(57)【要約】  微生物組成物および抗生物質を用いて大腸炎を処置する方法が、提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸炎と診断された対象を処置する方法であって、
（ａ）抗生物質を前記対象に投与すること、および
（ｂ）細菌胞子組成物（ＢＳＣ）を前記対象に投与すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記大腸炎が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗生物質が、バンコマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗生物質および前記細菌胞子組成物が、同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗生物質および前記細菌胞子組成物が、連続で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌胞子組成物が、前記抗生物質の最後の投薬の２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、または３週間以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌胞子組成物が、単回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌胞子組成物が、毎日、少なくとも２日ごとに、少なくとも３日ごとに、少なくとも４日ごとに、少なくとも５日ごとに、少なくとも６日ごとに、少なくとも毎週、少なくとも２週ごとに、少なくとも３週ごとに、少なくとも４週ごとに、少なくとも８週ごとに、少なくとも１２週ごとに、または少なくとも１６週ごとに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌胞子組成物が、カプセルまたは丸薬の中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、９９％以下の栄養細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、活動性の大腸炎を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、軽度〜中等度の潰瘍性大腸炎と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、前記ＢＳＣで少なくとも８週間にわたり毎週、または少なくとも８週間にわたり毎日処置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢＳＣが、胞子形成細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢＳＣが、胞子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記胞子が、ヒト糞便から直接得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記胞子が、エタノールを用いて直接得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、本質的に胞子からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、２０％以下の栄養細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
大腸炎を処置するための、抗生物質と組み合わせた細菌胞子組成物の使用。
【請求項２１】
大腸炎を処置する医薬を調製するための、抗生物質と組み合わせた細菌胞子組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、マイクロバイオーム関連技術を利用して炎症性腸疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸炎は、結腸の炎症を含む病気であり、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などがある。ＩＢＤは、胃腸（ＧＩ）管における様々な部位の兆候および症状、ならびに慢性炎症を再発および寛解させることを特徴とする。クローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）が、ＩＢＤの例である。ＩＢＤの症状は、典型的には下痢および腹痛を生じる。Merck Manualによれば、「特定の環境、食事、または感染源が同定されていない」(Walfishand Sachar, 2012, merckmanuals.com/ professional）。
【０００３】
クローン病は、必ずではないが、典型的には小腸に関与する。患者は一般に、瘻孔、腫瘤、および膿瘍を発症し、著しい肛囲病巣を有する場合がある。潰瘍性大腸炎は、典型的には結腸に制限され、直腸Ｓ状部を含む。肉眼的な直腸出血が、潰瘍性大腸炎患者では常に起こるが、これらの患者は、瘻孔または著しい肛囲病巣を発症しない。ＩＢＤの処置としては、例えば支持療法、５−アミノサリチル酸および誘導体、コルチコステロイド、免疫調整物質、サイトカイン、抗生物質、ならびにプロバイオティクス、例えば非病原性の大腸菌、ラクトバチルス属の菌種およびサッカロマイセスを挙げることができ、それらは嚢炎を予防するのに効果的であり得るが、他の治療的役割が明確に定義されていない（Merck Manual、上掲）。報告では、ヒト便移植が、一部の例で陽性結果を生じた。
【０００４】
利用可能な不適切な処置を考慮すると、標準治療での処置に比較して高い有効性を有し、そして／または標準治療と類似の有効性を有し、望ましくない副作用のリスクが低く、そして／または標準治療の有効性を増大させる、改善された方法など、大腸炎を処置するための改善された方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、大腸炎が細菌胞子組成物と抗生物質との組み合わせを用いて処置され得る、という発見に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって本発明は、大腸炎（例えばＩＢＤ、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎など）と診断された対象（例えば、ヒト対象）を処置する方法を提供する。該方法は、例えば活動性の大腸炎を有する対象、および／または軽度〜中等度の潰瘍性大腸炎と診断された対象、を処置することを含む。該方法は、（ａ）抗生物質（例えば、バンコマイシン）を該対象に投与すること、および（ｂ）細菌胞子組成物（ＢＳＣ）を該対象に投与すること、を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、該抗生物質および該細菌胞子組成物は、同時に投与されるが、別の実施形態においては、該抗生物質および該細菌胞子組成物は、連続で投与される。
【０００８】
様々な例において、該細菌胞子組成物は、場合により抗生物質の投薬（例えば、最終投薬）の２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、または３週間以内に投与される。
【０００９】
該細菌胞子組成物は、場合により単回または反復で投与され得る。
【００１０】
さらに該細菌胞子組成物は、場合により、毎日、少なくとも２日ごとに、少なくとも３日ごとに、少なくとも４日ごとに、少なくとも５日ごとに、少なくとも６日ごとに、少なくとも毎週、少なくとも２週ごとに、少なくとも３週ごとに、少なくとも４週ごとに、少なくとも８週ごとに、少なくとも１２週ごとに、または少なくとも１６週ごとに投与され得る。
【００１１】
特定の実施形態において、該対象は、ＢＳＣで少なくとも８週間にわたり毎週、または少なくとも８週間にわたり毎日処置される。
【００１２】
様々な実施形態において、該細菌胞子組成物は、カプセルまたは丸薬の中にある。
【００１３】
他の実施形態において、該組成物は、９９％以下の栄養細胞（例えば、２０％以下の栄養細胞）を含む。
【００１４】
該細菌胞子組成物は、胞子形成細菌および／または胞子を含み得る。様々な実施形態において、該胞子は、例えばエタノールの使用により、ヒトの糞便から直接得られる。幾つかの実施形態において、該組成物は、本質的に胞子からなる。
【００１５】
