(57)【要約】標本による３Ｄ細胞分類のための細胞学的解析試験。方法は、細胞を標本から単離し保存することと、富化済み細胞を光媒体に埋め込む前に細胞を富化させることとを含む。埋め込んだ細胞は、キャピラリーチューブ内に注入され、チューブ内で、疑似投影図観察サブシステムの視野内に細胞が現れるまで圧力が印加されて、疑似投影画像を取得する。キャピラリーチューブは、チューブ軸を中心に回転して、埋め込んだ細胞それぞれについて疑似投影画像のセットを提供し、疑似投影画像のセットは、再構成されて、３Ｄ細胞再構成図のセットを生成する。参照細胞が分類され、列挙され、第２の細胞分類器が、ターゲット細胞を検出する。適正分類器は、列挙される参照細胞の閾値に対して参照細胞の数を比較して、標本適正を判定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、標本からの３Ｄ細胞分類のための細胞学的解析試験：
複数の細胞を前記標本から単離し保存する；
前記複数の細胞を富化し、複数の富化細胞を生産する；
前記複数の富化細胞を光媒体に埋め込む；
前記複数の埋め込んだ富化細胞をキャピラリーチューブ内に注入する；
疑似投影図観察サブシステムの視野内に少なくとも１の埋め込んだ細胞が現れるまで、前記複数の埋め込んだ富化細胞に圧力を印加する；
前記疑似投影図観察サブシステムを用いて、前記視野内の前記少なくとも１の埋め込んだ細胞の少なくとも１の疑似投影画像を取得する；
前記キャピラリーチューブをチューブ軸を中心に回転し、前記疑似投影図観察サブシステムを用いた、異なる視界におけるさらなる疑似投影画像を生成し、それぞれの画像化された埋め込まれた細胞のための疑似投影画像のセットを提供する；
それぞれの画像化された埋め込まれた細胞を、前記疑似投影画像のセットからのデータを用いて再構成し、３Ｄ細胞再構成のセットを生産する；
生体標本分類器を操作して、前記３Ｄ細胞再構成のセットから、参照細胞を検出する；
前記標本の前記検出された参照細胞を列挙する；
受信者動作カーブ（ROC）より特徴付けられる、予め決められた一細胞の感度値および、予め決められた一細胞の特異値で、第二の細胞分類器を操作して、標的細胞を検出する；および
適性分類器を操作し、列挙された参照細胞の閾値に対して、参照細胞の数を比較し、標本適性を判定する。
【請求項２】
前記参照細胞が正常気管支上皮細胞を含み、前記標的細胞が異常肺細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記標的細胞が、異常扁平上皮細胞、腺癌細胞、気管支肺胞上皮癌細胞、異常神経内分泌細胞、小細胞癌細胞、非小細胞癌細胞、肺円柱細胞、腫瘍細胞、新生細胞及び気管支肺胞上皮癌細胞、並びに痰中に見出される他の細胞及び対象物からなる群より選ばれる請求項１の方法。
【請求項４】
前記閾値が統計的にあらかじめ決められた範囲である請求項１の方法。
【請求項５】
前記閾値が２５０から８００の正常気管支上皮細胞の範囲である請求項１の方法。
【請求項６】
特異度および感度のための適性分類器訓練を用いた生体標本分類器を生成することをさらに含む請求項１の方法、ただし感度は標的細胞に関連し、特異度は前記標本の非希望細胞に関する。
【請求項７】
適性分類器訓練は３次元画像区画化アルゴリズムを含む対象物を記述する特徴測定セットを用いて実行される請求項５の方法。
【請求項８】
前記対象物は核を含む細胞であり、３次元画像区画化アルゴリズムは背景から全細胞を、また、細胞から核を分離する請求項７の方法。
【請求項９】
適性分類器訓練は、細胞核、細胞質、及び細胞核小体、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他の形態要素からなる群より選択される特徴を含む特徴測定セットを用いて実行される請求項７の方法。
【請求項１０】
特異度および感度のための分類器訓練を用いた前記第二の細胞分類器の生成をさらに含む請求項１の方法。
【請求項１１】
分類器訓練が異常細胞と正常対象物からの特徴を用いて実行される請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記標本を痰標本から得ることを含む請求項１の方法。
【請求項１３】
前記痰標本を富化することをさらに含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記痰標本の富化は蛍光活性化細胞ソーティングまたは免疫磁気富化を用いることを含む請求項１３の方法。
【請求項１５】
以下を含む患者のために肺癌を示す試験を実行する方法：
前記患者から痰標本を得る；
前記標本から複数の細胞を単離し保存する；
前記複数の細胞を富化し、複数の富化細胞をえる生産する；
前記複数の富化細胞を光媒体に埋め込む；
前記複数の埋め込んだ富化細胞をキャピラリーチューブ内に注入する；
疑似投影図観察サブシステムの視野内に少なくとも１の埋め込んだ細胞が現れるまで、前記複数の埋め込んだ富化細胞に圧力を印加する；
前記疑似投影図観察サブシステムを用いて、前記視野内の前記少なくとも１の埋め込んだ細胞の少なくとも１の疑似投影画像を取得する；
前記キャピラリーチューブをチューブ軸を中心に回転し、前記疑似投影図観察サブシステムを用いた、異なる視界におけるさらなる疑似投影画像を生成し、それぞれの画像化された埋め込まれた細胞の疑似投影画像のセットを提供する；
それぞれの埋め込まれた細胞を、前記疑似投影画像のセットからのデータを用いて再構成し、３Ｄ細胞再構成のセットを生産する；
生体標本分類器を操作して、前記３Ｄ細胞再構成のセットから、参照細胞を検出する；
前記標本の前記検出された参照細胞を列挙する；
受信者動作カーブ（ROC）より特徴付けられる、予め決められた一細胞の感度値および、予め決められた一細胞の特異値で、第二の細胞分類器を操作して、標的細胞を検出する；および
列挙された正常気管支上皮細胞の閾値に対して、正常気管支上皮細胞の数を比較するために適性分類器を操作する。
【請求項１６】
さらに前記患者に対し低線量ＣＴを行うことを含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記閾値が統計的にあらかじめ決められた範囲である請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記閾値が２５０から８００の正常気管支上皮細胞の範囲である請求項１６の方法。
【請求項１９】
特異度および感度のための分類器訓練を用いた生体標本分類器の生成することをさらに含む請求項１５の方法。
【請求項２０】
分類器訓練は、背景から全細胞を、また、細胞から核を分離する３次元画像区画化アルゴリズムを含む前記細胞を記述する特徴測定セットを用いて実行される請求項１９の方法。
【請求項２１】
分類器訓練は細胞核、細胞質、及び細胞核小体、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他の形態要素からなる群より選択される特徴を含む特徴測定セットを用いて実行される請求項１９の方法。
【請求項２２】
特異度および感度のための分類器訓練を用いた前記異常細胞分類器を生成することをさらに含む請求項１５の方法。
【請求項２３】
分類器訓練が異常細胞と正常対象物からの特徴を用いて実行される請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記標本を痰標本から得ることを含む請求項１５の方法。
【請求項２５】
前記痰標本を富化することをさらに含む請求項１５の方法。
【請求項２６】
前記痰標本の富化は蛍光活性化細胞ソーティングまたは免疫磁気富化を用いる請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記標的細胞が、異常扁平上皮細胞、腺癌細胞、気管支肺胞上皮癌細胞、異常神経内分泌細胞、小細胞癌細胞、大細胞癌細胞、肺円柱細胞、腫瘍細胞、新生細胞及び気管支肺胞上皮癌細胞、並びに痰中に見出される他の細胞及び対象物からなる群より選ばれる請求項１５の方法。
【請求項２８】
前記参照細胞が正常気管支上皮細胞を含み、前記標的細胞が異常肺細胞を含む、請求項１５の方法。
【請求項２９】
以下を含む標本からの３D細胞分類のための細胞学的解析試験システム
複数の細胞を前記標本から単離し保存する手段；
前記複数の細胞を富化する手段；
１以上の富化細胞を光媒体に埋め込む手段；
１以上の埋め込まれた細胞をキャピラリーチューブ内に注入する手段；
前記１以上の埋め込まれた細胞に、疑似投影図観察サブシステムの視野内に現れるまで、圧力をかける手段；
前記疑似投影図観察サブシステムを用いて、少なくとも視野内の埋め込んだ細胞の少なくとも１の疑似投影画像を取得する手段；
前記疑似投影図観察サブシステムを用い、異なる視界におけるさらなる疑似投影画像を生成し、それぞれの埋め込まれた細胞のための疑似投影画像のセットを提供するために、前記キャピラリーチューブをチューブ軸を中心に回転する手段；
それぞれの埋め込まれた細胞を、前記疑似投影画像のセットからのデータを用いて再構成し、３Ｄ細胞再構成のセットを生産する手段；
生体標本分類器を操作して、前記３Ｄ細胞再構成のセットから、参照細胞を検出する手段；
前記検出された標本の参照細胞を列挙する手段；
標的細胞を検出するために、予め決められた一細胞の感度値および、予め決められた一細胞の特異値で、受信者動作カーブ（ROC）より特徴付けられる、第二の細胞分類器を操作する手段；および
列挙された参照細胞の閾値に対して、参照細胞の数を比較し、標本適性を判定するために、適性分類器を操作する手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び細胞以下スケールの光トモグラフィー（optical tomography：光断層撮影）に関する。より詳細には、本発明は、癌検出試験システムによって解析される試料の適正を判定するためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、米国において２番目に多い癌であり、最も致死率が高い（非特許文献４）。米国（ＵＳ）において３千百万人を超える患者が、主に喫煙歴により肺癌の発症について高いリスクにある。毎年約１６００００人の米国の患者が、肺癌で死亡している（非特許文献４）。肺癌のスクリーニング方法の開発のために数多くの試みが行われてきた。痰又は気管支洗浄標本に基づく伝統的な細胞学的方法は、比較的感度が低いことが示されており、癌を有する患者の約４０％〜６０％だけが陽性結果を有し、その大部分が気管支内扁平上皮癌によるものである（非特許文献５、６、７）。細胞学検査に関連する１つの明るい材料は、この手順の比較的高い（ほぼ９８％を超える）陽性的中率であり、陽性試験が疾病の信頼性のある指標となることを意味する（非特許文献７）。
