(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する方法、特にTGF阻害剤又はSNAI1阻害剤により内胚葉由来細胞への分化を阻害する方法を提供する。【選択図】  図4
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGFβ阻害剤又はSNAI1阻害剤を添加することで、幹細胞が内胚葉特性を取得することを抑制するステップ(a)、又は
前記幹細胞のSNAI1遺伝子を取り除くことで、前記幹細胞が内胚葉特性を取得することを抑制するステップ(b)、を含む幹細胞の分化を制御する方法。
【請求項２】
前記方法は、前記幹細胞が分化過程において内胚葉由来細胞を形成することに使用される請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記内胚葉由来細胞は、肝細胞及び胆管細胞、膵臓外分泌細胞、膵臓内分泌細胞、肺細胞、胸腺細胞、甲状腺細胞及び/又は胃腸管細胞である請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞は、哺乳動物幹細胞であり、好ましくは、ヒト胚性幹細胞又はiPS細胞である請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記TGF阻害剤は、TGFβシグナル伝達経路阻害剤、TGFβ発現阻害剤、TGFβ干渉剤及びTGFβ遮断抗体から選択される1種又は複数種であり、好ましくは、前記TGFβ阻害剤は、RepSox及びSB525334から選択される1種又は2種であり、より好ましくは、前記阻害剤は、終濃度が1μM以上となるように添加され、又は、好ましくは、前記SNAI1阻害剤は、SNAI1のsiRNAsである請求項1に記載の方法。
【請求項６】
製剤がTGFβ阻害剤又はSNAI1阻害剤である幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する製剤、又は幹細胞から中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞への分化を促進する製剤。
【請求項７】
TGFβ阻害剤又はSNAI1阻害剤の、幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する製剤の調製における使用、又は幹細胞から中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞への分化を促進する製剤における使用。
【請求項８】
分化開始後の3日内で上皮間葉転換を抑制することで、幹細胞が内胚葉特性を取得することを抑制することを含む幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する方法。
【請求項９】
上皮間葉転換を刺激し、その後間葉上皮転換を刺激すること、又はTGFβ及び/又はSNAI1の発現を刺激することを含む幹細胞向から内胚葉由来細胞への分化を促進する方法。
【請求項１０】
前記内胚葉由来細胞は、肝細胞及び胆管細胞、膵臓外分泌細胞、膵臓内分泌細胞、肺細胞、胸腺細胞、甲状腺細胞及び/又は胃腸管細胞である請求項8又は9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬分野に属し、多能性幹細胞の分化を制御する方法を提供する。特に、本発明は、多能性幹細胞からの内胚葉由来細胞への分化を制御する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、生体を構成する様々な異なるタイプの細胞に分化する能力を有し、3つの胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)に由来する細胞に分化することができる。
【０００３】
幹細胞の方向性分化が注目され始めている。分化過程における最初の中間段階では、胚体内胚葉タイプの細胞を形成する。純粋な目的細胞を得るために、望ましくない細胞タイプへの分化を抑制することが有利である。しかし、特定の細胞タイプへの分化の抑制についての研究結果は極めて少ない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、アクチビンAで活性化される内因性TGFβが上皮間葉転換(EMT)を促進し、SNAI1に依存して胚体内胚葉(DE)を形成するという発見に基づいてされたものである。SNAI1の遮断又はTGFβ阻害剤の使用により幹細胞のEMTを抑制することで、幹細胞が分化過程において内胚葉特性を取得することを抑制するため、DE由来細胞の形成を制御することができる。DEタイプの細胞が分化の初期段階で抑制されるため、分化により他の胚葉タイプの純粋な細胞を生成する効率がより高い。
【０００５】
間葉細胞状態(M)と上皮細胞状態(E)との転換は体細胞の再プログラミングにおける細胞運命決定に関与することを証明する研究が発表されている。多能性状態から体細胞状態への分化過程において類似する決定が存在するかどうかは、まだ明確ではない。
【０００６】
本発明の1つの基礎研究として、クラスターRNA-seq法によりhESCsから肝細胞への分化過程における細胞運命の転換図を描き、テストを行った結果、hESCsが分化し始めるときに同調的なEMTを伴い、肝臓特性を取得する前に非同調的なMETが存在することを示した。単一細胞解像度でこれらの変化を検証した結果、EMTは内因性TGFβがSNAI1により起動され肝細胞へ分化することによって媒介されることをさらに証明した。これらの研究により、上皮間葉転換はhESCsから肝細胞系譜細胞への分化過程における、細胞運命転換を決定するメカニズムであることを実証し、さらに、分化と再プログラミングとは類似する細胞運命決定を有することを明らかにした。
