(57)【要約】  本発明は、テトラヒドロピラニルメチルアミノピリミジンアミドの塩、例えば（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩、それを含有する医薬組成物、それを調製するプロセス、およびそれを使用した治療の方法を提供する。
2018524342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物Ｉ：
【化１】
2018524342.tif 000034
のクエン酸塩であって、式
【化２】
2018524342.tif 000035
を有する、クエン酸塩。
【請求項２】
結晶質形態である、請求項１に記載の塩。
【請求項３】
λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を使用して測定された以下の２θ値：１９．１°および２２．４°でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示す、請求項２に記載の結晶質形態。
【請求項４】
前記Ｘ線粉末回折パターンが１２．２°でのピークを更に含むことを特徴とする、請求項３に記載の結晶質形態。
【請求項５】
前記Ｘ線粉末回折パターンが１３．７°でのピークを更に含むことを特徴とする、請求項３または４に記載の結晶質形態。
【請求項６】
前記Ｘ線粉末回折パターンが１４．６°でのピークを更に含むことを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項７】
前記Ｘ線粉末回折パターンが１８．７°でのピークを更に含むことを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項８】
前記Ｘ線粉末回折パターンが２４．６°でのピークを更に含むことを特徴とする、請求項３〜７のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項９】
前記Ｘ線粉末回折パターンが２６．３°でのピークを更に含むことを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項１０】
λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を使用して測定された以下の２θ値：１２．２±０．２、１３．７±０．２、１４．６±０．２、１９．１±０．２、および２２．４±０．２でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示す、請求項２に記載の結晶質形態。
【請求項１１】
λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を使用して測定された以下の２θ値：１２．２±０．２、１３．７±０．２、１４．６±０．２、１８．７±０．２、１９．１±０．２、２２．４±０．２、２４．６±０．２、および２６．３±０．２でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示す、請求項２に記載の結晶質形態。
【請求項１２】
前記回折角２θでの前記ピークの相対強度が少なくとも１０％である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項１３】
前記回折角２θでの前記ピークの相対強度が少なくとも１５％である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項１４】
前記Ｘ線粉末回折パターンが実質的に図２に示すようなものである、請求項２に記載の結晶質形態。
【請求項１５】
回折角２θ、格子面間隔ｄ、および相対強度（最も強いピークに対するパーセンテージとして表される）に関して表される以下のＸ線粉末回折パターン：
【表１】
2018524342.tif 000036
【表２】
2018524342.tif 000037
によって特徴付けられる、請求項２に記載の結晶質形態。
【請求項１６】
ｃｍ−１単位の波数で表される以下のラマンシフト：１７１８、１２４２、７３１、６６２、５５３の任意の１つまたはすべてでのピークを含むラマンスペクトルを有する、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項１７】
２１２±５℃の融点を有する、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項１８】
図３に示すもものと実質的に同じ示差走査熱量測定曲線を有する、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項１９】
１つまたは複数の不活性担体および／または希釈剤と共に請求項１に記載の塩を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
１つまたは複数の不活性担体および／または希釈剤と共に請求項２〜９のいずれか一項に記載の結晶質形態を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
１つまたは複数の不活性担体および／または希釈剤と共に請求項１０に記載の結晶質形態を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
１つまたは複数の不活性担体および／または希釈剤と共に請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の結晶質形態を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
薬物として使用するための、請求項２に記載の塩または請求項２〜１８のいずれか一項に記載の結晶質形態。
【請求項２４】
疼痛、変形性関節症、糖尿病性腎症、および糖尿病性多発ニューロパシーから選択される症状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１に記載の塩または請求項２〜１８のいずれか一項に記載の結晶質形態の治療有効量を投与して、前記症状を治療することを含む、方法。
【請求項２５】
前記症状が疼痛である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記症状が炎症性疼痛である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記症状が慢性疼痛である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記症状が変形性関節症による疼痛である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記症状が神経障害性疼痛または内臓痛である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記症状が、急性および慢性の軽度乃至中程度の筋骨格系疼痛、腰痛、慢性腰痛、関節リウマチに関連する疼痛、肩関節痛、歯痛、変形性関節症、膝の変形性関節症、股関節部の変形性関節症、手の変形性関節症の兆候および症状、変形性関節症に伴う疼痛、癌性疼痛、糖尿病性多発ニューロパシー、内臓痛、急性疼痛、糖尿病性腎症、および神経障害性疼痛からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記症状が、（ａ）三叉神経痛および（ｂ）化学療法から生じる神経障害による疼痛から選択される疼痛である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記症状が変形性関節症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の塩の治療有効量を前記患者に投与して、前記症状を治療することを含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
化合物１
【化３】
2018524342.tif 000038
を製造する方法であって、以下の工程：
ｃ）有機溶媒中の化合物Ｉ
【化４】
2018524342.tif 000039
の溶液にクエン酸を添加する工程、
ｄ）得られた塩１を純粋な形態で単離する工程
を含む、方法。
【請求項３５】
工程ａ）における前記有機溶媒が、酢酸エチル、イソプロパノールおよびイソプロパノールと水との混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年７月２日出願の欧州特許出願公開第１５１７５０６６．８号明細書の利益および優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩およびそれを製造するプロセスを提供する。本発明は、急性および慢性の軽度乃至中程度の筋骨格系疼痛、腰痛、慢性腰痛、関節リウマチに関連する疼痛、肩関節痛、歯痛、変形性関節症、膝の変形性関節症、股関節部の変形性関節症、手の変形性関節症の兆候および症状、変形性関節症に伴う疼痛、癌性疼痛、糖尿病性多発ニューロパシー、内臓痛、急性疼痛、糖尿病性腎症、神経障害性疼痛などの病状の治療において使用される同じクエン酸塩、ならびに同じの塩を含む医薬組成物も提供する。
【背景技術】
【０００３】
国際公開第２０１１／０７３１５４号パンフレットは、それに例示されている化合物の具体的な塩または結晶形を開示することなく、多くのテトラヒドロピラニル−メチル−アミノ−（ヘテロ）アリール−アミドを開示している。特に、国際公開第２０１１／０７３１５４号パンフレットは、化合物Ｉ
【化１】
2018524342.tif 000003
を開示している。
【０００４】
国際公開第２０１１／０７３１５４号パンフレットに開示されている化合物は強力なＣＣＲ２アンタゴニストである。しかしながら、ヒトにおいて薬物として使用するために開発可能であると証明するには、原薬およびその固体状態は、生体外および生体内での薬物動態学的および薬理学的特性および安全性プロファイルに加えて、固形特性、純度、乾燥時間、濾過性、安定性、熱安定性、吸湿性、再現性および更なる物理化学的性質、例えば溶解性および固有の溶出速度など、化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）の条件に関する一連の基準を満たさなければならない。
【０００５】
ヒトにおいて医学的に使用される薬物生成物を開発する経過における最大の課題の１つは、安全性基準を満たすと同時に、ヒト用薬物の開発に適した固体形態を有する、すなわち上記の基準を累積的に満たす強力で有効な原薬を同定することである。これは、その固体、塩およびその多型の形態のそれぞれおよびすべてが、予想できないほど予測不可能な物理化学的および薬物動態学的特性を有するためである。
【０００６】
更に、固体、塩および多型の予測不可能かつ予想外の性質のために、所望の特性を有する固体形態を設計する方法について、当業者に対する一般的な指針も具体的な指針もない。したがって、幅広くかつ創造的な研究および実験が、すべての条件を満たす、選択された原薬の特定の固体形態に到達するのに必須である。重要なパラメーターを最適化した結果、もう１つのまたは他のパラメーターが低下することが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある目的の技術的問題は、ヒトにおいて薬物として使用するために開発可能である、ＣＣＲ２拮抗活性を有する原薬を提供することであり、
ａ）その原薬は、高い薬理学的効力、有効性、生体外および生体内薬物動態学、ならびに必要な安全性を特徴とし、かつ
ｂ）その原薬およびその固体形態は、固体形態特性、純度、乾燥時間、濾過性、安定性、熱安定性、吸湿性、再現性および更なる物理化学的性質、例えば溶解性および固有の溶出速度など、化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）の条件に関する一連の基準を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
