(57)【要約】  対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または脊髄損傷（ＳＣＩ）の検出またはその状態をモニターするための方法が提供される。一実施形態において、当該方法は、対象から得た体液の標本を、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ）から選択されるＴＢＩのマーカー、またはＡＬＤＯＣもしくはＢＬＢＰの外傷特異的分解産物（ＢＤＰ）についてアッセイするための試薬と接触させることを含む。当該方法はさらに、標本中に存在するマーカーの量を対照試料と比較して測定すること、および増加した量のマーカーが対照試料と比較して標本中に存在する時、ＴＢＩまたはＳＣＩの存在を判定することを含む。当該方法は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、αＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ／ＨＳＰ２７）、ＡＬＤＯＣ、ＣＳ、ＰＥＡ１５、もしくはＣＲＹＡＢの切断産物、またはこれらの２つ以上からなる組み合わせの量を測定することを含むことができる。【選択図】図１６
2018523092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象から得た体液の標本を、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７）、またはＡＬＤＯＣもしくはＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７の外傷特異的分解産物（ＢＤＰ）から選択されるＴＢＩのマーカーについてアッセイするための試薬と接触させること、
（ｂ）対照試料と比較して前記標本中に存在するマーカーの量を測定すること、ならびに
（ｃ）前記対照試料と比較したマーカーの量の増加が前記標本中に存在する時のＴＢＩまたはＳＣＩの存在を判定すること
を含む、前記対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）および／または脊髄損傷（ＳＣＩ）の状態を検出またはモニターするための方法。
【請求項２】
前記ＴＢＩのマーカーは、ＡＬＤＯＣまたはそのＢＤＰ、およびＢＬＢＰまたはそのＢＤＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、αＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ／ＨＳＰ２７）、ＡＬＤＯＣ、ＧＳ、ＰＥＡ１５、またはＣＲＹＡＢの外傷特異的タンパク質分解性切断産物、あるいはこれらのうちの２つ以上からなる任意の組み合わせの量を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＡＬＤＯＣの前記外傷特異的タンパク質分解性切断産物が、３８ｋＤａ断片、３５ｋＤａ断片、３０ｋＤａ断片、および２３ｋＤａ断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＧＳの前記外傷特異的タンパク質分解性切断産物は、３７＋３５ｋＤａ二重線、３２ｋＤａ断片、２３ｋＤａ断片、２０ｋＤａ断片、および１８ｋＤａ断片からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＰＥＡ１５の前記外傷特異的タンパク質分解性切断産物は、１２＋１３ｋＤａ二重線および８ｋＤａ断片からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
αＢ−クリスタリンの前記外傷特異的タンパク質分解性切断産物は、１８＋１９ｋＤａ二重線、１７ｋＤａ断片、１５＋１４ｋＤａ二重線および８ｋＤａ断片からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記対象から得た脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中の血液特異的タンパク質の量を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血液特異的タンパク質は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象から得た脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のプロスタグランジンシンターゼ（ＰＴＧＤＳ）の量を測定することをさらに含み、およびＰＴＧＤＳの量が減少した時、ＴＢＩの存在が判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の２０〜３０ｋＤａのＢＤＰの量を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）の前記試薬は、前記ＴＢＩのマーカーを特異的に結合する抗体を含み、および前記測定することはイムノアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノアッセイは、ウェスタンブロット法、またはＥＬＩＳＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対照試料は、前記対象から得た損傷前試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対照試料は、健常対象者の対照コホートから得た平均値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
追加のマーカーはアッセイされない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
４以下のマーカーがアッセイされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記体液の標本は、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、鼻水、耳垢、尿、唾液、涙、または脳微小透析液を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬は、タンパク質配列およびタンパク質配列断片特異的ペプチドを含み、ならびに前記測定することにおいて標的指向化定量的質量分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定することは、多重または併行反応モニタリング質量分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
バイオマーカーのセットを特異的に結合する試薬を含むキットであって、前記バイオマーカーは、
（ａ）アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）、および
（ｂ）脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ）
を含み、この中で前記試薬はポリヌクレオチドまたは抗体であり、前記試薬は、検出可能なマーカーで任意に標識され、およびこの中で、前記キットは任意に、前記試薬を収容するための少なくとも１つの容器および／または検査試料における外傷性の脳もしくは脊髄損傷の状態を判定するための前記試薬の使用のための説明書からさらになる、前記キット。
【請求項２２】
（ｃ）星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、および／または
（ｄ）グリア線維性酸性タンパク質の２０〜３０ｋダルトン断片（ＧＦＡＰ−ＢＤＰ）
を特異的に結合する試薬をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記バイオマーカーのセットは、最多４のバイオマーカーからなる、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
（ａ）対象から得た血清試料を請求項２１に記載のキットと接触させること、および
（ｂ）前記バイオマーカーに対する前記試薬の結合を測定すること
を含む、前記血清試料におけるバイオマーカーＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの発現を判定する方法。
【請求項２６】
（ａ）対象から得た血清試料を請求項２１に記載のキットと接触させること、および
（ｂ）前記バイオマーカーに対する前記試薬の結合を測定すること、
（ｃ）前記結合を対照試料と比較すること、ならびに
（ｄ）ＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰに対する前記試薬の結合が、前記対照試料に対して前記対象由来の前記血清試料において亢進する場合に存在していることになっているＴＢＩを判定すること
を含む、前記血清試料における外傷性脳損傷の状態を判定する方法。
【請求項２７】
対象由来の体液の標本を、対照試料と比較したＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの量の増加についてアッセイすることを含む、前記対象におけるＴＢＩを検出する方法であって、ＡＬＤＯＣおよび／またはＢＬＢＰの量の増加はＴＢＩを示す、前記方法。
【請求項２８】
前記アッセイすることは、推定損傷の２４時間以内に実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象は、乳幼児または児童である、請求項２７または２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体の内容が参照により本出願に組み込まれる２０１５年５月５日出願の米国仮特許出願番号第６２／１５７，３８９号の利益を請求する。
【０００２】
ＥＦＳウェブを介して提出される配列表に対する参照
２０１６年５月５日に作成し、本出願とともにＥＦＳウェブを介して電子的に提出した３ｋｂの大きさである「ＵＣＬＡ２１７＿ＳＬ」という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府の支援に関する謝辞
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＮＳ０７２６０６の下での政府の支援によってなされた。当該政府は、本発明におけるある一定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、国防省ＵＳＡＭＲＭＣ  ＣＤＭＲＰ賞によって授与された研究助成金第ＦＳＥＣＳＴＳ  ＥＭＳ＃１２３３９０７９号に関する政府の支援によってなされた。当該政府は、本発明におけるある一定の権利を有する。
【０００５】
本発明の技術分野
本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、軽度ＴＢＩ（脳震盪）および外傷性脊髄損傷（ＳＣＩ）ならびに慢性神経変性疾患からのこれらの区別を含む、神経外傷の重症度および転帰の検出、早期推定、進行および治療のモニタリングのための抗体、プローブ、キットおよび関連材料、ならびにこれらの使用を含む、本発明の内容の組成物に関する。
【背景技術】
【０００６】
毎年、１７０万人が米国においてＴＢＩに罹患している。１６０万〜３８０万人のしばしば報告されていない脳震盪が毎年発生しており、ＴＢＩは非常に有意な無症候性流行病となっている。さらに１００万人の患者が毎年、米国の救急部において脊椎損傷と評価され、その２〜３パーセントは、脊髄損傷に罹患している。神経外傷患者に対する救命処置の判断は、脳外傷患者の容態が典型的にＴＢＩ後に日に日に変化するので、発展する損傷進行による迅速な診断および反復される正確な危険評価を必要とする。中等度および重度の外傷性の脳および脊髄損傷患者を評価することは、安全な緊急処置、二次的な有害事象に応答するよう準備するために損傷の進展をモニターすること、および神経外傷患者に対する回復力の早期評価である転帰を推定することにとって決定的に重要である。神経外傷患者の評価は、患者間での重症度における広範な異種性によって疑われている。合併症の危険にある個々の脳震盪患者を識別すると、これらは、遷延性症候群に罹患しているまたはＣＡＴ走査所見が陽性である軽度ＴＢＩ患者であり、緊急治療応答者ならびにスポーツおよび軍隊の競技場経営に対する優先権がある。乳幼児、児童および若年の脳損傷は、世界規模での子供における死亡および身体障害の主要因を含み、さらに、診断は疑わしく、その理由は、ＴＢＩの徴候および症状が存在しない、または一般的な子供の病気と重なっているからである。発達中の脳は、ＣＡＴ走査の電離放射線に対してより感度が高いので、客観的なバイオマーカー検査を提供することによって、不必要なＣＴ走査を減らすことが必須である。若年者に加えて、高齢者は、転倒によるＴＢＩについての共通の標的群であり、ＴＢＩバイオマーカーシグナルを慢性神経変性マーカー特性と区別することが望ましい。
