(57)【要約】  本発明は、懸濁固形物を含有するフィードストリームから分析物の分離で使用するための分離媒体、上記分離媒体を使用する分離方法、及び懸濁固形物を含有するフィードストリームから分析物を分離するための分離媒体の用途に関する。本分離媒体は、表面が三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルとして提供され、当該ヒドロゲルは、少なくとも１つの標的分析物を結合する少なくとも１つのリガンドを含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルを含む分離媒体であって、前記ヒドロゲルが少なくとも１つの標的分析物を結合する少なくとも１つのリガンドを含む、分離媒体。
【請求項２】
前記ヒドロゲルの構造は、シェーンジャイロイド（Ｓｃｈｏｅｎ  ｇｙｒｏｉｄ）構造、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ダイヤモンド構造、シュワルツプリミティブ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）構造及びシェーンＩＷＰ構造を含む群から選択される、請求項１に記載の分離媒体。
【請求項３】
前記ヒドロゲルの構造は、ジャイロイド構造である、請求項１に記載の分離媒体。
【請求項４】
前記ヒドロゲルが熱応答性ヒドロゲルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離媒体。
【請求項５】
前記ヒドロゲルが、多糖類ヒドロゲル、例えば、アガロース又はセルロースヒドロゲルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離媒体。
【請求項６】
前記ヒドロゲルが、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー、好ましくは陽イオン交換、好ましくは陰イオン交換における使用のためのリガンドで官能化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離媒体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離媒体を含む、クロマトグラフィー装置。
【請求項８】
前記分離媒体が、カラム内に含まれるか、又はカラムの形態である、請求項７に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項９】
フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離媒体を、前記フィードストリームと接触させて、少なくとも１つの標的分析物を前記分離媒体に結合させることを含む、方法。
【請求項１０】
フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離媒体を、前記少なくとも１つの分析標的物が前記分離媒体に結合することを可能にする条件下でフィードストリームと接触させることを含む、方法。
【請求項１１】
前記フィードストリームは、懸濁固形物を含み、好ましくは、前記懸濁固形物は、組織、組織破片、細胞、細胞破片、生体分子、及び脂質、タンパク質、炭水化物及び／又は核酸の凝集体を含む生体分子の凝集体からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離媒体からの、又は前記分離媒体に結合された少なくとも１つの標的分析物を回収することを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって：
（ａ）前記分離媒体を前記フィードストリームと接触させる段階、及び
（ｂ）前記フィードストリームを回収する段階、を含む、方法。
【請求項１４】
前記分離媒体は、前記少なくとも１つの標的分析物が前記分離媒体に特異的に又は優先的に結合することを可能にする条件下で、前記フィードストリームと接触する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記フィードストリームは、懸濁固形物を含み、好ましくは、前記懸濁固形物は、組織、組織破片、細胞、細胞破片、生体分子、及び脂質、タンパク質、炭水化物及び／又は核酸の凝集体を含む生体分子の凝集体からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの標的分析物が、抗体、抗体の抗原結合断片、及びシトクロムＣ及びα−ラクトアルブミンなどのタンパク質からなる群から選択される、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得られた、生成物。
【請求項１８】
標的分析物を含有する組成物である、請求項１７記載の生成物。
【請求項１９】
前記フィードストリームが本発明の分離媒体と接触する前のフィードストリーム対比減少した濃度の標的分析物を含有するフィードストリームである、請求項１３に記載の生成物。
【請求項２０】
フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法であって、
ａ）少なくとも１つの標的分析物を特異的に及び／又は優先的に結合するリガンドを含む分離媒体をフィードストリームと接触させて、前記少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させる段階であって、
前記フィードストリームは、組織、組織破片、細胞、細胞破片、生体分子、及び脂質、タンパク質、炭水化物及び／又は核酸の凝集体を含む生体分子の凝集体からなる群から選択される懸濁固形物を含み、
前記分離媒体は、表面が三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルであり、
前記ヒドロゲルの構造は、シェーンジャイロイド構造、シュワルツダイヤモンド構造、シュワルツプリミティブ構造及びシェーンＩＷＰ構造、好ましくはジャイロイド構造を含む群から選択され、
前記ヒドロゲルは、熱応答性ヒドロゲル、好ましくは多糖類ヒドロゲル、好ましくはアガロース又はセルロースヒドロゲルであり、なお
前記ヒドロゲルは、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける使用のためのリガンドで官能化される、段階；及び
ｂ）前記分離媒体からの、前記分離媒体に結合された少なくとも１つの標的分析物を回収する段階をさらに含む段階、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．技術分野
本発明は、一般的に、表面が三重周期的最小表面（ｔｒｉｐｌｙ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）によって定義される構造を有するヒドロゲルを含む分離媒体であって、標的分析物、例えば、好ましい生体分子をフィードストリームから分離するのに使用され得る分離媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景技術
生体分子は、タンパク質、多糖類、脂質及び核酸などの大きな巨大分子だけでなく、１次代謝産物、２次代謝産物及び天然産物などの小さな分子を含む生物体内に存在する分子である。
【０００３】
現在、産業及び医学業界全般にかけて生体分子（生物医薬品又は生物製剤を含む）の使用における多大な関心が払われている。生物医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とは、生物学的原料から製造されるか、これから抽出されるか、これから半合成された医薬品である。
【０００４】
医薬品の対象となる生体分子には、抗体（組換え、天然、ヒト化、ポリクローナル及びモノクローナル）、治療用タンパク質（例えば、インシュリン、成長因子、及び貧血、関節リウマチ及び癌に対処する治療剤）、成長因子、ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ＤＮＡ（プラスミド及びその他のもの）及びＲＮＡを含む。
【０００５】
関心対象の他の生体分子には、乳製品栄養補助食品及び他の高価値タンパク質、例えば、ラクトフェリンが含まれる。
【０００６】
好ましい生体分子は、これらの分子を含有するフィードストリームからクロマトグラフィー分離によって得られることが多い。だが、クロマトグラフィー分離を利用して、複合フィードストリームから好ましくない生体分子を除去することもできる。例えば、牛乳からベータ−ラクトグロブリンを除去するか、組換え製造された治療用タンパク質を含有する発酵ブロスからタンパク質分解タンパク質を除去することができる。
【０００７】
標準クロマトグラフィー分離技術の１つの欠点は、標的分析物を分離可能になる以前に、たとえ低濃度の懸濁固形物でもフィードストリームから除去する必要があるということである。
【０００８】
例えば、生体分子含有フィードストリームは、細胞破片及び他の固形物を含有する発酵ブロス又は細胞培養物を含むことが多い。これらの懸濁固形物（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｓｏｌｉｄ）は、フィードストリームが通過するクロマトグラフィー媒体の閉塞を防止するために、遠心分離及び／又は濾過工程によって最初に除去されなければならない。
【０００９】
これらの追加的な処理工程は、製造時間とコストの両方を大幅に増加させる。
【００１０】
なお、遠心分離及び／又は濾過工程は、標的分析物の総収率の損失をもたらす。標的分析物が不安定化合物である場合、処理量を増大すると、変性条件（高せん断応力及び高温）及びプロセスストリーム中に存在するプロテアーゼに対する露出が増加する。結果的に、分析物の活性及び生成物の総収率の両方が減少する。
【００１１】
従って、フィードストリーム、懸濁固形物を含有した特定のフィードストリームから標的分析物、特に生体分子を分離するのに使用され得る追加的な分離媒体及び方法が必要である。
【００１２】
本発明の目的は、かかる必要性を満たすことにおいて少なくともある程度を果すこと、及び／又は公衆に有用な選択肢を、少なくとも提供することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
３．発明の要約
本発明は、一般的に、懸濁固形物を含有するフィードストリームから分析物の分離に使用するためのヒドロゲル、及び分離方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様において、本発明は、表面が三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルを含む分離媒体であって、上記ヒドロゲルが、少なくとも１つの標的分析物を結合する少なくとも１つのリガンドを含む、分離媒体を提供する。
【００１５】
一実施形態において、ヒドロゲルの構造は、シェーンジャイロイド（Ｓｃｈｏｅｎ  ｇｙｒｏｉｄ）（ジャイロイド）構造、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ダイヤモンド構造、シュワルツプリミティブ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）構造及びシェーンＩＷＰ構造を含む群から選択される。
【００１６】
一実施形態において、ヒドロゲルの構造は、ジャイロイド構造又はシュワルツダイヤモンド構造である。
【００１７】
一態様において、本発明は、ジャイロイド構造のヒドロゲルを含む分離媒体であって、上記ヒドロゲルが少なくとも１つの標的分析物を結合する少なくとも１つのリガンドを含む、分離媒体を提供する。
【００１８】
上記態様において：
一実施形態において、リガンドは、少なくとも１つの標的分析物に特異的に及び／又は優先的に結合する。
【００１９】
一実施形態において、ヒドロゲルは、多糖類ヒドロゲルである。一実施形態において、ヒドロゲルは、熱応答性である。好ましくは、ヒドロゲルは、アガロース又はセルロースを含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本発明の分離媒体を含むクロマトグラフィー装置に関する。一実施形態において、クロマトグラフィー装置は、クロマトグラフィーカラムである。
【００２１】
別の態様において、本発明は、分離媒体をフィードストリームと接触させることによって、フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離するための本発明の分離媒体の使用に関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件下で、上記分離媒体をフィードストリームと接触させることによって、フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離するための本発明の分離媒体の使用に関する。
【００２３】
別態様において、本発明は、分離媒体をフィードストリームと接触させて、少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させることによって、フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離するための本発明の分離媒体の使用に関する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させる段階を含むフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件下で、本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させる段階を含む、フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させて、少なくとも１つの標的分析物を上記分離媒体に結合させる段階を含む、フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関する。
【００２７】
