(57)【要約】バイオプリントされた三次元生体組織を製造するための改善された方法を本明細書に開示する。本方法は、低い温度への曝露、様々な期間の低い温度でのインキュベーション、構造的架橋処理を伴わない環境における製作に関する。2018532418.tif 000003
2018532418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a．生きている細胞を含むバイオインクを調製する工程；
b．押し出しバイオプリントによって表面上へ該バイオインクを付着させる工程；
c．18℃以上、しかし37℃未満の温度で該バイオインクをインキュベートする工程
を含む、三次元人工生体組織を製造する方法であって、
18℃以上、しかし37℃未満の温度での該インキュベーション中に、該バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、方法。
【請求項２】
バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の低温（hypothermic）ホールドへバイオインクを曝露する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、請求項3記載の方法。
【請求項５】
バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項3記載の方法。
【請求項６】
バイオインクが試験物質をさらに含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
バイオインクをエアロゾルスプレー技術によって付着させない、請求項1記載の方法。
【請求項８】
バイオインクが単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項1記載の方法。
【請求項９】
a．生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製する工程；
b．押し出しバイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させる工程；
c．18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートする工程；
d．押し出しバイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させる工程；および
e．18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートする工程
を含む、三次元人工生体組織を製造する方法であって、
18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、方法。
【請求項１０】
バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクを曝露する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
バイオプリントされた組織中のアポトーシスが、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
第1もしくは第2のバイオインクのうちの少なくとも1つまたは両方のバイオインクが試験物質を含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
第1または第2のバイオインクをエアロゾルスプレー技術によって付着させない、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
a．生きている細胞を含むバイオインクを調製すること；
b．押し出しバイオプリントによって表面上へ該バイオインクを付着させること；
c．18℃以上、しかし37℃未満の温度で該バイオインクをインキュベートすること；
d．18℃以上、しかし37℃未満の温度での該インキュベーション中に、組織をいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しないこと
によって操作された、三次元人工生体組織であって、
37℃以上でインキュベートされた組織よりも低いアポトーシスレベルを示す、組織。
【請求項１７】
バイオインクが、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ曝露された、請求項16記載の組織。
【請求項１８】
バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクがいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露されなかった、請求項17記載の組織。
【請求項１９】
バイオインクが試験物質をさらに含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項16記載の組織。
【請求項２０】
バイオインクがエアロゾルスプレー技術によって付着されなかった、請求項16記載の組織。
【請求項２１】
バイオインクが単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項16記載の組織。
【請求項２２】
灌流可能な血管を有さない、請求項16記載の組織。
【請求項２３】
単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項16記載の組織。
【請求項２４】
a．生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製すること；
b．押し出しバイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させること；
c．18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートすること；
d．押し出しバイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させること；および
e．18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートすること；
f．18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、いかなるバイオインクをもいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しないこと
によって操作された、三次元人工生体組織であって、
37℃以上でインキュベートされた組織よりも低いアポトーシスレベルを示す、組織。
【請求項２５】
バイオインクが、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ曝露された、請求項24記載の組織。
【請求項２６】
バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクがいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露されなかった、請求項25記載の組織。
【請求項２７】
複数のバイオインクのうちの少なくとも1つが試験物質をさらに含み、該試験物質が、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項24記載の組織。
【請求項２８】
第1または第2のバイオインクがエアロゾルスプレー技術によって付着されなかった、請求項24記載の組織。
【請求項２９】
灌流可能な血管を有さない、請求項24記載の組織。
【請求項３０】
第1または第2のバイオインクのいずれかが単一のヒト細胞タイプから本質的になる、請求項24記載の組織。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
組織工学および再生医学は、治療および研究の両方の観点から大きな将来性を有する分野である。人工組織は、組織工学研究の数多くの様々な手段の中心にある。これらの組織の製作および形成を改善することができる方法はまた、インビトロおよびインビボの両方におけるそれらの機能を改善することができ、当技術分野の進歩を促進するために必要である。
【発明の概要】
【０００２】
組織工学は人類にとって大きな可能性を有するが、これらの利点が十分に実現され得る前に、多くの課題が克服されなければならない。組織工学における課題の一つは、組織内での細胞タイプのコンパートメント化を達成および維持することである。バイオプリントは初期製作段階においてはそれらの課題の一部を克服するが、細胞生存性および機能を損なうことなく製作後の細胞コンパートメントの達成および維持を支持する、広く適用可能な、新しい方法が必要である。例えば、コンパートメント化を誘導するための一つの方法は、バイオインクの成分としてカルシウム架橋ヒドロゲルを利用することである。この方法の欠点は、非常に高濃度の二価架橋化合物（例えば、カルシウムイオン）が、組織における生存性に悪影響を与え得、ヒドロゲル成分の除去は、細胞をさらに損傷し得る酵素または化学物質での処理を必要とすることである。従って、広く適用され得、細胞コンパートメントを維持し、イオン性架橋剤および製作後の酵素的ヒドロゲル除去を回避する、コンパートメント化された組織の製造方法を開発した。ある局面において、本開示は、組織形成のための架橋の必要性がない、人工組織の製造を可能にする。
【０００３】
本明細書に開示されるのは、バイオプリントされた組織の生存性を改善し、より迅速に組織ジオメトリーの形成を促進し、組織均一性を改善し、かつ、研究および治療適用において組織が使用されるのに必要とされるような製作後のコンパートメント化を増強および維持する、方法である。これらの方法は、バイオプリント後の「低温（hypothermic）ホールド」または曝露と、続いての37℃を下回る温度での成熟またはインキュベーションからなる。これは架橋段階の排除を可能にし、それぞれ図11、16および17に示されるような遺伝子発現によってアッセイされたように、その後の組織形態、細胞生存性、および分化を改善する。
【０００４】
本明細書に記載されるのは、三次元人工生体組織を製造する方法であり、方法は：生きている細胞を含むバイオインクを調製する工程；押し出しバイオプリントによって表面上へバイオインクを付着させる工程；および18℃以上、しかし37℃未満の温度でバイオインクをインキュベートする工程を含み、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度でのインキュベーション中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。ある態様において、バイオプリントされた組織中のアポトーシスは、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される。ある態様において、方法は、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールドへバイオインクを曝露する工程をさらに含む。ある態様において、バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。ある態様において、バイオプリントされた組織中のアポトーシスは、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される。ある態様において、バイオインクは試験物質をさらに含み、試験物質は、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、バイオインクをエアロゾルスプレー技術によって付着させない。ある態様において、バイオインクは単一のヒト細胞タイプから本質的になる。
【０００５】
本明細書にさらに記載されるのは、三次元人工生体組織を製造する方法であり、方法は：生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製する工程；押し出しバイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させる工程；18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートする工程；押し出しバイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させる工程；および、18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートする工程を含み、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。ある態様において、バイオプリントされた組織中のアポトーシスは、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される。ある態様において、方法は、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクを曝露する工程をさらに含む。ある態様において、バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。ある態様において、バイオプリントされた組織中のアポトーシスは、前記方法によって製造されない人工組織と比較して、前記方法を使用する製造によって低減される。ある態様において、第1もしくは第2のバイオインクのうちの少なくとも1つまたは両方のバイオインクが試験物質を含み、ここで、試験物質は、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、第1または第2のバイオインクをエアロゾルスプレー技術によって付着させない。
【０００６】
