(57)【要約】  本発明は、そのゲノム中に、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有する、卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性があるブロッコリー及び他のＢ．オレラセア植物であって、前記遺伝子移入された配列が、第４染色体上の、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）によって区切られた染色体領域内に、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）によって区切られた領域内に位置し、特にＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の対立遺伝子Ｃによって特徴づけられる、植物に関する。本発明はまた、Ａ．カンジダのレース９オーストラリア変異体による感染に対して抵抗性を示すＢ．オレラセア、特にブロッコリー植物を作出又は同定する方法、並びに選択方法を提供する。本発明はまた、抵抗性遺伝子座に関連している分子遺伝学的マーカー、特にＳＮＰを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵菌類アルブゴ・カンジダ（Albugo candida）レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病（white blister rust）に抵抗性がある、ブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ（Brassica oleracea var. italica）ブロッコリー植物であって、
抵抗性を付与する遺伝子移入された配列をそのゲノム中に有し、
ここで、前記遺伝子移入された配列が、第４染色体上に、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）によって区切られた染色体領域内に、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）によって区切られた領域内に位置している、ブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ ブロッコリー植物。
【請求項２】
前記遺伝子移入された配列が、前記植物のゲノム中にホモ接合性に又はヘテロ接合性に存在する、請求項１に記載のＢ．オレラセア植物。
【請求項３】
前記抵抗性を付与する遺伝子移入された配列が、ロマネスコ（romanesco）Ｂ．オレラセア植物から遺伝子移入される、請求項１又は２に記載の植物。
【請求項４】
前記抵抗性を付与する遺伝子移入された配列が、Ｂ．オレラセアＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の種子のゲノムに存在する遺伝子移入された配列から選択され、ここで、前記種子のゲノムに存在する遺伝子移入された配列が、ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ−４２４３３で寄託されており、第４染色体上にあり、かつ抵抗性を付与する、請求項１から３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
前記遺伝子移入された配列が、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）を含む遺伝子座に位置する、請求項１から４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６】
前記遺伝子移入された配列が、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の対立遺伝子Ｃと連鎖不平衡にあり、好ましくは陽性の連鎖不平衡を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項７】
少なくとも１つの第４染色体上にあり、かつ前記抵抗性を付与する、前記遺伝子移入された配列の存在が、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）、からなる群から選択される、少なくとも１つのマーカーによって特徴づけられる、請求項１から６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項８】
前記遺伝子移入された配列の存在が、以下：
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）の対立遺伝子Ｇの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の対立遺伝子Ｃの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）の対立遺伝子Ｇの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）の対立遺伝子Ａの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）の対立遺伝子Ｃの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）の対立遺伝子Ａの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）の対立遺伝子Ｇの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）の対立遺伝子Ｃの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）の対立遺伝子Ｃの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）の対立遺伝子Ｔの存在；及び／又は
−  ＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）の対立遺伝子Ｇの存在、
によって特徴づけられる、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
前記遺伝子移入された配列が、前記抵抗性を付与する一遺伝子性かつ優性である抵抗性遺伝子を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１０】
前記植物が、ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３）の植物の後代であるか、又はＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３）の植物に由来する、請求項１から９のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のＢ．オレラセア植物の細胞であって、そのゲノム中に、卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を含み、ここで、前記遺伝子移入された配列が、ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４植物（ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３）の植物のゲノム中の、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）によって区切られた染色体領域内に、そして好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）とＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）との間に、存在する配列から選択される、Ｂ．オレラセア植物の細胞。
【請求項１２】
そのゲノム中に、卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有する、Ｂ．オレラセア植物の植物部位、外植片、接ぎ穂、切り穂（cutting）、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄又は頭部（head）であって、
前記植物、外植片、接ぎ穂、切り穂、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄又は頭部、及び／又は植物部位が、請求項１から１０のいずれか一項に記載の植物から得られ、かつ、請求項１１に記載の細胞を含む、Ｂ．オレラセア植物の植物部位、外植片、接ぎ穂、切り穂、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄又は頭部。
【請求項１３】
植物全体を再生することができない、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
成長すると、請求項１から１０のいずれか一項に記載の植物を生じる、Ｂ．オレラセア植物の種子。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の植物の再生可能な細胞の組織培養物であって、前記再生可能な細胞が、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根の先端、長角果、種子、花、子葉、及び／又は胚軸に由来し、かつ、それらのゲノム中に、卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する、第４染色体上の遺伝子移入された配列を含む、植物の再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項１６】
ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３）の植物のゲノム中に見られるような遺伝子移入された配列を有する、Ｂ．オレラセア・変種イタリカ、ブロッコリー植物を検出し及び／又は選択するための方法であって、
前記遺伝子移入された配列が卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与し、
選択されることになる植物の遺伝物質試料中に、以下の対立遺伝子：ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）の対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）の対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）の対立遺伝子Ｔ、及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つの検出を含む、方法。
【請求項１７】
そのゲノム中に、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有する、卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性があるブラッシカ・オレラセア植物であって、
前記遺伝子移入された配列が、第４染色体上に、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）によって区切られた染色体領域内に、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）によって区切られた領域内に位置し、かつ、
前記植物が、カリフラワー（Ｂ．オレラセア・亜種ボトリティス・変種ボトリティス（B. oleracea convar. botrytis var. botrytis））、芽キャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種オレラセア・変種ゲミフェラ（B. oleracea convar. oleracea var. gemnifera））、白キャベツ、オックスハートキャベツ（oxheart cabbage）（Ｂ．オレラセア・亜種カピタータ・変種アルバ（B. oleracea convar. capitata var. alba））及びサボイキャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種カピタータ・変種サバウダ（B. oleracea convar. capitata var. sabauda））から選択される、
ブラッシカ・オレラセア植物。
【請求項１８】
ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ−４２４３３で寄託されているＢ．オレラセアＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の植物又は種子、あるいは白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有するそれらの後代の使用であって、卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性があるブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ、ブロッコリー植物を得るための、育種プログラムにおける繁殖パートナーとしての、使用。
【請求項１９】
卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性がある、ブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ、ブロッコリー植物の作出のための方法であって、以下のステップ：
（ａ）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４２４３３から成長した植物、又は白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有するその後代と、感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを交配し；
（ｂ）白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有する、結果として得られた後代の中で１つの抵抗性植物を選択し；
（ｃ）場合により、ステップｂ）で得られた抵抗性植物を１又は数回自家受粉し、そして、結果として得られた後代の中で白発疹さび病に抵抗性がある植物を選択し；
（ｄ）場合により、ステップｂ）又はｃ）で選択された抵抗性植物と、感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを戻し交配し、並びに
（ｅ）白発疹さび病に抵抗性がある植物を選択すること、
を含み、
ここで、ＳＮＰマーカーが、ステップｂ）、ｃ）及び／又はｅ）で、白さび病に抵抗性がある植物を選択するために使用される、方法。
【請求項２０】
卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性がある、Ｂ．オレラセア ブロッコリー植物の作出のための方法であって、以下のステップ：
ａ１）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４２４３３から成長した植物、又は白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有するその後代と、感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを交配し、結果としてＦ１集団を生成し；
ａ２）Ｆ１集団を進めてＦ２集団を作成し；
ｂ）結果として得られた後代の中で１つの抵抗性植物を選択し；
ｃ）場合により、ステップｂ）で得られた抵抗性植物を１又は数回自家受粉し、そして、結果として得られた後代の中で白さび病に抵抗性がある植物を選択し；
ｄ）場合により、ステップｂ）又はｃ）で選択された抵抗性植物と、感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを戻し交配し、並びに
ｅ）白さび病に抵抗性がある植物を選択すること、
を含み、
ここで、ＳＮＰマーカーが、ステップｂ）、ｃ）及び／又はｅ）で、白さび病に抵抗性がある植物を選択するために使用される、方法。
【請求項２１】
卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性がある、Ｂ．オレラセア ブロッコリー植物の商業的入手方法であって、以下のステップ：
（ａ）寄託された種子ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４  ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３を発芽させることによって得られた植物、又は白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有するその後代と、白さび病に感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを戻し交配し；