【０００７】
ＴＢＩ患者の診断およびモニタリングは、脳の傷害の重症度を評価し危険度を正確に評価して、適切な予防処置で応じるために重要である。重度ＴＢＩ患者にとって、時宜を得た外科的介入は、救命し得る。軽度ＴＢＩ患者にとって、慢性疼痛および認知的または心理学的障害を発症させる危険にある脳震盪患者の識別は、治療の選択肢、対処戦略における誘導を提供し、および回復中の脳を第二の衝撃へ曝露するのを予防するのに役立つであろう。現行の重症度評価は主として、グラスゴー昏睡尺度を用いた昏睡の深度および持続期間に依存し、当該グラスゴー昏睡尺度は、患者の進行性障害の経過とともに日々変化し、昏睡を維持するために必要とされ得る服薬へ供される（Ｉａｎｋｏｖａ，２００６）。軽度ＴＢＩは、主観的で動機の上で影響され得る意識消失、認知的または心理学的症状および疼痛症状の時間によって評価される。神経イメージングツール、特に先進的な治療法は、集中治療患者に対して反復して投与されることが困難であり、標準化を欠いている種々の読み出し値を有しており、どこでも入手可能ではなく、軽度ＴＢＩ患者および小児患者にとって使用が制限されている。
【０００８】
代用の化学的バイオマーカーの血中濃度を測定することは、ＴＢＩ患者に対する危険および需要を分類するための診断開始点として、より単純で客観的でおよびより容易に標準化されたツールを提供することができる。神経外傷バイオマーカーは、外傷性脳細胞から短時間で放出されるべきであり、脳および機械的外傷に特異的であるべきであり、血液脳関門を容易に通過すべきであり、ならびに健常な対象において存在をまったく示さないまたは一貫して低濃度を示すべきである。
【０００９】
目下、ＴＢＩ患者の大部分である脳震盪患者にとっても、ＴＢＩの疑いのある小児患者にとっても、臨床用途において高感度で、客観的な、標準化された診断検査はない。当該患者は、持続性脳損傷に罹患する危険にある易損性の脳が反復性衝突するのを予防するための客観的危険評価の必要が特にある標的集団である。外傷の進行は、告知した介入を必要とし得る損傷後の連続した日数における二次的悪化について公知であるので、集中治療室の頭部外傷患者は、代わりのモニタリング、または時間および経費のかかる補充的なイメージングのために、反復性非侵襲的血液試料分析から利益を得ることのできる別の標的群である。さらに、短期間の急性後重症度評価を判定するための、およびＴＢＩ患者へ投与される薬剤または他の治療パラダイムの効能を判定するための脳損傷バイオマーカーの反復性生体液試料分析に対する需要が残っている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、これらの需要ならびにその他を、対象における軽度の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断を含む重症度範囲全体に対するＴＢＩの状態を検出もしくはモニターするための、および／または合併症の危険にある軽度ＴＢＩ患者を判定するための、および／または脊髄損傷（ＳＣＩ）の状態を検出もしくはモニターするための方法を提供することによって満たす。一実施形態において、当該方法は、対象から得た体液の標本を、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７）、またはＡＬＤＯＣもしくはＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７の外傷特異的分解産物（ＢＤＰ）から選択されるＴＢＩのマーカーについてアッセイするための試薬と接触させることを含む。当該方法はさらに、対照試料と比較して当該標本中に存在するマーカーの量を測定すること、およびマーカーの量の増加が当該対照試料と比較して当該標本中に存在する時、ＴＢＩまたはＳＣＩの存在を判定することを含む。一実施形態において、ＴＢＩのマーカーは、ＡＬＤＯＣおよび／またはそのＢＤＰ、ならびにＢＬＢＰおよび／またはそのＢＤＰである。任意に、当該方法はさらに、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、αＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ／ＨＳＰ２７）、ＡＬＤＯＣ、ＧＳ、ＰＥＡ１５、もしくはＣＲＹＡＢの外傷特異的タンパク質分解性切断産物、またはこれらの２つ以上からなる任意の組み合わせの量を測定することを含む。一実施形態において、当該方法はさらに、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、またはＧＦＡＰの２０〜３０ｋＤａのＢＤＰの量を測定することを含む。
【００１１】
ＡＬＤＯＣの外傷特異的タンパク質分解性切断産物の代表例としては、３８ｋＤａの主要断片、または３５ｋＤａ断片、３０ｋＤａ断片、および２５ｋＤａ断片が挙げられる。ＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７についての外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例は、３ｋＤａ分解産物である。ＧＳの外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例としては、３７＋３５ｋＤａの二重線、３２ｋＤａ断片、２３ｋＤａ断片、２０ｋＤａ断片、および１８ｋＤａ断片が挙げられる。ＰＥＡ１５の外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例としては、１２＋１３ｋＤａ二重線および８ｋＤａ断片が挙げられる。αＢ−クリスタリンの外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例は、１８＋１９ｋＤａ二重線、１７ｋＤａ断片、１５＋１４ｋＤａ二重線および８ｋＤａ断片からなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態において、当該方法はさらに、対象から得た脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中の血液特異的タンパク質の量を測定することを含む。このようなマーカーの検出およびモニタリングは、損傷後の脳室内脳出血の状態を判定するために使用することができる。一実施形態において、当該血液特異的タンパク質は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）である。別の実施形態において、当該方法はさらに、対象から得た脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のプロスタグランジンシンターゼ（ＰＴＧＤＳ）の量を測定することを含む。βトレースタンパク質としても公知のＰＴＧＤＳは、健常ＣＳＦ組成と正に相関して、対照、非ＴＢＩ  ＣＳＦにおいて豊富である。ＴＢＩの存在は、ＰＴＧＤＳの量が減少し、回復とともに増加する時に測定される。ＴＢＩ後に増加した血液特異的タンパク質または減少したＣＳＦタンパク質のようなマーカーの検出およびモニタリングはそれゆえ、損傷後の対照または正常レベルまでの回復の状態を判定するために使用することができる。
【００１３】
当該方法の一部の実施形態において、追加のマーカーは、本明細書に列挙されるもののほかはアッセイされない。他の実施形態において、本明細書に列挙されるマーカーのみがアッセイされる。一部の実施形態において、当業者に公知の追加のマーカーは、本明細書に列挙されるマーカーと併用してアッセイされる。他の実施形態において、考えられるマーカーの部分セットのみがアッセイされる。例えば、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、または２０のマーカーについてアッセイすることを含むことができる。１つの特定の実施形態において、４以下のマーカーがアッセイされる。
【００１４】
本発明の方法における使用のための試薬は、ＴＢＩのマーカーを特異的に結合する抗体または他の分子を含むことができる。一実施形態において、当該測定することは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの例としては、ウェスタンブロット法、免疫蛍光、免疫発光、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００１５】
別の実施形態において、当該試薬は、タンパク質配列におよびタンパク質配列断片に特異的なペプチドを含む。このような試薬は、当該測定することが標的指向化定量的質量分析を含む方法に対して有用である。一実施形態において、当該測定することは、多重または併行反応モニタリング質量分析を用いた、添加された（「スパイクされた」）標識された（例えば、重同位元素で標識された）既知の量の同じタンパク質特異的ペプチド（内部標準物質）と比較される、内在性（当該試料における）プロテオタイプ（ｐｒｏｔｅｏ−ｔｙｐｉｃ）ペプチドの定量的シグナル検出を含む。
【００１６】
一実施形態において、当該対照試料は、当該対象から得た損傷前試料である。別の実施形態において、対照試料は、健常対象者の対照コホートから得た平均値のような、正常な健常対象者を代表する。
【００１７】
本発明における使用のための体液の標本の代表例としては、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、鼻水、耳垢、尿、唾液、涙、および脳微小透析液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明は追加的に、バイオマーカーのセットを特異的に結合する試薬を含むキットを提供する。一実施形態において、当該バイオマーカーは、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ）を含む。当該試薬は典型的には、ポリヌクレオチドまたは抗体であり、検出可能なマーカーで任意に標識されている。当該キットは任意に、当該試薬を収容するための少なくとも１つの容器および／または検査試料における外傷性脳損傷の状態を判定するための試薬の使用のための説明書からさらになる。一部の実施形態において、当該キットは、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、および／またはグリア線維性酸性タンパク質の２０〜３０ｋダルトン断片（ＧＦＡＰ−ＢＤＰ）を特異的に結合する試薬を、単独でまたは本明細書に説明されるもしくは当該技術分野で公知の追加のマーカーとともに含む。一実施形態において、当該抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態において、当該セットのバイオマーカーは、最多３、４、５、６、７、８、９、または１０のバイオマーカーからなる。
【００１９】
本発明はさらに、対象から得た血清の試料中のバイオマーカーＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの発現を判定する方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、当該血清試料を本発明のキットと接触させること、および当該バイオマーカーへの当該試薬の結合を測定することを含む。
【００２０】
