(57)【要約】  本発明は、成体上皮幹細胞の三次元（３Ｄ）培養のためのハイドロゲルおよび方法ならびにその使用を提供する。
2018532421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体機能３Ｄハイドロゲル中で幹細胞を培養することを含む、上皮細胞オルガノイドを得るための方法であって、
ａ）前記細胞は、単離された組織またはオルガノイド断片を含み、前記細胞は、オルガノイド形成に適切な条件で培養されるか、または
ｂ）前記細胞は、単一のまたはクラスターの幹細胞を含み、前記細胞は、最初に細胞拡張に適切な条件で培養され、その後、オルガノイド形成に適切な条件で培養され、
ハイドロゲルは、架橋親水性ポリマーおよび生理活性分子を含み、生理活性分子は、ラミニン−１１１またはその機能的バリアントであり、ハイドロゲルは、０．０５〜０．５ｋＰａ、好ましくは０．０５〜０．３ｋＰａ、より好ましくは０．０８〜０．３ｋＰａ、最も好ましくは０．２〜０．３ｋＰａ、または最も好ましくは０．０８〜０．１５ｋＰａのせん断弾性率を有する、方法。
【請求項２】
ハイドロゲルが、ラミニン−１１１またはその機能的バリアントの他に、ＲＧＤ含有リガンドを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体機能３Ｄハイドロゲル中で幹細胞を培養することを含む、上皮細胞オルガノイドを得るための方法であって、
ａ）前記細胞は、単離された組織またはオルガノイド断片を含み、前記細胞は、オルガノイド形成に適切な条件で培養されるか、または
ｂ）前記細胞は、単一のまたはクラスターの幹細胞を含み、前記細胞は、最初に細胞拡張に適切な条件で培養され、その後、オルガノイド形成に適切な条件で培養され、
ハイドロゲルは、架橋親水性ポリマーおよび生理活性分子を含み、ハイドロゲルは、０．０５〜３．１ｋＰａのせん断弾性率を有する、方法。
【請求項４】
ハイドロゲルのせん断弾性率が、経時的に低下する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
方法の開始時点でのハイドロゲルのせん断弾性率が、０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１〜２ｋＰａ、最も好ましくは１．３ｋＰａまたは２ｋＰａであり、オルガノイド形成条件に切り替えるときのハイドロゲルのせん断弾性率が、５０〜５００Ｐａ、好ましくは１００〜３００Ｐａ、より好ましくは８０〜１５０Ｐａ、最も好ましくは１２０Ｐａである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ハイドロゲルのせん断弾性率の低下が、ハイドロゲルネットワークの分解を通じて達成される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
分解が、ハイドロゲル中のエステル結合の加水分解により達成され、エステル結合が、マルチアーム ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子の反応性基に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マルチアームＰＥＧ分子が、平均で３〜１２のアームを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
マルチアームＰＥＧ分子が、全ハイドロゲルネットワークの７０〜８０％を構成し、好ましくは残りのパーセンテージのハイドロゲルが、加水分解的に非分解性である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ハイドロゲルが、細胞分泌プロテアーゼによる分解に非感受性である、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ハイドロゲルのせん断弾性率の低下が、生体適合性能動機構、好ましくは、光、生体分子、小分子、温度または他の物理的パラメータの変化への曝露を含む生体適合性能動機構を通じて達成される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１２】
能動機構が、ハイドロゲルの１つの成分のみに選択的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
能動機構が、タンパク質分解酵素によるハイドロゲル中の特定の標的部位の切断を含み、好ましくは、タンパク質分解酵素が、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼなどの非哺乳類プロテアーゼである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ハイドロゲルが、ラミニン−１１１またはその機能的バリアントを含む、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ラミニン−１１１またはその機能的バリアントが、少なくとも５μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５００μｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは５〜２５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度である、請求項１、２または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
上皮幹細胞オルガノイドの形成および維持を定量化するための方法であって、
ａ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法を使用してオルガノイドを得ること、および
ｂ）定量的ハイコンテントアプローチにより、オルガノイドへの細胞の自己組織化をモニタリングすること
を含む方法。
【請求項１７】
成体上皮幹細胞を成長させるための方法であって、成体上皮幹細胞を、３Ｄハイドロゲル中で、細胞拡張に適切な条件で培養することを含み、ハイドロゲルは、架橋親水性ポリマーおよびラミニン−１１１またはその機能的バリアントを含み、ハイドロゲルは、０．２〜３．１ｋＰａのせん断弾性率を有する、方法。
【請求項１８】
機能的バリアントが、ＡＧ７３を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ハイドロゲルが、０．２、０．３、０．７、１．３または１．７ｋＰａのせん断弾性率を有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
上皮幹細胞が、多細胞培養物または単離された組織断片に由来する、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ハイドロゲルが、さらなる生理活性分子を含む、請求項３から１３または１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
さらなる生理活性分子が、オリゴペプチド、小分子、タンパク質、オリゴ糖類もしくは多糖類、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらなる生理活性分子が、ＲＧＤ含有リガンドを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＧＤ含有リガンドが、フィブロネクチンまたはその機能的バリアントである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＧＤ含有リガンドが、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＲＧＤＳＰＫ、ＲＧＤＴＰ、およびＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰを含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
フィブロネクチンの機能的バリアントが、分岐状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
フィブロネクチンの機能的バリアントが、ＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片、およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリオキサゾリン、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、またはその混合物もしくはコポリマーを含む群から選択される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房、腎臓、角膜、表皮、毛包、前立腺、眼または肺の上皮細胞を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ハイドロゲルが、生体適合性である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
薬理化合物または生体分子の活性をスクリーニングするための方法であって、
ａ）請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法を行い、細胞を生検試料から単離し、細胞を、試験される薬理化合物または生体分子の存在下または非存在下において培養すること、
ｂ）薬理化合物または生体分子の非存在下で培養した培養細胞と、薬理化合物または生体分子の存在下で培養した細胞とを比較して、細胞損傷もしくは細胞死の減少、または上皮接合の完全性もしくは炎症の回復をモニタリングすること
を含む方法。
【請求項３３】
上皮オルガノイドを成長させるための生体機能ハイドロゲルであって、ハイドロゲルは、架橋親水性ポリマーおよび機能分子を含み、機能分子は、ａ）ラミニン−１１１もしくはその機能的バリアント、またはｂ）ＲＧＤ含有リガンドであり、ハイドロゲルは、０．０５〜３．１ｋＰａのせん断弾性率を有する、生体機能ハイドロゲル。
【請求項３４】
前記ポリマーが、ハイドロゲル中に５％ｗ／ｖ未満、好ましくは３％ｗ／ｖ未満、より好ましくは２％ｗ／ｖ未満で存在する、請求項３３に記載のハイドロゲル。
【請求項３５】
ハイドロゲルが、脱イオン水中で２００％未満、好ましくは１５０％未満の膨潤率を示す、請求項３３または３４に記載のハイドロゲル。
【請求項３６】
機能分子が、０．１〜３ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３７】
ハイドロゲルが、０．５〜２ｋＰａ、好ましくは１．３ｋＰａのせん断弾性率を有する、請求項３３から３６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３８】
機能分子が、ＲＧＤ含有リガンドを含む、請求項３３から３７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３９】
ＲＧＤ含有リガンドが、フィブロネクチンまたはその機能的バリアントである、請求項３８に記載のハイドロゲル。
【請求項４０】
フィブロネクチンの機能的バリアントが、分岐状ペプチドまたは環状ペプチドである、請求項３９に記載のハイドロゲル。
【請求項４１】
フィブロネクチンの機能的バリアントが、ＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片、およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片を含む群から選択される、請求項４０に記載ハイドロゲル。
【請求項４２】
ＲＧＤ含有リガンドが、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＲＧＤＳＰＫ、ＲＧＤＴＰ、およびＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰを含む群から選択される、請求項３８に記載のハイドロゲル。
【請求項４３】
ハイドロゲルが、０．２〜０．７ｋＰａ、好ましくは０．２ｋＰａのせん断弾性率を有し、機能分子が、好ましくはラミニンまたはその機能的バリアントを含み、好ましくは、ラミニンが、少なくとも５μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５００μｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは５〜２５０μｇ／ｍｌの範囲である、請求項３３から３６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４４】
好ましくは、ＲＧＤ含有リガンドをさらに含む、請求項４３に記載のハイドロゲル。
【請求項４５】
ＲＧＤ含有リガンドを含まない、請求項４３に記載のハイドロゲル。
【請求項４６】
前記ポリマーがＰＥＧであり、前記ポリマーが好ましくはＰＥＧ−ビニルスルホンである、請求項３３から４５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４７】
前記ポリマーが、水溶液中で不安定なポリマーを含み、好ましくは、不安定なポリマーは自発的に加水分解する、請求項３３から４６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項４８】
不安定なポリマーが、ＰＥＧ−アクリレートを含む、請求項４７に記載のハイドロゲル。
【請求項４９】
ハイドロゲルが、水溶液中で安定な架橋ポリマーをさらに含み、好ましくは、不安定なポリマーが、ハイドロゲルネットワークの７０〜８０％を構成する、請求項４７または４８に記載のハイドロゲル。
【請求項５０】
安定なポリマーが、マルチアーム サブユニット、好ましくはマルチアームＰＥＧ−ビニルスルホンサブユニットを含む、請求項４９に記載のハイドロゲル。
【請求項５１】
水溶液でのインキュベーション前のハイドロゲルのせん断弾性率が、０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１〜２ｋＰａ、最も好ましくは１．３ｋＰａであり、水溶液での４日間のインキュベーション後のハイドロゲルのせん断弾性率が、５０〜５００Ｐａ、好ましくは１００〜３００Ｐａ、より好ましくは８０〜１５０Ｐａ、最も好ましくは１２０Ｐａである、請求項４７から５０のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５２】
ハイドロゲルが、細胞分泌プロテアーゼによる分解に非感受性である、請求項３３から５１のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５３】
ハイドロゲルが、最大１０％のマトリゲルまたは同様の天然由来バイオポリマーマトリックス、例えばＥＨＳマウス肉腫細胞により分泌されたゼラチン様タンパク質混合物を含むマトリックスをさらに含む、請求項３３から５２のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５４】
上皮幹細胞オルガノイドに対する薬理化合物または生体分子の効果を決定するための方法であって、
ａ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法を使用してオルガノイドを得ること、および
ｂ）定量的ハイコンテントアプローチにより、薬理化合物または生体分子に曝露されたオルガノイドの挙動をモニタリングすること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成体上皮細胞の三次元（３Ｄ）培養のためのハイドロゲルおよびその使用を提供する。本発明の態様は、ハイドロゲルで上皮細胞を成長させるための方法、ならびに幹細胞および腫瘍細胞から上皮細胞オルガノイドを得るための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患および胃腸（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ、ＧＩ）管の癌を含む腸疾患、外傷、ならびに新生児の先天性奇形の世界的な蔓延により、新たな治療法と臓器移植の両方が緊急的に必要とされている。ドナー不足と技術的な限界により、毎年およそ２００例の同種腸移植が行われているにすぎない［１］。同様に、ハイスループットスクリーニングによって同定された化合物の９０％が臨床試験フェーズＩを越えて進むことができず、さらに９０％が新薬になり損ねている［２］。この高い減少率は、ヒト生理を正確に模倣していない不死化細胞株および動物モデルに前臨床トランスレーショナルリサーチが大きく依存していることに起因している［２］。
【０００３】
（オルガノイド）
最近導入された幹細胞由来ＧＩオルガノイドは、基本的な実験モデルとして、移植可能な組織の原料として、および薬物スクリーニングのための生理学的に妥当なプラットフォームとして有望である。不死化細胞の培養と異なり、腸オルガノイドは、例えば、陰窩状突起に存在する生存可能な幹細胞を含み、自己再生および分化の連続的サイクルを繰り返して、複数の機能性細胞種を生じ、腸発達および恒常性の重要な態様を再現する。
【０００４】
重要なことに、上皮オルガノイドも、ヒト結腸、腺腫、腺癌組織から確立されており［３］、培養およびｅｘ  ｖｉｖｏ拡張された患者由来の陰窩または幹細胞を使用した個別化医療および自家移植への刺激的な可能性を開く。最近、そのような試みの実行可能性がマウスで実証された：単一の幹細胞から拡張された結腸上皮が表面的に損傷した結腸に首尾よく再導入され、完全移植、組織構造および機能の再構成がなされた［４］。それらの天然臓器への従前に類のない組織学的忠実性にもかかわらず、ＧＩ管の幹細胞由来オルガノイドにはいくつかの制限がある。その主なものは、３Ｄ足場としてのマトリゲルへの依存である［５］。
【０００５】
マトリゲルは、全ての細胞型のオルガノイド成長について３Ｄ足場を提供するために広く使用されている市販製品である［５］。腸［６］、網膜［７］［８］、腎臓［９］、肝臓［１０］、胃［１１］、前立腺［１２］、乳房［１３］〜［１５］、内耳［１６］、心筋線維［１７］、肝血管内皮［１８］、膵臓［１９］、卵管［２０］および脳［２１］オルガノイドを成長させるために使用されている。ニワトリ［６］、ラット［２２］およびヒト［１５］、［１９］、［２１］を含む、様々な種由来のオルガノイドを成長させるためにも使用されている。
【０００６】
