(57)【要約】本発明は、ダイマータンパク質の融合構築物に関し、このタンパク質の部分は、抗体のＣＨ１ドメインまたはＣＬドメインのいずれかに融合している。これらの融合構築物は、ダイマータンパク質の安定性、溶解性、循環半減期および産生収率を改善する。例えば、血液凝固因子について、２つの別々のポリペプチド鎖を含む活性形態に既になっているタンパク質の産生は、単鎖タンパク質に必要な活性化ステップが人工的にまたは患者の体内のいずれにおいても回避されるので、特に有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、前記第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的のタンパク質の第１の部分を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している前記目的のタンパク質の第２の部分を含む、ヘテロマー。
【請求項２】
前記第１の部分および前記第２の部分が、前記ヘテロマー中で前記目的のタンパク質を形成する、請求項１に記載のヘテロマー。
【請求項３】
前記目的のタンパク質が、活性化血液凝固因子およびゴナドトロピンからなる群から選択される、請求項１または２に記載のヘテロマー。
【請求項４】
前記目的のタンパク質が、フィブリン、トロンビン、第Ｖａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子および第ＸＩＩＩａ因子からなる群から選択される活性化血液凝固因子である、請求項３に記載のヘテロマー。
【請求項５】
前記目的のタンパク質が活性化血液凝固因子であり、前記第１の部分が前記活性化血液凝固因子の軽鎖であり、前記第２の部分が前記活性化血液凝固因子の重鎖である；または前記第１の部分が前記活性化血液凝固因子の重鎖であり、前記第２の部分が前記活性化血液凝固因子の軽鎖である、請求項３または４に記載のヘテロマー。
【請求項６】
前記目的のタンパク質が第ＶＩＩａ因子であり、前記第１の部分が第ＶＩＩａ因子の軽鎖であり、前記第２の部分が第ＶＩＩａ因子の重鎖である；または前記第１の部分が第ＶＩＩａ因子の重鎖であり、前記第２の部分が第ＶＩＩａ因子の軽鎖である、請求項３から５のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項７】
前記目的のタンパク質が、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよび甲状腺刺激ホルモンからなる群から選択されるゴナドトロピンである、請求項３に記載のヘテロマー。
【請求項８】
前記目的のタンパク質がゴナドトロピンであり、前記第１の部分が前記ゴナドトロピンのアルファ鎖であり、前記第２の部分が前記ゴナドトロピンのベータ鎖である；または前記第１の部分が前記ゴナドトロピンのベータ鎖であり、前記第２の部分が前記ゴナドトロピンのアルファ鎖である、請求項３または７に記載のヘテロマー。
【請求項９】
第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、前記第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的の第１のタンパク質を含み、前記第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している目的の第２のタンパク質を含む、ヘテロマー。
【請求項１０】
前記目的の第１のタンパク質および／または前記目的の第２のタンパク質が、プロタンパク質としてのまたは活性化形態の、フィブリン、トロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子を含む血液凝固因子；ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧおよびＴＳＨを含むゴナドトロピン；ならびに単鎖抗体断片、例えば、１つのポリペプチド中に抗体の単一のアームの重鎖および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項９に記載のヘテロマー。
【請求項１１】
前記ＣＨ１ドメインが、前記目的の第１の部分もしくは第１のタンパク質それぞれのＣ末端に融合し、および／または前記ＣＬドメインが、前記目的の第２の部分もしくは第２のタンパク質それぞれのＣ末端に融合している、請求項１から１０のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項１２】
リンカー配列が、前記目的の第１の部分もしくは第１のタンパク質それぞれと前記ＣＨ１ドメインとの間、および／または前記目的の第２の部分もしくは第２のタンパク質それぞれと前記ＣＬドメインとの間に存在する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項１３】
前記第１の融合ポリペプチドおよび／または前記第２の融合ポリペプチドが、さらなる融合パートナーを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項１４】
前記さらなる融合パートナーが、アルブミン、抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３部分、エラスチン様ポリペプチド、アルブミン結合ドメイン、Ｈｉｓタグならびにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグからなる群から選択される、請求項１３に記載のヘテロマー。
【請求項１５】
前記さらなる融合パートナーが、抗体のＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを含まない、請求項１３に記載のヘテロマー。
【請求項１６】
前記ＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体に由来する、請求項１から１５のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項１７】
前記ＣＬドメインが、Ｃκ軽鎖に由来する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項１８】
薬における使用のための、請求項１から１７のいずれか一項に記載のヘテロマー。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の前記第１の融合ポリペプチドおよび／または前記第２の融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のヘテロマーを産生する方法であって、前記第１の融合ポリペプチドおよび前記第２の融合ポリペプチドが宿主細胞において発現される、方法。
【請求項２２】
前記第１の融合ポリペプチドおよび前記第２の融合ポリペプチドが、同じ宿主細胞において共発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の融合ポリペプチドおよび前記第２の融合ポリペプチドが、前記宿主細胞によって分泌される、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ダイマー化が２つの抗体ドメインによって提供される、融合ポリペプチドのヘテロマーに関する。特に、抗体のＣＨ１ドメインは、タンパク質の第１の部分に融合し、抗体のＣＬドメインは、このタンパク質の第２の部分に融合している。ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを介したダイマー化によって、このタンパク質は、２つの部分によって形成される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液凝固は、ヒトまたは動物の身体において創傷を封鎖するための重要な天然プロセスである。血液凝固は、フィブリン血栓を最終的に生じる、種々の血液成分の複雑な相互作用からなる。血液成分である、凝固カスケードに関与する凝固因子は、タンパク質分解性切断によってプロテアーゼ酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質であるプロ酵素である。それによって、１つの凝固因子が次の凝固因子を切断して活性化する凝固カスケードが形成される。かかる変換を受けた凝固因子は、一般に「活性化因子」と呼ばれ、小文字の接尾辞「ａ」を付けることによって表される（例えば、第ＶＩＩａ因子）。凝固因子は一般に、下流タンパク質を切断することによって作用するセリンプロテアーゼである。これらのセリンプロテアーゼ因子の例は、トロンビンならびに第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子および第ＸＩＩ因子である。
【０００３】
第ＶＩＩ因子は、約５０ｋＤａの分子量を有する単鎖糖タンパク質である。第ＶＩＩ因子のＶＩＩａへの活性化は、第ＸＩＩａ因子などのいくつかの異なる血漿プロテアーゼによって触媒され得る。第ＶＩＩ因子の活性化は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって一緒になった２つのポリペプチド鎖、２８ｋＤａの重鎖および１７ｋＤａの軽鎖の形成を生じる。第ＩＸ因子はまた、５７ｋＤａの単鎖前駆体であり、第ＸＩａ因子による切断により活性セリンプロテアーゼ（第ＩＸａ因子）に変換される。第ＩＸａ因子は、１６ｋＤａの軽鎖および２９ｋＤａの重鎖からなる。
【０００４】
