(57)【要約】  本発明は、弱毒四価デングワクチン及びその製品を調製するプロセスに関する。また、本発明は、被験体に投与するための四価デングワクチンを調製するプロセス、患者においてデングウイルス血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法、並びに四価デングワクチンキットに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスであって、
（ｉ）培養下でベロ細胞を増幅させてベロ細胞のマスター及びワーキングバンクを作製することであって、無血清培地中で増殖するように前記ベロ細胞を適応させ、無血清培地中で増殖させ、２２５ｃｍ２組織培養（ＴＣ）フラスコ、その後Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）内でこの細胞の非動物起源のトリプシンを使用して継代培養することと；
（ｉｉ）前記マスター又はワーキングバンクから得られたベロ細胞に各ウイルスのシード又はワーキングバンクから得られたデングウイルス血清型１、２、３、及び４を感染させることであって、無血清培地による個別の培養下で前記ベロ細胞にデングウイルス血清型１、２、３、及び４を独立して感染させることと；
（ｉｉｉ）各デングウイルスに感染したベロ細胞を含有している２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ又はＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）を３６．５℃（±１℃）で１０日間〜２０日間インキュベートすることと；
（ｉｖ）各培養物の上清を収集することと；
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた各デングウイルス懸濁液を０．２μｍ多孔質膜で濾過し、前記濾過されたデングウイルスを−８０℃（±５℃）で保存することと；
（ｖｉ）前記血清型１、２、３、及び４のデングウイルスバルクを調製することと；
（ｖｉｉ）一価ワクチンを製剤化することと；
（ｖｉｉｉ）前記一価ワクチンを混合することによって四価ワクチンを製剤化することと；
（ｉｘ）前記四価ワクチンをバイアル瓶に充填することと；
（ｘ）前記バイアル瓶内の前記四価ワクチンを凍結乾燥させることと；
（ｘｉ）前記バイアル瓶内に前記凍結乾燥した四価ワクチンを密封することと；
（ｘｉｉ）凍結乾燥し、密封した製品を２℃〜８℃で保存して、弱毒四価デングワクチンを調製することと
を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
前記上清を工程（ｉｖ）で収集し、等体積の無血清培地を前記培養物に添加し、工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を繰り返す請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を１回〜約７回繰り返す請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
使用される前記デングウイルス株が、ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）又はその変異体；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）又はその変異体；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）又はその変異体、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）又はその変異体である請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスであって、
（ｉ）培養下でベロ細胞を増幅させてベロ細胞のマスター及びワーキングバンクを作製することであって、無血清培地中で増殖するように前記ベロ細胞を適応させ、無血清培地中で増殖させ、非動物起源のトリプシンを使用して継代培養することと；
（ｉｉ）前記マスター又はワーキングバンクから得られたベロ細胞に各ウイルスのシード又はワーキングバンクから得られたデングウイルス血清型１、２、３、及び４を感染させることであって、無血清培地による個別の培養下で前記ベロ細胞にデングウイルス血清型１、２、３、及び４を独立して感染させることと；
（ｉｉｉ）組織培養フラスコ又はＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）内で各デングウイルスに感染した前記ベロ細胞を３６．５℃（±１℃）で１０日間〜２０日間インキュベートすることと；
（ｉｖ）各培養物の上清を収集することと；
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた各デングウイルス懸濁液を０．２μｍ多孔質膜で濾過し、前記濾過されたデングウイルスを−８０℃（±５℃）で保存することと；
（ｖｉ）前記血清型１、２、３、及び４のデングウイルスバルクを調製することと；
（ｖｉｉ）一価ワクチンを製剤化することと；及び
（ｖｉｉｉ）前記一価ワクチンを混合することによって四価ワクチンを製剤化することと
を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項６】
使用される前記ベロ細胞株が、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１．４である請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記上清を工程（ｉｖ）で収集し、等体積の無血清培地を前記培養物に添加し、工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を繰り返す請求項５に記載のプロセス。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を１回〜約７回繰り返す請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
使用される前記デングウイルス株が、ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）又はその変異体；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）又はその変異体；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）又はその変異体、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）又はその変異体である請求項５に記載のプロセス。
【請求項１０】
各デング血清型についてのデングウイルス株の感染多重度（ＭＯＩ）が、ＤＥＮＶ１及び４については０．０１〜０．０３、ＤＥＮＶ２については０．０２〜０．０４、並びにＤＥＮＶ３については０．０５〜０．０８である請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記一価ワクチンを同体積比で混合して、前記四価デングワクチン１、２、３、４（弱毒）を得る請求項５に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記四価ワクチンをバイアル瓶に充填する工程と；前記バイアル瓶内の前記四価ワクチンを凍結乾燥する工程と；前記バイアル瓶内に前記凍結乾燥した四価ワクチンを密封する工程と；凍結乾燥及び密封された製品を２℃〜８℃で保存する工程とを更に含む請求項５に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記凍結乾燥プロセスにおいて使用されるパラメータが、凍結（−３０℃〜−５０℃）、真空（２０μｂａｒ〜１００μｂａｒ）、一次乾燥：−３０℃〜−５０℃（３６時間〜４２時間）及び−５℃〜−１０℃（１８時間〜２４時間）、二次乾燥：２５℃〜２９℃（８時間〜１５時間）である請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
請求項１に記載のプロセスによって生産されることを特徴とする弱毒四価デングワクチン。
【請求項１５】
被験体に投与するための四価デングワクチンを調製するプロセスであって、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム七水和物、及び水を含む組成物で、請求項１４に記載の前記密封及び凍結乾燥した四価デングワクチンを再構成する工程を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
