(57)【要約】  本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体、かかる抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
2018522562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヒトＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号１７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）とを含み、場合により、
ａ）前記ＨＣＤＲ１残基Ｓ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ｂ）前記ＨＣＤＲ１残基Ｉ４が、Ｍ、Ｌ、又はＶに変異しており、
ｃ）前記ＨＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａに変異しており、
ｄ）前記ＨＣＤＲ２残基Ｓ３が、Ａ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ｅ）前記ＨＣＤＲ２残基Ｐ４が、Ｖ、Ｔ、Ｌ  Ｑ、又はＥに変異しており、
ｆ）前記ＨＣＤＲ２残基Ｎ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｇ）前記ＨＣＤＲ２残基Ｔ９が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｈ）前記ＨＣＤＲ２残基Ｎ１０が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｉ）前記ＨＣＤＲ３残基Ｓ１が、Ａ、又はＭに変異しており、
ｊ）前記ＨＣＤＲ３残基Ｒ２が、Ａ、Ｓ、Ｑ、又はＫに変異しており、および、
ｋ）前記ＨＣＤＲ３残基Ｌ７が、Ｍに変異している、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号３７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）と、を含み、場合により、
ａ）前記ＬＣＤＲ１残基Ｑ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｂ）前記ＬＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｃ）前記ＬＣＤＲ１残基Ｓ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｄ）前記ＬＣＤＲ１残基Ｓ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｅ）前記ＬＣＤＲ２残基Ａ２が、Ｓに変異しており、
ｆ）前記ＬＣＤＲ２残基Ｎ３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｇ）前記ＬＣＤＲ２残基Ｓ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｈ）前記ＬＣＤＲ２残基Ｌ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｉ）前記ＬＣＤＲ２残基Ｑ６が、Ｅ、Ｄ、又はＮに変異しており、
ｊ）前記ＬＣＤＲ２残基Ｓ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｋ）前記ＬＣＤＲ３残基Ｓ３が、Ａに変異しており、
ｌ）前記ＬＣＤＲ３残基Ｄ４が、Ｎに変異しており、
ｍ）前記ＬＣＤＲ３残基Ｓ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、および、
ｎ）前記ＬＣＤＲ３残基Ｉ６が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖに変異している、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ）それぞれ、配列番号３６、４３、及び５１、
ｂ）それぞれ、配列番号３７、４４、及び５２、
ｃ）それぞれ、配列番号３８、４５、及び５３、
ｄ）それぞれ、配列番号３９、４６、及び５４、
ｅ）それぞれ、配列番号４０、４７、及び５５、
ｆ）それぞれ、配列番号４１、４７、及び５６、
ｇ）それぞれ、配列番号４２、４８、及び５７、
ｈ）それぞれ、配列番号３７、４９、及び５２、又は
ｉ）それぞれ、配列番号３７、５０、及び５２
の、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記配列番号１７のＨＣＤＲ１（ＳＹＧＩＳ）と、前記配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、前記配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）と、前記配列番号３７のＬＣＤＲ１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、前記配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、前記配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）とを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、以下の特性：
ａ）前記抗体と、可溶性ヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４）との免疫複合体が、血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される；
ｂ）０．０３％のポリソルベートＰ２０及び１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有しているダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて、２５℃下でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する；
ｃ）ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する；又は
ｄ）分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する；
のうちの少なくとも１つを有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
ＣＤ１５４がホモ三量体であり、前記抗体が、前記ホモ三量体中の第１のＣＤ１５４モノマーにＣＤ１５４のアミノ酸残基１８２〜２０７内で結合し、前記ホモ三量体中の第２のＣＤ１５４モノマーにＣＤ１５４のアミノ酸残基１７６〜２５３内で結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、前記第１のＣＤ１５４モノマー中の残基Ｅ１８２、Ｓ１８５、Ｑ１８６、Ａ１８７、Ｐ１８８、Ｓ２１４、Ａ２１５、及びＲ２０７に結合し、ここで残基付番は配列番号１に準拠する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、前記第２のＣＤ１５４モノマー中の残基Ｔ１７６、Ｆ１７７、Ｃ１７８、Ｑ２２０、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｇ２５０、及びＦ３５３に結合し、ここで残基付番は配列番号１に準拠する、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号５９の重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、場合により、前記ＶＨは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、場合により、前記ＶＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号６６、７２、又は７３の前記ＶＬを含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号５９の前記ＶＨ、及び配列番号６６の前記ＶＬを含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号５９の前記ＶＨ、及び配列番号７２の前記ＶＬを含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号５９の前記ＶＨ、及び配列番号７３の前記ＶＬを含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型アイソタイプである、請求項２に記載の抗体。
【請求項１６】
Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換が、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓであり、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記Ｆｃ領域に置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓを含み、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換が、置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓであり、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２０】
前記Ｆｃ領域に置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含み、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
ａ）それぞれ、配列番号８０及び８１、
ｂ）それぞれ、配列番号８２及び８１、又は
ｃ）それぞれ、配列番号８３及び８１
の、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が多重特異性である、請求項２に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、
ａ）それぞれ配列番号１７、２３、３０、３７、４４、及び５２の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号５９の前記ＶＨ及び配列番号６６の前記ＶＬ、又は
ｃ）配列番号８０の前記重鎖及び配列番号８１の前記軽鎖
を含む、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２４】
配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、ＣＤ１５４がホモ三量体であり、前記抗体が、前記ホモ三量体中の第１のＣＤ１５４モノマーにＣＤ１５４のアミノ酸残基１８２〜２０７内で結合し、前記ホモ三量体中の第２のＣＤ１５４モノマーにＣＤ１５４のアミノ酸残基１７６〜２５３内で結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２５】
治療薬又は造影剤に結合させた請求項２に記載の抗体を含む免疫複合体。
【請求項２６】
請求項２に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
前記配列番号５９の抗体ＶＨをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３の抗体ＶＬをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号７６、７７、７８、又は７９のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記配列番号５９の抗体ＶＨと、前記配列番号６６の抗体ＶＬとをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項２７、２８、２９、又は３０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分の製造方法であって、
前記抗体が発現される条件下で請求項３２に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞より産生された前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項３４】
自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療方法であって、
治療有効量の請求項２に記載の単離された抗体又は請求項２６に記載の医薬組成物を、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患の治療を必要としている患者に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記免疫介在性炎症性疾患又は前記自己免疫疾患が、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、多発性硬化症、甲状腺炎、１型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
関節炎が、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、又は痛風性関節炎である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、狼瘡である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、移植である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＢＤがクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第２の治療剤をさらに投与する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の治療薬が、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチラート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、コルチコステロイド、細胞毒性剤、免疫抑制剤、及び／又は抗体である、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
治療に使用するための、請求項２に記載の抗体又は請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、
ａ）それぞれ、配列番号１６、２２、及び２９、
ｂ）それぞれ、配列番号１７、２３、及び３０、
ｃ）それぞれ、配列番号１６、２４、及び３１、
ｄ）それぞれ、配列番号１８、２５、及び３２、
ｅ）それぞれ、配列番号１９、２６、及び３３、
ｆ）それぞれ、配列番号２０、２７、及び３４、又は
ｇ）それぞれ、配列番号２１、２８、及び３５
の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、場合により、前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２及び／又は前記ＨＣＤＲ３における保存的アミノ酸置換を１つ、２つ、又は３つ有し、
ここで、前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより定義されるものである、単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項４５】
ａ）それぞれ、配列番号３６、４３、及び５１、
ｂ）それぞれ、配列番号３７、４４、及び５２、
ｃ）それぞれ、配列番号３８、４５、及び５３、
ｄ）それぞれ、配列番号３９、４６、及び５４、
ｅ）それぞれ、配列番号４０、４７、及び５５、
ｆ）それぞれ、配列番号４１、４７、及び５６、
ｇ）それぞれ、配列番号４２、４８、及び５７、
ｈ）それぞれ、配列番号３７、４９、及び５２、又は
ｉ）それぞれ、配列番号３７、５０、及び５２
の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、場合により、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２及び／又は前記ＬＣＤＲ３における保存的アミノ酸置換を１つ、２つ、又は３つ有し、
ここで、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより定義されるものである、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
ａ）それぞれ配列番号１６、２２、及び２９の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３６、４３、及び５１の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３とを含む、又は
ｂ）配列番号５８の前記ＶＨと配列番号６５の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】
ａ）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、４４、及び５２の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号５９の前記ＶＨと配列番号６６の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４８】
ａ）それぞれ配列番号１６、２４、及び３１の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、４５、及び５３の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号６０の前記ＶＨと配列番号６７の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４９】
ａ）それぞれ配列番号１８、２５、及び３２の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３９、４６、及び５４の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号６１の前記ＶＨと配列番号６８の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５０】
ａ）それぞれ配列番号１９、２６、及び３３の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４０、４７、及び５５の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号６２の前記ＶＨと配列番号６９の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５１】
ａ）それぞれ配列番号２０、２７、及び３４の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４１、４７、及び５６の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号６３の前記ＶＨと配列番号７０の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５２】
ａ）それぞれ配列番号２１、２８、及び３５の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４２、４８、及び５７の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号６４の前記ＶＨと配列番号７１の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５３】
ａ）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、４９、及び５２の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号５９の前記ＶＨと配列番号７２の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５４】
ａ）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、及び前記ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、５０、及び５２の前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３と、を含む、又は
ｂ）配列番号５９の前記ＶＨと配列番号７３の前記ＶＬとを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５５】
前記抗体が、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型アイソタイプである、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５６】
Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む、請求項５５に記載の抗体。
【請求項５７】
前記Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換が、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓであり、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項５６に記載の抗体。
【請求項５８】
前記Ｆｃ領域に置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含み、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項５７に記載の抗体。
【請求項５９】
前記Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換が、置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓであり、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項５６に記載の抗体。
【請求項６０】
前記Ｆｃ領域に置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含み、残基付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項５９に記載の抗体。
【請求項６１】
前記抗体が多重特異性である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６２】
前記抗体が、以下の特性：
ａ）前記抗体と、可溶性ヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４）との免疫複合体は、血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される；
ｂ）０．０３％のポリソルベートＰ２０及び１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有しているダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて、２５℃下でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する；
ｃ）ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する；又は
ｄ）分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する；
のうちの少なくとも１つを有する、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６３】
治療薬又は造影剤に結合させた請求項４５に記載の抗体を含む免疫複合体。
【請求項６４】
請求項４５に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項６５】
請求項４５に記載の抗体ＶＨ、抗体ＶＬ、又は抗体ＶＨと抗体ＶＬとをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項６６】
請求項６５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項６７】
請求項６６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６８】
配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分の製造方法であって、
前記抗体が発現される条件下で請求項６７に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞より産生された前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項６９】
自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療方法であって、
治療有効量の請求項４５に記載の単離された抗体又は請求項６４に記載の医薬組成物を、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患の治療を必要としている患者に投与することを含む、方法。
【請求項７０】
前記免疫介在性炎症性疾患又は前記自己免疫疾患が、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、多発性硬化症、甲状腺炎、１型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
関節炎が、関節リウマチである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、狼瘡である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、移植である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
ＩＢＤがクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
第２の治療剤をさらに投与する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２の治療薬が、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチラート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、コルチコステロイド、細胞毒性剤、免疫抑制剤、及び／又は抗体である、請求項７６に記載の抗体。
【請求項７８】
治療に使用するための、請求項４５に記載の抗体又は請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
請求項２に記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
【請求項８０】
請求項２に記載の抗体を含むキット。
【請求項８１】
前記抗体を検出するための試薬及び使用説明書を更に含む、請求項８０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６２／３６７，６６０号（２０１６年７月２８日出願）及び米国特許仮出願第６２／２０１，１５０号（２０１５年８月５日出願）の利益を主張し、前述の各特許出願の全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体、かかる抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ｇｐ３９、ＴＮＦ関連活性化タンパク質（ＴＲＡＰ）、５ｃ８抗原、又はＴ−ＢＡＭとしても既知であるＣＤ１５４は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの三量体膜貫通タンパク質である。ＣＤ１５４は、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面で、活性化に応じ時間に制限のある様式で発現される。ＣＤ１５４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、好塩基球、肥満細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び血小板のセブセットでも活性化により発現される。ＣＤ１５４は、血中に可溶型としても存在する。
【０００４】
ＣＤ１５４は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ４０に結合し、標的とする細胞の種類に応じ様々な応答を引き起こす。ＣＤ４０〜ＣＤ１５４相互作用は、共刺激の増大、Ｔ細胞プライミング、サイトカイン産生、抗体のクラススイッチ及び親和性成熟、並びに抗体及び自己抗体の産生などといった、Ｔ細胞とＢ細胞との正常な相互作用に必須である。
【０００５】
ＣＤ１５４阻害によるＣＤ４０／ＣＤ１５４経路の遮断は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、及び同種移植片拒絶などといった自己免疫疾患においてその有効性が示されている。ヒトでは、ＣＤ４０又はＣＤ１５４のいずれかにおける変異により、ＩｇＧ又はＩｇＡのアイソタイプの欠損を特徴とする高ＩｇＭ症候群が生じる（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７２：２９１，１９９３）。
【０００６】
抗ＣＤ１５４抗体は、例えば、国際公開第１９９３／０８２０７号、同第１９９４／１０３０８号、同第１９９６／４０９１８号、同第１９９３／００９８１２号、同第１９９９／０５１２５８号、同第１９９５／００６４８０号、同第１９９５／００６４８１号、同第１９９５／００６６６６号、同第２００１／００２０５７号、同第１９９７／０１７４４６号、同第１９９９／０１２５６６号、同第２００１／０６８８６０号、同第２００５／００３１７５号、同第２００６／０３３７０２号、同第２００６／０３０２２０号、同第２００８／１１８３５６号、同第２０１２／０５２２０５号、同第２０１２／１３８７６８号、同第２０１２／１３８７６８号、同第２０１３／０５５７４５号、及び同第２０１３／０５６０６８号に記載されている。
【０００７】
抗ＣＤ１５４抗体は、ヒトにおける自己免疫疾患の治療において有効であることが示されている。しかしながら、治療時に観察される、血小板の活性化による血栓塞栓症により、臨床開発の継続が阻まれていた。血小板上のＦｃγＲＩＩａの関与が、抗ＣＤ１５４抗体５ｃ８による血小板活性化の原因となることが示されている（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９２：４０８３〜４０９２，２０１４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、安全性及び有効性プロファイルの向上した、更なる抗ＣＤ１５４抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、配列番号１のヒトＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号１７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）とを含み、場合により、
ＨＣＤＲ１残基Ｓ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ＨＣＤＲ１残基Ｉ４が、Ｍ、Ｌ、又はＶに変異しており、
ＨＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｓ３が、Ａ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｐ４が、Ｖ、Ｔ、Ｌ  Ｑ、又はＥに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｎ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｔ９が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｎ１０が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＨＣＤＲ３残基Ｓ１が、Ａ又はＭに変異しており、
ＨＣＤＲ３残基Ｒ２が、Ａ、Ｓ、Ｑ、又はＫに変異しており、かつ
ＨＣＤＲ３残基Ｌ７が、Ｍに変異している、
アンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体も提供し、かかる抗体は、本明細書に記載のとおりの特定のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明は、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体も提供し、かかる抗体は、本明細書に記載のとおりの特定のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明は、