本明細書にさらに記載されるのは、三次元人工生体組織であり、組織は：生きている細胞を含むバイオインクを調製すること；押し出しバイオプリントによって表面上へバイオインクを付着させること；18℃以上、しかし37℃未満の温度でバイオインクをインキュベートすること；18℃以上、しかし37℃未満の温度でのインキュベーション中に、組織をいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しないことによって操作され、ここで、組織は、37℃以上でインキュベートされた組織よりも低いアポトーシスレベルを示す。ある態様において、バイオインクは、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ曝露される。ある態様において、バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクはいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露されなかった。ある態様において、バイオインクは試験物質をさらに含み、ここで、試験物質は、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、バイオインクはエアロゾルスプレー技術によって付着されなかった。ある態様において、バイオインクは単一のヒト細胞タイプから本質的になる。ある態様において、組織は灌流可能な血管を有さない。ある態様において、組織は単一のヒト細胞タイプから本質的になる。
【０００７】
本明細書にさらに記載されるのは、三次元人工生体組織であり、組織は：生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製すること；押し出しバイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させること；18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートすること；押し出しバイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させること；18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートすること；および、18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、いかなるバイオインクをもいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しないことによって操作され、ここで、組織は、37℃以上でインキュベートされた組織よりも低いアポトーシスレベルを示す。ある態様において、バイオインクは、バイオプリント中または後に、2℃以上、しかし10℃未満の温度へ曝露された。ある態様において、バイオプリント中または後の2℃以上、しかし10℃未満の低温ホールド中に、バイオインクはいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露されなかった。ある態様において、複数のバイオインクのうちの少なくとも1つは試験物質をさらに含み、ここで、試験物質は、該物質で処理されない組織と比較して、組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である。ある態様において、第1または第2のバイオインクはエアロゾルスプレー技術によって付着されなかった。ある態様において、組織は灌流可能な血管を有さない。ある態様において、第1または第2のバイオインクのいずれかは単一のヒト細胞タイプから本質的になる。
【０００８】
さらに別の局面において、本明細書に開示されるのは、バイオインクを含む三次元人工生体組織であり、ここで、バイオインクは、1 mL当たり10万〜5000万個の細胞の濃度、および2〜20%のNovogelの濃度を含み、ここで、バイオインクは、30秒間〜1時間、2〜10℃の温度で保持される。
【０００９】
さらに別の局面において、本明細書に開示されるのは、バイオインクを含む三次元人工生体組織であり、ここで、バイオインクは、1 mL当たり10万〜5000万個の細胞の濃度、および2〜20%のNovogelの濃度を含み、ここで、バイオインクは、1時間〜15日間、18〜37℃の温度で保持される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
特許または出願ファイルはカラーで作成された少なくとも1つの図面を含有する。カラー図面を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、請求および必要費用の支払いに応じて特許庁によって提供されるだろう。
【００１１】
【図１】実験設計の非限定的な例を示し；この場合、実験設計は、本明細書に記載される人工組織を達成するために使用される様々なバイオプリント技術を描写する。
【図２】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第12日での実施例1の組織の2つ(第1の組織：A；第2の組織 B)のH&E染色を描写する(矢印は別個の基底層を示す)。
【図３】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第12日での実施例1の組織の2つ(第1の組織：A〜D；第2の組織 E〜H)の、H&E染色(A、C、E、およびG)およびCK14の可視化のための免疫組織化学(B、D、F、およびH)を描写する。
【図４】人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、プリント後第12日での実施例1の第3の組織のCK5/IVL/Dapi(AおよびC)およびCK10/Dapi(BおよびD)の可視化のための免疫組織化学を描写する。
【図５】実施例1の人工皮膚組織の顕微鏡写真の非限定的な例を示し；この場合、顕微鏡写真は、異なる方法論を使用してバイオプリントされた組織の比較を描写する(第10日での第1の組織(A)；第12日での第2の組織(B))。
【図６】本明細書の実施例1に記載される人工皮膚組織内の遺伝子発現についての例示的な実験データを示し；この場合、コラーゲン(COL1およびCOL4)、フィラグリン(FLG)、およびサイトケラチン(CK1およびCK10)についての遺伝子発現データ。
【図７】真皮組織が表皮組織化および分化に対して有する効果を示す。(A)実施例2の略図である。(B)プリントされた組織の巨視的視点を示す。(CおよびF)真皮ペーストを用いずに(C)または用いて(F)プリントされたH&E染色細胞の低倍率。(DおよびG)真皮ペーストを用いずに(D)または用いて(G)プリントされたH&E染色細胞のより高い倍率。分化ケラチノサイトの別個の層は、真皮ペーストを用いずに(E)または用いて(H)プリントされた細胞中において、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される。
【図８】実施例2の第12日でのバイオプリントされた皮膚組織の組織学的解析。H&E染色(A)、CK5/IVLに対する染色(B)、CK10(C)、トリクローム染色(D)、PCNAおよびコラーゲン(E)、ならびにTUNEL染色(F)を示す。
【図９】実施例2の第12日でのバイオプリントされた皮膚組織の遺伝子発現解析を示す。
【図１０】模式的概念図の非限定的な例を示す；この場合、模式的概念図は、間質層と、その上にある極性化した上皮単層を示す。
【図１１】37℃(AおよびB)または30℃(CおよびD)のいずれかでの実施例3に従ってバイオプリントされた細胞を比較する、肉眼で見たものを示す。
【図１２】実施例3からのバイオプリントされた腎臓組織構築物のH&E(A)およびトリクローム(B)染色を示す。
【図１３】刷子縁(A、矢印)およびコラーゲン付着(B、矢印)が強調されている、図11からの構築物を示す。
【図１４】広範囲にわたる内皮細胞網が、実施例3からの3Dバイオプリントされた腎臓組織構築物中に観察されることを示す。CD31(内皮細胞、緑色)およびTE7(線維芽細胞、赤色)についての染色が示される。内皮細胞で裏打ちされた推定内腔をもつ網には(*)が付いている。
【図１５】実施例3からの3Dバイオプリントされた腎臓組織中および2D hTERT-RPTEC細胞中のGGT活性を示し、しかし間質細胞単独中においては示さない。
【図１６】図16(B)は、本開示の方法（10分間の4℃低温ホールド、続いて5日間の30℃インキュベーション；いずれの時点でも組織構築物を架橋段階へ曝露しなかった）を使用してプリントされた皮膚組織の例を示し、TUNEL染色(緑色)は、これらの技術を使用しないでプリントされた組織(A)と比較した場合、より低いアポトーシスレベルを示す。
【図１７】4℃低温ホールドおよび30℃での5日間のインキュベーションで製作された皮膚組織(E、F、G、およびH)と、これらの技術を用いずに製作された皮膚組織(A、B、C、およびD)とを比較する遺伝子発現データを示す。qPCRによってアッセイされた遺伝子は以下であった：インボルクリン(IVL)(AおよびE)、CK10(BおよびF)、CK5(CおよびG)ならびにColla1(DおよびH)。
【図１８】18.2℃(A)、30.2℃(B)、32.0℃(C)、および36.9℃(D)での細胞性バイオインクの粘度の温度依存性を示す写真である。18.2℃(A)で形成し、肝臓組織の外縁が明確に見えるバイオインク(矢印によって示される暗い三角形に接する明瞭な菱形)は、30.2℃(B)で維持される。組織端は32.0℃(C)で分解し、36.9℃(D)で完全に消える。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
一局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体組織を製造する方法であり、方法は：生きている細胞を含むバイオインクを調製する工程；バイオプリントによって表面上へバイオインクを付着させる工程；18℃以上、しかし37℃未満の温度でバイオインクをインキュベートする工程を含み、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度でのインキュベーション中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。
【００１３】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体組織を製造する方法であり、方法は：生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製する工程；バイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させる工程；18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートする工程；バイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させる工程；および、18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートする工程を含み、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。
【００１４】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体組織であり、組織は：生きている細胞を含むバイオインクを調製する工程；バイオプリントによって表面上へバイオインクを付着させる工程；18℃以上、しかし37℃未満の温度でバイオインクをインキュベートする工程によって操作され、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度でのインキュベーション中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。
【００１５】
別の局面において、本明細書に開示されるのは、三次元人工生体組織であり、組織は：生きている細胞を含む複数のバイオインクを調製する工程；バイオプリントによって表面上へ第1のバイオインクを付着させる工程；18℃以上、しかし37℃未満の温度で第1のバイオインクをインキュベートする工程；バイオプリントによって表面上へ第2のバイオインクを付着させる工程；および、18℃以上、しかし37℃未満の温度で複数のバイオインクをインキュベートする工程によって操作され、ここで、18℃以上、しかし37℃未満の温度での第1のバイオインク、第2のバイオインク、または両方のバイオインクの曝露中に、バイオインクをいかなるイオン性、化学的、光または物理的架橋剤へも曝露しない。
【００１６】
本明細書に記載される人工組織および方法論の利点は、それらが、元の細胞タイプの機能性を損なうことなく、構造体の形状の保持を可能にすること、および、それらが、高イオンレベル、酵素またはUV光などの潜在的に有毒な架橋剤の使用を必要としないことである。バイオプリントされた構造体の形状は、有利なことに複数のアプローチによって維持される。寒冷曝露段階および／または37℃未満でのインキュベーション段階は、プリントされたバイオインクが成熟中にそれらの形状をよりよく維持することを可能にし、細胞を損傷し得る架橋剤（例えば、超生理的レベルのカルシウム）へのバイオプリントされた細胞の曝露を制限し、かつ、結果として生じるバイオプリントされた組織中のアポトーシスを低減させる(図16)点で、有利である。驚くべきことに、これは、複数の組織タイプについて、通常は身体に対して内部にある（従って、37℃である）組織タイプについてさえ、機能する(図11、腎臓組織)。バイオインクのプリント間の時間的遅延は、何らかの次の層の適用前に基底層の成熟を可能にする。本発明はまた、3D組織モデルへ新規のエアロゾルスプレープリント法を組み入れる。エアロゾルスプレーアプローチは、より薄い層を作ることを可能にし、成熟期間後、既存の組織層上へ材料を付着させることを可能にする点で、連続的付着法と比較して独特な非連続法を提供する。これは有利であり、何故ならば、それは、ネイティブな組織をインビボでよりよく模倣する組織をもたらし得るためである。これはまた有利であり得、何故ならば、それは、必要とされる細胞の数を減らすことができ、限られた細胞集団でバイオプリントを可能にするためである。このエアロゾルスプレー法は、複数の時点で複数の層を作るために適用することができる。例えば、この方法は、先ず未分化ケラチノサイトでスプレーし、続いて分化ケラチノサイトでスプレーすることによって、皮膚組織を構築するために使用することができ、これは、ネイティブな皮膚をよりよく模倣することができる。
【００１７】
