(57)【要約】【課題】【解決手段】実施形態は、細胞及びビーズを含む流体からビーズを除去するシステム及び方法に関する。一実施形態では、１以上の分離チャンバ（２１２、３０４、４００、６００）、１以上のフローセル（２１６、７１２、８００、１１００）、１以上の磁石（８３２Ａ〜８３２Ｉ、１３３０Ａ〜１３３０Ｉ）、及び／又は１以上の磁場を用いて、流体流からビーズを除去する。【選択図】図１１Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む流体流から磁気ビーズを除去するためのシステムであって、該システムは、
前記流体流を流すための流体流路であって、バッグ内の非直線状流路を含む該流体流路と、
前記バッグの近傍に設けられる磁場と、
前記流体流路において流体を移送するためのポンプと、
を備えることを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１記載のシステムにおいて、前記磁場は、複数の磁石によって生成されることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１記載のシステムにおいて、前記非直線状流路は、蛇行形状バッグ内のチャネルであることを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項１記載のシステムにおいて、前記バッグは障壁を有し、前記流体流が前記障壁の周りを流れることを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項１記載のシステムにおいて、前記磁気ビーズは鉄を含み、前記磁場によって、前記バッグの壁に引きつけられることを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項５記載のシステムにおいて、前記磁場の強度は、前記磁気ビーズを前記壁に対して保持できる強度であることを特徴とするシステム。
【請求項７】
請求項６記載のシステムにおいて、前記バッグの前記非直線状流路の長さは、前記磁場によって、前記流体流から前記磁気ビーズのうちの少なくとも約９０％の磁気ビーズを除去できる長さであることを特徴とするシステム。
【請求項８】
請求項７記載のシステムにおいて、前記ポンプは、流体を、約１０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で前記バッグへ移送することを特徴とするシステム。
【請求項９】
請求項８記載のシステムにおいて、前記バッグの出口は、前記流体流から前記磁気ビーズを除去した後に前記流体流中の前記細胞を濃縮するためのチャンバと流体連通していることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
請求項９記載のシステムにおいて、前記チャンバは、前記流体流から、液体及び更なる磁気ビーズを除去することを特徴とするシステム。
【請求項１１】
細胞を含む流体流から磁気ビーズを除去する方法であって、該方法は、
バッグ内の非直線状流路を含む流体流路において前記流体流を移送するステップと、
前記バッグ内において、前記流体流を磁場にさらすステップと、
前記流体流が前記バッグを流れる際、前記流体流から前記磁気ビーズのうちの少なくとも約８５％の磁気ビーズを除去するステップと、
を有し、
前記流体流を移送する前記ステップは、前記流体流をポンピングするステップを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、前記磁場は複数の磁石によって生成されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、前記複数の磁石は極を交互に配列したアレイであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１記載の方法において、前記非直線状流路は、蛇行形状バッグ内のチャネルであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１記載の方法において、前記磁気ビーズは鉄を含み、前記磁場によって、前記蛇行形状バッグの壁に引きつけられることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、前記磁場の強度は、前記磁気ビーズを前記壁に対して保持できる強度であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記バッグの前記非直線状流路の長さは、前記磁場によって、前記流体流から前記磁気ビーズのうちの少なくとも約９０％の磁気ビーズを除去できる長さであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記流体流を、約２０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で前記バッグへ移送することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記磁気ビーズを除去した後、前記流体流を前記バッグの出口から前記細胞を濃縮するためのチャンバへ移送することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、前記チャンバを用いて、前記流体流から、液体及び更なる磁気ビーズを除去することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年４月７日に出願された米国特許仮出願第６２／１４４，２２６号（タイトル：ビーズ除去）の優先権を主張するものであり、該米国特許仮出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ビーズは、細胞やその他の有機体の成長のような生物学的用途等を含む様々な用途において使用される。いくつかのプロセスにおいて、治療目的のために、細胞の成長、機能化、活性化が、ビーズを用いて行われる場合がある。細胞の成長、機能化又は活性化を行った後、細胞を使用する前に、ビーズを細胞から分離する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ビーズを細胞から分離する際、細胞を失わずに、できるだけ多くのビーズを除去することが望ましい。ビーズ除去プロセスにおいては、多くの細胞が失われる場合がある。
【０００４】