対象から得た血清試料における外傷性脳損傷の状態を判定する方法も提供される。一実施形態において、当該方法は、当該血清試料を本発明のキットと接触させること、および当該バイオマーカーに対する当該試薬の結合を測定すること、ならびに当該結合を対照試料と比較することを含む。ＴＢＩは次に、ＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰに対する当該試薬の結合が対照試料と比較して対象由来の血清試料中で亢進する場合、存在していると判定される。本発明はさらに、対象におけるＴＢＩを検出する方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、対象由来の体液の標本を、対照試料と比較したＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの量の増加についてアッセイすることを含む。ＡＬＤＯＣおよび／またはＢＬＢＰの量の増加は、ＴＢＩを示す。一実施形態において、当該アッセイすることは、推定損傷の２４時間以内に、および損傷後最長１週間までに実施される。一部の実施形態において、当該アッセイすることは、推定損傷の１〜３時間以内に、または１５〜３０分以内と早期に実施される。一部の実施形態において、当該対象は、例えば、揺さぶられっ子症候群を受けた疑いのある対象を含む乳幼児または児童である。この使用に適しているのは、ＡＬＤＯＣまたはＢＬＢＰのような、早期の発達中の脳において発現するバイオマーカーである。別の実施形態において、当該対象は、高齢者であり、当該方法は、ＴＢＩと慢性神経変性疾患とを、ＡＬＤＯＣの分解産物に対するＡＬＤＯＣの比率を測定することによって識別するために使用される。
【００２１】
本発明はさらに、対象におけるＳＣＩ後のＴＢＩの転帰および／または歩行の回復を推定する方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、対象由来の体液の標本を、ＰＥＡ１５またはＧＦＡＰの小さなＢＤＰの量の増加について、対照試料またはＴＢＩで生き残った人の試料と比較してアッセイすることを含み、この中で、ＰＥＡ１５またはＧＦＡＰの小さなＢＤＰの量の増加は死亡を確定する。対象におけるＴＢＩを治療する方法も提供される。一実施形態において、当該方法は、対象から損傷後の複数の時点で得た試料（縦断的な試料シリーズ）を、本明細書で説明するようなＴＢＩのマーカーについてアッセイすること、および当該アッセイがＴＢＩの存在を示す場合、ＴＢＩについて当該患者を治療することを含む。この方法は、当該患者の状態を経時的にモニターして、薬剤治療効能を、またはＴＢＩ患者の介入的治療が必要であろうかどうかを判定するために使用することができる。当業者は、本明細書に説明される方法の各々が、当該マーカーの非常に早期の損傷後放出および長期の検出ウィンドウならびに種々の生体液クリアランス動態によるマーカー、すなわちＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰ、ＧＳ、ＰＥＡ−１５、ＣＲＹＡＢ、上述のうちのいずれかのＢＤＰのうちのいずれか１つを単独で、または１つ以上の追加のマーカーと併用して実施することができることを認識するであろう。
【００２２】
ＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰといったマーカーは、ＰＥＡ１５およびＣＲＹＡＢと同様に、急性損傷したヒト脳細胞でありそれゆえ、損傷後の脳の傷付きやすい状態である脳震盪関連病理生理学的過程を追跡するために使用することのできる損傷から放出される。潜在的に可逆性のある損傷状態に対するこれらのマーカーのこの結合は、軽度ＴＢＩの診断をより高感度なものにする上で支援することができる病理機序情報を提供し、組織喪失を反映する細胞死で放出されるマーカーを追跡すること以外におよび当該追跡することに加えて、ＴＢＩ患者の薬物動態モニタリングに対して役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】棒グラフを用いて示された機械的外傷後のヒト新皮質星状細胞の細胞運命、および生細胞、漏出性細胞および死細胞の核を示す染色細胞の実況に関する顕微鏡写真。
【図２】棒グラフ、共焦点顕微鏡を介して温度およびガスを制御したステージ上で撮像した細胞の実況に関するタイムラプスビデオからの一連の顕微鏡写真、ならびにプロトコルの概略図で示すように、機械的に外傷を受けたヒト星状細胞は、マウス星状細胞と比較して、受傷後の損傷した状態における長期の持久性を示す。
【図３】ヒト星状細胞の機械的外傷は、イムノブロット（Ａ）および損傷後の種々の時点でマーカー量を示す棒グラフ（Ｂ〜Ｇ）で示すように、アストログリアマーカーの周辺流体への有意な放出を生じる。
【図４Ａ】神経外傷バイオマーカーが外傷を受けたヒト星状細胞の細胞運命と関係していることを示す二重プロット。
【図４Ｂ】神経外傷バイオマーカーが外傷を受けたヒト星状細胞の細胞運命と関係していることを示す二重プロット。
【図５】星状細胞損傷バイオマーカーの選択戦略に関する概略図。
【図６】アストログリア損傷マーカーが、損傷当日および損傷後５日間連続で、ＴＢＩ患者対後向き観察コホートにおける対照のＣＳＦにおいて上昇することを示している、イムノブロット（図６Ａ〜６Ｃ）ならびに損傷当日および損傷後５日間連続での２０〜２５名のＴＢＩ患者ならびに８〜１１名の対照のＣＳＦにおける目盛り付きデンシトメトリーを用いてイムノブロットシグナルから測定した対数尺度に基づいた光学濃度（図３を参照されたい）を示す四分位間範囲（ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ  ｒａｎｇｅ）（９０パーセンタイルおよび１０パーセンタイル）、中央値（線）および幾何平均（破線）を有する箱ひげ図とともにプロットした散布図（図６Ｄ〜図６Ｋ）（ｎ：１日あたりの被験者数）。
【図７】バイオマーカーＣＳＦ量に関するＴＢＩ患者転帰相関。
【図８】群分けしたアストログリア損傷マーカーの因子を用いたＴＢＩの範囲の評価。
【図９】細胞死における細胞創傷−ＧＦＡＰにおけるＢＬＢＰの比率は外傷を受けたヒト星状細胞およびＴＢＩ患者における外傷重症度を識別する。
【図１０】ＡＬＤＯＣレベルおよびとＴＢＩ患者転帰との相関。
【図１１】ブタ脊髄損傷後の組織病理学的重症度の基準、組織喪失および出血と相関した急性アストログリアマーカー放出。
【図１２】ブタ脊髄損傷後のＡＬＤＯＣおよびＧＦＡＰの一過的な上昇に関する転帰相関。
【図１３】定量的質量分析、多重反応モニタリングは、アストログリアＴＢＩマーカーの濃度を文書記録し、抗体とは無関係のマーカー量の比較を可能にする。
【図１４】既知の量の純粋なタンパク質を用いた、ＴＢＩのＣＳＦおよび血液におけるＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの量および濃度範囲に関する、抗体を基にした定量的評価。
【図１５】イムノブロット（Ａ）および損傷後の経時的に測定した量のグラフ（Ｂ）によって示されるような重度ＴＢＩ患者の血液試料における血液適合性アストログリアバイオマーカー。
【図１６】縦断的な重度ＴＢＩ血清試料のイムノブロットは、ＡＬＤＯＣ対ＧＦＡＰの検出ウィンドウの拡大を示す。
【図１７】ＴＢＩ後のＣＳＦおよび血漿におけるＢＬＢＰ分解産物を示すイムノブロット。
【図１８】損傷後の経時的に測定された量に関するイムノブロット（Ａ）およびグラフによって示されるような、損傷を受けた血液脳関門を通る直接的な通過によるアストログリア損傷マーカーの急性循環様相についての証拠。
【図１９】最高レベルのアストログリア損傷マーカーおよびＰＥＡ１５を示すイムノブロットデータは、合併症に罹患しているまたは罹患していない脳震盪後の軽度ＴＢＩ患者の血清において頑強におよび早期に検出される（ＣＴ＋：合併症あり−陽性ＣＡＴ走査、ＣＴ−：合併症なし、ＣＡＴ走査所見なし）。
【図２０】小児ＴＢＩ、乳幼児における血清ＡＬＤＯＣの急性のおよび頑強な検出を示すイムノブロットデータ。
【図２１】全長ＡＬＤＯＣが急性ＴＢＩにおける３８ｋＤａのＢＤＰよりも多量に存在するのに対し、２つの大きさのＡＬＤＯＣはアルツハイマー病の慢性神経変性容態において異なる比で存在する（表２に付与）ことを示すイムノブロットデータ。
【図２２】表３の閾値の区別の説明。
【図２３】表４の閾値の区別の説明。
【図２４】急性膜受傷および細胞死の遅延を有する星状細胞の百分率（Ａ）、ならびに伸張後のＧＦＡＰおよびＡｌｄｏＣの条件培地（ＣＭ）レベル（Ｂ）によって示されるような、ヒト外傷培養モデルにおける反復性軽度損傷後のグリア外傷放出マーカーレベルの上昇。
【図２５】カルパインおよびカスパーゼ活性化が外傷後のＧＦＡＰ上位および下位分解産物を生じたことを示す、ＧＦＡＰの２回のフィルム曝露。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＴＢＩ患者および対照由来のＣＳＦ、血漿および血清に関して初めて検査されたいくつかの新たなＴＢＩバイオマーカーを提供する。新たな神経外傷マーカーは、外傷モデルにおけるヒト脳アストログリアの細胞受傷および／または細胞死と関係する当該マーカーの放出機序によって規定される。本明細書に提示されるデータは、選択されたバイオマーカーが体液中での非常に関心のある動態および安定性を示すことを実証する。免疫学的検出能、感度および選択性が示されており、適切なモノクローナル抗体が選択された。ＴＢＩ後の最初の数時間および数日の間のＣＳＦおよび血清におけるマーカーの出現のタイミングは、添付の実施例および付録において提示される。本結果は、本明細書において説明されおよび患者の血清または血漿中で検出可能なマーカーが、中等度および重度ＴＢＩならびに軽度ＴＢＩ、ならびに致死的なＴＢＩを示すパターンを識別するために使用することができることを示す。当該マーカーを表１に要約する。
【００２５】
定義
本出願において使用される科学用語および技術用語はすべて、別段の指定がない限り、当該技術分野で通常使用される意味を有する。本出願において使用される場合、以下の語または句は、指定された意味を有する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「主要ＢＤＰ」におけるような「主要」は、最も頻繁におよび一貫して観察される分解産物を指し、例えば、ＡＬＤＯＣの３８ｋＤａのＢＤＰは、ＡＬＤＯＣの主要ＢＤＰである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「急性の」は、損傷時間後の早期時間を指し、典型的には、生体液試料を、急性とみなされる損傷当日に収集した。例えば、外傷モデルにおける損傷の１５〜３０分後、軽度ＴＢＩ患者における損傷の１〜２時間後、中等度および重度ＴＢＩ患者における損傷の３時間〜２４時間後である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、合併症のある軽度ＴＢＩは、Ｂｕｋｉら，２０１５を基にして、コンピュータ断層撮影、ＣＴ／ＣＡＴ走査所見が陽性である、または持続性の症候学的特徴をより広範に有する脳震盪患者について使用される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「有意差」は、統計的有意差、または当該状況下で妥当なレベルの信頼性で検出することのできる十分な程度である差など、当業者によって信頼できるとみなされる様式で検出されることのできる差を意味する。本明細書で提供される実施例において、対数変換データはガウス分布に従っており、本発明とは無関係の統計専門家によって統計分析に使用された。当該統計専門家は、非定常分散を用いる反復測定分散分析の混合モデルを使用することができる（ＣｒｏｗｄｅｒおよびＨａｎｄ，１９９０）。対数変換したときデータが線形であるので、有意差は、桁によってでさえ、典型的に多様である。ある例において、８０倍〜１３０００倍に及ぶＴＢＩと対照の間の増減が観察され、有意であることがわかっている。別の例において、６〜３２倍の損傷後の異なる日数にわたる変化は有意とみなされる。さらに別の例において、ＴＢＩの生き残った者と生き残らなかった者との変化は、４倍〜１４００倍であることが観察され、有意であることがわかっている。さらに別の例において、基準試料または対照試料に対する２倍の増加は、有意とみなされる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「対照」または「対照試料」は、正常レベルを代表する試料または健常であることが既知の対象から得たものを代表する試料のいずれかを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、別段の明確な記載がない限り、少なくとも１を意味する。
