(57)【要約】  本発明は、細菌の定量的な判定のための方法およびデバイスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の細菌を定量的に判定するための方法であって、
（ａ）試験されるべき前記サンプルを、判定されるべき前記細菌に結合することのできる、蛍光標識試薬、発光標識試薬、および、ラマン標識試薬から好ましくは選択される標識試薬とともにインキュベートするステップ、
（ｂ）前記細菌に結合しなかった標識試薬を、判定されるべき前記細菌に不透過性であり、前記標識試薬に透過性である膜を用いて、前記細菌から除去するステップ（ここで、判定されるべき前記細菌は、前記膜上に集められる）、
（ｃ）好ましくは、蛍光測定、発光測定および／またはラマン測定を用いて、集められた前記細菌に結合した前記標識試薬を判定するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）からの測定シグナルを定量的に評価するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記細菌は、レジオネラ、サルモネラ、リステリア、Ｅ．ｃｏｌｉのような大腸菌型細菌、ＭＲＳＡのような病院細菌から選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の方法であって、
前記標識試薬は、標識化核酸プローブ、抗体、バクテリオファージ、およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法であって、
標識化バクテリオファージ、好ましくは、蛍光標識化、発光標識化またはラマン標識化バクテリオファージが、前記標識試薬として用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、
（ｉ）第一のチャンバー（場合により、前記標識試薬のための貯蔵庫を備える）、
（ｉｉ）第二のチャンバー、および
（ｉｉｉ）前記の第一のチャンバーと前記の第二のチャンバーとの間に配列される、膜（前記膜は、判定されるべき前記細菌に不透過性であり、判定されるべき前記細菌に結合されない標識試薬に透過性である）、
を備える測定用セルが、前記判定のために用いられることを特徴とし、および、
前記のインキュベーションステップが終わった時点で、判定されるべき前記細菌に結合されない標識試薬（ｒｅｇｅｎｔ）は、前記の第一のチャンバーから除去されて、前記膜を通って、前記の第二のチャンバーへ移行する、
方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、
およそ０．５〜３μｍのポア直径を有する膜が用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、
前記標識試薬および試験されるべき前記サンプルは、ステップ（ａ）におけるインキュベーションの手順前および／または手順中に混合されることを特徴とする、
方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法であって、
共焦点光学システムを備えるレーザーが、ステップ（ｃ）における光学的判定手順のための光源として用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記レーザーは、検出ユニットを形成するように分光計と一緒に組み込まれたデバイスにおいて用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法であって、
ステップ（ｄ）における定量的評価は、特定の数の細菌を、所定の閾値に基づいて１つまたは複数のカテゴリーに分類するステップを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法であって、
少なくとも１つの参照シグナル、具体的には、レーザーによって生産される参照シグナルが、ステップ（ｄ）における定量的評価に用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項１２】
細菌を定量的に判定するための測定用セルであって、
（ｉ）第一のチャンバー（場合により、標識試薬のための貯蔵庫を備え、ここで、前記標識試薬は、好ましくは、蛍光標識試薬、発光標識試薬、および、ラマン標識試薬から選択される）、
（ｉｉ）第二のチャンバー、および
（ｉｉｉ）前記の第一のチャンバーと前記の第二のチャンバーとの間に配列される、膜（前記膜は、判定されるべき前記細菌に不透過性であり、判定されるべき前記細菌に結合されない標識試薬に透過性である）、
