(57)【要約】  キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞集団を調製する改善された方法が記載されている。
2018537970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を作製する方法であって、組換えＴ細胞受容体をコードするベクターを有するＴ細胞の集団を提供するステップ、前記Ｔ細胞の集団を増殖させる条件下及び時間の間、増殖培地内で前記Ｔ細胞の集団を培養するステップを含み、前記増殖培地はＡｋｔ活性の阻害剤を含む、方法。
【請求項２】
前記Ａｋｔ阻害剤は、前記培養するステップの間に前記増殖培地に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔ１又はＡｋｔ２の活性又はその両方を少なくとも２５％低下させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ａｋｔ阻害剤は、１０００ｎＭ未満のＩＣ５０でＡｋｔ１及びＡｋｔ２を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（１，３−ジヒドロ−１−［１−［［４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル］メチル］−４−ピペリジニル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン）、Ａｋｔ阻害剤Ｘ（２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１０Ｈ−フェノキサジン−１０−ブタナミン，モノヒドロクロリド）、ＭＫ−２２０６（８−（４−（１−アミノシクロブチル）フェニル）−９−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン）、アプロセルチブ（Ｎ−（（Ｓ）−１−アミノ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）プロパン−２−イル）−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フラン−２−カルボキサミド）、イパタセルチブ（（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−１−（４−（（５Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−５−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−３−（イソプロピルアミノ）プロパン−１−オン）、ＡＺＤ５３６３（４−ピペリジンカルボキサミド，４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル））、ペリフォシン、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、トリシルビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ−６７４５６３、ＰＦ−０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、ミルテフォシン、ＰＨＴ−４２７、ホノキオール、トリシリビンホスファート、ＫＰ３７２−１Ａ（１０Ｈ−インデノ［２，１−ｅ］テトラゾロ［１，５−ｂ］［１，２，４］トリアジン−１０−オン）、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＮＬ−７１−１０１、７−アザインドール、３−アミノピロリジン、イパタセルチブ、Ａ−４４３６５４、ＡＴ１３１４８、アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３）、ＤＣ１２０、エデルフォシン（１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３）、イルモフォシン（ＢＭ４１．４４０）、エルシルホスホコリン（ＥｒＰＣ）、エルフォシン（ＥｒＰＣ３、エルシルホスホホモコリン）、インドール−３−カルビノール、３−クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、ＳＲ１３６６８（ジエチル６−メトキシ−５，７−ジヒドロインドロ［２，３−ｂ］カルバゾール−２，１０−ジカルボン酸）、ＯＳＵ−Ａ９、ＰＨ−３１６、ＰＩＴ−１、ＰＩＴ−２、ＤＭ−ＰＩＴ−１、Ｎ−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］−Ｎ´−（３−ブロモフェニル）−チオ尿素）、ＴＣＮ−Ｐ、ＡＰＩ−１、ＡＲＱ０９２、ＢＡＹ１１２５９７６、３−メチル−キサンチン、キノリン−４−カルボキサミド、２−［４−（シクロヘキサ−１，３−ジエン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］フェノール、３−オキソ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸、ラクトキノマイシン、フレノリシン  Ｂ、カラフンギン、メデルマイシン、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ビニルケトン、及び４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖培地は、ＩＬ−２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組換えＴ細胞受容体は、操作されたＴＣＲ又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の集団を提供するステップは、
患者からＴ細胞を得るか、又は患者に対して同種異系のＴ細胞を得ること、
得られた前記Ｔ細胞を処理して、セントラルメモリーＴ細胞が豊富な細胞の集団を単離すること、及び、
単離された前記細胞の集団の少なくとも一部に、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うこと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の集団を提供するステップは、
患者からＴ細胞を得るか、又は患者に対して同種異系のＴ細胞を得ること、
得られた前記Ｔ細胞を処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞が豊富な細胞の集団を単離すること、及び
単離された前記細胞の集団の少なくとも一部に、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うこと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えＴ細胞受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、該キメラ抗原受容体は、
標的結合ドメインと、
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメインと、
共刺激ドメインと、
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記キメラ抗原受容体は、
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメインと、
共刺激ドメインと、
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キメラ抗原受容体は、前記標的結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的結合ドメインはｓｃＦｖである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｃＦｖは、腫瘍細胞抗原に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組換えＴ細胞受容体をコードするベクターを有するＴ細胞の集団を提供するステップは、Ｔ細胞の集団を活性化するステップ、及び、活性化された前記Ｔ細胞に、組換えＴ細胞受容体をコードするベクターを用いて形質導入を行うステップを含み、前記活性化ステップ及び前記形質導入ステップは、Ａｋｔ阻害剤の存在下で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞又はその組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＴ細胞の集団。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＴ細胞集団を投与するステップを含む、患者における癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を作製する方法に関し、特に、組換えＴ細胞受容体をコードするベクターを有するＴ細胞の集団を提供するステップ、Ｔ細胞の集団を増殖させる条件下及び時間の間、増殖培地内でＴ細胞の集団を培養するステップを含み、増殖培地はＡｋｔ活性の阻害剤を含む、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
