(57)【要約】  エフェドリンおよびその誘導体を含むアルカロイド化合物を製造するための方法。方法は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼにより触媒される化学反応の実施を包含する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）
【化１】
2018518189.tif 000009
を有するアルカロイド化合物を提供すること、
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物から化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物への酵素により触媒される変換を許容する反応条件下で、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼと接触させることを含む、化学式（ＩＩ）
【化２】
2018518189.tif 000010
を有するアルカロイド化合物を製造する方法であって、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素原子、メチル基またはメトキシ基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基、またはハロゲンであり、Ｒ３’は、水素原子であり、またはまとめてＲ３およびＲ３’は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ４〜Ｒ８は各々独立してまたは同時に水素原子、メチル基、ヒドロキシル基、ハロゲンまたはメトキシ基であり、ならびに化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物における各Ｒ１〜Ｒ８およびＲ３’は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物におけるＲ１〜Ｒ８およびＲ３’と同一である、方法。
【請求項２】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３はヒドロキシル基であり、Ｒ３’は水素原子であり、およびＲ４〜Ｒ８は水素原子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３はヒドロキシル基であり、Ｒ３’は水素原子であり、およびＲ４〜Ｒ８は水素原子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ２は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が２Ｒ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ２は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が２Ｓ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ３は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が１Ｒ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ３は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が１Ｓ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−ノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−ノルプソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−メチル−プソイドエフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−メチル−エフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−Ｎ−メチル−エフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−メチル−プソイドエフェドリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｎ−メチル−トランスフェラーゼは、チャット属に属する植物種から、またはマオウ属に属する植物から得られることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群から選択される、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、インビボで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、インビトロで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）操作可能に連結された構成要素として、
（ｉ）Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列、および
（ｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つ以上の核酸配列
を含むキメラ核酸配列を提供すること、
（ｂ）前記キメラ核酸配列を宿主細胞へと導入し、前記宿主細胞を増殖させて、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを産生し、および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を生成すること、ならびに
（ｃ）化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を収集すること
を含む、化学式（ＩＩ）
【化３】
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を有するアルカロイド化合物を調製するための方法であって、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素原子、メチル基またはメトキシ基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基、またはハロゲンであり、Ｒ３’は、水素原子であり、またはまとめてＲ３およびＲ３’は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、およびＲ４〜Ｒ８は各々独立してまたは同時に水素原子、メチル基、ヒドロキシル基、ハロゲンまたはメトキシ基である、方法。
【請求項２１】
前記細胞は、化合物（Ｉ）
【化４】
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を産生することができ、ならびに（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素原子、メチル基またはメトキシ基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基、またはハロゲンであり、Ｒ３’は、水素原子であり、またはまとめてＲ３およびＲ３’は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ４〜Ｒ８は各々独立してまたは同時に水素原子、メチル基、ヒドロキシル基、ハロゲンまたはメトキシ基であり、ならびに化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物における各Ｒ１〜Ｒ８およびＲ３’は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物におけるＲ１〜Ｒ８およびＲ３’と同一である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする前記核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８の群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許協力条約出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１6年６月２３日に出願の米国仮特許出願第６２／１８３，３７２号に由来する米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を請求する。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、アルカロイド化合物、特にエフェドリンを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本開示の背景
以下の段落は、本開示に対する背景として提供される。しかしながら、当該段落は、そこで論議されているいかなることも、従来技術または当業者の知識の一部であるということを認めることはない。
【０００４】
エフェドリンおよび関連アルカロイド化合物の薬理学的特性は、長く認識されてきた。したがって、エフェドリンはとりわけ、鬱血除去薬、刺激薬、集中助剤、および食欲抑制薬として使用されることがある。医薬製剤を調製するために、エフェドリンは、例えばチャット属、アラビアチャノキ属に属する植物種および例えばマオウ属、シナマオウ属に属する植物種を含む天然源から抽出されることがある。しかしながら、植物抽出性エフェドリンの収量は典型的にはあまり多くない（Ｓｈｕｋｌａら，２０００，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１６：４９９〜５０６）。実際、植物抽出物は通常、草本製剤の調製およびエフェドリンを含有するサプリメントのために使用される。植物抽出法は、当該方法の効率が制限されるので、実質的に純粋なエフェドリンの大規模製造にはあまり適していない。エフェドリンは、例えば、エフェドリンの（ＭａｎｓｋｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９２９，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５１：５８０〜５８２）またはプロピオン酸由来の（Ｆｅｌｄｍａｎら，１９６２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．３５，１３０９〜１３１１）ラセミ混合物を提供して１−フェニル−１，２−プロパンジオンをメチルアミンと縮合させることによって化学的に製造されることもある。概して、エフェドリンの化学的製造は、適切に経済的な点および多段調製法に関して必ずしも入手可能ではないいくつかの実質的に純粋な化合物の使用を包含するので、厄介である。その上、限定された鏡像異性純度のみが化学合成を通じて到達でき、すなわち、当該化学合成法は、（Ｒ）−鏡像異性体および（Ｓ）−鏡像異性体の混合物を生じる。この点において、異なるエフェドリン鏡像異性体が異なる薬理学的特性を呈することは留意される。したがって、エフェドリンの商業的バルク製造のために現に最も普遍的に使用されている方法は、２つの別個のステップ、すなわち、最初の生合成製造ステップ、それに続く化学合成ステップからなる。顕著なことに、この方法は、安価な添加物であるベンズアルデヒドの存在下での酵母における糖の発酵を包含し、結果的に、（Ｒ）−ＰＡＣとしても公知の（Ｒ）−フェニルアセチルカルビノールを製造する。この前駆体化合物はその後、化学的還元的アミノ化反応の実施によってエフェドリンを製造するために使用される。
