(57)【要約】  本発明は、抗ＬＡＧ‐３抗体、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６、並びにこのような抗体のヒト化及びキメラバージョンを対象とする。本発明は更に、このような抗ＬＡＧ‐３抗体のＬＡＧ‐３結合断片、免疫結合体を含むＬＡＧ‐３結合分子：並びに（ｉ）このようなＬＡＧ‐３結合断片、及び（ｉｉ）免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等を含む二重特異性分子に関係する。本発明はまた、ＬＡＧ‐３を検出する方法、及び免疫応答を刺激するためにＬＡＧ‐に結合する分子を使用する方法にも関係する。【選択図】図１０Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＬＡＧ‐３及びカニクイザルＬＡＧ‐３の両方に結合できるＬＡＧ‐３結合分子であって、
前記ＬＡＧ‐３結合分子は、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを備え、
前記可変重鎖ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、前記可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み：
（Ａ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８、配列番号９及び配列番号１０を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有し；
又は
（Ｂ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８、配列番号９及び配列番号１０を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２８、配列番号１４及び配列番号１５を有し；
又は
（Ｃ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８を有し；
又は
（Ｄ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８を有し；
又は
（Ｅ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５６、配列番号５７及び配列番号５８を有し；
又は
（Ｆ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８を有し；
又は
（Ｇ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８を有し；
又は
（Ｈ）（１）前記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｈＡｂ  ６の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し；
（２）前記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ｈＬＡＧ‐３  ｈＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８７、配列番号７７及び配列番号７８を有する、ＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項２】
前記分子は抗体である、請求項１に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項３】
前記分子は、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項４】
前記分子は、配列番号１６、配列番号１８、配列番号７９又は配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを備える、請求項１又は３に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項５】
前記分子は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号８３又は配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを備える、請求項１、３又は４に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項６】
前記分子は、ヒトＬＡＧ‐３及び第２のエピトープに同時に結合できる二重特異性結合分子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項７】
前記第２のエピトープは、免疫細胞の表面に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープである、請求項６に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項８】
前記第２のエピトープは、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープである、請求項６に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項９】
前記分子は：
（ａ）ダイアボディであり、前記ダイアボディは、２つ若しくは３つ若しくは４つの異なるポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である：又は
（ｂ）３価結合分子であり、前記３価結合分子は、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１０】
前記分子はＦｃ領域を備える、請求項９に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１１】
前記分子は、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を備える、請求項９に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１２】
前記ＡＢＤは、脱免疫化ＡＢＤである、請求項１１に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１３】
前記Ｆｃ領域は変異型Ｆｃ領域であり、前記変異型Ｆｃ領域は：
（ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する、１つ若しくは複数のアミノ酸修飾；及び／又は
（ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を増大させる１つ又は複数のアミノ酸修飾
を含む、請求項２〜５又は１０のうちのいずれか１項に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１４】
（ａ）前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する、１つ又は複数の前記アミノ酸修飾は、置換：
（１）Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又は
（２）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
を含み、
（ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を増大させる１つ又は複数の前記アミノ酸修飾は、置換：
（１）Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（２）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（３）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又は
（４）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
を含み、
前記番号付与は、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付与である、請求項１３に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１５】
前記分子は、Ｔ細胞仲介型免疫応答の刺激を必要とする被験者のＴ細胞仲介型免疫応答を刺激するために使用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１６】
前記分子は、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態の治療に使用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１７】
前記疾患又は状態は、癌又は感染症である、請求項１６に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１８】
前記疾患又は状態は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌である、請求項１７に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項１９】
前記疾患又は状態は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎臓癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌：膵臓癌；直腸癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である、請求項１７に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【請求項２０】
前記分子は検出可能に標識され、ＬＡＧ‐３の検出に使用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＬＡＧ‐３結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第６２／２５５，０９４号（２０１５年１１月１３日出願；係属）及び米国特許出願第６２／１７２，２７７号（２０１５年６月８日出願；係属）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願は、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１２１ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１６年５月１８日作成、サイズ：１０５，７７４バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、選択された抗ＬＡＧ‐３抗体：カニクイザルＬＡＧ‐３及びヒトＬＡＧ‐３の両方に結合できるＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＬＡＧ‐３結合ドメインを備える、ＬＡＧ‐３結合分子を対象とする。本発明は特に、このような抗体のヒト化若しくはキメラバージョンである、又はこのような抗ＬＡＧ‐３抗体のＬＡＧ‐３結合断片（特に免疫結合体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等）を備える、ＬＡＧ‐３結合分子に関する。本発明は特に、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに更に結合できる、このようなＬＡＧ‐３結合分子に関する。本発明はまた、ＬＡＧ‐３の検出又は免疫応答の刺激のためにこのようなＬＡＧ‐３結合分子を使用する方法に関係する。本発明はまた、上述のような選択された抗ＬＡＧ‐３抗体の１つ又は複数のＬＡＧ‐３結合ドメインを備えるＬＡＧ‐３結合分子を、免疫応答を刺激することによって被験者のこのような免疫応答を更に増強する、刺激する又は上方制御するのに効果的な１つ又は複数の追加の分子と組み合わせて投与する、併用療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
Ｉ．細胞仲介性免疫応答
ヒト及び他の哺乳類の免疫系は、感染及び疾患に対して保護を提供する役割を果たす。このような保護は、体液性免疫応答及び細胞仲介性免疫応答の両方によって提供される。体液性免疫応答により、異物標的（抗原）を認識して中和できる抗体及び他の生体分子の産生が得られる。対照的に、細胞仲介性免疫応答は、Ｔ細胞によるマクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、並びに抗原の認識に応じた様々なサイトカインの放出を伴う（非特許文献１）。
【０００５】
抗原に対して免疫応答を最適に仲介するＴ細胞の能力は、２つの別個のシグナリング相互作用を必要とする（非特許文献２、３）。まず、抗原提示細胞（抗原‐Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）の表面上に存在する抗原を、抗原特異性ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に対して提示する必要がある。このような提示により、提示された抗原に対して特異的となる免疫応答を開始するようにＴ細胞に指示するＴ細胞受容体（Ｔ‐Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を介して、シグナルが送達される。次に、ＡＰＣと別個のＴ細胞表面分子との間の相互作用によって仲介される一連の共刺激及び阻害シグナルが、まずＴ細胞の活性化及び増殖を、最終的にはＴ細胞の阻害をトリガする。従って、第１のシグナルは免疫応答に対して特異性を付与し、第２のシグナルは、上記応答の性質、強さ及び持続時間を決定する役割を果たす。
【０００６】
免疫系は、共刺激及び共阻害リガンド及び受容体によって厳密に制御される。これらの分子は、Ｔ細胞活性化のための第２のシグナルを提供し、また自己に対する免疫を制限しながら感染に対する免疫応答を最大化するための、ポジティブ及びネガティブシグナルの平衡ネットワークを提供する（非特許文献４、５）。自己寛容を維持し、免疫応答の期間及び振幅を変調するために重要な阻害経路を、まとめて免疫チェックポイントと呼ぶ。特に重要なのは、抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドと、ＣＤ４+Ｔリンパ球のＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４受容体との間の結合である（非特許文献６、１、７）。ＣＤ２８に対するＢ７．１又はＢ７．２の結合は、Ｔ細胞活性化を刺激し、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７．１又はＢ７．２の結合は、上記活性化を阻害する（非特許文献１、７、８）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上に恒常的に発現し（非特許文献９）、その一方でＣＴＬＡ‐４の発現は、Ｔ細胞活性化に続いて急速に上方制御される（非特許文献１０）。ＣＴＬＡ‐４は高親和性受容体である（非特許文献６）ため、結合はまず（ＣＤ２８による）Ｔ細胞増殖を開始させ、その後（ＣＴＬＡ‐４の初期発現によって）Ｔ細胞増殖を阻害し、これにより、増殖がもはや必要ない場合にその効果を減衰させる。
【０００７】
ＣＤ２８受容体のリガンドに対する更なる調査により、関連するＢ７分子のセット（「Ｂ７スーパファミリー（Ｂ７  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）」の識別及び特性決定が得られた（非特許文献６、８、１２、１３、３、１４、１５、１６）。現在、上記ファミリーの複数のメンバーが公知である：Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激因子リガンド（ＩＣＯＳ‐Ｌ）、プログラム死‐１リガンド（ＰＤ‐Ｌ１；Ｂ７‐Ｈ１）、プログラム死‐２リガンド（ＰＤ‐Ｌ２；Ｂ７‐ＤＣ）、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４及びＢ７‐Ｈ６（非特許文献１２、１７）。
【０００８】
ＩＩ．リンパ球活性化遺伝子３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ‐３：「ＬＡＧ‐３」）
リンパ球活性化遺伝子３は、「ＬＡＧ‐３」又はＣＤ２２３と呼ばれる細胞表面受容体タンパク質をエンコードする（非特許文献１８）。ＬＡＧ‐３は、活性化されたＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞並びにＮＫ細胞によって発現され、形質細胞様樹状細胞によって恒常的に発現される。ＬＡＧ‐３はＢ細胞、単球又は試験された他のいずれの細胞タイプによって発現されない（非特許文献１９）。
【０００９】
ＬＡＧ‐３は、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４に密接に関連することが分かっている（非特許文献１８、２０、２１、２２）。ＣＤ４と同様、ＬＡＧ‐３もまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、結合の親和性が有意に高い（非特許文献２３、２４、２５）。
【００１０】
研究により、ＬＡＧ‐３は、Ｔ細胞増殖、機能及びホメオスタシスの下方制御において重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１９、２６、２７、２８、２９、３０）。
【００１１】
研究により、抗体遮断によるＬＡＧ‐３機能の阻害は、ＬＡＧ‐３仲介性免疫系阻害を逆転でき、エフェクタ機能を部分的に復元できることが示唆されている（非特許文献２０、３１）。ＬＡＧ‐３は、ＴＣＲ誘導性カルシウムフラックスの阻害によってＴ細胞増殖を下方調節し、記憶Ｔ細胞プールのサイズを制御することが分かっている（非特許文献３２、３３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
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【非特許文献２】Viglietta, V. et al. (2007) “Modulating Co‐Stimulation,” Neurotherapeutics 4:666‐675
【非特許文献３】Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,” Adv. Immunol. 90:297‐339
【非特許文献４】Wang, L. et al. (2011) “VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T‐Cell Responses,” J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1‐16
【非特許文献５】Lepenies, B. et al. (2008) “The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders ‐ Drug Targets 8:279‐288
【非特許文献６】Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7‐CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116‐126
【非特許文献７】Lindley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28‐Mediated Costimulation,” Immunol. Rev. 229:307‐321
【非特許文献８】Greenwald, R.J. et al. (2005) “The B7 Family Revisited,” Ann. Rev. Immunol. 23:515‐548
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【非特許文献３１】Grosso, J.F. et al. (2007) “LAG‐3 Regulates CD8+ T‐Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance,” J. Clin. Invest. 117:3383‐3392
【非特許文献３２】Matsuzaki, J. et al. (2010) “Tumor‐Infiltrating NY‐ESO‐1‐Specific CD8+ T‐Cells Are Negatively Regulated By LAG‐3 and PD‐1 In Human Ovarian Cancer,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875‐7880
【非特許文献３３】Workman C.J., et al. (2004) “Lymphocyte Activation Gene‐3 (CD223) Regulates The Size Of The Expanding T‐Cell Population Following Antigen Activation in vivo,” J. Immunol. 172:5450‐5455
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上述のようなこれまでのあらゆる進歩にもかかわらず、癌細胞又は病原体感染細胞を、特に比較的低い治療濃度で攻撃するよう、身体の免疫系により強力に指示できる、改良された組成物に対する需要が存在し続けている。というのは、適応免疫系は、癌及び疾患に対する強力な防護機構であり得るものの、ＬＡＧ‐３の発現等の、腫瘍の微環境中の免疫抑制機構によって妨げられる場合があるためである。更に、腫瘍環境において腫瘍細胞、免疫細胞及び間質細胞が発現する共阻害性分子は、癌細胞に対するＴ細胞応答を支配的に弱化させる場合がある。よって、強力なＬＡＧ‐３結合分子に対する需要が存在し続けている。特に、所望の結合動態プロファイルを呈し、異なるＬＡＧ‐３エピトープに結合し、並びに／又は癌若しくは他の疾患及び状態に離間した患者に対して改善された治療的価値を提供できる単一の作用剤活性を呈する、ＬＡＧ‐３結合分子に対する需要が存在し続けている。本発明は、これらの及びその他の目標を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、選択された抗ＬＡＧ‐３抗体：カニクイザルＬＡＧ‐３及びヒトＬＡＧ‐３の両方に結合できるＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＬＡＧ‐３結合ドメインを備える、ＬＡＧ‐３結合分子を対象とする。本発明は特に、このような抗体のヒト化若しくはキメラバージョンである、又はこのような抗ＬＡＧ‐３抗体のＬＡＧ‐３結合断片（特に免疫結合体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等）を備える、ＬＡＧ‐３結合分子に関する。本発明は特に、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに更に結合できる、このようなＬＡＧ‐３結合分子に関する。本発明はまた、ＬＡＧ‐３の検出又は免疫応答の刺激のためにこのようなＬＡＧ‐３結合分子を使用する方法に関係する。本発明はまた、上述のような選択された抗ＬＡＧ‐３抗体の１つ又は複数のＬＡＧ‐３結合ドメインを備えるＬＡＧ‐３結合分子を、免疫応答を刺激することによって被験者のこのような免疫応答を更に増強する、刺激する又は上方制御するのに効果的な１つ又は複数の追加の分子と組み合わせて投与する、併用療法に関する。
【００１５】
詳細には、本発明は、ヒトＬＡＧ‐３及びカニクイザルＬＡＧ‐３の両方に結合できるＬＡＧ‐３結合分子を提供し、上記ＬＡＧ‐３結合分子は、３つの重鎖ＣＤＲドメイン、即ちＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３と、３つの軽鎖ＣＤＲドメイン、即ちＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３とを備え：
（Ａ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８、配列番号９及び配列番号１０を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有し；
又は
（Ｂ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８、配列番号９及び配列番号１０を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号２８、配列番号１４及び配列番号１５を有し；
又は
（Ｃ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８を有し；
又は
（Ｄ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８を有し；
又は
（Ｅ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５６、配列番号５７及び配列番号５８を有し；
又は
（Ｆ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８を有し；
又は
（Ｇ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ１の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８を有し；
又は
（Ｈ）（１）上記ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインは、ＬＡＧ‐３  ｈＡｂ  ６の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し；
（２）上記ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインは、ｈＬＡＧ‐３  ｈＡｂ  ６の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８７、配列番号７７及び配列番号７８を有する。
【００１６】
本発明は更に、上記重鎖可変ドメインが、配列番号６、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９又は配列番号５９のアミノ酸配列を有する、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００１７】
本発明は更に、上記軽鎖可変ドメインが、配列番号１１、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４又は配列番号６４のアミノ酸配列を有する、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００１８】
本発明は更に、上記重鎖可変ドメインが、配列番号１６、配列番号１８、配列番号７９又は配列番号８０のアミノ酸配列を有する、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００１９】
本発明は更に、上記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号８３又は配列番号８５のアミノ酸配列を有する、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００２０】
本発明は更に、上記分子が抗体であり、特に上記分子がキメラ抗体又はヒト化抗体である、全てのこのようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００２１】
本発明は更に、上記ＬＡＧ‐３結合分子が、ヒトＬＡＧ‐３及び第２のエピトープに同時に結合できる二重特異性結合分子である実施形態に関し、特に、上記第２のエピトープが、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープである（特に、上記第２のエピトープが、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープであり、また最も詳細には上記第２のエピトープがＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＴＩＧＩＴ又はＴＩＭ‐３のエピトープである）実施形態に関する。
【００２２】
本発明は更に、上記分子がダイアボディであり、また特に、上記ダイアボディが、２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記分子が３価結合分子であり、上記３価結合分子が、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、このような抗ＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記分子がＦｃ領域を備える、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記分子がアルブミン結合ドメイン、特に脱免疫化アルブミン結合ドメインを備える、このようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００２３】
本発明は更に、上記分子がＦｃ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｉｚａｂｌｅ：断片結晶化性）領域を備え、また上記Ｆｃ領域は変異型Ｆｃ領域であり、上記変異型Ｆｃ領域は、ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する、及び／又は血清半減期を増大させる１つ又は複数のアミノ酸修飾を含み、また更に詳細には、上記修飾は、以下：
（１）Ｌ２３４Ａ；
（２）Ｌ２３５Ａ；
（３）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
（４）Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（５）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（６）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又は
（７）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ；
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、この番号付与は、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付与である、全てのこのようなＬＡＧ‐３結合分子の実施形態に関する。
【００２４】
本発明は更に、上述のＬＡＧ‐３結合分子のうちのいずれを用いて、Ｔ細胞仲介型免疫応答を刺激する、実施形態に関する。本発明は更に、上述のＬＡＧ‐３結合分子のうちのいずれを、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態、特に癌又は感染症の治療に使用する実施形態に関する。
【００２５】
本発明は特に、癌の治療又は診断又は予後における上述のような使用に関し、上記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする。
【００２６】
本発明は特に、癌の治療又は診断又は予後における上述のような使用に関し、上記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎臓癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌：膵臓癌；直腸癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である。
【００２７】
本発明は更に、上述のＬＡＧ‐３結合分子のうちのいずれを検出可能に標識し、ＬＡＧ‐３の検出に使用する実施形態に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。図３Ｂに示すように、システイン残基がリンカー中及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図２】図２は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｃに示すように）ＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃに示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃダイアボディを示す。図３ＢはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを備えるポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図５】図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを備えるポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合部位を有する、代表的なＦｃ領域含有３価結合分子の概略図である。図６Ａ及び６Ｂはそれぞれ、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端又はＣ末端という異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを備える３価結合分子のドメインを示す。図６Ａ及び６Ｂの分子は４つの鎖を備える。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、Ｆｃ領域に対するＮ末端にある２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドリンカースペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを備える、３価結合分子のドメインを示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、Ｆｃ領域に対するＣ末端にある２つのダイアボディ型結合ドメインと、連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又は上記ダイアボディ型結合ドメインがその中に存在するｓｃＦｖ型結合ドメインとを備える、３価結合分子のドメインを、概略的に示す。図６Ｃ〜６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の、カニクイザルＬＡＧ‐３に対する結合特性を示す。ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）がカニクイザルＬＡＧ‐３に対する比較的良好な結合を示すことを実証する、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）（図７Ａ）、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）（図７Ｂ）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ（図７Ｃ）のＢｉａｃｏｒｅ結合曲線（ＲＵ；応答単位）。
【図８Ａ−８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６が、基準抗体ＬＡＧ  ３  ｍＡｂ  Ａが結合するものとは異なるエピトープに結合することを示す。競合抗体の不在下（図８Ａ）、過剰量のＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の存在下（図８Ｂ）、過剰量のＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の存在下（図８Ｃ）、又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの存在下（図８Ｄ）における、標識ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの結合プロファイル（ＲＵ；応答単位）。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるように、単離された抗体が、ＭＨＣクラスＩＩに対する可溶性ヒトＬＡＧ‐３（ｓｈＬＡＧ‐３）の結合を阻害することを示す。図９Ａは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の阻害曲線を示す。図９Ｂは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ、ヒト化  ｈＬＡＧ‐３  １（１．４）及びｈＬＡＧ‐３  ６（１．１）の阻害曲線を示す（ＲＬＵ；相対ルミネセンス単位）。
【図１０Ａ−１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、単離された抗体が、ＭＨＣクラスＩＩ発現Ｄａｕｄｉ細胞の表面上に対するｓｈＬＡＧ‐３の結合を阻害することを示す。図１０Ａは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５及び基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの阻害曲線を示す。図１０Ｂは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの阻害曲線を示す。図１０Ｃは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、及びヒト化ｈＬＡＧ‐３  １（１．４）、ｈＬＡＧ‐３  １（１．２）、ｈＬＡＧ‐３  １（２．２）、ｈＬＡＧ‐３  １（１．１）の阻害曲線を示す。各図は別個の実験を表す（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＬＡＧ‐３の発現が、刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって上方制御されることを示す。１１日目及び１４日目における、未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１Ａ）、並びに２体の異なるドナーからのＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１Ｂ及び１１Ｃ）に対する、ＬＡＧ‐３発現のフローサイトメトリー分析。全ての細胞は、抗ＣＤ４抗体で共染色した。
