(57)【要約】  本発明は、タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体を検出するための標準体の製造方法であって、Ａ）タンパク質ミスフォールディング病の凝集体のサイズの無機ナノ粒子を準備するステップ、Ｂ）（アミンまたはカルボキシ官能化されたナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため）ナノ粒子の表面に遊離アミノ基または遊離カルボキシ基を形成するステップ、Ｃ）ｉ）ステップＢ）での遊離アミノ基にマレインイミド−スペーサー−カルボン酸を結合するかまたはｉｉ）ステップＢ）での遊離カルボキシ基をＮＨＳエステルに変換するステップ、Ｄ）タンパク質凝集体のモノマーを、ｉ）モノマーの自由端のスルフヒドリル基を介してマレインイミド−スペーサー−カルボン酸に結合するかまたはｉｉ）モノマーの自由端のアミノ基を介してＮＨＳエステルに結合するステップを有する製造方法に関する。本発明の対象は、標準体およびタンパク質ミスフォールディング病の際に発生するタンパク質凝集体を検出する際の標準体の使用である。
2018514754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体を検出するための標準体の製造方法であって、
Ａ）タンパク質ミスフォールディング病の凝集体のサイズを有する無機ナノ粒子を準備するステップ、
Ｂ）アミンまたはカルボキシ官能化されたナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため、ナノ粒子の表面に遊離アミノ基または遊離カルボキシ基を形成するステップ、
Ｃ）ｉ）ステップＢ）での遊離アミノ基にマレインイミド−スペーサー−カルボン酸を結合するかまたは
ｉｉ）ステップＢ）での遊離カルボキシ基をＮＨＳエステルに変換するステップ、
Ｄ）タンパク質凝集体のモノマーを
ｉ）モノマーの自由端のスルフヒドリル基を介してマレインイミド−スペーサー−カルボン酸に結合するかまたは
ｉｉ）モノマーの自由端のアミノ基を介してＮＨＳエステルに結合するステップ
を有する製造方法。
【請求項２】
シリカナノ粒子を製造するためのステップＡ）でのストーバー合成を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップＢ）で遊離アミノ基を形成するための、エタノール中でのアミノプロピルトリエトキシシランによる表面のシラン化を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップＢ）で遊離カルボキシ基を形成するための、アミノ基と無水コハク酸の反応を特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
ステップＣ）ｉ）でマレインイミド−スペーサー−カルボン酸がステップＢ）の遊離アミノ基に結合される前に、マレインイミド−スペーサー−カルボン酸がＮＨＳエステルに変換される、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
ステップＣ）ｉ）の前またはステップＣ）ｉｉ）での、ＮＨＳエステルへの変換のための、ステップＣ）ｉ）からのマレインイミド−スペーサー−カルボン酸またはステップＢ）からの遊離カルボキシ基と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応を特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
ステップＤｉｉ）でのモノマーのアミノ基とＮＨＳエステルとの共有結合を特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
ステップＣ）ｉｉ）の実施の後、ストレプトアビジン分子をナノ粒子のＮＨＳエステルに配置し、かつステップＤ）の前にビオチン基をタンパク質凝集体のモノマーに配置することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
検出すべき凝集体のサイズを有する無機ナノ粒子を含む、タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体の検出における標準体であって、無機ナノ粒子の表面には、
ｉ）マレインイミド−スペーサー−カルボン酸または
ｉｉ）ＮＨＳエステルのいずれかが、
検出すべきタンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体のモノマーを結合するために配置されている、標準体。
【請求項１０】
マレインイミド−スペーサー−カルボン酸またはＮＨＳエステルの数が、おおよそで、凝集体に存在するモノマーの数と一致することを特徴とする請求項９に記載の標準体。
【請求項１１】
２〜２００ｎｍ、好ましくは２〜６０ｎｍ、特に好ましくは２〜２０ｎｍのナノ粒子のサイズを特徴とする請求項９または１０に記載の標準体。
【請求項１２】
ナノ粒子としてのシリカナノ粒子または金ナノ粒子または量子ドットを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一つに記載の標準体。
【請求項１３】
式
【化１】
2018514754.tif 000006
［式中、ＳＩＮＰ＝シリカナノ粒子またはシリカシェルを有する量子ドットナノ粒子］
を特徴とする請求項９〜１２のいずれか一つに記載の標準体。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一つに従って製造された標準体。
【請求項１５】
とりわけアルツハイマー型認知症の潜在的に毒性の凝集体および／またはオリゴマーを検出する際のタンパク質凝集体の検出における、請求項９〜１４のいずれか一つに記載の標準体の使用であって、未知数の結合部位を有する試料および既知数の結合部位を有す標準体が、蛍光を発する抗体またはペプチドによって処理され、かつ標準体の結果から上記試料での結合部位の数が推論される使用。
【請求項１６】
−  請求項９〜１４のいずれか一つに記載の標準体と、
−  アミロイドβ、プリオンタンパク質、血清アミロイドＡタンパク質、ＩｇＧ軽鎖、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＴＴＲ、ＤＩＳＣ１、ＦＵＳ、ＩＡＰＰ、ＳＯＤ１、α−シヌクレイン、タウ、ＴＤＰ−４３、ハンチンチンまたはリゾチームの群から選択される、検出すべきタンパク質ミスフォールディング病の少なくとも１つのモノマーまたは前記モノマーのエピトープと、
−  標準体およびモノマーを取り込むための溶媒と