本発明の実施形態は、上記の点及び他の点を考慮してなされた。しかしながら、ここで記載される課題は、本発明の実施形態の用途を、制限するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本節は、本発明のいくつかの実施形態の態様を簡単な形式で説明するためのものであり、主張される本発明の重要な又は必須の要素を特定することを意図していないし、また、請求項の範囲を制限することを意図しているものでもない。
【０００６】
いくつかの実施形態は、ビーズから細胞を分離するためのシステム及び方法に関する。ある実施形態では、分離において、遠心力を利用してビーズを分離するための１以上の分離チャンバが使用されてもよい。ある実施形態では、磁場及びフローセルを利用して、強磁性体材料（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、希土類金属等）を含むビーズが除去される。
【０００７】
他の実施形態では、細胞を含む流体流から（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、希土類金属等を含む）磁気ビーズを除去するシステム及び方法が提供される。ある実施形態では、流体流が流れる流体流路が利用される。流体流路は、バッグ内において非直線状流路を有する。磁場はバッグの近傍に与えられ、ポンプを用いて、バッグに流体が流される。流体が非直線状流路を流れると、磁場によって、磁気ビーズはバッグの壁に向かって引きつけられる。ビーズがバッグの壁に押し付けられて保持されることによって、磁気ビーズは流体流から除去される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、磁場は、複数の磁石のアレイによって生成される。アレイは、磁場を制御するような（磁極を特定の位置に配置するような）所定の方法で配置される。ある実施形態において、磁場の強さは、磁気ビーズをバッグの壁に対して保持できる程度の強度である。
【０００９】
さらに、バッグの非直線状流路は、種々の特徴を有する。例えば、非直線状流路は、蛇行形状バッグにおけるチャネルによって与えられる。他の例において、バッグは、障壁を有し、流体は該障壁の周りを流れる。非直線状流路は該障壁によって形成される。ある実施形態では、バッグの非直線状流路の長さは、磁場によって、流体流から少なくとも約９０％の前記磁気ビーズを除去できる長さである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、バッグの出口は、流体流をさらに処理するための部品・部材に接続される。例えば、バッグの出口は、流体流から磁気ビーズを除去した後に流体流中の細胞を濃縮するためのチャンバに流体接続される。細胞濃縮工程の一部として、該チャンバにおいて流体流から液体さらには残留ビーズが除去されてもよい。
【００１１】
非制限的且つ非包括的な実施形態が、添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ビーズと細胞を有する流体流を処理するために使用される一実施形態に係るシステムの図である。
【図２】図２は、例えば、図１に示されるシステムのようなシステムに使用される流体移送アセンブリの図である。
【図３】図３は、細胞を濃縮する及び／又はビーズを除去するために使用される２つのチャンバを利用する一実施形態に係る分離チャンバシステムの図である。
【図４】図４は、流体流から細胞を濃縮する及び／又はビーズを除去するために使用される分離チャンバの図である。
【図５】図５は、底部ポート／チューブにビーズが集まった状態の分離チャンバの近接図である。
【図６】図６は、細胞を濃縮する及び／又は細胞からビーズを分離するために使用される他の実施形態に係る分離チャンバの断面図である。
【図７】図７は、ビーズ及び細胞を含む流体流を処理するためのシステムの図である。
【図８】図８は、一実施形態に係る、磁気ビーズを除去するために使用されるフローセルの上面図である。
【図９】図９は、図８のフローセルの分解図である。
【図１０】図１０は、図８のフローセルの（一部分解）断面図である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｅは、他の実施形態に係る、磁気ビーズを除去するために使用される他のフローセルの図である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｆは、実施形態に係る、フローセルにおいて使用される非直線経路を有する異なる設計のバッグを示す図である。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｅは、フローセルのいくつかの実施形態において使用される磁石アレイの実施形態の図である。
【図１４】図１４は、一実施形態に係る、流体流から磁気ビーズを除去するプロセスのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の原理は、以下の詳細な説明及び添付図面に示される実施形態を参照することで、さらに理解されよう。詳細な実施形態において具体的な特徴が示され説明されるが、本発明は、以下で説明される実施形態に限定されないと理解されるべきである。
【００１４】
以下では、添付図面に示される実施形態が詳細に言及され説明される。可能な限り、図面及び以下の記載において、同一又は同様な部分に対しては、同じ参照符号が使用される。
【００１５】
図１は、ビーズ及び細胞を含む流体流を処理するために使用される一実施形態に係るシステム１００の図である。いくつかの実施形態において、細胞はヒトＴ細胞であり、ビーズはポリマーコーティングされた磁気材料から形成される。いつくかの実施形態において、システム１００は、細胞を含む流体の流れからビーズを分離（例えば、除去）する。また、システム１００は、細胞の濃縮、洗浄、細胞への保存溶液の添加を行うためにも使用される。図１は、細胞の成長、機能化及び／又は活性化の際に利用される、細胞及びビーズを含む流体を収容する収容バッグ１０４を示す。細胞を治療目的で使用するために、細胞はビーズから分離・濃縮されて、使用可能／有効量にされる。
【００１６】
分離／濃縮システム１０８は、システム１００の一部を構成し、細胞を含む流体流に対してビーズ除去（ｄｅ−ｂｅａｄ）を行う（すなわち、流体流からビーズを除去する）ために使用される。また、細胞を濃縮するためにも使用される。以下で詳細に説明されるが、分離／濃縮システム１０８は、様々なシステム、部品・部材、流体流路等を利用することによって、流体流からビーズを除去し及び／又は流体流からのビーズ分離後の細胞を濃縮する。