操作されたＴ細胞を利用する療法を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について調査されてきた。場合によっては、そのような療法において使用されるＴ細胞は、十分長い間ｉｎ  ｖｉｖｏで活性のままではない。従って、より長い期間、より強力な抗腫瘍機能を有する腫瘍特異的癌治療が当技術分野において必要とされる。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、抗原的に異なる腫瘍集団を特異的に認識するようにＣＡＲ  Ｔ細胞を操作することができるため、種々の癌を治療する安全且つ効果的な方法を提供し得る（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０５６８９４
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０：９５６３０４
【非特許文献２】Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：４７４
【非特許文献３】Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：９７２
【非特許文献４】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１２  １８：２１９９
【非特許文献５】Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１：６２９
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１２  ３５：６８９
【非特許文献７】Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
【非特許文献８】Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９６９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、より長い期間、より強力な抗腫瘍機能を有する腫瘍特異的癌治療が当技術分野において必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書において記載されているのは、種々のタイプのＴ細胞療法において使用するための改善されたＴ細胞集団を提供する方法である。当該方法は、例えばＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（ＣＡＳ  Ｎｏ．６１２８４７−０９−３）等のＡｋｔ阻害剤の存在下で、例えばＣＡＲ発現Ｔ細胞等のＴ細胞を培養すること及び／又は増殖させることを必要とする。Ａｋｔ阻害剤の存在下で培養する及び／又は増殖させることができるＴ細胞のタイプは：ＣＡＲ  Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（“ＴＩＬ”）、ＴＣＲが操作されたＴ細胞、又はＴ細胞クローンを含む。Ｔ細胞集団は：ＰＢＭＣ、単離されたセントラルメモリーＴ細胞、単離されたナイーブＴ細胞、単離されたステムメモリー（ｓｔｅｍ  ｍｅｍｏｒｙ）Ｔ細胞及びその組み合わせを含み得る。
【０００８】
以下に記載される研究は、ＣＡＲ  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖の間のＡｋｔ阻害剤の存在が、養子移入に続くＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を有意に改善することができるということを実証している。
【０００９】
Ａｋｔ阻害剤は：Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（１，３−ジヒドロ−１−［１−［［４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル］メチル］−４−ピペリジニル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン）、Ａｋｔ阻害剤Ｘ（２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１０Ｈ−フェノキサジン−１０−ブタナミン，モノヒドロクロリド）、ＭＫ−２２０６（８−（４−（１−アミノシクロブチル）フェニル）−９−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン）、アプロセルチブ（ｕｐｒｏｓｅｒｔｉｂ）（Ｎ−（（Ｓ）−１−アミノ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）プロパン−２−イル）−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フラン−２−カルボキサミド）、イパタセルチブ（（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−１−（４−（（５Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−５−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−３−（イソプロピルアミノ）プロパン−１−オン）、ＡＺＤ５３６３（４−ピペリジンカルボキサミド，４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル））、ペリフォシン、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、トリシルビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ−６７４５６３、ＰＦ−０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、ミルテフォシン、ＰＨＴ−４２７、ホノキオール、トリシリビンホスファート、及びＫＰ３７２−１Ａ（１０Ｈ−インデノ［２，１−ｅ］テトラゾロ［１，５−ｂ］［１，２，４］トリアジン−１０−オン）、Ａｋｔ阻害剤ＩＸ（ＣＡＳ９８５１０−８０−６）を含む群から選択されるＡｋｔ阻害剤を含む。
【００１０】
さらなるＡｋｔ阻害剤は：例えばイソキノリン−５−スルホンアミド（例えばＨ−８、Ｈ−８９、ＮＬ−７１−１０１）、アゼパン誘導体（例えば（−）−バラノール誘導体）、アミノフラザン（例えばＧＳＫ６９０６９３）、複素環（例えば７−アザインドール、６−フェニルプリン誘導体、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体、ＣＣＴ１２８９３０，３−アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、ＡＺＤ５３６３、Ａ−６７４５６３、Ａ−４４３６５４）、フェニルピラゾール誘導体（例えばＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８）、チオフェンカルボキサミド誘導体（例えばアフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３）、２−ピリミジル−５−アミドチオフェン誘導体（ＤＣ１２０）、アプロセルチブ（ＧＳＫ２１４１７９５））等のＡＴＰ競合的阻害剤；例えば２，３−ジフェニルキノキサリン類似体（例えば２，３−ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン誘導体（ＭＫ−２２０６））、アルキルリン脂質（例えばエデルフォシン（１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３）、イルモフォシン（ＢＭ４１．４４０）、ミルテフォシン（ヘキサデシルホスホコリン、ＨｅＰＣ）、ペリフォシン（Ｄ−２１２６６）、エルシルホスホコリン（ＥｒＰＣ）、エルフォシン（ＥｒＰＣ３、エルシルホスホホモコリン）、インドール−３−カルビノール類似体（例えばインドール−３−カルビノール、３−クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、ジエチル６−メトキシ−５，７−ジヒドロインドロ［２，３−ｂ］カルバゾール−２，１０−ジカルボン酸（ＳＲ１３６６８）、ＯＳＵ−Ａ９）、スルホンアミド誘導体（例えばＰＨ−３１６、ＰＨＴ−４２７）、チオ尿素誘導体（例えばＰＩＴ−１、ＰＩＴ−２、ＤＭ−ＰＩＴ−１、Ｎ−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］−Ｎ´−（３−ブロモフェニル）−チオ尿素）、プリン誘導体（例えばトリシリビン（ＴＣＮ、ＮＳＣ  １５４０２０）、トリシリビンモノホスファート活性類似体（ＴＣＮ−Ｐ）、４−アミノ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体、ＡＰＩ−１、３−フェニル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン誘導体、ＡＲＱ０９２）、ＢＡＹ  １１２５９７６、３−メチル−キサンチン、キノリン−４−カルボキサミド、２−［４−（シクロヘキサ−１，３−ジエン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］フェノール、３−オキソ−チルカル酸、３α−及び３β−アセトキシ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸等のアロステリック阻害剤；及び、例えば天然物、抗生物質、ラクトキノマイシン、フレノリシン  Ｂ、カラフンギン、メデルマイシン、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ビニルケトン、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）、１，６−ナフチリジノン誘導体、及びイミダゾ−１，２−ピリジン誘導体、及び
