(57)【要約】  本開示は、とりわけ、トランスジェニック動物、ならびにそれを用いて共通の軽鎖を有する抗体を作製する方法を提供する。ある特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、共通の軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを含んでもよく、共通の軽鎖導入遺伝子は、非免疫グロブリン軽鎖プロモーター及び共通の軽鎖コード配列を有する。ある特定の実施形態において、共通の軽鎖は、恒常的に発現される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通の軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを含むトランスジェニック動物であって、前記共通の軽鎖導入遺伝子は、非免疫グロブリン軽鎖プロモーター及び共通の軽鎖コード配列を含む、トランスジェニック動物。
【請求項２】
前記共通の軽鎖は、恒常的に発現される、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記共通の軽鎖導入遺伝子は、
ｉ．前記非免疫グロブリン軽鎖プロモーター、
ｉｉ．共通の軽鎖コード配列、及び
ｉｉｉ．介在配列がリコンビナーゼによって切断されない限り、共通の軽鎖が発現されるのを阻止する、前記介在配列
を含む、リコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子である、請求項１または２のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記リコンビナーゼが発現される場合、前記リコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子の前記介在配列が切断される、請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記リコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子の前記介在配列は、組換え部位によって隣接される、請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記介在配列は、選択可能なマーカーを含む、請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記選択可能なマーカーカセットは、下流の転写を阻止するポリアデニル化部位を含有する、請求項６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
リコンビナーゼ導入遺伝子をさらに含み、前記リコンビナーゼ導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖プロモーターに作動可能に連結されたリコンビナーゼコード配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記免疫グロブリン軽鎖プロモーターは、内在性免疫グロブリン軽鎖プロモーターである、請求項８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記リコンビナーゼ導入遺伝子は、自己不活性化リコンビナーゼ導入遺伝子である、請求項８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記自己不活性化リコンビナーゼ導入遺伝子は、組換え部位によって隣接されたリコンビナーゼコード配列を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅであり、前記組換え部位は、ｌｏｘ部位である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記リコンビナーゼ導入遺伝子と前記共通の軽鎖導入遺伝子とは、遺伝的に関連している、請求項８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記リコンビナーゼ導入遺伝子及び前記共通の軽鎖導入遺伝子の組換えは、多くとも２．５％の頻度で起こる、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記トランスジェニック動物は、前記遺伝的に関連した導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記トランスジェニック動物は、前記遺伝的に関連した導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記共通の軽鎖コード配列は、予め再構成された可変領域を含む共通の免疫グロブリン軽鎖をコードする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記共通の軽鎖コード配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域に作動可能に連結されたヒト可変領域をコードする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
前記トランスジェニック動物は、トランスジェニックトリである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記トランスジェニックトリは、トランスジェニックニワトリである、請求項１９に記載のトランスジェニックトリ。
【請求項２１】
前記共通の軽鎖導入遺伝子が、前記動物の前記ゲノムの、そこに存在する任意の偽遺伝子を含む、内在性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に置き換わる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
ハイブリッド動物を作製するための方法であって、
共通の軽鎖を産生するトランスジェニック動物を、合成重鎖ノックインを含むゲノムを含む第２のトランスジェニック動物と交配すること、及び
前記交配の後代を収集すること、を含む、方法。
【請求項２３】
前記合成重鎖ノックインは、ヒト重鎖ノックインである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
共通の軽鎖を有する抗体を産生するための方法であって、前記抗体は抗原に特異的であり、前記方法は、
ａ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物を前記抗原で免疫することと、
ｂ）前記免疫したトランスジェニック動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することと、
ｃ）前記ハイブリドーマをスクリーニングして抗原特異性ハイブリドーマを同定することと、
ｄ）前記抗原特異性ハイブリドーマから抗原特異性抗体を単離することと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記合成重鎖は、合成ヒト重鎖である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記トランスジェニック動物は、トランスジェニックニワトリである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
古典的抗体は、２つの同一の重鎖からなり、それらの各々が共通の軽鎖とヘテロ二量体を形成する。対照的に、二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖を有することができ、各対が異なる抗原に結合する。２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖のランダム会合により、多数の構成鎖の組み合わせの混合物が産生される。典型的には、ごくわずかな組み合わせのみが機能性抗体を産生し、それらの各々が標的抗原を認識する。２つの抗原に結合する能力は、第ＶＩＩＩ因子を模倣すること（Ｓａｍｐｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３，８（２）：ｅ５７４７９）、Ｔ細胞に腫瘍細胞を標的化させること（Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，１７（３）：３８５−３９２）、及び血液脳関門を横切る治療薬に付随すること（Ｂｉｅｎ−Ｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１４，２１１（２）：２３３−２４４）によって、凝固カスケードの構成成分を共局在化するために使用されてきた。
【０００２】
二重特異性抗体における潜在的な会合の数を制限することにより一貫性のある生成物を製造するための多くの手法が、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５，６７（２  Ｐｔ  Ａ）：９５−１０６）に記載されている。ある手法では、異なる軽鎖と二量体を形成する共通の重鎖が作製された（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５，６：６１１３）。別の手法では、異なる重鎖と二量体を形成する共通の軽鎖が作製された（米国特許出願第２０１４／０３１４７５５号及び同第２０１１／０１９５４５４号）。
【０００３】
