(57)【要約】  対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを癌の特徴付けおよび／または予後診断の提供のために使用することを含む、対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のための方法。決定された発現レベルは、シグネチャースコアの作成に使用される。本方法は、転移性疾患の同定およびモニターを可能とし、治療介入をガイドする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断の方法であって、
対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用する
ことを含む、方法。
【請求項２】
対象における転移能が高い癌を診断する方法であって、
対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを、対象が転移能が高い癌を有するか否かを同定するために使用する
ことを含む、方法。
【請求項３】
対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断の方法であって、
対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを再発および／または転移の可能性が高い細胞の存在または非存在を同定するために決定し、ここで、該細胞の存在または非存在を、癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用する
ことを含む、方法。
【請求項４】
対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断の方法であって、
ａ)対象からのサンプルにおいて
ｂ)表１から選択した少なくとも１、好ましくは１２遺伝子または完全配列または標的配列のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを対象からのサンプルに適用し、
ｃ)核酸プローブ−遺伝子複合体を検出する検出剤を適用し、
ｄ)検出剤を少なくとも１、好ましくは１２遺伝子のレベルの決定に使用し、
ｅ)ここで、少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の該決定されたレベルを、癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用する
ことを含む、方法。
【請求項５】
対象における癌を特徴付けおよび／または予後診断する方法であって、
ａ)対象からのサンプルにおいて
ｂ)表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子または全配列または標的配列のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを対象からのサンプルに適用し、
ｃ)核酸プライマーのセットを使用してヌクレオチド配列を増幅し
ｄ)少なくとも１、好ましくは１２遺伝子のレベルを決定するために特異的検出剤を使用して増幅生成物を検出し、
ｄ)ここで、少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の該決定されたレベルを、癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用する
ことを含む、方法。
【請求項６】
対象における癌の処置を選択する方法であって、
(ａ)対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを癌の特徴付けおよび／または予後診断の提供のために使用し、そして
(ｂ)癌の特徴付けおよび／または予後診断に対して適する処置を選択する
ことを含む、方法。
【請求項７】
対象における癌の処置を選択する方法であって、
(ａ)対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用し、
(ｂ)癌の特徴付けおよび／または予後診断に適する処置を選択し、そして
(ｃ)対象を選択した処置法で処置する
ことを含む、方法。
【請求項８】
癌の特徴付けおよび／または予後診断が高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性であるならば、選択される処置が
ａ)抗ホルモン処置、好ましくはビカルタミドおよび／またはアビラテロン
ｂ)細胞毒性剤
ｃ)生物学的製剤、好ましくは抗体および／またはワクチン、より好ましくはシプロイセルＴ
ｄ)放射線療法、所望により拡大放射線療法、好ましくは広範囲放射線療法
ｅ)標的療法
ｆ)手術
の１以上である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
癌の特徴付けおよび／または予後診断が高くない再発および／または転移および／または予後不良の可能性であれば、処置またはさらなる処置を選択／適用しない、請求項６〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
癌を、その後の処置またはさらなる処置が必要であるか否かについてモニターする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
表１から選択される少なくとも２以上の遺伝子から最大全７０遺伝子の発現レベルを決定することを含み、所望によりここで、少なくとも２遺伝子がＭＴ１ＡおよびＰＣＰ４を含むかまたは表２〜２４の何れか一つに挙げられている遺伝子の発現レベルが決定される、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
さらに対象におけるＰＳＡレベルおよび／またはグリーソンスコアの決定を含み、決定したＰＳＡレベルおよび／またはグリーソンスコアを決定した発現レベルと組み合わせて使用して、癌の特徴付けおよび／または予後診断(癌が転移の可能性を増大させたかどうかの診断を含む)を提供する、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
癌が前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌であるか、またはそれを含む、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
発現レベルの決定が
(ａ)表１から選択される完全配列または標的配列の少なくとも一つとハイブリダイズするプライマー(プライマー対)および／またはプローブ；および／または
(ｂ)表１／１Ａからの少なくとも１プローブおよび／またはプローブセット；および／または
(ｃ)表１Ｂからのおよび／または配列番号３１５１〜３１５４の少なくとも１プライマーおよび／またはプライマー対
を用いる、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
癌の特徴付けおよび／または予後診断または癌の診断が、高い再発の可能性の予測および／または高い転移の可能性の予測を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
癌の特徴付けおよび／または予後診断または癌の診断が、癌が予後不良であるか否かの決定を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
発現レベルと参照値または１以上の対照サンプルにおける発現レベルとの比較を含む、請求項１〜１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
発現レベルと１以上の対照サンプルにおける同じ遺伝子の発現レベルとを比較する、請求項１〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
発現レベルをマイクロアレイ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ−ｓｅｑ(ＲＮＡ配列決定)、インサイチュＲＮＡ検出または核酸増幅により決定する、請求項１〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
さらに総ＲＮＡをサンプルから抽出することを含むおよび／またはさらに対象からのサンプルを得ることを含む、請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
シグネチャースコアを、測定された発現レベルから、所望により式
【数１】
2018527886.tif 000077
〔ここで、ｗｉは各遺伝子の荷重であり、ｂｉは遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは前処理後の遺伝子発現であり、そしてｋは一定のオフセットである〕
に従って誘導する、請求項１〜２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
サンプルが前立腺細胞および／または組織または乳房細胞および／または組織を含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなる、請求項１〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋生検サンプルまたは摘出サンプルを含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなる、請求項１〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
正の荷重を有する表１から選択した少なくとも１遺伝子の高い発現レベルが高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を示す、請求項１〜２３の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
負の荷重を有する表１から選択した少なくとも１遺伝子の低い発現レベルが高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を示す、請求項１〜２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
シグネチャー閾値を越えるスコアが高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を示す、請求項２１またはその従属項の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
閾値以上のシグネチャースコアが高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を示す、請求項２１またはその従属項の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
シグネチャースコアを、表１〜２４のシグネチャーから選択したシグネチャーにおける測定した遺伝子の発現レベルについて計算する、請求項２１またはその従属項の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
対象に化学療法剤または放射線療法、所望により拡大放射線療法、好ましくは広範囲放射線療法を適用するかまたは対象に手術を実施することを含む、癌を処置する方法であって、対象が請求項６〜８またはその従属項の何れかに記載の方法に基づき処置について選択される、方法。
【請求項３０】
対象における癌の処置に使用するための化学療法剤であって、
ここで、対象が請求項６〜８またはその従属項の何れかに記載の方法に基づく処置について選択される、化学療法剤。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法または請求項３０の使用のための化学療法剤であって、
ここで、化学療法剤が
ａ)抗ホルモン処置、好ましくはビカルタミドおよび／またはアビラテロン
ｂ)細胞毒性剤
ｃ)生物学的製剤、好ましくは抗体および／またはワクチン、より好ましくはシプロイセルＴおよび／または
ｄ)標的化治療剤
を含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなる、方法または化学療法剤。
【請求項３２】
細胞毒性剤が白金ベースの薬剤および／またはタキサンである、請求項８または２９またはその従属項の何れかまたは３１に記載の方法。
【請求項３３】
白金ベースの薬剤がシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
タキサンがパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４の何れかに記載の方法を実施するための、システム、デバイスまたは試験キット。
【請求項３６】
対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのシステム、デバイスまたは試験キットであって、
ａ)対象からのサンプルにおいて表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルを決定するための１以上の試験デバイス、
ｂ)プロセッサー；および
ｃ)コンピューターアプリケーションを含む記憶媒体であって、プロセッサーにより実行されたとき、
(ｉ)１以上の試験デバイスにおけるサンプル中の表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の決定された発現レベルにアクセスするおよび／またはそれを計算する
(ii)サンプル中の表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子のレベルに上昇または減少があるか計算する；および
(iii)プロセッサーから癌の特徴付けをアウトプットする
ように設定されているもの
を含む、システム、デバイスまたは試験キット。
【請求項３７】
癌が前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌であるかまたはそれらを含むかまたはそのいずれかである、請求項３６に記載のシステム、デバイスまたは試験キット。
【請求項３８】
請求項１〜３４の何れかに記載の方法の実施に適応される、請求項３６または３７に記載のシステム、デバイスまたは試験キット。
【請求項３９】
さらにプロセッサーからのアウトプットのためのディスプレイを含む、請求項３６〜３８の何れかに記載のシステム、デバイスまたは試験キット。
【請求項４０】
請求項３６〜３９の何れかに定義した、コンピューターアプリケーションまたはコンピューターアプリケーションを含む記憶媒体。
【請求項４１】
対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのコンピュータープログラム製品であって、コンピューターに
(ｉ)１以上の試験デバイス上のサンプルにおける表１から選択された少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の決定された発現レベルにアクセスするおよび／またはそれを計算する；
(ii)サンプルにおける表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子のレベルに上昇または減少があるか計算する；および
(iii)癌の特徴付けおよび／または予後診断に関するアウトプットを提供する
ことをさせる、組み込まれたコンピューター読取可能プログラム指示を有する、非一過性コンピューター読取可能記憶デバイス。
【請求項４２】
癌が前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌であるかまたはそれを含む、請求項４１に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項４３】
表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子のＲＮＡ生成物と特異的にハイブリダイズするまたは表１からの完全配列または標的配列と特異的にハイブリダイズする１または好ましくは１２以上のオリゴヌクレオチドプローブを含み、さらに次の成分ａ)遮断プローブ
ｂ)プレアンプリファイヤー
ｃ)アンプリファイヤーおよび／または
ｄ)標識分子
の１以上を含む、対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのキット。
【請求項４４】
癌が前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌であるかまたはそれを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子の発現レベルに定義するヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるプローブおよび／またはプローブセットを含む、請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】
表１から選択される少なくとも１遺伝子、完全配列または標的配列と特異的にハイブリダイズする１、好ましくは１２以上のプローブおよび／またはプローブセットを含む、対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのキット。
【請求項４７】
表１から選択されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるプローブおよび／またはプローブセットを含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
表１から選択されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、プローブおよび／またはプローブセット。
【請求項４９】
表１〜２４におけるシグネチャーから選択されるシグネチャーからの各遺伝子とハイブリダイズする少なくとも１プローブおよび／またはプローブセットを含む、請求項４６または４７に記載のキットまたは請求項４８に記載のプローブおよび／またはプローブセット。
【請求項５０】
表１から選択される少なくとも１、好ましくは１２遺伝子、完全配列または標的配列を増幅するための１または好ましくは１２以上のプライマーおよび／またはプライマー対を含む、対象における特徴付けおよび／または予後診断癌のためのキット。
【請求項５１】
表１Ｂに定義するおよび／または配列番号３１５１〜３１５４のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるプライマーおよび／またはプライマー対を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
表１Ｂに定義するヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、プライマーおよび／またはプライマー対。
【請求項５３】
表１〜２４におけるシグネチャーから選択されるシグネチャーからの各遺伝子とハイブリダイズする少なくとも１プライマーおよび／またはプライマー対を含む、請求項５０または５１に記載のキットまたは請求項５２に記載のプライマーおよび／またはプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は癌、特に前立腺癌およびＥＲ陽性乳癌に関する。癌、特に前立腺癌およびＥＲ陽性乳癌の特徴付および予後推定の方法を提供する。本方法は、特に１以上の遺伝子シグネチャーの形態での各種バイオマーカーを利用する。本方法において有用なプライマー、プローブ、抗体、キット、デバイスおよびシステムも記載する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
前立腺癌は、生涯発症率１５.３％の最もありふれた男性の悪性腫瘍である(Howlader 2012)。１９９９〜２００６年のデータに基づき、前立腺癌患者の約８０％が、前立腺に臨床的に確認される早期疾患を示し(Altekruse et al 2010)、その約６５％が外科的切除または放射線療法により治癒する(Kattan et al 1999, Pound et al 1999)。３５％がＰＳＡの再上昇を示し、その約３５％が局所または転移先での再発を示し、これは不治である。現在まで、早期前立腺癌のどの患者が再発に至り、より強力な治療により利益を受ける可能性があるか不明である。グリーソンスコアにより測定する腫瘍グレードのような現在の予後診断係数は、予後診断的価値を有するが、低グレード(７以下)と考えられる患者の相当数がなお再発し、高グレード腫瘍の一定数は再発しない。さらにグリーソン７腫瘍の予後は相当多様である(Makarov et al 2002, Rasiah et al 2003)。さらに、グリーソンスコアの等級付けは変化しており、時間経過とともにグリーソンスコアの分布の変化に到ることが分かってきている(Albertsen et al 2005, Smith et al 2002)。
【発明の概要】
【０００３】
同じ解剖学的位置が起源の大部分の固形腫瘍が、分子レベルで多数の異なる存在を表すことが現在明らかとなっている(Perou et al 2000)。ＤＮＡマイクロアレイプラットホームは、保管されたパラフィン包埋組織から同時に数万の転写物の解析を可能にし、理想的に分子サブグループの同定に適する。この種の取り組みは、乳癌(van't Veer et al 2002)および結腸癌(Bertucci et al 2004)のような固形腫瘍において転移能を有する原発癌を同定している。
【０００４】
発明の記載
本発明は、転移する可能性のある癌(例えば前立腺癌およびＥＲ陽性乳癌)を同定する癌バイオマーカー、特に予後バイオマーカーの同定および照合に基づく。
【０００５】
本発明者らは、分子レベルで転移性疾患に類似する一群の原発前立腺癌を同定した。転移性サンプルとクラスター化した原発腫瘍サンプルは、不良な(悪い)予後の一群を定義する。これらの腫瘍は、細胞接着、細胞分化および細胞発生に関連する遺伝子の下方制御により定義され得る。これらの腫瘍は、アンドロゲン関連過程および上皮間葉遷移(ＥＭＴ)の上方制御により定義され得る。対照的に、良性および原発様良性腫瘍は、まとまって改善された(良好な)予後の群を定義する。何れのサブグループ内(すなわち転移性または非転移性生理を有する)の腫瘍であるかの前向き同定に使用できる一連のバイオマーカー／遺伝子シグネチャーが作成され、予後予測能力を有することが検証された。シグネチャーは、このように、例えば、腫瘍の再発および／または転移発症の可能性が高いか否かの決定のための、腫瘍の進行の前向き評価に使用できる。シグネチャーはまたここにさらに記載する不均一性試験においても優れたパフォーマンスを示す。特に、７０遺伝子シグネチャーをここに記載する。遺伝子シグネチャーはまたＥＲ陽性乳癌を含む他の癌タイプでも有効であることが示され、そのため、根底の分子生物学が、転移する可能性のある原発腫瘍の同定に適用性を有し得ることが示唆される。
【０００６】
それ故に、第一の態様において、本発明は、対象における、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断の方法であって、
対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを癌の特徴付けおよび／または予後診断の提供のために使用することを含む、方法を提供する。
【０００７】
本発明のさらなる態様によって、対象における転移能が高い前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を診断(または同定または特徴付け)する方法であって、
対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを、対象が、転移能が高い前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を有するか否かの同定に使用することを含む、方法が提供される。
【０００８】
本発明はまた、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を特徴付けおよび／または予後診断する方法であって、
対象からのサンプルにおける表１からの少なくとも１遺伝子の発現レベルを再発および／または転移の可能性が高い細胞の存在または非存在を同定するために決定し、ここで、該細胞の存在または非存在を、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用することを含む、方法にも関する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を特徴付けおよび／または予後診断する方法であって、
ａ)対象からサンプルを得て／対象から得たサンプルにおいて、
ｂ)表１から選択される少なくとも１遺伝子または全配列または標的配列のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを対象からのサンプルに適用し、
ｃ)核酸プローブ−遺伝子複合体を検出する検出剤を適用し、
ｄ)検出剤を少なくとも１遺伝子または全配列または標的配列のレベルの決定に使用し、
ｄ)ここで、少なくとも１遺伝子(または全配列または標的配列)の該決定されたレベルを、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用する
ことを含む、方法に関する。適当なプローブおよびプローブセットを表１に挙げ、さらなる詳細を表１Ａに提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を特徴付けおよび／または予後診断する方法であって、
ａ)対象からサンプルを得て／対象から得たサンプルにおいて
ｂ)表１から選択される少なくとも１遺伝子または全配列または標的配列のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸プライマーを対象からのサンプルに適用し、
ｃ)核酸プライマーのセットを使用してヌクレオチド配列を特異的に増幅させ、
ｄ)少なくとも１遺伝子または全配列または標的配列のレベルを決定するために特異的検出剤を使用して増幅生成物を検出し、
ｅ)ここで、少なくとも１遺伝子(または全配列または標的配列)の該決定されたレベルを、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用する
ことを含む、方法に関する。適当なプライマーおよびプライマー対を表１Ｂに挙げる。
【００１１】
検出剤は、蛍光標識のような標識または核酸プローブおよび／またはプライマー(適当であるならば)に結合したフルオロフォア／消光システムを含み得る。適当なシステムおよび方法は当分野で知られ、ここに記載する。
【００１２】
前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付け、予後診断または診断はまた処置のガイドに使用できる。
【００１３】
従って、さらなる態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の処置を選択する方法であって、
(ａ)対象からのサンプルにおいて表１から選択した少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断の提供のために使用し、そして
(ｂ)前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断に対して適する処置を選択する
ことを含む、方法に関する。
【００１４】
さらに他の態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の処置を選択する方法であって、
(ａ)対象からのサンプルにおいて表１から選択した少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断の提供のために使用し、
(ｂ)前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断に対して適する処置を選択し、そして
(ｃ)対象を選択した処置法で処置する
ことを含む、方法に関する。
【００１５】