（ｂ）卵菌類アルブゴ・カンジダのレース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性がある植物を選択すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記ステップｂ）、ｃ）及び／又はｅ）における選択が、以下の対立遺伝子：ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）の対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）の対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）の対立遺伝子Ｇ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）の対立遺伝子Ｃ、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）の対立遺伝子Ｔ、及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つの検出によって行われる、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法によって得られる、Ｂ．オレラセア ブロッコリー植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵菌類アルブゴ・カンジダ(Albugo candida)レース９、特にアルブゴ・カンジダ レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病(white blister rust)に対する、ブラッシカ・オレラセア(Brassica oleracea)の植物における抵抗性に関する。本発明によれば、前記抵抗性は、ブラッシカ・オレラセア植物のゲノム中の、第４染色体上に遺伝子移入された、ＤＮＡ配列によって提供される。前記遺伝子移入された配列は、ブラッシカ・オレラセア植物のゲノム中にホモ接合性に又はヘテロ接合性に存在し得る。特に好ましい抵抗性植物は、ブロッコリーである。本発明はさらに、白発疹さび病に抵抗性があるＢ．オレラセア植物を提供するための方法、白発疹さび病抵抗性のためのＤＮＡマーカー、並びに、卵菌類アルブゴ・カンジダ レース９、特にオーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性がある植物の同定における当該ＤＮＡマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景：
卵菌類アルブゴ・カンジダ（Pers. ex. Lev.）クンツェ（Kuntze）は、十字花科(crucifer family)としても知られているアブラナ科の偏性生体栄養性病原菌であり、白さび病（白発疹(white blister)、白発疹さび病、スタグヘッド(staghead)、Ａ．クルシフェラム（A.cruciferum）又はＡ．クルシフェラタム（A.cruciferatum）としても知られている）として知られている広範な病気を引き起こす。この病気は多くの野菜及び油糧種子作物、例えばブロッコリー、キャベツ、レイプ(rape)、カラシナ及びダイコンにとって有害である。
【０００３】
白さび病は世界中で、インド、カナダ、ヨーロッパ及びオーストラリアなど地理的にも環境的にも多様な国々で観察されている。オーストラリアでは、白発疹さび病は、国の南部におけるアブラナ科の作物に広まっている。
【０００４】
Ａ．カンジダは高度に特殊化しており、生きた宿主細胞間で増殖し、並びに、局所感染又は全身感染の結果であり得る、ある範囲の症状を引き起こす。アルブゴ属は、ある範囲の宿主に対して白さび病を引き起こすいくつかの種を含み、Ａ．カンジダの中で様々な宿主特異的形態が報告されている。したがってＡ．カンジダの特徴の１つはその高度な宿主特異性である。
【０００５】
Ａ．カンジダの増殖は、局所又は全身の２つのタイプの感染をもたらす。局所感染は、宿主の表皮の下で形成する白色又は乳黄色の遊走子嚢の小隆起(pustule)を特徴とする。これらは通常、葉の下方（背軸）表面に、そしてより低い程度で上方（向軸）表面に発症し、より一般的には成熟した葉で生じる。しかしながら、それらは任意の空中の(aerial)宿主器官に局在し得る。小隆起は、最初は小さく個別であるが、最終的に大きく融合する。小隆起が完全に発達すると、宿主の表皮は破裂して、乾燥した粉末状の遊走子嚢の破裂を放出する。その後、周囲の葉組織の壊死が起こり得る。
【０００６】
局所感染は通常、大幅な収量低下を招くことはないが、それでも市場向きでない製品をもたらすことになる。全身感染は、種子又は花部のために栽培された作物の生産性に重大な影響を及ぼし得る。全身感染は、卵菌の有性生殖を誘発すると考えられ、そして、花序、茎及び葉の歪み、過形成、肥大を引き起こす。病気の結果として花の花弁、胚珠及び花粉が奇形であると、不稔性がもたらされる場合もある。
【０００７】
Ａ．カンジダは、１０〜２０℃の適度な温度で、かつ湿潤条件において、最もよく成長する。２．５時間の葉の湿潤期間が感染をもたらすのに十分であり、これは１０〜１４日のインキュベーション期間後に症状が現れる。
【０００８】
アブラナ属（ブラッシカ）（Brassica）は、アブラナ科（以前は十字花科と呼ばれていた）の植物属である。アブラナ属は、レイプ、カリフラワー、ブロッコリー及びカブを含む、多くの重要な農作物及び園芸作物を含む。これら植物のほぼすべての部分が食用であり得る。レイプ及びレイプ種子はまた、食用及び燃料用の両方の油のために使用される。白色又は紫色の花、あるいは独特の色又は形状の葉を有するいくつかの種は、装飾目的で栽培されている。アブラナ科は、世界中に発生し、一年生植物、二年生植物及び多年生植物を含む。当該科はまた、多数の野生種を含む。
【０００９】
一部の作物では、白さび病が重大な収量の損失を引き起こし得る。他のアブラナ属作物では、白さび病は植物の外観に影響を与え、従って当該作物は、表面的な損傷のために、もはや商業的に実現可能ではなくなる。それゆえ、白さび病に抵抗性があるアブラナ属作物が大いに必要とされている。
【００１０】
白発疹さび病に対する抵抗性の遺伝的形質は、宿主種間及び宿主種内の両方で変化することが示されている。白さび病に対する抵抗性は、Ｂ．ラパ(B.rapa)、セイヨウアブラナ(B.napus)及びシロイヌナズナ（A.thaliana）において研究されており、そして、カラシナ(B.juncea)、アビシニアガラシ(B.carinata)、クロガラシ(B.nigra)におけるような、単一優性遺伝子によって、あるいは、前記抵抗性が多遺伝子性(polygenic)であると言われている複数遺伝子によってのいずれかで、制御されることが見出されている。白さび病に対する抵抗性はまた、宿主の特定の生化学的特性、例えば特定の糖、クロロフィルＩＩ又はフェノールのレベルの上昇と関連している。
【００１１】
Ａ．カンジダは現在、特定の宿主に感染するようにいくつかのレースに細分化されている。Ａ．カンジダの生物学的レースの現在の分類は、Ａ．カンジダの様々な分離株による感染に対するアブラナ科宿主の応答に基づいている。これまでに同定された異なるレースを表１に示す。Ａ．カンジダについて、用語「レース(race)」とは、本明細書で使用される場合、宿主属のいくつかの種に感染することができ、かつ他の種には感染することができない病原体の種類を指す一方で、ほとんどの病理システムでは、いくつかの種類の宿主種に感染することができるが、他の宿主種には感染することができない病原体の種類を意味すると解釈されることに留意すべきである。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
ここ数年で、これらのＡ．カンジダのレースは、レース内で異なる変異体の存在を認識するために細分化された。レース７の２つの広範な変異体が、２種類のＢ．ラパ(B.rapa)に対するそれらの病原性に基づいて同定され、並びに、レース２の４つの変異体が、１１品種のカラシナ(B.juncea)に対するそれらの病原性に基づいて特徴づけられた。
【００１４】
Ａ．カンジダ レース９は、オーストラリア南西部で、Ｂ．オレラセア・変種イタリカ(B. oleracea var.italica)（ブロッコリー）及びＢ．オレラセア・変種ボトリティス(B. oleracea var. botrytis)（カリフラワー）作物に拡大しており、この病原体はオーストラリアにおけるブロッコリー及びカリフラワー育種にとって一番の関心事となっている。この卵菌類病原体は、ブロッコリーの葉、茎又は花蕾(curd)上で増殖し、葉に白色の斑点症状を示し、そして蕾を白い直立したピンヘッド(pin heads)に変形させ、これは花蕾の品質及び貯蔵寿命に影響を与える。Ｂ．オレラセアに感染するオーストラリアのＡ．カンジダ株は、世界の他の地域で一般的に見られるヨーロッパ変異体と呼ばれるＡ．カンジダ レース９とは異なり；このヨーロッパ変異体は本質的にキャベツに病気を引き起こす。
【００１５】
実際に、オーストラリアのレース９は、いくつかの実験において、キャベツに対するよりもブロッコリーに対して積極的であるが、ヨーロッパでは、レース９はキャベツ及び芽キャベツに対してより積極的であるように見える。それゆえ、レース９は、キャベツに対してより積極的なヨーロッパ変異体と、ブロッコリーに対してより積極的なオーストラリア変異体の、少なくとも２つの変異体を含むことが報告されている（Petkowski et al、Proc.Vth IS on Brassica & XVIth Crucifer Genetics WS：133-141;2010）；例えば、国際公開第２０１０／１３５７８２号に報告されているように、Iron CMS及びBelstar商業品種はヨーロッパ変異体には抵抗性を示すが、オーストラリア変異体には感受性がある。
【００１６】
多くのブロッコリー作物においてＡ．カンジダによって引き起こされる白さび病の発生は、非常に深刻なものであると報告されている。多くの場合、感染率は１００％と高く、唯一の手段は作物全体を破壊することである。放置された畑では、全ての植物の全ての部分、葉からブロッコリー頭部までの完全な感染がしばしば観察される。成熟胞子嚢からの胞子負荷(spore load)は非常に大きいため、感染した植物の物理的破壊時に、胞子の雲が見られる。
【００１７】
現時点では、アブラナ属における白さび病を制御するために使用できる薬剤はほとんど知られていない。現在の制御方法は一般的に、管理慣行（制御された給水、換気、バランスの取れた栄養プログラム）及び殺菌スプレープログラムの組み合わせを含む。しかしながら、化学作物保護剤の使用を低減することを目的とした政策を実施している国が増加している。化学制御剤の使用が完全に禁止された場合、これはアブラナ属の種の栽培における主要な問題をもたらすであろう。
【００１８】
ブロッコリー（ブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ）におけるＡ．カンジダに対する遺伝的抵抗性は、白発疹さび病の制御に有用であろう。そのような抵抗性は、作物保護の安定性を増大させるだけでなく、環境に有害であり必ずしも効果的でない殺菌剤の必要性が減少し又は排除される結果となる。そのような抵抗性は、他のＢ．オレラセア植物、例えばカリフラワー、芽キャベツ(Brussel sprouts)、白キャベツ、サボイキャベツ等にとっても有益であり得る。
【００１９】
国際公開第２００８／１３３５０３号は、Ａ．カンジダに対する一遺伝子性優性抵抗性遺伝子を含んでいるが、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性遺伝子を含まないとされる、Ｂ．オレラセア植物を示す。
【００２０】
国際公開第２０１１／０３６１０８号は、第２染色体上に存在するＡ．カンジダに対する一遺伝子性半優性抵抗性遺伝子を含んでいるが、オーストラリア変異体に対する抵抗性を付与しないとされる、Ｂ．オレラセア植物を示す。
【００２１】
国際公開第２０１０／１３５７８２号は、第１染色体上に位置するＡ．カンジダに対する一遺伝子性優性抵抗性遺伝子を含む、Ｂ．オレラセア植物を示す。この遺伝子は、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体のいくつかの株に対して抵抗性を付与することができたが、一般的に、菌株に関わらず、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる、白さび病に対する抵抗性を付与することはできないと考えられる。同様に、品種Tyson（Minchintonら、Australian Plant Pathol 2013;42:169-178）は、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に抵抗性があると開示されているが、一般的に、実施例に示されているように、菌株に関わらず、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与することができないと考えられる（実施例６及び７参照）。
【００２２】
それゆえ、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性、すなわちいくつかの株に限定されない一般的な抵抗性を有するブロッコリー植物についての未だ満たされていない必要性がある。
【発明の概要】
【００２３】
概要
本発明者らは、Ａ．カンジダ レース９病原体のオーストラリア変異体に対する抵抗性を同定し、Ｂ．オレラセア植物にこの抵抗性を遺伝子移入することができ、したがって抵抗性Ｂ．オレラセア植物、より具体的にはブロッコリーの抵抗性植物を得た。本発明の抵抗性は、新たに発見された抵抗性を付与する配列によって与えられ、前記抵抗性は、一遺伝子性かつ優性性質であり、異なるＢ．オレラセアの遺伝的背景に転移可能である。
【００２４】
本発明は、ホモ接合性又はヘテロ接合性状態で存在する場合、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性の表現型を付与する、遺伝子移入された配列を提供する。本発明はまた、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性を示すＢ．オレラセア植物、特にブロッコリー植物、並びに、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性を示すＢ．オレラセア植物を作出又は同定する方法、並びに、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を含む種子、根及び他の植物部位、例えば花粉及び胚珠を提供する。本発明はまた、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列に関連している、すなわち優性性質である抵抗性遺伝子座に関連している、分子遺伝学的マーカー、特にＳＮＰを開示する。
【００２５】
定義:
卵菌類Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性があるB.オレラセア植物の植物は、B.オレラセア・亜種ボトリティス・変種イタリカ（ブロッコリー）、B.オレラセア・亜種ボトリティス・変種ボトリティス（カリフラワー）、B.オレラセア・亜種ボトリティス・変種アスパラゴイデス（B. oleracea convar. botrytis var. asparagoides ）（発芽（sprouting）ブロッコリー）、B.オレラセア・亜種オレラセア・変種ゲミフェラ（芽キャベツ）、B.オレラセア・亜種カピタータ・変種アルバ（白キャベツ、オックスハートキャベツ）、B.オレラセア・亜種カピタータ・変種ルブラ（B. oleracea convar. capitata var. rubra）（赤キャベツ）、B.オレラセア・亜種カピタータ・変種サバウダ（サボイキャベツ）、B.オレラセア・亜種アセフェラ・変種サベリカ（B. oleracea convar. acephela var. sabellica）（カーリーケールキャベツ（curly cale cabbage））、B.オレラセア・亜種アセフェラ・変種ゴンジロイデス（B. oleracea convar. acephela var. gongyloides）（カブカンラン（turnip cabbage））及びB.オレラセア・変種トロンチューダ・異名コスタータ（B. oleracea var. tronchuda syn. costata）（ポルトガルキャベツ）、からなる群から、最も好ましくはブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ、白キャベツ及びサボイキャベツから選択されてもよく、さらに最も好ましくはブロッコリーである。
【００２６】
Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体は、1963年にPound及びWilliamによって確立された、Ａ．カンジダの生物学的レースの現在の分類に従ってレース９に対応するＡ．カンジダの株であり（Pound及びWilliam、1963、Phytopathology 53:1146-1149）、これはさらに、キャベツ及び芽キャベツに対してより積極的であるヨーロッパ変異体レース９とは反対に、キャベツに対するよりもブロッコリーに対して積極的であると特徴づけられる。オーストラリア変異体はまた、２００１〜２００２年の夏にビクトリアンブロッコリー（Victorian broccoli）及びカリフラワー作物における白発疹さび病の発生、そして全てのオーストラリアのブロッコリー及びカリフラワー作付け地域への、その後の病気の蔓延の原因である、変異体であるとして知られている（Petkowski et al、Proc.Vth IS on Brassica & XVIth Crucifer Genetics WS：133-141）。
【００２７】
Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体の異なる株は、とりわけ圃場感染中に、共存し、これは感染した植物に対して異なる病原性を有し得る。
【００２８】
用語「抵抗性（Resistance）」は、害虫又は病原体、及び野菜種子産業（Vegetable Seed Industry）の非生物的ストレスに対する植物の反応について記載する、ＩＳＦ（国際種子連盟（International Seed Federation））の野菜及び鑑賞用作物セクションによって定義されている。
