(57)【要約】  本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体およびそれらの抗原結合断片、ならびにそれらの組成物および使用法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＭＰ９に結合し、
（ａ）それぞれ、配列番号６１、６２、および６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７１、７２、および７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号６４、６５、および６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号１、２、および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｄ）それぞれ、配列番号４、５、および６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｅ）それぞれ、配列番号２１、２２、および２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３１、３２、および３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｆ）それぞれ、配列番号２４、２５、および２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｇ）それぞれ、配列番号４１、４２、および４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５１、５２、および５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｈ）それぞれ、配列番号４４、４５、および４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、および８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９１、９２、および９３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｊ）それぞれ、配列番号８４、８５、および８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９４、９５、および９６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｋ）それぞれ、配列番号１０１、１０２、および１０３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１１、１１２、および１１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｌ）それぞれ、配列番号１０４、１０５、および１０６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１４、１１５、および１１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｍ）それぞれ、配列番号１２１、１２２、および１２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３１、１３２、および１３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｎ）それぞれ、配列番号１２４、１２５、および１２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３４、１３５、および１３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｏ）それぞれ、配列番号１４１、１４２、および１４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５１、１５２、および１５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｐ）それぞれ、配列番号１４４、１４５、および１４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５４、１５５、および１５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｑ）それぞれ、配列番号１６１、１６２、および１６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７１、１７２、および１７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｒ）それぞれ、配列番号１６４、１６５、および１６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７４、１７５、および１７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
（ａ）配列番号６７のＶＨ配列；
（ｂ）配列番号７のＶＨ配列；
（ｃ）配列番号２７のＶＨ配列；
（ｄ）配列番号４７のＶＨ配列；
（ｅ）配列番号８７のＶＨ配列；
（ｆ）配列番号１０７のＶＨ配列；
（ｇ）配列番号１２７のＶＨ配列；
（ｈ）配列番号１４７のＶＨ配列；または
（ｉ）配列番号１６７のＶＨ配列
を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
（ａ）配列番号７７のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号１７のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号３７のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号５７のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号９７のＶＬ配列；
（ｆ）配列番号１１７のＶＬ配列；
（ｇ）配列番号１３７のＶＬ配列；
（ｈ）配列番号１５７のＶＬ配列；または
（ｉ）配列番号１７７のＶＬ配列
を含む、請求項１から２のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
（ａ）配列番号６７のＶＨ配列および配列番号７７のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号７のＶＨ配列および配列番号１７のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号２７のＶＨ配列および配列番号３７のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号４７のＶＨ配列および配列番号５７のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号８７のＶＨ配列および配列番号９７のＶＬ配列；
（ｆ）配列番号１０７のＶＨ配列および配列番号１１７のＶＬ配列；
（ｇ）配列番号１２７のＶＨ配列および配列番号１３７のＶＬ配列；
（ｈ）配列番号１４７のＶＨ配列および配列番号１５７のＶＬ配列；または
（ｉ）配列番号１６７のＶＨ配列および配列番号１７７のＶＬ配列
を含む、請求項１から３のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
（ａ）配列番号６９の重鎖配列；
（ｂ）配列番号９の重鎖配列；
（ｃ）配列番号２９の重鎖配列；
（ｄ）配列番号４９の重鎖配列；
（ｅ）配列番号８９の重鎖配列；
（ｆ）配列番号１０９の重鎖配列；
（ｇ）配列番号１２９の重鎖配列；
（ｈ）配列番号１４９の重鎖配列；または
（ｉ）配列番号１６９の重鎖配列
を含む、請求項１から４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
（ａ）配列番号７９の軽鎖配列；
（ｂ）配列番号１９の軽鎖配列；
（ｃ）配列番号３９の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号５９の軽鎖配列；
（ｅ）配列番号９９の軽鎖配列；
（ｆ）配列番号１１９の軽鎖配列；
（ｇ）配列番号１３９の軽鎖配列；
（ｈ）配列番号１５９の軽鎖配列；または
（ｉ）配列番号１７９の軽鎖配列
を含む、請求項１から５のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
（ａ）配列番号６９の重鎖配列；および配列番号７９の軽鎖配列；
（ｂ）配列番号９の重鎖配列；および配列番号１９の軽鎖配列；
（ｃ）配列番号２９の重鎖配列；および配列番号３９の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号４９の重鎖配列；および配列番号５９の軽鎖配列；
（ｅ）配列番号８９の重鎖配列；および配列番号９９の軽鎖配列；
（ｆ）配列番号１０９の重鎖配列；および配列番号１１９の軽鎖配列；
（ｇ）配列番号１２９の重鎖配列；および配列番号１３９の軽鎖配列；
（ｈ）配列番号１４９の重鎖配列；および配列番号１５９の軽鎖配列；または
（ｉ）配列番号１６９の重鎖配列；および配列番号１７９の軽鎖配列
を含む、請求項１から６のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
ＩｇＧであるか、またはＩｇＧに由来する、請求項１から７のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
免疫コンジュゲートの成分である、請求項１から１０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
Ｆｃ領域内のアミノ酸の突然変異を介して、エフェクター機能が改変された、請求項１から１１のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片を交差遮断する単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
ヒトＢＭＰ９に結合し、（ａ）ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ７、およびヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有し；（ｂ）ヒトＢＭＰ９、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、およびマウスＢＭＰ９に、１ｎＭ未満のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
（ａ）ヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰ９の、Ｉ型ＢＭＰ受容体、例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、もしくはＡＬＫ３への結合を阻害するか；
（ｂ）ヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰ９の、ＩＩ型ＢＭＰ受容体、例えば、ＡｃｔＩＩＲＢへの結合を阻害するか；または
（ｃ）ヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰ９の、Ｉ型ＢＭＰ受容体、例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、もしくはＡＬＫ３、およびＩＩ型ＢＭＰ受容体、例えば、ＡｃｔＩＩＲＢの両方への結合を阻害する、
単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
ヒトＢＭＰ９の、前記Ｉ型ＢＭＰ受容体、前記ＩＩ型ＢＭＰ受容体、または前記Ｉ型ＢＭＰ受容体および前記ＩＩ型ＢＭＰ受容体への前記結合の前記阻害が、約１ｎＭ以下であるＩＣ５０における阻害である、請求項１５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
（ａ）配列番号２１５のアミノ酸残基２１〜２５、４３〜６０、８６、および９６内のエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合するか；または（ｂ）配列番号２１５のアミノ酸残基８３〜８５および９５〜１００内のエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
（ａ）配列番号２１５のアミノ酸残基であるＧ２１、Ｗ２２、Ｓ２４、Ｗ２５、Ｆ４３、Ｐ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｋ５３、Ｉ５６、Ｌ６０、Ｌ６３、Ｙ８６、およびＫ９６を含むエピトープにおいて；（ｂ）配列番号２１５のアミノ酸残基であるＳ８３、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、およびＥ１００を含むエピトープにおいて；（ｃ）配列番号２１５のアミノ酸残基であるＧ２１、Ｗ２２、Ｓ２４、Ｗ２５、Ｆ４３、Ｐ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｋ５３、Ｉ５６、Ｌ６０、Ｌ６３、Ｙ８６、およびＫ９６からなるエピトープにおいて；または（ｄ）配列番号２１５のアミノ酸残基であるＳ８３、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、およびＥ１００からなるエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する、請求項１７に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
（ａ）それぞれ、配列番号１８４、１８５、および１８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９２、１９３、および１９４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号１８１、１８２、および１８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１８９、１９０、および１９１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号１９７、１９８、および１９９の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２０５、２０６、および２０７の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｄ）それぞれ、配列番号２００、２０１、および２０２の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２０８、２０９、および２１０の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体、またはそれらの抗原結合断片である、請求項１から１９のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片、さらなる治療剤を含む組成物。
【請求項２３】
細胞内のＢＭＰ９の活性を低減する方法であって、前記細胞を、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２１から２２のいずれかに記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
【請求項２４】
それを必要とする患者における、ＢＭＰ９を阻害する方法であって、前記患者に、治療有効量の、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２１から２２のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記患者が、肝疾患を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記肝疾患が、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染；Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）感染；自己免疫性肝炎；アルコール曝露；毒素曝露；薬物曝露；肝外傷；胆道閉塞；原発性胆汁性肝硬変；アラジール症候群；慢性肝うっ血；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性硬化性胆管炎；ヘモクロマトーシス；アルファ１−アンチトリプシン欠損症；およびウィルソン病のうちの１つもしくは複数であるか、またはこれらと関連する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝疾患が、肝線維症、門脈高血圧症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝疾患、および肝硬変からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
さらなる治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記さらなる治療剤が、ＢＭＰ９の活性を低減する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記さらなる治療剤が、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはその抗原結合断片、可溶性受容体、タンパク質、または低分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記さらなる治療剤が、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗線維化剤、抗脂肪肝剤、抗アポトーシス剤、肝保護剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記さらなる治療剤が、テノフォビル、エンテカビル、ラミブジン、テルビブジン、アデホビル、ＰＥＧ化インターフェロン、ソホスブビル、テラプレビル、ダクラタスビル、シメプレビル、レダスプレビル、コルチコステロイド、ＧＦＴ−５０５、セニクリビロック、ビタミンＥ、ピオグリタゾン、メトフォルミン、オベチコール酸、ＧＲ−ＭＤ−０２、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）前記単離抗体もしくはその抗原結合断片、および前記さらなる治療剤を、同時もしくは逐次的に投与し、かつ／または（ｂ）前記単離抗体もしくはその抗原結合断片を、前記さらなる治療剤の投与に対して補助的に投与する、請求項２８から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
ヒトＢＭＰ９に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ配列またはＶＬ配列をコードする核酸配列を含み、前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）それぞれ、配列番号６１、６２、および６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７１、７２、および７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号６４、６５、および６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号１、２、および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｄ）それぞれ、配列番号４、５、および６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｅ）それぞれ、配列番号２１、２２、および２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３１、３２、および３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｆ）それぞれ、配列番号２４、２５、および２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｇ）それぞれ、配列番号４１、４２、および４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５１、５２、および５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｈ）それぞれ、配列番号４４、４５、および４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、および８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９１、９２、および９３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｊ）それぞれ、配列番号８４、８５、および８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９４、９５、および９６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｋ）それぞれ、配列番号１０１、１０２、および１０３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１１、１１２、および１１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｌ）それぞれ、配列番号１０４、１０５、および１０６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１４、１１５、および１１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｍ）それぞれ、配列番号１２１、１２２、および１２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３１、１３２、および１３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｎ）それぞれ、配列番号１２４、１２５、および１２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３４、１３５、および１３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｏ）それぞれ、配列番号１４１、１４２、および１４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５１、１５２、および１５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｐ）それぞれ、配列番号１４４、１４５、および１４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５４、１５５、および１５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｑ）それぞれ、配列番号１６１、１６２、および１６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７１、１７２、および１７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｒ）それぞれ、配列番号１６４、１６５、および１６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７４、１７５、および１７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号６７のＶＨ配列；
（ｂ）配列番号７のＶＨ配列；
（ｃ）配列番号２７のＶＨ配列；
（ｄ）配列番号４７のＶＨ配列；
（ｅ）配列番号８７のＶＨ配列；
（ｆ）配列番号１０７のＶＨ配列；
（ｇ）配列番号１２７のＶＨ配列；
（ｈ）配列番号１４７のＶＨ配列；または
（ｉ）配列番号１６７のＶＨ配列
を含むＶＨ配列をコードする、請求項３５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記核酸配列が、
（ａ）配列番号７７のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号１７のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号３７のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号５７のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号９７のＶＬ配列；
（ｆ）配列番号１１７のＶＬ配列；
（ｇ）配列番号１３７のＶＬ配列；
（ｈ）配列番号１５７のＶＬ配列；または
（ｉ）配列番号１７７のＶＬ配列
を含むＶＬ配列をコードする、請求項３５または３６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
ＶＨ配列をコードする核酸配列、およびＶＬ配列をコードする核酸配列を含み、前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号６７のＶＨ配列および配列番号７７のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号７のＶＨ配列および配列番号１７のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号２７のＶＨ配列および配列番号３７のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号４７のＶＨ配列および配列番号５７のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号８７のＶＨ配列および配列番号９７のＶＬ配列；
（ｆ）配列番号１０７のＶＨ配列および配列番号１１７のＶＬ配列；
（ｇ）配列番号１２７のＶＨ配列および配列番号１３７のＶＬ配列；
（ｈ）配列番号１４７のＶＨ配列および配列番号１５７のＶＬ配列；または
（ｉ）配列番号１６７のＶＨ配列および配列番号１７７のＶＬ配列
を含む、請求項３５から３７のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号６９の重鎖配列；
（ｂ）配列番号９の重鎖配列；
（ｃ）配列番号２９の重鎖配列；
（ｄ）配列番号４９の重鎖配列；
（ｅ）配列番号８９の重鎖配列；
（ｆ）配列番号１０９の重鎖配列；
（ｇ）配列番号１２９の重鎖配列；
（ｈ）配列番号１４９の重鎖配列；または
（ｉ）配列番号１６９の重鎖配列
を含む、請求項３５から３８のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号７９の軽鎖配列；
（ｂ）配列番号１９の軽鎖配列；
（ｃ）配列番号３９の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号５９の軽鎖配列；
（ｅ）配列番号９９の軽鎖配列；
（ｆ）配列番号１１９の軽鎖配列；
（ｇ）配列番号１３９の軽鎖配列；
（ｈ）配列番号１５９の軽鎖配列；または
（ｉ）配列番号１７９の軽鎖配列
を含む、請求項３５から３９のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号６９の重鎖配列；および配列番号７９の軽鎖配列；
（ｂ）配列番号９の重鎖配列；および配列番号１９の軽鎖配列；
（ｃ）配列番号２９の重鎖配列；および配列番号３９の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号４９の重鎖配列；および配列番号５９の軽鎖配列；
（ｅ）配列番号８９の重鎖配列；および配列番号９９の軽鎖配列；
（ｆ）配列番号１０９の重鎖配列；および配列番号１１９の軽鎖配列；
（ｇ）配列番号１２９の重鎖配列；および配列番号１３９の軽鎖配列；
（ｈ）配列番号１４９の重鎖配列；および配列番号１５９の軽鎖配列；または
（ｉ）配列番号１６９の重鎖配列；および配列番号１７９の軽鎖配列
を含む、請求項３５から４０のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
ヒトＢＭＰ９に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖または軽鎖をコードする核酸を含み、
（ａ）配列番号７０の重鎖配列；
（ｂ）配列番号６８のＶＨ配列；
（ｃ）配列番号８０の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号７８のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号１０の重鎖配列；
（ｆ）配列番号８のＶＨ配列；
（ｇ）配列番号２０の軽鎖配列；
（ｈ）配列番号１８のＶＬ配列；
（ｉ）配列番号３０の重鎖配列；
（ｊ）配列番号２８のＶＨ配列；
（ｋ）配列番号４０の軽鎖配列；
（ｌ）配列番号３８のＶＬ配列；
（ｍ）配列番号５０の重鎖配列；
（ｎ）配列番号４８のＶＨ配列；
（ｏ）配列番号６０の軽鎖配列；
（ｐ）配列番号５８のＶＬ配列；
（ｑ）配列番号９０の重鎖配列；
（ｒ）配列番号８８のＶＨ配列；
（ｓ）配列番号１００の軽鎖配列；
（ｔ）配列番号９８のＶＬ配列；
（ｕ）配列番号１１０の重鎖配列；
（ｖ）配列番号１０８のＶＨ配列；
（ｗ）配列番号１２０の軽鎖配列；
（ｘ）配列番号１１８のＶＬ配列；
（ｙ）配列番号１３０の重鎖配列；
（ｚ）配列番号１２８のＶＨ配列；
（ａａ）配列番号１４０の軽鎖配列；
（ｂｂ）配列番号１３８のＶＬ配列；
（ｃｃ）配列番号１５０の重鎖配列；
（ｄｄ）配列番号１４８のＶＨ配列；
（ｅｅ）配列番号１６０の軽鎖配列；
（ｆｆ）配列番号１５８のＶＬ配列；
（ｇｇ）配列番号１７０の重鎖配列；
（ｈｈ）配列番号１６８のＶＨ配列；
（ｉｉ）配列番号１８０の軽鎖配列；または
（ｊｊ）配列番号１７８のＶＬ配列；
のうちのいずれかの配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
ヒトＢＭＰ９に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨおよびＶＬをコードし、
（ａ）配列番号６８のＶＨ配列および配列番号７８のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号８のＶＨ配列および配列番号１８のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号２８のＶＨ配列および配列番号３８のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号４８のＶＨ配列および配列番号５８のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号８８のＶＨ配列および配列番号９８のＶＬ配列；
（ｆ）配列番号１０８のＶＨ配列および配列番号１１８のＶＬ配列；
（ｇ）配列番号１２８のＶＨ配列および配列番号１３８のＶＬ配列；
（ｈ）配列番号１４８のＶＨ配列および配列番号１５８のＶＬ配列；または
（ｉ）配列番号１６８のＶＨ配列および配列番号１７８のＶＬ配列
のうちのいずれかの配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
単一の連続ポリヌクレオチド上に配置された、請求項３４から４３のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
２つ以上の連続ポリヌクレオチド上に配置された、請求項３４から４３のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項３４から４５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４７】
請求項４６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４８】
請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片、請求項２１から２２のいずれかに記載の組成物、請求項３４から４５のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４６に記載のベクター、または請求項４７に記載の細胞の、医薬の製造における使用。
【請求項４９】
医薬としての使用のための、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片。
【請求項５０】
治療における使用のための、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片。
【請求項５１】
肝疾患を有する対象の処置における使用のための、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片。
【請求項５２】
前記肝疾患が、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染；Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）感染；自己免疫性肝炎；アルコール曝露；毒素曝露；薬物曝露；肝外傷；胆道閉塞；原発性胆汁性肝硬変；アラジール症候群；慢性肝うっ血；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性硬化性胆管炎；ヘモクロマトーシス；アルファ１−アンチトリプシン欠損症；およびウィルソン病であるか、またはこれらと関連する、請求項５１に記載の使用のための単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５３】
前記肝疾患が、肝線維症、門脈高血圧症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝疾患、または肝硬変からなる群から選択される、請求項５１に記載の使用のための単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５４】
それを必要とする患者におけるＢＭＰ９の活性の低減における使用のための、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５５】
ヒトＢＭＰ９に結合し、表１に列挙される抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５６】
表１に列挙される、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５７】
ヒトＢＭＰ９に結合し、
（ａ）表１に記載されるＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含み；
（ｂ）表１に記載されるＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含み；
（ｃ）表１に記載されるＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および表１に記載されるＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含み；
（ｄ）表１に記載される軽鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含み；
（ｅ）表１に記載される重鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含み；かつ／または
（ｆ）表１に記載される軽鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列、および表１に記載される重鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含む、
単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５８】
請求項５５から５７のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年６月５日に出願されたＰＣＴ公開／第ＰＣＴ／ＣＮ２０１５／０８０８８７号に対する優先権を主張する。同出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにより電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０１６年５月４日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５６９２８−ＷＯ−ＰＣＴ０２＿ＳＬ．ＴＸＴと名付けられ、１６８，４８７バイトのサイズである。
【０００３】
序説
本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片、ならびにそれらの組成物および使用法に関する。
【背景技術】
【０００４】
線維症とは、臓器内または組織内の細胞による、過剰な線維性結合組織の異常な形成または発生を指す病理学的過程である。線維症と関連する過程は、正常組織の形成または修復の一部として生じうるが、これらの過程の調節異常は、組織または臓器の機能を次第に損なう、細胞組成の改変および過剰な結合組織の沈着をもたらしうる。
【発明の概要】
【０００５】
肝硬変を含む線維性肝疾患には、全世界で１億人を超える人々が罹患し、毎年１００万件を超える死亡を引き起こしている。線維性肝疾患および肝硬変の主要な帰結のうちの１つである門脈高血圧症が、疾患の合併症の多くの原因となっている。肝硬変を含む線維性肝疾患を含む肝疾患のための既存の療法は、有効性が小さく、所望されない副作用を有しうる。さらに、肝硬変を含む線維性肝疾患を含む肝疾患のための、十分に効果的な処置または治癒は、現在のところ存在しない。したがって、線維性肝疾患および肝硬変を含み、門脈高血圧症などのその帰結を含む肝疾患を、阻害、防止、または転導することが可能であり、したがって、対象における肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症を処置または防止するのに使用されうる部分、ならびにこれらの消耗性疾患を診断するための方法も、大いに必要とされている。
【０００６】
本発明は、単離ＢＭＰ９結合分子（例えば、ＢＭＰ９結合抗体またはそれらの抗原結合断片）、このような分子を含む医薬組成物、このような分子および組成物を作製する方法、ならびに疾患、例えば、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、および門脈高血圧症の処置におけるその使用法を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１における抗体のうちのいずれかの、任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−１の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００９】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−２の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−３の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−４の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１２】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−５の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１３】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−６の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１４】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−７の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１５】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−８の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１６】
一態様では、本発明は、ＢＭＰ９に対する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＢＭＰ９−９の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１７】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１、２、および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００１８】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号４、５、および６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００１９】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号２１、２２、および２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３１、３２、および３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２０】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号２４、２５、および２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２１】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号４１、４２、および４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５１、５２、および５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２２】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号４４、４５、および４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２３】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号６１、６２、および６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７１、７２、および７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２４】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号６４、６５、および６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２５】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号８１、８２、および８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９１、９２、および９３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２６】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号８４、８５、および８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９４、９５、および９６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２７】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１０１、１０２、および１０３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１１、１１２、および１１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２８】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１０４、１０５、および１０６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１４、１１５、および１１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００２９】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１２１、１２２、および１２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３１、１３２、および１３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００３０】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１２４、１２５、および１２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３４、１３５、および１３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００３１】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１４１、１４２、および１４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５１、１５２、および１５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００３２】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１４４、１４５、および１４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５４、１５５、および１５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００３３】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１６１、１６２、および１６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７１、１７２、および１７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００３４】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＭＰ９に結合し、
