(57)【要約】  本発明は、生体高分子が限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を有する、生体高分子の製造方法に関し、その方法は、以下を含む、  ネイティブの高分子量を持つ生体高分子を含む組成物を凍結乾燥すること；  必要に応じて、該生体高分子を、精製および／または単離すること；  ここで、昇華プロセス中の温度は、当該生体高分子の、制御され、および、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分解を促進するように選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生体高分子を含む、生体高分子組成物の生産方法であって、ここで、少なくとも１つの生体高分子は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を有し、その方法は、以下を含む。
（ｉ）限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する生体高分子を含む第一の凍結組成物を提供する工程；
（ｉｉ）限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する生体高分子を含む第二の凍結組成物を提供する工程；
（ｉｉｉ）互いに、実質的に混合せずに、反応容器において組成物を一緒にする工程；
（ｉｖ）必要に応じて、組成物を凍結する工程；
（ｖ）生体高分子を含む、組成物を、凍結乾燥する工程；
（ｖ）必要に応じて、生体高分子を精製および／または単離する工程；
ここで、凍結乾燥プロセス中の最高温度は、当該生体高分子の、制御され、および限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分解を促進するように選択され、そして、第一および第二の組成物のｐＨ値は、少なくとも０．１相違するか、および／または、第一および第二の組成物は、相違する生体高分子を含む。
【請求項２】
第一および第二の組成物が、同じ生体高分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一および第二の組成物が、異なる生体高分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生体高分子を含む、第一および／または第二の組成物が、凍結された水性溶液またはエマルジョンである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第一および／または第二の組成物のｐＨ値が、１．５と８．５の範囲、好適には、２．５と６の範囲から選択される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
昇華プロセス中の温度が、−４０℃および１５０℃の範囲から選択される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
昇華プロセス中の圧力が、５０μｂａｒおよび８００μｂａｒの範囲から選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第一および／または第二の組成物の生体高分子が、ヒアルロン酸、コラーゲン、グルコサミノ  グリカン、多糖類およびフコイダンを含む群から選択され、好適には、生体高分子がヒアルロン酸である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第一および／または第二の組成物が、下記を含むエマルジョンである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）生体高分子、
（ｉｉ）水
（ｉｉｉ）必要に応じて、薬学上、皮膚病学上、および／または化粧用に許容される化合物またはオイル、
（ｉｖ）必要に応じて、乳化剤、および、
（ｖ）必要に応じて、エモリエント剤。
【請求項１０】
第一および／または第二の組成物が、さらに、皮膚病学の、薬学上または化粧用の添加物を追加で含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第一および／または第二の組成物が、得られた凍結乾燥製品が容易に溶け、または、容易にエマルジョンを形成するように、追加のコンポーネントを含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第一および／または第二の組成物が、同じ内容物を含み、そして、ｐＨ値および／または生体高分子が相違する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第一および／または第二の組成物が、適当な容器において、組み合わされ、凍結乾燥のプロセスに適し、かつ、一次包装として使用できる、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第一および／または第二の組成物の生体高分子が、ヒアルロン酸、コラーゲン、グルコサミノ  グリカン、多糖類および、フコイダンを含む群から選択される、好適には、生体高分子はヒアルロン酸である、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
薬学上、皮膚学上、または、化粧用、許容される生体高分子の生産のための、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１６】
請求項１乃至１４のいずれか１項で製造された組成物。
【請求項１７】
医薬品、皮膚科または化粧品の製品として、請求項１６の組成物の使用。
【請求項１８】
医薬品、皮膚科または化粧品の製品の製造のための、請求項１６の生体高分子組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚病学、薬学、および化粧品の分野における。特に、本発明は、薬学上、皮膚学上または化粧用の、適用される物質の生産の分野においてであり、そして、その使用および適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン、多糖類またはヒアルロン酸などの生体高分子は、化粧品や皮膚病の組成物に、通常、使用される。多くの場合、これらの生体高分子は、保湿剤や抗酸化剤として使用される。投与の一般的な形式は、クリーム、血清、パッチ、マスク、クリーム（ｂａｌｍｓ）、液体または軟膏としてである。
【０００３】
たとえば、ヒアルロン酸やヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）は、人間の組織の間で広く分布している生体高分子である。それは、次の構造を含む、陰イオン性の、非硫酸化グリコサミノグリカンである。
【０００４】
【化１】
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【０００５】
