(57)【要約】  毛乳頭細胞（dermal papilla cell）及び真皮鞘細胞（dermal sheath cell）にのみ特異的に結合し、細胞の増殖及び生存及び活性化の効能を有した機能性抗体及びその用途に係り、さらに具体的には、該機能性抗体を利用した脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物／化粧料組成物、及び脱毛防止方法または発毛促進方法に係わるが、該機能性抗体は、毛乳頭細胞にのみ特異的に発現している受容体タンパク質との結合を介して、細胞信号伝逹を介して、毛乳頭細胞の増殖及び生存及び活性化を促進し、それを介して、発毛を増進させうることを確認したが、脱毛の防止または治療において、さらに根本的にアプローチし、ターゲット治療が可能であり、毛乳頭細胞を含む細胞治療剤生産にも寄与することができると期待される。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７で表示されるアミノ酸配列からなるＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合する抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２、及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２、及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項４】
前記抗体は、配列番号７で表示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８で表示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項５】
前記抗体は、配列番号９で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＨＣＤＲ１、配列番号１０で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＨＣＤＲ２、及び配列番号１１で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＨＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＬＣＤＲ１、配列番号１３で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＬＣＤＲ２、及び配列番号１４で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＬＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１５で表示されるポリヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１６で表示されるポリヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項７】
前記抗体は、単一クローン抗体またはポリクローン抗体であることを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項８】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＩｇＮＡＲ、ｈｃＩｇＧ、（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４、［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ミニボディ（minibody）、ジアボディ（diabody）、トリボディ（tribody）、ナノボディ（nano body）及びキャメルボディ（camel body）からなる群から選択されるいずれか１つの軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
【請求項９】
請求項１に記載のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質を動物に注入する段階を含む抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法。
【請求項１０】
配列番号７及び配列番号８からなるアミノ酸配列をコーディングする単離されたポリヌクレオチドを含む抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片生産用発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片生産用発現ベクターで試験管内形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、バクテリア（Ｅ．Ｃｏｌｉ）や酵母（yeast）などの微生物、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及び抗体生産ハイブリドーマ細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現ベクターを利用し、宿主細胞に感染させる段階を含む試験管内抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを含む脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記抗体タンパク質は、前記抗体は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２、及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２、及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、毛乳頭細胞または真皮鞘細胞と特異的に結合し、前記毛乳頭細胞の増殖を促進させることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、ペースト剤及びカタプラズマ剤で構成された群から選択された剤形に製剤化されることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを含む脱毛防止用または発毛促進用の化粧料組成物。
【請求項１９】
前記抗体タンパク質は、前記抗体は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２、及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２、及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１８に記載の化粧料組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャクリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアロゾール、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘアせっけん、ヘオクレンジングフォーム、髪油、毛髪乾燥剤、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアジェル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムース及びヘアスプレーによって構成された群から選択された剤形に製剤化されることを特徴とする請求項１８に記載の化粧料組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組成物を頭皮に塗布したり噴霧したりする段階を含む脱毛防止方法または発毛促進方法。
【請求項２２】
下記の段階を含む毛乳頭細胞または真皮鞘細胞の量産方法：
ａ）頭皮から毛乳頭細胞または真皮鞘細胞を分離する段階、及び
ｂ）前記分離された毛乳頭細胞または真皮鞘細胞に、請求項２ないし８のうちいずれか１項に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体を処理する段階。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって生産された毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞を含む毛髪再生のための細胞治療剤。
【請求項２４】
請求項１０に記載の抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の脱毛防止用途または発毛促進用途。
【請求項２５】
請求項１に記載のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを、脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物または化粧料組成物の製造に利用する用途。
【請求項２６】
薬学的に有効量の請求項１に記載のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む脱毛の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛乳頭細胞（dermal papilla cell）の増殖を促進する役割を行い、生存能力を増進させ、細胞を活性化させる機能を有した抗体及びその用途に係り、さらに具体的には、前記抗体を利用した脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物／化粧料組成物、及び脱毛防止方法または発毛促進方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