種々の凝固因子、例えば、特に第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子は、血友病の処置における薬において、または制御できない出血を予防するために使用される。治療では、プロ酵素が投与され得、これは次いで、患者の凝固カスケードによって身体中で活性化される。不活性な因子は一般に、患者の身体中で部分的にのみ活性化され、活性化の速度は、異なる患者において変動し得るので、この薬物の投薬には不確実性が伴う。別のアプローチでは、因子は、患者への投与前に人工的に活性化される。しかし、このアプローチは、特異的な活性化ステップを必要とし、因子も活性化ステップの間に分解され得るので、制御が困難である。その活性形態が２つの別々の部分またはサブユニットからなる他の治療用タンパク質も同様の問題が伴う。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、改善された特性を有するダイマーまたはマルチマータンパク質の産生のための手段を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明者らは、２つまたはそれ超のポリペプチド鎖（サブユニット）からなるタンパク質、例えば、活性化凝固因子、特に第ＶＩＩａ因子が、第１の部分が抗体のＣＨ１ドメインに融合し、第２の部分が抗体のＣＬドメインに融合している、２つの融合ポリペプチド構築物を使用する組換え発現によって産生され得ることを見出した。不活性単鎖タンパク質として通常産生され、２つの別々のポリペプチド鎖への切断によって活性化される必要があるタンパク質、例えば、血液凝固因子について、２つの別々のポリペプチド鎖を含む活性形態に既になっているタンパク質の産生は、単鎖タンパク質に必要な活性化ステップが人工的にまたは患者の体内のいずれにおいても回避されるので、特に有利である。
【０００７】
ＣＨ１／ＣＬ融合ポリペプチドとしての産生は、タンパク質の安定性および循環半減期をさらに増加させる。患者の循環中の血液凝固因子の半減期は、処置における重要な因子である。特に、血友病などの先天性疾患の処置では、血液凝固因子は、患者に継続的に投与される。したがって、延長された半減期を有する治療薬は、必要とされる薬物の量および投与の回数を低減させる。したがって、ＣＨ１−ＣＬヘテロマーの使用は、第ＶＩＩ因子などの血液凝固因子に特に有利である。
【０００８】
したがって、第１の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的のタンパク質の第１の部分を含み、第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している目的のタンパク質の第２の部分を含む、ヘテロマーを提供する。このヘテロマーでは、第１の部分および第２の部分は、目的のタンパク質を形成するように集合している。１つの具体的な例は、第ＶＩＩａ因子であり、第１の部分は、第ＶＩＩａ因子の軽鎖に由来し、第２の部分は、第ＶＩＩａ因子の重鎖に由来する。
【０００９】
第２の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的の第１のタンパク質を含み、第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している目的の第２のタンパク質を含む、ヘテロマーに関する。このヘテロマーでは、特に、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、タンパク質複合体を形成するように集合している。
【００１０】
第３の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび／または第２の融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。第４の態様では、本発明は、この核酸を含む細胞を提供する。
【００１１】
第５の態様では、本発明は、第１または第２の態様に従うヘテロマーを産生する方法であって、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドが、哺乳動物細胞において発現される、方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の目的、特色、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から、当業者に明らかとなる。しかし、本出願の好ましい実施形態を示す以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体的な例は、例示として与えられているに過ぎないことを理解すべきである。開示された発明の精神および範囲内の種々の変化および改変は、以下を読めば当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Ｎ末端からＣ末端へと、第ＶＩＩａ因子の軽鎖、ＣＨ１ドメイン、および血清アルブミン（（Ｂ）のみ）を含む第１のポリペプチドならびにＮ末端からＣ末端へと、第ＶＩＩａ因子の重鎖およびＣＬドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロマーの模式図を示す。
【図２】図２は、３つの第ＶＩＩａ因子アルブミン構築物のウエスタンブロット分析を示す（実施例２を参照のこと）。ＦＶＩＩａ、ｉＳＮ：それぞれ、陽性対照および陰性対照；ＭＷ：分子量マーカー；構築物１、２、３：試験した構築物；左：還元条件、（１）ＣＨ１ドメインおよびアルブミンに融合している第ＶＩＩａ因子軽鎖、ならびに（２）ＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子重鎖への、発現されたタンパク質の解離を生じる；右：非還元条件、発現されたダイマータンパク質は会合したままである（３）。
【図３】図３は、（Ａ）３つの異なる希釈における、発色性ＣＯＡＳＥＴ（登録商標）ＦＶＩＩアッセイによって決定された、第ＶＩＩａ因子ヘテロダイマーアルブミン構築物１、２および３のタンパク質分解活性；ならびに（Ｂ）第ＶＩＩ因子アルブミン単鎖構築物と比較した、第ＶＩＩａ因子ヘテロダイマーアルブミン構築物のトロンビン活性化を示す（実施例３を参照のこと）。
【図４】図４は、３つの異なる希釈における、発色性ＣＯＡＳＥＴ（登録商標）ＦＶＩＩアッセイによって決定された、第ＶＩＩａ因子ヘテロダイマーＦｃテイル含有構築物のタンパク質分解活性を示す（実施例４を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書で使用する場合、以下の表現は、それらが使用される文脈が他を示す場合を除き、以下に示される意味を好ましくは有することを一般に意図する。
【００１５】
表現「含む」は、本明細書で使用する場合、その文字通りの意味以外に、表現「から本質的になる」および「からなる」もまた含み、これらを具体的に指す。したがって、表現「含む」とは、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を含まない実施形態、ならびに具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を包含し得るおよび／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、表現「有する」は、表現「含む」と理解すべきであり、これもまた、表現「から本質的になる」および「からなる」を含み、これらを具体的に指す。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸の分子鎖を指す。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸ならびに人工アミノ酸のいずれかを含み得、生物起源もしくは合成起源であり得る。ポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、ヒドロキシル化および／またはリン酸化によって、天然に（翻訳後修飾）または合成により修飾され得る。ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含むが、任意の特定の長さのものである必要はない；この用語は、いずれのサイズ制限も含まない。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１５０アミノ酸を含む。
【００１７】
用語「抗体」とは、特に、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。重鎖定常領域は、３つの重鎖定常ドメイン、またはＩｇＭ型もしくはＩｇＥ型の抗体の場合には４つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含み、第１の定常ドメインＣＨ１は、可変領域に隣接し、ヒンジ領域によって第２の定常ドメインＣＨ２に接続され得る。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン（ＣＬ）のみからなる。
【００１８】
特に、抗体は、任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２を含む、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭのものであり得る。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体、特にＩｇＧ１抗体である。重鎖定常領域は、任意の型、例えば、γ型、δ型、α型、μ型またはε型の重鎖のものであり得る。好ましくは、抗体の重鎖は、γ鎖である。さらに、軽鎖定常領域もまた、任意の型、例えば、κ型またはλ型の軽鎖のものであり得る。好ましくは、抗体の軽鎖は、κ鎖である。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体の場合には２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む全長抗体である。具体的な実施形態では、用語「抗体」とは、天然に存在する抗体、特に天然に存在するヒト抗体を指す。
【００１９】
