(57)【要約】  本開示は、１またはそれ以上の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを含む非天然結合タンパク質に関し、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＸｉＸｓＸ５Ｘ７ＸｓＱＱＸ１１ＡＦＹＸ１ｓＸ１５ＬＸ１ｓＸ１９ＰＸ２１ＬＸ２３Ｘ２４Ｘ２ｓＱＲＸ２８Ｘ２ｇｆＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸｉｏＳＸｉ２Ｘｉ３Ｘｉ４ＬＸｉ５ＥＡＸｉｇＫＬＸｓ２Ｘｓ３Ｘｓ４ＱＸｓ５ＰＸを備える。また、本開示は、本発明の非天然Ｉｇ結合タンパク質を含む親和性マトリックスなどの組成物にも関する。免疫グロブリンのアフィニティ精製のためのこれらのＩｇ結合タンパク質または組成物の使用およびアフィニティ精製の方法に関する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含む非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質であって、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：ＸｌＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸｌｌＡＦＹＸ１５Ｘｌ６ＬＸｌ８Ｘｌ９ＰＸ２ｌＬＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＱＲＸ２８Ｘ２９ＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＱＸ５６ＰＸ５８（配列番号１）を含み、
ここで、
ＸｌがＡ，Ｖ，Ｑ，ＮまたはＰであり、
Ｘ２がＤ，ＡまたはＱであり、
Ｘ３がＡ，ＳまたはＮであり、
Ｘ４がＫ，ＱまたはＮであり、
Ｘ５がＨまたはＦであり、
Ｘ６がＤ，Ｎ，ＳまたはＡであり、
Ｘ７がＥまたはＫであり、
Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、
ＸｌｌがＳまたはＮであり、
Ｘ１５がＥ，ＤまたはＱであり、
Ｘｌ６がＶまたはＩであり、
Ｘｌ８がＨまたはＮであり、
Ｘｌ９がＬまたはＭであり、
Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ２３がＴまたはＮであり、
Ｘ２４がＥまたはＡであり、
Ｘ２５がＤまたはＥであり、
Ｘ２８がＮ，ＳまたはＡであり、
Ｘ２９がＧまたはＡであり、
Ｘ４０がＶ，ＱまたはＴであり、
Ｘ４２がＫ，ＴまたはＡであり、
Ｘ４３がＥ，ＮまたはＳであり、
Ｘ４４がＶ，ＬまたはＩであり、
Ｘ４６がＧまたはＡであり、
Ｘ４９がＫまたはＱであり、
Ｘ５２がＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ５３がＤまたはＥであり、
Ｘ５４がＳまたはＡであり、
Ｘ５６がＡまたはＰであり、
Ｘ５８がＫまたはＰであり、
前記非天然Ｉｇ結合タンパク質のヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤが１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下であることを特徴とする非天然Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の非天然Ｉｇ結合タンパク質において、
少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＸ２１ＬＴＥＸ２５ＱＲＸ２８ＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＱＡＰＸ５８（配列番号３８）を含み、ここで、
ＸｌがＮ，Ｖ，ＰまたはＡであり、
Ｘ２がＤまたはＡであり、
Ｘ３がＡ，ＳまたはＮであり、
Ｘ４がＫまたはＱであり、
Ｘ５がＨまたはＦであり、
Ｘ６がＤ，ＳまたはＡであり、
Ｘ７がＥまたはＫであり、
Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、
ＸｌｌがＳまたはＮであり、
Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ２５がＤまたはＥであり、
Ｘ２８がＮ，ＳまたはＡであり、
Ｘ４０がＶ，ＴまたはＱであり、
Ｘ４２がＫまたはＡであり、
Ｘ４３がＥまたはＳであり、
Ｘ４４がＶ，ＬまたはＩであり、
Ｘ４６がＧまたはＡであり、
Ｘ４９がＫまたはＱであり、
Ｘ５２がＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ５３がＤまたはＥであり、
Ｘ５４がＳまたはＡであり、
Ｘ５８がＫまたはＰであることを特徴とする非天然Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の非天然Ｉｇ結合タンパク質において、
少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、
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以上のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする非天然Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか一項に記載の非天然Ｉｇ結合タンパク質において、
前記非天然Ｉｇ結合タンパク質がアルカリ性条件下で安定であることを特徴とする非天然Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか一項に記載の非天然Ｉｇ結合タンパク質において、
２，３，４，５，６，７または８の非天然Ｉｇ結合ドメインが互いに連結されていることを特徴とする非天然Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか一項に記載の非天然Ｉｇ結合タンパク質において、
前記非天然Ｉｇ結合タンパク質が、固相への部位特異的共有結合のための特異的付着部位を含むことを特徴とする非天然Ｉｇ結合タンパク質。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を含む組成物であって、好ましくは当該組成物がアフィニティ分離マトリックスであることを特徴とする組成物。
【請求項８】
免疫グロブリンのアフィニティ精製のための、請求項１乃至６の何れか一項に記載の非天然Ｉｇ結合タンパク質または請求項７に記載の組成物の使用。
【請求項９】
免疫グロブリンのアフィニティ精製方法であって、
ａ．免疫グロブリンを含有する液体を提供するステップと、
ｂ．請求項１乃至６の何れか一項に記載の固定化された非天然Ｉｇ結合タンパク質を含むアフィニティ分離マトリックスを提供するステップと、
ｃ．前記液体と前記アフィニティ分離マトリックスとを接触させるステップであって、前記免疫グロブリンが固定化されたタンパク質に結合する、ステップと、
ｄ．好ましくはｐＨの変化または塩濃度の変化により、前記免疫グロブリンをマトリックスから溶出し、それによって前記免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップとを含み、
ｅ．任意選択的に、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の間に実行される１またはそれ以上の洗浄ステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ２Ｂ、マウスＩｇＧ３、ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ２、ウシＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質の生成方法であって、少なくとも１のＩｇ結合ドメインが、天然に存在するＩｇ結合タンパク質からの少なくとも２の天然に存在するＩｇ結合ドメインのシャッフリングプロセスによって得ることができることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質、請求項１２に記載の核酸、または請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞または非ヒト宿主。
【請求項１５】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質の産生方法であって、
ａ．前記非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を得るために、結合タンパク質の発現のための適切な条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ．任意選択的に、前記非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を単離するステップとを備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１またはそれ以上の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを含む非天然結合タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明の非天然Ｉｇ結合タンパク質を含むアフィニティマトリックスのような組成物に関する。また、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製のためのＩｇ結合タンパク質または組成物の使用、並びに、本発明のＩｇ結合タンパク質を用いたアフィニティ精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物工学的および薬学的応用は、抗体を含有するサンプルからの混入物質の除去を必要とする。抗体を捕捉および精製するための確立された手順は、免疫グロブリンのための選択的リガンドとして黄色ブドウ球菌由来の細菌細胞表面プロテインＡを用いるアフィニティ・クロマトグラフィである（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１，２００２：２１７−２３１を参照）。野生型プロテインＡは、高い親和性および選択性でＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合し、高温および広範囲のｐＨ値において安定である。アルカリ安定性のような改善された特性を有するプロテインＡの変異体が、抗体を精製するために利用可能であり、プロテインＡリガンドを含む様々なクロマトグラフィマトリックスが市販されている。しかしながら、特に、野生型プロテインＡに基づくクロマトグラフィマトリックスは、アルカリ性条件に曝露した後の免疫グロブリンに対する結合能力の喪失を示す。
【０００３】
［本発明の根底にある技術的課題］
抗体またはＦｃ含有融合タンパク質の大規模製造プロセスの多くは、アフィニティ精製のためにプロテインＡを使用する。
【０００４】
しかしながら、免疫グロブリンのアフィニティ精製を容易にするには、アフィニティ・クロマトグラフィにおけるプロテインＡの適用に限界があるため、免疫グロブリンに特異的に結合する改善された特性を有する新規なＩｇ結合タンパク質を提供する必要性が従来より存在する。したがって、１μＭの親和性、さらには１００ｎＭ以下の親和性を有する免疫グロブリンに対するＩｇ結合タンパク質の特異性は、免疫グロブリンの効率的な精製のためにＩｇ結合タンパク質にとって重要な機能的特徴である。
【０００５】
さらに、Ｉｇ結合タンパク質を含むクロマトグラフィマトリックスの価値を最大限に利用するためには、アフィニティリガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい。クロマトグラフィサイクルの間に、マトリックス上の残留混入物質の浄化および除去のために徹底的な洗浄手順が必要である。この手順では、高濃度のＮａＯＨを含むアルカリ溶液をアフィニティリガンドマトリックスに適用することが一般的な方法である。野生型プロテインＡまたは天然に存在するプロテインＡドメインは、そのような過酷なアルカリ性条件に長期間耐えられず、免疫グロブリンの結合能力を急速に失う。このため、免疫グロブリンに結合することができる新規なアルカリ性安定タンパク質を得ることが、この分野で必要とされている。
【０００６】
本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製に特に適しているが、従来技術の欠点を克服する人工免疫グロブリン結合タンパク質を提供する。特に、本発明の非天然Ｉｇ結合タンパク質の重要な利点は、天然に存在するプロテインＡドメインと比較して、高ｐＨでの安定性の増加である。
【０００７】
以上の概説は、必ずしも本発明により解決されるすべての課題を記載しているわけではない。
【発明の概要】
【０００８】
第１態様において、本発明は、１またはそれ以上の非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを含む非天然Ｉｇ結合タンパク質であって、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが配列番号１のアミノ酸配列を含む、非天然Ｉｇ結合タンパク質に関する。
【０００９】
第１態様の一実施形態では、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：ＸｌＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸｌｌＡＦＹＸ１５Ｘｌ６ＬＸｌ８Ｘｌ９ＰＸ２ｌＬＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＱＲＸ２８Ｘ２９ＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＱＸ５６ＰＸ５８（配列番号１）を含み、ここで、