前記密封及び凍結乾燥したワクチンを前記組成物５ｍＬで再構成する請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
被験体においてデングウイルス血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１４に記載のワクチンを前記被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載のワクチンと、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム七水和物、及び水を含む再構成組成物とを含むことを特徴とする四価デングワクチンキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の援用
２０１５年８月３１日に作成された５６，４５０バイト（オペレーティングシステムＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「６０１３５＿＿１４６５７８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に電子送信によって提出され、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野である。本発明は、弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスに関する。また、本発明は、弱毒四価デングワクチンに関する。また、本発明は、ワクチンを再構成するための組成物の使用に関する。また、本発明は、患者において血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法に関する。また、本発明は、四価デングワクチンキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、デングは、ブラジルにおいて公衆衛生に大きな影響を及ぼす疾患である。風土病地域、主に東南アジア（太平洋地域）及びアメリカに暮らしている世界の人口の半分がこの疾患に冒されている。ＷＨＯによれば、ある最近の研究では、１年間に約３億９，０００万人（９５％確信区間２億８，４００万人〜５億２，８００万人）がデングに感染していると推定され、そのうちの９，６００万人（６，７００万人〜１億３，６００万人）で（任意の重篤度の疾患が）臨床的に顕在化している（非特許文献１）。デングの流行に関する別の研究では、１２８ヶ国における３９億人がデングウイルスに関連するリスクがあると推定された（非特許文献２）。
【０００４】
ブラジルでは、２０００年に２００，０００症例のデングが発生し、２０１０年には１００万症例が発生した。２０１５年には、３月までにブラジルで４６０，５０２症例のデングが報告されている。南東部地域では、国と比較して最も多数の症例が報告され（３０４，２５１症例、６６．１％）、続いて、中西部（５９，８５５症例；１３％）、北東部（５１，２２１症例；１１．１％）、北部（１９，４０２症例；４．２％）、及び南部（２５，７７３症例、５．６％）であった（非特許文献３）。
【０００５】
デング（ＤＦ）及びその重篤な形態である出血性デング（ＤＨＦ）／デングショック症候群（ＤＳＳ）は、デング血清型ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、及びＤＥＮ４のいずれかが感染することによって引き起こされ得る。
【０００６】
現在、この疾患を治療する抗ウイルス薬は存在せず、蚊ベクター（ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ））コントロールストラテジは効果がないことが証明されているので、デングの進行をコントロールする唯一の方法は、４種のデングウイルスに対するワクチンを使用して予防することによるものである。現在、ヒト使用について認可されているデングワクチンは存在しない。疫学的研究では、通常あるデング血清型による一次感染がＤＦを引き起し、二次感染がＤＨＦを引き起こす確率は、一次感染よりも１５倍〜８０倍高いことが示されている。したがって、有効なデングワクチンは、デングウイルスの４つの血清型で構成されていなければならない（非特許文献４）。しかし、四価デングワクチンの開発は、全てのデングウイルスの血清型に対して長期間の保護を与えなければならないので、非常に困難である（非特許文献５）。
【０００７】
特許文献１は、３０ヌクレオチドが欠失している４つのデングウイルス血清型の混合物又は抗原性キメラデングウイルスを含むプロセスから得られる製品に関する。
【０００８】
特許文献２には、デングウイルスに対する免疫応答を誘導する方法が記載されている。このデングウイルスに対する免疫応答を誘導する方法は、非複製免疫原を投与し、続いて、四価弱毒生ウイルスワクチンでブーストすることを含む。別の態様は、ＤＮＡ発現系、アデノウイルス発現ベクター、又はベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン系を含むプライム免疫原とＤＮＡ発現系を含まない以外は同じものを含むブースト免疫原とを用いる異種プライム−ブーストレジメンを使用して、デングウイルスに対する免疫応答を誘導する方法である。各発現系は、デングウイルスタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有する。上記特許には、デングワクチンのための免疫スキームが記載されている。このスキームでは、初回免疫に非複製免疫原を使用し、その後、四価弱毒生デングワクチンを使用する。本願の目的は、弱毒生デングワクチンを得るためのプロセスである。
【０００９】
本発明は、弱毒ウイルス株ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）及びその変異体；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）及びその変異体；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）及びその変異体；並びにｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）及びその変異体を使用する、４種のデングウイルスに対するワクチンの開発について教示する。特定のｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、及びｒＤＥＮ４Δ３０組み換え弱毒デングウイルスが特許文献３〜５に記載されており、これらはその全体が参照によって本明細書に援用される。
【００１０】
デングワクチン１、２、３、４（弱毒）と呼ばれる本発明のワクチンは、１０用量がバイアル瓶に入れられた凍結乾燥形態で提供される。このワクチンの開発において、以下のプロセスが確立された：ベロ細胞及びウイルスバンクを得るためにベロ細胞及び血清型１、２、３、及び４のデングウイルスを作製する；これらバンクから得られた細胞及びウイルスを含むウイルス懸濁液を作製する；これら懸濁液を濃縮し、バルクを調製する；一価及び四価ワクチンを製剤化する；充填する；凍結乾燥させ、製品を密封する。
【００１１】
分かる通り、デングワクチンの大規模生産を可能にする弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスは先行技術文献のいずれにも開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願第１３／３０５，６３９号（２００９年３月４日に出願された米国特許出願第１２／３９８，０４３号の継続、現在米国特許第８，０７５，９０３号（２００４年１０月２１日に出願された米国特許出願第１０／９７０，６４０号の継続、現在米国特許第７，５１７，５３１号（２００３年４月２５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／１３２７９号の継続）））、米国保健福祉省、名称「Ｄｅｎｇｕｅ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ３０  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ３’−ＵＴＲ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅｓ  １，２，３  ａｎｄ  ４，ｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  １，２，３  ａｎｄ  ４」
