(57)【要約】  本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）に関連する神経傷害を検出、診断、及び評価する低侵襲方法を提供する。遺伝子制御機能を果たす非コード小分子ＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の特定の種は、ＴＢＩ又はＣＴＥ後の細胞傷害及び酸化的ストレスと相関しているので、脳損傷の迅速低侵襲診断及び評価を可能にする。ＴＢＡに罹患しているか又は罹患するリスクのある被験体（例えば、フットボール選手、ボクサー、軍人、転倒の犠牲者）における神経傷害の早期同定及び長期評価は、臨床的、医学的、及び行動的意思決定を導くことによって臨床転帰を改善する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における脳損傷を検出する方法であって、
患者由来の生物学的サンプルを、配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも７０％の相補性を有する少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブと接触させる工程と、
前記少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブを定量することによって、配列番号１〜６９によって表される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルを決定する工程と、
前記発現レベルを健常被験体から得られたコントロール発現レベルと比較する工程と
を含み、
前記患者及びコントロールのマイクロＲＮＡ発現レベル間の差が１．２倍以上であることが、前記患者が脳損傷に罹患していることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
脳損傷が検出された場合、前記患者を治療的に有効な量の抗酸化剤で処理する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗酸化剤が、アルファ−トコフェロール、アスコルベート、コエンザイムＱ、アルファ−リポ酸、クルクミン、グルタチオン、尿酸、カロテン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシレドキシン、チオレドキシン、メシル酸チリラザド、及びＮＸＹ−０５９からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が、ヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルが、血液、脳脊髄液、又は脳組織である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルが、血漿又は血清である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記脳損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は慢性外傷性脳症である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記測定が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、又は遺伝子チップ解析を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブが、ＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロＲＮＡのコントロール発現レベルが、脳損傷に罹る前の前記患者に由来するサンプルから得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルが、脳損傷が疑われてから７２時間以内に前記患者から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
一定期間に亘って前記患者由来の生物学的サンプルに対して繰り返され、前記マイクロＲＮＡの発現レベルの経時変化が前記脳損傷の進行又は回復を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブが、配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも９０％の相補性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者における脳損傷を検出する低侵襲方法であって、
患者由来の血液、血漿、又は血清サンプルを、配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも７０％の相補性を有する少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブと接触させる工程と、
前記少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブを定量することによって、配列番号１〜６９によって表される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルを決定する工程と、
前記発現レベルを健常被験体から得られたコントロール発現レベルと比較する工程と
を含み、
前記患者及びコントロールのマイクロＲＮＡ発現レベル間の差が１．２倍以上であることが、前記患者が脳損傷に罹患していることを示すことを特徴とする方法。
【請求項１５】
脳損傷が検出された場合、前記患者を治療的に有効な量の抗酸化剤で処理する工程を更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
脳損傷を検出するためのキットであって、（ａ）配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも７０％の相補性を有する１以上のｍｉＲ特異的オリゴヌクレオチドプローブと、（ｂ）１以上のコントロールサンプルと、（ｃ）脳損傷を検出するための前記プローブ及び前記コントロールサンプルの使用について示す説明書とを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年３月２６日出願の米国非仮出願第１４／６６９，４５４号の出願日の利益を請求し、その開示全体を参照によって援用する。
【０００２】
配列表の参照
本願は、「ＵＭ０１４００２ＳＬ．ｔｘｔ」という名称の１つのテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を原出願の発明対象の一部として含む。配列表のテキストファイルは、２０１５年３月２５日に作成され、サイズは１２２ｋｂである。配列表の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
軽度ＴＢＩ（ｍＴＢＩ）の急性及び慢性の分子効果は、それほど研究も特性評価もされていない。過去数十年間に亘って、反復性ｍＴＢＩが、現行の方法では検出することができないやり方で脳の生化学的活性を変化させ得ることが次第に明らかになりつつある。この問題の最も重要な点は、運動選手及び軍人における反復性ｍＴＢＩと慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）の発現との間の明確な結び付きである。ｍＴＢＩに罹患している個体が直面している喫緊の課題は、振盪性損傷後に細胞レベルで生じる永続的な脳傷害のリスクなしに高リスクの活動に安全に戻れるのはいつなのかを決定することである。残念なことに、ＴＢＩによって引き起こされる神経傷害又はＣＴＥの進行を評価するための非侵襲的な方法又はツールは現在存在していない。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）は、約２２塩基対長の内因性非コード小分子ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、種をまたいで高度に保存されており、真核生物ゲノムにおける遺伝子のうちの１％〜２％を占めると同時に、アノテーションが付けられた全てのヒト遺伝子のうちの３０％を制御している可能性がある。成熟ｍｉＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）における配列特異的部位に結合し、翻訳を抑制するか又はｍＲＮＡの分解を制御することによってタンパク質合成を阻害する。一部の単一ｍｉＲＮＡが、数百の標的ｍＲＮＡを制御すると予測されている。ｍｉＲＮＡは、生物学的プロセスの重要なエピジェネティック制御因子であり、多くが器官、細胞、又は細胞区画で特異的に発現する。病的状況において循環ｍｉＲＮＡが変化するという知見から、神経変性疾患の潜在的バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡが開発された。ｍｉＲＮＡの放出は、Ａｒｇｏｎａｕｔ２（ａｇｏ２）に関連する受動的なものであろうと、エクソソーム又は微小胞を介した能動的分泌によって媒介されていようと、中枢神経系全体に亘ってタンパク質を劇的に発現させると考えられる。ＣＴＥの場合、この疾患の確定診断は、脳の特定の領域、例えば、大脳半球、視床、及び内側側頭葉における神経細胞死を同定することによって死後に行われる。しかし、顕著なニューロン喪失及び脳萎縮は、疾患の発生過程において遅発性の事象であり、恐らくシナプスの機能障害及び喪失、神経突起の退縮、及び軸索変性につながるタウの過リン酸化及び神経原線維タングルの沈着等の代謝変化がその前に生じる。かかる傷害によって、安定なｍｉＲＮＡが体循環に放出されることが証明されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、脳損傷を低侵襲的に検出するのに有用な方法及びキットを特徴とする。第１の態様では、本発明は、患者由来の生物学的サンプルを、配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも７０％の相補性を有する少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブと接触させ、前記少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブを定量することによって、配列番号１〜６９によって表される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルを決定し、前記発現レベルを健常被験体から得られたコントロール発現レベルと比較することによってヒト等の患者における脳損傷を検出する方法であって、前記患者及びコントロールのマイクロＲＮＡ発現レベル間の差が１．２倍以上であることが、前記患者が脳損傷に罹患していることを示す方法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、脳損傷が検出された場合、治療的に有効な量の抗酸化剤（例えば、アルファ−トコフェロール、アスコルベート、コエンザイムＱ、アルファ−リポ酸、クルクミン、グルタチオン、尿酸、カロテン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシレドキシン、チオレドキシン、メシル酸チリラザド、又はＮＸＹ−０５９）で前記患者を処理することを更に提供する。別の実施形態では、前記生物学的サンプルは、血液、脳脊髄液、脳組織である。更なる実施形態では、前記生物学的サンプルは、血漿又は血清である。前記方法を用いて、外傷性脳損傷及び慢性外傷性脳症等の脳損傷を検出することができる。前記方法は、例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、又は遺伝子チップ解析を用いて実施することができる。１つの実施形態では、前記生物学的サンプルは、患者が脳損傷に罹患する前に得られる。別の実施形態では、一定期間に亘って前記患者由来の生物学的サンプルに対して前記方法を繰り返して、脳損傷の進行又は治癒を測定することができる。