を含む、タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体を検出するための標準体の製造方法ならびにそのような標準体としての標準体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ミスフォールディング病という概念は、間違って折りたたまれて凝集するタンパク質によって引き起こされる疾患に対する集合概念である。医学的に特に重要なのは、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）およびパーキンソン病のような神経変性疾患である。タンパク質ミスフォールディング病の診断は、たいていは臨床症状の分析に限られており、死後になってようやくタンパク質凝集体の組織病理学的検出によってはっきりさせることができる。最も将来性のある、バイオマーカーに基づく診断法は、体液中の病的なタンパク質凝集体を直接的に検出するものである。これらの方法は、極めて感度が高くなければならないだけでなく、モノマーと凝集したタンパク質コンフォメーションを区別できなければならない。これらの方法はしばしば、いわゆる免疫検出に基づいており、つまり抗原／抗体結合によるタンパク質凝集体の単離または検出に基づいている。これらの方法では、バイオマーカーとしてタンパク質凝集体を定量的に決定するために、内部標準体の使用が必要である。公開公報ＷＯ２０１３／０９２９５１Ａ２（特許文献１）からは、タンパク質凝集病またはアミロイド変性またはタンパク質ミスフォールディング病を特徴づける生体固有のタンパク質からの病因性の凝集体またはオリゴマーを定量化するための標準体が公知である。この標準体の特徴は、ポリマーがポリペプチド配列から合成されており、それらのポリペプチド配列の配列が、相応の部分領域内で、タンパク質凝集病もしくはアミロイド変性もしくはタンパク質ミスフォールディング病を特徴づける生体固有のタンパク質と同一であるか、または相応の部分領域にわたってこれらの生体固有のタンパク質と少なくとも５０％の相同性を有していることであり、これらのポリマーは凝集していない。エピトープの数を、その配列が上記の生体固有のタンパク質のエピトープを形成する部分領域と同一であるか、またはこの部分領域と少なくとも５０％の相同性を有しているポリペプチド配列を使用することによって決定し、ここでこのポリペプチド配列はエピトープの生物活性を有している。このように選択されるポリペプチド配列を所望の数で、当該発明による標準体を合成する際に組み込み、かつ／または当該発明により相互に連結させる。この標準体は、病因性の凝集体またはオリゴマーの実際の数を決定するのに適している。
【０００３】
欠点は、この標準体が限定的にしか使用できないことである。
【０００４】
凝集体の標準体は、組換えＡβまたは合成Ａβからさらに製造することができる。これに関しては、Ａβの凝集を適切なバッファー条件下で誘発する。その後、様々な凝集体を、特殊な遠心分離技術およびクロマトグラフィ技術によって精製することができる。それだけでなく凝集体を安定化させるために、化学的架橋のための方法、例えばいわゆるＧｒａＦｉｘ法（Ｋａｓｔｎｅｒら２００８、Ｓｔａｒｋ  ２０１０（非特許文献１））が寄与し得る。
【０００５】
したがって欠点は、タンパク質ミスフォールディング病の際に生じる病的なタンパク質凝集体およびオリゴマーを決定するためのこれまでのすべての標準体が、限定的にしか使用できないことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０９２９５１Ａ２
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｓｔｎｅｒら２００８、Ｓｔａｒｋ  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、従来技術からの欠点を有しておらず、長期にわたって使用可能で、とりわけ様々なタンパク質ミスフォールディング病を検出するための標準体として万能に使用可能な標準体を提供することである。本発明のさらなる課題は、上記標準体の製造方法を提供することおよび上記標準体の有利な使用を提示することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
課題の解決
本発明の課題は、請求項１に記載の標準体の製造方法、他の独立請求項に記載の標準体自体および標準体の使用によって解決される。有利な形態は従属請求項から明らかである。
【００１０】
発明の説明
タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体を検出するための標準体の本発明による製造方法は、以下のステップを有している：
Ａ）タンパク質ミスフォールディング病の凝集体のサイズの無機ナノ粒子を準備するステップ、
Ｂ）（アミンまたはカルボキシ官能化されたナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため）ナノ粒子の表面に遊離アミノ基または遊離カルボキシ基を形成するステップ、
Ｃ）ｉ）ステップＢ）での遊離アミノ基にマレインイミド−スペーサー−カルボン酸を結合するかまたは
ｉｉ）ステップＢ）での遊離カルボキシ基をＮＨＳエステルに変換するステップ、
Ｄ）タンパク質凝集体のモノマーを
ｉ）モノマーの自由端のスルフヒドリル基を介してマレインイミド−スペーサー−カルボン酸に結合するかまたは
ｉｉ）モノマーの自由端のアミノ基を介してＮＨＳエステルに結合するステップ。
【００１１】
ステップＡ）に関し、ナノ粒子を酸化できることが有利であり、というのもヒドロキシル基（ＯＨ基）が、その後の合成ステップのための優れた起点だからである。
【００１２】
本発明の一形態では、シリカナノ粒子を製造するためにステップＡ）でストーバー合成を実施することができる。ストーバー合成は、規定サイズのナノ粒子を製造できることが有利である。
【００１３】
製造する標準体のサイズは、実質的には、検出すべきタンパク質凝集体のサイズに基づいて決定される。これにより有利には、標準体が、未知の試料中で検出すべきタンパク質凝集体と同じサイズを有する。ここで、この試料は、少なくとも一部はヒトまたは動物の体外で分析される。
【００１４】
本発明のさらなる一形態では、シリカナノ粒子が、本発明によるナノ粒子の少なくとも外側のシェルとして存在していれば、ステップＢ）で遊離アミノ基を形成するために、エタノール中で例えばアミノプロピルトリエトキシシランにより表面のシラン化を行うことができる。
【００１５】
本発明のさらなる一形態では、ステップＢ）で遊離カルボキシ基を形成するために、アミノ基と無水コハク酸の反応が行われる。ただし、遊離カルボキシ基を別のやり方で形成してもよい。
【００１６】
本発明のさらなる一形態では、ステップＣ）ｉ）でマレインイミド−スペーサー−カルボン酸をステップＢ）の遊離アミノ基に結合する前に、このマレインイミド−スペーサー−カルボン酸をＮＨＳエステルに変換する。この反応ステップは、ステップＣ）ｉｉ）ではその代わりに遊離カルボキシ基をＮＨＳエステルに変換するので重要である。
【００１７】