しかしながら、オルガノイド成長の足場としてのマトリゲルまたは同様の天然由来バイオポリマーのマトリックスに対する依存により、得られるオルガノイドの研究および使用にはいくつかの重大な制限が導入される。マトリゲルは、基底膜ＥＣＭリッチマウス肉腫由来であり［５］、患者に移した場合には、免疫原または病原体の顕著なリスクが導入され、特に、患者の罹患率および死亡率が免疫抑制後の感染に関連して顕著な分野で問題となる。さらに、マトリゲルのバッチ間変動は、一貫性のない細胞挙動をもたらす可能性があり、基本およびトランスレーショナルリサーチの両方の解釈を複雑にする未知の潜在的交絡変数を導入しうる。さらに、マトリゲルは現在のオルガノイド培養モデルの重要成分であるものの、オルガノイド形成におけるその役割はまだ確認されていない［４］。報告は、特に腸の発達および機能の制御における一般的微小環境、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を示唆している。しかしながら、マトリゲルを使用して微小環境因子の特定の役割を確定することは、その分子成分を容易に操作できないことを考慮すると難しい。さらに、胚性および成体幹細胞が同様に機械的環境によって深く影響を受けることは公知であるものの［２３］、マウスモデルまたはマトリゲルベースの培養内で制御された機械的調節を行うことは、現在不可能である。それゆえ、マトリゲルが、オルガノイドを成長させるための物理的支持を提供する単なる受動的な３Ｄ足場として機能するのか、または本質的に生物学的なきっかけを提供することによりオルガノイド形成に積極的に影響を与えているのかは明確でない。そのように、マトリゲルは、オルガノイド分野において顕著な進歩と発展を促したが、オルガノイド成長のためのこの３Ｄ足場への現在の依存は、当該分野におけるさらなる発展を著しく制限している。
【０００７】
（細胞を成長および分化させるための合成ハイドロゲルの使用）
化学的に定義されたおよび汎用性の組成により、合成ＥＣＭアナログ（合成ハイドロゲル、以下「ハイドロゲル」）は、天然の動物由来のマトリックス、例えばマトリゲル［２４］に対する魅力的な細胞培養代替物と考えられている。実際、ハイドロゲルは、細胞増殖、維持および分化を支持するために広く使用されている［２５］。低いまたは高いせん断弾性率を有するＲＧＤ機能化ＰＥＧハイドロゲルが、細胞株の細胞増殖を支持することが可能であることは、当該分野で公知である。
【０００８】
・Ｈａｌｓｔｅｎｂｅｒｇら［２６］は、ヒト胎児包皮線維芽細胞（ＨＦＦＦ）細胞株の増殖を支持するための高弾性率（１．２ｋＰａ）を有するＲＧＤおよびヘパリン機能化１０〜１５％ＰＥＧ−Ａｃｒハイドロゲルの使用を記載している。
【０００９】
・ＷＯ０３／０４０２３５、Ｌｕｔｏｌｆら［２７］は、ＨＦＦＦ細胞株の増殖を支持するための高弾性率（７．５〜１２．５ｋＰａ）を有するＲＧＤ機能化８〜１０％ＰＥＧ−ＶＳハイドロゲルの使用を記載している。
【００１０】
・Ｒｉｚｚｉら［２８］は、ＨＦＦＦ細胞株の増殖を支持するための低弾性率（０．１〜０．５ｋＰａ）を有するＲＧＤ機能化ＰＥＧ−ＶＳハイドロゲルの使用を記載している。
【００１１】
低せん断弾性率を有するハイドロゲルは、初代細胞および幹細胞の増殖および維持に使用されてきた。
【００１２】
・Ｂｏｔｔら［２９］は、初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の増殖および維持を支持するための低せん断弾性率（０．２５〜０．７ｋＰａ）を有するＲＧＤ機能化１．５〜２．５％ＰＥＧハイドロゲルの使用を記載している。
【００１３】
・Ｌｏｅｓｓｎｅｒら［３０］は、ヒト上皮幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の増殖および維持を支持するための低弾性率（０．２〜１．２ｋＰａ）を有するＲＧＤ機能化１．５〜２．５％ＰＥＧハイドロゲルの使用を記載している。
【００１４】
・ＷＯ２０１５／１５７７３２、Ｍｕｒｐｈｙら［３１］は、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞およびＨｕＶＥＣの増殖および維持を支持するための低弾性率（０．２６〜３．２ｋＰａ）を有するＲＧＤ機能化ＰＥＧ−ＶＳハイドロゲルの使用を記載している。
【００１５】
・Ｒａｚａら、２０１３［３２］は、ＮＢ−ＰＥＧがＭＭＰ標的配列含有ペプチドで架橋されている５％ｗｔの４アームの５−ノルボルネン−２−カルボン酸機能化（ＮＢ）ＰＥＧハイドロゲルでの、膵管不死化上皮細胞株（ＰＡＮＣ−１）の増殖および形態形成を記載している。ハイドロゲルは、高弾性率（３〜６ｋＰａ）を有し、ＵＶ光への曝露により製造される。
【００１６】
・Ｅｎｅｍｃｈｕｋｗｕ  ２０１３［３３］は、細胞クラスターへのＭＤＣＫ上皮細胞株の成長を支持するための、３．５％ＲＧＤ機能化ＰＥＧハイドロゲルの使用を記載している。
【００１７】
この目的のために使用されるハイドロゲルの物理的特徴は、研究者によっていつも決定されているわけではない。
【００１８】
・ＷＯ２０１４／１１７１４６、Ｌｅｖｉｓｏｎら［３４］は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの成長を支持するためのＲＧＤ機能化キトサンマトリックスハイドロゲルを記載している。
【００１９】
・ＷＯ２００９／０９９５５５、Ｆａｄｅｅｖら［３５］は、ｈＥＳＣに由来する心筋細胞の増殖および維持を支持するためのＲＧＤおよびラミニン由来ペプチドで機能化されたポリ（アクリレート）ハイドロゲルの使用を開示している。Ｆａｄｅｅｖは、これらのハイドロゲルの予測される物理的特性を説明していない。
【００２０】
合成ハイドロゲルは様々な細胞種の培養、拡張、増殖および分化のために広く使用されてきたが、これらのマトリックス内で上皮幹細胞形態形成を再現することおよび幹細胞から上皮細胞オルガノイドを成長させることは達成されていない。実際、合成ハイドロゲルは、細胞増殖および細胞株の分化に十分な支持を与えるが、現在利用可能なハイドロゲルが提供する微小環境は、幹細胞からオルガノイドを形成するために必要な機械的要件および生化学的複雑性を欠くと考えられている［３６］。
【００２１】
（ハイドロゲルを製造するための方法）
ハイドロゲルは、エステル含有ポリマー前駆体のフリーラジカル重合によって、または不飽和基への求核前駆体のＭｉｃｈａｅｌ型付加などの「バイオクリック」反応を介して形成することができる。フリーラジカル重合とは異なり、Ｍｉｃｈａｅｌ型付加架橋は、細胞毒性フリーラジカルまたはＵＶ光を必要としない［３７］。さらに、ハイドロゲルネットワークは、生体機能修飾を可能にする生理学的条件下で、例えば、インテグリン結合（ＲＧＤ）またはプロテアーゼ感受性ペプチドの組み込みを介して、形成することができる。多官能性ペプチドとアクリレート［８］、［１５］〜［１９］、ビニルスルホン［２０］〜［２２］およびマレイミド［４５］〜［４７］限定マルチアームＰＥＧマクロマーとの間のチオールＭｉｃｈａｅｌ型付加反応によって形成されたＰＥＧ−コ−ペプチドハイドロゲルが記載されてきた。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、生体機能３Ｄハイドロゲル中で細胞を培養することを含む、上皮細胞オルガノイドを得るための方法であって、
ａ）細胞は、単離された組織またはオルガノイド断片を含み、細胞は、オルガノイド形成に適切な条件で培養されるか、または
ｂ）細胞は、単一のまたはクラスターの幹細胞を含み、細胞は、最初に細胞拡張に適切な条件で培養され、その後、オルガノイド形成に適切な条件で培養され、
ハイドロゲルは、架橋親水性ポリマーおよび生理活性分子を含み、機能性分子は、ラミニン−１１１またはその機能的バリアントであり、ハイドロゲルは、０．０５〜０．５ｋＰａ、好ましくは０．０５〜０．３ｋＰａ、より好ましくは０．０８〜０．３ｋＰａ、最も好ましくは０．２〜０．３ｋＰａ、または最も好ましくは０．０８〜０．１５ｋＰａのせん断弾性率を有する、方法に関する。
【００２３】
合成ハイドロゲルを使用して上皮オルガノイドを成長させることは、従前に記載されている（Ｙｉｎら、３２ページ、１列［３６］）。本発明は、合成ハイドロゲルでの幹細胞からの上皮細胞形態形成およびオルガノイド形成の最初の実証を提供する。本明細書に記載の実施例のいくつかは、オルガノイドが、比較的低弾性率を有するハイドロゲルで成長しうることを実証する。さらに、ある特定の実施例は、上皮オルガノイドが、経時的に分解する動的ハイドロゲルにおいて、幹細胞の単一または小クラスターから成長させることができることを実証する。
【００２４】
本発明より前には、ＲＧＤ含有ペプチドは、上皮オルガノイド培養のための生体機能ハイドロゲルの必須成分と考えられていた。しかしながら、本発明は、一部において、ラミニン−１１１およびその機能的バリアントが、ＲＧＤ含有ペプチドの非存在下であっても、ハイドロゲルにおける上皮細胞成長を支持することができるという驚くべき発見に関する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、成体上皮幹細胞を培養するための三次元ハイドロゲルであって、ＲＧＤ含有ペプチドで機能化した架橋親水性ポリマーを含み、ＲＧＤ含有ペプチドの濃度は少なくとも０．０５％ｗ／ｖであり、ハイドロゲルは０．５〜５ｋＰａのせん断弾性率を有する、三次元ハイドロゲルを提供する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、成体上皮幹細胞を拡張させるための方法であって、単一細胞または多細胞クラスターを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を培養することを含む方法を提供する。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、正常上皮オルガノイドを培養および拡張するための方法であって、ｉ）上皮オルガノイドの断片を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切なオルガノイド形成条件下でオルガノイドを培養すること、またはｉｉ）単一のまたはクラスターの上皮幹細胞を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を拡張させ、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、上皮腫瘍由来オルガノイドを培養および拡張するための方法であって、腫瘍由来単一細胞または多細胞クラスターを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な細胞拡張条件下で細胞を拡張させ、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、上皮組織再生のための方法であって、ａ）患者由来の上皮幹細胞またはオルガノイドを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件または適切なオルガノイド形成条件下で拡張させること、およびｂ）拡張された幹細胞またはオルガノイドを患者に移植して戻すことを含む方法を提供する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、腸幹細胞自己再生およびコロニー形成を研究するための方法であって、腸幹細胞を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を培養することを含む方法を提供する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、腸幹細胞分化、腸組織極性化および形態形成を研究するための方法であって、ｉ）腸オルガノイドの断片を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切なオルガノイド形成条件下でオルガノイドを培養すること、またはｉｉ）単一のまたはクラスターの腸幹細胞を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な自己再生条件下で細胞を拡張させ、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法を提供する。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、腫瘍細胞死または成長停止の誘導における効力について、薬理化合物、生体分子のライブラリをスクリーニングするためのまたは細胞ベースの療法を評価するための方法であって、ｉ）腫瘍細胞またはオルガノイドを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、試験される薬理化合物、生体分子または細胞の存在下、適切な条件下で細胞またはオルガノイドを培養すること、ならびにｉｉ）細胞死および／または成長停止をモニタリングすることを含む方法を提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、腸疾患の処置における効力について、薬理化合物または生体分子のライブラリをスクリーニングするための方法であって、ｉ）患者由来の腸生検試料を用意すること、ｉｉ）腸生検試料を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、成長させ、試験される薬理化合物または生体分子の存在下、適切な条件下で生検試料を培養すること、ならびにｉｉｉ）嚢胞性線維症の場合には、フォルスコリン誘導オルガノイド膨張のモニタリングにより嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の成功した機能回復を評価すること、ｉｖ）炎症性腸疾患の場合には、炎症、細胞損傷もしくは死の成功した減少、または上皮接合の完全性の回復をモニタリングすることを含む方法を提供する。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、本発明による三次元ハイドロゲルの別個の体積を作製するためのキットオブパーツであって、成分ａ）１つまたは複数の親水性前駆体ポリマー、成分ｂ）フィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片、成分ｃ）前駆体ポリマーａ）のための架橋剤、および成分ｄ）ラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を含む、キットオブパーツを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａは、合成ハイドロゲル内で腸オルガノイドを構築するために満たす必要がある段階特異的微小環境要件を、単一の幹細胞から開始して示す。図１Ｂ〜Ｃは、抽出し、マトリゲル（図１Ｂ）または修飾のないＰＥＧ（図１Ｃ）に封入してから４８時間後の腸陰窩を示す。アスタリスクは死んだ陰窩を示し、矢印は生存して円形コロニーに再編成された陰窩を示す。
【図２】図２Ａは、マウス小腸基底膜を構成する重要なＥＣＭ成分を示す。ラミニン−１１１およびフィブロネクチンは、陰窩基底部付近に濃縮され、一方でヒアルロン酸受容体ＣＤ４４は、ＩＳＣによって特異的に発現される。図２Ｂ〜Ｅは、合成マトリックス内のオルガノイド培養物に対するラミニンベースの接着の効果を示す。図２Ｂ：オルガノイドのバイアビリティに対する様々なラミニン−１１１由来配列の効果。図２Ｃ：マトリゲル、修飾のないＰＥＧまたはＰＥＧ−ＡＧ７３で成長したオルガノイドの形態。図２Ｄ：ＡＧ７３−コンジュゲートＰＥＧマトリックスは、オルガノイドの成長を顕著に高める。図２Ｅ：オルガノイドバイアビリティおよび成長に対するＡＧ７３の効果は濃度依存性である。
【図３】図３Ａは、改変ハイドロゲルにおけるＩＳＣコロニー形成およびＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現を示す。改変ＰＥＧハイドロゲルを様々な前駆体濃度で調製した。図３Ｂは、マトリゲルおよびＭＴ  ＰＥＧ−ＡＧ７３ゲルで成長した腸オルガノイドの形態およびＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現を示す。図３Ｃは、マトリゲル、ＴＧ  ＰＥＧ−ＡＧ７３およびＭＴ  ＰＥＧ−ＡＧ７３で拡張された腸オルガノイドにおけるＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現の定量化を示す。図３Ｄは、マトリゲル、ＴＧ  ＰＥＧ−ＡＧ７３およびＭＴ  ＰＥＧ−ＡＧ７３における腸オルガノイドバイアビリティの定量化を示す。図３Ｅは、頂底極性の確立を示す。図３Ｆは、ＭＴ  ＰＥＧ−ＡＧ７３で成長したオルガノイド内のパネート（リゾチーム）およびゴブレット（ムチン）細胞の存在を示す。図３Ｇ〜Ｉは、ＰＥＧ−ＲＧＤ単独（図３Ｇ）またはＡＧ７３（図３Ｈ）もしくはヒアルロン酸（ＨＡ）（図３Ｉ）の存在下に２４時間埋め込んだ後の腸陰窩形態を示す。アスタリスクは死んだ陰窩を示し、矢印は生存して円形コロニーに再編成された陰窩を示す。図３Ｊは、ＩＳＣのマトリゲル不含培養を示す。新たに単離された腸陰窩はＰＥＧ−ＲＧＤで生存し、拡張ＩＳＣコロニーを形成し、このコロニーは継代、さらに拡張することができる。図３ＫおよびＬは、Ｗｎｔ３ａ含有培地におけるＩＳＣ拡張を示す。組換えＷｎｔ３ａは、ＩＳＣの拡張のためにＣＨＩＲ９９０２１およびＶＰＡに首尾よく置き換えることができる。図３Ｍは、様々なＰＥＧ含有量を有するＭＴ  ＰＥＧ−ＡＧ７３ゲルのレオロジー特性を示す。
【図４】図Ａ〜Ｄは、マトリゲルおよびＰＥＧ−ＲＧＤにおけるＩＳＣコロニー形態およびＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現を示す。図４Ｅおよび４Ｆは、マトリゲル（図４Ｆ）またはＰＥＧ−ＲＧＤ（図４Ｅ）で拡張されたＩＳＣにより形成された腸オルガノイドの形態およびＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現を示す。アスタリスクは自己蛍光を示し、白矢印はＬｇｒ５−ＥＧＦＰシグナルを示す。図４Ｇは、マトリゲルまたはＰＥＧ−ＲＧＤで拡張されたＩＳＣにより形成されたオルガノイドにおけるパネート（リゾチーム）およびゴブレット（ムチン）細胞の極性化および存在を示す。図Ｈは、ＰＥＧ−およびマトリゲルベースのＩＳＣならびにオルガノイド培養における腸マーカー発現を示す。プロットは、重要な腸遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す：Ｌｇｒ５（ＩＳＣ）、ＡＬＰＩ（エンテロサイト）、Ｃｈｒ−Ａ（腸内分泌細胞）、Ｍｕｃ−２（ゴブレット細胞）およびＬｙｚ（パネート細胞）。図４Ｉ〜Ｌは、ＩＳＣコロニー形成に対するインテグリンベースの接着およびゲル剛性の効果を示す。図４Ｉは、様々な濃度のＲＧＤリガンド存在下の７００Ｐａ  ＰＥＧマトリックスにおけるＩＳＣコロニーを示す。図４Ｋは、一定（１ｍＭ）のＲＧＤ濃度で様々な剛性を有するＰＥＧ−ＲＧＤマトリックスにおけるＩＳＣコロニーを示す。図４Ｊは、ＲＧＤ濃度の関数としてのＩＳＣコロニー形成効率の定量化を示す。図４Ｌは、マトリックス剛性の関数としてのＩＳＣコロニー形成効率の定量化を示す。