本発明はまた対象に化学療法剤または放射線療法、所望により拡大放射線療法、好ましくは広範囲放射線療法を適用するまたは対象に手術を実施することを含む、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を処置する方法にも関し、ここで、対象は、ここに記載する方法に基づき処置のために選択される。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の処置に使用する化学療法剤に関し、ここで、対象は、ここに記載する方法に基づき処置のために選択される。
【００１７】
さらに他の態様において、本発明は、対象に化学療法剤または放射線療法、所望により拡大放射線療法、好ましくは広範囲放射線療法を適用するまたは対象に手術を実施することを含む、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を処置する方法に関し、ここで、対象は表１において選択した正の荷重の少なくとも１遺伝子の発現レベルが上昇しているおよび／または対象は表１において選択した負の荷重の少なくとも１遺伝子の発現レベルが低下している。
【００１８】
本発明はまた対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の処置に使用するための化学療法剤にも関し、ここで、対象は表１において選択した正の荷重の少なくとも１遺伝子の発現レベルが上昇しているおよび／または対象は表１において選択した負の荷重の少なくとも１遺伝子の発現レベルが低下している。
【００１９】
本発明の全ての関連態様によるある実施態様において、化学療法剤は
ａ)抗ホルモン処置、好ましくはビカルタミドおよび／またはアビラテロン
ｂ)細胞毒性剤
ｃ)生物学的製剤、好ましくは抗体および／またはワクチン、より好ましくはシプロイセルＴおよび／または
ｄ)標的化治療剤
を含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなる。
【００２０】
適当な治療および治療剤を、ここにさらに詳細に記載する。処置はアジュバント療法を含んでよくまたはある実施態様ではアジュバント療法であり得る。
【００２１】
本発明の全ての態様において、癌は前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌であり得る。一般に、癌は原発腫瘍である。ある実施態様において、前立腺癌は原発前立腺癌であり得る。
【００２２】
遺伝子シグネチャーは、他の予後因子の決定と組み合わせたとき、特に有利な有用性を有し得る。それ故に、本発明の全態様は、癌の特徴付け、診断または予後診断における他の予後因子を含み得る。これは、複合リスクスコアの作成を含み得る。これは、前立腺癌で特に適用可能である。他の予後因子は、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)レベルおよび／またはグリーソンスコアを含む。ＭＲＩ走査結果もまた考慮に入れてよい。それ故に、本発明の全態様によって、特徴付け、予後診断または診断は、ＰＳＡレベルおよび／またはグリーソンスコアのような他の予後因子を考慮に入れ得る。ＰＳＡは周知の血清バイオマーカーであり、特に術前に測定したとき、本発明により使用し得る。例えば、４〜１０ng／mlのＰＳＡ値は“低リスク”と考えられ得る。１０〜２０ng／mlのＰＳＡ値は、“中リスク”を反映すると考えられ得る。２０ng／ml以上のＰＳＡ値は“高リスク”を反映すると考えられ得る。高リスクは予後不良に対応するおよび／または高悪性度疾患の指標である。ＰＳＡレベルは、測定された発現レベルと組み合わせて癌の最終特徴付けに寄与し得る。中リスクＰＳＡレベルは、陽性または高シグネチャースコアと組み合わさったとき予後不良の指標であり得る。
【００２３】
グリーソンシステムは２〜１０のスコアで前立腺腫瘍を等級付けするのに使用され、グリーソンスコア１０は最も異常を示す。グリーソンスコアが高いほど癌は攻撃性が強く、予後が悪い。このシステムは、前立腺癌組織が顕微鏡下でどのように見えるかに基づき、どの程度腫瘍が広がる可能性があるかを示す。低グリーソンスコアは、癌組織が正常前立腺組織に類似し、腫瘍が広がる可能性はあまりないことを意味し、高グリーソンスコアは癌組織が正常と極めて異なり、腫瘍が広がる可能性が高いことを意味する。グリーソンスコアは、癌細胞の最も一般的なグレード(一次的グレードパターン)および第二の最も一般的なグレード(二次的グレードパターン)のスコアの加算により計算する。２を超えるグレードが観察されるならば、一次的グレードを観察可能な最悪のグレードに加算して、グリーソンスコアを得る。グレードを2005年(2009年改定)のInternational Society of Urological Pathology (ISUP) Consensus Conference on Gleason Grading of Prostatic Carcinomaを使用して割り当てる。それ故に、ある実施態様において、７以上のグリーソンスコアは、予後不良の特徴付けに寄与する。このような実施態様において、７未満のグリーソンスコアは、予後良好の特徴付けに寄与する。ある実施態様において、７のグリーソンスコアは、予後良好と不良の中間に位置するとして分類される。それ故に、８以上のグリーソンスコアは予後不良として分類される。７未満のグリーソンスコアは予後良好の特徴付けに寄与し得る。ある実施態様において、それ故に、７のグリーソンスコアは、８以上のグリーソンスコアよりも予後不良の特徴付けとはならないが、６以下のグリーソンスコアよりはそれを特徴付ける。７のグリーソンスコアは、陽性または高シグネチャースコアと組み合わさったとき予後不良の指標であり得る。
【００２４】
グリーソンスコアおよびＰＳＡレベルの両方が癌の特徴付けに寄与するとき、それらは互いに荷重され得る。一般に、グリーソンスコアは、ＰＳＡレベルより大きな有意性が与えられる。それ故に、例えば、予後不良の指標であるグリーソンスコアと低リスクまたは予後良好と関連するＰＳＡレベルの組み合わせは、なお予後不良の結論を導く(表１からの１個または複数個の遺伝子の測定された発現レベルによる)。同様の判断がＭＲＩ結果に適用でき、これは、癌の最終特徴付けを行うのにＰＳＡレベルより大きな荷重が与えられ得る。
【００２５】
適当な遺伝子シグネチャーに含まれ得る遺伝子およびそれらの同定情報を、下記表１にさらに詳細に記載し、定義する。遺伝子はまた、相互交換可能に、バイオマーカーとも称され得る。適当な発現レベル決定アッセイが設計され得る完全配列も表に示す。同様に、適当な発現レベル決定アッセイが設計され得る標的配列も表に示す。標的配列を調べるプローブ配列も提供される。各配列タイプは、本発明の実施に有用であり、その独立した態様を形成する。
【００２６】
【表１−１】
2018527886.tif 000002
【表１−２】
2018527886.tif 000003
【００２７】
【表１−３】
2018527886.tif 000004
【表１−４】
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【００２８】
【表１−５】
2018527886.tif 000006
【表１−６】
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【００２９】
【表１−７】
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【表１−８】
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【００３０】
【表１−９】
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【表１−１０】
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【００３１】
【表１−１１】
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【００３２】
さらに詳細なプローブセットを、配向情報を含む表１Ａに見ることができる
【表２−１】
2018527886.tif 000013
【表２−２】
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【００３３】
【表２−３】
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【表２−４】
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【００３４】
【表２−５】
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【表２−６】
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【００３５】
【表２−７】
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【表２−８】
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【００３６】
【表２−９】
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【表２−１０】
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【００３７】
【表２−１１】
2018527886.tif 000023
【００３８】
表１は、遺伝子発現アッセイが標的とし得る完全配列、より特異的な標的配列およびこれらの標的配列とハイブリダイズするプローブ／プローブセットの配列識別子を挙げる。適当なプライマーおよび／またはプローブを、ここに特定する寄託遺伝子配列、完全配列および標的配列に基づき遺伝子発現を決定するために既知方法を使用して設計し得る。さらに、表１の遺伝子の遺伝子発現レベルの信頼できる決定を可能とする特異的核酸増幅アッセイ(例えばＱＰＣＲのようなＰＣＲ)も設計されている。これらのアッセイは表１Ｂに要約する。アッセイ標的配列およびプライマーおよびプライマー対は、本発明の個別の態様を形成する。標的の２つ、ＭＩＲ５７８およびＭＩＲ４５３０について、標的配列の短い長さのため、発明者らによる取り組みは増幅アッセイの産生に適用不可能であった。これらの標的について、市販のアッセイが利用可能であり、プライマーの配列を下に提供する。ＭＩＲ５７８について、Life Technologies 4426961 Origene HP300490アッセイを使用し得る。順方向および逆方向プライマーは次のとおりである。
ＣＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＡＧＧＡＴ  (配列番号３１５１)
ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＣ  (配列番号３１５２)
【００３９】
ＭＩＲ４５３０について、Life Technologies 4427012 Origene HP301022アッセイを使用し得る。順方向および逆方向プライマーは次のとおりである。
ＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＡＧＣ  (配列番号３１５３)
ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＣ  (配列番号３１５４)は上と同じと考えられる
【００４０】
これらの特異的プライマーは、本発明の方法の実施に有用であるが、本発明の一部を形成するとしてそれ自体をこの出願で特に特許請求していない。
【００４１】
【表３−１】
2018527886.tif 000024
【表３−２】
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【表３−３】
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【００４２】
ここに記載する配列の各々の相補体は、適当であるとして用い得ることは注意されるべきである(例えばハイブリダイズプローブおよび／またはプライマー対を含むプライマーの設計のため)。
【００４３】
ある実施態様において、表１の遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０の発現レベルが決定される。ここに記載するいくつかの解析は、７または１２遺伝子の測定された発現レベルを含むシグネチャーの提供が許容されるパフォーマンスを提供できることを示す。それ故に、ある実施態様において、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の最小数は１２である。７０遺伝子からの任意の７または１２遺伝子であり得る。
【００４４】
疑問を残さないために、付加的遺伝子(７０遺伝子以外)を、当業者に容易に認識されるとおり、シグネチャーに包含してよい。図２〜４に示すとおり、大型の遺伝子シグネチャーも適する可能性がある。
【００４５】
ある実施態様において、シグネチャースコアは、表１の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０遺伝子の測定された発現レベルに由来する。このようなシグネチャースコアの作成をここに記載する。シグネチャースコアは、７０遺伝子シグネチャーについて、表１に挙げる各遺伝子に帰属する重み付けを利用し得る。重み付けは、当然、例えば、計７０遺伝子シグネチャーより少ないものを含む、種々の組成物のシグネチャーを使用したとき、再計算する必要がある。同様の判断が、下記のバイアスおよび一定のオフセット値に適用される。
【００４６】
遺伝子シグネチャーを、ある実施態様において、ランク順に位置づけでき、例えば、１０遺伝子シグネチャーを表１に挙げられたランク付けされた最初の１０遺伝子から形成してよい。しかしながら、ランキングは、７０遺伝子シグネチャーにおけるパフォーマンスに基づく。従って、７０遺伝子シグネチャーのサブシグネチャーの位置づけは同じ階層に限定されず、適切にサイズ分類したシグネチャーを形成するために７０遺伝子のあらゆる組み合わせを使用して位置づけし得る。
【００４７】
コア遺伝子解析を実施して、シグネチャーから除いたときのパフォーマンスに対する影響に基づき、遺伝子のランキングを決定した。この解析は、元の７０シグネチャー遺伝子セットからの１０シグネチャー遺伝子の１０,０００無作為サンプリングを含んだ。各相互作用について、１０の無作為に選択したシグネチャー遺伝子を除去し、残った６５遺伝子のパフォーマンスを、これらの１０遺伝子が除去されたときのＨＲ(ハザード比)パフォーマンスに対する影響を決定するためのエンドポイントを使用して評価した。
【００４８】
これを２４８サンプルのFASTMAN Biopsy Validation Cohortを使用して実施したとき、評価は、生化学的再発(ＢＣＲ)エンドポイントを利用した。
【００４９】
シグネチャー遺伝子は、包含または除外に基づくＨＲパフォーマンス(デルタＨＲ)における変化に基づき荷重した。‘１’とランク付けされた遺伝子は除去されたときパフォーマンスに負の影響が最大であり、‘７０’とランク付けされた遺伝子は除去されたときパフォーマンスへの影響が最小である。結果を下記表３５に示す。
【００５０】
それ故に、ある実施態様において、遺伝子シグネチャーはランク順に位置づけされる。例えば、１０遺伝子シグネチャーは表３５に挙げたランク付けされた最初の１０遺伝子を含む。従って、ある実施態様において、表３５における１０位までの高いランクの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０遺伝子の発現レベルが決定される。
【００５１】
これを３２２サンプルのInternal Resection Validation Cohortを使用して実施したとき、評価は転移再発(ＭＥＴ)エンドポイントを利用した。
【００５２】
シグネチャー遺伝子を包含または除外に基づくＨＲパフォーマンス(デルタＨＲ)における変化に基づき荷重した。‘１’とランク付けされた遺伝子は除去されたときパフォーマンスに負の影響が最大であり、‘７０’とランク付けされた遺伝子は除去されたときパフォーマンスへの影響が最小である。結果は下記表３６に示す。
【００５３】
それ故に、ある実施態様において、遺伝子シグネチャーはランク順に位置づけされる。例えば、１０遺伝子シグネチャーは、表３６挙げるランク付けされた最初の１０遺伝子を含む。従って、ある実施態様において、表３６における１０までの高いランクの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０遺伝子の発現レベルが決定される。
【００５４】
複合ランキングの結果を表３８に示す。ある実施態様において、遺伝子シグネチャーはランク順に位置づけされる。例えば、１０遺伝子シグネチャーは、表３８に挙げるランク付けされた最初の１０遺伝子を含む。従って、ある実施態様において、表３８における１０までの高いランクの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０遺伝子の発現レベルが決定される。
【００５５】
表１の遺伝子からの選択を表す付加的遺伝子シグネチャーをここに記載し、これらは本発明の全態様に適用可能である。これらのシグネチャーはまた大きなシグネチャーの基礎も提供し得る。付加的シグネチャーを表２〜２４に、最終シグネチャースコアの計算時に採用し得る適当な荷重およびバイアススコアと共に記載する(ここにさらに記載するとおり)。当業者に容易に認識されるとおり、正のシグネチャースコアを定義する閾値が決定されたら、各シグネチャーのｋ値を設定できる。同様に、シグネチャーにおける各遺伝子のランキングは、各遺伝子に帰属する重み付けの再調査により容易に決定できる(ここで、大きな荷重はシグネチャーにおけるランキングが高いことを示す  −  ７０遺伝子シグネチャーに関してランク順は表１を参照のこと)。
【００５６】
それ故に、ある実施態様において、本発明の方法は、少なくともＭＴ１ＡおよびＰＣＰ４(表２に示す２遺伝子シグネチャー)の発現レベルの決定を含む。図２および３に示すとおり、２遺伝子シグネチャーほど少ないシグネチャーで、関係のある生物学の同定および転移再発の予測が可能である。大きなシグネチャーをこれら２遺伝子に基づき開発でき、その例を表３〜２４および表１に示す。これらの遺伝子の発現の調査のための適当なプローブおよびプローブセットは表１および１Ａに提供され、発現の決定に有用なプライマーを表１Ｂに挙げる。
【００５７】
【表４】
2018527886.tif 000027
【００５８】
【表５】
2018527886.tif 000028
【００５９】
【表６】
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【００６０】
【表７】
2018527886.tif 000030
【００６１】
【表８】
2018527886.tif 000031
【００６２】
【表９】
2018527886.tif 000032
【００６３】
【表１０】
2018527886.tif 000033
【００６４】
【表１１】
2018527886.tif 000034
【００６５】
【表１２】
2018527886.tif 000035
【００６６】
【表１３】
2018527886.tif 000036
【００６７】
【表１４】
2018527886.tif 000037
【００６８】
【表１５】
2018527886.tif 000038
【００６９】
【表１６】
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【００７０】
【表１７】
2018527886.tif 000040
【００７１】
【表１８】
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【００７２】
【表１９】
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【００７３】
【表２０】
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【００７４】
【表２１】
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【００７５】
【表２２】
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【００７６】
【表２３】
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【００７７】
【表２４】
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【００７８】
【表２５】
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【００７９】
【表２６】
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【００８０】
本発明の全態様に適用可能なある実施態様において、ＰＤＫ４単独の発現レベルは測定しない。ＰＤＫ４発現は、それ故に、一般に表１からの少なくとも１のさらなる遺伝子から最大全６９までのさらなる遺伝子と組み合わせて測定する。ある実施態様において、ＰＤＫ４発現を、配列番号５２、５３、６３、１０８、０９、１５２、１５３、１５７、１５８、１８４、１９４および／または２１６の各々の完全配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＰＤＫ４発現を、配列番号２８４、２８５、２９５、３４０、３４１、３８４、３８５、３８９、３９０、４１６、４２６および／または４４８の各々の標的配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＰＤＫ４発現を配列番号１０１１〜１０２１、１０２２〜１０３２、１１３２〜１１４２、１６２７〜１６３７、１６３８〜１６４８、２１２２〜２１３２、２１３３〜２１４３、２１７７〜２１８７、２１８８〜２１９８、２４７４〜２４８４、２５８４〜２５９４および２８３４〜２８４４から選択される１以上のプローブまたは配列番号１０１１〜１０２１、１０２２〜１０３２、１１３２〜１１４２、１６２７〜１６３７、１６３８〜１６４８、２１２２〜２１３２、２１３３〜２１４３、２１７７〜２１８７、２１８８〜２１９８、２４７４〜２４８４、２５８４〜２５９４および／または２８３４〜２８４４のプローブセットを使用して決定する。ある実施態様において、ＰＤＫ４発現を、配列番号３０５３および／または３１２１の各々のプライマーを用いる増幅(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)アッセイを使用して決定する。
【００８１】
本発明の全態様に適用可能なある実施態様において、ＫＩＦ１１、ＰＴＴＧ１またはＴＫ１単独の発現レベルは測定しない。ある実施態様において、ＫＩＦ１１、ＰＴＴＧ１およびＴＫ１の発現レベルは、３遺伝子シグネチャーとして共に測定し得る。ある実施態様において、ＫＩＦ１１、ＰＴＴＧ１および／またはＴＫ１の発現レベルは、７０遺伝子シグネチャーの形成を含む、表１からの少なくとも１のさらなる遺伝子と組み合わせて測定し得る。ある実施態様において、ＫＩＦ１１発現を、配列番号１８０および／または１８１の各々の完全配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＫＩＦ１１発現を、配列番号４１２および／または４１３の各々の標的配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＫＩＦ１１発現を、配列番号２４３０〜２４４０および２４４１〜２４５１から選択される１以上のプローブまたは配列番号２４３０〜２４４０および／または２４４１〜２４５１のプローブセットを使用して決定する。ある実施態様において、ＫＩＦ１１発現を、配列番号３０６２および／または３１３０の各々のプライマーを用いる増幅(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)アッセイを使用して決定する。
【００８２】
ある実施態様において、ＰＴＴＧ１発現を、配列番号６２および／または２０１の各々の完全配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＰＴＴＧ１発現を、配列番号２９４および／または４３３の各々の標的配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＰＴＴＧ１発現を配列番号１１２１〜１１３１および２６６１〜２６７１から選択される１以上のプローブまたは配列番号１１２１〜１１３１および／または２６６１〜２６７１のプローブセットを使用して決定する。ある実施態様において、ＰＴＴＧ１発現を、配列番号３０３７および／または３１０５の各々のプライマーを用いる増幅(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)アッセイを使用して決定する。
【００８３】
ある実施態様において、ＴＫ１発現を、配列番号１９７の完全配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＴＫ１発現を、配列番号４２９の標的配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＴＫ１発現を配列番号２６１７〜２６２７から選択される１以上のプローブまたは配列番号２６１７〜２６２７のプローブセットを使用して決定する。ある実施態様において、ＴＫ１発現を、配列番号３０６０および／または３１２８の各々のプライマーを用いる増幅(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)アッセイを使用して決定する。
【００８４】
本発明の全態様に適用可能なある実施態様において、ＡＮＯ７またはＭＹＢＰＣ１単独の発現レベルは測定しない。ある実施態様において、ＡＮＯ７およびＭＹＢＰＣ１の発現レベルは、２遺伝子シグネチャーとして一緒に測定してよい。ある実施態様において、ＡＮＯ７および／またはＭＹＢＰＣ１の発現レベルは、７０遺伝子シグネチャーの形成を含む、表１からの少なくとも１のさらなる遺伝子と組み合わせて測定し得る。
【００８５】
ある実施態様において、ＡＮＯ７発現を、配列番号３７、３８、１２５、２０５および／または２０６の各々の完全配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＡＮＯ７発現を、配列番号２６９、２７０、３５７、４３７および／または４３８の各々の標的配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＡＮＯ７発現を配列番号８４９〜８５９、８６０〜８７０、１８２５〜１８３５、２７１５〜２７２４および２７２５〜２７３５から選択される１以上のプローブまたは配列番号８４９〜８５９、８６０〜８７０、１８２５〜１８３５、２７１５〜２７２４および／または２７２５〜２７３５のプローブセットを使用して決定する。ある実施態様において、ＡＮＯ７発現を、配列番号３０２２および／または３０９０の各々のプライマーを用いる増幅(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)アッセイを使用して決定する。
【００８６】
ある実施態様において、ＭＹＢＰＣ１発現を、配列番号３９、４０、７４、７５、１０１、１０２、１０３および／または１４４の各々の完全配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＭＹＢＰＣ１発現を、配列番号２７１、２７２、３０６、３０７、３３３、３３４、３３５および／または３７６の各々の標的配列内の配列をターゲティングするアッセイを使用して決定する。ある実施態様において、ＭＹＢＰＣ１発現を、配列番号８７１〜８８１、８８２〜８９２、１２５３〜１２６３、１２６４〜１２７４、１５５０〜１５６０、１５６１〜１５７１、１５７２〜１５８２および２０３４〜２０４４から選択される１以上のプローブまたは配列番号８７１〜８８１、８８２〜８９２、１２５３〜１２６３、１２６４〜１２７４、１５５０〜１５６０、１５６１〜１５７１、１５７２〜１５８２および／または２０３４〜２０４４のプローブセットを使用して決定する。ある実施態様において、ＭＹＢＰＣ１発現を、配列番号３０２５および／または３０９３の各々のプライマーを用いる増幅(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)アッセイを使用して決定する。
