(57)【要約】RSウイルス(respiratory syncytial virus：RSV)ゲノム中のNS1および/またはNS2遺伝子の天然の位置が、より高い位置、すなわちプロモーターに対してより遠位の位置にシフトしている弱毒化表現型を有する新規組換えRSVを、本明細書において報告する。これら遺伝子位置の変化は、所望のレベルの弱毒化および免疫原性を達成するために、他の座位での突然変異と組み合わせて存在し得る。本明細書に記載の組換えRSV株は、弱毒生RSVワクチンとして使用するのに適している。記載されたウイルスをコードすることができるポリヌクレオチド配列、ならびにこれらウイルスを産生および使用する方法も提供する。2018537103.tif 000036
2018537103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
RSウイルス(respiratory syncytial virus：RSV)ゲノムに対する1つまたは複数の改変によって弱毒化された組換えRSVであって、該1つまたは複数の改変が、
(a) NS1遺伝子およびNS2遺伝子の、RSVゲノムの遺伝子位置1および2からの、それぞれ遺伝子位置7および8へのシフト；
(b) NS1遺伝子およびNS2遺伝子の、RSVゲノムの遺伝子位置1および2からの、それぞれ遺伝子位置9および10へのシフト；
(c) NS1遺伝子の、位置1よりも高い遺伝子位置へのシフト；
(d) NS2遺伝子の、位置2よりも高い遺伝子位置へのシフト；または
(e) (c)と(d)の組み合わせ
を含む、組換えRSV。
【請求項２】
前記1つまたは複数の改変が(a)を含む、請求項1に記載の組換えRSV。
【請求項３】
前記1つまたは複数の改変が(b)を含む、請求項1に記載の組換えRSV。
【請求項４】
前記1つまたは複数の改変が(c)を含む、請求項1に記載の組換えRSV。
【請求項５】
前記1つまたは複数の改変が(d)を含む、請求項1に記載の組換えRSV。
【請求項６】
前記1つまたは複数の改変が(e)を含む、請求項1に記載の組換えRSV。
【請求項７】
NS1遺伝子が遺伝子位置7または9にシフトした、請求項4〜6のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項８】
RSVゲノムが、NS1遺伝子またはNS2遺伝子の全部または一部の欠失を含む改変をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項９】
RSVゲノムが、M2-2遺伝子の全部または一部の欠失を含む改変をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項１０】
RSVゲノムが、前記1つまたは複数の改変を含み、かつSEQ ID NO:2 (6120/NS12FM2)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一のポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜2または4〜9のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項１１】
RSVゲノムが、SEQ ID NO:2 (6120/NS12FM2)で示されるポジティブセンス配列を含む、請求項10に記載の組換えRSV。
【請求項１２】
RSVゲノムが、前記1つまたは複数の改変を含み、かつSEQ ID NO:4 (6120/NS12Ltr)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一のポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項1または3〜9のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項１３】
RSVゲノムが、SEQ ID NO:4 (6120/NS12Ltr)で示されるポジティブセンス配列を含む、請求項12に記載の組換えRSV。
【請求項１４】
RSVゲノムが、前記1つまたは複数の改変を含み、かつSEQ ID NO:6 (6120/NS12FM2/ΔNS2)またはSEQ ID NO:8 (6120/NS12Ltr/ΔNS2)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一のポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の組換えRSV。
【請求項１５】
RSVゲノムが、SEQ ID NO:6 (6120/NS12FM2/ΔNS2)またはSEQ ID NO:8 (6120/NS12Ltr/ΔNS2)で示されるポジティブセンス配列を含む、請求項14に記載の組換えRSV。
【請求項１６】
RSVゲノムがレポーター遺伝子をさらに含み、任意で、該レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする、請求項1に記載の組換えRSV。
【請求項１７】
RSVゲノムが、
前記1つまたは複数の改変およびレポーター遺伝子、ならびにSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも90％、少なくとも95％、および/もしくは少なくとも99％同一のポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列；ならびに/または
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、もしくはSEQ ID NO:7に示されるポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列
を含む、請求項16に記載の組換えRSV。
【請求項１８】
遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、低下したNS1遺伝子および/またはNS2遺伝子の発現；
遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、低下したNS1遺伝子および/またはNS2遺伝子の転写；ならびに/または
遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、低下した宿主インターフェロン応答の阻害
を示す、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項１９】
ウイルス感染に応答してインターフェロンを産生し得る培養細胞において、次第に制限を受けやすくなる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項２０】
ウイルス感染に応答してインターフェロンを産生し得ない培養細胞において、複製効率を保持する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項２１】
サブタイプA RSVまたはサブタイプB RSVである、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項２２】
感染性であり、弱毒化されており、かつ自己複製性である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換えRSV。
【請求項２３】
請求項1〜22のいずれか一項に記載の組換えRSVゲノムのゲノムヌクレオチド配列、または該RSVゲノムのアンチゲノムcDNAもしくはRNA配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２４】
請求項23に記載の単離されたポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項23または請求項24に記載の単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む、細胞。
【請求項２６】
許容性の細胞培養物に請求項24に記載のベクターをトランスフェクトする段階；
該細胞培養物を、ウイルスの複製を可能にするのに十分な期間にわたってインキュベートする段階；および
複製された組換えRSVを精製する段階
を含む、組換えRSVを製造する方法。
【請求項２７】
請求項26に記載の方法によって製造された、組換えRSV。
【請求項２８】
請求項1〜22または27のいずれか一項に記載の組換えRSVを含む、薬学的組成物。
【請求項２９】
免疫原として有効な量の請求項28に記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてRSVに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項３０】
薬学的組成物を鼻腔内投与する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
RSVを注射、エアロゾル送達、鼻腔用スプレーまたは点鼻剤によって投与する、請求項29または30に記載の方法。
【請求項３２】
対象がヒトである、請求項29〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対象が1〜6ヶ月齢である、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
対象がRSVについて血清反応陰性である、請求項29〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
対象においてRSVに対する免疫応答を誘発するための、請求項1〜22または請求項27のいずれか一項に記載の組換えRSVの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2015年12月11日に出願された米国仮出願第62/266,206号の優先権を主張するものである。
【０００２】
分野
本明細書に開示される主題は、RSウイルス(respiratory syncytial virus: RSV)およびワクチンとして使用するのに適したその弱毒化変異株に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒトRSウイルス(RSV)は、幼児期に世界中のほぼ全ての人に感染し、かなりの死亡率および罹患率の原因となる。米国だけでも、RSVは毎年75,000〜125,000人の入院に関係しており、控えめに見積もっても、RSVは世界中で毎年6400万人の小児感染と16万人以上の小児死亡の原因になっていると推定される。RSVのもう1つの顕著な特徴は、幼児期の重度の感染の後に、気道反応性に対する素因を含めて、気道機能不全が頻繁に起こり、一部の個体においては何年間にもわたって続き、青年期以降にまで引きずる可能性があることである。RSV感染は喘息を悪化させ、喘息の発症に関わっている可能性がある。
【０００４】
RSVは、パラミクソウイルス科のメンバーであり、したがって、細胞質で複製し、宿主細胞の原形質膜で出芽することによって成熟するエンベロープウイルスである。RSVのゲノムは15.2キロベースのネガティブセンス一本鎖RNAであり、これはゲノムの3'末端の単一のウイルスプロモーターで開始する連続的ストップ-スタート機構により、ウイルスポリメラーゼによって10種のmRNAに転写される。各mRNAは単一の主要タンパク質をコードするが、例外として、2つの重複するオープンリーディングフレーム(ORF)を有するM2 mRNAは、2つの別個のタンパク質M2-1およびM2-2をコードする。11種のRSVタンパク質は、次のものである：RNA結合核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、大きなポリメラーゼタンパク質(L)、結合糖タンパク質(G)、融合タンパク質(F)、小さな疎水性(SH)表面糖タンパク質、内部マトリックスタンパク質(M)、2つの非構造タンパク質NS1およびNS2、ならびにM2-1およびM2-2タンパク質。RSV遺伝子の順序は、3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-Lである。各遺伝子は、遺伝子開始(GS)シグナルおよび遺伝子終止(GE)シグナルと呼ばれる、短い保存された転写シグナルに隣接しており、GSシグナルは、各遺伝子の上流端に存在して、それぞれの遺伝子の転写開始に関与し、GEシグナルは、各遺伝子の下流端に存在して、ポリA尾部の合成とその後のmRNA放出の誘導に関与する。転写は3'末端の単一のプロモーターで開始し、順次進行する。
【０００５】
RSVワクチンの開発は1960年代から進められてきたが、多くの要因によって複雑化している。例えば、不活化RSVを用いたRSV未感作乳幼児の免疫化は、その後の自然RSV感染時に疾患を増強することが示されており、実験動物での研究は、疾患増強が精製RSVサブユニットワクチンとも関連していることを示している。
【０００６】
免疫防御のもう1つの障害は、免疫防御の有効性が低下している呼吸気道内腔の表在細胞においてRSVが複製し、疾病を引き起こすことである。したがって、RSV感染の免疫による制御は非効率的であって、不完全であることが多く、可能な限り免疫原性であることがRSVワクチンにとって重要である。RSVワクチンに対する別の障害は、防御免疫応答の強さがウイルス複製(および抗原産生)の程度におおよそ比例することである。したがって、生ワクチンを製造するのに必要なRSVの弱毒化は、一般的に、複製および抗原合成の減少、ならびに付随する免疫原性の低下を同時に引き起こし、そのため、良好な耐容性を示すが、なおも十分に免疫原性である複製のレベルを特定することが有益である。
【０００７】
もう1つの障害は、RSVが細胞培養中に中程度の力価までしか増殖せず、かつ、精製が困難な長いフィラメント中に存在することが多いことである。RSVは、取り扱い中に容易に感染性を失いうる。さらなる障害は、弱毒突然変異を同定して開発することの困難さである。適切な突然変異はインビボで弱毒化させるものでなければならないが、インビトロでは複製に対する制限は最小限であるべきである。なぜなら、効率的なワクチン製造にとってそれが好ましいからである。別の障害は、RNAウイルスの特徴である遺伝的不安定性であり、そのため、弱毒突然変異は野生型(wt)のものに、または非弱毒化表現型を付与する別のものに戻りうる。不安定性および脱弱毒化は、点突然変異にとって特に問題である。
【０００８】
これらの要因を考え合わせると、インビトロで効率的に複製し、最大限に免疫原性であり、十分に弱毒化され、脱弱毒化しにくい、生きた弱毒RSV株が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
概要
RSVゲノムまたはアンチゲノム中のNS1および/またはNS2遺伝子の位置がプロモーターに対してより遠位の位置にシフトしている弱毒化表現型を有する新規な組換えRSVを、本明細書において報告する。遺伝子位置の変化は、所望のレベルの弱毒化および免疫原性を達成するために、他の座位での突然変異と組み合わせて存在し得る。本明細書に記載の組換えRSV株は、弱毒生RSVワクチンとして使用するのに適している。
【００１０】