標的アミノ酸配列は、その標的アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列の対応する一部分と、その長さ全体にわたって、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％または少なくとも９７％の相同性または同一性を共有する場合、参照アミノ酸配列に「由来する」。例えば、融合ポリペプチドのＣＨ１ドメインが、特定の抗体のＣＨ１ドメインに由来する場合、融合ポリペプチドのＣＨ１ドメインのアミノ酸は、抗体のＣＨ１ドメインと、その長さ全体にわたって、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％または少なくとも９７％の相同性または同一性を共有する。例えば、特定の抗体のＣＬドメインに由来する融合ポリペプチドのＣＬドメインについても、同じことが当てはまる。特定の実施形態では、参照アミノ酸配列に「由来する」標的アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の対応する一部と、その長さ全体にわたって、１００％相同、または特に１００％同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、好ましくは、参照配列の長さ全体にわたって、または相同性もしくは同一性が規定される配列に対応する参照配列の対応する一部の長さ全体にわたって、本発明に従って決定される。
【００２０】
タンパク質またはポリペプチドの用語「一部」とは、特に、タンパク質またはポリペプチドの特性のうち１つまたは複数を示す機能的一部を指す。特に、タンパク質またはポリペプチドが、特異的な酵素活性または結合能を有する場合、そのタンパク質またはポリペプチドの一部もまた、任意選択でより低い程度またはレベルで、特異的な酵素活性または結合能を有する。タンパク質またはポリペプチドの一部は、特に、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも２０％、特に、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を包含する。
【００２１】
用語「患者」とは、特に、動物またはヒト、特に哺乳動物を指す。具体的な実施形態では、患者はヒトである。
【００２２】
用語「医薬組成物」および同様の用語は、特に、ヒトまたは動物への投与に適切な組成物、即ち、薬学的に許容される成分を含む組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤または薬学的賦形剤、例えば、緩衝液、防腐剤および等張化剤と一緒に、活性化合物またはその塩もしくはプロドラッグを含む。
【００２３】
発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的のタンパク質の第１の部分を含み、第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している目的のタンパク質の第２の部分を含む、ヘテロマーを提供する。
【００２４】
ヘテロマーは、２つの部分を含む目的のタンパク質を提供するために使用される。タンパク質の各部分は、別々のポリペプチド鎖によって形成される。これらの部分のアセンブリを介して、目的のタンパク質は、特に、機能的形態で得られる。本発明によれば、タンパク質の部分の一方が抗体のＣＨ１ドメインに融合し、他方の部分が抗体のＣＬドメインに融合している。本発明だけを目的として、ＣＨ１ドメインに融合している部分は、「第１の部分」と称し、ＣＬドメインに融合している部分は、「第２の部分」と称する。指示子「第１の」および「第２の」は、これらの部分を識別するためだけに使用されるのであって、これらの部分のいずれの順序も示すものではない。ある特定の実施形態では、ヘテロマーは、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドからなる。これらの実施形態では、ヘテロマーは、ヘテロダイマーである。
【００２５】
抗体のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、天然の親和性を有し、接触した場合には互いに結合する。ＣＨ１とＣＬとの間の結合は、ＣＨ１ドメインのシステインとＣＬドメインのシステインとの間に形成される分子間ジスルフィド架橋によって、さらにもっと強化され得る。したがって、本明細書に記載される構築物では、ＣＨ１とＣＬとの結合は、第１の部分および第２の部分をごく接近させることによって、目的のタンパク質のアセンブリを支持する。それによって、部分が容易にアセンブルしないタンパク質であっても得ることができる。したがって、このヘテロマーでは、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドは、特に、特に非共有結合および／または共有結合を介して、互いに結合する。
【００２６】
さらに、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、免疫グロブリンフォールドを有する免疫グロブリンドメインである。免疫グロブリンドメイン、特に、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、それらの正しい３次元フォールドを容易に取る高度に安定な構造であり、分子内ジスルフィド架橋によってさらに安定化され得る。さらに、これらのドメインは、水性溶媒中で高度な溶解性を有し、発現細胞株によって高い収率で容易に産生される。目的のタンパク質の部分を抗体のＣＨ１ドメインまたはＣＬドメインに融合させることは、ある特定の実施形態では、これらの部分の産生速度、収率および／または安定性を増加させる。ＣＨ１またはＣＬのいずれかとの融合ポリペプチドとして各部分を別々に産生し、それらの融合ポリペプチドを組み合わせて目的のタンパク質を形成することさえも可能であり得る。
【００２７】
さらに、目的のタンパク質の部分へのＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの付加は、タンパク質の全体サイズを増加させる。これは、治療的タンパク質にとって特に有利である。小さいタンパク質は、腎臓濾過を介して循環から除去される。しかし、ある特定の閾値を上回る分子量を有するタンパク質は、著しく低い速度で血流から濾過される。各免疫グロブリンドメインは、約１０〜１２．５ｋＤａの分子量を有する。したがって、本明細書に記載されるヘテロマーでは、目的のタンパク質の分子量は、少なくとも２０ｋＤａ増加し、融合ポリペプチドがリンカーおよび／またはさらなる融合パートナーをさらに含む実施形態では、さらに増加されることさえあり得る。
【００２８】
本明細書に記載される融合ポリペプチドを使用して目的のタンパク質を形成するために、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、有利には、アセンブルした目的のタンパク質中でごく接近して、これらの部分の末端に融合している。しかし、この部分とＣＨ１ドメインまたはＣＬドメインとの間で適切なリンカー配列を使用すると、これらのドメインはまた、アセンブルした目的のタンパク質中で互いからより離れて、部分の末端に融合していてもよい。
【００２９】
用語「ＣＨ１／ＣＬドメイン」とは、本明細書で使用する場合、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの各々を別々に、ならびにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの両方を指す。したがって、ある特色がＣＨ１／ＣＬドメインに帰せられる場合、この特色は、ＣＨ１ドメインのみもしくはＣＬドメインのみ、またはＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの両方に当てはまり得る。用語「ＣＨ１ドメイン」および「ＣＬドメイン」はまた、それぞれの天然に存在するドメインに由来するドメイン、および／または２つのドメインの互いとの結合を促進するのに十分なそれぞれのドメインの機能的な一部をさらに包含する。
【００３０】
第１の融合ポリペプチドでは、ＣＨ１ドメインは、第１の部分のＣ末端またはＮ末端に融合していてもよい。同様に、第２の融合ポリペプチドでは、ＣＬドメインは、第２の部分のＣ末端またはＮ末端に融合していてもよい。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、第１の部分のＣ末端に融合している。さらなる実施形態では、ＣＬドメインは、第２の部分のＣ末端に融合している。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、第１の部分のＣ末端に融合し、ＣＬドメインは、第２の部分のＣ末端に融合している。
【００３１】
ＣＨ１／ＣＬドメインは、直接またはリンカーを介してのいずれかで、部分に融合していてもよい。直接的融合とは、ＣＨ１／ＣＬドメインの配列が、それら２つの配列間にいずれの中間アミノ酸も有さずに直接、部分の配列の後に続くまたはそれに先行するポリペプチドを指す。リンカーを介した融合とは、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ１／ＣＬドメインの配列と部分の配列との間に存在するポリペプチドを指す。これら１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ１／ＣＬドメインと部分との間にリンカーを形成する。これらの実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、第１の部分、リンカーおよびＣＨ１ドメインを含み、ならびに／または第２の融合ポリペプチドは、第２の部分、リンカーおよびＣＬドメインを含む。
【００３２】