特定の定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明確に特に指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのあらゆる言及は、特に明記のない限り、「および／または」を包含するように意図される。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「本質的になる」は、指定される細胞タイプが、唯一存在する細胞タイプであるが、バイオインクが、他の非細胞性材料（押し出し化合物、ヒドロゲル、細胞外マトリックス成分、栄養および培地成分、無機塩および有機塩、酸および塩基、緩衝化合物、ならびに細胞生存、接着、増殖を促進するかまたはプリントを容易にする他の非細胞性成分を含むがこれらに限定されない）を含有してもよいことを意味する。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「架橋剤」または「架橋」物質へ「曝露される」は、特定の架橋剤もしくは架橋物質の非生理的レベル、または所定の架橋可能な物質の有意な架橋をもたらすために十分ではない特定の架橋物質のレベルを意味する。有意な架橋は、1%、2%、3%、4%または5%を超える架橋である。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「組織」は、細胞の集合体を意味する。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「層」は、XおよびY面における、複数細胞厚の細胞の連合体を意味する。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織は、1つの層を含む。他の態様において、本明細書に記載される人工組織は、複数の層を含む。様々な態様において、層は、隣接した、実質的に隣接した、または隣接していない、細胞のシートを形成する。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織の各層は、X、Y、およびZ軸において複数の細胞を含む。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「バイオインク」は、バイオプリントにおいて使用するための液体、半固体、または固体組成物を意味する。いくつかの態様において、バイオインクは、細胞溶液、細胞集合体、細胞含有ゲル、多細胞体、細胞ペースト、または組織を含む。いくつかの態様において、バイオインクは、バイオプリントを可能にする特定の生体力学的特性を提供する非細胞性材料をさらに含む。いくつかの態様において、バイオインクは押し出し化合物を含む。いくつかの場合において、押し出し化合物は、バイオプリントプロセス後に除去されるように操作される。他の態様において、押し出し化合物の少なくとも一部分は、プリント後、細胞と共に取り込まれたままであり、除去されない。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「生体適合性液体」は、細胞に対する損傷無しに、細胞と接触するかまたは細胞を完全に覆うことができる、任意の液体を意味し、例としては、本出願に開示される増殖培地および生理的緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「バイオプリント」は、自動化されたまたは半自動化された、コンピューター支援される、三次元のプロトタイピングデバイス(例えば、バイオプリンター)と適合性がある方法論を介して、細胞(例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞集合体、多細胞体など)の、三次元の正確な付着を利用することを意味する。好適なバイオプリンターとしては、Organovo, Inc. (San Diego, CA)製のNovogen Bioprinter（登録商標）が挙げられる。いくつかのバイオプリント法は、表面への付着のために開口部を通して高粘度バイオインクを押し進めることを含む、押し出し法である。押し出し法は、連続的または非連続的であり得る。他のバイオプリント法は、エアロゾル、液滴、またはミストを表面上へスプレーすることを含む、射出法である。このタイプの方法は低濃度バイオインクを必要とする。この方法の例はインクジェット技術である。これらの方法は高粘度バイオインクと不適合である。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「スキャフォールド」は、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および無細胞化組織、ならびに人工組織の物理的構造体にとって不可欠でありかつ前記組織の損傷／破壊無しでは組織から除去することができない任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。さらなる態様において、無細胞化組織スキャフォールドは、無細胞化ネイティブ組織、または任意の方法で培養細胞によって生成された無細胞化細胞材料；例えば、生きている間に産生したECMを残して、死滅させられるかまたは無細胞化される細胞層を含む。従って、用語「スキャフォールドレスの」は、予め形成されたスキャフォールドが、使用時に、人工組織の不可欠な部分ではなく、除去されているか、または人工組織の不活性コンポーネントとして残っていることを示唆するように意図される。「スキャフォールドレスの」は、「スキャフォールドフリーの」および「予め形成されたスキャフォールドを含まない」と交換可能に使用される。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒト、非ヒト動物、任意の哺乳動物、または任意の脊椎動物である、任意の個体を意味する。この用語は、「患者」、「レシピエント」および「ドナー」と交換可能である。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「試験物質」は、該物質で処理されない皮膚組織と比較して前記皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている任意の生物学的、化学的または物理的な物質を指す。皮膚組織における変化の非限定的な例は、アレルギー反応、中毒反応、刺激反応；規定の分子状態によって測定される変化、例えば、mRNAレベルもしくは活性の変化、タンパク質レベルの変化、タンパク質修飾の変化もしくは後成的変化；または測定可能な細胞アウトカムを生じさせる変化、例えば、増殖、アポトーシス、細胞生存性、細胞分裂、細胞運動性、細胞骨格再配列、染色体数もしくは組成の変化であり得る。試験物質としては；全体的に、部分的に、単離された、または精製された、活性または不活性成分を含有する化学的組成物；物理的ストレッサー、例えば、光、UV光、機械的ストレス、熱、または冷気；生物学的な因子、例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、または真菌が挙げられるが、これらに限定されない。「試験物質」はまた、混合されたまたは別々に適用される複数の物質を指す。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「使用」は、当業者によって認識されるであろう組織の様々な可能な使用を包含する。これらの使用としては、非限定的な例として以下が挙げられる；対象中または上への人工組織のインプランテーションまたは移植；生物学的な、生物工学的なまたは薬理学的な発見の目的のために生物学的アッセイにおいて組織を含めること；催奇形物質試験を含む、毒物学試験；薬物動態ならびに薬物代謝および吸収ならびに浸透を決定するための試験を含む、薬理学試験；紫外線を含む任意の化学的または非化学的試験因子に対する、感作、真皮の任意の層の刺激または腐食を引き起こす可能性を決定するための試験を含む、美容的試験。「使用」はまた、バイオプリント後のインビトロでの、成熟、または組織密着のプロセスを指し得る。
【００２９】
人工三次元組織
現在の組織モデルおよび天然の組織と比較して、本明細書に開示されるバイオプリントプラットフォームを用いて皮膚を製作することの1つの利点は、プロセスが自動化されることである。これはより大きな再現性およびスケーラビリティを可能にする。例えば、ハイスループットスクリーニング適用を含むスクリーニング適用において使用するための6、12、24、48、96、384または1536-ウェルプレートなどのウェルプレートフォーマット中へバイオインクをプリントするために、組織ジオメトリーを小型化することが可能である。自動化されたプラットフォームの別の主な利点は、それが、組織をバイオプリントすることに加えて、毒性試験について物質を投与するために利用され得ることである。組織モデルにおける現在の試験は、組織を製作するためおよびその組織へ試験材料を適用するための両方に必要な手動アプローチによって制限され、局所投与への適用が制限される。プリントプラットフォームの柔軟性は、手動アプローチでは可能でない、適用、付着、および組織中への組み入れのための様々な方法を可能にする。例えば、試験物質は、エアロゾルスプレー技術を使用して微細なミストでスプレーされ得るか、または連続的付着モジュールを使用して真皮層中へ注入され得る。組織毒物学モデルにおけるバイオプリントの第3の主な利点は、層状構造体が作製および試験され得る時間枠である。バイオプリントアプローチは、同時にまたは遅れて細胞のシートを重ね合わせて複数の層を作ることができ、これらを次いで所定の期間の間成熟および分化させることができる。バイオプリントプラットフォームは、手動アプローチでは可能でない縦断的研究を可能にし、何故ならば、試験または治療物質が、プリントする間、組織へ曝露され得るかもしくは組織中へ組み入れられ得るか、または後の時点で成熟組織へ投与され得るためである。
【００３０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工生体組織は、1つまたは複数の細胞層を含む。さらなる態様において、層は重層化されている。いくつかの態様において、人工組織は基底層を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は皮膚組織である。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は腎臓組織である。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は肝臓組織である。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は肺組織である。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は消化管組織である。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は腸組織である。
【００３１】
いくつかの態様において、細胞をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた細胞を密着させて人工組織を形成する。なおさらなる態様において、人工組織は、製作時または使用時に、予め形成されたスキャフォールドを含まないかまたは実質的に含まない。いくつかの場合において、バイオプリントは、ネイティブな組織の適切な細胞性を模倣する組織の製作を可能にする。
【００３２】
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、それらが、三次元であり、予め形成されたスキャフォールドを含まず、細胞から本質的になり、高い細胞密度を有するという事実によって、先行技術によって製作された組織と区別される。ある態様において、人工組織は、30%を超えて細胞性、40%を超えて細胞性、50%を超えて細胞性、60%を超えて細胞性、70%を超えて細胞性、80%を超えて細胞性、または90%を超えて細胞性である。ある態様において、人工組織は、様々な時点で異なる非生理的温度でのインキュベーションへ曝露された。哺乳動物細胞について、生理的温度は、約37℃の正常な体温と定義される。
【００３３】
ネイティブな組織との区別
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、それらが、神経支配されない(例えば、神経組織を実質的に含まない)、成熟した血管を実質的に含まない、かつ／または血液成分を実質的に含まないという事実によって、ネイティブな(例えば、人工でない)組織と区別される。例えば、様々な態様において、三次元人工組織は、血漿、赤血球、血小板などおよび／または内生的に生じた血漿、赤血球、血小板などを含まない。ある態様において、組織はヘモグロビンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、神経支配またはニューロンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、以下のいずれかのような神経細胞マーカーを欠いている：βIIIチューブリン（Beat III tubulin）、MAP2、NeuNおよびニューロン特異性エノラーゼ。いくつかの態様において、人工組織は種キメラであり、ここで、組織の少なくとも1つの細胞または細胞タイプは、組織の別の細胞または細胞タイプとは異なる哺乳動物種に由来する。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は、インビボまたはエクスビボでの組織よりも増加した基礎代謝率によって特徴付けられる。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は、インビボまたはエクスビボ培養下の組織よりも増加した増殖速度によって特徴付けられる。いくつかの態様において、本明細書に記載される組織は、インビボまたはエクスビボ培養下の組織中の細胞と比較した場合に増加した細胞サイズによって特徴付けられる。
【００３４】
本開示の組織は、培養下での長期の生存性によって特徴付けられる。組織外植片は、インビトロ培養下で低い生存性を示す。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、培養下で7日後も生存可能である。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、培養下で10日後も生存可能である。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、培養下で14日後も生存可能である。ある態様において、本明細書に記載される三次元人工組織は、培養下で21日後も生存可能である。
【００３５】
