(57)【要約】  本明細書において、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する抗体が提供される。提供されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体又は抗原結合フラグメントを発現している細胞、並びに関連するベクター、及び検出可能に標識された抗体又は抗原結合フラグメントも記載されている。加えて、提供された抗体を使用する方法が記載されている。例えば、提供された抗体を使用して、ＢＣＭＡ発現がんの進行、退行、又は安定性を診断、処置、若しくはモニタすること、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいるため、ＢＣＭＡ特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受けることができるか否かを判定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する組換え抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は重鎖及び軽鎖を有し、前記重鎖は、
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む、組換え抗体、又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を更に含む、請求項１に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
（ａ）の抗体の重鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、（ｂ）の抗体の重鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、（ｆ）の抗体の重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、（ｋ）の抗体の重鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、（ｌ）の抗体の重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、（ｍ）の抗体の重鎖は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、又は（ｎ）の抗体の重鎖は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体の軽鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項２又は３に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの抗体又は抗原結合フラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬの相互作用を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ＥＬＩＳＡにより測定するとき、ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬの相互作用について約５．９ｎＭのＩＣ５０を示す、請求項８に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントはＩｇＧである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ＩｇＧ４は、そのＦｃ領域中にＳ２２８Ｐ置換、Ｌ２３４Ａ置換、及びＬ２３５Ａ置換を有する、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡに免疫特異的に結合し、カニクイザルＢＣＭＡに交差反応する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現している、組換え細胞。
【請求項１７】
前記細胞はハイブリドーマである、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記抗体は組換え的に生成される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメントであって、
ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）と、
ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）と、
ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）と、
ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含み、
ＨＣ１はＬＣ１と結合され、ＨＣ２はＬＣ２と結合され、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するために、ＨＣ１は配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含み、ＬＣ１は配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号６４を含み、またＢＣＭＡに免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するために、ＨＣ２は配列番号４、配列番号５、及び配列番号６を含み、ＬＣ２は配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６を含む、組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号５５を含むＨＣ１と、配列番号５６を含むＬＣ１と、配列番号６５を含むＨＣ２と、配列番号７６を含むＬＣ２と、を含む、請求項１９に記載の組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのフラグメント。
【請求項２１】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントはＩｇＧである、請求項２０に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２２】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１９、２０、又は２１のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２３】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定するとき、少なくとも０．２２ｎＭの親和性でヒトＢＣＭＡに免疫特異的に結合する、請求項１９〜２２に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２４】
前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、請求項１９〜２３に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２５】
前記抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、請求項１９〜２４に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２６】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約０．３７ｎＭ未満のＥＣ５０でインビトロでヒトＴ細胞活性化を誘発する、請求項１９〜２５に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２７】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約０．４５ｎＭ未満のＥＣ５０でインビトロでＢＣＭＡ発現細胞のＴ細胞依存性細胞傷害を誘発する、請求項１９〜２６に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２８】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、ＢＣＭＡアゴニストではない、請求項１９〜２７に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項２９】
前記抗体又は二重特異性結合フラグメントは、１０ｎＭ未満の濃度でＮＦ−κＢ活性化を変化させない、請求項１９〜２８に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している、組換え細胞。
【請求項３１】
前記細胞はハイブリドーマである、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
がんを有する対象を処置するための方法であって、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を、それを必要とする対象に、がんを処置するのに十分な時間投与することを含む、方法。
【請求項３３】
がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することを含む、方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を投与し、Ｔ細胞をがんにリダイレクトすることを含む、方法。
【請求項３５】
前記がんは血液がんである、請求項３２、３３、又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記血液がんはＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がんは多発性骨髄腫である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第２の治療剤を投与することを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法。
【請求項４３】
請求項１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントのＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、又はＬＣ２をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項１９〜２９のいずれか一項に定義されるようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント、及び／又は請求項４４に定義されるようなポリヌクレオチド、及びこれらのための包装、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年８月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／２０６，２４６号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、当該配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年８月１５日に作成され、ファイル名はＰＲＤ３３８３ＵＳＮＰ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは８７，３４１バイトである。
【０００３】
技術分野
本明細書で提供される開示は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体、ＢＣＭＡ及びクラスター決定因子３（ＣＤ３）に免疫特異的に結合する多重特異性抗体、並びに当該抗体の産生及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｂ細胞成熟抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても周知であるが、分化形質細胞に優先的に発現される腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである［Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ  １１（１１）：３８９７〜３９０４；Ｍａｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０（１１）：１６９３〜１７０２］。ＢＣＭＡは、非グリコシル化Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｂ細胞の成熟、増殖、及び生存に関与する。ＢＣＭＡは、ＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンドの受容体であり、これらのリガンドは、ＢＣＭＡに対する高親和性リガンドであるＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド、ＣＤ２５６、ＴＮＦＳＦ１３）、及びＢＣＭＡに対する低親和性リガンドであるＢ細胞活性化因子ＢＡＦＦ（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ−１、及びｚＴＮＦ４）である。ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは、構造類似性と、重複するが異なる受容体結合特異性とを示す。負の制御因子ＴＡＣＩもＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦのＢＣＭＡ及び／又はＴＡＣＩへの配位結合は、転写因子ＮＦ−κＢを活性化し、生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１）の発現を増加させ、アポトーシス促進因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）の発現を減少させることにより、アポトーシスを阻害して生存を促進する。この複合作用は、Ｂ細胞の分化、増殖、生存、及び抗体産生を促進する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１）２４４（１）：１１５〜１３３に概説されるように）。この発見と一致して、ＢＣＭＡはまた、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞などの悪性ヒトＢ細胞の増殖及び生存も支持する。Ｎｏｖａｋらは、ＭＭ細胞株及び新鮮単離ＭＭ細胞が、それらの細胞表面上にＢＣＭＡ及びＴＡＣＩタンパク質を発現し、それらの細胞表面上でのＢＡＦＦ−Ｒタンパク質の発現にばらつきがあることを発見している（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３（２）：６８９〜６９４）。
【０００５】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、２番目に多い血液悪性腫瘍であり、全がん死亡の２％を構成する。ＭＭは、異質性疾患であり、多くは染色体転座、とりわけｔ（１１；１４）、ｔ（４；１４）、ｔ（８；１４）、ｄｅｌ（１３）、ｄｅｌ（１７）により生じる（Ｄｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２（３）：８０２〜８０９；Ｇｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６（８）：２８３７〜２８４０；Ｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７（６）：１５６６〜１５７１）。ＭＭ罹患患者は、骨髄浸潤、骨破壊、腎不全、免疫不全、及びがん診断の心理社会的負担のために、様々な疾患関連症状が現れ得る。２００６年の時点で、ＭＭの５年相対生存率は約３４％であり、ＭＭが現在治療オプションのない治療の難しい疾患であることを浮き彫りにした。
【０００６】
リンパ腫及び多発性骨髄腫の治療に抗ＢＣＭＡ抗体を使用することは、国際公開第２００２０６６５１６号及び同第２０１０１０４９４９号で言及されている。ＢＣＭＡに対する抗体は、例えば、Ｇｒａｓ  Ｍ−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９５）１０９３〜１１０６、国際公開第２００１２４８１１号、及び同第２００１２４８１２号に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それでもなお、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ−Ｒ、及びＴＡＣＩ、すなわちＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属するＢ細胞受容体、並びにそれらのリガンドのＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬは、がんとの闘いで治療の対象であるという事実にもかかわらず、依然としてこのような病状の治療に使用可能な更なるオプションを有する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントが提供される。また、提供されたＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞、並びに関連するベクター、及び検出可能に標識された抗体及び抗原結合フラグメントも記載されている。加えて、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを使用する方法が記載されている。例えば、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ＢＣＭＡ発現がんの進行、退行、又は安定性を診断若しくはモニタすること、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいるか否かを判定することに使用でき、そのため、ＢＣＭＡ特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置に適し得る。
【０００９】
本明細書において、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に免疫特異的に結合する多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントが更に提供される。また、提供されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体をコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体を発現している細胞、並びに関連するベクター、及び検出可能に標識された多重特異性抗体も記載されている。加えて、提供された多重特異性抗体を使用する方法が記載されている。例えば、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＢＣＭＡ発現がんの進行、退行、又は安定性を診断若しくはモニタすること、患者ががんを処置されるべきか否かを判定すること、又は対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいるか否かを判定することに使用でき、そのため、ＢＣＭＡ特異性抗がん治療剤、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体による処置に適し得る。
【００１０】
ＢＣＭＡ特異性抗体
本明細書において、ＢＣＭＡに特異的な組換え抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡに結合する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡ及びカニクイザルＢＣＭＡに結合する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、ＢＣＭＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＥＬＩＳＡにより測定するとき、少なくとも５．９ｎＭのＩＣ５０でＡＰＲＩＬ結合を阻害し得る。
【００１１】
表１に、本明細書に記載された一部のＢＣＭＡ特異性抗体の例の概要を提供する。
【００１２】
【表１】
2018525005.tif 000002
【００１３】
一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１４】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において、９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｇＲ）に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をもたらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることにより殺傷する。本明細書に記載された抗体は、ＩｇＧアイソタイプのいずれかとの組み合わせで、可変ドメインの記載された特徴を有する抗体を含む。同ＩｇＧアイソタイプは、Ｆｃ配列が異なるエフェクター機能をもたらすために改変されている改変版を含む。
【００１５】
治療抗体の多くの用途について、Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、作用のメカニズムの一部ではない。これらのＦｃ媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エフェクター機能を改変することは、Ｆｃ領域を遺伝子操作して、ＦｃｇＲ又は補体因子への結合性を低下させることにより達成され得る。活性化（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩａ、及びＦｃｇＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃｇＲＩＩｂ）ＦｃｇＲ又は補体の第１のコンポーネント（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基により決まる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異が導入されて、Ｆｃ機能を低下又はサイレンシングさせる。本明細書に記載された抗体は、これらの改変を含んでもよい。
【００１６】
一実施形態において、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフェクター機能、（ｂ）ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩｂ、及び／又はＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性、（ｃ）ＦｃｇＲＩに対する低下した親和性、（ｄ）ＦｃｇＲＩＩａに対する低下した親和性、（ｅ）ＦｃｇＲＩＩｂに対する低下した親和性、（ｆ）ＦｃｇＲＩＩＩｂに対する低下した親和性、又は（ｇ）ＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性のうち１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｋ４０９Ｒ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。本明細書に記載された抗体は、これらの改変を含んでもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、記載された抗体は、ＥＬＩＳＡにより測定するとき、５．９ｎＭのＩＣ５０でＡＰＲＩＬ結合を阻害することができる。
【００１９】
一部の実施形態では、記載された抗体は、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株に結合する。
【００２０】
記載されたＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントに加えて、記載された抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能なポリヌクレオチド配列もまた提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。同様に、本明細書で提供されたＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成することができる。
【００２１】
ＢＣＭＡ特異性抗体を使用する方法
記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法もまた開示されている。本項に記載の方法に使用するための特定の抗体としては、表１の抗体に関して記載されたＣＤＲ一式を有するものが挙げられる。例えば、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、ＢＣＭＡ受容体の相互作用を使用して阻害することにより、がんを処置するのに有用であり得る。すなわち、抗体が毒物に結合され、この毒物をＢＣＭＡ発現がんに標的化する。更に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、生体サンプル、例えば、血液又は血清中におけるＢＣＭＡの存在を検出するのに、生体サンプル、例えば、血液又は血清中におけるＢＣＭＡの量を定量するのに、ＢＣＭＡ発現がんを診断するのに、がんで苦しむ対象を処置する方法を決定するのに、又は対象におけるＢＣＭＡ発現がんの進行をモニタするのに、有用であり得る。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのリンパ腫であり得る。記載された方法は、対象がＢＣＭＡ発現がんの処置、例えば、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受ける前に行われてもよい。更に、記載された方法は、対象がＢＣＭＡ発現がんの処置、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する多重特異性抗体による処置を受けた後に行われてもよい。
【００２２】
生体サンプル中のＢＣＭＡを検出する記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上に曝すことを含む。
【００２３】
また、対象におけるＢＣＭＡ発現がんを診断する記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上に曝すことを伴うが、この方法は、サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を定量する工程と、サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を、既知の標準又は参照サンプルと比較する工程と、対象のＢＣＭＡレベルががんに関連付けられるＢＣＭＡのレベル内に入るかどうかを判定する工程と、を含む。
【００２４】
本明細書において、対象中のＢＣＭＡ発現がんをモニタする方法もまた記載されている。記載された方法は、生体サンプルを、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上に曝す工程と、抗体又はその抗原結合フラグメントに結合したサンプル中に存在するＢＣＭＡの量を定量する工程と、サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を、既知の標準若しくは参照サンプル、又は対象から以前に得られた類似するサンプル中のＢＣＭＡの量のいずれか一方と比較する工程と、比較されたサンプル中のＢＣＭＡの量における差異に基づいて、対象のＢＣＭＡレベルががんの進行、退行、又は不変を示すかどうかを判定する工程と、を含む。
【００２５】
対象から得られ、又は同対象に由来するサンプルは、生体サンプル、例えば、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、組織会合していない循環腫瘍細胞、組織、外科手術的に切除された腫瘍組織、生検、微小針吸引サンプル、又は組織学的調製物である。
【００２６】
記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、記載された方法又は当業者に既知の他の方法での使用のために標識されてもよい。例えば、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、若しくはポリヒスチジン、又は当技術分野において既知の類似するこのような標識で標識されてもよい。
【００２７】
ＢＣＭＡ特異性抗体キット
開示されたＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットが本明細書において記載されている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントと、生体サンプル中のＢＣＭＡの存在を検出する際の使用のための試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、使用していないときに抗体又はフラグメントを収容するための容器と、抗体又はフラグメントの使用のための取扱説明書と、本明細書に記載されたとおり、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメント及び／又は検出可能に標識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
【００２８】
ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したＢＣＭＡを発現しているＭＭ細胞へのＴリンパ球のリダイレクトは、魅力的な別の方法を提示する。Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ＣＤ３標識化ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、及びイータ（η）の不変サブユニットを有する細胞表面で共発現されたＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）又はＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体のいずれかで構成される。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）に記載されている。現況技術に記載されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４である（Ｙａｎｇ  ＳＪ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）１３７；１０９７〜１１００）。ＳＰ３４は、霊長類及びヒトＣＤ３の両方に反応する。ＳＰ３４は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能である。現況技術に記載されている更なる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１である（国際公開第２００００４１４７４号参照）。現況技術に記載されている更なる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３である（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ＧｖＨＤ，Ａｎａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５４：８４４（１９９２））。ＳＰ３４はＣＤ３のε鎖だけに存在するエピトープを認識するが（Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３０４７参照）、ＵＣＨＴ−１及びＢＣ−３はε及びγ鎖の両方によって与えられるエピトープを認識しており、この点でＳＰ３４はＵＣＨＴ−１及びＢＣ−３とは異なる。抗体ＳＰ３４と同じ配列を有する抗体の配列は、国際公開第２００８１１９５６５号、同第２００８１１９５６６号、同第２００８１１９５６７号、同第２０１００３７８３６号、同第２０１００３７８３７号、及び同第２０１００３７８３８号で言及されている。抗体ＳＰ３４の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と９６％同じ配列は、米国特許第８２３６３０８号（国際公開第２００７０４２２６１号）で言及されている。
【００２９】
様々なＣＤ３及びＢＣＭＡに対する二重特異性抗体は、国際公開第２００７１１７６００号、同第２００９１３２０５８号、同第２０１２０６６０５８号、同第２０１２１４３４９８号、同第２０１３０７２４０６号、同第２０１３０７２４１５号、及び同第２０１４１２２１４４号で言及されている。しかしながら、臨床への進展について述べているデータは、現在のところ利用可能ではない。
【００３０】
本明細書において、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する、組換え多重特異性抗体（「ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体」）及びその多重特異性抗原結合フラグメントが記載されている。一実施形態では、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する組換え抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３１】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＢＣＭＡ特異性アームは、ヒトＢＣＭＡ及びカニクイザルＢＣＭＡに結合する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントのＢＣＭＡ特異性アームは、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する。好ましい実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、二重特異性抗体又は抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）、ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）、ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）、及びｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）を含み、ＨＣ１とＬＣ１とが対を成して、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＨＣ２とＬＣ２とが対を成して、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体、又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメントが提供される。別の実施形態では、抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している組換え細胞が提供される。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体のＢＣＭＡ結合アーム（又は「ＢＣＭＡ特異性アーム」）は、本明細書に記載されたＢＣＭＡ抗体から（例えば、表１で列記されたＣＤＲ配列を有する抗体から）得られる。
【００３２】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントのＢＣＭＡ特異性アームは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、少なくとも０．１８ｎＭの解離定数で、ＢＣＭＡに結合可能である。一部の実施形態では、記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体は、アゴニストではない。一部の実施形態では、記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体は、１０ｎＭ未満の濃度でＮＦ−κＢ活性化を変化させない。
【００３３】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体のＣＤ３結合アーム（又は「ＣＤ３特異性アーム」）は、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４、マウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプから得られる。（Ｋ．Ｒ．Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２〜３８３９）。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体のＣＤ３結合アームは、表２から選択される１つの重鎖及び１つの軽鎖を含む。
【００３４】
【表２】
2018525005.tif 000003
【００３５】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において、９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｇＲ）に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をもたらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることにより殺傷する。
