(57)【要約】本発明は、癌を有する対象の治療に効果的なIL-15系スーパーアゴニスト複合体を使用した療法を特徴とする。
2018532729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象体内の新生物を治療する方法であって、
上記対象に、有効量の養子細胞療法を実施するとともにIL-15:IL-15Rα複合体を含む医薬組成物を有効量投与して、上記新生物を治療する工程を含む方法。
【請求項２】
上記IL-15/IL-15Rα複合体は、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体(ALT-803)であり、該ALT-803は、二量体のIL-15RαSu/Fcおよび２つのIL-15N72D分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記IL-15N72D分子は配列番号３を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記IL-15RαSu/Fcは配列番号６を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記新生物は、血液癌、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、脊髄形成異常症、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、B細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、B細胞新生物、B細胞リンパ腫、白血病、皮膚T細胞リンパ腫、T細リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮/膀胱癌、メラノーマ、肺癌、腎細胞腫、乳癌、胃・食道癌、頭頸部癌、前立腺癌、大腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、肉腫、肥満細胞腫、および腺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記有効量の上記ALT-803を週に１回または２回投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
上記有効量の上記ALT-803を毎日投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
上記有効量の上記ALT-803は、0.1 μg/kg以上、100 mg/kg以下である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
上記医薬組成物は、全身的投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、膀胱内投与されるか、または、点滴注入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記養子細胞療法は、造血幹細胞移植、ドナー白血球輸注、または、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の養子移入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記養子細胞療法は、同種細胞、自己細胞、同系細胞、血縁細胞、非血縁細胞、ＭＨＣ適合細胞、ＭＨＣ不適合細胞、または同ハプロ細胞の移植を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記Ｔ細胞またはＮＫ細胞は操作されて、外因性自殺遺伝子、キメラ抗原受容体、またはＴ細胞受容体を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
上記ALT-803は、養子移入された細胞の増殖または活性化を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記ALT-803は、上記対象体内の養子移入されたCD8+Ｔ細胞またはＮＫ細胞の数を増加させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記ALT-803は、養子移入された細胞内でのIFN-γ、TNF-α、NKG2DまたはCD107aの発現を増大させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記投与は移植片対腫瘍活性を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記投与は移植片対宿主病を増大させない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記投与は腫瘍細胞の数を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記投与は、上記新生物の進行または再発を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
上記投与は、治療を受けない対象と比較して、上記対象の生存期間を延長する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
上記対象はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
上記対象は、先行の治療後に再発した新生物、または、先行の治療に抗療性がある新生物を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
上記養子細胞療法および上記ALT-803は、同時にまたは連続して実施および投与される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項２４】
先行の治療の後に再発した新生物を有する対象を治療する方法であって、
上記対象に、有効量のドナーリンパ球輸注療法および有効量のALT-803投与を実施して、先行の治療の後に再発した上記新生物を治療する工程を含む方法。
【請求項２５】
移植片対宿主病を誘発しない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
先行して実施された療法から再発した新生物を有する対象を識別することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
新生物治療キットであって、有効量のALT-803と、養子細胞療法と、該新生物治療キットの使用説明書とを備える治療キット。
【請求項２８】
上記養子細胞療法は、造血幹細胞、ドナー白血球、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞を含む、請求項２７に記載の治療キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、癌治療のための療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に記載される発明の前には、癌細胞に対抗する免疫活性を増大および／または誘導するための新たな戦略の開発が渇望されていた。
関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき２０１５年９月２５日出願の米国仮出願番号第６２／２３２５１５号の優先権を主張する国際出願であり、参照により当該仮出願の全体が本願に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、少なくとも部分的に、インターロイキン−１５（IL-15）のスーパーアゴニスト突然変異体と二量体IL-15受容体α/Fc融合タンパク質との複合体である、ALT-803についての以下のような驚くべき発見に基づくものである。すなわち、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体（ALT-803)が、造血幹細胞移植モデルおよびドナー白血球輸注（DLI）モデルにおいて、移植片対宿主病を増大させることなく、悪性血液疾患に対する移植片対腫瘍（graft-versus-tumor（GVT））活性を増強させるという発見である。
【０００４】
よって、本明細書には、対象体内の新生物を治療するための方法が記載される。ある態様では、対象は、新生物を有するか、又は、新生物のリスクを有すると識別される。対象に、有効量の養子細胞療法を実施するとともにIL-15:IL-15Rα複合体を含む医薬組成物を有効量投与して、新生物を治療する。
【０００５】
ある実施形態では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、IL-15ポリペプチド、IL-15変異体、またはその機能性断片、および、可溶性IL-15Rαポリペプチドまたはその機能性断片を含む。いくつかの場合においては、IL-15ポリペプチドとIL-15Rαポリペプチドの一方または両方が、免疫グロブリンFcドメインまたはその機能性断片をさらに含む。
【０００６】
例えば、IL-15/IL-15Rα複合体は、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体(ALT-803)であり、該ALT-803は、二量体のIL-15RαSu/Fcおよび２つのIL-15N72D分子を含む。例示的なIL-15N72D分子は、配列番号３を含む。いくつかの場合には、IL-15RαSu/Fcは、配列番号６を含む。
【０００７】
好ましくは、対象はこのような治療を必要とする哺乳類であり、例えば、新生物を有する、またはその素因を有すると診断された対象である。哺乳類は、任意の哺乳類である。例として、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、家畜、食用に飼育される動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびヤギ）が挙げられる。好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０００８】
本明細書に記載の方法を用いた治療に適した新生物には、血液癌、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、脊髄形成異常症、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、メラノーマ、肺癌、腎細胞腫、乳癌、胃・食道癌、頭頸部癌、前立腺癌、大腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、肉腫、肥満細胞腫、および腺癌が含まれる。
【０００９】
好ましくは、本明細書に記載の組成物の投与は、疾患治療後の新生物の将来の再発も防止する。
【００１０】
ALT-803の有効な投与量は、0.1 μg/kg（体重）以上、100 mg/kg（体重）以下であり、例えば、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800もしくは900 μg/kg（体重）、または、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくは100 mg/kg（体重）である。
【００１１】
養子細胞療法における有効投与量は、１投与あたり、1×103細胞以上、1×1012細胞以下であり、例えば、１投与あたり、1×103細胞、5×103細胞、1×104細胞、5×104細胞、1×105細胞、5×105細胞、1×106細胞、5×106細胞、1×107細胞、5×107細胞、1×108細胞、5×108細胞、1×109細胞、5×109細胞、1×1010細胞、5×1010細胞、1×1011細胞、5×1011細胞または1×1012細胞である。養子細胞療法の例示的な有効投与量は、１投与あたり5×106細胞である。
【００１２】
いくつかの場合では、ALT-803（および／または養子細胞療法）は毎日、例えば、２４時間ごとに投与（実施）される。あるいは、ALT-803（および／または養子細胞療法）は、継続的に投与（実施）される。または、１日あたり複数回（例えば、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、５時間ごと、６時間ごと、７時間ごと、８時間ごと、９時間ごと、１０時間ごと、１１時間ごと、または１２時間ごとに）投与（実施）される。
【００１３】
あるいは、ALT-803（および／または養子細胞療法）は、１週間におおよそ１回、例えば７日ごとに投与（実施）される。または、ALT-803（および／または養子細胞療法）は、１週間あたり、２回、３回、４回、５回、６回または７回投与（実施）される。ALT-803の１週間あたりの例示的な有効投与量は、0.0001 mg/kg（体重）以上、4 mg/kg（体重）以下であり、例えば、0.001、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3または4 mg/kg（体重）である。例えば、ALT-803の１週間あたりの有効投与量は、0.1 μg/kg（体重）以上、400 μg/kg（体重）以下である。あるいは、ALT-803は、固定投与量で投与されるか、身体の表面積に基づいて（すなわち、m2あたりで）投与される。いくつかの場合では、対象は、週毎のALT-803の静脈内投与を４回と、これに引き続いての２週間の投与休止期間からなる、６週間サイクルを２回受ける。最終的には、担当医師または担当獣医が、適切な量と投与計画を決定する。
【００１４】
本明細書に記載の組成物は、全身的投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、膀胱内投与されるか、または、点滴注入される。この組成物、すなわちALT-803および養子細胞療法は、同時にまたは連続して投与・実施されてもよい。
【００１５】
好ましくは、ALT-803の投与は、養子細胞療法または養子細胞移植と連携して行われる。このような養子細胞療法には、造血幹細胞の同種・自家移植、ドナー白血球（またはリンパ球）輸注（DLI）、腫瘍浸潤リンパ球の養子移入、または、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の養子移入が含まれるが、これらに限定されない。必要に応じ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を操作して、自殺遺伝子（例えば、外因性自殺遺伝子）、キメラ抗原受容体遺伝子、またはＴ細胞受容体（TCR）（例えば、腫瘍抗原に特異的なTCR）を発現させる。あるいは、細胞増殖、生存、存続、抗腫瘍活性を促進するその他の遺伝子を発現させる。移植細胞は、レシピエント（自己）または血縁関係／非血縁関係ドナーを含む各種供給者から得ることができる。例えば、養子細胞療法は、同種細胞、自己細胞、同系細胞、血縁細胞、非血縁細胞、ＭＨＣ適合細胞、ＭＨＣ不適合細胞、または同ハプロ細胞の移植を含む。ALT-803との併用療法は、インビボ、エクスビボ、インビトロ、またはこれらの組み合わせで実施可能である。
【００１６】
好ましくは、ALT-803は、養子移入された細胞の増殖または活性化を刺激する。例えば、ALT-803は、対象体内の養子移入されたCD8+Ｔ細胞またはＮＫ細胞の数を増やす。別の例では、ALT-803は、養子移入された細胞内のIFN-γ、TNF-α、NKG2DまたはCD107aの発現を増大させる。
【００１７】
好ましくは、ALT-803の投与および養子細胞療法の実施は、移植片対腫瘍活性を増強するが、移植片対宿主病を増大させることはない。例えば、ALT-803の投与および養子細胞療法の実施により、腫瘍細胞の数が減少する。別の例では、ALT-803の投与および養子細胞療法の実施により、新生物の進行の抑制または再発が抑制される。好ましくは、ALT-803の投与および養子細胞療法の実施により、治療を受けない対象に比較して、対象（例えばヒトである対象）の生存期間が延長される。いくつかの場合では、対象は、先行の治療後に再発した新生物、または、先行の治療に抗療性がある新生物を有する。
【００１８】
また、先行の治療の後に再発した新生物を有する対象を治療する方法も提供される。この方法は、対象に、有効量のドナーリンパ球輸注療法および有効量のALT-803の投与を実施して、先行の治療後に再発した新生物を治療する工程を含む。好ましくは、上記方法は、移植片対宿主病を誘発しない。いくつかの場合では、上記方法は、先行の治療後に再発した新生物を有する対象を識別することをさらに含む。
【００１９】
さらに、新生物治療キットも提供される。このキットは、有効量のALT-803と、養子細胞療法と、新生物治療キットの使用説明書とを備える。例えば、養子細胞療法は、造血幹細胞、ドナー白血球、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞を含む。あるいは、上記キットは、有効量のALT-803と、抗新生物治療物質とを含む。抗新生物物質としては、抗体（例えば、腫瘍特異的抗体）、化学療法剤（例えば、白金ベース薬剤、テトラジン、アジリジン、ニトロソ尿素類、ナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤）、抗代謝剤（例えば、抗葉酸塩、フルオロピリミジン類、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン類）、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド類、タキサン類）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、アントラサイクリン類）、プロテインキナーゼ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、または、免疫調節薬剤（例えば、サリドマイドおよび類似体）が挙げられる。
【００２０】
定義づけのない限り、本明細書中で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有するものである。以下の文献は、本発明で使用される用語のうちの多くものの一般的定義を当業者に提供する。Singleton、外、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994年)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988年)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger、外、(eds.), Springer Verlag (1991年)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991年)。特に明記のない限り、本明細書では、次の用語はそれらに帰属する以下の意味を有するものとする。
【００２１】
「（薬）剤」は、ペプチド、核酸分子、または、低分子化合物を意味する。例示的な治療剤は、ALT-803である。
【００２２】
「ALT-803」は、二量体IL-15RαSu/Fc融合タンパク質に非共有結合するIL-15N72Dを含み免疫刺激活性を有する複合体を意味する。この複合体は、IL-15 SAとも呼ばれる。ある実施形態では、IL-15N72Dおよび／またはIL-15RαSu/Fc融合タンパク質は、参照配列に対してアミノ酸変異を１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上有する。例示的なIL-15N72Dアミノ酸配列を、以下に示す。
【００２３】
「改善する」は、疾患の発症または進行を、遅延させ、抑制し、弱め、漸減させ、阻止し、または安定化させることを意味する。
【００２４】
「類似体」は、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然起源ポリペプチドの生物活性を保持している一方で、類似体の機能を天然起源ポリペプチドに比べて向上させる、ある種の生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、例えば、リガンド結合を変化させることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または、半減期を改善させ得る。類似体は、非天然型アミノ酸を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明は、抗体またはそのような抗体の断片が所望の生物活性を示す限りにおいて、これらを含む。また、本発明は、ヒト化抗体のようなキメラ抗体を含む。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。例えば、ヒト化は、従来技術に記載の方法を使用して、齧歯類の相補性決定領域の少なくとも一部で、ヒト抗体の対応する領域を置換することにより実施できる。
【００２６】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語には、ポリクローン性抗体および単一クローン性抗体の両方が包含されることが意図される。好ましい抗体は、抗原に反応する単一クローン性抗体である。「抗体」という用語には、また、抗原に反応する１つ以上の抗体の混合物（例えば、抗原に反応する、複数種の単一クローン性抗体のカクテル）が包含されることが意図される。「抗体」という用語には、さらに、すべての抗体、それらの生物学的機能性断片、単鎖抗体、遺伝子学的に改変された抗体（例えば、１種以上から由来する部分を含むキメラ抗体）、二機能抗体、抗体結合体、ヒト化抗体、および、ヒト抗体を包含されることが意図される。生物学的機能抗体断片を使用することも可能であり、これらは、抗体由来の、抗原に結合するのに十分なペプチド断片である。本明細書中で使用される「抗体」は、抗体全体のみならず、エピトープ、抗原、または、対象の抗原断片を結合可能な任意の抗原断片（例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv）を含むことを意味する。
【００２７】
分子「に結合する」は、当該の分子に物理化学的な親和性を有することを意味する。
【００２８】
「検出」は、検出対象の検体の有無や量を識別することを指す。
【００２９】
「疾患」は、細胞、組織または臓器の正常な機能を損なうかまたは干渉する、何らかの状態または障害を意味する。疾患の例としては、新生物および感染が挙げられる。
【００３０】
製剤または製剤成分の「有効量」および「治療有効量」は、該製剤または該成分が単体でまたは併用で所望の効果をもたらすのに十分な量である。例えば、「有効量」と言うとき、単体または併用で、治療を受けていない患者と比較して、疾患の症状を改善するのに必要な成分の量を意味する。疾患治療のために本発明を実施する際に使用される（１種または複数の）有効成分の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、健康状態によって変動する。最終的には、担当医師または担当獣医が、適切な量と投与計画を決定する。このような量が、「有効量」と呼ばれる。
【００３１】
「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。該一部は、好ましくは、基準核酸分子または基準ポリペプチドの全長の、少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%を含む。例えば、１つの断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有していてもよい。しかし、本発明は、ポリペプチドおよび核酸断片が、全長のポリペプチドおよび核酸の所望の生物活性をそれぞれ示す限りにおいて、これらも含む。核酸断片は、ほとんどどんな長さであっても使用される。例えば、全長が約10,000塩基対、約5,000塩基対、約3,000塩基対、約2,000塩基対、約1,000塩基対、約500塩基対、約200塩基対、約100塩基対、約50塩基対の長さ（すべての中間長さを含む）である例示的なポリヌクレオチドの断片が、本発明の多くの実施態様に含まれる。同様に、ポリペプチド断片は、ほとんどどんな長さであっても使用される。例えば、全長が約10,000個のアミノ酸、約5,000個のアミノ酸、約3,000個のアミノ酸、約2,000個のアミノ酸、約1,000個のアミノ酸、約5,000個のアミノ酸、約1,000個のアミノ酸、約500個のアミノ酸、約200個のアミノ酸、約100個のアミノ酸、または、約50個のアミノ酸の長さ（すべての中間長さを含む）である例示的なポリペプチドの断片が、本発明の多くの実施態様に含まれる。
