(57)【要約】  癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ：ａ）前記個体から得られた生検におけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体が前記抗癌治療に効率的に応答することの予測される確度を決定するステップとを含む方法。【選択図】図１Ａ
2018524614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ：
ａ）前記個体から得られたサンプルにおけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体が前記抗癌治療に効率的に応答することの予測される確度を決定するステップと
を含むインビトロ方法。
【請求項２】
非癌性組織のサンプルで測定される基準値よりも低い、ステップａ）で測定されたＴＲＦ２の核発現のレベルが、癌を有する前記個体が前記抗癌治療に効率的に応答することの良好な予測される確度の指標である、請求項１に記載のインビトロ方法。
【請求項３】
前記抗癌治療が、ＥＧＦＲのアンタゴニスト、好ましくはＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、及びＥＧＦＲに特異的に結合する化合物を含む群から選択されるもの、の投与を含む、請求項１又は請求項２に記載のインビトロ方法。
【請求項４】
前記癌が口腔扁平上皮癌である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のインビトロ方法。
【請求項５】
口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ
ａ）前記個体から得られたサンプルにおけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体の予後を決定するステップと
を含むインビトロ方法。
【請求項６】
非癌性組織のサンプルで測定される基準値よりも低い、ステップａ）で測定されたＴＲＦ２の核発現のレベルが、前記個体の良いアウトカムの指標である、請求項５に記載のインビトロ方法。
【請求項７】
口腔扁平上皮癌を有する個体の治療に使用するためのＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤。
【請求項８】
ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合するアプタマー、及びＴＲＦ２遺伝子発現の非特異的阻害剤から選択される、請求項７に記載の使用のためのＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤。
【請求項９】
口腔扁平上皮癌を有する個体の治療に使用するためのキットであって、
生理学的に許容される添加物中の、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤と、
生理学的に許容される添加物中の抗癌化合物と
を含むキット。
【請求項１０】
ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤が、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合するアプタマー、及びＴＲＦ２遺伝子発現の非特異的阻害剤から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
抗癌化合物がＥＧＦＲアンタゴニストである、請求項９又は請求項１０に記載の使用のためのキット。
【請求項１２】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、及びＥＧＦＲに、好ましくはＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的に結合する化合物を含む群から選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ及びザルツムマブを含む群から選択される、請求項１１又は請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用。
【請求項１５】
口腔扁平上皮癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用。
【請求項１６】
個体における口腔扁平上皮癌の重症度を決定するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現レベルのエクスビボ又はインビトロでの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個別化された癌治療のための方法を提供する。
【０００２】
特に、本発明は、化学療法剤としての１種以上の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）を有する個体の応答性を、該個体をかかる化学療法剤で治療する前に、予測する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
頭頸部癌は、フランスで５番目に多い癌であり、そのうちの９０％が、口腔粘膜の上皮細胞から生じる侵襲性の悪性腫瘍である口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）である。これらの腫瘍の３５％は口内に位置し、しばしば喫煙及び／又は飲酒に関連している。ＯＳＣＣは、全世界で６番目に多いタイプの新生物である。診断は、生検の病理学的検査によって確認される。
【０００４】
口腔癌は、癌が別の場所、一般に首のリンパ節に転移し終えたときに、しばしば診断される。この段階での発見の予後は、初期にすなわち口腔内の限局された領域で癌が発見されたときよりも、著しく悪い。後の段階で、転移はしばしば原発腫瘍の深部局所組織への侵襲を伴うことがある。
【０００５】
口腔癌は特に潜行性である。顕著な痛みや症状を伴わずに進行する可能性があるため、その初期段階で患者が気付かないことがあるからである。従って、それらの発生は、続発する原発腫瘍の発生リスクを大きく増加させる。これは、この病気との最初の遭遇から生存した個体は、２度目の癌を発症するリスクが最大２０倍高いことを意味する。
【０００６】
口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）は、口内の組織の白斑又は赤斑、或いは一般的な口内炎に類似した小さな硬化した潰瘍の出現によって特徴づけられ得る。他の症状は、口又は首の内部で感じることができるしこり又は塊、嚥下、発声又は咀嚼の際の痛み又は困難、いぼ状の塊、長時間続く嗄声、口腔／顔面領域のしびれを含むことがある。片側性の持続的な耳の痛みも警告サインであり得る。
【０００７】
ＯＳＣＣの実際の根治的治療は、しばしば集学的アプローチに依拠し、通常は化学療法が併用放射線、時として外科手術と組み合わされる。標的治療の開発にもかかわらず、この癌タイプは転移性グレードで未だ不治のままである。しかし、侵襲式頭頸部外科手術、放射線療法及び化学療法のような既存の治療は、生活の質に悪影響を有する美的及び機能的結果を生じる。
【０００８】
全生存率は、口内の局在に依存して５年で１２〜５０％の範囲である。ＯＳＣＣの８０％は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の過剰発現及び活性化に関連する。
【０００９】
従って、生活の質を向上させ、おそらくは生存期間を延ばすための新しい治療戦略を特定するためにさらに努力を高める必要がある。ＯＳＣＣ患者は手術を受け、次いで化学療法と組み合わせて又は化学療法なしで放射線療法を受ける。放射線／化学療法の主な衰弱性副作用は粘膜炎である。従って、治療を強化するとともに、個体の全生存期間を改善するのに最も適したさほど攻撃的でない個別化治療を管理するために予後不良の個体を特定することが重要である。
【発明の概要】
【００１０】
一つの態様において、本発明は、癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ：
ａ）前記個体から得られた生検におけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体が前記抗癌治療に効率的に応答することの予測される確度を決定するステップと
を含む方法に関する。
【００１１】
本発明の特定の態様において、癌は口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）である。
【００１２】
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ
ａ）前記個体から得られた生検におけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体の予後を決定するステップと
を含む方法に関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明はまた、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療の改善に使用するためのＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤に関する。
【００１４】
ある態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療の改善に使用するためのキットであって、
生理学的に許容される添加物中の、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤と、
生理学的に許容される添加物中の抗癌化合物と
を含むキットに関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、個体における口腔扁平上皮癌の重症度を決定するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＴＲＦ２が、腫瘍サイズマーカーとは独立の、予後不良のマーカーであることを示す。ＯＳＣＣ患者の全生存率に対する、腫瘍サイズ（Ｔ状態、図１Ａ）、節状態（Ｎ状態、図１Ｂ）又はＴＲＦ２発現（図１Ｃ）の影響を調べる単変量生存率解析。「Ｔ１＋Ｔ２」は、小さなサイズの腫瘍を有する個体のコホートを表し、「Ｔ３＋Ｔ４」は、大きなサイズの腫瘍を有する個体のコホートを表し、「Ｎ０」は、腫瘍がリンパ節に拡がっていない個体のコホートを表し、「Ｎ＋」は、腫瘍がリンパ節に拡がった個体のコホートを表すし、「０／＋」は、ＴＦＲ２スコアが０及び／又は１の個体のコホートを表し、「＋＋／＋＋＋」は、ＴＦＲ２スコアが２及び／又は３の個体のコホートを表す。腫瘍サイズ及びＴＲＦ２発現のオッズ比（図１Ｄ）。
【図２】図２は、ＴＲＦ２発現のダウンレギュレーション或いはＴＲＦ２の野生型又はドミナントネガティブ型の発現がＣＡＬ３３増殖を損なわないことを示す。図２Ａ：ヒト初代線維芽細胞（ＦＨＮ）（対照；レーン４）、スクランブルｓｈＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１８６４；ｓｈＣ；レーン１）を発現する或いはＴＲＦ２に対する２つの独立したｓｈＲＮＡ配列（ｓｈ１、ｓｈ２；それぞれレーン２、レーン３）を発現するＣＡＬ３３細胞を、イムノブロッティングによってＴＲＦ２の存在について試験した（上側パネル）。アクチンはローディングコントロールとして示す（下側パネル）。図２Ｂ：ｓｈＣ（菱形）、ｓｈ１（三角）及びｓｈ２（四角）ＣＡＬ３３細胞の累積集団倍加（ＣＰＤ）。図２Ｃ：対照発現ベクター（ｐＷＰＩＲ−ｃｏｎｔｒｏｌ；レーン１及び２）、ＴＲＦ２用のベクター（ｐＷＰＩＲ−ＴＲＦ２；レーン３及び４）又はドミナントネガティブ型のＴＲＦ２（ｐＷＰＩＲ−ｄｎＴＲＦ２；レーン５及び６）で安定にトランスフェクトされたＣＡＬ３３細胞を、イムノブロッティングによってＴＲＦ２の存在について試験した（上側パネル）。アクチンはローディングコントロールとして示す（下側パネル）。図２Ｄ：ｐＷＰＩＲ−ｃｏｎｔｒｏｌ（菱形）、ｐＷＰＩＲ−ＴＲＦ２（三角）及びｐＷＰＩＲ−ｄｎＴＲＦ２（四角）ＣＡＬ３３細胞の累積集団倍加（ＣＰＤ）。
【図３】図３は、ＴＲＦ２発現のダウンレギュレーション又はＴＲＦ２の野生型又はドミナントネガティブ型の発現がＣＡＬ２７増殖を損なわないことを示す。図３Ａ：ヒト初代線維芽細胞（ＦＨＮ）（対照；レーン１）、スクランブルｓｈＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１８６４；ｓｈＣ；レーン２）を発現する或いはＴＲＦ２に対する２つの独立したｓｈＲＮＡ配列（ｓｈ１、ｓｈ２；それぞれレーン３、レーン４）を発現するＣＡＬ２７細胞を、イムノブロッティングによってＴＲＦ２の存在について試験した（上側パネル）。アクチンはローディングコントロールとして示す（下側パネル）。図３Ｂ：ｓｈＣ（菱形）、ｓｈ１（三角）及びｓｈ２（四角）ＣＡＬ２７細胞の累積集団倍加（ＣＰＤ）。図３Ｃ：対照発現ベクター（ｐＷＰＩＲ−ｃｏｎｔｒｏｌ；レーン１及び２）、ＴＲＦ２用のベクター（ｐＷＰＩＲ−ＴＲＦ２；レーン３及び４）又はドミナントネガティブ型のＴＲＦ２（ｐＷＰＩＲ−ｄｎＴＲＦ２；レーン５及び６）で安定にトランスフェクトされたＣＡＬ２７細胞を、イムノブロッティングによってＴＲＦ２の存在について試験した（上側パネル）。アクチンはローディングコントロールとして示す（下側パネル）。図３Ｄ：ｐＷＰＩＲ−ｃｏｎｔｒｏｌ（菱形）、ｐＷＰＩＲ−ＴＲＦ２（三角）及びｐＷＰＩＲ−ｄｎＴＲＦ２（四角）ＣＡＬ２７細胞の累積集団倍加（ＣＰＤ）。
【図４】図４は、ＴＲＦ２のダウンレギュレーションがＣＡＬ３３のセクレトームを改変することを示す。図４Ａ：ｓｈＣ（左パネル）及びｓｈ２（右パネル）ＣＡＬ３３細胞上清を、血管新生促進／抑制性、炎症促進性サイトカイン及び増殖因子の存在について、抗体マクロアレイを用いて試験した。ｓｈＣ上清とｓｈ２上清との間で差分シグナルを有するサイトカインを四角で囲った（ＣＸＣＬ１（１）、ＩＬ６（２）、ＰＤＧＦ−ＢＢ（３）及びＲＡＮＴＥＳ（４））。図４Ｂ：図４Ａに示すシグナルの定量。ｓｈＣ  ＣＡＬ３３細胞からのサイトカイン発現は黒色の棒で表し、ｓｈ２  ＣＡＬ３３細胞からのサイトカイン発現は白色の棒で表す。ｓｈＣ  ＣＡＬ３３上清で得られたシグナル強度を参照（１００％）として示す。