一実施形態において、本使用又は方法はまた、分離媒体からの、又は分離媒体に結合された少なくとも１つの標的分析物を回収する段階を含む。
【００２８】
別の態様において、本発明は、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって、
（ａ）本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させる段階、及び
（ｂ）上記フィードストリームを回収する段階、を含む方法に関する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって、
（ａ）少なくとも１つの標的分析物が分離媒体を結合することを可能にする条件下で本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させる段階、及び
（ｂ）上記フィードストリームを回収する段階、を含む方法に関する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって、
（ａ）本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させて、上記少なくとも１つの標的分析物を上記分離媒体に結合させる段階、及び
（ｂ）上記フィードストリームを回収する段階、を含む方法に関する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された生成物に関する。別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られた生成物に関する。
【００３２】
上記態様において：
一実施形態において、上記生成物は、標的分析物を含有する組成物である。別の実施形態において、上記生成物は、フィードストリームが本発明の分離媒体と接触する前に、フィードストリームに比べて減少した濃度の標的分析物を含有するフィードストリームである。
【００３３】
一実施形態において、フィードストリームは、懸濁固形物を含有する。
【００３４】
本明細書において、特許明細書、その他の外部文書又はその他の情報源が参照されている場合、これは一般的に、本発明の特徴を論ずるための前後関係を提供することを目的とする。他に具体的に明示しない限り、そのような外部文書に対する参照は、いかなる管轄においても、そのような文書又は情報源が先行技術であるとか、又は当該技術分野において普及されている一般的な知識の一部を構成するということを認めるものと解釈されるべきではない。
【００３５】
本明細書に開示された範囲（例えば、１〜１０）の範囲に対する言及は、なおその範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９及び１０）及びその範囲内の任意の範囲の有理数（例えば、２〜８、１．５〜５．５及び３．１〜４．７）に対する言及を含むことを意図し、従って、本明細書において明示的に記載されているすべての範囲のすべての下位範囲が明示的に開示される。これらは、具体的に意図されたものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値との間のすべての数値の可能な組合わせは、本出願において同様の方式で明示的に記述されると見なされるべきである。
【００３６】
本発明に関連する当業者には、添付された特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の構造及び異なる実施形態及び用途における多くの変化が連想されるであろう。本明細書における開示及び説明は、純粋に例示的なものであり、いかなる意味でも限定しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
４．図面の簡単な説明
【図１】図１は、（ａ）及び（ｂ）２つの異なるジャイロイド構造の例；（ｃ）流路の分岐に起因する多孔性の変化を有するジャイロイド構造；（ｄ）２つの独立した流動チャンネル及び単一固相を含むこの中ジャイロイド構造；（ｅ）均一な直径を有する２つの独立した流動チャンネル及び３つの独立した固相材料を含むジャイロイド構造を示す一連の写真である。
【図２】図２は、ｓｉｎ（ｘ）・ｃｏｓ（ｙ）＋ｓｉｎ（ｙ）・ｃｏｓ（ｚ）＋ｓｉｎ（ｚ）・ｃｏｓ（ｘ）＜Ｇで定義されるジャイロイド構造の多孔性と定数Ｇとの関係を示すグラフである。
【図３】図３は、ｓｉｎ（ｘ）・ｃｏｓ（ｙ）＋ｓｉｎ（ｙ）・ｃｏｓ（ｚ）＋ｓｉｎ（ｚ）・ｃｏｓ（ｘ）＜０で定義される３Ｄプリントジャイロイドモノリスの写真である。
【図４】図４は、５０％セルロース粉末が添加され、様々なレベルの化学的架橋結合を有するセルロース及びアガロースベースのゲルの一連のＳＥＭ顕微鏡写真である。このゲルは、アセトン中に保存した後、水に保存し、続いて凍結乾燥したものを示している。顕微鏡写真は、ジャイロイド構造のチャンネルではなく、ヒドロゲルの内部多孔性を示す。
【図５】図５は、本発明の分離媒体を製造するプロセスを示す図である。
【図６】図６は、ジャイロイド構造のチャンネルを示す本発明の分離媒体の２つの光学顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ＳＮＡＰカラムにアガロースジャイロイド構造を含み、結合されたシトクロムＣが赤色を呈する、クロマトグラフィー装置（ＳＮＡＰカラム）の写真である。Ｓｎａｐは、「ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ」、３０８  Ｔｏｓｃａ  Ｄｒｉｖｅ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ  ０２０７２の登録商標である。
【図８】図８は、ＢＳＡ及び酵母細胞からのシトクロムＣの分離を示すクロマトグラムである。
【図９】図９は、クロマトグラフィー分析から収集された画分のＳＤＳＰＡＧＥゲルを示す。１：ロードサンプル。２−１０：フロースルーピーク（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｅａｋ）。１１−１７：溶出ピーク。Ｌ：Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐタンパク質標準のラダー。
【図１０】図１０は、レーン２〜１７からのゲルに対するＢＳＡ及びシトクロムＣバンドの相対バンド強度を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例４に記載されたように、本発明のＤＥＡＥアガロースカラムにロードされた２．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡの分離を示すクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、実施例４に記載されたように、ＤＥＡＥアガロースカラムにロードされた２．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと１．０ｍｇ／ｍｌシトクロムＣとの分離を示すクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、ＢＳＡ及びシトクロムＣ画分のＳＤＳＰＡＧＥゲルであり、ここで、ＯＮ＝サンプル上（ｏｎ  ｓａｍｐｌｅ）：Ｌ＝ラダー（ｌａｄｄｅｒ）：１−２＝フロースルーピーク；３〜７＝結合されていないサンプルを洗浄：８〜１４＝溶出。
【図１４】図１４は、アガロースＤＥＡＥカラムにロードされたＢＳＡ、酵母、酵母＋ＢＳＡサンプルの６００ｎｍの吸光度におけるクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、ベンジルアミンアガロースカラムにおいてα−ラクトアルブミンのクロマトグラムである。単一段階で１００％溶出緩衝液を添加して２８０ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度を分析した。
【図１６】図１６は、酵母の存在下でα−ラクトアルブミン、酵母のみ、及びα−ラクトアルブミンを捕捉するためのベンジルアミンアガロースカラムについての試験の２８０ｎｍでの吸光度を示すクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、酵母の存在下でα−ラクトアルブミン、酵母のみ、及びα−ラクトアルブミンを捕捉するためのベンジルアミンアガロースカラムについての試験の６００ｎｍでの吸光度を示すクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、シュワルツＤ陽イオン交換体上のシトクロムＣ結合のクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、シュワルツＤアガロース陽イオン交換体上のシトクロムＣ、酵母、及びシトクロムＣ＋酵母についての２８０ｎｍでのＵＶ吸光度のクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、シュワルツＤアガロース陽イオン交換体上のシトクロムＣ、酵母、及びシトクロムＣ＋酵母についての６００ｎｍでのＵＶ吸光度のクロマトグラムである。
【図２１】図２１は、シェーンジャイロイドセルロース陽イオン交換体のシトクロムＣ結合のクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、シェーンジャイロイドセルロース陽イオン交換体上のシトクロムＣ、酵母、及びシトクロムＣ＋酵母についての２８０ｎｍでのＵＶ吸光度のクロマトグラムである。
【図２３】図２３は、シェーンジャイロイドセルロース陽イオン交換体のシトクロムＣ、酵母、及びシトクロムＣ＋酵母についての６００ｎｍでのＵＶ吸光度のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
５．発明の詳細な説明
５．１定義
本明細書で使用される「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも部分的に〜から構成された」ということを意味する。用語「含む」を含む本明細書及び特許請求の範囲における説明を解釈するとき、それぞれの説明においてこの用語で前書きされる特徴以外に他の特徴も存在することができる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」のような関連用語も同様に解釈されるべきである。
【００３９】
本明細書で使用される「多孔性(ｐｏｒｏｓｉｔｙ)」という用語は、ボイド率又はボイドスペースを意味し、パーセンテージとして表される全体積に対する全ボイドの体積の百分率である。
【００４０】
「分析物」という用語は、当業者に知られ理解されるように、本明細書で使用され、関心のある化合物、物質又は化学的成分を指す。好ましくは、分析物は生体分子である。
【００４１】
「非標的分析物」という用語は、当業者に知られ理解されるように、本明細書で使用され、関心の対象ではない化合物、物質又は化学的成分を指す。例えば、非標的分析物は、細胞培養物又は細胞溶解物中のタンパク質、核酸、脂質又は他の細胞成分であり得る。非標的分析物は、分離媒体に結合せずに本発明の分離媒体を通過するか、標的分析物よりも低い特異性又は低い結合親和力で分離媒体を結合させ、非標的分析物が当業者によって容易に決定される溶出又は洗浄条件を使用して分離媒体から除去することができることを意図するが、これに限定されるのではない。
【００４２】
本明細書で使用される用語「結合」は、２つの物質間の付着を意味し、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、極性又は静電気力及びイオン結合を含む。２つの物質は、一般的に、溶液中に存在する分子（移動相）及びクロマトグラフィーマトリックス上に存在するリガンド（固相）に存在するリガンドと呼ばれる。
【００４３】
リガンド及び標的分析物に関連して本明細書で使用される用語「優先的に結合する」は、標的分析物が非標的分析物よりも高い効率でリガンドに結合することを意味する。
【００４４】
リガンド及び標的分析物に関連して使用される用語「特異的に結合する」は、標的分析物のみがリガンドに結合することを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される用語「標的分析物が結合することを可能にする条件下で」は、分析物とリガンドとの間の相互作用を可能にするｐＨ、イオン強度、組成、温度、粘度及び密度の観点から移動相の条件を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される用語「結合親和性」は、リガンドに結合するための分析物の親和性を意味する。所定の分析物−リガンド対の結合親和性を検出する様々な手段が当業界に知られている。当業者は、通常的な物質としてリガンドに対する分析物の結合親和性を決定するために、そのような手段を使用することができると考えられる。
【００４７】
本明細書で使用される用語「三重周期的最小表面」は、表面の小さな部分を使用して基本的な部分を取り、空間内の３つの独立した方向に写本を翻訳することによって、全表面を組立てるのに使用され得ることを意味する。
【００４８】
５．２本発明の分離媒体
懸濁固形物を含有したフィードストリームから標的分析物を直接分離するためには、懸濁固形物を自由に通過させながら、分析物結合のための適切な表面積を提供する分離媒体が必要である。
【００４９】
公知された分離技術の主な欠点は、関心のある多くの分析物が現在利用可能な方法を使用して回収され得る前に、フィードストリームを前処理又は前濾過する必要があることである。
【００５０】
本発明者らは、驚くべきことに、標的分析物を依然として保有しながら移動相の最上の流動パターンを達成する分離媒体が、表面が三重周期的最小表面、特にシェーンジャイロイド構造によって定義される構造を有するヒドロゲルであることを見出した。
【００５１】
シェーンジャイロイド構造の表面は、次の方程式で近似できる複雑な数学式によって定義される：
【数１】
2018537283.tif 000003
