(57)【要約】  疾患および状態を治療するのに有用な方法および化合物が提供される。１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ阻害化合物または１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ増強化合物を、疾患または状態のための治療として細胞、組織、および／または対象に投与する方法が提供される。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肝疾患または状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、対象における肝疾患または状態を治療するのに有効な量でマイクロＲＮＡ阻害化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、前記対象の少なくとも１つの細胞におけるマイクロＲＮＡ活性を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロＲＮＡ活性を減少させることが、マイクロＲＮＡレベルまたは機能を減少させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物がマイクロＲＮＡ活性を減少させ、前記対象の少なくとも１つの細胞におけるグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）酵素活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記肝疾患または状態が、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪の蓄積（脂肪肝）、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌、肝代償不全、脂肪性肝炎、および化学療法抵抗性のうちの１つまたは複数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記肝疾患または状態を治療することが、ＧＮＭＴ活性の対照レベルと比較して、前記対象の少なくとも１つの細胞におけるＧＮＭＴ活性を増加させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が医薬組成物中で投与され、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、検出可能な標識およびターゲティング剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲティング剤が肝臓ターゲティング剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡスポンジ化合物、アンチセンス阻害分子、およびバリアントｍｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、マイクロＲＮＡヘアピン阻害分子を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つを阻害する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記肝疾患または状態ががんではない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌、肝硬変、がん後の肝臓状態、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌、肝代償不全、脂肪性肝炎、または化学療法抵抗性の治療のための１つまたは複数のさらなる療法を、前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のさらなる療法が、前記対象への前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物の投与の前、投与と同時、および投与の後の時間のうちの１つまたは複数で前記対象に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のさらなる療法が、放射線療法、外科的療法、化学療法、分子標的化療法、細胞増殖抑制療法、および細胞傷害性療法から独立して選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物および前記１つまたは複数のさらなる療法を投与することが、前記対象における前記肝疾患または状態に対する相乗治療効果をもたらす、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物が外因性ｍｉＲＮＡ阻害化合物である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物のための投与手段が、経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、肝内投与、経鼻投与、局所投与、経皮投与、インプラント投与、および点滴投与のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物のための投与製剤が、持続放出製剤、ナノ粒子、マイクロ粒子、ヒドロゲル、吸収性担体、移植可能な製剤、および生分解性マトリクスのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与されたｍｉＲＮＡ阻害化合物が、前記対象における少なくとも１つの細胞の脱分化を低減させる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの細胞が肝細胞である、請求項２、４および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を増加させる方法であって、前記細胞を、前記細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を増加させるのに有効な量でｍｉＲＮＡ阻害化合物と接触させることを含み、ここで前記ＧＮＭＴ酵素活性の増加は前記細胞におけるＤＮＡ過剰メチル化を低減させる、前記方法。
【請求項２４】
前記ＧＮＭＴ酵素活性を増加させることが、前記細胞における前記ＧＮＭＴ酵素のレベルまたは機能を増加させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ細胞である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞が対象内にあり、前記接触させることが前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物を前記対象に投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物が医薬組成物中で投与され、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、検出可能な標識およびターゲティング剤のうちの１つまたは複数をさらに含み、前記ターゲティング剤は肝臓ターゲティング剤であってもよい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡスポンジ化合物、アンチセンス阻害化合物、および修飾ｍｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、マイクロＲＮＡヘアピン阻害分子を含む、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つを阻害する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が肝細胞である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、肝がん細胞、転移がん細胞、前がん肝細胞、肝硬変肝細胞、がん後肝細胞、線維症肝細胞、肝細胞、炎症性肝がん細胞、および化学療法抵抗性肝細胞のうちの１つまたは複数である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞ががん細胞ではない、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を、肝がん、転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌、肝代償不全、脂肪性肝炎、および化学療法抵抗性の治療のための１つまたは複数のさらなる療法と接触させることをさらに含む、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物と接触する前、接触と同時、および接触した後の時間のうちの１つまたは複数で前記細胞が１つまたは複数のさらなる療法と接触する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数のさらなる療法が、放射線療法、外科処置、化学療法、分子標的化がん療法、細胞増殖抑制療法、および細胞傷害性療法から独立して選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物および前記１つまたは複数のさらなる療法との接触が、前記細胞に対する前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物および／または前記１つもしくは複数のさらなる療法の相乗効果をもたらす、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物が外因性ｍｉＲＮＡ阻害化合物である、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物が、前記接触した細胞の脱分化を低減させる、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させる方法であって、前記細胞を、前記細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させるのに有効な量でｍｉＲＮＡエンハンサー化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項４３】
前記細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させることが、前記細胞におけるＤＮＡ過剰メチル化を増加させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＧＮＭＴ酵素活性を減少させることが、前記細胞における前記ＧＮＭＴ酵素のレベルまたは機能を減少させることを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ細胞である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｍｉＲＮＡエンハンサー化合物が医薬組成物中にあり、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイクロＲＮＡエンハンサー化合物が、検出可能な標識およびターゲティング剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記マイクロＲＮＡエンハンサー化合物がマイクロＲＮＡ配列を含む、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記マイクロＲＮＡエンハンサー化合物が、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つ、またはその機能的バリアントを含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与したｍｉＲＮＡエンハンサー化合物が、前記接触した細胞の脱分化を増加させる、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記接触した細胞が肝細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を変化させるｍｉＲＮＡモジュレート化合物を識別する方法であって、
（ａ）細胞を候補ｍｉＲＮＡモジュレート化合物と接触させること；
（ｂ）前記細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量を決定すること；および
（ｃ）ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方について決定した活性の量を、それぞれ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の対照量と比較すること、ここでｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐそれぞれの活性の対照量と比較して、前記接触した細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量の減少が、前記候補ｍｉＲＮＡモジュレート化合物をｍｉＲＮＡ阻害化合物として識別し、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐそれぞれの活性の対照量と比較して、前記接触した細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量の増加が、前記候補ｍｉＲＮＡモジュレート化合物をｍｉＲＮＡ増強化合物として識別する、
を含む、前記方法。
【請求項５４】
前記細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量を決定することが、前記接触した細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を、前記候補ｍｉＲＮＡモジュレーター化合物と接触していない対照細胞におけるＧＮＭＴ活性と比較することを含み、ここで前記対照細胞に対する、前記接触した細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性の増加が前記候補ｍｉＲＮＡモジュレーターをｍｉＲＮＡ阻害化合物として識別し、前記対照細胞に対する、前記接触した細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性の減少が前記候補ｍｉＲＮＡモジュレーターをｍｉＲＮＡエンハンサー化合物として識別する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ細胞である、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記接触した細胞が肝細胞である、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記接触した細胞が、肝がん細胞、転移がん細胞、前がん細胞、肝硬変細胞、がん後細胞、線維症細胞、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）細胞、ＮＡＳＨ細胞、線維症肝細胞、脂肪性肝炎肝細胞、化学療法抵抗性肝細胞、および正常細胞のうちの１つまたは複数である、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記識別したｍｉＲＮＡ阻害化合物を対象に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象が肝疾患または状態を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
対象における肝疾患または状態を治療するための医薬組成物であって、前記対象における肝疾患または状態を治療するのに有効な量で少なくとも１つのｍｉＲＮＡモジュレート化合物を含む、前記医薬組成物。
【請求項６２】
前記ｍｉＲＮＡモジュレート化合物がｍｉＲＮＡ活性阻害化合物である、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記ｍｉＲＮＡ阻害化合物が、前記対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つの活性を阻害する、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記ｍｉＲＮＡ活性を阻害することが、前記ｍｉＲＮＡのレベルまたは機能を減少させることを含む、請求項６２または６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡスポンジ化合物、アンチセンス阻害分子、およびバリアントｍｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物がマイクロＲＮＡヘアピン阻害分子を含む、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記マイクロＲＮＡ阻害化合物が、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つを阻害する、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記肝疾患または状態が、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌、肝代償不全、脂肪性肝炎、または化学療法抵抗性である、請求項６１〜６７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記ｍｉＲＮＡモジュレート化合物がｍｉＲＮＡ活性を増強させる化合物であり、前記ｍｉＲＮＡ活性を増強させることが、前記対象における前記ｍｉＲＮＡのレベルまたは機能を増加させることを含む、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記医薬組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項６１〜６９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記医薬組成物がターゲティング剤をさらに含む、請求項６１〜７０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記肝疾患または状態のうちの少なくとも１つががんではなく、前記対象ががんを有していない、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下で２０１５年８月２０日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／２０７，４５６号の利益を主張し、その開示はその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、肝臓に影響を及ぼす疾患および状態などの疾患および状態を治療するのに有用である方法および化合物に部分的に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝臓病学は継続的に進化している分野である：慢性肝疾患の疫学は極めて速い速度で変化しており、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が、以前にウイルス性肝炎が占めていた位置を引き継ぎ、メタボリックシンドローム関連死亡率の増加している原因として心血管疾患が課題となっている。ＮＡＦＬＤは、脂肪の蓄積（脂肪肝）から様々な程度の炎症および線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）まで、ならびに最終的に特発性肝硬変およびその臨床的続発症（肝細胞癌、肝代償不全）までに及ぶ広範囲の病理状態を包含する臨床病理学的用語である。研究および介入は肝炎および心血管疾患に大きな影響を及ぼしているが、ＮＡＦＬＤから肝硬変およびがんへの進行に関与する機構の理解は不十分なままである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様によれば、細胞および／または対象における肝疾患および状態を治療する方法が提供される。いくつかの態様では、本発明の方法は、そのような治療を必要とする細胞および／または対象に、細胞および／または対象のそれぞれにおける肝疾患または状態を治療するのに有効な量で１つまたは複数のマイクロＲＮＡ化合物の阻害剤を投与することを含んでもよい。
【０００５】
本発明の一態様によれば、対象における肝疾患または状態を治療する方法が提供される。方法は、そのような治療を必要とする対象に、対象における肝疾患または状態を治療するのに有効な量でマイクロＲＮＡ阻害化合物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は対象の少なくとも１つの細胞におけるマイクロＲＮＡ活性を減少させる。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ活性を減少させることは、マイクロＲＮＡレベルまたは機能を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は、マイクロＲＮＡ活性を減少させ、対象の少なくとも１つの細胞におけるグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）酵素活性を増加させる。いくつかの実施形態では、肝疾患または状態は、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪の蓄積（脂肪肝）、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変およびその臨床的続発症（肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝代償不全）、脂肪性肝炎、および化学療法抵抗性のうちの１つまたは複数である。特定の実施形態では、肝疾患または状態を治療することは、ＧＮＭＴ活性の対照レベルと比較して、対象の少なくとも１つの細胞におけるＧＮＭＴ活性を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は医薬組成物中で投与され、医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はまた、検出可能な標識およびターゲティング剤のうちの１つまたは複数も含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング剤は肝臓ターゲティング剤である。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は、ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡスポンジ（ｍｉＲＮＡ  ｓｐｏｎｇｅ）化合物、アンチセンス阻害分子、およびバリアントｍｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はマイクロＲＮＡヘアピン阻害分子を含む。いくつかの実施では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つを阻害する。特定の実施形態では、肝疾患または状態はがんではない。特定の実施形態では、方法はまた、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪の蓄積（脂肪肝）、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝代償不全、脂肪性肝炎、または化学療法抵抗性の治療のための１つまたは複数のさらなる療法を対象に投与することも含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のさらなる療法が、対象へのｍｉＲＮＡ阻害化合物の投与の前、投与と同時、および投与の後の時間のうちの１つまたは複数で対象に投与される。いくつかの実施形態で��、１つまたは複数のさらなる療法は、放射線療法、外科的療法、化学療法、分子標的化療法、細胞増殖抑制療法、および細胞傷害性療法から独立して選択される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物および１つまたは複数のさらなる療法を投与することは、対象における肝疾患または状態に対する相乗治療効果をもたらす。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物は外因性ｍｉＲＮＡ阻害化合物である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物のための投与手段は、経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、肝内投与、経鼻投与、局所投与、経皮投与、インプラント投与、および点滴投与のうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物のための投与製剤は、持続放出製剤、ナノ粒子、マイクロ粒子、ヒドロゲル、吸収性担体、移植可能な製剤、および生分解性マトリクスのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、投与されたｍｉＲＮＡ阻害化合物は対象における少なくとも１つの細胞の脱分化を低減させる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０００６】