【図５】図５は、ＴＲＦ２ダウンレギュレーションが腫瘍増殖を減少させることを示す。ｓｈＣ（菱形）、ｓｈ１（三角）又はｓｈ２（十字）を発現する１０６個のＣＡＬ３３ＬＵＣ細胞をヌードマウスに皮下注射した（ｎ＝１０／群）。バイオルミネセンスは、以前に記載された通りに（Ｇｒｅｐｉｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（１３）：１６８３−９４）毎週測定した。結果は平均＋ＳＤとして示す。ｓｈＣ、ｓｈ１及びｓｈ２マウスの腫瘍のサイズ間の統計差を示す：＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６】図６は、ＴＲＦ２のダウンレギュレーションが、照射に対する感度又は５ＦＵでの治療に対する感受性を変えないことを示す。表示した線量の照射後（図６Ａ、４及び８グレイ）或いは５ＦＵ（図６Ｂ）の非存在下（Ｃ、対照；黒色の棒）又は存在下（白色の棒）でのｓｈＣ、ｓｈ１及びｓｈ２  ＣＡＬ３３のクローン増殖。各細胞株について薬剤の非存在下でのコロニー数を基準値（１００％）とみなした。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、ＴＲＦ２ダウンレギュレーションがＣＡＬ３３を至適用量以下量（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｄｏｓｅ）のエルロチニブ／タルセバ及びセツキシマブ／アービタックスに対して感作することを示す。６ｎｍｏｌ／Ｌのセツキシマブ（ＣＸ；灰色の棒）又は０．１μｍｏｌ／Ｌのエルロチニブ（Ｅ；白色の棒）の存在下又は非存在下（Ｃ；黒色の棒）でのｓｈＣ、ｓｈ１及びｓｈ２  ＣＡＬ３３細胞のクローン増殖。各細胞株について薬剤の非存在下でのコロニーの数を基準値（１００％）とみなした。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、ＴＲＦ２のダウンレギュレーションがＣＡＬ３３細胞を低用量のエルロチニブに対して感作することを示す。ＭＴＴ試験は、０．１μｍｏｌ／Ｌのエルロチニブの存在下（Ｅ；灰色の棒）又は非存在下（Ｃ；黒色の棒）、ｓｈＣ及びｓｈ２  ＣＡＬ３３細胞で行った。未処理細胞の４日後の平均ＯＤを基準値（１００％）として用いる。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９】図９は、ＴＲＦ２のダウンレギュレーションがＣＡＬ２７細胞をセツキシマブに対して感作することを示す。セクシママブの存在下（ＣＸ；灰色棒）又は非存在下（Ｃ；黒色の棒）でのｓｈＣ及びｓｈ２  ＣＡＬ２７のクローン増殖。各細胞株について薬剤の非存在下でのコロニーの数を基準値（１００％）とみなした。＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
方法
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、本明細書において、ＯＳＣにおけるＴＲＦ２発現レベルと、患者の後向きコホートにおける腫瘍の侵襲性及び治療応答との間の関連性、並びにこの関連性の根底にある生物学的機序についての理解を提供する。以下の実施例の欄の実験データは、ＴＲＦ２の過剰発現が、腫瘍の大きさとは独立に、生存率に関して悪いアウトカムの指標であることを示している。ＴＲＦ２存在量は、免疫組織化学によって評価することができ、その検出は、患者の快適さ及び生活の質の向上のために副作用を回避する処置手段（放射線療法、化学療法及び手術）について決断を下すための新たな生物学的パラメータとして、ルーチン生検における有益な情報となるであろう。これは、個別化治療の一部をなすことができる。ＴＲＦ２すなわちテロメア反復結合因子２はシェルタリン複合体の構成要素であり、染色体の遠位端と相互作用して、それらを「Ｔループ」と呼ばれるコンフォメーションに折り畳まれた状態に維持する。折り畳まれると、テロメアは、エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡ修復システムによってＤＮＡ二本鎖損傷として認識されない。
【００２０】
ＴＲＦ２は、テロメアＤＮＡとシェルタリン複合体の他の構成要素との間の基本的連結を表す。正常細胞において、ＴＲＦ２の機能喪失は、テロメア座での特異的なＤＮＡ修復系の活性化を招き、細胞周期停止、老化又は細胞死をもたらす。反対に、皮膚におけるＴＲＦ２の過剰発現は、腫瘍形成の増加と関連する（Ｍｕｎｏｚ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００５；３７（１０）：１０６３−７１）。
【００２１】
ＴＲＦ２の過剰発現が多種多様なヒトの癌で観察されており、ＴＲＦ２が腫瘍の惹起及び発達において重要な役割を果たすことを示唆している（Ｈｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１３６（９）：１４０７−１４；  Ｄａ−Ｓｉｌｖａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２０１０；４２（８）：５４４−８；  Ｄｏｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００９；８（２２）：２１６６−７４；  Ｂｅｌｌｏｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６；１１９（９）：２０９０−７；  Ｏｈ  ＢＫ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；１６６（１）：７３−８０；  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９（３）：１１０５−１１；  Ｋｌａｐｐｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００３；１７（１０）：２００７−１５；  Ｍａｔｓｕｔａｎｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９（３）：５０７−１２）。
【００２２】
逆に、Ｄｉｅｈｌ他は、乳癌における悪性度の増加と共にＴＲＦ２発現が低下すると報告している（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ。２０１１；  １２７（３）：６２３−３０）。これらの著者はさらに、高レベルのＴＲＦ２タンパク質が進行癌細胞の保護に重要である可能性があることを示唆している。
【００２３】
頭頸部扁平上皮癌のさらに特定の分野において、癌細胞におけるＴＦＲ２発現の変動に関して明らかに相反する結果が観察されている。
【００２４】
例えば、Ｃｈｕａｎｇ他は、口腔扁平上皮癌においてＴＦＲ２タンパク質発現が減少し、侵襲的な臨床病理学的特徴と有意に関連すると報告している（Ｅｘｐ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｄ．  ２０１１；  ２：６３−６７）。
【００２５】
反対に、Ｐａｄｈｉ他は、ＴＲＦ２が頭頸部扁平上皮癌の癌細胞によって過剰発現されると近年報告している（Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１５；  ６（２）：１９２−２０２）。また、Ｓａｉｎｇｅｒ他は、ＴＲＦ２が口腔扁平上皮癌（ＯＣＣＳ）の癌細胞によって過剰発現されること、及びＴＲＦ２がテロメア長の短縮に役割を果たす可能性があることを報告している（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，２００７）。
【００２６】
しかしながら、これらの研究のいずれも、組織サンプルにおけるＴＲＦ２発現と、癌の拡がり、全生存率及び治療応答のような臨床データとの間の関連性を確立していない。これらの研究は、ＴＲＦ２を、標的療法に対する感受性／抵抗性の予後マーカー又は予測マーカーとして評価してもいない。
【００２７】
抗癌治療に効率的に応答する確度を予測する方法
本発明者らは、本明細書において、ＴＲＦ２の核発現レベルが、癌、特に口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）の予後又はアウトカムと相関することを示す。
【００２８】
さらに正確には、本発明者らは、ＴＲＦ２の核発現のレベルが、ＯＳＣＣの信頼できる予後マーカーをなすことを示す。
【００２９】
本発明者らは、ＴＲＦ２の核発現のレベルが、ＯＳＣＣに罹患した個体の抗癌治療処置（例えばＥＧＦＲのアンタゴニスト、特にＥＧＦＲ抗体に基づく治療処置）に対する応答性の信頼できる予後マーカーをなすことも示す。
【００３０】
さらに、本発明者らは、ＴＲＦ２の核発現のレベルが、ＯＳＣＣのアウトカム又は抗ＯＳＣＣ治療処置に対する応答性の独立した予後マーカーをなすことを示す。
【００３１】
本明細書の実施例に示すように、ＴＲＦ２の核発現のレベルは、（ｉ）従来の臨床的方法によって決定されるＯＳＣＣの臨床ステージとは無関係に、（ｉｉ）腫瘍組織外への癌性細胞の移動（転移）の程度とは無関係に、また（ｉｉｉ）腫瘍の大きさとも無関係に、信頼できる予後マーカーとして挙動する。
【００３２】
言い換えると、ＴＲＦ２の核発現のレベルは、ＯＳＣＣの新規かつ独立した予後マーカーをなす。さらに、本発明者らによって得られた実験データは、上記のマーカーが、ＯＳＣＣの従前入手可能なマーカーよりも格段に信頼できることを示す。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２の核発現のレベルは、（ｉ）ＯＳＣＣのアウトカムの予測方法における及び（ｉｉ）抗ＯＳＣＣ治療処置に対する患者の応答性の予測方法における唯一のＯＳＣＣマーカーとして使用し得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２の核発現のレベルは、ＯＳＣＣのアウトカムの予測方法における１種以上の既に入手可能なＯＳＣＣマーカーとの組合せで使用し得る。
【００３５】
第１の態様において、本発明は、癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ：
ａ）前記個体から得られたサンプルにおけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体が前記抗癌治療に効率的に応答することの予測される確度を決定するステップと
を含む方法に関する。
【００３６】
本発明の範囲内で、「個体」とは、その年齢又は性別を問わず、ネコ、イヌ、好ましくはヒトのようなあらゆる哺乳動物を意味するものである。特に、本発明に包含される個体は口腔扁平上皮癌を有し、従って「個体」という用語はまた、抗癌治療（例えば放射線療法及び／又は化学療法）を受けていてもいなくてもよい個体をいう。
【００３７】
本発明の範囲内で、「効率的に応答する確度」という表現は、癌を有する個体が、症状又は疾患自体の進行の安定化、緩和、治癒又は軽減に付され得ることを意味するものである。
【００３８】
本発明の範囲内で、「癌」という用語は、何らの制限もなく、結腸癌、乳癌、骨癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、前立腺癌、脳癌、膀胱癌、肝臓癌、膵臓癌、口腔扁平上皮癌を包含する。
【００３９】
本発明の範囲内で、「症状」という用語は、癌状態に対する身体の、認め得るあらゆる応答を意味するものである。実際に、症状は、病変、発赤、頭痛、めまい、腹痛、咳、視力障害、腫脹などを包含する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、癌は口腔扁平上皮癌である。
【００４１】
本発明の範囲内で、「症状」という用語は、口腔扁平上皮癌に言及する場合、口内、すなわち唇紅縁と、硬口蓋と軟口蓋のつなぎ目又は舌の後方３分の１との間に、紅板症又は白板症の領域として現れ、外方増殖性又は潰瘍化した状態となり得る、あらゆる口腔病変を意味するものである。
【００４２】
本発明の範囲内で、「サンプル」という用語は、例えば血液、唾液を含む流体、組織、細胞サンプル、器官、生検のような、個体から得られるあらゆる生物学的サンプルを意味するものである。
【００４３】
ある実施形態では、サンプルは、癌性上皮細胞、好ましくは上皮癌性細胞を含む。
【００４４】
ある実施形態では、サンプルは、腫瘍サンプル、好ましくは腫瘍組織生検又は腫瘍外科切除の全部もしくは一部である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、腫瘍サンプル、腫瘍組織生検又は腫瘍外科切除は、非癌性細胞を含んでいてもよい。換言すると、サンプルは、癌性及び非癌性（つまり正常）細胞又は組織の両方を収集することによって得ることができる。
【００４６】
サンプルは当技術分野における慣用技術に従って収集でき、診断のために直接使用しても或いはその後の診断のために保存してもよい。腫瘍サンプルは、新鮮、凍結又はパラフィン包埋したものであり得る。通常、利用可能な腫瘍サンプルは凍結又はパラフィン包埋され、ほとんどの場合、パラフィン包埋される。
【００４７】
本発明の範囲内で、「抗癌治療」という表現は、癌の症状の安定化、緩和、軽減のため又は癌の治癒のために、腫瘍を特異的・直接的に又は間接的に標的とする化合物でのあらゆる医学的処置を意味するものである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、抗癌治療に効率的に応答する口腔扁平上皮癌を有する個体は、腫瘍の大きさの有意な減少、腫瘍細胞の浸潤特性の低下、腫瘍細胞の遊走性の低下、平均癌性細胞数の減少、口腔扁平上皮癌の既知のバイオマーカーの発現の変化によって特徴づけることができる。
【００４９】
これらのパラメータの各々は、当技術分野で常用される公知の方法に従って評価することができる。
【００５０】
本発明の範囲内で、「ＴＲＦ２の核発現のレベルを測定」するという表現は、サンプル中に含まれる細胞の核内におけるＴＲＦ２タンパク質発現のレベル又はＴＲＦ２遺伝子発現のレベルのいずれかを定量的又は半定量的に測定することを意味するものである。
【００５１】
該当する場合、核画分は、アッセイされる癌性細胞を含むサンプルから当技術分野で公知の方法に従って得ることができる（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｄｅｃ；  １２（１２）：  １２０５−１２１２；  Ｗｉｌｋｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ．  Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｕｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  １：  Ｎｕｃｌｅｉ  ａｎｄ  ｓｕｂ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｈａｎｃｏｃｋ  （ｅｄ．））。
【００５２】
本発明の第１の実施形態によれば、「ＴＲＦ２の核発現のレベルを測定」するという表現は、ＴＲＦ２タンパク質核発現のレベルを定量的又は半定量的に測定することを意味するものである。
【００５３】
実際に、ＴＲＦ２タンパク質発現のレベルの測定は、当技術分野で公知のいずれかの方法に従って実施し得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本方法は、サンプルをＴＲＦ２タンパク質に選択的に結合できる化合物と接触させるステップを含んでいてもよく、該化合物はその後検出される。例えば、ＴＲＦ２タンパク質に選択的に結合できる化合物は、例えばモノクローナル抗体のような抗体又はアプタマーであり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２タンパク質発現、特にＴＲＦ２タンパク質核発現のレベルは、競合、直接反応又はサンドイッチ型アッセイのような免疫アッセイを含む、標準的な免疫診断技術を用いて測定し得る。このようなアッセイには、凝集テスト、ＥＬＩＳＡのような酵素標識及び媒介免疫測定、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、免疫沈降、免疫組織化学染色が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２タンパク質に選択的に結合できる化合物は、その使用前に、適切な固体担体上に固定化し得る。
【００５６】
いくつかの好ましい実施形態では、ＴＲＦ２タンパク質発現、特にＴＲＦ２タンパク質核発現のレベルは、免疫組織化学染色によって、好ましくはＴＲＦ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて測定し得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２タンパク質に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の任意の方法、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８８）に記載されているような方法に従って調製することができる。