ＸｌがＡ，Ｖ，Ｑ，ＮまたはＰ、好ましくはＮ，Ｖ，ＰまたはＡであり、
Ｘ２がＤ，ＡまたはＱ、好ましくはＤまたはＡであり、
Ｘ３がＡ，ＳまたはＮであり、
Ｘ４がＫ，ＱまたはＮ、好ましくはＫまたはＱであり、
Ｘ５がＨまたはＦであり、
Ｘ６がＤ，Ｎ，ＳまたはＡ、好ましくはＤ，ＳまたはＡであり、
Ｘ７がＥまたはＫであり、
Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、
ＸｌｌがＳまたはＮであり、
Ｘ１５がＥ，ＤまたはＱ、好ましくはＥであり、
Ｘｌ６がＶまたはＩ、好ましくはＩであり、
Ｘｌ８がＨまたはＮ、好ましくはＨであり、
Ｘｌ９がＬまたはＭ、好ましくはＬであり、
Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ２３がＴまたはＮ、好ましくはＴであり、
Ｘ２４がＥまたはＡ、好ましくはＥであり、
Ｘ２５がＤまたはＥであり、
Ｘ２８がＮ，ＳまたはＡであり、
Ｘ２９がＧまたはＡ、好ましくはＡであり、
Ｘ４０がＶ，ＱまたはＴであり、
Ｘ４２がＫ，ＴまたはＡ、好ましくはＫまたはＡであり、
Ｘ４３がＥ，ＮまたはＳ、好ましくはＥまたはＳであり、
Ｘ４４がＶ，ＬまたはＩであり、
Ｘ４６がＧまたはＡであり、
Ｘ４９がＫまたはＱであり、
Ｘ５２がＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ５３がＤまたはＥであり、
Ｘ５４がＳまたはＡであり、
Ｘ５６がＡまたはＰ、好ましくはＡであり、
Ｘ５８がＫまたはＰであり、
前記非天然Ｉｇ結合タンパク質のヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤが１μＭ以下、好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である。第１実施形態では、本発明は、１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含む結合タンパク質に関し、少なくとも１つの非天然Ｉｇ結合ドメインが、アルカリ処理後も免疫グロブリンに結合する能力を有する配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
第２態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質を含む組成物に関し、好ましくは、組成物がアフィニティ分離マトリックスである。
【００１１】
第３態様において、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製のための、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質または第２態様の組成物の使用に関する。
【００１２】
第４態様において、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製方法であって、（ａ）免疫グロブリンを含有する液体を提供するステップと、（ｂ）第１態様の固定化された非天然Ｉｇ結合タンパク質を含むアフィニティ分離マトリックスを提供するステップと、（ｃ）前記液体と前記アフィニティ分離マトリックスとを接触させるステップであって、前記免疫グロブリンが固定化されたＩｇ結合タンパク質に結合する、ステップと、（ｄ）前記免疫グロブリンをマトリックスから溶出し、それによって前記免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップとを含み、（ｅ）任意選択的に、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の間に実行される１またはそれ以上の洗浄ステップをさらに含むことを特徴とする方法に関する。
【００１３】
第５態様において、本発明は、第１態様に係る非天然Ｉｇ結合タンパク質の生成方法であって、各Ｉｇ結合ドメインが、天然に存在するＩｇ結合タンパク質から、少なくとも２の天然に存在するＩｇ結合ドメインのシャッフリングプロセスと、任意選択的な更なる突然変異の導入とにより得ることができることを特徴とする方法に関する。
【００１４】
第６態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００１５】
第７態様において、本発明は、第６態様の核酸分子を含むベクターに関する。
【００１６】
第８態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質、第６態様の核酸分子または第７態様のベクターを含む宿主細胞または非ヒト宿主に関する。
【００１７】
第９態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質の産生方法であって、ａ．前記非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を得るために、結合タンパク質の発現のための適切な条件下で、第８態様の宿主細胞を培養するステップと、ｂ．任意選択的に、前記非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を単離するステップとを備えることを特徴とする方法に関する。
【００１８】
この本発明の概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を説明するものではない。その他の実施形態は、以下の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、Ｉｇ結合タンパク質の生成のためのシャッフリングプロセスを示す図である。図１Ｂは、本発明のＩｇＧ結合タンパク質の一般配列（配列番号１）を示している。数字は、結合タンパク質中の対応するアミノ酸位置を指している。「Ｘ」は、以下に示す「Ｘ」のアミノ酸から選択されるアミノ酸を指している。例えば、位置２の「Ｘ」は、Ａ、ＤまたはＱから選択することができる。
【図２】図２は、選択された非天然Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９−３０）を示している。
【図３】図３は、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＨＭＳ１７４（ＤＥ３）に発現されたＩｇＧ結合タンパク質の分析を示している。可溶性画分および不溶性画分を生成し、ＳＤＳゲルに適用した。接種７時間後（図３Ａ）および接種２４時間後（図３Ｂ）の主培養物。レーン１−分子量マーカ、１４８４６４（配列番号１５）の可溶性（レーン２）および不溶性（レーン３）画分、１４８４６３（配列番号１４）の可溶性（レーン４）および不溶性（レーン５）画分、１４８４６１（配列番号１２）の可溶性（レーン６）および不溶性（レーン７）画分。灰色の矢印は、発現したタンパク質のおおよその大きさを指し示している。
【図４】図４は、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＩｇＧ結合タンパク質の分析を示している。１４８４６１（配列番号１２）の発現および精製（図４Ａ）および１４８４７１（配列番号２２）の発現および精製（図４Ｂ）。レーン１  分子量マーカ、レーン２  不溶性画分、レーン３  可溶性画分、レーン４  フロースルーＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラム、レーン５−９  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ溶出画分。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ結合タンパク質の結合アフィニティの分析を示している。アッセイは、オンターゲットとしてセツキシマブ（黒丸）およびアダリムマブ（白丸）で、オフターゲットとしてＢＳＡ（黒三角）で行った。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰを含むＳｔｒｅｐＴａｇを介して、ＩｇＧ結合タンパク質の結合を分析した。図５Ａは、Ｉｇ結合タンパク質１４８４７２（配列番号２３）を示しており、配列番号２３のＫＤは、５．９ｎＭ対セツキシマブおよび５．１ｎＭ対アダリムマブである。図５Ｂは、Ｉｇ結合タンパク質１４８４６１（配列番号１２）を示している。配列番号１２のＫＤは７．８ｎＭ対セツキシマブおよび７．５ｎＭ対アダリムマブであり、天然に存在するプロテインＡドメインと比較した本発明のさらなるＩｇＧ結合タンパク質の結果が表２に示されている（実施例５を参照）。
【図６】図６は、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるＩｇＧ結合タンパク質の結合アフィニティの分析を示している。図６Ａは、Ｉｇ結合タンパク質１４８４６３（配列番号１４）の分析を示している。分析した濃度は、０ｎＭ、１．５６ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭであった。配列番号１４のＫＤは１．３ｎＭである。図６Ｂは、Ｉｇ結合タンパク質１５４２５６（配列番号２８）の分析を示している。分析した濃度は、０、０．３９ｎＭ、０．７８ｎＭ、１．５６ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭであった。配列番号２８のＫＤは３．１ｎＭである。さらなる結果は表３に示されている（実施例６を参照）。
【図７】図７は、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ＲｅｓｉｎへのＩｇＧ結合タンパク質の固定化を示している。Ｉｇ結合タンパク質１４８４７０（配列番号２１）のプロファイル（図７Ａ）およびＩｇ結合タンパク質１４８４６０（配列番号１１）のプロファイル（図７Ｂ）が示されている。ｙ軸は２８０ｎｍでの吸収（ｍＡＵ）を示し、ｙ軸は溶出体積（ｍｌ）を示している。
【図８】図８は、アルカリ処理後のＳｕｌｆｏｌｉｎｋ  ｒｅｓｉｎに固定化されたＩｇＧ結合タンパク質のＩｇ結合活性を示している。この図は、連続的な０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理の８０分後の、天然のプロテインＡドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびドメインＺと比較した、様々なＩｇＧ結合タンパク質１４８４６２（配列番号１３、「１３」）、１４８４６３（配列番号１４、「１４」）、１４８４６７２（配列番号２３、「２３」）の残存活性を示している。
【図９】図９は、アルカリ処理後のエポキシ活性化樹脂に固定化されたＩｇＧ結合タンパク質のＩｇ結合を示している。Ｉｇ結合タンパク質１５４２５４（配列番号２６）、１５４２５５（配列番号２７）、１５４２５６（配列番号２８）および１５４２５７（配列番号３０）が、ＩｇＧ結合タンパク質１４８４６３（配列番号１４）と比較されている。６時間の連続的な０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理後の残存活性が示されている。
【図１０】図１０は、アルカリ処理後にエポキシ活性化樹脂に固定化された１，２，４または６のＩｇＧ結合ドメインからなるＩｇＧ結合タンパク質のＩｇ結合活性を示している。連続的な０．５ＭのＮａＯＨ処理の後の単量体１４８４６３（配列番号１４）、二量体１５０５７０（配列番号４５）、四量体１５０６６３（配列番号４６）および六量体１５０７７２（配列番号４７）のＩｇＧ結合活性が、示されている（０時間、薄い灰色のカラム；２時間、中間の灰色のカラム；４時間、濃い中間の灰色のカラム；６時間、濃い灰色のカラム）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［定義］
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載した特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらは変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２１】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ｌＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されているように定義される。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上別途必要な場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（備える）」という語および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、記載された整数またはステップまたは整数またはステップの群の包含を意味するものであるが、他の整数またはステップまたは整数またはステップの群の排除を意味するものではないことを理解されたい。
【００２３】
本明細書の本文中には、幾つかの文書（例えば、特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓなど）が引用されている。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような開示よりも先行する権利がないと認めるものとして解釈されるものではない。本明細書で引用される文書の幾つかは、「引用により援用される」ものとして特徴付けられる。そのように援用された文献の定義または教示と、本明細書に記載した定義または教示との間に矛盾がある場合、本明細書の記載が優先される。
【００２４】
本明細書中で言及されるすべての配列は、その全体的な内容および開示が本明細書の一部である添付の配列表に開示される。