【０００７】
制限因子により体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすることによって、再生医学に機能性細胞を得る新しい方法を提供するだけでなく、細胞運命決定のために新しいモデルを構築することができる。後者では、終末分化状態にある細胞が特定の条件下で多能性を回復できる。これは分子及び細胞ツールによりはっきりと観察できる。実際には、細胞運命転換のメカニズムを明らかにするため、再プログラミング過程について詳しい分析を行った1-3。特に興味深いのは、通常再プログラミング起動細胞である間葉細胞様マウス胚線維芽細胞(MEFs)が再プログラミングの終了後に上皮細胞特性を取得することである4。発明者と他の研究者はどちらもMETが再プログラミングに関する4つの因子(POU5F1、SOX2、KLF4、MYC)がMEFsに導入された後の、細胞変化を示す最初のマーカーである5，6。しかし、OK+M+Sの順序に従って導入したときに、同調法よりも再プログラミングを有効に促進する秩序があるEMT-MET過程7が起動されることで、間葉細胞運命と上皮細胞運命との転換が再プログラミング過程の発生、即ち、細胞が多能性を取得することを引き起こす原因であることを示す。通常の場合には、幹細胞分化過程が再プログラミングの逆過程と見なされているため、幹細胞の分化過程において、このような秩序があるEMT-MET過程が細胞運命の転換を推進する原因であると推測する。本発明において、秩序があるEMT-METはhESCs肝細胞様細胞への分化を促進することもできることを開示する。
【０００８】
本発明において、研究により、ヒト胚性幹細胞が肝細胞様細胞に分化する過程で秩序があるEMT-MET過程を経験し、特に、ヒト胚性幹細胞がDE由来細胞(例えば、肝細胞様細胞)に分化する過程には、TGFβに依存する上皮-間葉細胞の運命転換が存在する。
【０００９】
幹細胞分化を制御する方法を提供する。該方法は、
TGFβ阻害剤又はSNAI1阻害剤を上記幹細胞に導入することで、上記幹細胞が内胚葉特性を取得することを抑制するステップ(a)、又は
上記幹細胞のSNAI1遺伝子を取り除くことで、上記幹細胞が内胚葉特性を取得することを抑制するステップ(b)、を含む。
【００１０】
細胞の分化過程において、上記方法は、上記幹細胞から内胚葉由来細胞、例えば、肝細胞、胆管細胞、膵臓外分泌細胞、膵臓内分泌細胞、肺細胞、甲状腺細胞、及び他のタイプの胃腸管細胞を形成するのを抑制することに使用できる。
【００１１】
上記幹細胞は、哺乳動物幹細胞、好ましくは、ヒト胚性幹細胞又はiPS細胞である。
【００１２】
さらに、上記TGFβ阻害剤は、TGFβシグナル伝達経路阻害剤、TGFβ発現阻害剤、TGFβ干渉剤及びTGFβ遮断抗体からなる群より選択される。例えば、TGFβ阻害剤は、RepSox及びSB525334からなる群より選択される。
【００１３】
代替の実施形態として、阻害剤の濃度が1μM以上、好ましくは1〜20μM、より好ましくは1〜10μMである。本発明の好ましい実施例では、用量が終濃度2μMである。
【００１４】
さらに、上記SNAI1阻害剤は、SNAI1siRNAsである。
【００１５】
また、幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する方法を提供する。該方法は、分化開始後の3日内で上皮間葉転換を抑制することで、幹細胞が内胚葉特性を取得することを抑制することを含む。
【００１６】
一方、幹細胞向から内胚葉由来細胞への分化を促進する方法を提供する。該方法は、上皮間葉転換を刺激し、その後間葉上皮転換を刺激することを含む。
【００１７】
幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を促進する方法は、TGFβ及び/又はSNAI1の発現を刺激することを含む。
【００１８】
言い換えると、本発明は、幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する製剤、又は幹細胞から中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞への分化を促進する製剤を提供する。該製剤は、TGFβ阻害剤又はSNAI1阻害剤である。
【００１９】
また、本発明は、TGFβ阻害剤又はSNAI1阻害剤の、幹細胞から内胚葉由来細胞への分化を抑制する製剤の調製における使用、又は幹細胞から中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞への分化を促進する製剤における使用を提供する。
【００２０】
本発明に開示される阻害剤は、関連する治療薬物の調製に使用できる。
【００２１】
本発明において、hESCsから肝細胞系譜細胞への分化過程において秩序があるEMT-MET過程が発生するのを証明する証拠があり、これは体細胞の再プログラミングと類似するメカニズム7を反映する。これらの研究結果は、再プログラミング及び分化過程における細胞運命転換メカニズムに統一的な理解を提供することに寄与する。再プログラミングが分化の逆転であると考えられているため、このような統一なメカニズムは合理的であると推測される。これは、方向が反対であるにもかかわらず、細胞が必ず類似する段階を経るので、類似する過程及び調節物に関わるためである。系譜特異的分子は有効な再プログラミング因子であることが報道されている13，14。上記推測は該報道によって証明されることができる。さらなる研究の目標は、細胞運命の面から再プログラミング及び分化過程におけるこれらの細胞及び分子過程を調和する作用メカニズムを明らかにすることであるべきである。一方、インビボ及びインビトロのいずれにも間葉細胞状態と上皮細胞状態との転換、即ち、EMT及びMETが観察された 15-17。