【０００６】
第２の態様では、本発明は、患者由来の血液、血漿、又は血清サンプルを、配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも７０％の相補性を有する少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブと接触させ、前記少なくとも１つのｍｉＲ特異的オリゴデオキシヌクレオチドプローブを定量することによって、配列番号１〜６９によって表される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルを決定し、前記発現レベルを健常被験体から得られたコントロール発現レベルと比較することによって、ヒト等の患者における脳損傷を検出する低侵襲方法であって、前記患者及びコントロールのマイクロＲＮＡ発現レベル間の差が１．２倍以上であることが、前記患者が脳損傷に罹患していることを示す方法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、更に、前記患者を治療的に有効な量の抗酸化剤で処理することを更に提供する。
【０００７】
第３の態様では、本発明は、脳損傷を検出するためのキットであって、（ａ）配列番号１〜６９から選択される配列に対して少なくとも７０％の相補性を有する１以上のｍｉＲ特異的オリゴヌクレオチドプローブと、（ｂ）１以上のコントロールサンプルと、（ｃ）脳損傷を検出するための前記プローブ及び前記コントロールサンプルの使用について示す説明書とを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、シャム及びＴＢＩ損傷脳におけるＳｙｓｔｅｍ  ｘＣＴ染色を示す。パネルＡは、シャム手術動物である。パネルＢは、ＴＢＩの４８時間後のＴＢＩ動物である。パネルＣは、ＴＢＩの４６日間後のＴＢＩ動物である。パネルＤは、ＴＢＩ後４６日間に亘って生じたｘＣＴ染色の喪失及び緩やかな回復をグラフ表示したものである。一元配置分散分析、テューキーの事後検定。＊＊＝ｐ＜０．０１。レーザー走査型サイトメトリーによってデータを収集した。
【図２】パネルＥ及びＦは、ＴＢＩの４８時間後、２週間後、及び４６日間後における損傷した動物及び損傷していない動物のそれぞれの神経学的重篤度スコア及びフットフォルトを示す。両評価において、ｘＣＴが神経運動皮質に戻ることに対応してＴＢＩの４８時間後から４６日間後にかけて有意な改善がみられた。しかし、神経学的スコアは、通常のｘＣＴ発現レベルを有するシャムよりも有意に低いままであった。ｎ＝１２頭／群；独立両側ｔ検定。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図３】図３は、ラット及びヒト患者の皮質におけるＳｙｓｔｅｍ  ｘＣＴ（赤）及びＧＦＡＰ（緑）染色を示す。パネルＡは、シャム手術ラットである。パネルＢは、損傷の４６日間後のＴＢＩラットである。パネルＣは、ヒトコントロール患者である。パネルＤは、ステージＩＶのＣＴＥ患者である。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いて６０倍でデータを収集した。ヒト組織は、外傷性脳障害研究センター（ボストン大学）から供与頂いた。
【図４】図４は、ＴＢＩをシャムと比較した、８４個の酸化的ストレス遺伝子の倍数変化を示すヒートマップである。４頭のシャムコントロールラット又は４頭のＴＢＩラット由来のＦＦＰＥ７μＭ切片から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成及びユニバーサル酸化的ストレスアレイＲＴ２ＰＣＲプライマーによる予備増幅（ｐｒｅａｍｐ）用にプールした。酸化的ストレスアレイプレートをＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５  ｉＣｙｃｌｅｒにかけた。コントロール及びＴＢＩのデータをＲｐｌｐ１で正規化した。境界は２倍変化に設定した。
【図５】図５は、ｘＣＴを標的とすると予測されるｍｉＲＮＡの倍数変化を示す散布図である。４頭のシャムコントロールラット又は４頭のＴＢＩラット由来のＦＦＰＥ７μＭ切片から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成及びユニバーサル酸化的ストレスアレイＲＴ２ＰＣＲプライマーによる予備増幅用にプールした。Ｒａｔ  ｍｉＦｉｎｄｅｒ  ＡｒｒａｙプレートをＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５  ｉＣｙｃｌｅｒにかけた。コントロール及びＴＢＩのデータをＳＮＯＲＤ６１及びＳＮＯＲＤ９５で正規化した。境界は２倍変化に設定した。
【図６】図６は、ＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７において用いられるｍｉＲＮＡプローブのチャートである。＊＝ｘＣＴ（ＳＬＣ７Ａ１１）を標的とすると予測される。
【図７】図７は、コントロール被験体及び急性ＴＢＩに罹患している被験体（２４時間〜７２時間以内）から得られたヒト末梢血漿間のＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の倍数変化、９５％信頼区間、及びｐ値を示すチャートである。
【図８】図８は、コントロール被験体及びフットボール選手から得られたヒト末梢血漿間のＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の倍数変化、９５％信頼区間、及びｐ値を示すチャートである。
【図９】図９は、フットボール選手及び急性ＴＢＩに罹患している被験体（２４時間〜７２時間以内）から得られたヒト末梢血漿間のＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の倍数変化、９５％信頼区間、及びｐ値を示すチャートである。
【図１０】図１０は、コントロール被験体及びサッカー選手から得られたヒト末梢血漿間のＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の倍数変化、９５％信頼区間、及びｐ値を示すチャートである。
【図１１】図１１は、コントロール被験体及び慢性ＴＢＩ被験体から得られたヒト末梢血漿間のＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の倍数変化、９５％信頼区間、及びｐ値を示すチャートである。
【図１２】図１２は、急性ＴＢＩに罹患している被験体（２４時間〜７２時間以内）及び慢性ＴＢＩ被験体から得られたヒト末梢血漿間のＰＣＲアレイＣＭＩＨＳ０２２７７におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイル間の倍数変化、９５％信頼区間、及びｐ値を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参照文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に与えるものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するとき、以下の用語は、特に指定しない限り、これらに基づく意味を有する。
【００１０】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明示的に規定しない限り、複数の対象を含む。例えば、用語「細胞」は、複数の細胞（その混合物を含む）を含む。用語「核酸分子」は、複数の核酸分子を含む。
【００１１】
本明細書で使用するとき、以下の用語は、指定の意味を有する。
【００１２】
用語「結合」は、結合によって結合する原子がより大きな部分構造の一部であるとみなされるとき、２つの原子又は２つの部分間の共有結合を指す。結合は、特に指定しない限り、単結合であっても、二重結合であっても、三重結合であってもよい。分子の図中の２つの原子間の点線は、その位置に追加の結合が存在していてもよく、存在していなくてもよいことを示す。
【００１３】
特定のサンプルの「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的にサンプルの状態の指紋であり；２つの状態が、同様に発現している任意の特定の遺伝子を有する場合もあるが、同時に多数の遺伝子を評価することによって、細胞の状態に特有の遺伝子発現プロファイルを得ることができる。即ち、正常組織を異常（例えば、病気の又は損傷した）組織と区別することができ、異常組織内では、異なる予後状態（例えば、長期生存見込みが良好又は不良）を決定することができる。異なる状態の組織（例えば、血液、組織生検若しくは剖検サンプル、又は脳脊髄液）の発現プロファイルを比較することによって、これら各状態においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両方を含む）が得られる。組織において異なる発現を示す配列及び異なる予後転帰が生じる発現差異の同定によって、多方面でこの情報を使用することができるようになる。例えば、特定の治療レジメンを評価することができる（例えば、治療薬が特定の患者において長期予後を改善する作用を有するかどうかを判定するため）。同様に、患者サンプルを公知の発現プロファイルと比較することによって、診断を行ったり、確認したりすることができる。更に、これら遺伝子発現プロファイル（又は個々の遺伝子）によって、臨床効果を付与するために組織発現プロファイルを変化させるか又は正常化する薬物効果をスクリーニングすることができるようになる。
【００１４】