【００３２】
【表１】
2018523092.tif 000003
2018523092.tif 000004
【００３３】
本発明の方法
本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、軽度ＴＢＩ、および／または脊髄損傷（ＳＣＩ）の状態を検出またはモニターするための方法を提供する。当該方法は、対象におけるＴＢＩまたはＳＣＩの存在、進行、予測、および重症度の区別を判定するために使用することができる。一実施形態において、当該方法は、対象から得た体液の標本をアルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７）、またはＡＬＤＯＣもしくはＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７の外傷特異的な分解産物（ＢＤＰ）から選択されるＴＢＩのマーカーについてアッセイするための試薬と接触させることを含む。当該方法はさらに、対照試料と比較して、当該標本中に存在するマーカーの量を測定すること、およびマーカー量の増加が対照試料と比較して標本中に存在する時、ＴＢＩまたはＳＣＩの存在を判定することを含む。一実施形態において、ＴＢＩのマーカーは、ＡＬＤＯＣおよび／またはそのＢＤＰ、ならびにＢＬＢＰおよび／またはそのＢＤＰである。任意に、当該方法はさらに、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、αＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ／ＨＳＰ２７）、ＡＬＤＯＣ、ＧＳ、ＰＥＡ１５、またはＣＲＹＡＢの外傷特異的タンパク質分解性切断産物、あるいはこれらのうちの２つ以上からなる任意の組み合わせの量を測定することを含む。一実施形態において、当該方法はさらに、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）またはＧＦＡＰの２０〜３０ｋＤａのＢＤＰの量を測定することを含む。
【００３４】
ＴＢＩ後の日々におけるＢＬＢＰおよび／またはＰＥＡ１５の上昇のモニタリングは、損傷後の二次的な有害事象に関して知らせる。例えば、ＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰ、ＧＳおよびＰＥＡ１５のレベルの上昇の検出は、Ａ因子を算出するために使用することができ、ＧＦＡＰ、Ｓ１００ベータおよびＡＰＯＢのレベルは、Ｂ因子を算出するために使用することができ、当該算出は各因子に対するマーカー負荷を基にする。組み合わされたＡ因子およびＢ因子は、重症度によって患者を区別するために使用することができる。Ａ因子およびＢ因子の閾値は、ＴＢＩを生き残った者、生き残らなかった者および対照の間の境界を提供する。臨床試験または研究内での患者の評価は、因子分析を読み取りおよび実行する複数のバイオマーカーを提供するキットを用いることによって、より頑強であることができる。このことは、財政的におよびさもなくば実行できないかもしれない非常に大きなコホートサイズを必要とすることとは対照的に、非常に可変性のあるコホート内で個々の患者を追跡するための簡素化されたアプローチを提供する。各臨床試験または研究コホートのバイオマーカーパネルデータは、データベースへと入力することができ、標準化することができ、各患者は、組織死滅／出血対組織損傷／受傷因子を基に評価される。これら２つのクラスを代表する因子を用いることは、１つの０の読み取りによって、因子分析全体が任意の所与の患者についての相対的な状態出力を提供するのを防止しないであろうから、評価をより頑強にする。境界は、各患者が損傷後の所与の時間において独特な状態を有するであろう各コホートの重症度範囲を定める（ｐｉｎ  ｏｕｔ）。
【００３５】
一実施形態において、当該方法はさらに、細胞漏出性マーカーの例であるＢＬＢＰの量と細胞死のマーカーであるＧＦＡＰの量の比を算出することを含む。量は、光学濃度を用いて測定し得る。外傷モデルにおけるＢＬＢＰおよびＧＦＡＰの量の比は、０．６〜１．２に及び、軽度／中等度外傷に相当するのに対し、０．１〜０．４の比は重度外傷に相当する。このことは、重度外傷において軽度外傷後よりも比例してより多量のＧＦＡＰが認められるヒト培養外傷モデルにおける知見を反映している。中等度ＴＢＩ患者におけるＢＬＢＰ／ＧＦＡＰ比は０．４〜０．３に及ぶのに対し、重度ＴＢＩ患者における範囲は０．０１と０．０５の間であり、重度対中等度ＴＢＩ患者におけるＧＦＡＰ対ＢＬＢＰの比例した比較的多量を再度表す。このようなものとして、この比を用いることは、より頑強な患者重症度分類を提供する。２つのマーカーを含むことによって、有意性に到達するのに対し、１つのマーカー単独は、非常により大きなコホートサイズを必要とするであろう。これによりマーカーの併用は、臨床研究または臨床試験における評価ツールとして使用する時、最低限の所要患者登録サイズを減少させることによって、ＴＢＩ状態を評価しＴＢＩ進行をモニターする上で役に立つことができる。
【００３６】
対象におけるＴＢＩの状態を検出およびモニターするための方法は、軽度ＴＢＩまたは脳震盪後の合併症についての危険にある対象を識別するために使用することができる。この識別は、血清試料中のＡＬＤＯＣに加えて、ＢＬＢＰおよび／またはＰＥＡ１５の損傷後１〜２時間以内におよび損傷後最長１７時間に得られた試料を使用することなど、急性の存在を使用することによって行われる。ＡＬＤＯＣの上昇のみは、脳震盪を識別することができ、ＡＬＤＯＣならびにＢＬＢＰおよび／またはＰＥＡ１５の損傷当日の上昇は、合併症についての危険と関係する。
【００３７】
ＡＬＤＯＣの外傷特異的タンパク質分解性切断産物の代表例としては、最も一貫して認められた主要な３８ｋＤａ断片、３５ｋＤａ断片、３０ｋＤａ断片、および２３ｋＤａ断片が挙げられる。ＧＳの外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例としては、３７＋３５ｋＤａ二重線、３２ｋＤａ断片、２３ｋＤａ断片、２０ｋＤａ断片、および１８ｋＤａ断片が挙げられる。ＰＥＡ１５の外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例としては、１２＋１３ｋＤａ二重線および８ｋＤａ断片が挙げられる。αＢ−クリスタリンの外傷特異的タンパク質分解性切断産物の例は、１８＋１９ｋＤａ二重線、１７ｋＤａ断片、１５＋１４ｋＤａ二重線および８ｋＤａ断片からなる群から選択される。
【００３８】
全長のＡＬＤＯＣ（４０ｋＤａ）の量とＡＬＤＯＣ切断産物（３８ｋＤａ）の量の比は、損傷後時間、および急性対亜急性対慢性の脳損傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）を含む神経変性脳疾患の識別を示す。したがって、一実施形態において、ＴＢＩまたはＳＣＩを検出および／またはモニターする方法は、当該対象から得た標本中の４０ｋＤａのＡＬＤＯＣレベルと３８ｋＤａのＡＬＤＯＣレベルの比を決定することを含む。全長のＡＬＤＯＣが３８ｋＤａのＡＬＤＯＣのＢＤＰよりも非常に多量にあるので、３．６〜８．６に及ぶ１よりも大きな比はＴＢＩを示す（急性および亜急性、損傷後１〜５日にわたる）。３８ｋＤａのＡＬＤＯＣのＢＤＰは、全長のＡＬＤＯＣの光学シグナル密度と類似しておりまたは当該密度よりも大きかったので、０．４〜０．６に及ぶ１未満の比はアルツハイマー病を示し、その理由は、慢性変性容態によって急性損傷容態よりも断片の長期の部分的分解および蓄積が可能となるからである。
【００３９】
一実施形態において、当該方法はさらに、対象から得た脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中の血液特異的タンパク質の量を測定することを含む。このようなマーカーの検出およびモニタリングは、損傷後の脳室内脳出血の状態を判断するために使用することができる。一実施形態において、血液特異的タンパク質は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）である。別の実施形態において、当該方法はさらに、当該対象から得た脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のプロスタグランジンシンターゼ（ＰＴＧＤＳ）の量を測定することを含む。ベータトレースタンパク質としても公知のＰＴＧＤＳは、健常ＣＳＦ組成と正に相関している。ＴＢＩの存在は、ＰＴＧＤＳの量が減少しおよび回復とともに上昇する時に測定される。このようなマーカーの検出およびモニタリングはそれゆえ、損傷後の健常レベルまでの回復状態を判断するために使用することができる。一部の実施形態において、急性外傷により減少したＰＴＧＤＳレベルの回復は、その後の損傷後の日々にわたってモニターされ、生き残りを予測するのに対し、ＰＴＧＤＳレベルの持続的な低下は死亡を予測する。
【００４０】
当該方法の一部の実施形態において、本明細書で列挙されたもの以外の追加のマーカーはアッセイされない。他の実施形態において、本明細書で列挙されたマーカーのみがアッセイされる。一部の実施形態において、当業者に公知の追加のマーカーは、本明細書で列挙されたマーカーと併用してアッセイされる。他の実施形態において、考えられ得るマーカーの部分セットのみがアッセイされる。例えば、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、または２０のマーカーについてアッセイすることを含むことができる。１つの特定の実施形態において、４以下のマーカーがアッセイされる。
【００４１】
本発明の方法における使用のための試薬は、ＴＢＩマーカーを特異的に結合する抗体または他の分子を含むことができる。一実施形態において、当該測定することはイムノアッセイを含む。イムノアッセイの例としては、ウェスタンブロット法、免疫蛍光、免疫発光、ラジオイムノアッセイ、およびＥＬＩＳＡが挙げられる。ＡＬＤＯＣアイソフォーム特異的抗体は、ＥｎＣｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（フロリダ州ゲインズビル市）製のモノクローナル抗体クローン４Ａ９、１Ａ１、５Ｃ９およびＥ９として入手可能である。ＢＬＢＰ特異的モノクローナル抗体もＥｎＣｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手可能である。
【００４２】
別の実施形態において、当該試薬は、タンパク質配列およびタンパク質配列断片に特異的なペプチドを含む。このような試薬は、当該測定することが標的指向化定量的質量分析を含む方法にとって有用である。一実施形態において、当該測定することは、多重または併行反応モニタリング質量分析を用いる、添加された（「スパイクされた」）標識された（例えば、標識された重同位元素）既知の量の同じタンパク質特異的ペプチド（内部標準物質）と比較される内在性（当該試料における）プロテオタイプ（ｐｒｏｔｅｏ−ｔｙｐｉｃ）ペプチドの定量的シグナル検出を含む。
【００４３】
一実施形態において、対照試料は、対象から得た損傷前試料である。別の実施形態において、対照試料は、健常対象の対照コホートから得られた平均値など、正常な健常被験者を代表する。
【００４４】
本発明における使用のための体液の標本の代表例としては、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、鼻水、耳垢、尿、唾液、涙、および脳微小透析液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明はさらに、対象から得た血清または血漿の試料中のバイオマーカーＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの存在を判定する方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、当該血清または血漿の試料を本発明のキットと接触させること、および当該バイオマーカーへの当該試薬の結合を測定することを含む。