【００３２】
「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、ある物質について、自然な状態ではその物質に通常付随する成分が、程度の差はあるが、無いことを言う。「単離する」は、供給源または環境からの分離の程度の１つを意味する。「精製する」は、「単離」よりも高い程度の分離を意味する。
【００３３】
「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の物質が無い状態であり、何らかの不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的な影響を与えたり、その他の悪影響を及ぼしたりすることはない。つまり、本発明の核酸またはペプチドを組換えDNA技術により製造した場合、細胞性物質、ウイルス性物質、または培地が実質的に無ければ、該核酸またはペプチドは精製されている。本発明の核酸またはペプチドを化学的に合成した場合、化学的前駆物質またはその他の化学物質が実質的に無ければ、該核酸またはペプチドは精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）により測定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質によって、電気泳動ゲルに実質的に１本の帯が現われることを意味し得る。例えば、リン酸化または糖化といった修飾が可能なタンパク質については、異なる修飾によって、異なる単離タンパク質が生成され得る。これらの異なる単離タンパク質は、別々に精製可能である。
【００３４】
同様に、「実質的に純粋な」は、自然状態ではヌクレオチドまたはポリペプチドに付随する成分から分離されたヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、少なくとも60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、95重量%、または99重量%において、自然状態では該ヌクレオチドおよびポリペプチド付随するタンパク質および自然起源の有機分子が無いとき、実質的に純粋である。
【００３５】
本明細書中で使用する「IL-15:IL-15Rα 融合タンパク質複合体」は、IL-15Rαに非共有結合または共有結合されたIL-15を有する複合体である。IL-15Rαは、可溶性であっても、膜結合性であってもよい。いくつかの実施形態では、IL-15Rαは天然型IL-15Rαポリペプチドの可溶性ドメインである。可溶性IL-15Raは、IL-15Ra sushiドメインまたはIL-15RaΔE3であり得る。いくつかの場合では、可溶性IL-15Rαは、生物活性ポリペプチドおよび／またはIgG Fcドメインに共有結合されている。IL-15は、IL-15であってもよいし、第２の生物活性ポリペプチドに共有結合されたIL-15であってもよい。いくつかの場合では、IL-15は、リンカーを介してIL-15Rαドメインに共有結合されている。ある実施形態では、IL-15は、また、参照配列に対してアミノ酸変異を１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上有するIL-15変異体を表わし得る。ある実施形態では、IL-15は、IL-15N72Dである。別の実施形態では、IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体は、ALT-803である。
【００３６】
「単離された核酸」は、その核酸が由来する生体の自然起源ゲノムにおいて、該核酸の側面に位置する遺伝子が無い核酸を意味する。この用語は、例えば、(a)自然起源ゲノムDNA分子の一部であるDNAであって、その両側面には核酸配列（それが自然発生する生体のゲノム内では該分子の該一部の両側面に位置する核酸配列）が両方とも配置されていないDNAと；(b)ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれたDNAであって、その組込み後の分子が自然起源のベクターまたはゲノムDNAとは同一ではないDNAと；(c)cDNAのような分離分子、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により産生される断片、または制限断片と；(d)ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、とをカバーする。本発明に従って単離された核酸分子は、さらに、合成により生成された分子だけでなく、化学的に変質されたおよび／または修飾主鎖を有する核酸を含む。例えば、単離された核酸は、精製されたcDNAまたはRNAポリヌクレオチドである。単離された核酸分子は、また、メッセンジャーリボ核酸（mRNA）分子を含む。
【００３７】
「単離されたポリペプチド」は、自然状態では付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、少なくとも60重量%において、タンパク質および自然状態でポリペプチド付随する自然起源の有機分子が無いとき、単離された状態である。好ましくは、製剤の少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、最も好ましくは少なくとも99重量％が、本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または、タンパク質の化学合成によって得ることができる。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析といった任意の適切な方法で測定できる。
【００３８】
「マーカー」は、発現レベル、または疾患もしくは障害に関係する活性が変性した、任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００３９】
「新生物」は、過剰増殖またはアポトーシス低下により特徴付けられる疾患または障害を意味する。本発明を適用可能な新生物は以下の通りであるが、これらに限定されない。すなわち、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、肉腫や癌腫のような固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃・食道癌、頭頸部癌、直腸癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞腫、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、多型性神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、および、網膜芽腫）である。特定の実施形態では、新生物は、多発性骨髄腫、ベータ細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌、または、メラノーマである。本明細書中では、「（薬）剤を得る」における「得る」は、合成すること、購入することを含み、そうでない場合は、その（薬）剤を獲得することを含む。
【００４０】
「減少（低下）させる」は、少なくとも5%、10%、25%、50%、75%または100%のマイナスの変化を意味する。
【００４１】
「参照」は、基準条件または対照条件を意味する。
【００４２】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される配列と定義される。参照配列は、特定の配列のうちのサブセットでも、特定の配列の全体であってもよい。例えば、完全長cDNAの断片もしくは完全長遺伝子配列の断片であってもよく、または、完全なcDNAもしくは完全な遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、概して、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、または、約１００個のアミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、概して、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、さらに好ましくは約１００個のヌクレオチド、もしくは、約３００個のヌクレオチド、または、これらの数に近いまたはこれらの数の間の整数個のヌクレオチドである。
【００４３】
「特異的に結合する」は、本発明のポリペプチドを認識してこれに結合するが、サンプル（例えば、自然状態で本発明のポリペプチドを含む生物学的サンプル）中のその他の分子を実質的に認識・結合を行わない化合物または抗体について言う。
【００４４】
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一でなくてもよいが、典型的に略同一性を示す。内因性配列と「略同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズ可能である。本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一でなくてもよいが、典型的に略同一性を示す。内因性配列と「略同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズ可能である。「ハイブリダイズ」は、様々なストリンジェンシー条件下で、相補ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載の遺伝子）同士の間で二本鎖分子を形成する対、または、その対の部分を意味する。（例えば、Wahl, G. M.およびS. L. Berger (1987年) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R. (1987年) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい。）
例えば、緊縮塩分濃度は、通常、約750ｍMのNaClおよび75ｍMのクエン酸三ナトリウムよりも低く、好ましくは約500ｍMのNaClおよび50ｍMのクエン酸三ナトリウムよりも低く、より好ましくは約250ｍMのNaClおよび25ｍMのクエン酸三ナトリウムよりも低い。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）が無い状態で実行可能である。一方、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも35％のホルムアミド、好ましくは、少なくとも50％のホルムアミドの存在下で実行可能である。ストリンジェント温度条件は、通常、少なくとも30℃、好ましくは少なくとも37℃、最も好ましくは少なくとも42℃を含む。追加的パラメータを変化させることは、当業者には公知である。追加的パラメータとしては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS））の濃度、担体DNAの含有・非含有が挙げられる。ストリンジェンシーの様々なレベルは、これらの各種条件を必要に応じて組み合わせることで到達される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750ｍＭのNaCl、75ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび1％SDS中で引き起こされる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500ｍＭのNaCl、50ｍＭのクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミドおよび100μg/mlの変性サケ精子DNA（ssDNA）中で引き起こされる。最も好ましい実施形態の１つでは、ハイブリダイゼーションは、42℃で、250ｍＭのNaCl、25ｍＭのクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミドおよび200μg/mlのssDNA中で引き起こされる。当業者には、これらの条件の有用な変更が容易に明らかであろう。
【００４５】
ほとんどの用途においては、ハイブリダイゼーションの次に行われる洗浄工程も、様々なストリンジェンシーで行われる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩分濃度と温度とによって決定され得る。上記のように、塩分濃度を低下させることにより、または、温度を上昇させることにより、洗浄ストリンジェンシーを上げることができる。例えば、洗浄工程のための緊縮塩分濃度は、好ましくは約30ｍMのNaClおよび3ｍMのクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは約15ｍMのNaClおよび1.5ｍMのクエン酸三ナトリウムよりも低い。洗浄工程のためのストリンジェント温度条件は、通常、少なくとも25℃、より好ましくは少なくとも42℃、さらに好ましくは少なくとも68℃の温度を含む。好ましい実施形態では、洗浄工程は、25℃で、30ｍＭのNaCl、3ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、42℃で、15ｍＭのNaCl、1.5ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、68℃で、15ｍＭのNaCl、1.5ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中で行われる。当業者には、これらの条件のさらなる変更が容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に公知であり、BentonおよびDavis (Science 196:180, 1977年)；GrunsteinおよびHogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975年)；Ausubel、外、(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001年)；BergerおよびKimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987年, Academic Press, New York)；およびSambrook、外、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York、等に記載されている。
【００４６】
「略同一」は、ポリペプチドまたは核酸分子が、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のうちの任意の１つ）と、または、核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のうちの任意の１つ）と少なくとも50％の同一性を示すことを言う。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較に使用される配列と、少なくとも60%、より好ましくは80%または85%、より好ましくは90%、95%またはさらには99%同一である。
【００４７】
配列の同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group（University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOX programs）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／またはその他の修飾に相同性の程度を付与することにより、同一または類似の配列同士を対応させる。保存的置換は、典型的には、以下の群に含まれる置換を含む。すなわち、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、フェニルアラニン、および、チロシンである。同一性の程度を判定する例示的な手法においては、関連性の高い配列を示す可能性スコア（e-3からe-100）を備えるBLASTプログラムを使用してもよい。
【００４８】
「対象」は、哺乳類を意味し、ヒト、ヒト以外の哺乳類（例えば、ウシ科、ウマ科、イヌ科、ヒツジ科、またはネコ科の哺乳類）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、対象はこのような治療を必要とする哺乳類であり、例えば、Ｂ細胞リンパ腫と診断された、またはその素因を有すると診断された対象である。哺乳類は、任意の哺乳類である。例として、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、家畜、食用に飼育される動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびヤギ）が挙げられる。好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００４９】
本明細書に記載される範囲は、その範囲に含まれるすべての値を簡潔に表わしているものと理解されたい。例えば、1以上50以下の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群から選択される、任意の数、数の組み合わせ、または、部分範囲を含むと理解されたい。
【００５０】
本明細書で使用する「治療する」または「治療」という用語は、臨床的症状を示すとともに有害な状態、障害または疾患を被る個体に薬剤または製剤を投与し、症状の重篤度および／または頻度を低減し、症状および／またはその原因を取り除き、および／または損傷の改善または治療を促進することを指す。なお、障害または状態の治療は、該障害、状態またはそれに関連する症状の完治を除外することはないものの、これを必要とすることはない。
【００５１】
新生物患者の治療は、以下のうち任意のものを含んでいてもよい。すなわち、初期治療（例えば、手術）による既知の腫瘍の切除後に存在し得る残存腫瘍細胞を破壊して、起こり得る癌の再発を防ぐ、アジュバント療法（補助療法または補助的療法とも呼ばれる）と；外科的処置の前に、癌を縮小させるために行う新補助療法と；典型的には急性白血病を寛解する、導入療法と；寛解の後、寛解を持続させるために行われる地固め療法（強化療法とも呼ばれる）と；寛解を引き延ばすために、より少量またはより低頻度の投与により行われる維持療法と；一次治療（いわゆる標準治療）と；一次治療の後、疾患が応答または再発しない場合に実施される、二次治療（または三次治療、四次治療、等）（いわゆる救助療法）；と癌の大幅な縮小を期待せずに、症状の管理を行う待期療法（いわゆる支持療法）とである。
【００５２】
「予防する」および「予防」という用語は、臨床的には無症候の個人であって、特定の有害な状態、障害、または疾患の影響を受け易いまたは罹患し易い個人に、薬剤または組成物を投与することを指し、したがって、症状の出現および／またはその根底にある原因の発生の予防に関する。
【００５３】
特段の記載の無い限り、または、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「または（もしくは）」という用語は、包括的なものと理解されたい。特段の記載の無い限り、または、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「ある」および「上記（該）」という用語は、単数または複数を表すと理解されたい。
【００５４】
特段の記載の無い限り、または、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当該技術における通常の許容差の範囲内であって、例えば、平均からの標準偏差２以内であると理解されたい。「約」は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%または0.01%以内と理解してもよい。文脈から明らかでない限り、本明細書中のすべての数値は、「約」という用語によって修飾される。
【００５５】
本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基を列挙する詳述は、任意の単一基または列挙されている基の組み合わせとしての可変基の定義を包含する。本明細書の可変基または態様についての実施形態の詳述は、任意の単一の実施形態または他の実施形態もしくはその部分との組み合わせとしての実施形態を包含する。
【００５６】
本明細書中で提供される組成物または方法は、本明細書中に提供される他の組成物および方法のうちののうち１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００５７】
移行の用語である「〜を包含する／備える」は、「〜を含む」、「〜を含有する」または「〜を特徴とする」と同義であって、包括的またはオープンエンドであり、記載のない追加的要素や方法の工程を除外しない。対照的に、移行の用語「〜からなる」は、請求項に明記されていない要素、工程または成分を除外する。移行句である、「実質的に〜からなる」は、請求項の範囲を、明記された構成要素または工程と、クレームされた発明の「基本的且つ新規な特徴に物質的に影響しない構成要素または工程」とに限定する。
【００５８】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明および請求の範囲から明らかになる。定義のない限り、本明細書中で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有する。本明細書中に記載の方法や構成要素に類似するまたは等価の方法や構成要素を、本発明の実施や試用に用いることは可能ではあるが、適切な方法および構成要素は以下に記載のものである。本明細書中に引用される公開済みの外国特許および外国特許出願のすべてが、参照により本願に組み込まれる。
【００５９】