【００２９】
具体的には、抵抗性とは、類似の環境条件及び害虫又は病原体圧の下で感受性のある植物品種と比較した場合、特定の害虫又は病原体の成長及び発達、及び／又はそれらが引き起こす損傷を制限する、植物品種の能力を意味する。抵抗性品種は、重篤な害虫又は病原体圧の下で、いくつかの病気の症状又は損傷を示し得る。
【００３０】
感受性:植物品種が、特定の害虫又は病原体の成長及び発達を制限できないこと。
【００３１】
白さび病、特にＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に感受性のあるB.オレラセア（B.olearacea）植物は、例えば、Bejoからの市販の植物「Belstar」又は「Fiesta」、HM.Clauseからの品種「Rumba」、Sakataからの品種「Patriot」及び「Green Belt」、あるいはSyngentaからの品種「Monaco」である。全ての市販の品種のB.オレラセア（B.olearacea）ブロッコリーはこれまで、HM.Clause SAのBooster 品種及びSyngentaのTyson品種を除いて、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に感受性であるが、しかしながら、これらはＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体による全ての感染に抵抗性であるわけではない。
【００３２】
したがって、本発明に係る植物は、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対して少なくとも改善された抵抗性を有し、及び特にブロッコリー植物ブースター（Booster）に関し、より一般的には任意の市販品種のブロッコリーに関する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「子孫（offspring）」又は「後代（progeny）」は、１又は複数の親植物又はその子孫（descendants）からの栄養生殖又は有性生殖由来の後代として生じる任意の植物を指す。 例えば、子孫植物は、親植物のクローニング又は自家受粉によって、あるいは２つの親植物の交配によって得られてもよく、そして、自家受粉（selfings）並びにＦ１若しくはＦ２又はさらに別の世代を含んでもよい。Ｆ１は、親から生じる第一世代の子孫であり、その少なくとも１つが形質のドナーとして最初に使用されるが、第二世代（Ｆ２）又はそれ以降の世代（F3、F4等）の子孫はＦ１、Ｆ２等の自家受粉から生じる標本（specimens）である。したがってＦ１は、２つの真の繁殖パートナー（true breeding parents）（真の繁殖（true-breeding）は、形質についてホモ接合性である）間での交配から得られるハイブリッドであり得る（通常はある）が、Ｆ２は、前記Ｆ１ハイブリッドの自家受粉から得られる子孫であり得る（通常はある）。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「交配（cross）」、「交配する（crossing）」、「異花受粉（cross pollination）」又は「交雑育種（cross-breeding）」は、１つの植物上の１つの花の花粉が、別の植物上の花の胚珠（柱頭）に（人為的に又は自然に）付けられるプロセスを指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子は、これらに限定されるものではないが、コード配列及び／又はそれらの発現に必要とされる調節配列（regulatory sequence）を含む。遺伝子はまた、例えば他のタンパク質のための認識配列を形成する、非発現ＤＮＡセグメントを含むことができる。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、あるいは既知の又は予測された配列情報からの合成を含む、様々な供給源から得ることができ、並びに、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子型」は、個々の細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば、植物）、又は生物群の遺伝的構成を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ接合体（heterozygote）」は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子（所与の遺伝子又は配列の形態）を有する、二倍体又は倍数体の個々の細胞又は植物を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ接合性（heterozygous）」は、特定の遺伝子座における異なる対立遺伝子（所与の遺伝子又は配列の形態）の存在を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「ホモログ（homolog）」又は「ホモログ（homologue）」は、別の種由来の核酸又はペプチド配列と同様に、共通の起源及び／又機能を有する核酸又はペプチド配列を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「ホモ接合体（homozygote）」は、全ての相同染色体上の１又は複数の遺伝子座に同じ対立遺伝子を有する、個々の細胞又は植物を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「ホモ接合性（homozygous）」は、相同染色体セグメントにおける１又は複数の遺伝子座にある同一の対立遺伝子の存在を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリッド（hybrid）」は、１又は複数の遺伝子が異なっている親間での交配から生じる、任意の個々の細胞、組織又は植物を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（locus）」（複数形:「遺伝子座（loci）」）は、遺伝的に定義された任意の部位を指す。遺伝子座は、遺伝子、若しくは遺伝子の一部、又はＤＮＡ配列であってもよく、異なる配列で占められてもよい。遺伝子座はまた、１つのＳＮＰ（一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism））によって、又はいくつかのＳＮＰによって定義されてもよい。
【００４４】
遺伝子移入とは、１つの種、変異体若しくは株の遺伝子の又はゲノム配列の、これら種、変異体若しくは株の間の最初のハイブリッドからの別の種、変異体若しくは株の遺伝子プールへの、侵入を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明：
本発明は、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性を示すＢ．オレラセア植物、好ましくはＢ．オレラセア ブロッコリー植物、並びに、Ａ．カンジダ レース９のオーストラリア変異体による感染に対する抵抗性を示すＢ．オレラセア、特にブロッコリー植物を作出又は同定する方法に関する。本発明はまた、抵抗性遺伝子座に関連している分子遺伝学的マーカー、特にＳＮＰを開示する。本発明者らはまた、抵抗性を担う配列を異なる遺伝的背景に遺伝子移入することができ、さらに抵抗性表現型を与えることを示した（とりわけ、実施例１では異なるＦ２集団で、及び実施例４では２つの近交系で示されたように）。
【００４６】
本発明に係る種子及び植物は、ロマネスコ植物、目的の表現型を示す遺伝子移入パートナー、及びブロッコリーの近交系、再発性（recurrent）感受性の親の間での最初の交配、次いで、戻し交配及び二倍体形成（dihaploidization）プログラムにより得られた。このブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ（ブロッコリー）ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４種子の試料は、HM.Clause S.A.Rue Louis Saillant、Z.I.La Motte、26800 Porte les Valence、Franceによって、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約（「ブダペスト条約」）の要件に準じて、及びそれを充足して、国立産業食品及び海洋菌保存機関（National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria）（NCIMB）、（NCIMB Ltd、Ferguson Building、Craibstone Estate、Bucksburn、Aberdeen AB21 9YA、United Kingdom）で、２０１５年７月９日に、受託番号NCIMB 42433として寄託されている。
【００４７】
これらの寄託された種子から成長した植物は、Ａ．カンジダ レース９の任意のオーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性があるブロッコリー植物であり、かつ商業的に受け入れられる表現型である。
【００４８】
このブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ− ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４種子の寄託は、HM.Clause S.A.Rue Louis Saillant、Z.I.La Motte、26800 Porte les Valence、Franceによって維持されている。
【００４９】
第１の態様によれば、本発明はしたがって、卵菌類アルブゴ・カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性がある、B.オレラセア植物又は種子であって、そのゲノム中に、白発疹さび病に対する前記抵抗性を付与する遺伝子移入された配列又は区間（interval）を含む、B.オレラセア植物又は種子に関する。前記遺伝子移入された配列は、ホモ接合性、又はヘテロ接合性のいずれかで存在する場合、B.オレラセア植物又は種子に抵抗性を付与する。
【００５０】
遺伝子移入された区間は、表現型に関与する抵抗性遺伝子の単一優性対立遺伝子として作用する（すなわち抵抗性形質は一遺伝子性かつ優性である）。遺伝子移入された区間についてホモ接合性及びヘテロ接合性の植物はいずれも、白さび病抵抗性表現型を完全に示す。この表現型は、請求された遺伝子移入された配列又は区間を有する後代を同定するために使用することができる。抵抗性遺伝子として作用する遺伝子移入された区間は、目的の表現型を付与し、かつ予想外にも植物、種子又は頭部の市場性とは不適合な負の特徴、例えば葉柄上の小葉（leaflets）の存在、又は「キャット−アイズ（cat-eyes）」、すなわち未成熟に急に黄色の花になるいくつかのビーズの存在、とは関連していない。
【００５１】
Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体感染に対する抵抗性は、有利には、感受性のある（市販の）系統、例えばBelstar、Fiesta又はRumbaとの比較、あるいは一部の株にのみ抵抗性である系統、例えばBooster又はTysonとの比較によって、決定される。抵抗性は、実施例１に記載された病理学的試験によって、好ましくは接種の１５日後に、決定され得る。この抵抗性の評点付けにおいて、「１」のスコアは表面の７５％超に胞子形成を伴う葉に対応し、「３」のスコアは５１〜７５％に胞子形成を伴う表面に対応し、「５」のスコアは２６〜４０％の表面が胞子形成を伴い、「７」のスコアは１３〜２５％であり、「８」のスコアは１〜１２％であり、そして「９」は葉に胞子形成が存在しないことに対応する。スコア９を有する植物、すなわち葉の表面上に胞子形成のない植物は、抵抗性、より具体的には高度に抵抗性であると考えられることになる。
【００５２】
遺伝子移入された配列は好ましくは、Ｂ．オレラセアのゲノム中の第４染色体上に見られ、従って、それらが第４相同染色体の一方又は両方のいずれかに存在する場合、卵菌類Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する。
【００５３】
抵抗性を付与する遺伝子移入された配列は、より好ましくは、第４染色体の染色体領域内に位置し、当該領域は、一方の側がＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）により、そして他方の側がＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）により区切られており、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）とＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）との間である。
【００５４】
本明細書で言及されるＳＮＰ（一塩基多型）に対応する特定の多型、並びにＢ．オレラセアゲノム中のこれらＳＮＰのフランキング配列は、実験のセクション（とりわけ表１１参照）及び添付の配列表に示されている。第４染色体上にある、ブラッシカ・オレラセアＴＯ１０００ゲノムのバージョンＶ２．１に対するそれらの位置は、表１１に示されており、それらのフランキング配列も表１１に示されている。
【００５５】
抵抗性を付与する遺伝子移入された配列又は区間は、好ましくは、Ｂ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の植物のゲノムに存在する遺伝子移入された配列から選択され、その代表的種子はＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で寄託されている。それらは特に、前記Ｂ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の第４染色体上に存在する遺伝子移入された配列から選択される。実際に、寄託された種子は、１つの第４染色体ホモログ上に、目的の表現型を付与する遺伝子移入された配列を含み、ここで、前記遺伝子移入された配列はまた、Ｂ．オレラセアの遺伝的背景に表現型を付与している。このＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４種子の試料は、国立産業食品及び海洋菌保存機関（NCIMB）、（NCIMB Ltd、Ferguson Building、Craibstone Estate、Bucksburn、Aberdeen AB21 9YA、United Kingdom）で、２０１５年７月９日に、受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で寄託されている。寄託された種子はハイブリッド種子であり、それらは、抵抗性を付与する、１つの第４染色体ホモログ上のみにある遺伝子移入配列を有する。抵抗性配列は、とりわけ本願に開示されたマーカーによって、容易に同定することができる。
【００５６】
抵抗性を付与する配列は、全ての寄託された種子のゲノム中に存在し；したがって、これら寄託された種子のゲノムそれ自体が、本発明に係るＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する、Ｂ．オレラセアゲノム中の遺伝子移入された配列のリザーバー（reservoir）を務める。本発明の植物又は種子は、そのゲノム中に、このリザーバーから選択される遺伝子移入された配列を含む。
【００５７】
全ての寄託された種子は、遺伝子移入されたフラグメントを保有し、当該フラグメントは１つの第４染色体上の同じ遺伝子座にあり、かつ本発明に係る表現型を付与するが、この遺伝子移入されたフラグメントは種子間で長さがわずかに変化し得る。
【００５８】
したがって、本発明はまた、Ｂ．オレラセア種子又は植物、好ましくは栽培されたＢ．オレラセア種子又は植物、最も好ましくはブロッコリー種子又は植物であって、そのゲノム中に、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有し、ここで、前記抵抗性を付与する遺伝子移入された配列は、ＮＣＩＭＢ ４２４３３の寄託に対応するＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の種子のゲノムに存在する遺伝子移入された配列から選択される、Ｂ．オレラセア種子又は植物に関する。
【００５９】
「所与の遺伝子座における遺伝子移入された配列又は区間」又は「所与の遺伝子座に存在する／見られる遺伝子移入された配列又は区間」とは、この所与の遺伝子座に見られるゲノム区間が、遺伝子移入前にB.オレラセア ブロッコリーの生殖質（germplasm）に見られる対応するゲノム区間と同じ配列を有しないが、この遺伝子座において、同じ遺伝子座にＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ ４２４３３）の対応するゲノム区間に見られる配列を有し；したがって遺伝子移入された配列は本発明の植物に対して外生であることと、理解されるべきである。「同じ配列」を有するとは、比較されるべき２つの配列が、後代へのゲノム区間の伝達の間に起こり得る潜在的な点突然変異を除いて同一であること、すなわち好ましくは１ｋｂａｓｅの長さで少なくとも９９％同一であることを意味する。試験下でのゲノム区間は、本発明の意味において、同じ遺伝子座におけるＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４に見られる対応するゲノム区間と同じ配列を有することが推測でき、それはまた、前記試験下でのゲノム区間が、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与することができる場合である。