【０００５】
エフェドリンおよび関連アルカロイド化合物の合成と関連する十分に理解された化学的性質にもかかわらず、エフェドリンのデノボ生合成製造が達成され得るかどうかおよびどのように達成され得るかはこれまでわかっていなかった。このような生合成製造系は、エフェドリンの現に使用されている商業的製造系を稼働するのに必要とされるような、（Ｒ）−ＰＡＣをエフェドリンへ変換する化学合成ステップについての必要性を除去して、一段階法を使用した実質的に純粋なエフェドリンおよび関連アルカロイド化合物のための大規模な経済的製造方法を表すので、望ましい。
【０００６】
それゆえ、エフェドリンおよび関連アルカロイド化合物の製造のための改善された方法についての当該技術分野における需要が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
以下の段落は、後述のより詳細な説明へ読者を導入するよう企図するものであり、本開示の請求される対象を規定したり制限したりするよう企図するものではない。
【０００８】
一態様において、本開示は、エフェドリンおよび関連アルカロイド化合物に関する。
【０００９】
一態様において、本開示は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼに関する。
【００１０】
したがって、本開示は、少なくとも１つの実施において、化学式（ＩＩ）
【化１】
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を有するアルカロイド化合物を製造する方法を提供し、当該方法は、
化学式（Ｉ）
【化２】
2018518189.tif 000004
を有するアルカロイド化合物を提供すること、
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物から化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物への酵素により触媒される変換を許容する反応条件下で、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼと接触させることを含む。
【００１１】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物において、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素原子、メチル基またはメトキシ基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基、またはハロゲンであり、Ｒ３’は、水素原子であり、またはまとめてＲ３およびＲ３’は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ４〜Ｒ８は各々独立してまたは同時に水素原子、メチル基、ヒドロキシル基、ハロゲンまたはメトキシ基であり、ならびに化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物における各Ｒ１〜Ｒ８およびＲ３’は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物におけるＲ１〜Ｒ８およびＲ３’と同一である。
【００１２】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３はヒドロキシル基であり、Ｒ３’は水素原子であり、およびＲ４〜Ｒ８は水素原子である。このような実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物がノルエフェドリンとも呼ばれ、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物がエフェドリンとも呼ばれることは留意される。
【００１３】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３はヒドロキシル基であり、Ｒ３’は水素原子であり、およびＲ４〜Ｒ８は水素原子である。このような実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物がエフェドリンとも呼ばれ、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物がＮ−メチルエフェドリンとも呼ばれることは留意される。
【００１４】
一部の実施において、Ｒ２は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が２Ｒ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００１５】
一部の実施において、Ｒ２は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が２Ｓ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００１６】
一部の実施において、Ｒ３は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が１Ｒ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００１７】
一部の実施において、Ｒ３は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が１Ｓ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００１８】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンである。
【００１９】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−ノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンである。
【００２０】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリンである。
【００２１】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリンである。
【００２２】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−メチル−プソイドエフェドリンである。
【００２３】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−メチル−エフェドリンである。
【００２４】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−Ｎ−メチル−エフェドリンである。
【００２５】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−メチル−プソイドエフェドリンである。
【００２６】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１およびＲ４〜Ｒ８は各々水素原子であり、Ｒ２はメチル基であり、まとめてＲ３およびＲ３’はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成する。化学式（Ｉ）を有する化合物がカチノンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がメトカチノンとして公知であることは留意される。
【００２７】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ4、Ｒ７およびＲ８は各々水素原子であり、ならびにＲ３およびＲ６はヒドロキシル基である。化学式（Ｉ）を有する化合物がｐ−オクトパミンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がシネフリンとして公知であることは留意される。
【００２８】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は各々水素原子であり、ならびにＲ３およびＲ７はヒドロキシル基である。化学式（Ｉ）を有する化合物がＮ−デスメチルフェニレフリンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がフェニレフリンとして公知であることは留意される。
【００２９】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は各々水素原子であり、ならびにＲ３およびＲ６はヒドロキシル基である。化学式（Ｉ）を有する化合物がシネフリンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がＮ−メチル−シネフリンとして公知であることは留意される。
【００３０】
一部の実施において、Ｎ−メチル−トランスフェラーゼは、チャット属に属する植物種から、またはマオウ属に属する植物から得られまたは得られることができる。
【００３１】
一部の実施において、本明細書に開示される方法は、インビボで実施される。
【００３２】
一部の実施において、本明細書に開示される方法は、インビトロで実施される。
【００３３】
本開示の他の特長および利点は、詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、本開示の精神および範囲内の種々の変更および改変が、詳細な説明に関して当業者に明らかとなるであろうため、詳細な説明は、本開示の好ましい実施を示すが、説明のためにのみ付与されることは理解されるべきである。
【００３４】
本開示は、図面と関連して説明される以下に提供される段落にある。本明細書に提供される図面は、説明目的のために提供されており、本開示を制限するよう企図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、一般的な化学式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するある特定のアルカロイド化合物の化学構造を示す。
【図２】図２は、ノルエフェドリン（図２Ａ〜図２Ｄ）、エフェドリン（図２Ｅ〜図２Ｈ）、およびＮ−メチルエフェドリン（図２Ｉ〜図２Ｌ）の種々の立体異性体の化学構造を示す。
【図３】図３は、実施例１において説明される実験の実施、特に標準的なアッセイ条件下で種々の基質を用いたＮ−メチル化アルカロイドの生成において得られるある特定の結果を反映する棒グラフを示す。使用される基質は、ｘ軸に沿って列挙されており、Ｎ−メチル化生成物は、タンパク質μｇ当たり時間当たりのＭＳイオン計数として定量化される。誤差棒は、４〜６個の複製物を用いて算出される標準偏差（ＳＤ）を表す。ｐエフェドリンがプソイドエフェドリンを示すことは留意される。
【図４】図４は、実施例１において説明される実験の実施、特に標準的なアッセイ条件下でノルエフェドリン基質、エフェドリン基質、およびプソイドエフェドリン（ｐエフェドリン）基質を用いたＮ−メチル化アルカロイドの生成において得られるある特定の結果を反映する別の棒グラフを示す。使用される基質は、ｘ軸に沿って列挙されており、Ｎ−メチル化生成物は、タンパク質μｇ当たり時間当たりのｎｇアルカロイドとして定量化される。誤差棒は、４〜６個の複製物を用いて算出される標準偏差（ＳＤ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