予想外にも、化合物Ｉは、実証されるように（以下の生物学的データを参照）、ヒトにおいて薬物として使用するのに必要とされる上記の基準の大部分を満たすことが判明している。これらのパラメーターは、血漿タンパク質結合性（薬物動態学および薬力学に関連する）、生体外での代謝安定性（薬物動態学に関連する）、薬物動態学および安全性（ｈＥＲＧ、循環器系の安全性および薬物誘発脂質症に関連する）を含む。
【０００９】
しかしながら、化合物Ｉの遊離塩基は、準安定状態にあり、したがって変態を受けやすい非晶質材料であることが判明した。再現可能に製造することができる条件を満たさないことから、開発するための原薬として適していなかった。
【００１０】
エタノール、エタノール／水、２−プロパノール、２−プロパノール／水、アセトン、酢酸エチル、２−ブタノンまたはテトラヒドロフランなどの通常使用されるすべての溶媒中の溶液から結晶質形態で化合物Ｉを得る試みは失敗した。エタノール、エタノール／水、２−プロパノール、２−プロパノール／水、アセトン、酢酸エチル、２−ブタノンまたはテトラヒドロフランなどの通常使用されるすべての溶媒中の溶液から結晶質形態で化合物Ｉを得るかかる試みでは、非晶質物質のみが得られた。これらの失敗から、様々な酸との化合物Ｉの塩形態が研究された。
【００１１】
薬剤製造プロセスにおける物理化学的性質の再現性を確保するため、原薬は、常に明瞭な結晶質形態で入手しなければならない。原薬の結晶質形態またはその塩は、異なる多型変形（多型）で存在する場合、１つの多型形態から別の多型形態への自然な転化が起こり得る。かかる自然な相互変換は許容できず、必ず防ぐべきである。したがって、薬剤製造プロセスの再現性を確保するには、１つの結晶質形態のみで存在するか、または少なくとも多型に対する傾向が低いことを特徴とする原薬の塩を同定することが必須である。
【００１２】
本発明に従って、上記の技術的問題は実験および革新によって解決され、その結果として、特定の化合物（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩１
【化２】
2018524342.tif 000004
が同定された。クエン酸塩１は結晶質であり、すなわち特定の結晶変形によって定義され、したがって高純度および再現可能に高安定性で原薬を得ることが可能である。
【００１３】
化合物Ｉの種々の塩形態が製造および分析された。例えば、化合物Ｉのクエン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、エタンスルホン酸塩（ｅｓｉｌａｔｅ）およびメタンスルホン酸塩の結晶質形態が結晶化によって得られた。これらの塩形態の分析により、予想外にも、化合物Ｉのクエン酸塩、エタンスルホン酸塩およびメタンスルホン酸塩は、１つの多型形態のみを示すことが明らかとなった。これは、異なる多型変形で得られた化合物Ｉの臭化水素酸塩および塩酸塩と対照的である。
【００１４】
原薬の他の重要なパラメーターは吸湿性である。製造中の収着による原薬の水の吸収によって製剤中の原薬の量が減少し、したがって有効性が低下する。更に、原薬または製剤の吸水によって原薬の分解が起こり得る。したがって、含水しないかまたはほとんど吸湿性を有さない原薬またはその塩を同定することが必須である。
【００１５】
予想外にも、化合物Ｉのクエン酸塩１の結晶質形態は、９０％までの相対湿度での低いかつ可逆的な吸水を特徴とする（相対湿度８０％で吸水２．６％および相対湿度９０％で吸水３．４％）。一方、化合物Ｉの対応する臭化水素酸塩、塩酸塩、エタンスルホン酸塩およびメタンスルホン酸塩の結晶質形態は、８０％という低い相対湿度でかなりの量の水を容易に吸収し、不可逆的に潮解性となる。
【００１６】
したがって、本発明の一態様は、以下の式１：
【化３】
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を有する化合物を提供する。特定の実施形態において、この化合物は結晶質形態で提供される。
【００１７】
本発明の他の態様は、（ｉ）クエン酸塩１などの本明細書に記載の化合物、および（ｉｉ）１つまたは複数の担体および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。
【００１８】
本発明の他の態様は、クエン酸塩１、または病状を治療するのに使用される前記クエン酸塩１を含む医薬組成物を提供する。例示的な病状としては、例えば、疼痛（例えば、炎症性疼痛または神経障害性疼痛）および変形性関節症が挙げられる。
【００１９】
本発明の他の態様は、患者における病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、クエン酸塩１などの本明細書に記載の化合物の治療有効量を投与して、病状を治療することを含む、方法を提供する。例示的な病状としては、例えば、疼痛（例えば、炎症性疼痛または神経障害性疼痛）および変形性関節症が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】化合物（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの非晶質ベースのＸ線粉末ディフラクトグラムを示す。
【図２】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩のＸ線粉末ディフラクトグラムを示す。
【図３】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩の融点（ＤＳＣ／ＴＧ）の熱分析および決定を示す。
【図４】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩の収着等温線を示す。
【図５】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン臭化水素酸塩のＸ線粉末ディフラクトグラムを示す。
【図６】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン臭化水素酸塩の融点（ＤＳＣ／ＴＧ）の熱分析および決定を示す。
【図７】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン臭化水素酸塩の収着等温線を示す。
【図８】４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン塩酸塩のＸ線粉末ディフラクトグラムを示す。
【図９】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン塩酸塩の融点（ＤＳＣ／ＴＧ）の熱分析および決定を示す。
【図１０】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン塩酸塩の収着等温線を示す。
【図１１】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンエタンスルホン酸塩のＸ線粉末ディフラクトグラムを示す。
【図１２】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンエタンスルホン酸塩の融点（ＤＳＣ／ＴＧ）の熱分析および決定を示す。
【図１３】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンエタンスルホン酸塩の収着等温線を示す。
【図１４】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンメタンスルホン酸塩のＸ線粉末ディフラクトグラムを示す。
【図１５】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンメタンスルホン酸塩の融点（ＤＳＣ／ＴＧ）の熱分析および決定を示す。
【図１６】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンメタンスルホン酸塩の収着等温線を示す。
【図１７】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩のＦＴ−ラマンスペクトルを示す。
【図１８】（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンエタンスルホン酸塩のＦＴ−ラマンスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩形態、かかる塩形態を含有する医薬組成物、塩形態を製造する方法、ならびに疼痛および病状の治療などにおいて、かかる塩形態を使用する治療方法を提供する。本明細書に記述するように、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、予想外にも、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの他の塩形態と比べて複数の予想外の利点を提供することが発見された。例えば、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、９０％までの相対湿度で低いかつ可逆的な吸水を示すことが判明し、それは、８０％という低い相対湿度でかなりの量の水を容易に吸収し、不可逆的に潮解性となる臭化水素酸塩、塩酸塩、エタンスルホン酸塩およびメタンスルホン酸塩の対応する塩形態と対照的である。更に、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、予想外にも、１つのみの多型結晶質形態を示すことが判明し、これは、様々な多型変形を示す臭化水素酸および塩化水素酸から形成される対応する結晶質塩と対照的である。したがって、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノのクエン酸塩は、驚くべきことに、有益である複数の予想外の特性のために薬剤として開発するのに優れている。
【００２２】
本発明の種々の態様は、以下のセクションで更に記述される。特定の一セクションに記載の本発明の態様および実施形態は、特定のセクションに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語および語句が以下に定義される。
【００２４】
「対象」および「患者」という用語は、本発明の方法によって治療される生物を意味する。かかる生物は、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）を含み、最も好ましくはヒトである。
【００２５】
「有効量」という用語は、有益な結果または所望の結果を得るのに十分な化合物の量を意味する。有効量は、１つまたは複数の投与、適用または投薬量で投与することができるが、特定の製剤形態または投与経路に限定することを意図するものではない。
【００２６】
「治療する」という用語は、いずれかの効果、例えば、その結果として病状、疾患、障害などの改善、またはその症状の寛解が得られる、緩和、低減、調節、寛解または解消を含む。
【００２７】
本明細書全体を通して、組成物が特定の成分を有する、含む、もしくは含有すると記述される場合、または方法が特定の工程を有する、含む、もしくは含有すると記述される場合、更に、記載の成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物があることと、記載のプロセス工程から本質的になるまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法があることとが企図される。
【００２８】
Ｉ．４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩形態
