(57)【要約】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐから単離可能である単離されたタンパク質を本明細書に提供する。該タンパク質のうちの１つまたは複数を含む組成物、ならびに該タンパク質を作製するための方法及び該タンパク質を使用するための方法も提供する。電気泳動によりドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上で決定される８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、または６８ｋＤａの分子量を有する少なくとも２つの単離されたタンパク質であって、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから、鉄キレート剤を含む培地中でインキュベートするときは単離可能であり、前記鉄キレート剤を含まない前記培地中で増殖するときは単離可能でない前記タンパク質、及び薬学的に許容され得るキャリアを含み、  Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染症から動物を防護する、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動によりドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上で決定される８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、または６８ｋＤａの分子量を有する少なくとも２つの単離されたタンパク質であって、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから、鉄キレート剤を含む培地中でインキュベートするときは単離可能であり、前記鉄キレート剤を含まない前記培地中で増殖するときは単離可能でない前記タンパク質、及び
薬学的に許容され得るキャリアを含み、
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染症から動物を防護する、組成物。
【請求項２】
３５ｋＤａ及び３３ｋＤａの分子量を有する１つまたは２つのタンパク質をさらに含み、分子量が、電気泳動によりドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上で決定される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記動物が、マウス、ウシ、例えば酪牛、及びヒトから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質のうちの少なくとも１つが、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を含むタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから、鉄キレート剤を含む培地中でインキュベートするときに単離可能である８７ｋＤａタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４から選択されるタンパク質と構造的に類似する、または１００％同一性を有する少なくとも２つの単離されたタンパク質；ならびに
薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
【請求項８】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を含むタンパク質をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号４１、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４から選択されるタンパク質と構造的に類似する、または１００％同一性を有する少なくとも２つのタンパク質；及び
薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
【請求項１０】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を含むタンパク質をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
対象に、ある量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記対象における前記組成物の少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する抗体の生成を誘発するのに有効である、方法。
【請求項１３】
対象における感染症を処置するための方法であって、
有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物をグラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
対象における症状を処置するための方法であって、
有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物をグラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
対象におけるコロニー形成を低減させるための方法であって、
有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物をグラム陰性微生物によりコロニー形成された対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記グラム陰性微生物が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．．Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
対象における状態を処置するための方法であって、
有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記対象が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐにより引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記状態が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、またはそれらの組み合わせにより引き起こされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記状態が、乳房炎を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記状態が、対象の乳汁中の高体細胞数を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記状態が、低産乳量を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
対象における感染症を処置するための方法であって、
有効量の組成物を、グラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある対象に投与することを含み、前記組成物が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項２４】
対象における症状を処置するための方法であって、
有効量の組成物を、グラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある対象に投与することを含み、前記組成物が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項２５】
対象におけるコロニー形成を低減するための方法であって、
有効量の組成物を、グラム陰性微生物によりコロニー形成された対象に投与することを含み、前記組成物が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記グラム陰性微生物が、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象における状態を処置するための方法であって、
有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記組成物が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記対象が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐにより引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態が、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、またはそれらの組み合わせにより引き起こされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記状態が、乳房炎を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記状態が、対象の乳汁中の高体細胞数を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記状態が、低産乳量を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が哺乳類である、請求項１２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳類が、ヒトまたはウシである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．が、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａである、請求項１２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも７００マイクログラム（μｇ）及び１，２００μｇ以下のタンパク質が投与される、請求項１２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
タンパク質と特異的に結合する抗体を検出するためのキットであって、別々の容器内に：
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の単離されたタンパク質；及び
前記タンパク質と特異的に結合する抗体を検出する試薬を含む、前記キット。
【請求項３８】
タンパク質を検出するためのキットであって、別々の容器内に：
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の単離されたタンパク質と特異的に結合する抗体；及び
前記タンパク質と特異的に結合する第二の試薬を含む、前記キット。
【請求項３９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する単離された抗体を含む、組成物。
【請求項４０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物のタンパク質を含む単離された全細胞を含む、組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の全細胞に特異的に結合する単離された抗体を含む、組成物。
【請求項４２】
組成物を作製するための方法であって、
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから請求項１に記載の組成物を単離すること；及び
前記組成物に第二の細胞により発現される少なくとも１つの組換えタンパク質を補充することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記第二の細胞が、Ｅ  ｃｏｌｉである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を含むタンパク質から選択される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１９０，９４７号の利益を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染は、米国で毎年約１７０万件の院内感染（１００人の入院あたり４．５人）を占めており、全体で２０％〜６０％の範囲の死亡率、つまり９９，０００件の死亡が院内感染に直接関連している。このような感染による経済的影響は、米国で年間５０億〜１００億ドルの費用がかかると推定されている。
【０００３】
グラム陰性菌感染及びそれらの続発症はしばしば致命的である。米国だけで毎年７００，０００人を超える患者が細菌感染に感染しやすくなっていると推定されている。これらのうち、１６０，０００人が実際に敗血症を発症し、年間５０，０００人が死亡している。これらの大半は、Ｅ．ｃｏｌｉ（グラム陰性敗血症を有する患者から単離された最も一般的な病原体）、頻度では次にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが続く、グラム陰性桿菌に起因する院内感染であった。
【０００４】
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅを含むグラム陰性菌により引き起こされる感染症は、ヒトの健康管理及び動物農業環境の両方において重大な懸念事項であり続けている。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の細菌は、その生息地がヒトと動物の両方の腸管である大きな異種性の群である。この科は、多くの属を含み、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｅａｅ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｅａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｅａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｅａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｅａｅ、Ｐｒｏｔｅｅａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｅａｅ、及びＥｒｗｉｎｅａｅを含む８つの類に細分される。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の多くの種が、臨床的に関連する重大性を有する日和見病原体であることが多く、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．を含み、感染を引き起こす原因となる上位２０の生物である。臨床的に重要な疾患が生じるとき、それらは、Ｅ．ｃｏｌｉにより引き起こされることが多いが、他のものが感染して、衰弱性疾患を引き起こすこともある。大半の場合、細菌は、正常な宿主防護が不十分である場合、正常な腸内環境の外側にある組織に到達したときに病原性となる。これは、若齢者や老齢者において今日特にみられ、免疫不適格または免疫抑制のために一次感染の末期段階にあることが多く、生物が血流に達することを可能にしてしまい、敗血症を引き起こし、死亡または続発症をもたらす。
【０００５】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種は、桿状のグラム陰性、通性嫌気細菌であり、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に属する。現在、７つの種が知られており、ＤＮＡ相同性において類似性が実証されている：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａは、至るところに存在する。これらは、土壌、植生、水、ならびにヒト及び動物の腸管などの様々な環境でしばしば見出される。ヒト及び動物の両方において、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａは、皮膚もしくは皮、咽頭または胃腸管でコロニー形成することがあり、結腸及び腸管の多くの部分で正常な菌叢とみなされることが多い。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａは、動物及びヒト集団の両方において、２つの最も臨床的に関連する種である。
【０００６】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの病原性は、耐熱性エンテロトキシン、莢膜多糖類（ＣＰＳ）、リポ多糖類、アドヘシン（１型及び３型線毛、ＫＰＦ−２８フィンブリア、ＣＦ２９Ｋ及び凝集性アドへシン）、及び鉄獲得系（Ｐｏｄｓｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１（４）：５８９−６０３．１９９８；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１３：９８６−９９３，２００７）の生成を含む複数の病原因子に帰し得る。
【０００７】
動物におけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａは、ウマにおける子宮炎及び不妊症、ウシ種における乳房炎、ウシにおける肺病変から生じる血液性骨髄炎、ウマの膿胸における膿の蓄積、ネコ及びイヌの両方における気管支肺炎ならびに薬物治療、栄養失調、ストレス、内分泌疾患及び他の感染、例えばイヌパルボウイルス及びネコ免疫不全ウイルス感染から生じる免疫抑制の後に起こる二次感染の続発症の重要な原因である。
【０００８】
今日、農業は、世界的な生存のための一大必須要素である食糧に貢献するため、ヒトの繁栄にとって重要である。動物集団の安定性及び健康に多くの要因が悪影響を及ぼし、最も重大なものの１つは、成体及び／または若齢動物において広範な死亡を引き起こし得る感染性疾患である。生産動物の細菌感染は、動物の健康のすべての側面に深刻な影響を及ぼし、すべての部門に多大な経済的損失をもたらす可能性がある。今日、人獣共通感染症及び新興感染症は、ヒトの健康に脅威を与えている。すべてのヒト病原体の少なくとも６１％が動物とヒトとの間で感染する可能性がある。人畜共通感染症は、新興感染症の７５％を占める。生産動物における感染性疾患及び人畜共通感染症の増加は、特にウシ（牛肉及び牛乳）、ブタ、及び家禽部類における農業集約化に主に起因する。
【０００９】
ヒトでは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの相互作用は、日和見病原体（主に入院患者及び市中感染症）から、腸管では頻繁であり頻繁鼻咽頭では比較的頻度が少ない無症候性保菌まで及ぶ。院内感染として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａは、泌尿器及び呼吸器ならびに創傷及び軟組織感染の感染に大半が関連し、これらは致死性敗血症をもたらし得る。臨床症候群のスペクトルには、菌血症、肺炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、血栓性静脈炎、上気道感染、胆嚢炎、創傷感染、骨髄炎、内因性眼内炎、眼内炎；心内膜炎、及び髄膜炎が含まれる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａが、風土性院内感染の８％及び流行性感染の３〜７％を占めると推定される（Ｓｔａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ  ９−１３．Ｉｎ  Ｒ．Ｅ．Ｄｉｘｏｎ（ｅｄ．），Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｙｏｒｋｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ．１９８１）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａは、１４％もの多くの原発性菌血症の症例を引き起こし、グラム陰性敗血症の原因としてＥ．ｃｏｌｉのみに次ぐ多さである。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａは、膿胞性線維症を有する患者の２１％の気管支肺胞洗浄試料から単離されている（Ｌｙｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １５．２（２００２）：１９４−２２２）。
【００１０】
Ｋ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａ及びＫ．ｏｚａｅｎａｅは、比較的一般的ではなく、臨床的感染を誘発することはまれである。Ｋ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａは、鼻咽頭に関与する慢性炎症プロセスを誘発し得、Ｋ．ｏｚａｅｎａｅは、鼻粘膜の壊死及び鼻の粘液膿性分泌物を特徴とする慢性萎縮性鼻炎を誘発する。
【００１１】
Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａは、未成熟幼児及び新生児集中治療室における新生児菌血症に関係している。
【００１２】
カルバペネマーゼを生成するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの出現が、動物及びヒトの両方の健康分野において深刻な臨床的重要性を有する、世界的な健康に関する懸念事項となっている。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネマーゼ（ＫＰＣ）は、ほぼすべてのβ−ラクタム、フルオロキノロン、及びアミノグリコシドを含む複数の抗菌剤に耐性を付与することが示されている。カルバペネム類は、基質特異性拡張型のβ−ラクタマーゼを生成するＥ．ｃｏｌｉ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどのグラム陰性菌によって引き起こされる感染症を処置するために使用される広域スペクトルの抗菌活性を有するβ−ラクタム抗生物質のクラスである。カルバペネマーゼは、カルバペネム類を不活性化ことができ、他のクラスのβ−ラクタムを不活性化することができる場合もあるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより生成される酵素である。カルバペネマーゼは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐに属する細菌において見出される。この耐性機構は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの処置に利用可能な薬剤の数を制限する。
【００１３】
ヒト集団では、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症は、病院でよくあることであり、これらは、肺炎（血痰が出ることを特徴とする）及びカテーテル挿入患者における尿路感染を引き起こす。実際、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、尿路病原体としてＥ．ｃｏｌｉのみに次ぐものである。これは、全院内尿路感染症（ＵＴＩ）の６〜１７パーセントを占める。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ感染は、現在、以前よりもはるかに多く見られ、この発症率の増加は、細菌の抗生物質耐性特性に起因する可能性がある。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種は、耐性プラスミド（Ｒプラスミド）を含有し得、これは、アンピシリン及びカルベニシリンなどの抗生物質に対する耐性を付与する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔ，１１：８９３−８９７．２００５）。さらに悪いことに、Ｒプラスミドは、必ずしも同種のものではない他の腸細菌へと移行することができる。多剤耐性Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．の院内流行は、しばしば新しいタイプの菌株である、ＥＳＢＬ産生菌（基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ）により引き起こされる。過去数年間、臨床的なＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ分離株におけるＥＳＢＬ産生株の発生率は着実に増加している。ある特定の地域では、最大で４０％の発生頻度が報告されている。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症を処置するための有効な抗生物質は、わずかしか存在しない（セフェピム、ポリミキシンＢ、カルバペネム、メロペネム及びイミペネムなど）（Ｐａｒｃｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒｔ  ｌｕｎｇ，５：３６０−  ３６３．２００５；Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，４９：４１８５−４１９６．２００５；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９．１（２０１３）：１３３−６）。
【００１４】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを制御するために抗生物質を使用する代わりに、ワクチン接種による免疫学的制御が試される。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに対して有効なワクチンは、これらの細菌により引き起こされる、世界的に重大な罹患率及び死亡率を大幅に軽減するだろう。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに対する安全かつ有効なワクチンは、試みられているが、効果は限定的である。多くの細菌構成物が、潜在的なワクチン開発戦略として評価されており、これには、アドへジョン（ａｄｈｅｓｉｏｎ）及びフィンブリア、莢膜多糖類、リポ多糖類（ＬＰＳ）、及び外膜タンパク質が含まれる。抗莢膜多糖類抗体は、対応する莢膜血清型に対して高度の防御を提供すると見出された（Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１５０：８１７−８２２．１９８４；Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２３：６８７−６９０．１９８６）。２４価Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ莢膜多糖ワクチンが、第Ｉ相臨床試験において評価され、ワクチンが安全であることが示された（Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，５０：２２５−２３０．１９８５）。ワクチンのさらなる評価により、抗莢膜ワクチン接種が直面する問題が天然のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ集団における莢膜抗原の多様性であることが明らかになった。２４価ワクチンにおけるワクチン血清型の選択は、欧州及び米国で見出された菌血症患者由来の最も罹患率が高い血清型に基づいていた。しかしながら、ワクチンに含まれた血清型は、他の地域で見出された菌株のわずか２９％に過ぎず、これらの血清型が含まれていなかったため、有効性が欠如していた。加えて、ＬＰＳ含有ワクチンによる能動免疫化は、エンドトキシン含量によって引き起こされる有害な中毒反応の誘発をもたらし得ることが示されている（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，５０：８３−８６．２００５）。他のワクチン候補は、細胞毒素トキソイド、七価または一価細菌抽出物（Ｌｉｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０：２１７４−２１８０．２００２）及び／またはＯｍｐＡなどの外膜タンパク質を活用してＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ感染症を制御することについて評価されている。（Ｊｅａｎｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，Ｓｕｐｐｌ．４：Ａ２３−Ａ２７．２００２）。
【００１５】
哺乳類では、組織傷害または細菌感染への応答が急性炎症性応答をもたらすと示されている。この応答は、毛細血管透過性及び食細胞浸潤を増加させ、炎症として認識される臨床兆候；膨張、発熱、疼痛及び発赤をもたらす。制御しないままにしておくと、これは死を招く可能性がある。液性因子の活性化及びサイトカインの放出は、生理学的及び生化学的事象のカスケードをもたらす急性期タンパク質応答として集合的に知られる全身事象を媒介する。この反応の持続時間は、傷害の重症度及び全身感染の規模に直接関係する。細菌性敗血症、主要な手術、熱傷、及び他の身体外傷の間は、鉄、銅、及び亜鉛などの血清中の多数の金属イオンの濃度の変化があることが十分に立証されている。例えば、感染症の急性期には、鉄及び亜鉛の血漿レベルの低減及び銅の増加がある。血清中のこれらの微量金属イオンの変化は、任意の細菌感染症の重症度または進行に直接影響し得る。
【００１６】
鉄などの金属イオンは、電子輸送におけるその役割のために、大半の生物にとって不可欠な栄養素であることが示されている。鉄は中性ｐＨで非常に低い溶解度を有するため、血液中のトランスフェリン、分泌液中のラクトフェリン、アルブミン中のオボトランスフェリン、及び細胞内のフェリチンなどの専用のタンパク質キャリアとの会合により溶液中に保持されなければいけない。哺乳動物宿主中に通常存在する遊離鉄の濃度は、細菌の増殖を支持するのに十分ではないことが認識されている。したがって、宿主種内での鉄の利用率が低いことは、微生物が克服しなければならない感染症に対する最初の障壁の１つであり、細菌によりその宿主から鉄を得る戦略を開発したことは驚くべきことではない。
【００１７】
最も研究されている細菌の鉄獲得システムのうちの１つは、シデロフォアのものであり、これは第二鉄結合に関して宿主タンパク質キャリアと競合することができる低分子量鉄リガンドである（Ｍｉｅｔｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｒｅｖ，７１（３）：４１３−４５１．２００７）。キレート化鉄は、シデロフォアが細胞表面上の特定の受容体タンパク質と相互作用するとき、細菌のペリプラズムへと能動的に輸送される。この活動に必要なエネルギーは、タンパク質ＴｏｎＢ、ＥｘｂＢ、及びＥｘｂＤに依存していると思われる（Ｍｉｅｔｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｒｅｖ，７１（３）：４１３−４５１．２００７）。鉄がペリプラズムに到着すると、それは細胞質へとＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送系を介して輸送される（Ｂｕｄｚｉｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｆｒｏｍ  ｆｕｎｇｉ．Ｉｎ：Ｉｒｏｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．１ｓｔ  ｅｄ．Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １，２０１０。シデロフォア−鉄複合体が細胞質に入ると、鉄は放出され、シデロフォアは再循環するかまたは分解される。
【００１８】
大半のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌株は、シデロフォア受容体タンパク質ＦｅｐＡ、ＩｒｏＮ、ＣｉｒＡ、ＦｈｕＡ、及びＦｈｕＥをコードする遺伝子を有する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．４４：４０７−４１２．１９８７）。近年の研究は、受容体の特異性を研究するためにｆｅｐＡ、ＩｒｏＮ、及びＣｉｒＡタンパク質の単一突然変異体、二重突然変異体、及び三重突然変異体の作用を評価している（Ｒａｂｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１２：６９５３−６９６１  ２００３）。結果は、これらの受容体が完全に特異的ではないことを示しており；大半は、様々なシデロフォアからの鉄を活用することができ、いくつかのシデロフォアは、この３つのタンパク質のいずれによっても使用されることができる。加えて、いくつかのシデロフォア受容体タンパク質（鉄調節タンパク質）は、他の種の細菌または真菌類により生成されたシデロフォアを使用し、これは、「シデロフォア争奪（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｐｉｒａｃｙ）」と呼ばれる鉄獲得の機構である（Ｐｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８：１１９．１９９２）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａにおける鉄取り込み系の多さ及び重複性は、細菌が様々な条件下で鉄を得ることに与える重要性を強調している。鉄獲得がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ病原性の重要な側面であるという考慮すべき証拠がある（Ｂｒｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，６：１５９−１９６．２００６）。
現在、予防のためのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａワクチンは市場に出ていない、または、公開されている情報によると、前臨床または臨床開発が進行中のものはない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｐｏｄｓｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１（４）：５８９−６０３．１９９８