【００１１】
【化１】
2018537970.tif 000003
（Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ）
等の不可逆的阻害剤；を含む。
【００１２】
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の代謝及び分化の調節において重要な役割を果たす。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路は、Ｔ細胞受容体のシグナル伝達、共刺激分子及びサイトカイン受容体に応答して活性化される。これは、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）複合体−１の活性化、及びフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（Ｆｏｘｏ１）の細胞質の隔離をもたらす。常時活性型のＡｋｔであるキナーゼは、最終分化を誘導するようである。３つの関連する形態のヒトＡｋｔ：Ａｋｔ１（ヒトＲＡＣ−アルファセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）参照：ＮＰ＿００１０１４４３１）、Ａｋｔ２（ヒトＲＡＣ−ベータセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼアイソフォーム２；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）参照：ＮＰ＿００１２２９９５６）及びＡｋｔ３（ＲＡＣ−ガンマセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼアイソフォーム２；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）参照：ＮＰ＿００１１９３６５８）がある。３つの形態は、プロテインキナーゼＢアイソフォームＰＫＢα、β、γとしても知られている。有用なＡｋｔ阻害剤は、３つの形態のうち少なくとも１つを、好ましくは１０００ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害する。場合によっては、阻害剤は、例えばＡｋｔ１及びＡｋｔ２等、２つ以上の形態をそれぞれ１０００ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害する。
【００１３】
本明細書において記載するように処理することができるＴ細胞集団は、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする発現ベクター（例えばウイルス発現ベクター）を有する。細胞外ドメインは、例えばＣＤ１９又はＨＥＲ２などの標的と結合するリガンド、及び任意的に、例えばヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーで構成されている。膜貫通部分は、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３膜貫通ドメイン又は４ＩＢＢ膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）由来のシグナル伝達ドメイン及び１つ又は複数の共刺激ドメイン、例えば４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。細胞外ドメインは、ＣＡＲが、Ｔ細胞の表面に発現される場合に、標的を発現する細胞にＴ細胞活性を向けることを可能にする。細胞内領域にＣＤ３ζと直列に４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン等の共刺激ドメインを含めることは、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受け取ることを可能にする。例えば患者特異的自己Ｔ細胞等のＴ細胞は、本明細書において記載されるＣＡＲを発現するように操作することができ、操作された細胞を増殖させ且つＡＣＴにおいて使用することができる。様々なＴ細胞サブセットを使用することができる。加えて、ＣＡＲは、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞において発現させることができる。患者が本明細書において記載されるＣＡＲを発現するＴ細胞集団で治療される場合、その細胞は自己Ｔ細胞又は同種異系Ｔ細胞であり得る。場合によっては、使用される細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）であり、そのような細胞の使用は、他のタイプの患者特異的Ｔ細胞の使用と比較して、養子移植後の細胞の長期間持続を改善することができる。
【００１４】
共刺激ドメインは、例えば：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択することができる。特定の実施形態では、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体が存在する。
【００１５】
ＣＡＲは：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ヒトＩＬ−１３又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＩＬ−１３又はその変異体と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、スペーサー領域は、配列番号４、１４〜２０、５０及び５２を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む）；を含むことができ、スペーサーはＩｇＧヒンジ領域を含み；スペーサー領域は１０〜１５０のアミノ酸を含み；４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは配列番号７のアミノ酸配列を含み；及び、３から１５のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する。２つの共刺激ドメインがある特定の実施形態では、一方は４−ＩＢＢ共刺激ドメインであり、他方はＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ａｋｔ阻害剤はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を損なわなかったことを示す図である。全細胞数が、増殖の日数の関数としてプロットされている。ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスを用いて形質導入を行った。形質導入したＴ細胞を、ＩＬ−２  ５０Ｕ／ｍＬ及びＡｋｔ阻害剤（１μＭ／ｍＬ）（Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ、ＣＡＳ  ６１２８４７−０９−３、Ａｋｔ１／Ａｋｔ２の細胞透過性、可逆的＆選択的な阻害剤（Ａｋｔ１＆Ａｋｔ２に対してそれぞれＩＣ５０＝５８ｎＭ及び２１０ｎＭ）；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で維持した。Ａｋｔ阻害剤を含まない培養物を対照として使用した。生存細胞の総数を１日おきに測定した。
【図２】Ａｋｔ阻害剤は、ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能を阻害しなかったことを示す図である。ＣＤ８＋ＣＤ１９ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、２１日間Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの存在下又は非存在下で増殖させた。１０７ａ脱顆粒アッセイを、ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ１９＋ＬＣＬ細胞との一晩の同時培養後に実施した。ＯＫＴ３発現ＬＣＬを陽性対照として使用し、ＣＤ１９ネガティブＡＭＬ細胞ＫＧ１ａを陰性対照として使用した。
【図３】Ａｋｔ阻害剤で処理したＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞に対するより高いＣＤ６２Ｌ発現を示した図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスを用いて形質導入を行った。形質導入したＴ細胞を、ＩＬ−２  ５０Ｕ／ｍＬ及びＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（１μＭ／ｍＬ）（Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）の存在下で維持した。Ａｋｔ阻害剤無しの培養物を対照として使用した。ＣＡＲ発現を、ＥＧＦＲｔに対してＥｒｂｉｔｕｘで検出した。％ＣＡＲ＋ＣＤ６２Ｌ＋ダブルポジティブ細胞が示されている。
