(57)【要約】  本発明は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、抗炎症、新生血管再生、内在性幹細胞の可動及び増殖などの役割であって、虚血性損傷部位を減少させるだけではなく、神経機能を回復させるので、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患との治療剤として用いられうる。特に、本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、多回投与する場合、行動改善効果が非常に優れる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物。
【請求項２】
前記神経前駆細胞は、全分化能（万能）幹細胞から分化されたことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記神経前駆細胞は、全分化能（万能）幹細胞から分化された神経ロゼット段階前後の神経前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記全分化能（万能）幹細胞は、胚芽幹細胞、ｉＰＳＣｓ(ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ)、胚芽生殖細胞、または胚芽腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陰性神経前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記分泌タンパク質は、神経前駆細胞を細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞培養液は、神経前駆細胞をＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）とｂＦＧＦとが含有された無血清細胞培養培地で培養した後、細胞を除去して収得したことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物：
アグリン、アネキシンＡ５、ＢＳＧ、ピグリカン、カルポニン−３、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−１、コラーゲンα−２、クリン−３、デストリン、ジストログリカン、エフリン−Ｂ２、エクスポーチン−２、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インポーチン−９、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン２、プレイオトロフィン、プロフィリン−１、タンパク質ＤＪ−１、ラジキシン、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１、タリン−１、テスチカン、チモポイエチン、トランスゲリン−３、及びビメンチン。
【請求項１０】
前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物：
アグリン、アネキシンＡ２、アトラクチン、ピグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ、ダームシジン、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２、エズリン、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８、ニドゲン−１、パラチモシン、プロフィリン−２、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン、タリン−１、チモシンβ４、ＴＧＦＢＩ、トランスゲリン、及びビメンチン。
【請求項１１】
前記虚血性疾患は、虚血性脳血管疾患、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、及び四肢末端部虚血性疾患で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び脊髄損傷で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物は、１回投与用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物は、多回投与用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の治療学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む組成物；を対象に投与する段階を含む虚血性疾患または神経炎症疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ；ＮＰＣ）の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、その多分化能によって、多様な疾患の有望な治療候補物質として見なされる。例えば、間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）は、容易に収得及び分離が可能であり、血管新生を促進し、炎症を抑制する多くの栄養因子を分泌する（非特許文献１）。ＭＳＣのこのような特性は、ヒト疾病の治療に適用するための研究から考慮された。最近の研究によれば、ＭＳＣは、多くの動物モデル及びヒト臨床治療（非特許文献２、非特許文献３）で組織回復に寄与すると明かになった。いくつかの報告が、インビトロでＭＳＣがニューロン（非特許文献４）及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）（非特許文献３）を含む神経系列への分化能を言及しているが、これら分化された細胞が、インビボで如何なる機能を行うか否かの明確な証拠はない。ＭＳＣの有益な効果は、細胞代替よりは傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）機作によって誘導されると見られ、これにより、ＭＳＣの移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、長期間持続する改善ではない、一時的であり、限定された効果を有すると見られる（非特許文献５）。
【０００３】
一方、胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＥＳＣｓ）は、３個の胚芽生殖葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒ）から由来するあらゆる特定細胞の形態で分化し、強力な自己再生能力を有すると知られた。注目すべきことは、ＥＳＣから由来する神経前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ；ＮＰＣｓ）は、優先的にニューロン、星状細胞及び希少突起グリア細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）を含む神経系の特定形態の細胞に分化するために、脳組織の回復のための細胞源（ｃｅｌｌ  ｓｏｕｒｃｅ）と見なされるということである。これら細胞は、また内生神経前駆細胞の生存及び増殖を促進するいくつかの因子を分泌する（非特許文献６）。しかし、ＥＳＣから分化された神経前駆細胞（ＮＰＣ）または神経前駆細胞の培養液が、如何に疾患モデルで移植後、機能の改善に寄与するかは依然として知られていない。
【０００４】
逆分化幹細胞とは、全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を保有しない体細胞に遺伝子導入／転写因子導入、化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ）処理、成長因子処理などの多様な方式を通じて人為的な逆分化過程を通じて全分化能を有するように誘導された細胞を称する言葉であって、誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ；ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）とも称する（非特許文献７）。これら細胞は、胚芽幹細胞と比べる時、細胞の形態、培養方式、増殖速度、遺伝子発現と染色体変異態様、全分化能、免疫欠乏マウスでのテラトーマ形成能などで非常に高い類似性を示している。この誘導万能幹細胞の分化能は、胚芽幹細胞と類似しているが、これらから分化されたＮＰＣあるいはＮＰＣの培養液が、如何に疾患モデルで移植後、機能の改善に寄与するかはよく知られていない。
【０００５】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．，＆  Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｅ．（２００６）．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９８，１０７６−１０８４。
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｋａｔａｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｒｏｋｅ  ｉｎ  ｆｅｍａｌｅ  ｒａｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３，７７８−７８６。
【非特許文献３】Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．，＆  Ｐｈｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．（１９９９）．Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｇｒａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，ａｎｄ  ｔｈｅｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９６，１０７１１−１０７１６。
【非特許文献４】Ｂａｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｄ．，Ｊ．，＆  Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｊ．（２０１１）．Ｎｅｕｒｏｎ−ｌｉｋｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５２，４０１−４１２。
【非特許文献５】Ｃｈｏ，Ｓ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｒ．，Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｂａｒｒｏｗ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ，１８，１３５９−１３６８。
【非特許文献６】Ｃａｐｏｎｅ，Ｃ．，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ，Ｓ．，Ｆｕｍａｇａｌｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｅｒｔ  ａ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．ＰＬｏＳＯｎｅ，７，ｅ３７３。
