(57)【要約】本開示は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであるグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）と特異的に会合する分子を一般に提供する。より具体的には、本開示は、少なくともＧＩＴＲに結合する多価および／または多重特異性分子に関する。本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、抗体に由来するか、またはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲもしくはＶＨＨを含む抗体断片に由来する。【選択図】図１
2018523493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）に結合する単離されたポリペプチドであって、複数の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）結合ドメイン（ＴＢＤ）を含み、少なくとも第１のＴＢＤ（ＴＢＤ１）が、ＧＩＴＲに特異的に結合するＧＩＴＲ結合ドメイン（ＧＩＴＲ−ＢＤ）を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記複数のＴＢＤにおけるＴＢＤの各々がＧＩＴＲ−ＢＤを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記複数のＴＢＤが、ＧＩＴＲ上の同じエピトープに結合する２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含む、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも２つの前記ＧＩＴＲ−ＢＤが、ＧＩＴＲ上の異なるエピトープに結合する、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
同じＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも２つのコピーを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
同じＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも３つのコピーを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記複数のＴＢＤにおけるＴＢＤの各々が、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＧＩＴＲ−ＢＤを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記複数のＴＢＤにおけるＴＢＤの各々が、配列番号１９〜８０からなる群より選択される同じアミノ酸配列を含むＧＩＴＲ−ＢＤを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記複数のＴＢＤにおけるＴＢＤの各々が、配列番号４２〜６２からなる群より選択される同じアミノ酸配列を含むＧＩＴＲ−ＢＤを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記複数のＴＢＤにおけるＴＢＤの各々が、配列番号６３〜８０からなる群より選択される同じアミノ酸配列を含むＧＩＴＲ−ＢＤを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
複数のＧＩＴＲ−ＢＤにおけるＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも１つが、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）
と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
複数のＧＩＴＲ−ＢＤにおけるＧＩＴＲ−ＢＤの各々が、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
複数のＧＩＴＲ−ＢＤにおけるＧＩＴＲ−ＢＤの各々が、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む同じアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記複数のＴＢＤにおけるＴＢＤの各々が、リンカーポリペプチドを介して作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
ヘテロ二量体化ドメインを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＧＩＴＲ−ＢＤが、抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
前記複数のＴＢＤにおける各ＴＢＤが、抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲまたはＶＨＨである、請求項２１または請求項２２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記抗体またはその抗原結合性断片がｓｄＡｂである、請求項２１または請求項２２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ｓｄＡｂが、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記ｓｄＡｂが、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、操作されたＶＨドメインまたは操作されたＶＫドメインである、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
前記ｓｄＡｂが、重鎖のみの軟骨魚類抗体から生成される、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
少なくとも１つの前記ＴＢＤが、非抗体足場タンパク質を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
前記非抗体足場タンパク質が、アンキリンリピートタンパク質、ｄａｒｐｉｎ、アビマー、アンチカリン／リポカリン、セントリン、またはフィノマーである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
四価である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
構造：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃを含む融合タンパク質の２つのコピーを含む、請求項３０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
前記ＧＩＴＲ−ＢＤが、ｓｄＡｂ配列である、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＧＩＴＲ−ＢＤが、ヒト化または完全ヒトｓｄＡｂ配列である、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
六価である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３７】
構造：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃを含む融合タンパク質の２つのコピーを含む、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＧＩＴＲ−ＢＤが、ｓｄＡｂ配列である、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
前記ＧＩＴＲ−ＢＤが、ヒト化または完全ヒトｓｄＡｂ配列である、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
各ＧＩＴＲ−ＢＤが、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号８１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号８１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号８１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号８１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４４に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項４７】
請求項４６に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４４に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４９】
がんの処置を必要とする被験体におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の請求項４８に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５０】
がんを有する被験体の生存を増大させる方法であって、治療有効量の請求項１または請求項４３または請求項４４に記載のポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５１】
前記被験体がヒトである、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記がんが、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵がん、結腸直腸がん、結腸がん、腎がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、胚細胞がん、骨がん、肝がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連がんからなる群より選択される、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記がんが、転移性がん、難治性がん、または再発がんである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
腫瘍成長の阻害を必要とする被験体における腫瘍成長を阻害する方法であって、治療有効量の請求項４３または請求項４４に記載のポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５５】
腫瘍内制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度を低下せる方法、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導する方法、またはＴｒｅｇ細胞の頻度を低下させ、かつＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導する方法であって、請求項４３または請求項４４に記載のポリペプチドを被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５６】
前記被験体が、ＣＴ２６マウスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
新生物を処置するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５８】
腫瘍破壊を増進するように免疫細胞を調節するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１５年７月２３日に出願された米国仮出願第６２／１９５，８２２号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
２０１６年７月２２日に作成した、サイズが２０９ＫＢである「ＩＮＨＩ０２２００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名のテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであるグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）と特異的に会合する分子を一般に提供する。より具体的には、本開示は、少なくともＧＩＴＲに結合する多価および／または多重特異性分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーは、いくつかの構造的に関連性のある細胞表面受容体からなる。多量体リガンドによる活性化は、これらの受容体の多くに共通する特徴である。ＴＮＦＲＳＦの多くのメンバーは、適切に活性化されれば多くの病態において治療的有用性を有する。重要なこととして、この受容体ファミリーを適切に作動させるには、より高次のクラスター化が必要とされることが多く、従来の二価抗体はこれに理想的ではない。したがって、ＴＮＦＲＳＦのより強力なアゴニスト分子に関する治療上の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、少なくともグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）および／または活性化誘導性ＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ）としても公知）に結合する、多価ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）結合融合ポリペプチドを提供する。少なくともＧＩＴＲに結合するこれらの分子は、本明細書では、「ＧＩＴＲ標的化分子」または「ＧＩＴＲ標的化融合体」または「ＧＩＴＲ標的化タンパク質」または「ＧＩＴＲ標的化融合ポリペプチド」または「ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質」と呼ばれる。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、多価分子、例えば、多価ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、多重特異性分子、例えば、多重特異性ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、多価および多重特異性分子、例えば、多価および多重特異性ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質である。本明細書で使用される用語「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」または「ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質」または「ＧＩＴＲ標的化融合ポリペプチド」は、特に別段の表示がない限り、これらに限定されるものではないが多価誘導タンパク質、多重特異性融合タンパク質または多価および多重特異性融合タンパク質を含む、本開示の任意の融合タンパク質実施形態を指す。
【０００６】
これらのＧＩＴＲ標的化分子は、ＧＩＴＲに結合する少なくとも１つのドメインを含み、このドメインは、本明細書では「ＧＩＴＲ結合ドメイン」（ＧＩＴＲ−ＢＤ）と呼ばれる。これらのＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲと特異的に結合するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、抗体、または例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲもしくはＶＨＨを含む抗体断片であるか、あるいはそれに由来する、ポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂを含む。
【０００７】
本開示のＧＩＴＲ標的化分子は、ＧＩＴＲを含むＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを標的にする従来の抗体からの問題および制限を克服する。ＴＮＦＲＳＦのメンバーを標的にする従来の抗体は、ＤＲ４、ＤＲ５、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に対する活性抗体にとってのＦｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）の必要性により証明されるように、十分なアゴニスト活性を達成するために外因的架橋を必要とすることが示されている（Ｉｃｈｉｋａｗａら、２００１年、ａｌ  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、７巻、９５４〜９６０頁、Ｌｉら、２００８年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｒｅｓ．、６９巻、６９〜８２頁；Ｐｕｋａｃら、２００５年、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、９２巻、１４３０〜１４４１頁；Ｙａｎｄａら、２００８年、Ａｎｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、１９巻、１０６０〜１０６７頁；Ｙａｎｇら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、２５１巻：１４６〜１５７頁；Ｂｕｌｌｉａｒｄら、２０１３年、ＪＥＭ、２１０巻（９号）：１６８５頁；Ｂｕｌｌｉａｒｄら、２０１４年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、９２巻：４７５〜４８０頁）。ＦｃγＲによる架橋に加えて、オリゴマーリガンドまたは抗体結合実体（例えば、プロテインＡおよび二次抗体）の付加を含む他の外因性作用物質は、抗ＴＮＦＲＳＦ抗体クラスター化および下流のシグナル伝達を増進することが実証されている。例えば、ＤＲ５リガンドＴＲＡＩＬの付加は、抗ＤＲ５抗体のアポトーシス誘導能力を向上させる（Ｇｒａｖｅｓら、２０１４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２６巻：１７７〜１８９頁）。これらの発見は、二量体を超えるＴＮＦＲＳＦクラスター化の必要性を示唆している。
【０００８】
本開示は、ＧＩＴＲに特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、抗体に由来するか、またはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲもしくはＶＨＨを含む抗体断片に由来する。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、操作されたＶＨまたはＶＫドメインに由来しうる。ＶＨＨは、重鎖のみのラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、重鎖のみの軟骨魚類抗体から生成することができる。従来のヘテロ二量体のＶＨおよびＶＫドメインから単量体ｓｄＡｂを生成するために様々な方法が実行されており、そのような方法には、界面操作、および特異的生殖系列ファミリーの選択が含まれる。他の実施形態では、単離されたポリペプチドは、非抗体足場タンパク質、例えば、これらに限定されるものではないが、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン／リポカリン、セントリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）およびフィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）に由来する。