ヒアルロン酸は、特に、皮膚病において、いくつかの医療用途を有し、そして、化粧品において、通常使用され、特に、いわゆる、抗老化製品で使用される。
【０００６】
一般に、ヒアルロン酸などの生体高分子の生理活性は、直接、当該生体高分子の平均分子量に依存している。たとえば、ヒアルロン酸およびその皮膚科における使用を取り上げると、平均分子量は、皮膚浸透の深さ、および、ヒアルロン酸の潜在的な皮膚病上の効果を決定する（図１参照）。
生体高分子の生物学的機能は、平均分子量に依存し、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子を生成するために、いくつかの方法が開発されていることは知られている。
【０００７】
ＥＰ  ２  ４７９  １９４  Ａ２では、活性炭上で、ヒアルロン酸を加水分解することが記載されている。ＥＰ  ２  ４６３  ３０９  Ｂ１とＥＰ  １  ９９２  ６４５  Ａ１には、ヒアルロン酸の酸性加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｉｏｎ）のいくつかの方法が記載されている。他の方法は、酵素加水分解と濾過の使用（ＥＰ  ０  １３８  ５７２  Ｂ１）または、高温および強い剪断力の使用（ＥＰ  １  ９８７  １５３  Ｂ１）を含む。
【０００８】
これらすべての方法の問題は、特に、ヒアルロン酸は、炎症性である低分子量のヒアルロン酸を除去する広範な精製工程を必要とすることである。
【０００９】
したがって、生体高分子の平均分子量の制御を可能にし、さらに追加精製の工程を必要としない、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分子量分布を持つ、純粋な生体高分子、特に、ヒアルロン酸、の効率的な製造方法を提供することが必要である。
【００１０】
［発明の簡単な説明］
本発明は、少なくとも１つの生体高分子を含む、生体高分子組成物の生産方法に関し、ここで、少なくとも１つの生体高分子は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を有し、そして、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分子量の分布を有し、その方法は、以下を含む。
（ｉ）限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する生体高分子を含む第一の組成物を提供する工程；
（ｉｉ）限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する生体高分子を含む第二の組成物を提供する工程；
（ｉｉｉ）お互いに、実質的に混合せずに、反応容器において組成物を一緒にする工程；
（ｉｖ）必要に応じて、組成物を凍結する工程；
（ｖ）生体高分子を含む、組成物を、凍結乾燥する工程；
（ｖｉ）必要に応じて、生体高分子を精製および／または単離する工程；
ここで、凍結乾燥プロセス中の最高温度は、当該生体高分子の、制御され、および限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分解を促進するように選択され、そして、第一および第二の組成物のｐＨ値は、少なくとも０．１相違するか、また、第一および第二の組成物は、相違する生体高分子を含む。
【００１１】
本発明の一の実施形態において、生体高分子は、大きな分子量を有する生体高分子である。好適な実施形態において、生体高分子は、天然の大きな分子量を有する生体高分子である。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの生体高分子を含む生体高分子の組成物の製造方法に関し、ここで、この少なくとも１つの生体高分子は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を有し、そして、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）重量分布を有し、その方法は、以下を含む。
【００１３】
（ｉ）１．５と８．５の間の限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する、高い分子量を有する、生体高分子を含む、第一の組成物を提供する工程；
（ｉｉ）１．５と８．５の間の限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する、高い分子量を有する、生体高分子を含む、第二の組成物を提供する工程；
（ｉｉｉ）お互いに、実質的に混合せずに、反応容器において組成物を一緒にする工程；
（ｉｖ）必要に応じて、組成物を凍結する工程；
（ｖ）生体高分子を含む、組成物を、凍結乾燥する工程；
（ｖ）必要に応じて、生体高分子を精製および／または単離する工程；
ここで、凍結乾燥プロセス中の温度は、当該生体高分子の、制御され、および限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分解を促進するように選択され、そして、第一および第二の組成物のｐＨ値は、少なくとも０．１相違するか、また、第一および第二の組成物は、相違する生体高分子を含む。
本発明の一の好適な実施形態において、生体高分子は、大きな分子量を有する生体高分子である。より好適な実施形態において、生体高分子は、天然の大きな分子量を有する生体高分子である。
【００１４】
さらに、本発明は、生体高分子を生産するため当該方法の使用、および、その方法により製造される生体高分子の組成物に関する。
【００１５】
［定義］
本発明において、生体高分子は、生きている生物が作り出す高分子である。本発明は、好適には、生きている生物に起こる、通常の、そしてネイティブな変更以外には、技術的にまたは化学的に変更されていない、ネイティブの高分子量の生体高分子のみに関する。高分子としては、反復的な単量体モチーフ（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｍｏｔｉｖｅｓ）が特徴である。
【００１６】
一般的に、生体高分子は、３つの主要なクラスに分割される：ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび多糖類である。本発明の文脈において、「生体高分子」という用語は、ポリペプチドと多糖類のみを示す。本発明において、用語「生体高分子」は、たとえば、グリコシル化反応、部分的な加水分解、または、脂質のポリペプチドへの付加のような、生体高分子のすべての自然発生する変更を含む。
【００１７】
生物ユニットから成る高分子であって、生体内で生産されていない高分子、たとえば、ポリ乳酸などは、本発明の意味における生体高分子とは見なされない。本発明に従って処理された、上記の定義に従った、生体高分子が、本発明の文脈において生体高分子である。
【００１８】