【００６０】
Ｂ．オレラセア植物、種子又は細胞のゲノム中の遺伝子移入された配列の存在は、例えば、ＧＩＳＨ（遺伝的イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（genetic in situ hybridization））によって示され得る。ＧＩＳＨは実際に、１つの種又は株からのクロマチン物質の、別の種又は株に対する遺伝子移入の検出のための強力な技術である。ＧＩＳＨの利点は、遺伝子移入プロセスが「遺伝子移入されたゲノムの写真」によって可視化されることである。この技術を用いると、共優性である分子細胞遺伝学的マーカーの使用によって、ゲノムの特定の領域がホモ接合性又はヘテロ接合性であるかを確認することも可能である。本技術によって、目的の遺伝子移入された遺伝子がどの染色体に存在するかを決定することも可能である。
【００６１】
好ましい実施形態によれば、本発明の抵抗性表現型、すなわち卵菌類アルブゴ・カンジダ・レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列は、ロマネスコＢ．オレラセア植物から遺伝子移入される。
【００６２】
好ましい実施形態によれば、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列、また、寄託された種子のゲノム中に見られることになる抵抗性を付与する遺伝子移入された配列は、本発明に係るＢ．オレラセア植物、好ましくはブロッコリーの第４染色体上に遺伝子移入され、それらはより正確には第４染色体の染色体領域内にあり、当該領域は、一方の側がＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）により、そして他方の側がＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）により区切られており、より好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）とＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）との間である。換言すれば、本発明のＢ．オレラセア植物又は種子のゲノムにおいて、一方の側がＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）により、そして他方の側がＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）により区切られた領域内の第４染色体上のセクションは、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性に関与する配列を、Ｂ．オレラセアの遺伝的背景に、より好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）とＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）との間に、含む。前記遺伝子移入された配列は、好ましくは、ロマネスコＢ．オレラセア植物由来である。
【００６３】
好ましい実施形態によれば、本発明の植物又は種子のゲノム中に存在する遺伝子移入された配列は、以下の遺伝子座の１又は複数に見られることになる：
−ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）を含む遺伝子座、及び／又は
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）を含む遺伝子座。
【００６４】
ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６を含む遺伝子座が非常に好ましい。
【００６５】
この点において、前記ＳＮＰのフランキング配列が定義される限りにおいて、染色体における特定の位置が実際に、一塩基多型に関して定義され得ることに留意されたい。本発明者らはＳＮＰを使用しており、当該ＳＮＰは、それらのフランキング配列によって同定され、全てのＢ．オレラセアゲノム、特にＢ．オレラセア・変種イタリカ及びロマネスコＢ．オレラセアに存在し、遺伝子移入された配列と内在的に存在する配列とを区別するための、並びにＢ．オレラセア ブロッコリーゲノム中のロマネスコから遺伝子移入された配列を見つけ出すためのものである。
【００６６】
本発明者らは、目的の表現型、すなわちＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に必須の遺伝子移入された配列が、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）の近傍に、又は好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の近傍に、あるいは両方のＳＮＰの近傍に見られることになることを同定した。好ましくは、遺伝子移入された配列は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の位置を含む遺伝子座に見られることになる。ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の遺伝子座は、上記で定義された染色体領域、すなわちＢ．オレラセア第４染色体上で一方の側がＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６により、そして他方の側がＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３により区切られた染色体領域内に位置していることに留意すべきである。
【００６７】
抵抗性を付与する遺伝子移入された配列が、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６を含む遺伝子座に見られる場合、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子は、ロマネスコ遺伝子移入パートナーに、及び寄託された抵抗性Ｂ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４にも見られ、かつ実験のセクションで遺伝的に関連している抵抗性として実証された、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子であり、すなわちＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔである。ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の５’フランキング領域、又はＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の３’フランキング領域、あるいは両方の領域はまた、この領域において同一のＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４配列である。それゆえ、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６は、遺伝子移入された区間の３’境界又は５’境界の一部を形成してもよく、あるいは所望の表現型を付与する遺伝子移入された区間内にあってもよい。
【００６８】
抵抗性を付与する遺伝子移入された配列が、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６を含む遺伝子座に見られる場合、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子は、ロマネスコ遺伝子移入パートナーに、及び寄託された抵抗性ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４にも見られ、かつ実験のセクションで遺伝的に関連している抵抗性として実証された、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子であり、すなわちＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃである。ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の５’フランキング領域、又はＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の３’フランキング領域、あるいは両方の領域はまた、この領域におけるＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４配列と同一である。それゆえ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６は、遺伝子移入された区間の３’境界又は５’境界の一部を形成してもよく、あるいは所望の表現型を付与する遺伝子移入された区間内にあってもよい。
【００６９】
遺伝子移入された目的の配列の存在は実際に、所与のＳＮＰの特定の対立遺伝子の存在によって明らかにすることができ、ここで、前記対立遺伝子は遺伝子移入パートナーの特徴であり、したがって抵抗性に関連し、そして感受性に関連したこれらＳＮＰについて再発性Ｂ．オレラセア ブロッコリー親の対立遺伝子とは異なる。したがって、所与のＳＮＰの対立遺伝子は、本発明の遺伝子移入配列の存在を反映することができる。適切なＳＮＰの例は、以下、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）、からなるリストの全て又は一部である。
【００７０】
抵抗性に関連したこれら対立遺伝子はとりわけ、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）の対立遺伝子Ｇ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）の対立遺伝子Ｇ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）の対立遺伝子Ａ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）の対立遺伝子Ａ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）の対立遺伝子Ｇ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）の対立遺伝子Ｔ及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）の対立遺伝子Ｇであり；これら対立遺伝子は、寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４２４３３に見られるこれらＳＮＰの対立遺伝子に対応する。表１１は本発明の１１個のＳＮＰについて開示し、その対立遺伝子は抵抗性表現型に関連しており、すなわちその対立遺伝子は抵抗性表現型と共分離し、かつその対立遺伝子は感受性に関連している。
【００７１】
本発明の植物又は種子は好ましくは、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃによって特徴づけられ、好ましくは以下、ＢＯ−０１０８４３６の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４７の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４８の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７４９の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５０の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７５１の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７５２の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５３の対立遺伝子Ｃ、ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ、及びＢＮ−００６７７９３の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、５つ又は全てとの組み合わせである。実施例４に開示されているように、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃは、表現型と非常に高度に関連しているようであり、したがって本発明によれば最も好ましい。
【００７２】
別の実施形態によれば、本発明の植物又は種子のゲノム中に存在する遺伝子移入された配列は、先の実施形態に係るＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及び／又は好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６を含む遺伝子座に見られる遺伝子移入された配列に加えて、あるいはそれに代えて、以下の遺伝子座：
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６（配列番号５）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７（配列番号７）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８（配列番号８）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９（配列番号９）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０（配列番号１０）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１（配列番号１１）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２（配列番号１２）を含む遺伝子座；
−ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３（配列番号１３）を含む遺伝子座；及び／又は
−ＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３（配列番号１５）を含む遺伝子座、
の１又は複数に見られ、好ましくはこれら１１個全ての遺伝子座に見られることになる。
【００７３】
好ましい実施形態によれば、遺伝子移入された配列は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１を含む遺伝子座に見られることになる。
【００７４】
その結果、本発明の抵抗性植物又は種子はまた、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔにより、又は好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ、あるいはその両方によって特徴づけられてもよい。それらは、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃに加えて、以下の対立遺伝子：ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６の対立遺伝子Ｇ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７の対立遺伝子Ｇ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８の対立遺伝子Ａ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０の対立遺伝子Ａ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１の対立遺伝子Ｇ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３の対立遺伝子Ｃ；ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つによって特徴づけられてもよい。
【００７５】
遺伝子移入された配列の存在はまた、本発明によって定義されたＳＮＰ、特にＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６に近接した配列の遺伝子増幅、並びに、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で寄託された種子に対して増幅を実行することによって得られるそれぞれの増幅フラグメントの配列との比較によって、明らかにすることができる。遺伝子増幅のためのプライマーは、本発明に開示されたフランキング配列の使用によって定義することができ、潜在的には、利用可能なＢ．オレラセアゲノムアセンブリと組み合わせて定義することができる。
【００７６】