脱毛は、正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪がない状態をいい、一般的に、頭皮の成毛（太くて黒い毛髪）が抜けることを意味する。ヒト毛髪数は、約１０ないし１５万本ほどであり、成長期（anagen）、退行期（catagen）及び休止期（telogen）という固有の発毛周期を有し、成長及び脱落を反復し、一日平均５０−７０本ほどの毛髪が自然的に脱毛する。脱毛のメカニズムが正確に明らかにされていないが、これまで研究されたところでは、ホルモン不均衡など内分泌系異常、自律神経系、及び血液循環障害などの循環系の異状による過度な皮脂生成、毛根の栄養欠乏、アレルギー、細菌感染、遺伝的要因、精神的ストレス、大気汚染または飲食物などの環境的要因、及び老化などがその原因と推定されている。
【０００３】
一方、韓国内脱毛人口は、約１，０００万人であり、国民５人中１人が脱毛によって苦痛を受けている。従来、脱毛は、中壮年層で主に発生した一方、最近では、２０〜３０代の若年層でも頻繁に発生しながら、脱毛患者の年齢がだんだんと低くなっている。また、国民健康保険審査評価院によれば、韓国の脱毛診療人口は、毎年３．６％ずつ増加しており、２０１３年基準で、２０〜３０代のの比率が４５％に至り、そのうち女性が４０％以上を占めるほど脱毛人口の構成員が多様になっている。
【０００４】
かような脱毛は、精神的ストレスとして生活の質を低下させ、対人関係や社会生活に、決して小さくない支障をきたす。社会生活において、外貌から漂うイメージは、非常に印象的にアプローチし、その外貌の大切さが、自尊感や社会生活の見えない活力素になるという点において、脱毛の原因及びその治療に対する関心が日に日に高まっている。
【０００５】
そのために、脱毛症を緩和または治療するために、多くの研究が進められており、特に、毛髪成長を刺激させたり、脱毛現象を緩和させたりするための新物質開発のために、化粧品または製薬の産業分野で、かなり前から研究がなされてきており、それにより、女性ホルモン剤、血流促進剤などを使用する薬物療法や毛髪移植法などが開発された状態である。現在、脱毛治療に最も多く使用される薬物としては、ＦＤＡから承認を受けた２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピリミジン−３−オキシド（通称名「ミノキシジル（Minoxidil）」製剤、アメリカ特許第４，１３９，６１９号明細書及び同第４，５９６，８１２号明細書を参照）と、ＩＩ型５α還元酵素の特定抑制剤であるフィナステリド（finasteride）とが挙げられる。
【０００６】
ミノキシジル製剤は、血管拡張効果を介して、血流量を増加させる方法であり、高血圧治療剤として開発された薬物であったが、かような効果が、毛根に連結された血管も膨脹させ、血液から多様な栄養分を供給されることにより、毛髪の成長も誘導することができる。ロゲイン（Rogaine，Pharmacia & Upjohn Companyの商標名）として市販されているこの成分は、女性及び男性の脱毛患者に主に利用されているが、外皮用製剤であり、規則的に６ヵ月以上長期間にわたって使用しなければならず、発毛効能が非常に低い。また、ミノキシジルは、毛髪再生効能よりは、脱毛防止役割が強く、臨床研究の結果、約３０％以下の脱毛症患者においてだけ効果があると知られている。そして、ミノキシジルを含む脱毛治療用組成物は、臭いがきつく、高粘度性製品としての使用の不便さがあり、頭分泌物との固まり現象により、かえって頭皮の非衛生的な問題により、皮膚炎症を誘発するというような問題点がある。
【０００７】
また、フィナステリドを活性成分として使用した医薬品は、商品名プロペシア（Propecia，Merck ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．の商標名）として市販されており、それは、本来前立腺治療剤として開発されたが、臨床試験中に発毛の効果が明らかにされながら、前立腺治療剤だけではなく、発毛剤としても使用されている。それは、経口投与用丸剤であり、ＩＩ型５α還元酵素の機能を抑制し、男性ホルモンであるテストステロンが、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ：dihydrotestosterone）に転換されることを防止するものであり、毛髪再生に直接的な作用を行うものではない。また、それも、持続的であって規則的な服用を必要とし、男性脱毛患者には、男性ホルモン抑制による性欲減退、勃起不全のような副作用があり、女性及び子供には処方が禁止されている薬品である。
【０００８】
それゆえに、前述のような問題を解消すべく、新たな脱毛治療剤に係わる研究が活発に進められているが（韓国公開特許１０−２０１５−００８３０５４）、いまだに十分ではない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前述のような問題点を解決するために案出されたものであり、毛髪再生過程において、毛乳頭細胞は、毛根幹／前駆細胞の増殖及び分化を調節するタンパク質を分泌し、発毛周期調節に最も中枢的な役割を担当している。かような毛乳頭細胞の細胞膜にだけ発現している受容体タンパク質ＩＧＤＣＣ４に特異的に結合することにより、毛乳頭細胞を増殖及び活性化させ、毛髪再生に関与する多様な調節因子の生産を促進させる機能性抗体タンパク質を最初に究明し、それに基づいて、本発明完成に至った。
【００１０】
それゆえに、本発明の目的は、配列番号１７で表示されるアミノ酸配列からなるＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質を提供することである。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合することを介して、毛乳頭細胞の増殖、生存及び活性化の誘導作用を有している抗ＩＧＤＣＣ４機能性抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を提供することである。
【００１２】
また、本発明のさらに他の目的は、ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質に直接結合し、毛乳頭細胞の機能を促進する機能性抗体タンパク質を作製する段階を含む抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明のさらに他の目的は、配列番号７及び配列番号８からなるアミノ酸配列をコーディングする単離されたポリヌクレオチドを含む、抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその断片生産用発現ベクター、それを介して形質転換された宿主細胞、及びそれを利用した試験管内抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法を提供することである。
【００１４】
また、本発明のさらに他の目的は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを含む、脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物及び／または化粧料組成物を提供することである。
【００１５】
また、本発明のさらに他の目的は、前記組成物を頭皮に塗布したり噴霧したりする段階を含む脱毛防止方法または発毛促進方法を提供することである。
【００１６】
また、本発明のさらに他の目的は、ａ）頭皮から毛乳頭細胞または真皮鞘細胞を分離する段階；及びｂ）前記分離された毛乳頭細胞または真皮鞘細胞に、前記抗ＩＧＤＣＣ４抗体を処理する段階を含む毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞の量産方法を提供することである。
【００１７】
また、本発明のさらに他の目的は、前記方法によって生産された毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞を含む、毛髪再生のための細胞治療剤を提供することである。
【００１８】
また、本発明のさらに他の目的は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物または化粧料組成物の製造に利用する用途を提供することである。
【００１９】
また、本発明のさらに他の目的は、薬学的に有効量の前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、脱毛の治療方法を提供することである。
【００２０】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されるものではなく、言及されていないさらに他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前述のような本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１７で表示されるアミノ酸配列からなるＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質を提供する。
【００２２】
また、本発明は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合することを介して、毛乳頭細胞の増殖、生存及び活性化の誘導作用を有している抗ＩＧＤＣＣ４機能性抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を提供するものである。