【００１７】
流体処理の一部として、いくつかの実施形態では、ビーズの分離及び細胞の濃縮に加えて、分離／濃縮システム１０８を用いて細胞の洗浄が行われる。洗浄液１１２が分離／濃縮システム１０８によって使用されることで、細胞の洗浄が行われる。細胞の濃縮及び洗浄を行うシステム１０８の一部として使用されるシステム及び方法の例は、２０１５年８月１４日に出願された米国特許出願第１４／８２７，１３０号（タイトル：粒子の処理）に記載されている。該米国特許出願は、ここでの開示により本出願に組み込まれる。
【００１８】
細胞のビーズ除去、濃縮及び洗浄を行った後、充填システム１１６は、濃縮／洗浄された細胞を各収容容器に、所定の濃度及び／又は所定の細胞量で、分ける。一実施形態において、充填システム１１６は、各収容容器に対して、一回の投与量と考えられる量の治療用細胞を充填してもよい。また、充填システム１１６は、収容容器それぞれに対して、保存溶液を添加することも可能である。一例として、所定量のＤＭＳＯが、充填システム１１６によって、各収容容器に添加される。
【００１９】
図２は、図１に示されるシステムにおいて使用される流体移送アセンブリ２００を示す。ある実施形態では、アセンブリ２００はディスポーザブル部材であり、細胞からのビーズ分離、細胞の濃縮、細胞の洗浄、細胞の収容容器への収容を行うバッチプロセスにおいて一回限りで使用される。他の実施形態では、流体移送アセンブリ２００はリポーザブル（ｒｅｐｏｓａｂｌｅ）部材であり、例えば、滅菌プロセス後に再使用される。
【００２０】
図２に示されるように、アセンブリ２００は、カセット２０４を有する。該カセット２０４は、種々のバッグ及び／又は他の部材に接続されるチューブ配管をルーティングする。カセット２０４はまた、複数のチューブループ２０８Ａ〜２０８Ｅを有する。該チューブループはポンプと結合する。該ポンプによって、異なる箇所間において又は異なる部材間（例えば、分離／濃縮システム１０８、充填システム１１６（システム１００）、分離チャンバ２１２、フローセル２１６、廃棄バッグ２２０等）においてポンピングが行われる。
【００２１】
上述のように、アセンブリ２００はまた、細胞とビーズとの分離が行われる分離チャンバ２１２を有する。他の実施形態において、チャンバ２１２は、以下で詳細に説明されるが、細胞からのビーズの分離後に行われる細胞の濃縮及び洗浄のみに使用されてもよい。
【００２２】
図２に示される実施形態において、フローセル２１６は、細胞からビーズを分離するために設けられる。以下で詳細に説明されるように、フローセル（例えば、２１６）は、細胞からビーズを分離するために磁場を利用する磁気フローセルでよい。
【００２３】
図２に示されるように、アセンブリ２００はまた、流体又はその他の物質が移送される廃棄バッグ２２０を有する。ある実施形態では、廃棄バッグ２２０には、使用済みの洗浄流体と細胞濃縮のために細胞含有流体流から除去された流体と、が収容される。
【００２４】
図３は、２つのチャンバ３０４、３０８を使用する分離チャンバシステム３００の一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、システム３００は、２つのチャンバを用いて、ビーズを含む細胞流を処理する。これら実施形態において、チャンバ３０４のような第１チャンバを用いて、まず、流体流からビーズが除去される。ある実施形態において、チャンバ３０８は、細胞の洗浄及び濃縮を行うために主に使用されるが、残っているビーズを分離するために使用されてもよい。
【００２５】
図３に示されるように、分離チャンバシステム３００は、遠心分離ロータ３１２に取り付けられる。そして、遠心分離ロータは回転し、チャンバ３０４、３０８の各チャンバ内に遠心力場を形成する。各チャンバ内に遠心力場が形成される結果、チャンバ３０４において細胞からビーズが分離され、チャンバ３０８において細胞が濃縮・洗浄される。いくつかの実施形態では、分離チャンバを１つだけ用いて、細胞からのビーズの分離、細胞の洗浄、及び細胞の濃縮を行ってもよい。
【００２６】
図４及び図５は、分離チャンバ４００を示す。図４及び図５に示されるように、チャンバ４００は、３ポートチャンバ設計である。ある実施形態では、チャンバ４００のポートとしては、第１上部ポート、第２下部ポート、第３側部ポートがある。
【００２７】
いくかの実施形態において、チャンバ４００は、細胞とビーズと液体とを含む流体流をチャンバに移送することによって、使用される。流体流は、例えば、側部ポートを介してチャンバに流入する。チャンバにおいて、より重い粒子（例えば、ビーズ）は、チャンバ底部に集まる。チャンバ４００は、遠心力場にさらされ、ビーズがチャンバ底部に集まることを促進する。細胞は中間層に存在し、液体はチャンバの頂部に位置する。
【００２８】
小流量の液体を下部ポートからチャンバへ流すことによって、細胞がビーズに付着しないようにする。そのような液体を用いて細胞洗浄を行ってもよい。図５は、チャンバ４００の下部ポートの近接図である。図５に示すように、チャンバ４００の下部ポートに取り付けられたチューブにいくつかのビーズが集まっている。
【００２９】
特定の実施形態では、分離された後、流体流の種々の成分が、いずれかのポートを介してチャンバから取り出される。ある実施形態では、チャンバにおいて分離された液体は、上部ポートを介して、チャンバ４００から取り出される。いくつかの実施形態では、ビーズは、下部ポートを介して、取り出される。他の実施形態では、ビーズが取り出された後、細胞も下部ポートから取り出される。
【００３０】
チャンバのポートは、チャンバにおいて分離された流体流の成分を送るために容器に接続される。例えば、余剰の液体が取り出されるポートは、液体廃棄物を収容するための液体廃棄バッグに接続される。他の実施形態において、ビーズが取り出されるポートは、廃棄又は再利用するため、ビーズを収容するためのバッグが接続される。細胞が取り出されるポートは、システム１１６（図１）のような充填システムに接続される。システム１１６は、濃縮された細胞の流れをそれぞれの容器に送る。ＤＭＳＯのような保存溶液をそれぞれの容器に添加してもよい。
【００３１】