【非特許文献２】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１３：９８６−９９３，２００７
【非特許文献３】Ｓｔａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ  ９−１３．Ｉｎ  Ｒ．Ｅ．Ｄｉｘｏｎ（ｅｄ．），Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｙｏｒｋｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ．１９８１
【非特許文献４】Ｌｙｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １５．２（２００２）：１９４−２２２
【非特許文献５】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔ，１１：８９３−８９７．２００５
【非特許文献６】Ｐａｒｃｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｒｔ  ｌｕｎｇ，５：３６０−  ３６３．２００５
【非特許文献７】Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，４９：４１８５−４１９６．２００５
【非特許文献８】Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９．１（２０１３）：１３３−６
【非特許文献９】Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１５０：８１７−８２２．１９８４
【非特許文献１０】Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２３：６８７−６９０．１９８６
【非特許文献１１】Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，５０：２２５−２３０．１９８５
【非特許文献１２】Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，５０：８３−８６．２００５
【非特許文献１３】Ｌｉｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０：２１７４−２１８０．２００２
【非特許文献１４】Ｊｅａｎｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，Ｓｕｐｐｌ．４：Ａ２３−Ａ２７．２００２
【非特許文献１５】Ｍｉｅｔｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｒｅｖ，７１（３）：４１３−４５１．２００７
【非特許文献１６】Ｂｕｄｚｉｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｆｒｏｍ  ｆｕｎｇｉ．Ｉｎ：Ｉｒｏｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．１ｓｔ  ｅｄ．Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １，２０１０
【非特許文献１７】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．４４：４０７−４１２．１９８７
【非特許文献１８】Ｒａｂｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１２：６９５３−６９６１  ２００３
【非特許文献１９】Ｐｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８：１１９．１９９２
【非特許文献２０】Ｂｒｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，６：１５９−１９６．２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
組成物を本明細書に提供する。一実施形態では、組成物は、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、または６８ｋＤａの分子量を有する少なくとも２つの単離されたタンパク質を含む。タンパク質は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから、鉄キレート剤を含む培地中でインキュベートするときは単離可能であり、鉄キレート剤を含まない培地中で増殖するときは単離可能でない。組成物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染症から動物を防護する。一実施形態では、動物は、マウス、酪牛、またはヒトである。一実施形態では、タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
【００２１】
一実施形態では、組成物は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４から選択されるタンパク質と構造的に類似する、または１００％同一性を有する少なくとも２つの単離されたタンパク質を含む。
【００２２】
一実施形態では、組成物は、配列番号４１、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４から選択されるタンパク質と構造的に類似する、または１００％同一性を有する少なくとも２つのタンパク質を含む。
【００２３】
一実施形態では、組成物は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離可能である３５ｋＤａ及び３３ｋＤａの分子量を有する１つまたは２つのタンパク質も含む。一実施形態では、組成物は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４と構造的に類似する、または１００％同一性を有する、アミノ酸配列を有するタンパク質も含む。一実施形態では、組成物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから、鉄キレート剤を含む培地中でインキュベートするときに単離可能である８７ｋＤａタンパク質も含む。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得るキャリアも含む。一実施形態では、組成物は、アジュバントも含む。
【００２４】
方法も本明細書に提供する。一実施形態では、方法は、対象における組成物の少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する抗体の生成を誘発するのに有効である量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載の組成物をグラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載の組成物をグラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載の組成物をグラム陰性微生物によりコロニー形成された対象に投与することを含む。グラム陰性微生物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、またはそれらの組み合わせから選択することができる。
【００２５】
一実施形態では、方法は、対象における状態を処置するための方法であり、有効量の本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、対象は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐにより引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある。一実施形態では、状態は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、またはそれらの組み合わせにより引き起こされる。異なる実施形態では、状態は、乳房炎、対象の乳汁中の高体細胞数、低産乳量、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００２６】
一実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、ヒトまたはウシである。一実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａである。一実施形態では、少なくとも７００マイクログラム（μｇ）及び１，２００μｇ以下のタンパク質が投与される。
【００２７】
キットも本明細書に提供する。一実施形態では、キットは、別々の容器内に、本明細書に記載の組成物の単離されたタンパク質、及びタンパク質と特異的に結合する抗体を検出する試薬を含む。一実施形態では、キットは、別々の容器内に、本明細書に記載の組成物の単離されたタンパク質と特異的に結合する抗体、及びタンパク質と特異的に結合する第二の試薬を含む。
【００２８】
本明細書に記載の組成物のタンパク質を含む単離された全細胞、及び全細胞に特異的に結合する単離された抗体もさらに本明細書に提供する。
【００２９】
「及び／または」という用語は、列挙した要素の１つもしくはすべてまたは列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００３０】
「好ましい」及び「好ましくは」という語句は、ある特定の利益を、ある特定の状況下で与え得る本発明の実施形態を表す。しかしながら、同じまたは他の状況下では、他の実施形態も好ましくあり得る。さらには、１つまたは複数の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないと意味することはなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。
【００３１】
「含む」という用語及びその変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲に現れる場合に限定的な意味を有さない。
【００３２】
別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は、互換可能に使用され、１または１より多いことを意味する。
【００３３】
また本明細書において、端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００３４】
個々の工程を含む本明細書に開示する任意の方法については、工程は、任意の実行可能な順序で実行されてよい。また、適切な場合、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に実行してよい。
【００３５】
本発明の上記概要は、本発明のそれぞれの開示された実施形態またはすべての実装を記載することを意図しない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本明細書中のいくつかの箇所では、例の列挙によりガイダンスが提供され、その例は様々な組み合わせにおいて使用することができる。それぞれの例では、列挙したリストは、代表的な群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの同一性確認のためのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａマルチプレックスＰＣＲを示す。
【図２】金属調節タンパク質プロファイルの保存を示す、乳房炎を有するウシから単離されたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒのウシ野外分離株ならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａヒト分離株ＬＭ２１の電気泳動プロファイルを示す。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査して鉄過剰条件における金属調節タンパク質の発現を示すＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の鉄過剰及び鉄欠乏増殖条件を比較する外膜タンパク質プロファイルの差異を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、鉄欠乏；レーン３、鉄過剰。
【図４】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを示す。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定された、シデロフォア受容体タンパク質ＣｉｒＡ、ＦｅｃＡ、ＦｅｐＡ及びＦｈｕＡを、ポーリンタンパク質ＯｍｐＣ及びＯｍｐＡと共に示す、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１分離株を示す。
【図５】金属調節タンパク質プロファイルの多様性及び交差反応性を示す、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＬＭ２１の異なる属及び種の電気泳動プロファイル（図５Ａ）及びウェスタンブロット法（図５Ｂ）を示す。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１に由来する高度免疫化血清を、ウェスタンブロット法に使用した。
【図６】マウスにおける同種及び異種攻撃に対するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンの交差防御を示す。
【図７】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図８】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図９】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１０】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１１】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１２】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１３】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１４】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１５】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１６】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１７】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１８】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図１９】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例。
【図２０】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図２１】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図２２】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の攻撃後のマウスの生存率を示す。
【図２３】ＥＬＩＳＡにより測定したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種した若雌牛の血清学的反応を示す。
【図２４】Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる攻撃後にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを接種した場合と、対照を接種した場合の若雌牛の乳汁スコアを示す。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１攻撃後の累積乳汁スコアを示す。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる攻撃後のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種と対照との間の累積乳汁スコアの差異を示す。
【図２５】同種攻撃後のワクチン接種と対照との間のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の定量的クリアランスの差異を示す。
【図２６】プラセボ対照ウシと比較した、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種したウシのＥＬＩＳＡ血清学的反応を示す。
【図２７】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅキャピラリー電気泳動システムを使用するウェスタンブロット法を示す。試料Ａ、分子量マーカー；試料Ｂ、プラセボ血清でブロットしたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１ワクチン抗原；試料Ｃ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種ウシからの血清でブロットしたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１ワクチン抗原；試料Ｄ、分子量マーカー；試料Ｅ、プラセボ血清でブロットした組換えＦｅｃＡ；試料Ｆ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種ウシからの血清でブロットした組換えＦｅｃＡ。
【図２８】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種した後の大腸菌性乳房炎の罹患率を示す。グラフは、プラセボワクチン接種群、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種群における臨床的大腸菌性乳房炎を有する泌乳状態の１〜９０日目のウシの数を示す。データは、０．４６６７発病防止率を提供する（９５％ＣＩ：０．０４９４〜０．７００８）；Ｐ＝０．０３０５。
【図２９】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種した後の大腸菌性乳房炎の発症率を示す。グラフは、プラセボワクチン接種群、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種群における臨床的大腸菌性乳房炎の発症率を示す。データは、０．５４７８の発病防止率を提供する（９５％ＣＩ：０．１９５３〜０．７５４９）；Ｐ＝０．００５７。
【図３０】大腸菌性乳房炎を有さないウシの割合を経時的に示すグラフである。大腸菌群により引き起こされる乳房炎のハザード比の推定値は、０．４９４であり、９５％信頼区間は０．２６９〜０．９０６である。これは、すべての大腸菌性乳房炎の原因となる生物からの乳房炎のリスクのおおよそ５０．６％の低減を示し、生成された有意なｐ値と一致する（ｐ＝０．０２２７８）。各線は、大腸菌性乳房炎にまだ罹患していない個体の割合を表す。線が落ちるたびに、乳房炎事象が観察されたことを表す。
【図３１】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種した後のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎の罹患率を示す。グラフは、プラセボワクチン接種群、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種群における臨床的Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有する泌乳状態の１〜９０日目のウシの数を示す。
【図３２】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種した後のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎の発症率を示す。グラフは、プラセボワクチン接種群、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種群における泌乳状態の１〜９０日目のウシからの臨床的Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎の症例数を示す。
【図３３】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有さないウシの割合を経時的に示すグラフである。このＫｌｅｂｓｉｅｌｌａデータセットのハザード比の推定値は、０．２７２であり、９５％信頼区間は０．０８９〜０．８２５である。これは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａからの乳房炎のリスクのおおよそ７２．８％の低減を示し、生成された有意なｐ値と一致する（ｐ＝０．０２１５）。各線は、適格な乳房炎にまだ罹患していない個体の割合を表す。線が落ちるたびに、乳房炎事象が観察されたことを表す。
【図３４】泌乳８日目の（販売可能な乳汁）〜泌乳９０日目までの１日の産乳量（ウシ１頭あたりの乳汁のポンド数）のプロットを示す。
【図３５】試験の月毎に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを接種したウシ、及びプラセボを用いてワクチン接種したウシからのウシ１頭当たりの平均的な１日の産乳量を示す。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。
【図３６】Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＦＴ０７３によりコードされるアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図３７】Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＦＴ０７３によりコードされるアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【図３８】Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＦＴ０７３によりコードされるアミノ酸配列及び対応するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
タンパク質
タンパク質及びタンパク質を含む組成物を本明細書に提供する。本明細書で用いるとき、「タンパク質」は、広くは、ペプチド結合により連結した２つ以上のアミノ酸のポリマーを表す。ゆえに、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素という用語は、タンパク質の定義内に含まれる。この用語は、タンパク質の発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等も含む。タンパク質という用語は、アミノ酸のポリマーの特定の長さを暗示しない。タンパク質は、天然源から直接単離可能であってよいか、または組換え、酵素、または化学技術を利用して調製することができる。天然に存在するタンパク質の場合、そのようなタンパク質は、典型的に単離される。
【００３８】
「単離された」タンパク質は、その天然環境から取り出されているものである。例えば、単離されたタンパク質は、細胞質または細胞膜から取り出されているタンパク質であり、その天然環境のタンパク質、核酸、及び他の細胞物質の大半はもはや存在しない。
【００３９】
特定の源から「単離可能」であるとして特徴付けられるタンパク質は、適切な条件下で、特定の源によって生成されるタンパク質であるが、タンパク質は、代わりの源から、例えば、当業者に周知の組換え、化学、または酵素技術を使用して得られて良い。ゆえに、タンパク質を特定の源から「単離可能な」ものと特徴付けることは、タンパク質を得なければならない任意の特定の源、またはタンパク質を得なければならない任意の特定の条件もしくはプロセスを意味するものではない。
【００４０】
「精製された」タンパク質は、それに天然に付随する他の構成成分を、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％含まないものである。タンパク質が天然に存在する生物の外側で、例えば、化学または組換え手段により、生成されるタンパク質は、天然環境に決して存在しないために、定義上単離されて精製されたとみなされる。
【００４１】
本明細書に記載のタンパク質は、分子量、アミノ酸配列、タンパク質をコードする核酸、免疫学的活性、またはそのような特徴の２つ以上の任意の組み合わせを特徴とすることができる。タンパク質の分子量は、典型的にキロダルトン（ｋＤａ）で表示され、例えば、ゲル濾過、ゲル電気泳動、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、質量分析、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを含む）、及び観察されたまたは予測されたアミノ酸配列から分子量を算出することを含む通常の方法を使用して決定することができる。本明細書に記載のタンパク質の分子量を、ゲル電気泳動により、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、本明細書でＭＡＬＤＩとも呼ぶ）により、または推論されるタンパク質配列の分子量を決定することにより、決定した（表１を参照されたい）。別段の指定がない限り、分子量は、還元及び変性条件下で、約４％のスタッキングゲル及び約１０％の分離ゲルを有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用して、タンパク質を分離することにより決定される分子量を指す。一実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定されるタンパク質の分子量は、表示値の上下１、２、３、４、または５ｋＤａの分子量を含む。一実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定されるタンパク質の分子量は、表示値の上下１、２、３、４、または５ｋＤａの分子量を含む。
【表１】
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【００４２】
本発明のタンパク質は、金属調節タンパク質であってよい。本明細書で用いるとき、「金属調節タンパク質」は、高金属条件における同じ微生物の増殖と比較して、低金属条件において微生物を増殖させるときに、より高レベルで微生物によって自然に発現されるタンパク質である。金属調節タンパク質の例としては、シデロフォア受容体タンパク質が挙げられる。低金属及び高金属条件は本明細書に記載する。例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．により生成される金属調節タンパク質の１つのクラスは、高金属条件における微生物の増殖中には検出可能なレベルで発現されないが、低金属条件における増殖中に検出可能なレベルで発現される。
【００４３】
低鉄条件での増殖後にＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離可能な金属調節タンパク質の例は、１００ｋＤａ〜６０ｋＤａ、例えば、９７ｋＤａ〜６６ｋＤａの分子量を有する。低鉄条件での増殖後にＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離可能な金属調節タンパク質の特定の例は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して、８７ｋＤａ、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａのタンパク質を有する（表１）。８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａの分子量を有するタンパク質、ならびにタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を、図７〜１０に示す。
【００４４】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより発現され、これから単離可能であると予測される、及び金属の獲得に関与すると予測される他の金属調節タンパク質は、８３ｋＤａ、７８ｋＤａ、７８．４ｋＤａ、７６．２ｋＤａ、７４．７ｋＤａ、及び６６．２ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含み、この場合、分子量は推論されるアミノ酸配列から決定される。これらのタンパク質、及びタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を、図１１、１２、１５、及び１７〜１９に示す。金属調節タンパク質の追加の例は、本明細書に記載のタンパク質の組換えで生成されたものを含む。組換えで生成されたタンパク質は、ｍＲＮＡ転写物から翻訳可能なアミノ酸配列全体を含み得る。あるいは、組換えで生成された金属調節タンパク質は、翻訳可能アミノ酸配列全体の断片を含むことができる。例えば、組換えで生成された金属調節タンパク質は、切断可能配列をタンパク質のいずれかの末端で、例えば、切断可能シグナル配列をタンパク質のアミノ末端で欠いてよい。
【００４５】
他の金属調節タンパク質は、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４（図３６〜３８）に示すタンパク質を含む。ゆえに、金属調節タンパク質は、例えば、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質であることができる。
【００４６】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより発現され、これから単離可能であると予測される、及び金属の獲得に関与すると予測される他の金属調節タンパク質は、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【００４７】
金属調節されないタンパク質も本明細書に提供する。このようなタンパク質は、金属イオンの存在下、例えば、塩化第二鉄の存在下で発現され、低鉄条件において増殖させるときにも発現される。このようなタンパク質の例としては、ポーリンが挙げられる。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．から単離可能なこのようなタンパク質の例は、２６ｋＤａ〜４５ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．により生成された非金属調節タンパク質は、３５ｋＤａ及び３３ｋＤａであり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される。これらのタンパク質、及びタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例を、図２０及び２１に示す。
【００４８】
ゆえに、金属調節されないタンパク質は、例えば、配列番号５４、及び配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質であることができる（図２０及び２１）。
【００４９】
タンパク質が金属調節タンパク質であるか否かは、タンパク質の存在を比較するのに有用である方法、例えば、ゲル濾過、ゲル電気泳動、例えばドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、質量分析、及び液体クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣを含む方法により決定することができる。微生物の別々の培養物を高金属条件及び低金属条件下で増殖させ、本発明のタンパク質を本明細書に記載のように単離し、各培養物中に存在するタンパク質を分離して比較する。典型的には、各培養物から等量のタンパク質を使用する。好ましくは、還元及び変性条件下で、約４％のスタッキングゲル及び約１０％の分離ゲルを有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用して、タンパク質を分離する。例えば、各培養物から総タンパク質の３０マイクログラム（μｇ）を使用し、ゲルのウェルにロードしてよい。ゲルを泳動させ、タンパク質をクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）で染色した後、２つのレーンを比較することができる。タンパク質が検出可能なレベルで発現されているか否かを決定するとき、培養物から総タンパク質の３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、当技術分野で公知の方法を使用してクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）で染色する。目視可能なタンパク質は、検出可能なレベルで発現されているとみなし、目視できないタンパク質は、検出可能なレベルで発現されていないとみなす。
【００５０】
あるいは、タンパク質が金属調節されているか否かは、マイクロアレイに基づく遺伝子発現分析を使用して決定することができる。微生物の別々の培養物を高金属条件下及び低金属条件下で増殖させ、ＲＮＡを各培養物の細胞から抽出し、高金属条件において増殖させた細胞中のＲＮＡ発現と低金属条件において増殖させた細胞中のＲＮＡ発現との差異を検出し、比較する。例えば、標識ｃＤＮＡを、８〜１０μｇの細菌ＲＮＡから公知かつ通常の方法を使用して調製することができる。標識ｃＤＮＡは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムのマイクロアレイに適用することができる。このようなマイクロアレイは市販されており、このようなアレイを使用する遺伝子発現は通常行われるものである。