それぞれ、配列番号１６４、１６５、および１６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７４、１７５、および１７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【００３５】
本発明の一態様では、ヒトＢＭＰ９に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）それぞれ、配列番号１、２、および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号４、５、および６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号２１、２２、および２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３１、３２、および３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｄ）それぞれ、配列番号２４、２５、および２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｅ）それぞれ、配列番号４１、４２、および４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５１、５２、および５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｆ）それぞれ、配列番号４４、４５、および４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｇ）それぞれ、配列番号６１、６２、および６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７１、７２、および７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｈ）それぞれ、配列番号６４、６５、および６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、および８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９１、９２、および９３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｊ）それぞれ、配列番号８４、８５、および８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９４、９５、および９６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｋ）それぞれ、配列番号１０１、１０２、および１０３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１１、１１２、および１１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｌ）それぞれ、配列番号１０４、１０５、および１０６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１４、１１５、および１１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｍ）それぞれ、配列番号１２１、１２２、および１２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３１、１３２、および１３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｎ）それぞれ、配列番号１２４、１２５、および１２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３４、１３５、および１３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｏ）それぞれ、配列番号１４１、１４２、および１４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５１、１５２、および１５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｐ）それぞれ、配列番号１４４、１４５、および１４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５４、１５５、および１５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｑ）それぞれ、配列番号１６１、１６２、および１６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７１、１７２、および１７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｒ）それぞれ、配列番号１６４、１６５、および１６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７４、１７５、および１７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
のうちのいずれか１つまたは複数に対する、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定（ＣＤＲ）配列を含む。
【００３６】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−１のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−１のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−１のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００３７】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−２のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−２のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−２のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００３８】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−３のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−３のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−３のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００３９】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−４のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−４のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−４のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４０】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−５のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−５のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−５のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４１】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−６のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−６のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−６のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４２】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−７のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−７のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−７のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４３】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−８のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−８のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−８のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４４】
一態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−９のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。別の態様では、本発明は、表１に記載される、ＢＭＰ９−９のＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および／または表１に記載される、ＢＭＰ９−９のＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４５】
一態様では、本発明は、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４６】
一態様では、本発明は、
配列番号７のＶＨ配列；配列番号２７のＶＨ配列；配列番号４７のＶＨ配列；配列番号６７のＶＨ配列；配列番号８７のＶＨ配列；配列番号１０７のＶＨ配列；配列番号１２７のＶＨ配列；配列番号１４７のＶＨ配列；または配列番号１６７のＶＨ配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４７】
一態様では、本発明は、
配列番号１７のＶＬ配列；配列番号３７のＶＬ配列；配列番号５７のＶＬ配列；配列番号７７のＶＬ配列；配列番号９７のＶＬ配列；配列番号１１７のＶＬ配列；配列番号１３７のＶＬ配列；配列番号１５７のＶＬ配列；または配列番号１７７のＶＬ配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４８】
一態様では、本発明は、
配列番号７のＶＨ配列および配列番号１７のＶＬ配列；配列番号２７のＶＨ配列および配列番号３７のＶＬ配列；配列番号４７のＶＨ配列および配列番号５７のＶＬ配列；配列番号６７のＶＨ配列および配列番号７７のＶＬ配列；配列番号８７のＶＨ配列および配列番号９７のＶＬ配列；配列番号１０７のＶＨ配列および配列番号１１７のＶＬ配列；配列番号１２７のＶＨ配列および配列番号１３７のＶＬ配列；配列番号１４７のＶＨ配列および配列番号１５７のＶＬ配列；または配列番号１６７のＶＨ配列および配列番号１７７のＶＬ配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４９】
一態様では、本発明は、
配列番号９の重鎖配列；配列番号２９の重鎖配列；配列番号４９の重鎖配列；配列番号６９の重鎖配列；配列番号８９の重鎖配列；配列番号１０９の重鎖配列；配列番号１２９の重鎖配列；配列番号１４９の重鎖配列；または配列番号１６９の重鎖配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５０】
一態様では、本発明は、
配列番号１９の軽鎖配列；配列番号３９の軽鎖配列；配列番号５９の軽鎖配列；配列番号７９の軽鎖配列；配列番号９９の軽鎖配列；配列番号１１９の軽鎖配列；配列番号１３９の軽鎖配列；配列番号１５９の軽鎖配列；または配列番号１７９の軽鎖配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５１】
一態様では、本発明は、
配列番号９の重鎖配列；および配列番号１９の軽鎖配列；配列番号２９の重鎖配列；および配列番号３９の軽鎖配列；配列番号４９の重鎖配列；および配列番号５９の軽鎖配列；配列番号６９の重鎖配列；および配列番号７９の軽鎖配列；配列番号８９の重鎖配列；および配列番号９９の軽鎖配列；配列番号１０９の重鎖配列；および配列番号１１９の軽鎖配列；配列番号１２９の重鎖配列；および配列番号１３９の軽鎖配列；配列番号１４９の重鎖配列；および配列番号１５９の軽鎖配列；または配列番号１６９の重鎖配列；および配列番号１７９の軽鎖配列
を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５２】
本発明はまた、配列番号９の重鎖配列；配列番号２９の重鎖配列；配列番号４９の重鎖配列；配列番号６９の重鎖配列；配列番号８９の重鎖配列；配列番号１０９の重鎖配列；配列番号１２９の重鎖配列；配列番号１４９の重鎖配列；もしくは配列番号１６９の重鎖配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖、および／または配列番号１９の軽鎖配列；配列番号３９の軽鎖配列；配列番号５９の軽鎖配列；配列番号７９の軽鎖配列；配列番号９９の軽鎖配列；配列番号１１９の軽鎖配列；配列番号１３９の軽鎖配列；配列番号１５９の軽鎖配列；もしくは配列番号１７９の軽鎖配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を有するＢＭＰ９に結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。
【００５３】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に、１ｎＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５４】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に、５００ｐＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５５】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に、２００ｐＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５６】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に、１００ｐＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５７】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に、５０ｐＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５８】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に、２０ｐＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５９】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ１０に対するアフィニティーの、少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６０】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの、少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６１】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６２】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ７、およびヒトＢＭＰ１０に対するアフィニティーの、少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６３】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ１０に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６４】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６５】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６６】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ７、およびヒトＢＭＰ１０に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６７】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、および／またはマウスＢＭＰ９に、１ｎＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６８】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、および／またはマウスＢＭＰ９に、０．５ｎＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６９】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、および／またはマウスＢＭＰ９に、０．２ｎＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７０】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、および／またはマウスＢＭＰ９に、０．０５ｎＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７１】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、（ａ）ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ７、およびヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有し；（ｂ）ヒトＢＭＰ９、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、およびマウスＢＭＰ９に、１ｎＭ以下のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。ＫＤを列挙する前出の態様のうちのいずれかでは、ＫＤを、例えば、本明細書で記載される、ＭＳＤ−ＳＥＴアッセイにより測定することができる。
【００７２】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて、ヒトＢＭＰ１０への検出可能な結合を有さない、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７３】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の、ヒトＩ型ＢＭＰ受容体、例えば、ヒトＡＬＫ１、ヒトＡＬＫ２、および／またはヒトＡＬＫ３への結合を阻害する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７４】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の、ヒトＩＩ型ＢＭＰ受容体、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはヒトＢＭＰＲＩＩへの結合を阻害する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７５】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の、ヒトＩ型ＢＭＰ受容体、例えば、ヒトＡＬＫ１、ヒトＡＬＫ２、および／またはヒトＡＬＫ３への結合を阻害し、ヒトＢＭＰ９の、ヒトＩＩ型ＢＭＰ受容体、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはヒトＢＭＰＲＩＩへの結合を阻害する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。ヒトＩ型ＢＭＰ受容体およびヒトＩＩ型ＢＭＰ受容体の両方の、ヒトＢＭＰ９への結合の前記阻害は、同時でなくともよい。
【００７６】
前出の態様のうちのいずれかでは、ヒトＢＭＰ９の、Ｉ型ＢＭＰ受容体および／またはＩＩ型ＢＭＰ受容体への結合の阻害は、単離抗体またはその抗原結合断片の濃度が、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、または１×１０−９Ｍ未満であるときに生じる。一態様では、ヒトＢＭＰ９の、Ｉ型ＢＭＰ受容体および／またはＩＩ型ＢＭＰ受容体への結合の阻害は、単離抗体またはその抗原結合断片の濃度が、例えば、本明細書で記載される、ブロッキングＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される通り、１×１０−９Ｍ未満であるときに生じる。
【００７７】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、例えば、本明細書で記載されるアッセイにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝細胞株内または原発性肝細胞内の、ＢＭＰ９により誘導されるＩＤ１の発現の、少なくとも約５０％の低減を呈する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７８】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、例えば、本明細書で記載されるアッセイにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ９の活性を低減する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００７９】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、例えば、本明細書で記載される、ＨＥＫＴ−ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ９の活性を低減する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００８０】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ヒトＢＭＰ９の活性を低減する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００８１】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、前出の態様のうちのいずれかの抗体またはその単離抗原結合断片を交差遮断する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書で記載される、前出の態様のうちのいずれかの抗体またはその抗原結合断片を、約５００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の濃度で交差遮断する。
【００８２】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、（ａ）ヒトＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ７、およびヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも約１０００倍のアフィニティーを有し；（ｂ）ヒトＢＭＰ９、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、およびマウスＢＭＰ９に、１ｎＭ未満のＫＤで結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体、またはそれらの抗原結合断片である。
【００８３】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイにおいて測定される、２００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイにおいて測定される、１００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体、またはそれらの抗原結合断片である。
【００８４】
前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイにおいて測定される、約２００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。前出の態様のうちのいずれかを含む一態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイにおいて測定される、約１００ｐＭ以下のＩＣ５０を有する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体、またはそれらの抗原結合断片である。
【００８５】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の成熟断片である、配列番号２１５のアミノ酸残基２１〜２５、４３〜６０、８６、および９６を含むエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００８６】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の成熟断片である、配列番号２１５のアミノ酸残基２１〜２５、４３〜６０、８６、および９６内のエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００８７】
一態様では、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸残基２１〜２５、４３〜６０、８６、および９６を含むエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。一部の態様では、結合は、単離抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸と、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＧ２１、Ｗ２２、Ｓ２４、Ｗ２５、Ｆ４３、Ｐ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｋ５３、Ｉ５６、Ｌ６０、Ｌ６３、Ｙ８６、およびＫ９６との間の、直接的な相互作用を含む。
【００８８】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合し、ａ）軽鎖可変領域内のアミノ酸残基であるＹ３２、Ｄ５０、Ｓ９１、Ｄ９２、Ｔ９３、Ｓ９４、およびＬ９６と；ｂ）重鎖可変領域内のアミノ酸残基であるＷ４７、Ｉ５０、Ｌ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｉ１０２、Ｗ１０３、およびＳ１０４とを含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００８９】
一態様では、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸残基２１〜２５、４３〜６０、８６、および９６からなるエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。一部の態様では、結合は、単離抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸と、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＧ２１、Ｗ２２、Ｓ２４、Ｗ２５、Ｆ４３、Ｐ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｋ５３、Ｉ５６、Ｌ６０、Ｌ６３、Ｙ８６、およびＫ９６との間の、直接的な相互作用を含む。
【００９０】
一態様では、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＧ２１、Ｗ２２、Ｓ２４、Ｗ２５、Ｆ４３、Ｐ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｋ５３、Ｉ５６、Ｌ６０、Ｌ６３、Ｙ８６、およびＫ９６からなるエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９１】
一態様では、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＧ２１、Ｗ２２、Ｓ２４、Ｗ２５、Ｆ４３、Ｐ４４、Ｌ４５、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｋ５３、Ｉ５６、Ｌ６０、Ｌ６３、Ｙ８６、およびＫ９６を含むエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９２】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９の成熟断片である、配列番号２１５のアミノ酸残基８３〜８５および９５〜１００内のエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００９３】
一態様では、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＳ８３、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、およびＥ１００を含むエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。一部の態様では、結合は、単離抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸と、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＳ８３、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、およびＥ１００との間の、直接的な相互作用を含む。
【００９４】
一態様では、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＳ８３、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、およびＥ１００からなるエピトープにおいて、ヒトＢＭＰ９の成熟断片に結合する単離抗体またはその抗原結合断片に関する。一部の態様では、結合は、単離抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸と、配列番号２１５のアミノ酸残基であるＳ８３、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、およびＥ１００との間の、直接的な相互作用を含む。
【００９５】
一態様では、本発明は、例えば、マウス単離抗体もしくはその抗原結合断片、またはヒト化単離抗体もしくはその抗原結合断片である、それぞれ、配列番号１８４、１８５、および１８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ、配列番号１９２、１９３、および１９４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００９６】
一態様では、本発明は、表３に記載されるＢ２１１Ｇ２である単離抗体またはその抗原結合断片に関する。一部の態様では、本発明は、Ｂ２１１Ｇ２に由来するヒト化抗体に関する。
【００９７】
一態様では、本発明は、例えば、マウス単離抗体もしくはその抗原結合断片、またはヒト化単離抗体もしくはその抗原結合断片である、それぞれ、配列番号２００、２０１、および２０２の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ、配列番号２０８、２０９、および２１０の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００９８】
一態様では、本発明は、表３に記載される４Ｅ１０Ｄ７である単離抗体またはその抗原結合断片に関する。一部の態様では、本発明は、４Ｅ１０Ｄ７に由来するヒト化抗体に関する。
【００９９】
一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、単離モノクローナル抗体である。一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、単離ヒトモノクローナル抗体である。一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体である。一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、単離キメラ抗体である。一態様では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。
【０１００】
本発明の一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、単鎖抗体である。
【０１０１】
本発明の一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である。
【０１０２】
本発明の一態様では、ＢＭＰ９に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
【０１０３】
一態様では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、ＩｇＧであるか、またはＩｇＧに由来する。本発明の一態様では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
【０１０４】
本発明の一態様では、単離抗体またはそれらの抗原結合断片は、アミノ酸を、それぞれのヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列に由来する抗体フレームワークへと置換したフレームワークを含む。一態様では、抗体フレームワークへと置換されたアミノ酸は、Ｂ２１１Ｇ２からのものであるか、またはＢ２１１Ｇ２に由来する。一態様では、抗体フレームワークへと置換されたアミノ酸は、４Ｅ１０Ｄ７からのものであるか、または４Ｅ１０Ｄ７に由来する。一部の態様では、抗体フレームワークへと置換されたアミノ酸は、ＣＤＲアミノ酸を含む。
【０１０５】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、免疫コンジュゲートの成分である。一態様では、免疫コンジュゲートは、単離抗体またはその抗原結合断片、および、非限定的な例として、以下：酵素、毒素、ホルモン、成長因子、または薬物のうちのいずれかを含みうる。
【０１０６】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃ領域の突然変異を介して、エフェクター機能が改変されている。
【０１０７】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、肝細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝細胞株および／または原発性肝細胞）内のＢＭＰ９の活性、例えば、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化またはＩｄ１の発現を阻害する。このような態様では、原発性肝細胞は、肝臓内、例えば、肝細胞内に存在する、任意の細胞型を含む。本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、肝細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝細胞株および／または原発性肝細胞）内のＢＭＰ９の活性、例えば、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化またはＩｄ１の発現を、少なくとも約５０％阻害する。例えば、単離抗体またはその抗原結合断片は、肝細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝細胞株および／または原発性肝細胞）内のＢＭＰ９の活性、例えば、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化またはＩｄ１の発現を、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、または１００％阻害する。ＢＭＰ９の活性は、非限定的な例として、ｓｍａｄ１／５／８リン酸化の量、もしくはＩｄ１のｍＲＮＡの量またはタンパク質レベルを測定することにより測定することができる。
【０１０８】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ９の活性を低減する。本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書で記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ９の活性を低減する。
【０１０９】
一態様では、本発明は、例えば、本明細書で、例えば、表１に記載される、前出の態様のうちのいずれかの単離抗体またはその抗原結合断片、およびさらなる治療剤を提供する。さらなる治療剤は、単離抗体またはその抗原結合断片を含む組成物中に存在する場合もあり、別個の組成物中に存在する場合もある。
【０１１０】
本発明の一態様では、さらなる治療剤は、ＢＭＰ９の活性を低減する。
【０１１１】
本発明の一態様では、さらなる治療剤は、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはその抗原結合断片、可溶性ＢＭＰ９受容体、タンパク質、または低分子である。
【０１１２】
一態様では、さらなる治療剤は、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗線維化剤、抗脂肪肝剤、抗アポトーシス剤、肝保護剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１３】
一態様では、さらなる治療剤は、テノフォビル、エンテカビル、ラミブジン、テルビブジン、アデホビル、ＰＥＧ化インターフェロン、ソホスブビル、テラプレビル、ダクラタスビル、シメプレビル、レダスプレビル、コルチコステロイド、ＧＦＴ−５０５、セニクリビロック、ビタミンＥ、ピオグリタゾン、メトフォルミン、オベチコール酸、ＧＲ−ＭＤ−０２、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書の、例えば、表１に記載される、前出の態様のいずれかを含む単離抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。組成物は、任意選択で、例えば、本明細書で記載される、さらなる治療剤を、さらに含みうる。
【０１１５】
一態様では、例えば、表１に記載される、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする患者に、本明細書で記載されているか、または当技術分野で公知の治療法または治療手順などの治療法または治療手順と共に投与することができる。単離抗体またはその抗原結合断片は、方法または手順の前に、この後で、またはこれらと同時に投与することができる。単離抗体またはその抗原結合断片は、別の治療法または治療手順に対して補助的に投与することができる。
【０１１６】
一態様では、本発明は、細胞内のＢＭＰ９の活性を低減する方法を提供する。方法は、細胞を、例えば、本明細書で、例えば、表１に記載される、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップを含みうる。
【０１１７】
一態様では、本発明は、それを必要とする患者における、ＢＭＰ９を阻害する方法を提供する。方法は、患者に、治療有効量の、例えば、本明細書で、例えば、表１に記載される、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含みうる。一部の態様では、患者は、肝疾患を有する。一部の態様では、肝疾患を、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片で処置する。一部の態様では、肝疾患は、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染；Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）感染；自己免疫性肝炎；アルコール曝露；毒素曝露；薬物曝露；肝外傷；胆道閉塞；原発性胆汁性肝硬変；アラジール症候群；慢性肝うっ血；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性硬化性胆管炎；ヘモクロマトーシス；アルファ１−アンチトリプシン欠損症；およびウィルソン病などの因子のうちの１つまたは複数と関連する。一部の態様では、肝疾患は、肝線維症、門脈高血圧症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝疾患、および肝硬変、またはこれらの組合せである。一部の態様では、肝疾患は、肝線維症である。一部の態様では、肝疾患は、門脈高血圧症である。一部の態様では、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。一部の態様では、肝疾患は、脂肪肝疾患である。一部の態様では、肝疾患は、肝硬変である。