【０００３】
メディケア・メディケイドサービスセンター（ＣＭＳ：Centers for Medicare/Medicaid Services）は、最高リスクの患者における肺癌スクリーニングのための低線量ＣＴ  Ｘ線撮影スキャニング（ＬＤＣＴ：low dose CT radiographic scanning）について償還カバレッジ（reimbursement coverage）を最近認可し（非特許文献８）、また、米国予防サービスタスクフォース（US Preventive Services Task Force）並びに幾つかの他の専門及び擁護組織は、高リスク集団におけるスクリーニングを推奨している（非特許文献９，１０）。全米肺癌スクリーニング試験（National lung Cancer Screening Trial）の結果は、ＬＤＣＴの使用が、従来の胸部Ｘ線と比較して肺癌による致死率を２０％減少させ得ることを示した（非特許文献１０）。ＬＤＣＴは、（３回の連続するＬＤＣＴスキャン後に）肺腫瘍の検出については感度があるが、結節を有する患者では９６％もの偽陽性結果を伴う低い特異度を有し、低い陽性的中率をもたらす（非特許文献１１）。さらに、継続するサーベランス及び介入フォローアップに関連するコスト及び罹患率／致死率を、特に、偽陽性集団において考慮しなければならない（非特許文献１２）。したがって、遥かに高い特異度を有する無侵襲トリアージ試験（早期肺癌検出試験等）の付加は、ＬＤＣＴ検査で陽性と出る患者を管理する可能性を有する。さらに、試験の感度が同様に高い場合、この試験は、独立した１次肺癌スクリーニング試験としても有用である可能性を有する。
【０００４】
関連技術において、２次元形態学的パラメーターに基づく自動及び半自動アルゴリズム的分類器は、子宮頸部細胞診標本について１９９０年代以来、広く臨床使用されてきた。こうしたデバイスの１つは、フォーカルポイントプライマリスクリーニングシステム（FocalPoint Primary Screening System）（Becton-Dickinson、ニュージャージー州フランクリンレイク所在）として現在販売されている（非特許文献１、２）。フォーカルポイントの分類器は、ラベリングプロセスにおいて人間の細胞の評価に対して訓練され、その後、アルゴリズム的分類器に通知し、新たに提示される細胞（及び症例）に異常確率を与えることを可能にするものである。指定済みスコア閾値を上回る個々の細胞及び／又は症例は、その閾値を下回る細胞及び／又は症例に比べて、異常であることについてのリスクが遥かに高く、したがって、細胞学者による的を絞ったレビューに基づいて選択され得る（非特許文献１、２）。
【０００５】
この概念の３次元形態解析への拡張は、統計的に頑健であり、したがって、精度及び臨床性能を改善するかなり多くの数の測定パラメーターについての可能性を提供する。３次元解析は、細胞レベル及び細胞レベル以下の複雑さに対して、現在使用されている細胞診デバイスができるよりも遥かに高い解像度を提供する（非特許文献３）（）。肺癌の高い罹患率を考慮すると、肺癌を早期段階で検出するための肺癌検出試験についての必要性がある。こうした肺癌検出試験は、肺癌用の１次スクリーナーとしての使用の可能性と共に、ＬＤＣＴだけによる偽陽性及びスクリーニングのコストを低減するためＬＤＣＴを補助的に使用する試験としての可能性を有する。
【０００６】
こうした早期肺癌検出システムを求めて、光トモグラフィーを使用する生体細胞の３Ｄ撮像における進歩は、Nelsonによって開発されており、例えば２００３年２月１８日に発行された、「Apparatus and Method For Imaging Small Objects in a Flow Stream Using Optical Tomography」という名称の米国特許第６，５２２，７７５号（特許文献１）に開示され、その全開示は引用することにより本明細書の一部をなす。本分野における更なる主要な開発は、Fauver他による、２０１０年６月１５日に発行された、「Method and Apparatus for Pseudo-projection Formation for Optical Tomography」という名称の米国特許第７，７３８，９４５号（特許文献２）及びFauver他による、２０１１年３月１５日に発行された、「Focal Plane Tracking for Optical Microtomography」という名称の米国特許第７，９０７，７６５号（特許文献３）において教示され、特許文献２及び特許文献３の全開示は、同様に引用することにより本明細書の一部をなす。それらの特許の教示に基づいて構築して、従来の形態学的細胞解析の動作特性を大幅に改善する可能性を有する測定利点を提供するためにVisionGate, Inc.（アリゾナ州フェニックス所在）によって早期肺癌検出技術が開発された。こうした早期肺癌検出試験に関連する新しいシステム及び方法が、本明細書で述べられる。
【０００７】
こうした光トモグラフィーシステムにおける処理は、標本の調製で開始する。通常、患者から採取される標本は、病院又は診療所から受取られ、非診断要素を除去するために処理され、固定され、その後、染色される。染色済み標本は、その後、オプティカルゲルと混合され、マイクロキャピラリーチューブに挿入される。標本内の細胞等の対象物の画像は、光トモグラフィーシステムを使用して生成される。結果として得られる画像は、「疑似投影画像（pseudo-projection images）」と呼ばれる異なる複数の視点からの拡張された被写界深度画像のセットを含む。疑似投影画像のセットは、逆投影技法及びフィルタリング技法を使用して再構成されて、対象の細胞の３次元再構成をもたらし得る。３つ全ての次元においてアイソメトリックの又はほぼ等しい解像度を有することは、特に、定量的画像解析にとって３Ｄトモグラフィー細胞撮像における利点である。
【０００８】
そして、３次元再構成は、対象の構造、分子、又は分子プローブの定量化及び場所の決定を可能にするために、解析に利用可能であるままである。生体細胞等の対象物は、少なくとも１つの染色剤又は標識分子プローブによってラベル付けされてもよく、また、このバイオマーカーの測定量及び場所は、限定はしないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、及び膵癌等の種々の癌を含む、細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらす場合がある。
【０００９】
残念ながら、現在利用可能な試験技法は、標本が十分に解析されたかどうかを判定する方法の欠如によって妨げられている。異常細胞が、正常細胞と共に、所与の器官系の上皮から流れるため、標本が十分にサンプリングされたかどうかを判定するための最良のマーカーをこれらの正常細胞が提供することが本発明において発見された。本明細書で開示する新規な技法を使用して、これらの条件を満たす標本が、適正標本であると判定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，５２２，７７５号
【特許文献２】米国特許第７，７３８，９４５号
【特許文献３】米国特許第７，９０７，７６５号
【特許文献４】米国特許第８，１５５，４２０号
【特許文献５】米国特許第８，２５４，０２３号
【特許文献６】米国特許第７，８３５，５６１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Wilbur DC, Prey MU, Miller WM, Pawlick GF, Colgan TJ. The AutoPap System for Primary Screening in Cervical Cytology: Comparing the Results of a Prospective, Intended-Use Study with Routine Manual Practice. Acta Cytol 1998; 42:214-20.
【非特許文献２】Wilbur DC, Black-Schaffer WS, Luff RD, Abraham KP, Kemper C, Molina JT, Tench WD. The Becton Dickinson FocalPoint GS Imaging System Clinical Trials Demonstrate Significantly Improved Sensitivity for the Detection of Important Cervical Lesions. Am J Clin Pathol 2009; 132:767-75.
【非特許文献３】Meyer M, Hayenga J, Neumann T, Katdare R, Presley C, Steinhauer D, Bell T, Lancaster C, Nelson AC. The Cell-CT 3D Cell Imaging Technology Platform Enables the Detection of Lung Cancer Using the Non-Invasive LuCED Sputum Test, (submitted Ca Cytopathol)
【非特許文献４】American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2015. Atlanta, GA: American Cancer Society; 2015. Accessed at cancer.org/ on March 10, 2015.
【非特許文献５】Pilotti S, Rilke F, Gribaudi G, Ravasi GL. Sputum cytology for the diagnosis of carcinoma of the lung. Acta Cytol. 1982; 26:649-54.