【００５１】
本明細書に記載のタンパク質は、免疫学的活性を有してよい。「免疫学的活性」は、動物において免疫学的応答を誘発するタンパク質の能力を表す。タンパク質に対する免疫学的応答は、タンパク質に対する細胞及び／または抗体媒介性免疫応答の動物における発達である。通常、免疫学的応答は、以下の作用：エピトープまたはタンパク質のエピトープに指向された、抗体の生成、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞うちの１つまたは複数を含むが、これに限定されない。「エピトープ」は、特定のＢ細胞及び／またはＴ細胞が応答し、これにより抗体が生成される抗原上の部位を表す。免疫学的活性は、防護性であってよい。「防護性免疫学的活性」は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａによる感染を予防するまたは阻害する動物における免疫学的応答を誘発するタンパク質の能力を表す。タンパク質が防護性免疫学的活性を有するか否かは、例えば、実施例１１〜１４に記載の方法などの当技術分野で公知の方法により決定することができる。例えば、本明細書に記載のタンパク質、または本明細書に記載のタンパク質の組み合わせは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐによる攻撃から動物を防護する。本発明のタンパク質は、血清活動活性を有してよい。「血清活動活性」は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．，例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａに感染した動物からの回復期血清中に存在する抗体と反応する候補タンパク質の能力を表す。いくつかの態様では、回復期血清は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａに感染した動物からのものであってよい。本発明のタンパク質は、免疫調節性活性を有してよい。「免疫調節性活性」は、特定の抗原に対する免疫応答を亢進する非特異的な様式で作用するタンパク質の能力を表す。タンパク質が免疫調節性活性を有するか否かを決定するための方法は、当技術分野で公知である。
【００５２】
本明細書に記載のタンパク質は、基準タンパク質の特徴を有することができる。特徴は、例えば、分子量、アミノ酸配列、活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。基準タンパク質は、グラム陰性微生物、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ科のメンバー、好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、より好ましくは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより発現されるものであることができる。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株の例は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１である。
【００５３】
本明細書に記載のタンパク質は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５８、配列番号６１、または配列番号６４のアミノ酸配列と、下記のように構造的に類似するアミノ酸配列を有することができる。一実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号２０のアミノ酸配列と、下記のようにと構造的に類似するアミノ酸の領域を含むことができる。
【００５４】
本明細書で用いるとき、タンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列が、基準タンパク質と比較して特定量の配列類似性及び／または配列同一性を有する場合に、基準タンパク質と「構造的に類似」し得る。ゆえに、タンパク質は、基準タンパク質と比較して、十分なレベルのアミノ酸配列同一性、アミノ酸配列類似性、またはそれらの組み合わせを有する場合、基準タンパク質と「構造的に類似」し得る。
【００５５】
タンパク質配列類似性及びタンパク質配列同一性
２つのタンパク質の構造的類似性は、２つのタンパク質（例えば、本明細書に記載の候補タンパク質及び任意の適切な基準タンパク質）の残基を、それらの配列長に沿って同一のアミノ酸の数を最適化するように整列させることにより決定することができ、いずれかまたは両方の配列のギャップは、同一アミノ酸の数を最適化させるためのアライメントを作成する際に許容されるが、各配列のアミノ酸は、それでもなおそれらの適当な順序で残らなければいけない。基準タンパク質は、適切な場合は、本明細書に記載のタンパク質または任意の公知の金属調節タンパク質であってよい。候補タンパク質は、基準タンパク質と比較されるタンパク質である。候補タンパク質は、例えば、微生物から単離することができるか、組換え技術を使用して生成することができるか、または化学的にもしくは酵素的に合成されることができる。
【００５６】
本明細書以外に記載されているように修飾されない限り、アミノ酸配列のペアワイズ比較分析をＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用して実施することができる。あるいは、タンパク質は、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．によって記載され（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１７４，２４７−２５０（１９９９））、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト上で利用可能な、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して比較してよい。すべてのＢＬＡＳＴ２検索パラメータのための既定値を使用してよく、ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝３、及びｆｉｌｔｅｒ  ｏｎを含む。
【００５７】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性」割合（％）によって表されてよく、または「類似性」割合（％）によって表されてよい。「同一性」は、同一のアミノ酸の存在を表す。「類似性」は、同一のアミノ酸だけでなく保存的置換の存在も表す。タンパク質におけるアミノ酸の保存的置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてよい。例えば、特に生物学的活性と直接的に関連がないタンパク質の領域において、特定のサイズまたは特徴（例えば、電荷、疎水性、または親水性）を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸を、タンパク質の活性を変化させることなく、別のアミノ酸に置換することができることは、タンパク質生化学の分野で周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。正荷電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。負荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。保存的置換は、例えば、正電荷を維持するためのＬｙｓのＡｒｇへの置換及びその逆の置換；負電荷を維持するためのＧｌｕのＡｓｐへの置換及びその逆の置換；遊離−ＯＨを維持するためのＳｅｒのＴｈｒへの置換；ならびに遊離−ＮＨ２を維持するためのＧｌｎのＡｓｎへの置換を含む。同様に、タンパク質の機能活性、例えば、免疫学的活性を排除しない１つまたは複数の連続または非連続アミノ酸の欠失または付加を含有するタンパク質の生物学的に活性な類似体も企図される。
【００５８】
ゆえに、本明細書で用いるとき、本明細書に記載のタンパク質への言及及び／または１つまたは複数の配列番号のアミノ酸配列への言及は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％アミノ酸配列類似性を基準アミノ酸配列に対して有するタンパク質を含むことができる。
【００５９】
あるいは、本明細書で用いるとき、本明細書に記載のタンパク質への言及及び／または１つまたは複数の配列番号のアミノ酸配列への言及は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を基準アミノ酸配列に対して有するタンパク質を含むことができる。
【００６０】
実施例９に記載し、表３に示すように、本明細書に記載の金属調節タンパク質は、保存されている。表３は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒに存在する異なるタンパク質の高レベルの同一性割合（％）を示す。当業者は、異なる微生物により発現される金属調節タンパク質のアミノ酸配列を、容易に利用可能なアルゴリズム、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して容易に整列し、保存されているアミノ酸及び領域ならびに金属調節タンパク質にわたって可変であるアミノ酸及び領域を同定することができる。当業者は、修飾されたポリペプチドの活性に不当に影響を及ぼすことなく、置換、特に保存的置換が許容され得るタンパク質の領域をこのようなデータから推論することができる。
【００６１】
結果的に、本明細書に記載のタンパク質は、ある特定の変異体を含むことができ、それには、例えば、ポリペプチドが元々単離及び／もしくは同定された微生物種または菌株以外の微生物種または菌株から、生物学的または組換え的に生じる相同タンパク質が含まれる。
【００６２】
本明細書に記載のタンパク質は、１つまたは複数の追加の配列、例えば、カラムに捕捉することによる精製または抗体の使用を促進し得る、付加されたＣ末端及び／またはＮ末端アミノ酸のコード配列の付加を提供するように設計することもできる。そのようなタグとしては、例えば、ニッケルカラムでのタンパク質の精製を可能にするヒスチジンリッチタグが含まれる。そのような遺伝子改変技術及び好適な追加の配列は、分子生物学の分野で周知である。
【００６３】
本明細書に記載のタンパク質の「修飾」は、１つまたは複数の構成アミノ酸にて化学的にまたは酵素的に誘導体化されるタンパク質（またはその類似体、例えば、その断片）を含む。このような修飾は、例えば、側鎖修飾、骨格修飾、Ｎ末端修飾、及び／またはＣ末端修飾、例えば、アセチル化、水酸化、メチル化、アミド化、ならびに炭水化物及び／または脂質部分、補因子等の付着、ならびにそれらの組み合わせを含むことができる。本発明の修飾タンパク質は、未修飾タンパク質の生物学的活性、例えば、免疫学的活性を保持し得るか、または未改変タンパク質と比較して増減した生物学的活性を呈し得る。
【００６４】
本明細書に記載のタンパク質（生物学的に活性なその類似体及び／またその修飾体を含む）は、未変性（天然に存在する）、組換え、化学的に合成された、または酵素的に合成されたタンパク質を含むことができる。例えば、本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質を天然源から単離することによって調製されてよいか、または例えば、細菌または他の宿主細胞における融合タンパク質として調製することを含む、従来の方法によって組換えで調製されてよい。
【００６５】
基準微生物によって発現されるタンパク質は、基準微生物を低金属条件下で本明細書に記載のように増殖させること及び明細書中に開示するプロセスによるタンパク質のその後の単離よって得ることができる。あるいは、基準微生物によって発現されるタンパク質は、微生物を低金属条件、例えば、金属調節条件において増殖させたときに高レベルで発現されるコード領域を同定することによって得ることができる。金属調節コード領域は、クローン化して発現させることができ、発現された金属調節タンパク質は、本明細中に記載のプロセスによって同定され得る。候補タンパク質は、微生物から単離可能であることができる、または微生物、好ましくは、グラム陰性微生物、より好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバー、例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＫ．ｏｘｙｔｏｃａなどから同定することができる。候補タンパク質は、酵素的または化学的技術を使用して生成してもよい。
【００６６】
ポリヌクレオチド配列類似性及びポリヌクレオチド配列同一性
本明細書に記載のタンパク質はまた、タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して同定されてよい。ゆえに、本開示は、本明細書に記載のタンパク質をコードする、または標準的なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチド配列の補体を提供する。
【００６７】
本明細書で用いるとき、本明細書に記載のポリヌクレオチドに対する言及及び／または１つもしくは複数の配列番号の核酸配列に対する言及は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を、同定された基準ポリヌクレオチド配列に対して有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６８】
この文脈では、「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を表す。配列同一性は、２つのポリヌクレオチドの塩基を整列させて（例えば、候補配列のヌクレオチド配列と、タンパク質または配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４９、５１、５２、５３、５４、５５、５８、６１、もしくは６４をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を整列させて）、その配列長に沿って同一ヌクレオチドの数を最適化させることによって一般に決定され、いずれかまたは両方の配列のギャップは、共有されるヌクレオチドの数を最適化させるためのアライメントを作成する際に許容されるが、各配列のヌクレオチドは、それでもなおそれらの適当な順序で残らなければいけない。候補配列は、公知の配列と比較される配列、例えば、シグナル配列を伴わずにタンパク質をコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、または２９の適切な部分から選択される適切なヌクレオチド配列を含むヌクレオチドである。例えば、２つのポリヌクレオチド配列は、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９９；１７４：２４７−２５０によって記載され、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを使用して比較することができる。すべてのＢＬＡＳＴ２検索パラメータのための既定値を使用してよく、ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｃｈ＝１、ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈ＝−２、ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝２、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝１１、及びｆｉｌｔｅｒ  ｏｎを含む。
【００６９】
本開示は、微生物の全細胞調製物も提供し、この場合微生物は、本明細書に記載のタンパク質のうちの１つまたは複数を発現する。微生物は、タンパク質を天然に発現することができるか、または操作されて、本明細書に記載のタンパク質のうちの１つまたは複数を組換え的に発現することができる。全細胞調製物中に存在する細胞を、細胞が複製できないが、微生物により発現される本明細書に記載のタンパク質の免疫学的活性を維持するように、不活性化してよい。典型的には、細胞を、グルタルアルデヒド、ホルマリン、またはホルムアルデヒドなどの薬剤への曝露により死滅させてよい。
【００７０】
組成物
本明細書に記載の組成物は、少なくとも１つの本明細書に記載のタンパク質、または１よりも大きな整数（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４）である数のタンパク質を含んでよい。特定のレベルの配列類似性及び／または同一性が本明細書に明示されない限り（例えば、少なくとも８０％配列類似性、少なくとも９０％配列同一性等）、同定された配列番号のアミノ酸配列に対する言及は、「タンパク質配列類似性及びタンパク質配列同一性」という題名の項目において本明細書に記載されている配列類似性のレベル及び／または配列同一性のレベルを有する変異体を含む。一実施形態では、本明細書に記載のタンパク質を含む組成物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの微生物により、低金属条件、例えば低鉄条件下で発現されるタンパク質のサブセットであり、天然に存在しないタンパク質の組み合わせである。
【００７１】
組換えで生成されたタンパク質は、ベクターが適切な宿主細胞へと導入されたときにタンパク質の発現を可能にするベクターから発現されてよい。宿主細胞は、１つまたは複数の組換えで生成された本明細書に記載のタンパク質を生成するように構築されてよく、それゆえ、本明細書に記載のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むさらに１つのベクターを含むことができる。ゆえに、各ベクターは、１つまたは複数の本明細書に記載のポリヌクレオチド、すなわち、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００７２】
ある特定の組成物、例えば、組換えで生成されたタンパク質を含むものは、最大数のタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、最大数のタンパク質は、最大総数のタンパク質を表すことができる。ある特定の組成物は、例えば、５０タンパク質以下、例えば、４０以下のタンパク質、３０以下のタンパク質、２５以下のタンパク質、２０以下のタンパク質、１５以下のタンパク質、１０以下のタンパク質、９以下のタンパク質、８以下のタンパク質、７以下のタンパク質、６以下のタンパク質、５以下のタンパク質、４以下のタンパク質、３以下のタンパク質、２以下のタンパク質、または１以下のタンパク質を含むことができる。他の実施形態では、組換えで生成されたタンパク質の最大数は、同様の様式にて特定され得る。なおも他の実施形態では、組換えでなく生成されたタンパク質の最大数は、同様の様式にて特定され得る。
【００７３】
組成物は、１つの微生物から単離可能なタンパク質を含むことができる、または２つ以上の微生物の組み合わせから単離可能であることができる。例えば、組成物は、２つ以上のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．，から、または１つのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属のメンバーではない異なる微生物から単離可能なタンパク質を含むことができる。
【００７４】
ある特定の実施形態では、組成物は、全細胞が本明細書に記載のタンパク質のうちの１つまたは複数を発現する、全細胞調製物を含むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、全細胞は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．，であることができ、他の実施形態では、全細胞は、タンパク質のうちの１つまたは複数を発現するように遺伝子操作されたものである。いくつかの実施形態では、組成物は、２、３、４、５、または６つの菌株からの全細胞調製物を含むことができる。
【００７５】
一実施形態では、組成物は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．により低鉄において増殖中に発現されるポリペプチド及び少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の組換えで生成されたタンパク質を含む。例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．を、少なくとも１つの組換えタンパク質を発現するように操作することができるか、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．から単離された組成物に、第二の細胞により発現される少なくとも１つの組換えタンパク質を補充することができる。一実施形態では、そのような組成物は、天然に存在しない。
【００７６】
組成物の具体的な例としては、以下を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、組成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａから選択される分子量を有する少なくとも２つの金属調節タンパク質を含む。例えば、組成物は、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａ；８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、及び７２ｋＤａ；８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、及び６８ｋＤａ；８２ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａ；７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａ；８２ｋＤａ及び７８ｋＤａ；８２ｋＤａ及び６８ｋＤａ；または７２ｋＤａ及び６８ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含むことができる。任意選択で、組成物は、金属調節されない１つまたは２つのタンパク質を含み、この場合、タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される、３５ｋＤａ及び３３ｋＤａの分子量を有する。任意選択で、組成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される、８７ｋＤａの分子量を有する金属調節タンパク質を含む。任意選択で、組成物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより発現され、これから単離可能であると予測される少なくとも１つの金属調節タンパク質、例えば、８３ｋＤａ、７８ｋＤａ、７８．４ｋＤａ、７６．２ｋＤａ、７４．７ｋＤａ、または６６．２ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含み、この場合、分子量は、推論されるアミノ酸配列から決定される。ゆえに、一実施形態では組成物は、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、及び６８ｋＤａの分子量を有する２、３、または４つの金属調節タンパク質、金属調節されておらず３５ｋＤａ及び３３ｋＤａの分子量を有する２つのタンパク質、ならびに８７ｋＤａの分子量を有する金属調節タンパク質を含む。
【００７７】
一実施形態では、組成物は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４から選択されるタンパク質と構造的に類似する少なくとも２つのタンパク質を含む。例えば、組成物は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４；配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３；配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４４；配列番号４１、配列番号４３、及び配列番号４４；配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４；配列番号４１、配列番号４２；配列番号４１、及び配列番号４４；配列番号４３、及び配列番号４４と構造的に類似するタンパク質を含むことができる。任意選択で、組成物は、配列番号５４及び配列番号５５と構造的に類似する追加の２つのタンパク質を含む。任意選択で、組成物は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４から選択されるタンパク質と構造的に類似する少なくとも１つのタンパク質を含む。任意選択で、組成物は、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号２０のアミノ酸配列と構造的に類似するアミノ酸の領域を含むタンパク質と構造的に類似する少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００７８】
一実施形態では、組成物は、配列番号４１、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４から選択されるタンパク質と構造的に類似する少なくとも２つのタンパク質を含む。例えば、組成物は、配列番号４１、配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４；配列番号４１、配列番号５８、及び配列番号６１；配列番号４１、配列番号５８、及び配列番号６４；配列番号４１、配列番号６１、及び配列番号６４；配列番号５８、配列番号６１、及び配列番号６４；配列番号４１及び配列番号５８；配列番号４１及び配列番号６４；または配列番号６１、及び配列番号６４と構造的に類似するタンパク質を含むことができる。任意選択で、組成物は、配列番号５４及び配列番号５５と構造的に類似する追加の２つのタンパク質を含む。任意選択で、組成物は、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、及び配列番号５３から選択されるタンパク質と構造的に類似する少なくとも１つのタンパク質を含む。任意選択で、組成物は、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号２０のアミノ酸配列と構造的に類似するアミノ酸の領域を含むタンパク質と構造的に類似する少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００７９】
任意選択で、本明細書に記載のタンパク質は、キャリアタンパク質に共有結合またはコンジュゲートして、タンパク質の免疫学的特性を改善することができる。有用なキャリアタンパク質は当該分野で公知である。本明細書に記載のタンパク質の化学的カップリングは、公知かつ通常の方法を使用して行うことができる。例えば、様々なホモ二官能性及び／またはヘテロ二官能性架橋試薬、例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩、ビス（ジアゾベンジジン）、アジプイミド酸ジメチル、ピメリミド酸ジメチル、スペリイミド酸ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｐｅｒｉｍｉｄａｔｅ）、スベリン酸ジサクシンイミジル、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘアン（ｃｙｃｌｏｈｅａｎｅ）−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート及び（１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミドを使用することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８８））を参照されたい）。
【００８０】
本明細書に記載の組成物は、低濃度のリポ多糖類（ＬＰＳ）を含むことができる。ＬＰＳは、大半のグラム陰性微生物の外膜の成分であり（例えば、Ｎｉｋａｉｄｏ  ａｎｄ  Ｖａａｒａ，Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｉｎ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．７−２２（１９８７）を参照されたい）、典型的には、多糖類（Ｏ−特異的鎖、外部及び内部コア）及び脂質Ａ領域を含む。ＬＰＳの脂質Ａ成分は、ＬＰＳ構造の最も生物学的に活性な成分であり、哺乳類において広範囲の病態生理学的作用を一緒になって誘導する。最も劇的な作用は、発熱、播種性血管内凝固、補体活性化、低血圧ショック、及び死亡である。ＬＰＳの非特異的免疫刺激活性は、ＬＰＳを含む組成物の投与部位で肉芽腫の形成を増強し得る。そのような反応は、動物に過度のストレスをもたらし、それにより、動物はある期間にわたって飼料または水を摂取しなくなる可能性があり、その動物の感染性病態を悪化させる。加えて、注射部位での肉芽腫の形成は、注射部位での組織の傷跡または傷のために死体の状態を悪化させる可能性を増加させ得る。
【００８１】
ＬＰＳの濃度は、当技術分野で通常の方法を使用して決定することができる。そのような方法は、ＬＰＳによる色素結合の測定（例えば、Ｋｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６，１８９（１９８６）を参照されたい）またはカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）検査の使用（例えば、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓｔａｔｅ  Ｔｅｓｔ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１５０  Ｆｉｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８２）を参照されたい）を典型的に含む。ＬＡＬ検査と典型的に使用される４つの基本的な商用の方法がある：ゲル凝固試験；濁度（分光光度的）試験；比色試験；及び発色試験。ゲル凝固アッセイの例は、商標名Ｅ−ＴＯＸＡＴＥ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｓｉｇｍａ  技術告示番号２１０を参照されたい）、及びＰＹＲＯＴＥＬＬ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）の下で利用可能である。典型的には、アッセイ条件は、組成物をカブトガニ、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓの循環アメーバ様細胞のライセートを含有する調製物と接触させることを含む。ＬＰＳに曝露されたとき、ライセートは、混濁度ならびに粘性を増し、ゲル化し得る。約０．１ミリリットルの組成物をライセートに加える。典型的には、組成物のｐＨは、６〜８であり、好ましくは、６．８〜７．５である。組成物とライセートとの混合物は、１時間３７℃にて静置してインキュベートする。インキュベーション後、混合物を観察して、混合物がゲル化しているか否かを決定する。ゲル化は、エンドトキシンの存在を示す。組成物中に存在するエンドトキシンの量を決定するために、エンドトキシンの標準化溶液の希釈物を作製し、組成物を試験するのと同時に試験する。エンドトキシンの標準化溶液は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ番号２１０−ＳＥ）、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，カタログ番号２３５５０３）、及びＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，（カタログ番号Ｅ０００５）から市販されている。一般に、本発明の組成物を、微生物から本明細書に記載の方法（例えば、細胞を破砕及び可溶化すること、ならびに不溶性ポリペプチドを回収することを含む方法）によりポリペプチドを単離することによって調製するとき、本発明の組成物中のＬＰＳの量は、同じ条件下で破砕されているが可溶化されていない同量の同じ微生物の混合物中に存在するＬＰＳの量より少ない。典型的には、本明細書に記載の組成物中のＬＰＳのレベルは、優先順位の低い順に、同じ微生物を可溶化することではなく、破砕することにより調製される組成物におけるＬＰＳのレベルと比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減する。一実施形態では、本明細書に記載の組成物中のＬＰＳのレベルは、同じ微生物を可溶化することではなく、破砕することにより調製される組成物におけるＬＰＳのレベルと比べて９０％超、９５％超、または９９％超低減する。
【００８２】
本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容され得るキャリアを任意選択でさらに含む。「薬学的に許容され得る」は、希釈剤、キャリア、賦形剤、塩等が組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないことを表す。典型的には、組成物は、本明細書に記載のように使用される場合、薬学的に許容され得るキャリアを含む。本明細書に記載の組成物は、抗原に対する免疫応答を刺激するために好適な経路を含む、選択された投与経路に適応する様々な形態で医薬調製物に製剤化されてよい。ゆえに、本明細書に記載の組成物は、公知の経路、例えば、経口；皮内、経皮及び皮下を含む非経口；筋肉内、静脈内、腹腔内等を介して、ならびに局所的に、例えば鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮及び経直腸等を介して投与することができる。組成物は、動物の体全体にわたって、分泌型ＩｇＡ抗体の生成などの粘膜免疫を刺激するために、鼻または呼吸粘膜への（例えば、スプレーまたはエアロゾルを介した）投与などによって、粘膜表面に投与することができることが予測される。
【００８３】