【図４】Ａｋｔ阻害剤で処理したＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞がセントラルメモリー特徴を示したことを示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスを用いて形質導入を行った。形質導入したＴ細胞を、ＩＬ２  ５０Ｕ／ｍＬ及びＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（１μＭ／ｍＬ）Ａｋｔの存在下で維持した。Ａｋｔ阻害剤無しの培養物を対照として使用した。ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌの発現が、ゲートで囲まれた（ｇａｔｅｄ）ＣＡＲ陽性集団に示されている。
【図５】Ｅｘ  ｖｉｖｏでのＡｋｔ阻害（Ａｋｔｉ）が、養子療法のための強力なＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成することを示した図である。ホタルルシフェラーゼを発現するように操作されたＣＤ１９＋急性リンパ性白血病細胞（０．５×１０６；ＳｕｐＢ１５）をＮＳＧマウスに静脈内接種した。腫瘍移植の５日後、Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた２×１０６ＣＤ１９再指向（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ）を、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。Ｔ細胞を受けなかったマウス、非形質導入Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）を受けたマウス、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の間にＡｋｔ阻害剤で処理しなかったＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスを、対照として使用した。ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の腫瘍シグナルを、バイオフォトニックイメージングによってモニターした。
【図６Ａ】Ａｋｔ阻害が、異なるＴ細胞サブセットからのメモリーＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成を促進することを示した図である。バルクＴ細胞（ＰＢＭＣ）、精製されたセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、及び精製されたナイーブ／メモリーＴ細胞（ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞及びステムメモリーＴ細胞（ＴＮ、ＴＣＭ及びＴＳＣＭ））に、第２世代のＣＤ１９  ＣＡＲベクターをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、１７〜２１日間、１μＭのＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの存在下及び非存在下で、５０Ｕ／ＬのｒｈＩＬ２を含有する培地において増殖させた。結果として生じるＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ビオチン化Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）で染色し、ＣＡＲ検出のためのストレプトアビジン−ＰＥ及びＣＤ６２Ｌに対する抗体を後に伴った。ＣＡＲ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞の割合は、アイソタイプ染色された細胞のゲーティングに基づき描かれている。
【図６Ｂ】Ａｋｔ阻害が、異なるＴ細胞サブセットからのメモリーＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成を促進することを示した図である。２つの異なるドナー由来のＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の６つの細胞株からのＣＡＲ＋ＣＤ８＋に対するゲーティング後のＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２８＋Ｔ細胞の割合が示されている。どちらのドナーに対しても、ＰＢＭＣ、ＴＣＭ、及びＴＮ／ＴＣＭ／ＴＳＣＭの細胞集団を調製し、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、次に、Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの非存在下又は存在下で増殖させた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＣＡＲ又はいくつか他のＴ細胞受容体を発現し、改善された抗腫瘍活性を有するＴ細胞の集団を調製する方法が記載される。当該方法は、例えば、Ｔ細胞受容体発現Ｔ細胞集団の培養及び増殖の間に、細胞をＡｋｔ阻害剤と接触させることを必要とする。
【００１８】
キメラ抗原（ＣＡＲ）は、最低でも細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。従って、「抗原」という用語は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子に限定される。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含み得る。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単に細胞外認識ドメインが含有する認識要素とも呼ばれる）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、任意的に、１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣの制限とは無関係に、抗原に結合することも、Ｔ細胞活性化を伝達することもできる。従って、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型に無関係に、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療することができる「普遍的な」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を使用した養子免疫療法は、癌の治療のための強力な治療戦略となり得る。
【００１９】
ＣＡＲをコードする配列は、当技術分野において既知のいかなる手段によっても作製することができるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を使用して作製される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、簡便な当技術分野において既知の標準的な分子クローニングの技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援によるライゲーション、部位特異的変異誘発等）によって完全なコード配列に調製及び構築することができる。結果として生じるコード領域は、好ましくは、発現ベクター内に挿入され、適した発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
【００２０】
選択されていないＰＢＭＣ又は濃縮されたＣＤ３のＴ細胞、又は濃縮されたＣＤ３若しくはメモリーＴ細胞のサブセットを含む、患者から単離された種々のＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現、又は、いくつか他のＴ細胞受容体の発現のためのベクターを用いて形質導入し、さらに、本明細書において記載される方法によって培養することができる。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞のサブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することによって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞が豊富な細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化させ、例えばＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて形質導入することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出に対してもあり得るｅｘ  ｖｉｖｏでの選択に対しても非免疫原性の表面マーカーであるトランケート型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）並びにＣＡＲ（例えばＣＤ１９又はＨＥＲ２特異的ＣＡＲ）の発現を導く。活性化／遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができ、次に、凍結保存することができる。
【実施例１】
【００２１】
ＣＤ１９ＣＡＲの構築及び構造