【非特許文献６】Sing A, Freudenberg N, Kortsik C, Wertzel H, Klosa B, Hasse J. Comparison of the sensitivity of sputum and brush cytology in the diagnosis of lung carcinomas. Acta Cytol. 1997; 41:399-408.
【非特許文献７】Van Rensburg A, Neethling GS, Schubert PT, Koegelenberg CFN, Wright CA, Bollinger CT, Bernasconi M, Diacon AH. Impact of routine sputum cytology in a population at high risk for bronchial carcinoma. Int J Tuberc Lung Dis. 2014; 18:607-12. Press release: National Coverage Determination (NCD) for Screening for Lung Cancer with Low Dose Computed Tomography (LDCT). Baltimore, MD: Centers for Medicare and Medicaid Services; 2015. Accessed at cms.gov on March 10, 2015.
【非特許文献８】RadiologyInfo.org. Lung Cancer Screening. Oakbrook, IL: Radiologic Society of North America/American College of Radiology; 2015. Accessed at radiologyinfo.org on March 10, 2015.
【非特許文献９】Moyer VA, on behalf of the U.S. Preventive Services Task Force. Screening for Lung Cancer: U.S. Preventive Services Task Force Recommendation Statement. Ann Intern Med. 2014; 160:330-8.
【非特許文献１０】The National Lung Screening Trial Research Team. Reduced lung-cancer mortality with low dose computed tomographic scanning. N Engl J Med. 2011; 365:395-409
【非特許文献１１】Bach PB, Mirkin JN, Oliver TK, Azzoli CG, Berry DA, Brawley OT, et al. Benefits and harms of CT screening for lung Cancer. A systematic review. JAMA. 2012;307:2418-29
【非特許文献１２】Deans, S. The Radon Transform and some of its applications. Malabar: Dover, 2007.
【非特許文献１３】Raswiki. Maximum intensity projection (MIP). Retrieved from Radiopaedia.org: [Accessed March 19, 2015]
【非特許文献１４】Dartmouth. (2004). Cilia and Flagella. Retrieved from www.dartmouth.edu: URL dartmouth.edu [Accessed March 19. 2015]
【非特許文献１５】Meyer M, Fauver M, Rahn JR, Neumann T, Patten F, Seibel E, Nelson A. Automated cell analysis in 2D and 3D: A comparative study. Pattern Recognition, 2009; 42(1):141 -146.
【非特許文献１６】Meyer M, Patten F, Presley C, Neumann T, Nelson A. Three- Dimensional Cellular Morphometry: A New Horizon for Cytology and Cancer Detection. Journal of the American Society of Cytopathology, 2012; 1(1):6-7.
【非特許文献１７】Schapire R, Freund Y. Boosting, foundations and algorithms. Cambridge: MIT press, 2012.
【非特許文献１８】Breiman, L. Random Forests. Machine Learning, 2001; 45(1):5-32.
【非特許文献１９】Geisser, S. Predictive Inference. New York: Chapman and Hall, 1993
【非特許文献２０】Clopper C, Pearson E. The use of confidence fiducial limits illustrated in the case of the binomial. Biometrika, 1934; 26(4):404-413.
【非特許文献２１】Mody, D. Retrieved from cap.org: [Accessed March 19, 2015]
【非特許文献２２】Meyer M, Katdare R, Presley C, Wilbur D, Neumann T, Hayenga J, et al. Early detection of lung cancer based on three-dimensional, morphometric analysis of cells from sputum. Journal of Clinical Oncology, 2014; 32:5s.
【非特許文献２３】Fauver M, Seibel E, Rahn JR, Meyer M, Patten F, Neumann T, Nelson A. Three-dimensional imaging of single isolated cell nuclei using optical projection tomography. Optics Express, 2005; 13(11):4210-4223.
【発明の概要】
【００１２】
この要約は、簡略化した形態で、以下で詳細の説明において更に述べられる概念の選択を導入するものである。この要約は、特許請求される主題の重要な特徴を識別することを意図されず、特許請求される主題の範囲を決定するときの補助として使用されることも意図されない。
【００１３】
標本からの３Ｄ細胞分類についての細胞学的解析試験が開示される。方法は、細胞を標本から単離し保存することと、富化済み細胞を光媒体に埋め込む前に細胞を富化させることとを含む。埋め込んだ細胞は、キャピラリーチューブ内に注入され、チューブ内で、疑似投影図観察サブシステムの視野内に細胞が現れるまで圧力が印加されて、疑似投影画像を取得する。キャピラリーチューブは、チューブ軸を中心に回転して、埋め込んだ細胞それぞれについて疑似投影画像のセットを提供し、疑似投影画像のセットは、再構成されて、３Ｄ細胞再構成図のセットを生成する。参照細胞が分類され、列挙され、第２の細胞分類器が、ターゲット細胞を検出する。適正分類器は、列挙される参照細胞の閾値に対して参照細胞の数を比較して、標本適正を判定する。
【００１４】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に述べられるが、本発明は、構成及び内容の両方に関して、図面と併せて行われる以下の詳細な説明から、その他の目的及び特徴と共に、より十分に理解され、認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】痰試料を解析するための肺癌試験の機能概要を概略的に示す図である。
【図２】肺癌試験システムで使用される３Ｄ光トモグラフィー撮像システムの基本システムコンポーネントを概略的に示す図である。
【図３】Ａ〜Ｃは、腺癌細胞の３Ｄ画像の単一斜視図である。
【図４】肺円柱細胞上の繊毛を示す図である。
【図５】適正分類器を含む痰試料を解析するための肺癌試験の機能ブロック図を概略的に示す図である。
【図６】異常細胞分類器についてのＲＯＣ曲線を示す図である。
【図７】適正について正常気管支上皮細胞の数に対する異常細胞を有する症例をプロットする曲線をグラフにて示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図面において、同一の参照符号は、同様の要素又はコンポーネントを識別する。図面における要素のサイズ及び相対位置は、必ずしも一定比例尺で描かれていない。例えば、種々の要素の形状及び角度は一定比例尺で描かれておらず、これらの要素の一部は、図面の視認性を改善するため任意に拡大され位置決めされる。さらに、描かれる要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関する何らかの情報を伝えることを必ずしも意図しているわけではなく、単に、図面における認識を容易にするために選択されている。
【００１７】
以下の開示は、癌解析で使用するための標本適正分類器を述べる。例示的な実施形態による方法及びシステムの幾つかの特徴は、図において挙げられ述べられる。他の例示的な実施形態による方法及びシステムが、図に示されるものと異なる更なる手順又は特徴を含み得ることが理解されるであろう。例示的な実施形態は、光トモグラフィー細胞撮像システムに関して本明細書で述べられる。しかし、これらの例が、原理を示すためのものであること、及び、本発明がそれに限定されないことが理解されるであろう。