いくつかの態様では、RSVのゲノムに対する1つまたは複数の改変によって弱毒化された組換えRSVが提供される。いくつかの態様では、1つまたは複数の改変は、NS1遺伝子とNS2遺伝子の、RSVゲノムの遺伝子位置1および2からの、それぞれ、遺伝子位置7および8へのシフトを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の改変は、NS1およびNS2遺伝子の、(天然のRSVゲノムの)遺伝子位置1および2からの、それぞれ、組換えRSVのゲノムの遺伝子位置9および10へのシフトを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の改変は、位置1よりも高い遺伝子位置(例えば、遺伝子位置7または9)へのNS1遺伝子のシフトを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の改変は、位置2よりも高い遺伝子位置へのNS2遺伝子のシフトを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の改変は、位置1よりも高い遺伝子位置へのNS1遺伝子のシフトと、位置2よりも高い遺伝子位置へのNS2遺伝子のシフトとを含む。
【００１１】
NS1遺伝子および/またはNS2遺伝子の遺伝子位置をシフトさせる改変に加えて、組換えRSVのゲノムは、ウイルスの弱毒化または組換えウイルスの他の特性を増加または減少させるためのさらなる改変、例えばNS1、NS2遺伝子および/またはM2-2遺伝子の全部または一部の欠失など、を含むことができる。
【００１２】
いくつかの態様では、RSVゲノムは、上記の1つまたは複数の改変を含み、かつSEQ ID NO:2 (6120/NS12FM2)、SEQ ID NO:4 (6120/NS12Ltr)、SEQ ID NO:6 (6120/NS12FM2/ΔNS2)、またはSEQ ID NO:8 (6120/NS12Ltr/ΔNS2)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一のポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含む。例えば、RSVゲノムは、SEQ ID NO:2 (6120/NS12FM2)、SEQ ID NO:4 (6120/NS12Ltr)、SEQ ID NO:6 (6120/NS12FM2/ΔNS2)、またはSEQ ID NO:8 (6120/NS12Ltr/ΔNS2)で示されるポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含むか、または該ヌクレオチド配列からなることができる。
【００１３】
いくつかの態様において、RSVゲノムは、レポーター遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの態様では、RSVゲノムは、上記の1つまたは複数の改変およびレポーター遺伝子を含み、かつSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、もしくはSEQ ID NO:7に対するポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも90％、少なくとも95％、および/もしくは少なくとも99％同一のポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、組換えRSVは、(a)遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、低下したNS1遺伝子および/もしくはNS2遺伝子の発現、(b)遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、低下したNS1遺伝子および/もしくはNS2遺伝子の転写、ならびに/または(c)遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、低下した宿主インターフェロン応答の阻害、のうちの1つまたは複数を示す。いくつかの態様では、組換えRSVは、ウイルス感染に応答してインターフェロンを産生し得る培養細胞において、次第に制限を受けやすくなる。いくつかの態様では、組換えRSVは、ウイルス感染に応答してインターフェロンを産生し得ない培養細胞において複製効率を保持する。
【００１５】
本明細書に開示される組換えRSVの態様は、サブタイプA RSVまたはサブタイプB RSVであり得る。本明細書に開示される組換えRSVの態様は、感染性、弱毒性および自己複製性である。
【００１６】
開示されたウイルスの発現に関連する方法および組成物も、本明細書において提供する。例えば、記載されたウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子が開示される。
【００１７】
組換えRSVを含む薬学的組成物もまた提供する。該組成物はアジュバントをさらに含むことができる。免疫原として有効な量の開示された組換えRSVを対象に投与することによって、該対象において免疫応答を誘発する方法もまた開示する。いくつかの態様では、該対象は、ヒト対象、例えば、1〜6ヶ月齢、1〜12ヶ月齢、1〜18ヶ月齢、またはそれ以上のヒト対象である。
【００１８】
本開示の上記のおよび他の特徴ならびに利点は、添付の図面を参照しながら進めるいくつかの態様の以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】NS1およびNS2遺伝子が遺伝子位置7および8にシフトされた組換えRSV 6120/NS12FM2/GFPの作製を説明する概略図を示す。GFP遺伝子は遺伝子位置のナンバリングに含まれないことに留意されたい。示される配列(上から下へ)は、それぞれ、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10および11、SEQ ID NO:12、ならびにSEQ ID NO:13および14である。
【図２】NS1およびNS2遺伝子が位置9および10にシフトされた組換えRSV 6120/NS12Ltr/GFPウイルスの作製を説明する概略図を示す。示される配列(上から下へ)は、それぞれ、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10および11、SEQ ID NO:15、ならびにSEQ ID NO:16および17である。
【図３】アフリカミドリザルVero細胞におけるRSV 6120/NS12FM2/GFP、RSV ΔNS1/ΔNS2/GFPおよびwt RSV/GFPの複製を示す。
【図４】ヒト気道A549細胞におけるRSV 6120/NS12FM2/GFP、RSV ΔNS1/ΔNS2/GFPおよびwt RSV/GFPの複製を示す。
【図５】アフリカミドリザルVero細胞におけるRSV 6120/NS12Ltr/GFP、RSV ΔNS1/ΔNS2/GFPおよびwt RSV/GFPの複製を示す。
【図６】ヒト気道A549細胞におけるRSV 6120/NS12Ltr/GFP、RSV ΔNS1/ΔNS2/GFPおよびwt RSV/GFPの複製を示す。
【図７】RSV 6120/NS12FM2/GFPからのNS2遺伝子の欠失を説明する概略図を示す。上の配列ラインは、SEQ ID NO:18および19を示す。下の配列ラインは、SEQ ID NO:20および21を示す。
【図８】RSV 6120/NS12Ltr/GFPからのNS2遺伝子の欠失を説明する概略図を示す。上の配列ラインは、SEQ ID NO:18および22を示す。下の配列ラインは、SEQ ID NO:23および24を示す。
【図９】アフリカミドリザルVero細胞におけるRSV 6120/NS12FM2/ΔNS2/GFP、RSV 6120/NS12FM2/GFP、RSV ΔNS1/ΔNS2/GFPおよびwt RSV/GFPの複製を示す。
【図１０】ヒト気道A549細胞におけるRSV 6120/NS12FM2/ΔNS2/GFP、RSV 6120/NS12FM2/GFP、RSV ΔNS1/ΔNS2/GFPおよびwt RSV/GFPの複製を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表
添付の配列表に記載される核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R. 1.822に定義されるヌクレオチド塩基の標準的な文字略号およびアミノ酸の3文字コードを用いて示される。配列表は、2016年12月9日に作成された「Sequence.txt」(約164kb)という名前のファイルの形でASCIIテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表において：
SEQ ID NO:1は、組換えRSV株6120/NS12FM2GFPのアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:2は、組換えRSV株6120/NS12FM2のアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:3は、組換えRSV株6120/NS12LtrGFPのアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:4は、組換えRSV株6120/NS12LtrのアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:5は、組換えRSV株6120/NS12FM2/ΔNS2/GFPのアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:6は、組換えRSV株6120/NS12FM2/ΔNS2のアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:7は、組換えRSV株6120/NS12Ltr/ΔNS2/GFPのアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:8は、組換えRSV株6120/NS12Ltr/ΔNS2のアンチゲノムcDNA配列である。
SEQ ID NO:9〜24は、図1〜2および7〜8に示される組換えRSVアンチゲノムcDNA配列の断片である。
SEQ ID NO:25および26は、遺伝子開始転写シグナルのヌクレオチド配列である。
【００２１】
詳細な説明
本明細書には、ある範囲の弱毒表現型を示すヒトRSVの組換え株を作製するのに有用な突然変異が開示される。本発明の突然変異は、NS1および/またはNS2遺伝子を、RSVゲノムまたはアンチゲノム中のそれらの天然の位置から、より高い位置に、すなわちプロモーターに対してより遠位の位置に、シフトさせることに基づいている。また、このような突然変異を含み、弱毒生ワクチンとして使用するのに適した組換えRSV株も本明細書に開示される。さらに、開示されたウイルスの発現に関連する方法および組成物が本明細書に開示される。例えば、記載されたウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子が開示される。
【００２２】
本発明の組換えRSV株は、以下に詳述されるような改変または突然変異を含む、wt RSVゲノムまたはアンチゲノムを含む。wt RSVゲノムまたはアンチゲノムは、以下の11種のタンパク質をコードする：RNA結合核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、大きなポリメラーゼタンパク質(L)、付着表面糖タンパク質(G)、融合表面糖タンパク質(F)、小さな疎水性表面糖タンパク質(SH)、内部マトリックスタンパク質(M)、2つの非構造タンパク質NS1およびNS2、ならびにM2-1およびM2-2タンパク質。これらのタンパク質の完全なアミノ酸配列は当技術分野で公知である。RSVのゲノムは、10種のmRNAをコードする10種の遺伝子を含む、15.2kbのネガティブセンスRNAの一本鎖である。各mRNAは、2つの別個のタンパク質M2-1およびM2-2をコードするM2 mRNAを除いて、単一のタンパク質をコードする。RSV遺伝子の順序は、3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-Lであり、単一のウイルスプロモーターが3'末端に位置する。したがって、天然のRSVゲノムにおいて、NS1は位置1にあり、NS2は位置2に、Nは位置3に、Pは位置4に、Mは位置5に、SHは位置6に、Gは位置7に、Fは位置8に、M2は位置9に、Lは位置10にある。この組織構成は、図1の上のパネルに概略的に示される。
【００２３】
本明細書で報告されるように、NS1および/またはNS2を、プロモーター近位遺伝子としてのそれらの天然の位置から、より高い遺伝子位置に、すなわちプロモーターに対してさらに遠位の位置に、移動させることは、結果として、それらの転写および発現の減少をもたらす。非分節型ネガティブ鎖RNAウイルスでは、転写勾配は、ウイルスの遺伝子発現を調節する上で重要な要素である。ある最近の研究では、外来遺伝子を、2つの遺伝子位置が異なる、RSVゲノムのL遺伝子とトレーラーの間に配置した場合と比較して、F遺伝子とM2遺伝子の間に配置した場合に、その外来遺伝子の発現は4倍高いことが示された(Kwilas AR et al 2010 J Virol 84:7770-7781)。関連するパラインフルエンザウイルス3型に関する別の最近の研究は、遺伝子位置1、2または3からの外来遺伝子の発現が、遺伝子位置6と比較して30〜69倍、15〜29倍および5〜6倍高いことを明らかにした(Liang et al 2014 J Virol 88:4237-4250)。このことは、1つまたは複数の遺伝子をプロモーターに対して徐々に遠位になる位置に移動させることが、ある範囲の複数の遺伝子位置にわたった場合に実質的であり得る、遺伝子発現の漸進的な減少を提供できることを示している。
【００２４】
NS1およびNS2タンパク質は、インターフェロンおよびアポトーシスを含めて、宿主の自然応答に拮抗する。この拮抗作用は特にNS1において顕著である。NS1および/またはNS2が欠失された組換えRSV、特にNS1欠失変異体は、生RSVワクチンの製造に使用されるVero細胞においても観察される作用である、アポトーシスの増加によるインビトロでのウイルス複製の減少を示す(Bitko et al, 2007 J Virol 81:1786-1795)。例えば、RSV ΔNS2ウイルスを生ワクチンとして製造する努力は、不十分な低生産量(未公表の結果)のため、実を結んでいない。ΔNS2/ΔNS2ウイルスもまた、アフリカミドリザルにおいて過剰弱毒化されているようである(Jin et al 2003 Vaccine 21:3647-3652)。対照的に、NS1および/またはNS2遺伝子シフト突然変異を含む本発明のRSV組換えウイルスは、Vero細胞において増殖制限を示さなかった。このことは、どちらかの突然変異体によって産生されるNS1およびNS2のレベルが、効率的なウイルス複製を得るのに十分なほどにアポトーシスを制御していることを示しており、予測できなかった驚くべき結果である。しかし、これらのウイルスは、インターフェロンコンピテント細胞において弱毒化されたことから、予想されたNS1および/またはNS2の発現低下が、実際に該ウイルスを次第に制限に影響されやすくしたことを示している。
【００２５】
したがって、NS1および/またはNS2遺伝子シフトは、遺伝子欠失に関連する過剰弱毒化を回避するための新規な手段を提供する。プロモーターに対して徐々に遠位の位置に該遺伝子を配置できることは、弱毒化の程度を徐々に変化させる手段を提供する。遺伝子シフトは、以前に記載された他の弱毒突然変異と組み合わせることができる。さらに、NS1(特に)およびNS2は宿主インターフェロン応答を阻害するので、それらの発現を減少させることは、増大したインターフェロン発現のアジュバント効果のためにウイルス免疫原性を増加させる可能性がある。例えば、ウシモデルにおいて、NS欠失を有するウシRSV変異体は、天然宿主において増加した免疫原性を有することが示された(Valarcher et al 2003 J Virol 77:8426-8439)。また、アポトーシスの増加は、RSV NS1および/またはNS2タンパク質の発現低下の結果として生じると考えられ、これも免疫原性を高める可能性がある(Pulmanausahakul et al 2001 J Virol 75:10800-10807)。