有用なＣＤ１９特異的ＣＡＲの構造が以下に記載される。構築物であるＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）ＣＤ２８Ｔ２ＡＥＧＦＲｔｅｐＨＩＶ７が、特許文献１において詳細に記載されている。ＣＡＲ配列は、ＣＤ１９を標的とする配列、Ｆｃ受容体媒介認識モデルを大いに減少させる２つの突然変異（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）を含有するＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、共刺激ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達を含む。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列が、このＣＤ１９（ＥＱ）２８ζＣＡＲ配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出／選択マーカーであるＥＧＦＲｔから分離する。このＴ２Ａ連鎖は、単一の転写物からのＣＤ１９（ＥＱ）２８ζ及びＥＧＦＲｔ両方の同調的な発現をもたらす。
【００２２】
ＣＤ１９（ＥＱ）２８Ｚ配列を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファリーダーペプチドの、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ修飾ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ（二重変異がＦｃＲ認識を妨害する場所）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン配列との融合によって生成した。この配列を、コドン最適化の後に新規に合成した。Ｔ２Ａ配列を、Ｔ２Ａ含有プラスミドの消化から得た。ＥＧＦＲｔ配列を、ＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通成分（すなわち、塩基対１〜９７２）までのリーダーペプチド配列に及ぶものから得た。全ての３つの断片、１）ＣＤ１９（ＥＱ）２８Ｚ、２）Ｔ２Ａ、及び３）ＥＧＦＲｔを、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。
【実施例２】
【００２３】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲの発現に使用されるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ＣＡＲの発現に使用されるベクターであるｅｐＨＩＶ７を、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦ１プロモーターを使用してＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５´配列も３´配列も、ＨＸＢｃ２プロウイルスから以前に得たｐｖ６５３ＲＳＮから得た。ポリプリン区域ＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）を、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ由来のＨＩＶ−１株ｐＮＬ４−３から得た。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載されている。
【００２４】
手短に言えば、介在性ＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を有するｇａｇ−ｐｏｌ＋５´及び３´の末端反復配列（ＬＴＲｓ）由来の６５３ｂｐを含有するｐｖ６５３ＲＳＮを、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。ステップ１では、５´ＬＴＲからＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）の配列が、ｐ５´ＨＩＶ−１  ５１を作製し、次に、５´ＬＴＲを、ＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変し、第一にＣＭＶエンハンサーに連結させ、次に、複製のＳＶ４０開始点に連結させた（ｐ５´ＨＩＶ−２）。ステップ２では、３´ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３´ＨＩＶ−１を作製した後、３´ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行って、ＨＩＶ  Ｕ３におけるシス制御要素を除去し、ｐ３´ＨＩＶ−２を形成した。ステップ３では、ｐ５´ＨＩＶ−３及びｐ３´ＨＩＶ−２から単離したフラグメントを連結させて、ｐＨＩＶ−３を作製した。ステップ４では、ｐ３´ＨＩＶ−３を生成するために余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによりｐ３´ＨＩＶ−２をさらに改変し、ＷＰＲＥを含有する６００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐ３´ＨＩＶ−３に添加して、ｐ３´ＨＩＶ−４を作製した。ステップ５では、ｐＨＩＶ−３  ＲＲＥのサイズをＰＣＲによって減らし、ｐＨＩＶ−３由来の５´フラグメント（図示せず）及びｐ３´ＨＩＶ−４に連結させて、ｐＨＩＶ−６を作製した。ステップ６では、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＮＬ４−３から増幅させ、ｐＨＩＶ６におけるＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置してｐＨＩＶ−７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７−ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を使用して、４−プラスミド系を使用して親ベクターをパッケージングした。
【００２５】
パッケージングシグナルｐｓｉ（ψ）は、ベクター内へのウイルスゲノムの効率的なパッケージングに要求される。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の運搬及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入の効率を高めると実証されてきた。
【００２６】
ウイルスベクターの作製に要求されるヘルパー機能は、３つの別々のプラスミドに分けられ、組換えを介した複製可能なレンチウイルスの生成の可能性を減少させる：ｌ）ｐＣｇｐは、ウイルスベクター構築に要求されるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの運搬に寄与するＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする；及び、３）ｐＣＭＶ−Ｇは、ウイルスベクターの感染力に要求される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。
【００２７】
ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域には約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域が含まれ、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列内；３種全てのヘルパープラスミドのＣＭＶプロモーター配列内；及び、ヘルパープラスミドｐＣｇｐのＲＲＥ配列内；に位置する。これらの領域における相同性のために複製可能な組換えウイルスを生成することができる見込みは、多数の組換え事象を要求するため、極めて低い。加えて、いかなる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製に要求されるｔａｔ配列及び機能的ＬＴＲを欠いているであろう。
【００２８】
ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α−ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）に置き換え、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを使用してｅｐＨＩＶ７内に導入した。
【００２９】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、且つ、標的細胞の増殖性感染に要求されるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれてきた。加えて、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）ＣＤ２８Ｔ２ＡＥＧＦＲｔｅｐＨＩＶ７ベクター構築物は、インタクトな３´ＬＴＲプロモーターを含有しないため、結果として生じる標的とされた細胞における発現され且つ逆転写されたＤＮＡプロウイルスゲノムは、不活性ＬＴＲを有することになる。この設計の結果として、ＨＩＶ−Ｉ由来配列はプロウイルスから転写されることはなく、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されることになる。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図していない活性化の可能性を有意に減らすと予想される。
【実施例３】
【００３０】
患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターの作製