本方法のステップＣ）では、ナノ粒子の表面を活性化する。従来技術で通常であるのとは違い、標準体を製造する際に、タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体の個性を考慮することが重要である。よってナノ粒子自体の活性化を、モノマーまたはエピトープを添加する前に行わなければならない。例：Ａβ１−４２モノマーのアミノ酸配列は公知である。同じことが、タンパク質ミスフォールディング病に関与するその他のモノマーおよびタンパク質にも当てはまる。Ａβ１−４２の場合には、例えば、使用される抗体に対するエピトープ領域が、遊離アミノ基の後のアミノ酸１−１１の領域に配置されており、かつ凝集を担う領域内ではないことが公知である。モノマーの活性化を行うと、モノマーをナノ粒子の表面に配置し得る前に、既にモノマーが相互間で反応および凝集してしまうという重大な危険があるであろう。この記述は、タンパク質ミスフォールディング病のその他のすべての公知のモノマーおよびタンパク質（表１を参照）にも完全に相応に該当する。よってステップＣ）では、ステップＣ）ｉ）またはステップＣ）ｉｉ）を実施することによりナノ粒子の表面を活性化しなければならない。
【００１８】
その際、カルボキシ末端をもつナノ粒子のＥＤＣ／ＮＨＳによる処理が、カルボン酸をＮＨＳエステルに変換する。ＮＨＳエステルはペプチド上の第一級アミンと共にアミドへと反応し、それによりこれらのペプチドが粒子に結合する。これに反し、ペプチドをＥＤＣ／ＮＨＳで処理すると、粒子表面と反応するだけでなく、ペプチド相互間の結合も起こる。
【００１９】
基本的に、ＮＨＳエステルに変換するための、ステップＣ）ｉ）の前のマレインイミド−スペーサー−カルボン酸またはステップＢ）からの遊離カルボキシ基と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応は、ステップＣ）ｉ）の前またはステップＣ）ｉｉ）中に実施することができる。合成経路におけるＮＨＳエステルの形成は、その後の反応物質間の反応を実施し得るために重要である。
【００２０】
この後、ステップＤ）ではタンパク質凝集体のモノマーを
ｉ）モノマーの自由端のスルフヒドリル基を介してマレインイミド−スペーサー−カルボン酸に結合するかまたは
ｉｉ）モノマーの自由端のアミノ基を介してＮＨＳエステルに結合する。
【００２１】
これに関し、タンパク質凝集体のモノマーの全部の配列がナノ粒子の表面に結合する必要はない。むしろ、（それが公知であれば）エピトープ領域を、マレインイミド−スペーサー−カルボン酸またはＮＨＳエステルに結合すれば十分に足り得る。
【００２２】
つまり本発明の意味において概念「モノマー」とは、後に標準体を使用する際に、特異的な抗体またはタンパク質ミスフォールディング病を検出するペプチドを結合させるために利用されるエピトープ領域または一般的に言えば認識配列のことでもある。
【００２３】
この標準体は、本発明の一形態では、ナノ粒子表面に複数のモノマー種を有することもできる。これにより、有利には、２種以上の様々なモノマーから成るタンパク質凝集体のための標準体も製造できる。
【００２４】
本発明のさらなる有利な一形態では、ステップＣ）ｉｉ）の実施後、ストレプトアビジン分子をナノ粒子のＮＨＳエステルに配置し、かつステップＤ）の前にビオチン基をタンパク質凝集体のモノマーに配置する。これにより、有利には、ビオチン基を有するモノマーを粒子に結合できる。
【００２５】
ただし、ステップＤ）ｉｉ）でのモノマーのアミノ基とＮＨＳエステルとの結合は共有結合で行うことができる。
【００２６】
タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体を検出するための標準体は、とりわけ、提示した方法によって提供される。しかし標準体はその他の方法でも提供することができる。
【００２７】
本発明によれば、ナノ粒子の表面の遊離アミノ基は、遊離カルボキシ基またはマレイミド基に変換される。
【００２８】
上述の方法は、特に、ただし他にもあるが、シリカナノ粒子の製造に関していることを指摘しておく。金粒子も何の問題もなく表面に遊離アミノ基またはヒドロキシル基を備え得る。
【００２９】
金ナノ粒子の場合はリガンド交換反応を用い、この反応では、対応するチオールを介して上位官能化（Ｏｂｅｒｆｕｎｋｔｉｏｎａｌｉｓｉｅｒｕｎｇ）が行われる。これに関しては、３−メルカプトプロピオン酸で金粒子のカルボキシ官能化が、および２−メルカプトエチルアミンでアミノ官能化が得られることを言及しておく。そのうえ、下で示すように量子ドットも本方法の出発材料として用いることができる。
【００３０】
タンパク質凝集体の小さめのサイズ範囲、つまり約４〜７ｎｍの範囲では、量子ドットがナノ粒子として特に適している。約２〜６０ｎｍのタンパク質凝集体の中くらいのサイズ範囲では金ナノ粒子、大きいサイズ範囲（＞４０ｎｍ）ではプラスチック粒子、例えばラテックス、修飾されたポリスチレンなども適している。
【００３１】
ただしタンパク質ミスフォールディング病を検出するための標準体としての本発明によるシリカナノ粒子は、有利には、全サイズ範囲にわたって使用可能であり、示したやり方で容易に製造可能である。
【００３２】
プラスチックナノ粒子およびシリカナノ粒子の場合、有利には、粒子に蛍光色素または量子ドットを備えさせ、こうすることで内部に標識をつけるという可能性がさらに存在し、これにより例えばｓＦＩＤＡの手法でおよび／または粒子の分光学的特性に関連して、品質検査としての標準体の追加的な利点が得られる。
【００３３】
つまり本発明によるシリカナノ粒子は、ストーバー合成により、非晶質二酸化ケイ素から成る粒子である。この手法は、シリカナノ粒子の表面にヒドロキシル基を備えさせることが有利である。
【００３４】
ストーバー合成により、有利には、幅広いサイズ範囲にわたって粒子を合成することができ、これらの粒子はそれぞれ、非常に狭い、好ましくは単分散のサイズ分布を有している。この特性は、標準体としてナノ粒子を使用する際に特に有利である。
【００３５】
シリカナノ粒子およびＱＤシリカナノ粒子の合成
第１の変形形態では、シリカナノ粒子をストーバー合成によって製造する。このために、合成すべきナノ粒子の所望のサイズに応じて、エタノール、水、およびアンモニア溶液を互いに適切な比率で接触させる。この手法では、テトラエトキシオルトシリケート（略：ＴＥＯＳ）を添加してストーバー合成を実施する。溶媒、触媒、および反応物質の互いに対する比率が、粒子のサイズを決定し、かつナノ粒子が検出すべきタンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体、例えばオリゴマーのサイズになるように選択される。結果として、所望の凝集体および／またはオリゴマーのサイズを有するシリカナノ粒子が存在する。このシリカナノ粒子の表面にはヒドロキシル基が存在する。触媒は任意選択で除去される。このために粒子溶液を、例えば透析膜に入れ替えて、透析することができ、または遠心分離することができる。
【００３６】
第２の変形形態では、蛍光性の量子ドット（ＱＤ）、好ましくはＣｄＳｅ／ＺｎＳを、（３−スルファニルプロピル）トリメトキシトキシシラン（ＭＰＳ）で官能化する。これらのナノ粒子は、テトラエトキシオルトシリケート（ＴＥＯＳ）もそうであるように、官能化によりエトキシシラン基を有する。このようなナノ粒子は、ある特定のサイズのシリケートシェルを形成するために、ストーバー合成での結晶化中心として使用することができる。有利には、量子ドット自体の蛍光特性を備えたシリカＱＤ粒子が生じる。このようなシリカＱＤナノ粒子の表面もヒドロキシル基を有している。