【図１２】図１２（パネルＡ〜Ｆ）は、単離された抗ＬＡＧ‐３抗体が、刺激Ｔ細胞には結合するものの未刺激Ｔ細胞には結合しないことを示す。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（パネルＡ及びＤ）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２（パネルＢ及びＥ）又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３（パネルＣ及びＦ）で標識した、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＡ〜Ｃ）及び未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＤ〜Ｆ）のフローサイトメトリー分析。全ての細胞は、抗ＣＤ４抗体で共染色した。
【図１３】図１３（パネルＡ〜Ｄ）は、単離された抗ＬＡＧ‐３抗体が、刺激Ｔ細胞には結合するものの未刺激Ｔ細胞には結合しないことを示す。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４（パネルＡ及びＣ）、又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５（パネルＢ及びＤ）で標識した、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＡ〜Ｂ）及び未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＣ〜Ｄ）のフローサイトメトリー分析。全ての細胞は、抗ＣＤ４抗体で共染色した。
【図１４】図１４（パネルＡ〜Ｄ）は、代表的なドナーＤ：３４７６５由来の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ型抗原（ＳＥＢ）刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、ＬＡＧ‐３及びＰＤ‐１の発現が上方制御されることを示す。抗ＬＡＧ‐３／抗ＣＤ３抗体（パネルＡ）又は抗ＰＤ‐１／抗ＣＤ３抗体（パネルＢ）で標識した、１次刺激から４８時間後（パネルＡ〜Ｂ）の、代表的なドナー由来のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣの、並びに抗ＬＡＧ‐３／抗ＰＤ‐１抗体で標識した、２次刺激中にＳＥＢ単独（パネルＣ）で、又はアイソタイプ対照抗体（パネルＤ）で処置した５日目のＳＥＢ刺激（パネルＣ〜Ｄ）細胞の、フローサイトメトリー分析。
【図１５】図１５（パネルＡ〜Ｄ）は、代表的なドナーＤ：５３７２４由来のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣにおいて、ＬＡＧ‐３及びＰＤ‐１の発現が上方制御されることを示す。抗ＬＡＧ‐３／抗ＣＤ３抗体（パネルＡ）又は抗ＰＤ‐１／抗ＣＤ３抗体（パネルＢ）で標識した、１次刺激から４８時間後（パネルＡ〜Ｂ）の、代表的なドナー由来のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣの、並びに抗ＬＡＧ‐３／抗ＰＤ‐１抗体で標識した、ＳＥＢ単独（パネルＣ）で、又はアイソタイプ対照抗体（パネルＤ）で処置した５日目のＳＥＢ刺激（パネルＣ〜Ｄ）細胞の、フローサイトメトリー分析。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １が、抗ＰＤ‐１抗体による処置に相当するレベルまで、サイトカイン産生を刺激できることを示す。抗ＬＡＧ‐３又は抗ＰＤ‐１抗体で処置したＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの、ＩＦＮγ（図１６Ａ）及びＴＮＦα（図１６Ｂ）分泌プロファイル。
【図１７】図１７は、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １が、抗ＰＤ‐１抗体による処置に相当するレベルまで、サイトカイン産生を刺激できること、抗ＰＤ‐１抗体と組み合わせたＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １での処置により、サイトカイン放出の最大の増強がもたらされたことを示す。抗ＬＡＧ‐３及び抗ＰＤ‐１抗体を単独で及び組み合わせて用いて処置したＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの、ＩＦＮγ分泌プロファイル。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｂは、２体のドナー（図１８Ａ及び１８Ｂ）からのＳＥＢ刺激カニクイザルＰＢＭＣ上で発現する内在性ＬＡＧ‐３に対する、抗ＬＡＧ‐３抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの結合を示す。抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  Ａは、ＳＥＢ刺激に対する陽性対照として含めた。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、選択された抗ＬＡＧ‐３抗体：カニクイザルＬＡＧ‐３及びヒトＬＡＧ‐３の両方に結合できるＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＬＡＧ‐３結合ドメインを備える、ＬＡＧ‐３結合分子を対象とする。本発明は特に、このような抗体のヒト化若しくはキメラバージョンである、又はこのような抗ＬＡＧ‐３抗体のＬＡＧ‐３結合断片（特に免疫結合体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体等）を備える、ＬＡＧ‐３結合分子に関する。本発明は特に、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する分子のエピトープに更に結合できる、このようなＬＡＧ‐３結合分子に関する。本発明はまた、ＬＡＧ‐３の検出又は免疫応答の刺激のためにこのようなＬＡＧ‐３結合分子を使用する方法に関係する。本発明はまた、上述のような選択された抗ＬＡＧ‐３抗体の１つ又は複数のＬＡＧ‐３結合ドメインを備えるＬＡＧ‐３結合分子を、免疫応答を刺激することによって被験者のこのような免疫応答を更に増強する、刺激する又は上方制御するのに効果的な１つ又は複数の追加の分子と組み合わせて投与する、併用療法に関する。
【００３０】
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明の抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に免疫特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。
【００３１】
本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」）がこのような分子上に存在することにより、ポリペプチド又はタンパク質若しくは非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる、免疫グロブリン分子を指す。エピトープ含有分子は免疫原性活性を有してよく、これにより上記エピトープ含有分子は、動物の体内で抗体産生応答を誘発し、このような分子は「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」と呼ばれる。エピトープ含有分子が必ずしも免疫原性でなくてよい。
【００３２】
本発明の結合ドメインは、「免疫特異的（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」な様式でエピトープに結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に対して、代替的なエピトープに比べてより頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で反応又は連結する場合に、「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるＬＡＧ‐３エピトープに特異的に結合する抗体は、他のＬＡＧ‐３エピトープ又は非ＬＡＧ‐３エピトープに結合する場合に比べて、より高い親和性で、結合活性で、より迅速に、及び／又はより長期間、当該ＬＡＧ‐３エピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子それぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると言い表される。ある抗体の、あるエピトープに免疫特異的に結合する能力は、例えばイムノアッセイによって決定できる。
【００３３】
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）」ドメイン（「Ｈ」）を含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端（Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ）」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端（Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ）」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジドメインを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ある抗体の、抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにそのアミノ酸配列左右される。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、天然抗体の２つのエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種のみに結合できる（即ち天然抗体は単一特異性である）が、当該種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶL及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って本明細書において使用される場合、用語「エピト��プ結合ドメイン（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」は、エピトープ結合分子の、このような分子があるエピトープに免疫特異的に結合する能力の原因となる部分を指す。エピトープ結合断片は、上記抗体のＣＤＲドメインのうちの１個、２個、３個、４個、５個又は６個全てを含有でき、またこのようなエピトープに免疫特異的に結合できる一方で、上記抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してよい。しかしながら好ましくは、エピトープ結合断片は、上記抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有する。抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖であってよく（例えばｓｃＦｖ）、又はそれぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖を備えてよい（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ2断片等）。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は：モノクローナル抗体；多重特異性抗体；ヒト抗体；ヒト化抗体；合成抗体；キメラ抗体；ポリクローナル抗体；ラクダ化抗体；単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）；単鎖抗体；免疫学的に活性の抗体断片（例えば：Ｆａｂ断片；Ｆａｂ’断片；Ｆ（ａｂ’）2断片；Ｆｖ断片；ＶL及び／若しくはＶHドメインを含有する断片、又はある抗原等に特異的に結合するＶＬドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）（即ちＣＤＲL１、ＣＤＲL２及び／若しくはＣＤＲL３）若しくはＶＨドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）（即ちＣＤＲH１、ＣＤＲH２及び／若しくはＣＤＲH３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ、２つ若しくは３つを含有する断片等といったエピトープに結合できる、抗体断片）；二重官能性又は多重官能性抗体；ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）；細胞内抗体；及び以上のうちのいずれの、エピトープ結合断片を包含する。特に用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を包含することを意図したものである。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）又はサブクラスのものとすることができる（例えば米国公開特許第２００４０１８５０４５号；米国公開特許第２００５００３７０００号；米国公開特許第２００５００６４５１４号；米国公開特許第２００５０２１５７６７号；米国公開特許第２００７０００４９０９号；米国公開特許第２００７００３６７９９号；米国公開特許第２００７００７７２４６号；及び米国公開特許第２００７０２４４３０３号参照）。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663‐666）。２００を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【００３５】
本発明の抗ＬＡＧ‐３抗体は、抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の、ヒト化、キメラ又はラクダ化変異型を含む。
【００３６】
用語「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）」は、これらが所望の生物活性を示す限りにおいて、重鎖及び／又は軽鎖の一部分がある種（例えばマウス）由来のある抗体又は抗体クラス若しくはサブクラスと同一又は相同でありながら、残りの部分が別の種（例えばヒト）の抗体又は抗体クラス若しくはサブクラスと同一又は均質である、抗体を指す。本明細書における関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を備えた「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、略均質な抗体の集団のうちの１つの抗体を表し、即ち上記集団を構成する個々の抗体は、微量存在し得る自然発生的突然変異を有する抗体の可能性を除いて同一である。また本明細書において使用される場合、用語「ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、不均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。用語「モノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）」は、抗体の略均質な集団であるという抗体の特性を示し、いずれの特定の方法によって（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等によって）抗体を産生することを要求するものとして解釈してはならない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（例えばJennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性が最適化された抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善する��めの、遺伝子操作のために使用してよい。
【００３８】
用語「ｓｃＦｖ」は、単鎖可変ドメイン断片を指す。ｓｃＦｖ分子は、短い連結ペプチドを用いて軽鎖又は重鎖可変ドメインを連結することによって作製される。Bird et al.(1988)（"Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426）は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988), "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤又はアタッチメントを固体支持体に取り付ける等の更なる機能のために修飾できる。単鎖変異型は、組み換え又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成器を使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生のためには、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞といった、好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションといった慣用の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技法を用いて単離できる。
【００３９】
本発明は特に、本発明の抗ＬＡＧ‐３抗体のヒト化変異型、及びこれを含む多重特異性結合分子を包含する。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。エピトープ結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植されたＣＤＲのみを備えてよい。エピトープ結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾されてよい。これにより、ヒト個体の免疫原としての不変領域が削減されるが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220‐4224）。別のアプローチは、ヒト由来不変領域を提供することだけでなく、可変領域を修飾して、ヒト型に可能な限り近くなるように再成形することに焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つのＣＤＲを内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変領域を「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は：Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6‐Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851‐856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323‐327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534‐1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR‐Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773‐3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV‐Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124‐134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181‐4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266‐271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869‐2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti‐p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285‐4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149‐1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対してその１つ又は複数のアミノ酸配列が改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有し、これらは、オリジナ��の抗体からの１つ又は複数のＣＤＲ「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」（即ち、このようなＣＤＲに由来する、このようなＣＤＲのアミノ酸配列の知識に由来する、等）１つ又は複数のＣＤＲとも呼ばれる。抗体の可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００４０】
本発明の分子のエピトープ結合部位は、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを備えてよい。エピトープ結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除されるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220‐4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6‐Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851‐856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323‐327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534‐1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR‐Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773‐3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV‐Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124‐134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181‐4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266‐271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869‐2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti‐p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285‐4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149‐1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
【００４１】
非ヒト免疫グロブリン由来のエピトープ結合部位を備える多数の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
【００４２】
ＩＩ．Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは相互作用してＦｃ領域を形成し、このＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに限定されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
231      240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔによるＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４３】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
231      240          250          260          270          280
APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA 
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE 
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔによるＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４４】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
231      240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA   
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE   
390          400          410          420          430
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE   
440       447
ALHNRFTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔによるＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４５】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
231      240          250          260          270          280
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
340          350          360          370          380
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔによるＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００４６】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5thEd. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｋａｂａｔ）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内のアミノ酸の位置によって指定され、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているように識別される（Chothia, C. & Lesk, A. M.（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobrins,”. J. Mol. Biol. 196:901‐917）によって定義されるＣＤＲＨ１は、５残基前から始まることを理解されたい）。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てている。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
【００４７】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載されているようなＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43‐78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199‐211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明のＬＡＧ‐３結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けたＬＡＧ‐３結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
【００４８】
活性化及び阻害信号は、細胞Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）へのＦｃ領域のライゲーションによって形質導入される。正反対の機能をもたらすこのようなライゲーションの能力は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的差異に起因する。免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）及び免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれる、受容体の細胞質シグナリングドメイン内の２つの別個のドメインが、異なる応答の原因となる。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、その一方でＩＴＩＭ含有複合体はＦｃγＲＩＩＢしか含まない。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症促進性メディエータの放出につながる。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。最近、この阻害の分子的基礎が確率された。活性化ＦｃγＲと共同結紮すると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ポリリン酸イノシトール５’‐ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を防止する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ結紮に対する活性化応答を弱め、細胞応答性を阻害する。このようにして、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が中断される。
【００４９】
ＩＩＩ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
抗体の機能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ)に同時に結合できる多重特異性抗体ベースの分子を生成することにより、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関してより高い価（即ち３つ以上の結合部位）を有する抗体ベースの分子を生成することにより、増強できる。
【００５０】
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号；国際公開第２００９／１３２８７６号；国際公開第２００８／００３１０３号；国際公開第２００７／１４６９６８号；国際公開第２００９／０１８３８６号；国際公開第２０１２／００９５４４号；国際公開第２０１３／０７０５６５参照）、その殆どは、更なるエピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数のエピトープ結合断片（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、エピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号；国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号；国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号；国際公開第２００７／０４６８９３号）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば国際公開第２０１３／１７４８７３号；国際公開第２０１１／１３３８８６号；及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１３／１６３４２７号、及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。国際公開第２０１０／０２８７９７号；国際公開第２０１００２８７９６号；及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号；国際公開第２０１３／００３６５２号；国際公開第２０１２／１６２５８３号；国際公開第２０１２／１５６４３０号；国際公開第２０１１／０８６０９１号；国際公開第２００８／０２４１８８号；国際公開第２００７／０２４７１５号；国際公開第２００７／０７５２７０号；国際公開第１９９８／００２４６３号；国際公開第１９９２／０２２５８３号；及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００５１】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448;米国特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.);米国特許第２００４／０２２０３８８号；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）； Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１  号（Mertens et al.）； Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
【００５２】
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）として知られている抗体誘導体に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを介して連結することによって作製される。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００５３】
非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力を含むがこれに限定されない、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。
【００５４】
ダイアボディの二重特異性により、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋のために上記ダイアボディを使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。あるいは又は更に、二重特異性ダイアボディを用いて、異なる細胞の表面上又は単一の細胞上に受容体をコライゲーションできる。異なる細胞及び／又は受容体のコライゲーションは、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結合部位を含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現する、Ｂ７‐Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７‐Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ８０（Ｂ７‐１）、ＣＤ８６（Ｂ７‐２）、ＣＤ９４（ＫＬＲＤ１）、ＣＤ１３７（４‐１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ（４‐１ＢＢＬ）、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４（ＣＤ１５２）、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（ＣＤ２７５）、キラー活性化受容体（ＫＩＲ）、ＬＡＧ‐３（ＣＤ２２３）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４、ＣＤ２５８）、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１（ＣＤ２７９）、ＰＤ‐Ｌ１（Ｂ７‐Ｈ１、ＣＤ２７４）、ＰＤ‐Ｌ２（Ｂ７‐ＣＤ、ＣＤ２７３）、ＰＶＲ（ＮＥＣＬ５、ＣＤ１５５）、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３（ＨＡＶＣＲ２）、及び／又はＶＩＳＴＡ（ＰＤ‐１Ｈ）といった、いずれの免疫細胞の表面決定因子を指向し得る。特に、免疫チェックポイント（又はそのリガンド）の制御に関与する細胞表面受容体を指向するエピトープ結合部位は、免疫チェックポイント分子の阻害シグナリングに拮抗するか又はこれをブロックすることによって、被験者の免疫応答を刺激、上方制御又は増強する、二重特異性又は多重特異性結合分子の生成において有用である。免疫チェックポイントの制御に関与する分子としては、限定するものではないが、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３及び／又はＶＩＳＴＡが挙げられる。
【００５５】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止する（即ちホモ二量体化を防止する）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al.(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００５６】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００５７】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ‐Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２００６／１１３６６５号、並びにSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood 127(1):122-131; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449; Marvin, J.S. et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Holliger, P. et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-644参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【００５８】