【００８７】
“特徴付け”は、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の分類および／または評価を意味する。それ故に、本発明の方法は、例えば、高転移能を有する癌の同定を可能とする。本方法は、癌が転移性生物学癌または非転移性生物学癌の何れであるかの決定を利用する。本方法は、癌が再発の可能性が高いとして同定されることを可能とする。予後診断は、対象について前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の可能性のある転帰を予測することをいう。ここで決定する予後が悪いまたは予後不良は、転移の可能性が高いおよび／または再発の可能性が高いことを意味する。診断は、転移能が高い前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような特定のタイプの癌の存在の同定を意味する。それ故に、ここで採用されている用語“特徴付け”、“予後診断”および“診断”にある程度の重複があることは容易に明らかとなる。相対的表現の使用は、関連する遺伝子発現特性を示さず、故に、転移能が低い、再発の可能性が低いおよび／または予後良好である、癌に対する位置関係を示す。ここに記載する遺伝子シグネチャーは、特に早期にあると、診断されており、より高悪性度高リスクの疾患に進展するリスクが高いと同定されている(前立腺)癌患者の層別化に有用である。このより高悪性度の疾患は、処置３〜５年以内に発症し得る。最初の処置は例えば放射線療法および／または手術(前立腺切除)であり得る。高悪性度疾患の同定後、本方法は、ここに記載する処置の使用を必要とし得る。高転移能を有する癌がなければ、対象は積極的監視下におき、少なくとも始めは、さらなる処置をしない。適当な手段(ＰＳＡモニタリングの使用または本発明の方法の実施によるものを含む)の何れかによるさらなるモニタリングを使用して、さらなる介入が必要であるか否かを決定できる。
【００８８】
ある実施態様において、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断は、高い再発の可能性の予測を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる可能性がある。転移性生理を有する癌はここでは再発の可能性が高いとして示す。前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断は、再燃までの換算時間の予測を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる可能性がある。再燃は、当業者には理解されるとおり、再発と同じ範囲にあると考えられ得る。
【００８９】
再発は臨床的再発、転移再発または生化学的再発であり得る。前立腺癌において、生化学的再発は、前立腺癌処置後の対象におけるＰＳＡのレベルの上昇を意味する。生化学的再発は、前立腺癌が効果的に処置されていないまたは再発していることを示し得る。再発は手術、例えば根治的前立腺切除後および／または放射線療法後であり得る。
【００９０】
ある実施態様において、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断は、高い転移の可能性の予測を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる可能性がある。転移または転移性疾患は、ある臓器または部分から他の非隣接臓器または部分への癌の広がりである。こうして生じた疾患の新規発生は転移と称される。ある実施態様において、本発明の方法は、癌、特異的に前立腺癌の転移段階分けを促進する。それ故に、決定された発現レベル(例えば遺伝子シグネチャー陽性サンプルの決定)を使用して、対象をＭ１と分類できる。Ｍ１は、転移が存在することを意味する(すなわち癌が体の他の部分に広がっている)。遺伝子シグネチャー陰性サンプルについて、対象をＭ０として分類できる。Ｍ０は、癌がまだ体の他の部分に広がっていないことを意味する。このような方法を、転移の同定に使用される他の手段、例えば造影／走査技術と組み合わせて使用し得る。それ故に、本発明は、対象からのサンプルにおいて表１から選択した少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、ここで、該決定された発現レベルを使用して、対象がＭ１またはＭ０癌を有することを同定することを含む、癌の転移段階付けの方法を提供する。それ故に、ある実施態様において、方法は、
(ｉ)対象からのサンプルにおいて表１から選択された少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、そして
(ii)少なくとも１遺伝子を含む遺伝子シグネチャーについて対象からのサンプルが陽性または陰性であるか、少なくとも１遺伝子の発現レベルから評価する
ことを含み得る。適当な遺伝子シグネチャーおよびシグネチャースコアの誘導を、ここにさらに詳細に記載する。
【００９１】
ある実施態様において、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断は、癌が予後不良であるか否かの決定も含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる可能性がある。予後不良は、原因特異的、すなわち癌特異的または長期生存の可能性の減少であり得る。原因または癌特異的生存は、他の死因非存在下での癌生存を表す正味生存指標である。癌生存は６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月または１年、２年、３年、４年、５年などであり得る。長期生存は、診断後１年、５年、１０年または２０年の生存であり得る。予後不良の前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌は、高悪性度であり、増殖が速いおよび／または処置に対する耐性を示す。
【００９２】
ある実施態様において、正の荷重を有する表１から選択した少なくとも１遺伝子の高い発現レベルは、高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を示す。
【００９３】
さらなる実施態様において、負の荷重を有する表１から選択した少なくとも１遺伝子の低い発現レベルは、高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を示す。
【００９４】
発現レベルは、ここに記載する遺伝子シグネチャースコアへの寄与を考慮して、適当に荷重される。発現の閾値は、中央レベルに対して設定でき、それに対し“シグネチャー陽性”および“シグネチャー陰性”発現値を設定できる。このような中央閾値発現レベルおよび対応するシグネチャー陽性および陰性値を、次の表２５に示す。当業者により理解されるように中央値を各データセットについて個々に設定する。
【表２７−１】
2018527886.tif 000050
【表２７−２】
2018527886.tif 000051
【００９５】
ある実施態様において、ここに記載する方法は、表１に挙げる負の荷重の遺伝子の少なくとも一つと共に表１に挙げる正の荷重の遺伝子の少なくとも一つの発現レベルを決定することを含み得る。それ故に、本方法は、上方制御マーカーおよび下方制御マーカーの組み合わせを利用し得る。適切に荷重された、上方および下方制御マーカー発現レベルの組み合わせは、その後、最終シグネチャースコアに寄与し得るかまたはそれを形成し得る。
【００９６】
ある実施態様において、ここに記載する方法は、１以上の遺伝子の発現レベルの、参照値または１以上の対照サンプルの発現レベルもしくは同じサンプルにおける１以上の対照細胞の発現レベルとの比較を含む。対照細胞は、正常細胞(すなわち独立した方法で非癌性と特徴付けられる細胞)であり得る。１以上の対照サンプルは、非癌性細胞からなっても、癌細胞(前立腺、ＥＲ陽性乳房またはその他)と非癌性細胞の混合物を含んでもよい。発現レベルを、１以上の対照サンプルまたは対照細胞における同じ遺伝子の発現レベルと比較し得る。
【００９７】
参照値は、関係のある癌を有するおよび有しない対象からのサンプルのレベルまたはレベル範囲の決定による、少なくとも１遺伝子セットの発現の閾値レベルであり得る。前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌は、再発および／または転移および／または予後不良の可能性が高いおよび／または高くない癌であり得る。閾値を設定する適当な方法は当業者に周知である。閾値は、患者データの訓練事例集合から数学的に導き出し得る。こうして、スコア閾値は試験サンプルを特定の条件の存在または非存在に従い分ける。この量の解釈、すなわちカットオフ閾値は、既知転帰の患者集団からの開発または訓練段階において導かれ得る。閾値は、それ故に、種々の遺伝子シグネチャーに関連して当業者に知られるおよびここに記載する方法により、訓練データから本願発明方法の実施前に固定し得る。
【００９８】
参照値はまた最初の時点での対象からのサンプルにおける少なくとも１遺伝子の発現レベルの決定による、少なくとも１遺伝子セットの発現の閾値レベルでもあり得る。同じ対象について後の時点で決定された発現レベルをその後閾値レベルと比較する。それ故に、本発明の方法は、対象における疾患進行モニターのため、すなわち対象における疾患の現在進行中の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用し得る。例えば、本方法は、より高悪性度のまたは転移する可能性のある形態への増大している前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の同定(または“診断”)に使用できる。これは、ここにさらに詳述する処置決定のガイドとして使用し得る。ある実施態様において、このようなモニタリング方法は、処置を施すべきか否かを決定する。癌が転移性生物学群内にあると同定されたら、その癌は処置すべきである。癌が“非転移”であると同定されたならば、その癌が安定なままである(すなわち転移形態へと進化していない)ことを確認するために、さらなるモニタリングを実施し得る。このような状況において、さらなる処置は適用しなくてよいかもしれない。
【００９９】
発現レベルが正常細胞と再発および／または転移および／または予後不良の可能性が高くない前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌からの細胞で異ならない遺伝子について、同じサンプルにおける正常細胞における同じ遺伝子の発現レベルを対照として使用できる。
【０１００】
差は統計学的に有意な差であり得る。統計学的に有意は、単なる偶然により生じる可能性がないことを意味する。適当な統計学的評価を、任意の適当な方法により実施できる。
【０１０１】
ここに記載する方法は、さらに参照遺伝子の発現レベルの決定を含み得る。参照遺伝子は、標的遺伝子発現レベルが正常細胞と再発および／または転移および／または予後不良の可能性が高くない前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌からの細胞の間で異なる場合、必要である。
【０１０２】
ある実施態様において、表１から選択される少なくとも１遺伝子の発現レベルを参照遺伝子の発現レベルと比較する。
【０１０３】
参照遺伝子は、全ての前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌サンプルにわたり最小発現分散であるあらゆる遺伝子であり得る。それ故に、参照遺伝子は、発現レベルが再発および／または転移および／または予後不良の可能性により変わらないあらゆる遺伝子であり得る。当業者は、この基準に基づき、適当な参照遺伝子を十分に同定できる。参照遺伝子の発現レベルを、表１から選択される少なくとも１遺伝子の発現レベルと同じサンプルで決定し得る。
【０１０４】
参照遺伝子の発現レベルを異なるサンプルで決定し得る。異なるサンプルは、上記対照サンプルであり得る。参照遺伝子の発現レベルを、サンプルにおける正常細胞および／または前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌細胞で決定し得る。
【０１０５】
対象からのサンプルにおける少なくとも１遺伝子の発現レベルを統計モデルを使用して解析し得る。表１からの少なくとも２遺伝子から最大全７０遺伝子の発現レベルを測定する特定の実施態様において、遺伝子は荷重され得る。ここで使用する用語“荷重”は、統計計算におけるあるアイテムの相対的重要性をいう。各遺伝子の荷重は、当分野で知られる解析方法を使用して、患者サンプルのデータセットで決定できる。“シグネチャースコア”と称する全体的スコアを計算し、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断の提供のために使用し得る。一般に、スコアは、荷重遺伝子発現レベルの和をいう。７０遺伝子シグネチャースコアの計算のための適当な荷重は表１に示し、本発明の方法に従い用い得る。同様に、少ないシグネチャーの例についての適当な荷重は表２〜２４に示す。
【０１０６】
それ故に、本発明の全態様によって、方法は、
(ｉ)対象からのサンプルにおいて表１から選択された少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定し、そして
(ii)少なくとも１遺伝子を含む遺伝子シグネチャーについて対象からのサンプルが陽性または陰性であるかを、少なくとも１遺伝子の発現レベルから評価する
ことを含み得る。
【０１０７】
ここに記載するとおり、サンプルが遺伝子シグネチャーについて陽性であるならば、これは、癌が高転移能タイプのものであることを同定する。これは、(相対的)予後不良またはここに記載する特徴付け、予後診断または診断と適切に関連するその他を示し得る。当然の結果として、遺伝子シグネチャーについて陰性のサンプルは、その癌が高転移能タイプのものではないことを特定する。これは、(相対的)予後良好またはここに記載する特徴付け、予後診断または診断と適切に関連するその他を意味し得る。
【０１０８】
それ故に、最も単純な場合、１以上の遺伝子の発現レベルの上昇は、サンプルを遺伝子シグネチャーについて陽性として定義する。ある遺伝子について、１以上の遺伝子の発現レベルの減少が、サンプルを遺伝子シグネチャーについて陽性として定義する。しかしながら、複数の遺伝子の発現レベルを測定するとき、発現レベルの組み合わせは、一般にサンプルが遺伝子シグネチャーについて陽性であるか否かを決定するために合計される。それ故に、ある遺伝子は発現増加を示し、ある遺伝子は発現減少を示すかもしれない。これは、ここに詳細を記載するとおり、種々の方法で達成できる。
【０１０９】
特定の実施態様において、シグネチャースコアを次の数式に従い計算できる。
【数１】
2018527886.tif 000052
ここで、ｗｉは各遺伝子の荷重であり、ｂｉは遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは前処理後の遺伝子発現であり、そしてｋは一定のオフセットである。
【０１１０】
同様に、シグネチャーにおける各遺伝子に、バイアススコアが付与され得る。７０遺伝子シグネチャーのバイアススコア例を表１に特定し、本発明の方法の実施に従い採用し得る。当然、７０遺伝子シグネチャーのサブセットを表す、異なるシグネチャーを利用するとき、バイアス値は再計算される。例を表２〜２４に提供する。
【０１１１】
記載のとおり、ｋは一定のオフセットである。表１のバイアスおよび荷重値が７０遺伝子シグネチャーについて採用されるとき、一定のオフセットは、０.４３６５の値を有し得る。同様に、７０遺伝子シグネチャーのサブセットを表す異なるシグネチャーを利用するとき、ｋの値は再計算される。ｋの値は、“シグネチャー陽性”についての閾値がどこに設定されるかにより変わる。この閾値は、例えば特定の転帰または特徴付けに対する感度および／または特異性の最大化のために、どの考察が最も重要であるかにより設定される。適当な閾値は上記のとおり決定し得る。
【０１１２】
ある実施態様において、閾値を越えるスコアは予後不良(またはここに記載する特徴付け、予後診断または診断と適切に関連するその他)を示し得る。これらの実施態様において、閾値以下のスコアは予後良好を示し得る。他の実施態様において、閾値以上のスコアは予後不良(またはここに記載する特徴付け、予後診断または診断と適切に関連するその他)を示し得る。これらの実施態様において、閾値未満のスコアは予後良好を示し得る。当業者には、特に断らない限り、単純な数学的変換を、スコアの倒置に使用し、“超える”および“未満”をそれに応じて解釈すべきであることはまた認識される。
【０１１３】
“シグネチャースコア”は、遺伝子の発現レベルを集約する複合決定スコアを意味する。これを、患者データの訓練事例集合から数学的に導かれる閾値スコアと比較し得る。閾値スコアは、癌をバイオマーカーシグネチャー陽性のものと陰性に分ける能力を最大化する目的で確立される。患者訓練事例集合データは、好ましくはサブタイプ、予後診断、再発の可能性、長期生存、臨床的転帰、処置応答、診断、癌分類または個別化ゲノミクスプロファイルにより特徴付けられている癌組織サンプルに由来する。患者サンプルからの発現プロファイルおよび対応する決定スコアを、数学的に導かれるスコア決定閾値の同じ側の訓練事例における患者サンプルの特性と相関させ得る。ある例示的実施態様において、(直線状)分類子スカラーアウトプットの閾値を、訓練データセット内で観察される相互検証下、感受性および特異性の和を最大化するために最適化する。
【０１１４】
あるサンプルについての全体的発現データを、異なる量の出発物質、種々の抽出効率および増幅反応などを補正するために、当業者に知られる方法を使用して正規化し得る。
【０１１５】
ある実施態様において、サンプルにおけるバイオマーカー発現レベルを(直線状)分類子により評価する。ここで使用する(直線状)分類子は、複合決定スコアへの個々のバイオマーカー強度の荷重和をいう(“決定関数”)。決定スコアを、次いで、感度および特異性の観点である定値に対応する予め決定したカットオフスコア閾値と比較し、これは、サンプルがスコア閾値以上(決定関数陽性)であるかまたは未満(決定関数陰性)であるかを示す。
【０１１６】
効果的にコール(例えばバイオマーカーシグネチャーについて陽性または陰性)を作るための正規化データにおける(直線状)分類子の使用は、データ空間、すなわち分類子における全遺伝子の発現値の全ての可能な組み合わせを、分離超平面の手段により２の互いに素な線分に分けることを意味する。この分割は、経験的に(大)セットの訓練例で導き出される。普遍性を損なうことなく、１つを除く全バイオマーカーについてのある固定された一組の値を推定でき、これは自動的にその残ったバイオマーカーに対する閾値の値を固定し、そこで、バイオマーカーシグネチャーについて、決定は、例えば、陽性または陰性から、変わる。この閾値についての厳密な値は、分類子内での全ての他の遺伝子の実際に測定された発現プロファイルによるが、ある遺伝子の一般的指示は固定されたままである。それ故に、全体的遺伝子発現分類子の状況において、相対的発現は、あるバイオマーカーの上方または下方制御がシグネチャーについて陽性であるか否かの指標であるかどうかを示し得る。ある例示的実施態様において、サンプル発現閾値を越える発現スコアが、サンプルがバイオマーカーシグネチャーについて陽性であることを示す。ある他の例示的実施態様において、閾値スコアを越えるサンプル発現スコアは、対象が閾値スコア未満のサンプル発現スコアの対象と比較して、悪い臨床的予後であることを示す。
【０１１７】
ある他の例示的実施態様において、発現シグネチャーは、決定木(Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、ランダムフォレスト(Breiman, 2001 Random Forests, Machine Learning 45:5)、ニューラルネットワーク(Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)、直線状、対角線直線状、二次およびロジスティクス判別分析を含むが、これらに限定されない判別分析(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001)、Prediction Analysis for Microarrays(PAM, (Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572))またはSoft Independent Modeling of Class Analogy analysis(SIMCA, (Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139))を使用して導かれる。分類木(Breiman, Leo; Friedman, J. H.; Olshen, R. A.; Stone, C. J. (1984). Classification and regression trees. Monterey, CA: Wadsworth & Brooks/Cole Advanced Books & Software. ISBN 978-0-412-04841-8)は、論理および法則に基づく転帰予測の手段を提供する。分類木は、データを区画／分岐に分割する逐次法である、二元再帰分割分析と呼ばれる工程を介して構築される。目的は、予め決定した集合を識別する木の構築である。木の各ノードは変数に対応する。ノードで最良の分割を選択するために、各変数を順番に考慮し、そこで、全ての可能な分割を験し、考慮し、最良の分割は、各区画内の多様な分類標識の最大の減少を生じるものである。これを全変数で繰り返し、勝者をそのノードの最良のスプリッターとして選択する。この工程を次のノードで続け、この方法で、完全木が作成される。分類木の判別分析のような他の教師あり学習の取り組みを超える利点は、木の構築に使用される変数が分類別でも数値的でもまたはこの両方の混合でもよいことである。この方法で、遺伝子発現の方向性に基づいて、転帰を予測するための分類木の作成が可能である。
【０１１８】
ランダムフォレストアルゴリズム(Breiman, Leo (2001). “Random Forests”. Machine Learning 45 (1): 5-32. doi:10.1023/A:1010933404324)は、分類木にさらなる拡張を提供し、それにより分類木のコレクションは、無作為に“フォレスト”を形成するように作成され、各木からの予測転帰の平均を、転帰に関する予測を行うために使用する。
【０１１９】
バイオマーカー発現値は、種々の大きさを有する実寸大の対応するスカラー荷重の組み合わせで定義でき、これをさらに直線状または非直線状、代数、三角法または相関的手段により、代数、統計的学習、ベイジアン、回帰または類似アルゴリズムを経て単一スカラー値に組み合わせて、これはスカラー値の数学的に導いた決定関数と一体となって予測モデルを提供し、これにより、サンプルからの発現プロファイルは、特定の薬物、薬物群、分子サブタイプまたは処置レジメンに対する応答者または非応答者、耐性または非耐性の個別の集合に分解され得る。バイオマーカーメンバーシップを含むこのような予測モデルは、学習荷重および決定閾値により開発され、既知薬物応答および／または耐性の病歴の患者サンプルからの一連の代表的発現プロファイルから、相互検証、ブートストラップまたは類似サンプリング技術下、感度、特異性、陰性および陽性予測値、ハザード比またはこれらの任意の組み合わせについて最適化される。
【０１２０】
ある実施態様において、遺伝子を使用して、シグナルの荷重和を得て、ここで、個々の荷重は陽性または陰性であり得る。得られた和(“発現スコア”)を、予め決定した参照点または値と比較する。参照点または値との比較を使用して、病態または転帰を診断または予測し得る。
【０１２１】
上記のとおり、当業者は、種々の表に提供される分類子に含まれる遺伝子が分類子の等しくない荷重を担持することを認識する。それ故に、臨床的予後診断または治療剤に対する応答の診断または予測にわずか１バイオマーカーを使用してよいが、特異性および感度または診断または予測精度は、より多くの遺伝子の使用により高まり得る。
【０１２２】
ある例示的実施態様において、発現シグネチャーは、決定関数により定義される。決定関数は、(直線状)分類子を使用して導かれた一連の荷重発現値である。全直線状分類子は、次の式を使用して決定関数を定義する。
【数２】
2018527886.tif 000053
【０１２３】
あるサンプルについてマイクロアレイ遺伝子発現強度ｘｉのような全測定値をベクターｘに集める。次いで、各強度を対応する荷重ｗｉで乗じて、オフセット項ｂの加算後、決定関数ｆ(ｘ)の値を得る。決定関数を導く際、直線状分類子は、さらに、遺伝子発現データ空間を互いに素なセクションに分割する閾値の値を定義する。(直線状)分類子の例は、部分的最小二乗(ＰＬＳ)(Nguyen et al., Bioinformatics 18 (2002) 39-50)、サポートベクターマシン(ＳＶＭ)(Schoelkopf et al., Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)および縮小判別分析(ＳＤＡ)(Ahdesmaeki et al., Annals of applied statistics 4, 503-519 (2010))を含むが、これらに限定されない。ある例示的実施態様において、(直線状)分類子はＰＬＳ直線状分類子である。
【０１２４】
決定関数は、経験的に、例えば良好なまたは不良な臨床的予後を示す患者からの、大きなセットの訓練サンプルから導かれる。閾値は、ある治療的処置前後の臨床的予後を含むが、これらに限定されない種々の特性に基づき患者群を分ける。この量の解釈、すなわちカットオフ閾値は、既知転帰の一連の患者からの開発段階(“訓練”)において導かれる。決定スコアについての対応する荷重および反応性／耐性カットオフ閾値は、当業者に知られる方法により訓練データから演繹的に固定される。ある例示的実施態様において、部分的最小二乗判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)が荷重の決定に使用される(L. Stahle, S. Wold, J. Chemom. 1 (1987) 185-196; D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioinformatics 18 (2002) 39-50)。
【０１２５】
効果的に、これは、データ空間、すなわちバイオマーカー発現値の全ての可能な組み合わせのセットが、異なる臨床的分類または予測に対応する二つの相互に排他的群、例えば、良好な臨床的予後および不良な臨床的予後対応するものに分割されることを意味する。全体的分類子の状況的において、あるバイオマーカーの相対的過発現は、決定スコアを上昇させるか(陽性荷重)または低下させ(負の荷重)、こうして、例えば、良好な臨床的予後の、全体的決定に貢献する。
【０１２６】
本発明のある例示的実施態様において、上記の荷重和に適用する前にデータを非直線的に変換する。この非直線状変換は、データの次元性の増加を含むはずである。非直線状変換および荷重総和も、例えば、カーネル関数の使用により、暗示的に実施されるはずである(Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)。
【０１２７】