従って、インビボ及びインビトロで多くの側面からそれらの細胞運命転換過程でのカップリング作用をさらに分析する必要がある。それによって、正常の胚発育及び疾病過程の発生メカニズムに新しい知見及び新しいアイデアを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】秩序があるEMT-METにはhESCsから肝細胞様細胞への分化を伴う。(A)は、分化実験方法及び細胞分化の各段階を示す模式図である。同図には、代表的な写真及び特定段階のマーカー分子免疫蛍光画像を示し、縮尺が20μmである。(B) は、主成分分析により示される細胞分化過程で発生した運命転換である。PC2は、hESCsから肝細胞様細胞への分化過程に対応し、PC3は、上皮/間葉細胞表現型に対応する。(C) は、RNA-seqデータから選ばれたマーカー遺伝子の発現状況である。遺伝子発現量は、一定の時間内における平均発現量に標準化されたものである。マーカー遺伝子は、上から下へ順次に多能性、DE、肝芽細胞、肝細胞及びEMT/METに関する遺伝子である。(D)は、(C)で選ばれたマーカー遺伝子の方向性分化過程における発現傾向である。
【図２】アクチビンAがDEを過渡的な間葉細胞状態となるように誘導する。(A)は、hESCsから肝細胞への分化過程における特定段階のCDH1及びCDH2の動的発現を示す。(B)は、肝細胞の分化過程における細胞のE-M-E転換を示す。CDH1/CDH2の比率は、細胞の上皮/間葉状態のマーカーとして用いられる。(C)は、D0及びD3の間葉細胞遺伝子の相対的な発現レベルを示す。GAPDHの発現レベルは、任意に1とされる。(D)は、特定分化段階のCDH1及びCDH2免疫蛍光染色画像である。(E)は、0日目及び3日目に、細胞のF-アクチンがローダミン標識したファロイジンで染色された後の画像である。(F-G)は、hESCs及びDEの遊走実験を示す。(D及びE)における縮尺が20μmであり、(F)における縮尺が100μmである。
【図３】単細胞qPCR分析によりhESCsからDEへの分化過程において同調的なEMTが存在することを示す。(A)は、選ばれた遺伝子の発現ヒートマップである。(B)は、関連ネットワーク図である。異なる色が処理日数を示し、ノードサイズが2[相対発現量]で表される。中空矢印は、5/7日目にPOU5F1、SOX2及びNANOGを発現するhESCs様細胞を示す。中実矢印は、多能性マーカー遺伝子POU5F1、SOX2、NANOG;及びDEマーカー遺伝子SOX17、GATA4、GATA6を同時に発現する細胞を示す。(C)は、CDH1及びCDH2の単細胞遺伝子発現の散布図である。色は(B)の色と同じである。(D)は、特定遺伝子の0〜3日目の発現の関連性を示す。(E)は、SOX17及びGATA6と上皮細胞マーカー遺伝子CDH1及び間葉細胞マーカー遺伝子CDH2の単細胞遺伝子発現の散布図である。色は(B)の色と同じである。(F)は、3日目のCDH1とSOX17、CDH2とSOX17の免疫蛍光染色画像である。
【図４】TGFβは、アクチビンAが誘導するEMT及びDEの形成を媒介する。(A)は、培地における細胞が分泌したTGFβ1タンパク質の含有量を示す。(B)は、RepSoxで細胞を処理した後の選ばれたマーカー遺伝子の単細胞qPCR分析を示す。(C)は、図3Bで構築する関連図と同じであり、ノードサイズは2[相対発現量]で表される。(D)は、選定された一群のマーカー遺伝子のクラスターqPCR分析を示す。(E)は、RepSoxの有り/無しの場合における3日目の免疫蛍光染色画像である。縮尺が20μmである。(F)は、RepSoxの有り/無しの場合における3日目の細胞の遊走能力を示す。かかる実験は図2Fに示される。(G)は、特定遺伝子siRNAのqRT-PCR効率分析を示す。(H)は、SNAI1siRNAsで細胞を処理することにより、SOX17及びFOXA2の誘導発現を効果的に抑制したことを示す。
【図５】hESCsに由来する肝細胞様細胞が21日目にまで分化したときの特徴分析(A)は、細胞色素P450及びα-1-アンチトリプシン(AAT)の免疫蛍光染色画像である。赤色は細胞内で発現した細胞色素P450、緑色は細胞内で発現したα-1-アンチトリプシンを示す。(B)は、グリコーゲンPAS染色を示す。細胞におけるグリコーゲンを多く含む位置が赤色に染色され、成熟肝細胞は、グリコーゲンを貯蔵する機能を有する。(C)は、Alexa Fluor（登録商標）488で標識したLDL摂取である。緑色部分は、細胞に摂取されたLDLを示し、成熟肝細胞は、低密度リポタンパク質を摂取できる機能を有する。(D、E)は、インドシアニングリーン(ICG)の摂取及び放出を示す。
【図６】アクチビンAの有り/無しの場合におけるhESCs由来細胞TGFβ1の発現レベルのqRT-PCR分析GAPDH発現レベルは、任意に1とされる。データは、3回の独立した生物学的反復の平均値±SDで表される。hESCsにおけるTGFβ1遺伝子の発現は対照とされる。
【図７】陰性対照siRNA(siCK)又はSNAI1siRNA(siSNAI1)で処理した後の細胞における特定中内胚葉及び内胚葉マーカー遺伝子発現のqRT-PCR分析siRNAで処理されていない場合に、これらの遺伝子の発現レベルは1とされる。データは、3回の独立した生物学的反復の平均値±SDで表される。
【図８】hESCsから肝細胞様細胞への分化過程におけるEMT-MET模式図hESCsから肝細胞様細胞への分化過程において、順次EMT-METの運命転換を経る。具体的には、hESCsは、幹細胞マーカー遺伝子POU5F1およびNANOGを発現するとともに、上皮細胞マーカー遺伝子CDH1を発現する。胚体内胚葉(DE)細胞のマーカー遺伝子は、SOX17及びFOXA2であり、間葉細胞マーカー遺伝子CDH2も発現する。肝芽細胞(HB)のマーカー遺伝子は、HNF4A及びAFPであり、上皮細胞及び間葉細胞のマーカー遺伝子CDH1及びCDH2を同時に発現する。成熟肝細胞(HC)のマーカー遺伝子はALB及びTTRであり、上皮細胞マーカー遺伝子CDH1も発現する。肝分化段階の前期では、アクチビンAで活性化された内因性TGFβが上皮間葉転換(EMT)を促進でき、Snail1に依存して胚体内胚葉(DE)を形成する。