本発明の一態様は、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩形態を提供する。以下および作業実施例に記述されるように、本開示は、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンを、クエン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、エタンスルホン酸、およびメタンスルホン酸から選択される酸と反応させることによって製造される４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩形態を記述する。
【００２９】
４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、予想外にも、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの他の塩形態と比べて複数の予想外の利点を提供することが発見された。例えば、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、９０％までの相対湿度で低いかつ可逆的な吸水を示すことが判明し、それは、８０％という低い相対湿度でかなりの量の水を容易に吸収し、不可逆的に潮解性となる対応する臭化水素酸塩、塩酸塩、エタンスルホン酸塩およびメタンスルホン酸塩の塩形態と対照的である。更に、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、予想外にも、１つのみの多型結晶質形態を示すことが判明し、それは、様々な多型変形を示す臭化水素酸および塩化水素酸から形成される対応する結晶質塩と対照的である。したがって、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩は、有益である複数の予想外の特性のために薬剤として開発するのに優れている。
【００３０】
したがって、本発明の一態様は、化合物Ｉ：
【化４】
2018524342.tif 000006
のクエン酸塩であって、式
【化５】
2018524342.tif 000007
を有する、クエン酸塩を提供する。
【００３１】
特定の実施形態において、前記クエン酸塩は、結晶質形態である。
【００３２】
特定の実施形態において、結晶質形態は、λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を用いて測定された以下の２θ値：１９．１°および２２．４°でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示すことによって特徴付けられる。特定の実施形態において、結晶質形態は、Ｘ線粉末回折パターンが１２．２°のピークを更に含むことを特徴とする。特定の実施形態において、結晶質形態は、Ｘ線粉末回折パターンが１３．７°のピークを更に含むことを特徴とする。特定の実施形態において、結晶質形態は、Ｘ線粉末回折パターンが１４．６°のピークを更に含むことを特徴とする。特定の実施形態において、結晶質形態は、Ｘ線粉末回折パターンが１８．７°のピークを更に含むことを特徴とする。特定の実施形態において、結晶質形態は、Ｘ線粉末回折パターンが２４．６°のピークを更に含むことを特徴とする。特定の実施形態において、Ｘ線粉末回折パターンが２６．３°のピークを更に含むことを特徴とする。
【００３３】
特定の実施形態において、結晶質形態は、λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を用いて測定された以下の２θ値：１２．２±０．２、１３．７±０．２、１４．６±０．２、１９．１±０．２、および２２．４±０．２でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示す。他の特定の実施形態において、結晶質形態は、λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を用いて測定された以下の２θ値：１２．２±０．２、１３．７±０．２、１４．６±０．２、１８．７±０．２、１９．１±０．２、２２．４±０．２、２４．６±０．２、および２６．３±０．２でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【００３４】
特定の実施形態において、前記回折角２θでのピークの相対強度は少なくとも１０％である。他の特定の実施形態において、前記回折角２θでのピークの相対強度は少なくとも１５％である。
【００３５】
特定の実施形態において、結晶質形態は、実質的に図２に示されるＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３６】
特定の実施形態において、結晶質形態は、回折角２θ、格子面間隔ｄ、および相対強度（最も強いピークに対するパーセンテージとして表される）に関して表される以下のＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる。
【００３７】
【表１】
2018524342.tif 000008
【００３８】
【表２】
2018524342.tif 000009
【００３９】
結晶質形態は、そのラマンスペクトルに従って更に特徴付けることができる。したがって、特定の実施形態において、結晶質形態は、ｃｍ−１単位の波数で表される以下のラマンシフト：１７１８、１２４２、７３１、６６２、５５３の任意の１つまたはすべてでのピークを含むラマンスペクトルを有する。
【００４０】
結晶質形態は、その融点に従って更に特徴付けることができる。したがって、特定の実施形態において、結晶質形態は２１２±５℃の融点を有する。
【００４１】
結晶質形態は、その示差走査熱量測定曲線に従って更に特徴付けることができる。したがって、特定の実施形態において、結晶質形態は、図３に示すものと実質的に同じ示差走査熱量測定曲線を有する。
【００４２】
望ましくは、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩において、クエン酸：４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのモル比は、約１：１である。特定の実施形態では、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩において、クエン酸：４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのモル比は、１．２：１〜１：１．２の範囲である。他の特定の実施形態において、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのクエン酸塩では、クエン酸：４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのモル比は、１：１である。
【００４３】
化合物（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン（Ｉ）およびその製造プロセスが国際公開第２０１１／０７３１５４号パンフレットに開示されている。この化合物を製造するプロセスについての詳細は、国際公開第２０１１／０７３１５４号パンフレットに記載されている（実施例３０、ページ１５０）。
【００４４】
クエン酸塩１を製造するプロセスも提供される。例えば、本発明の一態様は、化合物１
【化６】
2018524342.tif 000010
を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）有機溶媒中の化合物Ｉ
【化７】
2018524342.tif 000011
の溶液にクエン酸を添加する工程、
ｂ）得られた塩１を純粋な形態で単離する工程
を含む、方法を提供する。
【００４５】
特定の実施形態において、この方法は、工程ａ）の有機溶媒が、酢酸エチル、イソプロパノールおよびイソプロパノールと水との混合物からなる群から選択されることを更に特徴とする。
【００４６】
ＩＩ．治療用途
セクションＩに記載されるような化合物（例えば、クエン酸塩１）および本明細書に記載の医薬組成物は薬物として有用である。この薬物は、ＣＣＲ２活性の抑制によって治療上の利点が得られる疾患を治療するための薬物であり得る。
【００４７】
ケモカイン受容体ＣＣＲ２は、炎症性および免疫調節性障害および疾患、ならびに自己免疫症状、例えば関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症の重要なメディエーターであると意味付けられると報告されている。例えば、国際公開第２０１０／０７００３２号パンフレットを参照されたい。したがって、ケモカイン受容体ＣＣＲ２を調節する作用物質は、かかる障害および疾患の治療に有用である。
【００４８】
より一般的には、多くの症状および疾患が炎症プロセスを伴うことが広く受け入れられている。かかる炎症は、重要なことに、単球からの分化によって形成されるマクロファージの活性によって誘発および／または促進される。単球は、例えば膜常在性ＣＣＲ２の高い発現を特徴とするのに対して、マクロファージにおけるＣＣＲ２発現は低いことが更に判明した。ＣＣＲ２は、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）の勾配に沿った炎症への単球の移動として説明される単球輸送の重要な制御因子である。
【００４９】
したがって、マクロファージによって誘発される炎症を低減するには、アンタゴニストによって単球ＣＣＲ２をブロックし、その結果、単球が、マクロファージへ転化する炎症領域に向かって移動することを誘発されないようにすることが望ましいと考えられる。
【００５０】
したがって、本発明の一態様は、患者におけるＣＣＲ２関連症状を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の化合物（例えば、クエン酸塩１またはその結晶質形態）の治療有効量を投与して、症状を治療することを含む。特定の実施形態において、ＣＣＲ２関連症状はＭＣＰ−１関連症状である。
【００５１】
特定の実施形態において、ＣＣＲ２関連症状は疼痛である。治療が企図される疼痛の例示的なタイプとしては、例えば、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、および内臓痛が挙げられる。特定の実施形態において、疼痛は慢性疼痛である。特定の実施形態において、疼痛は、変形性関節症による疼痛である。治療が企図される疼痛の他の例示的なタイプとしては、例えば、腰痛、股関節部疼痛、下肢痛、非ヘルペス性神経痛、ヘルペス後神経痛、糖尿病性神経障害、神経障害誘発痛、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連神経障害性疼痛、頭部外傷、毒素および化学療法から生じる神経障害、幻肢痛、有痛性外傷モノニューロパシー、有痛性多発ニューロパシー、視床痛症候群、脳卒中後疼痛、中枢神経系障害、手術後疼痛、手根管症候群、三叉神経痛、乳房摘出後症候群、開胸後症候群、断端痛、反復運動疼痛、神経障害性疼痛関連痛覚過敏および異痛症、アルコール症および他の薬物誘発疼痛が挙げられる。
【００５２】
他の特定の実施形態において、ＣＣＲ２関連症状は免疫関連疾患である。例示的な免疫関連疾患としては、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身発症型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎関節炎、胃潰瘍、セロネガティブ関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００５３】
