(57)【要約】  本発明は、O-グリコシド結合を介してアグリコンに結合した標識グリコシル基を含み、特定の構造式を有する化合物を、試料に添加することを含み、前記グリコシル基は、少なくとも１つの同位体、および／または検出のための標識である側鎖を含み、前記試料は、グルコシルセラミド以外のグリコシル基を有するグリコシル化代謝産物の存在についてスクリ-ニングされる、試料中のグリコシル化代謝産物を検出するための手段および方法を提供する。本発明は、さらに、対象におけるグリコシルセラミド以外のグリコシルセラミドの蓄積によって引き起こされる障害の治療方法であって、治療有効量のグルコシルセラミドシンタ-ゼ（GCS）阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
O-グリコシド結合を介してアグリコンに結合された標識化グリコシル基を含む以下の構造式の化合物：
【化１】
2018527946.tif 000006
式中、
R =水酸基または検出標識; そして
X =アグリコン;
を試料に添加することを含み、
前記グリコシル基は、少なくとも1つの同位体および/または検出のための標識であるR側鎖を含み、そして前記試料は、グルコシルセラミド以外のグリコシル基を有するグリコシル化代謝産物の存在についてスクリーニングされる、試料中のグリコシル化代謝産物を検出する方法。
【請求項２】
前記グリコシル化代謝産物は、グリコシル化またはキシロシル化代謝産物、特に、グリコシル化またはキシロシル化ステロール、（ジアシル）グリセロール、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニンまたはトリプトファンである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシル基が、LC-MS / MSを用いた検出のための少なくとも1つの13C-同位体を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
Xが、4-メチルウンベリフェロン、p-ニトロフェノ-ル、ドーパミン、セロトニン、ビタミンD前駆体、カルシフェロールまたはコレカルシフェロ-ル、ジヒドロカルシフェロ-ル、モノアシルグリセロール（エンドカンナビノイド）、（ジアシル）グリセロール、 レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニン、トリプトファン、およびステロール、特にセラミドまたはコレステロールからなる群から選ばれる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、グリコシルトランスフェラーゼ、特にグルコセレブロシダーゼまたはグルコシルセラミダーゼを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、過剰量のグリコシル化代謝産物、好ましくはグルコシルセラミド以外の蓄積によって引き起こされる障害に罹患している被験体由来の試料である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記障害が、リソソームスフィンゴ糖脂質貯蔵障害、骨粗鬆症、異常ビタミンD代謝またはα-シヌクレイン病（パ-キンソン病、レヴィー小体認知症）の1つ以上である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
被験体におけるグリコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害の治療に使用するためのグルコシルセラミドシンタ-ゼ（GCS）阻害剤。
【請求項９】
ミグリトール、ミグルスタット、エリグルスタットまたはビフェニル置換デオキシノジリマイシン誘導体を含む群から選択される、請求項8に記載の使用のためのグルコシルセラミドシンタ-ゼ（GCS）阻害剤。
【請求項１０】
前記ビフェニル置換デオキシノジリマイシン誘導体が、ビフェニル置換D-グルコ-デオキシノジリマイシンまたはビフェニル置換L-イド-デオキシノジリマイシン、特に以下の構造式：
【化２】
2018527946.tif 000007
XはFまたはCF 3である。
を有する群から選択されるビフェニル置換L-イド-デオキシノジリマイシンである、請求項9に記載の使用のためのグルコシルセラミドシンタ-ゼ（GCS）阻害剤。
【請求項１１】
前記グリコシル化代謝産物が、ドーパミン、セロトニン、ビタミンD前駆体、カルシフェロール、コレカルシフェロール、（ジアシル）グリセロール、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはステロール、特にコレステロールである、請求項8〜10のいずれか一項に記載の使用のためのグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤。 
【請求項１２】
前記障害が、骨粗鬆症、異常ビタミンD代謝またはα-シヌクレイン病（パ-キンソン病、レヴィー小体認知症）の1つ以上である、請求項8〜11のいずれか一項に記載の使用のためのグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤。
【請求項１３】
個体由来の関連試料中の、グルコシルセラミド以外の少なくとも1つのグリコシル化代謝産物のレベルを決定すること、前記レベルを参照と比較すること；前記試料を、前記比較に基づいて、リソソームスフィンゴ糖脂質貯蔵障害、骨粗鬆症、異常ビタミンD代謝またはα-シヌクレイン病のうちの1つ以上の障害の素因を有する個体からの試料としてタイピングすることを含む、個体由来の試料のタイピング方法。
【請求項１４】
前記少なくとも1つのグリコシル化代謝産物が、ステロール、（ジアシル）グリセロ-ル、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニンまたはトリプトファンを含む群の1つ以上である、請求項13に記載の試料のタイピング方法。
【請求項１５】
治療有効量のグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるグリコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積を原因とする障害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体からの試料中のグリコシル化代謝産物を検出する方法に関し、さらに、試料中のグリコシル化代謝産物のレベルに基づいて被験体からの試料をタイピングする方法に関する。これは、試料を、グリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる疾患に罹患している、またはその素因を有する被験体からの試料としてタイピングするために使用され得る。 本発明は、さらに、被験体におけるグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害の治療におけるグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学におけるグリコシル化は、タンパク質、脂質、または他の有機分子などの基質にグリカンを結合させるための酵素的プロセスである。グリコシル化は、同時翻訳および翻訳後修飾の一形態である。グリカンは、膜タンパク質および分泌タンパク質において様々な構造的および機能的役割を果たす。粗面小胞体で合成されたタンパク質の大部分は、グリコシル化を受ける。これは、酵素指向の部位特異的プロセスである。グリコシル化は、細胞質及び核において起こり、したがって、グリコシル化された基質は、細胞質および核の両方に存在する。
【０００３】
分子のグリコシル化は、様々な機能を果たす。例えば、グリコシル化は、タンパク質の適切な折り畳みにおいて役割を果たす。それらがグリコシル化されない限り、正しく折り畳まれない様々なタンパク質がある。ある種のアスパラギンのアミド窒素に結合した多糖を含まない限り安定でないタンパク質も存在する。実験は、非グリコシル化形態のこれらのタンパク質が、迅速に分解することを示した。グリコシル化は、特定の炭水化物部分を認識するレクチンと呼ばれる糖結合タンパク質を介した細胞間接着にも役割を果たす。 グリコシル化の重要性は、機能不全のグリコシル化に関連してヒトにおいて報告されている40以上の障害から明らかである。これらの障害のいずれに対しても効果的な治療は知られていない。
【０００４】