用語「イメージング剤」とは、本明細書で使用するとき、それに結合したときに化合物の検出、追跡、又は可視化に有用な任意の部分を指す。イメージング剤としては、例えば、酵素、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）、発光標識、生物発光標識、磁気標識、金属粒子（例えば、金粒子）、ナノ粒子、抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２分子）、及びビオチンが挙げられる。例えば、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、又は疎水結合によって、イメージング剤を化合物に結合させることができる。イメージング剤は、本発明に従って使用される化合物の化学構造に結合する放射性標識又は組み込まれる放射性同位体であってもよい。かかるイメージング剤を検出する方法としては、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書で使用するとき、「ｍｉＲＮＡ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、又は「ｍｉＲＮＡ」は、互換的に、ｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされていない（例えば、前駆体）又はプロセシングされた（例えば、成熟）ＲＮＡ転写物を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質には翻訳されないので、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」はタンパク質を含まない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写物は、「ｍｉＲ前駆体」又は「ｍｉＲ  ｐｒｅｃ」とも呼ばれ、典型的には、約７０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲ前駆体は、ＲＮＡｓｅ（例えば、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、又はＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ（例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ））で活性のある１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子に分解されることによってプロセシングされ得る。この活性のある１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、「プロセシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
【００１６】
用語「神経変性疾患」とは、本明細書で使用するとき、ニューロンの構造的又は機能的喪失を特徴とする任意の疾患、障害、病態、又は症状を指す。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、レビー小体型認知症、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。
【００１７】
本明細書で使用するとき、「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」とは、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。「ｍｉＲ特異的オリゴヌクレオチドプローブ」又はｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド」とは、特定のｍｉＲ遺伝子産物又は特定のｍｉＲ遺伝子産物の逆転写物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１８】
「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」とは、（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）検出される分子を指す。
【００１９】
本明細書で使用するとき、「サンプル」とは、被験体（例えば、ヒト）に由来する任意の生体物質を指す。サンプルとしては、血液、ＰＢＭＣ、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、細胞、組織、及び器官が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、好ましいサンプルとしては、血漿、ＣＳＦ、及び脳組織が挙げられる。
【００２０】
「治療的に有効な」という語句は、疾患又は障害の治療において用いられる活性成分の量を修飾することを意図する。この量は、疾患又は障害を低減又は排除するという目的を達成する。
【００２１】
用語「治療的に有効な」とは、過度の毒性、刺激、及びアレルギー応答なしに患者の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に相応であり、且つ意図する用途について有効である化合物（又はその塩、エステル、プロドラッグ、互変異性体、双性イオン形態等）を指す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、患者の「治療」に対する言及は、予防を含むことを意図する。用語「患者」は、哺乳類及び非哺乳類を意味する。哺乳類は、ヒト；非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー及び他の類人猿、並びにサルの種；家畜、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ；ペット、例えば、ウサギ、イヌ、及びネコ；ラット、マウス、及びモルモット等のげっ歯類を含む実験動物等が挙げられるが、これらに限定されない哺乳綱の任意の構成動物を意味する。非哺乳類の例としては、鳥類等が挙げられるが、これらに限定されない。用語「患者」は、特定の年齢又は性別を意味するものではない。
【００２３】
用語「プロドラッグ」とは、インビボでより活性が高くなる化合物を指す。特定の化合物は、Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｔｅｓｔａ，Ｂｅｒｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＨＣＡ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ２００３に記載の通り、プロドラッグとしても存在し得る。化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学的に変化して前記化合物を提供する、前記化合物の構造的に改変された形態である。更に、プロドラッグは、エクスビボ環境において化学的方法又は生化学的方法によって化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、好適な酵素又は化学試薬の入った経皮パッチリザーバに入れたときにゆっくりと化合物に変換され得る。プロドラッグは、一部の状況において、化合物又は親薬物よりも容易に投与することができるので、多くの場合有用である。例えば、プロドラッグは、経口投与によって生物学的に利用可能になり得るが、親薬物はそうではない。また、プロドラッグは、親薬物よりも医薬組成物における溶解度が改善されている場合もある。プロドラッグの加水分解的切断又は酸化的活性化に依存するもの等、広範なプロドラッグ誘導体が当技術分野において公知である。限定するものではないが、プロドラッグの例は、エステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、後で代謝的に加水分解されて活性実体であるカルボン酸になる化合物である。更なる例としては、化合物のペプチジル誘導体が挙げられる。
【００２４】
化合物は、治療的に許容可能な塩として存在していてもよい。好適な塩としては、有機酸及び無機酸の両方を用いて形成されるものが挙げられる。かかる酸付加塩は、通常、薬学的に許容可能である。しかし、薬学的に許容不可能な塩の塩が、対象化合物の調製及び精製において有用である場合もある。また、塩基付加塩を形成してもよく、これは薬学的に許容可能であり得る。塩の調製及び選択についてのより深い議論については、Ｓｔａｈｌ，Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨＡ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（２００２）を参照する。
【００２５】
用語「薬学的に許容可能な塩」とは、本明細書で使用するとき、水又は油に可溶性又は分散性であり且つ本明細書に定義する通り治療的に許容可能である化合物の塩又は双性イオン形態を表す。前記塩は、遊離塩基の形態の適切な化合物を好適な酸と反応させることによって、化合物の最後の単離及び精製中に又は別々に調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、Ｌ−アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ゲンチジン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ＤＬ−マンデル酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ホスホン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピログルタミン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、Ｌ−酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩（ｐ−トシル酸塩）、及びウンデカン酸塩が挙げられる。また、化合物中の塩基性基を、メチル、エチル、プロピル、及びブチルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミル硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステリルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物；並びにベンジル及びフェネチルの臭化物で四級化してもよい。治療的に許容可能な付加塩を形成するために使用することができる酸の例としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸、並びに有機酸、例えば、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、及びクエン酸が挙げられる。また、塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類イオンを化合物に配位させることによって形成してもよい。
【００２６】