Ｔ細胞集団の形質導入のためのベクターは、以下のように調製することができる。各プラスミド（ＣＤ（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＣｇｐ；ｐＣＭＶ−Ｇ；及びｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２）に対して、種子バンクが生成され、種子バンクは、発酵槽を播種して十分な量のプラスミドＤＮＡを生じるために使用される。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの作製におけるその使用に先立ち、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
【００３１】
手短に言えば、細胞は、無菌性及びウイルス汚染の欠如を確認するために試験された２９３Ｔワーキングセル（ＷＣＢ）から増殖させられる。２９３Ｔ  ＷＣＢ由来の２９３Ｔ細胞のバイアルが解凍させられる。十分な数の細胞が存在して、ベクター作製及び細胞トレイン維持のために適切な数の１０層のセルファクトリー（ＣＦｓ）を蒔くまで、細胞を成長させ、増殖させた。単一の細胞トレインを、作製のために使用することができる。
【００３２】
レンチウイルスベクターは、１０ＣＦまでのサブバッチで作製される。２つのサブバッチを同じ週に作製することができ、１週あたり約２０Ｌのレンチウイルス上清を作製することができる。全てのサブバッチから作製された材料は、製品のロットを作製するために、下流の処理段階の間にプールされる。２９３Ｔ細胞は、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）内のＣＦ中に蒔かれる。ファクトリーは、３７℃のインキュベーター内に置かれ、ＣＦの層全てに細胞を均一に分布させるため水平にされる。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｌ２、２Ｘ  ＨＢＳ及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＯ４法を使用して、細胞に上記の４つのレンチウイルスプラスミドが遺伝子導入される。遺伝子導入の３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清が回収、精製及び濃縮される。上清がＣＦから除去された後、エンド・オブ・プロダクション細胞が各ＣＦから回収される。細胞は、各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離によって回収される。細胞は、凍結培地に再懸濁され、凍結保存される。これらの細胞は、後に、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）の試験に使用される。
【００３３】
ベクターを精製し且つ製剤化するために、未精製の上清が、膜ろ過法によって浄化されて細胞片が除去される。宿主細胞のＤＮＡ及び残存プラスミドのＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによる消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））によって分解される。ウイルス上清は、０．４５μｍのフィルターを使用して細胞片が除去され浄化される。浄化された上清は、予め重さが量られた容器内に回収され、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）が添加される（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残存プラスミドのＤＮＡ及び宿主ゲノムのＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼによる消化が、３７℃で６時間行われる。エンドヌクレアーゼ処理された上清の最初のタンジェンシャルフローウルトラフィルトレーション（ＴＦＦ）濃縮が、ウイルスを２０倍まで濃縮しながら、未精製の上清から残存の低分子量成分を除去するために使用される。浄化されたエンドヌクレアーゼ処理されたウイルス上清は、流動速度を最大にしながら、剪断速度を４，０００秒−１以下に維持するように設計された流速で５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有するホローファイバーカートリッジを循環させられる。ヌクレアーゼで処理された上清のダイアフィルトレーションが、カートリッジの性能を持続させるために濃縮プロセスの間に開始される。８０％の透過置換速度（ｐｅｒｍｅａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｒａｔｅ）が、ダイアフィルトレーションバッファーとしてＰＢＳ中４％ラクトースを使用して確立される。ウイルス上清は、未精製の上清の２０倍の濃度を表す目標量までもたらされ、さらに、ダイアフィルトレーションは、１００％の透過置換速度で、４つの追加の交換量に対して続けられる。
【００３４】
ウイルス産物のさらなる濃縮を、高速遠心分離技術を使用することによって達成した。レンチウイルスの各サブバッチは、６℃で１６〜２０時間、６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）でＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６ｐｌｕｓ遠心機を使用してペレット状にされる。次に、各サブバッチからのウイルスペレットは、ＰＢＳ中４％ラクトースを有する５０ｍＬの量で再構成される。このバッファー中の再構成されたペレットは、ウイルス調製に対する最終製剤を表す。ベクター濃縮プロセス全体によって、約２００分の１まで体積が減少する。サブバッチ全ての完了に続いて、材料が−８０℃に置かれ、各サブバッチからの試料は、無菌性について試験される。試料の無菌性の確認に続いて、サブバッチは、頻繁に攪拌されながら３７℃で急速に解凍される。次に、この材料はプールされ、ウイルスベクタースイートのクラスＩＩタイプＡ／Ｂ３バイオセイフティーキャビネットに手動で分注される。無菌のＵＳＰクラス６、雄ネジが切られた０リングクライオバイアルにおいて１ｍＬの濃縮されたレンチウイルスの充填構成が使用される。
【００３５】
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残存宿主のＤＮＡ混入物及び残存宿主及びプラスミドのＤＮＡの導入が試験される。いくつかある試験の中で特に、正しいベクターが存在していることを確実にするために、ベクター同一性がＲＴ−ＰＣＲによって評価される。
【実施例４】
【００３６】
ＡＣＴにおける使用に適したＡｋｔ阻害剤増殖Ｔ細胞
Ｔリンパ球を、白血球フェレーシスによって健康な対象から得て、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で磁気的に単離した。単離の日に、２４ウェルプレート内の４×１０６のＣＤ８＋細胞を、３：１（ビーズ：細胞）の比でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化し、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）及びＡｋｔ阻害剤（Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ）（１ｕＭ／ｍＬ）の存在下で、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１０％熱失活ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔ細胞培地）中ＭＯＩ１．５で、上記のＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。３２℃±３℃の５６７×ｇでの３０分間のスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）の後、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日の５０Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２の最終濃度のサイトカイン補給及びＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（１ｕＭ／ｍＬ）と共に、０．５×１０６から１×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度を保つために要求される培地を添加しながら培養物を維持した。上記のように、レンチウイルスベクターは、選択及び切除目的でトランケート型ヒト上皮増殖因子受容体（ｈｕＥＧＦＲｔ）も発現した。
【００３７】
Ａｋｔ阻害剤処理のない形質導入したＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を対照として使用した。活性化／形質導入後８日目に、ビーズを、磁石を用いて培養物から除去し、操作されたＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイの前に２１日間、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０％熱失活ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補ったＲＰＭＩ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。
【００３８】