【００２５】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結された２またはそれ以上のアミノ酸の任意の線状分子鎖を指し、生成物の特定の長さを意味するものではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２またはそれ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語の何れかと同じ意味で使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾生成物を指すことも意図されており、それには、当技術分野で良く知られている、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解切断、天然に存在しないアミノ酸による修飾および同様の修飾を含むが、これらに限定されるものではない。したがって、２またはそれ以上のタンパク質ドメインを含むＩｇ結合タンパク質も、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」の定義に含まれる。
【００２６】
本発明の文脈において、「免疫グロブリン結合タンパク質」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合することができるタンパク質を説明するために使用される。このＦｃ領域への特異的結合のために、本発明の「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリン全体、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートに結合することができる。本発明の「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して特異的な結合を示すが、「免疫グロブリン結合タンパク質」が免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域の低下した親和性でさらに結合することが、除外されるものではない。
【００２７】
本明細書を通して、「免疫グロブリン結合タンパク質」という用語は、しばしば「Ｉｇ結合タンパク質」または「Ｉｇ−結合タンパク質」と略称される。時には、例えば「免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質」という表現のように、長い形式と短縮形式の両方が同時に使用されることもある。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、「免疫グロブリン結合タンパク質」は、１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含む。本明細書で使用する「免疫グロブリン結合ドメイン」（Ｉｇ結合ドメインと略称されることもある）という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合することができるタンパク質ドメインを指している。しかしながら、「免疫グロブリン結合ドメイン」は、免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域に、低下した親和性でさらに結合することが除外されるものではない。Ｆｃ領域への特異的結合に起因して、本発明の「免疫グロブリン結合ドメイン」は、免疫グロブリン全体、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートに結合することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、「免疫グロブリン結合ドメイン」は、天然に存在するＩｇ結合ドメイン、例えば黄色ブドウ球菌プロテインＡのドメインＣ（配列番号７）またはドメインＢ（配列番号６）またはドメインＥ（配列番号３）またはドメインＤ（配列番号４）またはドメインＡ（配列番号５）に対して最大８５％の配列同一性を示す非天然ドメインである。本発明の好ましい非天然Ｉｇ結合ドメインは、ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびドメインＺの位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｋ３５、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｐ５７に対応する位置に同一のアミノ酸を有する。天然に存在するドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびドメインＺに対する本発明のＩｇ結合ドメインの同一性は、少なくとも約５０％、最大で８５％である。
【００３０】
本明細書では、第１化合物（例えば、本発明のＩｇ結合タンパク質）が第２化合物（例えば、免疫グロブリンのような標的タンパク質などの抗原）に対して、５００μＭ以下、好ましくは１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、好ましくは５００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤを有する場合に、第１化合物は第２化合物に「結合する」と考えられる。本発明による「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関連する。「特異的結合」は、本発明のＩｇ結合タンパク質が、別の非免疫グロブリン標的への結合と比較して特異的である免疫グロブリンに強く結合することを意味する。例えば、Ｉｇ結合タンパク質が特異的に結合する標的（例えば、免疫グロブリン）の解離定数（ＫＤ）は、結合タンパク質が特異的に結合しない標的の解離定数（ＫＤ）よりも、１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらにより好ましくは１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍以上低い。
【００３１】
「解離定数」または「ＫＤ」という用語は、特異的結合アフィニティ（親和性）を規定する。本明細書で使用する用語「ＫＤ」（通常「モル／Ｌ」で測定され、「Ｍ」と略称されることもある）は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すものとする。本発明の文脈において、ＫＤという用語は、免疫グロブリン結合タンパク質と免疫グロブリンとの間の結合アフィニティを説明するために特に使用される。高いアフィニティは、低いＫＤ値に対応する。したがって、「少なくとも１０−７ＭのＫＤ」という表現は、１０−７Ｍまたはそれ未満の値（より強く結合すること）を意味する。１×１０−７Ｍは１００ｎＭに対応する。１０−５Ｍから１０−１２Ｍまでの値は、定量化できる結合アフィニティと考えることができる。本発明によれば、標的結合のためのアフィニティは、５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の範囲とすべきである。
【００３２】
結合アフィニティ、すなわち解離定数ＫＤを測定する方法は、当業者に知られており、例えば、当技術分野で知られている以下の方法：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの技術、バイオレイヤ干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリ、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、分析用超遠心法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡまたはＩＲＭＡ）および増強化学発光法（ＥＣＬ）から選択することができる。幾つかの方法は、以下の実施例に記載されている。
【００３３】
本明細書で使用する「天然に存在する」という用語は、対象物を自然界で見出すことができるという事実を指している。例えば、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていない生物に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。例えば、天然に存在するＩｇ結合ドメインは、細菌黄色ブドウ球菌、例えばプロテインＡドメインＣ（配列番号７）またはプロテインＡドメインＢ（配列番号６）またはプロテインＡドメインＥ（配列番号３）またはプロテインＡドメインＤ（配列番号４）またはプロテインＡドメインＡ（配列番号５）から単離することができる。
【００３４】
これとは対照的に、本明細書で使用する「非天然」という用語は、天然に存在しない物、すなわち人間によって生成または改変された物を指している。例えば、実験室で人間により（例えば、遺伝子工学、シャッフリングプロセス、または化学反応などにより）生成された、または意図的に改変されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、「非天然」である。「非天然」および「人工的」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。例えば、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインを含む本発明のＩｇ結合タンパク質は、非天然タンパク質である。
【００３５】
本発明において同じ意味で使用される「抗体」または「Ｉｇ」または「免疫グロブリン」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を持つ、２つの重鎖および２つの軽鎖（免疫グロブリンまたはＩｇＧ抗体）からなる４つのポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を含む。「抗体軽鎖」という用語は、２つのタンデム免疫グロブリンドメインと、１つの定常ドメインと、抗原結合に重要な１つの可変ドメインとからなる抗体鎖の小さなポリペプチドサブユニットを示している。「抗体重鎖」という用語は、抗体のクラスまたはアイソタイプを決定する抗体の大きなポリペプチドサブユニットを示している。さらに、結合特異性を依然として保持しているそのフラグメントまたは誘導体も、「抗体」という用語に含まれる。本明細書において、抗体フラグメントは、完全またはインタクトな抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含んでいると理解される。また、「抗体」という用語は、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖およびヒト化（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）抗体などの実施形態も含む。２つの重鎖および２つの軽鎖からなる全長ＩｇＧ抗体が、本発明において最も好ましい。重鎖および軽鎖は、非共有相互作用およびジスルフィド結合を介して連結される。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「リンカー」という用語は、その最も広い意味において、少なくとも２つの他の分子と共有結合する分子を指している。本発明の典型的な実施形態では、「リンカー」は、第１ポリペプチドを少なくとも１つのさらなるポリペプチドと連結する部分として理解されるべきである。第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと同じであっても、あるいは異なっていてもよい。これらの典型的な実施形態では、ペプチドリンカーが好ましい。これは、ペプチドリンカーが、第１ポリペプチドと第２ポリペプチド、例えば第１のＩｇ結合ドメインと第２のＩｇ結合ドメインとを連結するアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドに連結され、それによって単一の線状ポリペプチド鎖を生成する。リンカーの長さおよび組成は、少なくとも１のアミノ酸と３０のアミノ酸との間で変化し得る。より具体的には、ペプチドリンカーは１−３０のアミノ酸長、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９または３０のアミノ酸長を有する。ペプチドリンカーのアミノ酸配列はプロテアーゼに対して安定であり、かつ／または二次構造を形成しないことが好ましい。よく知られているのは、グリシンおよびセリンのような小さなアミノ酸からなるリンカーである。リンカーは、グリシンを豊富に含むものであってもよい（例えば、リンカー中の残基の５０％超がグリシン残基であってもよい）。好ましくは、グリシンおよびセリン残基のみからなる可変長のグリシン−セリン−リンカーである。一般的に、構造（ＳＧＧＧ）ｎのリンカーまたはＳＧＧＧの並べ替え、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎのリンカーを用いることができ、ここで、ｎは１乃至６のいずれかの数字であり、好ましくは１，２または３である。また、アミノ酸をさらに含むリンカーも好ましい。本発明の好ましい実施形態は、アラニン、プロリンおよびセリンからなるリンカーを含む。ペプチドリンカーは、約４０％−６０％のアラニン、約２０％−３５％のプロリン、および約１０％−３０％のセリンからなることが好ましい。好ましくは、アミノ酸アラニン、プロリンおよびセリンはリンカーアミノ酸配列全体に亘って均一に分布し、最大で２，３，４または５個の同一のアミノ酸残基、好ましくは最大で３個アミノ酸が隣接していることが好ましい。タンパク質の融合のための他のリンカーは、当技術分野で公知であり、使用することができる。
【００３７】