それぞれ配列番号１７、２３、３０、３７、４４、及び５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
配列番号５９のＶＨ及び配列番号６６のＶＬ；又は
配列番号８０の重鎖及び配列番号８１の軽鎖
を含み、かつ配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する、単離されたアンタゴニスト抗体も提供する。
【００１３】
本発明は、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分も提供し、ここで、ＣＤ１５４はホモ三量体であり、抗体は、ホモ三量体中の第１のＣＤ１５４モノマーについてはＣＤ１５４のアミノ酸残基１８２〜２０７内で結合し、ホモ三量体中の第２のＣＤ１５４モノマーについてはＣＤ１５４のアミノ酸残基１７６〜２５３内で結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する。
【００１４】
本発明は、治療薬又は造影剤に結合させた本発明の抗体又は抗体の抗原結合部分を含む、免疫複合体も提供する。
【００１５】
本発明は、本発明の抗体と、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物も提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の抗体ＶＨ、本発明の抗体ＶＬ、又は本発明の抗体ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドも提供する。
【００１７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
【００１８】
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００１９】
本発明は、抗体が発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞より産生された抗体を回収することと、を含む、抗体の産生方法も提供する。
【００２０】
本発明は、治療有効量の本発明の単離された抗体又は本発明の医薬組成物を、疾患を治療するのに十分な時間にわたって、疾患の治療を必要としている患者に投与することを含む、自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療方法も提供する。
【００２１】
本発明は、本発明の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【００２２】
本発明は、本発明の抗体を含むキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＣＤ１５４：抗体免疫複合体（ＩＣ）による血小板活性化に対する抗体Ｆｃの効果を示す図。可溶性ヒトＣＤ１５４（図中、ｓＣＤ４０Ｌとして示すｓｈＣＤ１５４）と抗ＣＤ１５４抗体５ｃ８（ＩｇＧ１アイソタイプ）（５ｃ８ＩｇＧ１  ＩＣ）とのＩＣは血小板を活性化したのに対し、ｓｈＣＤ１５４と、機能を欠失させたＩｇＧ１骨格のＩｇＧ１σ、ＩｇＧ１σ−ＹＴＥ、ＩｇＧ２σ、又はＩｇＧ２σ−ＹＴＥにクローン化した５ｃ８（それぞれ５ｃ８ＩｇＧ１ｚ、５ｃ８ＩｇＧ１ｚ−ＹＴＥ、５ｃ８ＩｇＧ２ｚ、又は５ｃ８ＩｇＧ２ｚ−ＹＴＥ）とのＩＣは効果を有しなかった。血小板活性化は、ＰＡＣ−１（ＰＡＣ−１抗体は、活性型のαＩＩｂβ３インテグリンの立体構造を特異的に認識する）及びＣＤ６２ｐ（Ｐ−セレクチンの表面への発現）を発現している血小板の合計の割合（％）として評価した。ＡＤＰ：陽性対照。ＰＢＳ：陰性対照。血小板の活性化について、５名の提供者を評価した。結果を各実験の平均±ＳＤとして示す。
【図２】ｓｈＣＤ１５４（図中ｓＣＤ４０Ｌ）と、エフェクター機能を欠失している（effector silent）ＩｇＧ２σ／κ抗ＣＤ１５４抗体Ｃ４ＬＢ５、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ１８９、Ｃ４ＬＢ１９１、Ｃ４ＬＢ１９９、及びＣ４ＬＢ１５０との免疫複合体（ＩＣ）は血小板を活性化しないことを示す。血小板活性化を、ＰＡＣ−１及びＣＤ６２ｐを発現している血小板の合計の割合（％）として評価した。ｓｈＣＤ１５４と５ｃ８ＩｇＧ１（５ｃ８ＩｇＧ１  ＩＣ）とのＩＣは血小板を活性化した。ＡＤＰ：陽性対照。血小板の活性化について、５名の提供者を評価した。結果を各試験の平均±ＳＤとして示す。
【図３】ｓｈＣＤ１５４（ｓＣＤ４０Ｌ）と抗ＣＤ１５４抗体Ｃ４ＬＢ８９（ＩｇＧ２σ／κ）、Ｃ４ＬＢ２３１（ＩｇＧ１σ／κ）、及びＣ４ＬＢ２３２（ＩｇＧ１σ／κ）との免疫複合体（ＩＣ）は血小板を活性化しないことを示す。血小板活性化を、ＰＡＣ−１及びＣＤ６２ｐを発現している血小板の合計の割合（％）として評価した。５ｃ８−ＩｇＧ１  ＩＣは血小板を活性化した。この活性化は抗ＦｃγＩＩａ抗体により阻害されたことから、ＣＤ１５４／５ｃ８−ＩｇＧ１  ＩＣの血小板活性化は血小板上のＦｃγＲＩＩａにより介在されることが示される。ＡＤＰ：陽性対照。ＰＢＳ：陰性対照。血小板の活性化について、５名の提供者を評価した。結果を各試験の平均±ＳＤとして示す。
【図４】ＣＤ１５４及びＣ４ＬＢ８９の相互作用面を示す。ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３における芳香族残基Ｆ５５、Ｙ１０１、及びＹ１０２は、ほとんどの相互作用に関与する（残基付番は配列番号５９に従う）。Ｃ４ＬＢ８９の軽鎖は結合には関与しない。
【図５】Ｃ４ＬＢ８９と複合体形成したマーモセットＣＤ１５４の結晶構造から特定された、エピトープ及びパラトープの残基の二次元図面を示す。エピトープの残基を楕円で囲み、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３におけるパラトープ残基を示す（図中、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として示す）。抗体は、２つのＣＤ１５４モノマーＡ及びＢに同時に結合する。エピトープの残基付番はヒトＣＤ１５４（配列番号１）に準拠し、抗原結合部位の残基付番はＣ４ＬＢ８９（配列番号５９）の重鎖可変領域に準拠する。
【図６Ａ】ヒトＣＤ１５４（配列番号１、一番上の列）及びマーモセットＣＤ１５４（配列番号２、一番下の列）の第１〜１８０残基のアラインメントを示す。このアラインメントにより、Ｃ４ＬＢ８９のエピトープ残基が、ヒト及びマーモセットのＣＤ１５１４間で保存されていることが示される。ＣＤ１５４モノマー１上のエピトープ残基には下線を付して、モノマー２上のエピトープ残基には二重下線を付している。
【図６Ｂ】ヒトＣＤ１５４（配列番号１、一番上の列）及びマーモセットＣＤ１５４（配列番号２、一番下の列）の第１８１〜２６１残基のアラインメントを示す。このアラインメントにより、Ｃ４ＬＢ８９のエピトープ残基が、ヒト及びマーモセットのＣＤ１５１４間で保存されていることが示される。ＣＤ１５４モノマー１上のエピトープ残基には下線を付して、モノマー２上のエピトープ残基には二重下線を付している。
【図７】ｓｈＣＤ１５４（図中ｓＣＤ４０Ｌ）と、ＩｇＧ１／κ抗ＣＤ１５４抗体Ｃ４ＬＢ２３７との免疫複合体（ＩＣ）は血小板を活性化しない一方、ｓｈＣＤ１５４と別のＩｇＧ１抗体５ｃ８は血小板を活性化することを示す。抗体単独では血小板活性化の効果を有しないことを、ＰＡＣ−１及びＣＤ６２ｐを発現している血小板の合計の割合（％）として評価した。ＡＤＰ：陽性対照。ＰＢＳ：陰性対照。血小板の活性化について、５名の提供者を評価した。結果を、各実験の平均±ＳＤとして示す。各群はｎ＝４とした。
【図８Ａ】ｓｈＣＤ１５４（図中ｓＣＤ４０Ｌ）と、Ｆｃ機能を欠失させたＣ４ＬＢ１１９との免疫複合体（ＩＣ）が、ＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化させる一方、ｓｈＣＤ１５４と、ＩｇＧ１上に発現するＣ４ＬＢ１１９  ＶＨ／ＶＬドメイン（Ｃ４ＬＢ２８７）を有する抗体とのＩＣが、ＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化したことを示す。ＡＤＰ：陽性対照。ＰＢＳ：陰性対照。
【図８Ｂ】ｓｈＣＤ１５４（図中ｓＣＤ４０Ｌ）と、Ｆｃ機能を欠失させたＣ４ＬＢ９４との免疫複合体（ＩＣ）が、ＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化させる一方、ｓｈＣＤ１５４と、ＩｇＧ１上に発現するＣ４ＬＢ９４  ＶＨ／ＶＬドメイン（Ｃ４ＬＢ２８９）を有する抗体とのＩＣが、ＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化したことを示す。ＡＤＰ：陽性対照。ＰＢＳ：陰性対照。
【図８Ｃ】ｓｈＣＤ１５４（図中ｓＣＤ４０Ｌ）と、Ｆｃ機能を欠失させたＣ４ＬＢ８３との免疫複合体（ＩＣ）が、中程度に血小板を活性化させる一方、ｓｈＣＤ１５４と、ＩｇＧ１（Ｃ４ＬＢ２８８）上に発現するＣ４ＬＢ８３  ＶＨ／ＶＬドメインを有する抗体とのＩＣが、ＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化したことを示す。ＡＤＰ：陽性対照。ＰＢＳ：陰性対照。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。
【００２５】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
【００２７】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
【００２８】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」とは、抗体が抗原又はかかる抗原内部のエピトープに、他の抗原に対するより高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約１×１０−８Ｍ以下、例えば約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で抗原又はかかる抗原内部のエピトープに結合し、非特異的抗原（例えばＢＳＡカゼイン）への結合に関しては、典型的には、そのＫＤより少なくとも１００倍小さいＫＤで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、抗原又は抗原内部のエピトープと特異的に結合する抗体は、他の関連抗原、例えばヒト又はサル、例えばカニクイザル（Macaca fascicularis）又はチンパンジー（Pan troglodytes）、又はコモンマーモセット（Callithrix jacchus）などの他の種由来の同様の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する可能性がある。単一特異性の抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに特異的に結合する。
【００２９】
「中和」又は「中和する」又は「中和抗体」又は「抗体アンタゴニスト」又は「アンタゴニスト」又は「拮抗性の」とは、ヒトＣＤ１５４の生物活性を部分的又は完全に阻害する抗体又は抗体の抗原結合部分を指す。中和抗体は、本明細書に記載のとおりのＣＤ１５４の生物活性用のアッセイを用いて特定することができる。ヒトＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体は、ヒトＣＤ１５４の生物活性を約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害し得る。
【００３０】
「ＣＤ１５４」は、ヒトＣＤ１５４（ｈＣＤ１５４）（例えば、ヒトＣＤ４０Ｌ）タンパク質を指す。ヒトＣＤ１５４の完全長のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ヒトＣＤ１５４は、細胞膜上ではＩＩ型膜タンパク質として、血漿中では可溶型としての存在が確認されている。膜結合型のＣＤ１５４（membrane bound form）は、残基２３〜４６の間に位置する膜貫通ドメインと、の残基４７〜２６１に及ぶ細胞外ドメインと、を備える、配列番号１の残基１〜２６１からなる。可溶型のヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４）は、膜結合型がタンパク質分解によるプロセシングを受けることにより形成されるものであり、配列番号１の残基１１３〜２６１を含む（ｓｈＣＤ１５４アミノ酸配列を配列番号４に示す）。膜結合型及び可溶型ＣＤ１５４はいずれも生理活性を有する三量体を形成する。「ＣＤ１５４」は、単量体、二量体、三量体、膜結合型、及び可溶型、並びにヒトＣＤ１５４の天然に生じる変異体を含む、ＣＤ１５４の様々な形態を包含する。ヒトＣＤ１５４の可溶型タイマー（ｓｈＣＤ１５４タイマー（timer））は、それぞれが配列番号４のアミノ酸配列を有する３つのポリペプチド鎖から構成される。
【００３１】
本明細書で使用される「抗体」は、広義が意図され、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体断片、二重特異性抗体又は多重特異性抗体、二量体の、四量体の若しくは多量体の抗体、一本鎖抗体、抗体ドメイン、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構造も含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全な抗体分子」は、複数のジスルフィド結合により分子間が連結されている２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域位にさらに分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、そしてＦＲ４、と並ぶ３つのＣＤＲと４つのＦＲ断片とからなる。
【００３２】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する配列多様性に基づく相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１３２：２１１〜５０，１９７０；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７，１９８７）により定義される構造において超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準化付番及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応関係については、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐａｒａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５〜７７，２００３に記載されている。用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載される方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【００３３】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４にさらに下位分類される。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常領域ドメインのアミノ酸配列をもとに、２種類の明確に異なる種類、すなわちκ（カッパ）及びλ（ラムダ）のいずれかに分類され得る。
【００３４】
「抗体断片」又は「抗体の抗原結合部分」は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２、及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）などといった、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位を保持する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗体断片としては、よく知られているＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、並びに１つのＶＨドメインを構成するドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、合成リンカーを介して１つに連結されることにより様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成可能であり、ここでＶＨ／ＶＬドメインは、分子内で対形成するか、又はＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構築物によって発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価の抗原結合部位又は二重特異性抗体を形成する。例えば、国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、同第１９９２／０１０４７号に記載される。
【００３５】
「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からのＣ末端リシンの除去などの潜在的なよく知られた代替物を除き、それぞれの重鎖及びそれぞれの軽鎖において単一のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原エピトープに結合する二重特異性のモノクローナル抗体以外は典型的には１つの抗原エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二価抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
【００３６】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又は抗体断片を指す（例えば、ＣＤ１５４に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ１５４以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。「単離された抗体」は、純度８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％などといった高純度に単離された抗体を包含する。
【００３７】
「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７〜４８，１９９７）に準拠して付番された抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
【００３８】
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位がヒト以外の種に由来しかつ可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域内に置換を含む可能性があることから、かかるフレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又は生殖細胞系列遺伝子配列の完全な複製物でなくてもよい。
【００３９】
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
【００４０】
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系の代表的なものには、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウス又はラットなどといったヒト以外の遺伝子導入動物を含む。「ヒト抗体」は、例えば天然に存在する体細胞突然変異、又はフレームワーク若しくは抗原結合部位、若しくはそれらの両方への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン配列と比較したときにアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、ヒト抗体は、アミノ酸配列において、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの場合では、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６，２０００に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６，２０１０及び国際公開第２００９／０８５４６２号）に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
【００４１】
単離されたヒト化抗体は合成品である。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するが、ファージディスプレイ組み込み合成ＣＤＲ及び／若しくは合成フレームワークなどの系を用いて作製され得るものであり、又はインビトロ変異導入により抗体特性を向上させることで、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
【００４２】
抗原結合部位がヒト以外の種に由来する抗体は、ヒト抗体の定義には含まれない。
【００４３】
「組換え抗体」としては、組換え法によって調製、発現、作製、又は単離される抗体及びその他のタンパク質を含む。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような部位の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）表面基からなり、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座の空間単位を形成する連続した及び／又は連続していないアミノ酸からなり得る。非連続的なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分のアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間で近接する。
【００４５】
「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。パラトープは元々一つながりのものであってもよく、又は一つながりの連続するアミノ酸ではなく抗体の隣接していないアミノ酸同士の空間的な関係によって形成される非連続なものであってもよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープのアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープのアミノ酸残基」はそれぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖残基及び重鎖残基を指し、あるいは概して「抗体パラトープ残基」は、抗原と接触するこれらの抗体アミノ酸を指す。
【００４６】
「二重特異性」とは、２種の異なる抗原と特異的に結合する抗体、又は同じ抗原内の２箇所の異なるエピトープと結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、その他の関連する抗原に対し交差反応性を有し得る、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
【００４７】
「多重特異性」とは、少なくとも２種の異なる抗原と特異的に結合する抗体、又は同じ抗原内の少なくとも２箇所の異なるエピトープと結合する抗体を指す。多重特異性抗体は、例えば、２種、３種、４種、若しくは５種の異なる抗原、又は同じ抗原内の異なるエピトープに結合し得る。
【００４８】
「〜と併用して」は、薬剤又は治療薬を、ヒトなどの対象に混合物の状態で一緒に、単独の薬剤として同時に、又は単独の薬剤として任意の順番で順次に投与できることを意味する。
【００４９】
「ＣＤ１５４生物活性」は、ＣＤ１５４がその受容体ＣＤ４０に結合した結果として生じる、任意の活性を指す。ＣＤ１５４生物活性には、例えば、ＣＤ１５４介在性のＣＤ４０＋Ｂ細胞若しくは樹状細胞（ＤＣ）の活性化、又はＣＤ４０シグナル伝達経路の下流の活性化があり得る。ＣＤ１５４生物活性は、ＩＣＡＭ−１の上方制御又はＢ細胞によるサイトカイン産生の増大、ＤＣ細胞によるＣＤ８０及び／若しくはＣＤ８６の表面発現の増大又はサイトカイン分泌を評価することによるＣＤ１５４介在性のＤＣ活性化、あるいはＮＦ−κＢ−誘導性プロモーターの制御下で分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現している細胞によるＳＥＡＰの分泌を測定するなどの、レポーター遺伝子アッセイにより評価されるＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化、を評価することによるＣＤ１５４介在性のＢ細胞の増殖又はＢ細胞の活性化を測定するなどといった、周知の方法及び本明細書に記載の方法を用い測定可能である。
【００５０】
「ベクター」は、生物システム内で複製可能な、又はこうした系間を移動することができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、生物システム内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。そのような生物システムの例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターの複製を可能にする生物学的要素を利用して再構成された生物システムを挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
【００５１】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物システム又は再構成された生物システムにおいて利用可能なベクターを意味する。
【００５２】
「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格鎖又は他の同等の共有結合化学を介して共有結合されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００５３】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドを「ペプチド」と呼称する場合もある。
【００５４】
本明細書では、表１に示すような従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを使用する。
【００５５】
【表１】
2018522562.tif 000003
【００５６】
組成物
本発明は、高親和性でＣＤ１５４に特異的に結合して、ＣＤ１５４の生物活性を効果的に中和する、アンタゴニスト抗体を提供する。本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体が血小板上のＦｃγＲＩＩａに対し結合すると血小板の活性化及び凝集、並びにそれに続く血栓塞栓症が生じるという現在の理解とは異なり、血小板活性化は、かかる抗体の結合するＣＤ１５４エピトープにも依存することが本明細書において発見されたことに少なくとも一部基づく。本明細書では、ＦｃγＲＩＩａに働きかけることが可能なＣＤ１５４上の特定のエピトープに結合する本発明の抗体は、血小板の活性化を介在させないように機能し得ることが発見されている。さらに、本発明の抗体は、所望により、望ましくない免疫賦活機能がさらに発動するのを防止するよう設計されたＦｃである。そのため、本発明の抗体は、臨床環境下において、ＣＤ１５４に特異的に結合する既存の抗体と比較してより望ましい安全性プロファイルを有し得る。
【００５７】
ＣＤ１５４は、マウス、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、及びヒトにおける自己免疫疾患、移植片拒絶、及びその他の免疫関連性疾患において標的とされる。複数の第ＩＩ相試験において、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体は、インビボにおけるＣＤ１５４活性を有効にブロックし、疾患を寛解することが示されている。ＣＤ１５４アンタゴニストは、免疫応答に対するその影響が他の全ての治療薬と異なる。ＣＤ１５４アンタゴニストだけが、マウス及びサルの両方で実証されたとおり、機能的な免疫寛容を誘導し得る治療薬である。マウスでは、実質的に全ての自己免疫疾患モデルがＣＤ１５４アンタゴニストにより有効に寛解され得、長期寛解が観察された（Ｎｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１５：３８４〜３９１，１９９７；Ｍａｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６３：４１８〜４２８，１９９８；Ｎｏｅｌｌｅ，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ  ４９：１７〜２２，１９９８；Ｑｕｅｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：３０７〜３２８，２００４）。
【００５８】
本発明は、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００５９】
本発明は、ＣＤ１５４に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分も提供し、かかるＣＤ１５４はホモ三量体であり、抗体は、ホモ三量体中の第１のＣＤ１５４モノマーについてはＣＤ１５４のアミノ酸残基１８２〜２０７内で結合し、ホモ三量体中の第２のＣＤ１５４モノマーについてはＣＤ１５４のアミノ酸残基１７６〜２５３内で結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する。
【００６０】
このような例となる抗体が抗体Ｃ４ＬＢ８９である。抗体Ｃ４ＬＢ２３５及びＣ４ＬＢ２３６の可変領域は、Ｃ４ＬＢ８９の可変領域と比較すると、ＬＣＤＲ２においてアミノ酸残基が１個異なることから、並びに、Ｃ４ＬＢ２３１及びＣ４ＬＢ２３２はＣ４ＬＢ８９と同一のＶＨ／ＶＬ配列を有することから、これらの抗体がＣ４ＬＢ８９と同一のＣＤ１５４エピトープにも結合することが予想される。残基１８２〜２０７及び１７６〜２５３内でＣＤ１５４に結合する抗体は、ＦｃγＲＩＩａを含むＦｃγＲと協働する能力を有する場合でさえ、血小板を活性化することが能力を有しない。したがって、これらの抗体は、ＣＤ１５４に特異的に結合するその他のアンタゴニスト抗体と比較した場合に改良された安全性プロファイルを有し得る。
【００６１】
本発明は、配列番号１のヒトＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号１７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）とを含み、場合により、
ＨＣＤＲ１残基Ｓ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ＨＣＤＲ１残基Ｉ４が、Ｍ、Ｌ、又はＶに変異しており、
ＨＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｓ３が、Ａ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｐ４が、Ｖ、Ｔ、Ｌ  Ｑ、又はＥに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｎ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｔ９が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＨＣＤＲ２残基Ｎ１０が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＨＣＤＲ３残基Ｓ１が、Ａ又はＭに変異しており、
ＨＣＤＲ３残基Ｒ２が、Ａ、Ｓ、Ｑ、又はＫに変異しており、かつ
ＨＣＤＲ３残基Ｌ７が、Ｍに変異している、アンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）とを含み、場合により、
ＬＣＤＲ１残基Ｑ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ１残基Ｓ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ１残基Ｓ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ２残基Ａ２が、Ｓに変異しており、
ＬＣＤＲ２残基Ｎ３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ２残基Ｓ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ２残基Ｌ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ２残基Ｑ６が、Ｅ、Ｄ、又はＮに変異しており、
ＬＣＤＲ２残基Ｓ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ＬＣＤＲ３残基Ｓ３が、Ａに変異しており、
ＬＣＤＲ３残基Ｄ４が、Ｎに変異しており、
ＬＣＤＲ３残基Ｓ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、かつ
ＬＣＤＲ３残基Ｉ６が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、又はＶに変異している。
【００６３】
