(57)【要約】粒子懸濁液が、たとえば、流量制限、試薬の送達及びマイクロ流体システムでの使用を含む種々の適用における使用のための特性を有する、そのような粒子懸濁液を含む組成物。提供される一部の組成物では、粒子懸濁液は変形可能な粒子を含み、特定の組成物では、変形可能な粒子はビーズまたはゲルビーズである。本明細書に記載されている組成物及び方法は、時にはマイクロ流体の背景で対象とする反応に試薬を効率的に送達するために移動固相組成物を利用する。本明細書に記載されている方法及び組成物は、たとえば、核酸の分析及び配列決定の応用を含む高度に多重化された試料の分析のための高度に並列化した反応系を生成することにおいて用途を有することができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形可能な粒子の懸濁液を含む組成物であって、前記懸濁液が
（ｉ）前記懸濁液における変形可能な粒子の少なくとも９５％が前記懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度；
（ｉｉ）約５ｋＰａ〜１００ｋＰａの間の弾性係数を有する変形可能な複数の粒子；
（ｉｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間の溶液粘度；及び
（ｉｖ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する変形可能な粒子
の１以上を特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
前記変形可能な粒子が前記変形可能な粒子よりも狭いマイクロ流体の物理的特徴を通過できる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記マイクロ流体の物理的特徴が、フィルター、障害物、通路、導管、空間またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記変形可能な粒子がビーズである、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ビーズがゲルビーズである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記変形可能な粒子が、直径約１μｍ〜約１ｍｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、約３０μｍ〜約８０μｍ及び約４０μｍ〜約６０μｍから成る群から選択される直径を有する、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記変形可能な粒子が約１０μｍ〜約１００μｍの直径を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記変形可能な粒子が約３０μｍ〜約１００μｍの直径を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記懸濁液が約５ｋＰａ〜約１００ｋＰａの間の剪断弾性率を特徴とする、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の変形可能な粒子の前記懸濁液から混入物を取り除く方法であって、
（ｉ）前記変形可能な粒子の前記直径よりも小さい細孔径を有するメッシュフィルターに前記変形可能な粒子を通すことと、
（ｉｉ）前記変形可能な粒子を回収することとを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記メッシュフィルターが約１０μｍ〜約５０μｍの細孔径を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記変形可能な粒子が約１０μｍ〜約１００μｍの直径を有する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変形可能な粒子が約３０μｍ〜約１００μｍの直径を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細孔径が約３０μｍである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細孔径が約４１μｍである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記変形可能な粒子がゲルビーズである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドで標識された変形可能なゲルビーズ組成物の保存方法であって、
（ｉ）オリゴヌクレオチドに連結された変形可能なゲルビーズの組成物を提供することと、
（ｉｉ）およそｐＨ７．４にて少なくとも１２週間、前記組成物を保存することとを含み、その際、連結されたオリゴヌクレオチドの解放が多くても０．０２５％である、前記保存方法。
【請求項１８】
前記変形可能なゲルビーズが約１０μｍ〜約１００μｍの直径を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記変形可能なゲルビーズが約３０μｍ〜約１００μｍの直径を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
変形可能な粒子の懸濁液を含む組成物であって、
（ｉ）ライゲーション緩衝液と、リガーゼ酵素と、オリゴヌクレオチドとを含み、いかなる還元剤も存在しない溶液を有する懸濁液であって、前記溶液が還元剤の非存在下であっても前記変形可能な粒子へのオリゴヌクレオチドのライゲーションを支えることと、
（ｉｉ）約５ｋＰａ〜１００ｋＰａの間の弾性係数を有する前記変形可能な粒子と、
（ｉｉｉ）凝集に耐性の前記変形可能な粒子であって、前記変形可能な粒子が還元剤の存在下にて別のやり方で凝集しやすくなることとを特徴とする、前記組成物。
【請求項２１】
前記懸濁液がさらに、
（ｉ）前記懸濁液における前記粒子の少なくとも９５％が前記懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度と、
（ｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間の溶液粘度と、
（ｉｉｉ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する粒子との１以上を特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の変形可能な粒子の前記懸濁液を用いた濾過方法であって、
（ｉ）流量リストリクターとして変形可能な粒子の前記懸濁液を使用することと、
（ｉｉ）濾過される溶液を前記懸濁液に通すこととを含む、前記濾過方法。
【請求項２３】
前記変形可能な粒子が約２ｎｍ〜６ｎｍの細孔径を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変形可能な粒子が約５ｎｍの細孔径を有する、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記変形可能な粒子が４．４ｎｍ未満のサイズのカットオフを提供する、請求項２２〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
粒子の懸濁液を含む組成物であって、前記懸濁液が、
（ｉ）前記懸濁液における前記粒子の少なくとも９５％が前記懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度、
（ｉｉ）約５ｋＰａ〜約１００ｋＰａの間の弾性係数を有する複数の粒子、
（ｉｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間の溶液粘度、及び
（ｉｖ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する粒子の１以上を有することを特徴とする、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その出願があらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１５年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／１６３，２３８号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
近況は、遺伝、疾患病理、疫学、農業及び種々の他の分野における分子生物学的システムに対する関心の急増及びその分析を示している。これと併せて、たとえば、生物医学的な及び細胞性のアッセイシステム、高処理能力の遺伝子分析システム、複雑な生命情報工学等を含む高度に複雑な生物系を分析するための分析方法及び分析システムが急増している。
【０００３】
種々のこれらの分析及び／または処理システムは、所与の分析のための成分を提示するために及び／または分析の過程で精製する、分離する、標識する、またはその他の方法で支援するために反応物質と相互作用させるために移動する固相の支持体、たとえば、粒子、ビーズまたはコロイド等を利用する。特定の適用については、これらの移動する固相は、それらがそれらの適用で機能する有効性を改善するために多数のパラメータの１以上を満たすことによって利益を得ることができる。本開示はこれらの及び他の要件を満たす方法、組成物及びシステムを記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
粒子懸濁液が、たとえば、試薬の送達及びマイクロ流体システムでの使用を含む種々の適用における使用のための新規で且つ有用な特性を有するそのような粒子懸濁液を含む改善された組成物本明細書に記載される。
【０００５】
態様では、本開示は粒子の懸濁液を含む組成物を提供する。粒子の懸濁液は、（ｉ）懸濁液における粒子の少なくとも９５％が懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度；（ｉｉ）約５ｋＰａ〜１００ｋＰａの間での弾性係数を有する粒子の複数性；（ｉｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間での溶液粘度；及び（ｉｖ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する懸濁液における粒子の１以上を有することを特徴とすることができる。
【０００６】
一般に、態様の１つでは、変形可能な粒子の懸濁液を含む組成物が提供され、懸濁液は、
（ｉ）懸濁液における変形可能な粒子の少なくとも９５％が懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度；
（ｉｉ）約５ｋＰａ〜１００ｋＰａの間での弾性係数を有する複数の変形可能粒子；
（ｉｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間の溶液粘度；及び
（ｉｖ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する変形可能な粒子
の１以上を特徴とする。
【０００７】
一実施形態では、変形可能な粒子は、変形可能な粒子より狭いマイクロ流体の物理的特徴を通過できる。
【０００８】
別の実施形態では、マイクロ流体の物理的特徴は、フィルター、障害物、通路、導管、空間またはそれらの組み合わせである。
【０００９】
一実施形態では、変形可能な粒子はビーズである。関連する実施形態では、ビーズはゲルビーズである。
【００１０】
別の実施形態では、変形可能な粒子は、直径約１μｍ〜約１ｍｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、約３０μｍ〜約８０μｍ及び約４０μｍ〜約６０μｍから成る群から選択される直径を有する。一実施形態では、変形可能な粒子は約１０μｍ〜約１００μｍの直径を有する。別の実施形態では、変形可能な粒子は約３０μｍ〜約１００μｍの直径を有する。
【００１１】
さらなる態様では、変形可能な粒子の懸濁液は、約５ｋＰａ〜約１００ｋＰａの間の剪断弾性率を特徴とする。
【００１２】
別の態様では、
（ｉ）変形可能な粒子の直径よりも小さな細孔径を有するメッシュフィルターに変形可能な粒子を通すことと、
（ｉｉ）変形可能な粒子を回収することとを含む、
変形可能な粒子の懸濁液から混入物を取り除く方法が提供される。
【００１３】
特定の実施形態では、メッシュフィルターは約１０μｍ〜約５０μｍの細孔径を含む。関連する実施形態では、変形可能な粒子は約１０μｍ〜約１００μｍの直径を有する。異なる実施形態では、変形可能な粒子は約３０μｍ〜約１００μｍの直径を有する。具体的な実施形態では、細孔径は約３０μｍである。さらに具体的な実施形態では、細孔径は約４１μｍである。一実施形態では、変形可能な粒子はゲルビーズである。
【００１４】
一般に、別の態様では、
（ｉ）オリゴヌクレオチドに連結された変形可能なゲルビーズの組成物を提供することと
（ｉｉ）およそｐＨ７．４にて組成物を少なくとも１２週間保存することとを含み、その際、連結されたオリゴヌクレオチドの解放は多くても０．０２５％である、オリゴヌクレオチドで標識された変形可能なゲルビーズを保存する方法が提供される。
【００１５】
一実施形態では、変形可能なゲルビーズは約１０μｍ〜約１００μｍの直径を有する。具体的な実施形態では、変形可能なゲルビーズは約３０μｍ〜約１００μｍの直径を有する。
【００１６】
一般に、別の態様では、
（ｉ）ライゲーション緩衝液とリガーゼ酵素とオリゴヌクレオチドとを含み、いかなる還元剤も存在しない溶液を有する懸濁液であって、その際、溶液は還元剤の非存在下でさえ変形可能な粒子へのオリゴヌクレオチドのライゲーションを支えることと、
（ｉｉ）約５ｋＰａ〜１００ｋＰａの間の弾性係数を有する変形可能な粒子と、
（ｉｉｉ）凝集に対して耐性である変形可能な粒子であって、その際、変形可能な粒子は還元剤の存在下にて別のやり方で凝集しやすくなることと
を特徴とする変形可能な粒子の懸濁液を含む組成物が提供される。
【００１７】
一実施形態では、懸濁液はさらに、
（ｉ）懸濁液における粒子の少なくとも９５％が懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度；
（ｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間の溶液粘度；及び
（ｉｉｉ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する粒子；
の１以上を特徴とする。
【００１８】
一般に、さらなる態様では、
（ｉ）流量リストリクターとして変形可能な粒子の懸濁液を使用することと、
（ｉｉ）濾過される溶液を懸濁液に通すこととを含む、上述の変形可能な粒子の懸濁液を用いて濾過する方法が提供される。
【００１９】
一実施形態では、変形可能な粒子は約２ｎｍ〜約６ｎｍの細孔径を有する。特定の実施形態では、変形可能な粒子は約５ｎｍの細孔径を有する。具体的な実施形態では、変形可能な粒子は４．４ｎｍ未満のサイズカットオフを提供する。
【００２０】
一般に、さらなる態様では、粒子の懸濁液を含む組成物が提供されており、懸濁液は、
（ｉ）懸濁液における粒子の少なくとも９５％が懸濁液についての平均粒径の１０％の範囲内にある粒径を有する粒子の分散度；