【非特許文献７】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．，Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、虚血性疾患と神経炎症疾患との根本的な治療方法を開発するために研究努力してきた。その結果、幹細胞移植とは異なる接近方式として、神経前駆細胞（ＮＰＣ）分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）の病変部位への投与を通じて虚血性損傷部位を減少させ、神経機能を回復させることによって、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患及び退行性神経系疾患とを効果的に治療することができるということを確認することによって、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、虚血性疾患または神経炎症疾患の予防または治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様によれば、本発明は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。
【００１２】
本発明者らは、虚血性疾患と神経炎症疾患との根本的な治療方法を開発するために研究努力してきた。その結果、幹細胞移植とは異なる接近方式として、神経前駆細胞分泌タンパク質の病変部位への投与を通じて虚血性損傷部位を減少させ、神経機能を回復させることによって、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患とを効果的に治療することができるということを確認した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。
（ｉｉ）本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、抗炎症、新生血管再生、内在性幹細胞の可動及び増殖などの役割であって、虚血性損傷部位を減少させるだけではなく、神経機能を回復させるので、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患との治療剤として用いられうる。
（ｉｉｉ）また、本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、多回投与する場合、一回性投与よりも行動改善効果が非常に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＢＳ対照群、培地対照群及びヒト胚芽幹細胞（ＥＳＣ）由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質処理群の虚血性病変部位のサイズを示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図２】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の体重変化を示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図３ａ】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図３ａは、ビーム均衡検査の結果を示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図３ｂ】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図３ｂは、捕捉可能牽引検査の結果を示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図３ｃ】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図３ｃは、フットフォールト検査の結果を示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図３ｄ】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図３ｄは、単位時間当たり行動の活発さを示すラインクロス（ｌｉｎｅ  ｃｒｏｓｓ）の結果を示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図４】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の総合的な行動神経改善効果（ｍＮＳＳ）の分析結果を示す。＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１。
【図５】ヒト誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の多回投与の効果を確認するための実験スケジュールを示す。ＢｒｄＵは、神経前駆細胞由来分泌タンパク質による脳組織に存在する内在性神経幹細胞（ｅｎｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｅｕｒｌａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の可動（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を確認するために注入した。
【図６ａ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ａは、ｍＮＳＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｉｂｉａｒｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｂ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｂは、上体姿勢（ｔｏｒｓｏ  ｔｗｉｓｔｉｎｇ）検査（左側）を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｃ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｃは、上体姿勢検査（右側）を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｄ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｄは、フットフォールト検査  （ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ  ｔｅｓｔ）を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｅ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｅは、ラインクロス検査を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｆ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｆは、Ｒｅａｒｉｎｇ検査を示す。Ｒｅａｒｉｎｇとは、実験動物が後足で立って前足をあげている姿勢を言うものであって、正常な動物で好奇心を探索する時の一般的な行動であり、単位時間当たり回数で表示される。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｇ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｇは、ビーム均衡（ｂｅａｍ  ｂａｌａｎｃｅ）検査を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｈ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｈは、捕捉可能牽引検査（Ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｅ  Ｔｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｉ】全分化能万能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。図６ｉは、対照群及び分泌タンパク質処理群の体重変化を示す。を示す。白色：対照群、黒色：培地対照群、黄色：分泌タンパク質１回処理群（セクレトーム−Ｓ）、赤色：分泌タンパク質４回処理群（セクレトーム−Ｍ）、＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】ＰＢＳ対照群、培地対照群、分泌タンパク質単回処理群（セクレトーム−Ｓ）及び分泌タンパク質多回処理群（セクレトーム−Ｍ）の虚血性病変部位のサイズを示す。
【図８ａ】神経前駆細胞（ＮＰＣ）−由来分泌タンパク質の繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）が有意にＥＤ−１陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー：２００μｍ、＊Ｐ＜０．００１。
【図８ｂ】神経前駆細胞（ＮＰＣ）−由来分泌タンパク質の繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）が有意にＥＤ−１陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー：２００μｍ、＊Ｐ＜０．００１。
【図９ａ】神経前駆細胞（ＮＰＣ）−由来分泌タンパク質の繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）が有意にＧＦＡＰ陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー：２００μｍ、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９ｂ】神経前駆細胞（ＮＰＣ）−由来分泌タンパク質の繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）が有意にＧＦＡＰ陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー：２００μｍ、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０】神経前駆細胞（ＮＰＣ）−由来分泌タンパク質の繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）によるラット脳組織での内在性神経幹細胞の可動を示す。スケールバー：５００μｍ。
【図１１】神経前駆細胞（ＮＰＣ）−由来分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にα−ＳＭＡ陽性血管の数を増加させるということを示す。＊Ｐ＜０．００５。
【図１２】脊髄損傷モデルでＢＢＢ  ｔｅｓｔを８週以上実施して、無処理対照群と比較した時、分泌タンパク質注入群で優れた行動回復が表われるということを示す（Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使われた用語、“神経前駆細胞の分泌タンパク質”は、神経前駆細胞の培養時に、神経前駆細胞から外部（培養培地）に分泌されたタンパク質の集合体を意味する。
【００１６】
本発明の一具現例によれば、本発明の分泌タンパク質の製造に用いられる神経前駆細胞は、全分化能（万能）幹細胞から分化されたものである。
【００１７】