図６は、細胞からビーズを分離するために使用される他の分離チャンバ６００の断面図である。図６に示されるように、チャンバ６００は、トラップ６０８とポート６０４とを備える。ある実施形態において、該ポートは、入口ポート又は出口ポート又は入口／出口ポートである。ある実施形態において、チャンバ６００は、遠心力場を生成する遠心分離機のロータに位置付けられる。流体流がチャンバ６００に移送されると、流体中で最も重い粒子（例えば、ビーズ）がトラップ６０８に集まり、そこに留まる。他の成分（例えば、液体、細胞等）の任意のものを、ポート６０４を介してチャンバ６００から取り出すことができる。
【００３２】
チャンバ４００、６００は例示の目的で示される。他の実施形態では、他のチャンバデザインが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、米国特許出願第１４／８２７，１３０号に開示されているチャンバデザインのいくつかが使用される。
【００３３】
前述のように、ある実施形態では、ビーズ除去のために使用されるフローセルが設けられる。ある実施形態において、ビーズは、磁気材料（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、希土類金属、又はそれらの合金）からなる磁気ビーズである。ある実施形態において、ビーズは、ポリマーでコーティングされた磁気材料から作製される（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）。これらの実施形態では、フローセルは、磁石（例えば、磁石アレイ）を備える。該磁石は、流体流から磁気ビーズを除去するために使用される。フローセルの詳細は以下で説明される。
【００３４】
図７は、ビーズ及び細胞を含む流体流からビーズを分離するためのフローセル７１２を利用する一実施形態に係る分離／濃縮システム７００のブロック図である。システム７００は、流体源７０４と、流体源をフローセル７１２に接続するチューブ７０８と、を有する。ポンプ７１６によって、流体源７０４から流体流をフローセル７１２を含む流体流路へポンピングする。フローセル７１２では、流体流からビーズが除去される。以下で詳細に説明するが、フローセル７１２は、磁石（例えば、磁石アレイ）を利用して、流体流から磁気ビーズを除去する。
【００３５】
流体流からビーズが除去された後、流体流中の細胞は濃縮及び／又は洗浄される。例えば、ビーズ除去された流体流は、チューブ７２０を介して濃縮器７２４に移送され、チャンバ７２８を用いて、細胞が濃縮される。ここでのチャンバは、例えば、上述のチャンバ４００又はチャンバ６００のいずれかであってよい。他の実施形態において、上述の米国特許出願第１４／８２７，１３０号に記載のチャンバのような３ポートチャンバであってもよい。細胞の濃縮の他に、洗浄流体を細胞に添加することによって、チャンバ７２８において細胞を洗浄してもよい。チャンバ７２８において、流体中に残存するビーズを除去してもよい。
【００３６】
細胞を濃縮／洗浄した後、収容するため、細胞の流れをポンプ７３６によってチューブ７３２を介して収容バッグ７４０に移送してもよい。他の実施形態では、チューブ７３２は、システム１１６のような充填システムに接続される。該システムによって、細胞の流れは、２つ以上の収容バッグへ移送され、使用まで貯蔵される。
【００３７】
システム７００はあくまで例示の目的で示される。上述のように、いくつかの実施形態において、システム７００は、システム１００のような、より大きなシステムに組み込まれる。他の実施形態において、システム７００は、スタンドアロンシステムとして動作させてもよい。いくつかの実施形態において、該システムは他の部品・部材を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において使用されるフローセルの特徴の例が以下で示される。他の実施形態において、システム７００は、図７で示される部材よりも少ない部材を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、システム７００は、濃縮器７２４を含まなくてもよく、ビーズ及び細胞を含む流体からビーズを除去するためだけに使用されてもよい。他の実施形態において、システム７００の一部は、アセンブリ２００（図２）のようなアセンブリに組み込まれてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、システム７００は、様々な体積の流体を処理するために使用される。一例として、流体源７０４は、システム７００によって処理される約１０ｍｌ〜約５０００ｍｌの量を収容してよい。一実施形態において、システム７００は、例えば、約１０ｍｌ〜約２５００ｍｌ、約１００ｍｌ〜約２０００ｍｌ、或いは約１５０ｍｌ〜約１５００ｍｌのように、約１ｍｌ〜約５０００ｍｌの量を処理する。ある実施形態において、システム７００は、約１０ｍｌよりも大きい量、約２０ｍｌよりも大きい量、約３０ｍｌよりも大きい量、約４０ｍｌよりも大きい量、約５０ｍｌよりも大きい量、約６０ｍｌよりも大きい量、約７０ｍｌよりも大きい量、約８０ｍｌよりも大きい量、約９０ｍｌよりも大きい量、或いは約１００ｍｌよりも大きい量を処理する。ある実施形態において、システム７００は、約５０００ｍｌよりも小さい量、約４０００ｍｌよりも小さい量、約３０００ｍｌよりも小さい量、約２０００ｍｌよりも小さい量、或いは約１０００ｍｌよりも小さい量を処理する。
【００３９】
システム７００のようなシステム及びその部材を流れる（例えば、フローセル７１２を流れる）流量は、例えば、約５ｍｌ／ｍｉｎ〜約２５０ｍｌ／ｍｉｎ、約１０ｍｌ／ｍｉｎ〜約２００ｍｌ／ｍｉｎ、或いは約１５ｍｌ／ｍｉｎ〜約１５０ｍｌ／ｍｉｎのように、約１ｍｌ／ｍｉｎ〜約５００ｍｌ／ｍｉｎの範囲にあってよい。ある実施形態において、システム７００は、約１０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で、約２０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で、約３０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で、約４０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で、或いは約５０ｍｌ／ｍｉｎよりも大きい流量で処理する。ある実施形態において、流量は、約５００ｍｌ／ｍｉｎよりも小さい流量、約４００ｍｌ／ｍｉｎよりも小さい流量、約３００ｍｌ／ｍｉｎよりも小さい流量、約２００ｍｌ／ｍｉｎよりも小さい流量、或いは約１００ｍｌ／ｍｉｎよりも小さい流量である。