本明細書に記載の組成物は、持続または遅延放出性インプラントを介して投与することもできる。本発明に従う使用に好適なインプラントは公知であり、例えば、Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｂ（ＷＯ  ０１／３７８１０（２００１））、及びＥｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（ＷＯ  ９６／０１６２０（１９９６））にて開示されるものを含む。インプラントは、エアロゾルまたはスプレーにより投与するのに十分に小さいサイズで生成することができる。インプラントはナノスフェア及びミクロスフェアを含むこともできる。
【００８４】
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のある特定の状態を処置するのに十分な量で投与されてよい。本明細書に記載の組成物中に存在するタンパク質または全細胞の量は変動することができる。例えば、タンパク質の投与量は、０．０１マイクログラム（μｇ）〜３００ｍｇ、典型的には０．１ｍｇ〜１０ｍｇであることができる。一実施形態では、タンパク質の投与量は、少なくとも７００μｇ、少なくとも９００μｇ、または少なくとも１，０００μｇであってよい。一実施形態では、投与量は、１，８００μｇ以下、１，６００μｇ以下、１，４００μｇ以下、または１，２００μｇ以下であってよい。組成物が全細胞調製物であるとき、細胞は、例えば、１０２細菌／ｍｌ、１０３細菌／ｍｌ、１０４細菌／ｍｌ、１０５細菌／ｍｌ、１０６細菌／ｍｌ、１０７細菌／ｍｌ、１０８細菌／ｍｌ、または１０９細菌／ｍｌの濃度で存在することができる。注射可能な組成物（例えば、皮下、筋肉内等）については、タンパク質は、投与される組成物の総体積が、０．５ｍｌ〜５．０ｍｌ、典型的には１．０〜２．０ｍｌであるような量で組成物中に存在してよい。組成物が全細胞調製物であるとき、細胞は好ましくは投与される組成物の総体積が、０．５ｍｌ〜５．０ｍｌ、典型的には１．０〜２．０ｍｌである量で組成物中に存在する。投与される量は、選択される特定のタンパク質、動物の体重、健康状態及び年齢、ならびに投与経路を含むがこれらに限定されない様々な因子に応じて変動してよい。ゆえに、所与の単位剤形中に含まれるタンパク質の絶対重量は、広範に変動することができ、因子、例えば動物の種、年齢、体重、及び健康状態、ならびに投与方法によって依存する。このような因子は、当業者により決定することができる。本発明に好適な投与量の他の例は、Ｅｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（米国特許第６，０２７，７３６号）において開示される。
【００８５】
製剤は、好都合には、単位剤形にて存在してよく、薬学分野において周知の方法により調製されてよい。薬学的に許容され得るキャリアを有する組成物を調製する方法は、活性化合物（例えば、本明細書に記載のタンパク質または全細胞）を、１つまたは複数の副成分を構成するキャリアと会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、均一にかつ本質的に、活性化合物を液体キャリア、細かく分割された固体キャリア、またはその両方と会合させ、次いで、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。
【００８６】
組成物は、アジュバントも含むことができる。「アジュバント」は、非特異的様式で作用して、特定の抗原に対する免疫応答を亢進することができる薬剤を表し、ゆえにアジュバントは、任意の所与の免疫化組成物において必要な抗原の量、及び／または目的の抗原に対する十分な免疫応答を発生させるために必要な注射の頻度を減らす可能性がある。アジュバントは、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、乳化剤、ムラミルジペプチド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、アブリジン、水酸化アルミニウム、油、サポニン、アルファ−トコフェロール、ポリサッカリド、乳化パラフィン（例えば、商標名ＥＭＵＬＳＩＧＥＮでＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａから入手可能なものを含む）、ＩＳＡ−７０、ＲＩＢＩ及び当技術分野で周知の他の物質を含んでよい。本明細書に記載のタンパク質が免疫調節性活性を有し得、このようなタンパク質が、直接的にＴ細胞及び／もしくはＢ細胞アクチベーターとして機能する、または様々なサイトカインの合成を増強する特定の細胞型に作用する、または細胞内のシグナル伝達経路を活性化するアジュバントとして使用され得ることが期待される。このようなタンパク質は、免疫応答を増強して現存する組成物の防御指数を増加させることが期待される。
【００８７】
別の実施形態では、薬学的に許容され得るキャリアを含む本明細書に記載の組成物は、生物学的応答修飾因子、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４及び／またはＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ならびに免疫細胞に影響する他のサイトカインを含むことができる。免疫化組成物は、当技術分野で公知の他の構成成分、例えば、抗生物質、防腐剤、抗酸化剤、またはキレート剤も含むことができる。
【００８８】
作製方法
本発明は、本明細書に記載のタンパク質を得るための方法も提供する。本発明のタンパク質及び全細胞は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバーから単離可能であってよい。本発明のタンパク質を得るため及び全細胞調製物を作製するために有用な微生物は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）などの保存機関から市販されている。加えて、そのような微生物は、当技術分野で通常かつ公知の方法により容易に手に入れることができる。微生物は、野外分離株として感染動物に由来してよく、微生物を使用して本発明のタンパク質及び／または全細胞調製物を得てよい、または将来の使用のために、例えば、−２０℃〜−９５℃、または−４０℃〜−５０℃の凍結貯蔵所にて、２０％グリセロールを含有する細菌学的培地、及び同様の培地中で保管してよい。
【００８９】
本発明のタンパク質を微生物から得るとき、微生物は、低金属条件下でインキュベートすることができる。本明細書で用いるとき、「低金属条件」という語句は、微生物に金属調節タンパク質を検出可能なレベルで発現させる量の遊離金属を含有する、環境、典型的には細菌学的培地を表す。本明細書で用いるとき、「高金属条件」という語句は、微生物に、本明細書に記載の金属調節タンパク質のうちの１つまたは複数を検出可能なレベルで発現させないか、またはそのようなタンパク質を低金属条件下の金属調節タンパク質の発現と比較して低減したレベルで発現させる量の遊離金属を含有する環境を表す。いくつかの場合では、「高金属条件」は、金属が豊富な天然環境及び／または金属が豊富な培地中での金属キレート剤を伴わない培養を含むことができる。対照的に、いくつかの場合では、「低金属条件」は、以下により詳述するような金属キレート剤を含む培地中での培養を含むことができる。金属は、周期表中に存在するものであり、第１〜１７群（ＩＵＰＡＣ表記；ＣＡＳ表記下では、それぞれ、群Ｉ−Ａ、ＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＶ−Ｂ、Ｖ−Ｂ、ＶＩ−Ｂ、ＶＩＩ−Ｂ、ＶＩＩＩ、Ｉ−Ｂ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＶ−Ａ、Ｖ−Ａ、ＶＩ−Ａ、及びＶＩＩ−Ａとも称される）に存在する。好ましくは、金属は、第２群から１２群、より好ましくは、第３〜１２群のものである。さらにより好ましくは、金属は、鉄、亜鉛、銅、マグネシウム、ニッケル、コバルト、マンガン、モリブデン、またはセレニウムであり、最も好ましくは、鉄である。
【００９０】
低金属条件は、通常、金属キレート化合物の細菌学的培地への添加、少量の金属を含有する細菌学的培地の使用、またはこれらの組み合わせの結果得られる。高金属条件は、通常、キレート剤が培地中に存在しない、金属を培地に添加する、またはこれらを組み合わせた場合に生じる。金属キレート剤の例は、天然及び合成化合物を含む。天然化合物の例は、植物フェノール化合物、例えばフラボノイドを含む。フラボノイドの例は、銅キレート剤カテキン及びナリンゲニン、ならびに鉄キレート剤ミリセチン及びケルセチンを含む。合成銅キレート剤の例は、例えば、テトラチオモリブデートを含み、合成亜鉛キレート剤の例は、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）−エチレンジアミンを含む。合成鉄キレート剤の例は、２，２’−ジピリジル（当技術分野でα，α’−ビピリジルとも称される）、８−ヒドロキシキノリン、エチレンジアミン−ジ−Ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）、デスフェリオキサミンアミンメタンスルホン酸塩（デスフェロール）、トランスフェリン、ラクトフェリン、オボトランスフェリン、生物学的シデロフォア、例えば、カテコラート及びヒドロキサメート、ならびにクエン酸塩を含む。一般的な二価カチオンキレート剤の例は、ＣＨＥＬＥＸ樹脂である。好ましくは、２，２’−ジピリジルが鉄キレート化のために使用される。典型的には、２，２’−ジピリジルは、微生物の増殖特徴に応じて、少なくとも０．００２５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）、少なくとも０．２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度、またはより高い量で培地に添加される。
【００９１】
ｆｕｒ遺伝子中に突然変異を有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．が、本発明の金属調節タンパク質のすべてではないが多くに構成的発現をもたらすことが期待される。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．におけるｆｕｒ突然変異の生成は、通常の方法、例えば、グラム陰性菌における遺伝子ノックアウト突然変異を生じるのに有用なトランスポゾン、化学、または部位特異的突然変異誘発を使用して生成することができる。
【００９２】
微生物をインキュベートするために使用される培地及び微生物をインキュベートするために使用される培地の体積は、変動することができる。本明細書に記載のタンパク質のうちの１つまたは複数を生成する能力に関して微生物を評価するとき、微生物は、適切な体積、例えば１０ミリリットル〜１リットルの培地中で増殖させることができる。微生物を、例えば、動物への投与における使用のためのタンパク質を得るために増殖させるとき、微生物は、より大量のタンパク質の単離を可能にするために発酵槽で増殖させてよい。発酵槽において微生物を増殖させるための方法は、当技術分野で通常かつ公知のものである。微生物の増殖のために使用される条件は、好ましくは、金属キレート剤、より好ましくは、鉄キレート剤、例えば、２，２’−ジピリジル、ｐＨ６．５〜７．５、好ましくは、６．９〜７．１、及び３７℃の温度を含む。
【００９３】
本発明のいくつか態様では、微生物は、増殖後回収されてよい。回収は、微生物をより小さな体積へと濃縮すること、及び増殖培地と異なる培地中に懸濁することを含む。微生物を濃縮するための方法は、当技術分野で通常かつ公知のものであり、例えば、濾過または遠心分離を含む。典型的には、濃縮された微生物は、適切な緩衝液中に懸濁される。使用することができる緩衝液の例は、ｐＨ８．５のトリス塩基（７．３グラム／リットル）を含有する。任意選択で、最終緩衝液はまた、タンパク質分解を最小化する。これは、最終緩衝液をｐＨ８．０超、好ましくは、少なくとも８．５とすること、及び／または１つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤（例えば、フェニルメタンスルホニルフッ化物）を含むことによって達成することができる。任意選択で、かつ好ましくは、濃縮した微生物を、破砕するまで−２０℃以下で凍結させる。
【００９４】
微生物を全細胞調製物として使用する場合、回収した細胞を通常かつ既知の方法を使用して処理して、細胞を不活性化してよい。あるいは、本明細書に記載のタンパク質を調製するために微生物を使用する場合、微生物は、当技術分野で通常かつ公知の化学的、物理的、または機械的方法を使用して粉砕してよく、それには例えば、沸騰、フレンチプレス、超音波処理、（例えば、リゾチームを用いる消化による）ペプチドグリカンの消化、またはホモジナイゼーションが含まれる。ホモジナイゼーションに有用である好適なデバイスの例は、モデルＣ５００−Ｂ  ＡＶＥＳＴＩＮホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ，Ｏｔｔａｗａ  Ｃａｎａｄａ）である。本明細書で用いるとき、「破砕」は、細胞を細かく砕くことを表す。微生物の破砕は、当技術分野で通常かつ公知の方法によって測定することができ、それには例えば、光学濃度の変更が含まれる。典型的には、微生物の１：１００希釈物の透過率が破砕の前に４０％〜６０％であるとき、透過率は、破砕後に８０％まで増加する（２０％〜４０％の増加）。物理的または機械的方法を使用する場合、破砕中の温度は、タンパク質分解をさらに最小化するために、典型的には低く、好適には４℃で維持する。化学的方法を使用する場合、細胞破砕に最適化するために温度を上昇させてよい。また、化学的方法と、物理的方法と、機械的方法との組み合わせを使用して、微生物の細胞壁を可溶化してよい。本明細書で用いるとき、「可溶化する」という用語は、細胞物質（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物）を、微生物が破砕された緩衝液の水相中に溶解すること、及び不溶性細胞物質の凝集物の形成を表す。理論によって制限されることを意図せず、可溶化の条件が、例えば、遠心分離によって容易に単離可能であるほど十分に大きい不溶性凝集物中への本明細書に記載のタンパク質の凝集をもたらすと考えられる。
【００９５】
本発明のタンパク質のうちの１つまたは複数を含む不溶性凝集物は、当技術分野で通常かつ公知の方法によって単離されてよい。一実施形態では、不溶性凝集物は、限外濾過によって単離されてよい。一実施形態では、不溶性凝集物は、遠心分離によって単離されてよい。典型的には、タンパク質、例えば膜タンパク質の遠心分離は、１００，０００ｘｇの遠心力によって達成することができる。このような遠心力の使用は超遠心機の使用を必要とし、大容量の試料を処理するための大規模化はしばしば困難であり、これらのタイプの遠心分離機では経済的でない。本明細書に記載の方法は、連続フロー遠心分離機、例えば、２５０ｍｌ／分の流速、１７ｐｓｉ、４６，０００ｘｇ〜６０，０００ｘｇの遠心力で使用することができる、Ｔ−１  Ｓｈａｒｐｌｅｓ（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）の使用を可能にするのに十分大きい不溶性凝集物の生成を提供する。他の大規模遠心分離機、例えば、チューブ状ボウル型、チャンバー型、及びディスク型構造のものを使用することができる。そのような遠心分離機は、当技術分野で通常使用され、公知であり、Ｐｅｎｎｗａｌｔ、Ｗｅｓｔｆａｌｉａ及びＡｌｐｈａ  Ｌａｖａｌなどの製造業者から市販されている。
【００９６】
最後に回収したタンパク質を、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、ダイアフィルトレーション、沈殿、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは親和性クロマトグラフィー、または限外濾過及び例えば、アルコール中でダイアフィルトレーションによりタンパク質を洗浄することにより、適切な緩衝液に対して洗浄かつ／または透析する。単離後、タンパク質を、緩衝液中に懸濁し、低温、例えば−２０℃以下で保管する。
【００９７】
全細胞調製物が作製される本発明のこれらの態様では、増殖後、微生物を、グルタルアルデヒド、ホルマリン、またはホルムアルデヒドなどの薬剤を、培養物中の細胞を不活性化させるのに十分な濃度で添加することで死滅させることができる。例えば、ホルマリンは、０．３％の濃度（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で添加することができる。細胞を不活性化するのに十分な期間の後、細胞を、例えば、ダイアフィルトレーション及び／または遠心分離により回収し、洗浄することができる。
【００９８】
他の態様では、本発明の単離されたタンパク質は、組換えで調製されてよい。組換えで調製するとき、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定し、適切な発現宿主へとクローニングしてよい。組換え発現宿主は、適切な培地において増殖し、破砕されてよく、タンパク質は上記のように単離されてよい。あるいは、組換えタンパク質が封入体を形成するとき、通常の方法を使用して、組換えタンパク質を単離及び精製することができる。例えば、封入体は、発現宿主から抽出することができ、封入体内に存在するタンパク質は上述のように可溶化される。
【００９９】
使用方法
本明細書に記載の組成物を使用する方法も提供する。本方法は、動物に有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。動物は、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたは七面鳥を含む）、ウシ科（例えば、ウシを含む）、ヤギ科（例えば、ヤギを含む）、ヒツジ科（例えば、ヒツジを含む）、ブタ科（例えば、ブタを含む）、バイソン科（例えば、バッファローを含む）、ウマ科（例えば、ウマを含む）、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコを含む）、シカ科のメンバー（例えば、シカ、エルク、ムース、カリブー及びトナカイを含む）、またはヒトであることができる。
【０１００】
いくつかの態様では、本方法は、動物への組成物の追加の投与（例えば、１つまたは複数のブースター投与）を、二次免疫応答を増強するまたは刺激するためにさらに含んでよい。ブースターは、初回投与後、例えば、組成物の初回投与の１〜８週間、好ましくは、２〜４週間後に投与することができる。後続のブースターは、毎年、１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与することができる。理論によって制限されることを意図せず、本発明のいくつかの態様では、動物は、動物に投与された組成物のタンパク質上に存在するエピトープと同一であるかまたはこれに構造的に関連するエピトープを有する組成物中に存在するタンパク質を発現する微生物への曝露により野外で攻撃されることになるために、毎年のブースターは必要とされないことが予想される。
【０１０１】
一態様では、本発明は、例えば、動物における抗体の生成を誘発することにより、または組換え技術により、抗体を作製するための方法を対象とする。生成される抗体は、組成物中に存在する少なくとも１つのタンパク質と特異的に結合する抗体を含む。本発明のこの態様では、「有効量」は、動物における抗体の生成をもたらすのに有効な量である。動物が本発明の組成物中に存在するタンパク質と特異的に結合する抗体を生成しているか否かを決定するための方法は、本明細書に記載のように決定することができる。本発明は、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、及びそのような抗体を含む組成物をさらに含む。
【０１０２】
本方法を使用して、組成物のタンパク質が単離された微生物以外の微生物により発現されるタンパク質と特異的に結合する抗体を生成してよい。本明細書で用いるとき、タンパク質と「特異的に結合する」ことができる抗体は、抗体の合成を誘発した抗原のエピトープと相互作用する、または構造的に関連するエピトープと相互作用する抗体である。本発明の組成物中に存在するタンパク質の少なくともいくつかは、異なる種及び異なる属の微生物のタンパク質内に保存されているエピトープを典型的に含む。したがって、一微生物に由来する組成物を使用して生成された抗体は、他の微生物により発現されたタンパク質に結合し、グラム陰性生物に対する広域スペクトルの防御を提供することを期待される。抗体が特異的に結合し得るグラム陰性微生物の例としては、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅを含む）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを含む）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．を含む）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバー、好ましくは、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．（例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａを含む）、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバー、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む）が挙げられる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．の例としては、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＫ．ｏｘｙｔｏｃａが挙げられる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒｓ．、Ｂｒｅｄｅｎｅｙ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ａｇｏｎａ、Ｂｌｏｃｋｌｅｙ、Ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ、Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈａｄａｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、及びＳ．ｔｙｐｈｉが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉの菌株の例としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１ａ、Ｏ２ａ、Ｏ７８、及びＯ１５７、異なるＯ：Ｈ血清型、例えば、０１０４、０１１１、０２６、０１１３、０９１、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉの溶血性菌株、例えばＫ８８＋、Ｆ４＋、Ｆ１８ａｂ＋、及びＦ１８ａｃ＋、ならびにＥ．ｃｏｌｉの尿路病原性菌株が挙げられる。それゆえ、本明細書に記載のタンパク質の組成物を使用して生成された抗体を使用して、発生元、源、及び／またはタンパク質獲得の様式に依存せずタンパク質を同定及び特徴決定し得る。
【０１０３】
本発明は、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質上に存在するエピトープに構造的に関連するエピトープを有するタンパク質を発現する微生物を標的とするためのかかる抗体の使用も対象とする。化合物は、抗体に共有結合することができ、この場合化合物は、例えば、トキシンであることができる。同様に、かかる化合物は、細菌シデロフォアに共有結合して微生物を標的とすることができる。本発明の抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ断片）の化学的カップリングまたはコンジュゲーションは、公知かつ通常の方法を使用して行うことができる。
【０１０４】
一態様では、本発明は、グラム陰性微生物により引き起こされる、ヒトを含む動物における感染症を処置することも対象とする。本明細書で用いるとき、「感染症」という用語は、グラム陰性微生物の動物の体内での存在を表し、これは、臨床的に顕著であってもなくてもよい。感染症を処置することは、予防的であることができる、またはその代わりに、動物が微生物に感染した後に開始することができる。予防的である、例えば、対象が微生物に感染する前に、または任意の感染症が亜臨床的であるうちに開始する処置は、感染症の「リスクがある」対象の処置であると本明細書で表す。本明細書で用いるとき、「リスクがある」という用語は、動物が、記載のリスクを実際に有するまたは有さない可能性があることを表す。ゆえに、典型的には、微生物による感染症の「リスクがある」動物は、微生物による感染症の任意の検出可能な兆候がまだ顕在化していなくても、微生物に感染したと特定されている領域に存在する、かつ／または微生物に曝露する可能性が高い動物であり、これは動物が亜臨床的量の微生物を有している可能性の有無にかかわらない。したがって、組成物の投与は、動物が最初に微生物と接触する前、最中、または後に行うことができる。動物が微生物と最初に接触した後に開始される処置は、微生物による感染症の症状の重症度及び／または臨床的徴候を低減させること、微生物を完全に除去すること、及び／または組成物が投与されていない動物と比較して臨床的に明らかな感染症を経験する可能性を低減させることをもたらし得る。本方法は、有効量の本発明の組成物を、グラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある動物に投与すること、及び感染症を引き起こす微生物の数が低減しているか否かを決定することを含む。グラム陰性微生物は、例えば、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅを含む）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを含む）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．を含む）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバー、好ましくは、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．（例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａを含む）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバーであってよい。一実施形態では、動物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａにより引き起こされる感染症を有するまたは有するリスクがある。本発明のこの態様では、「有効量」は、組成物を投与していない動物と比較して、動物内の特定の微生物の数を減少させる、または動物が臨床的に明らかな感染症を経験する可能性を減少させるのに有効な量である。感染症がグラム陰性微生物、例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａにより引き起こされているか否かを決定するための方法は、感染症が低減し��いるか否かを決定するための方法と同様、当技術分野で通常かつ公知のものである。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、グラム陰性微生物による感染症により引き起こされ得る動物におけるある特定の状態の１つまたは複数の症状または臨床的兆候を処置するための方法を対象とする。本方法は、有効量の本発明の組成物を、状態を有するもしくは有するリスクがある、または状態の症状及び／もしくは臨床的兆候を呈している動物に投与すること、ならびに状態の少なくとも１つの症状及び／または臨床的兆候が変化した、好ましくは減少したか否かを決定することを含む。グラム陰性微生物は、例えば、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅを含む）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを含む）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバー（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、及びＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．を含む）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科のメンバー、好ましくは、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．（例えば、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａを含む）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバーであってよい。一実施形態では、動物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａにより引き起こされる状態を有する。一実施形態では、動物は、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉにより引き起こされる状態を有する。グラム陰性微生物感染により引き起こされる症状及び／または臨床的兆候の例は、当業者に公知である。
【０１０６】
グラム陰性感染により引き起こされる状態に関連する症状及び／または臨床的兆候の処置は、予防的であることができる、またはさもなければ、本明細書に記載の状態の発症後に開始することができる。本明細書で用いるとき、「症状」という用語は、患者により経験される及び微生物による感染症により引き起こされる疾患または状態の主観的エビデンスを表す。本明細書で用いるとき、「臨床的兆候」または、簡潔に、「兆候」という用語は、微生物による感染症により引き起こされる疾患または状態の客観的エビデンスを表す。本明細書で言及する状態に関連する症状及び／または臨床的兆候ならびにそのような症状の評価は、当技術分野で通常かつ公知である。予防的である、例えば、対象で微生物により引き起こされる状態の症状または兆候が顕在化する前に開始される処置は、状態を発症する「リスクがある」対象の処置と本明細書で称する。ゆえに、典型的には、状態を発症する「リスクがある」動物は、微生物により引き起こされる任意の状態の症状または兆候がまだ顕在化していなくても、状態を有する動物が診断されている領域に存在する、かつ／または状態を引き起こす微生物に曝露する可能性が高い動物である。したがって、組成物の投与は、本明細書に記載の状態の発症の前、最中、または後に行うことができる。状態の発症後に開始された処置は、状態のうちの１つの症状もしくは兆候の重症度の低減、または症状もしくは兆候の完全な除去をもたらし得る。本発明のこの態様では、「有効量」は、疾患の症状もしくは兆候の顕在化を予防する、疾患の症状もしくは兆候の重症度を低減させる、かつ／または症状もしくは兆候を完全に除去するのに有効な量である。動物におけるグラム陰性微生物感染症の成功処置例を、実施例１１〜１９に開示しており、これは、本明細書に記載の組成物を投与することによるマウスモデルにおけるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより引き起こされた疾患に対する防御を実証している。このマウスモデルは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより引き起こされる疾患の研究用に一般的に認可されているモデルである。
【０１０７】
一実施形態では、状態は、ウシなどの産乳動物における乳房炎である。本方法は、有効量の本明細書に記載の組成物を、乳房炎を有するまたは有するリスクがある産乳動物に投与すること、及び乳房炎の少なくとも１つの症状または兆候が減少したか否かを決定することを含む。乳房炎は、乳腺の炎症を表す。これは、乳汁における物理的、化学的及び通常細菌学的変化ならびに腺組織における病理学的変化を特徴とする。これらの腺の変化はしばしば、いくつかの症候性状態、例えば、乳汁の変色、凝塊の存在、及び多数の白血球の存在をもたらす。臨床的に、乳房炎は、しばしば乳房の変形をもたらす乳腺における膨張、発熱、疼痛及び硬結として見られる。多くの場合、亜臨床的な感染症の診断は、乳汁の白血球含量または体細胞数（ＳＣＣ）に依存する間接的検査に大きく依存するようになっている。乳房に感染する最も一般的な生物は、大腸菌群、例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐである。比較的頻度は低いが乳房炎を引き起こす他の生物には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．が含まれる。
【０１０８】
別の実施形態では、状態は、ウシなどの動物の乳汁における高体細胞数（ＳＳＣ）である。本方法は、有効量の本明細書に記載の組成物を、高体細胞数を有するまたは有するリスクがある産乳動物に投与すること、及び動物から得た乳汁中の体細胞数が組成物を受ける前の動物から得た乳汁と比較して体細胞数が低下しているか否かを決定することを含む。別の実施形態では、動物の乳汁中の体細胞数を低下させるための方法を本明細書に提供する。体細胞は、動物の白血球を含み、典型的には通常の乳汁において低レベルで存在する。乳汁中の高レベルの体細胞は、例えば、乳汁１ミリリットル当たり２００，０００を超える細胞である。乳汁中の高レベルの体細胞は、感染症（乳房炎）の指標であってよいが、感染症と関係がない可能性もある。ＳＣＣは、典型的には、乳製品工場により、当技術分野で通常の方法を使用してモニターされる。ＳＣＣは、７５０，０００細胞／ｍｌ未満、４００，０００細胞／ｍｌ未満、または２００，０００細胞／ｍｌ未満まで減少する。
【０１０９】
別の実施形態では、状態は、ウシなどの産乳動物による低産乳量を処置することである。本方法は、有効量の本発明の組成物を、低産乳量を有するまたは有するリスクがある産乳動物に投与すること、及び動物による産乳量が組成物を受ける前の動物による産乳量と比較して増加したか否かを決定することを含む。別の実施形態は、ウシなどの産乳動物における産乳量を増加させるための方法を対象とする。本方法は、本明細書に記載の組成物を産乳動物に投与すること、及び動物による産乳量が組成物を受ける前の動物による産乳量と比較して増加したか否かを決定することを含む。本明細書に記載の組成物の投与後の産乳動物による産乳量は、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、または少なくとも３％増加する。ウシによる産乳量は、組成物の投与の前及び投与の２週間、８週間、または１６週間後に決定することができる。