【図５】図５は、ＰＥＧハイドロゲルにおけるＩＳＣコロニー形成に対する様々なＥＣＭ成分の効果を示す。それぞれのＥＣＭ成分を、軟性（３００Ｐａ）または硬性（１３００Ｐａ）マトリックスに、単独でまたはＲＧＤとの組み合わせで組み込んだ。ＦＮ：フィブロネクチン、Ｌａｍ−１１１：ラミニン−１１１、Ｃｏｌ−ＩＶ：コラーゲンＩＶ、Ｌａｍ−５１１：ラミニン５１１、ＨＡ：ヒアルロン酸、Ｃｏｌ−Ｉ：コラーゲンＩ。
【図６】図６は、軟性ＰＥＧハイドロゲルにおける腸オルガノイド形成を示す。図６Ａ：ラミニン−１１１は、軟性マトリックス内のＩＳＣコロニー形成を支持する。軟性のラミニン含有マトリックスで形成されたコロニーは、腸上皮の４種の分化細胞種を含有するオルガノイドを形成することができる（図６Ｂ）：Ｌ−ＦＡＢＰ（エンテロサイト）、Ｃｈｒ−Ａ（腸内分泌細胞）、Ｍｕｃ−２（ゴブレット細胞）およびＬｙｚ（パネート細胞）（図６Ｃ）。図６Ｄは、軟性ラミニン含有ＰＥＧゲルで成長した単一ＩＳＣから形成された腸オルガノイドを示す。
【図７】図７は、ＩＳＣ増殖、形態およびその末路に対するマトリックスタンパク質分解の効果を示す。図７Ａ：様々な剛性の分解性（ＤＧ）または非分解性（Ｎ−ＤＧ）ＰＥＧゲルに埋め込んだＩＳＣのコロニー形成効率。図７Ｂ〜Ｃ：ＩＳＣコロニー形状に対するマトリックス分解の効果を環状の形態計測分析により定量した。図７Ｄ：分解性または非分解性マトリックスで成長したコロニー内のＥ−カドヘリンおよびＦ−アクチンの発現および分布を示す蛍光画像。図７Ｅ：マトリックス分解性の関数としての円柱および極性化コロニーの割合の定量化。図７Ｆ〜Ｇ：分解性および非分解性マトリックスにおいて培養したコロニー内のＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現および定量化。図７Ｈ：分解性または非分解性ＰＥＧゲルで拡張され、オルガノイド形成条件下でのさらなる培養のためにマトリゲルに移されたＩＳＣコロニー。図７Ｉ：分解性または非分解性マトリックスで成長したＩＳＣコロニーのオルガノイド形成能の定量化。
【図８】図８は、オルガノイド形成が軟性マトリックスを必要とすることを示す。図８Ａ：分化条件に切り替えて２日後の形態およびＩＳＣコロニーにおけるＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現を示す明視野画像。図８Ｂ：一定の生化学組成を有するが、機械的特性は様々なＰＥＧ−マトリゲル複合体中の腸オルガノイド形態。図８Ｃ：様々な機械的特性を有する、ＰＥＧ−マトリゲル複合体中の腸オルガノイドバイアビリティの定量化。図８Ｄは、ラミニン−１１１が、オルガノイド形成のために、軟性（＜２００Ｐａ）マトリックスに加えて必要とされることを示す。ＡＧ７３、フィブロネクチン／ＲＧＤ、ヒアルロン酸およびパールカンは、ＩＳＣコロニー分化およびオルガノイド形成を支持することができなかった。図８Ｅ：ハイブリッドＰＥＧ−Ａｃｒ／ＰＥＧ−ＶＳマトリックスの形成した日および形成して４日後の機械的特性評価。最初の数字は、ゲル中のＰＥＧ−Ａｃｒポリマーのパーセンテージ（ＰＥＧ−ＶＳに対する）を示し、一方で、２番目の数字は、ゲルに対する全体のＰＥＧポリマー含有量（ｗ／ｖ）を示す。図８Ｆ：ＰＥＧ−Ａｃｒ／ＰＥＧ−ＶＳハイブリッドマトリックス中で４日間拡張したＩＳＣコロニー。挿入図は、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰを示す。図８Ｇ：ＰＥＧ−Ａｃｒ／ＰＥＧ−ＶＳハイブリッドマトリックス中で４日間拡張させ、その後、分化／オルガノイド形成条件下でさらに２日間培養したＩＳＣコロニー。図８Ｈ：７５％ＰＥＧ−Ａｃｒ／ＰＥＧ−ＶＳで拡張させたオルガノイドの、リゾチーム（パネート細胞）およびムチン−２（ゴブレット細胞）に対する免疫蛍光分析。
【図９】図９は、様々なマウスおよびヒトオルガノイドのＰＥＧ−ＲＧＤにおける培養および拡張を示す。図９Ａ：マウス膵管をＰＥＧ−ＲＧＤに埋め込み、２日間培養した。図９Ｂ：図９Ａに示す膵管の解離および再埋め込みから得られたマウス膵臓オルガノイド。図９Ｃ：様々な剛性を有するＰＥＧ−ＲＧＤマトリックス中のマウス膵臓オルガノイド。図９Ｄ：マトリックス剛性の関数としての膵臓オルガノイド形成効率の定量化。
【図１０】図１０は、様々なせん断弾性率を有し、ＲＧＤ有りまたは無しのハイドロゲルにおけるマウスおよびヒト腫瘍オルガノイドの生成を示す。図１０Ａ：様々な剛性を有するＰＥＧ−ＲＧＤマトリックスにおけるマウス結腸腺腫オルガノイド、およびマトリックス剛性の関数としての結腸腺腫オルガノイド形成効率の定量化。図１０Ｂ：ヒト患者由来結腸直腸癌オルガノイドは、軟性および硬性マトリックスにおいて、ＲＧＤ有りまたは無しで効率的に成長する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（定義）
ＡＧ７３（ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、配列番号１）は、ラミニンα１鎖の球状ドメインに由来する合成ペプチドである［５５］。
【００３７】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、「Ａおよび／またはＢ」などの表現で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、および「Ｂ」を含むことが意図されている。
【００３８】
ハイドロゲル（ゲル）は、親水性ポリマー鎖のネットワークを含むマトリックスである。
【００３９】
生体機能ハイドロゲルは、生きている細胞と相互作用して細胞バイアビリティおよび所望の細胞表現型を促進する生体接着性（もしくは生理活性）分子および／または細胞シグナル伝達分子を含有するハイドロゲルである。生体機能ハイドロゲルは、生理活性物質としても参照されうる。生体接着性分子の例としては、限定されないが、フィブロネクチン［５６］〜［５９］、ビトロネクチン［６０］、骨シアロタンパク質［６０］、ラミニン［６１］、［６２］、コラーゲン［６３］およびエラスチンが挙げられる。これらの分子は、細胞との相互作用を支配する細胞接着性ペプチドを含有する。細胞接着ペプチド配列の例としては、限定されないが、フィブロネクチン由来ＲＧＤ、ＫＱＡＧＤＶ、ＲＥＤＶおよびＰＨＳＲＮ、ラミニン由来ＹＩＧＳＲ、ＬＧＴＩＰＧ、ＩＫＶＡＶ、ＰＤＧＳＲ、ＬＲＥ、ＬＲＧＤＮおよびＩＫＬＬＩ、コラーゲン由来ＤＧＥＡおよびＧＦＯＧＥＲ、ならびにエラスチン由来ＶＡＰＧが挙げられる［６４］。
【００４０】
上皮細胞バイアビリティを促進するために上皮細胞と相互作用する生体接着性（または生体機能または生理活性）分子は従前に記載されている［３０］、［３１］。ハイドロゲルに生体機能を付与する生体接着性分子としては、限定されないが、フィブロネクチンまたはその機能的バリアント、例えば、ＦＦ  ＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片およびＦＮＩＩＩ１２−１４、またはＲＧＤ含有ペプチド、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＲＧＤＳＰＫ、ＲＧＤＴＰおよびＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰが挙げられる。生理活性分子の機能的バリアントは、同一または類似の生物学的または生化学的機能および類似の配列または組成を有する分子であり、例えば、切断型分子またはそのような分子の断片を指す。
【００４１】
生体適合性ハイドロゲルは、生きている組織および／または細胞に有意な毒性がなく、健康な個体において免疫病原性応答を誘発しないポリマーネットワークである。生体適合性能動機構は、特定の細胞または組織に対して毒性でない、例えば、温度の増加が組織の生理学的温度の範囲内であるプロセス、または有意な毒性を生じさせないために十分短く適用されるプロセスである。
【００４２】
「細胞適合反応により架橋可能」とは、生きている組織および／または細胞に対して有意に毒性でない反応により分子が架橋可能であることを意味する。そのような反応には、ｉ）ａ）酵素触媒反応、好ましくは第ＸＩＩＩａ因子などの活性化トランスグルタミナーゼに依存する反応、ならびにｂ）非酵素触媒および／または非触媒反応、好ましくはＭｉｃｈａｅｌ付加反応、からなる群から選択される恒久的共有結合形成、ならびに／またはｉｉ）シッフ塩基（イミン）結合、可逆性ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、可逆性ディールス・アルダー反応により形成される結合からなる群から選択される可逆的共有結合形成、ならびに／またはｉｉｉ）非共有結合（つまり、物理的）結合形成｛例えば、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス、静電的相互作用、ホスト−ゲスト相互作用、生体認識（ドメイン／タンパク質−リガンド相互作用）に基づくもの；自発的または温度変化もしくはバッファーのイオン強度の変化により誘導されるもの｝が含まれうる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「ＲＧＤ含有ペプチドで機能化した架橋親水性ポリマー」は、ハイドロゲルの親水性ポリマーとＲＧＤ含有ペプチドとの間の架橋による、アミノ酸配列「ＲＧＤ」を含有するペプチドのハイドロゲルへの組み込みを指す。
【００４４】
細胞を培養することは、維持および／または成長に適切な条件で細胞を維持するプロセスを指し、ここで条件は、例えば、細胞が保持される温度、栄養利用性、大気のＣＯ２含有量および細胞密度を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。上皮細胞を維持、増殖、拡張および様々な種類に分化するために適切な培養条件は、周知であり、文書化されている［６５］。オルガノイド形成に適切な条件は、細胞分化および多細胞構造の形成を促進し、可能にするための条件である。上皮細胞の拡張およびオルガノイド形成に適切な培養条件の詳細は、材料および方法を参照されたい。
【００４５】
加水分解は、水との相互作用を通じた結合の分解を指す。ハイドロゲルにおける加水分解的に非分解性の成分は、水との反応による分解に非感受性である。
【００４６】
ラミニンは、α、βおよびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有する細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーである。ラミニン−１１１は、ラミニン−１と同義である。ラミニン−１１１は、ＬＡＭＡ１遺伝子によってコードされる。
【００４７】
マトリゲルは、細胞培養の２Ｄおよび３Ｄモデルの両方で広く使用されている市販製品である。マトリゲルは、ＥＣＭリッチマウス腫瘍から抽出された可溶化基底膜調製物を含む。
【００４８】
オルガノイドは、幹細胞から発達し、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況に類似した様式の細胞選別および空間的に制限された分化系列決定を経て自己組織化（または自己パターン化）する、臓器特異的細胞種の三次元培養システムである。したがって、オルガノイドは、細胞の天然の生理を表し［６６］、天然の状況を模倣する細胞組成（残りの幹細胞、生理学的に近いニッチと、固有の細胞種との両方を含む）および解剖学的構造を有する。幹細胞は、組織またはオルガノイド断片から単離されうる。オルガノイドが生成される細胞は、分化して、ｉｎ  ｖｉｖｏの臓器と非常に類似の構造を形成するように自己組織化する、複数の細胞種を示す臓器様組織を形成する。したがって、オルガノイドは、ｉｎ  ｖｉｖｏの発達に非常に類似したシステムで、ヒト臓器およびヒト臓器発達を研究するための優れたモデルである。上皮細胞オルガノイドは、上皮細胞を含むオルガノイドである。単離された腸陰窩または幹細胞から成長したオルガノイドは、当該分野においては「エンテロイド（ｅｎｔｅｒｏｉｄ）」または「コロノイド（ｃｏｌｏｎｏｉｄ）」［６７］、［６８］と称される場合もある。
【００４９】
用語ＲＧＤまたはＲＧＤ配列は、最小の生理活性ＲＧＤ配列、つまりアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列であり、フィブロネクチンへの細胞結合を模倣するためにおよび／または付着依存性細胞の接着を促進するために十分な最小の（極小の）フィブロネクチン由来アミノ酸配列である。
【００５０】
ハイドロゲルのせん断弾性率は、ハイドロゲルの剛性率Ｇ、弾性率、または弾性と等しい。せん断弾性率は、せん断ひずみに対するせん断応力の比率として定義される。ハイドロゲルのせん断弾性率は、レオメータを使用して測定することができる（材料および方法を参照）。
【００５１】
本発明は、上皮細胞の拡張、形態形成およびオルガノイド形成を支持するために適切なハイドロゲルを提供する。これらのハイドロゲルは、本開示を部分的に形成する上皮幹細胞駆動オルガノイドの形成および維持の別個の段階を支配する微小環境特性および成分に基づくものである。
【００５２】
本発明は、上皮細胞の拡張および形態形成を支持するために適切なハイドロゲルを製造するための方法も提供する。これらの方法を使用して、３Ｄハイドロゲルの技術的特性は、ハイドロゲルにおける親水性ポリマー含有量ならびに実施例に記載されるようなポリマーハイドロゲル前駆体の分子量および／または機能性（架橋に利用可能な部位の数）を変動させることによって（ハイドロゲルが必要とされる培養方法にしたがって）調整することができる。
【００５３】
これらのシステムは、制御された生物物理学的および生化学的修飾を行うことができる十分定義された再現性のある環境を提供し、それゆえ、基礎および臨床研究において新規な、従来隔絶されていた方向性を開くものであり、一方で、臨床等級の腸細胞および組織の大規模生産の可能性も提供するものである。本明細書に記載の材料は、マウスおよびヒト起源のいずれからの他の正常および形質転換上皮オルガノイドの拡張のために使用することもできる。
【００５４】
本発明は、腸幹細胞（ＩＳＣ）自己再生、分化および形態形成を含む上皮幹細胞駆動オルガノイド形成（図１に要約）の別個の段階を支配する、重要な微小環境成分を提供する。この洞察を使用して、腸幹細胞およびオルガノイドの拡張のための、精密な機械的特性を有するポリ（エチレングリコール）ベースのハイドロゲルと、細胞外マトリックスへの接着を模倣する短い合成ペプチド配列とを含む、十分に定義された三次元培養システムを作製した。これらのシステムは、制御された生物物理学的および生化学的修飾を行うことができる十分定義された再現性のある環境を提供し、それゆえ、基礎および臨床研究において新規な、従来隔絶されていた方向性を開くものであり、一方で、臨床等級の腸細胞および組織の大規模生産の可能性も提供するものである。本明細書に記載の材料は、マウスおよびヒト起源由来の両方についての他の正常および形質転換上皮オルガノイドの拡張のために使用することもできる。
【００５５】
一部の実施形態では、本発明は、腸細胞培養のための２つの十分に定義された三次元ハイドロゲルシステムであって、一方で腸幹細胞（ＩＳＣ）の高純度拡張を支持し、他方でＩＳＣコロニーの拡張ならびにその後の分化およびオルガノイド形成の両方を支持する、三次元ハイドロゲルシステムを提供する。モジュール型の物理化学特性を有する合成ＰＥＧベースのハイドロゲルを含むこれらのハイドロゲルシステムの設計において、接着リガンドの種類および量、ならびにオルガノイド形成の別個の段階を支配する機械的特性の精密に定義された範囲を含む、重要な生物物理学的および生化学的パラメータを特定した（図１）。本発明の三次元ハイドロゲルシステムは、正常または腫瘍由来の他の種類の成体上皮幹細胞およびオルガノイドを培養するために適合させることができる。マウス膵臓および結腸腺腫由来オルガノイドの培養を本明細書で例示する。本発明の三次元ハイドロゲルシステムは、上皮組織の発達、生理学および疾患を研究するための基本的研究ツールとしてだけでなく、化学的に定義された再現性のある環境での薬理学的検査のためのプラットフォームとして、幅広い用途を見出すことができる。さらに、適正製造基準（ＧＭＰ）に適合する細胞および組織生産により、これらの材料は、ヒトにおける腸疾患および損傷の細胞ベースの処置に対する臨床的信頼性を有する。
【００５６】
本発明の一態様は、成体上皮幹細胞を培養するための三次元ハイドロゲルであって、ＲＧＤ含有ペプチドで機能化した架橋親水性ポリマーを含み、ここで、ＲＧＤ含有ペプチドの濃度は少なくとも０．０５％ｗ／ｖ（０．５ｍＭ）であり、ハイドロゲルは０．５〜５ｋＰａのせん断弾性率（剛性）を有する、三次元ハイドロゲルを提供する。
【００５７】
本発明の三次元ハイドロゲルは、成体上皮多能性幹細胞（主に腸細胞であるが、さらに結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房または肺幹細胞）の拡張のために特に最適化される。さらに本発明の三次元ハイドロゲルは、成体上皮多能性幹細胞（主に腸細胞であるが、さらに結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房または肺幹細胞）の拡張、ならびにその後の分化およびオルガノイド形成のためにも最適化される。
【００５８】
本発明の一部の実施形態では、親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキサゾリン、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）またはその混合物もしくはコポリマーを含む群から選択される。
【００５９】