ここで、ｘ、ｙ及びｚはデカルト座標系における媒体内の点などの位置であり、Ｇは任意の定数である。「＝」記号が「＜」記号に置換される場合、方程式は空間内の２つの個別領域を識別し、その境界面は上記の元の方程式で定義される。次に、２つの領域は、多孔性固形物及びボイド（流動チャンネル）として同定される。任意定数Ｇは、媒体の幾何学的構造内の固体及び空間（流動チャンネル）部分の相対的な体積分率を決定する任意の定数である。ジャイロイド構造の範囲は、この式の定数及び関数を変更して準備することができる。非限定的な例が図１に提示されている。
【００５２】
従って、本発明の分離媒体は、ジャイロイド構造のヒドロゲルを含み、上記ヒドロゲルは、標的分析物に結合する少なくとも１つのリガンドを含む。
【００５３】
ジャイロイド構造のヒドロゲルは、固相のリガンドと移動相の分析物との間に十分な接触を提供して結合を引き起こし、懸濁固形物の通過を可能にする。
【００５４】
一実施形態において、ジャイロイド構造は、下記方程式で定義される。
【数２】
2018537283.tif 000004
ここで、ｘ、ｙ及びｚはデカルト座標系における媒体内の点の位置であり、Ｇは−１．４１３〜１．４１３、好ましくは約−１．４〜約１．４、より好ましくは約−０．５〜約０．５である。不等式は方程式の左辺がＧよりも小さく、定義された体積内の座標ｘ、ｙ及びｚに固相がプリントされ、上記左辺がＧである離れた位置は、流動チャンネル（移動相）を含むということを示す。
【００５５】
一実施形態において、Ｇは０である。
【００５６】
一実施形態において、ジャイロイド構造を限定するヒドロゲルを通る相互連結チャンネルは、直径が約５〜約５００ｍｍ、好ましくは直径が約１０〜約２５０μｍである。
【００５７】
三重周期的最小表面の他のタイプは、本発明における幾何形状に定義されて使用することができる。三重周期的最小表面の他のタイプは、下記の方程式で定義されるシュワルツプリミティブ幾何構造である。
【数３】
2018537283.tif 000005
ここで、ｘ、ｙ、ｚ及びＧは上記で定義した通りである。
【００５８】
三重周期的最小表面の別のタイプは、以下の２つの方程式のうちのいずれかで定義されるシュワルツダイヤモンド幾何構造である。
【数４】
2018537283.tif 000006
又は
【数５】
2018537283.tif 000007
ここで、ｘ、ｙ、ｚ及びＧは上記で定義した通りである。
【００５９】
三重周期的最小表面の別のタイプは、下記の方程式で定義されるシェーンＩＷＰ幾何構造である。
【数６】
2018537283.tif 000008
ここで、ｘ、ｙ、ｚ及びＧは上記で定義した通りである。
【００６０】
ジャイロイド構造は自然的に生じるが（例えば、バタフライウィング、ミトコンドリア膜、ブロック共重合体及び水−脂質相）、ナノスケール及び非常に特異的な条件下でのみ自然的に形成される。本発明は、マイクロスケールでジャイロイド又は他の三重周期的構造を有するヒドロゲルに関する。
【００６１】
ヒドロゲルは、ナノメートル範囲（＜１μｍ）の細孔サイズを有する内部多孔性を特徴とする。これらの内部細孔は、マイクロメートル範囲、すなわちマイクロスケールにおいて細孔及び／又はチャンネルサイズを有するジャイロイド構造の幾何学的特徴よりもはるかに小さいサイズである。
【００６２】
一実施形態において、本発明のクロマトグラフィー媒体は、表面が約１０〜約９０％、好ましくは約５０〜約９０％、より好ましくは約３０〜約７０％の多孔性を有する三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルを含む。
【００６３】
一実施形態において、本発明のクロマトグラフィー媒体は、約１０〜約９０％、好ましくは約５０〜約９０％、より好ましくは約３０〜約７０％の多孔性を有するジャイロイド構造のヒドロゲルを含む。
【００６４】
「ジャイロイド構造」又は「シェーンジャイロイド」という用語は、２つの独立したジャイロイド形状チャンネルのネットワークが固相に分離されるか又はその逆の構造を含む。
【００６５】
本発明の分離媒体は、粒子幾何構造又はランダムパッキング手順に従って制限されない完全に制御された流れ部分を提供する。表面が三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルを含む分離媒体は、前処理の必要なしに、懸濁固形物粒子を含有する大量のフィードストリームの迅速なクロマトグラフィー処理を可能にする。一実施形態において、ヒドロゲルは、ジャイロイド構造である。
【００６６】
これは、（ａ）固体含有供給物を通過させるためのチャンネルにおける高い自由体積、（ｂ）固相の高い表面積（すなわち、標的分析物に対する高い吸着能力）、（ｃ）媒体の全長にわたって移動相及び固相における拡散のための均一な経路長さ、及び（ｄ）汚染危険を最小化してＣＩＰ洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｃｅ）要求量を減少させるデッドエンドゾーン（ｄｅａｄ  ｅｎｄ  ｚｏｎｅ）及び最小再循環領域がないことを含む特徴の組合わせに起因する。
【００６７】
これらの特性は、圧力降下が減少し、構造が高いせん断条件下で機械的に安定であり、固体／液体接触が改善されることを意味する。
【００６８】
一態様において、本発明は、表面が三重周期的表面によって定義される構造を有するセルロース又はアガロースヒドロゲルを含む分離媒体であって、上記構造のチャンネルが約５〜約５００μｍ直径であり、上記ヒドロゲルが約５０〜約９０％の多孔性を有し、上記ヒドロゲルが、少なくとも１つの標的分析物を結合する少なくとも１つのリガンドを含む、分離媒体を提供する。
【００６９】
一態様において、本発明は、ジャイロイド構造のセルロース又はアガロースヒドロゲルを含む分離媒体であって、上記ジャイロイドのチャンネルが約５〜約５００μｍ直径であり、上記ジャイロイド構造が約５０〜約９０％の多孔性を有し、上記ヒドロゲルが、少なくとも１つの標的分析物を結合する少なくとも１つのリガンドを含む、分離媒体を提供する。
【００７０】
５．３本発明の分離媒体の製造
本発明の分離媒体は、ヒドロゲル形成溶液をジャイロイド構造のヒドロゲルにセッティングすることによって製造される。ヒドロゲルの選択は、一部のヒドロゲルが特定の成形技術により適しているので、ジャイロイド構造が達成される方法に依存する。
【００７１】
一実施形態において、分離媒体は、従来の３Ｄプリンターがプラスチック又は他の適切な材料を使用して所望のジャイロイド構造のネガティブの鋳型を作るネガティブテンプレートを使用して準備される。アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）が好ましい。その後、鋳型は、ヒドロゲル形成溶液で注入した後、ゲル化され固体ヒドロゲルを形成する。その後、鋳型は、所望の３Ｄ構造を有するヒドロゲル媒体を残して（ＡＢＳ用）、アセトンで容易に溶解する。この物質は、クロマトグラフィーカラムに挿入して懸濁固形物を含有したフィードストリームから標的分析物を分離するのに使用することができる。
【００７２】
この技術の解像度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、鋳型製作に使用される３Ｄプリンターで達成できる解像度にのみ制限される。従って、壁及びチャンネルのサイズ、ねじれ（ｔｏｒｔｕｏｓｉｔｙ）及び厚さは、すべて自由に変更することができる。なお、複数の独立した流動チャンネルを含むヒドロゲルが製造されることができ、多孔性は同一の分離媒体内で変化され得る。
【００７３】
チャンネル内の流れの主軸に対するジャイロイド幾何構造の相対的な配向は、細孔を通って優先的な軸方向（又はほぼ軸方向）の流れを提供するようなものであり得るか、異なる流路の相互連結を助けるために軸に対して一定角度を成すことができるか、又は任意の他の中間相対的な配向を有することができる。
【００７４】
例えば、最も簡単なジャイロイド構造の場合（Ｇを除いたすべての定数は１である）：
【数７】
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多孔性は、定数Ｇを変更して簡単に調整することができる（図２参照）。
【００７５】
このようなジャイロイド構造の場合、ボイド率と定数Ｇとの間の関係は、ほぼ線形関係（−１．４１３＜Ｇ＜１．４１３の範囲内）を有することができるが、他の関係は、他のパラメーター（例えば、表面積、細孔サイズなど）に対しても有効である。なお、これらの関係は、ジャイロイド構造が基本方程式の異なる形態で定義される場合に異なるであろう。
【００７６】
ネガティブテンプレート方法は、特に熱応答性ヒドロゲルの製造に適している。熱応答性ヒドロゲルは、単純に温度を変化させることによってゲル化することができるヒドロゲル形成溶液から作られる。
【００７７】
例えば、セルロースベースヒドロゲルは、低温（４℃未満）でネガティブテンプレートにセルロース溶液を注入した後、温度を（約６０℃以上）上昇させて材料を熱的にゲル化して製造することができる。セルロース溶液は、尿素、チオ尿素又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とＮａＯＨ又はＬｉＯＨの組合わせ、特にＮａＯＨ／尿素の中にセルロース（５〜７重量％）を溶解させることによって製造され得る。感熱ゲル化後、ＮａＯＨ及び尿素は洗浄してセルロースヒドロゲルを再生することができる。
【００７８】
アガロースヒドロゲルは、アガロース溶液を高温（約８０℃）でネガティブテンプレートに注入した後、温度を４５℃未満に下げてゲル化することによって製造することができる。
【００７９】
図３は、ネガティブテンプレート技術を使用して製造されたセルロースヒドロゲルジャイロイド構造を示す。
【００８０】
ヒドロゲルの物理的構造は、物理的架橋剤の添加によって特定の所望の特性（例えば、平均細孔サイズ、細孔壁の厚さ、多孔性など）を達成するように変形され得る。物理的架橋結合に使用される添加剤には、微晶質セルロース、ナノセルロース、バクテリアセルロース、キチン、キトサン及びその他の非水溶性炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、セルロースヒドロゲルの製造において、追加のセルロースを飽和されたセルロース溶液に添加することができる。ゲル化／再生時、この物質はヒドロゲルに改善された強度及び剛性を提供する強化相として作用する。
【００８１】
ヒドロゲルの物理的構造は、化学的架橋剤を添加してより硬いゲルを生成することによって変形することができる。化学的架橋結合に使用される添加剤は、エピクロロヒドリン（ＥＣＨ）、グルタルアルデヒドなどを含むが、これらに限定されない。当業者は、架橋結合の程度を操作して、これらに限定されないが、破断時の伸び、破断時の最大圧縮荷重、弾性係数、耐クリープ性、平均ナノポア寸法、微細孔サイズ分布及び総表面積を含むゲルの物理的性質に影響を及ぼすことができる。
【００８２】
図４は、異なる架橋剤及び異なる濃度を含む本発明のヒドロゲル範囲のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【００８３】
ヒドロゲル（例えば、アルコール、アセトン、硫酸）の再生に使用される媒体を変化させることはまた、例えば、ヒドロゲルを収縮又は膨潤させることによってその特性に影響を及ぼし得る。
【００８４】
分離媒体として使用するためには、ヒドロゲルは、標的分析物に結合する少なくとも１つのリガンドの導入によって官能化されるべきである。
【００８５】
一実施形態において、ヒドロゲルを生成するために反応される重合体は、形成の前にリガンドで官能化される。別の実施形態において、ヒドロゲルは、形成後にリガンドで官能化される。ヒドロゲルのリガンド官能化のための技術は、当業界によく知られている。
【００８６】
リガンドは、標的分析物に結合するのに適した官能基を含む。必要とする官能基は、使用されるクロマトグラフィーのタイプに依存する。
【００８７】
標的分析物に結合するリガンドは、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー又はゲル浸透クロマトグラフィーに使用するためのリガンドを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
陰イオン交換クロマトグラフィー（負に荷電された生体分子を可逆的に吸着するための）の場合、リガンドの官能基は、アミン、第４級アミン、ジエチルアミン（ＤＥＡＥ）及びその他から選択され得る。陽イオン交換クロマトグラフィー（正に荷電された生体分子を捕捉するための）の場合、リガンドの官能基は、カルボキシル、スルホン酸及びその他から選択され得る。
【００８９】
親和性クロマトグラフィーの場合、リガンドは、免疫グロブリンを捕捉するために、タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、タンパク質Ｇ及びその他を含み得る。官能基イミノ二酢酸（ＩＤＡ）は、ＩＤＡにニッケル又は銅などの多価金属イオンを最初にロードすることによってＨｉｓ−タグタンパク質を捕捉するための金属親和性クロマトグラフィーに使用されるリガンドに存在する。他の特定の親和性リガンドは、他の標的分析物の特異的結合に使用され得る。
【００９０】
疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、リガンドには、アルキル鎖（ブチル、オクチル）、フェニル及びベンジルアミン基などの官能基を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
一実施形態において、リガンドは、小分子、陽イオン、陰イオン、荷電又は非荷電ポリマー、疎水性部分、生体模倣リガンド、マルチモーダルリガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体又はその抗原結合断片からなる群から選択される。
【００９２】
リガンドがヒドロゲルに結合する前に、ヒドロゲルは、反応性基の導入によって活性化されるべきである。一実施形態において、ヒドロゲルは、１、１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化によって活性化される。他のカルボニル化試薬、例えば、１、１′−カルボニルジ−１、２、４−ビアゾール（ＣＤ５）、１、１′−カルボニル−１、２、３−ベンゾトリアゾール（ＣＤＢ）も使用され得る。