【０００９】
一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む。
【００１２】
本開示はまた、２つまたはそれよりも多くのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＴＢＤ）を含み、少なくとも１つのＴＢＤがＧＩＴＲに結合する（このＴＢＤは本明細書ではＧＩＴＲ結合ドメイン（ＧＩＴＲ−ＢＤ）と呼ばれる）、多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、新生物の処置において有用性を有する。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、腫瘍細胞上で発現されるＴＮＦＲＳＦメンバー、例えば、少なくともＧＩＴＲに結合する。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示のＧＩＴＲ−ＢＤは、抗体に由来するか、またはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲもしくはＶＨＨを含む抗体断片に由来する。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、操作されたＶＨまたはＶＫドメインに由来しうる。ＶＨＨは、重鎖のみのラクダ科動物抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、重鎖のみの軟骨魚類抗体から生成することができる。従来のヘテロ二量体のＶＨおよびＶＫドメインから単量体ｓｄＡｂを生成するために様々な方法が実行されており、そのような方法には、界面操作、および特異的生殖系列ファミリーの選択が含まれる。他の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、非抗体足場タンパク質、例えば、これらに限定されるものではないが、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、セントリンおよびフィノマーに由来する。
【００１４】
一般に、本開示の多価融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを介して作動可能に連結されている少なくとも２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含む。本開示の多価融合タンパク質中の特異的ＧＩＴＲ−ＢＤ配列としてのｓｄＡｂ断片の利用には、多くの二重／多重特異性抗体アプローチに共通の重鎖：軽鎖誤対合問題を回避するという利益がある。加えて、本開示の多価融合タンパク質により、多くの二重特異性抗体に必要とされる長いリンカーの使用が回避される。
【００１５】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くの異なるＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、３つまたはそれよりも多くの異なるＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、４つまたはそれよりも多くの異なるＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、５つまたはそれよりも多くの異なるＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、６つまたはそれよりも多くの異なるＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００１６】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの複数のコピーを含有する。例えば、一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも２つのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも３つのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも４つのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも５つのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも６つのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＢＤの６つまたはそれよりも多くのコピーを含有する。
【００１７】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００１８】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００１９】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００２０】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００２１】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００２２】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００２３】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも１つのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの２つまたはそれよりも多くのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの３つまたはそれよりも多くのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの４つまたはそれよりも多くのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの５つまたはそれよりも多くのコピーを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの６つまたはそれよりも多くのコピーを含有する。
【００２４】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００２５】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む２つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む３つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む４つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む５つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む６つまたはそれよりも多くのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００２６】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００２７】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００２８】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００２９】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３０】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３１】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３２】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３３】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３４】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３５】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号２のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３６】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号３のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３７】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号４のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３８】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号５のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００３９】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む３つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む４つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む５つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号６のアミノ酸配列を含む６つまたはそれよりも多くの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００４０】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの少なくとも１つのコピーと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの２つまたはそれよりも多くのコピーと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの３つまたはそれよりも多くのコピーと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの４つまたはそれよりも多くのコピーと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの５つまたはそれよりも多くのコピーと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むＧＩＴＲ−ＢＤの６つまたはそれよりも多くのコピーと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００４１】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８１〜９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９４〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８１〜９３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９４〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、多価ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、四価である。本明細書で使用される四価ＧＩＴＲ標的化分子は、２つのＧＩＴＲ−ＢＤを含むＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを指す。例えば、一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合する単離されたポリペプチド配列である）。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するヒト化または完全ヒトｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号８１〜９３からなる群より選択されるアミノ酸配列の２つのコピーを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、多価ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、六価である。本明細書で使用される六価ＧＩＴＲ標的化分子は、３つのＧＩＴＲ−ＢＤを含むＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを指す。例えば、一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合する単離されたポリペプチド配列である）。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ヒト化または完全ヒトｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号９４〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本開示の多価融合タンパク質は、非架橋二価抗体と比較してＴＮＦＲＳＦメンバーの増進されたクラスター化が可能である。本開示の多価融合タンパク質により媒介されるＴＮＦＲＳＦメンバーの増進されたクラスター化は、非架橋二価抗体と比較して増進されたＴＮＦＲＳＦ依存性シグナル伝達を誘導する。ほとんどの実施形態において、多価融合タンパク質は、２つより多くのＧＩＴＲ−ＢＤ、例えば、３つ、４つ、５つまたは６つのＧＩＴＲ−ＢＤを組み込むことになる。これらの実施形態では、非ＴＮＦＲＳＦ抗原の相互作用は、さらなる架橋機能をもたらすことができ、ＴＮＦＲＳＦ活性化は、たった１つまたは２つのＴＢＤで達成される。
【００４７】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質はまた、１つまたは複数のＧＩＴＲ−ＢＤと、ＧＩＴＲ以外の標的と結合する１つまたは複数のさらなる結合ドメインとを含む。一部の実施形態では、多価、多重特異性融合タンパク質はまた、１つまたは複数のＧＩＴＲ−ＢＤと、非ＴＮＦＲＳＦメンバー抗原に向けられた１つまたは複数のさらなる結合ドメインとを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、多価、多重特異性融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦメンバーに向けられた１つまたは複数のさらなる結合ドメインも含むことができ、前記結合ドメインは、本明細書ではＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＴＢＤ）と呼ばれる。これらの実施形態のいずれにおいても、非ＴＮＦＲＳＦ抗原の相互作用は、さらなる架橋機能をもたらすことができ、ＴＮＦＲＳＦ活性化は、たった１つもしくは２つのＧＩＴＲ−ＢＤでまたはたった１つもしくは２つのＧＩＴＲ−ＢＤおよびＴＢＤで達成される。
【００４８】
一部の実施形態では、多価、多重特異性融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦメンバーに向けられた１つまたは複数のさらなる結合ドメインも含み、前記結合ドメインは、本明細書ではＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＴＢＤ）と呼ばれる。これらの実施形態では、多価、多重特異性融合タンパク質は、少なくとも２つの別個の抗原に結合する。一部の実施形態では、多価、多重特異性融合タンパク質のＴＢＤのすべてが、所与のＴＮＦＲＳＦメンバー上の同じエピトープを認識する。例えば、本開示の多価、多重特異性融合タンパク質は、所与のＴＮＦＲＳＦメンバーに対して同一の特異性を有する２、３、４、５または６つのＴＢＤを組み込むことができる。他の実施形態では、多価、多重特異性融合タンパク質は、所与のＴＮＦＲＳＦメンバー上の別個のエピトープを認識するＴＢＤを組み込む。例えば、本開示の多価、多重特異性融合タンパク質は、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０またはＣＤ１３７上の様々なエピトープに対して別個の認識特異性を有する２、３、４、５または６つのＴＢＤを組み込むことができる。これらの実施形態では、本開示の多価、多重特異性融合タンパク質は、特定のＴＮＦＲＳＦメンバーの別個の領域を標的にする複数のＴＢＤを含有する。一部の実施形態では、ＴＢＤは、同じＴＮＦＲＳＦメンバー上の異なるエピトープを認識することもあり、または別個のＴＮＦＲＳＦメンバー上のエピトープを認識することもある。例えば、本開示は、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合するＴＢＤを組み込む多価、多重特異性融合タンパク質を提供する。
【００４９】
他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＩＴＲと、非腫瘍細胞上で発現される第２のＴＮＦＲＳＦメンバー、例えば、非限定的な例としてＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）、エクトジスプラシンＡ２受容体（ＥＤ２Ｒ）、エクトジスプラシンＡ受容体（ＥＤＡＲ）、ＴｗｅａｋＲ、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦＲ、ＤＲ３、ＤＲ６またはＣＤ１３７とに結合する、多重特異性融合タンパク質である。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、多価でもある。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、二重特異性である。これらの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、免疫細胞を調節し、その結果、腫瘍破壊増進をもたらす。他の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、炎症状態の処置において有用性を有する。これらの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、免疫細胞を調節し、その結果、炎症性傷害の減弱に至る。例えば、ＴＮＦＲ２を特異的に作動させることで、Ｔｒｅｇ増殖を増進することができ、その結果、免疫抑制に至る。
【００５０】
一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００５１】
一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００５２】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。
【００５３】