本明細書で使われた用語、“幹細胞”は、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前段階の未分化細胞を総称し、特定の分化刺激（環境）によって特定細胞に分化することができる能力を有している。幹細胞は、細胞分裂が止められた分化された細胞とは異なって、細胞分裂によって自身と同一の細胞を生産（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）し、分化刺激が加えられれば、特定細胞に分化され、このような分化は、他の環境または他の分化刺激によって多様な細胞にも分化されうる分化の柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。
【００１８】
本発明で用いられる幹細胞は、インビトロで無限定増殖され、３種のあらゆる胚芽層（外胚葉、中胚葉と内胚葉）から由来の多様な細胞に分化されうる全分化能（万能）幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）である。より具体的に、前記全分化能（万能）幹細胞は、胚芽幹細胞（ＥＳＣｓ）、誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚芽生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）、または胚芽腫瘍細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）である。
【００１９】
胚芽幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から由来され、胚芽生殖細胞は、５〜１０週齢の生殖隆起（ｇｏｎａｄａｌ  ｒｉｄｇｅ）の原始生殖細胞から由来される。
【００２０】
誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣｓ）は、非全分化能細胞（例えば、体細胞）から全能性を付与する特定の遺伝子を挿入して人工的に由来の全分化能幹細胞の１つである。誘導万能幹細胞は、幹細胞遺伝子及びタンパク質発現、染色体メチル化、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）、胚芽体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を有するという面で全分化能幹細胞（例えば、胚芽幹細胞）と同一であると見なされる。
【００２１】
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、全分化能（万能）幹細胞（例えば、胚芽幹細胞または誘導万能幹細胞）を神経系列細胞に分化誘導して形成された神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ  ｒｏｓｅｔｔｅ）段階前後の神経前駆細胞である。
【００２２】
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ｐｏｌｙ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−陽性神経前駆細胞（ＮＰＣ）である。
【００２３】
本発明の他の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陰性神経前駆細胞（ＮＰＣ）である。
【００２４】
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性あるいは陰性神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、全分化能幹細胞から神経分化刺激を通じて分化された神経ロゼットで抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を用いて分離される。前記用語、“神経ロゼット”は、ヒト胚芽幹細胞の神経分化過程の初期段階の神経幹細胞を言い、神経ロゼットは、円柱型の放射状の形態を有する。前記神経ロゼットは、Ｐａｘ６及びＳｏｘ１のような初期神経外胚葉（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）マーカーを発現する細胞で構成され、多様なニューロン細胞及び神経膠細胞に分化することができる。
【００２５】
前記神経分化刺激は、当業者に通常実施される方法、例えば、無血清培地（Ｔｒｏｐｅｐｅ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｆａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｎｅｕｒｏｎ．３０：６５７８（２００１））、ＦＧＦｓ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、Ｗｎｔ、及びＲＡ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）のようなモルフォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｓ）の処理（Ｙｉｎｇ  ＱＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１８３１８６（２００３））によって分化することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
前記抗体としては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用することができる。ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する抗体は、当業者に通常実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６号）またはファージ抗体ライブラリー方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１−５９７（１９９１））によって製造可能である。抗体製造に対する一般的な過程は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｚｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１に詳細に記載されており、前記文献は、本明細書に参考として組み込まれる。例えば、単一クローン抗体を生産するハイブリードマ細胞の製造は、不死滅化細胞株を抗体生産リンパ球と融合させてなされ、この過程に必要な技術は、当業者によく知られており、容易に実施することができる。ポリクローナル抗体は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗原を適した動物に注射し、この動物から抗血清を収集した後、公知の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）技術を用いて抗血清から抗体を分離して得られる。
【００２７】
本明細書において、ＰＳＡ−ＮＣＡＭを言及しながら使われる用語“抗体”は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する特異抗体であって、ＰＳＡ−ＮＣＡＭタンパク質に対して特異的に結合し、完全な抗体の形態だけではなく、抗体分子の抗原結合断片を含む。完全な抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されており、抗体分子の抗原結合断片とは、抗原結合機能を保有している断片であって、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖを含む。
【００２８】
抗体を用いたＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分離のために、蛍光−活性細胞分類機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒｓ；ＦＡＣＳ）、磁性活性細胞分類機（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ；ＭＡＣＳ）、及び補体媒介性溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）方法を利用できる。
【００２９】
本発明の一具現例によれば、前記分泌タンパク質は、神経前駆細胞を動物細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態である。すなわち、本発明の組成物には、神経前駆細胞の分泌タンパク質が含有されている神経前駆細胞の培養液が含まれうるものである。
【００３０】
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）の細胞培養液は、神経前駆細胞をＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）及びｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）が含有された無血清動物細胞培養培地で培養した後、細胞を除去して収得することができる。前記培養には、継代培養した神経前駆細胞、例えば、Ｎ２、Ｂ−２７及び／またはＧｅｍ２１が添加されたｂＦＧＦ−含有細胞培養培地で４継代以上繰り返し培養して得た神経前駆細胞が用いられうる。
【００３１】
前記培養培地での細胞の除去は、遠心分離、濾過のような通常の細胞分離方法を使用して実施することができる。
【００３２】
前記細胞培養培地としては、神経前駆細胞の培養時に用いられる通常の培地を制限なしに使用し、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用することができる。
【００３３】
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、ヒト誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化されたものであり、この神経前駆細胞の分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含む：