【００９３】
ＣＤＩ活性化において、ヒドロゲル重合体内のヒドロキシ基は、１、１′−カルボニルジイミダゾールと反応して、Ｎ−アルキルカルバメートを形成し、次いで、リガンド中に存在するＮ−親核試薬と反応して反応性基を含むリガンドを提供する。
【００９４】
ヒドロゲルの内部チャンネルは、表面が三重周期的最小表面によって定義される構造であるが、本発明の分離媒体の外部形状は、これに限定されないが、シート又はメンブレン、ストランド、プラグ、ディスク、モノリス、シリンダー、円筒状環又はビーズを含むクロマトグラフィーにおける使用に適した任意の形状であり得る。所望の形状は、媒体が使用されるクロマトグラフィー装置のタイプに依存する。
【００９５】
別の態様において、本発明は、本発明の分離媒体を含むクロマトグラフィー装置を提供する。一実施形態において、クロマトグラフィー装置は、クロマトグラフィーカラムである。一実施形態において、カラムは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置などのクロマトグラフィー装置への連結を可能にする関連カートリッジを含む。
【００９６】
図５は、使用のためにクロマトグラフィーカラムに挿入されるジャイロイド構造の円筒状ヒドロゲルを含む分離媒体を生成するためのネガティブテンプレートの工程を示す。図６は、本発明の分離媒体のジャイロイド構造のチャンネルを示す。
【００９７】
５．４本発明の分離方法
本発明者らは、本明細書に記載された分離媒体を使用することによって、標的分析物をフィードストリームから効果的に分離又は除去できることを見出した。本発明者らは、本発明の分離媒体が、フィードストリームの前処理が高コスト及び／又は時間消耗的であり得るフィードストリームから、及び特に懸濁固形物を含むフィードストリームから、様々な分析物の分離又は除去のための多くの産業分野において、幅広い用途を有すると考えられる。
【００９８】
従って、一態様において、本発明は、分離媒体をフィードストリームと接触させる段階を含む、フィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離するための本発明の分離媒体の使用に関する。
【００９９】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件下で分離媒体をフィードストリームと接触させることを含むフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離するための本発明の分離媒体の使用に関する。
【０１００】
別の態様において、本発明は、上記分離媒体をフィードストリームと接触させて少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させることを含むフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離するための本発明の分離媒体の使用に関する。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させることを含むフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関する。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件下で本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させることを含むフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関する。
【０１０３】
別の態様において、本発明は、本発明の分離媒体をフィードストリームと接触させて少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させることを含むフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関する。
【０１０４】
上記態様において：
１つの実施形態において、上記使用又は方法は、上記分離媒体からの、少なくとも１つの標的分析物を回収することを選択的に含む。
【０１０５】
本使用又は方法の一実施形態において、分析物の分離又は除去は、懸濁固形物を除去するためにフィードストリームを前処理せずに行われる。
【０１０６】
本使用又は方法の一実施形態において、接触させる段階は、フィードストリームを分離媒体に通過させるか、少なくとも部分的に通過させることを含む。
【０１０７】
本使用又は方法の一実施形態において、フィードストリームは、懸濁固形物を含有する。
【０１０８】
本使用又は方法の一実施形態において、分離媒体は、少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させる条件下でフィードストリームと接触される。一実施形態において、少なくとも１つの標的分析物は、分離媒体に含まれたリガンドに特異的に結合する。
【０１０９】
少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件は、フィードストリームのｐＨ、塩度、伝導度又は温度を調節することを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、フィードストリームは、少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件下にある。
【０１１０】
他の実施形態では、少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件を調整して、結合相互作用を調節することができる。例えば、フィードストリームの条件を変更して、少なくとも１つの標的分析物の分離媒体への結合を増加又は減少させることができる。
【０１１１】
本使用又は方法の一実施形態において、接触させる段階は、分離媒体をフィードストリームと接触させて、少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させることを含む。
【０１１２】
本使用又は方法の一実施形態において、少なくとも１つの標的分析物は、分離媒体に優先的に結合する。本使用又は方法の一実施形態において、少なくとも１つの標的分析物は、分離媒体に特異的に結合する。好ましくは、標的分析物は、分離媒体に結合されたリガンドに優先的に結合するか、特異的に結合する。
【０１１３】
本使用又は方法の一実施形態において、分離媒体に結合されたリガンドは、分離媒体のヒドロゲルに含まれる。
【０１１４】
本使用又は方法の一実施形態において、リガンドは、イオン交換リガンド、好ましくは陽イオン交換リガンドである。一実施形態において、リガンドは、６−アミノへキサン酸、７−アミノへキサン酸及び８−アミノへキサン酸を含む郡から選択される。
【０１１５】
別の実施形態において、リガンドは、疎水性相互作用リガンドである。本使用又は方法の一実施形態において、リガンドは、ヒドロゲルのジャイロイド構造を限定する表面を形成するヒドロゲルの細孔及び／又はチャンネル表面に露出される。
【０１１６】
本使用又は方法の一実施形態において、フィードストリームは、懸濁固形物を含有する。本使用又は方法の一実施形態において、フィードストリームは、少なくとも１つの非標的分析物を含有する。本使用又は方法の一実施形態において、フィードストリームは、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ以上の非標的分析物を含有する。本使用又は方法の一実施形態において、フィードストリームは、非標的分析物を除去するために前処理されなかった。
【０１１７】
本使用又は方法の一実施形態において、少なくとも１つの標的分析物は、クロマトグラフィー分離によってフィードストリームから分離される。本使用又は方法の一実施形態において、クロマトグラフィー分離は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用、マルチモーダル又はゲル浸透クロマトグラフィーを含む。好ましくは、クロマトグラフィー分離は、イオン交換、親和性又はマルチモーダルクロマトグラフィーを含む。
【０１１８】
本使用又は方法の一実施形態において、少なくとも１つの標的分析物は、生体分子を含む。
【０１１９】
本使用又は方法の一実施形態において、少なくとも１つの標的分析物は、生体分子、タンパク質；タンパク質断片；オリゴペプチド及びオリゴペプチド断片を含むペプチド；ポリペプチド；ポリペプチド断片；抗体結合ドメイン；抗原；抗原断片；抗原決定基；エピトープ；ハブテン；免疫原;免疫原断片；抑制剤；補助因子；基質；酵素；受容体；受容体断片；受容体サブユニット；受容体サブユニット断片；リガンド；受容体リガンド；受容体作用剤；受容体きっ抗剤；シグナリング分子；シグナリングタンパク質；シグナリングタンパク質断片；単糖類；オリゴ糖；多糖類；糖タンパク質；脂質；細胞；細胞表面タンパク質；細胞表面脂質；細胞表面炭水化物；細胞表面糖タンパク質；細胞抽出物；ウイルス；ウイルスコートタンパク質；ステロイド；ホルモン；ステロイドホルモン；血清タンパク質、小分子及び巨大分子；及びこれらの任意の組合せからなる群から選択された分析物を含む。
【０１２０】
本使用又は方法の一実施形態において、標的分析物は、シトクロム、好ましくはシトクロムＣ又はα−ラクトアルブミンである。
【０１２１】
本使用又は方法の一実施形態において、フィードストリームは、生物学的流体又は非生物学的流体である。
【０１２２】
本使用又は方法の一実施形態において、生物学的流体は、血液、尿、血清、唾液、牛乳、乳清及び精液からなる群から選択される。
【０１２３】
本使用又は方法の一実施形態において、非生物学的流体は、生体分子を含む。一実施形態において、非生物学的流体は、細胞懸濁液、細胞スラリー、細胞溶解物、細胞培養培地、細胞成長培地、又はこれらの組合わせ、又はこれらの濾過水又は上清からなる群から選択される。
【０１２４】
本使用又は方法の一実施形態において、使用又は方法は、分離媒体をフィードストリームと接触させる段階と少なくとも１つの標的分析物を回収する段階との間で分離媒体を洗浄するさらなる段階を含む。一実施形態において、洗浄する段階は、分離媒体に洗浄緩衝液を通過させるか、又は少なくとも部分的に通過させて、分離媒体に結合された標的分析物を除去せずに、非結合標的分析物、フィードストリームの他の非結合成分及び／又は分離媒体からの残留懸濁物質を除去することを含む。一実施形態において、洗浄緩衝液は、標的分析物が分離媒体に結合しているフィードストリームの条件を維持する。一実施形態において、条件は、ｐＨ、塩度、伝導度、又は温度のうちの少なくとも１つである。
【０１２５】
当業者は、他の条件も、分離媒体への標的分析物の結合に関与し得ることを理解するであろう。追加の洗浄段階中に標的分析物と分離媒体との間の結合を維持するための適切な条件を維持することは、当業者の技術範囲内であると考えられる。
【０１２６】
回収段階は、フィードストリームを分離媒体に通過させた後に行われる。好ましくは、フィードストリームは、懸濁固形物及び／又は非標的分析物を除去するために、フィードストリームを前処理せずに、分離媒体を通過する。
【０１２７】
例えば、フィードストリーム中に存在し得る懸濁固形物は、細胞培養培地、細胞製剤を又は細胞溶解物に存在し得る細胞又は細胞破片を含むが、これに限定されない。さらなる例として、細胞又は細胞破片は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び／又はシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）などのバクテリア、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）及びミセリオフィオーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｙｏｒａ）などの糸状菌、リーシユマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）などの原生生物、Ｓｆ９、Ｓｆ２１及びＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅなどのバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）感染された昆虫細胞、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）又はアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などの植物及びハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の細胞、オーロックス（Ｂｏｓ  ｐｒｉｍｉｇｅｎｉｕｓ）の細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胎児腎臓細胞及びヒト癌細胞（ＨｅＬａ）などの哺乳類細胞から由来することができるが、これらに限定されない。
【０１２８】
回収は、当業界に公知された標準方法を使用して行われることができ、分離媒体中に含まれるリガンドと標的分析物との間の結合相互作用の性質に依存して、回収条件は当業者が容易に決定することができる。
【０１２９】
本使用又は方法の一実施形態において、回収する段階は、少なくとも１つの標的分析物を分離媒体から溶出することを含む。一実施形態において、溶出は分離媒体を緩衝液と接触させることを含む。一実施形態において、接触させる段階は、緩衝液を分離媒体に通過させるか、又は少なくとも部分的に通過させることを含む。
【０１３０】
本使用又は方法の別の実施形態において、分析物は分離媒体からリガンドを切断することによって回収する。
【０１３１】
本使用又は方法の別の実施形態において、分離媒体に接触する前にフィードストリーム中に存在する少なくとも１つの標的分析物の少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％が回収される。好ましくは、少なくとも１つの標的分析物の４０％〜６０％、好ましくは約５０％が回収される。