一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００５４】
一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００５５】
一部の実施形態では、多価融合タンパク質は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤと、配列番号１〜６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含有する。
【００５６】
本開示の多重特異性融合タンパク質は、非架橋二価抗体と比較してＴＮＦＲＳＦメンバーの増進されたクラスター化が可能である。本開示の多重特異性融合タンパク質により媒介されるＴＮＦＲＳＦメンバーの増進されたクラスター化は、非架橋二価抗体と比較して増進されたＴＮＦＲＳＦ依存性シグナル伝達を誘導する。ほとんどの実施形態において、多重特異性融合タンパク質は、２つより多くのＴＢＤ、例えば、３つ、４つ、５つまたは６つのＴＢＤを組み込むことになる。一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、ＴＢＤと、非ＴＮＦＲＳＦメンバー抗原に向けられた結合ドメインとを組み込むことになる。これらの実施形態では、非ＴＮＦＲＳＦ抗原の相互作用は、さらなる架橋機能をもたらすことができ、ＴＮＦＲＳＦ活性化は、たった１つまたは２つのＴＢＤで達成される。これらの実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、多重特異性であり、２つの別個の抗原に結合している。
【００５７】
一部の実施形態では、本開示のＴＢＤは、抗体に由来するか、またはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲもしくはＶＨＨを含む抗体断片に由来する。一部の実施形態では、ＴＢＤは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、操作されたＶＨまたはＶＫドメインに由来しうる。ＶＨＨは、重鎖のみのラクダ科動物抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、重鎖のみの軟骨魚類抗体から生成することができる。従来のヘテロ二量体のＶＨおよびＶＫドメインから単量体ｓｄＡｂを生成するために様々な方法が実行されており、そのような方法には、界面操作、および特異的生殖系列ファミリーの選択が含まれる。他の実施形態では、ＴＤＢは、非抗体足場タンパク質、例えば、これらに限定されるものではないが、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、セントリンおよびフィノマーに由来する。
【００５８】
一般に、本開示の多重特異性融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを介して作動可能に連結されている少なくとも２つまたはそれよりも多くのＴＢＤからなる。本開示の多重特異性融合タンパク質中の特異的ＴＢＤとしてのｓｄＡｂ断片の利用には、多くの二重／多重特異性抗体アプローチに共通の重鎖：軽鎖誤対合問題を回避するという利益がある。加えて、本開示の多重特異性融合タンパク質により、多くの二重特異性抗体に必要とされる長いリンカーの使用が回避される。
【００５９】
一部の実施形態では、多重特異性融合タンパク質のＴＢＤのすべてが、所与のＴＮＦＲＳＦメンバー上の同じエピトープを認識する。例えば、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＧＩＴＲに対して同一の特異性を有する２、３、４、５または６つのＴＢＤを組み込むことができる。他の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、所与のＴＮＦＲＳＦメンバー上の別個のエピトープを認識するＴＢＤを組み込む。例えば、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０またはＣＤ１３７上の様々なエピトープに対して別個の認識特異性を有する２、３、４、５または６つのＴＢＤを組み込むことができる。これらの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、特定のＴＮＦＲＳＦメンバーの別個の領域を標的にする複数のＴＢＤを含有する。一部の実施形態では、ＴＢＤは、同じＴＮＦＲＳＦメンバー上の異なるエピトープを認識することもあり、または別個のＴＮＦＲＳＦメンバー上のエピトープを認識することもある。例えば、本開示は、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合するＴＢＤを組み込む多重特異性融合タンパク質を提供する。
【００６０】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質、例えば、多価および／または多重特異性融合タンパク質は、単一のポリペプチドで構成されている。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、１つより多くのポリペプチドで構成されている。例えば、ヘテロ二量体化ドメインは、構築物が非対称融合タンパク質になるように融合タンパク質に組み込まれている。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域が融合タンパク質に組み込まれている場合、ＣＨ３ドメインをホモ二量体化ドメインとして使用することができ、またはＣＨ３二量体界面領域を、ヘテロ二量体化を可能にするように変異させることができる。
【００６１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴＢＤおよび／またはＧＩＴＲ−ＢＤを融合タンパク質の互いに反対側の端に含有する。例えば、一部の実施形態では、ＴＢＤおよび／またはＧＩＴＲ−ＢＤは、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分と融合タンパク質のカルボキシ末端（Ｃ末端）部分の両方に位置する。他の実施形態では、ＴＢＤおよび／またはＧＩＴＲ−ＢＤすべてが、融合タンパク質の同じ端に存在する。例えば、ＴＢＤおよび／またはＧＩＴＲ−ＢＤは、融合タンパク質のアミノ末端部分またはカルボキシル末端部分のどちらかに存在する。
【００６２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、およびＩｇＧ４サブクラスからなる群より選択されるＩｇＧアイソタイプである。
【００６３】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、ＩｇＧアイソタイプである。例えば、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、アミノ酸配列：
【化１】
2018523493.tif 000003
を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００６４】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、融合タンパク質のグリコシル化を防止するようにアミノ酸Ａｓｎ２９７（枠で囲まれている位置、カバット番号付け）が修飾される、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変化させるようにアミノ酸Ｌｅｕ２３５（枠で囲まれている位置、カバット番号付け）が修飾される、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）またはＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）。一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変化させるようにアミノ酸Ｌｅｕ２３４（枠で囲まれている位置、カバット番号付け）が修飾される、例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）。一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変化させるようにアミノ酸Ｌｅｕ２３４（枠で囲まれている位置、カバット番号付け）が修飾される、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）。一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸２３４および２３５の両方が変化される、例えば、Ｌｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）またはＬｅｕ２３４ＶａｌおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ）。一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減するようにＧｌｙ２３５が変化される。例えば、その場合、Ｇｌｙ２３５が融合タンパク質から欠失される。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ＣＤ３２Ａとの相互作用を増強するようにアミノ酸Ｇｌｙ２３６が修飾される、例えば、Ｇｌｙ２３６Ａｌａ（Ｇ２３６Ａ）。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘ）。
【００６６】
一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減させるように次の位置のうちの１つまたは複数が変化される：Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域内の修飾は、Ｆｃ受容体ガンマ受容体との結合を低減させるが、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合に対して最小限の影響しか及ぼさない。
【００６７】
一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減させるように次の位置のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸を欠いている：Ｇｌｕ２３３（Ｅ２３３）、Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、またはＬｅｕ２３５（Ｌ２３５）。これらの実施形態では、これら３つのアミノ酸のＦｃ欠失は、補体タンパク質Ｃ１ｑ結合を低減させる。これらの修飾Ｆｃ領域ポリペプチドは、本明細書では「Ｆｃ欠失」ポリペプチドと呼ばれる。
【化２】
2018523493.tif 000004
【００６８】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、アミノ酸配列：
【化３】
2018523493.tif 000005
を有する、ヒトＩｇＧ２アイソタイプのものである。
【００７０】
一部の実施形態では、融合タンパク質またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ２ポリペプチド配列を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域は、抗体のグリコシル化を防止するようにアミノ酸Ａｓｎ２９７（枠で囲まれている位置）が修飾される、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘ）。
【００７２】
一部の実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、アミノ酸配列：
【化４】
2018523493.tif 000006
を有する、ヒトＩｇＧ３アイソタイプのものである。
【００７３】
一部の実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ３ポリペプチド配列を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域は、抗体のグリコシル化を防止するようにアミノ酸Ａｓｎ２９７（枠で囲まれている位置、カバット番号付け）が修飾される、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域は、半減期を延長するようにアミノ酸４３５が修飾される、例えば、Ａｒｇ４３５Ｈｉｓ（Ｒ４３５Ｈ）。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘ）。
【００７５】
一部の実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、アミノ酸配列：
【化５】
2018523493.tif 000007
を有する、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【００７６】
一部の実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、アミノ酸配列：
【化６】
2018523493.tif 000008
を有する、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【００７８】
一部の実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。
【００７９】
他の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変化させるようにアミノ酸２３５が修飾される、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、抗体のグリコシル化を防止するようにアミノ酸Ａｓｎ２９７（カバット番号付け）が修飾される、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠く（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘ）。
【００８０】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を増強するように修飾される。ＦｃＲｎとの結合を増強するＦｃ変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（それぞれ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（カバット番号付け、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、２００６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８１巻（３３号）２３５１４〜２３５２４頁）、Ｍｅｔ４２８ＬｅｕおよびＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）（Ｚａｌｅｖｓｋｙら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２８巻（２号）１５７〜１５９頁）、またはＭｅｔ２５２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５６Ａｓｐ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ（それぞれ、Ｍ２５２Ｉ、Ｔ２５６Ｄ、Ｍ４２８Ｌ）、（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵ  ｉｎｄｅｘ）である。
【００８１】
本開示の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含む一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、変異または修飾される。これらの実施形態では、変異または修飾Ｆｃポリペプチドは、次の変異を含む：カバット番号付けシステムを使用してＭｅｔ２５２ＴｙｒおよびＭｅｔ４２８Ｌｅｕ（Ｍ２５２Ｙ、Ｍ４２８Ｌ）。
【００８２】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変化させるように修飾される、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６８巻（１０号）：３８６３〜７２頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２００１年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６６巻（４号）：２５７１〜５頁；Ｍｏｏｒｅら、２０１０年、ｍＡｂｓ、２巻（２号）：１８１〜１８９頁；Ｌａｚａｒら、２００６年、ＰＮＡＳ、１０３巻（１１号）：４００５〜４０１０頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、ＪＢＣ、２７６巻（９号）：６５９１〜６６０４頁；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６７巻（１８号）：８８８２〜８８９０頁；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００８年、Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．、４８巻：１５２〜１６４頁；Ａｌｅｇｒｅら、１９９２年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８巻：３４６１〜３４６８頁；（Ｋａｎｅｋｏ  ａｎｄ  Ｎｉｗａ、２０１１年、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２５巻（１号）：１〜１１頁で概説）に記載されているアミノ酸修飾。ＡＤＣＣを増強する変異の例としては、Ｓｅｒ２３９およびＩｌｅ３３２における修飾、例えば、Ｓｅｒ２３９ＡｓｐおよびＩｌｅ３３２Ｇｌｕ（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）が挙げられる。ＣＤＣを増強する変異の例としては、Ｌｙｓ３２６およびＧｌｕ３３における修飾が挙げられる。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、これらの位置の一方または両方が修飾される、例えば、カバット番号付けシステムを使用してＬｙｓ３２６Ａｌａおよび／またはＧｌｕ３３３Ａｌａ（Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ）。
【００８３】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体化を誘導するように修飾される。例えば、ＣＨ３ドメイン内のＴｈｒ３６６にアミノ酸修飾を有し、より嵩高いアミノ酸、例えばＴｒｙで置き換えられている（Ｔ３６６Ｗ）場合、Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８およびＴｙｒ４０７位においてさほど嵩高くないアミノ酸、例えば、それぞれＳｅｒ、ＡｌａおよびＶａｌへのアミノ酸修飾（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）を有する第２のＣＨ３ドメインと、優先的に対合することができる。ＣＨ３修飾によるヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入により、例えば、反対側のＣＨ３ドメインにおけるＳｅｒ３５４をＣｙｓに変化させ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｙ３４９をＣｙｓに変化させること（Ｙ３４９Ｃ）により、さらに安定させることができる（Ｃａｒｔｅｒ、２００１年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８巻：７〜１５頁で概説）。