【特許文献２】米国特許出願第１１／９８２，４８８号（２００７年１１月２日出願、２０１２年５月３１日公開、２０１２年８月１４日特許付与）、Ｍｏｎｉｋａ  Ｓｉｍｍｏｎｓ等、名称「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」
【特許文献３】米国特許第７，５１７，５３１号
【特許文献４】米国特許第７，２２６，６０２号
【特許文献５】米国特許第８，３３７，８６０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｈａｔｔ  Ｓ，Ｇｅｔｈｉｎｇ  ＰＷ，Ｂｒａｄｙ  ＯＪ，Ｍｅｓｓｉｎａ  ＪＰ，Ｆａｒｌｏｗ  ＡＷ，Ｍｏｙｅｓ  ＣＬ  ｅｔ．ａｌ  ２０１３．Ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ．Ｎａｔｕｒｅ；４９６：５０４−５０７．
【非特許文献２】Ｂｒａｄｙ  ＯＪ，Ｇｅｔｈｉｎｇ  ＰＷ，Ｂｈａｔｔ  Ｓ，Ｍｅｓｓｉｎａ  ＪＰ，Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ  ＪＳ，Ｈｏｅｎ  ＡＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ．２０１２；６：ｅ１７６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００１７６０．
【非特許文献３】Ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｏ  ｄａ  Ｓａｕｅｄｅ  Ｂｒａｚｉｌ．Ｂｏｌｅｔｉｍ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｅｇｉｃｏ．Ｍｏｎｉｔｏｒａｍｅｎｔｏ  ｄｅ  ｃａｓｏｓ  ｄｅ  ｄｅｎｇｕｅ．Ｖｏｌ．Ｎ°  １１．２０１５  ｉｎ  ｈｔｔ／／ｐｏｒｔａｌｓａｕｄｅ．ｇｏｖ．ｂｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｓｉｔｕａｃａｏ．ｅ
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．；Ｙａｍａｎａｋａ，Ａ．；Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｅ．２０１４．Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｓｅ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｙｅｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ．３２：１３２６−１３３７．
【非特許文献５】ＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）．Ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ｓｉｔｅ  “ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｄｅｎｇｕｅ＿ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｅｎ／”［２０１５年４月３０日にアクセス］．
【発明の概要】
【００１４】
上記問題を解決するために、本開示は、四価デングワクチンを調製するための既存のプロセスを超える顕著な利点を提供する。先ず、本発明の特定の実施形態は、継代数のより少ない（継代数１２３）ベロ細胞株を使用するので、この細胞株をより多数回継代することができる、即ち、収量が多い。更に、無血清培養培地で維持された細胞を用いて調製されたマスター及びワーキングベロ細胞バンクを非動物トリプシンを用いて継代培養し、５％ＤＭＳＯで安定化した。無血清培地を使用すると再現性が高くなり、言うまでもないことだが、ベロ細胞を維持及び増幅する継代培養において非動物トリプシンを使用すると、プロセスがより安全になり且つブタサーコウイルスが最終製品に混入する可能性をなくすことができる。更に、２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｌａｓｋｓ）又は１０枚のトレイ層を備えるＮｕｎｃ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ；培養面積約６，３２０ｃｍ２）内でベロ細胞を増殖させることができ、これによって、最高約２×１０９細胞／ＣＦＳの細胞／ＴＣフラスコの大量生産が可能になる。ベロ細胞（これからワーキングウイルスシードバンクを調製した）においてデングウイルスを更に複製させると、プロセスの生産性が増大した。ＣＦＳを使用する１回の生産サイクルで得られるウイルス懸濁液の最終体積は、１４Ｌ（高体積）である。本発明の特定の実施形態では、１回のウイルス生産サイクルで最高約７回収集することができる。ウイルスを含有する培地を培養物から除去し、除去された培地を新鮮培地と交換し、感染細胞を新たな培地でインキュベートし、インキュベート後にウイルスを含有する培地を収集することによって、感染細胞からデングウイルス懸濁液を収集する。これも本明細書に提供されるプロセスの生産性を増大させる。また、本開示は、ＴＣフラスコ及びＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）で増殖させたベロ細胞における血清型１、２、３、及び４のデングウイルス複製曲線の研究を通じて、ウイルス懸濁液の上清を収集するのに最適な時間についても教示し、これによって収集回数を増加させることができる。特定の実施形態では、本開示の四価ワクチンは、各血清型に従って異なる力価（それぞれ、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、及びＤＥＮＶ４について５．７±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、５．６±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、６．１±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、及び５．８±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ）のデングウイルスを含有する一価ワクチンを用いて調製され、これによって四価ワクチンにおける各血清型のウイルス粒子の均質性をより高くすることができる。最後に、請求されるプロセスの充填及び凍結乾燥の工程によって、２℃〜８℃で１年間安定なワクチンが得られる。
【００１５】
要約すると、本願の弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスは、高収量であり且つ非常に再現性が高い。前記プロセスの生成物であるワクチンは、高度に安定であり且つワクチンの製造において一般的に使用される動物起源の夾雑物（血清及びトリプシン）を含まない。前記特徴によって、デングワクチンを大規模生産することが可能になる。更に、本開示のデングワクチンは、２０１３年１１月からブラジルでヒト試験が行われている（第ＩＩ相臨床試験）。この試験の予備データによって、この製品が安全且つ免疫原性であることが証明されている。
【００１６】
一態様では、本発明は、以下の工程の任意のサブセット又は全てを含むという事実を特徴とする弱毒四価デングワクチンを調製するためのプロセスに関する：無血清培地中で非動物起源のトリプシンを使用して増殖するようにベロ細胞を適応させて、前記細胞の継代培養物を得る工程と；２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ、その後Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）においてベロ細胞を増幅させる工程と；ベロ細胞のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）及びワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）並びにデングウイルス血清型１、２、３、及び４のシードバンク及びワーキングシードバンクを作製する工程と；２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ又はＣＦＳ内で、ワーキング細胞バンクから得られたベロ細胞にワーキングシードウイルスバンクから得られたデングウイルスの血清型１、２、３、及び４を感染させる工程と；ベロ細胞／デングウイルス懸濁液を含有しているＴＣフラスコ又はＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）を３６．５℃（±１℃）で１０日間〜２０日間インキュベートする工程と；上清を収集し、濾過（０．２μｍ多孔質膜）し、−８０℃（±５℃）で保存する工程と；デングウイルスの血清型１、２、３、及び４のバルクを調製する工程と；これらバルクを用いて一価ワクチンを製剤化する工程と；４種の一価ワクチンを用いて四価ワクチンを製剤化する工程と；充填する工程と；凍結乾燥させる工程と；密封する工程と；ラベルを貼付し、製品を２℃〜８℃で保存する工程。