【００２３】
図面における英語及び省略語の意味
Day:日; Activin A:アクチビンA; Definitive endoderm:胚体内胚葉
Hepatoblast:肝芽細胞; Hepatocyte:肝細胞; Change around mean of expression:平均発現量の変化; Average expression of selected markers:選定されたマーカー遺伝子の平均発現量; Pluripotency:多能性; Epithelial genes:上皮細胞遺伝子; Mesenchymal genes:間葉細胞遺伝子
Relative gene expression:遺伝子相対発現量; Migration distance:遊走距離; 24hr:24時間; 48hr:48時間
Relative expression:相対発現量; Correlation:関連性
TGFβ1protein:TGFβ1タンパク質; Blank:空白対照; Activin A:アクチビンA;  Relative expression:相対発現量; Day:日; Fold change:倍数変化; Migration(um):遊走距離(um); Relative mRNA level: mRNA相対レベル
ICG Uptake: ICG摂取; ICG Release: ICG放出
Activin A:アクチビンA; Day 3:3日目
Relative mRNA level: mRNA相対レベル
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明を制限ではなく、明確に説明するために、本発明の詳細な説明を以下のいくつかの部分を分けて本発明の特徴、方法、実施例をそれぞれ説明する。
【００２５】
実験方法
【００２６】
ヒトESCsの培養及び肝細胞の方向性への分化
【００２７】
未分化のヒトH1ES細胞を37℃、5％CO2の条件下で、mTeSR1を培地(Stemcell Technologies，05850)として基底膜マトリックス(BD Biosciences，354277)上で単層培養を行った。細胞3〜5日毎に人工継代培養を行い、継代比率は1:4-1:6である。肝細胞の方向性への分化方法について、出願人は既存の文献をもとに改善して血清フリーの肝細胞の方向性への分化方法を提案した8，9。簡単に言えば、H1細胞を100ng/mlアクチビンA(Peprotech，A120-14E)を含有するRPMI/B27培地(インスリンを含まない。Gibco，A18956-01)で3日培養し、その後、20ng/ml BMP2(Peprotech，120-02)及び30ng/ml FGF-4(Peprotech，100-31)を含有するRPMI/B27(インスリンを含む。Gibco，17504-044)培地で4日培養し、次いで、20ng/ml HGF(Peprotech，100-39)及びKGF(Peprotech，100-19)を含有するRPMI/B27(インスリンを含む)培地で6日培養し、最後に20ng/mlオンコスタチンM(R&D Systems，295-OM/CF)を含有する肝細胞培地(Lonza，cc-3198)で8日培養した。肝細胞培地には、SingleQuots(EGFを含まない)が添加されている。
【００２８】
免疫蛍光染色
【００２９】
カバースリップでの細胞を4％パラホルムアルデヒド(PFA，井▲シ▼，GI001，広州)で30min固定し、PBSで3回リンスした後、0.3％Triton X-100(Sigma，T9284)/PBS膜で30min処理した。PBSで簡単に2回リンスした後、細胞を10％FBS(ExCell Biology，FSP500)/PBSに置き、室温で1hブロッキングした。アクチン染色では、細胞を1単位/mlローダミンファロイジン(Invitrogen，R415)に置き、室温で60minインキュベートした。免疫蛍光染色では、サンプルと第1抗体(0.3％Triton X-100/10％FBS含有する1xPBSに希釈される)を4℃で一晩インキュベートし、ブロッキング溶液で3回リンスした後、第2抗体とともに室温で1hインキュベートした。細胞をブロッキング溶液及びPBSで連続してリンスした後、DAPI(Sigma，D9542)で5min対比染色し、次いでZeiss LSM 710共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)下で結像させた。本研究で用いた抗体は付表S1を参照されたい。
【００３０】
リアルタイムRT-PCR
【００３１】
Trizol試薬(MRC，TR1187)で全RNAを抽出しReverTraAceキット(TOYOBO，34520B1)で2μg全RNAを逆転写した。生成物(cDNA)を適切に希釈してPCRテンプレートとした。SYBR（登録商標）Premix Ex TaqTMキット(TAKARA，RR420A)を用いてCFX96TouchTMリアルタイム蛍光定量PCR検出システム(Bio-Rad)でPCR反応を行った。GAPDHをインターナルコントロールとした。各項目について、測定は、3〜4回の生物学的反復を行い、データは、平均値±SDで表される。
【００３２】
siRNA処理
【００３３】