好ましくは、目的の表現型を付与する遺伝子移入された配列は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子と連鎖不平衡にある。好ましい実施形態によれば、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子は「Ｃ」である。別の実施形態によれば、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子「Ｔ」、及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃは、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列と連鎖不平衡にある。連鎖不平衡は実際に、連鎖が存在しない場合の交配集団解析におけるゲノム配列の共通の遺伝的形質を説明するために使用される。連鎖は、組み換えの頻度に依存する集団構造におけるゲノム配列の共通の遺伝的形質を説明する。
【００７７】
連鎖不平衡スコアは、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６と遺伝子移入された配列との関連がランダムでないことを意味する、任意の陽性のスコアであり得る。
【００７８】
したがってそのゲノム中に遺伝子移入された配列を含む本発明の植物又は種子において、前記遺伝子移入された配列は好ましくは、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６に対応する遺伝子座から２０ｃＭ未満、好ましくは１５ｃＭ未満、最も好ましくは１０ｃＭ未満、及びさらに好ましくは５ｃＭ未満の遺伝的距離でゲノム中に見られることになる。
【００７９】
別の実施形態では、遺伝子移入された配列は、本発明の植物又は種子のゲノム中の、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の両方の近傍に、好ましくは両方のＳＮＰから２０ｃＭ未満で、又は好ましくは両方から１５ｃＭ未満に、見られることになり；例えば遺伝子移入された配列は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６に対応する遺伝子座から５ｃＭ未満に、及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６から１５ｃＭ以下に、位置する。
【００８０】
一実施形態によれば、本発明の種子又は植物、好ましくはブロッコリー種子又は植物は、第４染色体上のＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在によって特徴づけられ、場合により前記ＳＮＰの対立遺伝子Ａの非存在と組み合わせて、特徴づけられる。実際に、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の遺伝子座における遺伝子移入された配列の存在、従って抵抗性の存在を確認し；さらに、対立遺伝子Ａの非存在は、遺伝子移入された配列がホモ接合性に存在すること、すなわち第４染色体の全てのホモログ上に存在することを示す。あるいは、本発明の種子又は植物、好ましくはブロッコリー種子又は植物は、第４染色体上のＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子ＣとＡ両方の存在によって特徴づけられ、遺伝子移入された配列のヘテロ接合性の存在を確認する。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の種子又は植物、特にブロッコリー種子又は植物のゲノム中に存在し、かつ、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する、遺伝子移入された配列又は区間は、少なくとも５キロベースの長さ、好ましくは少なくとも８、１０又は１５ｋｂの長さである。
【００８２】
好ましくは、遺伝子移入された配列又は区間はしかしながら、ロマネスコ遺伝子移入パートナーに関連する非商業的特徴の遺伝子移入を避けるために、あまり長くはない。したがって、本発明によれば、上述された遺伝子移入された配列は、２５ｃＭ未満の長さ、好ましくは２０ｃＭ未満又は１５ｃＭ未満であることが好ましい。
【００８３】
より好ましい実施形態によれば、遺伝子移入された配列は、連鎖引きずり（linkage drag）を避け又は制限するために、１０ｃＭ未満、又はさらに５ｃＭ未満の長さ、及び最も好ましくは５ｃＭ未満である。
【００８４】
好ましい実施形態によれば、前記遺伝子移入された配列は、所望の表現型に関連しない配列を可能な限り含まないように最小化される。
【００８５】
本発明に係る抵抗性は、オーストラリア変異体の株に関わらず、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体感染によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性であり、これは、Petkowskiらに言及され、かつ国際公開第２０１０／１３５７８２号に記載された、植物Booster、あるいは、Minchintonらに言及された植物Tysonに反している。この点において、圃場では、白さび病感染は一般的に、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体の複数の異なる株に起因し、オーストラリア変異体の株に関わらない抵抗性の重要性を強めていることに留意すべきである。
【００８６】
本発明のこの態様に係る種子又は植物は、好ましくは、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対して高度に抵抗性であり、とりわけ、自然感染条件下で栽培された季節の終わりまで、症状がないままである。いずれの場合においても、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対して抵抗性である本発明の種子又は植物は、葉の表面の２５％未満に胞子形成を伴い、好ましくは実施例１に記載の病理試験に従って１０％未満、さらに好ましくは葉の表面上に胞子形成を有さない。
【００８７】
Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対して抵抗性である、本発明の植物又は種子はまた、好ましくは、別の害虫、特に主として農業上重要な害虫に対して抵抗性又は耐性である。
【００８８】
本発明の植物又は種子は好ましくはまた、他の白さび病抵抗性遺伝子、好ましくは国際公開第２０１０／１３５７８２号に開示されたような第１染色体上の一遺伝子性優性遺伝子を含み、より好ましくは、前記植物又は種子は、そのゲノム中に国際公開第２０１０／１３５７８２号に定義された配列番号１及び／又は配列番号２を含む。
【００８９】
上記で詳述したように、本発明は、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体感染に対して抵抗性であるＢ．オレラセア植物、好ましくはブロッコリー植物、並びに、これら植物を生じる種子に関する。
【００９０】
本発明に係るＢ．オレラセア植物は、商業的な植物又は系統又は品種であってもよく、好ましくはその頭部のために栽培され得る。そのような商業的な植物又は系統は、好適な条件下で栽培された場合に、市場性のある頭部を生じる。
【００９１】
本発明に係る植物は、近交系又は二倍体植物又はハイブリッド、好ましくはブロッコリーであり得る。当該植物は、好ましくは栽培されたＢ．オレラセアである。
【００９２】
本発明に係る植物はまた、細胞質雄性不稔性であり得、例えばオグラ型ミトコンドリア不稔性（Ogura mitochondrial sterility）を有し得る。
【００９３】
特に好ましい本発明に係る植物又は種子はブロッコリー植物（Ｂ．オレラセア・変種イタリカ）である。あるいは、本発明はまた、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体のための宿主として知られている他のＢ．オレラセア植物、すなわちカリフラワー（Ｂ．オレラセア・亜種ボトリティス・変種ボトリティス）、芽キャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種オレラセア・変種ゲミフェラ）、白キャベツ、オックスハートキャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種カピタータ・変種アルバ）及びサボイキャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種カピタータ・変種サバウダ）に関する。抵抗性を付与する遺伝子移入された配列は、抵抗性ブロッコリー、とりわけＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４から、別のＢ．オレラセア植物へと、実施例に例示されたマーカーを用いる育種プログラムによって、転移され得る。本発明の植物又は種子は有利には、ロマネスコ植物又は種子ではない。
【００９４】
この点において、本発明者らは、初めて、抵抗性に関与する配列を同定し、これら配列に関連するＳＮＰマーカーを同定し、そして、ロマネスコ植物に最初に存在する前記配列が、別のＢ．オレラセア植物へと、抵抗性表現型を失うことなく、かつ他の有害な表現型を引き起こすことなく、転移され得ることを証明したことに留意すべきである。本発明者らは、そのような抵抗性遺伝子が存在し、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景へと、負の特徴を与えることなく抵抗性を付与するその能力（浸透）を保持しながら転移され得ることを実証し、並びに、この抵抗性に関連している遺伝的マーカーを同定すると、育種プログラムによって、前記配列を別のＢ．オレラセア植物へと、従ってカリフラワー、芽キャベツ、白キャベツ及びサボイキャベツへと、転移させることが可能である。
【００９５】
本発明に係る植物又は種子は、Ｂ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４、ＮＣＩＭＢ ４２４３３の寄託された種子から成長した植物の、後代又は子孫であり得る。寄託された種子から成長した植物は実際に、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対して抵抗性であり、したがってそれらは、そのゲノム中に抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有する。前記寄託された種子から成長した植物は、交配及び自家受粉及び／又は戻し交配、並びに目的の植物の選択によって、これら配列を別の背景に転移させるために使用することができる。
【００９６】
本発明はまた、寄託された種子のＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ ４２４３３）、及びこれら種子の１つから成長した植物に関する．これら種子は、目的の表現型を付与する遺伝子移入された配列を、ヘテロ接合性に含む。
【００９７】
本発明に係る遺伝子移入された配列の存在は、本発明者らによって同定されたＳＮＰのシークエンシングによって、及びより具体的にはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃによって、明らかにすることができる。遺伝子移入された目的の配列に関する、植物、種子又は植物部位のゲノムのヘテロ接合性状態は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ及びＡの同時存在によって明らかになり得る。遺伝子移入された目的の配列に関する植物、種子又は植物部位のゲノムのホモ接合性状態は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃのみの存在によって明らかになり得る。
【００９８】
本発明はまた、上述した本発明の種子又は植物から得られることになる可能性のある任意の植物、好ましくはブロッコリー種子又は植物、及びまた、そのような植物の植物部位、及び最も好ましくは外植片、接ぎ穂、切り穂（cutting）、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、頭部及び任意の他の植物部位に関し、ここで、前記植物、外植片、接ぎ穂、切り穂、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、頭部及び／又は植物部位は、本発明の第１の態様に係る種子又は植物から得られる、すなわちホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかでそのゲノム中に遺伝子移入された目的の配列を有する。これら植物部位、とりわけ外植片、接ぎ穂、切り穂、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄又は頭部は、そのゲノム中に、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を含む。本発明の本態様において言及される遺伝子移入された配列は、本発明の植物の文脈において上記で定義された配列である。本発明の第１の態様との関連で定義された遺伝子移入された配列の異なる特徴は、本発明の本態様に準用する。したがって遺伝子移入された配列は、好ましくは、寄託された材料Ｂ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３）に対応する植物のゲノム中に存在する配列から選択され、かつ抵抗性を付与する。それらは有利には、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）の対立遺伝子Ｔ及び／又はＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）についての対立遺伝子Ｃの存在、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６についての対立遺伝子Ｃにより特徴づけられる。
【００９９】
本発明はまた、Ｂ．オレラセア細胞の細胞に関し、これら細胞はそのゲノム中に、目的の表現型を付与する遺伝子移入された配列を含む。好ましくは、これら細胞はＢ．オレラセア・変種イタリカの細胞である。遺伝子移入された配列は、本発明の枠組みで既に定義された配列であり、それらは、本発明の先行する実施形態に係る植物及び種子に関して既に開示された同じ特徴及び好ましい実施形態によって特徴づけられる。これら遺伝子移入された配列の存在は、上記に開示され、かつ当業者によく知られている技術によって明らかにされ得る。とりわけ、遺伝子移入された配列が、本発明のそのような細胞のゲノム中にホモ接合性に又はヘテロ接合性に存在するかどうかが決定され得る。それらは有利には、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６（配列番号１４）についての対立遺伝子Ｔ及び／又はＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）についての対立遺伝子Ｃ、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６についての対立遺伝子Ｃの存在によって特徴づけられる。
【０１００】
上記で定義された植物、外植片、接ぎ穂、切り穂、種子、根、根茎、花粉、胚珠、胚、長角果、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、頭部及び／又は植物部位は、好ましくは、少なくとも１つの本発明の細胞を含み、好ましくはその細胞の大部分が本発明に係る細胞であり、より好ましくは定義された植物部位の全ての細胞が本発明の細胞である。
【０１０１】
本発明に係る細胞は、任意のタイプのＢ．オレラセア細胞、好ましくはＢ．オレラセア・変種イタリカ、とりわけＢ．オレラセア植物全体を再生することができる細胞であって、遺伝子移入された配列を有する細胞であり得る。あるいは、本発明に係る細胞は、特にＢ．オレラセア植物全体を再生することができない細胞であり得る。
【０１０２】
本発明に係る細胞は単離された細胞であってもよい。
【０１０３】
本発明はまた、本発明に係る上記で定義された植物の再生可能な細胞の組織培養物に関し；好ましくは、当該再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根の先端、長角果、種子、花、子葉、及び／又は胚軸に由来し、かつ、そのゲノム中に、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する第４染色体上の遺伝子移入された配列を含む。
【０１０４】
組織培養物は好ましくは、前記ブロッコリー植物の生理学的及び形態学的特徴を有する植物を再生することができ、かつ、前記ブロッコリー植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができることになる。本発明はまた、本発明の組織培養物から再生されるブロッコリー植物を提供する。
【０１０５】
本発明はまた、上記で定義された植物の、又は上記で定義された組織培養物由来のプロトプラストを提供し、前記プロトプラストは、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対する抵抗性を付与する前記遺伝子移入された配列を含む。
【０１０６】
別の態様によれば、本発明はまた、本発明の第１の態様により詳述されたＢ．オレラセア植物の使用に関し、すなわち抵抗性がある、特にブロッコリー植物の、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性があるＢ．オレラセア植物を得るための、育種プログラムにおける繁殖パートナーとしての、使用に関する。実際に、第１の態様に係るそのような植物は、そのゲノム中に、目的の表現型、すなわち抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有する。この植物と、感受性のある又は抵抗性の低い植物とを交配することによって、結果として、所望の表現型を付与するこれら配列を後代へと転移させることが可能であり、それは当該表現型が一遺伝子性形質であるためである。好ましくは、繁殖パートナーとして使用されることになる植物は、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列に関してホモ接合性の植物であって、この植物と別のＢ．オレラセアとの交配によって得られる全てのハイブリッド植物はまた、抵抗性表現型を付与する遺伝子移入された配列を有することになる。