【００１７】
特定の実施形態では、使用されるベロ細胞株は、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１．４（ｃＧＭＰＶｅｒｏ、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｏｔｈｉｏｐｓ）の腎臓）である。更なる実施形態では、使用されるデングウイルス株は、米国国立保健研究所（ＮＩＨ）から入手したｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８である。更なる実施形態では、各デング血清型のデングウイルス株のＭＯＩは、ＤＥＮＶ１及び４については約０．０１〜約０．０３；ＤＥＮＶ２については約０．０２〜約０．０４；並びにＤＥＮＶ３については約０．０５〜約０．０８であり得る。更なる実施形態では、一価ワクチンを同じ体積比で混合して、四価デングワクチン血清型１、２、３、４（弱毒）を得る。更なる実施形態では、フリーズドライ（凍結乾燥）プロセスで使用されるパラメータは、凍結（−３０℃〜−５０℃）、真空（２０μｂａｒ〜１００μｂａｒ）、一次乾燥：−３０℃〜−５０℃（３６時間〜４２時間）及び−５℃〜−１０℃（１８時間〜２４時間）、二次乾燥：２５℃〜２９℃（８時間〜１５時間）である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、上記プロセスによって生産される弱毒四価デングワクチンに関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、上記プロセスによって生産されたワクチンを再構成するためのリン酸二水素ナトリウム二水和物０．２Ｍ、リン酸水素二ナトリウム七水和物０．２Ｍ、及びＷＦＩ水（即ち、注射用水）を含む組成物の使用に関する。実施形態では、乾燥ワクチンを再構成するために前記組成物を５ｍＬ使用する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、上記ワクチンを被験体に投与することによって、前記被験体においてデングウイルス血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法に関する。特定の実施形態では、被験体はヒトである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、上記凍結乾燥四価ワクチンと、リン酸二水素ナトリウム二水和物０．２Ｍ、リン酸水素二ナトリウム七水和物０．２Ｍ、及びＷＦＩ水を含む再構成組成物とを含む四価デングワクチンキットに関する。
【００２２】
特定の実施形態では、弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスであって、（ｉ）培養下でベロ細胞を増幅させてベロ細胞のマスター及びワーキングバンクを作製することであって、無血清培地中で増殖するように前記ベロ細胞を適応させ、無血清培地中で増殖させ、２２５ｃｍ２組織培養（ＴＣ）フラスコ、その後Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）内でこの細胞の非動物起源のトリプシンを使用して継代培養することと；（ｉｉ）前記マスター又はワーキングバンクから得られたベロ細胞に各ウイルスのシード又はワーキングバンクから得られたデングウイルス血清型１、２、３、及び４を感染させることであって、無血清培地による個別の培養下で前記ベロ細胞にデングウイルス血清型１、２、３、及び４を独立して感染させることと；（ｉｉｉ）各デングウイルスに感染したベロ細胞を含有している２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ又はＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）を３６．５℃（±１℃）で１０日間〜２０日間インキュベートすることと；（ｉｖ）各培養上清を収集することと；（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた各デングウイルス懸濁液を０．２μｍ多孔質膜で濾過し、前記濾過されたデングウイルスを−８０℃（±５℃）で保存することと；（ｖｉ）前記血清型１、２、３、及び４のデングウイルスバルクを調製することと；（ｖｉｉ）一価ワクチンを製剤化することと；（ｖｉｉｉ）前記一価ワクチンを混合することによって四価ワクチンを製剤化することと；（ｉｘ）前記四価ワクチンをバイアル瓶に充填することと；（ｘ）前記バイアル瓶内の前記四価ワクチンを凍結乾燥させることと；（ｘｉ）前記バイアル瓶内に前記凍結乾燥した四価ワクチンを密封することと；（ｘｉｉ）凍結乾燥し、密封した製品を２℃〜８℃で保存して、弱毒四価デングワクチンを調製することとを含むプロセスが提供される。
【００２３】
特定の実施形態では、弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスであって、（ｉ）培養下でベロ細胞を増幅させてベロ細胞のマスター及びワーキングバンクを作製することであって、無血清培地中で増殖するように前記ベロ細胞を適応させ、無血清培地中で増殖させ、非動物起源のトリプシンを使用して継代培養することと；（ｉｉ）前記マスター又はワーキングバンクから得られたベロ細胞に各ウイルスのシード又はワーキングバンクから得られたデングウイルス血清型１、２、３、及び４を感染させることであって、無血清培地による個別の培養下で前記ベロ細胞にデングウイルス血清型１、２、３、及び４を独立して感染させることと；（ｉｉｉ）組織培養フラスコ又はＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）内で各デングウイルスに感染した前記ベロ細胞を３６．５℃（±１℃）で１０日間〜２０日間インキュベートすることと；（ｉｖ）各培養上清を収集することと；（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた各デングウイルス懸濁液を０．２μｍ多孔質膜で濾過し、前記濾過されたデングウイルスを−８０℃（±５℃）で保存することと；（ｖｉ）前記血清型１、２、３、及び４のデングウイルスバルクを調製することと；（ｖｉｉ）一価ワクチンを製剤化することと；（ｖｉｉｉ）前記一価ワクチンを混合することによって四価ワクチンを製剤化することとを含むプロセスが提供される。
【００２４】
特定の実施形態では、上記プロセスのいずれかによって生産される弱毒四価デングワクチンが提供される。
【００２５】
特定の実施形態では、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム七水和物、及び水を含む組成物中で、上記方法のいずれかによって生産された密封及び凍結乾燥された四価デングワクチンを再構成する工程を含む、被験体に投与するための四価デングワクチンを調製するプロセスが提供される。
【００２６】
また、上記ワクチンを被験体に投与することを含む、前記被験体においてデングウイルス血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法も提供される。
【００２７】
また、上記ワクチンと、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム七水和物、及び水を含む再構成組成物とを含む四価デングワクチンキットも提供される。
【００２８】
上記プロセス、ワクチン、方法、又はキットのいずれかの特定の実施形態では、使用されるデングウイルス株は、ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）又はその変異体；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）又はその変異体；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）又はその変異体、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）又はその変異体である。