【００２３】
本発明の一具現例として、前記抗体は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、配列番号２で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２、及び配列番号３で表示されるアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２、及び配列番号６で表示されるアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００２４】
本発明の他の具現例として、前記抗体は、配列番号７で表示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８で表示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００２５】
本発明のさらに他の具現例として、前記抗体は、配列番号９で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＨＣＤＲ１、配列番号１０で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＨＣＤＲ２、及び配列番号１１で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＨＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＬＣＤＲ１、配列番号１３で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＬＣＤＲ２、及び配列番号１４で表示されるポリヌクレオチド配列からなるＬＣＤＲ３からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００２６】
本発明のさらに他の具現例として、配列番号１５で表示されるポリヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１６で表示されるポリヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００２７】
本発明のさらに他の具現例として、前記抗体は、単一クローン抗体またはポリクローン抗体でもある。
【００２８】
本発明のさらに他の具現例として、前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＩｇＮＡＲ、ｈｃＩｇＧ、（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４、［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ミニボディ（minibody）、ジアボディ（diabody）、トリボディ（tribody）、ナノボディ（nano body）及びキャメルボディ（camel body）からなる群から選択されるいずれか１つの軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含んでもよい。
【００２９】
また、本発明は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質を動物に注入する段階を含む抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法を提供する。
【００３０】
また、配列番号７及び配列番号８からなるアミノ酸配列をコーディングする単離されたポリヌクレオチドを含む、抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその断片生産用発現ベクター、それを介して形質転換された宿主細胞、及びそれを利用した試験管内抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法を提供する。
【００３１】
本発明の一具現例として、前記宿主細胞は、バクテリア（Ｅ．Ｃｏｌｉ）や酵母（yeast）などの微生物、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及び抗体生産ハイブリドーマ細胞からなる群から選択されたいずれか一つでもある。
【００３２】
また、本発明は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを含む、脱毛防止用または発毛促進用の薬学的／化粧料組成物を提供する。
【００３３】
本発明の一具現例として、前記組成物は、毛乳頭細胞（dermal papilla cell）または真皮鞘細胞（dermal sheath cell）と特異的に結合し、前記毛乳頭細胞の増殖、生存、及び活性化を促進させることができる。
【００３４】
本発明の他の具現例として、前記薬学的組成物は、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、ペースト剤及びカタプラズマ剤で構成された群から選択された剤形にも製剤化される。
【００３５】
本発明のさらに他の具現例として、前記化粧料組成物は、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャクリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアロゾール、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘアせっけん、ヘオクレンジングフォーム、髪油、毛髪乾燥剤、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアジェル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムース及びヘアスプレーによって構成された群から選択された剤形にも製剤化される。
【００３６】
また、本発明は、前記化粧料組成物を頭皮に塗布したり噴霧したりする段階を含む脱毛防止方法または発毛促進方法を提供する。
【００３７】
また、本発明は、ａ）頭皮から毛乳頭細胞または真皮鞘細胞を分離する段階、及びｂ）前記分離された毛乳頭細胞または真皮鞘細胞に、前記抗ＩＧＤＣＣ４抗体を処理する段階を含む毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞の量産方法を提供する。
【００３８】
また、本発明のさらに他の目的は、前記方法によって生産された毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞を含む、毛髪再生のための細胞治療剤を提供する。
【００３９】
また、本発明は、前記抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその抗原結合領域を含む断片の脱毛防止用途または発毛促進用途を提供する。
【００４０】
また、本発明は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物または化粧料組成物の製造に利用する用途を提供する。
【００４１】
また、本発明は、薬学的に有効量の前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、脱毛の治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、毛乳頭細胞に特異的に結合する抗体及びその用途に係り、前記抗体は、毛乳頭細胞と特異的に結合し、毛乳頭細胞の増殖を促進し、それを介して発毛を増進させる可能性があることを具体的に確認した。
【００４３】
また、本発明は、タンパク質製剤を利用した脱毛治療剤として、現在脱毛治療剤として市販されているロゲイン（Rogaine）の長期間服用の必要性、及び低い臨床的治療効果、プロペシア（Propecia）の性欲減退などの副作用を解消し、抗体タンパク質の特性上、結合特異性及び生体内安定性などに非常にすぐれるという長所を有している。本発明は、毛乳頭細胞と特異的に結合することにより、毛乳頭細胞の増殖作用、生存作用及び活性化作用を増進させて脱毛を予防することができ、それにより、休止期脱毛患者に対する根本的な脱毛治療用製剤として利用することができると期待される。
【００４４】
また、本発明の抗体タンパク質を利用した試験管内毛乳頭細胞、または真皮鞘細胞の量産、及び前記細胞の直接的な移植を介して、毛髪再生のための細胞治療剤としても活用することができると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質（ＨＡＲＥ５７）とヒト毛乳頭細胞との結合を、流細胞分析を介して確認した結果である。
【図２】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質（ＨＡＲＥ５７）とヒト毛乳頭細胞との結合を、蛍光顕微鏡を介して確認した結果である。
【図３Ａ】マウスの皮膚組織において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質、毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞間の結合を確認したものであり、光学顕微鏡を介して確認した結果である。
【図３Ｂ】マウスの皮膚組織において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質、毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞間の結合を確認したものであり、蛍光顕微鏡を介して確認した結果である。