一実施形態では、ハイドロゲル前駆体分子を架橋することにより得られる、使用されるハイドロゲルは、好ましくは、細胞適合架橋反応により架橋された親水性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ベースのポリマー、最も好ましくはマルチアーム（つまり、分岐状）ＰＥＧベースのポリマーにより構成される。
【００６０】
ハイドロゲル前駆体は、直鎖状ＰＥＧ分子またはマルチアームＰＥＧハイドロゲル前駆体分子、好ましくは４つのアームもしくは８つのアームを有するマルチアームＰＥＧハイドロゲル前駆体分子を含む群から選択されうる。ハイドロゲル前駆体は、さらに、１０〜４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧハイドロゲル前駆体分子を含む群から選択されうる。
【００６１】
ハイドロゲルの親水性ポリマー含有量は、バッファー中で膨潤して平衡化して１〜１０％ｗ／ｖの範囲でありえ、好ましい範囲は２．０〜４．０％ｗ／ｖ、およびＩＳＣの拡張のために最適化された２．５〜３．５％ｗ／ｖでありうる。
【００６２】
好ましい実施形態では、ＰＥＧベースの前駆体分子は、生理学的条件下のトロンビン活性化第ＸＩＩＩａ因子もしくは当該分野で公知の別の酵素架橋機構のいずれかを使用して、またはＭｉｃｈａｅｌ付加を介して、または当該分野で公知の別の穏やかな化学的架橋機構によって架橋可能であるように選択される。好ましいＦＸＩＩＩａ媒介架橋を達成するためには、少なくとも２つのハイドロゲル前駆体分子の一方は、リジン含有ペプチド配列で機能化されており、他方はグルタミン含有ペプチド配列で機能化されている。好ましいＭｉｃｈａｅｌ付加媒介架橋を達成するためには、２つのハイドロゲル前駆体分子の一方は、求核性基、最も好ましくはチオールで機能化したマルチアームＰＥＧ端であり、他方は、求電子性基、最も好ましくはビニルスルホンまたはマレイミドで機能化したマルチアームＰＥＧ端である。
【００６３】
ハイドロゲル前駆体分子の架橋は、通常、ハイドロゲル内で培養する細胞種の存在下で行われ、細胞または細胞凝集物が、形成されるハイドロゲルマトリックス内に封入される、つまり、別個の細胞培養微小環境内に存在するように行われる。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態では、ＲＧＤ含有ペプチドは、フィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片を含む群から選択されるＲＧＤ結合モチーフを含有するペプチドである。
【００６５】
他の好ましい実施形態では、ＲＧＤ含有ペプチドの濃度は、０．０５％〜１％ｗ／ｖ（０．５〜１０ｍＭ）の範囲内である。より好ましい実施形態では、ＲＧＤ含有ペプチドの濃度は、０．１％ｗ／ｖ（１ｍＭ）である。
【００６６】
本発明の他の実施形態では、フィブロネクチン由来断片またはフィブロネクチンアナログは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＲＧＤＳＰ（配列番号２）、ＲＧＤＳＰＫ（配列番号３）、ＲＧＤＴＰ（配列番号４）、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号５）、シクロ（ＲＧＤＳＰ）（配列番号２）、シクロ（ＲＧＤＦＫ）（配列番号６）、シクロ（ＲＧＤＹＫ）（配列番号７）、シクロ（ＲＧＤＦＣ）（配列番号８）を含む群から選択されるペプチド、またはＩＩＩ１−Ｃ断片（Ｍｏｒｌａら、１９９４）、ＦＮＩＩＩ９−１０断片およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片（Ｍａｒｔｉｎｏら、２０１１）を含む群から選択される断片である。
【００６７】
本発明の三次元ハイドロゲルでは、少なくとも０．０５％（０．５ｍＭ）、好ましくは０．０５％〜１％ｗ／ｖ（０．５〜１０ｍＭ）の範囲内の濃度のＲＧＤ配列を提供するために十分な量のフィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片の存在が、成体上皮幹細胞の生存および増殖のために不可欠である。さらに、濃度範囲（０．５〜１０ｍＭ）は、ＰＥＧハイドロゲル分野において非典型的に高い。
【００６８】
本発明による三次元ハイドロゲルの機械的特性、つまり剛性は、ハイドロゲル中の親水性ポリマー含有量、ならびにポリマーハイドロゲル前駆体中の分子量および／または機能性（架橋に利用可能な部位の数）を変動させることによって変化させることができる。
【００６９】
本発明によれば、成体上皮幹細胞のコロニー形成、増殖および自己再生は、０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１．０〜１．５ｋＰａのせん断弾性率（剛性）で最適に行われる。
【００７０】
本発明の一実施形態では、本発明の三次元ハイドロゲルは、０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１．０〜１．５ｋＰａのせん断弾性率（剛性）を有する。０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１．０〜１．５ｋＰａの範囲の望ましい初期剛性は、ハイドロゲル内のポリマー（ＰＥＧ）含有量を２．０〜４．０％ｗ／ｖに設定することにより達成される。
【００７１】
好ましい一実施形態では、本発明の三次元ハイドロゲルは、２．０〜４．０％ｗ／ｖの範囲内の親水性ポリマー含有量を有し、０．０５％〜１．０％ｗ／ｖの範囲内のＲＧＤの濃度を有し、ハイドロゲルは０．５〜２．５ｋＰａのせん断弾性率を有する。
【００７２】
さらなる好ましい実施形態では、１．３ｋＰａのせん断弾性率（剛性）を有し、１ｍＭ（０，１％ｗ／ｖ）の濃度でＲＧＤを含有する本発明の三次元ハイドロゲルは、ＩＳＣ自己再生および大規模拡張のための最適な最小マトリックスである。
【００７３】
本発明のいずれかの実施形態では、ハイドロゲルは、本明細書に記載の他の成分に加えて最大１０％のマトリゲルまたは同様の天然由来バイオポリマーマトリックスを含んでもよい。１〜１０％、３〜１０％、５〜１０％、および好ましくは１０％のマトリゲルが使用されうる。
【００７４】
別の態様では、本発明は、最初に、ＩＳＣ自己再生およびコロニー形成に適した（したがってＩＳＣを拡張させる）剛性を提供するが、経時的に軟化してＩＳＣコロニー分化および上皮／腸オルガノイド形成をもたらし、さらにラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を含有している三次元ハイドロゲルを提供する。この動的三次元ハイドロゲルは、わずかに改変して、他の種類のマウスおよびヒト上皮幹細胞およびオルガノイドを培養するために使用することができる。
【００７５】
一実施形態では、本発明の三次元ハイドロゲルは、０．５〜５ｋＰａ、好ましくは０．５〜２．５ｋＰａの初期せん断弾性率（剛性）、および５０〜２００Ｐａの最終せん断弾性率（剛性）を有する。軟化の動態（時間）は細胞種依存的であるが、軟化は、幹細胞の拡張が生じている間の時間枠内で、分化、上皮出芽およびオルガノイド形成が始まる前に生じるべきである。上皮幹細胞から開始して出芽上皮オルガノイドを形成するために、本発明の三次元ハイドロゲルを軟らかくすること、つまり０．５〜５ｋＰａ、好ましくは０．５〜２．５ｋＰａの初期せん断弾性率（剛性）を、分化およびオルガノイド形成工程の開始時に５０〜２００Ｐａの最終せん断弾性率（剛性）に低下させることが必要である。本発明によれば、２００Ｐａ未満への剛性の低下が、オルガノイド形成の開始を成功させるために重要である。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明の三次元ハイドロゲルは、１〜２ｋＰａの初期せん断弾性率（剛性）、および８０〜１５０Ｐａの細胞培養４日後の最終せん断弾性率（剛性）を有する。
【００７７】
本発明の三次元ハイドロゲルの軟化、つまり剛性減少は、細胞適合性の受動的ストラテジー、好ましくは易加水分解性化学結合を含有する水溶性ポリマーもしくはポリマー骨格のドメインの組み込み、好ましくはＭｉｃｈａｅｌ付加によりチオール基との不安定なエステル結合を形成するアクリレート基で機能化したポリ（エチレングリコール）の組み込みによって、または細胞適合性の能動ストラテジー、好ましくは光の適用、人工的な切断部位、もしくは組織の細胞外マトリックスで比較的希少であるタンパク質もしくは糖などの生分解性材料の組み込みによって、当業者に公知の様々なストラテジーにより達成することができる。
【００７８】
ポリマーまたはポリマーのドメイン由来の易加水分解性化学結合は、ポリ（ａ−エステル）（例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリカプロラクトン、またはポリ（プロピレンフマレート）、ポリ無水物、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリホスホエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、またはそれらの組み合わせを含むポリマーの基から選択されうる。
【００７９】
人工的な（つまり、非哺乳類プロテアーゼによって認識される）切断部位は、好ましくは、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号９）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１０）内に含まれており、タバコエッチ病ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ；ＴＥＶ）プロテアーゼによって認識されるＱ／ＧまたはＱ／Ｓ部位である。
【００８０】
光媒介ストラテジーを介して軟化、つまり剛性の低下が達成されるハイドロゲルネットワークは、ＵＶ、可視光または二光子光への曝露に応答して分解を受ける感光性部分が組み込まれている。感光性部分は、好ましくはｏ−ニトロベンジルまたはｐ−ヒドロキシフェナシルファミリーから選択され、最も好ましくは、ｏニトロベンジル、ジメトキシニトロベンジル、およびヒドロキシフェナセチルヨウ化物である。
【００８１】
小腸オルガノイドの形成に最適化された特定の実施形態では、剛性の低下は、１：３の比率のＰＥＧ−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）／ＰＥＧ−アクリレート（ＰＥＧ−Ａｃｒ）ハイブリッドからなるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の特定の配合により達成することができる。
【００８２】
さらなる特定の実施形態では、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片は、５ｇ／ｍｌ〜２５０ｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００８３】
別の特定の実施形態では、本発明の三次元ハイドロゲルは、ラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を５μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌの濃度でさらに含み、親水性ポリマーが、１：３の比のＰＥＧ−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）／ＰＥＧ−アクリレート（ＰＥＧ−Ａｃｒ）ハイブリッドからなるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、ハイドロゲルは、０．５〜２．５ｋＰａの初期せん断弾性率、８０〜１５０Ｐａの細胞培養４日後の最終せん断弾性率を有する。
【００８４】
しかしながら、機械的特性、つまり剛性の必要な低下は、細胞分泌プロテアーゼ、例えばマトリックス−メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に感受性のペプチドのハイドロゲルへの組み込みを介したハイドロゲルへの分解特徴の付与によっては達成することができず、その理由は、タンパク質分解により、上皮幹細胞拡張、分化および形態形成の複数の態様が損なわれるからである。
【００８５】
本発明の別の態様は、本発明の三次元ハイドロゲルを調製する方法に関する。特に、この方法は、ａ）１つまたは複数の異なるハイドロゲル前駆体分子を用意するステップ、ｂ）ステップａ）のハイドロゲル前駆体分子を組み合わせ、その様々な組み合わせを別個の体積の基板に、好ましくはマルチウェルプレートに分配するステップ、ｃ）別個の体積に、１つまたは複数のＲＧＤ配列含有ペプチド、例えばフィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片を加え、ステップｅ）において存在するハイドロゲル前駆体分子または形成されるハイドロゲルの少なくとも１つに分子を接着させるかまたはそれらを自由に拡散させるステップ、ｄ）任意選択でラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を加えるステップ、ｅ）細胞を別個の体積の基板に加えるステップ、ならびにｆ）ハイドロゲル前駆体分子を架橋してハイドロゲルを形成するステップを含む。
【００８６】
上記方法のステップａ）では、使用されるハイドロゲル前駆体分子は、好ましくは化学的または酵素的に反応性のポリマーＰＥＧベースの前駆体であり、この前駆体には生体分子を繋ぐことができ、細胞バイアビリティを損なわない機構で架橋することができる。ＰＥＧベースの前駆体が、トランスグルタミナーゼの例えば第ＸＩＩＩａ因子などの（グルタミンおよびリジン保持）ペプチド基質を含む場合、架橋は、この酵素を用いて実施してもよい。経時的な機械的軟化が必要であるとき、親水性分解を容易にするために、ハイドロゲル前駆体分子は、例えば、不安定なエステル結合を含有するポリマー、つまり、経時的にハイドロゲルの構造的および機械的特性の局所的な変化を含むものでもよい。
【００８７】
ステップｅ）で、ハイドロゲル前駆体分子を架橋した三次元ハイドロゲルの形成は、少なくとも１つの架橋剤を使用して達成してもよい。ＰＥＧベースの前駆体分子が使用されるとき、トロンビン活性化ＸＩＩＩａ因子が選択される架橋剤である。しかしながら、互いに容易に反応性である２つの異なる前駆体分子を組み合わせて直ぐに架橋を生じさせることも考えられる（例えば、高度に選択的ないわゆるクリック化学、または他の化学的な非酵素触媒反応、例えばＭｉｃｈａｅｌ付加反応など）。
【００８８】
本発明の別の態様は、成体上皮幹細胞を拡張させるための方法であって、単一細胞または多細胞クラスターを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を培養することを含む方法を提供する。
【００８９】
一部の好ましい実施形態では、細胞は、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房または肺幹細胞である。
【００９０】
本発明の別の態様は、正常（健常）上皮オルガノイドを培養および拡張するための方法であって、ｉ）上皮オルガノイドの断片を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切なオルガノイド形成条件下でオルガノイドを培養すること、またはｉｉ）単一のまたはクラスターの上皮幹細胞を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を拡張し、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法を提供する。
【００９１】
一部の実施形態では、上皮オルガノイドは、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房または肺由来である。
【００９２】
本発明の別の態様は、上皮腫瘍由来オルガノイドを培養および拡張するための方法であって、腫瘍由来単一細胞または多細胞クラスターを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を拡張し、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法を提供する。
【００９３】
一部の実施形態では、腫瘍由来単一細胞は、結腸直腸、胃、肝臓、膵臓、乳房または肺の腫瘍に由来する。
【００９４】
本発明の別の態様は、上皮組織再生のための方法であって、ａ）患者由来の上皮幹細胞またはオルガノイドを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件または適切なオルガノイド形成条件下で拡張させること、およびｂ）拡張された幹細胞またはオルガノイドを患者に移植して戻すことを含む方法を提供する。
【００９５】
本発明の別の態様は、腸幹細胞自己再生およびコロニー形成を研究するための方法であって、腸幹細胞を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を培養することを含む方法を提供する。
【００９６】
本発明の別の態様は、腸幹細胞分化、腸組織極性化および形態形成を研究するための方法であって、ｉ）腸オルガノイドの断片を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切なオルガノイド形成条件下でオルガノイドを培養すること、またはｉｉ）単一のまたはクラスターの腸幹細胞を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な自己再生条件下で細胞を拡張し、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法である。
【００９７】
本発明の別の態様では、腫瘍細胞死または成長停止の誘導における効力について、薬理化合物または生体分子または細胞のライブラリをスクリーニングするための方法であって、ｉ）腫瘍細胞またはオルガノイドを本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、試験される化合物の存在下、適切な条件下で細胞またはオルガノイドを培養すること、ならびにｉｉ）細胞死および／または成長停止をモニタリングすることを含む方法を提供する。
【００９８】
細胞死および／または成長停止のモニタリングは、当業者に公知の方法によって実施される。
【００９９】