を備える、
測定用セル。
【請求項１３】
請求項１２に記載の測定用セルであって、
前記の第一のチャンバーの容量は、２〜２０ｍｌであることを特徴とする、
測定用セル。
【請求項１４】
請求項１２または１３のいずれかに記載の測定用セルであって、
前記標識試薬は、標識化バクテリオファージであることを特徴とする、
測定用セル。
【請求項１５】
細菌を定量的に判定するためのデバイスであって、
（ｉ）請求項１２から１４のいずれかに記載の測定用セル、
（ｉｉ）過剰の標識試薬を前記の第一のチャンバーから取り除いて、前記の第二のチャンバーにそれを移行させるための手段、
（ｉｉｉ）前記膜上に集められる標識化細菌の放射線、好ましくは、蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線を励起するための手段、および
（ｉｖ）集められた前記細菌が起源である測定シグナルを定量的に評価するための手段、
を備える、
デバイス。
【請求項１６】
請求項１２から１４のいずれかに記載の測定用セルまたは請求項１５に記載のデバイスの使用であって、
細菌を定量的に判定するための方法での、具体的には、請求項１から１１のいずれかに記載の方法での、
使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、
水サンプル中のレジオネラを定量的に判定するための、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を定量的に判定するための方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラは、２５〜５０℃の温度範囲の水中で、増殖するためのそれらの最適条件を見つけるグラム陰性細菌である。それらは、長い中断時間を有する、温水を産生および分配するためのシステム、スイミングプール、空調ユニットのための空気洗浄器、冷却塔、水タンクおよび水パイプ内に見られ得る。例えば、シャワーを浴びるとき、空調ユニットにより、スプリンクラーの結果として、またはジャクジーにおいて、エアロゾルの形態でレジオネラを含む水を吸入することは、危険であって多くの場合において致命的であるレジオネラ症として知られる病気を引き起こし得るヒトでの感染をもたらし得る。
【０００３】
したがって、Ｇｅｒｍａｎ  Ｄｒｉｎｋｉｎｇ  Ｗａｔｅｒ  Ｏｒｄｉｎａｎｃｅは、水が分注されてシャワーなどで噴霧化される加熱飲料水のための大規模プラントを含む飲料水設置のオーナーに影響を及ぼすレジオネラに関して、定期的に試験する義務を課す。この規制は、病院、学校、保育園、ホテル、および、とりわけケアホームに当てはまる。これらの確立は、年に１回レジオネラに関して試験する義務がある。近年、アパートのブロックのオーナーまたは家主、住宅購入組合および財産管理会社もまた、対応する試験を年に３回実施しなければならない。
【０００４】
Ｄｒｉｎｋｉｎｇ  Ｗａｔｅｒ  Ｏｒｄｉｎａｎｃｅは、レジオネラに関して１００ｍｌあたり１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）のテクニカルアクション値を確立する。試験が、この値が上回ったことを示すならば、関連のある保健所は直ちに報告されなければならない。
【０００５】
試験を実施する義務のコンテキストでは、分析論は、従来の微生物学的検出方法を用いて実施される。試験されるべき飲料水サンプルは、実験室において分けられて、ＩＳＯ  １１７３１（１９９８）およびＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １１７３１−２（２００８）に従って、２つの並列バッチで試験される。最初のサンプルの一部分は、寒天培地を含むペトリ皿に直接適用されて、サンプルの別の部分は、濾過後に寒天培地を含むペトリ皿に適用される。両方のバッチからの寒天プレートは、３６±２℃の一定温度で１０日間、インキュベーター内でインキュベートされる。インキュベーション中に増殖したレジオネラのコロニーは、それから、計数および評価される。定量的結果は、サンプルの１００ｍｌに基づく「コロニー形成単位」（ＣＦＵ）で与えられる。
【０００６】
特徴的なレジオネラコロニーの存在を確かめるために、少なくとも５つのコロニーが、システイン含有培地およびシステインフリー培地の両方で、少なくとも２日間、同時に継代培養される。アミノ酸システインはレジオネラに必須であるため、コロニーがシステイン含有培地上で増殖するがシステインフリー培地上では増殖しないならば、レジオネラが検出されると考えられる。