【００１８】
本発明は、光トモグラフィーシステムによって処理される患者の痰を含む標本を使用する早期肺癌検出システムを提供し、光トモグラフィーシステムは、アイソメトリックでサブミクロンの解像度の３Ｄ細胞画像を生成し、その画像は、その後、自動化特徴抽出及び分類アルゴリズムによってインタロゲートされ、痰内の異常細胞を高精度で識別する。異常細胞が、痰内で希少であり、非診断汚染物質が豊富であるため、高感度でかつ非常に高い特異度で細胞検出が可能なシステムだけが、標本適正を保証しながら、効率的に痰内の肺癌検出を達成し得る。
【００１９】
現在開示されている光トモグラフィーシステムについて考えられる多くの用途が存在する。光トモグラフィーシステムは、新生細胞の収率が低い標本、又は、非新生細胞の背景と比較した場合に異常細胞を認識するのが難しい標本において、最も有利である。例としては、早期又は末梢肺癌の場合、血液中の循環する腫瘍細胞、及び、痰内の新生細胞の検出が挙げられる。本予備試験は、後者の用途を研究するものである。
【００２０】
定義
一般に、本明細書で使用するとき、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２１】
特許請求の範囲又は明細書における用語「含む、備える（comprising）」と共に使用するときの語「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、別途文脈が指示しない限り、１つ又は２つ以上を意味する。用語「約（about）」は、述べた値プラス若しくはマイナス測定誤差の余裕度、又は、測定方法が全く示されない場合、プラス若しくはマイナス１０％を意味する。特許請求の範囲における用語「又は（or）」の使用は、単に代替物を挙げることが明示的に指示されない限り、又は、代替物が相互に排他的である場合、「及び／又は（and/or）」を意味するために使用される。用語「含む、備える（comprise）」、「有する（have）」、「含む（include）」、及び「含む（contain）」（並びにそれらの変形）は、オープンエンド連結動詞であり、特許請求の範囲において使用される場合、他の要素の付加を許容する。
【００２２】
本明細書全体を通して、「一例（one example）」若しくは「例示的な実施形態（an example embodiment）」、「一実施形態（one embodiment）」、「実施形態（an embodiment）」、又はこれらの用語の組合せ及び／又は変形に対する参照は、その実施形態に関連して述べられる特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の場所における、フレーズ「一実施形態において（in one embodiment）」又は「実施形態において（in an embodiment）」の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適した方法で組合されてもよい。
【００２３】
「キャピラリーチューブ」は、その一般的に受入れられる意味を有し、概して５００ミクロン以下の内径を有する透明なマイクロキャピラリーチューブ及び等価な物品を含むことを意図される。
【００２４】
「Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォーム」は、本明細書で先に参照したNelson特許及びFauver特許の教示並びにそれらの教示の改良を組込んだ、アリゾナ州フェニックスのVisionGate, Inc.によって製造される光トモグラフィーシステムを指す。
【００２５】
「被写界深度」は、指定された特徴について許容できない画像ブラーが生成されるまで、焦点面をシフトすることができる光軸に沿う長さである。
【００２６】
「ＬｕＣＥＤ（商標）試験」は、本明細書で先に参照したNelson特許及びFauver特許の教示並びにそれらの教示の改良を組込んだ、アリゾナ州フェニックスのVisionGate, Inc.によって開発されたＣｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームを使用する早期肺癌試験を指す。
【００２７】
「対象物（object）」は、個々の細胞、物品、もの、又は他の実体を意味する。
【００２８】
「疑似投影図」は、光学系の固有の被写界深度より広い範囲のサンプリングされる容積を表す単一画像を含み、こうして形成される疑似投影画像は、固定視点からの或る範囲の焦点面画像の積算を含む。疑似投影図の概念は、特許文献２に教示される。
【００２９】
「標本」は、個々の患者からの単一の試験又は手続きから取得される完全な生成物（例えば、解析用に提出された痰、生検材料又は鼻腔スワブ）を意味する。標本は、１つ以上の対象物で構成されてもよい。標本診断の結果は症例診断の一部になる。
【００３０】
「試料」は、アリコート又は標本の全て又は一部を含む、解析の準備ができている完成した細胞調製物を意味する。
【００３１】
画像処理の文脈で使用される「閾値（threshold）」は、或る特徴の任意の測定可能な特性についての決定境界値を含む。閾値は、機器の仕様、許容可能な誤り率、統計量、又は受入れられるパターン認識原理による他の基準に従って予め決定されてもよい又は設定されてもよい。
【００３２】
画像処理の文脈で使用される「ボクセル（voxel）」は、３Ｄグリッド上の体素である。
【００３３】
概要
図１を参照すると、痰試料を解析するための肺癌試験システムの機能概要が概略的に示される。試験システム５は、痰標本収集１０用の装置及び方法、それに続く、例えばＬｕＣＥＤ（商標）試験等の早期肺癌検出のための試験１２を含む。早期肺癌試験１２は、標本染色及び富化１４、３Ｄ細胞撮像２０、３Ｄ細胞分類２２、及び異常候補細胞の臨床レビュー２５用の装置及び方法を更に含む。
【００３４】
痰収集は、通常、患者の家庭における自発的咳を通して又は診療所における誘発を通して行われる。痰は、例えば、白血球（white cell）及び口腔扁平上皮細胞の大部分を除去することによって汚染物質及び非気管支上皮細胞を除去するために処理される。富化済み標本は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォーム上で処理され、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームは、例えば、先に参照したNelson及びFauverに開示されるように、アイソメトリックでサブミクロンの解像度を有する真の３Ｄで細胞をデジタル的に撮像する。癌に関連するバイオシグネチャーは、３Ｄ細胞画像上で測定され、癌特性を有する少数の細胞を識別するために使用されるスコアへと結合される。これらの細胞は、その後、VisionGate, Inc.（アリゾナ州フェニックス所在）によって開発されたＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）レビューステーション等のレビューステーションを使用してマニュアルによる細胞学者のレビューのために表示される。レビューステーションは、視覚的表示を提供し、細胞学者が、細胞画像を２Ｄ及び３Ｄで観察して、特異的細胞候補について決定的な正常又は異常状態を確立することを可能にする。３次元（３Ｄ）細胞分類２２は、以下で本明細書において開示される技法を使用して実施されてもよい。
【００３５】
細胞撮像システム２０は、例えば、画像取込み中に生じる動きを補正するため、光学機械デバイスとインタフェースするパーソナルコンピューターによって実行されるコンピューターソフトウェアを通して実行されるプロセスを含む。ほとんどの細胞画像は、十分に再構成される方式でフィルタ補正逆投影から現れる。このアルゴリズムは、不十分に再構成された細胞を識別するため、その細胞は更なる処理から排除され得る。不十分な品質の再構成を検出するための方法の一例は、２０１２年４月１０日に発行され、「System and Method for Detecting Poor Quality in 3D Reconstructions」という名称の米国特許第８，１５５，４２０号（特許文献４）においてMeyer他によって教示され、その開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００３６】
肺癌スクリーニングプログラムの開発における早期試みは、喀痰細胞診（非特許文献７）に基づいており、喀痰細胞診は、非常に良好な特異度を有するが、疾病検出に対して不十分な感度（平均して約６０％）を示した。この経験は、痰が肺癌の検出にとって価値がないと一部の人に結論付けさせた。パラフィンブロック内に埋め込まれた痰を含む注意深い解析は、標本が、実際には癌患者の８６％において異常細胞を含むことを示した（非特許文献８）。連続する３日にわたる朝の咳による収集が最適結果をもたらした。更なる解析は、腫瘍履歴のタイプ、サイズ、段階、及び場所を含む全ての関連する臨床因子によって層状化された痰内に異常細胞が存在することを示した（非特許文献９）。これらの標本特性に基づいて、現在開示されている肺癌検出試験は、自発的咳による痰を使用するものである。初期評価は、Ｃｙｔｏｙｔ（Hologic（マサチューセッツ州マールボロ所在）又はよく知られているＳａｃｃｏｍａｎｎｏ法による痰固定を使用して満足のいく結果を示した。標本適正の問題は、痰細胞診にとっても重要である。痰喀出の容積を増加させる試みは、様々な成功を収めた。痰誘発（非特許文献１０、１１）は、粘液の生成を増加させて、総合的な適正試料を達成するのを助けた。
【００３７】
痰富化及び調製の例
肺癌検出試験の一例において、痰標本は、解析に先立って、処理の３つの段階：１）痰細胞単離及び凍結保存；２）蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ：fluorescence activated cell sorting）による富化；及び３）光トモグラフィー撮像システムの光学コンポーネントにインデックスマッチングされる光学オイル内への富化済み細胞の埋め込みを受ける。
【００３８】