最も単純な二重特異性ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの２つのポリペプチドはそれぞれ、３つのドメインを備える。第１のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記ダイアボディの上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進して、上記ダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチドを互いに共有結合させる役割を果たす、ヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを備える。第２のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を備える第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインと複合体化して、上記第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体を促進する、相補的ヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含有する。上記第２のポリペプチド鎖の上記第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に対する上記第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このような分子は安定しており、強力であり、また２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。一実施形態では、上記第１及び第２のポリペプチドの上記第３のドメインはそれぞれ、上記ポリペプチドをジスルフィド結合によって一体に結合させる役割を果たすシステイン残基を含有する。図１は、このようなダイアボディの概略図を提供し、上記ダイアボディは、Ｅコイル／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン及びシステイン含有リンカーを、共有結合のために利用する。図２及び図３Ａ〜３Ｃにおいて提示されているように、上記ポリペプチドのうちの一方又は両方は更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、上記２つのダイアボディポリペプチド間の複合体化によって、細胞（例えばＢリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞）のＦｃ受容体に結合できるＦｃ領域が形成される。以下でより詳細に提示されるように、このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、配列が同一である必要はなく、有利には、これら２つのポリペプチド鎖間の複合体化を促進するよう修飾される。
【００５９】
このような分子の多数の変異型が記載されている（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９／００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。これらのＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、２ペアのポリペプチド鎖を含んでよい。第１のポリペプチド鎖は（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える第２のドメイン；（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）を含有し、上記ダイアボディの上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進して、上記ダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチドを互いに共有結合させる役割を果たす、第３のドメイン；並びに（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える。第２のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を備える第１のドメイン；（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を備える第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進するヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含有する。ここで、２つの第１のポリペプチドは互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。図３Ａ〜３Ｃは、異なるヘテロ二量体促進ドメインを利用するこのようなダイアボディの３つの変異型の概略図を提示する。
【００６０】
他のＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標登録）ダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を備える。従って、このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として関連して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような比較的複雑なＤＡＲＴ（登録商標）分子はまた、共有結合複合体を形成する機能を果たすシステイン含有ドメインを有する。よって上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃ領域を形成する。図４Ａ〜４Ｂは、３つのポリペプチド鎖を含むこのようなダイアボディの概略図を提示する。
【００６１】
更に他のＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、最大３つの異なる免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変ドメイン（ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３と呼ばれる）由来の結合領域を備えてよい、５つのポリペプチド鎖を含み得る。例えば、このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有してよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有してよい。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン：及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有してよく、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第３の鎖と第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有してよい。ここで上記第１及び第３のポリペプチドは互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。このような比較的複雑なＤＡＲＴ（登録商標）分子はまた、共有結合複合体を形成する機能を果たすシステイン含有ドメインも有し、これにより各ポリペプチド鎖は、システイン残基を伴うジスルフィド結合によって、少なくとも１つの追加のポリペプチド鎖に結合する。好ましくは、このようなドメインは、Ｎ末端からＣ末端への方向に並ぶ。図５は、５つのポリペプチド鎖を含むこのようなダイアボディの概略図を提示する。
【００６２】
４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば米国公開特許第２００５-００７９１７０号；米国公開特許第２００７-００３１４３６号；米国公開特許第２０１０-００９９８５３号；米国公開特許第２０１１-０２０６６７号；米国公開特許第２０１３-０１８９２６３号；欧州公開特許第１０７８００４号；欧州公開特許第２３７１８６６号；欧州公開特許第２３６１９３６号；及び欧州公開特許第１２９３５１４号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）。
【００６３】
近年、２つのダイアボディ型結合ドメイン及び１つの非ダイアボディ型結合ドメイン、並びにＦｃ領域を組み込んだ３価構造が記載されている（例えばＰＣＴ出願第PCT/US15/33076号、名称「Tri‐Specific Binding Molecules and Methods of Use Thereof」、２０１５年５月２９日出願；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号、名称「Tri‐Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof」、２０１５年５月２９日出願を参照）。このような３価分子を利用して、単一特異性、二重特異性又は三重特異性分子を生成してよい。図６Ａ〜６Ｆは、３つ又は４つのポリペプチド鎖を含むこのような３価分子の概略図を提示する。
【００６４】
ＩＶ．本発明のＬＡＧ‐３結合分子
本発明の好ましいＬＡＧ‐３結合分子としては、抗体、ダイアボディ、ＢｉＴＥ等が挙げられ、これらは、ヒトＬＡＧ‐３の連続又は不連続（例えば配座）部分（エピトープ）に結合できる。本発明のＬＡＧ‐３結合分子は好ましくは、１つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種（及び特にカニクイザル等の霊長類種）のＬＡＧ‐３分子に結合する能力も示す。代表的なヒトＬＡＧ‐３ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００２２７７．４；２２アミノ酸残基シグナル配列（下線）及び５０３アミノ酸残基成熟タンパク質を含む）は、アミノ酸配列（配列番号５）：
MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL
QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT
VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA
VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV
HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN
VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP
PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI
ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA
QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL
LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE
ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL
を有する。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、以下の基準のうちのいずれ（１つ又は複数）を特徴とする：
（１）刺激ヒトＴ細胞の表面に内在的に発現したヒトＬＡＧ‐３に特異的に結合する；
（２）平衡結合定数（ＫD）４０ｎＭ以下でヒトＬＡＧ‐３に特異的に結合する；
（３）平衡結合定数（ＫD）０．５ｎＭ以下でヒトＬＡＧ‐３に特異的に結合する；
（４）非ヒト霊長類ＬＡＧ‐３（例えばカニクイザルのＬＡＧ‐３）に特異的に結合する；
（５）平衡結合定数（ＫD）５０ｎＭ以下で非ヒト霊長類ＬＡＧ‐３に特異的に結合する；
（６）平衡結合定数（ＫD）５ｎＭ以下で非ヒト霊長類ＬＡＧ‐３に特異的に結合する；
（７）ＭＨＣクラスＩＩに対するＬＡＧ‐３の結合を阻害する（即ちブロックする、若しくはこれに干渉する）；
（８）免疫応答を刺激する；
（９）単一の作用剤として、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する；
（１０）抗ＰＤ‐１抗体と相乗作用して、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する；
（１１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６と同一のＬＡＧ‐３のエピトープに結合する；及び／又は
（１２）（例えばＢｉａｃｏｒｅ分析によって測定される）ＬＡＧ‐３結合に関して、抗ＬＡＧ‐３抗体２５７Ｆ（ＢＭＳ９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）と競合しない。
【００６６】
本明細書において使用される場合、用語「抗原特異的Ｔ細胞応答（ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ‐ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、Ｔ細胞が特異的である抗原によるＴ細胞の刺激に起因する、Ｔ細胞の応答を指す。抗原特異的刺激に対するＴ細胞の応答の非限定的な例としては、増殖及びサイトカイン産生（例えばＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ産生）が挙げられる。抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、分子の能力は、例えば本明細書に記載されている黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型抗原（「ＳＥＢ」）刺激ＰＢＭＣアッセイを用いて決定できる。
【００６７】
本発明の好ましいＬＡＧ‐３結合分子は、マウス抗ＬＡＧ‐３モノクローナル抗体「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５」、及び／又は「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６」のＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し、より好ましくは、このような抗ＬＡＧ‐３モノクローナル抗体の、ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは全て、及び／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは全てを有する。このような好ましいＬＡＧ‐３結合分子は、二重特異性（又は多重特異性）抗体、キメラ又はヒト化抗体、ＢｉＴｅ、ダイアボディ等、及び変異型Ｆｃ領域を有する結合分子を含む。
【００６８】
本発明は特に、以下：
（Ａ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １又はｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン；
（５）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン；
（６）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｂ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン；
（５）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン；
（６）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｃ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン；
（５）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン；
（６）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｄ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＨドメイン；
（５）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＬドメイン；
（６）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｅ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＨドメイン；
（５）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＬドメイン；
（６）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｆ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン；
（５）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン；
（６）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｇ）（１）抗ＬＡＧ‐３抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（２）抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及び抗ＬＡＧ‐３抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL
を有するＬＡＧ‐３結合ドメインを備える、ＬＡＧ‐３結合分子、又は
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６が免疫特異的に結合するエピトープに結合するか、若しくは上記エピトープとの結合に関して競合する、ＬＡＧ‐３結合分子に関する。
【００６９】
Ａ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １
１．マウス抗ヒト抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）。
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARES
LYDYYSMDYW GQGTSVTVSS 
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH１（配列番号８）：NYGMN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH２（配列番号９）：WINTYTGESTYADDFEG
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲH３（配列番号１０）：ESLYDYYSMDY
【００７０】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac
agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggta taccttcaga aactatggaa
tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg ttttaaagtg gatgggctgg
ataaacacct acactggaga gtcaacatat gctgatgact tcgagggacg
gtttgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca
acatcctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagaatcc
ctctatgatt actattctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac
cgtctcctca
である。
【００７１】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶLドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DVVVTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKLE IK
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL１（配列番号１３）：KSSQSLLHSDGKTYLN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL２（配列番号１４）：LVSELDS
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＣＤＲL３（配列番号１５）：WQGTHFPYT
【００７２】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１２（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gatgttgtgg tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca
accagcctcc atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccagag
cgcctaatct atctggtgtc tgaactggac tctggagtcc ctgacaggtt
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg
aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa
である。
【００７３】
２．「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １」を形成するための、抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のヒト化
上述のマウス抗ヒトＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １をヒト化することによって、ヒトレシピエントへの投与の際の抗原性を低減するための、抗ＬＡＧ‐３抗体のヒト化能力を実証した。上記ヒト化により、本明細書において「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐２」と称される２つのヒト化ＶＨドメイン、及び、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐１」、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐２」、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐３」、及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐４」と称される４つのヒト化ＶＬドメインが得られた。いずれの上記ヒト化ＶＬドメインを上記ヒト化ＶＨドメインと対合させてよい。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合させた上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体は、一般的に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １」と呼ばれ、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせは、特定のＶＨ／ＶＬドメインを参照することによって呼称され、例えばｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐１及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．２）」と呼称される。
【００７４】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインＶＨ‐１のアミノ酸配列（配列番号１６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
【００７５】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１７（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc
cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta
tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg
atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag
atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta
gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt attattgtgc ccgcgagagt
ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac
agtgagttcc
である。
【００７６】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインＶＨ‐２のアミノ酸配列（配列番号１８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES
LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
【００７７】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１９（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc
cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta
tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg
atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag
atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta
gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt atttctgtgc ccgcgagagt
ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac
agtgagttcc
である。
【００７８】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶLドメインVL‐１のアミノ酸配列（配列番号２０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【００７９】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２１（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca
gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg
gaaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca aagtccagag
agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt
ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg
aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct
tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa
である。
【００８０】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインＶＬ‐２のアミノ酸配列（配列番号２２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【００８１】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２３（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca
gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg
gaaagaccta tttgaactgg cttctgcaga gaccaggcca aagtccagag
agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt
ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg
aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct
tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa
である。
【００８２】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインＶＬ‐３のアミノ酸配列（配列番号２４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【００８３】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐３をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca
gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg
gaaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag
agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt
ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg
aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct
tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa
【００８４】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインＶＬ‐４のアミノ酸配列（配列番号２６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IK
【００８５】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐４をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号２７（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca
gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg
caaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag
agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt
ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg
aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct
tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa
である。
【００８６】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインＶＬ‐４のＣＤＲＬ１は、グリシン〜アラニンのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：KSSQSLLHSDAKTYLN（配列番号２８）を有する（置換されたアラニンは下線付きで示されている）。同様の置換は、上述のＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＣＤＲL１ドメインのいずれに組み込まれ得ると考えられる。
【００８７】
Ｂ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWLRQS HGESLEWIGY
IYPYSGDIGY NQKFKNRATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH
RNYFGPWFAY WGQGTPVTVS A
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH１（配列番号３１）：DYNIH
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨ  ＣＤＲH２（配列番号３２）：YIYPYSGDIGYNQKFKN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨ  ＣＤＲH３（配列番号３３）：WHRNYFGPWFAY
【００８８】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号３０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc
agtgaagatt tcctgcaaga cttctggata cacatttact gactacaaca
tacactggtt gaggcagagc catggagaga gccttgagtg gattggatat
atttatcctt acagtggtga tattggatac aaccagaagt tcaagaacag
ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc
gcagcctgac atctgaagac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac
aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactccggt
cactgtctct gca
である。
【００８９】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKL
LIYVVSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL
TFGAGTKLEL K
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL１（配列番号３６）：KASQSVDYDGESYMN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL２（配列番号３７）：VVSNLES
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL３（配列番号３８）：QQSSEDPLT
【００９０】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号３５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg
aaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc
ctcatttatg ttgtatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa
である。
【００９１】
Ｃ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
EVRLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVRQS HGQSLEWIGY
IYPYNGDTGY NQKFKTKATL TVDNSSNTAY MELRSLASED SAVYYCTRWS
RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH１（配列番号４１）：DYNIH
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH２（配列番号４２）：YIYPYNGDTGYNQKFKT
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH３（配列番号４３）：WSRNYFGPWFAY
【００９２】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号４０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gaggtccggc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc
agtgaagata tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca
ttcactgggt gaggcagagc catggacaga gccttgagtg gattggatat
atttatcctt ataatggtga tactggctac aaccagaagt tcaagaccaa