【００４６】
対象から得た血清または血漿の試料における外傷性脳損傷の状態を判定する方法も提供される。一実施形態において、当該方法は、当該血清／血漿試料を本発明のキットと接触させること、および当該バイオマーカーへの当該試薬の結合を測定すること、および当該結合を対照試料と比較することを含む。ＴＢＩは次に、ＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰへの当該試薬の結合が、対照試料と比較して当該対象由来の血清試料中で増加する場合に存在することが判定される。中等度から重度までのＴＢＩ患者について、ＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの量および濃度は図１４および実施例１３に付与され、バイオマーカーの比較は図１３および実施例１２における濃度で付与される。本発明はさらに、対象におけるＴＢＩを検出する方法を提供する。特に、当該方法は、診断がさもなくば明白ではない軽度ＴＢＩを検出するために使用することができる。一実施形態において、当該方法は、対象由来の体液の標本を、対照試料と比較したＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの量の増加についてアッセイすることを含む。ＡＬＤＯＣおよび／またはＢＬＢＰの量の増加は、ＴＢＩを示す。一実施形態において、当該アッセイすることは、疑われる損傷の２４時間以内に実施される。一部の実施形態において、当該アッセイすることは、疑われる損傷の１〜３時間以内に、または１５〜３０分以内と早期に実施される。一実施形態において、当該アッセイすることは、疑われる損傷後の最長７日間実施される。一部の実施形態において、当該対象は、例えば揺さぶられっ子症候群を受けた疑いのある対象を含む乳幼児または児童である。当該方法によって、脊髄損傷後すぐに対象において損傷の重症度が評価でき、転帰が予測できる。
【００４７】
本発明はさらに、対象におけるＴＢＩの転帰および／またはＳＣＩ後の回復を予測する方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、対象由来の体液の標本を、対照試料と比較したＰＥＡ１５および／または２０〜３０ｋＤａ（小分子）ＧＦＡＰ断片の量の増加についてアッセイすることを含み、この中で、ＰＥＡ１５および／または小分子（すなわち、下位）ＧＦＡＰ断片の量の増加は、死亡を確定する。対象におけるＴＢＩを治療する方法も提供される。一実施形態において、当該方法は、対象から得た試料を、本明細書に説明するＴＢＩのマーカーについてアッセイすること、および当該アッセイがＴＢＩの存在を示す場合、当該患者をＴＢＩについて治療することを含む。本発明はさらに、ＴＢＩについて治療中の対象における治療指針についてモニターする方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、対象から得た試料を本明細書に説明するＴＢＩのマーカーについてアッセイすること、および当該アッセイが損傷後の日々の間で患者の状態の悪化に関することを示す場合、すなわち、本明細書に説明するマーカーのいずれかの二次的なレベル上昇を示す場合、当該患者のＴＢＩについての治療を開始することを含む。本発明の方法はさらに、薬剤または他の患者治療を治療効果の早期評価についてモニターする上で使用する、および損傷後のＴＢＩの進行をモニターするための薬物動態（診断・治療）適用を提供する。当業者は、本明細書に説明するマーカーの異なる放出およびクリアランスの動態を考慮して、パネルとして本明細書に説明する複数のマーカーを使用する利点を認識するであろう。したがって、患者の評価には、複数のマーカー、すなわちＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰ、ＧＳ、ＰＥＡ−１５、ＣＲＹＡＢ、上述のうちのいずれかのＢＤＰのうちのいずれか１つを、単独でまたは１つ以上の追加のマーカーと併用して含むことができる。
【００４８】
本発明によって熟慮される一部の実施形態には、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）、αＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ）、もしくは脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７）、ＡＬＤＯＣ、ＧＳ、ＰＥＡ１５、ＣＲＹＡＢ、もしくはＢＬＢＰ／ＦＡＢＰ７の外傷特異的タンパク質分解性切断産物、またはこれらのうちの２つ以上からなる何らかの組み合わせを含む複数のＴＢＩマーカーの併用が含まれる。例えば、複数の実施形態には、ＴＢＩのマーカーがＧＳおよびアルドラーゼＣである、ＴＢＩのマーカーがＧＳおよびＰＥＡ１５である、ＴＢＩのマーカーがＧＳおよびαＢ−クリスタリンである、ＴＢＩのマーカーがＧＳおよびＢＬＢＰである、ＴＢＩのマーカーがアルドラーゼＣおよびＰＥＡ１５である、ＴＢＩのマーカーがアルドラーゼＣおよびαＢ−クリスタリンである、ＴＢＩのマーカーがアルドラーゼＣおよびＢＬＢＰである、ＴＢＩのマーカーがＰＥＡ１５およびαＢ−クリスタリンである、ＴＢＩのマーカーがＰＥＡ１５およびＢＬＢＰである、ＴＢＩのマーカーがαＢ−クリスタリンおよびＢＬＢＰである、ＴＢＩのマーカーがＧＳ、アルドラーゼＣ、およびＰＥＡ１５である、ＴＢＩのマーカーがＧＳ、ＢＬＢＰ、およびＰＥＡ１５である、ＴＢＩのマーカーがＧＳ、αＢ−クリスタリン、およびＰＥＡ１５である、ＴＢＩのマーカーがＧＳ、αＢ−クリスタリン、およびＢＬＢＰである、ＴＢＩのマーカーがＧＳ、αＢ−クリスタリン、およびアルドラーゼＣである、ＴＢＩのマーカーがＧＳ、ＢＬＢＰ、およびアルドラーゼＣである、ＴＢＩのマーカーがアルドラーゼＣ、ＰＥＡ１５、およびαＢ−クリスタリンである、ＴＢＩのマーカーがアルドラーゼＣ、ＰＥＡ１５、およびＢＬＢＰである、ＴＢＩのマーカーがアルドラーゼＣ、αＢ−クリスタリン、およびＢＬＢＰである、ならびにＴＢＩのマーカーがＰＥＡ１５、αＢ−クリスタリン、およびＢＬＢＰであるものを含む。先の複数の例において、ＴＢＩは、列挙されたタンパク質、その分解産物、またはそれらの両方であり得る。
【００４９】
キット
本発明はさらに、バイオマーカーのセットを特異的に結合する試薬を含むキットを提供する。一実施形態において、当該バイオマーカーは、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ）を含む。当該複数の試薬は典型的には、ポリヌクレオチドまたは抗体であり、検出可能なマーカーで任意に標識されている。キットは任意に、当該試薬を収容するための少なくとも１つの容器および／または検査試料における外傷性脳損傷の状態を判定するための試薬の使用についての説明書からさらになる。一部の実施形態において、キットはさらに、星状細胞リンタンパク質ＰＥＡ−１５（ＰＥＡ１５）および／またはグリア線維性酸性タンパク質の２０〜３０ｋダルトン断片（ＧＦＡＰ−ＢＤＰ）を特異的に結合する試薬を含む。一実施形態において、当該抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオマーカーのセットは、最多３、４、５、６、７、８、９、または１０のバイオマーカーからなる。
【００５０】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために、ならびに本発明品を作製および使用する上で当業者を支援するために呈されている。実施例は、いかなる方法においても、さもなくば本発明の範囲を制限するよう意図するものではない。
【００５１】
実施例１：機械的外傷後のヒト新皮質星状細胞の細胞運命
本実施例は、異なる重症度を用いた急性圧力−パルス外傷性伸張の３０分後および４８時間後のヒト星状細胞の母集団スコアを示す（図１、ＰＳＩは比較的軽度な損傷については２．６〜４．０に、および重度な損傷については４．４〜５．３に及ぶ）。ヒト星状細胞を１６〜１８週の寄贈された胎児新皮質脳標本から分離し、精製し、次に変形可能な膜上で分化させた（Ｗａｎｎｅｒ，２０１２）。細胞膜の受傷／損壊、機械的穿孔（Ｂａｒｂｅｅ，２００５）は、核形状評価（真ん中の図、染色された核、固定後にヘキスト染色、ややピンク色の点あり、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した核小体）を伴う、生培養物におけるＰＩの取り込みを用いて判定した。細胞死は、核濃縮（コンパクトになった染色質ならびに明るいヘキストおよびＰＩ染色を有する核濃縮した核）を伴うＰＩ取り込みによって判定した。細胞統合性損壊の有意な百分率は損傷３０分後に示される（左のグラフ）のに対し、有意な細胞死は損傷２日後に存在した（右の棒）。
【００５２】
実施例２：機械的に外傷を受けたヒト星状細胞は、損壊した状態における長期の持久性を示す
本実施例は、機械的に外傷を受けたヒト星状細胞が、受傷後の損壊した状態においてマウス星状細胞に対して長期の持久性を示すことを実証する（図２）。伸張中の色素の取り込み（０．０５ｍＭの１０ｋＤａデキストランローダミン）、ならびにアポトーシスによる細胞死（１０μＭのカスパーゼ３基質を用いたカスパーゼの活性化）を、温度および湿度を制御された回転ディスク共焦点顕微鏡上でのタイムラプス撮影を用いてモニターした（Ｌｅｖｉｎｅら，２０１６）。ヒトの外傷を受けて損傷しおよび再密封したヒトアストログリアは、統合性の損壊後の長期の持久性を示す。
【００５３】
図３に示すように、ヒト星状細胞の機械的外傷は、周辺流体へのアストログリアマーカーの有意な放出を生じさせる。図３Ａは、外傷を受けた星状細胞由来の濃縮した、変性した条件培地のイムノブロット（Ｌｅｖｉｎｅら，２０１６、Ｓｏｎｄｅｊら，２０１１）がグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）ならびにその公知のおよび新たに識別された分解産物（ＢＤＰ）対アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）、脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ）、星状細胞リンタンパク質（ＰＥＡ１５）ならびにαクリスタリン（ＣＲＹＡＢ）の異なる放出特性を示すことを示す。完全な範囲のシグナル強度を捕捉するために、イムノブロットの複数の曝露からのシグナルをデンシトメトリーで測定し（光学濃度）、単回曝露と符合させるために尺度を合わせた。示される数のドナーからのシグナルの尺度を合わせた密度を、図３Ｂ〜図３Ｇにおいて示すグラフにおいて対数空間軸上にプロットする。公知の上位のＧＦＡＰのＢＤＰ（３７〜５０ｋＤａ）は、時間（三角）および重症度（損傷５時間後の円）とともに放出の増大を示した。下位の新たなＧＦＡＰのＢＤＰは、損傷１日後および２日後にのみ有意に増加し、これらを細胞死と関係付けた（図１を参照されたい）。ＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は既に、損傷３０分後に２桁を上回って有意に増加し、このようなレベルの上昇は、測定した損傷後のすべての時点において流体においてとどまっていた。ＣＲＹＡＢレベルは、損傷５時間後および２日後に重症度の違いを示した。
【００５４】
実施例３：外傷を受けたヒト星状細胞の細胞運命と関係する神経外傷バイオマーカー
％膜透過性細胞（％受傷、赤色データ、左）に対する、ならびにＰＩ色素取り込みアッセイおよび核の形態（図１および図２を参照されたい）を用いた外傷を受けたヒト死星状細胞の百分率と相関した、ＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰ、ＰＥＡ１５およびＣＲＹＡＢについての外傷放出性アストログリアマーカーレベル（図３を参照されたい）の二重プロットを図４Ａに示す。回帰線（Ｒ２値）およびｐ値は、相関有意性を示す。ＡＬＤＯＣ、ＰＥＡ１５およびＣＲＹＡＢは、ヒトアストログリア細胞受傷と最も良い相関を示す。ＣＲＹＡＢ、ＢＬＢＰおよびＡＬＤＯＣはまた、外傷後の細胞死を伸ばすことと相関していた。
【００５５】