【００３７】
その後、シリカナノ粒子またはＱＤシリカナノ粒子を、例えばアミノプロピルトリエトキシシラン（略：ＡＰＴＥＳ）でシラン化する。これにより、有利には、粒子の表面に遊離アミノ基が固定化される。これに応じて生じる分子は、アミノ官能化シリカナノ粒子である（図１の［１］を参照）。３−アミノプロピルシリカナノ粒子または３−アミノプロピルシリカＱＤナノ粒子が生じる。
【００３８】
本方法の一変形形態では、この遊離アミノ基に無水コハク酸を結合させることができ、これによりカルボキシ官能化シリカナノ粒子が形成される。反応によりこの粒子は遊離カルボキシ基を有する（図１の［２］を参照）。
【００３９】
ナノ粒子表面では、多数の、好ましくは既知数のこのような遊離アミノ基またはカルボキシ基が配置されていることは自明である。
【００４０】
量子ドットの製造  表面修飾
さらなる一変形形態では、量子ドット（Ｑドット）をそのままコアとして使用する。量子ドットは市販されている。とりわけ蛍光特性をもつ小さなナノ粒子には、例えばＣｄＳｅ／ＺｎＳから成るいわゆるコア−シェル量子ドットが特に良く適している。これらの量子ドットは例えば２〜７ｎｍの範囲内であることができる。直径が大きくなるにつれ、蛍光が青から赤の方向にずれる。
【００４１】
さらなる本発明によるステップで、０．１ｎＭのＱドット（量子ドット）を、チオール−スペーサー−酸混合物と混ぜる。このチオール−スペーサー−酸混合物の例は、例えばＣＨＣｌ３１ｍｌ中の５５０ｍＭテトラメチルアンモニウムヒドロキシド、２７５ｍＭチオール−スペーサー−酸（例えば３−メルカプトプロピオン酸）から成っており、生じる水相は除去される。この溶液をＱドットと混合し、２日後、ＰＢＳ５０μＬを添加する。抽出によりＱドットが水相に移動し、カルボキシ官能化Ｑドットが得られる。
【００４２】
別の一変形形態では、乾燥したＱドット１ｍｇを、メタノール中でアミノ−スペーサー−チオール混合物と混ぜる。このアミノ−スペーサー−チオール混合物は、アミノ−スペーサー−チオール（例えば：２，２’−ジアミノジエチルジスルフィド）１００ｍｇを含んでいる。この混合物を、溶液がＱドットを取り込むまで超音波処理する。この混合物を遠心分離機にかけ、水中に取り込む。水相中にアミノ末端をもつＱドットが存在する。
【００４３】
ナノ粒子へのモノマーまたはエピトープ、一般的には認識配列のカップリング
カルボキシ末端をもつナノ粒子を、言及したように反応性ＮＨＳエステルに変換する。ＮＨＳエステルの形成は、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（略：ＥＤＣ）および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（略：ＮＨＳ）によって行われる。ＮＨＳエステルは、検出すべきタンパク質ミスフォールディング病のモノマーとして添加される第一級アミンと反応するための反応性の中間段階である。
【００４４】
本発明による方法の第２の変形形態は、図１の［１］からのアミノ官能化ナノ粒子を、マレインイミド−スペーサー−カルボキシ、例えば６−マレインイミドカプロン酸またはマレインイミド−ＰＥＧ（任意選択の長さ）−ＣＯＯＨと反応させる。この経路は図２Ｂに示している。
【００４５】
これにより、有利には、特異的にチオールと反応する基がナノ粒子の表面に導入される。
【００４６】
第３の変形形態では、上述のＮＨＳエステル粒子を、ナノ粒子の表面にストレプトアビジンを結合するために使用する（図２Ｃを参照）。
【００４７】
このような、つまりタンパク質凝集体のモノマー（またはエピトープ）なしのナノ粒子としてのナノ粒子は新規であり、これにより既に本発明の課題を解決している。
【００４８】
【化１】
2018514754.tif 000003
は、例えばシリカナノ粒子（ＳＩＮＰ）の表面にＮＨＳエステルを有する特に好ましい出発生成物の１つである。
【００４９】
【化２】
2018514754.tif 000004
は、例えばシリカナノ粒子（ＳＩＮＰ）の表面にマレインイミド基を有する特に好ましい出発生成物の１つである。
【００５０】
もちろんナノ粒子の表面には、ここではそれぞれ１個しか描かれていない化合物がたくさん配置されている。その数は、有利には、計算により正確に決定され、かつ粒子の直径に依存している。
【００５１】
本発明によるナノ粒子は、特に、本発明による製造方法によって製造または提供される。
【００５２】
表面にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをもつナノ粒子は、任意選択的にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを遊離しながら、検出すべきタンパク質ミスフォールディング病の任意選択的に凝集体および／またはオリゴマーのモノマーまたは合成エピトープの第一級アミンと反応する。
【００５３】
この方法は、モノマーのペプチド配列においてアミノ酸のリジンが１つまたは複数存在している場合に特に適している。この方法は、このアミノ酸が、エピトープ領域、つまり抗体のための結合領域には存在していない場合に特に適している。リジンがない場合、アミノ酸配列のＮ末端自体をナノ粒子との結合に使用することができるか、または追加的にリジンを導入したペプチド配列を使用することができる。
【００５４】
表面にマレインイミド基をもつナノ粒子は、任意選択的に、モノマーまたはエピトープのタンパク質配列内のもともと存在しているかまたは合成によってもたらされたチオール（例えばシステイン）と反応する。
【００５５】
表面にストレプトアビジンを有するナノ粒子は、ビオチン化されたモノマーまたはエピトープを特に強く結合させる。
【００５６】
上で挙げたモノマーまたはエピトープなしの標準体は、特に有利には、タンパク質ミスフォールディング病を検出するためのモノマーまたはエピトープを備えた標準体を引き続き製造するためのプラットフォーム技術として万能に使用可能である。モノマーまたはエピトープなしの標準体は、とりわけキットで、タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体のタンパク質またはモノマーまたはエピトープと一緒に、溶媒と一緒に提供される。
【００５７】
これらのシリカナノ粒子は、任意選択的にＮ−ヒドロキシスクシンイミドを遊離しながら、検出すべきタンパク質ミスフォールディング病の凝集体および／またはオリゴマーのモノマーの第一級アミンと反応する。
【００５８】
変形形態１では、モノマーの第一級アミンと反応する際にＮ−ヒドロキシスクシンイミドは遊離し（図２Ａおよび図２Ｃを参照）、これに反して変形形態２では、ＮＨＳエステルはシリカナノ粒子に留まる（図２Ｂを参照）。
【００５９】
スペーサー有りまたは無しでＮＨＳエステルにモノマーを結合するさらなる経路は、図２Ａ〜図２Ｃの一般的な経路に示されている。これらの経路は、生体機能化の様々な経路を説明している。化学的な表面特性に基づき、修飾は簡単に実施することができる。そのうえこの材料は、生理学的バッファー溶液中で安定しており、かつ健康に害がないとみなされる。