あるいは、本発明の第１の態様に係るヘテロ接合性植物が使用されてもよく；この場合、選択ステップが有利には、表現型の分離の観点から、例えば本発明のＳＮＰマーカーの存在に基づいて、加えられることになる。
【０１０７】
したがって本発明に係る植物は、所望の表現型を付与する配列をＢ．オレラセア植物又は生殖質に遺伝子移入するための、繁殖パートナーとして使用され得る。
【０１０８】
遺伝子移入された目的の配列は有利には、他の望ましい遺伝的形質、例えば他の病気に対する抵抗性を含む植物又は品種に導入されることになる。
【０１０９】
遺伝子移入された目的の配列は有利には、他の白さび病抵抗性遺伝子、例えば国際公開第２０１０／１３５７８２号に開示された第１染色体上の一遺伝子性優性遺伝子を含む、植物又は品種に導入されることになり；より好ましくは、それらはそのゲノム中に、国際公開第２０１０／１３５７８２号に定義された配列番号１及び／又は配列番号２を含む。
【０１１０】
本発明はまた、ＮＣＩＭＢに受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で寄託されたＢ．オレラセア・変種イタリカ−ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の植物又は種子、あるいは白発疹さび病に対する抵抗性を付与する本発明の遺伝子移入された配列を有するそれらの後代、特にＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃを有するそれらの後代による同じ使用に関する。前記植物はまた、目的の遺伝子移入配列についてヘテロ接合性であるが、所望の表現型をＢ．オレラセア植物又は生殖質に付与することを目的とする、育種プログラムにおける遺伝子移入パートナーとして適しており、すなわちＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性があるＢ．オレラセア植物を得るために適している。
【０１１１】
そのような育種プログラムにおいて、所望の表現型を示すか、又は所望の表現型に関連している配列を有する、後代の選択は、有利には、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子に基づいて実行され得る。後代は好ましくは、第４染色体上のＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在により選択される。あるいは、選択は、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの同時存在に基づいて行われ得る。
【０１１２】
あるいは、本発明の他のＳＮＰ、すなわちＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３はまた、上記で詳述したように使用され得る。
【０１１３】
所望の表現型を有する後代の選択はまた、とりわけ実施例１（病理試験）に開示されたような、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体感染の条件で行われ得る。
【０１１４】
したがって、本発明に係る植物、又は受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で寄託された種子から成長した植物は、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性がある商業的なブロッコリー系統及び品種、並びに白発疹さび病に対する抵抗性を付与する本発明の遺伝子移入された配列を有するそれらの後代、特にＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃを有するそれらの後代を得るための、マーカー補助選択に特に有用である。
【０１１５】
本発明はまた、所望の表現型、すなわち卵菌類アルブゴ・カンジダ・レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子の、同定、シークエンシング及び／又はクローニングを目的とするプログラムにおける前記植物の使用に関する。
【０１１６】
本発明の先行する態様のために記載された任意の特定の実施形態はまた、特に抵抗性を付与する遺伝子移入された配列の特徴に関して、本発明の本態様に適用可能である。
【０１１７】
さらに別の態様によれば、本発明はまた、所望の表現型を有するＢ．オレラセア植物、好ましくはブラッシカ・オレラセア・変種イタリカ、ブロッコリー植物、特に商業的な植物の作出のための方法又はプロセスに関する。
【０１１８】
実際に、本発明はまた、抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を、ブロッコリー植物から、他のＢ．オレラセア品種及び種に、特に他のブロッコリー種に、又はカリフラワー（Ｂ．オレラセア・亜種ボトリティス・変種ボトリティス）、芽キャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種オレラセア・変種ゲミフェラ）、白キャベツ、オックスハートキャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種カピタータ・変種アルバ）及びサボイキャベツ（Ｂ．オレラセア・亜種カピタータ・変種サバウダ）に、転移させることに関し；本発明は、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体抵抗性ブロッコリーの新たなタイプ及び品種を作出するために有用である。
【０１１９】
これらの特徴、すなわちＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対する抵抗性を有する植物の作出のための方法又はプロセスは、以下のステップ：
ａ）本発明の第１の態様に係る植物と、所望の表現型が取り込まれ又は改善されるべき、感受性のある又は抵抗性の低いＢ．オレラセア植物、好ましくはブロッコリー植物とを交配し；
ｂ）抵抗性を付与する配列を有する結果として得られた後代の中で植物を選択し；
ｃ）場合により、ステップｂ）で得られた植物を１又は複数回自家受粉し、そして、結果として得られた後代の中で抵抗性植物を選択すること、
を含み得、
ここで、ＳＮＰマーカーが好ましくは、ステップｂ）及びｃ）において、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する配列を有する植物を選択するために、使用される。
【０１２０】
ＳＮＰマーカーは、好ましくは、本発明の１１個のＳＮＰマーカーの１又は複数であり、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６である。好ましい実施形態によれば、選択は、少なくとも部分的には、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子を検出することによって行われる。あるいは、選択は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３の内から選択された少なくとも２個のＳＮＰの対立遺伝子の検出により行うことができ、好ましくは、少なくとも３個のＳＮＰ、例えば少なくとも４、５又は６個であって、そのうちの１つがＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６である。選択はまた、これら１１個全てのＳＮＰの対立遺伝子の検出により行うことができる。上記で開示した選択ステップにおいて選択される植物は、好ましくは、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在で選択される。
【０１２１】
好ましくは、ステップａ）の感受性のある又は抵抗性の低いＢ．オレラセア植物は、エリート（elite）系統であり、商業的に所望される形質又は所望される園芸形質を導入するために使用される。それは好ましくはブロッコリー植物である。
【０１２２】
これらの特徴を有する植物の作出のための方法又はプロセスはまた、以下の付加的なステップ：
ｄ）ステップｃ）で選択された抵抗性植物と、感受性のあるＢ．オレラセア植物とを戻し交配し；
ｅ）Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対する抵抗性を付与する配列を有する後代の中で植物を選択し；
ｆ）ステップｅ）で得られた植物を自家受粉し、又は、ステップｅ）で得られた別個の植物を交配し、並びに
ｇ）Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に抵抗性がある植物を選択すること、
を含んでもよい。
【０１２３】
先の方法のステップｂ）、ｃ）又はｇ）で選択された植物は、商業的な植物であってもよい。ステップｄ）、ｅ）及び／ｆ）は、２回又は３回以上繰り返されてもよく、必ずしも同じ感受性のあるＢ．オレラセア植物でなくともよい。前記感受性のあるＢ．オレラセア植物は、好ましくは育種系統である。この植物は好ましくは、商業的に所望される形質又は所望される園芸形質を導入するために使用される、エリート系統である。それは好ましくはブロッコリー植物である。
【０１２４】
自家受粉／交配及び戻し交配ステップは、任意の順序で実行されてもよく、挿入され得る。
【０１２５】
さらに、本発明の方法は有利には、抵抗性に関連している遺伝子移入された配列を有する植物を選択するため、又は目的の表現型を有する植物を選択するための、選択ステップの１又は複数のために、ＳＮＰマーカーを用いて実行される。
【０１２６】
したがって、抵抗性Ｂ．オレラセア ブロッコリー植物の作出のための本発明の方法は、有利には、以下のステップ：
ａ）本発明の第１の態様に係る植物と、感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを交配し；
ｂ）白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有する、結果として得られた後代の中で１つの抵抗性植物を選択し；
ｃ）場合により、ステップｂ）で得られた抵抗性植物を１又は数回自家受粉し、そして、結果として得られた後代の中で白発疹さび病に抵抗性がある植物を選択し；
ｄ）場合により、ステップｂ）又はｃ）で選択された抵抗性植物と、感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを戻し交配し、並びに、白発疹さび病に抵抗性がある植物を選択すること、
を含み、
ここで、ＳＮＰマーカーが、ステップｂ）、ｃ）及び／又はｄ）で、本明細書に開示された白さび病に抵抗性がある植物を選択するために使用される。
【０１２７】
ＳＮＰマーカーは好ましくは、本発明の１１個のＳＮＰマーカーの１又は複数であり、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６である。好ましい実施形態によれば、選択は、少なくとも部分的には、第４染色体上のＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子に基づいて行われる。選択は、例えば、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６を有し／によって特徴づけられる、対立遺伝子を検出することによって行われる。
【０１２８】
上記で開示された選択ステップで選択された植物は、好ましくは、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在により選択される。抵抗性に関与する遺伝子移入された配列をホモ接合性に有する植物を同定するために、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在は、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ａの非存在と組み合わせて検出される。
【０１２９】
あるいは、本発明の他のＳＮＰも、有利には使用することができ、すなわち、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６に代えて、又は有利にはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６に加えて、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３を使用することができる。
【０１３０】
所望の表現型を有する後代の選択はまた、とりわけ実施例１に開示されたような、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体感染の条件で行うことができる。
【０１３１】
対立遺伝子検出のために使用される方法は、特定の染色体遺伝子座上のＳＮＰの２つの異なる対立遺伝子間の区別を可能にする、任意の技術に基づき得る。
好ましくは、方法のステップａで使用される本発明の第１の態様に係る植物は、寄託された種子ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４  ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３を発芽させることによって得られた植物、又は白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有するそれらの後代、特にＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃを有するそれらの後代である。
【０１３２】
別の実施形態によれば、本発明はまた、卵菌類アルブゴ・カンジダ・レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性があるＢ．オレラセア植物、好ましくはブロッコリーの作出のための方法であって、以下のステップ：
ａ１）本発明の第１の態様に係る植物、又は寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４２４３３から成長した植物と、感受性のあるＢ．オレラセア植物、好ましくはブロッコリーとを交配し、結果としてＦ１集団を生成し；
ａ２）Ｆ１集団を進めてＦ２集団を作成し；
ｂ）結果として得られた後代の中で１つの抵抗性植物を選択し；
ｃ）場合により、ステップｂ）で得られた抵抗性植物を１又は数回自家受粉し、そして、結果として得られた後代の中で白さび病に抵抗性がある植物を選択し；
ｄ）場合により、ステップｂ）又はｃ）で選択された抵抗性植物と、感受性のあるＢ．オレラセア植物、好ましくはブロッコリーとを戻し交配し、並びに白さび病に抵抗性がある植物を選択すること、
を含み、
ここで、ＳＮＰマーカーが、ステップｂ）、ｃ）及び／又はｄ）で、本明細書に開示されたような白さび病に抵抗性がある植物を選択するために使用される、
方法を提供する。
【０１３３】
本発明はまた、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性がある、商業的なブロッコリー植物を得るための方法であって、以下のステップ：
ａ）寄託された種子ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４  ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３を発芽させることによって得られた植物、又は本発明の第１の態様に係る植物と、前記白発疹さび病に感受性のあるＢ．オレラセア ブロッコリー植物とを戻し交配し；
ｂ）卵菌類アルブゴ・カンジダ・レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に抵抗性がある植物を選択すること、
を含む、方法を提供する。
【０１３４】
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、抵抗性植物の選択は、以下の対立遺伝子：ＢＯ−０１０８４３６の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７４７の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４８の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７４９の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５０の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７５１の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７５２の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５３の対立遺伝子Ｃ、ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ、及びＢＮ−００６７７９３の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つの検出によって、好ましくはＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃを検出することによって、行われる。
【０１３５】