ある例示的実施態様において、患者訓練事例集合データは、対応する癌組織サンプルセットからの単離ＲＮＡに由来し、発現値を単離ＲＮＡ(から増幅されたｃＤＮＡ)とマイクロアレイをハイブリダイズすることにより決定する。ある例示的実施態様において、発現シグネチャーの誘導に使用するマイクロアレイは、トランスクリプトームアレイである。ここで使用する“トランスクリプトームアレイ”は、目的の疾患組織において発現されることが確認されている配列とハイブリダイズするように設計されるプローブセットを含むマイクロアレイをいう。選択的スプライシングならびに組織および生物学的状況間での多様なポリＡテイル処理を仮定し、他の組織源または生物学的状況に由来する同じ遺伝子配列に対して設計したプローブが目的の疾患組織で発現される転写物に効果的に結合せず、関連する可能性のある生物学的情報の喪失にいたることが考えられる。従って、どの配列が目的の疾患組織で発現されるかを、マイクロアレイプローブセットの誘導前に確認することが遊離であり得る。特定の疾患状況における発現配列の検証は、例えば、疾患組織サンプルセットから総ＲＮＡを単離および配列決定し、単離配列と既知核酸配列ベースを相互参照させて、トランスクリプトームアレイのプローブセットが目的の疾患組織で実際に発現される配列に対して設計されることを確認することにより実施する。トランスクリプトームアレイの製造方法は、米国特許出願公開２００６／０１３４６６３号に記載され、これを引用により本明細書に包含させる。ある例示的実施態様において、トランスクリプトームアレイのプローブセットを、トランスクリプトの３’末端の３００以内のヌクレオチドと結合するように設計する。標的転写物の３’末端の３００以内のヌクレオチドと結合するプローブセットを伴うトランスクリプトームアレイを設計する方法は米国特許出願公開２００９／００８２２１８号に開示され、これを引用により本明細書に包含させる。ある例示的実施態様において、本発明の遺伝子発現プロファイルの誘導に使用するマイクロアレイは、Almac Prostate Cancer DSATMマイクロアレイ(Almac Group, Craigavon, United Kingdom)である。
【０１２８】
最適(直線状)分類子を、“曲線下面積”(ＡＵＣ)のような診断を使用して、(直線状)分類子の性能を評価することにより選択できる。ＡＵＣは、受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線の曲線下面積であり、この両方とも当分野で周知である。ＡＵＣ測定は、完全データ範囲にわたる分類子の精度の比較に有用である。ＡＵＣが高い(直線状)分類子は、目的の２群(例えば、卵巣癌サンプルと正常または対照サンプル)に未知のものを正確に分類する能力が大きい。ＲＯＣ曲線は、特定の特性(例えば、ここに記載する遺伝子の何れかおよび／または付加的生化学上方の任意の項)のパフォーマンスを、２集団(例えば、治療剤に応答するおよび応答しない個体)の識別においてプロットするのに有用である。一般に、集団全体(例えば、症例および対照)にわたる特性データを、単一特性の値に基づき、ソートする。次いで、その特性の各値について、データの真の陽性および偽陽性率が計算される。真の陽性率は、その特性の値を超える症例数を計数し、次いで、陽性例の総数で除すことにより決定する。偽陽性率は、その特性の値を超える症例数を計数し、次いで、対照の総数で除すことにより計算する。この定義は特性が対照と比較して高い例で評価されるシナリオをいうが、この定義はまた特性が対照と比較して低いシナリオにも適用される(このようなシナリオにおいて、その特性についての値未満のサンプルを計数する)。ＲＯＣ曲線を、単一特性ならびに他の単一アウトプットについて作成でき、例えば、２以上の特性の組み合わせを数学的に組み合わせ(例えば、加算、減算、乗算など)、単一和値を得て、この単一和値をＲＯＣ曲線にプロットできる。さらに、組み合わせが単一アウトプット値をもたらす複数特性のあらゆる組み合わせをＲＯＣ曲線にプロットできる。これらの特性の組み合わせは試験を構成し得る。ＲＯＣ曲線は、試験の真の陽性率(感受性)対試験の偽陽性率(１特異性)のプロットである。
【０１２９】
あるいは、最適分類子を、Ｃｏｘ比例ハザード(ＰＨ)のような方法および一致指数(Ｃ指数)により評価した全ての可能な閾値にわたるパフォーマンスの測定を使用して時間事象エンドポイントに対するパフォーマンスを評価することにより選択できる(Harrell, Jr. 2010)。Ｃ指数は、“曲線下面積”(ＡＵＣ)測定基準(二分するエンドポイントのために使用)に類似し、生存データとの関係と関連するパフォーマンスを測定する。ＡＵＣの時間事象エンドポイントへの拡張はＣ指数であり、ハザード比(ＨＲ)を最大化するために最適化する閾値選択は相互検証中である。この場合、部分的Ｃｏｘ回帰アルゴリズム(Li and Gui, 2004)を、バイオマーカー発見解析に使用した。これは、最初の数潜在的要素がデータの情報の大部分を説明する点で、主成分分析に類似する。実行はAhdesmaki et al 2013に記載される。
【０１３０】
Ｃ指数値は、単一特性ならびに他の単一アウトプットについて作成でき、例えば、２以上の特性の組み合わせを数学的に組み合わせて(例えば、加算、減算、乗算など)単一和値を提供でき、この単一和値を統計的有意性について評価できる。さらに、組み合わせが単一アウトプット値をもたらす複数特性のあらゆる組み合わせを、時間事象クラス分類への有用性を評価するためＣ指数として評価できる。これらの特性の組み合わせは試験を構成し得る。連続的相互検証試験セットリスクスコア予測のＣ指数(Harrell, Jr. 2010、数式４参照)を、主パフォーマンス指標として評価した。
【０１３１】
表１(バイオマーカー)からの少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定する方法を、ここにより詳細に記載する。一般に、本方法は、対象から得たサンプルと、遺伝子に特異的なプライマーおよび／またはプローブまたは抗体または機能的に同等な結合剤のような検出剤(ここに詳述するとおり)を接触させ、発現生成物を検出することを含み得る。検出剤をここに記載するとおり標識してよい。比較を対照サンプルで決定した発現レベルについて行い、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後を提供し得る。
【０１３２】
本発明の全態様によって１個または複数個の遺伝子の発現レベルを、任意の適当な方法で測定する。ある実施態様において、発現レベルをタンパク質、ＲＮＡまたは後成的修飾のレベルで決定する。後成的修飾はＤＮＡのメチル化であり得る。
【０１３３】
ここに記載する遺伝子の何れかの発現レベルを、適切なＲＮＡの検出により検出し得る。アッセイは、ここに記載する遺伝子の特異的領域を調べ得る。例えば、アッセイは、特異的プライマー結合部位隣接領域および／またはここに記載するプローブセットがハイブリダイズする遺伝子の領域を調べ得る。アッセイは、適当であるならば遺伝子のプロモーター、ターミネーター、エクソンおよび／またはイントロン領域を調べ得る。アッセイは、各遺伝子について表１に特定する完全配列または標的配列もしくはその領域の１以上を調べ得る。
【０１３４】
ある実施態様において、本発明の全態様によって、少なくとも１遺伝子の発現を、表１に挙げる標的配列または完全配列の１以上とハイブリダイズするよう設計した１以上のプローブまたはプライマー(プライマー対)を使用して決定し得る。表１に特定するプローブおよびプローブセット(および表１Ａにさらに詳述)を本発明の全態様によって使用し得る。表１Ｂに挙げ、配列番号３１５１〜３１５４として同定されるプライマーおよびプライマー対を本発明の全態様によって使用し得る。
【０１３５】
従って、特定の実施態様において、発現レベルをマイクロアレイ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ−ｓｅｑ(ＲＮＡ配列決定)、インサイチュＲＮＡ検出または核酸増幅により決定する。核酸増幅は、ＰＣＲおよびリアルタイムおよびエンドポイント方法および定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)のようなその全変法を含む。他の核酸増幅技術は当分野で周知であり、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよび転写介在増幅(ＴＭＡ)のような方法を含む。他の適当な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅(米国特許６,４１０,２７６号)、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応(米国特許４,４３７,９７５号)、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応(ＷＯ９０／０６９９５号)、インベーダー法、鎖置換法およびニック置換増幅(ＷＯ２００４／０６７７２６号)を含む。この一覧は排他的であることを意図せず、任意の核酸増幅技術を、適切な核酸生成物が特異的に増幅される限り使用してよい。適当なプライマーおよび／またはプローブの設計は当業者の能力の範囲内である。ＮＣＢＩプライマー−ＢＬＡＳＴツールのような種々のプライマー設計ツールがこの方法の補助として自由に利用できる。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５(以上)ヌクレオチド長であり得る。ｍＲＮＡ発現レベルは、逆方向転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲとその後のｑＰＣＲ)により測定し得る。ＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作るのに使用する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイで髭右して、ＤＮＡ増幅工程が進むに連れて蛍光を生じさせ得る。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、細胞あたりのｍＲＮＡコピー数のような絶対測定値を作成し得る。キャピラリー電気泳動と組み合わせたノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイおよびＲＴ−ＰＣＲが全て、サンプルにおけるｍＲＮＡの発現レベル測定に使用されている。Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004参照のこと。多くの検出技術が周知であり、TAQMAN(登録商標)、MOLECULAR BEACONS(登録商標)、AMPLIFLUOR(登録商標)およびSCORPION(登録商標)、DzyNA(登録商標)、PlexorTMなどのように市販されている。
【０１３６】
適当な増幅アッセイ(ＰＣＲまたはｑＰＣＲ)が発明者らにより設計されており、表１Ｂにさらに詳しく説明する。各遺伝子についてそこに挙げた順方向および逆方向プライマーを本発明の全態様において使用し得る。同様に、配列番号３１５１〜３１５４のプライマーを、それぞれＭＩＲ５７８およびＭＩＲ４５３０の増幅に使用できる。
【０１３７】
ＲＮＡ−ｓｅｑは遺伝子発現変化の測定に次世代配列決定を使用する。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換するかまたは直接配列決定してよい。次世代配列決定技術は、ピロシーケンス、SOLiD配列決定、Ion Torrent半導体配列決定、Illumina色素配列決定、単一分子リアルタイム配列決定またはＤＮＡナノボール配列決定を含む。ＲＮＡ−ｓｅｑは、遺伝子発現レベルの定量を可能とする。
【０１３８】
インサイチュＲＮＡ検出は、組織および細胞から抽出せずにＲＮＡを検出することを含む。インサイチュＲＮＡ検出は、特異的ＲＮＡ配列を組織の一部または切片または組織全体(全組織標本ＩＳＨ)または細胞に局在化させるために標識(例えば放射標識、抗原標識または蛍光標識)プローブ(相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖)を使用するインサイチュハイブリダイゼーション(ＩＳＨ)を含む。放射、蛍光または抗原標識ベース(例えば、ジゴキシゲニン)何れかで標識されたプローブを、各々オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡または免疫組織化学を使用して組織に局在化させ、定量できる。ＩＳＨはまた２以上の転写物の同時検出のために２以上のプローブを使用できる。分枝ＤＮＡアッセイも、単一分子感受性を有するＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションアッセイのために使用できる。この取り組みは、ViewRNAアッセイを含む。サンプル(細胞、組織)を固定し、次いで処理して、ＲＮＡ標的接近(ＲＮＡ非マスキング)を可能とする。標的特異的プローブは各標的ＲＮＡとハイブリダイズする。続くシグナル増幅は隣接プローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づく(ＲＮＡ標的に並んで結合する個々のオリゴヌクレオチド)。典型的標的特異的プローブは４０オリゴヌクレオチドを含む。シグナル増幅を、一連の連続的ハイブリダイゼーション工程により達成する。プレアンプリファイヤー分子は、標的特異的ＲＮＡの各オリゴ対に結合し、次いで、複数アンプリファイヤー分子が各プレアンプリファイヤーに結合する。次に、複数標識プローブオリゴヌクレオチド(アルカリホスファターゼのような酵素にまたは直接フルオロフォアにコンジュゲート)は各アンプリファイヤー分子に結合する。別の、しかし、同等なシグナル増幅システムは、多重アッセイを可能とする。シグナルを用いる検出システムによって放出される蛍光または光を測定することにより可視化できる。検出は、ある実施態様においてハイコンテント造影システムまたは蛍光または明視野顕微鏡の使用を含み得る。
【０１３９】
それ故に、さらなる態様において、本発明は、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのキットの使用に関する。対象における前立腺癌の(インサイチュ)特徴付けおよび／または予後診断のためのキットは、表１から選択される少なくとも１遺伝子のＲＮＡ生成物に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む。各遺伝子についての適当なプローブおよびプローブセットを表１に挙げ、本発明のキットに包含させ得る。プローブおよびプローブセットも、本発明の別の態様を構成する。“プローブセット”は、単一遺伝子を標的(ハイブリダイゼーションによる)とするよう設計されたプローブのコレクションを意味する。グループ分けは表１(および表１Ａ)から明らかである。
【０１４０】
キットは、さらに次の
ａ)遮断プローブ
ｂ)プレアンプリファイヤー
ｃ)アンプリファイヤーおよび／または
ｄ)標識分子
の１以上の要素を含み得る。
【０１４１】
キットの要素は、ViewRNAアッセイの実施に適し得る(https://www.panomics.com/products/rna-in-situ-analysis/view-rna-overview)。
【０１４２】
キットの要素は核酸ベースの分子、所望によりＤＮＡ(またはＲＮＡ)であり得る。ブロッキングプローブは、標的特異的プローブ(本発明の少なくとも１遺伝子のＲＮＡ生成物に特異的なプローブ)により結合されない標的の部位に結合することにより背景シグナルの減少に作用する分子である。プレアンプリファイヤーは、標的に結合したとき、(１対の)標的特異的プローブに結合することができる分子である。アンプリファイヤーは、プレアンプリファイヤーに結合できる分子である。あるいは、アンプリファイヤーは、標的に結合したとき、(１対の)標的特異的プローブに直接結合できる能力を有し得る。アンプリファイヤーは、複数標識分子(標識プローブであり得る)のための結合部位を有する。
【０１４３】
ＲＮＡ発現を、ＲＮＡの一連のプローブへのハイブリダイゼーションにより決定し得る。プローブを、アレイに配列され得る。マイクロアレイプラットホームは、Affymetrix、IlluminaおよびAgilentのような業者により製造されているものを含む。Affymetrixにより製造されるマイクロアレイプラットホームの例は、U133 Plus2アレイ、Almac proprietary XcelTMアレイおよびProstate Cancer DSA(登録商標)を含むAlmac proprietary Cancer DSAs(登録商標)を含む。
【０１４４】
特定の実施態様において、本発明の全態様によって、少なくとも１遺伝子の発現を、表１に挙げるものから選択される１以上のプローブを使用して決定し得る。
【０１４５】
ある実施態様において、本発明の全態様によって、少なくとも１遺伝子の発現を、表１に挙げる標的配列または完全配列とハイブリダイズするように設計された１以上のプローブまたはプライマーを使用して決定できる。
【０１４６】
これらのプローブも、本発明のキットに取り込まれ得る。プローブ配列はまた、例えばＲＴ−ＰＣＲによる、発現の検出のためのプライマーの設計のためにも使用し得る。このようなプライマーも本発明のキットに取り込まれ得る。適当なプライマーは表１Ｂおよび配列番号３１５１〜３１５４に挙げる。
【０１４７】
対応する標的配列は、関係のあるプローブセットについて下の表１に挙げる。本発明は、これらの標的配列の任意の１以上を標的とする種々のプローブの使用を含み得る。
【０１４８】
同様に、完全遺伝子配列は、関係のあるプローブセットについて表１に挙げる。本発明は、標的配列としてのこれらの完全遺伝子配列の任意の１以上を標的とする種々のプローブの使用を含み得る。
【０１４９】
プロモーターでのまたはその周辺でのＤＮＡのメチル化率の増加が、遺伝子発現レベルの減少と相関することが示されている。ＤＮＡのメチル化は、ヒトにおける主後成的修飾である。メチル基(ｍ)がＤＮＡの特定のシトシン(Ｃ)残基に付加される、メチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素により実施されるＤＮＡの化学修飾である。哺乳動物において、メチル化はグアノシン残基に隣接するシトシン残基、すなわち配列ＣＧまたはＣｐＧジヌクレオチドでしか生じない。
【０１５０】
従って、さらに他の態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断の方法であって、
対象からのサンプルにおいて表１から選択される少なくとも１遺伝子のメチル化状態を決定し、ここで、決定したメチル化状態を、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供するために使用することを含む、
方法に関する。
【０１５１】
メチル化は、一般に遺伝子発現の下方制御をもたらす。それ故に、表１において負に荷重された遺伝子のメチル化(これは過剰メチル化であり得る)を、予後不良(またはここに記載する関連転帰)を示すために、ある実施態様により、決定し得る。これに加えてまたはこれとは別に、表１において正に荷重された遺伝子のメチル化の欠如(これは低メチル化であり得る)を、予後不良(またはここに記載する関連転帰)を示すために、ある実施態様により、決定し得る。
【０１５２】
メチル化状態の決定は、任意の適当な手段により達成できる。適当な例は、重亜硫酸ゲノム配列決定および／またはメチル化特異的ＰＣＲを含む。メチル化状態を評価するための種々の技術は当分野で知られ、本発明と組み合わせて使用できる。配列決定(ＮＧＳを含む)、メチル化特異的ＰＣＲ(MS-PCR)、融解曲線メチル化特異的ＰＣＲ(McMS-PCR)、重亜硫酸処理を伴うまたは伴わないＭＬＰＡ、ＱＡＭＡ(Zeschnigk et al, 2004)、MSRE-PCR(Melnikov et al, 2005)、MethyLight(Eads et al., 2000)、ConLight-MSP(Rand et al., 2002)、重亜硫酸変換特異的メチル化特異的ＰＣＲ(BS-MSP)(Sasaki et al., 2003)、COBRA(これは、重亜硫酸ナトリウム処理ＤＮＡのＰＣＲ生成物におけるメチル化依存的配列差異を明らかにするために制限酵素を利用する)、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長立体構造(MS-SNuPE)、メチル化感受性一本鎖立体構造解析(MS-SSCA)、融解曲線複合重亜硫酸制限解析(McCOBRA)(Akey et al., 2002)、PyroMethA、HeavyMethyl(Cottrell et al. 2004)、MALDI-TOF、MassARRAY、メチル化アレルの定量的解析(QAMA)、酵素局所メチル化アッセイ(ERMA)、QBSUPT、MethylQuant、定量的ＰＣＲ配列決定およびオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイシステム、ピロシーケンス、Meth-DOP-PCR。ＤＮＡのメチル化解析のいくつかの有用な技術の総説はNucleic acids research, 1998, Vol. 26, No. 10, 2255-2264, Nature Reviews, 2003, Vol.3, 253-266; Oral Oncology, 2006, Vol. 42, 5-13に提供される。
【０１５３】
メチル化状態を評価するための技術は、別個の取り組みに基づく。あるものは、エンドヌクレアーゼの使用を含む。このようなエンドヌクレアーゼは、非メチル化認識部位に対して優先的にメチル化認識部位を開裂するものでも、メチル化認識部位に対して非メチル化のものを優先的に開裂するものでもよい。前者の例のいくつかは、Acc III、Ban I、BstN I、Msp IおよびXma Iである。後者の例は、Acc II、Ava I、BssH II、BstU I、Hpa IIおよびNot Iである。開裂パターンの差異は、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの存在または非存在の指標である。開裂パターンは、直接的にまたは容易に識別可能な生成物を生じるさらなる反応後に検出できる。電気泳動、クロマトグラフィーおよびマススペクトロメトリーを含むが、これらに限定されないサイズおよび／または電荷の改変を検出する手段を修飾生成物の検出に使用できる。
【０１５４】
あるいは、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの同定は、ＭｅＣＰ２タンパク質のメチル結合ドメイン(ＭＢＤ)がメチル化ＤＮＡ配列に選択的に結合する能力を利用し得る(Cross et al, 1994; Shiraishi et al, 1999)。ＭＢＤはまたＭＢＰ、ＭＢＰ２、ＭＢＰ４、ポリ−ＭＢＤ(Jorgensen et al., 2006)またはメチル化核酸に結合した抗体のような試薬からも得ることができる。ＭＢＤを固体マトリクスに固定し、高度メチル化ＤＮＡ配列の単離のための分取カラムクロマトグラフィーに使用し得る。発現されるＨｉｓタグ付メチル−ＣｐＧ結合ドメインのようなバリアント形態を使用して、メチル化ＤＮＡ配列に選択的に結合させ得る。最終的には、制限エンドヌクレアーゼ消化ゲノムＤＮＡを発現Ｈｉｓタグ付メチル−ＣｐＧ結合ドメインと結合させる。他の方法は当分野で周知であり、数ある中で、メチル化−ＣｐＧアイランドリカバリーアッセイ(ＭＩＲＡ)を含む。もう一方の方法、ＭＢ−ＰＣＲは、メチル化ＤＮＡ捕捉のためにＰＣＲ容器の壁に固定化された組み換え、二価メチル−ＣｐＧ結合ポリペプチドと、続くＰＣＲによる結合したメチル化ＤＮＡ検出を使用する。
【０１５５】
メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフ検出のためのさらなる取り組みは、ＣｐＧジヌクレオチドモチーフのメチル化または非メチル化形態の何れかを選択的に修飾する化学試薬の使用である。適当な化学試薬は、ヒドラジンおよび重亜硫酸イオンを含む。本発明の方法は、ある実施態様において、重亜硫酸イオンを使用し得る。重亜硫酸変換は、非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンは維持される、重亜硫酸ナトリウムでのＤＮＡサンプルの処理を利用する(Furuichi et al., 1970)。この変換は、最終的に元のＤＮＡの配列の変化をもたらす。得られたウラシルが、シトシン塩基対形成行動と異なるチミジンの塩基対形成行動を有することは一般に知られる。これは、メチル化および非メチル化シトシン間の識別を可能とする。配列差異を評価するための分子生物学および核酸化学の有用な慣用技術は当分野で周知であり、文献に記載されている。例えば、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory Manual, (2001) 3rd edition, Cold Spring Harbor, NY; Gait, M.J.(ed.), Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, IRL Press (1984); Hames B.D., and Higgins, S.J. (eds.), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press (1985); and the series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.参照。
【０１５６】
いくつかの技術は、ＣｐＧジヌクレオチドでのメチル化状態の評価にプライマーを使用する。プライマー設計のための２種の取り組みが可能である。第一に、プライマーを、それ自体ＤＮＡのメチル化の可能性のあるあらゆる位置をカバーしないように設計し得る。差次的メチル化位置での配列多様性は２プライマー間に位置し、配列多様性の可視化はさらなるアッセイ工程を必要とする。このようなプライマーは、重亜硫酸ゲノム配列決定、COBRA、Ms-SnuPEおよび他のいくつかの技術で使用される。第二に、最初に処理した配列のメチル化または非メチル化バージョンの何れかと特異的にハイブリダイズするプライマーを設計し得る。ハイブリダイゼーション後、増幅反応を実施し、増幅生成物を当分野で知られる任意の検出系を使用してアッセイし得る。増幅生成物の存在は、サンプルがプライマーにハイブリダイズすることを示す。プライマーの特異性は、ＤＮＡが修飾されているかいないかを示し、これが次にＤＮＡがメチル化されているかいないかを示す。標的と相補性である十分な領域、例えば、１２、１５、１８または２０ヌクレオチドが存在するならば、プライマーはハイブリダイゼーションを妨害しないが、他の操作に有用であり得る付加的ヌクレオチド残基も含み得る。このような他の残基の例は、制限エンドヌクレアーゼ開裂、リガンド結合もしくは因子結合のための部位またはリンカーまたは反復であり得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾メチル化残基に特異的なものであっても、なくてもよい。
【０１５７】
修飾および非修飾核酸を識別するさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このようなプローブは修飾核酸と直接または修飾核酸のさらなる生成物、例えば増幅により得た生成物とハイブリダイズし得る。プローブベースのアッセイは、特異的配列へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび続くハイブリッドの検出を利用する。また、増幅生成物検出前にさらなる精製工程、例えば、沈殿工程があってよい。オリゴヌクレオチドプローブを、当分野で知られる任意の検出系を使用して標識し得る。これらは、蛍光部分、放射性同位体標識部分、生物発光部分、発光部分、化学発光部分、酵素、基質、受容体またはリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
ＭＳＰ取り組みにおいて、ＤＮＡを、重亜硫酸ナトリウム処理の結果としての配列差異を利用することにより、メチル化ＤＮＡを非メチル化ＤＮＡと識別するように設計したプライマー対を使用して増幅し得る(ＷＯ９７／４６７０５号)。例えば、重亜硫酸イオンは、非メチル化シトシン塩基を修飾し、それをウラシル塩基に変える。ウラシル塩基は、ハイブリダイゼーション条件でアデニン塩基とハイブリダイズする。それ故に、グアニン塩基の代わりにアデニン塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーが、重亜硫酸修飾ＤＮＡとハイブリダイズし、一方グアニン塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡにおける非修飾(メチル化)シトシン残基と結合する。ＤＮＡポリメラーゼおよび第二プライマーを使用する増幅は、容易に観察できる増幅生成物をもたらし、これは続いてＤＮＡがメチル化されているかいないかを示す。ＰＣＲが好ましい増幅方法ではあるが、ネステッドＰＣＲおよび多重ＰＣＲのようなこの基本的技術の変法も本発明の範囲内に含まれ得る。
【０１５９】