リンカーは、原則として、ＣＨ１／ＣＬドメインを部分に連結するのに適切な、任意の数のアミノ酸および任意のアミノ酸配列を有し得る。ある特定の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬドメインと部分との間のリンカーは、少なくとも３、好ましくは少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、ＣＨ１／ＣＬドメインと部分との間のリンカーは、５０もしくはそれ未満、好ましくは４５もしくはそれ未満、４０もしくはそれ未満、３５もしくはそれ未満、３０もしくはそれ未満、２５もしくはそれ未満または２０もしくはそれ未満のアミノ酸を含む。特に、ＣＨ１／ＣＬドメインと部分との間のリンカーは、５〜２０アミノ酸を含む。具体的な実施形態では、リンカーは、グリシン残基およびセリン残基からなる。グリシンおよびセリンは、２対１、３対１、４対１または５対１の比率（グリシン残基の数対セリン残基の数）で、リンカー中に存在し得る。例えば、リンカーは、１つのセリン残基が後に続く４つのグリシン残基の配列を含み得、特に、１、２、３、４、５または６リピートのこの配列を含み得る。具体的な例は、２リピートのアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１）からなるリンカー、４リピートのアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１）からなるリンカーおよび６リピートのアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１）からなるリンカーである。特に、６リピートのアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１）からなるリンカーが使用され得る。他の実施形態では、リンカーは、ヒトにおいて免疫原性潜在力を示さないまたは軽微な免疫原性潜在力しか示さない配列、好ましくは、ヒト配列または天然に存在する配列である配列を含む。さらに好ましい実施形態では、リンカーおよび隣接アミノ酸は、免疫原性潜在力を示さないまたは軽微な免疫原性潜在力しか示さない。
【００３３】
ある特定の実施形態では、第１および／または第２の融合ポリペプチドは、さらなる融合パートナーを含む。融合パートナーは、ＣＨ１／ＣＬドメインおよび目的のタンパク質の部分に対してＮ末端に、ＣＨ１／ＣＬドメインおよび目的のタンパク質の部分に対してＣ末端に、またはＣＨ１／ＣＬドメインと目的のタンパク質の部分との間に存在し得る。ある特定の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬドメインは、目的のタンパク質の部分とさらなる融合パートナーとの間に存在し得る。さらなる融合パートナーは、特に上記リンカーを使用して、直接的または間接的に、ＣＨ１／ＣＬドメインおよび／または目的のタンパク質の部分に融合していてもよい。ある特定の実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、さらなる融合パートナーを含む。
【００３４】
さらなる融合パートナーは、例えば、ヒトまたは動物の循環中の目的のタンパク質の半減期を増加させるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、検出可能な標識を提供するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびに融合ポリペプチドの精製および／または安定性を改善するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む、任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。具体的な実施形態では、さらなる融合パートナーは、ヒトまたは動物の循環中の目的のタンパク質の半減期を増加させる。例えば、さらなる融合パートナーは、腎クリアランスの閾値を超えるのに十分に大きいサイズ、特に、少なくとも４０ｋＤａ、特に、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａまたは少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する、タンパク質またはポリペプチドであり得る。さらなる実施形態では、さらなる融合パートナーは、半減期を延長させる受容体に結合することが可能であり得る、例えば、ＦｃＲｎに結合することができ得る。さらなる融合パートナーは、特に、アルブミン、抗体のヒンジ、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３部分、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、アルブミン結合ドメイン、Ｈｉｓタグならびにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、またはそれらの一部からなる群から選択され得、あるいはさらなる融合パートナーは、これらのタンパク質のうち１つに由来し得る。
【００３５】
ある特定の実施形態では、さらなる融合パートナーは、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン、または、ヘテロマーの循環半減期を引き延ばすことが可能なそれに由来する融合パートナーおよび／もしくはその一部である。血清アルブミンは特に、第１の融合ポリペプチド中に存在する。具体的な実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へと連続して、目的のタンパク質の部分、任意選択でリンカー、ＣＨ１ドメイン、任意選択でリンカー、およびヒト血清アルブミンに由来するさらなる融合パートナーまたはその一部を含む。これらの実施形態では、第２の融合ポリペプチドは、特に、Ｎ末端からＣ末端へと連続して、目的のタンパク質の部分、任意選択でリンカー、およびＣＬドメインを含む。
【００３６】
さらなる実施形態では、さらなる融合パートナーは、抗体のヒンジ、ＣＨ２および／もしくはＣＨ３部分、特に、抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３部分、またはそれらの機能的一部を含む、あるいは、それらに由来する。このさらなる融合パートナーは、特に、第１の融合ポリペプチド中に存在する。具体的な実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へと連続して、目的のタンパク質の部分、任意選択でリンカー、ＣＨ１ドメイン、任意選択でリンカー、ならびに抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３部分に由来するさらなる融合パートナーまたはその一部を含む。これらの実施形態では、第２の融合ポリペプチドは、特に、Ｎ末端からＣ末端へと連続して、目的のタンパク質の部分、任意選択でリンカーおよびＣＬドメインを含む。さらに、これらの実施形態では、ヘテロマーは、特に、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、さらなる融合パートナーのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに結合する、さらなるポリペプチド鎖を含む。具体的には、これらの実施形態でのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、同じ変異を有するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの結合親和性を低減させる変異を含む。それによって、第１のセットの変異を有するさらなる融合パートナーのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、別のさらなる融合パートナーのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインによりも、さらなるポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに、かなり高い親和性で結合する。同様に、第２のセットの変異を有するさらなるポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、別のさらなるポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインによりも、さらなる融合パートナーのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに、かなり高い親和性で結合する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のジスルフィド架橋が、さらなる融合パートナーのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとさらなるポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの間に形成される。
【００３７】
具体的な実施形態では、さらなる融合パートナーは、抗体のヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含まない、特に、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含まない、特に、抗体のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含まない。
【００３８】
さらなる実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、抗体のヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含まない、特に、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含まない、特に、抗体のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含まない。特に、第１の融合ポリペプチドは、抗体のヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全てを含むわけではない、特に、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのいずれも、特に、抗体のヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのいずれも含まない。