【００３６】
治療抗体の多くの用途について、Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、作用のメカニズムの一部ではない。これらのＦｃ媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エフェクター機能を改変することは、Ｆｃ領域を遺伝子操作して、ＦｃｇＲ又は補体因子への結合性を低下させることにより達成され得る。活性化（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩａ、及びＦｃｇＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃｇＲＩＩｂ）ＦｃｇＲ又は補体の第１のコンポーネント（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基により決まる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異が導入されて、Ｆｃ機能を低下又はサイレンシングさせる。
【００３７】
一実施形態において、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフェクター機能、（ｂ）ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩｂ、及び／又はＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性、（ｃ）ＦｃｇＲＩに対する低下した親和性、（ｄ）ＦｃｇＲＩＩａに対する低下した親和性、（ｅ）ＦｃｇＲＩＩｂに対する低下した親和性、（ｆ）ＦｃｇＲＩＩＩｂに対する低下した親和性、又は（ｇ）ＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性のうち１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＴ細胞及び／又は初代カニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
【００３９】
記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体に加えて、記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントのＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、又はＬＣ２をコードする単離された合成ポリヌクレオチドが提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供され、同様に、本明細書で提供されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成することができる。一部の実施形態では、細胞を培養することにより、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法が提供される。
【００４０】
本明細書において、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が更に提供される。
【００４１】
ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を使用する方法
記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントを使用する方法もまた開示される。例えば、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、ＢＣＭＡ発現がんの処置に有用であり得る。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫などのリンパ腫である。
【００４２】
ＢＣＭＡ発現がんの処置を、それを必要とする対象において行う記載された方法は、この対象に、治療的に有効な量の記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントを投与する工程を含む。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態では、治療的に有効な量のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者に、がんを処置するのに十分な時間投与することにより、がんを有する対象を処置するための方法が提供される。
【００４３】
がん細胞の成長又は増殖を阻害するために、治療的に有効な量のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合フラグメントを投与することにより、がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法が更に提供される。
【００４４】
また、本明細書において、Ｔ細胞をがんにリダイレクトするために、治療的に有効な量のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを投与することにより、Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現がん細胞にリダイレクトする方法も提供される。
【００４５】
ＢＣＭＡ×ＣＤ３特異性抗体キット
本明細書において、開示されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を含むキットが記載されている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を使用する方法又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体と、ＢＣＭＡ発現がんを処置する際の使用のための試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細書に記載された多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントのうち１つ若しくは２つ以上、使用していないときに抗体又はフラグメントを収容するための容器、並びに／又は抗体若しくはフラグメントの使用のための取扱説明書、本明細書に記載されたとおりの、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメント及び／若しくは検出可能に標識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】ヒトＢＣＭＡ（図１Ａ）及びカニクイザルＢＣＭＡ（図１Ｂ）をクローンするために使用されるベクター。
【図１Ｂ】ヒトＢＣＭＡ（図１Ａ）及びカニクイザルＢＣＭＡ（図１Ｂ）をクローンするために使用されるベクター。
【図２Ａ】ＢＣＭＢ６９のエピトープ位置及びヒトＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との相互作用。（図２Ａ）エピトープ位置の概観。ＢＣＭＢ６９は、ＢＣＭＡの凹状表面（黒色領域）に結合する。（図２Ｂ）ＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との直接接触を示す相互作用マップ。ＢＣＭＡに接触するＣＤＲ−Ｌ１を除く全てのＣＤＲからの残基。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＢＣＭＢ６９及びＡＰＲＩＬの両方に接触するＢＣＭＡ残基は黒色枠を有する。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた（水素結合に関しては３．５Åの距離の閾値）。（図２Ｃ及び図２Ｄ）ＢＣＭＢ６９の軽鎖（図２Ｃ）及び重鎖（図２Ｄ）とのＢＣＭＡの主な相互作用の拡大図。水素結合はオングストローム単位の距離を有する破線で示す。
【図２Ｂ】ＢＣＭＢ６９のエピトープ位置及びヒトＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との相互作用。（図２Ａ）エピトープ位置の概観ＢＣＭＢ６９は、ＢＣＭＡの凹状表面（黒色領域）に結合する。（図２Ｂ）ＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との直接接触を示す相互作用マップ。ＢＣＭＡに接触するＣＤＲ−Ｌ１を除く全てのＣＤＲからの残基。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＢＣＭＢ６９及びＡＰＲＩＬの両方に接触するＢＣＭＡ残基は黒色枠を有する。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた（水素結合に関しては３．５Åの距離の閾値）。（図２Ｃ及び図２Ｄ）ＢＣＭＢ６９の軽鎖（図２Ｃ）及び重鎖（図２Ｄ）とのＢＣＭＡの主な相互作用の拡大図。水素結合はオングストローム単位の距離を有する破線で示す。
【図２Ｃ】ＢＣＭＢ６９のエピトープ位置及びヒトＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との相互作用。（図２Ａ）エピトープ位置の概観ＢＣＭＢ６９は、ＢＣＭＡの凹状表面（黒色領域）に結合する。（図２Ｂ）ＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との直接接触を示す相互作用マップ。ＢＣＭＡに接触するＣＤＲ−Ｌ１を除く全てのＣＤＲからの残基。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＢＣＭＢ６９及びＡＰＲＩＬの両方に接触するＢＣＭＡ残基は黒色枠を有する。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた（水素結合に関しては３．５Åの距離の閾値）。（図２Ｃ及び図２Ｄ）ＢＣＭＢ６９の軽鎖（図２Ｃ）及び重鎖（図２Ｄ）とのＢＣＭＡの主な相互作用の拡大図。水素結合はオングストローム単位の距離を有する破線で示す。
【図２Ｄ】ＢＣＭＢ６９のエピトープ位置及びヒトＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との相互作用。（図２Ａ）エピトープ位置の概観ＢＣＭＢ６９は、ＢＣＭＡの凹状表面（黒色領域）に結合する。（図２Ｂ）ＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９との直接接触を示す相互作用マップ。ＢＣＭＡに接触するＣＤＲ−Ｌ１を除く全てのＣＤＲからの残基。ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示しており、骨格原子を指している。ＢＣＭＢ６９及びＡＰＲＩＬの両方に接触するＢＣＭＡ残基は黒色枠を有する。接触残基を特定するために４Åの距離のカットオフ値を用いた（水素結合に関しては３．５Åの距離の閾値）。（図２Ｃ及び図２Ｄ）ＢＣＭＢ６９の軽鎖（図２Ｃ）及び重鎖（図２Ｄ）とのＢＣＭＡの主な相互作用の拡大図。水素結合はオングストローム単位の距離を有する破線で示す。
【図３】ＢＣＭＢ６９のエピトープ及びパラトープ残基。エピトープ及びパラトープ残基は影付き、ＣＤＲ領域は下線付き（Ｋａｂａｔ定義）、ヒトと異なるＢＣＭＡ残基は太字イタリック体である。ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ及び細胞外ＢＣＭＡ配列のみを示す。
【図４Ａ】ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ及びＡＰＲＩＬ間（図４Ａ）並びにＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ及びＢＡＦＦ間（図４Ｂ）のクラッシュ領域。Ｆａｂ及びリガンド間のクラッシュ領域を示すＢＣＭＡ／ＡＰＲＩＬ及びＢＣＭＡ／ＢＡＦＦ複合体に対するＢＣＭＡ／ＢＣＭＢ６９複合体の構造的オーバーレイ。ＢＣＭＡの溶媒接触可能表面を表示する。Ｆａｂ及びリガンド分子をそれぞれ灰色及び黒色画で示す。両方の複合体中の等価ＢＣＭＡ  Ｃα原子の重ね合わせにより、オーバーレイを得た（ＡＰＲＩＬ複合体では０．９Å、ＢＡＦＦでは１．２ÅのＲＭＳＤ）。
【図４Ｂ】ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ及びＡＰＲＩＬ間（図４Ａ）並びにＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ及びＢＡＦＦ間（図４Ｂ）のクラッシュ領域。Ｆａｂ及びリガンド間のクラッシュ領域を示すＢＣＭＡ／ＡＰＲＩＬ及びＢＣＭＡ／ＢＡＦＦ複合体に対するＢＣＭＡ／ＢＣＭＢ６９複合体の構造的オーバーレイ。ＢＣＭＡの溶媒接触可能表面を表示する。Ｆａｂ及びリガンド分子をそれぞれ灰色及び黒色画で示す。両方の複合体中の等価ＢＣＭＡ  Ｃα原子の重ね合わせにより、オーバーレイを得た（ＡＰＲＩＬ複合体では０．９Å、ＢＡＦＦでは１．２ÅのＲＭＳＤ）。
【図５】ＢＣＭＢ７２のＳＰＲデータは、分子が、ヒト、カニクイザル、及びマウスＢＣＭＡに対する結合性を有することを実証する。カニクイザル及びマウスＢＣＭＡの平均ＫＤは、ヒトＢＣＭＡと比較するとき、それぞれ約３６倍及び４０２倍である。
【図６】ＢＣＭＡ＋細胞株におけるＢＣＭＢ７２の結合性に関するＥＣ５０の測定。ＢＣＭＢ７２を用いてＢＣＭＡに対して細胞株を染色した。細胞に対するＢＣＭＢ７２の結合性の幾何学的平均蛍光強度を示す。ＥＣ５０を凡例内に示す。約１００ｎＭの濃度で飽和に達した。平均蛍光強度を考慮して、Ｕ２９３２（ＥＣ５０＝７．９２ｎＭ）、ＭＭ１Ｒ（ＥＣ５０＝８．７４ｎＭ）、Ｈ９２９（ＥＣ５０＝１４．７ｎＭ）、ＥＪＭ（ＥＣ５０＝１７．５ｎＭ）、及びＬＰ１（ＥＣ５０＝２２．３ｎＭ）細胞についてＥＣ５０値を得た。データのグラフ化及びフィッティングは、可変勾配（４パラメータ）関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【図７】全血におけるＢＣＭＢ７２の結合プロファイル。３人の正常ヒトドナー由来の全血を、ＢＣＭＡに対するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はＢＣＭＢ７２で染色した。ゲーティング解析を行って、標準的な細胞特異的マーカーを用いて白血球集団中のリンパ球を同定した。１人の代表ドナーの染色強度をパネルに示しており、黒色実線は所望の抗体であり、灰色塗り潰しの破線は対応するアイソタイプである。ＢＣＭＡ発現なしは、３人の正常ドナーにおけるリンパ球、単球、顆粒球、又は形質細胞様ＤＣで観察された。ＢＣＭＢ７２は、３人の全てのドナーでＣＤ３＋Ｔ細胞に対する結合性を示したが、ドナー間で強度が異なった。ＢＣＭＢ７２は、このアッセイで試験した他のいずれの細胞種にも結合しなかった。
【図８Ａ】種々のＭＭ細胞株の存在下におけるＢＣＭＢ７２依存性Ｔ細胞活性化。Ｈ９２９（図９Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図９Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図９Ｃ）、Ｕ２６６（図９Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図９Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図８Ｂ】種々のＭＭ細胞株の存在下におけるＢＣＭＢ７２依存性Ｔ細胞活性化。Ｈ９２９（図９Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図９Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図９Ｃ）、Ｕ２６６（図９Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図９Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図８Ｃ】種々のＭＭ細胞株の存在下におけるＢＣＭＢ７２依存性Ｔ細胞活性化。Ｈ９２９（図９Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図９Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図９Ｃ）、Ｕ２６６（図９Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図９Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図８Ｄ】種々のＭＭ細胞株の存在下におけるＢＣＭＢ７２依存性Ｔ細胞活性化。Ｈ９２９（図９Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図９Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図９Ｃ）、Ｕ２６６（図９Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図９Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図８Ｅ】種々のＭＭ細胞株の存在下におけるＢＣＭＢ７２依存性Ｔ細胞活性化。Ｈ９２９（図９Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図９Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図９Ｃ）、Ｕ２６６（図９Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図９Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図９Ａ】複数の正常ドナー由来のＴ細胞を使用して２回の独立試験から得られたＥＣ５０及び最大Ｔ細胞活性化値の概要。各細胞株及び各試験について個々のドナーの値及びドナーの平均値を示す。データなし＝試験未実施、フィットなし＝ソフトウェアの曲線作成不能、〜値＝モデル外挿に基づく近似値。
【図９Ｂ】複数の正常ドナー由来のＴ細胞を使用して２回の独立試験から得られたＥＣ５０及び最大Ｔ細胞活性化値の概要。各細胞株及び各試験について個々のドナーの値及びドナーの平均値を示す。データなし＝試験未実施、フィットなし＝ソフトウェアの曲線作成不能、〜値＝モデル外挿に基づく近似値。
【図１０Ａ】種々の多発性骨髄腫細胞株のＴ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害。Ｈ９２９（図１１Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図１１Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図１１Ｃ）、Ｕ２６６（図１１Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図１１Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体濃度に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図１０Ｂ】種々の多発性骨髄腫細胞株のＴ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害。Ｈ９２９（図１１Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図１１Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図１１Ｃ）、Ｕ２６６（図１１Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図１１Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体濃度に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図１０Ｃ】種々の多発性骨髄腫細胞株のＴ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害。Ｈ９２９（図１１Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図１１Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図１１Ｃ）、Ｕ２６６（図１１Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図１１Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体濃度に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図１０Ｄ】種々の多発性骨髄腫細胞株のＴ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害。Ｈ９２９（図１１Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図１１Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図１１Ｃ）、Ｕ２６６（図１１Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図１１Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体濃度に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図１０Ｅ】種々の多発性骨髄腫細胞株のＴ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害。Ｈ９２９（図１１Ａ）、ＭＭ．１Ｒ（図１１Ｂ）、ＲＰＭＩ  ８２２６（図１１Ｃ）、Ｕ２６６（図１１Ｄ）、及びＭｖ４−１１（図１１Ｅ）細胞を、６人の正常ドナー由来のＴ細胞（ドナー平均±ＳＥＭを示す）及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、提示した抗体濃度に４８時間供した。ＥＣ５０値をグラフに示した。統計分析：モデル収束の単純な事実に加えて、ＬｏｇＥＣ５０に関する９５％信頼区間の幅を考慮して、フィットの妥当性を評価する。（対称であるため、ＬｏｇＥＣ５０に関する信頼区間を使用し、ＥＣ５０自体に関する信頼区間は使用しない。）＋／−２未満の区間（又は４未満の９５％信頼区間幅全体）を適切に考慮する。
【図１１Ａ】複数の正常ドナー由来のＴ細胞を使用して２回の独立試験から得られたＥＣ５０及び最大溶解値の概要。各細胞株及び各試験について個々のドナーの値及びドナーの平均値を示す。データなし＝試験未実施、フィットなし＝ソフトウェアの曲線作成不能、〜値＝モデル外挿に基づく近似値。
【図１１Ｂ】複数の正常ドナー由来のＴ細胞を使用して２回の独立試験から得られたＥＣ５０及び最大溶解値の概要。各細胞株及び各試験について個々のドナーの値及びドナーの平均値を示す。データなし＝試験未実施、フィットなし＝ソフトウェアの曲線作成不能、〜値＝モデル外挿に基づく近似値。
【図１２Ａ】Ｈ９２９細胞における細胞傷害性及びＴ細胞活性化。ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ＢＣＭＢ７２の変異体分子）をＴ細胞媒介性細胞傷害アッセイで試験した。ＢＣＭＡ陽性細胞株（Ｈ９２９）を、正常ドナー（ドナーＩＤ：Ｍ５７６３及びＭ６５７６）由来の外来性ヒトＴ細胞の存在下で種々の抗体濃度を用いて４８時間インキュベートした。４８時間インキュベーション後、フローサイトメトリーに基づく方法（ＦＡＣＳ）により細胞殺傷を測定し、細胞傷害性％として図１２Ａに報告した。図１２Ｂは、Ｔ細胞表面上のＣＤ２５のアップレギュレーションにより評価したときのＴ細胞活性化を示す。概して、データ点は作成したフィット曲線に沿ってぴったり並び、Ｔ細胞ドナー及び繰り返し試験間のばらつきはほとんどなかった。
【図１２Ｂ】Ｈ９２９細胞における細胞傷害性及びＴ細胞活性化。ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ＢＣＭＢ７２の変異体分子）をＴ細胞媒介性細胞傷害アッセイで試験した。ＢＣＭＡ陽性細胞株（Ｈ９２９）を、正常ドナー（ドナーＩＤ：Ｍ５７６３及びＭ６５７６）由来の外来性ヒトＴ細胞の存在下で種々の抗体濃度を用いて４８時間インキュベートした。４８時間インキュベーション後、フローサイトメトリーに基づく方法（ＦＡＣＳ）により細胞殺傷を測定し、細胞傷害性％として図１２Ａに報告した。図１２Ｂは、Ｔ細胞表面上のＣＤ２５のアップレギュレーションにより評価したときのＴ細胞活性化を示す。概して、データ点は作成したフィット曲線に沿ってぴったり並び、Ｔ細胞ドナー及び繰り返し試験間のばらつきはほとんどなかった。
【図１３】ＢＣＭＢ７２媒介性サイトカイン放出のＥＣ５０値の概要。細胞傷害性試験（実施例１２、図８参照）から得られたＲＰＭＩ８２２６細胞の上清を収集し、ＭＳＤに基づく多重アッセイを使用して６つの異なるサイトカイン濃度について分析した。ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）及びコントロール抗体（ＢＣＭＡ×無及び無×ＣＤ３）を種々の濃度で使用した。
【図１４Ａ】ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞株を使用して、Ｔ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害アッセイを行った。複数の正常ドナー（代表として３人のドナーＭ７１９７、Ｍ５１３７、及びＭ６４５７の概要を示す）由来のＴ細胞及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、細胞を種々の濃度のＢＣＭＢ７２に４８時間供した。エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比は５：１であった。図１４Ａは細胞傷害能を示し、右側の図１４ＢはＴ細胞活性化曲線を示しており、これらの曲線はＢＣＭＢ７２の種々のロット間で同様であった。
【図１４Ｂ】ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９細胞株を使用して、Ｔ細胞媒介性ＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害アッセイを行った。複数の正常ドナー（代表として３人のドナーＭ７１９７、Ｍ５１３７、及びＭ６４５７の概要を示す）由来のＴ細胞及びＦｃブロッカー（２ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、細胞を種々の濃度のＢＣＭＢ７２に４８時間供した。エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比は５：１であった。図１４Ａは細胞傷害能を示し、右側の図１４ＢはＴ細胞活性化曲線を示しており、これらの曲線はＢＣＭＢ７２の種々のロット間で同様であった。
【図１５】Ｈ９２９細胞を、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）及びコントロール抗体（ＢＣＭＡ×無及び無×ＣＤ３）を用いて上記グラフのＸ軸に示した用量で３０分間処理し、全タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅユーザーマニュアルのような標準プロトコルに従ってＳｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ分析法を使用して分析した。ハウスキーピング遺伝子としてアクチンを用いてデータを正規化し、比率をＹ軸にプロットした。ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは予想どおりＰ３８のリン酸化を誘発し、抗体は試験したいずれの濃度でも刺激作用を有さなかった。
【図１６Ａ】ＢＣＭＡを発現しているＨＥＫ−ＮＦκＢ細胞（図１６Ａ、図１６Ｃ、及び図１６Ｅ）又は親細胞（図１６Ｂ、図１６Ｄ、及び図１６Ｆ）をＴＮＦα及び種々の濃度のＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＢ７２で刺激した。３つの時間点、１６時間（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、２４時間（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）、及び４８時間（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）を分析した。ＴＮＦαは、ＨＥＫ−Ｎｆ−ｋＢ親細胞及びＨＥＫ−ＮＦ−ｋＢ−ＢＣＭＡ細胞の両方でＮＦ−ｋＢ活性化を誘発したが、ＡＰＲＩＬの誘発はＢＣＭＡ特異性細胞腫のみに見られた。ＢＣＭＢ７２は、親細胞株では効果を有しておらず、ＢＣＭＡ発現細胞では高濃度においてのみ活性化を示した。
【図１６Ｂ】ＢＣＭＡを発現しているＨＥＫ−ＮＦκＢ細胞（図１６Ａ、図１６Ｃ、及び図１６Ｅ）又は親細胞（図１６Ｂ、図１６Ｄ、及び図１６Ｆ）をＴＮＦα及び種々の濃度のＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＢ７２で刺激した。３つの時間点、１６時間（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、２４時間（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）、及び４８時間（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）を分析した。ＴＮＦαは、ＨＥＫ−Ｎｆ−ｋＢ親細胞及びＨＥＫ−ＮＦ−ｋＢ−ＢＣＭＡ細胞の両方でＮＦ−ｋＢ活性化を誘発したが、ＡＰＲＩＬの誘発はＢＣＭＡ特異性細胞腫のみに見られた。ＢＣＭＢ７２は、親細胞株では効果を有しておらず、ＢＣＭＡ発現細胞では高濃度においてのみ活性化を示した。
【図１６Ｃ】ＢＣＭＡを発現しているＨＥＫ−ＮＦκＢ細胞（図１６Ａ、図１６Ｃ、及び図１６Ｅ）又は親細胞（図１６Ｂ、図１６Ｄ、及び図１６Ｆ）をＴＮＦα及び種々の濃度のＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＢ７２で刺激した。３つの時間点、１６時間（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、２４時間（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）、及び４８時間（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）を分析した。ＴＮＦαは、ＨＥＫ−Ｎｆ−ｋＢ親細胞及びＨＥＫ−ＮＦ−ｋＢ−ＢＣＭＡ細胞の両方でＮＦ−ｋＢ活性化を誘発したが、ＡＰＲＩＬの誘発はＢＣＭＡ特異性細胞腫のみに見られた。ＢＣＭＢ７２は、親細胞株では効果を有しておらず、ＢＣＭＡ発現細胞では高濃度においてのみ活性化を示した。
【図１６Ｄ】ＢＣＭＡを発現しているＨＥＫ−ＮＦκＢ細胞（図１６Ａ、図１６Ｃ、及び図１６Ｅ）又は親細胞（図１６Ｂ、図１６Ｄ、及び図１６Ｆ）をＴＮＦα及び種々の濃度のＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＢ７２で刺激した。３つの時間点、１６時間（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、２４時間（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）、及び４８時間（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）を分析した。ＴＮＦαは、ＨＥＫ−Ｎｆ−ｋＢ親細胞及びＨＥＫ−ＮＦ−ｋＢ−ＢＣＭＡ細胞の両方でＮＦ−ｋＢ活性化を誘発したが、ＡＰＲＩＬの誘発はＢＣＭＡ特異性細胞腫のみに見られた。ＢＣＭＢ７２は、親細胞株では効果を有しておらず、ＢＣＭＡ発現細胞では高濃度においてのみ活性化を示した。
【図１６Ｅ】ＢＣＭＡを発現しているＨＥＫ−ＮＦκＢ細胞（図１６Ａ、図１６Ｃ、及び図１６Ｅ）又は親細胞（図１６Ｂ、図１６Ｄ、及び図１６Ｆ）をＴＮＦα及び種々の濃度のＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＢ７２で刺激した。３つの時間点、１６時間（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、２４時間（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）、及び４８時間（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）を分析した。ＴＮＦαは、ＨＥＫ−Ｎｆ−ｋＢ親細胞及びＨＥＫ−ＮＦ−ｋＢ−ＢＣＭＡ細胞の両方でＮＦ−ｋＢ活性化を誘発したが、ＡＰＲＩＬの誘発はＢＣＭＡ特異性細胞腫のみに見られた。ＢＣＭＢ７２は、親細胞株では効果を有しておらず、ＢＣＭＡ発現細胞では高濃度においてのみ活性化を示した。
【図１６Ｆ】ＢＣＭＡを発現しているＨＥＫ−ＮＦκＢ細胞（図１６Ａ、図１６Ｃ、及び図１６Ｅ）又は親細胞（図１６Ｂ、図１６Ｄ、及び図１６Ｆ）をＴＮＦα及び種々の濃度のＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＢ７２で刺激した。３つの時間点、１６時間（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、２４時間（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）、及び４８時間（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）を分析した。ＴＮＦαは、ＨＥＫ−Ｎｆ−ｋＢ親細胞及びＨＥＫ−ＮＦ−ｋＢ−ＢＣＭＡ細胞の両方でＮＦ−ｋＢ活性化を誘発したが、ＡＰＲＩＬの誘発はＢＣＭＡ特異性細胞腫のみに見られた。ＢＣＭＢ７２は、親細胞株では効果を有しておらず、ＢＣＭＡ発現細胞では高濃度においてのみ活性化を示した。