タンパク質に加えて、脂質などの他の有機分子もグリコシル化の対象である。グリコシル化に関連するヒトにおいて公知の障害のうち、実質的な部分は、グリコシル化脂質蓄積に関連する障害の群に属する。従って、グリコシル化脂質は、研究のための興味深い対象を形成する。ヒトにおける主要なグルコシル化代謝物は、グルコシルセラミド（セラミド-β-グルコシド：GlcCer）と呼ばれる最も単純なスフィンゴ糖脂質である。グルコシル化は、関与するグリカンが糖グルコ-スに基づくグリコシル化の一種である。グリコシル化のタイプの別の例は、糖キシロ-スに基づくキシロシル化である。この文脈において、一般的な用語「糖」および「糖類」は互換的に使用される。GlcCerは、給与体UDP-グルコ-スからセラミドへグルコースを移動させる、UGCT遺伝子によってコードされるグルコシルセラミドシンターゼGCS酵素の作用により、細胞質ゾル中に形成される。 GlcCerは、哺乳動物細胞に偏在しており、特に細胞膜に存在する（1）。植物およびいくつかの真菌におけるその存在もまた証明されている。GlcCerは、グルコシルセラミドシンターゼ酵素（GCS、EC2.4.1.80）によって形成される。Hirabayashiら（8）によって最初にクローニングされたトランスフェラーゼは、ゴルジ体のサイトゾルリーフレットに位置し、グルコース部分をUDP-グルコースからセラミドに転移させる（9）。GlcCerのグルコシル基の切断は、リソソーム酵素グルコセレブロシダーゼ（GBA、E.C.3.2.1.45）、外部IDはHGNC：4177; Entrez Gene：2629; Ensembl：ENSG00000177628; OMIM：606463およびUniProtKB：P04062によって達成することができ、これは加水分解に必要である。この酵素は、その欠損がゴーシェ病（GD）の根底にあるため、よく研究されている。
【０００５】
リソソーム蓄積疾患（LSD）の最も一般的なゴーシェ病（GD）は、スフィンゴ脂質の機能不全の代謝を伴い、スフィンゴ脂質を、患者の細胞および特定の器官に蓄積させるため、スフィンゴリピドーシスの一形態である。この障害は、挫傷、疲労、貧血、低血小板、ならびに、肝臓および脾臓の肥大化を特徴とする。これは、GBA（グルコシルセラミダ-ゼとしても知られている）の遺伝的欠損によって引き起こされる。酵素に欠陥がある場合、GlcCerは、特に白血球に、最も頻繁にマクロファージ（単核白血球）に蓄積する。 GlcCerは、脾臓、肝臓、腎臓、肺、脳、および骨髄に集積することができる。症状としては、肥大化した脾臓及び肝臓、肝機能障害、痛みを伴う骨折や骨病変、重度の神経学的合併症、リンパ節や(場合によっては)隣接関節の腫れ、腫脹した腹部、皮膚の褐色化、貧血、低血小板、および眼の白斑（強膜）における黄色の脂肪沈着物が含まれる。最も深刻な影響を受けた人は、感染の影響を受けやすくなる可能性がある。この病気は、染色体1に位置する遺伝子の劣性変異によって引き起こされ、男性および女性の両方に影響を及ぼす。
【０００６】
小さなアクチベータータンパク質サポシンCの助けを借りて、リソソーム中のGBAは、GlcCerをセラミドとグルコースに分解する。これは、スフィンゴ糖脂質異化の最後から2番目の段階である（13）。従って、GD患者におけるGBA活性の欠損は、リソソ-ムにおいて、最も顕著には、マクロファージにおいて、GlcCerの蓄積をもたらす。肥大化した脂質を含むマクロファージは、ゴーシェ細胞と呼ばれ、脾臓、肝臓、骨髄および肺で生じる。様々な組織におけるそれらの蓄積は、肝脾腫大症、汎血球減少症および骨格合併症などの様々な症状を引き起こすと考えられている（13）。内臓におけるゴーシェ細胞の存在は、GD患者の血液中のこれらの細胞のタンパク質マーカーの量の増加に反映される。このようなGDの血漿バイオマーカーの例は、キチナーゼキトトリオシダーゼおよびケモカインCCL18である（14）。症候性のGD患者はまた、GlcCerの脱アシル化形態である血漿グルコシルスフィンゴシン（GlcSph）の著しい増加を示す（15,16）。GDの非神経障害（1型）変異体は、現在、組換え酵素の慢性的2週間静脈内注入を意味する、酵素補充療法によって治療されている（17）。治療用酵素は、マクロファージのリソソームへの送達を確実にする末端マンノース残基を最大限に露出させるために、そのN-結合グリカンにおいて修飾される。基質低減と名付けられた、1型GDの代替治療は、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤の経口投与に基づいている（18-20）。この基質低減療法は、GlcCerの生合成を低下させることにより、GD患者におけるGlcCerの形成と分解との間のバランスを回復させることを目的とする。1型GD患者の治療が成功すると、内臓ゴーシェ細胞が減少し、グルコシルスフィンゴシンの循環およびゴーシェ細胞のバイオマーカーが矯正される（13）。
【０００７】
ゴーシェ病に罹患している患者に起こる症状の複雑なパターンのいくつかについては、今のところ説明がない。例えば、少なくとも一部のGD患者は、骨粗鬆症および説明できない異常なビタミンD代謝を示す。さらに、少なくともいくつかのGD患者およびこの疾患の保因者もまた、未知の理由で、パ-キンソニズムおよびレヴィー小体認知症のようなα-シヌクレイン病を発症するリスクが有意に高まっている。従って、スフィンゴ脂質の機能不全の代謝を有する患者において、これらの説明できない症状を引き起こす原因を理解し、これらの状態の治療の可能な方法を調査する必要がある。
【０００８】
スフィンゴ糖脂質GlcCerに加えて、グリセロ脂質、ステロールおよび他のスフィンゴ脂質を含む高等真核細胞の膜に報告されたグルコシル化構造を有する他の脂質がある。例えば、グルコシルジアシルグリセロ-ル（GlcDG）は様々な植物で同定されているが、哺乳類細胞におけるその存在は比較的乏しく報告されている（2,3）。同様に、ステロールグルコシドは、植物に存在することが知られているが（4）、哺乳動物細胞におけるそれらの存在はこれまでほとんど研究されていない。哺乳動物細胞におけるグルコシル-β-D-コレステロールまたは1-O-コレステリル-β-D-グルコピラノシド（GlcChol）の存在の指標は、Murofushiおよび共同研究者によって最初に提供された。彼らは、培養されたヒト線維芽細胞および胃粘膜におけるその発生を記載した（5,6）。熱ショックは、GlcCholの生合成を増加させ、続いてHSP70を誘導することが分かった（7）。最近の研究では、Akiymaらは、GCS欠損GM-95細胞が外因性GlcCer（10）の添加なしでGlcCholを合成することができないことを示した。加えて、同研究者は、少なくともインビトロで、GBAが、トランスグルコシル化を介して、GlcCerおよび人工25-NBD-コレステロールGlcCholから、25-NBD-コレステロールグルコシドを生成することを実証した（11）。このようなGBAがトランスグルコシル化を行う能力は、Glewおよび共同研究者によって、4-メチルウンベリフェリル-β-グルコシドからレチノールおよび他のアルコールへのグルコ-ス部分の触媒により転移を示すことが以前に実証された（12）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
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【特許文献２】Pata MO, Hannun YA, Ng CK. Plant sphingolipids: decoding the enigma of the Sphinx. New Phytol. 2010 Feb;185(3):611-30.
【特許文献３】Wu W, Narasaki R, Maeda F, Hasumi K. Glucosyldiacylglycerol enhances reciprocal activation of prourokinase and plasminogen. Biosci Biotechnol Biochem.  2004 Jul;68(7):1549-56.
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【特許文献５】Kunimoto S, Kobayashi T, Kobayashi S, Murakami-Murofushi K. Expression of cholesteryl glucoside by heat shock in human fibroblasts. Cell Stress Chaperones. 2000 Jan;5(1):3-7.
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【特許文献１９】Cox TM, Drelichman G, Cravo R, Balwani M, Burrow TA, Martins AM, Lukina E, Rosenbloom B, Ross L, Angell J, Puga AC. Eliglustat compared with imiglucerase in patients with Gaucher's disease type 1 stabilised on enzyme replacement therapy:  a phase 3, randomised, open-label, non-inferiority trial. Lancet. 2015 Mar 25. pii: S0140-6736(14)61841-9.
