(57)【要約】本発明は、操作された免疫グロブリン対立遺伝子を含む細胞、トランスジェニック哺乳類及び特にげっ歯類を含めたトランスジェニック動物を提供する。対立遺伝子の変異が対立遺伝子排除を障害するように設計され、二重特異性抗体の単離への利用が見込まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン重鎖遺伝子対立遺伝子排除が障害された遺伝子改変動物であって、
細胞１つにつき２つ以上の異なる抗原受容体、及び二重特異性抗原受容体の少なくとも一方を共発現する能力を各々が有するＢリンパ球の選択を可能にする、遺伝子改変動物。
【請求項２】
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子の１つ以上の定常領域コード部分の範囲内にあるエクソンが、発生中のＢリンパ球においてＶ（Ｄ）Ｊ再構成後に対立遺伝子排除が起こらないように変化している、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
【請求項３】
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子の変化が、前記免疫グロブリン重鎖遺伝子の１つ以上の定常領域コード部分における１つ以上のエクソンの発現の誘導可能な不活性化及び活性化の少なくとも一方を可能にする、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
【請求項４】
１つ以上の定常領域エクソンの一部又は全てが、同じ免疫グロブリン重鎖遺伝子における再構成したＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントと逆のリーディングフレーム方向に配置されている、請求項１に記載の遺伝子改変動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子。
【請求項５】
同じ染色体上の再構成したＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントからの定常領域エクソンの発現を阻止するＤＮＡカセットが挿入されている、請求項１に記載の遺伝子改変動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子。
【請求項６】
２つの異なる抗原を同時に注入したとき、又は１つの抗原を注入し、続いて第２の異なる抗原を注入したとき、２つ以上の異なる抗原受容体及び二重特異性抗原受容体の少なくとも一方を共発現するか又は連続的に発現する能力を各々が有するＢリンパ球を生成する、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
【請求項７】
前記２つの抗原受容体のヘテロ二量体化が発生又は分化イベントによって可能になるか、又はそれを誘導することができる、請求項６に記載の遺伝子改変動物のＢ細胞。
【請求項８】
前記動物の個々のＢ細胞における２つの再構成した免疫グロブリン重鎖遺伝子が、互いに効率的にホモ二量体化しない遺伝子産物を発現する、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
【請求項９】
前記２つの異なる重鎖遺伝子産物のホモ二量体化が起こらないか、又はヘテロ二量体化と比べて不利である、請求項８に記載の遺伝子改変動物のＢ細胞。
【請求項１０】
免疫グロブリン軽鎖遺伝子対立遺伝子排除が障害された遺伝子改変動物であって、
細胞１つにつき２つ以上の異なる抗原受容体、及び二重特異性抗原受容体の少なくとも一方を共発現する能力を各々が有するＢリンパ球の選択を可能にする、遺伝子改変動物。
【請求項１１】
前記動物の１つ以上の免疫グロブリン軽鎖遺伝子の範囲内にある定常領域コードエクソンが、発生中のＢリンパ球においてＶＪ再構成後に対立遺伝子排除が起こらないように変化している、請求項１０に記載の遺伝子改変動物。
【請求項１２】
前記遺伝子改変動物の１つ以上の免疫グロブリン軽鎖遺伝子の変化が、免疫グロブリン重鎖遺伝子の定常領域コード部分の発現の誘導可能な不活性化及び活性化の少なく一方を可能にする、請求項１０に記載の遺伝子改変動物。
【請求項１３】
１つ以上の定常領域エクソンの一部又は全てが、同じ免疫グロブリン軽鎖遺伝子における再構成したＶＪ遺伝子セグメントと逆のリーディングフレーム方向に配置されている、請求項１０に記載の遺伝子改変動物における免疫グロブリン軽鎖遺伝子。
【請求項１４】
同じ染色体上の前記再構成したＶＪ遺伝子セグメントからの定常領域エクソンの発現を阻止するＤＮＡカセットが挿入されている、請求項１０に記載の遺伝子改変動物における免疫グロブリン軽鎖遺伝子。
【請求項１５】
定常領域エクソンが、同じ細胞における両方でなく片方の重鎖対立遺伝子との会合に適合するように改変される、請求項１０に記載の遺伝子改変動物における免疫グロブリン軽鎖遺伝子。
【請求項１６】
２つの異なる抗原を同時に注入したとき、又は１つの抗原を注入し、続いて第２の異なる抗体を注入したとき、細胞１つにつき２つ以上の異なる抗原受容体、及び二重特異性抗原受容体の少なくとも一方を共発現するか又は連続的に発現する能力を各々が有するＢリンパ球を生成する、請求項１０に記載の遺伝子改変動物。
【請求項１７】
請求項１０に記載の遺伝子改変動物に由来する初代Ｂ細胞、不死化Ｂ細胞、又はハイブリドーマ。
【請求項１８】
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子の変化が、重鎖のみからなる二重特異性抗体の産生を可能にする、請求項１に記載の遺伝子改変動物。
【請求項１９】
請求項４又は５に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖遺伝子から転写される部分的又は全体的な免疫グロブリンタンパク質。
【請求項２０】
請求項７、９及び１７のいずれか一項に記載の細胞に由来する部分的又は全体的な免疫グロブリンタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト治療薬の開発用のトランスジェニック動物における二重特異性抗体の産生を含めた、免疫グロブリン分子の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の考察では、背景及び序論として特定の論文及び方法について記載する。本明細書に含まれるいかなる事項も、先行技術の「承認」と解釈されてはならない。本出願人は、適切な場合、本明細書に引用される論文及び方法が適用可能な法律の条項に基づく先行技術に該当しないことを実証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
様々な病因のヒト疾患の治療に重要な治療用分子クラスとして、モノクローナル抗体が登場している。ヒト並びにほとんどの脊椎動物では、抗体は、２つの同一の重（Ｈ）鎖が各々同一の軽（Ｌ）鎖と対になった二量体として存在する。各Ｈ鎖及びＬ鎖のＮ末端は可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）からなり、可変ドメインが一緒になってそのユニークな抗原結合特異性を備えたＨ−Ｌ対を提供する。従って、各抗体は２つの同一の抗原結合部位からなり、単一特異性である。
【０００４】
抗体ＶＨ及びＶＬドメインをコードするエクソンは、生殖細胞系列ＤＮＡには存在しない。代わりに、各ＶＨエクソンは、Ｈ鎖遺伝子座に存在するランダムに選択されたＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子の組換えによって生成される；同様に、個々のＶＬエクソンは、軽鎖遺伝子座におけるランダムに選択されたＶ及びＪ遺伝子の染色体再構成によって産生される。ヒトゲノムは、Ｈ鎖を発現することのできる対立遺伝子を２つ（各親から１つずつの対立遺伝子）、カッパ（κ）Ｌ鎖を発現することのできる対立遺伝子を２つ、及びラムダ（λ）Ｌ鎖を発現することのできる対立遺伝子を２つ含有する。Ｈ鎖遺伝子座には複数のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子があり、並びに両方のＬ鎖遺伝子座にも複数のＶ及びＪ遺伝子がある。各免疫グロブリン遺伝子座におけるＪ遺伝子の下流に、抗体の定常領域をコードする１つ以上のエクソンが存在する。重鎖遺伝子座では、異なる抗体クラス（アイソタイプ）を発現するエクソンもまた存在する。ゲノムに複数の免疫グロブリン対立遺伝子が存在するにも関わらず、各Ｂ細胞は、対立遺伝子排除と呼ばれる過程により、１つの機能性重鎖及び１つの機能性軽鎖より多くを同時に発現することができない。
【０００５】
Ｂ細胞の発生においては、初めにＨ鎖遺伝子を含む２つの相同染色体のうちの一方でＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子組換えが起こる。続いて生じたＶＨエクソンがＲＮＡレベルでスプライシングされ、Ｈ鎖の定常領域（ＣＨ）をコードするエクソンとつながる。ここで、ＶＤＪ遺伝子再構成後に形成されたＶＨエクソンがＣＨエクソンとインフレームである場合に限り、完全長Ｈ鎖が発現することができるようになる。小胞体（ＥＲ）でＨ鎖ポリペプチドが翻訳されると、それらは膜結合型ホモ二量体を形成し、ＶｐｒｅＢ及びλ５タンパク質と対になってプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）複合体を形成する。ＶｐｒｅＢ及びλ５は一緒になって代替Ｌ鎖として働き、正しく折り畳まれたプレＢＣＲのみがＥＲから細胞表面に輸送されることができる。十分な数のプレＢＣＲが細胞表面に到達すると、未だ完全には解明されていない機構によってシグナル伝達カスケードが惹起され、リコンビナーゼ活性化遺伝子（ＲＡＧ）の酵素が相同染色体上の第２の重鎖対立遺伝子のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子の組換えを進めることができなくなる。対照的に、第１の重鎖対立遺伝子から非機能性の重鎖遺伝子が生成された場合、プレＢＣＲが形成されず、ここで第２のＨ鎖対立遺伝子はＶＤＪ組換えが可能となる。このように、Ｈ鎖対立遺伝子排除は細胞表面プレＢＣＲからのシグナル伝達によって媒介される。これを最も良く例証するのがＢ細胞であり、ここではＣμ重鎖膜貫通エクソンの欠損によって重鎖対立遺伝子排除が重度に障害される結果となる（非特許文献１）。
【０００６】
機能性Ｈ鎖の産生のためのＶＤＪ遺伝子再構成が成功裏に完了すると、Ｌ鎖遺伝子座の１つにおいて同様に秩序立った形でＶＪ組換えが起こる。ヒト及びマウスの両方において、κＬ鎖遺伝子座はλＬ鎖遺伝子座よりも前に再構成する傾向がある。機能性のＬ鎖が産生されるまでこのＶＪ再構成が一度に１つのＬ鎖対立遺伝子で起こり、その後、ここでＬ鎖ポリペプチドがＨ鎖ホモ二量体と会合することができるようになる。プレＢＣＲのアセンブリの場合と同様に、各々Ｌ鎖と対合するホモ二量体Ｈ鎖からなる機能性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のみが、形質膜に輸送され、更なるＢ細胞発生に必要なシグナルを媒介することができる。細胞表面ＢＣＲシグナルはまた、ＲＡＧ発現も事実上オフにし、それ以上のＬ鎖再構成を阻止する。このように、Ｈ鎖及びＬ鎖の両方の遺伝子座において、対立遺伝子排除の媒介には形質膜上での重鎖発現が必要である。
【０００７】
Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子座における対立遺伝子排除が理由で、各Ｂリンパ球は単一特異性抗体の産生能しか有しない。しかしながら、治療上、１つの抗体分子につき２つの異なる抗原結合部位を有する人工的に操作された抗体が、幾つもの疾患の治療として有効であることが分かっている。かかる二重特異性抗体の生成は、典型的には、目的とする２つの異なる抗原の各々に対する単一特異性抗体のスクリーニング、同定、及び単離に別々に時間をかけて労力を費やすことを伴う。続いて、二重特異性抗体の片方としての操作される各候補モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子がクローニングされ、Ｈ鎖間又はＨ鎖とＬ鎖との間のヘテロタイプの会合が可能となるように改変される。更なる評価用の二重特異性抗体を得るためには、それらの２つの元のモノクローナル抗体由来の改変Ｈ鎖及び／又はＬ鎖遺伝子を細胞株にトランスフェクトしなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】キタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ）及びラジェウスキ（Ｒａｊｅｗｓｋｙ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５６巻、ｐ．１５４〜１５６、１９９２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、特に薬剤開発の初期段階における、二重特異性抗体のより効率的な産生方法が、未だ満たされていない重要なニーズとなっている。本明細書によって提供される方法及び組成物は、この重要なニーズに応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本概要は、以下で詳細な説明に更に記載する概念の幾つかを簡易な形で紹介するために提供される。本概要は、特許請求される主題の重要な又は本質的な特徴を特定することを意図するものでなく、また特許請求される主題の範囲を限定するために用いられることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点が、附属の図面に例示され且つ添付の特許請求の範囲に定義される態様を含め、以下の詳細な説明の記載から明らかであろう。
【００１１】
本明細書は、二重特異性抗体の単離方法について記載する。本明細書はまた、そのゲノムに改変された免疫グロブリン対立遺伝子又は他のトランス遺伝子を担持するトランスジェニック哺乳類を含めたトランスジェニック動物についても記載する。対立遺伝子の改変は、ＶＤＪ及び／又はＶＪ再構成後の対立遺伝子排除の正常な機構を妨げる。これらの遺伝子改変動物のＢ細胞は、２つ以上の抗原結合特異性を有する抗体を産生する能力を獲得する。対立遺伝子排除を抑制して免疫宿主からの二重特異性抗体の産生を促進することが、本発明の新規態様である。
【００１２】
一部の例示的実施形態において、本発明は、正常な対立遺伝子排除過程に作用するように免疫グロブリン対立遺伝子に改変を導入して、インフレームＶ（Ｄ）Ｊ再構成が続く他方の免疫グロブリン対立遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊ再構成を阻止しないようにするものである。Ｂ細胞発生中に対立遺伝子排除を媒介するシグナルに干渉することにより、本明細書に記載される発明は、そのＢ細胞が細胞１つにつき２つ以上の機能性ＶＨドメイン及び／又は２つ以上の機能性ＶＬドメインの発現能を有するように動物のゲノム内容を改変するための方法及び組成物を提供する。
【００１３】
この実施形態の例示的な一態様では、重鎖対立遺伝子排除を抑制するように２つのＨ鎖対立遺伝子の各々に導入された変異によってプレＢＣＲシグナル伝達が損なわれる。これらの変異はまた、ホモ二量体重鎖形成に不利に働くが、２つの変異重鎖間のヘテロ二量体化には適合するようにも選択される。結果として、２つの変異重鎖対立遺伝子のうちのいずれか一方から単独で発現する重鎖ポリペプチドは、ＥＲにおいて誤って折り畳まれ、従って形質膜に輸送されて対立遺伝子排除及び更なるＢ細胞発生のシグナルを媒介することはできないものと思われる。このように、プレＢＣＲアセンブリの成功は、両方の変異重鎖対立遺伝子が共発現して相補的なヘテロ二量体を形成するときに限り起こる。重鎖遺伝子座の定常領域もまた、アイソタイプスイッチングの程度が制限されるように改変され得る。個々のＢ細胞は、一種類の軽鎖のみと対合する２つの異なる重鎖を発現するものと思われるが、宿主のＢ細胞プールにおいては重鎖及び軽鎖の両方のレパートリーが極めて広範であるものと思われる。
【００１４】
この実施形態の別のバージョンにおいて、重鎖及び／又は軽鎖対立遺伝子の定常領域は、一方の対立遺伝子上のインフレームＶＤＪ又はＶＪ再構成が対立遺伝子排除に関して無能力になるが、後のＢ細胞発生段階での発現のために確保しておかれるように改変される。一つの具体的な例では、重鎖遺伝子座における一方の対立遺伝子のＪ遺伝子の下流に、生産的にアセンブルされたＶＤＪエクソンからの完全長重鎖の発現を阻止するＤＮＡカセットが挿入される。かかるＤＮＡカセットは、以下のエレメント：スプライスアクセプター、リボソームスキップ配列又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化シグナル配列、又は終止コドンのうちの１つ以上を含み得る。従って、この対立遺伝子からのインフレームＶＤＪエクソンは対立遺伝子排除を媒介せず、又は更なるＢ細胞発生を支持しない。しかしながら、第２の対立遺伝子上でインフレームＶＤＪ遺伝子再構成が起こる場合、Ｂ細胞はなおも正常に発生することができる。続くサイレンシングされた重鎖対立遺伝子の再活性化のため、挿入されたＤＮＡカセットに隣接するようにＣｒｅなどの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列が導入されてもよい。部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼが発現すると、ここでＤＮＡカセットは切り出されるか又は逆位になり、それまでサイレンシングされていたＶＤＪエクソンがスプライシングされて下流の他のＣＨエクソンにつながることができ、完全長重鎖発現が可能となる。或いは、ＤＮＡカセットは、それが通常のアイソタイプスイッチング機構によって重鎖遺伝子座から切り出され得るような位置に挿入されてもよい。両方の重鎖対立遺伝子の下流定常領域が、アイソタイプスイッチングの程度を制限するように更に改変されてもよく、両方の重鎖が共発現するときヘテロ二量体化に有利に働くか、又は一度に一方の重鎖のみの発現を許容するようにし得る。
【００１５】
代替的実施形態では、この直前に記載したものと類似した戦略を実施してκ又はλ軽鎖遺伝子座における対立遺伝子排除を無能力にしてもよく、ここで個々のＢ細胞から産生される二重特異性抗体は、２つの異なる軽鎖と対合した重鎖ホモ二量体又はヘテロ二量体からなる。
【００１６】
別の代替的実施形態では、重鎖対立遺伝子包含（ａｌｌｅｌｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）と類似した戦略を用いて、重鎖のみからなる二重特異性抗体が産生される。実施形態のこのバージョンでは、第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）をコードするエクソンが各対立遺伝子から取り除かれる。両方の重鎖対立遺伝子に、それらが発現するタンパク質が互いのヘテロ二量体化に有利に働き、且つ自己二量体化への適合性が低下するような更なる遺伝子改変が導入されてもよい。或いは、これらの重鎖対立遺伝子に、二重特異性重鎖単独抗体を産生するためＣＨ１がない重鎖対立遺伝子を前出の実施形態に記載されるとおり誘導可能な方法で連続的に発現させるような改変が導入されてもよい。
【００１７】
更に別の代替的実施形態では、対立遺伝子排除に必要な１つ以上のシグナル伝達分子が欠損した動物のＢ細胞による二重特異性抗体産生を可能にするため、免疫グロブリン対立遺伝子が改変される。
【００１８】
二重特異性抗体形成の助けとなる免疫グロブリン対立遺伝子に導入される特定の改変は、対立遺伝子排除に対しては最小限の効果しか及ぼさない。例えば、周知の「ノブ・イントゥ・ホール」変異と類似した改変を含有する重鎖は、容易にヘテロ二量体を形成する；しかしながら、この導入された改変は、各改変重鎖が単独で発現する場合にはホモ二量体形成を完全には抑制しない。一度に１つの免疫グロブリン対立遺伝子のみが再構成するため、最初に再構成された対立遺伝子から発現する重鎖ホモ二量体は対立遺伝子排除の能力を保持し得る。本方法は、プレＢＣＲ又はＢＣＲの１つ以上のシグナル伝達成分の欠損によって対立遺伝子排除が損なわれている動物又は細胞のコンテクストにおいてかかる免疫グロブリン対立遺伝子改変を実施し、この改変それ自体は対立遺伝子排除に最小限の影響しか及ぼさない。
【００１９】
従って、一部の実施形態においては、細胞１つにつき２つ以上の異なる抗原受容体及び／又は二重特異性抗原受容体を共発現する能力を各々が有するＢリンパ球の選択を可能にする、免疫グロブリン重鎖遺伝子対立遺伝子排除が障害された遺伝子改変動物が提供される。
【００２０】
一部の態様において、遺伝子改変動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子の１つ以上の定常領域コード部分の範囲内にあるエクソンが、発生中のＢリンパ球においてＶ（Ｄ）Ｊ再構成後に対立遺伝子排除が起こらないように変化している。一部の態様において、遺伝子改変動物における免疫グロブリン重鎖遺伝子の変化が、免疫グロブリン重鎖遺伝子の１つ以上の定常領域コード部分における１つ以上のエクソンの発現を誘導可能に不活性化及び／又は活性化することを可能にし；遺伝子改変動物の１つ以上の定常領域エクソンの一部又は全てが、同じ免疫グロブリン重鎖遺伝子における再構成したＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントと逆のリーディングフレーム方向に配置され；及び一部の態様において、遺伝子改変動物に、同じ染色体上の再構成したＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントからの定常領域エクソンの発現を阻止するＤＮＡカセットが挿入される。
【００２１】
一部の態様は、２つの異なる抗原を同時に注入したとき、又は１つの抗原を注入し、続いて第２の異なる抗原を注入したとき、２つ以上の異なる抗原受容体及び／又は二重特異性抗原受容体を共発現するか又は連続的に発現する能力を各々が有するＢリンパ球を生成する遺伝子改変動物を提供する。一部の態様では、Ｂリンパ球における２つの抗原受容体のヘテロ二量体化が発生又は分化イベントによって可能になるか、又はそれを誘導することができる。
【００２２】
他の態様は、動物の個々のＢ細胞における２つの再構成した免疫グロブリン重鎖遺伝子が互いに効率的にホモ二量体化しない遺伝子産物を発現する遺伝子改変動物を提供し；及び一部の態様では、２つの異なる重鎖遺伝子産物のホモ二量体化は起こらないか、又はヘテロ二量体化と比べて不利である。
【００２３】
更に他の実施形態は、細胞１つにつき２つ以上の異なる抗原受容体及び／又は二重特異性抗原受容体を共発現する能力を各々が有するＢリンパ球の選択を可能にする、免疫グロブリン軽鎖遺伝子対立遺伝子排除が障害された遺伝子改変動物を提供する。一部の態様では、動物の１つ以上の免疫グロブリン軽鎖遺伝子の範囲内にある定常領域コードエクソンが、発生中のＢリンパ球においてＶＪ再構成後に対立遺伝子排除が起こらないように変化している；及び他の態様において、遺伝子改変動物の１つ以上の免疫グロブリン軽鎖遺伝子の変化が、免疫グロブリン重鎖遺伝子の定常領域コード部分の発現を誘導可能に不活性化及び／又は活性化することを可能にする。
【００２４】
他の実施形態は、１つ以上の定常領域エクソンの一部又は全てが、同じ免疫グロブリン軽鎖遺伝子における再構成したＶＪ遺伝子セグメントと逆のリーディングフレーム方向に配置されている遺伝子改変動物における免疫グロブリン軽鎖遺伝子；同じ染色体上の再構成したＶＪ遺伝子セグメントからの定常領域エクソンの発現を阻止するＤＮＡカセットが挿入されている遺伝子改変動物における免疫グロブリン軽鎖遺伝子；及び定常領域エクソンが、同じＢ細胞における両方でなく片方の重鎖対立遺伝子との会合に適合するように改変される遺伝子改変動物における免疫グロブリン軽鎖遺伝子を提供する。
【００２５】
他の実施形態は、遺伝子改変動物に由来する初代Ｂ細胞、不死化Ｂ細胞、又はハイブリドーマを提供する。
更に他の実施形態は、免疫グロブリン重鎖遺伝子の変化が、重鎖のみからなる二重特異性抗体の産生を可能にする遺伝子改変動物を提供する。
【００２６】
他の実施形態は、遺伝子改変動物の操作された部分からの免疫グロブリン重鎖遺伝子から転写された部分的又は全体的な免疫グロブリンタンパク質；及び遺伝子改変動物の細胞に由来する部分的又は全体的な操作された免疫グロブリンタンパク質を含む。