さらなる態様では、本発明は、個別化治療に適した様式で、嚢胞性線維症（ＣＦ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などのヒト腸疾患をモデル化するために合成３Ｄハイドロゲルベースの培養システムを適合させるための拡張性および再現性のある方法を提供する。この目的のために、本発明に基づくオルガノイドシステムは、個々の患者由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長腸生検試料に対する薬理化合物または生体分子の効果を調べるためのスクリーニングツールとして利用することができる。そのような腸疾患の処置における効力について薬理化合物または生体分子のライブラリをスクリーニングするための方法は、ｉ）患者由来の腸生検試料を用意すること、ｉｉ）腸生検試料を本発明の三次元ハイドロゲルに封入し、成長させ、試験される薬理化合物または生体分子の存在下、適切な条件下で生検試料を培養すること、ならびにｉｉｉ）嚢胞性線維症の場合には、フォルスコリン誘導オルガノイド膨張のモニタリングにより嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の成功した機能回復を評価すること、またはｉｖ）炎症性腸疾患の場合には、炎症、細胞損傷もしくは細胞死の成功した減少または上皮接合の完全性の回復をモニタリングすることを含む方法である。
【０１００】
好ましい実施形態では、腸疾患は、嚢胞性線維症および炎症性腸疾患を含む群から選択される。
【０１０１】
本発明の三次元ハイドロゲルは、基本ツールおよびトランスレーショナルリサーチツールの両方としてインパクトがある。ＩＳＣ自己再生、分化、陰窩−絨毛パターン形成、炎症および悪性形質転換を含む腸特異的プロセスならびに頂底極性の確立およびルーメン形成を含む一般的な上皮現象を、十分に化学的に定義された再現可能な環境で研究することができる。本明細書で導入されるマトリックスの基礎として機能するＰＥＧハイドロゲルのモジュール性を考慮すると、ＥＣＭタンパク質、細胞間相互作用タンパク質、マトリックス分解性および機械的特性を含む微小環境パラメータの腸生物学の様々な態様に対する効果を解明することができる。さらに、本発明の三次元ハイドロゲルによって提供される化学的に定義された環境は、再現性および信頼性が最も重要である薬理学的化合物または生体分子のスクリーニングの高価で大規模な試みの状況において、特に有益である。結腸直腸腺癌由来のＣａｃｏ−２細胞株の単層は、経口投与薬物の薬物動態試験における腸吸収モデルとして現在の標準であるが、初代腸オルガノイドは、Ｃａｃｏ−２モデルの組織学的に実際的な相補物または代替物として機能することができ、患者由来オルガノイドを使用する個別化研究の可能性も提供する。本明細書で導入されるハイドロゲルシステムと、ロボットおよび液体処理技術とをインターフェイスで連結して、ハイスループット薬物スクリーニングを提供することが容易に考えられる。最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡張された結腸オルガノイドを移植すると損傷結腸上皮を効果的に修復できることが概念実証研究により実証されているが、マトリゲル拡張オルガノイドを使用してヒトの腸損傷および疾患を処置することは想像しうることではない。本明細書に記載のハイドロゲルは、化学的に定義された合成ペプチド配列を有するＰＥＧ骨格コンジュゲートを含み、したがってＧＭＰに適合している。本発明の三次元ハイドロゲルは、ＩＳＣおよび腸オルガノイドだけでなく、胃、結腸、直腸、膵臓、肝臓、肺および乳腺に由来するものを含む他の種類の上皮幹細胞およびオルガノイドを拡張および移植するためにも容易に適合させることができる。
【０１０２】
本発明の三次元ハイドロゲルは、上皮幹細胞およびオルガノイドを培養するための、合成の、化学的に定義された、動物製品不含の環境を提供する。つまり、上皮幹細胞を培養するために従来使用されているハイドロゲルマトリックスおよびオルガノイド（例えば、マトリゲル）は、動物由来（つまり、天然）製品であり、組成が十分に定義されていないが、一方で本発明の三次元ハイドロゲルは、実験室で合成的に製造することができる少数の十分に定義された成分を含む。したがって、それらは合成物で、十分に定義されている。そのような特性の利点は重要で、当業者にとって明らかである。但し、ある特定の用途のために、天然由来マトリックス成分またはその混合物の少量（例えば、マトリゲル、例えば、最大１０％のマトリゲル）を添加することは、本発明から除外されないと理解される。
【０１０３】
さらなる態様では、本発明は、別個の体積の本発明の三次元ハイドロゲルを作製するためのキットオブパーツであって、成分ａ）１つまたは複数の親水性前駆体ポリマー、成分ｂ）フィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片、成分ｃ）前駆体ポリマーａ）のための架橋剤、および成分ｄ）ラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を含む、キットオブパーツを提供する。本発明のキットオブパーツの実施形態では、親水性ポリマーは、マルチアームポリ（エチレングリコール）分子を含み、フィブロネクチン由来断片は、ＲＧＤＳＰＧペプチドである。
【０１０４】
本発明のキットオブパーツのさらなる実施形態では、マルチアーム ポリ（エチレングリコール）分子は、好ましくは成分ｃ）として含まれる酵素により架橋可能であり、好ましくは、少なくとも２つのハイドロゲル前駆体分子の一方は、架橋酵素に対するグルタミン担持ペプチド基質によって、他方はリジン担持ペプチド基質によって機能化されており、トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子が、成分ｃ）として含まれている。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のキットオブパーツの成分は、容器中、好ましくはマルチウェルプレートのウェルまたはチューブ中に、実質的に未反応形態で、好ましくは乾燥形態で、予め供給されて用意されている。実際、本発明の三次元ハイドロゲルの成分は、プレートまたは他の貯蔵器に、乾燥形態（凍結乾燥形態）で予め配合されていてもよい。キットは、本発明の方法の実行の仕方についての指示を含む取扱説明書をさらに含んでもよい。
【０１０６】
（上皮細胞オルガノイドを成長させるための方法）
別の態様では、本発明は、生体機能３Ｄハイドロゲル中で細胞を培養することを含む、上皮細胞オルガノイドを得るための方法であって、
ａ）細胞は、単離された組織またはオルガノイド断片を含み、細胞は、オルガノイド形成に適切な条件で培養されるか、または
ｂ）細胞は、単一のまたはクラスターの幹細胞を含み、細胞は、最初に細胞拡張に適切な条件で培養され、その後、オルガノイド形成に適切な条件で培養され、
ハイドロゲルは、０．０５〜３ｋＰａのせん断弾性率を有する、方法に関する。
【０１０７】
ハイドロゲル内の細胞の成長は、細胞をゲル内に封入することを必要とする。細胞は、５００〜１０００細胞μｌ−１、好ましくは、５００細胞μｌ−１の細胞密度で播種しうる。
【０１０８】
方法の一実施形態では、ハイドロゲルのせん断弾性率は経時的に低下し（実施例９）、好ましくは、方法の開始時点でのハイドロゲルのせん断弾性率は、０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１〜２ｋＰａ、最も好ましくは１．３ｋＰａまたは２ｋＰａであり、方法の終了でのハイドロゲルのせん断弾性率は、５０〜５００Ｐａ、好ましくは１００〜３００Ｐａ、より好ましくは８０〜１５０Ｐａ、最も好ましくは１２０Ｐａである。方法の開始は、幹細胞または組織断片が、ハイドロゲル内に最初に封入されたときを指す。方法の終了は、上皮オルガノイドが形成されたときである。
【０１０９】
本発明のこの実施形態で使用されるハイドロゲルの動的特徴は、ハイドロゲル中のエステル結合の加水分解により生じてもよく、好ましくは、エステル結合はマルチアーム ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子から誘導され、より好ましくは、マルチアームＰＥＧ分子は平均で３〜１２のアームを含み、最も好ましくは、アームはアクリレート基で終結する。これらのＰＥＧ分子は、好ましくは、動的ハイドロゲルネットワークの７０〜８０％を構成し、好ましくは残りのパーセンテージのハイドロゲルは、加水分解的に非分解性である。
【０１１０】
本発明の代替的実施形態では、生体適合性能動機構、好ましくは、光、生体分子、小分子、温度または他の物理的パラメータの変化への曝露を含む生体適合性能動機構を通じてハイドロゲルのせん断弾性率の低下が達成され、好ましくは、能動機構は、ハイドロゲルの１つの成分のみに選択的である。能動機構には、タンパク質分解酵素によるハイドロゲル中の特定の標的部位の切断が含まれうる。そのような酵素の例は、生化学的ツール（例えば、タンパク質工学）として広く使用されているタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）エンドペプチダーゼ、または別の非哺乳類プロテアーゼである。
【０１１１】
本発明のいずれかの方法で使用されるハイドロゲルは、好ましくはラミニン−１１１またはその機能的バリアントを含み（実施例１０）、好ましくは、ラミニン−１１１またはその機能的バリアントは、少なくとも５μｇ／ｍｌの濃度である。
【０１１２】
本発明の方法によって使用されるハイドロゲルは、腸細胞外マトリックスを構成する１つまたは複数の生体機能分子、例えば、限定されないが、ビトロネクチン、ＲＧＤ含有ペプチド、例えば、フィブリンおよびフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、プラスミン、アグリカン、ブレビカン、テネイシン、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、シンデカン−Ｉ（プロテオグリカン）、およびＩＧＦ結合タンパク質、またはこれらの分子の接着配列を含有するペプチドを組み込むことによって生体機能性が付与されうると理解される。
【０１１３】
本発明の別の態様は、上皮幹細胞オルガノイド形成を定量化するための方法であって、
ａ）本発明の方法を使用してオルガノイドを得ること、および
ｂ）定量的ハイコンテントイメージングアプローチにより、オルガノイドへの細胞の自己組織化をモニタリングすること
を含む方法に関する。
【０１１４】
（上皮細胞を成長させるための方法）
別の態様では、本発明は、成体上皮幹細胞を成長させるための方法であって、成体上皮幹細胞を、生体機能ハイドロゲルで、細胞拡張に適切な条件で培養させることを含み、ハイドロゲルは、ラミニン−１１１またはその断片を含み、ハイドロゲルは、０．２〜２ｋＰａのせん断弾性率を有する、方法に関する。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、ハイドロゲルは、０．２、０．３、０．７、１．３または１．７ｋＰａのせん断弾性率を有する（実施例７）。さらなる実施形態では、上皮幹細胞は、多細胞培養物または単離された組織断片に由来する。
【０１１６】
本発明のいずれかの方法で使用されるハイドロゲルは、好ましくは、架橋親水性ポリマーおよび機能分子を含み、好ましくは、機能分子は、オリゴペプチド、小分子、タンパク質、オリゴもしくは多糖類、またはオリゴもしくはポリヌクレオチドを含む。機能分子は、フィブロネクチンまたはその機能的バリアントなどのＲＧＤ含有リガンドであってもよく、好ましくはフィブロネクチンの機能的バリアントは、直鎖状、分岐状または環状ペプチドであり、より好ましくは、その機能的バリアントは、ＦＦ  ＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片、およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片を含む群から選択される。代替的実施形態では、ＲＧＤ含有リガンドは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＲＧＤＳＰＫ、ＲＧＤＴＰおよびＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰを含む群から選択されてもよい。
【０１１７】
本発明のいずれかの方法で使用されるハイドロゲルは、好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリオキサゾリン、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、またはその混合物もしくはコポリマーを含む群から選択されるポリマーを含む。
【０１１８】
本発明の方法は、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房、腎臓、角膜、表皮、毛包、前立腺、眼または肺の上皮細胞を含む細胞を成長させるために使用してもよい。
【０１１９】
本発明の方法は、腫瘍由来細胞、例えば、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房、腎臓、角膜、表皮、毛包、前立腺、眼または肺の腫瘍由来の細胞を成長させるために使用してもよい。
【０１２０】
本発明の方法で使用されるハイドロゲルは、好ましくは、細胞分泌プロテアーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）による分解に対して非感受性である。本発明の方法で使用されるハイドロゲルは、好ましくは、生体適合性である。
【０１２１】
本発明の方法は、上皮オルガノイドを成長させるハイドロゲルを製造するために最適化されている。しかしながら、本発明の方法は、他の種類の幹細胞およびオルガノイドの成長に使用するハイドロゲルを製造するために最適化されてもよいことが理解される。
【０１２２】
（ハイドロゲル）
本発明のハイドロゲルは、好ましくは５％ｗ／ｖ未満、より好ましくは３％ｗ／ｖ未満、最も好ましくは２％ｗ／ｖ未満でポリマーを含む。またハイドロゲルは、脱イオン水での膨潤率（架橋直後のゲルの体積に対する膨潤後のゲル体積の比として定義される）未満を示し、流体に曝露されたとき、好ましくは２００％未満、好ましくは１５０％未満の膨潤率を示す。
【０１２３】
本発明のハイドロゲル中の機能分子は、好ましくは、０．１〜４．５ｍＭ、最も好ましくは１ｍＭの濃度である。機能分子は、フィブロネクチンまたはその機能的バリアントでありうるＲＧＤ含有リガンドを含んでもよく、好ましくは、フィブロネクチンの機能的バリアントは分岐状または環状ペプチドである。その機能的バリアントは、ＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片、およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片を含む群から選択されうる。あるいは、ＲＧＤ含有リガンドは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰ、ＲＧＤＳＰＫ、ＲＧＤＴＰ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰを含む群から選択されてもよい。
【０１２４】
ハイドロゲルは、１．３ｋＰａのせん断弾性率を有しうる。あるいは、ハイドロゲルのせん断弾性率は、０．２〜０．７ｋＰａ、好ましくは０．２ｋＰａでありえ、好ましくは、ハイドロゲルの機能分子は、ラミニン−１１１またはその機能的バリアントを含み、好ましくは、ラミニン−１１１は、少なくとも５μｇ／ｍｌの濃度である。ハイドロゲルは、好ましくは、ＲＧＤ含有リガンドをさらに含む。
【０１２５】
ハイドロゲルのポリマーは、共有結合または非共有結合の架橋反応を介して架橋されているＰＥＧであってもよい。共有結合架橋反応は、酵素反応であってもよく、好ましくはトランスグルタミナーゼ媒介架橋反応であり、最も好ましくはトランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子媒介架橋反応である。共有結合架橋反応は、穏やかな化学選択的反応であってもよく、好ましくは「バイオクリック」反応のファミリーの一つであり、最も好ましくは、求核試薬とエチレン性不飽和結合、例えばマレイミドまたはビニルスルホンとの間のＭｉｃｈａｅｌ型付加反応であってもよい。
【０１２６】
あるいは、ポリマーは、好ましくは自発的な加水分解を受けることによって、架橋時に水溶液中のハイドロゲルネットワークを不安定にする官能基を含んでもよい。不安定ハイドロゲル成分は、加水分解的に分解性のエステル結合を含むＰＥＧ−アクリレートから誘導されうる。ハイドロゲルは、水溶液中で安定なポリマー、例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホンからさらに架橋されたものでもよく、好ましくは、不安定なポリマーは、架橋されたとき、ハイドロゲルポリマーネットワークの７０〜８０％を構成する。
【０１２７】
ハイドロゲルは、水溶液でのインキュベーション前のハイドロゲルのせん断弾性率が０．５〜２．５ｋＰａ、好ましくは１〜２ｋＰａ、最も好ましくは１．３ｋＰａであり、水溶液での４日間のインキュベーション後のハイドロゲルのせん断弾性率が５０〜５００Ｐａ、好ましくは１００〜３００Ｐａ、より好ましくは８０〜１５０Ｐａ、最も好ましくは１２０Ｐａであるように動的であってもよい。
【実施例】
【０１２８】
当業者は、ここに記載される本発明が、具体的に記載される以外の変更および改変を受けることが可能であることを理解する。本発明が、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、そのような変更および改変の全てを含むことを理解すべきである。本発明は、本明細書に個々または集合的に参照または示された全ての工程、特徴、組成物および化合物ならびに任意のおよび全ての組み合わせまたは前記工程もしくは特徴の任意の２つ以上の組み合わせも含む。したがって、本開示は、全ての態様が例証であって、限定的でなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、均等の意味および範囲内に入る全ての変更が、本発明の範囲に含まれることが意図されていると考えられるべきである。
【０１２９】
上記説明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解される。しかしながら、そのような実施例は、本発明を実施する方法の例示であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０１３０】