本発明による生体高分子の非制限例は、コラーゲン、デンプン、セルロース誘導体、グルコサミノ  グルカン、多糖類、またはフコイダンを含む。
【００１９】
本発明の文脈において、「凍結組成物」は、２５℃での物質のその状態に拘らず、物質の固体状態にある組成物を示す。大抵の実施態様において、凍結組成物は、２５℃で、物質の液体状態にある組成物であり、冷却され、物質の固体状態になる。一の実施態様で、冷却は、液体窒素における、ショック凍結（ｓｈｏｃｋ−ｆｒｅｅｚｉｎｇ）によりなされる。冷却の他の方法は、冷却とフリーザーにおける凍結である。好適な実施態様では、凍結は、−５０℃〜−４℃の温度でなされる。
【００２０】
本発明の文脈において、「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」または「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）」は、昇華によって水分を除去する、脱水プロセスを指す。「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、一般的に、「フリーズ・ドライ（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）」と呼ばれる。一般的に、凍結乾燥は、３つの段階を含む：
（ｉ）脱水される組成物を凍結すること、ここで、前記組成物が、その三重点（ｉｔｓ  ｔｒｉｐｌｅ  ｐｏｉｎｔ）以下に冷却されていることが重要である。適切な凍結法は、該組成物のコンポーネントに依存する；
（ｉｉ）水のほとんどが除去される、一次乾燥段階、ここで、圧力は、数μｂａｒまたは、さらに低く、低下される。この段階で、温度は、通常、水を昇華させる温度に調整される。好ましくは、しかし必須ではないが、この段階では、温度は、０℃未満に維持される；
（ｉｉｉ）二次乾燥段階、ここで、圧力は、必要に応じて低くされ、μｂａｒの範囲にダウンする、そして、温度は、好適には、０℃よりも上昇させ、より強く結合する水を除去する。
【００２１】
本発明の一実施形態において、二次乾燥段階の間、温度を調節する。別の実施形態では、一次乾燥段階の間、温度を調節する。特定の実施形態では、該組成物は、１回だけの乾燥ステップのみを使用して乾燥される。ここで、その条件は、２次乾燥段階の条件に対応する。別の実施形態では、該組成物は、１回だけの乾燥段階を使用して乾燥される。ここで、その条件は、１次乾燥段階の条件に対応する。
【００２２】
本発明の意味で、「昇華プロセス中の温度」は、組成物が配置されている、ストレージ・プレート（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｌａｔｅ）の温度を指す。
【００２３】
本発明の文脈において、「水溶液」という用語は、溶媒が水である、溶液を指す。本発明の文脈において、該用語は、さらに、たとえば、非水溶性生体高分子または、非水溶性の化粧品の添加物のような、成分の粗いまたはコロイド状懸濁液を指す。
【００２４】
本発明の文脈において、「エマルジョン」という用語は、通常、混ざり合わない液体の混合物を指す。本発明の文脈において、「エマルジョン」という用語は、特に、油中水型または水中油型のエマルジョンを指す。好ましくは、本発明の文脈において、エマルジョンは、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）や乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）を使用して安定化される。乳化剤の非制限の例としては、レシチン、ナトリウム  ステアロイル  ラクチレート、乳化機能を有する高分子または界面活性剤である。
本発明の文脈において、反応容器は、組成物を含み、および、処理するために適した任意の容器である。好適には、前記容器は、凍結および凍結乾燥のプロセスに適したものである。
【００２５】
［発明の詳細な説明］
発明者が、驚いたことに、生体高分子は、凍結乾燥プロセスの間に、制御された分解を受けることができ、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子を齎すことを見出した。さらに、本発明者は、分解された生体高分子の分子量分布は、凍結乾燥プロセスの間に凍結された組成物を組み合わせることによって影響を受けることができることを見出した。
【００２６】
本発明の第１の態様は、少なくとも１つの生体高分子を含む、生体高分子の組成物の製造方法に関し、ここで、少なくとも１つの生体高分子は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量および限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）重量分布を有し、その方法は、以下を含む。
（ｉ）限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する生体高分子を含む第一の組成物を提供する工程；
（ｉｉ）限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ｐＨ値を有する生体高分子を含む第二の組成物を提供する工程；
（ｉｉｉ）お互いに、実質的に混合せずに、反応容器において組成物を一緒にする工程；
（ｉｖ）必要に応じて、組成物を凍結する工程；
（ｖ）生体高分子を含む、組成物を、凍結乾燥する工程；
（ｖ）必要に応じて、生体高分子を精製および／または単離する工程；
ここで、凍結乾燥プロセス中の最高温度は、当該生体高分子の、制御され、および限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）分解を促進するように選択され、そして、第一および第二の組成物のｐＨ値は、少なくとも０．１相違するか、および／また、第一および第二の組成物は、相違する生体高分子を含む。
【００２７】
組成物を実質的に混合することなく、組成物を組み合わせることは、組成物を１つの反応容器中で混合するが、化合物の個々の濃度および、たとえば、ｐＨ値のような他の特性を保持するプロセスを指す。これは、２つの凍結組成物を提供および組み合わせることによって、または、凍結乾燥の前に組成物を覆い、そして、それらを凍結することによって、高粘度の２つの組成物を組み合わせることによって行うことができる。
【００２８】
好適な実施態様では、組成物は凍結され、そして、次いで、１つの容器で一緒にされる。
【００２９】
好ましい実施形態では、生体高分子は、高分子量を持つ生体高分子である。より好ましい実施形態では、生体高分子は、ネイティブの（ｎａｔｉｖｅ）高分子量を持つ生体高分子である。
【００３０】
生体高分子を含む組成物は、前記組成物が、少なくとも前記生体高分子に加えて、少量の水を含む限り、任意の種類の組成物で有りうる。前記組成物は、追加の生体高分子、即ち混合物を含むことができる。
【００３１】