【００５８】
実際に、免疫組織化学を実施するため、組織切片を個体から得て、アルコール、アセトン及びパラホルムアルデヒドのような任意の適切な固定剤によってガラススライド上に固定し、これに抗体を反応させることができる。免疫組織化学のための慣用方法は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８）、Ａｕｓｂｅｌ他（“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  １９８７）又はＢｒａｕｅｒ他（ＦＡＳＥＢ  Ｊ，  １５，  ２６８９−２７０１；  ２００１）に記載されている。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（登録商標）からのクローン４Ａ７９４．１５、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）からのクローン４Ａ７９４、ａｂｃａｍ（登録商標）からのａｂ１３５７９のような、ＴＲＦ２タンパク質に対する市販のモノクローナル抗体が適している。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２の核発現のレベルの尺度は、抗ＴＲＦ２抗体から得られた標識の強度及び／又は認め得る量のＴＲＦ２を発現する細胞の数に依拠してもよい。
【００６１】
本発明の第２の実施形態によれば、「ＴＲＦ２の核発現のレベルを測定」するという表現は、ＴＲＦ２遺伝子核発現のレベルを定量的又は半定量的に測定することを意味するものである。
【００６２】
実際に、ＴＲＦ２遺伝子発現のレベルの測定は、当技術分野で公知のいずれかの方法に従って実施し得る。「遺伝子発現」という記載が遺伝子からのメッセンジャーＲＮＡの合成に関連し、ＤＮＡの特定のセグメントが酵素ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡにコピーされることは当業者に理解される。「転写」と呼ばれるこのｍＲＮＡ合成は、細胞の核内で行われ、常に「核発現」に相当する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現のレベルの測定は、ｍＲＮＡの量の測定によって、特に当技術分野で常用される方法によって実施される。実際に、サンプル中に含まれる全核酸画分は、溶解酵素又は化学溶液を用いるような標準的な方法に従って得るか、或いは製造元の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出することができる。抽出されたｍＲＮＡは、次いで、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析）及び／又は増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出され得る。好ましくは、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む他の増幅方法を使用し得る。
【００６５】
実際に、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅のためのプローブは、当技術分野で公知のいずれかの方法によって設計及び取得することができる。
【００６６】
いくつかの他の実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現のレベルの測定は、ＤＮＡチップ解析技術（Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００６，  ７：２００−２１０）によって実施される。かかるＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、基材に化学的に付着させた様々な核酸プローブからなり、基材はマイクロチップ、ガラススライド又はマイクロスフェアサイズのビーズであり得る。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ又はシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス又はニトロセルロースから構成し得る。プローブは、ｃＤＮＡ又は約１０〜約６０塩基対であり得るオリゴヌクレオチドのような核酸を含む。発現レベルを決定するため、試験対象からのサンプル（任意的に最初に逆転写に付したもの）を標識し、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触させて、マイクロアレイ表面に付着したプローブ配列に相補的な標的核酸との間で複合体を形成させる。次いで、標識されかつハイブリダイズした複合体を検出し、定量化又は半定量化することができる。標識は、様々な方法、例えば放射性標識又は蛍光標識を用いることにより、達成し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、前記個体から得られたサンプルにおけるＴＲＦ２の核発現のレベルの測定は、腫瘍に浸潤したリンパ球を含むサンプル中で実施される。
【００６８】
本発明の範囲内で、「基準値」という表現は、細胞がＴＲＦ２を生理的レベルで発現する条件下で、ＴＲＦ２の核発現の「標準」レベルを表す値を意味するものである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、前記基準値は、１人の健康な個体、すなわちいかなる病状も病歴もない個体、から得られたサンプルで測定し得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、前記基準値は、１人又は複数人の健康な個体から得られた複数のサンプルで測定された平均値を表すことができる。いくつかの実施形態では、複数のサンプルは、２以上、３以上、５以上、１０以上、１５以上、２５以上、５０以上、１００以上、２５０以上、５００以上のサンプルを包含する。いくつかの実施形態では、１人以上の健康な個体は、２人以上、３人以上、５人以上、１０人以上、１５人以上、２５人以上、５０人以上、１００人以上、２５０人以上、５００人以上の健康な個人を包含する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、平均基準値は、保存されかつ定期的に再評価される複数のサンプルから集められてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、基準値は、個々の基底上皮非腫瘍細胞から測定し得る。
【００７３】
いくつかの他の実施形態では、基準値は、個々の基底リンパ球細胞から測定し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、基準値は、リンパ球及び／又は基底上皮細胞、及び／又は正常ヒト線維芽細胞のような、細胞株を含むサンプルから測定される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、基準値は、口腔扁平上皮癌を有する個体から得られた生検サンプルから測定することができ、前記測定は癌性細胞のない生検部分で行われる。
【００７６】
この好ましい実施形態では、（ｉ）癌性細胞を含む又はから本質的になる又はからなる生検サンプルの一部の測定値及び（ｉｉ）非癌性細胞（例えばリンパ球細胞）を含む又はから本質的になる又はからなる生検サンプルの別の部分で測定された基準値の両方は、口腔扁平上皮癌を有する同一の個体から得られる。いくつかの実施形態では、（ｉ）及び（ｉｉ）の値は、同じ患者に由来する２つの別個の生検サンプル、例えば、それぞれ癌性生検サンプル及び非癌性生検サンプル、で測定することができる。いくつかの他の実施形態では、上記の（ｉ）及び（ｉｉ）の値は、同じ生検サンプルで、ただし（ｉ）該生検サンプルの癌性部分及び（ｉｉ）該生検サンプルの非癌性部分で測定することができる。
【００７７】
実際に、（ｉ）及び（ｉｉ）の値は両方とも互いに正規化することができる。
【００７８】
或いは、いくつかの他の実施形態では、前記１又は複数のサンプルがいかなる癌性細胞も含まない場合、前記基準値は、非健常個体のコホートから得られたサンプルで測定することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、非健常個体は、口腔扁平上皮癌を有さない個体を包含する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、非健常個体は、何らの制限もなく、結腸癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、腎臓癌、リンパ腫、前立腺癌、脳癌、膀胱癌、肝臓癌、膵臓癌のような癌；空中飛散物質によるアレルギー、食物アレルギー、皮膚接触アレルギーのようなアレルギー；呼吸不全；心不全；腎不全；神経変性疾患；高血圧；細菌性又はウイルス性感染症；アルツハイマー病；パーキンソン病；糖尿病などの存在によって特徴づけられ得る。
【００８１】
ある実施形態では、前記１又は複数のサンプルがいかなる癌性細胞も含まない場合、好ましくはいかなる上皮癌性細胞も含まない場合、前記基準値は、１人以上の非健常個体から得られたサンプルで測定された平均値を表すことができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、前記１又は複数のサンプルがいかなる癌性細胞も含まない場合、好ましくはいかなる上皮癌性細胞も含まない場合、前記基準値は、１人以上の健常個体及び１人以上の非健常個体から得られたサンプルで測定された平均値を表すことができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、基準値は、口腔扁平上皮癌を有する個体から得られたサンプルからの、ＴＲＦ２の核発現の「標準」レベルを表す値を表すこともできる。或いは、基準値は、口腔扁平上皮癌の市販の細胞株、例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）からのＣＲＬ−３２１２（商標）（２Ａ３）、ＣＲＬ−３２３９（商標）、ＣＬＲ−３２４０（商標）、ＨＴＢ−４３（商標）（ＦａＤｕ）、ＣＲＬ−１６２８（商標）（ＳＣＣ−２５）、ＣＲＬ−１６２３（商標）（ＳＣＣ−１５）、ＣＲＬ−２０９５（商標）（ＣＡＬ  ２７）、ＣＲＬ−１６２４（商標）（ＳＣＣ−４）、ＣＲＬ−１６２９（商標）（ＳＣＣ−９）及びＣＣＬ−１３８（商標）（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２）、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＧｍｂＨ）からのＡＣＣ４４７（商標）（ＣＡＬ３３）からも測定し得る。
【００８４】
いくつかの好ましい実施形態では、市販細胞株は、ＣＲＬ−２０９５（商標）（ＣＡＬ２７）、ＣＣＬ−１３８（商標）（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２）及びＡＣＣ４４７（商標）（ＣＡＬ３３）を含む群から選択される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つのサンプルにおけるＴＲＦ２タンパク質発現のレベルを、免疫組織化学染色によって測定してもよく、その発現レベルのスコアリングを含む半定量的方法によってさらに解析してもよい。実際に、１つのサンプル中のＴＲＦ２タンパク質に関連する核染色を、ソフトウェアを用いて計算及び解析或いは視覚的に解析してもよく、スコアは前記サンプルに帰すことができる。例えば、４段階スコアリングは、ＴＲＦ２タンパク質発現の測定レベル、すなわち
０：ＴＲＦ２核発現の欠如、
＋１：低いＴＲＦ２核発現、
＋２：平均的なＴＲＦ２核発現、
＋３：強いＴＲＦ２核発現、
に応じて帰属させることができる。
【００８６】
この方法は、口腔扁平上皮癌を有する個体のサンプル及び本明細書で定義される基準値を提供するためのサンプルの両方に効率的に適用され得る。口腔扁平上皮癌を有する個体のサンプルから得られたスコアと、基準値を提供するためのサンプルから得られたスコアとの間の直接的な対比が容易になる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、基準値は＋２（平均的なＴＲＦ２核発現）のスコアに帰属させることができる。
【００８８】
ある実施形態では、非癌性組織のサンプルで測定される基準値よりも低い、ステップａ）で測定されるＴＲＦ２の核発現のレベルは、口腔扁平上皮癌を有する前記個体が前記抗癌治療に効率的に応答することの良好な予測される確度の指標である。
【００８９】
本発明の範囲内で、「基準値よりも低いＴＲＦ２の核発現のレベル」という表現は、基準値と比較して１０％以上低いＴＲＦ２の核発現のレベルを意味するものである。「１０％以上低い」という表現は、前記基準値と比較して、１５％以上低い、２０％以上低い、２５％以上低い、３０％以上低い、３５％以上低い、４０％以上低い、４５％以上低い、５０％以上低い、５５％以上低い、６０％以上低い、６５％以上低い、７０％以上低い、７５％以上低い、８０％以上低い、８５％以上低い、９０％以上低い、９５％以上低い、１００％低いことを包含する。
【００９０】
換言すると、口腔扁平上皮癌を有する個体のサンプルにおけるＴＲＦ２の核発現の測定レベルは、基準値の最大９０％を表すことができ、これは、基準値の最大８５％、最大８０％、最大７５％、最大７０％、最大６５％、最大６０％、最大５５％、最大５０％、最大４５％、最大４０％、最大３５％、最大３０％、最大２５％、最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、０％を包含する。
【００９１】
本発明の範囲内で、「非癌性組織のサンプル」という表現は、そのサンプルがいかなる癌細胞をも含まないことを条件として、血液、血漿、唾液、尿、精液を含む流体、組織、細胞サンプル、器官、生検のような、個体から得られる任意の生体サンプルを意味するものである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、非癌性組織のサンプルで測定される基準値よりも低い、ステップａ）で測定されるＴＲＦ２の核発現のレベルは、ＴＲＦ２発現阻害剤による前記個体の処置後に達成され得る。
【００９３】
以下の実施例の欄に示すように、ＣＡＬ３３系細胞におけるＴＲＦ２遺伝子発現のインビトロノックダウンは、エルロチニブ及びセツキシマブの効能を大幅に増加させる。
【００９４】
上述の通り、基準値は＋２（平均的なＴＲＦ２核発現）のスコアを帰属させることができる。従って、ステップａ）で測定されるＴＲＦ２の核発現のレベルとして、０又は＋１のスコアは、基準値としての＋２のスコアよりも低く、従って口腔扁平上皮癌を有する前記個体が抗癌治療に効率的に応答することの良好な予測される確度の指標であり得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、抗癌治療に効率的に応答する口腔扁平上皮癌を有する個体は、疾患に対する抗癌化合物のより良好な効率によって特徴づけることができる。
【００９６】