【００６０】
とりわけ、上で示した本発明による生体機能化シリカナノ粒子は、到達可能なエピトープの数を正確に決定可能で、安定しており、厳密にサイズを規定された標準体であり、これにより同様に、有利には、タンパク質ミスフォールディング病のための診断テスト法またはスパイク実験においてプラットフォーム技術として適用される。
【００６１】
タンパク質ミスフォールディング病の際に発生するタンパク質またはタンパク質凝集体の概要を表１に示している。対応するタンパク質凝集体のサイズは文献から公知である。例として、アルツハイマー型認知症のアミロイドβオリゴマーのサイズは約２０ｎｍである。
【００６２】
これに対応して、本方法のステップＡ）およびＢ）を実施する。
【００６３】
【表１】
2018514754.tif 000005
【００６４】
この場合、タンパク質ミスフォールディング病の毒性の凝集体および／またはオリゴマーを検出するための標準体は、無機ナノ粒子を含んでおり、この無機ナノ粒子の表面には、検出すべきタンパク質ミスフォールディング病の凝集体のモノマーまたはモノマーのエピトープのためのある特定の数の結合部位が配置されている。
【００６５】
これにより、有利には、このナノ粒子が結合部位ともども、いろいろなタンパク質ミスフォールディング病のためのプラットフォーム技術として利用することができる。
【００６６】
本発明の一形態では、モノマーを担持したナノ粒子が、タンパク質ミスフォールディング病の凝集体および／またはオリゴマーに相当するサイズを有している。
【００６７】
これにより、タンパク質ミスフォールディング病の際に発生する種のサイズに関して特に優れた模倣が成功することが分かった。
【００６８】
したがって本発明の一形態では、標準体におけるエピトープの数は、タンパク質凝集体に存在するモノマーまたはエピトープの数に相当する。よって、有利には、標準体は、天然に発生している毒性の凝集体および／またはオリゴマーのような結合部位の数を有している。
【００６９】
本発明のさらなる有利な一形態では、標準体のサイズは２〜２００ｎｍ、好ましくは２〜６０ｎｍ、特に好ましくは２〜２０ｎｍである。とりわけ約２〜２０ｎｍのサイズの場合には、たいていのタンパク質ミスフォールディング病の凝集体および／またはオリゴマーも入っている。つまりこの措置で、たいていのタンパク質ミスフォールディング病の毒性の凝集体および／またはオリゴマーと同一サイズの標準体が提供される。
【００７０】
シリカナノ粒子は、とりわけ有利には、ストーバー合成により規定通りに合成できる。その際、とりわけサイズが２〜２０または２５ｎｍの非常に小さなコアも製造することができる。シリカナノ粒子は、有利には、１〜２００ｎｍの大きさで製造可能であり、これに関してはあらゆる中間値を取ることができる。
【００７１】
ただし標準体は、金ナノ粒子または量子ドットをコアとして有していてもよい。
【００７２】
標準体は、金または量子ドットをコアとして有しており、かつシリケート層によって包まれていてもよい。
【００７３】
ナノ粒子の表面に、特に有利には、毒性の凝集体および／またはオリゴマーのモノマーを結合するための活性化したＮＨＳエステル、マレインイミド基またはストレプトアビジンが配置される。
【００７４】
ある特定の標準体は、特に有利には、約２５ｎｍ大のシリカナノ粒子のＮＨＳエステル活性化された表面に配置されたアルツハイマー型認知症の約４０個のアミロイドβモノマーを有する。これにより、有利には、検出すべき毒性のアミロイドβオリゴマーとおおよそ同一のサイズおよび任意選択的に空間構造を有し、かつ凝集体におけるのとおおよそ同じ数のエピトープを有する標準体が提供される。これにより、毒性のアミロイドβオリゴマーのように特定のおよびそれと類似の、抗体に対する結合能力を有する標準体が提供されることが分かった。
【００７５】
本発明の枠内で、従来技術の方法に従って製造された凝集体の標準体が、本発明による標準体がもう有していない幾つかの深刻な欠点を有していることが分かった。従来技術での欠点は、例えば均一性の不足に関している。タンパク質凝集はスピードが重大な意味を有するプロセスなので、精密な、予め規定したサイズの凝集体の製造は大きな挑戦である。サイズ分布が不均一であることも問題となり得る。これらの欠点は、これまでは取り除くことができなかった。
【００７６】
さらに、これまでの方法および標準体の適応力不足は、従来技術での基本的な問題である。こうして、表１にまとめたような疾患に関連するいろいろなタンパク質凝集体を検出するために、例えばｓＦＩＤＡ法を適合させることができる。ただしこの場合にはまず最初に、各々の凝集体の標準体に対し、手間のかかる実験で適切な凝集条件および精製条件を確定しなければならない。時として特定のタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではまったく凝集しないか、または満足な量では単離できない準安定性の中間体しか供給しない。
【００７７】
とりわけ、従来技術に基づく標準体の安定性は不十分であり、したがって標準体の使用が時間的に限られることが分かった。とりわけ、従来技術に基づく標準体は精製後および貯蔵中にさらに凝集する可能性があり、これはサイズ分布に望ましくない効果をもつ。
【００７８】
加えて本発明の枠内で、従来技術でのエピトープの到達性が不十分であることが分かった。比較的大きなタンパク質凝集体では、モノマーサブユニットの正確な数が公知である場合でさえ、抗体結合のために到達可能なエピトープの数を定量化することは困難である。
【００７９】
従来技術に基づく標準体では、タンパク質配列の選択でも制限があり、それによってもこの標準体の限定的な使用が生じていたことがさらに分かった。タンパク質配列が、少なくとも、凝集を担う疎水性の領域も抗体結合のためのエピトープも内包していなければならない。
【００８０】
上述の理由から、従来技術に基づく標準体は、製造および使用可能性において不経済なことが明らかである。結局は表面しか必要ないにもかかわらず、凝集体を製造するためにたいていは高価なタンパク質を使用する。
【００８１】
したがって本願では、割安な無機ナノ粒子も標準体の基体として使用する。
【００８２】
そのうえ従来技術での標準体には、サイズ分布が不均一なので生成物を精製するために時間および費用のかかる（例えばクロマトグラフィによる）方法が必要である。
【００８３】
その他の点では、従来技術に基づく標準体は機能的にも限定的にしか使用できない。つまり、従来技術に基づく標準体に標識可能性が不足していることが問題である。均一な凝集体の場合にはしばしば、所望の化学的修飾（例えば蛍光標識化）が、例えばエピトープの到達性のような特性に悪影響を及ぼし得る。
【００８４】
本発明による標準体は上述の欠点を有していない。本発明による標準体はむしろ狭いサイズ分布を有しており、生体共役のための表面修飾が可能である。その他の点では、本発明による標準体は所望のサイズ範囲内で水溶性である。本発明による標準体は、とりわけプラットフォーム技術のための標準体としてのその所望の特性を失うことなく、比較的長期にわたって貯蔵することができる。