第一および第二の組成物は、相違する生体高分子を含んでもよい。好適な実施態様では、両方の組成物は、同じ生体高分子を含む。他の好適な実施態様では、第一および第二の組成物は、それぞれ、１つだけ生体高分子を含む。
【００３２】
好適な実施態様では、生体高分子は、高分子量を有する生体高分子である。より好適な実施態様では、生体高分子は、ネイティブの（ｎａｔｉｖｅ）高分子量を有する生体高分子である。
【００３３】
特に、本方法は、ヒアルロン酸、コラーゲン、グルコサミノ  グリカン、多糖類およびフコイダンを含む群から選択される生体高分子が好適である。好ましい実施形態では、生体高分子は、グルコサミノ  グリカンまたは多糖類である。より好ましい実施形態では、生体高分子は、アルギン酸塩、リゾビアン（ｒｈｉｚｏｂｉａｎ）ガム、カルボキシメチル  セルロース  ナトリウム、プルラン、バイオサッカライドガム−１、グルコマンナン（ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎｅ）、β‐グルカン、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎｅ）、タマリンド  インディカ種多糖類およびヒアルロン酸からなる群から選択される。さらに、より好ましい実施形態では、生体高分子は、アルギン酸ナトリウムやヒアルロン酸である。最も好ましい実施形態では、生体高分子はヒアルロン酸である。
【００３４】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの生体高分子を含む、第一および／または第二の組成物は、水溶液又はエマルジョンである。より好ましい実施形態では、生体高分子を含む両組成物は、水溶液またはエマルションである。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、生体高分子を含む第一および／または第二の組成物は、生体高分子を含む組成物は、低から高い粘度を有するゲルまたは液体である。
【００３６】
本発明者は、特に、昇華プロセスにおける制御された条件および、たとえば、塩分濃度、pH値、真空、使用される乳化剤のような、組成物のパラメーターの制御により、分解した生体高分子の平均分子量を制御できることを見出した。
【００３７】
特に、本発明者は、異なるｐＨ値を有する、同じ生体高分子を含む、組成物を一緒にすると、生体高分子の相違する平均分子量の分布を導き、組成物のｐＨ値および／または容積に依拠して、異なる、限定された重量分布を許容することができることを見出した。
【００３８】
本発明の一実施形態では、生体高分子を含む、第一および／または第二の凍結された組成物は、１．５〜８．５の範囲から選択されたｐＨ値を有する。好ましい実施形態では、ｐＨ値は、２．５および６の範囲から選択される。
【００３９】
もし、第一および第二の組成物が、同じ生体高分子を有している場合、組成物のｐＨ値は、すくなくとも、０．１相違することが好ましい。好適な実施態様では、第一および第二の組成物のｐＨ値は、少なくとも、０．５相違する。さらに好適な実施態様では、第一および第二の組成物のｐＨ値は、少なくとも、１．相違する。一番好適な実施態様では、第一および第二の凍結組成物のｐＨ値は、少なくとも２．相違する。
【００４０】
発明者は、ｐＨ値、昇華プロセスの間の温度、および、生体高分子の平均分子量の間に、直接の相関関係を発見した。図２は、分析されたヒアルロン酸について見出された相関関係を示す。
【００４１】
処理された生体高分子の最終製品の平均分子量は、選択された温度とｐＨ値の組み合わせに、直接、依存していることは明らかである。さらに、本発明者は、複数の凍結組成物を積層し（ｓｔａｃｋ）または混合すると、最終製品の分子量分布を変化させることができることを見出した。
【００４２】
本発明の一実施形態では、昇華プロセス中の最高温度は、−４０℃から１５０℃の範囲から選択される。好ましい実施形態では、温度は、０から１４０℃の範囲から選択される。より好ましい実施形態では、温度は、６０から１３０℃の範囲から選択される。最も好ましい実施形態では、温度は、１２０℃である。
【００４３】
他の実施形態では、昇華プロセス中の温度は、凍結乾燥プロセス中に変えた。好ましい第一の実施形態では、昇華は、２つの温度で実施された。好ましい温度プロファイルの概要を図３に示す。
【００４４】
本発明の一実施形態では、昇華プロセスは、２つの異なる温度で実施される。好適には、最初の温度が、−３０℃から４０℃の範囲から選択され、そして、２番目の温度は、６０℃から１３０℃の範囲から選択される。好ましい実施形態では、第一の温度は、−２０から２０℃の範囲から選択され、そして、２番目の温度は、８０から１２０℃の範囲から選択される。最も好ましい実施形態では、第一の温度は、１０℃で、そして、２番目の温度は１２０℃である。
【００４５】
別の実施形態では、温度プロファイルは、２つ以上の異なる温度を含む。別の実施形態では、温度プロファイルは、連続的な温度勾配を含む。
【００４６】
本発明の一実施形態では、昇華ステップの間の圧力は、５０μｂａｒと８００μｂａｒの間である。本発明の好ましい実施形態では、圧力は、７５μｂａｒと６００μｂａｒの間であり、より好ましくは、１００μｂａｒと４００μｂａｒの間であり、さらにもっと好ましくは、１５０μｂａｒと３００μｂａｒの間である。最も好ましい実施形態では、昇華ステップの間の圧力は、３００μｂａｒである。
【００４７】
プロセスで生成される生体高分子組成物は、組成物から、精製され、または分離されるかもしれないが、好適には、それ以上の精製や分離のステップは実行されない。最も好ましい実施形態では、生体高分子は、直接、更なる処理および／または使用に適している。
【００４８】
本発明は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を有する、生体高分子組成物の製造方法に関するだけでなく、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子組成物の生産のため当該方法の使用、および、前記方法により製造された、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子組成物にも関する。
【００４９】
好ましい実施形態では、前記方法は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子を生産するために使用され、生体高分子は、ヒアルロン酸、コラーゲン、グルコサミノ  グリカン、多糖類およびフコイダンを含む群から選択される。
より好ましい実施形態では、生体高分子は、グルコサミノ  グリカンである。
より好ましい実施形態では、前記方法は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子を生産するために使用され、生体高分子は、アルギン酸塩、リゾビアン（ｒｈｉｚｏｂｉａｎ）ガム、カルボキシメチル  セルロース  ナトリウム、プルラン、バイオサッカライド（Ｂｉｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）ガム−１、グルコマンナン（ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎｅ）、β−グルカン、ペクチン、タマリンド  インディカ種多糖類、およびヒアルロン酸から選択される。