（実施例１：生理活性ハイドロゲルは、上皮細胞の成長を支持することができる）
マトリゲルが、上皮オルガノイドを成長させるために現在使用されている。マトリゲルが、物理的支持を提供する単なる受動的３Ｄ足場として機能しているのか、または本質的きっかけを提供することによってオルガノイド形成に積極的に影響を与えているのかという問いに対処するために、新たに単離した腸陰窩を、軟性の水和された、何ら生化学シグナルを与えることなくマトリゲルの基本的物理特性を模倣する、酵素的に架橋されたＰＥＧハイドロゲルに埋め込んだ。マトリゲルで培養した陰窩は２４時間以内に再編成されてルーメン含有上皮コロニーを形成したが、一方でＰＥＧに埋め込まれたものは再編成できず、同じ期間内で細胞死に至り（図１Ｂおよび図１Ｃ）、このことから、物理的支持だけでなく、マトリックスにより提供される活性な生化学的シグナルが、陰窩バイアビリティおよび形態形成に必要であることが示唆された。
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで腸上皮は、異なる時空間パターンで発現されるいくつかのタンパク質で構成された基底膜と直接接触している（図２Ａ）。注目すべきことに、フィブロネクチンおよびα１ラミニンサブユニットを含む特異的タンパク質成分の発現は、ＩＳＣ収容陰窩底部を囲む領域に限定されている。同様に、ＣＤ４４（ヒアルロン酸を認識し、それに結合する細胞表面受容体）は、ＩＳＣによって特異的に発現される。それらの物理的な近さを考慮すると、これらのタンパク質と糖はＩＳＣのニッチを構成することができ、ＰＥＧハイドロゲルへの組み込みは陰窩の生存および形態形成を高めうると推論された。動物由来全長フィブロネクチンを組み込むことによる接着きっかけの提供は、マトリゲルベースの培養に付き物の一連の制限を導入し、一方でタンパク質組み換え型の含有は、特に大規模細胞および組織生産の目的にとっては費用がかかりすぎる。したがって、共有結合的に付着する短いペプチド配列によりフィブロネクチンおよびラミニンベースの接着を模倣することが求められた。フィブロネクチンへの細胞結合を模倣することが知られるＲＧＤ配列は周知であるが、全長タンパク質との細胞の相互作用は短いアミノ酸配列によって上手く模倣されておらず、ラミニンべースの接着を再現することは単純ではない。
【０１３２】
腸細胞生存を支持する短い配列を特定するために、ラミニンα１サブユニット（表１）由来の特定の結合配列をＰＥＧ骨格に繋いで、軟性（Ｇ’＝２００Ｐａ）ハイドロゲルのライブラリを作製した。腸組織生存および形態形成についてのライブラリをスクリーニングすることにより、オルガノイドバイアビリティを有意に増強させ、さらなる成長を支持する２つのラミニン由来ペプチド、ＡＧ７３およびＡ５５が明らかとなった（図２Ｂ）。同じゲルでこれらの２つの配列を一緒に存在させると、おそらくは冗長的なシンデカンベースの接着シグナル伝達のために、相加的効果はないようであった。したがって、より強い別個の効果を有する配列、つまりＡＧ７３、および対応するＰＥＧゲル（ＴＧ  ＰＥＧ−ＡＧ７３として参照）を、さらなる特性決定のために選択した。ＰＥＧゲル骨格に繋ぐＡＧ７３ペプチドの量を変化させると、腸オルガノイドバイアビリティおよび成長に対する用量依存的効果が明らかになった（図２Ｃ〜Ｅ）。
【０１３３】
修飾のないＰＥＧまたはＰＥＧ  ＲＧＤと比較してＴＧ  ＰＥＧ−ＡＧ７３マトリックスでの生存率および形態形成は改善するにもかかわらず、プロセスの効率は、マトリゲルと比較して有意に低く、形態学的差異が明らかであった（図２Ｃ）。ＡＧ７３の効果が濃度依存的であることを考慮すると（図２Ｅ）、これらの差異は、合成系内のＡＧ７３リガンド密度が最適でない可能性に起因すると考えられた。この実施例で使用されるＰＥＧシステムに組み込むことができる繋ぎ因子の濃度には上限がある：この上限を超えると、ゲルの構造的完全性が破壊される。この限界を回避して、ＡＧ７３リガンドの濃度増加により合成マトリックスの生体機能性を増強させるために、化学的に架橋された機能化ＰＥＧゲルを検討した。
【０１３４】
（実施例２：機能化ハイドロゲルへの生体分子の組み込み）
最初の架橋反応におけるＰＥＧ高分子の構造を修飾すると、第２の架橋反応において低固形分含有量ハイドロゲルの生産が容易になり、機械的特性に影響を与えずに生体機能が付与された。
【０１３５】
ＡＧ７３リガンドを高密度で組み込むために、ＡＧ７３配列が２つの短いシステイン含有配列によって隣接される機能分子を設計した。ＶＳ−コンジュゲート４アーム液体ＰＥＧ高分子を、ＶＳ基と２つのシステイン残基を含有する短い架橋剤のチオールとのＭｉｃｈａｅｌ付加を介して、固体ハイドロゲルに共有結合的に連結した。得られた３、３．５および４％のＰＥＧゲル（以下、ＭＴ−ＰＥＧ−ＡＧ７３として参照）は、それぞれＡＧ７３リガンドの濃度が３．１、３．７および４．２ｍＭであり、したがって最高濃度を上回る濃度が酵素的に架橋されたマトリックスで達成された。これらのマトリックスは、ＴＧ  ＰＥＧ−ＡＧ７３ゲルよりかなり軟らかく（図３Ｍ）、したがって腸オルガノイド形成のための別の微小環境要件を満たしている。
【０１３６】
（実施例３：機能化ハイドロゲルはオルガノイド維持を支持する）
機能化ハイドロゲルは、腸組織断片内で上皮オルガノイド維持を支持することができた。ＭＴ  ＰＥＧ−ＡＧ７３に腸組織断片を埋め込むことにより、生存し、形態形成し続ける組織のパーセンテージが、マトリゲルにおいて観察されたものに近づくことが分かった（図３Ｂおよび図３Ｃ）。
【０１３７】
０．５または１ｍＭのいずれかでＲＧＤを含有する様々な剛性の機能化生理活性ハイドロゲル（４および８アームのＭＴ  ＰＥＧ−ＲＧＤ）に封入されたＩＳＣも、ＩＳＣ増殖を支持することができた（図３Ａ）。
【０１３８】
ＭＴ−ＰＥＧ−ＡＧ７３およびＭＴ  ＰＥＧ−ＲＧＤで成長したオルガノイド内のＩＳＣの維持を確認するために、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰリポーターマウスから抽出した組織を合成ハイドロゲルに埋め込み、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）発現をモニタリングした。Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰは、オルガノイドの陰窩状芽に局在する予想されたパターンで発現した（図３Ｂ）。マーカーを発現するオルガノイドの割合は、ＴＧ−ＰＥＧ−ＡＧ７３で培養したものよりもＭＴ−ＰＥＧ−ＡＧ７３における方が有意に高く、マトリゲルで培養したオルガノイドと少なくとも同等であった（図３Ｃ）。注目すべきことに、ＰＥＧの割合および結果としてマトリックス剛性が増加したときに、組織バイアビリティのわずかだが有意な低下が観察された（図３Ｄ）。ファロイジンを用いた染色により、Ｆ−アクチンが上皮の管腔側に濃縮していることが明らかになり、組織内の頂底極性の確立が確認された（図３Ｅ）。幹細胞の機能性細胞種への分化は、免疫蛍光分析により確認した。リゾチームの染色により、パネート細胞の存在が、Ｌｇｒ５＋幹細胞で散在した特徴的なチェッカーボード模様で予想位置に確認された（図３Ｆ）。したがって、オルガノイドは、ハイドロゲルでの培養中に、上皮細胞オルガノイドの通常の特性を保持していた。
【０１３９】
（実施例４：ハイドロゲルは上皮細胞の成長を支持する）
非機能化ＰＥＧ−ＲＧＤハイドロゲルで培養した新たに単離した陰窩は、生存して、コロニーを形成する（図３Ｇ〜Ｉ）。解離および再埋め込みに際し、これらの細胞は二次コロニーを生じ（図３Ｊ）、ＰＥＧ−ＲＧＤが新たに誘導されたＩＳＣの持続的培養のためにも使用しうることを示す。ＡＧ７３およびヒアルロン酸は、ＲＧＤと一緒に存在するとき、陰窩バイアビリティの相乗的増加を導く（図３Ｈおよび図３Ｉ）。したがって、ＩＳＣ培養は、ＰＥＧ−ＲＧＤで開始することができ、したがってマトリゲルが関与するステップを回避することができる。
【０１４０】
これらの培養におけるＬｇｒ５＋の拡張は、以前に記述されたように［７０］、標準的な腸オルガノイド成長培地［６９］に、ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫβ３阻害剤、したがってＷｎｔ経路の活性化因子、およびバルプロ酸、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、およびＮｏｔｃｈ経路に対するアゴニストを補足することによって増加した。ＨＤＡＣ阻害剤の存在下における持続的なＩＳＣ培養は有害な後成的変化の蓄積をもたらす可能性があるという懸念に対処するため、ＩＳＣが、代替的に、組換えＷｎｔ３ａの存在下でＰＥＧ−ＲＧＤにおいて首尾よく培養しうることを見出した（図３Ｋおよび図３Ｌ）。注目すべきことに、剛性依存的コロニー形成プロファイルと全体のコロニー形成効率は、ＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸含有培養で観察されたものと一致していた（図３Ｋおよび図３Ｌ）。
【０１４１】
細胞拡張に適切な培養条件（自己再生条件）でＰＥＧ−ＲＧＤハイドロゲルにおいて成長したＩＳＣコロニーを拡張し、次いで解離し、得られた単一細胞をＰＥＧ−ＲＧＤハイドロゲルに再埋め込みすると、マトリゲル（図４Ｂ）に匹敵する頑強なクローンコロニーの形成が導かれる（図４Ａ）。注目すべきことに、ＩＳＣマーカーＬｇｒ５は、ＴＧ−ＰＥＧ−ＲＧＤハイドロゲル内で培養したコロニーによって、マトリゲルで培養した細胞の場合と匹敵するレベルで発現され（図４Ｃおよび図４Ｄ）、真正のＩＳＣがＴＧ−ＰＥＧ−ＲＧＤハイドロゲル内で首尾よく培養および拡張されうることが示された。
【０１４２】
ＩＳＣが多系統分化能およびオルガノイドを形成する能力を保持していることを確認するために、拡張された幹細胞をマトリゲルに移植すると、幹細胞はさらに拡張され、その後、分化した。分化条件に切り替えて２日以内に、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰを均一に発現した球状コロニーが、陰窩様突起を含有するオルガノイドに変換され、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ発現は、後者の端部の領域に限定されていた（図４Ｅおよび図４Ｆ）。リゾチームおよびムチンについての免疫蛍光分析により、それぞれパネート細胞およびゴブレット細胞の存在が確立され（図４Ｇ）、ＩＳＣが多分化能を維持した合成ＴＧ−ＰＥＧ−ＲＧＤマトリックス内で拡張したことが確認された。
【０１４３】
ＩＳＣ維持は、主要な腸遺伝子の発現をｑＰＣＲにより評価することによっても確認した（図４Ｈ）。ＩＳＣ拡張条件下で、Ｌｇｒ５は、ＰＥＧ−ＲＧＤおよびマトリゲルの両方で成長したＩＳＣでも高度に発現しており、拡張した細胞における幹細胞性の維持が確認された。予測されたように、Ｌｇｒ５は、ＰＥＧおよびマトリゲルの両方で培養したオルガノイドにも多く存在しなかった。分化した腸細胞種のマーカーは、拡張条件下では発現されない。しかしながら、リゾチームは、マトリゲルベース拡張培養で顕著に発現しているようであり、マトリゲルで拡張されたコロニーは、分化したパネート細胞の集団を含有していることが示される。したがって、ＰＥＧベースのハイドロゲルは、精製Ｌｇｒ５＋ＩＳＣ集団の維持のためにより適切でありうる。
【０１４４】
（実施例５：ハイドロゲルにおける細胞増殖に対するＲＧＤ濃度の効果）
接着リガンドの最適濃度を決定するために、様々な量のＲＧＤペプチドを、非機能化生体機能ハイドロゲル（ＴＧ−ＰＥＧ−ＲＧＤ）に共有結合的に連結した。ＲＧＤの濃度の増加は、ＩＳＣコロニー形成効率の増加を導くが、後者は、およそ５００μΜのＲＧＤ濃度でプラトーに達する（図４Ｉおよび図４Ｊ）。
【０１４５】
（実施例６：ハイドロゲルにおける細胞増殖に対するマトリックス剛性の効果）
ＩＳＣ拡張に対するマトリックス剛性の効果を定義するために、ＰＥＧポリマー含有量によって決定される一連の機械的特性を有する機能化ハイドロゲル（Ｆ−ＰＥＧ−ＲＧＤ）を生成した。これらのハイドロゲルで培養したＩＳＣの挙動をモニタリングした。マトリックス剛性は、コロニー形成効率および成長に対して、顕著であるが二相様式の影響を与え（図４Ｋおよび図４Ｌ）、ＩＳＣ拡張は、中程度の剛性（１．３ｋＰａのせん断弾性率）のマトリックス内で最適であった。重要なことに軟性マトリックス（３００Ｐａのせん断弾性率）に埋め込まれた細胞は、ＲＧＤの濃度が最適（１ｍＭ）で存在するにもかかわらず、増殖したがわずかであり、適切な機械的環境が、最適なＩＳＣ拡張に重要であることが示唆された。ブレビスタチンを用いたミオシン媒介性収縮の遮断は、剛性により誘導されるコロニー形成効率の増加を失わせ、合成マトリックス内のＩＳＣ拡張のために細胞骨格の張力が必要であることが示唆される。
【０１４６】
（実施例７：細胞増殖に対する生体機能化合物の効果）
フィブロネクチンは、ＩＳＣ自己再生に対するＲＧＤの効果を表現型模写した（図５Ａ）。個別には、硬性マトリックスでのみ明らかなコロニー形成が導かれ、フィブロネクチンがＲＧＤと同時に存在するとき、相加的効果は観察されず、これらの２つの分子の予想される冗長効果が示唆された。
【０１４７】
ラミニン−１１１は単独で有効に軟性マトリックスにおけるコロニー形成を支持した。さらにマトリックス剛性にかかわらず、ＲＧＤと共に組み込まれたときに、コロニー形成効率の増加をもたらした（図５Ｂ）。
【０１４８】
コラーゲン−ＩＶおよびラミニン−５１１は、軟性または硬性ゲルにおいて、個別にまたはＲＧＤとの組み合わせで、ＩＳＣコロニー形成に影響を与えなかった（図５Ｃおよび図５Ｄ）。
【０１４９】
パールカン単独は、ＩＳＣ自己再生を変化させなかったが、硬性マトリックス内でＲＧＤと共存するとき、コロニー形成効率を顕著に増加させた（図５Ｅ）。
【０１５０】
ヒアルロン酸は、ＴＧ−ＰＥＧ−ＲＧＤゲルでの陰窩生存に肯定的効果を有するが（図３Ｉ）、ＲＧＤとの組み合わせにおいて個々のＩＳＣの生存および自己再生に影響を与えていないようであった（図５Ｅ）。
【０１５１】
コラーゲン−Ｉは、ＩＳＣ生存またはコロニー形成に対しては顕著な効果を有しないが、ＩＳＣ形態およびその末路／自己再生に深く影響を与えた：コラーゲン−ＩおよびＲＧＤ存在下の軟性ハイドロゲルに埋め込まれたＩＳＣは、典型的なルーメン化多細胞コロニーを形成できなかったが、代わりに紡錘様形態をとり、周囲のマトリックスに延びるアクチンリッチ突起を有していた（図５Ｆ）。ルーメン化コロニーが、コラーゲン−ＩおよびＲＧＤを含有する硬性ゲルで観察されたが、これらのコロニーは同様に構成細胞がマトリックスへ膜突起を延ばしている異常な形態を示した。注目すべきことに、コラーゲン−Ｉの存在下で培養した生存細胞およびコロニーはＬｇｒ５−ＥＧＦＰを大幅に失っており、幹細胞性の損失を示している。
【０１５２】
（ラミニン）
上述のように、ラミニンは単独で軟性マトリックスにおけるコロニー形成を効果的に支持した（図５Ｂ）。実際に、軟性の３００Ｐａハイドロゲルで、ラミニン−１１１は、ＲＧＤと比較して、ＩＳＣコロニー形成の誘導において有意により効率的である（図６Ａ）。さらに、ラミニン含有ゲルでのＩＳＣコロニー形成効率は、ＲＧＤ含有ゲルにおける場合（１．３ｋＰａ）と比較して、低い剛性（７００Ｐａ）にピークがある。したがって、拡張およびオルガノイド形成段階での分化の機械的必要性は、分化およびオルガノイド形成に適切な軟性（＞２００Ｐａ）マトリックス内でコロニー形成増強のためのラミニンを使用することによって満たされるかどうかを評価した。実際、高い（３０〜５０％）ＩＳＣコロニー形成が、ＲＧＤおよびラミニン−１１１の両方を含有する軟性ハイドロゲルで観察された。予測されたように、オルガノイド形成条件へ切り替えると、ＩＳＣコロニーの小部分が腸オルガノイドを生じ（図６Ｂ）、これにはパネート細胞、ゴブレット細胞、エンテロサイトおよび腸内分泌細胞が含まれた（図６Ｃ）。留意すべきことに、単一のＩＳＣは、ラミニンのみを含有する軟性（３００Ｐａ）ゲルで成長させたときも、オルガノイドを生じることが見出された（図６Ｄ）。
【０１５３】
（実施例８：分解性ハイドロゲルにおける細胞増殖）
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腸が正常に機能している間は低レベルで発現しているが、腸疾患の間は上方調節され、その間、炎症性応答およびその後の上皮損傷に寄与する。腸上皮のタンパク質分解反応は、全体としては検討されてきたが、ＩＳＣの、特にＭＭＰ媒介マトリックス分解の間の役割および挙動は解明されていない。
【０１５４】
ハイドロゲルにおける細胞成長に対するマトリックスタンパク質分解の効果を調べるために、後者を、細胞分泌プロテアーゼによって認識され切断されうるコラーゲンＩ由来配列を保有する機能化生理活性ハイドロゲルに埋め込んだ。プロテアーゼに対して非感受性にする修飾型配列を有するハイドロゲルで、細胞挙動を同様にモニタリングした。分解性および非分解性ハイドロゲルで培養した細胞はいずれもマトリックス剛性に対して類似した二相性の増殖応答を示した（図７Ａ）。しかしながら、高い機械的剛性では、コロニー形成効率は、分解性マトリックスにおける方が非分解性マトリックスを用いた場合と比較して有意に高かった。広域プロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１を用いた非分解性ゲル内のＭＭＰ活性のブロッキングは、低マトリックス剛性ではコロニー形成効率を変化させなかったが、高マトリックス剛性では非分解性ゲルで観察されるレベルまでコロニー形成効率が減少した（図７Ａ）。これらの結果は、マトリックス分解性が、高い機械的剛性で増殖優位性を与えることを示唆している。コロニー形成能とは別に、マトリックス分解性は、剛性依存的様式で、ＩＳＣコロニー形状に影響を与える。軟性マトリックスで培養したＩＳＣコロニーは、マトリックス分解性にかかわらず、円形で環状であるが、硬性分解性マトリックスで培養したＩＳＣコロニーは、不規則で偏心的な形状を示した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。同様にコロニー形態は、マトリックス分解により深く影響を受けた：非分解性マトリックスでは、極性化され良く組織化された円柱上皮コロニーを生ずる一方で、分解性マトリックスで形成されたコロニーは不完全に極性化され、広がった細胞を特徴とした（図７Ｄおよび図７Ｅ）。
【０１５５】