【０１３２】
本使用又は方法の別の実施形態において、分離媒体に接触する前にフィードストリーム中に存在する少なくとも１つの標的分析物の実質的に全てが回収される。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの標的分析物をフィードストリームから分離する方法であって、
ａ）少なくとも１つの標的分析物を特異的に及び／又は優先的に結合するリガンドを含む分離媒体をフィードストリームと接触させて、上記少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させる段階、
上記フィードストリームは、組織、組織破片、細胞、細胞破片、生体分子、及び脂質、タンパク質、炭水化物及び／又は核酸の凝集体を含む生体分子の凝集体からなる群から選択された懸濁固形物を含み、
上記分離媒体は、表面が三重周期的最小表面によって定義される構造を有するヒドロゲルであり、
上記ヒドロゲルの構造は、シェーンジャイロイド構造、シュワルツダイヤモンド構造、シュワルツプリミティブ構造及びシェーンＩＷＰ構造、好ましくはジャイロイド構造を含む群から選択され、
上記ヒドロゲルは、熱応答性ヒドロゲル、好ましくは多糖類ヒドロゲル、好ましくはアガロース又はセルロースヒドロゲルであり、なお
上記ヒドロゲルは、化イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける使用のためのリガンドで官能化される；及び
ｂ）上記分離媒体からの、又は上記分離媒体に結合された少なくとも１つの標的分析物を回収する段階をさらに含む段階、を含む方法に関する。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって、
（ａ）分離媒体をフィードストリームと接触させる段階、及び
（ｂ）フィードストリームを回収する段階、を含む方法に関する。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって、
（ａ）少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件下で分離媒体をフィードストリームと接触させる段階；及び
（ｂ）フィードストリームを回収する段階、を含む方法に関する。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法であって、
（ａ）上記分離媒体を上記フィードストリームと接触させて、上記少なくとも１つの標的分析物を分離媒体に結合させる段階、及び
（ｂ）上記フィードストリームを回収する段階、を含む方法に関する。
【０１３７】
少なくとも１つの標的分析物が分離媒体に結合することを可能にする条件は、本発明の分離態様の使用及び方法を参照して本明細書に記載されており、当業者が理解することができるように、本発明による減少させる方法に同一に適用可能である。
【０１３８】
当業者は、標的分析物をフィードストリームから分離するための分離媒体の使用又はフィードストリームから少なくとも１つの標的分析物を分離する方法に関連して本明細書で考慮される本発明の特定の実施形態は、また、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法である本発明の方法の実施形態として適用可能である。したがって、このような実施形態の全ては、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法である本発明の一部として本明細書で具体的に考慮される。
【０１３９】
本発明によるフィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度を減少させる方法のさらなる実施形態は、本明細書において「本発明の減少させる方法」の実施形態として記述される。
【０１４０】
本発明の減少させる方法の一実施形態において、回収段階は、フィードストリームを分離媒体に通過させた後にフィードストリームを収集することによって行われる。一実施形態において、フィードストリームは、懸濁固形物を含む。好ましくは、フィードストリームは、懸濁固形物及び／又は非標的分析物を除去するためにフィードストリームの任意の前処理なしに分離媒体を通過する。
【０１４１】
回収は、当業界に公知された標準方法を使用して行うことができる。
【０１４２】
減少させる方法の一実施形態において、回収は、分離媒体をフィードストリームと接触させた後、好ましくはフィードストリームを分離媒体に通過させた後、又は少なくとも部分的に通過させた後にフィードストリームを収集することを含む。
【０１４３】
減少させる方法の一実施形態において、フィードストリームは、分離媒体と接触する前にフィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度と比較して、減少した濃度の少なくとも１つの標的分析物を有する。
【０１４４】
減少させる方法の一実施形態において、フィードストリーム中の少なくとも１つの標的分析物の濃度は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％に減少する。
【０１４５】
減少させる方法の一実施形態において、接触させる段階は、実質的にすべての標的分析物を分離媒体に結合させることを含む。
【０１４６】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された製品に関する。一実施形態において、生成物は、標的分析物を含む組成物である。
【０１４７】
別の実施形態において、生成物は、フィードストリームが本発明の分離媒体と接触する前に、フィードストリームに比べて減少した濃度の標的分析物を含有するフィードストリームである。
【０１４８】
本発明の様々な態様は、以下の実施例を参照して非限定的な方式で説明されるであろう。
【実施例】
【０１４９】
６．実施例
６．１一般的なプロセス及び材料
材料
使用したセルロースは、シグマ アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入したＳｉｇｍａｃｅｌｌセルロースパウダー、タイプ２０（平均粒径２０μｍ）であった。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（純度９７％）をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）からペレット形態で購入した。尿素（ＡＣＳグレード）、及びエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）（純度９８％）もシグマ アルドリッチから購入した。Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｇａｒｏｓｅタイプのアガロースは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。工業グレードのアセトン（純度９５％）は、ＡＳＣＣ（Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）から購入した。すべての化学約品は受け取ったままで使用した。
【０１５０】
実施例１〜３の３Ｄジャイロイド鋳型プリント
鋳型のＣＡＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｉｄｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ）モデルは、Ｓｏｌｉｄ  ｗｏｒｋｓ  ２０１２（Ｄｅｓｓａｕｌｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して製作した。鋳型は、可溶性支持材料と共にＡＢＳｐｌｕｓを使用してＳｔｒａｔａｓｙｓ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｅｌｉｔｅ機械（Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  Ｌｔｄ．，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）上でプリントし、プリント後、Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  ＳＣＡ−１２００サポート除去システムを使用して除去し。次いで、鋳型をＭｉｌｌｉ−Ｑ水ですすぎ、周囲条件で放置して少なくとも７日間乾燥させた。
【０１５１】
実施例４−６の３Ｄ鋳型プリント
鋳型のＣＡＤ（コンピューターサポート設計）モデルは、Ｓｏｌｉｄ  ｗｏｒｋｓ  ２０１２（Ｄｅｓｓａｕｌｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して製作した。ＡＢＳｐｌｕｓからの鋳型は、可溶性支持材料と共にＳｔｒａｔａｓｙｓ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｅｌｉｔｅ機械（Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  Ｌｔｄ．，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）上でプリントし、プリント後、Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  ＳＣＡ−１２００サポート除去システムを使用して除去した。次いで、鋳型をＭｉｌｌｉ−Ｑ水ですすぎ、周囲条件で放置して少なくとも７日間乾燥させた。
【０１５２】
Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  ３ＺＭｏｄｅｌ材質の鋳型は、Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  ３ＺＴＭ支持材料と組合わせさせて、Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  ３Ｚ  ＰＲＯ装置（（Ｓｔｒａｔａｓｙｓ  Ｌｔｄ．，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）上でプリントし、プリント後、５０℃まで加熱されたＢｉｏａｃｔ  ＶＳＯ（Ｖａｎｔａｇｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｕｒｎｅｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）の浴を使用して除去した。次いで、鋳型は、４５℃のオーブンに入れて、少なくとも４８時間残留ＶＳＯを蒸発させた。
【０１５３】
セルロース溶液の製造
本発明のクロマトグラフィー媒体に使用されるセルロースヒドロゲルを製造するために、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の１２重量％尿素及び７重量％ＮａＯＨの水溶液を製造し、１２℃に冷却させた。
【０１５４】
セルロース粉末（５重量％）を溶液に添加し、約６０秒間撹拌した。混合物を−１２℃で一晩放置した後、セルロースが完全に溶解するまで約５分間激しく撹拌した。その後、溶液を遠心分離して任意のセルロース凝集体を除去した。溶液はさらに使用するまで約１℃で保存した。
【０１５５】
すべてのセルロース複合ヒドロゲルを製造するために、初期に溶解したセルロース部分のセルロース粉末の質量分率（１０、５０、１００等％）を約８００ｒｐｍのＬ４ＲＴ  Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ機械的混合機を使用してセルロース溶液中に溶解させて、最終ヒドロゲルにおける補強として作用するだけでなく、ゲル化過程における物理的架橋剤として作用する。
【０１５６】
溶液の温度は、溶液のゲル化を避けるために、混合工程の間に、３〜５℃に維持させた。添加された粉末が元の溶液に均一に分散するまで懸濁液を約５分間撹拌した。
【０１５７】
化学的に架橋結合されたヒドロゲルを生成するために、化学的架橋剤ＥＣＨは、使用されたセルロース（溶解されて最終的に溶液に混合した余分なセルロース）の質量分率（１、５、１０等％）として溶液に添加した。架橋剤を含有する溶液を約１０００ｒｐｍの回転速度でオーバーヘッドスターラーを使用して５分間撹拌し、ＥＣＨの良好な分散を達成した。溶液のゲル化を避けるために、混合工程の間に、溶液の温度を３〜５℃に維持した。
【０１５８】
アガロース溶液の製造
アガロースヒドロゲルを製造するために、アガロース粉末を約８００ｒｐｍで設定されたＳｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ４ＲＴ  メカニカルミキサー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して６：９４の質量比でＭｉｌｌｉ−Ｑ水と約６０秒混合してアガロース粉末を完全に分散させた。
【０１５９】
より強いヒドロゲルが要求される場合、セルロース粉末は、アガロース−水混合物に添加し、分散したアガロース粉末の質量画分（１０、５０、１００等％）として秤量し、アガロース−水混合物に添加した。次いで、この混合物を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを使用して１００ｒｐｍでさらに１２０秒間撹拌した。
【０１６０】
アガロース混合物をガラスビーカーに保管し、Ｐａｒａｆｉｌｍで覆った後、Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｔｉｍｅｓａｖｅｒ  １０００Ｗ電子レンジ（Ｓａｍｓｕｎｇ，Ｄａｅｇｕ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）に入れた。マイクロ波を１０００ワットで３０秒間作動させて混合物を約７５℃に加熱した。次いで、混合物をスパチュラで撹拌し、同一の設定で再び加熱した。アガロース粉末の全てが溶解するまでこれを繰り返して粘性溶液を形成した。添加されたセルロース粉末はすべて溶解しないまま残っている。