ggccacattg actgtagaca attcctccaa cacagcctac atggaactcc
gcagcctggc atctgaagac tctgcagtct attactgtac aagatggagc
aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct gca
である。
【００９３】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVLTQSPTS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL
LIYAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL
TFGAGTKLEL K
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＣＤＲＬ１（配列番号４６）：KASQSVDYDGDSYMN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＣＤＲＬ２（配列番号４７）：AASNLES
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＣＤＲＬ３（配列番号４８）：QQSSEDPLT
【００９４】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号４５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacattgtgc tgacccaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg
atagttatat gaactggtat caacagaaac caggacagcc acccaaactc
ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa
である。
【００９５】
Ｄ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
EVQLHQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWVKQS HGKSLEWIGY
IYPYNGDAGY NQNFKTKATL TVDNSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARWN
MNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH１（配列番号５１）：DYNIH
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH２（配列番号５２）：YIYPYNGDAGYNQNFKT
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH３（配列番号５３）：WNMNYFGPWFAY
【００９６】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号５０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gaggtccagc ttcaccagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc
agtgaagata tcctgcaaga cttctggata cactttcact gactacaaca
tacactgggt gaagcagagc catggaaaga gccttgagtg gattggatat
atttatcctt acaatggtga tgctggctac aaccagaact tcaagaccaa
ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggagctcc
gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatggaac
atgaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct gcg
である。
【００９７】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGVTYINWY QQKPGQPPKL
LIFAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSNEDPL
TFGAGTKLEL K
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＣＤＲＬ１（配列番号５６）：KASQSVDYDGVTYIN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＣＤＲＬ２（配列番号５７）：AASNLES
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＣＤＲＬ３（配列番号５８）：QQSNEDPLT
【００９８】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号５５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg
ttacttatat caactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc
ctcatctttg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgctc
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa
である。
【００９９】
Ｅ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVKQS PGKSLEWIGY
IYPYSGDFGY NQKFKSKATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH
RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH１（配列番号６１）：DYNIH
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH２（配列番号６２）：YIYPYSGDFGYNQKFKS
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH３（配列番号６３）：WHRNYFGPWFAY
【０１００】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号６０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc
agtgaagatt tcctgcaaag cttctggata cacatttact gactacaaca
tacactgggt gaagcagagc cctggaaaga gccttgaatg gattggatat
atttatcctt acagtggtga ttttggatac aaccagaagt tcaagagcaa
ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc
gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac
aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct gca
である。
【０１０１】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKL
LIYVVSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL
TFGAGTKLEL K
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL１（配列番号６６）：KASQSVDYDGESYMN
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL２（配列番号６７）：VVSNLES
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL３（配列番号６８）：QQSSEDPLT
【０１０２】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号６５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg
aaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc
ctcatttatg ttgtttccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa
である。
【０１０３】
Ｆ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６
１．マウス抗ヒト抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD
INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA
DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH１（配列番号７１）：DYNMD
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH２（配列番号７２）：DINPDNGVTIYNQKFEG
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH３（配列番号７２）：EADYFYFDY
【０１０４】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gaggtcctgc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc
agtgaagata ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca
tggactgggt gaagcagagc catggagaga gccttgagtg gattggagat
attaatcctg acaatggtgt tactatctac aaccagaagt ttgagggcaa
ggccacactg actgtagaca agtcctccag tacagcctac atggagctcc
gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagagaggcg
gattacttct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc
ctca
である。
【０１０５】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SVVAWYQQKP GQSPKLLIFS
ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIK
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL１（配列番号７６）：KASQDVSSVVA
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL２（配列番号７７）：SASYRYT
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL３（配列番号７８）：HYSTPWT
【０１０６】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインをエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号７５（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacattgtga tgacccagtc tcacagattc atgtccacat cagttggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt tctgttgtag
cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaattact gattttttcg
gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagtggatc
tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gcagacctgg
cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa a
である。
【０１０７】
２．「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６」を形成するための、抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のヒト化
上述のマウス抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６をヒト化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ＬＡＧ‐３抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。上記ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれは、上記ヒト化ＶＨドメインのうちの一方とペアとすることができる。従って、上記ヒト化ＶＨドメインとペアとなった上記ヒト化ＶＬドメインのうちの一方を備えるいずれの抗体は、一般に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６」と呼ばれ、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせは、特定のＶＨ／ＶＬドメインを参照して呼称される。例えばｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐１及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐２を備えるヒト化抗体は、具体的に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．２）」と呼ばれる。
【０１０８】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインＶＨ‐１のアミノ酸配列（配列番号７９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGD INPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
【０１０９】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８０（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
caggtccagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcaag
cgtgaaggtg tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca
tggactgggt ccgacaggcc ccaggacagg gcctggaatg gatgggcgac
atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaaat tcgagggcag
agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac atggaactgc
ggtccctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc
gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc
ctcc
である。
【０１１０】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインＶＨ‐２のアミノ酸配列（配列番号８１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSD
INPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA
DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
【０１１１】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８２（ＣＤＲH残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gaggtccagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtcaagc ctggcggcag
cctgagactg agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc gactacaaca
tggactgggt ccgacaggcc cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgac
atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaagt tcgagggccg
gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga
acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc
gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc
ctcc
である。
【０１１２】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインＶＬ‐１のアミノ酸配列（配列番号８３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIK
【０１１３】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐１をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８４（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga
cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg
cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc
gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc agattcagcg gcagcggctc
cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg
ccacctacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga
ggcaccaagc tggaaatcaa g
である。
【０１１４】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインＶＬ‐２のアミノ酸配列（配列番号８５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIK
【０１１５】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐２をエンコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号８６（ＣＤＲL残基をエンコードするヌクレオチドは下線付きで示されている）：
gacatcgtga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga
cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg
cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc
gccagctacc ggtacacagg cgtgcccgat agattcagcg gcagcggctc
cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc gaggacatcg
ccgtttacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga
ggcaccaagc tggaaatcaa g
である。
【０１１６】
ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインＶＬ‐１及びＶＬ‐２のＣＤＲL１は、リシン〜アルギニンのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：RASQDVSSVVA（配列番号８７）を有する（置換されたアルギニンは下線付きで示されている）。同様の置換は、上記ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＣＤＲL１ドメインのいずれに組み込まれ得ると考えられる。
【０１１７】
ここで提示されたＶＨ及び／又はＶＬドメインのアミノ酸配列に対する、若干の変化が考えられる。例えば、ここに記載されているＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣ末端アミノ酸残基を置換することによって、サブクローニングを促進できる。
【０１１８】
Ｖ．抗ＬＡＧ‐３抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５及び／又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６、並びに操作済みＦｃ領域を有するこれらの誘導体
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性信号にまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃ領域の、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的なＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号２）、ＩｇＧ３（配列番号３）及びＩｇＧ４（配列番号４）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
【０１１９】
Ｆｃ領域の修飾は通常、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化又はエフェクタ機能の変化につながる。本発明の抗体又は他の結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。上記実施形態では、エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明の分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１２０】
特定の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、野生型Ｆｃ領域（例えば配列番号１）のアミノ酸の配列に対する１つ又は複数の修飾（例えば置換、欠失又は挿入）を有するＦｃ領域を備え、上記修飾は、上記Ｆｃ領域の、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を低下させる。他の実施形態では、本発明の分子は、野生型Ｆｃ領域のアミノ酸に対する１つ又は複数の修飾を有するＦｃ領域を備え、上記修飾は、上記Ｆｃ領域の、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を上昇させる。他の実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃ領域を含み、ここで上記変異型は、Ｆｃドメインを含まない、又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性の上昇、及び／又はＦｃγＲＩＩＡへの結合の増大を与える、又は仲介する。代替実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃ領域を含み、ここで上記変異型は、Ｆｃ領域を含まない、又は野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクタ機能）の低下、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合の増大を与える、又は仲介する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むＬＡＧ‐３結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子と比べて、いずれのＦｃγＲに対する検出可能な結合を示さない。他の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域を含むＬＡＧ‐３結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃ領域は、単一のＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、又はＦｃγＲＩＩＩＡのうちの１つにしか結合しない。このような上昇した親和性及び／又は結合活性は好ましくは、当該細胞内において（修飾されたＦｃ領域を有しない）親分子の結合活性が検出できない場合に低いレベルのＦｃγＲを発現する細胞における、又は３００００〜２００００分子／細胞の密度、２００００〜１００００分子／細胞の密度、１００００〜５０００分子／細胞の密度、５０００〜１０００分子／細胞の密度、１０００〜２００分子／細胞の密度、若しくは２００分子／細胞以下（ただし少なくとも１０、５０、１００若しくは１５０分子／細胞）の密度で非ＦｃγＲ受容体標的抗原を発現する細胞において、検出可能なＦｃγＲへの結合又はＦｃγＲ関連活性の程度をインビトロで測定することによって評価される。
【０１２１】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、活性化及び／又は阻害Ｆｃγ受容体に関する親和性が変化した変異型Ｆｃ領域を備えてよい。一実施形態では、上記ＬＡＧ‐３結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が増大し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性が低下した、変異型Ｆｃ領域を備える。別の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性が増大した、変異型Ｆｃ領域を備える。更に別の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性も低下した、変異型Ｆｃ領域を備える。更に別の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、野生型Ｆｃ領域を備えた同等の分子に対して、ＦｃγＲＩＩＢに関する親和性が変化しておらず、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに関する親和性が低下（又は増大）した、変異型Ｆｃ領域を備える。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、免疫グロブリンが増強されたエフェクタ機能を有するように、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が変化した変異型Ｆｃ領域を含む。エフェクタ細胞機能の非限定的な例としては、抗体依存性細胞仲介細胞毒性、抗体依存性細胞食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及び相補性決定細胞仲介細胞毒性が挙げられる。
【０１２３】
ある好ましい実施形態では、親和性又はエフェクタ機能の変化は、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。本発明の他の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、又は少なくとも２５０％高い親和性で、１つ又は複数のＦｃＲに免疫特異的に結合する。このような測定は、インビボ又はインビトロアッセイとすることができ、好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイ等のインビトロアッセイである。
【０１２４】
様々な実施形態において、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型は、ＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性を刺激するか、又はＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性に拮抗する。好ましい実施形態では、上記分子は、ＦｃγＲＩＩＢの１つ又は複数の活性、例えば、Ｂ細胞受容体‐仲介型シグナリング、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、ＦｃεＲＩシグナリングのＦｃγＲＩＩＢ‐仲介型阻害、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化、ＳＨＩＰ動員、ＳＨＩＰリン酸化及びＳｈｃとの連結、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路中の１つ若しくは複数の下流分子の活性（例えばＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８若しくはＡｋｔ）に拮抗する変異体を含む。別の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、ＦｃεＲＩの１つ又は複数の活性、例えば肥満細胞活性化、カルシウム可動化、脱顆粒、サイトカイン産生又はセロトニン放出を刺激する変異体を含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、上記分子は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）からのＦｃ領域含有領域を含む。本明細書において使用される場合、Ｆｃ領域は、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに比べてある特定のＩｇＧアイソタイプと最も高い相同性を有する場合に、当該ＩｇＧアイソタイプのものであると表現される。上記様々なＩｇＧアイソタイプは、例えばFlesch, and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14: 141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 又はBruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166: 1351-1361に記載されているような、そのヒンジ及び／又はＦｃ領域のアミノ酸配列の違いにより、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性及びエフェクタ機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を含む様々な物理的及び機能的特性を呈する。このタイプの変異型Ｆｃ領域を、単独で、又はアミノ酸修飾と組み合わせて使用して、Ｆｃ仲介型エフェクタ機能及び／又は結合活性に影響を及ぼすことができる。組み合わせにおいて、アミノ酸修飾及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、同様の機能性（例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇）を示すことができ、また相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比べて、本発明の分子のエフェクタ機能性を修飾できる。他の実施形態では、アミノ酸修飾及びＩｇＧ  Ｆｃ領域は反対の機能性（例えばそれぞれＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇及び低下）を示すことができ、また、同一のアイソタイプの、Ｆｃ領域を含まない又は野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比べて、本発明の分子の特異的機能性を選択的に調節又は低下させるよう作用できる。
【０１２６】
好ましい具体的実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、これにより、上記変異体Ｆｃ領域が、Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73に開示されているもののようなＦｃ‐ＦｃＲ相互作用の結晶学的及び構造的分析に基づいて、ＦｃγＲと直接接触する位置において置換を有しない場合に上記分子のＦｃＲに対する親和性が変化する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸残基２３４‐２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸残基２６５‐２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸残基２９７‐２９９（Ｃ’／Ｅループ）及びアミノ酸残基３２７‐３３２（Ｆ／Ｇループ）である。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、構造的及び結晶学的分析に基づいてＦｃγＲと直接接触しない、例えばＦｃ‐ＦｃγＲ結合部位内にない、少なくとも１つの残基の修飾を含む、変異型Ｆｃ領域を含む。
【０１２７】
変異型Ｆｃ領域は当該技術分野において公知であり、例えばＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるような、Ｆｃ領域（若しくはその一部）を備える本発明の分子が呈するエフェクタ機能を付与又は改変するために、いずれの公知の変異型Ｆｃ領域を本発明において使用してよい。例えば、変化したエフェクタ機能として識別されるＦｃ領域変異型は、国際公開第０４／０６３３５１号；国際公開第０６／０８８４９４号；国際公開第０７／０２４２４９号；国際公開第０６／１１３６６５号；国際公開第０７／０２１８４１号；国際公開第０７／１０６７０７号；及び国際公開第２００８／１４０６０３号において開示されており、開示されているいずれの好適な変異体を、本発明の分子において使用してよい。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、１つ又は複数の領域において１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する変異型Ｆｃ領域を含み、上記１つ又は複数の修飾は、変異型Ｆｃ領域の、阻害型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ等）に対する親和性に対する活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＡ等）に対する親和性の比率を、（野生型Ｆｃ領域に対して）変化させる：
【数１】
2018527290.tif 000003
【０１２９】
（野生型Ｆｃ領域に対して）変異型Ｆｃ領域の親和性の比率が１を超える変異型Ｆｃ領域を有する本発明のＬＡＧ‐３結合分子が特に好ましい。このような分子は、例えば癌又は感染症といった、ＦｃγＲが仲介するエフェクタ細胞機能（例えばＡＤＣＣ）の効率の増強が望まれる疾患、障害、若しくは感染の治療的若しくは予防的処置、又はその症状の寛解を提供するにあたって特定の用途を有する。対照的に、親和性の比率が１未満である変異型Ｆｃ領域は、エフェクタ細胞機能の効率の低下を仲介する。表１は、例示的な単一、二重、三重、四重及び五重突然変異を、その親和性の比率が１を超えるか１未満であるかによって列挙している。
【０１３０】
【表１】
2018527290.tif 000004
【０１３１】
ある具体的な実施形態では、変異型Ｆｃ領域において、２３５、２４０、２４１、２４３、２４４、２４７、２６２、２６３、２６９、２９８、３２８、又は３３０位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）、及び好ましくは以下の残基：Ａ２４０、Ｉ２４０、Ｌ２４１、Ｌ２４３、Ｈ２４４、Ｎ２９８、Ｉ３２８又はＶ３３０のうちの１つ又は複数。異なる具体的な実施形態では、変異型Ｆｃ領域において、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８３、２８５、２８６、２８９、２９２、２９３、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）、好ましくは以下の残基：Ｈ２８０、Ｑ２８０、Ｙ２８０、Ｇ２９０、Ｓ２９０、Ｔ２９０、Ｙ２９０、Ｎ２９４、Ｋ２９５、Ｐ２９６、Ｄ２９８、Ｎ２９８、Ｐ２９８、Ｖ２９８、Ｉ３００又はＬ３００。
【０１３２】
ある好ましい実施形態では、変化した親和性でＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。好ましくは、上記変異型Ｆｃ領域は、以下の残基のうちのいずれか１つを有する：Ａ２５６、Ｎ２６８、Ｑ２７２、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ａ２９８、Ｍ３０１、Ａ３１２、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｎ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ｔ３３９、Ａ３３３、Ａ３３４、Ｅ３３４、Ｈ３３４、Ｌ３３４、Ｍ３３４、Ｑ３３４、Ｖ３３４、Ｋ３３５、Ｑ３３５、Ａ３５９、Ａ３６０又はＡ４３０。