【００２６】
8つの他のRSV遺伝子が存在するので、NS1および/またはNS2は、様々な転写・発現レベルを提供するために、いくつかの異なるより高い遺伝子位置に様々な組み合わせで移動され得る。NS1および/またはNS2遺伝子を、他の遺伝子と遺伝子の間の遺伝子間領域に、または他の非コード領域に移動させることができる。
【００２７】
いくつかの態様では、NS1およびNS2遺伝子を、より高い遺伝子位置または徐々により遠位の遺伝子位置にタンデムで移動させて、次第に増加する弱毒化表現型の段階的セットを提供することができる。したがって、いくつかの態様において、NS1およびNS2は、遺伝子位置2および3、3および4、4および5、5および6、6および7、7および8、8および9、または9および10にそれぞれ存在し得る。いくつかの態様では、NS1およびNS2遺伝子を、それぞれ遺伝子位置1および2から、それぞれ遺伝子位置7および8にタンデムで移動させることができる。いくつかの態様では、NS1およびNS2遺伝子を、それぞれ遺伝子位置1および2から、それぞれ遺伝子位置9および10にタンデムで移動させることができる。シフト前の該遺伝子の遺伝子位置番号は、シフト前の天然のRSVゲノムにおけるそれらの位置を指し、シフト後の該遺伝子の遺伝子位置番号は、改変されたRSVゲノムにおけるそれらの位置を指す。
【００２８】
あるいは、NS1およびNS2は、単独でまたは互いに独立して移動され得る。例えば、NS1またはNS2遺伝子のうちの1つのみを、より高い遺伝子位置に移動させることができる。したがって、いくつかの態様では、 NS1遺伝子は遺伝子位置1にあってよく、NS2は位置3、4、5、6、7、8、9または10にあってよい。いくつかの態様では、 NS2遺伝子は遺伝子位置2にあってよく、NS1は位置3、4、5、6、7、8、9または10にあってよい。いくつかの態様では、NS1およびNS2のそれぞれを、異なるより高い位置に独立して移動させることができる。例えば、NS1は位置2、3、4、5、6、7、8、9または10のいずれか1つにあってよく、NS2は位置3、4、5、6、7、8、9または10のいずれか1つにあってよい。
【００２９】
実施例1に記載され、図1に示される1つの例示的な実施態様では、NS1およびNS2遺伝子を、F遺伝子とM2遺伝子の間の遺伝子間領域の位置7および8に移動させて、組換えウイルス構築物中の遺伝子の順序を3' N-P-M-SH-G-F-NS1-NS2-M2-Lとした。この組換え構築物をRSV 6120/NS12FM2と命名する。この構築物のポリヌクレオチド配列をSEQ ID NO:2に示す。いくつかの実施態様は、SEQ ID NO:2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、およびその間の任意の数値で同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、組換えRSVは、本明細書に記載の6120およびNS12FM2の突然変異を含み、かつSEQ ID NO:2 (6120/NS12FM2)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を含むRSVゲノムを有する。
【００３１】
実施例2に記載され、図2に示される別の例示的な実施態様では、NS1およびNS2遺伝子を位置9および10に移動させて、組換えウイルス構築物中の遺伝子の順序を3' N-P-M-SH-G-F-M2-L-NS1-NS2とした。この組換え構築物をRSV 6120/NS12LTrと命名する。この構築物のポリヌクレオチド配列をSEQ ID NO:4に示す。いくつかの実施態様は、SEQ ID NO:4と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、およびその間の任意の数値で同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
いくつかの態様において、組換えRSVは、本明細書に記載の6120およびNS12Ltrの突然変異を含み、かつSEQ ID NO:4 (6120/NS12Ltr)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を含むRSVゲノムを有する。
【００３３】
いくつかの態様において、RSVゲノムまたはアンチゲノムは、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、NS1および/またはNS2遺伝子中に1つまたは複数の突然変異を含む。その突然変異は、点突然変異、置換または欠失であり得る。欠失は部分的または完全であってよい。いくつかの例示的な実施態様を実施例5および6に記載し、かつ図7および8に示す。これらには、構築物6120/NS12M2F/ΔNS2 (SEQ ID NO:6)および6120/NS12Ltr/ΔNS2 (SEQ ID NO:8)が含まれる。これらの構築物の設計および構築を実施例5および6に記載する。
【００３４】
いくつかの態様において、組換えRSVは、本明細書に記載の6120、NS12FM2、およびΔNS2の突然変異を含み、かつSEQ ID NO:6 (6120/NS12FM2/ΔNS2)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を含むRSVゲノムを有する。
【００３５】
いくつかの態様において、組換えRSVは、本明細書に記載の6120、NS12Ltr、およびΔNS2の突然変異を含み、かつSEQ ID NO:8 (6120/NS12Ltr/ΔNS2)と少なくとも90％、少なくとも95％、および/または少なくとも99％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を含むRSVゲノムを有する。
【００３６】
いくつかの態様において、組換えRSVのゲノムは、本明細書で論じられるような1つまたは複数の突然変異を含み、組換えRSVのゲノムの残りの配列の差は、D46 RSVのゲノム配列(GenBankアクセッション番号KT992094；参照により本明細書に組み入れられる)と比較して、生物学的に有意ではない(例えば、残りの配列の差異は、既知のシス作用性シグナルを改変したり、またはアミノ酸コードを変化させたり、または該ウイルスのインビトロ複製もしくはプラークサイズに測定可能な影響を及ぼしたりといった、野生型ゲノム配列に対する変化を含まない)。
【００３７】
別の例示的な態様において、アンチゲノムcDNAは、レポーター遺伝子、例えば高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子、を含むように改変され得る。GFP遺伝子は、RSVのP遺伝子とM遺伝子の間に(Munir et al 2008 J Virol 82:8780-8796)、またはゲノム中の最初の遺伝子として(Zhang et al 2002 J Virol 76:5654-5666)、またはいずれかの遺伝子ペアの間に挿入することができる。GFP遺伝子の第1の遺伝子位置への挿入は、細胞株における、およびインビトロヒト気道上皮(HAE)培養物におけるRSVの複製または病原性に、ほとんどまたは全く影響を及ぼさず(Zhang et al 2002 J Virol 76:5654-5666)、P遺伝子とM遺伝子の間に挿入されたGFPの場合も同様のようであった(Munir et al 2008 J Virol 82:8780-8796)。ウイルスゲノムからGFPを発現させる1つの目的は、初期の実験において感染のモニタリングを容易にすることである；なぜならば、それは、感染を妨げることなく、生細胞における感染の可視化を可能にするからである。初期実験では、GFPをこうした方法で使用することが多い。使用する場合、本開示における遺伝子位置のナンバリングにはGFPが含まれないことに留意されたい。GFPの発現は、初期の前臨床研究において役立ち得るが、一般的に、ヒトが利用するための製品にはそれは含まれない。いくつかの例示的な実施態様が本明細書に記載される。これらは、RSV 6120/NS12FM2/GFP (SEQ ID NO:1)、6120/NS12Ltr/GFP (SEQ ID NO:3)、6120/NS12M2F/ΔNS2/GFP (SEQ ID NO:5)および6120/NS12Ltr/ΔNS2/GFP (SEQ ID NO:7)である。これらの構築物の設計および構築を実施例1、2、5および6に記載し、図1、2、7および8に示す。
【００３８】
所望の特性を有するさらなるウイルス株を構築するために、追加の突然変異を導入することができる。例えば、追加される突然変異は、様々な強さの弱毒化を指定することができるため、弱毒化の漸進的増加をもたらす。こうして、候補ワクチン株は、少なくとも1つの、好ましくは2つ以上の異なる弱毒突然変異、例えば既知の生物学的に誘導された変異型RSV株のパネルから同定される突然変異、を組み込むことにより、さらに弱毒化され得る。このような突然変異のいくつかを例としてここで説明する。この例示的なパネルから、弱毒突然変異の大きな「メニュー」を作成することができ、そこでは、NS1および/またはNS2遺伝子シフト突然変異が、弱毒化レベルおよび他の望ましい表現型を調整するために、該パネル内の任意の他の1つまたは複数の突然変異と組み合わされる。追加の弱毒突然変異を非RSVネガティブ鎖RNAウイルスにおいて同定して、本発明のRSV変異体に組み込むことができ、そのためには、レシピエントRSVゲノムまたはアンチゲノム中の対応する相同部位に該突然変異をマッピングして、レシピエント中の既存の配列を突然変異遺伝子型に(同一のまたは保存的な突然変異により)変化させる。追加の有用な突然変異は、本明細書に組み入れられた参考文献に記載されるような組換えミニゲノム系および感染性ウイルスを用いた突然変異解析によって、経験的に決定することができる。弱毒化はまた、コドンペア脱最適化(codon-pair-deoptimization)によっても達成することができ、これは、特定の弱毒障害の同定に依存するのではなく、数ある作用の中でも特にmRNA翻訳の効率を低下させるような全体的なメカニズムによって遺伝子発現を変化させる(Le Nouen et al 2014 Proc Natl Acad Sci USA 111:13169-13174)。いくつかの例示的な追加の突然変異を以下に記載する。これらは単なる例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
NS1および/またはNS2遺伝子シフトを含む本発明の組換えRSV構築物は、NS1およびNS2遺伝子をそれらの天然の位置1および2に有するRSVと比較して、NS1および/またはNS2遺伝子の発現低下を示す。本明細書で使用する用語「発現」は、転写、翻訳、翻訳後修飾、および機能性タンパク質を形成および蓄積するのに必要な物理的安定性を含めて、タンパク質産生の全プロセスを包含することを指す。
【００４０】
組換えRSV構築物は、低下した宿主インターフェロン応答の阻害を示す、すなわち、そのようなウイルスを保有する細胞は、増加した宿主インターフェロンmRNAおよび/またはタンパク質の発現を示し、かつ/または低下したインターフェロン媒介性作用のウイルス阻害を示す。インターフェロンコンピテント細胞、すなわちウイルス感染に応答してインターフェロンを産生することができる培養細胞、例えばヒト気道上皮A549細胞(ATCC CCL-185)において、本発明の組換えRSV構築物は次第に制限を受けやすくなる。一方、インターフェロンインコンピテント細胞、すなわちウイルス感染に応答してインターフェロンを産生することができない培養細胞、例えばアフリカミドリザルVero細胞(ATCC CCL-81)では、本発明の組換えRSV構築物は複製効率を保持する。
【００４１】
Vero細胞内で効率的に複製する生RSVワクチン候補の能力は、該細胞がワクチン製造にしばしば使用される細胞基材であるため、有益である。これはNS1およびNS2遺伝子の場合に関係する。というのは、RSVからのいずれか一方または両方の欠失は、野生型RSVと比較して、細胞がNS欠失ウイルスに感染した場合により迅速かつより広範なアポトーシスをもたらすからである(Bitko, et al. 2007. J Virol 81:1786-1795)。開示された組換えRSVの態様は、発現を完全に失うことなく、NS1および/またはNS2の発現(ならびにインターフェロン拮抗作用)を低下させる能力を提供し、これはVero細胞における無制限の増殖という利点を提供する。さらに、NS1およびNS2遺伝子をRSVゲノム中のより高い遺伝子位置にシフトすることは、ある範囲の漸進的に増加する弱毒化表現型を導き出す手段を提供する。
【００４２】
追加の突然変異
いくつかの態様において、RSVゲノムまたはアンチゲノムは、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、N、P、M、SH、G、F、M2 (M2-1 ORFまたはM2-2 ORF)およびL遺伝子の1つまたは複数に1つまたは複数の突然変異を含む。例えば、RSVゲノムまたはアンチゲノムは、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、M2-2タンパク質の発現を除去するまたは低下させる突然変異をM2遺伝子のM2-2 ORFに含むことができる。そのような突然変異は、1つまたは複数の点突然変異、M2-2 ORFの部分的欠失、またはM2-2タンパク質の完全欠失を含み得る。
【００４３】
いくつかの態様において、本発明の組換えRSV株は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、遺伝子における、遺伝子間領域における、およびトレーラー領域における、非翻訳配列の欠失を含む。一態様では、そのような欠失は、SH遺伝子の下流端で起こり、本明細書では「6120変異」と呼ばれる突然変異をもたらす。これは、SH遺伝子の下流非翻訳領域の112ヌクレオチドの欠失と、SH遺伝子の最後の3つのコドンおよび終止コドンへの翻訳上サイレントな5つの点突然変異の導入を含む(Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140)。6120変異はアンチゲノムcDNAを細菌内で安定化させ、その結果、それはより容易に操作および調製できるようになる。wt RSVにおいて、この突然変異は、インビトロで複製効率を5倍増加させることが以前に見出されたが(Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140)、それがインビボで複製効率を増加させるとは考えられなかった。
【００４４】
いくつかの態様において、組換えRSV株は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、「cp」変異を含むことができる。この変異は、3種のタンパク質における5つのアミノ酸置換のセット(N (V267I)、F (E218AおよびT523I)、L (C319YおよびH1690Y))を指し、それらは一緒になって(それらだけで)血清反応陰性チンパンジーにおいて複製を約10分の1に減少させて、疾患を軽減させる(Whitehead, et al. 1998. J Virol 72:4467-4471)。このcp変異は、中程度の弱毒化表現型と関連することが以前に示された(Whitehead, et al. 1999. J Virol 72:4467-4471)。