【０１１８】
一部の態様では、本発明は、それを必要とする患者を処置する方法、または患者におけるＢＭＰ９の活性を低減する方法であって、本発明の抗体またはその抗原結合断片を、さらなる治療剤と併せて投与するステップを含む方法に関する。一部の態様では、さらなる治療剤は、ＢＭＰ９の活性を低減する。一部の態様では、さらなる治療剤は、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはその抗原結合断片、可溶性受容体、タンパク質、または低分子である。一部の態様では、さらなる治療剤は、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗線維化剤、抗脂肪肝剤、抗アポトーシス剤、肝保護剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の態様では、さらなる治療剤は、テノフォビル、エンテカビル、ラミブジン、テルビブジン、アデホビル、ＰＥＧ化インターフェロン、ソホスブビル、テラプレビル、ダクラタスビル、シメプレビル、レダスプレビル、コルチコステロイド、ＧＦＴ−５０５、セニクリビロック、ビタミンＥ、ピオグリタゾン、メトフォルミン、オベチコール酸、ＧＲ−ＭＤ−０２、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の態様では、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片、およびさらなる治療剤を、同時または逐次的に投与する。一部の態様では、単離抗体またはその抗原結合断片を、さらなる治療剤の投与に対して補助的に投与する。
【０１１９】
一態様では、本発明は、前出の態様のうちのいずれかを含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド、例えば、１つまたは複数の核酸分子を提供する。
【０１２０】
一態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体のうちのいずれかまたはそれらの抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨ配列またはＶＬ配列をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）それぞれ、配列番号１、２、および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号４、５、および６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号２１、２２、および２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３１、３２、および３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｄ）それぞれ、配列番号２４、２５、および２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｅ）それぞれ、配列番号４１、４２、および４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５１、５２、および５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｆ）それぞれ、配列番号４４、４５、および４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｇ）それぞれ、配列番号６１、６２、および６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７１、７２、および７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｈ）それぞれ、配列番号６４、６５、および６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｉ）それぞれ、配列番号８１、８２、および８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９１、９２、および９３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｊ）それぞれ、配列番号８４、８５、および８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９４、９５、および９６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｋ）それぞれ、配列番号１０１、１０２、および１０３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１１、１１２、および１１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｌ）それぞれ、配列番号１０４、１０５、および１０６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１４、１１５、および１１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｍ）それぞれ、配列番号１２１、１２２、および１２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３１、１３２、および１３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｎ）それぞれ、配列番号１２４、１２５、および１２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３４、１３５、および１３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｏ）それぞれ、配列番号１４１、１４２、および１４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５１、１５２、および１５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｐ）それぞれ、配列番号１４４、１４５、および１４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５４、１５５、および１５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｑ）それぞれ、配列番号１６１、１６２、および１６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７１、１７２、および１７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｒ）それぞれ、配列番号１６４、１６５、および１６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７４、１７５、および１７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
【０１２１】
一態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、単離抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７のＶＨ配列；配列番号２７のＶＨ配列；配列番号４７のＶＨ配列；配列番号６７のＶＨ配列；配列番号８７のＶＨ配列；配列番号１０７のＶＨ配列；配列番号１２７のＶＨ配列；配列番号１４７のＶＨ配列；または配列番号１６７のＶＨ配列のうちのいずれか１つを含む。
【０１２２】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、単離抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７のＶＬ配列；配列番号３７のＶＬ配列；配列番号５７のＶＬ配列；配列番号７７のＶＬ配列；配列番号９７のＶＬ配列；配列番号１１７のＶＬ配列；配列番号１３７のＶＬ配列；配列番号１５７のＶＬ配列；または配列番号１７７のＶＬ配列のうちのいずれか１つを含む。
【０１２３】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、単離抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号７のＶＨ配列および配列番号１７のＶＬ配列；配列番号２７のＶＨ配列および配列番号３７のＶＬ配列；配列番号４７のＶＨ配列および配列番号５７のＶＬ配列；配列番号６７のＶＨ配列および配列番号７７のＶＬ配列；配列番号８７のＶＨ配列および配列番号９７のＶＬ配列；配列番号１０７のＶＨ配列および配列番号１１７のＶＬ配列；配列番号１２７のＶＨ配列および配列番号１３７のＶＬ配列；配列番号１４７のＶＨ配列および配列番号１５７のＶＬ配列；または配列番号１６７のＶＨ配列および配列番号１７７のＶＬ配列
のうちのいずれか１つを含む。
【０１２４】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、単離抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号９の重鎖配列；配列番号２９の重鎖配列；配列番号４９の重鎖配列；配列番号６９の重鎖配列；配列番号８９の重鎖配列；配列番号１０９の重鎖配列；配列番号１２９の重鎖配列；配列番号１４９の重鎖配列；または配列番号１６９の重鎖配列
のうちのいずれか１つを含む。
【０１２５】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、単離抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号１９の軽鎖配列；配列番号３９の軽鎖配列；配列番号５９の軽鎖配列；配列番号７９の軽鎖配列；配列番号９９の軽鎖配列；配列番号１１９の軽鎖配列；配列番号１３９の軽鎖配列；配列番号１５９の軽鎖配列；または配列番号１７９の軽鎖配列
のうちのいずれか１つを含む。
【０１２６】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、単離抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号９の重鎖配列；および配列番号１９の軽鎖配列；配列番号２９の重鎖配列；および配列番号３９の軽鎖配列；配列番号４９の重鎖配列；および配列番号５９の軽鎖配列；配列番号６９の重鎖配列；および配列番号７９の軽鎖配列；配列番号８９の重鎖配列；および配列番号９９の軽鎖配列；配列番号１０９の重鎖配列；および配列番号１１９の軽鎖配列；配列番号１２９の重鎖配列；および配列番号１３９の軽鎖配列；配列番号１４９の重鎖配列；および配列番号１５９の軽鎖配列；または配列番号１６９の重鎖配列；および配列番号１７９の軽鎖配列
のうちのいずれか１つを含む。
【０１２７】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードし、
配列番号１０の重鎖配列；配列番号８のＶＨ配列；配列番号２０の軽鎖配列；配列番号１８のＶＬ配列；配列番号３０の重鎖配列；配列番号２８のＶＨ配列；配列番号４０の軽鎖配列；配列番号３８のＶＬ配列；配列番号５０の重鎖配列；配列番号４８のＶＨ配列；配列番号６０の軽鎖配列；配列番号５８のＶＬ配列；配列番号７０の重鎖配列；配列番号６８のＶＨ配列；配列番号８０の軽鎖配列；配列番号７８のＶＬ配列；配列番号９０の重鎖配列；配列番号８８のＶＨ配列；配列番号１００の軽鎖配列；配列番号９８のＶＬ配列；配列番号１１０の重鎖配列；配列番号１０８のＶＨ配列；配列番号１２０の軽鎖配列；配列番号１１８のＶＬ配列；配列番号１３０の重鎖配列；配列番号１２８のＶＨ配列；配列番号１４０の軽鎖配列；配列番号１３８のＶＬ配列；配列番号１５０の重鎖配列；配列番号１４８のＶＨ配列；配列番号１６０の軽鎖配列；配列番号１５８のＶＬ配列；配列番号１７０の重鎖配列；配列番号１６８のＶＨ配列；配列番号１８０の軽鎖配列；または配列番号１７８のＶＬ配列
のうちのいずれか１つを含む核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供する。
【０１２８】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片、例えば、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードし、
配列番号８のＶＨ配列および配列番号１８のＶＬ配列；配列番号２８のＶＨ配列および配列番号３８のＶＬ配列；配列番号４８のＶＨ配列および配列番号５８のＶＬ配列；配列番号６８のＶＨ配列および配列番号７８のＶＬ配列；配列番号８８のＶＨ配列および配列番号９８のＶＬ配列；配列番号１０８のＶＨ配列および配列番号１１８のＶＬ配列；配列番号１２８のＶＨ配列および配列番号１３８のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列および配列番号１５８のＶＬ配列；または配列番号１６８のＶＨ配列および配列番号１７８のＶＬ配列
のうちのいずれか１つを含む核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供する。
【０１２９】
一部の態様では、本発明は、単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、コードされる単離抗体またはその抗原結合断片が、表１に明示されるＶＬ配列、ＶＨ配列、軽鎖配列、または重鎖配列に対する、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
一態様では、本発明は、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供し、ここで、核酸が、
配列番号１０の重鎖配列；
配列番号３０の重鎖配列；
配列番号５０の重鎖配列；
配列番号７０の重鎖配列；
配列番号９０の重鎖配列；
配列番号１１０の重鎖配列；
配列番号１３０の重鎖配列；
配列番号１５０の重鎖配列；
配列番号１７０の重鎖配列；
配列番号２０の軽鎖配列；
配列番号４０の軽鎖配列；
配列番号６０の軽鎖配列；
配列番号８０の軽鎖配列；
配列番号１００の軽鎖配列；
配列番号１２０の軽鎖配列；
配列番号１４０の軽鎖配列；
配列番号１６０の軽鎖配列；
配列番号１８０の軽鎖配列；
配列番号８のＶＨ配列；
配列番号２８のＶＨ配列；
配列番号４８のＶＨ配列；
配列番号６８のＶＨ配列；
配列番号８８のＶＨ配列；
配列番号１０８のＶＨ配列；
配列番号１２８のＶＨ配列；
配列番号１４８のＶＨ配列；
配列番号１６８のＶＨ配列；
配列番号１８のＶＬ配列；
配列番号３８のＶＬ配列；
配列番号５８のＶＬ配列；
配列番号７８のＶＬ配列；
配列番号９８のＶＬ配列；
配列番号１１８のＶＬ配列；
配列番号１３８のＶＬ配列；
配列番号１５８のＶＬ配列；および
配列番号１７８のＶＬ配列
からなる群から選択される配列を含む。
【０１３１】
核酸に関する本発明の態様は、核酸を、単一の連続ポリヌクレオチド、例えば、１）本発明の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖またはＶＬ、および２）本発明の抗体またはその抗原結合断片の重鎖またはＶＨをコードする、単一の連続ポリヌクレオチド上に配置する実施形態を想定する。本発明はまた、核酸を、２つ以上の連続ポリヌクレオチド、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖またはＶＬをコードする、１つのポリヌクレオチド、および本発明の抗体またはその抗原結合断片の重鎖またはＶＨをコードする、別のポリヌクレオチドの上に配置する実施形態も想定する。
【０１３２】
本発明はまた、核酸またはポリヌクレオチド、例えば、本明細書で記載される核酸またはポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。本発明はまた、このような核酸またはポリヌクレオチドを含む細胞、例えば、宿主細胞も提供する。本発明の一態様では、単離宿主細胞は、このような核酸またはポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【０１３３】
一態様では、本発明は、（１）本発明の抗体の重鎖をコードする換え核酸セグメントと、（２）本発明の抗体の軽鎖をコードする、第２の換え核酸セグメントとを含み、前記ＤＮＡセグメントがそれぞれ、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターに作動可能に連結され、前記宿主細胞内で発現することが可能な、単離宿主細胞を提供する。本発明の別の態様では、単離宿主細胞は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれをコードする組換えＤＮＡセグメントを含み、前記ＤＮＡセグメントは、プロモーターに作動可能に連結され、前記宿主細胞内で発現することが可能である。一態様では、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞株である。一態様では、宿主細胞はヒト細胞株である。一態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。一態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。
【０１３４】
本発明は、本明細書で記載される、ＢＭＰ９に対する抗体もしくはその抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の、医薬の製造における使用を提供する。本発明は、例えば、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片の、医薬の製造、例えば、治療における使用のための医薬の製造、例えば、肝疾患を有する対象の処置のための医薬の製造における使用を提供する。本発明は、例えば、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片の、それを必要とする患者におけるＢＭＰ９の活性の低減における使用のための医薬の製造における使用を提供する。本発明は、医薬としての使用のための、本明細書で記載される、ＢＭＰ９に対する抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明は、治療における使用のための、本明細書で記載される、ＢＭＰ９に対する抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明は、線維性状態の処置における使用のための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染；Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）感染；自己免疫性肝炎；アルコール曝露；毒素曝露；薬物曝露；肝外傷；胆道閉塞；原発性胆汁性肝硬変；アラジール症候群；慢性肝うっ血；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性硬化性胆管炎；ヘモクロマトーシス；アルファ１−アンチトリプシン欠損症；またはウィルソン病からなる群から選択される、因子のうちの１つまたは複数と関連する肝疾患を含む肝疾患の処置における使用のための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明は、肝線維症、門脈高血圧症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝疾患、または肝硬変の処置における使用のための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１３５】
一態様では、本発明は、それを必要とする患者における、ＢＭＰ９の活性の低減における使用のための、例えば、本明細書で記載される、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１３６】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、ＣＤＲ、例えば、表１に列挙される、１つまたは複数のＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、ヒトＢＭＰ９に結合する、前記単離抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ、例えば、表１に列挙される抗体の、６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含みうる。
【０１３７】
一態様では、本発明は、表１に列挙される、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１３８】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１３９】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載されるＶＨアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨアミノ酸配列、および表１に記載されるＶＬアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１４１】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載される軽鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１４２】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載される重鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１４３】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、表１に記載される軽鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列、および表１に記載される重鎖アミノ酸配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１４４】
一態様では、本発明は、前出の態様のうちのいずれかの、抗体またはその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１４５】
一態様では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、表１に列挙されるＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。ヒトＢＭＰ９に結合する、前記抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ、例えば、表１に列挙される抗体の、６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含みうる。
【０１４６】
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１４７】
本明細書で使用される「ＢＭＰ９」とは、当技術分野で公知の、ＴＧＦβ／ＢＭＰスーパーファミリーのメンバーであって、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の強力な誘導剤であることが公知のメンバー（Tang et al. (2008) J Cell Mol Med.［PMID: 19175684］を参照されたい）である、骨形成タンパク質９（ＢＭＰ９）（本明細書ではまた互換的に、「ＢＭＰ９」、「ＢＭＰ−９」、「増殖分化因子２」、「ＧＤＦ−２」、「ＧＤＦ２」、および「成長／分化因子２前駆体」とも称する）またはＢＭＰ９をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ９はまた、グルコース代謝の調節に関与し、糖尿病マウスにおける血糖を低減することが可能であり、中枢神経系内のコリン作動性ニューロンの分化因子であり、鉄ホメオスタシスにおいて役割を果たすホルモン（ヘプシジン）の発現を誘導することも示されている（David et al. 2008. Circ Res. April 25; 102(8):914-22）。
【０１４８】
代表的なＢＭＰ９配列は、下記に明示される配列を含むがこれらに限定されない。
【０１４９】
ＢＭＰ９／増殖分化因子２［ヒト（Homo sapiens）］（ＮＰ＿０５７２８８）（配列番号２１３）
【０１５０】
【化１】
2018522540.tif 000002
【０１５１】
ＢＭＰ９／増殖分化因子２［ヒト（Homo sapiens）］（ＡＦ１８８２８５）（配列番号２１４）
【０１５２】
【化２】
2018522540.tif 000003
【０１５３】
ＢＭＰ９／増殖分化因子２［ヒト（Homo sapiens）］の成熟断片（ＮＰ＿０５７２８８によるアミノ酸）（配列番号２１５）：
【０１５４】
【化３】
2018522540.tif 000004
【０１５５】
当技術分野では、マウスおよび他の動物のＢＭＰ９分子が公知である（例えば、マウスＢＭＰ９についての、ＮＰ＿０６２３７９およびラットＢＭＰ９についての、ＮＰ＿００１０９９５６６を参照されたい）。
【０１５６】
本明細書で記載される通り、ＢＭＰ９に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＢＭＰ９タンパク質に結合する。本明細書で使用される「ｈｕＢＭＰ９」とは、ヒトＢＭＰ９またはその断片を指す。
【０１５７】
本明細書で使用される「ＢＭＰ２」とは、タンパク質である骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、またはＢＭＰ２をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ２はまた、ＢＤＡ２；およびＢＭＰ２Ａ；Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ＩＤ：ＯＭＩＭ：１１２２６１；ＭＧＩ：８８１７７；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：９２６；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＢＭＰ２  Ｇｅｎｅとしても公知である。種：ヒト：Ｅｎｔｒｅｚ：６５０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２５８４５；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１２６４３；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１２００；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿００１１９１；場所（ＵＣＳＣ）：第２０染色体：６．７５〜６．７６Ｍｂ。種：マウス：Ｅｎｔｒｅｚ：１２１５６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７３５８；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１２７４；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７５５３；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０３１５７９；場所（ＵＣＳＣ）：第２染色体：１３３．５５〜１３３．５６Ｍｂ。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ２に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＢＭＰ２タンパク質に結合する。
【０１５８】
本明細書で使用される「ＢＭＰ７」とは、タンパク質である骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、またはＢＭＰ７をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ７はまた、ＯＰ−１（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；ＯＰ−１；Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ＩＤ：ＯＭＩＭ：１１２２６７；ＭＧＩ：１０３３０２；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２０４１０；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＢＭＰ７  Ｇｅｎｅとしても公知である。種：ヒト：Ｅｎｔｒｅｚ：６５５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０１１４４；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１８０７５；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１７１９；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿００１７１０；場所（ＵＣＳＣ）：第２０染色体：５５．７４〜５５．８４Ｍｂ。種：マウス：Ｅｎｔｒｅｚ：１２１６２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ０００００００８９９９；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２３３５９；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７５５７；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０３１５８３；場所（ＵＣＳＣ）：第２染色体：１７２．８７〜１７２．９４Ｍｂ。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ７に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＢＭＰ７タンパク質に結合する。
【０１５９】
本明細書で使用される「ＢＭＰ１０」とは、当技術分野で公知の、ＴＧＦβ／ＢＭＰスーパーファミリーのメンバーである、骨形成タンパク質１０（ＢＭＰ１０）（本明細書ではまた互換的に、「ＢＭＰ１０」、「ＢＭＰ−１０」、「ＭＧＣ１２６７８３」、および「骨形成タンパク質１０前駆体」とも称する）またはＢＭＰ１０をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ１０は、心室発生時に、心筋細胞の増殖および成熟をモジュレートするのに不可欠な成分であることが示唆されている（Chen et al., (2004) Development. 131(9):2219-31およびNeubaus et al., (1999) Mech Dev., 80(2): 181-4）。代表的なＢＭＰ１０配列は、下記に明示される配列を含むがこれらに限定されない。
【０１６０】
骨形成タンパク質１０のプレプロタンパク質［ヒト（Homo sapiens）］（ＮＰ＿０５５２９７）（配列番号２１６）
【０１６１】
【化４】
2018522540.tif 000005
【０１６２】
骨形成タンパク質１０［ヒト（Homo sapiens）］（ＮＭ＿０１４４８２）（配列番号２１７）
【０１６３】
【化５】
2018522540.tif 000006
【０１６４】
当技術分野では、マウスおよび他の動物のＢＭＰ１０分子が公知である（例えば、マウスＢＭＰ１０についての、ＮＰ＿０３３８８６を参照されたい）。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ１０に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＢＭＰ１０タンパク質に結合する。
【０１６５】
「Ｓｍａｄ」とは、形質転換増殖因子ベータリガンドからの細胞外シグナルを、核へと伝達する細胞内タンパク質であって、下流の遺伝子転写を活性化させる細胞内タンパク質のファミリーを指す（例えば、Heldin CH (1997), Nature 390 (6659): 465-71；Attisano L (1998) Curr. Opin. Cell Biol. 10 (2): 188-94；Massague J (1998), Annu. Rev. Biochem. 67: 753-91；Attisano L (2002) Science 296 (5573): 1646-7；Whitman M (1998) Genes Dev. 12 (16): 2445-62；Wrana JL (2000) Sci. STKE 2000 (23): RE1；Wharton K, (2009), Development 136 (22): 3691-7を参照されたい）。受容体調節型Ｓｍａｄ（Ｒ−ＳＭＡＤ）は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８／９を含む。「Ｓｍａｄ」という用語は、Ｓｍａｄの遺伝子、例えば、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、もしくはＳｍａｄ８の遺伝子、またはＳｍａｄタンパク質、例えば、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、もしくはＳｍａｄ８を含む。理論に束縛されずに述べると、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８は、ＢＭＰ９を含むＢＭＰサブファミリーのリガンドにより、優先的に活性化すると考えられる。Ｓｍａｄファミリーの複数のメンバーは、それらの番号により、併せて言及される。したがって、例えば、「Ｓｍａｄ１／５／８」とは、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、および／またはＳｍａｄ８を指す。「Ｓｍａｄ１／５」とは、Ｓｍａｄ１および／またはＳｍａｄ５を指す。ここでもまた、理論に束縛されずに述べると、Ｓｍａｄを介するシグナル伝達は、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化をもたらすと考えられる。「ｐＳｍａｄ」とは、リン酸化Ｓｍａｄタンパク質を指す。
【０１６６】
「Ｉｄ１」とは、遺伝子であるＩｄ１、またはタンパク質であるＩｄ１を意味する（例えば、Benezra R, Cell 61 (1): 49-59；Hara E (1994) J Biol Chem 269 (3): 2139-45；Ruzinova MB (2003) Trends in Cell Biology 13 (8): 410-8；Perk J (2005) Nat Rev Cancer 5 (8): 603-614；Korchynskyi O (2002). J Biol Chem., 277 (7): 4883-91を参照されたい）。ＤＮＡ結合タンパク質阻害剤１（Ｉｄ１）とは、例えば、転写因子の塩基性ＨＬＨファミリーのメンバーと、ヘテロ二量体を形成しうる、ヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）タンパク質である。理論に束縛されずに述べると、Ｉｄ１は、ＢＭＰ９を含むＢＭＰシグナル伝達経路の周知の標的遺伝子である。
【０１６７】
本明細書で使用される「線維症」という用語とは、臓器内または組織内の細胞による、過剰な線維性結合組織の、異常な形成または発生を指す。線維症と関連する過程は、正常組織の形成または修復の一部として生じうるが、これらの過程の調節異常は、組織または臓器の機能を次第に損なう、細胞組成の改変および過剰な結合組織の沈着をもたらしうる。複数種類の線維症、例えば、膵嚢胞性線維症および肺嚢胞性線維症、とりわけ、小児において、筋内注射の合併症として生じうる、注射線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、炭鉱作業員塵肺症の合併症、および腎性全身性線維症が存在する。
【０１６８】
本明細書で使用される「線維性障害」、「線維性状態」、および「線維性疾患」という用語は、線維症を特徴とする障害、状態、または疾患を指すように互換的に使用される。線維性障害の例は、血管線維症、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、膵線維症、肝線維症（例えば、「線維性肝疾患」、例えば、肝硬変）、腎線維症、筋骨格線維症、心線維症（例えば、心内膜心筋線維症、特発性心筋症）、皮膚線維症（例えば、強皮症、外傷後、手術による皮膚瘢痕化、ケロイドおよび皮膚ケロイド形成）、眼線維症（例えば、緑内障、眼硬化症、角結膜瘢痕化、および翼状片）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、慢性移植片対宿主病、ペイロニー病、膀胱鏡検査後尿道狭窄症、特発性後腹膜線維症および薬物誘導性後腹膜線維症、縦隔線維症、進行性塊状線維症、増殖性線維症および新生物性線維症を含むがこれらに限定されない。
【０１６９】
本明細書で使用される「線維性肝疾患」および「肝線維症」という用語は、互換的に使用され、肝臓内の細胞による、過剰な線維性結合組織（例えば、コラーゲンを含む細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）タンパク質）の、異常な形成または発生を特徴とする肝疾患を指す。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、活性化した肝星細胞、門脈域線維芽細胞、および筋線維芽細胞は、肝臓内の主要な線維原性細胞（すなわち、ＥＣＭ産生細胞）であると考えられる。肝線維症は、門脈高血圧症をもたらす。進行性肝線維症は、肝硬変、肝不全を結果としてもたらす。
【０１７０】
肝硬変および／または門脈高血圧症を結果としてもたらす線維性肝疾患を含む、本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片で処置しうる線維性肝疾患は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染；Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）感染；自己免疫性肝炎；アルコール、毒素、または薬物への曝露；肝外傷；胆道閉塞；原発性胆汁性肝硬変；アラジール症候群；心疾患または肝流出路閉塞に由来する慢性肝うっ血を含む、慢性肝うっ血；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性硬化性胆管炎；ヘモクロマトーシス；アルファ１−アンチトリプシン欠損症；およびウィルソン病により引き起こされうる。
【０１７１】
本明細書で使用される「ＢＭＰ９抗体」、「抗ヒトＢＭＰ９抗体」、「ＢＭＰ９結合抗体」、「ＢＭＰ９アンタゴニスト抗体」（およびそれらの抗原結合断片）などの用語は、タンパク質であるＢＭＰ９に結合する抗体（およびそれらの抗原結合断片）を含む。
【０１７２】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、個別の細胞、組織、ならびに組織内および臓器内の細胞を含むがこれらに限定されない、線維性応答を経る傾向がある任意の細胞を指す。本明細書で使用される細胞という用語は、細胞自体のほか、細胞を取り囲む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む。例えば、細胞の線維性応答の阻害は、肺（または肺組織）内の１つもしくは複数の細胞；肝臓（または肝組織）内の１つもしくは複数の細胞；腎（または腎性組織）内の１つもしくは複数の細胞；筋肉組織内の１つもしくは複数の細胞；心（または心組織）内の１つもしくは複数の細胞；膵臓内の１つもしくは複数の細胞；皮膚内の１つもしくは複数の細胞；骨内の１つもしくは複数の細胞；血管系内の１つもしくは複数の細胞；１つもしくは複数の幹細胞；または眼内の１つもしくは複数の細胞の線維性応答の阻害を含むがこれらに限定されない。
【０１７３】
本明細書で使用される「上皮間葉転換」（ＥＭＴ）という用語は、胚発生の正常過程である、上皮表現型から、間葉系表現型への転換を指す。ＥＭＴはまた、イオンおよび流体の輸送体として機能する傷害上皮細胞が、マトリックスをリモデリングする間葉系細胞となる過程でもある。癌腫では、この形質転換は、細胞形状の改変、間葉系タンパク質の発現、および侵襲性の増大を結果としてもたらす。ＥＭＴを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて規定するための基準は、上皮細胞の極性の喪失、個別の細胞への分離、および細胞運動性を獲得した後における、その後の分散を伴う（Vincent-Salomon et al., Breast Cancer Res. 2003; 5(2): 101-106を参照されたい）。ＥＭＴ時に、発現、分布、および／または機能が変化し、因果的に関与する分子のクラスは、増殖因子（例えば、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β、ｗｎｔ）、転写因子（例えば、ｓｎａｉｌ、ＳＭＡＤ、ＬＥＦ、および核内β−カテニン）、細胞間接着軸の分子（カドヘリン、カテニン）、細胞骨格モジュレーター（Ｒｈｏファミリー）、および細胞外プロテアーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子）（Thompson et al., Cancer Research 65, 5991-5995, Jul. 15, 2005を参照されたい）を含む。
【０１７４】
本明細書で使用される「抗体」などの用語は、全抗体および任意のその抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖を含む。天然の「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互接続された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と、２つの軽（Ｌ）鎖とを含む、糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
【０１７５】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合断片」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」などの用語は、所与の抗原（例えば、ＢＭＰ９）に特異的に結合する能力を保持する、インタクト抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１７６】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の「抗原結合部分」を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
【０１７７】
抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。
【０１７８】
抗原結合部分は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【０１７９】
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。
【０１８０】
本明細書で使用される「アビディティー」という用語は、抗体−抗原複合体の、全体的な安定性または強度についての有益な尺度を指す。アビディティーは、３つ主要な因子：抗体エピトープのアフィニティー；抗原および抗体の両方の価数；ならびに相互作用部分の構造的配置により制御される。最終的に、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が、正確な抗原エピトープに結合する可能性を規定する。
【０１８１】
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
【０１８２】