他の特定の実施形態において、ＣＣＲ２関連症状は繊維性症状である。例示的な繊維性症状としては、例えば、肝臓繊維症（限定されないが、アルコール誘発肝硬変、ウイルス誘発肝硬変、自己免疫誘発肝炎）；肺繊維症（限定されないが、強皮症、特発性肺線維症）；腎臓繊維症（限定されないが、強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎）；皮膚繊維症（限定されないが、強皮症、肥厚性およびケロイド瘢痕化、火傷）；骨髄線維症；神経線維腫症；繊維腫；腸管繊維症；および外科的処置から生じる繊維性癒着が挙げられる。
【００５４】
他の特定の実施形態において、ＣＣＲ２関連症状は炎症性疾患である。
【００５５】
本発明の他の態様は、疼痛、変形性関節症、糖尿病性腎症、および糖尿病性多発ニューロパシーから選択される症状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に記載の化合物（例えば、クエン酸塩１またはその結晶質形態）の治療有効量を投与して、その症状を治療することを含む、方法を提供する。
【００５６】
特定の実施形態において、その症状は疼痛である。特定の実施形態において、その症状は炎症性疼痛である。特定の実施形態において、その症状は慢性疼痛である。特定の実施形態において、その症状は、変形性関節症による疼痛である。特定の実施形態において、その症状は神経障害性疼痛または内臓痛である。
【００５７】
特定の実施形態において、その症状は、急性および慢性の軽度乃至中程度の筋骨格系疼痛、腰痛、慢性腰痛、関節リウマチに関連する疼痛、肩関節痛、歯痛、変形性関節症、膝の変形性関節症、股関節部の変形性関節症、手の変形性関節症の兆候および症状、変形性関節症に伴う疼痛、癌性疼痛、糖尿病性多発ニューロパシー、内臓痛、急性疼痛、糖尿病性腎症、神経障害性疼痛からなる群から選択される。特定の実施形態において、その症状は、（ａ）三叉神経痛および（ｂ）化学療法から生じる神経障害による疼痛から選択される疼痛である。
【００５８】
特定の実施形態において、その症状は変形性関節症である。
【００５９】
特定の実施形態において、この方法は、クエン酸塩１の治療有効量を患者に投与して、その症状を治療することを含む。
【００６０】
より具体的な実施形態において、本発明は、ＣＣＲ２受容体の抑制が有益である疾患、例えば、（ｉ）急性および慢性の軽度乃至中程度の筋骨格系疼痛（腰痛、慢性腰痛、関節リウマチに関連する疼痛、肩関節痛、歯痛）；（ｉｉ）変形性関節症兆候および症状（膝の変形性関節症および／または股関節部の変形性関節症、手の変形性関節症、変形性関節症に伴う疼痛）；（ｉｉｉ）癌性疼痛；（ｉｖ）糖尿病性多発ニューロパシー；（ｖ）内臓痛；（ｖｉ）急性疼痛；（ｖｉｉ）糖尿病性腎症；および（ｖｉｉｉ）神経障害性疼痛などを治療するための、本明細書に記載の化合物の使用を提供する。
【００６１】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明の他の態様は、１種または複数種の不活性担体および／または希釈剤と共に本明細書に記載の化合物（例えば、クエン酸塩１）を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与などの特定の経路を介した投与のために製剤化され得る。
【００６２】
より一般的には、適切な投与形態は、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、エマルジョン剤または吸入可能な粉剤またはエアロゾル剤である。それぞれの場合において薬学的に有効な化合物の含有量は、組成物全体に対して０．１〜９０重量％、好ましくは０．５〜５０重量％の範囲であるべきであり、すなわち以下に指定される投与範囲に達するのに十分な量である。
【００６３】
製剤は、錠剤の形態で、粉末として、カプセル（例えば、ハードゼラチンカプセル）中の粉末として、溶液または懸濁液として経口投与され得る。吸入により投与される場合、活性物質の組み合わせは、粉末として、水性溶液もしくは水性エタノール性溶液として、または噴射剤ガス配合物を用いて与えられ得る。
【００６４】
適切な錠剤は、例えば、活性物質を公知の賦形剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはラクトースなどの不活性希釈剤、デンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤、デンプンまたはゼラチンなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの潤滑剤および／またはカルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、またはポリ酢酸ビニルなどの放出を遅らせる作用剤と混合することによって得られる。錠剤は、いくつかの層も含み得る。したがって、被覆タブレットは、タブレットに類似して形成されたコアを、錠剤コーティングに通常使用される物質、例えばコリジンまたはセラック、アラビアゴム、タルク、二酸化チタンまたは糖でコーティングすることによって製造され得る。遅延放出を達成するため、または不相溶性を防ぐために、コアは多くの層からもなり得る。同様に、タブレットコーティングは、場合によりタブレットについて上記の賦形剤を使用して、遅延放出を達成するために多くの層からなり得る。
【００６５】
本発明による活性物質またはその組み合わせを含有するシロップ剤は、甘味料、例えばサッカリン、シクラメート、グリセロールまたは糖および風味増強剤、例えば、バニリンまたはオレンジ抽出物などの風味を更に含有し得る。それらは、カルボキシルメチルセルロースナトリウムなどの懸濁補助剤または増粘剤、湿潤剤、例えば、脂肪アルコールとエチレンオキシドの縮合生成物、またはｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの保存剤も含有し得る。
【００６６】
１種または複数種の活性物質または活性物質の組み合わせを含有するカプセル剤は、例えば、ラクトースもしくはソルビトールなどの不活性担体と活性物質を混合し、それらをゼラチンカプセル内に充填することによって製造され得る。
【００６７】
適切な坐剤は、例えば天然脂肪もしくはポリエチレングリコールまたはその誘導体など、この目的のために提供される担体と混合することによって製造され得る。
【００６８】
使用することができる賦形剤としては、例えば、水、薬学的に許容される有機溶媒、例えばパラフィン（例えば、石油留分）、植物油（例えば、落花生油またはゴマ油）、単官能性または多官能性アルコール（例えば、エタノールまたはグリセロール）、担体、例えば、天然鉱物粉末（例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク）、合成鉱物粉末（例えば、高度に分散されたケイ酸およびケイ酸塩）、糖（例えば、ショ糖、ラクトースおよびグルコース）、乳化剤（例えば、リグニン、亜硫酸廃液、メチルセルロース、デンプンおよびポリビニルピロリドン）および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸およびラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
【００６９】
経口投与について、錠剤は、当然のことながら、上記の担体の他に、デンプン、好ましくはジャガイモデンプン、ゼラチンなどの種々の添加剤と共に、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびケイ酸二カルシウムなどの添加剤を含有し得る。更に、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの潤滑剤をタブレット形成プロセスに同時に使用してもよい。水性懸濁液の場合、上記の賦形剤に加えて活性物質を種々の風味増強剤と組み合わせてもよい。
【００７０】
ＩＶ．医療用途で使用されるキット
本発明の他の態様は、病状を治療するためのキットを提供する。このキットは、ｉ）疼痛、変形性関節症、糖尿病性腎症、または糖尿病性多発ニューロパシー（例えば、急性および慢性の軽度乃至中程度の筋骨格系疼痛、腰痛、慢性腰痛、関節リウマチに関連する疼痛、肩関節痛、歯痛、変形性関節症に伴う疼痛、癌性疼痛、内臓痛、急性疼痛、糖尿病性腎症、および神経障害性疼痛から選択される疼痛）などの病状を治療するための説明書；およびｉｉ）クエン酸塩１などの本明細書に記載の化合物を備える。このキットは、疼痛などの前記病状を治療するのに有効な量のクエン酸塩１を含有する１つまたは複数の単位用量を備え得る。
【実施例】
【００７１】
一般に説明される本発明は、本発明の特定の態様および実施形態を説明する目的でのみ包含され、かつ本発明を限定することを意図されない以下の実施例を参照して、より容易に理解されるであろう。
【００７２】
略語のリスト
ＡＵＣ  血漿中濃度−時間曲線下の面積
ＢＲ  臭化水素酸塩（臭化水素酸との塩）
ＢＳ  塩基（定義される塩ではない）
Ｃｍａｘ  ピーク濃度
ＣＩ  クエン酸塩（クエン酸との塩）
ＣＬ  クリアランス
ＣＬ  塩酸塩（塩化水素酸との塩）
ＥＳ  エタンスルホン酸塩（エタンスルホン酸１モルとの塩）
ｄ．ｂ．  乾燥量基準（で）
ＤＳＣ  示差走査熱量計
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＭＳＯ−ｄ６  重水素化ＤＭＳＯ
ＤＶＳ  動的水蒸気吸収装置
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ  エチレングリコール四酢酸
ＥＳＩ  エレクトロスプレーイオン化
ｆ  メス
Ｆ  経口バイオアベイラビリティ
ＦＣＳ  ウシ胎仔血清
ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ｈＥＲＧ  ヒト遅延整流性カリウムイオンチャンネル遺伝子
ＨＲ  高分解能
ＩＶ、ｉ．ｖ．  静脈内
ｍ  オス
Ｍ  モル／Ｌ
ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液  クエン酸／リン酸緩衝液
ＭＲＴｄｉｓｐ  静脈内投与後の平均滞留時間
ＭＲＴｔｏｔ  経口投与後の平均滞留時間
ＭＳ  質量分析
ＭＳ  メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸１モルとの塩）
ｍ／ｚ  質量電荷比
ＮＭＲ  核磁気共鳴
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＫ  薬物動態学
ＰＯ、ｐ．ｏ．  経口
ｒ．ｈ．  相対湿度
ＲＴ  室温
Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ緩衝液  ＮａＯＨ／ＮａＣＬ／グリシン緩衝液
ｔｍａｘ  最高血漿中濃度の時間
ＴＧ  熱重量測定
Ｖｓｓ  定常状態分布容積
ＶＬＥ  非常に低いエンドトキシン
ＸＲＰＤ  Ｘ線粉末回折
【００７３】
実施例１  −  化合物Ｉの塩の製造および物理化学的特徴付け
化合物Ｉのクエン酸塩を含む化合物Ｉの複数の塩を製造し、特徴付けた。実験手順および結果を以下に示す。化合物Ｉは、以下の式：
【化８】
2018524342.tif 000012
を有する。
【００７４】
パートＩ：用いられた分析法の説明
化合物Ｉの塩を特徴付けるために使用された分析方法の詳細を以下に示す。
【００７５】
【表３】
2018524342.tif 000013
【００７６】
【表４】
2018524342.tif 000014
【００７７】
【表５】
2018524342.tif 000015
【００７８】
Ｘ線粉末（ＸＲＰＤ）図
単色ＣｕＫα１放射線（λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡ）と共に、ＭＹＴＨＥＮ検出器およびＸ線源としてのＣｕ−陽極を備えた、伝達モードのＳＴＯＥ−ＳＴＡＤＩ  Ｐ−回折計を使用してＸ線粉末図を作成した。