【００２７】
本発明のこれら及び他の態様、目的及び特徴を以下に更に詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＶＤＪ組換え前の可変遺伝子セグメントを特徴とする重鎖遺伝子座における２つの典型的な対立遺伝子を示す図。
【図２】２つの重鎖対立遺伝子の同時発現による二重特異性抗体産生を可能にする重鎖対立遺伝子に対する改変を示す図。
【図３】種々の抗体クラスを発現するエクソンを特徴とする重鎖遺伝子座の定常領域ローカル（ｌｏｃａｌｅ）を示す図。
【図４】連続重鎖発現による二重特異性抗体産生のための重鎖対立遺伝子に対する改変を示す図。
【図５】連続重鎖発現による二重特異性抗体産生のための重鎖対立遺伝子に対する代替的改変を示す図。
【図６】誘導性の二重特異性抗体産生のための重鎖対立遺伝子に対する改変を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書において使用する用語は、当業者が理解するとおりの平易な通常の意味を有することが意図される。以下の定義は、読者が本発明を理解するのを助けることを意図しており、具体的に指示されない限り、かかる用語の意味を変えたり、又は他の形で限定したりしようと意図するものではない。
【００３０】
用語「トランス遺伝子」は、本明細書においては、細胞、特に宿主脊椎動物の細胞のゲノムに人工的に挿入されている、又は挿入されようとしている遺伝物質を記載するために用いられる。
【００３１】
「トランスジェニック動物」とは、その細胞の一部に染色体要素又は染色体外要素として存在するか、又はその生殖細胞系列ＤＮＡに（即ちその細胞のほとんど又は全てのゲノム配列に）安定に組み込まれた外来性核酸配列を有する非ヒト動物、通常は哺乳類、例えば他の哺乳類も想定されるがげっ歯類、特にマウス又はラットが意味される。
【００３２】
「ベクター」には、自己複製性であるか否かに関わらず、細胞の形質転換、形質導入又はトランスフェクションに使用することのできるプラスミド及びウイルス及び任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。
【００３３】
「細胞表面」は、細胞の形質膜、即ち、細胞外間隙に最も直接的に露出した、且つ細胞外間隙（細胞間隙を含む）にある細胞及びタンパク質の両方と接触するのに利用可能な細胞の部分を指す。
【００３４】
「二重特異性抗体」は、抗原特異性が互いに異なる２つの物理的に分離可能な抗原結合表面を含むものである。通常の抗体は、構造的に同一の、従って同じ抗原特異性を有する２つの物理的に分離可能な抗原結合表面を有する。二重特異性抗体の好ましいバージョンは、２つの物理的に分離可能な抗原結合表面を備える通常のＩｇＧ抗体分子に似ているが、それらの表面は構造的に同一ではなく互いに異なっている。本発明の文脈においては、これらの表面の両方が同じ重鎖タンパク質からなるが、それらが含む軽鎖タンパク質において表面は互いに異なり得る。或いは、２つの表面が同じ軽鎖タンパク質からなるが、それらが含む重鎖タンパク質において表面は互いに異なり得る。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「生産的再構成」は、インフレームで、且つ可変領域ドメイン翻訳が可能なＶＤＪ又はＶＪ再構成である。重鎖又は軽鎖の可変ドメインは、それが下流の定常領域エクソンとインフレームで発現することができる場合に「機能性」と考えられる。それぞれ生産的ＶＤＪ又はＶＪ再構成から翻訳された重鎖又は軽鎖タンパク質は、それが細胞表面上に発現することができる場合に「機能性」と称される。
【００３６】
本明細書に記載される免疫グロブリン「対立遺伝子」は、可変遺伝子セグメント、イントロンエンハンサー、定常領域遺伝子、及び内因性又は外因性供給源の他の配列を含み得る重鎖又は軽鎖遺伝子座における染色体セグメントを指す。
【００３７】
「対立遺伝子排除」は、げっ歯類又はヒトなどの脊椎動物種におけるＢ細胞の大部分が、２つの相同常染色体のうちの一方のみに生産的に再構成された重鎖遺伝子を担持するという事実を指す。同様に、軽鎖遺伝子座における対立遺伝子排除も類似のシナリオを指し得る。より一般的な意味では、対立遺伝子排除は、任意の重鎖又は軽鎖遺伝子座における生産的Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成が、それぞれ他の重鎖又は軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの更なる再構成を阻害するときはいつでも、それらの染色体位置がどこであろうと適用される。例えば、２組以上の重鎖ＶＤＪ連鎖群が同じ染色体に挿入される場合、それらの重鎖連鎖群の１つにおける生産的再構成が、他の重鎖連鎖群のいずれかにおける更なるＶ（Ｄ）Ｊ再構成も阻止する。同じ原理が軽鎖連鎖群にも適用される。原則的に、この種の「対立遺伝子」排除は、従来の対立遺伝子排除と同じ機構によって起こり得る。
【００３８】
「対立遺伝子包含（ａｌｌｅｌｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）」は、対立遺伝子排除の喪失、従ってＢ細胞が２つ以上の機能性重鎖可変ドメイン及び／又は２つ以上の機能性軽鎖可変ドメインを産生する能力を指す。
【００３９】
ゲノム「ローカル（ｌｏｃａｌｅ）」は、ゲノム、好ましくは遺伝子のうち、１つの特定の機能面と関連付けられる任意の領域である。この用語ローカルは、ここでは免疫グロブリン遺伝子座の一部分を指して用いられる。例えば、それは、Ｖ遺伝子セグメントローカル、又はＤ遺伝子セグメントローカル、又はＪ遺伝子セグメントローカル、又はより広義には、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全てを含む可変ローカルなど、一種の遺伝子セグメントを主として含有する免疫グロブリン遺伝子座の一部分を指すことができる。定常領域ローカルは、定常領域エクソンを含有する免疫グロブリン遺伝子座の一部分である。
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される技法の実施は、特に指示されない限り、当業者の技能の範囲内にある有機化学、高分子技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及びシーケンシング技術の従来技術及び説明を用い得る。かかる従来技術には、ポリヌクレオチドのポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション及びライゲーション、並びに標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が含まれる。好適な技法の具体的な例示は、本明細書の例を参照することによって入手し得る。しかしながら、他の均等な従来手順もまた、当然ながら用いることができる。かかる従来技術及び説明については、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編、１９９９年、「ゲノム解析：実験マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）」（第Ｉ〜ＩＶ巻）；ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）、スティーブンズ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）編、２００７年、「遺伝的変異：実験マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）、ドベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）編、２００３年、「ＰＣＲプライマー：実験マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；ボウテル（Ｂｏｗｔｅｌｌ）及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、２００３年、「分子クローニングからの簡約プロトコル：実験マニュアル（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、２００２年、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（全てコールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）発行）；ストライヤー、Ｌ．（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．）著、１９９５年、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（第４版）Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク州ニューヨーク；レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）著、「生化学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第３版、Ｗ．Ｈ．フリーマン出版社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．）、ニューヨーク州ニューヨーク；及びバーグ（Ｂｅｒｇ）ら著、２００２年、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第５版、Ｗ．Ｈ．フリーマン出版社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．）、ニューヨーク州ニューヨーク；ナジ（Ｎａｇｙ）ら編、２００３年、「マウス胚の操作：実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（第３版）コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（これらは全て、本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される）などの標準的な実験マニュアルを参照することができる。
【００４１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれることに留意されたい。従って、例えば「免疫グロブリン（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」と言うとき、それは１つ以上のかかる免疫グロブリンを指し、及び「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」と言うとき、それは均等なステップ及び当業者に公知の方法を指すなどとなる。
【００４２】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及される全ての刊行物は、ここに説明する発明との関連において用いられ得る装置、配合及び方法論を説明及び開示する目的から参照によって援用される。
【００４３】
値の範囲が提供される場合、当該範囲の上限と下限との間にある各中間値、及び当該の記載される範囲における任意の他の記載される値又は中間値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、その記載される範囲における任意の具体的に除外される限界値を条件として、独立にそのより小さい範囲に含まれ得る。提示される範囲が一方又は両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００４４】
以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するため数多くの具体的な詳細が示される。しかしながら、当業者には、これらの具体的な詳細の１つ以上がなくても本発明を実施し得ることは明らかであろう。他の場合には、本発明が不明瞭になることを避けるため、周知の特徴及び当業者に周知の手順は説明していない。
【００４５】
（発明の概要）