【００４５】
さらに、cpRSVの化学的突然変異誘発によって誘導され、温度感受性(ts)表現型について選択された6種の生物学的ウイルスの以前の分析は、合計6つの独立した突然変異をもたらし、これらの突然変異はそれぞれがts弱毒化表現型を付与し、かつNS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、本発明の組換えウイルスに導入できる可能性がある。これらのうち5つは、Lタンパク質におけるアミノ酸置換であり、これらは配列位置ではなくウイルス番号に基づいて命名された：「955」(N43I)、「530」(F521L)、「248」(Q831L)、「1009」(M1169V)、および「1030」(Y1321N) (Juhasz, et al. 1999. Vaccine 17:1416-1424; Collins, et al. 1999. Adv Virus Res 54:423-451; Firestone, et al. 1996. Virology 225:419-422; Whitehead, et al. 1999. J Virol 73:871-877)。6つ目の突然変異(「404」と呼ばれる)は、M2遺伝子の遺伝子開始転写シグナルにおける一塩基変化(GGGGCAAATA (SEQ ID NO:25)からGGGGCAAACA (SEQ ID NO:26)への変化、mRNAセンス)であった(Whitehead, et al. 1998. Virology 247:232-239)。最近、248変異と1030変異の遺伝的安定性を高めるために逆遺伝学が用いられた(Luongo, et al. 2009. Vaccine 27:5667-5676; Luongo, et al. 2012. J Virol 86:10792-10804)。別の弱毒突然変異は、Lタンパク質中のコドン1313を欠失させること、および増大した遺伝的安定性を付与するために該欠失をI1314L置換と組み合わせることを含む(Luongo, et al. 2013. J Virol 87:1985-1996)。
【００４６】
いくつかの態様では、組換えRSV株は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、Fタンパク質に1つまたは複数の変化、例えば、Fタンパク質中の2つのアミノ酸置換、すなわちK66EおよびQ101P、を含む「HEK」突然変異(Connors, et al. 1995. Virology 208:478-484; Whitehead, et al. 1998. J Virol 72:4467-4471に記載される)を含むことができる。本開示のA2株のF配列へのHEKアミノ酸割り当ての導入は、A2株の元の臨床分離株の初期継代(ヒト胚性腎細胞継代7、HEK-7)と同一のFタンパク質アミノ酸配列をもたらす(Connors, et al. 1995. Virology 208:478-484; Whitehead, et al. 1998. J Virol 72:4467-4471)。それは、結果的に、膜融合性がかなり低いFタンパク質をもたらし、A2株の元の臨床分離株の表現型を表していると考えられる(Liang et al. J Virol 2015 89:9499-9510)。HEK Fタンパク質はまた、より安定な3量体を形成する(Liang et al. J Virol 2015 89:9499-9510)。これは、おそらく高い免疫原性を示す融合前コンホメーションに富んだ、RSV Fタンパク質のより真正で免疫原性のある形態を提供しうる(McLellan et al. Science 2013 340(6136):1113-7; Science 2013 342(6158):592-8)。したがって、突然変異は、ウイルス複製の強さに対する効果に付加的な効果を加えて導入することができる。
【００４７】
いくつかの態様では、組換え株は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、Lタンパク質に1つまたは複数の変化、例えば、1321K(AAA)/S1313(TCA)を含む安定化1030または「1030s」突然変異(Luongo, et al. 2012. J Virol 86:10792-10804)を含むことができる。
【００４８】
いくつかの態様では、組換え株は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、Nタンパク質の1つまたは複数の変化、例えばT24Aなどのアミノ酸置換、またはNSタンパク質の1つまたは複数の変化、例えばK51Rなどのアミノ酸置換を含むことができる。
【００４９】
いくつかの態様では、ウイルス株は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、SH遺伝子の欠失を含む。例えば、いくつかの態様では、ウイルス株は、4197〜4615位(SEQ ID NO:1の4198〜4616)の419ヌクレオチドの欠失を含み、これは本明細書では「ΔSH」変異として示される。この欠失は、M遺伝子末端の欠失、M/SH遺伝子間領域、およびSH ORFの欠失をもたらす。
【００５０】
開示された組換えRSV株のFおよび/またはGタンパク質のアミノ酸配列は、(NS1/NS2遺伝子の位置の、例えばそれぞれ位置7および8、または9および10への、シフトに加えて、)最近流行している株を表すように(多岐にわたるGタンパク質の場合に特に関連し得る)、または初期継代臨床分離株を表すように改変することができる。欠失または置換をGタンパク質に導入して、免疫原性または他の所望の特性を改善することができる。例えば、免疫原性を改善するために、Gタンパク質中のCX3Cフラクタルカイン(fractalkine)モチーフを取り除くことができる(Chirkova et al. J Virol 2013 87:13466-13479)。いくつかの態様では、RSVのGタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、臨床分離株A/Maryland/001/11由来のヌクレオチド配列G001と置き換えることができる(「G001」)。いくつかの態様では、RSVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、臨床分離株A/Maryland/001/11由来のヌクレオチド配列F001と置き換えることができる(「F001」)。
【００５１】
いくつかの態様では、RSVのタンパク質をコードする野生型のまたは天然に存在するヌクレオチド配列は、NS1/NS2遺伝子の位置の(例えば、それぞれ位置7および8、または9および10への)シフトに加えて、選択された宿主、特にヒトにおいて発現が増加するように設計されたコドン最適化配列と置き換えることができる。あるいは、コドンレベルまたはコドンペアレベルで準最適であるように配列を設計することができる。
【００５２】
上記の突然変異に加えて、本発明による組換えRSVには、任意のRSVまたはRSV様ウイルス、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ネズミ(マウスの肺炎ウイルス)、もしくはトリ(七面鳥鼻気管炎ウイルス)のニューモウイルスに由来するか、または別のエンベロープを持ったウイルス、例えばパラインフルエンザウイルス(PIV)に由来する、異種のコードまたは非コードヌクレオチド配列を組み込むことができる。例示的な異種配列には、あるヒトRSV株に由来のRSV配列を、異なるヒトRSV株に由来の配列と組み合わせたものが含まれる。さらに別の局面において、1つまたは複数のヒトRSVコードまたは非コードポリヌクレオチドを、異種RSVまたは非RSVウイルス由来の対応する配列で置換して、新規な弱毒化ワクチン株を作製する。あるいは、組換えRSVは、2つ以上の野生型または変異型ヒトRSVサブグループ由来の配列、例えばヒトRSVサブグループAおよびサブグループB配列の組み合わせ、を組み込むことができる。RSVは2つの抗原サブグループAおよびBとして存在し、これらは、特にGタンパク質について、配列および抗原性の大きな差異を有する。1〜2年サイクルでA株とB株の優位性が入れ替わることは一般的であり、このことは、抗原性の差異が異種サブグループ株による再感染を容易にするのに十分であることを示唆している(Hall et al 1990 J Infect 162:1283-1290; Wattis 1991 J Infect Dis 163:464-469; Peret et al 1998 J Gen Virol 79:2221-2229)。したがって、組換えRSVは、防御の幅を広げるために、異種サブグループ由来の配列を組み込みうる。例えば、一方のサブグループの弱毒化RSVのFおよび/またはGタンパク質を、異種サブグループに適合した新しいワクチンを作製するために、他方のサブグループのものと交換することができる(Whitehead et al 1999 J Virol 73:9773-9780)。別の例として、異種サブグループのGタンパク質を、追加の遺伝子として発現させてもよい。このようにして、RSVワクチンは、両方の抗原サブグループを表す1つまたは複数の成分を用いて設計することができる。
【００５３】
本明細書に記載の特定の突然変異を有する組換えRSVに加えて、開示されたウイルスは、当業者には理解されるように、さらに改変され得る。例えば、組換えRSVは、そのタンパク質の1つまたは複数を欠失させたり、そうでなければ突然変異させたりしてもよく、あるいは異なる生物由来の異種遺伝子をゲノムまたはアンチゲノムに追加して、組換えRSVが細胞に感染して複製する際にそのタンパク質を発現するまたは組み込むようにしてもよい。さらに、当業者であれば、RSVに影響を及ぼすことが知られている以前に明らかにされた他の突然変異を、本明細書に記載の突然変異のいずれか1つまたは複数と組み合わせて、望ましい弱毒化または安定性の特性を備えた組換えRSVを作製することができることを理解するであろう。
【００５４】
いくつかの態様において、開示された組換えRSVワクチン株は、逆遺伝学と呼ばれる組換えDNAに基づく技術を用いて作製することができる(Collins, et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567)。このシステムは、限定された条件下で、適格な細胞基材中のcDNAから完全に感染性ウイルスをデノボ回収することを可能にする。逆遺伝学は、cDNA中間体を経てRSVゲノムに所定の突然変異を導入する手段を提供する。特定の弱毒突然変異を前臨床研究において特性解析し、それらを組み合わせて所望のレベルの弱毒化を達成した。cDNAからのワクチンウイルスの誘導は、外来性物質による汚染のリスクを最小限にし、かつ継代履歴を簡潔にして文書で十分に裏付けるのに役立つ。回収されると、遺伝子操作されたウイルス株は、生物学的に誘導されたウイルスと同じように増殖する。継代および増幅の結果、該ワクチンウイルスは元の回収からの組換えDNAを含まない。
【００５５】
本開示における実施例では、抗原サブグループAのRSV A2株を利用したが、この株は最も広く使用されている実験株であり、臨床研究で評価されている多数の弱毒RSV生ワクチン候補の親でもある。様々な追加のRSV株(例えば、RSV B1、RSV Long、RSV Line 19)が存在することを考えると、当業者は、特定のRSV株が所与の残基の位置を変えるヌクレオチドもしくはアミノ酸の挿入または欠失を持つ可能性があることを理解するであろう。例えば、別のRSV株のタンパク質が、A2株と比較して該タンパク質の上流末端に2個の追加のアミノ酸を有する場合、これはA2株に対する下流残基のアミノ酸ナンバリングを2ずつ増加させるであろう。しかし、これらの株は高度の配列同一性を共有するので、当業者は、A2参照株のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を問題の株の該配列と単にアライメントするだけで、対応する配列の位置を決定することができよう。したがって、本明細書に記載されるアミノ酸およびヌクレオチドの位置は、本開示の文脈において明確に列挙されるが、配列シフトが起こったとき、またはウイルス株間の配列変化のために、他の位置に対応し得ることを理解すべきである。2つ以上の関連ウイルス間のタンパク質もしくはタンパク質セグメント、または遺伝子、またはゲノムもしくはゲノムセグメントの比較において、「対応する」アミノ酸またはヌクレオチド残基は、異なる種において全く同じまたはほぼ同じ機能をもつと考えられるものである。
【００５６】
文脈が別のことを示さない限り、本開示で使用されるナンバリングは、野生型RSV A2株の配列(GenBankアクセッション番号M74568)に基づき、記載されるウイルスゲノム配列はポジティブセンスである。
【００５７】
本発明のいくつかの態様において、組換えRSV株は、D46と呼ばれるA2株の組換え型から誘導された。D46の完全な配列は、米国特許第6,790,449号に示されており、GenBankアクセッション番号KT992094として入手可能になっている。（いくつかの例および出版物において、親ウイルスおよび配列はD46ではなくD53と呼ばれているが、これは、アンチゲノムcDNAを増殖させるために使用された細菌株を指し、他の知られた有意性または効果を持たない記述上の差異である。本開示において、D46およびD53は相互に交換可能である。）D46のヌクレオチド配列は、RSV A2株M74568の配列と25個のヌクレオチド位置で異なり、それは1099位に1ヌクレオチドの挿入を含む。
【００５８】
記載されたウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列位置の配列ナンバリングに関して、慣例が採用され、所与のウイルス配列中の各ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、どのような改変にも関係なく、それが元の15,222ヌクレオチドの生物学的野生型A2ウイルス株(Genbankアクセッション番号M74568)において有する配列位置番号を保持した。したがって、ゲノムのいくつかは、ヌクレオチド長および場合によってはアミノ酸長の変化を引き起こす欠失および/または挿入を含むが、ゲノムおよびコードされたタンパク質における他の残基(ヌクレオチドまたはアミノ酸)の全てのナンバリングは不変のままである。当然のことながら、この便利な慣例の手段がなくとも、当業者は、長さが異なる可能性のあるウイルスゲノムまたはタンパク質間の対応する配列位置を容易に同定することができ、そうした対応する配列位置は、配列アラインメント、ならびにオープンリーディングフレームの位置、遺伝子開始シグナルや遺伝子終止シグナルのような周知のRNAの特徴の位置、およびアミノ酸配列の特徴の位置によって導き出される。
【００５９】