【図４Ａ】脳、心臓、腎臓、肝臓及び肺の組織において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質との結合を、光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡を介して確認したものであり、対照群での結合を示した結果である。
【図４Ｂ】脳、心臓、腎臓、肝臓及び肺の組織において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質との結合を、光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡を介して確認したものであり、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質（ＨＡＲＥ５７）処理群での結合を示した結果である。
【図５Ａ】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質とヒト血球細胞との結合を、流細胞分析を介して確認したものであり、対照群 での結合を示した結果である。
【図５Ｂ】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質とヒト血球細胞との結合を、流細胞分析を介して確認したものであり、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質（ＨＡＲＥ５７）処理群での結合を示した結果である。
【図６】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によるヒト毛乳頭細胞の増殖速度変化を示した結果である。
【図７Ａ】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によるヒト毛乳頭細胞の形態変化を確認したものであり、対照群での形態変化を示した結果である。
【図７Ｂ】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によるヒト毛乳頭細胞の形態変化を確認したものであり、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理群での形態変化を示した結果である。
【図８】６週齢Ｃ３Ｈマウスを利用して、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質を処理していない群での発毛増進いかんを肉眼で確認した結果である。
【図９】６週齢Ｃ３Ｈマウスを利用して、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理群での発毛増進いかんを肉眼で確認した結果である。
【図１０】ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−nude）において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理による発毛増進いかんを肉眼で確認した結果である。
【図１１Ａ】ストレスによって脱毛が進行したマウスにおいて、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理による発毛増進効果を確認したものであり、発毛増進いかんを肉眼で確認した結果である。
【図１１Ｂ】ストレスによって脱毛が進行したマウスにおいて、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理による発毛増進効果を確認したものであり、発毛増進いかんを肉眼で確認した結果である。
【図１２】毛乳頭細胞及びＨｅＬａ細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によるＩＧＤＣＣ４ ｍＲＮＡ発現を比較した結果である。
【図１３】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質（ＨＡＲＥ５７）とＩＧＤＣＣ４タンパク質との結合いかんを、ＥＬＩＳＡを介して確認した結果である。
【図１４】抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質（ＨＡＲＥ５７）処理による毛乳頭細胞内タンパク質の発現特性を、タンパク質アレイで確認した結果である。
【図１５】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増大した代表的な毛髪調節関与タンパク質（ＡＬＰＰ、サイトケラチン１９、ＥＤＡ−Ａ２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＩＬ−１α及びＩＬ−６）を確認した結果である。
【図１６Ａ】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増大したタンパク質を確認したものであり、ＦＧＦファミリーの発現増大を示した結果である。
【図１６Ｂ】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増加されたタンパク質を確認したものであり、Ｗｎｔファミリーの発現増大を示した結果である。
【図１６Ｃ】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増加されたタンパク質を確認したものであり、ＴＧＦファミリーの発現増大を示した結果である。
【図１６Ｄ】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増加されたタンパク質を確認したものであり、ＰＤＧＦファミリーの発現増大を示した結果である。
【図１６Ｅ】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増加されたタンパク質を確認したものであり、ＥＣＭファミリーの発現増大を示した結果である。
【図１６Ｆ】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理によって発現が増加されたタンパク質を確認したものであり、ＴＮＦファミリーの発現増大を示した結果である。
【図１７】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質処理による細胞増殖調節関連タンパク質の発現増大を確認した結果である。
【図１８】毛乳頭細胞において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体タンパク質による血球細胞調節因子の発現増大を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明者は、本発明の抗体は、毛乳頭細胞にだけ特異的に結合し、毛乳頭細胞の増殖、生存及び活性化を促進することができることを確認した。また、前記結果を基に、前記抗体を処理することにより、発毛効果、及び発毛関連調節因子の発現量を増加させる可能性があることを確認し、それに基づいて本発明を完成した。
【００４７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００４８】
本発明は、配列番号１７で表示されるアミノ酸配列からなるＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質を提供する。
【００４９】
本発明において、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質は、哺乳動物由来であるならば、制限がないが、望ましくは、ヒト，マウス，ラット由来でもあり、このとき、前記配列番号１７で表示されるアミノ酸配列と７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【００５０】
本発明において、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質を動物に注入する段階を含む抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法を提供することができる。
【００５１】
また、本発明は、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合する抗ＩＧＤＣＣ４抗体、その抗原結合領域を含む断片、または機能性変異体を提供する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫学的に、特定抗原と結合反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、ポリクローナル（polyclonal）抗体及びモノクローナル（monoclonal）抗体をいずれも含む。また、前記用語は、抗体、抗体断片、キメラ性抗体（例えば、ヒト化ムリン抗体）及び異種結合抗体（例えば、両特異性抗体）のような遺伝工学によって生産された形態を含む。
【００５３】
典型的には、該抗体は、重鎖（heavy chain）及び軽鎖（light chain）を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域（前記部位は、「ドメイン」としても知られている）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は「相補性決定領域」（ＣＤＲ：complementarity-determining region）と呼ばれる３個の多変可能な領域、及び４個の「構造領域」（framework region）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割を行う。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から始まり、順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また特定ＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【００５４】