本発明の別の態様によれば、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を増加させる方法が提供される。方法は、細胞を、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を増加させるのに有効な量でｍｉＲＮＡ阻害化合物と接触させることを含み、ここでＧＮＭＴ酵素活性の増加は細胞におけるＤＮＡ過剰メチル化を低減させる。特定の実施形態では、ＧＮＭＴ酵素活性を増加させることは、細胞におけるＧＮＭＴ酵素のレベルまたは機能を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞である。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞は対象内にあり、接触させることはｍｉＲＮＡ阻害化合物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物は医薬組成物中で投与され、医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はまた、検出可能な標識およびターゲティング剤のうちの１つまたは複数も含み、ターゲティング剤は肝臓ターゲティング剤であってもよい。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は、ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡスポンジ化合物、アンチセンス阻害化合物、および修飾ｍｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はマイクロＲＮＡヘアピン阻害分子を含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つを阻害する。特定の実施形態では、細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝がん細胞、転移がん細胞、前がん肝細胞、肝硬変肝細胞、がん後肝細胞、線維症肝細胞、肝細胞、炎症性肝がん細胞、および化学療法抵抗性肝細胞のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、細胞はがん細胞ではない。特定の実施形態では、方法はまた、細胞を、肝がん、転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪の蓄積（脂肪肝）、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変および肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝代償不全などのその臨床的続発症、脂肪性肝炎、または化学療法抵抗性の治療のための１つまたは複数のさらなる療法と接触させることも含む。いくつかの実施形態では、細胞がｍｉＲＮＡ阻害化合物と接触する前、接触と同時、および接触した後の時間のうちの１つまたは複数で細胞が１つまたは複数のさらなる療法と接触する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のさらなる療法は、放射線療法、外科処置、化学療法、分子標的化がん療法、細胞増殖抑制療法、および細胞傷害性療法から独立して選択される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物および１つまたは複数のさらなる療法との接触は、細胞に対するｍｉＲＮＡ阻害化合物および／または１つもしくは複数のさらなる療法の相乗効果がもたらす。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物は外因性ｍｉＲＮＡ阻害化合物である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物は、接触した細胞の脱分化を低減させる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０００７】
本発明の別の態様によれば、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させる方法が提供される。方法は、細胞を、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させるのに有効な量でｍｉＲＮＡエンハンサー化合物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させることは、細胞におけるＤＮＡ過剰メチル化を増加させる。特定の実施形態では、ＧＮＭＴ酵素活性を減少させることは、細胞におけるＧＮＭＴ酵素のレベルまたは機能を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞である。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡエンハンサー化合物は医薬組成物中にあり、医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体も含んでもよい。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物もまた、検出可能な標識およびターゲティング剤のうちの１つまたは複数も含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物はマイクロＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つ、またはその機能的バリアントを含む。特定の実施形態では、投与したｍｉＲＮＡエンハンサー化合物は、接触した細胞の脱分化を増加させる。いくつかの実施形態では、接触した細胞は肝細胞である。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を変化させるｍｉＲＮＡモジュレート化合物を識別する方法が提供される。方法は、（ａ）細胞を候補ｍｉＲＮＡモジュレート化合物と接触させること；（ｂ）細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量を決定すること；および（ｃ）ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方について決定した活性の量を、それぞれ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の対照量と比較すること、ここでｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐそれぞれの活性の対照量と比較して、接触した細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量の減少が、候補ｍｉＲＮＡモジュレート化合物をｍｉＲＮＡ阻害化合物として識別し、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐそれぞれの活性の対照量と比較して、接触した細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量の増加が、候補ｍｉＲＮＡモジュレート化合物をｍｉＲＮＡ増強化合物として識別する、を含む。いくつかの実施形態では、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の量を決定することが、接触した細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を、候補ｍｉＲＮＡモジュレーター化合物と接触していない対照細胞におけるＧＮＭＴ活性と比較することを含み、ここで対照細胞に対する、接触した細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性の増加が候補ｍｉＲＮＡモジュレーターをｍｉＲＮＡ阻害化合物として識別し、対照細胞に対する、接触した細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性の減少が候補ｍｉＲＮＡモジュレーターをｍｉＲＮＡエンハンサー化合物として識別する。特定の実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの実施形態では、接触した細胞は肝細胞である。特定の実施形態では、接触した細胞は、肝がん細胞、転移がん細胞、前がん肝細胞、肝硬変肝細胞、がん後肝細胞、線維症肝細胞、肝細胞、炎症性肝がん細胞、化学療法抵抗性肝細胞、および正常細胞のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、方法はまた、識別したｍｉＲＮＡ阻害化合物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は肝疾患または状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、対象における肝疾患または状態を治療するための医薬組成物が提供され、医薬組成物は、対象における肝疾患または状態を治療するのに有効な量で少なくとも１つのｍｉＲＮＡモジュレート化合物を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡモジュレート化合物はｍｉＲＮＡ活性阻害化合物である。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害化合物は対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つの活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ活性を阻害することは、ｍｉＲＮＡのレベルまたは機能を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は、ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡスポンジ化合物、アンチセンス阻害分子、およびバリアントｍｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はマイクロＲＮＡヘアピン阻害分子を含む。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、肝疾患または状態は、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝代償不全、脂肪性肝炎、または化学療法抵抗性である。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡモジュレート化合物はｍｉＲＮＡ活性を増強させる化合物であり、ｍｉＲＮＡ活性を増強させることは、対象におけるｍｉＲＮＡのレベルまたは機能を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。特定の実施形態では、医薬組成物はターゲティング剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、肝疾患または状態のうちの少なくとも１つはがんではなく、対象はがんを有していない。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００１０】
本発明は、本発明の任意の述べられた目的または特徴のうちの１つまたは複数を満たさなければならない組成物または方法に限定することを意図しない。また、本発明は本明細書に記載される例示的または基本的実施形態に限定されないことを留意することは重要である。当業者による修飾および置換は本発明の範囲内であるとみなされる。
【００１１】
配列の簡単な説明
配列番号１  ｍｉＲＢａｓｅ受託番号：ＭＩＭＡＴ０００４９５３を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐと称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのホモサピエンス配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
【００１２】
配列番号２  ｍｍｕ−ｍｉＲ−８７３ａ−５ｐと称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのハツカネズミ配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
配列番号３  ｒｎｏ−ｍｉＲ−８７３−５ｐと称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのドブネズミ配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
【００１３】
配列番号４  ｐｔｒ−ｍｉＲ−８７３と称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのブラックコットンウッド配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
配列番号５  ｂｔａ−ｍｉＲ−８７３と称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのウシ配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
【００１４】
配列番号６  ｅｃａ−ｍｉＲ−８７３と称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのウマ配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
配列番号７  ｐｐｙ−ｍｉＲ−８７３と称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのオランウータン配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ。
【００１５】
配列番号８  ｍｉＲＢａｓｅ受託番号：ＭＩＭＡＴ０００５４５６を有する、ｈｓａ−ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐと称されるＭＩＲ−５１８ｄ−５ｐについてのホモサピエンス配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
【００１６】
配列番号９  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａと称されるＭＩＲ−５２６ａについてのホモサピエンス配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
配列番号１０  ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐと称されるＭＩＲ−５２０ｃ−５ｐについてのホモサピエンス配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
【００１７】
配列番号１１  ｐｔｒ−ｍｉＲ−５２６ａと称されるＭＩＲ−５２６ａについてのブラックコットンウッド配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
配列番号１２  ｇｇｏ−ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐと称されるＭＩＲ−５１８ｄ−５ｐについてのゴリラ配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
【００１８】
配列番号１３  ｇｇｏ−ｍｉＲ−５２０ｃｄと称されるＭＩＲ−５２０Ｃについてのゴリラ配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
配列番号１４  ｇｇｏ−ｍｉＲ−５２６ａと称されるＭＩＲ−５２６ａについてのゴリラ配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
【００１９】
配列番号１５  ｐｐｙ−ｍｉＲＮＡ−５１８ｇ−５ｐと称されるＭＩＲ−５１８ｇ−５ｐについてのオランウータン配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ｍｉＲ−８７３−５ｐが肝臓におけるＧＮＭＴ発現を標的とすることを示す結果のグラフを示す。肝腫瘍（左のグラフ）および肝硬変患者のコホート（右のグラフ）におけるｍｉＲ−８７３−５ｐとＧＮＭＴ発現レベルとの間の相関研究からの結果の２つのグラフを示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。
【図１Ｂ】ｍｉＲ−８７３−５ｐが肝臓におけるＧＮＭＴ発現を標的とすることを示す結果のグラフを示す。出生後１日および成体のマウスの肝臓におけるＧＮＭＴ（左のグラフ）およびｍｉＲ−８７３−５ｐ（右のグラフ）のｑＰＣＲ分析の結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。
【図１Ｃ】ｍｉＲ−８７３−５ｐが肝臓におけるＧＮＭＴ発現を標的とすることを示す結果のグラフを示す。異なる時点での培養物中の肝細胞におけるＧＮＭＴ（左のグラフ）およびｍｉＲ−８７３−５ｐのｑＰＣＲ分析の結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。
【図１Ｄ】ｍｉＲ−８７３−５ｐが肝臓におけるＧＮＭＴ発現を標的とすることを示す結果のグラフを示す。ＢＤＬの異なる時点でのＧＮＭＴ（左のグラフ）およびｍｉＲ−８７３−５ｐのｑＰＣＲ分析の結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。
【図１Ｅ】ｍｉＲ−８７３−５ｐが肝臓におけるＧＮＭＴ発現を標的とすることを示す結果のグラフを示す。初代肝細胞のデオキシコール酸処理下でのＧＮＭＴ（左のグラフ）およびｍｉＲ−８７３−５ｐのｑＰＣＲ分析の結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。
【図１Ｆ】ｍｉＲ−８７３−５ｐが肝臓におけるＧＮＭＴ発現を標的とすることを示す結果のグラフを示す。ｍｉＲ−８７３−５ｐ過剰発現後の肝細胞（左のグラフ）およびｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害後のＢＣＬＣ３肝がん細胞（右のグラフ）におけるＧＮＭＴ発現のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、ｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が、肝細胞が脱分化するのを阻止することを実証する結果のグラフを提供する。グラフは、脱分化の異なる時点での培養物中の対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害された肝細胞における、示した遺伝子のｍＲＮＡ発現についてｑＰＣＲによって実施した分析からの結果を示す。図２Ａは、ＧＮＭＴについての結果を示す。図２Ｂは、ＨＮＦ４α（左）、アルブミン（中央）、およびＨＫ４（右）についての結果を示す。図２Ｃは、ＰＫＭ２（左）、ＡＦＰ（中央）、およびＨＧＦ（右）についての結果を示す。図２Ｄは、ＣＹＰ２Ｅ１（左）、ＣＹＰ３Ａ１１（中央）、およびＣＹＰ２Ｂ１０（右）についての結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊を表した。＃は２４時間と４８時間を比較している（ｍｉＲ−Ｃｔｒｌ）。黒色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｌ処理を表し、白色のバーはｍｉＲ−８７３−５ｐ−ｉｎｈ処理を表す。
【図３Ａ】マウスの退行した線維化表現型における胆管結紮後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害を実証する結果のグラフを示す。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルによって測定したＧＮＭＴ発現を示すグラフおよびウェスタンブロットである。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−Ｉｎｈ］）。
【図３Ｂ】マウスの退行した線維化表現型における胆管結紮後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害を実証する結果のブロットを示す。ＰＡＲＰ切断によって媒介されるアポトーシス分析を示す。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−Ｉｎｈ］）。
【図３Ｃ】マウスの退行した線維化表現型における胆管結紮後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害を実証する結果のグラフを示す。ＢＤＬ後のｍｉＲ−Ｃｔｒｌ下のマウスおよびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスの生存率を示すカプランマイヤー曲線である。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−Ｉｎｈ］）。
【図３Ｄ】マウスの退行した線維化表現型における胆管結紮後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害を実証する結果のグラフを示す。ＢＤＬの７日目におけるｍｉＲ−ＣｔｒｌおよびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウス下でのカスパーゼ３（Ｃ３）活性レベルの分析の結果を示す。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−Ｉｎｈ］）。
【図３Ｅ】マウスの退行した線維化表現型における胆管結紮後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害を実証する結果のグラフを示す。ＢＤＬの７日目におけるｍｉＲ−ＣｔｒｌおよびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウス下でのトランスアミナーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）レベルの分析の結果を示す。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−Ｉｎｈ］）。
【図３Ｆ】マウスの退行した線維化表現型における胆管結紮後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害を実証する結果のグラフおよび顕微鏡写真画像を示す。ＢＤＬの７日目におけるｍｉＲ−ＣｔｒｌおよびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウス由来の肝切片におけるシリウスレッド、Ｆ４／８０、αＳＭＡおよびＣＫ１９染色の顕微鏡写真画像を示し、ｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたＢＤＬに対する対照の変化の対応するグラフを提供する。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−Ｉｎｈ］）。
【図４Ａ】ＢＤＬ後のｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおける肝臓障害減衰を実証する結果のグラフを示す。対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおける示した遺伝子のｑＰＣＲによる分析の結果を示す。ＴＧＦβ（左）およびＭＭＰ９（右）についての結果を示す。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ］）。黒色のバーはＢＤＬなしを表し、白色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｒｌ  ＢＤＬを表し、灰色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ  ＢＤＬを表す。
【図４Ｂ】ＢＤＬ後のｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおける肝臓障害減衰を実証する結果のグラフを示す。対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおける示した遺伝子のｑＰＣＲによる分析の結果を示す。ＦＸＲ、ＨＮＦ１α、Ａｂｃｇ５、およびＡｂｃｇ８ＨＧＦ（左から右）についての結果を示す。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ］）。黒色のバーはＢＤＬなしを表し、白色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｒｌ  ＢＤＬを表し、灰色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ  ＢＤＬを表す。
【図４Ｃ】ＢＤＬ後のｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおける肝臓障害減衰を実証する結果のグラフを示す。対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおける示した遺伝子のｑＰＣＲによる分析の結果を示す。上段のｉＮＯＳ（左）、ＳＡＡ１（中央）、およびＣＸＣＬ１（右）ならびに下段のＴＮＦα（左）およびＩＬ−６（右）についての結果を示す。（値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、［対照対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ］）。黒色のバーはＢＤＬなしを表し、白色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｒｌ  ＢＤＬを表し、灰色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ  ＢＤＬを表す。
【図５Ａ】初代肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が胆汁酸に対するアポトーシス反応を低減させることを実証する結果のグラフを示す。２時間のＤＣＡ処理（１００μＭ）の前および後の対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害された肝細胞におけるカスパーゼ３（Ｃ３）活性のグラフである。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊（対照（ｃｔｌ）対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ）を表した。黒色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｌを表し、白色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ処理を表す。
