(57)【要約】高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされる癌を予防するための組成物および処置方法が提供される。予防に適している癌としては、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌および口腔癌が挙げられる。当該組成物は、２つの主要なウイルス性癌遺伝子のうち１つであるＨＰＶ１６  Ｅ６、およびそのパートナーとの間の相互作用をブロックしてＨＰＶ陽性細胞をアポトーシスに対して再感作させる。
2018527319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌の処置または予防方法であって、該処置または予防を必要とする対象体にスピナシンの有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
スピナシンがＤ,Ｌ−スピナシンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
スピナシンがＤ−スピナシンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
スピナシンがＬ−スピナシンである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
さらに、少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む、請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
さらに、シスプラチンおよびドキソルビシンからなる群から選択される少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸およびスピナシンの組合せの有効量を投与することを含む、請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
さらに、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＥＤＡ／エクトジスプラシン、ＥＤＡ−Ａ２／エクトジスプラシンＡ２、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−α、リンホトキシンα／ＴＮＦ−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、およびＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１からなる群から選択される少なくとも１種類のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの有考慮を投与することを含む、請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
対象体が哺乳動物である、請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
対象体がヒトである、請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
癌が、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌、口腔癌、中咽頭癌、肛門癌、膣癌、外陰癌および陰茎癌からなる群から選択される、請求項１〜１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
スピナシンが非経口、静脈内、または経膜（transmebranally）投与される、請求項１〜１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＨＰＶ１６  Ｅ６ウイルス性癌遺伝子とパートナーとの間の相互作用をブロックして高リスクヒトパピローマウイルス陽性細胞を細胞死プロセスに対して再感作させる方法であって、該細胞をスピナシンの有効量と接触させることを含む、方法。
【請求項１４】
細胞が哺乳動物のものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞がヒトのものである、請求項１３〜１４いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
細胞がインビボにある、請求項１３〜１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
細胞がエクスビボにある、請求項１３〜１６いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
スピナシンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸を含む、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌の処置または予防方法であって、該処置または予防を必要とする対象体に６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
さらに、少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
シスプラチンおよびドキソルビシンからなる群から選択される少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む、請求項２０〜２１いずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
さらに、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＥＤＡ／エクトジスプラシン、ＥＤＡ−Ａ２／エクトジスプラシンＡ２、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−α、リンホトキシンα／ＴＮＦ−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、およびＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１からなる群から選択される少なくとも１種類のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの有効量を投与することを含む、請求項２０〜２２いずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
対象体が哺乳動物である、請求項２０〜２３いずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
対象体がヒトである、請求項２０〜２４いずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
癌が、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌、口腔癌、中咽頭癌、肛門癌、膣癌、外陰癌、および陰茎癌からなる群から選択される、請求項２０〜２５いずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸が非経口、静脈内、または経膜（transmebranally）投与される、請求項２０〜２６いずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
ＨＰＶ１６  Ｅ６ウイルス性癌遺伝子とパートナーとの間の相互作用をブロックして高リスクヒトパピローマウイルス陽性細胞を細胞死プロセスに対して再感作させる方法であって、該細胞を６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸の有考慮と接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
細胞が哺乳動物のものである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞がヒトのものである、請求項２８〜２９いずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
細胞がインビボにある、請求項２８〜３０いずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
細胞がエクスビボにある、請求項２８〜３１いずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照による組み込み
出願データシートにおいて同定された全ての優先権主張またはその訂正は、37 CFR 1.57の下に引用により本願の開示に含まれる。本願は、２０１５年７月１６日に出願された米国仮出願第６２／１９３,５００号の利益を主張する。前記出願は、引用によりその全体として本願の開示に含まれ、本明細書の一部を明示的に構成する。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）グラントＲ２１  ＮＳ０７３０５９に基づく合衆国政府支援により行われた。合衆国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
分野
組成物および処置方法は、高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされる癌の処置または予防について提供される。予防可能な癌としては、子宮頚癌、頭部癌、頸部癌および口腔癌が挙げられる。該組成物は、２つの主要なウイルス性癌遺伝子のうちの１つであるＨＰＶ１６  Ｅ６とそのパートナーとの間の相互作用をブロックし、それにより、ＨＰＶ陽性細胞をアポトーシスまたは他の細胞死プロセスに対して再感作させる。
【背景技術】
【０００４】
高リスクタイプのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、特に１６型または１８型は、頭頚部癌（ＨＮＣ）の７０％までに加えてヒト子宮頚癌の全ケースの原因因子である（例えば、非特許文献１を参照）。ＨＮＣの全体にわたる発生率は、過去１０年の間安定しているが、ＨＰＶ関連ケース、特に中咽頭扁平上皮癌の発生率は、劇的に増加している（例えば、非特許文献２を参照）。ＨＰＶは、上皮組織に感染する小さい二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＰＶコード癌遺伝子Ｅ６およびＥ７は、細胞の不死化および形質転換の原因であり、その結果として、ＨＰＶ関連癌の発生の原因である。Ｅ７は、Ｒｂの不活化が最もよく知られているが、Ｅ６は、アポトーシスに関与するいくつかの分子の分解を促進する。
【０００５】
２種類のＨＰＶワクチン、ガーダシル（Gardasil）（MSD MSD, Merck, Kenilworth, NJ, USA）およびサーバリックス（Cervarix）（GSK, Glaxo SmithKline, London, UK）が承認されており、現在、ＨＰＶ感染症の予防に用いられている。しかしながら、それらは、既に感染している個体には利益をもたらさず、１５種類の高リスクウイルスのうちの２種類、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から身を守るだけである。外科的技術および切除技術は発生した癌を除去するために用いられる；しかしながら、これらの手法は、侵襲的で細胞破壊的であり、病変は処置後にしばしば再発する。シスプラチンおよびドキソルビシンなどの薬剤を利用する化学療法は、子宮頚癌の処置にも使用されているが、さまざまな結果をもたらしている（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８を参照）。
【０００６】
研究者および臨床医がこれらの比較的非特異的で有毒な薬剤を乗り越えるように取り組んでいるので、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）媒介外因性アポトーシス経路を活性化する試薬は、試薬は、いくつかのタイプの腫瘍の処置におけるそれらの有望さのためにかなりの関心を集めている（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；および非特許文献１７を参照）。
【０００７】
残念なことに、高リスクＥ６タンパク質は外因性および内因性両方のアポトーシス経路を妨害するので、ＴＲＡＩＬ、シスプラチンおよびドキソルビシンに基づくものを包含するアポトーシスを活性化することによって機能する治療は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連悪性腫瘍を有効に処置するそれらの能力において不利な立場に置かれている。高リスクタイプのヒトパピローマウイルス由来のＥ６タンパク質は、内因性アポトーシス経路の重要なメディエーターであるｐ５３の急速な分解を媒介するそれらの能力について周知されており（例えば、非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；および非特許文献２１を参照）、それによって、形質転換細胞の増殖および生存を増大させる（例えば、非特許文献２２；非特許文献２３を参照）。Ｅ６はまた、多くが外因性の受容体媒介アポトーシスに関与する他のパートナータンパク質と相互作用する。例えば、ＨＰＶ１６  Ｅ６は、ＴＮＦ  Ｒ１（非特許文献２４）、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）（非特許文献２５）およびカスパーゼ８（非特許文献２６；非特許文献２７）を包含するこれらの経路に関与するいくつかの分子と結合し、該分子を不活性化することが見出された。結果として、メディエーター分子、内因性経路の場合にはｐ５３、ならびに外因性経路の場合にはＦＡＤＤおよびカスパーゼ８が欠けているため、外因性または内因性細胞死経路のいずれかの関与は、意図されたデスシグナルの伝達をもたらさない。これらの細胞死誘導シグナル伝達経路のいずれかがＨＰＶ関連悪性腫瘍の消失のための有効な手段として使用される場合、失われたシグナル伝達分子を回復することが必要であろう。
ミリセチンは、インビトロでのＥ６／カスパーゼ８相互作用を阻害することができる化合物として同定されている（非特許文献２８）。残念なことに、ミリセチンは、いくつかのチロシンキナーゼを包含する多くの細胞性タンパク質を阻害することも知られており、その構造は、創薬の変更を困難にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Chaturvedi, A.K., et al., Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J Clin Oncol, 2011. 29(32): p. 4294-301
【非特許文献２】Adams, A.K., T.M. Wise-Draper, and S.I. Wells, Human papillomavirus induced transformation in cervical and head and neck cancers.  Cancers (Basel), 2014. 6(3): p. 1793-820
【非特許文献３】Bonomi, P., et al., Randomized trial of three cisplatin dose schedules in squamous-cell carcinoma of the cervix: a Gynecologic Oncology Group study. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 1985. 3(8): p. 1079-85
【非特許文献４】Thigpen, T., et al., Cis- platinum in treatment of advanced or recurrent squamous cell carcinoma of the cervix: a phase II study of the Gynecologic Oncology Group. Cancer, 1981. 48(4): p. 899-903
【非特許文献５】Thigpen, J.T., et al., A randomized comparison of a rapid versus prolonged (24 hr) infusion of cisplatin in therapy of squamous cell carcinoma of the uterine cervix: a Gynecologic Oncology Group study. Gynecologic oncology, 1989. 32(2): p. 198-202
【非特許文献６】Scatchard, K., et al., Chemotherapy for metastatic and recurrent cervical cancer. Cochrane Database Syst Rev, 2012. 10: p. CD006469
【非特許文献７】Lee, T.Y., et al., Promising treatment results of adjuvant chemotherapy following radical hysterectomy for intermediate risk stage 1B cervical cancer. Obstet Gynecol Sci, 2013. 56(1): p. 15-21