さらに、より好ましい実施形態では、前記方法は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子を生産するために使用され、アルギン酸ナトリウムまたはヒアルロン酸から選択される。最も好ましい実施形態では、前記方法は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を有する、ヒアルロン酸の製造のために使用される。
【００５０】
本発明者は、本発明は、生体高分子を含む複雑な組成物の製造に向いていることを見出した。これらの組成物は、限定された平均分子量を有する、少なくとも一つの生体高分子、と皮膚学、薬学または化粧品の成分のような他の成分を、所望により含み、そして、正に、使用のために、乳化されまたは溶解されるだけである。
【００５１】
複雑な組成物は、追加の生体高分子または他の高分子を含んでいてもよい。当該組成物が追加で水を含む限り、任意の組成物が適している。
【００５２】
好適な実施態様では、第一および／または第二の組成物は、下記を含む。
（ｉ）生体高分子、
（ｉｉ）水
（ｉｉｉ）必要に応じて、薬学上、皮膚病学上、および／または化粧用許容される化合物および／またはオイル、
（ｉｖ）必要に応じて、乳化剤、および、
（ｖ）必要に応じて、追加の薬学上、皮膚病学上、または化粧用の活性成分。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、第一および／または第二の凍結組成物は、低から高の粘度を有するゲルまたは液体である。
【００５４】
第一および／または第二の組成物は、好ましくは、さらに、追加の化粧学的、皮膚病学的または薬学的な成分または添加剤を含む。これらの成分の非限定の例は、エモリエント（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔｓ）、化粧上許容できる成分および、染料、香水またはパンテノールのような薬学的に活性な物質である。
【００５５】
好ましい実施態様では、第一および第二の凍結組成物は、生体高分子またはｐＨ値は例外の、同じ化合物を含むものである。最も好適な実施態様では、第一および第二の凍結組成物は、同じ化合物および同じ生体高分子を含むが、ｐＨ値のみが相違する。
【００５６】
当該成分や添加物の非限定の例は：皮膚コンディショニング剤、皮膚平滑化剤、パンテノールまたはパントテノールのような、肌の水和剤（ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ，）、グリセリン、乳酸または尿素などの天然保湿因子などである。また、代替としては、物理的または化学的日焼け止め、α−またはβ−ヒドロキシ酸、α−またはβ−ケト酸などの角質溶解剤（ｋｅｒａｔｏｌｉｔｉｃｓ）である。さらに、可能な成分は、ラジカル  キャッチャー、老化防止剤、ビタミンＣ（アスコルビン酸）のようなビタミン又はその誘導体、または、そのエステルまたは配糖体、カテキンのような抗酸化物またはフラボノイドを含む。
【００５７】
さらに、潜在的な成分は、レスベラトール、グルタチオン（ｇｌｕｔｈａｔｉｏｎ）、フェルラ酸（ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｑ１０、ポリフェノール、セラミド、飽和および／または不飽和脂肪酸およびグリセリドを含む。さらに、ホホバ油（ｊｏｊｏｂａ  ｏｉｌ）などワックスエステル（ｗａｘ  ｅｓｔｅｒｓ）などのエステル、一般のトリグリセリド（中性油（ｎｅｕｔｒａｌ  ｏｉｌ）、アルガン油（ａｒｇａｎ  ｏｉｌ）、シアバター（ｓｈｅａ  ｂｕｔｔｅｒ））または植物オイルからの不鹸化成分（ｕｎｓａｐｏｎｉｆｉａｂｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）である。
【００５８】
さらに、成分は、野菜、バイオテクノロジーまたは海洋の起源の多糖類と、その加水分解物を含む。他の成分は、例えば、ブロメライン（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）のような酵素、補酵素、酵素阻害剤、アミノ酸、天然および合成オリゴペプチド、コラーゲンやエラスチンなどのペプチド同様、その加水分解物、神経ペプチド、成長因子、アルカロイドを含む。いくつかの実施形態では、成分は、必要に応じて、エスチン（ａｅｓｃｉｎ）、ジンセノサイド、ルスコゲニン（ｒｕｓｃｏｇｅｎｉｎｅ）、またはアロイン（ａｌｏｉｎ）などの、フィトファルマカ（ｐｈｙｔｏｐｈａｒｍａｃａ）を含む。さらに、高分子は、アルギン酸塩、セルロース誘導体、澱粉、キトサン、コンドロイチン硫酸、さらに、生物学的機能と互換性を有する合成生体高分子である。
【００５９】
化粧品の添加剤の非制限例は、美白剤、無機または合成フィラーまたは、着色顔料、または染料、または粒子などの装飾的な物質を含む。本発明のいくつかの実施形態では、目、唇または顔の化粧美容のため物質を含む。
いくつかの実施形態では、第一および／または第二の凍結組成物は、さらに、抗にきびまたは、抗酒さ剤、銀またはその誘導体のような抗微生物剤、ヨウ素またはＰＶＰヨウ素、制汗剤（ａｎｔｉｐｅｒｓｐｉｒａｎｔｓ）、リドカインまたはイブプロフェンのような痛み緩和物質、収斂性（ａｄｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）の物質、消臭化合物、抗脂漏剤（ａｎｔｉｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｃ）または防腐剤などの治療的に活性な物質を含む。さらに、自家細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｅｌｌｓ）、同種細胞（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ）、幹細胞または血小板血漿（ＰＲＰ）のような細胞または細胞の成分を含む。
【００６０】
第一および／または第二の組成物は、好適には、たとえば、溶解性や乳化性、機械的安定性、製品の粘度や触覚（ｈａｐｔｉｃｓ）のような製品の最終的なパラメーターをコントロールするために、安定化剤、保存剤のような他の成分を含む。
【００６１】
本発明の特別な実施形態では、第一および第二の組成物は、適当な容器の中で一緒になり、該容器は、凍結および凍結乾燥プロセスで好ましく、同時に、定義されている平均分子量および限定された重量分布を持つ、少なくとも一つの生体高分子を含む凍結乾燥組成物の、必要に応じて、包装として使用できる。
【００６２】