【図５Ｂ】初代肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が胆汁酸に対するアポトーシス反応を低減させることを実証する結果のグラフを示す。ＤＣＡ処理の異なる時点での対照および阻害されたｍｉＲ−８７３−５ｐ肝細胞における示した遺伝子のｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析からの結果のグラフを提供する。ＧＮＭＴ、Ｂｃｌ−２、ＨＮＦ１α、およびＨＮＦ４α（左から右）の結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊（対照（ｃｔｌ）対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ）を表した。黒色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｌを表し、白色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ処理を表す。
【図５Ｃ】初代肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が胆汁酸に対するアポトーシス反応を低減させることを実証する結果のグラフを示す。ＤＣＡ処理の異なる時点での対照および阻害されたｍｉＲ−８７３−５ｐ肝細胞における示した遺伝子のｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析からの結果のグラフを提供する。ＦＸＲ、ＳＨＰ、ＢＳＥＰ、Ａｂｃｇ５およびＡｂｃｇ８（上段、左から右）、ならびにＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、およびＭＲＰ５（下段、左から右）についての結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊（対照（ｃｔｌ）対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ）を表した。黒色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｌを表し、白色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ処理を表す。
【図５Ｄ】初代肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が胆汁酸に対するアポトーシス反応を低減させることを実証する結果のグラフを示す。ＤＣＡ処理の異なる時点での対照および阻害されたｍｉＲ−８７３−５ｐ肝細胞における示した遺伝子のｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析からの結果のグラフを提供する。ｍｄｒ１、ｍｄｒ２、およびｍｄｒ３（左から右）についての結果を示す。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊；ｐ＜０．００１＊＊＊（対照（ｃｔｌ）対８７３−５ｐ−Ｉｎｈ）を表した。黒色のバーはｍｉＲ−Ｃｔｌを表し、白色のバーはｍｉＲ−８３７−５ｐ−ｉｎｈ処理を表す。
【図６Ａ】肝臓におけるｍｉＲ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ発現に関する情報を提供する。健常な肝臓と比較した腫瘍性肝臓試料における示したｍｉＲＮＡの発現分析の結果の表である。
【図６Ｂ】肝臓におけるｍｉＲ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ発現に関する情報を提供する。肝臓腫瘍におけるｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐとＧＮＭＴ発現レベルとの間の相関研究の結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】肝臓におけるｍｉＲ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ発現に関する情報を提供する。ＧＮＭＴ  ３’ＵＴＲ断片におけるｍｉＲ−８７３−５ｐの推定結合部位を示す概略図である。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、ＧＮＭＴの不在下でｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害の効果の欠如を実証するグラフを示す。図７Ａは、脱分化の異なる時点での培養物中の対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたＧｎｍｔ−ＫＯ−肝細胞における、示した遺伝子のｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲによる分析結果のグラフを提供し、ＨＮＨ４α、Ｍａｔｌａ、アルブミン、およびＨＫ４（左から右）についての結果を示す。図７Ｂは、ＤＣＡ処理（１００μＭ）の１時間および２時間後のＧｎｍｔ−ＫＯマウスに由来する対照およびｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害された肝細胞におけるカスパーゼ３活性アッセイを示すグラフである。統計的分析は、ｐ＜０．０５＊；ｐ＜０．０１＊＊を表す；＃は０時間のＤＣＡ  ｍｉＲ−Ｃｔｒｌと比較している。
【図８】肝臓脱分化を遮断するｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害および線維化ターゲティングＧＮＭＴ発現を例示する概略図である。概略図は、肝臓脱分化および線維化表現型に影響を及ぼす、ＧＮＭＴ発現の調節に対する肝臓におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐの効果を表す。左側に、ＧＮＭＴ発現を回復するｍｉＲ−８７３−５ｐを阻害する効果を示す。
【図９Ａ】ＮＡＦＬＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を示すグラフを提供する。健常（対照）、脂肪肝、およびＮＡＳＨ患者の肝臓におけるＧＮＭＴ発現を示す。
【図９Ｂ】ＮＡＦＬＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を示すグラフを提供する。健常（対照）、肝脂肪、およびＮＡＳＨ患者の肝臓におけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を示す。
【図９Ｃ】ＮＡＦＬＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を示すグラフを提供する。健常およびＮＡＳＨ患者の肝臓におけるＧＮＭＴとｍｉＲ−８７３−５ｐ発現との間の相関関係を示す。
【図９Ｄ】ＮＡＦＬＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を示すグラフを提供する。健常およびＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者の血清中のｍｉＲ−８７３−５ｐのレベルを示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ＮＡＦＬＤマウスモデルにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を示すグラフを提供する。図１０Ａ〜Ｃは、図１０Ａにおいてはメチオニンおよびコリン欠乏食（ＭＣＤＤ）を与えられたマウスと、図１０Ｂにおいては高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられたマウスと、そして図１０Ｃにおいては高コレステロール（ＨＣ）食を与えられたマウスと比較した、正常食（Ｃｈｏｗ）を与えられたマウスからの結果を示す。示した食餌を４週間にわたって各マウス対象に供給し、次いでｍｉＲ−８７３−５ｐおよびＧＮＭＴ  ｍＲＮＡレベルを決定した。
【図１１Ａ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証する概略図を提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。マウス注射の概略図を示す。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【図１１Ｂ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証する顕微鏡写真画像およびグラフを提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。抗ｍｉＲ処置または正常対照（ｃｔｒｌ）マウスの肝臓におけるヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ）およびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、スーダンＩＩＩ、シリウスレッドを含む組織学的分析の結果を示す。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【図１１Ｃ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証する顕微鏡写真画像およびグラフを提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。抗ｍｉＲ処置または正常対照（ｃｔｒｌ）マウスの肝臓におけるＦ４／８０、ＳＭＡ、およびＧＮＭＴを含む組織学的分析の結果を示す。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【図１１Ｄ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証するグラフを提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。肝臓トランスアミナーゼの血清中濃度を示すグラフを提供する。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【図１１Ｅ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証するグラフを提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。トリグリセリドの血清中濃度を示すグラフを提供する。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【図１１Ｆ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証するグラフを提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。ケトン体の血清中濃度を示すグラフを提供する。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【図１１Ｇ】ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害がＮＡＦＬＤに対抗することを実証するグラフを提供する。研究におけるマウスに４週の間、ＭＣＤＤを供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐを３週の間、尾注射した。標準（Ｃｈｏｗ）およびＭＣＤ食を供給し、抗ｍｉＲ−８７３−５ｐで処置したまたは処置していないマウスの肝臓の遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびコレステロールを示すグラフを提供する。ＭＣＤ食はまた、本明細書においてＭＣＤＤおよびＤＤＭＣとして交換可能に称されている。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここで、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの両方が肝疾患（その非限定的な例には、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝炎、脂肪肝、肝代償不全、肝線維症、肝硬変などが含まれる）、および肝がん発症ならびにＧＮＭＴ発現の調節による治療に影響を及ぼすことが確認された。また、高レベルのｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐが肝疾患動物モデルにおいて低レベルのＧＮＭＴと関連し、特定の肝疾患または状態を有する対象にも存在することが発見された。本発明は、いくつかの態様では、ＮＡＦＬＤ、肝硬変などの肝臓発がん促進性（ｐｒｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）状態（ＬＰＯＣ）、ならびに肝細胞癌（ＨＣＣ）および他の肝疾患および状態の治療としてｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を阻害することを含む。本発明の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性の阻害はＬＰＯＣにおいて化学防御を増加させ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性と関連する疾患において抗腫瘍化学療法抵抗性を低減させることができる。本発明の特定の態様では、ＮＡＦＬＤ、肝硬変、ＨＣＣ、肝臓発がん促進性状態、ならびに他の肝疾患および状態のための治療としてｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性レベルの標的化された低減を含む方法が提供される。
【００２２】
マイクロＲＮＡ（本明細書においてｍｉＲＮＡとも称される）は、ｍＲＮＡ分子における配列を標的とするようにＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を誘導するように作用する小さな内因性ＲＮＡ分子である。ＲＩＳＣが負荷されたｍｉＲＮＡは、配列特異的にそれらの標的ｍＲＮＡに結合し、翻訳阻害およびＲＮＡ不安定化などの手段を介して標的ｍＲＮＡを抑制する。配列番号１〜１５として本明細書に示されるマイクロＲＮＡの配列は、ｍｍｕ−ｍｉＲ−８７３ａ−５ｐとも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのハツカネズミ配列と同一の配列を有する、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐとも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのホモサピエンス配列、ｒｎｏ−ｍｉＲ−８７３−５ｐとも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのドブネズミ配列、ｐｔｒ−ｍｉＲ−８７３とも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのブラックコットンウッド配列、ｂｔａ−ｍｉＲ−８７３とも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのウシ配列、ｅｃａ−ｍｉＲ−８７３とも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのウマ配列、およびｐｐｙ−ｍｉＲ−８７３とも称されるＭＩＲ−８７３−５ｐについてのオランウータン配列を含む。ｈｓａ−ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐとも称されるＭＩＲ−５１８ｄ−５ｐについてのホモサピエンス配列も提供され、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａとも称されるＭＩＲ−５２６ａと同一の配列を有し、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−５ｐとも称されるＭＩＲ−５２０ｃ−５ｐについてのホモサピエンス配列、ｐｔｒ−ｍｉＲ−５２６ａとも称されるＭＩＲ−５２６ａについてのブラックコットンウッド配列、ｇｇｏ−ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐとも称されるＭＩＲ−５１８ｄ−５ｐについてのゴリラ配列、ｇｇｏ−ｍｉＲ−５２０ｃｄとも称されるＭＩＲ−５２０Ｃについてのゴリラ配列、ｇｇｏ−ｍｉＲ−５２６ａとも称されるＭＩＲ−５２６ａについてのゴリラ配列、およびｐｐｙ−ｍｉＲＮＡ−５１８ｇ−５ｐとも称されるＭＩＲ−５１８ｇ−５ｐについてのオランウータン配列。
【００２３】
本明細書に使用される場合、マイクロＲＮＡ活性の阻害は、マイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡの抑制および標的ｍＲＮＡから転写されたタンパク質の低減を意味する。本明細書に使用される場合、マイクロＲＮＡ活性の増強はマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡの効果の向上および標的ｍＲＮＡから転写されたタンパク質の量の増加を意味する。ここで、細胞および対象におけるマイクロＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性は、限定されないが、肝疾患および状態を含む疾患および状態の存在または不在と相関することが決定された。細胞、組織、または器官のうちの１つまたは複数における、より高いレベルのｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性は、細胞、組織、または器官のそれぞれにおける肝疾患または状態の可能性を増加させる。細胞、組織、または器官のうちの１つまたは複数における減少したレベルのｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性は、細胞、組織、または器官のそれぞれにおける肝疾患または状態の可能性を減少させる。
【００２４】
ここでまた、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの増加した活性は細胞の脱分化を生じることができ、細胞によるより多くの「胎児」特性の獲得を生じることができることが確認された。本発明の特定の態様は、細胞、組織、器官、または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を増強させることを含む。
【００２５】
ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ、およびＧＮＭＴ活性。
本発明は、いくつかの態様では、細胞、組織、および／または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ、およびＧＮＭＴの活性のうちの１つまたは複数をモジュレートする方法に関する。本明細書に使用される場合、「モジュレートする」という用語は、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ、および／またはＧＮＭＴの活性（例えば、レベルおよび／または機能）のレベルを変化させることを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ、および／またはＧＮＭＴの活性を変化させることは、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ、およびＧＮＭＴのうちの１つまたは複数のレベルを変化させることを含む。したがって、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を減少させることは、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方のレベル（例えば量）を減少させることを含んでもよい。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態は、肝疾患または状態のための治療として、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物のうちの１つまたは複数を、細胞、組織、または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のうちの１つまたは複数を減少させるのに有効な量で細胞、組織または対象に投与する方法を含む。肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝代償不全、脂肪性肝炎、および化学療法抵抗性などの肝疾患または状態は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物のうちの１つまたは両方と細胞または組織を接触させ、それによって細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐそれぞれの活性を減少させ、その結果として細胞または組織における肝疾患または状態を治療することで、細胞または組織において治療され得る。
【００２７】
肝がん、肝臓における転移がん、発がん促進性肝臓状態、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝代償不全、脂肪性肝炎、および化学療法抵抗性などの肝疾患または状態は、対象における肝疾患または状態を治療するために、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物のうちの１つまたは複数を、対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐそれぞれの活性を減少させるのに有効な量で対象に投与することによって対象において治療され得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、肝疾患または状態を治療するために、例えば、マイクロＲＮＡ阻害化合物を細胞、組織または対象に送達することによって、細胞、組織、または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは複数の活性を減少させることを含む。対象における肝疾患または状態を治療するために、１つまたは複数の細胞を、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物などのマイクロＲＮＡ阻害化合物と接触させることができ、それにより、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの少なくとも１つの減少したレベルの活性が生じる。マイクロＲＮＡ阻害化合物と接触すべき細胞が対象内にある場合、マイクロＲＮＡ阻害化合物は対象に投与され得る。
【００２９】
マイクロＲＮＡ阻害化合物およびエンハンサー化合物
本発明の方法のいくつかの実施形態において有用なマイクロＲＮＡ阻害化合物の例には、限定されないが、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物が含まれる。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増加させるために本発明の方法の特定の実施形態において有用であり得るマイクロＲＮＡエンハンサー化合物の非限定的な例は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ模倣化合物またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ模倣化合物などの外因性二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣化合物である。本発明はマイクロＲＮＡ活性をモジュレートする方法に部分的に関する。いくつかの場合、モジュレートすることはマイクロＲＮＡ活性を「阻害すること」であり、他の場合、モジュレートすることはマイクロＲＮＡ活性を「増強すること」であり、したがって「マイクロＲＮＡ阻害」化合物および「マイクロＲＮＡエンハンサー」化合物という用語は、本明細書において「マイクロＲＮＡモジュレーター」化合物という総称で称される場合がある。当業者は、本明細書に使用される場合、より高い、より低い、減少した、阻害した、低減した、増加した、および増強したなどの用語は、対照レベルまたは値と比較した相対レベルまたは値を表し得ることを認識すると予想される。
【００３０】
ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させる方法