分解性マトリックスで観察された形状および形態の変化は、非分解性マトリックスで成長したコロニーと比較して、有意に減弱化したＬｇｒ５発現と関係していることがさらに発見された（図７Ｆおよび図７Ｇ）。当然のことながら、Ｌｇｒ５の損失により、多分化系列決定およびオルガノイド形成能は縮小した（図７Ｈおよび図７Ｉ）。注目すべきことに、分解性マトリックス内のプロテアーゼ活性の薬理学的阻害は、コロニーの形状、形態、Ｌｇｒ５発現およびオルガノイド形成能に対する非分解性マトリックスの効果を表現型模写した（図７Ｂ〜Ｉ）。
【０１５６】
（実施例９：上皮オルガノイドを得るためのハイドロゲルでの上皮細胞の分化）
機能化ハイドロゲル（例えば、Ｆ−ＰＥＧ−ＲＧＤ）が、上皮細胞の腸オルガノイドへの分化および形態形成を支持するかを試験するために、より硬性のハイドロゲル、つまり上皮幹細胞の拡張および増殖に適切な条件で培養した細胞を、分化条件に切り替えた。切り替えにより、Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰの全体的消失およびコロニー破壊が導かれた（図８Ａ）。Ｆ−ＰＥＧ−ＲＧＤで拡張されたＩＳＣは分化することができ、マトリゲルに移植されたときオルガノイドを生ずることを考慮すると、この効果に対する原因として、増殖中の多分化能の喪失は除外された。
【０１５７】
細胞拡張のために最適化されたより硬性のマトリックスは、分化および形態形成のために必要な重要な微小環境因子を欠いている、または単に形態形成を促進するには硬すぎると推論された。興味深いことに、局在パターンでＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）を発現するコロニーの小部分は、マトリゲルで観察されるコロニーを連想させるものであり、「壊れた対称性」を有する、つまり非球形の極性化形状を示す、コロニーであった（図８Ｂ）。これにより、形状の変化と芽状領域を有する非球状組織の幾何形状をとることは局在Ｌｇｒ５発現の維持のために必須であり、そのような形状の変化は、組織による変形が容易な軟性マトリックスによって促進されうると仮定された。
【０１５８】
この仮定を試験するために、マトリゲルの一定（１０％）濃度が細胞生存に必要な化学的シグナル伝達と接着を提供し、一方で、ハイドロゲルの機械的特性が材料のＰＥＧ含有量を変化させることによって変動するマトリゲル−ＰＥＧ複合体を作製した。先に拡張されたオルガノイドの断片をマトリゲルに埋め込むと、生化学的および接着きっかけは同一の条件下で、腸形態形成がマトリックス剛性により制御されることが観察された：硬性マトリックスで培養したオルガノイド断片は球状に維持され、成長が極小であったのに対し、軟性マトリックスで培養したオルガノイド断片は、堅調な形態形成を経て、マトリゲルで通常観察される特徴的な出芽形状をとった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。ＩＳＣ拡張のためには高いマトリックス剛性が必要とされるが、硬性マトリックスは、軟性環境において最適であるＩＳＣ分化および形態形成を損なわせると結論づけられた。
【０１５９】
したがって、オルガノイド形成工程の機械的要件は、動的で段階依存的であるようであり、記述されている硬くて機械的に動きのないマトリックスは、単一ＩＳＣから腸オルガノイドを生成するために最適でないようである。分化の機械的要件とは別に、自己再生およびオルガノイド形成段階は、分化の生化学的要件も示しうると推論された。
【０１６０】
軟性ＰＥＧ−ＲＧＤマトリックスが、拡張されたＩＳＣコロニーの分化および形態形成を駆動するために十分であるかを試験するために、最適化した１ｋＰａのＰＥＧ−ＲＧＤのマトリックスでコロニーを成長させ、その後、分化およびオルガノイド形成条件下の軟性の（約２００ｋＰａ）Ｆ−ＰＥＧ−ＲＧＤマトリックスに移した。ＲＧＤとは別に、ＥＣＭタンパク質、ペプチド、ならびに糖、例えばラミニン−１１１、ＡＧ７３、フィブロネクチン、パールカンおよびヒアルロン酸を、別個の条件下でＰＥＧゲルに加えた。この実験では、顕著な形態形成およびオルガノイド形成が、ＲＧＤおよびラミニン−１１１の両方を含有するＰＥＧゲルでのみ観察された（図８Ｄ）。注目すべきことに、マトリゲルで予備形成されたオルガノイドを維持するために有益であることが上記で示されたラミニン由来ＡＧ７３ペプチドは、さらに、分化および形態形成のいくつかの初期の徴候も示した。
【０１６１】
（動的ハイドロゲル）
次いで、ＩＳＣ拡張に適切なより高い剛性を初期に与え、その後、軟化して分化およびオルガノイド形成を最適にする機械的な動的マトリックスの設計によって、オルガノイド形成プロセスの物理的必要性の進化を満たすことが求められた。この目的のために、ＰＥＧ分子の少なくとも一部で安定ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）ポリマー骨格がＰＥＧ−アクリレート（ＰＥＧ−Ａｃｒ）骨格で置き換えられている動的機能化ＰＥＧハイドロゲルを作製した（ＤＦ−ＰＥＧ−ＲＧＤ）。エステル結合の存在により、ＰＥＧ−Ａｃｒは、自発的な加水分解を受ける。ＰＥＧ−Ａｃｒがハイドロゲルに組み込まれるとき、究極的に全体的および持続的なゲル分解が導かれる。
【０１６２】
最終ゲル内のＰＥＧ−ＶＳおよびＰＥＧ−Ａｃｒの比率を変化させることにより、経時的な軟化の程度を含む構造的および機械的な動態に対する制御がもたらされた。全体的なＰＥＧポリマー含有量を変えることにより、初期ゲル剛性の制御を容易にした。ハイドロゲルを約１ｋＰａ（ＩＳＣ拡張のための最適値）のせん断弾性率で、経時的に軟化の程度を変動させて形成した（図８Ｅ）。注目すべきことに、ＰＥＧ−Ａｃｒのみを含むハイドロゲルの軟化は非常に広範であり、４日後に機械的特徴が排除された。次いで、ＩＳＣ拡張、続けてその後の分化およびオルガノイド形成の能力を支持する動的ハイドロゲルの能力を試験した。全ての条件でＩＳＣコロニー形成は広範であり、対照マトリックス（ＰＥＧ−ＶＳのみで構成）で観察されるコロニー形成と匹敵した（図８Ｆ）。極性およびＬｇｒ５−ＥＧＦＰ発現の両方の損失が、全てがＰＥＧ−Ａｃｒで構成されたゲルで示された。この挙動は、これらのマトリックスの迅速で広範な分解に起因しうる。
【０１６３】
拡張された細胞のコロニーを分化／オルガノイド形成条件へ２日間切り替えると、ゲルの軟化プロファイルが、出現する表現型に顕著に影響を与えることが分かった（図８Ｇ）。ＰＥＧ−Ａｃｒのみのゲルは６日目までに完全に分解した；常在コロニーは脱分極し、皿の底に沈降した。５０％ＰＥＧ−Ａｃｒを含有し、初期剛性が１ｋＰａのゲルで培養したコロニーは、円形のままでオルガノイドを形成することができず、対照（完全ＰＥＧ−ＶＳ）ハイドロゲルで成長したコロニーとよく似ていた。全体的なポリマー含有量を減少させることによりこれらのハイドロゲルの初期および最終剛性を低下させると、対照条件で観察される球状形態からの逸脱を示すコロニーが生じ、早期芽形成が示された。ＰＥＧ−Ａｃｒ含有量を７５％へ増加させると剛性の低下が増加し、この低下は形態形成を生じさせるために十分であった：これらのマトリックスで培養したコロニーは、芽を拡張させ、真正オルガノイドを形成した。リゾチームおよびムチン−２についての免疫蛍光分析により、パネートおよびゴブレット細胞の存在がそれぞれ明らかにされ、したがって分化が形態形成と同時に起こったことが確認された（図８Ｈ）。
【０１６４】
（実施例１０：オルガノイドを得るための膵臓細胞の成長）
成体マウス膵管の断片をＦ−ＰＥＧ−ＲＧＤに埋め込み、前述の条件で培養した。断片は生存し、４８時間以内に腔内上皮構造に再編成され（図９Ａ）、その後、これを解離し、様々な剛性のＦ−ＰＥＧ−ＲＧＤハイドロゲルに再埋め込みした。単一の膵臓細胞は、ハイドロゲルの剛性に強く依存した効率で進行してオルガノイドを形成した。ＩＳＣの場合と同様に、せん断弾性率の１．３ｋＰａの剛性が最適なオルガノイド形成のために必要であった（図９Ｂおよび図９Ｃ）。
【０１６５】
（実施例１１：マウスおよびヒト腫瘍オルガノイドの成長）
図１０は、ＲＧＤ有りまたは無しで様々なせん断弾性率を有するハイドロゲルにおけるマウスおよびヒト腫瘍オルガノイドの生成を示す。図１０Ａ：様々な剛性を有するＰＥＧ−ＲＧＤマトリックスにおけるマウス結腸腺腫オルガノイド、およびマトリックス剛性の関数としての結腸腺腫オルガノイド形成効率の定量化。図１０Ｂ：ヒト患者由来結腸直腸癌オルガノイドは、軟性および硬性マトリックスにおいて、ＲＧＤ有りまたは無しで効率的に成長する。
【０１６６】
（材料および方法）
（マウス）
腸陰窩を、ＥＰＦＬおよびＦＥＬＡＳＡで規定された動物実験プロトコルにしたがって、５〜１０週齢のヘテロ接合Ｌｇｒ５−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から抽出した。
【０１６７】
腸陰窩単離：マウス腸陰窩を当該分野で公知の手順にしたがって単離した。簡潔には、腸の近位部分を採集し、長手方向に開き、氷冷ＰＢＳで洗浄した。ガラススライドを使用して腸の管腔側を掻き取ることにより、管腔内容物と絨毛構造を除去した。氷冷ＰＢＳで再度洗浄した後、腸を２〜４ｍｍ小片にハサミで切断した。小片を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、穏やかにボルテックスしながら冷ＰＢＳで再度洗浄した（５〜１０回）。次いで、腸断片を、２０ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳ中、氷上で２０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを除去し、１０ｍｌの冷ＰＢＳを加え、懸濁液を手動で５分間振とうすることにより、陰窩を放出させた。上清を収集し、７０−．ｉｍのストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通した。残りの組織断片を１０ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、５〜１０回粉砕し、上清を７０−．ｉｍストレイナーに通した。先の手順をもう一度繰り返した。３つの陰窩含有画分を合わせ、８００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。ペレットを、１０ｍｌの冷Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、７００ｒｐｍで遠心分離して単一細胞および組織破片を除去した。得られたペレットを陰窩に富化し、次いでＰＥＧまたはマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；成長因子低減、フェノールレッド不含製剤）に埋め込んだ。
【０１６８】
（ＰＥＧ、ペプチド、およびハイドロゲル前駆体の合成）
２０および４０ｋＤａの分子量を有する、ビニルスルホン機能化４−および８アームＰＥＧ（４アームＰＥＧ−ＶＳおよび８アームＰＥＧ−ＶＳ）をＮＯＦから購入した。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）感受性配列（イタリック）を有するペプチドＡｃ−ＧＣＲＥ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（モル質量１７７３．１ｇ／ｍｏｌ）をＢｉｏｍａｔｉｋから得た。接着ペプチドＡｃ−ＧＲＣＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ２（モル質量１００２．０４ｇ／ｍｏｌ）をＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。改変マクロマーを合成するために、マルチアームＰＥＧ−ＶＳおよびペプチド（ＳＨ／ＶＳ＝１０）をトリエタノールアミン（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）に溶解し、不活性雰囲気下、３７℃で２時間反応させた。反応溶液を、４℃で４日間、超純水（ｐＨ＜７）（Ｓｎａｋｅ  Ｓｋｉｎ、ＭＷＣＯ  １０Ｋ、ＰＩＥＲＣＥ）に対して透析し、最終生成物を凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物を水に溶解し、１０％前駆体溶液を作製した。
【０１６９】
ＦＸＩＩＩａ基質ペプチドＡｃ−０  ＦＫＧＧＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＴＧ−ＭＭＰ−Ｌｙｓ）（配列番号３）およびＨ−ＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＴＧ−ＧＩｎ）（配列番号４）ならびにＲＧＤ提示接着ペプチドＨ−ＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ２（ＴＧ−Ｇｌｎ−ＲＧＤ）（配列番号５）は、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＴＧ−ＭＭＰ−ＬｙｓおよびＴＧ−ＧＩｎを、８アームＰＥＧ−ＶＳまたは８アームＰＥＧ−Ａｃｒに、先行技術に記載されるように結合させた。簡潔には、ＴＧ−ＭＭＰ−ＬｙｓおよびＴＧ−ＧＩｎを、トリエタノールアミン（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）に溶解させたＰＥＧに加え、３７℃で２時間反応させた。反応溶液を、４℃で３日間、超純水（Ｓｎａｋｅ  Ｓｋｉｎ、ＭＷＣＯ  １０Ｋ、ＰＩＥＲＣＥ）に対して透析した後、２つの生成物（ＰＥＧ−ＭＭＰ−ＬｙｓおよびＰＥＧ−Ｇｌｎ）を凍結乾燥した。得られた固体前駆体を超純水に溶解させて、１３．３３％ｗ／ｖの原液を作製した。
【０１７０】
（ＰＥＧハイドロゲルの機械的特徴）
ＰＥＧゲルのせん断弾性率は、Ｂｏｈｌｉｎ  ＣＶＯ１２０レオメータで微小ひずみ振動せん断測定を実施することによって決定した。簡潔には、予備成形した厚さ１〜１．４ｍｍのハイドロゲルディスクを完全細胞培養培地中で少なくとも３時間膨潤させ、次いで、レオメータの平行プレート間に挟み込んだ。ゲルの機械的応答を、３７℃で一定のひずみ（０．０５）モードで周波数掃引（０．１〜１０Ｈｚ）測定を行うことにより記録した。
【０１７１】
（ＰＥＧベースのハイドロゲルの形成および解離）
適切な体積の１３．３３％ｗ／ｖ  ＰＥＧ前駆体溶液を、化学量論的にバランスのとれた比率で混合し、所望の最終ＰＥＧ含有量のハイドロゲルネットワークを生成した。ハイドロゲル形成を、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭ、ｐＨ７．６）の存在下でトロンビン活性化ＦＸＩＩＩａ（１０Ｕ／ｍＬ；Ｇａｌｅｘｉｓ）を添加することにより誘発した。予備反応体積を、腸細胞または組織および細胞接着リガンドを含む生理活性分子の組み込みのために使用した。ゲルを、３７℃で３０分間インキュベートすることによって架橋した。下流の細胞プロセシングまたは再埋め込みのためのＰＥＧで成長したコロニーの解離および放出を、ゲルの酵素消化によって達成した。ゲルを、金属スパチュラの先端を使用して、プレートの底から慎重に剥離し、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（２０００Ｕ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）、０．５ｍＭのＮ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）および１０ｍＭのＹ２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補足した１ｍｌのＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移した。消化（１０分、３７℃）後、細胞懸濁液を１０ｍｌの冷媒で洗浄し、４０−．ｍのストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０１７２】
（細胞培養）
新たに単離した陰窩または解離したコロニー由来の単一細胞を、マトリゲルまたはハイドロゲル前駆体溶液に加え、２０μＬの液滴で２４ウェルプレートのウェルの底にキャストした。重合後（２０〜３０分、３７℃）、ゲルを、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、Ｎｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍｌ；内製）およびＲ−スポンジン（５００ｎｇ／ｍｌ；内製）を含む成長因子ならびにＣＨＩＲ９９０２１（３μΜ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびバルプロ酸（１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）を含む小分子を補足した、６００μｌ（マトリゲルについては５００μｌ）のＩＳＣ拡張培地｛Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｂ２７、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μΜのＮ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２｝で被覆した。単一細胞培養のために、チアゾビビン（２．５μΜ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびＪａｇｇｅｄ−１ペプチド（１ｍＭ；Ａｎａｓｐｅｃ）を最初の２日間、培地に導入した。広域プロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１を培地に加える一方でＰＥＧハイドロゲルに細胞を埋め込んだ。２日毎に成長因子を補給し、全培地を取り替えた。
【０１７３】
幹細胞分化およびオルガノイド形成を誘導するために、培地を取り出し、ゲルをＰＢＳ（１時間、３７℃）中でインキュベートして残余のＣＨＩＲ９９０２１およびバルプロ酸を取り除き、ＥＧＦ、ＮｏｇｇｉｎおよびＲｅｓｐｏｎｄｉｎを含有する新鮮な培地を加えた。全体的に、成長因子を２日毎に補給し、全培地を４日毎に取り替えた。
【０１７４】
（ＩＳＣコロニー形成効率および腸組織バイアビリティの定量化）