【特許文献２０】Hughes DA, Pastores GM. Eliglustat for Gaucher's disease: trippingly on the tongue. Lancet. 2015 Mar 25. pii: S0140-6736(15)60206-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在、スフィンゴ脂質の代謝不全によって引き起こされる障害におけるトランスグルコシル化の可能な役割に関する文献はほとんどない。スフィンゴリピドーシス、特にGDを有する患者において起こる説明できない症状、およびその中のGlcCer以外のグリコシル化脂質の可能な役割を考慮すると、特に、スフィンゴ脂質の代謝不全に関連する障害に罹患している被験体の細胞中に存在する、トランスグルコシル化プロセスおよび、GlcCer以外の得られたグリコシル化脂質のさらなる研究が特に必要である。特にインビボでの脂質間のトランスグルコシル化に関与する因子のより良い理解は、リソソーム蓄積症、特にスフィンゴリピドーシス、特にGDの根底にある機構における新しい洞察を得るのに寄与し、健康な個人と、このようなリソソーム蓄積症に罹患している、またはそのようなリソソーム蓄積症の罹患の可能性がある個人を区別するために用いられ得る。
【００１１】
したがって、本発明は、試料中のGlcCer以外のグリコシル化代謝産物を検出する手段および方法、ならびに被験体におけるグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる疾患の処置のための手段および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、O-グリコシド結合を介してアグリコンに結合された標識化グリコシル基を含む以下の構造式の化合物：
【００１３】
【化１】
2018527946.tif 000002
【００１４】
式中、
R =水酸基または検出標識; そして
X =アグリコン;
を試料に添加することを含み、
前記グリコシル基は、少なくとも1つの同位体および/または検出のための標識であるR側鎖を含み、そして前記試料は、グルコシルセラミド以外のグリコシル基を有するグリコシル化代謝産物の存在についてスクリーニングされる、試料中のグリコシル化代謝産物を検出する方法を提供する。前記方法は、好ましくは、前記化合物の添加に続いて、前記化合物をトランスグリコシル化のための基質として使用して、トランスグリコシル化反応が起こる条件下で、前記試料をインキュベートすることを含む。前記スクリーニングは、好ましくは、前記化合物ではない標識されたグリコシル基を含む分子の検出を含む。
【００１５】
トランス-グリコシル化反応の新規生成物を同定するために、標識された化合物は、試料中に存在するグリコシル基の可能な受容体に対するグリコシル基の供与体として、適切な手段であり、受容体は、標識されたグリコシル基をその上の供与体から転移させた後に、例えばグリコシルトランスフェラーゼによるトランスグリコシル化後に、検出可能である。標識は、試料中のグリコシル化代謝産物の存在を目視検査するために、またはハイパフォーマンス薄層クロマトグラフィー（HPTLC）および蛍光スキャニングのような分離技術を用いて検出するために、例えば、ホウ素-ジピロメテン（BODIPY）、NBDフルオロフォア、またはCy5などのシアニン色素などの蛍光標識などの適切なR側鎖であってもよい。グリコシル基の簡便な標識化を可能にするために、本発明の方法の特定の実施形態における化合物のR-基は、所望のように標識を置換する「クリック反応」化学反応を可能にするアジド（N3）である。特に、この場合の本発明の方法における化合物は、C6-アジド-Glc-X、好ましくはC6-アジド-GlcCerである。この実施形態では、試料は、好ましくはトランスグリコシル化反応が起こるようにインキュベ-トされる。
【００１６】
被験体の試料中のGlcXの天然発生の定量的検出を可能にするために、血漿、細胞および組織中のGlcXの定量のための高感度アッセイが必要である。液体クロマトグラフィー -質量分析法（LC-MS）は、一般的な検出および複雑な混合物中の特定の質量の化学物質の潜在的同定のための非常に高い感度と選択性を有する周知の技術であり、被験体の試料において、GlcCholのような、GlcXの発生を検出する適切な手段である。試料マトリックスの補正（イオン抑制またはイオン増強）を必要としないために、天然化合物および対応する同位体標識化合物の抽出効率、クロマトグラフィー挙動およびイオン化特性が同一であるため、特にGlcX標識された同位体を内部標準として使用することができる。したがって、本発明による方法のさらなる特定の実施形態では、化合物のグリコシル基は、LC-MS / MSを用いた検出のための少なくとも1つの13C-同位体を含む。本発明による方法における好ましい標識化合物は、13C6Glc-X化合物、より特定的には13C6GlcCerまたは13C6GlcChol、および特に13C6-β-GlcCholである。本発明は、また、化合物としての13C6GlcCerまたは13C6GlcChol、特に13C6-β-GlcCholおよび本発明による方法以外のその使用に関する。試料中のGlcX化合物の可能な定量的検出において、本発明は、試料中のグリコシドを検出する方法であって、前記グリコシドの放射性同位体標識形態を試料に内部標準として添加することをさらに含み、試料中の全量のグリコシド、および放射性同位体標識グリコシドを検出し、試料中のグリコシドを定量することを含む方法を提供する。放射性同位元素は、好ましくは前記グリコシドの糖類中に存在する。放射性同位元素は、好ましくは13 Cである。放射性同位体標識グリコシドは、好ましくは13C-グリコシドである。放射性標識グリコシル化代謝産物は、好ましくは13C6-グリコシドである。グリコシドは、好ましくは、アグリコンに結合したサッカライドを含む。アグリコンは、好ましくは、ステロール、モノアシルグリセロール（エンドカンナビノイド）、（ジアシル）グリセロール、レチノール、ジヒドロカルシフェロール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニンまたはトリプトファンである。アグリコンは好ましくはセラミドではない。
【００１７】
本明細書で使用される「グリコシル化代謝物」という用語は、好ましくはグリコシドである。 好ましい実施形態では、用語「グリコシル化代謝産物」は、用語「グリコシド」に置き換えられる。 グリコシドは、好ましくは、アグリコンに結合したサッカライドである。
【００１８】
本発明による方法の特定の実施形態において、グリコシル化代謝産物は、グリコシル化またはキシロシル化代謝産物、特にグルコシル化またはキシロシル化ステロール、モノアシルグリセロール（エンドカンナビノイド）、（ジアシル）グリセロール、レチノール、ジヒドロカルシフェロール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニン、またはトリプトファンである。そのような代謝産物は、グリコシル化形態の自然発生が、生理学的に関連し得る物理化学的特性の変化をもたらし得る興味深い基質である。
【００１９】
本発明による方法の好ましい実施形態において、アグリコンXは、4-メチルウンベリフェロン、p-ニトロフェノール、ドーパミン、セロトニン、ビタミンD前駆体、カルシフェロールまたはコレカルシフェロール、ジヒドロカルシフェロール、モノアシルグリセロール（エンドカンナビノイド）、（ジアシル） グリセロール、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニン、トリプトファン、およびステロール、特にセラミドまたはコレステロールである。本発明による方法の特に好ましい実施形態において、アグリコンXは、4-メチルウンベリフェロン、p-ニトロフェノール、ドーパミン、セロトニン、ビタミンD前駆体、カルシフェロールまたはコレカルシフェロール、ジヒドロカルシフェロール、モノアシルグリセロール（エンドカンナビノイド）、（ジアシル ）グリセロール、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニンおよびトリプトファンからなる群から選ばれる。このグループの合成または天然に存在するアグリコンは、化合物がトランスグリコシル化プロセスにおいてグリコシル基供与体として機能するのに適した基質として見出される。