受託番号で示すGenbankおよびNCBIの提出試料が、参照により本願に組み込まれる。本明細書中に引用されるその他の公開済みの文献、文書、原稿、学術文献のすべてが、参照により本願に組み込まれる。万一、不一致がある場合には、定義が記載された本明細書が優先される。さらに、構成要素、方法および実施例は、例示的なものであって、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、ALT-803の投与が、移植後のＣＤ８＋Ｔ細胞数およびＮＫ細胞数を増加させることを示す棒グラフである。図１Ａでは、致死線量の照射（11Gy）を受けたBalb/cレシピエントに、Ｂ６マウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。17日目と24日目に、マウス１匹あたり1μgのALT-803を、腹腔内注射によって２分割投与した。マウスを移植後28日目に致死させ、脾臓、胸腺およびＢＭを採取した。単一細胞懸濁液を調整し、抗H2Kd抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗Gr-1抗体、抗NK1.1抗体、および抗B220抗体で染色し、フローサイトメーターを使用して分析した。各群は５匹のマウスを含む。脾臓における、CD4+Ｔ細胞、CD8+Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数が示されている（*: P<0.05）。図１Ｂおよび図１Ｃでは、致死線量の照射（12Gy）を受けたCB6F1レシピエントに、B6CBAマウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。17日目と24日目に、マウス１匹あたり1μgのIL-15スーパーアゴニストを、腹腔内注射によって２分割投与した。マウスを移植後28日目に致死させ、脾臓、胸腺およびＢＭを採取した。単一細胞懸濁液を調整後、細胞を抗H2Kd、抗CD4、抗CD8で染色した（図１Ｂ）。細胞内染色について記載のように、脾細胞の培養も行った。その後、脾細胞を採取し、抗H2Kd抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体およびIFN-γ抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した（図１Ｃ）。各群は５匹のマウスを含む（*: P<0.05）。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ALT-803の投与が、CD8+ CD44+およびCD8+NKG2D+エフェクター／記憶Ｔ細胞を増加させることを示している。致死線量の照射（11Gy）を受けたCB6F1レシピエントに、Ｂ６マウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。28日目、35日目、および42日目に、マウス１匹あたり1μgのALT-803を、腹腔内注射によって投与した。マウスを移植後49日目に致死させ、脾臓を採取した。単一細胞懸濁液を調整し、抗H2Kd抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、および抗NKG2D抗体で染色した。細胞を獲得し、フローサイトメトリーによって分析した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ALT-803の投与が、CFSE標識Ｔ細胞のレシピエントにおいて、サイトカイン分泌を増加させ、CD8+Ｔ細胞の増殖を促進することを示している。致死線量の照射（1300 cGy）を受けた、B6D2F1マウス（図３Ａ）またはB6(Ly5.1)マウス（図３Ｂ）に、CFSE標識Ｂ6脾細胞（30×106）を0日目に移植し、ALT-803または媒体対照を与えた（輸注後0日目）。CFSE標識白血球輸注後３日目にマウス致死させ、脾細胞を抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD45.1抗体、および抗H2Kd抗体で染色した。そして、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＰＭＡ＋イオノマイシン刺激の実施後、抗IFN-γ抗体および抗TNF-α抗体で細胞内染色を行った。赤い線は、アイソタイプ対照の境界を示し、矢印は増殖の遅いCD8+Ｔ細胞におけるIFN-γ分泌の増加を示す。
【図４】図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃは、ALT-803の投与が、移植後にGVT活性を増強することを示している。致死線量の照射（13Gy）を受けたB6D2F1レシピエントに、Ｂ６マウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。移植を行った日に、すべてのレシピエントに、5×104個（図４Ａ）または1×105個（図４Ｂ）の精製したＢ６Ｔ細胞とともに、1×104個のP815細胞をさらに与えた。7日目と14日目に、マウス１匹あたり2.5μgのALT-803を、腹腔内注射によって２分割投与した。この移植用法のカプラン‐マイヤー曲線は、次のように表せる：媒体対照（黒い線）およびIL-15スーパーアゴニスト（赤い線）* ＝ p<0.05であり、各群のマウスは15匹である。図４Ｃにおいて、致死線量の照射（13Gy）を受けたCB6F1レシピエントに、Ｂ６マウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。移植を行った日に、すべてのレシピエントに、1×105個の精製したＢ６Ｔ細胞とともに、5×105個のA20細胞をさらに与えた。7日目と14日目に、マウス１匹あたり2.5μgのALT-803を、腹腔内注射によって２分割投与した。この移植用法のカプラン‐マイヤー曲線は、次のように表せる：媒体対照（黒い線）およびIL-15スーパーアゴニスト（赤い線）* ＝ p<0.05であり、各群は10匹のマウスからなる。
【図５】図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃは、ALT-803の投与が、HSCTレシピエントにおける、A20リンパ腫細胞の成長を遅延させることを示す。致死線量の照射（12Gy）を受けたCB6F1レシピエントに、B6マウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。移植を行った日に、すべてのレシピエントに、Ｔ細胞輸注とともに、5×105個のA20細胞をさらに与えた。7日目と14日目に、マウス１匹あたり2.5μgのALT-803を、腹腔内注射によって２分割投与した。図５Ａにはインビボ発光画像を示す。マウスには、１匹あたり3.75mgのルシフェリンを注射し、８分間培養させ、３分間撮像した。左が対象群、右がALT-803投与群である。計算した光子強度を図５Ｂに示す。* ＝ p<0.05であり、各群は10匹のマウスからなる。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄには、ネズミ白血病／リンパ腫モデルにおいて、ALT-803が、DLIの後に抗腫瘍活性を増大させることが示されている。致死線量の照射（12Gy）を受けたCB6F1レシピエントに、Ｂ６マウスから、5×106個のＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。移植を行った日に、すべてのレシピエントに、ルシフェラーゼ活性を有するトリプル融合遺伝子を含むA20-TGL (H2Kd)リンパ腫細胞を5×105個をさらに与えた。移植後14日目に、移植レシピエントには、CD5+磁気分離により単離されたＢ6Ｔ細胞を2.5×105個与えるか、または、与えなかった。移植後17日目および42日目に、マウスに、ALT-803（１匹あたり1μg）または対照を腹腔内注射によって投与した。各群の生存曲線および体重曲線を、図６Ａおよび図６Ｂに示す（N＝10−20）。IVIS機器を使って、図示のような連続生体発光画像を各時点で得た。A20-TGL細胞は、ルシフェラーゼタンパク質を発現し、インビボ生体発光撮像が可能であった。マウスには、3.75 mgのルシフェリンを注射し、５分間培養し、３分間撮像を行った。IVIS機器を使って、図示のような連続生体発光画像を各時点で得た（図６Ｃは、２つの実験を併せて示す）。左が対象群、右がALT-803投与群である。各マウスにつき、各時点での合計流束（光子／秒）を測定し、曲線としてプロットした（図６Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、少なくとも部分的に、インターロイキン−１５（IL-15）のスーパーアゴニスト突然変異体（IL-15N72D）と二量体IL-15受容体α/Fc融合タンパク質との複合体である、ALT-803についての以下のような驚くべき発見に基づくものである。すなわち、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体（ALT-803)が、造血幹細胞移植モデルおよびドナー白血球輸注（DLI）モデルにおいて、移植片対宿主病を増大させることなく、悪性血液疾患に対する移植片対腫瘍（graft-versus-tumor（GVT））活性を増強させるという発見である。
【００６２】
同種の、または場合によっては、自己の造血幹細胞の移植（HSCT）は、多くの悪性血液疾患について選択される治療である。（HSCTおよび養子細胞療法の手法については、RagerおよびPorter, Ther Adv Hematol (2011年) 2(6) 409-428；RoddieおよびPeggs, Expert Opin. Biol. Ther. (2011年) 11(4):473-487；Wang、外、Int. J. Cancer: (2015年)136, 1751-1768；およびChang, Y.J.およびX.J. Huang, Blood Rev, 2013年. 27(1): 55-62を参照されたい。）血液癌に治効のある選択肢としての同種のHSCTの効能は、原疾患、移植に先行する前処置、および、移植片中のドナー白血球がもたらす移植片対腫瘍（GVT）作用、といった複数の要因の影響を受ける。後のほうの２つの要因は、移植関連の死亡率（TRM）に適合していなくてはならない。例えば、強度を弱めた前処置は、現在、従来の骨髄破壊的前処置が誘発する、毒性が高く炎症性の「サイトカインストーム」を伴うことなく、ドナー細胞移植を十分に免疫抑制するために使用されている。これらのより低い毒性の戦略によって、以前であれば不適格であった患者の母集団におけるHSCTの使用が可能になった。しかし、再発には関連しない死亡率を下げる改善がなされたので、治療の失敗の原因のなかで最も多いのが再発である。感染および移植片対宿主病も、同種のHSCTの主な合併症である。したがって、毒性を高めることなくHSCTの臨床的効能を向上させるため、および、HSCTの後に再発した疾患を治療するために、さらなる治療手法が必要とされている。
【００６３】
本明細書に記載の発明以前の、同種HSCT後の再発の治療戦略には、免疫抑制の中止、二次的同種移植、または、DLIが含まれる。免疫抑制の中止は、単独使用で有効であることはまれであるが、限定されたケーススタディにおいては成果をあげている。二次的同種移植は、今でも再発に対する選択肢ではあるが、治療関連の罹患率および死亡率がかなり高い（治療を受けた患者の30％に達する）。これらの選択肢が不十分なので、DLI（免疫介在性抗腫瘍活性を向上させることを目的とした、ドナーのＴリンパ球の単離と、その後のレシピエントへの輸注）の使用は、同種HSCTの後の疾患の再発に対する一般的な療法の１つとなっている。一方、DLIのGVT活性は極めて疾患に左右され易く、GVHDのリスクは高いままである。移植生物学の大きな目標は、抗原提示細胞およびエフェクターＴ細胞に焦点をあてて、GVTをGVHDから切り離す戦略をつくることである。例えば、GVTおよびGVHDの背景である免疫エフェクター機構は異なっていてもよく、薬剤を使用してのこれらの差異の操作は、癌患者にとっての治療的利点につながり得る。
【００６４】
DLIは、再発した慢性骨髄性白血病（CML）の治療に有効であり、慢性期疾患が再発した患者のほとんどについて、持続的な長期間の分子的寛解を誘発できる。しかし、DLIによる加速期または急性転化期のCMLの治療は、慢性期CMLの治療に比べて、その効果が顕著に低い。さらには、急性骨髄性白血病（AML）におけるDLIの活性は、CMLの場合と比較して、不十分である。多くの場合、AMLの急速な増殖および高い疾患負荷は、GVL誘発だけで管理することはできず、GVLの完全な展開にはDLIの後に数週間の時間を要する場合がある。ほとんどの場合、再発した急性リンパ芽球性白血病は、DLIによる治療では難治であることが知られている。本明細書に記載の発明以前には、DLIは、骨髄腫が再発した患者の部分集団に対する有意義なGVT作用をもたらせるのみであった。場合によっては、DLIは、化学療法または免疫調節薬と併用により向上するが、毒性、GVHD、および応答の可変継続時間は、依然として重要な懸念事項である。同様に、幹細胞およびDLI療法の後の不活性非ホジキンリンパ腫（NHL）については、GVT作用が大きいことが報告されている。但し、より攻撃的なNHL組織学における高い作用を裏付ける証拠はより少ない。慢性リンパ性白血病またはホジキン白血病においては、DLIの幅広い研究は行われていないが、その活性は概して低いか、または、継続時間が短く、GVHDが大いに懸念される。これらの知見を総合すると、特に高リスク患者については、DLIの効能を改善し毒性を下げるためには、DLIの操作が必要であることがわかる。
【００６５】
癌患者のDLI治療における複数の異なる要因が評価されてきた。最適な細胞投与量と投与スケジュールは、GVTおよびGVHDの発生に影響を与え得る。非血縁者ドナーのDLIの後の転帰は、HLA適合同ハプロドナーからのDLIの後の転帰とは異なるのでないかという懸念があった。利用可能な移植片工学技術の進歩とともに、現在では、免疫のバランスをGVHDから離してGVTに傾ける試みに、DLIを適応可能である。例えば、同種反応性Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞の選択的排除、または、CD4+Ｔ細胞（およびTreg細胞）もしくはＮＫ細胞の高濃度化を利用して、GVHDが抑制されてきた。腫瘍に対するDLIの活性を増強する戦略は、移植の前にエクスビボで活性化することを含む。DLIに加え、腫瘍浸潤リンパ球のような自己リンパ球を使った養子細胞療法が、血液癌と固形腫瘍の両方のために、多くの臨床現場で研究されている。また、Ｔ細胞工学の進歩により、自殺遺伝子を移植リンパ球に導入して、GVHDの際には移植リンパ球を排除し、または、キメラ抗原受容体（CAR）もしくは様々な腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体を導入することで、移植細胞の免疫エフェクター活性が腫瘍に向けられている。免疫抑制調節薬および単一クローン性抗体の移植後の使用の評価も行われている。   特異性を向上させ、GVTを最大化し、養子免疫療法後のGVHDを最小化するために、これらの手法を引き立たせるさらなる戦略が必要である。以下に詳述するように、本明細書に記載の発明は、これらの満たされていないニーズを扱うものである。
【００６６】
上記の養子細胞療法による手法は、典型的には、細胞移植の生着を促進にするために移植に先立って行われる前処置も含む。このような処置は技術分野において公知であり、骨髄破壊的（MA）前処置、化学療法、放射線療法、強度低下前処置（RIC）および非MA処置を含み得る。上記のように、適切な前処置の選択が、TRM、移植の受容と存続、GVT活性、およびGVHDに影響する。本開示の目的のために、前処置は養子細胞療法の一部であると仮定される。
【００６７】
インターロイキン−１５（IL-15）は、実験モデルにおいてCD8+Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数を増やし機能を向上させる有力なサイトカインである。しかし、本明細書に記載の発明以前には、IL-15を治療に利用するには障壁があった。具体的には、IL-15はその効力が低く、インビボ半減期が短い点である。この克服を補助するために、IL-15N72D突然変異およびIL-15RαSu/Fc融解によって、IL-15スーパーアゴニスト複合体（ALT-803またはIL-15 SAと呼ばれる）が開発された。ALT-803の血清中半減期は大幅に長く、リンパ器官に対する体内分布が改善されており、動物モデルにおいて様々な腫瘍に対するインビボ活性が増強されている。
【００６８】
本明細書に記載のように、同種造血幹細胞移植を受けたマウスレシピエントにおけるALT-803の作用を評価した。以下に詳細に説明するように、移植レシピエントにALT-803を毎週投与することにより、CD8+Ｔ細胞（具体的には、CD44+記憶／活性化表現型）およびＮＫ細胞の数が大幅に増加した。ALT-803治療マウスでは、IFN-γとTNF-αとを発現するCD8+Ｔ細胞のレベルが上昇した。また、ALT-803は、CD8+Ｔ細胞におけるNKG2Dの発現を上方制御した。さらに、ALT-803は、同系同種モデルにおいて、増殖の遅い細胞および非増殖細胞を特異的に刺激して活性増殖細胞とすることによって、養子移植されたCFSE標識Ｔ細胞の増殖とサイトカイン分泌とを増大させた。以下に詳細に説明するように、ALT-803が、マウス肥満細胞腫（P815）およびマウスＢ細胞リンパ腫（A20）に対する抗腫瘍活性に及ぼす作用について評価した。ALT-803は、これらの腫瘍において、Ｔ細胞輸注の後の移植片対腫瘍(GVT)活性を増強した。ドナー白血球輸注（DLI）マウスモデルにおいて、ALT-803の投与が、移植片対宿主病を増大させることなく、A20リンパ腫細胞に対するGVT活性をもたらした。したがって、本明細書中に記載のように、ALT-803は、非常に有力なT細胞リンパ成長因子であり、また、幹細胞移植および適応免疫療法を補完する免疫療法薬剤である。
【００６９】
IL-15は、先天性免疫系および適応免疫系において様々な役割を果たす多面発現性サイトカインである。これらの役割には、免疫エフェクター細胞（特にＮＫ細胞、ＮＫ-Ｔ細胞、CD8+Ｔ細胞）の発生、活性化、ホーミングおよび生存が含まれる（Cooper, M.A.、外、Blood, 2001年. 97(10): p. 3146-51）。IL-15は、共通ガンマ鎖（γc）サイトカインファミリーの一員であり、IL-15Rα、IL-2Rβおよびγc鎖からなる受容体複合体に結合する（Grabstein, K.H.、外、Science, 1994年. 264(5161): p. 965-8；Giri, J.G.、外、Embo J, 1995年. 14(15): p. 3654-63）。さらに、IL-15は、ＮＫ細胞の発生、ホメオスタシスおよび活性の重要な調整役である（Prlic, M.、外、J Exp Med, 2003年. 197(8): p. 967-76；Carson, W.E.、外、J Clin Invest, 1997年. 99(5): p. 937-43）。正常なマウスに対するIL-15の投与またはトランスジェニックマウスモデルでのIL-15の過剰発現は、脾臓におけるＮＫ細胞の数と割合を増加させ、（Evans, R.、外、Cell Immunol, 1997年. 179(1): p. 66-73；Marks-Konczalik, J.、外、Proc Natl Acad Sci U S A, 2000年. 97(21): p. 11445-50）、ＮＫ細胞の細胞溶解性活性とサイトカイン分泌だけでなく、増殖と生存とを増大させる。幹細胞移植レシピエントでは、IL-15の投与によって、ＮＫ細胞の数を増やし、その機能を向上させることが可能であった（Katsanis, E.、外、Transplantation, 1996年. 62(6): p. 872-5；Judge, A.D.、外、J Exp Med, 2002年. 196(7): p. 935-46；Alpdogan, O.、外、Blood, 2005年. 105(2): p. 865-73；Sauter, C.T.、外、Bone marrow transplantation, 2013年. 48(9): p. 1237-42）。
【００７０】
組換えヒトIL-15（rhIL-15）の臨床的開発における主要な制限は、標準的哺乳動物細胞発現系における生産歩留が低く、血清中半減期が短いことである（Ward, A.、外、Protein Expr Purif, 2009年. 68(1): p. 42-8；Bessard, A.、外、Mol Cancer Ther, 2009年. 8(9): p. 2736-45）。同一細胞内で同時発現したタンパク質を両方とも有する、IL-15:IL-15Rα複合体の形成によって、トランス提示メカニズムを介して、IL-2βγc受容体をもつ免疫エフェクター細胞を刺激することができる。さらに、IL-15がIL-15Rαに結合すると、IL-15のIL-2Rβへの親和性が、遊離IL-15に比較して約150倍に増大された（Ring, A.M.、外、Nat Immunol, 2012年. 13(12): p. 1187-95）。IL-2Rβ結合能が増大した（天然型IL-15よりも4〜5倍高い）IL-15のスーパーアゴニスト突然変異体（IL-15N72D）が、治療使用のために確認された（Zhu, X.、外、Novel human interleukin-15 agonists. J Immunol, 2009年. 183(6): p. 3598-607）。
【００７１】
以下に詳述するように、IL-15N72Dと可溶性IL-15Rαとの強力な相互作用は、IL-15N72Dに結合したIL-15RαSu/Fcを有するIL-15スーパーアゴニスト複合体を作製するために開発された。可溶性融合タンパク質、IL-15RαSu/Fcは、ヒトIL-15RαSuドメインをFcドメインを含むヒトIgG1に結合させることにより産生された。IL-15:IL-15Rα複合体の研究により、IL-15の細胞内安定性が向上するという効果が示された（Bergamaschi, C.、外、J Biol Chem, 2008年. 283(7): p. 4189-99；Duitman, E.H.、外、Mol Cell Biol, 2008年. 28(15): p. 4851-61）。IL-15N72DとIL-15RαSu/Fcタンパク質との同時発現により、可溶性を有し安定的な複合体が作製された。この複合体は、天然型IL-15に比べて、血清中半減期が大幅により長く、生物活性がより高い（Han, K.P.、外、Cytokine, 2011年. 56(3): p. 804-10）。上記のように、このIL-15N72D：IL-15RαSu/Fc複合体（ALT-803）の有する、IL-15依存性細胞のインビトロ増殖を促進する活性は、遊離IL-15に比べて10倍高い（Zhu, X.、外、Novel human interleukin-15 agonists. J Immunol, 2009年. 183(6): p. 3598-607）。ALT-803は、多発性骨髄腫の同質遺伝子的マウスモデルに対して、強力な抗腫瘍活性を有する(Xu, W.、外、Cancer Res,2013年.73(10): p.3075-86)。本明細書では、マウスモデルの同種造血幹細胞移植（HSCT）レシピエントにおいて、ALT-803が免疫再構築および移植片対腫瘍（GVT）／移植片対白血病（GVL）活性に及ぼす強力な作用を説明する。
【００７２】
IL-15は、同種同ハプロHSCTレシピエントにおいて、抗腫瘍活性を増強する（Alpdogan, O.、外、 Blood, 2005年. 105(2): p. 865-73；Sauter, C.T.、外、Bone Marrow Transplant, 2013年. 48(9): p. 1237-42）。IL-15の半減期は、概ね投与後１時間であり、治療のためには毎日投与しなければならない（Stoklasek, T.A.，K.S. SchlunsおよびL. Lefrancois, J Immunol, 2006年. 177(9): p. 6072-80）。組換えヒトIL-15（rhIL-15）の長時間にわたる作用は、非ヒト霊長類において研究されており、IL-15を8〜14日間にわたり毎日投与すると、リンパ球増加および白血球増加が起こることがわかっている。これらの研究では、IL-15の投与を中止すると、28日目に白血球の数が正常に戻った（Berger, C.、外、Blood, 2009年. 114(12): p. 2417-26）。これらの研究では、免疫学的パラメータも、28日目にベースラインに戻った。IL-15には短い半減期と連日投与という制限があるために、IL-15の代替的投与戦略のさらなる評価が治療現場では求められている。
【００７３】
Conlonらは、組換えヒトIL-15をボーラス注入により毎日投与すると、NK細胞およびCD8+Ｔ細胞の再分配、増殖、NK細胞およびCD8+Ｔ細胞の活性化、ならびに炎症性サイトカイン産生の向上が確認されたと報告している（Conlon, K.C.、外、J Clin Oncol, 2015年. 33(1): p. 74-82）。同文献の著者らは、サイトカインの毒性を低減するために代替的な投与戦略の研究が行われたことにも言及している。ALT-803は、より好適な安全性プロファイルと、臨床的使用において有利なより長い血清中半減期とを有する。