本発明において使用可能な例示的リンカーは、少なくともアミノ酸配列ＳＧを有するリンカーまたはその他のリンカーであり、例えば、ＳＧＧＧＧ［配列番号３１］、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ［配列番号３２］、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ［配列番号３３］、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号３４］、ＧＧＧＧＳ［配列番号３５］、ＧＧＧＳ［配列番号３６］、ＳＧＧＧ［配列番号３７］、または（ＧＧＧＳ）ｎ（すなわち、配列番号３６のｎ回繰り返しであり、ここで、ｎは１と５の間である（例えば、ｎは１，２，３，４または５とすることができる）。）、（ＳＧＧＧ）ｎ（すなわち、配列番号３７のｎ回繰り返しであり、ここで、ｎは１と５の間である（例えば、ｎは１，２，３，４または５とすることができる）。）、またはＳＡＡＰＡＰＳＡＰＡＳＡＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＳＰＡＡＰＡＡＳ［配列番号４１］、ＡＳＰＳＰＡＡＰＡＰＡＰＳＡＡＳＰＡＰＡＡＰＡＰＡＡＳＰＡＡ［配列番号４２］、またはＡＳＰＡＰＳＡＰＳＡ［配列番号４３］である。２つのＩｇＧ結合ドメインまたは２つのＩｇＧ結合タンパク質の融合のためのその他のリンカーも当技術分野で公知であり、使用することができる。
【００３８】
「融合された」という用語は、成分が直接的にまたはペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されていることを意味する。「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第２タンパク質と遺伝的に結合した少なくとも第１タンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともとは別々のタンパク質をコードする２またはそれ以上の遺伝子を連結することによって作り出される。このため、融合タンパク質は、単一の線状ポリペプチドとして発現される、同一または異なる結合タンパク質の多量体を含み得る。これは、２，３，４またはそれ以上の結合ドメインまたは結合タンパク質を含むことができる。一般に、融合タンパク質は、当業者に良く知られている組み換えＤＮＡ技術によって人工的に生成される。本発明のＩｇ結合タンパク質は、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術のような多くの従来のよく知られた技術のいずれか、または市販の自動合成器によって準備することができる。
【００３９】
好ましくは、本明細書で使用する「多量体」という用語は、少なくとも２つのＩｇＧ結合ドメイン、好ましくは２（二量体）、３（三量体）、４（四量体）、５（五量体）、６（六量体）、７（七量体）または８（八量体）ＩｇＧ結合ドメイン、より好ましくは４，５または６ＩｇＧ結合ドメインを含む融合タンパク質に関する。好ましい実施形態では、多量体中のＩｇ結合ドメインは同一である。その他の実施形態では、多量体のＩｇ結合ドメインは異なっていてもよい。１またはそれ以上のリンカー配列が多量体のドメイン間に挿入される。
【００４０】
「アミノ酸配列同一性」という用語は、２またはそれ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（または差異）の定量的比較を指す。参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要に応じて配列を整列させてギャップを導入した後の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【００４１】
配列同一性を判定するために、クエリタンパク質の配列を参照タンパク質の配列に整列させる。整列の方法は、当技術分野において良く知られている。例えば、参照アミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を判定するためには、無料で入手できるＳＩＭ局所類似性プログラム（Ｘｉａｏｑｕｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７）が好ましくは使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照）。複数のアライメント分析のために、好ましくはＣｌｕｓｔａｌＷが使用される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０）。好ましくは、配列同一性パーセンテージを計算するときに、ＳＩＭ局所類似性プログラムまたはＣｌｕｓｔａｌＷのデフォルトパラメータが使用される。
【００４２】
本発明の文脈において、改変された配列とそれが由来する配列との間の配列同一性の程度は、特に断りのない限り、改変されていない配列の全長に対して計算される。
【００４３】
所与の位置における参照アミノ酸配列と異なるクエリ配列の各アミノ酸は、１つの差として数えられる。クエリ配列における挿入または削除も１つの差として数えられる。例えば、２つの結合ドメイン間のリンカーの挿入は、参照配列と比較して１つの差として数えられる。その後、差の合計は、非同一性のパーセンテージを得るために参照配列の長さに関連付けられる。同一性の定量的パーセンテージは、１００から非同一性のパーセンテージを差し引いたものとして計算される。
【００４４】
本明細書で使用する「約」という用語は、明示的に記載された量と、そこからの±１０％の偏差を包含する。より好ましくは、偏差５％が「約」という用語によって包含される。
【００４５】
本明細書中で使用する「シャッフルされた」という用語は、既知の配列のセットから出発して新規な非天然配列をもたらすアセンブリプロセスを指しており、このプロセスは、（ａ）シャッフルされる少なくとも２つの配列のセットを提供するステップと、（ｂ）前記配列のアライメントを行うステップと、（ｃ）アライメントした配列から新しい配列の組み立てを行うステップとを含み、新しい配列の各位置のアミノ酸は、アライメントした配列のいずれかの同じ位置から生じるものとすることができる。好ましくは、２またはそれ以上の連続するアミノ酸は、アライメントした配列の１つから生じる。
【００４６】
「クロマトグラフィ」という用語は、あるタイプの分子（例えば、免疫グロブリン）を試料中の他の分子（例えば、混入物質）から分離するために移動相および固定相を使用する分離技術を指す。液体移動相は、分子の混合物を含み、それらを固定相（固体マトリックスなど）を横切ってまたは通って移送する。移動相中の異なる分子の固定相との異なる相互作用に起因して、移動相中の分子を分離することができる。
【００４７】
「アフィニティ・クロマトグラフィ」という用語は、クロマトグラフィの特定のモードを指しており、このモードでは、固定相に結合したリガンドが移動相（試料）中の分子（すなわち免疫グロブリン）と相互作用する、すなわちリガンドが、精製される分子に対して特異的親和性を有する。本発明の文脈で理解されるように、アフィニティ・クロマトグラフィは、本発明のＩｇ結合タンパク質のようなクロマトグラフィリガンドを含む固定相に、免疫グロブリンを含有する試料を添加することを含む。「固体支持体」または「固体マトリックス」という用語は、固定相に関して同じ意味で使用される。
【００４８】
本明細書において同じ意味で使用される「アフィニティマトリックス」または「アフィニティ分離マトリックス」または「アフィニティ・クロマトグラフィマトリックス」は、アフィニティリガンド（例えば、本発明のＩｇ結合タンパク質）が付着されたマトリックス、例えばクロマトグラフィマトリックスを指している。リガンド（例えば、Ｉｇ結合タンパク質）は、親和性相互作用を介して、混合物から精製または除去される目的の分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）に結合することができる。
【００４９】
本明細書で使用する「アフィニティ精製」という用語は、マトリックスに固定化されたＩｇ結合タンパク質に免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質を結合させることによって、液体から免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質を精製する方法を指している。それにより、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質を除く混合物の他の全ての成分が除去される。さらなるステップでは、結合した免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質は、精製された形態で溶出させることができる。
【００５０】
「アルカリ安定」または「アルカリ安定性」または「苛性安定」または「苛性安定性」という用語は、免疫グロブリンに結合する能力を著しく失うことなく、アルカリ性条件に耐える本発明のＩｇ結合タンパク質の能力を意味する。この分野の当業者は、例えば実施例に記載のように、Ｉｇ結合タンパク質を水酸化ナトリウムとともにインキュベートして、当業者に知られている通常の実験、例えばクロマトグラフィ法により、免疫グロブリンへの結合活性の試験を行うことによって、アルカリ安定性を容易に試験することができる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、本発明のＩｇ結合タンパク質ならびに本発明のＩｇ結合タンパク質を含むマトリックスは、「増加した」または「改善された」アルカリ安定性を示し、これは、天然に存在するプロテインＡドメインと比較して、前記Ｉｇ結合タンパク質を組み込んだ分子およびマトリックスが長期間にわたりアルカリ性条件下で安定であること、すなわち、免疫グロブリンに結合する能力を失うことはなく、天然に存在するプロテインＡドメインよりも免疫グロブリンに結合する能力を失う程度が少ないこと意味している。
【００５２】
本明細書において同じ意味で使用される「結合活性」または「結合能力」または「静的結合能力」という用語は、本発明のＩｇ結合タンパク質が免疫グロブリンに結合する能力を指している。例えば、結合活性は、アルカリ処理の前および／または後に判定することができる。結合活性は、Ｉｇ結合タンパク質またはマトリックスに結合したＩｇ結合タンパク質、すなわち固定化された結合タンパク質について判定することができる。
【００５３】
分子生物学、細胞生物学、タンパク質化学および抗体技術の分野において一般的に知られており、実施されている方法は、継続的に更新された刊行物“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に十分に記載されている。細胞培養および培地に関する既知の技術は、“Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｄ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８−１５３，１９９７）、“Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ”（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７３−１０６，１９９１）、および“Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２５１−２７０，１９９０）に記載されている。
【００５４】
［本発明の実施形態］
以下、本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の様々な態様をより詳細に定義する。以下に定義される各態様は、明確に反対の表示がない限り、１または複数の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される１または複数の他の任意の特徴と組み合わせることができる。
【００５５】
第１態様では、本発明は、１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含む非天然免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質を対象とするものであり、少なくとも１のＩｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：ＸｌＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸｌｌＡＦＹＸ１５Ｘｌ６ＬＸｌ８Ｘｌ９ＰＸ２ｌＬＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＱＲＸ２８Ｘ２９ＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＱＸ５６ＰＸ５８（配列番号１）を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり又は構成され、ここで、ＸｌがＡ，Ｖ，Ｑ，ＮまたはＰ、好ましくはＮ，Ｖ，ＰまたはＡであり、Ｘ２がＤ，ＡまたはＱ、好ましくはＤまたはＡであり、Ｘ３がＡ，ＳまたはＮであり、Ｘ４がＫ，ＱまたはＮ、好ましくはＫまたはＱであり、Ｘ５がＨまたはＦであり、Ｘ６がＤ，Ｎ，ＳまたはＡ、好ましくはＤ，ＳまたはＡであり、Ｘ７がＥまたはＫであり、Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、ＸｌｌがＳまたはＮであり、Ｘ１５がＥ，ＤまたはＱ、好ましくはＥであり、Ｘｌ６がＶまたはＩ、好ましくはＩであり、Ｘｌ８がＨまたはＮ、好ましくはＨであり、Ｘｌ９がＬまたはＭ、好ましくはＬであり、Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、Ｘ２３がＴまたはＮ、好ましくはＴであり、Ｘ２４がＥまたはＡ、好ましくはＥであり、Ｘ２５がＤまたはＥであり、Ｘ２８がＮ，ＳまたはＡであり、Ｘ２９がＧまたはＡ、好ましくはＡであり、Ｘ４０がＶ，ＱまたはＴであり、Ｘ４２がＫ，ＴまたはＡ、好ましくはＫまたはＡであり、Ｘ４３がＥ，ＮまたはＳ、好ましくはＥまたはＳであり、Ｘ４４がＶ，ＬまたはＩであり、Ｘ４６がＧまたはＡであり、Ｘ４９がＫまたはＱであり、Ｘ５２がＮ，ＳまたはＤであり、Ｘ５３がＤまたはＥであり、Ｘ５４がＳまたはＡであり、Ｘ５６がＡまたはＰ、好ましくはＡであり、Ｘ５８がＫまたはＰであり、前記非天然Ｉｇ結合タンパク質のヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤが１μＭ以下、好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である。より詳細には、配列番号１、および配列番号３８に示される好ましい実施形態は、配列番号９−３０のアライメントから生じる一般配列である。このため、本発明のＩｇ結合タンパク質の各非天然Ｉｇ結合ドメインは、表１に示すように、天然に存在するＩｇ結合ドメインに対して約５０％〜約８５％の配列同一性を示す（実施例１を参照）。本発明のＩｇ結合タンパク質の各非天然Ｉｇ結合ドメインは、天然に存在するＩｇ結合ドメインの位置Ｑ９、Ａ１２、Ｆ１３、Ｌ１７、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｌ３４、Ｐ３８、Ｓ４１、Ｌ４５、Ａ４８、Ｌ５１、Ｑ５５に対応する位置に同一のアミノ酸を有し、より好ましくは、天然に存在するＩｇ結合ドメイン、例えば、ドメインＣ、ドメインＢ、ドメインＡ、ドメインＥおよびドメインＤの位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｋ３５、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｐ５７に対応する位置に同一のアミノ酸を有する。