【００２９】
本開示の目的は、その更なる利点と共に、添付図面及び以下の記載を参照することによってより深く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスの工程を全て記載している、本開示の要約である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は様々な実施形態に影響されやすいが、図面及び以下の詳細な議論に特定の実施形態が示されており、本開示は本発明の原理の例証であるとみなすことができ、また、本発明の範囲をこの明細書に例示及び開示されているものに限定することを意図するものではないことが理解される。
弱毒四価デングワクチンを調製するプロセス
【００３２】
第１の実施形態では、本発明は、以下の工程の任意のサブセット又は全てを含む弱毒四価デングワクチンを調製するプロセスに関する：無血清培地及び非動物起源のトリプシン中で増殖するようにベロ細胞を適応させる工程と；２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ、その後Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）内においてベロ細胞の培養下でこの細胞を増幅させる工程と；ベロ細胞のマスター及びワーキングバンク並びにデングウイルス血清型１、２、３、及び４のシード及びワーキングシードバンクを作製する工程と；２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ又はＣＦＳに含有されているベロ細胞に、前記バンクから得られたデングウイルスの血清型１、２、３、及び４を感染させる工程と；デングウイルスに感染しているベロ細胞／ウイルス懸濁液を含有している２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ又はＣＦＳを３６．５℃（±１℃）で１０日間〜２０日間インキュベートする工程と；これらの培養上清を収集し、これらデングウイルス懸濁液を０．２μｍ多孔質膜で濾過し、−８０℃（±５℃）で保存する工程と；血清型１、２、３、及び４のデングウイルスバルクを調製する工程と；これらバルクを用いて一価ワクチンを製剤化する工程と；前記一価ワクチンを混合して四価ワクチンを製剤化する工程と；充填する工程と；凍結乾燥させる工程と；密封し、製品を２℃〜８℃で保存する工程。更なる実施形態では、使用されるベロ細胞株は、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１．４（ｃＧＭＰＶｅｒｏ、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｏｔｈｉｏｐｓ）の腎臓；ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手可能）である。更なる実施形態では、使用されるデングウイルス株は、ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）又はその変異体；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）又はその変異体；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）又はその変異体；及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）又はその変異体である。使用することができる上記デングウイルス株の変異体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）配列番号１の全長に亘って少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を有するゲノムを有するｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）の変異体、及び配列番号１によってコードされているウイルスポリタンパク質に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するウイルスポリタンパク質をコードしている、上記割合の配列同一性を有する変異体；（２）配列番号２の全長に亘って少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を有するゲノムを有するｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）の変異体、及び配列番号２によってコードされているウイルスポリタンパク質に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するウイルスポリタンパク質をコードしている、上記割合の配列同一性を有する変異体；（３）配列番号３の全長に亘って少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又���９９．５％の配列同一性を有するゲノムを有するｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）の変異体、及び配列番号３によってコードされているウイルスポリタンパク質に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するウイルスポリタンパク質をコードしている、上記割合の配列同一性を有する変異体；並びに（４）配列番号３の全長に亘って少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を有するゲノムを有するｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）の変異体、及び配列番号４によってコードされているウイルスポリタンパク質に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するウイルスポリタンパク質をコードしている、上記割合の配列同一性を有する変異体。
【００３３】
ｒＤＥＮ１Δ３０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＹ１４５１２３）は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）における３０ヌクレオチド（Δ３０）が欠失している、ＤＥＮ１  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐａｃｉｆｉｃ（ＷＰ）野生型株に由来する弱毒生ワクチンである。本明細書で使用されるｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５株（配列番号１）は、ウイルスポリタンパク質のアミノ酸残基番号４８４におけるＬｙｓ→Ａｒｇ単一突然変異（Ａ１５４５Ｇ突然変異）をコードしている。
【００３４】
ＤＥＮ２ウイルスの開発については、ｒＤＥＮ４Δ３０の対応する遺伝子をＤＥＮ２のＭＥ領域に置換して、ワクチン候補ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）を作製する。本明細書で使用するｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３株（配列番号２）は、ウイルスポリタンパク質のアミノ酸残基番号１８６におけるＳｅｒ→Ｐｈｅ突然変異（Ｃ１４９５Ｔ突然変異）及びアミノ酸残基番号１１２におけるＬｅｕ→Ｐｈｅ突然変異（Ａ７１６３Ｃ突然変異）をコードしている。
【００３５】
ｒＤＥＮ３Δ３０／３１は、ｒＤＥＮ３Δ３０株に由来する弱毒生ワクチンである。最初に、ＤＥＮ３  Ｓｌｅｍａｎ／７８株の完全ｃＤＮＡコピーを構築し、３’ＵＴＲにおいて３０ヌクレオチドを欠失させる（Δ３０）。得られたｒＤＥＮ３Δ３０ウイルスから、３’−ＵＴＲにおける約３１ヌクレオチドを更に欠失させる［２］。したがって、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１は、オリジナルのΔ３０欠失と、オリジナルのＴＬ−２及びＴＬ−３構造の両方を除去する不連続な３１ｎｔの欠失とを含む。本明細書で使用される得られたｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４株（配列番号３）は、ウイルスポリタンパク質のアミノ酸残基番号１１５におけるＶａｌ→Ａｌａ突然変異（Ｔ７１６４Ｃ突然変異）をコードしている。