本発明はまた、大腸炎（例えば、本明細書に記載）を処置するための、抗生物質と組み合わせた細菌胞子組成物の使用、および大腸炎（例えば、本明細書に記載）を処置する医薬を調製するための、抗生物質と組み合わせた細菌胞子組成物の使用を提供する。
【００１６】
本明細書で参照される各特許文書および科学文献、ならびにそこに引用された特許文書および科学文献の全体的開示は、全ての目的で参照により本明細書に明白に組み入れられる。
【００１７】
本発明のさらなる特色および利点を、以下により詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】結腸の長さにおけるＤＳＳ誘発性の変動に及ぼす細菌胞子組成物（ＢＳＣ）の影響を示したグラフである。
【図２】大腸炎のＤＳＳモデルにおける結腸の肉眼的病理スコアに及ぼすＢＳＣの影響を示したグラフである。
【図３】最大ＤＳＳ誘発性体重変動に及ぼすＢＳＣの影響を示したグラフである。
【図４】大腸炎のＤＳＳモデルにおける臨床スコアに及ぼすＢＳＣの影響を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で提供される治療組成物および方法は、大腸炎の処置に有用である。同じく提供されるのは、標準治療に比較して改善された有効性および低い有害事象発生率を有する大腸炎処置を開発するのに有用な方法である。加えて、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための非免疫抑制性治療組成物および方法が、提供される。本明細書で用いられる「治療組成物」は、微生物組成物、例えば細菌胞子組成物（ＢＳＣ）と、場合により抗生物質を含み、それらは形態および／または時間的に一緒に、または別個に投与され得る。幾つかの実施形態において、該処置は、ＢＳＣを用い、抗生物質を用いない。
【００２０】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法は、大腸炎と診断された患者への抗生物質と、微生物組成物、例えば糞便に由来する微生物組成物（例えば、栄養性細菌および胞子を含有する、または実質的に胞子のみを含有する）または選択された細菌を含む設計された組成物と、の投与を含む。幾つかの実施形態において、選択された細菌の少なくとも一部は、胞子を形成することが可能である。幾つかの実施形態において、該細菌は、実質的に胞子の形態であり、該微生物組成物は、本明細書では細菌胞子組成物（ＢＳＣ）と称される。
【００２１】
本発明はまた、大腸炎（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎などのＩＢＤ）を処置するための、本明細書に記載された抗生物質と組み合わせた、本明細書に記載されたＢＳＣの使用、およびそのような処置のための医薬を調製するためのこれらの薬剤の使用を含む。
【００２２】
微生物組成物
本発明で用いられる微生物組成物は、細菌胞子組成物（ＢＳＣ）を包含する。胞子形成細菌に加えて（胞子の形態および／または栄養性形態であるかにかかわらず）、そのような組成物はまた、場合により非胞子形成細菌（例えば、ラクトバチルス、バクテロイデスまたはビフィドバクテリウム）を含み得る。したがって幾つかの実施形態において、本発明における使用に適した微生物組成物は、実質的に胞子（胞子組成物）または胞子形成細菌で構成される、例えば１％以上の胞子、５％以上の胞子、１０％以上の胞子、２０％以上の胞子、５０％以上の胞子、８０％以上の胞子、８５％以上の胞子、９０％以上の胞子、９５％以上の胞子、９８％以上の胞子、９９％以上の胞子、または１００％の胞子を含有する、細菌組成物である。胞子量は、当該技術分野で公知の方法を利用して、例えばジピコリン酸（ＤＰＡ）アッセイ、胞子ＣＦＵアッセイ、またはそのようなアッセイの組み合わせを利用して、決定され得る。幾つかの実施形態において、胞子のパーセンテージは、組成物中の発芽可能な細菌胞子のパーセンテージを指す。胞子のパーセンテージはさらに、バイオマス％（ｗ／ｗ）、全生物体の数、例えば当業者に公知の方法を利用して検出された生存可能な生物体の数を指し得る。胞子のパーセンテージは、検出されたゲノム数によっても参照され得る。
【００２３】
注目すべきこととして、胞子は、酸素および胃酸に耐性があるため、胞子は、簡便な配合剤を提供する。主なバイオマス（例えば、５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）がこれらの胞子形成生物体の栄養形態を含む胞子組成物によって、類似の効果を得ることができる。
【００２４】
微生物組成物、例えば本発明において有用な胞子組成物は、例えば胞子形態の培養細菌から調製された、糞便材料に由来する胞子調製物、糞便材料からの微生物叢の精製調製物、または胞子配合剤を含む。様々な実施形態において、該胞子調製物は、健常なヒトドナーから得られたヒト糞便材料などのヒト糞便材料から作製される。特定の例において、そのようなヒト糞便材料からの細菌細胞および胞子を含む画分が、溶媒（例えば、５０％エタノールｗｔ／ｗｔなどのエタノール）で処置されて、フィルミクテスの胞子を含む組成物を生成する。そのような組成物の例が、例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１４７４５号（国際公開第２０１４／１２１３０２号）および以下の実施例１に提供されている。
【００２５】
胞子アッセイ
組成物の胞子量を決定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ＤＰＡへの結合によるテルビウムイオンの蛍光増加に基づく胞子の熱失活によるＤＰＡ放出の蛍光モニタリングを利用するジピコリン酸アッセイ（ＤＰＡアッセイ）（例えば、Rosen et al., 1997, Anal Chem 69:1082-1085参照）を、利用することができる。
【００２６】
当該技術分野で公知の微生物学的アッセイ法は、組成物の胞子量を測定するのに有用である。一般に、そのようなアッセイは、栄養細胞を殺傷する条件下（例えば、熱または適当な溶媒）で組成物を処置すること、発芽および発育に好適な条件下で得られた胞子を播種すること、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）に基づいて胞子数および／または胞子の多様性を決定すること、を含む。発芽は生来、確率論的工程であり、胞子集団全体が、同調的に発芽するわけではないため、一般に胞子ＣＦＵの数は、胞子の総数よりも少ないのが常である。溶媒または熱失活を利用せずに類似の手順および発育培地を利用して、組成物中に存在し得る胞子形成栄養生物体を含む総ＣＦＵ量を定量することができる。
【００２７】
抗生物質
本明細書に記載された方法の特定の実施形態において、抗生物質療法が微生物組成物（ＢＳＣ）の前、ＢＳＣと同時、ＢＳＣの前および同時の両方、ＢＳＣの後、またはＢＳＣと同時もしくはＢＳＣの後の両方に施される。有用な抗生物質の例としては、例えばバンコマイシン、ネオマイシン、リファキシミン、メトロニダゾール、およびフィダキソマイシンが挙げられる。一般に該抗生物質は、クロストリジウム感染の原因に関連するもの、例えばフルオロキノロン、セファロスポリン、クリンダマイシンおよびペニシリンではない。
【００２８】
用量、配合、送達
発明において有用な方法は、例えばＢＳＣと１種または複数の抗生物質の組み合わせ（「治療的組み合わせ」と称される）の投与を含む。一般に、大腸炎を有する対象の、治療的組み合わせによる処置は、該疾患の少なくとも１つの兆候もしくは症状の改善、該疾患の少なくとも１つの兆候もしくは症状の改善期間の改善、または一般には抗生物質のみ（またはＢＳＣのみ）での処置に起因し得るものなどの少なくとも１つの副作用もしくは有害事象の低減をもたらす。
【００２９】
用量
ＢＳＣ用量の胞子数は一般に、１０４〜１０９である。幾つかの実施形態において、該用量は、例えば１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０６〜１０８、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１０１０、またはこれらの値の間のいずれかの範囲である。
【００３０】
治療的組み合わせの抗生物質成分は一般に、当該技術分野で公知の通り、標準用量で提供される。
【００３１】
投薬レジメンは一般に、治療的組み合わせを、毎日、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、毎週、２週ごとに、３週ごとに、または毎月、提供することを含む。処置は、慢性的に、または限定された期間に、例えば大腸炎発作に応答して、行われ得る。
【００３２】
配合剤