【実施例】
【００８５】
以下に、実施形態の例および添付の図に基づいて本発明をより詳しく説明するが、これにより本発明を限定する意図はない。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】プラットフォーム技術としてのシリカナノ粒子の基体の製造を示す。
【図２Ａ】変形形態２Ａに基づくシリカナノ粒子の製造を示す。
【図２Ｂ】変形形態２Ｂに基づくシリカナノ粒子の製造を示す。
【図２Ｃ】変形形態２Ｃに基づくシリカナノ粒子の製造を示す。
【図３】２０および８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰならびに２０ｎｍ大の２−ＭＡＰ−ＳｉＮＰについてｓＦＩＤＡによって測定した結果を示すグラフである。
【図４】２０および８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰならびに２０ｎｍ大の２−ＭＡＰ−ＳｉＮＰについてｓＦＩＤＡによって測定した結果を示すグラフである。
【図５】２０および８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰならびに２０ｎｍ大の２−ＭＡＰ−ＳｉＮＰについてｓＦＩＤＡによって測定した結果を示すグラフである。
【図６】２０および８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰならびに２０ｎｍ大の２−ＭＡＰ−ＳｉＮＰについてｓＦＩＤＡによって測定した結果を示すグラフである。
【図７】２０および８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰならびに２０ｎｍ大の２−ＭＡＰ−ＳｉＮＰについてｓＦＩＤＡによって測定した結果を示すグラフである。
【図８】以下のことを示している。Ａ  カルボキシ官能化量子ドットを生じさせる３−メルカプトプロピオン酸によるＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの表面官能化。Ｂ  アミノ官能化ナノ粒子を生じさせる２−メルカプトエチルアミンによるＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの表面官能化。Ｃ  シラン化量子ドットを生じさせる（３−スルファニルプロピル）トリメトキシトキシシランによるＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの表面官能化。
【００８７】
図３〜図７については、シリカナノ粒子をＨ２Ｏ、血漿および髄液（ＣＳＦ）中で系列的に希釈し、ｓＦＩＤＡでの２回または３回の決定で測定した。異なる標識をつけた２種の抗Ａβ抗体（ＩＣ１６−Ａｌｅｘａ６３３および６Ｅ１０−ＡＴＴＯ４８８）により官能化シリカナノ粒子を検出した後、ＴＩＲＦ顕微鏡での測定を行った。２種の蛍光色素のシグナルを異なるチャンネルで受光した（チャンネル１：ｅｘ６３３ｎｍ、ｅｍ７０５ｎｍ；チャンネル２：ｅｘ４８８ｎｍ、ｅｍ５２５ｎｍ）。各々のチャンネルからの規定の閾値より上の結果のみを（カットオフ）一緒にデータ分析に流し込んだ。両方のチャンネルを相互に共局在化させ、共局在化した結果の強度をｓＦＩＤＡリードアウトとして示した。
【００８８】
シリカナノ粒子の製造
以下では、アルツハイマー診断法に適用するためのアミロイドβシリカナノ粒子（Ａβ−ＳｉＮＰ）に基づいて製造を説明する。
【００８９】
Ｉ．ＳｉＮＰの全般的な合成
１．天然の毒性のＡβオリゴマーもおおよそこのサイズなので、直径２０ｎｍのシリカナノ粒子を製造する。
【００９０】
このためにエタノール、水、およびアンモニア溶液を、（所望のサイズに応じた）適切な比率でフラスコに入れ、強く撹拌する。２分後、ＴＥＯＳ（トリエトキシオルトシリケート）を添加する。この溶液を２日間室温で撹拌する（ストーバー合成）。２０ｎｍのＳｉＮＰのためには、エタノール（９９％）２００ｍｌ、水（脱イオン）２．７ｍｌ、アンモニア（３０％）４．４７ｍｌを撹拌し、ＴＥＯＳ４．４３ｍｌを混ぜる。反応は、室温で２日間、強く撹拌しながら実施した。
【００９１】
２．過剰な反応物質および触媒を除去するため、粒子溶液を透析膜（ＭＷＣＯ３５００）に入れ替えて、２日間エタノールに対して透析する。
【００９２】
３．シラン化のため、エタノール中のＳｉＮＰにアミノプロピルトリエトキシシランを付与し、これにより粒子表面に遊離アミノ基が固定化される。アミノプロピルトリエトキシシランは、アミノプロピルトリエトキシシラン分子の空間的に可能な結合数に対して５倍過剰に添加する。翌日、３回の遠心分離ステップとエタノールでの洗浄ステップにより、過剰なアミノプロピルトリエトキシシランを除去する。粒子を再び分離するため、各々の遠心分離ステップ（３０００ｇ、少なくとも２時間）の後にペレットを少なくとも２０分間超音波処理しなければならない。
【００９３】
２０ｎｍのＳｉＮＰの場合、エタノール中ＳｉＮＰ溶液（１０ｇ  ｌ−１）５０ｍｌに、ＡＰＴＥＳ１２０μｌを加えて一晩中撹拌する。
【００９４】
様々な生体機能化の経路をたどることができる。単に例として、つまりまったく制限する意図なく、その後の経路をより詳しく説明する。
【００９５】
Ａ．アミロイドβオリゴマー１−４２および２−ＭＡＰペプチドによる修飾、図１、図２Ａ
４Ａ．次のステップでは、アミノ基と無水コハク酸の反応により、粒子表面にカルボキシ基をもたらす。このために、粒子ペレットをアルゴン雰囲気下で０．１ＭのＤＭＦ中無水コハク酸に溶解し、２０分間超音波処理し、続いて一晩中室温のアルゴン雰囲気下で撹拌する。翌日、エタノールを用いた３回の遠心分離ステップと洗浄ステップ（３０００ｇ、少なくとも２時間）により、ＤＭＦ溶液をエタノールと交換する。粒子を再び分離するため、各々の遠心分離ステップの後にペレットを少なくとも３０分間超音波処理しなければならない。
【００９６】
２０ｎｍのＳｉＮＰの場合、（ステップ３Ａからの）アミン化ＳｉＮＰ５００ｍｇを、０．１ＭのＤＭＦ中無水コハク酸溶液５０ｍｌ中で一晩中撹拌する。
【００９７】
このやり方で［２］に基づくナノ粒子がもたらされる（ｃＳｉＮＰ）。これを用いて図２Ａに基づくステップを行う。
【００９８】
５Ａ．導入されたカルボキシ基は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により、第一級アミンと反応するための反応性の中間段階であるＮＨＳエステルに変換される。このために粒子ペレットを、１０ｍＭのＭＥＳバッファー（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）に取り、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、粒子表面の予測されるカルボキシ基に対して４：１の比率で添加する。タンパク質は、Ｎ末端で第一級アミノ基を有しているかまたは第一級アミンが側基（例えばリジン）に存在するので、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化は、タンパク質のカップリングに使用される。