【００３６】
ｒＤＥＮ４Δ３０は、組み換えＤＮＡ技術を使用して野生型ＤＥＮ４  Ｄｏｍｉｎｉｃａ／８１から得られた弱毒生ウイルスである。３’ＵＴＲの二次構造におけるＴＬ２として同定された１つのステム−ループ構造は、ＤＥＮ４ゲノムから３０ヌクレオチドを欠失させることによって既に除去されており（３’ｄ  １７２〜１４３）、その後Δ３０突然変異と命名されている。本明細書で使用されるｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８株（配列番号４）は、ウイルスポリタンパク質のアミノ酸残基番号１０２におけるＴｈｒ→Ｉｌｅ突然変異（Ｃ７１３２Ｔ突然変異）、アミノ酸残基番号１１２におけるＬｅｕ→Ｐｈｅ突然変異（Ａ７１６３Ｃ突然変異）、及びアミノ酸残基番号２４９におけるＬｙｓ→Ａｒｇ突然変異（Ａ８３０８Ｇ突然変異）をコードしている。
【００３７】
更なる実施形態では、デングウイルス株のＭＯＩは各デング血清型で異なり、ＤＥＮＶ１及び４については０．０１〜０．０３、ＤＥＮＶ２については０．０２〜０．０４、及びＤＥＮＶ３については０．０５〜０．０８である。更なる実施形態では、一価ワクチンを同じ体積比で混合して、四価デングワクチン血清型１、２、３、４（弱毒）を得る。更なる実施形態では、フリーズドライプロセスにおいて使用されるパラメータは、冷凍（−３０℃〜−５０℃）、真空（２０μｂａｒ〜１００μｂａｒ）、乾燥：−３０℃〜−５０℃（３６時間〜４０時間）、−５℃〜−１０℃（１８時間〜２４時間）、及び２５℃〜２９℃（８時間〜１５時間）である。特定の実施形態では、無血清培地へのベロ細胞の適応は、継代数１２３で実施され；ワーキング細胞バンクは継代数１３４で実施され；ベロ細胞を使用してデングウイルスを生産するプロセスは、継代数１３８〜１４９で実施される。
【００３８】
特定の実施形態では、一価ワクチンを製剤化する工程（ｖｉｉ）の前に安定剤を使用する。本発明の特定の実施形態に好適な安定剤としては、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、ＡＳＯ４（安定な水酸化アルミニウム及びモノホスホリルリピドＡの混合物を含む安定剤系）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマーＦ１２７、Ｆ６８（ＢＡＳＦ）、Ｐ８５（ＢＡＳＦ）、及びＰ１２３（ＢＡＳＦ）、多糖キトサン、並びに組み換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない［８、９］。
弱毒四価デングワクチン
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、上記プロセスによって生産される弱毒四価デングワクチンに関する。
乾燥ワクチンを再構成するための組成物の使用
【００４０】
別の実施形態では、リン酸二水素ナトリウム二水和物０．２Ｍ、リン酸水素二ナトリウム七水和物０．２Ｍ、及びＷＦＩ水を含む組成物を使用して、上記ワクチンを再構成する。更なる実施形態では、組成物５ｍＬを使用して、乾燥ワクチンを再構成する。
患者においてデングウイルス血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、上記ワクチンを被験体に投与することによって、前記被験体におけるデングウイルス血清型１、２、３、及び４に対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００４２】
デング感染に対する予防的処置については、デングウイルス血清型１〜４に個体を曝露する前に本発明のワクチンを投与してよく、得られる免疫応答がデング感染を阻害し得るか又は重篤度を低下させ得ることを意図する。
四価デングワクチンキット
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、上記ワクチンと、リン酸二水素ナトリウム二水和物０．２Ｍ、リン酸水素二ナトリウム七水和物０．２Ｍ、及びＷＦＩ水とを含む再構成組成物を含む四価デングワクチンキットに関する。
【実施例】
【００４４】
実施例１．生産プロセスの説明
デングワクチン１、２、３、４（弱毒）の生産プロセスは、以下の工程を含む：
【００４５】
工程１．ワクチンの生産プロセスにおいて使用される培養培地及び溶液の調製
【００４６】
ベロ細胞を維持するための無血清培養培地、バルクの調製品、及びワクチンの製剤は、以下の通り調製される：
【００４７】
ＶＰ−ＳＦＭ  ＡＧＴ又はＡＧＴ  ＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ）無血清培地：フラスコの粉末化された培養培地をＷＦＩ水で希釈し、それに、最後に培養培地がＬ−グルタミンを２００ｍＭ含むようにこの試薬を添加する。０．２μｍ膜で濾過することによって培地を滅菌し、ｐＨの測定及び無菌試験用のサンプルを採取する。
【００４８】
フェノールレッドを含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ−１５）培養培地：フラスコに含有されている粉末化された培養培地をＷＦＩ水で希釈する。次いで、０．２μｍ膜で培地を濾過する。無菌性、細菌内毒素、ｐＨ、及び外観試験用のサンプルを採取する。
【００４９】
濾過された培養培地をポリカーボナートフラスコに詰め、２℃〜８℃で保存する。
【００５０】
０．０２Ｍリン酸塩を含む緩衝生理食塩水は、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、及びＷＦＩ水で構成される。この溶液は、細胞増幅プロセス中に培養物を洗浄するため、及びデングウイルス懸濁液の濃縮において使用される。
【００５１】
工程２．マスター及びワーキングベロ細胞のバンクの調製
【００５２】
ベロ細胞株ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１．４（例えば、ｃＧＭＰＶｅｒｏ、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｏｔｈｉｏｐｓ）の腎臓、ｐ．１２３バッチ７３８８１２５）を適応させることによってベロ細胞バンクを得、無血清培地及び非動物起源のトリプシン中で培養した。この適応は、無血清培地（ＶＰ−ＳＦＭ  ＡＧＴ（登録商標）−ＧＩＢＣＯ）及び組み換えトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）−Ｇｉｂｃｏ）を使用して、細胞培養用の培養細胞２２５ｃｍ２Ｔ−フラスコ内でこの細胞を継代培養することによって実施した。無血清培地中で増殖させるために血清を含む培地でのみ増殖する細胞を適応させた後、無血清培地で増殖した培養物を使用して細胞バンクを調製した。
【００５３】
マスター及びワーキング細胞バンクの調製では、９０％〜１００％コンフルエントな培養フラスコに含有されている適応させたベロ細胞をトリプシンで剥離させ、培地ＯｐｔｉＰＲＯ  ＡＧＴ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させ、遠心分離し、ペレット化して、５％ＤＭＳＯを含有する同じ培地に再懸濁させる。細胞懸濁液をホモジナイズし、４〜１０×１０６細胞／ｍＬを含有しているクライオチューブに分注した。クライオチューブを８０℃（±５℃）の冷凍庫に４８時間入れ、次いで、液体窒素中で保存する。以下の品質管理試験を介してバンクを検定するためのサンプルを採取する：無菌性、核型分類、細胞の同一性、細胞及び動物における外来性汚染生物、血球吸着ウイルス、並びにマイコプラズマ。
【００５４】
工程３．デングウイルスの生産において細胞基材として使用されるベロ細胞の増幅
【００５５】
細胞増幅プロセスは、起源細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ８１．４）又はマスター若しくはワーキング細胞バンクから得られたベロ細胞を含有しているクライオチューブを３７℃（±１℃）の水浴内で解凍することを含む。解凍後、ベロ細胞の懸濁液を、無血清培地の入ったＴフラスコに入れ、細胞単層の被覆率がＴフラスコの培養面積の９０％〜１００％になるまで３６．５℃（±１℃）でインキュベートする。フラスコをインキュベータから取り出し、細胞を新規継代培養に付す。このプロセスでは、リン酸塩０．０２Ｍで緩衝された生理食塩水で細胞単層を洗浄し、組み換えトリプシン（Ｔｒｙｐｌｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）−ＧＩＢＣＯ）で剥離させる。細胞を無血清培地に懸濁させ、同じ培地を含有しているＴＣフラスコに分割する。被覆率が９０％〜１００％に達するまでＴＣフラスコを３６．５℃（±１℃）で再度インキュベートし、次いで、更に継代培養する。細胞の増幅は、先ず２２５ｃｍ２のＴＣフラスコで行い、次いで、１０枚のトレイ層を備えるＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＣＦＳ）で行う。