抗体は、抗原上のエピトープ及び各抗原内のエピトープを認識するが、エピトープの数は有限である。実際には、明らかにすることができるエピトープの数は、抗原の源と抗原が導入される動物との間の進化距離によって制限される。典型的には、目的が治療薬の創出である場合、抗原の源はヒトであり、典型的には、抗原が導入される動物はマウスである。進化距離は、ヒトとマウスとの関係（マウスの系統とヒトの系統は、約９５００万年前に分岐した）よりも進化的に互いからさらに離れた動物を使用することによって増加させることができる。例えば、約３億年前に、最後にヒトと共通の祖先を共有していたニワトリを免疫することによって、進化距離を増加させることができる。免疫したニワトリに由来する抗体の約３０％が、マウスハイブリドーマのパネルのメンバーによって明らかにされていないエピトープを対象とすることが示されている。
【０００４】
ニワトリ抗体は、固有のエピトープを認識するため有用であるが、治療薬としての使用を考慮した場合、それらは外来性のタンパク質である。たとえニワトリ抗体がヒト定常（Ｃ）領域に移植されたとしても、患者は抗ニワトリ可変（Ｖ）領域抗体を産生し、結果的に治療効果が失われる。この問題は、内在性ニワトリ免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖Ｖ遺伝子をヒト均等物で置き換えることによって解決することができ、結果として得られるトランスジェニックニワトリは、ヒト抗体を産生する。
【０００５】
本開示のある特定の態様は、予め構成された可変領域と共通の軽鎖を産生するトランスジェニック動物、ならびにそれを用いて二重特異性抗体を産生するための方法に関する。いくつかの態様において、トランスジェニック動物は、トランスジェニックトリ、例えば、ニワトリである。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、とりわけ、共通の軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを含むトランスジェニック動物であって、共通の軽鎖導入遺伝子は、非免疫グロブリン軽鎖プロモーター及び共通の軽鎖コード配列を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、共通の軽鎖は、恒常的に発現される。
【０００７】
ある特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、ａ）内在性免疫グロブリン軽鎖プロモーターに作動可能に連結されたリコンビナーゼコード配列を含む、リコンビナーゼ導入遺伝子と、ｂ）ｉ．非免疫グロブリン軽鎖プロモーター、ｉｉ．共通の軽鎖コード配列、及びｉｉｉ．介在配列がリコンビナーゼによって切断されない限り、共通の軽鎖が発現されるのを阻止する介在配列を含む、リコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子と、を含むゲノムを含む。
【０００８】
二重特異性抗体を産生するためには、軽鎖が抗体分子の両方の分岐部に共通していると有利であり、結合特異性は重鎖によってのみ決定される。軽鎖は、全抗体分子のアセンブリに適した構造を提供するが、抗原結合の受動的パートナーである。したがって、二重特異性の発現は、２つの重鎖及び１つの共通の軽鎖を必要とするのみであるため、単純化される。
【０００９】
通常、軽鎖遺伝子は、多様な配列のレパートリーを産生させるために、Ｂ細胞発生中の変異プロセス、ならびに抗原結合を正確にしかつ改善するために、免疫応答中のさらなる多様化及び選択を経る。共通の軽鎖の手法は、軽鎖がＢ細胞中で変化しないままであるように、あらゆる突然変異を回避することを目的としている。多様性のドライバーの１つは、遺伝子再構成のプロセスであり、Ｖ−Ｊ接合部に変化をもたらす不正確なプロセスにおいて、種々のＶ領域のうちの１つが種々のＪ領域のうちの１つと組み合わさり、重要なＣＤＲ３ループを形成する。共通の軽鎖の手法は、このステップを避け、全Ｂ細胞中の同じ配列を有する予め再構成された可変領域を発現させる。ニワトリにおける多様性の２番目に大きな源は、機能性Ｖに配列を供与する上流の偽遺伝子による遺伝子変換によるものである。上流の偽遺伝子がなければ、遺伝子変換は起こり得ない。
【００１０】
Ｂ細胞における抗体多様化の機構は、主として免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子に限定されるため、突然変異を起こさない共通の軽鎖を有するトランスジェニック動物、例えばニワトリを作製するための１つの手法は、非免疫グロブリン制御エレメントの転写制御下でゲノム内の別の遺伝子座に軽鎖を挿入することである（図１）。Ｂ細胞特異的発現は、Ｂ細胞のみでリコンビナーゼ媒介性組換えが起きたときに活性化される条件付き導入遺伝子を用いて達成される。Ｂ細胞のみでリコンビナーゼ媒介性組換えを達成するために、軽鎖遺伝子座にリコンビナーゼ遺伝子を挿入することによってリコンビナーゼの発現をＢ細胞特異性にする。初期Ｂ細胞発生中に軽鎖調節エレメントによってリコンビナーゼの発現を誘導すると、リコンビナーゼの活性は、共通の軽鎖の発現をブロックする終止配列をループアウトさせる。リコンビナーゼ遺伝子は軽鎖遺伝子座に位置するため、潜在的にその活性が損なわれる突然変異を受ける可能性があるが、活性リコンビナーゼが、ループアウトを行うように、著しい不活性化突然変異の前に、十分早く産生される。一旦ループアウトが生じると、リコンビナーゼはもはや必要ではない。実際、継続的な高レベルのリコンビナーゼ発現は、Ｂ細胞の機能に潜在的な悪影響を及ぼし得るため、好ましくない。したがって、自己不活性化リコンビナーゼ導入遺伝子、例えば、リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）遺伝子に隣接する組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）を含有するものが好ましい。リコンビナーゼ遺伝子は、安定であり、生殖系列に存在するが、軽鎖調節エレメントが生殖系列におけるリコンビナーゼの発現を駆動しないため、このことは、生殖系列の伝達、及び導入遺伝子を担持する完全トランスジェニックニワトリの確立にとって重大な意味を持つ。Ｂ細胞系列において、リコンビナーゼ活性が誘導され、共通の軽鎖の活性化と同時にリコンビナーゼ遺伝子の欠失を引き起こす。
【００１１】
潜在的により単純な手法は、予め再構成されたＶ領域を軽鎖遺伝子座に挿入し、上流の全ての偽遺伝子を除去し、遺伝子変換の可能性を排除することであるかもしれない。しかしながら、この手法は、軽鎖の著しい突然変異をもたらす可能性があり、共通の軽鎖ストラテジーの目的にそぐわない。遺伝子変換は、野生型細胞において固有の免疫前多様性の大部分を提供するが、偽遺伝子の非存在下では体細胞突然変異に変化する。また、マウスにおいて、予め再構成された可変領域が免疫グロブリン遺伝子座に挿入された場合に体細胞突然変異が起こることも示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】共通の軽鎖のＢ細胞特異的発現を達成するためのストラテジーを示す概略図を示す。このストラテジーでは、Ｂ細胞特異的なＣｒｅの発現がＣｒｅ及びＳＴＯＰカセットのループアウトをもたらし、ｈｕＶＫの発現を引き起こす。ハイグロ−ｐＡが除去される前にＣｒｅの喪失を引き起こすリーキーなＣｒｅ発現が懸念される場合、Ｃｒｅ自体をｆｌｏｘ化せずに行われてもよい。Ｂ細胞における継続的なＣｒｅの発現により、ハイグロ−ｐＡのループアウトが完了したことを確認する。
【図２】条件付きヒトＶＫに１５番染色体上の遺伝子間領域を標的化させることを示す概略図を示す。
【図３】本開示のいくつかの繁殖ストラテジーを示す。
【図４】自己不活性化Ｃｒｅをニワトリ軽鎖遺伝子座に挿入するためのストラテジーを示す概略図を示す。
【図５】予め再構成されたヒトＶＫの挿入及び偽遺伝子の除去を示す概略図を示す。
【図６】共通の軽鎖導入遺伝子の挿入、及び共通の軽鎖のＣｒｅ誘導性発現のためのストラテジーの概略図を示す。
【図７】ニワトリ軽鎖遺伝子座を取り囲む遺伝的及び物理的マップを示す。１Ｍｂは、約５ｃＭである（５％組換え頻度）。
【００１３】
定義
「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、及び「アッセイする」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書において同義に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的決定及び／または定性的決定の両方を含む。評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、相対的または絶対的であり得る。「〜の存在を決定すること」は、存在する何かの量を決定すること、及びそれが存在するかまたは存在しないかを決定することを含む。
【００１４】
「遺伝子」という用語は、プロモーター領域、コード配列、及び３’ＵＴＲを含む核酸配列を指す。
【００１５】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義に使用される。
【００１６】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、または二本鎖、及びそれらの化学修飾を包含する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において同義に使用される。
【００１７】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸断片に対する核酸配列の関連性を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。同様に、イントロンがコード配列に作動可能に連結されている場合、そのイントロンはｍＲＮＡからスプライシングされ、コード配列の発現を提供する。「非連結」は、関連する遺伝要素が互いに密接に関連しておらず、一方の機能が他方に影響を及ぼさないことを意味する。
【００１８】