先に記載したとおり、関連する遺伝子のメチル化状態を評価するある実施態様は、増幅生成物を産生するための増幅を必要とする。増幅生成物の存在を当分野で周知の方法を使用して直接的に評価でき、続く記載もまたここに記載する他の全ての増幅実施態様に適用される。それらは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルのような適当なゲルで単純に可視化され得る。検出は、二本鎖ＤＮＡに挿入される臭化エチジウムのような特異的色素の結合および例えばＤＮＡバンドのＵＶイルミネーター下での可視化を含み得る。増幅生成物を検出する他の手段は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを含む。あるいは、蛍光またはエネルギー移動を測定して、メチル化ＤＮＡの存在を決定できる。
【０１６０】
ＭＳＰ技術の具体例は、指定リアルタイム定量的ＭＳＰ(QMSP)であり、実時間または終了点でメチル化ＤＮＡの信頼できる定量化を可能とする。リアルタイム方法は、一般に増幅手順の連続的光学モニタリングに基づき、生成物における取り込みが定量でき、定量化が鋳型における配列のコピー数の指標である蛍光標識試薬を利用する。このような試薬の一つは、二本鎖ＤＮＡと優先的に結合し、蛍光が二本鎖ＤＮＡの結合により著しく増強される、SYBR Green Iと呼ばれる蛍光色素である。あるいは、標識プライマーおよび／または標識プローブを定量化に使用できる。これらは、TAQMAN(登録商標)、MOLECULAR BEACONS(登録商標)、AMPLIFLUOR(登録商標)およびSCORPION(登録商標)、DzyNA(登録商標)、PlexorＴＭなどのような周知および市販のリアルタイム増幅技術の特定の適用を表す。リアルタイムＰＣＲシステムにおいて、ＰＣＲ生成物の量の最初の顕著な増加が、最初の標的鋳型の量に対応する、対数期中のＰＣＲ反応をモニターすることが可能である。
【０１６１】
リアルタイムＰＣＲは反応中のアンプリコンの蓄積を検出する。何れにしても、リアルタイム方法を利用する必要はない。多くの適用は定量化を必要とせず、リアルタイムＰＣＲは、結果提示および保存を便利にし、同時にＰＣＲ後取扱いを避けるためのツールとしてのみ使用される。それ故に、解析は、標的ＤＮＡがサンプルに存在するか否かを確認するためだけに実施してよい。このようなエンドポイント検証を、増幅反応が完了した後に実施する。
【０１６２】
表１からの１以上の遺伝子の発現レベルは免疫組織化学により決定され得る。免疫組織化学により、タンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーのような結合剤の使用による、組織サンプルの細胞における該タンパク質の検出を意味する。それ故に、免疫組織化学により決定される発現レベルはタンパク質レベルである。サンプルは組織サンプルであってよく、癌(腫瘍)細胞、正常組織細胞および、所望により、浸潤性免疫細胞を含み得る。前立腺癌に適用可能な実施態様において、サンプルは前立腺組織サンプルであってよく、前立腺癌(腫瘍)細胞、前立腺上皮内腫瘍(ＰＩＮ)細胞、正常前立腺上皮、間質および、所望により、浸潤性免疫細胞を含み得る。ある実施態様において、サンプルにおける癌(腫瘍)細胞の少なくとも１遺伝子の発現レベルを、同じサンプルにおける正常細胞の同じ遺伝子(および／または参照遺伝子)の発現レベルと比較する。ある実施態様においてサンプルにおける癌(腫瘍)細胞の少なくとも１遺伝子の発現レベルを、対照サンプルの正常細胞における同じ遺伝子(および／または参照遺伝子)の発現レベルと比較する。正常細胞は、正常(非癌)上皮性細胞を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる可能性がある。ある実施態様において、正常細胞はＰＩＮ細胞および／または間質細胞を含まない。ある実施態様において、前立腺癌(腫瘍)細胞はＰＩＮ細胞および／または間質細胞を含まない。さらなる実施態様において、サンプルの前立腺癌(腫瘍)細胞における少なくとも１遺伝子の発現レベルを、(さらに)同じ細胞または対照サンプルにおける前立腺癌細胞の参照遺伝子の発現レベルと比較する。なおさらなる実施態様において、サンプルにおける癌(腫瘍)細胞の少なくとも１遺伝子の発現レベルを、癌(腫瘍)細胞における発現の強度、比率および／または局在化に基づく方法を使用して採点する(正常細胞と比較せずに)。採点方法は、既知転帰を有する一連の患者からの開発または訓練段階のものに由来し得る。
【０１６３】
従って、さらなる態様において、本発明は、表１から選択された少なくとも１遺伝子のタンパク質生成物に特異的に結合する抗体またはアプタマーに関する。抗体またはアプタマーが結合するエピトープ表１に特定する完全配列または標的配列に対応するアミノ酸配列に由来し得る。
【０１６４】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル起源のものであり得る。フラグメントおよび誘導体抗体は、ペプチド特異的結合機能を保持するＦａｂフラグメント、ＳｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、重鎖抗体、アプタマーなどを限定なしに含むためにも利用でき、これらは“抗体”の定義に包含される。このような抗体は本発明の方法において有用である。それらは特定のタンパク質またはある状況においてタンパク質の１以上の特定のアイソフォームのレベルの測定に使用され得る。当業者は、特定のアイソフォームを互いに識別することを可能とするエピトープを十分に同定することができる。
【０１６５】
特定の抗体を産生する方法は当業者に知られる。抗体はヒトでも非ヒト起源(例えばラットまたはマウスのような齧歯類)でもよく、既知技術によりヒト化などされていてよい(Jones et al., Nature (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al., Protein Engineering, 1996, 9(10):895-904; and Studnicka et al., Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. Protein Engineering, 1994, Vol.7, pg 805)。
【０１６６】
ある実施態様において、発現レベルを、標識にコンジュゲートした抗体またはアプタマーを使用して決定する。標識は、直接的または間接的に、検出を可能とする要素をいう。例えば、標識は酵素、所望によりペルオキシダーゼまたはフルオロフォアであり得る。
【０１６７】
標識は検出剤の一例であり、その一部を構成し得る。検出剤は、結合剤(これは、例えば抗体、プライマーまたはプローブであり得る)と標的の複合体の検出を助けるために使用し得る薬剤を意味する。結合剤は全体的検出剤の一部を形成し得る。抗体が酵素にコンジュゲートするとき、検出剤は酵素が検出可能な生成物を産生する化学反応を触媒するような化学組成物を含み得る。適切な酵素により触媒される反応の生成物は、限定しないが、蛍光性、発光性または放射性であってよくまたはそれらは可視光または紫外光を吸収し得る。このような検出可能標識の検出に適する検出器の例は、ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーターおよびデンシトメーターを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、検出剤は二次的抗体を含み得る。その場合、発現レベルを標的タンパク質に結合する非標識一次抗体および標識にコンジュゲートした二次的抗体を使用して決定し、ここで、二次的抗体は一次抗体に結合する。
【０１６８】
本発明はまた対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断のための上記抗体またはアプタマーの使用にも関する。
【０１６９】
タンパク質のレベルで発現レベルを決定するさらなる技術は、例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、マススペクトロメトリー、ＥＬＩＳＡおよびその他を含む(ImmunoAssay: A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005 edition参照)。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異性および感度を改善するために、モノクローナル抗体が、その特異的エピトープ認識のためにしばしば使用される。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体に比して標的に対する親和性が高いため、種々の免疫アッセイにおいて使用が成功している。
【０１７０】
本発明の全態様において、サンプルは任意の適当な形態であり得る。サンプルは、一般に原発腫瘍(腫瘍細胞内にもはや含まれていなくても、例えば、循環中に放出されていても)からの核酸(ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ)またはある実施態様においてタンパク質を含むことが意図される。サンプルは、前立腺または乳房細胞のような細胞およびしばしば適当な組織サンプル(例えば前立腺または乳房組織サンプル)を含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる可能性がある。サンプルは原発腫瘍サンプルを含むか、またはそれ自体であり得る。細胞または組織は、前立腺癌細胞またはＥＲ陽性乳癌細胞のような癌細胞を含み得る。特定の実施態様において、サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋生検サンプルのように固定されていてよい、生検サンプルを含む、本質的にそれらからなるまたはそれらからなる。組織サンプルは、任意の適当な技術により得ることができる。例は、生検手順、所望により微細針吸引生検手順を含む。体液サンプルも使用し得る。サンプルは、摘出材料を含み得る(例えば根治的前立腺摘出が実施されているとき)。適当なサンプルタイプは、全血、血清および血漿サンプルを含む血液、尿および精液を含む。
【０１７１】
ここに記載する方法は、さらに核酸、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのサンプルからの抽出を含み得る。適当な方法は当分野で知られ、RneasyおよびGeneJET RNA精製キットのような市販のキットの使用を含む。
【０１７２】
ある実施態様において、方法はさらに対象からのサンプルを得ることを含み得る。一般に、方法は単離サンプルで実施されるインビトロ方法である。
【０１７３】
本発明の方法は、高リスク癌(すなわち、高転移能群内であり、故に、予後不良であるもの)を同定することにより、どの患者を、より積極的な治療レジメに付すべきかの決定に有用であることが明らかとなり得る。
【０１７４】
本発明の方法は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の処置を選択し、所望により処置を実施することを含み得る。ある実施態様において、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断が、再発および／または転移および／または予後不良の可能性が高いものであれば、選択される処置は
ａ)抗ホルモン処置
ｂ)細胞毒性剤
ｃ)生物学的製剤
ｄ)放射線療法
ｅ)標的療法
ｆ)手術
の１以上であり得る。
【０１７５】
抗ホルモン処置(またはホルモン療法)は、選択したホルモン、特にテストステロンのレベルおよび／または活性を減少させる処置の形態を意味する。このホルモンは腫瘍増殖および／または転移を促進し得る。抗ホルモン処置は、ゴセレリン(ゾラデックスとも呼ばれる)、ブセレリン、ロイプロレリン(Prostapとも呼ばれる)、ヒストレリン(Vantas)およびトリプトレリン(デカペプチル)とも呼ばれる黄体ホルモン阻害剤を含み得る。抗ホルモン処置は、デガレリクス(ファーマゴン)のようなゴナドトロピン遊離ホルモン(ＧｎＲＨ)阻害剤またはフルタミド(Drogenilとも呼ばれる)およびビカルタミド(カソデックスとも呼ばれる)のような抗アンドロゲンを含み得る。特定の実施態様において、抗ホルモン処置はビカルタミドおよび／またはアビラテロンであり得る。
【０１７６】
細胞毒性剤はアジュバント療法として投与され得る。細胞毒性剤は白金ベースの薬剤および／またはタキサンであり得る。特定の実施態様において、白金ベースの薬剤は、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンから選択される。タキサンはパクリタキセル、カバジタキセルまたはドセタキセルであり得る。細胞毒性剤はまたビノレルビンまたはビンブラスチンのようなビンカアルカロイドであり得る。細胞毒性剤は、エトポシドのようなトポイソメラーゼ阻害剤またはドキソルビシンのようなアントラサイクリン(抗生物質)であり得る。細胞毒性剤は、エストラムスチンのようなアルキル化剤であり得る。アジュバントタキサンおよび／またはトポイソメラーゼ阻害剤治療は、ＥＲ陽性乳癌の処置に特に適し得る。
【０１７７】
生物学的製剤は、生物学的製剤方法により産生された医薬品を意味する。生物学的製剤は、例えば、ワクチン、血液または血液成分、細胞、遺伝子治療、組織または組み換え治療タンパク質であり得る。所望により、生物学的製剤は抗体および／またはワクチンである。生物学的製剤はシプロイセルＴであり得る。生物学的製剤は癌免疫療法であり得る。
【０１７８】
ある実施態様において、放射線療法は拡大放射線療法、好ましくは広範囲放射線療法である。特定の実施態様において、放射線療法は、(骨盤)リンパ節照射を含むか、または(骨盤)リンパ節照射である。アジュバント照射を使用し得る。
【０１７９】
手術は根治的前立腺摘出を含み得る。根治的前立腺摘出は、前立腺、精嚢および精管全体の摘出を意味する。さらなる実施態様において、手術は、腫瘍摘出、すなわち腫瘍の全てまたは一部の摘出を含む。手術は、拡大節郭清を含み得るかまたは拡大節郭清であり得る。
【０１８０】
標的療法は、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の処置のための特定の薬物標的に向けた標的化治療剤を使用する処置を意味する。特定の実施態様において、これは、ＰＡＲＰ、ＡＫＴ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲなどのような標的に向けた阻害剤であり得る。ＰＡＲＰ阻害剤は、酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ(ＰＡＲＰ)の薬理学的阻害剤の一群である。いくつかの形態の癌は正常な細胞よりＰＡＲＰに依存し、ＰＡＲＰを癌治療の魅力的な標的とする。実施例(臨床試験中)は、イニパリブ、オラパリブ、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ  ９７２２、ＭＫ  ４８２７、ＢＭＮ−６７３および３−アミノベンズアミドを含む。ＡＫＴは、タンパク質キナーゼＢ(ＰＫＢ)としても知られ、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写および細胞遊走のような複数の細胞プロセスに重要な役割を有するセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼである。ＡＫＴは腫瘍細胞生存、増殖および侵襲性と関連する。ＡＫＴ阻害剤の例は、ＶＱＤ−００２、ペリホシン、ミルテホシンおよびＡＺＤ５３６３を含む。ＭＥＴは、肝細胞増殖因子受容体(ＨＧＦＲ)をコードする癌原遺伝子である。肝細胞増殖因子受容体タンパク質はチロシンキナーゼ活性を有する。ＭＥＴ阻害のためのキナーゼ阻害剤の例は、Ｋ２５２ａ、ＳＵ１１２７４、ＰＨＡ−６６７５２、ＡＲＱ１９７、フォレチニブ、ＳＧＸ５２３およびＭＰ４７０を含む。ＭＥＴ活性はまたＨＧＦとの相互作用の阻害によっても遮断され得る。切断型ＨＧＦ、抗ＨＧＦ抗体および非開裂可能ＨＧＦを含む多くの適当なアンタゴニストが知られる。ＶＥＧＦ受容体は、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)の受容体である。レンバチニブ、モテサニブ、パゾパニブおよびレゴラフェニブのような種々の阻害剤が知られる。
【０１８１】
本方法が癌を高転移能群に入らないと同定したならば、種々の決定がなされ得る。癌が既に例えば放射線療法または手術で処置されているならば、癌をさらに処置しないとの決定がなされ得る。適当な手段(例えばＰＳＡレベルまたは本発明の方法の使用による)により癌のモニターを継続し、癌が同じ状態のままであるならば、さらなる処置を何ら行わないとの決定をなし得る。
【０１８２】
本発明の方法は、治療選択ならびに新規治療の臨床試験評価中の強化戦略のための患者群選択を手引できる。例えば、想定される抗癌剤または処置レジメを評価するとき、ここに開示する方法を使用して、高い再発および／または転移および／または予後不良の可能性を有するとして特徴付けられる前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を有する個体を臨床試験のために選択し得る。
【０１８３】
本発明はまたここに記載する方法実施のためのシステムまたはデバイスまたは試験キットにも関する。
【０１８４】
さらなる態様において、本発明は、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのシステム、デバイスまたは試験キットであって、
ａ)対象からのサンプルにおいて表１から選択される少なくとも１遺伝子の発現レベルを決定する１以上の試験デバイス
ｂ)プロセッサー；および
ｃ)コンピューターアプリケーションを含む記憶媒体であって、プロセッサーにより実行されたとき、
(ｉ)１以上の試験デバイスにおけるサンプル中の表１から選択される少なくとも１遺伝子の決定された発現レベルにアクセスするおよび／またはそれを計算する、
(ii)サンプル中の表１から選択された少なくとも１遺伝子のレベルに上昇または減少があるか計算する；および
(iii)プロセッサーから前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けをアウトプットする
ように設定されているもの
を含む、システム、デバイスまたは試験キットに関する。
【０１８５】
試験デバイスにより、遺伝子の発現レベルの決定を可能にするコンポーネントの組み合わせを意味する。コンポーネントは、タンパク質、ＲＮＡまたは後成的修飾のレベルで発現レベルを決定する方法について、上に記載した何れかを含み得る。例えばコンポーネントは抗体、プライマー、検出剤などであり得る。コンポーネントはまた次の顕微鏡、顕微鏡スライド、ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーターおよびデンシトメーターの１以上を含み得る。それ故に、本発明の方法の適用は、必要な変更を加えて本発明のこれらの態様に適用される。
【０１８６】
ある実施態様において、システム、デバイスまたは試験キットは、さらにプロセッサーからのアウトプットのための(電子)ディスプレイを含む。
【０１８７】
本発明はまた、コンピューターアプリケーションまたは上記コンピューターアプリケーションを含む記憶媒体にも関する。
【０１８８】
ある例示的実施態様において、ここに記載する方法による対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断のための、コンピューターにより実施される方法、システムおよびコンピュータープログラム製品が提供される。例えば、コンピュータープログラム製品は、コンピューターにより実施されたとき、該コンピューターに、ここに記載する対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断をさせる、組み込まれたコンピューター読取可能プログラム指示を有する非一過性コンピューター読取可能記憶デバイスを含み得る。例えば、コンピューター実行可能指示により、コンピューターは
(ｉ)１以上の試験デバイス上のサンプル中の表１から選択される少なくとも１遺伝子の決定された発現レベルにアクセスするおよび／またはそれを計算する；
(ii)サンプル中の表１から選択された少なくとも１遺伝子のレベルに上昇または減少があるか計算する；および
(iii)前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断に関するアウトプットを提供する
ようになり得る。
【０１８９】
ある例示的実施態様において、コンピューターにより実現される方法、システムおよびコンピュータープログラム製品は、例えば、コンピューターおよびモジュールを運用および実行する、コンピューターアプリケーションに埋め込まれ得る。実行したとき、アプリケーションは、ここに記載する例示的実施態様により、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌を特徴付けおよび／または予後診断する。
【０１９０】
ここで使用するコンピューターは、あらゆるコンピューター、サーバー、埋め込まれたシステムまたは計算システムに対応する。モジュールは、コンピューターのここに提示する種々の方法および処理機能の実施を促進するために配置された１以上のハードウェアまたはソフトウェアエレメントを含み得る。コンピューターは、例えば、プロセッサー、システムバス、システムメモリ、記憶媒体、インプット／アウトプットインタフェースおよびネットワークと接続するためのネットワークインタフェースのような種々の内部または外部コンポーネントを含み得る。コンピューターは、例えば慣用コンピューターシステム、組込コントローラー、ラップトップ、サーバー、カスタマイズされたマシン、実験室コンピューターもしくはデバイスのような任意の他のハードウェアプラットフォームまたはこれらの任意の組み合わせとして実行され得る。コンピューターは、例えば、データネットワークまたはバスシステムにより相互接続された複数コンピューターを使用して処理するように設計された分散型システムであり得る。
【０１９１】
プロセッサーは、ここに記載する操作および機能性を実施、リクエストフローおよびアドレスマッピングを管理し、計算実施およびコマンド作成のためにコードまたは指示を実施するように設定されてよい。プロセッサーは、コンピューターにおけるコンポーネントの作動をモニターおよび制御するために設定し得る。プロセッサーは、汎用プロセッサー、プロセッサーコア、マルチプロセッサー、再構成可能プロセッサー、マイクロコントローラー、デジタルシグナルプロセッサー(“ＤＳＰ”)、アプリケーション特異的集積回路(“ＡＳＩＣ”)、画像処理ユニット(“ＧＰＵ”)、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ(“ＦＰＧＡ”)、プログラム可能論理回路(“ＰＬＤ”)、コントローラー、状態機械、ゲート論理、個別のハードウェアコンポーネント、任意の他のプロセシング・ユニットまたはこれらの任意の組み合わせまたは多数のこれらであり得る。プロセッサーは、単一プロセシング・ユニット、複数プロセシング・ユニット、単一プロセシング・コア、複数プロセシング・コア、特殊用途プロセシング・コア、コプロセッサーまたはこれらの任意の組み合わせであり得る。ある例示的実施態様によって、プロセッサーは、コンピューターの他のコンポーネントと共に、１以上の他のコンピューター内で実行する仮想コンピューターであり得る。
【０１９２】
システムメモリは、リードオンリーメモリ(“ＲＯＭ”)、プログラム可能リードオンリーメモリ(“ＰＲＯＭ”)、消去可能プログラム可能リードオンリーメモリ(“ＥＰＲＯＭ”)、フラッシュメモリまたは電力を用いてまたは用いることなくプログラム指示またはデータの保存が可能な任意の他のデバイスのような不揮発性メモリを含み得る。システムメモリはまたランダム・アクセス・メモリ(“ＲＡＭ”)、静的ランダム・アクセス・メモリ(“ＳＲＡＭ”)、ダイナミック・ランダム・アクセス・メモリ(“ＤＲＡＭ”)および同期型ダイナミック・ランダム・アクセス・メモリ(“ＳＤＲＡＭ”)のような揮発性メモリも含み得る。他のタイプのＲＡＭもシステムメモリの実行に使用し得る。システムメモリは、単一メモリモジュールまたは複数メモリモジュールの使用により実行し得る。システムメモリはコンピューターの一部であるが、当業者は、システムメモリを、対象の技術の範囲から逸脱することなくコンピューターから離し得ることを認識する。システムメモリは、記憶媒体のような非揮発性記憶デバイスを含み得るまたはそれと関連して動作し得ることも認識される。
【０１９３】
記憶媒体はハードディスク、フロッピーディスク、コンパクトディスクリードオンリーメモリ(“ＣＤ−ＲＯＭ”)、デジタル多目的ディスク(“ＤＶＤ”)、ブルーレイディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、他の非揮発性メモリデバイス、ソリッドステートドライブ(“ＳＳＤ”)、あらゆる磁気記憶デバイス、あらゆる光学記憶デバイス、あらゆる電気記憶デバイス、あらゆる半導体記憶デバイス、あらゆる物理ベースの記憶デバイス、あらゆる他のデータ記憶デバイスまたはこれらの任意の組み合わせまたは多数のこれらを含み得る。記憶媒体は、１以上のオペレーションシステム、アプリケーションプログラムおよびモジュール、データまたは任意の他の情報のようなプログラムモジュールを保存し得る。記憶媒体は、コンピューターの一部であるかそれに接続されていてよい。記憶媒体はまた、サーバー、データベースサーバー、クラウド保存、ネットワーク接続保存などのようなコンピューターと接続した１以上の他のコンピューターの一部であってもよい。
【０１９４】
モジュールは、ここに提示する種々の方法および処理機能をコンピューターで実施することを促進するように設定された１以上のハードウェアまたはソフトウェアエレメントを含み得る。モジュールは、システムメモリ、記憶媒体または両方と関係して、ソフトウェアまたはファームウェアとして保存されるシークエンスの一つ以上を含み得る。記憶媒体は、それ故に指示またはコードがプロセッサーでの実行のために保存され得る、マシンまたはコンピューター読取可能媒体の例を表す。マシンまたはコンピューター読取可能媒体は、一般にプロセッサーに指示を与えるために使用されるあらゆる１個または複数個の媒体をいう。モジュールと組み合わさったこのようなマシンまたはコンピューター読取可能媒体はコンピューターソフトウェア産物を構成し得る。モジュールを含むコンピューターソフトウェア産物はまたネットワーク、任意のシグナル担持媒体または任意の他の伝達または送達技術によりモジュールをコンピューターに送達するための１以上のプロセスまたは方法と組み合わせられ得ることも認識される。モジュールはまたハードウェア回路またはＦＰＧＡもしくは他のＰＬＤのためのマイクロコードまたは設定情報のような、ハードウェア回路を設定するための情報も含み得る。
【０１９５】
インプット／アウトプット(“Ｉ／Ｏ”)インタフェースは、１以上の外部デバイスを、データを１以上の外部デバイスから受け取り、データを１以上の外部デバイスに送るように結合するために設定され得る。このような外部デバイスは、種々の内部デバイスと共に、周辺機器として知られる。Ｉ／Ｏインタフェースは、種々の周辺機器をコンピューターまたはプロセッサーに動作可能に接続するための電気的および物理的接続の両方を含み得る。Ｉ／Ｏインタフェースは周辺機器、コンピューターまたはプロセッサー間のデータ、アドレスおよびコントロールシグナルの接続のために設定され得る。Ｉ／Ｏインタフェースは、小型コンピューター用周辺機器インターフェース(“ＳＣＳＩ”)、シリアル接続ＳＣＳＩ(“ＳＡＳ”)、ファイバー・チャンネル、周辺構成要素相互接続(“ＰＣＩ”)、ＰＣＩエクスプレス(ＰＣＩｅ)、シリアルバス、パラレルバス、アドバンスド・テクノロジー・アタッチメント(“ＡＴＡ”)、シリアルＡＴＡ(“ＳＡＴＡ”)、ユニバーサル・シリアル・バス(“ＵＳＢ”)、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｏｌｔ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ、種々のビデオバスなどのような任意の標準インタフェースを実行するように設定され得る。Ｉ／Ｏインタフェースは、１インタフェースまたはバス技術を実行するように設定され得る。
【０１９６】