【００５６】
工程４．ワーキングデングウイルスバンクＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、及びＤＥＮ４の調製
【００５７】
増幅したベロ細胞を含有している培養領域２２５ｃｍ２のＴＣフラスコに、デングウイルス株ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５（配列番号１）；ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３（配列番号２）；ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４（配列番号３）；及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８（配列番号４）を別々に感染させる。ウイルス感染に使用されるＭＯＩ（感染多重度）は、血清型毎に異なる：ＤＥＮＶ１及び４については０．０１〜０．０３；ＤＥＮＶ２については０．０２〜０．０４；並びにＤＥＮＶ３については０．０５〜０．０８。感染した培養物を３６．５℃（±１℃）でインキュベートする。８日間インキュベートした後、ＤＥＮ１Δ３０、ＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、及びＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８に感染した培養物の上清を別々に収集し、滅菌膜で濾過し、−８０℃（±５℃）の冷凍庫で保存する。フラスコの培養培地を交換し、フラスコを３６．５℃（±１℃）で再度インキュベートする。この手順を３連続日間繰り返して、最後に４つのサンプルの上清を作製した。ＤＥＮ３に感染した培養物については、インキュベートの１０日目にこの手順を開始する。無菌及びウイルス滴定試験のために培養物の上清の各収集物のサンプルを採取する。
【００５８】
ワーキングバンクの調製では、無菌試験で承認された、力価が１０５．０ＰＦＵ／ｍＬよりも高い収集物を混合し、２ｍＬ〜４ｍＬでクライオチューブに分注し、液体窒素中で維持する。以下の試験で承認された後にバンクを使用する：ウイルスの同一性、無菌性、滴定、細胞及び動物における外来性汚染生物、血球吸着ウイルス、並びにマイコプラズマ。
【００５９】
工程５．デングワクチン製剤のためのデングウイルス血清型１、２、３、及び４の生産
【００６０】
増幅後、工程３に記載の通りの増幅プロセスから得られたＴＣフラスコ又はＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）に含有されているベロ細胞をトリプシン処理し、無血清培地（ＯｐｔｉＰＲＯ（登録商標）ＡＧＴ−ＧＩＢＣＯ）に懸濁させる。得られたベロ細胞懸濁液に、デングワクチンを生産するプロセスの工程４で調製されたデングウイルスのバンクから得られたデングウイルス株ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１，４９５．７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８を接種する。接種には、血清型毎に異なるＭＯＩ（感染多重度）を使用する：ＤＥＮＶ１及び４については０．０１〜０．０３；ＤＥＮＶ２については０．０２〜０．０４；並びにＤＥＮＶ３については０．０５〜０．０８。接種後、ウイルス／細胞懸濁液を３２℃（±１℃）で３０分間〜６０分間撹拌し、次いで、２２５ｃｍ２ＴＣフラスコ又は１０枚のトレイ層を備えるＣＦＳに分注する。ＴＣフラスコでは１００ｍＬ〜１５０ｍＬ、ＣＦＳでは１，２００ｍＬ〜１，８００ｍＬの体積に達するまで、培養物に無血清培養培地を添加する。異なるトレイ層数のＣＦＳについては、３の法則によって添加する培養培地の体積を計算する。培養物を３６．５℃（±１℃）でインキュベートする。インキュベートの８日目又は１０日目に培地の５０％〜６０％を除去し、同体積の無血清培地を培養物に添加する。培養物を３６．５℃（±１℃）で再度インキュベートする。感染したベロ細胞培養物の上清の収集は、デングウイルスのインキュベート後１０日目〜２０日目に行う。
【００６１】
収集プロセスは、ＴＣフラスコ又は感染したＣＦＳ培養物の上清を除去し、収集した上清を混合し、この混合物を滅菌濾過し、濾過したデングウイルス懸濁液をポリプロピレン／ポリカーボナートフラスコに分注し、−８０℃（±５℃）の冷凍庫で保存することを含む。無菌及びウイルス滴定試験用にサンプルを採取する。試験で承認された後、デングウイルス懸濁液の入ったフラスコを冷凍庫から取り出し、濃縮プロセスに進める。
【００６２】
収集したデングウイルス懸濁液を解凍し、３０ｋＤａ〜５０ｋＤａの多孔質膜を備えるＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する接線濾過プロセスによって濃縮する。品質管理試験：ウイルス滴定及び無菌用にサンプルを採取する。ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、又はｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８のウイルス濃縮物（Ｃ１）を命名し、−８０℃（±５℃）で保存する。
【００６３】
工程６．デングウイルスバルクの調製
【００６４】
デングウイルス濃縮物Ｃ１（ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、又はｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８）を−８０℃（±５℃）の冷凍庫から取り出し、解凍し、以下のプロセスに付す：フェノールレッドを含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地でウイルス濃縮物を希釈し、使用する希釈係数はその初期体積の５倍〜１０倍である。希釈した濃縮物を接線濾過（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）によってその初期体積の２．５倍〜３倍に再度濃縮する。この濃縮物をＣ２と呼ぶ。
【００６５】
濃縮物Ｃ２を０．２μｍ多孔質膜で濾過し、チューブ／フラスコに分注し、−８０℃（±５℃）の冷凍庫で保存する。品質管理試験（無菌性及び細菌内毒素、マイコプラズマ、細胞内の外来性汚染生物、血球吸着ウイルス、同一性、並びにウイルス滴定）用のサンプルを採取する。品質管理試験で承認された後、バルクを一価ワクチンの製剤に放出する。
【００６６】
２０１３年及び２０１４年に生産されたデングウイルスバルクロットを表１に示す。
【表１】
2018527408.tif 000003
【００６７】
工程７．一価ワクチンｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８、並びにデングワクチン血清型１、２、３、４（弱毒）の製剤化
【００６８】
各種デングウイルスにつき１つの４つのデング一価ワクチンを製剤化する（ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８）。製剤化するための計算は、各血清型に係る一価ワクチンが以下の量で提供されるような希釈係数を求めることからなる：それぞれＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、及びＤＥＮＶ４について５．７±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、５．６±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、６．１±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、及び５．８±０．２Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ。
【００６９】