【０１６１】
本発明の分離媒体の製造：実施例１〜３に対するジャイロイド構造のアガロースヒドロゲル
アガロース溶液を、使い捨てプラスチックシリンジを使用して３Ｄプリントジャイロイド鋳型に注入した。充填された鋳型を電子レンジに入れ、１０秒間１００ワットで加熱した。鋳型を、長軸を中心に回転させ、再び加熱した。これを４〜５回繰り返して鋳型の完全な充填を達成した。次いで、上記鋳型を−２０℃で３０分間冷凍器に入れてアガロース溶液を完全にゲル化させた。
【０１６２】
充填された鋳型をＳｃｈｏｔｔボトル中のアセトンに沈めた。密閉されたボトルを室温で、３０分間隔で１００Ｗ  Ｄｉｇｉｔｅｃｈ超音波洗浄器（Ｄｉｇｉｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｊｏｒｄａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）に入れてＡＢＳ鋳型を溶解させた。すべてのＡＢＳが溶解するまでアセトンを８〜１０回の超音波処理間隔の後にアセトンを交換した。次いで、アセトンは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して洗浄して、ジャイロイド構造のアガロースヒドロゲルを得た。
【０１６３】
本発明の分離媒体の製造：実施例１〜３のジャイロイド構造のセルロースヒドロゲル
セルロース溶液を、使い捨てプラスチックシリンジを使用して３Ｄプリントジャイロイド鋳型に注入した。充填された鋳型を８５℃のオーブンに５〜６時間放置して溶液をゲル化させた。鋳型をオーブンから取り出して室温で冷却させた。ＡＢＳは上述したように除去した。
【０１６４】
６．２実施例１：ジャイロイド構造のセルロース系ヒドロゲル
ジャイロイド構造のセルロース系ヒドロゲルを含む本発明の分離媒体を、上述した手順に従って製造した。いくつかのヒドロゲルは、ＥＣＨ架橋結合（１及び１０％）に製造された。ヒドロゲルはまた、セルロース粒子を添加して製造した。セルロース粉末（溶液を製造するのに使用されたセルロース対比１０、４０、５０及び１００重量％）を添加した。ＥＣＨで架橋されセルロース粉末で支持されるヒドロゲルを製造した。図４は、製造されたヒドロゲルのいくつかのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【０１６５】
６．３実施例２：ジャイロイド構造のアガロースベースヒドロゲル
ジャイロイド構造のアガロースベースヒドロゲルを含む本発明の分離媒体は、上述した手順に従って製造した。いくつかのヒドロゲルは、ＥＣＨ架橋結合（１及び１０％）で製造した。
【０１６６】
ヒドロゲルはまた、セルロース粒子を添加して製造した。セルロース粉末（溶液を製造するのに使用されるセルロース対比１０、４０、５０及び１００重量％）を添加した。
【０１６７】
ＥＣＨに架橋されセルロース粉末で支持されるヒドロゲルも製造した。図４は、製造されたヒドロゲルのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【０１６８】
６．４実施例３：分離媒体がジャイロイド構造のヒドロゲルである陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して懸濁固形物を含有するフィードストリームから標的シトクロムＣの回収
ジャイロイド構造のアガロースヒドロゲルは、上述した技術を使用して３Ｄプリントテンプレートからネガティブテンプレート方法を介して製作した。これは、酵母細胞を維持せずに、懸濁した酵母細胞の存在下で２つのタンパク質を分離するのに使用した。
【０１６９】
この実験に使用された分離媒体は、１．２ｍｍのチャンネルサイズ及び１．２ｍｍの壁厚さを有するジャイロイド構造のアガロースヒドロゲルの長さ２５ｍｍ、直径１０ｍｍのモノリスであった。モノリスの多孔性は、５０％であり、単純なジャイロイドの場合、Ｇは０であった。
【数８】
2018537283.tif 000010
ここで、ｘ、ｙ及びｚは、デカルト座標系におけるカラム内の点の位置であり、Ｇは、カラム幾何形状内の固体（吸着剤）及びボイド（流動チャンネル）部分の相対体積分率を決定する任意の定数である。
【０１７０】
ジャイロイドアガロースモノリスは、ジャイロイドモノリスのＡＢＳプラスチックプリントネガティブテンプレートをアガロースの高温溶液で充填し、これを室温で冷却してゲル化させて製造した。次いで、ＡＢＳをアセトンで溶解させて除去した。
【０１７１】
カルボニルジイミダゾール活性化
アセトンを使用してＡＢＳを除去した後、ヒドロゲルモノリスを６カラム体積のアセトンで洗浄して、残留ＡＢＳがシステム内に残らないようにした。
【０１７２】
アガロースモノリスを１、１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を使用して活性化させて、アガロースマトリックスの重合体主鎖に活性イミダゾール中間体を提供した。０．２ｇのＣＤＩをアガロースモノリスに添加し、これを１０ｍｌのアセトンに懸濁させた。混合物を一定に撹拌しながら２時間反応させた。
【０１７３】
反応混合物を除去し、モノリスを６モノリス容積のアセトンで素早く洗浄して、未反応ＣＤＩを除去した。活性化されたアガロース材料の加水分解を避けるために、洗浄段階が迅速に完了するのが必須であった。
【０１７４】
リガンド結合
リガンド６−アミノへキサン酸をアガロースヒドロゲルに結合させて陽イオン交換作用基、すなわち−ＣＯＯＨ基を導入した。モノリスは、ＮａＯＨを使用してｐＨ１０以下に製造した５Ｍ６−アミノへキサン酸及び１Ｍ重炭酸ナトリウムの６ｍｌ溶液に添加した。６−アミノへキサン酸は、陽イオン交換のためのリガンド末端に遊離カルボキシル基を有する、アミン結合を介してアガロースの表面に共有結合する。溶液を４８時間一定に撹拌しながら反応させた後、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液（リガンドカップルリング直後のタンパク質分離に使用しない場合）に入れた。
【０１７５】
分離
ジャイロイド構造の結合された官能化ヒドロゲルを反応容器から除去し、直径１０ｍｍのＳＮＡＰガラスカラム（Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）に入れ、ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に連結した。カラムを上向き流動構成を使用してシステムに連結した。
【０１７６】
上記システムをヒドロゲルが緩衝液中で完全に飽和するまでｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液（結合緩衝液）で洗浄した後、ｐＨ７でリン酸ナトリウム緩衝液及び１Ｍ  ＮａＣｌ（溶出緩衝液）で洗浄して、イオン交換マトリックスに対イオンを添加した。平衡に到逹した後、カラムを結合緩衝液中に再平衡化させた。
【０１７７】
５ｍｇ／ｍｌサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びｐＨ７．４の結合緩衝液中の２ｍｇ／ｍｌシトクロムＣの２ｍｌ溶液をカラムに入れた。シトクロムＣ（等電点、ｐＩ、９．６）はカラムに結合すると予想され、一方、ＢＳＡ（ｐＩ４．７）及び酵母細胞（ｐＩは、典型的に５．２〜６．４）は、通過すると予想された。
【０１７８】
図７は、サンプルローディング及び洗浄段階を完了した後のカラムを示し、これはシトクロムＣがカラムに結合されている赤い色で明確に示す。（結合されていないすべてのタンパク質が除去されるまで）約２５ｍｌの結合緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（１ＭのＮａＣｌ）は、すべての結合タンパク質が除去されたことが（カラムを出る流体でＵＶ吸光度の減少を観察することによって）明らかになるまでカラムに適用した。
【０１７９】
収集されたピーク画分を、ゲル電気泳動を使用して分析した。画分を室温で５分間遠心分離して、ゲルに適用する前に酵母固形物を溶液から除去した。クーマシーブリリアントブルー染色を１２時間ゲルに適用した後、酢酸溶液で脱染色してタンパク質ラダーを示した。
【０１８０】
ゲル上のバンドの密度は、オープンソースのＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定し、これは、試料サンプルレーンのバンドと比較して、クロマトグラムの各ピークに存在するＢＳＡ及びシトクロムＣの比例濃度を示すことができる相対強度を示す。
【０１８１】
結果
本発明の分離方法は、固形物を含有するフィードストリームからシトクロムＣを成功的に回収した。
【０１８２】
クロマトグラフィー分析（図８に示すように）は、酵母、ＢＳＡ及びいくつかのシトクロムＣがカラムと相互作用せずに、システムから溶出される約５ｍｌを中心とする高い流出ピークを示す。
【０１８３】
図９から分かるように、約３５ｍｌでの伝導度の急激な増加に伴う溶出ピークはシトクロムＣのみを含有した。
【０１８４】
ゲル電気泳動でＢＳＡ及び酵母からのシトクロムＣの分離が確認された（図９）。供給サンプル及びフロースルーピーク（レーン２〜１０）に該当するレーンは、６６．５ｋＤａのＢＳＡ及び１２．３ｋＤａのシトクロムＣを示す。レーン２〜６のゲルであまり明確でないバンドは、オンサンプル及びフロースルーピークに存在する損傷されないか、又は破壊された酵母細胞から排出されたタンパク質から生じる可能性がある。レーン７〜１０は、結合されない材料の漸進的除去を示し、図８のクロマトグラムと一致する。しかし、酵母はタンパク質よりもはるかに速くカラムから除去されたように見え、これは酵母細胞流れに支障を与えないことを示す。
【０１８５】
溶出緩衝液を適用すると、図８のＵＶピークが溶出サンプルに純粋なシトクロムＣの証拠と共に、タンパク質の溶出を示した。これは、レーン１１〜１７（図９参照）のゲルにおいて明らかであり、これは、溶出ピークに示され、次いで、アガロースジャイロイドカラムからのシトクロムＣの除去を示す。これは、３Ｄプリント方法を使用して製造された陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して、母細胞、シトクロムＣ及びＢＳＡの混合物からシトクロムＣの分離を検証する。
【０１８６】
ゲルに結合し、続いて溶出されるシトクロムＣの量は、ゲル上の各レーンの相対バンド強度から推測される、カラムにロードされた総量の約５０％であった（図１０）。
【０１８７】
クロマトグラムのピーク下の領域は、プロースルーピークについては１６３２ｍＡＵ  ｍｌ及び溶出ピークでは５２１ｍＡＵ  ｍｌを示す。より大きなフロースルーピーク領域は、溶出ピークにおいて溶出されたシトクロムＣと比較して、ＢＳＡ、非結合シトクロムＣ及び酵母細胞の存在によって生じるであろう。
【０１８８】
無視できる背圧が、クロマトグラフィーが進行される間に観察された。正常作動の間、０ＭＰａが記録され、これは、酵母の適用時に０．０１ＭＰａに増加した。これは、フロースルーピークがシステムを通過すると、０ＭＰａに戻る。背圧がないことは、酵母がカラムに捕捉されなかったが、サンプル適用及び洗浄段階で流入したことを示す。
【０１８９】
結論
ジャイロイド構造のアガロースヒドロゲルは、懸濁固形物を含み、ＢＳＡ、シトクロムＣ及び酵母細胞の混合物を含む、フィードストリームから陽イオン交換によるシトクロムＣのクロマトグラフィー分離を成功的に行った。酵母細胞は、予想通りカラムを通過した。
【０１９０】
ＢＳＡは、ヒドロゲルカラムによって維持されず、サンプル中のシトクロムＣの約５０％がヒドロゲルカラムに結合し、続いて１ＭのＮａＣｌの適用によって溶出された。
【０１９１】
６．５実施例４：陰イオン−分離媒体がジャイロイド構造のヒドロゲルである陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して懸濁固形物を含有するフィードストリームから３ＤプリントアガロースＤＥＡＥカラムの製造及び標的シトクロムＣの回収。
この研究は、簡単なタンパク質精製システムとして使用される最初の３Ｄプリント陰イオン交換クロマトグラフィー及び発酵ブロスをシミュレートするタンパク質及び固形物の溶液（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するより複雑なタンパク質捕捉段階を証明する。
【０１９２】
方法
ＤＥＡＥ機能化
上記の方法で詳細に記述されたように、Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  ３ＺＴＭモデル材料からプリントテンプレートを使用して製造された３Ｄプリントアガロースカラム（６％ｗ／ｗアガロース、５０ｍｍ長さ、１０ｍｍ直径、４００μｍチャンネルサイズ、５０％空隙率）は、Ｔｏｕｆｉｋ  ａｎｄ  Ｌａｂａｒｒｅ（Ｔｏｕｆｉｋ，Ｊ．，＆Ｌａｂａｒｒｅ，Ｄ．（１９９５），ジエチルアミノエチル基を有する多糖類表面による補体活性化の減少と置換度との間の関係Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１６（１４），１０８１−１０８８．ｄｏｉ：１０．１０１６／０１４２−９６１２（９５）９８９０４−ｓ）によって開発された方法を使用してＤＥＡＥリガンド２−クロロ−Ｎ、Ｎ−ジエチルエチルアミンヒドロクロリドで官能化した。アガロースを１ｇのアガロース：２７ｍｌのＤＥＡＥ：２０ｍｌのＮａＯＨの比率で４ＭのＮａＯＨ及び３ＭのＤＥＡＥに入れ、３０℃の水浴中で９０分間撹拌した。活性化の後、カラムを１ＭのＮａＣｌ１５ｍｌで洗浄した後、１ＭのＮａＯＨ１５ｍｌで洗浄し、次いで、１ＭのＨＣｌ１５ｍｌで３回洗浄した。カラムを使用するまで２０％イソプロパノール中に保存した。
【０１９３】
平衡化
ＡＫＴＡ開始ユニットを使用して、アガロースカラムをＳＮＡＰケーシングに入れ、ＡＫＴＡに取り付けた。７０％ＩＰＡを５．０ｍｌ／分でカラムを通過させて、ＳＮＡＰケーシングに伝達しながらカラムに流入した空気を除去した。カラムを２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液＋１ＭのＮａＣｌｐＨ７．０（マトリックスに対イオンを添加するために）の３カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化させた。