さらに、本発明は、当該限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）平均分子量を持つ生体高分子を含む組成物の前記製造方法の使用、および、本発明の方法によって生成される生体高分子を含む組成物に関する。
【００６３】
本発明の一実施形態では、最終組成物は、水溶液の液体、低粘度のエマルジョン、血清のような液体、マスク、クリーム、クリーム マスク、パッチまたは局所適用のセグメントの基礎として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ヒアルロン酸の、平均分子量、肌の浸透性および生物活性との相関。
【図２】本発明による、ヒアルロン酸を含有する組成物を処理するときの、ｐＨ、温度および得られた平均分子量の相関。
【図３】凍結乾燥プロセスの実行中の、示唆された温度プロファイル（ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）の概要。
【図４】本発明に従って処理された、ヒアルロン酸の平均分子量を決定するための検量線。
【図５ａ−１】本発明に従って処理された、ニュートラルオイル（ａ）および、セピノブ（Ｓｅｐｉｎｏｖ）ＥＭＴ−１０（ｂ）の溶出と分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）。
【図５ａ−２】本発明に従って処理された、ニュートラルオイル（ａ）および、セピノブ（Ｓｅｐｉｎｏｖ）ＥＭＴ−１０（ｂ）の溶出と分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）。
【図５ｂ−１】本発明に従って処理された、ニュートラルオイル（ａ）および、セピノブ（Ｓｅｐｉｎｏｖ）ＥＭＴ−１０（ｂ）の溶出と分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）。
【図５ｂ−２】本発明に従って処理された、ニュートラルオイル（ａ）および、セピノブ（Ｓｅｐｉｎｏｖ）ＥＭＴ−１０（ｂ）の溶出と分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）。
【図６ａ】ネイティブのヒアルロン酸と、１２０℃で凍結乾燥したヒアルロン酸との、溶出プロファイル（Ａ）と分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）（Ｂ）の比較。
【図６ｂ】ネイティブのヒアルロン酸と、１２０℃で凍結乾燥したヒアルロン酸との、溶出プロファイル（Ａ）と分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）（Ｂ）の比較。
【図７ａ】異なる温度で凍結乾燥した、ヒアルロン酸、セピノブＥＭＴ−１０およびニュートラルオイル（ｎｅｕｔｒａｌ  ｏｉｌ）の混合物の、溶出プロファイル（Ａ）および分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）（Ｂ）の比較。
【図７ｂ】異なる温度で凍結乾燥した、ヒアルロン酸、セピノブＥＭＴ−１０およびニュートラルオイル（ｎｅｕｔｒａｌ  ｏｉｌ）の混合物の、溶出プロファイル（Ａ）および分子質量プロファイル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ）（Ｂ）の比較。
【図８Ａ】６．２１から２．９の範囲で調整したｐＨを有する、１重量％の高分子量ＨＡサンプルの、凍結乾燥サンプルの分子量。
【図８Ｂ】６．２１から２．９で調整したｐＨを有する、１重量％の高分子量ＨＡサンプルの、凍結乾燥サンプルの分子量分布。
【図９】別のプロセス温度で、凍結乾燥したエマルジョンを含むヒアルロン酸の分子量。
【図１０】異なる体積比で積層された、ｐＨを６．２１〜２．９に調整した、１重量％の高分子量ＨＡの凍結乾燥サンプルの分子量分布。
【図１１】異なる体積比で積層された、ｐＨを４．９〜３．５に調整した、１重量％のプルランの凍結乾燥サンプルの分子量分布。
【図１２】異なる容積比で積層された、３．５および７．１５に調整したｐＨを有する、１重量％のアルギン酸ナトリウムサンプルの凍結乾燥サンプルの分子量分布。
【００６５】
［実施例］
実施例１：ヒアルロン酸の制御分解
脱イオン水を、１Ｌのラボ反応器に移動し、７５℃で撹拌した。ヒアルロン酸パウダーを加え、そして、７５℃、７００ｒｐｍで、１５分間、材料が溶解するまで攪拌した。乳化剤成分を追加し、そして、減圧下（２００μｂａｒ）、１４００ｒｐｍで、１５分間、５０℃で撹拌した。油成分を加えて、そして、１４００ｒｐｍ／４５℃／２００μｂａｒで、１０分撹拌し、その後、５分間、２１００ｒｐｍ／４５℃／２００μｂａｒで撹拌した。生成したエマルジョンは室温に冷却され、そして、１０ｍｌのガラスバイアルに移し、周囲条件下で、一夜保管した。サンプルは、最短で１６時間、ディープ  フリーザーの中で冷凍され、そして、その後、最高ターゲット温度になるまで凍結乾燥した。
【００６６】
原理の証拠のため、ヒアルロン酸は、発明された方法に従って処理された。ここで、純粋なヒアルロン酸と、ＭＣＴニュートラルオイルとセピノブＥＭＴ−１０を有するヒアルロン酸の組成物を、温度を変化させて凍結乾燥した。
【００６７】
以下のサンプルを分析した。
１．ニュートラルオイル、未処理
２．セピノブＥＭＴ−１０、未処理
３．ヒアルロン酸、未処理
４．セピノブＥＭＴ−１０、１２０℃で凍結乾燥
５．ヒアルロン酸、１２０℃で凍結乾燥
６．混合物（ヒアルロン酸、ニュートラルオイルとセピノブＥＭＴ−１０）、４０℃で凍結乾燥
７．混合物、６０℃で凍結乾燥
８．混合物、８０℃で凍結乾燥
９．混合物、１００℃で凍結乾燥
１０．混合物、１２０℃で凍結乾燥
【００６８】
サンプルは、３つの分析カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー  システムで、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。サンプルは、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、非溶性部分を濾過により除去した。
【００６９】
カラムは、デキストラン／プルラン標準品を使用して校正された。サンプルの分子質量は、当該検量線（検量線は、図４を参照）に基づき決定された。
【００７０】
純粋なヒアルロン酸のサンプルだけが完全に溶解性であった。セピノブ（Ｓｅｐｉｎｏｖ）ＥＭＴ−１０またはニュートラルオイルの溶解性の成分は、分析中に、問題のあるいかなるシグナルを生成しない（図５ａおよび５ｂを参照）。
【００７１】
結果は、その組成物および凍結乾燥温度が、ヒアルロン酸の平均分子量に影響を与えることを明確に示した。純粋なヒアルロン酸の、高温での凍結乾燥の効果が起こり、平均分子量の減少を齎す一方（図６ａ、ｂ参照）、その効果は、混合物においてより強かった（図７ａ、ｂを参照）。
【００７２】