【００２０】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態では、試料はグリコシルトランスフェラーゼ、特にグルコセレブロシダーゼ（GBAもしくはGBA1）またはグルコシルセラミダ-ゼ（GBA2）を含む。グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、使用した化合物から標識されたグリコシル基を試料中に存在するグリコシル基受容体に転移させる。したがって、グリコシルトランスフェラーゼは、検出されるグリコシル化代謝産物の標識を促進する。 特定の実施形態では、本発明による方法は、グリコシルトランスフェラーゼが試料に添加されることを含む。 例えば、組換えGBAなどのグリコシルトランスフェラーゼは、試料がそれ自身の機能性グリコシルトランスフェラーゼを含まない場合、または試料がそのグリコシルトランスフェラーゼを含むことが知られていないか確かでない場合に、その試料へ添加されてもよい。
【００２１】
本発明の方法における試料は、好ましくは、動物被験体、特に哺乳動物被験体、より詳細にはヒト被験体の試料である。
本発明による方法のさらに好ましい実施形態は、試料が、被験体由来の試料であり、特に過剰量のグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害に罹患しているヒト被験体であり、特に好ましい実施形態では、前記障害は、リソソームスフィンゴ糖脂質貯蔵障害、骨粗鬆症、異常ビタミンD代謝またはα-シヌクレイン病（パーキンソン病、レヴィー小体認知症）の1つ以上である。
【００２２】
リソソーム性スフィンゴ糖脂質貯蔵障害に罹患している被験体と比較して、健康な被験体の試料におけるGlcCer以外のグリコシル化代謝産物の定量的検出の結果は、試料中に存在する比較的高レベルのグリコシル化代謝産物と、その試料の被験体がリソソーム蓄積障害に罹患するリスクとの間に相関があることを示す。したがって、本発明はさらに、試料中のグリコシル化代謝産物のレベルに基づいて、被験体由来の試料をタイピングする方法に関し、特に、その試料を、グリコシル化代謝産物の蓄積にもたらされる障害に罹患しているか、その素因を有する被験体由来の試料としてタイピングする方法に関する。特に、本発明による個体からの試料のタイピング方法は、個体からの関連試料中のグルコシルセラミド以外の少なくとも1つのグリコシル化代謝産物のレベルを決定し、そのレベルを参照と比較し、前記試料を、前記比較に基づいて、リソソームスフィンゴ糖脂質貯蔵障害、骨粗鬆症、異常ビタミンD代謝またはα-シヌクレイン病のうちの1つ以上の障害の素因を有する個体からの試料としてタイピングすることを含む。
【００２３】
本発明による個体からの試料をタイピングする方法の特定の実施形態では、少なくとも1つのグリコシル化代謝産物は、ステロール、（ジアシル）グリセロール、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、 スレオニン、またはトリプトファンを含む群の１つ以上である。
【００２４】
本発明はさらに、被験体におけるグリコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害の治療に使用するためのグルコシルセラミド合成酵素（GCS）阻害剤に関する。特に、本発明は、被験体におけるグルコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害の治療に使用するためのグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤に関し、前記障害は、ゴーシェ病（GD）を含まない。また、本発明は、グリコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積による障害の治療方法であって、治療有効量のグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤を投与することを含む方法に関する。特に、本発明は、グリコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害の治療方法であって、治療有効量のグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。特に、本発明は、被験体におけるグリコシルセラミド以外のグリコシル化代謝産物の蓄積によって引き起こされる障害の治療方法であって、治療有効量のグルコシルセラミドシンタ-ゼ（GCS）阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含み、前記障害がゴーシェ病（GD）を含まない方法に関する。好ましい実施形態では、本発明の使用のための、または本発明の方法におけるグルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤は、ミグリトール、ミグルスタット、エリグルスタットまたはビフェニル置換デオキシノジリマイシン誘導体を含む群から選択される。
【００２５】
特に、本発明の使用のための、または本発明の方法におけるグルコシルセラミド合成酵素（GCS）阻害剤としてのビフェニル置換デオキシノジリマイシン誘導体は、ビフェニル置換D-グルコ-デオキシノジリマイシンまたはビフェニル置換L-イド- デオキシノジリマイシンであり、より詳細には、以下の構造式を有する群から選択されるビフェニル置換L-イドデオキシノジリマイシンである。：
【００２６】
【化２】
2018527946.tif 000003
【００２７】
XはFまたはCF 3である。
【００２８】
N-アルキル化デオキシノジリマイシン誘導体は、これらの化合物を神経病理学的リソソーム蓄積障害の治療に特に適したものにする二重グルコシルセラミドシンタ-ゼ/中性グルコシルセラミダーゼ阻害剤であることが示されている。ビフェニル置換L-イド形成デオキシノジリマイシン誘導体は、グルコシルセラミダーゼおよび非リソソームグルコシルセラミザーゼに対して選択的であり、腸内グリコシダ-ゼ阻害能力を示さない。具体的には、ビフェニル部分は、ナフチル部分およびピレニル部分などの他の可能な部分と比較して、毒性代謝産物の形成が起こりにくく、良好な薬剤様特性を有し、様々な構造改変を行うための薬化学的観点から魅力的である。 Xにおける化学修飾は、異なる選択性および効力プロファイルならびに改善された薬物代謝および薬物動態（DMPK）特性を提供する。これら及び種々の他のGCS阻害剤は、例えば、Amar T. Ghisaidoobe、Johannes M. F. G. Aerts、Herman S. Overkleeftら、Journal of Medicinal Chemistry. 2014 57：9096-9104.「改善された二重グルコシルセラミドシンターゼ/中性グルコシルセラミダーゼ阻害剤としてのビフェニル置換イミノ糖の同定および開発」に記載されている。
【００２９】
グルコシルセラミドシンターゼ（GCS）阻害剤が本発明の治療剤として使用され、その蓄積が障害を引き起こすグリコシル化代謝産物は、ドーパミン、セロトニン、ビタミンD前駆体、カルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロカルシフェロール、モノアシルグリセロール（エンドカンナビノイド）、（ジアシル）グリセロール、レチノール、トコフェロール、ゲラニオール、ファルネソール、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはステロール、特にコレステロールである。 特に、本発明による使用のための、または本発明の方法におけるグルコシルセラミドシンタ-ゼ（GCS）阻害剤は、骨粗鬆症、異常ビタミンD代謝またはα-シヌクレイン病（パーキンソン病、レヴィー小体認知症）の1つ以上を治療するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図面の説明
本発明のこれらおよび他の態様は、本出願の一部を形成する添付の図面によってさらに説明される。 図面は、明らかに明確に示されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
【図１】図1は、図示する。図1A：純粋なGlcChol-Glcおよびその同位体のMS-スキャン。アンモニウム付加物は、両方の化合物の中で最も豊富なM / Zである。生成物イオンM / Z 369.4は、両方の化合物の共通のフラグメントである。GlcChol-Glcおよび13C6標識Glc-Cholの産物イオン396.4、GlcCholについては566.6、13C6 GlcCholについては572.6の親スキャンが示されている。 [M + H] +および[M + Na] +はマイナ-M / Zである。 M / z 571.6は、GlcCholのナトリウム付加物を表す。図1B：Chol-Glcおよびその同位体13C6標識Glc-Cholの構造、それらの断片化パタ-ンM / Z 369.4は、グルコ-ス部分の損失後の両方の化合物の生成イオンである。図1C：UPLCからのChol-Glc（m / z 566.6> 369.4）および13C6標識Chol-Glc（m / z 572.6> 369.4）の溶出パタ-ン。図1D：GlcChol定量の直線性および37℃、60分間のrGBA1（5IU）でのその完全消化。