【００４０】
図８〜図１０は、いくつかの実施形態において、ビーズと細胞とを含む流体流からビーズ（例えば、磁気ビーズ）を除去するために使用されるフローセル８００の図である。いくつかの実施形態において、フローセル８００は、システム７００（図７）のようなシステムにおいて、フローセル７１２として使用される。図８は上面図である。図９は分解図である。図１０は一部分解図（図８）を含む（線ＡＡに沿った）断面図である
【００４１】
図８に示すように、液体は、矢印８０４Ａの方向に沿って、入口ポート８０４を通ってフローセル８００に流入する。そして、矢印８０８Ａの方向に沿って、出口ポート８０８を通ってフローセル８００から流出する。以下で詳細に説明されるように、フローセル８００の特徴としては、流体流からビーズを除去して、ビーズ除去された流体流を出口ポート８０８を介してフローセル８００から流出させることである。
【００４２】
図８〜図１０に示されるように、フローセル８００は、上部８１２と底部８１６（図９）とを有する。上部８１２は、流体流が流れるチャンバ８２４を画定するのに役立つ頂壁８２０を有する。チャンバ８２４内には、複数のリッジ８２８が設けられ、該リッジ８２８は、それらの上を流体流が通過する際に乱流が発生するように設計される。
【００４３】
底部８１６は、磁石（８３２Ａ〜８３２Ｉ）で構成されるアレイ８３２を有する。該アレイはチャンバ８２４とリッジ８２８の近傍（例えば、下方）に位置付けられる。磁石８３２Ａ〜８３２Ｉは、部材８３６によって所定位置に保持され、流体流中の磁気ビーズを引きつけ、チャンバ８２４の壁（例えば、底壁）に対してビーズを保持するように構成される。
【００４４】
実施形態において、リッジ８２８は、流体流からビーズを除去するのに役立つ。理論に束縛されるものではないが、リッジ８２８は、流体がリッジ８２８の上を通過する際に流体流において渦流を発生させると考えられる。その結果、最も重い粒子（すなわち、ビーズ）は、リッジの底部に沈降する傾向となる。渦流は、ビーズに付着するかもしれない細胞を分離する。さらに、磁石アレイ８３２は、ビーズを引きつけ、リッジの底部にトラップする。その結果、流体流がフローセル８００を流れると、流体流からビーズが除去される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、フローセル８００は、細胞含有流を、細胞濃縮及び／又は洗浄用チャンバ（例えば、チャンバ４００、チャンバ６００及び／又はチャンバ７２８）のようなチャンバに流入させる前に使用される。これらの実施形態において、流体流はフローセル８００を流れることで、流体流中の大多数のビーズが除去され、その後、流体流は、細胞の洗浄・濃縮、また、図７において説明したように、残存するビーズの除去が行われるチャンバへ向かう。
【００４６】
一実施形態において、さらに洗浄液が、フローセル８００に対して流入・流出される。例えば、一実施形態において、洗浄液は、（フローセル８００において最初の流体流の処理が行われた後）フローセル８００内を逆方向に流される。すなわち、洗浄液は、フローセル８００に対して、矢印８０８Ａの反対方向に沿って流入し、矢印８０４Ａの反対方向に沿って流出する。洗浄液によって、フローセル８００内の細胞は取り出され、洗浄液によって取り出された細胞はさらに洗浄・濃縮するためのチャンバへ向かう。
【００４７】
他の実施形態において、洗浄液を反対方向に流した後、矢印８０４Ａ及び矢印８０８Ａが示す方向に再度流すようにしてもよい。この場合、洗浄液をフローセル８００に対して２度流すことによって、最初の処理の後のフローセル８００に残った細胞が取り出される。いくつかの実施形態において、洗浄液は、フローセル８００に対して１度だけ流してもよい。この場合、矢印８０４Ａ、８０８Ａが示す方向と反対の方向に流してもよいし、同じ方向に流してもよい、
【００４８】
フローセル８００の上部及び底部は、任意の好適な材料から作製される。制限する意図はないが、いくつかの例としては、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ある実施形態において、フローセル８００の材料は透明及び／又は透光性であり、ユーザが、ビーズが流体流から除去されているかどうかを視認できるように構成される。
【００４９】
図１１Ａ〜図１１Ｅは、ビーズ及び細胞を含む流体流からビーズ（例えば、磁気ビーズ）を除去するために用いられるフローセル１１００の種々の図である。いくつかの実施形態において、フローセル１１００は、システム７００（図７）のようなシステムにおいて、フローセル７１２として使用される。図１１Ａは、フローセル１１００の上面図である。図１１Ａでは、固定部１１０４及びスライド部１１０８が示されている。スライド部１１０８は固定部１１０４のハウジング１１１２内に位置付けられている。明らかなように、ある実施形態において、スライド部１１０８は、矢印１１１６に示される方向で、ハウジング１１１２に対して出し入れされる。
【００５０】
図１１Ｂ〜図１１Ｅは、フローセル１１００の側面図である。図１１Ｂ〜図１１Ｅに示されるように、スライド部１１０８はプレート１１１８と、レール１１２０、１１２４と、を有する。レール１１２０、１１２４によって、プレート１１１８は、スライドしながらハウジング１１１２に出し入れすることが可能となる。明らかなように、レール１１２０、１１２４は、ハウジング１１１２内部のトラックと係合することによって、スライド動作中のレール１１２０、１１２４はガイドされる。
【００５１】
スライド部１１０８はプレート１１１８を有する。いくつかの実施形態において、プレート１１１８は、フローセル１１００を流れる流体流から磁気ビーズを除去するのに役立つ磁石又は磁石アレイを有する。他の実施形態において、磁石は、ハウジング１１１２の内面１１６４のようなハウジング１１１２の内壁に設けられる。プレート１１１８及び／又は内壁１１６４の一部として含まれる磁石及び／又は磁石アレイの例は、図１３Ａ〜図１３Ｅを参照して以下で説明される。
【００５２】
ある実施形態において、プレート１１１８は、磁気材料から作製され、磁気を帯びている（例えば、図１３Ｅ及び１３Ｆに示されるように、領域ごとに異なる極性とすることで磁石アレイが形成される）。他の実施形態において、プレート１１１８は、磁気材料（磁石や磁石アレイ）を締結部材で固定保持できるベースプレートのように、複数の材料／部材から構成されてもよい。ベースプレートは、高分子材料（例えば、ポリエチレン）、金属材料（例えば、アルミニウム）、又はそれら材料の組み合わせから作製することができる。