抗体Ｃ４ＬＢ８９とＣＤ１５４との複合体の結晶構造により、抗体はＶＨ残基のみでＣＤ１５４に結合することが明らかとなった。更なる分析により、上掲のとおり、抗体のＣＤＲにおける特定の置換（表１９及び表２０に掲示）が、全ての複合体構造に、ひいては抗体の特性に影響を与えることが予想外にも示された。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、
それぞれ、配列番号３６、４３、及び５１、
それぞれ、配列番号３７、４４、及び５２、
それぞれ、配列番号３８、４５、及び５３、
それぞれ、配列番号３９、４６、及び５４、
それぞれ、配列番号４０、４７、及び５５、
それぞれ、配列番号４１、４７、及び５６、
それぞれ、配列番号４２、４８、及び５７、
それぞれ、配列番号３７、４９、及び５２、又は
それぞれ、配列番号３７、５０、及び５２、の、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３７、４４、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、３０、３７、４４、及び５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、３０、３７、４９、及び５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、３０、３７、５０、及び５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体と、可溶性ヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４）との免疫複合体は、血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される。
【００７０】
血小板の活性化は、滑らかで非接着性の血小板を、生物学的に活性な物質を放出及び発現して血漿タンパク質のフィブリノーゲンに対する結合能を獲得する、粘着性で突起を形成した粒子へと変換する、よく知られているプロセスである。活性化は、重症動脈狭窄部位で見られるような、高流体せん断ストレスによる物理的刺激の結果としても生じる（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３〜２０）。血小板の活性化は、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらし、その結果、血小板表面のＰ−セレクチンの発現が上方制御され、フィブリノーゲンのインテグリン受容体αＩＩｂβ３に対する結合親和性が増大する。したがって、血小板の活性化は、Ｐ−セレクチンの表面発現の増大、又はプローブリガンド、例えば、ＰＡＣ−１の、血小板上αＩＩｂβ３インテグリンに対する結合を、例えばフローサイトメトリーを用い測定することにより測定され得る。本発明の抗体は、ｓｈＣＤ１５４と複合体を形成しているかかる抗体が、Ｐ−セレクチンの表面発現を増大させない場合、又は、ｓｈＣＤ１５４により誘導されるプローブリガンド（例えば、ＰＡＣ−１）のαＩＩｂβ３インテグリンに対する結合を増加させる場合と比較して、Ｐ−セレクチンの表面発現と比較して統計的に有意な様式でプローブリガンド（例えば、ＰＡＣ−１）のαＩＩｂβ３インテグリンに対する結合を上昇させない場合に、ヒト血小板を活性化させない。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、次の特性のうちの少なくとも１つを有する。
０．０３％のポリソルベートＰ２０及び１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有しているダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて、２５℃下でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する。
ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を、約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、約５×１０−９Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体は、カニクイザル（Macaca fascicularis）ＣＤ１５４又はマーモセット（Callithrix jacchus）ＣＤ１５４と交差反応する。
【００７４】
ヒト、カニクイザル又はマーモセットＣＤ１５４に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を用い実験により測定することができる。こうした方法では、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、若しくは当業者には周知である競合的結合アッセイを使用することができる。特定の抗体のＣＤ１５４に対する親和性についての測定値は、異なる条件（例えば、容量オスモル濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準的な条件及び本明細書に記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを用いた親和性測定での内部エラー（標準偏差（ＳＤ）として測定されるもの）は典型的に、典型的な検出範囲内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得ることが当業者には分かるであろう。したがって、用語「約」は、アッセイにおける典型的な標準偏差を表す。例えば、ＫＤが１×１０−９Ｍの場合の典型的なＳＤは、±０．３３×１０−９Ｍ以下である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を、約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値に阻害する。
【００７６】
Ｂ細胞の増殖アッセイでは、１×１０５個のヒト扁桃体Ｂ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換ヒトＩＬ−２１と、ロイシンジッパー融合タンパク質として発現させた０．５μｇ／ｍＬの三量体型組換可溶性ヒトＣＤ１５４と、最終容量２００μＬ／ウェルで０．００００６４〜２５μｇ／ｍＬの範囲の抗ＣＤ１５４抗体と、を用い培養することができる。２日間のインキュベート後、メチル（−３Ｈ）−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を培養物に添加し、終夜インキュベートした後、抗体のヒトＢ細胞の増殖に対する影響を測定することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性ＩＦＮ−βミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ〜５．４×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【００７９】
使用可能な細胞は、例えば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）である。ヒトＣＤ１５４は、三量体型可溶性ＣＤ１５４−ロイシンジッパー融合タンパク質として提供され得る。よく知られている方法を用い、分泌型アルカリホスファターゼ由来のシグナルを検出することができ、並びに阻害についてＩＣ５０を計算することもできる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ１５４ホモ三量体において、第１のＣＤ１５４モノマーと第２のＣＤ１５４モノマーとに同時に結合する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１のＣＤ１５４のアミノ酸残基１８２〜２０７内の、第１のＣＤ１５４モノマー中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＣＤ１５４残基に結合する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１のＣＤ１５４のアミノ酸残基１７６〜２５３内の、第２のＣＤ１５４モノマー中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＣＤ１５４残基に結合する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、第１のＣＤ１５４モノマー内の残基Ｅ１８２、Ｓ１８５、Ｑ１８６、Ａ１８７、Ｐ１８８、Ｓ２１４、Ａ２１５、及びＲ２０７に結合し、ここで残基付番は配列番号１に準拠する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、第２のＣＤ１５４モノマー中の残基Ｔ１７６、Ｆ１７７、Ｃ１７８、Ｑ２２０、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｇ２５０、及びＦ２５３に結合し、ここで残基付番は配列番号１に準拠する。
【００８５】
「内の」は、抗体が、一つづきのアミノ酸１８２〜２０７、１７６〜３５４、又は１８２〜２０７、及び１７６〜３５４内の残基のみに結合することを意味する。
【００８６】
このような例となる抗体が抗体Ｃ４ＬＢ８９である。抗体Ｃ４ＬＢ２３５及びＣ４ＬＢ２３６の可変領域は、Ｃ４ＬＢ８９の可変領域と比較すると、ＬＣＤＲ２においてアミノ酸残基が１個異なることから、並びに、Ｃ４ＬＢ２３１及びＣ４ＬＢ２３２はＣ４ＬＢ８９と同一のＶＨ／ＶＬ配列を有することから、これらの抗体がＣ４ＬＢ８９と同一のＣＤ１５４エピトープにも結合することが予想される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体のＶＨ中の残基であるパラトープ残基によりヒトＣＤ１５４に結合する。
【００８８】
「パラトープ残基」は、抗体ＶＨ又はＶＬにおいてＣＤ１５４の残基から４Å以内に存在する残基である。パラトープ残基は、抗体とＣＤ１５４との複合体の結晶構造から特定できる。
【００８９】
抗原との接触により、ＶＬは関係なくＶＨ抗原結合部位残基のみでＣＤ１５４と結合する代表的な抗体は、抗体Ｃ４ＬＢ８９のＶＨ及びＶＬを含む抗体である。Ｃ４ＬＢ２３５及びＣ４ＬＢ２３６の可変領域は、Ｃ４ＬＢ８９と比較すると、ＬＣＤＲ２においてアミノ酸残基が１個異なることから、並びに、Ｃ４ＬＢ２３１及びＣ４ＬＢ２３２はＣ４ＬＢ８９と同一のＶＨ／ＶＬ配列を有することから、これらの抗体がＶＨ残基のみでＣＤ１５４に結合することも予想される。配列番号１の残基１８２〜２０７若しくは１７６〜３５４内で、又はＣＤ１５４ホモ三量体中の第１のＣＤ１５４モノマー内の残基Ｅ１８２、Ｓ１８５、Ｑ１８６、Ａ１８７、Ｐ１８８、Ｓ２１４、Ａ２１５及びＲ２０７、並びに第２のＣＤ１５４モノマー内の残基Ｔ１７６、Ｆ１７７、Ｃ１７８、Ｑ２２０、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｇ２５０及びＦ２５３内でＣＤ１５４に結合する抗体は、ＦｃγＲＩＩａを含むＦｃγＲと協働する能力を有していたとしても血小板を活性化する能力を有しない。したがって、これらの抗体は、ＣＤ１５４に特異的に結合するその他の抗体と比較して、より向上された安全性を有し得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９の重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、場合により、ＶＨは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００９２】
それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む抗体、又は配列番号５９のＶＨのＨＣＤＲ若しくは配列番号５９のＶＨを有する抗体は、抗体ＶＨのみでＣＤ１５４と結合する。したがって、それぞれ配列番号５９のＶＨ、又は配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨを任意の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と組み合わせることができ、得られる抗体のＣＤ１５４に対する結合を本明細書に記載のアッセイを用い試験して、ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体を作製することができる。
【００９３】
例えば、それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨ、又は配列番号５９のＶＨを使用して、ＣＤ１５４に結合可能な２ドメイン特異的抗原結合断片を形成可能であるＶＬドメインをスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第１９９２／０１０４７号に開示される階層的２重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、Ｈ鎖（例えば配列番号５９のＶＨ）又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイ法に基づきＣＤ１５４に対する結合性及び拮抗活性についてスクリーニングする。
【００９４】
あるいは、配列番号５９のＶＨ、又はそれぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨを、既存のＣＤ１５４抗体又は本明細書に記載のＣＤ１５４抗体のＶＬドメインと組み合わせてもよく、得られる抗体は、ＣＤ１５４に対する結合性及び拮抗活性について試験される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、場合により、ＶＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＬとを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６６、７２、又は７３の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、場合により、ＶＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと、配列番号７２のＶＬとを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと、配列番号７３のＶＬとを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はＦｃ領域に少なくとも１つの置換を含み、かかる抗体はヒト血小板を活性化しない。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合が低減されている。
【０１０３】
「結合が低減されている」は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を有する本発明の抗体のＦｃγＲ受容体に対する結合が、置換を有していない親抗体の、同じＦｃγＲ受容体に対する結合と比較して、低減されていることを指す。「結合が低減されている」とは、結合が少なくとも約１／１００、少なくとも約１／５００、少なくとも約１／１０００、少なくとも約１／５０００、少なくとも約１／１０，０００、又は少なくとも約１／２０，０００に低減されていることであり得る。実際には、特定のＦｃγＲに対する「結合の低減」を示す抗体は、特定のＦｃγＲにより介在される統計的に有意なエフェクター機能を有する抗体を指す。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換は、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓであり、残基付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域に置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓを含み、残基付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換は、置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓであり、残基付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域に置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、又はＰ３３１Ｓを含み、残基付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１０９】
本発明は、配列番号８０の重鎖と配列番号８１の軽鎖とを含み配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する、アンタゴニスト抗体、又はその抗原結合部分も提供する。
【０１１０】
本発明は、配列番号８２の重鎖と配列番号８１の軽鎖とを含み配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体、又はその抗原結合部分も提供する。
【０１１１】
本発明は、配列番号８３の重鎖と配列番号８１の軽鎖とを含み配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体、又はその抗原結合部分も提供する。
【０１１２】
配列番号８０（ＩｇＧ１σ：Ｃ４ＬＢ２３１  ＨＣのＣ４ＬＢ８９のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＲＹＹＧＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１１３】
配列番号８１（Ｃ４ＬＢ８９及びＣ４ＬＢ２３１の軽鎖）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＡＮＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＤＳＩＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１１４】
配列番号８２（ＩｇＧ１σＹＴＥのＣ４ＬＢ８９のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＲＹＹＧＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１１５】
配列番号８３（ＩｇＧ２σのＣ４ＬＢ８９のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＲＹＹＧＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１１６】
本発明の抗体の免疫エフェクターの特性は、当業者には既知の技術により、Ｆｃ修飾によって強化又はサイレンシングすることが可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貧食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））の下方制御などのＦｃエフェクター機能は、これらの活性に関与するＦｃの残基を修飾することによって提供及び／又は調節され得る。例えば、Ｆｃ置換Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１、又はＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（国際公開第１１／０６６５０１号）又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを本発明の抗体に導入することもできる。
【０１１７】
本発明の抗体の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合は、Ｆｃγ受容体の可溶性組換体又は細胞に伴う形態を用い評価され得る。例えば、本発明の抗体の様々なＦｃγＲに対する相対的親和性及び結合活性を評価する際、直接的又は間接的測定（例えば、競合的結合測定）を行うことができる。代表的なアッセイでは、プレート上に捕捉した可溶性ＦｃγＲに結合する被検抗体は、１μｇ／ｍＬのビオチニル化ヒトＩｇＧ１と、抗原と予め複合体を形成させた被検抗体の段階希釈物との競合的な結合を用い評価される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（「ＡＤＣＰ」）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低減されている。
【０１１９】
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「ＡＤＣＣ」は、エフェクター細胞で発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）を介し、抗体被覆標的細胞の、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に基づき、細胞死を誘導する機構である。例えば、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩａを発現し、一方単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩａを発現する。本発明の抗体のＡＤＣＣ活性を評価する際、抗体を免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に添加することもでき、免疫エフェクター細胞が抗原抗体複合体により活性化されることで、標的細胞の細胞溶解が生じ得る。細胞溶解は、通常、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出される。そのようなアッセイ用のエフェクター細胞の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。代表的な標的細胞としては、Ｄ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１０９１５（商標））又はＣＤ１５４発現Ｔ細胞が挙げられる。
【０１２０】
「抗体依存性細胞貪食作用」（「ＡＤＣＰ」）とは、例えばマクロファージ又は樹状細胞などの貪食細胞による取り込みを通じ、抗体により被覆された標的細胞を排除する機構を指す。ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として用い、ＧＦＰ又はその他の標識された分子を発現するよう設計されたＣＤ１５４を発現するＤ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞を標的細胞として用いることで評価できる。エフェクター細胞：標的細胞比は例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞を、標的細胞と共に、抗ＣＤ１５４抗体を添加し又は添加せずに４時間インキュベートすることができる。インキュベーション後、細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅを用い剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体により識別され得るが、貪食作用の割合（％）は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋及びＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。
【０１２１】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合してこれを活性化し、かかる補体成分Ｃ１ｑが次に補体カスケードを活性化して標的細胞の細胞死を導く、細胞死を誘導する機構を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせて、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＡＤＣＣを容易にする。ＣＤ１５４発現細胞によるＣＤＣは、例えば、適切な培地にＪｕｒｋａｔ細胞を播種し、抗ＣＤ１５４抗体を混合物に添加した後、プールしたヒト血清を添加することにより測定することができる。インキュベート時間後、溶解した細胞の割合（％）は、標準法を用いＦＡＣＳアッセイにおいてヨウ化プロピジウム染色細胞の割合（％）として検出することができる。
【０１２２】
「ＡＤＣＣの低減」、「ＣＤＣの低減」、及び「ＡＤＣＰの低減」は、抗体により誘導されるＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又はＡＤＣＰを指し、本明細書に記載のアッセイ及び米国特許第８，８７１，２０４号に記載のアッセイなどのＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又はＡＤＣＰを測定する標準アッセイ法において統計的に有意である。
【０１２３】
所望の親和性及び中和プロファイルを有する本発明の抗体は、ヒトＣＤ１５４又はマーモセットＣＤ１５４でのパニングによる、及び場合により更なる抗体親和性成熟による変異体又は断片のライブラリから選択され得る。代表的なパニングキャンペーンにおいて、ファージライブラリはマーモセットＣＤ１５４によりパニングされ得る。あるいは、本発明の抗体は、ヒトＣＤ１５４若しくはマーモセットＣＤ１５４、又はこれらの両方によりマウスを免疫し、ヒトＣＤ１５４に対する結合についてハイブリドーマをスクリーニングし、続いて本明細書に記載の方法を用い抗体の拮抗特性を評価することにより作製することもできる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含む抗体によるＣＤ１５４に対する結合に競合する。
【０１２５】
特定のＶＨ及びＶＬ配列を含む本発明の抗体とのＣＤ１５４への特異的結合についての競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下での、ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体の、ＣＤ１５４への結合は、ＥＬＩＳＡ法によって評価することができ、又はＢｉａｃｏｒｅ分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて本発明の抗体との競合を示すことも可能である。かかる抗体は、かかる抗体が、参照抗体のＣＤ１５４に対する結合を８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上阻害するとき、ＣＤ１５４に対する結合について参照抗体（例えば、配列番号５９のＶＨと配列番号６６のＶＬとを含む抗体）と競合する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、配列番号５９のＶＨを国際公開第１９９３／０８２０７号、国際公開第１９９４／１０３０８号、国際公開第１９９６／４０９１８号、国際公開第１９９３／００９８１２号、国際公開第１９９９／０５１２５８号、国際公開第１９９５／００６４８０号、国際公開第１９９５／００６４８１号、国際公開第１９９５／００６６６６号、国際公開第２００１／００２０５７号、国際公開第１９９７／０１７４４６号、国際公開第１９９９／０１２５６６号、国際公開第２００１／０６８８６０号、国際公開第２００５／００３１７５号、国際公開第２００６／０３３７０２号、国際公開第２００６／０３０２２０号、国際公開第２００８／１１８３５６号、国際公開第２０１２／０５２２０５号、国際公開第２０１２／１３８７６８号、国際公開第２０１２／１３８７６８号、国際公開第２０１３／０５５７４５号、国際公開第２０１３／０５６０６８号のいずれかに記載のＶＬと組み合わせて、拮抗性の抗ＣＤ１５４抗体を作製することもできる。得られる抗体の結合活性及び拮抗活性は、本明細書に記載のアッセイ及びプロトコルを用い試験することができる。
【０１２７】
本発明は、
それぞれ、配列番号１６、２２、及び２９、
それぞれ、配列番号１７、２３、及び３０、
それぞれ、配列番号１６、２４、及び３１、
それぞれ、配列番号１８、２５、及び３２、
それぞれ、配列番号１９、２６、及び３３、
それぞれ、配列番号２０、２７、及び３４、又は
それぞれ、配列番号２１、２８、及び３５
の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体も提供する。
【０１２８】
本発明は、
それぞれ、配列番号１６、２２、及び２９、
それぞれ、配列番号１７、２３、及び３０、
それぞれ、配列番号１６、２４、及び３１、
それぞれ、配列番号１８、２５、及び３２、
それぞれ、配列番号１９、２６、及び３３、
それぞれ、配列番号２０、２７、及び３４、又は
それぞれ、配列番号２１、２８、及び３５、
それぞれ、配列番号３６、４３、及び５１、
それぞれ、配列番号３７、４４、及び５２、
それぞれ、配列番号３８、４５、及び５３、
それぞれ、配列番号３９、４６、及び５４、
それぞれ、配列番号４０、４７、及び５５、
それぞれ、配列番号４１、４７、及び５６、
それぞれ、配列番号４２、４８、及び５７、
それぞれ、配列番号３７、４９、及び５２、又は
それぞれ、配列番号３７、５０、及び５２、の、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１６、２２、及び２９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３６、４３、及び５１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号５８のＶＨと、配列番号６５のＶＬとを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、４４、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１６、２４、及び３１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、４５、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号６０のＶＨと、配列番号６７のＶＬとを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１８、２５、及び３２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３９、４６、及び５４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号６１のＶＨと、配列番号６８のＶＬとを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１９、２６、及び３３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４０、４７、及び５５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号６２のＶＨと、配列番号６９のＶＬとを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号２０、２７、及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４１、４７、及び５６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号６３のＶＨと、配列番号７０のＶＬとを含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号２１、２８、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４２、４８、及び５７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号６４のＶＨと、配列番号７１のＶＬとを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、４９、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号５９のＶＨと、配列番号７２のＶＬとを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、５０、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含み、あるいは配列番号５９のＶＨと、配列番号７３のＶＬとを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＬは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のＶＨと、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＬとを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含み、ここでＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及び／又はＩＭＧＴにより定義されるものである。
【０１４２】
表８、表９、及び表１４に示すＶＨ又はＶＬアミノ酸配列を含む本発明の抗体の変異体は、本発明の範囲内のものである。例えば、変異体は、抗体特性に悪影響を及ぼさないＶＨ及び／又はＶＬ中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、配列相同性は、本発明のＶＨ又はＶＬアミノ酸配列に対して約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。
【０１４３】
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）。同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。
