(57)【要約】がんの免疫応答サブタイプはＤＮＡ損傷と関連しており、それによって免疫療法を含む特定の治療法に対象を層別化することが可能であり、これらの治療法は、ＤＮＡ損傷療法と組み合わせることができる。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測するための方法は、対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップ含む。決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性が予測される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性が予測される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）前記組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記組合せ試験スコアを前記閾値スコアと比較するステップと
を含み、前記組合せ試験スコアが前記閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）前記組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記組合せ試験スコアを前記閾値スコアと比較するステップと
、を含み、前記組合せ試験スコアが前記閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つ遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）前記組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記組合せ試験スコアを前記閾値スコアと比較するステップと
を含み、前記組合せ試験スコアが前記閾値スコアを上回る場合、効果的に治療することができるがんが特定される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）前記組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記組合せ試験スコアを前記閾値スコアと比較するステップと
を含み、前記組合せ試験スコアが前記閾値スコアを上回る場合、効果的に治療することができるがんが特定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
がんの治療を選択するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、前記がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を使用して、前記がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）を使用して、前記がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択されたアンタゴニスト及び／又はアゴニストを使用して前記がんを治療するステップをさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）前記組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記組合せ試験スコアを前記閾値スコアと比較するステップと
を含み、前記組合せ試験スコアが前記閾値スコアを上回る場合、使用するための、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが選択される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
がんの治療を選択するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、前記がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を使用して、前記がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、前記決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）を使用して、前記がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択されたアンタゴニスト及び／又はアゴニストをＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて使用して、前記がんを治療するステップをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）前記組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記組合せ試験スコアを前記閾値スコアと比較するステップと
を含み、前記組合せ試験スコアが前記閾値スコアを上回る場合、使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが選択される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組合せ試験スコア（又は「シグネチャースコア」）が、式：
【数１】
2018524990.tif 000097
によって導き出され、式中、ｗｉは、各遺伝子の重みであり、ｂｉは、遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは、前処理後の遺伝子発現であり、ｋは、オフセット定数である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
がんを治療する方法であって、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを対象に投与するステップを含み、前記対象に由来するサンプルが、投与の前に、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈することを特徴とする、方法。
【請求項３８】