【００５３】
図１１Ｃ〜図１１Ｅに示される実施形態において、曲がりくねった非直線状（ｉｎｄｉｒｅｃｔ）流路を有するバッグ（例えば、１１４０）が用いられる。非直線状流路を有するバッグによって、該バッグの入口（例えば、１１４４）と出口（例えば、１１４８）との間の流路は、直線路ではなくなる（例えば、曲がりくねった流路、障害物を有する流路、バッフルを有する流路等）。図１１Ｃ〜図１１Ｅにおいて、バッグは、入口と出口との間に曲がりくねった流路を有する蛇行形状バッグ１１４０である。該流体流路は複数のチャネル壁によって構成される。
【００５４】
ある実施形態において、蛇行形状バッグ１１４０は、以下で詳細に説明されるが、スライド部１１０８に取り付け可能なディスポーザブル部材であってもよい。図１１Ｃに示されるように、蛇行形状バッグ１１４０は、入口ポート１１４４と出口ポート１１４８を有する。バッグ１１４０はさらに、例えば、ポンプや重力によって流体流が流されるチャネル１１５２を有する。チャネル１１５２によって、流体流用の流体流路の一部には、非直線状路を形成する障壁となるチャネル壁が設けられる。さらに、蛇行形状バッグ１１４０は、スライド部１１０８に取り付けるための機構を有してよい。例えば、穴１１５６、１１６０を用いて、蛇行形状バッグはスライド部１１０８に固定される。この場合、プレート１１１８は、穴１１５６、１１６０と嵌合するポスト１１３２、１１３６のような対応する機構を有する。さらに、プレート１１１８は、蛇行形状バッグ１１４０をプレート１１１８にさらに固定するクランプ１１２８を有してもよい。
【００５５】
蛇行形状バッグ１１４０は特定のデザインを有するように示されているが、そのようなデザインに制限されない。図１２Ａ及び図１２Ｂには、いくつかの実施形態と共に使用される他の蛇行形状バッグのデザインが示されている。また、図１２Ｃ〜図１２Ｆには、ある実施形態において使用される非直線状流路を有するバッグの他の例が示されている。
【００５６】
図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるバッグ１２００（図１２Ａ）及びバッグ１２１６（図１２Ｂ）のそれぞれは、いくつかの実施形態において、フローセルの一部として使用される。図１２Ａに示されるように、バッグ１２００は、入口ポート１２０４及び出口ポート１２０８を有する。バッグ１２００はさらに、例えば、ポンプや重力によって流体流が流されるチャネル１２１２を有する。同様に、図１２Ｂは、入口ポート１２２０及び出口ポート１２２４を有するバッグ１２１６を示す。バッグ１２１６はさらに、例えば、ポンプや重力によって流体流が流されるチャネル１２２８を有する。
【００５７】
類似しているが、バッグ１２００とバッグ１２１６にはいくつかの異なる特徴がある。例えば、入口ポートと出口ポートは異なる位置に配置されている。バッグ１２００では、入口ポート１２０４は、出口ポート１２０８が配置される辺と平行な辺に配置されている。一方、バッグ１２１６では、入口ポート１２２０は、出口ポート１２２４が配置されている辺と垂直な辺に配置されている。さらに、チャネル１２１２は、チャネル１２２８よりもわずかに長い。これらはあくまでも例であり、チャネル長、チャネル径、ポート配置等は異なってもよい。
【００５８】
図１２Ｃを参照すると、バッグ１２３２は、入口ポート１２３６と出口ポート１２４０とを有する。さらに、非直線状流路１２４４は、複数の障壁１２４６によって部分的に形成される。入口ポート１２３６に入る流体流は、障壁１２４６の周りを流れて、出口ポート１２４０に到達する。従って、流路１２４４は（曲がりくねった）非直線状となり、流体は、直線路よりも長い時間、バッグ１２３２内に滞在することになる。滞在時間が長くなることにより、流体流から磁気ビーズを除去するための（例えば、プレート１１１８上の磁石によって生成される）磁場の流体流への作用時間が、より長くなる。
【００５９】
図１２Ｄは、入口ポート１２５２と出口ポート１２５６とを有する他のバッグ１２４８を示す。非直線状流路１２６０は、複数の障壁１２６２によって部分的に形成される。入口ポート１２５２に入る流体流は、障壁１２６２の周りを流れて、出口ポート１２５６に到達する。従って、流路１２６０は（曲がりくねった）非直線的なものとなり、直線路よりも長い時間、流体はバッグ１２４８内に滞在することになる。
【００６０】
図１２Ｅは、入口ポート１２６８と出口ポート１２７２とを有する他のバッグ１２６４を示す。非直線状流路１２７６は、複数の障壁１２７８によって部分的に形成される。入口ポート１２６８に入る流体流は、障壁１２７８の周りを流れて、出口ポート１２７２に到達する。従って、流路１２７６は（曲がりくねった）非直線的なものとなり、直線路よりも長い時間、流体はバッグ１２６４内に滞在することになる。これにより、（例えば、プレート１１１８上の磁石によって生成される）磁場が流体流に作用する時間は、より長くなる。
【００６１】
図１２Ｆは、入口ポート１２８４と出口ポート１２８８とを有するさらに他のバッグ１２８２を示す。非直線状流路１２９２は、複数の障壁１２９４によって部分的に形成される。入口ポート１２８４に入る流体流は、障壁１２９４の周りを流れて、出口ポート１２８８に到達する。従って、流路１２９２は（曲がりくねった）非直線的なものとなり、直線路よりも長い時間、流体はバッグ１２８２内に滞在することになる。これにより、（例えば、プレート１１１８上の磁石によって生成される）磁場が流体流に作用する時間は、より長くなる。
【００６２】
ある実施形態において、バッグの非直線状流路は、流体がバッグ内を流れる際、磁場によって該流体から磁気ビーズを除去できる程度に十分な長さとなるように構成される。ある実施形態において、非直線状流路は、バッグを流れる流体から、約８０％を超えるビーズが除去できる程度に、又は約９０％を超えるビーズが除去できる程度に、又は約９５％を超えるビーズが除去できる程度に、又は約９８％を超えるビーズが除去できる程度に、又は約９９％を超えるビーズが除去できる程度に、十分な長さがよい。他の実施形態においては、流路は、バッグを流れる流体から、約９９％未満のビーズが除去できる程度に、又は約９８％未満のビーズが除去できる程度に、又は約９７％未満のビーズが除去できる程度に、十分な長さがよい。
【００６３】