【００３９】
ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、好ましくは同じ種に由来する、特に、ヒトＣＨ１ドメインおよびヒトＣＬドメインが使用される。任意の抗体由来のＣＨ１ドメイン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体のＣＨ１ドメインが使用され得る。特に、ＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ抗体に、特にＩｇＧ１抗体に由来する。ＣＨ１ドメインは、天然に存在するγ型、δ型、α型、μ型またはε型の重鎖に、特に、γ型重鎖に、特に、ヒトγ型重鎖などのヒト重鎖に由来し得る。ＣＨ１ドメインは、特に、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２の長さ全体にわたって、配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは９０％もしくは９５％相同もしくは同一であるアミノ酸配列を含み得る。具体的な実施形態では、ＣＨ１ドメインは、配列番号２の長さ全体にわたって、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。さらに、ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、そのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含むアミノ酸配列をさらに含む。このさらなるアミノ酸配列は、特に、１０もしくはそれ未満、特に７もしくはそれ未満または５もしくはそれ未満の残基の長さを有し、特に、配列番号３の配列もしくはその一部、特に、配列番号３のアミノ酸１〜５もしくは１〜７、または単一のシステイン残基からなる。
【００４０】
任意の抗体のＣＬドメインが使用され得る。ＣＬドメインは、天然に存在するκ型またはλ型軽鎖に、特に、κ型軽鎖、特に、ヒトκ型軽鎖などのヒト軽鎖に由来し得る。ＣＬドメインは、特に、配列番号４、５もしくは６のアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号４、５もしくは６の長さ全体にわたって、配列番号４、５もしくは６と少なくとも８０％、好ましくは９０％もしくは９５％相同もしくは同一であるアミノ酸配列を含み得る。具体的な実施形態では、ＣＬドメインは、それぞれ配列番号４、５または６の長さ全体にわたって、配列番号４、５または６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、ＣＬドメインは、配列番号４、５または６のアミノ酸配列からなる。
【００４１】
ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、特に、互いに特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは、本明細書に記載されるヘテロマーにおいて分子間ジスルフィド架橋を形成する。このジスルフィド架橋は、ＣＨ１ドメインのそのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含むさらなるアミノ酸配列のシステイン残基、特に、配列番号３中のアミノ酸５位のシステイン残基、またはそれに対応するＣＨ１ドメインのアミノ酸配列中のシステイン残基、ならびに／あるいはそれぞれ配列番号４、５もしくは６中のアミノ酸１０６位もしくは１０５位のシステイン残基、またはそれに対応するＣＬドメインのアミノ酸配列中のシステイン残基を含み得る。
【００４２】
目的のタンパク質は、２つまたはそれ超の部分を含む任意のタンパク質、特に、２つの部分からなる任意のタンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、天然に存在するタンパク質である、またはそれに由来するおよび／もしくはその一部である。特に、これに関して、用語「部分」とは、別個のポリペプチドを指し、各部分は、別々のポリペプチドによって形成される。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質の「部分」は、目的のタンパク質のサブユニットである。タンパク質の部分は、互いに異なるまたは同一であり得、好ましくは互いに異なり得る。目的のタンパク質が２つよりも多い部分を含む場合、少なくとも一方の部分は、第１の融合ポリペプチド中に存在し、少なくとももう一方の部分は、第２の融合ポリペプチド中に存在する。目的のタンパク質のさらなる部分もまた、特に、ヘテロマーの一部であり、これらの融合ポリペプチドの一方もしくは両方の一部であり得る、またはこれらの融合ポリペプチドのいずれかの一部としてではなく、ヘテロマー中に存在し得る。
【００４３】
目的のタンパク質の適切な例は、活性化血液凝固因子およびゴナドトロピンである。目的のタンパク質は、天然に存在するタンパク質または人工タンパク質であり得る。さらに、これらの部分は、このタンパク質の天然アミノ酸配列を含み得るもしくはそれからなり得る、または操作され得る。これは、天然アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列、および天然アミノ酸配列の短縮バージョン、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ヘテロマー中に存在する目的のタンパク質は、それが由来する天然タンパク質の特性、特に、生物学的活性および／もしくは酵素活性ならびに／または結合親和性および／もしくは結合特異性のうち１つまたは複数を示す。これは、ヘテロマー中の目的のタンパク質の特性が、それが由来する天然タンパク質中よりも低い実施形態を含む。例えば、目的のタンパク質は、天然タンパク質の生物学的活性もしくは酵素活性または結合親和性もしくは結合特異性の少なくとも１％、特に、少なくとも１０％または少なくとも２５％を有する。
【００４４】
ある特定の実施形態では、目的のタンパク質は、活性化血液凝固因子もしくはその一部である、またはそれらに由来する。血液凝固因子は一般に、酵素消化を介したポリペプチド種の切断によって活性化される、不活性前駆体タンパク質として発現される。次いで、活性化血液凝固因子は、セリンプロテアーゼとして作用し得、それによって次に活性化される下流標的タンパク質を切断し得る。活性化血液凝固因子の２つの別々のポリペプチド鎖、即ち、軽鎖および重鎖は、組換え発現されてもよい。このアプローチを用いると、上流因子による活性化は必要ない。活性化血液凝固因子は、目的のタンパク質の具体的な例である。特に、このタンパク質は、フィブリン、トロンビン、第Ｖａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子および第ＸＩＩＩａ因子からなる群から選択され得る。目的のタンパク質が血液凝固因子もしくはその一部である、またはそれらに由来するある特定の実施形態では、ヘテロマーは、特に、それぞれの血液凝固因子のセリンプロテアーゼ酵素活性を有する。
【００４５】
具体的な実施形態では、第１の部分は、活性化血液凝固因子の軽鎖またはその一部であり、第２の部分は、活性化血液凝固因子の重鎖またはその一部である。例えば、タンパク質は、第ＶＩＩａ因子であり、第１の部分は、第ＶＩＩａ因子の軽鎖またはその一部であり、第２の部分は、第ＶＩＩａ因子の重鎖またはその一部である。代替的な実施形態では、第１の部分は、活性化血液凝固因子の重鎖またはその一部であり、第２の部分は、活性化血液凝固因子の軽鎖またはその一部である。例えば、タンパク質は、第ＶＩＩａ因子であり、第１の部分は、第ＶＩＩａ因子の重鎖またはその一部であり、第２の部分は、第ＶＩＩａ因子の軽鎖またはその一部である。第ＶＩＩａ因子の軽鎖は、特に、配列番号７の６１〜２１２位のアミノ酸配列を含む、またはそれに由来し、第ＶＩＩａ因子の重鎖は、特に、配列番号７の２１３〜４６６位のアミノ酸配列を含む、またはそれに由来する。
【００４６】
したがって、具体的な実施形態では、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合し、任意選択でヒト血清アルブミンにさらに融合している第ＶＩＩａ因子の軽鎖を含み、第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子の重鎖を含む、ヘテロマーが提供され。これは、ヘテロダイマーがそれぞれのエレメントの機能的一部、例えば、第ＶＩＩａ因子の酵素活性を提供することが可能な第ＶＩＩａ因子の軽鎖および／または重鎖の機能的一部を含む実施形態を含む。
【００４７】
別の実施形態では、目的のタンパク質は、ゴナドトロピン、特に、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択されるゴナドトロピンである。第１の部分は、ゴナドトロピンのアルファ鎖であり得、第２の部分は、ゴナドトロピンのベータ鎖であり得る。あるいは、第１の部分は、ゴナドトロピンのベータ鎖であり得、第２の部分は、ゴナドトロピンのアルファ鎖であり得る。
【００４８】
具体的な実施形態では、目的のタンパク質は、抗体ではない。特に、第１の部分および／または第２の部分は、抗体の可変領域ではない。具体的には、第１の部分は重鎖可変領域ではなく、および／または第２の部分は軽鎖可変領域ではない。