【非特許文献８】Minotti, G., et al., Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharmacological reviews, 2004. 56(2): p. 185-229
【非特許文献９】Buchsbaum, D.J., et al., Antitumor efficacy of TRA-8 anti-DR5 monoclonal antibody alone or in combination with chemotherapy and/or radiation therapy in a human breast cancer model.  Clin Cancer Res, 2003. 9(10 Pt 1): p. 3731-41
【非特許文献１０】Younes, A. and M.E.  Kadin, Emerging applications of the tumor necrosis factor family of ligands and receptors in cancer therapy.  J Clin Oncol, 2003. 21(18): p. 3526-34
【非特許文献１１】Ichikawa, K., et al., Tumoricidal activity of a novel anti-human DR5 monoclonal antibody without hepatocyte cytotoxicity. Nat Med, 2001. 7(8): p. 954-60
【非特許文献１２】Chuntharapai, A., et al., Isotype-dependent inhibition of tumor growth in vivo by monoclonal antibodies to death receptor 4.  J Immunol, 2001. 166(8): p. 4891-8
【非特許文献１３】Tanaka, S., et al., Expression and antitumor effects of TRAIL in human cholangiocarcinoma.  Hepatology, 2000. 32(3): p. 523-7
【非特許文献１４】Bellail, A.C., et al., TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy: the promises and the challenges.  Rev Recent Clin Trials, 2009. 4(1): p. 34- 41
【非特許文献１５】El-Zawahry, A., J. McKillop, and C. Voelkel-Johnson, Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L/TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts. BMC Cancer, 2005. 5: p. 2
【非特許文献１６】Mom, C.H., et al., Mapatumumab, a fully human agonistic monoclonal antibody that targets TRAIL-R1, in combination with gemcitabine and cisplatin: a phase I study.  Clin Cancer Res, 2009. 15(17): p. 5584-90
【非特許文献１７】Naka, T., et al., Effects of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand alone and in combination with chemotherapeutic agents on patients' colon tumors grown in SCID mice.  Cancer Res, 2002. 62(20): p. 5800-6
【非特許文献１８】Huibregtse, J.M., M. Scheffner, and P.M. Howley, A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or 18. Embo J, 1991. 10(13): p. 4129-35
【非特許文献１９】Scheffner, M., et al., The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell, 1993. 75(3): p. 495-505
【非特許文献２０】Scheffner, M., et al., The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53.  Cell, 1990. 63(6): p. 1129-36
【非特許文献２１】Huibregtse, J.M., M. Scheffner, and P.M. Howley, A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or 18.  The EMBO journal, 1991. 10(13): p. 4129-35
【非特許文献２２】Crook, T., J.A. Tidy, and K.H. Vousden, Degradation of p53 can be targeted by HPV E6 sequences distinct from those required for p53 binding and trans-activation.  Cell, 1991. 67(3): p. 547- 56
【非特許文献２３】Lechner, M.S. and L.A. Laimins, Inhibition of p53 DNA binding by human papillomavirus E6 proteins.  Journal of virology, 1994. 68(7): p. 4262-73
【非特許文献２４】Tungteakkhun, S.S., et al., The full-length isoform of human papillomavirus 16 E6 and its splice variant E6* bind to different sites on the procaspase 8 death effector domain.  J Virol, 2010. 84(3): p. 1453-63
【非特許文献２５】Filippova, M., L. Parkhurst, and P.J. Duerksen-Hughes, The human papillomavirus 16 E6 protein binds to Fas-associated death domain and protects cells from Fas-triggered apoptosis.  J Biol Chem, 2004. 279(24): p. 25729-44
【非特許文献２６】Filippova, M., et al., The large and small isoforms of human papillomavirus type 16 E6 bind to and differentially affect procaspase 8 stability and activity. J Virol, 2007. 81(8): p. 4116-29
【非特許文献２７】Garnett, T.O., M. Filippova, and P.J. Duerksen-Hughes, Accelerated degradation of FADD and procaspase 8 in cells expressing human papilloma virus 16 E6 impairs TRAIL-mediated apoptosis.  Cell Death Differ, 2006. 13(11): p. 1915- 26
【非特許文献２８】Yuan, C.H., et al., Small molecule inhibitors of the HPV16- E6 interaction with caspase 8.  Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012. 22(5): p. 2125-9
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本開示の詳細は、その構造および操作の両方に関して、部分的には、同様の参照番号が同様の部分を指す添付図面の研究によって理解され得る。該図面は必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本開示の原理を例示することに重点が置かれている。
【００１０】
【図１】図１は、活性について試験した化合物の構造を示す。
【００１１】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、３−(１Ｈ−インドール−１−イル)プロパン−１−アミン（１）、３種類のベンゾイミダゾール誘導体（２〜４）、およびスピナシン（５）によるタンパク質−タンパク質相互作用の阻害に関するデータを示すグラフである。ビーズベースのスクリーニングアッセイを用いて、示された濃度（１.４μＭ〜３.２ｍＭ）の化合物を、３種類の異なるタンパク質／タンパク質相互作用：（図２Ａ）ＧＳＴ−Ｅ６／Ｈｉｓ−カスパーゼ８;（図２Ｂ）ＧＳＴ−Ｅ６／ＨｉｓＥ６ＡＰ；および（図２Ｃ）ＧＳＴ−カスパーゼ８／Ｈｉｓ−カスパーゼ８を阻害するそれらの能力について試験した。１.４μＭの試験化合物の存在下での結合を１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１２】
【図３】図３Ａ〜Ｅは、本明細書に記載の小分子の存在および非存在下におけるＴＲＡＩＬ誘導、シスプラチン誘導およびドキソサイクリン（doxocycline）誘導アポトーシスに対するＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞の抵抗性に関するデータを示すグラフである。（図３Ａ）ＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞は、ヒト骨肉腫細胞株Ｕ２ＯＳと比較して、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して抵抗性である。細胞（２×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートし、次いで、シクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）の存在下で、示された濃度のＴＲＡＩＬで処理した。一夜インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞の生存率を測定した；各グループについて、ＴＲＡＩＬで処理されていない細胞の生存率を１００％と設定した。（図３Ｂ）示された濃度の３種類の小分子をＳｉＨａ細胞に加え、一夜インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを行った。小分子で処理していない細胞の生存率を１００％と設定した。（図３Ｃ）シクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）の存在下において、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）の４時間前に、示された濃度のミリセチンまたはスピナシンを添加し、３７℃で一夜インキュベートした。小細胞で処理していない細胞の生存率を１００％と設定した。（図３Ｄおよび図３Ｅ）ＳｉＨａ細胞（２×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートした。（図３Ｄ）ドキソルビシンまたは（図３Ｅ）シスプラチンのいずれかの４時間前に１００μＭのミリセチンおよび５０μＭのスピナシンを添加した。一夜インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを用いて、生存率を測定し、ミリセチンまたはスピナシンのいずれかで処理していない細胞の生存率を１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１３】
【図４】図４Ａ〜Ｃは、ＴＲＡＩＬおよび化学療法薬で処理した後にミリセチンおよびスピナシン（５）がＳｉＨａ細胞におけるカスパーゼ３／７活性を増大させたことを示すグラフである。ＳｉＨａ細胞（２×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートし、次いで、１００μＭのミリセチンまたは５０μＭのスピナシンで４時間前処理した。それぞれ、（図４Ａ）ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）をシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）と一緒に、（図４Ｂ）シスプラチン（５０μＭ）を、または（図４Ｃ）ドキソルビシン（２μＭ）を添加した。０、１.５、３および６時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いてカスパーゼ３／７活性を測定した。各グループについて、処理の０時間目の活性を１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１４】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ミリセチンおよびスピナシン（５）が、ＴＲＡＩＬによる処理に対して、ＨＰＶ+細胞を再感作させるがＨＰＶ-細胞を再感作させないことを示すグラフである。ＳｉＨａ（２×１０4細胞／ウェル）およびＣ３３Ａ細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートし、次いで、細胞をミリセチン（１００μＭ）（図５Ａ）またはスピナシン（５０μＭ）（図５Ｂ）の存在下または非存在下で４時間前処理した。示された濃度のＴＲＡＩＬをシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）と一緒に添加し、細胞を一夜インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定し、ＴＲＡＩＬで処理していない細胞の生存率を１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１５】
【図６】図６Ａ〜Ｂは、イムノブロットであり、図６Ｂは、ミリセチンおよびスピナシン（５）による処理がカスパーゼ８およびｐ５３の細胞レベルを増加させたことを示すグラフである。（図６Ａ）ＳｉＨａ細胞（１×１０6／ウェル）を６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートした。示された濃度のミリセチンおよびスピナシンを添加し、次いで、細胞を２４時間インキュベートした。次いで、細胞を１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、次いで収集し、結果として生じたカスパーゼ８のレベルをイムノブロットによって測定した。（図６Ｂ）ＳｉＨａおよびＣ３３Ａ細胞（１×１０6／ウェル）を６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートした。ミリセチン２００μＭおよびスピナシン１００μＭを４μｇ／ｍｌのマトマイシンＣと一緒に添加し、２４時間インキュベートした。結果として生じたｐ５３のレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、非処理細胞において見られたｐ５３のレベルを１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１６】