【０００７】
上述した分析論は、微生物学的検出方法はコストがかかり、時間がかかるという点で、不利である。また、その方法は、それにより得られる結果が、およそ１５〜３５％の正確でない程度を有するという点でも不利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明により対処される問題は、したがって、レジオネラおよび他の細菌も定量的に判定するための改善された方法を提供することであり、それは、従来技術の不利な点の少なくとも一部を回避することができる。特に、当該方法は、高度な精度とともに、かなりより迅速な判定を可能にすることが意図される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この問題を解決するために、細菌を定量的に検出するための新規の方法およびデバイスが提供される。本発明は、標識化細菌の測定に関し、ここで、得られる測定シグナルは、サンプル中に存在する細菌の合計数と相関する。細菌は、発光放射線、蛍光放射線またはラマン放射線などを用いて検出され得る。
【００１０】
また、本発明は、以下の図を用いて説明されることも意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】測定キュベットとして形成された測定用セルを示す。測定用セルは、例えば１０ｍｌのサンプル容量を受け入れるための反応チャンバーまたは第一のチャンバー（１０）を備える。所定の量の標識試薬を好ましくは乾燥状態で含むラベル貯蔵庫（１２）は、第一のチャンバー（１０）内に提供される。第一のチャンバー（１０）は、サンプルを受け入れるために一方のサイドに開口部（１４）を備える。さらに、第一のチャンバー（１０）は、膜（１６）によって第二のチャンバー（１８）に接続される。膜（１６）は、第一のチャンバー（１０）内に存在する細菌に不透過性であるが細菌に結合されない標識試薬に透過性であるように設計される。  測定のために、第一のチャンバー（１０）内の液体は、標識試薬とのインキュベーション後に、第二のチャンバー（１８）へ移行される。サンプル内に存在してそれに結合した標識試薬を含む細菌は、膜（１６）上に沈着される。結合されない標識試薬は、膜（１６）を通過することができ、液体と一緒に第二のチャンバー（１８）に入る。膜（１６）上に沈着された細菌は、さらなる手段を伴わずにｉｎ  ｓｉｔｕで測定され得る。
【図２】検出されるべき細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはレジオネラに関して陽性と試験されたサンプルに対するスペクトル測定の結果を示す。測定シグナルは、分光計によって記録されて、その測定範囲は、好ましくは３５０〜５５０ｎｍである。分光計の光学的分解能は、好ましくは０．４〜０．１ｎｍである。判定されるべき細菌を起源とする蛍光シグナルは、５１０〜５２０ｎｍの範囲である（ＲＯＩ）。参照レーザーは、スペクトルの振幅が正しい参照値を有することを確認するために用いられる。評価は、１００ＣＦＵ／１００ｍｌと１０，０００ＣＦＵ／１００ｍｌの細菌計数に関する２つの閾値の確立を含む。図では、測定シグナルの強度は、１０，０００ＣＦＵの閾値を超える。したがって、判定されたサンプルは、非常に汚染されている。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を含むサンプルの判定の結果を示す。無機色素Ｋ２ＷＯ４：Ｅｕ（５〜１５ｎｍの粒子サイズ）に結合されたＥ．ｃｏｌｉファージを、標識試薬として用いた。  反応チャンバー内での標識試薬とのインキュベーション後、サンプル内に含まれる細菌を、膜上に沈着させて、そこでそれらを判定した。この目的のために、膜を、レーザー（４０５ｎｍ／２５ｍＷ）によって均一に照射して、６１０〜６１５ｎｍの波長で生産された放出放射線を定量的に判定した。修正インパルスにおいて測定されたシグナルの、サンプル内のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数への定量的変換は、公知の数のＥ．ｃｏｌｉ細菌、例えば１０〜１０９の範囲の細胞を有する標準的なサンプルを用いた以前のキャリブレーションによって可能であった。  １０，０００ＣＦＵの閾値の１０％に対応する強度で照射されたＣａ参照レーザーのピークは、スペクトルにおいて７０２ｎｍに見ることができる。  色素内に含まれるウォルフラムラベルからの、細菌を定量的に判定するために用いられない別のシグナルは、５９０〜６００ｎｍの範囲に検出され得る。  図３に示されるサンプルの判定は、９，０３０ＣＦＵの細菌計数に相当するシグナルをもたらした。この細菌計数は、検証のためのＦＡＣＳを用いることによって検証され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第一の態様は、サンプル中の細菌を定量的に判定する方法に関し、