「ホモ接合性」という用語は、相同染色体上の同じ遺伝子座に同一の対立遺伝子が存在することを示す。対照的に、「ヘテロ接合性」は、相同染色体上の同じ遺伝子座に異なる対立遺伝子が存在することを示す。トランスジェニック動物は、導入遺伝子に対してホモ接合性であり得るか、または相同染色体上の同じ遺伝子座にカウンターパートが存在しない場合、導入遺伝子に対してヘミ接合性であり得る。
【００１９】
遺伝子に関して、「内在性」という用語は、遺伝子が細胞に生来存在すること、すなわち、遺伝子が非改変細胞のゲノムの特定の遺伝子座に存在することを示す。内在性遺伝子は（自然に見出されるような）野生型細胞のその遺伝子座に存在する野生型遺伝子であり得る。内在性遺伝子は、野生型遺伝子と同じゲノムの遺伝子座に存在する場合、改変された内在性遺伝子であり得る。そのような改変された内在性遺伝子の例は、外来核酸が挿入された遺伝子である。内在性遺伝子は核ゲノム、ミトコンドリアゲノム等に存在し得る。
【００２０】
「構築物」という用語は、特異的なヌクレオチド配列（複数可）の発現の目的で作製された、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸、通常、組換えＤＮＡを指す。構築物は、ベクターまたはゲノムに存在し得る。
【００２１】
「組換え」という用語は、宿主細胞中には自然に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には存在しない様式で一緒に連結された２つ以上の自然に存在する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受容する場合、その核酸は細胞に対して「外来性」である。
【００２２】
「選択可能なマーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有する宿主の選択を容易にする、宿主中で発現することができるタンパク質を指す。選択可能なマーカーの例として、限定されないが、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）への耐性を付与するタンパク質、宿主細胞に栄養面での利点等の代謝上の利点を付与するタンパク質、及び細胞に機能性または表現型の利点（例えば細胞分割）を付与するタンパク質が挙げられる。
【００２３】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。該プロセスは、転写及び翻訳の両方を含む。
【００２４】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入する」という用語は、「トランスフェクション」及び「形質転換」、ならびに細胞に核酸を導入する他の全ての方法を含み、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得るか、または自律レプリコンに変換されるか、または一過性に発現され得る。
【００２５】
「コード配列」という用語は、適切な調節エレメントの制御下に置かれた場合に、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで、一旦転写及び翻訳されるとタンパク質を産生する核酸配列を指す。本明細書で用いられるコード配列は、連続したＯＲＦを有し得るか、またはイントロンもしくは非コード配列の存在によって中断されたＯＲＦを有し得る。この実施形態において、非コード配列は、ｍＲＮＡからスプライシングされ、成熟ｍＲＮＡを産生する。
【００２６】
１つの遺伝子座を別の遺伝子座で置き換えることに関する文脈において、「置き換える」という用語は、単一段階プロトコルまたは多段階プロトコルを指す。
【００２７】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
【００２８】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
【００２９】
「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００、または少なくとも５０，０００、またはそれ以上を指す。ある特定の場合において、複数は、少なくとも１０〜５０を含む。他の実施形態において、複数は、少なくとも５０〜１，０００であり得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、細胞に関連して、「単離された」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される細胞を指す。動物が単離された細胞を含有すると記載される場合、それらの単離された細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、次いで動物に移植される。
【００３１】
「後代」または「子孫」という用語は、特定の動物または細胞に由来する及びその子孫である全ての未来の世代を指す。したがって、任意の継続世代の後代動物がこの定義に含まれ、後代のＦ１、Ｆ２、Ｆ３世代等がこの定義に含まれる。
【００３２】
「トランスジェニック動物」という表現は、外来核酸（すなわち、動物に生来存在しない組換え核酸）を含有する細胞を含む動物を指す。外来核酸は、動物の全ての細胞、または動物の全てではないが一部の細胞に存在し得る。外来核酸分子は、「導入遺伝子」と称され、１つまたは多くの遺伝子、ｃＤＮＡ等を含有し得る。受精卵母細胞または初期胚由来細胞に導入遺伝子を挿入することにより、結果として得られるトランスジェニック動物は、完全にトランスジェニックであり得、外来核酸をその生殖系列に安定に伝達することができる。代替として、部分的にトランスジェニックな動物を作製するために、外来核酸を含有する組換え細胞または組織を動物に移入することによって、例えば、移植することによって、外来核酸が導入されてもよい。代替として、トランスジェニック動物は、遺伝子改変された体細胞からの核移植によって、または胚性幹細胞もしくは始原生殖細胞等の遺伝子改変された多機能性細胞の移植によって作製されてもよい。キメラ動物は、生殖系列に別の動物によって供与された細胞を有してもよく、その場合、その動物の後代は、供与された細胞中の染色体に対してヘテロ接合性であり得る。供与された細胞が外来核酸（すなわち、細胞に対して内在性ではない核酸）を含有する場合、キメラ動物の後代は「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸（すなわち、動物に生来存在しない組換え核酸）を含有する細胞で構成される動物である。外来核酸分子は、本明細書において「導入遺伝子」と称されてもよい。
【００３３】
「ハイブリッド動物」、「トランスジェニックハイブリッド動物」等の表現は、ある特定の品質を有する第１の動物を、ある特定の品質を有する第２の動物と交配させることから得られた動物を意味するために本明細書で同義に使用される。例えば、本開示のハイブリッド動物は、共通の軽鎖を産生する第１のトランスジェニック動物を、合成重鎖を産生する第２のトランスジェニック動物と交配させることから得られたトランスジェニック後代を指すことができる。ハイブリッド動物は、免疫して、抗原特異性抗体の産生の源として使用することができる。
【００３４】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義で使用される。これらの用語は当業者に十分に理解されており、抗原に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。抗体の１つの形態は、抗体の基本的な構造単位を構成する。この形態は、四量体であり、各対が１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する抗体鎖の２つの同一な対からなる。各対において、軽鎖及び重鎖の可変領域は、ともに抗原への結合に関与し、定常領域は、抗体のエフェクター機能に関与する。
【００３５】
認識された免疫グロブリンポリペプチドは、κ及びλ軽鎖、ならびにα、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、及びμ重鎖、または他の種の均等物を含む。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、約１１０アミノ酸の可変領域をＮＨ２末端に含み、κまたはλ定常領域をＣＯＯＨ末端に含む。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）も同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）と、前述の重鎖定常領域のうちの１つ、例えば、γ（約３３０アミノ酸）とを含む。
【００３６】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びＦｄ断片を含む、抗原に対する特異的結合性を保持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体及び非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）等の他の部分とさらにコンジュゲートさせてもよい。抗体はまた、限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合させてもよい。また、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及びまたは抗原に対する特異的結合を保持する他の抗体断片、ならびにモノクローナル抗体も、この用語に包含される。
【００３７】
抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７，１７（１）：１０５−１１１）を含む様々な他の形態で、また一本鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８，８５（１６）：５８７９−５８８３及びＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８，２４２（４８７７）：４２３−４２６、これらは参照により本明細書に組み込まれる）として存在し得る。（一般的に、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ  ｅｄ．１９８４、及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８６，３２３（６０８３）：１５−１６を参照）。
【００３８】
キメラ抗体は、その軽鎖及び重鎖の遺伝子が、典型的には遺伝子操作によって、異なる種に属する抗体の可変領域及び定常領域の遺伝子から構築された抗体である。例えば、ニワトリまたはウサギモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変部が、γ１及びγ３等のヒト定常部に結合され得る。治療用キメラ抗体の一例として、ニワトリまたはウサギ抗体由来の可変ドメインまたは抗原結合ドメインと、ヒト抗体由来の定常ドメインまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＣＲＬ９６８８の細胞によって作製される抗Ｔａｃキメラ抗体）が挙げられるが、他の哺乳動物種が使用されてもよい。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、対応して配置されたヒト抗体由来のアミノ酸で置換された、（例えば、フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲ内に）１つ以上のアミノ酸を含有する非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化版と比較して、ヒト宿主において低い免疫応答をもたらすことが予想される。
【００４０】
本発明の方法によって設計及び産生されるヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存アミノ酸置換を有し得ることを理解されたい。保存置換とは、以下の群からのもの等の組み合わせを意図する：ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒ。同じ群に存在しないアミノ酸は、「実質的に異なる」アミノ酸である。
【００４１】
「偽遺伝子」という用語は、開始コドン及び／または終止コドンを含有してもまたは含有しなくてもよいオープンリーディングフレームを含有する非転写核酸領域を説明するために使用される。アミノ酸配列を作製するためにオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列をコンピュータで翻訳できるという意味で、アミノ酸配列は、偽遺伝子により「コード」され得る。重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の文脈において、偽遺伝子は、プロモーター領域、組換えシグナル配列、またはリーダー配列を含有しない。
【００４２】
「上流の」及び「下流の」という用語は、転写の方向に関連して使用される。
【００４３】
「特異的結合」という用語は、異なる分析物の均一な混合物中に存在する特定の分析物に選択的に結合する抗体の能力を指す。ある特定の実施形態において、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい分析物と望ましくない分析物とを識別し、いくつかの実施形態では約１０〜１００倍またはそれ以上（例えば、約１０００倍または１０，０００倍超）である。
【００４４】
ある特定の実施形態において、抗体及び分析物が抗体／分析物複合体中で特異的に結合した場合のそれらの間の親和性は、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満、またはそれを下回るＫＤ（解離定数）によって特徴付けられる。
【００４５】
重抗体鎖または軽抗体鎖の「可変領域」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３、ならびにフレームワーク領域を含有する鎖のＮ末端成熟ドメインである。抗体の重鎖及び軽鎖の両方が、可変ドメインを含有する。全てのドメイン、ＣＤＲ、及び残基の数は、配列アラインメント及び構造上の知識に基づいて割り当てられる。フレームワーク及びＣＤＲ残基の同定及び番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ（Ｃｈｏｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２７８（２）：４５７−４７９）によって記載される通りである。
【００４６】
ＶＨは、抗体重鎖の可変ドメインである。ＶＬは、抗体軽鎖の可変ドメインである。
【００４７】
「遺伝子」及び「遺伝子座」という用語は、本明細書において同義で使用される。いずれの用語も、遺伝子が活発に転写されることまたは無傷であることを意味するものではない。どちらの用語も、不活性化された遺伝子を包含する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「キメラ」ニワトリは、少なくとも２つの源からのかなりの数の遺伝的に異なる細胞を含有するニワトリである。キメラ動物は、ある動物由来の細胞を別の動物の胚に移植することによって、または培養細胞（例えば、改変されたゲノムを有する）を胚に移植することによって作製され得る。移植された細胞は、宿主胚に取り込まれる前に培養物から採取されてもよい。胚は、動物に発達し、結果として得られた動物は、宿主からの細胞だけではなく、移植された細胞も含有し得る。供与された細胞が外来核酸（すなわち、細胞に対して内在性ではない核酸）を含有する場合、キメラ動物の後代は「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸（すなわち、動物に生来存在しない組換え核酸）を含有する細胞で構成される動物である。外来核酸分子は、本明細書において「導入遺伝子」と称されてもよい。
【００４９】
「不活性化」という用語は、遺伝子によってコードされるタンパク質が発現されないという意味で、発現されない遺伝子を示すことを意図する。遺伝子は、遺伝子のコード配列の一部及び／または調節配列を除去することによって不活性化することができる。妨害された遺伝子、例えば、「ノックアウト」は、不活性化遺伝子の一種である。以前は、発現された内在性配列（後に同じく発現されたヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられた）を含有していた遺伝子座は、不活性化内在性遺伝子を含有する。このように、発現されたヒト免疫グロブリン配列を含有する遺伝子座は、内在性免疫グロブリン遺伝子がヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられた場合、不活性化内在性免疫グロブリン遺伝子を有することができる。多くの場合、これは、（例えば、配列の少なくとも一部の欠失により）内在性配列をノックアウトし、次いで、以前は内在性配列によって占有されていた位置にヒト免疫グロブリン配列を挿入することによって行われ得る。
【００５０】
「組換え」という用語は、宿主細胞中には自然に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には存在しない様式で一緒に連結された２つ以上の自然に存在する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受容する場合、その核酸は細胞に対して「外来性」である。
【００５１】
「Ｃｒｅ」という用語は、Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８３，３２（４）：１３０１−１３１１によって開示されるように、ｌｏｘ部位（後述の定義を参照）でＤＮＡの部位特異的組換えを生じさせるリコンビナーゼを指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」及び「組換え部位」という用語は、部位特異的リコンビナーゼ、及びその認識部位（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、Ｆｌｐ−ＦＲＴ等）を指し、リコンビナーゼは、その２つの認識部位の間の配列を切断することができる。
【００５３】
「リコンビナーゼ導入遺伝子」という表現は、リコンビナーゼ、例えばＣｒｅの、コード配列を含む導入遺伝子を指す。本明細書で使用される「リコンビナーゼ誘導性」または「リコンビナーゼ誘導性の導入遺伝子」という表現は、同じ細胞内でリコンビナーゼが発現されるまで非機能性である導入遺伝子を指す。いくつかの場合において、リコンビナーゼの発現は、通常、下流の配列／遺伝子が発現されるのを防ぐ、配列（例えば、介在配列）の切断をもたらす。
【００５４】
本明細書において同義で使用される「Ｌｏｘ部位」及び「ＬｏｘＰ部位」という表現は、Ｃｒｅが部位特異的組換えを触媒することができるヌクレオチド配列を指す。既知であるように、ＬｏｘＰ部位は、８塩基対のスペーサー領域によって分離された２つの１３塩基対の逆方向反復からなる。他の好適なｌｏｘ部位は、Ｅ．ｃｏｌｉから単離されたヌクレオチド配列であるＬｏｘＢ、ＬｏｘＬ、及びＬｏｘＲ部位を含む。これらの配列は、Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８２，７９（１１）：３３９８−３４０２によって開示及び記載されている。いくつかの実施形態において、ｌｏｘ部位は、ＬｏｘＰ、ＬｏｘＣ２、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ５１７１、またはｌｏｘ５１１部位であり得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「自己不活性化」という用語（例えば、自己不活性化リコンビナーゼ導入遺伝子の文脈において）は、発現すると自身を不活性化する能力を有する遺伝子を指す。例えば、本開示の自己不活性化リコンビナーゼ導入遺伝子は、組換え部位、例えば、Ｌｏｘ部位によって隣接されてもよく、リコンビナーゼが発現すると、それ自体の切断及び自己不活性化を引き起こす。
