(57)【要約】  グリホサートに対する抵抗性を有する植物を本明細書において開示する。一実施形態において、本開示は、植物のＥＰＳＰＳ遺伝子における人為的非トランスジェニック変異に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ、Ｂ又はＤゲノムの少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の人為的非トランスジェニック変異を含むコムギ植物であって、前記変異が、野生型コムギ植物と比較してグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物に貢献するコムギ植物。
【請求項２】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、タンパク質の活性領域に変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質を産生する、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項３】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、Ａゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項４】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、表４に記載の１つ以上の変異を有するＡゲノムのＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、請求項３に記載のコムギ植物。
【請求項５】
前記Ａゲノムの前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、配列番号９の１７２位でのプロリンからセリンへの置換を有するポリペプチドをコードする、請求項３に記載のコムギ植物。
【請求項６】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、Ｂゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項７】
前記Ｂゲノムの前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、表４に記載の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、請求項６に記載のコムギ植物。
【請求項８】
前記Ｂゲノムの前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、配列番号９の１７２位でのプロリンからロイシンへの置換を有するポリペプチドをコードする、請求項６に記載のコムギ植物。
【請求項９】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、Ｄゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１０】
前記ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、表４に記載の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする、請求項９に記載のコムギ植物。
【請求項１１】
前記Ｄゲノムの前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の人為的非トランスジェニック変異が、配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）を有するポリペプチドをコードする、請求項９に記載のコムギ植物。
【請求項１２】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の変異が、前記Ｂ及びＤゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１３】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の変異が、前記Ａ及びＢゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１４】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の変異が、前記Ａ及びＤゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１５】
前記ＥＰＳＰＳ遺伝子における前記１つ以上の変異が、前記Ａ、Ｂ及びＤゲノムにおけるものである、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１６】
トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種(ssp. aestivum)である、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１７】
トリチカム・ツルギダム・デュラム亜種(subsp. Durum)である、請求項１に記載のコムギ植物。
【請求項１８】
請求項１に記載のコムギ植物からのコムギ穀粒。
【請求項１９】
請求項１８に記載のコムギ穀粒を含む穀粉。
【請求項２０】
請求項１に記載のコムギ植物の成分を含む食品。
【請求項２１】
請求項１に記載のコムギ植物からのコムギ種子、植物部位又は子孫。
【請求項２２】
Ａ、Ｂ及びＤゲノムの少なくとも２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の人為的非トランスジェニック変異を含むコムギ植物であって、前記ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が、配列番号９のアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの置換を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【請求項２３】
配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの置換（Ｔ１６８Ｉ）を有するＥＰＳＰＳポリペプチドを産生するＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における第２変異を更に含む、請求項２０に記載のコムギ植物。
【請求項２４】
Ａ、Ｂ及びＤゲノムの少なくとも２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の変異を含むコムギ植物であって、前記ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における変異が、配列番号９のアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を有するＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、更にＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における変異が、配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【請求項２５】
配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における第２変異を更に含む、請求項２４に記載のコムギ植物。
【請求項２６】
配列番号９のアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における第２変異を更に含む、請求項２４に記載のコムギ植物。
【請求項２７】
配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における変異を更に含む、請求項２４に記載のコムギ植物。
【請求項２８】
Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含むコムギ植物であって、前記ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が、少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が、少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が、変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【請求項２９】
Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の人為的非トランスジェニック変異を含むコムギ植物であって、前記ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し、前記ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し、前記ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し、更に野生型コムギ植物と比較してグリホサートに対する上昇した抵抗性を有するコムギ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２０１５年７月２日に出願の米国仮特許出願第６２／１８８３６０号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により全て本願に援用される。
【０００２】
本開示は、コムギ及びコムギ植物の１つ以上の５−エノール−ピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）同祖遺伝子における変異並びにこの変異をＥＰＳＰＳ同祖遺伝子配列の少なくとも１つに有する植物部位に関する。一実施形態において、この変異は人為的(human induced)非トランスジェニック変異である。別の実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ同祖遺伝子の少なくとも１つにおける変異の結果として除草剤グリホサートに対する抵抗性を有するコムギに関する。
【背景技術】
【０００３】
雑草の防除を目的として栽培業者が使用している除草剤の致死的効果に対してコムギを抵抗性にできたならば、コムギ栽培における雑草防除はおおいに改善されるであろう。そのような除草剤の１つがグリホサートであり、グリホサートは酵素５−エノール−ピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。アミノ酸及びリグニンを含めた多数の重要な化合物の生合成にはＥＰＳＰＳ活性が必要なため、その阻害は植物にとって致命的である。グリホサートは極めて効果的な除草剤であり、商業的農業で広く使用されている。
【０００４】
キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ及びワタを含めた多くの作付植物が、改変細菌性ＥＰＳＰＳを過剰発現するようにトランスジェニック操作されている。改変細菌性ＥＰＳＰＳはグリホサートに結合しないが、依然として、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及び３−ホスホシキミ酸を含めた植物の内在性基質に対して高い親和性を保持する。生育期にこれらの遺伝子操作作物を植えた畑にグリホサートを散布することで雑草を防除できるが、これは改変細菌性ＥＰＳＰＳを発現している作物が生き残るからである。
【０００５】
その商業的価値は途方もなく高いことから、トランスジェニックグリホサート抵抗性コムギが開発されたが（米国特許第７０７１３２５号）、遺伝子組み換え（ＧＭ）食品は消費者から受け入れられないことを主な理由として、市場にはでていない（Ｓｔｏｋｓｔａｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０８８−１０８９，２００４）。多くの消費者が遺伝子組み換え作物、特にはＧＭ食用作物に抵抗があり、非トランスジェニック手段を通してグリホサート抵抗性コムギを開発する試みがなされている。例えば、組み換えオリゴヌクレオチドを用いて内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子を変異させることが提案されている（米国特許出願公開第２００８／０２５６６６８号）が、グリホサート抵抗性アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物が実際にこのやり方で再生できたかは実証されておらず、このやり方がコムギで通用するかも示されなかった。
【０００６】
ＥＰＳＰＳの特性及びグリホサート結合ポケットが保存される性質についてはこれまでも研究されているものの、抵抗性につながるＥＰＳＰＳ酵素における特定のアミノ酸変化には種によって違いがある。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＳＰＳの９７位でのトレオニンからイソロイシンへの変化はグリホサートに対する感度と、酵素のその天然基質であるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）に対する低親和性につながり（Ｆｕｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４：９８５４−９８６０，２００９）、それとは対照的に、トウモロコシＥＰＳＰＳにおける同等のトレオニンからイソロイシンへの変化は、グリホサートによる阻害の低下につながる（米国特許第６５６６５８７号）。
【０００７】
要約すると、遺伝子操作の産物ではなく、それゆえに全ての消費者に受け入れられるグリホサート抵抗性コムギの開発は依然として商業的に注目されている。これまでの研究は、トランスジェニック操作による変異細菌性ＥＰＳＰＳの過剰発現がコムギを含めた多数の作物にグリホサート抵抗性をもたらすことを実証してきた。しかしながら、これまで、１つ以上の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異が全ての作付植物、特にはコムギ等の六倍体植物での抵抗性につながるというエビデンスはない。更に、グリホサート抵抗性をもたらし得る変異の性質は不明である。グリホサート結合ドメインはＥＰＳＰＳ全てで高度に保存されているという事実にも関わらず、種特異的な差異が指摘されているからである。
【０００８】
非トランスジェニックグリホサート抵抗性コムギへのニーズに応えるために、発明者は、標的選択的変異誘発スクリーニング法（ｔａｒｇｅｔ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いることで六倍体コムギＥＰＳＰＳの３つの同祖コピーのそれぞれにおいて特異的な変化を作り出し、同定した。これら３つのコムギＥＰＳＰＳ同祖遺伝子についての新規な部分ゲノムＤＮＡ配列を求め、次にそれを用いて各ＥＰＳＰＳホメオログ（ｈｏｍｏｅｏｌｏｇｕｅ）の活性部位領域に特異的な変化を有する個々のコムギ植物を同定した。選択マーカーとして変異を用いて交配することで、ＥＰＳＰＳの同祖コピーの全てにおける好ましい変化についてホモ接合である植物を作出した。これらのコムギ植物はそのゲノムに外来ＤＮＡを含めなくともグリホサートに抵抗性であることから、消費者にもコムギ品種改良家にも受け入れられるであろう。１つ以上のＥＰＳＰＳ同祖遺伝子における人為的非トランスジェニック変異の結果としてグリホサートに対して抵抗性があるそのような非トランスジェニックコムギ栽培品種は、パン、ケーキ、クッキー、トルティーヤ及びクラッカー等の小麦ベースの食品にとって大変な価値があるものとなる。
【発明の概要】
【０００９】
一実施形態において、本開示は、グリホサート抵抗性植物をもたらす１つ以上の変異をＥＰＳＰＳ遺伝子に有する植物及び植物部位に関し、以下に限定するものではないが、オオムギ、コムギ及びライムギ植物を含む。一実施形態において、本開示は、グリホサート耐性植物をもたらす１つ以上の変異をＥＰＳＰＳ遺伝子に有する植物及び植物部位に関し、以下に限定するものではないが、オオムギ、コムギ及びライムギ植物を含む。
【００１０】
一実施形態において、変異は人為的非トランスジェニック変異である。更に別の実施形態において、本開示は改変された遺伝子を有する植物に関し、遺伝子は、ゲノム編集により改変され且つグリホサートに対する抵抗性を有する植物に貢献する。
【００１１】
一実施形態において、本明細書で論じる植物はコムギ、オオムギ及びライムギを含む。一実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の変異を有する植物及び植物部位からの穀粒に関する。
【００１２】
一実施形態において、本開示は１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子又は相同遺伝子に非トランスジェニック変異を有する植物に関し、この変異はグリホサートに対する抵抗性を有する植物をもたらす。一実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子における非トランスジェニック変異に関し、この変異はグリホサートに対する抵抗性を有する植物をもたらす。
【００１３】
一実施形態において、１つ以上の変異はコムギＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。別の実施形態において、１つ以上の変異は、コムギＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。別の実施形態において、１つ以上の変異はＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。
【００１４】
一実施形態において、本開示はＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異に関し、以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む。
【００１５】
別の実施形態において、本開示は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）及びＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）に関する。
【００１６】
別の実施形態において、本開示はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異）に関する。
【００１７】
別の実施形態において、本開示はＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）に関する。
【００１８】
別の実施形態において、本開示はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の変異（以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む）に関する。
【００１９】
一実施形態において、本開示はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも２つの変異を含むコムギ植物に関し、Ａゲノムの変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。
【００２０】
更に別の実施形態において、本開示はＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に２つの変異を含むコムギ植物に関し、Ｄゲノムの変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする。
【００２１】
別の実施形態において、本開示は、野生型のコムギ植物、コムギ種子、コムギ植物部位及びその子孫と比較してグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物、コムギ種子、コムギ植物部位及びその子孫に関する。
【００２２】
別の実施形態において、本開示は、野生型のコムギ植物と比較してグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物、コムギ種子、コムギ植物部位及びその子孫に関し、グリホサートに対する抵抗性は、コムギ植物のＥＰＳＰＳ遺伝子の１つ以上における人為的非トランスジェニック変異により引き起こされる。別の実施形態において、本開示は、野生型のコムギ植物と比較してのグリホサート抵抗性並びに通常の発芽及び生存率を有するコムギ植物に関する。
【００２３】
別の実施形態において、変異を有するＥＰＳＰＳ遺伝子によりコードされる改変ＥＰＳＰＳタンパク質はグリホサートに対して変化した親和性を有する。更に別の実施形態において、改変ＥＰＳＰＳタンパク質は、酵素の内在性基質に対する相当な親和性を保持する。
【００２４】
別の実施形態において、本開示は、１つ以上の変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するコムギ植物、その植物の種子、花粉、植物部位及び子孫に関する。
【００２５】
別の実施形態において、本開示は、改変ＥＰＳＰＳタンパク質を有するコムギ種子及びコムギ穀粉を取り入れた食物及び食品に関し、改変ＥＰＳＰＳタンパク質は、１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子における人為的非トランスジェニック変異により引き起こされる低いグリホサート親和性を有する。
【００２６】
別の実施形態において、本開示は、野生型のコムギ植物と比較してグリホサートに対する親和性が低い１つ以上のＥＰＳＰＳタンパク質を有するコムギ植物に関し、このコムギ植物は、親コムギ植物から植物材料を得るステップと、この植物材料を変異原で処理して植物材料のＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーに少なくとも１つの変異を起こさせることで変異が誘発された植物材料（例えば、種子又は花粉）を作り出すステップと、子孫コムギ植物を分析することでＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける少なくとも１つの変異を検出するステップと、ＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫コムギ植物を選択するステップと、ＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫コムギ植物をＥＰＳＰＳ遺伝子の異なるコピーに少なくとも１つの変異を有する他の子孫コムギ植物と交配させるステップと、変異を有する子孫コムギ植物を同定し、変異を有する子孫コムギ植物を変異を有する他の子孫コムギ植物と交配させることでグリホサートに対する親和性が低いＥＰＳＰＳタンパク質を有する子孫コムギ植物をつくるサイクルを繰り返すステップにより作出される。別の実施形態において、本方法は、変異が誘発された植物材料を成長させる又は使用することで子孫コムギ植物をつくることを含む。
【００２７】
配列リストの簡単な説明
配列番号１は、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＥＰＳＰＳ  ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０６３２４７）を示す。
【００２８】
配列番号２は、オリザ・サティバＥＰＳＰＳゲノムＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００８３９９）を示す。
【００２９】
配列番号３は、配列番号２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０５６７１２）がコードするＥＰＳＰＳタンパク質を示す。
【００３０】
配列番号４〜５は、ゲノムシーケンシングに使用するトリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＥＰＳＰＳ特異的プライマーのＤＮＡ配列を示す。
【００３１】
配列番号６は、コムギのＡゲノムのＥＰＳＰＳについての部分ゲノムＤＮＡ配列を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示す。
【００３２】
配列番号７は、コムギのＢゲノムのＥＰＳＰＳについての部分ゲノムＤＮＡ配列を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示す。
【００３３】
配列番号８は、コムギのＤゲノムのＥＰＳＰＳについての部分ゲノムＤＮＡ配列を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示す。
【００３４】