本開示の方法によって製作される組織の一つの利点は、新規かつ有利なキメラを形成する能力である。いくつかの態様において、人工組織は種キメラであり、組織の少なくとも1つの細胞または細胞タイプは、組織の別の細胞または細胞タイプとは異なる哺乳動物種に由来する。例えば、真皮バイオインクはマウス、ラット、または霊長動物起源の細胞を含有し、表皮バイオインクはヒト起源の細胞を含有する。いくつかの態様において、人工組織は遺伝キメラであり、少なくとも1つの細胞または細胞タイプは、組織の任意の他の細胞または細胞タイプの遺伝的背景とは異なる遺伝的背景に由来する。例えば、真皮バイオインクの真皮線維芽細胞は、特定のドナーに由来し得、表皮バイオインクのケラチノサイトまたはメラノサイトは、異なるドナーに由来し得、遺伝キメラが作られる。いくつかの態様において、人工組織は他のタイプのキメラである。例えば、真皮バイオインクは、形質転換された真皮線維芽細胞を含み得、表皮バイオインクは、形質転換されていない初代ケラチノサイトまたはメラノサイトを含み得る。ある態様において、真皮バイオインクは、非真皮起源の線維芽細胞を含有し得る。ある態様において、皮下バイオインクは、非真皮起源の内皮細胞を含有し得る。ある態様において、組織は免疫細胞を含まない。ある態様において、組織はランゲルハンス細胞を含まない。ある態様において、組織はT細胞を含まない。ある態様において、組織は、以下のタンパク質の発現によってマークされる免疫細胞のいずれをも実質的に含まない：CD11c、DC-SIGN、CD11b、CD4、CD8、CD28、CD3、CD19、CD80、および／またはCD86。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織の1つまたは複数のコンポーネントはバイオプリントされ、これは、付加的な製造プロセスを含む。従って、そのような態様において、製造方法によって、製造者は、本明細書に記載される結果として生じる人工組織の組成を著しく制御する。従って、本明細書に記載される人工組織は、ネイティブな組織の層、構造体、コンパートメント、および／または細胞のいずれかを任意で含む。逆に、本明細書に記載される人工皮膚組織は、ネイティブな組織の層、構造体、コンパートメント、および／または細胞のいずれかを任意で欠く。
【００３７】
バイオプリント
本明細書に記載される組織および方法は、生きている細胞の組成物を含有する3D組織構造体を作るためのバイオインク製剤およびバイオプリント法を伴う。プリント法は、層をもたらしネイティブな組織を模倣するジオメトリーを作るためにバイオインクを利用する。様々な態様において、プリント法は、コラーゲンなどのマトリックス支持材料で任意でコーティングされる、様々な細孔サイズを有する様々なプリント表面を利用する。いくつかの態様において、プリント表面は静的またはフレキシブルであり得る。フレキシブルなプリント表面は、プリントされた組織が、製作後に屈曲および他の非静的条件へ供されることを可能にする。いくつかの態様において、ヒドロゲルが任意で添加され、生体材料を支持するか、または細胞が存在しない省スペースの領域を構成する。
【００３８】
いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織、アレイ、および方法は、3D組織モデルへの連続的付着プリントを組み入れる。連続的付着は、単一のまたは複数の層をもたらすために任意で利用される。一態様において、線維芽細胞から構成されるバイオインクは、真皮を模倣する組織をもたらすためにプリントされる。別の態様において、ケラチノサイトまたはケラチノサイトおよびメラノサイトの混合物から構成されるバイオインクは、表皮を模倣する組織をもたらすためにプリントされる。第3の態様は、バイオインクを組み合わせて、真皮バイオインクの上部に表皮バイオインクを同時に付着させる。連続的付着プリントは、細胞が正確なジオメトリー内に置かれることを可能にし、かつ、Novogel（登録商標）2.0およびNovogel（登録商標）3.0などの不活性ガスならびに細胞ペーストを含むがこれらに限定されない複数のバイオインク製剤の使用を可能にする点で、現在の3D組織モデルに対する利点を提供する。連続的付着は、Novogel（登録商標）製剤および様々なプリント表面中への様々な生体材料の任意的な組み入れを可能にし、細胞外マトリックスの産生および分化を促進する。
【００３９】
エアロゾルスプレーバイオプリント技術は、例えば、細胞懸濁液、培地、バイオインク、生体支持材料、またはそれらの組み合わせを含む材料のスプレーを可能にする。いくつかの態様において、本明細書に記載される人工組織および方法論は、一細胞層厚みの分解能で単一の細胞をエアロゾルスプレーする（例えば、スプレーする）能力および細胞集合体をスプレーする能力が特色である。しかしながら、スプレーされる層はまた、スプレー材料速度、距離、時間、体積、および粘度を含むがこれらに限定されないパラメーターを変えることによって、改変され得る。表皮層の作製について、細胞は、任意で、全層モデルを得るために他のバイオプリントされた層上へ、または、特に表皮モデルを得るために直接トランスウェルもしくは他のマトリックスコーティング表面上へ、スプレーされる。スプレー法は、スプレーされる材料を生体支持材料またはNovogel（登録商標）などの柔らかい表面中へ埋め込むために任意で利用される。例えば、真皮層は、コラーゲンゲル中へ線維芽細胞をスプレーすることによって作ることができる。
【００４０】
エアロゾルスプレー法は、x、y、およびz-軸において最初のプリント位置をゼロにするために、トランスウェル膜などの、平らなプリント表面を必要としない点で、連続的付着プリントと比較した場合に独特である。エアロゾルスプレー法は、連続的付着によって前にプリントされた構造体などの平坦でない表面へ層を適用するために任意で使用される。
【００４１】
使用されるプリント法にかかわらず、様々な因子が、バイオプリントされた組織細胞の増殖および／または分化を促進するために任意で改変される。いくつかの場合において、真皮培地、表皮培地、または真皮培地および表皮培地の組み合わせが、組織構築物へ添加される。さらに、培地組成は、所望の生物学を促進するために組織寿命における異なる時点で任意で変えられる。組織構築物は、任意で、気液界面へ移されるか、または湿度もしくはCO2の改変などの雰囲気変化へ供される。両方のプリントアプローチを組み合わせる仮定の実験設計を図1に示す。
【００４２】
いくつかの態様において、三次元人工生体組織／構築物の少なくとも1つのコンポーネントをバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた構築物は、三次元送達デバイス(例えば、バイオプリンター)による、生体適合性支持表面(例えば、ヒドロゲルおよび／または多孔性膜から構成される)上への、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体(例えば、シリンダー、スフェロイド、リボンなど)を含む細胞、および、任意で、閉じ込め材料の、三次元の、自動化された、コンピューター支援される付着に基づく迅速なプロトタイピング技術を利用する方法を用いて作られる。いくつかの局面において、表面は、あらかじめプリントされた細胞の層であることができる。いくつかの局面において、表面は、無細胞生体適合性表面であることができる。本明細書において使用される場合、いくつかの態様において、用語「人工」は、組織および／または器官を指すために使用される場合、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞集合体、ならびにそれらの層が、コンピュータースクリプトに従ってコンピューター支援されるデバイス(例えば、バイオプリンター)によって三次元構造体を形成するように位置決めされることを意味する。さらなる態様において、コンピュータースクリプトは、例えば、1つまたは複数のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。なおさらなる態様において、三次元組織構造体は、細胞または多細胞体のプリント後の融合によって形成し、これは、いくつかの場合において、初期形態形成における自己集合現象に類似している。
【００４３】
手動での配置を含む、三次元構造体をもたらすために、細胞、多細胞集合体、および／またはそれらの層を生体適合性表面上に配置する多数の方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化された、コンピューター支援される機器による位置決めが有利である。この技術での細胞または多細胞体の送達の利点は、様々な組成を有する、細胞、多細胞集合体、および／またはそれらの層の、計画されたまたは予め決められた配向またはパターンを示す構築物をもたらすための、細胞または多細胞体の、迅速、正確、かつ再現可能な配置を含む。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながらの、確実な高い細胞密度を含む。
【００４４】
いくつかの態様において、バイオプリントの方法は連続的および／または実質的に連続的である。連続的バイオプリント法の非限定的な例は、バイオインクのリザーバに接続された分配先端(例えば、注射器、注射針、キャピラリーチューブなど)を介してバイオプリンターからバイオインク(即ち、細胞、賦形剤もしくは押し出し化合物と組み合わされた細胞、または細胞の集合体)を分配することである。さらなる非限定的な態様において、連続的バイオプリント法は、機能単位の繰り返しパターンでバイオインクを分配することである。様々な態様において、繰り返し機能単位は、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則なジオメトリーを含む、任意の好適なジオメトリーを有し、それによって、1つまたは複数の組織層が生じ、平面ジオメトリーは、別個のバイオインクの空間的パターニングおよび／または空所によって達成される。さらなる態様において、バイオプリントされた機能単位の繰り返しパターンは層を含み、複数の層が、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、積層ジオメトリーを有する人工組織または器官が形成される。様々な態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、またはそれ以上の層が、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、人工組織または器官が形成される。さらなる態様において、積層ジオメトリーを有する組織の1つまたは複数の層はまた、平面ジオメトリーを有する。
【００４５】
いくつかの態様において、バイオプリントの方法は非連続的である。非連続的バイオプリントの非限定的な例は、バイオインクまたは細胞が分配され、次いでバイオインクまたは細胞の流れが停止され、ある時間の間休止され、次いで再開される場合である。これは、異なるバイオインクもしくは細胞、または同じバイオインクもしくは細胞が、層のプリントにおいて遅れて積層されることを可能にし得る。いくつかの態様において、非連続的バイオプリントは、エアロゾルスプレータイプのバイオプリントを使用して達成され、細胞は、エアロゾルスプレー技術を使用して既存の組織層または表面へ適用される。いくつかの態様において、真皮細胞を含む細胞および細胞マトリックス成分またはバイオインクの単一の層または複数の層が付着され、続いて、表皮細胞またはバイオインクの単一の層または複数の層が時間的に遅れて付着される。いくつかの態様において、表皮細胞の付着はエアロゾルスプレーによる。
【００４６】
ある態様において、第1のバイオインクの付着後に第2のバイオインクの付着が起こる。ある態様において、第2のバイオインクの付着は、それが第1のバイオインク上に付着される前に、時間的に遅らされる。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は10ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は、20、30、40、50、60、70、80、90または100ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は、200、300、400、500、600、700、800、900または1000ミリ秒を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒を超える。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60秒を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間を超える。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60分間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、または7日間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、または4週間を超える。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は10ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は、20、30、40、50、60、70、80、90または100ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は、200、300、400、500、600、700、800、900または1000ミリ秒未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒未満である。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60秒未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間未満である。ある態様において、遅延は、10、20、30、40、50、または60分間未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、4、5、6、または7日間未満である。ある態様において、遅延は、1、2、3、または4週間未満である。
【００４７】
バイオインク