【００４９】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載されるヘテロマー化技術は、目的の２つのタンパク質の複合体形成を提供するために使用される。本明細書で、第１の態様に従うヘテロマー中に存在する２つの部分は、タンパク質、即ち、同じタンパク質の部分ではないポリペプチドによって置き換えられる。したがって、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含むヘテロマーであって、第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的の第１のタンパク質を含み、第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している目的の第２のタンパク質を含む、ヘテロマーが提供される。このヘテロマーでは、特に、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、タンパク質複合体を形成するように集合する。目的のタンパク質の第１の部分および第２の部分を含むヘテロマーについて本明細書に記載される特色、実施形態および例は、目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質を含むヘテロマーにも同様に当てはまる。
【００５０】
目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質は、任意のポリペプチドであり得る。目的の第１および第２のタンパク質は、例えば、天然に存在するタンパク質または人工タンパク質であり得る。これらは、これらのタンパク質の天然アミノ酸配列を含み得るもしくはそれからなり得る、または操作され得る。これは、天然アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列、および天然アミノ酸配列の短縮バージョン、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ヘテロマー中に存在する目的の第１および／または第２のタンパク質は、それらが由来する天然タンパク質の特性、特に、生物学的活性および／もしくは酵素活性ならびに／または結合親和性および／もしくは結合特異性のうち１つまたは複数を示す。これは、ヘテロマー中の目的の第１および／または第２のタンパク質の特性が、それらが由来する天然タンパク質中よりも低い実施形態を含む。例えば、目的の第１および／または第２のタンパク質は、天然タンパク質の生物学的活性もしくは酵素活性または結合親和性もしくは結合特異性の少なくとも１％、特に、少なくとも１０％または少なくとも２５％を有する。ある特定の実施形態では、ヘテロマーは、単独で存在する場合に目的の第１および第２のタンパク質のいずれかによっては提供されない、またはより低い程度までしか提供されない、特異的な活性、特に酵素活性を有する。特に、ヘテロマーは、適切な組成物中に存在する場合、同じ条件下で、目的の第１および第２のタンパク質の各々のヘテロマーと同じ量を遊離タンパク質として含む対応する組成物よりも、高い酵素活性を有する。目的の第１および第２のタンパク質の一方または両方が血液凝固因子またはその一部である実施形態では、酵素活性は、特に、セリンプロテアーゼ活性である。
【００５１】
ある特定の実施形態では、目的の第１および第２のタンパク質の一方または両方は、酵素である。これらの実施形態では、ヘテロマーは、好ましくは、目的の第１のおよび／または第２のタンパク質の酵素活性のうち１つまたは複数を示す。さらなる実施形態では、目的の第１および第２のタンパク質のうち一方は、目的の他方のタンパク質の安定性、発現および／または３次元構造、特に、タンパク質フォールディングを支持する。本明細書で、目的の一方のタンパク質は、シャペロン様特性を有し得、特に、シャペロンまたはその機能的一部に由来し得る。さらなる実施形態では、目的の第１および第２のタンパク質のうち一方は、酵素であり、目的の他方のタンパク質は、この酵素の酵素活性をモジュレートする。これに関して、酵素活性のモジュレーションとは、酵素活性の速度および／もしくは特異性、第１のタンパク質部分の安定性、基質に対する結合親和性および／もしくは結合特異性、ならびに／または補因子への結合の変化、特に増加を指し得る。
【００５２】
例えば、目的の第１のタンパク質および／または目的の第２のタンパク質は、プロタンパク質としてのまたは活性化形態の、フィブリン、トロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子を含む血液凝固因子；ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧおよびＴＳＨを含むゴナドトロピン；ならびに単鎖抗体断片、例えば、１つのポリペプチド中に抗体の単一のアームの重鎖および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖ；ならびにそれらの一部、およびそれらに由来するタンパク質からなる群から選択され得る。ある特定の実施形態では、目的の第１および第２のタンパク質が由来する天然タンパク質は、事実上互いと相互作用し、および／または同じ生物学的経路もしくは反応に関与する。具体的な実施形態では、目的の第１および第２のタンパク質のうち一方は、血液凝固因子またはその一部である。特に、目的の第１および第２のタンパク質は共に、血液凝固因子であり、例えば、目的の第１のタンパク質は、第ＶＩＩＩａ因子もしくはその一部を含み、目的の第２のタンパク質は、フォンビルブランド因子もしくはその一部を含み、または逆もまた同様である。
【００５３】
ある特定の実施形態では、目的の第１のタンパク質は、第ＶＩＩＩａ因子またはその一部を含み、目的の第２のタンパク質は、フォンビルブランド因子またはその一部を含む。代替的実施形態では、目的の第１のタンパク質は、フォンビルブランド因子またはその一部を含み、目的の第２のタンパク質は、第ＶＩＩＩａ因子またはその一部を含む。これらの実施形態では、第ＶＩＩＩａ因子およびフォンビルブランド因子は、特に、互いと相互作用する。特に、これらの実施形態では、ヘテロマーは、第ＶＩＩＩａ因子−フォンビルブランド因子複合体の生物学的活性、特に、凝固カスケードにおける活性化第ＩＸ因子による第Ｘ因子の活性化を加速する活性を有する。フォンビルブランド因子の一部は、特に、Ｄ’ドメインおよび任意選択でＤ３ドメインを含み、ならびに／または特に、第ＶＩＩＩａ因子に結合することが可能である。具体的な実施形態では、第１および／または第２の融合ポリペプチド、特に、両方の融合ポリペプチドは、さらなる融合パートナー、特に、アルブミンなどの、ヘテロマーの循環半減期を引き延ばすさらなる融合パートナーを含む。
【００５４】
具体的な実施形態では、目的の第１および／または第２のタンパク質は、抗体ではない。特に、目的の第１および／または第２のタンパク質は、抗体の可変領域ではない。具体的には、目的の第１のタンパク質は、重鎖可変領域ではなく、および／または目的の第２の第１のタンパク質は、軽鎖可変領域ではない。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従うヘテロマーの第１の融合ポリペプチドおよび／または第２の融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明に従う核酸の核酸配列は、第１の融合ポリペプチドおよび／または第２の融合ポリペプチドをコードするのに適切な任意のヌクレオチド配列を有し得る。しかし、好ましくは、核酸配列は、本発明に従う核酸が発現される宿主細胞または生物の特定のコドン用法、特に、ヒトのコドン用法に、少なくとも部分的に順応される。本発明に従う核酸は、二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであり得る。
【００５６】
核酸は、第１の融合ポリペプチドのみもしくは第２の融合ポリペプチドのみ、または第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドの両方をコードし得る。特に、本発明に従う核酸は、２つのコード領域を含む単一の核酸分子であり得、この第１のコード領域は、第１の融合ポリペプチドをコードし、第２のコード領域は、第２の融合ポリペプチドをコードし、これらは、好ましくは、別々のアミノ酸鎖を生成するために、ＩＲＥＳエレメントなどの調節エレメントによって分離される。
【００５７】
融合ポリペプチドをコードするコード領域に加えて、本発明に従う核酸は、例えば、他のタンパク質をコードし得る、コード領域（複数可）の転写および／または翻訳に影響し得る、核酸の安定性または他の物理的もしくは化学的特性に影響し得る、あるいは全く機能を有さない可能性がある、さらなる核酸配列または他の修飾もまた含み得る。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従う核酸およびこの核酸と作動可能に接続したプロモーターを含む、発現カセットまたはベクターを提供する。さらに、発現カセットまたはベクターは、さらなるエレメント、特に、本発明に従う核酸の転写および／もしくは翻訳、発現カセットもしくはベクターの増幅および／もしくは複製、宿主細胞のゲノム中への発現カセットもしくはベクターの組込み、ならびに／または宿主細胞中の発現カセットもしくはベクターのコピー数に影響することならびに／またはそれらを調節することが可能なエレメントを含み得る。抗体を発現させるためのそれぞれの発現カセットを含む適切な発現カセットおよびベクターは、先行技術において周知であり、したがって、本明細書でさらに記載する必要はない。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドのうち一方をコードする本発明に従う核酸を含む１つの発現カセットを含むベクターが提供される。さらなる実施形態では、両方の融合ポリペプチドをコードする本発明に従う核酸を含む１つの発現カセットを含むベクターが提供される。なおさらなる実施形態では、一方の融合ポリペプチドをコードする本発明に従う核酸を各々が含む２つの発現カセットを含むベクターが提供される。