本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は他の神経学的欠陥に罹患していると考えられるか又は罹患するリスクのある被験体（例えば、ヒト）に由来するサンプル（例えば、脳組織、血液サンプル、又は脳脊髄液サンプル）中の１以上のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）の発現を評価することによって、ＴＢＩ又は慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）及び関連する病態を検出、診断、及び追跡する非侵襲的方法を特徴とする。本発明の方法は、単回又は複数回の外傷性事象、例えば、転倒事故、活動的なスポーツ（例えば、ボクシング及びフットボール）、車両事故、又は労働災害において経験される事象によって、或いは法執行又は軍人によって引き起こされる神経傷害の進行を診断、予測、及びモニタリングするために用いることができる。本発明の１つの実施形態では、本発明の方法によって、外傷性事象を経験したか又は経験するリスクのある被験体の血漿中のＴＢＩ神経傷害と相関しているｍｉＲＮＡを検出することができるようになる。
【００２７】
本発明は、特定のｍｉＲＮＡ種が神経傷害後に異なって制御されるという知見を包含する。表１及び２は、神経傷害の研究室モデルにおいてＴＢＩを経験したラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）においてアップレギュレート又はダウンレギュレートすることが見出されたｍｉＲＮＡ種（それぞれヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）及びラット）を列挙する。
【表１−１】
2018518147.tif 000003
【表１−２】
2018518147.tif 000004
【表２−１】
2018518147.tif 000005
【表２−２】
2018518147.tif 000006
【００２８】
ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリング方法
患者（例えば、ヒト）から得られた生物学的サンプル（例えば、器官、組織、又は細胞のサンプル、例えば、脳組織、血液サンプル、又は脳脊髄液（ＣＳＦ））において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ種の発現レベルを測定することができる。例えば、従来の生検技術によって脳損傷（例えば、ＴＢＩ又はＣＴＥ）に罹患していると疑われるか又は罹患するリスクのある患者から組織サンプル（例えば、脳組織、血液、又はＣＳＦ）を採取してよい。別の実施形態では、血液又はＣＳＦサンプルを患者（例えば、ヒト）から採取してよく、標準的な技術によってＲＮＡ抽出用に細胞（例えば、白血球）又は血清を単離してよい。ベースラインｍｉＲＮＡ発現プロファイルを決定するために、好ましくは、強い衝撃を受けるスポーツ（例えば、ボクシング、アメリカンフットボール、ラグビー、ホッケー、野球、及びサッカー）、兵役又は法執行業務、被験体が転倒しやすい健康状態（例えば、盲目、加齢）、又は被験体がＴＢＩに罹患するリスクを高める任意の他のもの（例えば、レーシングカーの運転、スカイダイビング、及び暴行の被害者）が挙げられるがこれらに限定されない、ＴＢＩのリスクが高い任意の活動を開始する前に、患者から血液、ＣＳＦ、又は組織サンプルを入手する。また、理想的には、治療期間中のｍｉＲＮＡ発現プロファイルの変化を測定するために、放射線療法、化学療法、又は他の治療的処置の前にベースライン血液又は組織サンプルを入手する。対応するコントロール組織又は血液サンプルは、患者の非患部組織から、正常ヒト個体若しくは正常個体の集団から、又は患者のサンプル中の細胞の大部分に対応する培養細胞から入手することができる。次いで、患者由来のサンプルと共にコントロール組織又は血液サンプルを処理し、その結果、患者のサンプルに由来するｍｉＲＮＡ発現プロファイルを、コントロール被験体又は群から採取したサンプルに由来する対応するｍｉＲＮＡ発現プロファイルと比較することができる。生物学的サンプルについての参照ｍｉＲＮＡ発現プロファイル標準を、コントロールとして使用してもよい。
【００２９】
患者（例えば、ヒト）から入手したサンプル中の本明細書で同定するｍｉＲＮＡ（例えば、配列番号１〜１４０）のうちの１以上のレベルの、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲＮＡのレベルに対する変化（例えば、増加又は減少）は、患者における脳損傷（例えば、ＴＢＩ）の存在の指標となる。１つの実施形態では、試験サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い（即ち、ｍｉＲＮＡの発現が「アップレギュレート」されている）。本明細書で使用するとき、患者由来の流体、細胞、又は組織サンプル中のｍｉＲＮＡの量がコントロール流体、細胞、又は組織サンプル中の同じｍｉＲＮＡの量よりも多い場合、ｍｉＲＮＡの発現は「アップレギュレート」されている。別の実施形態では、試験サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲＮＡの発現レベルよりも低い（即ち、ｍｉＲＮＡの発現が「ダウンレギュレート」されている）。本明細書で使用するとき、患者由来の流体、細胞、又は組織サンプルにおいて生成されるｍｉＲＮＡの量が流体、コントロール細胞、又は組織サンプルにおいて生成される量よりも少ない場合、ｍｉＲＮＡの発現は「ダウンレギュレート」されている。アップレギュレーション又はダウンレギュレーションがコントロール発現プロファイルに対して１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、若しくは２．０倍、又はそれ以上である場合、患者のｍｉＲＮＡ発現プロファイルが脳損傷の存在を示すとみなされる。コントロールサンプル及び正常サンプルにおける相対的ｍｉＲＮＡ発現は、１以上のｍｉＲＮＡ発現標準に対して決定することができる。前記標準は、例えば、ゼロｍｉＲＮＡ遺伝子発現レベル、標準化細胞株のｍｉＲＮＡ発現プロファイル、患者（例えば、ヒト）の非患部組織のｍｉＲＮＡ発現プロファイル、又は正常コントロール（例えば、ヒトコントロール）の集団について既に得られているｍｉＲＮＡ発現の平均レベルを含んでいてよい。
【００３０】
サンプル中のｍｉＲＮＡ発現レベルは、生物学的サンプル中のＲＮＡ発現レベルの検出に好適な任意の技術を用いて測定することができる。生物学的サンプル（例えば、細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを決定するのに好適な技術（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者に周知である。特定の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ種のレベルは、ノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、全細胞ＲＮＡは、核酸抽出バッファの存在下でホモジナイズし、続いて、遠心分離することによって細胞から精製することができる。核酸を沈殿させ、ＤＮａｓｅで処理し、沈殿させることによってＤＮＡを除去する。次いで、標準的な技術に従ってアガロースゲルでゲル電気泳動することによってＲＮＡ分子を分離し、ニトロセルロースフィルタに転写する。次いで、加熱によってＲＮＡをフィルタに固定化する。特定のＲＮＡの検出及び定量は、対象ＲＮＡに対して相補的な、適切に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いて行われる。例えば、開示全体が参照によって本明細書に援用されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７を参照。
【００３１】
所与のｍｉＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションに好適なプローブは、本明細書に記載及び列挙するｍｉＲＮＡ配列の核酸配列から作製することができ、例えば、対象ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、又は完全に相補的なプローブが挙げられるが、これらに限定されない。標識されたＤＮＡ及びＲＮＡプローブを調製する方法及びヌクレオチド配列を標的とするそのハイブリダイゼーション条件は、その開示が参照によって本明細書に援用されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １０  ａｎｄ  １１に記載されている。例えば、放射性核種、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、又は３５Ｓ；重金属；標識されたリガンドに対して特異的結合対のメンバーとして機能することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジン、又は抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素等で核酸プローブを標識してよい。
【００３２】
Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７−２５１のニックトランスレーション法又はＦｉｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３のランダムプライミング法（これらは開示全体が参照によって本明細書に援用される）のいずれかによって、プローブを高特異性活性に標識することができる。後者は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡテンプレートから高特異性活性の３２Ｐ標識プローブを合成するために最良の方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って既存のヌクレオチドを高放射活性ヌクレオチドで置換することによって、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを大きく超える特異的活性を揺する３２Ｐ標識核酸プローブを調製することが可能である。次いで、ハイブリダイズしたフィルタを写真フィルムに露光することによってハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィ検出を行うことができる。ハイブリダイズしたフィルタによって露光された写真フィルムの比重走査から、ｍｉＲＮＡ遺伝子転写レベルの正確な測定値が得られる。別のアプローチを用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ等のコンピュータイメージングシステムによってｍｉＲ遺伝子転写レベルを定量することができる。
【００３３】