本発明は、細胞、組織、器官、および／または対象における肝疾患または状態を治療するためにマイクロＲＮＡ  ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは複数の活性（例えば、レベルおよび／または機能）を低減させる方法を部分的に含む。本発明の組成物、化合物、および方法は、細胞、組織、もしくは対象のそれぞれにおける肝疾患もしくは状態の可能性が増加している細胞、組織、もしくは対象のうちの１つもしくは複数におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／もしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を特徴とし得るおよび／またはそれと関連し得る肝疾患もしくは状態を有するか、または有するリスクのある対象を治療するために使用され得る。本発明の特定の態様は、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を阻害するために使用され得、細胞におけるグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）酵素活性を増加させる方法および化合物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞を、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を増加させるのに有効な量でｍｉＲＮＡ阻害化合物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞、組織、器官、および対象における肝疾患または状態を治療するために、細胞を、細胞におけるＤＮＡ過剰メチル化を低減させるのに有効な量でｍｉＲＮＡ阻害化合物と接触させることを含む。本発明はまた、対象の１つまたは複数の細胞における初期の活性レベルから、対象における肝疾患または状態の症状を低減または消失させ、対象における肝疾患または状態を治療するのに有効である、より低い活性のレベルまでｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を減少／阻害することにも部分的に関する。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を阻害することは、細胞、組織、および／または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの機能を低減させることを含む。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの機能を低減させることは、細胞、組織、または対象における、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／もしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの量の減少ならびに／またはｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／もしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ分子の活性の減少に起因し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの量を変化させずにｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させることが理解されよう。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させる本発明の方法の非限定的な例は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐを、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐに結合し、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのそれぞれの活性を阻害するマイクロＲＮＡ阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの量を低減させ、それによって細胞、組織、または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させることが理解されよう。本発明の治療方法は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／もしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させるため、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／もしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの量を低減させるため、ならびに／または細胞、組織、および／もしくは対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／もしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの量および活性の両方を低減させるために、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ阻害化合物を、細胞、組織、または対象に投与することを含んでもよい。
【００３２】
ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を阻害する分子および化合物は本明細書においてマイクロＲＮＡ阻害化合物と称される。マイクロＲＮＡ阻害化合物は、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡに対して作用する標的ｍｉＲＮＡの能力を減少させる。本明細書に使用される場合、「標的ｍｉＲＮＡ」という用語は、その活性がｍｉＲＮＡ阻害化合物によって低減するｍｉＲＮＡを意味する。本発明の特定の態様では、標的マイクロＲＮＡはｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐである。本発明のいくつかの態様では、標的マイクロＲＮＡはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐである。
【００３３】
マイクロＲＮＡ阻害化合物の投与による標的ｍｉＲＮＡの活性の低減は、その標的マイクロＲＮＡの活性の直接的または間接的阻害に起因し得る。本明細書に使用される場合、「直接的阻害」という用語は、マイクロＲＮＡ阻害化合物のその標的マイクロＲＮＡとの結合に起因するマイクロＲＮＡ活性阻害を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、直接的マイクロＲＮＡ阻害は標的マイクロＲＮＡのその標的ｍＲＮＡとの結合を低減または消失させ、それによって標的マイクロＲＮＡの活性を阻害する。本発明の特定の実施形態では、直接的マイクロＲＮＡ阻害はマイクロＲＮＡのその標的ｍＲＮＡとの結合を阻止しなくてもよいが、マイクロＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の相互作用を妨げることができ、それによってマイクロＲＮＡの活性を阻害する。本明細書に使用される場合、「間接的マイクロＲＮＡ阻害」という用語は、マイクロＲＮＡ阻害化合物のマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡとの結合に起因するマイクロＲＮＡ活性の阻害を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、間接的マイクロＲＮＡ阻害はマイクロＲＮＡのその標的ｍＲＮＡとの結合の低減または消失を生じ、それによってマイクロＲＮＡの活性を阻害する。本発明の特定の実施形態では、間接的マイクロＲＮＡ阻害はマイクロＲＮＡのその標的ｍＲＮＡとの結合を阻止しなくてもよいが、マイクロＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の相互作用を妨げることができ、それによってマイクロＲＮＡの活性を阻害する。マイクロＲＮＡ阻害化合物（直接的および間接的の両方）を調製し、使用する一般的な方法は、米国特許第８，２８８，３５６号；米国特許第８，９０６，８７１号；米国特許第８，２４７，５４３号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１３−０１７１２４２号；米国特許第９，０９６，８５０号；ならびにＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｓｉｌｅｎｃｅ  ２０１０年、１：１０（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５８−９０７Ｘ−１−１０）；Ｂａｉｇｕｄｅ，Ｈ．およびＲａｎａ，Ｔ．Ｍ．２０１４年、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）９：２５４５；Ｅｓａｕ，Ｃ．Ｃ．２００８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４：５５；ならびにＺｈａｏ，Ｊ．Ｊ．ら、２０１５年  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔなどの刊行物に記載されており；それらの各々の内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【００３４】
限定されないが、ＲＮＡ分子、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ブロックｍｉｒ（ｂｌｏｃｋｍｉｒ）、ｍｉＲＮＡスポンジ分子、アンチセンス阻害分子、バリアントｍｉＲＮＡ分子などのうちの１つまたは複数を含む化合物を含む、多くの種類のマイクロＲＮＡ阻害化合物が本発明の態様において使用され得る。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐの活性を低減させるマイクロＲＮＡ阻害化合物の非限定的な例は、ｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヘアピン阻害剤ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）であり、それは、相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）成熟マイクロＲＮＡ鎖ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐと結合し、これを隔離する一本鎖の化学的に増強されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させるマイクロＲＮＡ阻害化合物の非限定的な例は、ｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヘアピン阻害剤ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）であり、それは、相補的な成熟マイクロＲＮＡ鎖ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐと結合し、これを隔離する一本鎖の化学的に増強されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐと結合し、その活性を低減させる他の配列は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのそれぞれの配列に相補的な配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本発明のいくつかの態様では、阻害化合物、例えば、ＭＩＲ−５２６ａ、ＭＩＲ−５２０ｃ−５ｐ、ＭＩＲ−５２０Ｃ、およびＭＩＲ−５１８ｇ−５ｐは、本明細書に開示される別のｍｉＲＮＡを阻害する方法に使用される。
【００３５】
マイクロＲＮＡ活性を阻害する本発明の化合物および方法に使用され得る別の種類の分子には、限定されないが、アンタゴｍｉｒ、ブロックｍｉｒ、およびマイクロＲＮＡスポンジが含まれる。アンタゴｍｉｒは、特異的に目的の標的マイクロＲＮＡに結合し、マイクロＲＮＡの細胞内標的の活性を阻害する化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドである。本発明の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐに結合し、それを阻害するアンタゴｍｉｒおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐに結合し、それを阻害するアンタゴｍｉｒのうちの１つまたは複数は、細胞における肝疾患もしくは状態を治療するために細胞に送達され得、および／または対象における肝疾患もしくは状態を治療するために対象に送達され得る。アンタゴｍｉｒを調製し、投与する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ，Ｊ．ら、（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３８（７０６８）：６８５〜９頁；Ｃｚｅｃｈ  Ｍ．Ｐ．（２００６年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４（１１）：１１９４〜５頁；Ｔａｙ，Ｆ．Ｃ．ら、２０１５年、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．８１：１１７；Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．２０１０年、ＲＮＡ  １６：２０４３；ならびにＶｅｌｕ  Ｃ．Ｘ．２０１４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４：２２２（それらの各々はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００３６】
ブロックｍｉｒは、それらが、マイクロＲＮＡに対する結合部位として役立つ標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含むように設計される。ブロックｍｉｒはｍＲＮＡに結合し、それによってマイクロＲＮＡが標的ｍＲＮＡ上の同じ部位に結合することを立体的に遮断することによってマイクロＲＮＡ活性を阻害し、そのブロックｍｉｒはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）による標的ｍＲＮＡの分解を阻止する。ブロックｍｉｒを調製し、投与する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第８，６９１９６５号；Ｓｔｅｎｖａｎｇら  Ｓｉｌｅｎｃｅ  ２０１２年、３：１；およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ａ．２０１３年、Ｂｌｏｏｄ  １２２：２９１１（それらの各々はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００３７】
スポンジＲＮＡは、それらの「シード領域」において同じ配列を有する多重マイクロＲＮＡに結合する小合成ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡスポンジ化合物の非限定的な例は、多重ｍｉＲＮＡ標的部位を含み、それによりｍｉＲＮＡに結合でき、それを隔離できる高度に発現された導入遺伝子である。細胞に投与された（例えば細胞内に送達されたか、または細胞内で発現された）マイクロＲＮＡ「スポンジ」は、細胞における機能の連続的なｍｉＲＮＡ喪失を生じ得る。本発明の方法のいくつかの実施形態において有用なスポンジＲＮＡは、相補的な結合部位をｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐに提供するＲＮＡ配列を含み、細胞内で発現されたか、または細胞に送達された場合、スポンジＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのそれぞれの活性を阻害するように細胞内で機能する。マイクロＲＮＡスポンジの結合部位は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのｍｉＲＮＡシード領域に相補的であり、特異的であり得る。本発明の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐのシード領域はｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ配列のヌクレオチド２〜８であり得る。本発明の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのシード領域はｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ配列のヌクレオチド２〜８であり得る。スポンジＲＮＡの設計および使用は当該技術分野において周知である。例えば、Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４、７２１〜７２６頁（２００７年）ならびにＥｂｅｒｔ，Ｍ．およびＰ．Ｓｈａｒｐ、ＲＮＡ．２０１０年１１月；１６（１１）：２０４３〜２０５０頁（それらの各々はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００３８】
アンチセンス阻害方法および化合物は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させ、ＧＮＭＴ活性を増加させるために本発明の態様において使用され得る。アンチセンス阻害分子の非限定的な例は、成熟ｍｉＲＮＡを隔離し、それによって細胞内標的ｍＲＮＡと競合する抗ｍｉＲＮＡおよび化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。競合はその細胞内標的ｍＲＮＡとのｍｉＲＮＡの結合のレベルを低減させ、それによりｍｉＲＮＡの活性を阻害する。アンチセンス阻害化合物および方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ａ．Ｇ．Ｔｏｒｒｅｓら、ＲＮＡ（２０１１年）、１７：９３３〜９４３頁；およびＴｏｒｒｅｓ  Ａ．Ｇ．２０１１年、Ａｒｔｉｆ  ＤＮＡ  ＰＮＡ  ＸＮＡ  ２：７１（それらの各々はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００３９】
バリアントｍｉＲＮＡ化合物は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐもしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させ、および／またはＧＮＭＴ活性を増加させるために本発明のいくつかの実施形態において使用され得る。バリアントｍｉＲＮＡ分子の非限定的な例は、それらの標的に結合するが、結合がｍｉＲＮＡ活性を生じない「ヌル」ｍｉＲＮＡである。例えば、Ｋａｔｏｈ  Ｔ．２００９年  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２３：４３３およびＷｙｍａｎ  Ｓ．Ｋ．２０１１年  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２１：１４５０（それらの各々はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００４０】
ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増加させる方法および化合物
本発明は、マイクロＲＮＡであるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは複数の活性（例えば、レベルおよび／または機能）を増加させる方法を部分的に含む。そのような活性を増加させることにより、処理した細胞の脱分化を生じさせることができ、処理した細胞は「胎児」細胞特性を獲得することができる。本発明の組成物、化合物、および方法は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増加させ、１つまたは複数の細胞の脱分化を生じさせるように１つまたは複数の細胞を接触させる（例えば処理する）ために使用され得る。本発明の特定の態様は、細胞におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増強させるために使用され得る方法および化合物を提供し、それらにより細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性が減少する。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増強させる分子および化合物は本明細書においてマイクロＲＮＡエンハンサー化合物と称される。マイクロＲＮＡエンハンサー化合物はｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡに対して作用するその標的ｍｉＲＮＡの能力を増加させ、それによりそのマイクロＲＮＡエンハンサー化合物は標的ｍＲＮＡからのタンパク質の転写を増加させることができる。本明細書に使用される場合、「標的ｍｉＲＮＡ」という用語は、その活性がｍｉＲＮＡエンハンサー化合物によって増加するｍｉＲＮＡを意味する。本発明の特定の態様では、標的マイクロＲＮＡはｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞を、細胞におけるＧＮＭＴ酵素活性を減少させるのに有効な量でｍｉＲＮＡエンハンサー化合物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞、組織、または器官を、細胞、組織、器官におけるＤＮＡ過剰メチル化を増加させるのに有効な量でｍｉＲＮＡエンハンサー化合物と接触させることを含む。本発明の特定の態様では、接触または処理した細胞は培養細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞、またはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である。
【００４１】
細胞、対象、および対照
本発明の方法は、細胞、組織、器官および／または対象と併せて使用され得る。本発明のいくつかの態様では、対象は、ヒトまたは限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、および霊長類、例えば、サルを含む脊椎動物である。したがって、本発明はヒトおよび非ヒト対象における疾患または状態を治療するために使用され得る。本発明のいくつかの態様では、対象は、家畜、動物園の動物、飼い慣らされた動物または飼い慣らされていない動物であってもよく、本発明の方法は獣医学的予防および治療レジメンに使用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、対象はヒトであり、本発明の方法はヒトの予防および治療レジメンに使用され得る。
【００４２】
本発明が適用され得る対象の非限定的な例は、肝疾患または状態であると診断されるか、それらを有する疑いがあるか、またはそれらを有するリスクのある対象である。本発明の方法は、治療時に肝疾患もしくは状態を有すると診断されている対象、または肝疾患もしくは状態を有するか、もしくは発症するリスクがあるとみなされている対象に適用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、肝疾患または状態は急性肝疾患または状態であり、本発明の特定の態様では、肝疾患または状態は慢性肝疾患または状態である。
【００４３】
本発明の方法が適用され得る細胞には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞である細胞が含まれる。細胞は、対象中、培養物中、および／もしくは懸濁物中、または任意の他の適切な条件の状態中に存在してもよい。本発明の方法が適用され得る細胞は、肝細胞またはヒトおよび非ヒト哺乳動物細胞を含めた他の種類の脊椎動物細胞であってもよい。本発明の特定の態様では、本発明の方法が適用され得る細胞は、肝がん細胞ではない健常な正常細胞である。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法が適用され得る細胞は、肝がん細胞、転移がん細胞、前がん肝細胞、肝硬変肝細胞、がん後肝細胞、線維症肝細胞、肝細胞、炎症性肝がん細胞、および化学療法抵抗性肝細胞のうちの１つまたは複数である。本発明の特定の実施形態では、マイクロＲＮＡモジュレーターと接触する細胞は、肝がん細胞、転移がん細胞、前がん肝細胞、肝硬変肝細胞、がん後肝細胞、線維症肝細胞、肝細胞、炎症性肝がん細胞、および化学療法抵抗性肝細胞である。本発明の特定の態様では、対照細胞は正常細胞であるが、疾患または状態（例えば限定されないが肝疾患または状態）を有する細胞もまた、例えば、疾患または状態を有する未処理の細胞に対する疾患または状態を有する処理した細胞の結果を比較するなどのために特定の状況において対照細胞として役立つ場合があることが理解されよう。
【００４４】
ＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、および／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルは、本発明の方法に従って、決定され得、ＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、および／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のそれぞれの対照レベルと比較され得る。対照は様々な形態を取ることができる所定の値であってもよい。それは中央または平均などの単一のカットオフ値であってもよい。それは、正常レベルのＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、および／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を有する群ならびに低減したレベルのＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、および／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を有する群のような比較群に基づいて確立され得る。比較群の別の例は、肝疾患または状態の１つまたは複数の症状または診断を有する群ならびに肝疾患または状態の１つまたは複数の症状または診断を有さない群であってもよい。典型的に、対照は、適切な年齢幅で見かけは健常な正常の個体または見かけは健常な細胞に基づいてもよい。本発明による対照は、所定の値に加えて、実験材料と並行に試験される材料の試料であってもよいことが理解されよう。例には、実験材料と並行に試験されるように製造により生成した対照集団または対照試料由来の試料が含まれる。
【００４５】