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明に従う核酸または本発明に従う発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、１つまたは２つの上記発現カセットを含む１つのベクターを含み得る。さらに、宿主細胞は、一方が第１の融合ポリペプチドをコードする発現カセットを含み、他方が第２の融合ポリペプチドをコードする発現カセットを含む、２つのベクターを含み得る。本発明に従う宿主細胞は、任意の宿主細胞であり得る。これは、単離された細胞または組織中に含まれる細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、培養細胞、特に、初代細胞、または樹立された細胞株の細胞、好ましくは、腫瘍由来細胞である。好ましくは、これは、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、または哺乳動物細胞、特にヒト細胞、例えば腫瘍由来ヒト細胞、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ、または霊長類細胞である。好ましくは、本発明に従う核酸のコード領域におけるコドン用法ならびに／または発現カセットもしくはベクターのプロモーターおよびさらなるエレメントは、使用される宿主細胞の型と適合性であり、より好ましくは、使用される宿主細胞の型のために最適化される。好ましくは、本発明に従うヘテロマーは、上記宿主細胞または細胞株によって産生される。ある特定の実施形態では、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドは、宿主細胞によって分泌される。
【００６０】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載されるヘテロマーを産生する方法を提供し、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドは、宿主細胞、特に、哺乳動物細胞において発現される。この方法は、特に、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞の提供を含む。核酸は、特に、上記核酸であり得、宿主細胞は、特に、上記宿主細胞であり得る。具体的な実施形態では、宿主細胞は、第１の融合ポリペプチドならびに第２の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、第１の融合ポリペプチドをコードする核酸および第２の融合ポリペプチドをコードするさらなる核酸を含む。したがって、ある特定の実施形態では、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドは、同じ宿主細胞において共発現される。
【００６１】
別の実施形態では、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドは、異なる宿主細胞において発現される。本発明に従うヘテロマーは、これらの融合ポリペプチドを接触させることによって、第１および第２の融合ポリペプチドの発現後に形成される。
【００６２】
具体的な実施形態では、ヘテロマーを産生する方法であって、ヘテロマーが、第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドを含み、第１の融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合し、任意選択でヒト血清アルブミンにさらに融合している第ＶＩＩａ因子の軽鎖を含み、第２の融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子の重鎖を含み；第１の融合ポリペプチドおよび第２の融合ポリペプチドが、宿主細胞において発現される、方法が提供される。ある特定の実施形態では、ヘテロマーは、宿主細胞によって分泌される。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本発明に従うヘテロマーは、医薬組成物中に存在する。したがって、本発明の別の態様は、本発明に従うヘテロマーを含む医薬組成物である。医薬組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤を含み得る。あるいは、ヘテロマーを含む医薬組成物は、かかるさらなる薬学的に活性な薬剤と組み合わせた使用のために設計され得る。
【００６４】
さらに、本発明は、薬における使用のための本発明に従うヘテロマーまたは本発明に従う医薬組成物、ならびにそれを必要とする患者への本発明に従うヘテロマーまたは本発明に従う医薬組成物の投与を含む処置のための方法を提供する。医療的使用または処置される疾患は、ヘテロマーによって形成される目的のタンパク質に依存する。
【００６５】
例えば、目的のタンパク質が活性化血液凝固因子である、または目的の第１および／もしくは第２のタンパク質が血液凝固因子である実施形態では、医療的使用は、凝血疾患の処置における使用である。特に、目的のタンパク質が第ＶＩＩａ因子もしくは別の活性化血液凝固因子である、または目的の第１のタンパク質もしくは目的の第２のタンパク質が第ＶＩＩ因子もしくは別の血液凝固因子であるヘテロマーは、血友病ＡおよびＢ；後天性血友病；先天性第ＶＩＩ因子欠乏症；インヒビターを有する患者のための血友病予防、外傷、救急または外科的介入、例えば、脊髄手術および心臓手術における出血；グランツマン血小板無力症；爆風肺損傷；ならびに出血、例えば、脳内出血、非特異的出血またはびまん性肺胞出血からなる群から選択される疾患の処置において使用され得る。特に、疾患は、特にインヒビターを有する患者における血友病ＡもしくはＢ、第ＶＩＩ因子欠乏症またはグランツマン血小板無力症である。
【００６６】
目的のタンパク質または目的の第１および第２のタンパク質のうち少なくとも一方がゴナドトロピン、特に卵胞刺激ホルモンである別の実施形態では、医療的使用は、不妊症処置における使用である。不妊症処置は、生殖補助技術、排卵誘発、体外受精、例えば、卵細胞質内精子注入法、配偶子卵管内移植、子宮内人工授精を用いた体外受精、女性における無排卵障害の処置、女性における卵成熟のための重症ホルモン欠乏性障害の処置、男性における精子産生欠乏症の処置、ならびに／または、例えば、対外受精刺激プロトコールの間のおよび／もしくは無排卵障害処置のための、生殖細胞成熟、例えば、濾胞形成および精子形成、特に、女性における濾胞成熟の有効化もしくは改善を含む。
【００６７】
ヘテロマーは、任意の適切な投与経路を使用して患者に投与され得る。具体的な実施形態では、ヘテロマーは、特に注射または注入によって非経口で、例えば、静脈内、筋内または皮下で投与される。さらなる実施形態では、ヘテロマーは、吸入によっても投与され得る。
【００６８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうち一方のホモダイマーもまた提供する。特に、第２の融合ポリペプチドの非存在下では、本明細書に記載される２つの第１の融合ポリペプチドのＣＨ１ドメインまたは２つの第２の融合ポリペプチドのＣＬドメインもまた、互いに結合して、２つの第１の融合ポリペプチドまたは２つの第２の融合ポリペプチドを含むホモダイマーを形成し得る。ヘテロマーに関する上記特色、実施形態および例は、ホモダイマーにも同様に当てはまる。
【００６９】
特に、２つの融合ポリペプチドを含むホモダイマーであって、各融合ポリペプチドが、抗体のＣＬドメインに融合している目的のタンパク質またはその部分を含む、ホモダイマーが提供される。ＣＬドメインは、特に、配列番号４のアミノ酸配列またはそれに由来する配列を含む。あるいは、２つの融合ポリペプチドを含むホモダイマーであって、各融合ポリペプチドが、抗体のＣＨ１ドメインに融合している目的のタンパク質またはその部分を含む、ホモダイマーが提供される。融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるさらなる融合パートナー、特に、血清アルブミンなどの、ホモダイマーの循環半減期を引き延ばすさらなる融合パートナーを含み得る。
【００７０】
目的のタンパク質は、本明細書に記載される任意のポリペプチドであり得る。特に、これは、事実上ホモダイマーとして存在する天然タンパク質に由来するタンパク質である。この実施形態では、融合ポリペプチドは、特に、目的のタンパク質またはその機能的一部を含む。さらに、目的のタンパク質は、２つの同一の部分またはサブユニットを含む天然タンパク質に由来し得る。この実施形態では、融合ポリペプチドは、特に、目的のタンパク質の部分もしくはサブユニット、またはその機能的一部を含む。
【００７１】
具体的な実施形態では、ホモダイマー中に存在する目的のタンパク質は、それが由来する天然タンパク質の特性、特に、生物学的活性および／もしくは酵素活性ならびに／または結合親和性および／もしくは結合特異性のうち１つまたは複数を示す。これは、ホモダイマー中の目的のタンパク質の特性が、それが由来する天然タンパク質中よりも低い実施形態を含む。例えば、目的のタンパク質は、天然タンパク質の生物学的活性もしくは酵素活性または結合親和性もしくは結合特異性の少なくとも１％、特に、少なくとも１０％または少なくとも２５％を有する。
【００７２】
本発明は、ホモダイマーの融合ポリペプチドをコードする核酸、この核酸を含む発現カセットおよびベクター、この発現カセットまたはベクターを含む宿主細胞、この宿主細胞を使用してホモダイマーを産生する方法、このホモダイマーを含む医薬組成物、ならびに薬における使用のためのホモダイマーもまた提供する。ヘテロマーに関するそれぞれの態様について本明細書に記載される特色、実施形態および例は、ホモダイマーに関する態様にも同様に当てはまる。
【００７３】