【０１４４】
２つのアミノ酸配列間の相同性（％）は、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４，１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して求めることもできる。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いる。さらに、２つのアミノ酸配列間の配列相同性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｇｃｇ＿ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））を、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかで、ギャップ重み（gap weight）１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、長さ重み（length weight）１、２、３、４、５、又は６で用い、求めることができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のＶＨと少なくとも９０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含み、ここで、抗体は、次の特性のうちの１つ以上を示す；
抗体と、ｓｈＣＤ１５４との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される；
実施例１の親和性測定に記載の実験デザインを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する；
ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を、約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＬと少なくとも９０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％が相同であるＶＬを含み、ここで、抗体は、次の特性のうちの１つ以上を示す。
抗体と、ｓｈＣＤ１５４との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される；
実施例１の親和性測定に記載の実験デザインを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する；
ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を、約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のＶＨと少なくとも９０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨと、少なくとも配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＬと少なくとも９０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬと、を含み、ここで、抗体は、次の特性のうち１つ以上を示す：
抗体と、ｓｈＣＤ１５４との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される；
実施例１の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する；
ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を、約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５８のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６０のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６１のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６２のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６３のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６４のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６５のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６６のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６７のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６８のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６９のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７０のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７１のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７２のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７３のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、抗体（the antibody the invention）本発明は、配列番号５８のＶＨと配列番号６５のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと配列番号６６のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６０のＶＨと配列番号６７のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６１のＶＨと配列番号６８のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６２のＶＨと配列番号６９のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６３のＶＨと配列番号７０のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６４のＶＨと配列番号７１のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと配列番号７２のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９のＶＨと配列番号７３のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、表８、表９、及び表１４に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列、又はそれらの保存的改変を含み、ここで抗体は、ＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体に望ましい官能特性を保持する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１６、２２、及び２９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１６、２４、及び３１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１８、２５、及び３２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号１９、２６、及び３３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号２０、２７、及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号（EQ ID）２１、２８、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３６、４３、及び５１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３７、４４、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３８、４５、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３９、４６、及び５４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、抗体（the antibody the invention）本発明は、それぞれ配列番号４０、４７、及び５５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号４１、４７、及び５６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号４２、４８、及び５７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３７、４９、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ配列番号３７、５０、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的改変を含む。
【０１９０】
特定のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列と、これらの保存的改変とを含む本発明の抗体は、
次の特性のうちの１つ以上を示す：
抗体と、ｓｈＣＤ１５４との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のＰ−セレクチン表面発現により測定される；
実施例１の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＣＤ１５４に結合する；
ＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を約２．７×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害する；又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【０１９１】
「保存的改変」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しない又はかかる結合特性を変更しないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸置換、付加、及び欠失を含む。保存的置換は、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有する、アミノ酸を含む。さらに、アラニン・スキャニング変異導入法についてこれまでに述べられているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７，１９９８；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４，１９９８）、ポリペプチド内の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる。本発明の抗体へのアミノ酸置換は、例えば、ＰＣＲによる変異導入（米国特許第４，６８３，１９５号）によるものなどの、よく知られている方法によって行われ得る。あるいは、変異体のライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン、例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドンを用いる既知の手法を用い作製することができる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
【０１９２】
実施例で説明する実施形態は、１つが重鎖に由来し、１つが軽鎖に由来する１対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、１つの重鎖又は軽鎖の可変領域を有してもよいということを認識するであろう。１つの可変領域を用いることで、例えばＣＤ１５４に特異的に結合可能な２ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成できる可変ドメインについてスクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、例えば、本明細書に記載されるとおり国際公開第１９９２／０１０４７号に開示される階層的２重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。
【０１９３】
本発明の抗体は、様々な技術を用い作製可能である。例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を用いモノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマ法において、ハムスター、ラット、又はサルなどのマウス又は他の宿主動物を、可溶型のＣＤ１５４などのヒト、マーモセット、又はカニクイザルＣＤ１５４若しくはＣＤ１５４断片で免疫し、続いて標準的な方法を用いて免疫した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原の親和性などの所望の特性を有する抗体の生成についてスクリーニングする。
【０１９４】
様々な宿主動物を使用して、本発明の抗体を生成することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、抗体を作製することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外の動物において作製された抗体を、様々な技術を用いてヒト化して、よりヒトに近い配列を作製することもできる。ヒト受容体フレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術は既知であり、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェーシング（Resurfacing）（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９〜４９９，１９９１）、特異性決定残基リサーフェーシング（米国特許公開第２０１００２６１６２０号）、ヒト適応（又はヒトフレームワーク適応）（米国特許公開第２００９／０１１８１２７号）、超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）、及びガイド選択（（Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１〜６８，２００５、米国特許第５，５６５，３３２号）を含む。これらの方法では、親抗体のＣＤＲが、フレームワークＣＤＲの長さ、相同性、若しくはカノニカル構造の情報、又はこれらの組み合わせに基づいた、親フレームワークに対する総合的な相同性をもとに選択され得る、ヒトフレームワーク上に移植される。
【０１９５】
ヒト化抗体は、国際公開第９０／００７８６１号及び国際公開第９２／２２６５３号に記載される開示物などの技術により、結合親和性を保存するよう改変した、フレームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰変異）、所望の抗原に対するそれらの選択性若しくは親和性を向上させるようにさらに最適化させることもでき、又は任意のＣＤＲに変異を導入して例えば抗体の親和性を向上させることにより、さらに最適化させることもできる。
【０１９６】
それらのゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスを使用して、標的タンパク質に対するヒト抗体を作製することができ、例えば、国際公開第９０／０４０３６号、米国第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、国際公開第０２／０６６６３０号、国際公開第０２／４３４７８号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１；Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３〜１３２６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５〜８５１；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６〜１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６〜１２４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５〜４５８；国際公開第０２／０４３４７８号）に記載されている。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子座は、破壊又は欠失されてよく、相同又は非相同組換え、導入染色体（transchromosome）、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座をマウスゲノム内に挿入することができる。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を用い、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる。
【０１９７】
ヒト抗体はファージディスプレイライブラリから選択することができ、ここでかかるファージは、ヒト免疫グロブリン、あるいは例えばＦａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対化若しくは対化抗体可変領域などのそれらの部分を発現するよう改変されている（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６，２０００；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２５４：６７〜８４，２００１；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９〜３１４，１９９６；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２，１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１，１９９１）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６，２０１０及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されるバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリをヒト、マーモセット、及び／又はカニクイザルＣＤ１５４の結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価をさらに行い、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長のＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、及びＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の同第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４２７，９０８号、及び同第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９６９，１０８号及び同第６，１７２，１９７号、並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。
【０１９８】
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の産生は、組換えタンパク質産生等の任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質の形態、又は全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されるか、あるいは抗原は、動物の身体内で、該抗原又はその一部をコードする核酸から新規に形成されてよい。
【０１９９】
本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であってもよい。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト生殖細胞系列遺伝子ＶＨ１＿１−６９、ＶＨ４＿４−３９、ＶＨ１＿１−０２、又はＶＨ４＿４−５９に由来するＶＨフレームワークを含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト生殖細胞系列遺伝子ＶＫＩＶ＿Ｂ３、ＶＫＩ＿Ｏ１２、又はＶＬ３＿３Ｒに由来するＶＬフレームワークを含む。
【０２０２】
本発明の抗体は、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型、ＩｇＧ型又はＩｇＭ型であってもよい。本発明の抗体は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、ＩｇＧ４型であってもよい。
【０２０３】
本発明の抗体をさらに改変して、親抗体と比較して特性が類似している又は変更されている改変抗体を作製することもできる。本発明の抗体では、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、定常領域、ＶＨフレームワーク、ＶＬフレームワーク、又は６つのうち任意の若しくは全てのＣＤＲを改変することもできる。
【０２０４】
本発明の抗体は、ＣＤＲグラフトにより改変することもできる。本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲ配列を異なるフレームワーク配列にグラフトしてもよい。ＣＤＲグラフトは、本明細書に記載の方法を用い行なうこともできる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、又は２１のＨＤＣＲ１、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８のＨＣＤＲ２、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５のＨＣＤＲ３、を含むＶＨと、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２のＬＣＤＲ１、配列番号４３、４４、４５、６、４７、４８、４９、又は５０のＬＣＤＲ２及び／あるいは配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、又は５７のＬＣＤＲ３を含むＶＬと、を含み、ここで、ＶＨフレームワークはＶＨ１＿１−６９、ＶＨ４＿４−３９、ＶＨ１＿１−０２、又はＶＨ４＿４−５９に由来せず、ＶＬフレームワークはＶＫＩＶ＿Ｂ３、ＶＫＩ＿Ｏ１２、又はＶＬ３＿３Ｒに由来しない。使用するフレームワーク配列は、生殖系列の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベース又は公開されているレファレンスから得ることもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子に関し、生殖系列ＤＮＡ及びコードされるタンパク質配列は、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎシステム（登録商標）ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ−ｉｍｇｔ＿ｏｒｇに見ることができる。本発明の抗体において既存のフレームワーク配列と置き換えて使用することのできるフレームワーク配列は、Ｃ４ＬＢ５、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ９４、Ｃ４ＬＢ１５０、Ｃ４ＬＢ１８９、Ｃ４ＬＢ１９１、Ｃ４ＬＢ１９９、Ｃ４ＬＢ２３１、Ｃ４ＬＢ２３２、Ｃ４ＬＢ３５、及びＣ４ＬＢ２５６に対し最も高い相同性（％）を示すものである。
【０２０５】
親抗体及び改変抗体のフレームワーク配列は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号に記載のとおり、得られた抗体の抗原への結合を回復及び／又は向上させる復帰変異によりさらに改変され得る。親抗体及び改変抗体のフレームワーク配列は、フレームワーク領域内の１つ以上の残基又はさらには１つ以上のＣＤＲ領域に変異を導入することによりさらに改変してＴ細胞エピトープを除去することで、抗体のもつ潜在的な免疫原性を除去することもできる。このアプローチは「脱免疫」とも呼ばれ、米国特許公開第２００３０１５３０４３号に詳述されている。
【０２０６】
本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、対象とする抗体の結合特性のうち１つ以上を向上させることもできる。部位特異的変異導入又はＰＣＲ介在性変異導入を実施して、変異（複数可）を導入することもでき、抗体の結合、又は他の対象とする機能特性に対する影響は、本明細書に記載のとおり、かつ実施例において提供されるとおり、インビトロ又はインビボで評価することができる。導入可能な代表的な置換は、上掲のとおり保存的な改変である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４、又は５個以上の残基が変更される。
【０２０７】
本発明の抗体にＦｃ置換を行い抗体の半減期を調節することもできる。例えば、置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅのうち１つ以上を導入して、得られる抗体の半減期を延長することもできる（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２３５１４〜２４０，２００６）。
【０２０８】
さらに、本発明の抗体を、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化等の反応によって、あるいはポリエチレングリコール部分の付加（ＰＥＧ化）及び脂質化等の自然界では生じない共有結合修飾等の反応によって翻訳後修飾してもよい。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体にポリエチレングリコールを融合させる（ＰＥＧ化）することによって薬物動態のプロファイルを向上させることができる。融合は当業者に既知の方法によって行われ得る。治療用抗体をＰＥＧと融合させると、機能は干渉されずに薬物動態が強化されることが示されている（Ｋｎｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９〜１８，２００４；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６〜１９，２００１；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１〜７０，２００３）。
【０２０９】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するように修飾される、本発明の抗体又はその断片は発明の範囲内である。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとのペアリングに影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基の水素（Ｈ）結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの因子によって影響される（Ｗｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：９８９〜１０１０，２００１）。ある場合においては、構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって特定することが可能であり、また、抗体の安定性に対するこれらの残基の作用は、特定された残基に変異を含む変異体を作製及び評価することにより試験することができる。示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で測定する場合、抗体の安定性を高める方法の１つは、変性の中点温度（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴｍは、その安定性と相関し、溶液中でのアンフォールディングし易さ及び変性し易さ、並びにそのタンパク質のアンフォールディングし易さに応じた分解プロセスとは逆相関する（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）。多数の研究では、ＤＳＣで熱安定性として測定された配合物の物理的安定性のランク付けと他の方法で測定された物理的安定性との間に相関があることが発見されている（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ  ５Ｅ８，２００３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：３０７６〜８９，２００４；Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １４０：１５５〜６８，１９９６；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２１：１３５３〜６１，２００４；Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５：２００〜８，１９９７）。配合研究では、ＦａｂのＴｍが、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、多重特異性抗体である。
【０２１２】
ＣＤ１５４に特異的に結合する本発明の単一特異性抗体は、二重特異性抗体として設計することもでき、このような抗体も本発明の範囲内に包含される。本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域は、公開された方法を用いて、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）などの構造として一本鎖二重特異性抗体（国際公開第１９９９／５７１５０号、米国特許公開第２０１１／０２０６６７２号）、又は米国特許第５，８６９，６２０号、国際公開第１９９５／１５３８８号、同第１９９７／１４７１９号、又は同第２０１１／０３６４６０号に開示されるものなどの構造として二重特異的ｓｃＦｖとして設計することもできる。
【０２１３】
本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域を、二重特異性の完全長の抗体として設計することも可能であり、かかる抗体の結合手はそれぞれ別個の抗原又はエピトープに結合する。このような二重特異性抗体は、米国特許第７，６９５，９３６号、国際公開第２００４／１１１２３３号、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００７／０２８７１７０号、国際公開第２００８／１１９３５３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７４号、同第２０１１／０１２３５３２号、国際公開第２０１１／１３１７４６号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、又は米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号に記載のものなどの技法を用い、２つの抗体重鎖間のＣＨ３相互作用を調節して二重特異性抗体を生成することにより作製することもできる。
【０２１４】
例えば、二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法に従って、無細胞環境下、インビトロにおいて、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中にそれぞれに異なる（asymmetrical）変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法では、２つの単一特異性の二価抗体が、ＣＨ３ドメインにヘテロ二量体の安定性を増進させる特定の置換を有するよう設計する。これらの抗体を、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートすることで、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が作製される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻されてもよい。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びβ−メルカプトエタノールであり、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベートを用いることができる。