【００７９】
ＦＴ−ラマン分光法
Ｂｒｕｋｅｒ  ＲＡＭ  ＩＩ  ＦＴ−Ｒａｍａｎ  Ｍｏｄｕｌｅ装置（分解能２ｃｍ−１、６４スキャン、レーザーパワー５００ｍＷ（集束レーザー））を使用して沸点チューブ内で試料を測定した。分析：３５００ｃｍ−１〜５０ｃｍ−１のスペクトル範囲でのベクターのスケーリング。
【００８０】
示差走査熱量測定  −  融点
化合物が、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定された融点によって特徴付けられ、ピーク最大値および開始温度によって評価される。実験の加熱速度は１０℃／分である。示される値は、ＴＡ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＱ−ｓｅｒｉｅｓ（商標）からのＤＳＣ装置を使用して決定された。
【００８１】
熱重量測定（ＴＧ）
ＴＡ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＱ−ｓｅｒｉｅｓからのＴＧ装置で熱重量測定データを収集した。この方法では、制御雰囲気下での温度の関数として材料の重量変化が測定される。
【００８２】
動的水蒸気吸収（ＤＶＳ）
Ｈｉｄｅｎ  ＩｓｏｃｈｅｍａからのＩＧＡｓｏｒｐ水分収着モニターを使用して収着等温線を作成した。相対湿度が１０％間隔の１０〜９０％の範囲で、吸着および脱着等温線が２５℃で得られた。
【００８３】
臭化水素酸塩形態についてのみ、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＤＶＳ−１水分収着モニターで収着等温線が登録された。
【００８４】
溶解性
自動振盪フラスコ法（室温において）を用いて溶解性を決定し、ＵＶ分光法により、この自動化セットアップ内の溶解された原薬の定量化を行った。
【００８５】
パートＩＩ：（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩（１）の製造
【００８６】
標題化合物を製造する例示的な手順を物理的特徴付けデータと共に以下に示す。製造手順は、標題化合物を製造する２つの異なる経路を含む。
製造オプションａ）遊離塩基Ｉから出発するクエン酸塩の製造：
【化９】
2018524342.tif 000016
酢酸エチル（２ｍＬ）中の遊離塩基Ｉ（２００ｍｇ、０．３７２ｍｍｏｌ）の溶液にクエン酸一水和物（７８．２ｍｇ；０．３７２ｍｍｏｌ）を添加する。その溶液を一晩（１８時間）撹拌する。懸濁液を濾過し、生成物を真空内で４０℃において乾燥させ、無色の結晶１４０ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ（５２％）が形成される。クエン酸塩１の物理的特徴付けデータを以下に示す。
ＮＭＲ（１Ｈ，４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．７−８．５（２Ｈ，ブロード），８．３４（１Ｈ，ｓ），７．２２（２Ｈ，ｍ），７．１２（２Ｈ，ｍ），７．０８（１Ｈ，ｔ），４．４９（１Ｈ，ｍ），４．３１（１Ｈ，ｄ），４．０９（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｍ），３．７４（１Ｈ，ｍ），３．５７−３．４４（２Ｈ，ｍ），３．４８（１Ｈ，ｍ），３．４７（１Ｈ，ｍ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．３３（１Ｈ，ｍ），３．２９（１Ｈ，ｍ），３．２７（１Ｈ，ｍ），３．０４（１Ｈ，ｍ），２．８４（１Ｈ，ｍ），２．５８（２Ｈ，ｄ），２．５０（２Ｈ，ｄ），２．２８（３Ｈ，ｓ），２．１２（１Ｈ，ｍ），１．９４（１Ｈ，ｍ），１．９１（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．７６（１Ｈ，ｍ），１．７０（１Ｈ，ｍ），１．６６（１Ｈ，ｍ），１．６３（１Ｈ，ｍ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．３７（１Ｈ，ｍ），１．２４（１Ｈ，ｍ）（回転異性体を含む）。
ＮＭＲ（１３Ｃ，１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７６．６，１７１，１６５．４，１６１．０，１５６．６，１５５．４，１４０．３，１３６．０，１２８．５，１２５．６，１０９．３，７８．５，７５．４，７２．４，７２．２，７１．２，６４．８，６４．４，６４．４，５５．５，５５．５，５１．５，５１．４，５０．２，４５．６，４４．１，４４．１，３８．８，３３．３，２９．６，２８．７，２８．７，２５．１，２３．１，２０．６，１１．７（回転異性体を含む）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５３８．３４００（［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃ３０Ｈ４４Ｎ５Ｏ４）
ＦＴ−ラマンスペクトル（固有のバンド）［ｃｍ−１］：１７１８、１２４２、７３１、６６２、５５３。
【００８７】
更なる特徴付けデータについては、以下の表ＩＩおよび図２〜４および１７を参照されたい。
【００８８】
製造オプションｂ）アミドカップリングに続く、クエン酸塩の製造：
【化１０】
2018524342.tif 000017
５０℃の２−メチルテトラヒドロフラン７５Ｌ中の１０．０ｋｇ（２９．２９ｍｏｌ）の懸濁液に１，１’−カルボニルジイミダゾール４．９９ｋｇ（３０．７５ｍｏｌ）を添加する。粉末漏斗を２−メチルテトラヒドロフラン５Ｌですすぐ。反応混合物を５０℃で７０分間撹拌する。次いで、８．８３ｋｇ（３０．７５ｍｏｌ）の３を反応混合物に添加し、漏斗を２−メチルテトラヒドロフラン５Ｌですすぐ。次に、トリエチルアミン７．４１ｋｇ（７３．２３ｍｏｌ）および２−メチルテトラヒドロフラン１０Ｌを添加し、反応混合物を還流下において１時間撹拌する。次いで、混合物を６０℃に冷却し、水５５Ｌ中の炭酸カリウム６．０７ｋｇ（４３．９４ｍｏｌ）の溶液を添加し、相を５５℃で分離する。有機層を６０Ｌで洗浄し、真空内で蒸留することによって溶媒８０Ｌを除去する。得られた残留物をイソプロピルアルコール８０Ｌで希釈し、真空内で蒸留することによって溶媒５５Ｌを除去する。得られた残留物をイソプロピルアルコール４０Ｌで希釈し、真空内で蒸留することによって溶媒４０Ｌを除去する。次に、水１１Ｌ中のクエン酸一水和物５．８５ｋｇ（２７．８３ｍｏｌ）を添加し、滴下漏斗をイソプロピルアルコール３０Ｌですすぐ。反応混合物を７５℃に加熱し、溶液が形成するまで撹拌し、次いで濾過する。水２Ｌとイソプロピルアルコール２０Ｌの混合物でフィルターをすすぐ。次いで、濾液をイソプロピルアルコール３０Ｌで希釈し、オプションａ）で得られた１００ｇの１で６５℃においてシーディング（ｓｅｅｄ）する。次に、混合物を３０分以内に５５℃に冷却し、次いで５５℃において更に１時間撹拌する。得られた懸濁液を５５℃においてイソプロピルアルコール６０Ｌで１時間以内に希釈し、次いで３時間以内に２０℃に冷却する。次いで、懸濁液を２０℃で１７時間撹拌し、濾過によって単離する。イソプロピルアルコール１９Ｌと水１Ｌの混合物でそれぞれ、濾過ケークを２回洗浄する。生成物を５０℃において真空内で乾燥させて、化合物１７．７６ｋｇ（８３％）が形成される。クエン酸塩１の物理的特徴付けデータを以下に示す。
ＮＭＲ（１Ｈ，４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．７−８．５（２Ｈ，ブロード），８．３４（１Ｈ，ｓ），７．２２（２Ｈ，ｍ），７．１２（２Ｈ，ｍ），７．０８（１Ｈ，ｔ），４．４９（１Ｈ，ｍ），４．３１（１Ｈ，ｄ），４．０９（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｍ），３．７４（１Ｈ，ｍ），３．５７−３．４４（２Ｈ，ｍ），３．４８（１Ｈ，ｍ），３．４７（１Ｈ，ｍ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．３３（１Ｈ，ｍ），３．２９（１Ｈ，ｍ），３．２７（１Ｈ，ｍ），３．０４（１Ｈ，ｍ），２．８４（１Ｈ，ｍ），２．５８（２Ｈ，ｄ），２．５０（２Ｈ，ｄ），２．２８（３Ｈ，ｓ），２．１２（１Ｈ，ｍ），１．９４（１Ｈ，ｍ），１．９１（３Ｈ，ｓ），１．８８（１Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．７６（１Ｈ，ｍ），１．７０（１Ｈ，ｍ），１．６６（１Ｈ，ｍ），１．６３（１Ｈ，ｍ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．４０（１Ｈ，ｍ），１．３７（１Ｈ，ｍ），１．２４（１Ｈ，ｍ）（回転異性体を含む）。
ＮＭＲ（１３Ｃ，１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７６．６，１７１，１６５．４，１６１．０，１５６．６，１５５．４，１４０．３，１３６．０，１２８．５，１２５．６，１０９．３，７８．５，７５．４，７２．４，７２．２，７１．２，６４．８，６４．４，６４．４，５５．５，５５．５，５１．５，５１．４，５０．２，４５．６，４４．１，４４．１，３８．８，３３．３，２９．６，２８．７，２８．７，２５．１，２３．１，２０．６，１１．７（回転異性体を含む）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５３８．３４００（［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃ３０Ｈ４４Ｎ５Ｏ４）。
ＦＴ−ラマンスペクトル（固有のバンド）［ｃｍ−１］：１７１８、１２４２、７３１、６６２、５５３。
【００８９】
更なる特徴付けデータについては、以下の表ＩＩおよび図２〜４および１７を参照されたい。
【００９０】
パートＩＩＩ：（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの更なる塩の製造
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの更なる塩を以下に記載のように製造し、特徴付けた。
【００９１】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン臭化水素酸塩の製造
メタノール２ｍＬ中の４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン１０３ｍｇ（０．１９１６ｍｍｏｌ）の溶液に臭化水素酸１．９１６ｍＬ（０．１Ｍ）を添加し、５０℃で２時間撹拌する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で４０℃において除去する。次に、テトラヒドロフラン４ｍＬを残留物に添加する。混合物を超音波処理し、次いで４０℃で２時間撹拌し、その後、室温で４時間保管する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で除去して、（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの臭化水素酸塩が形成される。
【００９２】
特徴付けデータについては、以下の表ＩＩＩおよび図５〜７を参照されたい。
【００９３】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン塩酸塩の製造