本明細書に開示されるのは、ある態様において、三次元の生きている組織、ならびに、細胞生存性および機能を損なうことなく製作後に細胞コンパートメントを維持するバイオプリントされた組織の製造方法である。いくつかの態様において、バイオプリンターからのバイオインクの付着または押し出しによって、細胞をバイオプリントする。いくつかの態様において、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体組成物を含む。いくつかの態様において、バイオインクは、液体もしくは半固体細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮物を含む。さらなる態様において、細胞溶液、懸濁液、または濃縮物は、液体または半固体(例えば、粘着性)担体および複数の細胞を含む。なおさらなる態様において、担体は、本明細書に記載されるもののような、好適な細胞栄養培地である。いくつかの態様において、バイオインクは、バイオプリント前に多細胞集合体へ任意で密着する複数の細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは、複数の細胞を含み、特定の平面および／または積層ジオメトリーをもたらすようにバイオプリントされ；ここで、バイオインク内の個々の細胞の密着は、バイオプリント前、中および／または後に起こる。いくつかの態様において、バイオインクは、(1)複数の細胞を固定体積で採取することによって生成され；ここで、細胞性成分は、総体積の少なくとも約30、40、50、60、70、80、90%または100%を占める。いくつかの態様において、バイオインクは、半固体または固体多細胞集合体または多細胞体を含む。さらなる態様において、バイオインクは、(1)複数の細胞または細胞集合体および生体適合性液体またはゲルを所定の比率で混合し、バイオインクを生じさせること、ならびに(2)バイオインクを圧縮し、所望の細胞密度および粘度を有するバイオインクを生成することによって、生成される。いくつかの態様において、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過(「TFF」)、またはそれらの組み合わせによって達成される。いくつかの態様において、バイオインクの圧縮は、押し出し可能である組成物をもたらし、多細胞集合体または多細胞体の形成を可能にする。いくつかの態様において、「押し出し可能な」は、ノズルまたはオリフィス(例えば、1つまたは複数のホールまたはチューブ)を通して(例えば、圧力下で)押し進めることによって形作られることが可能であることを意味する。いくつかの態様において、バイオインクの圧縮は、細胞を好適な密度へ増殖させることに起因する。バイオインクに必要な細胞密度は、使用される細胞および生成される組織または器官によって異なる。いくつかの態様において、バイオインクの細胞を密着および／または接着させる。いくつかの態様において、「密着させる」、「密着した」、および「密着」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、および／またはそれらの層を結合させる、細胞間接着特性を指す。さらなる態様において、これらの用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。いくつかの態様において、バイオインクは、支持材料、細胞培養培地(またはそのサプリメント)、細胞外マトリックス(またはその成分)、細胞接着剤、細胞死阻害剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、���し出し化合物、およびそれらの組み合わせをさらに含む。
【００４８】
様々な態様において、細胞は任意の好適な細胞である。さらなる様々な態様において、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において使用される細胞のタイプは、生成される構築物または組織のタイプに依存する。いくつかの態様において、バイオインクは1つのタイプの細胞を含む(「均一」または「単型」バイオインクとも呼ばれる)。いくつかの態様において、バイオインクは2つ以上のタイプの細胞を含む(「不均一」または「多型」バイオインクとも呼ばれる)。
【００４９】
いくつかの態様において、バイオインクは細胞培養培地を含む。細胞培養培地は任意の好適な培地である。様々な態様において、好適な細胞培養培地としては、非限定的な例として、ダルベッコリン酸緩衝食塩水、Earle平衡塩類、Hanks平衡塩類、Tyrode塩類、Alsever溶液、Gey平衡塩類溶液、Kreb's-Henseleit Buffer Modified、Kreb's-Ringer重炭酸塩緩衝液、Puck食塩水、ダルベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地/Nutrient F-12 Ham、Nutrient Mixture F-10 Ham (Ham's F-10)、培地199、最小必須培地イーグル、RPMI-1640培地、Ames培地、BGJb培地(Fitton-Jackson Modification)、Click培地、CMRL-1066培地、Fischer培地、Glascow最小必須培地(GMEM)、Iscove変法ダルベッコ培地(IMDM)、L-15培地(Leibovitz)、McCoy 5A変法培地、NCTC培地、Swim S-77培地、Waymouth培地、William培地E、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様において、細胞培養培地は改変されるかまたは補足される。いくつかの態様において、細胞培養培地は、アルブミン、セレン、トランスフェリン、フェチュイン、糖類、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン、多血小板血漿、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【００５０】
いくつかの態様において、バイオインクは、細胞外マトリックスの1つもしくは複数の成分またはその誘導体をさらに含む。いくつかの態様において、「細胞外マトリックス」は、細胞によって産生されそして細胞から細胞外空間中へ輸送されるタンパク質を含み、ここで、それらは、組織を一緒に保持し、抗張力を提供し、かつ／または細胞シグナル伝達を容易にするためのサポートとして役立つ。細胞外マトリックス成分の例としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナート、エラスチン、およびプロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの態様において、多細胞集合体は、様々なECMタンパク質(例えば、ゼラチン、フィブリノーゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／またはプロテオグリカン)を含有する。ECM成分またはECM成分の誘導体は、任意で、多細胞集合体を形成するために使用される細胞ペーストへ添加される。細胞ペーストへ添加されるECM成分またはECM成分の誘導体は、任意で、ヒトもしくは動物供給源から精製されるか、または当技術分野において公知の組換え法によって産生される。あるいは、ECM成分またはECM成分の誘導体は、細長い細胞体（elongate cellular body）中の細胞によって自然に分泌されるか、または、細長い細胞体を作製するために使用される細胞は、1つもしくは複数のECM成分もしくはECM成分の誘導体および／または1つもしくは複数の細胞接着分子もしくは細胞-基質接着分子(例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびアドヘリン（adherin）)の発現レベルを変えるように、当技術分野において公知の任意の好適な方法によって任意で遺伝子操作される。いくつかの態様において、ECM成分またはECM成分の誘導体は、多細胞集合体中の細胞の密着を促進する。例えば、ゼラチンおよび／またはフィブリノーゲンは、多細胞集合体を形成するために使用される細胞ペーストへ適切に添加される。フィブリノーゲンは、トロンビンの添加によってフィブリンへ変換される。
【００５１】
いくつかの態様において、バイオインクは、細胞死(例えば、壊死、アポトーシス、またはオートファゴサイトーシス)を阻害する物質をさらに含む。いくつかの態様において、バイオインクは抗アポトーシス剤をさらに含む。細胞死を阻害する物質としては、小分子、抗体、ペプチド、ペプチボディ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、細胞死を阻害する物質は、以下より選択される：抗TNF剤、インターロイキンの活性を阻害する物質、インターフェロンの活性を阻害する物質、GCSF(顆粒球コロニー刺激因子)の活性を阻害する物質、マクロファージ炎症蛋白の活性を阻害する物質、TGF-B(トランスホーミング増殖因子B)の活性を阻害する物質、MMP(マトリックスメタロプロテイナーゼ)の活性を阻害する物質、カスパーゼの活性を阻害する物質、MAPK/JNKシグナル伝達カスケードの活性を阻害する物質、Srcキナーゼの活性を阻害する物質、JAK(ヤーヌスキナーゼ)の活性を阻害する物質、またはそれらの組み合わせ。いくつかの態様において、バイオインクは抗酸化剤を含む。いくつかの態様において、バイオインクは酸素担体または他の細胞特異的栄養素を含む。
【００５２】
いくつかの態様において、バイオインクは、押し出し化合物(即ち、バイオインクの押し出し特性を変更する化合物)をさらに含む。押し出し化合物の例としては、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性剤ポリオール(例えば、Pluronic F-127またはPF-127)、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、細胞外マトリックス成分(およびその誘導体)、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然または合成ポリマー、ナノ繊維、および自己集合性ナノ繊維が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、押し出し化合物は、物理的、化学的、または酵素的手段によって、バイオプリント後に除去される。
【００５３】
ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜10億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜9億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜8億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜7億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜6億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜5億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜4億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり5000万〜3億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり少なくとも100万個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり少なくとも1000万個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり少なくとも5000万個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり少なくとも1億個の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり1億個未満の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり1000万個未満の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり500万個未満の細胞を含む。ある態様において、バイオインクは、1ミリリットル当たり100万個未満の細胞を含む。
【００５４】
ある態様において、バイオインクは粘稠液である。ある態様において、バイオインクは半固体である。ある態様において、バイオインクは固体である。ある態様において、バイオインクの粘度は100センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は200センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は500センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は1,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は2,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は5,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は10,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は20,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は50,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は100,000センチポアズを超える。ある態様において、バイオインクの粘度は100センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は200センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は500センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は1,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は2,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は5,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は10,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は20,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は50,000センチポアズ未満である。ある態様において、バイオインクの粘度は100,000センチポアズ未満である。