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基と反応し、異なる抗原決定基とは反応しない個々の、抗体の結合部位の能力を指す。抗体の結合部位は、分子のＦａｂ部分内に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築される。抗体の結合アフィニティーは、単一の抗原決定基と、抗体上の単一の結合部位との反応の強度である。結合特異性とは、抗原決定基と、抗体の結合部位との間に作用する引力および斥力の合計である。
【０１８３】
２つの実体の間の特異的結合とは、平衡定数（ＫＡまたはＫＡ）が少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１、または１０１４Ｍ−１である結合を意味する。抗体（例えば、ＢＭＰ９結合抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内の、コグネイト抗原（例えば、ヒトＢＭＰ９タンパク質）の存在を決定する結合反応を指す。上記で言及した平衡定数（ＫＡ）に加えて、本発明のＢＭＰ９結合抗体はまた典型的に、約１×１０−２秒−１、１×１０−３秒−１以下の解離速度定数（ＫｄまたはＫｏｆｆ）も有し、ＢＭＰ９に、非特異的抗原（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ１０またはＢＭＰ７）への結合についてのそのアフィニティーの、少なくとも２倍のアフィニティーで結合する。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句を、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用する。
【０１８４】
「キメラ抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）を、クラス、エフェクター機能、および／もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および／もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子（またはその抗原結合断片）；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変された可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子（またはその抗原結合断片）を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置きかえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識におけるその特異性を保持しうる。
【０１８５】
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけのコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
【０１８６】
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照されたい）。一実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
【０１８７】
本明細書で使用される「〜を遮断する」という用語は、相互作用または過程を停止させるか、または阻止すること、例えば、リガンド依存的なシグナル伝達またはリガンド非依存的なシグナル伝達を停止させることを指す。
【０１８８】
本明細書で使用される「〜を認識する」という用語は、そのコンフォメーショナルエピトープを見出し、これと相互作用する（例えば、結合する）、抗体またはその抗原結合断片を指す。
【０１８９】
本明細書では、「〜を交差遮断する」、「交差遮断された」、「〜を交差遮断すること」、「競合する」、「交差競合する」という用語、および類縁の用語は、標準的な競合的結合アッセイにおいて、他の抗体または結合剤の、ＢＭＰ９への結合に干渉する、抗体または他の結合剤の能力を意味するように、互換的に使用される。
【０１９０】
抗体または他の結合剤が、別の抗体または結合分子の、ＢＭＰ９への結合に干渉することが可能な能力または程度は、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができ、したがって、本発明に従い、抗体または他の結合剤が、交差遮断すると言いうるのかどうかも、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定することができる、Ｂｉａｃｏｒｅ技術の使用を伴う（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することにより）。交差遮断を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの手法を使用する。技法は、実質的に同様の結果をもたらすことが予測されるが、Ｂｉａｃｏｒｅ法による測定を、決定的であると考える。
【０１９１】
「〜を中和する」という用語は、抗体が、その標的に結合すると、標的の活性、レベル、または安定性を低減する；例えば、ＢＭＰ９抗体が、ＢＭＰ９に結合すると、シグナル伝達、または、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化および／もしくは線維症、例えば、肝線維症におけるその役割など、ＢＭＰ９の活性、レベル、または安定性を、少なくとも部分的に低減することにより、ＢＭＰ９を中和することを意味する。
【０１９２】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
【０１９３】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンへの特異的な結合が可能であるか、または分子と他の形で相互作用することが可能な、任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸または炭水化物もしくは糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有しうる。エピトープは、「直鎖状」エピトープの場合もあり、「コンフォメーショナル」エピトープの場合もある。
【０１９４】
「直鎖状エピトープ」という用語は、タンパク質と、相互作用分子（抗体など）との、相互作用点の全てを伴うエピトープが、タンパク質の一次（連続）アミノ酸配列に沿って、直鎖状に生じることを指す。
【０１９５】
本明細書で使用される、ＩｇＧ抗体に対する「高アフィニティー」という用語は、標的抗原、例えば、ＢＭＰ９に対するＫＤが、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ、または１０−１１Ｍ以下である抗体を指す。しかし、他の抗体アイソタイプに対する「高アフィニティー」結合は、変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高アフィニティー」結合は、ＫＤが、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下である抗体を指す。
【０１９６】
本明細書で使用される「ヒト抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体（およびそれらの抗原結合断片）を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体およびそれらの抗原結合断片は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含みうる。
【０１９７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」（またはその抗原結合断片）という語句は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝子供給源に由来する、抗体、抗体断片、二特異性抗体などを含むポリペプチドを指す。この用語はまた、単一の分子組成による抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
【０１９８】
「ヒトモノクローナル抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、単一の結合特異性を提示する抗体（およびそれらの抗原結合断片）であって、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト配列に由来する可変領域を有する抗体（およびそれらの抗原結合断片）を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞へと融合させた、ヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより作製する。
【０１９９】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」（またはその抗原結合断片）という語句は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される全てのヒト抗体（およびそれらの抗原結合断片）を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。一実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
【０２００】
本明細書で使用される「ヒト化」抗体（またはその抗原結合断片）とは、ヒトにおける免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体（またはその抗原結合断片）である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分）で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されているＸｏｍａ技術を含むがこれらに限定されない。
【０２０１】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。
【０２０２】
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
【０２０３】
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988による類似性検索法により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（ringbou ed., 2003）を参照されたい）により行うこともできる。
【０２０４】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990において記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschul et al., 前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｎ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
【０２０５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であり、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
【０２０６】
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch(J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
【０２０７】
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
【０２０８】
本明細書で使用される「単離抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（またはその抗原結合断片）を指す（例えば、ＢＭＰ９に特異的に結合する単離抗体は、ＢＭＰ９以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
【０２０９】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するように施されている。
【０２１０】
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」または「Ｋｏｎ」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」または「Ｋｏｆｆ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。一実施形態では、本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用するか、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。解離定数が、約１０−９Ｍ未満である場合、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ＫＤ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ（ＭＳＤ−ＳＥＴｔ）が、抗体のＫＤを決定するために好ましい方法である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Friquet, B., Chaffotte, A.F., Djavadi-Ohaniance, L., and Goldberg, M.E. (1985). Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immnunol Meth 77, 305-319を参照されたい）。
【０２１１】
本明細書で使用される「ＩＣ５０」という用語は、抗体またはその抗原結合断片の濃度であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、阻害性応答を誘導し、最大応答の５０％、すなわち、最大応答と、ベースラインとの半量である濃度を指す。
【０２１２】
「エフェクター機能」という用語は、抗原結合ドメイン以外の抗体のドメインを介する結合により媒介され、通例、エフェクター分子の結合により媒介される、抗体分子の活性を指す。エフェクター機能は、例えば、補体のＣ１成分の、抗体への結合により媒介される、補体介在性エフェクター機能を含む。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症性応答も刺激し、また、自己免疫過敏性にも関与しうる。エフェクター機能はまた、抗体の定常ドメインの、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への結合時に誘発されうる、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）介在性エフェクター機能も含む。抗体の、細胞表面上のＦｃ受容体への結合は、抗体でコーティングされた粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による、抗体でコーティングされた標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む、多数の重要かつ多様な生物学的応答を誘発する。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体または補体成分などのエフェクター分子に対する抗体のアフィニティーを改変すること、例えば、増強または低減することにより改変することができる。結合アフィニティーは一般に、エフェクター分子の結合部位を修飾することにより変動させるが、この場合、目的の部位を配置し、部位のうちの少なくとも一部を、適切な形で修飾することが適切である。また、抗体上の、エフェクター分子に対する結合部位の改変が、全体的な結合アフィニティーを著明に改変する必要はなく、相互作用の形状を改変して、エフェクター機構を、非産生性結合におけるように失効化させうることも想定される。エフェクター機能はまた、エフェクター分子の結合に直接関与せず、エフェクター機能の実行に、他の形で関与する部位を修飾することによっても改変しうることも、さらに想定される。
【０２１３】
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【０２１４】
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【０２１５】
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。それは転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
【０２１６】
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
【０２１７】
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
【０２１８】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」（またはその抗原結合断片）という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される全てのヒト抗体（およびそれらの抗原結合断片）を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、一実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
【０２１９】
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【０２２０】
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。
【０２２１】
「〜を処置する」、「〜を処置した」、「〜を処置すること」、および「処置」という用語は、疾患（例えば、肝線維症）の症候、合併症、もしくは生化学的徴標の発症を防止するか、もしくは遅延させるか、症候を緩和するか、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる進行を停止させるか、もしくは阻害する組成物または抗体の投与を含む。処置は、予防的な（疾患の発症を防止するか、もしくは遅延させるか、またはその臨床症候もしくは亜臨床症候の症状を防止する）場合もあり、疾患の発症の後における、症候の治療的抑制または緩和の場合もある。処置は、本明細書で記載される治療的尺度により測定することができる。本発明の「処置」法は、線維性疾患または線維性状態を治癒させるか、これらの重症度を低減するか、またはこれらの１つもしくは複数の症状を改善するための、対象の健康または生存を、このような処置の非存在下で予測される健康または生存を超えて延長するための、ＢＭＰ９抗体またはその抗原結合断片の、対象への投与を含む。例えば、「処置」は、対象における、線維性疾患の症状（例えば、息切れ、疲労感、咳、体重の減少、肺線維症または拒食症と関連する食欲不信、疲労感、体重の減少、門脈高血圧症、および肝線維症と関連する腹水）の、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の緩和を含む。
【０２２２】
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】ハイブリドーマ法により作出された抗ＢＭＰ９抗体についての、ＲＧＡアッセイによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性試験を示す図である。ａ．ハイブリドーマにより作出されたＢＭＰ９抗体の、ヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ９により誘導されるＲＧＡ活性に対する低減曲線およびＩＣ５０を示す図であり；ｂ．ハイブリドーマにより作出されたＢＭＰ９抗体の、ラットＢＭＰ９により誘導されるＲＧＡ活性に対する低減曲線およびＩＣ５０を示す図である。
【図２】ファージディスプレイ法により作出された抗ＢＭＰ９抗体についての、ＲＧＡアッセイによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性試験を示す図である。ａ．ファージディスプレイにより作出されたＢＭＰ９抗体の、ヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ９により誘導されるＲＧＡ活性に対する低減曲線およびＩＣ５０を示す図であり；ｂ．ファージディスプレイにより作出されたＢＭＰ９抗体の、ラットＢＭＰ９により誘導されるＲＧＡ活性に対する低減曲線およびＩＣ５０を示す図である。
【図３】ｓｍａｄ１／５リン酸化アッセイによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性試験を示す図である。ａ．ＣＦＳＣ細胞内の、ハイブリドーマにより作出されたＢＭＰ９抗体の、ヒトＢＭＰ９により誘導されるｓｍａｄ１／５／８リン酸化染色に対する低減曲線およびＩＣ５０を示す図である。ｂ．ＣＦＳＣ細胞内の、ファージディスプレイにより作出されたＢＭＰ９抗体の、ヒトＢＭＰ９により誘導されるｓｍａｄ１／５／８リン酸化染色に対する低減曲線およびＩＣ５０を示す図である。ｃ．抗ＢＭＰ９抗体の非存在下または存在下における、ＨＵＶＥＣ細胞内の、ＢＭＰ９により誘導されるｓｍａｄ１／５のリン酸化およびＩＤ１の発現についての、ウェスタンブロット法を示す図である。
【図４】ＢＭＰ９  ＨＤＩマウスモデルにおける、ハイブリドーマにより作出された抗ＢＭＰ９抗体についての、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を示す図である。異なる処置群についての、代表的な肝臓（ａ）、肝重量および体重（ｂ）、肝機能（ｃ）を、非処置対照および陰性対照と比較して示す図である。ｄ．ＩＤ１のｍＲＮＡ発現を、定量的ＰＣＲにより検出したことを示す図である。ＢＭＰ９  ｃＤＮＡとは、マウスＢＭＰ９をコードするｐｃＤＮＡ３．１−マウスＢＭＰ９を指し示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１とする。
【図５】ＢＭＰ９  ＨＤＩマウスモデルにおける、ファージディスプレイにより作出された抗ＢＭＰ９抗体についての、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を示す図である。異なる処置群についての、代表的な肝臓（ａ）、肝重量および体重（ｂ）、肝機能（ｃ）を、非処置対照および陰性対照と比較して示す図である。ｄ．ＩＤ１のｍＲＮＡ発現を、定量的ＰＣＲにより検出したことを示す図である。ＢＭＰ９  ｃＤＮＡとは、マウスＢＭＰ９をコードするプラスミドである、ｐｃＤＮＡ３．１−マウスＢＭＰ９を指し示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１とする。
【図６】ＣＣｌ４マウスモデルにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を示す図である。油またはＣＣｌ４を加えた、対照ＩｇＧによる処置群（ａ）、ＣＣｌ４を加えた、対照ＩｇＧまたはハイブリドーマにより作出されたＢＭＰ９  Ａｂによる処置群（ｂ）についてのウェスタンブロット結果を示した図である。右パネルは、ＧＡＰＤＨ発現により標準化した。有意差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１により表示する。ｃ、ｄ．異なる群についての、ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８の組織学結果を示した図である。ｃ．Ｃ５７ＢＬ／６マウスについてのデータを示す図である。ｄ．ＢＡＬＢ／ｃマウスについてのデータを示す図である。
【図７】ＣＣｌ４マウスモデルにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を示す図である。油またはＣＣｌ４を加えた、対照ＩｇＧによる処置群（ａ）、ＣＣｌ４を加えた、対照ＩｇＧまたはファージディスプレイにより作出されたＡｂによる処置群（ｂ）についてのウェスタンブロット結果を示した図である。右パネルは、ＧＡＰＤＨ発現により標準化した。有意差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１により表示する。（ｃ）異なる群についての、ｐＳｍａｄ１／５／８の組織学結果を示した図である。
【図８】マウス抗ＢＭＰ９抗体（２Ｂ１１Ｇ２および４Ｅ１０Ｄ７）による、２週間にわたるＣＣｌ４肝線維症マウスモデルにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を示す図である。異なる処置群についての、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色（ａ）、肝臓ヒドロキシプロリン含量（ｂ）、肝機能（ｃ）、肝重量（ｄ）の定量化を、非処置対照および陰性対照と比較して示す図である。（ｅ）ＩＤ１のｍＲＮＡ発現を、定量的ＰＣＲにより検出したことを示す図である。＊Ｐ＜０．０５とする。
【図９】正常マウス（ａ）およびＡＮＩＴラットモデル（ｂ）におけるＰＫアッセイを示す図である。
【図１０】カニクイザルにおける、抗体ＢＭＰ９−２の単回投与後の、全抗ＢＭＰ９濃度を示す（各直線は、単一のサルからのデータを表す）図である。
【図１１】カニクイザルにおける、抗体ＢＭＰ９−２（ＭＯＲ０２２９６２）の複数回投与研究期間中の、全抗ＢＭＰ９濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２２４】
本発明は、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片、ならびにこのような抗体および組成物の、医薬組成物、作製法、および使用法を提供する。
【０２２５】
ＢＭＰ９抗体およびそれらの抗原結合断片
本発明は、ヒトＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片を提供する。
【０２２６】
ＢＭＰ９によるシグナル伝達は、肝線維症／肝硬変、および門脈高血圧症の発症機序において役割を果たす。ＢＭＰ９の発現、血清レベル、およびシグナル伝達は、線維性条件下、例えば、肝硬変性肝組織内で増大および上昇する。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、本開示は、抗線維化療法としてのＢＭＰ９アンタゴニスト抗体が、慢性肝疾患および／または門脈高血圧症、例えば、肝線維症、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ウイルス感染（例えば、ＨＢＶまたはＨＣＶ）、アルコール、毒素、または免疫により誘導される、肝線維症または肝硬変を伴う患者に利益をもたらすことが予測されることを示唆する。
【０２２７】
このような抗ヒトＢＭＰ９抗体の例は、抗体ＢＭＰ９−１、ＢＭＰ９−２、ＢＭＰ９−３、ＢＭＰ９−４、ＢＭＰ９−５、ＢＭＰ９−６、ＢＭＰ９−７、ＢＭＰ９−８およびＢＭＰ９−９であり、これらの配列を、表１に列挙する。
【０２２８】
抗体ＢＭＰ９−１、ＢＭＰ９−２、ＢＭＰ９−３、ＢＭＰ９−４、ＢＭＰ９−５、ＢＭＰ９−６、ＢＭＰ９−７、ＢＭＰ９−８およびＢＭＰ９−９は全て、ヒトＢＭＰ９に、高アフィニティーで結合し、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ１０、およびヒトＢＭＰ２に対する選択性を上回る、高い選択性を伴う。これらの抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおいて、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化およびＩｄ１の誘導も阻害し、肝臓を、ＢＭＰ９により誘導される損傷からも保護する。
【０２２９】
本明細書で開示されるＢＭＰ９アンタゴニスト抗体は、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症の進行を、安全に改善または防止する、新規の治療法を表す。いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、本開示は、これが、ＢＭＰ９によるシグナル伝達の阻害を介して生じうることを示唆する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９タンパク質に対して、ヒトＢＭＰ２タンパク質、ヒトＢＭＰ１０タンパク質またはヒトＢＭＰ７タンパク質のうちのいずれかに対するアフィニティーの１００、５００、または１０００倍のアフィニティーで結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。ＢＭＰ７への結合を伴わない、ＢＭＰ９に対する特異性は重要である。ＢＭＰ７をノックアウトされたマウスは、腎臓、眼、および骨の欠損を伴い、生後に死亡する。同様にまた、ＢＭＰ７は、線維症と関連する慢性心疾患の進行を阻止するのに重要である。したがって、抗ＢＭＰ９抗体の、ＢＭＰ７との交差反応性は、所望されない。本明細書で提示される抗体は、ＢＭＰ７よりＢＭＰ９に特異的である。例えば、表５および表７を参照されたい。図１ａおよび図２ａはまた、ヒトＢＭＰ２およびＢＭＰ７タンパク質に対する結合特異性を上回る、ヒトＢＭＰ９に対する結合特異性についての証拠も示す。
【０２３１】
本発明の抗体は、実施例を含む本明細書で記載される通りに単離されたヒトモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体を含むがこれらに限定されない。
【０２３２】
このような抗ヒトＢＭＰ９抗体の例は、抗体ＢＭＰ９−１、ＢＭＰ９−２、ＢＭＰ９−３、ＢＭＰ９−４、ＢＭＰ９−５、ＢＭＰ９−６、ＢＭＰ９−７、ＢＭＰ９−８およびＢＭＰ９−９であり、これらの配列を、表１に列挙する。
【０２３３】
抗体ＢＭＰ９−２は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、ヒトＢＭＰ９に、高アフィニティーで結合し、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ７、またはヒトＢＭＰ１０に結合しない（すなわち、ヒトＢＭＰ９への結合について、例えば、１０００倍を超えて、例えば、１０，０００倍を超えて選択的である）、すなわち、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ７、またはヒトＢＭＰ１０に対して、検出可能な活性を有さない。抗体ＢＭＰ９−２はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＭＰ９の、ＡＬＫ１受容体およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体のいずれへの結合も阻害する。競合ＥＬＩＳＡにより測定される通り、ＢＭＰ９の、ＡＬＫ１への結合は、最大で５９％阻害され、ＡｃｔＲＩＩＢへの結合は、最大で８５％阻害される。同様にまた、マウスにおける単回１０ｍｇ／ｋｇの処置は、ＣＣｌ４により誘導されるｐＳｍａｄ１／５／８の抑制（ＩＨＣおよびウェスタンブロットにより測定される）をもたらした。同様にまた、抗体ＢＭＰ９−２の単回１０ｍｇ／ｋｇの注射は、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１産生の減少をもたらし、ＢＭＰ９により誘導される肝重量減少のレスキューをもたらした。
【０２３４】
抗体ＢＭＰ９−１、ＢＭＰ９−３、およびＢＭＰ９−４は全て、ヒトＢＭＰ９タンパク質に対する、ヒトＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ１０タンパク質、またはＢＭＰ７タンパク質と比較して高度な特異性を示す。本明細書で記載される抗体の作出および特徴づけに関するさらなる詳細については、実施例で提示する。
【０２３５】
本発明は、ＢＭＰ９（例えば、ヒトＢＭＰ９タンパク質）に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（または代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
【０２３６】
本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。
【０２３７】
本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。
【０２３８】
本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。
【０２３９】
本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。
【０２４０】
本発明は、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬドメインを含む抗体またはそれらの抗原結合断片を提供する。本発明はまた、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む抗体またはそれらの抗原結合断片も提供する。特に、本発明は、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片であって、表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（または代替的に、これらからなる）抗体およびそれらの抗原結合断片を提供する。
【０２４１】
本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合断片は、突然変異させているが、ＣＤＲ領域内の、表１に記載される配列に描示されるＣＤＲ領域との、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。一態様では、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合断片は、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を、表１に記載される配列に描示されるＣＤＲ領域と比較して突然変異させた突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０２４２】
本発明はまた、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合断片のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞内の発現について最適化することができる（例えば、表１は、抗体ＢＭＰ９−１、ＢＭＰ９−２、ＢＭＰ９−３、ＢＭＰ９−５、ＢＭＰ９−６、ＢＭＰ９−７、ＢＭＰ９−８およびＢＭＰ９−９の、重鎖および軽鎖の例となる核酸配列を示す）。
【０２４３】
【表１−１】
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【０２４４】
【表１−２】
2018522540.tif 000008
【０２４５】
【表１−３】
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【０２４６】
【表１−４】
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【０２４７】
【表１−５】
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【０２４８】
【表１−６】
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【０２４９】
【表１−７】
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【０２５０】
【表１−８】
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【０２５１】
【表１−９】
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【０２５２】
【表１−１０】
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【０２５３】
【表１−１１】
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【０２５４】
【表１−１２】
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【０２５５】
【表１−１３】
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【０２５６】
【表１−１４】
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【０２５７】
【表１−１５】
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【０２５８】
【表１−１６】
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【０２５９】
【表１−１７】
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【０２６０】
【表１−１８】
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【０２６１】
【表１−１９】
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【０２６２】
【表１−２０】
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【０２６３】
【表１−２１】
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【０２６４】
【表１−２２】
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【０２６５】
【表１−２３】
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【０２６６】
【表１−２４】
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【０２６７】
【表１−２５】
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【０２６８】
【表１−２６】
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【０２６９】
【表１−２７】
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【０２７０】
本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合断片は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載される配列との、少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有する、抗体およびそれらの抗原結合断片を含む。一実施形態では、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合断片は、実質的に同じ治療的活性を保持しながら、可変領域内の１、２、３、４または５以下のアミノ酸を、表１に記載される配列に描示される可変領域と比較して突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０２７１】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１、２、および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７２】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号４、５、および６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７３】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号２１、２２、および２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３１、３２、および３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７４】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号２４、２５、および２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７５】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号４１、４２、および４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５１、５２、および５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７６】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号４４、４５、および４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７７】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号６１、６２、および６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７１、７２、および７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７８】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号６４、６５、および６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２７９】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号８１、８２、および８３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９１、９２、および９３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８０】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号８４、８５、および８６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号９４、９５、および９６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８１】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１０１、１０２、および１０３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１１、１１２、および１１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８２】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１０４、１０５、および１０６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１１４、１１５、および１１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８３】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１２１、１２２、および１２３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３１、１３２、および１３３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８４】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１２４、１２５、および１２６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１３４、１３５、および１３６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８５】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１４１、１４２、および１４３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５１、１５２、および１５３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８６】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１４４、１４５、および１４６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１５４、１５５、および１５６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８７】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１６１、１６２、および１６３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７１、１７２、および１７３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８８】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合し、それぞれ、配列番号１６４、１６５、および１６６の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１７４、１７５、および１７６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２８９】