胞子は、送達および貯蔵の方法に基づいて配合される。例えば浣腸、直腸チューブ、鼻腔胃チューブ、胃内視鏡、または大腸内視鏡を介した送達のための胞子は典型的に、医薬的に許容し得る液体中にある。ＢＳＣを調製する方法の例は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１４７４５号（国際公開第２０１４／１２１３０２号）に見出され得る。
【００３３】
送達
そのような組成物の治療組成物または別の成分（例えば、ＢＳＣまたは抗生物質）は、当該技術分野で公知の方法を利用して、例えば経口的に（例えば、カプセルで）、近位結腸への大腸内視鏡を介して、遠位下部胃腸管への浣腸／直腸チューブにより、上部胃腸管への鼻腔胃チューブ／胃内視鏡により、カプセルで、または丸薬で送達され得る。送達は、既知の患部または疾患の疑いのある部位を標的とし得る。抗生物質は、追加の適切な方法、例えば注射または輸液により送達され得る。
【００３４】
例えばＢＳＣ組成物の、用量、配合、および送達に関するさらなる詳細は、以下の通りである。
【００３５】
本明細書に記載された組成物は、上記の通り、組成物のタイプに適した局所投与および全身投与経路をはじめとし、当該技術分野で公知の方法を利用して調製および投与され得る。例えば、微生物組成物は典型的には、経口投与されるか、または胃腸管に直接投与されるが、方法の成分である抗生物質治療薬は、経口的に、胃腸管に直接、輸液により、注射により、吸入により、または当該技術分野で用いられる他の方法により送達され得る。
【００３６】
治療組成物の成分は、従来の医薬担体、水性ベース、粉末ベースまたは油性ベース、増粘剤などを利用して配合され得る。
【００３７】
幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、１種または複数の医薬的に許容し得る担体（賦形剤）と組み合わせて、先の薬剤の１種または複数を有効成分として含む。治療組成物またはその成分を作製する際に、該薬剤は典型的には、賦形剤と混合されるか、賦形剤により希釈されるか、または例えばカプセル、サシェ剤、紙、または他のコンテナの形態の、そのような担体の中に封入される。賦形剤が、希釈剤として作用する場合、それは、有効成分のビヒクル、担体または媒体として作用する固形、半固形、または液体材料であり得る。したがって該配合剤は、錠剤、丸薬、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ剤、エアロゾル（固形として、または液体媒体中の）、例えば最大１０重量％の活性化合物を含有する軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、ならびに滅菌包装粉末の形態であり得る。
【００３８】
組成物は、単位投与剤形で配合され得る。用語「単位投与剤形」は、ヒト対象および他の哺乳動物のための単位投薬量として適し、各単位が、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性材料を適切な医薬賦形剤と会合して含有している、物理的に分離した単位を指す。治療組成物の成分が、該成分を投与するための使用説明書と共に、キットにおいて提供され得る。
【００３９】
組成物を含むカプセル、錠剤または丸薬は、胃腸管の所望の区分において、例えば結腸において、長期作用または放出の利点を付与する投与剤形を提供するようにコーティングまたは他の方法で調合され得る。例えば、ＢＳＣは、カプセル中で提供され得、内部および外部成分を含み得、後者が前者の外被の形態であり得る。そのようなカプセルの適切な材料としては、例えばヒプロメロース（hypermellose）が挙げられる。
【００４０】
細菌組成物を含む液体配合剤は、例えば水溶液、適宜着香されたシロップ、水性もしくは油性懸濁液、または綿実油、ゴマ油、ココナッツオイルもしくはピーナッツ油などの食用油を含む着香されたエマルジョン、ならびにエリキシルおよび類似の医薬ビヒクルの中で、経口送達用に調製され得る。
【００４１】
患者に投与される組成物の量および頻度は、投与されるもの、予防または治療などの投与の目的、患者の状態、投与の手法などに応じて変動するであろう。治療適用では、組成物は、疾患およびその合併症の症状を治癒または少なくとも一部停止させるのに、即ち疾患を緩和するのに十分な量で、既に罹患した患者に投与され得る。効果的量は、処置される疾患状態、ならびに疾患の重症度、患者の年齢、体重および一般的状態などの因子に応じた担当医の判断に依存するであろう。
【００４２】
組成物の治療的投薬量は、例えば処置が行われる個々の用途、該組成物の投与の手法、患者の健康および状態、ならびに処方する医師の判断に応じて変動し得る。
【００４３】
本発明による組成物の用量、配合、および送達に関する追加の情報は、以下の通りである。幾つかの例において、組成物は、固形、半固形、マイクロエマルジョン、ゲル、または液体形態の医薬調製物として投与される。そのような投与剤形の例としては、米国特許第３，０４８，５２６号、同第３，１０８，０４６号、同第４，７８６，５０５号、同第４，９１９，９３９号、および同第４，９５０，４８４号に開示された錠剤形態；米国特許第４，９０４，４７９号、同第６，４８２，４３５号、同第６，５７２，８７１号、および同第５，０１３，７２６号に開示されたゲル形態；米国特許第４，８００，０８３号、同第４，５３２，１２６号、同第４，９３５，２４３号、および同第６，２５８，３８０号に開示されたカプセル形態；ならびに米国特許第４，６２５，４９４号、同第４，４７８，８２２号、および同第５，６１０，１８４号に開示された液体形態が挙げられ、それらの特許はそれぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられる。経口で用いられ得る組成物の形態としては、錠剤、ゼラチンで作製されたプッシュフィットカプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑化剤とで作製された軟密封カプセルが挙げられる。錠剤は、場合により１種または複数の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製され得る。
【００４４】
圧縮錠は、適切な機械で、粉末または顆粒などの自由流動形態の有効成分を、場合により結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、不活性希釈剤、防腐剤、抗酸化剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、滑沢剤、界面活性剤、または分散剤と混合して、圧縮することにより調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で加湿された粉末化合物の混合物を、適切な機械で成形することにより作製され得る。該錠剤は、場合によりコーティングまたは刻み目を施すことができ、内部の有効成分の徐放または制御放出を提供するように配合され得る。錠剤は、場合により腸溶性コーティングを施して、胃または胃以外の消化管の一部（例えば、結腸、下部の腸）での放出を提供し得る。経口投与用の全ての配合剤は、そのような投与に適した投薬量であり得る。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、そして場合により安定化剤と混和された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、該活性化合物が、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤が、添加され得る。糖剤コアには、適切なコーティングが施されている。この目的で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を場合により含有し得る濃縮糖溶液が使用され得る。活性化合物用量の異なる組み合わせを識別する、または特徴づけるために、錠剤または糖剤コーティングに染料または色素が添加され得る。経口使用のための配合剤はまた、有効成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分がポリエチレングリコールなどの水溶性担体もしくは油性媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして存在し得る。経口液体調製物は、例えば水性もしくは油性懸濁液、溶液、エマルジョンシロップまたはエリキシルの形態をとることができ、あるいは使用前に水または適切なビヒクルで再構成する乾燥生成物として存在し得る。そのような液体調製物は、懸濁剤、例えばソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用油脂など、乳化剤、例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン、アカシアなど；非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、例えばアーモンド油、グリセリンなどの油性エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；防腐剤、例えばメチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸、そして所望なら通常の香味剤または着色剤など、従来の添加剤を含有し得る。