本明細書に記載される数値範囲は、その範囲を規定している数を含む。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって読むことができる本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。一実施形態によれば、方法の場合にはある特定のステップを含むと本明細書に記載される主題、または組成物の場合にはある特定の成分を含むと本明細書に記載される主題とは、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載される具体的な態様および実施形態を選択して組み合わせることが好ましく、具体的な実施形態のそれぞれの組合せから生じる具体的な主題もまた、本開示に属する。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
ＣＨ１／ＣＬ融合構築物としての第ＶＩＩａ因子の産生
第ＶＩＩａ因子軽鎖のＤＮＡを、抗体のＣＨ１ドメインにクローニングし、第ＶＩＩａ因子重鎖のＤＮＡを、抗体のＣＬドメイン（Ｃカッパ）にクローニングした。３つの異なるバージョンのＣＨ１ドメインを使用し、これらは各々、ＣＬドメインとのジスルフィド架橋の形成のために、システイン残基を含むヒンジ領域に由来する異なるさらなるＣ末端配列を含んだ（ＥＰＫＳＣ、ＥＰＫＳＣＤＫまたはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ）。第ＶＩＩａ因子重鎖のＣＬドメインへのクローニングから生じる構築物を、「ＤＮＡ  １」と指定し、第ＶＩＩａ因子軽鎖のＣＨ１ドメインへのクローニングから生じる構築物を、アルブミンのＤＮＡに対して上流にさらにクローニングし、「ＤＮＡ  ２」と指定した。
【００７５】
次のステップでは、ＤＮＡ  １を、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅの発現ベクターの１つ中にクローニングし、ＤＮＡ  ２を、第２の発現ベクター中にクローニングし、各ベクターは、他とは異なる耐性マーカー遺伝子を含んだ。
【００７６】
ＤＮＡ  １およびＤＮＡ  ２を含む発現ベクターの組合せを、以下の構築物の発現およびアセンブリのために、ＧＥＸ（商標）細胞株のトランスフェクションに使用した：
・構築物１＝配列ＥＰＫＳＣを含むＣＨ１に、およびアルブミンに融合している第ＶＩＩａ因子軽鎖；ＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子重鎖；
・構築物２＝配列ＥＰＫＳＣＤＫを含むＣＨ１に、およびアルブミンに融合している第ＶＩＩａ因子軽鎖；ＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子重鎖；
・構築物３＝配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴを含むＣＨ１に、およびアルブミンに融合している第ＶＩＩａ因子軽鎖；ＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子重鎖。
【００７７】
選択圧を細胞培養物に適用し、第ＶＩＩａ因子の力価を、ＥＬＩＳＡによって制御した。その後、正しい構築物の発現を、ウエスタンブロットによって分析した（実施例２を参照のこと）。構築物の活性を、発色性アッセイによって測定した（実施例３を参照のこと）。タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【００７８】
（実施例２）
ウエスタンブロットによる発現制御
正しい構築物の発現およびダイマーアセンブリについて制御するために、細胞培養物上清を、還元（図２、レーン１〜４）および非還元（図２、レーン５〜９）条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。メンブレンのブロッティングおよびブロッキングの後に、第ＶＩＩａ因子を、ＡＰコンジュゲート化二次抗体によって次に検出される抗第ＶＩＩ因子一次抗体によって検出した。対照として、無関係の細胞培養物上清（ｉＳＮ；陰性対照）および融合タンパク質なしの第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ、陽性対照）を使用した。図２から理解できるように、還元条件下では、発現されたタンパク質は、（１）ＣＨ１ドメインおよびアルブミンに融合している第ＶＩＩａ因子軽鎖ならびに（２）ＣＬドメインに融合している第ＶＩＩａ因子重鎖へと解離する。非還元条件下では、会合したヘテロダイマータンパク質が見られる（３）。
【００７９】
これらの結果は、第ＶＩＩａ因子の軽鎖または重鎖を含む構築物が発現され、発現が、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとのダイマー化を介した会合を生じたことを実証している。
【００８０】
（実施例３）
第ＶＩＩａ因子ＣＨ１／ＣＬ融合構築物の活性
実施例１に従って調製した第ＶＩＩａ因子ヘテロダイマーアルブミン構築物の活性を、製造業者の指示に従って発色性ＣＯＡＳＥＴ（登録商標）ＦＶＩＩアッセイによって決定した。このアッセイでは、第Ｘ因子が第ＶＩＩａ因子によって第Ｘａ因子へと活性化される。引き続いて、第Ｘａ因子は、基質（Ｓ−２７６５）から、４０５ｎｍで測光法で測定できる発色団ｐＮＡを分離する。したがって、このアッセイは、第ＶＩＩａ因子ヘテロダイマーアルブミン構築物の活性についての読み出しを提供する。このアッセイの原理を、以下に模式的に示す：
【化１】
2018524995.tif 000002
【００８１】
結果は図３Ａに示される。調製した構築物の活性を、各試料について３つの異なる希釈を使用して試験した。
【００８２】
図３Ａから理解できるように、強い色シグナルが、構築物の各々について得られ、これは、これらの構築物が生物学的に活性であることを示している。結果は、配列ＥＰＫＳＣを含むＣＨ１を有する構築物１について、特に良好である傾向があった。
【００８３】
さらに、第ＶＩＩ因子アルブミン融合構築物（アルブミンのＮ末端に融合している非活性化第ＶＩＩ因子を含む単鎖構築物）と比較した、ヘテロダイマー第ＶＩＩａ因子構築物の第ＶＩＩ因子活性を、完全自動化凝固分析器Ｃｅｖｅｒｏｎ（登録商標）アルファＴＧＡ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ）で実施するＱｕｉｃｋアッセイを使用して測定した。原則として、血漿をＴＦおよびリン脂質と３７℃で混合する。凝固を、塩化カルシウムの添加によって開始させる。カルシウムの添加からフィブリン血栓の形成までにかかった時間は、プロトロンビン時間として公知である。第ＶＩＩ因子試料を、ＰＢＳ／１０％第ＶＩＩ因子欠損血漿中に希釈し、ＰＴ−アッセイを、製造業者のプロトコールに従ってクエン酸緩衝液（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ）、Ｔｅｃｈｎｏｐｌａｓｔｉｎ  ＨＩＳ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ）、第ＶＩＩ因子欠損血漿（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を使用して実行した。第ＶＩＩ因子活性を、凝固分析器の内部較正を使用して計算した。結果は、図３Ｂに示され、本発明に従うヘテロダイマー第ＶＩＩａ因子構築物が、従来の第ＶＩＩ因子構築物よりもかなり活性が高いことを実証している。
【００８４】
（実施例４）
Ｆｃテイルを含む第ＶＩＩａ因子ＣＨ１／ＣＬ融合構築物の活性
ＣＨ１融合ポリペプチドがアルブミンの代わりにＦｃテイルを含むヘテロマー構築物を調製し、上記実施例に従って分析した。本明細書で、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドを、ＣＨ１ドメインのＣ末端に結合させ、別のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン構造を含む第３のポリペプチドもまた発現させた。ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインにおける特定の変異に起因して、「遊離」ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構造は、第ＶＩＩａ因子軽鎖−ＣＨ１構造を保有するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構造と常に対形成する。ＣＨ１／ＣＬドメインと第ＶＩＩａ因子部との間に変動する長さのリンカーを有する４つの異なる構築物を、発色性ＣＯＡＳＥＴ（登録商標）ＦＶＩＩアッセイにおいて試験した。図４に示すように、全ての構築物は、強い生物学的活性を示した。
【００８５】
（実施例５）
ＤＳＰプロセスにおける、アルブミンを有する第ＶＩＩａ因子ＣＨ１／ＣＬ融合構築物の回収
アルブミンを有する第ＶＩＩ因子プロタンパク質および第ＶＩＩａ因子ＣＨ１／ＣＬ融合構築物のＤＳＰプロセスを、同じクロマトグラフィー材料を同じ順序で用いて確立した。回収の比較において、２番目のステップは、予め活性化された融合構築物について、より効率的であった。
【００８６】
第ＶＩＩ因子プロタンパク質は、機能的（タンパク質分解的に活性な、を意味する）タンパク質を得るために活性化する必要がある。ジスルフィド架橋を介して連結された軽鎖および重鎖を生じる第ＶＩＩ因子の活性化は、下流プロセシング（ＤＳＰ）の間に、自己タンパク質分解的様式で第ＶＩＩ因子自体によって促進される。予め活性化された融合構築物の場合、軽鎖および重鎖を、異なるペプチドで別々に翻訳した。機能的に活性な第ＶＩＩａ因子融合タンパク質が細胞において形成され、上清中に分泌される。活性化ステップは、この構築物には必要ない。
【００８７】
【表１】
2018524995.tif 000003
【００８８】
実証されるように、本発明に従う融合タンパク質の全体的回収は、標準的なタンパク質の全体的回収の２倍超である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018524995.tif 000009
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