Ribobio(中国広州)公司は、ヒトSNAI1、SNAI2、TWIST1、TWIST2及びZEB1に対する3つの独立したsiRNAsをそれぞれ設計し合成した。製造業者の説明書に従って、Lipofectamine RNAiMAX試薬(Life Technologies，13778-150)を用いてsiRNAsトランスフェクションを行った。各siRNAの最終濃度は30nMである。mTeSR1で培養している融合度が70〜80％に達するH1細胞を連続して3回トランスフェクション(48時間ごと)した。その後、上記3回目のトランスフェクションの24時間後にアクチビンAで細胞を処理した。3回目のトランスフェクションの96h後にリアルタイムRT-PCRでsiRNAの遺伝子サイレンシング効率を測定した。各遺伝子に対して、最も効果的な2つのsiRNAsを選択して混合し、次の実験に用いた。
【００３４】
RNA-seq分析
【００３５】
hESCsから肝細胞様細胞への分化過程における0、1、2、3、5、7、9、11、13及び21日目に、それぞれ全RNAを抽出した。TruSeq RNAサンプルによりキット(Illumina，RS-122-2001)を調製し、約4μg RNAでcDNA迅速シーケンシングライブラリーを構築した。QIAquickゲルによりキット(QIAGEN，28704)を回収し、ゲルシートからDNA断片(250-300bp)を回収した。Qubit（登録商標）dsDNA HS分析キット(Invitrogen，Q32851)によりcDNAライブラリーの濃度を測定した。製造業者の説明書に従って，MiSeq上でサンプルをシーケンシングした。平均シーケンシング深度は、200万配列タグである。Bowtie2(v2.2.0)18及びRSEM(v1.2.17)19により配列及びENSEMBL(mm10v76)転写群を読みだして比較し、EDASeq(v2.0.0)20によりGC正規化した。glbase 21により分析した。読み出された配列は、GEOに保存され、番号:GSEXXXXXXである。
【００３６】
単細胞qPCR及び分析
【００３７】
製造業者の説明書に従って、Fluidigm C1及びBioMark HDにより単細胞qPCRを行った。簡単に言えば、濃度166〜250K/mLの細胞懸濁液を10-17μm C1TM単細胞自動調製IFC室(Fluidigm，PN100-5479)に置き、Fluidigm C1TMシステムにより細胞を捕獲した。各分析のときに、細胞がないウェル及び複数の細胞に占めされるウェルがともに排除された。細胞を捕獲した後、Ambion Single Cell-to-CTキット(Life Technologies，PN 4458237)及びC1TM単細胞自動調製モジュール2キット(Fluidigm，PN100-5519)により逆転写及びcDNA前増幅を行った。TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix(Life Technologies，4369016)及びinventoried TaqMan（登録商標）遺伝子発現分析(20X，Applied Biosystems)により分析する前に、前増幅生成物を10倍希釈した後、96.96dynamic Arrays TM on a BioMark System(Fluidigm)に加えた。単細胞qPCRは、Inventoried TaqManプライマーを使用した。Buganimらは2012に開示された方法22により相対発現量を計算し、Ct値=25を低発現遺伝子に使用する以外、glbase 21の一部として、関連ネットワーク図(mdsquish)を作製した。それについて、別途に説明する。簡単に言えば、特異値分解主成分2、3、4及び5に対して、全ての細胞間の標準化ユークリッド距離を測定した。その後、弱接続(点線)の閾値0.92及び強接続(実線)の閾値0.99によりネットワークを構築し、各ノードは、最大50本のベストスコア辺を有し、さらに、graphviz'neato'レイアウトデバイスによりネットワークをレイアウトした。ノードサイズは、2[相対発現量]で表される。
【００３８】
細胞遊走実験
【００３９】
スクラッチテストによりH1由来細胞の遊走能力を測定した。簡単に言えば、ピンヘッド又はガンヘッドを用いて、単層細胞で完全に覆われた培養皿の表面で無細胞領域を描き、スクラッチエッジにある細胞は、無細胞領域に入る。遊走前に，空白区域を撮影し、スクラッチのエッジを測定した。24-48h期間内で一定の時間毎に、細胞遊走を撮影してデータ分析に用いた。
【００４０】
ELISA
【００４１】
製造業者の説明書に従って、ELISAキット(R&D Systems，DB100B)により培地におけるTGFβタンパク質の含有量を測定した。
【００４２】
PAS染色
【００４３】
製造業者の説明書に従って、PAS染色キット(Polysciences，24200-1)によりPAS染色を行った。
【００４４】
LDL摂取
【００４５】
PBSで細胞をリンスし、4μg/ml低密度リポタンパク質(LDL)(Invitrogen，L23380)を含有する培地に置き、37℃で30minインキュベートした。その後、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定して透過処理した後、DAPI(Sigma，D9542)で染色した。蛍光顕微鏡で細胞が摂取したLDLの含有量を測定した。
【００４６】
ICG摂取及び放出
【００４７】
インドシアニングリーン(ICG)(Sigma，1340009)を5mg/m DMSOに溶解させた。細胞を用意した後、ICGを新たに調製した1mg/ml培地に希釈した。希釈されたICGを培養細胞に加え、37℃で30minインキュベートした。PBSでリンスした後、顕微鏡で細胞が摂取したICGを検出した。次いで、細胞をさらにICGがない培地に置き、6hインキュベートした後、顕微鏡で細胞がICGを放出したかどうかを検出した。
【００４８】
秩序があるEMT-MET転換はhESCsから肝細胞への分化に関係がある。
【００４９】