【０２１５】
二重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖に使用され得るＣＨ３の変異の例は、Ｋ４０９Ｒ及び／又はＦ４０５Ｌである。
【０２１６】
本発明の抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域が組み込まれ得る更なる二重特異性の構造は、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号）であり、あるいは様々な二量体形成ドメインを含みロイシンジッパー又はコラーゲン二量体形成ドメインなどの異なる特異性を有する２つの抗体アームにコネクトする構造（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）である。ＤＶＤは、ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２−ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長の抗体であり、リンカーは任意のものである。
【０２１７】
本発明は、特定のＶＨ配列及びＶＬ配列を有する配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体も提供し、ここで、抗体ＶＨは第１のポリヌクレオチドによりコードされ、抗体ＶＬは第２の合成ポリヌクレオチドによりコードされる。ポリヌクレオチドは相補的デオキシ核酸（complementary deoxynucleic acid）（ｃＤＮＡ）であってよく、好適な宿主における発現のためコドン最適化することができる。コドン最適化はよく知られている技術である。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体ＶＨ又はＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号７６、７７、７８、又は７９の配列を含む。
【０２１９】
配列番号７６（Ｃ４ＬＢ２３１のＶＨをコードしている）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧ
【０２２０】
配列番号７７（Ｃ４ＬＢ２３１のＶＬをコードしている）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴ
【０２２１】
配列番号７８（Ｃ４ＬＢ１９１のＶＨをコードしている）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＣＧＧＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
【０２２２】
配列番号７９（Ｃ４ＬＢ１９１のＶＬをコードしている）
ＡＧＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧ
【０２２３】
本発明は、本発明の抗体重鎖可変領域、抗体軽鎖可変領域、抗体重鎖、及び／又は抗体軽鎖のいずれかをコードしているポリヌクレオチド単離物も提供する。特定の代表的なポリヌクレオチドを本明細書に開示するが、遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの好ましさを考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、例えば、配列番号７６、７７、７８、及び７９に示す配列を有するポリヌクレオチドである。本発明の抗体のＶＨ若しくはＶＬ又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチド配列は、意図される宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーター又はエンハンサーなどの１つ又は２つ以上の制御因子に操作可能に連結され得る。ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであってよい。
【０２２４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに適した任意の他のベクターであってよい。例えば、任意に定常領域に連結される本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び／又は重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローン化され得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数可）内の制御配列に操作可能に連結されてよい。そのような制御配列は、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然に会合する又は異種プロモーター）、エンハンサー因子、及び転写終結配列を含み、抗体を発現するように選択された宿主細胞と適合性があるように選択される。ベクターを適切な宿主内に組み込んだなら、組み込んだポリヌクレオチドがコードしているタンパク質を高レベルで発現させるのに適した条件下で宿主を維持する。
【０２２５】
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするため、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
【０２２６】
好適なプロモーター及びエンハンサー因子は、当該技術分野において既知である。真核細胞における発現について、例示的なプロモーターとしては、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー因子、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（cytomegalovirus immediate early promoter）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、レトロウイルス由来の長鎖末端反復配列に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、並びに様々な当該技術分野に既知の組織特異的プロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。
【０２２７】
数多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くは、対象とする組換え構築物を作製するために市販されている。例えば以下のベクターを提供する。細菌系：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核細胞系：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０２２８】
本発明は、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞も提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。当然のことながら、用語「宿主細胞」は、対象とする特定の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫並びに対象とする特定の細胞から作製された安定な細胞株をも指すものと理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後の世代において特定の修飾が生じる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌（archeal）細胞であってよい。
【０２２９】
原核宿主細胞の例は、大腸菌、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）などの桿菌、及びサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、並びに様々なシュードモナス（Pseudomonas）種などの他の腸内細菌科のものである。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビジアエ（S. cerevisiae））及びピキア（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブリドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞系としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【０２３０】
本発明は、抗体が発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、かかる宿主細胞より産生された抗体を回収することと、を含む、本発明の抗体の産生方法も提供する。抗体を製造して精製する方法は当該技術分野において周知である。合成されたら（化学的又は組換えのいずれか）、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖及び／若しくは重鎖、又はＶＨ及び／若しくはＶＬなどの他の抗体断片を、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動など（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）などの標準的な手順により精製することができる。対象とする抗体は、実質的に純粋なものであってよく、例えば、細胞残屑、対象抗体以外の巨大分子などの混入物を含まず、例えば、純度が少なくとも約８０％〜８５％、純度が少なくとも約８５％〜９０％、純度が少なくとも約９０％〜９５％、又は純度が少なくとも約９８％〜９９％以上であり得る。
【０２３１】
本発明は、
抗体のＶＨをコードしている第１のポリヌクレオチドと、抗体のＶＬをコードしている第２のポリヌクレオチドと、を発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を発現ベクターで形質転換させることと、
ＶＬ及びＶＨが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で宿主細胞を培養することと、
宿主細胞又は培養培地からかかる抗体を回収することと、を含む、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する拮抗性抗体を産生する方法も提供する。
【０２３２】
本発明の特定のＶＨ配列又はＶＬ配列をコードしているポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的手法を用いベクターに組み込むこともできる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を用いて行われる。
【０２３３】
治療方法
本発明のＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体、例えば、抗体Ｃ４ＬＢ５、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ９４、Ｃ４ＬＢ１５０、Ｃ４ＬＢ１８９、Ｃ４ＬＢ１９１、Ｃ４ＬＢ１９９、Ｃ４ＬＢ２３１、Ｃ４ＬＢ２３２、Ｃ４ＬＢ３５、及びＣ４ＬＢ２３６を、任意の状態又は疾患の治療及び／又は予防に使用することもでき、ここで、ＣＤ１５４の作用を拮抗することは、治療上有効であり得るものであり、かつ疾患の症状を低減し得るものである。これらの例としては、アレルギー、自己免疫、癌、移植、ＧＶＨＤ、炎症及びその他の状態、特に、耐性の誘導及び／又は液性免疫の抑制が治療として望ましい治療が挙げられる。本発明の抗体により治療され得る疾患は、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、多発性硬化症、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症などの免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患である。
【０２３４】
ＣＤ１５４−ＣＤ４０相互作用の単なるブロッキングを超えて、抗ＣＤ１５４療法は免疫寛容の誘導を導く（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１１９９〜１２０６，１９８８）；Ｍａｒｋｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４：３２９〜３３５，１９９７；Ｊａｒｖｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７６：１３７５〜１３７９，２００３；Ｑｕｅｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０２：１９２０〜１９２６，２００３；Ｆｒｌｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２６：７２〜８４，２００３；Ｅｌｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７２：１４７３〜１４７８，２００１；Ｂｅｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １１：７１５〜７２０，２００２；Ｗｅｋｅｒｌｅ  ａｎｄ  Ｓｙｋｅｓ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００１．５２：３５３〜３７０１９；Ｃａｍｉｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７３：４５３〜４６１，２００２）。
【０２３５】
本発明は、治療有効量の本発明の抗体を、免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療するのに十分な時間にわたって、免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療を必要としている対象に投与することを含む、免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療方法も提供する。
【０２３６】
本発明は、治療有効量の本発明の抗体を、関節炎を治療するのに十分な時間にわたって、関節炎の治療を必要としている対象に投与することを含む、関節炎の治療方法も提供する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、関節炎は、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、又は痛風性関節炎である。
【０２３８】
本発明は、治療有効量の本発明の抗体を、狼瘡を治療するのに十分な時間にわたって、狼瘡の治療を必要としている対象に投与することを含む、狼瘡の治療方法も提供する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、狼瘡は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は皮膚エリテマトーデス（ＣＬＥ）である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、対象はループス腎炎を有する。
【０２４１】
本発明は、治療有効量の本発明の抗体を、炎症性腸疾患を治療するのに十分な時間にわたって、炎症性腸疾患の治療を必要としている対象に投与することを含む、炎症性腸疾患の治療方法も提供する。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
【０２４４】
「治療」は、治癒を目的とした処置（therapeutic treatment）を指す。治療を必要としている個体としては、障害又は障害の兆候を有するとして診断された対象が挙げられる。治療され得る対象としては、障害を有する傾向があるもの又は障害に対し感受性を有するもののうち、かかる障害が予防され得るものも挙げることができる。有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能であろうと又は検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的であろうと又は全体的であろうと）が挙げられる。有益な臨床結果としては、治療を受けた対象における、例えば、Ｂ細胞又は樹状細胞の増殖の低減、炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、免疫グロブリン（例えば、ＣＤ４０を担持する細胞はＢ細胞である場合）、これらの組み合わせの減少、抗炎症性タンパク質の産生増大、自己反応性細胞数の低減、免疫寛容の増強、自己反応性細胞の生存阻害、及び／又はＣＤ４０を発現している細胞がＣＤ１５４による刺激を受けることで介在される１種以上の症状の低減が挙げられる。
【０２４５】
臨床応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線透視撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリー、又は蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析、組織診断、肉眼所見、及びＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及びクロマトグラフィーなどにより検出可能な変化を含むがこれらに限定されない血液化学法などといった、スクリーニング技法を用い評価され得る。
【０２４６】
本発明の方法に使用され得る抗体の例は、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９、表１３、及び表１４に示すとおりのＶＨ、ＶＬ、ＨＣＤＲ及び／又はＬＣＤＲ領域と、抗体Ｃ４ＬＢ５、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ９４、Ｃ４ＬＢ１５０、Ｃ４ＬＢ１８９、Ｃ４ＬＢ１９１、Ｃ４ＬＢ１９９、Ｃ４ＬＢ２３１、Ｃ４ＬＢ２３２、Ｃ４ＬＢ３５、及びＣ４ＬＢ２３６と、を含む。
【０２４７】
本発明の方法を用いて任意の動物分類に属する対象を治療することができる。治療され得る対象の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【０２４８】
本発明の抗体はまた、かかる治療のための薬剤の調製においても有用であり得るものであり、薬剤は、本明細書に定められる投薬量で投与するために調製される。
【０２４９】
本発明の抗体は、第２の治療薬と併用して投与され得る。
【０２５０】
第２の治療薬は、有用であることが既知であるあらゆる薬剤又は薬剤の組み合わせ、あるいはこれまで自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療に使用されてきた又は現在使用されているものなどの、自己免疫疾患及び炎症性疾患のためのあらゆる既知の治療薬であり得る。このような治療法及び治療薬としては、外科術又は外科手技（例えば、脾摘出、リンパ節郭清、甲状腺摘除術、プラズマフェレーシス、白血球アフェレーシス（leukophoresis）、細胞、組織又は臓器移植、消化器外科手術（intestinal procedures）、及び臓器かん流など）、放射線療法、例えば、ステロイド療法及び非ステロイド療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、皮膚病薬による治療（例えば、アレルギー、接触性皮膚炎、及び乾癬などの皮膚の状態の治療に使用される外用薬）、免疫抑制療法、並びにその他の抗炎症性モノクローナル抗体療法などの治療法が挙げられる。
【０２５１】
第２の治療薬は、コルチコステロイド、抗マラリア薬、免疫抑制剤、細胞毒性剤、又はＢ細胞調製剤であり得る。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ミコフェノール酸ナトリウム、シクロスポリン、レフルノミド、タクロリムス、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、又はＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）（ベリムマブ）である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を第２の治療薬と組み合わせて投与する。代表的な第２の治療薬は、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチレート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、細胞毒性剤、免疫抑制剤、免疫調節機能のある抗体、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミゾリビン、クロラムブシル、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６；ＰｒｏＧｒａｆｒＭ）、ミコフェノール酸モフェチル、及びアザチオプリン（６−メルカプトプリン）、シロリムス（ラパマイシン）、デオキシスパガリン、レフルノミド、及びそのマロノニトリロアミド（malononitriloamide）類似体、抗ＣＴＬＡ４抗体及びＩｇ融合体、抗Ｂリンパ球刺激因子抗体（例えば、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−ＢＴＭ）及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合（ＢＬｙＳ−ｌｇ）、抗ＣＤ８０抗体、抗Ｔ細胞抗体、例えば、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４、コルチコステロイド、例えば、クロベタゾール、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノール（fluocinole）、フルオシノニド、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、スルファサラジン、メサラミン含有薬剤（５−ＡＳＡ剤として知られる）、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン（fenprofen）、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、メクロフェナマート（meclofamate）、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サリチラート、スリンダク、及びトルメチン、ホスホジエステラーゼ−４阻害剤、抗ＴＮＦα抗体ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）、及びＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）、サリドマイド、又はレナリドミドである。
【０２５４】
本発明の抗体を、第２の治療剤と組み合わせて、同時、順次、又は別々に投与することもできる。
【０２５５】
治療効果又はＲＡ（Treatment effectiveness or RA）は、米国リウマチ学会による診断基準、欧州リウマチ学会による診断基準、又は任意の他の診断基準により定義される臨床応答に基づき測定されるとおりの有効性を用い、評価することができる。例えば、Ｆｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３８：７２７〜３５  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｇｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９：３４〜４０を参照されたい。
【０２５６】
投与／医薬組成物
本発明は、本発明のＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体及び医薬的に許容される担体の医薬組成物を提供する。治療用途では、抗体本発明（the antibodies the invention）は、医薬的に許容され得る担体中の活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成物起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有させることができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子又は抗体の濃度は幅広く異なってもよく、即ち約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％まで、最大で５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％までであってよく、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０２５７】
本発明の方法における本発明の抗体の投与方法は、当該技術分野においてよく知られているように、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内若しくは皮下、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）、又は当業者に理解される他の手段などの任意の好適な経路であり得る。
【０２５８】
本発明の抗体を、例えば、静脈内（ＩＶ）注入又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の適当な経路によって対象に投与することができる。静脈内注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、又は２４０分にわたって、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間与えられてもよい。
【０２５９】
免疫介在性炎症性疾患又は関節リウマチなどの自己免疫疾患を有する患者に与える用量は、治療される疾患を緩和するか又は少なくとも部分的に停止するのに十分（「治療的に有効な量」）であり、時として、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ又は約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、又は約２４ｍｇ／ｋｇ、あるいは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇであってもよいが、さらにより高い量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０２６０】
例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの固定単位用量を与えても、又は患者の表面積に基づいて例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２の用量で与えてもよい。通常、１〜８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が関節リウマチなどの免疫介在性炎症性疾患を治療するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。
【０２６１】
本発明の抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月後に、又はそれ以上後に繰り返すことができる。治療過程を繰り返すことも可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であるか、又は異なる用量であってよい。例えば、本発明の抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、又は１６ｍｇ／ｋｇで１週間間隔で８週間にわたり投与され、８ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも１６ｍｇ／ｋｇで２週間毎にさらに１６週間の投与が続き、その後、４週間毎に８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇの静脈内注入による投与を続けて行うことができる。
【０２６２】
本発明の抗体は、例えば、６ケ月以上の期間にわたり週１回など、維持療法により提供されてもよい。
【０２６３】
例えば、本発明の抗体は、単回投与、若しくは、２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎の分割投与を用いて、又はこれらの併用を用いて、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量の１日用量として、例えば、１日当たり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇで、治療開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０週目のうちの少なくとも１週に、あるいはこれらの組み合わせで提供されてもよい。
【０２６４】
本発明の抗体は、関節炎若しくは関節リウマチなどの自己免疫疾患の免疫介在性炎症性疾患の発症リスクの低減、及び／あるいは自己免疫疾患のうち免疫介在性炎症性疾患の発症の遅延を目的として予防的に投与されてもよい。
【０２６５】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体と、を含むように調製することができる。
【０２６６】
例えば、本発明の抗体を含む静脈内注入用の医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投与する際には、約２００ｍＬの減菌リンガー液と、約８ｍｇ〜約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約１６００ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約８００ｍｇの本発明の抗体とを含むように調製することができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
【０２６７】
免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に有効な本発明の抗体の「治療有効量」は、標準的な研究手法によって決定することができる。例えば、インビトロアッセイを採用して至適用量範囲を特定する手立てとすることもできる。所望により、関節炎又は関節リウマチなどの免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療において有効であろう本発明の抗体の投与量は、当該技術分野でよく知られる関連する動物モデルに抗体を投与することによって決定することができる。具体的な有効量の選択は、当業者であれば幾つかの因子を考慮し（例えば臨床試験によって）決定することができる。このような因子には、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には公知のその他の因子が含まれる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度によって決まり、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。本発明の抗体の有効性及び有効量について、本明細書に記載したモデルのいずれかを用いて試験することができる。
【０２６８】
本発明の抗体を、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体に溶解させてもよい。この技法は、通常のタンパク調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥法及び再構成法を用いることができる。
【０２６９】
抗イディオタイプ抗体
本発明は、本発明の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２７０】
本発明は、配列番号５８のＶＨと、配列番号６５のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７１】
本発明は、配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７２】
本発明は、配列番号６０のＶＨと、配列番号６７のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７３】
本発明は、配列番号６１のＶＨと、配列番号６８のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７４】
本発明は、配列番号６２のＶＨと、配列番号６９のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７５】
本発明は、配列番号６３のＶＨと、配列番号７０のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７６】
本発明は、配列番号６４のＶＨと、配列番号７１のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７７】
本発明は、配列番号５９のＶＨと、配列番号７２のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７８】