全体的には、凍結乾燥処理中のパラメーターの選択は、凍結乾燥後のヒアルロン酸の平均分子量を制御するのに適切であることが、明確に目視できる。
【００７３】
実施例２：分解に及ぼすpH値の影響
１．４７８  Ｍｉｏ  Ｄａ（Ｃｏｎｔｉｐｒｏ社、ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量）の分子量を有するヒアルロン酸を、蒸留水に、８０℃で、５分間かけて溶解し、１重量％の水溶液にした。ｐＨを、塩酸で、２．９から６．２１の範囲に調整した。
【００７４】
７．５ｍｌのＨＡ溶液を、１０ｍｌのガラスバイアルに分配し、サンプルを、−２０℃で、一夜、凍結し、そして、キリスト  イプシロン  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ）プラス  ＨＴ装置に置き、そして、図３に示すように１０／１２０℃の温度プロファイルに従って、約２０時間処理した。
【００７５】
凍結乾燥したサンプルは、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で、０．３重量％の濃度に、希釈され、そして、プルランおよびデキストランの分子量標準に対して、ゲル浸透クロマトグラフィーの手段により、分析された。
【００７６】
調整したｐＨとは独立に、すべてのサンプルは開裂され、ｐＨ６．２１で、最高７６６ｋＤａ、そして、ｐＨ２．９で、最小８４．７５ｋＤａを示した（図７）。高分子における遊離酸の官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の量が高くなればなるほど、その高分子の開裂傾向が高くなる。低分子量のサンプルと同様に、高分子量の、相当するｅｌｕｇｒａｍを図８に示した。
【００７７】
実施例3:異なる分子量を持つヒアルロン酸の分解
ヒアルロン酸の４つの異なるタイプ（Ｃｏｎｔｉｐｒｏ社／ＧｆＮ  ３０１０（分子量：１４７８ｋＤａ）、Ｐｒｉｎｃｉｐｉｕｍ  Ｃｕｂｅ３（分子量：７３３ｋＤａ）、Ｐｒｉｎｃｉｐｉｕｍ  シグナル−１０（分子量：２５ｋＤａ）およびフリーダ  ミニ−ＨＡ（Ｆｒｅｄａ  ｍｉｎｉ−ＨＡ）（分子量：２７ｋＤａ））を、５分間、８０℃で、蒸留水に溶かし、１重量％の溶液にした。溶液は、そのまま使用されるか、または、ｐＨを、約３．５に調節した。
【００７８】
７．５ｍｌのＨＡ溶液は、１０ｍｌのガラスバイアルに分配され、サンプルは、−２０℃で、一夜、凍結され、そして、キリスト  イプシロン  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  プラス  ＨＴ  装置（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  ｐｌｕｓ  ＨＴ  ｄｅｖｉｃｅ）に置かれ、そして、図３に示すように、約２０時間、１０／１２０℃、または、代替として、１２０℃の温度プロファイルに従って処理した。
【００７９】
凍結乾燥サンプルは、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で、０．３重量％の濃度に希釈され、そして、プルランおよびデキストランの分子量標準に対して、ゲル浸透クロマトグラフィーの手段により分析された。
【００８０】
中高の分子量のＨＡは、次の表に示すように、蒸留水に溶解したオリジナルのｐＨで、分子量の緩やかな崩壊を示した。一方、低いｐＨで、物質の分子量は、劇的に崩壊した
【００８１】
【表１】
2018510927.tif 000003
【００８２】
実施例4：ヒアルロン酸を含むエマルジョン
高分子量のヒアルロン酸（ＧｆＮ／Ｃｏｎｔｉｐｒｏ  ３０１０、１．５ＭＤａ）５グラムを、蒸留水４６５ｇに溶解し、８０℃に加熱して、そして、Ｓｏｍａｋｏｎ  ＭＰ−ＬＢ（１Ｌ）混合機の手段で、１５分間、１４００ｒｐｍで、常圧で撹拌した。
【００８３】
７．５ｇのＳｅｐｉｎｏｖ  ＥＭＴ−１０（ＩＮＣＩ名：ヒドロキシエチル  アクリレート（および）ナトリウム  アクリロイル  ジメチル  タウリン共重合体（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｃｒｙｌａｔｅ  （ａｎｄ）  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｒｙｌｏｙｌ  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｔａｕｒａｔｅ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ））を加え、ｐＨを３．０５に調整し、そして、混合物を、１４００ｒｐｍ／２００μｂａｒで、８０℃で、さらに、１５分間攪拌した。
【００８４】
モデルオイル化合物として、中鎖トリグリシデリド（ｔｒｉｇｌｙｃｉｄｅｒｉｄｅｓ）（ＭＣＴｓ）の２５ｇを追加し、そして、５分間、２１００ｒｐｍ／２００μｂａｒで、ホモジナイズした。
【００８５】
得られたエマルション７．５ｍｌを、１０ｍｌガラスバイアルに分配した。サンプルは、−２０℃で、一夜、凍結され、そして、キリスト  イプシロン  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  プラス  ＨＴ装置に置かれ、そして、最高４０、６０、８０、１００および１２０℃で、約２０時間、処理された。
【００８６】
凍結乾燥サンプルは、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で、０．３重量％の濃度に希釈され、そして、ＧＰＣの手段で分析された。図９は、最高の処理温度の上昇とともに、ヒアルロン酸の分子量（Ｍｗ）の、温度依存性が減少することを示す。
【００８７】
実施例５：異なる生体高分子の凍結乾燥
高分子は、８０℃で、５分間、蒸留水で溶解し、１重量％の溶液にした。溶液のｐＨを測定し、そして、未処理の高分子溶液の分子量分布を、プルランとデキストランの分子量標準に対して、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で、０．３重量％に、サンプルを希釈して、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の手段によって、決定した。
【００８８】
７．５ｍｌの高分子溶液を、１０ｍｌのガラスバイアルに分配した。サンプルは、−２０℃で、一夜、凍結され、そして、キリスト  イプシロン  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  プラス  ＨＴ装置に置き、そして、図３に示すように、１０／１２０℃の温度プロファイルに従って、約２０時間、処理された。
【００８９】
凍結乾燥サンプルは、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で、０．３重量％の濃度に希釈され、そして、ＧＰＣの手段で分析された。結果は、次の表のとおりである