がんを治療する方法であって、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストをＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて対象に投与するステップを含み、前記対象に由来するサンプルが、投与の前に、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈することを特徴とする、方法。
【請求項３９】
対象におけるがんの治療に使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストであって、前記アンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与の前に、前記対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈する、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニスト。
【請求項４０】
対象におけるがんの治療に使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストであって、前記アンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与の前に、前記対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈し、前記アンタゴニスト及び／又はアゴニストが、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて投与される、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニスト。
【請求項４１】
対象におけるがんの治療に使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又はＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた刺激性免疫チェックポイントのアゴニストであって、前記アンタゴニスト及び／又はアゴニスト並びにＤＮＡ損傷治療剤の投与の前に、前記対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈する、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又はＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた刺激性免疫チェックポイントのアゴニスト。
【請求項４２】
前記組合せ試験スコア（又は「シグネチャースコア」）が、式：
【数２】
2018524990.tif 000098
によって導き出され、式中、ｗｉは、各遺伝子の重みであり、ｂｉは、遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは、前処理後の遺伝子発現であり、ｋは、オフセット定数である、請求項３７若しくは３８に記載の方法、又は請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項４３】
前記組合せ試験スコアが、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、若しくは４２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項４４】
前記組合せ試験スコアが、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、４２、若しくは４３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト、
【請求項４５】
前記組合せ試験スコアが、表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、若しくは４２〜４４のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項４６】
前記組合せ試験スコアが、表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、若しくは４２〜４５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項４７】
前記組合せ試験スコアが、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、若しくは４２〜４６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項４８】
前記組合せ試験スコアが、表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、若しくは４２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項４９】
それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、請求項３７、３８、若しくは４２〜４８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５０】
前記組合せ試験スコアが、表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての決定された発現レベルから導き出される、請求項３７、３８、若しくは４２〜４９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５１】
前記発現レベルが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを使用して判定される、請求項３７、３８、若しくは４２〜５０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５２】
前記対象が、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法による治療のために選択される、請求項３７、３８、若しくは４２〜５１のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５１のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５３】