【図７】図７Ａ〜Ｅは、ミリセチンおよびスピナシン（５）が、ＴＲＡＩＬによる処理に対して、ＨＰＶ+頭頚部癌細胞株を再感作させるがＨＰＶ-頭頚部癌細胞株を再感作させないことを示すグラフである。（図７Ａ）ＨＰＶ-およびＨＰＶ+  ＨＮ癌細胞株はともにＴＲＡＩＬ処理に対する抵抗性を示す。ＨＰＶ-（＃８４）（ミリセチン−図７Ｂ；スピナシン−図７Ｃ）およびＨＰＶ+（＃９０）（図７Ｄ；スピナシン−図７Ｅ）頭頚部癌細胞株（２×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートし、次いで、細胞をミリセチン（０〜２００μＭ）またはスピナシン（０〜１００μＭ）で４時間前処理した。ＴＲＡＩＬ５０μＭをシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）と一緒に添加し、細胞を一夜インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定し、小分子で処理していない細胞の生存率を１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１７】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ミリセチンおよびスピナシン（５）が、ドキソルビシンによる処理に対して、ＨＰＶ+  ＨＮＳＣＣ細胞株を再感作させるがＨＰＶ-  ＨＮＳＣＣ細胞株を再感作させないことを示すグラフを包含する。一のＨＰＶ-（図８Ａ；＃８４）および一のＨＰＶ+（図８Ｂ；＃９０）頭頚部癌細胞株（２×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜インキュベートし、次いで、細胞をミリセチンまたはスピナシン（０〜１２.５μＭ）で４時間前処理した。ドキソルビシン２μＭを添加し、細胞を一夜インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定し、小分子で処理していない細胞の生存率を１００％と設定した。実験はトリプリケートで行っており、エラーバーは標準偏差を示す。
【００１８】
【図９】図９は、スピナシンがＧＳＴ−Ｅ６と結合することができることを示すグラフである。Ｎ＜１は、タンパク質濃度が低すぎるかまたはスピナシン濃度が高すぎることを示すことができた。約０.５のＮは、Ｅ６の１つの分子と結合するスピナシンの２つの分子が存在する可能性があることを示す。
【００１９】
【図１０】図１０は、ＧＳＴ−Ｅ６／Ｈｉｓ−カスパーゼ８の結合におけるＤ,Ｌ−スピナシン無水物（１０−１）；Ｄ−スピナシン塩酸塩（１０−２）；Ｌ−スピナシン塩酸塩（１０−３）；スピナシン（１０−４）；およびスピナシン（１０−５）の活性を示すグラフである。
【００２０】
【図１１】図１１は、ＧＳＴ−Ｅ６／Ｈｉｓ−Ｅ６ＡＰの結合におけるＤ,Ｌ−スピナシン無水物（１０−１）；Ｄ−スピナシン塩酸塩（１０−２）；Ｌ−スピナシン塩酸塩（１０−３）；スピナシン（１０−４）；およびスピナシン（１０−５）の活性を示すグラフである。
【００２１】
【図１２】図１２Ａ〜Ｆは、Ｄ−スピナシンの試料についてのＮＭＲデータである
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の簡単な概要
Ｅ６／プロカスパーゼ８相互作用のさらなる、より扱いやすい阻害剤の同定が望ましい。ヒスチジンに対するホルムアルデヒドの作用の生成物である非天然アミノ酸である１つのこのような化合物であるスピナシン（５；図１を参照）は、Ｅ６とそのパートナータンパク質との間の特異的相互作用を阻害することが決定されている。ミリセチンおよびスピナシンはともに、ＨＰＶ+細胞をＴＲＡＩＬ、シスプラチンおよびドキソルビシンなどのインデューサーによって引き起こされるアポトーシスまたは他の細胞死経路に対して再感作させ、カスパーゼ３／７活性を増大させ、したがって、ＨＰＶ+細胞中のアポトーシスタンパク質のレベルを回復させることができることが判明した。したがって、スピナシンの使用によりＥ６機能を阻害する方法が提供され、ＨＰＶ媒介癌の処置および／または予防のための有効な治療法を提供することができる。
【００２３】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様において、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌の処置または予防方法であって、該処置または予防を必要とする対象体にスピナシンの有効量を投与することを含む方法が提供される。
【００２４】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、スピナシンはＤ,Ｌ−スピナシンである。
【００２５】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、スピナシンはＤ−スピナシンである。
【００２６】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、スピナシンはＬ−スピナシンである。
【００２７】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、当該方法は、さらに、少なくとも１種類の化学療法剤の有考慮を投与することを含む。
【００２８】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、当該方法は、さらに、シスプラチンおよびドキソルビシンからなる群から選択される少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む。
【００２９】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、当該方法は、６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸およびスピナシンの組合せの有効量を投与することを含む。
【００３０】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、当該方法は、さらに、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＥＤＡ／エクトジスプラシン、ＥＤＡ−Ａ２／エクトジスプラシンＡ２、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−α、リンホトキシンα／ＴＮＦ−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、およびＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１からなる群から選択される少なくとも１種類のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの有効量を投与することを含む。
【００３１】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、対象体は哺乳動物である。
【００３２】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、対象体はヒトである。
【００３３】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、癌は、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌、口腔癌、中咽頭癌、肛門癌、膣癌、外陰癌、および陰茎癌からなる群から選択される。
【００３４】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第一の態様の実施態様において、スピナシンは、非経口、静脈内、または経膜（transmebranally）投与される。
【００３５】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第二の態様において、高リスクヒトパピローマウイルス陽性細胞を、アポトーシスを含む細胞死メカニズムに対して再感作させることによってＨＰＶ１６  Ｅ６ウイルス性癌遺伝子とパートナーとの間の相互作用をブロックする方法であって、該細胞をスピナシンの有効量と接触させることを含む、方法が提供される。
【００３６】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第二の態様の実施態様において、細胞は哺乳動物のものである。
【００３７】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第二の態様の実施態様において、細胞はヒトのものである。
【００３８】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第二の態様の実施態様において、細胞はインビボにある。
【００３９】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第二の態様の実施態様において、細胞はエクスビボにある。
【００４０】
第三の態様において、スピナシンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００４１】
第四の態様において、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌の処置または予防方法であって、該処置または予防を必要とする対象体に６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸の有効量を投与することを含む、方法が提供される。
【００４２】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の態様の実施態様において、当該方法は、さらに、少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む。
【００４３】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の実施態様の態様において、当該方法は、さらに、シスプラチンおよびドキソルビシンからなる群から選択される少なくとも１種類の化学療法剤の有効量を投与することを含む。
【００４４】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の実施態様の態様において、当該方法は、さらに、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＥＤＡ／エクトジスプラシン、ＥＤＡ−Ａ２／エクトジスプラシンＡ２、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン、リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−α、リンホトキシンα／ＴＮＦ−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、およびＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１からなる群から選択される少なくとも１種類のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの有効量を投与することを含む。
【００４５】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の実施態様の態様において、対象体は哺乳動物である。
【００４６】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の実施態様の態様において、対象体はヒトである。
【００４７】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の実施態様の態様において、癌は、子宮頚癌、頭部癌、頚部癌、口腔癌、中咽頭癌、肛門癌、膣癌、外陰癌および陰茎癌からなる群から選択される。
【００４８】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第四の実施態様の態様において、化合物は、非経口、静脈内、または経膜（transmebranally）投与される。
【００４９】
第五の実施態様において、高リスクヒトパピローマウイルス陽性細胞を細胞死誘導プロセスに対して再感作させることによってＨＰＶ１６  Ｅ６ウイルス性癌遺伝子とパートナーとの間の相互作用をブロックする方法であって、該細胞を６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸の有効量と接触させることを含む、方法が提供される。
【００５０】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第五の実施態様の態様において、細胞は哺乳動物のものである。
【００５１】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第五の実施態様の態様において、細胞はヒトのものである。
【００５２】
一般的に適用できる（すなわち、本明細書で特定された態様または実施態様のいずれかと独立して組み合わせることができる）第五の実施態様の態様において、細胞はエクスビボにある。
【００５３】
第六の実施態様において、６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸 and 薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５４】
第一〜第六の実施態様の態様のいずれかを、本明細書で特定された全ての態様および実施態様に適用できる。さらにまた、第一〜第六の実施態様の態様の特徴のいずれかを、独立して、如何なる場合も、部分的にまたは全体的に、本明細書に記載の別の態様と組み合わせることができる、例えば、１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の態様を全体的にまたは部分的に組み合わせることができる。また、第一〜第六の実施態様の態様の特徴のいずれかは、他の態様または実施態様に対して任意であることができる。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
詳細な説明
以下の開示および実施例は、本発明の実施態様を詳細に例示する。当業者は、その範囲によって包含される本発明の多くの変形および変更が存在すると認識する。したがって、実施態様の記載は、本発明の範囲を限定するものではない。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載の例示的な実施態様は、限定することを意味するものではない。本明細書の教示は、例えば特許請求の範囲によって定義されカバーされるような、多数の異なる方法で適用され得る。本明細書における態様は多種多様な形態で具体化することができること、および本明細書に記載される特定の構造、機能、またはその両方は単に代表的なものであることは明らかである。本明細書の教示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の態様がいずれかの他の態様とは独立して実施され得ること、およびこれらの態様のうち２つ以上が様々な方法で組み合わせられ得ることを理解すべきである。例えば、本明細書に記載の態様のいずれかの妥当な数または組み合わせを使用して、組成物を利用してもよいか、または方法を当業者が実施してもよい。本明細書に提示される主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施態様が利用されてもよく、他の変更が行われてもよい。本明細書に一般的に記載され、図に例示されている本開示の態様は、広範囲の異なる構成で配置され得、置換され得、組み合わされ得、設計され得、これらの全てが明示的に企図され、本開示の一部をなす。開示された実施態様は、以下の実施例に限定されず、他の実施態様は、開示および特許請求の範囲の範囲内となり得ることを理解すべきである。
【００５６】
本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される塩」および「その薬学的に許容される塩」は、幅広い用語であり、それらの通常の慣習的な意味を当業者に与えるものとし（かつ、特別なまたはカスタマイズされた意味に限定されず）、薬学的に許容される非毒性の酸または塩基から調製された塩を意味するが、これらに限定されない。好適な薬学的に許容される塩としては、金属塩、例えば、アルミニウムの塩、亜鉛の塩、アルカリ金属塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩；有機塩、例えば、リジン、Ｎ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカインおよびトリスの塩；遊離酸および遊離塩基の塩；無機塩、例えば、硫酸塩、塩酸塩および臭化水素酸塩；ならびに、現在広く薬学的に用いられており、例えばThe Merck Indexのような当業者に周知の出典源に挙げられている他の塩が挙げられる。非毒性であり、所望の活性を実質的に妨害しないことを条件として、任意の適切な構成成分を選択して、本明細書に記載の治療剤の塩を調製することができる。塩に加えて、当該化合物の薬学的に許容される前駆体および誘導体を用いることができる。薬学的に許容されるアミド、低級アルキルエステルおよび保護誘導体もまた、種々の実施態様の組成物および方法における使用に好適であり得る。種々の実施態様の化合物を薬学的に許容される塩の形態で投与することは可能であるが、一般的に、当該化合物を中性の形態で投与することが好ましい。
【００５７】
１つ以上のキラル中心を有する本明細書に記載の化合物のいずれにおいても、絶対立体化学が明示されていない場合、各中心は独立してＲ配置もしくはＳ配置またはそれらの混合物であり得ることが理解される。かくして、本明細書で提供される化合物は、エナンチオマー的に純粋であるか、エナンチオマー的に濃縮されているか、ラセミ混合物であるか、ジアステレオマー的に純粋であるか、ジアステレオマー的に濃縮されているか、または立体異性体混合物である。加えて、ＥまたはＺと定義することができる幾何異性体を生じる１つ以上の二重結合を有する本明細書に記載の化合物のいずれにおいても、各二重結合は独立してＥまたはＺ、その混合物であってよいと解されるべきである。