本発明において、前記ＣＤＲは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＩｇＮＡＲ、ｈｃＩｇＧ、（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４、［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ミニボディ（minibody）、ジアボディ（diabody）、トリボディ（tribody）、ナノボディ（nano body）またはキャメルボディ（camel body）を含んでもよいが、それらに制限されるものではない。
【００５５】
本発明において、重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号１ないし３で表示されるアミノ酸、軽鎖可変領域のＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号４ないし６で表示されるアミノ酸からなり、前記配列番号１ないし６で表示されるアミノ酸配列と、それぞれ７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【００５６】
該重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号９ないし１１で表示されるポリヌクレオチド、軽鎖可変領域のＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）は、それぞれ配列番号１２ないし１４で表示されるポリヌクレオチドからなり、前記配列番号９ないし１４で表示されるポリヌクレオチド配列と、それぞれ７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【００５７】
また、該重鎖可変領域は、配列番号７で表示されるアミノ酸、該軽鎖可変領域は、配列番号８で表示されるアミノ酸からなり、前記配列番号７及び８で表示されるアミノ酸配列と、それぞれ７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【００５８】
また、該重鎖可変領域は、配列番号１５で表示されるポリヌクレオチド、該軽鎖可変領域は、配列番号１６で表示されるポリヌクレオチドからなり、前記配列番号１５及び１６で表示されるポリヌクレオチド配列と、それぞれ７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【００５９】
また、抗ＩＧＤＣＣ４抗体の機能性変異体は、ＩＧＤＣＣ４を特異的に認識することができる範囲内において、本明細書に記載された抗ＩＧＤＣＣ４抗体配列の生物学的均等物を含む。例えば、抗体の結合親和度及び／またはその他生物学的特性をさらに改善させるために、抗体のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列にさらなる変化を与えることができる。かような変形は、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含み、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷サイズなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形態及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり、アラニン、グリシン及びセリンは、類似した大きさを有し、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、類似形態を有するということが分かる。従って、かような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。
【００６０】
また、本発明は、配列番号７及び配列番号８からなるアミノ酸配列をコーディングする単離されたポリヌクレオチドを含む、抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその断片生産用発現ベクター、それを介して形質転換された宿主細胞、それを利用した試験管内抗ＩＧＤＣＣ４抗体生産方法を提供する。
【００６１】
本発明で使用される用語「形質転換」は、本来の細胞が有していたところとは異なる種類の外来遺伝子があるＤＮＡ鎖切片またはプラスミドが細胞間に浸透し、本来細胞に存在したＤＮＡと結合することにより、細胞の遺伝形質を変化させる分子生物学的技術を意味する。本発明の目的上、形質転換は、前記配列番号７及び配列番号８からなるアミノ酸配列をコーディングする単離されたポリヌクレオチドが、宿主細胞内に挿入され、抗ＩＧＤＣＣ４抗体、またはその断片生産を生産することを意味する。
【００６２】
前記宿主細胞は、望ましくは、バクテリア（Ｅ．Ｃｏｌｉ）や酵母（yeast）などの微生物、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及び抗体生産ハイブリドーマ細胞からなる群から選択されたいずれか一つでもあるが、それらに制限されるものではない。
【００６３】
本発明の一実施例においては、ヒト毛乳頭細胞と結合する抗体タンパク質を製造し（ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質）、前記抗体タンパク質と、マウス動物モデルの皮膚、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺の組織、またはヒト血球細胞との結合が観察されていない一方、毛乳頭細胞または真皮鞘細胞との結合を確認したが、前記抗体タンパク質と毛乳頭細胞との結合特異性を確認した（実施例１及び２参照）。また、前記抗体タンパク質処理による毛乳頭細胞の増殖、生存及び活性化の効果と、生体発毛増進効果とを確認し、前記抗体と特異的に結合する毛乳頭細胞の細胞膜タンパク質であるＩＧＤＣＣ４を同定し、抗ＩＧＤＣＣ４抗体（ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質）は、毛乳頭細胞で発現するＩＧＤＣＣ４と結合することにより、細胞信号伝逹経路を介して促進される発毛増進関連調節因子の発現量を増加させるが、本発明を、脱毛防止または発毛促進に活用することができることを確認した（実施例３ないし５参照）。
【００６４】
それにより、本発明は、前記抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を有効成分として含む、脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物を提供する。
【００６５】
本発明で使用される用語「脱毛」は、正常に毛髪が存在しなければならない部位に毛髪がない状態をいい、一般的に、頭皮の成毛（太くて黒い毛髪）が抜けることを意味する。以前の認識と異なり、脱毛が男性に限られたものではなく、女性にも大きく増加しており、１０代青少年にも、脱毛で悩む人口が増える勢いを示しているが、効果的な脱毛治療剤への関心が急増している。
【００６６】
現在、脱毛治療剤として、ＦＤＡで承認したミノキシジル（minoxidil）（経皮塗布剤）とフィナステリド（finasteride）（経口服用剤）との２種類がある。まず、ミノキシジルは、抗高血圧用経口薬剤として使用されたが、該薬剤を服用した患者において、多毛症が示されるのが観察され、現在頭皮塗布用として、男性型脱毛症に汎用されている。また、フィナステリドは、タイプII ５α−還元酵素（reductase）を抑制することにより、脱毛を予防し、毛髪の成長を増進させる男性型アンドロゲン性脱毛治療の経口治療剤として利用されている。
【００６７】
しかし、ミノキシジルは、多くの臨床研究によれば、３０％以下の患者でのみ効果があると報告され、使用を中断する場合、再び脱毛が進み、体重増加、浮腫、心臓拍動増加、狭心症、皮膚炎、かゆみ症などの副作用を有している。また、フィナステリドは、男性性機能障害、奇形児出産などの深刻な副作用が、臨床事例において報告されており、その使用に制限的であったり、患者自身が薬物に対する拒否感を示したりするような問題点がある。それにより、生体安定性が高いタンパク質製剤を利用した脱毛物質に対する消費者の関心が高くなっている。
【００６８】
一般的には、毛髪成長は、多くの遺伝子、成長因子及びその受容体、全身的ホルモンの作用などによる複雑なメカニズムによって起こるが、特に、上皮細胞からなる毛嚢の毛基質細胞（dermal matrix cell）と間葉系細胞とから構成された毛乳頭細胞（dermal papilla cell）が毛髪の形成及び成長に中枢的な要素として作用すると知られている。
【００６９】