前記サンプルが、がん細胞を含む、請求項１〜３８若しくは４２〜５２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５４】
前記サンプルが、組織サンプルであり、任意選択で、前記組織サンプルが、固定包埋組織サンプルである、請求項１〜３８、若しくは４２〜５３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５３のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５５】
前記がんが、白血病、脳のがん、前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、咽喉がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、肺がん、肉腫、子宮頸がん、精巣がん、膀胱がん、内分泌がん、子宮内膜がん、食道がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵臓がん、下垂体がん、腎臓がん、又は頭頸部がんから選択される、請求項１〜３８若しくは４２〜５４のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５４のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５６】
前記阻害性免疫チェックポイントが、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡから選択され、任意選択で、前記阻害性免疫チェックポイントが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ではない、請求項１〜３８若しくは４２〜５５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５５のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５７】
前記阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストが、
（ａ）抗体及び阻害性核酸分子、並びに／又は
（ｂ）ＭＧＡ２７１（Ｂ７−Ｈ３を標的とする）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ、ＣＴＬＡ−４を標的とする）、インドキシモド（ＩＤＯ経路を標的とする）、ＮＬＧ９１９（ＩＤＯ経路を標的とする）、リリルマブ（ＫＩＲを標的とする）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ３を標的とする）、ＢＭＳ−９８６０１６（ＬＡＧ３を標的とする）、ＣＴ−０１１（ＰＤ−１遮断薬）、ニボルマブ／ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１遮断薬）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＰＤＬ１遮断薬）、及びペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＰＤ−１を標的とする）
から選択され、任意選択で、前記アンタゴニストが、ペンブロリズマブではなく、並びに／又は前記阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストが、ＭＧＢ４５３（ＴＩＭ−３を標的とする）、ＬＡＧ５２５（ＬＡＧ−３を標的とする）、及びＰＤＲ００１（ＰＤ１遮断薬）から選択される、請求項１〜３８若しくは４２〜５６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５６のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５８】
前記刺激性免疫チェックポイントが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳから選択される、請求項１〜３８若しくは４２〜５７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５７のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項５９】
前記刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが、
（ａ）抗体、リポカリン、及びサイトカイン、並びに／又は
（ｂ）ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７のアゴニスト）、ＮＫＴＲ−２１４（ＣＤ１２２のアゴニスト）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７のアゴニスト）、ＴＲＸ５１８（ＧＩＴＲのアゴニスト）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０アゴニスト）、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、及びＭＥＤＩ６３８３（ＯＸ４０アゴニスト）
から選択される、請求項１〜３８若しくは４２〜５８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５８のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【請求項６０】
前記ＤＮＡ損傷治療剤が、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復標的化治療薬、ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、及びＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤から選択され、任意選択で、
（ａ）前記ＤＮＡ損傷剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び放射線から選択され、任意選択で、