【図２】図2は、野生型、GBA欠損およびGBA2欠損マウスの肝臓および胸腺におけるGlcCholを示す。図2A：野生型マウスの様々な組織におけるGlcChol（nmol /g湿重量）。図2B：野生型、GBA2-/-およびLIMP2-/-マウスの胸腺におけるGlcChol（nmol/g湿重量）。図2C：野生型GBA2-/-およびLIMP2-/-マウスの肝臓におけるGlcChol（nmol / g湿重量）。図2D：野生型GBA2-/-およびLIMP2-/-マウスの血漿中のGlcChol（pmol / ml）。図2E：正常、GENZ 112638で未処置および処置した1型GDマウスにおける血漿GlcChol（nM）。図2F：wtマウス、未処理の1型GD誘導マウス、マクロファージ特異的プロモーター（CD68）、一般的強力プロモーター（PGK）または非機能性SFFVプロモーターを用いたレンチウイルスGBA cDNA遺伝子治療で処置した1型GDの肝臓GlcChol。
【図３】図3は、GBAおよびGBA2による25-NBD CholGlcのインビトロでのトランスグルコシル化を示す。図3A：組換えrGBA1ならびにGBA2およびGBA3の過剰発現細胞の溶解物を、供与体として提示されたGlcCerの存在下、25-NBD-コレステロールとともに0時間および1時間インキュベ-トした。25-NBD-コレステロールグルコシドの形成は、HPTLCおよび蛍光スキャニングによって検出された。図3B：組換えrGBA1ならびにGBA2およびGBA3の過剰発現細胞の溶解物を、NBD-Cerの存在下、GlcCholと0時間および1時間インキュベートした。 NBD-GlcCerの形成は、HPTLCおよび蛍光スキャニングによって検出された。
【図４】図4は、GSL代謝酵素を操作したCOS7細胞におけるGlcCholを例示する。図4A：酵素を過剰発現していない（コントロール）、GBA2を過剰発現、GCSを過剰発現、および両方（GBA2 + GCS）を過剰発現したCOS細胞におけるGlcChol（nmol / gタンパク質）。GBA2（AMP-DNM）およびGBA（CBE）の指示された阻害剤と共に細胞を2日間インキュベートした。図4B：同じ細胞におけるGlcChol（umol / gタンパク質）。
【図５】図5は、NPCにおけるGlcChol異常を示す。図5A：Npc -/- マウスの肝臓におけるGlcChol（nmol / g湿重量）。図5B：spm-/spm NPCマウスの肝臓におけるGlcChol（nmol / g湿重量）。図5C：GBAを阻害するコンドリトールB-エポキシド（CBE）の非存在下および存在下で1日間、示された濃度のU18666AとともにインキュベートしたRAW267細胞中のGlcChol（pmol / mgタンパク質）。図5D：10μMのU18666Aと1日間インキュベ-トした後のリソソーム内コレステロールを低下させる1mMβ-メチルシクロデキストリン（β-mCD）の非存在下および存在下でのRAW267細胞におけるGlcChol（pmol / mgタンパク質）。
【図６】図6は、LSD患者および正常個体における血漿GlcCholを示す。図6A：1型GD患者、NPC患者、NPCキャリアおよび正常個体における血漿GlcChol。図6B：1型GD患者、NPC患者、NPCキャリアおよび正常個体における血漿GlcChol / Chol。図6C：エリグルスタット処理後の血漿GlcCholの減少。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される。しかし、当技術分野で知られている他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、そのように指示しない限り、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００３３】
LC-MS / MSによるGlcCholの定量
コレステロールのグルコシル化の生理学的意義は、それが分子をはるかに水溶性にするので、仮想的に大きい。GlcCholが哺乳類において生理学的に生じるかどうかを確かめるために、まずその定量的検出のためにLC-MS / MS手順を開発した。この目的のために、13C-同位体標識コレステロールグルコシドを合成し、LC-MS / MSによるGlcCholの高感度定量的検出において内部標準として使用した。同位体標識化合物の内部標準としての使用は、GlcCholの定量中、抽出効率、クロマトグラフィー挙動およびイオン化効率における補正の必要性を回避する。望ましくない付加物の形成を防ぐために、追加の塩の非存在下で脂質を抽出した。所望のアンモニウム付加物の形成を刺激するために、溶離液中に10mMのアンモニウムを添加した。GlcCholの高感度定量的測定は、内部標準として13 C-同位体標識GlcCholで可能であることが証明された（図1A〜C）。検出限界（LOD）は、0.5pmol/mL血漿であり、シグナル/ノイズ比が3であり、定量限界（LOQ）が0.9pmol/mL血漿であり、シグナル対ノイズ比が10であった。GlcCholは、準最適条件（Triton-X-100およびタウロコ-ル酸ナトリウムの非存在下）でさえも、組換えGBA1の優れた基質であることが判明した（図1D）。
【００３４】
マウスにおけるGlcCholの自然発生の実証
野生型マウスの様々な組織をGlcCholの存在について調べた。相対的に多量のグルコシル化ステロールが胸腺で認められた（図2）。組換えGBA1（rGBA1、Cerezyme（登録商標））による消化により、組織中の定量化構造（m / z 566.6）の同一性が確認され、野生型動物において測定された脂質の90％以上が実際にChol-β-D-Glcであることを示した。
【００３５】
次に、正常マウス、GBA2欠損動物およびリソソームへの輸送の障害によりGBAが著しく低下したLIMP-2 KOマウスから採取した組織について、肝臓および胸腺におけるGlcCholの濃度を決定した（39,40）。 図2Aおよび図2Bに示すように、GlcChol濃度は、GBA2欠損動物の組織、特に胸腺において著しく低かった。対照的に、GBA欠損LIMP-2 KOマウスでは、GlcCholの減少はなかったが、むしろレベルのわずかな増加が観察された（図2A、2B）。GlcCholの増加は、白血球系統において誘導されたGBA欠損を有するマウスの肝臓においても観察された（図2C）。遺伝子治療によるGBA欠損の効率的な修正は、付随するGlcCholの減少を導いた（図2C）。GCS阻害剤GENZ 112638を用いて誘導されたゴーシェ病のマウスの治療は、血漿GlcCerの部分的な減少および統計的に有意でないが若干の上昇した血漿GlcCholの減少をもたらした（図2D）。
【００３６】
胸腺中のグルコシル化ステロールの比較的高い量、湿重量1グラムあたり数ナノモルは、顕著である。この観察は、GBA欠損GD患者におけるNKT細胞およびB細胞における顕著な異常を考慮して、特に注意を要する（44）。Mistryらは、CD1への結合を介してGlcCerまたはGlcSphが上昇すると、これを引き起こす可能性があると推測している（44）。GlcCholがCD1と相互作用するかどうかを研究することは、GBA欠損GD患者におけるこの脂質の濃度の異常がそうである可能性があるので、現在興味深い。 実際に、GBAは、少なくともインビトロで、コレステロールのトランスグルコシル化によってGlcCholを形成することができる。4-メチルウンベリフェリル-β-グルコシドのような人工のβ-グルコシドは、天然のGlcCerと同様に、この反応において、インビトロで供与体として作用し得る。一方、GlcCholは、GBAによる加水分解のための優れた基質でもある。これらの表示は、インビボでのGlcChol代謝におけるβ-グルコシダーゼの重要性を示唆している。
【００３７】
β-グルコシダーゼによるインビトロトランスグリコシル化。