【図１７Ａ】Ｔ細胞は、ｓＢＣＭＡ媒介性及びＢＣＭＢ７２依存性活性化を示さない。ＢＣＭＢ７２（図１７Ａ）及び無×ＣＤ３コントロール抗体（図１７Ｂ）を、種々の用量の可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤの存在下で２人の正常ドナー（Ｍ７０７７及びＭ５１３７）由来のＴ細胞で用量設定した。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１７Ｂ】Ｔ細胞は、ｓＢＣＭＡ媒介性及びＢＣＭＢ７２依存性活性化を示さない。ＢＣＭＢ７２（図１７Ａ）及び無×ＣＤ３コントロール抗体（図１７Ｂ）を、種々の用量の可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤの存在下で２人の正常ドナー（Ｍ７０７７及びＭ５１３７）由来のＴ細胞で用量設定した。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１８Ａ】Ｈ９２９細胞でのＢＣＭＢ７２のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞傷害能における可溶性因子、ｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響。ドナーＴ細胞（Ｍ７０７７＆Ｍ６５２１）及びＢＣＭＢ７２を使用して、細胞を殺傷アッセイに４８時間供した。標的細胞傷害性を左側のグラフに示し、Ｔ細胞活性化を右側のグラフに示す（ｎ＝２）。各処理のＥＣ５０値を凡例内に示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ａ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｂ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｃ）の存在下における細胞傷害性を示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ｄ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｅ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｆ）の存在下におけるＴ細胞活性化を示す。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１８Ｂ】Ｈ９２９細胞でのＢＣＭＢ７２のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞傷害能における可溶性因子、ｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響。ドナーＴ細胞（Ｍ７０７７＆Ｍ６５２１）及びＢＣＭＢ７２を使用して、細胞を殺傷アッセイに４８時間供した。標的細胞傷害性を左側のグラフに示し、Ｔ細胞活性化を右側のグラフに示す（ｎ＝２）。各処理のＥＣ５０値を凡例内に示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ａ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｂ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｃ）の存在下における細胞傷害性を示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ｄ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｅ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｆ）の存在下におけるＴ細胞活性化を示す。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１８Ｃ】Ｈ９２９細胞でのＢＣＭＢ７２のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞傷害能における可溶性因子、ｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響。ドナーＴ細胞（Ｍ７０７７＆Ｍ６５２１）及びＢＣＭＢ７２を使用して、細胞を殺傷アッセイに４８時間供した。標的細胞傷害性を左側のグラフに示し、Ｔ細胞活性化を右側のグラフに示す（ｎ＝２）。各処理のＥＣ５０値を凡例内に示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ａ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｂ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｃ）の存在下における細胞傷害性を示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ｄ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｅ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｆ）の存在下におけるＴ細胞活性化を示す。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１８Ｄ】Ｈ９２９細胞でのＢＣＭＢ７２のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞傷害能における可溶性因子、ｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響。ドナーＴ細胞（Ｍ７０７７＆Ｍ６５２１）及びＢＣＭＢ７２を使用して、細胞を殺傷アッセイに４８時間供した。標的細胞傷害性を左側のグラフに示し、Ｔ細胞活性化を右側のグラフに示す（ｎ＝２）。各処理のＥＣ５０値を凡例内に示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ａ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｂ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｃ）の存在下における細胞傷害性を示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ｄ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｅ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｆ）の存在下におけるＴ細胞活性化を示す。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１８Ｅ】Ｈ９２９細胞でのＢＣＭＢ７２のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞傷害能における可溶性因子、ｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響。ドナーＴ細胞（Ｍ７０７７＆Ｍ６５２１）及びＢＣＭＢ７２を使用して、細胞を殺傷アッセイに４８時間供した。標的細胞傷害性を左側のグラフに示し、Ｔ細胞活性化を右側のグラフに示す（ｎ＝２）。各処理のＥＣ５０値を凡例内に示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ａ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｂ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｃ）の存在下における細胞傷害性を示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ｄ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｅ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｆ）の存在下におけるＴ細胞活性化を示す。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１８Ｆ】Ｈ９２９細胞でのＢＣＭＢ７２のＴ細胞活性化及びＴ細胞媒介性細胞傷害能における可溶性因子、ｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響。ドナーＴ細胞（Ｍ７０７７＆Ｍ６５２１）及びＢＣＭＢ７２を使用して、細胞を殺傷アッセイに４８時間供した。標的細胞傷害性を左側のグラフに示し、Ｔ細胞活性化を右側のグラフに示す（ｎ＝２）。各処理のＥＣ５０値を凡例内に示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ａ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｂ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｃ）の存在下における細胞傷害性を示す。ｓＢＣＭＡ（図１８Ｄ）、ＡＰＲＩＬ（図１８Ｅ）、及びＢＡＦＦ（図１８Ｆ）の存在下におけるＴ細胞活性化を示す。データ：平均±ＳＥＭ。
【図１９Ａ】２回の独立試験から得られたシグナルを、競合抗体の不在下でＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに結合するＢＣＭＡ−Ｆｃの最大シグナルに正規化した。ＡＰＲＩＬ（図１９Ａ）及びＢＡＦＦ（図１９Ｂ）に結合するＢＣＭＡを、ＢＣＭＢ７２及びコントロール抗体（無×ＣＤ３）濃度の関数としてプロットした。
【図１９Ｂ】２回の独立試験から得られたシグナルを、競合抗体の不在下でＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに結合するＢＣＭＡ−Ｆｃの最大シグナルに正規化した。ＡＰＲＩＬ（図１９Ａ）及びＢＡＦＦ（図１９Ｂ）に結合するＢＣＭＡを、ＢＣＭＢ７２及びコントロール抗体（無×ＣＤ３）濃度の関数としてプロットした。
【図２０Ａ】ヒト初代ＭＭ形質細胞に対するＢＣＭＢ７２の細胞傷害能。５人の異なる患者から得られた凍結骨髄由来単核細胞（ＭＭ２４０ＢＭ（図２０Ａ）、ＭＭ２５９ＢＭ（図２０Ｂ）、ＭＭ２７０ＢＭ（図２０Ｃ）、ＭＭ２７６ＢＭ（図２０Ｄ）、及びＭＭ２７７ＢＭ（図２０Ｅ））を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ（ＣＮＴＯ  ９４１２、左パネル）コントロールと比較したＢＣＭＢ７２の結合性、形質細胞の細胞傷害性（中）、及びＴ細胞活性化（右）を評価した。細胞傷害アッセイについては、Ｍ７０７７正常健康ドナー由来のＴ細胞を患者ＢＭＭＣサンプルに外部添加し、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）、ＢＣ３Ｂ４（ＢＣＭＡ×無）、又はＣＮＴＯ７００８（無×ＣＤ３）を用いて４８時間インキュベートした。ＢＣＭＢ７２は、全てのドナーサンプルに対して用量依存的に形質細胞に結合し、その平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＢＣＭＢ７２の処理に反応した生存形質細胞（ＣＤ１３８＋）の喪失及びＴ細胞上のＣＤ２５の随伴的なアップレギュレーションに注目されたい。Ｔ細胞活性化のＥＣ５０値をグラフに示す。
【図２０Ｂ】ヒト初代ＭＭ形質細胞に対するＢＣＭＢ７２の細胞傷害能。５人の異なる患者から得られた凍結骨髄由来単核細胞（ＭＭ２４０ＢＭ（図２０Ａ）、ＭＭ２５９ＢＭ（図２０Ｂ）、ＭＭ２７０ＢＭ（図２０Ｃ）、ＭＭ２７６ＢＭ（図２０Ｄ）、及びＭＭ２７７ＢＭ（図２０Ｅ））を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ（ＣＮＴＯ  ９４１２、左パネル）コントロールと比較したＢＣＭＢ７２の結合性、形質細胞の細胞傷害性（中）、及びＴ細胞活性化（右）を評価した。細胞傷害アッセイについては、Ｍ７０７７正常健康ドナー由来のＴ細胞を患者ＢＭＭＣサンプルに外部添加し、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）、ＢＣ３Ｂ４（ＢＣＭＡ×無）、又はＣＮＴＯ７００８（無×ＣＤ３）を用いて４８時間インキュベートした。ＢＣＭＢ７２は、全てのドナーサンプルに対して用量依存的に形質細胞に結合し、その平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＢＣＭＢ７２の処理に反応した生存形質細胞（ＣＤ１３８＋）の喪失及びＴ細胞上のＣＤ２５の随伴的なアップレギュレーションに注目されたい。Ｔ細胞活性化のＥＣ５０値をグラフに示す。
【図２０Ｃ】ヒト初代ＭＭ形質細胞に対するＢＣＭＢ７２の細胞傷害能。５人の異なる患者から得られた凍結骨髄由来単核細胞（ＭＭ２４０ＢＭ（図２０Ａ）、ＭＭ２５９ＢＭ（図２０Ｂ）、ＭＭ２７０ＢＭ（図２０Ｃ）、ＭＭ２７６ＢＭ（図２０Ｄ）、及びＭＭ２７７ＢＭ（図２０Ｅ））を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ（ＣＮＴＯ  ９４１２、左パネル）コントロールと比較したＢＣＭＢ７２の結合性、形質細胞の細胞傷害性（中）、及びＴ細胞活性化（右）を評価した。細胞傷害アッセイについては、Ｍ７０７７正常健康ドナー由来のＴ細胞を患者ＢＭＭＣサンプルに外部添加し、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）、ＢＣ３Ｂ４（ＢＣＭＡ×無）、又はＣＮＴＯ７００８（無×ＣＤ３）を用いて４８時間インキュベートした。ＢＣＭＢ７２は、全てのドナーサンプルに対して用量依存的に形質細胞に結合し、その平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＢＣＭＢ７２の処理に反応した生存形質細胞（ＣＤ１３８＋）の喪失及びＴ細胞上のＣＤ２５の随伴的なアップレギュレーションに注目されたい。Ｔ細胞活性化のＥＣ５０値をグラフに示す。
【図２０Ｄ】ヒト初代ＭＭ形質細胞に対するＢＣＭＢ７２の細胞傷害能。５人の異なる患者から得られた凍結骨髄由来単核細胞（ＭＭ２４０ＢＭ（図２０Ａ）、ＭＭ２５９ＢＭ（図２０Ｂ）、ＭＭ２７０ＢＭ（図２０Ｃ）、ＭＭ２７６ＢＭ（図２０Ｄ）、及びＭＭ２７７ＢＭ（図２０Ｅ））を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ（ＣＮＴＯ  ９４１２、左パネル）コントロールと比較したＢＣＭＢ７２の結合性、形質細胞の細胞傷害性（中）、及びＴ細胞活性化（右）を評価した。細胞傷害アッセイについては、Ｍ７０７７正常健康ドナー由来のＴ細胞を患者ＢＭＭＣサンプルに外部添加し、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）、ＢＣ３Ｂ４（ＢＣＭＡ×無）、又はＣＮＴＯ７００８（無×ＣＤ３）を用いて４８時間インキュベートした。ＢＣＭＢ７２は、全てのドナーサンプルに対して用量依存的に形質細胞に結合し、その平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＢＣＭＢ７２の処理に反応した生存形質細胞（ＣＤ１３８＋）の喪失及びＴ細胞上のＣＤ２５の随伴的なアップレギュレーションに注目されたい。Ｔ細胞活性化のＥＣ５０値をグラフに示す。
【図２０Ｅ】ヒト初代ＭＭ形質細胞に対するＢＣＭＢ７２の細胞傷害能。５人の異なる患者から得られた凍結骨髄由来単核細胞（ＭＭ２４０ＢＭ（図２０Ａ）、ＭＭ２５９ＢＭ（図２０Ｂ）、ＭＭ２７０ＢＭ（図２０Ｃ）、ＭＭ２７６ＢＭ（図２０Ｄ）、及びＭＭ２７７ＢＭ（図２０Ｅ））を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ（ＣＮＴＯ  ９４１２、左パネル）コントロールと比較したＢＣＭＢ７２の結合性、形質細胞の細胞傷害性（中）、及びＴ細胞活性化（右）を評価した。細胞傷害アッセイについては、Ｍ７０７７正常健康ドナー由来のＴ細胞を患者ＢＭＭＣサンプルに外部添加し、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）、ＢＣ３Ｂ４（ＢＣＭＡ×無）、又はＣＮＴＯ７００８（無×ＣＤ３）を用いて４８時間インキュベートした。ＢＣＭＢ７２は、全てのドナーサンプルに対して用量依存的に形質細胞に結合し、その平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＢＣＭＢ７２の処理に反応した生存形質細胞（ＣＤ１３８＋）の喪失及びＴ細胞上のＣＤ２５の随伴的なアップレギュレーションに注目されたい。Ｔ細胞活性化のＥＣ５０値をグラフに示す。
【図２１】Ｈ９２９予防モデルにおけるＢＣＭＢ７２のインビボでの有効性。
【図２２】Ｈ９２９異種移植マウスにおける血清可溶性ＢＣＭＡ濃度。ヒトＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、血清可溶性ＢＣＭＡ濃度を検出した。可溶性ＢＣＭＡ濃度は、これらの動物における腫瘍の負担とよく相関するＰＢＳコントロールと比較して、ＢＣＭＢ７２の１μｇ及び０．５μｇ／マウスを用いたマウス治療で著しく低かった。より低用量のＢＣＭＢ７２（０．１μｇ／マウス）は、ｓＢＣＭＡ濃度又は腫瘍サイズに効果がなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
定義
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用される。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【００４８】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、測定値、例えば、量、持続時間等に言及する場合の「約」という用語は、指定された値から最大±１０％の偏差を包含することを意味する。同様に、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、分子量、反応条件等の特性の量を表わす全ての数字は、「約」という用語により、全ての事例において修飾されていると理解されたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得られるのが求められる所望の特性に応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００５０】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例中で説明された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測定において見出される標準偏差を必然的に生じる、一定の誤差を本質的に含有する。
【００５１】
「単離された」は、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」されている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。本明細書で使用されるとき、「単離された」抗体又は抗原結合フラグメントは、種々の抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合フラグメントを実質的に含まない抗体又は抗原結合フラグメントを意味することを意図している（例えば、ＢＣＭＡに特異的に結合する単離された抗体は、ＢＣＭＡ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ＢＣＭＡのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連する抗原（例えば、ＢＣＭＡ種間ホモログ）に対する交差反応性を有してもよい。
【００５２】
「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼ばれ、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物でもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。各種の修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【００５３】
「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。天然の配列バリエーションが重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中におそらく存在するために、幾らかのレベルのバリエーションが本明細書に記載されたアミノ酸配列又は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に見出されると予測されるであろう。ただし、固有の結合特性（例えば、特異性及び親和性）にはほとんど影響しないか、又は影響しない。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク質の性質を認識できるほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」は、２つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％以上の同一性を意味する。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）。同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４，１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４〜４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【００５４】
タンパク質の機能に実質的な影響を有することなく、タンパク質のアミノ酸配列内に生じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には適用しないためである。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原結合フラグメントに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味する。他の実施形態は、本明細書に記載された抗体及び抗原結合フラグメントと顕著な同一性を共有しないが、１つ又は２つ以上のＣＤＲ又は結合性を付与するのに必要とされる他の配列を組み込む、フレームワーク、スキャフォールド、又は他の非結合領域を有し、本明細書に記載されたこのような配列に対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、ＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
【００５５】
「ベクター」とは、セグメントの複製又は発現をもたらすように、別の核酸セグメントを操作的に挿入可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスのことである。
【００５６】
「クローン」は、有糸分裂により、単一の細胞又は共通する祖先から得られる細胞集団である。「細胞株」は、多くの世代の間、インビトロにおいて安定して増殖させることができる初代細胞のクローンである。本明細書で提供された一部の例では、細胞は、細胞をＤＮＡでトランスフェクションすることにより、形質転換される。
【００５７】
「発現する」及び「生成する」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。また、これらの用語は、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリぺプチドへの翻訳を包含し、全ての天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養の増殖培地内でもよい。
【００５８】
「処置すること」又は「処置」という用語は、損傷、病理、又は病状の減弱又は改善における、何らかの成功又は成功の兆候を指し、これには、寛解、緩解、症状の減少、病状を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は低落速度を遅くすること、変性による最終的な衰弱を和らげること、患者の肉体的又は精神的健康を改善すること、あるいは生存期間の長さを延長することなどの、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。治療は、客観的又は主観的なパラメータにより評価されてもよい。同パラメータには、身体的検査、神経学的検査、又は精神医学評価の結果が挙げられる。
【００５９】
「有効量」又は「治療的に有効な量」は、必要とされる用量及び期間において、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。治療的に有効な量のＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を引き出す抗体の能力等の要因に従って変動し得る。治療的に有効な量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害作用より、治療的に有益な作用が上回る量でもある。
【００６０】
「抗体」は、特に断らない限り、免疫グロブリンの全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ）を意味し、種々の単量体、多量体、及びキメラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び抗体様ポリペプチド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される。
【００６１】
「抗原結合フラグメント」は、特定の抗原に対して結合親和性を示し得る、任意のタンパク質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂、ペプチド合成、及び組換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の、少なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方）、又は１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖若しくはＣＤＲと他のタンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体若しくは二量体、軽鎖単量体若しくは二量体、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる二量体、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第２００７０５９７８２号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、Ｖ．ｓｕｂ．Ｈ及びＣ．ｓｕｂ．Ｈ１ドメインから本質的になるＦｄフラグメント、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖフラグメント、ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ．、２１（１１）：４８４〜９０）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４〜５４６（１９８９））、ラクダ若しくはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ．、５（１）：１１１〜２４）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）等が挙げられるが、これらに限定されない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメントを生成するのに使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の抗原に対する親和性を付与する方向にポリペプチドセグメントをうまく包含させ得る、非抗体タンパク質性フレームワーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組換え的に生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的開裂により生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という語句は、所与の抗原結合フラグメントが、語句内で言及された抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸セグメントを包含することを意味するように使用され得る。
【００６２】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、分子の表面グルーピング、例えば、アミノ酸又は糖側鎖からなり、通常、特定の三次元構造特性並びに特定の荷電特性を有する。構造的及び非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的にブロックされるか、又は覆われるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内にある）とを含んでもよい。
【００６３】
抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、「特異的な結合」若しくは「免疫特異的な結合」又はそれらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによりコードされたドメインを介して、分子の混合集団を含有するサンプル中の他の分子に優先的に結合することなく、対象となるタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープに結合することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッセイにより測定された場合、約１×１０−８Ｍ未満のＫｄで、同じ性質の抗原に結合する。「［抗原］特異性」抗体（例えば、ＢＣＭＡ特異性抗体）等の表現は、列挙された抗体が列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意味する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。
【００６５】
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された方法の多くの実施形態において、対象はヒトである。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から単離された、類似する流体、細胞、又は組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）の収集物、並びに対象内に存在する流体、細胞、又は組織を意味する。一部の実施形態では、サンプルは、体液である。体液は、典型的には、生理学的温度において液体であり、対象又は生物学的ソース中に存在し、これらから採取され、これらから外に出され、又は他の方法で抽出された自然発生する流体を含んでもよい。特定の組織、臓器、又は局所的な領域から得られた特定の体液及び特定の他の体液は、対象又は生物学的ソースにおいて、より全体的に又は全身的に適していてもよい。体液の例には、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙、糞、痰、分泌組織及び臓器の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水液、例えば、非固体腫瘍に関連するもの、肋膜、心膜、腹膜、腹部及び他の体腔の流体、気管支洗浄により収集された流体等が挙げられる。体液はまた、対象又は生物学的ソースと接触した溶液、例えば、細胞又は臓器順化培地を含む細胞及び臓器培養培地、洗浄液等を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から取り出された材料又は対象中に存在する材料を包含する。
【００６７】
「既知の標準」は、既知の量又は濃度のＢＣＭＡを有する溶液でもよい。この場合、この溶液は、自然発生する溶液、例えば、初期、中期、後期、進行性、又は静的がんを有することが既知の患者からのサンプルでもよく、又はこの溶液は、希釈された既知の量のＢＣＭＡを有する緩衝水等の合成溶液でもよい。本明細書に記載された既知の標準は、対象から単離されたＢＣＭＡ、組換え若しくは精製されたＢＣＭＡタンパク質、又は病態に関連するＢＣＭＡ濃度の値を含んでもよい。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「ＢＣＭＡ」という用語は、ヒトＢ細胞成熟抗原を意味し、ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９、及びＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても周知であり、分化形質細胞に優先的に発現される腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔのアミノ酸１〜５４（又は５〜５１）により構成される。本明細書で使用されるとき、「ＢＣＭＡに対する抗体、抗ＢＣＭＡ抗体」という用語は、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する抗体を意味する。
【００６９】
「ＣＤ３」という用語は、ヒトＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体を意味する。ＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体は、６つの区別できるポリペプチド鎖から構成される。これらは、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０４２３４）、２つのＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６）、及び１つのＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ２０９６３）を含み、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖と会合する。「ＣＤ３」という用語は、特に断らない限り、細胞（Ｔ細胞を含む）により本来発現されているか、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞上に発現され得る任意のＣＤ３変異体、アイソフォーム、及び種間ホモログを含む。
【００７０】
「ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体」は、多重特異性抗体、場合により、二重特異性抗体であり、同二重特異性抗体は、２種類の異なる抗原結合領域を含み、一方の抗原結合領域は、抗原ＢＣＭＡに特異的に結合し、もう一方の抗原結合領域は、ＣＤ３に特異的に結合する。多重特異性抗体は、二重特異性抗体、ディアボディ、又は類似する分子であり得る（ディアボディの説明については、例えば、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１４），６４４４〜８（１９９３）を参照のこと）。本明細書で提供された二重特異性抗体、ディアボディ等は、ＢＣＭＡの一部に加えて、任意の適切な標的に結合してもよい。「二重特異性抗体」という用語は、異なる抗体配列により定義された、２種類の抗原結合領域を有する抗体と理解されたい。これは、異なる標的結合と理解され得るが、１つの標的中の異なるエピトープに十分結合することを含む。
【００７１】
「参照サンプル」は、別のサンプル、例えば、試験サンプルに対して比較され、比較されたサンプルの特徴を決定することができるサンプルである。参照サンプルは、試験サンプルとの比較の基礎として機能する、いくつかの特徴付けられた特性を有するであろう。例えば、参照サンプルは、がんを有する対象を示すＢＣＭＡレベルについてのベンチマークとして使用することができる。参照サンプルは、試験サンプルと平行して解析されることを必ずしも必要としない。このため、一部の例では、参照サンプルは、所与の条件を特徴付けるために予め決定された数値又は範囲、例えば、対象中のがんを示すＢＣＭＡレベルでもよい。この用語はまた、生理学的状態又は病態、例えば、ＢＣＭＡ発現がんに関連することが周知であるが、未知量のＢＣＭＡを有する、比較目的で使用されるサンプルを含む。
【００７２】
ＢＣＭＡ発現がんの進行の文脈において使用されるとき、「進行」という用語は、より重篤でない状態からより重篤な状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の増大を含むことができる。例えば、「結腸がんの進行」には、このようながんの、より重篤でない状態からより重篤な状態への進行、例えば、ステージＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩＩＩへ等の進行が挙げられる。
【００７３】
ＢＣＭＡ発現がんの退行の文脈において使用されるとき、「退行」という用語は、より重篤な状態からより重篤でない状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の低下を含むことができると考えられる。例えば、「結腸がんの退行」には、このようながんの、より重篤な状態からより重篤でない状態への退行、例えば、ステージＩＩＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩへ等の進行が挙げられる。
【００７４】
安定したＢＣＭＡ発現がんの文脈において使用されるとき、「安定した」という用語は、進行性がん又は退行性がんであるとみなすのに臨床的意義のある期間にわたり有意に十分に変化しない、又は変化していなかった病態を説明することを意図している。
【００７５】
本明細書に記載された実施形態は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に限定されるものではなく、当然、変動し得る。
【００７６】
ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメント
本明細書において、ＢＣＭＡに特異的に結合する、組換えモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントが記載されている。抗体分子の全体的な構造は、抗原結合ドメインを含む。同ドメインは、重鎖及び軽鎖並びにＦｃドメインを含み、補体固定及び結合抗体受容体を含む各種の機能を果たす。
【００７７】
記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、全てのアイソタイプである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びに４本鎖免疫グロブリン構造の合成多量体を含む。記載された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、雌鳥又はシチメンチョウの血清及び雌鳥又はシチメンチョウの卵黄中に一般的に見出されるＩｇＹアイソタイプも含む。
【００７８】
ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、任意の種から組換え手法により得ることができる。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト、又はそれらのキメラ版でもよい。ヒトへの投与において使用するために、非ヒト由来の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの患者への投与に基づいてほとんど抗原性がないように、遺伝的に又は構造的に改変することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントはキメラである。本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、非ヒト哺乳類、げっ歯類、又は爬虫類の抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインの少なくとも一部の部分を有するが、抗体又はその抗原結合フラグメントの残り部分がヒトに由来する、抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。
【００８０】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列）でもよい。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、又はウサギからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなる。同可変ドメイン中、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのうち少なくとも一部を含んでもよい。
【００８１】