アグリン（Ａｇｒｉｎ）、アネキシンＡ５（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ５）、ＢＳＧ（Ｂａｓｉｇｉｎ）、ピグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、カルポニン−３（Ｃａｌｐｏｎｉｎ−３）、コアクトシン−類似タンパク質（Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、コフィリン−１（Ｃｏｆｉｌｉｎ−１）、コラーゲンα−２、クリン−３（Ｃｕｌｌｉｎ−３）、デストリン（Ｄｅｓｔｒｉｎ）、ジストログリカン（Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ）、エフリン−Ｂ２（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２）、エクスポーチン−２（Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−２）、エズリン（Ｅｚｒｉｎ）、フィブロネクチン、ファイブリン−１（Ｆｉｂｕｌｉｎ−１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ガレクチン−３結合タンパク質（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、グラニュリン（Ｇｒａｎｕｌｉｎｓ）、成長／分化因子１１（Ｇｒｏｗｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １１）、ハプトグロビン（Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）、ヘモペキシン（Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ）、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン（Ｈｏｒｎｅｒｉｎ）、インポーチン−９（Ｉｍｐｏｒｔｉｎ−９）、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｗｏｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ループスＬａタンパク質（Ｌｕｐｕｓ  Ｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、大食細胞移動抑制因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、モエシン（Ｍｏｅｓｉｎ）、ニューロピリン２（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  ２）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、プロフィリン−１（Ｐｒｏｆｉｌｉｎ−１）、タンパク質ＤＪ−１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤＪ−１）、ラジキシン（Ｒａｄｉｘｉｎ）、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１（Ｓｅｐｔｉｎ−１１）、タリン−１（Ｔａｌｉｎ−１）、テスチカン（Ｔｅｓｔｉｃａｎ）、チモポイエチン（Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トランスゲリン−３（Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ−３）、及びビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）。
【００３４】
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、ヒト胚芽幹細胞（ＥＳＣ）から分化されたものであり、この神経前駆細胞の分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含む：
アグリン、アネキシンＡ２（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ２）、アトラクチン（Ａｔｔｒａｃｔｉｎ）、ピグリカン、セルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ（Ｃｏｒｏｎｉｎ−１Ｘ）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｉｃｉｄｉｎ）、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−２）、エズリン、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８）、ニドゲン−１（Ｎｉｄｏｇｅｎ−１）、パラチモシン（Ｐａｒａｔｈｙｍｏｓｉｎ）、プロフィリン−２（Ｐｒｏｆｉｌｉｎ−２）、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン（Ｓｅｃｒｅｔｏｇｒａｎｉｎ）、タリン−１、チモシンβ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ−４）、ＴＧＦＢＩ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｗｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｇ−ｈ３）、トランスゲリン（Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）、及びビメンチン。
【００３５】
本明細書で使われた用語、“治療”は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、虚血性疾患または神経炎症疾患の症状の発展を抑制するか、それを除去または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体で虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物にもなり、あるいは他の抗虚血／抗炎症組成物と共に投与されて、これら疾患に対する治療補助剤として適用されることもある。これにより、本明細書において、用語“治療”または“治療剤”は、“治療補助”または“治療補助剤”の意味を含む。
【００３６】
本明細書で使われた用語、“虚血性疾患”は、血管損傷による血液漏水（ｂｌｏｏｄ  ｌｅａｋａｇｅ）、塞栓（ｅｍｂｏｌｉｓｍ）または梗塞（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）などによって血流量が減少して、血液供給が遮断された組織が壊死に至る疾患を言う。
【００３７】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物として治療可能な虚血性疾患は、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、四肢末端部虚血性疾患、及び虚血性脳血管疾患で構成された群から選択される。
【００３８】
本明細書で使われた用語、“虚血性心臓疾患”は、心臓に血液を供給する冠状動脈が損傷されるか、狭小または閉塞されて、心臓筋肉への血流が減少して招かれる疾患を意味する。より具体的には、本発明の組成物として治療可能な虚血性心臓疾患は、狭心症、心筋梗塞症及び心不全症で構成された群から選択される。
【００３９】
本明細書で使われた用語、“虚血性脳血管疾患”は、脳血管が損傷されるか、狭小または閉塞されて、これにより血流を供給されていない脳組織が損傷される疾患を意味する。より具体的には、前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中であり、前記虚血性脳卒中は、脳出血及び脳梗塞を含む。
【００４０】
本明細書で使われた用語、“神経炎症疾患”は、炎症反応による神経組織の損傷で招かれる疾患を意味し、より具体的には、炎症反応による神経損傷疾患及び退行性神経系疾患を意味する。
【００４１】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物として治療可能な神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び脊髄損傷で構成された群から選択される。本発明において、脊髄損傷は、炎症性脊髄損傷及び外傷性脊髄損傷をいずれも含む意味として使われる。
【００４２】
本発明の一例によれば、ヒトＥＳＣ−由来及びｉＰＳＣ−由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を脳卒中実験モデル（ｐＭＣＡｏモデル）に投与した場合、単回及び多回投与時に、ＰＢＳ群と比較して、いずれも有意にＥＤ−１陽性細胞及びＧＦＡＰ陽性細胞の減少を誘発した（図８ａないし図８ｂ及び図９ａないし図９ｂ参照）。すなわち、分泌タンパク質は、炎症反応を減少させ、微小グリア細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）を不活性化（減少）させ（図８ａないし図８ｂ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）を不活性化（減少）させた（図９ａないし図９ｂ）。
【００４３】
また、本発明の分泌タンパク質は、ＤＣＸ遺伝子によって発現されるダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）の発現を増加させ、陽性神経前駆細胞を増加させる（図１０参照）。ダブルコルチンは、ニューロン移動タンパク質（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。このような結果は、分泌タンパク質の投与によって脳組織で内在性神経幹細胞（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が可動されたということを示す。
【００４４】
本発明の分泌タンパク質は、α−ＳＭＡ陽性血管の頻度を増加させるが、これは、新生血管が増加したということを意味する（図１１参照）。
【００４５】
このような抗炎症、内在性幹細胞の可動及び新生血管の増加効果は、本発明の神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質が神経保護作用（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）機能があるということを示唆する。すなわち、本発明の神経前駆細胞由来分泌タンパク質は、前記のような効果を示すことによって、神経炎症疾患に対する治療を可能にする。
【００４６】
一方、本発明の全分化能幹細胞由来神経前駆細胞の分泌タンパク質は、脊髄損傷に対する治療効果を有する。本発明の一実施例によれば、脊髄損傷モデルを用いたＢＢＢ  ｔｅｓｔでは、全分化能幹細胞（ＥＳＣ）由来神経前駆細胞の分泌タンパク質注入群（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で優れた行動回復が表われた（図１２参照）。誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）は、幹細胞遺伝子及びタンパク質発現、染色体メチル化、倍加時間、胚芽体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を有するという面で全分化能幹細胞（例えば、胚芽幹細胞）と同一であると見なされるので、やはり前記のような脊髄損傷に対する治療効果を有する。
【００４７】
本明細書で使われた用語、“投与”または“投与する”は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接に投与することによって、対象体の体内で同量を形成させることを言う。したがって、用語“投与する”は、本発明の有効成分である神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質）を病変部位に注入することを含むので、用語“投与する”は、“注入する”のような意味として使われる。
【００４８】
組成物の“治療的有効量”は、組成物を投与しようとする対象体に治療的または予防的の効果を提供するのに十分な含量を意味し、これにより、“予防的有効量”を含む意味である。本明細書で使われた用語、“対象体”は、制限なしにヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、犬、猫、馬、牛、豚、猿、チンパンジー、ヒヒまたは赤毛猿を含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。
【００４９】