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの放射性核種標識が実用的ではない場合、ランダムプライマー法を用いて、アナログ、例えば、ｄＴＴＰアナログである５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジントリホスフェートをプローブ分子に組み込むことができる。蛍光色素又は呈色反応を生じさせる酵素にカップリングしているアビジン、ストレプトアビジン、及び抗体（例えば、抗ビオチン抗体）等のビオチン結合タンパク質と反応させることによって、ビオチン化プローブオリゴヌクレオチドを検出することができる。
【００３４】
ノーザン及び他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加えて、インサイチュハイブリダイゼーションの技術を用いてＲＮＡ転写物のレベルを決定することができる。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも必要な細胞数が少なく、そして、顕微鏡のカバーグラス上に全細胞を付着させ、放射活性標識又は他の方法で標識された核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブを含有する溶液で細胞の核酸含有物をプロービングすることを含む。この技術は、被験体由来の組織生検サンプルの分析に特に適している。インサイチュハイブリダイゼーション技術の実施については、開示全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第５，４２７，９１６号により詳細に記載されている。所与のｍｉＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションに好適なプローブは、上記の通り対象ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、又は完全に相補的な核酸配列から作製することができる。
【００３５】
また、細胞内のｍｉＲＮＡ遺伝子転写物の相対数は、ｍｉＲＮＡ遺伝子転写物を逆転写し、続いて、逆転写された転写物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することによって決定することもできる。ｍｉＲＮＡ遺伝子転写物のレベルは、内部標準、例えば、同じサンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子由来のｍＲＮＡレベルと比較して定量することができる。内部標準として使用するのに好適な「ハウスキーピング」遺伝子としては、例えば、ミオシン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が挙げられる。定量及び半定量ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法及びその変法は、当業者に周知である。
【００３６】
場合によっては、サンプル（例えば、脳組織、血液、又は脳脊髄液（ＣＳＦ））中の複数の異なるｍｉＲＮＡ種の発現レベルを同時に決定することが望ましい場合がある。他の場合には、脳損傷と相関している公知のｍｉＲＮＡ種全ての転写物の発現レベルを決定することが望ましい場合もある。数百のｍｉＲＮＡ種の脳損傷特異的発現レベルを評価することは、時間がかかり、且つ大量の全ＲＮＡ（例えば、各ノーザンブロットにつき少なくとも２０マイクログラム）及び放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィ技術を必要とする。
【００３７】
これら制約を克服するために、ｍｉＲＮＡ種のセットに対して特異的なオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセットを含有するマイクロチップ形式のオリゴライブラリ（即ち、マイクロアレイ）を構築してよい。かかるマイクロアレイを用いると、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを作製し、それをハイブリダイズさせてマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドをプロービングして、ハイブリダイゼーション又は発現プロファイルを作成することによって、生物学的サンプル（例えば、脳組織、血液、又は脳脊髄液（ＣＳＦ））中の複数のマイクロＲＮＡの発現レベルを決定することができる。次いで、試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルのものと比較して、疑いのある疾患、病態、又は障害（例えば、外傷性脳損傷）と一致してどのマイクロＲＮＡの発現レベルが変化したかを決定することができる。
【００３８】
したがって、本発明は、被験体がＴＢＩに罹患しているか又は罹患するリスクが高いかどうかを診断する方法であって、被験体（例えば、ヒト）から入手した試験サンプル（例えば、脳組織、血液、又は脳脊髄液（ＣＳＦ））由来のＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを得ることと、前記標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイとハイブリダイズさせて試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを得ることと、前記試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを、コントロールサンプル又はレファレンス標準から作成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することとを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、ＴＢＩを有するか又はＴＢＩを発現するリスクのある被験体の指標となる方法を提供する。１つの実施形態では、マイクロアレイは、全ての公知のヒトｍｉＲＮＡのかなりの部分についてのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、マイクロアレイは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−２１、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１０１ａ、ｍｉＲ−１８ａ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３７４、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−４２３、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−９ａ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２０３ａ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１８−１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１４８ａ、及びｍｉＲ−１９ａからなる群から選択される１以上のｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】
マイクロアレイは、公知のｍｉＲＮＡ配列から作製される遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。前記アレイは、各ｍｉＲＮＡにつき２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有していてよい。一方は、活性成熟配列を含有し、他方は、ｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である。また、前記アレイは、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件についてのコントロールとして機能し得る、ヒトオルソログと数塩基だけ異なる１以上のマウス配列等のコントロールを含有していてもよい。両種に由来するｔＲＮＡ又は他のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）をマイクロチップに印刷して、特異的ハイブリダイゼーションに対する比較的安定な内部ポジティブコントロールを提供することもできる。マイクロチップには、非特異的ハイブリダイゼーションについての１以上の適切なコントロールが含まれていてもよい。この目的のために、任意の公知のｍｉＲＮＡと全く相同性を有しないことに基づいて配列を選択する。
【００４０】
マイクロアレイは、当技術分野において公知の技術を用いて作製することができる。例えば、適切な長さ、例えば、４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドは、Ｃ６位が修飾された５’−アミンであり、市販のマイクロアレイシステム、例えば、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎ（商標）活性化スライドを用いて印刷される。標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、標識されたプライマーを用いて標的ＲＮＡを逆転写することによって調製される。最初の鎖合成後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させて、ＲＮＡテンプレートを分解する。次いで、このようにして調製した、標識された標的ｃＤＮＡをハイブリダイゼーション条件（例えば、２５℃で１８時間、６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド）下でマイクロアレイチップにハイブリダイズさせ、続いて、３７℃で４０分間０．７５×ＴＮＴ（トリスＨＣｌ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄する。固定化されたプローブＤＮＡがサンプル中の相補的標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置においてハイブリダイゼーションが生じる。標識された標的ｃＤＮＡによって、結合が生じるアレイ上の正確な位置がマーキングされるので、自動検出及び定量が可能になる。出力は、ハイブリダイゼーション事象の一覧からなり、これは、特異的ｃＤＮＡ配列の相対存在量、ひいては、患者サンプル中の対応する相補的ｍｉＲＮＡの相対存在量を示す。アレイ上の各スポットの画像強度は、患者サンプル中の対応するｍｉＲＮＡの存在量に比例する。
【００４１】