増殖の評価は、Ａｋｔ阻害剤の存在がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖及び生存を損なわないことを明らかにした。図１において示されているように、Ａｋｔ阻害剤の存在下又は非存在下での培養後、同等のＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を観察した。エフェクター機能のＡｋｔ阻害剤の潜在的影響を検査するために、操作されたＣＤ８＋ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２１日間Ａｋｔ阻害剤の存在下又は非存在下で増殖させた。ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ１９＋ＬＣＬ細胞との一晩の共培養の後、１０７ａ脱顆粒アッセイを行った。ＯＫＴ３発現ＬＣＬを陽性対照として使用し、ＣＤ１９陰性ＡＭＬ細胞ＫＧ１ａを陰性対照として使用した。この研究の結果は図２において示されており、Ａｋｔ阻害剤で処理された細胞及び未処理の細胞が、ＣＤ１９抗原刺激後に同レベルのインターフェロンガンマ産生及びＣＤ１０７ａ発現を示すことが分かる。このように、Ａｋｔ阻害剤は、ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能を弱めるように見えなかった。
【００３９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞でのＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８の発現等のメモリー様表現型は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより良好な抗腫瘍活性に関連していることが多くある。従って、本発明者等は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖の後でＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を特徴付けた。手短に言えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスを用いて形質導入した。形質導入したＴ細胞を、ＩＬ２  ５０Ｕ／ｍＬ及びＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの存在下で維持した。Ａｋｔ阻害剤無しでの培養物を対照として使用した。ＣＡＲ発現を、ＥＧＦＲｔに対してＥｒｂｉｔｕｘを用いて検出した。この研究の結果は、図３において示されている（％ＣＡＲ＋ＣＤ６２Ｌ＋ダブルポジティブ細胞が描かれている）。本発明者等は、Ａｋｔにより阻害されたＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞のうち４０％がＣＤ６２Ｌを発現し、ＣＤ２８を同時発現したことを見出した（図３及び図４）一方、ＫＲＬＧ等の消耗マーカーは、Ａｋｔ阻害剤で処理された細胞では発現されなかった。対照的に、対照未処理ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞のわずか１０％がＣＤ６２Ｌを発現し、それらはＣＤ２８陰性であり、これは、Ａｋｔにより阻害されたＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞が養子移入に続いて優れた抗腫瘍活性を有し得ることを示している。
【００４０】
Ａｋｔ阻害剤により処理されたＣＡＲ  Ｔ細胞の効力を試験するために、ホタルルシフェラーゼを発現するように操作した０．５×１０６のＣＤ１９＋急性リンパ性白血病細胞（ＳｕｐＢ１５）を、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲｇａｍｍａＣｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに静脈内接種した。腫瘍移植の５日後、２ｘ１０６ＣＤ８＋ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍を有するマウスに静脈内注入した。対照マウスは、Ｔ細胞を受けなかったか、非形質導入Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）を受けたか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の間にＡｋｔ阻害剤で処理しなかったＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた。Ｔ細胞注入後の腫瘍シグナルを、バイオフォトニックイメージングによってモニターした。より低く一過性の抗腫瘍活性を示した未処理のＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞とは対照的に、Ａｋｔにより阻害されたＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全てのマウスにおいてＣＤ１９＋腫瘍を完全に根絶し（図５）、これは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのプライミング及び増殖の間のＡｋｔシグナル伝達の阻害は、優れた抗腫瘍活性を持つＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞集団を生じさせるということを示唆している。
【実施例５】
【００４１】
セントラルメモリーＴ細胞のＡｋｔ阻害剤処理
増殖及び／又は活性化の間のＡｋｔ阻害剤を用いたＣＡＲ  Ｔ細胞集団の処理は、ＣＤ８＋細胞集団だけでなく、例えばＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）集団等、他の細胞集団にも適用することができる。
【００４２】
ＣＡＲの発現に適したＴＣＭは以下のように調製することができる。同意した研究参加者から得られたアフェレーシス生成物が、フィコール処理され（ｆｉｃｏｌｌｅｄ）、洗浄され、一晩インキュベートされる。次に、ＧＭＰグレードの抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を使用して、細胞から単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞の集団が枯渇される。枯渇に続いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置上でＤＲＥＧ５６−ビオチン（ＣＯＨ臨床グレード）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、陰性画分細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ）が、ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ細胞に対して濃縮される。
【００４３】
濃縮に続いて、ＴＣＭ細胞は、完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５＋５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２中に配合され、Ｔｅｆｌｏｎ細胞培養バッグに移され、そこで細胞は、Ｄｙｎａｌ  ＣｌｉｎＥｘ（商標）Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激される。刺激の日に、細胞は、１．０から０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で、例えばＨＩＶ７レンチウイルスベクター等の所望のＣＡＲを発現するベクターを用いて形質導入される。培養物は、定期的なＡｋｔ阻害剤の添加と共に、細胞増殖に要求される完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ−２サイトカインが添加されながら（３ｘ１０５から２ｘ１０６生細胞／ｍＬの細胞密度、及び、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日のサイトカイン補給を保ち）、２１日間まで維持される。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９の細胞まで増殖する。培養期間の終わりに、細胞は収集され、２回洗浄され、臨床グレードの凍結保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ  ＣＳ５、ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中に配合される。
【００４４】
Ｔ細胞注入の日（一日又は複数日）に、凍結保存され放出された生成物が解凍され、洗浄され、再注入のために製剤化される。放出される細胞生成物を含有する凍結保存されたバイアルは、液体窒素貯蔵から取り出され、解凍され、冷却され、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄される。遠心分離後、上清が除去され、細胞は、防腐剤無添加生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈剤に再懸濁される。試料が、品質管理試験のために取り除かれる。
【実施例６】
【００４５】
Ａｋｔ阻害剤による処理が、異なるＴ細胞サブセットからのメモリーＴ細胞の生成を促進する