図面は、以下の詳細な説明とともに、本開示が実際にどのように実施され得るのかを当業者に対して明らかにする。
【００３７】
本開示の詳細な説明
種々の組成物および方法は、請求される各対象の実施形態の例を提供するために、以下に説明されるであろう。以下に説明される実施形態は、請求されるいかなる対象も制限せず、請求されるいかなる対象も、以下に説明されるものとは異なる方法（ｍｅｔｈｏｄ）、方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）、組成物または系を網羅し得る。請求される対象は、以下に説明されるいかなる１つの組成物、方法（ｍｅｔｈｏｄ）、系もしくは方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）の特長もすべて有する組成物もしくは方法に、または以下に説明する組成物、系もしくは方法のうちの複数もしくはすべてに対して共通の特長に制限されない。以下に説明される組成物、系、方法（ｍｅｔｈｏｄ）または方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）が、請求されるいかなる対象の実施形態でもないことは可能である。本文書において請求されていない以下に説明される組成物、系、方法（ｍｅｔｈｏｄ）または方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）において開示されるいかなる主題も、別の保護的手段の、例えば、継続特許出願の主題であり得、出願人、発明者または所有者は、本文書におけるいかなるこのような主題の開示によっても、当該主題を公開するために断念、放棄または献呈するよう企図するものではない。
【００３８】
先に記載したように、本開示は、エフェドリンおよびある特定の関連アルカロイド化合物の製造のための方法に関する。本明細書において提供される方法は、新規であり、前駆体化合物を使用する化学合成ステップについての必要性を除去する、エフェドリンおよび関連アルカロイド化合物の商業的規模でのデノボ生合成製造を許容する手段を初めて提供する。本開示の得られた化合物は、とりわけ医薬組成物の製造において有用である。
【００３９】
用語および定義
「ノルエフェドリン」という用語は、本明細書において使用する場合、図１Ａに示される化合物を指す。ノルエフェドリンという用語は、立体異性体の表記（例えば、（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン）とともに別段の具体的な使用がない限り、エフェドリンの４つの立体異性体、すなわち、（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドノルエフェドリン、（１Ｒ，２Ｒ）−ノルエフェドリンおよび（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドノルエフェドリンをすべて含むよう企図されることは留意される。
【００４０】
「エフェドリン」という用語は、本明細書において使用する場合、図１Ｂに示される化合物を指す。エフェドリンという用語は、立体異性体の表記（例えば、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン）とともに別段の具体的な使用がない限り、エフェドリンの４つの立体異性体、すなわち、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリン、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンおよび（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンをすべて含むよう企図されることは留意される。
【００４１】
本明細書で使用する場合の「Ｎ−メチルエフェドリン」という用語は、図１Ｃに示される化合物を指す。Ｎ−メチルエフェドリンという用語は、立体異性体の表記（例えば、（１Ｒ，２Ｓ）−Ｎ−メチルエフェドリン）とともに別段の具体的な使用がない限り、エフェドリンの４つの立体異性体、すなわち、（１Ｒ，２Ｓ）−Ｎ−メチルエフェドリン、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−メチルプソイドエフェドリン、（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−メチルエフェドリンおよび（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−メチルプソイドエフェドリンをすべて含むよう企図されることは留意される。
【００４２】
「（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ａに示される化合物を指す。
【００４３】
「（１Ｓ，２Ｒ）−ノルプソイドエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｂに示される化合物を指す。
【００４４】
本明細書で使用する「（１Ｒ，２Ｒ）−ノルエフェドリン」という用語は、図２Ｃに示される化合物を指す。
【００４５】
「（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドノルエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｄに示される化合物を指す。
【００４６】
「（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｅに示される化合物を指す。
【００４７】
「（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｆに示される化合物を指す。
【００４８】
「（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｇに示される化合物を指す。
【００４９】
「（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｈに示される化合物を指す。
【００５０】
「（１Ｒ，２Ｓ）−Ｎ−メチルエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｉに示される化合物を指す。
【００５１】
「（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−メチルプソイドエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｊに示される化合物を指す。
【００５２】
「（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−メチルエフェドリン」という用語は、本明細書で使用する場合、図２Ｋに示される化合物を指す。
【００５３】
本明細書で使用する「（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−メチルプソイドエフェドリン」という用語は、図２Ｌに示される化合物を指す。
【００５４】
本明細書において相互交換可能に使用され得る「Ｎ−メチルトランスフェラーゼ」および「ＮＭＴ」という用語は、（ｉ）例えば配列番号３を含む、本明細書で明らかにされる何らかのＮ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドを構成するアミノ酸配列と実質的に同一である、または（ｉｉ）本明細書で明らかにされる何らかのＮ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする何らかの核酸配列と少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成することができる核酸配列によってコードされるが同義のコドンの使用のためのアミノ酸残基の配列を含む何らかのおよびすべての酵素を指す。
【００５５】
本明細書において使用する「核酸配列」という用語は、天然の塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドのモノマーの配列を指す。当該用語には、非天然のモノマーまたはその一部を含む修飾されたまたは置換された配列も含む。本開示の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルを含む天然の塩基を含み得る。当該配列は、修飾された塩基も含有し得る。このような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザのアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル、ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００５６】
「Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列」、「Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列」という用語は、例えば配列番号１および配列番号２を含むＮ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする何らかのおよびすべての核酸配列を指す。Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列にはさらに、（ｉ）本明細書で明らかにされるＮ−メチルトランスフェラーゼポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする、または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリッド形成条件下で本明細書で明らかにされる何らかのＮ−メチルトランスフェラーゼ核酸配列とハイブリッド形成する、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するであろうが、同義のコドンの使用のためである、何らかのおよびすべての核酸配列を含む。
【００５７】