【０１３３】
異なる実施形態では、低下した親和性で（そのＦｃ領域を介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。
【０１３４】
異なる実施形態では、増強された親和性で（そのＦｃ領域を介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８、又は４３０位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。異なる実施形態では、増強された親和性でＦｃγＲＩＩＡに結合する変異型Ｆｃ領域において、以下の残基のうちのいずれか１つ：Ａ２５５、Ａ２５６、Ａ２５８、Ａ２６７、Ａ２６８、Ｎ２６８、Ａ２７２、Ｑ２７２、Ａ２７６、Ａ２８０、Ａ２８３、Ａ２８５、Ａ２８６、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ｍ３０１、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ａ３３１、Ｑ３３５、Ａ３３７又はＡ４３０。
【０１３５】
好ましい変異体は、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２７５、２８１、２８４、２９１、２９６、２９７、２９８、２９９、３０２、３０４、３０５、３１３、３２３、３２５、３２６、３２８、３３０又は３３２位のうちのいずれにおける１つ又は複数の修飾を含む。
【０１３６】
特に好ましい変異体は、群Ａ〜ＡＩから選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【０１３７】
【表２】
2018527290.tif 000005
【０１３８】
更に特に好ましい変異体は、群１〜１０５から選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【０１３９】
【表３】
2018527290.tif 000006
2018527290.tif 000007
【０１４０】
一実施形態では、本発明の多ＬＡＧ‐３結合分子は、Ｆｃ領域において少なくとも１つの修飾を有する変異型Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃドメインは、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで上記番号付与は、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付与である。
【０１４１】
ある具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は以下を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つの置換；
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される、少なくとも２つの置換；
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも３つの置換；
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも４つの置換；又は
（Ｅ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも５つの置換。
【０１４２】
別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、以下の置換を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ；又は
（Ｃ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌ。
【０１４３】
一実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低減された（又は略全く結合しない）変異型Ｆｃ領域を備える。一実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する結合が低減し（又は略結合せず）、かつＡＤＣＣエフェクタ機能が低下した（又は上記機能を有しない）、変異型Ｆｃ領域を備える。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ｇからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含む。ある具体的実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｄ２６５Ａ；Ｎ２９７Ｑ又はＮ２９７Ｇの置換を含む。
【０１４４】
異なる実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が低減し（若しくは略結合せず）、及び／又はエフェクタ機能が低下した、Ｆｃ領域を備える。ある具体的実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子はＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号２）又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号４）を備える。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を利用する場合、本発明は、鎖の交換の発生を低減するためのＩｇＧ４ヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば、配列番号１１７：ESKYGPPCPPCP（Lu et al., (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,” J. Pharmaceutical Sciences 97:960‐969）を参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。当該技術分野において公知である他の安定化突然変異をＩｇＧ４  Ｆｃ領域に導入してもよい（Peters, P et al., (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,” J. Biol. Chem., 287:24525-24533；国際公開第２００８／１４５１４２号）。
【０１４５】
他の実施形態では、本発明は：Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function " Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R " J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 " J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies " Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities " Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions " Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains " J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors " FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M . et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；米国特許第７，２７６，５８６号；及び米国特許第７，３１７，０９１号；並びに国際公開第００／４２０７２号及び国際公開第９９／５８５７２号に開示されているもの等の、公知のいずれのＦｃ変異体の使用を包含する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は更に、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよく、これにより、１つ又は複数の炭水化物部分は上記分子に共有結合によって付着する。好ましくは、Ｆｃ領域に１つ若しくは複数のグリコシル化部位及び／又は１つ若しくは複数の修飾を有する、本発明の分子は、未修飾抗体と比べて、増強された抗体仲介性エフェクタ機能、例えば増強されたＡＤＣＣ活性を与える、又は有する。いくつかの実施形態では、本発明は更に、Ｆｃ領域の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用することが分かっている、２４１、２４３、２４４、２４５、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、又は３０１位のアミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の１つ又は複数の修飾を含む、分子を含む。Ｆｃ領域の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用するアミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばJefferis et al. (1995) Immunology Letters, 44: 111-7（この文献は参照によりその全体が本出願に援用される）を参照されたい。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明は、好ましくは当該分子の機能性、例えば標的分子又はＦｃγＲへの結合活性を変化させることなく、１つ又は複数のグリコシル化部位を、当該分子の１つ又は複数の部位に導入することによって修飾された、分子を包含する。グリコシル化部位は、本発明の分子の可変及び／又は定常領域に導入してよい。本明細書において使用される場合、「グリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」は、オリゴ糖（即ち一体に連結した２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が特異的に共有結合によって付着する、抗体中のいずれの具体的なアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は典型的には、Ｎ結合又はＯ結合を介して抗体のバックボーンに連結する。Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を表す。Ｏ結合グリコシル化は、例えばセリン、トレオニンといったヒドロキシアミノ酸へのオリゴ糖部分の付着を表す。本発明の分子は、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化部位を含む、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよい。当該技術分野において公知のＮ結合又はＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位を、本発明に従って使用してよい。本発明の方法に従って使用できる例示的なＮ結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列：Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオニン又はセリンを示す。このような１つ又は複数の部位は、本発明が関与する技術分野において公知の方法を用いて、本発明の分子に導入してよい（例えばIN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116（その全体は参照によって本出願に援用される）を参照のこと）。グリコシル化部位を本発明の分子に導入するための例示的な方法は：分子のアミノ酸配列を修飾するか若しくは突然変異させて、所望のＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を得るステップを含んでよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を追加又は欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。抗体（及び抗体ドメイン、例えばＦｃ領域を含む分子）の炭水化物含量を改変する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明に包含される。例えば米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６Ｂ１号；米国特許出願第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（これらの全体は参照によって本出願に援用される）を参照されたい。他の実施形態では、本発明は、当該分子の１つ又は複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。ある具体的実施形態では、本発明は、２９７位に隣接する位置を修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位をシフトするステップを包含する。ある具体的実施形態では、本発明は２９６位を修飾することによって、２９７位ではなく２９６位をグリコシル化するステップを包含する。
【０１４９】
エフェクタ機能はまた、Ｆｃ領域に１つ又は複数のシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合を可能とし、その結果として吸収能力が改善され得る、並びに／又は補体仲介型細胞殺滅及びＡＤＣＣが増大し得るホモ二量体抗体を生成することにより、修飾できる（Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922）。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体はまた、Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565に記載されているようなヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製できる。あるいは、二重Ｆｃドメインを有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強され得る抗体を加工できる（Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge " Anti-Cancer Drug Design 3:219-230）。
【０１５０】
Ｆｃ領域を備える本発明の分子の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃ領域の結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（ｈａｌｆ‐ｌｉｆｅ）は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被験者の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、かつ（野生型Ｆｃ領域に対して）増大した半減期を呈する、変異型Ｆｃ領域を備える。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスによって番号付与された２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ又は複数の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む、変異型Ｆｃ領域を備える。Ｆｃ領域含有分子の半減期を増大させることができる多数の具体的な突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第  ７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。半減期が増強されたＦｃ領域含有分子としては、Ｆｃ領域残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を有するものも挙げられる。
【０１５３】
ある具体的実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は、以下の置換を含む：
（Ａ）２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）２５０Ｑ及び４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ。
【０１５４】
本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる１つ又は複数の突然変異
を含む、変異型Ｆｃ領域も包含する。
【０１５５】
ＶＩ．本発明の二重特異性ＬＡＧ‐３結合分子
本発明の一実施形態は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合できる二重特異性結合分子に関し、ここで上記第１のエピトープは、ヒトＬＡＧ‐３のエピトープであり、上記第２のエピトープは、ＬＡＧ‐３の同一の若しくは異なるエピトープであり、又は免疫細胞（例えばＴリンパ球等）の表面上に存在して免疫チェックポイントの制御に関与する別の分子のエピトープである。特定の実施形態では、上記第２のエピトープは好ましくはＬＡＧ‐３のエピトープではない。一実施形態では、上記第２のエピトープは、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープである。ある具体的実施形態では、上記第２のエピトープは、ＣＤ１３７、ＰＤ‐１、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ又はＴＩＭ‐３である。特定の実施形態では、このような二重特異性分子は、３つ以上のエピトープ結合部位を備える。このような二重特異性分子は例えば、ＬＡＧ‐３の２つ以上の異なるエピトープ、及びＬＡＧ‐３ではない分子の少なくとも１つのエピトープに結合してよい。
【０１５６】
本発明は、ＬＡＧ‐３及び上記第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に同時に結合できる二重特異性抗体を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＤ‐１及び上記第２のエピトープに同時に結合できる上記二重特異性抗体は、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第２００６／１０７６１７号、国際公開第２００７／０４６８９３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１０／０２８７９７、国際公開第２０１００２８７９６号、国際公開第２０１０／０２８７９５号、国際公開第２０１０／１０８１２７号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１３／０７０５６５号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１３／１７４８７３号、及び国際公開第２０１４／０２２５４０号に記載の方法のうちのいずれを用いて産生され、上記文献はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０１５７】
１．Ｆｃ領域を有しない二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは上記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖からなる、二重特異性１価ダイアボディに関し、その配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに対して共有結合して、第１のエピトープ（「エピトープ１」）及び第２のエピトープ（「エピトープ２」）（これらのエピトープは互いに同一ではない）に同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成することを可能とする。従ってこのような二重特異性ダイアボディは、上記第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン（ＶＬエヒ゜トーフ゜1／ＶＨエヒ゜トーフ゜1）と、上記第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン（ＶＬエヒ゜トーフ゜2／ＶＨエヒ゜トーフ゜2）とを備える。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、このような二重特異性ダイアボディの「第１の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、このような二重特異性ダイアボディの「第２の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。一実施形態では、このようなダイアボディ分子のエピトープ１は、ＬＡＧ‐３のエピトープであり、このようなダイアボディ分子のエピトープ２は、ＬＡＧ‐３のエピトープではない（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等のエピトープである）。
【０１５８】
このようなＬＡＧ‐２結合ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＬＡＧ‐３又は上記第２のエピトープを含有する抗原）に特異的な第１の官能性エピトープ結合部位を形成する。同様に上記第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち上記第２のエピトープを含有する抗原又はＬＡＧ‐３）に特異的な第２の官能性エピトープ結合部位を形成する。従って、上記第１及び第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインの選択は、上記ダイアボディの上記２つのポリペプチド鎖が合わせて、ＬＡＧ‐３のエピトープ及び上記第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを備える（即ちこれらが合わせて、ＶＬLAG‐3／ＶＨLAG‐3及びＶＬエヒ゜トーフ゜2／ＶＨエヒ゜トーフ゜2ドメインを備える）ように、整合される。結合ドメインの特定のペア（即ちＶＬエヒ゜トーフ゜1／ＶＨエヒ゜トーフ゜1又はＶＬエヒ゜トーフ゜2／ＶＨエヒ゜トーフ゜2）とは無関係に、エピトープ１を有する抗原のエピトープ、又はエピトープ２を有する抗原のエピトープは、上記ダイアボディの第１のエピトープ：第２のエピトープと呼称され、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在及び配向のみに関連を有する。
【０１５９】
このような二重特異性１価ダイアボディのある実施形態の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；上記第１のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン、又は上記第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬLAG‐3又はＶＬエヒ゜トーフ゜2）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬLAG‐3を含有する場合は）上記第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬエヒ゜トーフ゜2を含有する場合は）上記第１のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含む第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０１６０】
二重特異性１価ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン、又は上記第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬLAG‐3又はＶＬエヒ゜トーフ゜2；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬLAG‐3を含有する場合は）上記第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬエヒ゜トーフ゜2を含有する場合は）ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含む第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０１６１】
最も好ましくは、上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる介在リンカーペプチド（例えばリンカー１）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号８８）：GGGSGGGGを有する。
【０１６２】
上記第２の介在リンカーペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、ヘテロ二量体促進ドメインの選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在リンカーペプチド（リンカー２）は、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特に上記ヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在リンカーペプチド（リンカー２）が利用される。上記システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステイン残基を含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列番号８９：GGCGGGの配列を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号９０）、LGGGSG（配列番号９１）、GGGSGGGSGGG（配列番号９２）、ASTKG（配列番号９３）、LEPKSS（配列番号９４）、APSSS（配列番号９５）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【０１６３】
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号９６）又はVEPKSC（配列番号９７）又はAEPKSC（配列番号９８）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号９９）又はFNRGEC（配列番号１００）がある（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【０１６４】
しかしながらより好ましくは、このようなダイアボディのヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つのアミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成され、これにより上記ヘテロ二量体促進ドメインは実効電荷を有する（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH‐Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix‐stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled‐coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221‐228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235‐1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138‐140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross‐Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540‐557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real‐Time Monitoring of the Interactions of Two‐Stranded de novo Designed Coiled‐Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754‐1763; Fernandez‐Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled‐Coil Tag,” Protein Science 21:511‐519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End‐To‐End And End‐To‐Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032‐1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled‐Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477‐483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two‐Stranded α‐Helical Coiled‐Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α‐Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272‐37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′‐‐d‐‐d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′‐‐a‐‐a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled‐coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5): 2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled‐coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232‐1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C‐terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled‐Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79‐112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand‐Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355‐367）。
【０１６５】
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインのコイルドメインは、上記ヘテロ二量体促進ドメインに対して負の電荷を与えるよう選択された８つのアミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインのコイルドメインは、上記ヘテロ二量体促進ドメインに対して正の電荷を与えるよう選択された８つのアミノ酸残基のシーケンスを含んでよい（又はその逆であってよい）。両方のポリペプチド鎖がこのようなヘテロ二量体促進ドメインを備える際に、反対の電荷のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどちらのコイルを設けるかは重要ではない。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正荷電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できないが、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
【０１６６】
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの１つは、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号１０１：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を備え、そのグルタミン酸残基は、ｐＨ７において負の電荷を形成し、またその一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋ドメイン（配列番号１０２：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備え、そのリジン残基は、ｐＨ７において正の電荷を形成する。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。特に好ましいのは、配列番号１０１の上記４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１０３）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。同様に、特に好ましいのは、配列番号１０２の上記４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号１０４）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【０１６７】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号１０５）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【０１６８】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号１０５の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70A71EGVKALIDE ILAALP（配列番号１０６）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号１０７）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号１０８）を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号９０：GGGSである。
【０１６９】
２．Ｆｃ領域を含有する二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、ＬＡＧ‐３及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に同時に結合できるＦｃ領域を備える、二重特異性ダイアボディに関する。上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃ領域が形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
【０１７０】
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号９６）、VEPKSC（配列番号９７）又はAEPKSC（配列番号９８）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号９９）又はFNRGEC（配列番号１００）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号１０１：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK又は配列番号１０３：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号１０２：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE又は配列番号１０４：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備えるペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
【０１７１】
本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子は一般に、介在リンカーペプチド（リンカー）を含む。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含む。本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子において採用できる追加の又は代替のリンカーとしては、：GGGS（配列番号９０）、LGGGSG（配列番号９１）、GGGSGGGSGGG（配列番号９２）、ASTKG（配列番号９３）、DKTHTCPPCP（配列番号１０９）、LEPKSS（配列番号９４）、APSSS（配列番号９５）、及びAPSSSPME（配列番号１１０）、LEPKSADKTHTCPPC（配列番号１１１）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりに配列番号９４を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又は配列番号９４の直後に配列番号１０９を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号１１２）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号１１３）を形成してよい。本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジ領域を組み込んでよい。例示的なヒンジ領域としては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１１４）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号１１５）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号１１６）；及び鎖交換を低減するための安定化置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号１１７）が挙げられる。