【０１９４】
動的テスト
２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを、２．０ｍｌ注入ルーフを介してカラムにロードした。結合されていないサンプルを結合緩衝液で洗い流し、４カラム体積後、塩緩衝液をカラムに加えてタンパク質溶出を促進させた。
【０１９５】
タンパク質分離
牛心臓から来由された２．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び１ｍｇ／ｍｌシトクロムＣの２．０ｍｌ溶液を、注入ルーフを介してカラムにロードした。上記と同様の洗浄及び溶出の手順に従った。この実験に対して２．０ｍｌ画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）染色で分析した。
【０１９６】
固体通過
この分析のために３回の試験を完了した：０．５ｗ／ｗ％酵母；２．０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ；及び２．０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び０．５ｗ／ｗ％酵母。酵母サンプルは、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に必要な量の乾燥パン酵母を添加し、すべての顆粒がスラリーに分解されるまで１時間混合することによって製造した。ＤＥＡＥアガロースを含むＳＮＡＰカラムをＡＫＴＡ１０  Ｅｘｐｌｏｒｅｒに連結して平衡化した。各試験について、以前と動揺に緩衝液（結合及び溶出）を加えてサンプルをカラムにロードした。各試験から４ｍｌ画分を収集した；各サンプルの６００ｎｍでの光学密度を分光光度計で測定し、酵母通過を定量化した。各試験の後、カラムを１ＭのＮａＯＨで洗浄して、ハードウェア又はカラムに付着した酵母を除去した。
【０１９７】
結果及び考察
ＤＥＡＥアガロースカラムが成功的な陰イオン交換カラムであることは明らかである。ＢＳＡサンプルを適用し、その後の塩緩衝液中での溶出により、約５１．６％のＢＳＡがカラムに結合され、続いて溶出される（図１１、表１）。
【０１９８】
【表１】
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【０１９９】
シトクロムＣとＢＳＡとの混合物からシトクロムＣの分離が成功すること（図１２）は、作業で生成されたカラムの陰イオン交換能力をさらに立証する。緩衝液ｐＨ７．０において、ＢＳＡは負に荷電し（ｐＩ＝４．７）、シトクロムＣは正に荷電する（ｐＩ範囲１０〜１０．５）。したがって、ＢＳＡはカラムに結合し、一方、カラムに同様の荷電を有するシトクロムＣは通過するであろう。
【０２００】
クロマトグラムから、ＢＳＡのみを適用したときよりも多くのタンパク質がカラムを通過することが明らかである（図１１、図１２）。フロースルーピークは、結合されたタンパク質分析においてはるかに大きい一方、溶出ピークは同様の強度であり、これは、同量のＢＳＡがカラムに結合されていることを示す。
【０２０１】
ＢＳＡ／シトクロムＣ試験から収集した画分のゲル電気泳動は、図１２においてフロースルー及び溶出ピークに何があるかどうかを確認する。ＢＳＡ（ＭＷ＝６６．５ｋＤａ）及びシトクロムＣ（Ｍｗ＝１２．３ｋＤａ）は、サンプル（ＯＮ）のゲル上で明らかである（図１３）。両方のタンパク質の二量体も明らかである。フロースルーピークを示すレーンは、ＢＳＡ及びシトクロムＣを示し、続いて結合されていないサンプルを洗浄してタンパク質の残量を示す。溶出時（レーン８〜１４）、ＢＳＡのみがゲルに存在し、これはカラムに結合されたＢＳＡのみが確認される。
【０２０２】
３ＤプリントアガロースＤＥＡＥカラムは、固体通過を可能にする。しかし、溶出するカラムに結合された一定量の酵母が存在する。６００ｎｍでの光学密度の分析は、試験全般にわたって固体通過を示す、ＢＳＡのみでは、結合、洗浄及び溶出中に６００ｎｍでＯＤ変化がなく、これは、試験中に固体がないことを示し、これは、６００ｎｍで検出されたあらゆる吸光度が酵母を示すことを意味する（図１４）。酵母及び酵母／ＢＳＡでは、カラムに酵母の結合を示し、次いで、塩条件下で溶出されることを示す明確なフロースルーピーク及び溶出ピークが存在する。酵母の約８３．４％がカラムを介して流れ、残りは塩濃度が増加して溶出する。
【０２０３】
当業者は、条件を適切に変更することができ、これによって、例えば、結合緩衝液に塩を添加して、溶液のイオン強度を減少し、酵母がカラムに結合することを防止することにより、この効果が減少する。
【０２０４】
結論
３ＤプリントアガロースＤＥＡＥカラムが生成された。カラムは、タンパク質精製のための陰イオン交換体として作動し、ＢＳＡとシトクロムＣの混合物を分離すると、酵母の存在下で陰イオン交換体が確認される。予想した通り、酵母は陰イオン交換基と相互作用するが、緩衝制条件を操作すると、これを制御することができる。
【０２０５】
６．６実施例５：３Ｄプリントアガロース疎水性相互作用カラムの製造及び分離媒体がジャイロイド構造のヒドロゲルである懸濁固形物を含有するフィードストリームからα−ラクトアルブミンの回収
この研究は、簡単なタンパク質精製システムとして使用される最初の３Ｄプリント疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム、及び発酵ブロスをシミュレートしたタンパク質固体（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の溶液に対するより複雑なタンパク質捕捉段階を立証する。
【０２０６】
アガロースジャイロイドマトリックスをＣＤＩで活性化させた後、ベンジルアミンに結合させて、表面に固定化された極めて疎水性のベンジル基を介して疎水性マトリックスを製造した。カラム上のα−ラクトアルブミンの捕捉のみでなく、溶液中の２つのタンパク質捕捉（タンパク質の分離は成功しなかったが）が立証された。カラムに適用されたタンパク質の約６５％が捕捉され、これは効率が改善すべきであることを意味する。最後に、酵母細胞の溶液からのα−ラクトアルブミンの捕捉も立証されるが、酵母とカラムとの間の相互作用のため、酵母の７３％のみがカラムを通過する。これは文献ではほとんど報告されていない。
【０２０７】
方法
ＣＤＩ活性化及びベンジルアミン官能化
Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  ３ＺＭｏｄｅｌ材料から鋳型を使用して製造された３Ｄプリントアガロースカラム（６％ｗ／ｗアガロース、５０ｍｍ長さ、１０ｍｍ直径、４００μｍチャンネルサイズ、５０％空隙率）を１、１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で活性化し、続いて文献（Ｂｅｔｈａｌ，Ｇ．Ｓ，．Ａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｅａｒｎ，Ｍ．Ｔ．Ｗ．，＆Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｗ．Ｓ．（１９８７））から採択された方法を使用してベンジルアミンリガンドに結合させた。１、１′−カルボニルジイミダゾールによる様々な不溶性多糖類の活性化、及び活性化されたマトリックスの性質に対する調査。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，２１９（３），３６１−３７１．ｄｏｉ：http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(00)80379-9)，ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｍｉｌｌｉａ＆Ｓｍｉｔｈ，１９９２（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．，＆Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．（１９９２）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０２０８】
アガロースカラムを５０ｍＬのファルコンチューブに入れ、アセトン（３０／７０、５０／５０、７０／３０の比率で、次いで１００／０％アセトン／％水の比率で）に順次に洗浄し、活性化のために、１００％アセトン中に放置した。０．０８４ｇＣＤＩ／ｇアガロースをアガロース及びアセトンに添加し、一定の混合を保障するためにスピンホイール上で、室温で１時間放置した。１時間後、液体をアガロースから除去し、次いでアセトンを使用してカラムチャンネルに捕捉された未反応液体を洗浄した。新鮮なアセトンをファルコンチューブ中のカラムに入れ、一定容積のベンジルアミンをアセトン：ベンジルアミン１：０．１１の比率で加えた。これは、２４時間スピンホイールで反応するように放置した。リガンド結合が完了すると、液体はファルコンチューブからデカントした。２カラム容積のアセトンをカラムに加えて任意の米反応ベンジルアミンを除去した。使用する前までカラムを２０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に貯蔵した。
【０２０９】
平衡化
ＡＫＴＡ１０  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ装置を使用して、アガロースカラムをＳＮＡＰケーシングに入れ、ＡＫＴＡに取り付けた。７０％ＩＰＡを５．０ｍｌ／分でカラムに通過させて、ＳＮＡＰケーシングに伝達しながらカラムに流入した空気を除去した。次いでカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＋２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４ｐＨ６．０（結合緩衝液）の３カラム体積で平衡化させた。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０の溶出緩衝液も製造した。
【０２１０】
動的テスト
２．０ｍｇ／ｍｌのα−ラクトアルブミンを２．０ｍｌの注入ルーフを介して１ｍｌ／分でカラムにロードした。結合されていないサンプルを結合緩衝液で洗浄し、４カラム体積後に溶出緩衝液をカラムに加え、疎水性相互作用を減少させてタンパク質溶出を促進させた。試験の終了時に、７０％ＩＰＡ２カラム体積でカラムをフラッシュして、溶出緩衝液で除去されていないα−ラクトアルブミンを除去した。
【０２１１】
二重タンパク質溶出
２．０ｍｇ／ｍｌのα−ラクトアルブミン及び２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の２．０ｍｌ溶液を、１ｍｌ／分で注入ルーフを介してカラムにロードした。洗浄及び溶出及び洗浄のための上記と同様の手順が行われた。この試験に対して２．０ｍｌ画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）染色で分析した。
【０２１２】
固体通過
この分析のために３回の試験を完了した：酵母０．５ｗ／ｗ％；α−ラクトアルブミン２．０ｍｇ／ｍｌ；及びα−ラクトアルブミン２．０ｍｇ／ｍｌ及び酵母０．５ｗ／ｗ％。酵母サンプルは、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ６．０に必要な量の乾燥パン酵母を添加し、すべての顆粒がスラリーに分解されるまで１時間混合することによって製造した。挿入されたベンジルアミンカラムを有するＳＮＡＰケーシングをＡＫＴＡ１０  Ｅｘｐｌｏｒｅｒに連結し、平衡化させた。各試験について、以前と同様に１ｍｌ／分で緩衝液（結合及び溶出）を添加して、サンプルをカラムにロードした。各試験から４ｍｌの画分を収集し；各サンプルの６００ｎｍでの光学密度を分光光度計で測定し、酵母通過を定量化した。各試験の後、カラムを２カラム体積の７０％ＩＰＡ及び１ＭのＮａＯＨで洗浄して、ハードウェア又はカラムに付着され得るタンパク質又は酵母を除去した。
【０２１３】
結果及び考察
ベンジルアミンアガロース疎水性マトリックス上のタンパク質捕捉は、クロマトグラムから証明される（図１５）。２８０ｎｍ軸における吸光度のピークは、タンパク質がカラムから溶出する位置を立証する。添加された１．５〜１０ｍｌの間の最初のピークは、結合されていないα−ラクトアルブミンのフロースルーである。タンパク質がカラムから約２４ｍｌの緩衝液を加えて洗浄されなかったことは明らかであり、これは緩衝液が変更され、伝導率が減少すると、ここで溶出されるタンパク質は、疎水性相互作用を減少させるために（塩濃度を減少させる）、溶出されるタンパク質に対応することを意味する。従って、疎水性に基づいたタンパク質捕捉が成功的であることを証明する。ピークサイズの分析は、６５％のタンパク質が捕捉され、続いて溶出緩衝液で溶出されることを示す。当業者によるクロマトグラフィー条件のさらなる最適化を行って、所望の標的分析物の捕捉率を増加させることができる。
【０２１４】
酵母の存在下で、α−ラクトアルブミンはベンジルアミンアガロースカラムに結合され、続いて溶出緩衝液の存在下で溶出される（図１６）。これは、α−ラクトアルブミン、酵母、及びα−ラクトアルブミン＋酵母の３つの試験について、２８０ｎｍで結合された吸光度クロマトグラムに基づいて結論される。α−ラクトアルブミンラインは、ほぼ等量のタンパク質フロースルー及び溶出を示す。酵母のみについて、２８０ｎｍで大きなフロースルーピーク及び小さな溶出ピークが観察される。これは、カラムとの相互作用をする酵母に関連したいくつかの細胞外タンパク質によって、少量の酵母がカラムに結合されることを示す。酵母を含有するα−ラクトアルブミンの場合、α−ラクトアルブミン試験において溶出ピークのサイズと同様の溶出ピークと共に、大きなフロースルーピーク（おおよそ、α−ラクトアルブミンフロースルーと酵母フロースルーとの組合わせのサイズ）を記録する。これは、供給ブロスに存在する固形物の有無にかかわらず、カラムの同様の性能を示し、これは、酵母がベンジルアミンアガロースカラムの性能を阻害しないことを示す。