本発明の範囲内で、「疾患に対する抗癌化合物のより良好な効率」とは、前記抗癌化合物の同一用量を考慮して、「標準」基準値（例えば、非癌性組織のサンプルで測定される）と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが低い個体が、「標準」基準値と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが同等、同一又は高い個体と比較して、症状又は疾患の進行が止まるか減少する可能性が高いことを意味する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、「標準」基準値（例えば、非癌性組織のサンプルで測定される）と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが低い個体は、「標準」基準値と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが同等、同一又は高い個体を処置するために必要とされる前記抗癌化合物の用量と比較して、同様の結果を達成するために必要とされる前記抗癌化合物の用量が低いことによって特徴づけることができる。
【００９８】
実際に、より低い用量は、癌化学療法で常用される所定の抗ＥＧＦＲ阻害剤に関していう標準「ＩＣ５０」と比較して、有意に低下した測定効率「ＩＣ５０［低ＴＦＲ２］」を包含し得る。いくつかの実施形態では、より低い用量は、１：２〜１：１０００の範囲のＩＣ５０［低ＴＦＲ２］／標準ＩＣ５０比を包含し、この範囲は、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：７５、１：１００、１：１２５、１：１５０、１：１７５、１：２００、１：２５０、１：５００及び１：７５０を包含する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、抗癌治療はＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含み、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、及びＥＧＦＲに特異的に結合する化合物を含む群から選択し得る。
【０１００】
本発明の範囲内で、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」という表現は、ＥＧＦＲの生物学的活性を阻害するためにＥＧＦＲを特異的・直接的又は間接的に標的とする任意の化合物を意味するものである。
【０１０１】
ＥＧＦＲすなわち上皮増殖因子受容体は、いくつかのシグナル伝達カスケードを活性化するＥＧＦファミリーのチロシンキナーゼ結合リガンドの受容体である。ＥＧＦＲの公知のリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦＡ／ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、エピジェン／ＥＰＧＮ、ＢＴＣ／ベータセルリン、エピレギュリン／ＥＲＥＧ及びＨＢＥＧＦ／ヘパリン結合ＥＧＦが含まれる。
【０１０２】
ヒトＥＧＦＲ（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｎｏ．Ｐ００５３３）には、少なくとも４つのアイソフォームがある。アイソフォーム１（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｎｏ．Ｐ００５３３−１）は１２１０個のアミノ酸の基準配列を表す。ヒトＥＧＦＲ（アイソフォーム１）の細胞外ドメインは、２５番目のアミノ酸から６４５番目のアミノ酸までのアミノ酸配列によって表すことができる。アイソフォーム２（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｎｏ．ＰＲ００５３３−２）は、４０５個のアミノ酸からなるヒトＥＧＦＲのＣ末端欠失型であり、４０４及び４０５番目のアミノ酸のＦＬからＬＳへの変異によってさらに特徴づけられる。アイソフォーム３（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｎｏ．ＰＲ００５３３−３）は、７０５個のアミノ酸からなるヒトＥＧＦＲのＣ末端欠失型である。アイソフォーム４（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｎｏ．ＰＲ００５３３−４）は、６２８個のアミノ酸からなるヒトＥＧＦＲのＣ末端欠失型である。
【０１０３】
本発明の範囲内で、他の種に属する又は多型によって生じるＥＧＦＲは、本発明に包含される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストに効率的に応答する口腔扁平上皮癌を有する個体は、腫瘍の大きさの有意な減少、腫瘍細胞の浸潤特性の低下、腫瘍細胞の遊走性の低下、平均癌性細胞数の減少、口腔扁平上皮癌の既知のバイオマーカーの発現の変化によって特徴づけることができる。
【０１０５】
ある実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブなのようなチロシンキナーゼ阻害剤である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲに特異的に結合する化合物である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、最も好ましくは、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ−ｈ−Ｒ３）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）及びザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ）のようなモノクローナル抗体である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的に結合するアプタマーである。適切なアプタマーは、当技術分野で常用されるいずれかの方法、例えば、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；  ２４９（４９６８），５０５−１０）に当初記載されていたようなＳＥＬＥＸ法又はその改良方法によって得ることができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、非癌性組織のサンプルで測定される基準値と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが低い個体は、セツキシマブ及び／又はエルロチニブに効率的に応答する可能性がある。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、非癌性組織のサンプルで測定される基準値と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが低く、かつセツキシマブに効率的に応答する可能性のある個体は、セツキシマブに対する１：２〜１：１０の範囲内のＩＣ５０［低ＴＦＲ２］／標準ＩＣ５０比によって特徴づけることができ、上記の範囲は、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８及び１：９を包含する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、非癌性組織のサンプルで測定される基準値と比較してＴＲＦ２の核発現のレベルが低く、かつエルロチニブに効率的に応答する可能性のある個体は、エルロチニブに対する１：２〜１：１００の範囲内のＩＣ５０［低ＴＦＲ２］／標準ＩＣ５０比によって特徴づけることができ、上記の範囲は、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０及び１：７５を包含する。
【０１１２】
実施例の欄に示すように、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２の発現レベルを減少させることは、前記個体の治療に有用な抗癌剤の至適用量以下量（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｄｏｓｅ）に影響を有し得る。
【０１１３】
実際に、口腔扁平上皮癌を有し、かつＴＲＦ２の発現レベルが高い個体と比較して、口腔扁平上皮癌を有し、ＴＲＦ２の発現レベルが低い前記個体を効率的に治療するのに必要とされるより低い用量の抗癌剤は、前記抗癌剤の副作用によい影響を与え得る。
【０１１４】
さらに、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２発現のレベルの低下は、前記個体が前記抗癌剤に対する免疫応答を誘発する可能性にさらによい影響を与え得る。
【０１１５】
従って、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２の発現レベルを低下させることは、治療の時間経過内での前記抗癌薬の持続可能性に対して利益をもたらし得る。
【０１１６】
アウトカムの予測方法
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測するためのインビトロ方法であって、以下のステップ：
ａ）前記個体から得られたサンプルにおけるＴＲＦ２の核発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたレベルを基準値と比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）で行った比較から、前記個体のアウトカムを決定するステップと
を含む方法に関する。
【０１１７】
本発明の範囲内で、「アウトカム」という用語は、病状の改善、すなわち症状又は疾患自体の進行の安定化、緩和、治癒又は軽減をいうことがある。このようなアウトカムは「良いアウトカム」又は「肯定的アウトカム」と呼ぶことができる。
【０１１８】
本発明の範囲内で、「アウトカム」という用語は、病状の悪化、すなわち症状又は疾患自体の進行の増進及び個体の死さえをいうことがある。このようなアウトカムは、「悪いアウトカム」又は「否定的アウトカム」と呼ぶことができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、アウトカムは、口腔扁平上皮癌を治療するための医療処置の前に決定し得る。前記アウトカムは、口腔扁平上皮癌を治療するための抗癌治療の開始前数日以内又は数か月以内に決定し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、アウトカムは、口腔扁平上皮癌を治療するための医療処置の過程で決定し得る。
【０１２１】
いくつかの他の実施形態では、アウトカムは、口腔扁平上皮癌を治療するための医療処置後に決定し得る。前記アウトカムは、抗癌治療終了後数日以内又は数か月以内に決定し得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、医療処置を調整するために、口腔扁平上皮癌癌を有する個体のアウトカムの決定の組合せを行ってもよく、これは、治療の維持又は停止、医薬有効成分の用量の増加又は減少、１種以上の医薬有効成分の２回の投与間隔の増加又は減少を包含する。
【０１２３】
ある実施形態では、非癌性組織のサンプルで測定される基準値よりも低い、ステップａ）で測定されるＴＲＦ２の核発現のレベルは、前記個体に関する良いアウトカムの指標である。
【０１２４】
本発明の範囲内で、「基準値よりも低いＴＲＦ２の核発現のレベル」という表現は、基準値と比較して１０％以上低いＴＲＦ２の核発現のレベルを意味するものである。「１０％以上低い」という表現は、前記基準値と比較して、１５％以上低い、２０％以上低い、２５％以上低い、３０％以上低い、３５％以上低い、４０％以上低い、４５％以上低い、５０％以上低い、５５％以上低い、６０％以上低い、６５％以上低い、７０％以上低い、７５％以上低い、８０％以上低い、８５％以上低い、９０％以上低い、９５％以上低い、１００％低いことを包含する。
【０１２５】
本発明の範囲内で、「良いアウトカムは」という表現は、症状又は疾患自体の進行の安定化、緩和、治癒又は軽減或いは完全寛解を含む、医学的状態の改善を包含する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、良いアウトカムは、ＲＥＣＩＳＴ基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００９，  ４５１２２８−２４７）に従って評価することができる。
【０１２７】
固形腫瘍において、ＲＥＣＩＳＴ基準は、１以上の測定可能な病変の存在に基づく国際基準を提供する。「完全奏効（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、すべての標的病変の消失（完全寛解）を意味する。「部分奏効（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、標的病変の最長径の総和の３０％の減少を意味し、「進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）」は、標的病変の最長径の総和の２０％の増加を意味し、「安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）」は、上記の基準を満たさない変化を意味する。
【０１２８】
本発明の範囲内で、「良いアウトカム」という表現は、全生存期間予後の点での利益も包含する。いくつかの実施形態では、全生存期間予後の利益は、疾患の症状の悪化のない６か月以上の余命獲得と説明することができ、少なくとも９か月、１２か月、１５か月、１８か月、２４か月、３６か月、４８か月、６０か月、５年、６年、７年、８年の余命獲得を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、良いアウトカムは、９か月、１２か月、１５か月、１８か月、２４か月、３６か月、４８か月、６０か月、５年、６年、７年、８年で５０％以上の全生存率として説明し得る。
【０１３０】
別の態様において、本発明は、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤の投与を含む、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療方法に関する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本方法は抗癌化合物の投与も含む。
【０１３２】
口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを改善するための抗癌化合物のスクリーニング方法
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療及び／又はアウトカムの改善のため抗癌化合物をスクリーニングするためのインビトロ方法であって、
ａ）口腔扁平上皮癌のＴＲＦ２ノックダウン細胞株を候補抗癌化合物と接触させるステップと、
ｂ）口腔扁平上皮癌に関連するパラメータを測定するステップと、
ｃ）工程ｃ）からのパラメータを、候補抗癌化合物の非存在下で測定される同じパラメータと比較するステップと
