(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチド、このようなペプチドを作製する方法、ならびにプロテアーゼ耐性ペプチドを含む組成物およびこのようなペプチドを利用して処置する方法を提供する。ある種のアミノ酸残基の脂質付加および天然アミノ酸に対するアルファ−メチル官能性アミノ酸の置換の組み合わせが、プロテアーゼ耐性ペプチドを生成させることが分かった。【選択図】図１
2018518485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
Ｈ  Ｘ２  Ｅ  Ｇ  Ｓ  Ｘ６  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｖ  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｌ  Ｅ  Ｇ  Ｅ  Ａ  Ａ  Ｘ２０  Ｅ  Ｘ２２  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｖ  Ｖ  Ｘ２８  Ｇ  Ｇ（配列番号２）；
（式中、Ｘ２はＡまたはＡｉｂであり、
Ｘ６は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１３は、Ｙまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ２０は、脂質修飾Ｋ、Ｋまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ２２は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２５は、Ｗまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ２８は、Ｋ、Ｅまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸である。）
を含む単離ポリペプチドであって、
Ｘ１２、Ｘ２０またはＸ２４のうち１個のみにおいて脂質付加される、
単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、Ｃ末端アミドを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドであって、Ｘ２がＡｉｂである、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドであって、前記脂質修飾Ｋが、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−γＥ−パルミトイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）、Ｋ（γＥ−パルミトイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−ラウロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）、Ｋ（ε−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアレート）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアレート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドであって、前記脂質修飾ＫがＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）である、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ６がα−ＭｅＦであるか、Ｘ１１がα−ＭｅＳであるか、Ｘ１３がα−ＭｅＦであるか、Ｘ２２がα−ＭｅＦであるか、Ｘ２５がα−ＭｅＦであるか、Ｘ２８がα−ＭｅＫであるか、または何らかのそれらの組み合わせである、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチドであって、Ｘ２がＡｉｂであり、Ｘ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ１１がα−ＭｅＳであり、Ｘ１３がα−ＭｅＦであり、Ｘ２０がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり、Ｘ２２がα−ＭｅＦであり、Ｘ２５がα−ＭｅＦであり、Ｘ２８がα−ＭｅＫである（配列番号３）、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載のポリペプチドであって、タンパク質分解性分解に対して実質的に耐性がある、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドであって、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載のポリペプチドであって、少なくとも、対応する非脂質付加ポリペプチドと実質的に同じ受容体効力を維持する、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドであって、少なくとも、対応する非脂質付加ポリペプチドと実質的に同じ受容体選択性を維持する、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のポリペプチドであって、対応する非脂質付加ポリペプチドを超える受容体効力向上を示す、ポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列：
Ｈ  Ｘ２  Ｅ  Ｇ  Ｘ５  Ｘ６  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｘ１０  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｘ１４  Ｅ  Ｇ  Ｘ１７  Ａ  Ａ  Ｘ２０  Ｅ  Ｘ２２  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２６  Ｖ  Ｘ２８  Ｇ  Ｘ３０（配列番号４）；
（式中、Ｘ２はＡまたはＡｉｂであり、
Ｘ５は、ＴまたはＳであり、
Ｘ６は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ１０は、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１３は、Ｙ、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１４は、Ｌまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１７は、ＱまたはＥであり、
Ｘ２０は、Ｋ、Ｅまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ２２は、Ｆ、ノルロイシン、チロシンメチルエステルまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２５は、Ｗ、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２６は、Ｌ、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２８は、ＫまたはＥであり、
Ｘ３０は、ＲまたはＧである。）
を含む単離ポリペプチドであって、
２個の脂質修飾Ｋ残基を含み、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋ残基である、単離ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドであって、Ｘ６が、Ｆ、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫであり、Ｘ１１が、Ｓ、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫであり、Ｘ２０が、Ｋ、Ｅ、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫであり、Ｘ２２が、Ｆまたはα−ＭｅＦである、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のポリペプチドであって、Ｃ末端アミドを含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１３〜１５の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ２がＡｉｂである、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のポリペプチドであって、前記２個の脂質修飾Ｋ残基が同じであるかまたは異なり、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリペプチドであって、前記２個の脂質修飾Ｋ残基が両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）または両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）である、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ１０が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ１２が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ１３が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ１４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ２４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ２５が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１３〜１８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ２６が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち何れか１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１３〜２５の何れか１項に記載のポリペプチドであって、
Ｘ６がα−ＭｅＦであるか、
Ｘ１１がα−ＭｅＳであるか、
Ｘ２０がα−ＭｅＫであるか、
Ｘ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ１１がα−ＭｅＳであるか、
Ｘ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ２０がα−ＭｅＫであるか、
Ｘ１１がα−ＭｅＳであり、Ｘ２０がα−ＭｅＫであるか、または、
Ｘ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ１１がα−ＭｅＳであり、Ｘ２０がα−ＭｅＫである、
ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリペプチドであって、Ｘ１３が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２６に記載のポリペプチドであって、Ｘ１４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである、ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１３〜２８の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ５がＳである、ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１３〜２９の何れか１項に記載のポリペプチドであって、Ｘ１７がＥであり、Ｘ２８がＥであり、Ｘ３０がＧである、ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１３に記載のポリペプチドであって、配列番号２５２、配列番号２６３、配列番号２６９、配列番号４０５、配列番号４０８、配列番号４０９または配列番号４１０のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１３〜３１の何れか１項に記載のポリペプチドであって、タンパク質分解性分解に対して実質的に耐性がある、ポリペプチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のポリペプチドであって、合成ペプチドが、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある、ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１３〜３３の何れか１項に記載のポリペプチドであって、２個の脂質修飾Ｋ残基を含み、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと実質的に同じ受容体効力を維持する、ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３４に記載のポリペプチドであって、２個の脂質修飾Ｋ残基を含み、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと実質的に同じ受容体選択性を維持する、ポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載のポリペプチドであって、２個の脂質修飾Ｋ残基を含み、対応する非脂質付加ポリペプチドを超える受容体効力上昇を示す、ポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列：
Ｈ（Ａｉｂ）Ｅ  Ｇ  Ｓ（α−ＭｅＦ）Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｘ１０  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｘ１４  Ｅ  Ｘ１６  Ｘ１７  Ｘ１８  Ａ（α−ＭｅＫ）Ｘ２１  Ｆ  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２６  Ｖ  Ｅ  Ｇ  Ｇ（配列番号４８７）（式中、
Ｘ１０は、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、
Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１３は、Ｙまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１４は、Ｌまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１６は、Ｇまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１７は、Ｅまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ１８は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２１は、Ｅまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２５は、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり、
Ｘ２６は、Ｖまたは脂質修飾Ｋである。）
を含む単離ポリペプチドであって、
３個の脂質修飾Ｋ残基を含み、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８またはＸ２１のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋ残基である、
単離ポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリペプチドであって、Ｃ末端アミドを含む、ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３７に記載のポリペプチドであって、前記３個の脂質修飾Ｋ残基が同じであるかまたは異なり、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３７に記載のポリペプチドであって、前記３個の脂質修飾Ｋ残基が、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）または両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）である、ポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３７〜４０の何れか１項に記載のポリペプチドであって、タンパク質分解性分解に対して実質的に耐性がある、ポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドであって、合成ペプチドが、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある、ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項３７〜４２の何れか１項に記載のポリペプチドであって、３個の脂質修飾Ｋ残基を含み、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと実質的に同じ受容体効力を維持する、ポリペプチド。
【請求項４４】
請求項４３に記載のポリペプチドであって、３個の脂質修飾Ｋ残基を含み、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと実質的に同じ受容体選択性を維持する、ポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載のポリペプチドであって、３個の脂質修飾Ｋ残基を含み、対応する非脂質付加ポリペプチドを超える受容体効力上昇を示す、ポリペプチド。
【請求項４６】
請求項１〜４５の何れか１項に記載のポリペプチドであって、ｃＡＭＰアッセイにおける５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満または２ｐＭ未満のＥＣ５０でヒトＧＬＰ−１受容体に結合する、ポリペプチド。
【請求項４７】
請求項１〜４６の何れか１項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４９】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４６の何れか１項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、前記ペプチドの発現を可能にする条件下で請求項４９に記載の宿主細胞を培養することおよび前記ペプチドを回収することを含む、方法。
【請求項５１】
請求項１〜４６の何れか１項に記載のポリペプチドと、担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項５２】
請求項４６に記載の組成物を含む、キット。
【請求項５３】
低血糖またはインスリン放出不全により引き起こされるかまたはこれを特徴とする疾患または状態を処置または予防する方法であって、処置を必要とする対象に有効量の請求項１〜４６の何れか１項に記載のポリペプチドまたは請求項５１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記疾患または状態が糖尿病である、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記疾患または状態が２型糖尿病である、方法。
【請求項５６】
請求項５３〜５５の何れか１項に記載の方法であって、前記投与が、さらに、血糖コントロールを改善するか、体重管理を提供するか、β−細胞機能および質量を向上させるか、胃酸分泌および胃内容排出の速度を低下させるか、または何らかのそれらの組み合わせである、方法。
【請求項５７】
請求項５３〜５６の何れか１項に記載の方法であって、前記ポリペプチドまたは前記医薬組成物が経口で、または注射により投与される、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記ポリペプチドまたは前記医薬組成物が経口投与される、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記注射が、皮下投与または静脈内で行われる、方法。
【請求項６０】
請求項５３〜５９の何れか１項に記載の方法であって、前記ペプチドまたは前記医薬組成物が１日１回投与される、方法。
【請求項６１】
請求項５３〜６０の何れか１項に記載の方法であって、１つ以上の追加的な治療を行うことをさらに含む、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記追加的な治療が、血糖監視、食生活改善、運動、インスリン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、インクレチン、メトホルミン、グリブリド、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、胆汁酸捕捉剤または何らかのそれらの組み合わせを含む、方法。
【請求項６３】
請求項５３〜６２の何れか１項に記載の方法であって、前記対象がヒトである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９のもと、両者ともそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる、２０１５年６月１０日提出の米国仮特許出願第６２／１７３，６３１号明細書および２０１６年５月３１日提出の米国仮特許出願第６２／３４３，３９０号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
電子提出した配列リストに対する参照