（ａ）試験されるべきサンプルを、判定されるべき細菌に結合することのできる、蛍光標識試薬、発光標識試薬、および、ラマン標識試薬から好ましくは選択される標識試薬とともにインキュベートするステップ、
（ｂ）判定されるべき細菌に不透過性であり、標識試薬に透過性である膜を用いて、細菌に結合しなかった標識試薬を細菌から除去するステップ（判定されるべき細菌は、膜上に集められる）
（ｃ）好ましくは、蛍光測定、発光測定および／またはラマン測定を用いて、集められた細菌に結合した標識試薬を判定するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）からの測定シグナルを定量的に評価するステップ、を含む。
【００１３】
本発明に係る方法は、サンプル中の細菌の迅速かつ定量的な判定を可能にする。前記方法は、サンプルが採取された直後に実施され得て、判定されるべき細菌のその前の培養を伴わない。標識試薬が細菌に結合するのに必要なインキュベーション時間は、好ましくは１秒〜最大５分であり、特に好ましくは、最大２．５分までである。結果として、１０分未満、好ましくは５分未満の合計測定時間が達成され得る。
【００１４】
当該方法は、好ましくは、レジオネラを定量的に判定するために用いられる。しかしながら、他の細菌、具体的には、ヒト病原細菌、例えば、サルモネラ、リステリア、Ｅ．ｃｏｌｉのような大腸菌型細菌、例えばＥＨＥＣ、または、ＭＲＳＡのような病院細菌もまた判定され得る。細菌が判定されるサンプルは、スワイプサンプルまたは水サンプルならびに生物学的サンプル、例えば、肉、乳製品または卵製品由来の食品サンプル、または、血液、血漿、血清、尿のような体液などであってよい。
【００１５】
本発明に係る方法を用いた細菌の判定は、判定されるべき細菌に結合することのできる標識試薬を用いることにより、および、細菌に結合した標識試薬を起源とするシグナルを測定することにより、実施される。判定は、例えば、発光測定、蛍光測定を用いて、および／または、例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）を用いてラマン放射線を測定することによって、実施され得る。この場合では、判定されるべき細菌に結合することができ、判定されるべき細菌に関して選択的であり、すなわち、サンプルの他の成分内には存在しない、判定されるべき細菌上または内の構造を認識する、標識試薬、好ましくは、蛍光、発光またはラマン活性の標識試薬が用いられる。例えば、標識試薬は、標識化核酸プローブ、抗体、バクテリオファージおよびそれらの組み合わせから選択され得る。標識試薬は、好ましくは標識化バクテリオファージである。
【００１６】
一実施態様では、２００ｎｍ〜１０μｍの範囲内、具体的には２００ｎｍ〜２μｍなどの蛍光または発光放射線を放射する蛍光または発光標識試薬が用いられ得る。放射波長は、特に好ましくは、１３００〜１５００ｎｍの範囲である。
【００１７】
相補の細菌核酸配列とのハイブリダイゼーションに用いられる、蛍光標識化または発光標識化核酸プローブが原理的に知られていて、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ技術）などに用いられる。核酸プローブは、通常、デオキシリボヌクレオチド類似体および／または核酸類似体、例えば、ＬＮＡ結合ブロックに基づくプローブである。それらは、例えば、検出されるべき細菌に特異的なリボソームＲＮＡおよび／またはＤＮＡ配列に向けられ得る。
【００１８】
検出されるべき細菌に特異的な抗原、例えば、細菌の表面上に存在する抗原に向けられる、標識化抗体、例えば蛍光標識化または発光標識化抗体、すなわちポリクローナルまたはモノクローナル抗体および抗体フラグメントまたは誘導体も知られている。
【００１９】