【０１１０】
本発明はまた、グラム陰性微生物によるコロニー形成を低減させるための方法、例えば、グラム陰性微生物の付着部位、例えば、骨格系（例えば、骨、軟骨、腱及び靭帯）、筋系（例えば、骨格筋及び平滑筋）、循環系（例えば、心臓、血管、毛細血管及び血液）、神経系（例えば、脳、脊髄、及び末梢神経）、呼吸系（例えば、鼻、気管肺、気管支、細気管支、肺胞）、消化系（例えば、口、唾液腺、食道、肝臓、胃、大腸及び小腸）、排泄系（例えば、腎臓、尿管、膀胱及び尿道）、内分泌系（例えば、視床下部、下垂体、甲状腺、膵臓及び副腎）、生殖系（例えば、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、及び精嚢）、リンパ／免疫系（例えば、リンパ液、リンパ節及び管、単核または白血球、例えばマクロファージ、好中球、単球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球、例えばＴ細胞及びＢ細胞等）、及び特定の細胞系（例えば、前駆細胞、上皮細胞、幹細胞）等の組織をブロックすることも提供する。一実施形態では、グラム陰性微生物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａである。
【０１１１】
動物においてコロニー形成を低減させることは、予防的に行われてよい、またはその代わりに動物が微生物によりコロニー形成された後に開始することができる。予防的な、例えば、対象が微生物によりコロニー形成される前に、またはいずれのコロニー形成もまだ検出されない間に開始される処置は、微生物によるコロニー形成の「リスクがある」対象の処置と本明細書中で称する。ゆえに、典型的には、微生物によるコロニー形成の「リスクがある」動物は、まだ微生物によるコロニー形成の任意の検出可能な兆候がまだ顕在化していなくても、微生物によりコロニー形成されたと特定されている領域に存在する、かつ／または微生物に曝露する可能性が高い動物であり、これは動物が微生物のサブコロニー形成数を保有している可能性の有無にかかわらない。したがって、組成物の投与は、動物が微生物と最初に接触する前、最中、または後で行うことができる。動物が微生物と最初に接触した後に開始される処置は、微生物によるコロニー形成の程度を低減させること、微生物を完全に除去すること、及び／または組成物が投与されていない動物と比較して動物が微生物によりコロニー形成される可能性を低減させることをもたらし得る。ゆえに、本方法は、有効量の本発明の組成物を、グラム陰性微生物によりコロニー形成されたまたはコロニー形成されるリスクがある動物に投与することを含む。本発明のこの態様では、「有効量」は、微生物による動物のコロニー形成を低減させるために十分な量であり、この場合、コロニー形成を低減させることは、微生物によるコロニー形成の程度を低減させること、微生物を完全に除去すること、及び／または組成物が投与されていない動物と比較して動物が微生物によりコロニー形成される可能性を低減させることのうちの１つまたは複数を表す。微生物による動物のコロニー形成を評価するための方法は、当技術分野で通常かつ公知である。例えば、微生物による動物の腸管のコロニー形成は、動物の糞便中の微生物の存在を測定することによって決定することができる。微生物による動物のコロニー形成を低減させることにより、同じまたは異なる種の他の動物への微生物の伝搬が減少することが期待される。
【０１１２】
本発明の組成物を使用して、細菌感染症に対する能動または受動免疫を提供することができる。通常、組成物は、能動免疫を提供するために動物に投与されることができる。しかしながら、組成物を使用して、生成している動物から回収し受動免疫を提供するために他の動物に投与することができる、抗体などの免疫生成物の生成を誘発することもできる。免疫成分、例えば抗体を回収して、組成物（好ましくは、抗体を含有する）を、血清、血漿、血液、初乳等から受動免疫療法のために調製することができる。モノクローナル抗体及び／または抗イディオタイプを含む抗体組成物も、公知の方法を使用して調製することができる。キメラ抗体は、重鎖及び軽鎖両方のヒト由来の定常領域ならびに抗原特異的であるマウス由来の可変領域を含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１（２１）：６８５１−５；ＬｏＢｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６（１１）：４２２０−４；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２（５９９５）：６４３−６．）。ヒト化抗体は、マウス定常及びフレームワーク（ＦＲ）（可変領域のもの）を、ヒト対応物と置換する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１（６０６９）：５２２−５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２（６１６２）：３２３−７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９（４８４７）：１５３４−６；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６（２４）：１００２９−３３；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９（９）：２４７１−６．）。あるいは、ヒトモノクローナル抗体の生成のために、ほぼ完全にヒト起源のものである抗体を生成するように遺伝子操作されているある特定のマウス菌株を使用することができ；免疫化の後、これらのマウスのＢ細胞を回収し、不死化する（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８（４）：４５５−８；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；１３（１）：６５−９３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６８：８５６−９；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：６２８７−９５．）。受動抗体組成物及びその断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖまたはそれらの他の修飾形態は、血清、血漿、血液、初乳等の形態でレシピエントに投与されてよい。しかしながら、抗体は、血清、血漿、血液、初乳等から、周知の方法を使用して、濃縮または再構成形態、例えば、洗浄液、薬剤含浸包帯（ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）及び／または局所剤等における後の使用のために単離されてよい。受動免疫調製物は、急性全身性疾病の処置、または母親の初乳を介して十分なレベルの受動免疫を受けることができなかった若齢の動物の受動免疫化に特に有益で��り得る。受動免疫化に有用な抗体は、全身性または局所的感染症中に、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質上に存在するエピトープと構造的に関連するエピトープを有するタンパク質を発現する細菌を直接標的とすることができる様々な薬物または抗生物質にコンジュゲートすることにも有用であり得る。
【０１１３】
動物モデル、特にマウスモデルは、本発明の組成物を実験的に評価するために利用可能である。これらのマウスモデル（例えば、Ｍｅｎｏ  ａｎｄ  Ａｍａｋｏ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｉｏｌ．，３５（１０）：８４１−８４８；Ｖｅｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１５：８６５；Ｋｕｒｕｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（１）：８２−８８；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９（３）：４９７−５０５；及びＴｏｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ），４８（５）：６６５−６６９）は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属のメンバー、特にＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより引き起こされる疾患の研究のために一般に認可されているモデルである。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属のメンバーが動物、例えばウシにおいて疾患を引き起こす場合、天然の宿主を使用して、本明細書に記載の組成物を実験的に評価することができる。
【０１１４】
しかしながら、マウスモデルにおける防御は、組成物がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐによる感染症に対して動物に防御を与えることができるか否かを評価するための唯一の方法ではない。適応免疫応答は、２つの主な分類からなる：体液性（抗体）応答及び細胞性（Ｔ細胞）応答。細菌性病原体による感染後、感染部位の樹状細胞は、微生物抗原と遭遇し、シグナル伝達分子、例えば、表面受容体及びサイトカインを特定の細菌に関して保存された分子パターンに応答して生成する。これらのシグナルは、病原体の性質によって成形され、理想的には宿主を疾患から防御する適切な抗体及びＴ細胞応答をもたらす。一部の細菌性疾患が主に抗体機能により制御される一方で、他のものは防御のためにＴ細胞応答または抗体及びＴ細胞応答の両方を必要とする。ワクチンの生物学的な目的は、防御を提供する免疫応答を同定し、そしてヒトにおいてこれらの応答のうちの１つまたは複数を再現するためのワクチンを設計することである。
【０１１５】
抗体は、感染症に対する防御の付与において多くの異なる機能、例えば、補体固定、オプソニン作用、中和、及び／または凝集機能を有することができる。さらには、抗体の一部のサブクラスは、特定の機能において他のものより良好であり；例えば、補体固定に関しては、ヒトＩｇＧサブクラスについて次の順位が存在する：ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４）。
【０１１６】
抗体免疫学的機能は種々の方法で研究することができる。例えば、ウェスタンブロット法は、分離タンパク質のサイズに基づく抗原特異的結合を同定するために使用し、一方で標準的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、血清内の抗体価についての定量的情報を生じるために使用される。抗体表面結合試験は、血清中の抗体がインタクト細菌の表面上の抗原を認識できるか否かを決定するために使用され、これは抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで作用する潜在能力を有するか否かの重要な指標である。ゆえに、当業者は、抗体結合アッセイ、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（例えば、ヒト抗血清を使用する）、及び／または表面結合は、微生物感染症に対する免疫学的活性を提供する特異的に結合される抗原と正の相関があると認識する。しかしながら、当業者は、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、または表面結合アッセイなどのアッセイにおける抗体結合の欠如が、アッセイされた抗原が微生物感染症に対して免疫学的活性を提供し損ねることを意味しないことをさらに認識している。
【０１１７】
抗体は、栄養（例えば、鉄）の獲得を遮断することまたは浸透圧溶解をもたらす補体媒介性膜穿孔処理を開始することによって細菌死を媒介することができる。殺菌性抗体を、血清を生存培養物と混合し、当業者に公知の適切な条件下で生存可能な細菌の存在について測定することによりアッセイすることができる。細菌の死滅レベルを決定するための抗体及び補体結合細菌がヒトまたはマウス貪食細胞に結合されるオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）などの技術は、抗体機能を研究するために有用である。同様の酸化バーストアッセイは、抗体及び補体結合細菌との相互作用後に新しいヒトまたはマウス好中球による活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを評価するために使用することができる。
【０１１８】
いくつかの場合では、候補タンパク質が細胞媒介性免疫学的活性を有し、それゆえ、候補タンパク質が、抗体生成誘発の不在下で、免疫学的活性を呈し得ることを決定することができる。細胞傷害性またはＣＤ８  Ｔ細胞が、直接様々なエフェクター機構を介して感染した細胞を主に死滅させる一方、ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞はサイトカインに関する重要なシグナル伝達を提供するように機能する。これらのＴ細胞クラスは、それらが生成するサイトカインに基づいてさらに細分化することができ、異なるサブクラスは異なる細菌病原体に対して有効である。Ｔ細胞は、これらの表現型をフローサイトメトリーで評価することによって試験されることが多く、この場合、抗体は、Ｔ細胞を、例えば、活性化されたばかりのＣＤ４＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞等としての分類を可能にする特定の表面マーカーのレベルを可視化するために使用される。加えて、サイトカイン及びＴ細胞の他の生成物は、リンパ組織からＴ細胞を単離しこれらを同族抗原で再刺激することによって試験することができる。抗原刺激の後に、Ｔ細胞は、例えば、フローサイトメトリーでカップリングされる細胞内サイトカイン染色、または細胞上清の回収、及び１５〜２５個のサイトカインを同時に測定するためのＬｕｍｉｎｅｘビーズ技術の使用によって可視化され得るサイトカインを生成する。
【０１１９】
ゆえに、マウスモデルに加えて、当業者は、本明細書に記載の方法に相応する免疫学的活性は、以下：微生物病原体に曝露された動物からの血清が、候補タンパク質に特異的に結合する抗体を含有することを示すウェスタンブロットデータ、候補タンパク質に特異的に結合する抗体が、微生物病原体に特異的に結合することを示す細胞表面結合アッセイ、オプソニン化貪食作用データ、及びサイトカイン誘導のうちのいずれか１つまたは複数と相関し得ると認識する。
【０１２０】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のタンパク質と特異的に結合する抗体を検出するための方法を提供する。これらの方法は、例えば、動物が、本明細書に記載のタンパク質と特異的に結合する抗体を有するか否かを検出すること、及び本明細書に記載のタンパク質を発現する、または本明細書に記載のタンパク質とエピトープを共有するタンパク質を発現する微生物により引き起こされる状態を有し得るか否かを診断することにおいて有用である。このような診断システムはキットの形態をとってよい。本方法は、抗体を本明細書に記載のタンパク質を含む調製物と接触させて混合物を得ることを含む。抗体は、生体試料、例えば、血液、乳汁、または初乳中に存在し得る。本方法は、タンパク質：抗体複合体を形成するために、抗体がタンパク質と特異的に結合することを可能にする条件下で混合物をインキュベートすることをさらに含む。本明細書で用いるとき、「タンパク質：抗体複合体」という用語は、抗体がタンパク質に特異的に結合するときに結果として生じる複合体を表す。本明細書に記載のタンパク質を含む調製物は、タンパク質：抗体複合体の形成に適切な条件を提供する試薬、例えば緩衝液も含んでよい。タンパク質：抗体複合体は、その後検出される。抗体の検出は、当技術分野で公知であり、例えば、免疫蛍光またはペルオキシダーゼを含むことができる。本明細書に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体の存在を検出するための方法は、抗体を検出するために使用されている様々な形式、例えばラジオイムノアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイにおいて使用することができる。
【０１２１】
キット
本発明は、本明細書に記載のタンパク質と特異的に結合する抗体を検出するためのキットも提供する。検出される抗体は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＫ．ｏｘｙｔｏｃａなどのグラム陰性微生物により引き起こされる感染症を有すると疑われる動物から得てよい。別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のタンパク質を検出するためのキットを提供する。
【０１２２】
キットは、本明細書に記載のタンパク質のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ等）、または本明細書に記載の抗体を、好適なパッケージング材料内に、少なくとも１つのアッセイに十分な量で含む。任意選択で、他の試薬、例えば、本発明を実施するために必要な緩衝液及び溶液も含まれる。例えば、キットは、本明細書に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体の検出を可能にするための試薬、例えば、動物から得られた抗体に特異的に結合するように設計された検出可能に標識された二次抗体も含んでよい。パッケージングしたタンパク質の使用のための説明書も典型的に含まれる。本明細書で用いるとき、「パッケージング材料」という語句は、キットの内容物を収容するために使用される１つまたは複数の物理的構造を表す。パッケージング材料は、通常、無菌の混入物を含まない環境を提供するために周知の方法により構築される。パッケージング材料は、タンパク質を、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体を検出するために使用することができることを示すラベルを有してよい。加えて、パッケージング材料は、キット内の材料が抗体を検出するためにどのように使用されるかを示す説明書を含有する。本明細書で用いるとき、「パッケージ」という用語は、一定の限度内でタンパク質、及び他の試薬、例えば二次抗体を保持することができる、容器、例えばガラス、プラスティック、紙、ホイル等を表す。ゆえに、例えば、パッケージは、マイクログラム量のタンパク質が添付されているマイクロタイタープレートウェルであることができる。パッケージは、二次抗体も含有することができる。「使用説明書」は、典型的には試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ、例えば混合される試薬及び試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間、温度、緩衝液条件等を説明する具体的な表現を含む。
【０１２３】
本発明は、以下の実施例によって説明される。本明細書中に記載の本発明の範囲及び趣旨に従って、具体的な例、材料、量、及び手順は、広義に解釈するべきであることを理解されたい。
【実施例】
【０１２４】
実施例１
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの臨床分離株の単離
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの分離株を、担当獣医が診断して大腸菌性乳房炎の臨床的兆候（すなわち異常な乳汁；水様粘性、凝塊、血液、乳腺炎、膿の存在、乳房の膨張及び乳汁試料の細菌培養物の同定）を示す商業的な酪農牛群のウシの感染乳房から単離した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒのマスターシードストックを、分離株のそれぞれを、３０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）の２，２−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する５０００ｍｌのトリプチックソイブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）へと接種することにより調製した。培養物を、２００ｒｐｍで６時間、３７℃にて攪拌しながら増殖させた。細菌を、１０，０００ｘｇにて遠心分離により回収した。各分離株からの細菌ペレットを、２０％グリセロールを含有する５００ｍｌトリプチックソイブロスへと再懸濁し、２ｍｌ低温貯蔵用バイアル（１ｍｌ／バイアル）へと無菌的に分注して、−９０℃で保管した。各分離株には、マスターシードとしてそれを示す識別番号を与えた。例えば；１７のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ分離株を同定し、１１０１、１４３７、１４３８、１４３９、１４４０、１５６３、１５６５、１５６６、１５６７、１５６９、１５７０、１５７１、１５７２、１５７３、１５７４、１５７５、及び１５７６と指定した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａは、１５６４と指定し、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒは、１５６８と指定した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのウシマスターシード番号は１５７１、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのウシマスターシード番号は１５６４、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒのウシマスターシード番号は１５６８と指定した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのヒト分離株のマスターシード番号を準備し、ＬＭ２１と指定した（本明細書では１７４８とも称する）。基準菌株として使用するヒトＵＴＩ  Ｅ．ｃｏｌｉ分離株はＣＦＴ０７３と指定した。各分離株のマスターシードを増殖させて、ワーキングシードとし、これを次いで、金属調節タンパク質の生成のために使用した。小実験室規模プロセスを開発して、複数のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ分離株の初期金属調節タンパク質発現を検査した一方で、大規模生成プロセスを開発し、これは、発酵、細菌回収、破砕、可溶化、濃縮、ダイアフィルトレーション、及び最終ワクチン抗原の単離を含む。金属調節タンパク質発現のための小規模及び大規模化プロセスは両方とも、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査したとき、同一のタンパク質プロファイルを生成した。
【０１２５】
実施例２
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａからのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの同定及び分化。
疾患の臨床的兆候を呈しているヒト及びウシの両種からのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  １５６４分離株からＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１を分化させるために、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｃｈａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｉｎｔｅｒｎ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｒｅｓ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ．９：１３８−１４２）により記載されている種特異的プライマーを用いて使用した。アガロースゲル上のバンドの位置は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１では１０８ｂｐ、及びＫ．ｏｘｙｔｏｃａ  １５６４では３４３ｂｐであり、菌株同一性を確認した（図１）。
【０１２６】
プライマー及びＰＣＲ増幅：実施例１のワーキングシードを、血液寒天上に２通りでプレーティングした。プレートを、３５〜４０℃で１８〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを目視検査し、純粋であると決定した。２通りの純粋培養プレートのうちの１つからの単一の良好に単離されたコロニーを、１００μＬ滅菌水に懸濁した。懸濁液を、１０分間沸騰させて、細胞を溶解し、室温にて冷却させた。次いで、懸濁液を、２分間１３，０００ｒｐｍにてテーブルトップ微量遠心機にて遠心分離した。ＤＮＡ鋳型を含有する上清を、新しい、滅菌微量遠心機管へと移し、使用まで−２０℃で保管した。
【０１２７】
種特異的プライマーを、単一反応混合物中でＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＫ．ｏｘｙｔｏｃａの増幅のために使用した（表２）。Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの陽性対照が、アッセイに含まれた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのプライマー無し陰性対照も含まれた。ＰＣＲ反応は、ＱｉａｇｅｎマルチプレックスＰＣＲキットを製造業者の使用説明に従って使用して設定した。反応混合物は：各プライマー（フォワード及びリバース）の２５μＬ  ２ｘ  ＱｉａｇｅｎマルチプレックスＰＣＲマスターミックス；５μＬ  １０ｘプライマーミックス；１５μＬ  ＲＮａｓｅ不含水；５μＬ粗ＤＮＡ鋳型；及び５０μＬ総体積からなる。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りとした：初期変性を９５℃にて１５分間；３０サイクルの変性を９４℃で３０秒間；アニーリングを５５℃で１．５分間；及び伸長を７２℃で１．５分間。
【表２】
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ＰＣＲ生成物を、０．５ｘトリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）中１％アガロースゲル（臭化エチジウムで予め染色）上での電気泳動及びＵＶ透過照明法により可視化した。１００ｂｐのＤＮＡラダーを分子量マーカーとして使用した（図１）。
【０１２８】
実施例３
金属イオン制限の条件下で増殖させた複数の分離株の金属調節タンパク質発現をスクリーニングするためのプロセス
金属調節タンパク質のスクリーニングならびに以下の実施例で使用された免疫化組成物を、疾患の臨床的兆候を有するウシ種から得たＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質を使用して調製した。
【０１２９】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの複数の野外分離株、１５６３、１５６５、１５６６、１５６７、１５６９、１５７０、１５７１、１５７２、１５７３、１５７４、１５７５、及び１５７６ならびにＫ．ｏｘｙｔｏｃａの単一分離株１５６４及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの単一分離株１５６８を、乳房炎の臨床的兆候を示す複数の酪農牛群から回収した。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのヒト分離株ＬＭ２１も、金属調節タンパク質についてスクリーニングした。各分離株を、鉄制限の条件下で増殖させ、鉄制限下で発現されたタンパク質の外膜プロファイルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した（図２）。簡潔には、検査されるそれぞれの分離株を、３００μＭ  ２，２−ジピリジルを含有するＴＳＢへと接種し、３７℃でインキュベートした。１２時間にわたるインキュベーションの後、培養物を５００ｍｌの鉄限定培地へと継代培養（１：１００）し、３７℃でインキュベートした。８時間後、各培養物を、１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、４０ｍｌの浸透圧衝撃緩衝液（７．３ｇ／ｌトリス塩基；１．８６ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．９へと再懸濁し、超音波処理により破砕して、懸濁液を得た。懸濁剤を、３２，０００ｘｇで１２分間遠心分離して、清澄化した、つまり大きな細胞残屑を除去した。上清を回収し、４℃にて２４時間、４％ラウロイルサルコシンナトリウムの添加により可溶化した。洗浄剤−不溶性外膜タンパク質−富化画分を３２，０００ｘｇで２．５時間にわたる４℃での遠心分離により回収した。タンパク質ペレットを、２００μｌトリス−緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁した。
【０１３０】
各分離株に由来するタンパク質富化抽出物を、４％スタッキングゲル及び１０％分離ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズ分画した。電気泳動のための試料を、１０μｌの試料と３０μｌのＳＤＳ還元試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣＬ  ｐＨ６．８、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール）を配合することにより調製し、４分間沸騰させた。試料を、１８ｍＡ定電流で５時間にわたり４℃にて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  ｘｉセルパワーサプライ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，モデル１０００／５００）を使用して電気泳動した。ウシ及びヒト起源のＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの複数の分離株に由来するタンパク質を比較する電気泳動プロファイルを図２に示す。
【０１３１】
タンパク質富化抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、検査したすべての分離株の中で高度の保存性を示し、金属調節タンパク質に関する分子量の範囲は、９７ｋＤａ〜６６ｋＤａであり、非金属調節タンパク質、例えば、ポーリンに関する範囲は、３５ｋＤａ〜３３ｋＤａ（表１）であった。電気泳動プロファイルを、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  １Ｄ  Ｐｒｏゲルソフトウェア（Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して分析して、各菌株間のバンドパターン及び分子量較正を評価した。
【０１３２】
実施例４
一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる鉄過剰及び鉄欠乏下での金属調節タンパク質の分析
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の金属調節タンパク質の上方制御のより良好な展望を得るために、分離株を、鉄過剰及び鉄欠乏培地条件にて増殖させた。簡潔には、生物を、２つの別々の５００ｍｌボトルへと継代培養することにより予め調製しておいた凍結マスターシードストックから増殖させた。一方のボトルは、３００μＭ  ２，２−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する２００ｍｌの滅菌ＴＳＢを含有し、第二のボトルは、２００μＭ塩化第二鉄（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する２００ｍｌのトリプチックソイブロスを含有した。培養物を、３７℃にて２００ｒｐｍで継続的に撹拌しながら１２時間インキュベートした。１２時間のインキュベーション期間の後、培養物を、５００ｍの鉄過剰及び／または鉄欠乏培地のいずれかへと継代培養（１：１００）し、３７℃にて８時間インキュベートした。８時間後、各培養物を、１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、４０ｍｌの浸透圧衝撃緩衝液（７．３ｇ／ｌトリス塩基；１．８６ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．９に再懸濁した。懸濁液を、３２，０００ｘｇで１２分間遠心分離して、清澄化した、つまり大きな細胞残屑を除去した。上清を回収し、４℃にて２４時間にわたる４％ラウロイルサルコシンナトリウムの添加により可溶化した。洗浄剤−不溶性外膜タンパク質富化画分を、３２，０００ｘｇで２．５時間にわたる４℃での遠心分離により回収した。タンパク質ペレットを、２００μｌトリス−緩衝液（ｐＨ７．２）へと再懸濁した。
【０１３３】
各分離株に由来するタンパク質富化抽出物を、４％スタッキングゲル及び１０％分離ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズ分画した。電気泳動のための試料を、１０μｌの試料と３０μｌのＳＤＳ還元試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣＬ  ｐＨ６．８、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール）を配合することにより調製し、４分間沸騰させた。試料を、１８ｍＡ定電流で５時間にわたり４℃にて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  ｘｉセルパワーサプライ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，モデル１０００／５００）を使用して電気泳動した。鉄過剰及び鉄欠乏増殖条件下で増殖させた、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａに由来するタンパク質プロファイルを比較する電気泳動プロファイルを図３に示す。