（ｉｉ）約５ｋＰａ〜１００ｋＰａの間の弾性係数を有する複数の粒子；
（ｉｉｉ）約０．１ｃＰ〜約１００ｃＰの間の溶液粘度；及び
（ｉｖ）約１ｎｍ〜約２０ｎｍの細孔径を有する粒子
の１以上を有することを特徴とする。
【００２１】
参照による組み込み
本明細書で言及されている出版物、特許及び特許出願はすべて、各個々の出版物、特許または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み込まれるように指示されているのと同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】マイクロ流体システムを流れるゲルビーズ粒子の一連の写真画像である。
【図１Ｂ】マイクロ流体システムを流れるゲルビーズ粒子の一連の写真画像である。
【図１Ｃ】マイクロ流体システムを流れるゲルビーズ粒子の一連の写真画像である。
【図２】ゲルビーズ粒径に対する浸透圧を上げることの変形効果を示す図である。
【図３】混入比率に対するｐＨの経時的な影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の種々の実施形態が本明細書にて示され、記載されている一方で、そのような実施形態は例示のみの目的で提供されていることが当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく多数の変化、変更及び置換が当業者に想到されるであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する種々の代替が採用されてもよいことが理解されるべきである。
【００２４】
本開示は一般に、さらに広い生化学及び／または生物学の分析方法の一環として含む生化学反応における使用のための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載されている組成物及び方法は、時にはマイクロ流体の背景で対象とする反応に試薬を効率的に送達するために移動固相組成物を利用する。本明細書に記載されている方法及び組成物は、たとえば、核酸の分析及び配列決定の応用を含む高度に多重化された試料の分析のための高度に並列化した反応系を生成することにおいて用途を有することができる。
【００２５】
Ｉ．一般的な特性
生物学的、生化学的及び／または化学的な処理及び／または分析のための処理及び／または分析の反応で使用するための移動固相組成物が本明細書に記載される。場合によっては、マイクロ流体システムの中で試薬を運ぶ及び提示する及び／または送達するのに使用される移動固相システムが提供される。場合によっては、本明細書に記載されている組成物及びシステムは、マイクロ流体システムにおける試薬送達、ビヒクルまたは他の使用としてのそのような組成物の使用に利益をもたらす多数の様々なパラメータの１以上を満たすように構成される。
【００２６】
一般に、組成物の特性は、たとえば、マイクロ流体システムの中での流動特性、マイクロ流体システムでの使用に関連する及び反復する分析工程、試薬の負荷の操作のための組成物の機械的耐久性、組成物内での試薬の可用性及び信頼性、化学的な後処理及び安定性、反応条件との適合性、ならびに組成物の調節可能性のような態様に関係することができる。
【００２７】
本明細書に記載されている組成物は一般に、所望の適用に応じて本明細書に記載されているパラメータの１つ、数個またはほとんどを満たしてもよい。一般に、粒子組成物は、所望のパラメータを満たすために種々の異なる材料から製造されてもよい。たとえば、場合によっては、本明細書の粒子組成物を形成するマトリクスとして高分子材料が採用される。場合によっては、ポリマーメッシュ、絡み合ったポリマー等は、それらが試薬組成物との結合または会合のための広い表面積を提供するので使用される。特定の態様では、粒子組成物のための下層マトリクスとしてヒドロゲルポリマーが採用される。たとえば、線状ポリアクリルアミド、架橋線状ポリアクリルアミド等を含むポリアクリルアミドポリマーはビーズ組成物で使用されるポリマー材料として有用である。そのようなポリアクリルアミドの例には、たとえば、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣ）モノマーを組み込んで架橋基を提供する線状ポリアクリルアミドが挙げられる。他の場合では、たとえば、シリカ系粒子のような無機粒子材料が使用されてもよい。
【００２８】
本明細書に記載されている組成物の粒子、たとえば、ゲルビーズは、サイズの範囲内で本明細書に記載されているように使用することができる。ゲルビーズは、直径で１μｍ〜１ｍｍ、１０μｍ〜１００μｍ、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜８０μｍまたは４０μｍ〜６０μｍの間のサイズ設定できることが想定される。ビーズの例となる直径サイズには、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、５５μｍ、５７μｍ、６０μｍ、６４μｍ、７０μｍ、７２μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、５００μｍ、７５０μｍ及び１ｍｍが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ＩＩ．流動特性
マイクロ流体システムの中での移動固相成分の使用は、マイクロ流体の導管及び導管のネットワークの中でのそれら固相成分の流動特性に依存する。場合によっては、流れの信頼性、流速、粒子の間隔及び充填性すべてが、マイクロ流体の導管を通ってこれら固形の成分がどのように移動するのかに影響を与えることができる。一般に、粒子がマイクロ流体システムを通過している場合、マイクロ流体の状況の範囲内でさらに良好に操作するように粒子を構成するのではなく、採用される粒子の既存のパラメータの範囲内で操作するようにマイクロ流体の導管を適応させてもよい。その一方で、本開示は、マイクロ流体の状況にてさらに良好な性能を得るように提供され得る粒子組成物のパラメータに関する
【００３０】
Ａ．分散度
特定の適用では、これらの物質がマイクロ流体の導管及び導管のネットワークを通ってどのように移動するかの予測可能性、たとえば、これらのビーズがそのシステムを通って流れる速度、それらがその目的地に達する規則性、及び導管の目詰まり及び他の不具合のような不具合事象を回避する能力は、全体のシステムの性能に劇的に影響を与えることができる。たとえば、マイクロ流体システムで形成されている様々な液滴に個々のビーズまたは粒子を割り振るように望む（たとえば、その完全な開示が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２０１５／０００５１９９号を参照のこと）場合、所望の数のビーズを区画、たとえば、１つ及び１つのみに正確に送達する能力は、それらのビーズのマイクロ流体システムを通る流動特性によって決定づけられる。
【００３１】
種々の具体的な特性は本明細書に記載されている粒子の流動特性に影響を与えることができる。たとえば、分散度とも呼ばれる粒子組成物における粒径の不均質性は、異なるサイズの粒子は流動特性を有することができ、異なる潜在的欠陥モードを生じることができるので、マイクロ流体の導管を通る粒子懸濁液の流動特性に影響を与えることができる。本明細書に記載されている組成物によれば、粒子懸濁液は実質的に単分散の集団サイズを有することができ、それは本明細書で使用されるとき、粒子の少なくとも８０％が集団についての平均粒径の±１０％であることを意味する。場合によっては、懸濁液における粒子の少なくとも９０％が集団についての平均粒径の±１０％になるであろう。さらに他の場合では、懸濁液における粒子の少なくとも９５％が集団についての平均粒径の±１０％になり、さらに他の場合では、懸濁液における粒子の少なくとも９８％またはさらに９９％が集団についての平均粒径の±１０％になるであろう。本明細書で使用されるとき、粒径は一般に粒子の平均直径として測定することができる。