アレイの使用は、ｍＲＮＡ発現検出において幾つかの利点を有する。第１に、一時点における同じサンプル中の数百の遺伝子の全般的発現を同定することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブを慎重に設計することにより、成熟分子及び前駆体分子の両方の発現を同定することができる。第３に、ノーザンブロット分析と比較して、チップが必要とするＲＮＡ量が少なく、２．５マイクログラムの全ＲＮＡを用いて再現性のある結果が得られる。比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（１種当たり数百）から、各種につき異なるオリゴヌクレオチドプローブを備える、数種に共通のマイクロアレイを構築することができる。かかるツールによって、様々な条件下における各公知のｍｉＲＮＡの種をまたいだ発現を分析することができるようになる。
【００４２】
特異的ｍｉＲＮＡの定量的発現レベルアッセイに使用することに加えて、ｍｉＲＮｏｍｅのかなりの部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを使用して、ｍｉＲＮＡ発現パターンを分析するためにｍｉＲＮＡ遺伝子発現プロファイリングを実施することができる。異なるｍｉＲＮＡサインが、確立された疾患マーカーと、又は直接疾患状態と関連し得る。
【００４３】
本明細書に記載する発現プロファイリング法に従って、ＴＢＩに罹患していると疑われるか又は罹患するリスクのある被験体（例えば、ヒト）由来のサンプル（例えば、脳組織、血液、又は脳脊髄液（ＣＳＦ））から得られた全ＲＮＡを定量的に逆転写して、前記サンプル中のＲＮＡに対して相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。次いで、標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は、サンプル中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表す、サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルである。ハイブリダイゼーションプロファイルは、サンプル由来の標的オリゴデオキシヌクレオチドの、マイクロアレイにおけるｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドに対する結合から得られたシグナルを含む。プロファイルは、結合の存在又は非存在として記録してよい（シグナル対ゼロシグナル）。より好ましくは、記録されるプロファイルは、各ハイブリダイゼーションから得られたシグナルの強度を含む。このプロファイルを、正常、即ち、ＴＢＩではないコントロールサンプルに由来するハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。シグナルの変化は、被験体におけるＴＢＩの存在又はＴＢＩを発現する傾向の指標となる。
【００４４】
ｍｉＲＮＡ遺伝子発現を測定するための他の技術も当技術分野における技能の範囲内であり、ＲＮＡの転写及び分解の速度を測定するための様々な技術を含む。
【００４５】
脳損傷の治療
本明細書に記載の通り、脳損傷は、脳組織におけるＳｙｓｔｅｍ  ｘｃ−アンチポータ発現の顕著な減少及びこれら組織における抗酸化能の全体的喪失に関連している。抗酸化機構が弱いと、周囲の細胞及び組織に化学的に傷害を与える反応性酸素種（ＲＯＳ）が蓄積される。
【００４６】
患者（例えば、ヒト）が脳損傷に罹患していると臨床的に判定された際、臨床医は、抗酸化剤の投与又は抗酸化剤療法の経過が適切であると判定することができる。抗酸化剤の例としては、アルファ−トコフェロール、アスコルベート、コエンザイムＱ、アルファ−リポ酸、クルクミン、グルタチオン、尿酸、カロテン（例えば、レチノール、ベータ−カロテン）、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシレドキシン、チオレドキシン、メシル酸チリラザド、及びＮＸＹ−０５９が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、脳損傷の進行を減速させるために、治療的に有効な量の１以上の抗酸化剤を患者に投与する。
【００４７】
画像診断法
本発明は、ＴＢＩ、ＣＴＥ、又は関連する病態に罹患しているか又は罹患するリスクのある患者（例えば、ヒト）の診断及び医学的評価を提供する。例えば、患者（例えば、ヒト）におけるＴＢＩ又はＣＴＥに関連する疾患、障害、病態、又は症状の進行を診断又は追跡するための医用イメージング用途において、Ｓｙｓｔｅｍ  ｘｃ−に特異的なイメージング剤を、単独で又は他の剤及び化合物と組み合わせて用いてもよい。例えば、レントゲン技師及び他の医療従事者は、放射線撮像装置、例えば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャナを使用し、放射性核種等のトレーサ化合物を画像化する方法を行う技能を有する。（例えば、Ｓａｈａ，Ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  ＰＥＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１０）ＩＳＢＮ  ９７８−１−４４１９−０８０４−９、参照によって本明細書に援用される）。
【００４８】
また、本発明の方法は、ヒト、並びに動物、例えば、飼育動物、ペット（例えば、イヌ及びネコ）、エキゾチックアニマル、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、及びブタを含む有蹄類）、及び科学研究において用いられる動物（例えば、げっ歯類及び非ヒト霊長類）の医用イメージング及び診断にも有用である。
【００４９】
化合物の投与及び製剤
塩基付加塩は、化合物の最後の単離及び精製中に、金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、若しくは重炭酸塩等の好適な塩基、或いはアンモニア又は有機一級、二級、若しくは三級アミンとカルボキシ基を反応させることによって調製することができる。治療的に許容可能な塩のカチオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウムに加えて、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロへキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等の非毒性四級アミンカチオンが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、及びピペラジンが挙げられる。
【００５０】
化合物の塩は、遊離塩基の形態の適切な化合物を適切な酸と反応させることによって作製することができる。化合物は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン酸塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等が挙げられるがこれらに限定されない非毒性の無機又は有機塩基から調製される薬学的に許容可能な塩の形態で調製することができる。薬学的に許容可能な有機非毒性塩基に由来する塩としては、一級、二級、及び三級アミン、置換アミン（天然置換アミンを含む）、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、エチルアミン、２−ジエチルアミノエタノ、１，２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドロキシルアミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリスヒドロキシルアミノメタン、トリプロピルアミン、及びトロメタミンの塩が挙げられる。
【００５１】
化合物が塩基性である場合、塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、酒石酸、クエン酸、酢酸、フマル酸、アルキルスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、パラ−トルエンスルホン酸、樟脳酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、グルコン酸、グルタミン酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、及びコハク酸が挙げられるがこれらに限定されない非毒性の無機又は有機酸から調製される薬学的に許容可能な塩の形態で調製することができる。
【００５２】
化合物を未加工化学物質として投与することも可能であり得るが、医薬製剤として提示することも可能である。したがって、本発明は、化合物又はその薬学的に許容可能な塩、エステル、プロドラッグ若しくは溶媒和物を、その１以上の薬学的に許容可能な担体、及び任意で１以上の他の治療用成分と共に含む医薬製剤を提供する。担体は、製剤の他の成分に適合し、且つそのレシピエントにとって有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。周知の技術、担体、及び賦形剤のいずれかを、好適に且つ当技術分野、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて理解されている通り使用してよい。本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、又は圧縮プロセスを用いて製造することができる。
【００５３】
製剤としては、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、関節内、及び髄内を含む）、腹腔内、経粘膜、経皮、直腸内、及び局所（皮膚、頬側、舌下、及び眼内を含む）投与に好適なものが挙げられるが、大部分の好適な経路は、例えば、レシピエントの病態及び障害に依存し得る。本発明の画像診断法において用いるとき、静脈注射によって化合物を患者（例えば、ヒト）に投与してよい。製剤は、単位剤形で便利に提示されてよく、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製してよい。全ての方法は、本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、エステル、プロドラッグ若しくは溶媒和物（「活性成分」）を、１以上の副成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般的に、製剤は、液体担体若しくは微粉砕した固体担体又はこれらの両方と活性成分を均一且つ緊密に合わせ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。
【００５４】
経口投与に好適な製剤は、それぞれが所定の量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤、若しくは錠剤等の個別単位として；粉剤若しくは顆粒剤として；水性液体若しくは非水性液体の液剤若しくは懸濁剤として；又は水中油型液体エマルション若しくは油中水型液体エマルションとして提示してよい。また、活性成分は、ボーラス、舐剤、又はペースト剤として提示してもよい。