（ｉ）前記アルキル化剤が、白金含有剤、シクロホスファミド、及びブスルファンから選択され、任意選択で、前記白金含有剤が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンから選択され、
（ｉｉ）前記トポイソメラーゼ阻害剤が、トポイソメラーゼＩ阻害剤及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤から選択され、任意選択で、
（Ａ）前記トポイソメラーゼＩ阻害剤が、イリノテカン及びトポテカンから選択され、並びに／又は
（Ｂ）前記トポイソメラーゼＩＩ阻害剤が、エトポシド及びアントラサイクリンから選択され、任意選択で、前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン及びエピルビシンから選択され、
（ｉｉｉ）前記放射線が、電離放射線であり、並びに／又は
（ｂ）前記ＤＮＡ修復標的化治療薬が、非相同末端結合の阻害剤、相同組換えの阻害剤、ヌクレオチド除去修復の阻害剤、塩基除去修復の阻害剤、及びファンコーニ貧血経路の阻害剤から選択され、任意選択で、
（ｉ）前記非相同末端結合の阻害剤が、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、及びＮＵ７０２６から選択され、
（ｉｉ）前記塩基除去修復の阻害剤が、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ  １阻害剤、ＡＰＥＸ  ２阻害剤、及びリガーゼＩＩＩ阻害剤から選択され、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤が、ＡＴＭ阻害剤、ＣＨＫ  １阻害剤、及びＣＨＫ  ２阻害剤から選択され、任意選択で、
（Ａ）前記ＡＴＭ阻害剤が、ＣＰ４６６７２２及びＫＵ−５５９３３から選択され、
（Ｂ）前記ＣＨＫ  １阻害剤が、ＸＬ−８４４、ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、及びＰＦ００４７７７３６から選択され、
（Ｃ）前記ＣＨＫ  ２阻害剤が、ＸＬ−８４４、ＡＺＤ７７６２、及びＰＦ００４７７７３６から選択され、並びに／又は
（ｃ）前記ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤が、Ｗｅｅ１キナーゼ阻害剤及びＣＤＣ２５ａ、ｂ、若しくはｃ阻害剤から選択され、並びに／又は
（ｄ）前記ＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬及び熱ショックタンパク質阻害剤から選択され、任意選択で、前記熱ショックタンパク質阻害剤が、ゲルダナマイシン及びＡＵＹ９２２から選択される、請求項１〜３８若しくは４２〜５９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３９〜５９のいずれか一項に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な解剖学的部位に由来するがんの診断に有用な、ＤＮＡ損傷と関連する免疫応答サブタイプの使用を含む分子診断試験に関する。本発明は、ＤＮＡ損傷修復欠損の分子サブタイプと関連するこの免疫応答を特定するために４４遺伝子の分類モデルを使用することを含む。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを含む治療薬クラスに対する応答の層別化及びそれらの治療薬クラスに適した患者の選択が、１つの用途である。別の用途は、がん患者を阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに応答する患者と応答しない患者へ層別化することである。本発明は、従来的な治療法の選択を導くことができ、新規な治療薬の臨床試験評価の際にエンリッチメント戦略のための患者群の選択を同様に導くことができる、試験を提供する。自然免疫経路ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３の活性化と関連するがんサブタイプは、新鮮／凍結（ＦＦ）患者サンプル又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）患者サンプルから特定することができる。
【背景技術】
【０００２】
生物薬剤業界は、現在投与されている薬物よりも効果的であるか、より特異的であるか、又は悪性の副作用が少ない、新しい薬物治療の選択肢を絶えず探求している。ヒト集団内での遺伝的変動性によって多くの薬物の効果にかなりの差異が生じるため、新規又は代替の薬物療法が常に開発されている。したがって、多種多様な薬物療法の選択肢が現在利用可能ではあるが、患者が利益を得られない場合に備え、より多くの薬物療法が常に必要とされている。
【０００３】
従来的に、医師が使用する治療パラダイムは、疾患を治療する上で可能な限り高い成功率をもたらす第１選択肢の薬物療法を処方することとなっている。その第１選択肢の治療法が有効でない場合に、代替的な薬物療法が処方される。この治療パラダイムが、ある特定の疾患にとっては最適な方法でないことは明らかである。例えば、がんなどの疾患においては、多くの場合、最初の治療が、最も重要であり、治療が成功する最良の機会を提供するため、その特定の患者の疾患に対して最も有効であろう最初の薬物を選択する必要性は高い。
【０００４】
米国では本年、２０７，０９０人の女性が新たに乳がんと診断され、３９，８４０人の女性が乳がんに関連して死亡すると予想されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１０）。標準的な化学療法は、典型的に、直接的なＤＮＡ損傷剤、例えば、アントラサイクリン及びアルキル化剤、並びに抗代謝剤及び抗微小管作用剤を含む。
【０００５】
卵巣がんは、西洋諸国においてすべての婦人科系のがんの中で主要な死因である。この高い死亡率は、ほとんどの患者が進行期に診断されることに起因する。上皮卵巣がん（ＥＯＣ）は、卵巣悪性腫瘍のうちで９０％を占め、漿液性サブタイプ、粘液性サブタイプ、類内膜性サブタイプ、明細胞性サブタイプ、移行性サブタイプ、混合性サブタイプ、及び未分化性サブタイプを含む明確な組織学的区分に分類される。これらの組織構造が異なる病因から生じるという根拠は、増えつつある。現在の卵巣がんの標準的な治療は、減量手術及び標準的な白金タキサン系の細胞毒性化学療法である。しかしながら、すべての患者がこれに応答するわけではなく、応答する患者のうちおよそ７０％が、再発を経験する。組織学的分類又は分子的分類に基づいた卵巣がんのための特異的な標的化療法は、依然として市場に届いてはない。他の種類のがんについても同様に、適切な細胞毒性化学療法剤を選択する正確な手段は依然として存在しない。