あるいは、Ｉ／Ｏインタフェースは、複数インタフェースまたはバス技術を実行するように設定され得る。Ｉ／Ｏインタフェースは、システムバスの一部として、全体としてまたはそれと関連して動作するように設定され得る。Ｉ／Ｏインタフェースは、１以上の外部デバイス、内部デバイス、コンピューターまたはプロセッサー間の伝達を緩衝するための１以上のバッファーを含み得る。
【０１９７】
Ｉ／Ｏインタフェースは、コンピューターをマウス、タッチスクリーン、スキャナー、電子デジタイザ、センサー、レシーバー、タッチパッド、トラックボール、カメラ、マイク、キーボード、任意の他のポインティングデバイスまたはこれらの任意の組み合わせを含む、種々のインプットデバイスと連結させ得る。Ｉ／Ｏインタフェースは、コンピューターを、ビデオディスプレイ、スピーカー、プリンター、プロジェクター、触覚フィードバックデバイス、自動化制御、ロボットコンポーネント、アクチュエータ、モーター、ファン、ソレノイド、バルブ、ポンプ、トランスミッター、シグナルエミッター、光などを含む種々のアウトプットデバイスと連結させ得る。
【０１９８】
コンピューターは、ネットワーク中の１以上の他のシステムまたはコンピューターとのネットワークインタフェースを介して、論理接続を使用してネットワーク環境で動作し得る。ネットワーは広域ネットワーク(ＷＡＮ)、ローカルエリアネットワーク(ＬＡＮ)、イントラネット、インターネット、無線アクセスネットワーク、有線ネットワーク、モバイルネットワーク、電話ネットワーク、光学ネットワークまたはこれらの組み合わせを含み得る。ネットワークは、あらゆるトポロジーのパケットスイッチ、回路スイッチであり、任意の伝達プロトコールを使用し得る。ネットワーク内を連結する伝達は、光ファイバー・ケーブル、空間伝搬光、導波管、電気伝導体、ワイヤレスリンク、アンテナ、無線周波数伝達などのような種々のデジタルまたはアナログ伝達媒体を含み得る。
【０１９９】
プロセッサーは、システムバスを介してコンピューターまたは種々の周辺機器の他の要素に接続され得る。システムバスはプロセッサー内、プロセッサー外または両方であり得ることは認識される。ある実施態様によって、プロセッサー、ここに記載するコンピューターまたは種々の周辺機器の他の要素の何れかを、システム・オン・チップ(“ＳＯＣ”)、システム・オン・パッケージ(“ＳＯＰ”)またはＡＳＩＣデバイスのような単一デバイスに統合し得る。
【０２００】
ある実施態様は、ここに記載し、説明する機能を具現化するコンピュータープログラムを含んでよく、ここで、コンピュータープログラムは、マシン読取可能媒体に保存された指示および該指示を実施するプロセッサーを含む、コンピューターシステムで実行される。しかしながら、コンピュータープログラミングの実施態様の実行には多くの種々の方法があり、本実施態様は、コンピュータープログラム指示の何らかの１セットに限定されると解されてはならないことは明らかである。さらに、熟練したプログラマーは、このようなコンピュータープログラムを、ここに記載する開示された実施態様の１以上の実行のために書くことができる。それ故に、特定のセットのプログラムコード指示の記載は、その実施態様をどのように製造し、使用するかの適切な理解をするために必要であるとは解されない。さらに、当業者は、ここに記載の実施態様の１以上の態様を、１以上の計算システムに統合され得るため、ハードウェア、ソフトウェアまたはこれらの組み合わせにより実施し得ることを認識する。さらに、コンピューターにより実際される行為の何らかの引用は、１を超えるコンピューターがその行為を実施し得るため、単一コンピューターによる実施として解してはならない。
【０２０１】
ここに記載する例示的実施態様は、先に記載した方法およびプロセシング機能を実施するコンピューターハードウェアおよびソフトウェアと共に使用できる。ここに記載するシステム、方法および手順は、プログラム可能コンピューター、コンピューター−実行可能ソフトウェアまたはデジタル電気回路に統合され得る。ソフトウェアはコンピューター読取可能媒体に保存され得る。例えば、コンピューター読取可能媒体は、フロッピーディスク、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク、取り外し可能媒体、フラッシュメモリ、メモリスティック、光学媒体、光磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭなどを含み得る。デジタル電気回路は、集積回路、ゲート・アレイ、ビルディングブロック論理、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ(ＦＰＧＡ)などを含み得る。
【０２０２】
ここに記載する方法を実行するための試薬、ツールおよび／または指示はキットに提供し得る。このようなキットは、生検によるような患者から組織サンプルを採取するための試薬および組織を処理する試薬を含み得る。それ故に、キットは、ホルマリンのような適当な固定液およびパラフィンのような包埋試薬を含み得る。キットはまた患者のサンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを決定するための、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲを含む核酸増幅、ＮＧＳ(ＲＮＡ−ｓｅｑ)、ノーザンブロット、プロテオミクス解析または免疫組織化学を実施するための試薬のような発現レベル解析を実施するための１以上の試薬も含み得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマー、ノーザンブロット解析またはｂＤＮＡアッセイを実施するためのプローブおよび／またはウェスタンブロット、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡ解析のようなプロテオミクス解析を実施するためのここに記載する抗体またはアプタマーは、このようなキットに含まれ得る。アッセイのための適切な緩衝液も含まれ得る。これらのアッセイの何れかに必要な検出試薬も含まれ得る。キットはまた、例えばアレイまたはＰＣＲベースのキットであり、例えばポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰのようなさらなる試薬を含み得る。ここで注目するキットはまた発現レベル測定のためのアッセイをどのように実施するかを記載する指示書も含み得る。
【０２０３】
対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のためであり、増幅のためのおよび／または表１から選択される少なくとも１遺伝子、完全配列または標的配列に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーおよび／またはプライマー対を含む、キットが提供される。表１から選択される少なくとも１遺伝子、完全配列または標的配列と特異的にハイブリダイズする１以上のプローブを含む、対象における癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのキットも提供される。
【０２０４】
キットは、表１から選択される少なくとも１遺伝子に相補的な１以上のプライマー対および／またはプローブを含み得る。ある実施態様において、本発明の全態様によって、キットは、表１に挙げる標的配列または完全配列とハイブリダイズするように設計され、故に、発現レベルの決定を可能とする１以上のプローブまたはプライマー(プライマー対)を含み得る。表１に特定するプローブおよびプローブセットおよび１Ａを本発明の全態様によって使用し得る。表１Ｂに特定するプライマーおよびプライマー対も本発明の全態様によって用いられ得る。
【０２０５】
キットは、ここに特定する遺伝子シグネチャーの何れかを形成するためのプライマー／プライマー対／プローブ／プローブセットを含み得る(例えば表１〜２４の遺伝子シグネチャー参照)。
キットはまた参照遺伝子に相補的な１以上のプライマー対を含み得る。
【０２０６】
このようなキットはまた表１に挙げる遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０と相補的なプライマー対を含み得る。
【０２０７】
それ故に、さらなる態様において、本発明は、表１から選択される少なくとも１遺伝子のＲＮＡ生成物に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む、対象における前立腺癌の(インサイチュ)特徴付けおよび／または予後診断のためのキットに関する。各遺伝子についての適当なプローブおよびプローブセットを表１に挙げ、本発明のキットに取り込み得る。プローブおよびプローブセットも、本発明の別の態様を構成する。“プローブセット”は、単一遺伝子を標的(ハイブリダイゼーションによる)とするよう設計されたプローブのコレクションを意味する。グループ分けは表１(および表１Ａ)から明らかである。
【０２０８】
キットは、さらに次の
ａ)遮断プローブ
ｂ)プレアンプリファイヤー
ｃ)アンプリファイヤーおよび／または
ｄ)標識分子
の１以上の要素を含み得る。
【０２０９】
キットの要素は、ViewRNAアッセイの実施に適し得る(https://www.panomics.com/products/rna-in-situ-analysis/view-rna-overview)。
【０２１０】
キットの要素は核酸ベースの分子、所望によりＤＮＡ(またはＲＮＡ)であり得る。ブロッキングプローブは、標的特異的プローブ(本発明の少なくとも１遺伝子のＲＮＡ生成物に特異的なプローブ)により結合されない標的の部位に結合することにより背景シグナルの減少に作用する分子である。プレアンプリファイヤーは、標的に結合したとき、(１対の)標的特異的プローブに結合することができる分子である。アンプリファイヤーは、プレアンプリファイヤーに結合できる分子である。あるいは、アンプリファイヤーは、標的に結合したとき、(１対の)標的特異的プローブに直接結合できる能力を有し得る。アンプリファイヤーは、複数標識分子(標識プローブであり得る)のための結合部位を有する。
【０２１１】
対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのキットは、表１から選択される少なくとも１遺伝子のメチル化状態の決定を可能とする。適当であるならば、過剰メチル化または低メチル化であり得る、決定されたメチル化状態を使用して、前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断を提供する。このようなキットは、１以上の遺伝子のメチル化状態の直接決定のためのプライマーおよび／またはプローブを含み得る。それらは、故に、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡのメチル化および非メチル化形態を区別する、メチル化特異的プライマーおよび／またはプローブを含み得る。このようなプライマーおよび／またはプローブは、標的配列におけるシトシン残基の選択的修飾を、メチル化されているかどうかを反映させるために適合化された、ここに記載するプライマーおよびプローブの誘導体を含み得る。それ故に、“メチル化特異的”および“非メチル化特異的”プライマー(プライマー対に含まれるべき)およびプローブのセットを、特定のシトシン含有標的配列を探索するために設計し得る。このようなキットは、一般にまたＣｐＧジヌクレオチドモチーフのメチル化または非メチル化形態の何れかを選択的に修飾する試薬も含む。適当な化学試薬はヒドラジンおよび重亜硫酸イオンを含む。例は、重亜硫酸ナトリウムである。しかしながら、キットは、制限エンドヌクレアーゼのようなメチル化状態を決定するための上記の他の試薬を含み得る。メチル化特異的ＰＣＲプライマーは、非メチル化形態(非メチル化特異的)に存在するならば、ＣｐＧジヌクレオチド対の重亜硫酸変換またはＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているならば(メチル化特異的)変換の非存在を考慮するために、表１Ｂおよび配列番号３１５１〜３１５４のプライマー対に由来し得る。
【０２１２】
本発明はまた１以上の上記抗体またはアプタマーを含み、本発明の方法において有用である、対象における前立腺癌またはＥＲ陽性乳癌のような癌の特徴付けおよび／または予後診断のためのキットにも関する。
【０２１３】
キットに含まれる情報資料は、ここに記載する方法に関するおよび／またはここに記載する方法のための試薬の使用に関する、記述的資料、指導的資料、販売的資料または他の資料であり得る。例えば、キットの情報資料は、キット使用者が遺伝子発現解析実施および結果解釈の実質的情報を得ることができる場所である、連絡先情報、例えば、実際の住所、メールアドレス、ウェブサイトまたは電話番号を含んでよい。
【０２１４】
キットは、さらに上記コンピューターアプリケーションまたは記憶媒体を含んでよい。
【０２１５】
先に提示した実施態様におけるシステム、方法および行為の例は説明的であり、別の実施態様において、種々の実施態様の範囲および精神から逸脱することなく、ある行為は異なる順番で、互いに並行して、完全に削除されおよび／または異なる例示的実施態様間で組み合わされ実施できおよび／またはある付加的行為を実施してよい。従って、このような別の実施態様は、ここに記載する本発明の範囲に含まれる。
【０２１６】
特定の実施態様を上に詳細に記載しているが、その記載は単に説明を目的とする。それ故に、上記の多くの態様は特に断らない限り、必要なまたは必須の要素として意図されていない。
【０２１７】
例示的実施態様の開示された態様の修飾およびそれに対応する等価成分または行為は、上記のものに加えて、次の特許請求の範囲に定義する実施態様の精神および範囲から逸脱することなく、本開示を利用して当業者により製造でき、特許請求の範囲に、このような修飾および等価構造を包含させるための最も広い解釈である。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】１２６前立腺ＦＦＰＥ腫瘍サンプル中の１０００の最も可変的遺伝子を使用する遺伝子発現データの教師なし階層的クラスタリングを示すヒートマップである。全サンプルにわたる遺伝子発現を水平に示す。各遺伝子クラスターに対応する機能プロセスを、図の右に沿ってラベルする。
【０２１９】
【図２】シグネチャースコアを分子サブグループ(クラスター１および２対クラスター３および４)の区別と関連付ける交差検証下に計算したＡＵＣ。各シグネチャーにおける遺伝子の数をｘ軸に沿って記載し、ＡＵＣをｙ軸に示す。
【０２２０】
【図３】シグネチャースコアをTaylor原発腫瘍サンプルにおける転移性再発までの期間と関連付ける交差検証下に計算したＣ指数。各シグネチャーにおける遺伝子の数をｘ軸に沿って記載し、Ｃ指数をｙ軸に示す。
【０２２１】
【図４】シグネチャースコアに対する生物学的製剤不均一性の影響を評価するためにプロファイルした５切片内の交差検証下のシグネチャースコア範囲のパーセンテージとして計算した標準偏差(ＳＤ)。各シグネチャーにおける遺伝子の数をｘ軸に沿って記載し、パーセントＳＤをｙ軸に示す。
【０２２２】
【図５】転移性再発までの期間エンドポイントおよび予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用したTaylor原発腫瘍サンプルにおいて作成したカプラン・マイヤー。一変量ハザード比＝０.６２[１.９８,２０.２０]；ｐ＜０.０００１
【０２２３】
【図６】生化学的再発までの期間エンドポイントおよび予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用したTaylor原発腫瘍サンプルにおいて作成したカプラン・マイヤー。一変量ハザード比＝３.７６[１.７０、８.３４]；ｐ＜０.０００１
【０２２４】
【図７】Taylor解析からのキー予測因子の多変数Ｃｏｘ解析のワルド検定。
【０２２５】
【図８Ａ】各患者についての７０遺伝子シグネチャースコアおよび対応する生化学的再発転帰を使用するGlinksyデータにおけるＲＯＣ曲線。ＡＵＣ＝０.６９[０.５７、０.７９]；ｐ＝０.００３２
【０２２６】
【図８Ｂ】各患者についての７０遺伝子シグネチャースコアおよび対応する転移性再発転帰を使用するErhoデータにおけるＲＯＣ曲線。ＡＵＣ＝０.６１[０.５７、０.６５]；ｐ＜０.０００１
【０２２７】
【図９】再発までの期間エンドポイント(時間は月数)および予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用する乳癌データ(ＧＳＥ２０３４)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおいて作成したカプラン・マイヤー；signature_call_median 1(予後不良)およびsignature_call_median 0(予後良好)。一変量ハザード比＝１.２４[０.８０、１.９２]
【０２２８】
【図１０】各患者について７０遺伝子シグネチャースコアおよび対応する再発転帰をしようする乳癌データ(ＧＳＥ２０３４)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおけるＲＯＣ曲線。ＡＵＣ＝０.６２；ｐ＝０.００２
【０２２９】
【図１１】無再発生存エンドポイント(時間は日数)および予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用する乳癌データ(ＧＳＥ７３９０)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおいて作成したカプラン・マイヤー；signature_call_median 1(予後不良)およびsignature_call_median 0(予後良好)。一変量ハザード比＝１.７４[１.０４、２.９３]
【０２３０】
【図１２】無遠隔転移生存エンドポイント(時間は日数)および予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用する乳癌データ(ＧＳＥ７３９０)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおいて産生したカプラン・マイヤー；signature_call_median 1(予後不良)およびsignature_call_median 0(予後良好)。一変量ハザード比＝２.０１[１.０２、３.９６]
【０２３１】
【図１３】全体的生存エンドポイント(時間は日数)および予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用する乳癌データ(ＧＳＥ７３９０)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおいて産生したカプラン・マイヤー；signature_call_median 1(予後不良)およびsignature_call_median 0(予後良好)。一変量ハザード比＝２.５４[１.２４、５.１８]
【０２３２】
【図１４】無再発生存エンドポイント(時間は年数)および予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用する乳癌データ(ＧＳＥ２９９０)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおいて産生したカプラン・マイヤー；signature_call_median 1(予後不良)およびsignature_call_median 0(予後良好)。一変量ハザード比＝１.９１[１.１７、３.０９]
【０２３３】
【図１５】無遠隔転移生存エンドポイント(時間は年数)および予後良好／不良７０遺伝子シグネチャー予測を使用する乳癌データ(ＧＳＥ２９９０)ＥＲ陽性腫瘍サンプルにおいて作成したカプラン・マイヤー；signature_call_median 1(予後不良)およびsignature_call_median 0(予後良好)。一変量ハザード比＝２.３７[１.２６、４.４４]
【０２３４】
【図１６】手術後の摘出検証コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの、生化学的再発の時間予測との関係を示す１０年にわたるカプラン・マイヤー生存解析。生存確率(％)は、‘非Ｍｅｔ様’サブグループ(緑色)の２４１患者と比較したとき、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の８１患者の無進行生存(ＰＦＳ)の減少(月)を示した(ＨＲ＝１.７４[１.１８−２.５６]；ｐ＝０.０００９)。
【０２３５】
【図１７】手術後の摘出検証コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの、転移性疾患進行の時間予測との関係を示す１０年にわたるカプラン・マイヤー生存解析。生存確率(％)は、‘非Ｍｅｔ様’サブグループ(緑色)の２４１患者と比較したとき、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の８１患者の無進行生存(ＰＦＳ)の減少(月)を示した(ＨＲ＝３.６０[１.８１−７.１３]；ｐ＜０.０００１)。
【０２３６】
【図１８】治癒的放射線療法後のFASTMAN Biopsy Validationコホートにおける７０遺伝子シグネチャーの、生化学的再発の時間予測との関係を示す１０年にわたるカプラン・マイヤー生存解析。生存確率(％)は、‘非Ｍｅｔ様’サブグループ(緑色)の１９４患者と比較したとき、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の５４患者の無進行生存(ＰＦＳ)の減少(月)を示した(ＨＲ＝２.１８[１.１４−４.１７]；ｐ＝０.００４２)。
【０２３７】
【図１９】治癒的意図での放射線療法後のFASTMAN Biopsy Validationコホートにおける、７０遺伝子シグネチャーの、転移性疾患進行の時間予測との関係を示す１０年にわたるカプラン・マイヤー生存解析。生存確率(％)は、‘非Ｍｅｔ様’サブグループ(緑色)の１９４患者と比較したとき、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の５４患者の無進行生存(ＰＦＳ)の減少(月)を示した(ＨＲ＝３.５０[１.２８−９.５６]；ｐ＝０.００１７)。
【０２３８】
【図２０】FASTMAN生検検証データセットのコアセット解析。
【０２３９】
【図２１】内部摘出検証データセットのコアセット解析。
【０２４０】
【図２２】FASTMAN生検検証データセットのための最小遺伝子セット解析。
【０２４１】
【図２３】内部摘出検証データセットのための最小遺伝子セット解析。
【実施例】
【０２４２】
本発明は、次の実験例を参照して、さらに理解される。
【０２４３】
実施例１：組織プロセシング、階層的クラスタリングおよびサブタイプ同定
腫瘍材料
同時の転移が判明していない７０原発前立腺癌、リンパ節転移が判明している２０原発前立腺癌、転移前立腺癌を含む１１リンパ節、２５正常前立腺サンプル。
【０２４４】
ＦＦＰＥからの遺伝子発現プロファイリング
総ＲＮＡを、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用して大まかに摘出した(macrodissected)ＦＦＰＥ組織から抽出した。ＲＮＡを相補的デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)に変換させ、これを続いて増幅し、FL-OvationTM cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)のSPIA(登録商標)技術を使用して一本鎖形態に変換した。増幅一本鎖ｃＤＮＡを次いで断片化し、FL-OvationTM cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを次いでAlmac Prostate Cancer DSATMとハイブリダイズさせた。Almac Prostate Cancer DSATM研究ツールは貴重な保管組織バンクの使用を可能とする、ＦＦＰＥ組織サンプルの解析用に最適化されている。Almac Prostate Cancer DSATM研究ツールは、正常および癌性両方の前立腺組織におけるトランスクリプトームを表す革新的マイクロアレイプラットフォームである。その結果、Prostate Cancer DSATMは、一般的マイクロアレイプラットホームを使用しては入手できない、前立腺疾患および組織設定内のトランスクリプトームの包括的提示を提供する。アレイをAffymentrix Genechip(登録商標)Scanner 7G(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)を使用してスキャンした。
【０２４５】
データ作成
プロファイルしたサンプルの品質管理(ＱＣ)を、ＭＡＳ５前処理アルゴリズムを使用して実施した。平均ノイズおよび背景均一性、プレゼント・コールのパーセンテージ(アレイ品質)、シグナル品質、ＲＮＡ品質およびハイブリダイゼーション品質を含む、種々の技術的態様を評価した。対応するパラメータの分布および中央絶対偏差を分析し、可能性のある外れ値の同定に使用した。
Almac Prostate Cancer DSATMは、３’末端から３００ヌクレオチド以内の領域を主に標的とするプローブを含む。それ故に標準Affymetrix RNA品質尺度を適合させた  −  ハウスキーピング遺伝子について、３’末端プローブセットの強度と、３’末端プローブセット強度対平均背景強度の比を、通常の３’／５’比に加えて使用した。ハイブリダイゼーション対照を、強度およびプレゼント・コールがAffymetrixにより特定される要求に合うことを確実にするために、確認した。
【０２４６】
階層的クラスタリングおよび機能解析
サンプル前処理を、Robust Multi-Array解析(ＲＭＡ)を使用して実施した[１]。データマトリクスを、最初、特に、各Entrez geneについてのプレゼント・コールとの関係が最小であったプローブセットを利用する、Ensembleアノテーションバージョン７５を使用してEntrez Gene IDレベルに集約させた。１)Entrez Gene IDにマップされなかったまたは２)複数Entrez Gene IDにマップされたプローブセットを除いた。得られた遺伝子レベルデータマトリクスを、分散および強度の減少によりソートし、データマトリクスの増分サブセットをクラスター安定性について試験した。ＧＡＰ統計値[２]をサンプルおよび遺伝子クラスターの数の計算に適用し、一方クラスター組成物の安定性を区画比較方法を使用して評価した。最終の最も可変の遺伝子リストを、選択した数のサンプルクラスターの最小および最も安定なデータマトリクスに基づき、決定した。
中央遺伝子発現値に対してデータマトリクスを標準化した後、凝集型階層的クラスタリングをユークリッド距離およびWard連結方法を使用して実施した[３]。最適数のサンプルおよび遺伝子クラスターを、クラスター分散での変化と、参照ヌル分布下で予測される変化を比較するＧＡＰ統計値[２]を使用して決定した。サンプルクラスターにわたる臨床パラメータ因子レベルの有意性をＡＮＯＶＡ(連続的因子)またはカイ二乗解析(個別の因子)を使用して評価し、偽発見率について補正した(ｐ値および実施した試験数の積)。０.０５の補正ｐ値閾値を有意性の基準として使用した。
機能エンリッチメント解析を実施して、Gene Ontology生物学的過程分類を使用してクラスター化遺伝子セットと関連することが判明した生物学的実体を同定およびランク付けした[４]。実体を、統計により導かれたエンリッチメントスコアによりランク付けし[５]、複数試験について調節した[６]。０.０５の補正ｐ値を有意閾値として使用した。同定された富化過程を各遺伝子クラスターについての全体的群機能に集約させた。
階層的クラスタリング解析から、転移性サンプルと共にクラスタリングした原発腫瘍サンプルを‘不良’とラベルし、正常サンプルと共にクラスタリングした原発腫瘍サンプルを‘良好’とラベルする。
【０２４７】
シグネチャー作成
クラス標識同定後、遺伝子シグネチャーを原発腫瘍サンプル内の予後不良群の前向き同定を可能とするように導いた。次の工程は、遺伝子シグネチャーの開発手順を要約する。
１. 相互検証：サンプルをシグネチャー訓練／試験について、５相互検証(ＣＶ)フォール度に無作為に分割し、これを、モデルパフォーマンスの不偏推定を可能とするため１０回繰り返した。