本願とともに提出したＡＳＣＩＩテキストファイルにおいて電子提出した配列リスト（名称：ＯＲＰＥＰ−１０１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔ；サイズ：４２４，４１８バイト；および作成日：２０１６年６月７日）の内容は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、プロテアーゼ耐性ペプチド、このようなペプチドを作製する方法ならびにプロテアーゼ耐性ペプチドを含む組成物およびこのようなペプチドを利用して処置する方法を提供する。ペプチド配列中のある一定の位置でのアミノ酸の脂質修飾を本明細書中で記載する。
【背景技術】
【０００４】
長時間作用型ペプチド治療薬の開発は、血漿半減期が短いことおよび経口バイオアベイラビリティ不良などの要因により妨げられており、これは、元来ペプチドが酵素分解に対して感受性があることに大きく起因する。細胞表面でペプチドシグナル伝達事象を遮断することまたは消化中のタンパク質およびペプチドの胃での崩壊など、必須の生体分子過程を制御することを含め、タンパク質分解機能の大部分は必要なものである。したがって、原因となるプロテアーゼの活性は、多くの場合において、他の代謝の妨害を起こすことなく単純に阻害することはできない。
【０００５】
したがって、分解を克服するために、関心のあるペプチドの酵素耐性を向上させることが求められる。一般に、酵素耐性を向上させるために２つの方法：配列特異的な修飾、例えばペプチドそれ自身の一次構造に影響を与えるもの；および包括的に有効な修飾、例えばペプチドのある種の全体的な物理化学的特徴を変化させるものが利用される。戦略的に導入されるこのような修飾は、例えば酵素分解および／または腎臓限外ろ過によるクリアランスなど、作用が所望されるペプチドを除去するかまたは不活性化する天然の生理学的過程の効果を低下させ得る。
【０００６】
配列特異的な修飾としては、タンパク質分解耐性の非天然アミノ酸の組み込み、または天然の側鎖官能基間の環化、例えばジスルフィド形成（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）またはラクタム化（Ｌｙｓ−ＧｌｕまたはＬｙｓ−Ａｓｐ）を含む、より関係が深い修飾が挙げられる。さらなる修飾としては、ペプチド骨格内の非天然アミノ酸サロゲート間の環化、例えばオレフィンメタセシスステープリング（ｓｔａｐｌｉｎｇ）が挙げられる。
【０００７】
網羅的修飾としては、ペプチド脂質付加、例えばパルミトイル化および／またはＰＥＧ化などの過程が挙げられる。パルミトイル化は、血清中で天然に豊富に存在するアルブミンと可逆的に結合するペプチドの循環蓄積を生じさせる効果を有する。アルブミンと結合したペプチドは、結合複合体のサイズが糸球体ろ過カットオフを上回るので、効率的に腎臓限外ろ過を回避する。ペプチドがアルブミンの表面から解離するとき、これは再び内因性受容体と自由に相互作用する。ＰＥＧ化は、ペプチドをタンパク質分解から物理的に保護する効果を有し、顕著な親水性を付与し、これにより水和時に治療薬分子の流体力学半径が大幅に拡大して腎臓クリアランスが克服される。
【０００８】
これらの技術は、一般に治療用ペプチドに広く適用可能であり得、ある程度まで循環半減期を延長可能である一方で、経口投与に適切なペプチドを作製したいという要望に特に照らして、酵素分解に対するペプチドおよびタンパク質の安定性を向上させる方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、アミノ酸配列：Ｈ  Ｘ２  Ｅ  Ｇ  Ｓ  Ｘ６  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｖ  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｌ  Ｅ  Ｇ  Ｅ  Ａ  Ａ  Ｘ２０  Ｅ  Ｘ２２  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｖ  Ｖ  Ｘ２８  Ｇ  Ｇ（配列番号２）（式中、Ｘ２はＡまたはＡｉｂであり、Ｘ６は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ１３は、Ｙまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ２０は、脂質修飾Ｋ、Ｋまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ２２は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ２５は、Ｗまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ２８は、Ｋ、Ｅまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸である）を含む単離ポリペプチドであって、Ｘ１２、Ｘ２０またはＸ２４のうち１個のみにおいて脂質付加される、単離ポリペプチドを提供する。
【００１０】
ある一定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドはＣ末端アミドを含む。ある一定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドはＣ末端の酸を含む。
【００１１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ２はＡｉｂである。配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、脂質修飾Ｋは、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−γＥ−パルミトイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−ラウロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）、Ｋ（ε−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）、Ｋ（ε−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）、Ｋ（ε−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアレート）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアレート）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）、Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアレート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある一定の実施形態において、脂質修飾Ｋは、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）である。
【００１２】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであるか、Ｘ１１はα−ＭｅＳであるか、Ｘ１３はα−ＭｅＦであるか、Ｘ２２はα−ＭｅＦであるか、Ｘ２５はα−ＭｅＦであるか、Ｘ２８はα−ＭｅＫであるか、または何らかのそれらの組み合わせである。ある一定の実施形態において、Ｘ２はＡｉｂであり、Ｘ６はα−ＭｅＦであり、Ｘ１１はα−ＭｅＳであり、Ｘ１３はα−ＭｅＦであり、Ｘ２０はＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり、Ｘ２２はα−ＭｅＦであり、Ｘ２５はα−ＭｅＦであり、Ｘ２８はα−ＭｅＫである（配列番号３）。ある一定の実施形態において、本ペプチドは、配列番号４８、配列番号６０または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性がある。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、少なくとも、対応する非脂質付加ポリペプチドと実質的に同じ受容体効力を維持する。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、少なくとも、対応する非脂質付加ポリペプチドと実質的に同じ受容体選択性を維持する。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、対応する非脂質付加ポリペプチドを超える受容体効力上昇を示す。
【００１４】
本開示はまた、アミノ酸配列：Ｈ  Ｘ２  Ｅ  Ｇ  Ｘ５  Ｘ６  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｘ１０  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｘ１４  Ｅ  Ｇ  Ｘ１７  Ａ  Ａ  Ｘ２０  Ｅ  Ｘ２２  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２６  Ｖ  Ｘ２８  Ｇ  Ｘ３０（配列番号４）；（式中、Ｘ２はＡまたはＡｉｂであり、Ｘ５はＴまたはＳであり、Ｘ６は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ１０はＶまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ１３はＹ、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ１４はＬまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ１７はＱまたはＥであり、Ｘ２０は、Ｋ、Ｅまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ２２は、Ｆ、ノルロイシン、チロシンメチルエステルまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり、Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ２５は、Ｗ、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ２６は、Ｌ、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり、Ｘ２８は、ＫまたはＥであり、Ｘ３０は、ＲまたはＧである）を含む単離ポリペプチドであって、２個の脂質修飾Ｋ残基を含み、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋ残基である、単離ポリペプチドも提供する。ある一定の実施形態において、Ｘ６は、Ｆ、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫであり；Ｘ１１は、Ｓ  α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫであり；Ｘ２０は、Ｋ、Ｅ、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫである。
【００１５】
ある一定の実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｃ末端アミドを含む。ある一定の実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドはＣ末端の酸を含む。
【００１６】
配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ２はＡｉｂである。ある一定の実施形態において、２個の脂質修飾Ｋ残基は同じであるかまたは異なり、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある一定の実施形態において、２個の脂質修飾Ｋ残基は、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）、両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）または両方ともＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）である。
【００１７】
配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ１０が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ１２が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ１３が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ１４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ２４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ２５が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ２６が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋである。
【００１８】
配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ６がα−ＭｅＦであるか、Ｘ１１がα−ＭｅＳであるか、Ｘ２０がα−ＭｅＫであるか、Ｘ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ１１がα−ＭｅＳであるか、Ｘ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ２０がα−ＭｅＫであるか、Ｘ１１がα−ＭｅＳであり、Ｘ２０がα−ＭｅＫであるか、またはＸ６がα−ＭｅＦであり、Ｘ１１がα−ＭｅＳであり、Ｘ２０がα−ＭｅＫである。ある一定の実施形態において、Ｘ１３が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ１４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである。ある一定の実施形態において、Ｘ５はＳである。ある一定の実施形態において、Ｘ１７はＥであり、Ｘ２８はＥであり、Ｘ３０はＧである。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号２５２；配列番号２６３；配列番号２６９；配列番号４０５；配列番号４０８；配列番号４０９；または配列番号４１０のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本開示はまた、アミノ酸配列：Ｈ（Ａｉｂ）ＥＧＳ（α−ＭｅＦ）ＴＳＤＸ１０  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｘ１４Ｅ  Ｘ１６  Ｘ１７  Ｘ１８  Ａ（α−ＭｅＫ）Ｘ２１  Ｆ  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２６  ＶＥＧＧ（配列番号４８７）（式中、Ｘ１０はＶまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ１３はＹまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ１４はＬまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ１６はＧまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ１７はＥまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ１８はＡまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ２１はＥまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ２５はＦまたは脂質修飾Ｋであり；Ｘ２６はＶまたは脂質修飾Ｋである）を含む単離ポリペプチドであって、３個の脂質修飾Ｋ残基を含み、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８またはＸ２１のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋ残基である、単離ポリペプチドも提供する。
【００２０】
ある一定の実施形態において、配列番号４８７のアミノ酸配列を含むペプチドはＣ末端アミドを含む。ある一定の実施形態において、配列番号４８７のアミノ酸配列を含むペプチドはＣ末端の酸を含む。
【００２１】
ある一定の実施形態において、脂質修飾Ｋ残基は、本明細書中に記載のもののうち何れかなど、様々な脂質または脂質部分に連結され得る。ある一定の実施形態において、例としては、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。他の実施形態において、Ｋ残基の脂質修飾は、同じであってもよいしまたは異なっていてもよい。ある一定の実施形態において、これらは同じである。したがって、ある一定の実施形態において、少なくとも３個の脂質修飾Ｋ残基は、全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）；または全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり得る。配列番号４８７のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、全ての修飾残基がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）であり得るか；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）であり得るか；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）であり得るか；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）であり得るか；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）であり得るか；または全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり得る。
【００２２】
配列番号４または４８７のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、本ポリペプチドは、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性がある。ある一定の実施形態において、合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。ある一定の実施形態において、２個の脂質修飾Ｋ残基を含むポリペプチドは、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと実質的に同じ受容体効力を維持する。ある一定の実施形態において、２個の脂質修飾Ｋ残基を含むポリペプチドは、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと実質的に同じ受容体選択性を維持する。ある一定の実施形態において、２個の脂質修飾Ｋ残基を含むポリペプチドは、対応する非脂質付加ポリペプチドを超える受容体効力上昇を示す。
【００２３】
ｃＡＭＰアッセイにおいて５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満または２ｐＭ未満のＥＣ５０でヒトＧＬＰ−１受容体に結合し得る脂質付加ペプチドが本明細書中で提供される。
【００２４】
本開示は、本明細書中に記載の脂質付加ポリペプチドの何れかをコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。ある一定の実施形態は、このようなポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある一定の実施形態は、このようなヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２５】
ある一定の実施形態は、本明細書中に記載の脂質付加ポリペプチドを作製する方法を提供する。ある一定の実施形態において、本方法は、ペプチドの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、そのペプチドを回収することを含む。
【００２６】
ある一定の実施形態は、本明細書中の他所で詳述される脂質付加ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。ある一定の実施形態において、キットはこのような組成物を含む。
【００２７】
ある一定の実施形態は、低血糖またはインスリン放出不全により引き起こされるかまたはこれを特徴とする疾患または状態を処置または予防する方法を提供する。このような方法は、処置を必要とする対象に有効量の本明細書中の他所で詳述される脂質付加ポリペプチドを、またはこのようなポリペプチドを含む医薬組成物として、投与することを含む。ある一定の実施形態において、本疾患または状態は糖尿病である。ある一定の実施形態において、本疾患または状態は２型糖尿病である。ある一定の実施形態において、投与は、さらに、血糖コントロールを改善するか、体重管理をもたらすか、β−細胞機能および質量を向上させるか、胃酸分泌および胃内容排出速度を低下させるか、または何らかのそれらの組み合わせである。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドまたは本医薬組成物は、経口投与されるかまたは注射により投与される。ある一定の実施形態において、本ポリペプチドまたは本医薬組成物は経口投与される。ある一定の実施形態において、注射は、皮下または静脈内で行われる。ある一定の実施形態において、本ペプチドまたは本医薬組成物は、１日１回投与される。ある一定の実施形態において、疾患または状態を処置または予防する方法は、さらに、１つ以上の追加的な治療を行うことを含む。ある一定の実施形態において、追加的な治療には、血糖監視、食生活改善、運動、インスリン、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、インクレチン、メトホルミン、グリブリド、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、胆汁酸捕捉剤または何らかのそれらの組み合わせが含まれる。ある一定の実施形態において、処置される対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本明細書中で開示される脂質付加ポリペプチドを形成させるための、代表的な脂質、脂質部分およびリンカーを示す。