【００３２】
粒子の分散度の測定は一般に種々の既知の方法によって達成されてもよい。たとえば、高処理能力の測定については、たとえば、１０００個以上の粒子の測定、自動化顕微鏡（たとえば、Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ  Ｇ３システムを用いた）、動的画像解析（たとえば、流れ監視カメラシステムを用いた）、及び光散乱（たとえば、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ３０００システムを用いた）が使用されてもよい。場合によっては、分散度のレベルは％ＣＶとして述べられる平均値からの標準偏差という点で測定されてもよい。
【００３３】
場合によっては、所望の粒径を達成することは、厳重に制御された調製法と同様に調製後の選別及び分粒の技法、たとえば、濾過または篩の技法の１以上を介して達成することができる。しかしながら、特定の場合では、粒子の性質が粒子集団のための単純なサイズ排除に基づく分離法の使用を妨げてもよい。たとえば、高度に弾性または変形可能な粒子の場合、たとえば、本明細書にさらに詳細に記載されているように、篩または濾過の技法は、それらが目詰まりし易く絡まり易い可能性があるので、無効であってもよい。さらに、弾性粒子のせいで、変形し、さらに小さな開口部を通過する能力はさらに広いサイズ分布を生じる。その結果、場合によっては、粒子集団をサイズの分離／選択の代替方法に供してもよい。たとえば、第１の場合では、粒子の集団を粒径選択への浮遊濾過アプローチに供してもよい。そのような場合、粒子の溶液または懸濁液はチャンバーを介して適用される上昇流速と共に浮遊チャンバーにて提供され得る。さらに重く大きな粒子または凝集体の重力沈降が上昇流を克服し、これらの粒子が沈むようにまたは少なくともチャンバーの上部での溶出ポートに達することができないように流速を選択することができ、その場合、適正にサイズ設定された粒子を取り除くことができる。
【００３４】
代替ではあるが、関連するアプローチでは、ベクトルクロマトグラフィの方法及びシステムを用いてサイズ選択を行ってもよい。そのようなシステムでは、それを介して粒子の懸濁液が通過するさらに長い導管または管路を提供することができる。そのサイズ及び流れている細流を横切るその拡散を容易にするために、さらに小さな粒子は、流速が最大である流路の中央で大量の時間を費やすことができる。さらに大きな粒子はさらにゆっくり拡散する傾向があることがあり、その結果、流れのさらにゆっくり移動する部分で大量の時間を費やすことができる。十分に長い導管であれば、さらに小さな粒子はシステムから最初に浮上する傾向があり得る。
【００３５】
Ｂ．弾性
マイクロ流体システムを介する流動特性に関連する本開示の組成物の追加の特性はその弾性及び変形能である。場合によっては、粒子組成物がマイクロ流体導管（またはその一部）の断面の寸法の１以上に近づくまたはさらにそれを超える適用については、これらの組成物にとっての実質的に通過する能力は流体ネットワークを介したそれらの懸濁液の流れに制限なく直接影響を与える。その結果、本明細書に記載されている粒子組成物は相対的に弾性であり、及び／または変形可能であることができる。場合によっては、本明細書に記載されている粒子組成物は約５〜約１００ｋＰａの弾性係数を有するであろう。場合によっては、組成物は約５〜約５０ｋＰａの間の、または５０から約１００ｋＰａまでの弾性係数を含むであろう。さらに他の場合では、粒子組成物は、約５〜約１０ｋＰａ、約１０〜約２０ｋＰａ、約２０〜約３０ｋＰａ、約３０〜約４０ｋＰａ、約４０〜約５０ｋＰａ、約５０〜約６０ｋＰａ、約６０〜約７０ｋＰａ、約７０〜約８０ｋＰａ、約８０〜約９０ｋＰａ、約９０〜約１００ｋＰａの弾性係数を有するであろう。粒子組成物の弾性係数は、たとえば、浸透圧圧縮法、マイクロ機械変形法及び遠心分離圧縮法を含む種々の既知の方法を用いて特徴付けられてもよい
【００３６】
粒子組成物の弾性係数を制御することは、製造工程の制御及びまたは組成物の固相もしくは粒子成分の組成を介して達成することができる。たとえば、高分子粒子については、弾性係数は、粒子内でのポリマーの詰め込みのレベルを増やすことまたは減らすことによって、たとえば、ポリマーマトリクスの二次構造を制御すること、分子内及び分子間の静電相互作用を制御すること、または粒子に高い剛性を提供する架橋もしくは他の構造のレベルを制御することによって調整されてもよい。たとえば、線状のポリアクリルアミドポリマー粒子の場合、たとえば、ポリマーの架橋剤成分、たとえば、ビスアクリルアミドコポリマー及び架橋開始試薬、たとえば、ＴＥＭＥＤのレベルを増やすことまたは減らすことを介して粒子における架橋のレベルを増やしてもよいし、または減らしてもよい。
【００３７】
Ｃ．凝集／接着
前述に加えて、粒子組成物の別の重要なパラメータは、たとえば、組成物における他の粒子と同様にマイクロ流体導管の表面、壁、管または他の容器を含むシステム内の他の表面への接着を回避するその能力である。他の粒子への接着という点では、本明細書に記載されている組成物は、水溶液に懸濁する場合または、たとえば、限定しないで非水性キャリア流体における水性液滴内を含む水性環境にてマイクロ流体システムを介して移動する場合、組成物における粒子の１０％未満が２以上の粒子の凝集体の形態であることを意味する、非凝集性であることができる。場合によっては、粒子の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満またはさらに１％未満が凝集した粒子として存在するであろう。
【００３８】
場合によっては、さらに特定のツールを用いてビーズ／ビーズの相互作用力を測定することを望んでもよい。たとえば、場合によっては、上手く制御された流量調節器を用いて上手く制御された力を向けて相互作用力を決定する、凝集した粒子に適用される伸長流システムを用いてビーズ／ビーズの引力を測定してもよい。
【００３９】
粒子間相互作用、たとえば、接着及び相互作用を制御することは、たとえば、表面電荷、疎水性／親水性、表面上での反応性官能基の存在を制御することを含む多数の様々なアプローチを用いて行われてもよい。
【００４０】
Ｄ．他の表面との相互作用
粒子組成物はまた、それらが配置されるシステム、たとえば、マイクロ流体または他の管路、反応容器、壁、管等の表面に接着する傾向が低下していてもよい。粒子間凝集と同様に、上記で議論したように、特定の場合では、重要な粒子特性は、たとえば、表面接着を回避するために異なる表面へのその不活性に関係する。表面の絡まり、導管の目詰まり等を防ぐ能力はマイクロ流体システムにおける関心事である。同様に、反応物質及び／または生成物が相対的に低レベルで存在する反応系では、反応物質または生成物の容器表面への非特異的な吸着が、たとえば、反応物質または生成物を隠すことによってそれらの反応の解析結果を歪曲し得る。そのようなものとして、反応容器の表面に対して不活性であるように、場合によっては、積極的にはじくように粒子を構成することが望ましくてもよい。このことは、たとえば、反応容器の表面とは反対の正味電荷を有する粒子を選択することを含む多数の手段によって達成されてもよい。特定の場合では、粒子組成物は一般に親水性であり、且つ一般に非荷電であるように提供される。場合によっては、このことは、非荷電で親水性のポリマーから粒子組成物を作り出すことによって達成することができる。ポリマーの非限定例には、たとえば、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）、線状ポリアクリルアミドのようなポリアクリルアミドポリマー、セルロースポリマー、デキストラン等が挙げられる。