【００５８】
同様に、記載の化合物のいずれにおいても、全ての互変異性体が包含されることが意図されると解されるべきである。例えば、ホスフェート基の全ての互変異性体が包含されることが意図される。さらにまた、天然および非天然のプリン塩基およびピリミジン塩基の互変異性体を包含する当該技術分野で知られている複素環式塩基の全ての互変異性体が包含されることが意図される。
【００５９】
本明細書に記載の化合物が非充填原子価を有する場合、該原子価は、水素原子またはその同位体、例えば水素−１（プロチウム）および水素−２（ジュウテリウム）で充填され得ると解されるべきである。
【００６０】
本明細書に記載の化合物は同位体により標識され得ると解されるべきである。ジュウテリウムのような同位体による置換は、インビボ半減期の増加または必要用量の減少のようなより大きな代謝安定性から得られるある種の治療上の利点をもたらし得る。化合物構造中に表される各化学元素は、該元素の任意の同位体を含み得る。例えば、化合物構造において、水素原子は、該化合物に存在することが明示的に記載され得るか、または理解され得る。水素原子が存在し得る化合物の位置で、該水素原子は、水素−１（プロチウム）および水素−２（ジュウテリウム）を包含するがこれらに限定されない水素原子のいずれの同位体でもあり得る。かくして、本明細書における化合物の言及は、状況が明らかに他のことを指示しない限り、すべての可能性のある同位体形態を包含する。
【００６１】
本明細書に記載の方法および組み合わせは、結晶形態（化合物の同じ元素組成の異なる結晶充填配列を含む多形体としても知られている）、非晶質相、塩、溶媒和物および水和物を含むことが理解される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の化合物は、水、エタノールまたは同様のものなどの薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態で存在する。他の実施態様において、本明細書に記載の化合物は、非溶媒和形態で存在する。溶媒和物は、化学量論量または非化学量論量の溶媒を含み、結晶化のプロセス中にて水、エタノールまたは同様のものなどの薬学的に許容される溶媒を用いて形成することができる。溶媒が水である場合には水和物が形成され、溶媒がアルコールである場合にはアルコラートが形成される。加えて、本明細書で提供される化合物は、非溶媒和形態および溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は、本明細書で提供される化合物および方法の目的で非溶媒和形態と等価であると考えられる。
【００６２】
高リスクＨＰＶは、いくつかのタイプの癌を引き起こす。事実、すべての子宮頚癌のケースはＨＰＶに起因しており、ＨＰＶの２つのタイプ、１６と１８がすべてのケースの約７０％の原因である。肛門癌の約９５％はＨＰＶによって引き起こされる。これらのほとんどがＨＰＶ１６型によって引き起こされる。中咽頭癌（軟口蓋、舌根および扁桃を包含する喉の中央部分の癌）の約７０％はＨＰＶによって引き起こされる。米国では、中咽頭において診断された癌の半分以上がＨＰＶ１６型と連結している。ＨＰＶは、膣癌の約６５％、外陰癌の約５０％および陰茎癌の約３５％を引き起こす。これらのほとんどはＨＰＶ１６型によって引き起こされる。
【００６３】
高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＲ−ＨＰＶ）は、子宮頚癌のほぼ全てのケース、および頭頚部癌の約３０％を引き起こす。２種類の主要なウイルス性癌遺伝子のうちの１つであるＨＰＶ１６  Ｅ６は、カスパーゼ８およびｐ５３を包含するアポトーシスシグナル伝達に重要ないくつかのタンパク質と結合して該タンパク質の分解を促進することによって、細胞をアポトーシスから保護する。小分子を用いるＨＰＶ  Ｅ６およびそのパートナーとの間の相互作用をブロックすると、ＨＰＶ+細胞は、アポトーシスおよび他の細胞死誘導プロセスに対して再感作され得る。このような活性を有するいくつかの化合物を同定し、インビトロで用量依存性および特異性について試験し、細胞ベースのアッセイにおいて毒性について試験した。フラボノールであるミリセチン、およびヒスチジンのイミダゾールアミノ酸誘導体であるスピナシンは、Ｅ６が、インビトロで、カスパーゼ８、およびｐ５３分解を媒介するタンパク質であるＥ６ＡＰの両方に結合する能力を明らかに阻害した。加えて、両化合物は、ＳｉＨａ子宮頚癌細胞中のカスパーゼ８およびｐ５３のレベルを増加させることができ、カスパーゼ３／７活性の増大をもたらした。最終的に、ミリセチンおよびスピナシンはともに、癌特異的リガンドＴＲＡＩＬ、および化学療法剤であるドキソルビシンおよびシスプラチンによって引き起こされたアポトーシスに対して、ＨＰＶ+子宮頚癌細胞および口腔癌細胞を感作させたがＨＰＶ-子宮頚癌細胞および口腔癌細胞を感作させなかった。新しい治療法は、ＨＰＶ+癌患者の治療法の改善を提供する。
【００６４】
スピナシンは安全で耐容性が高い化合物であることが明らかになっている。例えば、Galli et al., “Evaluation of the Oral Toxicity of Spinacine Hydrochloride in a 13-week Study in Rats” Fd Chem. Toxic. Vol 27, No. 10, pp. 651-656, 1989を参照。その抗ウイルス活性（例えば、独国特許出願公開第３５２１３０３号を参照）、その抗微生物活性（例えば、Preusser, H. J. “Antimicrobial activity of alkaloids from amphibian venoms and effects on the ultrastructure of yeast cells”, Toxicon., Vol. 13, Issue 4, pp 285-9, 1975を参照）、γアミノ酪酸キャプチャーの阻害剤としての活性（例えば、Boreisha, I. K., Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal, Vol. 22, Issue 1, pages 20-23, 1988を参照）は研究されている。合成経路は公開されている。例えば、Biochemische Zeitschrift, Vol. 49, pp. 173, “Synthetic Alkaloids from Tyrosine Tryptophane and Histidine”, 1913を参照）、その抗悪心活性（例えば、米国特許第５,２６２,５３７号を参照）。スピナシンはまた、朝鮮人参（Panax ginseng）から誘導され得る。例えば、Han et al., “Spinacine from Panax ginseng”, Archives of Pharmacal Research, Vol. 10, Issue 4, pp 258-259, 1987を参照。
【００６５】
イミダゾール誘導体はＨＰＶ  Ｅ６のカスパーゼ８との相互作用を特異的に阻害する
ＨＰＶ  Ｅ６はカスパーゼ８と結合し（Garnett, T.O., M. Filippova, and P.J. Duerksen-Hughes, Accelerated degradation of FADD and procaspase 8 in cells expressing human papilloma virus 16 E6 impairs TRAIL-mediated apoptosis.  Cell death and differentiation, 2006. 13(11): p. 1915-26）、ミリセチンは、インビトロでＥ６／カスパーゼ８相互作用をブロックすることができる（Yuan, C.H., et al., Small molecule inhibitors of the HPV16-E6 interaction with caspase 8. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012. 22(5): p. 2125-9）。Ｅ６／カスパーゼ８相互作用の阻害剤を同定するために、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術（Perkin-Elmer）に基づくビーズベースのアッセイを用いる（Yuan, C.H., et al., Small molecule inhibitors of the HPV16-E6 interaction with caspase 8. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012. 22(5): p. 2125-9）。同じアプローチを用いて、ＡｃｔｉＰｒｏｂｅ  ２Ｋ（２,０００種類の化合物）ライブラリーをスクリーニングした。一次スクリーンにおいて、１１８（５.９％）種類の化合物がＥ６／カスパーゼ８相互作用を阻害する能力を示した。これら１１８種類の化合物のうち７９種類は、１０μＭよりも低いＥＣ50値を示し、したがって、さらなる分析のために選択した。これら７９種類の化合物のうち２３種類は、また、カスパーゼ８／カスパーゼ８ホモ二量体の形成をブロックすることができない点で（カウンタースクリーン）、Ｅ６／カスパーゼ８相互作用の特異的阻害を示した。これら２３種類の化合物は、３つの異なる化学的クラスを表し、それらのうちイミダゾールおよび関連ベンゾイミダゾールは、Ｅ６／カスパーゼ８結合の最良の阻害を示した。これらの分子の構造および物理的／化学的特性の分析によって、さらなる研究のために５種類のさらなる化合物が選択された：３−(１Ｈ−インドール−１−イル)プロパン−１−アミンメタンスルホナート（１）、ベンゾイミダゾール（２）、１Ｈ−ベンゾイミダゾール−１−メタノール（３）、２−(メトキシメチル)−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（４）、およびスピナシン（５）（図１）。
【００６６】
これら５種類の化合物の用量応答性を決定するために、まず、可変濃度のこれらの小分子を、Ｅ６／カスパーゼ８結合を阻害するそれらの能力について試験した。結果は、化合物１、２および５だけがＥ６／カスパーゼ８結合の用量依存性阻害を示したことを示した（図２Ａ）。Ｅ６／カスパーゼ８結合を妨害する能力について選択されたこれらの分子を、次に、Ｅ６関連タンパク質（Ｅ６ＡＰ）への結合のようなＥ６の他の相互作用に影響を及ぼし得るかを決定するために試験した。該Ｅ６／Ｅ６ＡＰ相互作用は、ｐ５３分解のＥ６媒介促進のために必要とされる（Huibregtse, J.M., M. Scheffner, and P.M. Howley, A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or 18.  The EMBO journal, 1991. 10(13): p. 4129-35）。これら５種類の化合物がＥ６／Ｅ６ＡＰ結合を阻害する能力を試験し、Ｅ６／カスパーゼ８結合を阻害したのと同じ薬剤である化合物１、２および５もまたＥ６／Ｅ６ＡＰ相互作用を阻害することができ、それらがＥ６／カスパーゼ８相互作用を阻害したのとほぼ同様に行うことができることが判明した（図２Ａ、図２Ｂ）。
【００６７】
この阻害が特異的であるか否かを調べるために、カウンタースクリーニングアッセイを用いて、ＧＳＴ−カスパーゼ８のＨｉｓ−カスパーゼ８への結合を阻害する候補の能力を評価した；それらは排除されなければならなかった。このカウンタースクリーニングアッセイでは、各ウェル中の材料は、ＧＳＴ−カスパーゼ８をＧＳＴ−Ｅ６と置き換えたことを除いて、一次スクリーニングと同じであった。化合物１および２は、カスパーゼ８／カスパーゼ８相互作用を阻害することができただけでなく、それらはＥ６／カスパーゼ８相互作用を阻害した。これは、それらの作用が非特異的であることを示した。しかしながら、スピナシン（５）は、それ自体へのカスパーゼ８の結合を有意に阻害せず、Ｅ６に対するその特異性の証拠を提供した（図２Ｃ）。これらの結果は、表１にまとめられており、試験した化合物のうち、スピナシンは、Ｅ６／カスパーゼ８およびＥ６／Ｅ６ＡＰ相互作用の阻害について最低のＥＣ50値を示したが、一方、カスパーゼ８／カスパーゼ８結合を阻害しなかった。
【表１】
2018527319.tif 000003
【００６８】
ミリセチンおよびスピナシンはＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対してＳｉＨａ細胞を感作させる
次いで、インビトロでＥ６／カスパーゼ８結合をブロックするものが細胞という面に関しても作用することができるか否かを決定するために、該分子を試験した。ＳｉＨａ細胞は、一般的に用いられるＨＰＶ関連悪性腫瘍モデルとして供される子宮頚癌に由来するＨＰＶ+細胞株である。ＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して抵抗性を有するか否かを決定するために、ＴＲＡＩＬを用いてＳｉＨａ細胞を試験し、細胞生存率を評価した。ＴＲＡＩＬ感受性ＨＰＶ-  Ｕ２ＯＳ細胞を正対照として供した。結果（図３Ａ）は、予想通り、Ｕ２ＯＳ細胞と比較して、ＳｉＨａ細胞がＴＲＡＩＬによる処理に対して相対的に抵抗性を有することを示している。さらにまた、ミリセチンおよびスピナシンはともに、ＴＲＡＩＬの非存在下でＳｉＨａ細胞に対して低い毒性を示した（図３Ｂ）。ミリセチンおよび／またはスピナシンがこれらＨＰＶ+細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して感作させ得るか否かを決定するために、ミリセチンおよび／またはスピナシンを試験した。示された濃度（０μＭ〜１２５μＭ）のミリセチン、（３）（負対照）およびスピナシン（５）をＴＲＡＩＬの存在下でＳｉＨａ細胞に加え、図３Ｃのデータは、負対照３とは対照的に、ＴＲＡＩＬの存在下にてミリセチンおよびスピナシンがともに１２５μＭの用量でＳｉＨａ細胞の生存率を３０〜４０％に低下させ得たことを示している。表２には、ＴＲＡＩＬの存在下または非存在下でＳｉＨａ細胞の５０％において死を誘導するのに要する濃度の３種類の試験化合物が挙げられており、比較される。該データは、ミリセチンおよびスピナシンがともにＴＲＡＩＬの非存在下よりも存在下のほうが有意に多くの細胞死を誘導したこと（ミリセチンについては３.５倍増加、スピナシンについては８.６倍増加）を示している（表２）。これらの結果は、Ｅ６／カスパーゼ８相互作用の阻害することにより、アポトーシスシグナルに対するＨＰＶ+細胞の感受性を回復させることができるという強力な証拠を提供する。
【表２】
2018527319.tif 000004
【００６９】
ミリセチンおよびスピナシンはドキソルビシンおよびシスプラチンに対するＳｉＨａ細胞の感受性を増大させる
ミリセチンおよびスピナシンはともに、インビトロで、Ｅ６と、ｐ５３の分解に関与するＥ３リガーゼであるＥ６ＡＰとの結合を阻害することができる。この観察結果に基づいて、ミリセチンおよびスピナシンが、ｐ５３が関与する経路の活性化を介して内因性アポトーシスを誘導することによって作用すると考えられるドキソルビシンおよびシスプラチンの２種類の薬剤に対するＳｉＨａ細胞の感受性を増大させるか否かを決定するために、ミリセチンおよびスピナシンを試験した。負対照と比較して、ミリセチンおよびスピナシンがともにドキソルビシンおよびシスプラチンに対するＳｉＨａ細胞の感受性を増大させたことが判明した（図３Ｄおよび図３Ｅ）。これらの結果は、ミリセチンおよびスピナシンがともにＥ６とＥ６ＡＰとの間の相互作用を阻害する（その結果として、予想されたｐ５３の増加をもたらす）能力が、ｐ５３媒介アポトーシスのインデューサーに対するＨＰＶ+細胞の感受性をもたらすことを示している。
【００７０】
ミリセチンおよびスピナシンはカスパーゼ３／７活性を増大させる
カスパーゼ３／７の活性化は、外因性アポトーシスおよび内因性アポトーシスの両方の必須マーカーであり、細胞死がアポトーシス経路を介して生じるか否かを決定するために用いることができる。図２のデータは、ミリセチンおよびスピナシンがともにインビトロでのＥ６／カスパーゼ８相互作用およびＥ６／Ｅ６ＡＰ相互作用を阻害することができ、その結果として細胞死を増加させることを示している。この細胞死がアポトーシスを介して生じる場合、ミリセチンまたはスピナシンによる細胞の前処理は、カスパーゼ３／７のＴＲＡＩＬ誘導性活性化、シスプラチン誘導性活性化およびドキソルビシン誘導性活性化のレベルを増加させる。これを試験するために、ミリセチンまたはスピナシンの存在下または非存在下でＴＲＡＩＬ、シスプラチンおよびドキソルビシン処理後にＳｉＨａ細胞においてカスパーゼ３／７活性を測定した。図４Ａに示されるように、ミリセチンまたはスピナシンをＴＲＡＩＬと組み合わせた場合、対照と比較して、カスパーゼ３／７活性が有意に増大したことが判明した。シスプラチンおよびドキソルビシンによる処理後に同様の結果が得られた（図４Ｂ、図４Ｃ）。これらのデータは、アポトーシスインデューサーとミリセチン／スピナシンとを組み合わせることによって誘導される細胞死の増加がアポトーシス経路を介して生じることが示されている。
【００７１】
ミリセチンおよびスピナシンはＨＰＶ  Ｅ６のカスパーゼ８との結合をブロックすることによってＨＰＶ+細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して再感作させる