本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、各種の形態で存在し得るが、表１に示された抗体ＣＤＲのうち１つ又は２つ以上を含むこととなる。
【００８２】
本明細書において、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する、組換え抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ又はその誘導体である。本明細書で例示されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトであるが、例示された抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ化されてもよい。
【００８３】
一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００８４】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも５．９ｎＭのＩＣ５０でＡＰＲＩＬ結合を阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１１と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８５】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５７と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５７と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号２８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８６】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３４と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３４と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号２８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８７】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３９と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３９と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号２８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８８】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４０と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号２８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００８９】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５８と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５８と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号２８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９０】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４３と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４３と実質的に同じか又は同一の重鎖可変ドメインと、配列番号２８と実質的に同じか又は同一の軽鎖可変ドメインとを含む。この段落において検討された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１つのアームが抗ＢＣＭＡアームである、二重特異性構築物への包含に適している。
【００９１】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体がＩｇＧ１アイソタイプからなる一部の実施形態では、抗体はＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号７４）を含む。
【００９２】
配列番号７４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００９３】
抗体がＩｇＧ４アイソタイプからなる一部の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域（配列番号７３）中に含有する。
【００９４】
配列番号７３
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【００９５】
上記段落において検討された、ＣＤＲ及び／又は可変ドメイン配列により定義された特異性抗体は、これらのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含んでもよい。
【００９６】
ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離された合成ポリヌクレオチドもまた開示される。本明細書で提供された可変ドメインセグメントをコード可能な単離されたポリヌクレオチドは、抗体又は抗原結合フラグメントを生成する同一の又は異なるベクターに含まれてもよい。
【００９７】
組換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内である。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド（及びこのポリヌクレオチドがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を含む。本発明の文脈において、下記注釈は、別途記載のない限り、変異を説明するのに使用される。ｉ）所与の位置におけるアミノ酸の置換は、例えば、Ｋ４０９Ｒと記載される。Ｋ４０９Ｒは、４０９位におけるリジンのアルギニンによる置換を意味する。ｉｉ）特定の変異体について、特定の三文字又は一文字コードは、コードＸａａ及びＸを含めて、アミノ酸残基を示すのに使用される。このため、４０９位におけるリジンについてのアルギニンの置換は、Ｋ４０９Ｒと指定され、又は４０９位におけるリジンについての任意のアミノ酸残基の置換は、Ｋ４０９Ｘと指定される。４０９位におけるリジンの欠失の場合には、この欠失は、Ｋ４０９＊により示される。当業者であれば、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を生成することができる。
【００９９】
これらの変異体としては、（ａ）１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸により置換されている変異体、（ｂ）１つ又は２つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加され、又は同ポリペプチドから欠失されている変異体、（ｃ）１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが別のペプチド又はポリペプチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合した変異体を挙げることができる。これらは、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体についてのエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等を付与してもよい。本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいてある種からのアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されている変異体を含んでもよい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残基により置換される。これらの変異体を得るための手法は、遺伝的（欠失、変異等）、化学的、及び酵素的手法を含めて、当業者に既知である。
【０１００】
本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、複数の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを具現化することができる。一部の実施形態では、抗体アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプ、好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体又はその抗原結合フラグメントの特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置により主に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を変化させることなく、別のアイソタイプに変更することができる。あるいは、抗原特異性を変化させることなく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術（アイソタイプスイッチング）が確立されてきた。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載された抗体又は抗原結合フラグメントの範囲内にある。
【０１０１】
本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＡＰＲＩＬ結合について少なくとも５．９ｎＭのＩＣ５０値を有する。記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントのＩＣ５０は、当該技術分野において周知の種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡに基づく方法又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により決定され得る。ＥＬＩＳＡによりＩＣ５０を測定するアッセイは、ＢＣＭＡ特異性抗体の存在下及び不在下でＢＣＭＡ結合プレートを有し、様々な濃度のＡＰＲＩＬを使用する。ＡＰＲＩＬのＢＣＭＡへの結合を阻害するＢＣＭＡ抗体は、「ＥＬＩＳＡにより測定するとき、ＡＰＲＩＬを阻害する」ことができる。
【０１０２】
本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。ベクターは、発現ベクターであり得る。このため、対象となるポリペプチドをコードする配列を含有する組換え発現ベクターは、本開示の範囲内であると想到される。発現ベクターは、１つ又は２つ以上の追加配列を含有してもよい。同追加配列には、例えば、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。広い各種の宿主細胞を形質転換するためのベクターは周知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに、他の細菌、酵母、及びウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本説明の範囲内にある組換え発現ベクターは、適切な調節エレメントに操作可能に連結することができる少なくとも１つの組換えタンパク質をコードする、合成的、遺伝的、又はｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む。このような調節エレメントには、転写プロモータ、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類の発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現される遺伝子に連結された適切なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’フランキング非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。
【０１０４】
脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳コントロール配列は、ウイルスソースにより提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，３  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）に記載されたように構築されてもよい。
【０１０５】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントのコード配列は、強力な構成的プロモータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等のためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。このようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列は、誘引性プロモータ、例えば、メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘引性プロモータ、ドキシサイクリン誘引性プロモータ、１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、例えば、プロテインキナーゼＲ  ２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素、ＭＸ遺伝子、ＡＤＡＲ１等を含有するプロモータの制御下に置かれる。
【０１０６】
本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を向上させるのに有益であり得る。一部の実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなる。同部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターのコンポーネントは、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサ」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【０１０７】
ベクターは、当技術分野において既知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ブラストサイジン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７３８〜１７４３（２０００））が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【０１０８】
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子で、種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して、ＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの生成細胞を生じさせることができる。このため、別の態様は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載され、例示された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を特徴とする。
【０１０９】
外来性遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当技術分野において既知であり、本明細書に記載され、例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目的で組換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法により、異種遺伝子配列を宿主細胞に適切に形質転換されるべきであり、その結果、異種遺伝子配列は、細胞の子孫により遺伝され、発現されることができ、レシピエント細胞の必須の成育及び生理学的機能が損なわれない。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組換えＤＮＡウイルス、組換えＲＮＡウイルス）等が挙げられる（Ｃｌｉｎｅ，２９  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９〜９２（１９８５）に記載）が、これらに限定されない。哺乳類細胞による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘因融合を使用しても、細胞を形質転換することができる。
【０１１０】
本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの発現に使用するのに適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞である。これらの細胞には、例えば、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株等が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当技術分野において十分確立されている。
【０１１１】
本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントの組換え発現について選択され、又はスクリーニングされてもよい。組換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異により得る。変異は、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はこのような方法の組み合わせにより得られる。
【０１１２】
治療のためにＢＣＭＡ特異性抗体を使用する方法
本明細書において、治療に使用するための、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。特に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、がん、例えば、ＢＣＭＡ発現がんを治療するのに有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書に記載されたとおりの抗体、例えば、ＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを含むがんを治療する方法を提供する。例えば、この使用は、ＢＣＭＡ受容体の相互作用を使用した阻害によるものであってよく、すなわち、抗体が毒物に結合され、この毒物をＢＣＭＡ発現がんに標的化する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのリンパ腫を含む。これらの方法に使用するための抗体としては、本明細書で上述されたもの、例えば、表１に列記された特徴（例えば、ＣＤＲ又は可変ドメイン配列）及びこれらの抗体の更なる検討において列記された特徴を有する、ＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントが挙げられる。
【０１１３】
本明細書に記載された一部の実施形態では、ＢＣＭＡ特異性抗体の免疫エフェクター特性は、当業者に既知の技術によるＦｃ改変によって向上するか、又はサイレンシングされることができる。例えば、Ｆｃエフェクター機能、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等が、これらの活性を担うＦｃ中の残基を改変することにより提供され、かつ／又は制御され得る。
【０１１４】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続けて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を意味する。
【０１１５】
ＡＤＣＣを誘引するモノクローナル抗体の能力は、そのオリゴ糖成分を操作することにより向上され得る。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７において、Ｎ−グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態にある。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により生成される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に付着した二分岐の複雑なタイプのオリゴ糖からのコアフコースの除去により、改善されたＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩａ結合を介して、抗原結合性又はＣＤＣ活性を変化させることなく、抗体のＡＤＣＣが向上される。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化抗体の成功した発現をもたらすことが報告された種々の方法、例えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４：２４９〜６５，２０１２）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜２６７４０，２００２）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４），２０１０、Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜３４７３，２００３）、アルファ．１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１〜９０８，２００４）、又はベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジアルファ−マンノシダーゼＩＩとの共発現又は強力なアルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシン（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：５０３２〜５０３６；２００６、Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３：８５１〜８６１，２００６；Ｘｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９９：６５２〜６５，２００８）を使用して達成され得る。
【０１１６】
本明細書において記載された一部の実施形態では、ＢＣＭＡ抗体により引き出されたＡＤＣＣはまた、抗体Ｆｃ中の特定の置換によって向上され得る。例示的な置換は、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号に記載されたように、アミノ酸位置２５６、２９０、２９８、３１２、３５６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８、又は４３０（ＥＵインデックスに従った残基番号付け）における置換である。
【０１１７】
ＢＣＭＡを検出する方法
本明細書において、サンプルを、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、生体サンプル中のＢＣＭＡを検出するための方法が提供される。本明細書に記載されたように、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得ることができる。一部の実施形態では、記載された方法は、サンプルを、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかと接触させることにより、生体サンプル中のＢＣＭＡを検出することを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、サンプルを、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントの２つ以上と接触させてもよい。例えば、サンプルを、第１のＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、第２のＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよく、この場合、第１の抗体又は抗原結合フラグメントと第２の抗体又は抗原結合フラグメントとは、同じ抗体又は抗原結合フラグメントではない。一部の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、表面、例えば、マルチウェルプレート、チップ又は類似する基材に固定されてもよい。他の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、全く固定されず又は付着されなくてもよい。
【０１１９】
記載されたＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、検出可能に標識されてもよい。一部の実施形態では、標識された抗体及び抗原結合フラグメントは、本明細書に記載された方法により、ＢＣＭＡの検出を容易にし得る。多くのこのような標識が、当業者に容易に既知である。例えば、適切な標識には、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。より具体的には、記載された標識には、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料等が挙げられる。
【０１２０】
記載されたＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、生体サンプル中のＢＣＭＡを検出するための各種のアッセイに使用されてもよい。一部の適切なアッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。
【０１２１】
本明細書に記載された一部の実施形態では、対象におけるＢＣＭＡ発現がん細胞の検出を使用して、対象がＢＣＭＡに向けられる治療剤により処置されてもよいことを判定することができる。
【０１２２】
ＢＣＭＡは、血液及び血清サンプル中に、検出可能なレベルで存在する。このため、本明細書において、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、血液から得られたサンプル、例えば、血清サンプル中のＢＣＭＡを検出するための方法が提供される。血液サンプル又はその派生物は、希釈され、画分され、又は他の方法で処理されて、記載された方法が行われ得るサンプルを生成することができる。一部の実施形態では、ＢＣＭＡは、当技術分野において既知の任意の回数のアッセイにより、血液サンプル又はその派生物中で検出することができる。例えば、同アッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
がんを診断するための方法
本明細書において、対象におけるＢＣＭＡ発現がんを診断するための方法が提供される。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのリンパ腫を含む。一部の実施形態では、上記されたように、生体サンプル、例えば、血液サンプル又は血清サンプル中のＢＣＭＡを検出することは、サンプルが得られた対象中のがんを診断する能力を提供する。あるいは、一部の実施形態では、他のサンプル、例えば、組織学的サンプル、微小針吸引サンプル、切除された腫瘍組織、循環細胞、循環腫瘍細胞等もまた、サンプルが得られた対象ががんを有するかどうかを評価するのに使用されてもよい。一部の実施形態では、サンプルが得られた対象ががんを有することが既に分かっていてもよいが、対象を苦しめているがんの種類は、未だに診断されていなくてもよく、又は予備的診断では未知であるため、対象から得られた生体サンプル中のＢＣＭＡを検出することにより、がんの診断を可能にし、又は明確にすることができる。例えば、対象ががんを有することが分かっていてもよいが、分かっていなくてもよく、又は、対象のがんがＢＣＭＡを発現しているかどうかが、不明であってもよい。
【０１２４】
一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた生体サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を決定し、観察されたＢＣＭＡの量をコントロール又は参照サンプル中のＢＣＭＡの量と比較することにより、対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいるどうかを評価することを含む。この場合、対象から得られたサンプル中のＢＣＭＡの量とコントロール又は参照サンプル中のＢＣＭＡの量との間の差は、対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいることの指標である。別の実施形態では、対象から得られた生体サンプル中に観察されたＢＣＭＡの量は、特定の形態又はステージのがんに関連することが既知のＢＣＭＡのレベルと比較されて、対象のがんの形態又はステージを決定することができる。一部の実施形態では、対象から得られたサンプル中のＢＣＭＡの量は、サンプルを、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体と接触させることにより評価される。ＢＣＭＡの存在について評価されるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得られてもよい。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などの血液がんを含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１２５】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんを診断する方法は、対象の生体サンプルを、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、表１で提供された抗体及びフラグメントから得られたもの）と接触させること、抗体又はその抗原結合フラグメントによって結合したサンプル中に存在するＢＣＭＡの量を定量すること、サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を既知の標準又は参照サンプルと比較すること、及び対象のＢＣＭＡレベルががんに関連するＢＣＭＡのレベル内に入るかどうかを判定することを含むであろう。更なる実施形態では、診断方法は、がん特異的処置を投与又は処方する更なる工程が続き得る。別の実施形態では、診断方法は、がんの処置を容易にするために、判定の結果を伝送する更なる工程が続き得る。一部の実施形態では、がん特異的処置は、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体などのＢＣＭＡ発現がんに対して向けられてもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた血液又は血清サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を決定することと、観察されたＢＣＭＡの量をコントロール又は参照サンプル中のＢＣＭＡの量と比較することと、により、対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいるかどうかを評価することを含む。この場合、対象から得られたサンプル中のＢＣＭＡの量とコントロール又は参照サンプル中のＢＣＭＡの量との間の差は、対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいることの指標である。
【０１２７】
一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいない対象から得られてもよい。一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいる対象から得られてもよい。コントロール又は参照サンプルがＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいない対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＢＣＭＡの量に対して、試験サンプル中に存在するＢＣＭＡの量における観察された増大は、評価された対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいることの指標である。コントロールサンプルがＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいない対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＢＣＭＡの量に対して、試験サンプル中に存在するＢＣＭＡの量における観察された減少又は類似性は、評価された対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいないことの指標である。コントロール又は参照サンプルがＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいる対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＢＣＭＡの量に対して、試験サンプル中に存在するＢＣＭＡの量における観察された類似性は、評価された対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいることの指標である。コントロール又は参照サンプルがＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいる対象から得られる一部の実施形態では、コントロール又は参照サンプルについて観察されたＢＣＭＡの量に対して、試験サンプル中に存在するＢＣＭＡの量における観察された減少は、評価された対象がＢＣＭＡ発現がんに苦しんでいないことの指標である。
【０１２８】
一部の実施形態では、対象から得られたサンプル中のＢＣＭＡの量は、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載された抗体と接触させることにより評価される。ＢＣＭＡの存在について評価されるサンプルは、血液サンプル、血清サンプル、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得られてもよい。
【０１２９】
種々の態様において、ＢＣＭＡの量は、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより決定される。一部の実施形態では、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する２つ以上の種類の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。一部の実施形態では、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、ＢＣＭＡに特異的に結合する第２の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。本明細書に記載されたものなどのＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントを、この能力において使用してもよい。
【０１３０】
ＢＣＭＡ特異性抗体及び抗原結合フラグメントの種々の組み合わせを使用して、記載された診断方法を行うための「第１」及び「第２」の抗体又は抗原結合フラグメントを提供することができる。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのリンパ腫を含む。
【０１３１】
特定の実施形態では、ＢＣＭＡの量は、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。
【０１３２】
記載された診断方法の種々の実施形態では、コントロール又は参照サンプルが使用される。このサンプルは、使用されるアッセイが適切に機能していることを保証する陽性又は陰性のアッセイコントロールでもよい。例えば、この性質のアッセイコントロールは、免疫組織化学アッセイに一般的に使用されてもよいと考えられる。あるいは、サンプルは、健康な対象からの生体サンプル中のＢＣＭＡの量について標準化された参照であってもよい。一部の実施形態では、試験された対象の観察されたＢＣＭＡレベルは、ＢＣＭＡ発現がんを有することが分かっている対象からのサンプル中に観察されたＢＣＭＡレベルと比較されてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、対象となる特定のがんに苦しんでいてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、初期段階のがんを有することが既知であり、同初期段階のがんは、ＢＣＭＡ発現がんであってもよく、又はＢＣＭＡ発現がんでなくてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、中間段階のがんを有することが既知であり、同中間段階のがんは、ＢＣＭＡ発現がんであってもよく、又はＢＣＭＡ発現がんでなくてもよい。一部の実施形態では、コントロール対象は、後期段階を有することが既知であり、同後期段階は、ＢＣＭＡ発現がんであってもよく、又はＢＣＭＡ発現がんでなくてもよい。