希釈係数を求めるための式は、バルク力価（Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ）の真数÷各種一価に望ましいウイルス力価（Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ）の真数である。ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４、及びｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８一価の製剤は、２倍濃縮したフェノールレッドを含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ−１５）培地、即ち、２倍濃縮されたオリジナルの成分が残存している培地を使用して行う。
【００７０】
デングワクチン血清型１、２、３、４（弱毒）製剤を作製するために、一価１、２、３、及び４ワクチンを同体積比で混合する。製剤化された四価ワクチンをホモジナイズした後、製品を濾過に付し（０．２μｍ多孔質膜）、以下の品質管理試験：無菌性、細菌内毒素、ウイルス滴定、ｐＨ、及び製品の外観用のサンプルを採取する。
【００７１】
工程８．四価デングワクチンの充填、凍結乾燥、及び密封
【００７２】
四価デングワクチンを製剤化した後、製品を使用してワクチン３ｍＬをバイアル瓶に充填する。品質管理試験（無菌性、細菌内毒素、ウイルス滴定、外観、及びｐＨ）用に、充填されたバイアル瓶のサンプルを採取する。
【００７３】
バイアル瓶を充填した後、凍結乾燥機に移し、凍結乾燥プロセスを開始させる。このプロセスでは、以下のパラメータを確立する：凍結（−３０℃〜−５０℃）、真空（２０μｂａｒ〜１００μｂａｒ）、乾燥−３０℃〜−５０℃（３６時間〜４０時間）、−５℃〜−１０℃（１８時間〜２４時間）、及び２５℃〜２９℃（８時間〜１５時間）。
【００７４】
凍結乾燥プロセスの最後に、凍結乾燥したワクチンの入ったバイアル瓶を密封プロセスに付す。最終製品であるデングワクチン１、２、３、４（弱毒）を２℃〜８℃で保存する。ワクチンロットのサンプルを無菌性、細菌内毒素、ウイルス滴定、希釈剤で再構成する前後の製品の外観、ｐＨ、残留ＤＮＡ、及び残留水分試験について試験する。
【００７５】
ワクチンの命名に関するブラジルの規制に従って、製品をデングワクチン血清型１、２、３、４（弱毒）と命名することができる。
【００７６】
製品は、このワクチンに対する特定の希釈剤（リン酸ナトリウムの混合物）５．０ｍＬ（１０用量／０．５ｍＬ／バイアル瓶に対応）を用いて再構成することができる。各用量は、デングワクチン１、２、３、４（弱毒）製剤で使用される各デングウイルスを１０２．７ＰＦＵ／用量〜１０３．７ＰＦＵ／用量含有する。２０１４年に生産された６つのバッチから得られた品質管理試験の結果を表２に示す。
【表２】
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ＩＩＩ  デングワクチン１、２、３、４（弱毒）を再構成するための希釈剤
組成：
１，０００ｍＬを調製する場合
溶液１（リン酸二水素ナトリウム二水和物０．２Ｍ）．．．．．．．１９５ｍＬ
溶液２（リン酸水素二ナトリウム七水和物０．２Ｍ）．．．．．．．．０５ｍＬ
ＷＦＩ水  ｑｓｐ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１，０００ｍＬ
【００７７】
体裁：５．０ｍＬのバイアル瓶又はアンプル
ＩＶ  デングワクチン１、２、３、４（弱毒）の安定性試験
２℃〜８℃における安定性試験
【００７８】
２℃〜８℃で保存したデングワクチン１、２、３、４（弱毒）の３つのバッチのサンプルにおいて実施した試験の結果を表３及び４に示す。
【表３】
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ＩＩＩ  デングワクチン１、２、３、４（弱毒）を再構成するための希釈剤
組成：
【００７９】
表３の結果の分析は、少なくとも１年間以下の保存については、デングウイルス血清型１、２、３、及び４の力価が変わらず満足のいくものであったことを示す。２℃〜８℃で１８ヶ月間保存後、ＤＥＮＶ３及びＤＥＮＶ４の力価は必要最小値（１０２．７ＰＦＵ／用量のワクチン）を下回った。
【表４】
2018527408.tif 000006
参照文献
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［２］  Ｂｒａｄｙ  ＯＪ，Ｇｅｔｈｉｎｇ  ＰＷ，Ｂｈａｔｔ  Ｓ，Ｍｅｓｓｉｎａ  ＪＰ，Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ  ＪＳ，Ｈｏｅｎ  ＡＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ．２０１２；６：ｅ１７６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００１７６０．
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［６］  Ｄｕｒｂｉｎ  ＡＰ，Ｋａｒｒｏｎ  ＲＡ，Ｓｕｎ  Ｗ，Ｖａｕｇｈｎ  ＤＷ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＭＪ，Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ  ＪＲ，Ｔｈｕｍａｒ  Ｂ，Ｍｅｎ  Ｒ，Ｌａｉ  ＣＪ，Ｅｌｋｉｎｓ  ＷＲ，Ｃｈａｎｏｃｋ  ＲＭ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＲ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ＳＳ．Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−４  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ３０  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｔｓ  ３’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ．ＡＭ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（２００１）Ｎｏｖ  ６５（５）：４０５−１３．
［７］  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ＳＳ，Ｆａｌｇｏｕｔ  Ｂ，Ｈａｎｌｅｙ  ＫＡ，Ｂｌａｎｅｙ  Ｊｒ  ＪＥ  Ｊｒ，Ｍａｒｋｏｆｆ  Ｌ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＢＲ．Ａ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ３０−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ３’  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｉｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００３）Ｊａｎ  ７７（２）：１６５３−７．
［８］  Ｗｉｇｇａｎ  Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄ  ＪＡ，Ｓｉｌｅｎｇｏ  ＳＪ，Ｋｉｎｎｅｙ  ＲＭ，Ｏｓｏｒｉｏ  ＪＥ，Ｈｕａｎｇ  ＣＹＨ，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ＤＴ．Ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（２０１１）７４５６−７４６２．
［９］  Ｂｕｒｋｅ  ＣＪ，Ｈｓｕ  Ｔ−Ａ，Ｖｏｌｋｉｎ  ＤＢ．Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）１６（１）：１−８．
【００８０】
本発明の特定の実施形態について記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲において、上記教示に鑑みて本発明の多くの改変例及び変形例が可能であることを理解するであろう。したがって、本明細書に提供される添付の特許請求の範囲及び開示の範囲内において、特定の実施形態に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施できると理解すべきである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018527408.tif 000010
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