ミリセチンおよびスピナシンがＥ６とカスパーゼ８との結合を特異的にブロックすることによってＳｉＨａ細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して再感作させるか否かを決定するために、ＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞における応答をＨＰＶ-ヒト子宮頚癌細胞、Ｃ３３Ａ由来のものと比較した。これらの細胞はＥ６を発現しないからである。ＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞は１００ｎｇ／ｍｌまでの濃度でＴＲＡＩＬに対する抵抗性を示したが、それらの感受性は、１００μＭのミリセチンの存在下で劇的に増大したことが判明した。対照的に、ＨＰＶ-  Ｃ３３Ａ細胞はミリセチンの存在下であっても依然としてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対して抵抗性であった（図５Ａ）。５０μＭのスピナシンによる処理後にも同様の結果が判明した（図５Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ミリセチンおよびスピナシンが、ＨＰＶ  Ｅ６とカスパーゼ８のようなアポトーシスタンパク質との結合を特異的にブロックすることによって、ＨＰＶ+細胞をＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対して再感作させることができることを示している。
【００７２】
ミリセチンおよびスピナシンはＳｉＨａ細胞中のカスパーゼ８およびｐ５３のレベルを増加させる
上記のデータは、ミリセチンおよびスピナシンがカスパーゼ３／７活性を増大させることができ（図４）、ＳｉＨａ細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス（図３Ａ〜Ｃおよび図５）およびｐ５３誘導アポトーシス（図３Ｄ〜Ｅ）に対して感作させることができることを示している。この能力がＥ６機能の阻害に起因している場合、ミリセチンおよびスピナシンによる処理後にＳｉＨａ細胞においてカスパーゼ８およびｐ５３のレベルの増加が観察できる。この予想を試験するために、ＳｉＨａ細胞を５０、１００および２００μＭのミリセチンまたはスピナシンで２４時間処理し、次いで、免疫ブロットによってカスパーゼ８のレベルを測定した。結果（図６Ａ）は、１００μＭおよび２００μＭの用量でのミリセチンによる処理によってカスパーゼ８のレベルの増加が生じるが、一方、スピナシンは５０〜２００μＭの用量でカスパーゼ８の増加を生じさせたことを示している。ｐ５３のレベルがどのように影響を受けたかを調べるために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。比較のために、ＨＰＶ  Ｅ６を欠いていて変異体ｐ５３を発現するＣ３３Ａ細胞も同じ濃度のスピナシンおよびミリセチンで処理した。ＤＮＡ損傷を引き起こしてｐ５３のレベルを増加させるために、マイトマイシンＣをアッセイに含ませた。この実験で得た結果（図６Ｂ）は、非処理細胞と比較して、ミリセチンによるＳｉＨａ細胞の処理が２００μＭの用量でｐ５３を４.４倍増加させること、およびスピナシンによる処理が１００μＭの用量でｐ５３を３.４倍増加させることを示している。さらにまた、Ｃ３３Ａ細胞中のｐ５３のレベルに有意な変化はなかった。これにより、Ｅ６の存在下においてのみミリセチンおよびスピナシンがアポトーシス経路に影響を与えるという結論が確認される。まとめると、これらの結果は、これらの小分子が、Ｅ６がその細胞パートナーに結合する能力をブロックしてＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞におけるカスパーゼ８およびｐ５３の分解を減少させることによって、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスおよびｐ５３誘導アポトーシスの両方に対するＳｉＨａ細胞の感受性を増大させることができることを示している。
【００７３】
ミリセチンおよびスピナシンはＨＰＶ+頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞をＴＲＡＩＬ誘導細胞死に対して感作させる
上記のように、ミリセチンおよびスピナシンは、ＳｉＨａ細胞をＴＲＡＩＬおよび化学療法薬に対して感作させる。これらのデータは、小分子阻害剤がＨＰＶ  Ｅ６機能をブロックすることができ、ＨＰＶ+子宮頚癌細胞株にアポトーシスまたは他の細胞死誘導プロセスを受けさせるという原理証明を与える。他のタイプのＨＰＶ+癌細胞を試験した。特に、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞をこの方法で感作させることもできる。選択した細胞株はすべて、１００ｎｇ／ｍｌの高濃度でＴＲＡＩＬに対する抵抗性を示した（図７Ａ）。組合せ実験のために、ミリセチン（０〜２００μＭ）またはスピナシン（０〜１００μＭ）と組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬを適用した。図７Ｂに示されるように、ＨＰＶ-  ＨＮＳＣＣ細胞株（ＳＣＣ８４、＃８４）は、ミリセチンまたはスピナシンの存在下でも非存在下でもＴＲＡＩＬに対して抵抗性であった。対照的に（図７Ｃ）、ＴＲＡＩＬ誘導細胞死は、ＵＰＣＩ−ＳＣＣ９０−ＵＰ−Ｃｌｏｎｅ３５、＃９０において３０％増強された。さらにまた、４０μＭのスピナシンもまた、ＨＰＶ+  ＃９０細胞株においてＴＲＡＩＬ誘導細胞死を５０％まで増強させることができた。まとめると、これらの結果は、ミリセチンおよびスピナシンがともに、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して、ＨＰＶ+  ＨＮＳＣＣ細胞株を感作させるがＨＰＶ-  ＨＮＳＣＣ細胞株を感作させないことを示しており、これにより、これらの小分子がＨＰＶ  Ｅ６機能をブロックするという前の結果が確認された。
【００７４】
ミリセチンおよびスピナシンはＨＰＶ+  ＨＮＳＣＣ細胞をドキソルビシンに対して感作させる
上記の結果は、ミリセチンおよびスピナシンがＨＰＶ+  ＨＮＳＣＣ細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して感作させることを示している。この感作が化学療法剤という面に関しても生じるのか否かを決定するために、いくつかのＨＮＳＣＣ細胞株を、組合せ処理に対するそれらの応答について試験した。図８Ａに示されるように、ＨＰＶ-  ＨＮＳＣＣ細胞株ＳＣＣ８４（＃８４）は、ミリセチンおよびスピナシンの存在下でも非存在下でもドキソルビシンに対して抵抗性であった。しかしながら、ＵＰＣＩ−ＳＣＣ９０−ＵＰ−Ｃｌｏｎｅ３５（＃９０）のようなＨＰＶ+  ＨＮＳＣＣ癌細胞株は、２μＭのドキソルビシンと示された小分子との組合せによって処理された場合に細胞死の増加を示した（図８Ｂ）。これらの実験において、スピナシンは、１２.５μＭの濃度で＃９０をドキソルビシンに対して５０％まで感作させ、ミリセチンよりも高い効力を示した。まとめると、これらのデータは、ミリセチンおよびスピナシンがＨＰＶ+子宮頚癌細胞およびＨＰＶ+口腔癌細胞のどちらをもドキソルビシンのような化学療法剤に対して感作させ得ることを示している。
【００７５】
ＨＰＶタンパク質の標的化
ＨＰＶタンパク質のいずれかを標的とする臨床使用に利用可能な小分子は、ＨＰＶ関連悪性腫瘍に対して現在利用可能な限られた治療選択肢の拡大および増強を行うためにこのような小さな阻害分子を開発することができるので（D'Abramo, C.M. and J. Archambault, Small molecule inhibitors of human papillomavirus protein - protein interactions. The open virology journal, 2011. 5: p. 80-95；Phelps, W.C., J.A. Barnes, and D.C. Lobe, Molecular targets for human papillomaviruses: prospects for antiviral therapy. Antiviral chemistry & chemotherapy, 1998. 9(5): p. 359-77）、望ましい。Ｅ６およびＥ７癌遺伝子は、癌発達中に比較的高いレベルで発現し、したがって、有用な標的としての役割を果たす可能性がある。例えば、Ｅ６は、通常、内因性アポトーシス経路および外因性アポトーシス経路の両方をブロックするように機能するので（Hebner, C., M. Beglin, and L.A. Laimins, Human papillomavirus E6 proteins mediate resistance to interferon-induced growth arrest through inhibition of p53 acetylation. Journal of virology, 2007. 81(23): p. 12740-7）、Ｅ６の阻害は細胞死を増加させると予測される。Ｅ６とその細胞パートナーとの間の相互作用をブロックする１つのアプローチはペプチドを使用することであり、Ｅ６とカスパーゼ８およびＦＡＤＤとの間の相互作用（Tungteakkhun, S.S., et al., The interaction between human papillomavirus type 16 and FADD is mediated by a novel E6 binding domain. Journal of virology, 2008. 82(19): p. 9600-14）またはＥ６とＥ６ＡＰとの間の相互作用（Tungteakkhun, S.S., et al., The interaction between human papillomavirus type 16 and FADD is mediated by a novel E6 binding domain. Journal of virology, 2008. 82(19): p. 9600-14；34. Liu, Y., et al., Design and characterization of helical peptides that inhibit the E6 protein of papillomavirus. Biochemistry, 2004. 43(23): p. 7421-31）を特異的に阻害することができるペプチド阻害剤が同定されている。しかしながら、本明細書に記載されているような小分子は、ペプチド阻害剤と比較すると、より安定であり、より容易に標的細胞に侵入し、薬物開発の間に有機化学者によってより容易に変更および最適化することができるので、多くの利点を有する。公表された研究は、Ｅ６とＥ６ＡＰとの間の相互作用を阻害することができるいくつかの化合物（１７〜２９μＭのＥＣ50値を有するもの）を同定しているので（D'Abramo, C.M. and J. Archambault, Small molecule inhibitors of human papillomavirus protein - protein interactions.  The open virology journal, 2011. 5: p. 80-95；Baleja, J.D., et al., Identification of inhibitors to papillomavirus type 16 E6 protein based on three-dimensional structures of interacting proteins.  Antiviral research, 2006. 72(1): p. 49-59）、この領域においていくらかの進歩が達成されている。しかしながら、限られたデータセットのためにこれらの化合物について構造−活性相関（ＳＡＲ）は行われておらず、これらの知見のいずれも臨床的に有用な介入に至っていない。ミリセチンはインビトロでのＥ６とカスパーゼ８との間の相互作用を阻害することが報告されており、予備的結果は、ミリセチンがＥ６と２：１の比率で結合することを示しているが、残念なことに、ミリセチンは、多くの細胞タンパク質（いくつかのキナーゼを含む）を阻害することが知られており、これは十分な特異性の欠如を示している。加えて、細胞ベースのモデル系という面に関して観察された高いＥＣ50値は、腫瘍に悪影響を及ぼすその能力が限定され得るとことを示唆する。そ���は、おそらく、細胞に侵入するその能力をその極性が制限するためである。極性基はＳＡＲを評価する際の重要な特徴であるので、この一連の化合物における標的の同定は、プロドラッグアプローチという手段に訴えることなしでは困難である。したがって、商業化のためのより優れたプラットフォームを提供することが期待されるより多くの「リード様」メンバーを含有するライブラリーを用いて、さらなるスクリーニングを行った。
【００７６】
５種類の試験化合物のうち、スピナシン（５）が、Ｅ６／カスパーゼ８結合およびＥ６／Ｅ６ＡＰ結合の両方について最も低いＥＣ50値を示しており、Ｅ６とカスパーゼ８およびＥ６ＡＰの両方との相互作用を最もよく特異的に阻害する。しかしながら、それはカスパーゼ８／カスパーゼ８結合を阻害せず、したがって、所望の特異性を示している。ＴＲＡＩＬによるＳｉＨａ細胞の処理を伴う実験において、ＥＣ50値は、ミリセチンによるものと比較して、スピナシンがよりよく細胞に侵入することができ、かくして、細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対してより効率的に再感作させることを示している（表２）。
【００７７】
ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに基づく治療は、単独で、または他の剤と組み合わせて、さまざまな種類の癌の処置のための魅力的な可能性である（Bellail, A.C., et al., TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:  the promises and the challenges.  Rev Recent Clin Trials, 2009. 4(1): p. 34-41；El-Zawahry, A., J. McKillop, and C. Voelkel-Johnson, Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L/TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts. BMC Cancer, 2005. 5: p. 2；Mom, C.H., et al., Mapatumumab, a fully human agonistic monoclonal antibody that targets TRAIL-R1, in combination with gemcitabine and cisplatin: a phase I study. Clin Cancer Res, 2009. 15(17): p. 5584-90；Naka, T., et al., Effects of tumor necrosis factor-related apoptosis- inducing ligand alone and in combination with chemotherapeutic agents on patients' colon tumors grown in SCID mice. Cancer Res, 2002. 62(20): p. 5800-6）。しかしながら、これらの処置は、アポトーシス経路を損なうＥ６の能力のために、それら自体がＨＰＶという面に関して役に立つとは考えられない。ＴＲＡＩＬと小分子との組合せは、Ｅ６発現細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して再感作させることができ、潜在的にこのギャップを埋めることが判明した。ミリセチンおよびスピナシンはともに、細胞をＴＲＡＩＬに対して感作させることに加えて、細胞を、ドキソルビシンおよびシスプラチンのような化学療法薬によって引き起こされる内因性アポトーシスに対して感作させることが判明した。これは臨床的に重要であり得る。それは、子宮頚癌がシスプラチンのような化学療法に対して比較的抵抗性である傾向にあるためである（Rein, D.T. and C.M. Kurbacher, The role of chemotherapy in invasive cancer of the cervix uteri: current standards and future prospects.  Anticancer Drugs, 2001. 12(10): p. 787-95）。結合を阻害し、細胞を感作させるために、ミリセチンはスピナシン（５０μＭ）よりも高い濃度（１００μＭ）を必要としており、これはスピナシンがより効率的な薬剤であることを示唆している。まとめると、これらのデータは、ミリセチンおよびスピナシンが、Ｅ６と、カスパーゼ８およびＥ６ＡＰ／ｐ５３を包含する複数のアポトーシスタンパク質との結合をブロックし得ることを示しており、これによって、Ｅ６によって損なわれるアポトーシス経路が再活性化され、ＨＰＶ+細胞がアポトーシスの内因性インデューサーおよび外因性インデューサーの両方に対して感受性になる。ＨＰＶ+  ＳｉＨａ細胞をＴＲＡＩＬおよび化学療法剤によって誘導されるアポトーシスに対して感作させるミリセチンおよびスピナシンの能力は、ＨＰＶ+  ＨＮＣ細胞において同一の効果が見られることを示唆している。ＨＮＣ細胞から得た結果は子宮頚部細胞から得た結果をしっかりと反映していたことが判明した。これは、本明細書に記載の方法および組成物が、起源の部位に関係なく、ＨＰＶ関連悪性腫瘍に幅広く適用可能であることを示している。このデータは、小分子がＥ６と直接的に相互作用し、ウイルスタンパク質を不安定化し、そのコンフォメーションを変化させるか、または直接的な干渉によって相互作用をブロックする作用様式を示唆している。後者の場合、１つの可能性は、ミリセチン／スピナシンがＥ６ＡＰおよびカスパーゼ８の両方によって必要とされるＥ６上の領域に結合することである。小分子とＴＲＡＩＬ／化学療法剤との組み合わせに関するこれらの結���は、ＨＰＶ+癌細胞の効果的かつ選択的死滅のため、およびＨＰＶ媒介癌を処置する治療戦略の開発のための治療アプローチに使用することができる。