「実質的に同一である」という用語によって意味されるのは、２つのポリペプチド配列が好ましくは少なくとも７０％同一であり、より好ましくは少なくとも８５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であり、例えば、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることである。２つのポリペプチド配列間の同一性の百分率を判定するために、このような２つの配列のアミノ酸配列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２：４８２）によって改変されたように、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，４８：４４３）の整列方法を用いて整列され、それにより、最高の桁の一致がこれら２つの配列間で得られ、同一のアミノ酸の数がこれら２つの配列間で判定される。２つのアミノ酸配列間での百分率同一性を算出する方法は概して、当該技術分野で認識されており、例えば、ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎ（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，１９８８，４８：１０７３）によって説明されているもの、ならびにＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  ｅ．ｄ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８，  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓにおいて説明されているものを含む。概して、コンピュータプログラムは、このような算出に採用されるであろう。この点において使用され得るコンピュータプログラムには、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８４，１２：３８７）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９０：２１５：４０３）を含むが、これらに限定されない。２つのポリペプチド間の百分率同一性を判定するための特に好ましい方法は、１０の間隙開口罰則および０．１の間隙伸長罰則を用いるＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ  Ｇ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５〜１０９１９）を伴う、クラスターＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ  Ｄ，Ｈｉｇｇｉｎｅｓ，Ｄ  ＧおよびＧｉｂｓｏｎ  Ｔ  Ｊ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２２（２２）：４６７３〜４６８０）を包含し、それにより２つの配列のうちの１つの全長の少なくとも５０％が整列に包含される２つの配列間で最高の桁の符合が得られる。
【００５８】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリッド形成条件」によって意味されるのは、溶液中の２つの相補的な核酸分子間での選択的なハイブリッド形成を促進する条件が選択されることである。ハイブリッド形成は、核酸配列分子のすべてまたは一部に対して生じ得る。ハイブリッド形成部分は典型的には、長さ少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドである。当業者は、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性が、Ｔｍによって決定され、それはナトリウム含有緩衝液中でナトリウムイオン濃度および温度の関数であることを認識するであろう（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｉ）または類似の等式）。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子に対して類似だが同一ではない分子を識別するために、１％ミスマッチを仮定して、Ｔｍの約１℃の低下を結果的に生じ得、例えば、９５％超の同一性を有する核酸分子が探索される場合、最終的な洗浄温度は、約５℃ほど低下するであろう。これらの考慮を元に、当業者は、適切なハイブリッド形成条件を容易に選択することができるであろう。好ましい実施形態において、ストリンジェントなハイブリッド形成条件が選択される。例として、以下の条件を採用して、ストリンジェントなハイブリッド形成を達成し得る。すなわち、（先の等式を基にした）Ｔｍ−５℃での５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート溶液／１．０％ＳＤＳでのハイブリッド形成、次いで、６０℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄である。中程度にストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃で３×ＳＳＣでの洗浄ステップを含む。しかしながら、等価のストリンジェンシーが代替的な緩衝液、塩および温度を用いて達成され得ることは理解される。ハイブリッド形成条件に関する追加の案内は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９，  ６．３．１〜６．３．６において、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，第３巻において認められ得る。
【００５９】
核酸配列の脈絡で本明細書で使用される「キメラ」という用語は、天然には結合していない少なくとも２つの結合した核酸配列を指す。キメラ核酸配列には、異なる天然起源の結合した核酸配列が含まれる。例えば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列に結合する酵母のプロモーターを構成する核酸配列は、キメラとみなされる。キメラ核酸配列は、同じ天然起源の核酸配列も含むことがあり、但し、それらは天然には結合していないことを条件とする。例えば、特定の細胞タイプから得られるプロモーターを構成する核酸配列は、同じ細胞タイプから得られるポリペプチドをコードする核酸配列へ結合し得るが、通常、プロモーターを構成する核酸配列には結合していない。キメラ核酸配列には、何らかの非天然核酸配列へ結合した何らかの天然核酸配列を含む核酸配列も含まれる。
【００６０】
「実質的に純粋な」および「分離された」という用語は、本明細書で相互交換可能に使用され得る場合、天然に付随する構成要素から分離された化合物、例えば、エフェドリンまたはポリペプチドを説明する。典型的には、化合物は、試料中の材料全体の少なくとも（容積による、湿重量もしくは乾重量による、またはモルパーセントもしくはモル画分による）６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、または９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％が関心対象の化合物である時、実質的に純粋である。純度は、何らかの適切な方法によって、例えば、ポリペプチドの場合、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００６１】
酵素もしくはタンパク質もしくはエフェドリン、または関連アルカロイド化合物との関係における本明細書で使用する場合の「収集された」という用語は、酵素もしくはエフェドリンまたは関連アルカロイド化合物の多かれ少なかれ純粋な形態を指す。
【００６２】
エフェドリンまたは関連アルカロイド化合物を製造する方法を説明するための本明細書で使用する場合の「インビボ」という用語は、第一の化合物を、例えば、細菌細胞または植物細胞を含む生細胞内で化合物の変換を触媒して、エフェドリンまたは関連アルカロイド化合物を形成することのできる酵素と接触させることを含む。
【００６３】
エフェドリンまたは関連アルカロイド化合物を製造する方法を説明するために本明細書で使用される場合の「インビトロ」という用語は、第一の化合物を、例えばマイクロウェルプレート、チューブ、フラスコ、ビーカー、タンク、反応炉およびこれらに類するものを含むがそれらに限定されない、生細胞の外側にある環境において化合物の変換を触媒して、エフェドリンまたは関連アルカロイド化合物を形成することのできる酵素と接触させることを指す。
【００６４】
「ハロゲン」という用語は、本明細書で使用する場合、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物の原子を指す。
【００６５】
本明細書で使用する「メチルドナー」という用語は、メチル（ＣＨ３）基を式（Ｉ）のアルカロイド化合物へ転移して、結果的に式（ＩＩ）のアルカロイド化合物を生じることのできる化合物または分子を指す。
【００６６】
本明細書で使用する「実質的に」、「本質的に」「約」および「およそ」のような程度の用語は、末端の結果が有意に変化しないような修飾された用語のかなりの量の偏差を意味すると留意されるべきである。これらの程度の点は、この偏差が修飾する用語の意味を否定しないであろう場合、修飾された用語の偏差を含むものとして解釈されるべきである。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「および／または」という語は、包含的論理和を表すよう企図される。すなわち、「Ｘおよび／またはＹ」は、例えば、ＸもしくはＹまたはその両方を意味するよう企図される。さらなる例として、「Ｘ、Ｙ、および／またはＺ」は、ＸもしくはＹもしくはＺまたはこれらの何らかの組み合わせを意味するよう企図される。
【００６８】
すべての公開物、特許および特許出願は、各個々の公開物と同程度までそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
一般的な実施
１つの実施において、本明細書に従って、化学式（ＩＩ）
【化３】
2018518189.tif 000005
を有するアルカロイド化合物を製造する方法が提供され、当該方法は、化学式（Ｉ）
【化４】
2018518189.tif 000006
を有するアルカロイド化合物を提供すること、
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物へ酵素により触媒される変換を許容する反応条件下で、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を、十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼと接触させることを含む。
【００７０】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物において、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素原子、メチル基またはメトキシ基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基またはハロゲンであり、Ｒ３’は、水素原子であり、またはまとめてＲ３およびＲ３’は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ４〜Ｒ８は各々独立してまたは同時に水素原子、メチル基、ヒドロキシル基、ハロゲンまたはメトキシ基であり、ならびに化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物における各Ｒ１〜Ｒ８およびＲ３’は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物におけるＲ１〜Ｒ８およびＲ３’と同一である。Ｒ３ハロゲン基には、塩素、フッ素、臭素およびヨウ素が含まれる。
【００７１】
１つの実施において、本開示は、化学式（ＩＩ）
【化５】
2018518189.tif 000007
を有するアルカロイド化合物を製造する方法を提供し、当該方法は、化学式（Ｉ）
【化６】
2018518189.tif 000008
を有するアルカロイド化合物を提供すること、