【００５５】
細胞タイプ
いくつかの態様において、任意の脊椎動物細胞が、バイオインクおよび三次元人工組織中に含めるために適している。さらなる態様において、細胞は、非限定的な例として、収縮性細胞または筋細胞(例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋芽細胞)、結合組織細胞(例えば、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および造骨細胞へ分化する細胞、コンドロサイト、またはリンパ組織)、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳房細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、腸細胞、胃腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、腎細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周皮細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞(例えば、胚細胞、幹細胞、および前駆細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、癌幹細胞)、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、疾患関連抗原を発現するかまたは疾患(例えば、癌)に関連する細胞、およびそれらの組み合わせである。ある態様において、バイオインクまたは組織は、線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、皮膚起源の線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、腎臓起源の線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、血管起源の線維芽細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、内皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、線維芽細胞および内皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、ケラチノサイトを含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、メラノサイトを含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、肝細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、星細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、表皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、真皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、上皮細胞を含む。ある態様において、バイオインクまたは組織は、尿細管上皮細胞を含む。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、単一の細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、2つの細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、3つの細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、4つの細胞タイプから本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、ヒト細胞から本質的になる。追加の態様において、バイオインクまたは組織は、ヒト初代細胞から本質的になる。
【００５６】
ある態様において、細胞は、生物学的に、化学的にまたは物理的に改変されている。生物学的改変としては、野生型、ドミナントネガティブ、切断または変異タンパク質をコードする導入遺伝子でのトランスフェクション、形質導入または感染のような、遺伝子改変が挙げられる。導入遺伝子はまた、miRNA、siRNA、shRNAまたはアンチセンスRNAをコードし得る。導入遺伝子は、一時的に維持され得るかまたは細胞ゲノム中へ安定して組込まれ得る。トランスフェクションは、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、およびエレクトロポレーションによって、または特別なトランスフェクション手段無しでのDNAの取り込みを通して、達成することができる。細胞は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはワクシニアウイルスのような、これらの目的のために一般的に使用される任意のウイルスベクターを用いて、ウイルスによって形質導入することができる。改変は、突然変異原、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、HDAC阻害剤、化学療法剤、蛍光標識もしくは追跡用色素、細胞永久もしくは細胞非永久色素での処理など、化学的であり得る。改変は、放射線、電磁放射線、X線、ならびに高温および低温ショックなど、物理的であり得る。
【００５７】
いくつかの態様において、細胞は成体分化細胞である。さらなる態様において、「分化細胞」は、単離時に、例えば、筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞と一致した、組織特異的表現型を有する細胞であり、ここで、組織特異的表現型（または表現型を示す可能性）は、単離時から使用時まで維持される。他の態様において、細胞は成体非分化細胞である。さらなる態様において、「非分化細胞」は、例えば、筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の、明確な組織特異的形質を有さないまたは失った細胞である。いくつかの態様において、非分化細胞は幹細胞を含む。さらなる態様において、「幹細胞」は、分化能および自己複製を示す細胞である。幹細胞としては、全能性細胞、多能性細胞、複能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、および前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。様々な態様において、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、羊膜幹細胞、および人工多能性幹細胞である。他の態様において、細胞は、成体分化細胞および成体非分化細胞の混合物である。
【００５８】
予め形成されたスキャフォールド
いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも含まないかまたは実質的に含まない人工組織である。さらなる態様において、「スキャフォールド」は、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および無細胞化組織、ならびに人工組織および／または器官の物理的構造体にとって不可欠でありかつ組織および／または器官から除去されない任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。なおさらなる態様において、無細胞化組織スキャフォールドは、無細胞化ネイティブ組織、または任意の方法で培養細胞によって生成された無細胞化細胞材料；例えば、生きている間に産生したECMを残して、死滅させられるかまたは無細胞化される細胞層を含む。
【００５９】
いくつかの態様において、人工組織／構築物およびそのアレイは、例えば、組織の形成、組織の任意の層の形成、または組織の形状の形成のために、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも利用しない。非限定的な例として、本発明の人工組織は、いかなる予め形成された、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックス層、または任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドをも、製造時にまたは使用時に利用しない。いくつかの態様において、人工組織は、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも実質的に含まない。さらなる態様において、組織の細胞性コンポーネントは、検出可能であるが微量または僅かな量のスキャフォールド、例えば、総組成物の2.0%未満、1.0%未満、または0.5%未満、を含有する。なおさらなる態様において、微量または僅かな量のスキャフォールドは、組織またはそのアレイの長期挙動に影響を与えるか、またはその主要な生物学的機能に干渉するには不十分である。追加の態様において、スキャフォールドコンポーネントは、物理的、化学的、または酵素的方法によって、プリント後に除去され、スキャフォールドコンポーネントを含まないかまたは実質的に含まない人工組織が得られる。
【００６０】
いくつかの態様において、本明細書に開示される、予め形成されたスキャフォールドを含まないか、または実質的に含まない人工組織は、組織工学の特定の他の方法で開発されたものとは全く対照的であり、ここでは、例えば、スキャフォールド材料が最初に形成され、次いで、細胞がスキャフォールド上へ播種され、その後、細胞は増殖し、スキャフォールドを満たしそしてスキャフォールドの形状をとる。一局面において、本明細書に記載されるバイオプリントの方法は、予め形成されたスキャフォールドを含まないかまたは実質的に含まない生存可能で有用な組織の作製を可能にする。別の局面において、本発明の細胞は、いくつかの態様において、閉じ込め材料を使用して所望の三次元形状に保持される。閉じ込め材料は、少なくとも、閉じ込め材料が一時的なものでありかつ／または細胞および／または組織から除去可能であるという事実において、スキャフォールドとは異なる。
【００６１】
低温（hypothermic）ホールド
ある態様において、組織を、バイオプリント後、一定期間、24℃を下回る温度での「低温ホールド」においてインキュベートするかまたは置く。ある態様において、この温度は0℃を超える。ある態様において、この温度は24℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ24℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ20℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ18℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ16℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ14℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ12℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ10℃未満である。ある態様において、この温度は、0℃超かつ8℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ8℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ10℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ12℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ8℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ14℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ16℃未満である。ある態様において、この温度は、2℃超かつ6℃未満である。ある態様において、この温度は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24℃である。
【００６２】
ある態様において、組織およびバイオインクを、一定の時間の間、低温ホールド温度でインキュベートする。このインキュベーションの期間は、少なくとも0.020、0.05、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10秒間であり得る。ある態様において、このインキュベーションの期間は、少なくとも10、20、30、40、50、または60秒間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、少なくとも10、20、30、40、50、または60分間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18時間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、多くとも10、20、30、40、50、または60秒間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、多くとも10、20、30、40、50、または60分間である。ある態様において、このインキュベーションの期間は、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18時間である。
【００６３】