GlcCholの生理学的発生を実証した後、種々のβ-グルコシダーゼの形成および分解における役割を調べた。哺乳類の細胞および組織は、GlcCerを分解することができるGBA以外の他のβ-グルコシダーゼを含む。全ての細胞は、GBA2（21-23）、KIAA1605、外部IdsHGNC：18986、Entrez Gene：57704; Ensembl：ENSG00000070610; OMIM：609471およびUniProtKB：Q9HCG7と命名された膜関連非リソソームグルコシルセラミザーゼを発現する。この酵素は、GD患者に欠損していない。実際に、GDの材料におけるGBA2の補完的過剰発現が報告されている（24）。肝細胞の小胞体（22）および他の細胞型のエンドリソソーム系（23）に位置すると言われているGBA2は、GBAとしてアクチベータータンパク質を必要とせずにGlcCerを分解し、それは前述の人工基質およびインヒビタ-特異性においてGBAとはさらに異なる。最後に、いくつかの組織は広域特異的サイトゾルβ-グルコシダーゼ（25）とも呼ばれる酵素GBA3を発現する。この酵素はインビトロでGlcCerに対する相対的に乏しい加水分解活性を示し、グルコシル化生体異物の脱毒化に主に関与していると考えられている（20）。3種全てのヒトβ-グルコシダーゼは、触媒作用において二重置換機構を利用し、効能によって保持されている。グリコシダーゼを保持することによって媒介されるトランスグルコシル化の多くの例が記載されている（26）。したがって、GBAの次に、理論的には、GBA2およびGBA3もまた、インビボでGlcCholを生成することに関与し得る。
【００３８】
これらの研究では、個体およびマウスのGBAおよびGBA2を欠く材料、ならびにコレステロールの内部リソソーム蓄積を特徴とするニーマン・ピック病C型の材料を使用する。 GlcCholに対するGD療法の影響が決定された。さらに、細胞内のGlcChol代謝は、特定の酵素の阻害によってスフィンゴ糖脂質代謝の様々な段階で干渉する物質を用いて研究された。GlcChol代謝におけるGBAの寄与は、β-グルコピラノシルシクロペプシトールオキシド（29）によるその独占的不活性化によって、他のβ-グルコシダーゼと区別することができるが、GCS（27）およびGBA2（28）に対する特異的阻害剤が利用可能である。これらの化合物は、GBAの触媒求核残基E340に共有結合する。活性ベースのプローブ（ABP）へのフルオロフォアの設置は、シクロペプチトール-エポキシドを十分に両親媒性にして、膜を横切って拡散し、GBAのin situ不活性化および関連する蛍光標識を可能にする（29,30）。
【００３９】
GBA3ではなく、GBAおよびGBA2の両方は、加水分解によって分解することができ、4MU-β-グルコシドの分解に最適な条件でGlcCholを合成することができる（図1D;補足表1）。 GlcChol代謝におけるGBAおよびGBA2の作用に関する基質および給与体濃度の重要性が実験的に実証されている。GlcCholを加水分解し、合成するいくつかのGBAの能力は、25-NBD-コレステロールを受容体として使用し、TLCおよび蛍光スキャニングによる25-NBD-グルコシド形成の検出を用いて、インビトロで研究された。酵素rGBA1の供給源として使用され、GBA2およびGBA3は、COS7細胞において個々に過剰発現された。酵素の過剰発現は、適切なアッセイを用いて酵素活性を測定し、広い特異性のβ-グルコピラノシルシクロペプチトアジリジン型ABP（38）を有する酵素の可視化によってチェックした。 rGBA1ならびにGBA2およびGBA3過剰発現細胞の溶解物を、給与体としての天然グルコシルセラミド（C16：0-GlcCerまたはC18：1-GlcCer）および受容体としての25-NBD-コレステロールとともにインキュベ-トした。各酵素の最適条件でインキュベ-トした後（以下の材料および方法の項を参照）、脂質を抽出し、HPTLCに供した。図3Aに示すように、rGBA1および過剰発現GBA2を有する細胞溶解物は、25-NBD-コレステロール - グルコシドと一致する追加の蛍光脂質を生成した。これは、過剰発現GBA3を有する細胞溶解物についてはほとんど観察されなかった。
【００４０】
GCSを過剰発現した細胞溶解物とUDP-グルコースとのインキュベ-ションはGlcCholの形成をもたらさず、同時に同じ酵素調製物はC6-NBD-GlcCerをC6-NBD-セラミド（示さず）から生成することが観察された。 したがって、GBAによるGlcCholのインビトロ形成が実証されるが、GBA3またはGCSによる有意な形成は示されない。 重要なことに、インビトロにおいて、かなりのトランスグリコシラーゼが、使用された条件下でGBA2について検出された。
【００４１】
次に、受容体としてのNBD-セラミド（40μM）の存在下で、rGBA1と、GBA 2またはGBA3を過剰発現する細胞の可溶化物とをおよびインキュベートすることにより、天然GlcChol（40μM）がトランスグルコシル化の給与体としても働くことができるかどうかを調べた。 GBA2を過剰発現する細胞の溶解物およびrGBA1は、蛍光NBD-GlcCerの顕著な形成を示した（図3B）。これは、過剰発現したGBA3を有する溶解物については観察されなかった（図3B）。予想通り、図3に示された知見は、グルコース部分がコレステロールとセラミドとの間で可逆的に交換される平衡反応として、GBAとGBA2の両方によるトランスグルコシル化が起こることを示している。
【００４２】
培養したCOS7細胞におけるGlcCholの代謝
培養したCOS7細胞のGlcChol含量およびこれに影響を与える因子を決定した。最初に、過剰発現したGBA2およびGCSの影響を研究した。図4は、細胞内GlcCholレベルおよびGlcCerレベルに対する効果を示す。 GCSの過剰発現のみが増加したGlcCerのレベルをもたらした（図4B）。GlcCholはGBA2の過剰発現によって変化しなかったが、GCSの過剰発現は12倍の増加を引き起こした。重要なことに、低ナノモルのAMP-DNM（28）によるGBA2活性の阻害は、細胞内GlcCholを減少させた。過剰発現したGCSを有する細胞でさえ、GlcCholの上昇は予防された（図4A）。対照的に、CBEを用いたGBAの阻害は、過剰発現したGCSを有する細胞における細胞内GlcCholレベルの増加をほとんど減少させなかった。これらの知見は、GCSはGlcChol自体を産生しないが、トランスグルコシル化によってGlcCholの形成において給与体として使用するのに十分なGlcCerを生成することが必要であることを示唆している。 COS7細胞におけるこのトランスグルコシル化は、GBAではなく、特にGBA2によって媒介される。後者の概念は、GBAの欠損ではなく、マウスにおけるGBA2の欠損が、組織の減少したGlcCholレベルを伴うという知見と一致する。
【００４３】
ニーマン・ピック病C型マウスおよびU18666A処置細胞におけるGlcChol
ニーマン・ピック病C型（NPC）では、コレステロールは、Npc1またはNpc2のいずれかの欠損に起因するコンパートメントからの輸出障害の結果として、リソソーム中に顕著に蓄積する（41）。Npc1欠損マウスおよび自発性spm NPCマウスの肝臓において、GlcChol含量の驚くべき25倍の増加が観察される（図5AおよびB）。測定されたグルコシル化ステロールの同一性を、rGBA1での消化によって調べた。正常なマウスの肝臓中のGlcCholの90％以上がコレステロールに消化されたが、npc1-/npc1-マウス由来の材料の場合、これはたった70％であった。この知見に基づいて、NPC肝臓中のm/z 572.6> 369.4の上昇した化合物の一部は、LC-MS法でコレステロールβ-グルコシドと区別できない糖とは異なって修飾されたコレステロール分子からなるようである。
NPCマウスの肝臓におけるGlcCholの観察結果を実験的に実証するために、RAW267細胞におけるリソソームからのコレステロール輸出障害がU18666Aへの曝露によって誘導された（42）。高いリソソ-ム内コレステロール濃度は、GBAによるGlcCholの形成を促進するようである。これは、2種類のNPCマウスの肝臓における25倍の上昇したGlcCholによって示される。これに従って、細胞内のU18666によるリソソームコレステロール蓄積の誘導は、GlcCholの急速な増加を引き起こす。コンドリトールB-エポキシドによるリソソームGBAの同時阻害は、U18666A暴露細胞におけるGlcCholの増加を完全に防止した（図5C）。過剰のGlcCholの形成はまた、NPC細胞中のリソソーム内コレステロールを減少させることが知られている薬剤であるβ-メチルシクロデキストリンの存在によっても防止された（43）。これは、コレステロールの極端なリソソーム内貯留中に、GBAが積極的にGlcCholを生成することを示している。通常のリソソームでは、GBAはグルコシル化ステロールを大きく分解する可能性が最も高い。
【００４４】