【００４５】
一実施形態において、提供された細菌胞子組成物は、ソフトゲル配合剤を包含する。ソフトゲルは、液体充填剤を取り囲むゼラチンベースのシェルを含有し得る。該シェルは、ゼラチン、可塑化剤（例えば、グリセリンおよび／またはソルビトール）、変性剤、水、色素、抗酸化剤または香味剤で作製され得る。該シェルは、デンプンまたはカラギーナンで作製され得る。外層は、腸溶性コーティングがなされ得る。一実施形態において、ソフトゲル配合剤は、ゼラチン層で覆われた組成物、例えば細菌胞子組成物の水溶性もしくは脂溶性充填溶液、または懸濁液を含み得る。
【００４６】
腸溶性コーティングは、細菌胞子組成物を消化器系で吸収する位置を制御し得る。例えば腸溶性コーティングは、細菌胞子組成物が胃で溶解せずに、むしろ小腸まで移行して溶解するように設計され得る。腸溶性コーティングは、低ｐＨ（胃内など）で安定し得て、より高いｐＨ（例えば、小腸内）で溶解し得る。腸溶性コーティング中で用いられ得る材料としては、例えばアルギン酸、酢酸フタル酸セルロース、プラスチック、ワックス、シェラック、および脂肪酸（例えば、ステアリン酸、パルミチン酸）が挙げられる。腸溶性コーティングは、例えば米国特許第５，２２５，２０２号、同第５，７３３，５７５号、同第６，１３９，８７５号、同第６，４２０，４７３号、同第６，４５５，０５２号、および同第６，５６９，４５７号に記載されており、それらの特許の全てが、全体として参照により本明細書に組み入れられる。腸溶性コーティングは、水性腸溶性コーティングであり得る。腸溶性コーティング中で用いられ得るポリマーの例としては、例えばシェラック、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、およびメタクリル酸が挙げられる。腸溶性コーティングは、（１）胃液が活性物質と反応すること、またはそれを破壊することを予防するため、（２）腸に到達する前の活性物質の希釈を予防するため、（３）調製物が胃を通過した後まで、確実に活性物質が放出されないように、そして（４）胃内が低ｐＨ値であるため、調製物中に含まれる生存する細菌が殺傷されるのを予防するために、用いられ得る。一実施形態において、食品または飲料の細菌胞子組成物または細菌組成物は、腸溶性コーティングを施された錠剤、カプセル、またはカプレットとして提供される。一実施形態において、該腸溶性コーティングは、胃の中にある時、錠剤、カプセル、またはカプレットを固めているように設計されている。該腸溶性コーティングは、胃内の酸性条件では固めていて、非酸性条件では分解し、それゆえ腸内で薬物を放出するように設計されている。ソフトゲル送達系はまた、リン脂質またはポリマーまたは天然ゴムを組み込んでいて、外部コーティングを含むゼラチン層の中に組成物、例えばプレバイオティック組成物を捕捉して、腸溶性コーティングなどの所望の遅延／制御放出効果を与えることができる。
【００４７】
一実施形態において、組成物が、本明細書に記載された通り、効果的量の細菌胞子集団と、１種または複数の放出制御賦形剤と、を含む投与剤形で提供される。適切な放出調節投薬ビヒクルとしては、親水性または疎水性マトリックスデバイス、水溶性分離層コーティング、腸溶性コーティング、浸透圧デバイス、マルチパーティキュレートデバイス、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該投与剤形は、錠剤、カプレット、カプセル、またはロリポップである。別の実施形態において、該投与剤形は、液体、経口懸濁液、経口溶液、または経口シロップである。さらに別の実施形態において、該投与剤形は、ゲルカプセル、軟ゼラチンカプセル、または硬ゼラチンカプセルである。別の実施形態において、細菌胞子集団を含む組成物は、発泡性投与剤形で提供される。該組成物はまた、非放出制御賦形剤を含み得る。
【００４８】
別の実施形態において、場合によりプレバイオティック材料と共に、細菌胞子組成物を含む組成物は、経口投与のために腸溶性コーティングペレットの形態で提供される。該組成物はさらに、モノステアリン酸グリセリル４０〜５０、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ステアリン酸マグネシウム、メタクリル酸コポリマーＣ型、ポリソルベート８０、球状糖、タルク、およびクエン酸トリエチルを含み得る。一実施形態において、細菌胞子集団を含む組成物は、経口投与のために腸溶性コーティング顆粒の形態で提供される。該組成物はさらに、カルナウバワックス、クロスポビドン、ジアセチル化モノグリセリド、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒプロメロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、水酸化ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、タルク、二酸化チタン、および黄色酸化第二鉄を含み得る。
【００４９】
一実施形態において、組成物は、経口投与のために様々な投与剤形で配合され得る。該組成物はまた、即時放出性、遅延放出性、持続放出性、長期放出性、持効性、パルス放出性、制御放出性、持続放出性、加速放出性、速放性、標的化（targeted）放出性、プログラム放出性（programmed-release）、および胃貯留投与剤形をはじめとする調節放出投与剤形として配合され得る。これらの投与剤形は、公知方法および技術に従って調製され得る（全体として参照により本明細書に組み入れられるRemington: The Science and Practice of Pharmacy、上掲; Modified-Release Drug Delivery Technology, Rathbone et al, Eds.,Drugs and the Pharmaceutical Science, Marcel Dekker, Inc.: New York, N.Y.,2002; Vol. 126参照）。一実施形態において、該組成物は、１種または複数の投与剤形である。例えば組成物は、固体または液体形態で投与され得る。固体投与剤形の例としては、カプセルもしくは錠剤の、粉末もしくは顆粒としての、または圧縮成形により従来通り形成された錠剤中に存在する、分離した単位が挙げられるが、これらに限定されない。そのような圧縮錠は、適切な機械で３種以上の薬剤および医薬的に許容し得る担体を圧縮することにより調製され得る。成形された錠剤は、場合により表面に刻まれた標示を有するコーティングまたは刻み目が施され、それによりプレバイオティックを含む組成物の即時放出、実質的な即時放出、徐放、制御放出、または持続放出を起こすように配合され得る。さらに、本発明の投与剤形は、全体として参照により本明細書に組み入れられるHandbook of Pharmaceutical Excipients, American PharmaceuticalAssociation (1986)に記載されるような当該技術分野で公知の許容し得る担体または塩を含み得る。
【００５０】
本明細書に記載された組成物は、場合により液体形態であり得る。該液体配合剤は、例えば溶液中水（water-in-solution）および／または懸濁液の形態の薬剤と、香味を付与された、または付与されていない、ポリエトキシル化ヒマシ油、アルコール、および／またはポリオキシエチル化モノオレイン酸ソルビタンを含むビヒクルと、を含み得る。各投与剤形は、活性剤の効果的量を含み、従来の賦形剤、ビヒクル、充填剤、結合剤、崩壊剤、ｐＨ調整物質、緩衝剤、溶媒、可溶化剤、甘味剤、着色剤などの医薬的に不活性の薬剤、および経口投与のための医薬的投与剤形中に含まれ得る任意の他の不活性剤を場合により含み得る。そのようなビヒクルおよび添加剤の例は、Remington’sPharmaceutical Sciences, 17th edition (1985)に見出され得る。