これらの抗体の各々は、ＢＭＰ９に結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を、「混合し、マッチさせ」て、本発明の他のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」ＢＭＰ９結合抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
【０２９０】
別の態様では、本発明は、表１に記載される、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むＢＭＰ９結合抗体を提供する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を使用して、またはＣｈｏｔｈｉａシステム（Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917；およびAl-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948）を使用して画定される。代替的に、ＣＤＲ領域を画定するための他の方法も使用することができる。例えば、ＣＤＲが、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなるように、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方によるＣＤＲの定義を組み合わせることができる。
【０２９１】
これらの抗体の各々は、ＢＭＰ９に結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のＢＭＰ９結合分子を創出するのに、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる。但し、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含有しなければならない）。このような「混合し、マッチさせた」ＢＭＰ９結合抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して調べることができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で突然変異させることにより創出しうることがたやすく明らかであろう。
【０２９２】
したがって、本発明は、配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１、１２１、１４１、１６１、４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、および１６４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、５、２５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１４５、および１６５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、６、２６、４６、６６、８６、１０６、１２６、１４６、および１６６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１、１３１、１５１、１７１、１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、および１７４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２、１３２、１５２、１７２、１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、および１７５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１６、３６、５６、７６、９６、１１６、１３６、１５６、および１７６のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、抗体が、ＢＭＰ９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０２９３】
一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、表１に記載される抗体である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−１である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−２である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−３である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−４である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−５である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−６である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−７である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−８である。一実施形態では、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体は、ＢＭＰ９−９である。
【０２９４】
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近似する（すなわち、同一性％が最大である）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しかし、ＶＨフレームワーク領域またはＶＬフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトとして同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、アミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差異を提示することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、なおまたは、４、３、２、または１アミノ酸以下の差異を提示しうる。
【０２９５】
ＢＭＰファミリーメンバーおよび肝線維症
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体またはその結合断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその結合断片は、表１に記載されている。
【０２９６】
一実施形態では、抗体またはその結合断片は、ＢＭＰ９には特異的に結合するが、他のＢＭＰタンパク質（ＢＭＰ２、ＢＭＰ１０またはＢＭＰ７など）には特異的に結合しない。
【０２９７】
ヒトおよびマウスにおいて、ＢＭＰ９は、肝臓内で発現し、ＢＭＰ９によるシグナル伝達は、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症の発症機序において役割を果たすと考えられる。いかなる理論にも束縛されずに述べると、ＢＭＰ９によるシグナル伝達は、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化をもたらし、これは、Ｉｄ１の活性化をもたらすと考えられる。Ｉｄ１の活性化は、肝細胞のアポトーシス、ＨＳＣの活性化、およびＨＳＣ−ＥＣクロストークをもたらし、これは、肝線維症をもたらす。肝臓内のＢＭＰ９発現の活性化は、肝細胞の細胞死および肝星細胞の活性化、肝線維症および線維性マーカー遺伝子（例えば、αＳＭＡ、ビメンチン、およびＣｏｌ１ａ１）の誘導、ならびに重度の肝損傷を引き起こすことが示されている。実施例を含む本明細書で記載される通り、驚くべきことに、かつ、予測外なことに、本発明のＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９に対して高度に特異的（ＢＭＰ２、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ７と比較して）であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ９を阻害し、ＢＭＰ９により誘導される肝線維症を含む、ＢＭＰ９により誘導される肝疾患の阻害を含むことが示された。
【０２９８】
ＢＭＰ９に対する、多様な種類の抗体およびそれらの抗原結合断片については、下記で記載する。
【０２９９】
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載される配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体は、ＢＭＰ９に結合し、表１に記載される抗体の、所望の機能的な特性を保持する。
【０３００】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、配列番号７、２７、４７、６７、８７、１０７、１２７、１４７および１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が、配列番号１７、３７、５７、７７、９７、１０７、１１７、１３７、１５７および１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；抗体が、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合し、抗体が、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知である、単離モノクローナル抗体（またはその機能的な抗原結合断片）を提供する。具体例では、このような抗体は、ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイ（本明細書で記載される）において、５００ｐＭ未満のＩＣ５０値を有する。具体例では、このような抗体は、ＣＣｌ４マウスモデル、例えば、本明細書で記載される、ＣＣｌ４マウスモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化を著明に阻害する。具体例では、このような抗体は、マウスＨＤＩモデル、例えば、本明細書で記載されるマウスＨＤＩモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、ＢＭＰ９によるＩｄ１の誘導を著明に阻害する。具体例では、このような抗体は、肝組織を、ＢＭＰ９により誘導される損傷、例えば、線維症から著明に保護する。
【０３０１】
一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号７、２７、４７、６７、８７、１０７、１２７、１４７または１６７、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７、１０７、１１７、１３７、１５７または１７７のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
【０３０２】
一実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９または１６９のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９、１３９、１５９、または１７９のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
【０３０３】
一実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示される配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０３０４】
一実施形態では、重鎖ヌクレオチド配列および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、表１に示される配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０３０５】
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０３０６】
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。
【０３０７】
保存的修飾を伴う抗体
一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを有し、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはその保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片の、所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とからなり、配列番号１、４、２１、２４、４１、４４、６１、６４、８１、８４、１０１、１０４、１２１、１２４、１４１、１４４、１６１および１６４、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２、５、２２、２５、４２、４５、６２、６５、８２、８５、１０２、１０５、１２２、１２５、１４２、１４５、１６２および１６５、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号３、６、２３、２６、４３、４６、６３、６６、８３、８６、１０３、１０６、１２３、１２６、１４３、１４６、１６３および１６６、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号１１、１４、３１、３４、５１、５４、７１、７４、９１、９４、１１１、１１４、１３１、１３４、１５１、１５４、１７１および１７４、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２、１５、３２、３５、５２、５５、７２、７５、９２、９５、１１２、１１５、１３２、１３５、１５２、１５５、１７２および１７５、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号１３、１６、３３、３６、５３、５６、７３、７６、９３、９６、１１３、１１６、１３３、１３６、１５３、１５６、１７３および１７６、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ３；抗体またはその抗原結合断片が、ＢＭＰ９に特異的に結合し、抗体が、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知である、単離モノクローナル抗体、またはその機能的な抗原結合断片を提供する。具体例では、抗体は、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合し、抗体は、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知である。具体例では、このような抗体は、ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイ（本明細書で記載される）において、５００ｐＭ未満のＩＣ５０値を有する。具体例では、このような抗体は、ＣＣｌ４マウスモデル、例えば、本明細書で記載される、ＣＣｌ４マウスモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化を著明に阻害する。具体例では、このような抗体は、マウスＨＤＩモデル、例えば、本明細書で記載されるマウスＨＤＩモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、ＢＭＰ９によるＩｄ１の誘導を著明に阻害する。具体例では、このような抗体は、肝組織を、ＢＭＰ９により誘導される損傷、例えば、線維症から著明に保護する。
【０３０８】
一実施形態では、哺乳動物細胞内の発現のために最適化された、本発明の抗体は、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはその保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片の、所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、哺乳動物細胞内の発現のために最適化された単離モノクローナル抗体であって、全長重鎖および全長軽鎖からなり、全長重鎖が、配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９の群から選択されたアミノ酸配列、およびこれらの保存的修飾を有し；全長軽鎖が、配列番号１９、３９、５９、７９、９９、１１９、１３９、１５９、１７９の群から選択されたアミノ酸配列、およびこれらの保存的修飾を有し；抗体が、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合し、抗体が、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知である、単離モノクローナル抗体を提供する。具体例では、抗体は、ＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合し、抗体は、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知である。具体例では、このような抗体は、ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイ（本明細書で記載される）において、５００ｐＭ未満のＩＣ５０値を有する。具体例では、このような抗体は、ＣＣｌ４マウスモデル、例えば、本明細書で記載される、ＣＣｌ４マウスモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化を著明に阻害する。具体例では、このような抗体は、マウスＨＤＩモデル、例えば、本明細書で記載されるマウスＨＤＩモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、ＢＭＰ９によるＩｄ１の誘導を著明に阻害する。具体例では、このような抗体は、肝組織を、ＢＭＰ９により誘導される損傷、例えば、線維症から著明に保護する。
【０３０９】
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に列挙されているＢＭＰ９結合抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、ＢＭＰ９結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合断片と交差競合する（例えば、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合断片の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の、ＢＭＰ９タンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、ＢＭＰ９への結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、ＢＭＰ９上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片と同じ、ＢＭＰ９上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ９上の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体は、マウスモノクローナル抗体である。このようなマウスモノクローナル抗体を、表３に列挙する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ９上の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体は、表３に列挙されるマウスモノクローナル抗体に由来する、ヒト化モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ９上の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。このようなヒト化モノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。
【０３１０】
抗原上の所望のエピトープを決定したら、例えば、本発明で記載される技法を使用して、そのエピトープに対する抗体を作り出すことが可能である。代替的に、発見過程において、抗体の作出および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報を解明することもできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見出す交差競合研究を行うことである。それらの交差競合に基づき、抗体を「ビニング」するハイスループット過程については、国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットにおいて記載されている。当業者により察知される通り、抗体が特異的に結合しうる、事実上いかなるものも、エピトープでありうるであろう。エピトープは、抗体が結合する残基を含みうる。
【０３１１】
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の、標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。
【０３１２】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当技術分野で周知の、任意の数のエピトープマッピング法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上で、タンパク質分子の部分に対応する、多数のペプチドを、共時的に合成し、ペプチドをなおも支持体へと接合させながら、ペプチドを、抗体と反応させることにより決定することができる。当技術分野では、このような技法が公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号明細書；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182；Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715において記載されている。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、水素／重水素交換、ｘ腺結晶構造解析、および二次元核磁気共鳴などにより、アミノ酸ＢＭＰ９の空間的コンフォメーションを決定することによりたやすく同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols、前出を参照されたい。タンパク質の抗原性領域はまた、例えば、Ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能な、Ｏｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるプロットなど、標準的な抗原性／疎水性プロットを使用して同定することもできる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためのホップ／ウッズ法、Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828、および疎水性プロットのためのカイト−ドゥーリトル法、Kyte-Doolittle technique, Kyte et al., (1982) J. MoI. Biol. 157:105-132を利用する。
【０３１３】
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
【０３１４】
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P.et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０３１５】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列または再配列された抗体配列を含む、公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のゲルミンＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子およびヒト軽鎖可変領域遺伝子についての、生殖細胞系列のＤＮＡ配列、ならびに再配列された抗体配列は、「ＩＭＧＴ」データベース（インターネットのwww.imgt.orgにおいて利用可能である；Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212を参照されたい；これらの各々の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）において見出すことができる。
【０３１６】
本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体およびそれらの抗原結合断片により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０３１７】
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ  ＣＤＲ１領域内、ＶＨ  ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ  ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ  ＣＤＲ１領域内、ＶＬ  ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ  ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
【０３１８】
抗原結合ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、ＢＭＰ９に特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリン、それらの抗原結合断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
【０３１９】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出す方法に関する。それらが、標的のＢＭＰ９タンパク質に特異的な結合領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．；およびＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（ＳｃｉＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
【０３２０】
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの第１０モジュール（１０  Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
【０３２１】
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのアルファ−ヘリックスおよびベータ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
【０３２２】
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
【０３２３】
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８アミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
【０３２４】
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合部位を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９１６８７３号にある。
【０３２５】
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットにおいて記載されている。
【０３２６】
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
【０３２７】
ヒトＢＭＰ９結合抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して作り出すことができる。例えば、非ヒト抗体を、操作ヒト抗体へと転換するのに使用されるヒト化技術である。米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書は、非ヒト抗体の結合特徴と比べて、同じ結合特徴または良好な結合特徴を維持しながら、抗体内の非ヒト抗体の可変領域を、ヒト可変領域で置きかえるためのｉｎ  ｖｉｖｏ法について記載している。方法は、非ヒト基準抗体の可変領域の、完全ヒト抗体による、エピトープ誘導型置換に依拠する。結果として得られるヒト抗体は一般に、基準非ヒト抗体と構造的に非類縁であるが、基準抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。略述すると、逐次的エピトープ誘導型相補性置換法は、被験抗体の、抗原への結合に応答するレポーター系の存在下で、限られた量の抗原への結合について、「競合体」と、基準抗体の多様なハイブリッド体のライブラリー（「被験抗体」）との、細胞内の競合を準備することにより可能となる。競合体は、単鎖Ｆｖ断片など、基準抗体またはその誘導体でありうる。競合体はまた、基準抗体と同じエピトープに結合する、抗原の天然リガンドまたは人工リガンドでもありうる。競合体の唯一の要件は、それが、基準抗体と同じエピトープに結合し、基準抗体と、抗原結合について競合することである。被験抗体は、非ヒト基準抗体に由来する、１つの共通の抗原結合Ｖ領域と、ヒト抗体のレパートリーライブラリーなど、多様な供給源からランダムに選択される他のＶ領域とを有する。基準抗体に由来する共通のＶ領域は、選択に、基準抗体に対する最高の抗原結合忠実度へのバイアスをかけるように、被験抗体を、抗原上の同じエピトープに、同じ配向性で配置するガイドとして用いられる。
【０３２８】
多くの種類のレポーター系を使用して、被験抗体と抗原との所望の相互作用を検出することができる。例えば、相補的レポーター断片は、断片の相補性によるレポーターの活性化が、被験抗体が、抗原に結合する場合に限り生じるように、抗原および被験抗体のそれぞれへと連結することができる。被験抗体−レポーター断片と抗原−レポーター断片との融合体を、競合体と共発現させる場合、レポーターの活性化は、被験抗体が競合体と競合する能力であって、被験抗体の、抗原に対するアフィニティーと比例する能力に依存する。使用しうる他のレポーター系は、米国特許出願第１０／２０８，７３０号明細書（公開第２００３０１９８９７１号）において開示されている、自己阻害レポーター再活性化の再活性化因子（ＲＡＩＲ系）、または米国特許出願第１０／０７６，８４５号明細書（公開第２００３０１５７５７９号）において開示されている競合活性化系を含む。
【０３２９】
逐次的エピトープ誘導型相補性置換系では、単一の被験抗体を、競合体、抗原、およびレポーター成分と共に発現する細胞を同定するように、選択を行う。これらの細胞内では、各被験抗体は、限られた量の抗原への結合について、競合体と一対一で競合する。レポーターの活性は、被験抗体に結合した抗原の量に比例し、被験抗体に結合した抗原の量は、被験抗体の、抗原に対するアフィニティーおよび被験抗体の安定性と比例する。被験抗体はまず、被験抗体として発現させる場合の基準抗体の活性と比べた、それらの活性に基づき選択する。選択の第１ラウンドの結果は、それらの各々が、基準抗体に由来する、同じ非ヒトＶ領域と、ライブラリーに由来するヒトＶ領域とから構成され、それらの各々が、抗原上の、基準抗体と同じエピトープに結合する、「ハイブリッド」抗体のセットである。第１ラウンドで選択されるハイブリッド抗体のうちの１つまたは複数は、抗原に対する、基準抗体のアフィニティー以上のアフィニティーを有するであろう。
【０３３０】
第２のＶ領域置きかえステップでは、第１のステップで選択されたヒトＶ領域を、残りの非ヒト基準抗体Ｖ領域の、コグネイトヒトＶ領域の多様なライブラリーによるヒト置換体を選択するためのガイドとして使用する。第１ラウンドで選択されたハイブリッド抗体はまた、選択の第２ラウンドのための競合体としても使用することができる。選択の第２ラウンドの結果は、基準抗体と構造的に異なるが、同じ抗原への結合について、基準抗体と競合する、完全ヒト抗体のセットである。選択されたヒト抗体の一部は、基準抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択されたヒト抗体の中で、１つまたは複数は、同じエピトープに、基準抗体のアフィニティー以上のアフィニティーで結合する。
【０３３１】
上記で記載した、マウスＢＭＰ９結合抗体またはキメラＢＭＰ９結合抗体のうちの１つを、基準抗体として使用するこの方法は、ヒトＢＭＰ９に、基準抗体以上の結合特異性および基準抗体以上の結合アフィニティーで結合するヒト抗体を作り出すのに、たやすく利用することができる。加えて、このようなヒトＢＭＰ９結合抗体はまた、ヒト抗体をカスタムで作製する企業、例えば、ＫａｌｏＢｉｏｓ，Ｉｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ）から購入することもできる。
【０３３２】
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバーを含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表されたＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
【０３３３】
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788; Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体および抗原結合断片と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
【０３３４】
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
【０３３５】
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
【０３３６】
したがって、本発明の特色は、ＢＭＰ９に対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書の一実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、ＢＭＰ９またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、ＢＭＰ９結合ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＢＭＰ９を伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
【０３３７】
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＢＭＰ９結合抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合領域は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体など、１つまたは複数の他の結合分子へと機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことができる。
【０３３８】
したがって、本発明は、ＢＭＰ９に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、ＢＭＰ９の別のエピトープである。
【０３３９】
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープおよび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
【０３４０】
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
【０３４１】
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合部位を創出する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2):83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照されたい）。
【０３４２】
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０３４３】
本発明の二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686； Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78、118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）から入手可能である。
【０３４４】
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
【０３４５】
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書において記載されている。
【０３４６】
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を利用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体複合体の存在が検出される。
【０３４７】
別の態様では、本発明は、ＢＭＰ９に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の、少なくとも２つの、同一であるかまたは異なる抗原結合部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、互いに連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片を、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の定常領域に結合する抗体または抗原結合断片、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
【０３４８】
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許である欧州特許第１０１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
【０３４９】
半減期を延長した抗体
本発明は、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体であって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体を提供する。
【０３５０】
多くの因子が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびにマクロファージおよび樹状細胞による取込み）などの因子である。様々な戦略を使用して、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により；ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により；またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の半減期を延長することができる。
【０３５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体、その抗原結合断片を、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。一実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化するための方法が公知であり、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
【０３５２】
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、規範的なアミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを伝達するコドンへと転換する。
【０３５３】
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
【０３５４】
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。ＰＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
【０３５５】
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
【０３５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
【０３５７】
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミンへとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、および同０１／７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。
【０３５８】
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
【０３５９】
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと（またはその抗原結合断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
【０３６０】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを利用して、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体およびそれらの抗原結合断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体およびそれらの抗原結合断片、またはコードされた抗体およびそれらの抗原結合断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。ＢＭＰ９に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