２. 前処理：プローブ強度レベルでのデータのＲＭＡ背景補正、続くプローブ対プローブセットおよびその後のプローブセット対Entrez Gene IDの強度の中央集計。Entrez geneレベル集約データマトリクスをｌｏｇ２変換し、分位正規化した。ＣＶ試験セット中のサンプルを対応するＣＶ訓練事例集合からの分位正規化モデルを使用して正規化し、モデルパフォーマンスの全推定値がサンプル毎に前処理されたシグネチャースコアに基づくことを確認したことに注意すべきである。
３. フィルタリング：遺伝子フィルターをモデル開発前に適用して、低分散および低強度の遺伝子の７５パーセントを除去した。
４. マシン学習：部分的最小二乗(ＰＬＳ)を使用して、“予後良好／不良”エンドポイントに対するアルゴリズムを訓練した。
５. 特性選択：遺伝子(最初のフィルター後に残っているもの)をＰＬＳアルゴリズムにより定義した各荷重を使用してランク付けし、最低絶対荷重の遺伝子の１０パーセントを除去する、特性選択のためのラッパーベースの方法が実行された。この方法を、残りが２遺伝子になるまで、最低絶対荷重を有する遺伝子を決定し、各回１０パーセントを除去するために遺伝子を再ランク付けする、特性消去(交差検証内)の各ラウンド後に繰り返す。
６. 暫定検証データセット１：公的データセット(Taylor et al)を、このデータセットからの原発腫瘍サンプルが各ＣＶ試験セットと並んで予測された(計算シグネチャースコア)暫定評価のために使用した。
７. 暫定検証データセット２：シグネチャースコアに対する生物学的製剤不均一性の影響を評価するために、ＦＦＰＥ腫瘍ブロックにわたる５切片をプロファイルした。これらの切片の各々のシグネチャースコアを、各ＣＶ試験セットと並行してＣＶ下計算した。
【０２４８】
モデル選択は次の工程を含んだ。
１. 交差検証下の訓練データにおける受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線下面積(ＡＵＣ)評価。
２. 交差検証下の暫定検証TaylorデータにおけるＣ指数の評価。Ｃ指数は、スコアを“良好”および“不良”予後群を帰属させるために二分する閾値の非存在下での、時間事象データ予測に関するパフォーマンス(ＡＵＣに類する)の指標である。
３. ＣＶ下に予測されたＦＦＰＥブロックの５切片にわたるシグネチャースコアにおける変動性の評価。変動性を、５サンプルにわたるシグネチャースコアの標準偏差(ＳＤ)を計算し、ＳＤをシグネチャースコア範囲の比(すなわちパーセントＳＤ計算)として表すことにより決定した。
訓練事例集合で高ＡＵＣ、Taylorセットで高Ｃ指数および不均一性サンプルにおいて低ＳＤをもたらしたシグネチャー長を選択した。
【０２４９】
多変数解析
興味深いのは、Taylorデータセットにおける前立腺癌患者の生化学的再発までの期間である。多変数Ｃｏｘ生存モデリングを使用して、バイオマーカーとの相互作用を試験し、説明し、予後因子を理解し、予後因子の相対的効果をモデル化した。臨床判断に基づき、術前ＰＳＡ(４ng／ml)、病理段階(“Ｔ２  Ａ／Ｂ／Ｃ”、“Ｔ３  Ａ／Ｂ／Ｃ”、“Ｔ４”)、グリーソン(＜７、７、８〜９)および二分化シグネチャースコアを独立した予測変数として使用した。術前ＰＳＡのｌｏｇ２変換を適用した。複数インピュテーションを使用して、全ての利用可能な事象が解析に使用されたことを確実にした。サンプルサイズは、４６名が生化学的再発事象を有する１６８患者で、生化学的再発までの中央期間は約１５年であった。比例ハザード仮定の公的試験、Ｐｒｅ  ＰＳＡのｌｏｇ変換の関数形式の評価およびネルソン・アーラン累積ハザード関数のグラフプロットを使用するモデルフィットは、全て、懸念の原因を提供しなかった。解析からの除去における２以上の標準誤差の回帰係数への変化により定義される１２の影響の大きなデータ点を同定した。これらを除かずまたはさらに試験されなかった。
【０２５０】
モデル選択後、２つの独立した前立腺癌データセットを最終モデルでさらに評価した。
１. Affymetrix U133Aプラットフォームにプロファイルされた７０の公的に利用可能な原発前立腺腫瘍サンプル(Glinsky et al)。
ａ. 臨床的情報は生化学的再発を含んだ(二成分転帰としてのみ)
２. Affymetrixヒトエクソンアレイプラットフォームにプロファイルされた５４５の公的に利用可能な原発前立腺腫瘍サンプル(Erho et al 2013)。
ａ. 臨床的情報は転移性再発を含んだ(二成分転帰としてのみ)
これらのデータセットの各々のパフォーマンスを、シグネチャーが再発する患者と再発しない患者を、スコアが高いほど、転移様疾患(悪い予後)を有し、それ故に再発転帰となる可能性が高い患者を表すとの仮定の下区別できることを確立するために、ＡＵＣを使用して評価した。
【０２５１】
乳癌データセットにおける最終モデルの評価
さらに興味がもたれているのは、未処置患者における予後予測に関する他のホルモン関連データセットにおける最終シグネチャーの評価である。３ＥＲ陽性乳癌データセットを評価した。
１. Gene Expression Omnibusデータベース、受入番号GSE2034から検索したデータセット
ａ. ２０９リンパ節転移陰性ＥＲ陽性患者
ｂ. エンドポイント：再発までの期間
２. Gene Expression Omnibusデータベース、受入番号GSE7390から検索したデータセット
ａ. １３４リンパ節転移陰性ＥＲ陽性患者
ｂ. エンドポイント１：無再発生存(ＲＦＳ)
ｃ. エンドポイント２：無遠隔転移生存(ＤＭＦＳ)
ｄ. エンドポイント３：全生存(ＯＳ)
３. Gene Expression Omnibusデータベース、受入番号GSE2990から検索したデータセット
ａ. １４９ＥＲ陽性患者
ｂ. エンドポイント１：無再発生存(ＲＦＳ)
ｃ. エンドポイント２：無遠隔転移生存(ＤＭＦＳ)
【０２５２】
各データセットについて、中央シグネチャースコアカットオフを適応して、中央値を越える得点ならばシグネチャー陽性(転移様)またはその他であればシグネチャー陰性(非転移様)の何れかとして患者を予測した。カプラン・マイヤー曲線を使用して、患者の２サブグループ間の生存差異を観察した。各エンドポイントに対するシグネチャー・コールのＣｏｘ比例ハザード回帰分析を使用して、各臨床的エンドポイントに対するパフォーマンスの指標としてシグネチャーに対する一変量ハザード比を計算した。
【０２５３】
結果
１２６サンプルがマイクロアレイＱＣを通過し、続いて１０００の最も可変の遺伝子に基づく教師なし階層的クラスタリングを受けた。４サンプルクラスターおよび４遺伝子クラスターを道程した(図１)。サンプルクラスターと腫瘍タイプの間に有意な相関があった。クラスター１および２(青色四角で強調)は主に転移および原発腫瘍からなり、クラスター３(赤色四角で強調)および４(黄色四角で強調)はそれぞれ良性および原発腫瘍からなった(ｐ＜０.０００１、表１)。機能解析(図１)は、クラスター１および２(転移および原発様転移腫瘍)が細胞接着、細胞分化および細胞発生に関連する遺伝子の下方制御、アンドロゲン関連処理および上皮間葉転換(ＥＭＴ)の上方制御により特徴付けられることを確認した(クラスター１および２は、以後“予後不良”群と称する)。クラスター３およびクラスター４(良性および原発様良性腫瘍)は、細胞接着、炎症性応答および細胞発生と関連する遺伝子の上方制御と関係した(クラスター３およびクラスター４は、以後“予後良好”と称する)。シグネチャー開発の目的で、クラスター１およびクラスター２の患者を、“予後不良”としてクラス標識し、クラスター３およびクラスター４における患者を“予後良好”としてクラス標識した。
【０２５４】
全ての考慮したシグネチャー長でのシグネチャー開発からの結果を図２、図３および図４に示し、これは、それぞれ、エンドポイント予測のための訓練事例集合におけるＡＵＣ、転移性再発までの期間に関するTaylorデータにおけるＣ指数および不均一性サンプルにおけるパーセントＳＤを示す。７０遺伝子のシグネチャー長を、ＡＵＣが高いままであるシグネチャー長(図２)、ＳＤが低いままであるシグネチャー長(図４)およびTaylorサンプルにおいてｃ指数値が高いままである最小シグネチャー長(図３)として選択した。
【０２５５】
最終７０遺伝子モデルのシグネチャーコンテントおよび重み付けを表１に挙げる。Taylorデータで計算した７０遺伝子スコアを、シグネチャースコア＞０.４２４１を有する患者が“予後不良”として分類され、シグネチャースコア≦０.４２４１を有する患者が“予後良好”として分類された０.４２４１閾値で二分した。予後良好および不良へのシグネチャー分類を使用して、２つの予測群について生存確率の差異を示すカプラン・マイヤー曲線を作成した。図５は、転移性再発までの期間エンドポイントのカプラン・マイヤーを示し(一変量ハザード比＝６.３２[１.９８、２０.２０])、図６は生化学的再発までの期間エンドポイントのカプラン・マイヤーを示す(一変量ハザード比＝３.７６[１.７０、８.３４])。
【０２５６】
図７および付随する表は、多変数解析の結果を示す。プロットは、ワルドのカイ二乗統計値からモデルにおける各変数の部分的効果を評価するその自由度を減じたものを表す。グリーソンは、最も重要な因子であり、バイオマーカー(すなわち遺伝子シグネチャー)および術前ＰＳＡが続く。これらの結果は、バイオマーカーが、標準病理学的因子の上に付加的予後情報を提供する。バイオマーカーと術前ＰＳＡの相互作用のため、これらの変数(および／または他の予後因子)を纏めて、複合リスクスコアを作成することも一つの可能性である。７０遺伝子シグネチャーモデルを２つの独立した前立腺癌データセットに適用した。
【０２５７】
図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれGlinksyおよびErhoデータセットの再発転帰に対するシグネチャースコア評価からのＲＯＣ曲線を示す。生化学的再発予測に関するGlinksyデータにおけるＡＵＣは０.６９[０.５７、０.７９]であり、転移性再発予測に関するErhoデータにおけるＡＵＣは０.６１[０.５７、０.６５]であった。
【０２５８】
乳癌データセットにおける最終モデルの評価
３乳癌データセットにおける７０遺伝子シグネチャーの評価の結果を以下に記載する。
１. Gene Expression Omnibusデータベース、受入番号GSE2034から検索したデータセット
ａ. ２０９リンパ節転移陰性ＥＲ陽性患者
ｂ. エンドポイント：再発までの期間
ｉ. ハザード比＝１.２４[０.８０、１.９２](カプラン・マイヤーを図９に示す)
ii. 再発予測に関するＡＵＣ＝０.６２；ｐ＝０.００２(ＲＯＣ曲線は図１０に示す)
２. Gene Expression Omnibusデータベース、受入番号GSE7390から検索したデータセット
ａ. １３４リンパ節転移陰性ＥＲ陽性患者
ｂ. エンドポイント１：無再発生存(ＲＦＳ)
ｉ. ハザード比＝１.７４[１.０４、２.９３](カプラン・マイヤーを図１１に示す)
ｃ. エンドポイント２：無遠隔転移生存(ＤＭＦＳ)
ｉ. ハザード比＝２.０１[１.０２、３.９６](カプラン・マイヤーを図１２に示す)
ｄ. エンドポイント３：全生存(ＯＳ)
ｉ. ハザード比＝２.５４[１.２４、５.１８](カプラン・マイヤーを図１３に示す)
３. Gene Expression Omnibusデータベース、受入番号GSE2990から検索したデータセット
ａ. １４９ＥＲ陽性患者
ｂ. エンドポイント１：無再発生存(ＲＦＳ)
ｉ. ハザード比＝１.９１[１.１７、３.０９](カプラン・マイヤーを図１４に示す)
ｃ. エンドポイント２：無遠隔転移生存(ＤＭＦＳ)
ｉ. ハザード比＝２.３７[１.２６、４.４４](カプラン・マイヤーを図１５に示す)
【０２５９】
参考文献
1. Irizarry RA, Bolstad BM, Collin F, Cope LM, Hobbs B, Speed TP. Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucleic acids research 2003;31:e15.
2.Tibshirani R, Walther G, Hastie T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. J Roy Stat Soc B 2001;63:411-23.
3. Ward JH. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association 1963;58:236-&.
4. Ashburner M, Ball CA, Blake JA, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature genetics 2000;25:25-9.
5. Cho RJ, Huang MX, Campbell MJ, et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nature genetics 2001;27:48-54.
6. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the False Discovery Rate - a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. J Roy Stat Soc B Met 1995;57:289-300.
【０２６０】
実施例２  −  全プローブセットの有効性確認
目的：
この解析の目的は遺伝子あたりの無作為プローブセットを選択したときの７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスの評価である。これは、シグネチャー遺伝子と関連するあるプローブセットの有意性の証拠を提供する。
【０２６１】
データ：
表２６は、シグネチャー遺伝子あたり利用可能なプローブセット数を概説する。表は、遺伝子あたりに選択可能なプローブセットの数が、遺伝子あたり１から最大２１プローブセットで変わることを示す。
【０２６２】
【表２８−１】
2018527886.tif 000054
【表２９】
2018527886.tif 000055
【０２６３】
解析：
次の解析工程を実施した。
・訓練データマトリクス前処理(ｎ＝１２６サンプル)
○ＲＭＡ背景補正
○分位正規化
○ＲＭＡ集計
・各シグネチャー遺伝子にアノテートされた無作為プローブセットを使用する訓練サンプルのためのシグネチャースコアの作成、１０００回
・サブタイプ標識に関するシグネチャースコアを使用するＡＵＣパフォーマンスの計算
・Ｍｉｎ(ＡＵＣ)＝０.９９６４およびＭａｘ(ＡＵＣ)＝１.００
・これは、全プローブセットがサブタイプ同定についてのシグネチャーとして有効であることを示す
完全性のために、シグネチャー遺伝子あたりのプローブセットの無作為選択は、＞１プローブセットのシグネチャー遺伝子についてのみ適用可能である、すなわちシグネチャー遺伝子の３０は遺伝子あたり１プローブセットしか有さず、従って、これらの遺伝子について、同じプローブセットが各回選択される。
【０２６４】
実施例３  −  ７０遺伝子シグネチャーについての検証研究
序論
先の実施例で概説したとおり、前立腺癌サンプルの探索コホートの転写プロファイルおよび階層的クラスタリングを使用して、我々は、転移性疾患および同時の転移を有することが知られる前立腺癌とクラスター化される、原発前立腺癌の異なる分子サブグループを同定した。転移性サンプルとクラスター化される原発腫瘍サンプルのこのサブグループは、予後不良集団を表し、一方良性様原発腫瘍は、予後良好サブグループを定義する。サブグループの機能解析は、上皮間葉転換(ＥＭＴ)および細胞遊走のような転移に関与することが知られる生物学的過程を同定した。このクラスターは、それ故に、‘転移様’サブグループとして同定され、この明細書の目的上‘Ｍｅｔ様’と称される。
【０２６５】
我々は、患者の‘Ｍｅｔ様’サブグループを前向きに同定するための７０遺伝子シグネチャーを開発した。この７０遺伝子アッセイを使用して、原発腫瘍からの疾患進行の前向き評価、疾患再発および／または転移進行の可能性の決定ができる。我々は、また、先に、７０遺伝子シグネチャーがまた不均一性試験において、サブグループ検出およびシグネチャースコア安定性を維持し、良好なパフォーマンスを示すことも示した。
【０２６６】
我々はまた異なる臨床的エンドポイントを有する３つの独立したインシリコデータセットにおける７０遺伝子シグネチャーを使用したこの分子サブグループの予後予測因子としての有意性も示している。Glinksyデータセット(７９前立腺癌例)において、シグネチャーは、統計学的に有意なＡＵＣ＝０.６９[０.５７−０.７９]、ｐ＝０.００３２で生化学的再発エンドポイントの良好な識別を示した(Glinsky et al 2004)。またErhoデータセット(５４５前立腺癌例)において、患者転移性再発エンドポイントを分類するシグネチャーを用いて、統計学的に有意な中程度の識別が観察された(ＡＵＣ  ０.６１２[０.５６９−０.６５３]、ｐ＜０.０００１)(Erho et al 2013)。最後に、Taylorデータセットにおいて、シグネチャーは、患者の転移性再発までの期間(ＨＲ＝６.３２[１.９８−２０.２０]、ｐ＜０.０００１)およびＨＲ  ３.７６[１.７０−８.３４]、ｐ＜０.０００１で生化学的再発までの期間と統計学的に有意に相関した(Taylor et al 2010)。重要なことに、転移性生物学サブグループはまたグリーソンスコアのような既知予後因子と無関係に前立腺摘出手術後の疾患再発により同定される悪い転帰の予測も示している。
【０２６７】
治癒的手術または照射後の再発が高リスクである前立腺癌患者の同定は、さらなる処置を必要としない男性への不必要な介入および副作用を避けながら、アジュバント化学療法または照射処置を受けるべき男性を同定するための重要な臨床的要求である。これに基づき、患者のこの高リスク集団の同定における我々の７０遺伝子アッセイの能力およびパフォーマンスは、治癒的手術後の摘出物または治癒的放射線療法後の生検検体の臨床的前立腺サンプルの独立したコホートにおける包括的臨床的検証を必要とした。
【０２６８】
目的
原発前立腺摘出物における前立腺予後７０遺伝子アッセイのパフォーマンスをさらに評価すること。
原発局在化前立腺癌摘出の独立したコホートにおける前立腺予後７０遺伝子アッセイを、治癒を意図する手術後生化学的再発および／または転移性疾患進行を発症するリスクが高い前立腺癌患者のサブグループを同定する能力について臨床的に検証すること。
摘出検体と比較した前立腺生検における前立腺予後７０遺伝子アッセイのパフォーマンスを評価すること。
原発局在化前立腺癌摘出の独立したコホートにおける前立腺予後７０遺伝子アッセイを照射処置後生化学的再発および／または転移性疾患進行を発症するリスクが高い前立腺癌患者のサブグループを同定する能力について臨床的に検証すること。
【０２６９】
材料および方法
７０遺伝子予後アッセイの処理および臨床的検証を、データ品質、整合性および検証目標を損なう恐れのある発現データにおける技術的または生物学的製剤交絡を避けるために、盲検式および無作為化方法で実施した。
【０２７０】
前立腺癌腫瘍材料
この研究は、前立腺癌検体の２つの別個のコホートの遺伝子発現解析を実施した。第一検証コホートはAlmac Diagnosticsにより内部で集められ、ユニバーシティ・カレッジ・ダブリン(６２サンプル)、ウェールズ癌バンク(１００サンプル)、サリー大学(４１サンプル)およびオスロ大学病院(１４６サンプル)の４医療施設から得た３４９前立腺摘出ＦＦＰＥ組織サンプルを含んだ。このコホートは３つの重要な臨床群である非再発患者(１８９サンプル)、生化学的再発(ＰＳＡ再発とも称する)患者(１１２サンプル)および転移進行患者(４８サンプル)にわたるサンプルからなった。摘出データセット組み込みサンプルを、次の包含基準に基づき採取した。
臨床的ＴステージＴ１ａ〜Ｔ３ｃ(診断時ＮＸＭ０)
治癒を意図する根治的前立腺摘出手術を受けた
ネオアジュバントホルモンまたは治療処置を受けていない
非再発群内の患者はアジュバント処置を受けていてはならない
３〜５年の臨床フォローアップデータが入手可能
前立腺摘出コホートのデータ解析に利用した人口統計的、臨床的および病理学的変数を表２７に要約する。
【０２７１】
第二の検証コホートは、FASTMAN Research Groupの一部としてのＱＵＢと協同して採取し、３１２前立腺生検ＦＦＰＥ組織サンプルを含んだ。このコホートは、５８生化学的再発、２４転移進行および１８去勢耐性前立腺癌(ＣＲＰＣ)が組み込まれた６０の処置失敗患者からなった。生検データセット組み込みサンプルを、次の包含基準に基づき採取した。
臨床的ＴステージＴ１ａ〜Ｔ３ｃ(診断時ＮＸＭ０)
治癒を意図した放射線療法を受けた
３〜５年の臨床フォローアップデータが入手可能
前立腺生検コホートのデータ解析に利用した人口統計的、臨床的および病理学的変数を表２８に要約する。
前立腺予後アッセイの検証としてのサンプル取得およびデータセット解析のための倫理審査による承認は、East of England Research Ethics Committeeから得た(Ref:14/EE/1066)。
【０２７２】
前立腺癌サンプルの遺伝子発現プロファイリング
サンプルプロファイリング前に、臨床的サンプルを、予め決定した因子の一覧、すなわち臨床的Ｔステージ、ＰＳＡ、グリーソン、年齢および応答を使用して、ＲＮＡ抽出バッチについて無作為化し、ｃＤＮＡ増幅処理バッチについて再無作為化した。医療施設因子も検証１に含んだ。試薬、設備および操作者のさらなる無作為化もサンプル処理前に実施した。
全サンプルは、中央病理判定され(E. Kay RCSI教授)、最も優勢なグリーソングレードを有する腫瘍領域に基づく巨視的解剖のために印をつけた。摘出サンプルについて、２×１０μm切片を処理し、一方生検サンプルでは４×５μm切片をプロファイリングに使用した。総ＲＮＡを、Roche High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用して巨視的解剖したＦＦＰＥ組織から抽出した。ＲＮＡを相補的デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)に変換させ、これを続いて増幅し、WT-OvationTM FFPE RNA Amplification System V3(NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA)のＳＰＩＡ(登録商標)技術を使用して一本鎖に返還した。次いで増幅一本鎖ｃＤＮＡを断片化し、FL-OvationTM cDNA Biotin Module V3(NuGEN Technologies Inc.)を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを次いでAlmac Prostate Cancer DSATMとハイブリダイズさせた。Almac Prostate Cancer DSATM研究ツールは貴重な保管組織バンクの使用を可能とする、ＦＦＰＥ組織サンプルの解析用に最適化されている。Almac Prostate Cancer DSATM研究ツールは、正常および癌性両方の前立腺組織におけるトランスクリプトームを表す革新的マイクロアレイプラットフォームである。その結果、Prostate Cancer DSATMは、一般的マイクロアレイプラットホームを使用しては入手できない、前立腺疾患および組織設定内のトランスクリプトームの包括的提示を提供する。アレイをAffymentrix Genechip(登録商標)Scanner 7G(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)を使用してスキャンした。
【０２７３】
工程管理
Stratagene Universal Human Reference(ＵＨＲ)サンプルおよびＥＳ−２細胞株材料を、臨床コホートのプロファイリング中の標準指標として、各処理バッチ内の工程管理として使用した。ＵＨＲ対照は、マイクロアレイプロファイリング実験のための普遍的参照ＲＮＡとして使用されるよう設計される。これらの対照は、対照ＲＮＡプールを作るための等量のＤＮａｓｅ処理細胞株ＲＮＡのプールから産生されている。ＥＳ−２細胞株は、卵巣癌を表すヒト明細胞癌細胞株であり、卵巣外科的腫瘍から確立された。ＥＳ−２細胞株は線維芽細胞形態学により特徴付けられ、接着性細胞株として培養される。細胞は、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)で修飾したマッコイ５ａ培地に、約２４時間の倍加時間で維持された。接着性性質および速い倍加時間のため、これらの細胞は、標準細胞株対照として大きくするのに適する。約１×１０６  ＥＳ−２細胞をペレット化し、一夜固定し、その後ホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)組織ブロックとして処理した。調製したＥＳ−２細胞株ＦＦＰＥブロックの一つの１０μm切片を、ＲＮＡ抽出に使用し、その後前立腺転移アッセイ特異的処理対照として下流プロファイリングした。
【０２７４】
データ作成およびＱＣ
サンプル処理中のサンプルの継続的ＱＣ評価を実施した。ＲＮＡおよびｃＤＮＡ濃度、すなわちＲＮＡ濃度について最小１２.５ng／μlおよびｃＤＮＡ濃度について最小１４０ng／μlのサンプルをマイクロアレイプロファイリングに進めた。
マイクロアレイデータ品質をこれらのコホートのプロファイリングを通してバッチ毎に連続的およびプロファイリングの完了後累積的に評価して、解析前に低品質サンプルを除外した。サンプルを、Robust Multi-Array(ＲＭＡ)平均方法を使用して前処理した(Irizarry et al. 2003)。ＱＣ評価は、次の品質測定基準の組み合わせを含んだ。
アレイ画像解析：アレイデータを何らかの画像アーチファクトの同定のために試験した
GeneChip QC：パーセント存在(％Ｐ)、平均シグナル非存在、スケール因子、平均背景および生Ｑ。％Ｐ＜１５％のサンプルは、ＱＣ不合格と判定した
主成分解析：ホテリングＴ２および残差Ｑ方法を、発現レベルでのサンプル外れ値同定に使用した
強度分布解析：コルモゴロフ・スミルノフ統計値(Massey. 1951)を使用して、サンプル強度分布を試験し、外れ値を同定した
前立腺アッセイ特異的細胞株ＥＳ−２について予め決定した合格限界を、統計的方法対照(ＳＰＣ)チャートを使用してモニターした。
【０２７５】
シグネチャースコアの作成
サンプルを、７０遺伝子アッセイ開発中に作成したｒｅｆＲＭＡ(Irizarry et al. 2003)前処理モデルを使用して、サンプル毎に前処理した。Ensembleバージョン７５を使用して、プローブセットを対応するEntrez Gene IDにアノテートした。プローブセット発現を、中央値を使用してEntrez Gene IDレベルに集約させた(およびアンチセンスプローブセットを除外)。アッセイスコアを、部分的最小二乗モデルからの次の式を使用して計算した。
【数３】
2018527886.tif 000056
式中、ｗｉは各Entrez geneの荷重であり、ｘｉは遺伝子発現であり、ｂｉはEntrez Gene特異的バイアスであり、ｋ＝０.４３６５である(表２９)。アッセイ・コールを、全サンプルについて所定のカットオフに基づき帰属させた。連続的シグネチャー結果＞カットオフのサンプルをアッセイ陽性’、他を‘アッセイ陰性’と標識した。
【０２７６】
一変量および多変数解析
生化学的再発(ＢＣＲ)までの期間および転移性疾患までの期間を使用する時間事象(生存)解析を使用して、７０遺伝子予後アッセイの予後効果を評価した。アッセイ状態(陽性または陰性)により定義した患者群の生存分布をカプラン・マイヤー(ＫＭ)生存曲線を使用して可視化する。
Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを使用して、７０遺伝子アッセイ状態および生存(ＢＣＲおよび転移性疾患)を評価した。ハザード比(ＨＲ)を使用して、アッセイ状態と生存エンドポイントの効果(関係)を定量化した。一変量(未調整)解析に加えて、多変数(調整)Ｃｏｘモデルを使用して、ＢＣＲおよび転移性疾患に対するアッセイ状態(陽性または陰性)の効果を評価し、生存転帰について診断時ＰＳＡ、患者年齢およびグリーソンスコアで調整した。全ての推定効果を、有意性と無関係に、アッセイおよびこれらの標準予後因子を含んだ、解析からの９５％信頼区間と共に報告する。Ｃｏｘ比例ハザード試験および有意のレベルからの推定パラメータ解釈、適合モデルの適合度を比例ハザード仮定の履行の確認を含み、調べた(Gramsbsch & Therneau, 1994)。