別の特に好ましい実施態様では、標識試薬は、蛍光または発光ラベルのようなラベルを保有するバクテリオファージであってよく、判定されるべき細菌上の特異的な表面構造を検出する。レジオネラのバクテリオファージは、Ｌａｍｍｅｔｙｎ（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．５６（２０００），１９１−１９７）などによって記載される。サルモネラのバクテリオファージは、Ａｔｔｅｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３（２００７），４５４３−４５４９）、Ｗｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔ  ２（２００３），１７８−３４０）、または、ｄｅＬａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８（２００９））などによって記載される。リステリアのバクテリオファージは、Ｋｌｕｍｐｐ＆Ｌｏｅｓｓｎｅｒ（ｗｗｗ．Ｎｃｂｉ．Ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞ＰＭＣ３８２７０９８）などによって記載される。ＭＲＳＡに関するバクテリオファージは、Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．Ｂｕｌ．４７（２０１３），２７−３４）などによって記載される。Ｅ．ｃｏｌｉのバクテリオファージ、例えば、Ｔファージ、λファージまたは他のファージは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）によって記載される。
【００２０】
本発明に係る方法に関し、標識化バクテリオファージ、例えば蛍光標識化または発光標識化バクテリオファージは、好ましくは、検出されるべき細菌に対して過剰で用いられる。およそ１０７〜１０９ファージが、バッチあたり用いられ得る。これらの条件下では、全ての細菌細胞は、通常、およそ５０〜４００ファージ、具体的には、およそ５０〜２５０または５０〜１５０ファージ内にカバーされることが見られる。Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞は、例えば、およそ７０ファージ内にカバーされ得る。
【００２１】
別の好ましい実施態様では、ラマン分光法によって検出され得る標識試薬、例えば、表面増強ラマン分光学的に活性の粒子を含む標識試薬が用いられ得る。前記標識試薬は、好ましくは、金属粒子、例えば、金または銀粒子、および／または、検出されるべき細菌に結合することのできるプローブに結合されるラマンレポーター分子を含む。ラマンレポーター分子は、イソチオシアネート色素またはマルチ−硫黄蛍光色素などから選択され得る。上述のように、プローブは、判定されるべき細菌に選択的に結合する核酸、抗体およびバクテリオファージから選択され得る。
【００２２】
標識試薬の蛍光または発光基は、標識試薬に好ましくは共有結合される任意の公知の有機または無機の蛍光または発光色素から選択され得る。適切な蛍光基は、蛍光色素、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オキサジンまたはフィコエリトリン、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはその変異体、および蛍光量子ドットである。表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）のための適切な検出基は、１つまたは複数のイソチオシアネート基および／または硫黄原子を含む物質である。
【００２３】
検出されるべき細菌は、反応チャンバー内で標識試薬と一緒にインキュベートされる。この目的のために、試験されるべきサンプルは、反応チャンバー内に導入される。標識試薬は、第一のチャンバー内への導入の前または後のいずれかに、サンプルと接触させられ得る。第一のチャンバーは、好ましくは、液体または乾燥形態で存在することのできる所定の量の標識試薬を含む貯蔵庫を備える。標識試薬は、好ましくは乾燥形態であり、サンプルとの接触後に、再構成可能な形態での液体である。判定されるべき細菌が標識試薬と一緒にインキュベートされる第一のチャンバーは、膜によって、少なくとも一方のサイドに境界が定められる。あるいは、標識試薬が加えられたサンプルは、インキュベーションチャンバーの外および追加のチャンバーの中に移行され得て、それは、膜によって境界が定められる。前記膜は、判定されるべき細菌に不透過性であるが、標識試薬、すなわち細菌に結合されない標識試薬に透過性である。前記膜は、例えばおよそ０．５〜３μｍ、例えば１〜２μｍのポア直径を有する。例えば、ナイロンのようなプラスチック材料製の適切な膜が知られる。
【００２４】