【００８４】
一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、二量体化を防止するように修飾される。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、単量体のものである。例えば、残基Ｔｈｒ３６６における荷電残基への修飾、例えば、Ｔｈｒ３６６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３６６Ａｒｇ、Ｔｈｒ３６６ＡｓｐまたはＴｈｒ３６６Ｇｌｕ（それぞれ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６ＤまたはＴ３６６Ｅ）は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する。
【００８５】
一部の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減させるように次の位置のうちの１つまたは複数が変化される：Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域内の修飾は、Ｆｃ受容体ガンマ受容体との結合を低減させるが、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合に対して最小限の影響しか及ぼさない。
【００８６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域に由来するポリペプチドを含有する。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧサブクラスのいずれかから選択することができる。例えば、融合タンパク質は、軽鎖のＣ末端システインとジスルフィド結合を形成するＣｙｓ２２０がセリンに変異されている（例えば、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ（Ｃ２２０Ｓ））、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号７）の配列を有する修飾ＩｇＧ１ヒンジを含有しうる。他の実施形態では、融合タンパク質は、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号８）を有する短縮型ヒンジを含有する。
【００８７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、鎖交換を防止するまたは低減させるように修飾されている（例えば、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ））、ＩｇＧ４からの修飾ヒンジであって、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣ（配列番号９）を有する修飾ヒンジを有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを含有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、リンカーおよびヒンジポリペプチドを含有する。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、Ｎ連結グリカン鎖のＮ２９７に結合されているフコースがないまたは低減されている。フコシル化を防止するための多くの方法があり、そのような方法には、ＦＵＴ８欠損細胞株における産生；哺乳動物細胞培地への阻害剤の添加、例えばカスタノスペルミン；および産生細胞株の代謝改変が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
一部の実施形態では、ＴＢＤは、ヒトにおいて見出される既存の抗体による認識をなくすように改変される。一部の実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、Ｌｅｕ１１位の変異、例えば、Ｌｅｕ１１Ｇｌｕ（Ｌ１１Ｅ）またはＬｅｕ１１Ｌｙｓ（Ｌ１１Ｋ）により修飾される。他の実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、カルボキシ末端領域における変化により修飾され、例えば、前記末端配列は、ＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＧＧ（配列番号１０）もしくはＧＱＧＴＬＶＴＶＥＰＧＧ（配列番号１１）またはこれらの修飾形からなる。一部の実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、１１位の変異によりおよびカルボキシ末端領域における変化により修飾される。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質のＴＢＤおよび／またはＧＩＴＲ−ＢＤは、アミノ酸リンカーを介して作動可能に連結されている。一部の実施形態では、これらのリンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンで主として構成されており、本明細書ではＧＳリンカーとして表される。本開示の融合タンパク質のＧＳリンカーは、様々な長さのもの、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長のものであってもよい。
【００９１】
一部の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）２（配列番号１２）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）３（配列番号１３）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）４（配列番号１４）；およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）５（配列番号１５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、リンカーは、非限定的な例としてＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１７）およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号１８）などの、グリシン残基を含む可撓性リンカーである。
【００９３】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、ＧＳリンカーとグリシンリンカーの組合せを含む。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１Ａは、本開示の例示的な多価融合タンパク質の略図である。
【００９５】
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、フローサイトメトリーにより評定した、ＣＨＯ細胞において発現されたＧＩＴＲとのＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の結合を実証する一連のグラフである。ＧＩＴＲ抗体、ＴＲＸ−５１８を対照としてこれらの研究に使用した。
【００９６】
【図３】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲ間の相互作用を遮断するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の能力を実証する一連のグラフである。本明細書では、ＧＩＴＲ発現ＣＨＯ細胞および組換えＧＩＴＲＬを使用するフローサイトメトリーアッセイを使用して、遮断能力を評定した。ＧＩＴＲ抗体、ＴＲＸ−５１８を対照としてこれらの研究に使用した。
【００９７】
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、フローサイトメトリーにより測定した、ＣＨＯ細胞の表面で発現されたヒトＧＩＴＲおよびカニクイザルＧＩＴＲ（「ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ」）に対するｈｚＣ０６ｖ１．１、ｈｚＣ０６ｖ１．２、ｈｚＣ０６ｖ１．３、ｈｚＣ０６ｖ１．４、ｈｚＣ０６ｖ２．１、ｈｚＣ０６ｖ２．２、ｈｚＣ０６ｖ２．３、ｈｚＣ０６ｖ２．４、ｈｚＣ０６ｖ３、ｈｚＣ０６ｖ３．１、ｈｚＣ０６ｖ３．２、ｈｚＣ０６ｖ３．３、ｈｚＣ０６ｖ３．４、ｈｚＣ０６ｖ３．５、ｈｚＣ０６ｖ３．６、ｈｚＣ０６ｖ３．７、ｈｚＣ０６ｖ３．８、ｈｚＣ０６ｖ３．９、ｈｚＣ０６ｖ３．１０、ｈｚＣ０６ｖ３．１１およびｈｚＣ０６ｖ３．１２と呼ばれる本開示のＧＩＴＲ標的化分子の結合を図示する一連のグラフである。
【００９８】
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅは、フローサイトメトリーにより測定した、ＣＨＯ細胞の表面で発現されたヒトＧＩＴＲおよびカニクイザルＧＩＴＲ（「ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ」）に対するｈｚＣ０４ｖ４．１、ｈｚＣ０４ｖ４．１．２、ｈｚＣ０４ｖ４．２、ｈｚＣ０４ｖ４．２．２、ｈｚＣ０４ｖ５、ｈｚＣ０４ｖ１．２．１、ｈｚＣ０４ｖ５．１、ｈｚＣ０４ｖ５．２、ｈｚＣ０４ｖ５．３、ｈｚＣ０４ｖ５．４、ｈｚＣ０４ｖ５．５、ｈｚＣ０４ｖ５．６、ｈｚＣ０４ｖ５．７、ｈｚＣ０４ｖ５．８、ｈｚＣ０４ｖ５．９、ｈｚＣ０４ｖ５．１０、ｈｚＣ０４ｖ５．１１およびｈｚＣ０４ｖ５．１２と呼ばれる本開示のＧＩＴＲ標的化分子の結合を図示する一連のグラフである。
【００９９】
【図６】図６は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合した単一ドメイン可変領域（ｓｄＡｂ）の２つのタンデムコピーを用いて構築される、本開示の四価抗ＧＩＴＲ分子の略図である。代替分子は、マウスＩｇＧ２ａに由来するＦｃドメインを用いて構築される。
【０１００】
【図７】図７は、本明細書では四価ｈｚＣ０６−ｈＩｇＧ１と呼ばれる本開示の抗ＧＩＴＲ分子の初代ヒトＴ細胞との結合を図示するグラフである。四価ｈｚＣ０６−ｈＩｇＧ１は、配列番号９３のＧＩＴＲ結合分子の２つのコピーを用いて構築され、そしてまた前記ＧＩＴＲ結合分子は、配列番号１のヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合した配列番号５９の単一ドメイン可変領域（ｓｄＡｂ）の２つのタンデムコピーを用いて構築される。
【０１０１】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＧＩＴＲを発現するレポーター細胞株におけるＮＦ−ｋＢシグナル伝達を活性化する本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子の能力を図示する一連のグラフである。
【０１０２】
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子での処置が投与日に関係なくＣＴ２６腫瘍成長を有意に低減させたことを図示する一連のグラフである。
【０１０３】
【図１０】図１０は、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子によるＣＴ２６腫瘍成長の用量依存的抑制を図示する一連のグラフである。
【０１０４】
【図１１】図１１は、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子によるＭＣ３８腫瘍成長の用量依存的抑制を図示する一連のグラフである。
【０１０５】
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、ＣＴ２６腫瘍成長の阻害に対するＦｃ機能の影響を図示する一連のグラフである。
【０１０６】
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、四価ＧＩＴＲ標的化分子での処置がＣＴ２６腫瘍での再負荷に対するその後の抵抗性を有したことを図示する一連のグラフである。
【０１０７】
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子での処置がＴｒｅｇ頻度を有意に低減させ、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ細胞のＴエフェクター細胞に対する比を変化させたことを図示する一連のグラフである。
【０１０８】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子での処置がＣＤ８  Ｔ細胞活性化および増殖を有意に誘導したことを図示する一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
本開示は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであるグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）と特異的に会合する分子を提供する。より具体的には、本開示は、少なくともＧＩＴＲに結合する多価分子に関する。これらの多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＴＢＤ）を含み、少なくとも１つのＴＢＤがＧＩＴＲに結合しており、このＴＢＤは本明細書では「ＧＩＴＲ結合ドメイン」（ＧＩＴＲ−ＢＤ）と呼ばれる。
【０１１０】
ＧＩＴＲは、ＴＮＦＲＳＦのメンバーであり、腫瘍内のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｏｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上で構成的に発現され、活性化後に他のＴ細胞集団上で上方制御される。それは、Ｔｒｅｇ媒介免疫自己寛容において主要な役割を果たすと仮定される。ＧＩＴＲアゴニストは、Ｔｒｅｇの抑制活性を減弱し、マウスモデルにおいてエフェクターＴ細胞による腫瘍の殺滅を増進することが証明されている。したがって、機能的ＧＩＴＲアゴニストには腫瘍免疫療法において大きな可能性がある。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを組み込む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、多価融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＩＴＲと、例えば任意の他のＴＮＦＲＳＦメンバーなどの、第２の抗原とに結合する、多重特異性融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、多重特異性および多価の融合タンパク質である。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲに結合する。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲとそのリガンドＧＩＴＲ−リガンド（ＧＩＴＲ−Ｌ）の相互作用を遮断、阻害または別様に調節する。他の実施形態では、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲとＧＩＴＲ−Ｌの相互作用を遮断も、阻害も、別様に調節もしない。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、同じＧＩＴＲ−ＢＤの複数のコピーを組み込む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＩＴＲ上の同じエピトープを認識する複数のＧＩＴＲ−ＢＤを組み込む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＩＴＲ上の別個のエピトープを認識する複数のＧＩＴＲ−ＢＤを組み込む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲ−Ｌ相互作用を遮断するＧＩＴＲ−ＢＤもあり、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲ−Ｌ相互作用を遮断しないものもある、複数のＧＩＴＲ−ＢＤを組み込む。好ましい実施形態では、本開示のＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、腫瘍細胞の直接的な細胞死を誘導する。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、ＧＩＴＲに特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）配列の少なくとも１つのコピーを含む。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、ＧＩＴＲに特異的に結合するｓｄＡｂの２つまたはそれよりも多くのコピー、例えば、ＧＩＴＲに特異的に結合するｓｄＡｂの３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、または６つもしくはそれよりも多くのコピーを含む。
【０１１４】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、特異的抗原と選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。たった１２〜１５ｋＤａの分子量しか有さない単一ドメイン抗体は、２本のタンパク質重鎖および２本の軽鎖で構成されている通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりはるかに小さく、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ、１本の軽鎖と半分の重鎖）および一本鎖可変断片（約２５ｋＤａ、軽鎖からのものと重鎖からのものである２つの可変ドメイン）よりも小さい。
【０１１５】
単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例としては、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠いている抗体、通常の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、これらに限定されるものではないがマウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギおよび／またはウシを含む、いずれの種に由来してもよい。一部の実施形態では、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いている重鎖抗体として公知の、天然に存在する単一ドメイン抗体である。明確にするために、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４本鎖免疫グロブリンの通常のＶＨと区別するために本明細書ではＶＨＨとして公知である。そのようなＶＨＨ分子は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ種において、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて産生される抗体に由来しうる。Ｃａｍｅｌｉｄａｅ以外の他の種が、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生することもあり、そのようなＶＨＨは、本開示の範囲内である。