好ましくは、これら方法のステップａ１）又はａ）で使用される本発明の第１の態様に係る植物は、寄託された種子ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４  ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３を発芽させることによって得られた植物、又は白発疹さび病に対する抵抗性を付与する配列を有するそれらの後代、特にＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃを有するそれらの後代である。
【０１３６】
本発明はまた、上述された方法の１つによって得られた、又は得られる植物に関する。そのような植物は実際に、本発明の第１の態様に係る所望の表現型を有する、すなわちＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性がある、Ｂ．オレラセア植物である。特に好ましい植物は、ブロッコリー植物（Ｂ．オレラセア・変種イタリカ）である。
【０１３７】
本発明はさらに、対立遺伝子検出に基づいて、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有するＢ．オレラセア植物を、検出し及び／又は選択するための方法に関する。そのような方法は、本発明の１１個のＳＮＰの少なくとも１つの対立遺伝子（複数）の検出に基づいており、特に、本発明のＳＮＰの少なくとも１つについての、抵抗性に関連している対立遺伝子の検出に基づいている。この点において、本発明の１１個のＳＮＰについて、抵抗性に関連した対立遺伝子の検出はそれ自体で、感受性に関連した対立遺伝子も検出されるか否かに関わらず、抵抗性表現型を示すが、一方で、抵抗性に関連した対立遺伝子の検出が無いことは感受性を示すことに留意されたい。「感受性のある」対立遺伝子の検出は、それ自体が有益であるわけではない。したがって、当該方法は有利には、以下の対立遺伝子：ＢＯ−０１０８４３６の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７４７の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４８の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７４９の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５０の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７５１の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７５２の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５３の対立遺伝子Ｃ、ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ、及びＢＮ−００６７７９３の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つが試験下の植物に存在するか否かの検出を含み、これら対立遺伝子の少なくとも１つの検出は、試験下の植物が、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性であることを結論付けさせる。好ましくは、当該方法は、第４染色体上のＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の中から選択された少なくとも１つのＳＮＰ、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子の検出を含むが、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ及び／又はＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔの検出は抵抗性を示す。当該方法は、白さび病に抵抗性があるＢ．オレラセア植物に対して行うことができ；したがって当該方法は、そのような植物が、そのゲノム中に本発明に係る遺伝子移入された配列を含み、従って本発明に従って得られたことを確認するために使用することができる。
【０１３８】
好ましくは、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃが、選択されるべき植物の遺伝物質試料中に検出される場合に、遺伝子移入された配列を有する植物が選択される。目的の対立遺伝子は、選択された植物においてホモ接合性に又はヘテロ接合性に存在し得る。
【０１３９】
したがって、特に好ましい実施形態によれば、選択は、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの同時存在時に行われる。抵抗性の表現型をホモ接合性に示す植物の選択のために、選択は好ましくは、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ同時検出時に、これらＳＮＰについての他の対立遺伝子の検出が無い組み合わせで行われ、特にＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｃ又はＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ａの検出が無い組み合わせで行われる。逆に、ＳＮＰの両方の対立遺伝子の検出は、抵抗性配列に関してヘテロ接合性植物を示す。
【０１４０】
そのような対立遺伝子の組み合わせは、寄託された種子から成長した植物において見られることになる。
【０１４１】
本発明の方法は、本発明の所与のＳＮＰについて抵抗性に関連した対立遺伝子のみを示す植物を検出することによって、抵抗性配列をホモ接合性に有する植物の選択を可能にし、並びに、抵抗性及び感受性に関連した両方の対立遺伝子を示す植物を検出することによって、これら配列をヘテロ接合性に有する植物の選択も可能にする。
【０１４２】
当該方法はまた、これら２つのタイプの抵抗性植物間での区別を可能にし、配列をヘテロ接合性に有する抵抗性植物は、本発明のＳＮＰの少なくとも１つについて、抵抗性及び感受性に関連した両方の対立遺伝子の同時存在によって特徴づけられる。
【０１４３】
検出又は選択はまた、以下：ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５２、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５３、ＳＮＰ ＢＮ−００６７７８６及びＳＮＰ ＢＮ−００６７７９３、の少なくとも１つの対立遺伝子、又は少なくとも２、３、若しくは４つ全てのＳＮＰの対立遺伝子の同定、あるいは、以下：ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４７、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４８、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４９、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５０、ＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１の少なくとも１つの対立遺伝子の同定を、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６に加えて、含み得る。
【０１４４】
したがって本発明の方法は、例えばＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４（ＮＣＩＭＢ受託番号４２４３３）の植物のゲノム中に見られるように、卵菌類Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白発疹さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入された配列を有する、Ｂ．オレラセア、特にブロッコリー植物を検出し及び／又は選択するのに適しており、選択及び／又は検出されるべき植物の遺伝物質試料において、以下の対立遺伝子：ＢＯ−０１０８４３６の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７４７の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７４８の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７４９の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５０の対立遺伝子Ａ、ＢＯ−０１０８７５１の対立遺伝子Ｇ、ＢＯ−０１０８７５２の対立遺伝子Ｃ、ＢＯ−０１０８７５３の対立遺伝子Ｃ、ＢＮ−００６７７８６の対立遺伝子Ｔ、及びＢＮ−００６７７９３の対立遺伝子Ｇ、の少なくとも１つの検出を含む。ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの検出が非常に好ましい。
【０１４５】
本発明のＳＮＰマーカーはまた、表現型を付与する最小限の遺伝子移入が同定され及び／又は選択され得るように、抵抗性遺伝子座をマッピングするために使用することができる。
【０１４６】
本発明の方法において詳述されたように、抵抗性を付与する配列の遺伝子移入に加えて、本発明のこれら配列はまた、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に抵抗性がある商業的なＢ．オレラセア植物を得るために、遺伝子工学によって、Ｂ．オレラセアの背景に導入され得る。所望の表現型を付与する遺伝子移入された配列の、とりわけ寄託ＮＣＩＭＢ ４２４３３からの、同定及びクローニングは、当業者によって、本願及び寄託された材料に与えられた配列情報に基づいて、行われ得る。
【０１４７】
本発明はまた、表現型を付与する遺伝子移入された配列をクローニングすること、及び／又はそれら配列をＢ．オレラセア植物に組み込むことを目的とする遺伝子操作、並びに、結果として得られた植物、好ましくはブロッコリー植物に関する。
【０１４８】
さらなる態様によれば、本発明はまた、本発明の第１の態様に係る抵抗性植物を交配することによって得られるＢ．オレラセアのハイブリッド植物、あるいは、Ｂ．オレラセアの植物、例えばＡ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に感受性のある植物を用いて、上記で開示された方法によって得られる抵抗性植物、あるいは、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性の異なるレベルを有する植物に関する。抵抗性植物は好ましくは、抵抗性を付与する配列についてホモ接合性である。抵抗性植物が抵抗性を付与する配列についてヘテロ接合性である場合、後代の半分のみが抵抗性であろう；したがって抵抗性を付与する配列を有する植物の選択ステップが加えられることが好ましい。
【０１４９】
特に好ましいハイブリッドＢ．オレラセア植物は、雄性不稔、あるいは農業目的の任意の他の形質又は表現型を示す植物である。
【０１５０】
本発明はまた、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体による感染から、Ｂ．オレラセア植物、特にブロッコリー植物の圃場を保護する方法を提供し、前記方法は、抵抗性表現型を示す本発明に係る種子を植えること、又は本発明に係る植物を育成すること、を含む。
【実施例】
【０１５１】
実施例：
実施例１：抵抗性植物の同定
フランスのブルターニュで行われた圃場試験において、ロマネスコ ブラッシカ・オレラセア植物は、高い天然のアルブゴ・カンジダ圧下で抵抗性を示した。
【０１５２】
ロマネスコ ブラッシカ・オレラセア植物は、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体の好ましい宿主であると知られていないが、次に本発明者らは、ブルターニュで見られた抵抗性表現型がアルブゴ・カンジダ オーストラリア変異体の圧に耐えうるかを確認するために、圃場試験においてまさにこの同じロマネスコＢ．オレラセア植物を試験することを決めた。結果は肯定的であり、ヨーロッパ変異体及びオーストラリア変異体両方に対する抵抗性決定論はおそらく、ユニークな遺伝子配列によって引き起こされたと考えられた。
【０１５３】
しかしながら、病理試験とともにする予備マッピング作業はそうではないことを示した。これは集団の分離に関するマッピング作業が、２つの異なる染色体上に２つの異なる局在を同定したためである。それゆえ、アルブゴ・カンジダ レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性を付与する遺伝子配列は、ヨーロッパ変異体に対する抵抗性を付与しなかった。最初に試験されたロマネスコ植物はおそらく両方の配列を有していた。
【０１５４】
ブロッコリー抵抗性植物の作成：
本発明者らは、元のロマネスコＢ．オレラセア植物とブロッコリー近交系とを交配して、第１世代ハイブリッドを得た。これをさらにブロッコリー近交系に２回戻し交配した。それらの得られた植物を、ヨーロッパＡ．カンジダ レース９株を用いて以下に記載された病理試験を通じてスクリーニングし、症状の無い植物を次のステップの戻し交配ステップのために維持した。次世代植物を、今度はオーストラリアＡ．カンジダ レース９変異体を用いて、再度病理試験で試験した。
【０１５５】
抵抗性植物のうちの１つを二倍体プログラムに使用して、オーストラリアＡ．カンジダ レース９変異体に対する抵抗性についてホモ接合性の抵抗性近交系を作出した。この植物をさらに感受性のあるブロッコリー植物に交配し、抵抗性をヘテロ接合性の方法で有する得られたハイブリッド後代植物ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４は、オーストラリアＡ．カンジダ レース９変異体に対して抵抗性である。それらの種子を、ＮＣＩＭＢに２０１５年７月９日に、受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で寄託した。
【０１５６】
抵抗性の同定：
オーストラリア変異体に対する抵抗性の性質をより良く同定するため、並びにこの新しい抵抗性の遺伝的位置をマッピングするために、５つの異なるＦ２集団からなる試験を設定した；実際に、元のロマネスコ抵抗性植物を５つの異なる感受性のあるブロッコリー植物に交配し、そして得られたＦ１植物を自家受粉して、Ｆ２種子を作出した。
【０１５７】
病理試験：
オーストラリア変異体Ａ．カンジダ株をオーストラリアのテンプルストー（Templestowe）に集め、冷凍庫で−８０℃に保存する。２〜３か月ごとに、感受性のある品種上で定期的に増殖させる：小隆起を含む凍結子葉を脱塩水で洗浄して、胞子を懸濁し、次いで懸濁液を、育成チャンバー（夜間は１６℃、昼間は１５℃、各条件につき１２時間）に置いた感受性のある植物上で蒸発させる（子葉期、播種後１週間）。
【０１５８】
新鮮な、新しい小隆起を有する子葉を、５００ｍｌの蒸留水とともにエルレンマイヤーフラスコに回収し、溶液を２．５ｌの蒸留水で２．１０5胞子／ｍｌに調整し、それによって接種材料を作製する。
【０１５９】
植物材料は、１つの感受性対照及び１つの抵抗性対照とともに、試験されるべき遺伝子型につき１９２植物からなる（すなわちＦ２集団につき１９２植物）：種子を播種し、１〜２葉期まで約３週間温室に入れる。次いで、葉をやさしくこすって葉のワックスを除去し、接種材料を葉に噴霧する。読み取りを噴霧後１５日で実施し、植物を育成チャンバー（夜間は１６℃、昼間は１５℃、各条件につき１２時間）内で栽培する。
【０１６０】
読み取りを１〜９のスケールで実施し、ここで、「１」は表面の７５％超に胞子形成を伴う葉に対応し、「３」は５１〜７５％、「５」は２６〜４０％の胞子形成、「７」は１３〜２５％、「８」は１〜１２％、であり、そして「９」は胞子形成が無い。結果を表２に示す。
【０１６１】
【表２】
2018525036.tif 000003
【０１６２】
いくつかの種子は発芽しなかった、従って集団当たりの植物の正確な数は１９２よりもわずかに低かった。
【０１６３】
全ての結果は３：１の分離比を支持し、Ａ．カンジダ オーストラリア変異体に対する抵抗性が優性抵抗性として作用することを実証している。集団ｎ°３は５％でわずかな偏差を示すが、１％では示さない（カイ二乗検定によって評価された有意性）。
【０１６４】
カイ二乗検定を、Ｒ統計ソフトウェア（http://www.r-project.org／）を用いて行って、１つの優性抵抗性遺伝子の仮説を確認した。結果を表３に示す。
【０１６５】
【表３】
2018525036.tif 000004
【０１６６】
実施例２：遺伝的解析：
各Ｆ２植物を個別にサンプリングし、そして磁気ビーズ（NucleoMag（登録商標） 96 Plant）を用いて、ビーズの製造業者（Macherey-Nagel）のプロトコルに従って、ＤＮＡを単離した。
【０１６７】
３：１の分離比に最もよく従った４つのＦ２集団、すなわち集団ｎ°１、２、４及び５のそれぞれについて、２２個のＦ２植物を、Ｂ．オレラセアゲノムに十分に広まった３８４個のＳＮＰマーカーにより、Illumina Veracode Golden Gate技術を用いて、遺伝子型決定した。４つの集団のそれぞれについて、２２個の植物のうち、それらの１１個をスコア９の植物の中からランダムに選び、そしてそれらの１１個をスコア１の植物から選んだ。所与の集団について、１１個未満の植物がスコア１であった場合、全てのスコア１の植物が遺伝子型決定され、追加の植物をスコア３の植物の中から選び、合計１１個の感受性のある植物が遺伝子型決定されるようにした。
【０１６８】