【０１３３】
がんをモニタするための方法
本明細書において、対象におけるＢＣＭＡ発現がんをモニタするための方法が提供される。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのリンパ腫を含む。一部の実施形態では、記載された方法は、対象から得られた試験サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を決定することと、観察されたＢＣＭＡの量をより早い時点で対象から同様にして得られた生体サンプル中のＢＣＭＡの量と比較することと、により、ＢＣＭＡ発現がんが進行性、退行性、又は不変なままであるかどうかを評価することを含む。この場合、試験サンプル中のＢＣＭＡの量とより早期のサンプル中のＢＣＭＡの量との間の差は、がんが、進行性、退行性、又は不変なままであるかどうかの指標を提供する。これに関して、より早期のサンプルについて観察された量に対して増大した量のＢＣＭＡを含む試験サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんの進行を示すことができる。逆に、より早期のサンプルについて観察された量に対して減少した量のＢＣＭＡを含む試験サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんの退行を示すことができる。
【０１３４】
したがって、より早期のサンプルについて観察された量に対してＢＣＭＡの量におけるわずかな差しか有さない試験サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんについて不変の病態を示すことができる。一部の実施形態では、対象から得られた生体サンプル中のＢＣＭＡの量は、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載された抗体と接触させることにより評価される。ＢＣＭＡの存在について評価されるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得られてもよい。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんをモニタする方法は、対象の生体サンプルを、ＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、表１で提供された抗体及びフラグメントから得られたもの）と接触させることと、サンプル中に存在するＢＣＭＡの量を定量することと、サンプル中に存在するＢＣＭＡの量をより早い時点において同じ対象から同様にして得られた生体サンプル中に存在することが決定されたＢＣＭＡの量と比較することと、対象のＢＣＭＡレベルが経時的に変化していたかどうかを判定することと、を含むであろう。より早期のサンプルについて観察された量に対して増大した量のＢＣＭＡを含む試験サンプルは、がんの進行を示すことができる。逆に、より早期のサンプルについて観察された量に対して減少した量のＢＣＭＡを含む試験サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんの退行を示すことができる。したがって、より早期のサンプルについて観察された量に対してＢＣＭＡの量におけるわずかな差しか有さない試験サンプルは、ＢＣＭＡ発現がんについて不変の病態を示すことができる。一部の実施形態では、サンプルのＢＣＭＡレベルは、単独で、又はより早い時点において評価されたサンプルについて観察されたＢＣＭＡレベルに加えて、既知の標準又は参照サンプルと比較されてもよい。更なる実施形態では、診断方法は、がん特異的処置を投与する更なる工程が続き得る。一部の実施形態では、がん特異的処置は、例えば、本明細書に記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体などのＢＣＭＡ発現がんに対して向けられてもよい。
【０１３６】
種々の態様において、ＢＣＭＡの量は、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより決定される。一部の実施形態では、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する２つ以上の種類の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。一部の実施形態では、サンプルを、ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、ついで、ＢＣＭＡに特異的に結合する第２の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよい。本明細書に記載されたもの等の抗体を、この能力において使用されてもよい。
【０１３７】
表１で記載された抗体及び抗原結合フラグメントの種々の組み合わせを使用して、記載されたモニタ方法を行うための「第１」及び「第２」の抗体又は抗原結合フラグメントを提供することができる。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がんを含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、ＢＣＭＡの量は、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。
【０１３９】
ＢＣＭＡを検出するためのキット
本明細書において、生体サンプル中のＢＣＭＡを検出するためのキットが提供される。これらのキットは、本明細書に記載されたＢＣＭＡ特異性抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、このキットを使用するための取扱説明書とを含む。
【０１４０】
提供されたＢＣＭＡ特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、溶液の中に存在してもよく、凍結乾燥されていてもよく、基材、キャリア、又はプレートに固着されていてもよく、又は検出可能に標識化されていてもよい。
【０１４１】
記載されたキットはまた、本明細書に記載された方法を行うのに有用な更なる構成要素を含んでもよい。例として、キットは、対象からサンプルを得るための手段、コントロール若しくは参照サンプル、例えば、ゆっくり進行するがんを有する対象及び／若しくはがんを有さない対象からのサンプル、１つ若しくはそれ以上のサンプル区画、及び／又は本発明の方法の実施を説明する取扱説明書、並びに組織特異的コントロール若しくは標準をも含んでもよい。
【０１４２】
ＢＣＭＡのレベルを決定するための手段は、例えば、ＢＣＭＡのレベルを決定するためのアッセイに使用するためのバッファ又は他の試薬を更に含み得る。取扱説明書は、例えば、アッセイを行うための印刷された取扱説明書及び／又はＢＣＭＡの発現レベルを評価するための取扱説明書であり得る。
【０１４３】
記載されたキットはまた、対象からサンプルを単離するための手段を含んでもよい。これらの手段は、対象から流体又は組織を得るのに使用され得る機器又は試薬のうち１つ又は２つ以上の品目を含み得る。対象からサンプルを得るための手段はまた、血液サンプルから血液成分、例えば、血清を単離するための手段を含んでもよい。好ましくは、キットは、ヒト対象で使用するために設計されている。
【０１４４】
多重特異性抗体
本明細書に記載された抗ＢＣＭＡ抗体の結合ドメインは、その表面上にＢＣＭＡを発現している細胞を認識する。上記されたように、ＢＣＭＡの発現は、がん細胞を示し得る。特定の部分集合の細胞に対するより特異的な標的化は、二重特異性分子、例えば、ＢＣＭＡ及び別の標的（ＣＤ３など）に結合する抗体又は抗体フラグメントを作製することにより達成され得る。これは、ＢＣＭＡに結合する第１の領域及び他の標的抗原に結合する第２の結合領域を含む分子を作製することにより達成される。抗原結合領域は、標的の特異的認識を可能にするいずれの形態もとることができ、例えば、結合領域は、重鎖可変ドメイン、Ｆｖ（重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの組み合わせ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、フィブロネクチン由来、若しくはフィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づく、又はテネイシン由来、若しくはテネイシン由来のＩＩＩ型ドメインのコンセンサスに基づく、例えば、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から得られるＣｅｎｔｙｒｉｎ分子、例えば、国際公開第２０１０／０５１２７４号及び同第２０１０／０９３６２７号を参照のこと）であってよく、又はこれらを含んでよい。したがって、ＢＣＭＡ及び別の抗原にそれぞれに結合する２種類の異なる抗原結合領域を含む二重特異性分子が提供される。
【０１４５】
本明細書に記載された一部の多重特異性抗体は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３にそれぞれ結合する２種類の異なる抗原結合領域を含む。好ましい実施形態では、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に結合する多重特異性抗体（ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体）及びその多重特異性抗原結合フラグメントが提供される。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するために対を成す第１の重鎖（ＨＣ１）及び第１の軽鎖（ＬＣ１）と、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するために対を成す第２の重鎖（ＨＣ２）及び第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含む。好ましい実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するために対を成す第１の重鎖（ＨＣ１）及び第１の軽鎖（ＬＣ１）を含むＢＣＭＡ特異性アームと、ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するために対を成す第２の重鎖（ＨＣ２）及び第２の軽鎖（ＬＣ２）を含むＣＤ３特異性アームと、を含む二重特異性抗体である。一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、全長抗体構造を有する抗体を含む。本明細書で使用されるとき、「全長抗体」は、２本の全長抗体重鎖と２本の全長抗体軽鎖とを有する抗体を意味する。全長抗体重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。全長抗体重鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＬ及びＣＬを含む。全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠いていてもよい。「Ｆａｂアーム」又は「半分子」という用語は、抗原に特異的に結合する一対の重鎖−軽鎖を意味する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインのうちの１つは、非抗体ベースの結合ドメイン、例えば、フィブロネクチン３型ドメインに基づく結合ドメイン、例えば、Ｃｅｎｔｙｒｉｎである。
【０１４６】
本明細書で提供された多重特異性抗体のＢＣＭＡ結合アームは、上記されたＢＣＭＡ特異性抗体のいずれかから得られてもよい。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、表１で記載された抗体クローンから得られた重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、表１で記載された抗体クローンから得られた重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、表１に記載された抗体クローンから得られた重鎖可変ドメインを含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、表１に記載された抗体クローンから得られた重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖可変ドメインを含む。このようなＢＣＭＡ結合アームの一部の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡに結合する第１の抗原結合領域は、クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。
【０１４７】
表３は、ＢＣＭＡに特異的な１つの重鎖及び軽鎖対とＣＤ３に特異的な別の重鎖及び軽鎖対とを有するＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のリストを提供し、特定の抗体ＩＤを列記して、記載された実施形態を産生するために使用される抗原特異性抗体アームを説明する。
【０１４８】
【表３】
2018525005.tif 000004
【０１４９】
二重特異性抗体の一部の実施形態では、ＢＣＭＡ結合アームは、カニクイザルＢＣＭＡ、好ましくは、その細胞外ドメインにも結合する。
【０１５０】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＢＣＭＡ結合アームは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。ＢＣＭＡ結合アームがＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、ＢＣＭＡ結合アームは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。
【０１５１】
二重特異性抗体の一部の実施形態では、第２の抗原結合アームは、ヒトＣＤ３に結合する。一部の好ましい実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３特異性アームは、ヒト初代Ｔ細胞及び／又はカニクイザル初代Ｔ細胞に結合し、これらを活性化するＣＤ３特異性抗体から得られる。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＣＤ３εのＮ末端において、エピトープに結合する。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＣＤ３εの６つのＮ末端アミノ酸を含むエピトープと接触する。一部の実施形態では、二重特異性抗体のＣＤ３特異性結合アームは、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４、マウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプから得られる。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、抗体ＳＰ３４のＣＤＲを含む。このようなＣＤ３結合アームは、５×１０−７Ｍ以下、例えば、１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、又は１×１０−９Ｍ以下の親和性で、ＣＤ３に結合し得る。ＣＤ３特異性結合アームは、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４のヒト化版のアームでもよい。ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）は、ＣＤ３特異性アームが得られる抗ＣＤ３抗体をヒト化するのに使用されてもよい。二重特異性抗体の一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、表２から選択される重鎖と軽鎖とのペアを含む。二重特異性抗体の他の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、表２に記載した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。例えば、本明細書に記載された二重特異性抗体のＣＤ３結合アームの一部の実施形態の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列は、以下のアミノ酸配列を含み得る：Ｈｃ  ＣＤＲ１、配列番号５９；Ｈｃ  ＣＤＲ２、配列番号６０；Ｈｃ  ＣＤＲ３、配列番号６１；Ｌｃ  ＣＤＲ１、配列番号６２；Ｌｃ  ＣＤＲ２、配列番号６３；及びＬｃ  ＣＤＲ３、配列番号６４。
【０１５２】
一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。ＣＤ３結合アームがＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、ＣＤ３結合アームは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代カニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
【０１５３】
一部の実施形態では、抗体クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖を含むＢＣＭＡ結合アームを有するＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖及び軽鎖を含むＢＣＭＡ結合アームを有するＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クローンＣＤ３Ｂ２１９の重鎖を含むＣＤ３結合アームを有するＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クローンＣＤ３Ｂ２１９の重鎖及び軽鎖を含むＣＤ３結合アームを有するＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖を含むＢＣＭＡ結合アームと、抗体クローンＣＤ３Ｂ２１９の重鎖を含むＣＤ３結合アームとを有する、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体クローンＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、又はＢＣＭＢ１７７の重鎖及び軽鎖を含むＢＣＭＡ結合アームと、抗体クローンＣＤ３Ｂ２１９の重鎖及び軽鎖を含むＣＤ３結合アームとを有する、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【０１５４】
例示的なＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を表９に提示する。
【０１５５】
種々のフォーマットの二重特異性抗体が記載されてきており、Ｃｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｔｙ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｖ  １２：２７６に近年レビューされた。
【０１５６】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明において記載されたもの等の制御されたＦａｂアーム交換により得られたディアボディ、クロスボディ、又は二重特異性抗体である。
【０１５７】
一部の実施形態では、二重特異性抗体には、ヘテロ二量体化する相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子（この分子の２つの側面はそれぞれ少なくとも２種類の抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含有する）、ＩｇＧ融合分子（全長ＩｇＧ抗体がエクストラＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合されている）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ディアボディが重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合されている）、Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂフラグメントが互いに融合されている）、ＳｃＦｖ−及びディアボディ−ベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるディアボディ若しくは異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。
【０１５８】
一部の実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子には、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的マッチされた抗体（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランド交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０１５９】
一部の実施形態では、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子には、Ｄｕａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）−Ｉｇ  （ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ−Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
【０１６０】
一部の実施形態では、ＩｇＧ融合分子には、Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）−Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【０１６１】
一部の実施形態では、Ｆｃ融合分子には、ＳｃＦｖ／Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ−ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）．ｓｕｂ．２−Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−−Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
【０１６２】
一部の実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体には、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ−Ａｃｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｂｉｓ−Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ−Ｆｖ（ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ−、ディアボディ−ベース及びドメイン抗体には、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、Ｔａｎｄｅｍ  Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ−ｌｉｋｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＳｃＦｖ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的指向性ナノボディ（dual targeting nanobody）（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的指向性の重鎖のみのドメイン抗体（dual targeting heavy chain only domain antibody）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本発明の全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して、インビトロでのセルフリー環境において又は共発現を使用するかのいずれか一方において、異なる特異性を有する２つの抗体半分子の好ましいヘテロ二量体形成のために、各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより生成されてもよい。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により開放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られた生成物は、それぞれ異なるエピトープ、すなわち、ＢＣＭＡ上のエピトープ及びＣＤ３上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【０１６４】
本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体化」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０１６５】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体化」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０１６６】
「ノブ−ｉｎ−ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）が、全長二重特異性抗体を生成するのに使用されてもよい。簡潔に、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）。
【０１６７】
他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されたように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されたように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ  Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ  Ｋ４０９Ｆ  Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ  Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）により促進されてもよい。
【０１６８】
上記された方法に加えて、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載された方法に従って、セルフリー環境でのインビトロにおいて、２つの単特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法において、第１の単特異性二価抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ抗体）及び第２の単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作される。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、これにより、Ｆａｂアーム交換による二重特異性抗体が生成される。インキュベーション条件は、最適には、非還元条件に戻されてもよい。使用されてもよい例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びベータ−メルカプトエタノール、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭ  ２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベーションが使用されてもよい。
【０１６９】
記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体に加えて、記載されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供され、同様に、本明細書で提供されたＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により生成することができる。
【０１７０】
多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントを使用する治療組成物及び処置方法
上記で検討されたＢＣＭＡ二重特異性抗体、例えば、上記で検討されたＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、治療に有用である。特に、ＢＣＭＡ二重特異性抗体は、がんを処置するのに有用である。また、本明細書において、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するための治療組成物が提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態では、当該医薬組成物は、ＢＣＭＡ発現がんの治療用であり、ＢＣＭＡ発現がんとしては、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がん、及びＢＣＭＡが発現していると今のところ判定される他のがんが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。がん、例えば、上記で検討された特定のがんを含む血液がんを処置するのに使用されてもよい特定の二重特異性抗体には、抗体ＢＣＭＢ６９、ＢＣＭＢ１１７、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２８、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、若しくはＢＣＭＢ１７７、又はＣＤ３Ｂ２１９が挙げられる。がん、例えば、これらの特定のがんを含む血液がんを処置するのに有用な二重特異性抗体の一例は、ＢＣＭＢ７２である。
【０１７１】
本明細書で提供された医薬組成物は、ａ）有効量の本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントと、ｂ）不活性でも又は生理学的に活性でもよい医薬的に許容され得る担体とを含む。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容され得る担体」という用語は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤等を含む。適切な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうち１種又は２種以上、並びにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。特に、適切な担体の関連する例には、（１）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含有又は非含有、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられ、抗酸化剤、例えば、トリプタミン及び安定化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）をも含有してもよい。
【０１７２】
本明細書における組成物はまた、処置される特定の障害に応じて、更なる治療剤を含有してもよい。好ましくは、多重特異性抗体又は抗体フラグメントと補助的な活性化合物とは、互いに有害に影響を及ぼさない補完的な活性を有するであろう。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤である。
【０１７３】
本発明の組成物は、各種の形態でもよい。これらには、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は、意図された投与方式及び治療用途により決まる。典型的に好ましい組成物は、注射用液又は注入用液の形態である。好ましい投与方式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、静脈内に、ボーラスとして又は一定期間にわたる連続的な注入により投与される。別の好ましい実施形態では、本組成物は、局所及び全身性の治療効果を発揮するために、筋肉内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病巣周囲の経路により投与される。
【０１７４】
非経口投与用の無菌組成物が、本発明の抗体、抗体フラグメント、又は抗体コンジュゲートを、必要とされる量で適切な溶媒に包含させ、続けて、マイクロフィルター法により滅菌することにより調製され得る。溶媒又は媒体として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにこれらの組み合わせを使用することができる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましいであろう。これらの組成物はまた、補助剤、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、及び安定化剤を含有してもよい。非経口投与用の無菌組成物はまた、使用時に滅菌水又は任意の他の注射用無菌媒体中に溶解されてもよい、無菌の固体組成物の形態に調製されてもよい。
【０１７５】
多重特異性抗体又は抗体フラグメントはまた、経口投与されてもよい。経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、粉末剤（ゼラチンカプセル剤、サッシェ剤）、又は顆粒剤が使用されてもよい。これらの組成物において、本発明による活性成分は、１つ又は２つ以上の不活性な希釈剤、例えば、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース、又はシリカと、アルゴン流下において混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、１つ又は２つ以上の滑材、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルク、着色剤、コーティング（糖衣錠）、又はグレーズを含んでもよい。
【０１７６】
経口投与用の液体組成物として、不活性な希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、植物油、又はパラフィンオイルを含有する、医薬的に許容され得る液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が使用されてもよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味料、増粘剤、着香剤、又は安定化製品を含んでもよい。
【０１７７】
用量は、所望の効果、処置の持続期間、及び使用される投与経路により決まる。用量は、一般的には、成人１日あたりに経口で５ｍｇ〜１０００ｍｇであり、単位用量は、活性物質１ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲である。一般的には、医師は、適切な用量を、処置される対象の年齢、体重、及び同対象に固有の任意の他の要因に応じて決定するであろう。
【０１７８】
また、本明細書において、当該ＢＣＭＡに結合し、Ｔ細胞を補充して、当該ＢＣＭＡ＋細胞を殺傷すること（すなわち、Ｔ細胞のリダイレクト）が可能な多重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与することにより、ＢＣＭＡ＋細胞を殺傷するための方法が提供される。本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントのいずれかは、治療的に使用されてもよい。例えば、一実施形態では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体のＢＣＭＢ７２を治療的に使用して、対象においてがんを治療してもよい。
【０１７９】
好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。より好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントを含有する、上記で開示された医薬組成物のうち１つは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。一実施形態において、この障害は、がんである。特に、がんはＢＣＭＡ発現がんであり、ＢＣＭＡ発現がんとしては、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がん、及びＢＣＭＡが発現していると今のところ判定される他のがんが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。
【０１８０】