化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物へ酵素により触媒される変換を許容する反応条件下で、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を、十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼと接触させることを含み、この中で、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはハロゲンであり、Ｒ２は、水素原子、メチル基またはメトキシ基であり、Ｒ３は、ヒドロキシル基、またはハロゲンであり、Ｒ３’は、水素原子であり、またはまとめてＲ３およびＲ３’は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成し、Ｒ４〜Ｒ８は各々独立してまたは同時に水素原子、メチル基、ヒドロキシル基、ハロゲンまたはメトキシ基であり、ならびに化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物における各Ｒ１〜Ｒ８およびＲ３’は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物におけるＲ１〜Ｒ８およびＲ３’と同一である。
【００７２】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１は水素原子であり、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３はヒドロキシル基であり、Ｒ３’は水素原子であり、およびＲ４〜Ｒ８は水素原子である。このような実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、ノルエフェドリンとも呼ばれ、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、エフェドリンとも呼ばれることは留意される。
【００７３】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２はメチル基であり、Ｒ３はヒドロキシル基であり、Ｒ３’は水素原子であり、およびＲ４〜Ｒ８は水素原子である。このような実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、エフェドリンとも呼ばれ、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、Ｎ−メチルエフェドリンとも呼ばれることは留意される。
【００７４】
一部の実施において、Ｒ２は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が２Ｒ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００７５】
一部の実施において、Ｒ２は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が２Ｓ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００７６】
一部の実施において、Ｒ３は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が１Ｒ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００７７】
一部の実施において、Ｒ３は、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物が１Ｓ−鏡像異性体であるよう空間的に配向される。
【００７８】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンである。
【００７９】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−ノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンである。
【００８０】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリンである。
【００８１】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−ノルプソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリンである。
【００８２】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−メチル−プソイドエフェドリンである。
【００８３】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−エフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ−メチル−エフェドリンである。
【００８４】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｒ，２Ｓ）−Ｎ−メチル−エフェドリンである。
【００８５】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−プソイドエフェドリンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−メチル−プソイドエフェドリンである。
【００８６】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１およびＲ４〜Ｒ８は各々水素原子であり、Ｒ２はメチル基であり、まとめてＲ３およびＲ３’はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成する。化学式（Ｉ）を有する化合物がカチノンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がメトカチノンとして公知であることは留意される。一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（Ｓ）−カチノンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（Ｓ）−メトカチノンである。一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、（Ｒ）−カチノンであり、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、（Ｒ）−メトカチノンである。
【００８７】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は各々水素原子であり、ならびにＲ３およびＲ６はヒドロキシル基である。化学式（Ｉ）を有する化合物がｐ−オクトパミンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がシネフリンとして公知であることは留意される。
【００８８】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は各々水素原子であり、ならびにＲ３およびＲ７はヒドロキシル基である。化学式（Ｉ）を有する化合物がＮ−デスメチルフェニレフリンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がフェニレフリンとして公知であることは留意される。
【００８９】
一部の実施において、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物の両方において、Ｒ１はメチル基であり、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は各々水素原子であり、ならびにＲ３およびＲ６はヒドロキシル基である。化学式（Ｉ）を有する化合物がシネフリンとして公知であり、化学式（ＩＩ）を有する化合物がＮ−メチル−シネフリンとして公知であることは留意される。
【００９０】
一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、３’−クロロ−２−アミノプロピオフェノン、ノルメフェドロン、ノルメテドロン、オキシドパミン、ｍ−チラミン、アンフェタミン、ノルアドレナリン、ノルメトラミノール、ゲペフリン、ドーパミン、ｐ−チラミン、ｐ−オクトパミン、フェニルエタノールアミン（β−ヒドロキシフェニルエタノールアミン）、２−フェネチルアミン、オルテタミン、β−メチル−フェネチルアミン、３−メトキシ−チラミン、ノルメトキシフェナミン、メスカリン、３，４−ジメトキシフェネチラミン、ノルマクロメリン、およびＳ−メトカチノンからなる化合物の群から選択される。
【００９１】
インビトロでの合成
本開示のある態様に従って、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、インビトロでの反応条件下で化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物から化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物への酵素により触媒される化学変換を許容する反応条件下で、十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼと接触させて生じる。このようなインビトロでの反応条件下で、開始反応構成要素は、多かれ少なかれ純粋な形態で提供され、実質的に進むための酵素触媒の際の必要な化学反応を許容する条件下で、互いに接触して混合される。化学式（Ｉ）を有する初期アルカロイド化合物の実質的に純粋な形態は、化学的に合成され得、またはカート属に属する植物種およびマオウ属に属する植物種からを含む天然源から分離され得る。適切な植物種には、アラビアチャノキ属、シナマオウ属およびフタマタマオウ属が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書に従って、多かれ少なかれ純粋な形態の酵素は、天然源、微生物種、および先に記載した植物種から分離され得、または当該酵素は、組換えで調製され得る。したがって、本明細書に提供されるのは、さらに、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを調製するための方法であり、
（ａ）操作可能に連結された構成要素として、
（ｉ）Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の核酸配列、および
（ｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つ以上の核酸配列
を含むキメラ核酸配列を提供すること、
（ｂ）当該キメラ核酸配列を宿主細胞へと導入し、当該宿主細胞を増殖させて、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを産生すること、ならびに
（ｃ）当該宿主細胞からＮ−メチルトランスフェラーゼを収集すること
を含む。
【００９３】
好ましい実施において、Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、マオウ属、チャット属、ゴマ属、アブラナ属およびミゾホオズキ属（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ）からなる群から選択される植物属に属する植物から得られることのできるまたは得られたポリペプチドである。特に好ましい実施において、Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、シナマオウ、アラビアチャノキ、ゴマ、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐｕｓ）およびエリスランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ  ｇｕｔｔａｔａ）からなる群から選択される植物種から得られることのできるまたは得られたポリペプチドである。