【０００６】
マイクロアレイ及び分子ゲノムの出現は、疾患の診断能力及び予後分類に対して大きな影響を及ぼす可能性があり、これらは、所定の治療レジメンに対する個々の患者の応答の予測に役立ち得る。マイクロアレイは、大量のゲノム情報の分析を行い、それによって、個体のゲノムフィンガープリントを提供する。これが、カスタムメイドの薬物治療レジメンに必要なツールを提供する分子技術の１つであるという大きな熱意が存在する。
【０００７】
現在、医療の専門家は、化学療法剤により利益を得るであろうがん患者を特定するのに役立つ選択肢が限られている。最適な第１選択肢の薬物の特定は、どの薬物治療が特定の患者のがんに最も有効となるかを正確に予測するための方法がないため、困難となっている。これにより、単剤応答率は比較的乏しくなり、がんの罹患率及び死亡が増えることになる。さらに、患者は、多くの場合、効果がなく、毒性であることも多い薬物療法を不必要に受けることになる。
【０００８】
多くのがんタイプにおいて、適切な治療を選択するために、分子マーカーが使用されている。例えば、エストロゲンホルモン受容体及びプロゲステロンホルモン受容体、並びにＨＥＲ２増殖因子受容体を発現しない、「トリプルネガティブ」と呼ばれる乳がんは、ＰＡＲＰ−１阻害剤療法に応答性であるとみられる（Ｌｉｎｎ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｖａｎ  ’ｔ  Ｖｅｅｒ，Ｌ．，Ｊ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５  Ｓｕｐｐｌ  １，１１−２６（２００９）、Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，Ｊ．ら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６４，２０５−２１４（２０１１）。近年の研究は、トリプルネガティブ状態の乳房腫瘍は、ＰＡＲＰ−１阻害剤を含む組合せ療法に対して応答性を示す可能性があるが、個々のＰＡＲＰ−１阻害剤に対しては応答性を十分に示さない場合があることを示している。（Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙら、２０１１）。
【０００９】
さらに、化学療法剤の応答性を示す分子サブタイプと関連する遺伝子分類器の特定を試みたその他の研究も存在する（Ｆａｒｍｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５，６８−７４（２００９）、Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８，３５５５−３５６１（２０１０））。国際公開第２０１２／０３７３７８号は、がんの分子診断試験について記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、特許請求の範囲に定義されている。関連する治療剤の医療上の使用が、治療方法に加えて企図される。一部の実施形態において、本発明のあらゆる態様によると、免疫チェックポイントは、ＰＤ１／ＰＤＬ１（本開示全体を通じて、それぞれ、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１と互換可能に称される）チェックポイントではない。一部の実施形態において、本発明のあらゆる態様によると、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、ペンブロリズマブではない。
【００１１】
本発明は、ＤＮＡ損傷修復欠損（ＤＤＲＤ）腫瘍と関連する免疫応答機序の解明に基づく。ＤＮＡ損傷修復欠損（ＤＤＲＤ）腫瘍は、免疫経路ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３を活性化し、ケモカインの産生をもたらす。したがって、本発明は、がんにおける遺伝子発現マーカーの集合を使用する方法であって、転写物の一部又はすべてが過剰発現又は過少発現される場合に、それらによってＤＮＡ損傷修復の欠損と関連している自然免疫応答を示すがんのサブタイプを特定するような方法を、部分的に対象とする。このサブタイプの指定は、いずれの特定の薬物とも関連するものではなく、むしろ適切ながん治療法のスクリーニング及び選択に有用な様式でがんの生物学的様態を説明するため、診断試験と考えることができる。ＤＮＡ損傷と関連する免疫応答は、しかしながら、Ｔ細胞の疲弊及びアネルギーと関連する免疫阻害性分子、例えば、ＩＤＯ１又はＰＤＬ１（ＣＤ２７４）の発現に起因して、活性Ｔ細胞抗腫瘍応答をもたらさない。したがって、本発明は、任意選択でＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを含む治療薬に対する応答性又は耐性を示すための方法もまた提供する。異なる態様において、この遺伝子又は遺伝子産物のリストは、マイクロアレイ、核酸増幅（例えば、Ｑ−ＰＣＲ）、配列決定（次世代シーケンシング及びＲＮＡｓｅｑを含む）、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、又はｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現を定量化することができる他の技術など、当該技術分野で公知の方法を使用して提供することができる、単一パラメーター又は多重パラメーターの予測試験の基盤を形成し得る。
【００１２】
加えて、本明細書に記載される生物学的経路は、悪性度及びステージと同様、がんそのものの特徴であり、そのため、単一のがん疾患タイプに限定されない。したがって、遺伝子又は遺伝子産物の集合を使用して、異なる組織における異なるがんタイプ全体にわたってがん治療薬の応答性を予測することができる。本発明の一実施形態において、これらの遺伝子又は遺伝子産物は、乳がん腫瘍及び卵巣がん腫瘍の両方を評価するのに有用である。
【００１３】