【００９９】
６Ａ．活性化した粒子を次のステップで、それぞれの生体分子に付与するかまたはその逆をする。ここでは、言及したように様々な潜在的なバイオマーカーまたはその他のペプチドを利用することができる。この具体例では、Ａβ１−４２ペプチドおよび／または２−ＭＡＰペプチド（後者は２つのカップリングされたＡβ１−１１ユニットから成る）を、シリカナノ粒子上の活性化した結合部位に共有結合させた。ペプチド相互間での架橋を阻止するため、過剰な１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを予め除去した。これは、１０ｍＭのＭＥＳバッファーに対する２回の遠心分離ステップと洗浄ステップ（３０００ｇ、０．５時間）によって行われる。この反応ステップはスピードが重視され、２〜３時間以内に実施されるべきである。
【０１００】
７Ａ．活性化した粒子を、１０ｍＭのＭＥＳバッファー中で、ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）から蒸発した乾燥した相応のペプチドの一定分量に付与し、これにより潜在的に自由な結合部位とペプチドのおおよそで５：１の比率を生じさせる。なぜなら約１０個に１個の結合部位に、空間的に１つのペプチドが結合できるからである（直径２０ｎｍに対して計算）。
【０１０１】
混合物を３０分間超音波処理し、これによりタンパク質薄膜を容器壁から剥がし、一晩中振動させながら室温でインキュベートする。
【０１０２】
８Ａ．翌日、結合していないペプチドを除去するために粒子を遠心分離に付してＨＦＩＰ中に取り、３０分間超音波処理する。２回のさらなる遠心分離ステップと水中での洗浄ステップの後には、水中に生体機能化シリカナノ粒子（例ではＡβ１−４２−ＳｉＮＰまたは２−ＭＡＰ−ＳｉＮＰ）が存在しており、その後の利用まで４℃で貯蔵することができる。
【０１０３】
Ｂ．合成エピトープ（オリゴペプチド）による共有結合修飾（図１、図２Ｂ）
Ａからのステップ４Ａの代わりに、ステップ４Ｂを行う。全般的なステップ３からのアミン化シリカナノ粒子（図１および図２Ｂでの［１］を参照）をＰＢＳ中に移す。これは、遠心分離（３０００ｇ、２０分、２５℃）とＰＢＳでの２回の洗浄によって行われる。ナノ粒子を超音波浴中での処理によって再び分散させる。
【０１０４】
５Ｂ．二官能性分子のマレインイミド−スペーサー−カルボン酸、例えばここでは６−マレインイミドカプロン酸をＤＭＦまたは水中に溶かし、ＥＤＣおよびＮＨＳと１：４：１の比率でＰＢＳ中で混合し、カルボン酸を反応性ＮＨＳエステルに変換するために３０分間室温で撹拌する。
【０１０５】
６Ｂ．この反応混合物を、全般的なステップ３からのアミン化シリカナノ粒子に添加し、詳しくは、存在しているアミン基に対して５倍モル過剰に添加する。直径２０ｎｍの場合、シリカナノ粒子上には約２０９５個の第一級アミン基が存在する。反応溶液を１時間、室温で撹拌する。
【０１０６】
７Ｂ．ＮＨＳと同じ濃度のエタノールアミンによって反応を停止させる。
【０１０７】
８Ｂ．末端にシステインまたはシスタミンを有する相応の合成エピトープ（例えば：Ａｂ１−１１＋ＳＨ）を、２０ｍＭのＰＢＳ中ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）溶液に溶解し、１時間インキュベートする。ＴＣＥＰは、場合によっては有り得るジスルフィドをチオールへと還元する。その後この溶液を、エピトープと、官能化すべき粒子の可能な表面部位（２０ｎｍ：２０９５）とのモル比が１：１になるように添加する。一晩中（約８時間）撹拌しながら反応を実施する。
【０１０８】
９Ｂ．ＰＢＳに対する透析（透析膜ＭＷＣＯ３５００）によって、または遠心分離（３０００ｇ、少なくとも２時間）と２回のＰＢＳ洗浄ステップによって精製を行う。
【０１０９】
図２Ｂの反応経路の最後には、図２Ａでの最終生成物に類似して、スペースの理由からもう示されていない概略的には球形のナノ粒子が、標準体として存在していることは自明である。
【０１１０】
Ｃ．合成エピトープ（オリゴペプチド）による非共有結合修飾、図１、図２Ｃ
全般的なステップ１〜３ならびにＡ．からの４Ａ、５Ａおよび６Ａの後、Ａ．からのステップ７Ａの代わりにステップ７Ｃを行う。ステップ６Ａからの活性化した粒子を、１０ｍＭのＭＥＳバッファー中で、ＰＢＳ中のストレプトアビジンと混合し、これにより潜在的に自由な結合部位とペプチドのおおよそで２０：１の比率が生じる。なぜなら約４０個に１個の結合部位に、空間的に１つのストレプトアビジンが結合できるからである（直径２０ｎｍに対して計算）（図２Ｃを参照）。
【０１１１】
８Ｃ．２時間後、ＮＨＳと同じモル比のＰＢＳ中エタノールアミンによって反応を抑える。続いて、ＰＢＳに対して透析（ＭＷＣＯ３５００）するか、または遠心分離に付して（３０００ｇ、少なくとも２時間）、２回ＰＢＳで洗浄する。
【０１１２】
９Ｃ．相応のビオチン化オリゴペプチド（またはエピトープ、図２Ｃを参照、白抜きの三角としてのビオチン基）をＰＢＳ中に溶解し、（理論上結合するストレプトアビジンの数に対して）１：１の比率で官能化ＳｉＮＰと混合して、２時間撹拌する。
【０１１３】
１０Ｃ．粒子を遠心分離に付して（３０００ｇ、少なくとも２時間）、２回ＰＢＳで洗浄する。
【０１１４】
図２Ｃの反応経路の最後には、図２Ａでの最終生成物に類似して、スペースの理由からもう示されていない概略的には球形のナノ粒子が、標準体として存在していることは自明である。
【０１１５】
分析
−  粒子の特徴づけ（サイズ、均一性、流体力学的半径）は、ＴＥＭ（透過型電子分光法）およびＤＬＳ（動的光散乱）の記録に基づいて行われる。
−  粒子の濃度は、各々のステップの後に、濃縮器での溶媒除去および既知のサイズに基づく計算により、重量測定法で決定することができる。
−  成功した官能化ステップは、ＦＴＩＲスペクトル（フーリエ変換赤外線分光法）によって記録される。
−  ペプチドの数は、例えば以下のように確定することができる：
【０１１６】
活性化した粒子をシステインＡβで官能化する。これにより、結合したペプチドごとに１つのチオール基が導入され、チオール基はエルマン試薬との化学量論的な１：１の反応によって検出することができる。この場合、システインのチオールとＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）；エルマン試薬）とが、２−ニトロ−５−チオベンゾアート（ＴＮＢ−）を遊離しながら反応し、ＴＮＢ−は黄色の色素ＴＮＢ２−へと脱プロトン化し、４１２ｎｍの波長で定量化することができる。
【０１１７】
結果
図３は、Ｈ２Ｏ中で１ｎＭ〜１ｆＭに希釈した２０ｎｍのＡβ１−４２−ＳｉＮＰに関するｓＦＩＤＡリードアウトを示している。試料は、ｓＦＩＤＡでの３回の決定で測定した。
【０１１８】
ｓＦＩＤＡリードアウトの明らかな濃度依存性が分かる。
【０１１９】