本発明の組成物が、薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、または培地などを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００５１】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与し、具体的には、非経口投与、より具体的には、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）投与、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）投与、傷（損傷）部位投与、脊髄あるいは髄腔内（Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与または血管内（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ）投与である。血管内投与である場合、動脈または静脈内に投与することができる。
【００５２】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物は、１回または多回として投与される。例えば、ヒトまたは他の動物に１回または分割された容量で多回投与される。単一投与組成物は、一定範囲の量またはその一部に該当する含量を含有して１日容量を満たすことができる。すなわち、本発明による治療組成物は、治療を必要とする患者に毎日単一または複数回投与する方式で投与されるか、一定時間（ｈｏｕｒｓ、ｄａｙ、ｗｅｅｋなど）の間隔を置いて単一または複数回投与する方式で投与される。
【００５４】
本明細書で使われた用語、“１回投与用”は、１回投与容量の分泌タンパク質を含む組成物または１回投与の形態で投与される組成物の用途を意味し、“多回投与用”は、多回投与容量の分泌タンパク質を含む組成物または多回投与の形態で投与される組成物の用途を意味する。
【００５５】
本発明の一例によれば、本発明の神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質を脳卒中動物モデルに１回投与する場合、虚血病変部位が減少し、行動改善効果を示した（図１ないし図４参照）。
【００５６】
一方、本発明の神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質を脳卒中動物モデルに多回投与する場合にも、やはり虚血病変部位が減少し、行動改善効果を示した（図６ａないし図６ｉ及び図７参照）。特に、単回投与群に比べて、多回投与群が行動改善により高い治療効果を発揮し（図６ａないし図６ｉ）、抗炎症効果もさらに高く表われ（図８ａないし図８ｂ及び図９ａないし図９ｂ参照）、分泌タンパク質の繰り返し投与が内在性神経幹細胞及び新生血管の数も有意に増加させるということを確認した。
【００５７】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量の形態で製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００５８】
本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の治療学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む組成物；を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む虚血性疾患または神経炎症疾患の予防または治療方法を提供する。
【００５９】
本発明の方法は、前述した本発明の組成物を利用するために、両者間の共通内容は、本明細書の過度な複雑性を回避するために、その記載を省略する。
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００６１】
実験材料及び実験方法
ヒトＥＳＣ−由来またはヒトｉＰＳＣ−由来ＮＰＣ及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性ＮＰＣ細胞の収得
ヒト細胞の使用は、医学研究倫理審議委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ、ＩＲＢ  Ｎｏ．４−２００８−０６４３）の承認を受けた。神経誘導のために、ｂＦＧＦがないｈＥＳＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でｈＥＳＣとｉＰＳＣとから由来の各胚芽体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ、ＥＢｓ）を５μＭ  ＤＭ（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び５〜１０μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む懸濁液で４日間培養し、以後、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦが補充された１ｘＮ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地でマトリゲルコーティングされたディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に５日間吸着させた（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ  ａｎｄ  ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｒｏｓｅｔｔｅｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ，７，ｅ３９７１５）。吸着されたＥＢコロニーの中心に表われた神経ロゼットをガラスピペットを用いて周辺の平らな細胞から気をつけて分離した。小さなロゼット塊をマトリゲルコーティングされたディッシュにシーディングし、１ｘＮ２、１ｘＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｅｅｍ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，２７０−２８１）。
【００６２】
８０〜９０％のコンフルエンシの拡張された神経ロゼットからなる神経前駆細胞（ＮＰＣ）を得た後、１０μＭ  Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ）に１時間露出させて、ＭＡＣＳ段階に入る前の細胞死が起こることを防止した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離した後に、細胞（〜１ｘ１０８細胞）を１％  ＢＳＡが含まれたＰＢＳでブロッキングし、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）が接合された抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体と共に４℃で１５分間培養した。集中的に洗浄した後、細胞懸濁液をＭＡＳＣ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）に入れ、カラムに残っている陽性−標識された細胞をチューブに溶離させた。分離されたＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞（ＮＰＣ）をＮ２Ｂ２７培地または２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦが追加されたＮＢＧ培地（１ｘＮ２、０．５ｘＢ２７及び０．５ｘＧ２１補充）（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）に４−５ｘ１０５細胞／ｃｍ２濃度で再びプレーティングした。培養培地は、毎日取り替え、細胞は、２〜３日ごとに継代培養した。
【００６３】
ヒト全分化能胚芽幹細胞（ＥＳＣ）由来−神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）で分泌タンパク質の分離
前記で収得したヒト全分化能胚芽幹細胞（ＥＳＣ）由来神経前駆細胞（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞）を基本培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）にＮ２（１００Ｘ−最終濃度１Ｘ）、Ｂ−２７（５０Ｘ−最終濃度０．５Ｘ）及びＧｅｍ２１（５０Ｘ−最終濃度０．５Ｘ）の血清除去補充剤を入れ、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加して、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コーティングされた６０ｍｍディッシュに４継代以上繰り返し培養して増幅した後、８〜１０個のディッシュに約９０％まで細胞が満ちるように培養した。培養液を除去した後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄し、無血清基本培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）にＩＴＳ（１００Ｘ−最終濃度１Ｘ）とｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）のみを添加して２４時間培養した。対照群は、細胞がないディッシュに同量の同じ組成の培養液（基本培養液にＩＴＳとｂＦＧＦとを同量で添加）を入れ、培養器で２４時間培養した後、回収したものを対照群として使用した。培養液をいずれも集めて遠心分離して（８００ｇで３０分）、細胞の破片などを除去した後、−７０℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使用した。
【００６４】
ヒト全分化能誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）−由来神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）で分泌タンパク質の分離
Ｐ０のヒト全分化能誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）をＤＭＥＭ／Ｆ−１２の基本培養液にＮ２、Ｂ−２７、Ｇｅｍ２１の血清除去補充剤を入れ、ｂＦＧＦを添加して、マトリゲルコーティングされた１００ｍｍディッシュにＰ４まで継代してディッシュに約９０％以上細胞が満ちるように培養した。以後、培養液を除去し、リン酸緩衝溶液で１回洗浄して、アキュターゼ酵素で細胞をディッシュから分離してＰＢＳで２〜３回洗浄した。そして、フェノールレッドが入っていないＤＭＥＭ基本培養液にＩＴＳのみを添加して、浮遊状態で２４時間培養した。培養液の対照群として、同量の基本培養液にＩＴＳを同量で添加して、培養器に２４時間培養したものを使用した。細胞が浮遊されている培養液をいずれも集めて遠心分離して（１０００ｇで２０分）、細胞の破片などを除去した後、−７０℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使用した。
【００６５】
細胞の培養条件は、次の通りである：
（１）細胞の基本培養条件−ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ｂＦＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ、Ｎ２  １００Ｘ−最終濃度１Ｘ、Ｂ−２７  ５０Ｘ−最終濃度０．５Ｘ、Ｇｅｍ２１  ５０Ｘ−最終濃度０．５Ｘ。
（２）分泌タンパク質獲得用培養条件−ＤＭＥＭ／ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ、ＩＴＳ  １００Ｘ−最終濃度１Ｘ。