【０１７２】
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明のダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープ（「エピトープ３」）に結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープ（「エピトープ４」）に結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表２に提示する。
【０１７３】
【表４】
2018527290.tif 000008
【０１７４】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディ（図３Ａ〜３Ｃ）である。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＬＡＧ‐３に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＬＡＧ‐３の同一のエピトープ又はＬＡＧ‐３の異なるエピトープに結合できる）、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な２つのエピトープ結合部位を備える。
【０１７５】
更なる実施形態では、上記二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び上記第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃ領域を形成する。このようなダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃ領域含有二重特異性ダイアボディは、２つの配向（表３）のうちのいずれを有してよい。
【０１７６】
【表５】
2018527290.tif 000009
【０１７７】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディ（図４Ａ〜４Ｂ）である。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＬＡＧ‐３に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な１つのエピトープ結合部位を備える。
【０１７８】
更なる実施形態では、上記二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
【０１７９】
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１結合部位を形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。このようなダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら、本明細書において提示されるように、これらのドメインは好ましくは、ＬＡＧ‐３を第２のエピトープ（又は第２及び第３のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等））に結合するように選択される。上記第２及び第３のエピトープは、同一の抗原分子の異なるエピトープであってよく、又は異なる抗原分子のエピトープであってよい。本発明のこのような態様について、以下で詳細に議論する。
【０１８０】
よって上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、二重特異性ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を備えるように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表４に示す。
【０１８１】
【表６】
2018527290.tif 000010
【０１８２】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位を有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。一実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＬＡＧ‐３に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＬＡＧ‐３の同一のエピトープ又はＬＡＧ‐３の異なるエピトープに結合してよい）、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な２つのエピトープ結合部位を備える。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＬＡＧ‐３に免疫特異的な３つのエピトープ結合部位（これらはＬＡＧ‐３の同一のエピトープ又はＬＡＧ‐３の異なるエピトープに結合してよい）、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣ  クラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な１つのエピトープ結合部位を備える。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＬＡＧ‐３に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び第２のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）に特異的な３つのエピトープ結合部位を備える。
【０１８３】
３．Ｆｃ領域を含有する二重特異性３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、Ｆｃ領域を備え、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープに同時に結合できる、二重特異性、３価結合分子に関し、ここで上記エピトープのうちの少なくとも１つは、上記エピトープのうちの別のものと同一ではない。従ってこのような二重特異性ダイアボディは、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、及び第３のエピトープに結合できる「ＶＬ３」／「ＶＨ３」ドメインを備える。一実施形態では、上記エピトープのうちの１つ又は２つは、ＬＡＧ‐３のエピトープであり、上記エピトープのうちの別の（又は他の）ものは、ＬＡＧ‐３のエピトープではない（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等のエピトープである）。このような二重特異性３価結合分子は、３つのエピトープ結合部位を備え、そのうちの２つは、結合部位Ａ及び結合部位Ｂを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合部位Ｃを提供する非ダイアボディ型結合ドメインである（例えば図６Ａ〜６Ｆ、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号参照）。
【０１８４】
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｂ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。
【０１８５】
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表５（図６Ａ及び６Ｂ）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
【０１８６】
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の可変軽鎖ドメインは、介在スペーサリンカーによって、このようなポリペプチド鎖の可変重鎖ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１４）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ又は複数の介在スペーサペプチドによって隔てられていてよい。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは、本明細書に提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。
【０１８７】
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合部位を形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。
【０１８８】
このようなダイアボディ分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら本明細書において提示されるように、これらのドメインは好ましくは、ＬＡＧ‐３及び第２のエピトープ（又は第２及び第３のエピトープ）を結合させるよう選択される（好ましくは、上記エピトープは、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３  ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等のエピトープである）。
【０１８９】
特にＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は第１のエピトープに関する１つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する１つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を含むよう、選択してよい。本発明の代表的な３価結合分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｆ及び表５に提示する。
【０１９０】
【表７】
2018527290.tif 000011
【０１９１】
本発明の一実施形態は、ＬＡＧ‐３に関する２つのエピトープ結合部位、及びＬＡＧ‐３以外の分子（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）上に存在する第２のエピトープに関する１つのエピトープ結合部位を備える、二重特異性３価結合分子に関する。ＬＡＧ‐３に関する２つのエピトープ結合部位は、同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合してよい。本発明の別の実施形態は、ＬＡＧ‐３に関する１つのエピトープ結合部位、及びＬＡＧ‐３以外の分子（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ‐４、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、ＯＸ４０、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＣＲ、ＴＩＭ‐３等）上に存在する第２の抗原に関する２つのエピトープ結合部位を備える、二重特異性３価結合分子に関する。上記第２の抗原に関する２つのエピトープ結合部位は、上記抗原の同一のエピトープ又は異なるエピトープ（例えばＬＡＧ‐３の同一の又は異なるエピトープ）に結合してよい。上述のように、このような二重特異性３価結合分子は、３つ又は４つのポリペプチド鎖を含んでよい。
【０１９２】
ＶＩＩ．定常ドメイン及びＦｃ領域
ここで提示されるのは、本発明のＬＡＧ‐３結合分子（例えば、抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）の生成に有用な抗体定常ドメインである。
【０１９３】
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインである。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１８）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
【０１９４】
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１９）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
【０１９５】
本明細書において提示されるように、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、Ｆｃ領域を備えてよい。本発明のこのような分子のＦｃ領域は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のものであってよい。本発明のＬＡＧ‐３結合分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域を備えてよい。上記ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域が存在する場合、上記ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃ領域と同一のアイソタイプのものである。
【０１９６】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２０）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【０１９７】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２１）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
【０１９８】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２２）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV 
である。
【０１９９】
ある例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１１４）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
【０２００】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１１５）：ERKCCVECPPCPである。
【０２０１】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１１６）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書に記載されているように、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的な安定化されたＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１１７）：ESKYGPPCPPCPである。
【０２０２】
本発明のＦｃ領域含有分子（例えば抗体、ダイアボディ及び３価分子）のＦｃ領域は、完全なＦｃ領域（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃ領域）であっても、又はＦｃ領域の断片のみであってもよい。任意に、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、Ｃ末端リシンアミノ酸残基を含まない。特に、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、操作済み変異型Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃ領域は、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しているか、又は１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。このようなＦｃ領域は、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０２０３】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low‐Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882‐8890を参照）。ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせ又は部分組み合わせで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域内に存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。
【０２０４】
特に、本発明のＦｃ領域含有分子のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。変異型Ｆｃ領域、及びこのような変化した結合を仲介できる突然変異の形態については、上述されている。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃ領域含有分子は、ＡＤＣＣエフェクタ機能が低下したＩｇＧ  Ｆｃ領域を備える。ある好ましい実施形態では、このような分子の第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域変異型は、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低いＦｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃ領域含有分子は、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号２）又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号４）を備える。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号１１７参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
【０２０５】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（配列番号１２３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２０６】
特に、本発明のＦｃ領域含有分子のポリペプチド鎖のＦｃ領域に関して、（対応する野生型Ｆｃ領域が呈する半減期に対して）血清半減期が増大することが好ましい。血清半減期が延長された変異型Ｆｃ領域及び突然変異形態については上述されている。ある好ましい実施形態では、このようなＦｃ領域含有分子の第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる、１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ又は複数の突然変異
を含む変異型Ｆｃ領域を備える、本発明のＦｃ領域含有分子を包含する。
【０２０７】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（配列番号１２４）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を含み、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２０８】
本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ４配列は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換（配列番号１２５）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
を含み、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２０９】
第１及び第３のポリペプチド鎖が同一ではないダイアボディ及び３価結合分子に関して、２つの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３のドメイン間、又は２つの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」とペアにすることができる。このような一連の突然変異は、Ｆｃ領域を形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は、これらのポリペプチド鎖を含むダイアボディの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。この戦略は、上述のように３つ、４つ又は５つの鎖を含むダイアボディ及び３価結合分子に関して利用してよく、ここで「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。
【０２１０】
好ましいノブは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Fc領域含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持第３のポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
【０２１１】
本発明のＦｃ領域含有分子の第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号１２６）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２１２】
２つのポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖）を有する、本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号１２７）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０２１３】
上述のように、配列番号１２６及び配列番号１２７のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃ領域を形成する。本発明はまた、１つ又は複数の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０２１４】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号１２６のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号１２７）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号１２６）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖）中に採用される。
【０２１５】
上述のように、本発明は、野生型ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、又は上述の置換の組み合わせを含むＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、Ｆｃ領域含有分子（例えば抗体及びＦｃ領域含有ダイアボディ）を包含する。このような変異型を包含するＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの例示的なアミノ酸配列は、（配列番号１２８）：
APEX1X2GGPSV  FLFPPKPKDT   LX3IX4RX5PEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD    GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY    RVVSVLTVLH
QDWLNGKEYK    CKVSNKALPA   PIEKTISKAK    GQPREPQVYT
LPPSREEMTK    NQVSLX6CX7VK GFYPSDIAVE    WESNGQPENN
YKTTPPVLDS    DGSFFLX8SKL  TVDKSRWQQG    NVFSCSVMHE
ALHX9X10YTQKS LSLSPGX11
であり、ここで：
（ａ）Ｘ1及びＸ2はいずれもＬ（野生型）であるか、又はいずれもＡ（ＦｃγＲ結合低下）であり；
（ｂ）Ｘ3、Ｘ4及びＸ5はそれぞれＭ、Ｓ及びＴ（野生型）であるか、又はＹ、Ｔ及びＥ（半減期延長）であり；
（ｃ）Ｘ6、Ｘ7及びＸ8はそれぞれＴ、Ｌ及びＹ（野生型）であるか、又はＷ、Ｌ及びＹ（ノブ）、若しくはＳ、Ａ及びＶ（ホール）であり；
（ｄ）Ｘ9及びＸ10はそれぞれＮ及びＨ（野生型）であるか、又はＮ及びＲ（タンパク質Ａ結合なし）、若しくはＡ及びＫ（タンパク質Ａ結合なし）であり；
（ｅ）Ｘ11はＫであるか、又は不在である。
【０２１６】
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを備える、ＬＡＧ‐３結合分子を包含する。
【０２１７】
ＶＩＩＩ．基準抗体
Ａ．基準抗ＬＡＧ‐３抗体
本発明の新規の抗ＬＡＧ‐３結合分子を評価及び特性決定するために、以下の基準抗体を採用した：２５Ｆ７（ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ、本明細書では「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ」と呼ぶ）。
【０２１８】
１．２５Ｆ７（「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ」）
２５Ｆ７（「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE
INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS
DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS
【０２１９】
２５Ｆ７（「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ
GTNLEIK 
【０２２０】
Ｂ．基準抗ＰＤ‐１抗体
抗ＰＤ‐１抗体と組み合わせた本発明の新規の抗ＬＡＧ‐３結合分子を評価及び特性決定するために、基準抗体を用いてよい。ＰＤ‐１に免疫特異的な抗体は公知であり（例えば米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第８，５５２，１５４号；国際公開第２０１２／１３５４０８号；国際公開第２０１２／１４５５４９号；及び国際公開第２０１３／０１４６６８号参照）：本明細書では「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」と呼ばれるニボルマブ（５Ｃ４、ＢＭＳ‐９３６５５８、ＯＮＯ‐４５３８、ＭＤＸ‐１１０６としても公知、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂがＯＰＤＩＶＯ（登録商標）として市販）；本明細書では「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」と呼ばれるペンブロリズマブ（以前はランブロリズマブとして公知、ＭＫ‐３４７５、ＳＣＨ‐９００４７５としても公知、ＭｅｒｃｋがＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）として市販）；本明細書では「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３」と呼ばれるＥＨ１２．２Ｈ７（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ）；本明細書では「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４」と呼ばれるピジリズマブ（ＣＴ‐０１１（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）としても公知）を含む。
【０２２１】
１．ニボルマブ（「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」）
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３１）（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV
IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND
DYWGQGTLVT VSS
を有する。
【０２２２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３２）（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ
GTKVEIK
を有する。
【０２２３】
２．ペンブロリズマブ（「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」）
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３３）（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG
INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD
YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
を有する。
【０２２４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３４）（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL
LIYLASYLESGVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL
TFGGGTKVEIK
を有する。
【０２２５】
３．ＥＨ１２．２Ｈ７（「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３」）
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３５）（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIHWVKQR PGQGLEWIGY
IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR
DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS
を有する。
【０２２６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３６）（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL
LIKFGSNLESGIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQHSWEIPY
TFGGGTKLEI K
を有する。
【０２２７】
４．ピジリズマブ  （「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４」）
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３７）（ＣＤＲH残基は下線付きで示されている）：
QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW
INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG
YDALDYWGQG TLVTVSS
を有する。
【０２２８】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１３８）（ＣＤＲL残基は下線付きで示されている）：
EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT
SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG
TKLEIK
を有する。
【０２２９】
ＩＸ．産生の方法
抗ＬＡＧ‐３ポリペプチド、並びに他のＬＡＧ‐３アゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータは、当該技術分野において公知の方法によって、例えば合成又は組み換えにより、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体のポリヌクレオチド及び／又は配列から生成できる。このようなペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータを製造する１つの方法は、ポリペプチドの化学合成と、これに続く、天然立体配座、即ち正しいジスルフィド結合を得るために適切な酸化条件下での処理とを伴う。これは、当業者に公知の方法論を用いて達成できる（例えばKelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1‐19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, ILを参照；米国特許第４，１０５，６０３号；米国特許第３，９７２，８５９号；米国特許第３，８４２，０６７号；及び米国特許第３，８６２，９２５号も参照）。
【０２３０】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341‐347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid‐Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen‐Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131‐5135; Ganesan, A. (2006) “Solid‐Phase Synthesis In The Twenty‐First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3‐10）。
【０２３１】
更に別の代替例では、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲのうちの１つ若しくは複数を有する、又はヒトＬＡＧ‐３若しくはその可溶形態への結合に関してＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６と競合する、完全ヒト抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう加工された市販のマウスを用いて得ることができる。ヒト化又はヒト抗体の生成のために、より望ましい（例えば完全なヒト抗体）又はよりロバストな免疫応答を生成するよう設計された遺伝子組み換え動物も使用してよい。このような技術の例は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，フレモント、ＣＡ）並びにＨＵＭＡｂ‐Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＴＣ  ＭＯＵＳＥ（商標）（いずれもＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，プリンストン、ＮＪ）である。
【０２３２】
ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばキメラ、ヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０２３３】
関心対象の抗体又はタンパク質は、エドマン分解による配列決定に供してよく、これは当業者には公知である。質量分析又はエドマン分解から生成されるペプチド情報を用いて、関心対象のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブ又はプライマを設計できる。
【０２３４】
関心対象のタンパク質クローニングの代替的な方法は、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のＣＤＲのうちの１つ若しくは複数を有する、又はヒトＬＡＧ‐３への結合に関してＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６と競合する、関心対象の抗体又はタンパク質を発現する細胞に関して、精製したＬＡＧ‐３又はその部分を用いて「パンニング（ｐａｎｎｎｉｎｇ）」することによるものである。「パンニング」手順は、ＬＡＧ‐３を発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、上記ｃＤＮＡを第２の細胞タイプにおいて過剰発現させ、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の存在又は不在下での、ＬＡＧ‐３への特異的結合に関して、第２の細胞タイプのトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって、実施してよい。「パンニング」による、細胞表面タンパク質に関する哺乳類遺伝子コーディングのクローニングにおいて使用される方法の詳細な説明は、従来技術中に見ることができる（例えばAruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation " Endocrinol. 140:5841-5854を参照）。
【０２３５】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０２３６】
関心対象の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をエンコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、対応する関心対象の内因性抗体又はタンパク質（これらが宿主細胞中に存在する場合）より５倍高い、より好ましくは１０倍高い、より好ましくは２０倍高い、より好ましくは５０倍高い、より好ましくは、１００倍高いレベルのｃＤＮＡを発現する。ＬＡＧ‐３への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは好ましくは、イムノアッセイ又はＦＡＣＳによって実行される。関心対象の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞を識別できる。