【００５６】
第１態様の好ましい実施形態では、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＸ２１ＬＴＥＸ２５ＱＲＸ２８ＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＱＡＰＸ５８（配列番号３８）を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
ＸｌがＮ，Ｖ，ＰまたはＡであり、
Ｘ２がＤまたはＡであり、
Ｘ３がＡ，ＳまたはＮであり、
Ｘ４がＫまたはＱであり、
Ｘ５がＨまたはＦであり、
Ｘ６がＤ，ＳまたはＡであり、
Ｘ７がＥまたはＫであり、
Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、
ＸｌｌがＳまたはＮであり、
Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ２５がＤまたはＥであり、
Ｘ２８がＮ，ＳまたはＡであり、
Ｘ４０がＶ，ＴまたはＱであり、
Ｘ４２がＫまたはＡであり、
Ｘ４３がＥまたはＳであり、
Ｘ４４がＶ，ＬまたはＩであり、
Ｘ４６がＧまたはＡであり、
Ｘ４９がＫまたはＱであり、
Ｘ５２がＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ５３がＤまたはＥであり、
Ｘ５４がＳまたはＡであり、
Ｘ５８がＫまたはＰである。
【００５７】
配列番号３８は、配列番号９−３０のアライメントから生じる一般アミノ酸配列であり、配列番号１の好ましい選択である。
【００５８】
第１態様の好ましい一実施形態では、少なくとも１つの非天然Ｉｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：
ＸｌＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸｌｌＡＦＹＸ１５Ｘｌ６ＬＸｌ８Ｘｌ９ＰＸ２ｌＬＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＱＲＸ２８Ｘ２９ＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４ＱＸ５６ＰＸ５８（配列番号２）を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
ＸｌがＡ，Ｖ，Ｑ，ＮまたはＰであり、Ｘ２がＤ，ＡまたはＱであり、Ｘ３がＡまたはＮであり、Ｘ４がＫ，ＱまたはＮであり、Ｘ５がＨまたはＦであり、Ｘ６がＤ，ＮまたはＡであり、Ｘ７がＥまたはＫであり、Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、ＸｌｌがＳまたはＮであり、Ｘ１５がＥまたはＤであり、Ｘｌ６がＶまたはＩであり、Ｘｌ８がＨまたはＮであり、Ｘｌ９がＬまたはＭであり、Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、Ｘ２３がＴまたはＮであり、Ｘ２４がＥまたはＡであり、Ｘ２５がＤまたはＥであり、Ｘ２８がＮ，ＳまたはＡであり、Ｘ２９がＧまたはＡであり、Ｘ４０がＶまたはＱであり、Ｘ４２がＫ，ＴまたはＡであり、Ｘ４３がＥまたはＮであり、Ｘ４４がＶ，ＬまたはＩであり、Ｘ４６がＧまたはＡであり、Ｘ４９がＫまたはＱであり、Ｘ５２がＮまたはＤであり、Ｘ５３がＤまたはＥであり、Ｘ５４がＳまたはＡであり、Ｘ５６がＡまたはＰであり、Ｘ５８がＫまたはＰである。
【００５９】
第１態様の好ましい一実施形態では、本発明に係るＩｇ結合タンパク質が１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含み、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２ＡＸ４Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＸ２５ＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＬＸ４６ＥＡＸ４９ＫＬＮＸ５３Ｘ５４ＱＡＰＫ（配列番号４８）を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
ＸｌがＮまたはＶであり、
Ｘ２がＤまたはＡであり、
Ｘ４がＫまたはＱであり、
Ｘ５がＨまたはＦであり、
Ｘ７がＥまたはＫであり、
Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、
ＸｌｌがＳまたはＮであり、
Ｘ２５がＤまたはＥであり、
Ｘ４０がＶまたはＱであり、
Ｘ４２がＫまたはＡであり、
Ｘ４３がＥまたはＳであり、
Ｘ４４がＶまたはＩであり、
Ｘ４６がＧまたはＡであり、
Ｘ４９がＫまたはＱであり、
Ｘ５３がＤまたはＥであり、
Ｘ５４がＳまたはＡである。
【００６０】
配列番号４８は、配列番号２４，２６，２７，２８および３０のアラインメントから生じる一般アミノ酸配列であり、配列番号３８の好ましい選択である。Ｉｇ結合タンパク質は、長時間のアルカリ処理後（例えば、少なくとも最大６時間、０．５ＭのＮａＯＨ）でも安定であり、例えば、本発明のＩｇ結合タンパク質は、天然に存在するプロテインＡドメインより高いアルカリ安定性を有する。
【００６１】
第１態様の別の実施形態では、本発明に係るＩｇ結合タンパク質が１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含み、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインが、アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＸ２１ＬＴＥＤＱＲＸ２８ＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＸ４０ＳＫＸ４３Ｘ４４ＬＧＥＡＫＫＬＸ５２ＤＡＱＡＰＰ（配列番号４９）を含み、または本質的にこのアミノ酸配列からなり、ここで、
ＸｌがＰ，ＮまたはＡであり、
Ｘ２がＡまたはＤであり、
Ｘ３がＡ，ＳまたはＮであり、
Ｘ４がＫまたはＱであり、
Ｘ５がＨまたはＦであり、
Ｘ６がＤ，ＳまたはＡであり、
Ｘ７がＫまたはＥであり、
Ｘ８がＤ，ＥまたはＡであり、
ＸｌｌがＳまたはＮであり、
Ｘ２ｌがＮ，ＳまたはＤであり、
Ｘ２８がＳまたはＡであり、
Ｘ４０がＶまたはＴであり、
Ｘ４３がＥまたはＳであり、
Ｘ４４がＩまたはＬであり、
Ｘ５２がＮ，ＳまたはＤである。
【００６２】
配列番号４９は、配列番号９−２３のアラインメントから生じる一般アミノ酸配列であり、配列番号３８の好ましい選択である。
【００６３】
第１態様の一実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質が１またはそれ以上のＩｇ結合ドメインを含み、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、以下のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
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【００６４】
特に好ましいのは、１またはそれ以上のＩｇ結合ドメインを含む非天然Ｉｇ結合タンパク質であって、少なくとも１の非天然Ｉｇ結合ドメインが、配列番号１３，１４，２３，２６，２７，２８および３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または本質的に当該アミノ酸配列からなるものである。
【００６５】
以下の実施例に示すように、本発明のタンパク質はＩｇＧに結合することが見出された。より詳細には、配列番号１の一般配列、より具体的には配列番号３８または配列番号２の一般配列、さらにより具体的には配列番号９−３０を含むＩｇ結合ポリペプチドが、天然に存在するＩｇ結合ドメインの結合特性に匹敵する高い親和性でＩｇＧに結合することができることが見出された（表２の実施例５および表３の実施例６を参照）。配列番号１の一般配列、より具体的には配列番号３８または配列番号２の一般配列、さらにより具体的には配列番号９−３０を含むＩｇ結合ポリペプチドが、数時間のアルカリ処理後、例えば０．５ＭのＮａＯＨによる最大６時間の処理後でさえも、ＩｇＧに結合することができることは、より驚くべき予期しないことであった。これは、天然に存在するプロテインＡドメインまたはドメインＺと比較して有利な特性である（例えば、実施例７および実施例８および図８および図９の比較データを参照）。
【００６６】
本発明の一実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質が、互いに連結された、１，２，３，４，５，６，７または８個、好ましくは４，５または６個の天然に存在しないＩｇ結合ドメインを含み、すなわち非天然Ｉｇ結合タンパク質が、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体等とすることができる。例えば、実施例１に記載の多量体融合構築物を作製するために、配列番号１４が用いられた。２以上のＩｇ結合ドメインを含む得られたＩｇ結合タンパク質は安定であり、アルカリ処理後でさえもＩｇ結合特性を示す（例えば、図１０を参照）。選択される多量体Ｉｇ結合タンパク質の非限定的な例は、配列番号４５（二量体）、配列番号４６（四量体）または配列番号４７（六量体）に提供される。
【００６７】
第１態様の幾つかの実施形態では、非天然Ｉｇ結合ドメインが互いに直接結合している。第１態様の他の実施形態では、非天然Ｉｇ結合ドメインが、ペプチドリンカーを介して互いに結合されている。第１態様の幾つかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質のすべての非天然Ｉｇ結合ドメインのアミノ酸配列が同一である（例えば、配列番号４５−４７）。第１態様の他の実施形態では、少なくとも１つの非天然Ｉｇ結合ドメインが、非天然免疫グロブリン結合タンパク質内の他のＩｇ結合ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する。
【００６８】
Ｉｇ結合タンパク質またはドメインの解離定数ＫＤは、上述したように、実施例のように判定することができる（例えば、実施例５および実施例６を参照）。典型的には、解離定数ＫＤは２０℃、２５℃または３０℃で測定される。特に断りのない限り、本明細書で列挙するＫＤ値は、表面プラズモン共鳴によって２５℃±３℃で測定される。第１態様の実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質が、０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは０．５ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲のヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤを有する。
【００６９】
第１態様の一実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質が、０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは０．５ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲のヒトＩｇＧ２に対する解離定数ＫＤを有する。
【００７０】
第１態様の一実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質が、０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは０．５ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲のヒトＩｇＧ４に対する解離定数ＫＤを有する。
【００７１】
第２態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質を含む組成物に関する。
【００７２】