を含む方法に関する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、口腔扁平上皮癌の細胞株は、生検後に又は代替的に商業的提供元から得ることができる。細胞株は、先行技術に記載された標準条件下で培養することができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、細胞株は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）からのＣＲＬ−３２１２（商標）（２Ａ３）、ＣＲＬ−３２３９（商標）、ＣＬＲ−３２４０（商標）、ＨＴＢ−４３（商標）（ＦａＤｕ）、ＣＲＬ−１６２８（商標）（ＳＣＣ−２５）、ＣＲＬ−１６２３（商標）（ＳＣＣ−１５）、ＣＲＬ−２０９５（商標）（ＣＡＬ  ２７）、ＣＲＬ−１６２４（商標）（ＳＣＣ−４）、ＣＲＬ−１６２９（商標）（ＳＣＣ−９）及びＣＣＬ−１３８（商標）（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２）、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＧｍｂＨ）からのＡＣＣ４４７（商標）（ＣＡＬ３３）のような口腔扁平上皮癌の市販の細胞株から選択される。
【０１３５】
いくつかの好ましい実施形態では、市販の細胞株は、ＣＲＬ−２０９５（商標）（ＣＡＬ２７）、ＣＣＬ−１３８（商標）（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２）及びＡＣＣ４４７（商標）（ＣＡＬ３３）を含む群から選択される。
【０１３６】
実際に、細胞株のＴＦＲ２ノックダウンは、遺伝子ノックアウト又はサイレンシングのような当技術分野における任意の方法によって、例えば、ＴＲＦ２遺伝子発現の適切な阻害剤、好ましくはアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合するアプタマー、並びにＴＲＦ２遺伝子発現の非特異的阻害剤を含む群から選択されるものの使用によって得ることができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２のノックダウンは、文献に十分に記載されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術（国際公開第２０１３／１７６７７２号、米国特許第８６９７３５９号、国際公開第２０１４／０８９２９０号）によって実施し得る。
【０１３８】
いくつかの他の実施形態では、ＴＲＦ２ノックダウンは、亜鉛フィンガー技術又は転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）技術のようなヌクレアーゼ技術の使用によって実施し得る（Ｕｌ  Ａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２０１５  Ｍａｙ  １０；２０５：１２０−７；  Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭａｎｕｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２０１５  Ｍａｙ  ２１；５８（４）：５７５−５８５．  Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２０１４  Ａｕｇ  １５；４６２（１）：１５−２４）。
【０１３９】
本発明の範囲内で、「口腔扁平上皮癌に関連するパラメータ」とは、疾患自体の発生と相関する測定可能なパラメータを意味するものである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記パラメータは、何らの制限もなく、細胞の平均サイズ、細胞の平均的形態、細胞の浸潤特性、細胞の増殖特性、細胞の遊走特性、特異的バイオマーカーの発現の変化、特異的バイオマーカーの分泌であり得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、候補抗癌化合物の存在下及び非存在下で測定されるパラメータ間で観察される変化は、口腔扁平上皮癌の処置を必要とする個体において口腔扁平上皮癌の処置に使用するための前記抗癌化合物の有効性の指標となり得る。
【０１４２】
さらに別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療及び／又はアウトカムの改善のため抗癌化合物をスクリーニングするためのインビボ方法であって、
ａ）口腔扁平上皮癌のＴＲＦ２ノックダウン非ヒト動物モデルを候補抗癌化合物と接触させるステップと、
ｂ）口腔扁平上皮癌に関連するパラメータを測定するステップと、
ｃ）工程ｃ）からのパラメータを、候補抗癌化合物の非存在下で測定される同じパラメータと比較するステップと
を含む方法に関する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、口腔扁平上皮癌のＴＲＦ２ノックダウン非ヒト動物モデルは、トランスジェニック非ヒトモデルを与えるための標準技術に従って得ることができる。
【０１４４】
いくつかの他の実施形態では、非ヒト動物モデルに口腔扁平上皮癌細胞を注射し、さらにＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤で腫瘍内又は全身的に処置し得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物モデルは、マウス、ラットのような齧歯類である。
【０１４６】
用途
ある態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療に使用するためのＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤に関する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、前記阻害剤の投与を必要とする個体に投与すべき前記阻害剤の投与計画は、前記個体の年齢、性別、体重及びその他の医学的状態又は病歴に依存し、１０μｇ〜１０００ｍｇの範囲であり得、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇを包含する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、前記阻害剤の投与を必要とする個体に投与すべき前記阻害剤の投与頻度は、前記個体の年齢、性別、体重及びその他の医学的状態又は病歴に依存し、毎日１回、２回、３回、毎週１回、２回、３回であり得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、前記阻害剤の投与を必要とする個体に投与すべき前記阻害剤の投与計画及び／又は投与頻度は、治療の時間経過内での症状の進行に応じて、任意の時点で調整し得る。
【０１５０】
一実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤で治療される個体は、既に開示した方法によって、抗癌治療に効率的に応答する確度の良い個体として既に同定されている。
【０１５１】
別の実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤で治療される個体は、既に開示した方法によって、抗癌治療に効率的に応答する確度の乏しい個体として既に同定されている。本発明の範囲内で、「ＴＲＦ２の阻害剤」という用語は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びアプタマーのような、ＴＲＦ２遺伝子発現の特異的阻害剤を包含し、前記阻害剤は、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合するアプタマー、及びＴＲＦ２遺伝子発現の非特異的阻害剤から選択される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、アプタマーは、インビボでのＴＲＦ２遺伝子阻害又はＴＲＦ２サイレンシングをもたらすため、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合するように、当技術分野で公知の方法に従って設計される。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の非特異的阻害剤は、ＴＲＦ２発現の調節に関与するいずれかの遺伝子又はタンパク質に作用し得る。
【０１５５】
いくつかの好ましい実施形態では、前記ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤は、ｓｈＲＮＡ、特に配列番号２又は配列番号３の配列を含むｓｈＲＮＡである。
【０１５６】
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用に関する。
【０１５７】
ある態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用に関する。
【０１５８】
本発明の範囲内で、「バイオマーカー」という用語は、生体内の生理学的又は病理学的事象と有意に相関する任意の測定可能なパラメータを意味するものである。
【０１５９】
以下の実施例の欄に示すように、ＴＲＦ２の核発現のレベルは、抗癌治療すなわち癌細胞を根絶するためのＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含む治療の有効性と有意に相関する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーとして使用するためのＴＲＦ２の核発現のレベルは、口腔扁平上皮癌を有する個体のアウトカムを予測或いは口腔扁平上皮癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するための１種以上の他の公知のバイオマーカーと組み合わせることができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、他のバイオマーカーは、腫瘍の大きさ、節状態、浸潤特性、ＲＡＮＴＥＳの発現レベル、ＩＬ６の発現レベル、ＩＬ８の発現レベル、ＣＸＣＬ９の発現レベル、ＣＸＣＬ１０の発現レベル、ＰＤＧＦＢＢの発現レベル、ＶＥＧＦの発現レベル及びＧＲＯ−αの発現レベルを含む群から選択し得る。
【０１６２】
本発明の範囲内で、「節状態」は、癌を有する個体におけるリンパ節の有無についての臨床所見に関する。実際に、癌がリンパ節に拡がっていると、癌は「リンパ節陽性」と呼ばれるのに対して、癌がリンパ節に拡がっていないと、癌は「リンパ節陰性」と呼ばれる。
【０１６３】
ある態様において、本発明は、個体における口腔扁平上皮癌の重症度を決定するためのバイオマーカーとしての、ＴＲＦ２の核発現のレベルのエクスビボ又はインビトロでの使用に関する。
【０１６４】
実施例の欄に示すように、ＴＲＦ２の核発現のレベルは口腔扁平上皮癌を有する個体の生存率と有意に相関する。従って、ＴＲＦ２の核発現のレベルは、口腔扁平上皮癌の重症度の指標である。
【０１６５】
個体内での癌の進行に応じて、口腔扁平上皮癌を４つのステージに分類できることは、当技術分野の文献に十分に記載されている。
【０１６６】
ステージＩの癌は、大きさが２ｃｍ未満であり、かつその領域のリンパ節に拡がっていない腫瘍を表すものと定義し得る。
【０１６７】
ステージＩＩの癌は、大きさが２ｃｍ超であるが、４ｃｍ未満であり、かつ依然としてその領域のリンパ節に拡がっていない腫瘍を表し得る。
【０１６８】
ステージＩＩＩの癌は、（ｉ）大きさが４ｃｍを超える腫瘍、又は（ｉｉ）いずれかの大きさであって、癌と首の同側の１つのリンパ節のみに拡がった腫瘍、又は（ｉｉｉ）３ｃｍ以下の癌を含むリンパ節のいずれかによって特徴づけることができる。
【０１６９】
ステージＩＶの癌は、（ｉ）唇及び口腔の周囲の組織に拡がった腫瘍、或いは（ｉｉ）その領域のリンパ節が腫瘍を含むもしくは含まない、或いは（ｉｉｉ）いずれかの大きさであって、癌と首の同側の２以上のリンパ節、首の片側もしくは両側のリンパ節、又は６ｃｍを超えるリンパ節に拡がった腫瘍、或いは（ｉｖ）身体の他の部分に拡がった腫瘍のいずれかによって定義し得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、「標準」基準値（例えば非癌性組織のサンプルで測定されるもの）に比べて１．５〜３倍の、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２の核発現の測定レベルは、ステージＩの癌の指標であり得る。
【０１７１】
本発明の範囲内で、「１．５〜３倍」という表現は、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８及び２．９倍を包含する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、「標準」基準値（例えば非癌性組織のサンプルで測定されるもの）に比べて３．１〜５倍の、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２の核発現の測定レベルは、ステージＩＩの癌の指標であり得る。「３．１〜５倍」という表現は、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８及び４．９倍を包含する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、「標準」基準値（例えば非癌性組織のサンプルで測定されるもの）に比べて５．１〜７倍の、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２の核発現の測定レベルは、ステージＩＩＩの癌の指標であり得る。
【０１７４】
本発明の範囲内で、「５．１〜７倍」という表現は、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８及び６．９倍を包含する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、「標準」基準値（例えば非癌性組織のサンプルで測定されるもの）に比べて少なくとも７．１倍の、口腔扁平上皮癌を有する個体におけるＴＲＦ２の核発現の測定レベルは、ステージＩＶの癌の指標であり得る。
【０１７６】
本発明の範囲内で、「少なくとも７．１」という表現は、７．５以上、８以上、９以上、１０以上、２５以上、５０以上、１００以上を包含する。
【０１７７】
キット
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体の治療に使用するためのキットであって、
生理学的に許容される添加物中の、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤と、
生理学的に許容される添加物中の抗癌化合物と
を含むキットに関する。
【０１７８】
一実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤で治療される個体は、既に開示した方法によって、抗癌治療に効率的に応答する確度の良い個体として既に同定されている。
【０１７９】
別の実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤で治療される個体は、既に開示した方法によって、抗癌治療に効率的に応答する確度の乏しい個体として既に同定されている。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤及び／又は抗癌化合物は、さらに、１種以上の生理学的に許容される添加物を含む組成物に製剤化し得る。
【０１８１】