毛乳頭細胞（dermal papilla cell）は、毛嚢の基底部に存在する細胞であり、毛嚢を構成する細胞に酸素及び栄養を供給し、毛髪の成長、及び毛嚢周期調節を担当する。また、毛髪成長は、毛乳頭（dermal papilla）を覆い包んでいる上皮細胞（epithelial cell）が分裂し、毛幹（hair shaft）を作りながら進められるために、毛乳頭細胞は、上皮細胞の分裂を調節する役割を行い、男性型脱毛症において、男性ホルモンが毛嚢に作用する部位も、毛乳頭細胞という点を考慮するとき、毛乳頭細胞の増殖が促進されれば、毛髪が健康になり、毛髪成長が促進され、脱毛を防ぐことができる。また、真皮鞘細胞（dermal sheath cell）は、毛乳頭細胞において、可逆的な分化能を有している細胞であり、毛乳頭細胞と同様に、発毛において重要な役割を行っている。
【００７０】
かような理論に基づいて、本発明者は、従来の脱毛治療剤の問題点を解消するための１つの代案として、請求項１のＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを含む脱毛防止または薬学的／化粧料組成物を提供しようとしたのである。
【００７１】
前記組成物は、毛乳頭細胞（dermal papilla cell）または真皮鞘細胞（dermal sheath cell）と特異的に結合し、前記毛乳頭細胞の増殖及び生存促進、毛乳頭細胞の活性化作用を介して脱毛を防止し、発毛を促進させることができ、望ましくは、ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合する抗体タンパク質を含んでもよいが、ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と結合し、毛乳頭細胞の機能を調節することができる製剤であるならば、制限なしに含まれてもよい。
【００７２】
毛乳頭細胞（dermal papilla cell）または真皮鞘細胞（dermal sheath cell）と特異的に結合し、前記毛乳頭細胞の増殖及び生存を促進させ、毛乳頭細胞の活性化作用を介して、脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物を提供しようとしたのである。
【００７３】
本発明の薬学的組成物は、臨床投与時、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、ペースト剤及びカタプラズマ剤によって構成された群から選択された剤形であり、非経口投与用剤形でもあるが、それらに限定されるものではない。
【００７４】
非経口投与用剤形に製剤化するために、安定剤または緩衝剤と共に水に混合し、溶液または懸濁液に製造して、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製造することができる。前記組成物は、滅菌されるか、あるいは防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩、及び／または緩衝剤などの補助剤、並びにその他治療的に有用な物質を含んでもよく、一般的な方法である混合、顆粒化方法またはコーティング方法によって製剤化することができる。
【００７５】
また、本発明による薬学的組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素、並びにその他医学分野に周知の要素によって決定される。本発明による薬剤学的組成物は、個別治療剤として投与するか、あるいは他の治療剤と併用しても投与され、従来の治療剤とは、順次または同時に投与されもし、単一または多重でも投与される。前述の要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されるであろう。
【００７６】
具体的には、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内での活性成分の吸収度、不活性率及び排泄速度、疾病種類、併用される薬物によって異なり、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１ないし１５０ｍｇ、望ましくは、０．０１ないし１００ｍｇを、毎日または隔日投与するか、あるいは１日１回ないし３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、脱毛の重症度、性別、体重、年齢などにより、増減されるので、前記投与量は、いかなる方法によっても、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７７】
一方、本発明の化粧料組成物は、当業界で一般的に製造されるいかなる剤形にも製造され、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クリンシング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤形化され、さらに詳細には、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャクリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアロゾール、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘアせっけん、ヘオクレンジングフォーム、髪油、毛髪乾燥剤、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアジェル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムース及びヘアスプレーによって構成された群から選択された剤形でもあるが、それらに制限されるものではない。
【００７８】
本発明の化粧料組成物に含有された化粧品学的に有効な担体は、剤形によって、当業界で一般的に利用される担体が利用される。本発明の剤形が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用される。
【００７９】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが利用され、特に、スプレーである場合には、追加してクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含んでもよい。
【００８０】
本発明の剤形が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００８１】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水・エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール・ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが利用される。
【００８２】
本発明の剤形が、界面活性剤含有クリンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用される。
【００８３】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分及び担体成分以外に、化粧品学的組成物に一般的に利用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような一般的な補助剤を含んでもよい。
【００８４】
また、本発明の他の様態として、前記の組成物を頭皮に塗布したり噴霧したりする段階を含む脱毛防止方法及び発毛促進方法を提供する。
【００８５】
また、本発明の他の様態として、前記の組成物を頭皮に塗布したり噴霧したりする段階を含む脱毛防止方法及び発毛促進方法を提供するが、ａ）頭皮から毛乳頭細胞または真皮鞘細胞を分離する段階、及びｂ）前記分離された毛乳頭細胞または真皮鞘細胞に、抗ＩＧＤＣＣ４抗体を処理する段階を含む毛乳頭細胞または真皮鞘細胞の量産方法を提供する。
【００８６】
本発明において、抗ＩＧＤＣＣ４抗体を処理することにより、毛乳頭細胞または真皮鞘細胞の増殖及び生存を増進させることができるという点に技術的特徴があり、当業界で周知の方法を介して、前記生産された毛乳頭細胞または真皮鞘細胞を培養する段階をさらに含んでもよい。
【００８７】
また、本発明の他の様態として、前記の方法によって生産された毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞を含む、毛髪再生のための細胞治療剤を提供する。
【００８８】
本発明で使用される用語「細胞治療剤」は、ヒトから分離、培養、及び特殊な操作を介して製造された細胞及び組織において、治療、診断及び予防の目的に使用され、細胞または組織の機能を復元させるために生きている、自家、同種または異種の細胞を体外で増殖して選別するか、あるいは他の方法で、細胞の生物学的特性を変化させるようない一連の行為を介して、治療、診断及び予防の目的に使用される医薬品を称するのである。本発明の目的上、前記細胞治療剤は、毛乳頭細胞または真皮鞘細胞を投与することにより、毛髪を再生させ、脱毛を防止して発毛を促進させる。
【００８９】
また、本発明の他の様態として、前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを、脱毛防止用または発毛促進用の薬学的組成物または化粧料組成物の製造に利用することができる。
【００９０】
また、本発明のさらに他の様態として、薬学的に有効量の前記ＩＧＤＣＣ４抗原タンパク質と特異的に結合するリガンド、抗体タンパク質、ポリペプチド及び小分子からなる群から選択されるいずれか一つを有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む脱毛の治療方法を提供する。
【００９１】