メタノール１ｍＬ中の（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン３０ｍｇ（０．０５５７ｍｍｏｌ）の溶液に塩化水素酸０．５５８ｍＬ（０．１Ｍ）を添加し、５０℃で２時間撹拌する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で４０℃において除去する。次に、テトラヒドロフラン１．２ｍＬを残留物に添加する。混合物を超音波処理し、次いで４０℃で２時間撹拌し、その後、室温で４時間保管する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で除去して、（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩酸塩が形成される。
【００９４】
特徴付けデータについては、以下の表ＩＶおよび図８〜１０を参照されたい。
【００９５】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンエタンスルホン酸塩の製造
メタノール２ｍＬ中の（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン１００ｍｇ（０．１８６ｍｍｏｌ）の溶液にエタンスルホン酸１．８６０ｍＬ（０．１Ｍ）を添加し、５０℃で２時間撹拌する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で４０℃において除去する。次に、アセトン４ｍＬを残留物に添加する。混合物を超音波処理し、次いで４０℃で２時間撹拌し、その後、室温で４時間保管する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で除去して、４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのエタンスルホン酸塩が形成される。
【００９６】
ＦＴ−ラマンスペクトル（固有のバンド）［ｃｍ−１］：１６３７、１２５３、１０１４、７４０、７１９、５３４、５２５、２１９。
【００９７】
特徴付けデータについては、以下の表Ｖおよび図１１〜１３および１８を参照されたい。
【００９８】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンメタンスルホン酸塩の製造
メタノール１ｍＬ中の（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン３０ｍｇ（０．０５５７ｍｍｏｌ）の溶液にメタンスルホン酸０．５５８ｍＬ（０．１Ｍ）を添加し、５０℃で２時間撹拌する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で４０℃において除去する。次に、トルエン１．２ｍＬを残留物に添加する。混合物を超音波処理し、次いで５０℃で２時間撹拌し、その後、室温で一晩保管する。次いで、溶媒を真空乾燥器内で除去して、（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンのメタンスルホン酸塩が形成される。
【００９９】
特徴付けデータについては、以下の表ＶＩおよび図１４〜１６を参照されたい。
【０１００】
パートＩＶ：（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩についての物理的特徴付けデータ
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの塩についての例示的な物理的特徴付けデータを以下に提供する。
【０１０１】
水性媒体中での溶解度
表Ｉに、異なる水性媒体中での２、４および６時間の時点での（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩の溶解度を示す。
【０１０２】
【表６】
2018524342.tif 000018
【０１０３】
表Ｉのデータから、（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩が酸性、中性および塩基性水性媒体中で高い溶解性であることが実証されている。
【０１０４】
クエン酸塩１の固体状態の特性
クエン酸塩１の様々な固体状態の特性を以下に示す。
【０１０５】
外観
固体状態において、（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩は白色の微結晶性物質である。
【０１０６】
収着挙動
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩のみが、８０％までの相対湿度に対して安定性を示す。水２．６％の吸水が確認される。吸水は可逆的であり、収着実験後、化合物は依然として固体状態のままである。他のすべての塩がより高い相対湿度で液相へ変化した（相対湿度６０〜７０％で開始して、塩の形態に応じて）。
【０１０７】
結晶化度および多型
クエン酸塩１
クエン酸塩は、図２のＸ線粉末回折図に見られるように高い結晶質である。Ｘ線粉末反射および強度（正規化された）を表ＩＩに示す。
【０１０８】
【表７】
2018524342.tif 000019
【０１０９】
【表８】
2018524342.tif 000020
【０１１０】
上記の表ＩＩにおいて、「２θ［°］」の値は、回析の角度（度）を意味し、ｄ値「Å」は、格子面間のÅの指定距離を意味する。
【０１１１】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンの結晶質クエン酸塩は、そのＸ線粉末図がとりわけ固有値２θ＝１９．１°（相対強度１００％）、２２．４°（相対強度９２％）、１２．２°（相対強度４１％）、１３．７°（相対強度３９％）、および１４．６°（相対強度３２％）（図２の図における最も突出したピークである、表ＩＩ）を有することを特徴とする。
【０１１２】
その結果、第１の態様に従って、本発明は、化合物Ｉ
【化１１】
2018524342.tif 000021
のクエン酸塩であって、次
【化１２】
2018524342.tif 000022
を有する、クエン酸塩を提供する。
【０１１３】
第２の実施形態において、塩１は結晶質形態である。
【０１１４】
第３の実施形態において、先の実施形態のいずれか１つに従って、化合物１の結晶質形態は、λ＝１．５４０５６Å、４０ｋＶ、４０ｍＡの単色ＣｕＫα１放射線を使用して測定された以下の２θ値：１９．１°および２２．４°でのピークを含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１１５】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、１２．２°でのピークを更に含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１１６】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、１３．７°でのピークを更に含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１１７】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、１４．６°でのピークを更に含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１１８】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、１８．７°でのピークを更に含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１１９】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、２４．６°でのピークを更に含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１２０】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、２６．３°でのピークを更に含むＸ線粉末回折パターンを示す。
【０１２１】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、ｃｍ−１単位の波数で表される以下のラマンシフト：１７１８、１２４２、７３１、６６２、５５３の任意の１つまたはすべてでのピークを含むラマンスペクトルを示す。
【０１２２】
先の実施形態のいずれか１つによる更なる実施形態において、結晶質形態は、２１２±５℃の融点を示す。
【０１２３】
クエン酸塩１は医薬組成物において提供される。したがって、本発明の他の態様は、任意に１つまたは複数の不活性担体および／または希釈剤と共に先の実施形態のいずれか１つによる塩を含有する医薬組成物である。
【０１２４】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンクエン酸塩についてのいくつかの実験から、１種類の結晶質形態のみが得られた。
【０１２５】
式（Ｉ）の化合物の臭化水素酸塩
式（Ｉ）の化合物の臭化水素酸塩は、図５のＸ線粉末回折で実証されるように中程度の結晶性の塩である。Ｘ線粉末の反射および強度（正規化された）を表ＩＩＩに示す。
【０１２６】
【表９】
2018524342.tif 000023
【０１２７】
上記の表ＩＩＩにおいて、「２θ［°］」の値は、回析の角度（度）を意味し、ｄ値「Å」は、格子面間のÅの指定距離を意味する。
【０１２８】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン臭化水素酸塩は、そのＸ線粉末図がとりわけ固有値２θ＝４．７°（相対強度１００％）、２０．４°相対強度（８３％）、１４．５°（相対強度７８％）、１５．３°（相対強度６２％）、および１９．４°（相対強度６２％）（図５の図における最も突出したピークである、表ＩＩＩ）を有することを特徴とする。
【０１２９】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン臭化水素酸塩の異なる多型変形は線粉末回折によって同定された。
【０１３０】
式（Ｉ）の化合物の塩酸塩
式（Ｉ）の化合物の塩酸塩は、図８のＸ線粉末回折図から分かるように、中程度の結晶性の塩である。Ｘ線粉末の反射および強度（正規化された）を表ＩＶに示す。
【０１３１】
【表１０】
2018524342.tif 000024
【０１３２】
上記の表ＩＶにおいて、「２θ［°］」の値は、回析の角度（度）を意味し、ｄ値「Å」は、格子面間のÅの指定距離を意味する。
【０１３３】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン塩酸塩は、そのＸ線粉末図がとりわけ固有値２θ＝１７．５°（相対強度１００％）、１５．４（相対強度９８％）、４．７°（相対強度９３％）、２０．５°（相対強度７７％）、および１４．６°（相対強度６４％）（図８の図における最も突出したピークである、表ＩＶ）を有することを特徴とする。
【０１３４】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノン塩酸塩の異なる多型変形は線粉末回折によって同定された。
【０１３５】
式（Ｉ）の化合物のエタンスルホン酸塩
式（Ｉ）の化合物のエタンスルホン酸塩は、図１１のＸ線粉末回折図から分かるように、高い結晶性の塩である。Ｘ線粉末の反射および強度（正規化された）を表Ｖに示す。
【０１３６】
【表１１】
2018524342.tif 000025
【０１３７】
【表１２】
2018524342.tif 000026
【０１３８】
上記の表Ｖにおいて、「２θ［°］」の値は、回析の角度（度）を意味し、ｄ値「Å」は、格子面間のÅの指定距離を意味する。
【０１３９】
（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンエタンスルホン酸塩は、そのＸ線粉末図がとりわけ固有値２θ＝１７．９°（相対強度１００％）、１３．３（相対強度８３％）、５．３°（相対強度６６％）、２０．９°（相対強度６６％）、および２０．０°（相対強度６３％）（図１１の図における最も突出したピークである、表Ｖ）を有することを特徴とする。