【００４１】
Ｅ．溶液粘度
粒子の集団内での個々の粒子の特性に加えて、本明細書に記載されている粒子組成物は特定の有用なパラメータを満たすバルク特性を有することができる。場合によっては、理解されるように、マイクロ流体システムを通って流れる個々の粒子の流動特性から離れて、粒子懸濁液の体積粘性率も本明細書に記載されている粒子懸濁液組成物の重要な流動特性であることができる。場合によっては、種々の異なる目的のいずれかを達成するために、粒子を含有する組成物の粘度は所望のパラメータの範囲内で制御されてもよい。たとえば、場合によっては、異なる流体間で一貫した流速を促進すると共にさらに一貫した流体の混合を可能にするために、粒子を含有する組成物はマイクロ流体システム内で組み合わせられる他の流体と類似する体積粘性率を有することが望ましい可能性がある。逆に、場合によっては、迅速な混合を防ぐために、異なる流速を提供するために等で、体積粘性率を制御して粒子を含有する組成物の実質的に異なる流体特性を提供してもよい。
【００４２】
一般に、粒子を含有する組成物のレオロジーまたは粘度は約０．５センチポイズ（ｃＰ）〜約５０００ｃＰの間であることができる。場合によっては、溶液粘度は０．５〜１００、０．５〜５０ｃＰ、１〜５０ｃＰ、及び場合によっては、１〜１０ｃＰであることができる。一方他の場合では、溶液粘度は高くてもよく、たとえば、１００〜１０００ｃＰ、１００〜５００ｃＰ等であってもよい。特定の場合、粘度は共通のマイクロ流体システム内で処理される他の流体のそれに類似するように目指すことができる。一般に、そのような流体には、分配流体、たとえば、フッ素化油及び界面活性剤と同様に水性流体、試薬等が挙げられる。一般に、これらの流体は約０．５ｃＰ〜約２０ｃｐの範囲での体積粘性率を有することができる。そのようなものとして、場合によっては、マイクロ流体システムにて堆積されると、約０．５ｃＰ〜約２０ｃＰの間、約１．０ｃＰ〜約１０．０ｃＰの間、またはさらに約１．０ｃＰ〜約５．０ｃＰの間の粘度を有する粒子含有組成物を提供することが望ましくてもよい。
【００４３】
一般に、粒子の弾性、粒子／粒子間活性、粒径分布、粒子濃度、温度を調整することを含む多数の異なるパラメータの１以上を調整することによって、または粘度改変剤の使用を介して粒子含有組成物のレオロジーを調整してもよい。
【００４４】
ＩＩＩ．機械的耐久性
移動する粒子相がマイクロ流体システムを通ってどのように移動するのかを理解することに加えて、本明細書に記載されている粒子システムにとって別の重要なパラメータは典型的な使用のもとでのその耐久性に関係する。場合によっては、それが、マイクロ流体システムを介して、または日常の操作、たとえば、ピペッティング、再懸濁液を遠心分離すること及び撹拌、凍結及び融解を介してこれらの粒子懸濁液を流す状況にあろうとなかろうと、本明細書に記載されている粒子組成物は、適当な刺激が適用されて所望の場合粒子を破壊しない限り、または破壊するまで実質的にインタクトのままであることができる。一般に、粒子組成物の耐久性は一般に機械的な操作工程に続いて得られる分散度のレベルによって測定される。たとえば、粒子組成物は、１回以上のピペッティング工程、マイクロ流体への注入／移動の工程、遠心分離工程、ボルテックスでの撹拌工程または他の機械的操作工程に続いてさえ、上述の分散度測定基準を保持することができる。
【００４５】
さらに、粒子組成物は、そのような特性を持つので一般に操作を円滑にすることができ、たとえば、適切な流動特性を可能にする一方で、遠心分離に基づく分離法も可能にする適当な密度を持つことができる。一般に、粒子組成物は、実質的な水性媒体にて水和した粒子について約１．００１〜１．２の間の密度を有してもよく、たとえば、１．００〜１．１０の密度を有する。
【００４６】
ＩＶ．試薬の負荷及び可用性
場合によっては、本明細書に記載されている粒子組成物は、マイクロ流体システム内での所望の位置への試薬ペイロードを正確に送達するための試薬送達ビヒクルとして使用されてもよい。理解されるように、これは、これらの粒子に試薬を負荷する能力及びいったん送達されるとそれらの試薬にアクセスする及び／またはそれを解放する能力に関する重要な粒子パラメータを暗示する。多数の適用について、本明細書で使用される粒子は試薬の負荷及びアッセイ系内の試薬へのアクセスの双方を円滑にする多孔性構造を含む。そのような多孔性粒子は、たとえば、多孔性の固形構造または半固形構造、高分子マトリクス様の構造（たとえば、絡み合ったポリマーマトリクス、架橋したポリマーメッシュ構造等）を含む種々の多孔性構造を含んでもよい。
【００４７】
Ａ．メッシュサイズ
理解されるように、多孔性粒子については、粒子に出入りする物質の能力がメッシュサイズ及び粒子の相対的な多孔性によってある程度支配されてもよい。場合によっては、大きな化合物または物質は、小さな孔の粒子よりも大きな孔の粒子に出たり入ったりして拡散し易く、粒子からのさらに迅速な分散または粒子への浸透可能にする。場合によっては、相対的に大きな高分子が粒子に効率的に出入りすることができることが望ましい可能性がある。
【００４８】
例として、場合によっては、粒子組成物にはその内部マトリクスに結合させた試薬が提供されてもよい。化学的な刺激剤を使用して粒子から試薬を解放させる場合、刺激剤の粒子の中への及び反応物質の粒子の外への効率的な拡散を可能にすることが望ましい可能性がある。
【００４９】
上記と比べると、他の態様では、さらに小さな分子が粒子に効率的に出入りするのを可能にする一方で、さらに大きな分子、たとえば、高分子様のオリゴヌクレオチド、タンパク質等の拡散を妨げるメッシュサイズを粒子に提供することが望ましくてもよい。
【００５０】
そのようなものとして、粒子は、１〜２０ｎｍ、場合によっては１〜１０ｎｍ、場合によっては１〜５ｎｍ、場合によっては、１〜４ｎｍ、場合によっては１〜３ｎｍ、場合によっては１〜２ｎｍのメッシュサイズまたは細孔径を有することが望ましい可能性がある。他の場合では、細孔径は５〜２０ｎｍ、５〜１０ｎｍ、またはさらに７〜１０ｎｍであってもよい。さらに小さな分子が孔から出入りして拡散するのを防ぐことが望ましい場合、１ｎｍより小さな細孔径、たとえば、０．０１〜１ｎｍの間が望ましくてもよい。細孔径の調整は、たとえば、ポリマーマトリクスに存在するポリマーの濃度を高めることによって、ポリマーマトリクスにおける架橋のレベルを調整することによって、及び／または高分子ポリマーでの浸透圧力を変化させてポリマーマトリクスの収縮を引き起こし細孔径を小さくすることによってを含む多数の方法によって達成されてもよい。
【００５１】
Ｂ．表面積
前に言及されたように、多数の適用については、本明細書に記載されている粒子組成物は試薬の送達システムとして有用であることができる。場合によっては、試薬送達の態様は送達される試薬を粒子に染み込ませることによって提供されてもよく、その際、そのような試薬は物理的障壁によって、またはその環境との溶媒の非相溶性によって保持され得る。しかしながら、場合によっては、試薬は、たとえば、共有結合または非共有結合の分子相互作用を介して、粒子を作り出すマトリクスに化学的に結合されるであろう。そのようなものとして、場合によっては、粒子組成物は十分に大きな表面積または十分な数の結合部位があって粒子当たり基準で所望の負荷能を達成する。
【００５２】
Ｄ．分子集密／密閉反応物質空間
多孔性粒子を用いることの別の利点は、周囲のキャリア流体に比べて粒子の領域の範囲内での局所濃度を高める能力を提供する。場合によっては、媒体全体におけるそれら反応物質の相対的な希釈にもかかわらず、その中に含有される反応物質間での密接な相互作用を強要する多孔性粒子を提供することが望ましいであろう。