配列番号９は、コムギＥＰＳＰＳタンパク質についてのアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号１０〜１３は、変異検出に使用するコムギＥＰＳＰＳ特異的プライマーのＤＮＡ配列を示す。
【００３６】
配列番号１４〜１７は、変異検出に有用なプライマーを示す。
【００３７】
配列番号１８は、コムギＥＰＳＰＳタンパク質の活性領域のアミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】イネＥＰＳＰＳタンパク質及びコムギＥＰＳＰＳタンパク質の配列アラインメントである。イネ及びコムギＥＰＳＰＳタンパク質間には相当な類似性がある。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本開示における数値範囲は近似値であるため、別段の定めがない限り、範囲外の値も含み得る。数値範囲は、任意の小さい値と任意の大きい値とが少なくとも２単位離れているならば、小さい値及び大きい値からとこれらの値を含めた１単位ずつ増える全ての値を含む。例えば、組成的な、物理的な又は他の特性、例えば分子量、粘度等が１００〜１０００である場合、全ての個々の値、例えば１００、１０１、１０２等及び部分範囲、例えば１００〜１４４、１５５〜１７０、１９７〜２００等が明確に列挙されたものとする。１未満又は１を超える分数を含む値（例えば、１．１、１．５等）を含む範囲の場合、適宜、１単位は０．０００１、０．００１、０．０１又は０．１と見なされる。１０未満の１桁の数字を含む範囲の場合（例えば、１〜５）、１単位は典型的には０．１であると見なされる。これらは具体的に意図したものの例にすぎず、列挙した最小値と最大値との間の数値の全ての考えられ得る組み合わせが本開示において明確に提示されたとみなされたい。数値範囲は、本開示において、とりわけ、混合物の成分の相対量、また方法で説明する様々な温度及び他のパラメータ範囲に関して設けられる。
【００４０】
本明細書において、「アレル」という語はある遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかであり、全てが１つの形質又は特徴に関わる。二倍体細胞又は生物において、所与の遺伝子の２つのアレルは、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。四倍体又は六倍体の細胞又は生物、例えばコムギにおいては、ゲノムの１つ上の所与の遺伝子の２つのアレルは、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占め、別のゲノム、例えば四倍体のＡ又はＢゲノム、或いは六倍体コムギのＡ、Ｂ又はＤゲノム上の同じ遺伝子座を占める同じ遺伝子の２つのアレルは第１のゲノムの遺伝子と同祖であり且つ同祖染色体上に存在すると言われる。
【００４１】
本明細書において、「改変」、「増加」、「低下」、「阻害」等の語は相対的、すなわち野生型又は改変していない状態と比較してのものであると見なす。「タンパク質のレベル」とは、特定のタンパク質、例えばＥＰＳＰＳの量のことであり、当該分野で公知の任意の手段、例えばウェスタンブロット分析又は他の免疫学的手段により測定し得る。
【００４２】
本明細書において、「改変ＥＰＳＰＳタンパク質活性」とは、グリホサートに対する親和性が低いＥＰＳＰＳタンパク質のことである。一実施形態において、ＥＰＳＰＳタンパク質はグリホサートに対しては変化した親和性を、ただし植物又は内在性基質に対しては相当な親和性を保持し得る。ＥＰＳＰＳ活性のレベルは変異体において変化するかもしれないものの、タンパク質それ自体の発現レベル（量）は変化しないことがわかる。逆に、より活性が高い又は低いタンパク質が産生されたならば、タンパク質の量は変化するかもしれないものの、活性は同じままとなる。量及び活性の両方における低下も考えられ、例えば、そのタンパク質をコードしている遺伝子が不活化される場合である。特定の実施形態において、タンパク質レベルの低下又はグリホサートに対する低い親和性は、無改変のコムギの胚乳におけるタンパク質レベル又はグリフォスフェート（ｇｌｙｐｈｏｓｐｈｇａｔｅ）に対する親和性と比較して、少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％である。タンパク質若しくは遺伝子発現のレベル又はグリホサートに対するＥＰＳＰＳタンパク質の親和性の低下は、植物及び穀粒の発育の任意の段階で、特には栄養成長中及び登熟段階中、或いは植物及び穀粒の成熟までの発育の全ての段階で、植物の分裂組織において起き得る。
【００４３】
本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチド配列の「同一性」及び「類似性」は、比較している２つの配列間での最適なグローバルアラインメントで判断する。最適なグローバルアラインメントは、例えばニードルマン−ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて達成する。配列は当該分野で公知のアルゴリズムを用いてもアラインし得て、以下に限定するものではないが、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖアルゴリズム又はＢｌａｓｔｎ若しくはＢＬＡＳＴ２配列プログラムを含む。
【００４４】
「同一性」とは、第１ポリペプチド又はポリヌクレオチドの特定の位置にあるアミノ酸又はヌクレオチドが、第１ポリペプチド又はポリヌクレオチドと最適なグローバルアラインメントにある第２ポリペプチド又はポリヌクレオチド中の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと同一であることを意味する。同一性とは対照的に、「類似性」は、保存的置換基であるアミノ酸を包含する。「保存的」置換基は、Ｂｌｏｓｕｍ６２置換行列（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）において正のスコアを有する任意の置換基である。
【００４５】
「配列Ａは配列Ｂにｎ％類似している」という記述は、配列Ａと配列Ｂとの最適なグローバルアラインメントの位置のｎ％が同一残基又はヌクレオチド及び保存的置換基から成ることを意味する。「配列Ａは配列Ｂとｎ％同一である」という記述は、配列Ａと配列Ｂとの最適なグローバルアラインメントの位置のｎ％が同一残基又はヌクレオチドから成ることを意味する。
【００４６】
本明細書において、「遺伝子」又は「遺伝子配列」という語は、ある遺伝子の部分又は完全コード配列、その相補的配列及びその５’又は３’非翻訳領域のことである。遺伝子は遺伝の機能単位でもあり、物理的には、ポリペプチド鎖の産生に関わるＤＮＡ（又はＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）の分子に沿ったヌクレオチドの特定のセグメント又は配列である。後者を続くプロセシング、例えば化学修飾又はフォールディングに供すると機能性タンパク質又はポリペプチドが得られる。遺伝子は、単離、部分単離又は生物のゲノム内で発見し得る。例えば、転写因子遺伝子は転写因子ポリペプチドをコードし、転写因子ポリペプチドは機能性になり得る又は転写のイニシエータとして機能するためのプロセシングを必要とし得る。
【００４７】
操作上、遺伝子はシス−トランス検定により定義し得て、この検定は、２つの変異が同一遺伝子で起きるか否かを確認する遺伝子試験であり、遺伝的に活性な単位の限界を求めるのに使用し得る。一般に、遺伝子は、コード領域の前（「リーダー」、上流）及び後ろ（「トレーラー、下流）にくる領域を含む。遺伝子は、「イントロン」と称される、介在性の非コード配列も含み得て、エクソンと称される個々のコードセグメントの間に位置する。殆どの遺伝子が、関連するプロモーター領域、すなわち転写開始コドンの調節配列５’を有する（同定できるプロモーターを有さない遺伝子もある）。遺伝子の機能は、エンハンサー、オペレーター及び他の調節要素でも調節し得る。
【００４８】
本明細書において、「改変植物」という語は、非トランスジェニック変異を有する植物、トランスジーンを含む植物、ゲノム編集を経た植物又はこれらの組み合わせを含む。
【００４９】
本明細書において、「植物」という語には、種子又は穀粒又は葯が取り除かれた植物を含めた未熟な又は成熟した全草への言及が含まれる。植物を生む種子又は胚も植物と見なす。
【００５０】
本明細書において、「植物部位」という語には、そこからコムギ植物を再生できる植物のプロトプラスト、植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊（ｐｌａｎｔ  ｃｌｕｍｐ）及び植物又は植物の部位において完全である植物細胞、例えば胚、花粉、胚珠、果皮、種子、花、小花、頭状花、穂、葉、根、根端、葯等である。
【００５１】
本明細書において、「ポリペプチド」という語は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合で互いにつながれた２つ以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、一般にはペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと称される短鎖のものと、一般にはタンパク質と称される長鎖のものの両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、自然な過程、例えばプロセシング及び他の翻訳後修飾、また化学修飾技法により修飾されたものを含む。そのような修飾は基礎的な書籍及びより詳細なモノグラフ、また巻数の多い研究文献に詳述されており、また当業者に周知である。当然のことながら、同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドの幾つかの部位に同じ又は異なる度合いで存在し得る。
【００５２】
本明細書において、一般に、「ポリヌクレオチド」という語は任意のポリリボヌクレオチド又はポリ−デオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡになり得る。この定義には、限定することなく、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくは、より典型的には、二本鎖若しくは三本鎖領域又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物になり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。「ポリヌクレオチド」という語は、変異誘発により１００％同一ではないものの同じアミノ酸配列をコードする、「オリゴヌクレオチド」と称されることが多い短いヌクレオチド又はフラグメントもその範囲に含む。
【００５３】
本明細書において、「グリホサートに対する低い親和性」という句は、通常測定されるものより低い率でグリホサートに結合及び／又は相互作用することを意味する。一実施形態において、グリホサートに対する低い親和性とは、グリホサートへの結合を示さないタンパク質のことである。別の実施形態において、グリホサートに対する低い親和性とは、野生型ＥＰＳＰＳより緩やかな率でグリホサートに結合する１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質のことである。一実施形態において、グリホサートに対する低い親和性とは、グリホサートに対する野生型ＥＰＳＰＳの結合率の約１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％の率でグリホサートに結合する１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質のことである。一実施形態において、グリホサートに対する低い親和性とは、グリホサートに対する野生型ＥＰＳＰＳの結合率の７０％未満又は６０％未満又は５０％未満又は４０％未満又は３０％未満又は２０％未満又は１０％未満又は５％未満の率でグリホサートに結合する１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質のことである。
【００５４】
本明細書において、「グリホサートに対する抵抗性」という語は、「グリホサートに対する耐性」という語と同じ意味で使用される。どちらの表現も、野生型の植物では通常、害及び／又は成長阻害を引き起こすであろうグリホサートの散布量下で成長できる植物の能力を包含する。「グリホサートに対する抵抗性」という語は、野生型の植物にとっては有害又は致命的であろうグリホサートの散布量で成長及び／又は実ることができる植物の能力を包含する。
【００５５】
一実施形態において、グリホサートに対する抵抗性／耐性は、野生型の植物と比較して高い割合又は量のグリホサートで成長できる、実れる又は生存できる植物の能力を包含し、以下に限定するものではないが、１〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％及び１００％超えを含む。
【００５６】
一実施形態において、グリホサートに対する抵抗性／耐性は、野生型の植物と比較して多いグリホサート散布回数で成長できる、実れる又は生存できる植物の能力を包含し、以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０回を超えるグリホサート散布回数を含む。
【００５７】
本明細書における「低下又は非機能性フラグメント」とは、全核酸配列のタンパク質コード配列と比較してグリホサートに対する親和性が低いＥＰＳＰＳタンパク質をコードする核酸配列のことである。言い換えると、ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする能力を実質的に保持しているが、そのコードされたＥＰＳＰＳポリペプチドのグリホサートに対する親和性は低い核酸又はフラグメントのことである。
【００５８】
本明細書における「フラグメント」という語は、人工的に（例えば、化学合成により）又は天然物を制限エンドヌクレアーゼ若しくは機械的せん断により複数片に切断することで構築した対象核酸の単離部分、或いはＰＣＲ、ＤＮＡポリメラーゼ若しくは当該分野で周知の他の重合技法で合成された又は当業者に周知の組み換え核酸テクノロジーによりホスト細胞において発現した核酸の一部であるポリヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＲフラグメント）を指す。
【００５９】
本開示のポリヌクレオチドに関して、「単離されたポリヌクレオチド」という表現を使う場合がある。この表現は、ＤＮＡの場合、由来元の生物の天然のゲノムにおいてすぐ隣（５’及び３’方向に）の配列から分離されたＤＮＡ分子のことである。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」は、ＰＣＲフラグメントを含み得る。別の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」はベクター、例えばプラスミド若しくはウイルスベクターに挿入された又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。「単離されたポリヌクレオチド分子」はｃＤＮＡ分子も含み得る。
【００６０】
本明細書において、一塩基多型（ＳＮＰ）は、トランジション（Ｃ／Ｔ又はＧ／Ａ）又はトランスバージョン（Ｃ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ａ又はＴ／Ｇ）としてのヌクレオチドの置換による２つのＤＮＡ間での１つのヌクレオチド塩基の違いである。一塩基バリアントは、ゲノムにおける１つの塩基の挿入及び欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）であるＳＮＰと見なされる。
【００６１】
本明細書において、「トランスジェニック植物」とは、同じ種、変種及び栽培品種の野生型植物では見られない遺伝子コンストラクト（「トランスジーン」）を含む植物のことである。本明細書における「トランスジーン」はバイオテクノロジー分野における通常の意味を有し、また組み換えＤＮＡ又はＲＮＡテクノロジーにより生み出された又は改変された及び植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。トランスジーンは、植物細胞由来の遺伝子配列を含み得る。典型的には、トランスジーンは、人間による操作、例えばトランスフォーメーションにより植物に導入されてきたが、当業者ならばわかるように、いずれの方法も用いることができる。
【００６２】
本明細書において、「改変ＥＰＳＰＳ遺伝子」は、非トランスジェニック変異又はトランスジーン又はゲノム編集又はこれらの組み合わせを介したＥＰＳＰＳ遺伝子の改変を含む。
【００６３】
本明細書において、「ＥＰＳＰＳ誘導体」とは、全ＥＰＳＰＳタンパク質／ペプチド／ポリペプチド配列と比較して低いグリホサート親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質／ペプチド／ポリペプチド配列のことである。「ＥＰＳＰＳ誘導体」という語は、改変ＥＰＳＰＳタンパク質／ペプチドの「フラグメント」又は「化学的誘導体」を包含する。
【００６４】
本明細書において、コムギ植物はトリチカム属に属する種の植物と定義され、この種は商業的に栽培され、例えば、トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種（普通又はパンコムギ）、トリチカム・エスチバムの他の亜種、トリチカム・ツルギダム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ）・デュラム亜種（デュラムコムギ、マカロニ又はパスタコムギとしても知られる）、トリチカム・モノコッカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）・モノコッカム亜種（栽培されたヒトツブコムギ又はスモールスペルト）、トリチカム・チモフェービ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ）・チモフェービ亜種、トリチカム・ツルギダム・ジコッコン（ｄｉｃｏｃｃｏｎ）亜種（栽培されたエンマー）及びトリチカム・ツルギダムの他の亜種（Ｆｅｌｄｍａｎ）を含む。コムギは、ＡＡＢＢＤＤ型ゲノムを有する六倍体コムギ又はＡＡＢＢ型ゲノムを有する四倍体コムギになり得る。コムギにおける遺伝的な多様性はハイブリダイゼーションによりライムギ及びオオムギを含めた特定の関連種に移行するため、本開示はそのようにしてつくられたハイブリッド種も含み、パンコムギとライムギとのハイブリッドであるライコムギを含む。一実施形態において、コムギ植物はトリチカム・エスチバム種であり、好ましくはエスチバム亜種である。或いは、変異又はトランスジーンはトリチカム・エスチバムからデュラムコムギへと簡単に移行できるため、コムギは好ましくはトリチカム・ツルギダム・デュラム亜種である。
【００６５】
別の実施形態において、本開示では、外来核酸をコムギ植物のゲノムに含めなくても野生型のコムギ植物と比較してグリホサートに対して抵抗性を示すコムギ植物について説明する。一実施形態において、本開示は、１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子における非トランスジェニック変異に関する。
【００６６】
更に別の実施形態において、本開示は、１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子における一連の独立した人為的非トランスジェニック変異、少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子にこれらの変異の１つ以上を有するコムギ植物並びにコムギの少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子において同様及び／又は追加の変異を作り出し、それらを同定する方法に関する。
【００６７】
更に別の実施形態において、本開示は、野生型の植物と比較してＥＰＳＰＳ遺伝子の発現を低下させる及び／又はグリホサートに対するＥＰＳＰＳタンパク質の親和性を低下させるトランスジーンを有するトランスジェニックコムギ植物に関する。
【００６８】
更に別の実施形態において、本開示は改変ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するコムギ植物に関し、ＥＰＳＰＳ遺伝子はゲノム編集により改変され、更にこの改変は、野生型の植物と比較してグリホサートに対して抵抗性を有する植物に貢献する。
【００６９】
Ｉ．５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）
一実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現を低下させることに関する。別の実施形態において、本開示は、グリホサートに対するＥＰＳＰＳタンパク質の親和性を低下させることに関する。一実施形態において、本開示は、グリホサートに対する親和性が低いＥＰＳＰＳタンパク質を有するコムギ植物に関する。一実施形態において、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現の低下又はグリホサートに対するＥＰＳＰＳタンパク質の親和性の低下は、非トランスジェニック変異、トランスジーン又はゲノム編集により達成できる。
【００７０】
一実施形態において、本開示は、非トランスジェニック変異又はトランスジーン又はゲノム編集を通じたＥＰＳＰＳ遺伝子の改変に関する。
【００７１】
一実施形態において、本開示は、非トランスジェニック変異又はトランスジーン又はゲノム編集を通じてＥＰＳＰＳ遺伝子を改変することで、無改変又は野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比較して、グリホサートに対する親和性は低いが植物基質に対する親和性は相当な改変ＥＰＳＰＳタンパク質を得ることに関する。一実施形態において、植物基質に対する相当な親和性とは、野生型ＥＰＳＰＳの植物基質に対する親和性の少なくとも７０％又は少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％を有する改変ＥＰＳＰＳタンパク質のことである。
【００７２】
図１に、イネＥＰＳＰＳ及びコムギＥＰＳＰＳタンパク質のタンパク質配列のアラインメントを示す。図からわかるように、相当な同一性が、イネＥＰＳＰＳタンパク質とコムギＥＰＳＰＳタンパク質との間に存在する。小さな差異が、Ｎ末端領域においてイネ及びコムギＥＰＳＰＳタンパク質間に見られる。
【００７３】
ＥＰＳＰＳタンパク質の活性領域は、イネ及びコムギＥＰＳＰＳタンパク質間で高度に保存されている。この活性領域は典型的には、以下のアミノ酸配列：ＦＬＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶＶＡＡＧＧＮ（配列番号１８）に包含される。
【００７４】
ＩＩ．ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異
一実施形態において、コムギ種子は、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）で変異誘発させ、次にＭ１植物に成長させることができる。次に、このＭ１植物を自家受粉させ、Ｍ１植物からの種子をＭ２植物に成長させ、次にＥＰＳＰＳ遺伝子座における変異についてスクリーニングした。Ｍ１植物は変異についてスクリーニングできるが、Ｍ２植物のスクリーニングの利点は、全ての体細胞変異が生殖細胞系列変異に対応することである。当業者ならば、本開示のＥＰＳＰＳ変異コムギ植物を作出するために、種子、花粉、植物組織又は植物細胞を含めた（ただしこれらに限定しない）多種多様なコムギ植物材料に変異を起こさせ得ることがわかる。しかしながら、植物ＤＮＡを変異についてスクリーニングする場合、変異を誘発させた植物材料のタイプが影響し得る。例えば、変異を誘発させていない植物の授粉に先立って花粉を変異誘発に供する場合、その授粉で得られる種子はＭ１植物へと成長する。Ｍ１植物の全ての細胞が花粉で作られた変異を含むため、次に、Ｍ２世代を待つ代わりに、これらのＭ１植物をＥＰＳＰＳ変異についてスクリーニングし得る。
【００７５】
主に点変異及び短い欠失、挿入、トランスバージョン及び／又はトランジション（約１〜約５個のヌクレオチド）を作り出す変異原、例えば化学変異原又は放射線を用いて変異を作り出し得る。本明細書で開示の方法に準拠した変異原には、以下に限定するものではないが、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（ＥＮＵ）、トリエチルメラミン（ＴＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ジエチルサルフェート、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ア）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ジエポキシブタン（BＥＢ）等）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジンジヒドロクロリド（ＩＣＲ−１７０）及びホルムアルデヒドが含まれる。