【０１１６】
ＧＩＴＲ  ＶＨＨ（ラマ由来）およびヒト化配列を下記にて示し、下記にて提示する配列中にＣＤＲ配列を示す。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ結合ｓｄＡｂは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は、二価であり、１分子当り２つのＧＩＴＲ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、２つのＧＩＴＲ結合ｓｄＡｂ（２ｘ）がＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は、四価であり、１分子当り４つのＧＩＴＲ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、３つのＧＩＴＲ結合ｓｄＡｂ（３ｘ）がＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は、六価であり、１分子当り６つのＧＩＴＲ結合ドメインを有する。
例示的ＧＩＴＲ結合ｓｄＡｂ
【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【０１１７】
一部の実施形態では、本開示のＧＩＴＲを標的にする融合タンパク質は、アミノ酸リンカーを介して作動可能に連結されている２つまたはそれよりも多くのポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、これらのリンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンで主として構成されており、本明細書ではＧＳリンカーとして表される。本開示の融合タンパク質のＧＳリンカーは、様々な長さのもの、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長のものであってもよい。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）２（配列番号１２）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）３（配列番号１３）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）４（配列番号１４）；およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）５（配列番号１５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、リンカーは、非限定的な例としてＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＧ（配列番号１７）およびＧＧＧＧＧＧ（配列番号１８）などの、グリシン残基を含む可撓性リンカーである。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ結合融合タンパク質は、ＧＳリンカーとグリシンリンカーの組合せを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、多価ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、四価である。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合する単離されたポリペプチド配列である）。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、本開示の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するヒト化または完全ヒトｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、四価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号８１〜９３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、多価ＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、六価である。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するヒト化または単離されたポリペプチド配列である）。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、本開示の六価ＧＩＴＲ標的化分子は、次の構造を有するＧＩＴＲ標的化融合タンパク質の２つのコピーを含む：（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−（ＧＩＴＲ−ＢＤ）−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（式中、ＧＩＴＲ−ＢＤは、ＧＩＴＲに結合するヒト化または完全ヒトｓｄＡｂ配列である）。一部の実施形態では、六価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１０６、１０９、１１２、１１７、１２０、１２５、１３１、１３８、１４３、１４８および１４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、配列番号１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２３、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４１、１４４および１４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、配列番号１０８、１１１、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２６、１２７、１２９、１３３、１３５、１４０、１４２、１４５、１４６および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む。一部の実施形態では、六価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号１９〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、六価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号４２〜６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、六価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号６３〜８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＧＩＴＲ−ＢＤを含有する。一部の実施形態では、六価ＧＩＴＲ標的化分子は、配列番号９４〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
本明細書に記載のＧＩＴＲ標的化タンパク質は、様々な治療、診断および予防適応に有用である。例えば、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、被験体における様々な疾患および障害の処置に有用である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、炎症性疾患もしくは障害に罹患している被験体または炎症性疾患もしくは障害のリスクがあると同定された被験体における疾患もしくは障害の処置、そのような疾患もしくは障害の症状の緩和、そのような疾患もしくは障害の改善、および／またはそのような疾患もしくは障害の進行の遅延に有用である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、がんもしくは他の新生物状態の処置、がんもしくは他の新生物状態の症状の緩和、がんもしくは他の新生物状態の改善、および／またはがんもしくは他の新生物状態の進行の遅延に有用である。一部の実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮／子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、食道がん、胃腸がん、膵がん、結腸直腸がん、結腸がん、腎がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、胚細胞がん、骨がん、肝がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、およびウイルス関連がんである。ある特定の実施形態では、がんは、転移性がん、難治性がん、または再発がんである。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、それを必要とする被験体の腫瘍内の制御性Ｔ細胞の数を低減または枯渇させるのに有用である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、被験体における免疫応答を刺激するのに有用である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、自己免疫疾患もしくは障害の処置、自己免疫疾患もしくは障害の症状の緩和、自己免疫疾患もしくは障害の改善、および／または自己免疫疾患もしくは障害の進行の遅延に有用である。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化タンパク質は、ウイルス、細菌および寄生生物感染症の処置、そのような感染症の症状の緩和、そのような感染症の改善、ならびに／またはそのような感染症の進行の遅延に有用である。
【０１２４】
本開示のＧＩＴＲ標的化分子を含む、本開示の治療製剤は、被験体におけるＧＩＴＲの異常な活性および／もしくは発現に関連する疾患もしくは障害を処置するために、またはそのような疾患もしく障害に関連する症状を緩和するために使用される。治療レジメンは、様々な臨床および／または検査室手順のいずれかを含む標準的な方法を使用して、ＧＩＴＲの異常な活性および／または発現に関連する疾患または障害に罹患している（またはそのような疾患もしくは障害を発現するリスクがある）被験体、例えば、ヒト患者を同定することにより行われる。用語、患者は、ヒトおよび獣医学的被験体を含む。用語、被験体は、ヒトおよび他の哺乳動物を含む。
【０１２５】
ＧＩＴＲの異常な活性および／または発現に関連する特定の疾患または障害を診断または処置するための任意の公知の方法に関連して処置の効能が決定される。ＧＩＴＲの異常な活性および／または発現に関連する疾患または障害の１つまたは複数の症状の緩和は、ＧＩＴＲ標的化分子が臨床的利益をもたらすことを示す。
【０１２６】
本開示のＧＩＴＲ標的化分子の治療的使用は、１つまたは複数のさらなる薬剤の投与を含むこともある。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなる薬剤は、抗ＧＩＴＲ抗体もしくは融合タンパク質、抗ＰＤ１抗体もしくは融合タンパク質、ＬＡＧ−３抗体もしくは融合タンパク質、ＣＴＬＡ−４抗体もしくは融合タンパク質、および／またはＰＤ−Ｌ１抗体もしくは融合タンパク質である。
【０１２７】
本発明のＧＩＴＲ標的化分子を単独で投与してもよく、または他の処置方法とともに投与してもよい。それらを、他の処置方法、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、または別の治療用ポリペプチド／抗体などの生物製剤の投与の前に提供してもよく、そのような他の処置方法と実質的に同時に提供してもよく、またはそのような他の処置方法の後に提供してもよい。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明のＧＩＴＲ標的化分子を化学療法剤と併用してもよい。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣｙｔｏｘａｎ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ダイネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルフィノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメテレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；副腎皮質ホルモン合成阻害薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベルカリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）パクリタキセルのクレモフォール不含、アルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、イリノイ州）、およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）；クロラムブシル；Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵおよびロイコボリンを伴うイリノテカンの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン（オキサリプラチン処置レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含む）；細胞増殖を低減させるＰＫＣ−アルファ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ｈ−Ｒａｓ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））およびＶＥＧＦ−Ａ阻害剤、ならびに上記もののいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
さらなる非限定的例示的化学療法剤としては、がんに対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤および選択的エステロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦａｒｅｓｔｏｎ（登録商標）トレミフェンを含む）；副腎におけるエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、Ｍｅｇａｓｅ（登録商標）酢酸メゲストロール、Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、Ｒｉｖｉｓｏｒ（登録商標）ボロゾール、Ｆｅｍａｒａ（登録商標）レトロゾールおよびＡｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）アナストロゾールなど；ならびに抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関係づけられるシグナル伝達経路における例えばＰＫＣ−アルファ、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓなどの遺伝子の発現を阻害するもの；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現阻害剤；ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えば、Ａｌｌｏｖｅｃｔｉｎ（登録商標）ワクチン、Ｌｅｕｖｅｃｔｉｎ（登録商標）ワクチンおよびＶａｘｉｄ（登録商標）ワクチン；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）ｒＩＬ−２；Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、Ａｂａｒｅｌｉｘ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに上記もののいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１３０】
一部の実施形態では、本発明のＧＩＴＲ標的化分子を抗血管新生剤と一緒に使用してもよい。血管新生剤は、血管新生、脈管形成または望ましくない血管透過性を直接または間接的に阻害する、小分子量物質、ポリヌクレオチオド（例えば、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡ）を含む）、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体またはそれらのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を指す。抗血管新生剤には血管新生因子またはその受容体に結合してその血管新生活性を遮断する薬剤が含まれることは、理解されるはずである。例えば、抗血管新生剤は、血管新生剤に対する抗体もしくは他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体（例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））もしくはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体もしくはＦｌｔ−１受容体）に対する抗体；抗ＰＤＧＦＲ阻害剤、例えばＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）；ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達を遮断する小分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）／ＳＵ１１２４８（スニチニブリンゴ酸塩）、ＡＭＧ７０６、または例えば国際特許出願ＷＯ２００４／１１３３０４に記載されているもの）である。抗血管新生剤には、ネイティブ血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含まれる。例えば、ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ（１９９１年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３巻：２１７〜３９頁；ＳｔｒｅｉｔおよびＤｅｔｍａｒ（２００３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２巻：３１７２〜３１７９頁（例えば、悪性黒色腫に関する抗血管新生療法を収載している表３）；ＦｅｒｒａｒａおよびＡｌｉｔａｌｏ（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５巻（１２号）：１３５９〜１３６４頁；Ｔｏｎｉｎｉら（２００３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２巻：６５４９〜６５５６頁（例えば、公知の抗血管新生因子を収載している表２）；ならびにＳａｔｏ（２００３年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、８巻：２００〜２０６頁（例えば、治験において使用された抗血管新生剤を収載している表１）を参照されたい。