【０１３４】
実施例５
金属調節タンパク質の大規模製造プロセス
発酵
低温貯蔵用バイアルのワーキングシード（１０９ＣＦＵ／ｍｌにて１ｍｌ）を使用して、３４マイクログラム／リットルの２，２−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ）、２．５グラム／リットルの酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ）及びグリセロール（３％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含有するデキストロース（Ｂａｃｔｏ）を含まない５００ｍｌの３７℃トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）に接種した。培養物を、１６０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃にて１６時間インキュベートし、次いで、上記培地を２つの１．５Ｌボトルに分けた。この二次培養物をさらに２．５時間、３７℃にて増殖させた。この培養物を使用して、Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４消泡剤（１５０ｍｌ）を添加した３００リットルの上述の培地を充填した４００Ｌ  ＤＣＩ−Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ  ＳＩＰ発酵槽（ＤＣＩ，Ｓｔ．Ｃｌｏｕｄ，ＭＮ）に接種した。発酵のパラメータは以下の通りとした：１７〜１２０リットルのエアー／分、０〜６０リットルのエアー／分及び５ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の背圧で分散させ、５００回転／分まで撹拌を増加することによって、６０％＋／−２０％に溶存酸素（ＤＯ）を維持した。５０％ＮａＯＨ及び２５％Ｈ３ＰＯ４で自動滴定することによってｐＨを６．９〜７．２に一定に保持した。温度は３７℃に維持した。発酵を、５．５時間にわたって継続して増殖させ、その時点で、発酵槽の温度を１５℃まで下げ、２５％Ｈ３ＰＯ４でｐＨを５．０まで下げることによって発酵を終了させた（１：２０希釈にて５４０ナノメートルで光学密度１５）。培養物を、回収に備えて２００リットルのタンク（ＬＥＥ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔモデル２０００ＬＤＢＴ）へと無菌で移した。
【０１３５】
回収
細菌発酵物を、Ｗａｕｋｅｓｈａモデル１３０  Ｕ２供給ポンプ（Ｗａｕｋｅｓｈａ  Ｃｈｅｒｒｙ−Ｂｕｒｒｅｌｌ，Ｄｅｌｅｖａｎ，ＷＩ）に接続された、４つの３０ｆｔ２アルファ０．１ｕｍオープンチャネルフィルター（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ，カタログ番号ＰＳＭ１０Ｃ５２）を備えたＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｍａｘｉｓｅｔｔｅ−２５（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏ，ＭＡ）を使用して濃縮及び洗浄した。３００リットルの元々の培養物体積を、３０〜４０ｐｓｉのフィルター入口圧力及び２〜１５ｐｓｉのリテンテート圧力を使用して６０リットルまで減少させた。次いで、細菌リテンテートを、２．７２グラム／リットル酢酸ナトリウム三水和物で構成された２００リットルの酢酸ナトリウム三水和物溶液ｐＨ５．０を使用して洗浄した。６０リットルの細菌リテンテートを、次いで、１４．５２グラム／リットルのトリス塩基及び８．６のｐＨに調整された１．８６グラム／リットルのＥＤＴＡを含有する１００リットルの浸透圧衝撃緩衝液（ＯＭＳ）で洗浄した。ＯＭＳ中のＥＤＴＡは、細胞壁からの多くのＬＰＳの除去に役立ち、一方で上昇したｐＨは、凍結及び破砕後のタンパク質分解の多くを防いだ。プロテアーゼ阻害剤を、上昇したｐＨの代わりにまたはこれに加えて使用してよい。リテンテートを、次いで、４０リットルになるまで濃縮して、任意の混入している外因性タンパク質の除去を助け、次いでさらに２００リットルの上記ＯＭＳを加えて、すべての細菌を洗浄してフィルターを通して回収タンクへと入れた。リテンテートを、２００リットルタンクにある間に底部に搭載した磁気駆動のミキサーを使用して十分に混合した。リテンテートをガンマ照射した５リットルのＩｎｖｉｔｒｏ（商標）容器へと無菌で分注（５リットル）し、貯蔵のために−２０℃の冷凍庫に入れた。細菌ペレットを凍結させることにより細胞壁構造が弱まり、下流での破砕をより効率的にする。ペレット質量を、１ｍｌ試料の発酵した培養物及び最終回収物を遠心分離することにより算出した。予め秤量した１ｍｌコニカル管を、１３，０００ｒｐｍで１０分間Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８にて遠心分離した。上清を捨て、ペレットを滅菌水に再懸濁した。この混合物を再度、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してから、再度デカンテーションした。この洗浄したペレットを１２５℃のオーブンに７５分間置いてから、秤量し、外挿して、回収体積ペレット質量を決定した。発酵プロセスにより、２．３キログラムの乾燥ペレット質量が得られた。
【０１３６】
細菌回収のための代替方法を使用することができる。細菌回収は、中空糸フィルター法の使用により行われてよい。細菌培養物は、０．２μＭ〜５ｋＤａの範囲のサイズであるフィルターカートリッジを使用して；好ましくは、７５０ｋＤａカートリッジを用いて、回収する。培養物は、体積を２〜２０分の１へと減少し、続いて、１〜５回、緩衝液を用いたダイアフィルトレーションにより洗浄され、その後４℃で貯蔵または−２０℃で凍結される。この様式では、望ましくない培地タンパク質、細菌タンパク質及びＬＰＳは、培養物から除去される。別の代替的な細菌回収が、工業規模遠心分離機の使用により、例えば、ディスクスタック遠心分離機の使用により行われてよい。
【０１３７】
破砕（ホモジナイゼーション）
ＯＭＳ中の凍結した細菌細胞スラリーを４℃で解凍した（２．３ｋｇのペレット質量）。各容器からの培養物懸濁液を、１３リットルＯＭＳ  ｐＨ８．５を含有する底部に搭載されたミキサー（ＬｉｇｈｔｎｉｎミキサーモデルＭＢＩ６１０Ｈ５５）を有する２００リットルのプロセスタンク（モデル２００ＬＤＢＴ）へと無菌で吸引した。ＯＭＳの体積は、ペレット質量に３０．８Ｌ／Ｋｇを乗じることによりホモジナイゼーション体積を算出し、ホモジナイゼーション体積を取り、発酵回収物からの細菌の体積を引くことにより決定した。バルク細菌懸濁液を１８Ｈｚで１８時間継続的に混合しながら４℃まで冷却し、この時点で、それはホモジナイゼーションにより破砕した。簡潔には、細胞懸濁液を含有する２００リットルタンクを、ＡｖｅｓｔｉｎモデルＥＦ−Ｃ５００Ｂホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ）に接続した。第二の２００リットルプロセスタンク（空）をホモジナイザーに接続し、それによりプロセスタンク中の液体はホモジナイザーを通して空のタンクへと通過し再度戻すことができ、これにより、クローズドシステムを維持しながら複数回のホモジナイズするための通過を可能にした。ホモジナイゼーション中の温度は、４℃に維持した。各通過の開始時に、流体を、ホモジナイザー（５００リットル／時間）を通してＷａｕｋｅｓｈａモデル３０Ｕ２ポンプ（Ｗａｕｋｅｓｈａ）を介して６０ｐｓｉにて循環させ、元々のタンクへと戻し、一方でホモジナイザー圧は１１，０００〜３０，０００ｐｓｉに調整した。最初の通過前に、２つのホモジナイズ前の試料をホモジナイザーから取り出して、破砕の程度を決定するかつｐＨをモニタリングするためのベースラインを確立した。破砕の程度は、非ホモジナイズ試料と比較して、透過率（１：１００希釈で５４０ｎｍでの％Ｔ）によりモニターした。ホモジナイザーの通過数を、可溶化の効率及び最終産物の品質に直接相関する、細胞壁の完全性及び破砕の程度の変動性に基づいて異なる生物に関して標準化した。例えば、破砕されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａがホモジナイザーを２回通過すると、最終透過率は、１：１００希釈で７８〜８３％Ｔとなった。同じペレット質量及び開始ＯＤを有するＥ．ｃｏｌｉは、２回目の通過後、（１：１００希釈で）８０〜８６％の％Ｔを得た。同一条件下で、細菌はそれらの細胞壁完全性が異なり、その破砕の能力が変動することが観察されている。この変動性は、金属調節タンパク質の可溶化及び修復の程度及び効率に影響し得る。一般に、細胞は、最小でも２回の通過の後、少なくとも８０％の透過率に達するまでホモジナイザーを通過する。
【０１３８】
ホモジナイゼーションの後、ラウロイルサルコシンナトリウム（Ｈａｍｐｔｏｓｙｌ  Ｌ−３０，Ｃｈｅｍ／Ｓｅｒｖ）を、ホモジナイズした細菌懸濁液へと可溶化のために無菌で加えた。加えたサルコシン（３０％）の量は、リットル単位で可溶化体積の０．０８３倍に等しい（可溶化体積は、発酵乾燥ペレット質量に３４．７Ｌ／Ｋｇを乗じることにより決定した）。タンクを、ホモジナイザーから取り除き、２〜７℃の冷蔵庫に入れ、１８Ｈｚで１２〜９６時間混合した。この時間は、可溶化を完了するのに有益であった。上昇したｐＨ（８．０〜８．５）でＯＭＳ中の可溶化時間を増加させると、金属調節タンパク質が一つに凝集して大きな不溶性凝集物を形成し、これは遠心分離により除去が容易であることが発見された。可溶化後の最適なＯＤは、通常、５４０ｎｍで２５〜３０％Ｔであった。タンパク質回収の１２〜２４時間前に、０．１５％のホルマリンを防腐剤として、最終可溶化体積に加えた。
【０１３９】
タンパク質回収
可溶化されたプロセス流体内の凝集した金属調節タンパク質を、Ｔ−１  Ｓｈａｒｐｌｅｓ（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎｓ，Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）を使用して遠心分離により回収した。簡潔には、可溶化したホモジネートのタンクを、２００ｍｌ／分の供給速度、１１ｐｓｉ、３０，０００ｒｐｍの遠心速度で１２台のＳｈａｒｐｌｅへと供給した。流出液を、第二の２００リットルプロセスタンクへとクローズド無菌ループを介して回収し、クローズドシステムを維持しながら遠心分離機を複数回通過できるようにした。遠心分離中の温度は、４℃に維持した。可溶化したホモジネートを、１５０ｍｌ／分の供給速度、２１ｐｓｉ、５０，０００ｒｐｍの遠心速度で遠心分離機を最大１２回通過させた。タンパク質を、最初の通過後に回収し、廃棄し、その時点で可溶化した流体は、元々の体積の１／３まで濃縮された。体積の低減は、２〜１２回の通過のプロセス時間を短縮させた。簡潔には、可溶化されたホモジネートタンクを、濃縮用のＷａｕｋｅｓｈａモデル１３０Ｕ２供給ポンプに接続された３つの３０．１ｆｔ２スクリーン−チャネルシリーズオメガ１０ｋｄ  Ｍａｘｉｓｅｔｔｅフィルター（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）を備えたＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＡＴ２５Ｈｏｌｄｅｒに接続した。濃縮後、プロセスが完了するまで遠心分離を継続した。各通過後にタンパク質を回収した。タンパク質を回収し、防腐剤として０．３％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するトリス−緩衝液ｐＨ８．５を含有する２つの８リットル容器へと再懸濁及び分注した。容器を、ミキサーモデルＴｕｒｂｕｌａ  Ｔ１０Ｂ（Ｍ．Ｏ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ  ｊｅｒｓｅｙ）に入れ、タンパク質が緩衝液中に再懸濁するまで混合した。
【０１４０】
ダイアフィルトレーション
タンパク質懸濁液を、ダイアフィルトレーションにより４℃で洗浄して、タンパク質に結合している可能性がある任意の混入サルコシンを除去した。タンパク質の２つの容器を、２０Ｈｚで混合する底部に搭載したＬｉｇｈｔｎｉｎミキサー、モデルＭＢＩ６１０Ｈ５５を備えた、０．３％ホルマリンを含有するトリス−緩衝液ｐＨ８．５の４０ｍｌ  ＴＢＷ／ｇタンパク質回収物を含有する２００リットルタンク中に吸引した。プロセスタンクを３３℃インキュベーターに最小で１２時間にわたってタンパク質不活性化のために入れた。プロセスタンクを、Ｗａｕｋｅｓｈａモデル３０Ｕ２供給ポンプに接続された２つの２６．９ｆｔ２スクリーン−チャネルシリーズオメガ１０Ｋ  Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅフィルター（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）を備えた、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｅｒアセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）へと無菌で接続した。溶液を、おおよそ３５リットルになるまで濃縮し、０．１％ホルマリン溶液を含有する２００リットルのトリス−緩衝液、ｐＨ７．４で再懸濁した。溶液を、再度おおよそ３５リットルになるまで濃縮し、０．１％ホルマリン溶液を含有する２００リットルのトリス−緩衝液、ｐＨ７．４で再度再懸濁した。次いで、溶液を、おおよそ３５リットルになるまで濃縮し、０．１％ホルマリン溶液を含有する８０リットルのトリス−緩衝液、ｐＨ７．４で再懸濁した。次いで、溶液を、タンパク質ペレット質量の６．５倍の標的体積まで濾過により濃縮した。タンパク質濃縮物を、滅菌２０リットルＮａｌｇｅｎｅ容器へと無菌で分注し、３３℃のインキュベーターに１２〜２４時間にわたって、最終抗原不活性化のために入れた。
【０１４１】
このプロセスにより、ＬＰＳの量が低減し、サルコシン残渣が非常に少ないまたはこれを含まない、金属調節タンパク質を含有する組成物を生成した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度及びバンドプロファイルについて検査し、細菌汚染、残存サルコシン及びＬＰＳについても検査した。完了した生成物のバンドプロファイルは、電気泳動により検査して一貫したパターンを示した。組成物を、サルコシンに関して、改変した寒天ゲル拡散試験の使用により検査し、この検査では、ヒツジ赤血球（５％）を寒天ベース（１．５％）へと組み込んだ。ウェルを、寒天へと切り入れ、完了した生成物の試料を、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５１．０及び２．０％で公知の濃度のサルコシンの対照試料とともに、ウェルに入れた。ゲルを、２５℃で２４時間インキュベートし、溶血の程度を、対照と比較して決定した。このプロセスは、０．０５％未満の検出可能なサルコシンのレベルを除去した。この濃度で対照試料における最小溶血が示された。ＬＰＳの濃度を、商標名ＰＹＲＯＴＥＬＬ（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）の下で利用可能なカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）試験により検査した。
【０１４２】
凍結及びホモジナイゼーションによる細胞溶解の後、タンパク質を中空糸法により回収してよい。細菌ライセートを、濾過して、全細胞及び大きな残屑を微粒子及び可溶性タンパク質から分離する。これは、０．２μＭ〜５ｋＤａの範囲のサイズの中空糸カートリッジ（好ましくは、０．６５μＭ公称孔径を有する）を使用して達成され得る。この様式では、全未溶解細胞及び大きな残屑は保持され、場合によってはフィルターにより濃縮され、一方で目的のタンパク質及び微粒子はフィルターを通過し、回収される。加えて、目的のタンパク質の回収を増加させるために、緩衝液で１〜２０回リテンテートを洗浄することが望ましくあり得る。
【０１４３】
上記の一次回収に続いて、微粒子の細菌膜を、上記のようにサルコシンで可溶化し、その後、さらに分画するまたはタンパク質を回収し、中空糸法により洗浄する。これは次の３つの機能を果たす：望ましくないサイトゾルタンパク質の除去、ＬＰＳを含む望ましくない膜成分の除去、ならびに所望の金属調節タンパク質及びポーリンタンパク質のより高い分子量形態への疎水性凝集。可溶化工程の後、溶液を、０．２μＭ〜５ｋＤａの範囲のサイズの中空糸カートリッジ；好ましくは、実験室及び／またはパイロットスケール限外濾過カートリッジ（例えば、（ＵＦＰ−７５０−Ｅ−６Ａ）サイズ６Ａ限外濾過中空糸カートリッジ（６３．５ｃｍ  Ｌ）；ポリスルホン膜（任意選択で７５０  ０００ＮＭＷＣ孔径を有する）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して濾過する。この工程はまた、濃縮（２〜２０倍）ならびに緩衝液及びエタノールを用いるダイアフィルトレーション洗浄工程（１倍〜２０倍）を含んで、望ましくないタンパク質、膜成分、ＤＮＡ及びサルコシンの除去を向上させ、ゆえに回収した金属調節タンパク質及びポーリンタンパク質の純度を増加させることができる。
【０１４４】
上記のように調製された組成物中に存在するタンパク質の例を図４に示す。５つの高分子量タンパク質（そのうち４つは、図４にて、ＦｅｐＡ、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＡ、及びＣｉｒＡとして同定され、１つは、ＦｅｐＡと同定されるバンドの上へと移動する）及び図４においてＯｍｐＣ及びＯｍｐＡ）と同定される２つの低分子量バンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質を分離した後に観察された。
【０１４５】
実施例６
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ分離株１５７１の金属調節タンパク質の特徴決定
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株１５７１から実施例５に記載のように調製された組成物のタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用して特徴決定した。これらの方法は、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ分離株についても使用された。
【０１４６】
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株１５７１から実施例５に記載のように調製された組成物のタンパク質を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して特徴決定した。組成物の一部を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した。組成物のタンパク質を分離した後、ゲルを、クーマシーブリリアントブルーまたは銀のいずれかで染色して、タンパク質を可視化した。この方法は、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ分離株から得た組成物を特徴決定するためにも使用された。
【０１４７】
材料及び方法
切除及び洗浄。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離し、タンパク質を可視化するために染色した後、ゲルを１０分間水で２回洗浄した。目的の各タンパク質バンドを、試料中に存在するゲルの量を減らすためにタンパク質バンドに可能な限り近いところで切ることによって切除した。６つのゲル断片を図４中でＦｅｐＡ、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＡ、ＣｉｒＡ、ＯｍｐＣ、及びＯｍｐＡと同定される６つのバンドを使用して調製した。
【０１４８】
各ゲル切片を、１×１ｍｍ立方体へと切り、１．５ｍｌ管へと入れた。ゲル片を、水で１５分間洗浄した。洗浄工程において使用されたすべての溶媒体積は、ゲル切片の体積の２倍におおよそ等しかった。次に、ゲル切片を、水／アセトニトリル（１：１）で１５分間洗浄した。タンパク質が銀で染色されているとき、水／アセトニトリル混合物を除去し、ゲル片をＳｐｅｅｄＶａｃ（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）にて乾燥させ、次いで下記のように還元し、アルキル化した。ゲル片が銀染色されていないとき、水／アセトニトリル混合物を除去し、ゲル片が粘着性の白色に変わるまでアセトニトリルを加えて被覆し、その時点で、アセトニトリルを除去した。ゲル片を、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中に再水和し、５分後、ゲル片の体積の２倍に等しいアセトニトリルの体積を加えた。これを、１５分間インキュベートし、液体を除去し、ゲル片をＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。
【０１４９】
還元及びアルキル化。乾燥させたゲル片を、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３に再水和し、４５分間５６℃にてインキュベートした。管を室温まで冷却した後、液体を除去し、同じ体積の５５ｍＭヨードアセトアミドと１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３との混合物を即座に加えた。これを、３０分間にわたって室温で暗所にてインキュベートした。液体を除去し、ゲル片が粘着性の白色に変わるまでアセトニトリルを加えて被覆し、その時点でアセトニトリルを除去した。ゲル片を１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３に再水和し、５分後、ゲル片の体積の２倍に等しいアセトニトリルの体積を加えた。これを、１５分間インキュベートし、液体を除去し、ゲル片をＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。ゲルがクマシーブルーで染色され、残存するクマシーがまだ残っている場合、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／アセトニトリルでの洗浄を繰り返した。
【０１５０】
ゲル内消化。ゲル片をＳｐｅｅｄＶａｃにて完全に乾燥させた。ゲル片を消化緩衝液（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１２．５ナノグラム／マイクロリットル（ｎｇ／μｌ）トリプシン）に４℃で再水和した。十分な緩衝液を加えて、ゲル片を被覆し、必要に応じてさらに加えた。ゲル片を氷上で４５分間インキュベートし、上清を除去し、トリプシンを含まない５〜２μｌの同じ緩衝液で置き換えた。これを、３７℃にて一晩エアーインキュベーター中でインキュベートした。
【０１５１】
ペプチドの抽出。十分な体積の２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を加えて、ゲル片を被覆し、１５分間（典型的には浴超音波処理器内で）インキュベートした。同じ体積のアセトニトリルを加え、１５分間（可能であれば浴超音波処理器内で）インキュベートし、上清を回収した。ＮＨ４ＨＣＯ３の代わりに５％ギ酸を用いて、抽出を２回繰り返した。十分な体積の５％ギ酸を加えてゲル片を被覆し、１５分間（典型的には浴超音波処理器内で）インキュベートした。同じ体積のアセトニトリルを加え、１５分間（典型的には浴超音波処理器内で）インキュベートし、上清を回収した。抽出物をプールし、１０ｍＭ  ＤＴＴを加えて１ｍＭ  ＤＴＴの最終濃度とした。試料をＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させて、おおよそ５μｌの最終体積とした。
【０１５２】
ペプチドの脱塩。試料を、ＺＩＰＴＩＰピペットチップ（Ｃ１８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を製造業者の指示通りに使用して脱塩した。簡潔には、試料を、再構成溶液（５：９５アセトニトリル：Ｈ２Ｏ、０．１％〜０．５％トリフルオロ酢酸）中で再構成し、遠心分離し、ｐＨを調べて、３未満であると確認した。ＺＩＰＴＩＰを、１０μｌの溶液１（５０：５０アセトニトリル：Ｈ２Ｏ、０．１％トリフルオロ酢酸）を吸引し、吸引したアリコートを廃棄することによって水和した。この後、１０μｌの溶液２（脱イオン化Ｈ２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸）を吸引し、吸引したアリコートを廃棄した。試料を、１０μｌの試料をゆっくりとチップへと吸引し、それを試料管へと排出し、これを５〜６回繰り返すことによりチップへとロードした。１０マイクロリットルの溶液２を、チップへと吸引し、溶液を排出により廃棄し、このプロセスを５〜７回繰り返して洗浄した。ペプチドを、２．５μｌの氷冷溶液３（６０：４０、アセトニトリル：Ｈ２Ｏ、０．１％トリフルオロ酢酸）を吸引し、排出し、次いで同じアリコートをチップの内外へ３回再吸引することにより溶出した。溶液をチップから排出した後、管にキャップをし、氷上で保管した。
【０１５３】
質量分析のペプチドマッピング。ペプチドを１０μｌ〜３０μｌの５％ギ酸中に懸濁し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）により分析した。ペプチド断片の質量スペクトルを製造者の指示通りに決定した。簡潔には、トリプシン消化から生じるペプチドを含有する試料をマトリックスであるシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸と混合し、標的へ移し、乾燥させた。乾燥試料を質量分析計に置き、照射し、そして各イオンの飛行時間を検出し、組成物中に存在する各タンパク質のペプチドマスフィンガープリントを決定するために使用した。公知のポリペプチドを、機器を標準化するために使用した。
【０１５４】
データ分析。Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅのペプチドマスフィンガープリント検索方法（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ、及びｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ、Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０，３５５１−３５６７を参照されたい）を使用して、各質量スペクトルにおいて実験上観察されたペプチドの質量を、タンパク質の予測される質量と比較した。検索パラメータは以下を含んだ：データベース、ＮＣＢＩｎｒ；分類、細菌（真正細菌）；検索のタイプ、ペプチドマスフィンガープリント；酵素、トリプシン；固定修飾、カルバミドメチル（Ｃ）または無し；可変修飾、酸化（Ｍ）、カルバミドメチル（Ｃ）、組み合わせ、または無し；質量値、モノアイソトピック；タンパク質質量、無制限；ペプチド質量許容度、±１００ｐｐｍ〜±３００ｐｐｍもしくは４５０ｐｐｍ、または±１Ｄａ；ペプチド電荷状態、Ｍｒ；最大欠失切断、０または１；クエリー数、２５。
【０１５５】
ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、使用されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、６８ｋＤａ、３５ｋＤａ及び３３ｋＤａにて移動したことを示した（表１）。追加のタンパク質は、光バンドであり、８７ｋＤａで移動した。ＭＡＬＤＩ分析及びアミノ酸配列に基づいて予測された分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した、またＭＡＬＤＩを使用した、推定されたタンパク質の分子量間で良好な一致があったと示した（表１）。図４のタンパク質は、ＭＡＬＤＩにより同定した。これらの分析は、各ペプチドマスフィンガープリントに関して最良タンパク質一致を表すタンパク質配列をもたらした。ＦｅｐＡと標識されたバンドに関する最良タンパク質一致は、ＮＣＢＩ基準配列ＷＰ＿０１２０６８４２２．１であり；ＦｅｃＡと標識されたバンドに関する最良タンパク質一致は、ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿９４３４００．１であり；ＦｈｕＡと標識されたバンドに関する最良タンパク質一致は、ＮＣＢＩ基準配列ＷＰ＿００４１７８６２４．１であり；ＣｉｒＡと標識されたバンドに関する最良タンパク質一致は、ＮＣＢＩ基準配列ＷＰ＿０１５９５８７３８．１であり；ＯｍｐＣと標識されたバンドに関する最良タンパク質一致は、ＮＣＢＩ基準配列ＷＰ＿０１５９５８７４９．１であり；ＯｍｐＡと標識されたバンドに関する最良タンパク質一致は、ＮＣＢＩ基準配列ＷＰ＿００２８９８４０８．１であった。
【０１５６】
ゲノム配列
ゲノムＤＮＡをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１分離株から、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ｇＤＮＡ  ミニ細菌キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、製品番号：ＣＳ１１３０１）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡの抽出の前に、分離株の新しい培養物を、５％ヒツジ血液を有するトリプチケースソイ寒天ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，製品コード：２２１２６１）上で一晩３７℃にて増殖させた。手法は、製造業者のプロトコルに従った。ゲノムＤＮＡの最終収量は３３．７μｇであり、これを配列決定まで−２０℃で保管した。ゲノムＤＮＡを、配列決定のために、ＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．に提出した（Ｗｈｅｅｌｉｎｇ，ＩＬ）。
【０１５７】
標的遺伝子の同定
分離株の完全なゲノム配列を受け取った後、ｔｂｌａｓｔｎアライメントを、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースを用いて行って、目的の潜在的な遺伝子を同定した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ゲノム配列の最初の分析は、ＭＡＬＤＩによる６つのバンドのデータ分析の結果を使用した。この分析は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ゲノム配列中に存在する遺伝子によりコードされる以下のタンパク質の同定をもたらした：ＦｅｐＡ、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＡ、ＣｉｒＡ、ＯｍｐＣ、及びＯｍｐＡ。これらのタンパク質、及びそれらをコードする遺伝子を、それぞれ、図１０、７、８、９、２０、及び２１に開示する。完全なゲノム配列の別の分析は、配列内のＴｏｎ  Ｂ依存性ホモログに基づいた。アルゴリズムパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２及びＧａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１とした。ｂｌａｓｔｘ検索を使用して、ｔｂｌａｓｔｎアライメントで見出された相同遺伝子により翻訳されたタンパク質を同定した。アルゴリズムパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２及びＧａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１とした。金属調節ポリペプチドの同定した相同体のペアワイズ配列アライメント。アルゴリズムパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ：１４、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ：４、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｅｓ：１とした。
【０１５８】
他の金属調節タンパク質ＢｔｕＢ、ＹｂｉＬ、ＹｎｃＤ、ＩｒｏＮ、ＩｕｔＡ、ＦｉｔＡ、ＦｃｕＡ、フェリックエンターバクチン（Ｆｅｒｒｉｃ  Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｉｎ）コリシンＢ／Ｄ受容体及びＦｏｘＡに対する潜在的な相同体を同定するために、「ｔｂｌａｓｔｎ」アライメントを、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ分離株の配列決定したゲノムに対して行った。９個の潜在的な相同体が、ゲノム内でそれぞれ最も高い同一性を有する配列を見ることによって同定され、これらを図１１〜１９に開示する。潜在的な相同体のうちの３つの部分ヌクレオチド配列及び予測されたアミノ酸配列を同定した（ＹｎｃＤ、ＩｒｏＮ、及びＦｉｔＡ、それぞれ図１３、１４、及び１６）。
【０１５９】
実施例７
ホルスタイン種去勢雄牛の高度免疫化（Ｈｙｐｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）及びポリクローナル抗体の調製