【００５１】
該組成物は、随意に摂取され得る。疾患、障害、病状または事象によって誘起されたディスバイオシスが該組成物の投与によって取り組まれている例では、総摂取期間は、約１週間〜約５２週間、または約４週間〜約２６週間、または約４週間〜約１２週間、または約６週間であり得る。一実施形態において、細菌胞子組成物はまた、本明細書に記載された通り別の物質（例えば、抗生物質）と組み合わせて投与され得る。一実施形態において、総処置期間は、約５日間〜約３５日間である。一実施形態において、総処置期間は、約７日間〜約９０日間、または約７日間〜約６０日間、または約１４日間〜約５０日間、または約１４日間〜約４０日間、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約３０日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約３４日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約３６日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約３８日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約４２日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約６０日間である。別の実施形態において、総処置期間は、約９０日間である。別の実施形態において、１つの治療過程の後に、誘発レジメンと、それに続く維持レジメン（maintenance regimen）など、別の治療過程が行われ得る。
【００５２】
動物モデル
本明細書で提供された治療組成物および方法は、当該技術分野で公知の大腸炎の動物モデルでテストされ得る。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルおよびトリニトロベンゼンスルホン酸塩（ＴＮＢＳ）モデルなど、少なくとも６６の異なるタイプの動物モデルが記載されている（Mizoguchi, 2012, Prog Mol Biol Transl Sci 105:263-320）。候補となる治療組成物および／または方法は、動物における疾患の兆候もしくは症状の誘発前、誘発の際、または少なくとも１つの兆候もしくは症状の発現後に、該組成物を動物モデルに投与することによりテストされる。抗生物質での前処置および／または同時処置を含む方法において、前処置は、１つまたは複数の兆候または症状の誘発前、誘発の際、または発現後に施され得る。実施例（下記）で、そのようなテストのさらなるガイダンスを提供する。
【００５３】
有効性の尺度
処置の有効性は、兆候および／または症状を評価することにより、そして改善の誘発および／または寛解もしくは改善状態の維持が、例えば少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも８週間、または少なくとも１２週間、実現されるかどうかにより、決定され得る。例えば内視鏡で、組織学的に、または画像技術を介して判断される粘膜治癒が、そのような評価に、特に大腸炎、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎と診断された対象における長期臨床転帰を予測するために、用いられ得る。寛解または兆候または症状は、クローン病ではクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）、ＰＣＤＡＩ、もしくは緩和、またはＰＣＤＡＩもしくはＣＤＡＩのうちの１つもしくは複数の要素、例えば液状便または軟便の数、腹痛、一般的健康問題、合併症の存在（関節痛もしくは関節炎、ブドウ膜炎；虹彩の炎症；結節性紅斑、壊疽性膿皮症もしくはアフタ性潰瘍の存在；裂肛、瘻孔、もしくは膿瘍；他の瘻孔、または発熱など）、下痢のためにアヘン剤もしくはジフェノキシラート／アトロピンを使用していること、腹部腫瘤の存在、０．４７未満（男性）もしくは０．４２未満（女性）のヘマトクリット；または標準体重からの偏差パーセンテージなどの臨床標示を利用して決定され得る。幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法により処置された対象は、１５０未満のＣＤＡＩを実現および／または保持する。幾つかの実施形態において、方法の陽性反応は、対象のＣＤＡＩの少なくとも７０ポイントの低下である。
【００５４】
潰瘍性大腸炎において、治療有効性の指標としては、例えば排便頻度の正常化、排便の欠如または切迫性、および糞便中の血液の非存在が挙げられる。寛解は、少なくとも１つの兆候または症状が処置の完了後少なくとも４週間にわたり減少していれば、実現されたと見なされる。粘膜治癒は、臨床寛解の尺度の一例である。他の兆候／症状は、Ｃ−反応性タンパク質および／または他の急性期指標、ならびにクオリティー・オブ・ライフに関連するものなど主観的標示の正常化を包含し得る。標示の他の例としては、Montreal分類、Mayoスコア（内視鏡サブスコアを含む、または含まない）、または小児潰瘍性大腸炎指数を用いた中等度から軽度への改善を挙げることができる。
【００５５】
一般に、本明細書に記載された方法および組成物は、大腸炎と診断された対象を処置するのに有用である。
【００５６】
大腸炎を処置するための治療組成物および／または方法の有効性の他の指標としては、７日目の治療組成物のＢＳＣ成分中で同定された少なくとも１種の細菌ＯＴＵの生着、例えば生着もしくは少なくとも１種のキーストーン細菌ＯＴＵ；２週目、３週目、４週目、５週目、６週目、７週目、８週目、９週目、１０週目、１１週目、もしくは１２週目の少なくとも１種の細菌ＯＴＵの生着；４週目、５週目、６週目、７週目、８週目、９週目、１０週目、１１週目、もしくは１２週目の臨床寛解（例えば、Mayoスコアが２以下で１を超えるサブスコアがないこと）；または４週目の内視鏡的寛解（Mayo内視鏡スコアが０であること）が挙げられる。キーストーンＯＴＵは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３０８１７号（国際公開第２０１４／１４５９５８号）に記載されている。
【００５７】
定義
本明細書に記載された治療組成物の「治療上効果的な量」は、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答、例えば少なくとも１つの障害パラメータの緩和、または障害の少なくとも１つの症状の緩和を誘導する化合物の能力（そして場合により、投与される任意の追加的薬剤の影響）などの因子に応じて変動し得る。治療上効果的な量はまた、該組成物の任意の毒性または有害作用より治療上の有益効果がまさる量である。本明細書に記載された組成物は、一般に治療上効果的な量で投与される。
【００５８】
該治療組成物の個々の成分（ＢＳＣおよび抗生物質）の治療上効果的な量には範囲があり得ることも、理解されよう。
【００５９】
均等物
全ての技術的特色は個別に、そのような特色の全ての可能な組み合わせに組み合され得る。
【００６０】
本発明は、その主旨または本質的特徴を逸脱することなく、他の特別な形態に具体化され得る。それゆえ前述の実施形態は、全ての点で、本明細書に記載された本発明への限定というよりむしろ例示と見なされなければならない。
【実施例】
【００６１】
以下の非限定的実施例は、本明細書に記載された発明の実施形態をさらに例示している。
【００６２】
実施例１：ＢＳＣを作製する方法
ＢＳＣは、健常なヒトドナーから得られた糞便標本を用いて調製された。糞便試料を分画して、フィルミクテスの胞子の調製物を得た。手短に述べると、新鮮な糞便標本を採取し、その後、−８０℃に凍結した。およそ１５０ｇを通常の生理食塩水に懸濁させ、ホモジネートして、メッシュスクリーンでろ過した。得られたスラリーを遠心分離し、細菌細胞および胞子を含有する上清を採取して、１００％エタノールを使用して５０％（ｗｔ／ｗｔ）にした。エタノール調製物を室温で１時間インキュベートし、遠心分離によってペレット化させて、生理食塩水で洗浄してエタノールを除去し、滅菌グリセロールに再懸濁させて、ＢＳＣを生成した。ＢＳＣを使用に取り掛かるまで−８０℃で貯蔵した。
【００６３】
ＢＳＣを、胞子濃度および残留グラム陰性菌の非存在に関して特徴づけた。ジピコリン酸（ＤＰＡ）量を測定し、ＤＰＡ量に対して３つの共生種を表す胞子の既知数を正規化することによって、胞子量を決定した（Hindle and Hall.  1999 Analyst 124:1599-604）。MacConkeyラクトース寒天およびバクテロイデス胆汁エスクリン寒天での選択培養により、残留グラム陰性菌の非存在を確認した。栄養微生物は、任意のＢＳＣ調製物中にアッセイ検出限界内で見出されなかった（３０コロニー形成単位／ｍＬ未満）。