【０１３１】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、他の抗腫瘍剤、例えば、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、ＣＴＬＡ４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ抗体イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、ＰＤ−１阻害剤（例えば、抗ＰＤ１抗体、ＢＭＳ−９３６５５８）、ＰＤＬ１阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ１抗体、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＰＤＬ２阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ２抗体）、サイトカイン、標的：ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、またはＶＥＧＦ受容体のうちの１つまたは複数と結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生物活性および有機化学薬剤などと組み合わせて使用される。
【０１３２】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子は、処置中および／または後に、１つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は、単一の治療用組成物に製剤化され、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は同時に投与される。あるいは、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は互いに別々であり、例えば、各々が別々の治療用組成物に製剤化され、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は同時に投与されるか、またはＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は処置レジメン中の異なる時点で投与される。例えば、ＧＩＴＲ標的化分子は、さらなる薬剤の投与前に投与され、ＧＩＴＲ標的化分子は、さらなる薬剤の投与後に投与され、またはＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は、交互の様式で投与される。本明細書に記載のＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は、単一用量でまたは複数用量で投与される。
【０１３３】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は、同時に投与される。例えば、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤を単一の組成物に製剤化することができ、または２つもしくはそれよりも多くの別々の組成物として投与することができる。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は、逐次的に投与され、またはＧＩＴＲ標的化分子およびさらなる薬剤は、処置レジメン中の異なる時点で投与される。
【０１３４】
所望の特異性を有するＧＩＴＲ標的化分子のスクリーニング方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素アッセイ、フローサイトメトリー、および当技術分野内で公知の他の免疫学的に媒介される技術が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
本開示は、本融合タンパク質をコードする核酸配列および特にＤＮＡ配列をさらに提供する。好ましくは、前記ＤＮＡ配列は、染色体外複製に適したベクター、例えば、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣまたはエピソームにより保有される。詳細には、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターは、本明細書に記載のＧＩＴＲ標的化分子を調製する方法および融合タンパク質の有意な量を得る方法を助長するために使用することができる。ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに挿入することができ、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。タンパク質コード配列を発現させるために様々な宿主−ベクター系を利用することができる。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌などの、微生物が含まれる。利用される宿主−ベクター系に依存して、多数の好適な転写および翻訳エレメントのいずれか１つを利用することができる。
【０１３６】
本開示は、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することによりＧＩＴＲ標的化分子を産生させる方法であって、前記細胞が、本明細書に記載のＧＩＴＲ標的化分子をコードする単離された核酸分子、および／またはこれらの単離された核酸配列を含むベクターを含む、方法も提供する。本開示は、ＧＩＴＲ標的化分子の発現をもたらす条件下で細胞を培養することによりＧＩＴＲ標的化分子を産生させる方法であって、前記細胞が、本明細書に記載のＧＩＴＲ標的化分子をコードする単離された核酸分子、および／またはこれらの単離された核酸配列を含むベクターを含む、方法を提供する。
【０１３７】
本開示の（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）融合タンパク質、ならびにそれらの誘導体、断片、類似体および同族体を、投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを典型的に含む。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことを意図したものである。好適な担体は、参照により本明細書に組み込まれる、当分野における標準参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好適な例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も使用されることがある。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１３８】
本開示の医薬組成物は、その所期の投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、腫瘍内、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁物は、次の構成成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用蒸留水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度を調整するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基で調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数用量バイアルに封入することができる。
【０１３９】
注射剤用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、および無菌注射用溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合、組成物は、無菌でなければならず、容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適する混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散物の場合は必要粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１４０】
無菌注射用溶液は、上に列挙した成分の１つまたは組合せを必要に応じて有する適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込み、その後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本の分散媒と上に列挙したものからのその他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１４１】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。それらをゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、液体担体を使用して口腔洗浄液として使用するために調製することもでき、この場合、前記液体担体中の化合物が経口適用され、口に含んですすぎ、吐き出されるか、または嚥下される。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有することができる：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはコーンスターチ；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテックス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または矯味矯臭剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料。
【０１４２】
吸入による投与のために、化合物は、好適な噴霧体、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーから、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１４３】
経粘膜または経皮手段により全身投与することもできる。経粘膜または経皮投与のために、浸透させることになるバリアに適した浸透剤が製剤化の際に使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与用は、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当技術分野において一般に公知であるような軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化される。
【０１４４】
化合物を直腸送達のために坐剤の形態に（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または停留浣腸の形態に調製することもできる。
【０１４５】
一実施形態では、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、活性化合物は、該化合物を身体からの急速な除去から保護することになる担体を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであるだろう。前記材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から購入することもできる。リポソーム懸濁物を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１４６】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のため単位剤形での経口または非経口組成物の製剤化は特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、処置すべき被験体のための単位投薬量として適している物理的に別個の単位であって、各単位が、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性化合物を含有する、前記単位を指す。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の特有の特徴、および達成される特定の治療効果、および個体の処置のためのそのような活性化合物の配合分野に固有の制限により決まり、そのような特徴、効果および制限に直接依存する。
【０１４７】
医薬組成物を投与についての指示と一緒にキット、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。これらの医薬組成物を使用のための指示とともに診断キットに含めることができる。
【０１４８】
医薬組成物は、特定の適応症の処置または予防に有効な量で投与される。治療有効量は、処置を受ける被験体の体重、被験体の身体もしくは健康状態、処置すべき状態の広範さ、または処置を受ける被験体の年齢に典型的に依存する。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り体重１ｋｇにつき約５０μｇ〜体重１ｋｇにつき約５０ｍｇの範囲の量で投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り体重１ｋｇにつき約１００μｇ〜体重１ｋｇにつき約５０ｍｇの範囲の量で投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り体重１ｋｇにつき約１００μｇ〜体重１ｋｇにつき約２０ｍｇの範囲の量で投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り体重１ｋｇにつき約０．５ｍｇ〜体重１ｋｇにつき約２０ｍｇの範囲の量で投与してもよい。
【０１４９】
一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇの範囲の量で投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り約２０ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲の量で投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り約２０ｍｇ〜約３００ｍｇの範囲の量で投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を１用量当り約２０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲の量で投与してもよい。
【０１５０】
医薬組成物を必要に応じて被験体に投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物の有効用量は、被験体に１回または複数回、投与される。様々な実施形態では、医薬組成物の有効用量は、被験体に月１回、月１回未満、例えば、２カ月ごとに、３カ月ごとに、または６カ月ごとに投与される。他の実施形態では、医薬組成物の有効用量は、月１回より多く、例えば、２週間ごとに、週１回、週２回、週３回、１日１回、または１日に複数回、投与される。医薬組成物の有効用量は、被験体に少なくとも１回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物の有効用量を複数回投与してもよく、これは、少なくとも１カ月、少なくとも６カ月または少なくとも１年間にわたっての投与を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、状態の１つまたは複数の症状を緩和するために必要に応じて被験体に投与される。
【０１５１】
別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学および専門用語は、当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈による別段の要求がない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語はその単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチオド化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野において周知の、一般に使用されているものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って行われるか、または当技術分野において一般に達成されているように行われるか、または本明細書に記載の通りに行われる。上述の技術および手順は、一般に、当技術分野において周知の、ならびに本明細書の至るところで引用され、論じられている様々な一般的なおよびより特異的な参考文献に記載されているような、従来の方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学ならびに医学および製薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにそれらの検査手技および技術は、当技術分野において周知の、一般に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化および送達、ならびに患者の処置には、標準的技術が使用される。用語、患者は、ヒトおよび獣医学的被験体を含む。
【０１５２】
本開示に従って利用される、下記の用語は、別段の指示がない限り、下記の意味を有すると理解されるものとする：
【０１５３】
本明細書で使用される用語「標的化融合タンパク質」および「抗体」は同義語でありうる。本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と特異的に免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「に特異的に結合する」または「と免疫反応する」または「に対する」は、抗体が、所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しない、またははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ発現ライブラリー、ならびに単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片、例えば、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、操作されたＶＨまたはＶＫが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
基本抗体構造単位が四量体を含むことは公知である。各四量体は、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する、同一の２対のポリペプチド鎖で構成されている。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する、約１００〜１１０またはそれよりも多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担当する定常領域を規定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤクラスのいずれかに関するものであり、これらのクラスは、分子内に存在する重鎖の性質が互いに異なる。ある特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのようなサブクラス（アイソタイプとしても公知）も有する。さらに、ヒトの場合、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖でありうる。
【０１５５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）または「モノクローナ抗体組成物」は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団のすべての分子において同一である。ｍＡｂは、該ｍＡｂに対する特有の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含有する。
【０１５６】
用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域」とも呼ばれる、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐にわたるストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知の、より高度に保存される隣接ストレッチ間に挿入されている。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリン中の超可変領域間にまたは超可変領域に隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合される抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）の定義に従っている。
【０１５７】
本開示の融合タンパク質の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片部分は、本明細書では互換的に、本明細書における標的化ポリペプチドと呼ばれる。
【０１５８】
本明細書で使用される用語「エピトープ」は、免疫グロブリンもしくはその断片またはＴ細胞受容体との／による特異的結合が可能な任意のタンパク質決定基を含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体との／による特異的結合が可能な任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基から通常はなり、特異的三次元構造特徴はもちろん、特異的電荷特徴も通常は有する。抗体は、解離定数が、≦１μＭ、例えば、≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭおよびより好ましくは≦１ｎＭであるとき、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１５９】
本明細書で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」および「特異的結合」は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的である抗原との間で起こるタイプの非共有結合性相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）によって表現することができ、Ｋｄが小さいほど大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を使用して定量することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離速度を測定することを必然的に伴い、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に同等に影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、「オンレート定数」（ｋｏｎ）と「オフレート定数」（ｋｏｆｆ）の両方を、濃度ならびに実際の会合および解離速度の計算により決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ、３６１巻：１８６〜８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比は、親和性に関係しないすべてのパラメータの削除を可能にし、解離定数Ｋｄに等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、５９巻、４３９〜４７３頁を参照されたい）。本開示の抗体は、アッセイ、例えば、放射リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー結合アッセイ、または当業者に公知の同様のアッセイにより測定して平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、および最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭであるとき、抗原と特異的に結合すると言われる。
【０１６０】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換の点で異なる。
【０１６１】
保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニンバリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１６２】
本明細書で論じられる、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列の小規模な変動は、そのアミノ酸配列の変動が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持することを条件に、本開示により包含されると企図される。特に、保存的アミノ酸置き換えが企図される。保存的置き換えは、側鎖に関連性があるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、（１）酸性アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸であるファミリー、（２）塩基性アミノ酸がリシン、アルギニン、ヒスチジンであるファミリー、（３）非極性アミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであるファミリー、および（４）非荷電極性アミノ酸がグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンであるファミリーに分けられる。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンおよびトレオニンを含む。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。アミノ酸の他のファミリーは、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、および（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを含む。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの孤立した置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連性のあるアミノ酸での同様の置き換えは、特に、その置き換えにフレームワーク部位内のアミノ酸が関与しない場合、結果として得られる分子の結合または特性に大きな影響を与えないと予想することは理にかなっている。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書中で詳細に説明される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体を当業者は容易に調製することができる。断片または類似体の好適なアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公開または専売の配列データベースと比較することにより同定することができる。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を使用して、公知の構造および／または機能の他のタンパク質中に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質コンホメーションドメインを同定する。公知の三次元構造に折り畳めるタンパク質配列を同定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：１６４頁（１９９１年）。したがって、上述の例は、本開示に従って構造的および機能的ドメインを定義するために使用されうる配列モチーフおよび構造コンホメーションを当業者には認識することができることを実証するものである。
【０１６３】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させるもの、（２）酸化に対する感受性を低減させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変化させるもの、（４）結合親和性を変化させるもの、および（４）そのような類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与または修飾するものである。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含むことができる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）行ってもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないはずである（例えば、置き換えアミノ酸は、親配列中に存在するヘリックスを破壊する傾向も、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を崩壊する傾向も、ないはずである）。当技術分野において認識されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．  Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻、１０５頁（１９９１年）に記載されている。
【０１６４】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドであって、しかし、残りのアミノ酸配列が、例えば完全長ｃＤＮＡ配列から推論される、天然に存在する配列内の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は、典型的には少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常は少なくとも５０アミノ酸長、およびよりいっそう好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用される用語「類似体」は、推論されるアミノ酸配列の一部分との実質的同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドであって、好適な結合条件下でＧＩＴＲとの特異的結合を有するポリペプチドを指す。典型的に、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関しての保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は、典型的には少なくとも２０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも５０アミノ鎖長であるか、それより長く、および多くの場合、天然に存在する完全長ポリペプチドと同様の長さでありうる。
【０１６５】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものに類似した特性を有する非ペプチド薬として製薬業界において一般に使用される。非ペプチド化合物のこれらのタイプは、「ペプチド模倣物」または「ペプチドミメティック」と称される。Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．、１５巻：２９頁（１９８６年）、ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、ＴＩＮＳ、３９２頁（１９８５年）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、３０巻：１２２９頁（１９８７年）。そのような化合物は、コンピュータ化された分子モデリングに補助されて開発されることが多い。治療的に有用なペプチドに構造的に類似しているペプチド模倣物を使用して、同等の治療または予防効果を生じさせることができる。一般に、ペプチドミメティックは、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、当技術分野において周知の方法により、１つまたは複数のペプチド結合が、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される結合によって任意選択で置き換えられている。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）での系統的置換を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列バリエーションを含む制約されたペプチドを、当技術分野において公知の方法（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１巻：３８７頁（１９９２年））により、例えば、ペプチドを環化する分子間ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基の付加により、生成することができる。
【０１６６】
用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、および／または生物材料から製造された抽出物を示すために本明細書では使用される。
【０１６７】
本明細書で使用される用語「標識する」または「標識された」は、放射標識されたアミノ酸の組み込み、または印を付けたアビジン（例えば、光学的方法もしくは熱量測定方法により検出することができる蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合を指す。ある特定の状況では、標識またはマーカーは、治療的であることもある。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、それらを使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、これらに限定されるものではないが次のものが挙げられる：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光性、ビオチニル基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）により認識される所定のポリペプチドエピトープが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、標識は、潜在的立体障害を低減させるために様々な長さのスペーサーアームにより結合される。本明細書で使用される用語「医薬品薬剤または薬物」は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。
【０１６８】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置すること」、「処置」などは、障害および／または障害に伴う症状の低減および／または改善を指す。「緩和する」および／または「緩和すること」は、例えばがんなどの疾患の発症または進行を減少させる、抑制する、減弱させる、弱める、抑止する、および／または安定化する、を意味する。障害または状態の処置が、障害、状態またはそれに関連する症状を完全に除去することを、除外しないが、必要ではないことは、理解されるであろう。
【０１６９】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらのものと見なされている意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ、同様に、用語「から本質的になること」または「本質的になる」は、米国特許法においてそれらのものと見なされている意味を有することができ、これらの用語は非限定的であり、したがって、列挙されているものの基本的または新規の特徴が、先行技術実施形態を除外するが列挙されているものより多くのものの存在により変化されない限り、列挙されているものより多くのものの存在を許容する。
【０１７０】
「有効量」は、未処置の患者と比較して疾患の症状を改善するために必要な量を意味する。疾患の治療的処置のための本開示の実施に使用される活性化合物の有効量は、投与様式、被験体の年齢、体重および全体的な健康に依存して変動する。最終的には、担当の医師または獣医師が適切な量および投薬レジメンを決定することになる。そのような量が「有効」量と呼ばれる。
【０１７１】
「被験体」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、齧歯動物、ヒツジ、霊長類、ラクダ科動物もしくはネコを含むがこれらに限定されない、哺乳動物を意味する。
【０１７２】
本明細書で使用される用語「投与すること」は、治療剤を、そのような薬剤での処置を必要とする被験体に移入、送達、導入または輸送する任意の様式を指す。そのような様式には、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内および皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの完全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含有する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有することがある。
【０１７４】
本明細書において提供される範囲は、範囲内の値のすべてについての省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０からなる群からの、任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【０１７５】
具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、単数または複数であると理解される。具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「または」は、包括的であると理解される。
【０１７６】
具体的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差以内と理解される。約は、述べられている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内と理解することができる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書において提供されるすべての数値は、用語「約」により修飾されている。
【０１７７】
本開示を以下の実施例でさらに説明することにするが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載の本開示の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１  ＧＩＴＲ標的化分子はＧＩＴＲに結合する）