月齢４カ月の２頭のホルスタイン種去勢雄牛に、実施例５及び６に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１組成物を使用して２８日間隔で３回皮下注射してワクチン接種した。免疫化組成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された８７ｋＤａ、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、６８ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを含んだ。タンパク質を、単一のワクチン製剤へと乳化させた。簡潔には、３２０ｍｇ抗原（金属調節タンパク質及びポーリン）を３５５ｍｌの生理食塩水に混合した。抗原溶液を、８０ｍｌのＥＭＵＬＳＩＧＥＮへと乳化させて、２ｍｌの注射可能な体積中に２２．５％ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ濃度で１５００μｇ総タンパク質の最終用量を得た。３回目のワクチンの２８日後、各去勢雄牛からの２．０リットルの血液をプールし、４℃で２４時間凝固させた。血清を、全血液から３０００ｘｇにて３０分間の遠心分離により分離した。血清８００ｍｌを、１０，０００ｘｇで３０分間再度遠心分離して、任意の混入細胞残屑を除去し、滅菌５０ｍｌコニカル管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中２５ｍｌ体積へと一定分量に分け、使用まで−８０℃で凍結させた。２５ミリリットルの高度免疫化血清を、標準的な硫酸アンモニウム沈殿を使用して精製した。簡潔には、外因性血清タンパク質を、まず抗体沈殿の前に、０．５体積の飽和硫酸アンモニウムｐＨ７．２を加えることにより除去した。溶液を、１００ｒｐｍで２４時間４℃にて撹拌した。溶液を、３０００ｘｇで３０分間再度遠心分離した。上清を回収し、十分な飽和硫酸アンモニウムを加えることにより沈殿させて、５５％飽和の最終濃度を得た。溶液を１００ｒｐｍで２４時間４℃にて撹拌した。沈殿物を、３０００ｘｇで３０分間遠心分離した。各試料からの最終ペレットを、２ｍｌ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２に再懸濁した。沈殿した抗体を、次いで、５０，０００分子カットオフ透析チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌ．）を使用して、３０時間にわたって、リン酸緩衝生理食塩水の３回の１リットル交換に対して透析して、硫酸アンモニウムを除去した。最初の２リットルの交換は、０．０２％アジ化ナトリウムで保存した。最後の１リットル緩衝液交換は、保存剤を含有しなかった。透析液を回収し、３０００ｘｇで３０分間にわたり再度遠心分離して、任意の残存残屑を除去した。抗体溶液を使用前に４℃で４８時間未満にわたって保管した。各試料は、血液寒天上に置いて、無菌性を確認した。
【０１６０】
実施例８
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１金属調節タンパク質とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの他の菌株との交差反応性
実施例７のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の精製された金属調節タンパク質に対して生成された高度免疫化血清を、異なる属及び種からの細菌に対するその交差反応性について検査した。実施例３からの金属調節タンパク質（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５６４、１５６９、１５７１、ＬＭ２１、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  １５６８、及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７）に、電気泳動に供し、その後、実施例７に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１高度免疫化血清を用いたウェスタンブロット分析に供した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７からの金属調節タンパク質も実施例３に記載の通りに調製して検査した。
【０１６１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７、ウシ及びヒト起源のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ならびにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの精製された金属調節タンパク質を、電気泳動に供し、その後、実施例７に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の高度免疫化血清を用いたウェスタンブロット分析に供した。簡潔には、外膜調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で４％スタッキングゲル及び７．５％分離ゲルを使用してサイズ分画した。１０μｌ試料を１０μｌのＳＤＳ還元試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣＬ  ｐｈ６．８、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール）と配合し、４分間沸騰させた。試料を、１８ｍＡ定電流で５時間にわたり４℃にて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  ｘｉセル及びモデル１０００／５００パワーサプライ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用して電気泳動した。バンド移動を、広範囲のカレイドスコープ標準物（ＢｉｏＲａｄ）を用いて可視化して、エレクトロブロット転写に役立て、ブロット上の分子量基準としてビオチン化された広範囲標準物を用いた（図５Ａ及び５Ｂを参照されたい）。ウェスタンブロット分析については、タンパク質を、ゲルからトランス−ブロットニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）上へと一晩、４℃で５０Ｖにて、Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中で、ＢｉｏＲａｄトランス−ブロット転写セル及びＰａｃ  ３００パワーサプライ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、エレクトロブロットした。ニトロセルロース膜を、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ−２０ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中３％フィッシュゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を使用して１時間、３７℃で振とうしながら、ブロックした。膜を、３７℃で乾燥させ、３％フィッシュゼラチンを含有するＴＢＳ中でブロックし、このプロセスを繰り返した。次いで、膜を、実施例７に記載したように免疫化した去勢雄牛から収集したポリクローナル高度免疫化血清でプローブした。一次抗体を、１％フィッシュゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０及び０．２％アジ化ナトリウム（抗体緩衝液）を含有するＴＢＳ中に１／５０に希釈した。膜を、一次抗体溶液と一晩シェーカー上で室温にてインキュベートした。次いで、膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＢＳ（ＴＴＢＳ）中で２回洗浄し、アルカリホスファターゼ−コンジュゲートマウス抗ウシＩｇＧクローンＢＧ−１８（Ｓｉｇｍａ）の１／１０，０００希釈物及びアビジン−コンジュゲートアルカリホスファターゼ（ＢｉｏＲａｄ）の１／３０００希釈物を含有する抗体緩衝液へと移した。膜を、３７℃にて２時間シェーカー上でインキュベートし、次いで、ＴＴＢＳ中で４回洗浄して未結合コンジュゲートを除去した。ブロットを、１×ＡＰ発色緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中にアルカリ性リン酸塩発色試薬Ａ及びＢを含有する基質溶液中で３０分間、３７℃にてシェーカー上で分離させた。その結果得られたウェスタンイムノブロットを、ＢｉｏＲａｄ  ＧＳ−８００濃度計を使用して記録した。（図５Ａ及び５Ｂを参照されたい）。
【０１６２】
ウェスタンブロット分析により、実施例５の精製された金属調節タンパク質に対して調製された陽性抗血清が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７（レーン２）Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ（レーン３）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５６９（レーン４）Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＬＭ２１（レーン５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１（レーン６）及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  １５６８（レーン７）の複数の金属調節タンパク質と強く反応したことが明らかになった。これらの結果は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの金属調節タンパク質が高度の抗原相同性をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの異なる菌株ならびに細菌の異なる属及び種に対して有することを示す。
【０１６３】
実施例９
金属調節タンパク質の配列同一性
他のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ分離株に対するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の様々な金属調節タンパク質の相同性をさらに実証するために、複数のペプチド（ＣｉｒＡ、ＦｃｕＡ、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＡ、及びＩｕｔＡ）のアミノ酸配列同一性を調べて、相同性の割合（％）を決定した。分離株はまた、特定の疾患状態、例えば、ウシ種における乳房炎ならびにヒトにおける敗血症、肺炎、新生児敗血症、肝膿瘍、尿路感染症、脳脊髄感染症及びＥＴＥＣ下痢症に基づいて選択された。タンパク質配列を、ＮＣＢＩのタンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）の規定設定を使用して分析した。ｅゼロに等しいｅ値との一致及び９５％を超えるクエリーカバレッジは、相同であるとみなした。表３は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１と、農業動物及びヒトの両方において異なる疾患状態を誘導したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの他の分離株との間で共有される金属調節タンパク質を示す。すべての分離株が検査されたすべての鉄調節タンパク質を含有するわけではないが、表３から見られるように、大半の金属調節タンパク質がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌株にわたって９９〜１００％同一性に達した。加えて、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン菌株において見出された金属調節タンパク質の大半が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの他の分離株と比較して、６０％を超えて最大で９９％までの有意な同一性を示す。個別の金属調節タンパク質が６００を超えるアミノ酸から構成されること、及び免疫応答が５〜２０アミノ酸の範囲のエピトープを認識することを考慮すると、これらのタンパク質が優れた標的抗原であることが明確に実証される。ゆえに、金属調節タンパク質を使用して調製されたワクチンは、ヒト及び動物集団の両方における広域スペクトルの疾患状態の原因となる複数のグラム陰性病原体を対象とする広範防御性のワクチンを提供することが期待される。
【表３】
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【０１６４】
実施例１０
病原性を増強するためのマウスにおけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１の連続継代
病原性を増強するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１を、新しい宿主種であるマウスにおいて連続的に継代した。簡潔には、実施例１の上記の培養物を使用して、２匹のマウスに０．１または０．２ｍｌのいずれかで１．０×１０９ＣＦＵ／ｍｌの分離株を皮下注射した。接種の２４時間後、マウスは罹患したが死亡していなかった。マウスを、頚椎脱臼により安楽死させ、各肝臓を、炎に当てたループ（ｆｌａｍｅｄ  ｌｏｏｐ）を使用して培養し、血液寒天上にプレーティングした。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。０．２用量からのコロニーの数は、血液寒天プレート上で増殖し、これは、分離株が全身に達したことを示す。これらのコロニーを、単離のために画線し、同じ隊を使用して再度マウスを介して継代させた。最終的なマウス継代では、攻撃の２４時間後にすべてのマウスが死亡したが、これは、分離株が、結果のパラメータとして死亡を伴う病原性の増強により新しい宿主種において増殖するように適応したことを明らかに実証している。分離株を、最終肝臓単離物から継代培養し、増殖させて凍結した攻撃シードとした。簡潔には、血液プレートからの単一コロニーを、３２ｇｍ  ＴＳＢ、５ｇｍ酵母抽出物、及び２，２−ジピリジルを２５μｇ／リットルで含有する２０ｍｌのＴＳＢに継代培養した。培養物を、２００ｒｐｍで２時間撹拌し、その時点で、３７℃に予め加温しておいた同じ培地に継代培養した。２時間後、１０ｍｌの培養物を１００ｍｌの予め加温しておいたＴＳＢへと上述のように移したが、但し、２，２−ジピリジルの濃度を２５μｇ／ｌとした。この培養物を、それらが５４０ｎｍでＯＤ１．０に達するまで増殖させ、その時点で、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、９０ｍｌの冷ＴＳＢに上記のように再懸濁したが、但し、これは２０％グリセロールを含有した。１ｍｌの細菌懸濁液のアリコートを、２ｍｌクライオバイアルへと分注し；ラベルを付けて、使用まで−９０℃で保管した。
【０１６５】
実施例１１
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１に由来する免疫化組成物の調製
実施例５に記載の通りにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１から作製されたタンパク質を使用して、マウスへの投与のための組成物を調製して、生存病毒の同種及び異種攻撃に対するワクチンの有効性を決定した。Ｈａｒｌａｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た、１６〜２２グラムの体重の８０匹の雌ＣＦ−１マウスを、４つの群（２０マウス／群）、２つのワクチン接種群及び２つのプラセボ群に等しく分けた。マウスは、ポリカーボネートマウスケージ（Ａｎｃｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｌｌｍｏｒｅ，ＮＹ）に収容した。４つのケージを、各処置群に使用して（５マウス／ケージ）、各ケージのマウスの数を最小限にした。群を、１〜４と番号付けした。群１をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａプラセボと指定し、群２をＥ．ｃｏｌｉプラセボと指定し、群３及び４は両方とも実施例５のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１組成物を用いてワクチン接種した。ワクチン組成物は図４に示すタンパク質を含有した。
【０１６６】
実施例１２
マウスワクチン接種
ストックワクチンを、タンパク質懸濁液（１０００μｇ総タンパク質／ｍｌ）を市販のアジュバントである、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）へと２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌのアジュバント濃度を得るように乳化することにより調製した。マウス用量を投与して、０．１ｍｌの注射可能な体積中に１００μｇ総タンパク質の最終用量を得た。プラセボを、上記製剤中で抗原を生理食塩水と置き換えること、及び懸濁液をＥＭＵＬＳＩＧＥＮへと２２．５％のアジュバント濃度を得るように乳化させることにより、調製した。食餌及び水は、すべてのマウスに自由に与えた。マウスは、２回、２１日間隔でプラセボ及び／またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチンを皮下でワクチン接種させた。
【０１６７】
実施例１３
攻撃生物の調製
実施例１０に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ分離株１５７１を、群１及び３の同種攻撃に使用し、群２及び４のマウスは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３で攻撃した（異種攻撃）。簡潔には、凍結ストックからの攻撃分離株を、血液寒天プレート上に画線し、３７℃で１８時間インキュベートした。ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａプレートまたはＥ．ｃｏｌｉプレートのいずれかからの単一のコロニーを、２５μｇ／ｍｌ  ２，２’ジピリジルを含有するトリプチックソイブロス（Ｄｉｆｃｏ）の２つの５０ｍｌボトルのうちの１つに継代培養した。培養物を、５４０ｎｍにて０．９５〜１．０のＯＤが達成されるまで２００ｒｐｍで回転させながら３７℃で６時間インキュベートし、その時点で、１０，０００ｘｇで１０分間４℃にて遠心分離して、細菌をペレット化した。細菌ペレットを、生理食塩水中４℃にて遠心分離により２回洗浄した。最終ペレットを、生理食塩水中１００ｍｌに再懸濁し戻し、攻撃に使用した。攻撃の直前に、１ｍｌの上記細菌懸濁液を、１０倍まで連続希釈して、ＣＦＵ／マウス用量の数を数えた。
【０１６８】
実施例１４
攻撃
マウスに対して、二回目のワクチン接種の２８日後に攻撃を行った。群１及び３のマウスを、０．１ｍｌ体積中５．７×１０７ＣＦＵのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１を用いて腹腔内攻撃し、群２及び４のマウスは、０．１ｍｌ体積中１．３×１０７ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３を用いて腹腔内攻撃した。マウスを、攻撃後１０日間にわたって死亡率に関して毎日モニターした。
【０１６９】
群１及び３（同種攻撃）における攻撃されたマウスの死亡率を比較すると、群３のワクチン接種マウスは高度の防御（９０％生存能（ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ））を示し、対照的に、そのプラセボ対照が示した生存率はわずか２５％であった。比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５７１組成物を用いてワクチン接種し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３で攻撃された（異種攻撃）マウスは、６０％生存能で有意な程度の防御を示し、対照的に、そのプラセボ対照が有した生存能は、投与されたワクチンの用量でわずか３０％であった。より高用量の抗原、例えば、１５０ｕｇ〜２００ｕｇで免疫化すると、より高度の防御がもたらされ得ることが期待される。結果は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１組成物が、細菌の別の属に対する防御能力を有することを明確に実証する（図６）。
【０１７０】
実施例１５
発現クローンの構築及び組換え金属調節タンパク質の精製
金属調節タンパク質ＦｅｃＡ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株１５７１由来）のアミノ酸配列（配列番号４１、４番目のアミノ酸はＮである）、ならびにＣｉｒＡ、ＦｅｐＡ及びＩｕｔＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＣＦＴ０７３由来）のアミノ酸配列（図３６〜３８）を、アセンブリのためにＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に提出した。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ソフトウェアを使用して、最適化された遺伝子合成のために、タンパク質配列をＤＮＡへと逆翻訳した。配列を、Ｎ末端に６×ヒスチジンタグを付加する、ｐＱＥ３０Ｘａ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）へとクローニングし、このベクターを使用して、ＸＬ−１  ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株を形質転換した。組換え金属調節タンパク質を標準的な方法を使用して発現及び精製した。凍結細菌ストック（１００ｕｌ）を使用して、プラスミド維持のために１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを有する２０ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロスに接種して、培養物を３７℃で振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）中で増殖させた。１６時間後、培養物を１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを有する１ＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロスへと１：５０に希釈し、０．６の光学密度（６００ｎｍ）まで増殖させ、次いで１ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導した。細菌ペレットを、４，０００ｘｇで２０分間４℃にて遠心分離することにより回収し、リン酸緩衝食塩水中で洗浄し、次いで、１００ｕｇ／ｍｌリゾチームを有する２０ｍＭトリス緩衝液に再懸濁した。次いで、細胞を、５０％デューティ比及び５出力（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）にて８分間氷上で超音波処理することにより破砕した。ライセートを、遠心分離に１０分間４０，０００ｘｇで４℃にて供して、不溶性物質を除去した。可溶性上清を、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により処理して、ヒスチジンタグ付き組換えタンパク質を精製し、次いで、アニオン交換クロマトグラフィーを行って純度を増加させ、エンドトキシンを除去した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して推定し、タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ濃度測定により７０パーセント超で測定した。エンドトキシンは、カブトガニ血球抽出成分を使用する細菌エンドトキシンに関するカイネティック比濁試験を使用して４０ＥＵ／ｍｇタンパク質未満であると確認した。これらの結果を表４にまとめる。
【表４】
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【０１７１】
実施例１６
複数のワクチン製剤を評価するマウス敗血症モデルにおけるワクチン媒介性防御
マウス敗血症モデルを、以下のワクチン組成物；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅウシ菌株１５７１、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヒト菌株ＬＭ２１の抽出金属調節タンパク質（実施例５に記載の通りに調製）、及び４つの組換え金属調節タンパク質ＦｅｃＡ、ＣｉｒＡ、ＦｅｐＡ及びＩｕｔＡを含有する製剤（実施例１５に記載の通りに調製）を評価するために選択した。１６〜２２グラムの体重の８０匹の雌ＣＦ−１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、６群（１０マウスを含有する群１を除いて、一群あたり１５マウス）に無作為に分けた。群は、１〜６と番号付けした。群１、２、及び３は対照と指定した。群１は、ナイーブ対照（非ワクチン接種／攻撃）とし、群２は、５０％不完全フロイントアジュバント、１０μｇ  ＣｐＧ及び２．５μｇモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）を有するアジュバント対照（ワクチン接種／攻撃）とし、群３は、５０％不完全フロイントアジュバントを有するアジュバント対照（ワクチン接種／攻撃）とした。群４、５、及び６は、それらの適切なアジュバント対照群に相関するそれらのそれぞれのワクチン製剤を用いてワクチン接種した（表５）。マウスは、ポリカーボネートマウスケージ（Ａｎｃｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｌｌｍｏｒｅ，ＮＹ）に収容した。３つのケージを、各処置群に使用して（５マウス／ケージ）、各ケージのマウスの数を最小限にした。すべてのマウスを、最初のワクチン接種の１週間前に順化させた。個別のワクチン製剤を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１を攻撃生物と使用して、マウス敗血症モデルにおける死亡に対するそれらの防御能力に関して評価した（実施例１０）。
【表５】
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【０１７２】
実施例１７
ワクチン調製及びワクチン接種
ワクチン調製のために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌株１５７１及びＬＭ２１のそれぞれに由来する１００マイクログラムのタンパク質抽出物または２０ｇのリン酸緩衝食塩水中の各組換えタンパク質を、それらの適切な試験アジュバントで製剤化した（表５を参照されたい）。マウスは、肩甲下腰帯にて皮下で０．１ｍｌの適切なワクチンを用いて１４日間隔で３回免疫化した。すべてのマウスに対して、二回目のワクチン接種の４２日後に攻撃した。
【０１７３】
実施例１８
攻撃生物の調製
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１細菌攻撃分離株を、実施例１０に記載の凍結ストックから調製した。簡潔には、凍結ストックからの攻撃分離株を、血液寒天プレート上に画線し、３７℃で１８時間インキュベートした。単一のコロニーを、２５μｇ／ｍｌ  ２，２’ジピリジルを含有する１００ｍｌのトリプチックソイブロス（Ｄｉｆｃｏ）へと継代培養した。培養物を、５４０ｎｍで０．９５〜１．０のＯＤに達するまで２００ｒｐｍで回転させながら３７℃で６時間インキュベートし、その時点で、１０，０００ｘｇで１０分間４℃にて遠心分離して、細菌をペレット化した。細菌ペレットを、遠心分離により生理食塩水中で４℃にて一度洗浄した。最終ペレットを、生理食塩水中１００ｍｌに再懸濁し戻し、攻撃に使用した。すべてのマウスに、０．１ｍｌ体積中８．５×１０７コロニー形成ユニットのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１を腹腔内攻撃した。攻撃の直前に、１ｍｌの上記細菌懸濁液を、１０倍まで連続希釈して、ＣＦＵ／マウス用量の数を数えた。
【０１７４】
実施例１９
攻撃結果
ナイーブ及びプラセボ対照のうち、群１のナイーブマウスの８０パーセント（８０％）が、攻撃後に死亡し、それに比べて群２のマウスでは７３％が死亡し、群３のマウスでは８０％が死亡した（表６）。これらの結果により、アジュバント単独では、攻撃に対する防御を提供しないことが実証され、これは、アジュバントにより誘導された非特異的免疫性がなかったことを示す。比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５７１由来のワクチン組成物を使用して（攻撃に対して同種）群４においては３匹のマウスのみが死亡した（８０％生存率）（表６、図２２）。比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １７４８由来のワクチン組成物を使用して（攻撃に対して異種）群５では４匹のマウスのみが死亡した（７４％生存率）（表６、図２２）。これらの結果は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１から調製したワクチン組成物が、同種及び異種攻撃に対する防御免疫性またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの複数の菌株に対する防御を提供することができることを明確に実証する。
【０１７５】
比較して、最初にＭＡＬＤＩにより同定され、次いで、ＦｅｃＡ、ＣｉｒＡ、ＦｅｐＡ及びＩｕｔＡを含むＥ．ｃｏｌｉからクローニング、発現、及び精製された組換えタンパク質のワクチン組成物も、有意な程度の防御を攻撃に対して誘導した。組換えタンパク質を用いてワクチン接種した（単回用量の２０μｇの各タンパク質で試験した）マウスの５３パーセント（５３％）が、攻撃から生存した。より高い濃度（例えば、マイクログラム用量）の組換えタンパク質が、抽出されたタンパク質群と比較して同等の防御をもたらすと予測される。加えて、この組成物中のエンドトキシンの量は、１００ＥＵ／用量未満であった。これを考慮して、ＬＰＳは、ワクチン組成物に混入し得る菌体抗原がＥ．ｃｏｌｉ由来であるが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに由来しないために、菌体抗原の存在に基づき防御を提供しなかったと述べることができる。この情報及び攻撃菌株の異種特性に基づき、防御の程度は、ワクチン組成物中の組換えタンパク質に起因すると結論付けることができる。
【表６】
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【０１７６】
実施例２０
ホルスタイン種若雌牛における乳房内攻撃に対するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１由来の金属調節タンパク質の有効性
乳房炎は、乳腺及び乳房組織の炎症であり、乳牛の主要な風土病である。これは通常、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａなどの様々な細菌種による乳頭管の細菌侵入に対する免疫応答として生じる。この実験研究では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１に由来する金属調節タンパク質を含むサブユニットワクチンを使用して、ホルスタイン種若雌牛における生存乳房間攻撃に対する有効性を評価した。この実験研究のワクチン接種及び非ワクチン接種プラセボ対照間のワクチン有効性を確立するために使用した試験パラメータは、１）乳房内攻撃後の定量的クリアランス、２）体細胞数、３）ワクチン接種に対する血清学的反応、４）乳汁の質、５）直腸の温度及び６）攻撃後の乳房炎症とした。
【０１７７】
実施例２１
ワクチン調製
実施例５に記載の通りにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１から作製されたワクチン組成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される、８７ｋＤａ、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、６８ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを含んだ。菌株１５７１に由来する免疫化組成物を使用して、抽出したタンパク質懸濁液（６００μｇ総タンパク質／ミリリットル）を市販のアジュバント（ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ，ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｎｅｂｒ．）へとＩＫＡプロセスパイロット２０００／４−ＤＲ（ＩＫＡ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）を使用して２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌのアジュバント濃度を有する２．０ｍｌの注射可能な体積中１，２００μｇ総タンパク質の最終用量を得るように乳化することにより、実験用ワクチンを調製した。プラセボワクチンを、上記プロトコルにおいてタンパク質懸濁液を生理食塩水に置き換えることで調製した。
【０１７８】
実施例２２
実験設計及び牛群のワクチン接種
分娩前おおよそ６０日の８頭のホルスタイン種若雌牛を、４頭の若雌牛／群からなる２つの群に無作為に割り当てた。若雌牛を、耳タグにより識別し、大きな商業酪農場でおおよそ５００頭のウシと混合させた。群−１の若雌牛は、プラセボ対照としての役割を果たし、群−２の若雌牛は、実施例２１のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１ワクチン組成物を用いてワクチン接種した。若雌牛は、右上肩の皮下に２１日間隔で２ｍｌのプラセボ及び／またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いて２回ワクチン接種した。若雌牛は、１日２回、彼らの生産段階に適切な混合飼料を与えられた。すべての若雌牛には、試験中、自由に水を飲ませた。
【０１７９】
血液を、最初のワクチン接種時、２回目のワクチン接種時、及び再度２回目のワクチン接種の２週間後に採取した。すべての血液は、滅菌した１３ｘ７５ミリメートル（ｍｍ）バキュテイナ採血管、ブランドＳＳＴ番号３６９７８３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）に採取した。凝固後、採血管を８００ｘｇで３０分間遠心分離し、分析まで−８０℃で凍結させた。分娩のおおよそ３０日後の若雌牛を、乳房内攻撃のために別の施設へと移送した。