【００６６】
脳卒中モデルの製作
局所脳虚血による神経細胞損傷に対して神経細胞保護効果を測定するために、応用された血管内縫合糸挿入法（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ  ｓｕｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用した。Ｚｉａ  Ｌｏｎｇａ（Ｚｅａ  Ｌｏｎｇａ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ．，１９８９，２０，８４−９１）が開発した方法である局所脳虚血モデルであって、他のモデルとは異なって、臨床的に類似しているという長所がある。このような理由で虚血再灌流（ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）に対する機転研究やさまざまな薬物の効果をスクリーニングするのに適したモデルである。局所脳虚血モデルは、前述した長所の以外にも、プローブを用いて中大脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ）を一時的に閉鎖して再灌流される損傷と、永久的に閉鎖して持続的な細胞損傷をいずれも観察することができるという長所も有している。脳血流量によって虚血性中心部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃｏｒｅ）と虚血性反陰影部位（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｅｎｕｍｂｒａ）との差が決定されるが、前者は、１５％未満であり、後者は、４０％未満である。１０〜２０分間閉鎖すれば、中心部で神経細胞が散発的に死んで、１時間程度誘発すれば、中心部位（ｃｏｒｅ）が生じながら脳組織損傷が大きくなり、２〜３時間誘発すれば、永久的に閉鎖されたものと類似した損傷を受ける。
【００６７】
一週間の順化後、呼吸麻酔器を使用して実験動物（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ、体重２５０〜３００ｇ）を麻酔させ、麻酔剤としてイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を使用した。まず、白ラットを８０％  Ｎ２Ｏと２０％  Ｏ２とが混ぜられた混合ガスに５％のイソフルランで全身麻酔を誘導した後、２〜２．５％で麻酔を保持した。脳卒中モデルの製作のために、白ラットの左側首の皮膚を切開した後、内側に総頚動脈（ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ）、外頚動脈（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ）及び内頚動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ）を剥離して導出した後、それぞれの血管をブラックシルク糸で少し縛って血流を遮断した。総頚動脈を半分程度切断し、切断面を通じてナイロン縫合糸の端部を焼灼してラウンディングして、０．４０ｍｍになるように製作した２５ｍｍの４−０ナイロンプローブ（ｐｒｏｂｅ）を挿入した。外頚動脈を通じて挿入したナイロンプローブを内頚動脈を経て中大脳動脈部位に入れて固定して、総頚動脈盆地で約１８〜２０ｍｍ程度挿入した後、中大脳動脈の起始部を塞いだ後、糸で固定して中大脳動脈を永久に閉鎖した後、皮膚切開部位再び縫合した後、麻酔から自然回復させた。
【００６８】
脳卒中モデルに脳動脈を通じる分泌タンパク質の注入及び行動実験：
ａ．ヒトＥＳＣ−由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質の注入
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を０．２ｍｇ／ｋｇ（体積５０μ）ほど動脈注射し、対照群には同じ体積の培養液あるいはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を投与した。分泌タンパク質液を注入した後、１４日間動物の状態を観察し、注入前１回、注入後４回にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。
【００６９】
ｂ．ヒトｉＰＳＣ−由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質の注入−多回投与
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を回当たり０．７ｍｇ／Ｋｇ（３００ｇラットの場合、２００μｇ）、注射量は、体積２００μｌほど静脈注射した（ｐｅｎｉｌｅ  ｖｅｉｎ投与）。対照群には、同じ体積の培養液を投与した。タンパク質分離でのように、分泌タンパク質の対照群に同量の基本培養液にＩＴＳを同量で添加して、培養器に２４時間培養した後、対照群として使用した。分泌タンパク質液を注入した後、１４日間動物の状態を観察し、注入前１回（０日）、注入後４回（３日、７日、１０日及び１４日）にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。
【００７０】
ｃ．行動実験
＜１＞  上体姿勢検査：実験動物の大脳皮質と線条体感覚と見なされる上体姿勢を試験するために、非対称運動行動を測定した。
＜２＞  ビーム均衡検査：実験動物が狭いビーム上で安定して均衡を取ることを通じて総前庭運動機能（ｇｒｏｓｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌｏｍｏｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を評価した。
＜３＞  フットフォールト検査：運動において、運動動き（ｍｏｔｏｒ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）の調整（協同）と統合（総合）とを検査する時に使用する実験方法であって、フットフォールト（Ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ）は、動物が前足や後足を元の場所に置かないか（ｍｉｓｐｌａｃｅ）、足が格子板バー（ｇｒｉｄ  ｂａｒ）の間に落ちる場合と定義し、フットフォールトは、正常な動物においては、特に対称的である。
＜４＞  捕捉可能牽引検査：検査のうち、捕捉可能如何は、実験動物が前足で水平方向のロープにぶら下げることができる能力を通じて測定した。捕捉可能牽引検査は、実験動物の筋肉強度を評価するために行われた。この検査は、従来に報告された方法で実施した。鉄棒（直径２ｃｍ、長さ１００ｃｍ）を水平にスポンジゴムパッド（厚さ７．５ｃｍ）の７０ｃｍ上に位置させた。実験動物の前足を鉄棒に位置させた後、放した。実験動物を５秒間鉄棒にぶら下げられるようにした。落ちるのにかかる時間と後足を鉄棒上に乗せるか否かを通じて、次のように点数を計算した：０点−実験動物が５秒間ぶら下げられ、後足を乗せる、１点−実験動物が５秒間ぶら下げられ、後足を乗せることができない、２点−実験動物が３〜４秒間ぶら下げられる、３点−実験動物が０〜２秒間ぶら下げられる。
＜５＞  オープンフィールド検査（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ）：一般的な歩行活動レベルを調べるのに使われる検査であって、動物の行動態様と特性とを直接観察して動物の活動性、情緒性及び行動パターンなどを測定した。
＜６＞  ｍＮＳＳ：前記の多様な検査を通じて得られた運動、感覚、均衡、反応及び情緒の検査値の総合成績で、点数を下記の基準によって計算した（一個体当たり点数を合算してｍＮＳＳを測定）。
−オープンフィールド検査（動物の情緒性、活動性、行動パターンなどを測定）
動きない：３
１〜２０回：２
２１〜３０回：１
３０回以上：０
−捕捉可能牽引検査（筋力測定）
０〜５秒：３
６〜１０秒：２
１１〜２０秒：１
２１秒以上：０
−ビーム均衡検査（均衡感覚測定）
０点：１＝安定的姿勢
２＝ビームの側面を握って多少搖れる程度
１点：３＝１本以上の足がビームから脱落する場合
４＝均衡を取ろうと努力するが、落ちる場合
２点：５＝均衡を取ることができず、ビームに逆にぶら下げられてから落ちる場合
６＝ビーム上で全く均衡を取ることができず、落ちる場合
−フットフォールト検査（運動協応能力）
０〜５回：０
６〜１０秒：１
１１〜２０秒：２
２１秒以上：３
−上体姿勢検査（非対称運動行動）
０回：２
１〜４回：１
５回以上：０
【００７１】
脳虚血誘発１４日後に、白ラットをゾレチルで麻酔した後、開胸した後、右心耳を切開して針を左心室に注入した後、ポンプを用いてリン酸緩衝溶液を心臓に灌流させて血液を除去した後、脳組織を摘出した。標本製作のための組織切片をブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を基準にパラフィンに包埋し、損傷された脳組織を確認するために、脳組織切片をヘマトキシリンに染色し、脱水し、固定し、スライドをデジタルカメラで撮影した後、コンピュータに移した。イメージ分析プログラム（ｉｍａｇｅ  Ｊ）を使用して脳梗塞の比率（％）を下記の数式１で計算した。
（数式１）
脳梗塞の比率（％）＝（正常左半球の面積−脳梗塞部位の正常組織の面積）／正常左半球の面積×１００
【００７２】
免疫組織化学的分析及び定量化
脳組織を２４時間４％  ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した。パラフィン断面の製作のために、累進エタノールで組織を脱水させ、パラフィンに包埋させた。パラフィン包埋された脳をミクロトーム上で５ｍｍの厚さ層に切断し、キシレンで１０分間脱パラピン化した後、累進アルコールで再水和した。切片に１０ｍＭ  クエン酸を１時間処理した後、ＰＢＳ及び０．５％  トリトンＸ−１００を含有する５％  ＢＳＡ溶液を添加した。以後、脳切片をＥＤ−１（Ａｂｃａｍ）（１：１００）、ダブルコルチン（ＤＣＸ；Ａｂｃａｍ、１：１００）、神経膠線維硝酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１００）及びα−平滑筋アクチン（ａＳＭＡ；Ａｂｃａｍ、１：１００）に対する１次抗体と共に１５〜１７時間４℃で培養した。切片を１次抗体と共に一晩中培養した後に、ＰＢＳで洗浄し、切片を蛍光標識された２次抗体（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８または５９４，１５００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と１時間培養した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１）を用いて切片の蛍光イメージを得た。
【００７３】
分泌タンパク質の分析（Ｓｅｃｒｅｔｏｍｉｃｓ）
ｈＥＳＣ由来の神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質とヒトｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、それぞれ４〜１２％の勾配ノベックスビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥして分離した後、ゲルコードブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質バンドが見えるようにゲルを染色した。該染色されたゲルは、同じサイズの１０バンドで切って、リン−ゲルトリプシン分解を公知の方法で行った。
【００７４】