【００９４】
好ましい実施において、Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９によって表されるポリペプチド配列を有するポリペプチドである。
【００９５】
宿主細胞の増殖は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの産生をもたらす。当該ポリペプチドはその後、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過などを含む種々の異なるタンパク質精製技術によって、収集、分離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）および他の宿主細胞成分から分離（ｓｅｐａｒａｔｅｄ）され得る。タンパク質精製に関するさらなる一般的な案内は例えば、Ｃｕｔｌｅｒ，  Ｐ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００４，第２版において認められ得る。したがって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドの実質的に純粋な調製物が得られ得る。
【００９６】
本発明に従って、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物から化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物への酵素により触媒される化学変換を許容する反応条件下で、十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼとの接触において生じる。種々のメチルドナーが使用され得る。好ましい実施において、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、メチルドナーとして使用される。他の実施形態において、Ｌ−メチオニン、Ｌ−メチオニンエチルエステル（ＭＥＥ）、メチオニンのメチルエステル（ＭＭＥ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン（ＮＡＭ）のようなＮ誘導体化メチオニン類似体、およびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−メチオニン（ＤＭＭ）、アジリジニウム系ＳＡＭ類似体、置換Ｌ−メチル基を含むＳＡＭ類似体、例えば、末端のアルキニル基、ケト基もしくはアミノ基、またはＳ／Ｓｅ−Ｍｅｔ類似体を含むがこれらに限定されない天然または合成のメチルドナーを含む他のメチルドナーが使用される。本発明に従って使用され得るこれらおよび他のメチルドナーに対するさらなる参照は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０１４）  ５３：１５２１〜１５２６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２０１５）  １６１  （Ｐｔ  ３）：６７４〜６８２、Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  （２０１４）  ５３：３９６５〜３９６９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２００６）  ２：３１〜３２、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （２０１３）  １１：７６０６〜７６１０、およびＡｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０１４）  ４５０：１１〜１９において認めることができる。使用されるメチルドナーの量は変わり得る。一部の実施において、等モル量、またはおよそ等モル量のメチルドナーおよび化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物が提供される。一部の実施において、メチルドナーは、等モル量の化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を超過して提供される。
【００９７】
一部の実施において、当該薬剤は、互いに接触して生じ、混合されて混合物を形成する。一部の実施において、当該混合物は、緩衝剤、ｐＨ調整剤、または他の酵素を含む、酵素触媒を容易にするために水およびさらなる任意の追加薬を含む水性混合物である。当該反応は、ある範囲の異なる温度で実施され得る。好ましい実施において、当該反応は、約１８℃〜３７℃の温度で実施される。インビトロでの反応の完了の際、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物は、多かれ少なかれ純粋な形態で得られ得る。
【００９８】
インビボでの合成
本開示のある態様に従って、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物は、インビボでの反応条件下での化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物から化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物への酵素により触媒される化学変換を許容する反応条件下で、十分量のメチルドナーおよび触媒量のＮ−メチルトランスフェラーゼとの接触において生じる。このようなインビボでの反応条件下で、生細胞は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生するような様式で変化する。ある特定の実施において、生細胞は、細菌細胞および真菌細胞を含む微生物である。他の実施形態において、生細胞は、植物を含む多細胞生物である。
【００９９】
１つの実施において、生細胞は、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を産生することはできるが、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生することはできない宿主細胞に対して選択される。このような細胞には、細菌、酵母、他の真菌細胞、植物細胞、または動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。したがって、例としてのみ、宿主細胞は、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を産生ができるが、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生することができない酵母宿主細胞であり得る。
【０１００】
一部の実施において、例えば、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物に対する前駆体として機能する以下の化合物のうちの１つ以上、すなわち、（１Ｒ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）、（１Ｓ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｓ−ＰＡＣ）、（Ｓ）−カチオン、１フェニルプロパン−１，２−ジオン、ベンゾイル−ＣｏＡ、ベンズアルデヒドまたは安息香酸を産生することができるこのような宿主細胞、酵母細胞が使用され、このような細胞は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生することはできない。一部の実施において、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物に対する前駆体化合物として機能する化合物（１Ｒ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）、（１Ｓ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｓ−ＰＡＣ）、（Ｓ）−カチオン、１フェニルプロパン−１，２−ジオン、ベンゾイル−ＣｏＡ、ベンズアルデヒドまたは安息香酸は、ベンズアルデヒドを外来的に補充した細胞によって合成される。化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生するような様式でこのような宿主細胞を調節するために、本発明に従ったＮ−メチルトランスフェラーゼは、宿主細胞において異種性に導入および発現され得る。
【０１０１】
一部の実施において、宿主細胞は、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物および／またはその前駆体を産生することのできる１つ以上の酵素を含む。
【０１０２】
一部の実施において、宿主細胞は、（Ｓ）−カチノンからのノルエフェドリンの生成を結果として生じる反応を触媒することのできる還元酵素を含む。
【０１０３】
一部の実施において、当該宿主細胞は、（１Ｒ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）、（１Ｓ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｓ−ＰＡＣ）、からのノルエフェドリンの生成を結果的に生じる反応を触媒することのできるトランスアミナーゼを含む。
【０１０４】
一部の実施において、宿主細胞は、１−フェニル−プロパン−１，２−ジオンからの（Ｓ）−カチオンの生成を結果的に生じる反応を触媒することのできるトランスアミナーゼを含む。
【０１０５】
一部の実施において、宿主細胞は、ベンズアルデヒドからの（１Ｒ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）、（１Ｓ）−フェニルアセチルカルビノール（Ｓ−ＰＡＣ）の生成を結果的に生じる反応を触媒することのできるカルボリガーゼを含む。
【０１０６】
一部の実施において、宿主細胞は、ベンゾイル−ＣｏＡからの１−フェニル−プロパン−１，２−ジオンの生成を結果的に生じる反応を触媒することのできるカルボリガーゼを含む。
【０１０７】
一部の実施において、宿主細胞は、安息香酸からのベンゾイル−ＣｏＡの生成を結果的に生じる反応を触媒することのできるＣｏＡ−リガーゼを含む。
【０１０８】
一部の実施において、宿主細胞は、ベンズアルデヒドからの安息香酸の生成を結果的に生じる反応を触媒することのできるデヒドロゲナーゼを含む。
【０１０９】
他の実施形態において、生細胞は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を天然に産生するが、生細胞は、生成される化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物のレベルが、このような生細胞における上述の酵素のうちのいずれかの異種性導入なしで、細胞によって産生されるレベルに対して調節されるような様式で調節される。
【０１１０】
本明細書に提供される化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生するために、さらに、
（ａ）操作可能に連結された構成要素として、
（ｉ）Ｎ−メチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列、および