【図２】図２は、ｐＨ８．３で１００μｇ／ｍＬネプリライシンにより加水分解されるペプチド１００μｇ中のパーセント残留ペプチドを示す。
【図３】図３は、ｐＨ２で２００μｇ／ｍＬペプシン、１００ｍＭ  ＨＣｌにより加水分解されるペプチド１００μｇ中のパーセント残留ペプチドを示す。
【図４】図４は、ｐＨ８．１で１５０μｇ／ｍＬトリプシンにより加水分解されるペプチド１００μｇ中のパーセント残留ペプチドを示す。
【図５】図５は、ｐＨ８で１００μｇ／ｍＬキモトリプシンにより加水分解されるペプチド１００μｇ中のパーセント残留ペプチドを示す。
【図６】図６は、ｐＨ６．８で１００μｇ／ｍＬ新鮮ＳＩＦ／パンクレアチン（登録商標）により加水分解されるペプチド１０００μｇ中のパーセント残留ペプチドを示す。
【図７】図７は、ｐＨ６．８で（エンテロキナーゼとともに）１００μｇ／ｍＬ新鮮ＳＩＦ／パンクレアチン（登録商標）により加水分解されるペプチド１０００μｇ中のパーセント残留ペプチドの３つ組試験からの平均値を示す。
【図８】図８は、配列番号３および配列番号１７に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図９】図９は、配列番号４８および配列番号６０に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１０】図１０は、配列番号６８および配列番号２５２に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１１】図１１は、配列番号２６３および配列番号２６９に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１２】図１２は、配列番号４０５および配列番号４０６に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１３】図１３は、配列番号４０７および配列番号４０８に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１４】図１４は、配列番号４０９および配列番号４１０に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１５】図１５は、配列番号４８８および配列番号４８９に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【図１６】図１６は、配列番号４９０（リラグルチド）および配列番号４９１（セマグルチド）に対する、化学構造、化学式および分子量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
当然のことながら、本明細書中で示され、記載される特定の実施は例であり、本願の範囲を何ら限定するものではない。
【００３０】
本明細書中で言及される、公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名および科学文献は、それらの全体において、それぞれが具体的かつ個々に参照により組み込まれることが示される場合と同程度まで、参照により本明細書によって組み込まれる。本明細書中で引用されるあらゆる参照および本願の具体的な教示の間の矛盾は何れも、後者を優先して解決される。同様に、語句の当技術分野で理解される定義と本願で具体的に教示される語句の定義との間の矛盾は何れも、後者を優先して解決される。
【００３１】
本願で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容から別段の明らかな指示がない限り、具体的に、それらが指す用語の複数形も包含する。「約」という用語は、本明細書中で、おおよそまたは大体の領域でおよそを意味するために使用される。「約」という用語が数字範囲と組み合わせて使用される場合、「約」は、示される数値を上回り、下回り、その境界を拡大することによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、２０％の変動で述べられる値を上回る、および下回る数値を修飾するために本明細書中で使用される。
【００３２】
さらに、「および／または」は、本明細書中で使用する場合、他のものを伴うかまたは伴わない２つの指定の特性または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきものである。したがって、「および／または」という用語は、本明細書中で「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句で使用される場合、「および／または」という用語は、次の態様のそれぞれ：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）を包含するものとする。
【００３３】
「を含む」という語とともに態様が本明細書中に記載されるときは如何なる場合も、「からなる」および／または「基本的にからなる」という用語で記載される類似の態様も提供されることを理解されたい。
【００３４】
本明細書中で使用される技術および科学用語は、別段の定めがない限り、本願が属する技術分野の通常の技術者により一般的に理解される意味を有する。本明細書中で当業者にとって公知の様々な方法および材料について言及する。ペプチド合成の一般的原理を説明する標準的な参考研究は、Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，“Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（２００４）を含む。
【００３５】
単位、接頭辞および符号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で受容される形態で記す。数値範囲は、範囲を定める数字を含む。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に、左から右に記載される。本明細書中で提供される見出しは本開示の様々な態様の制限ではなく、これは、全体として本明細書を参照することによって得られる。したがって、直下で定められる用語は、その全体において本明細書を参照することによってより完全に定められる。
【００３６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」および「タンパク質断片」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１個以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーであるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００３７】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能する、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるものならびに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物を指し、例えばアルファ炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合しており、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語は全体で交換可能に使用される。
【００３８】
「断片」、「類似体（アナログ）」、「誘導体」または「変異体（バリアント）」という用語は、本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチドを指す場合、対応するネイティブペプチド、例えば、ＧＬＰ−１の少なくとも一部の活性を保持するあらゆるペプチドを含む。本明細書中で使用する場合、「脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体」という用語は、例えば、ネイティブＧＬＰ−１ペプチドのＧＬＰ−１活性の少なくとも一部を依然として維持しながら、例えばペプチドプロテアーゼ耐性を付与するために１個以上の脂質付加アミノ酸を含む合成ペプチドを指す。ペプチドの代謝安定性を向上させようとするための化学修飾は、主要なペプチド鎖の合成後のさらなる化学操作を含み得る。操作の例としては、ラクタム化、ジスルフィド架橋閉環、脂質付加および／またはＰＥＧ化が挙げられる。
【００３９】
「脂質修飾アミノ酸」および「脂質付加アミノ酸」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、脂質部分連結がある、アミノ酸、一般的にはリジンまたはシステインを指す。「脂質付加ポリペプチド」、「リポタンパク質」などの用語は、１個以上の脂質修飾アミノ酸を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。図１は、脂質、脂質部分およびリンカーの様々な代表例を示す。
【００４０】
「組成物」または「医薬組成物」という用語は、処置を必要とする対象への投与のための、例えば、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤とともに本明細書中で提供されるペプチドまたはポリペプチドを含有する組成物を指す。
【００４１】
「薬学的に許容可能な（製薬上許容される）」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的なリスク／ベネフィット比と釣り合った、過剰な毒性または他の合併症がない、ヒトおよび動物組織との接触に適切である組成物を指す。
【００４２】
「有効量」は、対象へのその投与が、単回投与または一連の投与の一部としての何れかで、処置にとって有効である、本明細書中で提供されるペプチドまたはポリペプチドの量である。
【００４３】
「対象（被験体）」という用語は、本明細書中で提供されるペプチドまたはポリペプチドでの処置を必要とする、あらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ、乳牛、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなどが挙げられるが限定されない。ある態様において、対象はヒト対象である。
【００４４】
ペプチドが天然の酵素の影響を受け易いことに対処する組成物および方法が本明細書中で提供される。選択されたアミノ酸残基に脂質付加することによって、野生型ペプチドと実質的に同じである受容体効力および選択性を依然として維持するかまたは受容体効力および選択性の向上を示しながら、酵素性分解に対する耐性向上を示すペプチドが提供される。
【００４５】
プロテアーゼ耐性を示すペプチド
この開示は、プロテアーゼ耐性が向上し、効力が上昇した脂質付加ペプチドを提供する。プロテアーゼ耐性および効力の向上は、ペプチド上での脂質付加の位置と関連があり得る。脂質付加には、カルボキシルまたはアミノ末端脂質付加または主鎖脂質付加が含まれ得る。ある一定の実施形態において、修飾は主鎖アミノ酸残基のものである。ある一定の実施形態において、プロテアーゼ耐性の向上および効力上昇は、１個以上の主鎖アミノ酸残基の脂質付加の選択的および戦略的な位置と関連する。脂質修飾アミノ酸付きのペプチドを調製する方法は当技術分野で公知である。
【００４６】
ある一定の実施形態において、少なくとも１個の脂質付加アミノ酸残基を含む脂質付加ペプチドが提供される。ある一定の実施形態において、脂質付加ペプチドは、少なくとも２個の脂質付加アミノ酸残基を含む。ある一定の実施形態において、脂質付加ペプチドは、１個の脂質付加アミノ酸残基のみを含有する。本明細書中で使用する場合、１個の脂質または脂質部分が連結されるペプチドは、一脂質付加ペプチドと呼ぶ。その他の実施形態において、脂質付加ペプチドは、２個の脂質付加アミノ酸残基を含有する。本明細書中で使用する場合、２個の脂質または脂質部分が連結されるペプチドは、ビス脂質付加ペプチドと呼ぶ。
【００４７】
ある一定の実施形態において、脂質付加ペプチドは合成ペプチドである。その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１５／０８６６８６Ａ２号パンフレットとして公開される国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７７２４０号明細書を参照のこと。ある一定の実施形態において、脂質付加合成ペプチドは、ネイティブアミノ酸残基に対するアルファ−メチル官能性アミノ酸の少なくとも１つの置換を含む。他の実施形態において、脂質付加合成ペプチドは、ネイティブアミノ酸残基に対する、アルファ−メチル官能性アミノ酸の少なくとも２、３、４、５、６またはそれを超える置換を含む。
【００４８】
本明細書中で記載される場合、「合成ペプチド」は、１個のアミノ酸のカルボキシル基またはＣ末端を別のもののアミノ基またはＮ末端に化学的にカップリングすることによって作製されたアミノ酸残基のポリマーを指す。化学ペプチド合成は、一般的にはペプチドのＣ末端で開始し、Ｎ末端で終了する。合成ペプチドを作製するための様々な方法が当技術分野で周知である。
【００４９】
本明細書中で記載のように、「アルファ−メチル官能性アミノ酸」は、アミノ酸の第１の（アルファ）炭素原子が、アルファ炭素に結合されたメチル基（ＣＨ３）置換基を含む、アミノ酸を指す。アルファ−メチル官能性アミノ酸は、このような官能化を含む天然の２０種類のアミノ酸の何れかを含む。
【００５０】
本明細書を通して記載される場合、アルファ−メチル官能性アミノ酸は、ペプチド中の何らかのネイティブアミノ酸を置き換え得る。「ネイティブ」アミノ酸という用語は、生体で産生されるタンパク質において存在する標準的な２０種類のアミノ酸のうち１つを指す。
【００５１】
置換は、例えばアルファ−官能性アミノ酸での、ネイティブアミノ酸の置換を指す。合成ペプチドの化学合成中、ネイティブアミノ酸をアルファ官能性アミノ酸で容易に置換し得る。
【００５２】
本明細書中に記載の合成ペプチドはあらゆる長さ、例えばあらゆる数のアミノ酸長、例えば、約５アミノ酸〜約２００アミノ酸長、約１０アミノ酸〜約１５０アミノ酸長、約２０アミノ酸〜約１００アミノ酸長、約３０アミノ酸〜約７５アミノ酸長または約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸または約１００アミノ酸長であり得る。
【００５３】
本明細書中に記載のある種の脂質付加合成ペプチドは、少なくとも、置換を含まない対応する合成ペプチドと実質的に同じ受容体効力を維持するかまたは受容体効力上昇を示しながら、ネイティブアミノ酸に対して置換された１個以上のアルファ−官能性アミノ酸を含有する。プロテアーゼ耐性および効力の向上は、ペプチド上の脂質付加およびアルファ−官能性アミノ酸置換アミノ酸の選択的および戦略的な位置と関連し得る。ある一定の実施形態において、少なくとも実質的に同じ受容体効力および選択性を維持するかまたは受容体効力および選択性の上昇を示す合成ペプチドは、ネイティブアミノ酸に対して置換された２個以上のアルファ−官能性アミノ酸を含有する。いくつかの実施形態において、少なくとも実質的に同じ受容体効力および選択性を維持するかまたは受容体効力および選択性の上昇を示す合成ペプチドは、ネイティブアミノ酸に対して置換された３、４、５、６個またはそれを超えるアルファ−官能性アミノ酸を含有する。
【００５４】
受容体「効力」という用語は、ペプチドの最大半量（５０％）有効濃度（ＥＣ５０）の逆数を指す。ＥＣ５０は、ペプチドの選択された標的に対する、指定された曝露時間後の、ベースライン反応と最大反応との間の半分の生物学的反応を誘導するペプチドの濃度を指す。したがって、ＥＣ５０に対して小さい値を示すペプチドは、対応する高い受容体効力を有し、一方でＥＣ５０に対して大きい値を示すペプチドは、対応する低い受容体効力を有し−受容体に関連する反応を誘導するのに必要とされるペプチドが多いほど、その受容体に対するペプチドの効力は低い。
【００５５】
受容体効力およびＥＣ５０を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、適切には、１つ以上の細胞受容体反応の刺激を決定することを含む。例えば、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）またはグルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（胃抑制ポリペプチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する適切な細胞株は、標準的な方法によって作製される。これらの様々な受容体のペプチド活性化の結果、機能活性アッセイにおいて測定され得るｃＡＭＰ二次メッセンジャーの下流産生が起こる。これらの測定から、ＥＣ５０値が容易に決定される。
【００５６】
全体を通して記載される場合、１個以上の、例えば１個または２個の連結される脂質または脂質部分およびネイティブアミノ酸に対するアルファ−メチル官能性アミノ酸の置換を含む脂質付加ペプチドは、脂質もしくは脂質部分または非天然アミノ酸を含まない対応するペプチドと比較した場合、「実質的に同じ」受容体効力を維持し得るかまたは受容体効力の上昇を示し得る。本明細書中で使用する場合、受容体効力に言及するとき、「実質的に同じ」は、非脂質付加であるかまたは非脂質付加でありアミノ酸修飾の数が異なるおよび／またはより少ない、対応するペプチドまたは他の適切な比較配列（例えば対照）の受容体効力と脂質付加ペプチドを比較した場合に、脂質付加ペプチドが、例えば少なくとも約７５％の受容体効力を示し得ることを意味する。さらなる実施形態において、本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチドは、非脂質付加であるかまたは非脂質付加であり、アミノ酸修飾の数が異なるおよび／またはより少ない対応するペプチドまたは他の適切な比較配列（例えば対照）の受容体効力と脂質付加ペプチドを比較した場合に、例えば、約８０％の受容体効力、約８５％の受容体効力、約９０％の受容体効力、約９１％の受容体効力、約９２％の受容体効力、約９３％の受容体効力、約９４％の受容体効力、約９５％の受容体効力、約９６％の受容体効力、約９７％の受容体効力、約９８％の受容体効力、約９９％の受容体効力、約９９．１％の受容体効力、約９９．２％の受容体効力、約９９．３％の受容体効力、約９９．４％の受容体効力、約９９．５％の受容体効力、約９９．６％の受容体効力、約９９．７％の受容体効力、約９９．８％の受容体効力、約９９．９％の受容体効力または約１００％の受容体効力を示し得る。本明細書中で使用する場合、「上昇」とは、受容体効力に言及するとき、脂質付加ペプチドが、非脂質付加であるかまたは非脂質付加であり、アミノ酸修飾の数が異なるおよび／またはより少ない対応するペプチドまたは他の適切な比較配列（例えば対照）の受容体効力よりも高い受容体効力を示すことを意味する。ある一定の実施形態において、受容体効力の上昇は、例えば、１％大きい受容体効力、２％パーセント大きい受容体効力、３％パーセント大きい受容体効力、４％パーセント大きい受容体効力、５％パーセント大きい受容体効力、６％パーセント大きい受容体効力、７％パーセント大きい受容体効力、８％パーセント大きい受容体効力、９％パーセント大きい受容体効力、１０％パーセント大きい受容体効力を指す。ある一定の実施形態において、受容体効力の上昇は、例えば、１％〜１０％大きい受容体効力、１％〜２０％パーセント大きい受容体効力、１％〜３０％パーセント大きい受容体効力、１％〜４０％パーセント大きい受容体効力、１％〜５０％パーセント大きい受容体効力、５％〜１０％大きい受容体効力、５％〜２０％パーセント大きい受容体効力、５％〜３０％パーセント大きい受容体効力、５％〜４０％パーセント大きい受容体効力、５％〜５０％パーセント大きい受容体効力、１０〜５０％パーセント大きい受容体効力、２０〜５０％パーセント大きい受容体効力、３０〜５０％パーセント大きい受容体効力、４０％〜５０％パーセント大きい受容体効力または５０％〜１００％パーセント大きい受容体効力を指す。
【００５７】
全体を通して記載される場合、１個以上の、例えば１個または２個の連結される脂質または脂質部分およびネイティブアミノ酸に対するアルファ−メチル官能性アミノ酸の置換を含む本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチドは、本明細書中に記載のように、少なくとも、脂質または脂質部分または非天然アミノ酸を含まない対応するペプチドまたは他の適切な比較配列（例えば対照）と「実質的に同じ選択性」も維持し得る。本明細書中で使用する場合、「選択性」は、ペプチドがその標的（例えば、それが結合するように設計されるアゴニスト）に結合する能力を指し、一方で他の非標的タンパク質には結合しない。本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチドは、「実質的に同じ選択性」を示し得、したがって、脂質付加ペプチドを、本明細書中で記載のように、脂質または脂質部分を含まないペプチドまたは他の適切な比較配列（例えば対照）の選択性と比較する場合、例えば少なくとも約７５％の選択性を示し得る。例えば、本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチドは、本明細書中で記載のように、脂質または脂質部分を含まない対応するペプチドまたは他の適切な比較配列（例えば対照）の選択性と脂質付加ペプチドを比較した場合、約８０％の選択性、約８５％の選択性、約９０％の選択性、約９１％の選択性、約９２％の選択性、約９３％の選択性、約９４％の選択性、約９５％の選択性、約９６％の選択性、約９７％の選択性、約９８％の選択性、約９９％の選択性、約９９．１％の選択性、約９９．２％の選択性、約９９．３％の選択性、約９９．４％の選択性、約９９．５％の選択性、約９９．６％の選択性、約９９．７％の選択性、約９９．８％の選択性、約９９．９％の選択性または約１００％の選択性を示し得る。ある一定の実施形態において、ＧＬＰ−１類似体における脂質付加および／またはアルファ−メチルアミノ酸の選択的および戦略的な組み込みは両者とも、ＧＬＰ−１受容体効力を上昇させ、したがってこの受容体に対する選択性を上昇させる。
【００５８】