本発明は、動物から二重特異性抗体を迅速に単離するための方法及び組成物を提供する。免疫系に存在するＢリンパ球は、通常、対立遺伝子排除と呼ばれる過程により、１つの機能性重鎖及び１つの機能性軽鎖より多くを発現することができない。本発明の特定の実施形態は、発生中のＢ細胞における免疫グロブリン遺伝子座の１つ以上における対立遺伝子排除が無能力になるような動物のゲノム内容に対する改変を提供する。本明細書に記載される方法は、細胞１つにつき２つ以上の機能性ＶＨドメイン及び／又は２つ以上の機能性ＶＬドメインを発現する能力をＢ細胞に付与する。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明は、正常な対立遺伝子排除過程に作用するように免疫グロブリン対立遺伝子に改変を実施して、一方の対立遺伝子のインフレームＶ（Ｄ）Ｊ再構成が他方の対立遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊ再構成を阻害しないようにするものである。特定の実施形態はまた、トランスジェニック動物から二重特異性抗体を単離する２つの一般的な戦略も実施する。第１の戦略は、２つ以上の目的の抗原による同時免疫レジメンを伴う。第２の戦略は、異なる目的の抗原による連続免疫を伴う。
【００４７】
重鎖及び軽鎖の両方とも再構成後の対立遺伝子排除には細胞表面への重鎖の輸送が必要である。好ましい実施形態において、本発明は、新しく合成された重鎖ポリペプチドが誤って折り畳まれた場合、ＥＲに保持されて対立遺伝子排除を媒介する能力を欠く可能性を利用する。適切なタンパク質の折り畳みの達成には、重鎖のＶＤＪ組換え後−代替軽鎖複合体との必要なＶＨドメイン対合に加えて−重鎖ポリペプチドの二量体化が必要である。ＩｇＭ及びＩｇＥを除く全てのアイソタイプに関して、重鎖ホモ二量体化は２つのＣＨ３ドメイン間の対称なタンパク質相互作用によって開始される。ＩｇＭ及びＩｇＥ重鎖は、そのＣＨ４ドメイン間のタンパク質相互作用によってホモ二量体化を開始する。
【００４８】
この実施形態の一態様において、重鎖対立遺伝子はアイソタイプスイッチングの程度を制限するように改変され、両方の対立遺伝子上のＣＨ３又はＣＨ４二量体化ドメインをコードするエクソンが、ホモ二量体化への適合性は低いが互いに相補的であるためヘテロ二量体化するように改変される。いずれかの対立遺伝子上のインフレームＶＤＪ再構成から単独で発現する重鎖ポリペプチドは正しいタンパク質の折り畳みを不十分にしか達成せず、従って細胞表面に輸送されて対立遺伝子排除を媒介することができない。
【００４９】
ＶＨ−ＶＬ対合に加え、軽鎖対立遺伝子排除には、誤って折り畳まれ易い重鎖ＣＨ１ドメインの正しいタンパク質の折り畳みが必要である（例えば、ファイギ（Ｆｅｉｇｅ）ら著、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、第３４巻、ｐ．５６９〜５７９、２００９年を参照のこと）。正しいタンパク質の折り畳みを達成するには、各重鎖ＣＨ１ドメインが軽鎖の定常領域（Ｃκ又はＣλ）と会合しなければならない。本発明の方法の拡張した態様では、両方の重鎖対立遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするエクソン並びに軽鎖定常領域ドメインのエクソンに対する遺伝子改変が実施され、各軽鎖が、両方でなく、一方の対立遺伝子のみから発現する重鎖と会合することができるようにされる。
【００５０】
前述のＣＨ１改変を伴う又は伴わない、前述のＣＨ３改変を有するトランスジェニックマウスが、２つの目的の抗原で同時に免疫される。繰り返し免疫を用いると、両方の抗原を認識するＢ細胞のクローン性増殖を最大化し得る。免疫レジメンの完了後、標準的なハイブリドーマ又は他の技法を用いて、両方の目的の抗原に対する二重特異性抗体を産生するＢ細胞が単離される。
【００５１】
この実施形態の別のバージョンでは、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物が両方の染色体上に操作されたバージョンの重鎖対立遺伝子を担持しており、ここで改変は重鎖分子の定常ドメインを発現する重鎖ローカルに導入される。操作された対立遺伝子の両方が、Ｂ細胞発生中にＶＤＪ再構成を起こして重鎖多様性を作り出す能力を有する。操作された対立遺伝子の一方はまた、プレＢＣＲシグナルを生成することのできる完全長膜貫通重鎖タンパク質の発現能も有する。他方の操作された対立遺伝子は、この点で無能にされている。
【００５２】
この実施形態の一態様において、２つの操作された対立遺伝子は、Ｃｒｅ又はＦｌｐなどの１つ以上の部位特異的リコンビナーゼの認識配列（野生型又は変異型）を担持している。これらの認識部位は、部位特異的組換えがその遺伝子座の定常ドメインコード部分の機能性を変化させるような形で配置される。即ち、対立遺伝子が完全に機能性の重鎖タンパク質の発現能を有する場合、部位特異的組換えによって遺伝子座からこの特性が失われる。同様に、対立遺伝子が完全に機能性の重鎖タンパク質の発現能を有しない場合、部位特異的組換えによって機能性重鎖の発現能力が遺伝子座に付与される。
【００５３】
この直前に要約した部位特異的リコンビナーゼが媒介する変化は、２つの相同染色体上にある重鎖遺伝子座の定常ドメインコード部分におけるＤＮＡ断片を欠失させるか又は逆位にすることにより達成される。本発明の特定の実施形態において、一方の染色体上の定常ドメインの完全な機能性の部位特異的リコンビナーゼ依存性の喪失は、同期した、又はほぼ同期した他方の染色体上の完全な機能性の獲得によって達成される。有利な態様では、この部位特異的リコンビナーゼの発現は、Ｃγ１又はＡｉｃｄａ（活性化誘導性デアミナーゼ）など、Ｂ細胞活性化の間に誘導される遺伝子由来のプロモーターの制御下にある。
【００５４】
この直前に説明したトランスジェニックマウスは、抗原に特異的な抗体分子を発現するＢ細胞のクローン性増殖を可能にする抗原で免疫される。それらが担持している重鎖遺伝子改変に起因して、この抗原に特異的な抗体は、２つの重鎖対立遺伝子のうちの一方のみの再構成されたバージョン、即ち、その定常ドメインコード部分における完全な機能性によって定義される対立遺伝子によってコードされる重鎖を含む。他方の対立遺伝子はかかる機能性を欠いており、そのため抗原特異的クローン性増殖に必要なシグナル伝達過程に関与する能力を有する重鎖をコードしない。繰り返し免疫を用いると、クローン性増殖及び抗原特異的抗体多様性を最大化し得る。
【００５５】
免疫レジメンの完了後、部位特異的組換えを誘導すると、一方の染色体から他方の染色体への重鎖定常ドメイン機能性のスイッチが生じる。このスイッチの結果として、免疫に使用した抗原に特異的な抗体の重鎖をコードする対立遺伝子から定常ドメインの完全な機能性が失われる。同時又はその近くで、定常ドメインの完全な機能性が既に失われている対立遺伝子が、ここでこの機能性を獲得する。この機能性のスイッチを通じて、免疫レジメンに使用した抗原に応答したクローン性増殖に関与する細胞が新規重鎖タンパク質の発現を獲得する。
【００５６】
この直前に説明した誘導性部位特異的リコンビナーゼ依存性スイッチの後、マウスが第２の抗原で免疫される。第２の抗原に応答したクローン性増殖は、第２の対立遺伝子によってコードされる重鎖を含む抗体；即ち、誘導性部位特異的リコンビナーゼイベントに起因して定常ドメインの機能性を獲得するものに依存する。最初の場合と同様に、第２の免疫を繰り返してクローン性増殖及び抗原特異的抗体多様性を最大化し得る。
【００５７】
第２の抗原に特異的な抗体を発現するクローン性増殖細胞には、以前第１の抗原に応答したクローン性増殖に関与したものが含まれる。第２のクローン性増殖中、これらの細胞は、第１の抗原に特異性を有する重鎖タンパク質を発現せず、代わりに第２の対立遺伝子から異なる重鎖タンパク質を発現する。それらが発現する、第２の抗原に対する特異性に寄与する重鎖タンパク質は、誘導性部位特異的組換えイベントの結果として定常ドメインの完全な機能性を獲得した重鎖対立遺伝子によってコードされる。
【００５８】
第２の免疫レジメンの完了後、ハイブリドーマ又は他の技法を用いて、第１及び第２の抗原の両方に特異的なＢ細胞が単離される。第２の部位特異的リコンビナーゼイベントを誘導して、第１の抗原に対する抗原特異性を有する対立遺伝子に完全な機能性を回復してもよい。例えば、第２の部位特異的リコンビナーゼの発現は、タモキシフェン又はドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｌｉｎｅ）によって誘導可能なものなど、誘導可能なシステムの制御下にあってもよい。この改変により、一方が第１の免疫レジメンで使用される抗原に特異的で、他方が第２の免疫レジメンで使用される抗原に特異的な、２つの異なる抗体分子を発現する細胞の能力を評価し得る。
【００５９】
第２の部位特異的組換え後、ここでヘテロ二量体の相補的な半分であるタンパク質又はタンパク質ドメイン（ヘテロダイマライザーと呼ばれる）と共に各重鎖対立遺伝子上のアセンブルされたＶＤＪエクソンが発現する。有利な態様では、ヘテロダイマライザーは変異ＩｇＧ１対立遺伝子であり、ここでは両方の対立遺伝子のＣＨ３ドメインをコードする４番目のエクソンが、互いのヘテロ二量体化を促進してホモ二量体化を抑制するように変異している。或いは、ヘテロダイマライザー対は、ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎ（これらは生理学的にヘテロ二量体化してＡＰ−１転写因子を形成する）、ロイシンジッパー、又はヘテロ二量体を形成する同様のタンパク質など、非免疫グロブリン（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｌｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）タンパク質であってもよい。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、対立遺伝子排除が重鎖遺伝子座で障害されるのでなく、むしろ代わりにそれが軽鎖遺伝子座で障害される。本発明のこのバージョンでは、重鎖対立遺伝子排除は正常である。本発明の軽鎖対立遺伝子包含のバージョンは、概念上重鎖対立遺伝子包含のバージョンと同様であり、関連性のある相同軽鎖遺伝子の定常ドメインコード部分における類似の改変を特徴とする。これは、適切に段階分けされた誘導可能な部位特異的組換えステップと組み合わせた同様の二重免疫スキームを用いて利用される。本発明の重鎖対立遺伝子包含のバージョンに関して説明したのと同じように二重特異性Ｂ細胞が同定及び／又は単離される。本発明のこの軽鎖対立遺伝子包含のバージョンによれば、２つの軽鎖タンパク質及び１つの重鎖タンパク質を各々が含む二重特異性抗体が得られ、一方、重鎖対立遺伝子包含のバージョンによれば、１つの軽鎖タンパク質及び２つの重鎖を各々が含む二重特異性抗体が得られる。
【００６１】
代替的実施形態では、この直前に重鎖対立遺伝子包含について説明したものと類似した戦略を実施して、重鎖のみからなる二重特異性抗体を産生するＢ細胞が生成される。この実施形態では、両方の重鎖対立遺伝子から、ＣＨ１ドメインをコードするエクソンが取り除かれる。各重鎖対立遺伝子から発現するＣＨ１がないポリペプチドは、正しいタンパク質の折り畳み並びに細胞表面への輸送に関して軽鎖又は代替軽鎖の存在への依存を例えあったとしても僅かしか呈しないはずである（例えば、ファイギ（Ｆｅｉｇｅ）ら著、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、第３４巻、ｐ．５６９〜５７９、２００９年を参照のこと）。両方の重鎖対立遺伝子の可変遺伝子セグメントが、ラクダ科動物など、一本鎖抗体を天然で発現する動物に由来してもよく、又は軽鎖なしで発現したときのＶＨドメインの熱安定性を改善する改変を有する又は有しない他の動物に由来してもよい。
【００６２】
この実施形態の一つのバージョンでは、重鎖対立遺伝子が、アイソタイプスイッチングの程度を制限するように更に改変され、両方の対立遺伝子上のＣＨ３又はＣＨ４二量体化ドメインをコードするエクソンが、ホモ二量体化への適合性は低いが互いに相補的であるためヘテロ二量体化するように変異している。いずれかの変異対立遺伝子から単独で発現するＣＨ１がない重鎖ポリペプチドは、変異が効率的な重鎖ホモ二量体化を抑制するため、細胞表面に輸送されて対立遺伝子排除を媒介することはないはずである。従って、Ｂ細胞発生の成功は、両方の変異重鎖対立遺伝子からのＣＨ１がない重鎖の同時発現に依存する。