（ｉｉ）宿主細胞における発現を制御することのできる１つ以上の核酸配列
を含むキメラ核酸配列を提供すること、
（ｂ）当該キメラ核酸配列を宿主細胞へと導入して、当該宿主細胞を増殖させて、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを産生し、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生すること、ならびに
（ｃ）化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を収集すること
を含む化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を調製するための方法がさらに本明細書に提供される。
【０１１１】
一部の実施において、当該核酸配列は、上述の植物種から分離され得る。一部の実施において、当該核酸配列は、１つの配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８として本明細書において明らかにされる核酸配列から選択される。
【０１１２】
本発明に従ってＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を制御することのできる核酸配列へ連結される。したがって、本開示は、宿主細胞における発現を制御することのできるプロモーターへ連結されたＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列も提供する。本明細書において使用され得る宿主細胞における発現を制御することのできる核酸配列には、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を制御することのできる何らかの転写プロモーターが含まれる。概して、細菌細胞から得られたプロモーターは、細菌宿主が本発明に従って選択される時に使用されるが、真菌プロモーターは真菌宿主が選択される時に使用されるであろうし、植物プロモーターは、植物細胞が選択される時に使用されるなどである。宿主細胞における発現を制御するさらなる核酸エレメント可能エレメントには、転写終結因子、エンハンサーおよびこれらに類するものが含まれ、それらはすべて、本開示のキメラ核酸配列に含まれ得る。
【０１１３】
本開示に従って、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列へ連結された宿主細胞における発現を制御することのできるプロモーターを含むキメラ核酸配列は、宿主細胞における良好な発現を確実にする組換え発現ベクターへと統合することができる。したがって、本開示には、操作可能に連結された構成要素として
（ｉ）宿主細胞における発現を制御することのできる核酸配列、および
（ｉｉ）Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列
を含む組換え発現ベクターが含まれ、この中で、当該発現ベクターは、宿主細胞における発現に適している。「宿主細胞における発現に適した」という用語は、組換え発現ベクターが宿主細胞における発現を達成するのに必要とされる遺伝要素へ連結された本開示のキメラ核酸配列を含む。この点における発現ベクターに含まれ得る遺伝要素には、転写終結領域、マーカー遺伝子をコードする１つ以上の核酸配列、１つ以上の複製起点およびこれらに類するものが含まれる。好ましい実施形態において、発現ベクターはさらに、宿主細胞のゲノムにおけるベクターまたはその一部、例えば、植物宿主細胞が使用される場合、植物の核ゲノムへの統合を容易にするＴ−ＤＮＡの左右のボーダー配列の統合に必要とされる遺伝要素を含む。
【０１１４】
本開示に従って、発現ベクターはさらに、マーカー遺伝子を含有し得る。本開示に従って使用され得るマーカー遺伝子には、選択可能なおよびスクリーニング可能なマーカー遺伝子をすべて含む非形質転換細胞からの形質転換細胞の識別を可能にする遺伝子をすべて含む。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性マーカー、例えば、カナマイシンまたはアンピシリンのような耐性マーカーであり得る。目視検査を通じて形質転換体を識別するために採用され得るスクリーニング可能なマーカーには、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（米国特許第５，２６８，４６３号および第５，５９９，６７０号）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｎｉｅｄｚら，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１４：４０３）が含まれる。
【０１１５】
特に簡便に使用され得る１つの宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。大腸菌ベクターの調製は、制限消化、ライゲーション、ゲル電気泳動（ｇｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の方法のような普遍的に公知の技術を用いて達成され得る。広範な種々のクローニングベクターは、組換え発現ベクターを調製するのに必要とされる必要なステップを実施するために利用可能である。ベクターのうち、大腸菌において機能する複製系を有するのは、ｐＢＲ３２２のようなベクター、ｐＵＣシリーズのベクター、Ｍ１３ｍｐシリーズのベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどである。典型的には、これらのクローニングベクターは、形質転換された細胞の選択を可能にするマーカーを含有する。核酸配列は、これらのベクターに導入され得、当該ベクターは、コンピテント細胞を調製すること、電気穿孔法によって、または当業者に周知の他の方法を用いて大腸菌において導入され得る。大腸菌は、ルリアブロス培地のような適切な培地中で増殖し得、収集され得る。組換え発現ベクターは、細胞を収集および溶解する際に、細胞から容易に収集され得る。さらに、組換えベクターの調製および組換え生物の増殖に関する一般的な案内は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，第３版において認められ得る。
【０１１６】
本開示にさらに含まれるのは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の核酸配列を操作可能に連結された構成要素として転写の５’から３’への方向において含むキメラ核酸配列を含む。上述のように、宿主細胞は、好ましくは、化学式（Ｉ）を有するアルカロイド化合物を産生することはできるが、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物を産生することはできない、しかし本開示のキメラ核酸配列の導入のための宿主細胞である。
【０１１７】
上述のように、他の実施形態において、宿主細胞は、化学式（ＩＩ）を有するアルカロイドを天然に産生するが、宿主細胞は、このような宿主細胞における上述の酵素のうちのいずれかの異種性導入なしで、細胞によって産生されるこのようなアルカロイドのレベルに対して、細胞において産生される化学式（ＩＩ）を有するアルカロイドのレベルが調節されるような様式で調節される。このような調節はＮ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性の調節を含むが、これらに限定されない様々な修飾技術によって、例えばアンチセンス法のような遺伝子サイレンシング法によってＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする天然の核酸配列を調節することによって、または例えば部位特異的変異誘発、標的指向化変異誘発、無作為変異誘発、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング、有機溶媒の添加、遺伝子シャッフリングもしくはこれらの組み合わせ、および当業者に公知の他の技術を用いて酵素の活性の調節を結果的に生じる修飾技術の使用によって達成され得、各方法は、宿主細胞における化学式（ＩＩ）を有するアルカロイド化合物のレベルが高まるような様式で、Ｎ−メチルトランスフェラーゼの酵素の活性を変化させるよう設計されている。
【０１１８】
実施例
以後提供されるのは、本開示の方法を実施するための具体的な実施例および本開示の組成物を表す実施である。実施例は、説明目的のみのために提供され、いかなる方法においても本開示の範囲を制限するよう企図するものではない。
【０１１９】
実施例１−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびシナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）により産生されるＮ−メチルトランスフェラーゼのための基質としてのエフェドリン、ノルエフェドリン、プソイドエフェドリン、カチノン、シネフリンおよびオクトパミン
本実施例は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼのための基質としてのエフェドリンおよび５つの他の関連化合物の使用を説明する。Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、マオウ属に属する植物、特にシナマオウから得られ、細菌宿主細胞、特に大腸菌において発現する。本実施例はさらに、基質としてノルエフェドリンを使用してシナマオウから得られたＮ−メチルトランスフェラーゼの使用を説明する。
【０１２０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコンストラクト組立ておよびタンパク質発現
Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）酵素配列（すなわち、配列番号１および配列番号２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を下流精製目的のためのベクターによりコードされたＨｉｓタグとともにフレーム内で大腸菌発現ベクターｐＥＴ４７ｂ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へとサブクローニングした。コンストラクトを大腸菌株ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＲｏｓｅｔｔａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと形質転換した。組換えＨｉｓタグ付きタンパク質産生を標準的な手順（Ｆａｒｒｏｗら．２０１３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：２８９７７）および製造元の説明書により実施した。簡潔には、ｐＥＴ４７ｂを保有する大腸菌の培養物を軌道振盪機（２００ｒｐｍ）上で、ゲンタマイシン、ストレプトマイシンおよびカナマイシン（Ａｒｃｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）またはクロラムフェニコールおよびカナマイシン（Ｒｏｓｅｔｔａ）を含有する１ＬのＬＢ培地中での対数期まで増殖させた。組換えＨｉｓタグ付きタンパク質産生は、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって開始した。ＮＭＴを産生するために、培養物を１５℃で２４時間増殖させた。