【００７４】
本明細書では、ALT-803が、同種HSCTのレシピエントにおけるNK細胞とCD8+Ｔ細胞とを刺激する、強力な免疫療法薬剤であることを示す結果を説明する。以下に詳述するように、ALT-803は、CD8+記憶Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を促進したが、CD4+Ｔ細胞については促進しなかった。また、ALT-803は、CD8+Ｔ細胞におけるNKG2Dの発現レベルを大幅に増大させた。NKG2Dは、先天性免疫細胞の活性化受容体であり、主に、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、活性化されたCD8+Ｔ細胞の表面で発現する。NKG2D受容体は、腫瘍形成および腫瘍監視に対する先天性免疫と適応免疫との両方において、中枢的な役割を果たす（Bauer, S.、外、Science, 1999年. 285(5428): p. 727-9；Coudert, J.D.およびW. Held, Semin Cancer Biol, 2006年. 16(5): p. 333-43）。多発性骨髄腫マウスモデルにおいて、抗原刺激が無い場合に、ALT-803が、記憶CD8+Ｔ細胞に増殖を促し、先天性免疫に伴う受容体を上方制御させ、IFN-γを分泌させ、悪性細胞を破壊する能力を獲得させることは、すでに確認されている（Xu, W.、外、Cancer Res, 2013年. 73(10): p. 3075-86）。
【００７５】
本明細書で説明する結果は、ALT-803が、HSCT状況で、免疫細胞に同様の作用を及ぼすことを示すものである。したがって、NKG2D発現の高いCD8+Ｔ細胞（すなわち、NKT細胞）がALT-803により誘発され、HSCTにおいて強力な抗腫瘍活性に寄与する可能性がある。本明細書に記載の結果は、CD8+Ｔ細胞でのNKG2Dの発現は、CD8+Ｔ細胞の生存および細胞障害性機能を促進することにより、介在するGVHDおよびGVTに関連している、という最近の報告（Karimi, M.A.、外、Blood, 2015年）と整合する。NKG2D遮断が、GVHDを減衰させる一方で、CD8+Ｔ細胞に抗腫瘍活性を回復させることが認められた。ＮＫ細胞およびＮＫ-Ｔ細胞の対腫瘍細胞介在細胞障害についての活性化受容体として機能することに加え、NKG2Dが、腫瘍細胞によりストレス誘導性NKG2Dリガンドが過剰発現している腫瘍部位に、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を動員する受容体として作用するのではないかということが示唆されている。本明細書に記載のHSCT研究において、ALT-803はCD4+Ｔ細胞の増殖と活性化を大幅に促進することはなかった。
【００７６】
Ｔ細胞除去モデルでは、同種HSCTの後にIL-15を投与すると、TCD-BMT後のGVHDの作用に影響することなく、GVHDの発生を増大させ得る（Alpdogan, O.、外、Blood, 2005年. 105(2): p. 865-73）。興味深いことには、IL-15は、非常に低投与量のＴ細胞輸注のレシピエントにおいてはGVHDを増大させなかった（Sauter, C.T.、外、Bone Marrow Transplant, 2013年. 48(9): p. 1237-42）。この研究では同じモデルを使用し、ALT-803がGVHDの発生を増大させず、同ハプロHSCTレシピエントの生存を改善することが確認された。本明細書に記載の結果は、ALT-803が、同ハプロHSCTレシピエントにおいてＮＫ細胞の数を増加させることを示している。ALT-803は、また、ＮＫ細胞の細胞障害性を強力に活性化する（Seay, K.、外、J Virol, 2015年. 89(12): p. 6264-74）。不適合HSCTのレシピエントにおけるＮＫ細胞の同種反応性は、宿主由来抗原提示細胞を減少させて、これによりGVHDの発生を抑制する可能性がある（Ruggeri, L.、外、Science, 2002年. 295(5562): p. 2097-100）。したがって、同ハプロHSCTにおけるALT-803投与によるＮＫ細胞の数の増加とその細胞障害性の増大が、GVTのみならず、宿主由来抗原提示細胞の減少にも寄与することが想定される。宿主由来抗原提示細胞の減少は、GVHDの原因である、宿主に特異的なCD8+エフェクターＴ細胞の活性を低下させる。しかし、ＮＫ細胞に関連するGVT活性は、移植前または移植後にＴ細胞輸注を受けない、A20リンパ腫を有するレシピエントにおいては、Ａ20腫瘍細胞の成長に打ち勝ち、該レシピエントの全体的な生存を改善するのには十分強力ではないことは明らかであった。ALT-803治療群では、低投与量のＴ細胞輸注だけで、生存平均に達することができた。これは、CD8+記憶Ｔ細胞を増殖させ、そのエフェクター機能を増強するという、ALT-803に独特の能力の結果である可能性が高い。
【００７７】
DLIは、同種HSCTの後にGVTの作用を増大させることによって、再発を管理するための戦略として開発された（Kolb, H.J.、外、Blood, 1990年. 76(12): p. 2462-5）。DLIは、HSCT後の再発疾患に苦しむレシピエントの、ほとんどの悪性血液疾患を治療するために使用されている。急性白血病患者においては、一般的な奏効率は30％より低く、また、継続的ではない（Tomblyn, M.およびH.M. Lazarus, Bone marrow transplantation, 2008年. 42(9): p. 569-79）。Collinsらは、急性白血病患者では、DLIに対する奏効率が20％よりも低いことを発見した（Collins, R.H., Jr.、外、J Clin Oncol, 1997年. 15(2): p. 433-44）。近年、同種HSCTの後に再発したまたは持続する悪性血液疾患を治療するために、DLIの効能を増強する方法が開発されている（Chang, Y.J.およびX.J. Huang, Blood Rev, 2013年. 27(1): p. 55-62）。様々なサイトカインによってドナー白血球の活性を増強することが行われている。同種HSCT後の再発白血病に苦しむ患者に対する、DLI後のIL-2治療は、有益な転帰をもたらさず、GVHDの発生を増大させた（Inamoto, Y.、外、Biol Blood Marrow Transplant, 2011. 17(9): p. 1308-15）。本明細書に記載の発明以前では、ヒトまたは移植マウスモデルにおいて、DLIの後にIL-15を使用することは無かった。本明細書では、A20リンパ腫マウスモデルシステムに対する、DLIモデルの開発を説明する。本明細書に記載の実験は、精製Ｔ細胞含有DLIの活性の考察と、ALT-803投与がリンパ腫マウスモデルにおいて、DLIの活性を大幅に向上させたことを示す結果に焦点を当てる。さらには、非移植リンパ腫モデルにおける予備的結果は、ALT-803が、リンパ球枯渇後の正常マウスへの自己Ｔ細胞輸注がもたらす抗リンパ腫活性を増強することを示している。これは、ALT-803がリンパ腫／白血病の療法において重要な役割を担っていることを示唆する。
【００７８】
本明細書では、週１回のALT-803の投与が、腫瘍マウスモデル、マウス肥満細胞腫、およびマウスＢ細胞リンパ腫に持続的な免疫学的抗腫瘍活性をもたらすことを示す結果を説明する。ALT-803の有する、同系マウスモデルにおける多発性骨髄腫に対する実質的な抗腫瘍活性についても、すでに報告されている（Xu, W.、外、Cancer Res,2013年.73(10): p.3075-86）。これは、rhIL-15に比べて、ALT-803の血清中半減期はより長く、薬物動態学的プロファイルが好適であることに起因している可能性が高い（Han, K.P.、外、Cytokine, 2011年. 56(3): p. 804-10）。これらの研究の結果は、現在、悪性固形腫瘍および血液悪性腫瘍について多くの臨床試験において毎週の投与計画が適用されていることの根拠である。
【００７９】
まとめると、ALT-803は強力なリンパ球成長因子であり、GVHDを悪化させることなく、幹細胞移植および適応Ｔ細胞療法のレシピエントの免疫機能を増強する強力な治療剤として有用である。
IL-15:IL-15Rα複合体
上記のように、IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体は、天然型IL-15Rαの可溶性IL-15Rαドメインに非共有結合したIL-15を有する複合体のことを指す。いくつかの場合では、可溶性IL-15Rαは、生物活性ポリペプチドおよび／またはIgG Fcドメインに共有結合されている。IL-15は、IL-15であってもよいし、第２の生物活性ポリペプチドに共有結合されたIL-15であってもよい。IL-15:IL-15Rα複合体の結晶構造は、ChirifuらのNat Immunol 8, 1001-1007（2007年）に記載されており、同文献が参照により本願に組み込まれる。
【００８０】
ある態様では、本発明は、IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体の作製方法を提供する。この方法は、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）に、IL-15（またはIL-15変異体）をコードする第１のDNAベクターと、IL-15Rα融合タンパク質をコードする第２のDNAベクターとを導入する工程と、IL-15（またはIL-1５変異体）およびIL-15Rα融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞または培地から、IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体を精製する工程とを含む。
【００８１】
別の態様では、本発明は、IL-15Rα/Fc融合タンパク質を含有するIL-15:IL-15Rα複合体の作製方法を提供する。この方法は、宿主細胞に、IL-15（またはIL-15変異体）をコードする第１のDNAと、IL-15Rα/Fc融合タンパク質をコードする第２のDNAとを導入する工程と、IL-15（またはIL-1５変異体）とIL-15Rα/Fc融合タンパク質とを発現するのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞または培地から、IL-15:IL-15Rα/Fc複合体を精製する工程とを含む。
【００８２】
別の態様では、本発明は、IL-15Rα/Fc融合タンパク質を含有するIL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体の作製方法を提供する。この方法は、IL-15（またはIL-1５変異体）とIL-15Rα/Fc融合タンパク質とを宿主細胞内で同時発現させる工程と、IL-15（またはIL-1５変異体）とIL-15Rα/Fc融合タンパク質とを発現するのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞または培地から、IL-15:IL-15Rα/Fc融合タンパク質複合体を精製する工程とを含む。
【００８３】
別の態様では、本発明は、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体の作製方法を提供する。この方法は、IL-15N72DとIL-15RαSu/Fc融合タンパク質とを宿主細胞内で同時発現させる工程と、IL-15N72DとIL-15RαSu/Fc融合タンパク質とが発現するのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞または培地から、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を精製する工程とを含み、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc複合体のIL-15結合部位は両方とも完全に占有されている。
【００８４】
本明細書で詳述する発明の上記態様または他の態様の様々な実施形態において、IL-15Rα融合タンパク質は、生物活性ポリペプチド（例えば、IgGの重鎖不変ドメインやIgGの重鎖不変ドメインのFcドメイン）に共有結合したIL-15Rαのような可溶性IL-15Rαを含む。本発明の上記態様の他の実施形態では、IL-15は、第２の生物活性ポリペプチドに共有結合されたIL-15のようなIL-15を含む。他の実施形態では、宿主細胞または培地からIL-15:IL-15Rα複合体を精製する工程は、IL-15:IL-15Rα融合タンパク質複合体に特異的に結合する親和性試薬上のIL-15:IL-15Rα複合体を捕捉する工程を含む。他の実施形態では、IL-15Rα融合タンパク質は、IL-15Rα/Fc融合タンパク質と、Fcドメインに特異的に結合する親和性試薬とを含む。他の実施形態では、親和性試薬はプロテインAまたはプロテインGである。他の実施形態では、親和性試薬は抗体である。他の実施形態では、宿主細胞または培地からIL-15:IL-15Rα複合体を精製する工程は、イオン交換クロマトグラフィーを含む。他の実施形態では、宿主細胞または培地からIL-15:IL-15Rα複合体を精製する工程は、サイズ排除クロマトグラフィーを含む。
【００８５】
他の実施形態では、IL-15Rαは、IL-15RαSushi（IL-15RαSu）を含む。他の実施形態では、IL-15は、変異体IL-15（例えば、IL-15N72D）である。他の実施形態では、IL-15:IL-15Rα複合体のIL-15結合部位は、完全に占有されている。他の実施形態では、IL-15:IL-15RαSu/Fc複合体のIL-15結合部位は両方とも、完全に占有されている。他の実施形態では、IL-15:IL-15Rα複合体は、複合体電荷特性または複合体サイズ特性に基づいて精製される。他の実施形態では、完全占有されたIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体は、複合体電荷特性に基づいて、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。他の実施形態では、完全占有されたIL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合タンパク質複合体は、低イオン強度中性ｐＨ緩衝剤を有する第四級アミン系樹脂、および、イオン強度を上昇させる緩衝剤を使用する溶出条件を利用して精製される。
【００８６】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体のある実施形態では、IL-15ポリペプチドは、天然型IL-15ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するIL-15変異体である。本明細書では、ヒトIL-15ポリペプチドを、huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、野生型(wt)IL-15と呼び、その変異体は、天然型アミノ酸と、その成熟配列中での位置と、変異体アミノ酸とで呼称される。例えば、huIL15N72Dは、72位のNのDへの置換を含むヒトIL-15を示す。ある実施形態では、IL-15変異体は、例えば、天然型IL-15ポリペプチドと比べてIL-15RβγC受容体に対する増大した結合活性によって実証されているように、IL-15アゴニストとして機能する。ある実施形態では、IL-15変異体は、例えば、天然型IL-15ポリペプチドと比べてIL-15RβγC受容体に対する減少した結合活性によって実証されているように、IL-15アゴニストとして機能する。ある実施形態では、IL-15変異体は、天然型IL-15ポリペプチドと比べてIL-15RβγC受容体に対して増大した結合親和性または減少した結合活性を有している。ある実施形態では、IL-15変異体の配列は天然型IL-15の配列と比べて、少なくとも１つの（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の）アミノ酸変化を有している。アミノ酸変化は、IL-15Rβおよび／またはIL-15RγCと相互作用するIL-15のドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸置換または欠失を含み得る。ある実施形態では、アミノ酸変化は成熟ヒトIL-15配列の８、61、65、72、92、101、108または111位における１つまたは複数のアミノ酸置換もしくは欠失である。例えば、アミノ酸変化は、成熟ヒトIL-15配列の8位のDからNまたはAへの、61位のＤからAへの、65位のＮからＡへの、72位のＮからＲへの、または108位のＱからＡへの置換もしくはこれらの置換の組み合わせである。ある実施形態では、アミノ酸変化は成熟ヒトIL-15配列の72位におけるNからDへの置換である。
ALT-803
ALT-803は、IL-2Rβγへの結合能が強化されるとともに生物活性が増強されたIL-15突然変異体を包含する（米国特許第8507222号明細書。同文献は、参照により本願に組み込まれる）。このIL-15のスーパーアゴニスト突然変異体は、刊行物（J Immunol 2009年 183:3598）に記載されており、米国特許商標庁によって、スーパーアゴニストについての１件の特許が発行され、複数の特許出願が係属中である（例えば、米国特許出願番号第12/151980号および第13/238925号）。このIL-15スーパーアゴニストと、可溶性IL-15α受容体融合タンパク質（IL-15RαSu/Fc）とを組み合わると、インビトロおよびインビボで非常に強力なL-15活性を有するタンパク質複合体が得られる（Han、外、2011年, Cytokine, 56: 804-810；Xu、外、2013年, Cancer Res. 73:3075-86；Wong、外、2013年, OncoImmunology 2:e26442）。このIL-15スーパーアゴニスト複合体（IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc）をALT-803と呼ぶ。薬物動態学的分析により、この複合体の半減期は、マウスへの静脈内投与から25時間であることが示された。ALT-803は、免疫正常マウスの攻撃的固形腫瘍および血液腫瘍モデルに対し、優れた抗腫瘍活性を示す。ALT-803は、週２回または週１回の静脈内投与計画で単剤療法として投与可能であるし、または、抗体との併用療法として投与可能である。また、ALT-803の抗腫瘍反応は継続的である。また、ALT-803治療後に治癒された腫瘍マウスは、同じ腫瘍細胞による再攻撃に対して高い耐性を見せた。これは、ALT-803が、再導入された腫瘍細胞に対して、効果的な免疫学的記憶応答を誘発することを意味する。
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５(IL-15)は、エフェクターＮＫ細胞およびCD8+記憶Ｔ細胞の発生、増殖および活性化にとって重要なサイトカインである。IL-15は、IL-15受容体α（IL-15Rα）に結合し、エフェクター細胞上でIL-2/IL-15受容体β−共通γ鎖（IL-15Rβγc）複合体へのトランスとして現われる。IL-15とIL-2とは、IL-15Rβγcへの結合、および、STAT3経路とSTAT5経路とを介して信号を共有する。しかし、IL-2は、また、CD4+CD25+FoxP3+調節Ｔ（Treg）細胞の維持を補助し、活性化されたCD8+Ｔ細胞の細胞死を誘発する。これらの作用が、IL-2の対腫瘍活性を制限する可能性がある。IL-15は、これらの免疫抑制活性を、IL-2と共有しない。さらに、IL-15は、エフェクターCD8+Ｔ細胞に抗アポトーシス信号を供給する唯一のサイトカインとして知られている。IL-15は、単剤投与されても、IL-15Rαとの複合体として投与されても、動物実験モデルにおける十分に確立された固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示し、癌を治癒する可能性がある最も有望な免疫治療薬剤の１つとして特定されている。
【００８７】
IL-15に基づく癌治療剤の臨床的開発を促進するために、IL-15に比べて生物活性が向上したIL-15突然変異体（IL-15N72D）が特定された（Zhu、外、J Immunol, 183: 3598-3607, 2009年）。このIL-15スーパーアゴニスト（IL-15N72D）の薬物動態、生体内分布、および生物活性は、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合複合体（ALT-803）の作製によりさらに改善され、このスーパーアゴニスト複合体は、インビボで天然型サイトカインの25倍以上の活性を有する（Han、外、Cytokine, 56: 804-810, 2011年）。
Fcドメイン
ALT-803は、IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合複合体を包含する。IgGのFc領域を別のタンパク質（例えば、様々なサイトカインと可溶性受容体）のドメインと組み合わせる融合タンパク質が報告されている（例えば、Capon、外、Nature, 337:525-531, 1989年；Chamow、外、Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996年；米国特許第5116964号および第5541087号明細書を参照されたい）。この基本型融合タンパク質は、IgG Fcのヒンジ領域中のシステイン残基を介して結合されるホモ二量体タンパク質であり、重鎖可変ドメインとCH1ドメインと軽鎖とが無いIgG分子に類似した分子をもたらす。Fcドメインを含む融合タンパク質の二量体特性には、別の分子との高次相互作用（すなわち、二価または二重特異性結合）をもたらすという利点がある。構造的相同性に起因して、Fc融合タンパク質は類似のアイソタイプを有するヒトIgGのそれに相当するインビボの薬物動態プロファイルを示す。IgGクラスの免疫グロブリンは、ヒトの血液中に最も豊富なタンパク質の１つであり、循環血中半減期は21日にも及ぶ。IL-15またはIL-15融合タンパク質の循環血中半減期を引き延ばすために、および／または、その生物活性を増強するために、ヒトの重鎖IgGタンパク質のFcタンパク質に共有結合されたIL-15RαSuに非共有結合したIL-15ドメインを含む融合タンパク質複合体（例えば、ALT-803）が作製された。
【００８８】
用語「Fc」は、抗体の非抗原結合断片を指す。この「Fc」は、単量体の形態であってもよく、多量体の形態であってもよい。天然型Fcの原免疫グロブリン供給源はヒト起源であることが好ましく、任意の免疫グロブリンであってもよいが、IgG1およびIgG2が好ましい。天然型Fcは二量体または多量体形態内へ共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合できる単量体ポリペプチドで構成されている。天然型Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、IgG、IgA、IgE）またはサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2）に依存して１〜４の範囲にある。天然型Fcの一例は、IgGのパパイン消化由来のジスルフィド結合した二量体である（Ellison、外、(1982年), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9を参照されたい）。本明細書で用いられる用語「天然型Fc」は単量体、二量体、および多量体形態についての総称である。Fcドメインは、プロテインＡ、プロテインＧ、各種のFc受容体および相補タンパク質に対する結合部位を含む。