単一の埋め込みＩＳＣのコロニー形成効率を定量するために、細胞含有（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ）マトリゲルまたはＰＥＧゲルの厚さ全体にまたがる位相ｚスタックを、ゲル内の５つの異なる位置で収集した（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１）。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）におけるＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプラグインを使用して、播種後４日目でコロニー形成した細胞の割合を定量化した。ＰＥＧに埋め込まれた腸組織断片のバイアビリティを評価するために、ゲル全体の位相コントラスト画像を収集した。生存組織の割合は、上皮形態に基づいて推定した：埋め込みの２４時間後、中央ルーメンを囲む上皮単層を特色とする組織は生存可能と判断した。
【０１７５】
（免疫蛍光分析）
マトリゲルまたはＰＥＧに埋め込まれた腸オルガノイドを、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（３０分、ＲＴ）で固定した。固定プロセスにより、典型的に、マトリゲルは完全に分解された。その後、懸濁した組織を収集し、遠心分離（８００ｒｐｍ、５分）してＰＦＡを取り除き、超純水で洗浄して、ペレット化した。水に再懸濁した後、オルガノイドをスライドガラス上に広げ、乾燥により付着させた。ＰＢＳを加えて付着オルガノイドを再水和した。固定後、ＰＥＧに埋め込んだまたはガラスに広げたオルガノイドを、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理（１時間、ＲＴ）し、少なくとも２時間ブロッキングした（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清）。試料を、次いで、ブロッキングバッファー溶解ファロイジン−Ａｌｅｘａ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびリゾチーム（１：５０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはムチン−２（１：２５；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する一次抗体と共にインキュベートした（一晩、４℃）。ＰＢＳで３時間洗浄した（その間にＰＢＳを１時間毎に入れ替えた）後、試料を二次抗体（Ａｌｅｘａ６４７）とインキュベートし、オルガノイドを落射蛍光（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１）でまたは共焦点（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０）モードで画像化した。
【０１７６】
本発明のさらなる態様を、以下の番号の付いた項目で定義する：
１．成体上皮幹細胞を培養するための三次元ハイドロゲルであって、ＲＧＤ含有ペプチドで機能化した架橋親水性ポリマーを含み、ここで、ＲＧＤ含有ペプチドの濃度は少なくとも０．０５％ｗ／ｖであり、ハイドロゲルは０．５〜５ｋＰａのせん断弾性率を有する、三次元ハイドロゲル。
【０１７７】
２．せん断弾性率は、０．５〜２．５ｋＰａである、項目１に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１７８】
３．ＲＧＤ含有ペプチドは、フィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片を含む群から選択されるＲＧＤ結合モチーフを含有するペプチドである、項目１または２に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１７９】
４．フィブロネクチン由来断片またはフィブロネクチンアナログは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＲＧＤＳＰ（配列番号２）、ＲＧＤＳＰＫ（配列番号３）、ＲＧＤＴＰ（配列番号４）、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号５）、シクロ（ＲＧＤＳＰ）（配列番号２）、シクロ（ＲＧＤＦＫ）（配列番号６）、シクロ（ＲＧＤＹＫ）（配列番号７）、シクロ（ＲＧＤＦＣ）（配列番号８）、またはＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片を含む群から選択されるペプチドである、項目１から３のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８０】
５．親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキサゾリン、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）またはその混合物もしくはコポリマーを含む群から選択される、項目１から４のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８１】
６．親水性ポリマー含有量は２．０〜４．０％ｗ／ｖの範囲内であり、ＲＧＤ含有ペプチドの濃度は０．０５％〜１．０％ｗ／ｖの範囲内であり、せん断弾性率は０．５〜２．５ｋＰａである、項目１から５のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８２】
７．せん断弾性率は１．３ｋＰａであり、ＲＧＤ含有ペプチド濃度は０，１％ｗ／ｖである、項目１から６のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８３】
８．ラミニン１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を５．ｇ／ｍｌ〜２５０．ｇ／ｍｌの濃度でさらに含み、０．５〜２．５ｋＰａの初期せん断弾性率、および５０〜２００Ｐａの最終せん断弾性率を有する、項目１から５のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８４】
９．初期せん断弾性率は１．０〜２．０ｋＰａであり、細胞培養４日後の最終せん断弾性率は８０〜１５０Ｐａである、項目８に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８５】
１０．ハイドロゲルは、ラミニン１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を５．ｇ／ｍｌ〜２５０．ｇ／ｍｌの濃度でさらに含み、親水性ポリマーは、１：３の比のＰＥＧ−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）／ＰＥＧ−アクリレート（ＰＥＧ−Ａｃｒ）ハイブリッドからなるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、ハイドロゲルは、０．５〜２．５ｋＰａの初期せん断弾性率、および８０〜１５０Ｐａの細胞培養４日後の最終せん断弾性率を有する、項目１から５のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【０１８６】
１１．成体上皮幹細胞を拡張させるための方法であって、単一細胞または多細胞クラスターを項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を培養することを含む方法。
【０１８７】
１２．細胞は、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房または肺幹細胞である、項目１１に記載の方法。
【０１８８】
１３．正常上皮オルガノイドを培養および拡張させるための方法であって、ｉ）上皮オルガノイドの断片を項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切なオルガノイド形成条件下でオルガノイドを培養すること、またはｉｉ）単一のまたはクラスターの上皮幹細胞を、項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な自己再生条件下で細胞を拡張させ、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法。
【０１８９】
１４．上皮オルガノイドは、腸、結腸、胃、肝臓、膵臓、直腸、乳房または肺由来である、項目１３に記載の方法。
【０１９０】
１５．上皮腫瘍由来オルガノイドを培養および拡張するための方法であって、腫瘍由来単一細胞または多細胞クラスターを項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を拡張させ、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法。
【０１９１】
１６．腫瘍由来細胞は、結腸直腸、胃、肝臓、膵臓、乳房または肺腫瘍由来である、項目１５に記載の方法。
【０１９２】
１７．上皮組織再生のための方法であって、ａ）患者由来の上皮幹細胞またはオルガノイドを項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件または適切なオルガノイド形成条件下で拡張させること、およびｂ）拡張された幹細胞またはオルガノイドを患者に移植して戻すことを含む方法。
【０１９３】
１８．腸幹細胞自己再生およびコロニー形成を研究するための方法であって、腸幹細胞を項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な幹細胞拡張条件下で細胞を培養することを含む方法。
【０１９４】
１９．腸幹細胞分化、腸組織極性化および形態形成を研究するための方法であって、ｉ）腸オルガノイドの断片を項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切なオルガノイド形成条件下でオルガノイドを培養すること、またはｉｉ）単一のまたはクラスターの腸幹細胞を項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、適切な自己再生条件下で細胞を拡張させ、その後、適切なオルガノイド形成条件に切り替えることを含む方法。
【０１９５】
２０．腫瘍細胞死または成長停止の誘導における効力について、薬理化合物、生体分子のライブラリをスクリーニングするためのまたは細胞ベースの療法を評価するための方法であって、ｉ）腫瘍細胞またはオルガノイドを項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、試験される薬理化合物、生体分子または細胞の存在下、適切な条件下で細胞またはオルガノイドを培養すること、ならびにｉｉ）細胞死および／または成長停止をモニタリングすること、を含む方法。
【０１９６】
２１．腸疾患の処置における効力について、薬理化合物もしくは生体分子のライブラリをスクリーニングするための方法であって、ｉ）患者由来の腸生検試料を用意すること、ｉｉ）腸生検試料を項目１から１０のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲルに封入し、成長させ、試験される薬理化合物または生体分子の存在下、適切な条件下で生検試料を培養すること、ならびにｉｉｉ）嚢胞性線維症の場合には、フォルスコリン誘導オルガノイド膨張のモニタリングにより嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の成功した機能回復を評価すること、またはｉｉｉ）炎症性腸疾患の場合には、炎症、細胞損傷もしくは細胞死の減少または上皮接合の完全性の回復をモニタリングすることを含む方法。
【０１９７】
２２．腸疾患は、嚢胞性線維症および炎症性腸疾患を含む群から選択される、項目２１に記載の方法。
【０１９８】
２３．項目１から１０のいずれか一項に記載の別個の体積の三次元ハイドロゲルを作製するためのキットオブパーツであって、成分ａ）１つまたは複数の親水性前駆体ポリマー、成分ｂ）フィブロネクチン、フィブロネクチンアナログまたはフィブロネクチン由来断片、成分ｃ）前駆体ポリマーａ）のための架橋剤、および成分ｄ）ラミニン−１１１、ラミニン−１１１アナログまたはラミニン−１１１断片を含む、キットオブパーツ。
【０１９９】
２４．親水性ポリマーは、マルチアーム ポリ（エチレングリコール）分子を含み、フィブロネクチン由来断片は、１０ＲＧＤＳＰＧペプチドである、項目２３に記載のキットオブパーツ。
【０２００】
２５．成分は、容器中、好ましくはマルチウェルプレートのウェルまたはチューブ中に、実質的に未反応形態で、好ましくは乾燥形態で、予め供給されて用意されている、項目２３または２４に記載のキットオブパーツ。
【０２０１】
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【図１】
2018532421.tif 000003
【図２−１】
2018532421.tif 000004
【図２−２】
2018532421.tif 000005
【図３−１】
2018532421.tif 000006
【図３−２】
2018532421.tif 000007
【図４−１】
2018532421.tif 000008
【図４−２】
2018532421.tif 000009
【図４−３】
2018532421.tif 000010
【図５−１】
2018532421.tif 000011
【図５−２】
2018532421.tif 000012
【図６】
2018532421.tif 000013
【図７−１】
2018532421.tif 000014
【図７−２】
2018532421.tif 000015
【図８−１】
2018532421.tif 000016
【図８−２】
2018532421.tif 000017
【図９】
2018532421.tif 000018
【図１０】
2018532421.tif 000019
【配列表】
2018532421000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月7日(2018.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
本発明の他の実施形態では、フィブロネクチン由来断片またはフィブロネクチンアナログは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号２）、ＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＲＧＤＳＰＫ（配列番号４）、ＲＧＤＴＰ（配列番号５）、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号６）、シクロ（ＲＧＤＳＰ）（配列番号３）、シクロ（ＲＧＤＦＫ）（配列番号７）、シクロ（ＲＧＤＹＫ）（配列番号８）、シクロ（ＲＧＤＦＣ）（配列番号９）を含む群から選択されるペプチド、またはＩＩＩ１−Ｃ断片（Ｍｏｒｌａら、１９９４）、ＦＮＩＩＩ９−１０断片およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片（Ｍａｒｔｉｎｏら、２０１１）を含む群から選択される断片である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
人工的な（つまり、非哺乳類プロテアーゼによって認識される）切断部位は、好ましくは、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１０）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１１）内に含まれており、タバコエッチ病ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ；ＴＥＶ）プロテアーゼによって認識されるＱ／ＧまたはＱ／Ｓ部位である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
ＦＸＩＩＩａ基質ペプチドＡｃ−０  ＦＫＧＧＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＴＧ−ＭＭＰ−Ｌｙｓ）（配列番号１２）およびＨ−ＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＴＧ−ＧＩｎ）（配列番号１３）ならびにＲＧＤ提示接着ペプチドＨ−ＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ２（ＴＧ−Ｇｌｎ−ＲＧＤ）（配列番号１４）は、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＴＧ−ＭＭＰ−ＬｙｓおよびＴＧ−ＧＩｎを、８アームＰＥＧ−ＶＳまたは８アームＰＥＧ−Ａｃｒに、先行技術に記載されるように結合させた。簡潔には、ＴＧ−ＭＭＰ−ＬｙｓおよびＴＧ−ＧＩｎを、トリエタノールアミン（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）に溶解させたＰＥＧに加え、３７℃で２時間反応させた。反応溶液を、４℃で３日間、超純水（Ｓｎａｋｅ  Ｓｋｉｎ、ＭＷＣＯ  １０Ｋ、ＰＩＥＲＣＥ）に対して透析した後、２つの生成物（ＰＥＧ−ＭＭＰ−ＬｙｓおよびＰＥＧ−Ｇｌｎ）を凍結乾燥した。得られた固体前駆体を超純水に溶解させて、１３．３３％ｗ／ｖの原液を作製した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
４．フィブロネクチン由来断片またはフィブロネクチンアナログは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号２）、ＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＲＧＤＳＰＫ（配列番号４）、ＲＧＤＴＰ（配列番号５）、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号６）、シクロ（ＲＧＤＳＰ）（配列番号３）、シクロ（ＲＧＤＦＫ）（配列番号７）、シクロ（ＲＧＤＹＫ）（配列番号８）、シクロ（ＲＧＤＦＣ）（配列番号９）、またはＩＩＩ１−Ｃ断片、ＦＮＩＩＩ９−１０断片およびＦＮＩＩＩ１２−１４断片を含む群から選択されるペプチドである、項目１から３のいずれか一項に記載の三次元ハイドロゲル。
【国際調査報告】
2018532421.tif 000020
2018532421.tif 000021
2018532421.tif 000022
2018532421.tif 000023