本発明は、配列番号５９のＶＨと、配列番号７３のＶＬとを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０２７９】
抗イディオタイプ（Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原をブロッキングするＩｄを使用して、サンプル中の未結合の抗体（例えば、本明細書に記載の本発明のＣＤ１５４抗体）を検出することもできる。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全ての抗体（未結合のもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することもできる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されるよう、かかる抗体で動物を免疫することにより調製することができる。
【０２８０】
抗Ｉｄ抗体を、さらに別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として使用して、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生させてもよい。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導する元のｍＡｂとエピトープが同一であってもよい。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同じ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は様々であってよく（これにより抗Ｉｄ抗体変異体が産生される）、及び／又はＨＬＡ−ＤＲ抗体に特異的に結合する抗体を本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な手法により誘導体化してもよい。
【０２８１】
免疫複合体（Immunoconjugates）
「免疫複合体」は、１つ以上の異種分子（複数可）と融合させた本発明の抗体を指す。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を、１つ以上の細胞毒性剤と融合させる。このような細胞毒性剤の例としては、化学療法剤又は薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はそれらの断片）、及び放射性同位体が挙げられる。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）であり、ここで、本発明の抗体は、マイタンシノイド（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（例えば、米国特許第５，６３５，４８３号、及び同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号）、ドラスタチン、カリチアマイシン、又はこれらの誘導体（例えば、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３３３６〜３３４２；ａｎｄ  Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：２９２５〜２９２８を参照されたい）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（例えば、Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  １３：４７７〜５２３；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８〜３６２；Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  １６：７１７〜７２１；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：８２９〜８３４；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９〜１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４５：４３３６〜４３４３；並びに米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどの１つ以上の薬剤と融合される。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa））、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセン（tricothecenes）などといった酵素活性を有する毒素又はそれらの断片と融合している本発明の抗体を含む。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を放射性原子と複合させて、放射性複合体を形成させる。放射性複合体の産生には様々な放射性同位体を使用することができる。例としては、Ａｔ２１１、１１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。検出に放射性複合体を使用する場合、シンチグラフ検査のため、例えば、ｔｃ９９ｍ若しくは１１２３の放射性原子、又は例えば、ヨウ素−１２３アゲイン（iodine-123 again）、ヨウ素−１３１、インジウム−Ｉ１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄などといった、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴画像としても既知、ｍｒｉ）用のスピン標識を含み得る。
【０２８６】
本発明の抗体と、細胞毒性剤との複合体は、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミダートＨＱなど）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジル基質）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性（bis-active）フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用い作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８に記載のとおりに調製できる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は放射性核種を抗体に融合させるにあたり代表的なキレート剤である。例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞中で細胞毒性剤を放出するのを促進する「分解可能なリンカー（cleavable linker）」とすることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１２７〜１３１；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０２８７】
免疫複合体又はＡＤＣは、市販（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ））のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）などの架橋剤により調製することができる。
【０２８８】
本発明は、治療薬又は造影剤に結合させた、配列番号１のＣＤ１５４に特異的に結合する抗体を含む、免疫複合体も提供する。
【０２８９】
本発明の更なる実施形態
以下に、本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の更なる実施形態を列挙する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの１つ１つにもまた関係する。
１）配列番号１のヒトＣＤ１５４に特異的に結合するアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号１７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）とを含み、場合により、
ａ）ＨＣＤＲ１残基Ｓ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ｂ）ＨＣＤＲ１残基Ｉ４が、Ｍ、Ｌ、又はＶに変異しており、
ｃ）ＨＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａに変異しており、
ｄ）ＨＣＤＲ２残基Ｓ３が、Ａ、Ｔ、又はＶに変異しており、
ｅ）ＨＣＤＲ２残基Ｐ４が、Ｖ、Ｔ、Ｌ  Ｑ、又はＥに変異しており、
ｆ）ＨＣＤＲ２残基Ｎ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｇ）ＨＣＤＲ２残基Ｔ９が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｈ）ＨＣＤＲ２残基Ｎ１０が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｉ）ＨＣＤＲ３残基Ｓ１が、Ａ、又はＭに変異しており、
ｊ）ＨＣＤＲ３残基Ｒ２が、Ａ、Ｓ、Ｑ、又はＫに変異しており、
ｋ）ＨＣＤＲ３残基Ｌ７が、Ｍに変異している、アンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。
２）配列番号３７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）と、を含む請求項１に記載の抗体であって、所望により、
ａ）ＬＣＤＲ１残基Ｑ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｂ）ＬＣＤＲ１残基Ｓ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｃ）ＬＣＤＲ１残基Ｓ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｄ）ＬＣＤＲ１残基Ｓ８が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｅ）ＬＣＤＲ２残基Ａ２が、Ｓに変異しており、
ｆ）ＬＣＤＲ２残基Ｎ３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｇ）ＬＣＤＲ２残基Ｓ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｈ）ＬＣＤＲ２残基Ｌ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｉ）ＬＣＤＲ２残基Ｑ６が、Ｅ、Ｄ、又はＮに変異しており、
ｊ）ＬＣＤＲ２残基Ｓ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｋ）ＬＣＤＲ３残基Ｓ３が、Ａに変異しており、
ｌ）ＬＣＤＲ３残基Ｄ４が、Ｎに変異しており、
ｍ）ＬＣＤＲ３残基Ｓ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに変異しており、
ｎ）ＬＣＤＲ３残基Ｉ６が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖに変異している、抗体。
３）配列番号１７のＨＣＤＲ１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）と、配列番号３７のＬＣＤＲ１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）とを含む、実施形態１又は２に記載の抗体。
４）
ａ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号６６のＶＬ、又は
ｂ）配列番号８０の重鎖及び配列番号８１の軽鎖を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の抗体。
５）配列番号４の可溶性ヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４）に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体。
６）Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
７）抗体がヒト血小板を活性化させない、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の抗体。
８）実施例１の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１１Ｍ以下の解離定数ＫＤでｓｈＣＤ１５４に結合する、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の抗体。
９）かかる抗体が、約７．０×１０−１１Ｍ〜約６×１０−１０ＭのＩＣ５０値でｓｈＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を阻害する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の抗体。
１０）かかる抗体が、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのｓｈＣＤ１５４介在性の発現を阻害する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の抗体。
１１）かかる抗体が、ｓｈＣＤ１５４に対する結合に関し、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体と競合し、ここで、かかるＶＨが配列番号５９の配列を含み、かかるＶＬが配列番号６６の配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
１２）かかる抗体が、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）、及び／又は３（ＨＣＤＲ３）における保存的アミノ酸置換を場合により１つ、２つ、又は３つ有する、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ここで、ＨＣＤＲが、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより定義されるものである、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。
１３）かかる抗体が、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）、及び／又は３（ＬＣＤＲ３）における保存的アミノ酸置換を場合により１つ、２つ、又は３つ有する、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＨのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＣＤＲが、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより定義されるものである、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の抗体。
１４）
ａ）それぞれ配列番号１６、２２、及び２９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｂ）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｃ）それぞれ配列番号１６、２４、及び３１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｄ）それぞれ配列番号１８、２５、及び３２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｅ）それぞれ配列番号１９、２６、及び３３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｆ）それぞれ配列番号２０、２７、及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、又は
ｇ）それぞれ配列番号２１、２８、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変
を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の抗体。
１５）
ａ）それぞれ配列番号３６、４３、及び５１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｂ）それぞれ配列番号３７、４４、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｃ）それぞれ配列番号３８、４５、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｄ）それぞれ配列番号３９、４６、及び５４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｅ）それぞれ配列番号４０、４７、及び５５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｆ）それぞれ配列番号４１、４７、及び５６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｇ）それぞれ配列番号４２、４８、及び５７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
ｈ）それぞれ配列番号３７、４９、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変、又は
ｉ）それぞれ配列番号３７、５０、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、それらの保存的改変
を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
１６）
ａ）それぞれ、配列番号１６、２２、及び２９、
ｂ）それぞれ、配列番号１７、２３、及び３０、
ｃ）それぞれ、配列番号１６、２４、及び３１、
ｄ）それぞれ、配列番号１８、２５、及び３２、
ｅ）それぞれ、配列番号１９、２６、及び３３、
ｆ）それぞれ、配列番号２０、２７、及び３４、又は
それぞれ、配列番号２１、２８、及び３５
の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の抗体。
１７）
ａ）それぞれ、配列番号３６、４３、及び５１、
ｂ）それぞれ、配列番号３７、４４、及び５２、
ｃ）それぞれ、配列番号３８、４５、及び５３、
ｄ）それぞれ、配列番号３９、４６、及び５４、
ｅ）それぞれ、配列番号４０、４７、及び５５、
ｆ）それぞれ、配列番号４１、４７、及び５６、
ｇ）それぞれ、配列番号４２、４８、及び５７、
ｈ）それぞれ、配列番号３７、４９、及び５２、又は
ｉ）それぞれ、配列番号３７、５０、及び５２
の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の抗体。
１８）それぞれ配列番号１６、２２、及び２９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３６、４３、及び５１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
１９）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、４４、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２０）それぞれ配列番号１６、２４、及び３１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３８、４５、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２１）それぞれ配列番号１８、２５、及び３２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３９、４６、及び５４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２２）それぞれ配列番号１９、２６、及び３３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４０、４７、及び５５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２３）それぞれ配列番号２０、２７、及び３４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４１、４７、及び５６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２４）それぞれ配列番号２１、２８、及び３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４２、４８、及び５７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２５）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、４９、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２６）それぞれ配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３７、５０、及び５２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
２７）配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＨを含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の抗体。
２８）配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、又は７３のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同であるＶＬを含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の抗体。
２９）配列番号５８のＶＨと配列番号６５のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３０）配列番号５９のＶＨと配列番号６６のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３１）配列番号６０のＶＨと配列番号６７のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３２）配列番号６１のＶＨと配列番号６８のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３３）配列番号６２のＶＨと配列番号６９のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３４）配列番号６３のＶＨと配列番号７０のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３５）配列番号６４のＶＨと配列番号７１のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３６）配列番号５９のＶＨと配列番号７２のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３７）配列番号５９のＶＨと配列番号７３のＶＬとを含み、ここで、場合により、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３８）Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の抗体。
３９）Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換が、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓであり、ここで、残基付番はＥＵインデックスに準拠する、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の抗体。
４０）Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換が、置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓであり、ここで、残基付番はＥＵインデックスに準拠する、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の抗体。
４１）かかる抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプである、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の抗体。
４２）抗体パラトープ残基の全てがＶＨに存在する、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の抗体。
４３）かかる抗体が、可溶性ヒトＣＤ１５４三量体内の、第１のＣＤ１５４モノマー及び第２のＣＤ１５４モノマーに同時に結合する、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の抗体。
４４）かかる抗体が、配列番号１のＣＤ１５４のアミノ酸残基１８２〜２０７内の、第１のＣＤ１５４モノマー中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＣＤ１５４残基に結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する、実施形態４３に記載の抗体。
４５）かかる抗体が、配列番号１のＣＤ１５４のアミノ酸残基１７６〜２５３内の、第２のＣＤ１５４モノマー中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＣＤ１５４残基に結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する、実施形態４３又は４４に記載の抗体。
４６）かかる抗体が、第１のＣＤ１５４モノマー中の残基Ｅ１８２、Ｓ１８５、Ｑ１８６、Ａ１８７、Ｐ１８８、Ｓ２１４、Ａ２１５、及びＲ２０７に結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の抗体。
４７）かかる抗体が、第２のＣＤ１５４モノマー中の残基Ｔ１７６、Ｆ１７７、Ｃ１７８、Ｑ２２０、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｇ２５０、及びＦ３５３に結合し、ここで、残基付番は配列番号１に準拠する、実施形態４３〜４６のいずれか１つに記載の抗体。
４８）異なる結合特異性を有する第２の抗原結合分子に結合している実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合部分を含む二重特異性分子。
４９）
ａ）ｓｈＣＤ１５４との免疫複合体においてヒト血小板を活性化しない、
ｂ）解離定数ＫＤ約５×１０−９Ｍ以下でｓｈＣＤ１５４に結合する、
ｃ）ｓｈＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を阻害する、又は
ｄ）ＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイにおいてＣＤ１５４生物活性を阻害する、実施形態１〜４７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項４８に記載の二重特異性分子。
５０）治療薬又は造影剤に結合させた実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合部分を含む免疫複合体。
５１）実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
５２）実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体ＶＨ、抗体ＶＬ、又は抗体ＶＨと抗体ＶＬとをコードしているポリヌクレオチド。
５３）実施形態５２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
５４）実施形態５３に記載のベクターを含む宿主細胞。
５５）抗体が発現される条件下で実施形態５４に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞より産生された抗体を回収することと、を含む、抗体の産生方法。
５６）自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療に使用するための、実施形態１〜４７のいずれかに記載の抗体、又は実施形態５１に記載の医薬組成物。
５７）関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、多発性硬化症、甲状腺炎、１型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症に使用するための、実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体。
５８）関節リウマチの治療に使用するための実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体。
５９）狼瘡の治療に使用するための実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体。
６０）移植の処置（treatment of transplantation）に使用するための実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体。
６１）炎症性腸疾患の治療に使用するための実施形態１〜４７のいずれか１つに記載の抗体。
６２）実施形態５６〜６１のいずれの記載に従って第２の治療薬と組み合わせて使用するための実施形態１〜４７のいずれかに記載の抗体。
６３）第２の治療薬が、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチラート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、コルチコステロイド、細胞毒性剤、免疫抑制剤、及び／又は抗体である、実施形態６２に記載の抗体。
【０２９０】
本発明は、配列番号１のヒトＣＤ１５４に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号１７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）と、配列番号３７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）と、を含む単離された抗体又はその抗原結合部分も提供する。
【０２９１】
本発明は、配列番号１７のＨＣＤＲ１（ＳＹＧＩＳ）と、配列番号２３のＨＣＤＲ２（ＷＩＳＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ）と、配列番号３０のＨＣＤＲ３（ＳＲＹＹＧＤＬＤＹ）と、配列番号３７のＬＣＤＲ１（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）と、配列番号４４のＬＣＤＲ２（ＹＡＮＳＬＱＳ）と、配列番号５２のＬＣＤＲ３（ＱＱＳＤＳＩＰＷＴ）と、を含む、配列番号４の可溶性のヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４）に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体も提供する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５９のＶＨと配列番号６６のＶＬとを含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、かかる抗体は、実施例１の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いＫＤを測定したときに、約５×１０−９Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１１Ｍ以下の解離定数ＫＤでｓｈＣＤ１５４に結合する。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、かかる抗体は、約７．０×１０−１１Ｍ〜約６×１０−１０ＭのＩＣ５０値でｓｈＣＤ１５４介在性のヒトＢ細胞の増殖を阻害する。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、抗体は、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びヒトＣＤ４０を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＮＦ−κＢ−誘導性インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）ミニマルプロモーター下、約２．１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で、ＳＥＡＰのｓｈＣＤ１５４介在性の発現を阻害する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプであり、場合により、野生型ＩｇＧ１と比較して重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、抗体は配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含み、かつＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比較して重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、抗体は配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含み、かつＩｇＧ１／κアイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比較して重鎖置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む。