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示すように、本開示の様々なＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、フローサイトメトリーにより評価して、ＣＨＯ細胞上で発現されるＧＩＴＲと結合する。ＧＩＴＲ抗体、ＴＲＸ−５１８を対照としてこれらの研究に使用した。
【０１７９】
ＣＨＯ細胞の表面で発現されたヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲに対する、本明細書ではｈｚＣ０６ｖ１．１（配列番号４２）、ｈｚＣ０６ｖ１．２（配列番号４３）、ｈｚＣ０６ｖ１．３（配列番号４４）、ｈｚＣ０６ｖ１．４（配列番号４５）、ｈｚＣ０６ｖ２．１（配列番号４６）、ｈｚＣ０６ｖ２．２（配列番号４７）、ｈｚＣ０６ｖ２．３（配列番号４８）、ｈｚＣ０６ｖ２．４（配列番号４９）、ｈｚＣ０６ｖ３（配列番号５０）、ｈｚＣ０６ｖ３．１（配列番号５１）、ｈｚＣ０６ｖ３．２（配列番号５２）、ｈｚＣ０６ｖ３．３（配列番号５３）、ｈｚＣ０６ｖ３．４（配列番号５４）、ｈｚＣ０６ｖ３．５（配列番号５５）、ｈｚＣ０６ｖ３．６（配列番号５６）、ｈｚＣ０６ｖ３．７（配列番号５７）、ｈｚＣ０６ｖ３．８（配列番号５８）、ｈｚＣ０６ｖ３．９（配列番号５９）、ｈｚＣ０６ｖ３．１０（配列番号６０）、ｈｚＣ０６ｖ３．１１（配列番号６１）、ｈｚＣ０６ｖ３．１２（配列番号６２）、ｈｚＣ０４ｖ４．１（配列番号６３）、ｈｚＣ０４ｖ４．１．２（配列番号６４）、ｈｚＣ０４ｖ４．２（配列番号６５）、ｈｚＣ０４ｖ４．２．２（配列番号６６）、ｈｚＣ０４ｖ５（配列番号６７）、ｈｚＣ０４ｖ１．２．１（配列番号６８）、ｈｚＣ０４ｖ５．１（配列番号６９）、ｈｚＣ０４ｖ５．２（配列番号７０）、ｈｚＣ０４ｖ５．３（配列番号７１）、ｈｚＣ０４ｖ５．４（配列番号７２）、ｈｚＣ０４ｖ５．５（配列番号７３）、ｈｚＣ０４ｖ５．６（配列番号７４）、ｈｚＣ０４ｖ５．７（配列番号７５）、ｈｚＣ０４ｖ５．８（配列番号７６）、ｈｚＣ０４ｖ５．９（配列番号７７）、ｈｚＣ０４ｖ５．１０（配列番号７８）、ｈｚＣ０４ｖ５．１１（配列番号７９）、およびｈｚＣ０４ｖ５．１２（配列番号８０）と呼ばれるＧＩＴＲ標的化分子の結合親和性を、フローサイトメトリーにより決定した。結果を図４Ａ〜４Ｅおよび５Ａ〜５Ｅに示す。
【０１８０】
（実施例２  ＧＩＴＲ標的化分子はＧＩＴＲとＧＩＴＲ−Ｌとの相互作用を遮断する）
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示すように、本開示の様々なＧＩＴＲ標的化融合タンパク質は、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を遮断することができた。簡単に言うと、これらの研究では、ＧＩＴＲ発現ＣＨＯ細胞および組換えＧＩＴＲＬを使用するフローサイトメトリーアッセイを使用して、遮断能力の評価を実行した。ＧＩＴＲ抗体、ＴＲＸ−５１８を対照としてこれらの研究に使用した。
【０１８１】
（実施例３  ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲに対するＧＩＴＲ標的化分子の結合親和性）
ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲ細胞外ドメインヒトＩｇＧ１融合タンパク質（ＧＩＴＲ−Ｆｃ）に対する、本明細書では二価ｈｚＣ０６ｖ３．９−ｈＩｇＧ１または２ｘ  ｈｚＣ０６ｖ３．９−ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号９３）と呼ばれるＧＩＴＲ標的化分子の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により決定した。簡単に言うと、ビオチン化ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃをチップ表面に捕捉し、次いで二価ｈｚＣ０６ｖ３．９−ｈＩｇＧ１を１０種の濃度（０ｎＭ〜６００ｎＭ）で、４０ｕｌ／分で１２０秒間注入した。解離を２４０秒間追跡した。ｋａ１、ｋｄ１、およびＫＤ１を下の表において報告する。
【表１】
2018523493.tif 000035
【０１８２】
（実施例４  初代ヒトＴ細胞に対するＧＩＴＲ標的化分子の結合）
初代ヒトＴ細胞に対する、本明細書では四価ｈｚＣ０６−ｈＩｇＧ１と呼ばれる本開示の抗ＧＩＴＲ分子の能力を本明細書では評価した。四価ｈｚＣ０６−ｈＩｇＧ１は、配列番号９３のＧＩＴＲ標的化分子の２つのコピーを用いて構築し、そしてまた前記ＧＩＴＲ結合分子は、配列番号１のヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合した配列番号５９の単一ドメイン可変領域（ｓｄＡｂ）の２つのタンデムコピーを用いて構築する。
【０１８３】
健常ヒトドナーから蛍光活性化セルソーティングによって単離した全ＰＢＭＣまたは精製Ｔｒｅｇを調製した。組換えヒトＩＬ２を補充した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化した。細胞を様々な濃度の四価ｈｚＣ０６−ｈＩｇＧ１および表面表現型決定用抗体カクテルとともにインキュベートした。次いで試料を洗浄し、蛍光標識抗ｈＩｇＧ二次抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーにより評価した。活性化ＣＤ４  Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ２５での染色により同定した。これらの研究の結果を、３名のドナーからの活性化ＣＤ４  Ｔ細胞（黒塗り記号、実線）および２名のドナーからの活性化Ｔｒｅｇ（白抜き記号、破線）について図７に示す。
【０１８４】
（実施例５  ＧＩＴＲ標的化分子はＮＦ−ｋＢシグナル伝達を活性化する）
四価抗ＧＩＴＲ標的化分子は、ＧＩＴＲを発現するレポーター細胞株におけるＮＦ−ｋＢシグナル伝達を活性化した。本明細書に記載する研究は、本開示の２つの四価ＧＩＴＲ標的化分子を使用した。第１の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、本明細書では２ｘ  ｈｚＣ０６ｖ３．９  ＩｇＧ１−Ｆｃ（配列番号９３）と呼ばれるＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含み、そしてまた前記ＧＩＴＲ結合融合タンパク質は、ｈｚＣ０６ｖ３．９  ＧＩＴＲ−ＢＤ（配列番号５９）および配列番号１のＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドの２つのコピーを含む。第２の四価ＧＩＴＲ標的化分子は、本明細書では２ｘ  Ｃ０６  ＩｇＧ１−Ｆｃと呼ばれるＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含み、そしてまた前記ＧＩＴＲ結合融合タンパク質は、Ｃ０６  ＧＩＴＲ−ＢＤ（配列番号２２）および配列番号１のＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドの２つのコピーを含む。
【０１８５】
ＮＦ−ｋＢに駆動される分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を含有するＨＥＫ２９３細胞株にヒトＧＩＴＲ（図８Ａ）またはカニクイザルＧＩＴＲ（図８Ｂ）を安定的にトランスフェクトした。それらの細胞株を、力価測定用量（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）の四価ＧＩＴＲ抗体とともに一晩、３７℃でインキュベートした。６５０ｎＭでの光学密度により測定する基質の加水分解によってＳＥＡＰレポーター遺伝子発現を定量した。
【０１８６】
（実施例６  腫瘍モデルにおけるＧＩＴＲ標的化分子）
図９Ａ〜９Ｃに示すように、本開示のＧＩＴＲ標的化分子での処置は、投与日に関係なくＣＴ２６腫瘍成長を有意に低減させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下接種し、本明細書では２ｘ  Ｃ０６−ＩｇＧ１  Ｆｃと呼ばれるＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む（そしてまた、前記ＧＩＴＲ結合融合タンパク質が、配列番号２２のＧＩＴＲ−ＢＤおよび配列番号１のヒトＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチド配列の２つのコピーを含む）四価Ｃ０６−ｈＩｇＧ１、または対照としてのヒトＩｇＧ１−Ｆｃを、７日目（図９Ａ）、９日目（図９Ｂ）または１１日目（図９Ｃ）に投与し、これらの時点で平均腫瘍体積は、１２５、２３０または３１０ｍｍ３であった。四価Ｃ０６−ＩｇＧ１  Ｆｃ処置は、処置日に関係なく投与の６〜８日後に開始して、ヒトＦｃと比較して腫瘍成長の有意な低減をもたらした（ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定により決定）。
【０１８７】
図１０に示すように、本開示のＧＩＴＲ標的化分子での処置は、ＣＴ２６腫瘍成長の用量依存性抑制を生じさせた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下接種し、本明細書では２ｘ  Ｃ０６−ｍＩｇＧ１  ２ａ  Ｆｃと呼ばれるＧＩＴＲ結合融合タンパク質の２つのコピーを含む四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａであって、そしてまた、前記ＧＩＴＲ結合融合タンパク質が、配列番号２２のＧＩＴＲ−ＢＤおよびマウスＩｇＧ２ａ配列の２つのコピーを含む、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａ、または対照としての非特異的ｍＩｇＧ２ａを、９日目（近似的腫瘍体積２６０ｍｍ３）に投与した。四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａ処置は、２．５、０．２５、０．０８または０．０２５ｍｇ／ｋｇで投与したとき対照と比較して腫瘍体積の有意な低減をもたらした（ｐ＜０．０５）。０．００８ｍｇ／ｋｇで投薬した四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａは、ＣＴ２６腫瘍成長を有意に抑制しなかった。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡと、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａ群のｍＩｇＧ２ａとの多重比較により決定した。
【０１８８】
図１１Ａ〜１１Ｂに示すように、本開示のＧＩＴＲ標的化分子での処置は、ＭＣ３８腫瘍成長の用量依存性抑制を生じさせた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８結腸直腸癌細胞を皮下接種し、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａまたは対照としての非特異的ｍＩｇＧ２ａを７日目（平均腫瘍体積１１０〜１１５ｍｍ３）に投与した。０．０８またはそれより上の用量での四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａの投与は、１４日目に開始して、ｍＩｇＧ２ａ対照と比較して有意な腫瘍成長低減をもたらした（ｐ＜０．０５）（図１１Ａ）。０．０２５での四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａ処置は、１８日目に開始して、ｍＩｇＧ２ａ対照と比較して腫瘍成長を有意に低減させた（ｐ＜０．０５）。０．００８ｍｇ／ｋｇで投薬した四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａは、ＭＣ３８腫瘍成長を有意に抑制しなかった。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡと、Ｃ０６群のＩｇＧ２ａとの多重比較により決定した。ＭＣ３８接種後２０日目の個々の腫瘍体積を図１１Ｂに示す。この時点での２．５、０．２５および０．０８ｍｇ／ｋｇ処置群における腫瘍成長の低減は同様である。
【０１８９】
（実施例７  ＣＴ２６腫瘍成長の阻害に対するＦｃ機能の影響）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下接種し、野生型Ｆｃを有するか、Ｆｃ受容体との結合を遮断するためのＮ２９７Ｇ変異を有する（ｍＩｇＧ２ａ−サイレント）、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａを９日目（平均腫瘍体積２６０ｍｍ３）に投与した。非特異的ｍＩｇＧ２ａ、抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ１−ｍＩｇＧ２ａ、および抗ＧＩＴＲ対照ｍＡｂ１−ｍＩｇＧ２ａ−サイレントを対照として使用した。図１２Ａに示すように、野生型Ｆｃを有する四価Ｃ０６は最も強力であったが、野生型形式とサイレント形式両方が、対照と比較して腫瘍成長を有意に低減させた（ｐ＜０．０５）。ｍＡｂ１は、野生型Ｆｃ形式で投与した場合にのみＣＴ２６成長を阻害した。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡと、処置群のｍＩｇＧ２ａとの多重比較により決定した。ＣＴ２６接種後２２日目の個々の腫瘍体積を図１２Ｂに示す。四価Ｃ０６のＦｃ野生型形式とサイレント形式間の腫瘍成長の差は有意でないが、形式は、腫瘍成長を抑制するｍＡｂ１の能力について有意であった。カプラン・マイヤー分析は、野生型Ｆｃを有する四価Ｃ０６での処置がＣＴ２６担持マウスの生存を有意に向上させることができることを示す（図１２Ｃ）。１０日目の四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａの単回投与は、メジアン生存を、ｍＩｇＧ２ａ対照群についての２０日と比較して６６日に延長する。
【０１９０】
（実施例８  ＧＩＴＲ標的化分子での処置は再負荷に対する抵抗性をもたらす）
四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａ誘導ＣＴ２６拒絶を被ったマウスは、再負荷に対して抵抗性であった。四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａでの処置によりＣＴ２６腫瘍を拒絶したＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６、Ｒｅｎｃａ、またはＥＭＴ６マウス腫瘍細胞株を再接種した。図１３Ａに示すように、以前にＣＴ２６を拒絶したマウスは、このモデルの後続の再接種時に腫瘍成長に対して完全に抵抗性であった。重要なこととして、年齢を一致させた未処置マウスは、ＣＴ２６腫瘍成長を実証した。図１３Ｂに示すように、Ｒｅｎｃａ腫瘍は、以前にＣＴ２６を拒絶したマウスではあまり成長しなかった。実際、４匹のマウスのうちの２匹は、完全に抵抗性であり、１匹のマウスは、年齢を一致させた未処置対照と比較してＲｅｎｃａ成長の顕著な低減を有した。ＲｅｎｃａはＣＴ２６とＴ細胞エピトープを共有し、これは、Ｔ細胞媒介免疫が誘導されることを示唆している。図１３Ｃに示すように、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、それらが、Ｃ０６処置により前もってＣＴ２６を除去したか、または未処置であったかにかかわらず、ＥＭＴ６腫瘍がよく成長する。ＥＭＴ６はＣＴ２６とＴ細胞エピトープを共有しない。
【０１９１】
（実施例９  Ｔ細胞に対するＧＩＴＲ標的化分子での処置の効果）
処置は、Ｔｒｅｇ頻度を有意に低下させ、腫瘍微小環境内のＴエフェクター細胞に対する比を変化させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下接種し、野生型Ｆｃを有するか、Ｆｃ受容体との結合を遮断するためのＮ２９７Ｇ変異を有する（ｍＩｇＧ２ａ−サイレント）、２．５ｍｇ／ｋｇの四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａを９日目に投与した。非特異的ｍＩｇＧ２ａを対照として使用した。処置の３日後に末梢血および腫瘍を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。図１４Ａに示すように、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａでの処置は、循環Ｔｒｅｇ、通常のＣＤ４  Ｔ細胞（４Ｔｃｏｎ）、およびＣＤ８  Ｔ細胞（８Ｔ）の頻度を有意に低下させた（ｐ＜０．０５）。ｍＩｇＧ２ａ−サイレント形式では効果が観察されなかった。図１４Ｂに示すように、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａでの処置は、腫瘍内Ｔｒｅｇおよび通常のＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を有意に低下させた（ｐ＜０．００１）が、ＣＤ８  Ｔ細胞を変化させなかった。ｍＩｇＧ２ａ−サイレント形式では効果が観察されなかった。図１４Ｃに示すように、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａによるＴｒｅｇの強力な低減の結果として、腫瘍内でのエフェクターＴ細胞のＴｒｅｇに対する比が有意に増加された（ｐ＜０．０５）。統計的有意性を対応のない両側ｔ検定によって決定した。
【０１９２】
（実施例１０  Ｔ細胞活性化および増殖に対するＧＩＴＲ標的化分子の効果）
処置は、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化および増殖を有意に誘導した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下接種し、野生型Ｆｃを有するか、Ｆｃ受容体との結合を遮断するためのＮ２９７Ｇ変異を有する（ｍＩｇＧ２ａ−サイレント）、２．５ｍｇ／ｋｇの四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａを９日目に投与した。非特異的ｍＩｇＧ２ａを対照として使用した。処置の１２日後に末梢血をフローサイトメトリーにより分析した。図１５Ａに示すように、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａでの処置は、循環ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を有意に誘導した（ｐ＜０．００５）が、Ｔｒｅｇおよび通常のＣＤ４  Ｔ細胞を変化させなかった。ｍＩｇＧ２ａ−サイレント形式ではこの効果が観察されなかった。図１５Ｂに示すように、ＣＤ８  Ｔ細胞も、四価Ｃ０６−ｍＩｇＧ２ａでの処置後に活性化された増殖性の表現型（ＣＤ６２Ｌ−Ｋｉ６７＋）をとった。統計的有意性を対応のない両側ｔ検定によって決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018523493.tif 000043
【図９】
2018523493.tif 000044
【図１０】
2018523493.tif 000045
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018523493.tif 000048
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018523493.tif 000052
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