【００６４】
実施例２：広域スペクトル抗生物質の前処置を行った、または行わなかった大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデル
ＤＳＳモデルは、例えば潰瘍性大腸炎をはじめとする炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のモデルとして用いられる特徴が明確な大腸炎モデルである(Wirtz, 2007 Nat Protoc 2:541-6）。このモデルにおいて、ＤＳＳを飲料水中で送達し、基底腺窩細胞への直接の毒性を通して大腸炎を誘発し、粘膜破壊を起こして、自然免疫の活性化を確実にする。ＤＳＳ誘発性炎症は、大腸に限定され、その病理は、適応免疫とは独立している。ＢＳＣをこのモデルでテストして、ＩＢＤのこれらの特色、例えばＤＳＳモデルにおい発現された潰瘍性大腸炎、を緩和する健常なマイクロバイオームの能力を決定した。
【００６５】
手短に述べると、１群あたり１５匹の３週齢雄C57Bl/6マウス（未処置対照群は１０匹）を、表１に従って処置した。
【表１】
2018524354.tif 000003
【００６６】
この実験の目的は、ＩＢＤ、例えばＵＣを処置する際のＢＳＣの有効性に及ぼす抗生物質カクテルでの前処置の影響を評価することであった。したがって３群が、それらの処置を受ける前に、飲料水中の抗生物質カクテルの１０日処置を受けた（群５〜７）。群２および４〜７のマウスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（対照群２および５）、ＢＳＣ（群４および７）、またはマウス盲腸スラリー（群６）のいずれかで週３回、経口胃管栄養法により投与された。３１〜３５日目に、マウスを飲料水中の２％ＤＳＳに暴露し（群２〜７）、その後、４１日目まで観察した。定期的測定には、体重および臨床スコアが含まれた。４１日目に、動物を安楽死させ、重量、長さ、および肉眼的病理をはじめとする結腸の特色を評価した。結腸試料を、組織病理用に調製し、処置群および試験群の性質を知らされていない病理学者がスコアづけした。
【００６７】
全体として、ＤＳＳ処置は、未処置マウスに比較して有意な体重減少、臨床スコアおよび肉眼的病理スコアの増悪、結腸の長さの減少をもたらした（群２対群１）。抗生物質前処置を行わずにＰＢＳを受けた陰性対照マウス（群２）に比較したブデソニド処置（群３）での臨床スコアの小さいが有意な改善を除き、ＢＳＣのみ（群４）またはブデソニド（群３；グルココルチコイド陽性対照）を受けたマウスでは、疾患パラメータのいずれにも統計学的に有意な変動が観察されなかった。
【００６８】
広域スペクトル抗生物質カクテルで前処置されてＰＢＳを投与されたマウス（Ａｂｘ対照、群５）は、陰性対照群に比較して、ＤＳＳ病理を大きく防御した。抗生物質カクテルの後にＳＰＦマウス盲腸材料を経口接種されたマウス（Ａｂｘ＋ＳＰＦ、群６）は、この防御を喪失し、陰性対照群と同等のＤＳＳ感受性を示した。Ａｂｘ＋ＢＳＣ（群７）処置マウスは、抗生物質処置のみ（Ａｂｘ対照、群５）と同様に、ＤＳＳ誘発性疾患を防御した。しかし、抗生物質処置のみ（群５）に比較してＡｂｘ＋ＢＳＣ（群７）の結腸の長さの増加に基づく結腸病理のさらなる防御の指標があった（図１）。一般に結腸の短縮は、炎症を示す。Ａｂｘ＋ＰＢＳ処置とＡｂｘ＋ＢＳＣ処置の間の結腸組織病理スコアにおける全体的な有意差は存在しなかったが、処置の影響は、Ａｂｘ＋ＢＳＣコホートで一貫していた（図２）。そのコホート内で類似した一貫性のある影響が、体重変動で観察された（Ａｂｘ＋ＢＳＣは、Ａｂｘ＋ＰＢＳよりも一貫した防御効果を有した）（図３）。ＤＳＳ処置後にＡｂｘ＋ＢＳＣ群では体重減少率％の減少、より低い臨床スコア、およびより低い肉眼的病理スコアを示す非有意の傾向があった（図４）。
【００６９】
要約すると、これらのデータから、ＤＳＳ処置が体重減少、臨床スコア増加、結腸短縮、および炎症を生じることが実証される。抗生物質前処置がない場合、ブデソニドおよびＢＳＣ処置のみは、病理への防御をほとんど、または全くもたらさなかった。広域スペクトル抗生物質での前処置は、ＤＳＳ誘発性疾患を予防したが、正常マウスからの盲腸内容物の接種は、ＤＳＳ病理への感受性を回復させた。抗生物質前処置の後、投与されたＰＢＳおよびＢＳＣ処置の両方（群５および７）は、ＤＳＳ誘発性疾患の予防に有効であった。加えてＢＳＣは、動物間変動性の減少および群内でのより長い結腸の長さによって示される通り、抗生物質のみにより付与される防御を超える改善をもたらした。これらのデータから、抗生物質前処置と組み合わせたＢＳＣが、マウスＤＳＳ実験大腸炎モデルにおいて防御性があることが示される。
【００７０】
実施例３：バンコマイシンでの前処置を行った、または行わなかった大腸炎のＤＳＳモデル
抗生物質のみとしてバンコマイシンを評価する群を追加して、潰瘍性大腸炎に及ぼす抗生物質およびＢＳＣの影響をさらに検査するために、上記のＤＳＳモデルを用いた。この実験において、１群あたり１５匹の３週齢雄C57Bl/6マウス（未処置対照群は９匹）を、表２に従って処置した。
【表２】
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【００７１】
ＢＳＣの有効性への影響を評価するための処置を受ける前に、バンコマイシン（群５および６）または抗生物質混合物（群７および８）のいずれかを、飲料水中でマウスへ投与した。ＰＢＳ（群２、５、および７）またはＢＳＣ（群６および８）のいずれかを、経口胃管栄養法により９日目に開始して試験終了時（３８日目）まで継続して週３回、マウスに投与した。群４では、０日目に開始して週３回、ＢＳＣを投与した。２８〜３２日目に、マウスを飲料水中の２％ＤＳＳに暴露し（群２〜８）、３８日目まで観察した。定期的測定には、体重および臨床スコアが含まれた。３８日目に、動物を安楽死させ、重量、長さ、および肉眼的病理をはじめとする結腸の特色を評価した。結腸試料を、組織病理用に調製し、処置群および試験項目の性質を知らされていない病理学者がスコアづけした。
【００７２】
全体としてＤＳＳ処置は、有意な体重減少、臨床スコアおよび肉眼的病理スコアの増悪、結腸の肥厚、結腸の長さの減少、ならびに結腸の炎症および浮腫の増加を生じた（陰性対照群２対非処置群１）。陽性対照である抗ＩＬ−１２  ｐ４０（群３）は、陰性対照に比較して、３６〜３８日目に開始した体重および臨床スコアの改善、ならびに最大臨床および組織病理スコアの全体的減少による活性のシグナルを示した。
【００７３】
ＢＳＣのみを受けた動物（群４）は、陰性対照に比較して、ＤＳＳ誘発に続いてより重度の最大体重減少を示した（１５．５％対２２．１％）。しかし３８日目の試験終了時に、臨床スコア、結腸の長さ、肉眼的病理、および組織病理スコアにおける差異はなかった。体重変動および臨床症状は、飲料水へのＤＳＳ添加前の３週間ＢＳＣ処置の間には観察されなかった。
【００７４】
バンコマイシンでの前処置（群５）は、ＤＳＳ誘発性疾患への有意な防御を提供した。バンコマイシン群（群５）における最大体重減少は、陰性対照群に比較して有意に低下した。バンコマイシン群（群５）は、陰性対照（群２）に比較した結腸の長さの増加、結腸重量の減少、ならびに肉眼的病理および組織病理スコアの改善に示される通り、臨床スコアの減少および結腸病理の全体的改善をもたらした。
【００７５】
Ｖａｎｃｏ＋ＢＳＣ（群６）は、 体重減少をＶａｎｃｏ対照（群６）と同程度まで防御した。しかしＶａｎｃｏ＋ＢＳＣ処置は、バンコマイシンのみに比較して、複数の尺度において利益を提供した。Ｖａｎｃｏ＋ＢＳＣを受けたマウスは、Ｖａｎｃｏのみのコホート（群５）に比較して、臨床スコアの改善および低い結腸重量を示した。Ｖａｎｃｏ＋ＢＳＣ群における肉眼的病理スコアは、Ｖａｎｃｏのみの群よりも高かったが、盲検での顕微鏡組織病理スコアには差異がなかった。
【００７６】
Ａｂｘ対照（群７）コホートは、Ｖａｎｃｏ対照群と同様に、陰性対照（群２）に比較してＤＳＳ処置に応答した体重減少の低下、臨床スコアの改善および結腸病理の減少を示した。ＢＳＣ（群８）と組み合わせたＡｂｘは、Ａｂｘ＋ＢＳＣ（群８）での処置が結腸重量の低下をもたらしたことを除き、Ａｂｘのみ（群７）と類似の転帰をもたらした。結腸重量減少の観察は、Ｖａｎｃｏ＋ＢＳＣをＶａｎｃｏのみの対照に比較して観察された類似の効果と一致する。
【００７７】