【００９０】
【表２】
2018510927.tif 000004
【００９１】
【表３】
2018510927.tif 000005
【００９２】
実施例６：積層された（ｓｔａｃｋｅｄ）、ヒアルロン酸溶液のｐＨおよび容量変化
１．４７８のＭｉｏ  Ｄａ（Ｃｏｎｔｉｐｒｏ社、ゲル浸透クロマトグラフィーによる、分子量）の分子量のヒアルロン酸を、８０℃で、５分間、蒸留水で、溶解し、１重量％の溶液にした。溶液の１画分を、通常のｐＨで使用し、２番目の画分を、塩酸でｐＨ２．９に調整した。
ｐＨ６．２１のＨＡ溶液を、１０ｍｌガラスバイアルに、０．７５〜６．７５ｍｌの異なる容量で分注した。サンプルを、−２０℃で凍結し、そして、６．７５〜０．７５ｍｌのｐＨ２．９のＨＡ溶液で積層し（ｓｔａｃｋｅｄ）、そして、再度凍結し、そして、−２０℃で、一晩、保存した。対応する容量比を以下の表に示す。
【００９３】
【表４】
2018510927.tif 000006
【００９４】
サンプルを、Ｃｈｒｉｓｔ  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  プラス  ＨＴ装置に入れ、そして、図３に示すように、１０／１２０℃の温度プロファイルに従って、約２０時間処理した。
【００９５】
凍結乾燥されたサンプルを、０．３重量％の濃度に、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で、希釈し、そして、プルランおよびデキストラン分子量標準に対して、ゲル浸透クロマトグラフィーの手段により分析した。
体積比に依存して、異なる形状の分子量分布が形成され（図１０参照）、体積分率（ｖｏｌｕｍｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）および体積分率（ｖｏｌｕｍｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の調整されたｐＨに依存して、分子量分布の任意の形状が得られることが示される。標的生物学的機能に依存して、最適な分子量分布を設計することができる。
【００９６】
実施例７：積層された（ｓｔａｃｋｅｄ）、プルラン溶液の、ｐＨおよび容量の変化
分子量３７１ｋＤａのプルラン（林原社、ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量）を、８０℃で、蒸留水で、５分間で溶解し１重量％の溶液にした。その溶液の１画分を、通常のｐＨ（４．９）で使用し、２番目の画分を、塩酸で、ｐＨ３．５に調整した。
ｐＨ４．９のプルラン溶液を、１０ｍｌのガラスバイアルに、０．７５〜６．７５ｍｌの異なる容量で分注した。サンプルを、−２０℃で凍結し、そして、６．７５〜０．７５ｍｌのｐＨ２．９のプルラン溶液で積層し（ｓｔａｃｋｅｄ）、そして、再び凍結し、そして、−２０℃で、一晩、保存した。対応する容量比を以下の表に示す。
【００９７】
【表５】
2018510927.tif 000007
【００９８】
サンプルを、Ｃｈｒｉｓｔ  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  プラス  ＨＴ装置に入れ、そして、図３に示すように、１０／１２０℃の温度プロファイルに従って、約２０時間処理した。
凍結乾燥されたサンプルを、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で希釈し、０．３重量％の濃度にし、そして、プルランおよびデキストラン分子量標準に対する、ゲル浸透クロマトグラフィーの手段により分析した。
体積比に応じて、異なる形状の分子量分布を達成することができる（図１１参照）。分子量Ｍｗは、主に、低ｐＨ溶液の量によって影響される。
【００９９】
実施例８：積層した（ｓｔａｃｋｅｄ）アルギン酸ナトリウム溶液のｐＨおよび容量の変化
８８１ｋＤａの分子量を有するアルギン酸ナトリウム（Ｃａｒｇｉｌｌ社、ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量）を、８０℃で、蒸留水で、５分間溶解し、１重量％の溶液にした。溶液の１画分を、通常のｐＨ（７．１５）で使用し、２番目の画分を、塩酸で、ｐＨ３．５に調整した。
ｐＨ７．１５のアルギン酸ナトリウム溶液を、１０ｍｌガラスバイアル中に、０．７５〜６．７５ｍｌの異なる容量で分注した。サンプルを、−２０℃で凍結し、そして、６．７５〜０．７５ｍｌの、ｐＨ３．５のアルギン酸ナトリウム溶液を積層し（ｓｔａｃｋｅｄ）、そして、再び凍結し、そして、−２０℃で、一晩、保存した。対応する容量比を以下の表に示す。
【０１００】
【表６】
2018510927.tif 000008
【０１０１】
サンプルを、Ｃｈｒｉｓｔ  ２−１０Ｄ  ＬＳＣ  プラス  ＨＴ装置に入れ、そして、図３に示すように、１０／１２０℃の温度プロファイルに従って、約２０時間処理した。
【０１０２】
凍結乾燥されたサンプルを、ＧＰＣバッファー（ｐＨ７．４）で希釈し、０．３重量％の濃度にして、そして、プルランおよびデキストラン分子量標準に対するゲル浸透クロマトグラフィーの手段により分析した。体積比に依存して、異なる形状の分子量分布を成形することができる（図１２参照）。分子量のシフトは、主に、凍結乾燥条件の影響を受け、そして、低ｐＨ溶液の量の影響は、ほとんど受けなかった。
【図１】
2018510927.tif 000009
【図２】
2018510927.tif 000010
【図３】
2018510927.tif 000011
【図４】
2018510927.tif 000012
【図５ａ−１】
2018510927.tif 000013
【図５ａ−２】
2018510927.tif 000014
【図５ｂ−１】
2018510927.tif 000015
【図５ｂ−２】
2018510927.tif 000016
【図６ａ】
2018510927.tif 000017
【図６ｂ】
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【図７ａ】
2018510927.tif 000019
【図７ｂ】
2018510927.tif 000020
【図８Ａ】
2018510927.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図９】
2018510927.tif 000023
【図１０】
2018510927.tif 000024
【図１１】
2018510927.tif 000025
【図１２】
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【国際調査報告】
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2018510927.tif 000028
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