【００８９】
ある実施態様では、用語「Fc変異体」は、天然型Fcから改変されているがサルベージ受容体であるFcRnへの結合部位を未だ含んでいる分子または配列を指す。国際公開第97/34631号（1997年9月25日公開）および国際公開第96/32478号は、例示的なFc変異体、および、サルベージ受容体との相互作用を記載している。これら文献を参照により本明細書に組み込む。したがって、用語「Fc変異体」は、非ヒト天然型Fcからヒト化された分子または配列を包含する。さらに、天然型Fcは、本発明の融合分子に不要な構造特性または生物活性をもたらすので除去されてもよい部位を含んでいる。したがって、ある実施態様では、用語「Fc変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ−末端異質性、（４）グリコシル化、（５）相補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、（７）抗体依存性の細胞傷害（ADCC）、または（８）抗体依存性細胞食作用（ADCP）に影響を及ぼすかまたはこれに関与する天然型Fcの部位または残基のうちの１つまたは複数を欠失した分子または配列を含んでいる。Fc変異体を、以下にさらに詳細に説明する。
【００９０】
用語「Fcドメイン」は、天然型Fc、Fc変異体分子、および上記の配列を包含する。Fc変異体および天然型Fcと同様に、用語「Fcドメイン」は、全抗体から消化されたにせよ、組換え遺伝子発現または他の手段で産生されたにせよ、単量体または多量体形態の分子を包含する。
融合タンパク質複合体
本発明は、IL-15N72DとIL-15RαSu/Fcとの間のタンパク質複合体であるALT-803を提供する。
【００９１】
例示的なIL-15N72D核酸配列を（リーダーペプチドとともに）以下に示す（配列番号１）。
(リーダーペプチド)
atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggt-
(IL-15N72D)
aactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
（終止コドン）
taa
例示的なIL-15N72Dアミノ酸配列を（リーダーペプチドとともに）以下に示す（配列番号２）。
(リーダーペプチド)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG-
(IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
いくつかの場合には、リーダーペプチドは、成熟IL-15N72Dポリペプチド（配列番号３）から、分割される。
(IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
例示的なIL-15RαSu/Fc核酸配列を（リーダーペプチドとともに）以下に示す（配列番号４）。
(リーダーペプチド)
atggacagacttacttcttcattcctgctcctgattgtccctgcgtacgtcttgtcc-
(IL-15RαSu)
atcacgtgccctccccccatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgtattaga-
（IgG1 CH2-CH3（Fcドメイン））
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa-
（終止コドン）
taa
例示的なIL-15RαSu/Fcアミノ酸配列を（リーダーペプチドとともに）以下に示す（配列番号５）。
(リーダーペプチド)
MDRLTSSFLLLIVPAYVLS-
(IL-15RαSu)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR-
（IgG1 CH2-CH3（Fcドメイン））
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
いくつかの場合には、成熟IL-15RαSu/Fcタンパク質は、リーダー配列を欠失している（配列番号６）。
(IL-15RαSu)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR-
（IgG1 CH2-CH3（Fcドメイン））
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ある実施形態では、ALT-803ポリペプチドは、他のタンパク質ドメインへの融合のためのスカフォールドとしての働きをもつ可能性がある。そのような融合タンパク質複合体においては、第１の融合タンパク質が、インターロイキン−１５(IL-15)またはその機能性断片に共有結合された第１の生物活性ポリペプチドを含み、第２の融合タンパク質が、可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（IL-15Rα）ポリペプチドまたはその機能性断片に共有結合された第２の生物活性ポリペプチドを含み、第１の融合タンパク質のIL-15ドメインが、第２の融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインに結合して、可溶性融合タンパク質複合体を構成する。本発明の融合タンパク質複合体は、また、第１および第２の融合タンパク質の一方または両方に結合された免疫グロブリンFcドメインまたはその機能性断片を含む。好ましくは、第１および第２の融合タンパク質に結合されたFcドメイン同士が相互作用して、融合タンパク質複合体を形成する。このような複合体は、免疫グロブリンFcドメイン間のジスルフィド結合形成によって、安定化されてもよい。ある実施形態では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、IL-15ポリペプチド、IL-15変異体またはその機能性断片、および、可溶性IL-15Rαポリペプチドまたはその機能性断片を含む。IL-15ポリペプチドとIL-15Rαポリペプチドの一方または両方が、免疫グロブリンFcドメインまたはその機能性断片をさらに含む。
【００９２】
別の実施形態では、第１および第２の生物活性ポリペプチドの一方または両方は、抗体またはその機能性断片を含む。
【００９３】
別の実施形態では、抗体ドメインに対する抗原は、細胞表面受容体またはリガンドを含む。
【００９４】
別の実施形態では、抗原は、CD抗原、サイトカイン、ケモカイン受容体もしくはリガンド、成長因子受容体もしくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、MHC/MHC様分子、Fc因子、Toll様受容体、NK受容体、TCR、BCR、陽性／陰性同時刺激受容体もしくはリガンド、死受容体もしくはリガンド、腫瘍関連抗原、または、ウィルスがコードする抗原を含む。
【００９５】
本明細書で用いられる用語「生物活性ポリペプチド」または「エフェクター分子」は、本明細書で検討する所望の作用をもたらすことのできるアミノ酸配列を意味し、その例としては、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、糖もしくは多糖類、脂質もしくは糖脂質、糖タンパク質、またはリポタンパク質が挙げられる。エフェクター分子は化学物質も包含する。生物活性タンパク質もしくはエフェクタータンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするエフェクター分子核酸も意図される。したがって、適切な分子には、調節因子、酵素、抗体または薬剤、ならびに、DNA、RNA、およびオリゴヌクレオチドが含まれる。生物活性ポリペプチドまたはエフェクター分子は天然由来であってもよく、または公知成分から、例えば、遺伝子組み換えまたは化学合成によって合成でき、そして異種成分を包んでいてもよい。生物活性ポリペプチドまたエフェクター分子は通常、遠心分離またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的分子サイズ測定技術で評価して、約0.1〜100KDまたは最大で約1000KDの大きさであり、好ましくは約0.1、0.2、0.5、1、２、５、10、20、30および50KDの間である。本発明の望ましい効果としては、例えば、増強した結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を作製すること、疾患の予防または治療において、標的細胞を殺傷して細胞増殖または細胞死等を誘発して免疫応答を開始すること、または、診断目的で検出分子として作用することを包含するが、これらに限定されない。このような検出のために、アッセイを用いることができ、例えば、細胞を培養して増殖させることを一連の工程を含むアッセイを用いることができる。
【００９６】
本発明に従って本発明の融合タンパク質複合体にエフェクター分子を共有結合することは、多くの重要な利点をもたらす。公知構造のペプチドのような、単一のエフェクター分子を含む本発明の融合タンパク質複合体を産生できる。さらに、多種のエフェクター分子を同様のDNAベクター内に産生できる。すなわち、感染細胞又は病的細胞を認識するために、異なるエフェクター分子のライブラリーを融合タンパク質複合体に結合することができる。さらに、治療適用のためには、本発明の融合タンパク質複合体を対象に投与するのではなく、むしろ、融合タンパク質複合体をコードするDNA発現ベクターを、融合タンパク質複合体のインビボ発現のために投与してもよい。このような手法により、典型的には組換えタンパク質の調整に関連する高コストな精製工程を避け、そして従来の手法に関連する抗原の取り込みおよび処理の複雑さを避けることができる。
【００９７】
記載のように、本明細書に開示の融合タンパク質および抗体の成分、例えば、エフェクター分子複合体（サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク毒素、免疫グロブリンドメイン、または、その他の生物活性分子、等）および任意のペプチドリンカーは、融合タンパク質または抗体がそれに意図された機能を有する限りにおいて、ほとんどの方法で構造化できる。具体的には、融合タンパク質の各成分を、所望により、少なくとも１つの適切なペプチドリンカー配列の分、別の成分から離間できる。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の修飾、識別および／または精製を促進するために、タグを包含できる。
治療用薬剤
本発明は、治療剤として使用されるALT-803を含有する医薬組成物を提供する。１つの態様では、ALT-803は生理食塩水のような薬学的に許容可能な緩衝剤に調整されて、全身投与される。好ましい投与経路としては、例えば、患者体内に継続的持続的レベルの組成物を提供できる、膀胱への点滴注入、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内射または皮内注射等が挙げられる。ヒトまたはその他の動物である患者の治療は、治療有効量の本明細書で識別される治療剤を、生理学的に許容可能な担体内で使用して行われる。適切な担体およびその処方は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（E. W. Martin著）に記載されている。投与される治療剤の量は、投与方法、患者の年齢と体重によって、また、新生物または感染の臨床的症状に応じて変更される。概して、この量は、新生物または感染に関連する他の疾患の治療に使用される他の薬剤の量の範囲内であるが、特定の例では化合物の特異性が高まっていることから、必要量はより少ない。化合物は、対象の免疫応答を向上させる投与量、または、新生細胞の増殖、生存または侵襲性を低下させる投与量で投与される。これらの投与量は、当業者には公知の方法で決定される。あるいは、化合物は、ウイルスまたはその他の対象病原体による感染を低減させる投与量で投与される。
医薬組成物の調整
新生物または感染の治療を目的としたALT-803の投与は、他の成分との組み合わせにより、新生物または感染を緩和、抑制、または安定化する薬剤濃度となる、任意の適切な方法で行うことができる。ALT-803は、任意の適切な量で、任意の適当な担体物質に含有させることができ、概して、組成物の総重量の1〜95重量％の量で含まれる。組成物は、非経口的（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、小胞内、腹腔内）投与経路に適した投与形態で提供可能である。医薬組成物は、従来の医薬実務に従って調整できる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照されたい）。
【００９８】
当業者にとっては、動物モデルとの比較によりヒトへの投与量を変更することは当該技術分野における慣例であるので、ヒトへの投与量を、当初はマウスまたはヒト以外の霊長類に使用された化合物量から推定して決定することができる。ある実施形態では、投与量が、体重1kgあたりの化合物の量として、約0.1μgから約5000μgの間で、または、約1μgから約4000μgの間で、または、約10μgから約3000μgの間で、変動することが想定される。他の実施形態では、この投与量は、体重1kgあたり、約0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500または5000μgであってもよい。他の実施係蹄では、投与量は、体重1kgあたりの化合物の量として、約0.5μgから約20μgの範囲内であってもよい。他の実施形態では、投与量は、体重1kgあたり、約0.5、1、3、6、10、または20mgであってもよい。もちろん、このような治療プロトコルで慣例的に行われているように、この投与量を初期の臨床試験の結果と特定の患者の必要とに応じて、増減により調節してもよい。
【００９９】
特定の実施形態では、ALT-803は非経口投与に適した賦形剤に処方される。特定の実施形態では、ALT-803は、0.5μg/kgから約15μg/kg（例えば、0.5、1、3、5、10または15μg/kg）投与される。
【０１００】
膀胱癌の治療では、ALT-803が膀胱への点滴注入により投与される。点滴注入の方法は公知である。例えば、Lawrencia、外、Gene Ther 8, 760-8 (2001年)；Nogawa、外、J Clin Invest 115, 978-85 (2005年)；Ng、外、Methods Enzymol 391, 304-13 2005年；Tyagi、外、J Urol 171, 483-9 (2004年)；Trevisani、外、J Pharmacol Exp Ther 309, 1167-73 (2004年)；Trevisani、外、Nat Neurosci 5, 546-51 (2002年))；(Segal、外、1975年). (Dyson、外、2005年) (Batista、外、2005年；Dyson、外、2005年）を参照されたい。ある実施形態では、点滴注入のためのALT-803の投与量は、１回の投与あたり約5μgから1000μgの間で変動することが想定される。他の実施形態では、膀胱内投与量は、１回の投与あたり約25、50、100、200または400μgであってよい。他の実施形態では、ALT-803は、マイトマイシンCまたはカルメット-ゲラン杆菌（BCG）を含む標準的療法と併用して、点滴注入によって膀胱に投与される。
【０１０１】
医薬組成物は、適切な賦形剤とともに、投与時に治療剤を制御的に放出する医薬組成物に調整される。例としては、シングルもしくはマルチユニット錠剤組成物またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロカプセル、細粒、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、および、リポソームが挙げられる。
非経口組成物
ALT-803を含む医薬組成物は、投与形態で、処方で、または、適切な送達装置もしくは薬学的に許容可能な従来の非毒性担体およびアジュバントを含有する移植片を介して、注射、輸注または移植により非経口投与（皮下、静脈内、小胞内、腹腔内、等）されてもよい。これらの組成物の処方と調整は、医薬品処方の当業者には公知である。処方は、上記のRemingtonのThe Science and Practice of Pharmacyに記載されている。
【０１０２】
非経口での使用のための、ALT-803を含む組成物は、ユニット投与形態（例えば、単回投与用アンプル、シリンジまたはバッグ）で供給されてもよく、複数回の投与量を含み適切な保存薬を添加可能なバイアルとして供給されてもよい。この組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、輸注装置、または、移植用送達装置の形態であってもよく、使用前に水または別の適切な賦形剤で復元される乾燥粉体として提供されてもよい。新生物または感染を改善または抑制する活性薬剤とは別に、組成物は、非経口的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよい。単数または複数の活性治療剤は、制御的放出のために、細粒、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等に組み入れられてもよい。さらに、組成物は、懸濁剤、溶解剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤および／または分散剤を含んでもよい。
【０１０３】
上記のとおり、ALT-803を含む医薬組成物は、滅菌注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調整するためには、１種または複数種の適切な抗新生物／抗感染薬剤を、非経口的に許容可能な液体賦形剤に溶解または懸濁させる。使用できる許容可能な賦形剤および溶媒としては、水、適当な量の塩酸、水酸化ナトリウム、または適切な緩衝剤の添加によりｐＨが適切に調節された水、1，3−ブタンジオール、リンゲル液、および、等張塩化ナトリウム溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。水性製剤は、１種または複数種の保存薬（例えば、メチル、エチル、またはｎープロピルｐヒドロキシベンゾエート）を含んでいてもよい。これら化合物のうちの１つが、水に少しまたはわずかにしか溶解しない場合は、溶解促進剤または可溶化剤を添加してもよい。あるいは、溶媒に10〜60% w/wのプロピレングリコールを含有させてもよい。
【０１０４】
本明細書に記載の方法は、対象（このような治療を必要としていると特定された対象を含む）に有効量の本明細書に記載の化合物または本明細書に記載の組成物を投与して、このような効果をもたらす工程を含む。このような治療を必要とする対象の特定は、対象の判断または医療専門家の判断で行われてもよいし、主観的（例えば、オピニオン）または客観的（検査または診断方法により測定可能）であってよい。
【０１０５】
本発明の治療方法（予防療法を含む）は、概して、治療有効量の本明細書に記載の化合物（例えば、本明細書に記載の処方箋の化合物）の、該化合物を必要とする対象（例えば動物やヒト）への投与を含む。対象は、哺乳動物を含み、特にヒトである。このような治療は、対象、特に新生物性または感染性疾患、障害、またはこれらの症状をもつか、疑われるか、リスクを有するヒトに対して提供するのが適切である。「リスクを有する」対象の判定は、任意の検査によって、または対象もしくは医療提供者の意見によって、客観的または主観的判定であってもよい（例えば、遺伝的検査、酵素またはタンパク質マーカー、（本明細書で定義する）マーカー、家族歴、など）。ALT-803は、免疫応答の増強が望まれるその他のいかなる障害の治療にも使用可能である。
【０１０６】
ある実施形態では、本発明は、治療の進行を監視するための方法を提供する。この方法は、診断マーカー（マーカー）（例えば、本明細書の化合物により調節された本明細書中で説明するターゲット、タンパク質、またはその指示薬、など）のレベルを判定する工程を含む。あるいは、新生物または感染に関連する障害またはその症状をもつ対象であって、その障害または症状を治療するのに十分な量の化合物の投与を受けた対象の診断的測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）を含む。この方法において判定されたマーカーのレベルを、健常な対照または他の患者での既知のマーカーレベルと比較することにより、対象の疾患状態を確定することができる。好ましい実施形態では、対象における第２のマーカーレベルを、上記第１のマーカーレベルの判定よりも後の時点で判定する。そして、これら２つのレベルを比較することにより、疾患の進行または療法の効能を監視する。ある好ましい実施形態では、対象における治療前のマーカーレベルを、本発明に係る治療の開始よりも前に判定する。この治療前のマーカーレベルを、治療開始後の対象のマーカーレベルと比較することにより、治療の効能を判定可能である。
併用療法
いくつかの場合においては、ALT-803を、抗体（例えば、腫瘍特異的抗体）のような抗新生物薬または抗感染薬と併用して投与する。抗体およびALT-803は、同時に投与してもよいし、連続的に投与してもよい。いくつかの実施形態では、抗体治療は適応症のための確立された療法であり、ALT-803治療を抗体療法に追加することにより、患者に対する治療の利点が向上する。このような向上は、患者１人あたりの応答の向上として、または、患者集団の応答の向上として測定され得る。併用療法は、抗体のより低量またはより低頻度の投与での、向上した応答を提供可能であり、より許容性に優れた治療計画が可能となる。以上のように、ALT-803と抗体との併用療法は、増大したADCC、ADCP、および／またはＮＫ細胞、T細胞、好中球もしくは単球細胞レベル、または、免疫応答等の様々な機構を介して、増強された臨床的活性を提供可能である。
【０１０７】
必要であれば、ALT-803の投与を任意の従来の療法と併用する。従来の療法としては、手術、放射線療法、化学療法、蛋白質製剤による治療、または、生物学的療法があるが、これらに限定されない。化学療法用薬剤としては、アルキル化剤（例えば、白金系薬剤、テトラジン、アジリジン、ニトロソ尿素類、ナイトロジェンマスタード）、抗代謝剤（例えば、抗葉酸剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似物、チオプリン)、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド、タキサン)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、トポイソメラーゼIおよびII阻害剤)、細胞障害抗生物質(例えば、アントラサイクリン)、タンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）および免疫調節薬剤（例えば、サリドマイドおよび類似物）が挙げられる。
【０１０８】
他の実施形態では、ALT-803の投与は、養子細胞療法または移植と連携して行われる。このような養子細胞療法には、造血幹細胞の同種・自家移植、ドナー白血球輸注輸注（DLI）、腫瘍浸潤リンパ球の養子移入、または、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞（自殺遺伝子、キメラ抗原受容体由来の遺伝子、腫瘍抗原に特異的なTCR、または細胞増殖、生存、存続、対腫瘍活性を促進するその他の遺伝子を含む細胞）の養子移入が含まれるが、これらに限定されない。移植細胞は、レシピエント（自己）または血縁関係／非血縁関係ドナーを含む各種供給者から得ることができる。ALT-803を使った併用療法は、インビボ、エクスビボ、インビトロ、またはこれらを組み合わせて実施可能である。
キットまたは医薬システム