図４は、Ｈ２Ｏ中で１ｎＭ〜１ｆＭに希釈した２０ｎｍの２ＭＡＰ−ＳｉＮＰに関するｓＦＩＤＡリードアウトを示している（２ＭＡＰ分子は、２つの相互にカップリングされたＡβ１−１１サブユニットから成る）。
【０１２０】
試料は、ｓＦＩＤＡでの２回の決定で測定した。ｓＦＩＤＡリードアウトの明らかな濃度依存性が分かり、かつＨ２Ｏ対照群が非常に低いフェムトモル範囲までとはっきりと一線を画していることが分かる。
【０１２１】
図５は、Ｈ２Ｏ中での８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰの系列希釈に関するｓＦＩＤＡリードアウトを示している。Ａβ１−４２−ＳｉＮＰ濃度とｓＦＩＤＡリードアウトの間の明確な相関関係が分かる。
【０１２２】
図６では、ＣＳＦ中での８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰの系列希釈に関するｓＦＩＤＡリードアウトを示している。Ａβ１−４２−ＳｉＮＰ濃度とｓＦＩＤＡリードアウトの間の明確な相関関係が分かる。
【０１２３】
図７は、血漿中での８０ｎｍ大のＡβ１−４２−ＳｉＮＰの系列希釈に関するｓＦＩＤＡリードアウトを示している。Ａβ１−４２−ＳｉＮＰ濃度とｓＦＩＤＡリードアウトの間の明確な相関関係が分かり、かつ血漿対照群からのシグナルが明らかに一線を画していることが分かる。
【０１２４】
図８は以下のことを示している。
Ａ  カルボキシ官能化量子ドットを生じさせる３−メルカプトプロピオン酸によるＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの表面官能化。
Ｂ  アミノ官能化ナノ粒子を生じさせる２−メルカプトエチルアミンによるＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの表面官能化。
Ｃ  シラン化量子ドットを生じさせる（３−スルファニルプロピル）トリメトキシトキシシランによるＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの表面官能化。その後、このシラン化量子ドットをストーバー合成によりシリケートシェルによって取り囲むことができる。
【０１２５】
タンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体および／またはオリゴマーを検出するための標準体の製造方法は、以下のステップによって行われる：
【０１２６】
Ａ）検出すべきタンパク質ミスフォールディング病のタンパク質凝集体および／またはオリゴマーのサイズの無機ナノ粒子を準備するステップ。
【０１２７】
Ｂ）認識配列をカップリングするステップ（３つの変形形態）。
【０１２８】
変形形態１．第一級アミンへの認識配列のカップリング
ｉ．アミンまたはカルボキシ官能化ナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため、ナノ粒子の表面に遊離アミノ基またはカルボキシ基を形成する。
ｉｉ．任意選択的に：遊離アミノ基をカルボキシ基に変換する。
ｉｉｉ．ナノ粒子の表面のカルボキシ基をＮＨＳエステルに変換する。
ｉｖ．ステップｉｉｉ）からのＮＨＳエステルに、タンパク質ミスフォールディング病の潜在的に毒性の凝集体および／またはオリゴマーのモノマーのアミノ基を結合する。
ｖ．
【０１２９】
変形形態２．チオールでの認識配列のカップリング
ｉ．アミノ官能化ナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため、ナノ粒子の表面に遊離のアミノ基またはカルボキシ基を形成する。
ｉｉ．第一級アミンにカルボキシ−スペーサー−マレイミド分子をカップリングする。
ｉｉｉ．ステップｉｉ）からのマレイミド基に、タンパク質ミスフォールディング病の認識配列またはオリゴマーペプチドのチオール基を結合する。
【０１３０】
変形形態３．
ｉ．アミノ官能化ナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため、ナノ粒子の表面に遊離アミノ基を形成する。
ｉｉ．アミンまたはカルボキシ官能化ナノ粒子へとナノ粒子表面を官能化するため、ナノ粒子の表面に遊離のアミノ基またはカルボキシ基を形成する。
ｉｉｉ．任意選択的に：遊離のアミノ基をカルボキシ基に変換する。
ｉｖ．ナノ粒子の表面のカルボキシ基をＮＨＳエステルに変換する。
ｖ．ステップｉｖ）からのＮＨＳエステルに、ストレプトアビジンのアミノ基を結合する。
ｖｉ．ストレプトアビジン分子に、タンパク質ミスフォールディング病のビオチン化された認識配列を結合する。
【０１３１】
概念定義
本発明の意味において、以下の概念は下記のように理解されるべきである。
【０１３２】
エピトープとは、免疫学において、抗原の表面のうち、抗体が結合し得る領域のことである。
【０１３３】
抗原とは、免疫学において、免疫系によって異物とみなされる分子のことである。
【０１３４】
アシル基、アシル、またはアルカノイルとは、化学において、一般構造がＲ−（Ｃ＝Ｏ）−の官能基のことであり、これに関しＲは、オルガニル残基（アルキル基、アリール基、もしくはヘテロ芳香族基など）または水素原子である。
【０１３５】
イミド（イミド化合物）は、官能基Ｒ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、つまりジアシルアミドである有機化合物の一物質群である。
【０１３６】
スクシンイミドは、カルボン酸イミドの群からの一化合物およびコハク酸のイミドである。
【０１３７】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、構造式ではたいていＨＯＳｕと略され、ＩＵＰＡＣによれば１−ヒドロキシ−２，５−ピロリジンジオン）は、スクシンイミドのＮ−ヒドロキシ誘導体である。この物質は、有機合成において、とりわけいわゆるＮＨＳエステルを製造するために使用される。
【０１３８】
ＮＨＳエステルは、「活性化カルボン酸」であり、アルコールより明らかに求核性の（例えばペプチドまたはタンパク質の）アミノ官能基と容易に反応する。
【図１】
2018514754.tif 000007
【図２Ａ】
2018514754.tif 000008
【図２Ｂ】
2018514754.tif 000009
【図２Ｃ】
2018514754.tif 000010
【図３】
2018514754.tif 000011
【図４】
2018514754.tif 000012
【図５】
2018514754.tif 000013
【図６】
2018514754.tif 000014
【図７】
2018514754.tif 000015
【図８】
2018514754.tif 000016
【国際調査報告】
2018514754.tif 000017
2018514754.tif 000018
2018514754.tif 000019
2018514754.tif 000020
2018514754.tif 000021
2018514754.tif 000022
2018514754.tif 000023
2018514754.tif 000024