ある一定の実施形態において、本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチドはまた、対応する野生型タンパク質における置換されたネイティブアミノ酸に対応する１個以上のアルファ−メチル官能性アミノ酸も含み得る。例えば、元の、野生型ペプチド配列中のアミノ酸は、同じ側鎖を有するアルファ−メチル官能性アミノ酸で置換され得、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＬｙｓは、それぞれα−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｙｒ、α−ＭｅＳｅｒ、α−ＭｅＡｒｇ、α−ＭｅＡｌａ（Ａｉｂ）、α−ＭｅＶａｌ、α−ＭｅＬｅｕ、α−ＭｅＨｉｓまたはα−ＭｅＬｙｓで置換され得る。
【００５９】
ある一定の実施形態において、本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチド中のアルファ−メチル官能性アミノ酸は、置換ネイティブアミノ酸と同じクラスに対応し得る。例えば、脂肪族アルファ−メチル官能性アミノ酸は、脂肪族ネイティブアミノ酸に対して置換され得；ヒドロキシルアルファ−メチル官能性アミノ酸は、ヒドロキシルネイティブアミノ酸に対して置換され得；硫黄含有アルファ−メチル官能性アミノ酸は、硫黄含有ネイティブアミノ酸に対して置換され得；環状アルファ−メチル官能性アミノ酸は、環状ネイティブアミノ酸に対して置換され得；芳香族アルファ−メチル官能性アミノ酸は、芳香族ネイティブアミノ酸に対して置換され得；塩基性アルファ−メチル官能性アミノ酸は、塩基性ネイティブアミノ酸に対して置換され得；および／または酸性アルファ−メチル官能性アミノ酸は、酸性ネイティブアミノ酸に対して置換され得る。
【００６０】
さらなる実施形態において、本明細書中で提供されるような脂質付加ペプチド中のアルファ−メチル官能性アミノ酸は、置換ネイティブアミノ酸に対応しない。
【００６１】
アルファ−メチル官能性アミノ酸の販売元としては、例えばＢａｃｈｅｍ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄが挙げられる。
【００６２】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加合成ペプチド中の少なくとも１個のアルファ−メチル官能性アミノ酸はアルファ−メチルフェニルアラニンである。
【００６３】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の合成脂質付加ペプチド中の少なくとも１個のアルファ−メチル官能性アミノ酸は、アルファ−メチル官能性ヒスチジン、アルファ−メチル官能性アラニン、アルファ−メチル官能性イソロイシン、アルファ−メチル官能性アルギニン、アルファ−メチル官能性ロイシン、アルファ−メチル官能性アスパラギン、アルファ−メチル官能性リジン、アルファ−メチル官能性アスパラギン酸、アルファ−メチル官能性メチオニン、アルファ−メチル官能性システイン、アルファ−メチル官能性フェニルアラニン、アルファ−メチル官能性グルタミン酸、アルファ−メチル官能性スレオニン、アルファ−メチル官能性グルタミン、アルファ−メチル官能性トリプトファン、アルファ−メチル官能性グリシン、アルファ−メチル官能性バリン、アルファ−メチル官能性オルニチン、アルファ−メチル官能性プロリン、アルファ−メチル官能性セレノシステイン、アルファ−メチル官能性セリンおよびアルファ−メチル官能性チロシンから選択される。
【００６４】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、「タンパク質分解性分解」は、一般に酵素によるペプチド結合の加水分解により引き起こされる、より小さいペプチドまたはさらにはアミノ酸へのペプチドの崩壊を意味する。
【００６６】
タンパク質分解性分解に対して「実質的に耐性」がある脂質付加ペプチドは、例えば、定められた時間にわたる、酵素が一般に活性である条件（例えば、適切なｐＨ、温度、他の環境条件）での酵素への曝露後、少なくとも約５０％がインタクトなままであり得る。本明細書中で提供される脂質付加ペプチドは、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１９２時間、少なくとも２１６時間、少なくとも２４０時間または約３６時間〜約２４０時間、約４８時間〜２４０時間、約７２時間〜約２４０時間、約９６時間〜約２４０時間、約１２０時間〜約２４０時間、約１４４時間〜約２４０時間、約１６８時間〜約２４０時間、約１９２時間〜約２４０時間または約２１６時間〜約２４０時間にわたり、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。ある一定の実施形態において、定められた時間にわたる、酵素が一般に活性である条件での酵素への曝露後、少なくとも約６０％の脂質付加ペプチドがインタクトなままであり、例えば、定められた時間にわたる、酵素が一般に活性である条件での酵素への曝露後、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％または少なくとも約１００％の脂質付加ペプチドがインタクトなままである。
【００６７】
本明細書中で提供される脂質付加ペプチドは、例えばヒトの身体など、実質的に哺乳動物の体内で見られる１個以上の酵素によるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。例えば、脂質付加ペプチドは、実質的に、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシンのうち１個以上によるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。ある一定の実施形態において、脂質付加ペプチドは、列挙される酵素のうち２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上または適切には全てによるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。本明細書中に記載の脂質付加ペプチドはまた、実質的に、当技術分野で公知の他の酵素によるタンパク質分解性分解に対しても耐性があり得る。ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的に、消化性（胃）酵素および／または血液／血清中の酵素によるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。
【００６８】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的に、ＤＰＰ−ＩＶおよびネプリライシンによるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的に、ペプシン、トリプシン、α−キモトリプシンおよびエラスターゼによるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的に、プラスミン、トロンビンおよびカリクレインによるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的に、ペプシン、トリプシンおよびα−キモトリプシンによるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、実質的に、ペプシンおよびトリプシンなどによるタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。
【００６９】
全体を通じて提供される様々な実施形態におけるものを含め、本明細書中に記載のように、アミノ酸残基の脂質付加および／またはネイティブアミノ酸に対するアルファ−官能性アミノ酸の置換は、タンパク質分解性切断の影響を受け易い部位であるネイティブアミノ酸残基で起こり得る。すなわち、置換されるアミノ酸残基は、ネイティブペプチド中のペプチド結合の切断において、タンパク質分解性酵素が活性である部位であるものと判定される。タンパク質分解性切断の部位を決定するための方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中に記載されている。
【００７０】
列挙される特徴を有する脂質付加ペプチドを得るための本明細書中で提供される方法に従い、あらゆるクラスのペプチドを調製し得る。
【００７１】
代表的な実施形態において、脂質付加ペプチドは、インクレチンクラスペプチドであり得る。本明細書中で記載のように調製し得る代表的な合成インクレチンクラスペプチドとしては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）、エキセナチドペプチド、プラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリン、オキシントモジュリン、インスリンまたは血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）が挙げられるが限定されない。
【００７２】
ペプチドのさらなるクラスを本明細書中で記載のように調製し得る。
【００７３】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドは、ＧＬＰ−１の配列由来であり、本明細書中で脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体と呼ぶ。
【００７４】
列挙される特徴を有する合成ペプチドを得るために調製し得る明細書中に記載の様々なペプチドおよびペプチドのクラスのネイティブ（野生型）ペプチドに対する配列は当技術分野で周知である。
【００７５】
ＧＬＰ−１（７−３６）に対するネイティブアミノ酸配列は、以下で示されるように当技術分野で公知である：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号１）。
【００７６】
ある一定の実施形態において、表１で示されるものなど、少なくとも１個の脂質修飾アミノ酸残基を含む脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体が提供される。ある一定の実施形態において、脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、脂質修飾アミノ酸残基を１個しか含有しない。本明細書中で開示される一脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、実質的に、タンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。例えば、ある一定の実施形態において、一脂質付加ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。本明細書中で開示される一脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、対応する非脂質付加ＧＬＰ−１ペプチドまたはＧＬＰ−１ペプチド類似体と、実質的に同じ受容体効力および選択性を維持し得るか、または受容体効力および選択性の上昇を示し得る。
【００７７】
ある一定の実施形態において、一脂質付加ペプチドは、Ｋ（リジン）１個のみまたはＣ（システイン）残基１個のみにおいて脂質付加される。したがって、ある一定の実施形態は、アミノ酸配列：
Ｈ  Ｘ２  Ｅ  Ｇ  Ｓ  Ｘ６  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｖ  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｌ  Ｅ  Ｇ  Ｅ  Ａ  Ａ  Ｘ２０  Ｅ  Ｘ２２  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｖ  Ｖ  Ｘ２８  Ｇ  Ｇ（配列番号２）；
（式中、Ｘ２は、ＡまたはＡｉｂであり；
Ｘ６は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｓ、脂質修飾Ｋまたは脂質修飾Ｃであり；
Ｘ１３は、Ｙまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ２０は、脂質修飾Ｋ、脂質修飾Ｃ、Ｋまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ２２は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ２４は、Ａ、脂質修飾Ｋまたは脂質修飾Ｃであり；
Ｘ２５は、Ｗまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ２８は、Ｋ、Ｅまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸である）
を含む単離ポリペプチドであって、Ｘ１２、Ｘ２０またはＸ２４のうち１個のみにおいて脂質付加される単離ポリペプチドを提供する。
【００７８】
ある一定の実施形態において、一脂質付加ペプチドは、１個以上のアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）置換を含む。配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ２はＡｉｂである。
【００７９】
脂質付加Ｋまたは脂質付加Ｃは、様々な脂質または脂質部分、例えば本明細書中に記載のものの何れかなどに連結され得る。例としては、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；Ｋ（γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−ラウロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）；Ｋ（ε−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアレート）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアレート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ２０は、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）である。
【００８０】
ある一定の実施形態において、アルファ−メチル官能性アミノ酸は、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫである。配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり；Ｘ１１はα−ＭｅＳであり；Ｘ１３はα−ＭｅＦであり；Ｘ２２はα−ＭｅＦであり；Ｘ２５はα−ＭｅＦであり；および／またはＸ２８はα−ＭｅＫである。配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり；Ｘ１１はα−ＭｅＳであり；Ｘ１３はα−ＭｅＦであり；Ｘ２２はα−ＭｅＦであり；Ｘ２５はα−ＭｅＦであり；Ｘ２８はα−ＭｅＫである。配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ２はＡｉｂであり；Ｘ６はα−ＭｅＦであり；Ｘ１１はα−ＭｅＳであり；Ｘ１３はα−ＭｅＦであり；Ｘ２０はＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり；Ｘ２２はα−ＭｅＦであり；Ｘ２５はα−ＭｅＦであり；Ｘ２８はα−ＭｅＫである（配列番号３；表１）。
【００８１】
ある一定の実施形態において、本ペプチドは、配列番号４８（表１）、配列番号６０（表１）または配列番号６８（表１）のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
ある一定の実施形態において、配列番号２、３、４８、６０または６８のアミノ酸配列を含むペプチドは、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性がある。例えば、ある一定の実施形態において、本ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。ある一定の実施形態において、配列番号２、３、４８、６０または６８のアミノ酸配列を含むペプチドは、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと比較した場合、実質的に同じ受容体効力を維持するか、または受容体効力の上昇を示す。ある一定の実施形態において、配列番号２、３、４８、６０または６８のアミノ酸配列を含むペプチドは、少なくとも、対応する非脂質付加ペプチドと比較した場合、実質的に同じ受容体を維持するか、または受容体効力および選択性の上昇を示す。
【００８３】
【表１】
2018518485.tif 000003
【００８４】
【表２】
2018518485.tif 000004
【００８５】
【表３】
2018518485.tif 000005
【００８６】
【表４】
2018518485.tif 000006
【００８７】
【表５】
2018518485.tif 000007
【００８８】
【表６】
2018518485.tif 000008
【００８９】
【表７】
2018518485.tif 000009
【００９０】
【表８】
2018518485.tif 000010
【００９１】
【表９】
2018518485.tif 000011
【００９２】
【表１０】
2018518485.tif 000012
【００９３】
【表１１】
2018518485.tif 000013
【００９４】
【表１２】
2018518485.tif 000014
【００９５】
【表１３】
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【００９６】
【表１４】
2018518485.tif 000016
【００９７】
【表１５】
2018518485.tif 000017
【００９８】
【表１６】
2018518485.tif 000018
【００９９】
【表１７】
2018518485.tif 000019
【０１００】
【表１８】
2018518485.tif 000020
【０１０１】
ある一定の実施形態において、表２で示されるものなど、少なくとも２個の脂質修飾アミノ酸残基を含む脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体が提供される。ある一定の実施形態において、脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、２個の脂質付加アミノ酸残基を含有する。本明細書中で開示されるビス脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、実質的に、タンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。例えば、ある一定の実施形態において、ビス脂質付加ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。本明細書中で開示されるビス脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、対応する非脂質付加ＧＬＰ−１ペプチドまたはＧＬＰ−１ペプチド類似体と、実質的に同じ受容体効力および選択性を維持し得るか、または受容体効力および選択性の上昇を示し得る。
【０１０２】
ビス脂質付加ペプチドは、２個のアミノ酸残基で脂質修飾される。ある一定の実施形態において、これは、同じペプチド中の、２個のＫ（リジン）残基、２個のＣ（システイン）残基または１個のＫおよび１個のＣ残基におけるものであり得る。ある一定の実施形態において、２個のＫ残基が脂質修飾される。したがって、ある一定の実施形態は、アミノ酸配列：
Ｈ  Ｘ２  Ｅ  Ｇ  Ｘ５  Ｘ６  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｘ１０  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｘ１４  Ｅ  Ｇ  Ｘ１７  Ａ  Ａ  Ｘ２０  Ｅ  Ｘ２２  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２６
Ｖ  Ｘ２８  Ｇ  Ｘ３０（配列番号４）；
（式中、Ｘ２は、ＡまたはＡｉｂであり；
Ｘ５は、ＴまたはＳであり；
Ｘ６は、Ｆまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１３は、Ｙ、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１４は、Ｌまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１７は、ＱまたはＥであり；
Ｘ２０は、Ｋ、Ｅまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ２２は、Ｆ、ノルロイシン、チロシンメチルエステルまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２５は、Ｗ、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２６は、Ｌ、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２８は、ＫまたはＥであり；
Ｘ３０は、ＲまたはＧである）を含む単離ポリペプチドであって、
２個の脂質修飾Ｋ残基を含み、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋ残基である、単離ポリペプチドを提供する。
【０１０３】
ある一定の実施形態において、ビス脂質付加ペプチドは、１個以上のアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）置換を含む。配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、Ｘ２はＡｉｂである。ある一定の実施形態において、アルファ−メチル官能性アミノ酸は、α−ＭｅＦ、α−ＭｅＳまたはα−ＭｅＫのうち１個である。
【０１０４】