凍結保存及びＦＡＣＳ富化
痰は、粘液溶解薬ジチオトレイトール（ＤＴＴ：dithiothreitol）（Fisher Scientific（マサチューセッツ州ウォルサム所在））によって処理される。長期貯蔵の場合、標本は、その後、４１μｍナイロンネットを通してろ過され、１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide）（Fisher Scientific（マサチューセッツ州ウォルサム所在））内で−８０℃に維持される。ろ過後、保存される標本の最大１００μＬのアリコートが、肺癌検出試験解析のために取出される。最初に、痰細胞は、下流の肺癌検出試験撮像のためにヘマトキシリン（Electron Microscopy Sciences（ペンシルベニア州ハットフィールド所在））で染色される。細胞は、その後、気管支上皮細胞について富化させると共に、汚染性炎症細胞（好中球及びマクロファージ）を枯渇させるために選択される蛍光コンジュゲートを含む抗体カクテルで処理される。抗サイトケラチンＦＩＴＣコンジュゲートカクテル（Cell Signaling（マサチューセッツ州ダンバース所在））は、正常及び悪性の両方の上皮細胞において発現するサイトケラチンをターゲットにする。抗ＣＤ４５−ＡＰＣコンジュゲート（Mylteni（ドイツ、ベルギッシュ  グラッドバッハ（Bergisch Gladbach）所在））は、陰性選択のために炎症細胞をターゲットにする。細胞は、細胞ソーティングに先立って、ＤＡＰＩ（Life Technologies（ニューヨーク州グランドアイランド所在））によっても染色される。ＦＡＣＳ富化の場合、ＤＡＰＩ陽性のマザーゲートが作成されて、ダブレット細胞及びデブリを排除し、それに続いて、高い側方散乱事象を排除する。ダブレット細胞は、主に口腔扁平上皮細胞である。その後、高サイトケラチン（高ＦＩＴＣ）及び低ＣＤ４５（低ＡＰＣ）のドーターゲートが引かれる。このドーターゲート内の細胞の集合は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）光トモグラフィーシステム等の光トモグラフィーシステムを使用する、より効率的でかつ下流の肺癌検出試験解析についてソーティングされた富化済みターゲット上皮細胞である。
【００３９】
富化済み細胞の埋め込み
ＦＡＣＳ富化に続いて、細胞は、エタノール中で脱水され、それに続いて、キシレン中で懸濁される。細胞は、その後、適した容積の光媒体に移送され、そこに埋め込まれる。光媒体は、光トモグラフィーシステムのために、整合する屈折率を有する粘性オイルである。埋め込まれると、細胞は、光トモグラフィーシステム上で撮像するため、使い捨てカートリッジ内に注入される。
【００４０】
ここで、図２を参照すると、肺癌試験システムにおいて使用される３Ｄ光トモグラフィー撮像システムの基本システムコンポーネントが示される。細胞撮像システム２０は、フロー中の細胞を撮像するための、自動化された高解像度３Ｄトモグラフィック顕微鏡及びコンピューティングシステムである。コンデンサーレンズ９２に光学的に結合される照明源９０が含まれ、コンデンサーレンズ９２は、対物レンズ９４と光学的に協働して、キャピラリーチューブ９６内に含まれる対象物１の画像をスキャンする。画像は、振動ミラー１０２によって対象物が占める容積をスキャンすることによって取得され、ビームスプリッター１０４を通して高速度カメラ１０６に伝達される。高速度カメラは、複数の疑似投影画像１１０を生成する。多数のアキシャルチューブ回転位置について疑似投影画像のセットが、各対象物について生成される。
【００４１】
試験システムは任意の１つのコントラスト法に限定されないが、一例において、肺癌検出試験は、伝統的に使用されるヘマトキシリン染色に基づく細胞形態学を特にターゲットにする。肺癌検出試験用途において、光トモグラフィーシステムは、全ての次元において等しい解像度（すなわち、アイソメトリック解像度）を有する３Ｄ細胞画像をコンピューター処理し、測定が向きに無関係であることを可能にする。さらに、従来の顕微鏡法に典型的である焦点面曖昧さ及び視点向き依存性をなくすことは、広範囲の細胞タイプを自動的に認識し、支配的に正常な細胞集団内で希少な異常細胞を明確に識別するための情報コンテンツを提供する。光トモグラフィーシステム出力は、全ての細胞の約０．５％を、ＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）（VisionGate, Inc.（アリゾナ州フェニックス所在））ワークステーション、焦点面及び向き曖昧さのない画像の人間によるレビューを可能にする撮像ソフトウェアを使用して確認される異常候補として識別する。
【００４２】
光トモグラフィーシステム撮像は、小容積液体懸濁液に関して実施される。肺癌検出試験の場合、これらの細胞は、先に述べた富化済み上皮細胞集団からのものである。光トモグラフィーシステムは密接に一致する対象物を分離し得るため、単一ファイル細胞フローの狭く収束されたコアは、標準的なフローサイトメトリーにおける要件ではあるが、必要でない。
【００４３】
肺癌試験システムの例の動作は、本明細書で先に参照によって組込まれたNelson及びFauverの参考文献、並びに、２０１２年８月２８日に発行された、「Optical Tomography System With High-Speed Scanner」という名称の、Watson他に対する米国特許第８，２５４，０２３号（特許文献５）を含む他の特許に記載され、それらの特許は、同様に、引用することにより本明細書の一部をなす。動作中、生体細胞１の染色済み核は、光媒体１１２内で懸濁され、また、例えば、６２μｍ内径を有するキャピラリーチューブ９６内に注入される。キャピラリーシステムは、使い捨てであるように設計されており、したがって、標本間の相互汚染の可能性をなくす。圧力１１４が流体に印加され、流体は、チューブが回転するにつれて３Ｄデータが収集される前に、対象物１を撮像用の所定の位置に移動させる。ミラー１０２が作動されて、対象物を通して焦点面をスイープし、画像が、カメラによって積算されて、それぞれの単一視点からの疑似投影図を作成する（非特許文献２４）。光トモグラフィーシステムに対してキャピラリーチューブ９６をインタフェースするガラスホルダーは示されない。ホルダーは、キャピラリーの外径よりわずかに大きい中央部を通してカットされた穴を有し、ガラスは、両側が平坦であって、対物レンズ及びコンデンサーレンズに対する光学結合を可能にする。輸送媒体内に埋め込まれる細胞がロードされたキャピラリーチューブは、ホルダーを通してねじ込まれる。細胞を保持する輸送媒体、ガラスキャピラリー、キャピラリーホルダー、レンズにインタフェースするオイル、及びレンズそれ自身は、同じ光学指数の材料から作られる。結果として、光線は、光トモグラフィーシステム光学系、キャピラリー、及び細胞を、屈折なしで通過し、一方、細胞は、回転して、キャピラリーが３６０度を回転するにつれて撮影される５００の疑似投影図のセットの取込みを可能にしてもよい。細胞は、流体媒体内に懸濁されるため、疑似投影画像１１０が収集されている間に、少量の移動を生じ易い。
【００４４】
したがって、疑似投影図内の細胞画像は、細胞特徴が再構成中に互いに強化されるように共通センターに登録されなければならない。Meyer他に対して２０１０年１１月１６日に発行された、「Method for Image Processing and Reconstruction of Images for Optical Tomography」という名称の米国特許第７，８３５，５６１号（特許文献６）は、疑似投影図についての誤差補正技術を開示する。特許文献６は引用することにより本明細書の一部をなす。補正済み疑似投影図のセットは、従来のＸ線ＣＴで使用中のアルゴリズムと同様のフィルタ補正逆投影アルゴリズムを使用して処理されて、トモグラフィック３Ｄ細胞再構成をコンピューター処理する（非特許文献１３）。３つの角度位置：０ｇ、９０ｇ、及び１８０ｇで撮影された疑似投影画像１１０が示される。５８５ｎｍ波長の光源９０による照明が提供されて、ヘマトキシリン吸収スペクトルに基づく画像コントラストを最適化する。再構成において、３Ｄピクセル又はボクセルは立方体であり、各寸法が７０ｎｍのサイズである。再構成容積は、画像収集容積が対象物の周りでクロップされるため、サイズが変動する。通常、容積は、側部上で約２００ピクセル〜３００ピクセルである。
【００４５】
ここで図３Ａ〜図３Ｃを参照すると、腺癌細胞の３Ｄ画像の斜視図が示される。図３Ａは、最大値投影法における腺癌細胞を示す（非特許文献１３）。３Ｄ画像のグレー値が種々の細胞特徴に関連するため、細胞構造をカラー及び透明度の値にマッピングするルックアップテーブルは、中央（図３Ｂに示す）及び右（図３Ｃに示す）の細胞画像を生成するために確立された。これらの画像のカラー再生において、細胞質は乳白色４０２で表され、核はオパックブルー４０４で表され、ルースなクロマチン及びヌクレオプラズムは半透明グリーン４０６で表され、凝縮クロマチン及び核小体はオパックレッド４０８で表される。白黒のみの図面を提供するという国際特許規則に関する制約が与えられる場合、これらのカラーは、対応する参照符号４０４、４０６、及び４０８で識別される境界によって識別された（破線境界として示す）。
【００４６】
ここで図４を参照すると、肺円柱細胞上の繊毛が示される。個々の繊毛ストランドを示す撮像済み正常気管支上皮細胞は径が約２５０ｎｍである。これは、３Ｄ細胞撮像システムの解像度を更に証明する。
【００４７】
細胞分類
ここで図５を参照すると、適正分類器を含む痰試料を解析するための肺癌試験の機能ブロック図が概略的に示される。幾つかの細胞分類アルゴリズムが含まれる。光トモグラフィーシステム技術の１つの利点は、人間レビュアーにとって微妙過ぎる又は複雑過ぎる細胞特徴を検出し得る自動化３Ｄ細胞解析に起因する。自動化分類は、非常に変動性のある標本の人間レビューをなくす。さらに、３Ｄ画像に基づく分類は、細胞疾病状態を包括的に識別するための本質的な画像情報を２Ｄスライスが保持しない場合があるため、標準的な２Ｄ固定焦点面画像に基づく分類に関連する固有の制限を克服する（非特許文献１４）。細胞分類は、肺癌検出試験によって処理される何千もの正常細胞から少数の希少な異常細胞を自動的に識別する可能性を有する。