ALT-803を含む医薬組成物を、新生物治療に使用されるキットまたは医薬システムに組み込んでもよい。本発明のこの態様に係るキットまたは医薬システムは、１つまたは複数の容器手段（例えばバイアル、チューブ、アンプル、ビン、シリンジ、またはバッグ）をぴったりと収容する筐体、紙箱、チューブ等の運搬手段を備える。本発明のこのキットまたは医薬システムは、また、ALT-803の使用に関する説明書を備えていてもよい。
組換えタンパク質の発現
概して、本発明の融合タンパク質複合体（例えば、ALT-803の成分）の調整は、本明細書に開示する手順および認可された組換えDNA技術によって実施できる。
【０１０９】
概して、組換えポリペプチドは、適当な発現ビヒクルに含まれたポリペプチドをコードする核酸分子のすべてもしくはその一部またはその断片を使用して、適切な宿主細胞の形質転換により産生される。分子生物学分野の当業者には、多種多様な発現系のうちの任意のものを使用して組換えタンパク質を提供できることが理解されるであろう。使用される宿主細胞自体は、本発明にとって重要ではない。組換えポリペプチドは、実施的にどのような真核細胞宿主（Saccharomyces cerevisiae、昆虫細胞（例えば、Sf21細胞）または哺乳動物細胞（例えば、NIH 3T3細胞、HeLa細胞、COS細胞または好ましくは、CHO細胞）内でも産生可能である。このような細胞は、多種多様な供給源から調達できる（例えば、American Type Culture Collection（Rockland, Md）。また、Ausubel、外、Current Protocol in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1997年を参照されたい）。トランスフェクションの方法および発現ビヒクルの選択は、選択された宿主系に依存する。形質転換の方法は、例えば、Ausubel、外の上記文献に記載されている。発現ビヒクルは、例えばCloning Vectors: A Laboratory Manual（P. H. Pouwels、外、1985年, Supp. 1987）に提供されているものから選択してもよい。
【０１１０】
組換えポリペプチドの産生のための様々な発現系が存在する。このようなポリペプチド産生に有用な発現ベクターには、染色体ベクター、エピソームベクター、ウィルス由来のベクター（例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、パポバウイルス（例えばSV40）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス等のウイルス由来のもの）およびこれらの組み合わせに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
組換えポリペプチドが発現されれば、例えば、親和性クロマトグラフィーを使用して単離する。１つの例では、このポリペプチドに対する（例えば、本明細書に記載のように産生された）抗体をカラムに付着させ、組換えポリペプチドの単離に使用する。親和性クロマトグラフィーの前の、ポリペプチドを有する細胞の溶解と分別とは標準的な方法で実施可能である（Ausubel、外の上記文献を参照されたい）。単離の後、所望により、組換えタンパク質を高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製してもよい（例えば、Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier（1980年）を参照されたい）。
【０１１２】
本明細書では、本発明の生物活性ポリペプチドまたはエフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメインまたはその他の生物活性タンパク質（例えば酵素）等の因子を含んでいてもよい。また、生物活性ポリペプチドは、非タンパク質毒素、細胞毒性薬、化学療法剤、検出可能な標識、放射性物質、等の他の化合物との複合体を包含できる。
【０１１３】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響を及ぼして細胞免疫性の各種作用の何れかに関与する、細胞によって産生される何れかの因子によって定義される。サイトカインの例としては、IL-2ファミリー、インターフェロン（IFN）、IL-10、IL-1、IL-17、TGFおよびTNFサイトカインファミリー、ならびにIL-1からIL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α、およびTNFβが挙げられる、これらに限定されない。
【０１１４】
本発明の一態様では、第１の融合タンパク質はインターロイキン−１５（IL-15）ドメインまたはその機能的断片と共有結合されたる第１の生物活性ポリペプチドを含む。IL-15はＴ細胞の活性化および増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞の活性化および増殖に影響するIL-15活性は、ある意味ではIL-2と類似しているが、根本的な違いはよく特徴付けられている（Waldmann, T A, 2006年, Nature Rev. Immunol. 6:595-601）。
【０１１５】
本発明の別の態様では、第１の融合タンパク質はIL-15変異体（本明細書ではIL-15突然変異体とも呼ぶ）であるインターロイキン−１５（IL-15）ドメインを含む。IL-15変異体は、天然型（又は野生型）IL-15タンパク質とは異なったアミノ酸を含んでいることが好ましい。IL-15変異体はIL-15Rαポリペプチドと結合して、IL-15アゴニストまたはアンタゴニストとして機能することが好ましい。アゴニスト活性を伴うIL-15変異体は、スーパーアゴニスト活性を有することが好ましい。いくつかの実施形態では、IL-15変異体は、そのIL-15Rαとの関連とは関わりなく、IL-15アゴニストまたはアンタゴニストとして機能する。IL-15アゴニストは、野生型IL-15と比較して相当のまた増強された生物活性によって例示される。IL-15アンタゴニストは、野生型IL-15と比較して低下した生物活性で、または、IL-15介在応答を阻害する能力によって例示される。いくつかの例では、IL-15変異体は増強されたまたは低下した活性でIL-2/15RβγC受容体と結合する。いくつかの実施形態では、IL-15変異体の配列は、天然型IL-15配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば、置換または欠失を有していて、このような変化はIL-15アゴニストまたはアンタゴニスト活性をもたらす。アミノ酸置換／欠失が、IL-15Rβおよび／またはγCと相互作用するIL-15のドメイン内にあることが好ましい。アミノ酸置換／欠失がIL-15Rαポリペプチドとの結合またはIL-15変異体を産生する能力に影響を及ぼさないことがより好ましい。IL-15変異体を生成する適切なアミノ酸置換／欠失は、推定されるもしくは公知のIL-15構造に基づいて、または、公知構造を有するIL-2のような同族分子とIL-15との比較に基づいて、本明細書で提供されているような合理的なもしくは無作為的な突然変異生成および機能アッセイ、またはその他の実験方法によって識別できる。さらなる適切なアミノ酸置換は保存的または非保存的な変化および追加アミノ酸の挿入である。好ましくは、本発明のIL-15変異体が、成熟型ヒトIL-15配列の6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111または112位に１つまたは複数のアミノ酸置換／欠失を含む。具体的には、D8N（「D8」は天然型成熟ヒトIL-15配列のアミノ酸および残基位置を示し、「N」はIL-15変異体における上記位置で置換されたアミノ酸残基を示す）、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104PまたはQ108A置換はアンタゴニスト活性を有するIL-15変異体もたらし、N72D置換はアゴニスト活性を有するIL-15変異体をもたらす。
【０１１６】
サイトカインと同様に、ケモカインは、他の細胞に暴露されたときに細胞免疫の多数の作用の何れかに関与する任意の化学因子または分子と定義される。適切なケモカインとしては、CXC、CC、CおよびCX.sub.3Cケモカインファミリー、ならびに、CCL-1からCCL-28、CXC-1からCXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1、およびランテスがあるが、これらに限定されない。
【０１１７】
成長因子は、特定の細胞に暴露されると罹患細胞の増殖および／または分化を誘発する任意の分子を包含する。成長因子はタンパク質及び化学分子を包含し、そのいくつかは、GM-CSF、G-CSF、ヒト成長因子および幹細胞成長因子を包含する。その他の成長因子も、本明細書に記載の使用に適切であり得る。
【０１１８】
毒素又は細胞毒性薬は、細胞に暴露されたときに致死作用または生育阻害作用を有する任意の物質を包含する。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、ジフテリア毒素（DT）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（PE）、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、またはゲロニンのような、植物または細菌起源の細胞毒素であってよい。このような毒素の生物活性断片は当該技術分野において周知であって、例えば、DTA鎖およびリシンＡ鎖を包含する。さらには、毒素は、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）のような細胞表面で活性な薬剤であってよい。
【０１１９】
さらに、エフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メソトレキサート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、またはシスプラチンのような化学療法剤であってよい。
【０１２０】
また、エフェクター分子は診断または画像検討に適した検出可能な標識化分子であってもよい。このような標識は、ビオチンもしくはストレプタビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子もしくは結晶、酵素もしくはその触媒活性断片、蛍光標識（例えば、緑色蛍光タンパク質、FITC、フィコエリトリン、サイコム（cychome）、テキサスレッドもしくは量子ドット）、放射性核種（例えば、ヨウ素−131、イットリウム−90、レニウム−188、もしくはビスマス−212）、燐光性分子もしくは化学発光分子、または、PET、超音波もしくはMRIによって検出可能な標識（Gd系もしくは常磁性金属イオン系造影剤）を包含する。エフェクターまたはタグを含むタンパク質の産生と使用に関する開示としては、例えば、Moskaug、外、J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989)；Pastan, I.、外、Cell 47, 641, 1986; Pastan、外、Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992)；"Chimeric Toxins" OlsnesおよびPhil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982)；国際公開第94/29350号；国際公開第94/04689号；国際公開第2005／046449；および米国特許第5,620,939号を参照。
【０１２１】
共役結合したIL-15およびIL-15Rαドメインを包むタンパク質融合又は共役複合体には、いくつかの重要な用途がある。損傷または殺傷を受けやすい細胞または組織は、本明細書に開示されている方法で容易にアッセイできる。
【０１２２】
本発明のIL-15およびIL-15Rαポリペプチドは、天然由来のIL-15およびIL-15Rα分子（例えば、ヒト、マウスもしくはその他の齧歯動物、またはその他の哺乳動物のIL-15およびIL-15Rα分子とアミノ酸配列において適切に対応する。これらのポリペプチドおよびコードする核酸の配列は文献中で公知であって、ヒトインターロイキン１５（IL15）mRNA--GenBank：U14407.1（参照により本明細書に組み込まれる）、ハツカネズミ筋肉インターロイキン１５(IL15) mRNA--GenBank：U14332.1（参照により本明細書に組み込まれる）、ヒトインターロイキン−１５受容体α鎖前駆体(IL15RA) mRNA--GenBank：U31628.1（参照により本明細書に組み込まれる）、ハツカネズミ筋肉インターロイキン１５受容体、α鎖−GenBank：BC095982.1 （参照により本明細書に組み込まれる）を包含する。
【０１２３】
ある状況下では、本発明の多価体のタンパク質融合又は共役複合体を作製して、例えば、sc-TCRまたはsc-抗体の価を増加させることが有用でありえる。特に、融合タンパク質複合体のIL-15ドメインとIL-15Rαドメインとの間の相互作用は多価複合体を作製する手段を提供する。また、多価融合タンパク質は、例えば、標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識化技術を用いて１〜４つの（同一または異なる）タンパク質の間の共有結合又は非共有結合、または、ラテックスビーズのような適切な固体支持体への接合により作製できる。化学的に架橋した（例えば、ナノ粒子に架橋した）タンパク質も、適切な多価の種である。例えば、タンパク質は、修飾され得るタグ配列（例えば、ビオチン化BirA、またはCysもしくはHisのような化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基）をコードする配列を含むことにより修飾可能である。このようなアミノ酸タグまたは化学反応性アミノ酸は、融合タンパク質または抗体の様々な位置に配置されてもよいが、好ましくは、生物活性ポリペプチドまたはエフェクター分子の活性部位から遠位に配置されるのが好ましい。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ−末端を、タグまたそのような反応性アミノ酸を１つまたは複数含有している別の融合タンパク質と共有結合させることができる。２つ以上の融合タンパク質を適切なナノ粒子と化学的に結合させて多価の分子を得る目的で、適切な側鎖を包含させてもよい。例示的なナノ粒子は、リポソーム、コア−シェル粒子、または、タンパク質系粒子もしくはPLGA系粒子を包含する。
【０１２４】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質複合体のポリペプチドの一方または療法は、免疫グロブリンドメインを含む。あるいは、タンパク質結合ドメイン−IL-15融合タンパク質は、免疫グロブリンドメインとさらに結合されていてもよい。好ましい免疫グロブリンドメインは、別の免疫グロブリンドメインと相互作用して上で提供される多連鎖タンパク質を形成できる領域を含む。例えば、IgG1 CH2-CH3,のような、免疫グロブリン重鎖領域は、安定に相互作用してFc領域を作り出すことができる。Fcドメインを包含する好ましい免疫グロブリンドメインは、また、エフェクター機能（Fc受容体または相補タンパク質結合活性を含む）と糖化部位との少なくとも一方を有する領域を含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは突然変異を含み、この突然変異は、Fc受容体もしくは相補体の結合活性または糖化を低下または増大させて、得られたタンパク質の生物活性に影響を及ぼす。例えば、Fc受容体への結合を減少させる突然変異を含む免疫グロブリンドメインを、Fc受容体含有細胞への結合活性がより低い本発明の融合タンパク質複合体を生成するために用いることができ、これは特異抗原を認識または検出するように設計された試薬にとって有利である。
核酸およびベクター
本発明は、さらに、核酸配列を提供し、特に、本発明のタンパク質（例えば、ALT-803の成分）をコードするDNA配列を提供する。好ましくは、DNA配列は、染色体外複製に適したベクター（例えば、ファージ、ウィルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、またはエピソーム）によって担持されている。特に、所望の融合タンパク質をコードするDNAベクターを使用して、本明細書に記載されている調製方法を容易化し、有意量の融合タンパク質を得ることができる。DNA配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入できる。各種の宿主−ベクター系を用いて、タンパク質をコードする配列を発現することができる。これらは、ウィルスに感染した哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス等）；ウィルスに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウィルス）；酵母ベクターを含有している酵母、または、バクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNAで形質転換された細菌のような微生物を包含する。用いた宿主−ベクター系に応じて、多数の適切な転写要素および翻訳要素のうちの任意の１つを用いることができる。上記のSambrook、外、および、上記のAusubel、外を参照されたい。
【０１２５】
本発明には、可溶性融合タンパク質複合体を作製する方法が含まれる。この方法は、本明細書に記載されている第１および第２の融合タンパク質をコードするDNAベクターを宿主細胞に導入する工程と、細胞または培地中に融合タンパク質を発現するのに十分で、且つ、第１の融合タンパク質のIL-15ドメインと第２の融合タンパク質の可溶性IL-15Rαドメインの間を連合させて可溶性融合タンパク質複合体を形成させるのに十分な条件下で、宿主細胞を培養し、可溶性融合タンパク質複合体を宿主細胞または培地から精製する工程とを含んでいる。
【０１２６】
概して、発明に係る好ましいDNAベクターは、リン酸ジエステル結合によって結合しているヌクレオチド配列を含有し、このリン酸ジエステル結合は、５’から３’方向に、生物活性ポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列を導入するための、エフェクター分子をコードする配列と操作可能に結合する第１クローニング部位を含有している。
【０１２７】
DNAベクターによりコードされる融合タンパク質成分はカセット形式で提供されてもよい。用語「カセット」とは、標準的な組換え方法で各成分を別の成分に容易に置き換えることができることを意味する。特に、カセット形式に構成されたDNAベクターは、コードされた融合複合体を、血清型を有しているかまたは発生させる能力を有している病原体に対して用いる場合に特に望ましい。
【０１２８】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作製するには、適切なリガーゼを用いて、生物活性ポリペプチドをコードする配列をエフェクターペプチドをコードする配列に結合する。提示されるペプチドをコードするDNAは、天然の供給源（例えば、適切な細胞株）からDNAを単離して、または公知の合成方法（例えば、リン酸トリエステル法）によって得ることができる。例えば、Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed., 1984年)を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドも、市販の自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて製造することができる。単離後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または当該技術分野で公知のその他の手段により、生物活性ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅できる。生物活性ポリペプチド遺伝子を増幅するのに適切なPCRプライマーにより、PCR産物に制限部位が添加されてもよい。好ましくは、PCR産物は、エフェクターペプチド用のスプライス部位と、生物活性ポリペプチド−エフェクター融合複合体の適切な発現および分泌に必要なリーダー配列とを含んでいる。PCR産物が、リンカー配列をコードする配列、または、このような配列のライゲーションのための制限酵素部位を包含していることも好ましい。
【０１２９】
本明細書に記載されている融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって産生されることが好ましい。例えば、生物活性ポリペプチドをコードするDNA分子を単離後、配列をエフェクターポリペプチドをコードする別のDNA分子にライゲート（結合）することができる。生物活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、エフェクターペプチドをコードするDNA配列に直接結合してもよいし、または、より典型的には、生物活性ポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列との間に、本明細書で検討されたようなリンカー配列をコードするDNA配列を介在させて、適切なリガーゼを用いて結合させてもよい。得られるハイブリッドDNA分子を適切な宿主細胞内で発現させて、融合タンパク質複合体を産生できる。DNA分子を５’から３’方向に互いにライゲートして、ライゲーション後にコードされるポリペプチドの翻訳フレームが変化しないようにする（すなわち、DNA分子をフレーム中で互いにライゲートする）。得られるＤＮＡ分子はインフレーム融合タンパク質をコードする。
【０１３０】
その他のヌクレオチド配列が、遺伝子構築物に含まれていてもよい。例えば、エフェクターペプチドと融合した生物活性ポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、または、融合タンパク質を細胞表面又は培養培地に誘導するリーダー配列を構築物に含有させてもよいし、構築物が挿入されている発現ベクター中に存在させてもよい。免疫グロブリンまたはCMVプロモータが特に好ましい。
【０１３１】
変異生物活性ポリペプチド、IL-15、または、Fcドメインをコードする配列を得るときに、当業者は生物活性の損失又は低下を伴わずに、ある特定のアミノ酸置換、付加、欠失および翻訳後修飾によってポリペプチドを修飾できることを認識するであろう。特に、保存アミノ酸置換は周知である。すなわち、１つのアミノ酸の、類似した大きさ、電荷、極性および構造のアミノ酸での置換は、タンパク質機能を有意に変化させる可能性が少ない。タンパク質の構成要素である２０の標準アミノ酸は、以下のような保存アミノ酸の４群に大まかに分類できる：非極性（疎水性）グループは、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンを包む；極性（非電荷、中性）グループは、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニンおよびチロシンを包む；正の電荷をもつ（塩基性）グループは、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンを含む；及び負の電荷をもつ（酸性）グループはアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。タンパク質における１つのアミノ酸の同じグループの別のアミノ酸との置換は、タンパク質の生物活性に悪影響を及ぼしにくい。別の例では、アミノ酸位置を改変することにより、タンパク質の生物活性を低下または増強させることができる。このような変化は、不規則に、または、１つ以上の標的残基の公知のもしくは予測される構造的もしくは機能的特性に基づくに部位特異的突然変異を介して導入できる。変異タンパク質の発現の後に、上記改変に起因する生物活性の変化を結合アッセイまたは機能アッセイを用いて容易に評価できる。