【０３００】
いくつかの実施形態では、抗体は配列番号５９のＶＨと、配列番号６６のＶＬとを含み、かつＩｇＧ２／κアイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比較して重鎖置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８０の重鎖（ＨＣ）と、配列番号８１の軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８０の重鎖（ＨＣ）と、配列番号８１の軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性の抗体である。
【０３０４】
抗体は、治療、例えば、自己免疫疾患の治療に使用するのに好適である。
【０３０５】
抗体は、治療、例えば、免疫介在性炎症性疾患の治療に使用するのに好適である。
【０３０６】
抗体は、治療、例えば、関節炎の治療に使用するのに好適である。
【０３０７】
抗体は、治療、例えば、全身性紅斑性狼瘡の治療に使用するのに好適である。
【０３０８】
抗体は、治療、例えば、炎症性腸疾患の治療に使用するのに好適である。
【０３０９】
抗体は、処置、例えば、移植の処置に使用するのに好適である。
【０３１０】
抗体は、治療、例えば、腎移植の処置に使用するのに好適である。
【０３１１】
抗体は、治療、例えば、皮膚移植の処置に使用するのに好適である。
【０３１２】
抗体は、治療、例えば、骨髄移植の処置に使用するのに好適である。
【０３１３】
抗体は、治療、例えば、移植片対宿主病の治療に使用するのに好適である。
【０３１４】
抗体は、治療、例えば、免疫性血小板減少の治療に使用するのに好適である。
【０３１５】
抗体は、治療、例えば、多発性硬化症の治療に使用するのに好適である。
【０３１６】
抗体は、治療、例えば、甲状腺炎の治療に使用するのに好適である。
【０３１７】
抗体は、治療、例えば、１型糖尿病の治療に使用するのに好適である。
【０３１８】
抗体は、治療、例えば、アテローム性動脈硬化症の治療に使用するのに好適である。
【０３１９】
抗体は、治療、例えば、関節リウマチの治療に使用するのに好適である。
【０３２０】
抗体は、治療、例えば、クローン病の治療に使用するのに好適である。
【０３２１】
抗体は、治療、例えば、潰瘍性大腸炎の治療に使用するのに好適である。
【０３２２】
抗体は、治療、例えば、炎症性腸疾患の治療に第２の治療薬と組み合わせて使用するのに好適である。
【０３２３】
次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０３２４】
実施例１．材料及び方法
使用するタンパク質の生成
内因性ＣＤ１５４シグナルは三量体であることから、組換ＣＤ１５４を様々な方法で発現させて機能性の組換三量体を得た。可溶性ヒトＣＤ１５４（ｓｈＣＤ１５４；配列番号４）、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）（本明細書においてマーモセットとして呼称）の可溶性ＣＤ１５４（ｓｍＣＤ１５４；配列番号５）又はカニクイザル（Macaca fascicularis）（本明細書においてカニクイザルとして呼称）の可溶性ＣＤ１５４（ｓｃＣＤ１５４；配列番号６）をクローニングし、Ｈｉｓ６（配列番号１０）融合体（ｓｈＣＤ１５４−ｈｉｓ，配列番号７；ｓｍＣＤ１５４−ｈｉｓ，配列番号８；ｓｃＣＤ１５４−ｈｉｓ，配列番号９）として、又はロイシンジッパー（ＩＬＺ）（配列番号１１）との融合体（ｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺ，配列番号１２；ｓｍＣＤ１５４−ＩＬＺ，配列番号１３；ｓｃＣＤ１５４−ＩＬＺ，配列番号１４）として発現させた。標準法を用いクローニング、発現、及びタンパク質精製を行った。Ｈｉｓ融合体及びＩＬＺ融合体のいずれもほとんどが三量体であった。ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと、標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号２１３２７）を用いｓｍＣＤ１５４及びｓｍＣＤ１５４−ＩＬＺをビオチニル化した。ビオチニル化の成功をＨＡＢＡ−アビジンアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号４６６１０）及びＯｃｔｅｔにより分析した。ヒトＣＤ４０（配列番号１５）を発現している細胞をいくつかのアッセイに使用した。ヒトＣＤ１５４を内因的に発現しているＤ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１０９１５（商標）をいくつかのアッセイに使用した。
【０３２５】
ヒトＣＤ１５４；配列番号１
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３２６】
マーモセットＣＤ１５４；配列番号２
ＭＩＥＴＹＮＱＰＶＰＲＳＡＡＴＧＰＰＶＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＫＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＰＰＮＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＩＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３２７】
カニクイザルＣＤ１５４；配列番号３
ＭＩＥＴＹＮＱＰＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＶＲＭＫＩＦＭＹＬＬＴＩＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＫＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３２８】
ｓｈＣＤ１５４；配列番号４
ＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３２９】
ｓｍＣＤ１５４；配列番号５
ＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＰＰＮＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＩＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３０】
ｓｃＣＤ１５４；配列番号６
ＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３１】
ｓｈＣＤ１５４−ｈｉｓ；配列番号７
ＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３２】
ｓｍＣＤ１５４−ｈｉｓ；配列番号８
ＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＰＰＮＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＩＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３３】
ｓｃＣＤ１５４−ｈｉｓ；配列番号９
ＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３４】
Ｈｉｓ６；配列番号１０
ＨＨＨＨＨＨ
【０３３５】
ＩＬＺ；配列番号１１
ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲ
【０３３６】
ｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺ；配列番号１２
ＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲＧＧＧＳＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３７】
ｓｍＣＤ１５４−ＩＬＺ；配列番号１３
ＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲＧＧＧＳＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＰＰＮＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＩＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３８】
ｓｃＣＤ１５４−ＩＬＺ；配列番号１４
ＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲＧＧＧＳＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【０３３９】
ヒトＣＤ４０；配列番号１５
ＭＶＲＬＰＬＱＣＶＬＷＧＣＬＬＴＡＶＨＰＥＰＰＴＡＣＲＥＫＱＹＬＩＮＳＱＣＣＳＬＣＱＰＧＱＫＬＶＳＤＣＴＥＦＴＥＴＥＣＬＰＣＧＥＳＥＦＬＤＴＷＮＲＥＴＨＣＨＱＨＫＹＣＤＰＮＬＧＬＲＶＱＱＫＧＴＳＥＴＤＴＩＣＴＣＥＥＧＷＨＣＴＳＥＡＣＥＳＣＶＬＨＲＳＣＳＰＧＦＧＶＫＱＩＡＴＧＶＳＤＴＩＣＥＰＣＰＶＧＦＦＳＮＶＳＳＡＦＥＫＣＨＰＷＴＳＣＥＴＫＤＬＶＶＱＱＡＧＴＮＫＴＤＶＶＣＧＰＱＤＲＬＲＡＬＶＶＩＰＩＩＦＧＩＬＦＡＩＬＬＶＬＶＦＩＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶＱＥＲＱ
【０３４０】
親和性の測定
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システム（ＢｉｏＲａｄ）使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、親和性測定を実施した。アミンカップリング化学反応についての製造元の使用説明書を用い、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９〜００５〜０９８）を、ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ，カタログ番号１７６〜５０１１）の加工アルギン酸ポリマー層にカップリングさせて、バイオセンサー表面を調製した。約４７００  ＲＵ（レスポンスユニット）の被検抗体を固定した。速度論的実験を、ランニングバッファー（ＤＰＢＳ＋０．０３％ポリソルベートＰ２０＋１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で２５℃にて実施した。速度論的実験を実施するにあたり、０．３９１ｎＭ〜１００ｎＭ（４倍段階希釈）の範囲の濃度の分析種（ｓｈＣＤ１５４−ｈｉｓ及びｓｍＣＤ１５４−ｈｉｓ）の注入後１００  ＲＵの抗体を捕捉した。５０μＬ／分で３分間会合段階をモニターした後、１５分間緩衝液を流した（解離段階）。１００μＬ／分で１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７９６１）を１８秒間ずつ２回流してチップ表面を再生した。
【０３４１】
回収したデータはＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用い加工した。まず、インタースポットを用いバックグラウンドについてデータを補正した。次に、分析物の注入のため緩衝液注入を用い、データのダブルリファレンスサブトラクション（double reference subtraction）を行った。ラングミュア型の１：１結合モデルを用い、データの速度論的分析を実施した。
【０３４２】
ＣＤ１５４により誘導されるＲａｍｏｓ細胞活性化
細胞活性化のマーカーとしてＣＤ５４を用い、抗ＣＤ１５４抗体がＲａｍｏｓ細胞の活性化を阻害する能力を評価した。供給元のプロトコルに準拠して維持したＲａｍｏｓ細胞（バーキットリンパ腫細胞，ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５９６（商標））を、１００μＬ／ウェルの完全増殖培地を入れた９６ウェルＶ底プレートに２．０×１０５個／ウェルで播種した。０．２、２、又は２０μｇ／ｍＬの被検抗体を、４０ｎｇ／ｍＬ  ｓｍＣＤ１５４−ｈｉｓと室温で１時間プレインキュベートした後、細胞に加えた。プレートをカバーし終夜インキュベートした（３７℃，５％  ＣＯ２）。翌日、アッセイプレートをスピンダウンし、使用済みの処理培地を除去した。得られた細胞ペレットを冷ＰＢＳ／２％  ＦＢＳで洗浄した後、かかる細胞を、ＰＥ標識した抗ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗体又は適切な対照アイソタイプにより４℃で１時間染色した。細胞を冷ＰＢＳ／２％  ＦＢＳで洗浄し、１００μＬ／ウェルにて冷ＰＢＳ／２％  ＦＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで蛍光シグナル（黄色チャネル）を測定した。次の基準、「５Ｃ８抗体と比較したときの％力価が５Ｃ８の力価の５％を超過している」を満たしたとき、抗体はアンタゴニストであるものと判定された。ここで、％力価とは、試験した中で最も高濃度の５Ｃ８と比較して正規化した阻害率（％）を指す。
【０３４３】
ＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイ
抗ＣＤ１５４抗体が、ＣＤ１５４により誘導されるＣＤ４０下流のシグナル伝達経路を阻害する能力を、ヒトＣＤ４０を発現するよう改変したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用い評価して、ＮＦ−κＢ−誘導性プロモーター（ＩＦＮ−κミニマルプロモーター）の制御下、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を導入した。細胞を、ヒト若しくはカニクイザルＣＤ１５４のいずれか、又はＪｕｒｋａｔ細胞により刺激した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞を供給元のプロトコルに準拠して維持し、全ての活性アッセイを、１０％ウシ胎仔血清（熱失活）と１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘとを添加したＤＭＥＭで行った。細胞を、１ウェル当たり２．５又は５×１０４個の細胞密度、１００μＬ用量で９６ウェル組織培養プレートに播種し、終夜インキュベートした（３７℃，５％  ＣＯ２）。翌日、ｓｈＣＤ１５４−Ｈｉｓ若しくはｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺ、又はＤ１．１Ｊｕｒｋａｔ細胞の４倍濃度の溶液を、抗ＣＤ１５４抗体の４倍濃度の溶液（適した濃度にて）と１：１の割合でプレインキュベートして、２倍濃度のＣＤ１５４：抗体のプレ複合体混合物溶液を得た。ＣＤ１５４：抗体混合物は室温で１時間インキュベートし、一方Ｄ１．１Ｊｕｒｋａｔ：ｍＡｂ混合物は３７℃かつ５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。プレ複合体インキュベート時間の終了時に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞を入れた９６ウェルアッセイプレートに２倍濃度のプレ複合体溶液１００μＬ／ウェルを添加した。最終アッセイ用量は、最終濃度８０ｎｇ／ｍＬのｓｈＣＤ１５４−Ｈｉｓ、若しくは４０ｎｇ／ｍＬのｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺのＣＤ１５４、若しくは２．５〜６．０×１０４個のＤ１．１Ｊｕｒｋａｔ細胞で２００μＬ／ウェルとした。１６〜２４時間の処理時間後（３７℃，５％  ＣＯ２）、４０μＬ／ウェルの上清を１６０μＬ／ウェルのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と３７℃で３０〜６０インキュベートし、吸光度（６５０ｎｍ）を測定することにより、上清のホスファターゼ活性を分析した（ＳＥＡＰ）。
【０３４４】
Ｊｕｒｋａｔ細胞介在性の樹状細胞活性化アッセイ
抗ＣＤ１５４抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞介在性のＤＣ活性化阻害能を、ＤＣによる各種サイトカインの産生低下を測定することにより評価した。ヒト単球（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）を５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦと共に６日間培養した。細胞には３日目に新しい培地（ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ添加）を補充した。６日目の細胞アッセイには未成熟なＤＣｓ（ｉＤＣｓ）（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４ｌｏｗ  ＣＤ８３−）を使用した。２．５×１０５個のＤ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０００ｒａｄで放射線照射）を０．００００６４〜２５μｇ／ｍＬ  μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１５４抗体と共に１５〜２０分間インキュベートした後、９６ウェル丸底プレートで、２００μＬ／ウェルの最終用量にて２．５×１０４個のｉＤＣと共培養した。４８時間のインキュベート後、サイトカイン分析のため上清を回収した。
【０３４５】
Ｊｕｒｋａｔ細胞介在性のＢ細胞活性化アッセイ
抗ＣＤ１５４抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞介在性Ｂ細胞活性化阻害能を、Ｂ細胞の増殖に対する抗体の作用を評価することにより評価した。１×１０５個のＤ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞（５０００ｒａｄで放射線照射）を、ＩＬ−２１（１００ｎｇ／ｍＬ）及び０．００７７ｎｇ／ｍＬ−１５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１５４抗体の存在下、９６ウェル丸底プレートで２００μＬ／ウェルの最終用量にて、１×１０５個のヒト扁桃体Ｂ細胞と共培養した。２日間のインキュベート後、メチル（−３Ｈ）−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を培養物に添加し、終夜インキュベートした後、ヒトＢ細胞の増殖を測定した。
【０３４６】
ＣＤ１５４介在性のＢ細胞活性化アッセイ
抗ＣＤ１５４抗体による組換ＣＤ１５４介在性Ｂ細胞活性化阻害能を、ヒト又はカニクイザルのＢ細胞において評価した。１×１０５個のヒト扁桃体Ｂ細胞又はカニクイザル脾臓細胞を、９６ウェル丸底プレートで２００μＬ／ウェルの最終用量にて１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−２１、０．５μｇ／ｍＬのｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺ、及び０．００７７ｎｇ／ｍＬ〜１５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１５４抗体を用い培養した。２日間のインキュベート後、メチル（−３Ｈ）−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を培養物に添加し、終夜インキュベートした後、ヒトＢ細胞の増殖を測定した。
【０３４７】
実施例２．ファージディスプレイライブラリからの抗ＣＤ１５４抗体の単離
ＣＤ１５４結合性のＦａｂを、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６，２０１０、国際公開第２００９／０８５４６２号、米国特許出願公開第２０１０／００２１４７７号）に記載のものなどの新規のｐＩＸファージディスプレイからスクリーニングした。簡潔に言えば、ライブラリは、ヒトスキャフォールドを多様化することによって作製されたものであり、生殖細胞系列ＶＨ遺伝子であるＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０１及びＩＧＨＶ５−５１＊０１をＨ３ループを介してヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組み替え、そしてヒト生殖細胞系列ＶＬκ遺伝子であるＯ１２（ＩＧＫＶ１−３９＊０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０＊０１）及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１＊０１）をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子で組み替えることで、完全なＶＨ及びＶＬドメインを構築した。多様化に際し、重鎖及び軽鎖可変領域内の、タンパク質抗原及びペプチド抗原と高頻度に接していると確認された位置に相当するＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の位置を選択した。選択した位置での配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーのそれぞれの位置で見られる残基に制限した。長さがアミノ酸７〜１４個分の単鎖〜中鎖型の合成ループを用いることで、Ｈ３ループにおいて多様性が発生した。Ｈ３でのアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリ設計の詳細は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６，２０１０に記載されている。ライブラリを生成するために利用した足場は、これらの由来するヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子に準じて命名した。ｓｍＣＤ１５４又は完全長のカニクイザルＣＤ１５４を発現している細胞に対するパニング実験にあたって、３つの重鎖ライブラリを、４個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせることで１２とおりの固有の組み合わせのＶＨ：ＶＬを作製した。
【０３４８】
このライブラリを、ＣＨＯ−ｓ細胞、又はビオチニル化及び非ビオチニル化ｓｍＣＤ１５４（配列番号５）のいずれかにおいて安定的に発現させた完全長のカニクイザルＣＤ１５４（配列番号３）に対しパニングした。数回のパニング後、ｓｍＣＤ１５４を抗原として用いるポリクローナルファージＥＬＩＳＡを行い、各パニング実験について特異的な集積（enrichment）を検出した。各Ｆａｂクローンから発現したＦａｂタンパク質をプレート上に直接コートした非ビオチニル化ｓｍＣＤ１５４に対する結合分子として使用するモノクローナルＦａｂ  ＥＬＩＳＡにより、上記のパニング実験から回収されｓｍＣＤ１５４に対する結合分子が集積していることが確認されたファージをさらにスクリーニングした。陰性対照Ｆａｂと比較して結合シグナルが４倍高いＦａｂクローンを選択し、完全ＩｇＧフォーマット内でスクリーニングしたの。スクリーニングしたＦａｂをＩｇＧ２σ／κ骨格にクローン化し、さらにこれを用いＤ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する結合について特性評価した。ＩｇＧ２σは、機能を欠失させたＦｃ（silent Fc）であり、野生型ＩｇＧ２と比較して置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを有する。ＩｇＧ２σは、米国特許第８，９６１，９６７号に記載されている。
【０３４９】
実施例３．ラットにおける抗ＣＤ１５４抗体の作製
ヒト免疫グロブリンの遺伝子座を発現しているトランスジェニックラット、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）；ＯＭＴ，Ｉｎｃを使用して、抗ＣＤ１５４抗体を作製した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の内在性イムノグロブリン遺伝子座は、ラットＣＨ遺伝子座に連結させたヒトＩｇκ及びＩｇλ遺伝子座と、ヒト由来のＶセグメント、Ｄセグメント、及びＪセグメントを有するヒト／ラットキメラＩｇＨ遺伝子座とにより置き換えられている。かかるＩｇＨ遺伝子座は、２２個のヒトＶＨセグメントと、全てのヒトＤセグメント及びＪＨセグメントとを天然の構成でラットＣＨ遺伝子座に連結して含有する。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の作製及び特性評価は、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：１４８１〜１４９０，２０１３、及び国際公開第２０１４／０９３９０８号に記載されている。
【０３５０】
複数箇所における反復免疫（repetitive immunization at multiple sites）（ＲＩＭＭＳ）プロトコルにより、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）をｓｍＣＤ１５４で免疫した。４５日間の免疫レジメン後、４匹のラット全てからリンパ節を摘出し、ハイブリドーマの作製に使用した。ｓｍＣＤ１５４への結合を示したｍＡｂを特定する結合ＥＬＩＳＡにより、９６ウェルプレートでハイブリドーマの上清をスクリーニングし、陰性対照の平均値よりも３倍超も高いアッセイシグナルを示すハイブリドーマ上清をスクリーニングした。
【０３５１】
スクリーニングした抗体を完全長のＩｇＧ２σ／λとしてクローン化した。ＣＤ１５４誘導性のＲａｍｏｓ細胞活性化においてアンタゴニスト活性を示す抗体を更なる特性評価のためスクリーニングした。
【０３５２】
実施例４．抗体の特性評価
ファージディスプレイ又はヒトイムノグロブリン遺伝子座を発現する遺伝子導入マウスにより得られ、実施例２及び３に記載のとおりのアンタゴニスト活性を示したいくつかの抗ＣＤ１５４抗体を配列決定し、さらにヒト及びカニクイザル樹状細胞に対する結合、ヒト及びカニクイザル樹状細胞及びＢ細胞に対する機能阻害能、並びに抗体エフェクター機能について特性評価した。標準的な方法を用い、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を配列決定した。
【０３５３】
表２は、選択抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列を示す。
【０３５４】
表３は、選択抗体のＨＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０３５５】
表４は、選択抗体のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。
【０３５６】
表５は、選択抗体のＬＣＤＲ１アミノ酸配列を示す。
【０３５７】
表６は、選択抗体のＬＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０３５８】
表７は、選択抗体のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。
【０３５９】
表８は、選択抗体のＶＨアミノ酸配列を示す。
【０３６０】
表９は、選択抗体のＶＬアミノ酸配列を示す。
【０３６１】
【表２】
2018522562.tif 000004
【０３６２】
【表３】
2018522562.tif 000005
【０３６３】
【表４】
2018522562.tif 000006
【０３６４】
【表５】
2018522562.tif 000007
【０３６５】
【表６】
2018522562.tif 000008
【０３６６】
【表７】
2018522562.tif 000009
【０３６７】
【表８】
2018522562.tif 000010
【０３６８】
【表９】
2018522562.tif 000011
【０３６９】
ＮＦ−κＢ  ＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイを用い測定されたとおり、抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（表１０中、Ｄ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞）により提供される内因性ＣＤ１５４及び組換えにより発現されたヒトＣＤ１５４三量体（ｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺ又はｓｈＣＤ１５４−ｈｉｓとして発現）のいずれについても機能を阻害した。抗体は、０．０８〜２１．１５ｎＭの範囲のＩＣ５０値でシグナル伝達を阻害された。アッセイにおいてスクリーニングされた抗体のＩＣ５０を表１０に示す。表中、各抗体についてのＩＣ５０値の範囲は、別個の実験より得られたＩＣ５０値のうち最低値と最高値を表す一方、単一の値は、その抗体に対し行われた実験が１回であったこと、あるいは得られた有効なＩＣ５０値が１つのみであったことを意味する。
【０３７０】
【表１０】
2018522562.tif 000012
【０３７１】
ＤＣ活性化についてのマーカーとしてＩＬ−１２ｐ４０分泌を用い、抗体の、樹状細胞活性化阻害能を評価した。抗体は、０．０２〜０．４９ｎＭの範囲のＩＣ５０値でＪｕｒｋａｔ細胞により提供される内因性ＣＤ１５４により誘導されるＤＣ活性化を阻害した。表１１は、アッセイにおける、スクリーニングされた抗体のＩＣ５０値を示す。表中、ＩＣ５０範囲は、２〜４名の提供者に対し、１〜６回繰り返した別個の実験から得られたＩＣ５０値のうち最低値と最高値を表す。
【０３７２】
【表１１】
2018522562.tif 000013
【０３７３】
Ｂ細胞の増殖をリードアウトとして用い、かかる抗体のヒト又はカニクイザルＢ細胞活性化に対する阻害能を測定した。内因性ＣＤ１５４（Ｄ１．１  Ｊｕｒｋａｔ細胞）及び組換ヒトＣＤ１５４三量体（ｓｈＣＤ１５４−ＩＬＺ）の両方を阻害した抗体では、０．０１〜５．３５ｎＭの範囲のＩＣ５０値で増殖が誘導された。表１２は、ヒト又はカニクイザルＢ細胞活性化アッセイにおいて得られた様々な抗体についてのＩＣ５０値を示す。表中、ＩＣ５０範囲は、２〜４名の提供者に対し、１〜６回繰り返した別個の実験から得られたＩＣ５０値のうち最低値と最高値を表す。表中、単一のＩＣ５０値は、得られた有効なＩＣ５０値が１つであったことを意味する。
【０３７４】
【表１２】
2018522562.tif 000014
【０３７５】
実施例５．移植後改変リスクを最小限に抑えるための抗体エンジニアリング
抗体Ｃ４ＬＢ８９のＶＬは、ＬＣＤＲ２に推定脱アミノ化部位を含んでいた（軽鎖Ｃ４ＬＬ４９中Ｎ５２〜Ｓ５３，配列番号６６）。ＶＬ中各位置（Ｎ５２Ｓ及びＳ５３Ｔ）に対する置換は別個に行った。変異した軽鎖を親重鎖Ｃ４ＬＨ１６５（配列番号５９）と同時発現させて、抗体Ｃ４ＬＢ２３５及びＣ４ＬＢ２３６をＩｇＧ２σ／κとして作製した。ＬＣＤＲ２、並びにＣ４ＬＢ２３５及びＣ４ＬＢ２３６のＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ表１３及び表１４に示す。Ｃ４ＬＢ２３５は、配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ、配列番号３７、４９、及び５２のＬＣＤＲ、配列番号５９のＶＨ、並びに配列番号７２のＶＬを含む。Ｃ４ＬＢ２３６は、配列番号１７、２３、及び３０のＨＣＤＲ、配列番号３７、５０、及び５２のＬＣＤＲ、配列番号５９のＶＨ、並びに配列番号７３のＶＬを含む。
【０３７６】
【表１３】
2018522562.tif 000015
【０３７７】
【表１４】
2018522562.tif 000016
【０３７８】
両方の抗体を、カニクイザルＢ細胞の増殖に対する阻害能について試験した。Ｃ４ＬＢ２３５はＣ４ＬＢ８９と同様の力価を示したのに対し、Ｃ４ＬＢ２３６は、Ｃ４ＬＢ８９と比較して力価の低減を示した。
【０３７９】
実施例６．エフェクター機能を欠失させた抗ＣＤ１５４抗体は血小板活性化を誘導しない
抗ＣＤ１５４抗体は、臨床における自己免疫疾患患者においてポジティブな結果伴い開発されてきたものの、血栓塞栓症（ＴＥ）が随伴することより、かかる抗体の更なる臨床開発は中断された。ヒト化５ｃ８抗体（ＩｇＧ１／κ）は、臨床的に誘導されたＴＥにおける抗ＣＤ１５４抗体である（Ｙａｚｄａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ  １３：３７７〜３８０，２００４）。ヒト化５ｃ８により介在される血栓塞栓症（ＴＥ）は、Ｆｃを血小板ＦｃγＲＩＩａ受容体に結合させることにより血小板を架橋するハイオーダーでの抗ＣＤ１５４／ＣＤ１５４免疫複合体（ＩＣ）の形成による血小板活性化及び凝集の結果として生じることが仮定される。インビトロでは、ＦｃγＲＩＩａ受容体結合能を欠いている機能欠失Ｆｃ（ＩｇＧ１中Ｄ２６５Ａ置換）を有するよう設計した５ｃ８抗体は血小板を活性化させなかった（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９２：４０８３〜４０９２，２０１４）。