【００５３】
Ｅ．刺激への応答、溶解可能性
前述のように、場合によっては、粒子は特定の刺激の適用の際にその試薬ペイロードを解放するように構成されてもよい。場合によっては、試薬解放に加えて、またはそれに代わって、たとえば、エントレインメントからの解放によるのであれ、または粒子マトリクスからの化学的解離によるのであれ、試薬の解放を円滑にするために、粒子は刺激の適用の際に溶解できるまたは分解できるように構成されてもよい。
【００５４】
場合によっては、本明細書に記載されている粒子組成物はその試薬ペイロードを解放するように及び／または所望の時間枠内で実質的に溶解するように構成されるであろう。場合によっては、粒子組成物は、適当な刺激、たとえば、任意で高温、たとえば、９５℃を含む、還元剤のような化学的な刺激剤に曝露されていることから所望の時間枠内で試薬の少なくとも９０％を解放するであろう。場合によっては、試薬ペイロードの少なくとも９５％が解放され、ペイロードの少なくとも９８％またはさらに少なくとも９９％が解放されるであろう。場合によっては、刺激剤への曝露から解放までの所望の時間枠は、２０分未満、１０分未満、５分未満、３分未満、２分未満、１分未満であろう。場合によっては、所望の時間枠は上述のとおりであろうが、１秒を超え、１０秒を超え、２０秒を超え、３０秒を超え、４０秒を超え、５０秒を超える。
【００５５】
オリゴヌクレオチドのゲルビーズへの連結は、ジスルフィド結合、エステル結合、シリルエーテルリンカー（たとえば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２０３６７５号を参照のこと）、生物学的リンカー、ＵＶ切断性リンカー等を含むが、これらに限定されない多数のアプローチを介することができる。
【００５６】
刺激剤を用いてゲルビーズからのオリゴヌクレオチドの解放を制御することができる。解放を制御するアプローチの１つはｐＨ条件を変えることである。別のアプローチは１以上の還元剤（たとえば、ジスルフィド結合を解放するための）の作用を介する。
【００５７】
Ｖ．化学的構成
多数の適用において、粒子組成物の重要な特性はそれらがその化学的環境とどのように相互作用するかに関係する。場合によっては、これらの組成物は多種多様な化学的条件、たとえば、極端なｐＨ、イオン強度、極性試薬等に曝露されてもよい。場合によっては、これらの組成物にとってその特性について相対的に静的なままであることが望ましくなる一方で、他の場合では、変化した環境が粒子の特性の変化を刺激し、たとえば、それに結合する試薬を解放することが望まれるであろう。
【００５８】
場合によっては、本明細書に記載されている組成物の多数の適用が粒子を多種多様な環境及び／または機械的条件に供し、これら粒子のその環境との適合性が重要な特性である。
【００５９】
Ａ．エマルションの化学的性質との適合性
本明細書に記載されている粒子組成物は対象とする反応のための試薬送達システムとして有用であることができるので、これらの粒子は当然、関連する反応条件と一般に適合性であり得ることになる。多数の適用について、そのような適合性は、根底にある反応に否定的な影響を与える方法では試薬と相互作用しない粒子組成物を含むことができる。場合によっては、適合性は、所与の反応系によって認容されるようなもの以外の過剰な電荷、疎水性、親水性、または極性を有さない粒子組成物の使用を介して達成することができる。場合によっては、粒子組成物は、実質的に中性のｐＨ環境、たとえば、およそｐＨ６〜およそｐＨ８の間で使用される場合、実質的に非イオン性のマトリクスを含んでもよい。場合によっては、上述のｐＨ範囲での場合、粒子組成物内での粒子のゼータ電位は±０〜５ｍＶになるであろう。
【００６０】
しかしながら、場合によっては、粒子組成物は相対的に曖昧な環境条件に供されるであろう。場合によっては、粒子組成物は、水性液滴に送達される試薬を非水性キャリア流体にて同時分配するのに使用されるであろう。場合によっては、液滴が形成されるキャリア流体としてフッ素化された油を使用することができる。そのような場合、水性相または水性液滴は、非水性キャリア流体にて液滴を安定化するように、すなわち、他の液滴との合体に対する感受性を減らすように作動する相対的に高濃度の極性化合物または界面活性剤を含有できることが多い。理解されるように、これらの大きな極性界面活性剤化合物は、それらを絡ませること、それらを他の物質にアクセスできないようにすること等によって粒子のような物質の表面に対して有意な負の効果を有することができる。
【００６１】
粒子組成物（たとえば、ゲルビーズ）は、少なくとも１つの区分が粒子を含むように液滴に分配されてもよい。このことは、区分の約１％、５％、１０％、２０％＞、３０％＞、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上について真実であってもよい。このことは、区分の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上について真実であってもよい。このことは、区分の約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満について真実であってもよい。
【００６２】
ビーズまたはゲルビーズのような粒子の最終的な希釈は１つの液滴当たり１つの粒子または液滴当たり所望の数の粒子の負荷を達成してもよい。場合によっては、ポアソン分布を用いて液滴当たりの粒子またはビーズの最終濃度を指図するまたは予測する。
【００６３】
本明細書に記載されている粒子組成物の利点はポアソン分布を達成するのに都合が良い粒子の変形能に関係する。具体的には、粒子の変形能の物理的特徴は、１以上の粒子を運ぶ液滴の形成に対するさらに良好な制御を可能にする。本明細書に記載されている粒子組成物における粒子の変形能に関する別の利点は液滴内で同時分配する改善された能力である。この利点は、実際は細胞性のまたは分子上の、細胞、細胞成分、または他の粒子との粒子の改善された同時分配を支えることが想定される。一実施形態では、単一粒子と単一細胞の改善された同時分配が提供される。
【００６４】
Ｂ．イオン強度及びｐＨ耐性
上記で議論した極性界面活性剤に関してと同様に、粒子組成物は場合によっては、多種多様なイオン強度及びｐＨを有する環境に供されてもよい。場合によっては、粒子組成物にとって根底にある構造、たとえば、非解離性で非溶解性の構造を保持するだけでなく、その容積を実質的に維持することも望ましくてもよい。そのような耐性は、上記で言及したように架橋のレベルを調整すること、ポリマーにおける電荷モノマーのレベルを調整すること等を含む多数の方法によって付与されてもよい。
【００６５】
Ｃ．刺激に対する応答性