【００４８】
３Ｄ細胞分類２２についての分類ステップは、不十分な再構成を検出する分類器３０、正常細胞ギャラリー用の分類器３２、染色分類器３６、適正分類器３７、及び異常細胞分類器４２を含む。細胞学的検出システムで使用される分類器は、以下で述べるように訓練される。１つの有用な例において、不十分な再構成を検出する分類器３０は、Meyer他を参照して先に述べられたものであってもよい。一例において、正常細胞ギャラリー用の分類器３２は、レビューステーションを使用して異常細胞を人間が識別するための参照ポイントとして役立つ正常細胞を識別する。これらの正常細胞タイプ：正常扁平上皮中間細胞３４、正常円柱上皮細胞３８、及び正常マクロファージ４０を識別する３つの分類器が存在する。
【００４９】
染色分類器３６は、例えば、扁平上皮中間細胞として識別される細胞を処理することによって動作する。扁平上皮中間細胞の核は、一定の倍数性を有し、その総合的な積算グレースケール光学密度値を、標本染色が最適吸収コントラスト用の正しい範囲内にあるかどうかを評価するために使用され得る理想的な特徴にする。平均及びメジアングレースケール値は、それぞれの核についてコンピューター処理され、移動平均が維持されてもよい。平均についての安定値は、検討中の核の個々のグレースケール値についての正規化として使用される場合がある染色である。
【００５０】
適正分類器３７は、例えば、正常気管支上皮細胞を含む参照細胞を列挙し、標本の処理が総合的な細胞数に基づいて適正であるかどうかを判定するために使用される。適正分類器３７は、本明細書において以下でより詳細に記載される。
【００５１】
異常細胞分類器は、本明細書で述べる分類器訓練法を使用して異常特性を有するターゲット細胞を識別するために訓練されることによって生成される。これらのターゲット細胞（通常、処理される全ての細胞の０．５％）は、アリゾナ州フェニックスのVisionGate, Inc.によって開発されたＣｅｌｌＧａｚｅｅｒ（商標）ワークステーション等のレビューステーション２５を使用して病理学者によって検査され続ける。或る特定の実施形態において、ターゲット細胞は、異常扁平上皮細胞、腺癌細胞、気管支肺胞上皮癌細胞、異常神経内分泌細胞、小細胞癌細胞、大細胞癌細胞、肺円柱細胞、腫瘍細胞、新生細胞及び気管支肺胞上皮癌細胞、並びに痰中に見出される他の細胞及び対象物を含む。
【００５２】
分類器訓練−入力及び方法
上述した細胞検出分類器の作成及び最適化は、そのプロセスが、参照又はグラウンドトゥルースに従って細胞を正確に診断することを目指すため、一般に、「分類器訓練（classifier training）」と呼ばれる。精度に対して２つの主要な態様が存在する：第１は特異度であり（正常細胞は分類器によって正常と呼ばれる）、第２は感度である（異常細胞は分類器によって異常であると呼ばれる）。アルゴリズム訓練法は、適用的ブースト式ロジスティック回帰（Adaptively Boosted Logistic Regression）（非特許文献１８）及びランダムフォレスト（Random Forest）（非特許文献１９）を含む。当業者は、テンプレート法、適応的処理等のような分類器のために他の古典的な訓練技法をどのように適用するかをよく知っているであろう。
【００５３】
分類器を訓練するために使用される方法は、データが入力として使用される場合、著しく良好な成果を保証する。主に、分類器精度は、分類器訓練プロセスに対する入力が、細胞の臨床的に重要な態様を正確に記述し、光トモグラフィーシステム結果に影響を及ぼす可能性がある環境因子に対して頑健であるときに保証される：
１．図３Ａ〜図３Ｃを参照して先に示したように、光トモグラフィーシステムによって生成される３次元細胞画像は、高い解像度を有し、正しい分類をサポートするクリティカルな特徴の的確な測定を可能にする。
２．分類において有用である幾つかの特徴は、３Ｄ画像においてのみ出現する（非特許文献１７）。その結果、３Ｄ特徴セットは、細胞をより多く記述するだけでなく、３次元撮像に基づく分類を、２Ｄ撮像に対してより正確にする（非特許文献１６）。
３．３次元画像区画化アルゴリズムは、背景から全細胞を、また、細胞から核を分離するために開発された。これらの区画化アルゴリズムの精度は、区画化済みトレースを、人間が導出する細胞又は核エンベロープトレースと比較することによって確認された。
４．特徴測定は、細胞、細胞核、細胞質、及び細胞核小体の種々の態様を記述する。試験システムの一例において、５９４の特徴が、各３Ｄ細胞画像についてコンピューター処理され、その特徴は、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他のより微妙な形態要素を表す。これらの特徴のコンピューター処理は、細胞の向きに無関係であると確認された。
５．分類器訓練についての診断的真理（病理学の至適基準）は、２人の細胞検査技師及び１人の細胞病理学者によって提供される階層的細胞診断に基づく。ＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）ワークステーションのユーザーは、例えば、正常又は異常であると宣告された細胞に関する性能を強調する訓練及び試験プログラムを最初に終了しなければならない。
【００５４】
分類器訓練−統計的考察
第２に、本明細書の発明者らによって実施される１つの試験において、分類器訓練プロセスの精度は、３つの態様を包含した厳密なプロセスを通して保証された：
１．分類器を訓練するために使用されたデータベースは、２項分布９５％信頼区間（非特許文献２１）が、許容可能な限度内で性能推定の変動を維持することを保証するのに十分な材料を含むように調製された。
２．過剰訓練は、訓練プロセスの考えられる１つの落とし穴であり、そこでは、多過ぎる情報が分類器内に含まれる可能性があるため、結果は、訓練において使用されるデータに過剰に専用化される可能性がある。この状況は、分類器性能について過剰に楽観的な推定を生成する。過剰訓練のリスクは、訓練データの一部を取得するとともにこれを試験データとして使用することを伴う交差検証によって軽減され得る。分類器において使用され得る情報量の限界は、訓練データに基づく性能推定が試験データによる推定を超える場合に達せられる。
３．最後に、過剰訓練に対する更なる保証として、分類器は、訓練プロセスの一部でなかった細胞の第２のセットによるデータに対して試験された。
【００５５】
異常細胞分類器訓練概要
以下の考察は、異常細胞分類器４２についての訓練を左右するパラメーターを規定するために使用された：
１．痰試料中の異常細胞が十分でなく、痰中の非診断要素が十分であるため、分類器は、高い感度及び非常に高い特異度で動作しなければならない。表４において後で述べるように、高い症例検出感度は、単一細胞分類器感度が７５％であり、標本が２つ以上の異常細胞を含むときに維持される。
２．ワークロードを保証することは、妥当な限界内で維持され、特異度についての目標は９９％に設定された。
３．下限２項分布９５％信頼限界（非特許文献２１）についての区間は、感度について７０％以内に、また、特異度について９８．５％以内に維持された。
【００５６】
これらの考察に基づいて、訓練は、少なくとも３２５の異常細胞及び２５００の正常対象物を必要とした。表１は、異常細胞分類器を訓練するために使用した細胞数を与え、先の要件が満たされたことを示す。
【表１】
2018527896.tif 000003
【００５７】
図６の肺癌検出試験受信者動作特性（ＲＯＣ：Receiver Operator Characteristic）曲線は、肺癌検出試験が性能目標を満たすことを示す。さらに、表１に示す訓練セットの試料の数は、非常に狭い２項分布９５％信頼区間内でこの分類性能をサポートする。表２は、信頼区間（非特許文献２１）を有する肺癌検出試験の感度及び特異度が、意図される最低目標を満たすことを示す。
【表２】
2018527896.tif 000004
【００５８】
表２に示す性能は、同様に、分類器訓練に含まれなかった細胞を使用して確認された。表３は、訓練に基づく性能投影が、全体として細胞集団に対して一般化されたことを示す。
【表３】
2018527896.tif 000005
【００５９】
表３において、Ａ５４９（American Type Culture Collection（バージニア州マナサス所在））細胞株が分類器感度を試験するために使用されたことに留意されたい。Ａ５４９は、肺腺癌由来の細胞株である。以下の表６で述べるように、肺癌検出試験は、多くの異なる異常細胞タイプを識別するために訓練される。腺癌及び扁平上皮癌細胞（Ａ５４９細胞を含む）は、最も顕著な特徴を有し、表２に示すベースライン７５％より大きな割合で識別される。
【００６０】
最後に、高い検出率が、各陽性症例について所望される。単一細胞検出の感度は、表４に示す異常症例の検出につながる。
【表４】
2018527896.tif 000006
【００６１】
VisionGate, Inc.によって構築された肺癌検出試験異常分類器の一例は、９９．５％特異度において７５％の個々の細胞感度で動作する。表２で示す下限２項分布９５％信頼限界は７１％である。細胞解析の独立性を仮定すると、症例感度は、任意の１つの細胞を検出する確率及び解析において現れる異常細胞の数の知識に基づいてコンピューター処理されてもよい。光トモグラフィーシステムが一度に一回細胞を処理するため、独立性は良好な仮定である。代替的に、標本処理に関連する因子又は細胞が病変の同じ部分からのものであるという事実は、症例からの細胞のスコアリングに影響を及ぼす場合がある。細胞検出感度に基づく症例検出性能の過剰に楽観的な推定に対する保存的方法として、本発明者らは、個々の細胞検出感度について下限９５％信頼限界を使用して症例検出感度を推定した。この保存的値を使用すると、症例検出感度は、解析中に遭遇する異常細胞の数に基づいて推定され得る。例えば、１つの異常細胞だけに遭遇した場合、症例感度の下限は７１％であることになる。２つの異常細胞に遭遇した場合、症例感度は１００％×（１−０．２９×０．２９）＝９１．６％になる。遭遇する異常細胞数に対する症例検出のこのトレンドは、表４に示される。