本発明のいくつかの態様では、対象について決定されるＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のうちの１つまたは複数の値は、その同じ対象におけるＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のそれぞれの後の決定のための対照値として役立つ場合があり、それにより対象における「ベースライン」ＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性からの変化の評価を可能にする。したがって、初期のＧＮＭＴ、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性レベルは、対象、細胞、もしくは組織に存在し得るおよび／またはそれらにおいて決定され得、本発明の方法および化合物は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルを減少させ、対象についての対照レベルとして役立つ初期のレベルを用いて、その対象におけるＧＮＭＴ活性のレベルを増加させるために使用され得る。本発明の方法およびマイクロＲＮＡ阻害化合物を使用すると、細胞および／または対照におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルは、細胞および／もしくは対象のそれぞれにおける肝疾患もしくは状態の治療として初期のレベルと比較して、または細胞および／もしくは対象のそれぞれにおける非接触対照レベルと比較して、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少し得る。本発明の方法およびマイクロＲＮＡ阻害化合物を使用すると、細胞および／または対象におけるＧＮＭＴ活性のレベルは、細胞および／もしくは対象のそれぞれにおける肝疾患もしくは状態の治療として初期のレベルと比較して、または細胞および／もしくは対象のそれぞれにおける非接触対照レベルと比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２５０％、５００％、１０００％、５０００％またはそれ以上増加し得る。
【００４６】
本発明の方法およびマイクロＲＮＡエンハンサー化合物を使用すると、細胞および／または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルは、そのような接触前の細胞における初期のレベルと比較して、または非接触対照細胞レベルと比較して、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物との接触後、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２５０％、５００％、１０００％、５０００％またはそれ以上増加し得る。本発明の方法およびマイクロＲＮＡエンハンサー化合物を使用すると、細胞および／または対照におけるＧＮＭＴ活性のレベルは、そのような接触前の細胞における初期のレベルと比較して、または非接触対照細胞レベルと比較して、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少し得る。
【００４７】
治療
肝疾患および状態は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を阻害し、および／またはＧＮＭＴを増加させる本発明の方法を使用して治療され得る疾患および状態の例である。本発明の方法におけるマイクロＲＮＡ阻害剤により治療され得る肝疾患および状態には、限定されないが、肝がん、肝臓における転移がん、肝臓の前がん状態、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝硬変、がん後の肝臓状態、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、特発性肝硬変、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非代償性肝臓、脂肪性肝炎、および化学療法抵抗性が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象における化学療法抵抗性を低減させるため、ならびに腫瘍成長および再発を低減させるために使用され得る。マイクロＲＮＡ阻害化合物の投与は、がんを治療される対象における化学療法抵抗性を低減させるのに有用であり得、本発明の治療方法の不在において提示されるより、対象に対して肯定的な治療結果となる成功するがん療法の可能性を増加させ得る。したがって、本発明のマイクロＲＮＡ阻害剤の投与は、化学療法剤により治療されているか、または化学療法剤により治療される予定の対象における化学療法抵抗性を低減させることができる。
【００４８】
本発明の特定の態様では、対象は、肝疾患または状態の診断前または後のうちの１つまたは複数の時間にマイクロＲＮＡ阻害化合物を投与されてもよい。本発明のいくつかの態様では、対象は、肝疾患もしくは状態を有するか、または発症するリスクがある。肝疾患または状態を発症するリスクがある対象は、肝疾患または状態を発症する対照リスクと比較して肝疾患または状態を発症する増加した可能性を有する対象である。本発明のいくつかの実施形態では、リスクのレベルはリスクの対照レベルと比較して統計的に有意であり得る。リスクのある対象には、例えば、既存の疾患および／または遺伝的異常を有さない対照対象より対象を肝疾患または状態に罹りやすくする既存の疾患および／または遺伝的異常のある対象、それらになると予想される対象、それらを有する対象；肝疾患または状態の家族歴および／または既往歴を有する対象；ならびに以前に肝疾患または状態を治療されている対象が含まれ得る。対象を肝疾患または状態により罹りやすくする既存の疾患および／または遺伝的異常は、存在が肝疾患または状態を発症する、より高い可能性との相関関係を有すると以前に識別されている場合の疾患または遺伝的異常であり得ることが理解されよう。
【００４９】
本明細書に使用される場合、「治療する」、「治療した」、または「治療すること」という用語は、肝疾患または状態に対して使用される場合、対象が肝疾患または状態を発症する可能性を減少させる予防的治療を指してもよく、また、肝疾患もしくは状態のレベルを消失もしくは減少させるため、肝疾患もしくは状態がより進行する（例えば、より重症になる）ことを阻止するため、ならびに／またはｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の対象における活性を低減させ、対象におけるＧＮＭＴ活性のレベルを増加させる療法の不在下の対象と比較して対象における肝疾患もしくは状態の進行を遅らせるために対象が肝疾患または状態を発症した後の治療を指してもよい。
【００５０】
マイクロＲＮＡモジュレーター化合物の送達／投与
本発明のマイクロＲＮＡ阻害化合物は、肝疾患または状態を治療するためにｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を低減させ、ならびに／または対象におけるＧＮＭＴ酵素の活性を増加させるのに有効な量および様式で対象に投与され得る。本発明の方法は、いくつかの実施形態では、そのような治療を必要とする対象に、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ阻害化合物を、対象における肝疾患または状態を低減させるために投与することを含む。本発明のマイクロＲＮＡ阻害化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞のうちの１つまたは複数におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよび／またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させるために投与され得る。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性はマイクロＲＮＡ阻害化合物を細胞内に遺伝的に導入することによって低減され得る。ターゲティング剤および方法は、特異的細胞型、細胞亜型、器官、対象内の空間領域、および／または細胞内の細胞下領域へのマイクロＲＮＡ阻害化合物の送達を支援するために使用され得る。遺伝的ターゲティングなどの当該技術分野において公知の方法もまた、細胞および／または対象におけるマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の量を制御するために本発明の実施形態において使用され得る。本発明のいくつかの実施形態は、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物の遺伝学的に標的化された発現のための試薬を含んでもよい。
【００５２】
マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、本発明の方法において、個々に、または１つもしくは複数のさらなる化合物と組み合わせて投与されてもよい。肝疾患または状態を治療するために対象または細胞に投与されるマイクロＲＮＡ阻害化合物は、１つもしくは複数の他の治療剤もしくは活性と共に相乗的に作用し、１つもしくは複数の治療剤もしくは活性の有効性を増加させることができ、および／または肝疾患もしくは状態を治療する際のマイクロＲＮＡ阻害化合物の有効性を増加させることができる。
【００５３】
マイクロＲＮＡ阻害化合物の投与を含む本発明の治療方法は、肝疾患もしくは状態の発症前ならびに／または肝疾患もしくは状態の初期段階、中期段階、および後期段階を含む、肝疾患もしくは状態が存在する場合およびこれらの段階のいずれかの前後の全ての時間に使用され得る。本発明の方法はまた、対象における肝疾患もしくは状態を治療するときに成功しなかった、最低限の成功であった、および／またはもはや成功しない、１つもしくは複数の他の医薬を用いて肝疾患または状態を以前に治療されている対象を治療するためであり得る。
【００５４】
さらなるマイクロＲＮＡ阻害化合物が本発明の治療方法において識別され、使用されてもよいことが理解されよう。例えば、候補化合物が、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐのうちの１つまたは両方の活性を減少させるそれらの能力、ＧＮＭＴ酵素の活性を増加させるそれらの能力ならびに本明細書に提示されるアッセイおよび方法を使用して肝疾患または状態を治療するそれらの能力について試験されてもよい。
【００５５】
マイクロＲＮＡモジュレーター化合物の成分
本発明の方法において有用なマイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、本発明の治療方法において、単独で、または例えば、ターゲティング剤、標識化剤、膜通過送達剤、塩基配列タグなどの１つもしくは複数の要素と併用して投与されてもよい。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はマイクロＲＮＡ阻害分子からなり、本発明の特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物はマイクロＲＮＡ阻害分子および１つまたは複数のさらなる要素を含む。同様に、本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物はマイクロＲＮＡエンハンサー分子からなり、本発明の特定の実施形態では、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物はマイクロＲＮＡエンハンサー分子および１つまたは複数のさらなる要素を含む。
【００５６】
本発明の方法のいくつかの実施形態による有用なターゲティング剤は、本発明のマイクロＲＮＡモジュレーター化合物を、肝細胞もしくは他の種類の細胞などの治療される細胞におよび／または細胞内に誘導する薬剤を含んでもよい。最適なターゲティング化合物は、肝疾患または状態の性質、および標的化される細胞型に依存すると予想される。非限定的な例では、本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物を肝細胞へおよび／または肝細胞内へと標的化することが望まれ得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、任意のさらなる付着要素を有さないマイクロＲＮＡモジュレーター分子を含むことが理解されよう。例えば、本発明のいくつかの態様では、マイクロＲＮＡモジュレーターは、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物に付着した送達分子、標識などがないことを意味する、「裸の」形態で細胞および／または対象に投与されてもよく、本発明のいくつかの態様では、マイクロＲＮＡモジュレーターはトランスフェクション手段により細胞および／または対象に投与されてもよい。
【００５７】
マイクロＲＮＡモジュレーター化合物が、細胞もしくは組織−担体剤、ターゲティング剤、標識化剤、送達剤などのうちの１つもしくは複数を有する組成物にまたはその組成物内に付着される場合、当業者は、本発明の方法に使用するための適切な薬剤の選択および使用を理解しており、それらが可能であると予想される。本発明のいくつかの態様では、担体剤は、ナノ担体、ナノ粒子、細胞透過担体、ポリマー、デンドリマー、バイオコンジュゲート、脂質ベースの担体、または他の適切な担体剤のうちの１つまたは複数を含む。本発明の態様に使用され得るさらなる送達およびターゲティング手段および手順は当該技術分野において記載されている。例えば、Ｔｏｒｒｅｓ  Ａ．Ｇ．２０１１年、Ａｒｔｉｆ  ＤＮＡ  ＰＮＡ  ＸＮＡ  ７月〜１２月：２（３）：７１〜８頁、Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、（２０１２年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．６月；９（６）：６４９〜５６頁、Ｌｉ，Ｆ．およびＪ．Ｙ．Ｗａｎｇ（２００９年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．５月；６（５）：５３１〜４１頁、ならびにＰｏｅｌｓｔｒａ，Ｋ．ら、（２０１２年）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７月  ２０；１６１（２）：１８８〜９７頁（各々の内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００５８】
標識化剤は、細胞および組織におけるマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の位置を決定するために本発明の方法において使用され得、また、本発明の方法において投与されている治療化合物の細胞、組織、または器官の位置を評価するために使用され得る。酵素標識、染料、放射性標識などのような標識化剤を付着させ、利用する手段は、当該技術分野において周知である。
【００５９】
有効量
本発明の方法は、いくつかの態様では、１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ阻害化合物を、肝疾患もしくは状態を治療するための有効量、またはマイクロＲＮＡエンハンサー化合物の場合、接触した細胞の脱分化を生じさせるための有効量で対象に投与することを含む。肝疾患もしくは状態を治療すること、または細胞脱分化を生じさせることに関して使用される「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な量である。例えば、マイクロＲＮＡ阻害化合物の有効量は、（ｉ）疾患もしくは状態の進行を遅延または停止させるか；または（ｉｉ）肝疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を反転、低減、もしくは消失させるのに必要なその量であり得る。本発明のいくつかの態様では、有効量は、肝疾患または状態の治療を必要とする対象に投与される場合、肝疾患もしくは状態を予防および／または治療する治療反応を生じるマイクロＲＮＡ阻害化合物のその量である。本発明のいくつかの態様によれば、有効量は、肝疾患または状態のための別の治療的処置と組み合わせてまたは同時投与される場合、肝疾患もしくは状態を予防および／または治療する治療反応を生じるマイクロＲＮＡ阻害化合物のその量である。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物を用いて対象を治療する生物学的効果は、肝疾患または状態に起因する症状の改善およびまたは絶対的消失であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、生物学的効果は、例えば、対象が肝疾患または状態ではないことを示す診断検査によって証明されるように肝疾患または状態の完全な解消である。
【００６０】
典型的に、肝疾患または状態を治療するためのレベルまで、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐもしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を減少させ、および／またはＧＮＭＴ酵素の活性を増加させるマイクロＲＮＡ阻害化合物の有効量は、盲検試験において対照集団に対する試験集団についての有効量を確立する、臨床試験において決定される。いくつかの実施形態では、有効量は所望の反応を生じる量、例えば、肝疾患または状態を有する細胞、組織、および／または対象における肝疾患または状態を軽減する量である。したがって、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させることによって治療され得る肝疾患または状態を治療するためのマイクロＲＮＡ阻害化合物の有効量は、投与された場合、マイクロＲＮＡ阻害化合物を投与していない細胞、組織、および／または対象に存在する量より少ない量まで、対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の量を減少させる量であり得る。同様に、ＧＮＭＴ酵素活性を増加させることによって治療され得る肝疾患または状態を治療するためのマイクロＲＮＡ阻害化合物の有効量は、投与された場合、マイクロＲＮＡ阻害化合物を投与していない細胞、組織、および／または対象に存在する量より多い量まで、対象におけるＧＮＭＴ酵素活性の量を増加させる量であり得る。本発明の特定の態様では、マイクロＲＮＡ阻害化合物と接触していないか、またはそれを投与されていない細胞、組織、および／もしくは対象に存在するｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ活性、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ活性、もしくはＧＮＭＴ酵素活性のレベルは、「対照」量と称される。肝疾患または状態を治療する場合、所望の反応は、細胞、組織、および／または対象における肝疾患または状態の１つまたは複数の症状を低減または消失させることができる。低減または消失は一時的であってもよいか、または恒久的であってもよい。肝疾患または状態のステータスは、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ活性、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ活性、および／またはＧＮＭＴ酵素活性、症状の評価、臨床試験などを決定する方法を使用してモニターされ得ることが理解されよう。本発明のいくつかの態様では、肝疾患または状態の治療に対する所望の反応はまた、発症を遅延させることができるか、またはさらに肝疾患もしくは状態の発症を阻止することができる。
【００６１】
ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐもしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を減少させ、および／またはＧＮＭＴ酵素活性を増加させる化合物の有効量はまた、細胞または対象に対するマイクロＲＮＡ阻害化合物の投与の生理的効果、例えば、投与後の肝疾患または状態の減少を評価することによって決定され得る。アッセイおよび／または対象の症状モニタリングは、本発明の医薬化合物の有効性を決定するため、および治療に対する反応の存在または不在を決定するために使用され得る。限定することを意図するものではないが、例は、マイクロＲＮＡ阻害化合物による対象の治療前後の対象における肝疾患または状態のステータスを決定するための当該技術分野において公知の肝機能試験の使用である。対象に投与されるマイクロＲＮＡ阻害化合物の量は、少なくとも部分的に、疾患および／または状態ステータスのそのような決定に基づいて修飾されてもよいことが理解されよう。治療の量は、例えば、マイクロＲＮＡ阻害化合物の量を増加または減少させることによって、投与されるマイクロＲＮＡ阻害化合物の組成物を変化させることによって、投与経路を変化させることによって、投薬のタイミングを変化させることなどによって変えられてもよい。マイクロＲＮＡ阻害化合物の有効量は、治療される特定の状態、治療される対象の年齢および健康状態、状態の重症度、治療継続時間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および見解の範囲内のさらなる要因に応じて変わると予想される。例えば、有効量は、肝疾患または状態を治療するのに有効であるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐもしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性および／またはＧＮＭＴ酵素活性の所望のレベルに依存し得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに本発明の方法において使用するための特定のマイクロＲＮＡ阻害剤の有効量を経験的に決定することができる。本明細書において提供される教示と組み合わせて、様々なマイクロＲＮＡ阻害化合物ならびに効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度および好ましい投与様式などの重み係数の中から選択することによって、有効な予防的または治療的処置レジメンが特定の対象を治療するのに有効であるように計画され得る。
【００６２】
本発明の実施形態に使用される場合、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物の有効量は、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物と接触させた細胞の脱分化を増加させ、および／またはＧＮＭＴ酵素活性を減少させるのに必要なその量であり得る。本発明のいくつかの態様では、有効量は、細胞と接触させた場合、細胞において所望の生物学的効果を生じるマイクロＲＮＡエンハンサー化合物のその量である。
【００６３】
マイクロＲＮＡモジュレート医薬組成物および投薬
本発明の方法を使用して投与されるマイクロＲＮＡモジュレーター化合物はまた、本明細書において「医薬化合物」とも称される。医薬化合物の投薬量は、特に任意の合併症の事象において個々の医療供給者または獣医によって調節され得る。治療有効量は典型的に、１日または複数の日にわたって１日に１回または複数回の投与量で、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまで変わる。絶対量は、併用治療、投与回数ならびに年齢、健康状態、サイズおよび体重を含む個々の対象のパラメーターを含む様々な要因に依存すると予想される。これらは当業者に周知の要因であり、慣用の実験だけで対処され得る。いくつかの実施形態では、最大用量、すなわち、妥当な医学的判断に従う最大の安全な用量が使用され得る。
【００６４】
本発明の方法は、いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ阻害化合物の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれ以上の回数の用量を投与することを含んでもよい。いくつかの場合、医薬化合物（例えば、マイクロＲＮＡ阻害化合物、マイクロＲＮＡエンハンサー化合物、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物、またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物など）は、少なくとも毎日、一日おき、毎週、隔週、毎月などで対象に投与され得る。用量は、１日に１回または１日に１回より多く、例えば、２４時間を１つの期間として２、３、４、５回、またはそれより多い回数、投与されてもよい。
【００６５】
本発明の方法は、いくつかの態様では、医薬化合物単独、１つまたは複数の他のマイクロＲＮＡ阻害化合物との組合せ、および／または肝疾患もしくは状態を有する対象に投与される他の薬物療法もしくは治療活性もしくはレジメンとの組合せの投与を含む。医薬化合物は医薬組成物中で投与されてもよい。本発明の方法に使用される医薬組成物は、滅菌され、対象への投与に適した重量または体積の単位で所望の反応を生じるのに十分なレベルまで、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させる量のマイクロＲＮＡ阻害化合物を含有し得る。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させるマイクロＲＮＡ阻害化合物を含む医薬組成物の対象へ投与される用量は、異なるパラメーターに従って、特に使用される投与様式および対象のステータスに従って選択され得る。他の要因には、所望の治療期間が含まれる。対象の反応が適用される最初の用量で不十分である事象において、より多くの用量（または異なる、より局在化された送達経路による効果的により多くの用量）が、患者の耐性が許容される程度まで利用されてもよい。
【００６６】
投与方法