生理学的に許容される適切な添加物には、あらゆる慣用溶媒、分散媒体、充填剤、固体担体、水性溶液、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれるが、これらに限定されない。生理学的に許容される適切な添加物には、例えば、水、緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組合せが含まれる。生理学的に許容される添加物は、湿潤剤又は乳化剤、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤及び／又は抗癌化合物の有効期間又は有効性を高めることができる防腐剤のような少量の補助物質をさらに含み得る。生理学的に許容される添加物の調製及び使用は、当技術分野で周知である。生理食塩水緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。生理学的に許容される添加物は、さらに、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤のような少量の補助物質を含んでいてもよく、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤及び／又は抗癌化合物の貯蔵有効期間又は有効性を高めることができる。生理学的に許容される添加物の調製及び使用は、当技術分野で周知である。
【０１８２】
かかるＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤及び／又はかかる抗癌化合物は、同時に又は遅延モードで投与し得る。
【０１８３】
ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤及び／又は抗癌化合物の投与は、例えば皮下又は筋肉内注射による非経口的、並びに経口、鼻腔内又は腫瘍内投与に依拠し得る。他の投与モードは、経口製剤、肺製剤、坐剤及び経皮施用を用いるが、これらに限定されない。経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムのような、常用される添加物を含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤は、本明細書において既に定義されている。
【０１８５】
ある実施形態では、ＴＲＦ２遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＴＲＦ２遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに特異的に結合するアプタマー、並びにＴＲＦ２遺伝子発現の非特異的阻害剤から選択される。
【０１８６】
ある実施形態では、抗癌化合物は、ＥＧＦＲアンタゴニストである。
【０１８７】
ある実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、及びＥＧＦＲ（好ましくはＥＧＦＲの細胞外ドメイン）に特異的に結合する化合物を含む群から選択される。
【０１８８】
ある実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ及びザルツムマブを含む群から選択される。
【０１８９】
別の態様において、本発明は、口腔扁平上皮癌を有する個体が抗癌治療に効率的に応答する確度を予測するためのキットであって、
ａ）前記個体から得られたサンプル中のＴＲＦ２の核発現レベルを測定するための試薬と、
ｂ）前記抗癌治療に対する応答と正又は負の相関をもつ１以上の他のパラメータを決定するための試薬と
を含むキットに関する。
【０１９０】
本発明の範囲内で、「試薬」という用語は、核酸プローブ、蛍光プローブ、抗体、アプタマー、液体溶液等を包含し得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、キットは、ＴＲＦ２の核発現の基準値を測定するために、基底上皮細胞株をさらに含んでいてもよい。
【実施例】
【０１９２】
１−材料及び方法
１．１−患者及び組織サンプル
６２個のＯＳＣＣ組織サンプルは、１９９６年から２０１１年の間にＣｅｎｔｅｒ  Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｌａｃａｓｓａｇｎｅ及びＳｔ  Ｒｏｃｈ病院で診察された患者から得た。全患者は組織学的に確認し、それらの同意を得た。ＯＳＣＣ患者の腫瘍切片は、Ｃｅｎｔｒｅ  Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｌａｃａｓｓａｇｎｅ及びＨｏｓｐｉｔａｌ病院の組織学研究所で免疫組織化学による評価に十分であることが前もって試験された。患者のＴＮＭ分類、診断、診察日、治療及び最終知得状態のような臨床データは、ｃｌｉｎｉｃｏｍ（登録商標）データベースでの検索によって得た。生存期間は、口腔癌の診断日から算出した。この研究における重要な患者の特徴を表１にまとめる。
【０１９３】
【表１】
2018524614.tif 000003
2018524614.tif 000004
【０１９４】
ＯＳＣＣ患者の平均年齢は６０．５歳であった。大半の患者は男性（７１％）であり、性比は２．４５であった。腫瘍の大部分は浸潤性（４４％）（Ｔ４ステージ）であり、４ｃｍ超と測定された。患者の６３％はリンパ節の浸潤を呈さなかった。患者の大部分は外科手術（６７％）及び放射線療法（６７％）によって治療されたが、化学療法はわずか１４人の患者（２５％）で使用された。メジアン生存期間（ＭＳＴ）は４５．３か月であり、１年生存率は７８．５％であった。
【０１９５】
１．２−細胞株
ＡＴＣＣ（登録商標）からの以下の２種類の頭頸部癌細胞株：
ＣＡＬ３３（商標）：Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｌａｃａｓｓａｇｎｅ（フランス、ニース）で樹立された、ｐ５３用に変異させた舌のヒトＯＳＣＣ（Ｇｉｏａｎｎｉ  Ｊｅｔ  ａｌ。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９８８；  ２４（９）：１４４５−５５）、
ＣＡＬ２７（商標）：Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｌａｃａｓｓａｇｎｅ（フランス、ニース）で樹立されたヒトＯＳＣＣ
を研究した。
【０１９６】
細胞増殖、浸潤能力及び治療応答に対するＴＲＦ２ノックダウンの影響をさらに解析するために、ＴＲＦ２に対するｓｈＲＮＡ及びドミナントネガティブ型のＴＲＦ２を発現するＣＡＬ３３細胞を創製した（Ｂｉｒｏｃｃｉｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；１５（７）：８１８−２８）。ＣＡＬ３３細胞はレンチウイルスベクター（ｐＬＫＯｐｕｒｏ−３ｘＬａｃＯ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて感染させた。プラスミドはスクランブル（ｓｈＣ；配列番号１）或いはＴＲＦ２特異的ｓｈＲＮＡであるｓｈ１（配列番号２）又はｓｈ２（配列番号３）を含んでいた。
【０１９７】
これらに使用した核酸配列を以下の表２にまとめる。
【０１９８】
【表２】
2018524614.tif 000005
【０１９９】
１．３−インビトロ増殖アッセイ
累積集団倍加アッセイ（Ｎｅｋａｎｔｉ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２０１０；６（５）：４９９−５１２）のため、１０５個の細胞を、直径１００ｍｍのペトリ皿で７．５％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中３７℃及び５％ＣＯ２で２８日間培養した。細胞は毎日計数し（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ社）、培地は５日毎に交換した。各継代における細胞は、収集細胞の総数と播種細胞の総数との比に、前継代からの細胞の総数を乗じたものとして計算した。集団倍加数は、以下の式を用いて計算した。
Ｘ＝［ｌｏｇ１０（ＮＨ）−ｌｏｇ１０（ＮＩ）］／ｌｏｇ１０（２）
式中、ＮＩは播種細胞数であり、ＮＨは収集細胞数である。
【０２００】
累積倍加レベルを得るため、各継代について集団倍加数を計算し、次いで前の継代の集団倍加レベルに加えた。集団倍加時間は、次の式で得ることができる。
ＴＤ＝ｔｐｌｇ２／（ｌｇＮＨ−ｌｇＮＩ）
式中、ＮＩは播種細胞数であり、ＮＨは収集細胞数であり、ｔは培養時間（時間単位）である。
【０２０１】
平均及び標準偏差は３回の独立した実験で算出した。統計解析はｔ検定を用いて行った。コロニー形成アッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ）のために、細胞（２×１０３）を６０ｍｍ培養皿に播種した。細胞接着して２４時間後に、エルロチニブ／タルセバ（１μｍｏｌ／Ｌ）の存在下又は非存在下で１０日間増殖させるため、培地を、１０％血清を補充した通常のＤＭＥＭと交換した。次いで、培養皿をＧｉｅｍｓａ（Ｆｌｕｋａ社製）で染色し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ（米国））を用いて結果をコンピューター解析するためプレートをスキャンした。腫瘍細胞増殖を減少させるエルロチニブ／タルセバの濃度は、製造元の指示に従って３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ社（フランス、リヨン））を用いて測定した。
【０２０２】
１．４−インビトロ細胞遊走及び浸潤
スフェロイドを得るために、４０００個の細胞を、７．５％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−７．５％ＦＣＳ）のハンギングドロップ２０μＬに播種した。７日後に、スフェロイドをＤＭＥＭ−３％ＦＣＳ中に希釈したｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移して１５日間培養した。ＡＭＧ  Ｅｖｏｓ顕微鏡４０倍対物レンズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で撮像し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ（米国））を用いてスフェロイドの直径を測定した。
【０２０３】
１．５−ウェスタンブロット
ウエスタンブロッティングには、以下の抗体：抗リン酸化ＥＲＫ１，２（Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス））、抗リン酸化Ａｋｔ、抗Ａｋｔ、抗ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社（英国ケンブリッジ））、抗ＥＲＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ））、抗ＴＲＦ２（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏ社（英国ケンブリッジ））及びα−チューブリン（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（フランス、イルキルシュ））を用いた。
【０２０４】
１．６−腫瘍異種移植片の形成及びサイズ評価
１０６個の細胞を、５週齢のヌード（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）の側腹部に皮下注射した。バイオルミネセンスは、インビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を製造元の指示に従って使用して定量した。腫瘍体積［（ｖ＝Ｌ×ｌ２×０．５２）］は、ノギスを用いて平行に求めた。バイオルミネセンスの値と腫瘍体積との間には線形関係があった。
【０２０５】
１．７−ヒト及びマウス組織切片におけるＴＲＦ２の免疫組織化学染色
ＴＲＦ２に対する免疫組織化学染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織塊からの３μｍ組織切片で実施した。病理組織学的分析は、マッソントリクローム（青色コラーゲン）染色した３μｍ組織切片で行い、Ｌｅｉｃａ  Ｓｌｉｄｅ  Ｐａｔｈでスキャンした。各腫瘍に対して、画像を撮像し、Ｌｅｉｃａ  Ｓｌｉｄｅ  Ｐａｔｈ  Ｇａｔｅｗａｙソフトウェアを用いて以下のパラメータ：切片の総面積、壊死領域、白血球炎症性浸潤の存在、赤血球の血管外漏出の存在、血管周囲のコラーゲンの厚さ、血管の数を解析した。
【０２０６】
脱パラフィン切片のＰＢＳ中での内在性ペルオキシダーゼ不活性化を３０分間行った後、再水和（Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ  ４８、Ｄａｋｏ社（米国カリフォルニア州カーピンテリア）及びｐＨ＝９の緩衝液中９７℃で２０分間抗原の熱処理賦活を行った（Ｄａｋｏ  ＰＴ  Ｌｉｎｋ装置）。インキュベーションは１：１００に希釈した抗ＴＲＦ２モノクローナル抗体を用いて室温で２０分間行った。二次抗体を適用した後、組織切片を発色基質３’，３’−ジアミノベンジジンで処理し、マイヤーのヘマトキシリンで核を対比染色した。リンパ球及び／又は基底上皮細胞に対するＴＲＦ２反応性を内部陽性対照とみなした。ＴＲＦ２の核発現は半定量的に解析され、２名の病理学者（Ｄ．  Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ及びＡ．  Ｓｕｄａｋａ）及び２名の外科医（Ｈ．  Ｒａｙｂａｕｄ及びＹ．Ｂｅｎｈａｍｏｕ）によって独立に検証された。相違があった場合は、切片の解読について第三者の意見を求めた。
【０２０７】
腫瘍は以下の通り分類した。
０：腫瘍細胞における核発現の欠如、
＋１：低い発現、
＋２：平均的発現、
＋３：強い発現。
【０２０８】
組織切片が２つの異なるスコアを含む場合は、染色した核の３０％超に関するものであれば上位のスコアを選択した。
【０２０９】
１．８−免疫蛍光
腫瘍切片は、免疫蛍光実験について以前に記載された通り（Ｐｅｒｒｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；１３（６）：８３４−４３）取り扱った。切片を、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１（クローンＭＥＣ１３．３；  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びモノクローナル抗α平滑筋アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ２５４７，１：１０００；Ｓｉｇｍａ（フランス））と共にインキュベートした。
【０２１０】
１．９−統計的解析法
すべての解析のエンドポイントは全生存（ＯＳ）であり、これは患者の初回診断から死亡までの時間として定義される。死亡しなかった患者については、初回診断から最後に記録された経過観察までの時間を用いた。ＯＳ率はカプラン・マイヤー法に従って計算した。ＴＲＦ２スコアによって定義される異なるグループ間のハザード比（ＨＲ）（信頼区間対応する）はＣｏｘ回帰モデルによって求めた。サブグループ内の免疫組織化学因子の分類は、解析結果とは独立に、予め定義した。すべての解析は、すべての免疫組織化学判定及び臨床歴が完全に記録されている６２人の患者に基づく。単変量及び多変量解析のために、腫瘍の０及び＋１のスコアと＋２及び＋３のスコアとを、「ＴＲＦ２陰性」及び「ＴＲＦ２陽性」を表す独立したグループにまとめた。
【０２１１】
１．１０−免疫蛍光によるＤＮＡ損傷の評価