多変数(調整)Ｃｏｘモデルも使用して、ＢＣＲおよび転移性疾患に対するアッセイ状態(陽性または陰性)の影響を評価し、ＣＡＰＲＡスコアについて調整した(Cooperberg et al. 2006)。各サンプルのＣＡＰＲＡスコアを、ＰＳＡ、生検グリーソンスコア、臨床的Ｔステージ、陽性生検コアのパーセンテージおよび年齢を使用して決定した。
統計的有意性の全試験は、有意の５％レベルで２側であった。統計的解析をMedCalc version 13を使用して実施した。
【０２７７】
結果
７０遺伝子シグネチャーは、摘出検証コホートにおける‘Ｍｅｔ様’サブグループの生化学的再発までの期間を予測する
５〜１０年臨床フォローアップデータを使用して、一変量生存解析を、マイクロアレイデータＱＣを通過した３２２サンプルで実施し、手術後の摘出データセットにおける
生化学的再発までの期間の予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。カプラン・マイヤー生存曲線は、非Ｍｅｔ様サンプル(緑色)と比較して、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の早い再発までの期間(月)の予測における７０遺伝子シグネチャーの有意な相関を示す。これは、‘Ｍｅｔ様’サブグループ内のサンプルが、治癒を意図する根治的前立腺摘出手術後、生化学的疾患再発を発症するリスクが高いことを示唆する(ＨＲ＝１.７４[１.１８−２.５６]；ｐ＝０.０００９)(図１６)。データセットの多変数解析を実施して、手術時の年齢、診断時のＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む既知臨床的予後因子と独立して、生化学的再発の予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。これらの予後因子を考慮して、前立腺予後的７０遺伝子シグネチャーは、年齢、ＰＳＡおよびグリーソングレード(＜７および＞７の両方)と独立して、生化学的再発の予測と有意に相関した(ＨＲ  １.６５[１.１６−２.３４]；ｐ＝０.００５５)(表３０ａ)。
【０２７８】
７０遺伝子シグネチャーは摘出検証コホートにおける‘Ｍｅｔ様’サブグループの転移性疾患進行までの期間を予測する
次に、５〜１０年臨床フォローアップデータを使用して、一変量生存解析を、マイクロアレイデータＱＣを通過した３２２サンプルでも行い、手術後の摘出データセットにおける局所または遠隔部位への転移進行までの期間の予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。生化学的再発と同様に、カプラン・マイヤー生存曲線は、非Ｍｅｔ様サンプル(緑色)と比較して‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の転移進行予測における７０遺伝子シグネチャーの有意な相関を示す。これは、‘Ｍｅｔ様’サブグループ内の患者が、治癒を意図する根治的前立腺摘出手術後転移性疾患進行を発症するリスクが高いことを示唆する(ＨＲ＝３.６０[１.８１−７.１３]；ｐ＜０.０００１)(図１７)。摘出データセットの多変数解析を調べ、手術時の年齢、診断時のＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む既知臨床的予後因子と独立して、転移進行予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。‘Ｍｅｔ様’サブグループの前立腺予後的７０遺伝子シグネチャースコアは、年齢、ＰＳＡおよびグリーソングレード(＜７および＞７の両方)とは無関係に、転移性疾患進行との有意な相関を示し(ＨＲ  ３.５０[１.９５−６.２７]；ｐ＜０.０００１)、したがって、この群内の患者の進行が‘高リスク’であることが支持される(表３０ｂ)。興味深いことに、７０遺伝子シグネチャーは、転移性疾患の予測について、年齢、ＰＳＡおよびグリーソン＜７とは対照的に予後因子として良好なパフォーマンスを示すことが明らかである(表３０ｂ)。
【０２７９】
７０遺伝子シグネチャーは、生検検証コホートにおける‘Ｍｅｔ様’サブグループの生化学的再発までの期間を予測する
一変量生存解析を、３２２サンプルの集めた５〜１０年フォローアップ臨床的データを使用して実施し、治癒を意図する放射線療法後の生検データセットにおける生化学的再発までの期間の予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。カプラン・マイヤー生存曲線は、非Ｍｅｔ様サンプル(緑色)と比較して、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の早い再発までの期間(月)の予測における７０遺伝子シグネチャーの有意な相関を示す。摘出データセットと同様、これは、‘Ｍｅｔ様’サブグループ内の患者が、治癒を意図する根治的放射線療法後、生化学的疾患再発を発症するリスクが高いことを示唆する(ＨＲ＝２.１８[１.１４−４.１７]；ｐ＝０.００４２)(図１８)。次いで、データセットの多変数解析を実施して、診断時の年齢、診断時のＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む他の一般的に使用される予後因子と独立して、生化学的再発予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。‘Ｍｅｔ様’群の前立腺予後的７０遺伝子シグネチャーは、年齢、ＰＳＡおよびグリーソングレード(＜７および＞７の両方)と独立して、生化学的再発の予測と有意に相関し(ＨＲ  １.９６[１.１１−３.４８]；ｐ＝０.０２２０)、このサブグループ内の患者が生化学的再発を発症するリスクが高いことを示唆する(表３１ａ)。注目すべきは、このデータは、共変数解析内の他の変数が‘Ｍｅｔ様’サブグループにおける高い疾患再発のリスクの同定と有意に相関しないことを示唆する(表３１ａ)。
【０２８０】
７０遺伝子シグネチャーは、生検検証コホートにおける‘Ｍｅｔ様’サブグループの転移性疾患進行までの期間を予測する
これに続いて、一変量生存解析をまた２４８のＱＣ通過サンプルでも実施し、手術後の生検データセットにおける、局所または遠隔部位何れかの転移進行までの期間の予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを決定した。生化学的再発と同様、カプラン・マイヤー生存曲線は、非Ｍｅｔ様サンプル(緑色)と比較して、‘Ｍｅｔ様’サブグループ(青色)の転移進行の予測における７０遺伝子シグネチャーの有意性を示す。これは、‘Ｍｅｔ様’サブグループ内の患者が治癒を意図する根治的放射線療法処置後、転移性疾患進行を発症するリスクが高いことを示唆する(ＨＲ＝３.５０[１.２８−９.５６]；ｐ＝０.００１７)(図１９)。生検データセットの多変数解析を実施して、さらに診断時の年齢、診断時のＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む他の既知臨床的予後因子と独立して、転移進行の予測における７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンスを評価した。前立腺予後的７０遺伝子シグネチャーは、年齢、ＰＳＡおよびグリーソングレード(＜７および＞７の両方)と独立して、転移性疾患進行の予測と有意に相関することを示した(ＨＲ  ２.６６[１.１０−６.４０]；ｐ＜０.０３０４)(表３１ｂ)。生検コホートにおける生化学的再発の評価と同様に、このデータは、共変数解析内の他の変数が、‘Ｍｅｔ様’サブグループにおける高い疾患再発のリスクの同定と有意に相関しないことを示唆する(表３１ｂ)。
【０２８１】
纏めると、摘出および生検コホート両方のデータは、最初の処置から３〜５年以内により高悪性度高リスクの疾患を発症するリスクが高い可能性がある前立腺癌患者を早期検出から同定するための患者層別因子として実行され得る前立腺癌分野における予後アッセイとして７０遺伝子シグネチャーを支持する。
【０２８２】
ＣＡＰＲＡスコアリングシステムと比較した生化学的および転移性再発における予後ツールとしての７０遺伝子シグネチャーのパフォーマンス
前立腺癌用のＣＡＰＲＡおよびＣＡＰＲＡ−Ｓスコアリングシステムは、術前生検材料(ＣＡＰＲＡ)および術後摘出材料(ＣＡＰＲＡ−Ｓ)を使用する、疾患再発リスク予測のために開発されている多変数予後ツールである。スコアリングシステムは、リスクレベルの範囲に基づき転帰を提供でき、ＰＳＡレベル、患者年齢、グリーソングレードおよび臨床的Ｔステージを考慮した得点システムにより計算され、それにより累積得点が高いほど、疾患再発のリスクが高い(Cooperberg et al 2005)。術後にリスクの評価および予測に使用されるＣＡＰＲＡ−Ｓも、精嚢侵襲(ＳＶＩ)、節外拡大(ＥＣＥ)、リンパ節侵襲(ＬＮＩ)および切除縁を含む付加的臨床的因子の採点を含む。生検材料についてＣＡＰＲＡスコアリングシステムに利用される唯一の付加的因子は、陽性スコア％＞または＜３４％である。まず、我々は、ＣＡＰＲＡ−Ｓスコアリングシステムと比較した新規７０遺伝子シグネチャーの予後パフォーマンスを検討した。多変数解析において、ＣＡＰＲＡ−Ｓ採点のみが生化学的再発と有意に相関したが(ＨＲ＝１.３６[１.２８−１.４５]、ｐ＜０.０００１)、転移アッセイおよびＣＡＰＲＡ−Ｓ採点両方が転移性疾患の発症と有意に相関した(ＨＲ  ２.５３[１.４０−４.６０]；ｐ＝０.００２４およびＨＲ＝１.４３[１.２８−１.６１]、ｐ＜０.０００１(表３２ａおよび３２ｂ)。これらのデータは、転移シグネチャーがＣＡＰＲＡ−Ｓスコアリングシステムにさらなる情報を提供することを示す。
【０２８３】
最後に、我々は、ＣＡＰＲＡスコアリングシステムと比較した我々の７０遺伝子シグネチャーの予後パフォーマンスも調べた。７０遺伝子シグネチャーのみが、予後転帰と有意に相関し、生検データセットにおける生化学的再発発症の機会が高いとして高リスク‘Ｍｅｔ様’サブグループを同定し(ＨＲ  ２.０５[１.１８−３.５９]；ｐ＝０.０１１９)、一方ＣＡＰＲＡスコアは、予後アッセイと独立して有意性を示さなかった(表３３ａ)。同様に、生検検証コホートにおいて、７０遺伝子シグネチャーのみが予後転帰と有意に相関し、高リスク‘Ｍｅｔ様’サブグループを転移性疾患進行の発症の機会が高いと同定した(ＨＲ  ３.３９[１.４４−７.９７]；ｐ＝０.００５４)(表３３ｂ)。合わせて、７０遺伝子シグネチャーとＣＡＰＲＡスコアリングシステムの比較は、生検材料における良好なパフォーマンスを示し、前立腺癌の分野内での予後アッセイとしての７０遺伝子シグネチャーの使用のさらなる証拠を提供する。
【０２８４】
考察
原発局在化前立腺癌の約３５％が、手術または外照射療法のような根治的処置にも関わらずより高悪性度および再発性疾患状態に進行するが、一方、原発癌の大多数は、臨床的に著しい疾患に進行しない。このことを念頭において、この分野内での大きな臨床的問題は、最終的にどの患者がさらなるおよびより強い処置レジメンを必要とする可能性があり、どの患者が、必要でないならば、毒性であり、耐容性が低い治療を避けることができるかを決定できるであろう、患者層別化を可能にするために、これらの患者サブグループを容易に識別するにはどうするかよいかである。層別化のための可能性のある取り組みは、単一予後因子の組み合わせとそれらの相関の両方あるいはＤＮＡ−マイクロアレイプロファイリングからの遺伝子発現プロファイルに基づく、複合予後因子の開発であると考えられている(Buhmeida et al 2006)。
【０２８５】
この取り組みを利用して、Almac Diagnosticsは、生化学的または転移性再発のより高悪性度の疾患を発症するリスクが高い高リスク前立腺癌集団の同定を促進する有望な予後アッセイとして、７０遺伝子シグネチャーを開発し、検証した。本明細書内のデータは、摘出および生検両方の材料における前立腺予後アッセイのパフォーマンスを強く支持する。原発前立腺摘出および生検の２つの独立した臨床的検証コホートにおいて、７０遺伝子シグネチャーは、‘Ｍｅｔ様’生物学内にあり、生化学的疾患再発または３〜５年のフォローアップ内の転移性疾患のリスクが高い患者サブグループを正確に同定できる。‘Ｍｅｔ様’生物学を有する患者のサブグループは、術後にアジュバントホルモン療法、放射線療法またはタキサン類での処置のようなさらなる処置を受けるべき集団であると考えられる。これとは反対に、非Ｍｅｔ様サブグループ内と同定された患者は、さらなる処置を免れ、標準臨床的フォローアップを介してモニターすべきである。この予後アッセイは、二つの明らかな臨床的有用性を有することが示される。
摘出材料からの、治癒を意図する根治的前立腺摘出手術後、高リスク疾患(生化学的再発または転移進行)に進行し得る定義した前立腺癌コホートのサブセットの予測。
生検材料からの、治癒を意図する根治的前立腺摘出手術後、高リスク疾患(生化学的再発または転移進行)に進行し得る定義した前立腺癌コホートのサブセットの予測。
【０２８６】
表の解説
表２８  −  内部摘出コホートの解析について考慮した人口統計的、臨床的および病理学的変数の要約。表は、患者総数、手術時の年齢の中央値および範囲(歳)、再発までの期間(月)、術前ＰＳＡレベル(ng／ml)および４医療施設の各々からの、各再発サブグループ内で、代表的グリーソングレードの各々と相関する、各病理学的Ｔステージサブグループ内で、リンパ節侵襲(ＬＮＩ)、精嚢侵襲(ＳＶＩ)、節外拡大(ＥＣＥ)および陰性、汎発性または限局性切除縁を有する患者と相関する患者数(％)を概説する。
【０２８７】
表２９  −  FASTMAN生検コホートの解析について考慮した人口統計的、臨床的および病理学的変数の要約。表は、患者総数、診断時の年齢の中央値および範囲(歳)、再発までの期間(月)、診断時のＰＳＡレベル(ng／ml)および、各再発サブグループ内でおよび各病理学的Ｔステージサブグループ内で、代表的グリーソングレードの各々と相関する患者数(％)を概説する。
【０２８８】
表３０  −  ７０遺伝子シグネチャーの遺伝子、重み付けおよびバイアス。
【０２８９】
表３１  −  Ａ)手術時の年齢、ＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む他の予後臨床的因子と独立したアッセイパフォーマンスを証明する、生化学的再発についての内部摘出コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの多変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。Ｂ)手術時の年齢、ＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む他の予後臨床的因子と独立したアッセイパフォーマンスを証明する、転移性疾患進行についての内部摘出コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの多変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。
【０２９０】
表３２  −  Ａ)診断時の年齢、ＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む他の予後臨床的因子と独立したアッセイパフォーマンスを証明する生化学的再発についてのFASTMAN生検コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの多変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。Ｂ)診断時の年齢、ＰＳＡレベルおよび複合グリーソンスコアを含む他の予後臨床的因子と独立したアッセイパフォーマンスを証明する、転移性疾患進行についてのFASTMAN生検コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの多変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。
【０２９１】
表３３  −  Ａ)別の予後採点アッセイに対するアッセイパフォーマンスを証明する、生化学的再発についての内部摘出コホート内のＣＡＰＲＡ−Ｓスコアリングシステムと比較した７０遺伝子シグネチャーの共変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を、各比較について表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。Ｂ)別の予後採点アッセイに対するアッセイパフォーマンスを証明する、転移性疾患進行についての内部摘出コホート内のＣＡＰＲＡ−Ｓスコアリングシステムと比較した７０遺伝子シグネチャーの共変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を、各比較について表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。
【０２９２】
表３４  −  Ａ)別の予後採点アッセイに対するアッセイパフォーマンスを証明する、生化学的再発についてのFASTMAN生検コホート内のＣＡＰＲＡスコアリングシステムと比較した７０遺伝子シグネチャーの共変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を、各比較について表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。Ｂ)別の予後採点アッセイに対するアッセイパフォーマンスを証明する、転移性疾患進行についてのFASTMAN生検コホート内のＣＡＰＲＡスコアリングシステムと比較した７０遺伝子シグネチャーの共変数解析。Ｐ値、ハザード比(ＨＲ)およびＨＲの９５％信頼区間(ＣＩ)を、各比較について表内に概説する。赤色で強調しているＰ値は統計的有意を示す。
【０２９３】
【表３０】
2018527886.tif 000057
【０２９４】
【表３１】
2018527886.tif 000058
【０２９５】
【表３２】
2018527886.tif 000059
【０２９６】
表３１：ａ)生化学的再発およびｂ)転移進行についての内部摘出コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの多変数解析
ａ)生化学的再発
【表３３ａ】
2018527886.tif 000060
ｂ)転移性疾患
【表３３ｂ】
2018527886.tif 000061
【０２９７】
表３２：ａ)生化学的再発およびｂ)転移進行についてのFASTMAN生検コホートにおける７０遺伝子シグネチャーの多変数解析。
ａ)生化学的再発
【表３４ａ】
2018527886.tif 000062
ｂ)転移性疾患
【表３４ｂ】
2018527886.tif 000063
【０２９８】
表３３：ａ)生化学的再発およびｂ)転移進行についての内部摘出コホートにおけるＣＡＰＲＡスコアリングシステムに対する７０遺伝子シグネチャーの解析および比較。
ａ)生化学的再発
【表３５ａ】
2018527886.tif 000064
ｂ)転移性疾患
【表３５ｂ】
2018527886.tif 000065
【０２９９】
表３４：ａ)生化学的再発およびｂ)転移進行についてFASTMAN生検コホートにおけるＣＡＰＲＡスコアリングシステムに対する７０遺伝子シグネチャーの解析および比較。
ａ)生化学的再発
【表３６ａ】
2018527886.tif 000066
ｂ)転移性疾患
【表３６ｂ】
2018527886.tif 000067
【０３００】
実施例４  −  コアおよび最小遺伝子解析
サンプル：
・内部訓練サンプル(探索コホート)：このサンプルセットは、Almac Prostate DSATMマイクロアレイにプロファイルした１２６のＦＦＰＥ前立腺摘出ＦＦＰＥ組織サンプルからなった。
・FASTMAN Biopsy Validationコホート：このサンプルセットは、Movember Programme下FASTMAN Research Groupと協同して採取した２４８前立腺生検ＦＦＰＥ組織サンプルからなった。
・Internal Resection Validationコホート：このサンプルセットは、Almac Diagnosticsにより内部的に採取した３２２前立腺摘出ＦＦＰＥ組織サンプルからなった。サンプルは、ユニバーシティ・カレッジ・ダブリン(６１サンプル)、ウェールズ癌バンク(８５サンプル)、サリー大学(３４サンプル)およびオスロ大学病院(１４２サンプル)の４医療施設から得た。
【０３０１】
方法：
コア遺伝子解析
シグネチャーのコア遺伝子セットを評価する目的は、シグネチャーから除いたときのパフォーマンスに対する影響に基づき、Entrez Geneのランキングを決定することである。
この解析は、元の７０シグネチャーEntrez Geneセットからの１０シグネチャーEntrez Geneの１０,０００無作為サンプリングを含んだ。各相互作用として、１０の無作為に選択したシグネチャーEntrez Geneを除き、残った６５遺伝子のパフォーマンスを、これら１０個のEntrez Geneを次の２データセットにおいて除いたときのＨＲ(ハザード比)パフォーマンスに対する影響を決定するためのエンドポイントを使用して評価した。
・FASTMAN Biopsy Validationコホート  −  ２４８サンプル
・Internal Resection Validationコホート  −  ３２２サンプル
FASTMAN生検検証を生化学的再発(ＢＣＲ)エンドポイントを使用して評価し、内部摘出検証を転移性再発(ＭＥＴ)エンドポイントを使用して評価した。２データセットの各々の中で、シグネチャーEntrez Geneの包含または除外に基づくＨＲパフォーマンス(デルタＨＲ)における変化に基づき荷重した。Entrez Geneランク付け‘１’は、除去したときパフォーマンスに最大の負の影響を有し、ランク付け‘７０’は、除去したときパフォーマンスに最小の影響を有する。
【０３０２】
最小遺伝子解析
Entrez Geneの最小数評価の目的は、有意なパフォーマンスが、元のシグネチャーの小さなサブセット内で達成できるかどうかの決定である。
この解析は、１個のEntrez gene／特性から開始して、最大３０個のEntrez Gene／特性で７０シグネチャーEntrez Geneの１０,０００無作為サンプリングを含んだ。各無作為に選択した特性長について、シグネチャーを導かれるＣＶおよびモデルパラメータ下のＰＬＳマシン学習方法を使用して再開発した。各特性長で、全ての無作為に選択したシグネチャーを適用して、次の２データセットについてシグネチャースコアを計算した。
・FASTMAN Biopsy Validationコホート  −  ２４８サンプル
・Internal Resection Validationコホート  −  ３２２サンプル
連続的シグネチャースコアを、ＨＲ効果を決定するための転帰で評価し、FASTMAN生検検証をＢＣＲで評価し、内部摘出検証をＭＥＴで評価した。各特性長での全無作為シグネチャーのＨＲを要約および作図し、ＣＶにわたるパフォーマンスを可視化した。
【０３０３】
結果
コア遺伝子解析
２データセットの７０遺伝子シグネチャーにおけるコア遺伝子解析の結果をこのセクションに提供する。
【０３０４】
・FASTMAN生検検証：７０シグネチャーEntrez Geneについてこのデータセットで測定したデルタＨＲパフォーマンスを図２０に示す。この図は、このデータセット内で良好なＨＲパフォーマンスの維持において最も重要である、シグネチャーにおける上位１０位にランク付けされたEntrez Geneを強調する。このランキングはまた下記表３５に見ることができる。
【表３７−１】
2018527886.tif 000068
【表３７−２】
2018527886.tif 000069
【０３０５】
・内部摘出検証：７０シグネチャーEntrez Geneについてこのデータセットで測定したデルタＨＲパフォーマンスを図２に示す。この図は、このデータセット内で良好なＨＲパフォーマンスの維持において最も重要である、シグネチャーにおける上位１０位にランク付けされたEntrez Geneを強調する。このランキングはまた下記表３６に見ることができる。
【表３８−１】
2018527886.tif 000070
【表３８−２】
2018527886.tif 000071
【０３０６】
・これら２データセットにわたるデルタＨＲを評価して、シグネチャーEntrez Geneの各々について複合Entrez Geneランキングを得た。これを下記表３７に要約する。
【表３９−１】
2018527886.tif 000072
【表３９−２】
2018527886.tif 000073
【表３９−３】
2018527886.tif 000074
【０３０７】
複合コアセット解析に基づきシグネチャーEntrez Geneに帰属されたランクを下記表３８に要約する。
【表４０−１】
2018527886.tif 000075
【表４０−２】
2018527886.tif 000076
【０３０８】
最小遺伝子解析
２データセットにおける７０遺伝子シグネチャーの最小遺伝子解析の結果をこのセクションに提供する。
・FASTMAN生検検証：このデータセットにおいて、特性長１〜３０のシグネチャーEntrez Geneの無作為サンプリングを使用して測定した平均ＨＲパフォーマンスを図２２に示す。この図は、有意なＨＲパフォーマンス(すなわちＨＲ＞１の低いＣＩ)を維持するために、最小１２のシグネチャーEntrez Geneを選択しなければならないことを示す。
・内部摘出検証：このデータセットにおいて、特性長１〜３０のシグネチャーEntrez Geneの無作為サンプリングを使用して測定した平均ＨＲパフォーマンスを図２３に示す。この図は、有意なＨＲパフォーマンス(すなわちＨＲ＞１の低いＣＩ)を維持するために、最小７のシグネチャーEntrez Geneを選択しなければならないことを示す。
【０３０９】
本発明は、ここに記載する特定の実施態様により範囲が限定されるものではない。事実、ここに記載するものに加えて、本発明の種々の修飾が上の記載および添付する図面から当業者には明らかとなる。このような修飾は、添付する特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。さらに、ここに記載する全ての実施態様は、適当であるならば、より広く適用でき、任意かつ全ての他の矛盾のない実施態様と組み合わせ可能であると考えられる。
【０３１０】
種々の刊行物がここに引用されており、その開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【図１】
2018527886.tif 000078
【図２】
2018527886.tif 000079
【図３】
2018527886.tif 000080
【図４】
2018527886.tif 000081
【図５】
2018527886.tif 000082
【図６】
2018527886.tif 000083
【図７】
2018527886.tif 000084
【図８】
2018527886.tif 000085
【図９】
2018527886.tif 000086
【図１０】
2018527886.tif 000087
【図１１】
2018527886.tif 000088
【図１２】
2018527886.tif 000089
【図１３】
2018527886.tif 000090
【図１４】
2018527886.tif 000091
【図１５】
2018527886.tif 000092
【図１６】
2018527886.tif 000093
【図１７】
2018527886.tif 000094
【図１８】
2018527886.tif 000095
【図１９】
2018527886.tif 000096
【図２０】
2018527886.tif 000097
【図２１】
2018527886.tif 000098
【図２２】
2018527886.tif 000099
【図２３】
2018527886.tif 000100
【配列表】
2018527886000001.app
【国際調査報告】
2018527886.tif 000101
2018527886.tif 000102
2018527886.tif 000103
2018527886.tif 000104
2018527886.tif 000105
2018527886.tif 000106