ある実施形態において、バッグ１１４０、１２００、１２１６、１２３２、１２４８、１２６４、１２８２は、高分子材料製の２枚のシートを、例えば、高周波溶接、超音波溶接、レーザ溶接、及び／又は溶剤接着等により密封することで作製される。いくつかの実施形態において、流路（例えば、チャネル１１５２、１２１２、１２２８及び障壁１２４６、１２６２、１２７８、１２９４）の特徴は、該特徴が構成されるようなパターンで２枚のシートを密封することによって形成される。そのようなシートは、任意の好適な材料で構成される。限定はされないが、そのような材料の例としては、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６４】
ある実施形態において、バッグ１１４０、１２００、１２１６、１２３２、１２４８、１２６４、１２８２はさらに、流体流から磁気ビーズを除去するのに役立つ特徴を有する。バッグ１１４０、１２００、１２１６、１２３２、１２４８、１２６４、１２８２は、例えば、以下のような構造を有するポリマー材料製シートで作製することができる。一例として、該構造は、リッジ８２８（図８）と同様のリッジを有する。他の例では、該構造は、流体流が流れる表面に粗さを付与する形状物の規則的な又はランダムなパターンであってもよい。該構造は、バッグ（例えば、バッグ１１４０、１２００、１２１６、１２３２、１２４８、１２６４、１２８２）の壁にビーズを保持させるのに有用である。ある実施形態において、該構造は、例えば、流体が該構造を通過すると流体流中に渦流が発生し、液体を、磁場が存在する壁に向かって移動させる等によって、バッグにおける流体流に影響を与える。他の例としては、バッグは、ビーズがバッグの壁に保持されているかどうかをユーザが視認できるように、透明及び／又は透光性であってもよい。
【００６５】
図１１Ｃ〜図１１Ｅに戻って、蛇行形状バッグ１１４０は、第１スライド部１１０８をハウジング１１１２から取り出して、第１スライド部１１０８に取り付けられる（図１１Ｃ）。蛇行形状バッグ１１４０は、ポスト１１３２、１１３６を穴１１５６、１１６０にそれぞれ挿入することによって、第１スライド部１１０８に位置付けられる（図１１Ｄ）。また、クランプ１１２８によって、蛇行形状バッグは、プレート１１１８にさらに固定される。最後に、スライド部１１０８は、ハウジング１１１２内へ戻される（図１１Ｅ）。
【００６６】
バッグ１１４０をプレート１１１８へ取り付けて、ハウジング１１１２に位置付けると、バッグ１１４０は磁場にさらされる。磁場は、プレート１１１８上に設けられた又はハウジング１１１２の内面１１６４に設けられた磁石又は磁石アレイによって生成される。実施形態において、磁石又は磁石アレイは、流体流がチャネルを通過する際に流体流中のビーズを引きつける磁場が最大となるように配置される。
【００６７】
バッグ１１４０の入口ポート１１４４及び出口ポート１１４８は、流体流を処理するためのシステムの他の部品・部材に流体接続される。例えば、図７を参照して説明したように、入口ポート１１４４は流体源７０４に取り付けられ、出口ポート１１４８は、濃縮器７２４に取り付けられる。
【００６８】
いくつかの実施形態において使用される磁石アレイの例は、図１３Ａ〜図１３Ｅに示される。図１３Ａは、フローセル８００のアレイ８３２（図８〜図１０）と同様の、丸型磁石のアレイ１３００を示す。アレイ１３００は、５列に配置された４５個の磁石を有する。他の実施形態では、アレイ１３００は、異なるパターンに配列された異なる数の磁石を有してもよい。
【００６９】
図１３Ａは、１列に配置された角型磁石１３３０Ａ〜１３３０Ｉを有するアレイ１３３０を示す。他の実施形態において、磁石は異なるパターンに配列されてもよい。例えば、磁石１３３０Ａ〜１３３０Ｉは、他の磁石１３３０Ａ〜１３３０Ｉに対して垂直に位置付けられてもよい。
【００７０】
図１３Ｃは、正方形磁石のアレイ１３６０を示す。アレイ１３６０は、５列に配置された４５個の磁石を有する。他の実施形態において、アレイ１３６０は、異なるパターンに配列された異なる数の磁石を有してもよい。
【００７１】
ある実施形態において、アレイの配列によって、磁場の特徴が制御される。例えば、ハルバッハ配列を行うことによって、蛇行形状バッグ近傍に強い磁場を形成することができる。図１３Ｄは、ハルバッハ配列を行ったアレイの（ＢＢ線の）断面図である。図１３Ｄに示されるように、この配列においては、アレイ１３６０の上面における磁場は強められ、強磁場１３６４を生成し、底面における磁場は相殺され、弱磁場１３６８を生成する。実施形態において、磁気ビーズ及び細胞を含む流体流がバッグを流れる際に磁気ビーズを蛇行形状バッグの壁に保持させるため、蛇行形状バッグを強磁場１３６４と同様の磁場近傍に位置付けられるように、フローセルは構成される。
【００７２】
図１３Ｅは、正方形磁石を有する別のアレイ１３７２を示す。アレイ１３７２の磁石は、極が交互になるように配列される。図１３Ｅは、上面１３７６の極の状態を示す上面図である。明らかであるが、底面においては、反対の極となっている。ある実施形態において、アレイ１３７２は、流体流からの磁気ビーズの除去を一層高める磁場を提供する。
【００７３】
上記の磁石の配列はあくまでも例示である。他の実施形態では、フローセルに用いられる磁場の特徴を変化させるような異なる形状の磁石、異なるサイズの磁石、異なる磁石配列であってもよい。またさらに、他の実施形態では、磁石は、永久磁石でも電磁石でもよい。磁石に加えて、アレイはさらに、磁石を区切って配置するために強磁性体材料のような他の材料を用いてもよい。これは、ビーズを捕獲するために用いられる磁場の形状、強度、又は大きさを制御するのに役立つ。
【００７４】
図１４は、本発明の実施形態において行われるプロセスのフローチャート１４００を示す。以下では、フローチャート１４００のステップを行うための特定の部品・部材が説明されるが、本発明はそれらに限定されない。例えば、いくつかのステップは、フローセル（例えば、フローセル７１２、８００、１１００）によって行われ、他のステップは、ポンプ（例えば、ポンプ７１６）によって行われるように記載されてもよい。これらはあくまでも例示の目的で行われるものであり、フローチャート１４００は、特定の装置や特定の部品・部材によって行われることに制限されない。
【００７５】