【０１３２】
ヌクレオチド配列間の相同性は、DNAハイブリダイゼーション分析によって判定でき、ここで２本鎖DNAハイブリッドの安定性は生じる塩基対の程度に依存している。高温および／または低塩含量の条件はハイブリッドの安定性を低下させ、そして選択された相同性程度よりも相同性が低い配列のアニーリングを防止するように変化させることができる。例えば、約55％のＧ−Ｃ含量を有する配列については、40〜50℃、６×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液）および0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、約60〜70％の相同性を示し、50〜65℃、１×SSC、および0.1％SDSのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、約82〜97％の相同性を示し、そして、５２℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、約99〜100％の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較する（及び相同性の程度を測定する）ための広範囲のコンピュータプログラムも利用可能で、市販及び無料ソフトウェアの両方の供給者のリストが、Ausbel、外(1999年)に記載されている。 利用が簡単な配列比較および複数の多重配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul、外、1997年)およびClustalW programsである。BLASTは、WWW上の「ncbi.nlm.nih.gov」で入手可能であり、ClastalWのバージョンは、「2.ebi.ac.uk」で入手可能である。
【０１３３】
融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を果たすことができる限りにおいて、ほとんど任意の順序で構成することができる。例えば、ある実施形態では、生物活性ポリペプチドはエフェクター分子のＣ末端またはＮ末端に位置付けられる。
【０１３４】
本発明の好ましいエフェクター分子は、これらのドメインに意図される機能に資する大きさを有するであろう。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋方法を含む多様な方法によって作製し、生物活性ポリペプチドと融合させることができる。例えば、Means, G. E.およびFeeney, R. E. (1974年) in Chemical Modification of Proteins, Holden-Dayを参照されたい。また、S. S. Wong (1991年) in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Pressも参照されたい。しかしながら、組換え操作を用いてインフレーム融合タンパク質を作製することが概して好ましい。
【０１３５】
上述のように、本発明による融合分子又は共役分子は、いくつかの方法で構成可能である。例示的な構成では、生物活性ポリペプチドのＣ−末端がエフェクター分子のＮ末端に操作可能に結合される。この結合は所望により組換え方法で実現できる。しかしながら、別の構造では、生物活性ポリペプチドのＮ−末端がエフェクター分子のＣ末端に結合される。
【０１３６】
あるいはまたはこれに加えて、必要に応じて、１つまた複数の追加エフェクター分子を生物活性ポリペプチドまたは共役複合体に挿入することができる。
ベクターおよび発現
ALT-803を発現するために多数の戦略を用いることができる。例えば、ALT-803をコードする構築物を、制限酵素を使用して適切なベクターに組み込んで、そのベクターに切れ目を形成して構築物を挿入し、その後ライゲーションを行ってもよい。そして、遺伝子構築物を含むベクターを、適切な宿主に導入して、融合タンパク質を発現する。概要については、上記のSambrook、外を参照されたい。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは用いられている宿主に適合し、そしてこれに適したレプリコンを有していなければならない。ベクターは、発現しようとする融合タンパク質複合体をコードするDNA配列を収容できなければならない。適切な宿主細胞としては、真核細胞および原核細胞が含まれるが、容易に形質転換できて培養培地中で迅速な成長を示すものが好ましい。具体的に好ましい宿主細胞としては、E. coli, Bacillus subtillus等の原核生物、および、動物細胞ならびに酵母株（例えば、S. cerevisiae）のような真核細胞が挙げられる。哺乳動物の細胞、特にJ558、NSO、SP2-OまたはCHOが一般に好ましい。その他の適切な宿主としては、例えば、Sf9のような昆虫細胞がある。従来の培養条件が用いられる。上記のSambrookを参照されたい。次いで、安定的に形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞株を選択できる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞は、公知の手順によって確認できる。例えば、免疫グロブリンに結合している融合タンパク質複合体の発現は、結合した免疫グロブリンに特異的なELISAおよび／または免疫ブロット法によって確認できる。IL-15ドメインまたはIL-15Rαドメインに結合した生物活性ポリペプチドを含有する融合タンパク質の発現を検出するためのその他の方法は、実施例に開示される。
【０１３７】
上記で概説したように、宿主細宿は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を繁殖させるための予備的目的で用いることができる。したがって、宿主細胞は、その内部において融合タンパク質の産生が具体的に意図される原核細胞または真核細胞を包含し得る。よって、宿主細胞は、具体的に、酵母細胞、ハエ細胞、蠕虫細胞、植物細胞、カエル細胞、哺乳動物細胞、および融合体をコードする核酸を繁殖させる器官を包含する。使用可能な哺乳動物細胞の非限定的な例としては、CHO dhfr細胞（UrlaubおよびChasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216（1980年））、293細胞（Graham、外、J Gen. Virol., 36:59 （1977年））または SP2またはNSOのような骨髄腫細胞（GalfreおよびMilstein、Meth. Enzymol., 73(B):3 (1981年)）が挙げられる。
【０１３８】
所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を繁殖させる能力を有する宿主細胞は、非哺乳動物の真核細胞も包含する。そのような細胞としては、昆虫（例えば、Sp. frugiperda）細胞、酵母（S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris., K. lactis, H. polymorpha；概要については、Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992年)に記載）細胞、菌類および植物細胞が挙げられる。E. coli and Bacillusのようなある種の原核生物も想定される。
【０１３９】
所望の融合タンパク質をコードする核酸は、標準的な細胞トランスフェクション技術で、宿主細胞に導入可能である。用語「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」は、核酸を宿主細胞内へ導入する全ての従来技術を包含することを意図している。そのような従来技術には、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウィルス形質導入および／または組込みが含まれる。宿主細胞をトランスフェクトする適切な方法は、上記のSambrook、外、およびその他の実験用教科書に記載されている。
【０１４０】
本発明では、各種のプロモーター（転写開始調節領域）を用いることができる。適切なプロモーターは、提案された発現宿主に依存して選択される。異種起源由来のプロモーターは、それらが選択された宿主内で機能する限りにおいて、使用可能である。
【０１４１】
プロモーター選択も、ペプチド又はタンパク質産生の望ましい効率およびレベルに依存している。tacのような誘導可能なプロモーターは、E. coliにおいてタンパク質発現のレベルを劇的に上昇させる目的でよく用いられる。タンパク質の過剰発現は宿主細胞に害を及ぼし得る。よって、宿主細胞生育を制限してもよい。誘導可能なプロモーター系の使用によって、遺伝子発現の誘導よりも前に宿主細胞が受容可能な密度に培養されるので、より高い産物収率が容易になる。
【０１４２】
本発明では、各種のシグナル配列を用いることができる。生物活性ポリペプチドをコードする配列と同族のシグナル配列を用いることができる。あるいは、発現宿主における効率的な分泌および処理のために選択または設計されたシグナル配列を用いることができる。例えば、適切なシグナル配列／宿主細胞の組み合わせは、B. subtilis中に分泌するためのB. subtilis sacBシグナル配列、および、Saccharomyces cerevisiae α−交配因子又はP. pastoris分泌のためのP. pastoris酸ホスファターゼphoIシグナル配列を包含する。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列を介してまたは通常１０未満のコドンからなる短いヌクレオチド架橋を介して、タンパク質をコードする配列に直接結合してもよく、ここでこの架橋は下流のタンパク質配列の正確なリーディングフレームを保証する。
【０１４３】
転写および翻訳を増強する要素は、真核タンパク質発現系に対して確認されている。例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）プロモーター1000bpを異種プロモーターのどちらかの側に位置づけることにより、植物細胞における転写レベルを10〜400倍まで上昇させ得る。発現構築物は、また、適切な翻訳開始配列を包含するべきである。発現構築物を改変して、適切な翻訳開始のためにコザックコンセンサス配列を包含させることにより、翻訳のレベルを１０倍まで上昇させ得る。
【０１４４】
発現構築物の一部であってもよいし、発現構築物とは別個であってもよい選択マーカーがよく用いられる（例えば、マーカーは、発現ベクターにより運ばれる）。このマーカーを目的の遺伝子とは異なる部位に組み込んでもよい。例としては、抗生物質に対して耐性をもたらすマーカー（例えば、blaはE. coli宿主細胞にアンピリシンに対する抵抗をもたらし、nptIIは各種の原核細胞および真核細胞にカナマイシン耐性をもたらす）か、または、最少栄養培地での宿主の成長を可能にするマーカー（例えば、HIS4はP. pastoris or His- S.のヒスチジン不在での成長を可能にする）が挙げられる。選択可能なマーカーは、そのマーカーの他に依存しない発現を可能にするそれ自体の転写および複写開始領域および終止調節領域を有している。マーカーとして抗生物質耐性を用いる場合、選択用の抗生物質の濃度を抗生物質に応じて、概して培地１ｍＬあたり抗生物質１０〜６００μｇの範囲で、変化させる。
【０１４５】
発現構築物は、公知の組換えDNA技術を用いて構成される（Sambrook、外、1989年; Ausubel、外、1999年）。制限酵素消化およびライゲーションは、DNAの２つの断片を結合するために用いられる基本的な工程である。DNA断片の末端はライゲーションの前に改変を必要とすることがあり、これは突出部に埋めること、ヌクレアーゼ（例えば、ExoIII）で断片の末端部分を欠失すること、部位特異的突然変異、またはPCRで新たな塩基対を加えることによって達成できる。選択された断片の結合を促進するために、ポリリンカーおよびアダプターを用いることができる。典型的には、発現構築物は、E. coliの制限と、ライゲーションと、形質転換とを連続させて、階的に構成化される。発現構築物の構築に適した多数のクローニングベクターは当該技術分野において公知であって（λΖΑΡおよびpBLUESCRIPT SK-1, （Stratagene社、La Jolla, CA）、pET（Novagen Inc.、Madison, WI）、Ausubel、外（1999年）に引用）、特定の選択は本発明に重要ではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物の宿主細胞内への導入のために選択された遺伝子導入系に影響されるであろう。各段階の終わりに、得られた構築物を、制限、DNA配列、ハイブリダイゼーションおよびPCR分析によって分析してもよい。
【０１４６】
発現構築物は、宿主内で線状または環状の何れかのクローニングベクターとして形質転換してもよいし、クローニングベクターからの除去後そのまま用いてもよいし、送達ベクター上に導入してもよい。送達ベクターは、選択された宿主細胞型中への発現構築物の導入および保持を容易化する。発現構築物は、多数の公知の遺伝子導入システム（例えば、自然の受容能力、化学的媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、遺伝子銃形質転換、トランスフェクション、または接合）（Ausubel、外、1999年；Sambrook、外、1989年）のうちの任意のものよって宿主細胞内へ導入される。遺伝子導入システムは、用いられた宿主細胞およびベクター系に応じて選択される。
【０１４７】
例えば、発現構築物を、プロトプラスト形質転換またはエレクトロポレーションによって S. cerevisiae細胞内に導入することができる。S. cerevisiaeのエレクトロポレーションは容易に達成されて、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率を生じる。
【０１４８】
本発明は、さらに、目的の融合タンパク質を単離するための製造工程を提供する。この工程では、調節配列と操作可能に結合された目的のタンパク質をコードする核酸がその中に導入された、宿主細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、細菌細胞または動物細胞）を培養倍地中で生産規模で生育させて目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する。続いて、採取した宿主細胞または培養培地から目的の融合タンパク質を単離する。培地または採取した細胞から目的のタンパク質を単離する際には、標準的なタンパク質精製技術を用いることができる。具体的には、精製技術は、回転ボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクターまたは発酵槽を含む各種の実施手段から、大規模で（すなわち、少なくともミリグラム量で）所望の融合タンパク質を発現および精製するために用いることができる。
【０１４９】
発現されたタンパク質融合複合体は、公知の方法で単離および精製できる。典型的には、培養培地を遠心分離またはろ過し、次いで上澄液を親和性または免役親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーもしくは発現された融合複合体に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免役親和性プロトコル）により精製する。本発明の融合タンパク質は、公知技術の適切な組合わせによって分離および精製できる。これらの方法は、例えば、塩析および溶媒沈殿のような溶解性を利用する方法；透析、限外ろ過、ゲルろ過、およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法；イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーのような特異的な親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、および等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、Ni-NTAのような金属親和性カラムを包含する。これらの方法に関する開示としては、上記のSambrook、外、およびAusubel、外の全般を参照されたい。
【０１５０】
本発明の融合タンパク質が実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質が少なくとも80％、または90％〜95％の均質性（w/w）であるように、融合タンパク質が細胞に自然に付随している細胞置換分から単離されていることが好ましい。少なくとも98％〜99％の均質性（w/w）を有している融合タンパク質が、多くの医薬、臨床および研究での適用に最も好ましい。実質的な精製後には、融合タンパク質は、治療適用における夾雑物を実質的に含まない状態であるべきである。部分的にまたは実質的純粋にまで精製されると、可溶性融合タンパク質を治療的に、または本明細書に記載されているようなインビトロ又はインビボでのアッセイの実施に用いることができる。実質的な純度はクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動のような各種標準技術によって判定できる。
【０１５１】
本発明の融合タンパク質複合体は、癌性であるもしくは感染している、または１つまたは複数の病気に感染する虞のある各種細胞を用いるインビトロまたはインビボでの使用に適している。
【０１５２】
ヒトインターロイキン−１５（hIL-15）は、抗原提示細胞上に発現されたヒトIL-15受容体α鎖（hIL-15Rα）によって、免疫エフェクター細胞にトランス提示されている。IL-15Rαは、主に細胞外sushiドメイン（IL-15RαSu）を介して、高い親和性（38 pM）でhIL-15に結合する。本明細書に記載のように、IL-15ドメインおよびIL-15RαSuドメインは、可溶性複合体（例えば、ALT-803）を生成させるために使用可能であり、または、複数ドメイン融合複合体を構築するための骨格（スカフォールド）として使用可能である。
【０１５３】
IgGドメイン、特にFc断片は、承認済み生物製剤を含む多数の治療用分子のための二量体のスカフォールドとして成功裏に用いられている。例えば、エタネルセプトは、ヒトIgG1のFcドメインに結合した可溶性ヒトp75腫瘍壊死因子−α（TNF-α）受容体（sTNFR）の二量体である。この二量体化により、エタネルセプトによるTNF-α活性の阻害は、一量体のsTNFRよりも1,000倍にまで強力となり、そして一量体形態より５倍長い血清中半減期を有する融合体を提供する。結果的に、エタネルセプトはインビボにおけるTNF-αの炎症誘発活性を中和するとともに、多数の異なる自己免疫適応症について患者の転帰を改善するのに効果的である。
【０１５４】
その二量体化活性に加えて、Fc断片は、天然のキラー（NK）細胞、好中球、単球細胞、食細胞および樹状細胞上に提示されるFcγ受容体との相補活性及び相互作用を介して、細胞毒性エフェクター機能ももたらす。抗癌治療用抗体およびその他の抗体ドメイン−Fc融合タンパク質との関連では、これらの活性は、動物の腫瘍モデルおよび癌患者において観察された効能に重要な役割を果たしているようである。しかし、これらの細胞傷害性エフェクターの応答は多くの治療適用において十分ではないかもしれない。したがって、Fcドメインのエフェクター活性を改善ならびに拡張すること、および、疾患部位のＮＫ細胞およびＴ細胞活性を含む細胞溶解性免疫応答の活性または動員を免疫療法分子を介して増強する他の方法を開発することに高い関心が寄せられている。
【０１５５】
ヒト由来免疫刺激性薬剤を開発する取り組みにおいて、ヒトIL-15（hIL-15）およびIL-15受容体ドメインが使用された。   hIL-15は、高い結合親和性（平衡解離定数（KD）〜10−11M）でhIL-15受容体α鎖（hIL-15Rα）と結合するサイトカインの短い４本α螺旋束ファミリーの一員である。得られる複合体を、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の表面に表示されたヒトIL-2/15受容体β共通γ鎖（hIL-15RβγC）複合体にトランス提示する。このサイトカイン／受容体相互作用は、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の拡張および活性化を引き起こし、これがウィルス感染細胞および悪性腫瘍細胞を根絶するために重要な役割を果す。正常には、hIL-15およびhIL-15Rαは樹状細胞内で同時に産生されて細胞内で複合体を形成し、これは続いて分泌されて細胞表面上にヘテロ二量体として提示される。いくつかの研究では、IL-15/IL-15Rα複合体が細胞表面を切開し、可溶性機能性形態として放出されることが示唆された。したがって、hIL-15とhIL-15Rαとの相互作用の特徴は、これらの鎖間結合ドメインが、ヒト由来免疫刺激性複合体として、および、標的特異性結合可能な可溶性二量体分子を産生するスカフォールドとして働く可能性を有することを示唆している。
【０１５６】
本発明の実施においては、特に明示のない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術が使用される。これらの技術は、当業者の認識範囲において公知である。このような技術は、次のような文献に十分に説明されている。“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989年); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984年); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987年); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996年); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987年); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987年); “PCR:The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994年)；“Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991年)。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であり、したがって、本発明の作製と実施において考慮されてもよい。特定の実施形態に特に有用な技術を、次の章で検討する。
【０１５７】
以下の実施例は、当業者に完全な開示および本発明のアッセイ、スクリーニングならびに治療方法をいかに作製および使用するかの説明を提供する目的で記載される。以下の実施例は、本願発明者らが本発明とみなしている事項の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１５８】
実施例１：材料および方法
マウスおよび骨髄移植（BMT）
メスのC57BL/6（B6, H-2Kb）マウス、Balb/c（H-2Kd）マウス、B6CBAF1（H-2Kb/k）マウス、CB6F1（H-2Kb/d）マウスおよびB6D2F1（H2Kb/d）マウスを、Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から入手した。BMT実験で使用したマウスの週齢は、10〜12週であった。BMTプロトコルは、Thomas Jefferson Universityのthe Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)に承認された。