したがって、本発明の医薬組成物は、様々ながんの治療又は予防に有用であり、がんとしては、ＢＣＭＡ発現がんが挙げられ（ただし、これらに限定されない）、ＢＣＭＡ発現がんとしては、急性多発性骨髄腫（ＭＭ）などのＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がん、及びＢＣＭＡが発現していると今のところ判定される他のがんが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０１８１】
同様に、本明細書において、選択された細胞集団の成長を阻害するための方法であって、ＢＣＭＡ発現標的細胞又はこのような標的細胞を含有する組織を、有効量の本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントと、単独で、又は他の細胞毒性剤若しくは治療剤との組み合わせにおいてかのいずれか一方で、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の存在下で接触させることを含む、方法が更に提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤である。選択された細胞集団の成長を阻害するための方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて実施され得る。
【０１８２】
インビトロでの使用例には、疾患細胞又は悪性細胞を殺傷するための同じ患者への移植前の自家骨髄の処理、適格性Ｔ細胞を殺傷し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための移植前の骨髄の処理、標的抗原を発現していない所望の変異体を除く全ての細胞を殺傷し、又は不要な抗原を発現している変異体を殺傷するための細胞培養物の処理が挙げられる。非臨床的なインビトロでの使用条件は、当業者により容易に決定される。
【０１８３】
臨床的なエクスビボでの使用例は、がん処置における自家移植前での、骨髄から腫瘍細胞を除去することである。処置は、下記のように行われ得る。骨髄を、患者又は他の個体から収集し、ついで、本発明の細胞毒性剤を添加された血清含有培地中でインキュベートする。濃度は、約３０分〜約４８時間、約３７℃において、約１０μＭ〜１μＭの範囲である。インキュベーションの濃度及び時間の正確な条件、すなわち用量は、当業者により容易に決定される。インキュベーション後、骨髄細胞を、血清含有培地で洗浄し、既知の方法に従って、ｉ．ｖ．注入により患者に戻す。患者が他の処置、例えば、一連の骨髄破壊的化学療法又は全身照射を受けている状況において、骨髄の収集と処理された細胞の再注入との時間の間、処理された骨髄細胞は、標準的な医療機器を使用して、液体窒素中で凍結保存される。
【０１８４】
臨床的なインビボでの使用について、治療的に有効な量の多重特異性抗体又は抗原結合フラグメントがそれを必要とする対象に投与される。例えば、ＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体及びその多重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、ＢＣＭＡ発現がんの処置に有用であり得る。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ発現がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのＢ細胞がんである。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。一部の実施形態では、多重特異性抗体又は多重特異性抗原結合フラグメントは、無菌試験済みの溶液として投与されるであろう。
【０１８５】
処置及び使用の上記方法における投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分離用量を、時間をかけて投与してもよく、又は用量を治療状況の緊急性によって示されるように、比例して減少又は増加させてよい。非経口組成物は、投与の容易性及び用量の均一性のための投与形態に製剤化されてもよい。
【０１８６】
多重特異性抗体及びフラグメントの効率的な投与及び投与計画は、処置される疾患又は状態により決まり、当業者により決定されてもよい。本発明の化合物の治療的に有効な量の例示的で非限定的な範囲は、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１、約０．０１、約０．１、約１、又は約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１８７】
当技術分野において通常の技能を有する医師又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を、容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要されるより少ないレベルで医薬組成物中に利用される多重特異性抗体又はフラグメントの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増大させることができる。一般的には、本発明の二重特異性抗体の適切な日量は、治療効果を生じさせるのに有効な最も少ない用量である化合物量であろう。投与は、例えば、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下でもよい。一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、ｍｇ／ｍ２で算出された毎週投与での注入により投与されてもよい。このような用量は、例えば、下記：用量（ｍｇ／ｋｇ）×７０：１．８に従って、上記で提供されたｍｇ／ｋｇ用量に基づくことができる。このような投与は、例えば、１〜８回、例えば、３〜５回繰り返されてもよい。投与は、２〜２４時間、例えば、２〜１２時間の期間にわたる連続的な注入により行われてもよい。一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、毒性の副作用を減少させるために、長期間、例えば、２４時間超にわたるゆっくりとした連続的な注入により投与されてもよい。
【０１８８】
一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、１週間に１回で与えられる場合、最大８回、例えば、４〜６回の固定用量として算出された毎週投与において投与されてもよい。このような計画は、例えば、６ケ月又は１２ケ月後に、必要に応じて１回又は２回以上の回数繰り返されてもよい。このような固定用量は、例えば、上記で提供されたｍｇ／ｋｇ用量に基づくことができるが、このとき体重は、７０ｋｇと仮定する。用量は、例えば、生体サンプルを採取し、本発明の多重特異性抗体のＢＣＭＡ抗原結合領域を標的にする抗イディオタイプ抗体を使用することによって、本発明の二重特異性抗体の投与時の血中量を測定することにより、決定又は調節されてもよい。
【０１８９】
一実施形態において、多重特異性抗体又はフラグメントは、維持治療、例えば、６ケ月以上の期間に週一回等により投与されてもよい。
【０１９０】
多重特異性抗体又はフラグメントはまた、がんの進行リスクを低下させ、がんの進行におけるイベントの発生の開始を遅延させ、かつ／又はがんが緩解した際の再発リスクを低下させるために、予防的に投与されてもよい。
【０１９１】
本明細書に記載された多重特異性抗体及びそのフラグメントはまた、組み合わせ治療において投与されてもよい、すなわち、処置される疾患又は状態に関連する他の治療剤と組み合わせられてもよい。したがって、一実施形態において、抗体含有医薬は、１種又は２種以上の他の治療剤、例えば、化学療法剤と組み合わせるためのものである。一部の実施形態では、他の治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。このような組み合わせ投与は、同時、任意の順序において、別々又は連続的でもよい。同時投与について、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物又は別々の組成物として投与されてもよい。
【０１９２】
一実施形態において、対象においてＢＣＭＡを発現している細胞が関与する障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又はフラグメント、例えば、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を投与し、かつ放射線治療を行うことを含む方法が提供される。一実施形態において、がんを治療又は予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療的に有効な量の、本明細書に記載された多重特異性抗体又はフラグメント、例えば、ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体を投与し、かつ放射線治療を行うことを含む方法が提供される。放射線治療としては、提供される患者に対する、放射線又は放射性医薬の関連する投与を含んでもよい。放射線源は、処置される患者の外側又は内側のいずれか一方であってもよい（放射線処置は、例えば、放射線外部照射（ＥＢＲＴ）又は組織内照射療法（ＢＴ）の形態でもよい）。このような方法を実施するのに使用されてもよい放射性元素には、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１が挙げられる。
【０１９３】
キット
また、本明細書において、例えば、記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと、特定の細胞種を殺傷するための抗体又はフラグメントを使用するための取扱説明書と、を含むキットも提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。取扱説明書は、多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて使用するための指示を含んでもよい。
【０１９４】
典型的には、キットは、多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する区画を有するであろう。多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、凍結乾燥状態、液状、又はキットに含ませるのに修正可能な他の形態でもよい。キットはまた、キットの取扱説明書に記載された方法を実施するのに必要とされる、更なる要素を含有してもよい。同要素は、例えば、凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者への投与の前に多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせるための更なる薬剤、及び多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを患者に投与するのを支援するツールである。
【０１９５】
診断的使用
本明細書に記載された多重特異性抗体及びフラグメントはまた、診断目的に使用されてもよい。このため、本明細書で定義されたような多重特異性抗体又はフラグメントを含む診断組成物及びその使用もまた提供される。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗体又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、本明細書に記載されたようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントである。一実施形態において、本発明は、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体と、ＢＣＭＡに対する抗体の結合を検出するための１種又は２種以上の試薬と、を含む容器を含む、がんを診断するためのキットを提供する。試薬には、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検出可能なタグを挙げることができる。試薬はまた、酵素反応のための二次若しくは三次抗体又は試薬を含んでもよい。この場合、酵素反応は、可視化することができる生成物を生じる。例えば、本明細書に記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、酵素、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、若しくはポリヒスチジン、又は、当技術分野において公知の類似するこのような標識で標識されてもよい。
【０１９６】
記載された主題の例示的な実施形態
本明細書における主題をより良くより完全に説明するために、本項は提示された主題の例示的な実施形態の列挙を提供する。
【０１９７】
実施形態の列挙：
１．ＢＣＭＡに免疫特異的に結合する組換え抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、抗体は重鎖及び軽鎖を有し、当該重鎖は、
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む、組換え抗体、又はその抗原結合フラグメント。
２．当該抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を更に含む、実施形態１に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
３．（ａ）の抗体の重鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、（ｂ）の抗体の重鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、（ｆ）の抗体の重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、（ｋ）の抗体の重鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、（ｌ）の抗体の重鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、（ｍ）の抗体の重鎖は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、又は（ｎ）の抗体の重鎖は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
４．抗体の軽鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、実施形態２又は３に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
５．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
６．抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトの抗体又は抗原結合フラグメントである、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
７．抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
８．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬの相互作用を阻害する、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
９．抗体又は抗原結合フラグメントは、ＥＬＩＳＡにより測定するとき、ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬの相互作用について約５．９ｎＭのＩＣ５０を示す、実施形態８に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１０．抗体又はその抗原結合フラグメントはＩｇＧである、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１１．ＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１２．ＩｇＧ４は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３４Ａ置換、及びＬ２３５Ａ置換を有する、実施形態１１に記載の抗体。
１３．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡに免疫特異的に結合し、カニクイザルＢＣＭＡに交差反応する、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１４．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１５．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１６．実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを発現している、組換え細胞。
１７．細胞はハイブリドーマである、実施形態１６に記載の細胞。
１８．抗体は組換え的に生成される、実施形態１６に記載の細胞。
１９．組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメントであって、
ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）、
ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）、
ｃ）第１の軽鎖（ＬＣ１）、と、
ｄ）第２の軽鎖（ＬＣ２）を含み、
ＨＣ１はＬＣ１と結合され、ＨＣ２はＬＣ２と結合され、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成するために、ＨＣ１は配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含み、ＬＣ１は配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号６４を含み、またＢＣＭＡに免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成するために、ＨＣ２は配列番号４、配列番号５、及び配列番号６を含み、ＬＣ２は配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６を含む、組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性結合フラグメント。
２０．配列番号５５を含むＨＣ１と、配列番号５６を含むＬＣ１と、配列番号６５を含むＨＣ２と、ａ）配列番号６６又はｂ）配列番号７６を含むＬＣ２と、を含む、実施形態１９に記載の組換えＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又はそのフラグメント。
２１．抗体又は二重特異性結合フラグメントはＩｇＧである、実施形態２０に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２２．抗体又は二重特異性結合フラグメントはＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１９、２０、又は２１のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２３．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴により測定するとき、少なくとも０．２２ｎＭの親和性でヒトＢＣＭＡに免疫特異的に結合する、実施形態１９〜２２に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２４．抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、実施形態１９〜２３に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２５．抗体又はその二重特異性結合フラグメントは、ヒト多発性骨髄腫細胞の表面上のＢＣＭＡに結合する、実施形態１９〜２４に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２６．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約０．３７ｎＭ未満のＥＣ５０でインビトロでヒトＴ細胞活性化を誘発する、実施形態１９〜２５に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２７．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、約０．４５ｎＭ未満のＥＣ５０でインビトロでＢＣＭＡ発現細胞のＴ細胞依存性細胞傷害を誘発する、実施形態１９〜２６に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２８．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、ＢＣＭＡアゴニストではない、実施形態１９〜２７に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
２９．抗体又は二重特異性結合フラグメントは、１０ｎＭ未満の濃度でＮＦ−κＢ活性化を変化させない、実施形態１９〜２８に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント。
３０．実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性結合フラグメントを発現している、組換え細胞。
３１．細胞はハイブリドーマである、実施形態３０に記載の細胞。
３２．がんを有する対象を処置するための方法であって、実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を、それを必要とする対象に、がんを処置するのに十分な時間投与することを含む、方法。
３３．がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することを含む、方法。
３４．Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現がん細胞にリダイレクトする方法であって、実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントの治療的に有効な量を投与し、Ｔ細胞をがんにリダイレクトすることを含む、方法。
３５．がんは血液がんである、実施形態３２、３３、又は３４に記載の方法。
３６．血液がんはＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がんである、実施形態３５に記載の方法。
３７．ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞がんは多発性骨髄腫である、実施形態３６に記載の方法。
３８．第２の治療剤を投与することを更に含む、実施形態３２に記載の方法。
３９．第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療剤である、実施形態３８に記載の方法。
４０．化学療法剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である、実施形態３９に記載の方法。
４１．実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
４２．実施形態３０〜３１のいずれか一項に記載の細胞を培養することにより、実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントを生成するための方法。
４３．実施形態１９〜２９のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメントのＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、又はＬＣ２をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
４４．実施形態１９〜２９のいずれか一項に定義されるようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体又は二重特異性結合フラグメント、及び／又は請求項４４に定義されるようなポリヌクレオチド、及びこれらのための包装、を含む、キット。
【実施例】
【０１９８】
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的とするものであり、それらを考慮して種々の改変又は変更が、当業者に明らかであろう。また、本明細書に記載された実施例及び実施形態は、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【０１９９】
実施例１：材料
ＢＣＭＡ  ＥＣＤ分子
組換えヒト（ｈ）ＢＣＭＡ−Ｆｃ融合タンパク質（カタログ＃１９３−ＢＣ−０５０、ｈＢＣＭＡ（配列番号１）のアミノ酸１〜５４に相当する）及び組換えマウス（ｍ）ＢＣＭＡ−Ｆｃ融合タンパク質（カタログ＃５９３−ＢＣ−０５０、ｍＢＣＭＡ（配列番号２）のアミノ酸１〜４９に相当する）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。組換えカニクイザルＢＣＭＡタンパク質は、遺伝子合成技術（米国特許第６，６７０，１２７号、同第６，５２１，４２７号）から得たｃＤＮＡから調製した。全てのタンパク質を、使用前にエンドトキシンについて検査し、ファージパニング試験のためにビオチン化した。これらの材料を結合性及び親和性の測定にも使用した。
【０２００】
可溶性ヒトＢＣＭＡをＡＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号Ｐ０１１Ｘｐ、ロット番号０３３−０１３）から入手し、特性試験に使用した。
【０２０１】
ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、及びＴＡＣＩ分子
可溶性ｈＡＰＲＩＬ（カタログ＃ＤＹ８８４）、ｈＢＡＦＦ（カタログ＃２１４９−ＢＦ）、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（カタログ＃１１６２−ＢＲ、ｈＢＡＦＦ−Ｒのアミノ酸７〜７１に相当する）、及びｈＴＡＣ１（ＴＡＣＩのアミノ酸２〜１６６に相当する）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＢＡＦＦ−Ｒ及びＴＡＣ１をＳＰＲ試験のためにビオチン化した。
【０２０２】
ＢＣＭＡ細胞株の生成
ヒトＢＣＭＡ（図１Ａ）及びカニクイザルＢＣＭＡ（図１Ｂ）を提供するベクターを、標準的な方法を使用してＨＥＫ２９３  ｅｘｐｉ細胞に一次的にトランスフェクションした。トランスフェクションされた２９３Ｆ付着細胞を、安定したプラスミド組込み用に選択した。ついで、単一細胞を選別し、ＢＣＭＡ表面受容体発現を、抗ヒトＢＣＭＡ−ＰＥ標識抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＦＡＢ１９３Ｐ）を使用するＦＡＣＳにより定量した。
【０２０３】
実施例２：ヒトＢＣＭＡモノクローナル抗体発現ハイブリドーマの単離
ヒト免疫グロブリントランスジェニックラット株（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）、ＯＭＴ，Ｉｎｃ．）を使用して、ヒトＢＣＭＡモノクローナル抗体発現ハイブリドーマ細胞を発生させた。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、完全なヒトＩｇＬ座（Ｊκ−Ｃκに結合した１２のＶκ及びＪλ−Ｃλに結合した１６のＶλ）と共に、キメラヒト／ラットＩｇＨ座（ラットＣＨ座に結合した自然構成での２２のヒトＶＨセグメント、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントからなる）を含む。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０（４）：１４８１〜１４９０を参照のこと）。したがって、ラットは、ラットＩｇＭ又はκの発現の減少を示し、免疫付与に応じて、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生成する。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットにより生じるゲノム修飾は、国際公開第１４／０９３９０８号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら）に記載されている。
【０２０４】
組換えヒトＢＣＭＡ（ｒｈＢＣＭＡ）で免疫化されるとき、このトランスジェニックラットは、ヒトＢＣＭＡに特異的なヒトＩｇＧ抗体を産生する。
【０２０５】
免疫化計画を以下のように実施した：６匹のラットをｈＢＣＭＡ−Ｆｃ融合で免疫化した。２１日間の免疫規制飼育の後、免疫化ラットから脾臓及びリンパ節を採取し、これらを使用して合計４つのハイブリドーマライブラリを生成した。ライブラリを滴定し、ＥＬＩＳＡでアッセイし、ビオチン化ｈＢＣＭＡに結合性を示すｍＡｂを同定した。ｍＡｂをＭＳＤ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎプレート上に捕捉した。更なる確認スクリーニングの後、ヒトＢＣＭＡ及びカニクイザルＢＣＭＡに特異的な結合性を示したハイブリドーマ上清を、配列決定し、クローンし、発現させ、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方に変換した。
【０２０６】
実施例３：ＢＣＭＡ抗体の精製
清澄化した培養上清中のＢＣＭＡ抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂により捕捉し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。抗体を含む画分をプールし、２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ７．２）で直ちに中和し、ついで１×Ｄ−ＰＢＳ又は指定がある場合は他の所望のバッファにバッファ交換した。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計でＯＤ２８０を測定して決定し、その吸光係数を用いて計算した。抗体の純度及び均質性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣにより評価した。単量体がＳＥ−ＨＰＬＣにより９５％未満であった場合、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００を用いたＳＥＣポリッシュ工程を行った。
【０２０７】
実施例４：ＢＣＭＡに細胞結合するＢＣＭＡ抗体の特性
操作されたＢＣＭＡ発現細胞並びにがん細胞株Ｕ２３９２、ＥＪＭ、ＭＭＩＲ、Ｕ２６６、ＯＰＭ２、及びＲＰＭＩ−１８２２６に対するＢＣＭＡ抗体の結合性を、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）細胞結合アッセイ及びフローサイトメトリーを使用して評価した。スクリーニングアッセイの目的は、ＢＣＭＡを発現している細胞に結合した抗体を特定すること、並びにカニクイザルＢＣＭＡを発現している細胞との交差反応性を特定することであった。
【０２０８】
ＭＳＤ細胞結合アッセイについては、細胞を固定し、ＢＣＭＡ抗体サンプルを３回アッセイした。簡潔に言えば、精製ＢＣＭＡ抗体の発現上清を１０μｇ／ｍＬに正規化した。ウェルあたりに５０００個の細胞を、３８４ウェルプレート（ＭＡ６０００，ｃａｔ．Ｌ２１ＸＢ，ＭＳＤ）に播種し、２時間付着させた。ついで、細胞を、ＰＢＳ中の２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で、１５分間ブロッキングした。ついで、抗体上清を加え、ＲＴで１時間放置した。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ついで、ルテニウム標識化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１μｇ／ｍＬで加え、室温において１時間インキュベートした。ついで、更なる洗浄工程を適用し、ついで、ウェルあたり３５μＬの（界面活性剤を含まない）ＭＳＤリードバッファＴを加え、検出のために、３０分間インキュベートした。ついで、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６０００を使用して、プレートを読み取った。データを、コントロールに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５を使用してグラフ化した。陽性のバインダーを、バックグラウンドより３倍高いシグナルを有するヒットであると決定した。アッセイを、データ整合性のために繰り返し、トップバインダーを、更なる開発のために選択した。
【０２０９】
フローサイトメトリーについては、細胞を生存性染料と共にインキュベートし、１００，０００個の細胞をＵ底プレートに添加し、遠心分離して細胞をペレット状にした。滴定したＢＣＭＡ抗体を細胞に添加した。インキュベーション期間の後、細胞をペレット状にし、洗浄した。二次抗体に特異的なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７標識種を細胞に添加し、インキュベートした。細胞をペレット状にし、７回洗浄した。細胞を適量のランニングバッファで再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して分析した。細胞を、サイズについてはＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａ、一重線及び生存性染料についてはＳＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ｈによりゲート開閉した。生細胞集団のｇｅｏＭＦＩ値をグラフ化し、可能であれば、すなわち曲線が十分にＳ字状であれば、ＥＣ５０値の計算に使用した。
【０２１０】
ＡＰＲＩＬリガンド結合の阻害
ＢＣＭＡ抗体パネルを、ＡＰＲＩＬ結合競合ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。可溶性ヒトＡｐｒｉｌをＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入し（カタログ＃ＤＹ８８４）、固定されたＢＣＭＡへのＡＰＲＩＬの結合を阻害する抗ＢＣＭＡ抗体の能力を評価した。
【０２１１】
簡潔に言えば、９６ウェル透明マキシソルブプレートを、ＰＢＳで作製した０．５μｇ／ｍＬ  ＢＣＭＡ−ＥＣＤの１００μＬで処理し、室温で一晩インキュベートした。ついでプレートを、ＰＢＳ中に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＥＬＩＳＡ洗浄バッファ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＷＡ１２６）で３回洗浄した後、ＰＢＳ中に１％  ＢＳＡ５を含むＲｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ９９５）の３００μＬ／ウェルで阻害した。）。競合結合については、ＢＣＭＡ抗体を１００μｍの容量でプレートに添加し、ＡＰＲＩＬ添加前に３０分間インキュベートした。３０分後、ウェルあたり１ｎｇのＡＰＲＩＬを添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。未結合のＡＰＲＩＬをＥＬＩＳＡ洗浄バッファで洗浄し、結合したビオチン化ＡＰＲＩＬを、ＳＡ−ＨＲＰ複合体を用いて４５０ｎＭの光学濃度で検出した。
【０２１２】
実施例５：ヒット評価及び選択
特性試験の完了後、以下の特徴を有するように、Ｍ２ハイブリドーマから得られた抗体（ＢＣＭＢ６９と命名）を決定した。
・組換えヒトＢＣＭＡに結合する
・組換えカニクイザルＢＣＭＡに結合する
・マウスＢＣＭＡへの弱い結合性を示す
・フローサイトメトリーにより測定するとき、ＨＥＫ発現ヒトＢＣＭＡ及びＨＥＫ発現カニクイザルＢＣＭＡの両方に結合する
・ＢＣＭＡ（Ｕ２３９２、ＥＪＭ、ＭＭＩＲ、Ｕ２６６、ＯＰＭ２、及びＲＰＭＩ−１８２２６）を発現するヒトがん株に結合する
・ＩＣ５０＝５．９ｎＭでＡＰＲＩＬ結合を阻害する
結果として、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を作製するために、ＢＣＭＢ６９（表４及び表５）を発現させ、精製した。
【０２１３】
【表４】
2018525005.tif 000005
【０２１４】
【表５】
2018525005.tif 000006
【０２１５】
実施例６：抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂの結晶構造
抗体／抗原相互作用を原子的詳細において特徴付け、抗体の作用機序の理解を深め、いずれか必要な抗体操作の試行を支持するために、１つの抗ＢＣＭＡ抗体（ＢＣＭＢ６９）の結晶構造を遊離Ｆａｂ形態並びにヒトＢＣＭＡに結合した場合において決定した。
【０２１６】
材料
Ｈｉｓタグを付けたＢＣＭＡ  Ｆａｂ（配列番号７５及び７６、以降は単にＢＣＭＢ６９  Ｆａｂとする）をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。Ｆａｂを１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．４）中に得た。
【０２１７】