ある実施形態において、フローチャート１４００は、細胞（例えば、Ｔ細胞）と磁気ビーズとを含む流体流のような流体流を処理するために行われる。そのような処理は、細胞を含む流体流から磁気ビーズを除去するステップを有する。フロー１４００は、ステップ１４０４から始まり、流体流を流体流路に沿って流すステップ１４０８へ進む。該流体流路は、バッグ内に非直線状流路を有する。ステップ１４０８は、いくつかのサブステップを有する。例えば、いくつかの実施形態において、流体を（例えば、ポンプ７１６によって）ポンピングするためのサブステップ１４１４をオプションとして含んでもよい。他の実施形態では、ステップ１４０８において、流体は重力によって移送されてもよい。
【００７６】
ステップ１４０８は、所定流量でビーズ・細胞含有流体流を移送させるステップを有してもよい。例えば、流体は、約５ｍｌ／ｍｉｎ〜約２５０ｍｌ／ｍｉｎ、約１０ｍｌ／ｍｉｎ〜約２００ｍｌ／ｍｉｎ、或いは約１５ｍｌ／ｍｉｎ〜約１５０ｍｌ／ｍｉｎのように、約１ｍｌ／ｍｉｎ〜約５００ｍｌ／ｍｉｎの流量で移送される。ある実施形態においては、流量は、約１０ｍｌ／ｍｉｎより大きい、又は約２０ｍｌ／ｍｉｎより大きい、又は約３０ｍｌ／ｍｉｎより大きい、又は約４０ｍｌ／ｍｉｎより大きい、又は約５０ｍｌ／ｍｉｎより大きい。ある実施形態においては、流量は、約５００ｍｌ／ｍｉｎより小さい、又は約４００ｍｌ／ｍｉｎより小さい、又は約３００ｍｌ／ｍｉｎより小さい、又は約２００ｍｌ／ｍｉｎより小さい、又は約１００ｍｌ／ｍｉｎより小さい。
【００７７】
ステップ１４０８の後、フロー１４００は、ステップ１４１６へ進む。ステップ１４１６では、流体流が磁場にさらされる。いくつかの実施形態において、ステップ１４１６は、磁石又は磁石アレイを有するフローセル７１２、８００、１１００のようなフローセルを使用してもよい。ステップ１４１６は、いくつかのサブステップを有してもよい。いくつかの実施形態において、ステップ１４１６では、流体流がバッグを流れる際、該流体流が磁場にさらされる。
【００７８】
ある実施形態において、ステップ１４１６は、いくつかのサブステップを有してもよい。例えば、サブステップ１４２０において、流体流は、磁石が交互配列されたアレイによって生成された磁場にさらされる。該アレイは、アレイ１３７２（図１３Ｅ）と同様であってもよいし、異なる配置であってもよい。他の実施形態において、ステップ１４１６において用いられる磁場は、電磁石で生成されてもよい。これらの実施形態において、サブステップ１４２４では、電磁石をＯＮすることによって、磁場が生成される。
【００７９】
ステップ１４１６の後、ステップ１４２８において、流体流からビーズが除去される。上述のように、ビーズは磁性を有しており、ステップ１４１６において磁場にさらされることで、流体流からビーズが除去される。ステップ１４２８は、いくつかのサブステップを有してもよい。例えば、サブステップ１４３２において、流体流がバッグを通過する際、磁場によってビーズを引きつけ、バッグの壁に該ビーズを保持させる。
【００８０】
ある実施形態において、ステップ１４２８では、大部分の細胞を失わずに、流体流中の大部分のビーズは除去される。ある実施形態において、流体流中のビーズのうち、約７５％より多いビーズ、又は約８０％より多いビーズ、又は約８５％より多いビーズ、又は約９０％より多いビーズ、又は約９５％より多いビーズ、又は約９６％より多いビーズ、又は約９８％より多いビーズ、が流体流から除去される。他の実施形態においては、ステップ１４２８において、流体流中のビーズのうち、約９９％未満のビーズ、又は約９８％未満のビーズ、又は約９７％未満のビーズ、がバッグを通過する流体流から除去される。
【００８１】
ステップ１４２８の後、流体流中の細胞を濃縮するためのオプションとしてのステップ１４３６が行われてもよい。ステップ１４３６は、濃縮器／洗浄システム（例えば、システム１０８、濃縮器７２４）によって行うことができる。ステップ１４３６は、流体を細胞濃縮用チャンバへ移送させるためのサブステップ１４４０のような、いくつかのサブステップを含んでよい。ある実施形態において、濃縮・洗浄のためのチャンバとしては、細胞３ポートチャンバを用いることができる（例えば、チャンバ４００、６００）。また、残存したビーズは、そのようなチャンバによって、流体流からさらに除去される。
【００８２】
オプションとしてのステップ１４３６の後、オプションとしてのステップ１４４４において、細胞は貯蔵される。ある実施形態において、流体からビーズを除去した後、溶液中の細胞のうち、約９０％を超える細胞が、又は約９５％を超える細胞が、又は約９６％を超える細胞が、又は約９７％を超える細胞が、又は約９８％を超える細胞が、又は約９９％を超える細胞が、溶液から回収され、例えば、治療目的のために使用される。他の実施形態において、溶液中の細胞のうち、約９９％未満の細胞が、又は約９８％未満の細胞が、又は約９７％未満の細胞が、又は約９６％未満の細胞が、又は約９５％未満の細胞が、回収される。フロー１４００はステップ１４４８で終了する。
【００８３】
フローチャート１４００は、ステップがある特定の順序で列挙されて記載されているが、本開示は、そのような順序に制限されない。他の実施形態において、ステップは、異なる順序で、或いは並行して、或いは異なる回数で（例えば、他のステップの前後で）、行われてもよい。さらに、上記したように、フローチャート１４００は、いくつかのオプションとしてのステップを有する。しかしながら、オプションとして示されていない上記ステップは、本発明において必須であると考えるべきではなく、いくつかの実施形態では行われ、他の実施形態では行われなくてもよい。
【００８４】
当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の方法及び構造に対して種々の変形及び変更を行えることは理解できよう。従って、本発明は、上記の特定の実施形態又は実施例に限定されないと理解されるべきである。むしろ、本発明は、以下の請求項及びそれらの等価物の範囲内において、変形形態及び変更形態をも含むことが意図されている。
【００８５】
本発明の実施形態及び適用例が示され説明されてきたが、本発明は、上記した構成に制限されないと理解されるべきである。当業者に明らかな種々の変形、変更等は、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の構成、動作、また方法及びシステムにおける詳細において行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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