【００６２】
表２、表３、及び表４の示唆は、肺癌検出試験にとって重要である。これらの表に示す結果は、異常細胞が、肺癌検出試験によって解析される群内にある場合、異常細胞が確信をもって検出されるため、症例は高感度で識別されることになることを示す。これは、肺癌検出試験解析における異常細胞存在の問題を、癌検出率を決定する残りの因子として残す。
【００６３】
標本適正
痰が、患者ごとの非常に変動性のある標本であるため、肺癌検出試験によって解析される細胞が疾病検出について十分な肺サンプリングを含むかどうかを評価するプロセスが必要とされる。古典的な痰適正は、豊富な肺胞マクロファージの存在に基づいて評価される（非特許文献２２）。しかし、これらの細胞タイプは、肺癌検出試験の細胞富化プロセスを通して保存されない。さらに、痰中のマクロファージの存在と異常細胞の存在との間の関係についての従来の評価は、この適正判定法において信頼を与えなかった。その結果、肺癌検出試験適正は、化生細胞及び円柱細胞を含む正常気管支上皮細胞等の参照細胞の列挙に基づく。先に述べたように、肺癌検出試験は、これらの細胞を自動的に列挙するため、適正についての別個のマニュアル解析は必要とされない。先に述べたように、肺癌検出試験標本処理は、痰中の非診断要素を取除く。この処理は、富化済み細胞ペレット内で細胞内容物をランダム化する効果を有する。これは、癌患者からの標本の肺癌検出試験解析中に異常細胞に遭遇する可能性が、試料中の異常細胞の数と正常細胞の数との比及び肺癌検出試験によって処理される正常細胞の数に主に依存することを意味する。この比は、病変サイズ、咳の動態等を含む多くの因子に依存する。症例検出は、その後、異常細胞は、同様に処理されるように十分な正常気管支上皮細胞を処理することに主に依存することになる。
【００６４】
ここで図７を参照すると、適正についての気管支上皮細胞の数に対する異常細胞を有する症例をプロットする曲線がグラフで示される。曲線８０は、垂直Ｙ軸上の異常細胞を有する症例のパーセントと水平Ｘ軸上の気管支上皮細胞の数との関係を表す。第１の適正閾値８２は２５０の気管支上皮細胞に対応する。第２の適正閾値８４は８００の気管支上皮細胞に対応する。異常細胞症例の分類は、異常細胞分類器４２によって決定される。曲線８０のトレンドが、自発的咳を通して生成される標本について有効であることに留意されたい。誘発が咳の動態を変化させるため、異なる曲線が、誘発を通して収集される標本について生成される必要があることになる。
【００６５】
本明細書で述べる肺癌検出試験の使用は、この試験がいかに臨床実践と統合されるかに左右される。２つのモード：１次スクリーナー及びＬＤＣＴによる補助が存在する。１次スクリーニングモードにおいて、肺癌検出試験は、肺癌が侵襲的状態まで進む前に肺癌を検出する目標を持つ第１の株スクリーナーとして使用される。このモードにおいて、肺癌検出試験感度は、９０％より大きくなるようにセットされる（非特許文献２３）。図７のグラフを参照すると、このレベルの感度は、肺癌検出試験が８００の正常気管支上皮細胞を処理したときに起こる。そのため、１次スクリーニングの場合、８００は、適正について正常気管支上皮細胞の必要とされる数である。補助モードにおいて、肺癌検出試験は、ＬＤＣＴに従って、ＬＤＣＴからのどの陽性症例が異常細胞を真に有するかを決定し、７０％の下限肺癌検出試験感度は許容可能である。その理由は、臨床医が、２つの直交するスクリーニング結果を利用することになるからである。閾値８２で示すように、７０％の肺癌検出試験感度は、２５０の正常な気管支上皮細胞が識別されたときに達成され得る。
【００６６】
要約すると、肺癌検出試験は、２つの動作モードを有し、適正及び予想される症例感度についての条件は表５に与えられる。
【表５】
2018527896.tif 000007
【００６７】
異常細胞の識別が全くない適正基準に達した後、試験は、支障なく終了してもよく、症例は正常と呼ばれ得る。肺癌検出試験による異常細胞の発見が適正の考察を不要にすることに留意されたい。この症例において、異常結果は、肺癌検出試験によってレポートされる。
【００６８】
分類器開発及び特徴
一般に、特徴は、３Ｄトモグラムの種々の態様の数値表現を提供するためにコンピューター処理される。コンピューター処理される特徴は、対象物のエキスパート診断と共に使用されて、対象物タイプを区別し得る分類器を開発する。例えば、Ｍ個の３Ｄトモグラムを有するデータセットは、第１のタイプ、タイプ１の対象物についてコンピューター処理されてもよく、Ｎ個の３Ｄトモグラムを有するデータセットは、第２のタイプ、タイプ２の対象物についてコンピューター処理されてもよく、第１及び第２のタイプの対象物は、正常細胞及び異常細胞等である。ここで、「Ｍ」及び「Ｎ」はタイプ１及びタイプ２の値の数をそれぞれ表す。データセットは、好ましくは、光トモグラフィーシステムによって生成される。光トモグラフィーシステムは、例えば、細胞等の対象物の３Ｄ画像を含む３Ｄトモグラムを提供する。細胞は、通常、核小体等の細胞小器官を有する核等の他の特徴を含む。対象物タイプは、様々なタイプの細胞、細胞小器官、選択された疾病状態を示す細胞、プローブ、正常細胞、又は対象の他の特徴を含んでもよい。ｘの３Ｄ画像特徴のセットは、全てのＭ＋Ｎの対象物についての３Ｄトモグラムに基づいてコンピューター処理される。次に、対象物タイプを最もよく弁別するｙの３Ｄ画像特徴の洗練された特徴セットが見出される。ここで、「ｘ」及び「ｙ」は、各段階における３Ｄ画像特徴の数を表す。ｙの３Ｄ画像特徴の洗練された３Ｄ画像特徴セットが使用されて、その出力が対象物タイプに相関する分類器を構築する。１つの例示的な実施形態において、段階１０２において、３Ｄトモグラムのセットが組立てられ、組立てられたセットは、３Ｄ生物学的対象物タイプを区別するためエキスパートによって使用されることになる実質的に全ての重要なマーカーを表す。３Ｄトモグラムの代表的なセットを組立てて、３Ｄ画像特徴セットは、重要なマーカーを特徴付ける各対象物についてコンピューター処理されてもよい。
【００６９】
特徴
細胞等の生物学的対象物のトモグラムは、複数の観測可能でかつ測定可能な特性を示し、その特性の一部は、分類用の特徴として使用されてもよい。以下の表６は、特徴、すなわち分類目的を果たすために使用される重要なマーカーの概要を提供する。
【表６】
2018527896.tif 000008
【００７０】
更なる説明として、１つの有用な例において、３Ｄ生物学的対象物内で発生するボイドは、コンピューター処理済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。ボイドに関連する別の特性は、対象物内のボイドの数を含んでもよい。ボイドに関連する別の特性は、ボイドの容積又はボイドの数を含む。更に別の特性は、ボイドの表面積又はボイドの数を含む。核間ボイドの形状及び場所は、同様に、有用な特徴特性として使用されてもよい。さらに、特徴特性の組合せは、同様に、本明細書で先に述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００７１】
同様に、３Ｄ生物学的対象物内で発生する陥入は、コンピューター処理済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。陥入に関連する別の特性は、対象物内の陥入の数を含んでもよい。陥入に関連する別の特性は、陥入の容積又は陥入の数を含む。更に別の特性は、陥入のサイズ又は陥入の数を含む。核陥入の場所は、同様に、有用な特徴特性を含む。さらに、特徴特性の組合せは、同様に、本明細書で先に述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００７２】
３Ｄ生物学的対象物内で発生する陥入ボイドは、コンピューター処理済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。陥入ボイドの容積、表面積、形状、陥入に接続されるボイドの場所、及び陥入特徴の組合せは、同様に有利には、本明細書で先に述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００７３】
３Ｄ生物学的対象物内で発生する核小体は、コンピューター処理済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。核小体又はクロマチン凝縮である可能性がある対象物の容積、表面積、形状、場所、又は上記特性の組合せは、有利には、本明細書で先に述べた分類器を構築するために使用されてもよい。３Ｄ生物学的対象物内で発生する核テキスチャ特徴は、有用な分類特徴であることがここでわかった。種々のサイズに作られた構造要素を使用して、ブラーレジデュー技法が使用されて、核内の種々のサイズに作られた特徴を分離する。ブラーレジデュー技法は、通常、フィルタを使用して画像をブラー処理し、マーキング操作を適用することによって、結果として得られるブラーレジデューを測定することを必要とする。全体の３Ｄ容積は、その後、離散的コンポーネントの数、容積ヒストグラム、平均容積及び分散、並びに形状ヒストグラムであるとしてコンピューター処理される。
【００７４】
核小体と、陥入と、ボイドと、核エンベロープとの間の空間的関係を記述する距離メトリックは、有用な分類特徴であることがここでわかった。例えば、３つの核小体が見出される場合、平均及び分散の、また、最小及び最大の核小体間距離が見出される場合がある。同様に、核小体のクラスタについての平均座標と対象物全体についての質量中心との間の距離が見出される場合がある。同様なコンピューター処理は、上記実体のうちの任意の実体を核小体及び核の質量中心に代入することによって形成されてもよい。
【００７５】
高速フーリエ変換（ＦＦＴ：Fast Fourier Transform）特徴は、有用な分類特徴であることがここでわかった。ＦＦＴ特徴は、３Ｄトモグラムの高速フーリエ変換によって形成される。ＦＦＴ特徴は、ＦＦＴ分類の顕著な、また平均的な特性を特徴付ける。
【００７６】