【００５６】
本明細書で使用される「介在配列」という用語は、２つの作動可能に連結された遺伝要素間に挿入されたときに、それらの要素が作動可能に連結されるのを阻止する遺伝子配列を指し指し、介在配列は、２つの遺伝要素間に自然には見られない。例えば、介在配列は、タンパク質コード配列がプロモーターから転写されるのを阻止する、プロモーター（例えば、非免疫グロブリン軽鎖プロモーター）とタンパク質コード配列（例えば、共通の軽鎖のコード配列）との間に挿入されたヌクレオチドの配列であってもよい。介在配列は、組換え部位によって隣接されてもよい。好適なリコンビナーゼの存在下で、プロモーター配列とコード配列とを分離している介在配列が切断され得、それによって、プロモーター配列及びコード配列を作動可能な連結に配置し、コード配列が転写されるようにする。
【００５７】
「遺伝的に関連した」という用語は、同じ染色体上に存在する２つの遺伝要素を指し、そのため、遺伝要素は減数分裂中に一緒に遺伝する傾向がある（すなわち、要素は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満の組換え頻度を有する）。互いに近接して連結された２つの遺伝要素は、染色体交差事象（または「組換え」）の間に異なる染色分体上に分離される可能性が低い。２つの遺伝的に関連した要素が組換えの間に分離する確率は、２つの要素間の配列の量に依存し、「組換え頻度」と称される可能性の割合として算出することができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「共通の軽鎖」または「共通の免疫グロブリン軽鎖」という用語は、複数の重鎖可変領域と対形成して、異なる抗原に結合する抗体を産生することができる軽鎖可変領域を指す。共通の軽鎖は、抗原結合の受動的パートナーであり、抗原結合は、重鎖によって決定される。例えば、二重特異性抗体は、２つの結合特異性を有し、場合によっては、二重特異性抗体の両方のアームが同じ軽鎖（すなわち、「共通の」軽鎖）及び異なる重鎖（アームの結合特異性を主に決定する）を有する。
【００５９】
本開示の共通の軽鎖は、「予め再構成された軽鎖可変領域」（または「予め再構成された可変領域」）を含み、軽鎖可変領域は、定義された配列を有し、異なる特異性の抗体を産生するように複数の重鎖可変領域と良好に対形成できる特性について選択されている。本開示の「共通の軽鎖導入遺伝子」は、１つの長いオープンリーディングフレーム内に、少なくとも共通の軽鎖コード配列（または予め再構成された軽鎖可変領域）及び軽鎖定常領域を含む導入遺伝子であり得る。この導入遺伝子は、ｃＤＮＡであってもよい。さらなる定義は、本開示の他の箇所に見られる。
発明を実施するための形態
【００６０】
本主題発明を詳細に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としているのであって、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００６１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。
【００６２】
他に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等の任意の方法及び材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料を次に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物は、刊行物が関連して引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうではないと明確に定められていない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含み、「１つの候補薬剤（ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の候補薬剤及び当業者に既知のその等価物等への言及を含む。特許請求の範囲は、任意の選択的な要素を除外するように記載されてもよいことにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許要素の列挙に関連して、「唯一」、「のみ」等のそのような排他的専門用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。
【００６４】
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいずれの記載も、先行発明のために、本発明がそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があり得る。
【００６５】
本明細書において引用される全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物または特許が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が関連して引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も、出願日より前のその開示のためであり、本発明が、先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものであると解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があり得る。
【００６６】
本開示を読むことで当業者には明らかとなるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態は、本発明の範囲または主旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれの特徴からも容易に分離され得るかまたはそれらと組み合わされ得る個別の構成要素及び特徴を有する。列挙されるいずれの方法も、列挙される事象の順序または論理的に可能な任意の他の順序で行われ得る。
【００６７】
前述のように、トランスジェニック動物が提供される。ある特定の実施形態において、動物は、比較的少ない数の軽鎖遺伝子を有する任意の非ヒト動物、またはそれらの一次抗原レパートリーを発達させるために遺伝子変換を用いる動物であってもよく、そのため、動物は、多種多様な異なる動物のいずれであってもよい。一実施形態において、動物は、トリ、例えば、ニワトリもしくはシチメンチョウ等のキジ目のメンバー、またはアヒルもしくはガチョウ等のガンカモ目のメンバー、または哺乳動物、例えば、ウサギ等のウサギ目、またはウシ、ヒツジ、ブタ、もしくはヤギ等の家畜であってもよい。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、げっ歯類（例えば、マウスもしくはラット）、または非げっ歯類（例えば、非マウスもしくは非ラット）、非霊長類トランスジェニック動物であってもよい。
【００６８】
本開示のいくつかは、１つ以上の導入遺伝子を含有するトランスジェニックニワトリに関する。多くの動物の免疫グロブリン遺伝子座のヌクレオチド配列が知られており、同様に、そのような動物のゲノムを改変するための方法も知られているため、以下に記載する一般概念は、任意の好適な動物、特に、それらの一次抗原レパートリーを発達させるために遺伝子変換を用いる動物に、容易に適応され得る。転写された免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子の可変領域と、異なる可変領域を含有する作動可能に連結された（上流）偽遺伝子との間の遺伝子変換による抗体多様性の生成は、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ（Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９９８  １７：４３−７０）、Ｂｕｃｃｈｉｎｉ（Ｎａｔｕｒｅ  １９８７  ３２６：４０９−１１）、Ｋｎｉｇｈｔ（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  ５６：１７９−２１８）、Ｌａｎｇｍａｎ（Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  １４４：４２２−４６）、Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １５：１８５−２０６）、Ｒｅｙｎａｕｄ（Ｃｅｌｌ  １９８９  ５９：１７１−８３）、及びＲａｔｃｌｉｆｆｅ（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  ３０：１０１−１１８）等の多種多様な刊行物に記載されている。
【００６９】
いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物のゲノムは、リコンビナーゼ導入遺伝子、すなわち、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）コード配列を含有するように改変され、リコンビナーゼコード配列は、動物の内在性免疫グロブリン軽鎖プロモーターに作動可能に連結され、「内在性免疫グロブリン軽鎖プロモーター」という用語は、非改変動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する免疫グロブリン軽鎖プロモーターであることが意図される。換言すると、リコンビナーゼ導入遺伝子は、プロモーターがＢ細胞及び抗体を産生する他の細胞におけるリコンビナーゼの発現を駆動する様式で、内在性免疫グロブリン軽鎖プロモーターの下流に配置される。この改変は、内在性軽鎖コード配列の発現を不活性化する。動物のゲノムはまた、非免疫グロブリン軽鎖プロモーター（例えば、恒常的プロモーター、またはＢ細胞において活性であることが予想される別のプロモーター）、共通の軽鎖のコード配列（例えば、共通の軽鎖をコードするｃＤＮＡ）、及び介在配列がリコンビナーゼによって切断されない限り、共通の軽鎖が発現されるのを阻止する介在配列を含む、リコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子も含有する。明らかであるように、介在配列は、組換え部位、例えば、Ｌｏｘ部位によって隣接されてもよく、そのため、Ｂ細胞におけるリコンビナーゼの発現は介在配列を切断し、それによって非免疫グロブリン軽鎖プロモーターによる共通の軽鎖の発現を可能にする。
【００７０】
いくつかの実施形態において、リコンビナーゼ導入遺伝子及びリコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子は、互いに対して遺伝的に関連し得るが、同じ遺伝子座には存在しない。例えば、リコンビナーゼ導入遺伝子（免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に固有に存在する）とリコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子とは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ、または少なくとも１Ｍｂの距離だけ互いから離れていてもよく、それによって共通の軽鎖コード配列が、高頻度変異、再構成、及び遺伝子変換（共通の軽鎖コード配列がリコンビナーゼ導入遺伝子に直接隣接している場合に起こる）に供されるのを阻止するが、それにもかかわらず、リコンビナーゼ導入遺伝子と共通の軽鎖導入遺伝子との間の組換えが比較的低い頻度で、すなわち、最大１０％、最大５％、最大２．５％、または最大１％の頻度で起こるように、同じ染色体上に連結される。リコンビナーゼ導入遺伝子間の連結は、はるかにより効率的に機能する交配ストラテジーを可能にする。
【００７１】
トランスジェニック動物は、リコンビナーゼ導入遺伝子及びリコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子に対して、特に、これらの導入遺伝子が遺伝的に関連している場合、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。トランスジェニック動物が導入遺伝子に対してヘテロ接合性である場合、軽鎖遺伝子座の他の対立遺伝子が不活性化され得、すなわち、その動物によって産生される軽鎖のみが共通の軽鎖となる。例えば、ＵＳ２０１０／０８２７５９を参照されたい。
【００７２】
動物の重鎖遺伝子座は、野生型であってもよいか、または改変されていてもよい。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物は、ａ）ｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域と、ｉｉ）重鎖フレームワークと、を含む重鎖可変領域をコードする核酸を含む機能性ＩｇＨ遺伝子、ならびにｂ）ｉ）軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域と、ｉｉ）アミノ酸配列においてａ）（ｉｉ）の重鎖フレームワークと同一である重鎖フレームワーク領域と、を各々含む重鎖可変領域をコードする複数の偽遺伝子を含む、「合成」免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座（「ＳｙｎＶ」）をさらに含むゲノムを有してもよく、組換えＩｇＨ遺伝子座は、作動可能な連結中に、イントロン領域、定常ドメイン領域をコードする領域、及び３’非翻訳領域を含み、イントロン領域の少なくとも一部は、前記トランスジェニック動物のゲノムに対して内在性であり、ａ）の前記核酸及びｂ）の偽遺伝子は、前記トランスジェニック動物のゲノムに対して外来性であり、ｂ）の偽遺伝子によってコードされるＣＤＲの各アミノ酸残基、及びａ）の軽鎖可変領域のＣＤＲの各アミノ酸残基は、同じ群の２〜５個のアミノ酸残基から選択され、前記複数の偽遺伝子は、前記機能性ＩｇＨ遺伝子に作動可能に連結され、前記トランスジェニック動物における遺伝子変換によりａ）の核酸にヌクレオチド配列を供与し、前記トランスジェニック動物は、前記機能性ＩｇＨ可変領域の多様化形態を含む組換え免疫グロブリンを発現する。前記群の２〜５個のアミノ酸のうちの少なくとも１つは、チロシンまたはトリプトファン残基であり得、該群の２〜５個のアミノ酸のうちの少なくとも１つは、アラニン、グリシンまたはセリン残基であってもよい。これらの実施形態において、重鎖フレームワークは、ヒトフレームワークであってもよく、例えば、ヒト生殖系列フレームワークと同一のアミノ酸配列を有してもよい。動物は、改変された重鎖遺伝子座に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。これに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，５９２，６４４に見出すことができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、共通の軽鎖コード配列は、予め再構成された可変領域またはｃＤＮＡを含む共通の免疫グロブリン軽鎖をコードする。
【００７４】
いくつかの実施形態において、リコンビナーゼ誘導性の共通の軽鎖導入遺伝子の介在配列は、選択可能なマーカーカセット、例えば、ハイグロマイシン残基カセットを含有してもよく、そうすることで、その構築物を含有する細胞が選択され得る。これらの実施形態において、選択可能なマーカーカセットは、下流の転写を阻止するポリアデニル化部位を含有し得る。
【００７５】
上記のトランスジェニック動物は、組み換えによって動物のゲノムを改変することにより作製され得る。トランスジェニック動物、例えば、マウス及びニワトリ等を作製するための方法が既知であり、特に、遺伝子変換を用いる動物のゲノムを改変するための方法（例えば、トリについてはＳａｙｅｇｈ，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９９９  ７２：３１−７及びＫａｍｉｈｉｒａ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  ９１：１７１−８９、ウサギについてはＢｏｓｚｅ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２００３  １２：５４１−５３及びＦａｎ，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．１９９９  ４９：５８３−９４、ウシについてはＳａｌａｍｏｎｅ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  １２４：４６９−７２を参照されたい）、同様に、それらの種の多くの生殖系列免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の構造及び／または配列も既知であり（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ  Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  １９９８  １７：４３−７０及びＲａｔｃｌｉｆｆｅ  Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６  ３０：１０１−１１８）、前述の動物は、本開示において提供される日常的な方法によって作製され得る。トランスジェニックニワトリを作製するための方法が既知である。例えば、８，５９２，６４４、ＵＳ８，８８９，６６２、Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．２０１５  ９４：７９９−８０３）、ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ（Ｎａｔｕｒｅ．２００６  ４４１：７６６−９）、及びＳｃｈｕｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  １１０：２０１７０−５を参照されたい。
【００７６】
また、共通の軽鎖を含有する抗体を産生するための方法も提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、前述のようなトランスジェニック動物を抗原で免疫することを含んでもよく、抗体がポリクローナルである場合、該方法は、動物の出血から抗体を単離することを含んでもよい。動物が共通の軽鎖配列に対してホモ接合性である場合、ポリクローナル抗血清中の全ての抗体は同じ軽鎖を有するはずである。モノクローナル抗体が所望される場合、方法は、ｂ）免疫したトランスジェニック動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製すること、ｃ）ハイブリドーマをスクリーニングして抗原特異性ハイブリドーマを同定すること、及びｄ）抗原特異性ハイブリドーマから抗原特異性抗体を単離することを含んでもよい。