【００５５】
経口的に使用することができる医薬調製品としては、錠剤、ゼラチンで作製されるプッシュフィットカプセル剤に加えて、ゼラチン及び可塑剤（例えば、グリセロール又はソルビトール）で作製される軟質封入カプセル剤が挙げられる。錠剤は、任意で１以上の副成分と共に、圧縮又は成形することによって作製することができる。圧縮錠剤は、任意で結合剤、不活性希釈剤、又は滑沢剤、表面活性剤、又は分散剤と混合した、粉末又は顆粒等の自由流動形態の活性成分を好適な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末状化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製することができる。錠剤は、任意で、コーティングするか又は割線を入れてもよく、錠剤中の活性成分を徐放又は制御放出するように製剤化してよい。経口投与用の全ての製剤は、かかる投与に好適な投薬量でなければならない。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、並びに任意で安定剤と混合された活性成分を含有し得る。軟カプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール等の好適な液体に溶解又は懸濁していてよい。更に、安定剤を添加してもよい。糖衣錠の核は、好適にコーティングされる。この目的のために、濃縮糖溶液を用いてよく、これは、任意で、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有していてよい。様々な組合せの活性化合物の用量を同定又は特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに色素又は顔料を添加してもよい。
【００５６】
注入、例えば、ボーラス注入又は持続点滴による非経口投与用に化合物を製剤化してもよい。注入用製剤は、保存剤が添加された単位剤形、例えば、アンプル又は多用量容器で提示してよい。組成物は、油性又は水性のビヒクルの懸濁液、溶液、又はエマルション等の形態をとってよく、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有していてよい。製剤は、単位用量又は多用量容器、例えば、密封アンプル及びバイアルで提示してもよく、また、使用直前に滅菌液体担体、例えば、生理食塩水又はパイロジェンフリー滅菌水を添加するだけでよい、粉末形態又はフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即席注入溶液及び懸濁液は、既に記載した種類の滅菌粉剤、顆粒剤、及び錠剤から調製してよい。
【００５７】
非経口投与用の製剤としては、抗酸化剤、バッファ、静菌剤、及び前記製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含有していてよい活性化合物の水性及び非水性（油性）滅菌注入溶液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含んでいてよい水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等の懸濁液の濃度を増大させる物質を含有していてよい。任意で、前記懸濁液は、好適な安定剤又は高濃度溶液を調製できる程度まで化合物の溶解度を増大させる剤を含有していてもよい。
【００５８】
既に記載した製剤に加えて、化合物は、デポー製剤として製剤化してもよい。かかる長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与してよい。したがって、例えば、化合物は、好適な高分子物質若しくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中エマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、或いはやや難溶性である誘導体、例えば、やや難溶性である塩として製剤化してよい。
【００５９】
頬側又は舌下投与では、化合物は、従来の方法で製剤化された錠剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、又はゲル剤の形態をとってよい。かかる組成物は、スクロース及びアカシア又はトラガカント等の風味基剤中に活性成分を含んでいてよい。
【００６０】
また、化合物は、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含有する、坐剤又は停留浣腸等の直腸内組成物に製剤化してもよい。
【００６１】
化合物は、局所的に、即ち、非全身投与によって投与してよい。これは、前記化合物が血流にそれ程入らないように、表皮又は頬側口腔に外用的に化合物を塗布すること、並びにかかる化合物を耳、眼、及び鼻に滴下することを含む。対照的に、全身投与は、経口、静脈内、腹腔内、及び筋肉内投与を指す。
【００６２】
局所投与に好適な製剤としては、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤、又はペースト剤等の炎症部位に皮膚を通じて浸透するのに好適な固体、液体、又は半固体の調製品、及び眼、耳、又は鼻に投与するのに好適な滴剤が挙げられる。活性成分は、局所投与の場合、製剤の０．００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％〜２重量％含まれ得る。しかし、製剤の１０％ｗ／ｗまで含まれ得るが、好ましくは、５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは、０．１％ｗ／ｗ〜１％ｗ／ｗ含まれる。
【００６３】
局所経路を介して、医薬組成物は、軟膏剤等の液体若しくは半液体の形態、又は粉剤等の固体の形態であってよい。また、高分子ミクロスフィア等の懸濁化剤、又は制御放出を可能にする高分子パッチ及びヒドロゲルの形態であってもよい。この局所組成物は、無水形態、水性形態、又はエマルションの形態であってよい。化合物は、組成物の総重量に対して、一般的に０．００１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜１重量％の濃度で局所的に用いられる。
【００６４】
吸入による投与の場合、化合物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、又はエアロゾルスプレーを送達する他の従来の手段から便利に送達することができる。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適な気体等の好適な噴射剤を含んでいてよい。加圧エアロゾルの場合、定量を送達するための弁を設けることによって投薬単位を決定することができる。或いは、吸入又はガス注入によって投与する場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば、化合物とラクトース又はデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってよい。粉末組成物は、単位剤形、例えば、カプセル剤、カートリッジ、ゼラチン、又は吸入器若しくは注入器を用いてそれから粉末を投与することができるブリスターパックで提示してもよい。
【００６５】
好ましい単位投薬製剤は、以下に記載する有効な用量又はその適切な比率の活性成分を含有するものである。
【００６６】
特に上記した成分に加えて、本明細書に記載する製剤は、対象となる製剤の種類に関連して当技術分野において従来用いられている他の剤を含んでいてよく、例えば、経口投与に好適なものは、着香剤を含んでいてよい。
【００６７】
化合物は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で経口的に又は注射を介して投与してよい。成人の用量範囲は、一般的に、５ｍｇ／日〜２ｇ／日である。錠剤又は個別の単位で提供される他の提示形態は、便利なことには、かかる投薬量で又はその倍数として有効な化合物の量を含有していてよく、例えば、単位は、５ｍｇ〜５００ｍｇ、通常、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇを含有する。
【００６８】
化合物は、１回〜３回の服用において、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の日用量で投与することができる。更に、化合物は、組成物の重量に対して、一般的に０．００１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜１重量％の濃度で全身的に使用することができる。
【００６９】
単一剤形を作製するために担体材料と合わせてよい活性成分の量は、治療されるホスト及び具体的な投与モードに依存して変動する。
【００７０】
化合物は、様々なモード、例えば、経口、局所、又は注射によって投与してよい。患者に投与される化合物の正確な量は、主治医の責任である。任意の具体的な患者に対する特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組合せ、治療される正確な障害、及び治療される徴候又は病態の重篤度を含む様々な要因に依存する。また、投与経路は、病態及びその重篤度に依存して変動し得る。
【００７１】
特定の場合、別の治療剤又は診断剤と組み合わせて、本明細書に記載する少なくとも１つの化合物（又はその薬学的に許容可能な塩、エステル、又はプロドラッグ）を投与することが適切であり得る。ほんの一例として、本明細書に記載する化合物のうちの１つを投与したときに患者が経験する副作用のうちの１つが高血圧である場合、初期治療剤と組み合わせて抗高血圧剤を投与することが適切であり得る。又はほんの一例として、本明細書に記載する化合物のうちの１つの治療的有効性をアジュバントの投与によって強化することができる（即ち、アジュバントは、単独では、最低限の治療効果しか有し得ないが、別の治療剤と組み合わせると、患者に対する治療効果全体が強化される）。又はほんの一例として、同様に治療効果を有する別の治療剤（これも治療レジメンを含む）と共に本明細書に記載する化合物のうちの１つを投与することによって、患者が経験する効果を増大させることができる。ほんの一例として、本明細書に記載する化合物のうちの１つを投与することを含む疼痛の治療においては、疼痛のための別の治療剤を患者に投与することによっても治療効果を増大させることができる。いずれの場合も、治療される疾患、障害、又は病態にかかわらず、患者が経験する効果全体が、単に２つの治療剤の相加効果である場合もあり、患者が相乗効果を経験する場合もある。
【００７２】