【０３６１】
さらに、抗体およびそれらの抗原結合断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。一実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ、９１３１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチド（配列番号２１８）である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号２１８）は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
【０３６２】
一実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片を、診断剤または検出用薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
【０３６３】
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体およびそれらの抗原結合断片の使用もさらに包含する。抗体およびその抗原結合断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
【０３６４】
さらに、抗体およびその抗原結合断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
【０３６５】
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。一実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50において記載されている。
【０３６６】
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Amonet al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (ed), pp.243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., 「Antibodies For Drug Delivery」, Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506(1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16(Academic Press 1985)；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０３６７】
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
【０３６８】
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＢＭＰ９結合抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号７、２７、４７、６７、８７、１０７、１２７、１４７、または１６７のいずれかに示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号１７、３７、５７、７７、９７、１１７、１３７、１５７、または１７７のいずれかに示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ＢＭＰ９抗原結合能を呈示することが可能である。
【０３６９】
本発明ではまた、表１で示したＢＭＰ９結合抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、表１で示したＢＭＰ９結合抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
【０３７０】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号７、２７、４７、６７、８７、１０７、１２７、１４７、または１６７のいずれかに示される成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な成熟重鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。本発明のいくつかの核酸配列は、配列番号１７、３７、５７、７７、９７、１１７、１３７、１５７、および１７７のいずれかに示される成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０３７１】
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＢＭＰ９結合抗体またはその結合断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
【０３７２】
本発明ではまた、上記で記載したＢＭＰ９結合抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、ＢＭＰ９結合抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＢＭＰ９結合ポリヌクレオチドおよびＢＭＰ９結合ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al., 前出; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
【０３７３】
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、ＢＭＰ９結合の抗体鎖の抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有することが典型的である。一実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、ＢＭＰ９結合の、抗体鎖の抗原結合断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
【０３７４】
発現ベクターはまた、挿入されたＢＭＰ９結合抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたＢＭＰ９結合抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。ＢＭＰ９結合抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体およびそれらの抗原結合断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
【０３７５】
ＢＭＰ９結合抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合部位配列なども有する。本発明のＢＭＰ９結合ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
【０３７６】
一実施形態では、本発明のＢＭＰ９結合ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。哺乳動物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０３７７】
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる（一般に、Sambrook et al., 前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、ＢＭＰ９結合抗体鎖または結合断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
【０３７８】
本発明のモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む様々な技法により作製することができる。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換または発がん性形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの技法を援用することができる。
【０３７９】
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、融合体のための免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび免疫化法が公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
【０３８０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体およびそれらの抗原結合断片は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
【０３８１】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＢＭＰ９を指向するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを使用して作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソームマウスは、本明細書で、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
【０３８２】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性ミュー鎖遺伝子座および内因性カッパ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と併せて、再配列されていないヒト重（ミューおよびガンマ）鎖免疫グロブリン配列およびカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはＫの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧ−カッパモノクローナル抗体を作り出す（Lonberg, N. et al., 1994 前出; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101において総説される; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93；ならびにHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノムの修飾は、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；ならびにFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに記載されている。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；Suraniらによる、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７１１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号も参照されたい。
【０３８３】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細書で「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号において詳細に記載されている。
【０３８４】
当技術分野ではなおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスジェニック動物系も入手可能であり、本発明のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称する代替的なトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されている。
【０３８５】
当技術分野ではさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスクロモソーム動物系も入手可能であり、本発明のＢＭＰ９結合抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができるが、このようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有するウシも記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＢＭＰ９結合抗体をもたらすのに使用することができる。
【０３８６】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では、ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が確立されているか、または下記の実施例で記載する。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらによる米国特許第５，４２７，９０８号明細書；および同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる米国特許第５，９６９，１０８号明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
【０３８７】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化するとヒト抗体応答を作り出しうるようにヒト免疫細胞を再構成した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる米国特許第５，４７６，９９６号明細書；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
【０３８８】
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体およびそれらの抗原結合断片は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨ内および／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと、修飾が施された抗体およびそれらの抗原結合断片を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
【０３８９】
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３９０】
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスである。
【０３９１】
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
【０３９２】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３９３】
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
【０３９４】
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３９５】
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３９６】
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号においてさらに記載されている。
【０３９７】
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃ−ガンマ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号においてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、Ｆｃ−ガンマＲＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
【０３９８】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；および同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
【０３９９】
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、ＬｅｃＩ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。
【０４００】
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するＢＭＰ９結合抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなＢＭＰ９結合抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＢＭＰ９結合抗体の構造的特徴を使用して、構造的に類縁のＢＭＰ９結合抗体であって、ヒトＢＭＰ９に結合し、また、ＢＭＰ９の、１つまたは複数の機能的特性も阻害すること（例えば、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知であり、例えば、ＨＵＶＥＣアッセイに続くウェスタンブロット法（本明細書で記載される）、またはＣＦＳＣアッセイに続くＣｅｌｌｏｍｉｃｓ走査（本明細書で記載される）により測定される、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化を阻害し；例えば、マウスＨＤＩモデル、例えば、本明細書で記載されるマウスＨＤＩモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、ＢＭＰ９によるＩｄ１の誘導を阻害する）など、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の、少なくとも１つの機能的特性を保持するＢＭＰ９結合抗体を創出する。
【０４０１】
例えば、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の、１つもしくは複数のＣＤＲ領域、またはそれらの突然変異を、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと、組換えにより組み合わせて、上記で論じた通り、さらなる、組換えにより操作された本発明のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
【０４０２】
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５０２５５５５２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
【０４０３】
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書で記載されるＢＭＰ９結合抗体の機能的特性であって、ヒトＢＭＰ９タンパク質に特異的に結合すること、および／またはＢＭＰ９の１つまたは複数の機能的特性を阻害すること（例えば、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ９により誘導されるＩｄ１の誘導、ＢＭＰ９による線維性マーカーの誘導、および／またはＢＭＰ９により誘導される肝損傷を阻害し、この場合、アッセイのいずれも、当技術分野で公知であり、例えば、ＨＵＶＥＣアッセイに続くウェスタンブロット法（本明細書で記載される）、またはＣＦＳＣアッセイに続くＣｅｌｌｏｍｉｃｓ走査（本明細書で記載される）により測定される、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化を阻害し；例えば、マウスＨＤＩモデル、例えば、本明細書で記載されるマウスＨＤＩモデルにおける、用量を１０ｍｇ／ｋｇとする単回注射時に、ＢＭＰ９によるＩｄ１の誘導を阻害する）を含むがこれらに限定されない機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体である。
【０４０４】
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
【０４０５】
本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片を操作する方法についての一実施形態では、突然変異を、ＢＭＰ９結合抗体をコードする配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に導入することができ、結果として得られる修飾ＢＭＰ９結合抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
【０４０６】
本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片は、多様な機能的アッセイにより特徴付けることができる。例えば、それらは、ＢＭＰ９を阻害するそれらの能力により特徴付けることができる。
【０４０７】
ＢＭＰ９に結合する抗体の能力は、対象の抗体を標識することにより、直接的に検出することもでき、抗体を標識せずに、当技術分野で公知の、多様なサンドイッチアッセイフォーマットを使用して、結合を間接的に検出することもできる。
【０４０８】
一実施形態では、本発明のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片は、基準ＢＭＰ９結合抗体の、ＢＭＰ９ポリペプチドへの結合を遮断するか、またはこれと競合する。これらは、上記で記載した、完全ヒトＢＭＰ９結合抗体またはヒト化ＢＭＰ９結合抗体でありうる。それらはまた、基準抗体と同じエピトープに結合する、他のヒトＢＭＰ９結合抗体、マウスＢＭＰ９結合抗体、キメラＢＭＰ９結合抗体、またはヒト化ＢＭＰ９結合抗体でもありうる。基準抗体の結合を遮断するか、またはこれと競合する能力は、被験下のＢＭＰ９結合抗体が、基準抗体により規定されるエピトープと同じであるかもしくは類似のエピトープ、または基準ＢＭＰ９結合抗体が結合するエピトープと十分に近位のエピトープに結合することを指し示す。このような抗体は、とりわけ、基準抗体について同定される有利な特性を共有する可能性が高い。基準抗体を遮断するか、またはこれと競合する能力は、例えば、競合的結合アッセイにより決定することができる。競合的結合アッセイでは、被験下の抗体を、基準抗体の、ＢＭＰ９ポリペプチドなど、共通の抗原への特異的結合を阻害する能力について検討する。過剰量の被験抗体が、基準抗体の結合を実質的に阻害する場合、被験抗体は、抗原への特異的結合について、基準抗体と競合する。実質的な阻害とは、被験抗体が、基準抗体の特異的結合を、通例、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減することを意味する。
【０４０９】
抗体の、特定のタンパク質、この場合、ＢＭＰ９への結合についての、基準抗体との競合について評価するのに使用しうる、多数の公知の競合的結合アッセイが存在する。これらは、例えば、直接的固相イムノアッセイまたは間接的固相イムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接的固相イムノアッセイまたは間接的固相イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983を参照されたい）；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986を参照されたい）；直接的固相標識アッセイ、直接的固相標識サンドイッチアッセイ（Harlow & Lane、前出を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する、直接的固相標識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988を参照されたい）；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990）；および直接的標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990）を含む。このようなアッセイは、非標識化被験ＢＭＰ９結合抗体または標識化基準抗体のいずれかを保有する固体表面または細胞に結合させた精製抗原の使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験抗体の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通例、被験抗体は、過剰に存在する。競合アッセイ（競合抗体）により同定される抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体と、基準抗体が結合するエピトープと、立体障害が生じる程度に十分に近位の隣接エピトープに結合する抗体とを含む。
【０４１０】
選択されたＢＭＰ９結合モノクローナル抗体が、固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、市販の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ製の試薬）を使用して、各抗体をビオチニル化することができる。非標識化モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合研究は、ＢＭＰ９ポリペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して実施することができる。ビオチニル化ＭＡｂの結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブにより検出することができる。精製ＢＭＰ９結合抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施することができる。例えば、マイクロ滴定プレートのウェルを、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧによりコーティングすることができる。１％のＢＳＡによるブロッキングの後で、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の、ＢＭＰ９結合モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、雰囲気温度で、１〜２時間にわたり反応させる。次いで、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブと反応させることができる。次いで、精製抗体のアイソタイプを決定しうるように、プレートを、現像および解析する。
【０４１１】
ＢＭＰ９結合モノクローナル抗体の、ＢＭＰ９ポリペプチドを発現する生細胞への結合を裏付けるために、フローサイトメトリーを使用することができる。略述すると、ＢＭＰ９を発現する細胞株（標準的な成長条件下で成長させた）を、０．１％のＢＳＡおよび１０％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中に多様な濃度のＢＭＰ９結合抗体と共に混合し、３７℃で、１時間にわたりインキュベートすることができる。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下で、フルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。試料は、単一の細胞にゲートをかけるように、光特性および側方散乱特性を使用する、ＦＡＣＳｃａｎ装置により解析することができる。蛍光顕微鏡法を使用する代替的なアッセイを、フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはこれの代わりに）使用することができる。細胞は、上記で記載した通りに正確に染色し、蛍光顕微鏡法により検討することができる。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能とするが、抗原の密度に応じて、感度が低下する場合がある。
【０４１２】
本発明のＢＭＰ９結合抗体およびそれらの抗原結合断片は、ウェスタンブロット法により、ＢＭＰ９ポリペプチドまたはＢＭＰ９抗原性断片との反応性について、さらに調べることができる。略述すると、精製ＢＭＰ９ポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはＢＭＰ９を発現する細胞に由来する細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動の後、分離された抗原を、ニトロセルロース膜へと移し、１０％のウシ胎仔血清でブロッキングし、被験モノクローナル抗体でプローブする。抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して、ヒトＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）で現像することができる。
【０４１３】
機能的アッセイの例はまた、下記の実施例でも記載する。
【０４１４】
予防的使用および治療的使用
本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の任意の抗体またはその抗原結合断片を投与することにより、ＢＭＰ９の活性の増大と関連する疾患または障害を処置する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することにより、肝線維症を処置する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することにより、肝硬変を処置する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することにより、門脈高血圧症を処置する方法を提供する。
【０４１５】
本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を使用して、とりわけ、肝疾患、例えば、肝線維症を処置する、例えば、その進行を防止するか、遅延させるか、または転導することができる。本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を使用して、とりわけ、肝硬変を処置する、例えば、その進行を防止するか、遅延させるか、または転導することができる。本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を使用して、とりわけ、門脈高血圧症を処置する、例えば、その進行を防止するか、遅延させるか、または転導することができる。抗体またはそれらの抗原結合断片はまた、患者における肝線維症、肝硬変、および／または門脈高血圧症を処置するための他の療法と組み合わせて使用することもできる。本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を使用して、とりわけ、末期肝疾患、例えば、静脈瘤、黄疸、腹水、肝性脳症、肝腎症候群、特発性細菌性腹膜炎、および肝肺症候群を処置する、例えば、これらの進行を防止するか、遅延させるか、または転導することができる。
【０４１６】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片を投与することにより、ＢＭＰ９関連疾患またはＢＭＰ９関連障害を処置する方法を提供する。抗体またはそれらの抗原結合断片が有用となりうる、公知のＢＭＰ９関連疾患またはＢＭＰ９関連障害の例は、腫瘍血管新生の阻害を含む血管新生；腎性貧血およびがん誘導性貧血を含む貧血；異所性骨化疾患；アテローム性動脈硬化、高血圧症、および心疾患を含む血管疾患を含む。加えて、抗体またはそれらの抗原結合断片が有用となりうる、公知のＢＭＰ９関連疾患またはＢＭＰ９関連障害の例は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）感染；Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）感染；自己免疫性肝炎；アルコール、毒素、または薬物への曝露；肝外傷；胆道閉塞；原発性胆汁性肝硬変；アラジール症候群；心疾患または肝流出路閉塞に由来する慢性肝うっ血を含む慢性肝うっ血；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性硬化性胆管炎；ヘモクロマトーシス；アルファ１−アンチトリプシン欠損症；およびウィルソン病により引き起こされる線維性肝疾患を含む、肝硬変および／または門脈高血圧症を結果としてもたらす線維性肝疾患を含む線維性肝疾患を含む。
【０４１７】
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片を投与することにより、ＢＭＰ９関連疾患またはＢＭＰ９関連障害を処置する方法であって、前記疾患または障害が、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症である、方法を提供する。
【０４１８】
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症を処置する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、肝疾患、例えば、肝線維症または肝硬変を処置する方法を提供する。
【０４１９】
具体的な実施形態では、本発明は、門脈高血圧症を処置する方法を提供する。
【０４２０】
一実施形態では、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする患者に、本明細書で記載されているか、または当技術分野で公知の治療法または手順などの、治療法または手順と共に投与することができる。このような方法または手順は、非限定的な例として、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎のための抗ウイルス療法、抗炎症剤、抗脂肪肝剤、抗アポトーシス剤、もしくは肝保護剤、または他の抗線維化剤との共投与を含む。
【０４２１】
例えば、表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、「標準的」な抗線維化剤と組み合わせて使用することができる。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒素、免疫抑制性剤、放射性毒性剤、および／または治療用抗体と組み合わせて（すなわち、これらと併せて、または連携させて（すなわち、イムノコンジュゲート））投与することができる。本発明により想定される、特定の共療法剤は、ステロイド（例えば、プレドニゾンなどのコルチコステロイド）、免疫抑制剤および／または抗炎症剤（例えば、ガンマ−インターフェロン、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ペニシラミン、シクロスポリン、コルヒチン、抗胸腺細胞グロブリン、ミコフェノール酸モフェチル、およびヒドロキシクロロキン）、細胞毒性薬、カルシウムチャネル遮断剤（例えば、ニフェジピン）、アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ジメチルスルホキシド、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）阻害剤、インターロイキン５（ＩＬ−５）阻害剤、およびパンカスパーゼ阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【０４２２】
表１に記載される単離抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用されうる、さらなる抗線維化剤は、レクチン（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０２６，２８３号明細書に記載されている）のほか、Ｗｙｎｎら（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Journal Clin. Invest. Vol 117 Number 3, March 2007, p 524）により記載されている抗線維化剤を含むがこれらに限定されない。例えば、さらなる抗線維化剤および抗線維化療法は、多様な抗炎症性薬／免疫抑制性薬／細胞毒性薬（コルヒチン、アザチオプリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、サリドマイド、ペントキシフィリン、およびテオフィリンを含む）、ＴＧＦ−βシグナル伝達修飾剤（リラキシン、ＳＭＡＤ７、ＨＧＦ、およびＢＭＰ７のほか、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＥＧＲ−１、およびＣＴＧＦ阻害剤を含む）（例えば、ペルフェニドン、Ｆ−３５１、Ｆ−２００、およびＦ−５７３）、サイトカインおよびサイトカイン受容体のアンタゴニスト（ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−１３Ｒβ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、オンコスタチンＭ、ＷＩＳＰ−１、およびＰＤＧＦの阻害剤）、サイトカインおよびケモカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α／β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１）、ケモカインアンタゴニスト（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ１７、およびＣＣＬ１８の阻害剤）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ２、およびＣＸＣＲ４の阻害剤）、ＴＬＲアンタゴニスト（ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９の阻害剤）、血管新生アンタゴニスト（ＶＥＧＦ特異的抗体およびアデノシンデアミナーゼ置換療法）、降圧薬（ベータ遮断剤、ならびにＡＮＧ  ＩＩ、ＡＣＥ、およびアルドステロンの阻害剤）、血管作動性物質（ＥＴ−１受容体アンタゴニストおよびボセタン）、コラーゲンを合成およびプロセシングする酵素の阻害剤（プロリルヒドロキシラーゼの阻害剤）、Ｂ細胞アンタゴニスト（リツキシマブ）、インテグリン／接着分子アンタゴニスト（α１β１およびαｖβ６インテグリンを遮断する分子のほか、インテグリン結合キナーゼの阻害剤、ならびにＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１に特異的な抗体）、筋線維芽細胞を標的とするアポトーシス促進薬、ＭＭＰ阻害剤（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１２の阻害剤）、ならびにＴＩＭＰ阻害剤（ＴＩＭＰ−１に特異的な抗体）を含むがこれらに限定されない。
【０４２３】
表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、「標準的」な抗糖尿病剤、例えば、メトフォルミンと組み合わせて、糖尿病関連ＮＡＳＨ線維症を処置するのに使用することができる。表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用されうる、他の抗糖尿病剤は、当技術分野で公知であり、スルホニルウレア（例えば、グリブリド、グリピジド、およびグリメピリド）、メグリチニド（例えば、レパグリニドおよびナテグリニド）、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）、ＤＰＰ−４阻害剤（例えば、シタグリプチン、サキサグリプチン、およびリナグリプチン）、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、エキセナチドおよびリラグルチド）、ＳＧＬＴ２阻害剤（例えば、カングリフロジンおよびダパグリフロジン）、およびインスリンを含む。
【０４２４】
表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、「標準的」な抗ウイルス剤、例えば、抗ＨＢＶウイルス剤および抗ＨＣＶウイルス剤と組み合わせて、ＨＢＶ関連線維症および／またはＨＣＶ関連線維症を処置するのに使用することができる。表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用されうる、他の抗ウイルス剤は、当技術分野で公知であり、インターフェロン（例えば、ＩＦＮアルファ−２ｂ、ＩＦＮアルファ−２ａ、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ、およびＩＦＮアルファコン１）、リバビリンと組み合わせたインターフェロン、プロテアーゼ阻害剤（例えば、レジパスビル、ソホスブビル、ボセプレビル、またはテラプレビル、テノフォビル、ダクラタスビル、シメプレビル、レダスプレビル）、および他の抗ウイルス剤（例えば、ラミブジン、アデホビル、テルビブジン、およびエンテカビル）を含む。
【０４２５】
表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、「標準的」な抗炎症剤、例えば、コルチコステロイド、ＧＦＴ−５０５、およびセニクリビロック、ならびにこれらの組合せと組み合わせて使用することができる。
【０４２６】
表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、「標準的」な抗脂肪肝剤、例えば、ビタミンＥ、ピオグリタゾン、メトフォルミン、オベチコール酸、およびこれらの組合せと組み合わせて使用することができる。
【０４２７】
表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、「標準的」な抗アポトーシス剤または肝保護剤、例えば、オベチコール酸、ＧＦＴ−５０５、ＧＲ−ＭＤ−０２、およびこれらの組合せと組み合わせて使用することができる。
【０４２８】
当業者により察知される通り、表１に記載される抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を伴う組合せ療法は、上記で記載した複数のクラスの薬剤を伴う組合せ療法を含むことが可能であり、例えば、１つまたは複数の抗ウイルス剤、および１つまたは複数のさらなる抗線維化剤を伴いうる。
【０４２９】
本発明の治療剤を、別の１つまたは複数の薬剤と併せて投与する場合、２つ（または２つ以上）を、任意の順序で、逐次的に投与することもでき、同時に投与することもできる。一部の態様では、本発明の抗体を、第２の薬剤または方法による治療もまた施される対象に投与する。他の態様では、結合分子を、手術による処置と共に投与する。
【０４３０】
ＢＭＰ９結合抗体による組合せ処置に適する薬剤は、当技術分野で公知の薬剤であって、ＢＭＰ９の発現、レベル、安定性、および／または活性を阻害するか、または低減する薬剤を含む。このような薬剤は、ＢＭＰ９に対する抗体、ｓｉＲＮＡ、可溶性ＢＭＰ９受容体、タンパク質、および低分子を含む。
【０４３１】
当技術分野では、ＢＭＰ９に対する多様な抗体であって、とりわけ、文献に記載されているか、または市販されている抗体、例えば、マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂクローン３６０１０７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ３２０９）、および例えば、米国特許出願公開第２０１４／００５６９０２号明細書において記載されている抗体を含む抗体が公知である。
【０４３２】
当技術分野では、ＢＭＰ９に対する、多様なｓｉＲＮＡが公知である。
【０４３３】
例えば、ＡＬＫ１およびＡｃｔＲＩＩｂの可溶性断片などの、可溶性ＢＭＰ受容体を含む、ＢＭＰ９のさらなる阻害剤が公知である。これらのうちのいずれかを、本明細書で開示される、任意の抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用することができる。
【０４３４】
組合せ療法レジメンは、相加的結果をもたらす場合もあり、相乗結果（例えば、ＢＭＰ９活性の低減であって、２つの薬剤の組合せ使用について予測される低減を超える低減）をもたらす場合もある。一実施形態では、本発明は、肝疾患、例えば、線維症、門脈高血圧症、もしくは肝硬変、または上記で記載した別のＢＭＰ９関連疾患を、本発明のＢＭＰ９結合抗体と、上記で記載した抗線維化剤または抗線維化法とにより、阻止および／または処置するための組合せ療法を提供する。