【０１８０】
実施例２３
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１におけるナリジクス酸耐性の選択
実施例１のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１分離株を、ナリジクス酸耐性にした。攻撃菌株において公知の抗生物質に対する耐性を誘発することは、環境におけるその有病率のために攻撃された試料に混入し得る他のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌株からの攻撃菌株の分化を助ける。抗生物質耐性を誘導するために、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５７１菌株を、漸増濃度のナリジクス酸中で増殖させた。簡潔には、３５ｇｍトリプチックソイ、５ｇｍ酵母抽出物、及び２，２−ジピリジルを２５μｇで含有するＴＳＢの２つの１．０リットルストック溶液を調製し、３０分間オートクレーブし、次いで、４℃まで冷却した。ナリジクス酸を、１リットルＴＳＢストック溶液のうちの１つに、０．２ｕフィルターを通して膜濾過により加えて、１５０μｇ／ｍｌの最終濃度とした。そうして１５０μｇナリジクス酸を含有するＴＳＢを、２０ｍｌストック（５０ｍｌコニカル管）溶液へと、ナリジクス酸を伴わないＴＳＢを希釈剤として使用して希釈して、以下の濃度を得た；０（ナリジクス酸無し）、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び非希釈１５０μｇ。
【０１８１】
実施例１のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５７１分離株を、凍結貯蔵庫から取り出し、血液寒天上にプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートし、その時点で、単一コロニーを採取し、非ナリジクス酸ＴＳＢ管のうちの１つに無菌で接種し、３時間３７℃で、２００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。接種の３時間後、２ｍｌの培養物を、予め３７℃まで加温した２０ｍｌの２５μｇナリジクス酸管へと移した。培養物を、３７℃にて、２００ｒｐｍで迅速に撹拌しながら３時間増殖させた。このプロセスを２回繰り返し、次いで、次の濃度のナリジクス酸に移した。増殖が生じなかった場合、プロセスを前回の濃度で繰り返し、それから次の漸増濃度へと移した。これを、増殖が最高濃度のナリジクス酸で確立されるまで各濃度で行った。増殖が１５０μｇ／ｍｌレベルで確立されたら、培養物を、１５０μｇ／ｍｌナリジクス酸を含有するＥＭＢ上にプレーティングした。分離株の単一コロニーを選択し、１５０μｇ／ｍｌナリジクス酸を含有する１００ｍｌ  ＴＳＢ（上記の培地）へと移した。培養物を、３７℃で４．５時間または５４０ｎｍにて１．０のＯＤが達成されるまで増殖させた。次いで、培養物を、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、その時点で、上清を廃棄し、ペレットを、上記の通りだが２０％グリセロール及び２５μｇ／ｍｌ  ２，２−ジピリジルを含有する９０ｍｌのＴＳＢ培地に再懸濁した。細菌懸濁液の１ｍｌアリコートを、２ｍｌクライオバイアルに分注し、使用まで−９０℃で保管した。
【０１８２】
実施例２４
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１を用いた乳房内攻撃
攻撃の前に、各若雌牛の全４つの分房からの乳汁試料を回収し、細菌学的な分析を行って、いずれの分房も感染していないことを決定した。攻撃の当日、実施例２３の凍結ストックからのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５７１のナリジクス酸耐性菌株を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に所定のレベルまで希釈して、１．０ｍｌ体積中に１００コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の攻撃用量を得た。乳頭カニューレを使用して、すべての若雌牛に対して、それぞれの乳房の乳頭管を通して１つの分房に攻撃した。次いで、攻撃用量を、乳頭及び乳房内へと手で搾り上げた。若雌牛を、それらの直腸の温度、乳汁の質、及び乳房の炎症の差異について各搾乳の際にモニターした。加えて、体細胞数の決定及び攻撃生物の計数のために、乳汁試料を各若雌牛の攻撃した分房から採取した。若雌牛を、攻撃後７日間１日２回搾乳し、その時点で試験を終了した。
【０１８３】
結果
ワクチン接種に対する血清学的反応
ワクチン接種に対する血清学的反応を、ＥＬＩＳＡによりモニターした。各血清試料を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１抗原を捕捉分子として個別に使用して実行した。簡潔には、９６ウェルプレートをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１抗原を用いて高度免疫化されているシチメンチョウからのシチメンチョウ血清の１：１，０００希釈物でコーティングした。コーティング後、プレートを、ＰＶＡ／ＰＢＳでブロックし、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  １５７１抗原からの抗原を、ウェルに加えてインキュベートした。次いで、抗原を、除去し、プレートを洗浄し、評価すべきウシ血清の１：１，０００希釈物をプレートに２通りで加えた。血清を除去し、プレートを洗浄した。ヒツジ抗ウシコンジュゲートをプレートに１：２０，０００希釈で加え、インキュベートした。コンジュゲートを、プレートから除去した。プレートを洗浄し、基質を発色のために加え、発色をその後分光光度計で読み取った。Ｓ／Ｐ算出については、陰性対照血清からの平均シグナルを、すべてのＯＤ値から差し引いた。評価される試料については、試料の平均ＯＤを、平均陽性対照試料ＯＤで割った。
【０１８４】
図２３は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１ワクチン組成物を用いてワクチン接種した若雌牛の血清学的反応を示す。ワクチン接種したすべての若雌牛は、抗体反応を、プラセボ対照とは対照的に最初のワクチン接種の２１日後に示した。このあと、２回目のワクチン接種の２１日後に抗体の増加を伴う既往反応を示した。
【０１８５】
酪農業においてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａにより引き起こされる乳房炎は、しばしば異常な乳汁として見られる乳汁の質の喪失の原因となる。例えば、乳房炎を有するウシは、フレーク、小さなスラグ、大きな凝塊を含む、または粘質の水っぽい粘性を有する乳汁をしばしば有し得る。これらの特徴は、臨床的乳房炎を示している。図２４は、１６日間にわたる各若雌牛に関する乳汁スコアを示す。１のスコアは正常、２はフレークの存在を表し、３は小さなスラグの存在を表し、４は大きなスラグまたは凝塊の存在を表し、５は、粘質または水っぽい粘性を表す。結果は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１組成物を用いたワクチン接種が、乳汁の質の全体的な定量的計測を改善したことを示す。ワクチン接種は、非ワクチン接種対照と比較して乳汁の質を統計学的に改善した（ｐ＝０．０４２）。これは、すべての４つの非ワクチン接種対照が攻撃後に臨床的乳房炎を発症した一方で、ワクチン接種した若雌牛のうち２頭のみが乳房炎の定義を満たしたことから、乳房炎の低減と直接相関した。乳房炎の存在は、対照の場合と比較してワクチン接種の場合に有意に減少した（ｐ＝０．０４６）。
【０１８６】
分娩の３０日後、若雌牛を、１００ＣＦＵのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１を用いて、乳頭管を通して乳房内で攻撃した。若雌牛を、攻撃後７日間連続で１日２回搾乳した。攻撃された分房からの乳汁試料を回収し、計数時まで−９０℃で凍結させた。図２５は、２回の攻撃前試料採取、及び１４回の攻撃後連続的試料採取（すなわち、７日間連続で１日あたり２回の試料採取）に関するワクチン接種とプラセボ対照との間での乳汁試料中の攻撃生物の蔓延の差異を示す。対照と比較してワクチン接種した若雌牛の感染乳房に由来する乳汁中に放出されているＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの量の有意な低減があった。試験期間を通して平均して、ワクチン接種した若雌牛は、試料採取した５６のうちわずか１５、つまり２７％の陽性Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳汁試料を有した。対照的に；プラセボ対照における陽性Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳汁試料の数は、６４％、つまり５６のうち３６が陽性であった。
【０１８７】
実施例２５
慢性感染酪農牛群におけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するワクチン組成物の評価
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａに帰する慢性乳房炎の病歴を有する商業的な酪農牛群を、実施例５に記載のワクチン組成物の評価のために選択した。この実験研究のワクチン有効性を確立するための基準は、以下：１）プラセボ対照と比較した、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａワクチン接種の間でＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより引き起こされる臨床的乳房炎の罹患率及び発症率の減少、２）プラセボ対照と比較した、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａワクチン接種の間で大腸菌性乳房炎の罹患率及び発症率の減少、３）プラセボ対照と比較した、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａワクチン接種の間で体細胞数の改善（すなわち、低減）ならびに４）プラセボ対照と比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａワクチン接種の間で産乳量における改善（すなわち、増加）、の９５％信頼区間を有する推定される発病防止率に基づく。
【０１８８】
実施例２６
ワクチン調製
実施例５に記載の通りにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１から作製されたワクチン組成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した、８７ｋＤａ、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、６８ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを含んだ。菌株１５７１に由来する免疫化組成物を使用して、抽出したタンパク質懸濁液（６００μｇ総タンパク質／ミリリットル）を市販のアジュバント（ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ，ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｎｅｂｒ．）へとＩＫＡプロセスパイロット２０００／４−ＤＲ（ＩＫＡ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）を使用して、２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌのアジュバント濃度を有する２．０ｍｌの注射可能な体積中１，２００μｇ総タンパク質の最終用量を得るように乳化することにより、実験用ワクチンを調製した。プラセボワクチンを、上記プロトコルにおいて生理食塩水にタンパク質懸濁液を置き換えることにより調製した。
【０１８９】
実施例２７
実験設計及び牛群ワクチン接種
本試験は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを制御する、検証的、無作為化、盲検、及びプラセボ対照有効性試験として実施された。合計で、５６９頭のホルスタインまたはジャージー種のウシ及び若雌牛を、本試験に登録した。ウシは、乾乳期にある時期を除いて単一のフリーストール牛舎に収容した。乾乳期の間、ウシは指定の乾乳牛舎へと移動させた。若雌牛は、分娩が近くなるまで若雌牛舎におり、分娩の時点で、フリーストール牛舎へと移動させて搾乳牛群に混ざった。ウシを無作為化してＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン、またはアジュバントのみを含有するプラセボワクチンのいずれかを受けさせた。ウシ及び若雌牛は、登録の当日に２ｍｌで皮下に注射し、３週間後に２回目の用量を投与した。乾乳期が近いウシ及び分娩が近いウシを除いて、全ウシ群ワクチン接種レジメンを行って試験を開始し、３週間後にブースター投与を行った。乾乳ウシプロトコルを設定して、すべてのウシ及び若雌牛に、２１７日間の有仔期間（ｄａｙｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｃａｌｆ）（ＤＣＣ）を達したら、２用量のワクチンを、３〜４週間の間隔でワクチン接種した。実験設計を表７にまとめる。
【表７】
2018527405.tif 000008
【０１９０】
結果
ワクチン接種に対する各ウシの血清学的反応を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。各群から２０頭のウシを無作為に選択して、プラセボ対照と比較してＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  １５７１組成物に対するワクチン接種後の血清学的反応を評価した。ウシから採血し、それらの血清を、最初のワクチン接種時、２回目のワクチン接種時、及びそれらの２回目のワクチン接種の２週間後に回収した。血清は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による分析まで、凍結して保管した。
【０１９１】
９６（９６）ウェルのポリスチレンプレートを、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ポリペプチドを標的抗原としてコーティングした。ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された、８７ｋＤａ、８２ｋＤａ、７８ｋＤａ、７２ｋＤａ、６８ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの分子量を有した。各血清試料を、１：４００から１：４０９，６００へと４倍希釈し、２通りで検査した。各検査プレートは、公知の陽性対照血清（実施例７の高度免疫化血清）の標的希釈（１：４００）の２つのウェルを含有した。これらの陽性対照ウェルは、１）確かな検査を保証するためのプレート内対照及び２）血清力価を算出する手段という目的を果たした。力価は、試料の希釈曲線がプレート上の陽性対照ウェルの平均ＯＤ値の５０％と交わる点として定義した。コンピュータソフトウェアを使用して、インターセプトポイントを決定して、プレート上で検査した各血清試料に関する算出された力価値を生成及び報告した。
【０１９２】
ワクチンポリペプチドに対する抗体は、ワクチンを１回目の投与後にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種において検出可能であり、２回目の投与の後、有意に増加した（図２６）。この酪農場ではＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染が慢性的に発生し、天然曝露による死亡が継続的に生じていることは興味深い。しかしながら、この曝露は、金属調節タンパク質が、自然野外条件下及び感染中に細菌の表面上で発現されているとしても、金属調節タンパク質に対する免疫性を誘導しなかった。ウシが、調製された金属調節タンパク質のワクチン組成物を用いてワクチン接種されるまで、適応免疫応答はこれらの標的免疫原を生成しなかった。これは図２６において見ることができ、ここで、ワクチン接種または刺激されてワクチン組成物における標的免疫原を認識するものと対照的に、非ワクチン接種動物は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａに継続的に曝露されているとしても抗体反応を示さない。
【０１９３】
実施例２５からの血清を、ウェスタンブロット法により分析して、ワクチン製剤から何のタンパク質が認識されたかを決定した。ウェスタン分析は、ＷＥＳキャピラリー電気泳動システム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を使用して行った。精製されたポリペプチドを用いてワクチン接種したウシからの血清は、ワクチン組成物中の金属調節タンパク質と反応し、一方でプラセボを用いてワクチン接種したウシからの血清は反応しなかった。加えて、精製されたポリペプチドを用いてワクチン接種したウシは、組換えタンパク質ＦｅｃＡと反応したが、プラセボワクチン接種ウシからの血清は反応しなかった（図２７）。これらのデータにより、ワクチンが金属調節タンパク質ＦｅｃＡを含有したことが確認された。また、これらのデータにより、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅへの自然感染は、これらのタンパク質に対する強い免疫応答を誘導できないことを確認した。
【０１９４】
実施例２７からのウシを１日３回搾乳し、乳房の膨張、乳汁色の変化、フレーク状のまたは塊状の乳汁等の乳房炎の臨床的兆候についてモニターした。加えて、産乳量が通常レベルから低下しているウシのリストを毎日、農場経営者から牧夫に、乳房炎を確認するためのさらなる警告として提供した。ウシが乳房炎を有する疑いがある場合、２通りだが、独立した乳汁試料をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｓｔｉｔｉｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌの推奨慣行に従い、無菌で収集し、第一の試料が汚染されている場合（２を超える生物の単離）、第二の試料を検査することができる。
【０１９５】
乳汁試料を、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに提出して、乳房炎事象に関する原因物質を決定した。好気性培養を、１０μｌを血液及びＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレート上にプレーティングすることにより完了して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、及び他の大腸菌群、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｐｐ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、及びＳｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．を含む乳房炎病原体の存在及び同定を決定した。細菌同定手法は、州の診断検査室により行い、すべての分離株に関してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる細菌同定の確認を行った。２回目のワクチン接種の２週間以上後に発生した乳房炎事象は、試験の適格事象とみなした。
【０１９６】
この試験のための泌乳１〜９０日目のウシにおいて大腸菌群に起因すると確認された臨床的乳房炎は５３例あり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎は２０例あった。この発症率は、ワクチン有効性を判断するのに十分であった。
【０１９７】
泌乳期の最初の９０日間に大腸菌性乳房炎を有したウシは４６頭であった。臨床的に罹患したウシの培養により同定される大腸菌群には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｅｒｒａｔｉａ及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒが含まれる。これらのウシの３０（３０）頭は、プラセボ群（全体で２２５頭）であり、１６頭はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群（全体で２２５頭）であった。ワクチン接種したウシにおける大腸菌性乳房炎の罹患率の４７％減少は、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０３０５）（図２８）。
【０１９８】
泌乳１〜９０日目のウシにおいて大腸菌性乳房炎の５３例の別々の症例があった。これらの事象の３６（３６）例は、プラセボ群のウシに由来し、１７例は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群のウシに由来した。ワクチン接種したウシにおける臨床的乳房炎の発症率の５５％減少は、統計学的に非常に有意であった（ｐ＝０．００５７）（図２９）。
【０１９９】
適切なワクチン防御により、酪農場では、大腸菌性乳房炎を有さないウシの割合が高くなることが期待される。図３０は、大腸菌性乳房炎を有さないウシの割合を経時的に示し、プラセボ群のウシでは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群のウシよりも早い速度で落ちる（すなわち、より多くのウシが大腸菌性乳房炎を有する）ことを実証する（ｐ＝０．０２２７８）。
【０２００】
大腸菌性乳房炎を引き起こす最も一般的な生物は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａであり、続いてＥ．ｃｏｌｉである。ウシが泌乳毎に４回、市販のＪ５ワクチンでワクチン接種していた牛群においてこのように多くの大腸菌性乳房炎が見られたことは驚くベきことであった。乾燥させた肥料固形物の上にウシを寝かせることにより、高発症率の原因が部分的に明らかになる可能性がある。しかしながら、高攻撃に直面しても、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種したウシは、プラセボを用いてワクチン接種したウシと比較して、有意な防御を有した（図２８及び２９）。
【０２０１】
酪農業における乳房炎に伴う別の大きな問題は再発性感染症である。単一の乳房炎エピソードの実際のコストはウシ及び乳汁の価格で変動するが、処置費、取替原価、及び販売可能な乳汁の低減からの経済的損失は、壊滅的であり得る。１９９１年に実施されたある実験では、１つの乳房炎エピソードのコストを１０７ドル／ウシとした（Ｈｏｂｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９：１９０−１９６）。これらのコストは、単一のウシに感染が再発したときにはもちろん増幅する。本試験では、再発性感染症は、プラセボ群において、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群よりも頻繁に生じ、これは、表８に見ることができる。プラセボ群における９頭のウシがどのように再発性乳房炎事象を有し、５頭のウシが３または４回の再発性感染症を有したことに留意された。比較して、ワクチン接種群においては４頭のウシのみが、モニタリング期間に乳房炎の単回再発を有した。
【表８】
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【０２０２】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎は、この牛群における最大の大腸菌性問題である。１８頭のウシがその泌乳期の最初の９０日間にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有した。これらのウシのうち、１４（１４）頭が、プラセボ群（全体で２２５）であり、４頭のウシがＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群であった（全体で２２５）（図３１）。ワクチン接種群におけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎の罹患率の７１％減少は、高く統計学的に有意であった（ｐ＝０．０１７１；）。前述のとおり、ＩＳＵ  Ｄａｉｒｙの経験は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有するウシの６０〜８０％がその泌乳期間内に集団を離れるということである。臨床的Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有すると診断されたウシは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群では４頭のみであったのに対し、プラセボ群では１４頭であり、プラセボ群においてワクチン接種群よりも６〜８頭多くのウシがその泌乳期が終わる前に殺処分されるまたは死亡すると予測された。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いたワクチン接種は、乳房炎エピソードのコストを減らし、殺処分を減らすことも含む。
【０２０３】
適切なワクチン防御により、酪農場では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有さないウシの割合が高くなることが期待される。図３３は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有さないウシの割合を経時的に示し、プラセボ群のウシでは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群のウシよりも早い速度で落ちる（すなわち、より多くのウシがＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎を有する）ことを実証する（ｐ＝０．０２１５）。
【０２０４】
泌乳１〜９０日目のウシにおいてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎の２０例の別々の症例があった。これらの事象の１６（１６）例は、プラセボ群のウシに由来し、この短い観察期間中に２頭のウシにおいてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎が再発した。４例のみのＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種群に由来するウシで観察され、これらの動物の中で観察期間中に再発したものはなかった（図３２）。ワクチン接種したウシにおけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ乳房炎の発症率の７５％減少は、統計学的に非常に有意であった（ｐ＝０．００５６）。
【０２０５】
ウシを、試験期間を通して１日３回搾乳し、生産された乳汁のポンド数は、酪農場でソフトウェアを介して電子的に記録した。ウシは、酪農改善協会（Ｄａｉｒｙ  Ｈｅｒｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＤＨＩＡ）によりおおよそ１カ月毎に検査され、各ウシの乳汁中の体細胞数を決定し、Ｄａｉｒｙ  Ｃｏｍｐソフトウェアに記録した。
【０２０６】
ウシにより生成される乳汁の量は、全身健康状態の有用な指標であることができる。酪農業において、臨床的乳房炎が罹患したウシの産乳量を減少させることが周知である（Ｇｒｏｈｎ，ｅｔ．ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，８７：３３５８−３３７４；Ｐｉｎｚｏｎ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，９４：１８７３−１８９２）。本試験では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種ウシでは、最初の９０ＤＩＭの間、プラセボウシよりも乳量が平均で１日あたり２．０ポンド多かった。９０日間にわたって、これは、推定でウシ１頭あたり１８０ポンド多い乳量に相当することが予想され、その間にウシはピーク泌乳であると予測される。典型的には、酪農業では、ピーク乳汁のときに乳量が１ポンド増加するごとに、典型的な３０５日の泌乳期において２００〜２５０ポンド多い乳量が得られる。それゆえ、ピーク泌乳でのワクチン接種ウシにおける２ポンドの増加は、典型的な３０５日の泌乳期に追加の４００〜５００ポンドの乳量をもたらすと予測される。９０ＤＩＭまでのこの試験におけるウシ１頭あたりで生成される乳汁の平均ポンド数のグラフを図３４に示す。
【０２０７】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種ウシによる産乳量の統計学的に有意な増加（Ｐ＝０．００００）は、２つの群間の臨床的乳房炎の差異のみに基づいて説明することは困難である。月毎の産乳量差異のより詳細な分析（図３５）は、夏の数カ月における最大の差異を示す。興味深いことに、夏における条件は、大腸菌群が肥料中で生存するための理想的な条件を提供し、大腸菌性感染症の増加と関連する。
【０２０８】
体細胞数（ＳＣＣ）を日常的に使用して、乳汁の質をモニターし、典型的には臨床的乳房炎中に増加する。本試験で分析した臨床的乳房炎に加えて、ＳＣＣは、亜臨床的乳房炎の良好な指標でもある。乳汁結果において述べたように、臨床的乳房炎単独の場合にそのような産乳量の大きな増加が見られることは驚くべきことである。それゆえ、ＳＣＣを、被験動物における乳房健康状態の独立した指標として使用した。本試験では、体細胞数は、プラセボウシと比較して、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン接種ウシにおいて減少した。データは、カテゴリー的に、かつ数値的に分析することができる。カテゴリー的に、酪農業では、亜臨床的であっても、２００，０００超の細胞／ｍｌの閾値を乳房炎の指標として使用する。プラセボでワクチン接種したウシからの乳汁は、２００，０００ＳＣＣ／ｍｌを２５．４％の期間で上回っていたが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチンを用いてワクチン接種したウシからの乳汁は、このレベルを１１．７％の期間でのみ上回った。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １５７１ワクチン群における臨床的に有意なＳＣＣの保有率の５４％減少は、統計学的に非常に有意であった（Ｐ＝０．００００）。群間のＳＣＣの定量的比較は、４２％のワクチン接種におけるＳＣＣの全体的な減少を示し、これも非常に有意であった（Ｐ＝０．００００；付録Ｃ）。ワクチン接種ウシ間でのＳＣＣの減少は、臨床的乳房炎の低減と一致しており、臨床的大腸菌性乳房炎のみならず、亜臨床的大腸菌性乳房炎にも起因する可能性がある産乳量の増加を説明するための見識を提供する。
【０２０９】
本明細書中に記載される全特許、特許出願、及び公報、ならびに電子的に利用可能な資料（例えば、ヌクレオチド配列寄託、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ、ならびにアミノ酸配列寄託、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ、ならびにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付コード領域からの翻訳を含む）のすべての開示内容は、その全体が参照により組み込まれている。公報において参照される補足資料（例えば、補足表、補足図、補足材料及び方法、ならびに／または補足実験データ）も同様に、その全体が参照により組み込まれる。本出願の開示内容と参照により本明細書中に組み込まれる任意の文献の開示内容（複数可）との間に何らかの矛盾が存在する場合、本出願の開示内容が優先されるべきである。上述の詳細な説明及び実施例は、単に理解の明確化のために与えられている。これらから不必要に限定解釈してはならない。本発明は、示され記載される正確な詳細に限定されず、当業者にとって明らかである変更が、特許請求の範囲で定義される本発明内に含まれることになる。
【０２１０】
別段の記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲の中で使用される成分の量、分子量等を表わす数値はいずれも、「約」という用語により、すべての場合において修飾されているものと理解されたい。したがって、これとは反対の記載が別途ない限り、本明細書及び特許請求の範囲中に記載される数値パラメータは概算値であり、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動してよい。最低限でも、特許請求の範囲の同等物の原理を制限するものではないが、各数値パラメータを解釈する際には、少なくとも報告された有効桁数を考慮し、従来の端数処理の手法（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いるべきである。
【０２１１】
発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメータは概算値であるが、個々の実施例に記載した数値は、可能な限り正確に報告した。しかしながら、いずれの数値も、そのそれぞれの検査測定値に見られる標準偏差から生じる、必然的にある範囲を含有する。
【０２１２】
見出しはいずれも読者の便宜のためのものであり、特に明示した場合を除いて、その見出しに続く本文の意味を限定するために用いるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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