好ましい実施態様では、測定用セルが、本発明に係る判定方法において用いられ、そのセルは、少なくとも２つのチャンバーおよびチャンバー間に配列された膜を備え、その膜は、判定されるべき細菌に不透過性であり、判定されるべき細菌に結合されない標識試薬に透過性である。例えば、測定用セルは、インキュベーションのための第一のチャンバー、および、分離されたサンプル成分および過剰のラベルを受け入れるための第二のチャンバーを備えることができ、それらのチャンバーは、上述のように膜によって接続される。
【００２５】
インキュベーション手順が終わった時点で、細菌に結合されていない標識試薬は膜を通して除去されて、判定されるべき細菌が膜上に集められる。このステップは、非結合の標識試薬および膜と接触しているサンプル液体が膜を通過して、細菌が膜上に集められるように、バキュームを膜に適用することによって実施され得る。あるいは、サンプル液体および非結合の標識試薬は、遠心分離によっても除去され得る。非結合の標識試薬および細菌から分離されたサンプル液体は、好ましくは、膜の後ろに配置された第二のチャンバーに移行される。
【００２６】
標識試薬および試験されるべきサンプルは、インキュベーション手順前および／または手順中に均一に混合され得る。測定デバイス内に場合により組み込まれる振動素子が、この目的のために提供され得る。インキュベーション後に、標識化細菌は、場合により、１回または数回洗浄され得る。
【００２７】
インキュベーション手順のために提供される第一のチャンバーは、定量的な判定に十分な量の細菌を含むサンプル容量を受け入れることができるように設計される。反応チャンバーは、通常、０．５ｍｌまたはそれよりも多く、例えば１〜１００ｍｌ、好ましくは５〜５０ｍｌのサンプル容量が意図される。およそ１０ｍｌの容量が特に好ましい。
【００２８】
本発明に係る方法は、ラベル基の特徴である放射線、例えば、蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線を測定することによる、集められた細菌に結合した標識試薬の判定に関する。この目的のために、光源からの励起光が、集められた細菌の上に照らされて、細菌上に位置する標識試薬により放射される蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線が測定される。好ましい実施態様では、測定は、サンプル液体および過剰の標識試薬が除去された時点で、および、場合により１回または複数回の洗浄ステップ後に、集められた細菌を膜上で直接試験することによって実施される。
【００２９】
量子カスケードレーザーのようなレーザーが、好ましくは光源として用いられる。このレーザーは、集められた細菌を照射する、好ましくは、集められた細菌を範囲的に照射する、好ましくは、膜上に集められた細菌を範囲的に照射することを可能にするために、適切な光学システムに接続される。レーザーシステムは、光学的に透明なファイバー、例えばガラスファイバーを用いて、反応チャンバー内に連結され得る。
【００３０】
蛍光または発光を検出するために、例えば３５０〜４２０ｎｍの照射波長を有するＵＶ範囲マルチモードまたはシングルモードレーザーダイオードが、レーザーとして用いられ得る。市販される標準的なレーザーダイオードを用いることによって達成され得る３６５ｎｍおよび４０５ｎｍの照射波長が好ましい。ラマン放射線を検出するために、ＵＶ、ＶＩＳまたは近赤外線の範囲内の適切な照射波長を有するレーザーも用いられ得る。
【００３１】
細菌に結合した標識試薬は、蛍光分光法を用いて、好ましくは、蛍光相関分光法を用いて、および／または、ラマン分光法によって、判定され得る。この場合では、光源を起源とする励起光は、判定されるべき細菌が中に配置される励起体積を産生するために、適切な共焦点光学システムを用いてサンプルに焦点が合わせられる。
【００３２】
細菌に結合した標識試薬によって放出される放射線、例えば、蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線は、光検出器を用いて測定される。光検出器は、例えば、アバランシェフォトダイオードまたはＥＭＣＣＤカメラであってよい。分光計は、好ましくは、光検出器として用いられて、その分光計は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、および、２００または２５０ｎｍまでの範囲にわたる放射される光をスペクトル的に分解するのを可能にさせる。光検出器、例えば、２００〜２０００ｎｍの測定範囲を有する分光計が、好ましくは用いられる。分光計の光学的分解能は、０．３５〜１ｎｍ、好ましくは、およそ０．６〜０．９ｎｍである。
【００３３】