【００６３】
前述のＣＨ１ドメインコードエクソンが欠損した、且つ前述のＣＨ３改変を有するトランスジェニックマウスは、２つの目的の抗原で同時に免疫される。繰り返し免疫を用いると、両方の抗原を認識するＢ細胞のクローン性増殖を最大化し得る。免疫レジメンの完了後、標準的なハイブリドーマ又は他の技法を用いて、両方の目的の抗原に対する二重特異性抗体を産生するＢ細胞が単離される。
【００６４】
この実施形態の代替的なバージョンでは、ＣＨ１ドメインがない重鎖の対立遺伝子包含が、前出の実施形態において説明した重鎖対立遺伝子包含スキームと類似の誘導可能な方法で各変異重鎖対立遺伝子を連続的に発現させることによって達成される。重鎖対立遺伝子はまた、一方の対立遺伝子上のインフレームＶＤＪ再構成が対立遺伝子排除に関して無能力となり、且つ後のＢ細胞発生段階での発現のため確保しておかれるように改変される。これも同様に、一方の重鎖対立遺伝子のオープンリーディングフレームをＤＮＡカセットによるか又は重鎖定常領域をコードする１つ以上のエクソンの逆位によって分断することにより達成される。各変異重鎖対立遺伝子の発現を変化させるため、部位特異的ＤＮＡ組換えの誘導可能なイベントも同様に導入される。同様のダブル免疫スキームと、続く第２の誘導可能な部位特異的組換えステップを用いると、二重特異性Ｂ細胞が得られる。本発明のこの重鎖対立遺伝子包含のバージョンによれば、各々が軽鎖のない重鎖を２つ含む二重特異性抗体が得られる。
【００６５】
他の代替的実施形態では、Ｂ細胞による二重特異性抗体産生が可能となるように改変される免疫グロブリン対立遺伝子が、対立遺伝子排除に必要な１つ以上のシグナル伝達分子が欠損している動物に組み入れられる。
【００６６】
特定の場合に、本方法は、二重特異性抗体形成の助けとなるが、対立遺伝子排除には最小限の効果しか及ぼさないように設計される改変を免疫グロブリン遺伝子に導入する。具体的な一態様において、周知の「ノブ・イントゥ・ホール」変異と類似した改変を含む重鎖が、重鎖のＣＨ３ドメインをコードするエクソンに導入される（例えば、リッジウェイ（Ｒｉｄｇｗａｙ）ら著、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ）、第９巻、ｐ．６１７〜６２１、１９９６年を参照のこと）。導入された改変は、改変された重鎖の各々が単独で発現する場合にはホモ二量体形成を完全には抑制しない。一度に１つの免疫グロブリン対立遺伝子のみが再構成するため、最初に再構成された対立遺伝子から発現する重鎖ホモ二量体は対立遺伝子排除の能力を保持していることがあり得る。本発明は、プレＢＣＲ又はＢＣＲの１つ以上のシグナル伝達成分の欠損に起因して対立遺伝子排除が損なわれた動物又は細胞にかかる免疫グロブリン対立遺伝子改変を実施するもので、この改変それ自体は対立遺伝子排除に最小限の効果しか及ぼさない。かかる変異体の一例は、Ｅ２Ａが欠損しているマウス系統である（例えば、ハウザー（Ｈａｕｓｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１９２巻、ｐ．２４６０〜２４７０、２０１４年を参照のこと）。
【００６７】
前述のＣＨ３改変及びプレＢＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達成分の欠損を有するトランスジェニックマウスが、２つの目的の抗原で同時に免疫される。繰り返し免疫を用いると、両方の抗原を認識するＢ細胞のクローン性増殖を最大化し得る。免疫レジメンの完了後、標準的なハイブリドーマ又は他の技法を用いて、両方の目的の抗原に対する二重特異性抗体を産生するＢ細胞が単離される。
【００６８】
図１は、ヒト及びほとんどの脊椎動物に典型的に見られる２つの重鎖対立遺伝子（１０１及び１０２）を示す。各重鎖対立遺伝子が、ＩｇＭの定常領域をコードするＣμエクソン（１０８）の上流にある複数のＶ（１０３）、Ｄ（１０４）、及びＪ（１０５）遺伝子からなる。各染色体上には、Ｊ遺伝子と１番目のＣＨエクソンとの間に５’「イントロン」エンハンサー（１０６）及びスイッチ領域（１０７）などの調節エレメントもまた存在する。好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスのＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは、ヒトコード領域とマウス非コード領域とからなるキメラである。図中の表示される成分は以下のとおりである：重鎖遺伝子座の染色体セグメント（１０１、１０２）；可変領域遺伝子セグメント（１０３）；Ｄ領域遺伝子セグメント（１０４）；Ｊ領域遺伝子セグメント（１０５）；重鎖「イントロン」エンハンサー（１０６）；スイッチ領域（１０７）；ＩｇＭの定常領域をコードするＣμエクソン（１０８）。
【００６９】
図２は、Ｂ細胞を対立遺伝子包含が可能なものにするため本発明が両方の重鎖対立遺伝子（２０１、２０２）に実施する改変の例を示す。生殖細胞系列構成下では、各重鎖対立遺伝子が、再構成されていないＶ（２０３）、Ｄ（２０４）、及びＪ（２０５）遺伝子と、それに続くＩｇＧアイソタイプをコードする改変Ｃγエクソン（２０８及び２０９）からなる。好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスのＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは、ヒトコード領域とマウス非コード領域とからなるキメラである。Ｂ細胞発生時、ランダムに選択されたＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子がアセンブルして（２１０）、ＶＨエクソン（２１１、２１２）を形成する。各重鎖対立遺伝子のＣＨ３エクソン内の特定のコドンは、コードされる重鎖が互いとのヘテロ二量体化に適合するように変異している（変異Ｃγ１など、これらの２つの重鎖対立遺伝子のそのｃＤＮＡ配列は［配列番号１及び２］として特定される）。加えて、この改変により、いずれかの対立遺伝子が単独で発現した場合に翻訳された重鎖ポリペプチドに誤った折り畳みが生じる。結果的に、両方の対立遺伝子の同時発現により変異重鎖ポリペプチドがヘテロ二量体を形成しない限り、プレＢＣＲは形成されず、形質膜に輸送されて対立遺伝子排除を媒介することができない。この実施形態の拡張したバージョンでは、前述のＣＨ３変異と組み合わせて、両方の重鎖対立遺伝子のＣＨ１エクソン内の特定のコドンが同様に、各重鎖が異なる軽鎖と対合し得るように改変される。この図は変異ＩｇＧ重鎖を使用した対立遺伝子排除の抑制並びに重鎖ヘテロ二量体化の促進を例示するが、他のアイソタイプ（即ち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ）も同様に用いられ得る。図中の表示される成分は以下のとおりである：改変重鎖対立遺伝子の染色体セグメント（２０１、２０２）；可変領域遺伝子セグメント（２０３）；Ｄ領域遺伝子セグメント（２０４）；Ｊ領域遺伝子セグメント（２０５）；重鎖「イントロン」エンハンサー（２０６）；スイッチ領域（２０７）；ＩｇＧの変異定常領域をコードするＣγエクソン（２０８、２０９）；ＶＤＪ組換えイベント（２１０）；アセンブルされたＶＤＪエクソン（２１１、２１２）。
【００７０】
図３は、げっ歯類に見られる２つの相同染色体上の重鎖遺伝子を示す（典型的なヒト重鎖遺伝子座も非常に類似しているが、より多くの定常領域遺伝子を有する）。この図では、染色体の定常領域ローカルの構造を強調するため、両方の重鎖対立遺伝子（３０１、３０２）のＶ（３０３）及びＤ（３０４）遺伝子を図１と比較して圧縮している（「ｎ」で示される）。好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスのＶ（３０３）、Ｄ（３０４）、及びＪ（３０５）遺伝子セグメントは、ヒトコード領域とマウス非コード領域とからなるキメラである。ＩｇＭ及びＩｇＤ（３０８、個々のＣＨエクソンは図示せず）は、Ｂ細胞が発現する最初のアイソタイプである。他の抗体クラスをコードするＣＨエクソン（３０９〜３１４、個々のエクソンは図示せず）が更に下流に存在する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統では、これらは、Ｃγ３（３０９）、Ｃγ１（３１０）、Ｃγ２ｂ（３１１）、Ｃγ２ｃ（３１２）、Ｃε（３１３）、及びＣα（３１４）である。ＢＡＬＢ／ｃなどの特定のマウス系統はＣγ２ｃの代わりにＣγ２ａを有する。Ｃδを除き、各抗体クラスの１番目のＣＨエクソンの前にアイソタイプスイッチ領域（３０７）が存在する。図中の表示される成分は以下のとおりである：重鎖対立遺伝子（３０１、３０２）；括弧内に示されるＶ遺伝子、「ｎ」は複数個の遺伝子セグメントを指す（３０３）；括弧内に示されるＤ遺伝子、「ｎ」は複数個の遺伝子セグメントを指す（３０４）；Ｊ遺伝子（３０５）；重鎖「イントロン」エンハンサー（３０６）；スイッチ領域（３０７）；Ｃμ及びＣδ（３０８、個々のエクソンは図示せず）；ＩｇＧ及び他の抗体クラスのＣＨエクソン（３０９〜３１４、個々のエクソンは図示せず）。
【００７１】
図４には、天然のＢ細胞に見られるであろうとおりの、ＶＤＪ再構成が起こって異なるＶＨエクソン（４０３、４０４）が産生された後の２つの重鎖対立遺伝子（４０１、４０２）を示す。対立遺伝子４０１上では、Ｃμ及び／又はＣδをコードするエクソン（４０６）は再構成したＶＤＪエクソン（４０３）と同じセンス方向（下の矢印）である。対照的に、対立遺伝子４０２上ではＣμ及び／又はＣδエクソン（４１２）はＶＤＪエクソン（４０４）と逆向き（下の矢印）に存在する。従って、対立遺伝子４０２は、そのＣμ及び／又はＣδエクソンがアンチセンス構成であるため完全長重鎖ポリペプチドの発現能を有さず、正常なＢ細胞発生は対立遺伝子４０１からの機能性重鎖の発現に依存する。対立遺伝子４０２における逆位のＣμ及び／又はＣδエクソン（４１２）には、２つの逆向きの部位特異的ＤＮＡ組換え認識配列（４０９、４１０）が直ちに隣接している。対立遺伝子４０１では、これらの２つの部位特異的ＤＮＡ組換え認識配列（４０９、４１０）は、同様に逆向きで、更に離れて：一方（４０９）がＣμ及び／又はＣδエクソン（４０６）の上流に、他方（４１０）がＣγエクソン（４０８）の下流に配置される。免疫原に対するＢ細胞応答の間（４１４）、対立遺伝子４０１はアイソタイプスイッチングを起こし、それにより下流の部位特異的ＤＮＡ組換え配列（４１０）がその上流の対応物（４０９）の近くにくる。部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの発現が誘導されると（４１５）、生じる組換え部位（４１６、４１７）はもはや組換えに関してコンピテントでないため、両方の対立遺伝子上のその認識配列（４０９、４１０）が隣接しているＤＮＡセグメントが不可逆的な逆位を起こす。対立遺伝子４０２はここで完全長重鎖の発現能を有し、一方、対立遺伝子４０１はそのＣＨエクソンの逆位により不活性化される。第２の抗原の免疫後（４１８）、対立遺伝子４０２がアイソタイプスイッチングを起こす。両方の対立遺伝子の逆位可能なＤＮＡセグメントには第２の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列（４１１）が更に隣接し、これらはハイブリドーマ生成前又は生成後に導入することができる。間に介在するＤＮＡ断片の切り出し後、ここで両方の対立遺伝子上のＶＤＪエクソン（４０３、４０４）が、重鎖ヘテロ二量体化に適合するように改変された下流ＣＨエクソン（４１３）と共に発現することになる。図中の表示される成分は以下のとおりである：重鎖対立遺伝子（４０１、４０２）；アセンブルされたＶＤＪエクソン（４０３、４０４）；重鎖「イントロン」エンハンサー（４０５）；初めはアセンブルされたＶＤＪエクソン（４０３）に対してセンス方向（下の矢印）のＣμ及び／又はＣδエクソン（４０６）；スイッチ領域（４０７）；スイッチしたアイソタイプのＣＨエクソン（４０８）；最初の部位特異的リコンビナーゼの認識配列（４０９、この部位の配列は、４１０と表示される部位と逆向きである）；第２の部位特異的リコンビナーゼの認識配列（４１１）；初めはアセンブルされたＶＤＪエクソン（４０４）に対して逆方向（下の矢印）のＣμ及び／又はＣδエクソン（４１２）；重鎖ヘテロ二量体化に適合する改変されたエクソン（４１３）；抗原応答と、それに続くアイソタイプスイッチング（４１４）；最初の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ発現（４１５）；部位特異的ＤＮＡ組換え後の残りのＤＮＡ配列（４１６、４１７）；第２の免疫原に対する抗原応答及びアイソタイプスイッチング（４１８）。