【００７６】
現在知られている又は今後考案される適切な植物ＤＮＡ準備方法を用いて、ＥＰＳＰＳ変異スクリーニング用のコムギ植物ＤＮＡを準備し得る。例えば、Ｃｈｅｎ＆Ｒｏｎａｌｄ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １７：５３−５７，１９９９；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｖｉａ，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：７４８−７４９，１９９３を参照のこと。加えて、幾つかの市販のキットが入手可能であり、Ｑｉａｇｅｎ社（バレンシア、カリフォルニア州）及びＱｂｉｏｇｅｎｅ社（カールスバッド、カリフォルニア州）のキットを含む。
【００７７】
一実施形態においては、次に、変異を誘発させた植物組織起源の植物の個体群全体のＥＰＳＰＳ遺伝子における変異についてのスクリーニングを促進するために、個々のコムギ植物から準備したＤＮＡをプールした。プールした群のサイズは用いるスクリーニング法の感度及びスクリーニングする植物の倍数性に依存し得る。好ましくは、２つ以上の個々のコムギ植物の群をプールする。
【００７８】
別の実施形態においては、ＤＮＡサンプルをプールした後、プールをＥＰＳＰＳ配列特異的増幅技法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供する。ＰＣＲの概要に関しては、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｓｎｉｎｓｋｙ，ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０を参照のこと。ＥＰＳＰＳ遺伝子座又はＥＰＳＰＳ遺伝子座の真横の配列に特異的ないずれのプライマーを利用しても、プールしたＤＮＡサンプル内のＥＰＳＰＳ配列を増幅し得る。好ましくは、有用な変異が最も起き易いＥＰＳＰＳ遺伝子座の領域を増幅するようにプライマーを設計する。最も好ましくは、酵素の活性ドメインをコードするＥＰＳＰＳ遺伝子の保存領域を増幅するようにプライマーを設計する。ＥＰＳＰＳ酵素のこの領域は当該分野で周知である（Ｐａｄｇｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６（３３）：２２３６４−２２３６９，１９９１；Ｓｃｈｏｎｂｒｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９８（４）：１３７６−１３８０，２００１；Ｆｕｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４（１５）：９８５４−９８６０，２００９）。加えて、点変異のスクリーニングを容易にするために、プライマーは公知の多型部位を回避することが好ましい。一実施形態においては、１度に１つのホメオログだけが変異についてスクリーニングされるように、プライマーを、ホメオログの１つだけを増幅するように設計する。プライマーはホメオログ間の多型部位を標的にできるため、ホメオログの１つを増幅するだけである。
【００７９】
ゲル上でのＰＣＲ産物の検出を促進するために、ＰＣＲプライマーは、慣用の又は今後考案される標識方法を用いて標識し得る。
【００８０】
一実施形態においては、オリザ・サティバ（イネ）ＥＰＳＰＳ  ｃＤＮＡ（配列番号１；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０６３２４７）及びゲノムＤＮＡ（配列番号２；ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００８３９９）配列をＧｅｎＢａｎｋのコムギ発現配列タグ（ＥＳＴ）に対してＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＮ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いてアラインし、ＥＳＴのＵｎｉｇｅｎｅクラスタ（Ｔａ．１２６８７；引き上げられ、Ｔａ．１７９１２に置き換えられた）を同定した。次に、Ｕｎｉｇｅｎｅ配列をイネＥＰＳＰＳ  ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列とアラインし、酵素の活性ドメインをコードするコムギＥＰＳＰＳ遺伝子の領域を増幅するように表１のＰＣＲプライマー（配列番号４〜５）を設計した。これらのＰＣＲプライマーを使用して、野生型四倍体及び六倍体栽培品種であるクロノス（トリチカム・ツルギダム、デュラム）及びエクスプレス（トリチカム・エスチバム、ＰＶＰ＃９００００１２）のそれぞれから準備したコムギゲノムＤＮＡからのＥＰＳＰＳを増幅した。
【００８１】
【表１】
2018518983.tif 000003
【００８２】
いずれの適切なクローニングベクターも使用できたが、ＰＣＲ増幅産物を、ＴＯＰＯ  Ｔａクローニング（登録商標）キット（ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、９２００８）を使用してクローニングした。複数の独立したクローンをシーケンシングした。２つのカテゴリの配列をクロノスからのゲノムＤＮＡで同定した。これら２つに加えて追加の配列カテゴリをエクスプレスのゲノムＤＮＡで同定した。これらは３種のコムギＥＰＳＰＳホメオログを代表すると考えられた。イネゲノムとの予測されるシンテニーに基づき、染色体７Ｂの一部の公知の転座により、コムギＥＰＳＰＳ  Ａ及びＤゲノムコピーは染色体７Ａ及び７Ｄ上に局在すると予測され、Ｂゲノムコピーは染色体４Ａ上にあると予測された（ｈｔｔｐ：／／ｗｈｅａｔ．ｐｗ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ＮＳＦ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ｍａｐｐｉｎｇ＿ｄａｔａ）。これを念頭に置いて、ゲノムＤＮＡを、同じＰＣＲプライマー（配列番号：４〜５）を使用して、ホメオログ群７Ａ、Ｂ、Ｄ及び４Ａの改変染色体補体を含むチャイニーズスプリング（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ）ゼロ染色体／四染色体コムギ系統から増幅し、ＰＣＲ増幅産物をシーケンシングした。同じ３つのＥＰＳＰＳ配列カテゴリを、エクスプレスにおける同定と同様にゼロ染色体／四染色体系統で同定した。得られた配列は、コムギにおけるＥＰＳＰＳ同祖遺伝子について新規な部分ゲノム配列を表すと確認された（配列番号６〜８）。
【００８３】
別の実施形態においては、次に、３つの部分ゲノム配列で同定されたヌクレオチドの違いに基づいて各ＥＰＳＰＳホメオログを特異的に増幅するようにプライマーを設計した。ＥＰＳＰＳ配列内の有用な変異を同定するのに有用だと判明しているＰＣＲプライマー例（配列番号９〜１２）を下の表２に示す。ＥＰＳＰのＡホメオログを、左プライマーとしての配列番号９を右プライマーとしての配列番号１０と組み合わせて使用して増幅した。ＥＰＳＰのＢホメオログを、左プライマーとしての配列番号９を右プライマーとしての配列番号１１と組み合わせて使用して増幅し、このＰＣＲ産物を更に後述するＴａｑＭａｎプロトコルを用いてスクリーニングした。ＥＰＳＰのＤホメオログを左プライマーとしての配列番号９を右プライマーとしての配列番号１２と組み合わせて使用して増幅した。
【００８４】
【表２】
2018518983.tif 000004
【００８５】
様々なプライマーの組み合わせからのＰＣＲ増幅産物をシーケンシングすることで、プライマー対が所望のホメオログを特異的に増幅したことを確認した。次に、ＰＣＲ産物を使用して各ホメオログ中のＥＰＳＰＳ変異についてスクリーニングした。
【００８６】
別の実施形態においては、ＰＣＲ増幅産物を、野生型及び変異配列間のヌクレオチドの違いを同定する任意の方法を用いてＥＰＳＰＳ変異についてスクリーニングし得る。これらは、例えば、限定するものではないが、シーケンシング、変性高圧液体クロマトグラフィ（ｄＨＰＬＣ）、一定変性剤キャピラリ電気泳動（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＤＣＥ）、温度勾配キャピラリ電気泳動（ＴＧＣＥ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３（１０）：１４９９−１５１１，２００２を参照のこと）又はＣｏｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２６：４８０−４８４，２００１が記載の高スループット法で用いられているような酵素での切断によるフラグメンテーションを含み得る。好ましくは、ＰＣＲ増幅産物を、野生型及び変異配列間でのヘテロ二本鎖におけるミスマッチを優先的に切断するエンドヌクレアーゼとインキュベートする。
【００８７】
別の実施形態において、切断産物を、自動シーケンシングゲル装置を使用して電気泳動にかけ、ゲルイメージを標準的な市販の画像処理プログラムの助けを借りて分析する。ＰＣＲ増幅産物は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰジェノタイピングアッセイ（プロトコル番号４３３２８５６Ｃ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して一塩基多型についてもスクリーニングし得る。
【００８８】
【表３】
2018518983.tif 000005
【００８９】
一実施形態において、本明細書で開示及び想定する変異は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及び３−ホスホシキミ酸を含めた内在性基質の結合における最小限の変化でもってグリホサートの結合を減少させるＥＰＳＰＳ酵素の活性ドメインにおけるミスセンス変異を含む。
【００９０】
一実施形態において、コムギＥＰＳＰＳ遺伝子における変異は、アミノ酸位１７３でのトレオニンからイソロイシンへの変化をもたらす変異（本明細書においてはＴ１７３Ｉ変異と称する）、アミノ酸位１７７でのプロリンからセリンへの変化をもたらす変異（本明細書においてはＰ１７７Ｓ変異と称する）及びアミノ酸位１７７でのプロリンからイソロイシンへの変化をもたらす変異（本明細書においてはＰ１７７Ｌ変異と称する）を含む。明確にするために、コムギＥＰＳＰＳタンパク質における変異アミノ酸に、公開されているイネＥＰＳＰＳタンパク質配列（配列番号３）に従って番号をふる。好ましい変異は、上述したような酵素活性を変化させるＥＰＳＰＳ酵素の活性ドメインにおける他の変異も含む。タンパク質の機能へのその影響（すなわち、完全な耐性〜機能喪失）を予測するために、各新規な変異を、ＳＩＦＴ（Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ  ｆｒｏｍ  Ｔｏｌｅｒａｎｔ；Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３８１２−３８１４，２００３）、ＰＳＳＭ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １２：１３５−１４３，１９９６）及びＰＡＲＳＥＳＮＰ（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３８０８−３８１１，２００３）等のバイオインフォマティクスツールを用いて評価する。例えば、０．０５未満のＳＩＦＴスコア及びＰＳＳＭスコアにおける大きな変化（例えば、およそ１０以上）は、タンパク質の機能に対して有害な作用を及ぼし易い変異を示す。
【００９１】
Ａ．ＥＰＳＰＳ遺伝子
一実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子における１つ以上の非トランスジェニック変異に関する。別の実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子における１つ以上の変異に関する。一実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異に関し、以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０より多い変異を含む。
【００９２】
別の実施形態において、ＥＰＳＰＳ遺伝子は、表４に挙げた１つ以上の変異を有するポリペプチドをもたらす１つ以上の非トランスジェニック変異及びホメオログにおける対応する変異及びこれらの組み合わせを含み得る。
【００９３】
別の実施形態において、本開示は、対応するホメオログのＥＰＳＰＳ遺伝子における本明細書で開示の１つ以上の非トランスジェニック変異に対応する変異に関する。例えば、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における同定された変異は、Ｂ及び／又はＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における有益な変異になり得る。当業者ならば、ホメオログにおける変異が全く同じ位置にはない場合もあることがわかる。
【００９４】
当業者ならば、異なるコムギ変種ではＥＰＳＰＳ遺伝子の遺伝子配列が天然で異なり得ることがわかる。
【００９５】
発明者は、グリホサートに対する抵抗性を有する植物を作出するためには、ＥＰＳＰＳ遺伝子機能を変化させる変異が望ましいことを突き止めた。好ましい変異はミスセンス及びナンセンスな変化を含み、メッセンジャーＲＮＡからの１つ以上のＥＰＳＰＳタンパク質の翻訳を途中でトランケートする変異、例えばＥＰＳＰＳメッセンジャーＲＮＡのコード領域内に終止コドンを作り出す変異を含む。そのような変異は、挿入、反復配列、スプライスジャンクション変異、修飾されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び点変異を含む。
【００９６】
更に別の実施形態において、１つ以上の変異はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。別の実施形態において、１つ以上の変異はＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。更に別の実施形態において、１つ以上の変異はＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。更に別の実施形態において、１つ以上の変異はＡ及びＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。更に別の実施形態において、１つ以上の変異はＡ及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。別の実施形態において、１つ以上の変異はＢ及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。更に別の実施形態において、１つ以上の変異はＡ、Ｂ及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子におけるものである。
【００９７】
１．Ａゲノム
一実施形態において、本開示は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異に関し、以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０を超える変異を含む。一実施形態において、１つ以上の非トランスジェニック変異は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおけるものである。別の実施形態において、非トランスジェニック変異はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。一実施形態において、変異はホモ接合である。
【００９８】
表４で同定した以下の変異は、本明細書で開示の様々な実施形態に従って作り出し、同定した変異の例である。これらは限定ではなく説明を目的としたものである。後出の変異は単なる例であって、同様の変異も考えられることを理解されたい。
【００９９】
表４は、Ａ、Ｂ及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における代表的な変異のリストである。アミノ酸変化を、公開されているイネタンパク質配列（配列番号３）、またコムギタンパク質配列（配列番号９）の両方に従って同定する。
【０１００】
【表４】
2018518983.tif 000006
2018518983.tif 000007
2018518983.tif 000008
【０１０１】
一実施形態において、Ａゲノムにおいて同定され表４に記載した２つ以上の変異は、Ａゲノムが２つ以上の変異を含むように組み合わせ得る。
【０１０２】
別の実施形態において、Ｂゲノムにおいて同定され表４に記載した２つ以上の変異は、Ｂゲノムが２つ以上の変異を含むように組み合わせ得る。
【０１０３】
更に別の実施形態において、Ｄゲノムにおいて同定され表４に記載した２つ以上の変異は、Ｄゲノムが２つ以上の変異を含むように組み合わせ得る。
【０１０４】
【表５】
2018518983.tif 000009
2018518983.tif 000010
【０１０５】
一実施形態において、表４のＡゲノムで同定された変異はいずれも、表４に記載のＢゲノムにおける任意の変異と組み合わせ得る。
【０１０６】
【表６】
2018518983.tif 000011
2018518983.tif 000012
【０１０７】
別の実施形態において、表４のＡゲノムで同定された変異はいずれも、表４に記載のＤゲノムにおける任意の変異と組み合わせ得る。
【０１０８】
【表７】
2018518983.tif 000013
【０１０９】
更に別の実施形態において、表４のＡゲノムで同定された変異はいずれも、表４のＢゲノムにおける任意の変異及び表４に記載のＤゲノムにおける任意の変異と組み合わせ得る。
【０１１０】
【表８】
2018518983.tif 000014
2018518983.tif 000015
【０１１１】
別の実施形態において、表４のＢゲノムで同定された変異はいずれも、表４に記載のＤゲノムにおける任意の変異と組み合わせ得る。
【０１１２】
一実施形態において、本開示は、表４に記載の１つ以上の変異を有するポリペプチドを産生する１つ以上の非トランスジェニック変異を有する配列番号６に対応するＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、表４で挙げた１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性を有する。
【０１１３】
更に別の実施形態において、ポリヌクレオチドは表４で挙げた１つ以上の非トランスジェニック変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をコードし、ＥＰＳＰＳタンパク質は１つ以上の非トランスジェニック変異を含み且つＥＰＳＰＳ−Ａタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性を有する。
【０１１４】
２．Ｂゲノム
一実施形態において、本開示はＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異に関し、以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０を超える変異を含む。一実施形態において、１つ以上の非トランスジェニック変異はＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおけるものである。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。更に別の実施形態において、変異はホモ接合である。
【０１１５】
一実施形態において、本開示は、表４で挙げた１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有する配列番号７に対応するＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは表４に記載の１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードし且つ配列番号７に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性を有する。
【０１１６】
更に別の実施形態において、本開示は、１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードし且つＥＰＳＰＳ−Ｂタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性を有する１つ以上の非トランスジェニック変異を有するＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドに関する。
【０１１７】
３．Ｄゲノム
一実施形態において、本開示はＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子における複数の非トランスジェニック変異に関し、以下に限定するものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１０を超える変異を含む。一実施形態において、１つ以上の非トランスジェニック変異は、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおけるものである。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。更に別の実施形態において、変異はホモ接合である。
【０１１８】
一実施形態において、本開示は、表４で挙げた１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有する配列番号８に対応するＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、表４に記載の１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードし且つ配列番号８に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性を有する。
【０１１９】
更に別の実施形態において、本開示は、１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードし且つＥＰＳＰＳ−Ｄタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性を有する１つ以上の非トランスジェニック変異を有するＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドに関する。
【０１２０】
Ｂ．ＥＰＳＰＳタンパク質
更に別の実施形態において、本開示は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比較して１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらすＥＰＳＰＳ遺伝子における１つ以上の非トランスジェニック変異（ＥＰＳＰＳ変異と題したセクションで上述したとおり）に関する。一実施形態において、非トランスジェニック変異は、表４に記載の変異に限定するものではないが、ホメオログにおける対応する変異及びこれらの組み合わせを含む。
【０１２１】
別の実施形態において、本開示は、グリホサートに対する親和性が低いＥＰＳＰＳタンパク質をもたらすＥＰＳＰＳ遺伝子における１つ以上の非トランスジェニック変異に関する。幾つかの実施形態において、ＥＰＳＰＳ遺伝子における変異は、ＥＰＳＰＳタンパク質の発現を低下させる。他の実施形態において、ＥＰＳＰＳ遺伝子における変異は、不安定な又は機能が低下したＥＰＳＰＳタンパク質を作り出す。
【０１２２】
１．ＥＰＳＰＳタンパク質の発現レベル
別の実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質の発現レベルは、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質の発現レベルの０〜２％、２〜５％、５〜７％、７〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％及び９５〜９９％低下する。
【０１２３】
更に別の実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質の発現レベルは、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質の発現レベルと比較して１０〜２０％又は２０〜３０％又は３０〜４０％又は４０〜５０％又は５０〜６０％又は６０〜７０％又は７０〜８０％又は８０〜９０％又は９０〜９９％低下する。