【０１４０】
式（Ｉ）の化合物のメタンスルホン酸塩
式（Ｉ）の化合物のメタンスルホン酸塩は、図１４のＸ線粉末回折図から分かるように、中程度の結晶性の塩である。Ｘ線粉末の反射および強度（正規化された）を表ＶＩに示す。
【０１４１】
【表１３】
2018524342.tif 000027
【０１４２】
上記の表ＶＩにおいて、「２θ［°］」の値は、回析の角度（度）を意味し、ｄ値「Å」は、格子面間のÅの指定距離を意味する。
【０１４３】
（（４−（（３Ｒ，４Ｒ）−３−メトキシテトラヒドロ−ピラン−４−イルアミノ）ピペリジン−１−イル）（５−メチル−６−（（（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ｐ−トリル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ）ピリミジン−４−イル）メタノンメタンスルホン酸塩は、そのＸ線粉末図がとりわけ固有値２θ＝１４．７°（相対強度１００％）、１２．３（相対強度７７％）、２０．７°（相対強度５５％）、１７．７°（相対強度５３％）、および９．９°（相対強度５１％）（図１４の図における最も突出したピークである、表ＶＩ）を有することを特徴とする。
【０１４４】
熱分析
結晶質クエン酸塩１の熱分析から、融点＝２１２±５℃（開始、ＤＳＣ：加熱速度１０Ｋ．分−１；ＤＳＣ／ＴＧ図を図３に示す）が示される。乾燥すると、１．６％の重量減少が生じる。したがって、クエン酸塩は溶媒を吸収する傾向が低い（水の場合、低吸湿性を意味する）。
【０１４５】
化合物Ｉの結晶質臭化水素酸塩の熱分析から、融点＝２４８±５℃（開始、ＤＳＣ：加熱速度１０Ｋ．分−１；ＤＳＣ／ＴＧ図を図６に示す）が示される。付随する重量減少（乾燥させた場合に２．９％の重量減少）と共に広い吸熱作用が４０〜１１０℃で起こる。
【０１４６】
化合物Ｉの結晶質塩酸塩の熱分析から、融点＝２３３±５℃（開始、ＤＳＣ：加熱速度１０Ｋ．分−１；ＤＳＣ／ＴＧ図を図９に示す）が示される。広い吸熱作用が４０〜８０℃で起こる。弱い吸熱作用が１３０〜１５０℃で起こる（乾燥させた場合に２．８％の重量減少）。
【０１４７】
化合物Ｉの結晶質エタンスルホン酸塩の熱分析から、融点＝１９９±５℃（開始、ＤＳＣ：加熱速度１０Ｋ．分−１；ＤＳＣ／ＴＧ図を図１２に示す）が示される。弱く広い吸熱作用が４０〜１００℃で起こる。乾燥した場合の重量減少２．４％は、吸熱作用と相関する。
【０１４８】
化合物Ｉの結晶質メタンスルホン酸塩の熱分析から、融点＝２２６±５℃（開始、ＤＳＣ：加熱速度１０Ｋ．分−１；ＤＳＣ／ＴＧ図を図１５に示す）が示される。弱く広い吸熱作用が３０〜１１０℃で起こる。
【０１４９】
収着等温線
結晶質クエン酸塩１の収着等温線は、１０〜８０％の湿度範囲で水の吸収２．６％を示す（図４に示される図）。
【０１５０】
化合物Ｉの結晶質臭化水素酸塩の収着等温線は、１０〜８０％の湿度範囲で水の吸収４．５％を示す（図７に示される図）。
【０１５１】
化合物Ｉの結晶質塩酸塩の収着等温線は、１０〜８０％の湿度範囲で水の吸収１５％を示す（図１０に示される図）。
【０１５２】
化合物Ｉの結晶質エタンスルホン酸塩の収着等温線は、１０〜８０％の湿度範囲で水の吸収２０％を示す（図１３に示される図）。
【０１５３】
化合物Ｉの結晶質メタンスルホン酸塩の収着等温線は、１０〜８０％の湿度範囲で水の吸収３０％を示す（図１６に示される図）。
【０１５４】
化合物Ｉの塩について選択された物理的性質の概要
化合物Ｉのクエン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、エタンスルホン酸塩およびメタンスルホン酸塩の選択された特性を表ＶＩＩに示す。
【０１５５】
【表１４】
2018524342.tif 000028
【０１５６】
実施例２  −  化合物Ｉおよびそのクエン酸塩１を特徴付ける生物活性データ
実験を行い、化合物Ｉおよびそのクエン酸塩１の生物活性を評価した。実験手順および結果の説明を以下に示す。
【０１５７】
パートＩ：生物学的アッセイの記述
血漿タンパク質結合性
Ｄｉａｎｏｒｍ  Ｔｅｆｌｏｎ透析セル（マイクロ０．２）が使用される。それぞれのセルは、ドナー（すなわち、緩衝液チャンバ）およびアクセプターチャンバ（すなわち、血漿チャンバ）からなり、５ｋＤａ分子量カットオフの超薄半透膜で分離されている。それぞれの試験化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中で１ｍＭにおいて調製し、最終濃度１．０μＭに希釈する。透析緩衝液２００μＬのアリコート（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４）を緩衝液チャンバ内に分配する。試験化合物透析溶液２００μＬのアリコートを結晶チャンバ内に分配する。回転下において３７℃でインキュベーションを２時間行う。次いで、透析液を反応チューブ内に移す。緩衝液フラクションのチューブはアセトニトリル／水（８０／２０（ｖ／ｖ））０．２ｍＬを含有する。血漿透析液２５μＬのアリコートをディープウェルプレートに移し、アセトニトリル／水（８０／２０（ｖ／ｖ））２５μＬ、緩衝液２５μＬ、較正用溶液２５μＬ、および内標準溶液２５μＬと混合する。アセトニトリル２００μＬを添加することによってタンパク質の沈殿を行う。緩衝透析液５０μＬのアリコートをディープウェルプレートに移し、ブランク血漿２５μＬ、内標準溶液２５μＬ、およびアセトニトリル２００μＬと混合する。結合（パーセント）は、式：結合％＝（血漿中濃度−緩衝液濃度／血漿中濃度）×１００で計算される。
【０１５８】
生体外代謝安定性
試験化合物の代謝分解を肝細胞懸濁液中でアッセイする。肝細胞を適切な緩衝系においてインキュベートする。インキュベータ（３７℃、１０％ＣＯ２）において（一般に）３０分間プレインキュベーションした後、試験化合物溶液（１μＭ）５μＬを肝細胞懸濁液３９５μＬ（０．２５〜５×１０６細胞／ｍＬの範囲の細胞密度、通常１×１０６細胞／ｍＬ、最終ＤＭＳＯ濃度０．０５％）に添加する。細胞を６時間インキュベートし（インキュベータ、オービタルシェーカ）、試料（２５μＬ）を０、０．５、１、２、４および６時間の時点で採取する。試料をアセトニトリルに移し、遠心分離（５分間）によってペレット状にする。上清を新たな９６ディープウェルプレートに移し、窒素下において蒸発させ、再懸濁する。親化合物の低下をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。以下のようにＣＬｉｎｔを計算する：ＣＬ＿ＩＮＴＲＩＮＳＩＣ＝用量／ＡＵＣ＝（Ｃ０／ＣＤ）／（ＡＵＤ＋ｃｌａｓｔ／ｋ）×１０００／６０。Ｃ０：インキュベーションにおける初期濃度［μＭ］、ＣＤ：ウイルス細胞の細胞密度［１０ｅ６細胞／ｍＬ］、ＡＵＤ：データ下の面積［μＭ×時］、ｃｌａｓｔ：最後のデータポイントの濃度［μＭ］、ｋ：親化合物の低下の回帰ラインの勾配［時−１］。計算された生体外の肝固有クリアランスを固有の生体内肝クリアランスにスケールアップし、それを用いて、肝臓モデル（ｗｅｌｌ  ｓｔｉｒｒｅｄモデル）を使用することによって生体外肝血液クリアランス（ＣＬ）を予測することができる。
・ＣＬ＿ＩＮＴＲＩＮＳＩＣ＿ＩＮＶＩＶＯ［ｍｌ／分／ｋｇ］＝（ＣＬ＿ＩＮＴＲＩＮＳＩＣ［μＬ／分／１０ｅ６細胞］×肝細胞性（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）［１０ｅ６細胞／ｇ肝臓］×肝臓係数［ｇ／ｋｇ体重］）／１０００
・ＣＬ［ｍｌ／分／ｋｇ］＝ＣＬ＿ＩＮＴＲＩＮＳＩＣ＿ＩＮＶＩＶＯ［ｍｌ／分／ｋｇ］×肝臓の血流［ｍｌ／分／ｋｇ］／（ＣＬ＿ＩＮＴＲＩＮＳＩＣ＿ＩＮＶＩＶＯ［ｍｌ／分／ｋｇ］＋肝臓の血流［ｍｌ／分／ｋｇ］）
【０１５９】
薬物動態学（動物実験）
静脈内（ＩＶ）または経口（ＰＯ）単回投与後の試験化合物の薬物動態学を、
・メスＢＡＬＢ／ｃマウス（平均体重：２５ｇ）
・オスＷｉｓｔａｒ（Ｈａｎ）ラット（平均体重：２６０ｇ）
・オスおよびメスＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタ（平均体重：２４ｋｇ）
・オスのビーグル犬（平均体重：１５ｋｇ）
において調べた。投与前にすべての非げっ歯類を一晩絶食させ、マウスおよびラットには無制限に摂取可能に食餌および水を与えた。化合物の経口用量は、０．５％  Ｎａｔｒｏｓｏｌ中の懸濁液として、または０．５％Ｎａｔｒｏｓｏｌ／０．０１５％Ｔｗｅｅｎ８０懸濁液として通常投与された。静脈内投与では、０．９％ＮａＣＬ中の溶液として、または水中に９．１％ＨＰ−βシクロデキストリンを含有する溶液として用量を適用した。
【０１６０】
静脈サンプリングし、ＥＤＴＡ被覆チューブ中に血液を浸すことによって血液を採取した。試験化合物の投与から４８時間後までに試料を採取した。次いで、遠心分離（４℃において約９０００ｇで５分間）によって血漿を分離した。試験化合物を決定するために血漿をＰＣＲプレートに移した。生物分析まですべての試料を約−２０℃で保存した。血漿中の試験化合物の濃度をＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって決定した。定量化の下限は０．５ｎｍｏｌ／Ｌ〜１ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【０１６１】
ｈＥＲＧ−チャネルアッセイ
細胞：
ＨＥＫ（ヒト胚腎臓）２９３細胞にｈＥＲＧ  ｃＤＮＡを安定にトランスフェクトした。パッチクランプ実験で使用するために決定された細胞を抗生物質なしで培養した。
【０１６２】
ピペットおよび溶液
ＮａＯＨと共に、ＮａＣｌ（１３７）、ＫＣｌ（４．０）、ＭｇＣｌ２（１．０）、ＣａＣｌ２（１．８）、グルコース（１０）、ＨＥＰＥＳ（１０）を含有（ｍＭ）する槽溶液（ｐＨ７．４）で細胞を灌流した。水平プラー（ＤＭＺ−Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｕｌｌｅｒ，Ｚｅｉｔｚ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、パッチピペットをホウケイ酸ガラス管材料（Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｌｓｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から作製し、ＫＯＨと共にアスパラギン酸カリウム（１３０）、ＭｇＣｌ２（５．０）、ＥＧＴＡ（５．０）、Ｋ２ＡＴＰ（４．０）、ＨＥＰＥＳ（１０．０）を含有（ｍＭ）するピペット溶液（ｐＨ７．２）で充填した。マイクロ電極の抵抗は、２〜５ＭΩの範囲であった。
【０１６３】
刺激および記録：
ＥＰＣ−１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＰａｔｃｈＭａｓｔｅｒソフトウェア（ＨＥＫＡ）を使用して膜電流を記録した。電流信号は、５ｋＨｚでデジタル化する前に２．５ｋＨｚでフィルターされたベッセル（Ｂｅｓｓｅｌ）であった。
【０１６４】
パッチクランプ技術の全細胞構造を用いて、ｈＥＲＧ仲介膜電流を通常２８℃で記録した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を−６０ｍＶの保持電位において固定し、１５秒間隔で繰り返される、固定振幅を有するパルスパターン（活性化／不活性化：２０００ｍｓにわたり４０ｍＶ；回復：２ｍｓにわたり１２０ｍＶ；２ｍｓで４０ｍＶに低下；不活性化末尾電流：５０ｍｓにわたり４０ｍＶ）を用いて、ｈＥＲＧ仲介不活性化末尾電流を誘発した。それぞれのパルス間隔の間に、Ｐ／ｎリーク電流除去（ｌｅａｋ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）手順のために０．２倍に縮小された４つのパルスを記録した。リンギングなく安全に記録されるレベルまでＲｓ補正を用いた。残りの未補正Ｒｓだけでなく実際の温度および保持電流も記録した。