【実施例】
【００７８】
タンパク質精製
ｐＧＥＸ−Ｅ６、ｐＴｒｉＥｘ−Ｅ６ＡＰ、およびｐＴｒｉＥｘ−カスパーゼ８  ＤＥＤプラスミドの構築が報告されている（Tungteakkhun, S.S., et al., The interaction between human papillomavirus type 16 and FADD is mediated by a novel E6 binding domain.  Journal of virology, 2008. 82(19): p. 9600-14）。ＧＳＴＥ６、Ｈｉｓ−Ｅ６ＡＰ、およびＨｉｓ−カスパーゼ８  ＤＥＤの発現および精製は、従前の記載（Tungteakkhun, S.S., et al., The interaction between human papillomavirus type 16 and FADD is mediated by a novel E6 binding domain. Journal of virology, 2008. 82(19): p. 9600-14；Tungteakkhun, S.S., et al., The full-length isoform of human papillomavirus 16 E6 and its splice variant E6* bind to different sites on the procaspase 8 death effector domain. Journal of virology, 2010. 84(3): p. 1453-63）に従って行った。ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグタンパク質を、それぞれＧＳＴ希釈バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ８.０、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）およびＨｉｓ希釈バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７.４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）で希釈した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ−Ｔｈｅ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Thermo Scientific）を用いて、タンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色法によって分離した後、単離タンパク質の純度を評価した。
【００７９】
小分子ライブラリーおよびさらなる化合物の取得
TimTec, LLC（Newark, DE, USA）から２,０００化合物小分子ライブラリー（ＡｃｔｉＰｒｏｂｅ  ２Ｋ）を取得した。これは該ライブラリーが非常に多様なリード様化合物の選択を含むからである。５種類のさらなる誘導体を購入した（Sigma（St. Louis, MO, USA）からベンゾイミダゾール、２−(メトキシメチル)−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、および３−(１Ｈ−インドール−１−イル)プロパン−１−アミンメタンスルホナート；ならびにTimTecから１Ｈ−ベンゾイミダゾール−１−メタノールおよび４,５,６,７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸）。
【００８０】
小分子ライブラリーのスクリーニング
ＧＳＴ−Ｅ６間、ＧＳＴ−カスパーゼ８間、Ｈｉｓ−Ｅ６ＡＰ間およびＨｉｓ−カスパーゼ８間の相互作用を評価するためにＡｌｐｈａ−ＳｃｒｅｅｎTM技術を用いた。従前の記載（Tungteakkhun, S.S., et al., The interaction between human papillomavirus type 16 and FADD is mediated by a novel E6 binding domain. Journal of virology, 2008. 82(19): p. 9600- 14）に従って、総体積２５μlの白色３８４ウェルプレート（Perkin-Elmer）中にて結合アッセイを行った。簡単には、１０μＭの各試験化合物の非存在下または存在下でのブロッキングバッファー（０.５ｍｇ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中０.５％Ｔｗｅｅｎ２０）５μｌとの各反応混合物中にＧＳＴ−Ｅ６  ５μｌ（５０ｎｇ）およびＨｉｓ−カスパーゼ８  ５μｌ（８７.５ｎｇ）を含む。ライブラリーのメンバーは、ＤＭＳＯ中にて１０μＭで存在した。この混合物を室温で１時間インキュベートした後、製造者のプロトコールに従って、各ウェルにドナービーズ５μｌおよびアクセプタービーズ５μｌ（Perkin-Elmer）を添加した。該混合物を暗所にて室温で一夜インキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Perkin-Elmer）を用いて、放出されたシグナルを検出した。試験化合物の存在下で、結合親和性を、担体だけ（ＤＭＳＯ）の存在下での結合のパーセンテージとして算出した。
【００８１】
細胞培養
America Type Culture Collection（Manassas, VA, USA）からＵ２ＯＳ、ＳｉＨａおよびＣ３３Ａ細胞を入手し、従前の記載（Tungteakkhun, S.S., et al., The interaction between human papillomavirus type 16 and FADD is mediated by a novel E6 binding domain. Journal of virology, 2008. 82(19): p. 9600-14）に従って追加したイーグル最小必須培地（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）中にて培養した。ＨＮＳＣＣ細胞株をいくつかの供給源から入手した：ＵＤ−ＳＣＣ２−ＴＣ−Ｃｌｏｎｅ５（＃２ＴＣ）、ＵＰＣＩ−ＳＣＣ９０−ＵＰ−Ｃｌｏｎｅ３５（＃９０）およびＳＣＣ８４は、Sanford Research（South Dakota, SD, USA）のDr. John Leeからの寄贈であった。ＨＮＳＣＣ細胞は、１０％のＦＢＳを追加したダルベッコの変法イーグル培地（Mediatech, VA）にて培養した。
【００８２】
細胞生存率アッセイ
ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインを、Ｎ末端Ｈｉｓ×６ｔａｇを含有するｐＴｒｉＥｘ発現プラスミド中にクローン化した。Ｈｉｓ−ＴＲＡＩＬをイー・コリ（E. coli）ＢＬ−２１  ｐＬｙｓ株において発現させ、従前の記載に従って精製した。ドキソルビシンおよびシスプラチンはSigmaから購入した。使用前に、Ｈｉｓ−ＴＲＡＩＬ、ドキソルビシンおよびシスプラチンをＰＢＳで所望の濃度に希釈した。ＴＲＡＩＬ、シスプラチンおよびドキソルビシンによる処理後の細胞生存を則愛知するために、ＳｉＨａ（２×１０4／ウェル）、Ｃ３３Ａ（１×１０4／ウェル）およびＨＮＳＣＣ細胞（２×１０4／ウェル）を９６ウェルプレートに播き、一夜付着させた。所望の濃度の小分子を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、示されるとおり、ＴＲＡＩＬ、シスプラチンまたはドキソルビシンを添加した。ＴＲＡＩＬ処理群はde novoタンパク質合成を阻害するためにシクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）を含有していた。該細胞を１６時間インキュベートした後、従前の記載（Filippova, M., L. Parkhurst, and P.J. Duerksen-Hughes, The human papillomavirus 16 E6 protein binds to Fas-associated death domain and protects cells from Fas-triggered apoptosis.  The Journal of biological chemistry, 2004. 279(24): p. 25729-44）に従ってＭＴＴアッセイによって細胞生存率測定した。すべての実験を少なくとも３回繰り返し（異なる日に実施した３つの生物学的複製）。各実験群をこれらの個々の実験のそれぞれにおいてトリプリケートで測定した。示されたデータは、代表的な実験からのものである。
【００８３】
カスパーゼ活性アッセイ
細胞を２×１０4細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレーティングし、一夜インキュベートした。次いで、小分子を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）、シスプラチン（５０μＭ）およびドキソルビシン（２μＭ）を添加した。示された時点で、シクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）をＴＲＡＩＬと一緒に添加した。製造者の指示書に従って、カスパーゼ３／７活性用の蛍光発生的基質ＣｅｌｌＴｉｔｉｅｒ−Ｇｌｏ（Promega, Fitchburg, WI, USA）を用いて、カスパーゼ３／７活性を測定した。簡単には、５×受動溶解バッファー（Promega）２０μｌの添加によって細胞を溶解した。該プレートをオービタル振盪器上に置き、室温で１０分間インキュベートした。細胞溶解物２０μｌを白色プレートに移し、適切なウェルに基質単独または基質＋カスパーゼ３／７阻害剤を添加した。１０分間インキュベートした後、プレートリーディング蛍光測定装置（Ｆｌｘ８００、Bio-Tek Instrument Co., Vinooski, VT, USA）を用いて、放出されたフルオロフォアを測定した。阻害剤で処理したウェルにおける活性を、阻害剤を欠いているウェルにおける活性から差し引いた。得られた差を非処理細胞のカスパーゼ活性のパーセンテージとして表した。
【００８４】
免疫ブロット分析
細胞（１×１０6）を収集し、ＰＢＳで洗浄した。４℃にて３,０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって全液体を除去した。氷上にて細胞ペレットを溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド；使用直前に、バッファー１０ｍｌあたりプロテアーゼ阻害剤混合物（Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland）１錠を添加）１００μｌに１０分間溶解した。次いで、溶解物（総タンパク質１０〜４０μｇ／レーン）を１０％または１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、ｉＢｌｏｔ（登録商標）ドライブロッティングシステム（Invitrogen）を用いてＰＶＤＦ膜に移した。抗カスパーゼ８モノクローナル抗体（BD Pharmingen, Franklin, NJ, USA）および抗βアクチンモノクローナル抗体（Sigma）を１：５０００希釈率で適用した。使用した二次抗体は、１：３０,０００希釈率での、カスパーゼ８についてはヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ８００（LI-COR Biosciences）、βアクチンについてはヤギ抗マウスＤｙ６８０（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA）であった。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（LI-COR Biosciences）を用いてシグナルを測定し、相対光単位（relative light unit）で表した。
【００８５】
ｐ５３  ＥＬＩＳＡ
若干変更した従前の記載（Filippova, M., et al., The large and small isoforms of human papillomavirus type 16 E6 bind to and differentially affect procaspase 8 stability and activity. J Virol, 2007. 81(8): p. 4116-29）に従って、ｐ５３  ＥＬＩＳＡを行った。モノクローナルキャプチャー抗体として、クローンｐＡｂ１２２（ＡＴＣＣから入手したハイブリドーマ、プロテインＡセファロースを用いて培養培地から精製した抗体）によって分泌された抗体を使用した。この抗体は、幅広い特異性を有しており、５３のヒト形態およびマウス形態の両方、ならびに該タンパク質の野生型および変異体の両方と結合する。４℃で一夜インキュベートすることによって、これらの抗体をＮｕｎｃ−イムノプレート、ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｓｕｒｆａｃｅ（NalgeNunc International, Rochester, NY, USA）の表面に吸収させた（５０μＬ／ウェル、４μｇ／ｍＬ）。次いで、Ａｕｔｏ  Ｓｔｒｉｐ  Ｗａｓｈｅｒ、ＥＬＸ５０（Bio-Tek Instruments, Inc.）にてＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０.１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、このプレートを６回洗浄した。１０％ウシ血清（Invitrogen）（ブロッキングバッファー）を含む２００μＬ／ウェルのＰＢＳと一緒に室温で２時間インキュベートすることによって非特異的結合部位をブロックし、次いで、上記に従って洗浄した。次いで、試験すべき各細胞溶解物１００μＬを、コーティングしたウェルに添加し、４℃で一夜インキュベートした。洗浄後、ブロッキングバッファーで希釈した４μｇ／ｍＬのビオチニル化抗p５３抗体（ポリクローナル、ヒツジにて産生させた、Roche）を含有する溶液１００μＬを各ウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。該プレートを洗浄し、次いで、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Sigma；１００μＬ／ウェル、ブロッキングバッファーで希釈した２.５μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、基質（０.１Ｍクエン酸に溶解した０.３ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ（２,２'−アジノ−ジ−(３−エチルベンズチアゾリンスルホナート）、ｐＨ４.３５；使用直前に１μＬ／ｍＬ  ３０％Ｈ2Ｏ2を添加した）１００μＬを各ウェルに添加し、約３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Dynex Technologies；MRX Revelation software, Chantilly, VA, USA）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。ＢＣＡ法（Pierce, Chantilly, VA, USA）を用いて各溶解物のタンパク質濃度も測定し、１ウェルあたりの細胞数の可能な変動について、測定されたｐ５３値を正規化するために使用した。各ｐ５３値（ＥＬＩＳＡアッセイから得た）をタンパク質濃度で割って、正規化ｐ５３値（総タンパク質１ｍｇあたりのｐ５３のｎｇ）を得た。複製物（最低３つ）の平均および標準偏差を計算し、対照に対して正規化し、グラフを作成するために使用した。
【００８６】
処置の方法