【０１２４】
２．ＥＰＳＰＳタンパク質の活性
更に別の実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質はグリホサートに対して低い親和性を有し、この低い親和性は、グリホサートに対する野生型ＥＰＳＰＳタンパク質の親和性の０〜１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％及び９９％超である。別の実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比較してグリホサートに対する親和性を有さない又はゼロの親和性を有する。
【０１２５】
更に別の実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質はグリホサートに対しては低い親和性を有するが、植物又は内在性基質に対しては野生型の親和性を有する。一実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質は植物又は内在性基質に対して相当な親和性を有し、植物基質に対する親和性は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比較して約１００％又は９９％又は９８％又は９７％又は９６％又は９５％又は９４％又は９３％又は９２％又は９１％又は９０％である。
【０１２６】
更に別の実施形態において、本明細書で開示の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質の活性は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質の活性レベルの１〜１０％又は１０〜３０％又は３０〜５０％又は５０〜７０％又は７０〜８０％又は８０〜９０％又は９０〜９５％である。
【０１２７】
ＩＩＩ．ゲノム編集
一実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現が低下した及び／又はＥＰＳＰＳタンパク質の活性が低下した植物に関し、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現の低下及び／又はＥＰＳＰＳタンパク質の活性の低下はゲノム編集により達成される。
【０１２８】
一実施形態において、本開示はゲノム編集したＥＰＳＰＳ遺伝子を有するコムギ植物に関し、コムギ植物は、野生型植物と比較して改変されたＥＰＳＰＳタンパク質を有する。
【０１２９】
ゲノム編集又は操作されたヌクレアーゼを用いたゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＧＥＥＮ）は、人為的に操作されたヌクレアーゼ又は「分子バサミ」を使用してＤＮＡを挿入、置換又はゲノムから除去する遺伝子操作のタイプの１つである。ヌクレアーゼは、ゲノムの所望の位置で特異的二重鎖切断（ＤＳＢ）を行い、相同組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＨＲ）及び非相同末端結合（ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）の天然の工程でもって誘発された切断を修復する細胞の内在メカニズムを制御する。使用される操作されたヌクレアーゼには現在、４つの主なファミリー：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼを含めた操作されたメガヌクレアーゼある。
【０１３０】
Ａ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることで作り出される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作でき、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼは複雑なゲノム内の独特の配列を標的にできるようになる。内在するＤＮＡ修復機構を利用することで、これらの試薬を使用してより高次の生物のゲノムを精確に改変し得る。
【０１３１】
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合させた操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから成る。ＺＦＮを使用して特定のＤＮＡ配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発させ、それによって外来の鋳型との部位特異的な相同組み換えを促進し得る。この外来の鋳型は、ゲノムに導入する配列を含む。
【０１３２】
ジンクフィンガードメインを操作するための公開されている方法には、（１）コンテキスト依存アセンブリ（Ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＣｏＤＡ）、（２）オリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）及び（３）モジュラーアセンブリが含まれる。
【０１３３】
一実施形態において、本開示は、ＺＦＮを使用してＥＰＳＰＳ遺伝子及びそのコードされた酵素のグリホサート耐性を上昇させることに関する。
【０１３４】
Ｂ．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及びＦｏｋＩエンドヌクレアーゼから成る配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥは、３４個のアミノ酸のタンデム反復ユニットを備えた高度に保存された中心領域を有するＤＮＡ結合タンパク質である。各反復単位についての塩基優先性は、反復可変二残基（ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉ−ｒｅｓｉｄｕｅ、ＲＶＤ）と称される２つのアミノ酸残基により決定され、ＲＶＤは標的ＤＮＡにおける１つの特定のヌクレオチドを認識する。ＤＮＡ結合反復単位のアレイは、特定のＤＮＡ配列を標的とするようにカスタマイズし得る。ＺＦＮと同様に、ゲノムにおける標的とする特定の配列上での２つのＴＡＬＥＮの二量体化はＤＳＢのＦｏｋＩ依存的な導入をもたらし、相同組み換え型修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）及び非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構を刺激する。
【０１３５】
一実施形態において、本開示は、ＴＡＬＥＮを使用してＥＰＳＰＳ遺伝子及びそのコードされた酵素のグリホサート耐性を上昇させることに関する。
【０１３６】
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
規則的な間隔でもってクラスタ化された短い反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ）タイプＩＩシステムは、ゲノム工学のためのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼテクノロジーである。このシステムには２つの別個の構成要素：（１）ガイドＲＮＡ及び（２）エンドヌクレアーゼがあり、この場合、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９である。
【０１３７】
ガイドＲＮＡは、内在性細菌性ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを組み合わせて一本鎖キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写物にしたものである。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的特異性とｔｒａｃｒＲＮＡの足場特性とを組み合わせて１つの転写物にしたものである。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９が細胞で発現する場合、ゲノム標的配列を改変できる又は永久に破壊できる。
【０１３８】
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ中の標的配列との塩基対形成及び標的配列に対する相補性により標的配列にリクルートされる。Ｃａｓ９をうまく結合させるために、ゲノム標的配列は、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列を標的配列のすぐ後ろに含まなくてもならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合は、野生型Ｃａｓ９がＤＮＡの両方の鎖を切断して二重鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすようにＣａｓ９をゲノム標的配列へと限局する。Ｃａｓ９はＰＡＭ配列の上流で３〜４個のヌクレオチドを切断する。ＤＳＢは２つの一般的な修復経路：（１）ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路又は（２）ＨＤＲ経路の一方を通して修復し得る。ＮＨＥＪ修復経路ではＤＳＢ部位での挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）が起きることが多く、これはフレームシフト及び／又は未成熟終止コドンにつながって標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を効果的に破壊し得る。
【０１３９】
ＨＤＲ経路は修復用鋳型の存在を必要とし、この鋳型はＤＳＢを直すのに用いられる。ＨＤＲは修復用鋳型の配列を切断された標的配列に忠実にコピーする。修復用鋳型を用いたＨＤＲの使用により、特定のヌクレオチド変化を標的遺伝子に導入できる。
【０１４０】
一実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＥＰＳＰＳ遺伝子及びそのコードされた酵素のグリホサート耐性を上昇させることに関する。
【０１４１】
Ｄ．再操作されたホーミングヌクレアーゼを含めたメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、大きな認識部位を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである（１２〜４０個の塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）。その結果、この部位は一般に、所与のゲノムで一度だけ生じる。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼにより認識される１８塩基対配列は、平均的に、偶然一度発見するにはヒトゲノムのサイズの２０倍を必要とする（ミスマッチが１つの配列はヒトサイズのゲノムあたり約３回起きるが）。従って、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然の制限酵素だと見なされる。
【０１４２】
メガヌクレアーゼの中でも、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ型のホーミングヌクレアーゼが、過去１５年にわたってゲノム及びゲノム工学の研究にとって貴重なツールとなっている。タンパク質を操作してその認識配列を改変することで、標的配列を変化させることができる。
【０１４３】
一実施形態において、本開示は、再操作されたホーミングヌクレアーゼを含めたメガヌクレアーゼを使用してＥＰＳＰＳ遺伝子及びそのコードされた酵素のグリホサート耐性を上昇させることに関する。
【０１４４】
ＩＶ．コムギ栽培品種
一実施形態において、二倍体、多倍数体、四倍体及び六倍体である少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子を有するコムギ栽培品種を用い得る。
【０１４５】
別の実施形態において、コムギはトリチカム・エスチバムである。
【０１４６】
一実施形態において、いずれのコムギ栽培品種を用いてもＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を作り出せる。一実施形態において、いずれのコムギ栽培品種を用いてもＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を作り出せる。別の実施形態において、いずれのコムギ栽培品種を用いてもＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を作り出せる。別の実施形態において、いずれのコムギ栽培品種を用いてもＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を作り出せる。
【０１４７】
一実施形態において、いずれのコムギ栽培品種も、ＥＰＳＰＳ変異を交配させて異なる栽培品種にするための系統として使用し得る。別の実施形態において、少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子を有するいずれのコムギ栽培品種も使用し得て、以下に限定するものではないが、硬質赤色春コムギ、硬質白色コムギ、デュラムコムギ、軟質白色春コムギ、軟質白色冬コムギ、硬質赤色冬コムギ、普通コムギ、クラブコムギ、スペルトコムギ、エンマーコムギ、パスタコムギ及びツルギダムコムギを含む。
【０１４８】
一実施形態において、硬質赤色春コムギは、以下に限定するものではないが、ブルズアイ（Ｂｕｌｌｓｅｙｅ）、カベルネ（Ｃａｂｅｒｎｅｔ）、カルロジョ（Ｃａｌ  Ｒｏｊｏ）、ハンク（Ｈａｎｋ）、ホアキン（Ｊｏａｑｕｉｎ）、ケルセ（Ｋｅｌｓｅ）、ラリアット（Ｌａｒｉａｔ）、ラシック（Ｌａｓｓｉｋ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、マイカ（Ｍｉｋａ）、ＰＲ  １４０４、レッドウィング（Ｒｅｄｗｉｎｇ）、サミット（Ｓｕｍｍｉｔ）５１５、ＳＹ  ３１４、トリプル（Ｔｒｉｐｌｅ）ＩＶ、ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）、ＷＢ−パトロン（ＷＢ−Ｐａｔｒｏｎ）、ＷＢ−ロックランド（ＷＢ−Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、イエコーラロッジョ（Ｙｅｃｏｒａ  Ｒｏｊｏ）、アコード（Ａｃｃｏｒｄ）、エイム（Ａｉｍ）、アンザ（Ａｎｚａ）、ベーカー（Ｂａｋｅｒ）、ベスハシタ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｓｈｉｔａ）、ボーナス（Ｂｏｎｕｓ）、ボラー（Ｂｏｒａｈ）、ブリム（Ｂｒｉｍ）、ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ）、バックプロント（Ｂｕｃｋ  Ｐｒｏｎｔｏ）、ビュート（Ｂｕｔｔｅ）８６、キャバリエ（Ｃａｖａｌｉｅｒ）、チャレンジャー（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ）、チーフ（Ｃｈｉｅｆ）、シアノ（Ｃｉａｎｏ）Ｔ７９、コルサ（Ｃｏｌｕｓａ）、コンパニオン（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）、カッパー（Ｃｏｐｐｅｒ）、カヤーマ（Ｃｕｙａｍａ）、ダッシュ（Ｄａｓｈ）１２、エルドン（Ｅｌｄｏｎ）、エナノ（Ｅｎａｎｏ）、エクスプレス（Ｅｘｐｒｅｓｓ）、エクスプレッソ（Ｅｘｐｒｅｓｓｏ）、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、ジェネロ（Ｇｅｎｅｒｏ）Ｆ８１、グランディン（Ｇｒａｎｄｉｎ）、ヘレナ（Ｈｅｌｅｎａ）５５４、ホリス（Ｈｏｌｌｉｓ）、イムリス（Ｉｍｕｒｉｓ）Ｔ７９、イニア（Ｉｎｉａ）６６Ｒ、ジェローム（Ｊｅｒｏｍｅ）、カーン（Ｋｅｒｎ）、レン（Ｌｅｎ）、マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、マッケイ（ＭｃＫａｙ）、ノーマッド（Ｎｏｍａｄ）、ノースウェスト（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ）１０、オスロ（Ｏｓｌｏ）、パヴォン（Ｐａｖｏｎ）Ｆ７６、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）、ピティック（Ｐｉｔｉｃ）６２、ポコレッド（Ｐｏｃｏ  Ｒｅｄ）、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）、プロブランド（Ｐｒｏｂｒａｎｄ）７１１、プロブランド７５１、プロブランド７７１、プロブランド７５、プロブレッド（Ｐｒｏｂｒｅｄ）、プロインタキュゲイ（Ｐｒｏｉｎｔａ  Ｑｕｅｇｕａｙ）、プロインタキンタル（Ｐｒｏｉｎｔａ  Ｑｕｉｎｔａｌ）、リッチ（Ｒｉｃｈ）、ＲＳＩ  ５、サジタリオ（Ｓａｇｉｔｔａｒｉｏ）、スカーレット（Ｓｃａｒｌｅｔ）、セラ（Ｓｅｒｒａ）、シャスタ（Ｓｈａｓｔａ）、ソラーノ（Ｓｏｌａｎｏ）、スピルマン（Ｓｐｉｌｌｍａｎ）、スプライト（Ｓｐｒｉｔｅ）、スタンダー（Ｓｔａｎｄｅｒ）、ステラ（Ｓｔｅｌｌａｒ）、ストア（Ｓｔｏａ）、サクセス（Ｓｕｃｃｅｓｓ）、サミット（Ｓｕｍｍｉｔ）、サンスター（Ｓｕｎｓｔａｒ）２、サンスターキング（Ｓｕｎｓｔａｒ  Ｋｉｎｇ）、タディニア（Ｔａｄｉｎｉａ）、タミー（Ｔａｍｍｙ）、タノリ（Ｔａｎｏｒｉ）７１、タラ（Ｔａｒａ）２０００、テンポ（Ｔｅｍｐｏ）、テシア（Ｔｅｓｉａ）Ｔ７９、トピック（Ｔｏｐｉｃ）、ＵＩウィンチェスター（Ｗｉｎ��ｈｅｓｔｅｒ）、ヴァンス（Ｖａｎｃｅ）、ヴァンダール（Ｖａｎｄａｌ）、Ｗ４４４、ワンパム（Ｗａｍｐｕｍ）、ウェアド（Ｗａｒｅｄ）、ＷＢ−フュージョン（Ｆｕｚｉｏｎ）、ウェストブレッド（Ｗｅｓｔｂｒｅｄ）９０６Ｒ、ウェストブレッド９１１、ウェストブレッド９２６、ウェストブレッド９３６、ウェストブレッドディスカバリー（Ｗｅｓｔｂｒｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、ウェストブレッドランボー（Ｗｅｓｔｂｒｅｄ  Ｒａｍｂｏ）、ヨーロー（Ｙｏｌｏ）及びジーク（Ｚｅｋｅ）を含む。
【０１４９】
別の実施形態において、硬質白色コムギは、以下に限定するものではないが、ブランカフエルテ（Ｂｌａｎｃａ  Ｆｕｅｒｔｅ）、ブランカグランデ（Ｂｌａｎｃａ  Ｇｒａｎｄｅ）５１５、ブランカロイヤル（Ｂｌａｎｃａ  Ｒｏｙａｌｅ）、クリアホワイト（Ｃｌｅａｒ  Ｗｈｉｔｅ）、パトウィン（Ｐａｔｗｉｎ）、パトウィン５１５、ＷＢ−クリスタロ（Ｃｒｉｓｔａｌｌｏ）、ＷＢ−パロマ（Ｐａｌｏｍａ）、ＷＢ−ペルラ（Ｐｅｒｌａ）、アルタブランカ（Ａｌｔａ  Ｂｌａｎｃａ）、ブランカグランデ（Ｂｌａｎｃａ  Ｇｒａｎｄｅ）、デラーノ（Ｄｅｌａｎｏ）、ゴールデンスパイク（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｐｉｋｅ）、ＩＤ３７７Ｓ、クラシック（Ｋｌａｓｉｃ）、ロクサ（Ｌｏｃｈｓａ）、ロロ（Ｌｏｌｏ）、メイコン（Ｍａｃｏｎ）、オーティス（Ｏｔｉｓ）、フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）、ピマ（Ｐｉｍａ）７７、プラタ（Ｐｌａｔａ）、プリスティーン（Ｐｒｉｓｔｉｎｅ）、ラモナ（Ｒａｍｏｎａ）５０、シエテセロス（Ｓｉｅｔｅ  Ｃｅｒｒｏｓ）６６、バイオレット（Ｖａｉｏｌｅｔ）及びウィンサム（Ｗｉｎｓｏｍｅ）を含む。
【０１５０】
更に別の実施形態において、デュラムコムギは、以下に限定するものではないが、クラウン（Ｃｒｏｗｎ）、デザートキング（Ｄｅｓｅｒｔ  Ｋｉｎｇ）、デザートキングＨＰ、デュラキング（Ｄｕｒａｋｉｎｇ）、フォルティシモ（Ｆｏｒｔｉｓｓｉｍｏ）、ハヴァス（Ｈａｖａｓｕ）、クロノス（Ｋｒｏｎｏｓ）、メストラーレ（Ｍａｅｓｔｒａｌｅ）、ノルマーノ（Ｎｏｒｍａｎｎｏ）、オリータ（Ｏｒｉｔａ）、プラチナム（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）、Ｑ−マックス（Ｑ−Ｍａｘ）、ＲＳＩ  ５９、サラゴーラ（Ｓａｒａｇｏｌｌａ）、タンゴ（Ｔａｎｇｏ）、ティパイ（Ｔｉｐａｉ）、トッパー（Ｔｏｐｐｅｒ）、ユートピア（Ｕｔｏｐｉａ）、ヴォランテ（Ｖｏｌａｎｔｅ）、ＷＢ−ミード（Ｍｅａｄ）、ウェストモア（Ｗｅｓｔｍｏｒｅ）、アルデンテ（Ａｌｄｅｎｔｅ）、アルデュラ（Ａｌｄｕｒａ）、アルター（Ａｌｔａｒ）８４、アルバ（Ａｒｕｂａ）、ビッターン（Ｂｉｔｔｅｒｎ）、ブラバデュール（Ｂｒａｖａｄｕｒ）、カンデュラ（Ｃａｎｄｕｒａ）、コルテス（Ｃｏｒｔｅｚ）、デラックス（Ｄｅｌｕｘｅ）、デザートタイタン（Ｄｅｓｅｒｔ  Ｔｉｔａｎ）、デュレックス（Ｄｕｒｅｘ）、ダーフォート（Ｄｕｒｆｏｒｔ）、エディ（Ｅｄｄｉｅ）、ジャーメイン（Ｇｅｒｍａｉｎｓ）５００３Ｄ、インペリアル（Ｉｍｐｅｒｉａｌ）、コファ（Ｋｏｆａ）、ラヴァンテ（Ｌｅｖａｎｔｅ）、マット（Ｍａｔｔ）、ミード（Ｍｅａｄ）、メキシカリ（Ｍｅｘｉｃａｌｉ）７５、ミノス（Ｍｉｎｏｓ）、モドック（Ｍｏｄｏｃ）、モホーク（Ｍｏｈａｗｋ）、ニューデュラ（Ｎｕｄｕｒａ）、オコティーロ（Ｏｃｏｔｉｌｌｏ）、プロデュラ（Ｐｒｏｄｕｒａ）、リーヴァ（Ｒｅｖａ）、リア（Ｒｉａ）、セプター（Ｓｅｐｔｒｅ）、スカイ（Ｓｋｙ）、タクナ（Ｔａｃｎａ）、タイタン（Ｔｉｔａｎ）、トランプ（Ｔｒｕｍｐ）、ワード（Ｗａｒｄ）、ウェストブレッド８０３、ウェストブレッド８８１、ウェストブレッド８８３、ウェストブレッド１０００Ｄ、ウェストブレッドレイカー（Ｗｅｓｔｂｒｅｄ  Ｌａｋｅｒ）、ウェストブレッドターボ（Ｗｅｓｔｂｒｅｄ  Ｔｕｒｂｏ）及びヤヴァロス（Ｙａｖａｒｏｓ）７９を含む。
【０１５１】
別の実施形態において、軟質白色春コムギは、以下に限定するものではないが、アルポワ（Ａｌｐｏｗａ）、アルチュラス（Ａｌｔｕｒａｓ）、ベーブ（Ｂａｂｅ）、ディーヴァ（Ｄｉｖａ）、ＪＤ、ニューダークウィン（Ｎｅｗ  Ｄｉｒｋｗｉｎ）、ニック（Ｎｉｃｋ）、ツイン（Ｔｗｉｎ）、ウィット（Ｗｈｉｔ）、ブランカ（Ｂｌａｎｃａ）、ブリス（Ｂｌｉｓｓ）、カロルワ（Ｃａｌｏｒｗａ）、センテニアル（Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ）、チャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）、ダークウィン（Ｄｉｒｋｗｉｎ）、エデン（Ｅｄｅｎ）、エドウォール（Ｅｄｗａｌｌ）、フィールダー（Ｆｉｅｌｄｅｒ）、フィールドウィン（Ｆｉｅｌｄｗｉｎ）、ジュビリー（Ｊｕｂｉｌｅｅ）、ルイーズ（Ｌｏｕｉｓｅ）、オーウェンス（Ｏｗｅｎｓ）、ペナワワ（Ｐｅｎａｗａｗａ）、ポメレール（Ｐｏｍｅｒｅｌｌｅ）、スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、サンスタープロミス（Ｓｕｎｓｔａｒ  Ｐｒｏｍｉｓｅ）、スーパーダークウィン（Ｓｕｐｅｒ  Ｄｉｒｋｗｉｎ）、トレジャー（Ｔｒｅａｓｕｒｅ）、ＵＩカタルド（Ｃａｔａｌｄｏ）、ＵＩプティ（Ｐｅｔｔｉｔ）、ユルキュイ（Ｕｒｑｕｉｅ）、ヴァンナ（Ｖａｎｎａ）、ワデュエル（Ｗａｄｕｅｌ）、ワデュエル９４、ワカンツ（Ｗａｋａｎｚ）、ワラデイ（Ｗａｌｌａｄａｙ）、ワワワイ（Ｗａｗａｗａｉ）、ホワイトバード（Ｗｈｉｔｅｂｉｒｄ）及びザック（Ｚａｋ）を含む。
【０１５２】
更に別の実施形態において、軟質白色冬コムギは、以下に限定するものではないが、ＡＰバッジャー（Ｂａｄｇｅｒ）、ＡＰレガシー（Ｌｅｇａｃｙ）、ブランデージ（Ｂｒｕｎｄａｇｅ）９６、ブリュノー（Ｂｒｕｎｅａｕ）、カラ（Ｃａｒａ）、ゲッツェ（Ｇｏｅｔｚｅ）、レギオン（Ｌｅｇｉｏｎ）、メアリー（Ｍａｒｙ）、スカイルズ（Ｓｋｉｌｅｓ）、スティーブンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）、ＳＹオヴェーション（Ｏｖａｔｉｏｎ）、タブス（Ｔｕｂｂｓ）、ＷＢ−ジャンクション（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、ＷＢ−５２８、ゼルファ（Ｘｅｒｐｈａ）、ヤンヒル（Ｙａｍｈｉｌｌ）、バービー（Ｂａｒｂｅｅ）、ベイスン（Ｂａｓｉｎ）、ビタールート（Ｂｉｔｔｅｒｒｏｏｔ）、ブリュール（Ｂｒｕｅｈｌ）、カスタン（Ｃａｓｔａｎ）、チャカール（Ｃｈｕｋａｒ）、コダ（Ｃｏｄａ）、ダウズ（Ｄａｗｓ）、エドウィン（Ｅｄｗｉｎ）、エルタン（Ｅｌｔａｎ）、ファロ（Ｆａｒｏ）、フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）、フット（Ｆｏｏｔｅ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、ヒル（Ｈｉｌｌ）８１、ヒラー（Ｈｉｌｌｅｒ）、ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、ハイアック（Ｈｙａｋ）、ハイスロップ（Ｈｙｓｌｏｐ）、アイダホ（Ｉｄａｈｏ）５８７、クモール（Ｋｍｏｒ）、ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）、リュージェイン（Ｌｅｗｊａｉｎ）、マクヴィカー（ＭａｃＶｉｃａｒ）、マドセン（Ｍａｄｓｅｎ）、マルコム（Ｍａｌｃｏｌｍ）、マサミ（Ｍａｓａｍｉ）、マクダーミッド（ＭｃＤｅｒｍｉｄ）、モロ（Ｍｏｒｏ）、ニューゲインズ（Ｎｕｇａｉｎｅｓ）、ＯＲＣＦ−１０１、ＯＲＣＦ−１０２、ＯＲＣＦ−１０３、ロッド（Ｒｏｄ）、ローデ（Ｒｏｈｄｅ）、ルロ（Ｒｕｌｏ）、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）、サリュート（Ｓａｌｕｔｅ）、テンプル（Ｔｅｍｐｌｅ）、トレス（Ｔｒｅｓ）、タブス０６、ＵＩＣＦ−ブランデージ（Ｂｒｕｎｄａｇｅ）、ＷＢ−５２３及びウェザーフォードを含む。