ある態様において、低温ホールドを繰り返す。ある態様において、低温ホールドを1、2、3、4、5、6、7、8、9、10回、またはそれ以上繰り返す。ある態様において、低温ホールドを10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100回、またはそれ以上繰り返す。ある態様において、低温ホールドは、低温温度にある生体適合性液体へバイオインクを接触させることによって達成される。ある態様において、ホールドは、温度制御されたまたは「冷却された」表面へバイオインクを接触させることによって達成される。
【００６４】
低い温度（low temperature）のインキュベーション
ある態様において、組織を、バイオプリント後、単一の低い温度でまたは低い温度の組み合わせで、「成熟させる」またはインキュベートする。低い温度は、37℃を下回る任意の温度である。ある態様において、この段階は前述の低温ホールドとは無関係である。ある態様において、この段階は前述の低温ホールド後に生じる。ある態様において、この段階は前述の低温ホールド無しで生じる。ある態様において、この温度は、18℃超しかし37℃未満であり得る。ある態様において、この温度は、約24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36℃である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約19℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約20℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約21℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約22℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約23℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約24℃超、しかし37℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし36℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし35℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし34℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし33℃未満である。ある態様において、この温度は、約18℃超、しかし32℃未満である。ある態様において、この温度は、約28℃超、しかし32℃未満である。
【００６５】
ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、1時間を超えるが20日間未満である。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間である。ある態様において、時間の量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、または20日間である。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、2時間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、4時間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、8時間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、12時間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、16時間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、24時間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、3日間を超える。ある態様において、組織をインキュベートする時間の量は、7日間を超える。
【００６６】
ヒドロゲル
ある態様において、本開示の方法によって製造される組織はヒドロゲルを利用し、例としては、コラーゲン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、多糖類、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)およびプロテオグリカン（これは、例えば、コンドロイチン硫酸（chrondroitin sulfate）、フィブロネクチン、ケラチン硫酸、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、デコリン、アグレカン、パールカンを含有し得る）およびそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、好適なヒドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、好適なヒドロゲルとしては、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられる。様々な具体的な態様において、ヒドロゲル、NovoGel（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Matrigel（商標）、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリラート(PEG-DA)、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン（silicon）、シルク、またはそれらの組み合わせである。
【００６７】
架橋剤
ある態様において、本開示の方法によって製造される組織は、コンパートメント化された組織を形成するためにいかなる架橋も必要としない。ある態様において、組織は、化学的架橋、非限定的な例として、グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）またはビスエポキシドを必要としない。ある態様において、組織は、イオン性架橋剤による架橋を必要としない。ある態様において、組織は、いかなるカチオン性またはアニオン性架橋剤による架橋も必要としない。ある態様において、組織は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、アルギナート、またはそれらの任意の組み合わせによる架橋を必要としない。ある態様において、組織は、酵素的架橋剤よる架橋を必要としない。ある態様において、細胞は、物理的架橋を必要としない。ある態様において、組織は、光架橋を必要としない。ある態様において、組織は、紫外線もしくは可視光を含む、光架橋または放射線架橋を必要としない。
【００６８】
低イオン環境
ある態様において、バイオプリントされた組織、バイオインク、および細胞を、生理的レベルを超えないカルシウムなどの二価カチオン性架橋化合物へ曝露する。この目的のための生理的レベルは、イオン性カルシウムについては1〜1.5 mMであり、総カルシウムについては2〜3 mMである。ある態様において、組織またはバイオインクを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mMを超える総カルシウムへ曝露する。ある態様において、組織またはバイオインクを、5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50 mMを超える総カルシウムへ曝露する。カルシウムは、塩化カルシウムまたはリン酸カルシウムを含むが、これらに限定されない、カルシウムの全てのイオン種を含む。ある態様において、組織またはバイオインクを、ストロンチウム、マグネシウム、バリウムのような他の二価カチオン性架橋化合物、または銅、アルミニウム、もしくは鉄を含み得る他の多価イオンへ曝露しない。ある態様において、組織またはバイオインクを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10 mMを超えるイオン性架橋剤へ曝露する。ある態様において、組織またはバイオインクを、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100 mMを超えるイオン性架橋剤へ曝露する。
【００６９】
アポトーシスの低減
ある態様において、本開示の方法によって製造されるバイオプリントされた組織は、本開示の方法によってバイオプリントされないバイオプリントされた組織と比較した場合、バイオプリントされた組織中のアポトーシスを低減させる。ある態様において、アポトーシスは、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、またはそれ以上低減される。ある態様において、アポトーシスは10%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは25%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは30%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは50%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは70%以上低減される。ある態様において、アポトーシスは90%以上低減される。ある態様において、アポトーシスの低減は、アポトーシスの分子マーカーの変化によって測定され；非限定的な例としては、DNA断片化、TUNEL染色、活性化カスパーゼの変化、カスパーゼ切断産物の変化、総カスパーゼの変化、アポトーシスの減少または増加と一致するmRNAレベルの変化、アポトーシスの細胞表面マーカーの変化(非限定的な例として、アネキシンV)が挙げられる。分子マーカーの変化は、免疫組織化学(IHC)、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、リアルタイムPCRを含むPCR、または市販されているものを含む任意のホモジニアスカスパーゼアッセイによって測定することができる。
【００７０】
ある態様において、本明細書に開示されるのは、インビトロおよび治療適用のための、改善された生存性および有用性を有する組織のシステムである。ある態様において、本明細書に含まれるのは、インビトロおよび治療適用のための、改善された生存性および有用性を有する組織のアレイである。アレイは、治療薬としての潜在的な使用のための化合物の、増強されたスクリーニングを可能にする、複数の組織のインビトロ連合体である。ある態様において、アレイまたはシステムは、組織間に少なくとも20μmのスペースを空ける。ある態様において、アレイまたはシステムは、組織間に少なくとも100μmのスペースを空ける。ある態様において、アレイまたはシステムは、組織間に少なくとも1000μmのスペースを空ける。ある態様において、アレイまたはシステムにおいて使用するための組織は、組成的に同じである。ある態様において、アレイまたはシステムにおいて使用するための組織は、組成的に異なる。ある態様において、アレイまたはシステムにおいて使用するための組織は、生体適合性表面へ結合される。ある態様において、アレイまたはシステムにおいて使用するための組織は、生体適合性表面へ固定される。結合は、物理的手段を通して、または生体適合性表面上にコーティングされた細胞接着分子によって、行うことができる。ある態様において、結合は、付着される細胞による細胞接着タンパク質または分子の分泌を通して行う。
【００７１】
本明細書における開示はビジネス方法を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される技術および方法の速度およびスケーラビリティは、移植のための人工組織および／または器官の作製、またはインビトロアッセイなどの、研究開発のための細胞ベースのツールの作製における使用のための、産業施設および／または商業施設を設計、建築、および運営するために利用される。さらなる態様において、人工組織および／または器官ならびにそのアレイは、例えば、細胞アレイ(例えば、マイクロアレイまたはチップ)、組織アレイ(例えば、マイクロアレイまたはチップ)、ならびに生物学的アッセイ、ハイスループット薬物スクリーニング、毒物学および毒性試験のためのキットとして、製造、保管、分配、市販、宣伝、および販売される。他の態様において、人工組織および／または器官ならびにそのアレイは、サービスとして生物学的アッセイおよび／または薬物スクリーニングを行うために製造および利用される。他の態様において、ビジネス方法は、移植において使用するための組織バイオプリンティングの需要に関与する。
【実施例】
【００７２】
実施例1  37℃未満でのインキュベーションは皮膚組織形成を改善する
手順
1ミリリットル当たり1億5000万個の細胞の濃度で、6%ゼラチン (Novogel（登録商標）2.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。
【００７３】
上部を縁取る1mm壁を有する4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、カップに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。
【００７４】
次いで、95%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)および5%初代成人ヒト表皮メラノサイト(HEMa)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、直後にまたは.20秒から数時間もしくは数日の間に、真皮バイオインクの上部にプリントした。
【００７５】
細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって90.5%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって160,000細胞と推定された。
【００７６】
次いで、培地をトランスウェルの外部ウェルへ2 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:40:10比率のHDFa:HEKa:HEMa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。48時間後に培地を変え、続いてその後毎日変えた。