一実施態様では、標識化細菌は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）によって判定される。当該方法は、単色レーザー光を用いたラマンレポーター分子の励起に基づき、それにより、特異的なラマンスペクトルが放射される。シグナルは、ラマンレポーター分子と、それが結合される金属ナノ粒子との間の相互作用によって増幅される。好ましい金属ナノ粒子は、銀または金のような貴金属からなり、異なる構造およびサイズを有し得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１３，１１３，１３９１−１４２８，ＥＰ  ２  １３４  ６４２  Ｂ１）。
【００３４】
光検出器において得られる測定シグナルは、定量的に評価される。このことは、試験されるべきサンプル内に存在する細菌の数を与え、それは、結果として測定される蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線と相関する。測定される細菌の数は、サンプル容量あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の特異的な値に相当する。
【００３５】
測定シグナルに基づいて判定される細菌の数は、閾値を用いて１つまたは複数のカテゴリーに分類され得る。これらの閾値は、特定の方法に特有の蛍光強度と相関する。レジオネラが検出される場合は、例えば、１００ｍｌあたりの１００ＣＦＵに相当する第一の閾値が設定され得る。判定される細菌の数がこの値を超える場合は、対応する水系内のレジオネラを制御するための手段を取らなければならない。１００ｍｌあたり１０，０００ＣＦＵは、別の閾値として設定され得る。判定される細菌の数がこの値を超える場合は、対応する水系の即時休業を伴う緊急手段を取らなければならない。
【００３６】
定量的評価を助けるために、例えば、参照レーザーを用いて生産され得る少なくとも１つの参照シグナルを用いることによって、キャリブレーションが実施され得る。あるいは、キャリブレーションは、内部標準、例えば、光学的に検出可能な標識試薬とは異なる蛍光ラベル、発光ラベルまたはラマンラベルを保有する、蛍光、発光またはラマン活性の粒子を用いることによって実施してもよい。
【００３７】
また、本発明は、
（ｉ）第一のチャンバー（場合により、判定されるべき細菌、例えばバクテリオファージのための標識試薬を含む貯蔵庫を備え、標識試薬は、好ましくは、蛍光標識試薬、発光標識試薬、および、ラマン標識試薬から選択される）
（ｉｉ）第二のチャンバー、および
（ｉｉｉ）第一のチャンバーと第二のチャンバーとの間に配列される、膜（膜は、判定されるべき細菌に不透過性であり、判定されるべき細菌に結合されない標識試薬に透過性である）、
を備える、細菌を定量的に判定するための測定用セルにも関する。
【００３８】
また、本発明は、
（ｉ）上記に規定される測定用セル、
（ｉｉ）過剰の標識試薬を第一のチャンバーから取り除いて、第二のチャンバーにそれを移行させるための手段、
（ｉｉｉ）膜上に集められる標識化細菌の放射線、例えば、蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線を励起するための手段、および
（ｉｖ）集められた細菌が起源である測定シグナルを定量的に評価するための手段、
を備える、細菌を定量的に判定するためのデバイスにも関する。
【００３９】
本発明に係る測定用セルおよびデバイスは、細菌を定量的に判定するための方法、具体的には、本発明に係る上述の方法において、用いられ得る。水サンプル中のレジオネラを定量的に判定するための使用が特に好ましい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の細菌を定量的に判定するための方法であって、
（ａ）試験されるべき前記サンプルを、判定されるべき前記細菌に結合することのできる標識試薬とともにインキュベートするステップ（前記標識試薬は、標識化バクテリオファージ、好ましくは、蛍光標識化バクテリオファージ、発光標識化バクテリオファージ、または、ラマン標識化バクテリオファージであり、検出されるべき前記細菌に対して過剰で用いられる）、
（ｂ）前記細菌に結合しなかった標識試薬を、判定されるべき前記細菌に不透過性であり、前記標識試薬に透過性である膜を用いて、前記細菌から除去するステップ（ここで、判定されるべき前記細菌は、前記膜上に集められる）、