スライドを−２０℃のメタノール又は室温の４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いでブロッキング緩衝液（０．８×ＰＢＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び３％牛乳）で１時間インキュベートし、その後、５３ＢＰ１抗体（ＮＢ１００−３０５；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を０．８×ＰＢＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄し、抗マウスＡｌｅｘａ４８８抗体（Ａ２１２０２；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び抗ウサギＡｌｅｘａ５５５抗体（Ａ−３１５７２；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共にインキュベートした。０．８×ＰＢＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した後、核をＤＡＰＩで標識した。
【０２１２】
１．１１−マイクロアレイによるＣＡＬ３３セクレトームの決定
１０６個のｓｈＣ及びｓｈ２  ＣＡＬ３３細胞を標準条件下で４８時間増殖させた。細胞の上清を遠心分離し、製造元のプロトコール（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｒｒａｙ  Ｉ；Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ社）に指示されている通り、サイトカイン発現を試験するために特定のメンブレン上でインキュベートした。メンブレンは化学発光によって現れた。様々なスポットの強度の定量はＯｄｙｓｓｅｙ撮像装置（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて行った。相対強度は、メンブレンに含まれる陰性及び陽性対照に対して正規化した。
【０２１３】
２−結果
２．１−ＴＲＦ２発現及びＯＳＣＣ患者の生存
ＯＳＣＣにおけるＴＲＦ２発現の免疫組織化学によるスコアリングで従前利用できるものはなかった。従って、乳癌におけるＨＥＲ２評価を参考にしてＴＲＦ２を決定するためのスコアを確立した。ＯＳＣＣ患者におけるＴＲＦ２発現レベル及び他の病理学的因子の予後有意性を単変量解析によって評価した。
【０２１４】
免疫組織化学データは、腫瘍サイズ（Ｔ）及び節状態（Ｎ）（いずれも患者のアウトカムに対する予後不良因子として知られる。）が全生存と有意に相関していた（それぞれｐ＝０．０１５及び０．０００８）ことを示す（図１Ａ及び１Ｂ）。上述のスコアリング法によれば、３４名の患者がＴＲＦ２陽性であり、２４名の患者がＴＲＦ２陰性であった。患者のＯＳＣＣ組織切片におけるＴＲＦ２核発現と生存率との間に有意な関係が観察され（メジアン生存期間は０〜＋１の患者では７１か月であったのに対して、＋２〜＋３の患者では２４か月；ｐ＝０．０４１８）、ＯＳＣＣに対する新たな生物学的予後マーカーがもたらされる（図１Ｃ）。多変量解析は、ＴＲＦ２スコア（ＯＲ＝２．３５［１．０１−５．４５］９５％ＣＩ，ｐ＝０．０４２４）が、腫瘍サイズ（ＯＲ＝３．４５［１．３８７−８．６２８］９５％ＣＩ，ｐ＝０．００７）とは無関係であることを示していた（図１Ｄ）。
【０２１５】
２．２−ＯＳＣＣ細胞株におけるＴＲＦ２発現／活性の調節のインビトロ効果
ＯＳＣＣ細胞におけるＴＲＦ２発現は予後マーカーであるように思われるので、次にインビトロでのＯＳＣＣ細胞株の特徴を明らかにした。ＣＡＬ３３細胞は正常ヒト線維芽細胞と比較して有意に高いＴＲＦ２発現を示した。次いで、ＴＲＦ２をノックダウンした又は野生型もしくはドミナントネガティブ型のＴＲＦ２を過剰発現するＣＡＬ３３細胞の増殖及び浸潤能力を評価した（図２Ｂ）。３種類の異なるｓｈＲＮＡを試験して、ＣＡＬ３３細胞におけるＴＲＦ２ノックダウンにおけるそれらの有効性を比較したところ、ｓｈＲＮＡ＃２が最も効率的であった（図２Ａ）。ＴＲＦ２の発現／活性の操作は、ＣＡＬ３３細胞の増殖及び浸潤能力に影響しなかった（図２Ｂ及び２Ｄ）。同等の結果がＣＡＬ２７細胞で得られた（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄ）。５３ＢＰ１フォーカスの数によって証明されるＤＮＡ損傷に差はみられなかった。
【０２１６】
２．３−ＴＲＦ２ダウンレギュレーションは腫瘍細胞のセクレトームを改変する
上記の結果は、患者のサンプルの観察結果とは明らかに相違していた。しかし、それらは、ＴＲＦ２の発現が、細胞の微小環境でパラクリンのように作用する特定の因子の発現に影響する可能性があることを示唆していた。
【０２１７】
従って、ＴＲＦ２発現がＯＳＣＣ細胞のセクレトームに影響を及ぼしていたという仮説を立証するため、ＴＲＦ２ノックダウンあり又はなしでＣＡＬ３３細胞の上清中のサイトカイン発現を測定した（図４Ａ及び４Ｂ）。ＣＡＬ３３におけるＴＲＦ２ノックダウンは、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、インターロイキン６（ＩＬ６）、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＲＡＮＴＥＳの誘導並びにＶＥＧＦ発現の低下をもたらした（表３参照）。
【０２１８】
【表３】
2018524614.tif 000006
【０２１９】
ｑＰＣＲによって評価した様々な遺伝子の発現百分率を示す。測定された遺伝子について、参照値（１００）は、ｓｈＣ細胞における所定の遺伝子の内容に対応する。統計的に有意な差異が示されている。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２２０】
サイトカイン遺伝子誘導は、別の細胞株（ＣＡＬ２７）でもほぼ同一であった。
【０２２１】
これらの結果は、ＴＲＦ２は、そのテロメア安定化作用とは独立に、遺伝子発現レギュレーターとして働くことを示唆している。
【０２２２】
２．４−ＴＲＦ２ノックダウンはマウスでのＯＳＣＣ異種移植片の増殖を減少させる
ＣＡＬ３３細胞におけるＴＲＦ２発現が腫瘍の侵襲性と関連していたという仮説を評価するため、対照又はＴＲＦ２に対する２つの独立したｓｈＲＮＡのいずれかを発現するＣＡＬ３３をヌードマウスに注射した。ＴＲＦ２をノックダウンした腫瘍は、小さくて円形であり、発光が注射部位の周辺領域に限られていたことで立証されるように、湿潤性が低下していた（図５）。最小の腫瘍は、最も高いＴＲＦ２ノックダウン（ｓｈＴＲＦ２＃２群）と関連していた。
【０２２３】
２．５−ＴＲＦ２ノックダウンは血管組織化を防ぎ、線維症、炎症及び腫瘍壊死に好都合である
ＴＲＦ２発現がどのように腫瘍の増殖を調節するかについてさらに理解するため、腫瘍切片を分析した。対照腫瘍と比較して、ｓｈＴＲＦ２腫瘍は、重大な壊死領域（７．５％対２６％、ｐ＝０．０１８）及び血管周囲のより薄いコラーゲン層（３７μｍ対７μｍ、ｐ＝０．００１）によって特徴づけられた。さらに、炎症及び赤血球の血管外漏出が、ノックダウンＴＲＦ２腫瘍切片における血管周囲で観察され、急性炎症及び不規則な血管網を示唆した。次いで、腫瘍切片を、ＣＤ３１（内皮細胞）／α−ＳＭＡ（周皮細胞）標識での血管新生についてモニターした。対照腫瘍は、α−ＳＭＡ標識細胞で血管が覆われた高い血管密度によって特徴づけられた。ｓｈＴＲＦ２腫瘍の血管網はもっと無秩序であり、ＣＤ３１／α−ＳＭＡ同時標識の欠如によって特徴づけられた。分散したＣＤ３１及びα−ＳＭＡ陽性細胞が観察された。α−ＳＭＡ陽性細胞の数は線維化領域に特有であった。
【０２２４】
２．６−ＴＲＦ２をノックダウンしたＣＡＬ３３細胞は、エルロチニブ／タルセバ及びセツキシマブ／アービタックスに対してより敏感である
ＯＳＣＣは、ＥＧＦＲ受容体の過剰発現及びその後の下流シグナル伝達経路、特に異常増殖を招くＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼ及びＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路の活性化によって特徴づけられる（Ｂｏｚｅｃ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２０（１０）：１７０３−７）。次いで、抗ＥＧＦＲ治療、特にセツキシマブは、パフォーマンスステータスに劣る患者に特に使用される（Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４；５０（１１）：１０４１−８；  Ｐｅｙｒａｄｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１３；４９（６）：４８２−９１）。
【０２２５】
ＴＲＦ２発現がＥＧＦＲの主要阻害剤、特にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤、エルロチニブ／タルセバ又はＥＧＦＲ標的化抗体セツキシマブ／アービタックスに対する応答性に影響しかねないという仮説を検討した。エルロチニブは、ＩＣ５０（５．４μｍｏｌ／Ｌ）を上回る用量で、ＣＡＬ３３細胞におけるＥＧＦＲ活性及びその後の下流シグナル伝達経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ活性）を効率的に阻害した（Ｑｕｅｓｎｅｌｌｅ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２；１３（１０）：９３５−４５）。
【０２２６】
ＴＲＦ２のノックダウンは、ＯＳＣＣの治療のための２つの治療戦略である放射線療法（図６Ａ）又は５ＦＵ（図６Ｂ）の有効性に影響しない。
【０２２７】
対照的に、ＴＲＦ２のノックダウンは、エルロチニブとセツキシマブの２種類の薬剤のＩＣ５０（それぞれ、５．４μｍｏｌ／Ｌ（Ｑｕｅｓｎｅｌｌｅ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２；１３（１０）：９３５−４５）及び３０ｎｍｏｌ／Ｌ（Ｒｅｂｕｃｃｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；３８（１）：１８９−２００）である。）を大幅に下回る用量で使用したＣＡＬ３３細胞におけるエルロチニブ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）及びセツキシマブ（６ｎｍｏｌ／Ｌ）の有効性を劇的に増大させた（ｓｈ１については４０％及び６０％阻害、ｓｈ２については５０％及び６０％阻害、図７）。
【０２２８】
ＭＴＴ試験によって、ＴＲＦ２をｓｈ２でノックダウンしたときにエルロチニブがＣＡＬ３３増殖を阻害することを確認した（図８）。ＴＲＦ２のノックダウンは、ＣＡＬ２７におけるセツキシマブの有効性を増大させた（図９）。これらの結果は、ＴＲＦ２発現が、ＯＳＣＣにおける抗ＥＧＦＲ治療の適切な予測マーカーを構成し得ることを示唆していた。
【０２２９】
３−考察
数多くの論文が癌におけるＴＲＦ２の役割について記載しているが、ＯＳＣＣにおけるＴＲＦ２の役割について記載した公開論文はない。
【０２３０】
こうして、市販のモノクローナル抗ＴＲＦ２抗体での免疫組織化学による簡単なＴＲＦ２読取りスコアが病理学者に提供される。さらに、ＴＲＦ２発現は、腫瘍の存在を確認するために常に行われる診断生検で簡単に決定できた。予後マーカーとしてのその適切さを確認するための前向き研究で、このようなＴＲＦ２発現を判定しなければならない。
【０２３１】
インビトロアッセイは、高レベルのＴＲＦ２を発現するＯＳＣＣ細胞が、増殖、遊走及び浸潤性に関していかなる利点を有していないことを示し、以前の結果（Ｂｉｒｏｃｃｉｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；１５（７）：８１８−２８）が確認された。ただし、ＴＲＦ２は、ＩＬ６のＲＡＳ依存性発現を介して腫瘍の微小環境を調節することが示されている（Ｂｉｒｏｃｃｉｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；１５（７）：８１８−２８））。本明細書の実験モデルでは、ＥＧＦＲの過剰発現／活性化はＲＡＳ経路の活性化を招き、これは試験した細胞が高い基礎レベルのＩＬ６を発現することを説明する。Ｂｉｒｏｃｃｉｏ他は、ＩＬ６が、細胞増殖を維持するために活性ＲＡＳの存在下でＴＲＦ２の欠損を補うと記載している。
【０２３２】
ＴＲＦ２ダウンレギュレーションによって誘導される様々な遺伝子は炎症プロセス及び血管新生バランスに関係づけられ、ＴＲＦ２発現の低下に関連するインビボ効果を考慮するとそれらの誘導は矛盾しているようにみえるかもしれない。抗血管新生特性を有するＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０及び血管の周皮細胞被覆度の増加による血管新生依存性腫瘍の増殖を阻害するＰＤＧＦ−ＢＢを除いて、他の誘導サイトカインは予後不良のマーカーと考えられる（ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＧＲＯ−α）（Ａｌｄｉｎｕｃｃｉ  Ｄ，  Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉ  Ａ．  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ２０１４；２０１４：２９２３７６；  Ｍａｕｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５；３６（２）：９２−１０１；  Ｚａｒｏｇｏｕｌｉｄｉｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１４；３２（５）：１９７−２０５；  Ｖｅｒｂｅｋｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２０１１；２２（５−６）：３４５−５８）。
【０２３３】
実験はヌードマウスで行ったが、ナチュラルキラー及びマクロファージの存在が依然として抗腫瘍プログラムに参加する可能性がある。従って、ＴＲＦ２発現０／１＋に対応する腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を高めるサイトカインの発現を誘導する可能性があり、ＲＡＮＴＥＳは、癌免疫療法のアジュバントとして使用される有益な因子と思われる（Ｌａｐｔｅｖａ  Ｎ，  Ｈｕａｎｇ  ＸＦ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０；１０（５）：７２５−３３）。ＩＬ６は腫瘍促進因子とも考えられている。しかし、ＩＬ６はＢ細胞分化を促進することができ（Ｂ細胞はヌードマウスに存在する）、これは腫瘍増殖を防止すると考えられる。さらに、ＧＲＯ−α／ＣＸＣＬ１及びＩＬ８／ＣＸＣＬ８は、癌細胞の免疫駆除に重要な役割を果たす白血球の主要な化学誘引物質である。従って、ＴＲＦ２レベルの低い腫瘍細胞は、免疫細胞に対する化学誘引物質をより多く発現し、腫瘍増殖を間接的に減速させる。
【０２３４】