本発明は、特許法に適合し、本発明の新規な原理を適用するために必要とされる情報を当業者に提供し、必要とされる例示的でかつ専用のこうしたコンポーネントを構築し使用するために、本明細書でかなり詳細に述べられた。しかし、本発明が異なる機器及びデバイスによって実施されてもよいこと、及び、機器の詳細及び動作手順の両方について、種々の修正が、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく達成されてもよいことが理解される。
【００７７】
参考文献
以下の出版物の教示は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
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【図１】
2018527896.tif 000009
【図２】
2018527896.tif 000010
【図３】
2018527896.tif 000011
【図４】
2018527896.tif 000012
【図５】
2018527896.tif 000013
【図６】
2018527896.tif 000014
【図７】
2018527896.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月22日(2018.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、標本からの３Ｄ細胞分類のための細胞学的解析試験：
複数の細胞を前記標本から単離し保存する；
前記複数の細胞を富化し、複数の富化細胞を生産する；
前記複数の富化細胞を光媒体に埋め込む；
前記複数の埋め込んだ富化細胞をキャピラリーチューブ内に注入する；
疑似投影図観察サブシステムの視野内に少なくとも１の埋め込んだ細胞が現れるまで、前記複数の埋め込んだ富化細胞に圧力を印加する；
前記疑似投影図観察サブシステムを用いて、前記視野内の前記少なくとも１の埋め込んだ細胞の少なくとも１の疑似投影画像を取得する；
前記キャピラリーチューブをチューブ軸を中心に回転し、前記疑似投影図観察サブシステムを用いた、異なる視界におけるさらなる疑似投影画像を生成し、それぞれの画像化された埋め込まれた細胞のための疑似投影画像のセットを提供する；
それぞれの画像化された埋め込まれた細胞を、前記疑似投影画像のセットからのデータを用いて再構成し、３Ｄ細胞再構成のセットを生産する；
生体標本分類器を操作して、前記３Ｄ細胞再構成のセットから、参照細胞を検出する；
前記標本の前記検出された参照細胞を列挙する；
受信者動作カーブ（ROC）より特徴付けられる、予め決められた一細胞の感度値および、予め決められた一細胞の特異値で、第二の細胞分類器を操作して、標的細胞を検出する；および
適性分類器を操作し、列挙された参照細胞の閾値に対して、参照細胞の数を比較し、標本適性を判定する。
【請求項２】
前記参照細胞が正常気管支上皮細胞を含み、前記標的細胞が異常肺細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記標的細胞が、異常扁平上皮細胞、腺癌細胞、気管支肺胞上皮癌細胞、異常神経内分泌細胞、小細胞癌細胞、大細胞癌細胞、肺円柱細胞、腫瘍細胞、新生細胞及び気管支肺胞上皮癌細胞、並びに痰中に見出される他の細胞及び対象物からなる群より選ばれる請求項１の方法。
【請求項４】
前記閾値が統計的にあらかじめ決められた範囲である請求項１の方法。
【請求項５】
前記閾値が２５０から８００の正常気管支上皮細胞の範囲である請求項１の方法。
【請求項６】
特異度および感度のための適性分類器訓練を用いた生体標本分類器を生成することをさらに含む請求項１の方法、ただし感度は標的細胞に関連し、特異度は前記標本の非希望細胞に関する。
【請求項７】
適性分類器訓練は３次元画像区画化アルゴリズムを含む対象物を記述する特徴測定セットを用いて実行される請求項５の方法。
【請求項８】
前記対象物は核を含む細胞であり、３次元画像区画化アルゴリズムは背景から全細胞を、また、細胞から核を分離する請求項７の方法。
【請求項９】
適性分類器訓練は、細胞核、細胞質、及び細胞核小体、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他の形態要素からなる群より選択される特徴を含む特徴測定セットを用いて実行される請求項７の方法。
【請求項１０】
特異度および感度のための分類器訓練を用いた前記第二の細胞分類器の生成をさらに含む請求項１の方法。
【請求項１１】
分類器訓練が異常細胞と正常対象物からの特徴を用いて実行される請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記標本を痰標本から得ることを含む請求項１の方法。
【請求項１３】
前記痰標本を富化することをさらに含む請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記痰標本の富化は蛍光活性化細胞ソーティングまたは免疫磁気富化を用いることを含む請求項１３の方法。
【請求項１５】
以下を含む患者のために肺癌を示す試験を実行する方法：
前記患者から痰標本を得る；
前記標本から複数の細胞を単離し保存する；
前記複数の細胞を富化し、複数の富化細胞をえる生産する；
前記複数の富化細胞を光媒体に埋め込む；
前記複数の埋め込んだ富化細胞をキャピラリーチューブ内に注入する；
疑似投影図観察サブシステムの視野内に少なくとも１の埋め込んだ細胞が現れるまで、前記複数の埋め込んだ富化細胞に圧力を印加する；
前記疑似投影図観察サブシステムを用いて、前記視野内の前記少なくとも１の埋め込んだ細胞の少なくとも１の疑似投影画像を取得する；
前記キャピラリーチューブをチューブ軸を中心に回転し、前記疑似投影図観察サブシステムを用いた、異なる視界におけるさらなる疑似投影画像を生成し、それぞれの画像化された埋め込まれた細胞の疑似投影画像のセットを提供する；
それぞれの埋め込まれた細胞を、前記疑似投影画像のセットからのデータを用いて再構成し、３Ｄ細胞再構成のセットを生産する；
生体標本分類器を操作して、前記３Ｄ細胞再構成のセットから、参照細胞を検出する；
前記標本の前記検出された参照細胞を列挙する；
受信者動作カーブ（ROC）より特徴付けられる、予め決められた一細胞の感度値および、予め決められた一細胞の特異値で、第二の細胞分類器を操作して、標的細胞を検出する；および
列挙された正常気管支上皮細胞の閾値に対して、正常気管支上皮細胞の数を比較するために適性分類器を操作する。
【請求項１６】
さらに前記患者に対し低線量ＣＴを行うことを含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記閾値が統計的にあらかじめ決められた範囲である請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記閾値が２５０から８００の正常気管支上皮細胞の範囲である請求項１６の方法。
【請求項１９】
特異度および感度のための分類器訓練を用いた生体標本分類器の生成することをさらに含む請求項１５の方法。
【請求項２０】
分類器訓練は、背景から全細胞を、また、細胞から核を分離する３次元画像区画化アルゴリズムを含む前記細胞を記述する特徴測定セットを用いて実行される請求項１９の方法。
【請求項２１】
分類器訓練は細胞核、細胞質、及び細胞核小体、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他の形態要素からなる群より選択される特徴を含む特徴測定セットを用いて実行される請求項１９の方法。
【請求項２２】
特異度および感度のための分類器訓練を用いた前記第二の細胞分類器を生成することをさらに含む請求項１５の方法。
【請求項２３】
分類器訓練が異常細胞と正常対象物からの特徴を用いて実行される請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記標本を痰標本から得ることを含む請求項１５の方法。
【請求項２５】
前記痰標本を富化することをさらに含む請求項１５の方法。
【請求項２６】
前記痰標本の富化は蛍光活性化細胞ソーティングまたは免疫磁気富化を用いる請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記標的細胞が、異常扁平上皮細胞、腺癌細胞、気管支肺胞上皮癌細胞、異常神経内分泌細胞、小細胞癌細胞、大細胞癌細胞、肺円柱細胞、腫瘍細胞、新生細胞及び気管支肺胞上皮癌細胞、並びに痰中に見出される他の細胞及び対象物からなる群より選ばれる請求項１５の方法。
【請求項２８】
前記参照細胞が正常気管支上皮細胞を含み、前記標的細胞が異常肺細胞を含む、請求項１５の方法。
【請求項２９】
以下を含む標本からの３D細胞分類のための細胞学的解析試験システム
複数の細胞を前記標本から単離し保存する手段；
前記複数の細胞を富化する手段；
１以上の富化細胞を光媒体に埋め込む手段；
１以上の埋め込まれた細胞をキャピラリーチューブ内に注入する手段；
前記１以上の埋め込まれた細胞に、疑似投影図観察サブシステムの視野内に現れるまで、圧力をかける手段；
前記疑似投影図観察サブシステムを用いて、少なくとも視野内の埋め込んだ細胞の少なくとも１の疑似投影画像を取得する手段；
前記疑似投影図観察サブシステムを用い、異なる視界におけるさらなる疑似投影画像を生成し、それぞれの埋め込まれた細胞のための疑似投影画像のセットを提供するために、前記キャピラリーチューブをチューブ軸を中心に回転する手段；
それぞれの埋め込まれた細胞を、前記疑似投影画像のセットからのデータを用いて再構成し、３Ｄ細胞再構成のセットを生産する手段；
生体標本分類器を操作して、前記３Ｄ細胞再構成のセットから、参照細胞を検出する手段；
前記検出された標本の参照細胞を列挙する手段；
標的細胞を検出するために、予め決められた一細胞の感度値および、予め決められた一細胞の特異値で、受信者動作カーブ（ROC）より特徴付けられる、第２の細胞分類器を操作する手段；および
列挙された参照細胞の閾値に対して、参照細胞の数を比較し、標本適性を判定するために、適性分類器を操作する手段。
【国際調査報告】
2018527896.tif 000016