【０１５３】
別の実施形態において、硬質赤色冬コムギは、以下に限定するものではないが、アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）、アーチャー（Ａｒｃｈｅｒ）、ベイタム（Ｂａｔｕｍ）、ブリザード（Ｂｌｉｚｚａｒｄ）、ボネヴィル（Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ）、バウンダリー（Ｂｏｕｎｄａｒｙ）、デクロ（Ｄｅｃｌｏ）、デロリス（Ｄｅｌｏｒｉｓ）、フィンレー（Ｆｉｎｌｅｙ）、ガーランド（Ｇａｒｌａｎｄ）、ハットン（Ｈａｔｔｏｎ）、ホフ（Ｈｏｆｆ）、ロングホーン（Ｌｏｎｇｈｏｒｎ）、マニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）、メリディアン（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）、プロモントリー（Ｐｒｏｍｏｎｔｏｒｙ）、ヴォナ（Ｖｏｎａ）、ワンサー（Ｗａｎｓｅｒ）、ウィンリッジ（Ｗｉｎｒｉｄｇｅ）を含む。
【０１５４】
別の実施形態において、普通コムギ（六倍体、易脱穀性）、トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種は、以下に限定するものではないが、ソノラ（Ｓｏｎｏｒａ）、ウィットウォルカリング（Ｗｉｔ  Ｗｏｌｋｏｒｉｎｇ）、チダムブランデマール（Ｃｈｉｄｄａｍ  Ｂｌａｎｃ  Ｄｅ  Ｍａｒｓ）、インディアジャムー（Ｉｎｄｉａ−Ｊａｍｍｕ）、フォイシー（Ｆｏｉｓｙ）を含む。
【０１５５】
更に別の実施形態において、スペルトコムギ（六倍体、非易脱穀性）、トリチカム・エスチバム・スペルト亜種は、以下に限定するものではないが、スパニッシュスペルト（Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｓｐｅｌｔ）、スイススペルト（Ｓｗｉｓｓ  Ｓｐｅｌｔ）を含む。
【０１５６】
更に別の実施形態において、エンマーコムギ（四倍体）、トリチカム・ツルギダム・ジコッカム亜種は、以下に限定するものではないが、エチオピアンブルーティンジ（Ｅｔｈｉｏｐｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｔｉｎｇｅ）を含む。
【０１５７】
別の実施形態において、パスタコムギ（四倍体、易脱穀性）、トリチカム・ツルギダム・デュラム亜種は、以下に限定するものではないが、ブルービアード（Ｂｌｕｅ  Ｂｅａｒｄ）、デュラム−イラク（Ｄｕｒｕｍ−Ｉｒａｑ）を含む。
【０１５８】
更に別の実施形態において、ツルギダムコムギ（四倍体、易脱穀性）、トリチカム・ツルギダム・ツルギダム亜種は、以下に限定するものではないが、アクモリンカ（Ａｋｍｏｌｉｎｋａ）、マパーチャ（Ｍａｐａｒｃｈａ）を含む。
【０１５９】
一実施形態において、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に対する相当なパーセント同一性を有する少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子を有するコムギ栽培品種を、本明細書で開示の方法及び組成物と共に使用し得る。
【０１６０】
コムギ栽培品種に関して本明細書で言うところの「相当なパーセント同一性」とは、遺伝子のＤＮＡ配列が、ヌクレオチドレベルで、実質的に同様のタンパク質をコードするのに十分なだけ配列番号６、７及び８に類似しており、栽培品種間でのアレル差（又は交互ｍＲＮＡスプライシング）を許容することを意味する。一実施形態において、遺伝子の保存領域におけるパーセント同一性がより高い（例えば、少なくとも約９０％）ならば、「相当なパーセント同一性」は、ＥＰＳＰＳ遺伝子と配列番号６、７及び８との間のコード領域におけるパーセント同一性が約８５％もの低さである場合に存在し得る。好ましくは、コード領域におけるパーセント同一性は８５〜９０％、より好ましくは９０〜９５％であり、最適には９５％を超える。従って、当業者ならば、本開示の範囲及び意図から逸脱することなく、商業的に人気が高い又は特定の所望の特徴を有するコムギ栽培品種を利用してＥＰＳＰＳ変異コムギ植物を作出することを好み得る。或いは、当業者ならば、本開示にしたがった１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子内の変異についてのスクリーニングを促進するために、自殖性栽培品種等の殆ど多型を有さないコムギ栽培品種を利用することを好み得る。
【０１６１】
Ｖ．ＥＰＳＰＳ変異の同定に関する代表的な方法
当業者ならば、数々の技法及び方法が、変異及び／又は非トランスジェニック変異を作り出すのに利用できることがわかる。１つの代表的な方法を後述する。
【０１６２】
本明細書で開示のＥＰＳＰＳ変異及びコムギ植物を作出、同定するために、ＴＩＬＬＩＮＧとして知られる方法を利用した。ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：４５５−４５７，２０００；ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２３：４３９−４４２，２０００；米国特許出願公開第２００４００５３２３６号及び米国特許第５９９４０７５号を参照のこと。これらの文献は全て参照により本明細書に援用される。基本的なＴＩＬＬＩＮＧ法においては、植物材料、例えば種子を化学的変異誘発に供し、この変異誘発は、種子の細胞のゲノム内で一連の変異を作り出す。変異を誘発させた種子を成熟したＭ１植物へと成長させ、自家受粉させる。得られたＭ２植物からのＤＮＡサンプルをプールし、次に対象となる遺伝子における変異についてスクリーニングする。対象となる遺伝子で変異が同定されたら、その変異が生じたＭ２植物の種子を成熟したＭ３植物へと成長させ、対象となる遺伝子におけるその変異に関連した表現型の特徴についてスクリーニングする。
【０１６３】
一実施形態においては、四倍体の栽培品種であるクロノスを用いた。他の実施形態においては、六倍体の栽培品種であるエクスプレスを用いた。
【０１６４】
一実施形態においては、コムギの種子に変異を起こさせ、次にＭ１植物に成長させる。次に、このＭ１植物を自家受粉させ、Ｍ１植物の種子をＭ２植物へと成長させ、次にＥＰＳＰＳ遺伝子座における変異についてスクリーニグする。Ｍ１植物は本明細書で開示の代替の実施形態に従って変異についてスクリーニングできるが、Ｍ２植物をスクリーニングする利点は、全ての体細胞変異が生殖細胞系列変異に対応することである。
【０１６５】
当業者ならば、本明細書で開示のＥＰＳＰＳ変異コムギ植物を作出するために、種子、花粉、植物組織又は植物細胞を含めた（これらに限定するわけではない）多種多様なコムギ植物材料に変異を起こさせ得ることがわかる。しかしながら、植物ＤＮＡを変異についてスクリーニングする場合、変異を誘発させた植物材料のタイプが影響し得る。例えば、変異を誘発させていない植物の授粉に先立って花粉を変異誘発に供する場合、その授粉から得られる種子をＭ１植物に成長させる。Ｍ１植物の全ての細胞が花粉において作り出された変異を含むため、Ｍ２世代を待つ代わりに、次にこれらのＭ１植物をＥＰＳＰＳ変異についてスクリーニングし得る。
【０１６６】
主に点変異、短い欠失（約１〜約３０個のヌクレオチド）、挿入、トランスバージョン及びトランジションを作り出す変異原、例えば化学変異原又は放射線、例えばＸ線及び高速中性子を用いて変異を作り出し得る。本明細書で開示の方法に準拠した変異原には、以下に限定するものではないが、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、トリエチルメラミン（ＴＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ジエチルサルフェート、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ア）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ジエポキシブタン（ＤＥＢ）等）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジンジヒドロクロリド（ＩＣＲ−１７０）、アジ化ナトリウム及びホルムアルデヒドが含まれる。変異原によって直接引き起こされてはいないと考えられるＥＰＳＰＳ遺伝子における自然変異も同定できる。
【０１６７】
現在知られている又は今後考案される適切な植物ＤＮＡ準備方法を用いて、ＥＰＳＰＳ変異スクリーニング用のコムギ植物ＤＮＡを準備し得る。例えば、Ｃｈｅｎ＆Ｒｏｎａｌｄ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １７：５３−５７，１９９９；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｖｉａ，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：７４８−７４９，１９９３を参照のこと。加えて、この目的に合わせて設計された幾つかの市販キットが入手可能であり、Ｑｉａｇｅｎ社（バレンシア、カリフォルニア州）及びＱｂｉｏｇｅｎｅ社（カールスバッド、カリフォルニア州）のキットを含む。
【０１６８】
一実施形態においては、変異を誘発させた植物組織起源の植物の個体群全体の１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子における変異についてのスクリーニングを促進するために、個々のコムギ植物から準備したＤＮＡをプールした。プールした群のサイズは用いるスクリーニング法の感度に依存し得る。好ましくは、２種以上の個々のコムギ植物の群をプールする。
【０１６９】
別の実施形態においては、ＤＮＡサンプルをプールした後、プールをＥＰＳＰＳ配列特異的増幅技法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供する。ＰＣＲの概要に関しては、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｓｎｉｎｓｋｙ，ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０を参照のこと。
【０１７０】
ＥＰＳＰＳ遺伝子座又はこれらの遺伝子座の１つのすぐ隣の配列に特異的ないずれのプライマーを利用しても、プールしたＤＮＡサンプル内のＥＰＳＰＳ配列を増幅し得る。好ましくは、有用な変異が最も起き易いＥＰＳＰＳ遺伝子座の領域を増幅するようにプライマーを設計する。最も好ましくは、プライマーを、１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子のエクソン領域を検出するように設計する。加えて、特定のゲノムにおける点変異をスクリーニングし易くするために、プライマーが公知の多型部位を標的とするとするようにゲノム特異的プライマーを設計することが好ましい。ゲル上でのＰＣＲ産物の検出を促進するために、ＰＣＲプライマーは、慣用の又は今後考案される標識方法を用いて標識し得る。
【０１７１】
一実施形態において、プライマーは、ＥＰＳＰＳ遺伝子（配列番号６、７及び８）をベースにして設計する。別の実施形態において、プライマーは、ＥＰＳＰＳ遺伝子に対して５’又は３’で設計し得る。
【０１７２】
別の実施形態においては、ＰＣＲ増幅産物を、野生型及び変異配列間のヌクレオチドの違いを同定する任意の方法を用いてＥＰＳＰＳ変異についてスクリーニングし得る。これらは、例えば、限定するものではないが、シーケンシング、変性高圧液体クロマトグラフィ（ｄＨＰＬＣ）、一定変性剤キャピラリ電気泳動（ＣＤＣＥ）、温度勾配キャピラリ電気泳動（ＴＧＣＥ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３（１０）：１４９９−１５１１，２００２を参照のこと）又はＣｏｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２６：４８０−４８４，２００１が記載の高スループット法で用いられているような酵素での切断によるフラグメンテーションを含み得る。好ましくは、ＰＣＲ増幅産物を、野生型及び変異配列間でのヘテロ二本鎖におけるミスマッチを優先的に切断するエンドヌクレアーゼとインキュベートする。
【０１７３】
別の実施形態において、切断産物を、自動シーケンシングゲル装置を使用して電気泳動にかけ、ゲルイメージを標準的な市販の画像処理プログラムの助けを借りて分析する。
【０１７４】
更に別の実施形態においては、変異ＥＰＳＰＳ遺伝子配列を有するＭ２植物が同定されたら、変異を分析して発現、翻訳及び／又はＥＰＳＰＳ酵素の活性に対するその影響を確認する。一実施形態においては、ＥＰＳＰＳ配列全体に対する変異の正確な位置を求めるために、変異を含むＰＣＲフラグメントを、標準的なシーケンシング技法を用いてシーケンシングにかける。タンパク質の機能へのその影響（すなわち、完全な耐性〜機能喪失）を予測するために、各変異を、ＳＩＦＴ（Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ  ｆｒｏｍ  Ｔｏｌｅｒａｎｔ；Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３８１２−３８１４，２００３）、ＰＳＳＭ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １２：１３５−１４３，１９９６）及びＰＡＲＳＥＳＮＰ（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３８０８−３８１１，２００３）等のバイオインフォマティクスツールを用いて評価する。例えば、０．０５未満のＳＩＦＴスコア及びＰＳＳＭスコアにおける大きな変化（例えば、およそ１０以上）は、タンパク質の機能に対して有害な作用を有し易い変異を示す。これらのプログラムは予測に役立つことが知られているが、当業者ならば、予測した結果が常に正確であるとは限らないことがわかる。
【０１７５】
別の実施形態において、Ｍ２植物における変異の最初の評価でそれが有用な性質であり且つＥＰＳＰＳ遺伝子内の有用な位置にあると判明したならば、次に、その変異を含むコムギ植物の表現型の分析を更に進め得る。六倍体コムギにおいて、Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれにおける変異は通常、表現型が検出される前に組み合せなくてはならない。四倍体コムギにおいては、Ａ及びＢゲノム変異を組み合わせる。加えて、変異を有する植物は、いずれの世代であっても、バックグラウンド変異を排除するために、２回以上戻し交配又は他配し得る。次に、ＥＰＳＰＳ変異についてホモ接合である植物を作り出すために、戻し交配又は他配した植物を自家受粉又は交配させ得る。
【０１７６】
これらのホモ接合ＥＰＳＰＳ変異植物の幾つかの物理的な特徴を評価し、変異が、望ましくない負の作用、例えば種子収量の著しい低下を引き起こすことなく、コムギ植物において有用な表現型の変化をもたらすかを判断する。
【０１７７】
一実施形態においては、ＥＰＳＰＳに複数の好ましい１つの変異を含む植物の種子に再度変異を起こさせ、次に子孫をスクリーニングにかけることで、１部位の変異の場合の耐性よりグリホサート耐性を上昇させる好ましい第２部位の変異を見つけ出し得る。
【０１７８】
ＶＩ．コムギ植物の作出方法
別の実施形態において、本開示は、グリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物を作出する方法に関する。別の実施形態において、本開示は、グリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物を作出する方法に関する。
【０１７９】
別の実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子変異を野生型植物に他配する方法に関する。
【０１８０】
更に別の実施形態において、本開示は、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比較してグリホサートに対する親和性が低い１つ以上のＥＰＳＰＳタンパク質を有する植物を作出する方法に関する。
【０１８１】
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの非トランスジェニック変異を、親植物からの植物材料又は植物部位のＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーで誘発させ、変異を誘発させた植物材料を成長させる又は使用することで子孫植物をつくり、変異を誘発させた植物材料及び／又は子孫植物を分析することでＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける少なくとも１つの変異を検出し、ＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫植物を選択することを含む。
【０１８２】
別の実施形態において、本方法は更に、ＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫植物をＥＰＳＰＳ遺伝子の異なるコピーに少なくとも１つの変異を有する他の子孫植物と交配させることを含む。変異を有する子孫植物を同定し、その子孫植物を他の子孫植物（変異を有する）と交配させる工程を繰り返すことでＥＰＳＰＳ活性が低下した子孫コムギ植物を作出できる。
【０１８３】
別の実施形態において、コムギ植物の改変ＥＰＳＰＳタンパク質のグリホサートに対する親和性は、野生型植物のＥＰＳＰＳタンパク質の親和性の０〜２％、２〜５％、５〜７％、７〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％又は９５〜９９％に低下する。
【０１８４】
Ａ．２つ以上のゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の変異を有する植物を作出する方法
更に別の実施形態において、本開示は植物を作出する方法に関し、この方法は以下の：少なくとも１つの非トランスジェニック変異を、ＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含む親植物からの植物材料のＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーで誘発させ、変異を誘発させた植物材料を成長させる又は使用することで子孫植物をつくり、ＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも２つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫コムギ植物を選択することを含む。例えば、親植物はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を有し得る。選択された子孫植物はＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子にある変異を、また１つ以上の変異をＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に有し得る。この例は単に明確にするためのものであって、本明細書で開示の方法を限定すべきではない。
【０１８５】
更に別の実施形態において、本開示は植物を作出する方法に関し、この方法は、少なくとも１つの非トランスジェニック変異を、２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの変異を含む親植物からの植物材料のＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーで誘発させ、変異を誘発させた植物材料を成長させる又は使用することで子孫植物をつくり、ＥＰＳＰＳ遺伝子の３つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫植物を選択することを含む。この実施形態においては、Ａ、Ｂ及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの変異が存在し得る。
【０１８６】
別の実施形態において、本開示はコムギ植物を作出する方法に関し、この方法は、第１ＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を有する第１植物を第２ＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を有する第２植物と交配させ、ＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも２つのコピーに少なくとも１つの変異を有する子孫植物を選択することを含む。
【０１８７】
別の実施形態において、本開示は植物の作出方法に関し、この方法は、第１及び第２ＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を有する第１植物を第３ＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を有する第２植物と交配させ、ＥＰＳＰＳ遺伝子の３つのコピー全てに少なくとも１つの変異を有する子孫植物を選択することを含む。この実施形態においては、Ａ，Ｂ及びＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの変異が存在し得る。
【０１８８】
ＶＩＩ．コムギ植物、コムギ種子及びコムギ植物の部位
一実施形態において、グリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物を本明細書で開示の方法に従って作出する。更に別の実施形態において、野生型コムギ植物と比較してグリホサートに対する抵抗性及び改変されていない成長特性を有するコムギ植物を、本明細書で開示の方法に従って作出する。更に別の実施形態において、グリホサートに対する抵抗性及び野生型の発芽率を有するコムギ植物を本明細書で開示する。
【０１８９】
更に別の実施形態において、グリホサートに対する抵抗性を有し、発芽する種子をつけるコムギ植物を本明細書で開示する。更に別の実施形態において、グリホサートに対する抵抗性及び野生型の稔性を有するコムギ植物を本明細書で開示する。
【０１９０】
更に別の実施形態において、グリホサートに対する抵抗性及び通常の収量を有するコムギ植物を本明細書で開示する。
【０１９１】
一実施形態において、コムギ植物又はその部位は、畑１ヘクタールあたり３４．４ｇ以上又は６８．８ｇ以上のグリホサートのイソプロピルアミン塩の散布量に耐性である。
【０１９２】
別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位はＥＰＳＰＳ遺伝子又は改変ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の変異を有する。別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位はＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の変異を有する。
【０１９３】
別の実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を含むコムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位に関する。別の実施形態において、本開示は２つのゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を含むコムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位に関する。更に別の実施形態において、本開示は、３つのゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を含むコムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位に関する。
【０１９４】