要約すると、これらのデータから、ＤＳＳ処置が体重減少、臨床スコア増加、結腸短縮、および炎症をもたらすことが実証される。陽性対照である抗ＩＬ−１２  ｐ４０（群３）は、陰性対照に比較して、３６〜３８日目に開始する体重および臨床スコアの改善、ならびに最大臨床および組織病理スコアの全体的減少による活性のシグナルを示した。抗生物質前処置がない場合、ＢＳＣ処置のみは、飲料水へのＤＳＳ添加の前の３週間ＢＳＣ処置の間に体重変動および臨床症状がなかったことで示される通り、耐容性が良好であった。しかしＢＳＣのみの処置は、ＤＳＳ誘発性病理に対して防御効果を有さなかった。バンコマイシンまたは広域スペクトル抗生物質混合物での前処置は、ＤＳＳ誘発性疾患を大きく防御したが、これらのコホートは、非処置マウスに比較した肉眼的病理および組織病理スコアの変動に示される通り、結腸病理の増悪を示した。バンコマイシン前処置後のＢＳＣ投与もまた、ＤＳＳ誘発性疾患を防御したが、臨床スコアおよび結腸重量の改善に基づけば、Ｖａｎｃｏよりも有意に有効であり、最大体重減少の低下、結腸の長さの増加および組織病理減少の非有意な傾向があった。広域スペクトル抗生物質混合物の後のＢＳＣ処置は、ほとんどの尺度において、対照群よりも高レベルのＤＳＳ誘発の防御を提供しなかったが、ＢＳＣが抗生物質処置と組み合わされると、結腸重量が減少した。まとめると、これらのデータから、バンコマイシン後のＢＳＣ処置が、マウスＤＳＳ実験的大腸炎モデルにおいて防御性があり、それゆえＩＢＤ、例えば潰瘍性大腸炎を処置するための処置レジメンとして有用であることが示される。
【００７８】
実施例４：広域スペクトル抗生物質の前処置を行った、および行わなかった大腸炎のＴＮＢＳモデル
ピクリルスルホン酸とも呼ばれるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は、炎症性腸疾患の化学誘発物質として用いられることが多い（Wirtz, 2007, 上掲）。ＴＮＢＳ誘発性大腸炎を得るために、ＴＮＢＳをエタノール中で調製して、結腸に直接投与する。エタノールとＴＮＢＳの組み合わせは、上皮粘膜層の破壊と、自己および微生物タンパク質のハプテン化をもたらし、免疫原性を増大させて、適応Ｔｈ１型免疫応答を誘発する。このモデルは、適応免疫の調整物質に加えて、上皮損傷への防御に関与する治療薬の評価を可能にする。
【００７９】
このモデルにおけるＢＳＣの有効性をテストするために、１群あたり１８匹の３週齢雌Balb/cマウス（非処置群は１０匹）を、表３に従って処置した。
【表３】
2018524354.tif 000005
【００８０】
この実験の目的は、ＢＳＣの有効性に及ぼす抗生物質前処置の影響を評価することであり、それゆえ３群が、それらの処置を受ける前に飲料水中の抗生物質カクテルの１０日間処置を受けた（群５〜７）。群２および４〜７のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（対照群２および５）、ＢＳＣ（群４および７）、またはマウス盲腸スラリー（群６）のいずれかを週３回、経口胃管栄養法により投与した。３１日目に、マウスに結腸内２％ＴＮＢＳを投与し（群２〜７）、その後、３８日目まで観察した。定期的測定には、体重および臨床スコアが含まれた。３８日目に、動物を安楽死させ、結腸の特色を評価して、全体的な肉眼的病理スコアを作成した。結腸試料を、組織病理用に調製し、処置群および試験項目の性質を知らされていない病理学者がスコアづけした。
【００８１】
ＴＮＢＳ誘発後の死亡が、最も顕著な転帰であった。５０％を超える動物の喪失から、ＴＮＢＳの過剰投与が生じたことが示唆される。加えて、ＴＮＢＳ点滴注入の際の麻酔用のキシラジンおよびケタミンの使用は、疾患の重症度を増大させた可能性がある。この知見は、文献の報告と一致する（Scheiffele and Fuss, 2002 Curr Protocols Immunol.  Unit15.19.  Published Online: 1 AUG 2002, DOI: 10.1002/0471142735.im1519s49）。死亡率の動態は、処置群間で異ならないようであった（群２〜７）。死亡率は、３９％（陰性対照群２およびＢＳＣ群４において７／１８の死亡）〜６１％（陽性対照群３において１１／１８の死亡）の範囲内であった。Ａｂｘ対照群５は、５６％（１０／１８死亡）の中間レベルの死亡率を有した。非処置分では死亡がなかった。ＢＳＣを受けた群（群４および７）での死亡率は、いずれの他の処置群とも異ならなかった。
【００８２】
ＴＮＢＳ処置はまた、非処置マウスに比較して有意な体重減少、臨床および肉眼的病理スコアの増悪、ならびに死亡をもたらした（群２対群１）。グルココルチコイド陽性対照であるブデソニド（群３）は、検査されたいずれのパラメータに関してもマウスをＴＮＢＳ誘発性疾患から有意に防御しなかった。むしろ、該陽性対照群は、陰性対照マウスよりも有意に多くの体重を減少させ、臨床スコアを増悪させた。ＢＳＣのみで投与されたマウス（群４）は、体重、臨床スコア、または肉眼的および組織的スコアにおいて陰性対照マウスと異ならなかった。Ａｂｘ対照（群５）は、陰性対照（群２）に比較して有意により大きな最大体重減少および臨床スコアの増悪を示した。総括すると、Ａｂｘ＋ＳＰＦ（群６）コホートは、臨床スコアの改善を除き、Ａｂｘ対照（群５）と類似した成績であった。
【００８３】
最小の有効性を有した他の処置群とは対照的に、Ａｂｘ＋ＢＳＣ（群７）は、一貫した改善兆候を有した。３６日目および全体として体重減少が有意に低下したＡｂｘ＋ＢＳＣ（群７）は、対象よりも低い最大体重減少を有した（Ａｂｘ対照群５）。統計学的に有意ではなかったが、Ａｂｘ＋ＢＳＣ（群７）は、処置群で最低値の１つであり対照群（Ａｂｘ対照群５）よりも有意に低い臨床スコアを有した。Ａｂｘ＋ＢＳＣ（群７）はまた、肉眼的病理に関して強い防御傾向を示した（ｐ＝０．１）。Ａｂｘ＋ＢＳＣマウスは、いずれの処置群でも最低の肉眼的病理スコアを有した。組織病理スコアに関して、処置群のいずれにも有意差が観察されなかった。したがって、抗生物質混合物前処置へのＢＳＣの添加は、体重、臨床スコアおよび結腸肉眼病理への有益効果を有したと思われる。
【００８４】
要約すると、高レベルの死亡率と、対応する有意な臨床症状および組織病理があり、ことによると麻酔の結果として、ＴＮＢＳによる動物の過剰投与が示された設定にこれらのデータが存在する、という観察にもかかわらず、これらのデータは、ＴＮＢＳ大腸炎モデルにおける抗生物質処置後に送達されたＢＳＣの有効性シグナルと一致している。幾つかの実施形態において、ＩＢＤと診断された、またはＩＢＤ突発のリスクを有する対象が、抗生物質（複数可）とＢＳＣとの組み合わせで処置される。
【００８５】
実施例５：広域スペクトル抗生物質またはバンコマイシン前処置を行った、および行わなかった大腸炎のＴＮＢＳモデル
追加の実験を、ＴＮＢＳモデル（上記）を用い、抗生物質と組み合わせたＢＳＣを用いて実施した。これらの実験では、１群あたり２４匹の３週齢雄Balb/cマウス（非処置対照群では９匹）を、表４に従って処置した。
【表４】
2018524354.tif 000006
【００８６】
バンコマイシン（群５および６）または抗生物質混合物（群７および８）のいずれかを、ＢＳＣの有効性に及ぼす影響を評価するための処置を受ける前に、飲料水中でマウスに投与した（群５〜８）。マウスに、ＰＢＳ（群２、５および７）またはＢＳＣ（群６および８）のいずれかを７日目から開始して試験終了時（３５日目）まで継続して週３回、経口胃管栄養法により投与した。群４のマウスは、ＢＳＣを０日目に開始した経口胃管栄養法により週３回受けた。２８日目に、マウスはイソフルランで麻酔されて、結腸内２％ＴＮＢＳを受けた（群２〜８）。定期的測定には、体重および臨床スコアが含まれた。３５日目に、動物を安楽死させ、肉眼的病理を評価した。結腸試料を、組織病理用に調製し、処置群および試験項目の性質を知らされていない病理学者がスコアづけした。
【００８７】
総括すると、ＴＮＢＳ処置は、有意な体重減少、死亡率、ならびに臨床および肉眼的病理の増悪をもたらした（陰性対照群２対非処置群１）。ＴＮＢＳ誘発後の死亡率は、陰性対照群での３３％が最高であった（８／２４死亡または安楽死）。非処置対照群１、Ａｂｘ対照群７、またはＡｂｘ＋ＢＳＣ群８には死亡がなかった。中間レベルの死亡が、陽性対照群３（１／２４、４％）、ＢＳＣ群４（１／２４、４％）、Ｖａｎｃｏ対照群５（２／２４、８％）およびＶａｎｃｏ＋ＢＳＣ群６（３／２４、１２％）で認められた。全ての生存曲線の比較から、処置群の間で死亡分布の有意差が見出された（ログランク（Mantel-Cox）検定、ｐ＝０．０２）。さらなる対解析から、非処置群１（ｐ＝０．０６）に比較して陰性対照群２では強い生存率低下傾向が示され、それは他の群でも互いに異ならなかった。したがって生存曲線で観察された差異は、陰性対照群でのより高い死亡率に起因する可能性があった。