バルクＴ細胞、上記のように精製したＴＣＭ、及び精製されたナイーブ／メモリーＴ細胞（非特許文献６）に、上記の第２世代のＣＤ１９  ＣＡＲをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、１７〜２１日間１μＭのＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの存在下及び非存在下で、５０Ｕ／ＬのｒｈＩＬ２を含有する培地において増殖させた。結果として生じるＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ビオチン化Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）で染色し、ＣＡＲ検出のためのストレプトアビジン−ＰＥ及びＣＤ６２Ｌに対する抗体を後に伴った。ＣＤ６２を発現する細胞は、ＴＣＭ細胞又はＴＳＣＭ細胞を表す。エフェクターＴ細胞はＣＤ６２Ｌを発現しない。図６Ａは、この分析の結果を示しており、Ａｋｔ阻害剤の存在下での培養は、開始Ｔ細胞集団がバルクＴ細胞、ＴＣＭ細胞又はナイーブ／メモリーＴ細胞であったかどうかに無関係に、ＣＤ６２Ｌ＋発現ＣＡＲ  Ｔ細胞の割合を増加させることが分かる。
【００４６】
２人のドナーからの試料を使用して、ＰＢＭＣ、ＴＣＭ、及びＴＮ／ＴＣＭ／ＴＳＣＭの細胞集団を調製した。これら６つの細胞集団のそれぞれに、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、次に、１７〜２１日間、上記のようにＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩの非存在下又は存在下で増殖させた。図６Ｂにおいて見ることができるように、Ａｋｔ阻害剤は、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２８＋／ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を増加させた。
【実施例７】
【００４７】
ＣＡＲの構造
本明細書において記載されるＴ細胞集団を作製する方法は、ＣＡＲを発現する細胞を調製するために使用することができ、あらゆる所望のＣＡＲと共に使用することができる。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞外ドメインは、例えばＨＥＲ２又は腫瘍細胞上で発現されるいくつか他の受容体に結合するｓｃＦｖ等、標的に結合するｓｃＦｖ、又は、例えばＣＤ１９等の標的に結合するリガンドであり得る標的ドメイン、及び、任意的に、例えばヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーで構成される。
【００４８】
本明細書において記載されるＣＡＲは、標的ドメイン（すなわちｓｃＦＶ又はリガンド）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含み得る。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらの一部は、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分又はＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書において記載されるＣＡＲに使用することができる種々のスペーサーを提供している。
【００４９】
【表１】
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一部のスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のヒンジ領域のうち全て又は一部、すなわち、例えばＩｇＧ４  Ｆｅヒンジ又はＣＤ８ヒンジ等、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインからＣＨ２ドメインの間にある配列を含む。一部のスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリン由来の配列は、１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えば１、２、３、４又は５の置換、例えばオフターゲット結合を減少させる置換を含み得る。
【００５０】
「アミノ酸修飾」は、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を指す。「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ペプチド又はタンパク質の配列における特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸と交換することを指す。置換を行って、結果として生じるタンパク質におけるアミノ酸を、非保存の様式で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸までコドンを変えることによって）、又は、保存的様式で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸までコドンを変えることによって）変えることができる。そのような保存的変化は、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能における変化をより少なくする。以下は、アミノ酸の種々のグループの例である：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）（ｐＨ６．０で負に荷電した）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）（ｐＨ６．０で正に荷電した）塩基性アミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別のグループは、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。
【００５１】
特定の実施形態では、スペーサーは、未修飾のスペーサーにおいて存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ又は複数のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。１つ又は複数の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ又は複数のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下により詳細に記載されるこのナンバリングスキームにおいて、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列における最初のアミノ酸のように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９である。
【００５２】
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ又は複数の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。
【００５３】
特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、未修飾の領域において存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ又は複数のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域から得られる。１つ又は複数の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ又は複数のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
【００５４】
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ又は複数の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ４領域から得られ、未修飾のスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置にて上記の同定されたアミノ酸で置換される。
【００５５】
本明細書において論じられる免疫グロブリンにおけるアミノ酸の位置に対して、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームによる（参照により全内容が本願に援用される非特許文献７）。ＥＵインデックス又は非特許文献７に記載のＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（非特許文献８）。
【００５６】
様々な膜貫通ドメインを、ＣＡＲにおいて使用することができる。表２は、適した膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対するカルボキシ末端に位置する。
【００５７】
【表２】
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本明細書において記載されるＣＡＲのうち多くは、１つ又は複数の（例えば２つの）共刺激ドメインを含む。１つ又は複数の共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適した共刺激ドメインの例を含む。
【００５８】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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