組換えウイルスは、細胞培養、げっ歯類および非ヒト霊長類において、感染力、複製動態、収量、タンパク質発現の効率、および遺伝的安定性について、当技術分野で公知の方法を用いて評価され得る。これらの半許容系(semi-permissive system)は、複製のあらゆる違いを確実に検出できるわけではないが、かなりの違いは特に検出することができる。また、組換え株は、成人、血清反応陽性小児、および血清反応陰性小児において続けて評価され得る。以前の類似した株が、血清反応陰性小児において耐容性良好であることがすでに示されている場合には、新たな株を血清反応陰性小児で直接評価してもよい。評価は、複数の候補ワクチンの同時評価を可能にする少人数の、例えば、10人のワクチンレシピエントと5人のプラセボレシピエントのグループで行うことができる。候補ワクチンは、ワクチンウイルスの感染力、複製動態、ウイルス排出、耐容性、免疫原性、および遺伝的安定性について、予防接種直後の時期に評価することができ、ワクチンを受けた対象は、安全性、RSV疾患、およびRSV特異的血清抗体の変化について、次のRSVシーズン中に調査を受けうる（Karron, et al. 2015, Science Transl Med 2015 7(312):312ra175に記載のとおりであり、これはその全体が本明細書に組み入れられる）。したがって、選択された代表的なウイルスの分析は、候補を絞り込んで最適なものを同定するための比較的迅速なトリアージ(triage)を提供することができる。
【００６０】
タンパク質またはペプチドへの言及は、その天然に存在する形態、ならびにそのようなタンパク質の任意のフラグメント、ドメイン、またはホモログを含む。本明細書で使用する用語「ホモログ」は、天然に存在するタンパク質またはペプチド(すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」タンパク質)とは、天然に存在するタンパク質またはペプチドに対するわずかな修飾によって異なっているが、天然に存在する形態の基本的なタンパク質および側鎖構造を維持しているタンパク質またはペプチドを指すために使用される。そのような変化としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：1個または数個のアミノ酸側鎖の変化；欠失(例えば、タンパク質またはペプチドのトランケート型)、挿入および/または置換を含む、1個または数個のアミノ酸の変化；1個または数個の原子の立体化学の変化；および/またはメチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化を含むがこれらに限定されない、マイナーな誘導体化。ホモログは、天然に存在するタンパク質またはペプチドと比較して、増強された、低下した、または実質的に類似した性質を有し得る。所与のタンパク質のホモログは、基準タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％同一(または全ての整数の増加で、45％〜99％の間の任意の同一性パーセント)であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【００６１】
本発明の一局面では、選択された遺伝子セグメント、例えば、あるRSV由来の選択されたタンパク質またはタンパク質領域(例えば、細胞質尾部、膜貫通ドメインもしくは細胞外ドメイン、エピトープ部位もしくは領域、結合部位もしくは領域、活性部位もしくは活性部位を含む領域など)をコードするものは、野生型または親RSV株と比較して所望の表現型の変化を有する新規組換え体を得るために、同じまたは異なるRSVもしくは他の供給源由来の対応する遺伝子セグメントと置換することができる。例えば、このタイプの組換え体は、あるRSVの細胞質尾部および/または膜貫通ドメインが別のRSVの細胞外ドメインに融合されたキメラタンパク質を発現し得る。このタイプの他の例示的な組換え体は、重複するタンパク質領域、例えば重複する免疫原性領域を発現する。本明細書で使用する「対応する」(counterpart)遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質またはタンパク質領域は、典型的には、(例えば、異なるRSV遺伝子に由来するか、異なるRSV株における同じ(すなわち、相同または対立)遺伝子もしくは遺伝子セグメントを表す)異種の供給源に由来する。これに関連して選択される典型的な対応する部分は、全体的な構造的特徴を共有しており、例えば、各対応する部分は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、結合部位もしくは領域、エピトープ部位もしくは領域などの、同等な構造的「ドメイン」をコードすることができる。対応するドメインおよびそれらをコードする遺伝子セグメントは、ある範囲のサイズおよびアミノ酸(またはヌクレオチド)配列変異を有する種の集合を包含し、その範囲は、該ドメインまたは遺伝子セグメント変異体の間に共通する生物学的活性によって規定される。例えば、本発明内の対応する遺伝子セグメントによってコードされる2つの選択されたタンパク質ドメインは、膜貫通機能、特異的結合活性、免疫学的認識部位などを提供するといった、実質的に同じ質的活性を共有することができる。より典型的には、対応する部分間で、例えば選択されたタンパク質セグメントまたはタンパク質間で、共有される特定の生物学的活性は、量的には実質的に類似している、すなわち、それらは、それぞれの量的活性プロファイルの点で30％を超えて変わることはなく、好ましくは20％、より好ましくは5〜10％を超えて変わることはないであろう。
【００６２】
本発明の別の局面において、cDNA発現ゲノム(cDNA-expressed genome)またはアンチゲノムから産生される感染性RSVは、RSV株もしくはRSV様株のいずれか、例えばヒト、ウシ、ネズミなど、または任意のニューモウイルスもしくはメタニューモウイルス、例えばマウス肺炎ウイルスもしくはトリメタニューモウイルスのいずれかであり得る。防御免疫応答を生じさせるために、RSV株は、免疫される対象に対して内因性のものであり得、例えば、ヒトの免疫化にはヒトRSVが使用される。しかしながら、内因性RSVのゲノムまたはアンチゲノムは、異なる供給源の組み合わせからRSV遺伝子もしくは遺伝子セグメントを発現するように改変することができ、例えば、異なるRSV種、RSVサブグループもしくはRSV株由来の、またはRSVとヒトパラインフルエンザウイルス(PIV)のような別の呼吸器病原体由来の、遺伝子もしくは遺伝子セグメントの組み合わせを発現するように改変されうる(例えば、以下を参照されたい：Hoffman et al. J. Virol. 71:4272-4277 (1997); Durbin et al. Virology 235(2):323-32 (1997); 1997年5月23日出願のMurphy et al. 米国特許出願第60/047,575号、ならびに感染性PIVクローンを産生するための以下のプラスミド：p3/7(131) (ATCC 97990)；p3/7(131)2G (ATCC 97889)；およびp218(131) (ATCC 97991)；それぞれ1997年4月18日にブダペスト条約の条項の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA.)に寄託され、上記の受託番号が付与された)。
【００６３】
本発明の特定の態様では、ヒトRSVの個々の内部遺伝子が、例えば、ウシもしくは他のRSVの対応する遺伝子で、またはPIVのような別の呼吸器病原体の対応する遺伝子もしく外来遺伝子で置き換えられた組換えRSVが提供される。また、プロモーターもしくは転写シグナルのようなヒトRSVのシス作用配列も、例えば、それらのウシRSV対応部分で置き換えることができる。逆に、ウシRSVゲノムまたはアンチゲノムのバックグラウンドに、ヒト弱毒遺伝子またはシス作用配列を挿入することによって、弱毒生ウシRSVを作製するための手段が提供される。
【００６４】
したがって、ヒトへの投与を意図した感染性組換えRSVは、弱毒化などの目的のために、例えばウシRSVまたはPIV由来の、遺伝子を含むように改変されたヒトRSVであり得る。例えば、PIV由来の遺伝子または遺伝子セグメントを挿入することによって、PIVとRSVの両方に対する二価ワクチンが提供される。あるいは、異種RSV種、サブグループもしくは株、またはPIVなどの異なる呼吸器病原体は、例えば、ヒトRSV感染からの防御を引き出すエピトープまたはタンパク質をコードする遺伝子を含むように、改変され得る。例えば、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子をウシ糖タンパク質遺伝子の代わりに用いることができ、その結果、得られたウシRSVは、ヒトRSV表面糖タンパク質を有し、かつ残りのウシ遺伝的バックグラウンドのためにヒト宿主内で制限された複製能力を保持するようになると考えられ、ヒトRSV株に対して防御免疫応答を誘発する。
【００６５】
ワクチン開発のために他のタイプの弱毒突然変異を分析して、感染性RSVに組み込む能力は、RSVクローンの標的を定めた変化の広範な集団にまで及ぶ。例えば、増殖に必須ではない任意のRSV遺伝子は、毒性、病原性、免疫原性および他の表現型特性に所望の効果を生じるように取り除かれてもよいし、そうでなければ改変されてもよい。
【００６６】
本明細書で使用する「異種遺伝子」は、異なるRSVの株もしくは型、または非RSV源から採取された遺伝子を指す。これらの異種遺伝子を全体的または部分的に挿入して、遺伝子の順序を変更し、遺伝子重複を除去し、RSVゲノムのプロモーターをそのアンチゲノム対応物で置き換え、遺伝子の一部を除去または置換し、遺伝子全体さえも欠失させることができる。様々な遺伝子間領域または他の場所にユニークな制限部位を挿入するなど、操作を容易にするために、異なるまたは追加の改変を該配列において行うことができる。非翻訳遺伝子配列は、外来配列を挿入する収容能力を高めるために除去され得る。
【００６７】
本発明の組換えRSVの全ウイルス遺伝子または遺伝子セグメントの変化を含む欠失、挿入、置換および他の突然変異は、免疫抑制個体の場合に関係しうる、非常に安定したワクチン候補をもたらす。こうした突然変異の多くは、得られるワクチン株の弱毒化をもたらす一方で、他の突然変異は様々なタイプの所望の表現型変化を指定するであろう。例えば、宿主免疫を特異的に妨害するタンパク質をコードする、ある種のウイルス遺伝子が知られている(例えば、Kato et al., EMBO. J. 16:578-87 (1997)を参照されたい)。ワクチンウイルスにおけるこのような遺伝子の除去は、毒性および病原性を減少させ、かつ/または免疫原性を改善することが期待される。
【００６８】
本発明のRSV内の他の突然変異は、ゲノムの3'末端をアンチゲノム由来のその対応部分と置き換えることを含み、これはRNAの複製および転写の変化に関連する。さらに、遺伝子間領域(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4594-4598 (1986))は、短くしたり長くしたり、または配列の内容を変化させたりすることができ、また、天然に存在する遺伝子重複(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5134-5138 (1987))は、本明細書に記載の方法によって除去したり、または異なる遺伝子間領域に変更したりすることができる。
【００６９】
別の態様では、所定のRSV遺伝子の翻訳開始部位を取り囲む配列(好ましくは、-3位のヌクレオチドを含む)は、単独でまたは上流の開始コドンの導入との組み合わせで、翻訳のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを指定することによってRSV遺伝子発現を調節するように改変される。
【００７０】
代替的に、または本明細書に開示される他のRSV改変との組み合わせで、RSV遺伝子発現は、ウイルスの所定の1つまたは複数の遺伝子の転写GSシグナルを変更することによって調節され得る。1つの例示的な態様では、M2のGSシグナルが、ウイルス複製にts制限を付け加えるための特定の突然変異を含むように改変される。
【００７１】
本発明内のさらに別のRSVクローンは、転写GEシグナルに対する改変を含む。例えば、NS1およびNS2遺伝子のGEシグナルをN遺伝子のそれと置き換えるか、または突然変異させて、リードスルーmRNAレベルの低下および下流遺伝子からのタンパク質発現の増加をもたらすRSVクローンが提供される。結果として生じる組換えウイルスは、増殖速度の増加およびプラークサイズの増加を示し、RSVゲノム中のシス作用調節エレメントの改変によるRSV増殖特性の変化の一例を提供する。
【００７２】
別の局面において、Gタンパク質の発現は、G mRNAを改変することで高めることができる。Gタンパク質は、膜結合型と分泌型の両方として発現され、後者の形態は、G遺伝子の翻訳オープンリーディングフレーム内の開始部位での翻訳開始によって発現される。分泌型は、発現されたGタンパク質の半分を占める可能性がある。内部開始部位の除去(例えば、配列の変更、欠失などによる)は、単独でまたは上流開始部位の配列関係の変更と合わせて、Gタンパク質発現の望ましい変化をもたらす。分泌型のGタンパク質の除去はまた、典型的な組換えRSVに対する宿主免疫応答の質を改善するであろう。なぜならば、Gタンパク質の可溶性形態は、中和抗体を捕捉する「おとり」として作用すると考えられるからである。また、可溶性Gタンパク質は、Th2優位な応答のその選択的刺激のために、免疫病理の増進に関与している。
【００７３】
さらに他の態様において、ワクチン製剤に有用なRSVは、循環ウイルスの抗原連続変異(antigenic drift)に応えるように、都合よく改変され得る。典型的には、その改変はGおよび/またはFタンパク質におけるものである。GもしくはF遺伝子全体、またはその特定の免疫原性領域をコードするセグメントが、感染性クローン中の対応する領域の置換によって、またはいくつかの抗原型が表されるように該遺伝子の1つまたは複数のコピーを追加することによって、RSVゲノムまたはアンチゲノムcDNAに組み込まれる。
【００７４】
組換えRSVに対する上記の改変に加えて、操作を容易にするために、様々な遺伝子間領域または他の場所にユニークな制限部位を挿入するなどの、異なるまたは追加の改変をRSVクローンにおいて行うことができる。非翻訳遺伝子配列は、外来配列を挿入する収容能力を高めるために除去され得る。
【００７５】
上述した特定の突然変異を感染性RSVクローンに導入することは、様々な周知の方法によって達成することができる。「感染性クローン」とは、感染性ウイルスを産生することが可能なゲノムRNAまたはアンチゲノムRNAに転写され得る、合成のまたはその他のcDNAもしくはその産物を意味する。「感染性」という用語は、培養細胞、動物またはヒト宿主内で複製して、同じ活性を有する子孫ウイルスまたはウイルス構造を産生することができるウイルスまたはウイルス構造を指す。したがって、特定された突然変異は、ゲノムまたはアンチゲノムのcDNAコピーに従来技術(例えば、部位特異的突然変異誘発)によって導入することができる。アンチゲノムまたはゲノムcDNAのサブフラグメントを用いて完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAを構築することは、当業者に周知であり、各領域を別々に操作して(小さなcDNAは大きなものよりも操作しやすい)、その後完全なcDNAに容易に組み立てることができるという利点を有する。したがって、完全なアンチゲノムもしくはゲノムcDNA、またはその任意のサブフラグメントは、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発のテンプレートとして使用され得る。突然変異したサブフラグメントは、その後、完全なアンチゲノムまたはゲノムcDNAに組み立てることができる。突然変異は、単一のヌクレオチド変化から、1つまたは複数の遺伝子またはゲノム領域を含む大きなcDNAピースの置換まで、様々であり得る。
【００７６】