リン−ゲル分解によって製造されたペプチドをＮａｎｏ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマトグラフィー（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と結合したＬｉｎｅａｒＴｒａｐ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ（ＬＴＱ）質量分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）とを使用して分析した。具体的に、トリプシン処理したペプチドをＣ１８レギュラー５マイクロンサイズレジンがパッキングされた分析カラム（７５μｍｘ１１ｃｍ）に適用した。９７％  溶液Ａ（蒸留水に０．１％  ギ酸）から６０％  溶液Ｂ（アセトニトリルに０．１％  ギ酸）に流速０．３μｌ／時間の条件で分線型４５分勾配を実施した。分離されたペプチドイオンをナノＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）ソースで電気噴霧した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、全体ＭＳスキャンを断片で選別して最も多い５種のスペクトルを結果−依存スキャンで求めた。動的排除に対する繰り返し係数を１に、繰り返し期間を３０秒に、動的排除期間を１８０秒に、排除質量幅を１．５Ｄａに、動作排除リストを５０に設定した。
【００７５】
ペプチド及びタンパク質の確認は、ｉｐｉ．ＨＵＭＡＮ  ｖ３．７６データベース（８９  ３７８エントリー）でターボ−ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を使用して検索した。データベース検索後、スカーフフォルド２（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて確認されたペプチド及びタンパク質を確認した。ＳＥＱＵＥＳＴ検索で得たペプチドのうち、０．９５以上のペプチドプロフェット（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ）蓋然性を有する１セットのペプチドを選別した。また、０．９９以上のプロテインプロフェット（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ）蓋然性及び２本以上の固有ペプチドを有するタンパク質リストを求めた。
【００７６】
脊髄損傷（Ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ：ＳＣＩ）モデル製作、分泌体注入及び行動回復検査（ＢＢＢ  ｓｃｏｒｅ  ｔｅｓｔ）
実験動物（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ、体重２５０〜３００ｇ）を麻酔した後、脊椎骨の除去を実施した（ｌａｍｉｎｅｃｔｏｍｙ）。ＮＹＵ  Ｉｍｐａｃｔｏｒを用いて１０ｇのｒｏｄを用いて露出された脊髄上に落として脊髄損傷を誘発した（ＳＣＩモデル製作）。以後、傷をよく消毒した後、皮膚を縫合した。脊髄損傷を受けた後、その傷部分に、本発明の全分化能幹細胞（ＥＳＣ）由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。次いで、約３日間隔で２回さらに静脈に投与した。分泌タンパク質を注入した後、ＢＢＢ  ｔｅｓｔを１週間ごとに施行した。ＢＢＢ  ｔｅｓｔを８週以上実施して、対照群と比較した。
【００７７】
統計分析
グループ間の統計学的有意度は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎが適用されたｏｎｅ−ｗａｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）を用いて求め、ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５を統計学的に有意なものと判定した。
【００７８】
実験結果１：ヒト胚芽幹細胞（ＥＳＣ）−由来神経前駆細胞の分泌タンパク質
脳卒中モデルでヒトＥＳＣ−由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質による疾患の改善を見るために、次の３個の群で２週間実験を行った。脳卒中誘発２４時間後、行動実験で疾患の誘導が確認された白ラットを３個群に任意に割り当てた後、右側外頚動脈に分泌タンパク質（０．２ｍｇ／ｋｇ、体積５０μｌ）、培地またはＰＢＳを同量（５０μｌ）で注射した。各物質を注入した後、３、７、１０及び１４日に動物の状態と体重とを確認し、行動分析を実施した。
【００７９】
【表１】
2018518503.tif 000003
【００８０】
虚血病変部位の分析結果
白ラットで永久ＭＣＡＯを通じる脳卒中の誘導は、幅広い脳病変の損傷を誘導した。脳卒中誘発１４日経過後、脳を摘出した後、ＴＴＣ（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）染色で脳の損傷有無と損傷部位とを確認した。ＴＴＣ染色は、細胞内の正常ミトコンドリア酸化酵素システム（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ）と反応して染色されるが、脳虚血損傷を受けてミトコンドリアが損傷されれば、酸化システムが撹乱されて染色にならず、白色を表わすので、脳の損傷部位を区別することができる。
【００８１】
図１に示されたように、中脳動脈結紮によって誘発された損傷は、主に右側脳の皮質部位と線条体部位とに発生した（図１）。また、神経前駆細胞の分泌タンパク質の注入が虚血性病変部位（ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ）を減少させた。ＰＢＳ対照群は、右脳の６０％近く損傷され、培地対照群は、４６％程度が損傷されたが、分泌タンパク質処理群は、損傷部位が２９％程度で対照群に比べて損傷部位が著しく減少した。
【００８２】
体重分析の結果
脳卒中誘発が白ラットの運動能力を減少させて、直ちに体重の減少が７日まで進行し、多様な治療剤は、運動能力の回復を通じて体重の増加を誘導する。分泌タンパク質の注入も、細胞移植と類似に体重増加を誘導した（図２）。神経損傷の回復で最も目立つ現象は、体重の回復である。分泌タンパク質処理群は、ＰＢＳ対照群に比べて有意な改善を示した。
【００８３】
行動分析の結果
分泌タンパク質処理群は、ビーム均衡検査で２つの対照群に比べて、統計的に有意な行動改善効果を示し、この効果は、治療３日目から表われるなど即刻な効果が表われた（図３ａ）。
【００８４】
また、捕捉可能牽引検査（ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｅ  ｔｒａｃｔｉｏｎ）でも、治療（注入）７日目に２つの対照群に比べて、統計的に有意な効果を示した（図３ｂ）。
【００８５】
さらに、分泌タンパク質の注入は、網での失足（ｆｏｏｔ  ｆａｕｌｔ）頻度を減少させる効果を示した（図３ｃ）。単位時間当たり行動の活発さを測定するラインクロスも、改善される趨勢を示した（図３ｄ）。
【００８６】
総合的な行動神経改善効果（ｍＮＳＳ）の分析結果
ｍＮＳＳ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ  ｔｅｓｔ）は、神経学的機能を測定するための構成表である。運動（筋肉状態）とｍｅｎｓｏｒｙ（時刻、触覚及び自己収容（ｐｒｏｐｒｉｏｃｅｐｔｉｖｅ））の項目で評価した。正常は、０点であり、点数が高いほど機能異常の程度が激しいと判断する。図４に示されたように、ｍＮＳＳの分析で分泌タンパク質処理群は、治療序盤からＰＢＳ対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果（行動改善）を示した（図４）。
【００８７】
ｍＮＳＳ検査でＰＢＳ対照群は、脳虚血を誘発させた１日後、平均５．４点で、１４日後、平均５．５点で、脳卒中による神経行動学的障害が保持されることが見られた。培地対照群の場合には、一時的な行動改善効果が治療３日に見えたが、追加的な改善効果は発揮することができなかった。一方、分泌タンパク質処理群の場合には、治療３日（ｍＮＳＳ  ４．５点）から１０日（ｍＮＳＳ  ３点）まで持続的な行動改善効果を示した。
【００８８】
分泌タンパク質の分析結果
ｉＰＳＣｓ由来の神経前駆細胞（ＮＰＣ）から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた：アグリン、アネキシンＡ５、ＢＳＧ、ビグリカン、カルポニン−３、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−１、コラーゲンα−２、クリン−３、デストリン、ジストログリカン、エフリン−Ｂ２、エクスポーチン−２、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インポーチン−９、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン２、プレイオトロフィン、プロフィリン−１、タンパク質ＤＪ−１、ラジキシン、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１、タリン−１、テスチカン、チモポイエチン、トランスゲリン−３、ビメンチン。
【００８９】
ヒト胚芽幹細胞の神経前駆細胞（ＮＰＣ）から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた：アグリン、アネキシンＡ２、アトラクチン、ビグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ、ダームシジン、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２、エズリン、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８、ニドゲン−１、パラチモシン、プロフィリン−２、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン、タリン−１、チモシンβ４、ＴＧＦＢＩ、トランスゲリン、ビメンチン。
【００９０】
脊髄損傷の治療効果
脊髄損傷（ＳＣＩ）モデルを作り、その損傷部分に直接全分化能幹細胞（ＥＳＣ）由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質約３０μｌを５箇所分けて注入した。次いで、約３日間隔で２回さらに静脈に分泌タンパク質を約２００μｇ（２００μｌ）ずつ注入した。毎週行動回復に対して脊髄損傷行動回復テスト方法（ＢＢＢ  ｔｅｓｔ）によって評価した。ＢＢＢ試験法は、脊髄損傷研究者に通常よく知られた試験法である。ＢＢＢ  ｔｅｓｔを８週以上実施して、無処理対照群（コントロール）と比較した時、分泌タンパク質注入群で優れた行動回復結果を示した（図１２）。
【００９１】
実験結果２：ヒト誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）−由来神経前駆細胞の分泌タンパク質＋多回投与
脳卒中モデルで神経前駆細胞（ＮＰＣ）分泌タンパク質の単回及び多回投与による疾患の改善を見るために、次の４個の群で２週間実験を行った。実験スケジュールは、図５のようである。
【００９２】
【表２】
2018518503.tif 000004
【００９３】
図６ａないし図６ｉは、全分化能誘導万能幹細胞由来−神経前駆細胞分泌タンパク質の単回投与ｖｓ．４回投与の実験結果を示す。ほとんどの条件で分泌タンパク質（セクレトーム−Ｍ）４回処理群が、他の群に比べて、格段の行動改善効果を発揮することが分かる。すなわち、単回投与群に比べて、多回投与群が行動改善に非常に有意な治療効果を発揮するということを確認した。