【０２３７】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば抗ＬＡＧ‐３ポリペプチドは、固相法を採用した自動ポリペプチド合成器によって産生してよい。
【０２３８】
本発明は、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体、及び上記抗体の、ＬＡＧ‐３に結合するいずれのポリペプチド断片の変異型（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等の抗体及び融合ポリペプチド、並びに活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０２３９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの１つ若しくは複数、又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体を備える融合タンパク質も包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＬＡＧ‐３、及びネイティブ分子内では上記抗体融合タンパク質が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列又は同種配列に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【０２４０】
Ｘ．本発明のＬＡＧ‐３結合分子の使用
本発明は、本発明のＬＡＧ‐３結合分子（例えば、抗ＬＡＧ‐３抗体、抗ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ等）、このような分子由来のポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用剤を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
【０２４１】
既に議論したように、ＬＡＧ‐３は、Ｔ細胞の増殖、機能及びホメオスタシスの下方制御において重要な役割を果たす。本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、ＬＡＧ‐３の機能を阻害することによって、ＬＡＧ‐３仲介性免疫系阻害を反転させる能力を有する。従って、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６、これらのヒト化誘導体、並びにこれらのＬＡＧ‐３結合断片を含む分子（例えば、二重特異性ダイアボディ等）、又はこのような抗体との結合に関して競合する分子を用いて、ＬＡＧ‐３仲介性免疫系阻害をブロックすることにより、上記免疫系の活性化を促進できる。
【０２４２】
ＬＡＧ‐３及び細胞表面上に存在する免疫チェックポイントの制御に関与する別の分子（例えばＰＤ‐１）に結合する、本発明の二重特異性ＬＡＧ‐３結合分子は、ＬＡＧ‐３及び上記免疫チェックポイント分子が仲介する免疫系阻害をブロックすることによって、免疫系を増強する。従って本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、被験者の免疫応答（例えばＴ細胞仲介性免疫応答）を増強するために有用である。特に本発明のＬＡＧ‐３結合分子を用いて、病原体の存在に関連する癌及び疾患（例えば細菌、真菌、ウイルス又は原虫感染）を含む、望ましくない様式で抑制された免疫系に関連するいずれの疾患又は状態を治療できる。
【０２４３】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる癌としては、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌が挙げられる。本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０２４４】
特に本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０２４５】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる病原体関連疾患としては、慢性ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染が挙げられる。本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる慢性感染としては：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアが挙げられる。
【０２４６】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、腫瘍ワクチン等の免疫原性作用剤と組み合わせることができる。このようなワクチンは、精製腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）、自己又は同種異系腫瘍細胞を含んでよい。多数の腫瘍ワクチン戦略が記載されている（例えばPalena, C., et al., (2006) “Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies,” Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I., et al. (2011) “Cancer immunotherapy comes of age,” Nature 480, 480-489; Zhang, X. M. et al. (2008) “The Anti-Tumor Immune Response Induced By A Combination of MAGE-3/MAGE-n-Derived Peptides,” Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L. et al. (2002) “Generation of T-cell Immunity to the HER-2/neu Protein After Active Immunization with HER-2/neu Peptide-Based Vaccines,” J. Clin. Oncol. 20:2624-2632; Vermeij, R. et al. (2012) “Potentiation of a p53-SLP Vaccine By Cyclophosphamide In Ovarian Cancer: A Single-Arm Phase II Study.” Int. J. Cancer 131:E670-E680参照）。本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、化学療法レジームと組み合わせることができる。これらの例では、投与される化学療法試薬の投与量を削減できる場合がある（Mokyr. M.B. et al. (1998) “Realization Of The Therapeutic Potential Of CTLA‐4 Blockade In Low‐Dose Chemotherapy‐Treated Tumor‐Bearing Mice,” Cancer Research 58: 5301‐5304）。
【０２４７】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、Ｔ細胞活性化のレベルを上昇させるために宿主免疫応答を活性化する抗体といった、他の免疫刺激分子と組み合わせることができる。特に、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ‐４抗体は、免疫系を活性化させることが実証されている（例えばdel Rio, M-L. et al. (2005) “Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation,” Eur. J. Immunol 35:3545-3560; Barber, D. L. et al. (2006) “Restoring Function In Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection,” Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) “Involvement of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy by PD-L1 blockade,” Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al., (1996) “Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade,” Science 271, 1734-1736参照）。本発明のＬＡＧ‐３結合分子と組み合わせることができる更なる免疫刺激分子としては：樹状細胞（ＤＣ）機能及び抗原提示を活性化させる、樹状細胞の表面上の分子に対する抗体；Ｔ細胞ヘルパー活性を代替できる抗ＣＤ４０抗体；並びにＰＤ‐Ｌ１、ＣＴＬＡ‐４、ＯＸ‐４０  ４‐１ＢＢ及びＩＣＯＳといった、Ｔ細胞共刺激分子に対する活性化抗体（例えばIto et al. (2000) “Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies,”Immunobiology 201:527-40；米国特許第５，８１１，０９７号；Weinberg et al. (2000) “Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity,” Immunol 164:2160-2169; Melero et al. (1997) “Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors,” Nature Medicine 3: 682-685; Hutloff et al. (1999)  “ICOS is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related to CD28,” Nature 397: 263-266;及びMoran, A.E. et al. (2013) “The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy,” Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004参照）、並びに／又は抗原結合時にＴ細胞を刺激する役割を果たす、様々な共刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４‐１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０等）からの１つ若しくは複数の細胞内シグナリングドメインに融合した疾患抗原を対象とする抗原結合ドメインを備える、刺激キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えばTettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood  123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia 28(8):1596-1605参照）が挙げられる。
【０２４８】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子を阻害キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）と組み合わせて、標的の免疫療法応答を転向させることができる。ｉＣＡＲとしては：抗原結合時にＴ細胞応答を制限する役割を果たす、様々な阻害タンパク質受容体（例えば、ＣＴＬＡ‐４、ＰＤ‐１等）からの１つ又は複数の細胞内シグナリングドメインに融合した疾患抗原を対象とする抗原結合ドメイン（例えばFedorov V.D. (2013) “PD-1- and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses,” Sci Tranl Med. 5(215):215ra172）が挙げられる。
【０２４９】
特に本発明の抗ＬＡＧ‐３抗体は、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ‐３抗体及び／又は癌ワクチンと併用される。
【０２５０】
治療における利用に加えて、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、着脱可能に標識でき、試料中のＬＡＧ‐３の検出又は細胞上のＬＡＧ‐３の撮像に使用できる。
【０２５１】
ＸＩ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＬＡＧ‐３結合分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＬＡＧ‐３結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明は特に、ＬＡＧ‐３結合分子が：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体；ヒト化ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １；  ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体；いずれのこのような抗体のＬＡＧ‐３結合断片である、医薬組成物、又はＬＡＧ‐３結合分子が二重特異性ＬＡＧ‐３ダイアボディ（例えば、ＬＡＧ‐３×ＰＤ‐１二重特異性ダイアボディ）である、医薬組成物を包含する。特に包含されるのは：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む、分子である。
【０２５２】
本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
【０２５３】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【０２５４】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０２５５】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
本発明はまた、本発明のＬＡＧ‐３結合分子（及びより好ましくは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体；ヒト化ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体；いずれのこのような抗体のＬＡＧ‐３結合断片；又はＬＡＧ‐３結合分子が二重特異性ＬＡＧ‐３ダイアボディ（例えばＬＡＧ‐３×ＰＤ‐１二重特異性ダイアボディ）であるもの）で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。特に包含されるのは、単独で又は薬学的に許容可能なキャリアと共に：ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む、分子である。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０２５７】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明のＬＡＧ‐３結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、癌に関連する１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【０２５８】
ＸＩＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０２５９】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０２６０】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【０２６１】
本発明はまた、本発明のＬＡＧ‐３結合分子を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０２６２】
凍結乾燥された本発明のＬＡＧ‐３結合分子は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このようなＬＡＧ‐３結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
【０２６３】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０２６４】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。
【０２６５】
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な、ウイルスの存在（又はその影響）の増殖の低減、並びにウイルス性疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０２６６】
本発明に包含されるＬＡＧ‐３結合分子（例えば抗体、ダイアボディ等）に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含されるＬＡＧ結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、又は少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｋｇ体重以上である。算出された用量は、ベースラインにおける患者の体重に基づいて投与される。ベースライン又は確立された安定体重からの体重の有意な（≧１０％の）変化は、用量の再計算を喚起するものとする。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本発明に包含されるＬＡＧ‐３結合二重特異性分子（例えば、ダイアボディ及び３価結合分子）に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、少なくとも約０．３ｎｇ／ｋｇ／日〜約０．９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約３ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３０ｎｇ／ｋｇ／日〜約９０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１００ｎｇ／ｋｇ／日〜約３００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２００ｎｇ／ｋｇ／日〜約６００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３００ｎｇ／ｋｇ／日〜約９００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４００ｎｇ／ｋｇ／日〜約８００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、又は少なくとも約１，０００ｎｇ／ｋｇ／日である。算出された用量は、ベースラインにおける患者の体重に基づいて投与される。ベースライン又は確立された安定体重からの体重の有意な（≧１０％の）変化は、用量の再計算を喚起するものとする。
【０２６８】
別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明のＬＡＧ‐３結合分子の１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日に亘って投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明のＬＡＧ‐３結合分子（及び特に、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体；ヒト化ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６抗体；いずれのこのような抗体のＬＡＧ‐３結合断片；又はＬＡＧ‐３結合分子が二重特異性ＬＡＧ‐３ダイアボディ（例えばＬＡＧ‐３×ＰＤ‐１二重特異性Ｆｃダイアボディ）であるもの）の用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する三重特異性結合分子の用量を投与しない）ことを含む。特に包含されるのは、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む分子の（同一週の５日目、６日目及び７日目における）投与である。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超える治療のコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。
【０２６９】
別の実施形態では、投与される用量は、上記ＬＡＧ‐３結合分子の１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４に亘って（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンに亘って）漸増する。表６は、ダイアボディを用いた典型的な治療コースに関する、上述の異なる投薬レジメンの５つの例を提供する。
【０２７０】
【表８】
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【０２７１】
本発明のＬＡＧ‐３結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は偏向できる。
【０２７２】
患者に投与される本発明のＬＡＧ‐３結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０２７３】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０２７４】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０２７５】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明のＬＡＧ‐３結合分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240;Buchwald et al.(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med. 321:574-579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science228:190-192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（２‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunn et al.に従って使用できる（米国特許第5,945,155号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身���内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０２７６】
放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372-397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０２７７】
本発明の組成物が、本発明のＬＡＧ‐３結合分子をエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードするＬＡＧ‐３結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２７８】
治療的又は予防的有効量の本発明のＬＡＧ‐３結合分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【０２７９】
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。本開示の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対して多数の修正を実施できることは、当業者には明らかであろう。
【０２８０】
実施例１  抗ＬＡＧ‐３モノクローナル抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の特性決定
６つのマウスモノクローナル抗体を、ヒト及びカニクイザルＬＡＧ‐３の両方に免疫特異的に結合できるものとして単離し、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４」、「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５」及び「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６」の呼称を与えた。これらの抗体のＣＤＲは異なることが分かっており、上述されている。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １をヒト化すると、本明細書において「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメイン、並びに本明細書において「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐１」、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐２」、「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐３」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐４」と呼ばれる４つのヒト化ＶＬドメインが得られた。またＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６をヒト化すると、本明細書において「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＨ‐２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメイン、並びに本明細書において「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐１」及び「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６  ＶＬ‐２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＬドメインが得られた。上述されているように、所与の抗体のヒト化重鎖及び軽鎖可変ドメインは、いずれの組み合わせで使用してよく、ヒト化可変ドメインの特定の組み合わせは、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称され、例えばｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＨ‐１及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １  ＶＬ‐２を含むヒト化抗体は具体的に「ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．２）」と呼ばれる。
【０２８１】
全長ヒト化ｍＡｂを、以下のようにして構成した：ヒト化ＶＬドメインのＣ末端をヒト軽鎖κ領域のＮ末端に融合させて軽鎖を生成し、各軽鎖を、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＡＡ）置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域又はＳ２２８Ｐ置換を含むヒトＩｇＧ４定常領域のＮ末端に融合させた同一の抗体のヒト化ＶＨドメインを備える重鎖と対合させる。
【０２８２】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＡＡ）置換を含む例示的なヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列は、（配列番号１３９）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP
KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC
LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０２８３】
配列番号１３９において、アミノ酸残基１‐９８はＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号１２０）に対応し、アミノ酸残基９９‐１１３はＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号１１４）に対応し、アミノ酸残基１１４‐３２９は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線）を含むＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号１２３）に対応する。
【０２８４】
Ｓ２２８Ｐ置換を含む例示的なヒトＩｇＧ４定常領域のアミノ酸配列は、（配列番号１４０）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES
KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED
PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０２８５】
配列番号１４０において、アミノ酸残基１‐９８はＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号１２２）に対応し、アミノ酸残基９９‐１１０は、Ｓ２２８Ｐ置換（下線）を含む安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号１１７）に対応し、アミノ酸残基１１１‐３２６はＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）に対応する。
【０２８６】
抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６、複数のヒト化ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ、及び基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて調査した。  抗ＬＡＧ‐３抗体を捕捉し、Ｈｉｓタグ付与可溶性ヒトＬＡＧ‐３（ｓｈＬＡＧ‐３‐Ｈｉｓ）を用いてインキュベートして、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって結合の動態を分析した。算出されたｋａ、ｋｄ及びＫＤを表７に提示する。
【０２８７】
【表９】
2018527290.tif 000013
【０２８８】
更なる研究において、ヒト化抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）、並びに基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの、ヒト及びカニクイザルＬＡＧ‐３両方に対する結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて調査した。これらの研究では、可溶性ＬＡＧ‐３融合タンパク質（マウスＩｇＧ２ａに融合したヒト又はカニクイザルＬＡＧ‐３の細胞外ドメイン）をＦａｂ２ヤギ抗マウスＦｃ表面上で捕捉し、抗ＬＡＧ‐３抗体を用いてインキュベートして、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって結合の動態を決定した。カニクイザルＬＡＧ‐３に結合するＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）の結合曲線を、それぞれ図７Ａ〜７Ｃに示し、算出されたｋａ、ｋｄ及びＫＤを表８に提示する。別の研究において、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）を含む二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの、ヒト及びカニクイザルＬＡＧ‐３両方に対する結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて調査した。この研究では、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）含有ダイアボディをＦａｂ2ヤギ抗ヒトＦｃ表面上で捕捉し、可溶性ＬＡＧ‐３融合タンパク質（Ｈｉｓタグに融合したヒト又はカニクイザルＬＡＧ‐３の細胞外ドメイン）を用いてインキュベートして、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって結合の動態を決定した。算出されたｋａ、ｋｄ及びＫＤを表８に提示する。
【０２８９】
【表１０】
2018527290.tif 000014
【０２９０】
この結果は、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６が、基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａよりも良好な結合動態を呈することを実証している。更に、ヒト化ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６は、カニクイザルＬＡＧ‐３との比較的良好な交差反応性結合動態を呈する。
【０２９１】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６及び基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａのエピトープ特異性を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて試験した。上記抗体が異なるＬＡＧ‐エピトープに結合するかどうかを決定するために、ｓｈＬＡＧ‐３‐Ｈｉｓを、製造元が推奨する手順に従ってＣＭ５センサチップ上で不動化されたマウスＰｅｎｔａＨｉｓ抗体によって捕捉した。簡潔に述べると、センサチップ表面上のカルボキシル基を、０．２ＭのＮ‐エチル‐Ｎ‐（３ジエチルアミノ‐プロピル）カルボジイミド及び０．０５ＭのＮ‐ヒドロキシ‐スクシンイミドを含有する溶液の注入によって活性化した。抗ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の活性化済みＣＭ５表面全体に亘って、流量５μＬ／分で注入し、その後、残留するアミン反応性基を不活性化するために１Ｍのエタノールアミンを注入した。結合実験は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０界面活性剤を含有するＨＢＳ‐ＥＰバッファ中で実施した。各抗体（ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６及びＬＡＧ‐２  ｍＡｂ  Ａ）を、捕捉されたｈＬＡＧ‐３  Ｈｉｓ全体に亘って、１８０秒間、流量５μＬ／分、濃度１μＭで予備注入した後、バッファを流し、競合する抗体を同一条件で注入した。競合する抗体の結合応答を、バッファと共に予備注入されたｈＬＡＧ‐３  Ｈｉｓに対するその結合応答と比較することによって、同一のエピトープに関して競合する抗体を同定した。不動化された抗ＰｅｎｔａＨｉｓ表面の再生成を、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５のパルス注入によって実施した。不動化されたタンパク質を有しない処置対象表面全体に亘る分析物の注入によって、基準曲線を得た。結合曲線は、リアルタイムセンソグラムデータから、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ４．１によって生成された。
【０２９２】
この実験の結果を図８Ａ〜８Ｄに示す。この実験の結果は、ビオチン化抗体ＬＡＧ３  ｍＡｂ  Ａが、過剰量の非ビオチン化抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の存在下でさえ、ｓｈＬＡＧ‐３‐Ｈｉｓに結合できたことを示している。対照的に、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６の結合をブロックした。従って上記結果は、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６が、ＬＡＧ‐３の同一の又は重なり合ったエピトープに結合し易く、ＬＡＧ‐３への結合に関して互いに競合することを示す。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６はいずれも、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａが結合するエピトープとは別個のエピトープに結合することが分かった。
【０２９３】
抗ＬＡＧ３抗体を更に特性決定するために、ＬＡＧ‐３とＭＨＣクラスＩＩとの間の結合をブロックする抗ＬＡＧ３抗体の能力を、２つの異なるアッセイにおいて評価した。一方のアッセイでは、ある表面上で不動化されたＭＨＣクラスＩＩに対する可溶性ヒトＬＡＧ３‐Ｆｃ融合タンパク質の結合をブロックする上記抗体の能力を試験した。このアッセイのために、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５（０〜６７ｎＭ、２倍段階希釈）をそれぞれ、可溶性ヒトＬＡＧ‐３‐Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍＬ）と混合し、不動化されたＭＨＣクラスＩＩ（１μｇ／ｍＬ）を用いて別個にインキュベートした。不動化されたＭＨＣクラスＩＩに結合したＬＡＧ‐３の量を、ヤギ抗ヒトＦｃγ‐ＨＲＰ二次抗体を用いて評価した。追加の実験では、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ、並びにヒト化抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）（０．００９６〜７．０ｎＭ、３倍段階希釈）を、可溶性ヒトＬＡＧ‐３‐Ｈｉｓ融合タンパク質（０．２μｇ／ｍｌ）と混合して、上述のように、不動化されたＭＨＣクラスＩＩへの結合に関してアッセイした。これらの実験の結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。