【０１２１】
酵素の精製および活性アッセイ
精製のために、誘導／インキュベーション後に得られた細菌ペレットを、１０ｍＬの再懸濁緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８．５、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５ｍＭジチオスレイトール）中で再懸濁し、フレンチ圧力セル（１，０００ｐｓｉ）を用いて４℃で溶解した。遠心分離（１０，０００ｇ）して不溶性のデブリを除去した後、上清を氷上で、軌道振盪機（６０ｒｐｍ）上で緩衝液により平衡化したＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともに６０分間インキュベートした。タンパク質を負荷した樹脂を２．５ｍＭイミダゾールを含有する１０ｍＬの冷再懸濁緩衝液で洗浄し、タンパク質を再懸濁緩衝液中の増大する濃度（１０〜２００ｍＭ）のイミダゾールを用いて段階的に溶出した。４０ｍＭイミダゾール溶出からの総タンパク質をＰＤ−１０カラム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびイミダゾール非含有再懸濁緩衝液を用いて脱塩した。組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、収量および純度を評価し、イムノブロット分析をα−Ｈｉｓ一次抗体およびヤギ抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて実施した。総タンパク質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。算出されたタンパク質濃度をゲルデンシトメトリーで調整した。標準的な酵素アッセイは、およそ１００μｇ／ｍＬの精製されたＮＭＴタンパク質を含んでおり、これは、触媒性能の線形範囲において存在するよう測定した。具体的には、標準的な酵素反応は、合計１００μｌの反応容積中の５０ｍＭトリスｐＨ８．５、１０（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭアルカロイド基質、１ｍＭ  ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）および１００μｇ／ｍＬの精製されたＮＭＴタンパク質からなった。反応物を３７℃で４時間インキュベートし、１）反応混合物のｐＨ１０〜１１への塩基性化、および２）１ｍＬ酢酸エチルの即時添加を介して停止させた。クエンチした反応物をボルテックスし、遠心分離して（１０，０００ｒｐｍ）、有機相および水相を分離し、有機相を注意深く抜去し、新たなチューブに入れ、真空乾固するよう減少させ、５００μＬの溶媒Ａ（１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．５、５％（ｖ／ｖ）メタノール）中で再懸濁した。懸濁液を遠心分離した（１０，０００ｒｐｍ）後、ＬＣ−ＭＳによって分析して、不溶性物質を除去した。
【０１２２】
液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析
１０μＬの試料を、１２００Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＣＬシステムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ６４１０Ｂ三重四極子質量分析装置を用いたＬＣ−ＭＳ分析のために注入した。鏡像異性体対（例えば、プソイドエフェドリン／エフェドリン）を分離するＰｒｏｄｉｇｙフェニル−３カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を採用するすでに説明されたＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．８７９：７２７，２０１１］を用いて試料を分画した。簡潔には、ＨＰＬＣ勾配は、０．２ｍｌ／分の流量で１分間、９５％溶媒Ａ（溶媒Ｂ＝１００％メタノール）として開始し、１９分間にわたって３０％溶媒Ａ／７０％溶媒Ｂまで低下させた後、０．５分間にわたって１０％溶媒Ａ／９０％溶媒Ａまで漸次移動させた後、１００％Ａまで即時回復させ、５分間平衡化した。保持時間（分）は次の通りであった。すなわち、ノルエフェドリン＝４．３、エフェドリン＝６．９、プソイドエフェドリン＝７．９、カチノン＝７．１、メチルエフェドリン＝１０．６、メチルプソイドエフェドリン＝１１．９、メトカチノン＝１０．１であった。ＥＳＩおよびＭＳの条件は、説明されたのと本質的に同じであった［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．８７９：７２７，２０１１］。簡潔には、ＭＳを、すべての遷移について４０００Ｖのプローブ電圧および３Ｖの抽出装置電位、２００ｍｓのドウェルタイムで陽性イオンモードでＭＳを作動させ、ＣＩＤスペクトルを生成物の識別のために獲得した。窒素をＣＩＤ分析に使用した。酵素生成物のＣＩＤスペクトルおよび保持時間を、確実な標準物質のそれらと比較した。追加の比較は、公開された値［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．８７９：７２７，２０１１；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｓｓｂａｎｋ．ｊｐ］を用いて行った。酵素活性を、ＴＩＣ（総イオン計数）スペクトルの生成物ピークの下の総面積を積分することによって測定した。煮沸した酵素からなる対照試料は、無視できる量の生成物を生じた。ＭＳデータ分析を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて実施し、その後の酵素活性の算出を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の支援で手動で実施した。
【０１２３】
シナマオウ植物組織の分析
比較目的のために、２．０グラムのシナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）植物組織をＫｒｉｚｅｖｓｋｉら［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１：８９５，２０１０］によりＮＭＴ活性について分析した。簡潔には、若芽の先端（内部先端から５ｃｍ）を二年生シナマオウ植物から収集し、液体窒素下で乳鉢および乳棒において微粉に挽いた。この粉末を冷抽出緩衝液［５０ｍＭトリスｐＨ８．５、１０（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５ｍＭジチオスレイトール］へ添加し、ボルテックスした。遠心分離（１０，０００ｇ）を実施して不溶性物質を除去し、製造元の説明書によりＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター（１０ｋＤカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて上清を１ｍＬへ濃縮した。数回の洗浄を３つの新鮮カラムを用いて実施して、植物由来の抽出混合物中に存在する痕跡量のアルカロイドをすべて除去した後、ＮＭＴアッセイをすることを確実にした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中で産生された酵素について先に説明した通りアッセイを実施した。
【０１２４】
結果
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の天然シナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）ＮＭＴ（配列番号１）の発現は、最適下の結果を生じた。改善された発現は、コドンを最適化した合成遺伝子（配列番号２）を使用する時に観察された。ウェスタンブロット法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この合成でコードされたＮＭＴの発現が、Ｒｏｓｅｔｔａ細胞におけるタンパク質産生と比較してＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ大腸菌を用いると優れていることを明らかにしたので、実験はすべて、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓの細胞株およびプロトコルを使用して実施した。酵素アッセイを種々の時点および酵素量を使用して実施し、活性の線形範囲を測定した。予備的結果は、酵素活性が４時間にわたって線形で持続することを示したので、４時間を標準的なアッセイのための時間フレームとして選択した。シナマオウ由来のタンパク質を用いて実施した直列アッセイは、かなりの速度の生成物代謝回転を明らかにした。このようなものとして、４時間アッセイは、植物由来の酵素についても実施した。ノルエフェドリンを植物由来の抽出物のための基質として使用し、標準的なアッセイ条件下での大腸菌産生ＮＭＴに匹敵するレベルでエフェドリンを産生した。植物由来ＮＭＴアッセイを陽性対照として実施し、標準的なアッセイ条件が活性に適切であることを確認した。精製された大腸菌由来ＮＭＴの場合に次の基質を検討した。すなわち、エフェドリン、ノルエフェドリン、プソイドエフェドリン、カチノン、シネフリンおよびオクトパミンである。結果は図３に示すとおりである。酵素をアッセイ開始の２０分前に煮沸したことを除く同一条件を用いた対照試料は、検出可能な生成物を生じなかったことは留意される。本結果は、ＮＭＴがＮ−メチル化のための広範囲の分子を受け取っていることを示している。したがって、ＮＭＴは、アンフェタミン類似体タイプの分子構造を有する（例えば、アルファ炭素に対してメチル基が付着した）第一級アミン（ノルエフェドリン）および第二級アミン（エフェドリン、プソイドエフェドリン）を受け取っている。基質として作用する別のアンフェタミンタイプのアルカロイドは、ＮＭＴがメトカチノンへ変換するカチノンを含んでいた。これらの結果は、ＮＭＴがβ−ヒドロキシルの代わりにβ−ケト基を有するアルカロイドを代謝回転することができることを示した。シネフリンおよびオクトパミンはアンフェタミンタイプの構造を有していないが、基質として受け取られた。
【０１２５】
基質としての有効性の点でアルカロイド間の定量的な比較を可能にするために、標準曲線を３つのアルカロイドおよびそれらのＮ−メチル化生成物について準備した。このことは、ｎｇのアルカロイドの点で絶対的な生成物の定量化を可能にした。図４に示す結果は、ノルエフェドリンが好ましいＮＭＴ基質であり、わずかな差でプソイドエフェドリンが続くことを明らかにした。エフェドリンのＮ−メチルエフェドリンへの変換効率は、やや低かった。酵素をアッセイ開始２０分前に煮沸したこと以外は同一条件を使用した対照試料は、検出可能な生成物を生じなかった。
【図１Ａ】
2018518189.tif 000013
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月21日(2018.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018518189000001.app
【国際調査報告】
2018518189.tif 000019
2018518189.tif 000020
2018518189.tif 000021