Ｃ末端にＨｉｓタグを有するヒトＢＣＭＡ細胞外領域（配列番号１の残基５〜５１、以降は単にＢＣＭＡとする）をバキュロウイルス系を用いて発現させ、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質を５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中に得た。
【０２１８】
結晶化
ＢＣＭＡ／ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ複合体
ＢＣＭＡとＢＣＭＢ６９  Ｆａｂとを３．８：１のモル比（ＢＣＭＡ過剰）で４℃で約１６時間混合し、一方で２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）にバッファ交換することにより、Ｆａｂ／抗原複合体を調製した。°その後、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中で５１〜６３ｍＭ  ＮａＣｌのグラジエントを用いて複合体をモノＳ  ５／５０カラムから溶出させ、１７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ線回折に適した結晶を、マイクロ播種を用いたシッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃で使用して、２５％ＰＥＧ  ３ｋＤａ、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）から得られた。
【０２１９】
ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂ
ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂを更に精製することなく９ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ線回折に適した結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃で用いて、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％ＭＰＤ、０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）から得た。
【０２２０】
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集のため、結晶を、２０％グリセロールを添加した対応する母液を含むクライオプロテクタント溶液中に数秒間浸漬した後、液体窒素中で瞬間凍結した。ＢＣＭＡ／ＢＣＭＢ６９複合体のＸ線回析データは、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＣＬＳ）のビームラインＣＭＣＦ−０８ＩＤでＲａｙｏｎｉｘ  ３００ＨＳ  ＣＣＤ検出器を使用して収集したが、遊離ＢＣＭＢ６９  ＦａｂのＸ線データは、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）のビームライン１７−ＩＤでＤｅｃｔｒｉｓ  Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ  Ｐｉｘｅｌ  Ａｒｒａｙ検出器を使用して収集した。回折データをプログラムＨＫＬで処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．＆  Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．（１９９７）．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７６：３０７〜３２６．）。
【０２２１】
構造を、Ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換法（ＭＲ）により解析した（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．（２００１）．Ｐｕｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５７：１３７３〜８２）。遊離Ｆａｂ構造の場合、ＭＲの探索モデルは、抗インフルエンザヘマグルチニン５ｊ８  Ｆａｂ（ＰＤＢコード：４Ｍ５Ｙ）であった。ＢＣＭＡ／Ｆａｂ複合体の場合、ＭＲの探索モデルは、ＢＣＭＡの結晶構造（ＰＤＢコード：１ＸＵ２）及びＢＣＭＢ６９遊離Ｆａｂ構造であった。構造を、ＰＨＥＮＩＸを用いて微細化し（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｏｐａｌ，Ｋ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｉｏｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｒ．，ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｎ．Ｗ．，Ｐａｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｏｍｏ，Ｔ．Ｄ．，Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｎ．Ｋ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．＆  Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．（２００４）．Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＨＥＮＩＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ  １１：５３〜５．）、ＣＯＯＴを使用してモデル調整を行った（Ｅｍｓｌｅｙ  Ｐ．＆  Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）．Ｃｏｏｔ：Ｍｏｄｅｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２）。他の全ての結晶学的計算は、ＣＣＰ４のプログラムスイートを用いて行った（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，１９９４）。全ての分子グラフィックはＰｙＭｏｌを用いて生成した（ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．（２００２）．Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｄｅｌａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０２２２】
ＢＣＭＢ６９遊離Ｆａｂ構造及び複合体の両方のデータ統計値を表６に示す。
【０２２３】
【表６】
2018525005.tif 000007
【０２２４】
エピトープ、パラトープ、及び相互作用
ＢＣＭＢ６９は、ＢＣＭＡのβ−ヘアピン領域内の残基（残基Ｙ１３−Ｈ１９）及びヘリックス−ループ−ヘリックス領域内の残基（残基Ｌ２６、Ｒ２７、及びＮ３１−Ｌ３５）から構成される立体構造エピトープを認識する（図３及び４）。ＢＣＭＢ６９エピトープは、ＢＣＭＡ上の約８３０Å２の面積からなり、リガンド結合ＤＸＬモチーフ（β−ヘアピンのＩ型ターン内の残基Ｄ１５−Ｌ１８）を含み、これは抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に覆われた浅い空洞内に突き出している。ＤＸＬターンの先端にあるロイシン１７は、抗体の空洞内に完全に埋没し、ＢＣＭＢ６９との広範な相互作用を有する。別の主要なエピトープ残基はＡｒｇ２７であり、これは３１０−ヘリックスｈ１上にあり、重鎖ＣＤＲといくつかの水素結合接触を形成する。
【０２２５】
ＢＣＭＢ６９パラトープは、ＣＤＲ−Ｌ１を除く全てのＣＤＲからの残基で構成される（図２及び３）。重鎖は、軽鎖と比較して２倍のＢＣＭＡとの接触数を有する。ＣＤＲ−Ｈ３のループ先端にある小さな側鎖（１０２−ＧＡＶＡＧ−１０６）（配列番号７７）は、ＣＤＲ−Ｈ３のＢＣＭＡへの挿入と、広範な抗体／抗原接触の達成とに役立つ（ＣＤＲ−Ｈ３により全接触の４０％が形成される）。ＢＣＭＢ６９  ＣＤＲは、ＢＣＭＡの椅子状構造の凹状表面上に集まっており、ＣＤＲ−Ｌ２（残基Ｙ４８、Ｄ５２、Ｐ５４、Ｓ５５）、ＣＤＲ−Ｈ１（残基Ｇ３２−Ｙ３４）、及びＣＤＲ−Ｈ３（Ｄ１０１、Ａ１０３、Ｖ１０４、Ｙ１１０）は、ｈ１ヘリックス及びｈ１ｈ２ループにより形成される「シート」に接触しているが、ＣＤＲ−Ｌ３（残基Ｗ９０、Ｓ９２、Ｄ９５）、ＣＤＲ−Ｈ１（Ｆ３５）、ＣＤＲ−Ｈ２（Ｙ５４、Ｙ６０）、及びＣＤＲ−Ｈ３（Ｈ１００、Ｇ１０２、Ａ１０３、Ａ１０５）は、ＢＣＭＡのβ−ヘアピンにより形成される「バック」と相互作用する。「椅子の脚」（ｈ２ヘリックス）にある唯一のエピトープ残基であるＬｅｕ３５は、ＣＤＲ−Ｌ２の残基Ｄ５２とのファンデルワールス接触を有する。
【０２２６】
ＢＣＭＡは、小さく（約５０残基）かつコンパクトな細胞外ドメインを有する。非競合抗体又はリガンドがＢＣＭＡに結合するのに利用できる表面は限られている。ＢＣＭＢ６９エピトープ残基のほとんどは、ＡＰＲＩＬ（１４のエピトープ残基のうちの１２）及びＢＡＦＦ（１４の残基のうちの９）にも結合する残基である。ＢＣＭＡの最も高親和性のリガンドであるＡＰＲＩＬの場合、共用されないエピトープ残基はＦ１４及びＳ１６だけであるが（図２Ｂ）、ＢＡＦＦでは、非共用残基はＦ１４、Ｌ２６、Ｔ３２、Ｐ３３、及びＬ３５である。ＤＸＬループは、リガンド及びＢＣＭＢ６９の両方により埋没される。
【０２２７】
提案されるＢＣＭＢ６９の作用機序
ＢＣＭＢ６９は、ＭＭがん細胞に対するＴ細胞のリダイレクトに関する候補である。ＢＣＭＢ６９×抗ＣＤ３二重特異性抗体により媒介されるがん細胞の殺傷は、ＢＣＭＢ６９エピトープの構造及び位置により弱められるとは推測されない。エピトープの接触可能位置は、ＢＣＭＢ６９  Ｆａｂアームを膜結合型ＢＣＭＡに結合させるが、他方のＦａｂアームは、依然としてＴ細胞膜内のＣＤ３に結合している。
【０２２８】
ＢＣＭＢ６９はまた、ＢＣＭＡ結合部位の立体的閉塞及び直接競合により、形質細胞内のＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦシグナル伝達経路を途絶させることもできる。ＢＣＭＡ／ＢＣＭＢ６９構造のＢＣＭＡ／ＡＰＲＩＬ及びＢＣＭＡ／ＢＡＦＦ構造へのオーバーレイ（Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｈｏｎｇ，Ｘ．，Ｋａｐｐｌｅｒ，Ｊ．，Ｊｉａｎｇ，Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｐａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｈｕ，Ｈ．Ｂ．，Ｄａｉ，Ｓ．＆  Ｚｈａｎｇ，Ｇ．（２００３）．Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：４９〜５６；Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．，Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｌｗｅｂｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ａ．，Ｒｕｎｙｏｎ，Ｓ．，Ｙａｎ，Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｊ．，Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｐａｎ，Ｂ．，Ｓｋｅｌｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．＆  Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ，Ｍ．Ａ．（２００５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：７２１８〜７２２７．）は、ＢＣＭＢ６９及びＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ間のクラッシュ領域を示し（図２Ｂ並びに図４Ａ及び４Ｂ）、ＢＣＭＡが抗体及び天然リガンドに同時に結合できなくする。ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ−Ｒなどの他の受容体を使用してシグナルを送ることができ、ＢＣＭＡノックアウトマウスは依然として生存することができる。したがって、ＢＣＭＡの閉塞によるＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦ活性の阻害は、ＭＭ患者にとって決定的な毒性ではないことがある。
【０２２９】
実施例７：ＢＣＭＢ６９変異体の構造に基づく設計
非結合ＢＣＭＢ６９可変ドメインの翻訳後修飾モチーフ及び凝集リスクの計算評価は、Ｄ１０１−Ｇ１０２残基（ＣＤＲ−Ｈ３）の異性化の媒体リスクと、凝集リスクを有し得るＣＤＲ領域内の４８６Å２の疎水性パッチとを示す。パッチ内で最も露出した疎水性残基は、Ｉ５８（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｆ３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、及びＶ１０４（ＣＤＲ−Ｈ３）である（Ｖ１０４は、Ｆｖ相同性モデルには関連したが、Ｆａｂ結晶構造には関連しなかった）。ＢＣＭＢ６９可変ドメインにおける異性化及び凝集リスクを排除するために、様々な突然変異を合理的に設計した（表７）。
【０２３０】
【表７】
2018525005.tif 000008
【０２３１】
構造に基づくＢＣＭＢ６９変異体のＣＤＲ配列とＶＨ及びＶＬ配列とをそれぞれ表８及び表９に示す。
【０２３２】
【表８】
2018525005.tif 000009
【０２３３】
【表９−１】
2018525005.tif 000010
【０２３４】
【表９−２】
2018525005.tif 000011
【０２３５】
【表９−３】
2018525005.tif 000012
【０２３６】
したがって、ＢＣＭＢ６９に加えて、２８の変異体を発現させ、実施例３に記載したように精製し、実施例４に記載したようにフローサイトメトリーによりＢＣＭＡ発現細胞への結合性について特徴付けた。２８の変異体のうちの７つは、ＢＣＭＡを発現している細胞に結合したことから、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性パネルを作製するために先に進めた。
【０２３７】
実施例８：ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの二重特異性フォーマットにおけるＢＣＭＡ及びＣＤ３抗体の調製
ＢＣＭＡ抗体は、Ｆｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ（ＥＵインデックスによる番号付け）を有するＩｇＧ４として発現された。配列番号５５及び配列番号５６の配列をそれぞれ有する重鎖及び軽鎖を含む、単特異性抗ＣＤ３抗体のＣＤ３Ｂ１９も生成した。
【０２３８】
プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法を使用して、単特異性抗体を精製した。溶出後、プールを、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２内へ透析した。
【０２３９】
二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体を、（国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載されたような）インビトロでのＦａｂアーム交換において、単特異性ＣＤ３  ｍＡｂと単特異性ＢＣＭＡ  ｍＡｂとを組み合わせることにより生成した。簡潔に言えば、ＰＢＳ（ｐＨ７〜７．４）中の約１〜２０ｍｇ／ｍＬの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体（モル比１：１）（又は場合によっては、一方の親抗体を６％過剰にして、もう一方の抗体を激減させる）と、７５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）とを混合し、３１℃で５時間インキュベートし、ついで標準的な方法を使用して、透析、透析ろ過、タンジェント流ろ過、及び／又は回転細胞ろ過により、２−ＭＥＡを除去した。カチオン交換（ＣＥＸ）ＨＰＬＣ又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ＨＰＬＣのいずれかにより、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体の形成を分析する。望ましい場合には、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体を分取ＣＥＸ又はＨＩＣによりポリッシュし、残留親抗体を除去した。
【０２４０】
代表的なＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖を以下の表１０に示す。ＢＣＭＢ１７８は、ＣＤ３アームと組み合わせたときに発現が悪く、結果として、更なる特徴付けを行わなかった。
【０２４１】
【表１０−１】
2018525005.tif 000013
【０２４２】
【表１０−２】
2018525005.tif 000014
【０２４３】
【表１０−３】
2018525005.tif 000015
【０２４４】
【表１０−４】
2018525005.tif 000016
【０２４５】
【表１０−５】
2018525005.tif 000017
【０２４６】
【表１０−６】
2018525005.tif 000018
【０２４７】
【表１０−７】
2018525005.tif 000019
【０２４８】
実施例９：ＢＣＭＡ抗体及びＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＢＣＭＡ親和性の測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ＣＤ３二重特異性抗体の生成に使用されるＢＣＭＡ抗体のヒトＢＣＭＡ親和性の値を測定した。ＳＰＲのために従ったプロトコルは、実施例４に記載したプロトコルと同様であった。表１１に示した結果は、全てのサンプルが様々な親和性で単量体ＢＣＭＡ抗原に結合したことを示す。親ｍＡｂ（ＢＣＭＢ６９）は、〜１．４ｎＭの結合親和性を有した。ＢＣＭＢ１１７及びＢＣＭＢ１２８は、ＢＣＭＢ６９の範囲内の親和性を有したが、ＢＣＭＢ１２３、ＢＣＭＢ１２９、ＢＣＭＢ１７６、及びＢＣＭＢ１７７は、オフ速度が速いために比較的弱い親和性を有した（３〜１５倍）。データの再現性を評価するために、全てのサンプルを少なくとも３回実施し、標準偏差を記録した。
【０２４９】
【表１１】
2018525005.tif 000020
【０２５０】
また、ＳＰＲを使用して、ヒト及びカニクイザルＢＣＭＡに対するＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の親和性の値も測定した。表１２の結果は、全てのサンプルが様々な親和性でＦｃ−ＢＣＭＡ抗原に結合したことを示す。ＢＣ３Ｂ７及びＢＣ３Ｂ９は、ヒトＢＣＭＡに対してＢＣＭＢ７２の範囲内の親和性を有したが、残りの二重特異性抗体は、ＢＣＭＢ７２と比較すると２〜３倍弱い親和性を有した。カニクイザルＦｃ−ＢＣＭＡに対しては、ＢＣ３Ｂ７及びＢＣ３Ｂ９は、ＢＣＭＢ７２より２〜３倍強い親和性を有したが（ＫＤはそれぞれ０．６５〜０．３７ｎＭ）、残りのｍＡｂは、ＢＣＭＢ７２と同様の結合を維持した（ＫＤは〜０．８〜１．２ｎＭ）。データの再現性を評価するために、全てのサンプルを少なくとも３回実施し、標準偏差を記録した。
【０２５１】
【表１２】
2018525005.tif 000021
【０２５２】
抗ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体（ＢＣＭＢ７２）のＦｃ−融合ＢＣＭＡタンパク質（ヒト、カニクイザル、及びマウス）との結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。
【０２５３】
ストレプトアビジン誘導体化センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｒｏｄ＃  ＢＲ−１００５−３１）のフローセル２、３、及び４を、それぞれビオチン化Ｆｃ−融合ヒト、カニクイザル、又はマウスＢＣＭＡを用いて固定した（ＢＣＭＡ固定濃度は１２〜１６応答ユニット（ＲＵ）；Ｆｃ−ＢＣＭＡタンパク質：ヒト（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｐｒｏｄ＃  １９３−ＦＣ）、カニクイザル（自社製；Ｃａｔ＃  ＢＣＭＷ６．００１）、及びマウス（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｐｒｏｄ＃  ５９３−ＢＣ）を自社でビオチン化した）。フローセル１にはタンパク質を固定せず、参照表面として使用した。ランニングバッファ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．００５％Ｐ２０、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２５℃において結合速度論試験を行った。ＢＣＭＢ７２は、１００ｎＭから開始して５倍希釈で０．１６ｎＭまでランニングバッファで調製した。これらの溶液を５０μＬ／分で５分間注入し（会合相）、ランニングバッファを流すことにより解離を１５分間モニタした。グリシン（ｐＨ１．５）の短時間注入及び１００μＬ／分のランニングバッファにより、チップ表面を再生した。ＢＣＭＢ７２とＦｃ−ＢＣＭＡとの相互作用の結合速度論分析は、検体注入の参照控除曲線からバッファ注入により作成された曲線を差し引くことにより、データの重複参照によって行った。センサーグラムの全体的速度論フィッティングは、Ｔｗｏ−Ｓｔａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）を使用して行った。異なるＢＣＭＡ種のＴｗｏ−Ｓｔａｔｅ結合モデルから得られた結合親和性の結果を、最初の複合体（ＫＤ１）及び最終複合体（ＫＤ）として記録する（図５）。
【０２５４】
実施例１０：多発性骨髄腫バックグラウンドの不死化細胞株の存在下におけるＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体の標的特異性Ｔ細胞活性化及び細胞傷害能
ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体により媒介されるＴ細胞の活性化を評価した。簡潔に言えば、ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）及びコントロール抗体（ＢＣＭＡ×無及び無×ＣＤ３）をＰＢＳで８００μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで４倍系列希釈して用量設定を調製した。最後のカラムをＰＢＳのみとして残した（溶媒コントロール）。
【０２５５】
ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ＦＢＳ、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加した、抗生物質を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（培養培地）で、標的細胞を培養した。設定日（１日目）には、標的細胞を計数し、１０００万個の細胞を１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を捨てた。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＦＣＳＥ増殖染料を１８μＬの無菌ＤＭＳＯで再構成し、この溶液の１μＬを無菌ＰＢＳの１０ｍＬで希釈した。細胞ペレットを１ｍＬのＣＦＳＥ希釈物で再懸濁し、直接光から覆って室温で８分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬのＨＩ  ＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、過剰なＣＦＳＥをクエンチした。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ−１６４０で細胞を２回洗浄した。１０ｍＬのＲＰＭＩで再構成した後、細胞を計数し、細胞生存性を集計表に記録した。細胞を２．２×１０＾５／ｍＬに希釈し、使用するまで３７℃でインキュベートした。
【０２５６】
正常ドナー由来の汎Ｔ細胞を３７℃の水浴で解凍した後、凍結バイアルの中身を５０ｍＬ円錐バイアルに移し、１５ｍＬの低温培地で再構成した。ついで細胞を４℃において１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを５〜１０ｍＬの培地で再構成した。Ｔ細胞を計数し、生存性を記録した。ついで細胞を培地で１．１×１０＾６／ｍＬに再構成した。
【０２５７】
２×１０＾５個の標的細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加し、ついでＦｃブロッカーを添加した（２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで）。全ての細胞株を室温で１０分間インキュベートし、Ｆｃ受容体活性を阻害した。１×１０＾５個のＴ細胞をウェルに添加した（５：１のエフェクター：標的比）。標的及びＴ細胞を混合した後、２０μＬのＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体希釈物を各ウェルに添加した。プレートを３７℃において５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【０２５８】
２日後、プレートを４℃において１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μＬの上清を別のプレートに移し、サイトカイン放出アッセイ用に−８０℃で保存した。細胞を２００μＬのＰＢＳで洗浄し、５０μＬの近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料（１：２００希釈物）及び抗ＣＤ２５  ＰＥ抗体（１：５０希釈物）で室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、最後に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。標的細胞傷害性（標的％）及びＴ細胞活性化ＣＤ２５＋（生存Ｔ細胞％）について、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ及びＦｌｏｗＪｏ  ７．６を使用して細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、最小２乗法を用いた可変勾配（４パラメータ）関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０２５９】
図８は、Ｔ細胞表面上のＣＤ２５のアップレギュレーションにより評価するとき、ＢＣＭＢ７２が一貫して標的特異性Ｔ細胞活性化を促進することを示す。Ｆｃブロッカーを使用して、標的細胞への抗体のＦｃ受容体依存性結合を防止した。概して、データ点は作成したフィット曲線に沿ってぴったり並び、Ｔ細胞ドナー間のばらつきはほとんどなかった。ＢＣＭＡ＋細胞では４５〜８５％の最大活性化を達成し、ＢＣＭＡ−細胞では４〜１０％であった（バックグラウンド濃度に等しい）。複数の正常ドナー由来のＴ細胞を使用して２回の独立試験から得られたＥＣ５０及び最大Ｔ細胞活性化値の概要を図９に示す。
【０２６０】
図１０は、ＢＣＭＢ７２がＢＣＭＡ＋細胞株に対して一貫して強い細胞傷害性を有したことを示す。Ｆｃブロッカーを使用して、標的細胞へのＢＣＭＢ７２のＦｃ受容体依存性結合を防止した。概して、データ点は作成したフィット曲線に沿ってぴったり並び、Ｔ細胞ドナー間のばらつきはほとんどなかった。ＢＣＭＡ＋細胞では６２〜９７％の最大溶解を達成し、ＢＣＭＡ−細胞では４〜１８％であった。複数の正常ドナー由来のＴ細胞を使用して２回の独立試験から得られたＥＣ５０及び最大溶解値の概要を図１１に示す。
【０２６１】
他の６つのＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体は、８３〜９３％の最大細胞傷害性（図１２Ａ）と、２人の異なるドナーのＴ細胞を用いたＢＣＭＡ＋Ｈ９２９細胞での７４〜８３％のＴ細胞活性化（図１２Ｂ）とを示した。これらの６つのＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体分子は、０．０４〜０．０９ｎＭの範囲のＥＣ５０値でＢＣＭＡ＋標的細胞の殺傷に効力がある。
【０２６２】
実施例１１：ＢＣＭＡ＋細胞株におけるＢＣＭＢ７２の結合効率
悪性バックグラウンドの種々のＢＣＭＡ＋細胞株に結合するＢＣＭＢ７２のＥＣ５０値を評価した。簡潔に言えば、二重特異性抗体ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）をＰＢＳで７５０μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで３倍系列希釈して用量設定を調製した。最後のカラムをＰＢＳのみとして残した（溶媒コントロール）。
【０２６３】
ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ＦＢＳ、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加した、抗生物質を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（培養培地）で、Ｈ９２９標的細胞を培養した。アッセイについては、標的細胞の密度及び生存性を測定し、その後、細胞を４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ついで細胞ペレットを１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５．５×１０５細胞／ｍＬで細胞をＰＢＳで再懸濁し、９６ウェルＵ底プレートのウェルあたり９０μＬの細胞懸濁液を分取し、ついでＢＣＭＢ７２希釈物の１０μＬ／ウェルを分取した。プレートを４℃において暗所で１時間インキュベートし、ついで１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを２００μＬのＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃに対するＰＥ標識二次抗体をＦＡＣＳバッファで１：２５に溶解し、この混合液の５０μＬを対応するウェルに添加した。サンプルを４℃で２０分間インキュベートし、上記のようにＦＡＣＳバッファで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩでの分析用に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。ＢＣＭＢ７２の結合性についてＦｌｏｗＪｏ  ７．６を使用してデータを分析し、データのグラフ化及びフィッティングは、最小２乗法を用いた可変勾配関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０２６４】
図６に見られるように、ＢＣＭＢ７２は、試験した全てのＢＣＭＡ＋細胞株に結合することができる。Ｈ９２９細胞に対する結合性のＥＣ５０は１４．７ｎＭであり、ＭＭ．１Ｒ細胞に対しては９．７４ｎＭ、ＥＪＭ細胞に対しては１７．５ｎＭ、ＬＰ１細胞に対しては２２．３ｎＭ、及びＵ−２９３２細胞に対しては７．９２ｎＭであった。
【０２６５】
実施例１２：エクスビボでの正常ヒトドナー由来の全血におけるＢＣＭＡの発現及びＢＣＭＢ７２の結合性の分析
白血球でのＢＣＭＡの発現及びＢＣＭＢ７２の結合性を、エクスビボで３人の正常ヒトドナー由来の全血において評価した。簡潔に言えば、正常ヒトドナー由来の新鮮末梢血を試験前にヘパリン被覆管に保存した。血液を１００μＬの一定分量で９６ウェルＵ底プレートにピペットで移した。染色抗体を、試験の集計表に示したように、マスターミックスで調製した。マスターミックスを、ＢＣＭＡに対する抗体（すなわち、ＢＣＭＢ７２）と共に血液に直接添加した。室温で３０分間のインキュベーション後、血液を有するプレートを４℃において１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清血漿を捨て、ペレットを４回連続繰り返して赤血球溶解に供し、各洗浄の間に５分間インキュベートした。溶解の完了後、ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、ついで１：２００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ近赤外染料及び１：５０の抗ＩｇＧ４  ＰＥ（ＢＣＭＢ７２を有するウェルについてのみ）を有するＰＢＳで染色した。プレートを更に室温で１５分間インキュベートした。その後、サンプルを２００μＬのＦＡＣＳバッファで洗浄し、最後にＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａでの分析用に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。各ウェルから約１００，０００のイベントを収集した。分析をＦｌｏｗＪｏ  ７．６で行った。
【０２６６】
図７に示すように、ＢＣＭＡ発現なしは、３人の正常ドナーにおけるリンパ球、単球、顆粒球、又は形質細胞様ＤＣで観察された。ＢＣＭＢ７２は、３人の全てのドナーでＣＤ３＋Ｔ細胞に対する結合性を示したが、ドナー間で強度が異なった。ＢＣＭＢ７２は、このアッセイで試験した他のいずれの細胞種にも結合しなかった。
【０２６７】
実施例１３：サイトカインプロファイルにおけるＢＣＭＢ７２の効果
Ｔ細胞媒介性殺傷アッセイから得られた上清におけるサイトカインプロファイルを、ＢＣＭＢ７２及びコントロール抗体を使用して評価した。Ｔ細胞及び抗体を、Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイで行ったように播種した（実施例１０参照）。４８時間のインキュベーション後、細胞上清を採取し、ＭＳＤに基づくＥＬＩＳＡを使用して異なる（１０／３０Ｐｌｅｘ）サイトカインを測定した。サイトカイン濃度をｐｇ／ｍＬとして表し、データのグラフ化及びフィッティングは、可変勾配（４パラメータ）関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。６人のＴ細胞ドナーを用いたＲＰＭＩ８２２６細胞株から得た６種類のサイトカインのＥＣ５０値を図１３に示す。データは、Ｔ細胞の活性化から得られた有意なサイトカイン放出を示す。コントロール抗体では、サイトカイン放出が少ない／ないことが観察された（データは示していない）。
【０２６８】
実施例１４：Ｔ細胞活性化及びＴ細胞媒介性標的細胞殺傷におけるＨＥＫ及びＣＨＯ産生（一過性＆安定細胞株）ＢＣＭＢ７２の機能性比較
異なる細胞において及び異なる発現方式の下で産生された二重特異性抗体は、活性が異なり得る。したがって、ＨＥＫ細胞（一過性発現）又はＣＨＯ細胞（一過性若しくは安定発現）で産生されたＢＣＭＢ７２のインビトロでの有効性を評価した。
【０２６９】
ＢＣＭＢ７２をＰＢＳで８００μｇ／ｍＬに希釈した。各試験で指示するように、９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで３倍又は４倍系列希釈のいずれかで用量設定を調製した。最後のカラムをＰＢＳのみとして残した（溶媒コントロール）。
【０２７０】
ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ＦＢＳ、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加した、抗生物質を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（培養培地）で、Ｈ９２９標的細胞を培養した。設定日（１日目）には、細胞を計数し、１０００万個の細胞を１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨てた。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＦＣＳＥ増殖染料を１８μＬの無菌ＤＭＳＯで再構成し、この溶液の１μＬを無菌ＰＢＳの１０ｍＬで希釈した。Ｈ９２９細胞ペレットを１ｍＬのＣＦＳＥ希釈物で再懸濁し、直接光から覆って室温で８分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬのＨＩ  ＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、過剰なＣＦＳＥをクエンチした。１０％ＦＢＳを有する１６４０  ＲＰＭＩで細胞を２回洗浄した。１０ｍＬのＲＰＭＩで再構成した後、細胞を計数し、細胞生存性を集計表に記録した。細胞を指示濃度に希釈し、使用するまで３７℃でインキュベートした。
【０２７１】
正常ドナー由来のＴ細胞を３７℃の水浴で解凍した後、バイアルの中身を５０ｍＬ円錐バイアルに移し、１５ｍＬの低温培地で再構成した。ついで細胞を４℃において１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを５〜１０ｍＬの培地で再構成した。Ｔ細胞を計数し、適切な濃度に培地で再構成した（各試験の集計表参照）。