【０４３５】
診断的使用
一態様では、本発明は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）の文脈では、９ＢＭＰ９タンパク質および／または核酸発現、ならびにＢＭＰ９機能を決定するための診断アッセイ、あるいは個体が、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症と関連する疾患もしくは障害に罹患しているのかどうか、または肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症と関連する障害を発症する危険性があるのかどうかを決定するための診断アッセイを包含する。
【０４３６】
競合アッセイなどの診断アッセイは、共通の結合パートナー上の、限定的な数の結合部位について、被験試料解析物と競合する、標識化類似体（「トレーサー」）の能力に依拠する。一般に、結合パートナーを、競合の前または後に不溶化させ、次いで、結合パートナーに結合したトレーサーおよび解析物を、結合しなかったトレーサーおよび解析物から分離する。この分離は、デカントすること（結合パートナーを、あらかじめ不溶化させた場合）または遠心分離すること（結合パートナーを、競合反応の後で沈殿させた場合）により達せられる。被験試料解析物の量は、マーカー物質の量により測定される、結合したトレーサーの量に反比例する。被験試料中に存在する解析物の量を、定量的に決定するために、既知量の解析物による用量反応曲線を調製し、試験結果と比較する。酵素を検出可能マーカーとして使用する場合、これらのアッセイを、ＥＬＩＳＡ系と呼ぶ。この形態のアッセイでは、抗体と、ＢＭＰ９結合抗体との競合的結合は、血清試料中の抗体、最も特に、血清試料中の中和抗体についての尺度である、結合したＢＭＰ９、好ましくは、結合した、本発明のＢＭＰ９エピトープを結果としてもたらす。
【０４３７】
アッセイの著明な利点は、測定を、中和抗体（すなわち、ＢＭＰ９、具体的には、エピトープの結合に干渉するもの）について直接行うことである。特に、ＥＬＩＳＡ試験の形態における、このようなアッセイは、臨床環境およびルーチンの血液スクリーニングにおいて、無視できない適用を有する。
【０４３８】
肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症と関連する障害を伴う患者についての、臨床診断または臨床モニタリングでは、正常対象に由来する、対応する生物学的試料中のレベルと比較した、例えば、肝臓内の、ＢＭＰ９タンパク質またはＢＭＰ９  ｍＲＮＡのレベルの上昇の検出は、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症と関連する障害を伴う患者を示す。
【０４３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断法またはイメージングは、米国特許出願公開第２００６／００６７９３５号明細書において記載されている。略述すると、これらの方法は一般に、患者に、非侵襲的方法により検出可能なマーカーまたは標識へと作動可能に接合させた、診断的有効量のＢＭＰ９結合分子を、投与または導入するステップを含む。抗体−マーカーコンジュゲートに、局在化し、ＢＭＰ９に結合するのに十分な時間を与える。次いで、患者を、検出デバイスへと曝露して、検出可能マーカーを同定し、これにより、患者の組織内のＢＭＰ９結合分子の画像を形成する。ＢＭＰ９結合抗体またはその抗原結合断片の存在は、抗体−マーカーが、組織の構成要素に結合するのかどうかを決定することにより検出する。肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症を伴わない正常個体と比較した、ＢＭＰ９タンパク質またはタンパク質の組合せのレベルの上昇の検出は、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症と関連する障害に対する素因、および／またはこれらの発症を示す。本発明のこれらの態様はまた、組織イメージング法および診断法と処置法との組合せにおける使用のための態様でもある。
【０４４０】
本発明はまた、診断アッセイ、予後診断アッセイ、薬理遺伝学、および臨床試験のモニタリングを、予後診断（予測）の目的で使用して、これにより、個体を予防的に処置する、予測医学の分野にも関する。
【０４４１】
本発明はまた、個体が、ＢＭＰ９経路活性の調節異常と関連する障害を発症する危険性があるのかどうかを決定するための予後診断（予測）アッセイも提供する。例えば、ＢＭＰ９遺伝子内の突然変異については、生物学的試料中でアッセイすることができる。このようなアッセイを、予後診断または予測の目的で使用して、これにより、ＢＭＰ９、核酸の発現、または活性を特徴とするか、またはこれらと関連する障害が発症する前に、個体を予防的に処置することができる。
【０４４２】
本発明の別の態様は、個体におけるＢＭＰ９核酸の発現またはＢＭＰ９の活性を決定し、これにより、その個体に適切な治療剤または予防剤を選択するための方法（本明細書では、「薬理遺伝学」と称する）を提供する。薬理遺伝学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に応答する個体の能力を決定するのに検討される、個体の遺伝子型）に基づく個体の治療的処置または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能とする。
【０４４３】
本発明のさらに別の態様は、薬剤（例えば、薬物）の、ＢＭＰ９の発現または活性に対する影響を、臨床試験においてモニタリングする方法を提供する。
【０４４４】
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたＢＭＰ９結合抗体またはその結合断片を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、ＢＭＰ９関連疾患（例えば、肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変、または門脈高血圧症）の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的な担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０４４５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することができる。薬学的に許容される担体は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
【０４４６】
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
【０４４７】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、ＢＭＰ９結合抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。ＢＭＰ９結合抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
【０４４８】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０４４９】
医師または獣医師は、医薬組成物中で利用される本発明の抗体およびそれらの抗原結合断片の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載されるアレルギー性の炎症性障害を処置するために有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範囲であり、より通例では、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。抗体の硝子体内投与では、投与量は、約０．０００１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。
【０４５０】
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるＢＭＰ９結合抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するように調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
【０４５１】
［実施例］
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、付属の特許請求の範囲によっても包含される。
【実施例１】
【０４５２】
組換えＢＭＰ９の作出
全長ｈＢＭＰ９タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターへとクローニングし、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。ｈＢＭＰ９構築物を、２９３Ｆ細胞株へと、一過性にトランスフェクトし、細胞を、ｈＢＭＰ９タンパク質の産生のために、さらに最適化した。最終的な産生を、１０Ｌのスケールおよび複数の試行で実行した。細胞生存率が８０％超の場合に、最終採取物を回収した。最終採取物中の細胞破砕物を、遠心分離工程および濾過工程により除去した。標的ｈＢＭＰ９タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーを使用することにより精製した。限外濾過を使用して、ｈＢＭＰ９タンパク質を濃縮し、緩衝液を交換した。タンパク質の定量化を、ローリー法により決定した。精製されたｈＢＭＰ９タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、およびＨＰＬＣにより解析した。
【実施例２】
【０４５３】
ハイブリドーマ技術による、抗ＢＭＰ９抗体の作出
マウスの免疫化および融合
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、２５〜５０ｕｇのｈｕＢＭＰ９の、４回にわたる皮下注射または腹腔内注射を伴う反復的手順により、ヒトＢＭＰ９組換えタンパク質（ｈｕＢＭＰ９）で免疫化した。免疫化されたマウスの脾臓を採取し、単離された脾臓細胞を、骨髄腫細胞（Ｐ３Ａｇ８．６５３細胞株）へと融合させて、ハイブリドーマクローンを創出した。ハイブリドーマクローンに由来する上清を、一次スクリーニングアッセイとしての結合ＥＬＩＳＡで調べて、陽性クローンの、ＢＭＰ９への結合を同定した。次いで、一次スクリーニング結合アッセイから同定された陽性クローンの上清を、ブロッキングＥＬＩＳＡにおいて試験して、ＢＭＰ９と、その受容体との相互作用を阻害しうる陽性クローンを同定した。４つの異なる組換えＢＭＰ９受容体：ヒトＡｌｋ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、３７０−ＡＬ−１００）；ヒトＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、８１１−ＢＲ−１００）；ヒトＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、３４０−Ｒ２−１００）；ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。
【０４５４】
２つのクローンを、Ｂｉａｃｏｒｅにより検証される、ｈｕＢＭＰ９に高アフィニティーで結合するそれらの能力に基づき、特異的なＢＭＰ９受容体相互作用を遮断するそれらの能力について、ヒト化のために選択した。２Ｂ１１Ｇ２が、ヒトＢＭＰ９と、ヒトＡｌｋ１との結合を阻害するのに対し、４Ｅ１０Ｄ７抗体は、ヒトＢＭＰ９と、ヒトＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害しうる。したがって、２Ｂ１１Ｇ２が、Ｉ型受容体相互作用の阻害剤として分類されるのに対し、４Ｅ１０Ｄ７は、ＩＩ型受容体相互作用の阻害剤として分類される。
【０４５５】
マウスハイブリドーマ抗体である、２Ｂ１１Ｇ２および４Ｅ１０Ｄ７の結合特性および配列を、それぞれ、表２および３に示す。
【０４５６】
【表２】
2018522540.tif 000034
【０４５７】
【表３−１】
2018522540.tif 000035
【０４５８】
【表３−２】
2018522540.tif 000036
【０４５９】
２Ｂ１１Ｇ２ヒト化抗体のデザイン
２Ｂ１１Ｇ２マウス抗体に由来するヒト化抗体を、ＣＤＲグラフティングによりデザインした。略述すると、ヒト化は、非ヒト動物抗体のＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列（「ドナー」と称する）を、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（「アクセプター」と称する）へとグラフトすることにより作出した。
【０４６０】
ヒト生殖細胞系列配列である１−４６（ＶＢＡＳＥ  ＶＨ１  １−４６；ＩＭＧＴ  ＩＧＨＶ１−４６＊０１）を、２Ｂ１１Ｇ２  ＶＨをヒト化するためのアクセプターフレームワークとして選択し；２Ｂ１１Ｇ２  ＶＨのＣＤＲを、アクセプターフレームワークへとグラフトして、２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＨ１＿Ｈｚ０と名付けられる、２Ｂ１１Ｇ２  ＶＨの初回ヒト化配列を作出した。重鎖フレームワーク内の７１、７３、７８、９４位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けの慣例による）を、対応するマウスドナー残基へと突然変異させて、配列２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＨ１＿Ｈｚ１を作出した。２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＨ１＿Ｈｚ０および２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＨ１＿Ｈｚ１のＣＤＲ２内の、潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）であるＮＧ部位を、それぞれ、配列２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＨ１＿Ｈｚ０＿Ｎ５５Ｑ内および配列２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＨ１＿Ｈｚ１＿Ｎ５５Ｑ内で、ＮＧをＱＧで置換することにより除去した。
【０４６１】
ヒト生殖細胞系列配列であるＡ１０（ＶＢＡＳＥ  ＶＫＶＩ  Ａ１０；ＩＭＧＴ  ＩＧＫＶ６−２１＊０１）を、２Ｂ１１Ｇ２  ＶＬをヒト化するためのアクセプターフレームワークとして選択し；２Ｂ１１Ｇ２  ＶＬのＣＤＲを、アクセプターフレームワークへとグラフトして、２Ｂ１１Ｇ２＿ＶＫ６＿Ｈｚ０と名付けられる、２Ｂ１１Ｇ２  ＶＬの初回ヒト化配列を作出した。ドナー配列と、アクセプター配列との間で、フレームワークは高度に保存的であったため、さらなるフレームワーク突然変異は、導入しなかった。
【０４６２】
各ヒト化配列のヌクレオチド配列は、コドン最適化により作出した。
【０４６３】
複数のヒト化ＶＨ配列および複数のヒト化ＶＬ配列をデザインした；ＩｇＧ１内またはＦａｂ内のヒト化抗体のパネルは、各ヒト化ＶＨ配列と、各ヒト化ＶＬ配列とを組み合わせることにより作出することができる。ＶＨ配列およびＶＬ配列を、異なるプラスミド内に保有させ、したがって、重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドの両方を、発現宿主細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞）へと共トランスフェクトして、特異的抗体を作出した。このヒト化研究では、キメラ抗体またはヒト化抗体を、ＩｇＧ１形態で作製した。
【０４６４】
４Ｅ１０Ｄ７ヒト化抗体のデザイン
４Ｅ１０Ｄ７マウス抗体に由来するヒト化抗体を、上記で記載した通り、ＣＤＲグラフティングによりデザインした。
【０４６５】
ヒト生殖細胞系列配列である１−０２（ＶＢＡＳＥ  ＶＨ１  １−０２；ＩＭＧＴ  ＩＧＨＶ１−２＊０２）を、４Ｅ１０Ｄ７  ＶＨをヒト化するためのアクセプターフレームワークとして選択し；４Ｅ１０Ｄ７  ＶＨのＣＤＲを、アクセプターフレームワークへとグラフトして４Ｅ１０Ｄ７＿ＶＨ１＿Ｈｚ０と名付けられる、４Ｅ１０Ｄ７  ＶＨの初回ヒト化配列を作出した。重鎖フレームワーク内の７１、７３、９４位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けの慣例による）を、対応するマウスドナー残基へと突然変異させて、配列４Ｅ１０Ｄ７＿ＶＨ１＿Ｈｚ１を作出した。４Ｅ１０Ｄ７＿ＶＨ１＿Ｈｚ１のＣＤＲ２内の、潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）であるＮＧ部位は、配列４Ｅ１０Ｄ７＿ＶＨ１＿Ｈｚ１＿Ｎ５５Ｑ内で、ＮＧをＱＧで置換することにより除去した。
【０４６６】
ヒト生殖細胞系列配列であるＬ２５（ＶＢＡＳＥ  ＶＫＩＩＩ  Ｌ２５；ＩＭＧＴ  ＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８＊０１）を、４Ｅ１０Ｄ７  ＶＬをヒト化するためのアクセプターフレームワークとして選択し；４Ｅ１０Ｄ７  ＶＬのＣＤＲを、アクセプターフレームワークへとグラフトして４Ｅ１０Ｄ７＿ＶＫ３＿Ｈｚ０と名付けられる、４Ｅ１０Ｄ７  ＶＬの初回ヒト化配列を作出した。軽鎖フレームワーク内の４、３６、４６、８３、および８７位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けの慣例による）を、対応するマウスドナー残基へと突然変異させて、４Ｅ１０Ｄ７＿ＶＫ３＿Ｈｚ３と名付けられるヒト化配列を作出した。
【０４６７】
ヒト化ＶＨ配列およびヒト化ＶＬ配列は、異なるプラスミド内に保有させ、宿主細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞）に、１つの重鎖プラスミドおよび１つの軽鎖プラスミドを共トランスフェクトして、特異的なＩｇＧ１抗体を作出した。
【０４６８】
ヒト化抗体の作製および精製
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２４０４０−０３２）および４ｍＭのＬ−ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０〜０６１）を補充したＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００５００９２ＤＫ）中で培養した。細胞を、トランスフェクションの前日に、１ｍｌ当たり１×１０６個の密度で処理し、抗生剤を、培地から除去した。トランスフェクションの当日に、細胞密度および生存率をまず測定して、密度が、１ｍｌ当たりの細胞１．５〜２．０×１０６個の範囲内にあり、生存率が、９５％を超えていることを確認した。プラスミドＤＮＡの使用量は、細胞の容量により計算し、総プラスミドＤＮＡ量は、抗体の発現には、典型的に、細胞１×１０６個当たり１ｕｇであった。重鎖（ＨＣ）プラスミド、および軽鎖（ＬＣ）プラスミド（推奨されるＨＣ：ＬＣ比は、ＩｇＧの発現には、１：１．５であり、Ｆａｂの発現には、１．５：１である）を、増強剤：ＤＮＡの比を、１〜４ｕｌ：１０ｕｇで、トランスフェクション増強剤である２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＭＡＸ−１（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｘｐ−７１１）を補充した滅菌水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０９７７−０１５）へと添加し、これに続き、ＰＥＩ：ＤＮＡの比を、４：１で、１ｍｇ／ｍｌのトランスフェクション試薬であるＰＥＩ（ポリエチレンイミン、直鎖状、２５Ｄａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４８８５）を添加した。次いで、混合物を、細胞へと静かに添加した。トランスフェクションの２４時間後に、トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９５５３）を、０．５％の最終濃度で、細胞へと添加した。トランスフェクト細胞を、一般に、トランスフェクションの５〜７日後に、６０％〜８０％の生存率で採取した。
【０４６９】
精製工程は、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により行った。略述すると、採取した細胞を、１００００Ｇで１０分間にわたり遠心分離し、上清を、０．２２ｕｍの膜を通して濾過して、細かな細胞破砕物を除去した。等容量のＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ａ１２５８６−０１）を、上清へと添加して、捕捉効率を改善することが推奨された。ＩｇＧの精製には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ装置へと接続し、Ｆａｂの精製には、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。試料をローディングする前に、カラムを、１０ＣＶ（カラム容量）のランニング緩衝液（ＤＰＢＳ）で平衡化させた。試料をローディングした後で、カラムを、８ＣＶのＤＰＢＳで洗浄した。クエン酸溶出緩衝液勾配（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）により、抗体試料を、カラムから溶出させ、次いで、中和緩衝液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を伴う深底ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ  Ｐｌａｔｅ、カタログ番号：ＴＨＭ＃２７８７４３）へと集めた。抗体試料を、ウェルからプールし、次いで、ＰＢＳ中で透析するか、またはＡｍｉｃｏｎ遠心管を介して濾過することにより、処理した。
【０４７０】
ヒト化変異体のアフィニティー成熟
４Ｅ１０Ｄ７および２Ｂ１１Ｇ２に基づくヒト化抗体を、結合アフィニティーについてアッセイし、各マウス抗体に由来する、単一のヒト化変異体を、合理的デザイン、ならびに酵母ディスプレイライブラリーを使用する、結合「ホットスポット」およびＣＤＲ領域にわたる突然変異誘発の両方によるアフィニティー成熟によるさらなる精緻化のために選択した。変異体抗体を、結合アフィニティーについてアッセイした。
【０４７１】
親４Ｅ１０Ｄ７由来のヒト化抗体であるｈｚ４５に基づく、合計２１の重鎖変異体（４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｈ＿０１〜４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｈ＿２１と名付けられる）をデザインする一方、４Ｅ１０Ｄ７−ｈｚ４５（４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｌ＿００と名付けられる）に由来する軽鎖を、全てのさらなる変異体内で使用した。
【０４７２】
親２Ｂ１１Ｇ２由来のヒト化抗体であるｈｚ４２またはｈｚ５２  ＶＨ（２Ｂ１１Ｇ２＿ＡＭ＿Ｈ＿０１〜２Ｂ１１Ｇ２＿ＡＭ＿Ｈ＿５０と名付けられる）に基づく、合計５０の重鎖変異体、および親２Ｂ１１Ｇ２由来のヒト化抗体であるｈｚ５２  ＶＬ（２Ｂ１１Ｇ２＿ＡＭ＿Ｌ＿０１〜２Ｂ１１Ｇ２＿ＡＭ＿Ｌ＿０５と名付けられる）に基づく、５つの軽鎖変異体をデザインした。
【０４７３】
アフィニティーの改善を示す、突然変異を伴う鎖を、ＩｇＧフォーマットまたはＦａｂフォーマットで構築した。その後、重鎖および軽鎖の識別子に由来する添え字を使用して、導出された抗体を名付け直した。例えば、４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｈ＿０１重鎖、および４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｌ＿００軽鎖を含むＩｇＧは、ＡＭ０１００と名付け直し；４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｈ＿１９重鎖、および４Ｅ１０Ｄ７＿ＡＭ＿Ｌ＿００軽鎖を含むＩｇＧは、ＡＭ１９００と名付け直し；２Ｂ１１Ｇ２＿ＡＭ＿Ｈ＿４４重鎖、および２Ｂ１１Ｇ２＿ＡＭ＿０５軽鎖を含むＩｇＧは、ＡＭ４４０５と名付け直した。
【０４７４】
本明細書で記載されるＢＲＥ−Ｌｕｃアッセイを使用して、構築された抗体を、ｈｕＢＭＰ９への結合、およびＢＭＰ９シグナル伝達の阻害についてアッセイした。
【実施例３】
【０４７５】
ファージディスプレイ技術による抗ＢＭＰ９抗体の作出
上記で記載した、マウスハイブリドーマ手順およびヒト化手順により、抗ＢＭＰ９抗体を同定する取組みと並行して、ファージディスプレイを使用して、完全ヒト抗ＢＭＰ９抗体を同定した。略述すると、ヒトＢＭＰ９を認識する抗体を選択するために、複数のパニング戦略を利用した。ヒトＢＭＰ９タンパク質に対する治療用抗体は、抗体変異体タンパク質の供給源として、市販のファージディスプレイライブラリーである、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用する、高結合アフィニティーを有するクローンの選択により作出した。ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86）に基づき、ファージ表面（Ｌｏｈｎｉｎｇによる国際公開第０１／０５９５０号パンフレット）上にＦａｂを提示するために、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術を利用する。ライブラリーの多様性を維持しながら、抗体の結合アフィニティーを増大させるために、第２ラウンドでは、溶液パニングおよび固相パニングの両方のアウトプットを、ＲａｐＭＡＴ（商標）工程へと持ち込み、一方、第３ラウンドでは、全細胞パニング戦略および示差的全細胞パニング戦略のアウトプットを持ち込んだ（Prassler et al., (2009) Immunotherapy; 1: 571-583）。
【０４７６】
全長ＩｇＧを発現させるために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、Ｆａｂ発現ベクターから、ヒト定常ドメインを含む、適切な発現ベクターへとサブクローニングした。真核ＨＫＢ１１細胞に、ＩｇＧの重鎖および軽鎖の両方をコードする発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトした。
【０４７７】
抗体を、ＢＭＰ９の、その受容体への結合の、結合アフィニティー、特異性、および阻害についてアッセイした。抗ＢＭＰ９抗体を、３つの群：Ｉ型阻害剤（ＡＬＫ１の、ＢＭＰ９への結合を阻害することが可能である）、ＩＩ型阻害剤（ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＢＭＰＲＩＩの結合を阻害することが可能である）、またはＩ＋ＩＩ型阻害剤（ＡＬＫ１ならびにＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＢＭＰＲＩＩの結合を阻害することが可能である）へと分類した。
【０４７８】
ｈｕＢＭＰ９に対する最高のアフィニティーを示す抗体を、さらなる操作にかけた。操作工程は、ＰＣＲベースの戦略を使用して実施した。オーバーラップエクステンションＰＣＲによる合成およびアセンブリーの後で、再操作されたＶＨ断片およびＶＬ断片を、その後のＦａｂまたはＩｇＧの発現に適切なベクター骨格へとサブクローニングした。操作工程は、以下の側面：生殖細胞系列化、ＰＴＭ部位の除去、および／またはコドンの最適化を伴った。
【実施例４】
【０４７９】
ＢＭＰ受容体阻害アッセイ
ブロッキングＥＬＩＳＡを使用して、ＢＭＰ９と、その受容体との相互作用を阻害しうる陽性クローンを同定した。４つの異なる組換えＢＭＰ９受容体：ヒトＡｌｋ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、３７０−ＡＬ−１００）；ヒトＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、８１１−ＢＲ−１００）；ヒトＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、３４０−Ｒ２−１００）；ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができる。
【０４８０】
抗体試料の、特異的なリガンド／受容体の組合せに対する遮断活性は、ＥＬＩＳＡにより測定した。略述すると、コーティング緩衝液（ＰＢＳ）中、１ｕｇ／ｍｌの濃度の受容体５０ｕｌを、４℃で一晩にわたり、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートへと添加した後、ＰＢＳＴで１回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートを、各ウェル内に２００ｕｌのブロッキング緩衝液（１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ）でブロッキングし、次いで、室温（ＲＴ）で、１時間にわたりインキュベートした後、ＰＢＳＴで、３回にわたり洗浄した。希釈された抗体試料を、ビオチニル化ヒトＢＭＰ９（１ｕｇ／ｍｌのｂｉｏ−ｈＢＭＰ９）と混合し、ＲＴで、４５分間にわたりインキュベートした。抗体と、ｂｉｏ−ｈＢＭＰ９との混合物を、ウェル１つ当たり５０ｕｌのプレートへと添加し、次いで、ＲＴで、３０分間にわたりインキュベートした後、ＰＢＳＴで、３回にわたり洗浄した。５０ｕｌのＰｏｌｙ−ＨＲＰストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、２１１４０）を、プレートの各ウェルへと添加し、ＲＴで、３０分間にわたりインキュベートした後、ＰＢＳＴで、５回にわたり洗浄した。最後に、ＴＭＢ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；００２０２３）５０ｕｌ、および１ＮのＨＣｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＳＳ０１１００）５０ｕｌを、各ウェルへと添加して、反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、４５０ｎｍで読み取って、リードアウトであるＯＤ４５０を得た。抗体が、Ａｌｋ１の、ＢＭＰ９への結合を、１ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害した場合、それらの抗体を「Ｉ型」阻害剤として特徴づけた。抗体を、それらが、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＢＭＰＲＩＩの、ＢＭＰ９への結合を、１ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害した場合、「ＩＩ型」阻害剤として特徴づけた。抗体を、それらが、Ａｌｋ１のＢＭＰ９への結合を、１ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害し、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＢＭＰＲＩＩの、ＢＭＰ９への結合を、１ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害した場合、「Ｉ＋ＩＩ型」として特徴づけた。各ＢＭＰ受容体の、ヒトＢＭＰ９への結合の阻害は、個別のアッセイで測定した。
【実施例５】
【０４８１】
抗ＢＭＰ９抗体の、ＢＭＰ９に対する結合アフィニティー
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイは、緊密な結合剤について、Ｆａｂ−抗原間相互作用アフィニティー（ＫＤ）の決定を可能とする（参照により本明細書に組み込まれる、Friquet, B., Chaffotte,A.F., Djavadi-Ohaniance,L., and Goldberg,M.E. (1985). Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immnunol Meth 77, 305-319を参照されたい）。この技法は、いずれの相互作用パートナーの固定化または標識化も要求せず、強い相互作用（ｐＭ〜低ｎＭの範囲）に適する。略述すると、一定濃度のＦａｂ（予測値Ｋであるか、またはこれを下回る濃度の）混合物を、平衡に達するまで、適切な濃度範囲内の抗原と共に、共インキュベートした。遊離Ｆａｂ結合部位の量は、混合物を、抗原でコーティングしたプレートに移し、短時間のインキュベーションを施すことにより決定した。結果として、遊離Ｆａｂを、プレートに結合させ、Ｆａｂ−抗原複合体を除去するための洗浄ステップの後で、検出抗体により検出した。結果として得られるシグナルを、抗原濃度と対比してプロットし、非線形曲線の当てはめにより、ＫＤを正確に決定した。
【０４８２】
抗原（ヒトＢＭＰ９（ＧＤ−４３−ＫＳ００）；カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５５６６−ＢＰ）、またはマウスＢＭＰ９（ｉＰＲＯＴ１０１７１５））の、２２の２ｎ倍系列希釈液を、０．５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ７９０６−５００Ｇ）および０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０（ＶＷＲカタログ番号４３７０８２Ｑ））を含有するインキュベーション緩衝液（ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｐ０１９５）中で調製した。一定濃度のＦａｂを添加した。容量６０ｕｌずつの各抗原：Ｆａｂミックスを、二連で、３８４ウェルポリプロピレン製マイクロ滴定プレート（ＰＰ  ＭＴＰ、Ｇｒｅｉｎｅｒカタログ番号７８１２８０）へと分注した。インキュベーション緩衝液は、陰性対照として用い、抗原を含有しない試料は、陽性対照として用いた（Ｂｍａｘ）。プレートを密封し、室温（ＲＴ）で、一晩にわたり（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。
【０４８３】
３８４ウェルの標準ＭＳＤアレイプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙカタログ番号Ｌ２１ＸＡ）を、捕捉剤としての、ＰＢＳ中で希釈された、ウェル１つ当たり３０ｕｌのヒトＢＭＰ９でコーティングし、４℃でＯ／Ｎにわたりインキュベートした。ウェル１つ当たり７０ｕｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｔ１６８０）；０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を伴う）で３回にわたり洗浄した後、プレートを、ウェル１つ当たり５０ｕｌのブロッキング緩衝液（５％のＢＳＡを伴うＰＢＳ）により、ＲＴで、１時間にわたりブロッキングした。洗浄の後、容量をウェル１つ当たり３０ｕｌとする抗原：Ｆａｂミックスを、ＰＰ  ＭＴＰから、コーティングされたＭＳＤプレートへと移し、ＲＴで、２０分間にわたりインキュベートした。さらなる洗浄ステップの後、インキュベーション緩衝液中で１：１０００に希釈された、３０ｕｌの検出抗体（ＭＳＤスルホタグＮＨＳエステル（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙカタログ番号Ｒ９１ＡＮ−１とコンジュゲートさせた、ヤギ抗ヒトＦａｂ特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−００５−０９７））を、各ウェルへと添加し、ＲＴで、３０分間にわたりインキュベートした。ＭＳＤプレートを洗浄し、ウェル１つ当たり３５ｕｌのリード緩衝液（ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ  ４×、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙカタログ番号Ｒ９２ＴＣ−１）を、添加し、次いで、ＲＴで、５分間にわたりインキュベートした。ＥＣＬシグナルを、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で測定した。データを、Ｆａｂのための、１：１の当てはめモデルに従い、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアにより査定した（Piehler et al., 1997による）。
【実施例６】
【０４８４】
抗ＢＭＰ９抗体の結合特異性
抗ＢＭＰ９抗体の、ＢＭＰ９に対する結合アフィニティーを確認し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるＳＰＲを介して、他の抗原に対するアフィニティー（および特異性）を決定した。標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学反応を使用して、特異的な表面密度（ｒｈＢＭＰ９は５０ＲＵ、ｒｈＢＭＰ２は８００ＲＵ、ｒｈＢＭＰ７は５８０ＲＵ、ｒｈＢＭＰ１０は３９０ＲＵ）に達するように、抗原（組換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰ９、またはｒｈＢＭＰ２（Ｒ＆Ｄカタログ番号３５５−ＢＭ−０１０）、ｒｈＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄカタログ番号３５４−ＢＰ−０１０）、またはｒｈＢＭＰ１０（Ｒ＆Ｄカタログ番号２９２６−ＢＰ−０２５））を、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。ランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋であり、３０ｕｌ／分とした。反応速度の測定を、２倍の系列希釈による、６つの異なるＦａｂ濃度（３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ）を使用して行った。試料を、ＫＩＮＪＥＣＴにより、３０ｕｌ／分の流量で、注入時間を１８０秒間とし、解離時間を１５００秒間として、測定した。各サイクルの後で、結合した解析物を、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５（ｒｈＢＭＰ９の場合）または５０ｍＭのＮａＯＨ（ｒｈＢＭＰ２、ｒｈＢＭＰ７またはｒｈＢＭＰ１０の場合）で除去するように、センサーチップを再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの速度定数を決定し、次いで、その後にＫＤを計算するように、生データを、１：１結合モデルへと当てはめた。
【０４８５】
当業者は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＯｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ）を含む他の方法を使用して、抗体の、ＢＭＰ９に対するアフィニティーを測定しうることを察知するであろう。各技法は、実質的に同様の結果をもたらすことが予測されるが、約１０ｎＭ未満のＫＤを有する抗体には、ＭＳＤ−ＳＥＴにより測定される、結合アフィニティーおよびＫＤが、決定的であると考えられる。
【実施例７】
【０４８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、抗ＢＭＰ９抗体の活性
ＢＲＥ（ＢＭＰ９応答性エレメント）駆動型ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３ＴＩＤ−ＢＲＥ２−ｌｕｃ細胞を使用して、ＢＭＰ９により誘導されるシグナル伝達を阻害する抗体の能力についてアッセイした。
【０４８７】
安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＴＩＤ−ＢＲＥ２−ｌｕｃ細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコースのＤＭＥＭ；ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−ＩＩ、４．５ｇ／ｌのグルコースは含有するが、ピルビン酸ナトリウムは含有しないＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ、＃３１９６５）、および、抗生剤を含有しない、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＰＡＮ＃Ｐ３０−１５０２、５６℃で３０分間にわたるインキュベーションにより熱不活化された）中で増殖させた。細胞を、５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃でインキュベートした。継代培養のために、１倍濃度のＤＰＢＳ（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を伴わない；Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０）中で、１回洗浄した後、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液（ＰＡＡ、＃Ｌ１１−００７）で解離させた。細胞を、毎週２回継代培養した。選択用抗生剤として、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ  ＨＣＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｒ２１０−０１）を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で、継代培養細胞へと添加した。
【０４８８】
レポーター遺伝子アッセイのために、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して、細胞を解離させ、３８４ウェル平底白色アッセイプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、＃３５−３９８８）内の測定用培地（選択用抗生剤を伴わない培養培地）中に、ウェル１つ当たりの細胞１×１０４個の密度で播種し、３７℃および５％のＣＯ２で、一晩にわたりインキュベートした。翌日、精製されたＩｇＧを、抗原（最終濃度：３００ｐＭ）と共に、３７℃で、３０分間にわたり、プレインキュベートした。ヒトＢＭＰ９による活性の誘導には、本発明者らは、組換えヒトＢＭＰ９複合体（２００ｎｇ／ｍｌ、ＡｕｔｅｋＢｉｏ  ＦＴＺ  Ｉｎｃ．により精製されている）を使用し；ヒトＢＭＰ２による活性の誘導には、本発明者らは、組換えヒトＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ＃３５５−ＢＭ−０１０／ＣＦ）を使用し；ヒトＢＭＰ７による活性の誘導には、本発明者らは、組換えヒトＢＭＰ７（４００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ＃３５４−ＢＰ−０１０／ＣＦ）を使用し；ラットＢＭＰ９による活性の誘導には、本発明者らは、９０ｍｍのディッシュ内に播種された２９３Ｔ細胞内で、６ｕｇのｐｃＤＮＡ３．１−ラットＢＭＰ９プラスミドを過剰発現させ；４８時間後、ラットＢＭＰ９馴化培地としての培養培地を回収し、本発明者らは、１６分の１に希釈したラットＢＭＰ９馴化培地を使用する。プレインキュベートされた抗体−抗原混合物を、細胞へと添加し、刺激の１８時間後、細胞を溶解させ、製造元のプロトコールに従い、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム；Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６２０）を、細胞へと添加することにより、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光は、Ｔｅｃａｎリーダー（積分時間：２５０ミリ秒；減衰：なし；待機時間（ｔｉｍｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）：３ミリ秒）により測定した。
【実施例８】
【０４８９】
Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化アッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞アッセイのために、ＨＵＶＥＣ細胞を、Ａｌｌｃｅｌｌｓから購入し、ＨＵＶＥＣ培地（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、Ｈ−００４）中で培養した。６ウェルプレートに、ウェル１つ当たりの細胞３×１０５個を播種し、培地中で培養した。次いで、細胞を、５％のＣＯ２を伴い、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした。０．５％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で、細胞へと、ＢＭＰ９を伴うかまたは伴わないＢＭＰ９抗体（上記で記載した組換えヒトＢＭＰ９複合体）を添加した。１時間後、細胞を採取し、ＳＤＳ試料緩衝液中で、９５℃で１０分間にわたり変性させる。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜（ｉＢｌｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃３４０９５）へとブロッティングした。膜を、５％の脱脂粉乳で、１時間にわたりブロッキングし、次いで、一次抗体である、抗ｐｈｏｓｐｈｏr−Ｓｍａｄ１／５  Ａｂ（ＣＳＴ＃９５１６、１：１０００）、抗ＩＤ１  Ａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ＃ＳＣ−４８８、１：２００）、または抗ＧＡＰＤＨ  Ａｂ（ＣＳＴ＃２１１８、１：２０００）と共に、４℃で一晩にわたりインキュベートした。洗浄した後で、適切な西洋ワサビコンジュゲート二次抗体である、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ＃７０７６、１：２５００）または抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ＃７０７４、１：２５００）を使用することにより、膜を、室温で、１時間にわたり、インキュベートした。結果を、ＢｉｏＲｅｄ  ＣｈｅｍＤｏｃ  Ｉｍａｇｅマシンにより可視化した。
【０４９０】
ＣＦＳＣ細胞アッセイのために、ＣＦＳＣ細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭと共に培養した。０日目に、１ｍｌ当たりの細胞１．０×１０５個の懸濁液、ウェル１つ当たり５０μｌ（ウェル１つ当たりの細胞５×１０３個）を、ＰＥ製黒色９６ウェルプレート内の培養培地と共に播種し、３７℃、５％のＣＯ２で、一晩にわたりインキュベートする。１日目に、抗体希釈液およびヒトＢＭＰ９溶液：組換えヒトＢＭＰ９複合体（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＡｂ（１２ｕｇ／ｍｌから、１：３の比で、６回にわたり希釈する）を調製する。抗体とＢＭＰ９とを混合し（１：１）、３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、次いで、ウェル１つ当たり５０μｌのＢＭＰ／Ａｂ混合物を、前日の培地５０μｌを含有する細胞プレートへと添加し、５％ＣＯ２を伴い、３７℃でインキュベートする。１．５時間後、プレートを、４％のパラホルムアルデヒド中、室温で１５分間にわたり固定し、ＰＢＳによる洗浄の後、細胞を、ＰＢＳ中に０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００により、室温で、さらに１５分間にわたり透過化する。再度洗浄し、細胞を、ＰＢＳ中に３％のＢＳＡで、室温で１時間にわたりブロッキングする。次いで、ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢ３８４８）と共に、４℃で、一晩にわたりインキュベートし、洗浄の後、ＤＡＰＩ色素を加えた二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ウサギ抗体、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃Ａ２１２０６）と共に、室温で、さらに２時間にわたりインキュベートする。完全に洗浄し、次いで、１００ｕｌのＰＢＳを補充し、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＨＣＳ  Ｓｙｓｔｅｍで読み取る。
【実施例９】
【０４９１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、抗ＢＭＰ９抗体の活性
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、抗ＢＭＰ９抗体の有効性は、肝線維症についてのハイドロダイナミック注入（ＨＤＩ）マウスモデルを使用して測定した。
【０４９２】
特定の病原体に曝されていない（ＳＰＦ）７〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により供給された。施設に到着したら、マウスを、少なくとも７日間にわたり馴致した。無作為に群分けした後で、マウスを、ＢＭＰ９  Ａｂまたはヒト対照ＩｇＧで１回、静脈内処置した後、ＢＭＰ９プラスミドまたはブランクベクターのハイドロダイナミック注入（ＨＤＩ）を施した。４日後、秤量の後、全てのマウスを屠殺して、血液試料および肝組織試料を回収した。１００ｍｇ／ｋｇのケタミンによる麻酔下で、心穿刺を実施して、可能な限り多くの血液を得た。全肝臓を、生理食塩液で、速やかにフラッシュ洗浄し、ペーパータオル上で短時間ブロッティングした後、肝重量／体重比を測定するのに秤量した。肝臓の形状観察の後、肝臓をスライスし、次いで、肝臓の小片を、極低温バイアルへと移し、分子生物学解析のために、液体窒素中で瞬時凍結させた。全ての試料を、解析の前に、−８０℃で保存した。
【０４９３】
血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルおよび血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを含む肝機能を、Ｑｕｉｃｋ  Ａｕｔｏ  Ｎｅｏ  ＡＬＴキットおよびＱｕｉｃｋ  Ａｕｔｏ  Ｎｅｏ  ＡＳＴキット（株式会社シノテスト、日本）を使用して、ＨＩＴＡＣＨＩ  ７０２０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより測定した。肝組織を、遺伝子発現プロファイリングおよび組織学解析にかけた。遺伝子発現プロファイリングのために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により、全ＲＮＡを、組織から抽出し、製造元の指示書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写キットを使用して、精製ＲＮＡの逆転写を実施し、次いで、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）およびＡＢＩ  ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムを使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより、遺伝子転写物の定量化を実施した。マウスＩＤ１に使用されるプライマー対は、５’−ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣ−３’（配列番号２１９）および５’−ＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号２２０）であり；マウスＧＡＰＤＨに使用されるプライマー対は、５’−ＣＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号２２１）および５’−ＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２２２）であった。肝組織を、Ｔ−ｐｅｒ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、＃７８５１０）中に溶解させて、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５  Ａｂ（ＣＳＴ＃９５１６、１：１０００）、抗ＩＤ１  Ａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ＃ＳＣ−４８８、１：２００）、抗ＧＡＰＤＨ  Ａｂ（ＣＳＴ＃２１１８、１：２０００）、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ＃７０７６、１：２５００）、および抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ＃７０７４、１：２５００）により、ＩＤ１およびｐ−ｓｍａｄ１／５についてのウェスタンブロットを実施し、ウェスタン工程は、ｓｍａｄ１／５リン酸化アッセイ実験による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性試験と同じであった。
【実施例１０】
【０４９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝損傷についてのＣＣｌ４マウスモデル
特定の病原体に曝されていない（ＳＰＦ）７〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により供給された。
【０４９５】
施設に到着したら、マウスを、少なくとも７日間にわたり馴致した。無作為に群分けした後で、マウスを、毎週２回、オリーブ油中に溶存させた２５％のＣＣｌ４  ４μｌ／ｇで腹腔内処理して、２週間にわたり、肝線維症を誘導した。初回のＣＣｌ４注射と同時に、ＢＭＰ９  Ａｂもまた、静脈内注射して（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回）、肝線維症時におけるそれらの機能を試験した。マウスを、１週間後に屠殺し、肝組織を、タンパク質発現プロファイリングおよび組織学解析にかけた。
【０４９６】
組織学のために、肝臓検体を、１０％の緩衝ホルマリンで、１６〜１８時間にわたり固定し、パラフィンで包埋した。免疫組織化学は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）自動式スライド染色器（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）を使用することにより行った。ウサギポリクローナル抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）抗体を、適切な濃度で、一次抗体として適用した。タンパク質の発現については、ウェスタンブロットを実施した。材料および方法は、上記で記載したＳｍａｄ１／５リン酸化アッセイ実験による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性試験と同じであった。
【実施例１１】
【０４９７】
結合アフィニティーアッセイ、特異性アッセイ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害アッセイの結果
ヒト化ハイブリドーマにより作出されたＩｇＧについての、結合アフィニティー、特異性、およびＩＣ５０値（ＢＲＥ−Ｌｕｃ  ＲＧＡ内で測定される）を、表４および表５にまとめる。
【０４９８】
【表４】
2018522540.tif 000037
【０４９９】
【表５】
2018522540.tif 000038
【０５００】
ファージディスプレイにより作出された完全ヒト抗体についての、結合アフィニティー、特異性、およびＩＣ５０値（ＢＲＥ−Ｌｕｃ  ＲＧＡ内で測定される）を、表６および表７にまとめる。
【０５０１】
【表６】
2018522540.tif 000039
【０５０２】
【表７】
2018522540.tif 000040
【０５０３】
まとめると、これらのデータは、ヒトＢＭＰ９の、少なくとも３つの異なるエピトープへの結合が可能な、抗ＢＭＰ９抗体の同定を示す。ＡＭ４４０５、ＭＯＲ０２２９２８、およびＭＯＲ０２３７８７は、ｈｕＭＢＰ９のエピトープに結合し、ここで、結合は、Ｉ型ＢＭＰ受容体（例えば、Ａｌｋ１）の、ＢＭＰ９との相互作用を阻害することが可能である。これに対し、ＡＭ０１００、ＡＭ１９００、ＭＯＲ０２３０７３、ＭＯＲ０２３７９３、ＭＯＲ０２３７９５、ＭＯＲ０２３７９６、ＭＯＲ０２３０９０、およびＭＯＲ０２３０９３は、ｈｕＭＢＰ９のエピトープに結合し、ここで、結合は、ＩＩ型ＢＭＰ受容体（例えば、ＡｃｔＩＩＲ、ＢＭＰＲＩＩ）の、ＢＭＰ９との相互作用を阻害することが可能である。ＭＯＲ０２２９６２およびＭＯＲ０２２９６５は、別個のエピトープに結合し、ここで、結合は、Ｉ型ＢＭＰ受容体およびＩＩ型ＢＭＰ受容体の両方の、ＢＭＰ９との相互作用を阻害することが可能である。本明細書で開示される抗体による、Ｉ型ＢＭＰ受容体もしくはＩＩ型ＢＭＰ受容体、またはＩ型ＢＭＰ受容体およびＩＩ型ＢＭＰ受容体の両方の阻害は、約１ｎＭ以下であるＩＣ５０で達成された。
【０５０４】
これらのデータはまた、ヒト抗体およびヒト化抗体を含む抗体が、ｈｕＢＭＰ９に、高いアフィニティーおよび特異性で結合することが可能な、２つの異なるパニング供給源から同定されたことも指し示す。例えば、同定された全ての抗体は、ｈｕＢＭＰ９に、１ｎＭ未満、例えば、５００ｐＭ未満のＫＤで結合する。同定された抗体の多くは、ｈｕＢＭＰ９に、２００ｐＭ未満のＫＤで結合する。同様にまた、本発明の抗体は、カニクイザルＢＭＰ９、ラットＢＭＰ９、および／またはマウスＢＭＰ９とも交差反応することが可能であり、これは、これらの抗体を、疾患の動物モデルにおいて使用しうるという点で、有益である。最後に、全ての抗体は、ＢＭＰ９に対して高度に特異的であり、ことＢＭＰ９に対して、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ７、およびヒトＢＭＰ２の少なくとも１０００倍の特異性を有し；多くの場合、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ７、またはヒトＢＭＰ２に対する結合を呈さなかった。同様にまた、これらの抗体は、レポーター遺伝子アッセイ（「ＲＧＡ」）における、ＢＭＰ９シグナルの誘導を、１ｎＭ未満の、多くの場合、２００ｐＭ未満のＩＣ５０で阻害することが可能である。まとめると、これらの結果は、本発明の抗体が、高度に特異的、かつ、強力な抗ＢＭＰ９抗体であることを裏付ける。
【実施例１２】
【０５０５】
ｈｕＢＭＰ９を伴う２Ｂ１１Ｇ２  Ｆａｂの結晶構造
２Ｂ１１Ｇ２キメラＦａｂ抗体と複合した、ヒトＢＭＰ９の結晶構造を、２．８Åで解明したところ、各非対称単位内に、２つのｈＢＭＰ９成熟ドメインおよび２つのＦａｂ分子の１つのホモ二量体を含有した。構造は、内部データベースである、Ｐｒｏａｓｉｓへと、１ｄｐｂｄの受託番号（本明細書の下記では、２Ｂ１１Ｇ２キメラＦａｂを伴うｈＢＭＰ９のこの構造を１ｄｐｂｄと称する）で寄託された。
【０５０６】
１ｄｐｂｄの構造を、ＢＭＰ９−Ａｌｋ１−ＡｃｔＲＩＩｂ（ＰＤＢ：４ＦＡＯ）の構造へと重ね合わせることにより、２Ｂ１１Ｇ２およびＡｌｋ１が、ＢＭＰ９の、同じ結合表面（成熟ドメイン）を共有することが示されたが、これは、２Ｂ１１Ｇ２が、ＢＭＰ９への結合について、Ａｌｋ１と競合しうるという実験観察と符合する。構造はまた、ＡｃｔＲＩＩｂの、ＢＭＰ９との相互作用が、２Ｂ１１Ｇ２  Ｆａｂの、ＢＭＰ９への結合時に、影響を受けないことも示唆した。
【０５０７】
２Ｂ１１Ｇ２の６つのＣＤＲは全て、ＢＭＰ９との相互作用に寄与し、主要な結合界面は、ＢＭＰ９と、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびＬＣＤＲ３との間で確立されている。ＨＣＤＲ１は、ＢＭＰ９に、疎水性相互作用を介して結合し、具体的には、ＨＣＤＲ１のＴｈｒ２８およびＰｒｏ３０が、ＢＭＰ９のＧｌｙ２１、Ｓｅｒ２４、およびＴｒｐ２５（ＢＭＰ９成熟ドメインについての番号付けによる）と相互作用する。ＨＣＤＲ２は、ＢＭＰ９に、主に、疎水性相互作用を介して結合し、具体的には、Ｖａｌ５０は、ＢＭＰ９のフェニル基により取り囲まれ、Ｔｙｒ５２は、１つのＢＭＰ９単量体のＴｒｐ２２とＨ結合し、別のＢＭＰ９単量体のＬｅｕ６０およびＰｈｅ４３と疎水性相互作用し、Ｖａｌ５７およびＳｅｒ５９は、ＢＭＰ９のＰｈｅ４３およびＰｒｏ４４と疎水性相互作用する。ＨＣＤＲ３は、ＢＭＰ９に、主に、疎水性相互作用を介して結合し、具体的には、Ｐｈｅ１０２には、１つのＢＭＰ９単量体のＰｈｅ４３、Ｉｌｅ５６、およびＬｅｕ６０、ならびに別のＢＭＰ９単量体のＴｒｐ２２およびＴｒｐ２５がパッキングし、Ｔｙｒ１０３には、ＢＭＰ９のＴｙｒ８６およびＴｒｐ２５がスタッキングする。ＬＣＤＲ１内のＡｓｎ３２は、ＢＭＰ９と相互作用する、ＬＣＤＲ１内の唯一の残基である。ＬＣＤＲ２内のＴｙｒ５０は、ＢＭＰ９のＡｓｐ４７と共に、Ｈ結合を形成する。ＬＣＤＲ３は、ＢＭＰ９に、疎水性相互作用と、極性相互作用との混合を介して結合し、具体的には、Ｓｅｒ９１およびＳｅｒ９３は、ＢＭＰ９のＡｓｐ４７およびＡｓｐ４８のそれぞれと共に、Ｈ結合を形成し、Ｈｉｓ９２の主鎖は、ＢＭＰ９内のＡｓｐ４７およびＡｓｐ４８の主鎖と共に、Ｈ結合を形成し、Ｔｒｐ９４およびＴｙｒ９６は、ＢＭＰ９のＰｒｏ４４およびＡｌａ４６と共に、疎水性相互作用する。
【０５０８】
受容体競合阻害アッセイからの結果は、２Ｂ１１Ｇ２が、ＢＭＰ９のＩ型受容体の阻害剤であることを指し示した。結晶構造は、２Ｂ１１Ｇ２が、Ａｌｋ１（Ｉ型ＢＭＰ受容体）の結合部位と重なり合うエピトープに結合することを示すことにより、これを確認する。
【０５０９】
２Ｂ１１Ｇ２  Ｆａｂと、ｈｕＢＭＰ９の成熟断片（配列番号２１５）との相互作用を、表８に例示する。
【０５１０】
【表８】
2018522540.tif 000041
【実施例１３】
【０５１１】
抗ＢＭＰ９抗体についての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の評価結果
上記の図１ａおよび表５において示される通り、ハイブリドーマ由来抗体である、２Ｂ１１Ｇ２−ＡＭ４４０５、４Ｅ１０Ｄ７−ＡＭ０１００は、ヒトＢＭＰ９により誘導されるレポーター遺伝子活性を、比較的低値のＩＣ５０で阻害しうる一方、ヒトＢＭＰ２またはヒトＢＭＰ７により誘導されるレポーター遺伝子活性に対しては、ほとんど影響を及ぼさなかった。同様にまた、図１ｂにおいて示される通り、親抗体は、ラットＢＭＰ９により誘導されるレポーター遺伝子活性を阻害することが可能であり、明確な低減曲線に当てはまっていたが、これは、これらの抗体が、ヒトＢＭＰ９およびラットＢＭＰ９によるシグナル伝達に対しても、同様の阻害活性を及ぼすことを意味する。まとめると、これらの結果は、抗ＢＭＰ９抗体が、ＢＭＰ９によるシグナル伝達を特異的に阻害することが可能であり、異なる種に由来するＢＭＰ９タンパク質と交差反応することが可能である（例えば、ヒトＢＭＰ９およびラットＢＭＰ９と交差反応しうる）ことを裏付ける。
【０５１２】
同様にまた、ファージディスプレイにより作出された抗体も、ＢＭＰ９に対して特異的であり、異なる種に由来するＢＭＰ９と交差反応性であることが示された。上記の図２ａおよび表７において示される通り、完全ヒト抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９によるシグナル伝達を、１ｎＭ未満の濃度で阻害しえたが、ＢＭＰ２またはＢＭＰ７によるシグナル伝達には、最大１ｕＭの濃度で、影響を及ぼさなかった。特に、Ｍｏｒ０２２９６２は、ヒトＢＭＰ９により誘導されるレポーター遺伝子活性を、比較的低値のＩＣ５０で阻害しうる一方、ヒトＢＭＰ２またはヒトＢＭＰ７により誘導されるレポーター遺伝子活性に対しては、ほとんど影響を及ぼさなかった。図１ｂにおいて示される通り、Ｍｏｒ０２２９６２抗体は、ラットＢＭＰ９により誘導されるレポーター遺伝子活性を阻害することが可能であり、明確な低減曲線に当てはまっていた。まとめると、これらの結果は、ファージディスプレイにより作出されたＢＭＰ９抗体が、ＢＭＰ９によるシグナル伝達を特異的に阻害することが可能であり、異なる種に由来するＢＭＰ９タンパク質と交差反応することが可能である（例えば、ヒトＢＭＰ９およびラットＢＭＰ９と交差反応しうる）ことを裏付ける。
【実施例１４】
【０５１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化アッセイの結果
抗ＢＭＰ９抗体が、ＢＭＰ９により誘導されるＳｍａｄ１／５のリン酸化および／またはＩｄ１の発現を阻害する能力を、下記で記載される２つの細胞株：ＨＵＶＥＣおよびＣＦＳＣにおいて測定した。
【０５１４】
理論に束縛されずに述べると、ＢＭＰ９によるシグナル伝達時には、ＢＭＰ９リガンドはまず、その受容体に結合し、Ｓｍａｄ１／５／８をリン酸化し、次いで、ｃｏ−Ｓｍａｄを一助とすると考えられる。次に、リン酸化されたＳｍａｄ１／５／８は、核に移行して、ＢＭＰ９の標的遺伝子、例えば、ＩＤ１の発現を促進する。したがって、本発明者らは、リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８（「ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８」）のレベルおよびＩＤ１の発現レベルを、ＢＭＰ９によるシグナル伝達についてのリードアウトとして試験した。図３ａにおいて示される通り、本発明者らが、ＣＦＳＣ細胞を、ＢＭＰ９およびハイブリドーマにより作出された抗体で処理および処置したところ、親４Ｅ１０Ｄ７抗体は、ＢＭＰ９により誘導される、ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８染色のレベルを阻害しえた。図３ｂにおいて示される通り、ファージディスプレイにより作出された抗体である、ＭＯＲ０２２９６２抗体は、ＣＳＦＣ細胞内でＢＭＰ９により誘導される、ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８染色のレベルを阻害しえた。さらに、図３ｃにおいて示される通り、ＨＵＶＥＣ細胞内でも、ファージディスプレイにより作出された抗ＢＭＰ９抗体およびハイブリドーマにより作出された抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９により誘導される、リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８のレベルおよびＩＤ１の発現レベルを低減しえた。上記のデータの全ては、抗ＢＭＰ９抗体が、ＢＭＰ９によるシグナル伝達を阻害することを指し示す。
【実施例１５】
【０５１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、抗ＢＭＰ９抗体の活性についての結果
肝損傷についてのリードアウトとしての肝臓形状、肝重量および体重、肝機能を使用して、本発明者らは、ＢＭＰ９発現プラスミドのハイドロダイナミック注入が、マウスにおける、重度の肝損傷を誘導しうることを見出した。図４および５に示される通り、ＢＭＰ９のＨＤＩプラスミドは、肝重量および体重の減少（図４ｂ／５ｂ）、ならびにＡＬＴレベル、ＡＳＴレベルの上昇（図４ｃ／５ｃ）を随伴する、重度の肝壊死（図４ａ／５ａ）を引き起こしえた。マウスを、抗ＢＭＰ９抗体で同時に処置したところ、ＢＭＰ９のＨＤＩプラスミドだけと比較して、肝壊死は減少し、ＡＬＴレベルおよびＡＳＴレベルも低下する一方で、肝重量および体重は改善された（図４／図５）。まとめると、これらの結果は、抗ＢＭＰ９抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ９により誘導される肝損傷を、効果的に遮断しうることを指し示す。さらに、抗ＢＭＰ９抗体はまた、ＢＭＰ９によるシグナル伝達の標的遺伝子であるＩＤ１の、ＢＭＰ９により誘導される発現も阻害しえた（図４ｄ／５ｄ）。上記のデータの全ては、抗ＢＭＰ９抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ９によるシグナル伝達およびその機能の両方を遮断しうることを示す。
【実施例１６】
【０５１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝損傷のＣＣｌ４マウスモデルの結果
ウェスタンブロットおよび組織学のいずれによっても、ＣＣｌ４で処置されたマウスにおける、ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化が、油対照と比較して上方調節された（図６ａ、６ｂ、および６ｃ／図７ａ、７ｂ、および７ｃ）ことから、ＢＭＰ９および肝損傷の上方調節が指し示される。マウスを、抗ＢＭＰ９抗体で処置したところ、ＣＣｌ４により誘導されるｓｍａｄ１／５／８のリン酸化が阻害されたことから、抗ＢＭＰ９抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ９によるシグナル伝達を効果的に遮断しえたことが指し示される。
【実施例１７】
【０５１７】
長期ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、肝線維症のＣＣｌ４マウスモデル
特定の病原体に曝されていない（ＳＰＦ）７〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により供給された。無作為に群分けした後で、マウスに、静脈内注射（１０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＭＰ９抗体またはマウス対照ＩｇＧ）して、肝線維症時におけるそれらの機能を試験した。抗体注射の２時間後、マウスを、オリーブ油中に溶存させた２５％のＣＣｌ４  ４μｌ／ｇで腹腔内処理し、その後、同じＣＣｌ４用量で、毎週２回、２週間にわたり処理して、肝線維症を誘導した。
【０５１８】
２週間後、マウスを屠殺して、血液試料および肝組織試料を回収した。イソフルランによる麻酔下で、血液試料を回収した。全肝臓を、生理食塩液で、速やかにフラッシュ洗浄し、ペーパータオル上で短時間ブロッティングした後、秤量した。肝臓の形状観察の後、肝臓をスライスし、極低温バイアルへと移し、分子生物学解析のために、液体窒素中で瞬時凍結させた。全ての試料を、解析の前に、−８０℃で保存した。
【０５１９】
血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを、Ｑｕｉｃｋ  Ａｕｔｏ  Ｎｅｏ  ＡＬＴキットおよびＱｕｉｃｋ  Ａｕｔｏ  Ｎｅｏ  ＡＳＴキット（株式会社シノテスト、日本）を使用して、ＨＩＴＡＣＨＩ  ７０２０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより測定した。肝組織を、遺伝子発現解析および組織学解析にかけた。遺伝子発現解析のために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により、全ＲＮＡを、組織から抽出し、製造元の指示書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写キットを使用して、精製ＲＮＡの逆転写を実施し、次いで、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）およびＡＢＩ  ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムを使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより、遺伝子転写物の定量化を実施した。マウスＩＤ１に使用されるプライマー対は、５’−ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣ−３’（配列番号２１９）および５’−ＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号２２０）であり；マウスＧＡＰＤＨに使用されるプライマー対は、５’−ＣＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号２２１）および５’−ＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２２２）であった。肝臓内ヒドロキシプロリン含量を、改変型Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）でアッセイした。組織学のために、肝臓検体を、１０％の緩衝ホルマリンで、１６〜１８時間にわたり固定し、パラフィンで包埋し、次いで、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色および線維性領域の定量化にかけた。
【０５２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける肝線維症のＣＣｌ４マウスモデルの結果
Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色、および肝線維症についてのリードアウトとしての肝臓ヒドロキシプロリン含量を使用して、本発明者らは、ＣＣｌ４の注射が、マウスにおける肝線維症を誘導しうることを見出した。図８に示される通り、対照ＩｇＧを加えたＣＣｌ４の注射は、陽性のＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色、および肝臓ヒドロキシプロリン含量の増大により決定される肝線維症を誘導しえた（図８ａおよび８ｂ）。これらには、ＡＬＴレベルの上昇（図８ｃ）、および肝重量の増大（図８ｄ）が随伴した。ＣＣｌ４による処置はまた、その標的遺伝子であるＩｄ１を上方調節することにより、ＢＭＰ９によるシグナル伝達も活性化させた（図８ｅ）。マウスを、抗ＢＭＰ９抗体で処置したところ、Ｉｄ１遺伝子の誘導が劇的に減少したことから、ＢＭＰ９抗体による、ＢＭＰ９シグナル伝達の十分な遮断が指し示される。これと同時に、ＣＣｌ４により誘導される肝線維症が、有意に減殺され、ＡＬＴレベルが、有意に低下する一方で、肝重量は、対照ＩｇＧ群と比較して改善された（図８）。まとめると、長期ｉｎ  ｖｉｖｏモデルからのこれらの結果は、抗ＢＭＰ９抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ９によるシグナル伝達を、効果的に遮断することが可能であり、ＣＣｌ４により誘導される肝線維症を改善しうることを指し示す。
【実施例１８】
【０５２１】
薬物動態（ＰＫ）アッセイ
マウスＰＫ：抗体４Ｅ１０Ｄ７
特定の病原体に曝されていない（ＳＰＦ）７〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（ＳＬＡＣ）により供給された。施設に到着したら、マウスを、少なくとも７日間にわたり馴致した。研究では、合計で１５匹の雄マウスを使用し、異なる処置および多様な時間経過に基づき、５つの群へと無作為化した。０日目に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＭＰ９抗体である４Ｅ１０Ｄ７による注射（静脈内）群１〜４；１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧによる注射群５の投与容量を５ｍｌ／ｋｇとする。血液は、ある特定の群から、投与の−１日目および２時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後に回収した（表９）。異なる群は、特異的な時点で屠殺した。非終末採血では、麻酔下で、眼窩採血／尾切断を介して、血液を回収した。終末採血（Ｔ）では、心穿刺を介して、血液を回収した。
【０５２２】
【表９】
2018522540.tif 000042
【０５２３】
多様な時点におけるＩｇＧ濃度を、競合Ｅｌｉｓａアッセイにより検出した。９６ウェルプレートを、０．２５μｇ／ｍＬ、ウェル１つ当たり１００μｌのヒトＢＭＰ９複合体でコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートする。洗浄緩衝液（１倍濃度のＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０）による、３回にわたる洗浄の後、ウェル１つ当たり３００ｕｌのブロッキング緩衝液（１倍濃度のＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０＋１％のＢＳＡ）を添加し、室温、４５０ｒｐｍで、１時間にわたり振とうする。次いで、被験試料を調製する：検量線のためには、１２０μｌのＡｂ（１００ｕｇ／ｍｌから、８％のナイーブマウス血清を含有するアッセイ緩衝液中、１：３の比で、７回にわたり希釈する）を、１２０μｌのビオチニル化Ａｂ（アッセイ緩衝液中、０．０６７ｕｇ／ｍｌへと希釈する）と混合し；血清試料のためには、９．６μｌの血清試料を、１２０μｌのアッセイ緩衝液（１２．５倍に希釈する）へと添加し、１２０μｌのビオチニル化Ａｂ（アッセイ緩衝液中、０．０６７ｕｇ／ｍｌへと希釈する）と混合する。アッセイ緩衝液は、１倍濃度のＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋１％のＢＳＡとした。プレートを、洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１００μｌの調製試料を、各時点について二連で添加し、室温で、２時間にわたりインキュベートする。その後、さらに３回にわたる洗浄の後、ウェル１つ当たり１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００、Ｐｉｅｒｃｅ＃２１１４０）を、各ウェルへと添加し、４５０ｒｐｍで振とうしながら、暗所内で、１時間にわたりインキュベートする。次いで、洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃００２０２３）を、アッセイプレートの各ウェルへと添加し、密封し、４５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で、約５分間にわたりインキュベートする。１ＭのＨＣｌ、ウェル１つ当たり１００μｌを添加することにより、反応を停止させ、次いで、ＯＤを４５０ｎｍにおいて読み取る。
【０５２４】
ＡＮＩＴラットモデルにおけるＰＫアッセイ：４Ｅ１０Ｄ７
７〜８週齢の雄ＳＤラットは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により供給された。施設に到着したら、ラットを、少なくとも７日間にわたり馴致した。この研究では、６匹の雄ラットを使用し、異なる処置に基づき、２つの群へと無作為化する。０日目に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＭＰ９  ＩｇＧによる注射（静脈内）群１；１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧによる注射群２である、群１および２に、ＡＮＩＴ飼料（ＳＬＡＣにより供給される）を供餌した。血液を、各ラットから、投与の−１日目、および２時間後、６時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、１２０時間後、１９２時間後、３３６時間後、５０４時間後に回収した。全ての群は、３週間後に屠殺した。非終末採血では、麻酔下で、眼窩採血／尾切断を介して、血液を回収した。終末採血では、心穿刺を介して、血液を回収した。多様な時点におけるＩｇＧ濃度を、正常マウスにおけるＰＫアッセイと同様に、競合Ｅｌｉｓａアッセイにより検出した。
【０５２５】
結果
結果を、図９に示す。正常マウスおよびＡＮＩＴラットモデルのいずれにおいても、親Ａｂである４Ｅ１０Ｄ７は、同様のＰＫプロファイルを示した。Ａｂは、２時間以内に、ピーク濃度に達し、低下し始め、２４時間後以前に半分に降下し、次いで、１週間以内に、５０ｕｇ／ｍｌで比較的安定した。
【０５２６】
カニクイザルにおける薬物動態（ＰＫ）アッセイ：ＭＯＲ０２２９６２
単回投与研究：
３〜４歳であり、２．５〜４ｋｇの雄カニクイザル（Macaca fascicularis）３匹に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＭＰ９抗体であるＭＯＲ０２２９６２（Ａｂ  ＢＭＰ９−２）を、静脈内投与した。血液を、投与前、および投与の０．２５時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後、１６８時間後、２４０時間後、３３６時間後、４０８時間後、５０４時間後、５７６時間後、６７２時間後、７４４時間後、８４０時間後、９１２時間後、および１００８時間後に回収した。多様な時点における全ＭＯＲ０２２９６２  Ａｂ濃度を、抗体のＦｃドメインを認識するサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。時間の関数としての全ＭＯＲ０２２９６２濃度を、各個体について、図１０に示す。最大濃度は、全ての個体において、投与後最初のサンプリング時点である、０．２５時間後に観察された。終末排出半減期（ｔ１／２）は、１３２〜１４５時間（５．５〜６．０日間）であった。研究の３２日目に始まる、１匹の動物におけるＭＯＲ０２２９６２のクリアランスの、見かけの加速化（図１０）は、同時の抗薬物抗体の検出と符合する。
【０５２７】
反復投与研究：
２〜５歳であり、２．３〜３．８ｋｇの雄カニクイザル（Macaca fascicularis）に、１０、３０、または１００ｍｇ／ｋｇ／週（群１つ当たりのｎ＝２）の抗ＢＭＰ９抗体（ＭＯＲ０２２９６２）を、４週間（５用量）にわたり、静脈内投与した。対照動物（ｎ＝２）には、同等投与用量（１ｍＬ／ｋｇ）のビヒクルを、４週間（５用量）にわたり施した。血液は、各用量の投与前、各投与の０．２５時間後、ならびに初回投与および最終回前投与の、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後に回収した。多様な時点における全ＭＯＲ０２２９６２  Ａｂ濃度を、抗体のＦｃドメインを認識するサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。時間の関数としての全ＭＯＲ０２２９６２  Ａｂ濃度を、図１１に示す。最大濃度（Ｃｍａｘ）は、全ての処置動物において、投与後最初のサンプリング時点である、０．２５時間後に観察された。ＭＯＲ０２２９６２への曝露（ＣｍａｘまたはＡＵＣ０−７ｄ）１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたり、用量比例的に増大した。初回投与後におけるＡＵＣ０−７ｄと、最終回前投与後におけるＡＵＣ０−７ｄとの比である、薬物蓄積は、３つの投与群にわたり、１．３〜２．３の範囲であった。
【実施例１９】
【０５２８】
開発可能性
当技術分野で公知のアッセイを使用して、ｈｕＢＭＰ９に対して、良好なアフィニティーおよび特異性を有するＩｇＧ抗体（ｈｕＢＭＰ７、ｈｕＢＭＰ２、およびｈｕＢＭＰ１０への結合と比べた）を、開発可能性について評価した。略述すると、抗体の凝集を、サイズ除外クロマトグラフィーにより測定し；融点を、ｐＨ＝７．５において評価し；疎水性を、硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４、ヒスチジン、ｐＨ＝６中の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により評価し；産生力価を、ＨＥＫ−２９３Ｔ発現系内で測定した。結果を、表１１にまとめる。これらの結果は、本発明の抗ＢＭＰ９抗体が、予測外に良好な開発可能特性を呈し、したがって、医薬剤としての開発に適することを裏付ける。
【０５２９】
【表１０】
2018522540.tif 000043
【実施例２０】
【０５３０】
ｈＢＭＰ９二量体を伴うＭＯＲ０２２９６２  Ｆｖの結晶構造
ＭＯＲ０２２９６２  Ｆｖドメインと複合させた、ヒトＢＭＰ９の結晶構造を、２．２Åで解明した。各非対称性単位は、１つのｈＢＭＰ９ホモ二量体、および２つのＦｖ分子を含有する。構造は、内部データベースである、Ｐｒｏａｓｉｓへと、１ｓｓｏｄの受託番号（本明細書の下記では、ＭＯＲ０２２９６２  Ｆｖを伴うｈＢＭＰ９のこの構造を１ｓｓｏｄと称する）で寄託された。
【０５３１】
１ｓｓｏｄの構造を、ＢＭＰ９−Ａｌｋ１−ＡｃｔＲＩＩｂ（ＰＤＢ：４ＦＡＯ）の構造へと重ね合わせることにより、ＭＯＲ０２２９６２およびＡｃｔＲＩＩｂが、ＢＭＰ９上で、重複する接触面（成熟ドメイン）を共有することが示されたが、これは、ＭＯＲ０２２９６２が、ＢＭＰ９への結合について、ＡｃｔＲＩＩｂと競合しうるという実験観察と、良好に符合する。構造はまた、ＭＯＲ０２２９６２の、ＢＭＰ９への結合表面が、Ａｌｋ１の、ＢＭＰ９への結合表面と、直接には重なり合わないことも示す。
【０５３２】
結晶構造は、ＭＯＲ０２２９６２が、疎水性相互作用を伴う、Ｌ８５、Ｌ９５、Ｙ９７、Ｈ９８、および水素結合ネットワークを伴うＳ８３、Ｈ９８、Ｅ１００を含む、ＢＭＰ９内のエピトープに結合することを示す。ＭＯＲ０２２９６２  Ｆｖと、ｈｕＢＭＰ９の成熟断片（配列番号２１５）との詳細な相互作用を、下記の表１２に例示する。
【０５３３】
生化学実験は、ＭＯＲ０２２９６２が、生化学実験では、予測外に、ＡｃｔＲＩＩｂ（ＩＩ型ＢＭＰ受容体）およびＡｌｋ１（Ｉ型ＢＭＰ受容体）の両方の、ＢＭＰ９への結合を、ある程度遮断することが可能であることを示すので、これは、ＭＯＲ０２２９６２が結合するエピトープが、Ｉ型のＢＭＰ９受容体型およびＩＩ型のＢＭＰ９受容体型の両方の遮断を結果としてもたらす、新たな結合エピトープに相当することを指し示すが、機構は、依然として不明である。
【０５３４】
【表１１】
2018522540.tif 000044
したがって、ある実施形態では、本発明は、ＢＭＰ９に結合し、ａ）軽鎖可変領域の、以下のアミノ酸残基：Ｙ３２、Ｄ５０、Ｓ９１、Ｄ９２、Ｔ９３、Ｓ９４、およびＬ９６；ならびにｂ）重鎖可変領域内の、以下のアミノ酸残基：Ｗ４７、Ｉ５０、Ｌ５２、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｉ１０２、Ｗ１０３、およびＳ１０４を含む単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０５３５】
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者により通例理解される意味と同じ意味を有する。
【０５３６】
別段に指し示されない限り、具体的な詳細について記載されていない、全ての方法、ステップ、技法、および操作を実施することができ、当業者に明らかな通り、それ自体、公知の方式で実施されている。例えば、ここでもまた、本明細書で言及される、標準的なハンドブック、および一般的な背景技術、ならびにその中で引用されている、さらなる参考文献が参照される。別段に指し示されない限り、本明細書で引用される参考文献の各々は、参照によりその全体において組み込まれる。
【０５３７】
本出願の記載を通して、本明細書の記載（例えば、表１）と、配列表との間に齟齬が見られる場合、本明細書の記載が優先されるものとする。
【０５３８】
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的なものであり、下記に提示される。
【０５３９】
本明細書では、特定の態様および特許請求の範囲について、詳細に開示してきたが、これは、例示だけを目的とする例としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、または任意の、対応する、将来の適用についての、特許請求の範囲の対象物の範囲に関して、限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定される、本開示の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本開示に対して、多様な代替、改変、および変更を施しうることを想定する。核酸の出発材料、対象のクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書で記載される態様について通じた当業者には、ルーチンの事柄であると考えられる。他の態様、利点、および変更も、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。当業者は、ルーチンの実験だけを使用して、本明細書で記載される、本発明の具体的な態様についての、多くの同等物を認識し、これらを確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることが意図される。後日になされる、対応する出願における、特許請求の範囲の再起草は、多様な諸国の特許法による制限に起因する可能性があり、特許請求の範囲の対象物の放棄として解釈すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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