脂質修飾Ｋ残基は、本明細書中に記載のもののうち何れかなど、様々な脂質または脂質部分に連結され得る。例としては、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。Ｋ残基の脂質修飾は、同じであってもよいし、または異なっていてもよい。ある一定の実施形態において、これらは同じである。したがって、ある一定の実施形態において、少なくとも２個の脂質修飾Ｋ残基は、両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）；または両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり得る。配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、両修飾残基が、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）であり得るか；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）であり得るか；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）であり得るか；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）であり得るか；両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）であり得るか；または両方がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり得る。
【０１０５】
ある一定の実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのアミノ酸脂質修飾は、２カ所の個別の領域で起こり：位置Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４の１個のアミノ酸が脂質修飾Ｋ残基であり、位置Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６の別のアミノ酸が脂質修飾Ｋ残基である。したがって、ある一定の実施形態において：
Ｘ１０が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋであるか；
Ｘ１２が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋであるか；
Ｘ１３が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋであるか；
Ｘ１４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋであるか；
Ｘ２４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋであるか；
Ｘ２５が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋであるか；または
Ｘ２６が脂質修飾Ｋであり、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋである。
【０１０６】
配列番号４のアミノ酸配列を含むビス脂質付加ポリペプチド中のアルファ−メチル官能性アミノ酸の数、位置および正体は変動し得る。ある一定の実施形態において、位置Ｘ６はα−ＭｅＦであり；Ｘ１１はα−ＭｅＳであり；Ｘ２０はα−ＭｅＫであり；および／またはＸ２２はα−ＭｅＦである。ある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦである。ある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり、Ｘ１１はα−ＭｅＳである。ある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり、Ｘ２０はα−ＭｅＫである。ある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり、Ｘ１１はα−ＭｅＳであり、Ｘ２０はα−ＭｅＫであり、Ｘ２２はα−ＭｅＦである。
【０１０７】
ある一定の実施形態において、脂質修飾アミノ酸残基の位置に伴い、配列番号４のアミノ酸配列を含むビス脂質付加ポリペプチド中のアルファ−メチル官能性アミノ酸の数、位置および正体は変動し得る。Ｘ１３が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである、ある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり、Ｘ１１はα−ＭｅＳである。Ｘ１４が脂質修飾Ｋであり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋである、ある一定の実施形態において、Ｘ６はα−ＭｅＦであり、Ｘ１１はα−ＭｅＳである。
【０１０８】
配列番号４のＧＬＰ−１由来のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、１個以上の野生型ＧＬＰ−１配列アミノ酸が別の天然のアミノ酸で置換され得る。例えば、ある一定の実施形態において、位置Ｘ５の野生型Ｔ残基はＳで置換される。ある一定の実施形態において、位置Ｘ１７、Ｘ２８およびＸ３０の野生型Ｑ、ＫおよびＲ残基はそれぞれ、Ｅ、ＥおよびＧでそれぞれ置換され得る。
【０１０９】
配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、本ペプチドは、配列番号２５２（表２）；配列番号２６３（表２）；配列番号２６９（表２）；配列番号４０５（表２）；配列番号４０８（表２）；配列番号４０９（表２）；または配列番号４１０（表２）のアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
ある一定の実施形態において、配列番号４、２５２、２６３、２６９、４０５、４０８、４０９または４１０のアミノ酸配列を含むペプチドは、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性がある。例えば、ある一定の実施形態において、本ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。ある一定の実施形態において、配列番号４、２５２、２６３、２６９、４０５、４０８、４０９または４１０のアミノ酸配列を含むペプチドは、対応する非脂質付加ペプチドと比較した場合、少なくとも実質的に同じ受容体効力を維持する。ある一定の実施形態において、配列番号４、２５２、２６３、２６９、４０５、４０８、４０９または４１０のアミノ酸配列を含むペプチドは、対応する非脂質付加ペプチドと比較した場合、少なくとも実質的に同じ受容体効力および選択性を維持する。
【０１１１】
【表１９】
2018518485.tif 000021
【０１１２】
【表２０】
2018518485.tif 000022
【０１１３】
【表２１】
2018518485.tif 000023
【０１１４】
【表２２】
2018518485.tif 000024
【０１１５】
【表２３】
2018518485.tif 000025
【０１１６】
【表２４】
2018518485.tif 000026
【０１１７】
【表２５】
2018518485.tif 000027
【０１１８】
【表２６】
2018518485.tif 000028
【０１１９】
【表２７】
2018518485.tif 000029
【０１２０】
【表２８】
2018518485.tif 000030
【０１２１】
【表２９】
2018518485.tif 000031
【０１２２】
【表３０】
2018518485.tif 000032
【０１２３】
【表３１】
2018518485.tif 000033
【０１２４】
【表３２】
2018518485.tif 000034
【０１２５】
【表３３】
2018518485.tif 000035
【０１２６】
【表３４】
2018518485.tif 000036
【０１２７】
【表３５】
2018518485.tif 000037
【０１２８】
【表３６】
2018518485.tif 000038
【０１２９】
ある一定の実施形態において、表３で示されるものなど、少なくとも３個の脂質修飾アミノ酸残基を含む脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体が提供される。ある一定の実施形態において、脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、３個の脂質付加アミノ酸残基を含有する。本明細書中で開示される三脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。例えば、ある一定の実施形態において、本三脂質付加ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよび／またはペプシン分解に対して実質的に耐性がある。本明細書中で開示される三脂質付加ＧＬＰ−１ペプチド類似体は、対応する非脂質付加ＧＬＰ−１ペプチドまたはＧＬＰ−１ペプチド類似体と実質的に同じ受容体効力および選択性を維持し得るか、または受容体効力および選択性の上昇を示し得る。
【０１３０】
三脂質付加ペプチドは、３カ所のアミノ酸残基での脂質修飾である。ある一定の実施形態において、これは、同じペプチド中の、３個のＫ（リジン）残基、３個のＣ（システイン）残基におけるものであり得るか、または１個のＫ、１個のＣ残基および３個のＫまたはＣ残基におけるものであり得る。ある一定の実施形態において、３個のＫ残基は脂質修飾される。したがってある一定の実施形態は、アミノ酸配列：
Ｈ（Ａｉｂ）Ｅ  Ｇ  Ｓ（α−ＭｅＦ）Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｘ１０  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｘ１３  Ｘ１４  Ｅ  Ｘ１６  Ｘ１７  Ｘ１８  Ａ（α−ＭｅＫ）Ｘ２１  Ｆ  Ｉ  Ｘ２４  Ｘ２５  Ｘ２６  Ｖ  Ｅ  Ｇ  Ｇ（配列番号４８７）；
（式中、Ｘ１０は、Ｖまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１１は、Ｓまたはアルファ−メチル官能性アミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｓまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１３は、Ｙまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１４は、Ｌまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１６は、Ｇまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１７は、Ｅまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ１８は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２１は、Ｅまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２４は、Ａまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２５は、Ｆまたは脂質修飾Ｋであり；
Ｘ２６は、Ｖまたは脂質修飾Ｋである）を含む単離ポリペプチドであって、
３個の脂質修飾Ｋ残基を含み、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８またはＸ２１のうち１個が脂質修飾Ｋ残基であり、Ｘ２４、Ｘ２５またはＸ２６のうち１個が脂質修飾Ｋ残基である、単離ポリペプチドを提供する。
【０１３１】
脂質修飾Ｋ残基は、本明細書中に記載のものの何れかなど、様々な脂質または脂質部分に連結され得る。例としては、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；および何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。Ｋ残基の脂質修飾は同じであってもよいし、または異なっていてもよい。ある一定の実施形態において、これらは同じである。したがって、ある一定の実施形態において、少なくとも３個の脂質修飾Ｋ残基は、全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）；全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）；または全てＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり得る。配列番号４８７のアミノ酸配列を含むペプチドのある一定の実施形態において、全ての修飾残基がＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ラウロイル）であり得るか；全てがＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミテート）であり得るか；全てがＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ミリストイル）であり得るか；全てがＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−パルミトイル）であり得るか；全てがＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアロイル）であり得るか；または全てがＫ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）であり得る。
【０１３２】
【表３７】
2018518485.tif 000039
【０１３３】
【表３８】
2018518485.tif 000040
【０１３４】
【表３９】
2018518485.tif 000041
【０１３５】
【表４０】
2018518485.tif 000042
【０１３６】
【表４１】
2018518485.tif 000043
【０１３７】
ペプチドのＣ末端は一般に遊離カルボン酸またはアミドの何れかである。したがって、ある一定の態様において、表１、２および３中のペプチドの何れか１つは、Ｃ末端の酸またはＣ末端アミドの何れかを有し得る。ある一定の態様において、表１、２および３中のペプチドの何れか１つはＣ末端の酸を含む。ある一定の態様において、表１、２および３中のペプチドの何れか１つはＣ末端アミドを含む。
【０１３８】
本明細書中で提供される様々なポリペプチドで使用されるリンカーは、構造の形成を促進し得る。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーは、１〜５０個のアミノ酸、１〜２５個のアミノ酸、２５〜５０個のアミノ酸または３０〜５０個のアミノ酸を含み得る。一般に、長いリンカーは高い活性に相関する（より柔軟）だけでなく、ペプチドがより露出されるようになるので安定性も低下する。リンカーは、例えば、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、残基（式中、ｎは、少なくとも１であり、例えば、最大で４、５、６、１０、２０、５０、１００またはそれを超える整数である）を含み得、任意選択により、溶解度を上昇させるためにいくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基が全体的に分散される。あるいは、ある一定のリンカーは、例えばリンカーがＯ−結合グリコシル化を受けることになる場合、セリン残基を全く含まない。いくつかの態様において、例えば２つ以上のアゴニストポリペプチドを二量体の立体配置にするためにリンカーの二量体化が使用される場合、リンカーはシステイン残基を含有し得る。いくつかの態様において、アゴニストポリペプチドは、少なくとも１、２、３、４個またはそれを超えるリンカーを含み得る。リンカーの長さおよびアミノ酸配列は容易に選択および最適化され得る。
【０１３９】
脂質付加ペプチドを調製する方法
ペプチドに脂質および脂質部分を連結する様々な方法が公知であるが、脂質付加ペプチドを調製する少なくとも１つの代表的な方法を本明細書中で提供する。
【０１４０】
ある一定の実施形態において、脂質付加ペプチドは、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲレジンなどのＣ末端カルボキサミドとして調製され得る。ある一定の実施形態において、ＮＭＰ中でＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用し、無水酢酸およびピリジンの溶液で残存する官能基をキャッピングすることなどによって、アミノ酸（天然および非天然の両方）が周囲温度でカップリングされ得る。このような方法において、周囲温度でＤＭＦ中のピペリジン（２０％ｖ／ｖ）を使用してＮ−Ｆｍｏｃ基を脱ブロック化し得、Ｃ末端残基がＮ−Ｂｏｃ−保護型、例えばＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまたはＢｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨまたは同等物として組み込まれる。脂質付加の位置において、自動アセンブリ中にペプチド骨格にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨが組み込まれ得、完了時に、１％ＴＦＡ、２％ＴＩＰＳ、ＤＣＭ（１０×１分、２０．０ｍＬ／ｇ）での合成レジンの処理によって、Ｍｍｔ保護基が手作業で、および選択的に除去され得る。５％ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰなどによって酸性化レジンを不活性化し得、ペプチド切断前に必要とされる場合、露出リジンアミノ官能基をアシル化するか、ＰＥＧ化するか、または脂質付加する。
【０１４１】
適切な切断カクテルでの処理によって、レジン支持体から粗製ペプチドを切断し得る。ある一定の実施形態において、カクテルは、撹拌（周囲温度で３×１時間）を伴う、ＴＦＡ（９５％ｖ／ｖ）、ＴＩＰＳ（２．５％ｖ／ｖ）および水（２．５％ｖ／ｖ）からなる。切断アリコートを合わせ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、遠心分離によって固形物を分離し得る。クロマトグラフィー精製前に、乾燥窒素流下で粗製ペプチドを乾燥させ、適切な水性緩衝液中で再構成し、ろ過し得る。
【０１４２】
酢酸／アセトニトリル／水（１：５：５０  ｖ／ｖ）の溶液中で粗製一脂質付加ペプチドを溶解し、ろ過し得る。２１０ｎｍでのＵＶ吸収により監視して、Ｖａｒｉａｎ  ＳＤ−１  ＰｒｅｐＳｔａｒバイナリポンプ系を用いて、３０分間にわたり、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａ固定相（２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン）上で、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中１０〜７０％、１５〜８０％または２０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状の溶媒勾配で溶出させるなど、粗製ろ液をクロマトグラフィーにかけ得る。次いで、ペプチド含有分画をプールし、凍結（ドライアイス／アセトン）させ、凍結乾燥し得る。
【０１４３】
０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液（１：５アセトニトリル／水ｖ／ｖ、ｐＨ８．０）などにおいて、粗製ビス脂質付加ペプチドを溶解させ、ろ過し得る。２１０ｎｍでのＵＶ吸収により監視して、Ｖａｒｉａｎ  ＳＤ−１  ＰｒｅｐＳｔａｒバイナリポンプ系を用いて、３０分間にわたり、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８固定相（１９．０×２５０ｍｍ、５ミクロン）上でＡに対して２０〜９０％Ｂの直線状の溶媒勾配で溶出させるなど、粗製ろ液をクロマトグラフィーにかけ得る。（Ａ＝水中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、Ｂ＝１：２水／アセトニトリル中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム）。次いで、ペプチド含有分画をプールし、凍結（ドライアイス／アセトン）させ、凍結乾燥し得る。
【０１４４】
ペプチド配列は、表１および２で開示されるものなどのＧＬＰ−１類似体配列であり得る。脂質または脂質部分は、Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−γＥ−ステアレート）；Ｋ（γＥ−パルミトイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ラウロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−ラウロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ラウロイル）；Ｋ（ε−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−１２−（４−カルボキシフェノキシ）ドデカノイル）；Ｋ（ε−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアロイル）；Ｋ（ε−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−γＥ−γＥ−γＥ−ステアレート）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−ステアレート）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）；Ｋ（ε−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ステアレート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−ステアレート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）；Ｋ（ε−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−（ＰＥＧ）２−ステアレート）および何らかのそれらの組み合わせを含むが限定されない、本明細書中で開示される何らかのものなどであり得る。
【０１４５】
合成ペプチドを調製する方法