以下、本発明の理解の一助とするために、望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものであるのみ、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１．毛乳頭細胞結合ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の発掘
本発明者は、ＩＧＤＣＣ４受容体タンパク質と特異的に結合し、毛乳頭細胞を活性化させるダンクロン抗体タンパク質を最初に究明し、以下の実施例においては、それをＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と命名した。
【００９３】
本実施例においては、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と、ヒト毛乳頭細胞（ＤＰ：dermal papilla cell）との優秀な結合能を確認しようとしたのである。具体的には、培養中の１００，０００個のヒト毛乳頭細胞をエッペンチューブに入れ、ＳＭ（staining media：ＰＢＳ（−）＋２％ ＦＢＳ）で洗浄した後、ＨＡＲＥ５７単一クローン抗体を添加し、３０分間一次免疫染色を行った。一次抗体と結合させた後、結合されていない抗体を除去するために、ＳＭ（staining media：ＰＢＳ（−）＋２％ ＦＢＳ）で遠心分離を行った後、２回ずつ洗浄した。その後、抗マウスＰＥ二次抗体を添加し、３０分間室温で反応させ、前記と同一方法で洗浄した後、流細胞分析用サンプルとして利用した。流細胞分析を行う前、死んだ細胞除去のためにＰＩ（propidium iodide）を添加し、１０，０００個の細胞情報を保存し、流細胞分析用データとして利用した。対照群としては、isotype ＩｇＧを一次抗体として添加した群を利用した。
【００９４】
また、細胞免疫染色のために、培養中のヒト毛乳頭細胞から培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で２回ずつ洗浄した。その後、前記流細胞分析と同一方法で、一次抗体及び二次抗体を添加した後、蛍光顕微鏡を利用し、細胞との結合いかんを判読した。また、抗体の免疫染色後、ＤＡＰＩで細胞核染色を行い、細胞との結合いかんを判別した。
【００９５】
その結果、図１に示されているように、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、ヒト毛乳頭細胞と結合することを確認し、図２に示されているように、蛍光顕微鏡を介して、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、ヒト毛乳頭細胞と高い結合力を有しているという事実が確認された。
【００９６】
実施例２．ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の特異的結合能確認
本実施例においては、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と毛乳頭細胞との特異的結合能を確認すべく、マウス動物モデルの皮膚組織及びヒト血液細胞を利用し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の結合特性を分析した。
【００９７】
２−１．マウス動物モデルでの特異的結合能確認
マウスの皮膚組織切片を利用し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の結合特性を分析した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚組織をＯＣＴ液で凍結保存した後、Cryotome機器利用して皮膚組織を切片し、免疫染色用分析用に利用した。非特異的な結合を防止するために、blocking bufferで３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）溶液で４回ずつ洗浄した。ＨＡＲＥ５７抗体で一次染色を実施し、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、二次抗体である抗マウスＩｇＧ−ＰＥ抗体で免疫蛍光染色を実施した。その後、蛍光顕微鏡を利用し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と皮膚組織との結合特性を観察した。
【００９８】
また、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と異なる組織細胞との結合特性を分析するために、マウスの脳、心臓、腎臓、肝臓及び肺の組織を採取し、ＯＣＴ溶液で組織凍結保存を実施した。その後、前記と同一方法で処理し、蛍光顕微鏡を利用し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と、多様な組織との結合特性を観察した。
【００９９】
その結果、図３に示されているように、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、毛嚢内に存在する毛乳頭細胞と特異的に結合していることを確認し、毛乳頭細胞に可逆的な分化能を有している兄弟細胞である真皮鞘細胞（dermal sheath cell）とも特異的に結合していることを確認した。しかし、皮膚組織の他の細胞とは、全く結合せず、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の結合特異性を確認した。また、図４に示されているように、脳、心臓、腎臓、肝臓及び肺の組織においては、対照群と同様に、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質との結合を観察することができなかった。
【０１００】
２−２．ヒト血球細胞との結合能確認
ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と、ヒト血液から採取した血球細胞との結合特性を、流細胞分析機で分析した。具体的には、ヒト血球細胞を採取し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質において、室温で３０分間一次細胞染色を行った後、遠心分離を介して、非結合抗体タンパク質を除去した。ＳＭ（staining media）で２回ずつ洗浄した後、二次抗体である抗マウスＩｇＧ−ＰＥ抗体を添加し、免疫染色を実施した。二次抗体との反応後、ＳＭ液で、２回の遠心分離を介して、非結合二次抗体を除去した。その後、ヒトＢ免疫細胞結合抗体であるｈＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体と、Ｔ免疫細胞結合抗体であるｈＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体とで、細胞免疫を実施した後、流細胞分析用サンプルとして利用した。流細胞分析時、死んだ血球細胞を除去するために、ＰＩ（propidium iodide）で染色を実施し、各サンプル当たり１０，０００個の細胞情報を保管して分析用資料として利用した。
【０１０１】
その結果、図５に示されているように、ヒト血球細胞において、対照群と同様に、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質との結合を観察することができなかった。前記実施例１及び２−１の結果と総合して見るとき、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、毛乳頭細胞及び真皮鞘細胞と特異的な結合能があることを確認した。
【０１０２】
実施例３．ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質による毛乳頭細胞増殖促進効果確認
本実施例においては、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質処理による毛乳頭細胞増殖の変化を確認すべく、ヒト毛乳頭細胞（ＤＰ）において、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の細胞調節生理機能を分析した。具体的には、培養中のヒト毛乳頭細胞を回収し、ＤＭＥＭで２回ずつ洗浄した。その後、１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり入れ、ＤＭＥＭ培養液に各濃度（０．５，１．５，１０，５０ｎｇ／ｍｌ）のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を入れた後、３７゜Ｃで７２時間培養を行った。該培養後、ＭＴＴ assay kitを利用し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質処理によるヒト毛乳頭細胞の増殖速度変化を調査した。
【０１０３】
また、ヒト毛乳頭細胞の活性効能を検証するために、培養中のヒト毛乳頭細胞を、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）が添加されたＦＢＳ free ＤＭＥＭバッジで培養した後、ヒト毛乳頭細胞の形態的変化を観察した。対照群としては、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理していない群を利用した。
【０１０４】
その結果、図６及び図７に示されているように、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理した群は、対照群と比較し、増殖速度が有意的に増大し、多様な形態的変化を観察することができた。前記結果は、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、ヒト毛乳頭細胞の活性化刺激を促進し、増殖能を向上させるということを示す。