E-カドヘリン(CDH1)の顕著発現が存在するため、hESCsは、多能性状態にある上皮細胞であると見なされるべきである。同様に、肝細胞も上皮細胞であるが、体細胞であり且つ完全に分化したものである。従って、hESCsから肝細胞を生成するのは、あるタイプの上皮細胞から別のタイプの上皮細胞への転換過程に従い、多能性の緩やかな喪失及び肝細胞の特性の取得を伴い、間葉細胞状態を経る必要がない。細胞運命図及びhESCsから肝細胞への分化経路図を描画するため、化学成分が確定し、血清を含まないhESCsから肝細胞への分化実験方法を採用し、アクチビンA、FGF4/BMP2、HGF/KGF及びOncostatin M8，9を順次加えた。図1Aに示すように、0、3、13及び21目に、POU5F1/NANOG(多能性)、SOX17/FOXA2(胚体内胚葉;DE)、HNF4A/AFP(肝芽細胞)及びALB/TTR(肝細胞)で異なる段階を標識した。主成分分析により、上皮細胞状態がhESCsから開始し、hESCsが上皮細胞状態に回復する前に、3日目に間葉細胞状態に転換することがはっきり観察された(図1B)。図1Cで詳細に分析する分子マーカーはこのような秩序があるEMT-MET転換をさらに証明した。実際には、これらの遺伝子発現モードは、分化系における成体型の相対的な各段階をシミュレーションすることに使用され得る(図1D)ため、上皮細胞多能性状態から間葉細胞状態、さらに上皮肝芽細胞/肝細胞への過程は、協調的な動的変化であることを示す。EMT-METに加えて、多能性、DE、肝芽細胞及び肝細胞運命が特有する遺伝子の顕著な変化及び動的変化が観察された(図1D)。これらの結果により、秩序がある上皮-間葉上皮転換はhESCsから肝細胞への分化の原因を証明し、再プログラミングという既知の過程と類似するEMT-MET過程を反映した7。
【００５０】
細胞分化過程における過渡的な間葉細胞状態
【００５１】
図1には、クラスターRNA-seqに関わる間葉細胞状態は、間葉細胞マーカー遺伝子、例えば、CDH2(N-カドヘリン)及びSNAI1の顕著な発現、上皮細胞CDH1(E-カドヘリン)の迅速な喪失、並びに多能性マーカー遺伝子、例えば、POU5F1及びNANOGのダウンレギュレーションと定義される。しかし、アクチビンAインビトロが誘導するhESCsからDEへの分化過程においても類似する変化が観察された10，11。これらの過渡的な状態の細胞が間葉細胞表現型を完全に有するか、それともCDH1発現をダウンレギュレーションすることしかできず、真の間葉細胞機能及び遊走機能を取得していないかは、まだ明確ではない。この間葉細胞状態の特性をさらに研究するために、出願人は分化過程におけるCDH1及びCDH2の発現図を描画した。該発現図には、3日目にCDH1がダウンレギュレーションされ、CDH2がアップレギュレーションされ(図2A)、即ち、上皮細胞特性がダウンレギュレーションされるとともに、間葉細胞特性を取得することを示す。タンパク質レベルでCDH1及びCDH2を染色表示した結果、3日目にCDH1がほとんど完全になくなるとともに、CDH2を取得した(図2D)。興味深いことに、それからの数日で細胞はCDH1及びCDH2の両方に対して陽性であることにより、CDH1及びCDH2の発現は互いに排斥するわけではないことを示す(図2D)。そして、出願人は、1群の間葉細胞遺伝子、例えば、VIM、SNAI1、SNAI2、ZEB1及びTWIST1の0及び3日目の発現レベルを比較した結果、これらの遺伝子がアップレギュレーションされたのに対して、CDH1がダウンレギュレーションされた(図2C)。3日目に細胞におけるFアクチンをファロイジン染色した結果、アクチンミクロフィラメント構造は間葉細胞が特有するものであることを示す(図2E)。これらの細胞が確実に間葉細胞であることを証明するために、出願人はスクラッチテストを行った結果、3日目のみの細胞が遊走できるのに対して、0日目のhESCsが全く移動しなかった(図2F及び2G)。以上より、3日目の細胞は間違いなく間葉細胞であることが考えられる。
【００５２】
hESCsの分化は、EMTの発生から同調的に開始する。
【００５３】
図1Bに示すクラスターRNA-seqデータセットは、上皮細胞から間葉細胞、さらに上皮細胞までの運命変化全体を示す。時間に従ってE-M-E段階における多能性状態から肝細胞状態までの異なるモードを明らかにすることができるが(図1C)、クラスター法により分化過程における異質性を反映することができない。単一細胞レベルの解像度でこの過程をさらに分析するために、出願人は、501個の細胞(図3A)から46個の遺伝子及び2個の対照遺伝子(GAPDH，ACTB)を選定して単細胞qPCRを行い、全ての細胞の遺伝子発現に関連するネットワークを構築した(図3B)。POU5F1が内胚葉に入った後、最初はアップレギュレーションされたが、3日目からダウンレギュレーションされるようになった。POU5F1及びNANOGは、完全になくならず、低レベルのままで分化の7日目まで継続した(図3B)。これはクラスターRNA-seqの結果(図1C)と一致する。予想通り、SOX17及びGATA6は3日目にアップレギュレーションされ、その後、GATA4及びHNF4Aは軽度に誘導された(図3B)。3日目の細胞がアクチビンAに対する反応及びDE特性の取得面で高い同質性(クラスターRNA-seqと比較して、R2=0.74である)を示すので、それらはEMTをほぼ同時に経たことを示す。これは初期hESCsの同質性又はアクチビンAの同調能力を反映すると考えられる。
【００５４】
意外なことには、同調性が5日目に終止され、多くの細胞が同時にCDH1及びCDH2を発現し、クラスターとの関連性も顕著に低減した(R2=0.45)。これは、高い異質性が存在することを示す。同調から非同調への転換と一致するのは、初期EMTが特異的である（細胞が3日目にCDH2のみを発現する）一方、その後のMETが異質的である（多くの細胞が5日目に同時にCDH1及びCDH2を発現し、少量の細胞のみが7日目にCDH2を発現しなくなる）(図3B及び3C)。