マイクロＲＮＡモジュレート化合物（例えば、マイクロＲＮＡ阻害化合物またはマイクロＲＮＡエンハンサー化合物）のための様々な投与経路が本発明の方法における使用のために利用可能である。選択される特定の送達様式は、治療される特定の状態および治療効果に必要とされる投薬量に少なくとも部分的に依存すると予想される。一般的に言えば、本発明の方法は、臨床的に許容されない副作用を引き起こさずに肝疾患または状態の治療の有効なレベルを生じる任意の様式を意味する、医学的に許容される任意の投与様式を使用して実施され得る。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、経口、腸内、粘膜、経皮、および／または非経口経路によって投与され得る。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、および胸骨内注射、または点滴技術を含む。他の経路には、限定されないが、鼻腔（例えば、胃−鼻チューブによる）、皮膚、膣、直腸、および舌下が含まれる。本発明の送達経路は、髄腔内、脳室内、または頭蓋内を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、持続放出マトリクス内に配置され得、対象におけるマトリクスの配置によって投与され得る。本発明のいくつかの態様では、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、特異的細胞または細胞小器官を標的とする送達剤でコーティングしたナノ粒子を使用して対象細胞に送達され得る。様々な送達手段、方法、薬剤は当該技術分野において公知である。送達方法および送達剤の非限定的な例は本明細書の他の部分にさらに提供される。本発明のいくつかの態様では、マイクロＲＮＡモジュレーターを参照して「送達すること」という用語は、１つまたは複数の「裸の」マイクロＲＮＡ阻害化合物配列の細胞または対象への投与を意味する場合があり、本発明の特定の態様では、「送達すること」は、トランスフェクション手段による細胞または対象への投与を意味する。トランスフェクション手段を使用するマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の送達は、細胞および／または対象へのベクターの投与を含んでもよい。
【００６７】
本発明のいくつかの方法では、１つまたは複数のマイクロＲＮＡモジュレーター化合物は、製剤中で投与されてもよく、薬学的に許容される溶液中で投与されてもよく、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、アジュバント、および任意選択に他の治療成分を慣用的に含有してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は同時投与のために別の治療剤と製剤化されてもよい。本発明の方法によれば、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物は医薬組成物中に投与されてもよい。一般に、医薬組成物はマイクロＲＮＡモジュレーター化合物および任意選択に薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は当業者に周知である。本明細書に使用される場合、薬学的に許容される担体は、肝疾患または状態を治療するために活性成分の生物活性の有効性、例えばマイクロＲＮＡ阻害化合物の能力などを妨げない非毒性物質を意味する。治療的使用のためにマイクロＲＮＡモジュレーター化合物を投与し、送達する多くの方法は当該技術分野において公知であり、本発明の方法において利用され得る。
【００６８】
薬学的に許容される担体には、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当該技術分野において周知である他の物質が含まれる。例示的な薬学的に許容される担体は米国特許第５，２１１，６５７号に記載されており、その他は当業者に公知である。そのような調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、および任意選択に他の治療剤を慣用的に含有してもよい。医薬に使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩が、その薬学的に許容される塩を調製するために便宜上使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容される塩には、限定されないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、および同種のものから調製される塩が含まれる。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製されてもよい。
【００６９】
本発明の方法のいくつかの実施形態は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡモジュレート化合物を組織に直接投与することを含む。いくつかの実施形態では、化合物が投与される組織は、肝疾患もしくは状態が存在するか、または発生する可能性がある組織であり、その非限定的な例は肝臓である。直接組織投与は直接注射または他の手段によって達成され得る。多くの経口送達される化合物は肝臓までおよび肝臓を通って自然に移動し、本発明の治療方法のいくつかの実施形態は、対象への１つまたは複数のマイクロＲＮＡ阻害化合物の経口投与を含む。マイクロＲＮＡ阻害化合物は、単独で、もしくは他の治療剤と併用して１回投与されてもよいか、または代替としてそれらは複数回の投与で投与されてもよい。複数回投与される場合、マイクロＲＮＡ阻害化合物は異なる経路を介して投与されてもよい。例えば、限定することを意図しないが、最初（または最初の数回）の投与は経口投与を介してなされてもよく、１回または複数回のさらなる投与は経口および／または全身投与であってもよい。
【００７０】
マイクロＲＮＡ阻害化合物を全身に投与することが望まれる本発明の実施形態に関して、マイクロＲＮＡ阻害化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入によって非経口投与のために製剤化されてもよい。注射用の製剤は、加えられる防腐剤と共にまたは防腐剤なしで単位剤形中、例えば、アンプル中または複数回用量容器中に存在してもよい。マイクロＲＮＡモジュレーター化合物製剤（医薬組成物とも称される）は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルションのような形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。
【００７１】
非経口投与用の調製物には、滅菌水性または非水性液剤、懸濁剤、およびエマルションが含まれる。非水性液剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁剤が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給物、電解補給物（リンゲルデキストロースに基づいたものなど）、ならびに同種のものが含まれる。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスならびに同種のものなどの防腐剤および他の添加剤も存在してもよい。より低い用量は静脈内投与などの他の投与形態に起因する。対象の反応が適用される最初の用量で不十分である事象において、より多くの用量（または異なる、より局在化された送達経路による効果的により多くの用量）が、患者の耐性が許容される程度まで利用されてもよい。必要に応じて、１日当たり複数回用量が、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ阻害化合物の適切な全身または局所レベルを達成し、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の適切な低減を達成するように使用されてもよい。
【００７２】
さらに他の実施形態では、本発明の方法は、受容者、例えば対象内への移植に適した生体適合性微粒子、ナノ粒子、またはインプラントなどの送達ビヒクルの使用を含む。この方法に従って有用であり得る例示的な生体内分解性インプラントは、生体高分子を含有するための生体適合性、生分解性ポリマーマトリクスを記載しているＰＣＴ公報第ＷＯ９５／２４９２９号（本明細書に参照により組み込まれる）に記載されている。そのような送達手段は当該技術分野において周知であり、対象におけるマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の持続放出を達成するために使用され得、分解しないが、長時間にわたる拡散によって放出するように選択され得る。
【００７３】
非生分解性および生分解性ポリマーマトリクスの両方は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡモジュレート化合物を対象に送達するために本発明の方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、マトリクスは生分解性であってもよい。マトリクスポリマーは天然または合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、一般に数時間から１年ほどまたはそれ以上の放出が望まれる期間に基づいて選択されてもよい。典型的に、数時間と３時間との間から１２カ月までの範囲の期間にわたる放出が使用され得る。ポリマーは任意選択に水中にその約９０重量％までを吸収できるヒドロゲルの形態であり、さらに任意選択に多価イオンまたは他のポリマーと架橋している。
【００７４】
一般に、マイクロＲＮＡモジュレート化合物は、本発明のいくつかの実施形態では、拡散する目的で生体内分解性インプラントを使用して、またはポリマーマトリクスの分解によって送達され得る。そのような使用のための例示的な合成ポリマーは当該技術分野において周知である。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーは、当該技術分野において公知の方法を使用してマイクロＲＮＡモジュレーター化合物を送達するために使用され得る。生体内分解性ヒドロゲルなどの生体接着性ポリマー（Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．ＰａｔｈａｋおよびＪ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３年、２６、５８１〜５８７頁（その教示は本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと）もまた、肝疾患または状態を治療するためのマイクロＲＮＡ阻害化合物を送達するために使用され得る。さらなる適切な送達系には、徐放、遅延放出または持続放出送達系が含まれ得る。そのような系はマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の反復投与を回避することができ、対象および医療従事者への利便性を増加させる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。（例えば、米国特許第５，０７５，１０９号；同第４，４５２，７７５号；同第４，６７５，１８９号；同第５，７３６，１５２号；同第３，８５４，４８０号；同第５，１３３，９７４号；および同第５，４０７，６８６号（それらの各々の教示は本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと）。加えて、ポンプベースのハードウェア送達系が使用されてもよく、そのいくつかは移植用に適合される。
【００７５】
長期間の持続放出インプラントの使用は、対象の予防的処置および再発性肝疾患または状態を発症するリスクのある対象に適切であり得る。本明細書に使用される場合、長期間の放出は、インプラントが、少なくとも１０日、２０日、３０日、６０日、９０日またはそれ以上まで治療レベルのマイクロＲＮＡ阻害化合物を送達するように構築され、配置されることを意味する。長期間の持続放出インプラントは当業者に周知であり、上記の放出系のいくつかを含む。
【００７６】
マイクロＲＮＡモジュレーター化合物の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する分子または化合物を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第２１版、（２００６年）］と混合することによって保存用に調製されてもよい。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、利用される投薬量および濃度にて受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００７７】
モジュレーター効果および治療有効性の評価
細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を減少または増加させる候補マイクロＲＮＡモジュレーター化合物の有効性の評価もまた、例えば、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増加または減少させるそれらの能力について候補マイクロＲＮＡモジュレート化合物を評価するためのスクリーニングアッセイとして培養物由来の細胞中で本発明のアッセイを使用して行うことができる。細胞、組織、または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を低減させるマイクロＲＮＡ阻害化合物は、肝疾患または状態の治療に使用され得、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増加させるマイクロＲＮＡエンハンサー化合物は、薬物試験、培養、細胞株の維持などに有用であり得る、細胞を脱分化するために使用され得る。
【００７８】
適切なアッセイは、マイクロＲＮＡ活性、例えば、細胞、組織、および対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を決定する手段を含んでもよい。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルは、本発明の様々な方法を実施するとき、多くの手段において決定され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルは、細胞、組織、または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のそれぞれの対照レベルに対して測定され得る。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルの１つの可能な測定は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の絶対レベルの測定である。これは、例えば、細胞または組織の単位ごとにｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルで表すことができる。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルの別の測定は、経時的なｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐもしくはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルおよび／もしくは活性の変化ならびに／または関連細胞および組織における経時的なＧＮＭＴ酵素のレベルおよび／もしくは活性の変化の測定である。これは、絶対量で表してもよいか、または経時的なパーセンテージの増加もしくは減少の観点で表してもよい。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐについての活性アッセイもまた、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害剤、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害剤、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐエンハンサー、またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐエンハンサー化合物の有効性を評価するために使用され得る。加えて、本発明の特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性と相関するように増加または減少するポリペプチドに結合する抗体またはその抗原結合断片が、マイクロＲＮＡモジュレーター化合物との接触（例えば処理）後のｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を評価するために使用され得る。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の減少は、少なくとも０．２％、０．５％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、７．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少であってもよく、この範囲の全ての値を含む。マイクロＲＮＡ阻害化合物との接触後のｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の減少は、対象における肝疾患または状態を治療するためのマイクロＲＮＡ阻害化合物の有効性を示すことができる。
【００８０】
当業者によって理解されるように、本発明の治療の評価はまた、肝疾患または状態の症状または臨床的エンドポイントの評価に基づいてもよく、そのような評価は、肝疾患もしくは状態のステータスならびに／または肝疾患もしくは状態の治療の有効性を評価する本発明の方法と併用して使用され得る。
【００８１】
キット
ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害化合物、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害化合物、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐエンハンサー化合物、またはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐエンハンサー化合物などの１つまたは複数のマイクロＲＮＡモジュレーター化合物および本発明の方法におけるその使用のための指示書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。本発明のキットは、肝疾患もしくは状態を治療するため、または細胞（複数可）に脱分化をもたらすように１つもしくは複数の細胞と接触させるために使用され得るマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の１つまたは複数を含んでもよい。マイクロＲＮＡモジュレーター化合物を含有するキットは本発明の治療方法に使用するために調製され得る。本発明のキットの成分は水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されてもよい。本発明のキットは、１つもしくは複数の容器手段または試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジもしくは同種のものなどの一連の容器手段を中に閉じ込めて受容するように区分化される担体を含んでもよい。第１の容器手段または一連の容器手段はマイクロＲＮＡモジュレーター化合物などの１つまたは複数の化合物を含有してもよい。第２の容器手段または一連の容器手段は、本発明の治療方法の実施形態において投与されるマイクロＲＮＡモジュレーター化合物の一部として含まれてもよいターゲティング剤、標識化剤、送達剤などを含有してもよい。
【００８２】
本発明のキットはまた、指示書を含んでもよい。指示書は典型的に記載された形態であり、キットによって具体化される治療を実施するため、およびその治療に基づいた決定を行うための指針を提供すると予想される。
【００８３】
候補化合物を識別する方法
本発明の特定の態様は、細胞、組織、および／または対象におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性を増加または減少させる本発明の方法においてマイクロＲＮＡモジュレーターとして使用され得る候補化合物を識別および／またはスクリーニングする方法を含む。方法は、候補化合物を細胞もしくは組織と接触させることおよび／または候補化合物を対象に投与することならびに細胞、組織、および／または対象の候補化合物との接触前後のｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の量を決定することを含んでもよい。適切な対照と比較したｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の量の減少は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルを減少させることができる化合物の指標であり、適切な対照と比較したｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性の量の増加は、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐまたはｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの活性のレベルを増加させることができる化合物の指標である。
【００８４】
以下の実施例は本発明の実施の特定の場合を例示するために提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者に明らかであるように、本発明は様々な組成物および方法に応用されよう。
【実施例】
【００８５】
実施例１
材料および方法
ヒト試料
肝臓ＤＮＡおよびＲＮＡは、ＢＣＬＣ組織コレクション（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃ、バルセロナ、スペイン）からのＨＣＣ患者（表１に記載される）およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｓｔｕｒｉａｓ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂａｎｋによって提供された２つの健常な肝臓から得た。
【００８６】
【表１】
2018523696.tif 000003
【００８７】
肝機能を維持し、ＢＣＬＣステージＡ（ｎ＝３４）およびＢ（ｎ＝１３）のいずれかに相当する肝硬変およびＨＣＣを有する４７人の患者が、Ｄｒａ．Ｅｒｉｃａ  Ｖｉｌｌａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｎａ  ａｎｄ  Ｒｅｇｇｉｏ  Ｅｍｉｌｉａ、モデナ、イタリア）によって提供された。さらなる情報は、Ｖｉｌｌａ  Ｅ．ら、Ｇｕｔ．２０１６年５月；６５（５）：８６１〜９頁、Ｅｐｕｂ  ２０１５年２月９日に提供されている。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言において具体化されている倫理原則に従って、研究に含まれる全ての患者から得た。
【００８８】
動物
３カ月齢のオス（Ｃ５７ＢＬ６）、ＧＮＭＴ野性型（ＷＴ）およびＧｎｍｔ−ノックアウト（ＫＯ）マウスを研究に使用した。動物処置は、ＡＡＡＬＡＣの認証を得ているＣＩＣ  ｂｉｏＧＵＮＥ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの指針に従って承認された。
【００８９】
細胞株
ヒト肝がん細胞株ＢＣＬＣ３は以前に特徴付けられており、Ｄｒ．Ｊｏｒｄｉ  ＢｒｕｉｘおよびＤｒａ．Ｌｏｒｅｔｏ  Ｂｏｉｘ（ＢＣＬＣグループＨｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃ、バルセロナ、スペイン）によって提供された。細胞を、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ−Ｆ１２中に維持した。
【００９０】
初代肝細胞の単離および培養
初代肝細胞を、Ｅｍｂａｄｅ，Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ  ２０１２年；５５：１２３７〜１２４８頁に記載されているようにコラゲナーゼ灌流によってオスのＷＴ  Ｇｎｍｔ−ＫＯマウスから単離した。接着細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有するＭＥＭ中に維持した。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイレンシング
初代ＷＴおよびＧｎｍｔ−ＫＯ肝細胞に、製造業者の手順に従ってＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用してｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヘアピン阻害剤／模倣物ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ラファイエット、ＣＯ）をトランスフェクトした。対照に非関連ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）をトランスフェクトした。模倣物トランスフェクションを特異的ｍｉＲＮＡ  ｑＰＣＲによって確認し、一方で阻害剤トランスフェクションをｑＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによってその標的ｍＲＮＡ  ＧＮＭＴのモジュレーションによって確認した。
【００９２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３阻害
３カ月齢のオスのＷＴマウスの尾静脈に、ｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヘアピン阻害剤ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐ（２．５μＭ）または非関連対照ｓｉＲＮＡを、ＢＤＬの３日後から７日後まで２日毎に製造業者の指示書に従ってｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、イルキルシュ、フランス）を使用して静脈内注射した。次いで動物を屠殺し、肝臓を除去し、液体窒素中で即座に凍結するか、または後の分析のためにホルマリン固定した。
【００９３】
免疫組織化学