一般的に、種々の実施態様の化合物を静脈内または皮下単位投与剤形の医薬組成物で投与するのが好ましい；しかしながら、他の投与経路もまた考えられる。考えられる投与経路としては、経口、非経口、静脈内、皮下、経膜および皮下が挙げられるがこれらに限定されない。種々の実施態様の化合物は、例えば経口投与のための、液体製剤に製剤化され得る。好適な剤形としては、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。特に好ましい経口投与用単位投与剤形としては錠剤およびカプセル剤が挙げられる。例えば子宮頚部組織への、好適な経膜投与用剤形としては圧注が挙げられる。１日１回の投与用に構成された単位投与剤形が特に好ましい；しかしながら、特定の実施態様では、単位投与剤形を１日２回またはそれ以上の投与用に構成するのが望ましい場合がある。
【００８７】
種々の実施態様の医薬組成物は、好ましくは、レシピエントの血液または他の体液と等張である。該組成物の等張性は、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を用いて得ることができる。塩化ナトリウムが特に好ましい。酢酸および塩、クエン酸および塩、ホウ酸および塩、ならびにリン酸および塩などのバッファーを用いることができる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル油または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースをベースとするもの）などが挙げられる。特定の実施態様では、活性化合物を還元状態で維持するのが望ましい場合がある。したがって、還元剤、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、または製薬分野で知られているような他の還元剤を製剤中に含むのが望ましい場合がある。
【００８８】
医薬組成の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を用いて選択されたレベルで維持することができる。メチルセルロースは、容易にかつ経済的に入手可能であり、作業が容易であるために、好ましい。他の好適な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された増粘剤に依存する。好ましくは、選択された粘度を達成する量が用いられる。粘性組成物は、通常、このような増粘剤の添加によって液剤から調製される。
【００８９】
医薬組成物の有効期間を増加させるために薬学的に許容される保存剤を用いることができる。ベンジルアルコールが好適であり得るが、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノール、または塩化ベンザルコニウムを包含する種々の保存剤を用いることもできる。該保存剤の好適な濃度は、典型的には、組成物の総重量に基づいて約０.０２％〜約２％であるが、選択された該保存剤に依存して、それよりも多い量または少ない量が望ましい場合がある。上記の還元剤は、製剤の良好な有効期間を維持するために有利に使用することができる。
【００９０】
種々の実施態様の化合物は、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどの好適な担体、希釈剤または賦形剤賦形剤と混合することができ、投与経路および所望の製剤に依存して、湿潤剤または乳化剤、ｐＨバッファー、ゲル化するかまたは粘度を高める添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。例えば、“Remington:  The Science and Practice of Pharmacy”, Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition (June 1, 2003) and “Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Pub. Co.；第１８版および第１９版（それぞれ、１９８５年１２月および１９９０年６月）を参照。かかる製剤は、錯化剤、金属イオン、高分子化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ハイドロゲル、デキストランなど、リポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層または多重層リポソーム、赤血球ゴーストまたはスフェロブラスト（spheroblast）を含むことができる。リポソーム製剤に適している脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。このようなさらなる成分の存在は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼすことがあり、かくして、担体の特徴が選択された投与経路に適合するように、意図される用途に従って選択される。
【００９１】
経口投与について、当該医薬組成物は、錠剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、乳剤、ハードもしくはソフトカプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として提供され得る。経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野で知られている方法に従って調製することができ、以下の薬剤の１種類以上を含むことができる：甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤。水性懸濁剤は、活性成分を、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合して含むことができる。
【００９２】
経口用製剤は、また、活性成分を炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンのような不活性固体希釈剤と混合したハードゼラチンカプセル剤として、またはソフトゼラチンカプセル剤として提供することができる。ソフトカプセル剤においては、活性化合物を、好適な液体、例えば、水、または落花生油、オリーブ油、脂肪油、流動パラフィンもしくは液体ポリエチレングリコールのような油性媒体に溶解または懸濁させることができる。経口投与のために製剤化された安定剤およびマイクロスフェアを使用することもできる。カプセル剤としては、ゼラチンで作られているプッシュフィット型カプセル剤（push-fit capsule）、ならびにゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールのような可塑剤で作られている密閉型ソフトカプセル剤が挙げられる。該プッシュフィット型カプセルは、活性成分を、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに所望により安定剤と混合して含有することができる。種々の実施態様の化合物を還元形態で維持するのが望ましい場合（特定の活性な代謝物の場合）、カプセル剤または他の投与剤形に還元剤を含むのが望ましい場合がある。
【００９３】
錠剤は、コーティングされていないか、または消化管内での崩壊および吸収を遅延させるために公知の方法によってコーティングされることによってより長い期間にわたって持続的な作用を提供することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルのような時間遅延物質を用いることができる。錠剤のような固体形態で投与される場合、該固体形態は、活性成分を、典型的には約０.００１重量％またはそれ以下から約５０重量％またはそれ以上まで、好ましくは約０.００５、０.０１、０.０２、０.０３、０.０４、０.０５、０.０６、０.０７、０.０８、０.０９、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９または１重量％から約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５重量％まで含む。
【００９４】
錠剤は、活性成分を、不活性物質を包含する非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して含有することができる。例えば、錠剤は、所望により１種類以上のさらなる成分を用いて、打錠または成形によって調製することができる。打錠錠剤は、所望により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合していてもよい粉末または顆粒のような流動性形態の活性成分を好適な機械で打錠することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を好適な機械で成形することによって調製することができる。
【００９５】
好ましくは、各錠剤またはカプセル剤は、種々の実施態様の化合物を約１０ｍｇまたはそれ以下から約１,０００ｍｇまたはそれ以上まで、より好ましくは約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇから約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００または９００ｍｇまで含有する。最も好ましくは、錠剤またはカプセル剤は、分割量が投与されることを可能にするための投与量の範囲内で提供される。かくして、患者に適切な投与量および毎日投与される投与回数を都合よく選択することができる。特定の実施態様では、（例えば、併用療法において）投与されるべき治療剤の２種類以上を１個の錠剤または他の投与剤形に組み込むのが好ましい場合がある；しかしながら、他の実施態様では、複数の治療剤を別々の投与剤形で提供するのが好ましい場合がある。
【００９６】
好適な不活性物質としては、希釈剤、例えば炭水化物、マンニトール、ラクトース、無水ラクトース、セルロース、シュークロース、修飾デキストラン、デンプンなど、または無機塩、例えばトリリン酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる。製剤中に崩壊剤または造粒剤、、例えば、コーンスターチのようなデンプン、アルギン酸、デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮（orange peel）、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイト、不溶性陽イオン交換樹脂、粉末状ガム、例えば寒天、カラヤもしくはトラガカント、またはアルギン酸もしくはその塩を含むことができる。
【００９７】
硬い錠剤を形成するために結合剤を使用することができる。結合剤としては、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然物由来の物質、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。
【００９８】
滑沢剤、例えばステアリン酸またはそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン、流動パラフィン、植物油およびワックス、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、デンプン、タルク、焼成シリカ（pyrogenic silica）、水和ケイアルミン酸（hydrated silicoaluminate）などを錠剤製剤に含むことができる。
【００９９】
界面活性剤、例えば、陰イオン洗剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウム、陽イオン洗剤、例えば塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウム、または非イオン性洗剤、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート、シュークロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースを使用することもできる。
【０１００】
拡散または浸出メカニズムによる放出を可能にする不活性マトリックスにアミホスチンまたはその類縁物質が組み込まれている制御放出製剤を用いることができる。該製剤に徐々に劣化するマトリックスを組み込むこともできる。他の送達系としては、時限放出（timed release）送達系、遅延放出送達系または持続放出送達系を挙げることができる。
【０１０１】
コーティング剤、例えば、非腸溶性物質、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポビドンおよびポリエチレングリコール、または腸溶性物質、例えばフタル酸エステルを使用することができる。識別のため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または顔料を加えることができる。
【０１０２】
液体剤形で経口投与する場合、液体担体、例えば、水、石油（petroleum）、動物もしくは植物起源の油、例えば落花生油、鉱油、大豆油もしくはゴマ油、または合成油を活性成分に加えることができる。生理食塩水、デキストロース、または他の糖類溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールもまた好適な液体担体である。該医薬組成物は、水中油型エマルションの形態であってもよい。該油相は、植物油、例えばオリーブ油またはアラキス油、鉱油、例えば流動パラフィン、またはそれらの混合物であり得る。好適な乳化剤としては、天然起源のガム、例えばアカシアガムおよびトラガカントガム、天然起源のホスファチド、例えばダイズレシチン、脂肪酸およびヘキトール無水物由来のエステルもしくは部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、ならびにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。該エマルションは甘味剤および矯味矯臭剤を含有することもできる。
【０１０３】
種々の実施態様の化合物が静脈注射、非経口注射または他の注射によって投与される場合、好ましくは、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液または油性懸濁液の形態である。懸濁液は、好適な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、当該技術分野で周知の方法に従って製剤化することができる。好適なｐＨ、等張性、安定性などを有する許容される水性溶液の調製は、当該分野のスキルの範囲内である。好ましい注射用医薬組成物は、好ましくは、等張性ビヒクル、例えば、１,３−ブタンジオール、水、等張性塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、乳酸リンゲル溶液、または当該技術分野で知られている他のビヒクルを含有する。加えて、慣用的に溶媒または懸濁媒体として滅菌固定油を用いることができる。この目的で、合成モノサッカリドまたはジサッカリドを含むブランド固定油を用いることができ、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射用製剤の製剤化に使用することができる。該医薬組成物は、安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に知られている他の添加剤を含有することもできる。
【０１０４】
注射の期間は、種々の要因に依存して調節することができ、連続静脈内投与の数秒もしくはそれ以下から、０.５、０.１、０.２５、０.５、０.７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間またはそれ以上までの間にわたって投与される単回投与を含むことができる。
【０１０５】
種々の実施態様の組成物は、さらに、医薬組成物中に慣習的に見出される付加的な成分を、それらの技術分野で確立された方法およびそれらの技術分野で確立されたレベルで使用することができる。かくして、例えば、当該組成物は、併用療法に適合しているさらなる薬学的に活性な物質（例えば、追加の抗微生物剤、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、抗炎症剤、還元剤など）を含有することができるか、または、種々の実施態様の種々の投与剤形の物理的製剤化に有用な物質、例えば、賦形剤、色素、増粘剤、安定剤、保存剤または抗酸化剤を含有することができる。
【０１０６】