第２態様の好ましい実施形態において、組成物は、固体支持体に結合された上記実施形態の何れかに係る非天然Ｉｇ結合タンパク質を含むアフィニティ分離マトリックスである。アフィニティ分離マトリックスは、固体支持体に結合した本発明の複数のＩｇ結合タンパク質を含む。
【００７３】
本発明の非天然Ｉｇ結合タンパク質を含むこのマトリックスは、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン誘導体、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートのような免疫グロブリンおよび他のＦｃ含有タンパク質の分離、例えばクロマトグラフィ分離に有用である。アフィニティ・クロマトグラフィのための固体支持マトリックスは、従来より知られており、例えば、アガロースおよびアガロースの安定化誘導体（例えば、ｒＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗまたはＭａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標））、制御された細孔ガラス（例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ樹脂）、モノリス（例えば、ＣＩＭ（登録商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（例えば、ＣＭジルコニアまたはＣＰＧ（登録商標））、酸化チタン、または合成ポリマー（例えば、Ｐｏｒｏｓ  ５０ＡまたはＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）Ａ樹脂などのポリスチレン、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなど）および種々の組成物のヒドロゲルを含むが、それらに限定されるものではない。特定の実施形態では、支持体が、多糖類のようなポリヒドロキシポリマーを含む。
【００７４】
支持体に適した多糖類の例には、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなど、およびそれらの安定化された変異体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
固体支持体のフォーマットは、任意の適切な周知の種類のものとすることができる。本発明のＩｇ結合タンパク質を結合するためのそのような固体支持体は、例えば、カラム、キャピラリ、粒子、膜、フィルタ、モノリス、ファイバ、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセット、またはクロマトグラフィにおいて一般的に使用されて当業者に周知の任意の他のフォーマットのうちの一つを含むが、それらに限定されるものではない。マトリックスの一実施形態において、担体は、ビーズとしても知られている実質的に球形の粒子、例えばセファロースまたはアガロースビーズからなる。適切な粒子サイズは、５−５００μｍの直径範囲、例えば１０−１００μｍ、さらに例えば２０−８０μｍの直径範囲とすることができる。代替的な実施形態では、担体は膜、例えばヒドロゲル膜である。幾つかの実施形態では、アフィニティ精製は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質が共有結合しているマトリックスとしての膜を含む。
【００７６】
固体支持体は、カートリッジ内の膜の形態であってもよい。一実施形態では、固体マトリックスは、多孔質または非多孔質のビーズまたは粒子の形態である。ビーズまたは粒子の形態のマトリックスは、充填床として、または膨張床を含む懸濁された状態で使用することができる。モノリス、充填床および膨張床の場合、分離手順は、一般に、移動相における濃度勾配または濃縮段階を伴う従来のクロマトグラフィに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ式モードが使用される。
【００７７】
幾つかの実施形態では、アフィニティ精製は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質が共有結合している固体支持体を含有するクロマトグラフィカラムを含む。
【００７８】
本発明のＩｇ結合性タンパク質は、例えば、本発明のＩｇ結合タンパク質に存在するアミノ基、スルフヒドリル基および／またはカルボキシ基を使用して、従来のカップリング技術により、適切な固体支持体に結合させることができる。カップリングは、Ｉｇ結合タンパク質の窒素、酸素または硫黄原子を介して行われるものであってもよい。
【００７９】
好ましくは、ＮまたはＣ末端ペプチドリンカーに含まれるアミノ酸は、前記窒素、酸素または硫黄原子を含む。Ｉｇ結合タンパク質は、担体表面と本発明のＩｇ結合タンパク質との間に適切な距離を提供するために、スペーサ要素を介して担体に直接的または間接的に結合され、それにより、Ｉｇ結合タンパク質の利用可能性を改善するとともに、支持体に対する本発明のＩｇ結合タンパク質の化学的結合を促進する。固体支持体へのタンパク質リガンドの固定化の方法は、この分野で周知であり、標準的な技術および装置を用いてこの分野の当業者によって容易に実施される。
【００８０】
一実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質は、固相（マトリックス）への共有結合のための付着部位を含む。好ましくは、付着部位は、固相への部位特異的付着を提供するために特異的である。特定の付着部位は、システインまたはリジンなどの天然アミノ酸、または例えばスルフヒドリル基、マレイミド基、エポキシ基またはアルケン基から選択される固相の反応性基との特異的化学反応を可能にする非天然アミノ酸、固相とタンパク質との間のリンカーを含む。Ｎ末端は、アミノ反応性試薬を用いて酸性ｐＨで優先的に標識化される。本発明の好ましい実施形態は、末端システインを有する５−２０アミノ酸、好ましくは１０アミノ酸の短いＮ−またはＣ−末端ペプチド配列を含む。Ｃ末端ペプチド配列のアミノ酸は、好ましくはプロリン、アラニン、セリン、例えばＡＳＰＡＰＳＡＰＡＣ（配列番号３９）から選択される。
【００８１】
第３態様において、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製のための、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質または第２態様の組成物の使用を対象としており、すなわち本発明のＩｇ結合タンパク質がアフィニティ・クロマトグラフィのため使用される。幾つかの実施形態において、本発明のＩｇ結合タンパク質は、本発明の第２態様に記載されるように、固体支持体上に固定化される。第３態様の一実施形態では、精製される免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ２Ｂ、マウスＩｇＧ３、ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ２、ウシＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートからなる群から選択される。
【００８２】
第４態様において、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティ精製方法を対象とし、この方法は、（ａ）免疫グロブリンを含有する液体を提供するステップと、（ｂ）第１態様の固定化された非天然Ｉｇ結合タンパク質を含むアフィニティ分離マトリックスを提供するステップと、（ｃ）前記液体と前記アフィニティ分離マトリックスとを接触させるステップであって、前記免疫グロブリンが固定化されたＩｇ結合タンパク質に結合する、ステップと、（ｄ）前記免疫グロブリンをマトリックスから溶出し、それによって前記免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップとを含み、（ｅ）任意選択的に、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の間に実行される１またはそれ以上の洗浄ステップをさらに含む。アフィニティ分離マトリックスは、上述した実施形態に従うものであり、当業者に知られている通りである。
【００８３】
第４態様の幾つかの実施形態では、ステップ（ｄ）におけるマトリックスからの免疫グロブリンの単離は、ｐＨの変化または塩濃度の変化によって行われる。第４態様の幾つかの実施形態では、上記方法は、（ｆ）前記溶出液を回収するステップをさらに含む。
【００８４】
第４態様の一実施形態では、免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ２Ｂ、マウスＩｇＧ３、ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ２、ウシＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートからなる群から選択される。
【００８５】
第５態様において、本発明は、第１態様に係る少なくとも１のＩｇ結合ドメインを含む非天然Ｉｇ結合タンパク質の生成方法を対象とするものであり、Ｉｇ結合ドメインのアミノ酸配列が、天然に存在するプロテインＡからの少なくとも２の天然に存在するプロテインＡドメインのアミノ酸配列のシャッフリングプロセスによって得られる。より詳細には、本明細書から理解されるように、シャッフリングプロセスは、同一ではない既知のアミノ酸配列のセットから開始される新規かつ人工のアミノ酸配列をもたらすアセンブリプロセスであり、このプロセスは、（ａ）シャッフルされる少なくとも２の配列のセット、例えば５つの天然に存在するプロテインＡドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣおよびプロテインＡ誘導体（例えば任意の天然に存在するドメインと少なくとも９０％の同一性を有するＺドメインまたは他のドメイン）の配列を提供するステップと、（ｂ）配列のアライメントを行うステップと、（ｃ）インシリコで統計的フラグメンテーションを行うステップと、その後の（ｄ）様々なフラグメントから新しい配列のインシリコ組み立てを行い、相対的な順序を維持したモザイク生成物を生成するステップとを備える。ステップｃ）において生成されたフラグメントは、任意の長さであってもよく、フラグメント化された親配列が長さｎを有する場合、フラグメントは長さ１乃至ｎ−１を有することができる。このため、再構築されたタンパク質は、１またはそれ以上のアミノ酸の部分配列を含む一連のフラグメントから構成され、それら部分配列が、ステップ（ｂ）でアライメントしたプロテインＡからの個々のＩｇＧ結合ドメインの１またはそれ以上における対応する位置に存在する。すなわち、組み立てられたモザイク配列のあらゆるアミノ酸の位置には、プロテインＡからのアライメントしたＩｇＧ結合ドメインの中に、対応する位置に同じアミノ酸を含む少なくとも１のタンパク質が存在する。しかしながら、再構築されたタンパク質の全体のアミノ酸配列は、プロテインＡ由来のＩｇＧ結合ドメインのいずれかの全体のアミノ酸配列と同一ではないという点で人工的である。新しい配列の各位置のアミノ酸は、アライメントした配列のいずれかの同じ位置に対応する。モザイク生成物中のアミノ酸の相対位置は出発配列に対して維持される。新規な人工ＩｇＧ結合タンパク質の生成のための一般的なシャッフリングプロセスが図１Ａに示されている。
【００８６】
この最初のシャッフルされたタンパク質が生成された後、必要に応じてシャッフルされたタンパク質の結合特性をさらに改変するために、任意選択的に、アミノ酸配列の部位特異的ランダム化によってタンパク質をさらに改変することができる。例えば、さらなる改変は、個々のアミノ酸残基の部位飽和突然変異誘発により導入して、複数の改変シャッフルポリペプチドを生成することができる。その後、これらのＩｇＧ結合タンパク質をスクリーニングして、関心のあるあらゆる結合特性を有する改変シャッフルポリペプチドを同定することができる。
【００８７】
このため、本発明のＩｇＧ結合タンパク質の生成には、１または２の基本的なステップ、すなわち関連配列をアライメントおよびシャッフルして、シャッフルしたポリペプチドを生成する第１ステップと、必要に応じて、シャッフルしたタンパク質の結合活性をさらに改変する第２ステップとを伴う。
【００８８】
本発明のＩｇ結合タンパク質は、１またはそれ以上の非天然Ｉｇ結合ドメインを含み、各非天然Ｉｇ結合ドメインが、Ｑ９、Ａ１２、Ｆ１３、Ｌ１７、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０，Ｉ３１、Ｌ３４、Ｐ３８、Ｓ４１、Ｌ４５、Ａ４８、Ｌ５１、Ｑ５５に対応する位置に、天然に存在するプロテインＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥまたはドメインＺと同一のアミノ酸を有し、より好ましくは自然に存在するＩｇ結合ドメインの位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｋ３５、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｐ５７に対応する同じアミノ酸を有する。
【００８９】
天然に存在するプロテインＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥまたはドメインＺに対する本発明のＩｇ結合タンパク質の配列同一性は多くとも約８５％である（詳細については表１を参照）。
【００９０】
第６態様では、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質をコードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子に関する。
【００９１】
また、本発明は、本発明の第６態様の核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含する。
【００９２】
第７態様において、本発明は、第６態様の核酸分子を含むベクターに関する。