合成ペプチド調製する方法も提供される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本方法は、適切には、置換のためのペプチド中の少なくとも１個のネイティブアミノ酸残基を同定することを含む。他の実施形態において、本方法、適切には、置換のためのペプチド中の少なくとも２個のネイティブアミノ酸残基を同定することを含む。次いで、同定されたネイティブアミノ酸残基をアルファ−メチル官能性アミノ酸で置換し得る。
【０１４７】
全体にわたり記載されるように、本明細書中で提供される方法によって調製される合成ペプチドは、適切には、置換を含まない対応する合成ペプチドと、実質的に同じ受容体効力および一部の場合では選択性を維持するか、または受容体効力および一部の場合では選択性の上昇を示す。さらに、本明細書中に記載の方法に従い調製される合成ペプチドはまた、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性でもあり得る。
【０１４８】
適切には、本明細書中で提供される方法において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸は置換ネイティブアミノ酸残基に対応し、さらなる実施形態において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸は、置換ネイティブアミノ酸残基と同じクラスに対応する。
【０１４９】
さらなる実施形態において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸はアルファ−メチルフェニルアラニンであり得る。代表的な実施形態において、アルファ−メチルフェニルアラニンは、対応するネイティブアミノ酸に対して置換されるが、本方法のさらなる実施形態において、アルファ−メチルフェニルアラニンは、置換が起こっている同じネイティブアミノ酸に対応する必要はない。
【０１５０】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の方法に従い調製される合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシン分解のうち１つ以上に対して実質的に耐性があり得る。
【０１５１】
実施形態において、合成ペプチドは、ＮＯＶＡＳＹＮ（登録商標）ＴＧＲレジン上でＣ末端カルボキサミドとして調製され得る。ＮＭＰ中でＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用し、無水酢酸およびピリジンの溶液で残存する官能基をキャッピングして、アミノ酸（天然および非天然の両方）を周囲温度でカップリングさせ得る。Ｆｍｏｃは、適切には、周囲温度でＤＭＦ中のピペリジンを使用して脱ブロック化される。
【０１５２】
本明細書中に記載の場合、置換のためのペプチド中の少なくとも１個のネイティブアミノ酸残基を同定することは、適切には、酵素性切断を受け易い部位のアミノ酸を同定することを含む。酵素性切断を受け易い部位のアミノ酸を同定する代表的な方法は当技術分野で周知である。ある一定の実施形態において、酵素性切断を受け易い部位のアミノ酸を同定する方法は、適切には、所定の時間にわたり酵素が活性である条件下で（例えば、適切なｐＨ、緩衝液条件、温度など）、天然ペプチド（例えば野生型ペプチド）を単一酵素に曝露し、ペプチドの酵素性分解産物を測定することを含む。酵素性分解産物を測定するための代表的な方法としては、例えば逆相液体クロマトグラフィー−質量分析が挙げられる。
【０１５３】
プロテアーゼの溶液にペプチド溶液を添加し得る。適切には約３７℃でペプチドおよび酵素を同時温置し得る。温置したペプチド−酵素混合物のアリコートを定期的に採取し、タンパク質分解活性を捕捉するために不活性化し、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって分析し得る。両方のＵＶ吸収（例えば２１０ｎｍ）によって、および質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を使用したイオン化によって、分析物を検出し得る。処理後にペプチドの酵素切断由来のペプチド性の種（断片）を分析し得、正確な切断位置を同定するために、それらの分子質量を使用し得る（各場合において切断し易い結合を強調する）。
【０１５４】
ある一定の実施形態において、列挙される特徴を有するペプチドの何らかのクラスを調製するために、本明細書中に記載の方法を使用し得る。
【０１５５】
ある一定の実施形態において、インクレチンクラスペプチドを調製するために、本方法を使用し得る。本明細書中で記載のように調製し得る合成インクレチンクラスペプチドとしては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）、エキセナチドペプチド、プラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリンおよびオキシントモジュリンが挙げられるが限定されない。
【０１５６】
本明細書中に記載のようにペプチドのさらなるクラスを調製し得る。
【０１５７】
実施形態において、合成ＧＬＰ−１ペプチドを調製するために本方法を使用し得る。さらなる実施形態において、合成インスリンを調製するために本方法を使用し得る。
【０１５８】
さらなる実施形態において、タンパク質分解に対して安定であるペプチドを調製する方法が提供される。適切には、このような方法は、ペプチドを１個以上のプロテアーゼに曝露し、タンパク質分解性切断を受け易い部位である少なくとも２個のネイティブアミノ酸残基を同定し、同定されたアミノ酸残基をアルファ−メチル官能性アミノ酸で置換することを含む。
【０１５９】
全体にわたり記載されるように、適切には、このような方法は、置換を含まない対応する合成ペプチドと、実質的に同じ受容体効力および一部の場合では選択性を維持するか、または受容体効力および一部の場合では選択性の上昇を示す、合成ペプチドを提供する。さらなる実施形態において、本方法はまた、実質的にタンパク質分解性分解に対して耐性がある合成ペプチドも提供する。
【０１６０】
適切には、本明細書中で提供される方法において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸は、置換ネイティブアミノ酸残基に対応し、さらなる実施形態において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸は、置換ネイティブアミノ酸残基と同じクラスに対応する。
【０１６１】
またさらなる実施形態において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸は、アルファ−メチル官能性ヒスチジン、アルファ−メチル官能性アラニン、アルファ−メチル官能性イソロイシン、アルファ−メチル官能性アルギニン、アルファ−メチル官能性ロイシン、アルファ−メチル官能性アスパラギン、アルファ−メチル官能性リジン、アルファ−メチル官能性アスパラギン酸、アルファ−メチル官能性メチオニン、アルファ−メチル官能性システイン、アルファ−メチル官能性フェニルアラニン、アルファ−メチル官能性グルタミン酸、アルファ−メチル官能性スレオニン、アルファ−メチル官能性グルタミン、アルファ−メチル官能性トリプトファン、アルファ−メチル官能性グリシン、アルファ−メチル官能性バリン、アルファ−メチル官能性オルニチン、アルファ−メチル官能性プロリン、アルファ−メチル官能性セレノシステイン、アルファ−メチル官能性セリンおよびアルファ−メチル官能性チロシンから選択され得る。
【０１６２】
さらなる実施形態において、置換アルファ−メチル官能性アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンおよび／またはアルファ−メチルリジンであり得る。代表的な実施形態において、アルファ−メチルフェニルアラニンおよび／またはアルファ−メチルリジンは、対応するネイティブアミノ酸に対して置換され得るが、本方法のさらなる実施形態において、アルファ−メチルフェニルアラニンおよび／またはアルファ−メチルリジンは、置換が起こっている同じネイティブアミノ酸に対応する必要はない。
【０１６３】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の方法に従い調製される合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシン分解のうち１つ以上に対して実質的に耐性があり得る。
【０１６４】
脂質付加ペプチドを含む処方物
本明細書中に記載の脂質付加ペプチドを含む処方物（または医薬組成物）も提供される。適切には、このような処方物は、本明細書中で記載のような脂質付加ペプチドと担体とを含む。このような処方物は、全体を通して記載される様々な方法において容易に投与され得る。いくつかの実施形態において、本処方物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【０１６５】
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、脂質付加ペプチドの生物学的活性の有効性を妨害しない１つ以上の無毒性材料を意味する。「担体」という用語は、適用を促進するために脂質付加ペプチドが合わせられる有機または無機成分、天然または合成を意味する。
【０１６６】
本明細書中に記載のような処方物は、特定の投与量に対して処方し得る。最適反応を提供するために、投与計画を調整し得る。投与を容易にし、投薬を均一にするために単位剤型で非経口組成物を処方することは有用であり得る。単位剤型は、本明細書中で使用する場合、処置しようとする対象に対する単位投与量として適した物理的に分離された単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して治療効果を生じさせるために計算された所定量の脂質付加ペプチドを含有する。単位剤型に対する仕様は、（ａ）脂質付加ペプチドの特有の特徴および達成しようとする特定の治療効果および（ｂ）このような脂質付加ペプチドの合成の技術分野に固有の制限により決定され、これらに直接依存する。
【０１６７】
本明細書中に記載の処方物は、経口、鼻腔、肺、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与などの特定の投与経路に対して処方され得る。本処方物は、都合よく、単位剤型で与えられ得、薬学の技術分野で公知の何らかの方法によって調製され得る。単一剤型を生成させるために担体材料と合わせられ得る脂質付加ペプチドの量は、処置されている対象および特定の投与方式に依存して変動する。単一剤型を生成させるために担体材料と合わせられ得る脂質付加ペプチドの量は、一般に治療効果を生じさせる組成物の量である。
【０１６８】
脂質付加ペプチドを利用した処置方法
本明細書中に記載の、脂質付加ペプチド、例えば処方物を、それを必要とする対象に投与することを含む、患者を処置する方法も本明細書中で提供される。
【０１６９】
適切には、本明細書中に記載の様々な方法で本脂質付加ペプチドを投与され得る対象は、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、霊長類、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタなどである。
【０１７０】
本明細書中に記載の様々な方法の何れかにおいて本脂質付加ペプチドが対象に投与され得る方法としては、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮、経口、内視鏡的、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば肝内）、徐放埋め込み物または皮下投与または浸透圧性もしくは機械ポンプを使用する投与を介したものが挙げられるが限定されない。
【０１７１】
適切には、脂質付加ペプチドは、適切な診断後、例えば数時間または数日以内など、できる限り早く投与され得る。
【０１７２】
本明細書中に記載されるように、適切には、あらゆる年代の成人および小児を含め、ヒトである哺乳動物対象に対して様々な方法が行われ得る。
【０１７３】
ある一定の実施形態において、糖尿病と診断された対象（本明細書中で患者とも呼ぶ）を処置することを含む処置の方法は、治療的有効量の適切な本明細書中で記載のような脂質付加ペプチド、適切には本明細書中に記載のような脂質付加ＧＬＰ−１ペプチドを投与することを含む。
【０１７４】
本明細書中で使用する場合、「治療的有効量」という用語は、疾患または障害（またはその１つ以上の症状）の重症度を軽減する、このような疾患または障害の１つ以上の症状を緩和する、このような疾患または障害の進行を予防する、このような疾患または障害の退行を引き起こす、または別の治療の治療効果を促進もしくは向上させるのに十分である脂質付加ペプチドまたは処方物の量を指す。いくつかの実施形態において、治療的有効量は、予め指定され得ず、医療提供者、例えば医師または他の医療関係者によって、様々な手段、例えば用量漸増法を使用して、決定され得る。
【０１７５】
実施形態において、治療的有効量の脂質付加インスリンを患者に投与することを含む、糖尿病と診断された患者を処置する方法が提供される。
【０１７６】
本明細書中に記載のように、ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の脂質付加ペプチドまたは処方物の投与の方法は、経口で送達され得る。本明細書中に記載のように、脂質付加ペプチドは、実質的に、例えば経口投与後の胃での酵素による分解など、タンパク質分解性分解に対して耐性があり得る。
【０１７７】
実施形態のあらゆるものの範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の方法および適用に対する他の適切な改変および適合がなされ得ることが、関連技術分野の通常の技術者にとって容易に明らかとなろう。次の実施例は、単なる例示のために本明細書中に含まれるものであり、限定するものではない。
【実施例】
【０１７８】
実施例１：タンパク質分解耐性脂質付加ペプチドの化学合成および試験
１．導入
次のものは、本明細書中に記載のようなタンパク質分解耐性ペプチドを調製するための代表的な方法を提供する。
【０１７９】
２．略語
Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＥＫ、エンテロキナーゼ；ＥＳＩ、エレクトロスプレーイオン化法；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＧＩＰ、胃抑制ポリペプチド；ＧＬＰ−１、グルカゴン様ペプチド−１；ＨＣＴＵ、Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；ＥＣ５０、最大半量（５０％）有効濃度；ＬＣ／ＭＳ、液体クロマトグラフィー質量分析法；ＭｅＣＮ、アセトニトリル；Ｍｍｔ、４−メトキシトリチル；ＮＭＰ、Ｎ−メチルピロリジノン；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ｔＢｕ、三級ブチル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；Ｔｒｉｓ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Ｔｒｔ、トリフェニルメチル；ＵＶ、紫外線。
【０１８０】
３．実験
３．１．ペプチド合成
３．１．１．材料
Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を得た。非天然アミノ酸は、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得て、Ｐｈａｒｍａｒｏｎ（Ｃｈｉｎａ）またはＰｅｐｔｅｃｈ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＵＳＡ）により調製された。Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲ（ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｒｉｎｋ）およびＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＡ（ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｗａｎｇ）合成レジンを得た。ペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕプロトコールを用いて自動合成（ＰＴＩ  Ｐｒｅｌｕｄｅ）により調製された。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）は、それらの側鎖トリチル（Ｔｒｔ）誘導体として組み込んだ。トリプトファン（Ｔｒｐ）およびリジン（Ｌｙｓ）は、それらの側鎖Ｂｏｃ誘導体として組み込んだ。セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）およびチロシン（Ｔｙｒ）は、側鎖ｔＢｕエーテルとして組み込み、アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）はそれらの側鎖ＯｔＢｕエステルとして組み込んだ。アルギニン（Ａｒｇ）は、側鎖Ｐｂｆ誘導体として組み込んだ。合成試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから得た。溶媒は、入手可能な最高グレードでＭｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから得て、さらに精製せずに使用した。
【０１８１】
３．１．２．α−メチルアミノ酸を含有する脂質付加ペプチドの化学合成
別段の指示がない限り、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲレジン上でＣ末端カルボキサミドとしてペプチドを調製した（最初の置換０．２４ｍｍｏｌｅ／ｇ）。ＮＭＰ中のＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用して、無水酢酸およびピリジンの溶液で残存する官能基をキャッピングして、周囲温度でアミノ酸（天然および非天然の両方）をカップリングした。周囲温度でＤＭＦ中のピペリジン（２０％ｖ／ｖ）を使用して、Ｎ−Ｆｍｏｃ基を脱ブロック化した。Ｎ−Ｂｏｃ−保護型、例えばＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨまたはＢｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨまたは同等物としてＣ末端残基を組み込んだ。脂質付加の位置で、自動アセンブリ中にＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨをペプチド骨格に組み込み、終了時に、１％ＴＦＡ、２％ＴＩＰＳ、ＤＣＭ（１０×１分、２０．０ｍＬ／ｇ）での合成レジンの処理によってＭｍｔ保護基を手作業で除去した。５％ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰで酸性化レジンを不活性化し、ペプチド切断前に、露出されたリジンアミノ官能基に対して、必要に応じて、アシル化、ＰＥＧ化または脂質付加を行った。
【０１８２】
３．１．３．脂質付加ペプチドの切断
撹拌しながら（周囲温度で３×１時間）ＴＦＡ（９５％ｖ／ｖ）、ＴＩＰＳ（２．５％ｖ／ｖ）、水（２．５％ｖ／ｖ）からなるカクテルでの処理によって、レジン支持体から粗製ペプチドを切断した。切断アリコートを合わせ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、冷ジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、遠心分離によって固形物を分離した。クロマトグラフィー精製前に、乾燥窒素流下で粗製ペプチドを乾燥させ、適切な緩衝液中で再構成し、ろ過した。
【０１８３】
３．１．４．粗製一脂質付加ペプチドの精製
酢酸／アセトニトリル／水（１：５：５０  ｖ／ｖ）の溶液中で粗製一脂質付加ペプチドを溶解させ、ろ過した。２１０ｎｍでのＵＶ吸収により監視し、Ｖａｒｉａｎ  ＳＤ−１  ＰｒｅｐＳｔａｒバイナリポンプ系を用いて、３０分間にわたり、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａ固定相（２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン）上で水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中１０〜７０％、１５〜８０％または２０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状の溶媒勾配で溶出させるなど、粗製ろ液をクロマトグラフィーにかけた。ペプチド含有分画をプールし、凍結（ドライアイス／アセトン）させ、凍結乾燥させた。
【０１８４】
３．１．５．粗製ビス脂質付加ペプチドの精製
０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液（１：５アセトニトリル／水ｖ／ｖ、ｐＨ８．０）中で、粗製ビス脂質付加ペプチドを溶解させ、ろ過した。２１０ｎｍでのＵＶ吸収により監視し、Ｖａｒｉａｎ  ＳＤ−１  ＰｒｅｐＳｔａｒバイナリポンプ系を用いて、３０分間にわたり、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８固定相（１９．０×２５０ｍｍ、５ミクロン）上でＡに対して２０〜９０％Ｂの直線状の溶媒勾配で溶出させるなど、粗製ろ液をクロマトグラフィーにかけた。（Ａ＝水中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、Ｂ＝１：２水／アセトニトリル中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム）。ペプチド含有分画をプールし、凍結（ドライアイス／アセトン）させ、凍結乾燥させた。
【０１８５】
３．１．６．ペプチド分析および特徴評価
Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ  ３１００プラットフォームを使用して、シングル四重極ＬＣ／ＭＳによって、精製ペプチドの特徴を調べた。周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の全体的に直線状の二元勾配を使用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８固定相（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）に対する溶出によって、分析物をクロマトグラフィーにかけた。２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって、分析物を検出し、計算した理論値に対して分子質量を検証した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ二元勾配系を使用して、分析ＲＰ−ＨＰＬＣスペクトルを記録した。水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状の二元勾配を使用して、４０℃、１５分間にわたる、１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１でのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａ固定相（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）に対する溶出によって、分析物をクロマトグラフィーにかけた。
【０１８６】
３．２．α−メチル残基を含有するペプチドのタンパク質分解耐性の評価
表３は、未修飾リガンドにおける多数の部位での加水分解を通じて内因性ペプチドホルモン、例えばＧＬＰ−１の不活性化に関与すると思われるいくつかの市販の循環性および消化性プロテアーゼを詳述する。ネイティブペプチドおよび本明細書中に記載のような既知の影響を受け易い部位でα−メチルアミノ酸を含有するそれらの修飾型の両方とともに、これらのプロテアーゼのうちいくつかを温置した。
【０１８７】
【表４２】
2018518485.tif 000044
【０１８８】
３．３．ペプチドおよびプロテアーゼ保存溶液の調製
ネプリライシン：１０．０μｇ（約１０単位）組み換えネプリライシン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：１１８２−ＺＮＣ−０１０）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に調整）中で１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。非脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）とともに１０μＬ（１μｇ、約１単位）のネプリライシン保存溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：３３。脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）とともに１００μＬ（１０μｇ、約１０単位）のネプリライシン保存溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：２．５。
【０１８９】
ペプシン：凍結乾燥ブタ膵臓ペプシン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ７０１２）をアッセイ緩衝液（０．１Ｍ  ＨＣｌ、ｐＨ２．０）中２００μｇ／ｍＬ（約５００単位／ｍＬ）の溶液になるように再構成して、酵素保存溶液を得た。非脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）とともに、１０μＬ（２μｇ、約５単位）の酵素溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：６。脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）とともに、１００μＬ（２０μｇ、約５０単位）の酵素溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約２：１。
【０１９０】
トリプシン：凍結乾燥ブタ膵臓トリプシン（Ｓｉｇｍａ：Ｔ１４２６）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整）中１００μｇ／ｍＬ（約３００単位／ｍＬ）の溶液になるように再構成して、酵素保存溶液を得た。非脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）とともに、１０μＬ（１μｇ、約３単位）の酵素溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：１１。脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）とともに、１００μＬ（１０μｇ、約３０単位）の酵素溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１．２：１。
【０１９１】
α−キモトリプシン：１０．０μｇ（約１０単位）組み換えα−キモトリプシン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：６９０７−ＳＥ−０１０）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整）中で１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。非脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）とともに、１０μＬ（１μｇ、約１単位）のα−キモトリプシン保存溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：３３。脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）とともに、１００μＬ（１０μｇ、約１０単位）のα−キモトリプシン保存溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：２．５。
【０１９２】
エラスターゼ：１．０ｍｇ（約５単位）凍結乾燥ブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ：Ｅ７８８５）を再構成して、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）中で１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ、約５０単位／ｍＬ）にし、ＮａＯＨ（０．１Ｍ）を使用してｐＨ８．１に調整し、酵素保存溶液を得た。非脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）とともに、２０μＬ（２００μｇ、約１単位）のエラスターゼ保存溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：３３。脂質付加ペプチドの評価のために、１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）とともに、１００μＬ（１０００μｇ、約５単位）のエラスターゼ保存溶液を温置した。酵素（単位）：ペプチド（μｍｏｌｅｓ）の比率は約１：５。
【０１９３】
３．４  ペプチドタンパク質分解手順
３．４．１  ネプリライシンに対する非脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
１０．０μｇ（約１０単位）組み換えネプリライシン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：１１８２−ＺＮＣ−０１０）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に調整）中で１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で３３０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製した。１０μＬ（１μｇ、約１単位）のネプリライシン保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり３７℃の温度制御水浴中で混合物を同時温置した（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：３３）。ペプチド−酵素混合物の１５μＬアリコート（約１５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（１５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を添加することによって、すぐに不活性化し、タンパク質分解活性を捕捉した。２０μＬアリコート（約１０μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出した。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。
【０１９４】
３．４．２  ネプリライシンに対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
１０．０μｇ（約１０単位）組み換えネプリライシン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：１１８２−ＺＮＣ−０１０）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に調整）中で１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で２５０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製した。１００μＬ（１０μｇ、約１０単位）のネプリライシン保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり、３７℃の温度制御浴中で混合物を同時温置した（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：２．５）。ペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコート（約１２．５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（２５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）への添加によってすぐに不活性化し、タンパク質分解活性を捕捉した。２５μＬアリコート（約６μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。表４はこの実験の結果を示す。
【０１９５】
【表４３】
2018518485.tif 000045
【０１９６】
３．４．３  ブタ膵臓ペプシンに対する非脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
凍結乾燥ブタ膵臓ペプシン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ７０１２）をアッセイ緩衝液（１．０Ｍ  ＨＣｌ、ｐＨ２．０）中で２００μｇ／ｍＬ（約５００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で３３０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度に調製した。１０μＬ（２μｇ、約５単位）のペプシン保存溶液を１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり３７℃の温度制御水浴中で混合物を同時温置した（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：６）。ペプチド−酵素混合物の１５μＬアリコート（約１５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、等体積（１５μＬ）の水／アセトニトリル（１：４、ｐＨ８）中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液に添加することによって、すぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉した。２０μＬアリコート（約１０μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。表５はこの実験の結果を示す。
【０１９７】
３．４．４  ブタ膵臓ペプシンに対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
凍結乾燥ブタ膵臓ペプシン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ７０１２）をアッセイ緩衝液（１．０Ｍ  ＨＣｌ、ｐＨ２．０）中で２００μｇ／ｍＬ（約５００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で２５０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製した。５０μＬ（１０μｇ、約２５単位）のペプシン保存溶液を１００μＬのペプチド溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり３７℃の温度制御水浴中で混合物を同時温置した（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：１。ペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコート（約１７μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、等体積（２５μＬ）の水／アセトニトリル（１：４、ｐＨ８）中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液への添加によってすぐに不活性化し、タンパク質分解活性を捕捉した。２５μＬアリコート（約８μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ方法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。表５はこの実験の結果を示す。
【０１９８】
【表４４】
2018518485.tif 000046
【０１９９】
３．４．５  ブタ膵臓トリプシンに対する非脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
凍結乾燥ブタ膵臓トリプシン（Ｓｉｇｍａ：Ｔ７４０９）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整）中で２００μｇ／ｍＬ（約３００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で３３０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製した。１０μＬ（２μｇ、約３単位）のトリプシン保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり３７℃の温度制御水浴中で混合物を同時温置した（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］比率は約１：１１）。ペプチド−酵素混合物の１５μＬアリコート（約１５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（１５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）に添加することによって、すぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉した。２０μＬアリコート（約１０μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。表６はこの実験の結果を示す。
【０２００】
３．４．６  ブタ膵臓トリプシンに対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
凍結乾燥ブタ膵臓トリプシン（Ｓｉｇｍａ：Ｔ７４０９）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整）中で２００μｇ／ｍＬ（約３００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得た。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で２５０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製した。５０μＬ（１０μｇ、約１５単位）のトリプシン保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり、３７℃の温度制御浴中で混合物を同時温置した（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：１．７）。ペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコート（約１７μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（２５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）への添加によってすぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉した。２５μＬアリコート（約８μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。表６はこの実験の結果を示す。
【０２０１】
【表４５】
2018518485.tif 000047
【０２０２】
３．４．７  α−キモトリプシンに対する非脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
１０．０μｇ（約１０単位）組み換えα−キモトリプシン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：６９０７−ＳＥ−０１０）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整）中で１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得る。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で３３０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度に調製する。１０μＬ（１μｇ、約１単位）のα−キモトリプシン保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）に添加し、混合物を実験時間にわたり３７℃の温度制御水浴中で同時温置する（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：３３）。ペプチド−酵素混合物の１５μＬアリコート（約１５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（１５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を添加することによってすぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉する。２０μＬアリコート（約１０μｇ初期ペプチド）を次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣで分析する：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べる。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定する。
【０２０３】
３．４．８  α−キモトリプシンに対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
１０．０μｇ（約１０単位）組み換えα−キモトリプシン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：６９０７−ＳＥ−０１０）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整）中で１００μＬ（１００μｇ／ｍＬ、約１００単位／ｍＬ）に再構成して、酵素保存溶液を得る。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で２５０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製する。１００μＬ（１０μｇ、約１０単位）のα−キモトリプシン保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり、３７℃の温度制御浴中で混合物を同時温置する（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：２．５）。ペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコート（約１２．５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ  ４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（２５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）への添加によって、すぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉する。次のように、ＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって２５μＬアリコート（約６μｇ初期ペプチド）を分析する：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べる。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。手作業での積分（ＡＵＣ）によって、実験の時間経過にわたり残留するインタクトなペプチドを推定する。
【０２０４】
【表４６】
2018518485.tif 000048
【０２０５】