【００９４】
体重分析の結果
分泌タンパク質単回及び多回処理群は、ＰＢＳ対照群に比べて、治療３日目に有意な改善を示した（図６ｉ）。しかし、経時的に、群間の体重差は、統計的有意性を喪失した。
【００９５】
行動分析の結果
上体姿勢検査で分泌タンパク質多回処理群は、他の群に比べて、統計的に有意な脳損傷部位側である左側上体非対称運動の改善効果を誘導した（図６ｂ）。一方、非損傷側である右側上体非対称運動は、群間の統計的有意性が分泌タンパク質多回投与群の１０日を除いては観察されていない（図６ｃ）。
【００９６】
分泌タンパク質の繰り返し投与は、網での失足頻度を減少させる傾向性を示したが、１４日を除いては対照群と統計的有意性が見られなかった（図６ｄ）。単位時間当たり行動の活発さを測定するラインクロスも、分泌タンパク質の単回及び多回投与で改善される趨勢を示した（図６ｅ）。
【００９７】
Ｒｅａｒｉｎｇスコアも、分泌タンパク質の単回及び繰り返し投与が、他の実験群に比べて、改善を誘導する傾向性を確認し（図６ｆ）、ビーム均衡検査で２つの対照群に比べて、分泌タンパク質の多回投与が、統計的に有意な行動改善効果を示し、この効果は、治療３日目から表われるなど即時的な効果が表われた（図６ｇ）。また、捕捉可能牽引検査でも、治療（注入）７日目に２つの対照群に比べて、統計的に有意な効果を示した（図６ｈ）。
【００９８】
総合的な行動神経改善効果（ｍＮＳＳ）の分析結果
図６ａに示されたように、ｍＮＳＳの分析で分泌タンパク質多回処理群は、治療序盤からＰＢＳ対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果（行動改善）を示した。分泌タンパク質単回処理群も、対照群に比べて、実験期間の間に有意な治療効果を発揮し、培地対照群に比べて、優越した行動改善効果を示した。
【００９９】
虚血病変部位の分析結果
図７は、ラットｐＭＣＡｏモデルで神経前駆細胞（ＮＰＣ）由来分泌タンパク質の投与１４日経過時に、梗塞サイズに及ぼす効果を示す。ＰＢＳ（コントロール）、培地対照群（ブランク）、ＮＰＣ−由来分泌タンパク質単回（セクレトーム−Ｓ）またはＮＰＣ−由来分泌タンパク質の繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）したラットで治療１４日経過後の代表的イメージを示す。ラットｐＭＣＡｏモデルで神経前駆細胞由来分泌タンパク質の投与１４日経過時に、脳梗塞サイズに及ぼす効果を示す。単回及び多回投与時に、ＰＢＳ群と比較していずれも＊Ｐ＜０．０１である。特に、分泌タンパク質の多回投与時に、培地対照群（ブランク）に比べて、Ｐ＜０．０５の有意な改善効果を確認した。
【０１００】
抗炎症効果−ＥＤ−１陽性細胞の減少
図８ａないし図８ｂは、ＮＰＣ−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のＥＤ−１陽性細胞の頻度が減少し、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にＥＤ−１陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー：２００μｍ。ＥＤ−１陽性細胞の数を少なくとも５個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。コントロールと分泌タンパク質−繰り返し投与グループ間の比較時に、＊Ｐ＜０．００１である。
【０１０１】
抗炎症効果−ＧＦＡＰ陽性細胞の減少
図９ａないし図９ｂは、ＮＰＣ−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のＧＦＡＰ陽性細胞の頻度を減少させ、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にＧＦＡＰ陽性細胞の減少を誘発するということを示す。特に、ＧＦＡＰの発現は、培地対照群（ブランク）に比べて、分泌タンパク質繰り返し治療群でも有意な減少を誘導した。スケールバー：２００μｍ。ＧＦＡＰ陽性細胞の数を少なくとも５個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。各グループ間の多重比較時に、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【０１０２】
内在性幹細胞の可動効果
図１０は、分泌タンパク質の投与によるラット脳組織での内在性神経幹細胞の可動を示す。分泌タンパク質投与１４日経過後、試験した。ＤＣＸ（赤色）陽性細胞がラット虚血脳で観察された。スケールバー：５００μｍ。
【０１０３】
新生血管の増加効果
図１１は、ＮＰＣ−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のα−ＳＭＡ陽性血管の頻度が増加し、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意に血管の数を増加させるということを示す。α−ＳＭＡ陽性血管の数を少なくとも５個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。コントロールと分泌タンパク質−繰り返し投与（セクレトーム−Ｍ）グループ間の比較時に、＊Ｐ＜０．００５である。
【０１０４】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
2018518503.tif 000005
【図２】
2018518503.tif 000006
【図３ａ】
2018518503.tif 000007
【図３ｂ】
2018518503.tif 000008
【図３ｃ】
2018518503.tif 000009
【図３ｄ】
2018518503.tif 000010
【図４】
2018518503.tif 000011
【図５】
2018518503.tif 000012
【図６ａ】
2018518503.tif 000013
【図６ｂ】
2018518503.tif 000014
【図６ｃ】
2018518503.tif 000015
【図６ｄ】
2018518503.tif 000016
【図６ｅ】
2018518503.tif 000017
【図６ｆ】
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【図６ｇ】
2018518503.tif 000019
【図６ｈ】
2018518503.tif 000020
【図６ｉ】
2018518503.tif 000021
【図７】
2018518503.tif 000022
【図８ａ】
2018518503.tif 000023
【図８ｂ】
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【図９ａ】
2018518503.tif 000025
【図９ｂ】
2018518503.tif 000026
【図１０】
2018518503.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月21日(2017.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経前駆細胞（ＮＰＣ）の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物。
【請求項２】
前記神経前駆細胞は、全分化能（万能）幹細胞から分化されたことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記神経前駆細胞は、全分化能（万能）幹細胞から分化された神経ロゼット段階前後の神経前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記全分化能（万能）幹細胞は、胚芽幹細胞、ｉＰＳＣｓ(ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ)、胚芽生殖細胞、または胚芽腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陰性神経前駆細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記分泌タンパク質は、神経前駆細胞を細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞培養液は、神経前駆細胞をＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）とｂＦＧＦとが含有された無血清細胞培養培地で培養した後、細胞を除去して収得したことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物：
アグリン、アネキシンＡ５、ＢＳＧ、ピグリカン、カルポニン−３、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−１、コラーゲンα−２、クリン−３、デストリン、ジストログリカン、エフリン−Ｂ２、エクスポーチン−２、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インポーチン−９、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン２、プレイオトロフィン、プロフィリン−１、タンパク質ＤＪ−１、ラジキシン、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１、タリン−１、テスチカン、チモポイエチン、トランスゲリン−３、及びビメンチン。
【請求項１０】
前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物：
アグリン、アネキシンＡ２、アトラクチン、ピグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ、ダームシジン、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２、エズリン、ガレクチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８、ニドゲン−１、パラチモシン、プロフィリン−２、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン、タリン−１、チモシンβ４、ＴＧＦＢＩ、トランスゲリン、及びビメンチン。
【請求項１１】
前記虚血性疾患は、虚血性脳血管疾患、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、及び四肢末端部虚血性疾患で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び脊髄損傷で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物は、１回投与用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物は、多回投与用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、全分化能幹細胞から分化された神経ロゼットで抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を用いて分離されることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【国際調査報告】
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