【００９３】
ベクターは、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用することができる任意の分子またはエンティティ（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００９４】
第７態様の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
【００９５】
第８態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質、第６態様の核酸分子、または第７態様のベクターを含む、宿主細胞、好ましくは単離された宿主細胞、または非ヒト宿主に関する。
【００９６】
例えば、本発明のＩｇ結合タンパク質をコードする１またはそれ以上の核酸分子を適切な宿主中で発現させ、産生された結合タンパク質を単離することができる。
【００９７】
宿主細胞は、核酸配列で形質転換された細胞、または形質転換が可能な細胞であり、それによって目的の遺伝子を発現する。
【００９８】
適切な宿主細胞には、原核生物または真核生物が含まれる。種々の哺乳類細胞または昆虫細胞の培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。本発明によれば、宿主は、本発明のタンパク質でトランスフェクトされかつ／または本発明のタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物であってもよい。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物が非ヒト哺乳動物である。
【００９９】
第９態様において、本発明は、第１態様の非天然Ｉｇ結合タンパク質の産生方法であって、（ａ）前記非天然Ｉｇ結合タンパク質を得るために、結合タンパク質の発現のための適切な条件下で、第７態様の宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）任意選択的に、前記非天然Ｉｇ結合タンパク質を単離するステップとを備えることを特徴とする方法に関する。
【０１００】
また、本発明は、第９態様の方法によって産生される非天然Ｉｇ結合タンパク質も包含する。原核生物または真核生物の宿主を培養するための適切な条件は、当業者に良く知られている。本発明のＩｇ結合分子は、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術のような多くの従来の良く知られた技術のいずれかによって、または市販の自動合成器によって準備することができる。一方、それらは、従来の組換え技術単独で、または従来の合成技術と組み合わせて調製することもできる。本発明によるコンジュゲートは、化学的方法、例えばリジンまたはシステイン・ベースの化学反応により、または従来の組換え技術により、当業者に知られているように、化合物を組み合わせることによって得ることができる。本明細書で使用される「コンジュゲート」という用語は、第２タンパク質または非タンパク質性部分などの他の物質に化学的に結合した少なくとも第１タンパク質を含む分子、またはそのようなタンパク質から本質的になる分子に関する。
【０１０１】
本発明の一実施形態は、上述した本発明に係るＩｇ結合タンパク質の調製方法に関するもので、この方法は、（ａ）上述した結合タンパク質をコードする核酸を準備するステップと、（ｂ）前記核酸を発現ベクターに導入するステップと、（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと、（ｄ）宿主細胞を培養するステップと、（ｅ）Ｉｇ結合タンパク質が発現される培養条件に宿主細胞を供し、それにより（ｅ）上記のような結合タンパク質を生成するステップと、任意選択的に（ｆ）ステップ（ｅ）で産生されたタンパク質を単離するステップと、（ｇ）任意選択的に、タンパク質を上記のように固体マトリックスに結合させるステップとを備える。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態では、非天然Ｉｇ結合タンパク質の生成は、無細胞インビトロ転写／翻訳によって行われる。
【０１０３】
［実施例］
以下の実施例は、本発明のさらなる説明のために提供されるものである。しかしながら、本発明はそれらに限定されるものではなく、以下の実施例は上記記載に基づく本発明の実行可能性を示すに過ぎない。本発明の完全な開示のために、本出願に引用される文献も参照される。それら文献は、引用により本出願に完全に組み込まれるものである。
【０１０４】
実施例１．シャッフリングプロセスによる本発明のＩｇＧ結合タンパク質の生成
本発明のＩｇＧ結合タンパク質を、天然に存在するプロテインＡドメインおよびプロテインＡ誘導体（例えば、Ｚドメインまたは任意の天然に存在するドメインと少なくとも９０％の同一性を有する他のドメイン）のシャッフリングプロセスによって最初に生成した。シャッフリングプロセスは、ａ）５つの天然に存在するプロテインＡドメインＥ、Ｂ、Ｄ、ＡおよびＣおよびプロテインＡ誘導体ドメインＺの配列を提供するステップと、ｂ）前記配列のアライメントを行うステップと、ｃ）インシリコで統計的フラグメンテーションを行って、天然に存在するＩｇ結合ドメインの位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｋ３５、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｐ５７が維持されるという条件で組み換えが可能な配列を特定するステップと、ｄ）様々なフラグメントの新しい人工的な配列を構築して、モザイク生成物、すなわち新規なアミノ酸配列を生成するステップとを備えるものであった。
【０１０５】
モザイク生成物中のアミノ酸の相対位置を出発配列に対して維持した。少なくとも位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｋ３５、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｐ５７は、「シャッフルされた」配列と全ての天然に存在するプロテインＡドメインとで同一である。再構築された「シャッフルされた」タンパク質の全体のアミノ酸配列は、天然に存在するプロテインＡドメインまたはドメインＺのいずれかの全体のアミノ酸配列と８５％以上同一ではないという点で人工的である。例えば、天然に存在するプロテインＡドメインまたはドメインＺと比較したＩｇ結合タンパク質の同一性を表１に示す。
【０１０６】
表１．天然に存在するプロテインＡドメインに対するＩｇＧ結合タンパク質の同一性
「Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｚ」は、天然に存在するプロテインＡドメインおよびドメインＺ（配列番号３−８）を指している。数字「９−３０」は、本発明のＩｇ結合タンパク質の例を示している。例えば、数字「９−２４」は対応する配列番号９−２４を示し、「２５」は配列番号２６を示し、「２６」は配列番号２７を示し、「２７」は配列番号２８を示し、「２８」は配列番号３０を示している。
【０１０７】
【表１】
2018523994.tif 000004
【０１０８】
「シャッフルされた」ＩｇＧ結合タンパク質ならびに天然に存在するプロテインＡドメインおよび誘導体（例えば、ドメインＣ、ドメインＢ、ドメインＡ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＺ）の遺伝子を当業者に知られている標準的な方法で合成し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡシークエンシングを用いて、挿入断片の正しい配列を確認した。
【０１０９】
２以上の結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質を生成するために、２，４または６の同一のＩｇＧ結合ドメイン（配列番号１４）を、アミノ酸リンカー（配列番号４１および配列番号４２）を介して遺伝的に融合させた。融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４５−４７に示す。
【０１１０】
特定の膜付着および精製のために、Ｃ末端Ｃｙｓ（ＡＳＰＡＰＳＡＰＳＡＣ；配列番号３９）およびｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号４４）を有する短いペプチドリンカーを、Ｉｇ結合タンパク質のＣ末端（例えば、配列番号５０および配列番号５１を参照）に付加した。
【０１１１】
実施例２．ＩｇＧ結合タンパク質の発現
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）コンピテント細胞を、ＩｇＧ結合タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。細胞を選択的寒天プレート（カナマイシン）上に分散させ、３７℃で一晩インキュベートした。前培養物を単一コロニーから１００ｍｌのスーパーリッチ培地（改変Ｈ１５培地２％グルコース、５％酵母エキス、１％カザミノ酸、０．７６％グリセロール、１％トルラ酵母ＲＮＡ、２５０ｍＭのＭＯＰＳ、２０２ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍｇ／ＬのＲＮａｓｅ  Ａ、ｐＨ７．４、消泡剤ＳＥ１５）に接種し、ラクトースおよび消泡剤を含まない１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したバッフル付き１リットル三角フラスコ中で、従来のオービタルシェーカーを用いて１６０ｒｐｍ、３７℃で１６時間培養した。ＯＤ６００リードアウトは６−１２の範囲内とする必要がある。主培養物を、グリセロール、グルコース、ラクトース、消泡剤および１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１Ｌの厚壁三角フラスコ中の４００ｍｌのスーパーリッチ培地中で、０．５の調整された開始ＯＤ６００で前の一晩培養物から接種した。培養物を共鳴音響ミキサ（ＲＡＭｂｉｏ）に移し、３７℃で２０×ｇでインキュベートした。Ｏｘｙ−Ｐｕｍｐストッパによってエアレーションを促進した。グルコースを代謝させ、続いてラクトースを細胞に入れることにより、組み換えタンパク質発現を誘導した。予め設定された時点で、ＯＤ６００を測定し、５／ＯＤ６００に調整した試料を取り出し、ペレット化し、−２０℃で凍結させた。細胞を約２４時間一晩増殖させて、約４５−６０の最終的なＯＤ６００に達した。バイオマスを回収するために、細胞を１６０００×ｇで１０分間、２０℃で遠心分離した。ペレットを秤量し（湿重量）、上清中のｐＨを測定した。処理前に細胞を−２０℃で保存した。
【０１１２】
実施例３．ＩｇＧ結合タンパク質の発現および可溶性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
発酵中に採取した試料を３００μｌ抽出緩衝液（０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、０．５×のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、７．５ｍＭのＭｇＳＣ４、４０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加したＰＢＳ）に再懸濁し、サーモミキサで７００ｒｐｍ、室温で１５分間攪拌して可溶化した。可溶性タンパク質を、遠心分離（１６０００×ｇ、２分、室温）によって不溶性タンパク質から分離した。上清を回収し（可溶性画分）、ペレット（不溶性画分）を等量の尿素緩衝液（８Ｍ尿素、０．２Ｍトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に再懸濁した。可溶性画分および不溶性画分の両方から５０μｌを採取し、１２μｌ、５×の試料緩衝液および５μｌの０．５ＭのＤＴＴを添加した。試料を９５℃で５分間沸騰させた。最後に、これらの試料８μｌを、製造者の推奨に従って作動させたＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳゲルに加え、クマシーで染色した。すべてのＩｇＧ結合タンパク質の高レベル発現は、選択された期間内に最適化された条件下で見出された（図３）。全ての発現されたＩｇ結合性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば９５％以上まで可溶性であった。
【０１１３】
実施例４．ＩｇＧ結合タンパク質の精製
すべてのＩｇＧ結合タンパク質を、Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号４４）を有するＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分中で発現させた。細胞を超音波処理によって溶解させ、最初の精製工程をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−カラムで製造者の指示に従って行った。ジスルフィド形成を回避するために、緩衝液に１ｍＭのＤＴＴを補充した。溶出画分を、２０ｍＭのクエン酸ｐＨ６．０および１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。ピーク画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１４】
実施例５．ＩｇＧ結合タンパク質が（ＥＬＩＳＡによって測定される）高い親和性でＩｇＧに結合する
ＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ４に対するＩｇＧ結合タンパク質の親和性を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ４含有抗体（例えば、ＩｇＧ１のためにセツキシマブ、ＩｇＧ２のためにパニツムマブ、またはＩｇＧ４のためにナタリズマブ）を９６ウェルＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（２μｇ／ｍｌ）に固定化した。４℃で１６時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ  ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ウェルをＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックした（室温で２時間）。ネガティブコントロールは、ＢＳＡのみでブロックされたウェルであった。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温でＩｇＧ結合タンパク質（ＰＢＳＴ中）とともに１時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＩＢＡのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰ（１：１００００）とともに室温で１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの活性を、ＴＭＢ−Ｐｌｕｓ基質を添加することによって視覚化した。３０分後、０．２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。結果を表２に示す。
【０１１５】
表２．ＩｇＧ結合タンパク質の結合分析（セツキシマブによる結合分析；ＣＩＤ＝クローン識別番号）
【表２】
2018523994.tif 000005
【０１１６】
実施例６．ＩｇＧ結合タンパク質が（表面ピアスモン共鳴実験で測定される）高い親和性でＩｇＧに結合する
ＣＭ５センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＰＲランニング緩衝液で平衡化した。ＥＤＣおよびＮＨＳの混合物を通過させることによって表面露出したカルボキシル基を活性化して、反応性エステル基を得た。７００−１５００ＲＵのオンリガンドをフローセルに固定し、オフリガンドを別のフローセルに固定した。リガンド固定化後のエタノールアミンの注入は、非共有結合したＩｇ結合タンパク質を除去する。リガンド結合の際に、タンパク質分析物が表面に蓄積され、屈折率が増加した。この屈折率の変化をリアルタイムで測定し、時間に対する応答または共鳴単位（ＲＵ）としてプロットした。適切な流速（μｌ／分）による連続希釈法で分析物をチップに加えた。各実験の後、チップ表面を再生緩衝液で再生し、ランニング緩衝液で平衡化した。対照サンプルをマトリックスに適用した。前述したように、再生および再平衡化を行った。結合の調査は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用により実施し、データ評価は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデル（ＲＩ＝０）を使用して、製造業者によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアによって行った。評価した解離定数（ＫＤ）をオフターゲットに対して標準化した。結果を表３に示す。
【０１１７】
表３．ＩｇＧ結合タンパク質の結合分析（ｈＩｇＧ１−Ｆｃとの結合分析；ＣＩＤ＝クローン識別番号）
【表３】
2018523994.tif 000006
【０１１８】
実施例７．ＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリング樹脂へのＩｇＧ結合タンパク質の結合および固定化されたＩｇＧ結合タンパク質のアルカリ安定性
ＩｇＧ結合タンパク質を、製造元の説明書に従って、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）カップリング樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ；カタログ番号２０４０２）にカップリングさせた。カラムの樹脂床容量は３００μｌであった。カラムをカップリング緩衝液（５０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ、ｐＨ８．５）の４つの樹脂床容量で平衡化した。ＩｇＧ結合タンパク質をカラムに添加した（１−２ｍｌ／ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリング樹脂）。ＩｇＧ結合タンパク質を、Ｃ末端（ＡＳＰＡＰＳＡＰＳＡＣ；配列番号３９）でシステインを介してマトリックスに結合させた。カラムを１５分間混合し、混合せずにさらに３０分間インキュベートし、カップリング緩衝液で洗浄した。系の流量は０．５ｍｌ／分であった。３００μｌの５０ｍＭシステイン溶液をカラムに添加し、１５分間混合し、混合せずにさらに３０分間インキュベートし、１ＭのＮａＣｌで洗浄し、続いてＰＢＳで洗浄した。
【０１１９】
全ての画分について２８０ｎｍでの吸光度を測定した。すべてのＩｇＧ結合タンパク質は、マトリックスに共有結合され得るものであり、図６は、ＩｇＧ結合タンパク質１４８４７０（図６Ａ）および１４８４６０（図６Ｂ）のＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリング樹脂マトリックスへのカップリングを例示的に示している。
【０１２０】
セツキシマブを、共有結合したＩｇＧ結合タンパク質を有するＳｕｌｆｏＬｉｎｋ樹脂カラムに飽和量（５ｍｇ；１ｍｇ／ｍｌ樹脂）で適用した。マトリックスを１００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ２．５で洗浄して、固定化したＩｇＧ結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出させた。Ｉｇ結合タンパク質の結合活性（静的結合能）を判定するために、溶出したＩｇＧの濃度を分光学的に測定した。溶出画分を２８０ｎｍの吸光度で分析した。固定化したタンパク質のＩｇＧ結合活性を、室温で２０、４０または８０分間、０．５ＭのＮａＯＨでインキュベートする前後で分析した。ＮａＯＨ処理前の固定化タンパク質のＩｇＧ結合活性を１００％と定義した。タンパク質のＩｇＧ結合活性を、天然に存在するドメインＣ、Ｂ、Ａ、Ｄ、ＥまたはドメインＺの活性と比較した。
【０１２１】
図８は、ＩｇＧ結合タンパク質１４８４６２（図中では「１３」と称する）、１４８４６３（図中では「１４」と称する）、１４８４７２（図中では「２３」と称する）および天然に存在するプロテインＡドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣおよびドメインＺのＩｇＧ結合活性を示している。ＩｇＧ結合活性は、０．５ＭのＮａＯＨで８０分間インキュベートした後に示される。本発明のＩｇＧ結合タンパク質は、アルカリ処理後にセツキシマブに対して高い結合活性を示している。
【０１２２】
実施例８．エポキシ活性化マトリックスに結合したＩｇＧ結合タンパク質の苛性安定性
精製ＩｇＧ結合タンパク質を、製造者の指示（カップリング条件：ｐＨ９．０で一晩、エタノールアミンで５時間ブロッキング）に従って、エポキシ活性化マトリックス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ、ＧＥ；カタログ番号１７−０４８０−０１）にカップリングさせた。セツキシマブをＩｇＧサンプル（５ｍｇ；１ｍｇ／ｍｌマトリックス）として使用した。セツキシマブを、固定化ＩｇＧ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄して、固定化ＩｇＧ結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出させた。Ｉｇ結合タンパク質の結合活性（静的結合能）を測定するために、溶出したＩｇＧの濃度を２８０ｎｍで分光学的に測定した。カラムを、室温（２２℃±３℃）で０．５ＭのＮａＯＨで６時間インキュベートした。固定化したタンパク質のＩｇＧ結合活性を、０．５ＭのＮａＯＨで６時間インキュベートする前後で分析した。ＮａＯＨ処理前の固定化タンパク質のＩｇＧ結合活性を１００％と定義した。
【０１２３】
図９は、例えばＩｇＧ結合タンパク質１５４２５４（図中では「配列番号２６」と称する）、１５４２５５（図中では「配列番号２７」と称する）、１５４２５６（図中では「配列番号２８」と称する）および１５４２５７（図中では「配列番号３０」と称する）の活性は、ＩｇＧ結合タンパク質１４８４６３（「配列番号１４」）の活性と比較して高く、よって任意の天然に存在するプロテインＡドメインよりも高かったことを示している。すべての固定したＩｇＧ結合タンパク質は、０．５ＭのＮａＯＨで６時間インキュベートした後、元のＩｇＧ結合活性の少なくとも３５％、最大５０％を示した。図１０は、０、２、４、６時間のアルカリ処理後にエポキシ活性化樹脂に固定化された２、４または６つのＩｇＧ結合ドメインからなる多量体ＩｇＧ結合タンパク質のＩｇ結合活性（能力）が、１つのＩｇＧ結合ドメインからなる単量体ＩｇＧ結合タンパク質の活性（能力）に匹敵することを示している。
【０１２４】
［配列表フリーテキスト情報］
配列番号１    非天然Ｉｇ結合ドメインの一般配列
配列番号２    非天然Ｉｇ結合ドメインの一般配列
配列番号３    黄色ブドウ球菌ドメインＥ（ＣＩＤ  １４８４７３）
配列番号４    黄色ブドウ球菌ドメインＤ（ＣＩＤ  １４８４７４）
配列番号５    黄色ブドウ球菌ドメインＡ（ＣＩＤ  １４８４７５）
配列番号６    黄色ブドウ球菌ドメインＢ（ＣＩＤ  １４８４７６）
配列番号７    黄色ブドウ球菌ドメインＣ（ＣＩＤ  １４８４７７）
配列番号８    プロテインＡのドメインＺ（ＣＩＤ  １４８４７８）
配列番号９    シャッフル配列ＩＢ９，ＣＩＤ  １４８４５８
配列番号１０  シャッフル配列ＩＢ１０，ＣＩＤ  １４８４５９
配列番号１１  シャッフル配列ＩＢ１１，ＣＩＤ  １４８４６０
配列番号１２  シャッフル配列ＩＢ１２，ＣＩＤ  １４８４６１
配列番号１３  シャッフル配列ＩＢ１３，ＣＩＤ  １４８４６２  
配列番号１４  シャッフル配列ＩＢ１４，ＣＩＤ  １４８４６３
配列番号１５  シャッフル配列ＩＢ１５，ＣＩＤ  １４８４６４
配列番号１６  シャッフル配列ＩＢ１６，ＣＩＤ  １４８４６５
配列番号１７  シャッフル配列ＩＢ１７，ＣＩＤ  １４８４６６
配列番号１８  シャッフル配列ＩＢ１８，ＣＩＤ  １４８４６７
配列番号１９  シャッフル配列ＩＢ１９，ＣＩＤ  １４８４６８
配列番号２０  シャッフル配列ＩＢ２０，ＣＩＤ  １４８４６９
配列番号２１  シャッフル配列ＩＢ２１，ＣＩＤ  １４８４７０
配列番号２２  シャッフル配列ＩＢ２２，ＣＩＤ  １４８４７１
配列番号２３  シャッフル配列ＩＢ２３，ＣＩＤ  １４８４７２
配列番号２４  シャッフル配列ＩＢ２４，ＣＩＤ  １５４２５３
配列番号２５  シャッフル配列ＩＢ１５ｂ
配列番号２６  シャッフル配列ＩＢ２５，ＣＩＤ  １５４２５４
配列番号２７  シャッフル配列ＩＢ２６，ＣＩＤ  １５４２５５
配列番号２８  シャッフル配列ＩＢ２７，ＣＩＤ  １５４２５６
配列番号２９  シャッフル配列ＩＢ２９
配列番号３０  シャッフル配列ＩＢ２８，ＣＩＤ  １５４２５７
配列番号３１  リンカー
配列番号３２  リンカー
配列番号３３  リンカー
配列番号３４  リンカー
配列番号３５  リンカー
配列番号３６  リンカー
配列番号３７  リンカー
配列番号３８  例えばＩＢ９−ＩＢ２８についての非天然Ｉｇ結合ドメインの一般配列
配列番号３９  Ｃ末端結合配列（ＡＰＳ１０／Ｃ）
配列番号４０  Ｃ末端結合配列（ＡＰＳ３０／Ｃ）
配列番号４１  ＡＰＳ３０リンカー
配列番号４２  ＡＰＳ３０リンカー
配列番号４３  ＡＰＳ１０リンカー
配列番号４４  Ｓｔｒｅｐｔａｇ
配列番号４５  ＩＢ１４二量体，ＣＩＤ  １５０５７０
配列番号４６  ＩＢ１４四量体，ＣＩＤ  １５０６６３
配列番号４７  ＩＢ１４六量体，ＣＩＤ  １５０７７２
配列番号４８  例えばＩＢ２４−ＩＢ２８についての一般配列
配列番号４９  例えばＩＢ９−ＩＢ２３についての一般配列
配列番号５０  Ｃ末端結合配列およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇを有する配列番号１４
配列番号５１  Ｃ末端結合配列およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇを有する配列番号２８
【図１Ａ】
2018523994.tif 000008
【図１Ｂ】
2018523994.tif 000009
【図２】
2018523994.tif 000010
【図３Ａ】
2018523994.tif 000011
【図３Ｂ】
2018523994.tif 000012
【図４Ａ】
2018523994.tif 000013
【図４Ｂ】
2018523994.tif 000014
【図５】
2018523994.tif 000015
【図６】
2018523994.tif 000016
【図７Ａ】
2018523994.tif 000017
【図７Ｂ】
2018523994.tif 000018
【図８】
2018523994.tif 000019
【図９】
2018523994.tif 000020
【図１０】
2018523994.tif 000021
【配列表】
2018523994000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月25日(2017.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018523994000001.app
【国際調査報告】
2018523994.tif 000022
2018523994.tif 000023