特定の実施態様において、スピナシン（４,５,６,７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ(４,５−ｃ)ピリジン−６−カルボン酸）および／またはＤＩＰＣ（６,７−ジヒドロイミダゾ[５,４−ｃ]ピリジン−６−カルボン酸）を１種類以上のＴＮＦスーパーファミリーリガンドとともに投与することができる。ほとんどのＴＮＦリガンドは、細胞外ドメインが特異的メタロプロテイナーゼによって切断されて可溶性サイトカインを生じることができるＩＩ型膜貫通型タンパク質である。切断されたリガンドおよび切断されていないリガンドは、ＡＰＲＩＬとヘテロ三量体を形成するＴＮＦ−βおよびＢＡＦＦとヘテロ三量体を形成するリンホトキシンβを除いて非共有ホモ三量体として活性である。ＴＮＦファミリーリガンドは、膜貫通型ドメインを、ＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）である、ＴＮＦファミリーリガンドのホールマーク構造を含有するコア領域に連結する可変長のストーク（stalk）によって特徴付けられる。該ＴＨＤは、「ゼリーロール」トポロジーを有する逆平行βプリーツシートサンドイッチである。該βストランド内の保存残基は、三量体構造を安定化させる特異的なサブユニット間接触を提供する。隣接するβストランドを連結するループ内の配列は、ファミリーメンバー特異的であり、受容体特異性を付与するのに重要である。ＴＮＦスーパーファミリーリガンドとしては、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９；ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３；ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７；ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８；ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５；ＥＤＡ／エクトジスプラシン；ＥＤＡ−Ａ２／エクトジスプラシンＡ２；Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６；ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８；ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４；リンホトキシン；リンホトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３；ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４；ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５；ＴＮＦ−α；リンホトキシンα／ＴＮＦ−β；ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０；ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ；ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２；およびＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
種々の実施態様の化合物は、キットの形態で管理医（administering physician）または他の医療専門家（health care professional）に提供することができる。該キットは、該化合物を好適な医薬組成物で含有する容器と、医薬組成物を対象体に投与するための説明書とを収納しているパッケージである。該キットは、所望により１種類以上のさらなる治療剤を含有することができる。例えば、１種類以上のさらなる抗レトロウイルス剤、抗菌剤、抗感染剤および／または他の剤と組み合わせて種々の実施態様の化合物を含む１種類以上の組成物を含有するキットが提供され得るか、または、種々の実施態様の化合物およびさらなる治療剤を含有する別々の医薬組成物が提供され得る。キットは、また、連続的または逐次的投与のために種々の実施態様の化合物の別々の用量を含有することもできる。キットは、所望により１種類以上の診断ツールおよび使用説明書を含有することができる。キットは、該化合物および他の治療剤を投与するための説明書とともに、好適な送達デバイス、例えば、注射器などを含有することができる。キットは、所望により、含まれている治療剤のいずれかまたは全ての保存、再構成（適用可能な場合）および投与のための説明書を含有することができる。キットは、対象体に与えるべき投与の回数を反映する複数の容器を含むことができる。
【０１０８】
種々の実施態様において、種々の実施態様の化合物のうちの１つ、ならびにＨＰＶ起因性癌の処置または予防に現在用いられている１種類以上の抗ウイルス剤、例えばシスプラチンおよびドキソルビシンを含む、癌の予防または処置の処置用キットが提供される。
【０１０９】
好ましい実子態様の化合物とともに、アポトーシスを活性化することによって機能するものを包含する他の化学療法剤を投与することもできる。好適な化学療法剤としては、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されない：アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード：例えば、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、クロラムブシル、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、イホスファミドおよびメルファラン；ニトロソ尿素：例えば、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン；アルキルスルホネート：ブスルファン；トリアジン：ダカルバジン（ＤＴＩＣ）およびテモゾロミド（テモダール（登録商標））；エチレンイミン：チオテパおよびアルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）；プラチナ薬剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサプラチン））；代謝拮抗剤（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標）））；抗腫瘍抗生物質（アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））、エピルビシン、イダルビシン）；アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としても作用する））；トポイソメラーゼ阻害剤（トポテカンおよびイリノテカン（ＣＰＴ−１１）を包含するトポイソメラーゼＩ阻害剤、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ミトキサントロン（抗腫瘍抗生物質としても作用する）を包含するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）；有糸分裂阻害剤（パクリタキセル（タキソール（登録商標））およびドセタキセル（タキソテール（登録商標））などのタキサン、エポチロン：イクサベピロン（イグゼンプラ（登録商標））、ビンカアルカロイド：ビンブラスチン（ベルバン（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、およびビノレルビン（ナベルビン（登録商標））、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標）））；コルチコステロイド（プレドニゾン、メチルプレドニゾロン（ソルメドロール（登録商標））、デキサメタゾン（デカドロン（登録商標）））；Ｌ−アスパラギナーゼ（酵素である）、およびプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））。
【０１１０】
本開示は、図面および前記の説明において詳細に例示および説明されているが、そのような例示および説明は、例示的または典型的であって限定的ではないとみなされるべきである。本開示は、記載した実施態様に限定されない。開示された実施形態に対する変形は、図面、本開示および特許請求の範囲の研究から、特許請求の範囲に係る開示を実施する上での当業者によって理解され、達成され得る。
【０１１１】
本明細書で引用された全ての参考文献は、出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する。出典明示により本明細書の一部を構成する刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、本明細書は、そのような矛盾するものよりも優先される（supersede and／or take precedence）ことを意図する。
【０１１２】
他に定義しない限り、全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、当業者にそれらの通常の慣習的な意味を与えるものとし、本明細書で明示的に定義されていない限り、特別なまたはカスタマイズされた意味に限定されるものではない。本開示の特定の特徴または態様を説明する際に特定の用語を使用することは、その用語が、その用語が関連付けられている本開示の特徴または態様の特定の特徴を含むように限定されることを意味するものではない。特に明示的に記載されていない限り、本出願で使用されている用語およびフレーズ、ならびに、特に添付の特許請求の範囲における、それらの変形は、限定するのではなく制約がないように解釈されるべきである。上記の例として、用語「包含すること」とは、「限定なしで、包含すること」、「包含するがこれらに限定されない」などを意味すると解釈されるべきである；本明細書で用いる場合、用語「を含む」とは、「包含する」、「含有する」または「によって特徴付けられる」ことと同意義であり、包括的であるかまたは制約がなく、列挙されていないさらなる要素または方法の工程を排除しない；用語「有する」とは、「少なくとも有する」と解釈されるべきである；用語「包含する」とは、「包含するがこれらに限定されない」と解釈されるべきである；用語「例」とは、議論中の項目の例示的な例を提供するために使用されるのであって、その網羅的または限定的なリストではない；「知られている」、「通常の」、「標準の」、および類似の意味の用語などの形容詞は、記載された項目を所定の期間にまたは所定の時点で利用可能な項目に限定するものとして解釈されるべきではなく、現在または将来いつでも利用可能であり得るかまたは知られ得る、知られている技術、通常の技術、または標準の技術を網羅すると解釈されるべきである；また、「好ましくは」、「好ましい」、「望まれる」、「望ましい」および類似の意味の語句のような用語の使用は、特定の特徴が本発明の構造または機能にとって決定的に重大な意味を持つこと、必須であること、または重要であることを暗示するものと理解されるべきではなく、単に、本発明の特定の実施態様において利用されてもされなくてもよい別のまたは追加の特徴を強調することを意図しているに過ぎない。同様に、接続詞「および」で連結された一群の項目は、これらの項目の１つ１つがグループに含まれていることを要求するものと解釈されるべきではなく、他に明示的に記載されない限り、「および／または」として解釈されるべきである。同様に、接続詞「または」で連結された一群の項目は、その群の間での相互排他性を要求するものと解釈されるべきではなく、他に明示的に記載されない限り、「および／または」として解釈されるべきである。
【０１１３】
ある範囲の値が与えられている場合、上限および下限、ならびにこの範囲の上限と下限の間に介在する各値は、実施態様の範囲内に含まれると解される。
【０１１４】
本明細書において実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切であるように、複数形から単数形および／または単数形から複数形に翻訳することができる。様々な単数／複数の変更（permutation）は、明瞭にするために本明細書に明示的に記載されてもよい。不定冠詞「a」または「an」は、複数を除外しない。単一のプロセッサまたは他のユニットは、特許請求の範囲に記載されたいくつかの項目の機能を発揮することができる。特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用できないことを示すものではない。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１５】
特定の数の導入された請求項の記載が意図されている場合には、そのような意図は該請求項に明示的に記載されており、そのような記載がない場合にはそのような意図が存在しないことは、当業者にはさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために導入句「少なくとも１つ」および「１つ以上」の使用を含むことができる。しかしながら、そのような語句の使用は、たとえ同じ請求項が導入句「１つ以上」または「少なくとも１つ」、および「a」または「an」などの不定冠詞を包含する場合でさえ、不定冠詞「a」または「an」による請求項の記載の導入は、そのようなクレームの記載を含む特定のクレームを、そのような記載を１つだけ含む実施態様に限定することを暗示すると解釈されるものではない（例えば、「a」および／または「an」は、典型的には、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）；請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同様である。加えて、特定の数の導入された請求項の記載が明示的に記載されていても、当業者であれば、そのような記載は、典型的に少なくとも記載された数を意味すると解釈すべきであることを認識するであろう（例えば、他の修飾語を付けていない「２つの記載」の最低限の記載は、典型的には、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらにまた、「Ａ、ＢおよびＣなどのうち少なくとも１つ」と類似の慣習が用いられる場合、一般的に、このような構成は、当業者がこの慣習（例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａ単独を有する系、Ｂ単独を有する系、Ｃ単独を有する系、ＡおよびＢを一緒に有する系、ＡおよびＣを一緒に有する系、ＢおよびＣを一緒に有する系、および／またはＡ、ＢおよびＣを一緒に有する系などを包含するがこれらに限定されない）を理解するであろうという意味で意図されている。「Ａ、ＢおよびＣなどのうち少なくとも１つ」と類似の慣習が用いられる場合、一般的に、このような構成は、当業者がこの慣習（例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａ単独を有する系、Ｂ単独を有する系、Ｃ単独を有する系、ＡおよびＢを一緒に有する系、ＡおよびＣを一緒に有する系、ＢおよびＣを一緒に有する系、および／またはＡ、ＢおよびＣを一緒に有する系などを包含するがこれらに限定されない）を理解するであろうという意味で意図されている。説明、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語および／または離接句（disjunctive word and／or phrase）は、これらの用語の１つ、これらの用語のいずれか、またはこれらの用語の両方を含む可能性を意図すると解されるべきである。例えば、語句「ＡまたはＢ」とは、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと解される。
【０１１６】
本明細書で使用される成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものと解されるべきである。したがって、反対のことが指示されていない限り、本明細書に記載された数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、かつ、本願に対する優先権を主張する任意の出願において任意の請求項の範囲と均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは有効数字の桁数および通常の丸めアプローチを考慮して解釈されるべきである。
【０１１７】
さらにまた、上記は明瞭さおよび理解のために例示および実施例によって多少詳しく記載されているが、特定の変更および改変を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、説明および実施例は、本発明の範囲を本明細書に記載の特定の実施態様および実施例に限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明の真の範囲および精神に付随するすべての改変および代替を網羅するものと解釈されるべきでもない。
【図１】
2018527319.tif 000005
【図２】
2018527319.tif 000006
【図３】
2018527319.tif 000007
【図４】
2018527319.tif 000008
【図５】
2018527319.tif 000009
【図６】
2018527319.tif 000010
【図７】
2018527319.tif 000011
【図８】
2018527319.tif 000012
【図９】
2018527319.tif 000013
【図１０】
2018527319.tif 000014
【図１１】
2018527319.tif 000015
【図１２Ａ】
2018527319.tif 000016
【図１２Ｂ】
2018527319.tif 000017
【図１２Ｃ】
2018527319.tif 000018
【図１２Ｄ】
2018527319.tif 000019
【図１２Ｅ】
2018527319.tif 000020
【図１２Ｆ】
2018527319.tif 000021
【国際調査報告】
2018527319.tif 000022
2018527319.tif 000023