パラフィン包埋した肝臓試料を切片化し、脱ろうし、水和した。免疫組織化学を、Ｂａｒｂｉｅｒ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ｌ．ら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１５年；６：２５０９〜２５２３頁に記載されているように実施した。
【００９４】
薬物治療
ＭＥＭ（０％ＦＢＳ）中で一晩培養した初代肝細胞を、示した時間の間、１００μＭのデオキシコール酸（ＤＣＡ）を用いて処理した。
【００９５】
マイクロＲＮＡ定量的リアルタイムＰＣＲ
特異的ＲＴ−ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット手順に従って分析したｍｉＲＮＡの各々について実施した。１０〜５０ｎｇのＲＮＡを反応のために使用した。定量的ＰＣＲを、製造業者の手順に従ってＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）および各ｍｉＲＮＡについての特異的プライマーを用いて実施した。あらゆる場合において、分析した各ｍｉＲＮＡを、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｍｉＲＮＡを用いて正規化した。
【００９６】
アポトーシス測定
カスパーゼ３活性アッセイを、Ｅｍｂａｄｅ  Ｎ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ（２０１２年）；５５：１２３７〜１２４８頁に記載されているように実施した。
【００９７】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ネズミおよびヒトＧＮＭＴ  ｃＤＮＡ配列は、Ｓｏｕｒｃｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（それぞれｃＤＮＡクローンＭＧＣ：１３７３８  ＩＭＡＧＥ：４２１０２３６およびｃＤＮＡクローンＭＧＣ：４５０４４  ＩＭＡＧＥ：５２２９２７２）から購入した。それらの３’ＵＴＲ配列をｐｍｉｒＧＬＯベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、サニーベール、ＣＡ）内にサブクローニングし、ｐｍｉｒＧＬＯ−ＧＮＭＴ−３’ＵＴＲを得た。肝細胞およびＢＣＬＣ３細胞に、それぞれＭＥＭまたはＤＭＥＭ−Ｆ１２中のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  Ｄｕｏトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用してｍｉＲＩＤＩＡＮマイクロＲＮＡヘアピン阻害剤／模倣物ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐまたは非関連ｓｉＲＮＡと一緒にｐｍｉｒＧＬＯまたはｐｍｉｒＧＬＯ−ＧＮＭＴ−３’ＵＴＲベクターをトランスフェクトした。細胞溶解物中のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。正規化したデータをホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケ活性の比として算出した。
【００９８】
ＳＡＭｅ測定
肝臓Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）およびＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｏｐｅｚ  Ｎ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０１２年）；１４３：７８７〜７９８ｅ１３頁に記載されているようにＬｏｃｋｓｐｒａｙイオン化源を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計に連結したＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＰＬＣシステムを使用してＬＣ／ＭＳによって決定した。
【００９９】
グローバルＤＮＡメチル化測定。質量分析による５ｍＣの定量化
グローバルＤＮＡメチル化（５ｍＣ）およびヒドロキシメチル化（５ｈｍＣ）分析を、Ｌｅ，Ｔ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１１年）；４１２：２０３〜２０９頁に記載されている方法に従って実施した。
【０１００】
統計的分析
データは平均±ＳＥＭとして表す。必要な場合、統計的有意性を、不等分散が見られたときはいつでもスチューデントのｔ検定またはウェルチのｔ検定によって決定した。ｐ値＜０．０５は有意とみなした。
【０１０１】
結果
ｍｉＲＮＡターゲティングＧＮＭＴ発現の識別
ＧＮＭＴ発現を制御できるｍｉＲＮＡを識別するために、３回の独立した不偏の手法を利用した：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＨｕｍａｎ、ＭｉｃｒｏＣｏｓｍ、およびマイクロＲＮＡ。分析から検索した広範囲の全てのデータベース一致ｍｉＲＮＡから、ヒト肝がんＢＣＬＣ細胞におけるｍｉＲＮＡパネル内に誘発されているように見える、より高いスコアを有するものを選択した（図６Ａ）。ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐおよびｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの両方は、健常な正常肝臓に対してそれらの肝がん細胞のほとんどにおいて誘発されることが見出された（図６Ａ）。加えて、これらのｍｉＲＮＡおよびＧＮＭＴレベルの発現を、ＨＣＣ患者腫瘍試料（患者の特徴は表１に記載されている）の選択したコホートにおいて評価した。有意な統計的相関関係が、ＧＮＭＴ発現が低い肝臓腫瘍と高いｍｉＲ−８７３−５ｐとの間に見出され（図１Ａの左のパネル）、一方、ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの場合、関連性は識別されなかった（図６Ｂ）。さらに、対の肝硬変組織をそれらの非肝硬変組織と比較することにより、ｍｉＲ−８７３−５ｐ発現レベルの重要な相違およびｍｉＲ−８７３−５ｐとＧＮＭＴ発現レベルとの間の有意な逆相関を識別した（図１Ａ、右のパネル）。
【０１０２】
ＧＮＭＴは主に成体肝臓において発現されるが、出生後の器官において発現は最小である。実験結果により、高分化型の肝細胞におけるＧＮＭＴレベルの増加はｍｉＲ−８７３−５ｐレベルの低減を伴うことが示された（図１Ｂ）。対照的に、培養物中の初代肝細胞の脱分化の間、ＧＮＭＴ発現の減少がｍｉＲ−８７３−５ｐレベルの増加と顕著に相関することが観察された（図１Ｃ）。
【０１０３】
ｍｉＲ−８７３−５ｐとＧＮＭＴレベルとの間の関連性を、胆管結紮（ＢＤＬ）誘発性肝線維症などの肝臓損傷マウスモデルにおいてさらに調査した。これらの状況下で、ＧＮＭＴ  ｍＲＮＡ発現はｍｉＲ−８７３−５ｐ発現の著しい増加と関連するＢＤＬの１、３および７日後に低減した（図１Ｄ）。ＢＤＬ誘発性肝線維症は肝臓における胆汁酸の蓄積の直接的な結果であり、胆汁酸、デオキシコール酸（ＤＣＡ）による初代肝細胞の処理により、ｍｉＲ−８７３−５ｐレベルの上昇を伴うＧＮＭＴ発現の下方制御が観察された（図１Ｅ）。まとめると、これらの見解は、ｍｉＲ−８７３−５ｐの発現の変化が、肝臓分化および肝臓損傷の両方において肝臓のＧＮＭＴレベルの変化と密接に関連していることを示唆しており、ＧＮＭＴ発現の調節におけるその役割を支持している。
【０１０４】
ＧＮＭＴ３’ＵＴＲはｍｉＲ−８７３−５ｐに対する結合部位を含有する
ｍｉＲ−８７３−５ｐがＧＮＭＴ発現をどのように調節するかを調査するために、ＧＮＭＴの３’ＵＴＲをルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合し、ｐｍｉｒＧＬＯベクター（ｐｍｉｒＧＬＯ−ＧＮＭＴ−３’ＵＴＲ）内にクローニングした。図６Ｃは、ＧＮＭＴの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐに対する推定結合部位を示す。ルシフェラーゼ活性により、初代野性型マウス肝細胞において、模倣物ｍｉＲ−８７３−５ｐによるトランスフェクションが、対照ｍｉＲＮＡによりトランスフェクトされたものと比較して３’ＵＴＲ  ＧＮＭＴのレポーター活性を約５０％減少させることが明らかになった（図１Ｆ、左のパネル）。他方で、ＢＣＬＣ３細胞（高レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐによって特徴付けられる）におけるｐｍｉｒＧＬＯ−ＧＮＭＴ−３’ＵＴＲによって駆動されるルシフェラーゼ活性の反応により、特異的阻害剤によってｍｉＲ−８７３−５ｐをサイレンシングした後に中和された基礎レベルでさえこのレポーター活性の低減が明らかになった（図１Ｆ、右のパネル）。全体的に、これらの結果は、ＧＮＭＴ発現の調節における重要なプレーヤーとしてのｍｉＲ−８７３−５ｐについての役割を支持した。
【０１０５】
ｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害は初代肝細胞の分化を維持する
ＧＮＭＴは肝臓分化のマーカーである（Ａｌｉｖａ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００年；３３：９０７〜９１４頁を参照のこと）。ｍｉＲ−８７３−５ｐの発現の変化が、初代肝細胞が培養物中で受ける脱分化に対抗するかどうかを評価するために、ｍｉＲ−８７３−５ｐをその特異的阻害剤を用いて阻害した。その結果により、ＧＮＭＴレベルが培養物中での増加時間に伴って徐々に低減したことが示された。加えて、ｍｉＲ−８７３−５ｐのアブレーションにより、脱分化プロセスの間、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方においてＧＮＭＴ発現が増加した（図２Ａ〜Ｄ）。有意に、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）のような極めて重要な分化マーカーならびにアルブミンおよびヘキソキナーゼ４（ＨＫ４）のような正常な分化した肝臓に関連するそれらの遺伝子は、ｍｉＲ−８７３−５ｐを遮断した後に部分的に再び安定化した（図２Ｂ）。同様に、ピルビン酸キナーゼＭ２アイソフォーム（ＰＫＭ２）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（図２Ｃ）およびグルタミナーゼ１（ＧＬＳ１）（データは示さず）のような脱分化表現型と関連する遺伝子およびタンパク質の発現は低減した。初代肝細胞における保存状態の良いシトクロムＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ）解毒系がｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害後に見出された（図２Ｄ）。この結果により、制御された下方制御下でｍｉＲ−８７３−５ｐのレベルを維持することが肝臓表現型に顕著な影響を与えるという見解が支持された。特に、培養物中の初代肝細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐノックダウン時のＧＮＭＴ発現の増加が、以前に記載されているようにＳ６Ｋの活性化、Ｓ６（Ｔｈｒ３８９）のリン酸化および４ＥＢＰ１（Ｔｈ３７／４６）の上昇を誘発するマイトジェン因子肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のレベルを上昇させることもまた、確認された。（Ｙｅｎ，Ｃ．−Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１１年：１８；２８６〜２９６頁を参照のこと）。
【０１０６】
注目すべきことに、Ｇｎｍｔ−ＫＯマウスに由来する初代肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害は肝臓表現型の喪失に対抗することができず、肝臓脱分化の間のＧＮＭＴ発現におけるｍｉＲ−８７３−５ｐの特異性をさらに強調する（図７Ａ）。しかしながら、ｍｉＲ−８７３−５ｐがＧｎｍｔ−ＫＯ肝細胞の脱分化において調節されないことに留意することが重要である。
【０１０７】
ｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害は、胆管結紮後、肝臓障害を軽減する
ｍｉＲ−８７３−５ｐおよびＧＮＭＴの変化が肝臓損傷において重要な役割を果たすかどうかを評価するために、ｍｉＲ−８７３−５ｐのレベルを、炎症反応および胆汁酸恒常性の変化が肝臓において起こったときに外科処置の３日後から開始してＢＤＬ誘発性線維症マウスモデルにおいてこのｍｉＲＮＡの特異的阻害剤によるｉ．ｖ．注射によってモジュレートした。ＢＤＬ齧歯動物におけるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害により、ＧＮＭＴ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現が正常値まで回復したことが見出された（図３Ａの上側および下側パネル）。ｍｉＲ−８７３−５ｐの特異的阻害は、ＢＤＬ後のマウスの生存率を、ｍｉＲ対照処置マウスの４０％未満の生存率と比較して劇的に、すなわち最大で１００％まで増加させた（図３Ｃ）。この効果は、カスパーゼ３活性、アポトーシス活性のリードアウトとしてＰＡＲＰの切断ならびに最終的にＡＬＴおよびＡＳＴのレベルの有意な低減を伴った（図３Ａ〜Ｅ）。加えて、Ｆ４／８０のような炎症マーカーの染色、シリウスレッドとしての線維形成指標の証拠、アルファ平滑アクチン（α−ＳＭＡ）およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）は、ｍｉＲ対照と比較してｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害されたマウスにおいて低かった（図３Ｆ）。
【０１０８】
加えて、線維形成促進性サイトカイントランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）発現およびメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）発現の低減を、ＪＮＫおよびＳｍａｄ２／３の活性の低減を伴ったノックダウン肝臓において検出した（図４Ａ）。激しい反応がｍｉＲ−８７３−５ｐが阻害された肝臓における胆汁酸代謝の再プログラミングにおいて示され（図４Ｂ）、肝細胞核因子１α（ＨＮＦ１α）およびファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）発現は回復し、ＡＢＣＧ５およびＡＢＣＧ８の上方制御による胆汁酸の能動輸送が誘発した。
【０１０９】
加えて、ＢＤＬ後の炎症反応の低減もまた、ｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害時に検出した。この結果は、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）発現、免疫反応に直接関与するケモカイン受容体のレベル、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１（ＣＸＣＬ１）および急性期応答遺伝子血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）の減少によって実証された（図４Ｃ）。さらに、炎症性シグナルインターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の減少は、ＧＮＭＴが上方制御されたままであるそれらの肝臓においてＢＤＬ後、ＳＴＡＴ３活性化によって媒介される反応を抑制した（図４Ｃ）。
【０１１０】
全体的に、データは、ｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が、肝臓障害の間、ＧＮＭＴの低減に対抗し、この腫瘍抑制遺伝子の不在に関連している線維形成促進性および炎症促進性表現型を鈍化するという結論を支持する。
【０１１１】
ｍｉＲ−８７３−５ｐの不在は胆汁酸によって媒介される初代肝細胞におけるアポトーシス反応をモジュレートする
胆汁酸は、ＢＤＬ誘発性損傷ならびに臨床線維症および肝硬変の病因に深く関与している。ＤＣＡ処理後の上昇したｍｉＲ−８７３−５ｐレベルの結果としてＧＮＭＴの下方制御に基づいて（図１Ｆ）、このｍｉＲＮＡの阻害効果を分析した。結果は、ｍｉＲ−８７３−５ｐの遮断が、ＧＮＭＴレベルの対応する増加と一致するように、初代肝細胞においてカスパーゼ３活性によって媒介されるアポトーシス反応の低減を生じたことを示した（図５Ａ）。アポトーシス活性に対する影響はＧｎｍｔ−ＫＯ肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害後に観察されず、ＧＮＭＴ発現におけるｍｉＲ−８７３−５ｐの効果の特異性が強調され、ｍｉＲ−８７３−５ｐ発現の有意な変化は、ＤＣＡ処理後、Ｇｎｍｔ−ＫＯ肝細胞において観察されなかった。野性型肝細胞におけるｍｉＲ−８７３−５ｐのアブレーション後、ＤＣＡによって媒介されるアポトーシス刺激に対する耐性はアポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の有意な増加と関連した（図５Ｂ）。さらに、肝臓恒常性を維持するための胆汁酸代謝と関連する遺伝子プロファイルの適切な調節がｍｉＲ−８７３−５ｐの不在下で識別された。胆汁酸が重要なレベルの転写因子ＨＮＦ１αを抑制する中枢機構はＨＮＦ４αの下方制御によることが以前に報告されている（Ｊｕｎｇ，Ｄ．およびＫｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋ  Ｇ．Ａ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ  ２００３年；３７：６２２〜６３１頁を参照のこと）。加えて、ＨＮＦ１αおよびＨＮＦ４αを維持する２４時間前のｍｉＲ−８７３−５ｐのアブレーションはＤＣＡの存在下で上昇した（図５Ｂ）。ＦＸＲ、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）および低分子ヘテロ二量体パートナー（ＳＨＰ）遺伝子ならびにＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣ）ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５ならびに安定なＧＮＭＴレベルと関連するＡＢＣＧ５の量の増加により、ＤＣＡの低い毒性効果が示唆された（図５Ｃ）。さらに、ｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害は、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）ＭＤＲ１、ＮＤＲ２およびＭＤＲ３成体肝臓マーカーの発現を誘発した（図５Ｄ）。最後に、ウェスタンブロットの結果により、得られたＪＮＫ活性化は、ＧＮＭＴの発現が安定なままである場合、顕著に減少し、ＤＣＡのシグナリングにおいて防御の役割を有するように見えるｃ−ｊｕｎリン酸化はｍｉＲ−８７３−５ｐの不在下で増加することが示された。
【０１１２】
肝臓ｍｉＲ−８７３−５ｐ−ＧＮＭＴ依存の阻害によって媒介されるエピゲノム機構
ＧＮＭＴは全メチル基転移フラックスの必須の調節因子であり、この酵素をエピジェネティック制御因子に関与させている。さらに、ＧＮＭＴは肝細胞分化のプロセスにおいて変化することが見出された。そのような遺伝子およびタンパク質は、ＳＡＭｅ含有量およびメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）Ｉ／ＩＩＩのようにメチル化反応（ＧＮＭＴが基本的な役割を果たす場合）と直接関連するので、ＳＡＭｅ合成を担う第１の酵素、再生ＳＡＭｅに対するメチオニン救出経路に関与するＭＴＡホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）、ならびにＳ−アデノシルホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）のアデノシン（Ａｄｏ）およびＬ−ホモシステイン（Ｈｃｙ）への可逆的加水分解を触媒する遺伝子Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）が、ｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害後に誘発された。加えて、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸の５−メチルテトラヒドロ葉酸への変換を触媒するメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）、メチオニンに対するホモシステイン再メチル化のための補基質はｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害後に明確に誘発された。したがって、ｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害は分化した肝細胞のエピジェネティックステータスを維持した。実際にｍｉＲ−８７３−５ｐのノックダウンは、肝細胞脱分化の間の細胞内メチル化能力の指標である比ＳＡＭｅ／ＳＡＨの増加を顕著に鈍化させた（表２Ａ）。
【０１１３】
【表２】
2018523696.tif 000004
【０１１４】
同様に、ＢＤＬマウスにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害は、ＳＡＭｅレベルおよびＳＡＭｅ／ＳＡＨ比の増加を阻止した（表２Ｂ）。
【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
ＤＮＡ（ＣｐＧ）メチル化は、肝臓において線維形成促進性の形質転換を駆動するエピゲノムの全体的な変化において役割を有すると記載されている（Ｍａｎｎ，Ｄ．Ａ．、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ  ２０１４年；６０：１４１８〜１４２５頁を参照のこと）。本明細書に記載される実験において、ＢＤＬの間のｍｉＲ−８７３−５ｐのノックダウンおよびＧＮＭＴ発現の増加が、全体のＤＮＡ（ＣｐＧ）メチル化速度の増加を阻止したことが見出された。
【０１１７】
この結果により、ＢＤＬ後のｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害が、ＳＴＡＴ３およびｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）リン酸化の対応する停止を伴って肝臓におけるサイトカインシグナル抑制因子３（ＳＯＣＳ３）ならびにＳＴＡＴおよびＲＡＳ経路のＲａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリーメンバー（ＲＡＳＳＦ１Ａ）阻害剤のレベルを誘発したことが示された。これらの結果は、それらの対応するプロモーターの過剰メチル化によるＧＮＭＴの慢性サイレンシング後のＳＯＣＳ３およびＲＡＳＳＦ１Ａについて以前に記載されている抑制効果と一致し（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｈａｎｔａｒ  Ｍ．Ｌ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ  ２００８年；４７：１１９１〜１１９９頁を参照のこと）、増殖の異常な度合いおよび肝臓悪性形質転換と関連した。
【０１１８】
この考えを補強すると、筋線維芽細胞分化転換における重要な阻害剤であり、したがって静止肝星細胞表現型に関連している、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）は、ＢＤＬ後、ｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害下で再発現した。ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ、ｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）はＰＰＡＲγ発現の抑制をモジュレートする（Ｍａｎｎ  Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０年；１３８：７０４〜７１４頁、７１４．ｅ１〜４を参照のこと）。現在、ＧＮＭＴの上方制御によるｍｉＲ−８７３−５ｐ阻害は、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方においてＢＤＬ後、非常に代表的なレベルの線維形成促進性のｈｕｂ  ＥＺＨ２を劇的に低減させることが確認されており、それによりこの線維形成促進性プロセスの基礎となるエピジェネティックネットワークにおける極めて重要な制御を与え、それにより肝臓ＧＮＭＴ−ｍｉＲ−８７３−５ｐ依存発現の迅速な回復は特異的遺伝子のエピジェネティック調節を導くことができるという結論を支持する。
【０１１９】
実施例２
材料および方法
ヒト試料：
肝硬変を有する患者のコホートからのＲＮＡは、Ｄｒ．Ｊａｖｉｅｒ  Ｃｒｅｓｐｏ  （Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ  Ｍａｒｑｕｅｓ  ｄｅ  Ｖａｌｄｅｃｉｌｌａ．Ｓａｎｔａｎｄｅｒ）（ｎ＝４２）およびＲａｍｉｒｏ  Ｊｏｖｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｌｅｎｃｉａ）（ｎ＝３０）によって提供された。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言において具体化されている倫理原則に従って、研究に含まれる全ての患者から得た。
【０１２０】
スーダンＩＩＩ法：
ＯＣＴ包埋した凍結試料を切片化し（８〜１２μｍ厚）、６０％のイソプロパノールで浄化し、次いで新たに調製したスーダンＩＩＩ溶液（イソプロパノール中０．５％、０．２ｍｍフィルターで濾過したスーダンＩＩＩ  Ｐａｎｒｅａｃ  Ｒｅｆ：２５１７３１．１６０６）で１時間染色し、最後に６０％のイソプロパノールで再び浄化した。切片を、製造業者の指示書に従ってマイヤーヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ：ＭＨＳ３２−１Ｌ）で対比染色し、脂質定量化のために水性封入剤で封入した。