【００５５】
興味深いことに、5及び7日目に、少量(それぞれ11及び12個)のhESC様細胞が発見された。これらの細胞は、いずれもPOU5F1、SOX2、NANOG及びCDH1を発現するが、HNF4A又はSOX17を発現しない(図3B，中空矢印)。これは、それらは細胞分化に抵抗するか、又は分化したhESCsが以前の状態のエピジェネティック記憶を保持し、ある方式にて未分化のhESCsとより類似する状態に回復するためであると考えられる。さらに、5及び7日目に、それぞれ11及び5個の細胞が同時にPOU5F1、SOX2、NANOG、SOX17、GATA4及びGATA6が発現された(図3B，中実矢印)。これは、成体型が完成していないことを示す。ある細胞が5日目に肝芽細胞マーカー遺伝子HNF4Aを発現し始めるが、7日目に広く発現するようになった。しかし、7日目の細胞は、高い異質性を示し(クラスターRNA-seqと比較してR2=0.29である)、hESC様細胞(n=12)、混合内胚葉前駆体細胞(n=5)、肝芽細胞(n=62)、さらに、低レベルのAFPを発現する少量の成体型肝細胞様細胞(n=5)からなる混合細胞集団(図3B)が存在する。しかし、これらの単細胞分析から分かるように、hESCsと肝細胞様細胞との間に秩序があるEMT-MET過程が存在し、クラスター-seqデータセットと一致する。
【００５６】
EMTは胚体内胚葉の形成前に発生する。
【００５７】
次いで、出願人はEMTとDEマーカーの取得との間の関係の問題を解析してみた。EOMES遺伝子がサイレンシングするときに、EMTはDEマーカーと分離できることが報道されている11。本研究において、出願人は、単細胞qPCR分析技術を使用し、関連図形を形成することにより、DEマーカーの取得及びEMT発生の時間順序を表示できる。0-3日の単細胞qPCR関連遺伝子発現(図3D)をクラスター分析したところ、CDH1又はCDH2を中心とする2つのクラスターを発見した。CDH1クラスターはPOU5F1及びSOX2を含み、即ち、多能性状態である一方、CDH2クラスターは、主要なDEマーカー遺伝子であるFOXA2、GATA6、GATA4及びSOX17を含む。正確な時間をより詳しく確定するために、出願人は、単一の細胞におけるCDH1又はCDH2及びDEマーカー遺伝子SOX17とGATA6の発現について散布図を描画した(図3E)。その結果、3日目にSOX17及びGATA6発現とCDH1発現とが互いに排斥するのに対して、SOX17及びGATA6発現とCDH2発現とが同時に進むことを発見した。このような変化をさらに分析するために、出願人は免疫蛍光分析を行った結果、SOX17陽性細胞はいずれもCDH1に対して陰性であるが、CDH2に対して陽性であった(図3F)。さらに重要なことは、CDH2に対して陽性であるが、SOX17に対して陰性である細胞が存在する。これは、EMTが発生したが、これらの細胞におけるSOX17がまだ十分に誘導されていないことを示す(図3F)。これらの結果は、EMTがDEの特殊化前に発生することを示す。
【００５８】
アクチビンAにより活性化される内因性TGFβはEMTの発生及びDEの形成を促進する。
【００５９】
分化過程の開始時に、迅速で同調的なEMTが発生した。しかし、アクチビンAは、EMTを誘導する強力な誘導剤ではないため、他のEMT誘導信号の刺激により作用を発揮する可能性がある。TGFβは、MEFsをiPSCsに再プログラミングすることには、主な障害である（即ち、再プログラミング因子によりそれを抑制することにより、MET及び体細胞の再プログラミングを発生させる必要がある）ことが出願人によって報道されている5。出願人のRNA-seqデータは、アクチビンA処理によりTGFβを強力に誘導することができ、このように、DEの形成過程において、内因性TGFβはEMTを誘導することができる。このような仮説を検証するために、qRT-PCRによりTGFB1遺伝子発現を測定した結果、アクチビンAが3日目にTGFB1を顕著に活性化したことを示す(図6)。同様に、ELISA法により培地における3日目の細胞のTGFβタンパク質(1.5ng/ml)の生理学的レベルを検出することができる(図4A)。EMTに対する作用を研究するために、TGFβシグナル伝達経路阻害剤RepSox12を細胞に加えて単細胞qPCR分析を行った結果、EMTを抑制するだけではなく、DEの形成を抑制したことを示す(図4C;表S5)。明らかになるように、3日目にRepSoxで処理した細胞がhESCsに非常に接近し、POU5F1及びNANOGを抑制し続けた(図4C)。それにより、TGFβが媒介するEMTはアクチビンAで処理したhESCsが多能性状態から脱離するのに必要なものであることを示す。実際には、これらの細胞は、hESCsと同一のレベルのCDH1及びSOX2発現を保持する(図4C)。しかし、アクチビンAで処理した細胞は、3日目にSOX17を顕著に発現した一方、RepSox処理は、その誘導を完全に抑制した(図4C)。また、RepSoxで処理した細胞において、外胚葉マーカー、例えば、SOX1及びPAX6が軽度に誘導された(図4C)。これらの結果から分かるように、RepSoxが存在する場合に、アクチビンAで処理したhESCsは、EMTを経てDEに分化できなかった。
【００６０】