【００８８】
陰性対照／群２のマウスは、非処置群１コホートに比較して、有意な体重減少を示した。この体重減少に続いて、２８日目にＴＮＢＳ投与が行われ、体重減少は３５日目（終了時）まで維持された。３１〜３３日目の間、陽性対照群３、ＢＳＣ群４、およびＡｂｘ対照群７のマウスは全て、陰性対照群のマウスよりも有意に体重を増加させた。最大体重減少率％を分析すると、ＢＳＣのみ（群４）はまた、陰性対照マウス（ｐ＝０．１０）に比較して改善傾向を示した。
【００８９】
抗生物質混合物のみで前処置されたマウス（Ａｂｘ対照群７）は、体重減少の防御を示したが、バンコマイシンのみ（Ｖａｎｃｏ対照群５）の影響はなかった。バンコマイシンまたは抗生物質の前処置（群６および８）に続いてＢＳＣを投与した場合には、各対照群（群５および７）に比較して、有意な体重増加はなかった。総括すると、バンコマイシンまたは抗生物質混合物を受けた群のいずれも、陰性対照／群２に比較して、最大体重減少率％に及ぼす有意な影響はなかった。
【００９０】
陰性対照群の臨床スコアは、非処置群に比較して、ＴＮＢＳ処置により有意に増悪した。臨床スコアは、陽性対照群３、ＢＳＣ群４、およびＡｂｘ対照群７の全てで陰性対照群よりも有意に低かったため、それらの群で改善した。Ｖａｎｃｏ対照群５は、陰性対照群２に対して統計学的に改善されなかったが、バンコマイシンと組み合わせたＢＳＣ（群６）は、Ｖａｎｃｏ対照群５に対して改善された臨床スコアを有しており、併用処置による追加的利益が示された。臨床スコアにおける有意差は、Ａｂｘ対照群とＡｂｘ＋ＢＳＣの間では全く観察されなかった。したがって、抗ＩＬ−１２陽性対照およびＢＳＣのみの両方もまた、ＴＮＢＳ大腸炎の臨床徴候および症状を改善した。バンコマイシン後のＢＳＣもまた、バンコマイシンのみの対照に比較して改善を示した。
【００９１】
予測通り、ＴＮＢＳ処置は、非処置群１に比較して陰性対照群２において有意に増加した肉眼的病理スコアをもたらした。体重減少の低下および臨床スコアの改善と正確に合致して、結腸肉眼的病理スコアが、ＢＳＣのみ（群４）で有意に改善した。組織病理スコアもまた、他のエンドポイントと一致しており、陽性対照群２は有意な疾患の組織学的徴候を有し、ＢＳＣ群４は強い改善傾向を有した（ｐ＝０．１４）。Ｖａｎｃｏ群は、陰性対照群２と異なっていなかったが、Ｖａｎｃｏ＋ＢＳＣ組み合わせ群（群６）での組織病理学は、Ｖａｎｃｏのみ（群５）に比較して有意な改善があった。さらなる有意な差異は、群間に認められなかった。
【００９２】
要約すると、ＴＮＢＳ誘発性疾患は、体重減少、死亡率、ならびに臨床および肉眼的病理スコアの増悪を特徴とした。ＢＳＣのみを受けた群は、測定された３種のパラメータ（体重、臨床スコア、および肉眼的病理スコア）を有意に改善し、他の３種（死亡率、最大体重減少、および組織病理）の強い改善傾向を有した。加えて、ＢＳＣとバンコマイシンの組み合わせは、バンコマイシンのみの対照群に比較すると、臨床および組織病理スコアを有意に改善した。対照的に、抗生物質混合物のみ（Ａｂｘ対照群５）により付与された有意なレベルの防御は、ＢＳＣ処置を加えることにより（Ａｂｘ＋ＢＳＣ）追加の利益を検出することが困難になった。
【００９３】
これらのデータから、ＢＳＣと、バンコマイシン後のＢＳＣの両方が、マウスのＴＮＢＳ実験的大腸炎モデルにおいて防御性であることが示される。
【００９４】
本出願者らは、この実験を反復して、ＴＮＢＳ誘発性疾患が体重減少、死亡率、ならびに臨床スコアおよび結腸病理の増悪を特徴としてづけられたことに注目している。死亡率は、最初のＴＮＢＳ試験のものより低かったが、それでも２５％と高く、効果を越えるＴＮＢＳの毒性が実験で見られたことが示される。ＢＳＣのみ、またはバンコマイシンもしくは抗生物質との組み合わせは、転帰を有意に改善しなかった。抗ＩＬ−１２  ｐ４０は、この試験における体重、死亡率、または臨床スコアへの有益効果を全く有さず、肉眼的病理の改善により評定される通り、組織損傷の改善に関連した。抗ＩＬ−１２  ｐ４０対照では予想外に低い応答であったため、本出願者らは、この実験の全体的結果が異常であったと考えている。
【００９５】
実施例６：活動性の軽度〜中等度潰瘍性大腸炎を有するヒト対象の処置
潰瘍性大腸炎を処置するためのＢＳＣの安全性および可能な有効性を決定するために、軽度〜中等度潰瘍性大腸炎を有する対象を同定する（例えば、少なくとも１５ｃｍの疾患を有するというＳ字結腸鏡検査、４以上１０以下のMayoスコア、および２以上のMayo内視鏡サブスコアと測定された対象）。対象は、ビヒクルまたはバンコマイシンで６日間前処置され、その後、表５に示された通り処置される。
【表５】
2018524354.tif 000007
【００９６】
潰瘍性大腸炎の臨床症状を評価することに加えて、対象の胃腸マイクロバイオームの組成物の変動を評定する。
【００９７】
ＢＳＣでの処置は、例えば総Mayoスコアのベースラインからの１ポイント以上（例えば、３ポイント以上）の低下；８週目の直腸出血サブスコアの１ポイント以上の低下、もしくは０もしくは１の絶対直腸出血サブスコア；８週目に０または１の内視鏡Mayoスコアにより示される完全な内視鏡的寛解；または８週目の２以上の総Mayoスコアおよび０もしくは１の内視鏡サブスコアにより示される完全寛解、によって示される通り、潰瘍性大腸炎を改善する。
【００９８】
本発明を、以下の番号づけされたパラグラフにさらに記載する。
【００９９】
１．大腸炎と診断された対象を処置する方法であって、（ａ）抗生物質を該対象に投与すること、および（ｂ）細菌胞子組成物（ＢＳＣ）を該対象に投与すること、を含む、方法。
２．該大腸炎が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、パラグラフ１の方法。
３．該抗生物質が、バンコマイシンである、パラグラフ１または２の方法。
４．該抗生物質および該細菌胞子組成物が、同時に投与される、パラグラフ１〜３のいずれか１つの方法。
５．該抗生物質および該細菌胞子組成物が、連続で投与される、パラグラフ１〜３のいずれか１つの方法。
６．該細菌胞子組成物が、該抗生物質の最後の投薬の２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、または３週間以内に投与される、パラグラフ１〜５のいずれか１つの方法。
７．該細菌胞子組成物が、単回投与される、パラグラフ１〜６のいずれか１つの方法。
８．該細菌胞子組成物が、毎日、少なくとも２日ごとに、少なくとも３日ごとに、少なくとも４日ごとに、少なくとも５日ごとに、少なくとも６日ごとに、少なくとも毎週、少なくとも２週ごとに、少なくとも３週ごとに、少なくとも４週ごとに、少なくとも８週ごとに、少なくとも１２週ごとに、または少なくとも１６週ごとに投与される、パラグラフ１〜６のいずれか１つの方法。
９．該細菌胞子組成物が、カプセルまたは丸薬の中にある、パラグラフ１〜８のいずれか１つの方法。
１０．該組成物が、９９％以下の栄養細胞を含む、パラグラフ１〜９のいずれか１つの方法。
１１．該対象が、活動性の大腸炎を有する、パラグラフ１〜１０のいずれか１つの方法。
１２．該対象が、軽度〜中等度の潰瘍性大腸炎と診断されている、パラグラフ１〜１１のいずれか１つの方法。
１３．該対象が、該ＢＳＣで少なくとも８週間にわたり毎週、または少なくとも８週間にわたり毎日処置される、パラグラフ１〜１２のいずれか１つの方法。
１４．該ＢＳＣが、胞子形成細菌を含む、パラグラフ１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．該ＢＳＣが、胞子を含む、パラグラフ１〜１４のいずれか１つの方法。
１６．該胞子が、ヒト糞便から直接得られる、パラグラフ１５の方法。
１７．該胞子が、エタノールを用いて直接得られる、パラグラフ１６の方法。
１８．該組成物が、本質的に胞子からなる、パラグラフ１４〜１７のいずれか１つの方法。
１９．該組成物が、２０％以下の栄養細胞を含む、パラグラフ１０の方法。
２０．大腸炎を処置するための、抗生物質と組み合わせた細菌胞子組成物の使用。
２１．大腸炎を処置する医薬を調製するための、抗生物質と組み合わせた細菌胞子組成物の使用。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲にある。
【図１】
2018524354.tif 000008
【図２】
2018524354.tif 000009
【図３】
2018524354.tif 000010
【図４】
2018524354.tif 000011
【国際調査報告】
2018524354.tif 000012