【０２１５】
カラムを通る酵母通過は、クロマトグラム上の６００ｎｍでのＵＶ吸光度をモニタリングすることによって観察される。以前のように、α−ラクトアルブミン、酵母、及びα−ラクトアルブミン＋酵母の３つの試験を行った。α−ラクトアルブミン試験は、α−ラクトアルブミンが６００ｎｍで非常に小さな吸光度を有することを示す。酵母のみの試験は、大きなフロースルーピーク及び小さな溶出ピークを有し、これはまた、吸着剤と吸着質の相互作用の証拠になる。酵母及び酵母とα−ラクトアルブミンは、２つ試験の両方で本質的に同じトラックを有し、これは、酵母の継代が両方の試験で同じであることを示す。ピーク強度の比較は、酵母の７３％がカラムを介して流れることを示す。最適化は、酵母細胞とタンパク質とカラムとの間の相互作用を減らすために必要である。これは塩濃度及びｐＨを変化させることによって行われる。
【０２１６】
図１７において、溶出ピーク以後の各試験に対する長い尾部は、緩衝液の変化のために２５ｍＡｕの新しいベースラインを示し；溶出緩衝液は結合緩衝液よりも６００ｎｍでより高いＵＶ吸光度を有することを留意しなければならない。
【０２１７】
結論
３Ｄプリントアガロースベンジルアミンカラムが製造された。カラムは、タンパク質精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスとして作動する；α−ラクトアルブミン及びＢＳＡの捕捉は、これを証明する。タンパク質の捕捉効率（現在６５％）は、活性化及びリガンド結合プロトコールを最適化することにより、改善することができる。
【０２１８】
６．７実施例６：（ａ）３Ｄプリントシュワルツダイヤモンドアガロース陽イオン交換（ＣＭ）クロマトグラフィーカラム及び（ｂ）シェーンジャイロイドセルロース陽イオン交換（ＣＭ）クロマトグラフィーカラムの製造及び使用
この研究は、カルボキシメチル陽イオン交換体を生成するために、陽イオン交換リガンドで官能化された２つの３Ｄプリントクロマトグラフィーカラムの生成に対して詳細に説明する。第１のカラムは、３％プリント法を使用して５０％のボイド率を有するシュワルツダイヤモンド構造に製造された６％アガロースカラムであった。第２のカラムは、５０％のボイド率を有するシェーンジャイロイド構造に製造された５％セルロースカラムであった。アガロース及びセルロースヒドロゲルは、Ｓｏｌｉｄｓｃａｐｅ  ３ＺＭｏｄｅｌ材料から製造された鋳型を使用して上記記述した方法を使用して製造した。
【０２１９】
２つのカラム上にシトクロムＣの捕捉が示され、アガロースシュワルツダイヤモンドに対して３７％の捕捉効率、及びセルロースシェーンジャイロイドに対して８９．２％の捕捉効率が示される。セルロースジャイロイドの酵母通過が、アガロースシュワルツダイヤモンドでよりも高かったにもかかわらず、２つのカラム両方の固形物（サッカロマイセス・セレビシエ）の存在下で同様の捕捉効率を有することと立証された。
【０２２０】
方法
カラムの仕様
シュワルツダイヤモンドカラムは、６％アガロースヒドロゲルで製造された、長さ５０ｍｍ、直径１０ｍｍ、チャンネル５００μｍ、ボイド率５０％のカラムであった。シェーンジャイロイドカラムは、５％エピクロロヒドリンで架橋されたセルロースを５０％添加した５％セルロースヒドロゲルで製造された長さ５０ｍｍ、直径１０ｍｍ、チャンネル５００μｍ、ボイド率５０％のカラムであった。
【０２２１】
ＣＤＩ活性化及びリガンド結合
２つのカラムについて同じ官能化方法を行った。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｅｔｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｇ．Ｓ．，Ａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｅａｒｎ，Ｍ．Ｔ．Ｗ．，＆Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｗ．Ｓ．（１９８７）．１、１′−カルボニルジイミダゾールによる様々な不溶性多糖類の活性化、及び活性化されたマトリックスの性質に対する調査。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，２１９（３），３６１−３７１．ｄｏｉ：http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(00)80379-9）ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｍｉｌｌｉａ＆Ｓｍｉｔｈ，１９９２（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．，＆Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．（１９９２）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）は、アガロース及びセルロース活性化及びその後のリガンド結合に適合させ：１、１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を使用して、多糖類ゲル中のヒドロキシル基を活性化させ、６−アミノへキサン酸を活性化されたマトリックスに結合させて、リガンド中に存在するカルボキシル基を介して表面に陽イオン交換基を生成させた。カラムを％アセトン／％水が３０／７０、５０／５０、７０／３０、１００／０で添加された混合物の３カラム体積で、アセトンで、水性で順次に洗浄した。続いて、カラムを３カラム体積の新鮮なアセトンに入れ、０．２ｇＣＤＩを添加した。各混合物をスピンホイールの上に１時間放置した。活性化以後に、反応混合物をカラムからデカントし、続いてカラムを２カラム体積のアセトンで洗浄して米反応ＣＤＩ基を除去した。リガンド６−アミノへキサン酸をアガロースカラムに結合させるために、カラムを、ＮａＯＨを使用してｐＨ１０以下に製造した５Ｍ６−アミノへキサン酸及び１Ｍ重炭酸ナトリウムの６ｍｌ溶液に添加した。６−アミノへキサン酸は、陽イオン交換のためのリガンドの末端に遊離カルボキシル基を有する、アミン結合を介してアガロースの表面に共有結合を形成する。上記溶液を４８時間一定に撹拌しながら反応させた後、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液に入れた（リガンド結合直後のタンパク質分離に使用しない場合）。
【０２２２】
平衡化
すべての動的テストは、ＡＫＴＡ１０  Ｅｘｐｌｏｒｅｒで行ったし、ここで活性化された３ＤプリントカラムをガラスＳＮＡＰカラムケーシングに入れ、ＡＫＴＡに取り付けた。カラムを５カラム体積の７０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で洗浄してチャンネルからすべての空気を除去した。３カラム体積の溶出緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム＋１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）をカラム上で洗浄して陽イオン交換基に対イオンを添加した。次いで、カラムを３カラム体積の結合緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化させてタンパク質サンプル適用のためのカラムを製造した。
【０２２３】
タンパク質結合
２．０ｍｌの２．０ｍｇ／ｍｌシトクロムＣを１ｍｌ／分でカラムにロードした。次いで、カラムを４．５カラム体積の結合緩衝液で洗浄して未結合サンプルを除去した。最後に、４カラム体積の溶出緩衝液をカラムに加えて、結合されたシトクロムＣをカラムから溶出させた。次いで、カラムを次の試験の準備のために結合緩衝液で再平衡化した。
【０２２４】
酵母の存在下でタンパク質結合
０．２５％ｗ／ｗパン酵母を２．０ｍｌの結合緩衝液に混合した。次いで、これを新たに平衡化されたカラムに入れ、洗浄及び溶出過程を上記と同様に行った。次いで、カラムを３カラム体積の１ＭのＮａＯＨで洗浄して、カラム又はＡＫＴＡハードウェアに付着された酵母細胞を除去した。次いで、カラムを上記のような結合緩衝液で再平衡化した。別の０．２５％ｗｔ／ｗｔの酵母溶液を製造した後、２．０ｍｇ／ｍｌシトクロムＣを添加した。これは以前と同じ過程に従ってカラムに適用した。
【０２２５】
結果及び考察
（ａ）シュワルツダイヤモンドアガロース
試験過程中に２８０ｎｍでＵＶ吸光度をモニタリングすると（図１８）、カラムにロードされたシトクロムＣの３７％が結合され、続いて塩溶出緩衝液を添加して溶出されることを示す。これは、衝溶液ｐＨ７．０におけるように、陽イオン交換体としてのカラムの能力を証明するのに、シトクロムＣ（ｐＩ１０．０〜１０．５を有する）が正に荷電しており、これは、アガロースマトリックスに結合された負に荷電された陽イオン交換リガンドに結合することを意味する。しかし、結合効率は非常に低く；これは、緩衝液タイプ及び塩濃度を変化させることによって最適化することができる。
【０２２６】
シトクロムＣ、酵母及びシトクロムＣ及び酵母試験から２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を分析した結果、シトクロムＣ及び酵母は両方ともこの波長で吸光度を有することを示す（図１９）。これは、細胞及びタンパク質が分離されることができないが、シトクロムＣ及び酵母試験に対するピークの強度は、シトクロムＣのみ及び酵母のみの試験におけるピークの合計であることを示す。これは、酵母の存在下でシトクロムＣ捕捉がほとんど影響を受けないことを示し、これは、固体の存在下でタンパク質捕捉メカニズムとしてシュワルツＤアガロース陽イオン交換体の能力を確認する。
【０２２７】
６００ｎｍでのＵＶ吸光度は固形物の通過を示すが、５５０ｎｍでのシトクロムＣに対する吸光度スペクトルのピークによって６００ｎｍでわずかなシトクロムＣ検出があることが明らかである（値の間の近接は、６００ｎｍでシトクロムＣの非ゼロを引き起こす）。再び、シトクロムＣ及び酵母試験で検出されたピークは、シトクロムＣのみ及び酵母のみの試験の合計に等しい（図２０）。
【０２２８】
結果は、シュワルツＤアガロース陽イオン交換体の酵母通過が９４．２％であることを示す。少量のタンパク質がカラムに結合する理由は、陽イオン交換体と酵母細胞ブロスのいくつかの部分との間の相互作用のためである。Ｔａｒｉらは、この伝導度で０．０９５の相互作用係数を報告している（Ｔａｒｉ，Ｃ．，Ｖｅｎｎａｐｕｓａ，Ｒ．Ｒ．，Ｃａｂｒｅｒａ，Ｒ．Ｂ．，＆Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌａｈｏｒｅ，Ｍ．（２００８）、バイオプロダクト吸着剤表面へのバイオマス付着のための診断道具としてのコロイド沈着実験（Ｃｏｌｌｏｉｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｓｓ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｎｔｏ  ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅｓ）。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８３（２），１８３−１９１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｔｂ．１８５２）（樹脂への細胞親和性は塩濃度と共に増加する）ので、酵母のいくつかの結合が期待され、おおよそ１０％のタンパク質結合が起こるであろう。
【０２２９】
（ｂ）シェーンジャイロイドセルロース
シュワルツＤアガロース陽イオン交換体からの同じ分析がここで適用される。捕捉効率及び酵母通過が報告されるであろう。考察の残り部分は本質的に同一に維持される。
【０２３０】
シェーンジャイロイドアガロースカラムでのタンパク質捕捉は、クロマトグラムで証明される（図２１）。８９．２％のシトクロムＣ捕捉に等しい溶出ピークと比較して、小さなフロースルーピークが観察される。
【０２３１】
２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度の合計は、緩衝液のみのカラムでのシトクロムＣの捕捉と、酵母混合物中のシトクロムＣの捕捉との間の挙動にほとんど変化がないことを示し、これは、固形物の存在がタンパク質結合能力を撹乱させないことを意味する。酵母通過は、６００ｎｍでのＵＶ吸光度から計算される（図２３）。酵母のみの曲線に対する相対ピーク強度の分析は、９４．５％の酵母通過を提供する。
【０２３２】
結論
この研究は、独特の幾何学的構造であるシュワルツダイヤモンドが堅固な耐久性クロマトグラフィー用３Ｄプリント陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの構造として使用できることを確認する。３７％のタンパク質捕捉効率が達成され、懸濁固体ブロスの一部の場合減少しない。ブロスの細胞通過は９４．２％であり、これは、タンパク質と細胞の両方を処理することができるカラムの能力を示す。
【０２３３】
なお、堅固な耐久性クロマトグラフィーのための３Ｄプリント陽イオン交換クロマトグラフィーカラムとしてセルロースを使用する可能性が立証される。ここで、タンパク質捕捉効率は、はるかに高かったし（８９％）、固体通過は９４．５％である。
【産業上の利用可能性】
【０２３４】
７．産業上の利用可能性
本発明の分離媒体を使用して、フィードストリームから標的分析物を得ることができる。フィードストリームに懸濁固形物が含まれている場合、最初に固形物を除去する必要なく、分離媒体を直接使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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