出願人は、qRT-PCRによるEMTに対する分析及び系譜マーカーによりTGFβの作用をさらに検証した。その結果は、RepSoxがCDH2、SNAI1、SNAI2、ZEB1、KLF8及びVIMの発現を抑制するとともに、CDH1の発現を維持し、中内胚葉/内胚葉マーカー、例えば、GSC，EOMES、MIXL1、SOX17、FOXA2、GATA4、GATA6、HHEX及びLGR5の発現を抑制することを示す(図4D)。なお、他の系譜マーカー、例えば、PAX6、GATA2、BMP4及びGATA3が軽度にアップレギュレーションされるため、中胚葉/神経外胚葉という異なる細胞運命が存在することを示す。免疫染色により、RepSoxの有り/無しの場合に、CDH1とSOX17との排斥性及びCDH2とSOX17との共同制御を検証した(図4E)。また、出願人はこれらの細胞の遊走能力を測定した結果、DE細胞と比較して、RepSoxがある場合に、アクチビンAで誘導した細胞の3日目の活動能力が比較的悪い(図4H)。これらの結果からわかるように、TGFβは、EMTに必要であるだけではなく、アクチビンAで誘導したhESCsにおいて DEを形成するのに必要なものである。
【００６１】
SNAI1は、EMT及びDEの形成に必要なものである。
【００６２】
次いで、出願人は、3日目にアップレギュレーションされた転写因子を注目し、RNA-seqデータセットに応じてSNAI1及びTWISTのファミリーメンバーを研究することを決定した(図1C及び2C)。まず、これらの遺伝子のsiRNAsを設計し、qRT-PCRによりそれらの遺伝子サイレンシング効率を検出した(図4G)。結果は、これらの候補遺伝子の中に、SNAI1は、CDH2及びDEマーカー、例えば、SOX17及びFOXA2を活性化する最も重要な遺伝子であることを発見した(図4H)。また、SNAI1遺伝子がサイレンシングするときに、検出された全ての中内胚葉/内胚葉マーカー遺伝子の発現が類似する抑制を受けた(図7)。これらの結果から分かるように、SNAI1はEMT及びDE細胞運命転換には欠かせないものである。以上より、出願人のデータは、アクチビンAがTGFβのオートクリンを誘導し、逆にSNAI1媒介性EMT過程（hESCsから肝細胞への分化過程における固有の間葉細胞段階を含む）を誘導することを示す。
【００６３】
本発明を説明するために、以下の実施例を挙げる。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。
【００６４】
実施例1
【００６５】
TGFβ阻害剤によりhESCsから胚体内胚葉への分化を抑制する。
【００６６】
分化過程の細胞培養条件は以下の通りである。融合度が約50％の未分化ヒトH1ES細胞を接種した後、Accutaseで24h継代培養した。その融合度が37℃、5％CO2の条件下で約90％に達した。次いで、H1細胞を2μM Repsoxの有り/無しの条件で、アクチビンAが補充されたRPMI/B27培地(インスリンを含まない)に3日培養した。
【００６７】
hESCsの分化開始の0日目に終濃度2μMとなるようにTGFβシグナル経路阻害剤RepSoxを加えた。
【００６８】
細胞分化過程において、異なる胚葉タイプの細胞の各マーカー遺伝子、即ち、SOX1/PAX6(外胚葉マーカー遺伝子)、GATA2/BMP4(中胚葉マーカー遺伝子)、SOX17/FOXA2(内胚葉マーカー遺伝子)の発現を検出することにより、分化細胞を評価した。
【００６９】
単細胞qPCR及びバイオインフォマティクス、免疫蛍光染色、リアルタイムRT-PCR等の技術を用いてTGFβ阻害剤の、hESCsから肝細胞への分化に対する影響を評価する。これらの方法の詳細は、実験方法を参照されたい。
【００７０】
研究結果を図4B-Eに示す。hESCsのマーカー遺伝子であるPOU5F1/NANOG、外胚葉のマーカー遺伝子であるSOX1/PAX6、及び中胚葉のマーカー遺伝子は、それぞれ発現した(図4B-D)。しかし、この期間中に、内胚葉マーカー遺伝子は発現しなかった。
【００７１】
対照群として、TGFβシグナル経路阻害剤を加えない以外、同様の培養条件でhESCsを分化させた。ほとんどのhESCs由来細胞は、内胚葉マーカー遺伝子、例えば、SOX17、FOXA2、GATA4及びGATA6を顕著に発現したが、他の胚葉タイプの細胞マーカー遺伝子がほとんど検出されなかった。
【００７２】
従って、TGFβシグナル経路阻害剤を加えることにより、hESCsが分化して胚体内胚葉由来細胞を形成することを抑制できると判断できる。
【００７３】
また、TGFβ阻害剤は、外胚葉及び中胚葉のマーカー遺伝子の発現を向上させることができる(図4B-D)。
【００７４】
実施例2
【００７５】
SNAI1s iRNAsによりhESCsから胚体内胚葉への分化を抑制する。
【００７６】
細胞が分化する過程における培養条件は以下の通りである。H1細胞を3回目のトランスフェクション後に、20ng/mlアクチビンAが補充されたRPMI/B27培地(インスリンを含まない)に3日培養した。
【００７７】
細胞分化の過程において、胚体内胚葉の各マーカー遺伝子、即ちSOX17、FOXA2、GSC、GATA4、GATA6等の発現を検出することにより、分化細胞を評価した。
【００７８】
方法は、siRNA処理及びリアルタイムRT-PCRを含む。実験方法の詳細は、上述した実験方法の記載を参照されたい。
【００７９】
研究結果を図4G-H及び図7に示す。候補遺伝子の中に、SNAI1は、CDH2及びDEマーカー遺伝子、例えば、SOX17及びFOXA2を活性化する最も重要な遺伝子である(図4H)。また、SNAI1遺伝子がサイレンシングするときに、検出した全ての中内胚葉/内胚葉マーカー遺伝子の発現は、いずれも同様な抑制を受けた(図7)。これらの結果から分かるように、SNAI1は、EMT及びDE細胞運命決定に欠かせないものである。SNAI1が抑制されたり、遺伝子がサイレンシングしたりすると、hESCsが分化して胚体内胚葉由来細胞を形成することを抑制できる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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