図４Ｂは、ＧＦＡＰ外傷−放出の二重プロットを示し、これは、ＧＦＡＰが機械的外傷によって負わせられる細胞死と相関していること、および細胞受傷と弱い／まったくない相関を示している。プロットは、群分けしたＧＦＡＰ断片の大きさによって分離される（上位バンド：５０〜３７ｋＤ、下位バンド：２５〜１９ｋＤ）。
【００５６】
実施例４：星状細胞損傷バイオマーカー選択戦略
候補となる星状細胞損傷バイオマーカーを次の戦略によって選択した（図５）。ＴＢＩのＣＳＦプロテオームを、１９名の重度ＴＢＩ患者からのＣＳＦ試料を用いたボトムアップ質量分析によって編集し、９名の対照被験者からのＣＳＦプロテオーム（Ｃｒｌ）と比較した。このＴＢＩのＣＳＦプロテオーム（４８３のタンパク質）は、対照ＣＳＦのプロテオーム（４０２のタンパク質）由来の２５２のタンパク質と重複しており、残りは２３１の独特なＴＢＩのＣＳＦタンパク質であった。このＴＢＩのＣＳＦタンパク質の６０％は、公開された血漿プロテオームにおいても存在し（Ｏｍｅｎｎら，２００５、Ｓｃｈｅｎｋら，２００８）、多量な場合、ＴＢＩバイオマーカーとして適切ではないかもしれない。候補となる脳損傷マーカーを選択するために、本発明者らは、単純な外傷モデルにおけるプロテオームアプローチを用いた、外傷を受けた星状細胞から放出されるタンパク質を判定し、７９の差次的に放出されるタンパク質を、圧力−パルス伸張後にマウス星状細胞を伸張して識別した（Ｌｅｖｉｎｅら，２０１５、Ｓｏｎｄｅｊら，２０１１）。
【００５７】
この「トラウマトーム」から、４８のタンパク質（６２％）がＴＢＩのＣＳＦにおいて存在した。非常に星状細胞に豊富なタンパク質（他の細胞タイプよりも５倍以上多い；Ｃａｈｏｙら，２００８）を選択することで、１１の損傷バイオマーカータンパク質の小さな候補プールが得られた（黒色で囲んだ３つのフィールド）。これらには、３つのタンパク質ＧＦＡＰおよびペルオキシレドキシン６（Ｐｒｄｘ６、両方とも血漿中に存在）ならびにＮ，Ｎ−ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ１、３の中央のフィールド）が含まれていた。追加の３つのタンパク質は星状細胞に豊富であり、「トラウマトーム」タンパク質は、ＴＢＩのＣＳＦに存在し、および対照ＣＳＦにも存在し、当該タンパク質は、アルドラーゼＣ（ＡＬＤＯＣ）、クラスタリン（ＣＬＵＳ）およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ、３の下位のフィールド）であった。クラスタリンおよびＡＰＯＥは星状細胞によって分泌し、それらのレベルは、外傷後に流体中で減少した（矢印）。星状細胞に非常に豊富である追加の５つの外傷放出性タンパク質は、ショットガン質量分析を基にしたＴＢＩのＣＳＦプロテオームリストにおいて列挙されなかった。これら５つは、エズリン（Ｅｚｒ）、Ｆボックスオンリータンパク質２（ＦＢＸ２）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、星状細胞リンタンパク質１５（ＰＥＡ１５）および脳脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ、５の上位フィールド、破線の輪郭）であった。ＧＦＡＰ、ＡＬＤＯＣ、ＧＳ、ＢＬＢＰ、ＰＥＡ１５およびＣＲＹＡＢは、その後の免疫学的検査および質量分析検査において含まれていた。
【００５８】
実施例５．アストログリア損傷マーカーは、損傷当日におよび損傷後５日間連続でＴＢＩ患者のＣＳＦにおいて上昇する
本実施例は、アストログリア損傷マーカーが、損傷当日および損傷後５日間連続で、ＴＢＩ患者対後向き観察コホートにおける対照のＣＳＦにおいて上昇することを実証する。図６Ａは、３０μｌの対照ＣＳＦ（Ｃｒｌ）とともに５４歳男性重度ＴＢＩ患者（１ａ〜１ｆ）の損傷当日（ｉ）および損傷後の５日間（ｉ＋１〜ｉ＋５）からの３０μｌのＣＳＦ試料の縦断的セットのＧＦＡＰ（ＢＤＰ３７、２５、２０および１８ｋＤａとともにある５０ｋＤａ）およびＳ１００□およびＡＬＤＯＣ（４０ｋＤａ）、ＧＳ（４５ｋＤａ）、ＢＬＢＰ（１５ｋＤａ）およびＰＥＡ１５（１５ｋＤａ）のイムノブロットを示す。ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は、損傷当日に最強のシグナルを、および損傷３日後に第二の上昇を示し、このことは、患者の二次的な虚血性エピソードと関係していた。出血指標のＡＰＯＢ（１３０および２５０ｋＤａ）は、損傷後経時的に変化する強度を有しており、健常ＣＳＦからはなく、ＣＳＦマーカーであるＰＴＧＤＳ（２２ｋＤａ）は、ＣｒｌのＣＳＦにおいて頑強なシグナルを有していたが、ＴＢＩ後および損傷翌日の急性期にはなく、その損傷後の日々においてシグナルを徐々に回復した。
【００５９】
図６Ｂは、４名のＴＢＩ患者（２．〜５．）由来の６個のＣＳＦ試料（３０μｌ／レーン）を示し、損傷当日（患者２、３、４ａ）および損傷翌日（４ｂ、５）に健常な４３歳男性由来の対照ＣＳＦとともに、ＧＦＡＰおよび「上位の」ＢＤＰのシグナル強度が５０〜３７ｋＤａで変化すること、ならびに２５／２３ｋＤａ二重線、２０ｋＤａおよび１８ｋＤａの小分子ＢＤＰを含む「下位／新たな」ＧＦＡＰのＢＤＰを示す。上位のＧＦＡＰのＢＤＰ内にある個々のバンドは、たがいに対して類似の強度を有するのに対し、下位のＧＦＡＰのＢＤＰ間での相対的な量は、患者間で特徴的に異なっていた。
【００６０】
図６Ｃは、ＣＳＦイムノブロットを示し（３０μｌ／レーン）、５名のＴＢＩ患者（６．〜１０．）における全長のＡＬＤＯＣ（４０ｋＤａ）および３名のＴＢＩ患者（８〜１０）における損傷４日後の変化する強度の３８ｋＤａのＡＬＤＯＣのＢＤＰを実証している。健常な対照被験者は、ＡＬＤＯＣを示さなかった。
【００６１】
散布図（図６Ｄ〜図６Ｋ）（同日および患者の平均化した複製物）を、損傷当日および損傷５日後の２０〜２５名のＴＢＩ患者ならびに８〜１１名の対照のＣＳＦにおける目盛り付きデンシトメトリーを用いてイムノブロットシグナルから測定した対数尺度光学濃度（図３を参照されたい）を示す四分位間範囲（ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ  ｒａｎｇｅ）（９０パーセンタイルおよび１０パーセンタイル）、中央値（線）および幾何平均（破線）を有する箱ひげ図とともにプロットする（ｎ：１日当たりの被験者数）。（図６Ｄ）上位ＧＦＡＰシグナル（５０〜３７ｋＤａ）は、ＴＢＩ全日でＣｒｌに対して高く（Ｐ＜０．０６）、示すように経時的に低かった（Ｐ＜０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ、方法を参照されたい）。（図６Ｅ）下位ＧＦＡＰのＢＤＰ（２５〜１８ｋＤａ）は、Ｃｒｌに対してＴＢＩにおいて高く（Ｐ＜０．０３）、損傷翌日と損傷後のその後の日々の間で低かった（Ｐ＜０．０５）。（図６Ｆ）ＡＬＤＯＣ（Ｐ＜０．００４）および（図６Ｇ）ＧＳ（Ｐ＜０．００１）は、Ｃｒｌに対して低くなることなくＴＢＩのＣＳＦにおいて各日で高かった。（図６Ｈ）ＢＬＢＰ（Ｐ＜０．０３）および（図６Ｉ）ＰＥＡ１５（Ｐ＜０．００４）は、より大きなシグナル範囲で示す日にＣｒｌに対してＴＢＩにおいて高いレベルを有していた。血清タンパク質ＡＰＯＢ（図６Ｊ）は、ＣｒｌのＣＳＦに対してＴＢＩにおいて高かった（Ｐ＜０．００５）のに対し、ＣＳＦ標準物質ＰＴＧＤＳは、ＴＢＩに対してＣｒｌにおいて強く（Ｐ＜０．００４）、レベルは、種々の伸びへと一過性に枯渇した後、転帰依存性回復をした（図７を参照されたい）。
【００６２】
実施例６：バイオマーカーＣＳＦ量のＴＢＩ患者転帰相関
本実施例は、新たな、細胞死と関係する下位のＧＦＡＰ分解産物のＣＳＦレベルが、ＴＢＩの生き残った者に対して生き残らなかった者において２桁ほどより高かったことを実証する（図７）。ＰＥＡ１５レベルは、ＴＢＩ後の生き残った者に対して、生き残らなかった者において２〜３桁高く、損傷３日後のｐ値は、ｐ＝０．０７であった。損傷後に一過性に低下する健常マーカーＰＴＧＤＳのレベルは、ＴＢＩの生き残った者において損傷３日後までに有意な回復を示したのに対し、生き残らなかった者においては、レベルは低いままであった。
【００６３】
実施例７：群分けしたアストログリアマーカーの因子を用いたＴＢＩの範囲の評価
本実施例は、損傷の範囲にわたるＴＢＩの評価において有用な因子を創出するためのアストログリア外傷マーカーの群分けを実証する。マーカーパネルによって包含される多様なデータを組み合わせるために、スピアマン相関係数を基にした教師なし学習アルゴリズムを採用した多変量分散分析を使用した（因子分析、ＦａｂｒｉｇａｒおよびＷｅｇｅｎｅｒ，２０１２、Ｔｕｃｋｅｒ，１９９７）。このアプローチは、神経外傷バイオマーカーの分野にとって新しく、当該マーカーのＴＢＩのＣＳＦシグナルを基にして本実施例においてマーカーを群分けすることによって潜在的な神経外傷容態を明らかにする。公知のアストログリアマーカーＳ１００β、公知のおよび新たなＢＤＰを有する細胞死マーカーＧＦＡＰ、ならびに出血指標ＡＰＯＢをＡ因子へと群分けした（図８Ａ、灰色、Ｃｒｏｎｂａｃｈ係数α＝０．９２１を用いて組み合わされた負荷を用いる）。新たな「細胞漏出性」の、ＢＤＰを有する細胞受傷マーカーＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰ、ＧＳおよびＰＥＡ１５をＢ因子へと群分けした（α＝０．８７９）。図８Ｂにおいて示されるように、Ａ因子の一時的な特性は、損傷後の日々にわたって有意に低下したのに対し、Ｂ因子の軌跡は低下しなかった。Ａ因子のデータは、損傷後の数日間における生き残った者と生き残らなかった者の間の有意差を示した（図８Ｃ）。Ｂ因子のデータは生き残りの差を示さなかった（図８Ｄ）。マーカー全部に対してシグナルが存在する１２名のＴＢＩ患者からの標準化されたマーカー密度読み取りを、図８Ａにおいて示される負荷を用いてＡ因子およびＢ因子へと変換した後、たがいに対してプロットした（図８Ｅ）。ＴＢＩの範囲における不均一性は、この二重プロットにおける組み合わされたパネルデータの広がりにおいて反映されている。分類ツリー分析（図８Ｆ）は、所与の因子閾値（Ｂｒｅｉｍａｎ，１９８４）によるＴＢＩの対照、生き残った者および生き残らなかった者を区別する境界を決定した。複数の因子へと群分けしたバイオマーカーレベルを用いた患者区別閾値を図８Ｅにおける複数の線によって示す。
【００６４】
この算術的な多変量教師なし学習アプローチは、このパネルのマーカーを、相関係数から得られた重み（負荷）を与えられた各マーカーと組み合わせて、患者コホートにおける分散が、このマーカーの寄与によってどれだけ多く捕捉されているかを表す。列挙されたマーカーの全体的な高い負荷（０．８〜０．９５）は、この２つの因子への頑強な分類を提供する。Ａ因子は、細胞死、出血および組織喪失と関係したマーカーを反映する。Ｂ因子は、細胞漏出、受傷および組織損壊と関係したマーカーを反映する（図８Ａを参照されたい）。結果として生じる値は、所与のコホート内での各患者のバイオマーカーパネルの読み取りを基にした当該患者の独特な位置を提供する。このアプローチは、このＴＢＩコホートにおいて観察される患者の多様性の大部分を確実に網羅している。因子分析は、たった数個のバイオマーカーの読み取り（多くの異なる入力を用いたより複雑な主成分分析と比較される）を用いてＴＢＩにおいて観察される大きな患者の不均一性を捕捉するための簡素化されたフレームワークを提供する。臨床試験において、検査キットからのこれらのバイオマーカーパネルの読み取りは、他の患者と比較して個々のＴＢＩ患者の価値のあるモニタリング情報を提供することができる成長性データベースへと入力することができる。このツールは、患者の評価を簡素化して、組織損壊および組織死滅の生体液徴候を用いた進行中の患者の評価の頑強性を強化することができる。
【００６５】
実施例８：外傷を受けたヒト星状細胞およびＴＢＩ患者における外傷重症度の区別
本実施例は、対象の標本におけるＢＬＢＰレベルとＧＦＡＰレベルの比が、外傷を受けたヒト星状細胞およびＴＢＩ患者における外傷重症度を区別するために使用することができることを実証する。「細胞死」マーカーＧＦＡＰにおける「細胞漏出性」マーカーＢＬＢＰの流体レベル比における有意差は、インビトロ（図９、ＣＭ、条件培地、左）でおよびＴＢＩ患者（ＣＳＦ、図９の右側パネル）で示される。６名のドナー由来のヒト星状細胞は異なる重症度で、示されるＰＳＩ圧力−パルスによって外傷を受けた。中等度対重度ＴＢＩ患者を、ＣＳＦにおける１４倍の異なるＢＬＢＰ／ＧＦＡＰ比によって識別する（ｎ＝９）。中等度のＴＢＩ患者を、８を超える蘇生後グラスゴー昏睡尺度（ＧＣＳ）によって定義するのに対し、重度ＴＢＩ患者は８未満のＧＣＳを有していた。