本明細書に記載される本発明は、いずれか１つの薬物に限定されるものではなく、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに代表されるある範囲の薬物のいずれかに応答するものと応答しないものとを特定するために使用することができる。例は、本明細書に記載されている。そのような薬物は、ＤＮＡ損傷及び／又はＤＮＡ損傷修復に直接的又は間接的に影響を及ぼす薬物、例えば、５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、及びシクロホスファミドに基づくネオアジュバントレジメン、例えば、ＦＥＣ（５−フルオロウラシル／エピルビシン／シクロホスファミド）及びＦＡＣ（５−フルオロウラシル／アドリアマイシン／シクロホスファミド）と組み合わせて投与してもよい。
【００１４】
本発明は、全生存期間、無増悪生存期間、放射線応答（ＲＥＣＩＳＴによって定義される）、完全応答、部分的応答、疾患の安定、並びにＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、及びＣＡ１９−９などを含むがこれらに限定されない血清マーカーなど、応答の様々な分類を使用した、薬物に対する応答の予測に関する。別の態様において、本発明は、がんにおいてＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）分子サブタイプと関連する自然免疫応答の特定に関する。この分子サブタイプは、とりわけ、一方が４０個の遺伝子を含み、他方が４４個の遺伝子を含む、２つの異なる遺伝子分類器を使用することによって検出することができる。ＤＤＲＤ分類器は、Ａｌｍａｃの乳房疾患特異的アレイ（ＤＳＡ（商標））において、５３個のプローブセットからなる分類器によって最初に定義された。ＤＮＡ損傷薬を含む化学療法レジメンに対する応答を予測するその能力に関してこの分類器の機能的関連性を検証するために、分類器を遺伝子レベルで再定義する必要があった。これにより、Ａｌｍａｃの乳房ＤＳＡ（商標）以外のマイクロアレイプラットフォームでプロファイリングされた独立データセットからのマイクロアレイデータを使用したＤＤＲＤ分類器の評価が容易になると思われた。遺伝子レベルでの分類器の定義を容易にするために、Ａｌｍａｃの乳房ＤＳＡ（商標）プローブセットがマッピングする遺伝子を定義する必要があった。これは、Ｅｎｓｅｍｂｌ及びＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅなどの公的に利用可能なゲノムブラウザデータベースの利用を伴った。結果は、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルに関してのみ提供するが、これは、このモデルが、４０遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルよりも優位であるためである。これらの結果は、この分類器モデルが、ＤＮＡ損傷治療薬を含む化学療法レジメンに対する応答の有効及び有意な予測因子であることを実証する。
【００１５】
４０遺伝子の分類器モデル及び４４遺伝子の分類器モデルの両方によるサブタイプの特定を使用して、場合によりＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤及びＤＮＡ修復標的化治療薬と組み合わせた、がん治療薬クラス、特に、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性の予測、並びにそれらに適した患者の選択を行うことができる。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、配列決定（例えば、ＲＮＡｓｅｑ）、並びに免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの免疫アッセイといった、上述の従来的な診断上の使用のためのキットに関する。このようなキットは、遺伝子又は遺伝子産物の発現をアッセイするため及びｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を定量化するための適切な試薬及び指示書を含む。
【００１７】
本発明は、免疫応答の増大を有するＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）ヒト腫瘍を特定するための方法もまた提供する。本発明を使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなど、免疫チェックポイントに影響を及ぼす薬物に対して感受性で応答する患者、又は耐性で応答しない患者を特定することができる可能性が高い。これらの薬物は、ＤＮＡの直接的な損傷、ＤＮＡの間接的な損傷、又は正常なＤＮＡ損傷シグナル伝達及び／若しくは修復のプロセスの阻害を行う薬物と組み合わされ得る。
【００１８】
本発明はまた、従来的な患者の治療を導くことにも関する。本発明はまた、特定の免疫チェックポイントをアゴナイズ又はアンタゴナイズするクラスの新規な薬物の臨床試験のための患者を選択することにも関する。
【００１９】
本発明及び方法は、保管されているホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検材料、並びに新鮮／凍結（ＦＦ）組織を本発明におけるすべての転写物のアッセイで使用することに対応し、したがって、ほとんどの広く利用可能な種類の生検材料に適合性がある。発現レベルは、ＦＦＰＥ組織、新鮮凍結組織、又はＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）などの溶液中に保管されている新鮮組織から得られたＲＮＡを使用して判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ−１】ＥＲ陰性（Ａ）及びＥＲ陽性（Ｂ）のＢＲＣＡ１／２変異体の乳房サンプル並びに散発性野生型対照の乳房サンプルの階層化分析を表す図である。プローブセットクラスター群のアノテーションを右手側に示し、各プローブセットクラスター群の経路分析の関するアノテーションを各画像の左手側に示す。各画像の凡例は、サンプルの変異の状態を示し、同様に、分類器生成のために各サンプルを割り当てたシグネチャー群を示す。