【０２７２】
Ｈ９２９細胞をウェルに添加し、ついでＴ細胞を添加した（５：１のエフェクター：標的比）。この試験一式では、Ｆｃブロッカーは使用しなかった。標的及びＴ細胞を混合した後、２０μＬのＢＣＭＢ７２希釈物を各ウェルに添加した。プレートを３７℃において５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【０２７３】
２日後、細胞を含むプレートを遠心分離し、上清を捨てるか又はサイトカイン放出アッセイ用に保存した。細胞を２００μＬのＰＢＳで洗浄し、５０μＬの近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料（１：２００希釈物）及び抗ＣＤ２５  ＰＥ抗体（１：５０希釈物）で室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、最後に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。細胞は、同日にＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを使用してフローサイトメトリーを実施し、標的細胞傷害性（標的％）及びＴ細胞活性化ＣＤ２５＋（生存Ｔ細胞％）についてＦｌｏｗＪｏ  ７．６で分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、可変勾配（４パラメータ）関数及び最小２乗法を用いた非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０２７４】
図１４に見られるように、ＨＥＫ細胞で産生されたＢＣＭＢ７２及びＣＨＯ細胞で産生されたＢＣＭＢ７２は、Ｔ細胞リダイレクトアッセイにおいて標的細胞に対する細胞障害性及びＴ細胞に対する刺激の点で、実質的に同様に機能した。８５％の最大殺傷及び８０％のＴ細胞活性化を概ね達成した。細胞傷害性の平均ＥＣ５０値は、ＨＥＫ細胞で産生されたＢＣＭＢ７２では０．２９ｎＭ、ＣＨＯ細胞で産生されたＢＣＭＢ７２では０．４２〜０．４７ｎＭであった。Ｔ細胞活性化の平均ＥＣ５０値は、ＨＥＫ細胞で産生されたＢＣＭＢ７２では０．２８ｎＭ、ＣＨＯ細胞で産生されたＢＣＭＢ７２では０．３７〜０．４１ｎＭであった。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔを使用した比較分析は、ＥＣ５０値間に統計的有意性を示さなかった。
【０２７５】
実施例１５：ＢＣＭＢ７２によるＰ３８シグナル伝達活性化
ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬは共に、２つの受容体ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原、ＴＮＦＲＳＦ  １７）及びＴＡＣＩ（膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用体、ＴＮＦＲＳＦ  １３ｂ）に結合する。ＢＣＭＡの結合は、ＪＮＫ及びＰ３８  ＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化する。ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＢＣＭＢ７２は、ＢＣＭＡに向けてアゴニスト作用を及ぼし得る可能性がある。この試験は２つの部分を含んだ。１．ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ処理後のＨ９２９又はＭＭ１．Ｒ細胞におけるＰ３８ａ  ＭＡＰＫの変化をモニタするために、簡単なウエスタン分析アッセイを開発すること。２．新たに開発されたアッセイを使用して、ＢＣＭＢ７２がＢＣＭＡに向けていずれかのアゴニスト作用を有するかどうかを調べること。
【０２７６】
細胞処理
Ｈ９２９又はＭＭ１．Ｒ細胞を、処理前に３７℃において５％ＣＯ２の存在下で２４時間、血清を含まないＲＰＭＩ培地に１．５ｅ６／ｍＬで播種した。処理日に、細胞を遠沈させ、血清を含まないＲＰＭＩ中に１．５ｅ６／ｍＬで再懸濁した。経時変化アッセイでは、細胞を１０本の管に管あたり５ｍＬを分取した。各管の細胞を、１０００ｎｇ／ｍＬのＡＰＲＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃５８６０−ＡＰ−０１０）又は１０００ｎｇ／ｍＬのＢＡＦＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２１４９−ＢＦ−０１０）を用いてそれぞれ０、５、１５、３０、及び６０分間、３７℃において５％ＣＯ２の存在下で処理した。インキュベーション後、細胞を直ちにペレット状にし、細胞溶解物を形成するために−８０℃で凍結した。ＢＣＭＢ７２のアゴニスト作用アッセイについて、Ｈ９２９細胞処理群を表１３に列記した。ＢＣＭＢ７２のアゴニスト作用アッセイは２回行った。
【０２７７】
【表１３】
2018525005.tif 000022
【０２７８】
Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ分析用の細胞溶解物の調製
ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファで細胞を溶解した。タンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ  ＃５００−０１１２）及びウシ血清アルブミン標準を用いてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。
【０２７９】
Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ分析
Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ分析を、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅユーザーマニュアルに従ってＷｅｓ−Ｒａｂｂｉｔ（１２−２３０ＫＤａ）Ｍａｓｔｅｒ  ｋｉｔ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ＃ＰＳ−ＭＫ０１）を用いて行った。簡潔に言うと、細胞溶解物サンプルをマスターミックスと混合して、１×サンプルバッファ、１×蛍光分子量マーク、及び４０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の最終濃度にし、ついで９５℃で５分間加熱した。サンプル、阻害試薬、一次抗体蛍光体−ｐ３８  ＭＡＰＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：ＶＷＲ＃  ＭＡ５−１５１８２）又はＡｃｔｉｎ−ｂｅｔａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃８４５７Ｓ）、ＨＲＰ結合二次抗体、化学発光基質、並びに分離及び積層マトリックスを、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓマイクロプレート内の指定のウェルに分配し、プレートの読み込み後、分離電気泳動及び免疫検出工程をキャピラリーシステムで実施したが、これらは完全自動化であった。電気泳動中、タンパク質は、積層及び分離マトリックスにより分子量に基づいて分離され、独自の光活性化捕獲化学を用いてキャピラリー壁に固定された。一次抗体を抗体希釈剤ＩＩ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ＃０４２−２０３）で１：５０に希釈した。標的タンパク質を、一次抗体で６０分間、ついでＨＲＰ結合二次抗体を用いて免疫学的検出を行った。Ｓｉｍｏｎ−ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ分析を室温で行い、機器のデフォルト設定を使用した。デジタル画像をＣｏｍｐａｓｓソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて分析し、検出タンパク質の定量データを分子量、シグナル／ピーク強度、及びピーク面積として記録した。
【０２８０】
結果
経時変化試験から得られた情報に基づいて、１５分間のインキュベーション終点を使用してＨ９２９細胞でＢＣＭＢ７２アゴニストアッセイを行った。ｐ３８  ＭＡＰＫシグナルをヒトベータアクチンシグナルにより正規化した。２つのアッセイから得られた正規化ｐ３８  ＭＡＰＫシグナルの平均を図１５に示す。ＢＣＭＢ７２アゴニストアッセイは、ＢＣＭＢ７２がＨ９２９細胞においてＢＣＭＡに向けたアゴニスト作用を有していないことを実証した。
【０２８１】
実施例１６：ＢＣＭＢ７２によるＮＦκＢシグナル伝達
ＢＣＭＡは、内因性リガンドに応答してＮＦ−κＢシグナル伝達を生じさせ得る表面受容体である。ＮＦ−κＢ経路活性化におけるＢＣＭＡに結合したＢＣＭＢ７２の影響を、ＮＦκＢプロモータの下でアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するＢＣＭＡ発現レポーター細胞株を使用して評価した。
【０２８２】
ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（培養培地）で細胞を培養した。試験前夜に、細胞をトリプシン処理（３７℃に予め加温した０．２５％トリプシン中に５分）により採取し、３０ｍＬの培養培地で洗浄した。ついで細胞を４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血清を含まないＤＭＥＭ（ＧｌｕｔａＭＡＸ含有）で２．５×１０＾５細胞／ｍＬに再構成した。５×１０＾４個の細胞を９６ウェル平底プレートのウェルに添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０２８３】
翌朝、種々の刺激性試薬（ＴＮＦα、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＢ７２）を対応するウェルに添加し（試験プレートマップ参照）、プレートを３７℃で更に１６、２４、又は４８時間インキュベートし、これらはそれぞれ早期、中期、及び後期のシグナル伝達時点を表した。各時点の後、１０μＬの馴化培養培地をウェルから収集し、ＳＥＡＰキット（Ｃａｙｍａｎ，６００２７２）内で提供される９６ウェル固体プレートに移し、蓋で覆った。ＳＥＡＰ標準は、バルク標準（５Ｕ／ｍＬ）を、血清を含まないＤＭＥＭ（ＧｌｕｔａＭＡＸ含有）で１：１０に希釈することにより調製し、ついで１：２の系列希釈を調製した。希釈範囲は５０〜０．７８ｍＵ／ｍＬである。サンプルを有するプレートを６５℃で３０分間インキュベートし、内因性アルカリホスファターゼを不活性化した。このアッセイで発現されたＳＥＡＰは、これらのインキュベーション条件下で安定である。プレートを室温でインキュベートした後、１０μＬの標準希釈物を適切なウェルに添加した。５０μＬの基質溶液を全てのウェルに添加し、サンプルを軽く撹拌し、溶液をウェルに分配した。サンプルを２０〜３０分間インキュベートし、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して化学発光を評価した。化学発光の読取値を標準曲線に基づいて活性単位濃度に変換し、値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０で分析し、グラフ分析用にＧｒａｐｈ  Ｐｒｉｓｍ  ６にインポートした。
【０２８４】
図１６は、ＡＰＲＩＬが０．４６ｎＭ程度の低濃度でもＢＣＭＡを刺激できたのに対し、概してＢＣＭＢ７２は１０ｎＭ未満の濃度ではＢＣＭＡ形質導入細胞でＮＦ−κＢ経路を活性化しなかったことを実証する。高ＢＣＭＢ７２濃度（４４〜１３３ｎＭ）では、中程度のＢＣＭＢ７２依存性活性化が観察された。
【０２８５】
実施例１７：標的細胞の不在下でのＴ細胞活性化におけるＢＣＭＡの細胞外ドメインの外部添加の影響
ＢＣＭＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、溶液中で三量体を形成し得る。したがって、多数の二重特異性抗体が、標的細胞の不在下でＢＣＭＡ  ＥＣＤ三量体及び架橋ＴＣＲ複合体に結合できる可能性がある。これは同様にして、標的非依存性でＴ細胞を活性化し得る。この試験は、外部添加したＢＣＭＡのＥＣＤが、標的細胞との相互作用なしにＣＤ２５発現濃度でＴ細胞活性化を誘発し得るかどうかを調べた。
【０２８６】
ＢＣＭＢ７２（ＢＣＭＡ×ＣＤ３）及びコントロール（無×ＣＤ３）をＰＢＳで８００μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで３倍系列希釈して用量設定を調製した。最後のカラムをＰＢＳのみとして残した（溶媒コントロール）。
【０２８７】
可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤ（ｓＢＣＭＡ）をＰＢＳで３６μｇ／ｍＬ（６．６７μＭ）に希釈した。９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで３倍系列希釈して用量設定を調製した。上部のウェルをＰＢＳのみとして残した（溶媒コントロール）。
【０２８８】
正常ドナー由来の汎Ｔ細胞を３７℃の水浴で解凍した後、凍結バイアルの中身を５０ｍＬ円錐バイアルに移し、３０ｍＬの低温培地で再構成した。ついで細胞を４℃において１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍＬの培地で再構成した。Ｔ細胞を計数し、生存性を記録した。ついで細胞を培地で０．５２５×１０＾６／ｍＬに再構成した。
【０２８９】
１×１０＾５個のＴ細胞（１９０μＬ）をウェルに添加し、ついで５μＬのｓＢＣＭＡ希釈物及び５μＬのＢＣＭＢ７２希釈物を添加した。プレートを３７℃において５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【０２９０】
２日後、プレートを４℃において１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳで洗浄し、５０μＬの近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料（１：２００希釈物）及び抗ＣＤ２５  ＰＥ抗体（１：５０希釈物）で室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、最後に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。Ｔ細胞活性化ＣＤ２５＋（生存Ｔ細胞％）について、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ及びＦｌｏｗＪｏ  ７．６を使用して細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、最小２乗フィッティング法を用いた非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０２９１】
正常ドナー由来のＴ細胞は、ＢＣＭＢ７２の存在下でｓＢＣＭＡ  ＥＣＤ媒介性活性化を示さなかった。高濃度（＞４０ｎＭ）のＢＣＭＢ７２では、ｓＢＣＭＡ非依存性において、Ｔ細胞の低パーセンテージの弱い活性化（１０〜１５％）が観察された（図１７）。
【０２９２】
実施例１８：Ｔ細胞活性化及びＢＣＭＢ７２依存性細胞傷害における可溶性ＢＣＭＡのＥＣＤ、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの影響
可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤは、ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体のシンクとして働き得るが、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは、表面受容体とＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体との相互作用の競合的阻害剤であり得る。ＢＣＭＢ７２依存性細胞殺傷のインビトロでの細胞傷害能における可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤ並びに内因性リガンドＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦの影響を、固定細胞株Ｈ９２９及び正常ドナーＭ７０７７由来の汎Ｔ細胞を用いたＴ細胞リダイレクトアッセイで評価した。
【０２９３】
ＢＣＭＢ７２をＰＢＳで８００μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで３倍系列希釈して用量設定を調製した。最後のカラムをＰＢＳのみとして残した（溶媒コントロール）。可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤを９μｇ／ｍＬに希釈し、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦを１０μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルＵ底プレートにおいてＰＢＳで３倍系列希釈して、両方の試薬の用量設定を調製した。
【０２９４】
ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ＦＢＳ、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加した、抗生物質を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（培養培地）で、Ｈ９２９標的細胞を培養した。設定日（１日目）には、標的細胞を計数し、１０００万個の細胞を１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を捨てた。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＦＣＳＥ増殖染料を１８μＬの無菌ＤＭＳＯで再構成し、この溶液の１μＬを無菌ＰＢＳの１０ｍＬで希釈した。細胞ペレットを１ｍＬのＣＦＳＥ希釈物で再懸濁し、直接光から覆って室温で８分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬのＨＩ  ＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、過剰なＣＦＳＥをクエンチした。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ−１６４０で細胞を２回洗浄した。１０ｍＬのＲＰＭＩで再構成した後、細胞を計数し、細胞生存性を集計表に記録した。細胞を２．２×１０＾５／ｍＬに希釈し、使用するまで３７℃でインキュベートした。
【０２９５】
正常ドナー由来の汎Ｔ細胞を３７℃の水浴で解凍した後、凍結バイアルの中身を５０ｍＬ円錐バイアルに移し、３０ｍＬの低温培地で再構成した。ついで細胞を４℃において１３５０ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍＬの培地で再構成した。Ｔ細胞を計数し、生存性を記録した。ついで細胞を培地で１．１×１０＾６／ｍＬに再構成した。
【０２９６】
２×１０＾５個のＨ９２９細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加した。この試験では、Ｆｃブロッカーを用いたインキュベーションは必要なかった。１×１０＾５個のＴ細胞をウェルに添加した（５：１のエフェクター：標的比）。標的及びＴ細胞を混合した後、２０μＬのｓＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、又はＢＡＦＦのいずれかをウェルに添加し、ついで５μＬの抗体希釈物を添加した。プレートを３７℃において５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【０２９７】
２日後、プレートを４℃において１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬのＰＢＳで洗浄し、５０μＬの近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料（１：２００希釈物）及び抗ＣＤ２５  ＰＥ抗体（１：５０希釈物）で室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、最後に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。標的細胞傷害性（標的％）及びＴ細胞活性化ＣＤ２５＋（生存Ｔ細胞％）について、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ及びＦｌｏｗＪｏ  ７．６を使用して細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、最小２乗法を用いた可変勾配（４パラメータ）関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０２９８】
ＢＣＭＢ７２は、可溶性ＢＣＭＡ  ＥＣＤの存在下でＨ９２９細胞に細胞傷害性を及ぼすことができ、高用量（＞１６０ｎＭ）のＢＣＭＡ  ＥＣＤでＥＣ５０にごくわずかな影響（２倍上昇）があった。Ｔ細胞活性化も同様に影響を受けた（図１８Ａ及び１８Ｄ参照）。ＡＰＲＩＬは、細胞傷害性及びＴ細胞活性化のＥＣ５０値を高用量（４６ｎＭ）で６倍に上昇させたが、より低い用量ではアッセイに与えた影響は最小限であった（図１８Ｂ及び１８Ｅ参照）。最大殺傷は、ｓＢＣＭＡ又はＡＰＲＩＬにより影響を受けなかった。対照的に、外因性ＢＡＦＦは、５１ｎＭ以下の濃度でＢＣＭＢ７２媒介性細胞傷害に影響を与えなかった（図１８Ｃ参照）。全ての事例におけるＴ細胞活性化能は、予想どおり殺傷データとよく相関した（図１８Ｆ参照）。
【０２９９】
実施例１９：インビトロでのＢＣＭＡへの結合におけるＢＣＭＢ７２、ＡＰＲＩＬ、及びＢＡＦＦの競合
２つのＴＮＦリガンド、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは、ＢＣＭＡに結合し、シグナル伝達カスケードを誘発し、細胞の生存及び増殖をもたらし得る。ＢＣＭＡの細胞外ドメインは、これら２つのリガンド、並びにこのモチーフに対して挙げられた抗体に結合する、短い５４個のアミノ酸フラグメントである。ここでは、これらのリガンドのＢＣＭＢ７２に対する競合性を評価した。
【０３００】
アッセイをＥＬＩＳＡに基づくフォーマットで設定した。競合アッセイの調製において、ＢＣＭＡ−ＦｃをＭＳＤ  ＳｕｌｆｏＴａｇで標識した。ＢＣＭＡ−Ｆｃの５０μｇバイアルを５００μＬのＰＢＳで再構成し、０．１ｍｇ／ｍＬ（３．１２５μＭの単量体）を得た。１５０ｎモルのＮＨＳ−ｓｕｌｆｏＴａｇを５０μＬの水に溶解し、３ｍＭの溶液を得た。１０×過剰の標識反応のために、５．２μＬの３ｍＭ  ＮＨＳ−ＳｕｌｆｏＴａｇ（１５．６ｎモル）を５００ｕＬのＢＣＭＡ−Ｆｃ（１．５６ｎモルの単量体）に添加した。暗所において室温で２時間反応させた。５０μＬの１Ｍトリスを添加し、未反応ＮＨＳをクエンチした。過剰なＳｕｌｆｏｔａｇ及びトリスを、ＰＢＳで平衡化した２ｍＬ  ７ｋ  ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａスピンカラム上でのバッファ交換により除去した。最終容量は〜６３０μＬであり、したがって最終ＳｕｌｆｏＴａｇ−ＢＣＭＡ−Ｆｃを２．５μＭとして使用した。
【０３０１】
競合アッセイについては、抗ＢＡＦＦ（１００μｇ）及び抗ＡＰＲＩＬ（１００μｇ）を２００μＬのＰＢＳで再構成し、０．５ｍｇ／ｍＬの原液を得た。３０μＬ（６μｇ）の抗ＡＰＲＩＬ及び抗ＢＡＦＦを、２．９７ｍＬのＰＢＳでそれぞれ希釈し、２μｇ／ｍＬの溶液を得た。９６ウェルＭＳＤ高結合プレートの各ウェルに、２５μＬの２μｇ／ｍＬ抗ＡＰＲＩＬを添加した。第２の９６ウェルＭＳＤ高結合プレートの各ウェルに、２５μＬの２μｇ／ｍＬ抗ＢＡＦＦを添加した。プレートを一晩、４℃に維持し、抗体を固定した。抗ＡＰＲＩＬ及び抗ＢＡＦＦで被覆されたプレートの中身を捨て、ウェルあたり３００μＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋを添加した。室温で１時間阻害後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１０μｇの各組換えＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦを１００μＬのＰＢＳで再懸濁し、０．１ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。各ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦの３ｍＬの２μｇ／ｍＬ溶液を、新たに再構成したタンパク質の６０μＬを２．９４ｍＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで希釈することにより作製した。２５μＬの２μｇ／ｍＬ  ＡＰＲＩＬを抗ＡＰＲＩＬ被覆プレートの各ウェルに添加し、２５μＬの２μｇ／ｍＬ  ＢＡＦＦを抗ＢＡＦＦ被覆プレートの各ウェルに添加した。室温で１時間捕捉後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。５００μｇの抗ＢＣＭＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓ  Ｍａｂ１９３）を１ｍＬのＰＢＳで再構成し、０．５ｍｇ／ｍＬ（３．３μＭ）の原液を得た。抗ＢＣＭＡ  Ｍａｂ１９３、ＢＣＭＢ７２．００４、及びコントロール抗体（無×ＣＤ３）をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで１μＭに希釈した。１００μＬの抗体を２００μＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋに混合することにより、１１ｐｔの３倍系列希釈系を調製した。６ｍＬの３０ｎＭ  ＳｕｌｆｏＴａｇ−ＢＣＭＡ−ＦＣを、７２μＬの上記タンパク質を５．９２８ｍＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで希釈することにより調製した。２５μＬのステップ１１の各抗体を、以下の図１のプレートマップに従ってＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ捕捉プレートの各ウェルに添加した。２５μＬの３０ｎＭ  ＳｕｌｆｏＴａｇ−ＢＣＭＡ−Ｆｃを両方のプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１５０μＬの１×ＭＳＤリードバッファＴを各ウェルに添加し、プレートをセクタ６０００イメージャでスキャンした。上記のように正確に試験を繰り返し、第２の独立した一連の結果を得た。
【０３０２】
図１９に見られるように、ＢＣＭＢ７２の量を増加させてインキュベートしたとき、コントロール抗体（無×ＣＤ３）では見られないが、ＢＣＭＡ−Ｆｃタンパク質は、プレート結合ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦへの結合が妨げられた。観測結果は、それぞれ３回の繰り返しを有する２回の独立試験で一致した。
【０３０３】
実施例２０：多発性骨髄腫患者の骨髄ＣＤ１３８陽性細胞のＢＣＭＢ７２への結合性及び細胞傷害性
多発性骨髄腫患者由来の一次サンプルにおけるＢＣＭＢ７２の能力を評価するために、５人の患者由来の凍結骨髄の多発性骨髄腫サンプル及び健康ドナー由来のＴ細胞を使用した細胞傷害性殺傷アッセイでこの抗体を試験した。抗体結合性及びＴ細胞活性化能も測定した。
【０３０４】
ＢＣＭＢ７２結合アッセイ
９６ウェルＵ底プレートにおいてウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を分取し、ついで９５μＬの培地を分取した。次に、５μＬのＢＣＭＢ７２の系列希釈又はコントロールをウェルに添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートした。染色後、細胞を１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、２００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。細胞を再度遠心分離し、上清を捨てた後、ペレットを５０μＬの近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料（１：２００希釈物）、抗ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ  ＰＥ抗体（１：５０希釈物）、抗ＣＤ１３８（ＭＩ１５  １：５０希釈物及びＤＬ−１０１  １：５０希釈物）で再構成し、暗所において室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、２００μＬのＦＡＣＳバッファで洗浄し、最後に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。ＣＤ１３８＋  ＭＮＣでのＢＣＭＢ７２の結合強度について、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ及びＦｌｏｗＪｏ  ７．６を使用してサンプルを分析した。データのフィッティングは、最小２乗法を用いた可変勾配（４パラメータ）関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０３０５】
Ｔ細胞リダイレクトアッセイ
１×１０＾５個の標的細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加し、ついで１×１０＾５個のＴ細胞を添加した（５：１のおよそのエフェクター：標的比、ただし、骨髄由来の肥満細胞中の形質細胞計数を平均２０％とする）。標的及びＴ細胞を混合した後、５μＬのＢＣＭＢ７２希釈物を各ウェルに添加した。プレートを３７℃において５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【０３０６】
２日後、プレートを遠心分離し、上清を捨てた。細胞を２００μＬのＰＢＳで洗浄し、５０μＬの近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料（１：２００希釈物）を有するＰＢＳ、抗ＣＤ１３８（ＭＩ１５  １：５０希釈物及びＤＬ−１０１  １：５０希釈物）、抗ＴＣＲ  α／β（１：５０希釈物）、及び抗ＣＤ２５  ＰＥ（１：５０希釈物）で室温で２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、最後に１５０μＬのＦＡＣＳバッファで再構成した。形質細胞傷害性（死滅ＣＤ１３８＋細胞％）及びＴ細胞活性化ＣＤ２５＋（生存Ｔ細胞％）について、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ及びＦｌｏｗＪｏ  ７．６を使用して細胞を分析した。データのグラフ化及びフィッティングは、最小２乗法を用いた可変勾配（４パラメータ）関数を有する非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６で行った。
【０３０７】
結果
図２０は、ＣＤ１３８＋形質細胞の喪失により立証されるように、ＢＣＭＢ７２が４８時間後に用量依存的に全ての患者サンプルに結合し、その殺傷を誘発したことを示す。Ｔ細胞活性化データは、予想どおり殺傷データとよく相関している。Ｔ細胞活性化の平均ＥＣ５０は、１ｎＭの範囲内であった。これらのデータは、ＢＣＭＢ７２がインビトロで原発性多発性骨髄腫の骨髄細胞を殺傷できることを立証している。
【０３０８】
実施例２１：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスでのＨ９２９ヒト多発性骨髄腫異種移植片の腫瘍形成予防におけるＢＣＭＢ７２の抗腫瘍効果
この試験は、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）ヒト化ＮＳＧ（ＮＯＤ  ＳＣＩＤ  Ｇａｍｍａ）マウスでのＨ９２９ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）異種移植片の腫瘍形成予防におけるＢＣＭＢ７２の効果を評価した。ＮＳＧマウスは、成熟機能性Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠失する免疫不全状態株である。試験７日前に、同齢雌ＮＳＧマウスに１×１０７個のヒトＰＢＭＣを静脈内注射した。ＰＢＭＣ接種後１日目に、各マウスにＨ９２９ヒトＭＭ細胞（２００μＬのＰＢＳ中に５×１０６個の細胞）を右後背面脇腹に皮下移植し、ついでＰＢＳ並びにＢＣＭＢ７２  ０．１μｇ（０．００５ｍｇ／ｋｇ）、０．５μｇ（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）、及び１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）／動物を静脈内（ＩＶ）投与した。合計５つの治療について、ＰＢＳコントロール及びＢＣＭＢ７２を１日おき又は２日おきに投与した。Ｈ９２９  ｓｃ腫瘍は、腫瘍細胞移植後、早ければ８日目にＰＢＳ及び０．１μｇ  ＢＣＭＢ７２治療群で検出可能であった。これら２つの群の腫瘍は、２２日目に平均腫瘍体積が＞５００ｍｍ３になるまで成長し続けた。２４日目までに、ＰＢＳコントロール群の平均腫瘍体積は１０００ｍｍ３を超えていた。興味深いことに、ｓｃ  Ｈ９２９腫瘍は、０．５μｇ及び１μｇのＢＣＭＢ７２で治療したマウスでは成長しなかった（図２１）。したがって、ＢＣＭＢ７２は、０．５及び１μｇ／動物で治療した全ての動物でＨ９２９ヒトＭＭ異種移植片の腫瘍形成を阻害した。
【０３０９】
実施例２２：ＢＣＭＢ７２で治療されたＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスでのＨ９２９（ヒト多発性骨髄腫細胞）異種移植片由来のマウス血清中の可溶性ＢＣＭＡの定量
この試験は、Ｈ９２９異種移植片マウス由来の血清中の可溶性ＢＣＭＡ濃度を定量するために、及び可溶性ＢＣＭＡ濃度をこれらの動物における腫瘍の負担に相関させるために設計された。
【０３１０】
簡潔に言えば、異種移植片試験サンプルから得た血清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られるＢＣＭＡ酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）により分析した。血清を解凍し、希釈用試薬で１：５０に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡを製造業者のプロトコルに従って実施した。ＥＬＩＳＡプレートを、４５０ｎｍに設定したＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーＭ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を使用して分析した。ＥＬＩＳＡ内の各ウェルは、元の異種移植片試験の一匹のマウス由来の血清に対応する。
【０３１１】
ＢＣＭＢ７２の１μｇ及び０．５μｇで治療されたマウスのマウス血清中の可溶性ＢＣＭＡ濃度は、ＰＢＳのみ又はＢＣＭＢ７２の０．１μｇ／マウスと比較するとき、有意な低下があった（図２２）。これらのデータは、ＢＣＭＢ７２の１μｇ及び０．５μｇで治療されたマウスで腫瘍の成長がないか又は最小限であった、異種移植片試験を支持する。これらのデータは、血清サンプル中の可溶性ＢＣＭＡが、多発性骨髄腫の指標を評価するための潜在的バイオマーカーとして洞察力に優れ、生存可溶性ＢＣＭＡが病気の負担をモニタするのに役立ち得ることを示唆する。
【０３１２】
【表１４−１】
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【０３１３】
【表１４−２】
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【０３１４】
【表１４−３】
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【０３１５】
【表１４−４】
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【０３１６】
【表１４−５】
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【０３１７】
【表１４−６】
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【０３１８】
【表１４−７】
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【０３１９】
【表１４−８】
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【０３２０】
【表１４−９】
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【０３２１】
【表１４−１０】
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【０３２２】
【表１４−１１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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