【０１０５】
実施例４．マウス動物モデルを利用した発毛増進効果確認
本実施例においては、前記実施例３の結果を基に、マウス動物モデルを利用し、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質処理による発毛増進効果を、in vivoで確認しようとしたのである。特に、脱毛の多様な発生原因別の発毛増進効果を検証するために、正常マウス、遺伝子欠乏によるヌードマウス、及びストレスによって脱毛が進行したマウスそれぞれに対して実験を進めた。
【０１０６】
具体的には、正常マウスにおいて、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質処理による生体発毛増進効果を検証すべく、６週齢Ｃ３Ｈマウスに除毛を施し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む製剤を毎日１回ずつ２週間塗布した後、それによる発毛増進効果を肉眼で観察した。また、遺伝子欠乏による脱毛の治療効能を検証すべく、先天性遺伝欠乏により、全身無毛症の症状を有したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−nude）を利用した。前記ヌードマウスは、毛嚢に存在する毛乳頭細胞の数が少ないために、zigzag typeの毛が皮下組織に存在している動物モデルと知られており、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む製剤を毎日１回ずつ１７日間塗布した後、それによる発毛増進効果を肉眼で観察し、対照群としては、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理していない群を利用した。
【０１０７】
同時に、ストレスによる脱毛の治療効能を検証すべく、限定された飼育ケージの過密した環境内で飼育したマウスのうち、脱毛が誘発されたマウスを選別し、選別されたマウスを対象に、前記と同一方法で、１４日後の効果を観察した。
【０１０８】
その結果、図９及び図１０に示されているように、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理していない対照群と比較し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理した群において、顕著に優秀な発毛増進効果を確認し、図１１に示されているように、遺伝的欠乏によるヌードマウスにおいても、従来ヌードマウスの毛髪形態であるzigzag typeからguard typeに毛髪に発達し、皮膚外に出ることにより、毛髪再生が促進されることを確認した。また、図１２に示されているように、ストレスによって脱毛が進行したマウスにおいても、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質処理による発毛増進効果を確認した。前記結果は、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、毛乳頭細胞を活性化させることにより、発毛を増進させるが、脱毛治療に有用に利用される可能性があることを示す。
【０１０９】
実施例５．ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質による発毛増進メカニズムの確認
本実施例においては、前記実施例３及び４で確認した発毛増進効果のメカニズムを確認すべく、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質と特異的に結合するタンパク質を同定し、それと係わる信号伝達メカニズム及び関連因子の変化を分析した。
【０１１０】
５−１．ターゲット受容体タンパク質及び信号伝達メカニズムの確認
ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、毛乳頭細胞の細胞膜タンパク質との特異的結合による信号伝達を介して、毛乳頭細胞の活性化を誘導するという前題下で実験を進めた。そのために、ＨＡＲＥ５７抗体結合細胞膜タンパク質を発現する毛乳頭細胞と、ＨＡＲＥ５７抗体結合細胞膜タンパク質を発現しないＨｅＬａ細胞とを利用し、microarrayを施行した後、両者間のｍＲＮＡ発現を比較した。また、前記実験を介して同定されたＩＧＤＣＣ４タンパク質と、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質との特異的結合を検証すべく、ＩＧＤＣＣ４タンパク質のextracellular regionを利用し、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質との結合いかんを、ＥＬＩＳＡ技法で分析した。
【０１１１】
同時に、毛乳頭細胞の細胞膜タンパク質と結合するＩＧＤＣＣ４受容体タンパク質を介した細胞の信号伝逹メカニズムを究明するために、試験管で培養したヒト毛乳頭細胞に、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）を処理した後、４８時間培養した。その後、１，０００個の細胞内タンパク質の発現特性を、タンパク質アレイ方法を介して分析し、対照群としては、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理していない群を利用した。
【０１１２】
その結果、図１２ないし図１３に示されているように、多様な毛乳頭細胞の細胞膜タンパク質のうち、ＨｅＬａ細胞で全く発現されない一方、毛乳頭細胞においては、約２３５倍に高発現された遺伝子ＩＧＤＣＣ４（ＮＯＰＥ、ＤＤＭ３６、ＫＩＡＡ１６２８）を発掘し、ＥＬＩＳＡを介して、前記ＩＧＤＣＣ４タンパク質と、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質との特異的な結合能を再び確認した。また、図１４に示されているように、細胞内での増殖及び生存に関与するタンパク質、及び毛乳頭細胞による多様な細胞調節因子の発現が、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質の刺激によって増大されることを確認した。前記結果は、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、毛乳頭細胞の細胞膜タンパク質のうち一つであるＩＧＤＣＣ４タンパク質と特異的に結合することにより、毛乳頭細胞の増殖関連タンパク質の発現を増大させ、発毛を促進させることを示す。
【０１１３】
５−２．発毛増進関連調節因子の発現量比較
前記実施例５−１のタンパク質アレイの結果を基に、発毛または毛髪再生に関与するタンパク質または調節因子の発現を比較した、具体的には、幹細胞の代表的バイオマーカーであるＡＬＰＰ、毛髪再生に関与するＦＧＦ，Ｗｎｔ，ＴＧＦ，ＰＤＧＦ，ＥＣＭ，ＴＮＦファミリータンパク質、細胞増殖関連タンパク質、及び血球細胞調節因子の発現を比較し、対照群としては、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理していない群を利用した。
【０１１４】
その結果、図１５に示されているように、対照群に比べ、１．５倍以上発現が増大したタンパク質として、ＡＬＰＰ、サイトケラチン１９、ＥＤＡ−Ａ２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＩＬ−１α、ＩＬ−６を確認し、特に、幹細胞の代表的なバイオマーカーであるＡＬＰＰの発現増大を介して、ＨＡＲＥ５７抗体タンパク質は、毛乳頭細胞の幹細胞としての機能にも影響を及ぼすことを確認した。また、図１６に示されているように、ＦＧＦファミリータンパク質（ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２）及びＷｎｔファミリータンパク質受容体（Frizzled−１、Frizzled−３及びFrizzled−４）の発現増大を確認し、ＴＧＦファミリータンパク質（ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ５、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β２）、ＰＤＧＦファミリータンパク質（ＨＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ２）、ＥＣＭファミリータンパク質（ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１５及びＲＥＣＫ）及びＴＮＦファミリータンパク質（ＥＤＡ−Ａ２、ＮＧＦＲ、ＴＮＦＳＦ４、ＴＬＲ１、ＴＲＡＩＬ及びＴＮＦＳＦ１２）の発現が増大されることを確認した。同時に、図１７及び図１８に示されているように、細胞増殖関連タンパク質として、ＧＭＮＮ、ＲＯＣＫ１、ＷＩＦ−１などの発現増大を、血球細胞調節因子として、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−αなどの増加を確認することにより、本発明のＨＡＲＥ５７抗体タンパク質を処理した場合、多様な調節因子の発現増大を介して、毛乳頭細胞の増殖及び発毛が促進されることを確認した。
【０１１５】
前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述された実施例は、あらゆる面において、例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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