【０１５９】
骨髄（BM）細胞を大腿骨および脛骨から無菌的に取り出し、抗Thy 1.2抗体を使用して4℃で30分間培養を行うことによりＴ細胞を除去（TCD）した。その後、Low-TOX-Mウサギ補体（Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada）を使用して37℃で40分間培養を行った。あるいは、抗CD5磁気ビーズの枯渇（Miltenyi, Auburn, CA）を介して培養を行った。補体除去の後の汚染Ｔ細胞の典型的なレベルは、全骨髄白血球の0.2％以上0.5％以下であった。
【０１６０】
磁気ビーズ（Miltenyi, Auburn, CA）に結合した抗CD5抗体を使用した正の選択により、脾臓Ｔ細胞を得た。いくつかの場合では、CD4+Ｔ細胞集団およびCD8+Ｔ細胞集団を、それぞれ独立して分離した（Miltenyi, Auburn, CA）。細胞（脾臓Ｔ細胞を含むまたは含まない5x106 BM細胞）をDulbecco Modified Eagle’s Medium (DMEM)中に懸濁させ、０日目に致死線量照射を受けたレシピエントに尾静脈内注入により移植した（全量は0.25ml）。０日目には移植よりも前に、レシピエントは、137Cs線源から合計11〜13Gyの全身照射（株依存）を受けた。胃腸毒性を抑制するために、照射は３時間の間隔を空けて分割して行った。マウスは殺菌済みマイクロアイソレータケージに収容し、通常の飼料と加圧滅菌された高濃度塩素含有の飲用水（pH3.0）を与えた。
細胞株、抗体およびサイトカイン
P-815（H-2d）細胞株を、ATCC（Manassas, VA）から入手した。Marcel van den Brink博士（Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY）から、レトロウイルス形質導入により、単純ヘルペスウイルスサイミジンキナーゼ、高度緑色蛍光タンパク質（eGFP）、およびホタルルシフェラーゼ（TGL）からなる三重融合タンパク質を発現したA20（H-2d）マウスリンパ腫細胞株の提供を受けた。5％のCO2含有雰囲気で、10% FBS含有RPMI中で細胞を培養した。
【０１６１】
抗ネズミCD16/CD32 FcR block（2.4G2）およびネズミ抗原に対する以下の蛍光色素標識抗体のすべてをBD Pharmingen（San Diego, CA）から入手した：H2Kd (SF1-1.1)、CD3 (500A2)、CD4 (RM4-5)、CD8 (53-6.7)、CD25 (PC61)、CD44 (IM7)、CD45R/B220 (RA3-6B2)、CD62L (MEL-14)、NK1.1 (PK136)、TNF-α (MP6-XT22)、IFN-γ (XMG1.2)、NK2GD、isotype controls；rat IgG2a-κ、rat IgG1-κ hamster、およびIgG1-κ。
【０１６２】
ALT-803は、Altor BioScience Corporation（Miramar, Florida）により生成された。ALT-803は、１日あたり1〜5μgの量を腹腔内に毎週投与した。
フローサイトメトリー
25μLあたり106個の細胞を含む単一細胞懸濁液を、CD16/CD32 FcR blockを使用して4℃で培養した。次いで、細胞を合計50μlの抗体を使用して、4℃で培養した。染色された細胞を、CellQuestソフトウェアを使用したFACS Caliburフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）で、または、FlowJoソフトウェア（Treestar, San Carlos, CA）を使用したLSRIIフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）で分析した。
移植片対宿主疾患の評価
GVHDの重篤度を、上記の臨床的GVHDスコアリングシステムを使用して評価した（Cooke, K.R.、外、Blood, 1996年. 88(8): p. 3230-9）。簡単に説明すると、コードされたケージ内の耳パンチをしたマウスを一匹ずつ、０から２までの段階に基づく５つの臨床パラメータ（具体的には、体重の減少、姿勢、移動性、被毛および皮膚）を使用してスコア付けを行った。５つの評価スコアの合計（0〜10）により、臨床的GVHD指標を作成した。生存の監視は毎日行った。スコアが５以上のマウスを、瀕死であると見なし、致死させた。
PMA−イオノマイシン刺激および細胞内染色
PMA（20 ng/mL）およびイオノマイシン（1 μM）を使用して、脾細胞を５時間培養した。PMAおよびイオノマイシンの添加の２時間後に、濃度10 μg/mLのブレフェルディンAを添加した。最初に細胞を表面抗体で染色した後、固定して、BD Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences, San Diego, CA)を用いて透過化処理した。次に、細胞を細胞内抗体で染色した。
CFSE標識
細胞を上記（Lyons, A.B.およびC.R. Parish、Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods, 1994年. 171(1): p. 131-7）のカルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識した。簡単に説明すると、脾細胞を、最終濃度2.5μMのCFSEを使用して、PBS中で37℃で20分間培養した。その後、静脈内注射の前に、細胞をPBSで３回洗浄した。
統計
グラフに示されたすべての値は、平均の±SEMを表わす。生存データは、Mantel-Coxログランク検定を利用して分析した。その他のすべての分析では、ノンパラメトリック非対のマン・ホイットニーのＵ検定を利用した。
【実施例２】
【０１６３】
実施例２：HSCT後の、ALT-803の免疫細胞に対する作用
まず、ALT-803の作用を、Ｔ細胞除去モデルにおいて評価した。致死線量の照射を受けたBALB/cレシピエントに、B6マウスからＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。移植後17日目と24日目に、ALT-803を腹腔内（i.p.）注射で２回投与により投与した。マウスを移植後28日目に致死させた。すべてのレシピエントで、脾臓とBMにおける生着は90％を超えていた。脾臓およびBMの生着と細胞充実性については、ALT-803投与群と対照群の間で有意な差はなかった。ALT-803の投与により、CD8+Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数が大幅に増加したが、CD4+Ｔ細胞の数には変化がなかった（図１Ａ）。マウスを同じ投与量とスケジュールで処置したB6CBA→CB6F1移植モデルにおいて、同様の活性が観察された（図１Ｂ）。ALT-803は、CD8+による細胞内でのIFN-γ分泌も増大させたが、このモデルではCD4+Ｔ細胞ではそうではなかった（図１Ｃ）。
【０１６４】
次に、ALT-803がCD4+ならびにCD8+未投与(CD44low)Ｔ細胞集団および記憶(CD44high)Ｔ細胞集団に及ぼす作用を評価した。ここでも、レシピエントは、HSCT後28日目、35日目、42日目に、1μｇのALT-803の腹腔内投与を受けた。(B6→CB6F1)。ALT-803の投与は、CD8+記憶／エフェクターＴ細胞集団を概ね増加させた、CD4+記憶Ｔ細胞集団と未投与Ｔ細胞集団とには何らの活性も見られなかった。CD8+未投与Ｔ細胞も、ALT-803投与群と未投与群の両方において、影響を受けないままであった（図２Ａ）。リンパ球上のその他の活性化マーカーも評価した。CD8+Ｔ細胞において、NKG2D発現が10倍に増加したことが識別された。これは、CD8+Ｔ細胞の一部が、ALT-803への暴露の後、自然様表現型を有するエフェクター／細胞障害性リンパ球（図２Ｂ）に変化したことを示唆する。HSCT後にALT-803が免疫細胞に及ぼすこれらの作用は、以前の臨床試験で観察された変化（Wong, H.C.、E.K. Jeng、およびP.R. Rhode、Oncoimmunology, 2013. 2(11): p. e26442）に類似している。表面CD107a発現における大きな変化は、CD4+Ｔ細胞においてもCD8+Ｔ細胞においても認められなかった。これは、腫瘍に対する細胞溶解パーフォリン／グランザイム経路の脱果粒のマーカーである。
【０１６５】
B6マウスから致死線量照射を受けたB6D2F1レシピエントマウスに養子移入されたCFSE標識脾細胞に、ALT-803が及ぼす作用を評価した。CFSE標識Ｔ細胞輸注の同種レシピエントにおいて、ALT-803治療は、活発なIFN-γおよびTNF-αの分泌と連携して、増殖の遅いCD8+Ｔ細胞の増殖を具体的に促進した。しかし、CD4+Ｔ細胞の増殖については、ALT-803の作用は認められなかった（図３Ａおよび図３Ｂ）。これまでの実験では、IL-15投与後の、CD8+Ｔ細胞によるTNF-α分泌に大幅な増加は認められなかった（Sauter, C.T.、外、Bone Marrow Transplant, 2013年. 48(9): p. 1237-42）。これは、インビボでのCD8+Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌の誘発について、ALT-803は天然型IL-15よりも強力であることを示唆している。次に、ALT-803活性を、CFSE標識Ｔ細胞輸注の同系レシピエントにおいて評価した。ここでも、ALT-803は、養子移入されたCD8+Ｔ細胞において増殖とIFN-γ分泌とを増大させたが、それらのTNF-α分泌を増加させることはなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、さらに、同系ではなくむしろ同種のＴ細胞移入状況でのTCR-MHC係合のような追加の刺激性シグナルが、ALT-803刺激によるTNF-α分泌の誘発に必要である可能性を示唆している。
【実施例３】
【０１６６】
実施例３：マウス腫瘍モデルにおけるALT-803の抗腫瘍活性
次に、ALT-803の抗腫瘍活性を、マウス肥満細胞腫（P815）およびマウスB細胞リンパ腫（A20）の２種類の腫瘍モデルで検証した。まず、ALT-803の抗腫瘍活性を、Ｔ細胞を投与しないP815モデルで評価した。Ｔ細胞輸注をせずにALT-803を投与すると、parent-F1モデルにおけるP815レシピエントに有意な移植片対腫瘍（GVT）活性は検出されなかった。B6→B6D2F1モデルに少量のＴ細胞輸注を行うと、ALT-803の投与が、5x104個と1x105個という２つの異なるＴ細胞投与量において、P815腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を増強させることがわかった（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの実験では、GVHDの兆候は観察されなかった。すべてのマウスが、後ろ脚の麻痺を伴う腫瘍の発生、または、剖検で認められた腫瘍転移が原因で死亡した。したがって、P815モデルに、Ｔ細胞輸注とともにALT-803を投与することにより、対照と比較して、腫瘍マウスに大幅な生存率改善をもたらした。
【０１６７】
A20マウスリンパ腫モデルでは、Ｔ細胞輸注を行ったまたは行わない同種HSCTのレシピエントにおいて、A20細胞に対する抗リンパ腫活性を評価した。A20細胞は、van den Brink博士の研究室（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY）から提供を受けた。A20細胞は、生物発光イメージング（BLI）により腫瘍成長の検出を可能とするルシフェラーゼ活性を有する３重遺伝子構築物を発現する。まず、A20マウス腫瘍モデルを作製した。B6CBAF1→CB6F1（MHC-不適合）モデルでは、1×105個のドナーＴ細胞の輸注により、大幅な抗腫瘍活性と生存率改善とがもたらされた。したがって、CB6F1マウスは致死線量の照射を受け、1×105個のＴ細胞とともにB6CBAF1 BM細胞が移植された。すべてのマウスには、BM移植と同じ日にA20腫瘍細胞が与えられた。ALT-803投与群のすべてのマウスは生存した。これは、対照群と比較して統計学的に有意である（図４Ｃ）。
【０１６８】
次に、A20モデルにおいてＴ細胞輸注を一切行わず、同種HSCTレシピエントでのALT-803の抗リンパ腫／白血病活性を調査した。ALT-803の投与量および投与経路は、上記したものと同じである。腫瘍の成長の判定は、IVIS生物発光システムを使用した光子強度測定によって行った（図５Ａおよび図５Ｂ）。ALT-803の２回の投与がインビボでのA20細胞の成長を遅らせることができることは観察されたが、ALT-803投与により遅延された腫瘍の成長が、ALT-803群と対照群との間の生存の差異をもたらすことはなかった（図５Ｃ）。ALT-803は、Ｔ細胞輸注がなくても、A20リンパ腫細胞に対する抗腫瘍活性を好適に生成可能である。
【０１６９】
これらの実験結果を総合すると、ALT-803は、マウスHSCTにおいて、エフェクター／記憶CD8+Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を効果的に促進し、これらの細胞のエフェクター機能を強力に増強することによって、抗リンパ腫／白血病活性を大幅に増大させることが示されている。
【実施例４】
【０１７０】
実施例４：ALT-803は、ドナー白血球輸注(DLI)により抗腫瘍活性を増大させる
DLIは、同種HSCTの後のGVTの作用を増大させることによる、再発管理のための戦略として開発されてきた（Kolb, H.J.、外、Blood, 1990年. 76(12): p. 2462-5）。DLIは、同種HSCTが実施される悪性血液疾患のほとんどすべてにおいて使用される。しかし、DLIに対する応答は、細胞収集方法、タイミング、輸注される細胞投与量、さらには使用される細胞サブタイプについて変動する（Tomblyn, M. およびH.M. Lazarus, Bone marrow transplantation, 2008年. 42(9): p. 569-79での見解）。DLIの効能の強化が、同種HSCTの後の再発患者の転帰を改善することが想定される。そのため、動物モデルにおいてALT-803がDLIの効能を増強できるか否かを試験した。この目的のために、同種HSCTのレシピエントでDLIモデルを作製した。致死線量の照射を受けたCB6F1レシピエントに、Ｔ細胞除去B6BM細胞を移植した。移植と同日に、A20マウスリンパ腫細胞を輸注した。同種HSCTのレシピエント体内での腫瘍の成長の後、精製したＴ細胞を輸注した。中程度投与量のＴ細胞輸注（2.5×105細胞）により、同種HSCTのレシピエント体内で、腫瘍の成長の後のGVL活性がもたらされた。ALT-803投与群では、未処置群と比較して、移植後により良好な生存と抑制された体重減少が認められた（図６Ｂおよび図６Ｂ）。また、すべてのマウスについて、BLIを使用して腫瘍の成長を評価した。ALT-803の投与により、BLIでの光子強度が大幅に低下した。これは、ALT-803が腫瘍の成長を阻害できたことを示唆している（図６Ｃおよび図６Ｄ）。ALT-803投与群では、対照群と比較してGVHDスコアの上昇と体重減少とは観察されなかった（図６Ｂ）。これは、このマウスHSCTモデルにおいては、ALT-803はGVHDを促進しなかったことを示唆している。よって、マウスモデルでは、同種HSCT後のALT-803投与が、GVHDを悪化させることなく、GVL／リンパ腫活性を増強する。
【実施例５】
【０１７１】
実施例５：ALT-803は同種の造血幹細胞移植後に移植片対腫瘍活性を大幅に増強する
インターロイキン−１５（IL-15）は、先天性免疫系および適応免疫系において様々な役割を果たす多面発現性サイトカインである。これらの役割には、免疫エフェクター細胞の発生、活性化、ホーミングおよび生存が含まれる。IL-15が、正常なマウスおよび幹細胞移植のレシピエントにおいて、CD8＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数と機能を増大させることは以前から示されてきた。しかし、依然として、IL-15を治療に利用するには障壁がある。具体的には、IL-15はその有効性が低く、インビボ半減期が短い点である。これを克服するために、生物活性がより増強されたIL-15突然変異体（IL-15N72D; J. Immunol, 2009; 183:3598）が開発された。同時発現するIL-15N72Dは、IL-15RαSu/Fcと連携して、生物活性を有し非常に強力なIL-15スーパーアゴニスト複合体（IL-15SA。ALT-803としても知られる。Cytokine, 2011; 56:804）を産生した。同種造血幹細胞移植（HSCT）レシピエントにおける、免疫再構築および移植片対腫瘍（GVT）活性に対するALT-803の作用を評価した。致死線量の照射を受けたBALB/cレシピエントに、B6マウスからＴ細胞除去（TCD）骨髄（BM）細胞を移植した。移植後17日目と24日目に、ALT-803を腹腔内注射で２回投与により投与した。マウスを移植後28日目に致死させた。IL-15の投与により、CD8+Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数が大幅に増加した。ALT-803は、CD8+Ｔ細胞からのインターフェロン−γ分泌も増大させた。B6CBA→CB6F1移植モデルにおいて、同様の活性が観察された。また、ALT-803は、CD8+Ｔ細胞上でのNKG2DおよびCD107aの発現を上方制御した。また、CFSE（カルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステル）標識Ｔ細胞輸注のレシピエントにおいて、ALT-803投与は、CD8+Ｔ細胞における活発なIFN-γおよびTNF-αの分泌と連携して、増殖の遅いCD8+Ｔ細胞を特異的に増加させた。一方、CD4+Ｔ細胞増殖には影響がなかった。次に、ALT-803の抗腫瘍活性を、マウス肥満細胞腫（P815）、マウスB細胞リンパ腫（A20）およびマウス腎細胞腫（Renca）の3種類の腫瘍モデルで検証した。ALT-803の投与が、同種HSCTのレシピエントにおいて、P815およびA20に対するGVT活性を増強し、しかも、この活性はHSCTを伴うＴ細胞輸注が低薬量でよいことが確認された。同種HSCTのレシピエントでは、ALT-803投与後のRencaに対する増強されたGVT活性は、Ｔ細胞輸注を必要としなかった。
【０１７２】
結論として、ALT-803は、HSCT後のCD8+およびＮＫＴ細胞の再形成と機能を増強する非常に強力なサイトカイン複合体であり、移植後の免疫療法の候補と言える。
【実施例６】
【０１７３】
実施例６：ドナーリンパ球輸注（DLI）と併用されるALT-803は、同種造血幹細胞移植後に移植片対腫瘍活性を大幅に増強する
ドナーリンパ球輸注（DLI）は、再発患者において、造血幹細胞移植（HSCT）後の移植片対腫瘍(GVT)作用を増強するために臨床的に使用され奏功してきた。しかし、抗腫瘍活性の増強、移植片対宿主病（GVHD）の抑制および日和見感染からの合併症の抑制のための改善はさらに可能である。本明細書に記載の結果は、輸注細胞機能を「強化」する方法として、サイトカイン療法をDLIと併用すると、腫瘍浄化力が強化されることの明らかな証拠を示している。
【０１７４】
インターロイキン−１５（IL-15）は、正常マウスおよび幹細胞移植レシピエントにおいてCD8+ T細胞およびＮＫ細胞の数と機能を増大させる有力なサイトカインである。それにも関わらず、本明細書に記載の発明以前には、IL-15を治療に利用するには障壁があった。具体的には、IL-15はその有効性が低く、インビボ半減期が短い点である。これを克服するために、半減期がより長くより効果が高いALT-803が開発された。
【０１７５】
本明細書に記載のように、CFSE標識Ｔ細胞のレシピエントへのALT-803の投与は、CD8+Ｔ細胞の増殖と、CD8+Ｔ細胞からのIFN-γおよびTNF-α分泌とを増大させる。parent-F1モデルにおいて輸注されたＴ細胞投与量を滴定することにより、マウスDLIモデルを開発した。そして、同種HSCTマウスレシピエントにいて、ALT-803投与とDLIとを組み合わせた。このモデルでは、致死線量の照射を受けたCB6F1（H2Kb/d）マウスに、C57BL6マウス（H2Kb）からＴ細胞除去骨髄細胞を移植した。すべてのHSCTレシピエントには、ルシフェラーゼ生成遺伝子をトランスフェクトしたA20B細胞リンパ腫細胞と同時注射した。これにより、生物発光イメージングとインビボでの腫瘍進行の追跡が可能になる。DLI（2.5×105個のＴ細胞）および、BMT後17日目と24日目に１匹あたり1μgのALT-803注射を受けたマウスでは、腫瘍量が減少し、全体の生存が向上し（p ＝ 0.04）、腫瘍の成長が低下（p ＝ 0.02）することがわかる。ALT-803投与群の体重減少は、対照群よりも有意に小さかった（p ＝ 0.007）。週毎の臨床スコアリングでは、GVHD症状は認められず、ALT-803療法の効能および全般的な安全性の療法が強調された。さらに、Ｔ細胞消耗マーカーを、生存マウスにおけるCD8+Ｔ細胞について評価した。腫瘍量が排除された後でも、Ｔ細胞上でプログラム死１（PD-1）発現の増大が確認された。ALT-803を使用した治療は、移植後120日よりも長く生存したマウスにおいて、ドナーCD8＋Ｔ細胞におけるPD-1発現を低下させた。
【０１７６】
結論として、ALT-803は、Ｔ細胞のサイトカイン分泌と増殖とを増大させることにより、CD8+Ｔ細胞機能を増強した一方で、Ｔ細胞の消耗を防ぐこともできた。ALT-803は、待望のリンパ成長因子であり、DLIと併用すると、HSCT後の再発性疾患の治療に有用である。
その他の実施形態
発明の詳細な説明によって本発明を説明してきたが、上記の説明は例示を意図したものであって、本願発明の範囲を限定するものではない。本願発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。その他の態様、効果、および改変は、以下の特許請求の範囲に包含される。
【０１７７】
本明細書中で言及した特許文献および学術文献は、当業者により利用可能な知識を構築する。本明細書中に引用される米国特許および公開済みまたは未公開の米国特許出願のすべてが、参照により本願に組み込まれる。本明細書中に引用される公開済みの外国特許および外国特許出願のすべてが、参照により本願に組み込まれる。
受託番号で示すGenbankおよびNCBIの提出試料が、参照により本願に組み込まれる。
本明細書中に引用されるその他の公開済みの文献、文書、原稿、学術文献のすべてが、参照により本願に組み込まれる。
【０１７８】
本発明を、その好ましい実施形態を参照して具体的に示すとともに説明してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱しない限り、様式や詳細について多様な変更が可能であることが当業者には理解されるであろう。
【図１】
2018532729.tif 000003
【図２】
2018532729.tif 000004
【図３】
2018532729.tif 000005
【図４】
2018532729.tif 000006
【図５】
2018532729.tif 000007
【図６】
2018532729.tif 000008
【国際調査報告】
2018532729.tif 000009
2018532729.tif 000010
2018532729.tif 000011
2018532729.tif 000012