上記に比べて、場合によっては、本明細書に記載されている粒子組成物を用いて、特定の化学的または物理的な刺激の適用の際、試薬ペイロードを解放し、効率的に且つ平等に生じるこの能力は重要な特性であることができる。たとえば、メッシュサイズ、表面積、単分散度を含む上述のパラメータの多数が粒子組成物の応答性に寄与する。例として、応答性特性には、化学的な接続の切断によって試薬を解放する能力、大きな分子を引き留める細孔ネットワークの拡大、または溶解する能力が挙げられてもよい。これらの種類の粒子組成物によれば、且つ場合によっては上記で言及されたように、粒子組成物は、適当な刺激の適用、たとえば、化学的刺激との接触または熱刺激もしくは機械的刺激への曝露の１０分以内での粒子からの試薬の完全なまたは実質的に完全な解放を達成することができる。実質的に完全な解放によって、粒子が記載されている時間枠の範囲内でその試薬最大容積の少なくとも約５０％、場合によっては少なくとも６０％、場合によっては少なくとも７０％、場合によっては少なくとも８０％を解放することができる一方で、さらに他の場合では、その試薬を運ぶ最大容積の少なくとも９０％またはさらに少なくとも９５％または９９％を解放することができることを意味する。場合によっては、実質的な解放は１秒〜１０分で生じる一方で、場合によっては、それには８分未満、６分未満、５分未満、４分未満、３分未満、それ以下かかってもよい。試薬の解放を測定することは一般に、所与の試薬の濃度を測定するのに有用な多数の方法のいずれかを用いて液量に分散された遊離のまたは未結合の試薬を検出することによって達成することができる。そのような方法には、結合した試薬から遊離の試薬を分離するための粒子成分の分離のための工程が含まれてもよい。これを、粒子についての試薬最大容積の既知の量もしくは理論的な量に対して比較してもよいし、または合計の試薬最大容積の代用として長時間の解放、たとえば、１、２、３、４、５、１２時間以上の解放とくらべてもよく、たとえば、１０分の解放を１２時間の解放と比べて試薬最大容積に対して解放された試薬の分配量を提供してもよい。
【００６６】
ＶＩ．組成物の調節可能性
前述から理解されるように、粒子組成物は、所望の反応目標を達成するために選択し、調整することができる、上述されている特性の１、２、３、４以上を含むことができることが多い。これらの組成物は一般に上述されている特性のすべてにて高度に調節可能であるという利益を共有する。
【００６７】
ＶＩＩ．粒子の変形能
粒子、たとえば、ゲルビーズの変形能はマイクロ流体システムにおいて有利である。たとえば、変形可能な粒子は、その変形能または弾性の性質のゆえに、たとえば、マイクロ流体システムの構造物、障害物、フィルターまたは他の物理的特徴のような特徴を通過することができる。変形可能な粒子にとって変形可能な粒子自体よりも狭い通路を有する領域、空間、フィルター、障害物または他の物理的特徴を通過することも可能である。
【００６８】
図１は、ゲルビーズの変形能を明らかにする低速度撮影の顕微鏡写真における変形可能な粒子であるゲルビーズを示している。図１Ａにおける白い矢印は、マイクロ流体システムのＴ字路におけるゲルビーズの流れの方向及び２つのゲルビーズを示している。図１Ｂでは、２つのビーズはさらに一緒に移動する。図１Ｃでは、２つのビーズはＴ字路を過ぎて進むにつれて明瞭に変形する。
【００６９】
ＶＩＩＩ．圧縮弾性率
粒子変形能の測定単位の１つが圧縮弾性率（Ｋ）である。有用な粒子（たとえば、ゲルビーズ）変形能はある範囲でのＫ値で得ることができることが想定される。たとえば、０．１ｋＰａから２００ｋＰａまで。さらに具体的には、１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲。他の有用な範囲には、１０ｋＰａ〜１００ｋＰａ、２５ｋＰａ〜１００ｋＰａ、２５ｋＰａ〜７５ｋＰａ、及び３０ｋＰａ〜６５ｋＰａを挙げることができる。
【００７０】
粒子の圧縮弾性率（Ｋ）は、デキストランに基づく浸透圧法を用いて異なるサイズ設定のゲルビーズについて測定した。
【００７１】
実験：３つのサイズ、５７．６μｍ、６４．８μｍ及び７２．１μｍのゲルビーズをそれぞれの圧縮弾性率（Ｋ）について調べた。ゲルビーズを様々な濃度のデキストラン（デキストランＭｒ＝７０，０００）に曝露した。デキストランの濃度比率の上昇はゲルビーズでの浸透圧（Ｐａ）の上昇を生じる。上昇する浸透圧の適用の経過にわたって、ゲルビーズを画像化し、サイズ区分した。図２は実験結果の図を示す。ｙ軸は、デキストラン処理したゲルビーズ容積の対数の測定されたゲルビーズの当初の容積に対する比として測定されたビーズのサイズを示す。ｘ軸はデキストラン濃度の関数として調べた浸透圧（Ｐａ）の範囲を示す。
【００７２】
結果は、調べた浸透圧（Ｐａ）範囲にわたって異なるビーズのサイズについて圧縮弾性率（Ｋ）にはほとんど変動がないことを示した。３つのゲルビーズのサイズのそれぞれについての圧縮弾性率（Ｋ）の値を以下の表１で示す。表１で提示されるように、ｋＰａとして測定されたＫはゲルビーズの直径の上昇に伴って幾分上昇する。しかしながら、ｋＰａ値間の小さな、しかし、測定できる程度の変動がゲルビーズのサイズに関連して観察された。
【表１】
2018518950.tif 000003
【００７３】
ＩＸ．剪断弾性率
変形能の別の測定単位は、ｋＰａとして測定可能である剪断弾性率（Ｇ）である。有用な粒子（たとえば、ゲルビーズ）変形能はある範囲でのＧ値で得ることができることが想定される。たとえば、０．１ｋＰａから２００ｋＰａまで。さらに具体的には、１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲。他の有用な範囲には、５ｋＰａ〜１００ｋＰａ、１０ｋＰａ〜１００ｋＰａ、２５ｋＰａ〜１００ｋＰａ、２５ｋＰａ〜７５ｋＰａ、及び３０ｋＰａ〜６５ｋＰａを挙げることができる。
【００７４】
Ｘ．メッシュ濾過ゲルビーズによるゲルビーズ混入物の除去
ゲルビーズは、油に保存すると（生成の後）または水性緩衝液で洗浄すると凝集することができる。大きな細片も周囲環境からゲルビーズ溶液に入ることができる。これらの集塊／細片はマイクロ流体チップ内でのマイクロ流体導管を塞ぐことができ、試料の損失をもたらす。しかしながら、メッシュまたはトラックを刻んだフィルターを用いてその製造の間にゲルビーズを濾過して＞４ゲルビーズの集塊を取り除くことができる。
【００７５】
メッシュフィルターを採用してゲルビーズの集塊及び細片を取り除いた。
【００７６】
実験：３０ｕｍのゲルビーズをメッシュ濾過した。ゲルビーズをナイロン織メッシュ（９０ｍｍの直径）に通し、３０ｕｍ、２０ｕｍ、１０ｕｍ及び５ｕｍのメッシュサイズにて調べた。機能化の前に３回及びその後で３回ゲルビーズを濾過した。各回の濾過の後、フィルターを取り換えた。使用したフィルターは、４５ｍＬのＤＮＡライゲーション緩衝液の入った５０ｍＬのスクリューキャップ付きのプラスチック管に入れた。メッシュに保持されたゲルビーズ／細片（たとえば、フィルター）を場合によっては３００ｕｍのＦｌｏＣａｍで調べた。無視できるほどのビーズの損失が観察された（＜５ｍＬ）。工程時間選択は以下のとおりだった。フィルター装置をすすぎ、設定する２０分。１回の濾過当たり５分（合計１５分）。ＦｌｏｗＣａｍを介して各濃縮液試料を流す１０分（任意で）。
【００７７】
２０ｕｍ及び１０ｕｍにてトラックを刻んだポリカーボネートを用いてゲルビーズの濾過を調べた。
【００７８】
３０ｕｍのゲルビーズについての結果は、一部の大きな混入物が取り除かれ、好まれるメッシュは２０ｕｍの孔（均一な細孔径）を有するナイロンメッシュフィルターであることを示した。濾過条件のない制御は約２００，０００のゲルビーズにて見いだされた多数の集塊を示した（＜５または≧６のゲルビーズの集塊に下位分類される）。２０ｕｍのナイロン織メッシュ、直径９０ｍｍを介した３回の濾過に続いて、集塊の数で有意な低下があった。
【００７９】
実験：５４ｕｍのゲルビーズをメッシュで濾過した。ゲルビーズを６０ｕｍ、４１ｕｍ、３０ｕｍ、及び１０ｕｍのメッシュサイズのナイロンメッシュに通した。２０ｕｍ及び１０ｕｍにてトラックを刻んだポリカーボネートを用いてゲルビーズの濾過を調べた。結果は、一部の大きな混入物が取り除かれ、好まれるメッシュは４１ｕｍの孔（均一な細孔径）を有するナイロンメッシュフィルターであることを示した。
【００８０】
濾過条件のない制御は約１００，０００のゲルビーズにて見いだされた多数の集塊を示した（＜５または≧６のゲルビーズの集塊に下位分類される）。４１ｕｍのナイロン織メッシュ、直径９０ｍｍを介した３回の濾過に続いて、集塊の数で有意な低下があった。
【００８１】