【０３８０】
少なくともＦｃγＲＩＩａに対する結合能が破壊されており、エフェクター機能が低下している抗ＣＤ１５４抗体は、したがって、ＴＥのリスクを低減させた治療法としてより好適であり得る。
【０３８１】
最終的に、様々なＦｃ置換によりエフェクター機能を欠失させた抗ＣＤ１５４抗体を作製し、血小板活性化に対するその効果を試験した。
【０３８２】
ヒト化５ｃ８抗体ＶＨ及びＶＬ（Ｋａｒｐｕｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：３２１〜３２９，２００１）を、ＩｇＧ１σ／κ、ＩｇＧ１σＹＴＥ／κ、ＩｇＧ２σ／κ、又はＩｇＧ２σＹＴＥ／κとしてクローン化し、血小板活性化におけるＦｃの効果を評価した；得られた抗体は５ｃ８ＩｇＧ１σ、５ｃ８ＩｇＧ１σＹＴＥ、５ｃ８ＩｇＧ２σ、及び５ｃ８ＩｇＧ２σＹＴＥ）と命名した。ＩｇＧ１σは、野生型ＩｇＧ１と比較して置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む。ＩｇＧ１σＹＴＥは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ  Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓという置換を含む。ＩｇＧ２σは、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓという置換を含む。ＩｇＧ２σＹＴＥは、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓという置換を含む。残基付番はＥＵインデックスに準拠する。ＩｇＧ２σ骨格を有する抗体は、米国特許第８，９６１，９６７号に記載のとおりエフェクター機能及びＦｃγＲに対する結合能を欠失している。ＹＴＥ置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４、Ｔ２５６Ｅ）はＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２３５１４〜２４，２００６に記載されている。
【０３８３】
それぞれ配列番号７４及び７５におけるヒト化５ｃ８のＶＨドメイン及びＶＬドメインを示す。
【０３８４】
配列番号７４
ｑｖｑｌｖｑｓｇａｅｖｖｋｐｇａｓｖｋｌｓｃｋａｓｇｙｉｆｔｓｙｙｍｙｗｖｋｑａｐｇｑｇｌｅｗｉｇｅｉｎｐｓｎｇｄｔｎｆｎｅｋｆｋｓｋａｔｌｔｖｄｋｓａｓｔａｙｍｅｌｓｓｌｒｓｅｄｔａｖｙｙｃｔｒｓｄｇｒｎｄｍｄｓｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ
【０３８５】
配列番号７５
ｄｉｖｌｔｑｓｐａｔｌｓｖｓｐｇｅｒａｔｉｓｃｒａｓｑｒｖｓｓｓｔｙｓｙｍｈｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｌｌｉｋｙａｓｎｌｅｓｇｖｐａｒｆｓｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｓｓｖｅｐｅｄｆａｔｙｙｃｑｈｓｗｅｉｐｐｔｆｇｇｇｔｋｌｅｉｋ
【０３８６】
血小板活性化における効果について、５ｃ８ＩｇＧ１σ、５ｃ８ＩｇＧ１σＹＴＥ、５ｃ８ＩｇＧ２σ、及び５ｃ８ＩｇＧ２σＹＴＥを試験した。
【０３８７】
ｓｈＣＤ１５４単独に対する応答性の低さについて予めスクリーニングした健常なヒト提供者由来の血液を使用した。血小板の活性化は、有効性が確認されている血小板活性化マーカーＰＡＣ−１（活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）及びＣＤ６２ｐ（Ｐ−セレクチン）を用い、フローサイトメトリーにより評価した。簡潔に言うと、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有させた改変タイロード−ＨＥＰＥＳ緩衝液に全血（ＷＢ）を添加した。抗ＰＡＣ１及び抗ＣＤ６２ｐ抗体にＦｃγＲＩＩａブロッキング抗体（クローンＩＶ．３，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃６００１２）を合わせて、又は合わせずに、かかる混合物に添加し、２５分間インキュベートした。ＣＤ１５４：抗ＣＤ１５４のモル比を３：１で予め形成させた、可溶性ＣＤ１５４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，カタログ番号３１０〜０２；配列番号４又はＴｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２１〜７０８８）／抗体の免疫複合体をかかる混合物に加え、さらに２０分間インキュベートした。血小板を１％ホルマリンで固定した後、ＦＡＣＳ解析を行った。各条件についての血小板活性化を、ＰＡＣ−１及びＣＤ６２ｐを発現しているとしてゲーティングされた血小板の割合（％）（ＣＤ６１陽性イベント）として評価した。５０００  ＣＤ６１を発現しているイベント（血小板）を捕捉し、各処理条件について解析した。実験結果を図１に示す。ＣＤ１５４／５ｃ８ＩｇＧ１（野生型ＩｇＧ１）ＩＣは血小板を活性化させたのに対し、５ｃ８−ＩｇＧ１σ、５ｃ８ＩｇＧ１σＹＴＥ、５ｃ８ＩｇＧ２σ、及び５ｃ８ＩｇＧ２σ−ＹＴＥを有するＣＤ１５４  ＩＣは血小板を活性化させなかった。ＡＤＰによる血小板活性化は、免疫複合体により阻害されなかった（データ非掲載）。単独で血小板を活性化させた抗体はなかった（データ非掲載）。
【０３８８】
抗ＣＤ１５４抗体のＣ４ＬＢ５、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ９４、Ｃ４ＬＢ１５０、Ｃ４ＬＢ１８９、Ｃ４ＬＢ１９１、Ｃ４ＬＢ１９９（全てのＩｇＧ２σはエフェクターを欠失しているｍＡｂである）を血小板活性化アッセイでも試験して、かかる抗体ではＦｃγＲＩＩａに対する結合能が破壊されていること、並びに血小板を活性化しなかったことを確認した。図２は、Ｃ４ＬＢ５、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ１５０、Ｃ４ＬＢ１８９、Ｃ４ＬＢ１９１、又はＣ４ＬＢ１９９と複合体を形成しているＣＤ１５４の免疫複合体は血小板を活性化できないことを実証する実験結果を示す。ＣＤ１５４／Ｃ４ＬＢ９４  ＩＣは血小板に対しＰＡＣ−１を誘導した。結果は、概して、ＩｇＧ１σ、ＩｇＧ１σＹＴＥ、ＩｇＧ２σ、又はＩｇＧ２σＹＴＥアイソタイプを有する抗ＣＤ１５４抗体が、血小板を活性化し得ないこと、ひいては野生型ＩｇＧ１をもつ抗体よりも安全性プロファイルが改善されていることを実証する。
【０３８９】
実施例７：アイソタイプのスイッチングが抗体特性に及ぼす効果
抗体Ｃ４ＬＢ８９の可変領域を、ＩｇＧ１σ／及びＩｇＧ１σＹＴＥアイソタイプとしてクローン化して、機能性及び開発有効性（developability）における潜在的な差異を評価した。新しい抗体をＣ４ＬＢ２３１（ＩｇＧ１σ）及びＣ４ＬＢ２３２（ＩｇＧ１σＹＴＥ）と命名した。
【０３９０】
得られるＩｇＧ１σ及びＩｇＧ１σＹＴＥ抗体をそれらの機能性について親抗体と比較した。Ｃ４ＬＢ２３１及びＣ４ＬＢ２３２の機能は親Ｃ４ＬＢ８９と同等であった。表１５は、表中に示すとおりの機能性アッセイにおける各抗体のＩＣ５０値又はＩＣ５０値範囲を示す。表中、ＩＣ５０範囲は、２〜４名の提供者に対し、１〜６回繰り返した実験から得られたＩＣ５０値のうち最低値と最高値を表す。表中、単一のＩＣ５０値は、得られた有効なＩＣ５０値が１つであったことを意味する。
【０３９１】
【表１５】
2018522562.tif 000017
【０３９２】
Ｃ４ＬＢ２３１及びＣ４ＬＢ２３２についても血小板に対するそれらの効果を試験した。ｓｈＣＤ１５４：Ｃ４ＬＢ２３１又はｓｈＣＤ１５４：Ｃ４ＬＢ２３２  ＩＣのいずれも、ベースラインを超えて血小板を活性化しない。ＣＤ１５４／５ｃ８ＩｇＧ１  ＩＣは血小板を活性化し、この活性化はＩＶ．３の存在下では阻害されたことから、血小板活性化はＩＣのＦｃγＲＩＩａに対する結合により介在されることが実証された。図３は実験結果を示す。
【０３９３】
実施例８．抗ＣＤ１５４抗体は高親和性でヒトＣＤ１５４に結合する
ＰｒｏｔｅＯｎを用い、実施例１に記載のとおり親和性測定を行った。会合速度（on-rate）、解離速度（off-rate）及び親和性を表１６に示す。この表中に報告したパラメーターは、２相結合モデルを適用したＣ４ＬＢ９４及びＣ４ＬＢ１５０を除き全てのサンプルについてラングミュア型の１：１結合モデルにより得られた。
【０３９４】
【表１６】
2018522562.tif 000018
【０３９５】
実施例９．マーモセットＣＤ１５４とＣ４ＬＢ８９との複合体の結晶構造
Ｘ線結晶構造解析を用い、抗体Ｃ４ＬＢ８９のエピトープを同定した。Ｈｉｓタグを付与したＣ４ＬＢ８９のＦａｂ断片と、Ｈｉｓタグを付与した可溶型のマーモセットＣＤ４０Ｌ（ｓｍＣＤ１５４−ｈｉｓ）とをＨＥＫ２９３  ＧｎＴＩ細胞で発現させて、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを用い精製した。ｓｍＣＤ１５４：Ｃ４ＬＢ８９複合体を４℃で終夜インキュベートし、濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて複合体を形成していない分析種から分離した。１６％  ＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍ  クエン酸アンモニウム、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を含む溶液から蒸気拡散法によりこの複合体を結晶化した。この結晶は１６２．１Åの単位格子乗数で立方晶系空間群Ｐ２１３に属する。複合体の構造は、検索モデルとしてＣ４ＬＢ８９  Ｆａｂ及びＣＤ４０Ｌ（ＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １ＡＬＹ）の結晶構造を用いる分子置換モデルにより決定した。
【０３９６】
ｓｍＣＤ１５４：Ｃ４ＬＢ８９複合体は、結晶学的な３回軸に位置する、対称性の三量体である。Ｃ４ＬＢ８９は、細胞表面からの末端の２つのサブユニットとの接触面でｍＣＤ１５４に結合する。エピトープは、２つのＣＤ１５４サブユニットのそれぞれから８残基ずつ、１６残基を含む。エピトープの残基は、第１のＣＤ１５４サブユニットにおいてＥ１８２、Ｓ１８５、Ｑ１８６、Ａ１８７、Ｐ１８８、Ｓ２１４、Ａ２１５、及びＲ２０７と、第２のＣＤ１５４サブユニットにおいてＴ１７６、Ｆ１７７、Ｃ１７８、Ｑ２２０、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｇ２５０、及びＦ２５３と、を含む。エピトープの残基付番は配列番号１の完全長のヒトＣＤ１５４に準拠する。パラトープは、ＣＤ１５４残基から４Å以内の抗体残基として定義した。Ｃ４ＬＢ８９の抗原結合部位は、Ｃ４ＬＢ８９の重鎖のうち９残基：ＨＣＤＲ１からＳ３１、及びＹ３２と、ＨＣＤＲ２からＳ５２、Ｉ５４、Ｆ５５、及びＮ５７と、ＨＣＤＲ３からＲ１００、Ｙ１０１、及びＹ１０２と、を含む。パラトープの残基付番は、配列番号５９のＣ４ＬＢ８９  ＶＨに準拠する。軽鎖はｍＣＤ１５４との接触には関与しない。接触数から、ＨＣＤＲ２におけるＦ５５は重要な抗原認識要素である。Ｆ５５は、ＣＤ１５４残基Ｔ１７６、Ｆ１７７、Ｃ１７８、Ｑ２２０、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｇ２５０、及びＦ２５３を接触させる。ＨＣＤＲ３残基Ｙ１０１及びＹ１０２も結合に関与する。図４はＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の接触残基と、ＬＣのＣＤ１５４に対する結合能の欠失とを示す。図５は、エピトープ及びパラトープの残基についてカトゥーンを示す。
【０３９７】
ヒト及びマーモセットの可溶性ＣＤ１５４タンパク質間の違いは、アミノ酸にしてわずか８残基であった。全てのｍＣＤ１５４  Ｃ４ＬＢ８９エピトープ残基はヒトにおいて保存されている。したがって、エピトープはマーモセット及びヒトのＣＤ１５４間で保存されていることが期待される。ヒト及びマーモセットの完全長のＣＤ１５４タンパク質のアラインメントを図６に示す。
【０３９８】
実施例１０．抗ＣＤ１５４抗体による血小板活性化はエピトープに依存する
Ｃ４ＬＢ８９可変領域（配列番号５９のＶＨ及び配列番号６６のＶＬ）をＩｇＧ１／κとしてクローン化し、Ｃ４ＬＢ２３７抗体を得た。実施例１に記載のとおりにＰｒｏｔｅＯｎを用いて測定したとき、Ｃ４ＬＢ２３７はヒトＣＤ１５４（表１７）結合能を保持していることが確認された。Ｃ４ＬＢ２３７のヒトＣＤ１５４に対する親和性は２３．６±５．４ｐＭであった。ＩｇＧ２σ由来のＣ４ＬＢ８９から誘導されるＶＨ／ＶＬのアイソタイプのＩｇＧ１へのスイッチは、得られた抗体の結合親和性を変えるようである。
【０３９９】
期待されたとおり、Ｃ４ＬＢ２３７はヒトＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａに対し、それぞれＫＤ０．９９４μＭ及び０．１４６μＭで結合した。Ｃ４ＬＢ２３７は、ＮＦ−κＢ  ＳＥＡＰレポーター遺伝子アッセイにおいて、ｓｈＣＤ１５４−ｈｉｓを使用してシグナル伝達を誘導した場合に、Ｃ４ＬＢ２３１と同等の力価を示し、かつＣ４ＬＢ８９を上回る力価を示した（表１８）。
【０４００】
Ｃ４ＬＢ２３７を血小板活性化に対する効果について試験した。図７に示すとおり、ｓｈＣＤ１５４：Ｃ４ＬＢ２３７  ＩＣはベースラインを超えて血小板を活性化しなかった。この結果から、Ｆｃに加えて抗体のエピトープが抗体の血小板活性化能の有無に関係することが示唆された。
【０４０１】
【表１７】
2018522562.tif 000019
【０４０２】
【表１８】
2018522562.tif 000020
【０４０３】
実施例１１．Ｃ４ＬＢ８９における中立変異の設計
ＣＤ１５４と複合体を形成しているＣ４ＬＢ８９の結晶構造解析により、Ｃ４ＬＢ８９のＣＤＲにおける、複合体の全体構造に影響を及ぼさずに変異を導入可能であり、ひいてはＣ４ＬＢ８９抗体の特性に影響しないことが予想される部分が明らかとなった。軽鎖ＣＤＲにおけるこれらの中立変異を表１９に掲載し、重鎖ＣＤＲについては表２０に掲載する。変異を導入可能な残基付番を、各ＣＤＲ及びＶＬ又はＶＨの両方に対し示す。例えば、配列番号３７のＬＣＤＲ１上の残基Ｑ４（ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ）は、抗体の特性を実質的に変化させずにＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへと変異誘導可能である。配列番号６６のＶＬにおける対応する残基はＱ２７である。
【０４０４】
表１９又は表２０に示す変異は、標準法を用い、単一のものとして、あるいは組み合わせてＣ４ＬＢ８９に対しなすことができる。得られるＶＨ／ＶＬ対を、本明細書に記載の方法を用いて発現させ、変異を導入した抗体を単離し、特性評価する。
【０４０５】
【表１９】
2018522562.tif 000021
【０４０６】
【表２０】
2018522562.tif 000022
【０４０７】
実施例１２．血小板活性化及びよりハイオーダーの免疫複合体形成の評価
Ｆａｂ領域と、Ｃ４ＬＢ２３１及び５Ｃ８ＩｇＧ１のｓｈＣＤ１５４との結晶構造データの評価、ＳＣ−ＨＰＬＣ及びＤＬＳによる上記の実験、並びに血小板活性化データのレビューに関する評価をもとに、抗ＣＤ１５４抗体とｓｈＣＤ１５４三量体との結合におけるわずかな差が、ハイオーダーの免疫複合体形成を促進し得るとの仮説を立てた。１）Ｃ４ＬＢ２３１  Ｆａｂは、ｓＣＤ１５４三量体の２つのサブユニット間に結合する一方で、５Ｃ８  Ｆａｂは、ｓＣＤ１５４の１つのサブユニットに結合する。２）Ｃ４ＬＢ２３１  Ｆａｂは、５ｃ８  Ｆａｂと比較して、立体構造がより安定であり、かつ３）抗ＣＤ１５４抗体とのｓＣＤ１５４結合角度がより安定なようである。
【０４０８】
抗体のエピトープの介在する血小板活性化の役割、及びハイオーダーでのｓｈＣＤ１５４との免疫複合体形成をさらに評価する目的で、様々な抗ＣＤ１５４抗体のＶＨ及びＶＬをクローン化し、Ｆｃの機能を欠失させたＩｇＧ２σ及びＩｇＧ１σアイソタイプとして、又はＩｇＧ１として発現させた。作製された抗体を表２１に示す。実施例６に記載のとおりに血小板活性化アッセイを行った。サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）による、よりハイオーダーでの免疫複合体形成についての評価にあたり、モル濃度比１：１（あるいは１０：１０とも表記可能）及び１０：１で抗体をｓｈＣＤ１５４と複合体化させて、免疫複合体形成における濃度依存性の差異が存在するかを評価した。
【０４０９】
【表２１】
2018522562.tif 000023
【０４１０】
配列番号８４  Ｃ４ＬＢ１１９のＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＹＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＤＰＹＦＧＹＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＬＮＹＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０４１１】
配列番号８５  Ｃ４ＬＢ１１９のＶＬ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０４１２】
配列番号８６  Ｃ４ＬＢ８３のＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＩＰＩＦＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＦＲＧＹＴＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０４１３】
配列番号８７  Ｃ４ＬＢ８３のＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＮＮＷＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＦＳＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０４１４】
実施例１に記載のプロトコルを用いて、Ｃ４ＬＢ８３及びＣ４ＬＢ１１９の結合特性と機能性を評価し、表２２に示す。
【０４１５】
【表２２】
2018522562.tif 000024
【０４１６】
方法
ＳＥ−ＨＰＬＣ
表２１に示す抗体と、Ａｌｅｘａｆｌｕｏ−４４８標識ｓｈＣＤ１５４との免疫複合体を、１１０μＬの１ｘＰＢＳで、抗体：ｓｈＣＤ１５４のモル比を１：１及び１０：１で調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。各測定にあたり、５μｇのＡＦ４８８標識ｓｈＣＤ１５４と、１５μｇ（１：１比）又は１５０μｇ（１０：１比）の抗ＣＤ１５４ｍＡｂとを含有する１００μＬの各サンプルをカラムに注入した（Ａｇｉｌｅｎｔ，１１００／１２００システム）。標準の保持時間をもとに分子量を計算した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。タンパク質の分子量と保持時間との関係は次式を満たす。
ｌｏｇ（Ｍ）＝ｂ−ｃＴ，
式中、Ｍは分子量であり、Ｔは保持時間であり、かつｂ及びｃは定数である。ｌｏｇ（Ｍ）及びＴの線形曲線（linear curve）は、Ｒ２＝０．９９２８とした最小二乗法により標準ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムから得た。
【０４１７】
ＤＬＳ
ＤＬＳ測定は、光散乱の原理と、分子運動又はブラウン運動とに基づくものである。ブラウン運動、典型的には、溶液中の分子挙動は、相の内外の両方で光散乱を招き、建設的干渉及び破壊的干渉を生じる。その結果が、時間に伴う散乱光の強度の変動である。ＤＬＳ又はＱＥＬＳ（順弾性光散乱）解析中、散乱光強度におけるこの時間依存性の変動は高速光子カウンターにより捕捉される。この変動は、分散速度に正比例する。ストークス・アインシュタインの式を用いた相関データの分析により、流体力学的半径を得た。サンプルの分析により単量体及び二量体を識別可能なＳＥＣ−ＭＡＬＳ又はＳＥＣとは異なり、ＤＬＳは約４のサイズファクター（size factor）により分類される分析種の分析のみが可能であり、したがって、単量体及び四量体が分析されはじめる。しかしながら、単量体と二量体とは識別されず、混合物の重量平均が報告されることになる。
【０４１８】
ストークス・アインシュタインの式：Ｒｈ＝ｋＴ／６πηＤ；式中、
Ｄ＝拡散係数、
ｋ＝ボルツマン定数
Ｔ＝温度
η＝粘度
【０４１９】
１０μＭの抗体単独、又は表２１に示す抗体とｓｈＣＤ１５４との免疫複合体、及び、抗体：ｓｈＣＤ１５４（１０μＭ抗体と１μＭ又は１０μＭ  ｓｈＣＤ１５４のいずれか）のモル濃度１０：１又は１０：１０でＰＢＳで調製した。全てのサンプルは、バイアルインサート（ポリマーフィートを施した２５０μＬの不活性化ガラス，Ａｇｉｌｅｎｔカタログ番号５１８１〜８８７２）を入れたガラスバイアルで調製し、ＰＢＳ、ｍＡｂ、ｓｈＣＤ１５４の順でサンプルを加えた。サンプルを穏やかにボルテックスにかけて混合した後、ｒｏｃｋｉｎｇ（Ｎｕｔａｔｉｎｇ  Ｍｉｘｅｒ（ＶＷＲ）約３０ｒｅｖ／ｍｉｎで室温で２３時間インキュベートした。必要な場合、標準法を用い最初に抗体を濃縮した。
【０４２０】
２３℃にてＤｙｎａＰｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＤＬＳ機器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し、全てのサンプルにおいて粒子径及び分析種分布（species distribution）を求めた。まずはＢＳＡを用いＤＬＳの一貫性を確認した（データ非掲載）。３重測定のため、３つのウェルのそれぞれに３０μＬのサンプルを入れ測定を行った。ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーでＤＬＳ測定値を取得した。各サンプルに対し２５秒間のデータ取得を行った。レーザーの出力は装置により自動的に調節した。データ解析に使用するパラメーターには、ＰＢＳの粘度は、２３℃下では１．０１９ｃＰであるというものと、ＰＢＳの屈折率は５８９ｎｍ、かつ２３℃下では１．３３３であるというものを含めた。プログラムには球状タンパク質モデルを使用した。シグナルを各ピークに割り当てた。ここで、ピーク１は０．１〜１０ｎｍ、ピーク２は１０〜１００ｎｍ、ピーク３は１００〜１０００ｎｍ、及びピーク４は１０００〜５０００ｎｍであった。サンプル中に沈殿物（形成される場合）が視認される場合、それについて記録した。Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いデータ解析を行った。質量％の分析種半径（Ｒｈ）に対するプロットを作製した。ピーク半径、多分散性、質量％、及び％強度を計算し、記録した。
【０４２１】
結果
血小板活性化
ｓｈＣＤ１５４と、Ｆｃを欠失させたＩｇＧ２σ若しくはＩｇＧ１σとして、又は野生型ＩｇＧ１として発現させた抗体との免疫複合体による血小板活性化能を評価した。様々なＩｇＧ足場に対しクローン化した５ｃ８抗体を対照として使用した。図３は、抗ＦｃγＲＩＩａ抗体が５ｃ８ＩｇＧ１介在性の血小板活性化を阻害したことから、５ｃ８ＩｇＧ１：ｓｈＣＤ１５４免疫複合体がＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化したことを示す。エフェクターを欠失させたＦｃ、ＩｇＧ１σ、又はＩｇＧ２σでクローン化した５ｃ８  ＶＨ／ＶＬ領域は、それらの血小板活性化能を失っていた（図１）。これらの結果は、これまでに記載した内容と一致している。しかしながら、予想外にも、実施例１０で実施した実験により、野生型ＩｇＧ１抗体との免疫複合体（Ｃ４ＬＢＢ２３７：ｓｈＣＤ１５４）は血小板（図７）を活性化しないことが示され、可能性のある、エピトープに依存性の血小板活性化に研究をさらに進めた。
【０４２２】
エピトープ及び／又はＦｃが血小板活性化並びにハイオーダーでの免疫複合体の形成に対し及ぼす効果を評価することを目的として、４個の別個の抗体のＶＨ／ＶＬ領域をＩｇＧ２σ、ＩｇＧ１σ、又は野生型ＩｇＧ１としてクローン化した。これまでに文献において開示されていることとは反対に、いくつかの場合では、血小板の活性化はＦｃγＲＩＩａ介在性の架橋とは独立して抗体のエピトープにより介在されることが判明した。
【０４２３】
図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃに分析の要約を示す。抗ＦｃγＲＩＩａ抗体により予めブロッキングすると血小板活性化の阻害が生じないことから、Ｆｃ機能を欠失させた抗体Ｃ４ＬＢ１１９（図８Ａ）及びＣ４ＬＢ９４（図８Ｂ）の免疫複合体は、ＦｃγＲＩＩａに依存した方法で血小板を活性化した。同様にしてＦｃ機能を欠失させた抗体Ｃ４ＬＢ８３のＩＣは、血小板をわずかに活性化した（図８Ｃ）。野生型ＩｇＧ１でクローン化したものと同じＶＨ／ＶＬドメインを有する抗体のＩＣは、各場合でＦｃγＲＩＩａ介在性の方法で血小板を活性化した（図８Ａ中Ｃ４ＬＢ２７８、図８Ｂ中Ｃ４ＬＢ２８９、及び図８Ｃ中Ｃ４ＬＢ２８８）。したがって、機能を欠失させたＦｃを有しているのにもかかわらず血小板の活性化を介在したいくつかの抗体が特定された。１つのＶＨ／ＶＬドメイン対は、機能を欠失させたＩｇＧ１（Ｃ４ＬＢ２３１）又は野生型ＩｇＧ１（Ｃ４ＬＢ２３７）のいずれでも血小板の活性化を介在しなかったことが特定された。これらのデータは、抗体のエピトープが、血小板凝集の介在において役割を果たすことを示す。
【０４２４】
よりハイオーダーの免疫複合体形成
ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＤＬＳを使用して、ハイオーダーの免疫複合体の形成の存在、並びにこれらの、表２１に示す抗ＣＤ１５４抗体とｓｈＣＤ１５４との免疫複合体の適切な大きさと、をさらに評価した。ｓｈＣＤ１５４は溶液中で三量体であることから、溶液中の抗体：ｓｈＣＤ１５４三量体に見込まれる化学量論は３：１である。カラムから溶出不能であり、低収率（％）が確認されている非常に大きい免疫複合体とを例外として、ＳＥ−ＨＰＬＣに関しては、免疫複合体が重くなるほど、ひいては大きくなるほど保持時間が短くなる一方で、免疫複合体が軽くなるほど、ひいては小さくなるほど保持時間が長くなる。ＤＬＳの場合、半径（Ｒｈ）値が大きくなるほど免疫複合体が大きくなる。プレートＤＬＳ法では、ＩｇＧ単量体、二量体、三量体、及び四量体を識別できない。したがって、得られるＲｈ値は単量体−三量体の重量平均となり、Ｒｈ値が６．５に近くなるほど、ｍＡｂ溶液がハイオーダーの分析種を、典型的には二量体を含有していることを表し得る。ｍＡｂのｓｈＣＤ１５４に対する結合が化学量論的なものである場合、２種類の分析種は、３：１複合体（約５００ｋＤａ）と、未結合の抗体（約１５０ｋＤａ）とで表されることになり、この場合、約８．８ｎｍ及び５〜６．５ｎｍのＲｈ値がそれぞれ３：１複合体及び未結合のｍＡｂに相当する。いずれの技法でも、免疫複合体の分子量を正確に分類できないものの、相対的な大きさでの分類も可能である。表２３は、保持時間及び流体力学的半径とおよその分子量との関係を示す。
【０４２５】
【表２３】
2018522562.tif 000025
【０４２６】
ＤＬＳ
ＣＤ１５４を含まないｍＡｂ、及び抗体：ｓｈＣＤ１５４免疫複合体の大きさを、抗体（１０：１モル比）過剰、及び等濃度（１：１モル比）で抗体：ｓｈＣＤ１５４複合体が形成される条件下で評価した。抗体が過剰な条件下では、抗体は、典型的には、ＣＤ１５４部位飽和させて免疫複合体を形成し、未結合の過剰な抗体が存在する。等濃度下では、未結合の抗体又は未結合のｓｈＣＤ１５４は存在しない。ｓｈＣＤ１５４の非存在下、及びモル濃度比１０：１及び１０：１０でのｓｈＣＤ１５４の存在下で、各ｍＡｂについて得られたＲｈ値を表２４に示す。
【０４２７】
公称分子量１５０ｋＤａの典型的なｍＡｂでは、５．０〜６．５ｎｍのＲｈ値が得られる。多くの場合、サイズ排除クロマトグラフィー中に見られるＩｇＧ二量体は、プレートＤＬＳ法では分離できない。得られるＲｈ値は単量体−三量体の重量平均となり、Ｒｈ値が６．５に近くなるほど、ｍＡｂ溶液がハイオーダーで抗体分子種を、典型的には二量体を含有していることを表し得る。
【０４２８】
ＣＤ１５４の存在しないｍＡｂに関しては、Ｒｈ値がそれぞれ６．９ｎｍ及び７．１ｎｍであったＣ４ＬＢ２８７及びＣ４ＬＢ２３４を除く全てのｍＡｂで、５．５〜６．３ｎｍの見込みＲｈ値が観察されたことから、これらの抗体が元々の凝集傾向を有していることが示された。
【０４２９】
１０：１比で形成された抗体：ｓｈＣＤ１５４複合体のＲｈ値は概して約８．８ｎｍ未満であり、ハイオーダーの免疫複合体が形成されたことを示す５ｃ８ＩｇＧ２σ（Ｃ４ＬＢ７１）及びＣ４ＬＢ２３４（Ｒｈ値はそれぞれ８．９及び９．３ｎｍ）を除き、化学量論比３：１の複合体ではハイオーダーの免疫複合体の形成はなかったことが示唆される。
【０４３０】
ｓｈＣＤ１５４濃度を１０μＭに上昇させると、１μＭ  ＣＤ１５４（１０：１の抗体：ＣＤ１５４比）との複合体と比較して抗体：ｓｈＣＤ１５４免疫複合体のＲｈは高くなった。抗体：ｓｈＣＤ１５４複合体の一部では、高分子量を有する第２の分析種が全質量の７〜２５％の範囲で存在することが実証された。Ｃ４ＬＢ７１、５Ｃ８ＩｇＧ１、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ１１９、Ｃ４ＬＢ９４、Ｃ４ＬＢ２３４、及びＣ４ＬＢ２８９のＩＣ  Ｒｈ値は、それぞれ、２２．１、６１５、５６．３、４５．０、１８．３、１８．７、及び１９．６ｎｍであった。さらに、Ｃ４ＬＢ８９、Ｃ４ＬＢ１１９、Ｃ４ＬＢ８３、Ｃ４ＬＢ２２８も９００〜４０００ｎｍの分析種を形成し、Ｃ４ＬＢ８９及びＣ４ＬＢ１１９は、非常に大型の免疫複合体を示す沈殿物を形成した。Ｒｈ１２ｎｍ付近の分析種は、典型的には約１，０００ｋＤａの質量に相当するため、これらのｍＡｂは、これらの条件下ではＣＤ１５４と非常に大型の免疫複合体を形成する。
【０４３１】
【表２４】
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【０４３２】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
表２５は、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析により得られた、抗ＣＤ１５４抗体単独、及びｓｈＣＤ１５４との免疫複合体の保持時間、回収率、及び推定分子量（ＭＷ）を示す。典型的な抗体は、約１５０ｋＤのＭＷを有し、ｓｈＣＤ１５４三量体は約５０ｋＤａのＭＷを有する。したがって、化学量論比が３：１であるｍＡｂ：ｓｈＣＤ１５４三量体複合体の有する推定分子量は約５００ｋＤａである。
【０４３３】
【表２５】
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【０４３４】
全ての抗体はｓｈＣＤ１５４と免疫複合体を形成した。Ｃ４ＬＢ２３１、Ｃ４ＬＢ２３７、Ｃ４ＬＢ２９０、Ｃ４ＬＢ２８７（全てのＩｇＧ１σ）は、ｓＣＤ１５４と免疫複合体を形成し、７．０分の時点で溶出したものの、Ｃ４ＬＢ２９０及びＣ４ＬＢ２８７の収率（％）は、１：１条件下では１０：１条件下と比較して低かったのに対し、Ｃ４ＬＢ２３１及びＣ４ＬＢ２３７では収率が高かった（８０％超）。Ｃ４ＬＢ２８９（ＩｇＧ１）、Ｃ４ＬＢ２３４（ＩｇＧ１σ）、５ｃ８ＩｇＧ１σ（Ｃ４ＬＢ７１）、及びＣ４ＬＢＢ９４（ＩｇＧ２σ）は、６．２〜６．５分とより早い時点で溶出したことから、前述のｍＡｂよりも大型の複合体が形成されていたことが示唆される。５ｃ８ＩｇＧ１は、３：１のｍＡｂ：ｓｈＣＤ１５４三量体免疫複合体に見込まれる保持時間でブロードのピークを有していたものの、ブロードのピーク及び低収率（１：１条件下で５６％）により、カラムと相互作用し得る、又はカラムに入らないよりハイオーダーの免疫複合体が形成されていた可能性があることが示唆された。Ｃ４ＬＢ８９及びＣ４ＬＢ１１９（いずれもＩｇＧ２σ）はｓｈＣＤ１５４と複合体を形成し、ブロードのピークでもって溶出し、収率は非常に低かった（１：１条件下で６〜１７％）。これはカラムに入らない大型の複合体が形成されたためである可能性がある。概して、ＩｇＧ２σアイソタイプの抗体は、ＩｇＧ１σ又はＩｇＧ１の抗体と比較して、より大型の免疫複合体を形成した。
【０４３５】
表２６は、抗体の特性評価の要約を示す。最終的に、血小板活性化データ、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＤＬＳデータ共に、血小板活性化は活性型Ｆｃによってのみ起因するものではないことを示唆する。かかるデータは、ＩｇＧ１σ及びＩｇＧ２σなどの機能を欠失したＦｃを有する抗体が、ｍＡｂとｓｈＣＤ１５４三量体が３：１の、予想される複合体よりも大型の免疫複合体を形成可能であること、並びにＦｃの機能を欠失している抗体のうちいくつかが血小板活性化能を有していることを示唆する。このデータにより、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、抗体が結合するエピトープ）と、ハイオーダーの免疫複合体形成の両方が血小板活性化に関与するという結論が裏付けられた。
【０４３６】
【表２６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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