組換えRSVは、RSVのゲノムRNAをコードするcDNAを、転写と複製を担うヌクレオカプシドを生成するのに必要なウイルスタンパク質と共に、細胞内共発現させることによって産生され得る。他のRSVタンパク質をコードするプラスミドも、これらの必須タンパク質と共に含めることができる。別法として、RNAをインビトロ転写反応で合成して、培養細胞にトランスフェクションすることができる。
【００７７】
したがって、本明細書には、記載された変異型ウイルスをコードする、記載されたゲノムもしくはアンチゲノムを構成する、記載されたゲノムもしくはアンチゲノムを発現する、または組換えRSVをインビトロで作製するのに有用な種々のタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドも記載される。いくつかの例示的なポリヌクレオチドの核酸配列もまた提供される。上記の核酸配列のいずれかからなるか、または本質的にそれらからなる配列を含むポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。さらに、上記の配列またはSEQ ID NOのいずれかに対して少なくとも約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％もしくはそれ以上の同一性、またはその間の任意の数値の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびに上記の分子にハイブリダイズする、または上記の分子の相補体であるポリヌクレオチドが含まれる。
【００７８】
これらのポリヌクレオチドは、組換えRSVを産生するために、ベクター内に含まれるか、またはベクターによって発現され得る。したがって、単離されたポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクションされた細胞もまた、本発明の範囲内であり、本明細書において例示される。
【００７９】
本発明の関連する局面では、組換えRSVを産生するための組成物(例えば、RSVをコードするcDNAを含む単離されたポリヌクレオチドおよびベクター)ならびに方法が提供される。本発明のこれらの局面には、本明細書に記載するように改変されたRSVゲノムまたはアンチゲノムを含む新規な単離されたポリヌクレオチド分子、ならびにそのような分子を組み込んだベクターが含まれる。また、RSVタンパク質をコードする1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含む同じまたは異なる発現ベクターも提供される。これらのタンパク質はまた、ゲノムまたはアンチゲノムcDNAから直接発現させることもできる。1つまたは複数のベクターは、好ましくは、細胞または無細胞溶解物中で発現または共発現され、それにより感染性の変異型RSV粒子またはサブウイルス粒子を産生する。
【００８０】
一局面において、本発明は、感染細胞内でのRSV増殖を可能にする条件下で、RSV感染を許容する宿主細胞に組換えRSV株を感染させることを含む、1または複数種の精製RSVタンパク質の産生方法を包含する。培養下での複製期間の後、細胞を溶解して、組換えRSVをそこから分離する。ウイルスの分離後、1または複数種の所望のRSVタンパク質を精製し、ワクチン、診断および他の用途のための1または複数種のRSVタンパク質を得る。
【００８１】
上記の方法および組成物は、感染性ウイルスもしくはサブウイルス粒子、またはそれらの誘導体を生じさせる。感染性ウイルスは、本物のRSVウイルス粒子に匹敵し、そのままで感染性である。それは新鮮細胞に直接感染することができる。感染性サブウイルス粒子は、典型的には、適切な条件下で感染を開始することができるウイルス粒子のサブ成分である。例えば、ゲノムRNAまたはアンチゲノムRNAとN、P、LおよびM2-1タンパク質を含むヌクレオカプシドは、細胞の細胞質に導入された場合に感染を開始することができるサブウイルス粒子の例である。本発明の範囲内で提供されるサブウイルス粒子には、感染力に必須ではない1または複数種のタンパク質、タンパク質セグメント、または他のウイルス成分を欠くウイルス粒子が含まれる。
【００８２】
他の態様において、本発明は、上記のような変異型RSVゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターと、RSVのN、P、LおよびRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質をコードする1または複数種の単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター(同じまたは異なるベクター)とを含む細胞または無細胞溶解物を提供する。これらのタンパク質の1または複数種は、ゲノムまたはアンチゲノムcDNAから発現させることもできる。発現されると、ゲノムまたはアンチゲノムとN、P、LおよびRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質が組み合わさって、感染性RSVウイルスまたはサブウイルス粒子を産生する。
【００８３】
本発明の組換えRSVは、RSV感染を受けやすい宿主においてRSVに対する所望の免疫応答を引き出すために、様々な組成物中で有用である。本発明の弱毒変異型RSV株は、感染したヒト宿主において防御免疫応答を誘発することができるが、免疫された宿主において重篤な呼吸器疾患の許容できない症状を引き起こさないように十分に弱毒化されている。弱毒化ウイルスまたはサブウイルス粒子は、細胞培養上清中に存在してもよいし、培養物から分離されてもよいし、部分的または完全に精製されてもよい。ウイルスはまた、凍結乾燥されてもよく、必要に応じて、保存または宿主への送達のために種々の他の成分と組み合わせることができる。
【００８４】
本発明の別の局面では、組換え変異体は、他の病原体、特にパラインフルエンザウイルス(PIV)のような呼吸器病原体の防御抗原のための「ベクター」として使用することができる。例えば、感染性弱毒ワクチンウイルスを産生するために、PIV由来の防御抗原をコードする配列を組み込んだ組換えRSVを遺伝子工学的に作製することができる。
【００８５】
関連する局面において、本発明は、対象哺乳動物におけるRSVに対する免疫応答を誘発するために、個体の免疫系を刺激する方法を提供する。この方法は、生理学的に許容される担体および/またはアジュバント中に免疫学的に十分な量の弱毒化組換え変異型RSVを含む免疫原性製剤を投与することを含む。
【００８６】
本発明はさらに、生理学的に許容される担体および/またはアジュバント、ならびに分離された弱毒化変異型RSV粒子またはサブウイルス粒子を含む新規ワクチンを提供する。
【００８７】
本明細書で提供される組換えRSV株の宿主から候補ワクチンウイルスを選択するために、生存能力、インビトロでの効率的な複製、インビボでの弱毒性、免疫原性、および表現型安定性の基準が周知の方法に従って決定される。本発明のワクチンにおいて最も望まれるウイルスは、生存能力を維持すべきであり、ワクチンの製造を可能にする許容条件下にインビトロで十分に複製すべきであり、安定した弱毒化表現型を持つべきであり、耐容性が良好であるべきであり、(より低いレベルにもかかわらず)免疫した宿主において複製を示すべきであり、その後の野生型ウイルスの感染により引き起こされる重篤な疾患に対する防御を与えるのに十分なワクチンの免疫応答を効果的に誘発すべきである。
【００８８】
ワクチン用および他の目的でRSVウイルスを増殖させるために、RSV増殖を可能にする多くの細胞株を使用することができる。RSVは種々のヒトおよび動物の細胞内で増殖する。ワクチン用の弱毒化RSウイルスを増殖させるための好ましい細胞株には、DBSFRhL-2、MRC-5およびVero細胞が含まれる。最も高いウイルス収量は、通常、Vero細胞のような上皮細胞株により達成される。典型的には、約0.001〜1.0またはそれ以上の範囲の感染多重度でウイルスを細胞に接種して、ウイルスの複製を許容する条件下で、例えば約30〜37℃で約3〜10日間、またはウイルスが適切な力価に達するのに必要な期間、培養する。温度感受性ウイルスは、「許容温度」として32℃を用いて増殖させることが多い。ウイルスを細胞培養物から取り出して、典型的には周知の清澄化手順、例えば遠心分離によって細胞成分から分離し、当業者に周知の方法を用いて、必要に応じてさらに精製することができる。
【００８９】
本明細書に記載するように弱毒化されたRSVは、ワクチンでの使用のために適切な弱毒性、表現型復帰に対する抵抗性、および免疫原性を確認するために、種々のよく知られた、一般的に受け入れられたインビトロおよびインビボモデルにおいて試験することができる。インビトロアッセイでは、多重弱毒化された、生物学的に誘導された、または組換えRSVであり得る改変型ウイルスが、ウイルス複製の温度感受性または「ts表現型」について、および小さなプラークの表現型について試験される。改変型ウイルスはまた、インビトロヒト気道上皮(HAE)モデルにおいて評価することもでき、このモデルは、非ヒト霊長類およびヒトにおけるそれらの相対的弱毒化の順にウイルスをランク付けする手段を提供するようである(Zhang et al 2002 J Virol 76:5654-5666; Schaap-Nutt et al 2010 Vaccine 28:2788-2798; Ilyushina et al 2012 J Virol 86:11725-11734)。改変型ウイルスはRSV感染の動物モデルにおいてさらに試験される。様々な動物モデル(例えば、ネズミ、コットンラット、および霊長類)が記載されており、当業者には公知である。
【００９０】
上記の記載に従って、また以下の実施例に基づいて、本発明はまた、ワクチンに利用するための分離された感染性RSV組成物を提供する。ワクチンの成分である弱毒化ウイルスは、分離された、典型的には精製された形態である。分離されたとは、感染個体の鼻咽頭のような、野生型ウイルスの天然環境以外にあるRSVを指すことを意味する。より一般的には、分離されたとは、細胞培養物または他の人工培地の成分として弱毒化ウイルスを含むことを意味する。例えば、本発明の弱毒化RSVは、感染した細胞培養物によって産生され、該細胞培養物から分離されて、スタビライザーに添加され得る。
【００９１】
本発明のRSVワクチンは、有効成分として、本明細書に記載のように産生されたRSVを免疫原として有効な量で含有する。生物学的に誘導されたまたは組換えRSVは、ワクチン製剤に直接使用することができる。生物学的に誘導されたまたは組換えにより改変されたウイルスは、生理学的に許容される担体および/またはアジュバントと共に宿主に導入され得る。有用な担体は当技術分野において周知であり、例えば、水、緩衝水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などが含まれる。得られた水溶液は、そのままで使用するために、または使用前に解凍される凍結形態で、または凍結乾燥して、包装することができ、凍結乾燥製剤は、上記のように、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含むことができ、それらには、限定するものではないが、以下が含まれる：pH調整・緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、スクロース、硫酸マグネシウム、リン酸緩衝剤、HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝剤、ソルビタンモノラウレート、およびオレイン酸トリエタノールアミン。許容されるアジュバントには、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンが含まれ、これらは当技術分野で周知の物質である。好ましいアジュバントにはまた、Stimulon(商標)QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worchester, Mass.)、MPL(商標)(3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA；RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.)、およびインターロイキン-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.)も含まれる。
【００９２】
宿主は、RSVワクチン組成物で免疫化すると、RSVウイルスタンパク質、例えばFおよびG糖タンパク質、に特異的な抗体を産生することによって該ワクチンに応答する。さらに、自然免疫応答および細胞性免疫応答が誘導され、これは免疫応答を調節するだけでなく、抗ウイルスエフェクターを提供することができる。ワクチン接種の結果、宿主は、RSV感染に対して少なくとも部分的または完全に免疫になるか、または中等度もしくは重度のRSV疾患、特に下気道疾患、の発症に抵抗性を持つようになる。
【００９３】
本発明の弱毒化RSVを含有するワクチン組成物は、RSVに対する個体の免疫応答能を誘導または増強するのに十分な「免疫原として有効な用量」で、RSV感染を受けやすいか、そうでなければRSV感染のリスクがある対象に投与される。RSVワクチン組成物は、注射、エアロゾル送達、鼻腔用スプレー、点鼻剤、経口接種、または局所適用を含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法によって投与することができる。ヒト対象の場合、本発明の弱毒化ウイルスは、十分に確立されたヒトRSVワクチンプロトコルに従って投与される(Karron et al. JID 191:1093-104, 2005)。簡単に説明すると、成人または小児に、典型的には0.5ml量の生理学的に許容される希釈剤または担体中の、RSVワクチンの免疫原として有効な用量を、液滴によって鼻腔内接種する。これは、非複製性ワクチンによる非経口免疫化と比較して、簡便性および安全性の利点を有する。それはまた、RSVに対する抵抗において主要な役割を果たす、局所呼吸器免疫の直接的な刺激をもたらす。さらに、このワクチン接種方法は、一般的には幼い頃に見られる母親由来のRSV特異的血清抗体の免疫抑制作用を効果的に迂回する。また、RSV抗原の非経口投与は免疫病理学的合併症を伴うことがあるが、こうしたことは生ウイルスでは観察されていない。
【００９４】
いくつかの態様では、ワクチンは鼻腔内、皮下、または筋肉内に投与され得る。いくつかの態様では、それは上気道に投与され得る。これは、スプレー、液滴またはエアロゾル送達を含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法によって行うことができる。多くの場合、該組成物は、RSV抗体について血清反応陰性である個体、または経胎盤的に獲得した母親由来のRSV抗体を有する個体に投与される。
【００９５】
全ての対象において、投与されるRSVワクチンの正確な量ならびに投与時期および頻度は、患者の健康状態と体重、投与方法、製剤の性質などを含む様々な要因によって決定される。投与量は、一般に、患者あたり約3.0 log10〜約6.0 log10プラーク形成単位(「PFU」)またはそれ以上のウイルス、より一般には患者あたり約4.0 log10〜5.0 log10 PFUウイルスの範囲である。一態様では、患者あたり約5.0 log10〜6.0 log10 PFUを、例えば1〜6ヶ月齢の乳児期に投与することができ、1回目の投与の2〜6ヶ月またはそれ以上の後に1または複数回の追加のブースター量を投与することができる。別の態様では、乳児に、約5.0 log10〜6.0 log10 PFU/患者の用量を、多くの他の小児期ワクチンの推奨される投与時期である約2、4および6ヶ月齢で投与することができる。さらに別の態様では、追加のブースター量を約10〜15ヶ月齢で投与することができる。どのような場合でも、ワクチン製剤は、抗RSV免疫応答を効果的に刺激または誘発するのに十分な量(「有効量」)の本発明の弱毒化RSVを提供すべきである。