NPCおよびGD患者のGlcChol
未治療症候群1型GD患者の血漿中のGlcCholレベルは、NPC患者、キャリアおよび健常対照において同様に決定された。 図6Aに示すように、GlcCholは症候性GD患者の血漿中で増加する傾向があり、NPC患者の血漿中では顕著ではない傾向がある。異常は、血漿GlcCholがCholに関連する場合により顕著である（図6B）。エリグルスタットで処置した1型GD患者の血漿検体の調査は、投与したGCS阻害剤によるスフィンゴ糖脂質合成の阻害に顕著な減少を示した（図6C）。 ERTで治療したマッチした患者は同様の反応を示したが、エリグルスタットよりも弱いGS阻害剤であるザベスカでSRTを受けた患者ではなかった（図6C）。
【００４５】
トランスグルコシル化を介してGlcCholを最大限に形成するために、給与体としての高濃度のGlcCerおよび受容体としての高濃度のコレステロールが最適である。逆に低高濃度のセラミド、および低濃度のGlcCerおよびコレステロールは、純粋なGlcCholの形成を低下させる。この考察は、GBA2とGBAに対しても同様に適用される。ステロールおよびスフィンゴ脂質の変動は、例えば、コレステロールが豊富なリポタンパクの取り込み後またはスフィンゴミエリンからのセラミドの放出後に、細胞内で起こると考えられる。β-グルコシダーゼをトランスグルコシル化することによって、（グルコシル化された）スフィンゴ脂質とステロールとの間にある平衡を維持する能力は、細胞にとって有益な緩衝効果を有し得る。これに関して興味深いのは、GCSの阻害が、培養細胞、マウスの組織およびGD患者の血漿におけるGlcCholの減少を導くという現在の知見である。これは、GlcCerの利用可能性が、トランスグルコシル化によるGlcCholの形成の重要な要因であることを強く示唆している。β-グルコシダーゼGBAおよびGBA2もまたGlcCerを加水分解し、その濃度を低下させる傾向があるため、様々なGlcCer代謝酵素と局所コレステロール濃度との絶妙なバランスが、細胞内区画におけるGlcCholの形成を決定する。
【００４６】
材料
25- [N- [（7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル）メチル]アミノ] -27-ノルコレステロール（25-NBD-コレステロール）、N- [6- [（7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾ-ル-4-イル）アミノ]ヘキサノイル]-D-グルコシル-β1-1'-スフィンゴシン（C6-NBD-GlcCer）、N- [6 - [（7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル）アミノ] ヘキサノイル]-D-エリスロ-スフィンゴシン（C6-NBD-Cer）、D-グルコシル-β-1,1'-N-パルミトイル-D-エリスロ-スフィンゴシン（C16：0-GlcCer）およびD-グルコシル-β-1,1'N-オレオイル-D-エリスロ-スフィンゴシン（C18：1-GlcCer）は、Avanti Polar Lipids（Alabaster、AL、アメリカ）から購入した。4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシド（4MU-Glc）は、Glycosynth（商標）（Winwick Quay Warrington、Cheshire、英国）から購入した。コンドリトールB-エポキシド（CBE）はEnzo Life Sciences Inc.（Farmingdale、NY、アメリカ）、1-O-コレステリル-β-D-グルコピラノシド（β-コレステリルグルコシド、β-GlcChol）およびギ酸アンモニウム（LC-MS品質）は、Sigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。N-（5-アダマンタン-1-イル-メトキシ-ペンチル）-デオキシノジリマイシン（AMP-DNM）および13C6同位体標識β-コレステリルグルコシド（13C6-β-GlcChol）は、ライデン大学（ライデン、オランダ）のライデン化学研究所理学部生物有機合成学部で化学的に合成された。ゴーシェ病における酵素補充療法に使用される組換えヒトGBA1であるセレザイム（登録商標）は、Genzyme（Genzyme Nederland、Naarden、オランダ）から入手した。
LC-MS級メタノール、2-プロパノール、水、HPLC級クロロホルムはBiosolveから購入した。ギ酸アンモニウムLC-MS等級は、Sigma-Aldrich Chemie GmbHから購入した。
【００４７】
マウス
以下のマウスを研究のために使用した：GBA欠損が誘導されたGD1マウス（31,32）; 自発的ニーマン・ピック病C型を有するマウス（33）およびNpc1-/-マウス（34）; LIMP2-/-マウス（35）、およびGBA2-/-マウス（22）。
動物を殺し、組織を直ちに凍結し、-80℃で保存した。
【００４８】
GBA2、GBA3およびUCGCをコ-ドするcDNAのクローニング
クローニングプライマーの設計は、ネズミGBA2についてはNM_172692.3、ヒトGBA3についてはNM_172692.3、ヒトUCGCについてはNM_003358.2に基づく。以下に列挙するプライマーを用いて、全長コード配列をpcDNA3.1/Myc-His（Invitrogen、Life Technologies、Carlsbad、CA、アメリカ）にクローニングした。
RB143：GAATTCGCCGCCACCATGGTAACCTGCGTCCCGGおよび
RB144：mGBA2のGCGGCCGCTCTGAATTGAGGTTTGCCAG;
RB252：GAATTCGCCGCCACCATGGCTTTCCCTGCAGGATTTGおよび
RB253：hGBA3のGCGGCCGCTACAGATGTGCTTCAAGGCC;
RB111：TCCTGCGGGAGCGTTGTCおよび
RB114：hUCGCのGGTACCTACATCTAGGATTTCCTCTGC。
【００４９】
細胞培養およびトランスフェクション
COS-7細胞を、5％ウシ胎仔血清（FBS; Bodinco、Alkmaar、オランダ）およびペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies、アメリカ）の存在下で、Iscove改変ダルベッコ培地（Life Technologies、Carlsbad、CA、アメリカ）を37℃で5％CO2下で培養した。細胞を6ウェルプレート中で75％コンフルエントに播種し、FuGENE（登録商標）6トランスフェクション試薬（Promega Benelux、Leiden、オランダ）をメーカー説明書に従って使用して、FuGENE：DNA比3：1でトランスフェクションした。 72時間後、培地を除去し、細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、25mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）中でこすり取って回収した。
【００５０】
トランスグルコシラーゼ活性のインビトロアッセイ
GBA2、GBA3、GCSを過剰発現するCOS-7細胞のホモジネート、および組換えGBA1を用いて、酵素のそれぞれのトランスグルコシラーゼ活性を測定した。原理的には、アッセイは、いくつかの改変を加えて先に記載したように行った（11）。まず、GBA2、GBA3またはGCSを過剰発現する細胞のホモジネート40μLを、氷上で25μMの25mM CBE水溶液10μLと20分間プレインキュベートした（希釈組換えGBA1を含有する試料をCBE非存在下でプレインキュベートした）。各試料に、100μMの給与体（C18：1-GlcCerまたはβ-CGのいずれか）および40μMの受容体（25-NBD-コレステロールまたはC6-NBD-Cerのいずれか）を含む200μLの適切な緩衝液を添加した。GBA2過剰発現細胞のトランスグルコシラ-ゼ活性を150mMクエン酸-リン酸緩衝液（pH 5.8）中で測定し、組み換えGBA1のアッセイを0.1％BSA、0.1％トリトンおよび0.2％のタウロコール酸ナトリウムを含む150mMクエン酸-リン酸緩衝液（pH5.2）中で行った。GBA3については、アッセイは100mM Hepes緩衝液、pH7.0を含有した。12.5mM UDP-グルコース、6.25mM MgCl2、0.125％BSA、および0.625％CHAPSを含む125mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5中でGCSのトランスグリコリアーゼアッセイを行った。37℃で1時間インキュベートした後、クロロホルム/メタノール（2：1、v / v）の添加により反応を停止させ、Bligh and Dyer（36）に従って脂質を抽出した。その後、溶出液としてクロロホルム/メタノール（85:15、v / v）を用いて、Typhoon Variable Mode Imagerを用いてNBD標識脂質を検出することにより、HPTLCシリカゲル60プレ-ト（Merck、Darmstadt、ドイツ）上で薄層クロマトグラフィーにより脂質を分離した（GE Healthcare Bio-Science Corp.、Piscataway、NJ、アメリカ）（37）。