【００６６】
実施例９：ＡＬＤＯＣレベルとＴＢＩ患者の転帰との相関
図１０に提示されるデータは、ＴＢＩ６か月後の拡張グラスゴー転帰尺度（ＧＯＳｅ）を用いて評価される重度ＴＢＩ患者の転帰に対してプロットされたＡＬＤＯＣおよびＧＦＡＰのレベルを示す。１２（１１）名のＴＢＩ患者からのデータは、ＡＬＤＯＣの上昇を早期に（白色、ｉ、ｉ＋１、＋２）、および好ましくない転帰を有する患者における損傷後後期に（黒色、ｉ＋３、＋４および＋５の損傷後の経過日）示すのに対し、ＧＦＡＰレベルは、損傷後の経過日において高いレベルを同様に維持することはなかった。
【００６７】
実施例１０：ＴＢＩマーカーと脊髄損傷の重症度および転帰との相関
本実施例は、ブタ動物モデルにおけるアストログリア外傷マーカーと脊髄損傷の重症度との相関を実証する。図１１：急性ＵＣＬＡアストログリアマーカーの放出は、ブタ脊髄損傷後の組織病理学的重症度の基準、組織喪失および出血と相関した。Ａ）急性（損傷１５〜３０分後）ＵＣＬＡアストログリア損傷マーカーＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰおよびグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）ならびにＧＦＡＰのＣＳＦシグナル密度を、確立した損傷重り落下モデル（Ｌｅｅら，２０１３）を用いた脊髄挫傷損傷の１週間後のユカタンブタ脊髄における体軸方向の腔径に対してプロットする。スピアマン相関は、組織喪失の増大と有意に関係したこれらのアストログリアＣＳＦマーカーレベルの急性上昇を示す。組織病理学：当該腔の体軸方向の伸展は、ズダンブラック染色した水平方向の脊髄切片における尺度である（所与のｐ値およびＲ２値、ｎ＝１０個体）。Ｂ）ＡＬＤＯＣおよびＧＳの急性（損傷１５〜３０分後）のＣＳＦシグナル密度は、損傷した水平方向の脊髄切片におけるブタ免疫グロブリン（ＩｇＧ）蛍光を用いて測定され併行染色した非損傷の水平方向の脊髄切片によって標準化された、損傷１週間後の白質間質性組織出血と有意に関係していた。体軸方向の連続画像に関するこのような標準化された白質蛍光シグナルを各動物についてプロットし（ｎ＝８個体）、曲線下面積（ＡＵＣ）を先の非損傷シグナルレベルとの距離にわたって測定した。
【００６８】
図１２は、ブタ脊髄損傷後のＡＬＤＯＣおよびＧＦＡＰの急性上昇と転帰との相関を示す。歩行の回復は、ブタ脊髄損傷後のＡＬＤＯＣおよびＧＦＡＰの急性ＣＳＦレベルと関係している。ユカタンブタにおける脊髄損傷後の歩行回復のレベルを示すブタにおける歩行運動の回復について確立された検査であるブタ胸部損傷行動尺度（ＰＴＩＢＳ）（Ｌｅｅら，２０１３）を用いた損傷１週間後の歩行の回復を予測するＡＬＤＯＣ（黒色の点）およびＧＦＡＰ（白色の点）の急性損傷後ＣＳＦレベル（損傷１５〜３０分後）をプロットする。有意な逆相関は、ほとんど歩行運動していない動物における比較的高いＡＬＤＯＣ（Ｒ２−０．８８）およびＧＦＡＰ（Ｒ２−０．８９）のレベルで存在し、当該動物は、後肢を引き摺り、せいぜいゆっくり歩行し、損傷１週間後まで歩行した動物における低い急性ＡＬＤＯＣおよびＧＦＡＰレベルであった。予備的なバイオマーカー閾値は、背景色によって示されており、回復中の動物の非常に早期の区別の実現可能性を示している。
【００６９】
実施例１１：アストログリアのＴＢＩマーカーの定量的質量分析
本実施例は、定量的質量分析が損傷後のアストログリアのＴＢＩマーカーのレベルの上昇を確認して、免疫学的方法が標準化されていない場合の免疫学的方法を用いるときに制限される客観的マーカー量比較を提供することを実証する。抗体非依存性の同時および定量的質量分析アプローチである多重反応モニタリングを、神経外傷バイオマーカー分野において最初に用いて、ＴＢＩ患者のＣＳＦにおける公知のおよび新たなアストログリアマーカーの量を比較した。マーカー特異的ペプチドを定義した量の添加した同位体標識ペプチドと併行して測定する（表６を参照されたい）。図１３Ａは、ＡＬＤＯＣおよびＧＦＡＰが損傷当日にＴＢＩのＣＳＦにおける最高濃度を有していたことを示し、両方とも示される他のマーカーのレベルとは有意に異なっていた。さらに、ＢＬＢＰレベルは損傷当日、ＧＳレベルよりも有意に高かった。図１３Ｂに示されるように、ＴＢＩの３日後までに、ＡＬＤＯＣレベルは、ＧＦＡＰ濃度よりもある規模だけ異なって、有意に優れていた。
【００７０】
実施例１２：ＴＢＩのＣＳＦおよび血液におけるＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの定量的イムノアッセイ
本実施例は、標準曲線を用いたＴＢＩ標本のＣＳＦおよび血液におけるＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰのレベルの抗体を基にした定量的評価を提供する。図１４における箱プロットは、ＡＬＤＯＣ（左側）およびＢＬＢＰ（右側）ならびにこれらのＣＳＦおよび血液（血清および血漿）における量の中央値ならびに四分位間濃度範囲を示す。挿入図は、２つの濃度範囲およびイムノブロット検出条件を用いたアイソフォーム特異的組換えタンパク質ＡＬＤＯＣおよびＢＬＢＰの既知の量を用いた用量応答を示す（表７を参照されたい）。
【００７１】
実施例１３：重度ＴＢＩ患者の血液試料におけるアストログリアバイオマーカーの検出
本実施例は、アストログリア外傷マーカーが重度ＴＢＩに罹患している患者から得た試料を用いた血液検査と適合性があることを実証する。図１５Ａは、１つの対照血漿試料（Ｃｒｌ）とともに３名の異なる重度ＴＢＩ患者からの縦断的血漿試料を示す。多量のタンパク質がイムノアフィニティアルブミンおよび免疫グロブリン枯渇カラム（Ｓｉｇｍａ，ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ）を用いて回収される。２５ｋＤａの新たなＧＦＡＰ分解産物は、損傷当日一度も検出されなかった（ｉ）が、損傷後のその後の日々において出現した。ＡＬＤＯＣは一貫して、３名の患者全員におけるすべての時点において存在していた。短命マーカーのＰＥＡ１５およびＢＬＢＰは、損傷当日に頑強に存在しており、各患者におけるその後の損傷後の日々にわたって異なる時間特性を示した。最多１１の対照血液試料（Ｃｒｌ）と比較される２２名の重度ＴＢＩ患者から得た２６の血清試料および２４の血漿試料由来のＡＬＤＯＣ（Ｂ１）、ＢＬＢＰ（Ｂ２）、ＧＦＡＰ／２５ｋＤａのＢＤＰ（Ｂ３）およびＰＥＡ１５（Ｂ４）についての目盛り付きデンシトメトリーシグナルを図１５Ｂにプロットする。縦断的な同一患者のデータを灰色の線によって結ぶ。ＡＬＤＯＣは、損傷当日および損傷後の毎日で有意に上昇したのに対し、ＧＦＡＰは損傷翌日に有意に高い開始となった。ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は、対照レベルに対して損傷当日は有意に高かった。
【００７２】
実施例１４：ＡＬＤＯＣ対ＧＦＡＰの拡張した検出ウィンドウ
本実施例は、縦断的な重度ＴＢＩ血清試料を用いて、ＡＬＤＯＣ対ＧＦＡＰの拡張した検出ウィンドウを実証する。ＡＬＤＯＣは、ＧＦＡＰの２５ｋＤａのＢＤＰの最初の検出の１９時間前に検出され、ＡＬＤＯＣシグナルは、３７ｋＤａの公知のＧＦＡＰのＢＤＰである特異的ＧＦＡＰシグナルの最後のものよりも２日間以上長く存在していた（図１７）。
【００７３】
実施例１５：ＢＬＢＰ分解産物
全長の１５ｋＤａのＢＬＢＰに加えて、３ｋＤａのＢＬＢＰ特異的断片を、損傷当日および種々の損傷後の日々におけるＴＢＩのＣＳＦおよび血漿における２つの抗体を用いて検出した。結果を図１７に示す。
【００７４】
実施例１６：ＴＢＩマーカーの急性循環様相
図１８は、損傷した血液脳関門を通る直接的な通過による新たなアストログリア損傷マーカーの急性循環様相についての証拠を提示する。図１８のパネルＡは、ＴＢＩ直後（損傷３時間後）および損傷翌日の同じ重度ＴＢＩ患者のＣＳＦおよび血清中のＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５とともにＧＦＡＰの２５ｋＤａのＢＤＰについてのイムノブロットを示す。ＧＦＡＰは、ＣＳＦにおいて最初に、および血清中で１日遅れて現れるのに対し、ＡＬＤＯＣは、両時点で両方の生体液中に存在していた。ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は、血清中に最初に存在し、ＣＳＦに遅れて出現した。４つのアストログリアマーカー全部の対数空間軸におけるトレースは、ＣＳＦから血清へのＧＦＡＰの２５ｋＤａのＢＤＰについての切り替え、生体液で安定したＡＬＤＯＣのより定常の存在、ならびに血清中での短命のＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５の存在の後のＣＳＦにおける出現および遅延した上昇を提供する（図１８Ｂ）。
【００７５】
これらの観察は、損傷部位から循環中へのＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５の直接的な通過を示唆する。３つのマーカーは全部、アストログリア突起に局在し、細部末端は、毛細管および血管を完全に巻くことが公知である（Ｍａｔｈｉｉｓｅｎら，２０１０）。外傷性損傷は軽度ＴＢＩでさえ、血管周辺のアストログリア線維の破損を生じ、これらのマーカーが血液中へ直接通過することを可能にする（Ｂａｒｚｏら，１９９６、Ｈｉｃｋｓら，１９９３、Ｋｏｒｎら，２００５）。ＧＦＡＰは、アストログリア末端には局在しておらず、図３に示すように、２５ｋＤａのＧＦＡＰのＢＤＰは、生じるのに時間がかかり、ＣＳＦにおいてまず蓄積することをもたらし、および血清中でその後出現することをもたらす細胞死の間に遅延した放出があることを示唆している。血液脳関門の開放を介したアストログリア終足に関する直接的な通過の利点は、非常に急性の損傷後血液検査を可能にすることにある。
【００７６】
実施例１７：軽度ＴＢＩ患者の血清におけるアストログリア損傷マーカーの早期検出
本実施例は、軽度ＴＢＩ患者の血清における最高レベルのアストログリア損傷マーカーの頑強なおよび早期の検出を実証する。損傷後早期の７名の軽度ＴＢＩ（ｍＴＢＩ）患者由来の１０個の血清試料を１個の対照血清（Ｃｒｌ）とともに図１９に示す。試料を、ＧＦＡＰ、ＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５についてプローブ付けした。特異的ＧＦＡＰシグナルはかすかであり、１名の患者が損傷３１時間後までにＧＦＡＰ／２５ｋＤａのＢＤＰを示す（患者番号ＩＩ）４名のｍＴＢＩ患者に制限された。ＡＬＤＯＣの３８ｋＤａのＢＤＰは、対照に対してｍＴＢＩ患者全員において一貫しておよび強く高かった。ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は、変化し得る強度を示し、５名のｍＴＢＩ患者において存在していた。ＡＬＤＯＣ、ＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は、損傷１時間後にすでに検出された。脳震盪患者はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査を受け、病変／出血に関して陽性の所見を有するものはＣＴ＋、おそらくｍＴＢＩ合併症患者であり、可視的な創傷を有さない患者はＣＴ陰性であり、または合併症がないものとして分類された（Ｂｕｋｉら，２０１５）。ＡＬＤＯＣの頑強な存在ならびにＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５についての差次的なシグナルは、脳震盪患者における危険の識別を補強するのに適している。
【００７７】
実施例１８：小児ＴＢＩにおける血清ＡＬＤＯＣの急性のおよび頑強な検出