（ｃ）好ましくは、蛍光測定、発光測定および／またはラマン測定を用いて、集められた前記細菌に結合した前記標識試薬を判定するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）からの測定シグナルを定量的に評価するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記細菌は、レジオネラ、サルモネラ、リステリア、Ｅ．ｃｏｌｉのような大腸菌型細菌、ＭＲＳＡのような病院細菌から選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の方法であって、
（ｉ）第一のチャンバー（場合により、前記標識試薬のための貯蔵庫を備える）、
（ｉｉ）第二のチャンバー、および
（ｉｉｉ）前記の第一のチャンバーと前記の第二のチャンバーとの間に配列される、膜（前記膜は、判定されるべき前記細菌に不透過性であり、判定されるべき前記細菌に結合されない標識試薬に透過性である）、
を備える測定用セルが、前記判定のために用いられることを特徴とし、および、
前記のインキュベーションステップが終わった時点で、判定されるべき前記細菌に結合されない標識試薬は、前記の第一のチャンバーから除去されて、前記膜を通って前記の第二のチャンバーへ移行する、
方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法であって、
およそ０．５〜３μｍのポア直径を有する膜が用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、
前記標識試薬および試験されるべき前記サンプルは、ステップ（ａ）におけるインキュベーションの手順前および／または手順中に混合されることを特徴とする、
方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、
光源として共焦点光学部品を備えるレーザーが、ステップ（ｃ）における光学的判定のために用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記レーザーは、検出ユニットを形成するように分光計と一緒に組み込まれたデバイスにおいて用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法であって、
ステップ（ｄ）における定量的評価は、特定の数の細菌を、所定の閾値に基づいて１つまたは複数のカテゴリーに分類するステップを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の方法であって、
少なくとも１つの参照シグナル、具体的には、レーザーによって生産される参照シグナルが、ステップ（ｄ）における定量的評価に用いられることを特徴とする、
方法。
【請求項１０】
細菌を定量的に判定するための測定用セルであって、
（ｉ）第一のチャンバー（標識試薬のための貯蔵庫を備え、ここで、前記標識試薬は、標識化バクテリオファージ、好ましくは、蛍光標識化バクテリオファージ、発光標識化バクテリオファージ、または、ラマン標識化バクテリオファージである）、
（ｉｉ）第二のチャンバー、および
（ｉｉｉ）前記の第一のチャンバーと前記の第二のチャンバーとの間に配列される、膜（前記膜は、判定されるべき前記細菌に不透過性であり、判定されるべき前記細菌に結合されない標識試薬に透過性である）、
を備える、
測定用セル。
【請求項１１】
請求項１０に記載の測定用セルであって、
前記の第一のチャンバーの容量は、２〜２０ｍｌであることを特徴とする、
測定用セル。
【請求項１２】
細菌を定量的に判定するためのデバイスであって、
（ｉ）請求項１０または１１のいずれかに記載の測定用セル、
（ｉｉ）過剰の標識試薬を前記の第一のチャンバーから取り除いて、前記の第二のチャンバーにそれを移行させるための手段、
（ｉｉｉ）前記膜上に集められる標識化細菌の放射線、好ましくは、蛍光放射線、発光放射線および／またはラマン放射線を励起するための手段、および
（ｉｖ）集められた前記細菌が起源である測定シグナルを定量的に評価するための手段、
を備える、
デバイス。
【請求項１３】
請求項１０または１１のいずれかに記載の測定用セルまたは請求項１２に記載のデバイスの使用であって、
細菌を定量的に判定するための方法での、具体的には、請求項１から９のいずれかに記載の方法での、
使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、
水サンプル中のレジオネラを定量的に判定するための、
使用。
【国際調査報告】
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