【００７７】
プリントされた構築物を、30℃で5日間、加湿されていないインキュベータ中へ置いた。これは、成熟期間中の組織形状の維持を可能にする重要な段階である。5日後、さらに7日間、温度を37℃へ上げた。
【００７８】
第2、9、および12日に、構築物を、RNA解析のために溶解させたか、または組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
【００７９】
結果
第12日での皮膚組織のH&E染色は別個の層状構造を示す(図2および3)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。このアプローチでの予想外の知見は、観察された層状構造の程度である。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する(矢印)。この層はCK14に対して特異的に染色され、これは、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置されたことを示している。
【００８０】
分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5およびインボルクリン(IVL)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。層状構造はまた、中期分化におけるCK10-陽性有棘および顆粒ケラチノサイトを含む(図4)。
【００８１】
以前のプリント法は表皮層のCK14陽性染色を生じさせたが、観察されたパターンは、第10日で、層の全体にわたって広がっており、基底領域に非特異的である。本アプローチにおいて、予想外であることは、第12日において、ネイティブなヒト皮膚と同様に、染色が表皮層の底部での規定の領域に限定されることである(図5)。
【００８２】
遺伝子発現解析は組織学的知見を支持している。データは、経時的に表皮分化マーカーCK1、CK10、および特に後期マーカーFLGの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲン4レベルが経時的に増加することを示しており、これは基底膜の形成を示唆している。コラーゲンIレベルは実験の時間経過にわたって維持され、これは真皮層が生存可能のままであることを示唆している(図6)。
【００８３】
実施例2  4℃での瞬間的曝露および37℃未満でのインキュベーションは皮膚組織形成を改善する
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel（登録商標）)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞：ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度を減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。
【００８４】
4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter（登録商標）プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。
【００８５】
100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。別のしかし同一の表皮ペースト構造体を、真皮シートの隣りに、直接的にトランスウェルプリント表面上へ同時に付着させた。この構造体は、表皮ケラチノサイトペーストのみから構成され、真皮組織を含有しなかった。
【００８６】
細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって87.1%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって60,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。これは、Novogelを強固にするための重要な工程であり、これは、プリントされた形状を維持し、構築物間の均一性を改善するのを助ける。
【００８７】
次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ3 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(30〜37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり1.5 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。その後続いて、培地を、48時間(第4日)で1.5 mlの体積で変えた。第5日に、培地を変え、1ウェル当たり1mlへさらに減らし、その後毎日変えた。
【００８８】
プリントされた構築物を、加湿していないインキュベータに30℃で5日間置いた。これは重要な工程であり、成熟期間中に組織の形を維持することを可能にする。5日後、さらなる7日間のために温度を37℃に上げた。
【００８９】
第0および12日に、構築物を、RNA解析のために溶解させたか、または組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
【００９０】
結果
トランスウェル表面上に直接プリントされる場合に対して、真皮シートの上部にプリントされたペーストの表皮層パターニングを比較するためのその後の組織学的解析は、予想外の知見をもたらした(図7AおよびB)。第12日での皮膚組織のH&E染色は、表皮ペーストが真皮層の上部にプリントされた構造体においてのみ、別個の層状構造を示す(図7CおよびD対FおよびG、図8A)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)［顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー］に対して同時に染色されることによって可視化される(図7E対H、図8B)。別個の緑色層は、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置され、より分化したIVL陽性細胞の層は上部に配置されたことを示している。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。
【００９１】
増殖マーカーPCNAに対する染色(図8E、緑色)は、真皮線維芽細胞および基底層ケラチノサイトの両方において増殖が高いが、分化中のケラチノサイトにおいては高くないことを示している。このパターンは、ネイティブな皮膚において見られるものと類似している。TUNELによるアポトーシスに対する染色(図8F)もまた、真皮層または表皮層のいずれにおいてもごくわずかな陽性染色細胞を低く示している。まとめて、PCNAおよびTUNEL染色は、全層組織の真皮コンパートメントおよび表皮コンパートメントの両方が第12日に生存可能であることを実証している。
【００９２】
遺伝子発現解析は組織学的知見を支持している。データは、第0日と比較しての第12日での、中期表皮分化マーカーCK1、CK10、および後期マーカーIVL、ロリクリンの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲンIおよび4レベルは実験の時間経過にわたって維持され、一方、コラーゲン3レベルは増加することを示しており、これは、真皮層が生存可能かつ機能的のままであることを示唆している(図9)。
【００９３】
多くの驚くべき結果がこれから決定された；例えば、表皮ペーストは別個の層状構造中へ重層化することができること。現在の3D皮膚モデルは、これを達成するために、長期間にわたる単一のケラチノサイト単層の分化に頼る。ここで、本発明者らは、重層化がペーストで達成することが可能であることを示す。ペーストの厚みは単層よりも大きく（単層では約18〜20ミクロン）細胞がペースト内で自己組織化し、層として分化し得ることを示す。また、本発明者らは、真皮組織の存在無しでトランスウェル表面上へ直接プリントされたケラチノサイトペーストが、重層化層へ組織化しなかったことを示す。同じ分化マーカーに対する染色は、規定された層を含まないかまたは別個の細胞形態を含まない混合発現を示す。この予想外の知見は、真皮層が表皮ケラチノサイトの分化および／または重層化を指示すること、ならびに表皮細胞単独には存在しない、真皮細胞および表皮細胞の組み合わせの独自性があることを示している。3)表皮細胞および真皮細胞の両方から構成された組織中において観察された層状構造の程度は、CK5-陽性基底層の染色を含み、これは、ネイティブなヒト皮膚と同様に、表皮層の底部での規定の領域に限定される。層状構造はまた、中期分化におけるCK10陽性(図8C)有棘および顆粒ケラチノサイトを含み、その上にH&Eおよびトリクローム染色(それぞれ図8AおよびD)によって可視であるケラチノサイトの形態学的に別個の角化層を含む。
【００９４】
このアプローチの注目すべき利点は、真皮層の外観である。H&E染色は、真皮線維芽細胞が、前の実施例1および2におけるような薄いシートを形成しないが、より厚い構造体を形成することを示している。コラーゲン付着（これは、真皮中における通常の線維芽細胞機能の重要な指標である）が、トリクローム染色(青色)および真皮細胞間のコラーゲン3についての免疫蛍光染色(赤色)の両方によって理解され得る(図8)。
【００９５】
実施例3  37℃を下回るインキュベーションは腎臓組織形成を改善する
腎臓近位尿細管モデルの間質層は、Novogel（登録商標）中の腎臓線維芽細胞およびHUVECから構成される。間質層の厚みおよび細胞性を低減させるために、細胞比を50%線維芽細胞/50% HUVECへ変更し、細胞の濃度は1億2500万個の細胞/mLとした。これらの細胞比を使用して組織を製作する試みは、組織の「玉になる（ball up）」傾向によって阻止され、理想的である薄く広がった間質層の種類を妨げた。バイオプリント後の構築物形状の維持を助けるために、プリント後3日間、組織を30℃でインキュベートし、Novogel（登録商標）消失速度を遅くした。
【００９６】
結果として示された組織は、37℃のインキュベーション(図11AおよびB)と比較した場合、30℃のインキュベーション後に、その全体寸法をよりよく保持しており(図11CおよびD)、かつ、細胞が増殖しECMを分泌し、結合剤としてのNovogel（登録商標）材料(図11B)が置き換えられることを可能にする。この成熟段階に続いて、組織は、構造体への上皮細胞の添加のために37℃へシフトされ得、30℃での培養時間の結果としての組織特徴または生存性の減少はなかった。H&E染色が示され(図12A)、刷子縁が示される(図13A、矢印)。トリクローム染色は、コラーゲン分泌を示し(図12B、青色、および13B、矢印)、CD31染色は、HUVEC網の存在を示す(図14、アスタリスク)。バイオプリントされた組織は、培養状態で経時増加するγ-グルタミル-トランスフェラーゼ活性を示し、これは機能している上皮層を示す(図15)。腎臓は通常は37℃で維持される完全に内部の構造体であるということを考慮すると、30℃での培養時間が、所望の構造的および機能的特徴を有する組織をもたらすであろうことは予想外である。
【００９７】
実施例4  4℃の低温ホールドおよび30℃のインキュベーションを使用して製作された皮膚組織の比較
本明細書に開示される方法を使用して製作される組織は、量的および質的改善を示す。図16を参照して、5日間の30℃インキュベーション段階を伴う4℃ホールドを使用して製作された皮膚組織は、これらの技術を用いずに製作された組織(図16A)と比較した場合、TUNEL染色によって示されるように、低減したアポトーシスを示す(図16B)。同様に、組織を遺伝子発現分化マーカーについてアッセイすると、IVL、CK10、CK5およびColla1は、5日間の30℃インキュベーション段階を伴う4℃ホールドを使用して製作された組織(図17E、F、G、およびH)において、これらの技術を用いずに製作された組織(図17A、B、C、およびD)と比較した場合、上昇する。まとめると、図16および図17は、低温ホールドおよび37℃を下回るインキュベーションを使用して製作された組織は、増加した生存性および分化を有する組織をもたらすことを示している。
【００９８】
実施例5  37℃を下回るインキュベーションは組織端での分解を防ぐ
初代ヒト肝細胞、内皮細胞、および星細胞を含む肝臓組織を、バイオプリントし、直ちに様々な温度(18.2℃、30.2℃、32.0℃、および36.9℃)下でインキュベータ中に置き、画像化した。
【００９９】
図18A〜Dは、18.2℃(A)、30.2℃(B)、32.0℃(C)、および36.9℃(D)での細胞性バイオインクの粘度の温度依存性を示す写真である。18.2℃(A)において、形成し、肝臓組織の外縁上で明確に可視であるバイオインク(矢印によって示される暗い三角形に接する明瞭な菱形)は、30.2℃(B)で維持される。組織端は32.0℃(C)で分解し、36.9℃(D)で完全に消える。従って、36.9℃でのインキュベーションは、所望の構造的および機能的特徴を有する肝臓組織をもたらさない。
【図１】
2018532418.tif 000004
【図２】
2018532418.tif 000005
【図３】
2018532418.tif 000006
【図４】
2018532418.tif 000007
【図５】
2018532418.tif 000008
【図６】
2018532418.tif 000009
【図７】
2018532418.tif 000010
【図８】
2018532418.tif 000011
【図９】
2018532418.tif 000012
【図１０】
2018532418.tif 000013
【図１１】
2018532418.tif 000014
【図１２】
2018532418.tif 000015
【図１３】
2018532418.tif 000016
【図１４】
2018532418.tif 000017
【図１５】
2018532418.tif 000018
【図１６】
2018532418.tif 000019
【図１７】
2018532418.tif 000020
【図１８】
2018532418.tif 000021
【国際調査報告】
2018532418.tif 000022