【０１６５】
化合物の製造および適用：
調べられる様々な細胞のそれぞれ対し、試験アイテムの濃度を逐次適用した。最初の被験物質濃度の適用前に少なくとも９０秒間、ベースライン電流の定常状態レベルを測定した。
【０１６６】
試験アイテムをＤＭＳＯに溶解して、最高最終濃度の１０００倍のストック溶液を生成した。このストックをＤＭＳＯ中で更に希釈し、残りの最終濃度の１０００倍のストック溶液にした。実験を開始する前に１：１０００希釈工程のそれぞれにより、細胞外緩衝液中の最終希釈液をこれらのストックから新たに調製した。
【０１６７】
データ分析：
＋４０ｍＶに上昇した後、ピーク電流の振幅を３ｍｓ測定した。ベースラインおよび各濃度に関して、次の濃度を適用する前に最後の３つの掃引のピーク電流を平均化した。実際の平均ピーク電流および平均ベースラインピーク電流の分数として、各細胞について残留電流（Ｉ／Ｉ０）を計算した。電流抑制を（１−Ｉ／Ｉ０）＊１００％と表した。すべての細胞の電流抑制は平均±ＳＤとして報告される。平均電流抑制データから、最小二乗法を用いてヒル（Ｈｉｌｌ）等式に基づいてＩＣ５０が推定される。
【０１６８】
生体外でのリン脂質症アッセイ
１．細胞培養：
細胞系：Ｕ９３７。細胞密度：０．５×１０６細胞／ｍＬ。培地の量：３ｍＬ／ウェル。
【０１６９】
２．材料およびデバイス：
−  Ｆａｌｃｏｎ組織培養フラスコ１７５ｃｍ２
−  試験チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
−  ６ウェルマイクロプレート
−  層流
−  冷却遠心機
−  ピペット
−  フローサイトメーター：Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ／ＭＣＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）
【０１７０】
３．培地および添加剤：
３．１  １０％ＦＣＳおよび０．００５％ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０の調製：
培地：
−  ＶＬＥ  ＲＰＭＩ  １６４０培地（１×）、２〜８℃で保存
添加剤：
−  ウシ胎児血清、−２０℃で保存
−  ゲンタマイシン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ（＝１％溶液）
【０１７１】
ＲＰＭＩ１６４０  ５００ｍＬにＦＣＳ  ５６ｍＬおよびゲンタマイシン２．６ｍＬを添加する。即時使用可能な培地を２〜８℃で保存する。
【０１７２】
３．２ホルムアルデヒド標準溶液（濃度３．７％）の調製：
１×ＰＢＳ中でホルムアルデヒド３７％を希釈し（希釈比１：１０）、３．７％標準溶液を調製し、それを２〜８℃で保存する。
【０１７３】
３．３緩衝液
ＰＢＳ−ダルベッコ（１×）、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋なし。室温で保存する。
【０１７４】
細胞染色のための色素
４．１生細胞の染色：
４．１．１ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）
ＰＩストック溶液：１ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ（暗所で４℃において保存）。
【０１７５】
ＰＩ即時使用可能な溶液：ＰＢＳで１：１００において希釈されたストック溶液（それぞれの実験のために新たに調製された）。
【０１７６】
４．１．２ナイルレッド（ＮｉｌｅＲｅｄ）（ＮＲ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）
ＮＲストック溶液：１ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ（暗所で４℃において保存）。
【０１７７】
生細胞染色のためのＮＲ即時使用可能な溶液：ＰＢＳで１：１００において希釈されたＮＲストック溶液（それぞれの実験のために新たに調製された）。
【０１７８】
４．２固定細胞の染色
ナイルレッドのストック溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）の調製：１００％ＤＭＳＯ  １ｍＬにナイルレッド１ｍｇを溶解し、２〜８℃で保存する。
【０１７９】
固定細胞染のためのナイルレッド標準溶液（濃度１μｇ／ｍＬ）の調製：１×ＰＢＳにナイルレッドストック溶液を希釈する（希釈比１：１０００）。細胞を染色する直前に標準溶液を調製し、使用しなければならない。
【０１８０】
５．細胞のシーディングおよび処理：
細胞のシーディングおよび処理は以下のように行われ得る：
−  １００％ＤＭＳＯに試験化合物を溶解して最終濃度の１００倍にし、計画された実験に従ってそれを希釈する。
−  最初に、６ウェルプレートの関連するウェルにストック溶液３０μＬを充填し、０．５×１０６細胞／ｍＬを含有する細胞浮遊液３ｍＬ／ウェルに再懸濁する（ＤＭＳＯ最終濃度＝１％）。
−  １種類の化合物および濃度につき１つのウェルを使用する。
−  培地を交換することなく、３７℃、５％ＣＯ２および相対湿度９５％において４８時間インキュベートする。
【０１８１】
細胞収集：
細胞収集は以下のように行われ得る：
−  Ｓａｒｓｔｅｄｔチューブ（氷上）に細胞浮遊液を移す。
−  １３０×ｇ、４℃で４分間遠心分離し、上清を廃棄する。
−  ＰＢＳ  ３ｍＬ／チューブ（氷冷）に再懸濁する。
−  フローサイトメトリーで決定するために、Ｓａｒｓｔｅｄｔチューブ（氷上）に細胞浮遊液１ｍＬを満たす（ヨウ化プロピジウムには０．５ｍＬおよびナイルレッド生細胞染色には０．５ｍＬ）。
−  残留物を１３０×ｇ、４℃で４分間遠心分離し、上清を廃棄する。
−  ３．７％ホルムアルデヒド溶液１ｍＬ／チューブを添加する。
−  ３０分間固定化する（室温で固定化した後の細胞を）。
−  １３０×ｇ、室温で４分間遠心分離し、上清を廃棄する。
−  固定細胞の染色のために、ナイルレッド標準溶液１．３ｍＬ中に各チューブで再懸濁する。
−  色素を５分間インキュベートする。
−  １３０×ｇ、室温で４分間遠心分離し、上清を廃棄する。
−  ＰＢＳ  ３ｍＬに再懸濁する。
−  １３０×ｇ、室温で４分間遠心分離し、上清を廃棄する。
−  ＰＢＳ  ０．５ｍＬに再懸濁し（＝ナイルレッド染色固定細胞のフラクション）、フローサイトメトリー法を用いてリン脂質症を決定する。
【０１８２】
７．細胞染色およびフローサイトメトリー測定
フローサイトメトリー測定のために、各試料から細胞の３×０．５ｍＬ懸濁液を調製する（バイアビリティ決定用の非固定細胞、リン脂質症分析用の非固定細胞および固定細胞）。
【０１８３】
７．１  バイアビリティ決定のためのＰＩ染色およびフローサイトメトリー測定
測定直前に、１試料（非固定細胞浮遊液０．５ｍＬ）につきＰＩ即時使用可能な溶液１２．５μＬを添加し、測定前に更に１５分間氷上に維持する。
【０１８４】
１試料につき一万（１０，０００）個の細胞を高流量において以下のパラメーターについて分析する：
−  収集されていない、１０，０００細胞を測定する時間、
−  収集されていない、横方向の点在（直線）に対する前方向の点在（直線）、
−  収集されていない、細胞数（直線）に対する黄色蛍光（λ＝５６８〜５９０ｎｍ；対数）。
【０１８５】
１０，０００細胞を測定する時間は、試料中の細胞密度に相関する。
【０１８６】
生細胞および死細胞の蛍光依存性分化のカットオフゲートは、細胞培地＋賦形剤曝露コントロール細胞の分析に基づいて定義される。カットオフよりも低い蛍光を有する細胞は、生存細胞と定義される。試料の絶対バイアビリティは、全細胞数に対する生細胞の関係であり、パーセンテージで表される。
【０１８７】
７．２  ＰＬ決定のためのナイルレッド染色およびフローサイトメトリー測定
７．２．１ナイルレッド生細胞染色
測定直前に、１試料（非固定細胞浮遊液０．５ｍＬ）につき生細胞染色用のＮＲ即時使用可能な溶液５０μＬを添加する。試料を更に５分間氷上に維持する。その後、それをＰＢＳ  ４ｍＬ（４℃、２５０×Ｇにおいて８分間）で１回洗浄し、最後にＰＢＳ  ４００μＬに再懸濁する。
【０１８８】
７．２．２ナイルレッド固定細胞染色
上記の説明を参照されたい（６．細胞収集）。ナイルレッド染色非固定細胞およびナイルレッド染色固定細胞を以下の手順に従って測定する。
【０１８９】
１試料につき１０，０００個の細胞を高流量において以下のパラメーターについて分析する：
−  収集されていない、横方向の点在（直線）に対する前方向の点在（直線）、
−  収集されていない、細胞数（直線）に対する緑色蛍光（λ＝５０４〜５４１ｎｍ；対数）、
−  収集されていない、細胞数（直線）に対する近赤外蛍光（λ＝６６０〜６８０ｎｍ；対数）。
【０１９０】
８．シグナル分析
リン脂質形成可能性の分析から、試験化合物の相対バイアビリティ９０％未満の試料を排除する。すべての分析パラメーターおよび絶対蛍光強度の一致性に応じてケースバイケースで、バイアビリティ９０〜９５％を有する試料が評価ケースに選択される。
【０１９１】
コントロールに対するバイアビリティ＞９０％（ＰＩ排除に基づく）を有する試料のすべてに関して、ＮＲ染色後の平均絶対蛍光強度は、緑色蛍光および近赤外蛍光について計算される。
【０１９２】
各チャンネルに関して、特定の試料の絶対蛍光強度は、それぞれの実験のすべての細胞培地＋賦形剤曝露コントロール細胞の平均絶対蛍光強度と相関する。チャンネル毎に、試料の相対強度は、１００で設定されるコントロールの平均絶対蛍光強度に対するこの試料の絶対蛍光強度の関係であり、コントロール細胞蛍光強度に対するパーセンテージで表される。
【０１９３】
９．リン脂質症の評価
試験化合物のリン脂質形成可能性の評価は、固定細胞および非固定細胞に関して両方の波長においてシグナル強度に基づいて手作業で行われる。
【０１９４】
パートＩＩ：化合物Ｉ（遊離塩基）およびそのクエン酸塩１についての生物活性アッセイの結果
上述のアッセイにおいて決定された、化合物Ｉおよびそのクエン酸塩１についての生物学的データを以下の表に示す。
【０１９５】
【表１５】
2018524342.tif 000029
【０１９６】
【表１６】
2018524342.tif 000030
【０１９７】
【表１７】
2018524342.tif 000031
【０１９８】
【表１８】
2018524342.tif 000032
【０１９９】
【表１９】
2018524342.tif 000033
【０２００】
ｈＥＲＧ仲介カリウム電流の抑制
化合物Ｉは、ＩＣ５０＞３０μＭでｈＥＲＧ仲介カリウム電流を抑制した（１０μＭで１２％抑制、３０μＭで２８％抑制）。
【０２０１】
生体外でのリン脂質症アッセイ
化合物Ｉは、生体外リン脂質症アッセイにおいてリン脂質形成性である傾向を示し、この生体外アッセイにおける化合物Ｉの脂質形成最低濃度は２００μＭである。
【０２０２】
参照による組み込み
本明細書で参照される特許文書および科学論文のそれぞれの開示全体が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものではなく、すべての点で考察されるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の本明細書ではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等な意味および範囲内にあるすべての変更形態がその中に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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