【００７２】
図５は、連続重鎖発現による二重特異性抗体産生のための重鎖対立遺伝子に対する代替的な改変を示す。天然のＢ細胞に見られるであろうとおりの、ＶＤＪ再構成が起こって異なるＶＨエクソン（５０３、５０４）が産生された後の２つの重鎖対立遺伝子（５０１、５０２）が示される。対立遺伝子５０１上には、２つの逆向きの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列（５０９、５１０）が隣接するＤＮＡカセット（５１２）が、Ｊ遺伝子の下流、Ｃμ及び／又はＣδ定常ドメインをコードするエクソン（５０６）の前に挿入されている。ＤＮＡカセット（５１２）は、アセンブルされたＶＤＪエクソン（５０３）と逆方向（下の矢印）であり、以下のうちの１つ以上を含む：スプライスアクセプター、リボソームスキップ配列又はＩＲＥＳ、オープンリーディングフレーム、終止コドン、又はポリアデニル化シグナル配列。同様のＤＮＡカセット（５１４）が対立遺伝子５０２上の類似のローカルにも挿入されるが、これは再構成したＶＤＪエクソン（５０４）と同じセンス方向（下の矢印）である。対立遺伝子５０２は、ＤＮＡカセット（５１４）がＶＤＪエクソン（５０４）に続くそのオープンリーディングフレームを分断するため、完全長重鎖を発現することができない。対照的に、対立遺伝子５０１は、逆位のＤＮＡカセットがそのオープンリーディングフレームを分断しないため、完全長重鎖を発現することができる。両方の対立遺伝子とも、ＩｇＧエクソンの下流に第２のＤＮＡリコンビナーゼの認識部位（５１１）がある。同様に両方の対立遺伝子上で、第１のＤＮＡリコンビナーゼの認識部位（５０９）の上流に第２のＤＮＡリコンビナーゼのための別の部位（５１１）も挿入されている。Ｂ細胞が免疫原に応答するとき（５１５）、対立遺伝子５０１はアイソタイプスイッチングを起こす。第１の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの発現が誘導されると（５１６）、生じる組換え部位（５１７、５１８）はもはや組換えに関してコンピテントでないため、両方の対立遺伝子上のＤＮＡカセット（５１２、５１４）が不可逆的な逆位を起こす。対立遺伝子５０２は、ここでＤＮＡカセット（５１４）が逆方向となり、もはや重鎖オープンリーディングフレームを分断しないため、ここで完全長重鎖の発現能を有するようになる。対照的に、対立遺伝子５０１のオープンリーディングフレームは、そのＶＤＪエクソン（５０３）と同じ方向のＤＮＡカセット（５１２）によって分断される。第２の抗原による免疫後（５１９）、対立遺伝子５０２はアイソタイプスイッチングを起こす。ハイブリドーマ生成前又は生成後に第２の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの発現が誘導されると、間に介在するＤＮＡ断片（５１２、５１４）がここでそのコグネイト認識配列（５１１）において切り出される。続いて、両方の対立遺伝子上のＶＤＪエクソン（５０３、５０４）が、ここで重鎖ヘテロ二量体化のために改変されたＣＨエクソン（５１３）と共に発現する。図中の表示される成分は以下のとおりである：重鎖対立遺伝子（５０１、５０２）；アセンブルされたＶＤＪエクソン（５０３、５０４）；重鎖「イントロン」エンハンサー（５０５）；Ｃμ及び／又はＣδエクソン（５０６）；スイッチ領域（５０７）；���イッチしたアイソタイプのＣＨエクソン（５０８）；最初の部位特異的リコンビナーゼの認識配列（５０９、この部位の配列は５１０と表示される部位と逆方向である）；第２の部位特異的リコンビナーゼの認識配列（５１１）；初めはＶＤＪエクソン（５０３）に対して逆方向（下の矢印）のＤＮＡカセット（５１２）；重鎖ヘテロ二量体化に適合する改変されたエクソン（５１３）；初めはＶＤＪエクソン（５０４）に対してセンス方向（下の矢印）のＤＮＡカセット（５１４）；抗原応答と、それに続くアイソタイプスイッチング（５１５）；第１の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ発現（５１６）；部位特異的ＤＮＡ組換え後の残りのＤＮＡ配列（５１７、５１８）；第２の免疫原に対する抗原応答及びアイソタイプスイッチング（５１９）。
【００７３】
図６は、誘導可能な二重特異性抗体産生のための重鎖対立遺伝子に対する改変を示す。生殖細胞系列の構成では、一方の重鎖対立遺伝子（６０１）が、再構成されていないＶ（６０３）、Ｄ（６０４）及びＪ（６０５）遺伝子と、それに続く２つの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列（６０９）が隣接しているＣμ及び／又はＣδエクソン（６０８）からなる。他方の重鎖対立遺伝子（６０２）上には、同じ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの２つの認識配列（６０９）が隣接しているセンス方向（下の矢印）のＤＮＡカセット（６１０）が、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子の下流に挿入されている。好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスのＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは、ヒトコード領域とマウス非コード領域とからなるキメラである。ＤＮＡカセットは以下のうちの１つ以上を含む：スプライスアクセプター、リボソームスキップ配列又はＩＲＥＳ、オープンリーディングフレーム、終止コドン、又はポリアデニル化シグナル配列。加えて、重鎖対立遺伝子は、ヘテロ二量体化のためＣＨエクソン（６１１及び６１２）に対して図２に記載されるもの（図２の２０８及び２０９）と同じ改変を含む。ＶＤＪ組換えイベント後（６１４）、対立遺伝子６０１上のインフレームＶＨエクソン（６１５）のアセンブリの成功により、完全長重鎖の正常な発現がもたらされる。対照的に、対立遺伝子６０２上のＤＮＡカセット（６１０）では、いかなるＶＤＪ再構成（６１６）の成功によっても完全長重鎖ポリペプチドの発現を可能にすることができない。部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ遺伝子の発現後（６１７）、第１の対立遺伝子（６０１）上のＣＨエクソン（６０８）並びに第２の対立遺伝子（６０２）上のＤＮＡカセット（６１０）が染色体から切り出される。両方の対立遺伝子上のＶＤＪエクソン（６１５、６１６）が、ここで重鎖ヘテロ二量体化の助けとなる改変を含む下流ＣＨエクソンと共に発現することができようになる。図中の表示される成分は以下のとおりである：改変重鎖対立遺伝子（６０１、６０２）；括弧内に示されるＶ遺伝子、「ｎ」は複数個の遺伝子セグメントの存在を指す（６０３）；括弧内に示されるＤ遺伝子、「ｎ」は複数個の遺伝子セグメントの存在を指す（６０４）；Ｊ遺伝子（６０５）；重鎖「イントロン」エンハンサー（６０６）；スイッチ領域（６０７）；Ｃμ及び／又はＣδエクソン（６０８）；部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列（６０９）；下の矢印によって指示されるセンス方向のＤＮＡカセット（６１０）；変異Ｃγ１エクソン（６１１；６１２）；重鎖３’エンハンサー（６１３）；ＶＤＪ組換えイベント（６１４）；アセンブルされたＶＤＪエクソン（６１５、６１６）；部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの活性化（６１７）。
【００７４】
トランスジェニック細胞ライブラリ
本発明のトランスジェニック細胞を用いることにより、形質細胞の表面上にある目的の抗体を同定するための発現ライブラリ、好ましくは低複雑度のライブラリを作製し得る。従って本発明はまた、形質細胞上に発現する抗原特異的抗体を同定するための、本発明の細胞技術を用いて作製された抗体ライブラリも含む。
【００７５】
トランスジェニック動物
本発明の具体的な態様において、本発明は、操作された重鎖又は軽鎖遺伝子を担持するトランスジェニック動物を提供する。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック動物はヒト免疫グロブリン領域を更に含む。例えば、内因性マウス免疫グロブリン領域をヒト免疫グロブリン配列に置き換えて、創薬を目的とした部分的又は完全ヒト抗体を作り出すための数多くの方法が開発されている。かかるマウスの例としては、例えば、米国特許第７，１４５，０５６号明細書；同第７，０６４，２４４号明細書；同第７，０４１，８７１号明細書；同第６，６７３，９８６号明細書；同第６，５９６，５４１号明細書；同第６，５７０，０６１号明細書；同第６，１６２，９６３号明細書；同第６，１３０，３６４号明細書；同第６，０９１，００１号明細書；同第６，０２３，０１０号明細書；同第５，５９３，５９８号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，６１２，２０５号明細書；及び同第５，５９１，６６９号明細書に記載されるものが挙げられる。
【００７７】
特に好ましい態様において、本発明のトランスジェニック動物は、ワブル（Ｗａｂｌ）及びキリーン（Ｋｉｌｌｅｅｎ）による同時係属出願の米国特許出願公開第２０１３／０２１９５３５号明細書に記載されるとおりのキメラ免疫グロブリンセグメントを含む。かかるトランスジェニック動物は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有し、この導入された領域は、ヒト可変領域コード配列と、非ヒト脊椎動物の内因性ゲノムをベースとする非コード可変配列とを含む。好ましくは、本発明のトランスジェニック細胞及び動物は、内因性免疫グロブリン領域の一部又は全てが取り除かれているゲノムを有する。
【００７８】
抗体産生における使用
細胞のインビトロ培養は、数多くの治療用バイオテクノロジー製品の生産の基本となっており、タンパク質産物の細胞内産生及び支持培地中への放出を伴う。培養下で成長する細胞からの時間の経過に伴うタンパク質産生の量及び質は、例えば、細胞濃度、細胞周期段階、細胞のタンパク質生合成速度、細胞の生存及び成長を支持するために用いられる培地の条件、及び培養下の細胞の寿命など、幾つもの要因に依存する（例えば、フレネー（Ｆｒｅｓｎｅｙ）、「動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、２０１０年；及び「医薬及び細胞ベースの治療薬のための細胞培養技術（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」、オツターク（Ｏｚｔｕｒｋ）及びハ（Ｈａ）編、ＣＲＣ出版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、２００６年を参照のこと）。
【００７９】
本発明は、動物を２つ以上の抗原で同時にチャレンジするか、又は初めに１つの抗原でチャレンジし、次に後にもう１つの抗原でチャレンジする免疫スキームから得られるＢ細胞の供給源を提供する。いずれの場合にも、個々の動物の抗原特異的抗体力価を増加させるため複数回の免疫が用いられ得る。これらの２つの免疫シリーズの間に、誘導可能な部位特異的組換えステップが含まれる。最後の免疫スキームの後、Ｂ細胞が単離され、培養されるか又はハイブリドーマの作成に使用され、又は免疫グロブリン鎖遺伝子のクローニング用ＲＮＡの供給源として使用される。Ｂ細胞又はそれが含有する抗体鎖は、二重特異的抗原結合特性に関して試験される。ハイブリドーマの場合、これは、ハイブリドーマを直接二重特異性抗体に関してスクリーニングするか、又は一方の種類の抗原に対する特異性に関してスクリーニングし、次にそれらが第２の種類の抗原に対する特異性を付与する追加的な再構成された免疫グロブリン鎖遺伝子を担持しているかどうか、即ちそれらが潜在性の又は発現済みの二重特異性を有するかどうかを更に分析することにより達成される。