３．４．９  ブタ膵臓エラスターゼに対する非脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
１．０ｍｇ（約５単位）凍結乾燥ブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ：Ｅ７８８５）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）中で１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ、約５０単位／ｍＬ）に再構成し、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）を用いてｐＨ８．１に調整して、酵素保存溶液を得る。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で３３０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製する。２０μＬ（２００μｇ、約１単位）のエラスターゼ保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約３３μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり３７℃の温度制御水浴中で混合物を同時温置する（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：３３）。ペプチド−酵素混合物の１５μＬアリコート（約１５μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１  水／アセトニトリル中の等体積（１５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）に添加することによって、すぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉する。次のように、ＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって２０μＬアリコート（約１０μｇ初期ペプチド）を分析する：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べる。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。手作業での積分（ＡＵＣ）によって、実験の時間経過にわたり、残留するインタクトなペプチドを推定する。
【０２０６】
３．４．１０  ブタ膵臓エラスターゼに対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
１．０ｍｇ（約５単位）凍結乾燥ブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ：Ｅ７８８５）をアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）中で１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ、約５０単位／ｍＬ）に再構成し、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）を用いてｐＨ８．１に調整して、酵素保存溶液を得る。ペプチド保存溶液をアッセイ緩衝液、純水または１ＸＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）中で２５０μＭ（約１．０ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるように調製する。１００μＬ（１０００μｇ、約５単位）のエラスターゼ保存溶液を１００μＬのペプチド保存溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇのペプチド、約２５μｍｏｌｅｓ）に添加し、実験時間にわたり３７℃の温度制御浴中で混合物を同時温置する（酵素［単位］：ペプチド［μｍｏｌｅｓ］の比率は約１：５）。ペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコート（約１７μｇ初期ペプチド）を一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、３０分、１ｈｒ、２ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ）、１：１水／アセトニトリル中の等体積（２５μＬ）の５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）への添加によってすぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉する。次のように、２５μＬアリコート（約８μｇ初期ペプチド）をＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べる。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定する。
【０２０７】
３．４．１１  空腹状態模倣腸液（ＦＡＳＳＩＦ／パンクレアチン（登録商標））に対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
Ｇａｌｉａ，Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｈｏｅｒｔｅｒ、Ｌｏｅｂｅｎｂｅｒｇ，Ｒｅｐｐａｓ  ａｎｄ  Ｄｒｅｓｓｍａｎ：Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（１９９８）６９８−７０５により記載されるものに従い、ＦＡＳＳＩＦ／Ｐ（空腹状態模倣腸液＋ＵＳＰパンクレアチン（登録商標））の新鮮な懸濁液を調製した。得られた調製物は、タンパク質分解の面で約３７５単位／ｍＬ（３７５ｋＵ／Ｌ）と同等であり、保存せずにすぐに使用した。パンクレアチン（登録商標）（２００μＬ）なしで予め加温したＦＡＳＳＩＦ中で評価用のペプチド（１．０ｍｇ、約２５０ｎｍｏｌｅｓ）を最初に溶解し、これに予め加温した新鮮ＦＡＳＳＩＦ／パンクレアチン（登録商標）（１００μＬ）を添加して、可能性のある消化を開始させた。エッペンドルフ反応チューブを瞬間的にボルテックス処理した後、実験時間にわたり、恒温水浴中で３７℃にて混合物を温置した。同時温置ペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコートを一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、５ｍ、１０ｍ、１５ｍ、３０ｍ、１ｈ、２ｈ）、１：１水／アセトニトリル（７５μＬ）中の１０％ＴＦＡの溶液に添加することによって、すぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉した。不活性化した試料を遠心分離して（７８００ＲＰＭ、３分間）、固形物をペレット化し、上清溶液の３０μＬアリコートを次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。
【０２０８】
【表４７】
2018518485.tif 000049
【０２０９】
３．４．１２  エンテロキナーゼによる完全チモーゲン活性化後の空腹状態模倣腸液（ＦＡＳＳＩＦ／パンクレアチン（登録商標））に対する一またはビス脂質付加ペプチドのタンパク質分解耐性の評価
Ｇａｌｉａ，Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｈｏｅｒｔｅｒ，Ｌｏｅｂｅｎｂｅｒｇ，Ｒｅｐｐａｓ  ａｎｄ  Ｄｒｅｓｓｍａｎ：Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（１９９８）６９８−７０５により記載されるものに従い、ＦＡＳＳＩＦ／Ｐ（空腹状態模倣腸液＋ＵＳＰパンクレアチン（登録商標））の新鮮な懸濁液を調製した。得られた調製物にヒトエンテロキナーゼ（１００μｇ／ｍＬ）を添加して、混合物の完全チモーゲン活性についての可能性を確実にし、保存せずにこれをすぐに使用した。パンクレアチン（登録商標）（２００μＬ）なしで予め温めたＦＡＳＳＩＦ中で最初に評価用のペプチド（１．０ｍｇ、約２５０ｎｍｏｌｅｓ）を溶解し、これに予め温めた新鮮ＦＡＳＳＩＦ／パンクレアチン（登録商標）（１００μＬ）を添加して、可能性のある消化を開始させた。エッペンドルフ反応チューブを瞬間的にボルテックス処理した後、混合物を恒温水浴中で３７℃にて実験時間にわたり温置した。同時温置したペプチド−酵素混合物の２５μＬアリコートを一定時間ごとに採取し（ｔ＝０、５ｍ、１０ｍ、１５ｍ、３０ｍ、１ｈ、２ｈ）、１：１水／アセトニトリル（７５μＬ）中の１０％ＴＦＡ溶液に添加することによって、すぐに不活性化して、タンパク質分解活性を捕捉した。不活性化した試料を遠心分離して（７８００ＲＰＭ、３分間）、固形物をペレット化し、上清溶液の３０μＬアリコートを次のようにＬＣ／ＭＳおよび／または分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した：ＬＣ／ＭＳ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、周囲温度にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で３０分間にわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収およびＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いたイオン化法の両方によって検出。酵素加水分解由来のペプチド断片を分子量によって同定し、切断部位の位置を調べた。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ法：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ８−Ａカラム（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、４０℃にて１．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で１０分間または１５分間の何れかにわたり、水（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）中の１０〜９０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ  ｖ／ｖ）の直線状二元勾配で溶出し、２１０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出。実験の時間経過にわたり、手作業での積分（ＡＵＣ）によって、残留するインタクトなペプチドを推定した。
【０２１０】
【表４８】
2018518485.tif 000050
【０２１１】
４．１  ｃＡＭＰアッセイ
生物学的活性について、例えば１つ以上の細胞受容体反応の刺激について、本明細書中に記載の脂質付加ＧＬＰ−１類似体ペプチドの生物学的活性／受容体効力を適切に試験する。標準的な方法によって、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞において、ヒト、マウス、ラットまたはイヌＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）またはグルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（胃抑制ポリペプチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する安定な細胞株を作製する。これらの様々な受容体のペプチド活性化の結果、ｃＡＭＰ二次メッセンジャーの下流での蓄積が起こり、これを機能活性アッセイにおいて測定し得る。
【０２１２】
「アッセイ緩衝液」を使用してｃＡＭＰアッセイを行った：アッセイ緩衝液：ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ８２６４）中０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ３０５９）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ入り、ｐＨ７．４、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ＃Ｉ７０１８）を含有。
【０２１３】
アッセイ緩衝液中で行われる試験試料の１１回の５倍連続希釈を行うために低タンパク質結合３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１２８０）を使用する。試料希釈液は２つ組で作製する。
【０２１４】
水浴中で、関心のある受容体を発現する細胞の凍結クライオバイアルを迅速に凍結融解し、予め温めたアッセイ緩衝液に移し、５分間にわたり２４０×ｇで遠心沈殿を行う。バッチによる最適濃度（例えばｈＧＣＧＲ細胞は２×１０５個／ｍＬ、ｈＧＬＰ−１ＲおよびｈＧＩＰＲ細胞は１×１０５個／ｍＬ）で、アッセイ緩衝液中で細胞を再懸濁する。
【０２１５】
希釈プレートから、５μＬレプリカを黒色のウェルが浅いｕ底３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６７６）上にスタンプする。これに、５μＬ細胞懸濁液を添加し、プレートを室温で３０分間温置する。
【０２１６】
製造者の推奨による２段階プロトコールに従い、市販のｃＡＭＰダイナミック２ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｃａｔ＃６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用してｃＡＭＰレベルを測定する。簡潔に述べると、キット中で提供される結合・溶解緩衝液（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＆  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）中でそれぞれ１／２０希釈することによって、抗ｃＡＭＰクリプタート（ドナーフルオロフォア）およびｃＡＭＰ−ｄ２（アクセプターフルオロフォア）を個別に作製する。５μＬ抗ｃＡＭＰクリプタートをアッセイプレートのウェルに添加し、非特異的結合（ＮＳＢ）ウェルを除くウェルに５μＬ  ｃＡＭＰ−ｄ２を添加し、これに結合・溶解緩衝液（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＆  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を添加する。室温で１時間にわたりプレートを温置し、次いで、３２０ｎｍの励起波長および６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長を使用してＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取る。次いでｃＡＭＰアッセイで決定される合成ペプチドのＥＣ５０値を決定する。
【０２１７】
生物学的活性／受容体効力を決定するためのさらなる実験において、ヒト、マウスまたはラットＧＣＧＲまたはＧＬＰ−１受容体の安定な組み換え体発現があるＣＨＯ細胞を上記のようなアッセイ緩衝液中で培養する）。１×細胞凍結培地−ＤＭＳＯ血清不含（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中、１×１０７または２×１０７個／バイアルの何れかで凍結保存細胞ストックを調製し、−８０℃で保存する。細胞を３７℃で迅速に凍結融解し、次いでヒト、ラットおよびマウス血清アルブミンに対してそれぞれ４．４、３．２および３．２％で血清アルブミンを含有するアッセイ緩衝液（上記のような緩衝液）中で希釈する。ペプチドを１００％ＤＭＳＯ中で連続希釈し、次いで指定の最終濃度で血清アルブミンを含有する上記のようなアッセイ緩衝液中で１００倍希釈する。次いで、希釈したペプチドを３８４黒色浅底ウェルマイクロタイターアッセイプレートに移す。アッセイプレートに細胞を添加し、室温で３０分間温置する。温置後、アッセイを停止させ、製造者のガイドラインに従い、ＣｉｓＢｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手可能なＨＴＲＦ（登録商標）ダイナミックｄ２  ｃＡＭＰアッセイキットを使用してｃＡＭＰレベルを測定する。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）蛍光プレートリーダー上でプレートの読み取りを行う。ヒトおよびラット血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、マウス血清アルブミンはＥｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ  Ｌｔｄ．から購入する。
【０２１８】
製造者のガイドラインに記載のようにデータを％Ｄｅｌｔａ  Ｆに変換し、４−パラメーターロジスティックフィットによって分析して、ＥＣ５０値を決定する。決定したＥＣ５０値は、組み換え細胞株におけるＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体での試験ペプチドの効力ならびに血清アルブミンに対するペプチドの親和性の両方に依存し、これらは遊離ペプチドの量を決定する。血清アルブミンとの結合によって、得られるＥＣ５０値が上昇する。アルブミン血漿濃度での遊離ペプチドの分画および０％血清アルブミン（ＳＡ）でのＥＣ５０は、ＳＡ濃度を用いてｃＡＭＰ生成の変動に基づいて計算し得る。様々なペプチド間および様々な条件にわたるＧＬＰ−１ＲおよびＧＣＧＲでの活性のバランスを比較するために、これらを相関させ得、ここでＥＣ５０は比較ペプチドのものに関連する。表７〜１０は、これらの実験の結果を示す。
【０２１９】
【表４９】
2018518485.tif 000051
【０２２０】
【表５０】
2018518485.tif 000052
【０２２１】
【表５１】
2018518485.tif 000053
【０２２２】
【表５２】
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【０２２３】
【表５３】
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【０２２４】
【表５４】
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【０２２５】
【表５５】
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【０２２６】
【表５６】
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【０２２７】
【表５７】
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【０２２８】
【表５８】
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【０２２９】
【表５９】
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【０２３０】
【表６０】
2018518485.tif 000062
【０２３１】
【表６１】
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【０２３２】
【表６２】
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【０２３３】
【表６３】
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【０２３４】
【表６４】
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【０２３５】
【表６５】
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【０２３６】
【表６６】
2018518485.tif 000068
【０２３７】
【表６７】
2018518485.tif 000069
【０２３８】
【表６８】
2018518485.tif 000070
【０２３９】
比較配列の例は表１３で見られる。さらなる比較配列は、国際公開第２０１５／０８６６８６Ａ２号パンフレットとして公開されている国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７７２４０号明細書で見ることができ、このような配列は本明細書中に参照により組み込まれる。
【０２４０】
本願で引用される全ての書類、特許、雑誌論文および他の資料は参照により本明細書によって組み込まれる。
【０２４１】
本開示は、添付の図面への参照を含め、多数の実施形態を提供するが、様々な変更および改変が当業者にとって明らかであり得ることを理解されたい。このような変更および改変は、それらがそこから逸脱しない限り、添付の特許請求の範囲により定められるように本開示の範囲内に含まれるものと理解されたい。
【図１】
2018518485.tif 000071
【図２】
2018518485.tif 000072
【図３】
2018518485.tif 000073
【図４】
2018518485.tif 000074
【図５】
2018518485.tif 000075
【図６】
2018518485.tif 000076
【図７】
2018518485.tif 000077
【図８】
2018518485.tif 000078
【図９】
2018518485.tif 000079
【図１０】
2018518485.tif 000080
【図１１】
2018518485.tif 000081
【図１２】
2018518485.tif 000082
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018518485.tif 000085
【図１６】
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【配列表】
2018518485000001.app
【国際調査報告】
2018518485.tif 000087
2018518485.tif 000088
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