【００９６】
いくつかの態様では、ワクチンは、単一のRSV株もしくは抗原サブグループ、例えばAまたはB、に対する免疫応答、または複数のRSV株もしくはサブグループに対する免疫応答を誘発する弱毒化組換えウイルスを含み得る。これに関連して、組換え変異型RSVは、1つまたは複数のRSV株またはサブグループに対するより効果的な防御のために、異なる免疫原特性を有する他のRSVワクチン株またはサブグループとワクチン製剤中で組み合わせることができる。それらは、ワクチン混合物として一緒に投与されてもよいし、1つのRSV株または複数のRSV株もしくはサブグループに対するより効果的な防御を誘導するための協調的な治療プロトコルで別々に投与されてもよい。
【００９７】
結果として生じる免疫応答は、様々な方法で特徴付けることができる。これらには、RSV特異的抗体の分析用の鼻洗浄液または血清のサンプルを採取することが含まれ、抗体は、補体結合、プラーク中和、酵素結合免疫吸着アッセイ、ルシフェラーゼ免疫沈降アッセイ、およびフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない試験によって、検出することができる。さらに、免疫応答は、以下によって検出することができる：鼻洗浄液もしくは血清中のサイトカインのアッセイ、いずれかの供給源からの免疫細胞のELISPOT、鼻洗浄液もしくは血清サンプルの定量的RT-PCRまたはマイクロアレイ分析、ならびにインビトロでのウイルス抗原への再曝露による鼻洗浄液もしくは血清由来の免疫細胞の再刺激と、フローサイトメトリーによるサイトカイン、表面マーカーまたは他の免疫相関指標の産生もしくは表示の分析、あるいはRSV抗原を提示するインジケータ標的細胞に対する細胞傷害活性の分析。これに関連して、個体はまた、上気道疾患の兆候および症状についてもモニタリングされる。
【００９８】
ワクチンウイルスの弱毒化のレベルは、例えば、免疫された宿主の気道に存在するウイルスの量を定量し、その量を、野生型RSVまたは候補ワクチン株として評価された他の弱毒化RSウイルスによって産生された量と比較することによって、決定することができる。例えば、本発明の弱毒化ウイルスは、野生型ウイルスの複製レベルと比較して、チンパンジーのような高度に感受性の宿主の上気道において、より大きな程度の複製制限を有するであろう(例えば10〜1000倍少ない)。上気道でのウイルスの複製に関連した鼻漏の発生をさらに低減させるために、理想的なワクチン候補ウイルスは、上気道と下気道の両方において制限されたレベルの複製を示すべきである。しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスは、ワクチン接種個体において防御を与えるために、十分に感染性でありかつヒトにおいて免疫原性でなければならない。感染した宿主の鼻咽頭におけるRSVのレベルを測定する方法は、文献に記載されており周知である。検体は鼻咽頭分泌物の吸引または洗い出しによって得られ、ウイルスは実験室手順による組織培養またはその他で定量化される。例えば、Belshe et al., J. Med. Virology 1:157-162 (1977); Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969); およびWright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41:238-247 (1973)を参照されたい。このウイルスは、チンパンジーのような宿主動物の鼻咽頭において簡便に測定することができる。
【００９９】
要約すると、本開示に記載される材料、情報、および方法は、段階的な弱毒化表現型を有する一連の弱毒株を提供し、かつ臨床的ベンチマークに基づいて適切なワクチン候補株を選択するための指針を提供する。以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【０１００】
さらなる態様
項目1．  RSVゲノムまたはアンチゲノム配列を含む弱毒化表現型を有する組換えRSウイルス変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド分子であって、該RSVゲノムまたはアンチゲノムは、
(a) NS1遺伝子が位置1よりも高い遺伝子位置にある；
(b) NS2遺伝子が位置2よりも高い遺伝子位置にある；および
(c) (a)と(b)の組み合わせ；
からなる群より選択される改変を含み、任意で、レポーター遺伝子をさらに含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
項目2．  前記改変が(a)と(b)の組み合わせである、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目3．  NS1遺伝子が遺伝子位置7にあり、かつNS2遺伝子が遺伝子位置8にある、項目2記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目4．  NS1遺伝子が遺伝子位置9にあり、かつNS2遺伝子が遺伝子位置10にある、項目2記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目5．  前記改変が(a)である、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目6．  NS1遺伝子が遺伝子位置7または9にある、項目5記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目7．  前記改変が(b)である、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目8．  RSVゲノムまたはアンチゲノムがNS1またはNS2遺伝子の全部または一部の欠失をさらに含む、項目5、6または7記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目9．  M2-2遺伝子の全部または一部の欠失をさらに含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目10．  RSVゲノムまたはアンチゲノムが、SEQ ID NO:2と少なくとも90％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を有する、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目11．  RSVゲノムまたはアンチゲノムが、SEQ ID NO:2に示されるポジティブセンス配列を有する、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目12．  RSVゲノムまたはアンチゲノムが、SEQ ID NO:4と少なくとも90％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を有する、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目13．  RSVゲノムまたはアンチゲノムが、SEQ ID NO:4に示されるポジティブセンス配列を有する、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目14．  RSVゲノムまたはアンチゲノムが、SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:8からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を有する、項目8記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目15．  レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする、項目1記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目16．  RSVゲノムまたはアンチゲノムが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一である配列によって示されるポジティブセンス配列を有する、項目15記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目17．  遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、NS1遺伝子および/またはNS2遺伝子の発現が低下している、項目1〜16のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目18．  遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、NS1遺伝子および/またはNS2遺伝子の転写が低下している、項目1〜17のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目19．  遺伝子位置1にNS1遺伝子および遺伝子位置2にNS2遺伝子を有するRSVと比較して、宿主インターフェロン応答の阻害が低下している、項目1〜16のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目20．  RSV変異体が、ウイルス感染に応答してインターフェロンを産生し得る培養細胞において、次第に制限を受けやすくなる、項目1〜16のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目21．  RSV変異体が、ウイルス感染に応答してインターフェロンを産生し得ない培養細胞において、複製効率を保持する、項目1〜16のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
項目22．  項目1〜21のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
項目23．  項目1〜21のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、細胞。
項目24．  項目1〜21のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子によってコードされる組換えRSV変異体を免疫学的に有効な量で含有する、薬学的組成物。
項目25．  アジュバントをさらに含む、項目24記載の薬学的組成物。
項目26．  項目24記載の薬学的組成物を投与することを含んでなる、RSVに対して対象をワクチン接種する方法。
項目27．  薬学的組成物を鼻腔内投与する、項目26記載の方法。
項目28．  薬学的組成物を注射、エアロゾル送達、鼻腔用スプレー、または点鼻剤によって投与する、項目26または27記載の方法。
【０１０１】
例示的な配列
RSV 6120/NS12FM2GFPのアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:1)
2018537103.tif 000003
2018537103.tif 000004
2018537103.tif 000005
2018537103.tif 000006
【０１０２】
RSV 6120/NS12FM2のアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:2)
2018537103.tif 000007
2018537103.tif 000008
2018537103.tif 000009
2018537103.tif 000010
【０１０３】
RSV 6120/NS12LtrGFPのアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:3)
2018537103.tif 000011
2018537103.tif 000012
2018537103.tif 000013
2018537103.tif 000014
2018537103.tif 000015
【０１０４】
RSV 6120/NS12LtrのアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:4)
2018537103.tif 000016
2018537103.tif 000017
2018537103.tif 000018
2018537103.tif 000019
【０１０５】
RSV 6120/NS12FM2/ΔNS2GFPのアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:5)
2018537103.tif 000020
2018537103.tif 000021
2018537103.tif 000022
2018537103.tif 000023
【０１０６】
RSV 6120/NS12FM2/ΔNS2のアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:6)
2018537103.tif 000024
2018537103.tif 000025
2018537103.tif 000026
2018537103.tif 000027
【０１０７】
RSV 6120/NS12Ltr/ΔNS2/GFPのアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:7)
2018537103.tif 000028
2018537103.tif 000029
2018537103.tif 000030
2018537103.tif 000031
【０１０８】
RSV 6120/NS12Ltr/ΔNS2のアンチゲノムcDNA配列(SEQ ID NO:8)
2018537103.tif 000032
2018537103.tif 000033
2018537103.tif 000034
2018537103.tif 000035
【実施例】
【０１０９】
要約すると、本開示に記載される材料、情報、および方法は、段階的な弱毒表現型を有する一連の弱毒化株を提供し、かつ臨床的ベンチマークに基づいて適切なワクチン候補株を選択するための指針を提供する。以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【０１１０】
実施例1
この実施例は、組換えRSV 6120/NS12FM2/GFPおよび6120/NS12FM2の設計、構築および回収を示す。
【０１１１】