一実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルに１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。
【０１９５】
一実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルに１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。
【０１９６】
一実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルに１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。
【０１９７】
別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、表４で挙げた１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号６に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０１９８】
更に別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、表４で挙げた１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリペプチドは１つ以上の非トランスジェニック変異を含み且つＥＰＳＰＳ−Ａタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０１９９】
別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、表４で挙げた１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の変異を有するポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号７に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２００】
更に別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、このＥＰＳＰＳタンパク質は１つ以上の非トランスジェニック変異を含み且つＥＰＳＰＳ−Ｂタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２０１】
別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、表４で挙げた１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の変異を有するポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号８に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２０２】
更に別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、このＥＰＳＰＳタンパク質は１つ以上の非トランスジェニック変異を含み且つＥＰＳＰＳ−Ｄタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２０３】
別の実施形態において、コムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位は、表４で列挙した１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードするＥＰＳＰＳ遺伝子における１つ以上の変異及びホメオログにおける対応する変異を有する。以下に限定するものではないが、表４で開示の変異、また対応するホメオログにおける変異を含め、本明細書で開示の変異を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２５個を超えて有するコムギ植物、コムギ種子又はコムギ植物の部位を作り出し得る。
【０２０４】
ＶＩＩＩ．穀粒、穀粉及びデンプン
別の実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子又は改変ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を含むコムギ穀粒、穀粉又はデンプンに関する。別の実施形態において、本開示は胚を含むコムギ穀粒に関し、胚はＥＰＳＰＳ遺伝子又は改変ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。
【０２０５】
別の実施形態において、コムギ穀粒、穀粉又はデンプンは、表４に記載の変異並びにホモログ及びホメオログにおける対応する変異を含め（これらに限定されない）、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。
【０２０６】
更に別の実施形態において、本開示は、１、２又は３つのゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも１つの非トランスジェニック変異を含むコムギ穀粒又は穀粉に関する。
【０２０７】
更に別の実施形態において、本開示は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を含むコムギ穀粒、穀粉又はデンプンに関する。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。
【０２０８】
一実施形態において、コムギ穀粒、穀粉又はデンプンは、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルに１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。
【０２０９】
一実施形態において、コムギ穀粒、穀粉又はデンプンは、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルに１つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施形態において、非トランスジェニック変異は、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子の両方のアレルにおいて同一である。
【０２１０】
一実施形態において、本開示は、表４で挙げた１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有する配列番号６に対応するＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドを含むコムギ穀粒、穀粉又はデンプンに関する。別の実施形態において、コムギ穀粒又はコムギ穀粉は１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み且つ配列番号６に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２１１】
更に別の実施形態において、コムギ穀粒、穀粉又はデンプンは、表４に記載の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ＥＰＳＰＳタンパク質は、ＥＰＳＰＳ−Ａタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２１２】
一実施形態において、本開示は、表４に記載の１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の変異を有する配列番号７に対応するＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドを含むコムギ穀粒、穀粉又はデンプンに関する。別の実施形態において、コムギ穀粒又はコムギ穀粉は１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み且つ配列番号７に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２１３】
更に別の実施形態において、コムギ穀粒、コムギ穀粉又はデンプンは、表４に記載の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をコードする１つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ＥＰＳＰＳタンパク質は、ＥＰＳＰＳ−Ｂタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２１４】
一実施形態において、本開示は、表４に記載の１つ以上の変異を有するポリペプチドをコードする１つ以上の変異を有する配列番号８に対応するＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子のポリヌクレオチドを含むコムギ穀粒、コムギ穀粉又はデンプンに関する。別の実施形態において、コムギ穀粒又はコムギ穀粉は１つ以上の変異を有するポリヌクレオチドを含み且つ配列番号８に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２１５】
更に別の実施形態において、コムギ穀粒、コムギ穀粉又はデンプンは、表４に記載の１つ以上の変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をコードする１つ以上の変異を有するポリヌクレオチドを含み、ＥＰＳＰＳタンパク質は、ＥＰＳＰＳ−Ｄタンパク質に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える同一性又は類似性を有する。
【０２１６】
更に別の実施形態において、本開示は、胚乳、野生型のコムギ穀粒又は穀粉と比較して低いＥＰＳＰＳ遺伝子の遺伝子発現レベル、活性又は発現レベル及び活性を含むコムギ穀粒又は穀粉に関する。
【０２１７】
ＩＸ．食品
一実施形態において、本開示は、上述した穀粒又は穀粉から製造した穀粉又は他の製品を対象とする。別の実施形態において、穀粉、粗砕物又は精製デンプンは食品の成分になり得る。
【０２１８】
食品は、以下に限定するものではないが、ベーグル、ビスケット、パン、ロールパン、クロワッサン、ダンプリング、イングリッシュマフィン、マフィン、ピタパン、クイックブレッド、フラットブレッド、サワードウブレッド、冷蔵／冷凍生地製品、生地、ベークドビーンズ、ブリトー、チリ、タコ、タマル、トルティーヤ、ポットパイ、インスタントのシリアル、インスタント食品、詰め物、電子レンジ対応食品、ブラウニー、ケーキ、チーズケーキ、コーヒーケーキ、クッキー、デザート、ペーストリー、スイートロール、キャンディバー、パイ皮、パイの詰め物、ベビーフード、ミックス粉、バッター、パン粉、グレービーミックス、ミートエクステンダー、肉代用品、シーズニングミックス、スープミックス、グレービー、ルー、サラダドレッシング、スープ、サワークリーム、麺、パスタ、ラーメンの麺、焼きそばの麺、ロウミンの麺、アイスクリームのトッピング、棒アイス、アイスクリームコーン、アイスクリームサンドイッチ、クラッカー、クルトン、ドーナッツ、春巻、押出成形スナック、フルーツと穀類が入ったバー、電子レンジ対応スナック製品、栄養バー、パンケーキ、半焼き製パン製品、プリッツェル、プリン、グラノーラ系製品、スナックチップ、スナック食品、スナックミックス、ワッフル、ピザ生地、飼料又はペットフードを含む。
【０２１９】
一実施形態において、穀粉は全粒粉（例えば、超微粉砕全粒粉、例えば超微粉砕全粒コムギ穀粉）である。一実施形態において、全粒粉は精製穀粉要素（例えば、精製コムギ穀粉又は精製穀粉）及び粗砕物（例えば、超微粉砕粗砕物）を含む。精製コムギ穀粉は、例えば、清浄化したコムギを粉砕し、篩にかける（選別）することで調製される穀粉になり得る。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、精製コムギ穀粉のカテゴリに含めるためには穀粉が特定の粒径規格を満たすことを要求している。精製コムギ穀粉の粒径は、少なくとも９８％が「２１２マイクロメートル（Ｕ．Ｓ．ワイヤ７０）」と称される織金網のもの以下の開口部を有する網を通過する穀粉とされる。
【０２２０】
別の実施形態において、粗砕物は、ふすま及び胚芽の少なくとも一方を含む。例えば、胚芽は、コムギの穀粒内に見られる植物の胚である。胚芽は脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及び植物栄養素、例えばフラボノイドを含む。ふすまは幾つかの細胞層を含み得て、またかなりの量の脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及び植物栄養素、例えばフラボノイドを有する。
【０２２１】
例えば、本開示の粗砕物又は全粒穀粉又は精製穀粉を様々な量で使用することで、焼いた食品、スナック製品及び食品中の精製又は全粒穀粉と置き換え得る。全粒穀粉（すなわち、超微粉砕全粒穀粉）はまた、自家製の焼いた食品で使用できるように消費者に直接市販し得る。ある実施形態例において、全粒穀粉の顆粒化プロファイルは、全粒穀粉の粒子の９８％（質量基準）が２１２マイクロメートル未満となるようなものである。
【０２２２】
別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、栄養サプリメントの成分になり得る。栄養サプリメントは、典型的にはビタミン、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、酵素、酸化防止剤、ハーブ、香辛料、プロバイオティクス、抽出物、プレバイオティクス及び繊維を含めた１種以上の原料を含有する食餌に添加する製品になり得る。
【０２２３】
更なる実施形態において、栄養サプリメントは、個体の健康全般を支援するいずれの公知の栄養素も含み得て、例は、以下に限定するものではないが、ビタミン、ミネラル、他の繊維成分、脂肪酸、酸化防止剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ルテイン、リボース、オメガ−３脂肪酸及び／又は他の栄養成分を含む。胚乳は栄養素含有量が高いため、繊維及び他の必須の栄養分の送達、消化機能及び健康の向上、体重管理、血糖値管理、心臓の健康、糖尿病のリスク低下、潜在的な関節炎のリスク低下並びに個体の健康全般及びウェルネスを含め、個体に数多くのメリットをもたらす多くの用途があると考えられる。
【０２２４】
更に別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、食餌サプリメントの成分になり得る。米連邦規則集は食餌サプリメントを、食餌を補うことを目的とし、ビタミン、ミネラル、ハーブ、植物性薬品、アミノ酸及び他の物質又はその要素を含めた１種以上の食餌成分を含有し、経口で丸薬、カプセル、錠剤又は液体として摂取する、また食餌サプリメントであると正面に表示されている製品と定義している。
【０２２５】
更に別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、繊維サプリメント又はその成分になり得る。繊維サプリメントは、以下に限定するものではないが、以下の形態：即席飲料ミックス、即席飲料、栄養バー、ウェハース、クッキー、クラッカー、ゼリー飲料、カプセル、チューイングキャンディ、チュアブル錠及び丸薬で届け得る。一実施形態では繊維サプリメントを、フレーバーシェイク又はモルトタイプの飲料の形態で届ける。
【０２２６】
別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、消化促進サプリメントの成分として含め得る。全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、消化促進サプリメント単体の成分になり得る、或いは１種以上のプレバイオティクス化合物及び／又はプロバイオティク生物と組み合わせ得る。プレバイオティック化合物は、結腸にいる数が限定された微生物の成長及び／又は活動を選択的に刺激することで宿主に有益な影響を及ぼし得る消化できない食品原料である。本開示の範囲内のプレバイオティック化合物の例は、以下に限定するものではないが、オリゴ糖及びイヌリンを含み得る。
【０２２７】
プロバイオティクスとは、十分な量で投与した場合に、宿主に健康上のメリットをもたらす微生物である。プロバイオティック生物は、以下に限定するものではないが、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィズス菌、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を含む。
【０２２８】
更に別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、機能性食品の成分として含め得る。米国食品技術者協会は機能性食品を、基本的な栄養を超えて健康上のメリットをもたらす食品及び食品成分と定義している。これは従来の食品、強化、栄養富化又は栄養強化食品並びに食餌サプリメントを含む。全粒穀粉及び粗砕物又は精製穀粉は多くのビタミン及びミネラルを含み、高い酸素ラジカル吸収能を有し、また繊維含有量が高く、機能性食品における／としての使用に理想的である。
【０２２９】
別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は医療用食品に使用し得る。医療用食品は、医師の完全なる監督下で摂取又は投与されるように処方される食品と定義され、一般に認められている科学原理に基づいて医学的判断により特徴的な栄養要件が確立されている疾患又は状態を特殊な食餌で管理するためのものである。全粒穀粉及び粗砕物又は精製穀粉の栄養含有量及び酸化防止能は、これらを医療用食品での使用に理想的なものにしている。
【０２３０】
更に別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は医薬品にも使用し得る。全粒穀粉及び粗砕物又は精製穀粉は繊維含有量が多く、極めて細かい顆粒度を有するため、医薬品における担体としての使用に適している。
【０２３１】
更に別の実施形態において、全粒穀粉又は粗砕物又は精製穀粉は、栄養サプリメント、食餌サプリメント又は消化促進サプリメントとして、全粒穀粉又は粗砕物を単一の原料又は多くの栄養原料の１つにすることで届けることが考えられる。届け方の例は、以下に限定するものではないが、即席飲料ミックス、即席飲料、栄養バー、ウェハース、クッキー、クラッカー、ゼリー飲料、カプセル及びチューイングキャンディを含む。
【０２３２】
更に別の実施形態において、微粉砕工程を用いることで、複数種のコムギから構成される穀粉又は複数種の穀類から構成される粗砕物を作り得る。一実施形態においては、あるタイプのコムギからのふすま及び胚芽を粉砕し、別のタイプのコムギの粉砕された胚乳又は全粒コムギとブレンドし得る。或いは、あるタイプの穀類のふすま及び胚芽を粉砕し、別のタイプの穀物の粉砕された胚乳又は全粒穀粉とブレンドし得る。
【０２３３】
更に別の実施形態において、第１タイプのコムギ又は穀類のふすま及び胚芽を、第２タイプのコムギ又は穀類のふすま及び胚芽とブレンドすることで複数の穀類から構成される粗砕物を製造し得る。本開示が、１種以上の穀類のふすま、胚芽、胚乳及び全粒穀粉の１つ以上の任意の組み合わせを混合することを包含することが考えられる。この複数種の穀類、複数種のコムギのアプローチを用いることで注文通りの穀粉を作り、１つの穀粉を構成する複数タイプの穀類又はコムギの特性及び栄養素含有量を利用し得る。
【０２３４】
本明細書で開示の全粒穀粉は、多種多様な微粉砕法で製造し得る。ある模範的な方法では、穀粒の胚乳、ふすま及び胚芽を別々の流れへと分けることなく、１つの流れで穀粒を粉砕する。清浄でテンパリングした穀粒を第１通過グラインダ、例えばハンマーミル、ローラーミル、ピンミル、インパクトミル、ディスクミル、エアアトリションミル、ギャップミル等に送る。
【０２３５】
粉砕後、穀粒を取り出し、シフターに送る。粉砕済みの粒子を選別するための当該分野で公知のいずれのシフターも使用し得る。シフターの網を通過する材料が本開示の全粒穀粉であり、更なる加工を必要としない。網上に残る材料は第２分級物と称される。この第２分級物は更なる粒子粉砕を必要とする。従って、この第２分級物を第２通過グラインダに送り得る。
【０２３６】
粉砕後、第２分級物を第２シフターに送り得る。第２シフターの網を通過した材料が全粒穀粉である。網上に残った材料は第４分級物と称され、更に加工して粒径を小さくする必要がある。フィードバックループを介して更に加工するために、第２シフターの網上の第４分級物を第１通過グラインダ又は第２通過グラインダに戻す。
【０２３７】
本開示の全粒穀粉、粗砕物、精製デンプン及び／又は穀類製品は、当該分野で公知の多数の微粉砕方法により製造し得ることが考えられる。
【０２３８】
Ｘ．植物の品種改良
別の実施形態において、本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ植物及び植物部位を用いて植物の品種改良をする方法を対象としている。
【０２３９】
１つのそのような実施形態は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種を別のコムギ変種と交配させてＦ１植物の第１世代個体群を形成する方法である。この方法で作り出した第１世代Ｆ１植物の個体群も本開示の実施形態である。Ｆ１植物のこの第１世代個体群は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種の本質的に完全なアレルセットを含む。当業者ならば、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種を用いて作った特定のＦ１植物を同定するために品種改良に関する書籍又は分子法を利用でき、そのような個々の植物も本開示に包含される。これらの実施形態は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の変異を有するコムギ変種のトランスジェニックな又は戻し交配による転換を用いることで第１世代Ｆ１植物を作ることもカバーする。
【０２４０】
別の実施形態において、本開示は、子孫コムギ植物の開発方法に関する。子孫コムギ植物の開発方法は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種を第２コムギ植物と交配させ、品種改良法を実施することを含む。ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来の系統を作出する特定の方法は、以下の通りである。
【０２４１】
当業者ならば、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種を別のコムギ変種、例えばエリート変種と交配させ得る。この交配由来のＦ１種子を育てて同種の個体群を形成し得る。Ｆ１種子は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種からの１組のアレル及びもう一方のコムギ変種からの１組のアレルを含む。
【０２４２】
Ｆ１ゲノムは、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種５０％及びもう一方のエリート変種５０％から成る。Ｆ１種子は成長してＦ２種子を形成する。Ｆ１種子は自殖、或いは別のコムギ栽培品種と品種改良し得る。
【０２４３】
平均して、Ｆ２種子は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種からのアレルの５０％、また他方のコムギ変種のアレルの５０％を受け継ぐが、個体群の植物の様々な個体はＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来のアレルをずっと高い割合で有し得る（Ｗａｎｇ  Ｊ．ａｎｄ  Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｏ，２０００，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．４０：６５９−６６５及びＢｅｒｎａｒｄｏ，Ｒ．  ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｋａｈｌｅｒ，２００１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０２：９８６−９９２）。
【０２４４】
Ｆ２種子は成長し、植物の選択は、目視での観察及び／又は特質の測定及び／又はマーカー支援選択に基づいて行い得る。ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来の、遺伝子由来の特質を示す子孫を選択し、各植物を別々に収穫する。各植物からのこのＦ３種子を個別に並べて成長させ、自殖させる。次に、選択した列又は各植物を個別に収穫し、脱穀する。ここでも選択は、目視による観察及び／又は植物の望ましい特質、例えばＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有する望ましいコムギ変種の１種以上由来の特質についての測定に基づく。