ＱＴＬ検出を４つの集団にわたって（２２×４＝合計８８個体）、Kruskal-Wallis検定（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.org/）を用いて行った。
結果は、抵抗性遺伝子座が第４染色体（Ｃ４）上の位置２ ７８０  ６９２と３９ ０８５ １１０との間に位置することを示し、そのようなゲノム上の物理的位置は、ヨーロッパヌクレオチドアーカイブ（European Nucleotide Archive)及びEnsemblPLants -http://plants.ensembl.org/Brassica_oleracea/Info/Indexにより公開された、ブラッシカ・オレラセアＴＯ１０００ゲノムのバージョンＶ２．１に基づいている。
【０１６９】
結果を表４に示す。（マーカー内の多型ヌクレオチドの）物理的位置は、ブラッシカ・オレラセアＴＯ１０００ゲノムのバージョンＶ２．１に関して、第４染色体上に与えられている。マーカーの配列を表１１に詳細に示す。
【０１７０】
【表４】
2018525036.tif 000005
【０１７１】
マーカーの検証：
遺伝子型決定をＫＡＳＰ（商標）技術を用いて行った。
【０１７２】
同定された最も密接に関連したマーカーを、４つの集団の全ての植物で試験した。同じゲノム領域内にあるが、発見に使用された３８４個のＳＮＰのセットには最初はなかった、追加のマーカーも遺伝子型決定した。Ｆ２集団ｎ°１はこの第１相では試験しなかった。ＱＴＬ検出を各集団について個別にKruskal-Wallis検定（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.org/）を用いて行った。表５は、１又は複数の集団における各マーカーについての−ｌｏｇ１０（ｐ−値）値を示す。ＮＴは、表５において「試験されていない（not tested）」ことを意味する。結果は、Ｆ２集団のｎ°２について得られた結果を考慮して、Ｃ４：８ ０７９  ８６８に位置するマーカーＢＮ−００６７７８６が、より緊密に抵抗性に関連したマーカーであることを示した。
【０１７３】
【表５】
2018525036.tif 000006
【０１７４】
第２の遺伝子型決定実験を、ＫＡＳＰ（商標）技術を用いて行った。
【０１７５】
位置Ｃ４：６ ０６９  ７０５とＣ４：８ ７１２  ４８４との間に位置する２４個のＳＮＰを、Ｆ２集団ｎ°１の２つの親系統間の多型についてスクリーニングした。それらのうち５つが多型性を示し、Ｆ２集団ｎ°１全体に関してさらに遺伝子型決定された。したがってＦ２集団ｎ°１はこの第２相で試験された。１つのマーカーは、予想された分離を示さず、したがって分析から除かれた。関連試験はKruskal-Wallis検定（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.org/）を用いて行った。結果を表６に示す。
【０１７６】
【表６】
2018525036.tif 000007
【０１７７】
マーカー検証の第１相は、位置Ｃ４：８ ０８１  １０４にあるＢＮ−００６７７９３上に位置する、抵抗性の右境界位置（すなわち、染色体に沿った座標に従った区間の下流境界）を精緻化することを可能にした。
【０１７８】
マーカー検証の第２相は、位置Ｃ４：６  ０６９  ７０５にあるマーカーＢＮ−００００２５３上に位置する、抵抗性の左境界位置（すなわち、染色体に沿った座標に従った区間の上流境界）を精緻化することを可能にした。
【０１７９】
第１相は異なる集団に関して実施されたが、第２相は単一の集団、すなわちＦ２集団ｎ°１に関して実施されたことに留意されたい。
【０１８０】
抵抗性を付与する最小の遺伝子移入フラグメントを決定するために、最初に所与の集団において最も高い−ｌｏｇ  ｐ値が決定され、次いでこの値の減少を示す最も近いＳＮＰに対する遺伝子移入フラグメントの境界を設定するために、好ましくは別の集団に関する結果によって確認されなければならない。
【０１８１】
したがって抵抗性を含む区間は、染色体Ｃ４上の位置６ ０６９  ７０５と８ ０８１  １０４との間の２  ０１１  ３９９  ｂｐ領域にわたる。
【０１８２】
ファインマッピング：
遺伝子型決定をＫＡＳＰ（商標）技術を用いて行った。
【０１８３】
抵抗性遺伝子座をさらに詳細にマッピングするために、位置Ｃ４：７ ３６６ ４７８とＣ４：７ ４７９ ２８３との間に位置する１１個のＳＮＰを、５つのＦ２集団の親系統間の多型についてスクリーニングした。それらのうち１つのみ（位置Ｃ４：７ ４２７ ４９９に位置するマーカーＢＯ−０１０８４３６）が多型性であり（集団ｎ°３において）、集団ｎ°３全体でさらに試験された。
【０１８４】
次に関連試験を、Kruskal-Wallis検定（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.org/）を用いて、集団ｎ°３のマーカーＢＯ−０１０８４３６について行った。結果を表７に示す。
【０１８５】
【表７】
2018525036.tif 000008
【０１８６】
集団の研究及び信頼区間の重なりのために、抵抗性区間の境界は以下のように設けられた：左境界：Ｃ４：７ ４２７ ４９９、マーカーＢＯ−０１０８４３６に対応する、並びに、右境界：Ｃ４：８ ０８１ １０４、マーカーＢＮ−００６７７９３に対応する。したがって抵抗性を含む区間は、染色体Ｃ４上の位置７ ４２７ ４９９と８ ０８１ １０４との間の６５３ ６０５  ｂｐ領域にわたる。
【０１８７】
実施例３：染色体Ｃ４上のアルブゴ・カンジダに対する抵抗性に関連しているさらなるマーカーの同定
抵抗性を含む区間は、染色体Ｃ４上の位置７ ４２７ ４９９と８ ０８１ １０４との間の６５３ ６０５  ｂｐ領域にわたる。本明細書に前述した参照ゲノム配列を見ると、７３個の遺伝子がこの領域内で同定された。これら遺伝子内の多型を、ＰＣＲによる増幅及び増幅領域のシークエンシング後に、より詳細に研究した。最も有望な増幅領域を、以下のプライマーを用いて生成した：
フォワードプライマー  ＣＧＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＴＡＡＣＡＴＧＡ（配列番号４１）
リバースプライマー  ＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＧＡＣＧＴＴＡＴ（配列番号４２）
【０１８８】
ＰＣＲミックスを以下のように調製した：
ＭｉｌｌｉＱ水              ４μＬ
１０Ｘ緩衝液                １．５μＬ
ｄＮＴＰ  ２，５ｍＭ        １．５μＬ
ＭｇＣｌ２  ２５  ｍＭ        １．５μＬ
フォワードプライマー１０μＭ  ０．７μＬ
リバースプライマー１０μＭ    ０．７μＬ
Ｔａｑ  Ｓｉｇｍａ  Ｊｕｍｐ  ０．１μＬ
ＤＮＡテンプレート            ５μＬ
【０１８９】
ＰＣＲ増幅を、以下のプログラムを用いてApplied Biosystems 2720 Thermal Cyclerで行った：
ステップ１：９４℃で３分；ステップ２：９４℃で３０秒；ステップ３：６０℃で３０秒；ステップ４：７２℃で２分；ステップ５：７２℃で７分
ステップ２〜５を４０回繰り返す
ステップ６は１５℃で保持する。
【０１９０】
増幅を、５つの集団（抵抗性源を含む）の親系統、及び集団ｎ°１の１つの組み換え植物に対して行った。この植物は病理試験においてスコア４であり、抵抗性領域上流に感受性のある親プロファイル、並びに抵抗性領域下流にヘテロ接合性プロファイルを有する。当該植物は表現型的に感受性があるので、抵抗性遺伝子位置に感受性のある対立遺伝子を有することが予想される。
【０１９１】
アンプリコンのシークエンシングを、GATC Biotech using Sangerシークエンシング技術によって両方の鎖に対して行った。配列解析を、両方の鎖の配列をマージする前に、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアを用いて行った。４つの感受性のある親及び感受性のある組み換え植物の間で多型は同定されなかった。コンセンサス感受性配列と抵抗性源配列との間のいくつかのヌクレオチド多型が、増幅フラグメントにおいて同定された；それらのうち、８個のＳＮＰが、抵抗性親配列を感受性のある親コンセンサス配列及び参照配列から区別する際に、特に堅牢であるとして選択された。これらマーカーの対立遺伝子を表８に報告する。
【０１９２】
【表８】
2018525036.tif 000009
【０１９３】
マッピング集団におけるマーカーの検証
遺伝子型決定を、ＫＡＳＰ（商標）技術を用いて行った。マーカーのいくつかを、Ｆ２分離集団ｎ°１及び３において遺伝子型決定した。
【０１９４】
関連試験を、各集団について個別にKruskal-Wallis検定（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.org/）を用いて行った。結果を表９に示す。
【０１９５】
【表９】
2018525036.tif 000010
【０１９６】
したがって抵抗性を含む区間は、染色体Ｃ４上の位置６ ０６９ ７０５と７ ４６３ ２４８との間の領域において、非常に高い確率である。
【０１９７】
実施例４：育種生殖質（breeding germplasm）における分子マーカーの評価
遺伝子型決定を、ＫＡＳＰ（商標）技術を用いて行った。４８８個の異なる遺伝子型をサンプリングし、磁気ビーズ（NucleoMag（登録商標）96 Plant）を用いて、ビーズの製造業者（Macherey-Nagel）のプロトコルに従って、ＤＮＡを単離した。４８８個の遺伝子型は以下によって構成されている：
−  最初のロマネスコ抵抗性源、
−  寄託されたハイブリッドＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４、
−  本発明のフラグメントの遺伝子移入によって抵抗性にされた２個の抵抗性系統、
−  ５１個のブロッコリーの商業的なハイブリッド
−  ４３３系統のブロッコリー。
【０１９８】
関連試験を、Kruskal-Wallis検定（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.org/）を用いてマーカーＢＯ−０１０８７４６（配列番号６）について行った。−ｌｏｇ１０（ｐ−値）の２４３．５（Ｋ統計値＝４８７）が見られた。ピアソン相関検定も行った（Ｒ統計ソフトウェアhttp://www.r-project.orｇ/）。相関係数１．０が９５％信頼区間で観察された（ｔ統計値＝８５３２７７１７６、ｐ−値＝０．０）。
【０１９９】
これらの検定は、遺伝子型と表現型との間に１００％の相関を示した。すなわち、全ての抵抗性植物（最初のロマネスコ、ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４、及び２個の抵抗性系統）は、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｃの存在を示す一方で、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に対して感受性のある全ての他の植物は、この対立遺伝子の存在を示さないが、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ｔのみを示す。
【０２００】
マーカーＢＯ−０１０８７４６を、Ａ．カンジダ レース９オーストラリア変異体に抵抗性であるブロッコリー植物を同定及び選択するための最も予測的なＳＮＰとして確認した。
【０２０１】
実施例５：ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の遺伝子型決定
実施例１に詳述したように、ロマネスコＢ．オレラセア植物と近交系ブロッコリー系統との間の最初の交配から得られた抵抗性植物を二倍体プログラムに用いて、オーストラリアＡ．カンジダ レース９変異体に対する抵抗性についてホモ接合性の抵抗性近交系を作出した。この植物をさらに感受性のあるブロッコリー植物に交配して、ヘテロ接合性の方法で抵抗性を有する得られたハイブリッド後代植物ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４は、オーストラリアＡ．カンジダ レース９変異体に対して抵抗性である。抵抗性に関連している遺伝子移入された配列を有するハイブリッド植物を生じるＢＲＯＣＯ−Ｃ４植物の種子を、ＮＣＩＭＢに、２０１５年７月９日に、受託番号ＮＣＩＭＢ ４２４３３の下で提出した。
【０２０２】
ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４の植物を、実施例２〜４で同定されたマーカーについて遺伝子型決定した。表１０に詳述したように、ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４植物／種子が、抵抗性に関連しているとして上記に示されたＳＮＰの全ての対立遺伝子を示すことを確認した。
【０２０３】
【表１０】
2018525036.tif 000011
【０２０４】
したがって、これら結果は、ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４植物が、Ａ．カンジダ レース９、オーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性を付与する遺伝子移入フラグメントを有する植物であることを確認する。
【０２０５】
表１１：全て第４染色体上にある実施例で使用された全てのＳＮＰのマーカー配列。感受性（Ｓ）表現型に関連する対立遺伝子が括弧内に最初に示され、抵抗性（Ｒ）表現型に関連する対立遺伝子が続く。ＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６及びＢＮ−００６７７９３により、好ましくはＳＮＰ ＢＯ−０１０８４３６及びＳＮＰ ＢＯ−０１０８７５１によって区切られる、本発明の遺伝子移入フラグメントの外側では、感受性／抵抗性の表現型との関連は非常に低いか、又は存在しないことに留意しなければならない。
【０２０６】
【表１１−１】
2018525036.tif 000012
【表１１−２】
2018525036.tif 000013
【表１１−３】
2018525036.tif 000014
【表１１−４】
2018525036.tif 000015
【０２０７】
実施例６：異なる植物の抵抗性レベルの比較
６つの異なる遺伝子型に対応する異なる植物を成長させ、実施例１に記載したように接種した。試験された植物は以下のとおりである：
−  Ａ：Tyson、Minchintonらによって言及された品種；
−  Ｂ：TysonのＦ２；
−  Ｃ：本発明で使用されたロマネスコ遺伝子移入パートナー；
−  Ｄ：第１染色体上に抵抗性遺伝子を有する国際公開第２０１０／１３５７８２号に係るブロッコリー系統、
−  Ｅ：ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４に由来するブロッコリーハイブリッドＣＭＳ；
−  Ｆ：ＢＲＯＣＣＯ−Ｃ４に由来するブロッコリー系統。
【０２０８】
抵抗性アッセイを、各遺伝子型Ａ〜Ｆにつき及び各繰り返しにおいて６つの植物で、４回繰り返した。結果を以下の表１２に報告する。
【０２０９】
これらの結果から推測できるように、第４染色体上のＢＲＯＣＣＯ  Ｃ４の遺伝子移入フラグメントを有する植物（遺伝子型Ｃ、Ｅ及びＦ）のみが、アルブゴ・カンジダ・レース９のオーストラリア変異体に対する抵抗性、すなわち高抵抗性を示している。
【０２１０】
Minchintonらによって言及された植物Tysonが本発明の遺伝子移入フラグメントを有さないことを確認するために、本発明者らはさらに、Tysonに存在するＳＮＰ ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子を決定した。植物Tysonは、ＢＯ−０１０８７４６の対立遺伝子Ａについてホモ接合性であるが、対照的に本発明の植物はこのＳＮＰの対立遺伝子Ｃを有する。
【０２１１】
実施例７：圃場試験
寄託された種子に由来する異なるハイブリッドを得て、他の商業的なハイブリッドと共に圃場試験で試験した。圃場試験はオーストラリアで２年連続の秋に行った。表１３（Ｎ年の秋）及び表１４（Ｎ＋１年の秋）は、各植物について、成長した植物の合計数、白さび病により感染した植物の数、及び感染した植物のパーセンテージを報告している。注目すべきは、特に厳しい抵抗性の試験をこれら圃場試験に採用し、植物は実際に、実施例１の病理試験において厳密に９未満のスコアを有する場合に、「白さび病により感染した」とみなされ、そして、胞子を全く有さない、すなわち高度に抵抗性である植物のみが、非感染とみなされた。
【０２１２】
これらの表から推測できるように、本発明に係る９個のハイブリッドが、試験された植物の１００％が非感染である、唯一の抵抗性植物である。試験は、本発明に係る１つの所与のハイブリッドについてオーストラリアの異なる地域で再現された：白さび病はこのハイブリッドについて観察されず、卵菌類アルブゴ・カンジダ・レース９のオーストラリア変異体によって引き起こされる白さび病に対する抵抗性が、実際に株依存性でない一般的な抵抗性であることを確認した。
【０２１３】
【表１２】
2018525036.tif 000016
【表１３】
2018525036.tif 000017
【表１４】
2018525036.tif 000018
【配列表】
2018525036000001.app
【国際調査報告】
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2018525036.tif 000020
2018525036.tif 000021
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