6120/NS12FM2/GFPを構築するために使用したRSVアンチゲノムは、D46(またはD53)と呼ばれる非改変WT RSV A2株のアンチゲノムcDNAの「6120」誘導体であった。D46/D53は、現行の逆遺伝学システムの基礎であり(Collins, et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567)、その完全な配列は、米国特許第6,790,449号およびGenBank KT992094に示されており、本発明の構築物と比較して1938位(N遺伝子のORF中)に単一の差異を有する。具体的には、米国特許第6,790,449号およびGenBank KT992094での1938位のヌクレオチド割り当てはAであるが、本明細書で提供される配列ではGである。この差異はアミノ酸コードを変化させず、影響のない差異であると理解される。6120誘導体は、SH遺伝子の下流の非翻訳領域の112ヌクレオチドの欠失を、SH ORFの最後の3つのコドンおよび終止コドンを含む5つのヌクレオチドの置換(アミノ酸コードを変化させない)とともに含んでいた(Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140)。さらに、このアンチゲノムcDNAは、RSV P遺伝子とM遺伝子の間に挿入された高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を第3の遺伝子として含むように予め改変されていた(Munir et al 2008 J Virol 82:8780-8796)。第1の遺伝子位置へのGFP遺伝子の挿入は、細胞株およびインビトロヒト気道上皮(HAE)培養物におけるRSVの複製または病原性にほとんどまたはまったく影響を及ぼさないことが以前に示された(Zhang et al 2002 J Virol 76:5654-5666)；そしてP遺伝子とM遺伝子の間に挿入されたGFPの場合も同様のようであった(Munir et al 2008 J Virol 82:8780-8796)。ウイルスゲノムからGFPを発現させる目的は、初期実験において感染のモニタリングを容易にすることであった。なぜならば、それは感染を妨げることなく生存細胞への感染を可視化することができるためである。初期の実験では、GFPはこのようなやり方で用いられることが多い。GFP遺伝子は遺伝子位置のナンバリングに含まれなかったことに留意されたい。
【０１１２】
図1の上部(「RSVゲノム」の略図より上)は、NS1およびNS2 ORFとそれらの隣接遺伝子配列の大部分の、該ゲノム中のそれらの天然の位置1および2からの欠失を示す。この欠失は、NS1遺伝子の上流の非翻訳領域をN遺伝子ORFに融合させる結果をもたらす。図1の下部(「RSVゲノム」の略図より下)は、F遺伝子とM2遺伝子との遺伝子間領域におけるKpnI部位の作製およびこの部位でのNS1/NS2遺伝子カセットの挿入を示す。6120/NS12FM2/GFPにおいて、NS1遺伝子とNS2遺伝子は、組換えDNA法によって、RSVアンチゲノムcDNA中のそれらの天然の位置1および2から位置7および8にシフトされた。GFP遺伝子は遺伝子位置のナンバリングに含まれなかったことに留意されたい。このシフトを図1に示す。組換えRSV 6120/NS12FM2/GFPウイルスを逆遺伝学により回収した。
【０１１３】
最終ワクチン製品の場合、GFPは存在しないことが好ましいであろう。したがって、部位特異的突然変異誘発を用いてRSV 6120/NS12FM2/GFP cDNAからGFP遺伝子を除去し、RSV 6120/NS12FM2を作製した。この構築物は、他の点では図1に示したものと同一である。RSV 6120/NS12FM2は、逆遺伝学により回収したところ、Vero細胞内でRSV 6120/NS12FM2/GFPと同様に複製することが見いだされた。
【０１１４】
命名法に関しては、必然的に、使用に若干の柔軟性があることに注意されたい。例えば、6120/NS12FM2/ΔNS2は、6120_NS12FM2_ΔNS2および6120_NS12FM2_DNS2(一部の記号はインシリコで変更可能であることを反映している)、または6120/NS12FM2/ΔNS2、または6120/NS12FM2/ΔNS2、または6120NS12FM2/ΔNS2など、とも呼ばれることがある。別の例として、RSV 6120/NS12FM2は6120/NS12FM2と同等である(一部の記述子はその意味に必須ではない）。別の例として、本明細書に記載されるように、様々な名称を簡略化のために省略することができる；例えば、6120/NS12FM2は、F-M2と省略され得る。
【０１１５】
実施例2
この実施例は、rRSV 6120/NS12Ltr/GFPおよび6120/NS12Ltrの設計および構築を示す。
【０１１６】
6120/NS12Ltr/GFPを構築するために使用したRSVアンチゲノムは、WT RSVアンチゲノムcDNAの「6120」誘導体であり、実施例1に記載したように、これもウイルスのM遺伝子とP遺伝子の間にGFP遺伝子を含んでいた。
【０１１７】
RSV 6120/NS12Ltr/GFPにおいて、NS1遺伝子とNS2遺伝子は、組換えDNA法によって、該アンチゲノムcDNA中のそれらの天然の位置1および2から位置9および10にシフトされた。GFP遺伝子は遺伝子位置のナンバリングに含まれないことに留意されたい。図2の上部(「RSVゲノム」の略図より上)は、図1と同様にNS1およびNS2 ORFの欠失を示す。図2の下部(「RSVゲノム」の略図より下)は、L遺伝子の直後のトレーラー領域におけるKpnI部位の作製およびこの部位でのNS1/NS2遺伝子カセットの挿入を示す。RSV 6120/NS12Ltr/GFPウイルスを逆遺伝学により回収した。
【０１１８】
さらに、GFP遺伝子を部位特異的突然変異誘発によって欠失させた、RSV 6120/NS12Ltrと呼ばれる後続バージョンを構築した。この構築物は、他の点では図2に示したものと同一である。
【０１１９】
実施例3
この実施例は、組換えRSV 6120/NS12FM2/GFPの複製特性を記載する。
【０１２０】
組換えRSV 6120/NS12FM2/GFP (F-M2)ウイルスのマルチサイクル複製の動態および収量を、ウイルス感染に応答してI型インターフェロンを産生することができないアフリカミドリザルVero細胞において、wt RSV/GFP (wt RSV)およびRSV ΔNS1/ΔNS2/GFP (delNS1_NS2)のそれと比較した。wt RSVおよびdelNS1_NS2ウイルスも6120骨格であり、ウイルス遺伝子PおよびMの間にGFP遺伝子を含むことに留意されたい。したがって、F-M2ウイルスおよび対照ウイルスは、同じウイルス骨格に基づいており、直接比較することができる。
【０１２１】
Vero細胞内に調製して、0.01のMOIで感染させたウイルスストックを用いて、ウイルスあたり2つの独立した培養物(01および02)を評価した。感染後、細胞上清サンプルを毎日採取し、続いてVero細胞におけるプラーク滴定(plaque titration)によって並行して評価した。これらの結果は、ワクチンウイルス製造の基材であるVero細胞において、F-M2ウイルスがwt RSVと同様に効率よく複製したが、delNS1_NS2ウイルスは制限されたことを示した。図3を参照されたい。かくして、F-M2ウイルスは、効率的なワクチン製造能力を保持する。この結果は、NS1またはNS2の欠失が、ワクチン製造に用いられるVero細胞を含む細胞培養においてRSV複製の効率を大幅に低下させることが示されているため、予測できなかった。なぜならば、これらのウイルスタンパク質のいずれか一方または両方の欠失はアポトーシスの増加をもたらし、結果的に細胞単層の崩壊を招くからである(Bitko et al 2007 J Virol 81:1786-1795)。これは、delNS1_NS2変異体の大幅に減少した複製によって図3において証明される。さらに、RSVのΔNS1変異体を含む臨床試験材料を作製しようとする試みは、不十分な力価のために成功しなかった。wt RSVの効率と区別できない効率で複製するF-M2ウイルスの能力は、NS1およびNS2の低下した発現レベルが、効率的なウイルス複製に十分なアポトーシスの抑制を維持するのに十分であった、ということを示している。
【０１２２】
ウイルス複製の同様の比較を、ウイルス感染に対してインターフェロン応答をする能力があるヒト気道A549細胞において並行して実施した。図3と同じVero増殖ウイルスを用いて感染を行い、0.01のMOIで感染させた；ウイルス複製をVero細胞でのプラークアッセイにより定量化した。これらの結果は、F-M2ウイルスがwt RSVほど効率的に複製しないが、delNS1_NS2ウイルスよりも効率的に複製することを示した。図4を参照されたい。NS1およびNS2アクセサリータンパク質に変異/欠失を有するウイルスによるA549細胞における増殖効率は、インビボでの弱毒化のマーカーとなる。類似のΔNS1ΔNS2ウイルスはインビボで過度に弱毒化されていることが示された(Jin et al 203 Vaccine 21:3647-3652)。F-M2ウイルスの中間的な制限レベルは、この遺伝子シフトが、単独でまたは他の弱毒突然変異と組み合わせて、ワクチンウイルスにおける有用な弱毒突然変異であることを示す。
【０１２３】
実施例4
この実施例は、組換えRSV 6120/NS12Ltr/GFPの複製特性を記載する。
【０１２４】
RSV 6120/NS12Ltr/GFP (L-tr)ウイルスを、実施例3の実験デザインに従って、Vero細胞におけるマルチサイクル複製についてwt RSV/GFP (wt RSV)およびRSV ΔNS1/ΔNS2GFP (delNS1_NS2)と比較した。これらの結果は、L-trウイルスがVero細胞においてwt RSVと同様に効率よく複製し、したがって効率的なワクチン製造能力を保持することを示した。図5を参照されたい。
【０１２５】
ウイルス複製の同様の比較を、ヒト気道A549細胞において並行して行った。これらの結果は、L-trウイルスがwt RSVほど効率的に複製しないが、delNS1_NS2ウイルスよりも効率的に複製することを示した。図6を参照されたい。さらに、L-trウイルスはF-M2ウイルスほど効率的に複製せず(図4参照)、NS1およびNS2遺伝子を徐々にプロモーターの遠位位置に移動させると制限レベルが増加するという解釈と一致する。この遺伝子シフトは、F-M2ウイルスのより弱毒化された代替ウイルスを提供し、これはそのままの状態で有用なワクチンウイルス(好ましくはGFP遺伝子を欠失させたもの)であるか、または別の弱毒突然変異の追加によってさらに改変される。
【０１２６】
実施例5
この実施例は、RSV 6120/NS12M2F/GFPおよびRSV 6120/NS12FM2からのNS2遺伝子の欠失を記載する。
【０１２７】
NS1および/またはNS2の遺伝子シフトを別の弱毒突然変異とどのように組み合わせることができるかを例示するために、RSV 6120/NS12FM2/GFPおよびRSV 6120/NS12FM2からNS2遺伝子を欠失させて、それぞれRSV 6120/NS12FM2/ΔNS2/GFPおよびRSV 6120/NS12FM2/ΔNS2を生じさせた。RSV 6120/NS12FM2/ΔNS2/GFPの作製を図7に示す。図1と同じRSV 6120/NS12FM2/GFP (上部)を部位特異的突然変異誘発によって改変し、NS2遺伝子のGSシグナルの最初のヌクレオチドからM2-2遺伝子の最初のヌクレオチドまでの領域を、両端を含めて欠失させた。これは、6120/NS12FM2/GFP中の完全なNS2遺伝子ならびに長いNS2-M2遺伝子間領域を欠失させた。NS2遺伝子のみの欠失は、NS1遺伝子の欠失によるはるかに高いレベルの弱毒化と比較して(Teng et al 2000 J Virol 74:9317-9321)、中程度の量の弱毒化をもたらすことが以前に示されている(Whitehead et al 1999 J Virol 73:3438-3442)。両方のウイルスは逆遺伝学によって容易に回収された。
【０１２８】
実施例6
この実施例は、RSV 6120/NS12Ltr/GFPおよびRSV 6120/NS12LtrからのNS2遺伝子の欠失を記載する。
【０１２９】
RSV 6120/NS12Ltr/GFPおよびRSV 6120/NS12LtrからもNS2遺伝子を欠失させて、RSV 6120/NS12Ltr/ΔNS2/GFPおよびRSV 6120/NS12Ltr/ΔNS2を生じさせた。RSV 6120/NS12Ltr/ΔNS2/GFPの作製を図8に示す。図2と同じRSV 6120/NS12Ltr/GFP (上部)を部位特異的突然変異誘発によって改変し、NS2遺伝子のGSシグナルの最初のヌクレオチドからNS2遺伝子のGEシグナルの最後のヌクレオチドまでの領域を、両端を含めて欠失させた。これは完全なNS2遺伝子を欠失させた。
【０１３０】
実施例7
この実施例は、組換えウイルス6120/NS12FM2/ΔNS2/GFPの複製特性を記載する。
【０１３１】
組換え6120/NS12FM2/ΔNS2/GFP (F-M2/delNS2)ウイルスのマルチサイクル複製の動態および収量を、実施例3の一般的実験デザインに従って、アフリカミドリザルVero細胞において、その直近の親であるRSV 6120/NS12FM2/GFP (F-M2)、wt RSV/GFP (wt RSV)、およびRSV ΔNS1/ΔNS2/GFP (delNS1_NS2)のそれと比較した。これらの結果(図9)は、F-M2/delNS2ウイルスがワクチンウイルス製造の基材であるVero細胞においてF-M2およびwt RSVとほぼ同じ効率で複製したのに対して、delNS1_NS2は以前に示されたように制限されたことを示した。したがって、F-M2/delNS2ウイルスは、F-M2およびΔNS2の2つの弱毒化要素を含んでいるにもかかわらず、効率的なワクチン製造能力を保持する。
【０１３２】
ウイルス複製の同様の比較を、実施例3の一般的な実験設計に従って、ヒト気道A549細胞において並行して行った。これらの結果(図10)は、これらのウイルスが、wt RSV＜F-M2＜F-M2/delNS2＜delNS1_NS2の順に増加する、ある範囲の制限を受けたことを示した。上記のように、NS1および/またはNS2アクセサリータンパク質に変異/欠損を有するウイルスによるA549細胞における増殖制限は、インビボでの弱毒化のマーカーとなる。F-M2/delNS2がF-M2よりも制限されるという観察は、これらの突然変異の組み合わせがさらに制限された誘導体を実際にもたらしたことを示している。図10におけるdelNS1_NS2ウイルスに類似したΔNS1ΔNS2ウイルスがアフリカミドリザルで過度に弱毒化されていることが、以前に示された(Jin et al 203 Vaccine 21:3647-3652)。したがって、F-M2ウイルスとF-M2/delNS2ウイルスの利用可能性は、制限が比較的少ないものの、ある範囲の制限を示す2つの代替物を提供する。
【０１３３】
これらは今や、HAE培養物、げっ歯類、およびアフリカミドリザルにおいて、ベンチマークとしての以前のワクチン候補と並行して評価され得る(Karron et al 2013 Curr Top Microbiol Immunol 372:259-284)。好ましくは、この分析は、記載されるような、GFP遺伝子を含まないF-M2およびF-M2/delNS2のバージョンを含むであろう。さらに、図8に記載のRSV 6120/NS12Ltr/ΔNS2/GFP (L-tr/delNS2)構築物とそのGFPを欠く誘導体もまた、並行して評価され得る。L-trシフトはF-M2シフトよりも弱毒性であるので(図4対図6)、これはさらなる範囲の制限を提供するであろう。1つ以上の適切な候補ワクチンは、記載されるように(例えば、Karron, et al. 2015, Science Transl Med 2015 7(312):312ra175)、ヒトボランティアにおいて評価され得る。
【０１３４】
記載された方法または組成物の正確な詳細は、記載された実施態様の精神から逸脱することなく、変更または改変され得ることが明らかであろう。本発明者らは、以下の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる全てのそのような改変および変形を請求するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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