【０１２１】
Ｈ＆Ｅ法：
パラフィン包埋した肝臓試料を切片化し（５μｍ厚）、キシレン代替品（Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｒｅｆ：ＨＳ−２０２）で脱ろうし、段階的なアルコール溶液から蒸留水まで水和した。切片をＨａｒｒｙのヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ：ＨＨＳ１２８−４Ｌ）で５分およびエオシン水溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ：ＨＴ１１０２３２−１Ｌ）で１５分染色した。試料を段階的なアルコール溶液により脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒで１０分間浄化した。最後に切片をＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ  ０６５２２−５００ｍｌ）で封入した。
【０１２２】
シリウスレッド法：
パラフィン包埋した肝臓試料を切片化し（５μｍ厚）、キシレン代替品（Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｒｅｆ：ＨＳ−２０２）で脱ろうし、段階的なアルコール溶液から蒸留水まで水和した。切片を、飽和ピクリン酸中の０．０１％のファストグリーンＦＣＦで１５分間染色し、すぐに飽和ピクリン酸中の０．０４％のファストグリーンＦＣＦ／０．１％のシリウスレッド中に１５分間入れた。切片を１００％のアルコール中で３０秒間直接脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒで１０分間浄化した。最後に切片をＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ  ０６５２２−５００ｍｌ）で封入した。
【０１２３】
α平滑筋アクチン免疫蛍光
脱ろうし、再水和した切片を、沸騰の選択を可能にせずに２０分の間、９７℃にてＰＴリンクモジュール（ＤＡＫＯ  Ｄｅｎｍａｒｋ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グロストルプ、デンマーク）中で１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．０を用いて抗原回復に供し、次いでヤギ抗マウスＦａｂ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ＰＡ）（１時間、ＲＴ、１：１０）を用いて遮断し、続いて３％過酸化水素と１０分インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。次いで切片を、ＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清を用いて３０分間遮断し、室温にて１時間、一次Ｃｙ３−ＳＭＡ抗体（１：２００）（Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ：Ｃ６１９８）とインキュベートした。スライドをＤＡＰＩで対比染色し、ＤＡＫＯ蛍光封入剤（ＤＡＫＯ  Ｒｅｆ：Ｓ３０２３）で封入した。
【０１２４】
Ｆ４／８０免疫組織化学：
脱ろうし、再水和した切片を、室温にて１５分、プロテイナーゼＫを用いて抗原回復に供した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素との１０分のインキュベーションにより遮断し、次いで切片を、ＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清を用いて３０分間遮断し、Ｆ４／８０一次抗体（１：５０、３７℃にて１時間、Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｒｅｆ：ＭＣＡ４９７ＢＢ）（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ）と、続いて３０分抗Ｒａｔ  Ｉｍｍｐｒｅｓｓ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｆ：ＭＰ−７４０４）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、ＣＡ）とインキュベートした。比色検出をＶｅｃｔｏｒ  Ｖｉｐ紫基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｆ：ｓｋ−４６００）を用いて完了した。スライドをマイヤーヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ：ＭＨＳ３２−１Ｌ）により対比染色し、最後に試料を段階的なアルコール溶液により脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒにより浄化し、ＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ  ０６５２２−５００ｍｌ）で封入した。
【０１２５】
グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）（免疫組織化学）：
再水和した切片を、ヤギ抗マウスＦａｂ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（１時間、室温、１：１０）を用いて遮断し、次いで、マウスモノクローナル抗ＧＮＭＴ一次抗体（１：４００）、続いてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス抗体Ｅｎｖｉｓｉｏｎシステム（ＤＡＫＯ）により室温にて３時間染色し、ペルオキシダーゼ基質３，３  ３−ジアミノ−ベンシジン色原体（ＤＡＫＯ）により染色し、ヘマトキシリンにより対比染色した。
【０１２６】
抗ｍｉＲ−８７３−５ｐの静脈内（ｉ．ｖ．）投与：
抗ｍｉＲ−８７３−５ｐをｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）。使用した抗Ｍｉｒ−８７５−５ｐはＤｈａｒｍａｃｏｎ（ｈｓａ−ｍｉＲ−８７３−５ｐ）から購入した。これらのヘアピン阻害剤は、機能性を高め、ｍｉＲ−８７３における以下の配列：ｇｃａｇｇａａｃｕｕｇｕｇａｇｕｃｕｃｃｕ（ヒトについての配列番号１）（ｍｉＲＢａｓｅ受託番号：ＭＩＭＡＴ０００４９５３）を標的とするように所有者の修飾パターンを用いて設計した一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。これらの配列は相補的な成熟マイクロＲＮＡ鎖に結合し、それを隔離する（実施例１も参照のこと）。Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を送達系として使用して、抗ｍｉＲＮＡの肝細胞内へのｉｎ  ｖｉｖｏ送達の高効率を得た。製造業者の推奨に従って、１．７ｍｇ／Ｋｇをｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３．０と組み合わせて使用した。抗ｍｉＲＮＡのＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとの調製を製造業者によって推奨されるように実施した。マウスに１５０μｌの抗ｍｉＲＮＡ／ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを週に２回投与した。
【０１２７】
ｑＰＣＲ法：
２μｇの得られたＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により処理し、ｃＤＮＡをランダムプライマーおよびＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でＭ−ＭＬＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。得られたｃＤＮＡをＲＮａｓｅフリー水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１／２０に希釈し、５マイクロリットルをＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲを、合計２０μｌの反応体積で、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を備えたＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５  Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒおよび特異的プライマーを使用して実施し、全ての反応を３連で実施した。これらのプライマーについてのＰＣＲ条件を最適化し、６０℃の融解温度、および各ステップ３０秒で４０サイクルを使用した。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  ３  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって合成された。ＰＣＲ産物の特異性を融解曲線によりチェックした後、Ｃｔ値を試料と同時に実施した標準曲線に外挿し、次いでデータをハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現に正規化した。
【０１２８】
マイクロＲＮＡ定量的リアルタイムＰＣＲ
特異的ＲＴ−ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ手順に従って、ｍｉＲ−８７３−５ｐについて実施した。１０〜５０ｎｇのＲＮＡを反応のために使用した。ｑＰＣＲを、製造業者の手順に従って、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｍｉＲ−８７３−５ｐについての特異的プライマーを用いて実施した。ｍｉＲ−８７３−５ｐを、Ｕ６  ｓｎＲＮＡを用いて正規化した。
【０１２９】
動物
３カ月齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを研究において使用した。動物処置は、ＡＡＡＬＡＣ認証を有するＣＩＣ  ｂｉｏＧＵＮＥ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの指針に従って承認された。マウスに、標準的な維持食、メチオニンおよびコリン欠乏食（ＭＣＤＤ）、高脂肪食（ＨＦＤ）または高コレステロール食（ＨＣＤ）を与えた。
【０１３０】
採血法および試料の取り扱い
顎下腺血液試料を、滅菌４ｍｍランセット（ＭｅｄｉＰｏｉｎｔ、ミネオラ、ＮＹ）を用いて無麻酔マウスの右顎下腺静脈を切開することによって得た。眼窩後方の血液試料を、麻酔マウスの右眼窩後方網状組織から採取した。各マウスを、目盛り付きの噴霧器を用いて調節した４％のイソフルランを含む吸入チャンバ（ＩｓｏＦｌｏ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バークシャー、ＵＫ）に配置することによって麻酔を誘導した。血液試料を血清セパレーターゲルチューブ（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンパーク、ＮＪ）中に堆積させ、血清分離のために遠心分離した（９，３００×ｇ、１５分、４℃）。
【０１３１】
臨床化学パラメーター
血清生化学のパネルが実施され、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ−ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ−ＧＰＴ）、トリグリセリド、グルコース、コレステロール、タンパク質およびアルブミンを含んだ。製造業者の提案されたプロトコールに従って、Ｓｅｌｅｃｔｒａ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｐｉｎｌａｂ  １００分析器（Ｖｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ディーレン、オランダ）を使用して試料を分析した。較正した対照を各使用前に実施し、それらは試料を分析する前に確立した範囲内であった。
【０１３２】
総脂質の定量化
肝臓（３００ｍｇ）を均質化し、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．、およびＷ．Ｊ．Ｄｙｅｒ（１９５９年）Ｃａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８月；３７（８）：９１１〜７頁に記載されているように脂質を抽出した。製造業者の指示書（Ａ．Ｍｅｎａｒｉｎｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、イタリア）に従ってキットを使用してＴＧを定量した。血清を血液から抽出し、製造業者の指示書を使用してＷａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ（リッチモンド、ＶＡ）製の市販のキットを使用してケトン体を定量した。ケトン体定量のために使用したキットは以下であり、それは２つの成分および較正キットを有する）：Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｔ−ＫＢ  Ｒ１  Ｓｅｔ  ｒｅｆ  ４１５−７３３０１、Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｔ−ＫＢ  Ｒ２  Ｓｅｔ  Ｒｅｆ  ４１３−７３６０１；およびケトン体較正器３００  Ｒｅｆ  ４１２−７３７９１。
【０１３３】
結果
ＮＡＦＬＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現
ＧＮＭＴ発現およびＳＡＭｅ代謝は脂肪症および脂肪性肝炎を有する患者において著しく機能が損なわれる。ｑＰＣＲを使用して、ＧＮＭＴおよびｍｉＲ−８７３−５ｐ発現を、健常な対照患者およびＮＡＦＬＤ患者の肝臓試料において測定し、ｍｉＲ−８７３−５ｐレベルの増加を伴うＧＮＭＴの減少が明らかになった（図９Ａ〜Ｂ）。加えて、ＧＮＭＴ−ｍｉＲ−８７３レベルの間の有意な逆相関が確認された（図９Ｃ）。最終的に、ｍｉＲ−８７３−５ｐレベルは、健常な対照患者と比較してＮＡＦＬＤに罹患している患者由来の血清試料中で増加することが見出された（図９Ｄ）。
【０１３４】
ＮＡＦＬＤマウスモデルにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐ発現
脂肪肝の発症におけるＧＮＭＴ／ｍｉＲ−８７３調節の役割を研究するために、ＧＮＭＴおよびｍｉＲ−８７３−５ｐの両方の発現レベルを異なるＮＡＦＬＤマウスモデルにおいて測定した。マウスに、標準的な維持食、メチオニンおよびコリン欠乏食（ＭＣＤＤ、図１０Ａ）、高脂肪食（ＨＦＤ、図１０Ｂ）または高コレステロール食（ＨＣＤ、図１０Ｃ）を与えた。研究した食餌全てにおいて、ＧＮＭＴとｍｉＲ−８７３−５ｐ発現との間の逆相関が観察され、ＮＡＦＬＤの発症においてｍｉＲ−８７３−５ｐの役割が示される。
【０１３５】
ＭＣＤＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの阻害はＮＡＦＬＤ発症に対抗する
ＮＡＦＬＤにおけるｍｉＲ−８７３−５ｐの役割を研究するために、マウスにＭＣＤ食を４週間与え、ｍｉＲ−８７３−５ｐを、３週間にわたる週に２回の尾静脈注射によって特異的抗ｍｉＲ−８７３−５ｐにより阻害した。ＭＣＤ食後のｍｉＲ−８７３−が阻害されたマウスの免疫組織化学（ＩＨＣ）による最終的な特性付けは、より低い量の肝臓脂質含有量（スーダンレッド）、ならびに炎症性および線維形成促進性マーカー（Ｆ４／８０、シリウスレッドおよびαＳＭＡ）の減少を示す。これらの結果は対照ＭＣＤ食マウスと比較して増加したＧＮＭＴレベルを伴った（図１１Ａ〜Ｃ）。さらに、ＭＣＤ食マウスから採取した血清の分析により、少ない肝臓の損傷を示す抗ｍｉＲ−８７３−５ｐで処置したマウスにおいて肝臓トランスアミナーゼレベル（ＧＯＴ、ＧＰＴ）の減少が示された。他の血清マーカーにより、ケトン体の増加と一緒にトリグリセリドの減少が明らかになり（図１１Ｄ〜Ｆ）、肝臓から血液までのトリグリセリドの低減した輸送および血液中のケトン体の結果として生じた増加と共に肝臓における脂肪酸酸化の増加が示される。最終的に、これらの肝臓の総脂質含有量を分析した。この場合、研究により、ｍｉＲ−８７３阻害がＭＣＤ食の終わりに肝臓における異なる脂質の有意な低減を媒介することが示され、遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびコレステロールのより少ない含有量が示される（図１１Ｇ）。
【０１３６】
考察
メタボリックシンドロームは臨床的因子：糖尿病、腹部肥満、高コレステロールおよび高血圧の集まりである。世界の成人集団のうちの約２０〜２５パーセントがメタボリックシンドロームを有し、そのシンドロームを有していない人々と比較して心臓発作または脳卒中が原因で死亡する可能性が２倍になり、心臓発作または脳卒中を有する可能性が３倍になると推定される。加えて、メタボリックシンドロームを有する人々は２型糖尿病を発症する５倍高いリスクを有する。毎年、世界中で３２０万人の人々が糖尿病に関連する合併症が原因で死亡している。さらに、肥満は世界中に広まっている。ヒトの歴史において初めて、過体重の人々の数が低体重の人々の数に匹敵している。世界的に、１０億人超の過体重の成人が存在し、約３億人が臨床的に肥満である。肥満はＥＵの異なる地域において医療費の２〜８％および死因の１０〜１３％を占める。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は最も一般的な肝疾患である。なぜなら、その患者数は西洋諸国の一般集団において２０〜３０％であると推定されるからである。ＮＡＦＬＤはメタボリックシンドロームの特徴と強く関連することが示されている。インスリン耐性はＮＡＦＬＤおよびメタボリックシンドロームの両方における重要な病原因子である。臨床、実験および疫学研究からの利用可能なデータにより、ＮＡＦＬＤがメタボリックシンドロームの肝臓の兆候であり得ることが示される。
【０１３７】
グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）は、哺乳動物の肝臓における全メチル基転移フラックスの必須の調節因子である。異なるＤＮＡメチル化パターンは、肝臓発生、肝臓脱分化および肝疾患進行の特性であり、それらの中でＧＮＭＴのレベルが機構によって劇的に減少するプロセスである、ＮＡＦＬＤ、線維症、肝硬変および肝がんはまだ十分に理解されていない［Ａｖｉｌａ  ＭＡら、（２０００年）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３３：９０７〜９１４１頁］。
【０１３８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡサイレンシングによって、または転写後レベルにおいての両方で遺伝子発現を調節する高度に保存された非コード低分子ＲＮＡの新たに出現したクラスである［Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｙ  ｗ．ら、（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１５：３３１〜３４１頁］。ｍｉＲＮＡは、分化および代謝、ならびに増殖、アポトーシスおよび腫瘍形成のような細胞応答を含む必須の生物学的プロセスを調節する［Ｍｅｌｔｚｅｒ，Ｐ．Ｓ．（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：７４５〜７４頁］。肝臓において、ｍｉＲＮＡの痕跡は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変および肝がんに関与している［Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．（２００８年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３５８：５０２〜５１１頁］。
【０１３９】
興味深いことに、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐについての推定結合部位をＧＮＭＴの３’ＵＴＲにおいて識別し、ＧＮＭＴ調節におけるｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐについての潜在的な役割を示唆している。ここで、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐの肝臓発現はＮＡＦＬＤ患者のコホートにおいて増加することが識別された。これらの状況下で、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐの阻害はＧＮＭＴレベルを誘発した。実際に、ｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐ阻害によるＧＮＭＴ発現の回復は、脂肪肝食下のマウスにおいて脂肪症および脂肪性肝炎の発症を低減させた。まとめると、この結果により、ＮＡＦＬＤおよび他の肝疾患における新たな治療手法としてのｍｉＲＮＡ−８７３−５ｐの役割が強調される。
【０１４０】
実施例３
ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの阻害
同様に実験を、抗ｍｉＲ−５１８−５ｐ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して実施する。本明細書の実施例１および２における方法を参照のこと。抗Ｍｉｒ−５１８−５ｐはＤｈａｒｍａｃｏｎ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８−５ｐ）から得る。これらのヘアピン阻害剤は、機能性を高め、ｍｉＲ−５１８における以下の配列：ｃｕｃｕａｇａｇｇｇａａｇｃａｃｕｕｕｃｕｇ（ヒトについての配列番号８）（ｍｉＲＢａｓｅ受託番号：ＭＩＭＡＴ０００５４５６）を標的とするように所有者の修飾パターンを用いて設計した一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。抗ｍｉＲ配列は相補的な成熟マイクロＲＮＡ鎖に結合し、それを隔離する。実施例１および２も参照のこと。阻害実験は本明細書の実施例１および２に示されるように実施する。実験により、ｍｉＲ−５１８ｄ−５ｐの阻害がＧＮＭＴレベルを誘発することが実証される。ｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐ阻害によるＧＮＭＴ発現の回復は脂肪肝食下でマウスにおける脂肪症および脂肪性肝炎の発症を低減させる。まとめると、この結果により、ＮＡＦＬＤおよび他の肝疾患における治療手法としてのｍｉＲＮＡ−５１８ｄ−５ｐの役割が強調される。
【０１４１】
等価物
本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載し例示したが、当業者は、機能を実施するためならびに／あるいは本明細書に記載される結果および／または利点の１つもしくは複数を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変更および／または修飾の各々は本発明の範囲内であるとみなされる。より一般には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および構成が例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途（複数も含む）に依存することが容易に理解されよう。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を慣用の実験のみを使用して認識するか、または解明することができよう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されること、および添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内であることが理解され、本発明は具体的に記載され、請求されているもの以外で実施されてもよい。本発明は、本明細書に記載される各々の個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組合せは、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が互いに矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４２】
本明細書に定義され、使用される場合、全ての定義は、辞書的定義、参照により組み込まれる文献における定義、および／または定義された用語の通常の意味よりも優先されることが理解されるべきである。
【０１４３】
本明細書および特許請求の範囲のそれらの中で使用される場合、不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確に反対に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１４４】
本明細書および特許請求の範囲のそれらの中で使用される場合、「および／または」という語句は、そのように結合した要素、すなわちいくつかの場合、接続的に存在し、他の場合、選言的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。明確に反対に示されない限り、具体的に特定されたそれらの要素に関連するかまたは関連しないかに関わらず、「および／または」という節によって具体的に特定された要素以外の他の要素が任意選択に存在してもよい。
【０１４５】
本出願において引用されているか、または参照されている全ての参考文献、特許および特許出願ならびに刊行物は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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