【０２９４】
別のアッセイでは、細胞表面上の天然ＭＨＣクラスＩＩに対する可溶性ヒトＬＡＧ３‐Ｆｃ融合タンパク質（ｓｈＬＡＧ‐３‐Ｆｃ）の結合をブロックする、本発明の抗ＬＡＧ‐３抗体の能力を試験した。このアッセイのために、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５及び基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ（０．１〜２６．７ｎｇ／ｍｌ、２倍段階希釈）それぞれを、ビオチン化可溶性ヒトＬＡＧ‐３‐Ｆｃ融合タンパク質（０．５μｇ／ｍｌ）と混合し、ＭＨＣ  ＩＩ陽性Ｄａｕｄｉ細胞を用いて別個にインキュベートした。上記Ｄａｕｄｉ細胞の表面に結合したＬＡＧ‐３の量を、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン二次抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析によって決定した。更なる別個の実験では、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ；又はＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １並びにヒト化抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．４）、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．２）、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（２．２）及びｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（１．１）を、上述のようにアッセイした。これらの実験の結果をそれぞれ図１０Ａ〜１０Ｃに示す。
【０２９５】
これらの阻害アッセイの結果（図９Ａ〜９Ｂ及び図１０Ａ〜１０Ｃ）は、試験した全ての抗ＬＡＧ‐３抗体が、ＭＨＣクラスＩＩに対するｓｈＬＡＧ‐３‐Ｆｃ融合タンパク質の結合をブロックしたことを示す。
【０２９６】
実施例２：フローサイトメトリーの方法論
以下に記載の実験における、細胞上のチェックポイント阻害物質：ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３の発現レベルを決定するための実験は、以下の適切に蛍光標識された市販の抗体（フィコエリトリン‐シアニン７（ＰＥ‐Ｃｙ７）コンジュゲート抗ＣＤ４［クローンＳＫ３］又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＣＤ４［クローンＲＰＡ‐Ｔ４］、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＬＡＧ‐３［クローン３ＤＳ２２３Ｈ］、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＰＤ‐１［クローンＥＨ１２．２Ｈ７］又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ若しくはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））、及び適切なアイソタイプ対照を使用した。全ての抗体は、製造元が推奨する濃度で使用した。一次抗体の添加のために、暗所において、氷上で３０分間、ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ中、１０％ＦＣＳ）中での細胞染色を実施した。２回洗浄した後、細胞を、暗所において、氷上で３０分間、適切な二次試薬で染色するか、又はフローサイトメーターで直ちに分析した。死亡細胞を排除するために、全ての試料を生存性染料：７‐アミノアクチノマイシンＤ（７‐ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ若しくはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、又は４'，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール、ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて共染色した。全ての試料を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ又はＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、アシュランド、オレゴン州）を用いて分析した。
【０２９７】
実施例３：ＬＡＧ‐３の発現、及び刺激Ｔ細胞への抗体結合
ＬＡＧ‐３の発現、及び単離したＬＡＧ‐３抗体の、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞の表面上のＬＡＧ‐３に特異的に結合する能力を試験した。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得た。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、製造元の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心法を用いて、健康なドナーからインフォームドコンセントのもとで得た全血から精製し、続いて製造元の指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）非接触ヒトＴ細胞キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｔ細胞を精製した。刺激のために、単離したＴ細胞を、製造元の指示に従い、組み換えヒトＩＬ‐２［３０Ｕ／ｍｌ］（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ細胞アクティベータビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で１０〜１４日間培養した。単離したばかりの未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞（１１日目又は１４日目に培養物から取得）上におけるＬＡＧ‐３の発現を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４及びＰＥコンジュゲート抗ＬＡＧ‐３を用いて、上述のようにフローサイトメトリーによって試験した。
【０２９８】
これらの研究の結果を図１１Ａ〜１１Ｃに示す。未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＬＡＧ‐３の発現は観察されなかった（図１１Ａ）。しかしながら、２体の異なるドナー（Ｄ：５８４６８及びＤ：４３５３０）由来のＣＤ３／ＣＤ８刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＬＡＧ‐３の発現が劇的に増加した（図１１Ｂ及び１１Ｃ）。
【０２９９】
ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １（図１２、パネルＡ及びＤ）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ２（図１２、パネルＢ及びＥ）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３（図１２、パネルＣ及びＦ）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４（図１３、パネルＡ及びＣ）、並びにＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ５（図１３、パネルＢ及びＤ）の、刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞に特異的に結合する能力を調査した。１４日目に培養物から取得した（ドナーＤ：５８４６８から上述のようにして調製した）刺激Ｔ細胞、及び（ドナーＤ：４３５３０から上述のようにして調製した）新鮮な未刺激細胞を、単離した抗ＬＡＧ‐３抗体、及び以下の適切に蛍光標識した二次試薬（ＰＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ））、及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４を用いたフローサイトメトリーに供した。図１２、パネルＡ〜Ｆ及び図１３、パネルＡ〜Ｄに示すように、試験した各抗ＬＡＧ‐３抗体は、刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞のみに結合し、未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞には結合しなかった。
【０３００】
これらの研究の結果は、ＬＡＧ‐３が刺激Ｔ細胞に対して上方制御されること、及び本発明の抗ＬＡＧ‐３抗体が刺激Ｔ細胞のみに特異的に結合することを実証している。
【０３０１】
実施例４：抗ＬＡＧ抗体の機能的活性
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型（ＳＥＢ）は、高い割合のＴ細胞（５〜３０％）を活性化できる、微生物超抗原である。ＳＥＢは、ペプチド結合溝の外側でＭＨＣ  ＩＩに結合するため、ＭＨＣ  ＩＩ依存性であるが、制限されておらず、またＴＣＲ仲介性でもない。Ｔ細胞のＳＥＢ刺激により、オリゴクローナルＴ細胞増殖及びサイトカイン産生がもたらされる（ただしドナーによる変動性は観察され得る）。ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣ上での、抗ＬＡＧ‐３及び抗ＰＤ‐１抗体の単独での及び組み合わせての発現を試験した。
【０３０２】
上述のようにして精製したＰＢＭＣを、Ｔ‐２５バルクフラスコ中のＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、単独で、又は０．１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に（一次刺激）、２〜３日間培養した。ＳＥＢ刺激の第１ラウンドの終了時、ＰＢＳを用いてＰＢＭＣを２回洗浄して、培地単独、０．１ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを含み抗体を含まない培地（二次刺激）、又はＳＥＢ及び対照ＩｇＧ抗体を含む培地中に、１〜５×１０5細胞／ウェルの濃度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、更に２〜３日間培養した。一次バルクＳＥＢ刺激から４８時間後、ＰＥコンジュゲート抗ＬＡＧ‐３及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３；又はＡＰＣコンジュゲート抗ＰＤ‐１及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３を用いたフローサイトメトリーによって、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３発現に関して細胞を試験した。ＳＥＢ刺激を用いた９６ウェルプレートにおける二次培養の５日目、抗体を用いずに又は対照抗体を用いて処置したウェルを、ＰＥコンジュゲート抗ＬＡＧ‐３及びＡＰＣコンジュゲート抗ＰＤ‐１を用いて、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３発現に関してフローサイトメトリーを用いて試験した。
【０３０３】
２体の代表的なドナー（Ｄ：３４７６５及びＤ：５３７２４）からのフローサイトメトリーの結果を、図１４、パネルＡ‐Ｄ（Ｄ：３４７６５）及び図１５、パネルＡ‐Ｄ（Ｄ：５３７２４）に示す。これらの結果は、ＬＡＧ‐３及びＰＤ‐１が、ＳＥＢ刺激の４８時間後に上方制御され、ＳＥＢ刺激を伴う培養の５日目に更なる増強が見られることを実証している。これらの研究では、ドナー１は、ＳＥＢ刺激後に、より多くのＬＡＧ‐３／ＰＤ‐１二重陽性細胞を有していた。ＳＥＢ刺激後に対照抗体を追加しても、ＬＡＧ‐３又はＰＤ‐１発現は変化しなかった（図１４、パネルＣ及びＤと図１５、パネルＣ及びＤを比較）。
【０３０４】
ＰＢＭＣのＳＥＢ刺激後の免疫チェックポイントタンパク質ＬＡＧ‐３及びＰＤ‐１の上方制御は、再刺激時のサイトカイン放出を制限する。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５」と呼ばれるＰＤ‐１モノクローナル抗体、並びに基準抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １（２３５Ａ／２３５Ａ  Ｆｃ変異型（ＡＡ））、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ及び市販の抗ＬＡＧ３抗体１７Ｂ４（＃ＬＳ‐Ｃ１８６９２、ＬＳ  Ｂｉｏ、名称「ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ｂ」を含む）の、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を試験した。
【０３０５】
二次刺激中に細胞を、抗体を伴わずに、アイソタイプ対照抗体を伴って、又は抗ＬＡＧ‐３及び抗ＰＤ‐１抗体を単独で若しくは組み合わせて伴って、播種したことを除いて、ＰＢＭＣをＳＥＢで上述のように刺激した。二次刺激の終了時、上清を採取し、製造元の指示に従って、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）用のヒトＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカイン分泌を測定した。図１６Ａ〜１６Ｂは、抗体を用いずに、又は以下の抗体：アイソタイプ対照、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ｂ、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ４若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６のうちの１つを用いて処置した代表的なドナー（Ｄ：３８１６６）からのＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの、ＩＦＮγ（図１６Ａ）及びＴＮＦα（図１６Ｂ）分泌プロファイルを示す。この研究に関して、抗体は、０．００９、０．０３９、０．１５６、０．６２５、２．５、１０及び４０μｇ／ｍｌで使用した。図１７は、抗体を用いずに；アイソタイプ対照抗体を用いて；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａを用いて；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １を用いて；又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５及び／若しくはＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３を用いて処置した、別の代表的なドナー（Ｄ：５８１０８）からのＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの、ＩＦＮγ分泌プロファイルを示す。この研究に関して、抗体は１０μｇ／ｍｌで使用した。
【０３０６】
これらの研究の結果は、抗ＰＤ‐１抗体が、再刺激時のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ（図１６Ａ及び図１７）並びにＴＮＦα（図１６Ｂ）産生の増大によって証明されるように、免疫系機能を劇的に増強させたことを実証している。驚くべきことに、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １もまた、抗ＰＤ‐１抗体に匹敵するレベルまで、複数のドナーに亘ってサイトカイン産生を増大させることが観察されたが、基準抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ及びＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ｂ、並びに単離された抗体のうちのいくつか（ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３、ＬＡＧ‐４及びＬＡＧ‐６）は、サイトカイン放出をわずかしか増強させなかった。更に、抗ＬＡＧ‐３抗体と抗ＰＤ‐１との組み合わせは、再刺激時のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのサイトカイン放出（図１７）の更なる増強をもたらした。ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １は、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ３及び基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａに比べて、抗ＰＤ‐１抗体と組み合わせた場合に、サイトカイン放出を最も増強させた。
【０３０７】
実施例５：内因性カニクイザルＬＡＧ‐３への結合
ヒト化抗体ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）及び基準抗体ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａの、カニクイザルＰＢＭＣ上に発現する内因性ＬＡＧ‐３に結合する能力を、ＦＡＣＳによって調査した。この研究のために、ＰＢＭＣをドナーであるカニクイザルの全血から単離し、単独で、又は概ね上述されているようにＳＥＢ刺激（５００ｎｇ／ｍＬ）を伴って、培養した。ＳＥＢ刺激の６６時間後、（未刺激及び刺激）細胞を、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）、ＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  Ａ又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １抗体（１０倍段階希釈）で染色した。上記抗体を、ヤギ抗ヒトＦｃ‐ＡＰＣ標識二次抗体を用いて検出した。２体のカニクイザルドナーに関して、図１８Ａ〜１８Ｂに結合をプロットしている。
【０３０８】
ＳＥＢ刺激は、抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １によって検出されるようなＰＤ‐１発現の増強によって確認された。これらの研究の結果は、ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  ６（１．１）が、刺激カニクイザルＰＢＭＣの表面上で発現する内因性ＬＡＧ‐３に結合することを実証している。
【０３０９】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０３１０】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：ＩｇＧ１  Ｆｃ領域；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号２：ＩｇＧ２  Ｆｃ領域；Ｘａａ２１６はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号３：ＩｇＧ３  Ｆｃ領域；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号４：ＩｇＧ４  Ｆｃ領域；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号５：ＬＡＧ−３
配列番号６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ
配列番号７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ  ＣＤＲ１
配列番号９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ  ＣＤＲ２
配列番号１０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ  ＣＤＲ３
配列番号１１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ
配列番号１２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ  ＣＤＲ１
配列番号１４：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ  ＣＤＲ２
配列番号１５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ  ＣＤＲ３
配列番号１６：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ１
配列番号１７：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ２
配列番号１９：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＨ２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２０：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ１
配列番号２１：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ２
配列番号２３：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ３
配列番号２５：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ３をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２６：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ４
配列番号２７：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ４をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２８：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  １のＶＬ４  ＣＤＲ１
配列番号２９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＨ
配列番号３０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＨをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＨ  ＣＤＲ１
配列番号３２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＨ  ＣＤＲ２
配列番号３３：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＨ  ＣＤＲ３
配列番号３４：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＬ
配列番号３５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＬをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＬ  ＣＤＲ１
配列番号３７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＬ  ＣＤＲ２
配列番号３８：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２のＶＬ  ＣＤＲ３
配列番号３９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＨ
配列番号４０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＨをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号４１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＨ  ＣＤＲ１
配列番号４２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＨ  ＣＤＲ２
配列番号４３：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＨ  ＣＤＲ３
配列番号４４：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＬ
配列番号４５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＬをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号４６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＬ  ＣＤＲ１
配列番号４７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＬ  ＣＤＲ２
配列番号４８：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ３のＶＬ  ＣＤＲ３
配列番号４９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＨ
配列番号５０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＨをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号５１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＨ  ＣＤＲ１
配列番号５２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＨ  ＣＤＲ２
配列番号５３：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＨ  ＣＤＲ３
配列番号５４：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＬ
配列番号５５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＬをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号５６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＬ  ＣＤＲ１
配列番号５７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＬ  ＣＤＲ２
配列番号５８：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ４のＶＬ  ＣＤＲ３
配列番号５９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＨ
配列番号６０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＨをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号６１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＨ  ＣＤＲ１
配列番号６２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＨ  ＣＤＲ２
配列番号６３：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＨ  ＣＤＲ３
配列番号６４：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＬ
配列番号６５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＬをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号６６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＬ  ＣＤＲ１
配列番号６７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＬ  ＣＤＲ２
配列番号６８：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ５のＶＬ  ＣＤＲ３
配列番号６９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ
配列番号７０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号７１：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ  ＣＤＲ１
配列番号７２：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ  ＣＤＲ２
配列番号７３：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ  ＣＤＲ３
配列番号７４：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ
配列番号７５：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号７６：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ  ＣＤＲ１
配列番号７７：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ  ＣＤＲ２
配列番号７８：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ  ＣＤＲ３
配列番号７９：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ−１
配列番号８０：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ−１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８１：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ−２
配列番号８２：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＨ−２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８３：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ−１
配列番号８４：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ−１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８５：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ−２
配列番号８６：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ−２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８７：ｈＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ６のＶＬ−１／ＶＬ−２  ＣＤＲＬ１
配列番号８８：リンカー
配列番号８９：Ｃｙｓリンカー２
配列番号９０：ＡＢＤリンカー
配列番号９１〜９５：リンカー
配列番号９６〜１００：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１０１：Ｅコイル
配列番号１０２：Ｋコイル
配列番号１０３：修飾されたＥコイル
配列番号１０４：修飾されたＫコイル
配列番号１０５：ＡＢＤ
配列番号１０６〜１０８：脱免疫化ＡＢＤ
配列番号１０９：ヒンジリンカー
配列番号１１０：リンカー
配列番号１１１：Ｃｙｓリンカー
配列番号１１２〜１１３：リンカー
配列番号１１４：ＩｇＧ１ヒンジ
配列番号１１５：ＩｇＧ２ヒンジ
配列番号１１６：ＩｇＧ４ヒンジ
配列番号１１７：ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ２２８Ｐ）
配列番号１１８：ＬＣκ
配列番号１１９：ＬＣλ
配列番号１２０：ＩｇＧ１  ＣＨ１
配列番号１２１：ＩｇＧ２  ＣＨ１
配列番号１２２：ＩｇＧ４  ＣＨ１
配列番号１２３：ＩｇＧ１（ＡＡ）；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２４：ＩｇＧ１  Ｆｃ（ＡＡ／ＹＴＥ）；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２５：ＩｇＧ４  Ｆｃ（ＹＴＥ）；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２６：ノブＦｃドメイン；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２７：ホールＦｃ；Ｘａａ２１７はリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２８：ＩｇＧ１  Ｆｃユニバーサル；Ｘａａ４（Ｘ１）及びＸａａ５（Ｘ２）はいずれもＬ（野生型）であるか、又はいずれもＡ（ＦｃγＲ結合低下）であり；Ｘａａ２２（Ｘ３）、  Ｘａａ２４（Ｘ４）及びＸａａ２６（Ｘ５）はそれぞれＭ、Ｓ及びＴ（野生型）であるか、又はＹ、Ｔ及びＥ（半減期延長）であり；Ｘａａ１３６（Ｘ６）及びＸａａ１３８（Ｘ７）はそれぞれＴ及びＬ（野生型）であるか、又はＷ及びＬ（野生型）、若しくはＳ及びＡ（ノブ）であり；Ｘａａ１７７（Ｘ８）は、Ｘａａ１３６（Ｘ６）がＴ又はＷの何れかでＸａａ１３８（Ｘ７）がＬの時、Ｙ（野生型）であるか、Ｘａａ１３６（Ｘ６）及びＸａａ１３８（Ｘ７）がそれぞれＳ及びＡの時、Ｖ（ノブ）であり；Ｘａａ２０４（Ｘ９）及びＸａａ２０５（Ｘ１０）はそれぞれＮ及びＨ（野生型）であるか、又はＮ及びＲ（タンパク質Ａ結合なし）、若しくはＡ及びＫ（タンパク質Ａ結合なし）であり；Ｘａａ２１７（Ｘ１１）はＫであるか、又は不在である
配列番号１２９：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ＡのＶＨ
配列番号１３０：ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ＡのＶＬ
配列番号１３１：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＶＨ
配列番号１３２：ＰＤ−１  ｍＡｂ  １のＶＬ
配列番号１３４：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ２のＶＬ
配列番号１３５：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＶＨ
配列番号１３６：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ３のＶＬ
配列番号１３７：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＨ
配列番号１３８：ＰＤ−１  ｍＡｂ  ４のＶＬ
配列番号１３９：ＩｇＧ１全定常領域（ＡＡ）；Ｘａａ３３０はＫであるか、又は不在である
配列番号１４０：ＩｇＧ４全定常領域（Ｐ）；Ｘａａ３２７はＫであるか、又は不在である
【図１】
2018527290.tif 000015
【図２】
2018527290.tif 000016
【図３Ａ】
2018527290.tif 000017
【図３Ｂ】
2018527290.tif 000018
【図３Ｃ】
2018527290.tif 000019
【図４Ａ】
2018527290.tif 000020
【図４Ｂ】
2018527290.tif 000021
【図５】
2018527290.tif 000022
【図６Ａ】
2018527290.tif 000023
【図６Ｂ】
2018527290.tif 000024
【図６Ｃ】
2018527290.tif 000025
【図６Ｄ】
2018527290.tif 000026
【図６Ｅ】
2018527290.tif 000027
【図６Ｆ】
2018527290.tif 000028
【図７】
2018527290.tif 000029
【図８】
2018527290.tif 000030
【図９】
2018527290.tif 000031
【図１０Ａ】
2018527290.tif 000032
【図１０Ｂ】
2018527290.tif 000033
【図１０Ｃ】
2018527290.tif 000034
【図１１】
2018527290.tif 000035
【図１２】
2018527290.tif 000036
【図１３】
2018527290.tif 000037
【図１４】
2018527290.tif 000038
【図１５】
2018527290.tif 000039
【図１６Ａ】
2018527290.tif 000040
【図１６Ｂ】
2018527290.tif 000041
【図１７】
2018527290.tif 000042
【図１８】
2018527290.tif 000043
【配列表】
2018527290000001.app
【国際調査報告】
2018527290.tif 000044
2018527290.tif 000045
2018527290.tif 000046