可能な併用療法の非限定的な具体例としては、不活性若しくは活性化合物、又は湿潤剤、風味増強剤、保存剤、安定剤、湿度調整剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調節剤、乳化剤、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂ遮断剤、抗酸化剤、色素脱失剤（例えば、ヒドロキノン又はコウジ酸）、軟化剤、保湿剤（例えば、グリセロール、ＰＥＧ４００、又は尿素）、抗脂漏剤又は抗にきび剤（例えば、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステアミン、これらの塩若しくはこれらの誘導体、又は過酸化ベンゾイル）、抗生物質（例えば、エリスロマイシン及びテトラサイクリン）、化学療法剤（例えば、パクリタキセル）、抗真菌剤（例えば、ケトコナゾール）、毛髪の再成長を促進する剤（例えば、ミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピリミジン３−オキシド）、非ステロイド性抗炎症剤（カロテノイド、特にｐ−カロテン）、抗乾癬剤（例えば、アントラリン及びその誘導体、エイコサ−５，８，１１，１４−テトライン酸及びエイコサ−５，８，１１−トリイン酸、並びにこれらのエステル及びアミド、レチノイド、例えば、天然又は合成のコルチコステロイド又はエストロゲンであってよいＲＡＲ又はＲＸＲ受容体リガンド、アルファ−ヒドロキシ酸及びａ−ケト酸又はこれらの誘導体、例えば、酢酸、リンゴ酸、クエン酸、及びこれらの塩、アミド、又はエステル、或いはｐ−ヒドロキシ酸又はその誘導体、例えば、サリチル酸及びその塩、アミド、又はエステル）、イオンチャネルブロッカー（例えば、カリウムチャネルブロッカー）を含む他の薬物と共に化合物を使用することが挙げられ、或いは、より具体的には、免疫系に干渉することが知られている医薬と組み合わせる医薬組成物の場合、抗痙攣剤としては、トピラメート、トピラメートのアナログ、カルバマゼピン、バルプロ酸、ラモトリジン、ガバペンチン、フェニトイン等、及びこれらの混合物又は薬学的に許容可能な塩が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、化合物に本質的に備わっている有利な特性が、予想される添加によって悪影響を受けないか又は実質的に受けないように、注意を払ってこれら組成物に添加する他の化合物を選択する。
【００７３】
いずれの場合も、複数の治療剤又は診断剤を任意の順序で又は更には同時に投与してよい。同時の場合、複数の治療剤又は診断剤を単一の一体型で又は複数の形態で提供してよい（ほんの一例として、単一の丸剤又は２個の別個の丸剤のいずれかとして）。治療剤又は診断剤のうちの１つを複数回投与してもよく、両方を複数回投与してもよい。同時ではない場合、複数回投与間のタイミングは、数分間〜４週間の範囲の任意の期間であってよい。
【００７４】
したがって、別の態様では、かかる治療を必要としている被験体（例えば、ヒト又は動物）における疾患、障害、病態、又は症状を診断又は治療する方法であって、当技術分野において公知である前記障害を治療するための少なくとも１つの追加の剤と組み合わせて、前記疾患、障害、病態、又は症状を低減又は予防するのに有効な量の化合物を前記被験体に投与する工程を含む方法を本明細書に提示する。
【実施例】
【００７５】
前述の例は本発明の単なる例示であることが理解される。使用される物品及び／又は方法に対して特定の変更を行ってもよく、それでも本発明の目的は達成される。かかる変更は、請求する発明の範囲内であると考えられる。
【００７６】
実施例１．  げっ歯類モデルにおけるＴＢＩ前後の遺伝子アレイ解析
Ｓｙｓｔｅｍ  ｘｃ−は、２つの異なるサブユニットｘＣＴ及び４Ｆ２ｈｃ（ＳＬＣ３Ａ２）で構成されるシスチン／グルタミン酸アンチポータであり、ヘテロマーアミノ酸トランスポータ（ＨＡＴ）ファミリーのメンバーである。生理学的条件下では、Ｓｙｓｔｅｍ  ｘｃ−は、原形質膜を貫通する細胞外のＬ−シスチンと細胞内のＬ−グルタミン酸との交換を媒介する。ＣＮＳでは、Ｌ−シスチンの流入がグルタチオン（ＧＳＨ）の生合成における臨界律速段階を表し、一方、Ｌ−グルタミン酸の同時流出は、興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）シグナル伝達を開始させるための興奮性神経伝達物質放出の非小胞性経路として機能する。ＧＳＨは、生理学的細胞代謝の結果発生する反応性酸素種（ＲＯＳ）の捕捉を担当する重要な細胞抗酸化剤として機能する。したがって、Ｓｙｓｔｅｍ  ｘｃ−活性の全般的喪失は、細胞内グルタチオンレベルの低下につながり、ＣＮＳが細胞ＲＯＳの増加に起因して酸化的ストレスを受けやすくなる。ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、及びカタラーゼ等の他の抗酸化剤系がＲＯＳを最初に代謝する可能性があるが、個体の加齢と共にこれら代償的酵素の捕捉効率が失われるので、ＲＯＳが長期間に亘って増加する。グルタチオンが失われ、低効率で作用する抗酸化剤系を支持すると、ＲＯＳが蓄積することによって、ＣＴＥにつながる神経変性事象の段階的プロセスに関連する神経病態につながる克服できない酸化的ストレスが生じることがある。
【００７７】
動物実験において、本発明者らは、１回のＴＢＩによって、重要なトランスポータタンパク質サブユニットであるｘＣＴ（ＳＬＣ７Ａ１１；図１〜３）が急速に、全般的に、長期間失われることを見出した。時間と共に（ＴＢＩの４６日間後）ｘＣＴのレベルは徐々に回復するが、以前のＴＢＩレベルに達することはなく、このことは、損傷がｘＣＴの長期喪失を誘導することを示唆する。ｘＣＴは、Ｓｙｓｔｅｍ  ｘｃ−の触媒サブユニットであり、脳におけるグルタチオン（ＧＳＨ）の生合成を担当する遍在性アンチポータである。ＧＳＨは、正常代謝又は神経損傷の結果発生する傷害性反応性酸素種（ＲＯＳ）を捕捉する主な細胞抗酸化剤である。
【００７８】
実施例２：酸化的ストレス及び抗酸化剤防御遺伝子のｍｉＲＮＡ発現プロファイル
この研究を更に詳しく調べるために、本発明者らは、遺伝子アレイ解析を実施して、ＧＳＨの喪失を補うために酸化的ストレス遺伝子がアップレギュレートされるかどうかを判定した（図４）。この試験から、本発明者らは、正反対の結果を見出した；ＴＢＩによって、重要な抗酸化剤防御遺伝子がダウンレギュレートされ、ニューロンがＲＯＳによる損傷を非常に受けやすくなった。ｘＣＴサブユニット及び抗酸化剤防御遺伝子がＴＢＩによってダウンレギュレートされる機序を明らかにするための取り組みにおいて、本発明者らは、側方流体衝撃ＴＢＩモデルにおける神経損傷後のラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｕｓ）の皮質脳組織に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現プロファイル実験を実施した（図５）。以前得られた知見に鑑みて、本発明者らは、抗酸化剤防御遺伝子及びｘＣＴと特異的に相互作用するｍｉＲＮＡを選択した。ＴＢＩの結果著しく（２倍〜１３倍）アップレギュレート又はダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡの特定のクラスタが見出された（表３）。更なる実験は、これら高度に保存されているｍｉＲＮＡの全てがＴＢＩ研究において新規であり、血漿中で検出できることを示す。
【表３】
2018518147.tif 000007
【００７９】
実施例３：ヒト末梢血漿のｍｉＲＮＡ発現プロファイル
各被験体から血液約３ｍＬを回収し、下記の通り処理した。製造業者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（５０）プロトコルに従って血漿２００μＬから全ＲＮＡを単離し、調製した。単離した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを調製した。Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット及び特注のｍｉＳｃｒｉｐｔ  ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙを用いてＢｉｏ−Ｒａｓｄ  ｉＱ５サイクラーにおいてリアルタイムＰＣＲを実施した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒを用いてデータ解析を実施した。以下の血漿サンプルが得られた。
【表４】
2018518147.tif 000008
【００８０】
全ての血漿サンプルは、モンタナ大学の治験審査委員会のプロトコルに従って自由意志による寄付によって得られた。ランダムに（コントロール群）、フットボール又はサッカーのスポーツに参加している学生運動選手、及び急性（７２時間以内）ＴＢＩ又は慢性（７２時間超）ＴＢＩに罹患していることが分かっている被験体からサンプルを入手した。
【００８１】
提示するデータは、サンプルを比較したときの倍数変化、９５％ＣＩ、及びｐ値を示す。データの初期解析は、急性ＴＢＩ後に幾つかのｍｉＲＮＡレベルが増加する強い傾向が存在することを示し、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、及びｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐはコントロールと急性ＴＢＩとの間のスクリーニングにおいて有意差を示す。また、コントロールとサッカー選手との間では、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、及びｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐにおいて有意差がみられた。データの多くは、有意である（即ち、ｐ＜０．０５）傾向がある。また、データは、ｍｉＲＮＡレベルの変化に対して性別が強い影響を及ぼし得ることを示唆している（フットボール選手対サッカー選手）。興味深いことに、慢性ＴＢＩ群の解析は、ｍｉＲＮＡのレベルが代償手段として潜在的に回復し、低下することを示唆し、この知見は、このパネルを用いて急性ＴＢＩと慢性ＴＢＩとを区別するために、このパネルを更に使用することができることを示唆する。
【００８２】
全ての実施形態
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が参照することによって援用されていることを具体的且つ個別に示すかのように、参照によって本明細書に援用される。前述の発明は、明確に理解させるために例示及び実例として若干詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなしに特定の変更及び改変を行い得ることが、本発明の教示に鑑みて当業者には容易に明らかになるであろう。
【００８３】
他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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