【００８０】
（実施例）
以下の例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用すればよいかについての完全な開示及び説明を提供するために示され、本発明者らがその発明であると見なすものの範囲を限定することを意図するものでなく、また、以下の実験が実施される唯一全ての実験であることを表明又は含意することを意図するものでもない。当業者は、広義に説明されるとおりの本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態として示されるとおりの本発明に対して数多くの変形例及び／又は改良例を作成し得ることを理解するであろう。従って、本実施形態はあらゆる点で例示的且つ非限定的なものと考えられるべきである。
【００８１】
使用する用語及び数値（例えば、ベクター、量、温度等）に関しては正確を期すように努めているが、幾らかの実験誤差及び偏差は考慮されなければならない。特に指示がない限り、部数は重量部数であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、及び圧力は大気圧下又はほぼ大気圧下である。
【００８２】
実施例１．２つ以上の抗原による同時免疫後の二重特異性抗体の単離が可能な操作された重鎖対立遺伝子。アイソタイプスイッチ能力を欠く２つの改変重鎖対立遺伝子（図２に示されるとおり）を担持するトランスジェニックマウスを作成する。両方の対立遺伝子ともＶＤＪ組換えを起こすことができる。好ましい実施形態において、Ｂ細胞発生時にＩｇＭ重鎖の代わりにＩｇＧ１が発現し、しかしＩｇＭを含めた任意の他のアイソタイプを用いてもよい。ＩｇＧ１のみを発現するＢ細胞は極めて正常に発生し、免疫時に抗原に応答する（例えば、ワイスマン（Ｗａｉｓｍａｎ）ら著、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第２０４巻、ｐ．７４７〜７５８、２００７年を参照のこと）。
【００８３】
両方のＩｇＧ１対立遺伝子とも、４番目のエクソン（ＣＨ３ドメインをコードする）が、重鎖ヘテロ二量体の形成を促進し且つホモ二量体化を抑制するように変異している。好ましい方法では、変異は、一方の重鎖対立遺伝子上のＤ２７６Ｋ、Ｅ２３３Ｋ、及びＱ２３４Ｋ；及び他方の重鎖対立遺伝子上のＫ２８６Ｄ、Ｋ２６９Ｄ、及びＴ２４７Ｄである（アミノ酸付番はＣＨ１の最初のコドンから開始する）。ヒトＩｇＧ１重鎖における同様の位置の変異は、ヘテロ二量体化及び細胞株における二重特異性抗体の分泌を促進することが示されている（例えば、グナセカラン（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８５巻、ｐ．１９６３７〜１９６４６、２０１０年を参照のこと）。
【００８４】
Ｂ細胞発生時、変異ＩｇＧ１重鎖はプレＢＣＲを形成するにはホモ二量体化が不十分であるため、一方の重鎖対立遺伝子のみが再構成されたプロＢ細胞は発生が阻まれる。従って、対立遺伝子排除を媒介するには不十分なシグナルしか伝達されず、変異Ｃγ１を発現する第２の重鎖対立遺伝子がＶＤＪ組換え可能になる。Ｂ細胞の発生は、両方の変異重鎖が共発現し、且つヘテロ二量体化してプレＢＣＲを形成したときに限り、プロＢ細胞段階を超えて進行することができる。
【００８５】
最終的に、この好ましい方法のトランスジェニックマウスにおける成熟Ｂ細胞は、１つの軽鎖を含む細胞１つにつき２つの機能性重鎖を有することになる。このトランスジェニックマウスは、２つ以上の目的の抗原による同時免疫と、続く標準方法を用いたハイブリドーマの作成に使用し得る。このトランスジェニックマウスに由来するハイブリドーマは、二重特異性抗体の直接単離が可能である。
【００８６】
この実施例１に関する重鎖対立遺伝子の例示的実施形態では、両方の重鎖対立遺伝子（２０１、２０２）のＶ（２０３）、Ｄ（２０４）、及びＪ（２０５）遺伝子は、ヒトコード配列をマウス調節配列と共に含み、これはワブル（Ｗａｂｌ）及びキリーン（Ｋｉｌｌｅｅｎ）による同時係属出願の米国特許出願公開第２０１３／０２１９５３５号明細書に説明されている。野生型マウスに見られる重鎖「イントロン」エンハンサー（２０６）並びに全ての下流エレメントの配列は、重鎖定常領域遺伝子を含め、ＬＯＣＵＳ：ＮＧ＿００５８３８（１．．１８０，９７１）に記載される。この実施例１では、全てのアイソタイプのＣＨエクソンを包含する８，６０８．．１７５，１３４にわたる配列が両方の重鎖対立遺伝子から欠失し、改変Ｃγ１エクソンに置き換えられている（図２のエレメント２０８及び２０９）。両方のエレメント２０８及び２０９のエクソン４は、自己二量体化よりも互いとのヘテロ二量体化に有利に働くように変異している。両方の重鎖対立遺伝子の変異Ｃγ１  ｃＤＮＡ配列が［配列番号１及び２］として特定され、並びに重鎖対立遺伝子の野生型ｃＤＮＡ配列が［配列番号３］として特定される。
【００８７】
実施例２．連続免疫後の二重特異性抗体の単離が可能な操作された重鎖対立遺伝子
部位特異的ＤＮＡ組換えによってオン又はオフを切り換えることのできる重鎖対立遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを作成する。対立遺伝子の一方は、生産的ＶＤＪ再構成後に完全長重鎖の発現能を有するが、他方の対立遺伝子はこの機能性を欠いている。
【００８８】
両方の対立遺伝子が、定常ドメインコードローカルの範囲内に位置する１つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識配列を含有する。これらの部位における部位特異的組換えは両方の対立遺伝子においてＤＮＡ断片の逆位を生じさせ、この逆位の結果としてこれらの対立遺伝子における定常ドメイン機能性が変化する。
【００８９】
部位特異的組換えは、当初完全長重鎖タンパク質の発現能を欠いている対立遺伝子にその能力を付与する。対照的に、部位特異的組換えは、当初この能力を有している対立遺伝子からそれを取り除く。
【００９０】
この実施形態の一つのバージョンを図４に示し、ここでは関連性のある部位特異的組換え配列に４０９及び４１０を付し、及び定常ドメインコードエクソンを４０６及び４１２と表示している。定常ドメインコードエクソンの転写方向は表示がある構成要素のすぐ下に矢印で示している。
【００９１】
図４は、ＶＤＪ再構成が起こってＶＨエクソン（４０３及び４０４）が生成された後の構成になった２つの対立遺伝子が示される。しかしながら、図４に示される対立遺伝子のＶＤＪ再構成は、いずれかの対立遺伝子に非生産的な遺伝子セグメント連結をもたらす可能性もある。同様に、この過程はまた、いずれかの対立遺伝子に生産的再構成をもたらす可能性もある。Ｂ細胞は対立遺伝子４０１から完全長重鎖分子を発現する場合に限り骨髄におけるその発生を完了し、これは、対立遺伝子４０２が生産的なＶＤＪ組換えを起こすことができたとしても、それはＣμ及び／又はＣδエクソンの全て又は一部が逆方向であるため完全長重鎖を発現できないことが理由である。
【００９２】
図４に示される対立遺伝子を担持するマウスにおいて発生する末梢Ｂ細胞は、対立遺伝子４０１に由来する重鎖を含むＢ細胞抗原受容体（膜貫通型又は分泌型）を発現する。これらのＢ細胞抗原受容体の軽鎖は、それらの軽鎖遺伝子座のうちの一方における正常な独立したＶＪ再構成に由来する。
【００９３】
図４に示される対立遺伝子を担持するマウスを免疫すると、免疫原に特異的な抗体を発現するＢ細胞のクローン性増殖が生じる。決定的なことに、この場合もまた、これらの抗体は対立遺伝子４０１に由来する重鎖だけを含む。繰り返し免疫により、通常のマウスで起こるものと同様のクローン性増殖、体細胞超変異、及びアイソタイプスイッチングの増強がもたらされる（図４に４１４として示す）。
【００９４】
Ｂリンパ球を含めた複数の細胞型で特定の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの誘導性発現が可能なトランスジェニックマウス系が存在し、又はそれが可能となるように容易に操作することができる。本方法の更に別の実施形態において、図４に示される変異対立遺伝子４０１及び４０２を担持するトランスジェニックマウスは、タモキシフェン誘導性システムなどの誘導性部位特異的リコンビナーゼシステムを更に有する。免疫に使用した抗原に対して実証可能な抗体応答を示した免疫マウスにおいて、関連性のある部位特異的リコンビナーゼの発現を生じさせる。
【００９５】
部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの発現後（図４の４１５）、両方の対立遺伝子において、誘導されたＤＮＡリコンビナーゼの部位が隣接する染色体セグメントが逆位を起こす。結果として生じる特徴は、対立遺伝子４０１上の完全長重鎖の発現能の喪失である。同時に、対立遺伝子４０２が完全長重鎖の発現能を獲得する。
【００９６】
免疫に応答してクローン性増殖を起こしたＢ細胞の一部で対立遺伝子４０２が生産的に再構成される。かかる第２の対立遺伝子の生産的再構成の頻度は、典型的には通常の場合よりもはるかに高く、なぜならこの対立遺伝子はＢ細胞発生時に完全長重鎖を発現せず、しかしそれにも関わらずＶＤＪ再構成を起こす能力は有するためである。
【００９７】
図４に示される新たに活性化された対立遺伝子４０２を担持するマウスを免疫すると、免疫に使用した抗原に特異的なＢ細胞抗原受容体を発現するＢ細胞のクローン性増殖が生じる。これらのＢ細胞抗原受容体（膜貫通型又は分泌型）は、対立遺伝子４０２に由来する重鎖だけを含む。繰り返し免疫により、通常のマウスで起こるものと同様のクローン性増殖、体細胞超変異、及びアイソタイプスイッチングの増強がもたらされる。
【００９８】
２回目の免疫に使用した抗原に特異的なＢ細胞には、一部に第１の抗原に応答したクローン性増殖を起こさなかったものが含まれる。かかるＢ細胞は、これらの免疫の両方で使用した抗原の認識能を有する二重特異性抗体の望ましい供給源ではない。
【００９９】
しかしながら、第２の抗原に特異的なＢ細胞のある割合は、第１の抗原に応答したクローン性増殖に関与した。これらのＢ細胞は、それらの再構成された重鎖遺伝子のうちの一方が第１の免疫原に対する特異性を有し、他方の再構成された重鎖遺伝子が第２の免疫原に対する特異性を有するため、明らかな二重特異性抗体源である。いずれの場合にも、個々のＢ細胞は１つの軽鎖タンパク質を両方の重鎖タンパク質と対にしている。
【０１００】
ハイブリドーマ又は他のクローニング技術を利用して、第２の免疫抗原に特異性を有するＢ細胞を回収し得る。次にこれらのＢ細胞を分析して、それらが第１の免疫抗原に対する特異性を付与する再構成した重鎖遺伝子もまた担持しているかどうかを決定する。
【０１０１】
実施例３．連続免疫後の二重特異性抗体の単離が可能な代替的な操作された重鎖対立遺伝子。ここに説明する方法は実施例２に説明するものと極めて良く似ている。部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼシステムによってオン又はオフを切り換えることのできる２つの重鎖免疫グロブリン対立遺伝子を担持するようにトランスジェニックマウスを操作する。２つの対立遺伝子は、実施例２に説明するものと同様の連続免疫スキーム向けに設計し、結果的にそれらの定常ドメインローカルにおける概して同種の機能性を特徴とする。これらの対立遺伝子が異なる点は、所望の種類の二重特異性Ｂ細胞を単離する際の効率を改善するように設計されたエレメントを含むことである。
【０１０２】
この実施形態は図５に示す。２つの操作された重鎖対立遺伝子のうちの一方（対立遺伝子５０１）には、重鎖エンハンサー（５０５）より後ろ、但しＣμエクソン（５０６）の前のスイッチ領域（５０７）より前に、２つの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列（５０９及び５１０）が隣接するＤＮＡカセット（５１２）が挿入されており、従って重鎖エンハンサー（５０５）はアイソタイプスイッチング後もゲノムに残る。第２の重鎖対立遺伝子（対立遺伝子５０２）にも類似した位置に同様のエレメントが、但し逆向き（下の矢印）に挿入される。これらのＤＮＡカセットは、アセンブルされたＶＤＪエクソンと同じ転写方向で整列しているとき重鎖エクソンのオープンリーディングフレームを分断するように設計される。