【００７７】
ある特定の実施形態において、治療抗体を産生するために、動物を、ＧＤ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２０、Ｌｙｍ−１、ＣＤ６、補体活性化受容体（ＣＡＲ）、ＥＧＰ４０、ＶＥＧＦ、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２  ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、ＢＬｙＳ（ＴＮＦ及びＡＰＯＬに関連するリガンド）、ＣＡ１２５（癌抗原１２５）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲに関連するヘテロ多量体）、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ（インテグリンαＬ）、ＣＤ１４（単球分化抗原）、ＣＤ２０、ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体）、ＣＤ４４ｖ６（白血球の接着を媒介）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）、ＣＤ８０（ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の共刺激因子）、補体成分Ｃ５、ＣＴＬＡ、ＥＧＦＲ、エオタキシン（サイトカインＡ１１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡクラスＩＩ、ＩｇＥ、ＧＰｉｉｂ／ｉｉｉａ（インテグリン）、インテグリンａＶβ３、インテグリンａ４β１、及びａ４β７、インテグリンβ２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ｌｅｗｉｓｙ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤＧＦβＲ（血小板由来増殖因子β受容体）、ＰＭＳＡ、腎癌抗原Ｇ２５０、ＲＳＶ、Ｅ−セレクチン、ＴＧＦｂｅｔａ１、ＴＧＦｂｅｔａ２、ＴＮＦα、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質１）、またはＶＥＧＦ等で免疫してもよい。
【００７８】
抗原は、アジュバントを用いてまたは用いずに、任意の都合のよい様式でトランスジェニック宿主動物に投与することができ、また所定の予定に従って投与することができる。
【００７９】
免疫後、免疫されたトランスジェニック動物からの血清または乳汁は、抗原に特異的な医薬品グレードのポリクローナル抗体の精製のために分画することができる。トランスジェニックトリの場合、卵黄を分画することによっても抗体を作製することができる。濃縮され、精製された免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、ゲル濾過等）、硫酸アンモニウム等の塩、エタノール等の有機溶媒、またはポリエチレングリコール等のポリマーを用いた選択的沈殿によって得ることができる。
【００８０】
モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞、例えば、脾臓細胞が、免疫されたトランスジェニック動物から単離され、ハイブリドーマの産生のために形質転換細胞株との細胞融合に使用され得るか、または抗体をコードするｃＤＮＡが、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、トランスフェクト細胞において発現させられる。モノクローナル抗体を作製するための手順は、当該技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願第０５８３９８０Ａ１号、米国特許第４，９７７，０８１号、ＷＯ９７／１６５３７、及びＥＰ０４９１０５７Ｂ１を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。クローン化したｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のＩｎ  ｖｉｔｒｏ産生は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９（２０００）、及びＢｕｒｔｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７（１９９５）によって記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
抗体が既にヒトフレームワーク領域を含有していない場合、方法は、抗体をヒト化することをさらに含んでもよく、その方法は、抗体の定常ドメインをヒト定常ドメインと交換してキメラ抗体を作製すること、及びある特定の場合には、例えば、ＣＤＲグラフト化またはリサーフェシング等によって、抗体の可変ドメインをヒト化することを含んでもよい。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号；同第４，８１６，５６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６の方法に従って行われてもよく、各々が、参照により、本明細書に引用された参考文献を含めて、全体として本明細書に組み込まれる。
【００８２】
このように、トランスジェニック動物に加えて、トランスジェニック動物を抗原で免疫すること、及びそのトランスジェニック動物から、抗原に特異的に結合する抗体を得ることを含む方法もまた提供される。該方法は、トランスジェニック動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製すること、及びハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含んでもよい。
【００８３】
一旦、異なる抗原に結合するモノクローナル抗体が単離されると、次いで、任意の都合のよい方法を用いて二重特異性抗体を作製することができる。例えば、２つの重鎖配列を単一の共通の軽鎖とともに単一の宿主細胞において発現させることができ、その場合、これらの細胞によって分泌される抗体の一部が二重特異性であるべきである。代替として、２つの重鎖及び共通の軽鎖を別々に発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでフォールディングするかまたは結合させてもよい。
【００８４】
合成ＶＨを有する動物の場合、親和性成熟中に機能性遺伝子の可変ドメインに対して起こる、遺伝子変換によるものではないアミノ酸変化の結果として生じる比較的少数のアミノ酸を除いて（すなわち、アミノ酸の１０％未満、５％未満、３％未満、または１％未満に起こる）、動物によって産生される全ての抗体は、共通の軽鎖及び重鎖を有するべきであり、ＣＤＲは、前述の遺伝子座によってコードされる２〜５個のアミノ酸からなる。同様に、フレームワーク領域は、単量体型、製造し易さ、高溶解度、及び熱力学安定性等の望ましい特質を有することが分かっている所定の配列を含む。
【００８５】
抗体の重鎖可変ドメインは、動物の免疫系によって「自然に」作製される。そのような抗体は、ある特定の場合において、宿主細胞によって翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）され得、トランスジェニック動物の種に特有のグリコシル化パターン及び組成を有し得る。
【００８６】
ある特定の実施形態において、トランスジェニック動物によって産生される抗体が提供され、抗体は、可変ドメインに連結された定常ドメインを含み、可変ドメインは、ａ）共通の軽鎖可変ドメイン、ならびにａ）ｉ．２〜５個の異なるアミノ酸からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域と、ｉｉ．重鎖フレームワーク領域とを含む重鎖可変ドメインを含む。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態及び態様を示し、さらに説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００８８】
本開示の原理のいくつかを以下の実施例に示す。明らかであるように、後述のＶＫ遺伝子に適用される原理は、他の軽鎖遺伝子にも適用され得る。
【００８９】
実施例１
突然変異を起こさない共通の軽鎖を有するトランスジェニックニワトリを作製する
Ｂ細胞における抗体多様化の機構は、主として免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子に限定されるため、突然変異を起こさない共通の軽鎖を有するトランスジェニックニワトリを作製するための１つの手法は、非免疫グロブリン制御エレメントの転写制御下でゲノム内の別の遺伝子座に軽鎖を挿入することであった（図１）。Ｂ細胞特異的発現は、Ｂ細胞のみでＣｒｅ媒介性組換えが起きたときに活性化される条件付き導入遺伝子を用いて達成した。Ｂ細胞のみでＣｒｅの組換えを達成するために、軽鎖遺伝子座にＣｒｅ遺伝子を挿入することによってＣｒｅの発現をＢ細胞特異性にした（図２）。初期Ｂ細胞発生中に軽鎖調節エレメントによってＣｒｅの発現を誘導すると、Ｃｒｅリコンビナーゼの活性は、共通の軽鎖の発現をブロックする終止配列をループアウトさせた。
【００９０】
代替の手法は、予め再構成されたＶ領域を軽鎖遺伝子座に挿入し、上流の全ての偽遺伝子を除去し、遺伝子変換の可能性を排除することであってもよい（図３及び図４）。
【００９１】
実施例２
ＣＲＹＳＴＡＬ社製ヒト重鎖と対形成及び発現する予め再構成されたヒトＶＫ共通の軽鎖について軽鎖ライブラリーをスクリーニングする