受容体として、25-NBDコレステロールを用いたトランスグルコシル化アッセイにおいて新たに形成された蛍光脂質の同定は、0.2％（w / v）タウロコール酸ナトリウムおよび0.1％（v / v）Triton X-100の存在下で、pH5.2の過剰組換えGBA（McIlvaine緩衝液）を用いたNBD-コレステロールへの完全消化の実証により、プレートからかきとることによる同定に続いて行われた。
【００５１】
LC-MS / MSによるGlcCholの分析
Waters Acquity（商標）TQD装置をすべての実験に使用した。この装置は、質量分析器としてタンデム四重極質量分析計と組み合わせたUPLCシステムからなっていた。データをMasslynx 4.1ソフトウェア（Waters Corporation; Milford MA）で分析した。
GlcCholおよび13C6-β-GlcChol（内部標準）を、BEH C18逆相カラム（Waters 2.1xの50ミリメートル、粒子サイズ1.7μm）を用い、移動相、10mMギ酸アンモニウムを含む、2-プロパノール：水 90：10（v / v）（溶離液A）、および10mMギ酸アンモニウムを含む、メタノール（溶離液B）のイソクラティック溶離をすることにより分離した。ULPCプログラムは、10％Aと90％Bからなり、5.0分の間に適用された。質量分析計の迂回弁は、系汚染を防ぐために検体の溶出前（0〜0.25分）および後（4〜5分）にUPLC流出液を廃棄するようにプログラムした。流速は0.250mL /分であり、GlcCholおよび内部標準の両方の保持時間は1.43分であった（図2C）。カラム温度およびオートサンプラーの温度は、運転中、それぞれ23℃および10℃に保った。
GlcCholおよび13C6-β-GlcCholの溶液および両方の化合物の混合物をメタノール中の5mMギ酸アンモニウム中に1pmol /μLの濃度で調製した。化合物を直接注入によって質量分析計に導入し、ES +（エレクトロスプレー陽性）モードにおける両方の化合物についての最適な調整条件を決定した（表1）。両方の化合物のための最も豊富な種は、アンモニウム付加物、[M+NH4] +、GlcCholための566.6> 369.4および13C6-β-GlcCholための572.6> 369.4（図2Bも参照。）であった。生成物イオンは、グルコース部分が失われた後の分子のコレステロール部分を表す。13C同位体はグルコース分子上にあるので、13C6-β-GlcCholの娘断片は369.4の同じm / z比を有する。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
m/z 566.6>369.4の化合物がGlcCholであることの確認は、0.2％（w / v）のタウロコール酸ナトリウムおよび0.1％（v / v）トリトンX-100の存在下で、過剰量の組み換えGBA pH5.2（McIlvaineバッファー）を用いてコレステロールへの完全消化を実証することにより行われた。
【００５４】
ヒト血漿中の総GlcCholの定量
血漿試料中のGlcCholの定量分析のために、我々は、上記遷移のMRMモードを使用するLC-MS / MS法を開発した。
第1に、GlcCholは、Bligh and Dyerの方法（28）に従って、いくつかの変更を加え、健康な個体の血漿から抽出した。血漿20μLをエッペンドルフチュ-ブ（2mL）にピペットで入れ、メタノール中0.1pmol /μLの13C6-β-GlcCholを含有する20μLの内部標準溶液を添加し、続いてメタノール280μLおよび150μLのクロロホルムを。短時間の混合後、試料を室温で30分間放置し、時々混合し、15700×gで10分間遠心分離して沈殿したタンパク質をスピンダウンさせた。上清をエッペンドルフチューブに移し、150μLのクロロホルムと250μLの水を加えて相の分離を誘導した。遠心分離（15700×gで5分間）後、より低い疎水性相を清浄なエッペンドルフチューブに移し、上相を300μLのクロロホルムの添加により洗浄した。低相をプールし、窒素気流下、35℃で乾燥させた。次に、残渣を700μLのブタノールおよび700μLの水に溶解し、よく混合し、15700×gで10分間遠心分離した。上層（ブタノ-ル）をスクリューキャップ付きの1mLチューブに移し、試料を35℃の穏やかな窒素気流下で乾燥させた。続いて、残渣を150μLの溶離液Bに混合および超音波処理によって溶解させ、遠心分離（15700×gで5分）後、100μLのアリコートをインサートを有するUPLCバイアルに移した。 10μLの溶液を分析のために注入した。
【００５５】
第2に、血漿中のGlcCholの定量のために、試料にβ-GlcChol（濃度：0-2.5-5-10-50-100-200-1000pmolβ-GlcChol /血漿mL）を添加し、内部標準を添加し、 試料を抽出した。 比率、転移13C6-β-GlcCholからの領域に対する移行GlcCholからの面積の比を、血漿試料に混ぜられたGlcCholの濃度に対してプロットした。 線形反応は、全濃度範囲にわたって得られた（y = 0.0108x + 1.9188、R2 = 0.998）。10回の反復測定により、健康状態のボランティアの血漿中で、ラン間変動（CV％2.6で164.2±4.3pmol / mL）およびラン変化（CV％2.2で166.8±3.6pmol / mL）を測定した。
【００５６】
検出限界（LOD）は、0.5pmol / mL血漿であり、シグナル対ノイズ比は3であり、定量限界（LOQ）は、0.9pmol / mL血漿であり、シグナル対ノイズ比は10であった。シグナル対ノイズの計算 比はピ-クツ-ピ-ク法を用いて行った。
【００５７】
LC-MS / MSによるCOS-7細胞のGlcCholの分析
GBA2および/またはGCSを過剰発現するCOS-7細胞を、氷上で超音波処理することによってホモジナイズした。抽出前に、メタノール中の2 pmolの13C標識GlcChol（内部標準として使用）をホモジネート180μLに添加した。次に、メタノール、クロロホルムおよび水（1：1：0.9、v / v / v）の添加によりBlighおよびDyerの方法に従って脂質を抽出し、窒素流下で下相を乾固させた。単離した脂質を水/ブタノール抽出（1：1、v / v）により精製し、β-GlcCholを前述のようにLC-MSにより分析した。
【００５８】
HPLCによるCOS-7細胞のGlcCerおよびCerの分析
GBA2および/またはGCSを過剰発現するCOS-7細胞を、氷上での超音波処理によってホモジナイズした。抽出前に、メタノール中の1nmolのC17-スフィンガニン（内部標準として使用）を100μLのホモジネートに添加した。次に、メタノール、クロロホルムおよび水（1：1：0.9、v / v / v）の添加によりBlighおよびDyerの方法に従って脂質を抽出し、40℃の窒素気流下で下相を乾固した。 単離した脂質を電子レンジで脱アシル化し、誘導体化し、前に記載したようにHPLCで分析した（29）。
【００５９】
COS-7細胞におけるGCase活性のインビトロアッセイ
GBA2および/またはGCSを過剰発現するCOS-7細胞のホモジネートを、先に記載したような人工の4MU-Glc基質を用いてGBA2の酵素活性について分析した（38）。 要するに、12.5μLのホモジネートを50μLの基質溶液（150mMクエン酸-リン酸緩衝液（pH 5.8）中の3mM 4MU-Glc）と共に37℃で20または120分間インキュベートした。反応を1.25mLの停止緩衝液（0.3Mグリシン/ NaOH、pH10.6）の添加により停止させ、放出された4MUをLS55蛍光分光計（Perkin-Elmer、Waltham、MA、USA）で測定した。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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