【０２４５】
育成及び選択の工程は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するホモ接合コムギ変種由来のコムギ植物が得られるまで何回でも繰り返し得る。ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するホモ接合コムギ変種由来のコムギ植物は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来の望ましい特質を含み得て、その一部は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種を交配させた他方の本来のコムギ変種で発現していない可能性があり、一部は両方のコムギ変種で発現している可能性があるが、ここではＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異変異を有するコムギ変種で発現しているレベル以上のレベルになり得る。
【０２４６】
交配、自殖及び選択の品種改良工程を繰り返すことで、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来のコムギ植物の別の個体群（平均で、遺伝子の２５％がＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来である）を作り出し得るが、この個体群の様々な個々の植物は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ変種由来のアレルをずっと高い割合で有し得る。本開示の別の実施形態は、ＥＰＳＰＳ遺伝子における１つ以上の非トランスジェニック変異由来の特質を有する別のコムギ植物と交配させた、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の非トランスジェニック変異を有するホモ接合コムギ変種由来のコムギ植物である。
【０２４７】
Ａ．マーカーとしての変異
遺伝子マーカーは遺伝子のアレル形態又は遺伝子座により決定される生物学的特徴であり、１つの世代から別の世代へと伝達されるため、個体、植物、組織、細胞、核、染色体又は遺伝子を追跡し続けるための実験プローブ又はタグとして使用できる。遺伝学及び植物の品種改良で使用する遺伝子マーカーは２つのカテゴリ：古典的マーカー及びＤＮＡマーカーに分類できる。古典的マーカーは、形態学的マーカー、細胞学的マーカー及び生化学的マーカーを含む。ＤＮＡマーカーは、異なる多型検出技法又は方法（サザンブロット法−核酸ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応及びＤＮＡシーケンシング）に基づいた多くのシステムへと発展し、例えば制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法、単純反復配列（ＳＳＲ）、一塩基多型（ＳＮＰ）等である。
【０２４８】
１つのヌクレオチド塩基が遺伝の最小単位であることから、ＳＮＰは究極の／最も単純な形態の分子マーカーであり、従って最大数のマーカーが得られる。ＳＮＰは動物及び植物で極めて一般的に起きる。典型的には、ＳＮＰ頻度は植物において１００〜３００塩基対あたり１ＳＮＰの範囲である。ＳＮＰは、遺伝子のコード配列、遺伝子の非コード領域内又は遺伝子同士の遺伝子間領域に染色体領域毎に異なる頻度で存在し得る。
【０２４９】
ＳＮＰは共優性マーカーであり、遺伝子にリンクしていることが多く、多型に関する最も単純な／究極の形態で存在するため、遺伝子の研究及び品種改良において極めて魅力的且つ潜在的な遺伝子マーカーになった。更に、ＳＮＰは極めて容易に自動化でき、また迅速に検出でき、多型を検出する効率は高い。
【０２５０】
一実施形態において、本開示は、植物の品種改良においてマーカーとして使用し得る、一塩基多型である、ＥＰＳＰＳ遺伝子における変異に関する。ＥＰＳＰＳ遺伝子における変異は原因として作用し、その分離は例えばＫＡＳＰプローブを使用して追跡し得る。
【０２５１】
別の実施形態において、本開示のセクションＩＩで同定した変異は、植物の品種改良においてマーカーとして使用し得る。更に別の実施形態において、表１〜３の１つ以上の変異は、植物の品種改良においてマーカーとして使用し得る。
【０２５２】
一実施形態において、変異は、以下に限定するものではないが、ＳＮＰ−制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＣＡＰＳ、Ａｘｉｏｍ  ＳＮＰアレイ、ｉＳｅｌｅｃｔアレイ、ＴａｑＭａｎプローブ及びＫＡＳＰプローブを含む技法で追跡し得る。別の実施形態においては、次世代シーケンシング技法を用い得て、以下に限定するものではないが、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、インディアナポリス、インディアナ州）、ＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＳＯＬｉＤ  ａｎｄ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）を含む。
【０２５３】
ＰＣＲをベースにしたＫＡＳＰ（商標）ジェノタイピングアッセイは、公知のＳＮＰ及びインデルの正確な２アレル識別を可能にする均一蛍光（ＦＲＥＴ）ベースアッセイである。ＰＣＲをベースにしたＫＡＳＰ技術の重要な特徴は普遍的なＦＲＥＴカセットレポーターシステムの使用であり、これは高コストの二重標識プローブの必要性を排除する。アレル特異的順方向プライマーはそれぞれ、２つのＦＲＥＴカセットの１つに対応する専有テール配列を有する（一方の標識はＦＡＭ色素、他方はＨＥＸ色素）。２アレル識別は、２アレル特異的順方向プライマーの競合的結合を通して達成する。
【０２５４】
植物、組成物及び方法について、以下の非限定的な段落により更に説明する。
【０２５５】
１．Ａ、Ｂ又はＤゲノムの少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、変異が、野生型植物と比較してグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物に貢献するコムギ植物。
【０２５６】
２．Ａ、Ｂ又はＤゲノムの少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、遺伝子変異が活性領域に変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質を産生し、更に変異が、野生型植物と比較してグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物に貢献するコムギ植物。
【０２５７】
３．Ａ、Ｂ又はＤゲノムの少なくとも１つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、遺伝子変異が、グリホサートに対する親和性が低く、植物基質に対して野生型と同様の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質を産生し、更に変異が、野生型植物と比較してグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物に貢献するコムギ植物。
【０２５８】
４．ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異がＢ及びＤゲノムにおけるものである、段落１〜３のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２５９】
５．ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異がＡ及びＢゲノムにおけるものである、段落１〜３のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６０】
６．ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異がＡ及びＤゲノムにおけるものである、段落１〜３のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６１】
７．ＥＰＳＰＳ遺伝子の変異がＡ、Ｂ及びＤゲノムにおけるものである、段落１〜３のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６２】
８．変異がグリホサートに対する親和性が低いＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６３】
９．変異が植物基質に対して野生型と同様の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６４】
１０．変異がグリホサートに対して親和性が低く、植物基質に対して野生型と同様の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６５】
１１．変異が野生型ＥＰＳＰＳのグリホサートに対する親和性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０又は９０％から成る群から選択されるグリホサートに対する親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６６】
１２．変異についてホモ接合である、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６７】
１３．トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種である、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６８】
１４．トリチカム・ツルギダム・デュラム亜種である、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２６９】
１５．変異が表１〜３に記載されている、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０２７０】
１６．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物からのコムギ穀粒。
【０２７１】
１７．先行の段落のいずれかに記載のコムギ穀粒を含む穀粉。
【０２７２】
１８．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物の成分を含む食品。
【０２７３】
１９．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物からのコムギ種子、植物部位又は子孫。
【０２７４】
２０．ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現を低下させる及び／又はグリホサートに対するＥＰＳＰＳタンパク質の親和性を低下させるトランスジーンを含み、低下した発現及び／又は低下したグリホサート親和性が、グリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物に貢献するトランスジェニックコムギ植物。
【０２７５】
２１．トランスジーンが植物基質に対して野生型と同様の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落２０に記載のコムギ植物。
【０２７６】
２２．トランスジーンがタンパク質の活性領域に変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落２０に記載のコムギ植物。
【０２７７】
２３．トランスジーンがグリホサートに対して親和性が低く、植物基質に対して野生型ＥＰＳＰＳと同様の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落２０に記載のコムギ植物。
【０２７８】
２４．トランスジーンが、野生型ＥＰＳＰＳのグリホサートに対する親和性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０又は９０％から成る群から選択されるグリホサートに対する親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落２０に記載のコムギ植物。
【０２７９】
２５．トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種である、段落２０に記載のコムギ植物。
【０２８０】
２６．トリチカム・ツルギダム・デュラム亜種である、段落２０に記載のコムギ植物。
【０２８１】
２７．段落２０〜２６のいずれかに記載のコムギ植物のコムギ穀粒。
【０２８２】
２８．段落２７のコムギ穀粒を含む穀粉。
【０２８３】
２９．段落２０〜２８に記載のコムギ植物の成分を含む食品。
【０２８４】
３０．段落２０〜２６のコムギ植物からのコムギ種子、植物部位又は子孫。
【０２８５】
３１．改変ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、ＥＰＳＰＳ遺伝子がゲノム編集により改変され、改変がグリホサートに対する抵抗性を有するコムギ植物に貢献するコムギ植物。
【０２８６】
３２．改変ＥＰＳＰＳ遺伝子が植物基質に対して野生型の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落３１に記載のコムギ植物。
【０２８７】
３３．改変ＥＰＳＰＳ遺伝子がタンパク質の活性領域に変異を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落３１に記載のコムギ植物。
【０２８８】
３４．改変ＥＰＳＰＳ遺伝子が、グリホサートに対して低い親和性及び植物基質に対して野生型と同様の親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落３１に記載のコムギ植物。
【０２８９】
３５．改変ＥＰＳＰＳ遺伝子が、グリホサートに対する野生型ＥＰＳＰＳの親和性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％から成る群から選択されるグリホサートに対する親和性を有するＥＰＳＰＳタンパク質をもたらす、段落３１に記載のコムギ植物。
【０２９０】
３６．トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種である、段落３１に記載のコムギ植物。
【０２９１】
３７．トリチカム・ツルギダム・デュラム亜種である、段落３１に記載のコムギ植物。
【０２９２】
３８．段落３１〜３７のいずれかに記載のコムギ植物からのコムギ穀粒。
【０２９３】
３９．段落３８のコムギ穀粒を含む穀粉。
【０２９４】
４０．段落３１〜３９に記載のコムギ植物の成分を含む食品。
【０２９５】
４１．段落３１〜３７のコムギ植物からのコムギ種子、植物部位又は子孫。
【０２９６】
４２．（ａ）親コムギ植物から植物材料を得るステップと、
（ｂ）この植物材料を変異原で処理することで植物材料のＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーに少なくとも１つの変異を誘発させて変異誘発された植物材料を作り出すステップと、
（ｃ）変異誘発された植物材料を栽培して子孫コムギ植物をつくるステップと、
（ｄ）子孫コムギ植物を分析することでＥＰＳＰＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける少なくとも１つの変異を検出するステップと、
（ｅ）親コムギ植物と比較して除草剤のグリホサートに対して抵抗性である子孫コムギ植物を選択するステップと、
（ｆ）子孫コムギ植物を栽培してグリホサートに対して抵抗性である追加の子孫コムギ植物をつくるサイクルを繰り返すステップ
とを含む、野生型コムギ植物と比較して除草剤のグリホサートに対して抵抗性であるコムギ植物を作出する方法。
【０２９７】
４３．植物材料が、種子、花粉、植物細胞又は植物組織から成る群から選択される、段落４２に記載の方法。
【０２９８】
４４．変異原がエチルメタンスルホネートである、段落４２に記載の方法。
【０２９９】
４５．使用するエチルメタンスルホネートの濃度が０．７５〜約１．２％である、段落４４に記載の方法。
【０３００】
４６．子孫コムギ植物を、
（ａ）ゲノムＤＮＡを子孫コムギ植物から単離し、
（ｂ）単離したゲノムＤＮＡ中のＥＰＳＰＳ遺伝子のセグメントを、このＥＰＳＰＳ遺伝子又はこのＥＰＳＰＳ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用して増幅する
ことで分析する、段落４２に記載の方法。
【０３０１】
４７．ＥＰＳＰＳ遺伝子配列が実質的に配列番号６と同一である、先行の段落のいずれかに記載の方法。
【０３０２】
４８．ＥＰＳＰＳ遺伝子配列が実質的に配列番号７と同一である、先行の段落のいずれかに記載の方法。
【０３０３】
４９．ＥＰＳＰＳ遺伝子配列が実質的に配列番号８と同一である、先行の段落のいずれかに記載の方法。
【０３０４】
５０．少なくとも１つのプライマーが、配列番号９〜１２から成る群の配列と実質的に同一の配列を有する、先行の段落のいずれかに記載の方法。
【０３０５】
５１．ステップ（ｄ）で検出した変異を評価することで、変異がグリホサートに対する抵抗性を上昇させる公算を判断する、先行の段落のいずれかに記載の方法。
【０３０６】
５２．変異を、ＳＩＦＴ、ＰＳＳＭ及びＰＡＲＳＥＳＮＰから成る群から選択されるバイオインフォマティクスツールを使用して評価する、先行の段落のいずれかに記載の方法。
【０３０７】
５３．先行の段落のいずれかに記載の方法により作出するコムギ植物。
【０３０８】
５４．段落５３のコムギ植物の花、種子、花粉、植物部位又は子孫。
【０３０９】
５５．段落５４の種子の部位。
【０３１０】
５６．段落５３のコムギ植物の種子の任意の一部を取り入れた食物及び食品。
【０３１１】
５７．コムギ植物を段落５３のコムギ植物で品種改良することで作出される、グリホサートに対して抵抗性を示すコムギ植物。
【０３１２】
５８．配列番号６に対する相当な同一性を有し且つ変異原での処理後に内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子内に非トランスジェニック変異を有する内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０３１３】
５９．非トランスジェニック変異がミスセンス変異である、段落５８に記載の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０３１４】
６０．変異が配列番号９のＴ１６８Ｉである、段落５９に記載の非トランスジェニックミスセンス変異。
【０３１５】
６１．変異が配列番号９のＰ１７２Ｓである、段落５９に記載の非トランスジェニックミスセンス変異。
【０３１６】
６２．先行の段落のいずれかに記載の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むコムギ植物。
【０３１７】
６３．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物の花、種子、花粉、植物部位及び子孫。
【０３１８】
６４．先行の段落のいずれかに記載の種子の部位。
【０３１９】
６５．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物の種子の任意の一部を取り入れた食物及び食品。
【０３２０】
６６．配列番号７に対する相当な同一性を有し且つ変異原での処理後に内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子内に非トランスジェニック変異を有する内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０３２１】
６７．非トランスジェニック変異がミスセンス変異である、段落６６に記載の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０３２２】
６８．変異が配列番号９のＴ１６８Ｉである、段落６７の非トランスジェニックミスセンス変異。
【０３２３】
６９．変異が段落番号９のＰ１７２Ｓである、段落６７の非トランスジェニックミスセンス変異。
【０３２４】
７０．段落６６の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むコムギ植物。
【０３２５】
７１．先行の段落のいずれかに記載のＥＰＳＰＳ植物の花、種子、花粉、植物部位及び子孫。
【０３２６】
７２．先行の段落のいずれかに記載の種子の部位。
【０３２７】
７３．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物の種子の任意の一部を取り入れた食物及び食品。
【０３２８】
７４．配列番号８に対する相当な同一性を有し且つ変異原での処理後に内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子内に非トランスジェニック変異を有する内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０３２９】
７５．非トランスジェニック変異がミスセンス変異である、段落７４に記載の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０３３０】
７６．変異が配列番号３の１７３位（Ｔ１７３Ｉ）又は配列番号９のＴ１６８Ｉ位でのトレオニンからイソロイシンである、段落７５に記載の非トランスジェニックミスセンス変異。
【０３３１】
７７．変異が、配列番号３の１７７位（Ｐ１７７Ｓ）又は配列番号９のＰ１７２Ｓ位でのプロリンからセリンである、請求項７５に記載の非トランスジェニックミスセンス変異。
【０３３２】
７８．段落７４の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むコムギ植物。
【０３３３】
７９．先行の段落のいずれかに記載のＥＰＳＰＳ植物の花、種子、花粉、植物部位及び子孫。
【０３３４】
８０．先行の段落のいずれかに記載の種子の部位。
【０３３５】
８１．先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物の種子の任意の一部を取り入れた食物及び食品。
【０３３６】
８２．先行の段落のいずれかに記載の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子から選択された２つ以上の内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むコムギ植物。
【０３３７】
８３．Ａ、Ｂ及びＤゲノムの少なくとも２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が、配列番号９のアミノ酸位１７２（配列番号３のＰ１７７Ｓ）でのプロリンからセリンへの変異を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３３８】
８４．ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも２つの変異を含み、Ａゲノムの変異ＥＰＳＰＳ遺伝子が、配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）（配列番号３のＴ１７３Ｉ及びＰ１７７Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３３９】
８５．ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子に少なくとも２つの変異を含み、Ｄゲノムの変異ＥＰＳＰＳ遺伝子が、配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）（配列番号３のＴ１７３Ｉ及びＰ１７７Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４０】
８６．Ａ、Ｂ及びＤゲノムの少なくとも２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）（配列番号３のＴ１７３Ｉ及びＰ１７７Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４１】
８７．Ａ、Ｂ及びＤゲノムの少なくとも２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４２】
８８．Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４３】
８９．Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及び／又はアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４４】