図２０は、小児ＴＢＩ患者の血清試料におけるＡＬＤＯＣの急性のおよび頑強な検出を示す。ＴＢＩに罹患している５名の乳児（１〜４か月齢）由来の損傷当日の血清試料を、２２か月齢の子供由来の対照血清の隣に示す。頑強なＡＬＤＯＣシグナルは、対照症例に対して乳児ＴＢＩ全員において検出されるが、２名の乳児のみが弱いＧＦＡＰシグナル（３４ｋＤａのＢＤＰ、未説明、症例番号Ｉ、ＩＩＩ）を示した。
【００７８】
実施例１９：アルツハイマー病についてのＣＳＦマーカーとしてのＡＬＤＯＣ
本実施例は、アルツハイマー病の慢性神経変性容態に罹患している患者に由来するＣＳＦ試料が全長（４０ｋＤａ）および３８ｋＤａのＢＤＰのＡＬＤＯＣの等しく異なるレベルを呈することを実証する。対照的に、急性ＴＢＩ患者のＣＳＦにおいて検出されたＡＬＤＯＣは、３８ｋＤａのＢＤＰに対して全長（４０ｋＤａ）の明確な優勢を示す。１名の重度ＴＢＩ患者（症例番号Ｉ）および２名の齢を一致させた対照（症例番号ＶＩおよびＶＩＩ）および負荷のためのタンパク質染色（ポンソーＳ）と比較した５名のアルツハイマー病患者（ＡＤ、病期０．５、症例番号ＩＩおよびＩＩＩ；病期１、症例番号ＩＶおよびＶ、Ｆａｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１４を基にしている）由来の７個のＣＳＦ試料を図２１に示す。ＴＢＩ患者は、損傷４日後に主として全長のＡＬＤＯＣおよびわずかな３８ｋＤａ断片を有していたのに対し、慢性変性ＡＤ試料は、全長および３８ｋＤａのＡＬＤＯＣのＢＤＰの等しい存在を示していた。本データは、急性および慢性の脳損傷が、ＡＬＤＯＣ／ＡＬＤＯＣのＢＤＰの比を基にして識別することができることを示唆する。
【００７９】
【表２】
2018523092.tif 000005
【００８０】
本表は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者および中等度〜重度ＴＢＩ患者のＣＳＦにおける全長のＡＬＤＯＣ（４０ｋＤａ）とその分解産物（３８ｋＤａ）の平均比を示す。当該タンパク質に関する異なるエピトープに対する異なるＡＬＤＯＣ抗体は結果的に、４０対３８ｋＤａのバンドのシグナル強度の強調を変化させた。組み合わされた平均した２０個のＡＤ試料および２５個のＴＢＩ試料は、ＡＬＤＯＣ抗体全部の左側のデータにあった。平均ＡＤ比は、両側Ｔ検定によって有意である平均ＴＢＩ比よりも６倍小さかった。右側には、１０個のＡＤのＣＳＦ試料および５個のＴＢＩ患者の試料を、ＡＬＤＯＣ検出のための同じ抗体（Ｅ９）を用いて分析した。また、より多量の全長シグナルを示すＴＢＩとより多量のＢＤＰのＡＬＤＯＣシグナルを示すＡＤの間には有意な２０倍の差があった。データ例を図２１に示す。このことは、ＴＢＩと慢性神経変性疾患との違いを提供する。両データ選択は結果的に、慢性神経変性容態を意味するＡＬＤＯＣの主要な３８ｋＤａのＢＤＰの量の増加を基にした有意に異なる比を生じる。急性ＴＢＩは、全長の４０ｋＤａのＡＬＤＯＣのより多くの量によって、急性におよびＴＢＩ後最長５日間、容易に識別することができる。
【００８１】
実施例２０：多変量判別解析
多変量分類ツリー分析（Ｂｒｅｉｍａｎ，１９８４）を用いて、損傷に関する対照および生き残るまたは生き残らないＴＢＩ患者へと被験者コホートを最も正確に分割するマーカーを判定し、各々３０μｌのＣＳＦ試料のイムノブロット法によって分析した。ＡｌｄｏＣおよびＰＴＧＤＳの２つのマーカーのみを用いて１００％の正確性を得る際に、（表３）、当該マーカーのみが将来の非侵襲性アッセイのために血中で検出可能であることを知るために本解析を反復した（表４）。表３に提示されるデータに使用するマーカーは、Ａｌｄｏ  ＣおよびＰＴＧＤＳであったのに対し、考慮されたが使用されなかったマーカーは、ＧＦＡＰ、ＰＥＡ１５、ＧＦＡＰ下位、Ｓ１００Ｂ，ＢＬＢＰ、ＧＳ、ＡＰＯＢ、ＰＴＧＤＳ、およびＡｌｄｏＣの３８ｋＤであった。表３はしたがって、ＴＢＩの検出および生き残る者の転帰の予測を、分類ツリー解析におけるマーカー全部を用いて要約する。この解析は、ＡＬＤＯＣおよびＰＴＧＤＳを最良の区別マーカーとして選択した。検査されるマーカー全部のうち、当該マーカーを算術的な教師なし学習アプローチによって利用した。複数の群、ｎ＝２１、対照全部、および３０ＴＢＩ試料の損傷全日のＴＢＩとした。示される７ｎｇ／３０μｌのＣＳＦは、イムノブロット法を用いると、２３３ｎｇ／ｍｌのＣＳＦの濃度と等しい。群分けおよび予測された転帰は１００％正確に符合するので、正確性は優れていた。図２２は、表３の閾値の区別の説明を提供する。
【００８２】
【表３】
2018523092.tif 000006
【００８３】
表４は、新たな血液適合性グリアマーカーを用いたＴＢＩの検出および生き残る者の転帰の予測を示す。表４（１）について使用したマーカーは、総Ａｌｄｏ  Ｃとした。考慮されたが使用されなかったマーカーは、ＧＦＡＰ下位、ＢＬＢＰ、ＰＥＡ  １５、Ａｌｄｏ  Ｃの３８ｋＤ分解産物（ＢＤＰ）であった。考慮されなかった（省略された）マーカーは、総ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＧＳ、ＡＰＯＢ、およびＰＴＧＤＳであった。群は、ｎ＝２１の対照全部、およびコホート全体における合計３０名の損傷当日のＴＢＩ患者であった。正確性は９５％であり、重みのない確率補正は、２０／２１または０．９５２であった。９６％の等しい優先性確率の正確性＝０．９６＝（１．０＋１．０＋０．８７５）があった。図２３は、表４の閾値の区別の説明を提供する。
【００８４】
【表４】
2018523092.tif 000007
【００８５】
【表５】
2018523092.tif 000008
【００８６】
【表６】
2018523092.tif 000009
【００８７】
実施例２１：マーカーシグナル密度［ＯＤ］とＣＡＴ走査撮影データとのスピアマン相関
二次的なＴＢＩ進行は、二次損傷としばしば関係する頭蓋内圧（ＩＣＰ）の上昇を生じる可能性がある。細胞死滅マーカーＧＦＡＰ下位ＢＤＰ（１９、２０、２５ｋＤａ二重線）のレベルとＩＣＰとの有意な相関が観察される。出血マーカーＡＰＯＢは、実質外＋実質内病変体積および正中線偏位と有意に相関する。これらのＣＴ所見は両方とも、硬膜外血腫、硬膜下血腫、くも膜下出血および実質内病変を含む脳の出血と関係する。グリア損傷マーカーＢＬＢＰおよびＰＥＡ１５は、細胞死グリアマーカーＧＦＡＰ下位ＢＤＰと同様に、脳組織挫傷、頭蓋内出血およびびまん性軸索損傷を含む実質内病変と相関する。
【００８８】
【表７】
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【００８９】
実施例２２：ヒト外傷培養モデルにおける反復性軽度損傷後のグリア外傷放出マーカーのレベル上昇
図２４は、反復性軽度損傷についてのモデルを用いて得られた結果を示す。ヒト星状細胞は、３０分間隔（３０’）または１日間隔（１Ｄ）の単回（●）または二重の（●−●）軽度圧力パルスを受けた。急性漏出性および遅延性の死滅した細胞集団は、反復性外傷によってほとんど変化しなかった（図２４Ａ）。また、外傷放出マーカーＧＦＡＰおよびＡｌｄｏＣの条件培地（ＣＭ）流体レベルは、単回軽度伸張と比較して、直ちに追随する反復性軽度損傷の後に上昇し、２回の損傷が１日間隔である時、わずかに上昇するのみであった。ＡｌｄｏＣレベルは、直ちに追随する軽度伸張の後に単回の重度損傷（●）のものにほぼ到達し、反復性損傷に対するＡｌｄｏＣレベルの感度を示した。
【００９０】
実施例２３：外傷後のカルパインおよびカスパーゼ活性化で生じるＧＦＡＰ上位および下位分解産物
ＤＡＫＯ抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体を用いた条件培地試料における損傷４８時間後のＧＦＡＰ、上位および下位分解産物の２回のフィルム曝露を図２５に示す。重度に伸張したおよび未伸張の培養物は、薬剤、カルパイン阻害薬ＰＤ１５０６０６（１００μＭ、「Ｃａｌｉ」）またはパンカスパーゼ阻害薬Ｚ−ＶＡＤ  ＦＭＫ（８．８μＭ、「Ｃａｓｉ」）のいずれも受容しなかった。外傷放出性ＧＦＡＰ上位および下位ＢＤＰは、カルパインおよびカスパーゼの両方の阻害によって減少し、損傷後のＧＦＡＰを分解する両酵素の外傷誘発性活性化を示唆した。同じ実験の細胞可溶化物画分の類似の分析によって示唆されるように、この酵素分解の一部は細胞において生じ、一部は細胞外で生じる。未伸張培養物における下位ＧＦＡＰのＢＤＰの微量放出は、少数の非外傷性細胞死によるものであった。
【００９１】
実施例２４：アストログリア損傷マーカーのウェスタンブロット法に使用される抗体およびタンパク質
【表８】
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【００９２】
実施例２５：多重反応モニタリング質量分析
ＴＢＩ損傷バイオマーカータンパク質の生体液濃度を、標的指向化多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析によって測定した。生体液試料をまずエンドプロテイナーゼであるトリプシンを用いて消化し、タンパク質全部をそれらの個々のトリプシン処理ペプチドへと切断した。タンパク質特異的ペプチドシグナルを、それらの個々のタンパク質に対する代用基準として使用した。ＭＲＭ−ＭＳにおいて、ペプチドシグナルを、以下の表７に示すような前駆体→生成物イオン遷移として公知のものによって測定する（例えば、５５４．８２１（２＋）→９２４．５１４（１＋，ｙ８））。関心対象の特異的前駆体イオンの選択は、増感を可能にする。選択された前駆体由来の特異的生成物イオンからシグナルを測定することによって、ＭＲＭは、高度の分析物特異性を可能にする。定量化のため、重リジン［Ｋ（標識：１３Ｃ（６）１５Ｎ（２））］または重アルギニン［Ｒ（標識：１３Ｃ（６）１５Ｎ（４））］のいずれかを含有する定義した量の安定同位体標識した標準物質（ＳＩＳ）ペプチドを生体液試料中へとスパイクする。これらの重標準物質ペプチドは、それらの内在性（軽）対応物と化学的に同一であるが、内在性生体液ペプチドとの識別のために、＋８および＋１０Ｄａ（それぞれＫおよびＲ）の質量移行を示す。軽および重ＭＲＭ移行間のピーク面積比の比較は、バイオマーカー濃度の絶対的な定量化を可能にする。本発明者らのアッセイのために、トリプシン消化した生体液をまず、０．１％ギ酸水溶液および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液の溶出系を用いる逆相液体クロマトグラフィーによって分離し、試料の複雑性をさらに低下させ、シグナル感度を改善した。
【００９３】
【表９】
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【００９４】
参考文献
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【０１１２】
本出願のいたるところで種々の公開物が参照されている。これらの公開物の開示はそれらの全体において、本発明が属する技術分野の状態をより完全に説明するために、本明細書により本出願へと参照により組み込まれる。
【０１１３】
当業者は、上述の説明において開示された概念および具体的な実施形態が、本発明の同じ目的を実施するための他の実施形態を変更または設計するための基礎として容易に利用され得ることを認識するであろう。当業者は、このような等価の実施形態が添付の特許請求に示すような本発明の精神および範囲から逸脱しないことも認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６−１】
2018523092.tif 000021
【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018523092.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2018523092000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月9日(2018.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018523092000001.app
【国際調査報告】
2018523092.tif 000043
2018523092.tif 000044
2018523092.tif 000045
2018523092.tif 000046