本明細書の実験データは、ＴＲＦ２が、標的療法セツキシマブ／アービタックス及びエルロチニブ／タルセバに対する治療応答の適切な予測マーカーを表し得ることも示唆している。セツキシマブは一般に使用されている白金塩よりも攻撃的が低いので、パフォーマンスステータスに劣る患者にのみ使用されている。しかし、セツキシマブに対する感受性は、ＲＡＳの変異、ＨＥＲ２の過剰発現又はＰＩ３キナーゼ活性の活性化によって変化させることができる。エルロチニブ／タルセバは頭頸部腫瘍の患者に用いられたが、その５０％のみが治療に対する客観的応答を示した（Ａｇｕｌｎｉｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；２５（１６）：２１８４−９０）。皮膚生検におけるＥＧＦＲ／ｐＥＧＦＲレベルは代替マーカーとみなされたが、著者らは、レスポンダーのより良い評価には追加のマーカーが必要であることを示唆していた。従って、治療する適切な患者を階級化するために同じ皮膚生検でＴＲＦ２を検出し得る。最近の研究では、ネオアジュバント設定のエルロチニブ／タルセバで治療した腫瘍におけるＥＧＦＲ／ｐＥＧＦＲ比の検出が記載されている（Ｔｓｉｅｎ  ＣＩｅｔ  ａｌ．  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  ２０１３；３５（９）：１３２３−３０）。これらの著者は、薬剤応答及びＥＧＦＲの活性に関して腫瘍不均一性を記載している。これらの結果は、レスポンダーのさらに正確な判定が必要であることを示唆している。エルロチニブ／タルセバは肺がん患者の治療に集中的に使用されているが、治療効果を予測するＥＧＦＲの特異的変異の有無について患者を検査する必要がある。肺癌でみられる変異は、頭頸部腫瘍では観察されていないが、他の変異が報告されている。応答の予測マーカーとしてのこれらの変異の価値は現時点では検証されていないが、ＴＲＦ２レベルと同時に解析し得る。結論として、今般、再発のリスクのある個体を判定するとともに、抗ＥＧＦＲ標的治療の恩恵を受けることができる患者を階級化するための貴重なツールが提供される。
【０２３５】
参考文献
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Ｂｏｚｅｃ  Ａ，  Ｓｕｄａｋａ  Ａ，  Ｔｏｕｓｓａｎ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ，  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２０（１０）：１７０３−７．
Ｂｒａｕｅｒ  ＡＵ，  Ｓａｖａｓｋａｎ  ＮＥ，  Ｋｏｌｅ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ａｆｔｅｒ  ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｌｅｓｉｏｎ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ，  ２００１；１５，  ２６８９−２７０１．
Ｃｈｕａｎｇ  ＨＣ，  Ｃｈｅｎ  ＣＨ，  Ｈｕａｎｇ  ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＦ１  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｄ．  ２０１１；２（１）：６３−６７．
Ｄａ−Ｓｉｌｖａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｔｅｒｅｄ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （ＴＰＰ１，  ＰＯＴ１，  ＲＡＰ１，  ＴＲＦ１  ａｎｄ  ＴＲＦ２）  ｉｎ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２０１０；４２（８）：５４４−８．
Ｄｉｅｈｌ  ＭＣ，  Ｉｄｏｗｕ  ＭＯ，  Ｋｉｍｍｅｌｓｈｕｅ  ＫＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ＴＲＦ２  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｈｏｒｔ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．  ２０１１；  １２７（３）：６２３−３０．
Ｄｏｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐ１  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＦ２  ａｎｄ  ＴＲＦ２  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００９；８（２２）：２１６６−７４．
Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐ５３  ａｎｄ  ＴＲＦ２  ｉｎ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄａｍａｇｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｄｅｃ；  １２（１２）：  １２０５−１２１２．
Ｇｉｏａｎｎｉ  Ｊ，  Ｆｉｓｃｈｅｌ  ＪＬ，  Ｌａｍｂｅｒｔ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｎｇｕｅ：  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９８８；２４（９）：１４４５−５５．
Ｇｒｅｐｉｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ／Ａｖａｓｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＸＣＬ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１２；３１（１３）：１６８３−９４．
Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８８．
Ｈｏｈｅｉｓｅｌ  ＪＤ．  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００６，  ７（３）：２００−２１０．
Ｈｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＦ１，  ＴＲＦ２，  ＴＩＮ２，  ＴＥＲＴ，  ＫＵ７０，  ａｎｄ  ＢＲＣＡ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｓｔａｇｅ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１３６（９）：１４０７−１４．
Ｋｌａｐｐｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ＴＲＦ２  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００３；１７（１０）：２００７−１５．
Ｌａｐｔｅｖａ  Ｎ，  Ｈｕａｎｇ  ＸＦ．  ＣＣＬ５  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０；１０（５）：７２５−３３．
Ｍａｔｓｕｔａｎｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｎｄ  ２  ａｎｄ  ＴＲＦ１−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９（３）：５０７−１２．
Ｍａｕｅｒ  Ｊ，  Ｄｅｎｓｏｎ  ＪＬ，  Ｂｒｕｎｉｎｇ  ＪＣ．  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＩＬ−６  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５；３６（２）：９２−１０１．
Ｍｕｎｏｚ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  ＸＰＦ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＴＲＦ２  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００５；３７（１０）：１０６３−７１．
Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  （ＴＲＦ）−１  ａｎｄ  ＴＲＦ２  ｉｎ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９（３）：１１０５−１１．
Ｎｅｋａｎｔｉ  Ｕ，  Ｄａｓｔｉｄａｒ  Ｓ，  Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  ｊｅｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｈｙｐｏｘｉａ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２０１０；６（５）：４９９−５１２．
Ｏｈ  ＢＫ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＴＲＦ１，  ＴＲＦ２，  ａｎｄ  ＴＩＮ２  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；１６６（１）：７３−８０．
Ｐａｄｈｉ  Ｓ，  Ｓａｈａ  Ａ，  Ｋａｒ  Ｍ，  Ｇｈｏｓｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃｏ−Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−Ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１５；  ６（２）：１９２−２０２．
Ｐｅｒｒｉ  Ｆ，  Ｍｕｔｏ  Ｐ，  Ａｖｅｒｓａ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  ｔｅａｍ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；１３（６）：８３４−４３．
Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  Ｆ，  Ｃｏｉｎｕ  Ａ，  Ｒｉｂｏｌｄｉ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｒ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４；５０（１１）：１０４１−８．
Ｐｅｙｒａｄｅ  Ｆ，  Ｃｕｐｉｓｓｏｌ  Ｄ，  Ｇｅｏｆｆｒｏｉｓ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ．  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１３；４９（６）：４８２−９１．
Ｑｕｅｓｎｅｌｌｅ  ＫＭ，  Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＳＥ，  Ｒａｔａｙ  ＭＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２；１３（１０）：９３５−４５．
Ｒｅｂｕｃｃｉ  Ｍ，  Ｐｅｉｘｏｔｏ  Ｐ，  Ｄｅｗｉｔｔｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＮＳＣＣ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＫＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ｔｈｉｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；３８（１）：１８９−２００．
Ｓａｉｎｇｅｒ  ＲＮ，  Ｔｅｌａｎｇ  ＳＤ，  Ｓｈｕｋｌａ  ＳＮ，  Ｐａｔｅｌ  ＰＳ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ．  ２００７  Ｆｅｂ  １４；２：９−１９．
Ｔｓｉｅｎ  ＣＩ，  Ｎｙａｔｉ  ＭＫ，  Ａｈｓａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｏｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  ２０１３；３５（９）：１３２３−３０．
Ｔｕｅｒｋ  Ｃ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｌ．  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９０；ｖｏｌ．  ２４９（４９６８），  ５０５−１０．
Ｕｌ  Ａｉｎ  Ｑ，  Ｃｈｕｎｇ  ＪＹ，  Ｋｉｍ  ＹＨ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：  ＺＦＮ，  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ＲＧＥＮ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２０１５  Ｍａｙ  １０；２０５：１２０−７．
Ｖｅｒｂｅｋｅ  Ｈ，  Ｓｔｒｕｙｆ  Ｓ，  Ｌａｕｒｅｙｓ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２０１１；２２（５−６）：３４５−５８．
Ｗｉｌｋｉｅ  Ｇ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  Ｅ．Ｃ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ．  Ｈａｎｃｏｃｋ  （ｅｄ．）  Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｕｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  １：  Ｎｕｃｌｅｉ  ａｎｄ  ｓｕｂ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  （ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００８）  ＩＳＢＮ：  ９７８−１−４９３９−１６７９−５  （Ｐｒｉｎｔ）  ９７８−１−４９３９−１６８０−１  （Ｏｎｌｉｎｅ）．
Ｗｒｉｇｈｔ  ＤＡ，  Ｌｉ  Ｔ，  Ｙａｎｇ  Ｂ，  Ｓｐａｌｄｉｎｇ  ＭＨ．  ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２０１４  Ａｕｇ  １５；４６２（１）：１５−２４．
Ｚａｒｏｇｏｕｌｉｄｉｓ  Ｐ，  Ｋａｔｓｉｋｏｇｉａｎｎｉ  Ｆ，  Ｔｓｉｏｕｄａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１４；３２（５）：１９７−２０５．
【図１】
2018524614.tif 000007
【図２】
2018524614.tif 000008
【図３】
2018524614.tif 000009
【図４】
2018524614.tif 000010
【図５】
2018524614.tif 000011
【図６】
2018524614.tif 000012
【図７】
2018524614.tif 000013
【図８】
2018524614.tif 000014
【図９】
2018524614.tif 000015
【配列表】
2018524614000001.app
【国際調査報告】
2018524614.tif 000016
2018524614.tif 000017
2018524614.tif 000018