【０１０３】
一実施形態において、対立遺伝子５０１は、ＶＨエクソンから逆向きに整列したネズミ科動物インテグリンβ−７（Ｉｔｇｂ７）遺伝子のエクソン１５及び１６からなる。Ｉｔｇｂ７エクソンは両方ともスプライスアクセプターを含む。加えて、Ｉｔｇｂ７エクソン１５は終止コドンを有し、一方Ｉｔｇｂ７エクソン１６は終止コドン並びにポリアデニル化配列シグナルを含む。逆の転写方向のため、このＤＮＡカセットは対立遺伝子５０１上のインフレームＶＤＪ組換えからの重鎖発現に干渉しない。
【０１０４】
好ましい構成では、対立遺伝子５０２における挿入されたＤＮＡカセットは、ＶＤＪ組換えからのインフレームＶＨエクソンのアセンブリに成功したＢ細胞に生存、機能性、又は選択上の利点を提供する遺伝子由来のオープンリーディングフレームからなる。かかる遺伝子の例は、抗アポトーシスＢ細胞リンパ腫−２（Ｂｃｌ２）である。有利な遺伝子のオープンリーディングフレームは、重鎖ｍＲＮＡと同じ転写方向に整列する。この遺伝子がＶＨエクソンとの融合タンパク質として発現することができないように、スプライスアクセプターと有利な遺伝子のオープンリーディングフレームとの間にピコルナウイルス由来の２Ａペプチドなどのリボソームスキップ配列が配置される。２Ａペプチドはまた、有利な遺伝子がインフレームＶＨエクソンのアセンブリに成功したＢリンパ球においてのみ発現し、生産的ＶＤＪ再構成を欠くＢ細胞では発現しないことも確実にする。
【０１０５】
一例示的実施形態において、両方の重鎖対立遺伝子（５０１、５０２）上のアセンブルされたＶＤＪ遺伝子（５０３、５０４）は、ヒトコード配列をマウス調節配列と共に含む個々の遺伝子セグメントに由来し、これについてはワブル（Ｗａｂｌ）及びキリーン（Ｋｉｌｌｅｅｎ）による同時係属出願の米国特許出願公開第２０１３／０２１９５３５号明細書に説明されている。下流にある全ての内因性配列は、重鎖定常領域遺伝子を含め、ＬＯＣＵＳ：ＮＧ＿００５８３８（１．．１８０，９７１）に記載されている。Ｉｔｇｂ７及びＢｃｌ２  ＤＮＡカセット（それぞれエレメント５１２及び５１４）の配列は［配列番号４及び５］として特定され、この遺伝子座の約１７８，０００位、重鎖「イントロン」エンハンサーと１番目のエクソンＣμエクソンのスイッチ領域との間に挿入される。この実施形態において、第１の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの認識配列（エレメント５０９及び５１０）はｌｏｘ６６及びｌｏｘ７１である（例えば、オーベルドエルファー（Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｆｅｒ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）、第３１巻、ｐ．ｅ１４０、２００３年を参照のこと）。またこの実施形態において、第２の部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの認識配列（エレメント５１１）は、Ｆｌｐ酵素によって使用されるものである（例えば、マックロード（ＭｃＬｅｏｄ）ら著、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、第６巻、ｐ．３３５７〜３３６７、１９８６年を参照のこと）。この実施形態において、ヘテロ二量体（各重鎖対立遺伝子上のエレメント５１３）は、自己二量体化よりも互いとのヘテロ二量体化に有利に働くように設計された変異Ｃγ１である。両方の重鎖対立遺伝子の変異Ｃγ１  ｃＤＮＡ配列が［配列番号１及び２］として特定される。
【０１０６】
実施例２にあるとおり、最初の免疫後、逆位のＩｔｇｂ７カセットは重鎖遺伝子座の転写活性に何ら効果を及ぼさないため、対立遺伝子５０１は通常どおり抗原に応答することができる。第２のＤＮＡカセットは対立遺伝子５０２の重鎖オープンリーディングフレームを分断するため、免疫原に対する特異性は最初の免疫後の対立遺伝子５０２からは選択されない。
【０１０７】
部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼが発現すると（５１６）、両方の重鎖対立遺伝子上のＤＮＡカセットが逆位になる。ここで対立遺伝子５０１におけるＩｔｇｂ７遺伝子カセットのオープンリーディングフレームが重鎖ｍＲＮＡと同じ転写方向になる。事実上、Ｉｔｇｂ７遺伝子の終止コドン及びポリアデニル化シグナル配列が、対立遺伝子５０１からの完全長重鎖の発現を阻止する。
【０１０８】
対照的に、対立遺伝子５０２はここで、挿入された有利な遺伝子のオープンリーディングフレームがもはや重鎖ｍＲＮＡと同じ向きでないため、完全長重鎖を発現することができるようになる。続いて対立遺伝子５０２は２回目の免疫において免疫原に応答することができる。
【０１０９】
ハイブリドーマ又は他のクローニング技術を利用して、第２の免疫抗原に特異性を有するＢ細胞を回収し得る。次にこれらのＢ細胞を分析して、それらが第１の免疫抗原に対する特異性を付与する再構成した重鎖遺伝子もまた担持しているかどうかを決定することができる。
【０１１０】
実施例４．２つ以上の抗原による同時免疫後に二重特異性抗体の単離が可能な代替的操作された重鎖対立遺伝子。この実施例４のスキームは図６に示され、これは実施例１並びに実施例３の両方のエレメントを一部含む。アイソタイプスイッチ能力を欠く２つの改変重鎖対立遺伝子を担持するようにトランスジェニックマウスを通常の方法で操作する。一方の重鎖対立遺伝子（図６の６０１）では、Ｃμ及び／又はＣδ重鎖エクソンに、直接向けられた部位特異的リコンビナーゼ認識配列が隣接する。更に下流に、［配列番号１及び２］として特定されるとおりの２つの重鎖対立遺伝子の変異Ｃγ１  ｃＤＮＡ配列など、図２及び実施例３で対立遺伝子２０１に関して説明したとおりの重鎖間ヘテロ二量体化のためのＣＨ３変異を含むＣγ１エクソンがある。対立遺伝子６０１は、アセンブルされたＶＨエクソンから転写されるそのオープンリーディングフレームが部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列によって途切れていないため、通常のＢ細胞発生を支持することができる。第２の重鎖対立遺伝子（図６の６０２）では、直接向けられた同じ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの認識配列（６０９）が隣接するＤＮＡカセット（６１０）がＪ遺伝子（６０５）の下流に挿入される。従って、ＤＮＡカセット（６１０）はそのオープンリーディングフレームを分断するように設計されているため、対立遺伝子６０２上のインフレームＶＤＪアセンブリは完全長重鎖を発現する能力を失っている。これらのエレメントの更に下流に、対立遺伝子６０１によってコードされる変異ＩｇＧ１重鎖とのヘテロタイプな会合のための相補的なＣＨ３変異を含むＣγ１エクソンがある。
【０１１１】
実施例３にあるとおりの好ましい構成では、対立遺伝子６０２における挿入されたＤＮＡカセットは、ＶＤＪ組換えからのインフレームＶＨエクソンのアセンブリに成功したＢ細胞に生存、機能性、又は選択上の利点を提供する遺伝子由来のオープンリーディングフレームを含む。このＤＮＡカセットはまた、有利な遺伝子のオープンリーディングフレームの前にスプライスアクセプター及び２Ａペプチド配列も含む。重要なことに、２Ａペプチドはまた、有利な遺伝子がインフレームＶＨエクソンのアセンブリに成功したＢリンパ球においてのみ発現し、生産的ＶＤＪ再構成を欠くＢ細胞では発現しないことも確実にする。
【０１１２】
部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼの発現が導入されると、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ認識配列が隣接した間に介在するＤＮＡセグメントが両方の重鎖対立遺伝子から切り出される。続いて、ここで両方の重鎖が完全長重鎖発現に関してコンピテントになる。実施例１で説明したとおり、これらの２つの変異ＩｇＧ１重鎖は細胞表面発現及び分泌に関して互いに相互依存している。成熟Ｂ細胞の生存にはＢＣＲの細胞表面発現もまた必要であるため（例えば、ラム（Ｌａｍ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第９０巻、ｐ．１０７３〜１０８３、１９９７年を参照のこと）、いずれかの変異重鎖対立遺伝子単独の発現はＢ細胞死をもたらす可能性が高い。
【０１１３】
実施例１にあるとおり、この例のトランスジェニックマウスの成熟Ｂ細胞は、１つの軽鎖を含む細胞１つにつき２つの機能性重鎖を有する。続いてこのトランスジェニックマウスを２つ以上の目的の抗原による同時免疫に使用し得る。標準方法を用いて二重特異性抗体を有するハイブリドーマを作成する。
【０１１４】
例えば例示的実施形態において、ワブル（Ｗａｂｌ）及びキリーン（Ｋｉｌｌｅｅｎ）による同時係属出願の米国特許出願公開第２０１３／０２１９５３５号明細書に記載されるとおり、両方の重鎖対立遺伝子（６０１、６０２）のＶ（６０３）、Ｄ（６０４）、及びＪ（６０５）遺伝子がヒトコード配列をマウス調節配列と共に含む。重鎖「イントロン」エンハンサー（６０６）並びに全ての下流エレメントの配列は、野生型マウスに見られる重鎖定常領域遺伝子を含め、ＬＯＣＵＳ：ＮＧ＿００５８３８（１．．１８０，９７１）に記載されている。対立遺伝子６０１では、全ての下流アイソタイプのＣδ及びＣＨエクソンを包含する８，６０８．．１６８，７２８にわたる配列が欠失している。加えて、対立遺伝子６０１のＣμエクソン（遺伝子座の１７１２３０．．１７５１３４）には、２つの直接向けられた標準ｌｏｘＰ部位が隣接する。対立遺伝子６０２では、全てのアイソタイプのＣＨエクソンを包含する遺伝子座の８，６０８．．１７５，１３４にわたる配列が欠失している。２つの直接向けられたｌｏｘＰ部位が隣接するＩｔｇｂ７  ＤＮＡカセットが、遺伝子座の約１７８，０００位に挿入されている。両方の対立遺伝子上の３’ｌｏｘＰ部位の下流に、改変Ｃγ１エクソン（エレメント６１１、６１２）の配列がある。両方のエレメント６１１及び６１２のエクソン４が、自己二量体化よりも互いとのヘテロ二量体化に有利に働くように変異している。両方の重鎖対立遺伝子の変異Ｃγ１  ｃＤＮＡ配列が［配列番号１及び２］として特定される。
【０１１５】
上記は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。本発明の原理を具体化する且つその趣旨及び範囲内に含まれる様々な変形例を考案することが、本明細書に明示的に説明又は図示されていなくても当業者には可能であることが理解されるであろう。更に、本明細書に記載される全ての例及び条件付きの文言は、主に、本発明の原理及び本発明者らによって当該技術分野の促進に寄与される概念を読者が理解する際に助けとなるように意図され、かかる具体的に記載される例及び条件に限定されないものと解釈されなければならない。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態並びにそれらの具体的な例を記載する本明細書における全ての記述が、それらの構造及び機能の両方の均等物を包含するように意図される。加えて、かかる均等物が、現在公知の均等物及び将来開発される均等物の両方、即ち構造に関わらず同じ機能を果たす開発される任意の要素を含むように意図される。従って、本発明の範囲が本明細書に図示及び記載される例示的実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって具体化される。以下の特許請求の範囲においては、用語「手段（ｍｅａｎｓ）」を使用しない限り、そこに記載されるいかなる特徴又は要素も、米国特許法第１１２条第６パラグラフに規定されるミーンズ・プラス・ファンクションの限定と解釈されてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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