９０．Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及び／又はアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４５】
９１．Ａ、Ｂ及びＤゲノムの少なくとも２つのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が配列番号９のアミノ酸位１７２にプロリンからセリンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が配列番号９のアミノ酸位１６８にトレオニンからイソロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４６】
９２．Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し、グリホサートに対する上昇した抵抗性を有するコムギ植物。
【０３４７】
９３．Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し、グリホサートに対する上昇した抵抗性を有するコムギ植物。
【０３４８】
９４．Ａ、Ｂ及びＤゲノムのそれぞれのＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を含み、ＡゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも１つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及び／又はアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＤゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が少なくとも２つの変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１６８でのトレオニンからイソロイシンへの変化（Ｔ１６８Ｉ）及びアミノ酸位１７２でのプロリンからセリンへの変化（Ｐ１７２Ｓ）を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードし、ＢゲノムのＥＰＳＰＳ遺伝子が変異を有し且つ配列番号９のアミノ酸位１７２でのプロリンからロイシンへの変化を含むＥＰＳＰＳポリペプチドをコードするコムギ植物。
【０３４９】
９５．トリチカム・エスチバム・エスチバム亜種である、段落８２〜９４のいずれかに記載のコムギ植物。
【０３５０】
９６．トリチカム・ツルギダム・デュラム亜種である、段落８２〜９４のいずれかに記載のコムギ植物。
【０３５１】
９７．段落８２〜９４のいずれかに記載のコムギ植物からのコムギ穀粒。
【０３５２】
９８．段落９７のコムギ穀粒を含む穀粉。
【０３５３】
９９．段落８２〜９４のコムギ植物の成分を含む食品。
【０３５４】
１００．段落８２〜９４のコムギ植物からのコムギ種子、植物部位又は子孫。
【０３５５】
１０１．グリホサートに対する抵抗性を有する、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０３５６】
１０２．グリホサートに対する抵抗性及び改変されていない成長特性を有する、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０３５７】
１０３．ＥＰＳＰＳタンパク質がグリホサートに対する低い親和性及び植物又は内在性基質に対する相当な親和性を有する、先行の段落のいずれかに記載のコムギ植物。
【０３５８】
以下の実施例は例証のためのものにすぎず、限定を目的とはしていない。本明細書で論じる変異は単なる具体例であって、同様の変異も考えられることを理解されたい。
【実施例】
【０３５９】
実施例１
Ａ．変異誘発
六倍体の栽培品種であるエクスプレス（トリチカム・エスチバム、ＰＶＰ＃９００００１２）のコムギ種子をＨ2Ｏ中での減圧浸潤に供した（約１０００個の種子／１００ｍｌのＨ2Ｏ、約４分）。次に、種子を周囲温度のヒュームフード内のシェイカー上に置いた（４５ｒｐｍ）。変異原であるエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）を吸水した種子に最終濃度約０．７５〜約１．２％（体積／体積）で添加した。１８時間にわたるインキュベーション後、ＥＭＳ溶液を新鮮なＨ2Ｏと４回交換した。次に、種子を流れる水で約４〜８時間にわたってすすぎ洗いした。最期に、変異誘発させた種子を鉢植え用土に蒔き（９６個／トレイ）、屋内で発芽させた。４〜６週齢の植物を畑に移して完全に成熟したＭ１植物へと成長させた。成熟したＭ１植物を自家受粉させ、次にＭ１植物からの種子を回収し、蒔いてＭ２植物をつくった。
【０３６０】
Ｂ．ＤＮＡの準備
Ｍ２植物がＥＰＳＰＳ遺伝子座に変異を有することを確認するために、上述した通りにつくったＭ２植物からのＤＮＡを抽出し、準備した。Ｍ２植物のＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（ヴァレンシア、カリフォルニア州）ＤＮｅａｓｙ（登録商標）９６プラントキットに含まれる方法及び試薬を用いて準備した。約５０ｍｇの冷凍植物サンプルをサンプル管にタングステンビーズと共に入れ、液体窒素で冷凍し、１分間にわたって各２０ＨｚでＲｅｔｓｃｈ（登録商標）ミキサーミルＭＭ３００を使用して２回粉砕した。次に、８０℃の４００μｌの溶液ＡＰ１［Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＰ１、溶液ＤＸ及びリボヌクレアーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ）］をサンプルに添加した。サンプル管を封止し、１５秒シェイクした。１３０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＰ２の添加に続いて、サンプル管を１５秒シェイクした。サンプルをマイナス２０℃の冷凍庫内に少なくとも１時間いれた。次に、サンプルを２０分間にわたって５６００ｘｇで遠心分離した。上清のアリコート４００μｌを別のサンプル管に移した。６００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＰ３／Ｅの添加後、このサンプル管に蓋をし、１５秒シェイクした。フィルタープレートを矩形のウェルブロック上に置き、１ｍｌのサンプル溶液を各ウェルに入れ、プレートを封止した。プレート及びブロックを４分間にわたる５６００ｘｇでの遠心分離に供した。次に、８００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷをフィルタープレートの各ウェルに添加した。プレートを封止し、１５分間にわたって５６００ｘｇで矩形のウェルブロックにおいて回転させた。次に、フィルタープレートを新しいサンプル管セット上に置き、８０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＥをフィルタに適用した。サンプル管に蓋をし、室温で１分間にわたってインキュベートし、２分間にわたって５６００ｘｇで回転させた。このステップを、追加の８０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＥを使用して繰り返した。フィルタープレートを取り外し、プールされた濾液が入ったサンプル管に蓋をした。次に、個々のサンプルをＤＮＡ濃度５〜１０ｎｇ／μｌに正規化した。
【０３６１】
Ｃ．ＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）
Ｍ２のＤＮＡを、２つの個々の植物のグループへとプールした。プール内の各個体のＤＮＡ濃度は約０．８ｎｇ／μｌであり、プール全体の最終濃度は１．６ｎｇ／μｌであった。次に、５μｌのプールしたＤＮＡサンプル（又は８ｎｇ）をマイクロタイタープレート上に並べ、遺伝子特異的ＰＣＲに供した。
【０３６２】
ＰＣＲ増幅を、２．５ｎｇのプールしたＤＮＡ、０．７５Ｘ  ＥｘＴａｑバッファー（Ｐａｎｖｅｒａ（登録商標）、マディソン、ウィスコンシン州）、２．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．３μＭプライマー及び０．０５Ｕ  Ｅｘ−Ｔａｑ（Ｐａｎｖｅｒａ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼが入った体積１５μｌで行った。ＰＣＲ増幅を、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）サーマルサイクラーを使用して以下のように行った：９５℃で２分；８サイクルの「タッチダウンＰＣＲ」（９４℃で２０秒、続いて７０〜６８℃での３０秒間にわたるアニーリングステップ及び１サイクルあたり１℃の低下、次に７２℃まで１秒あたり０．５℃温度を上昇させ、続いて１分間にわたって７２℃）；９４℃で２０秒、６３〜６１℃で３０秒、７２℃まで０．５℃／秒で上昇、７２℃で１分を２５〜４５サイクル；７２℃で８分；９８℃で８分；８０℃で２０秒；８０℃で７秒−０．３℃／サイクルを６０サイクル。
【０３６３】
ＰＣＲプライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ハイポント、ノースカロライナ州）を以下の通りに混合した。
２．５μｌ  １００μＭ  ＩＲＤ−７００標識左プライマー
７．５μｌ  １００μＭ左プライマー
９．０μｌ  １００μＭ  ＩＲＤ−８００標識右プライマー
１．０μｌ  １００μＭ右プライマー
標識は上述したように各プライマーに又はプライマーの１つだけにつけることができる。或いは、Ｃｙ５．５修飾プライマーを使用し得る。標識を、慣用のホスホラミダイト化学反応を用いてオリゴヌクレオチドに結合させた。
【０３６４】
ＰＣＲ産物（１５μｌ）を９６ウェルプレートで消化させた。次に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸］（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．００２％（質量／体積）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、２０ｎｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及びＣＥＬ１（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社、１：１０００００希釈）を含有する３０μｌの溶液を氷上で混合しながら添加し、
プレートを４５℃で１５分間にわたってインキュベートした。ＣＥＬ１の比活性は８００単位／μｌであり、単位は、製造業者により、ｐＨ８．５、１分、３７℃で１ｎｇの酸可溶性物質を、せん断し熱変性させたウシ胸腺ＤＮＡから得るのに必要な酵素の量として定義された。反応は、１０μｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を０．５ｍｇ／ｍｌのブルーデキストラン及び７５ｍＭ  ＥＤＴＡと共に添加し、続いて８０μｌのイソプロパノールを添加することで停止させた。反応物を８０℃で沈澱させ、４０００ｒｐｍで３０分間にわたってＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０で回転させた。ペレットを、０．０１７％ブロモフェノールブルー色素のはいった８μｌの３３％ホルムアミドに再懸濁させ、８０℃で７分間、次に９５℃で２分間にわたって加熱した。サンプルを、コームローディングロボット（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用してメンブレンコームに移した。コームをスラブアクリルアミドゲル（６．５％）に挿入し、１０分間電気泳動させ、取り出した。電気泳動を、４時間にわたって１５００−Ｖ、４０−Ｗ及び４０ｍＡリミット、５０℃で継続した。
【０３６５】
電気泳動中、ゲルを、ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標）（リンカーン、ネブラスカ州）スキャナを使用して撮像し、スキャナはＩＲ  Ｄｙｅ  ７００及び８００標識を検出可能なチャネルにセットした。ゲル画像は、９６本のレーン全てに共通するバックグラウンドバンドの配列特異的パターンを示した。稀な事象、例えば変異により新たなバンドが出現し、バックグランドパターンから目立つ。対象の変異を示すバンドを有する植物を、野生型ＤＮＡと混合したプールの個々のメンバーをＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）し、次に個々のＰＣＲ産物をシーケンシングすることで評価した。シーケンシングにより確認された変異を有する植物を上述したように育てた（例えば、Ｍ２植物を２回戻し交配又は他配することでバックグラウンド変異を排除し、自家受粉させることで変異についてホモ接合の植物を作り出した）。
【０３６６】
Ｄ．Ａゲノムの変異Ｐ１７７Ｓの同定及び評価
栽培品種エクスプレスの種子起源のコムギ植物のＤＮＡ（０．７５％ＥＭＳ中でインキュベート）をプライマーＴａＥＰＳ１ＣＬ及びＥｐ４８６ＡＲ（配列番号１０及び１１）を使用して増幅した。次に、ＰＣＲ増幅産物をＣＥＬ１とインキュベートし、電気泳動に供した。電気泳動ゲル画像は約２００ｂｐのＩＲＤ−７００標識フラグメントを示し、約４８６ｂｐの全長ＰＣＲ増幅産物についてのバックグランドパターン上で目立った。従って、このフラグメントは、ＥＰＳＰＳ遺伝子配列のＡホメオログにおける変異により作り出されたヘテロ二重鎖を含んでいるようであった。このフラグメントの配列を解析したところ、変異は、イネＥＰＳＰＳについて公開されているゲノムＤＮＡ（配列番号２）に従って番号をふったヌクレオチド１２３３でのシトシンからチミンへの変化であった。この変異は、ＡゲノムＥＰＳＰＳホメオログによりコードされたＥＰＳＰＳポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７７（公開されているイネＥＰＳＰＳタンパク質配列番号３に従って番号をふった）でのプロリンからセリンへの変化に関連した。
【０３６７】
Ｅ．Ｂゲノムの変異Ｔ１７３Ｉの同定及び評価
１．２％ＥＭＳ中でインキュベートした栽培品種エクスプレスの種子起源のコムギ植物のＤＮＡをプライマーＴａＥＰＳ１ＣＬ及びＥｐ５５８ＢＲ（配列番号１０及び１２）を使用して増幅した。次に、ＰＣＲ増幅産物を、改変したＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰジェノタイピングアッセイ（ＰＮ４３３２８５６Ｃ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能、フォスターシティ、カリフォルニア州）をＰＣＲプライマー（配列番号１４〜１５）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（配列番号１６〜１７）と共に用いて、イネＥＰＳＰＳについて公開されているゲノムＤＮＡ（配列番号２）に従って番号をふったヌクレオチド１２２２でのシトシンからチミンへの変化を同定することでスクリーニングした。この変異は、ＢゲノムＥＰＳＰＳホメオログによりコードされたＥＰＳＰＳポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７３（公開されているイネＥＰＳＰＳタンパク質配列番号３に従って番号をふった）でのトレオニンからイソロイシンへの変化に関連した。
【０３６８】
Ｆ．Ｄゲノムの変異Ｔ１７３Ｉの同定及び評価
栽培品種エクスプレスの種子起源のコムギ植物のＤＮＡ（１．０％ＥＭＳ中でインキュベート）をプライマーＴａＥＰＳ１ＣＬ及びＴａＥＰＳＪＲ（配列番号１０及び１３）で増幅した。次に、ＰＣＲ増幅産物をＣＥＬ１とインキュベートし、電気泳動に供した。電気泳動ゲル画像は長さ約１６０ｂｐのＩＲＤ＿７００標識フラグメントを示し、長さ約１０００ｂｐの全長ＰＣＲ増幅産物についてのバックグランドパターン上で目立った。従って、このフラグメントは、ＥＰＳＰＳ遺伝子配列のＢホメオログにおける変異により作り出されたヘテロ二重鎖を含んでいるようであった。このフラグメントの配列を解析したところ、変異は、イネＥＰＳＰＳについて公開されているゲノムＤＮＡ（配列番号２）に従って番号をふったヌクレオチド１２２２でのシトシンからチミンへの変化であった。この変異は、ＤゲノムＥＰＳＰＳホメオログによりコードされたＥＰＳＰＳポリペプチドにおけるアミノ酸番号１７３（公開されているイネＥＰＳＰＳタンパク質配列番号３に従って番号をふった）でのトレオニンからイソロイシンへの変化に関連した。
【０３６９】
Ｇ．表現型の解析
研究用に選択したコムギ植物
一重の好ましい変異（ＢゲノムにおけるＴ１７３Ｉ変異、ＤゲノムにおけるＴ１７３Ｉ変異及びＡゲノムにおけるＰ１７７Ｓ変異）をＭ３種子で同定した。野生型の同胞も同定し、コントロールとして使用した。ＤゲノムのＴ１７３Ｉ変異についてホモ接合である植物をＡゲノムのＰ１７７Ｓ変異についてホモ接合の植物と交配させることで二重変異植物を作り出した。
【０３７０】
グリホサートに対する抵抗性の測定
グロースチャンバでの研究：一重の好ましい変異についてホモ接合である植物からの種子及び野生型の同胞コントロール植物からの種子を表面滅菌し、湿った発芽紙上に一晩置き、次に、０又は０．１５Ｍグリホサートを含有する０．１Ｘムラシゲ＆スクーグ（ＭＳ）培地の入ったガラス管で育てた。発芽を、グロースチャンバにおいて、８０マイクロアインシュタインの１６時間の光／８時間の闇の光条件下で行った。成長１０〜１４日目に、苗条及び根の長さを測定した。グリホサートを含有する培地上で、苗条及び根の長さは共に、好ましい変異についてホモ接合である種子のほうが野生型の同胞コントロール種子より有意に長く、これは好ましい変異を有する種子がグリホサートに対して抵抗性であったことを示す。野生型の種子はグリホサートを含有する培地上で生い茂り損ね、殆どは成長できなかったが、変異を有する種子の殆どはよく成長した。
【０３７１】
二重の好ましい変異（Ｔ１７３Ｉ及びＰ１７７Ｓの両方）についてホモ接合である植物からの種子を一重の好ましい変異のそれぞれについてホモ接合である種子と、グリホサート含有ＭＳ培地上での生存能について比較した。野生型の同胞植物からの種子をポジティブコントロールとして使用した。種子は上述した通りに発芽させた。苗条及び根の長さの測定結果は、二重の好ましい変異についてホモ接合である種子のほうが一重の好ましい変異のそれぞれについてホモ接合である種子よりグリホサートに対する抵抗性がより高いことを示した。１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を有する種子の３つグループ全て（二重Ｔ１７３Ｉ及びＰ１７７Ｓ；一重Ｔ１７３Ｉ；一重Ｐ１７７Ｓ）がグリホサートに抵抗性であり、殆どが成長しなかった野生型同胞植物からの種子と比較してよく成長した。
【０３７２】
Ｈ．Ａ：Ｐ１７７Ｓ及びＤ：１７３Ｉについてホモ接合である植物の種子の再変異誘発
一実施形態において、Ａゲノム又はＤゲノムにおける変異についてホモ接合である植物の種子の再変異誘発により第二点突然変異（ｓｅｃｏｎｄ−ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を同定できる。単点Ａ及びＤゲノム植物の子孫種子を再変異誘発させ、ＥＰＳＰＳに第二点変異を含む独立したＭ２変異体を同定した。Ａゲノムに変異Ｐ１７７Ｓ及びＴ１７３Ｉの両方を含む植物を同定した。この組み合わせは２回独立して同定された。別々に、Ｄゲノムに変異Ｐ１７７Ｓ及びＴ１７３Ｉを含む植物を同定した。Ａ及びＤゲノムにおける両方の二重変異体が１つの植物に組み込まれるように交配を行った。別々に、ＢゲノムＴ１７３Ｉ変異を、Ａ及びＤゲノムに二重の変異を含む植物と交配させた。加えて、別々に、ＢゲノムＰ１７７Ｌ（Ｐ１７２Ｌ）をＡ及びＤゲノムに二重の変異を含む植物と交配させた。
【０３７３】
上記の実施例は本開示を例証するためのものであって、その範囲を限定するためのものではない。当業者ならば本開示の他の変化形もすぐにわかり、これらは添付の請求項及びその等価物全てに包含される。上の実施例ではコムギの１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子に変異を作り出し、同定するのにＴＩＬＬＩＮＧ技術を用いているが、当業者ならば、他の方法、例えば標的変異誘発（部位指向的変異誘発、部位特異的変異誘発又はオリゴヌクレオチド指向的変異誘発としても知られる）を用いてコムギの１つ以上のＥＰＳＰＳ遺伝子座に有用な変異を作り出し得ることがわかる（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７（２６）：１２０２８−１２０３３，２０１０；Ｓａｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １５６：１２６９−１２７７，２０１１を参照のこと）。当業者ならば、追加の方法を用いることでコムギＥＰＳＰＳ遺伝子の活性を不活化又は低下させ得ることもわかる。これらの方法は、限定するものではないが、ＥＰＳＰＳ転写物を変異させる又はその蓄積を減少させるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９変異誘発、ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガー変異誘発、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ及びヘアピンＲＮＡベースの方法を含む。本明細書で引用した全ての出版物、特許及び特許出願は参照により本明細書に援用される。
【０３７４】
情報としての配列一覧
配列番号１は、オリザ・サティバＥＰＳＰＳ  ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０６３２４７）を示す。
【０３７５】
2018518983.tif 000016
【０３７６】
配列番号２は、オリザ・サティバＥＰＳＰＳゲノムＤＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００８３９９）を示す。
【０３７７】
2018518983.tif 000017
2018518983.tif 000018
【０３７８】
配列番号３は、配列番号２によりコードされるＥＰＳＰＳタンパク質を示す（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０５６７１２）を示す。
【０３７９】
2018518983.tif 000019
【０３８０】
配列番号４〜５は、ゲノムシーケンシングに使用するトリチカム・エスチバムＥＰＳＰＳ特異的プライマーのＤＮＡ配列を示す。
【０３８１】
【表９】
2018518983.tif 000020
【０３８２】
配列番号６は、コムギのＡゲノムのＥＰＳＰＳについての部分ゲノムＤＮＡ配列を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示す。
【０３８３】
2018518983.tif 000021
【０３８４】
配列番号７は、コムギのＢゲノムのＥＰＳＰＳについての部分ゲノムＤＮＡ配列を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示す。
【０３８５】
2018518983.tif 000022
【０３８６】
配列番号８は、コムギのＤゲノムのＥＰＳＰＳについての部分ゲノムＤＮＡ配列を含むＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示す。
【０３８７】
2018518983.tif 000023
【０３８８】
配列番号９は、コムギＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０３８９】
2018518983.tif 000024
【０３９０】
配列番号１０〜１３は、変異検出に使用したコムギＥＰＳＰＳ特異的プライマーについてのＤＮＡ配列を示す。
【０３９１】
【表１０】
2018518983.tif 000025
【０３９２】
配列番号１４〜１７は、Ｔ１７３Ｉ変異検出に有用なＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーを示す。
【０３９３】
【表１１】
2018518983.tif 000026
【０３９４】
配列番号１８は、コムギＥＰＳＰＳタンパク質の活性領域を示す。
【０３９５】
ＦＬＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶＶＡＡＧＧＮ
【図１】
2018518983.tif 000027
【配列表】
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【国際調査報告】
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