Ｙ．ゲルビーズの凝集の防止
本明細書に記載されている粒子組成物は、連結されたオリゴヌクレオチド、たとえば、コンビナトリアル法によって連結されるバーコードを含むことができる。一部のコンビナトリアル法では、ライゲーションのプロトコールを用いてビーズ上でバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド配列を集合させてもよい（たとえば、本明細書の他所に記載されているような分解性ビーズ）。たとえば、オリゴヌクレオチドを含有するバーコードが連結されるべきであるビーズの分離集団が提供されてもよい（参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０３７８３４９号を参照のこと）。ライゲーションのプロトコールに従って、ゲルビーズは、凝集する及び粘着性である傾向を有することが見いだされている。特定の理論に拘束されず考えられる可能性の１つは、ライゲーションのプロトコールにおける蛍光色素分子の包含がゲルビーズの凝集を引き起こすことである。別の可能性は、ライゲーションのプロトコールにおける還元剤の存在がゲルビーズに対して有害に影響し、観察された凝集及び粘着性を生じることである。ライゲーション反応では、ＤＴＴは４０μＭまでで存在する。
【００８２】
実験：還元剤への曝露の際に、ゲルビーズのサイズ及び凝集における変化を調べた。約２０μｍのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）還元剤にてゲルビーズを３０分間インキュベートし、ゲルビーズの凝集を生じた。低濃度のＴＣＥＰでインキュベートしたゲルビーズはサイズが上昇することが見いだされた。
【００８３】
別の試験では、エマルションへのゲルビーズの注入の調製における粘着性ゲルビーズの効果を調べた。ライゲーションのプロトコールに由来する粘着性のゲルビーズはエマルションへのゲルビーズの目詰まり及び不均一な注入を引き起こすことが見いだされた。４０μＭのＤＴＴの条件下でライゲーションのプロトコールを実行することは流体チップ上でのゲルビーズの不均一な注入及び凝集を引き起こすことも見いだされた。
【００８４】
観察されたゲルビーズの凝集及び粘着性はライゲーションのプロトコールのライゲーション緩衝液を変更することによって改善され得ることが発見された。還元剤を取り除き、還元剤を含まないまたは還元剤を実質的に含まないライゲーションのプロトコールを作り出すことによって、ゲルビーズは凝集せず、粘着性がなくなった（データは示さず）。このことは、たとえば、エマルションへのビーズ注入速度を測定することによって測定可能だった（データは示さず）。ライゲーションのプロトコールのライゲーション酵素の成分は、ライゲーションのプロトコールを実施して凝集及び粘着性の欠乏を達成するのに先立って酵素から排除することができるあるレベルの還元剤を含むことも発見された。要するに、結果は、ライゲーションのプロトコールが還元剤を伴わずに実施されると、ゲルビーズはさらに良好に安定化され、低下した凝集及び粘着性を示すことができることを示した。驚くべきことに、リガーゼ酵素からの還元剤の除去は、ゲルビーズの特性を改善するだけでなく、ゲルビーズを伴ったライゲーションのプロトコールにおける酵素の活性に対して有害効果も有さないことが発見された。
【００８５】
Ｚ．オリゴヌクレオチド／ゲルビーズの結合を保存するためのｐＨの最適化
標識したゲルビーズ、たとえば、オリゴヌクレオチドのタグを付けたまたはそれをバーコードにしたゲルビーズを調製し、保存することにおいて、解放のための刺激がなくても保存の間にオリゴヌクレオチドがゲルビーズから好ましくなく解放される混入効果が観察されている。この問題点に対する解決策としてｐＨの最適化を検討した。
【００８６】
実験：週の経過にわたって１２週まで、バーコードを付けたゲルビーズを種々のｐＨ条件での保存緩衝液で保存し、混入比率（解放されたオリゴヌクレオチド）を週ごとに測定した。結果は図３で説明されているが、ｐＨ７．４が１２週間にわたる保存期間で混入を減らすのに最適であることを示した。ｐＨ７．４で保存した場合、０．０２５％という少ない混入が検出された。ｐＨが上昇するにつれて混入比率が上昇した。最大の混入は調べた最高のｐＨであるｐＨ８．２で生じ、０．１１０％という多くの混入が検出された。混入の結果を表２にて要約する。
【表２】
2018518950.tif 000004
【００８７】
ＡＡ．フィルターとしてゲルビーズを使用すること
ゲルビーズはその物理的構造にある範囲のメッシュサイズを含むことができる。ゲルビーズで提供されるメッシュサイズは、それによって十分に小さなサイズの物体はゲルビーズの中に及びそれを通ってさえ拡散するまたは流れることができる一方で、さらに大きなサイズの物体はゲルビーズの中に拡散するまたは流れることができない流量リストリクターとして有用であることができる。実験的な論理的根拠は、さらに大きなメッシュサイズのゲルビーズはゲルビーズの中へのＦＩＴＣ−デキストランの拡散を生じるはずである一方で、さらに小さなメッシュサイズのゲルビーズではゲルビーズの中への拡散を可能にしないはずであることである。
【００８８】
実験：ＦＩＴＣ−デキストランを用いて２つの異なるメッシュサイズのゲルビーズで調べた。表３で示すようにＦＩＴＣ−デキストランの０．１％ｗ／ｗストック溶液を試験で使用した。
【表３−１】
2018518950.tif 000005
【表３−２】
2018518950.tif 000006
【００８９】
ストック溶液を０．０５５％ｗ／ｗの最終濃度まで希釈した。動的光散乱を用いて各分子量のＦＩＴＣ−デキストランについてストークス半径を測定した（データは示さず）。１０ｕＬの詰めたゲルビーズを９０ｕＬのＦＩＴＣ−デキストランに加え、暗所で一晩インキュベートした。ゲルビーズの明視野（位相差）及び蛍光（４８８ｎｍ）の画像を撮った。調べた６つのゲルビーズのロットについて、ゲルビーズのメッシュサイズはゲルビーズのロットすべてにわたって一貫しており、＜４．４ｎｍでのサイズ区分であることが測定された（データは示さず）。
【００９０】
前述の発明は明瞭さと理解を目的にかなり詳細に記載されている一方で、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態及び詳細にて種々の変更を行うことができることが本開示を読むことにより当業者に明らかであるだろう。たとえば、上述の技法及び装置はすべて種々の組み合わせで使用することができる。たとえば、粒子の送達は記載されているようにアレイウェルサイジング法によって実践することができる。本出願で引用されている出版物、特許、特許出願及び／または他の文書はすべて、各個々の出版物、特許、特許出願及び／または他の文書があらゆる目的で参照によって組み入れられるように個々に且つ別々に示されるのと同じ程度にあらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる。
【００９１】
本発明の好まれる実施形態が本明細書にて示され、記載されている一方で、そのような実施形態は例示のみの目的で提供されていることが当業者に明白であろう。本発明から逸脱することなく多数の多様性、変化及び置換が当業者に想到されるであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する種々の代替は本発明を実践することで採用されてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内での方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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