選択されたヒト重鎖可変領域と良好に対形成する、予め再構成されたヒト軽鎖可変領域を同定することができる。ヒトＶＫ３ファミリー配列のライブラリーを、Ｃｒｙｓｔａｌ社製ヒトＶＨ３−２３遺伝子を担持する発現構築物とともに２９３細胞にコトランスフェクトする。培養上清を、産生されたＩｇＧのレベルについてＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。生殖系列配列に最も酷似したヒトＶＫ配列が好ましい。このヒトＶＫ遺伝子は、共通の軽鎖と称される。共通の軽鎖遺伝子は、１つの長いオープンリーディングフレーム内にヒトＶＫ領域及びニワトリ軽鎖定常領域を含有する。イントロンは必要ではない。
【００９２】
実施例３
予め再構成されたヒトＶＫ遺伝子（共通の軽鎖）のニワトリ１５番染色体への挿入
ヒトＶＫ共通の軽鎖は、ニワトリβアクチンプロモーターまたはＣＡＧプロモーターによって駆動され、Ｂ細胞における高レベルの発現を保証する（図３）。Ｂ細胞においてのみ共通の軽鎖の高レベルの発現を有することが望ましいため、導入遺伝子をＣｒｅ組換えによって活性化する。Ｃｒｅ組換えの前にプロモーターがハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するように、ｌｏｘ２２７２部位によって隣接されたハイグロマイシン耐性カセットを、プロモーター領域と共通の軽鎖遺伝子との間に配置する。Ｃｒｅが発現すると、ハイグロ遺伝子が切断され、単一のｌｏｘ２２７２部位が残り、プロモーターが共通の軽鎖の発現を駆動することができる。構築物はまた、クロマチンインスレーターとして作用する、ニワトリβグロビン遺伝子座由来のＨＳ４部位も含有する。
【００９３】
同質遺伝子ＤＮＡ標的化アームを用いた相同組換えにより、共通の軽鎖導入遺伝子を１５番染色体に挿入する。ＩｇＬ−Ｃｒｅ及び共通の軽鎖導入遺伝子の両方が存在する必要があるため、下流の繁殖ストラテジーが単純化されるように、挿入位置は、内在性軽鎖遺伝子座の十分近くになるよう選択される。軽鎖遺伝子座を取り囲むニワトリ１５番染色体上では、５００ｋｂが２．５ｃＭまたは２．５％の組換え頻度とほぼ同じである。ニワトリ軽鎖遺伝子座の５００ｋｂ以内に共通の軽鎖遺伝子を配置することで、共通の軽鎖導入遺伝子及びＣｒｅ導入遺伝子（以下を参照）が、約９８％の時間は連結されたままであることを確実にする（図７）。内在性軽鎖遺伝子座から５００ｋｂ未満または約５００ｋｂの遺伝子間領域が、共通の軽鎖の挿入のために選択される。共通の軽鎖導入遺伝子の突然変異率を増加させる可能性がある潜在的な突然変異機構を回避するために、内在性軽鎖遺伝子座に近すぎないことが望ましい。ＩｇＬ−Ｃｒｅ／共通の軽鎖染色体またはハプロタイプは、本質的に単位として遺伝し、完全ヒト抗体を産生するために重鎖導入遺伝子と共通の軽鎖とを合わせるのに必要な下流の繁殖ストラテジーを大幅に単純化する。
【００９４】
共通の軽鎖を１５番染色体に挿入するための標的化構築物は、標的化に使用されるＰＧＣ細胞に対して同質遺伝子的な５’及び３’相同領域を含有する。相同領域は、細胞に存在する軽鎖遺伝子座に対してホモ接合性であるトリ由来のゲノムＤＮＡから増幅し、配列がその染色体に対して同質遺伝子的であることを確実にする。これらの細胞は、以前の軽鎖ノックアウト及びノックイン導入遺伝子に使用されており、トリは、細胞の生殖系列の伝達によって作製されている。ヘテロ接合性のトリを異形交配して、両方の染色体上に軽鎖遺伝子座及び密接に連結した配列（標的化のために選択された領域等）を担持するホモ接合性のトリを作製した。ホモ接合性ＤＮＡ由来の相同領域をクローン化することにより、配列が以前に標的化した軽鎖と同じ染色体に由来することを確実にする。ニワトリＰＧＣでは、相同領域がゲノムと厳密に一致することが要求され、相同領域におけるたとえ数個のヌクレオチド変化であっても、標的化の頻度を妨げるかまたは大幅に低下させる。ニワトリは近交系ではないため、標的化に用いられるＰＧＣ細胞は、互いに関連した大規模な一塩基多型を担持する異なる２セットの染色体を含有しており、一方の対立遺伝子と一致する相同領域が他方の対立遺伝子と関連した多型を含有することが保証される。厳密な配列相同性が要求されるため、特異的対立遺伝子のために設計された標的化ベクターは、その対立遺伝子のみを標的化する。少なくとも全長４ｋｂの相同領域であれば、標的化のために十分である。代替として、標的化する領域に隣接した二重鎖切断を作製するためにＣＲＩＳＰＲと組み合わせた、全部で１〜２ｋｂのより短い相同領域もまた使用することができる。
【００９５】
ニワトリβアクチンまたはＣＡＧ（βアクチン＋ＣＭＶ媒介性初期エンハンサー）等のユビキタスな強いプロモーターが使用される。ＰＧＣにおける標的化事象の選択のため、また非Ｂ系列細胞における共通の軽鎖の発現をブロックする終止配列として作用するために、ハイグロマイシン耐性カセットが、プロモーターと共通の軽鎖との間に配置される。ハイグロマイシンカセットは、共通の軽鎖遺伝子が転写されないように、ポリアデニル化部位を含有する。ハイグロマイシン遺伝子及び共通の軽鎖の両方を含有する長い転写物が作製される事象において、ハイグロ遺伝子の長いオープンリーディングフレーム及び終止コドンは、共通の軽鎖の翻訳を阻止する。ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、またはｌｏｘ５１７１等の代替のｌｏｘＰ部位は、ハイグロマイシンカセットに隣接する。２つの導入遺伝子の間に組換えが存在しないように、自己不活性化Ｃｒｅ及び共通の軽鎖の周囲にミスマッチｌｏｘＰ部位を使用することが重要である。
【００９６】
ＩｇＬ−Ｃｒｅ／共通の軽鎖染色体を担持するニワトリを、ＩｇＬノックアウト及び種々の重鎖導入遺伝子等の他の導入遺伝子を担持するニワトリと繁殖させる（図４）。ＩｇＬノックアウトニワトリとの繁殖により、内在性ニワトリ軽鎖のホモ接合性の機能性ノックアウトを有するトリ（一方の対立遺伝子が単純なノックアウトを有し、他方の対立遺伝子がＩｇＬ−Ｃｒｅ導入遺伝子を有する）を作製する。共通の軽鎖は、これらのニワトリにおいて発現される唯一の軽鎖である。ＩｇＬ−Ｃｒｅ／共通の軽鎖染色体を含有するトリを重鎖ノックアウトと交雑して、共通の軽鎖及びヒト重鎖ノックアウトを含有するトリを作製する。これらのトリを軽鎖ノックアウト及びヒト重鎖ノックインを含有するトリと繁殖させて、以下の遺伝子型を有するトリを作製する：共通の軽鎖／ＩｇＬノックアウト；ヒト重鎖ノックイン／ＩｇＨノックアウト（図４）。
【００９７】
代替として、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを用いて、ヒトＶＫ導入遺伝子をゲノムにランダムに挿入する。
【００９８】
実施例４
ＩＧＬ−ＣＲＥを作製するために、ニワトリＩＧＬ遺伝子座にＣＲＥリコンビナーゼノックインを挿入する
Ｃｒｅの発現をＢ細胞特異的にするために、軽鎖プロモーター及びエンハンサーエレメントによってその発現が駆動されるニワトリ軽鎖遺伝子座にＣｒｅ遺伝子を挿入する（図５）。ニワトリにおいて、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の両方が、初期Ｂ細胞発生中に同時に再構成及び発現するため、代替軽鎖は存在しない。したがって、軽鎖遺伝子座からの発現は、Ｂ細胞受容体の発現が非常に重要であるＢ細胞発生の段階と一致している。軽鎖遺伝子座にＣｒｅを挿入するために、最初に、ａｔｔＰ部位を、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼを用いた挿入のためのドッキング部位としての役割を果たす遺伝子座に標的化する。Ｃｒｙｓｔａｌ社は、相同組換えによって軽鎖遺伝子座にａｔｔＰ部位及びプロモーターレスのｎｅｏ遺伝子が挿入され、Ｖ、Ｊ、及びＣコード領域、ならびにイントロンが置き換えられた軽鎖ノックアウトを作製した。Ｃｒｅ挿入構築物は、Ｂ細胞特異的発現のためにニワトリ軽鎖プロモーターに連結されたＣｒｅ遺伝子、及びβアクチンプロモーターに連結されたａｔｔＢ部位を含有する。軽鎖遺伝子座のａｔｔＰ部位に構築物を挿入すると、βアクチンプロモーターがｎｅｏ遺伝子の発現を駆動し、Ｇ４１８による適切な組込み選択を促進する。次いで、Ｃｒｅ遺伝子が遺伝子座の内在性軽鎖プロモーター及びエンハンサーエレメントの転写制御下に置から、Ｂ細胞特異的発現を提供する。構築物は、ａｔｔＢ部位、βアクチンプロモーター、βグロビンＨＳ４クロマチンインスレーターの２つのコピー、ニワトリＩｇＬプロモーター、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子、ウサギグロビンポリＡシグナル、ニワトリＩｇＬ  ＪＣイントロン、ｌｏｘＰ部位を、この順序で含有する。Ｃｒｅ構築物の挿入は、Ｖ及びＪ領域がＣｒｅで置き換えられ、ＪＣイントロンが置き換えられるが、定常領域は存在しない、再構築された軽鎖遺伝子座をもたらす。
【００９９】
Ｃｒｅ遺伝子はまた、ＣｒｅがＢ細胞系列において一過性にのみ発現されるように、自己不活性化であり得る。ＬｏｘＰ部位がＣｒｅ遺伝子の両側に配置され、Ｂ細胞系列における発現の誘導によって産生されたＣｒｅリコンビナーゼがＣｒｅ遺伝子を切断する。この場合、ヒトＶＫ導入遺伝子においてハイグロマイシンカセットをｆｌｏｘ化するために変異ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、またはｌｏｘ５１７１等）が使用されるため、それらは軽鎖遺伝子座でＣｒｅに隣接する古典的ｌｏｘＰ部位と組み換えられない。
【０１００】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／２１０，９２６号の利益を主張するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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