【図１Ａ−２】ＥＲ陰性（Ａ）及びＥＲ陽性（Ｂ）のＢＲＣＡ１／２変異体の乳房サンプル並びに散発性野生型対照の乳房サンプルの階層化分析を表す図である。プローブセットクラスター群のアノテーションを右手側に示し、各プローブセットクラスター群の経路分析の関するアノテーションを各画像の左手側に示す。各画像の凡例は、サンプルの変異の状態を示し、同様に、分類器生成のために各サンプルを割り当てたシグネチャー群を示す。
【図１Ｂ−１】ＥＲ陰性（Ａ）及びＥＲ陽性（Ｂ）のＢＲＣＡ１／２変異体の乳房サンプル並びに散発性野生型対照の乳房サンプルの階層化分析を表す図である。プローブセットクラスター群のアノテーションを右手側に示し、各プローブセットクラスター群の経路分析の関するアノテーションを各画像の左手側に示す。各画像の凡例は、サンプルの変異の状態を示し、同様に、分類器生成のために各サンプルを割り当てたシグネチャー群を示す。
【図１Ｂ−２】ＥＲ陰性（Ａ）及びＥＲ陽性（Ｂ）のＢＲＣＡ１／２変異体の乳房サンプル並びに散発性野生型対照の乳房サンプルの階層化分析を表す図である。プローブセットクラスター群のアノテーションを右手側に示し、各プローブセットクラスター群の経路分析の関するアノテーションを各画像の左手側に示す。各画像の凡例は、サンプルの変異の状態を示し、同様に、分類器生成のために各サンプルを割り当てたシグネチャー群を示す。
【図２Ａ】（Ａ）組合せサンプルセット、（Ｂ）ＥＲ陰性サンプルセット、及び（Ｃ）ＥＲ陽性サンプルセットの５倍交差検証を１０回反復した、各分類モデルのＡＵＣ性能を比較するボックスプロットの図である。（Ｄ）閾値を選択するために使用した交差検証予測の感度と特異度を足したプロットである。感度と特異度を足した最大値は１．６８２であり、対応するシグネチャースコアは約０．３７である。
【図２Ｂ】（Ａ）組合せサンプルセット、（Ｂ）ＥＲ陰性サンプルセット、及び（Ｃ）ＥＲ陽性サンプルセットの５倍交差検証を１０回反復した、各分類モデルのＡＵＣ性能を比較するボックスプロットの図である。（Ｄ）閾値を選択するために使用した交差検証予測の感度と特異度を足したプロットである。感度と特異度を足した最大値は１．６８２であり、対応するシグネチャースコアは約０．３７である。
【図２Ｃ】（Ａ）組合せサンプルセット、（Ｂ）ＥＲ陰性サンプルセット、及び（Ｃ）ＥＲ陽性サンプルセットの５倍交差検証を１０回反復した、各分類モデルのＡＵＣ性能を比較するボックスプロットの図である。（Ｄ）閾値を選択するために使用した交差検証予測の感度と特異度を足したプロットである。感度と特異度を足した最大値は１．６８２であり、対応するシグネチャースコアは約０．３７である。
【図２Ｄ】（Ａ）組合せサンプルセット、（Ｂ）ＥＲ陰性サンプルセット、及び（Ｃ）ＥＲ陽性サンプルセットの５倍交差検証を１０回反復した、各分類モデルのＡＵＣ性能を比較するボックスプロットの図である。（Ｄ）閾値を選択するために使用した交差検証予測の感度と特異度を足したプロットである。感度と特異度を足した最大値は１．６８２であり、対応するシグネチャースコアは約０．３７である。
【図３】交差検証によって推測した、４４遺伝子の分類器モデルを使用してＢＲＣＡの状態を予測するための分類性能のＲＯＣ曲線の図である。ＡＵＣは、分類器モデルの適用後で約０．６８である。９５％信頼限界を、１０００回反復のブートストラップにより推測した。
【図４】アントラサイクリンに基づく化学療法に対する応答を予測するための３つの独立したデータセットの組合せ分析：ＦＥＣ、ＦＡＣ１、及びＦＡＣ２（Ｂｏｎｎｅｆｏｉら、２００７；Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １０３，２６４−２７２（２０１１）；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６，７１１−７１８（２０１０）における４４遺伝子の分類器モデルの分類性能のＲＯＣ曲線の図である。ＡＵＣは、分類器モデルの適用後で約０．７８である。９５％信頼限界を、１０００回反復のブートストラップにより推測した。
【図５】Ｔ／ＦＡＣ処置サンプルにおける応答に関する３つの独立したデータセット（Ｈｅｓｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，４２３６−４２４４（２００６）；Ｌｅｅら、２０１０；Ｔａｂｃｈｙ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６，５３５１−５３６１（２０１０）の組合せ分析における４４遺伝子の分類器モデルの分類性能のＲＯＣ曲線の図である。ＡＵＣは、それぞれの分類器モデルの適用後で約０．６１である。９５％信頼限界を、１０００回のブートストラップ反復を使用して決定した。
【図６】２５９個の漿液性卵巣がんサンプルにおけるＡｌｍａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社内の卵巣データセットからの白金及びタキソール処置サンプルにおける応答に関する４４遺伝子の分類器モデルの分類性能のＲＯＣ曲線の図である。ＡＵＣは、分類器モデルの適用後で約０．６８である。９５％信頼限界を、１０００回のブートストラップ反復を使用して決定した。
【図７】健常なドナー及びファンコーニ貧血変異を有する患者から採取した骨髄サンプルにおける４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器スコアを表すヒストグラムである。ＡＵＣは、分類器モデルの適用後で０．９０である。９５％信頼限界を、１０００回のブートストラップ反復を使用して決定した。
【図８】４４遺伝子の分類器モデルをＢＲＣＡ１変異体細胞株及び野生型細胞株における治療応答と相関付ける図である。（Ａ）ＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞における、ＨＣＣ１９３７−ＥＶ細胞と比較して増大したＢＲＣＡ１の発現を確認する、ウエスタンブロット分析。（Ｂ）対照のベクターのみをトランスフェクトしたＨＣＣ１９３７（ＨＣＣ１９３７−ＥＶ）細胞株及びＢＲＣＡ１の外因性発現を回復させたＨＣＣ１９３７（ＨＣＣ１９３７−ＢＲ）細胞株における、平均の４４遺伝子モデル（ＤＤＲＤ）分類器スコア（±標準誤差）。ある濃度範囲のＰＡＲＰ阻害剤ＫＵ００５８９４８（Ｃ）及びシスプラチン（Ｄ）への一定曝露下における親ＨＣＣ１９３７細胞及びＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞の生存率を表すヒストグラム。
【図９Ａ】ＤＤＲＤ腫瘍がリンパ球浸潤と関連していることを示す表及び画像である。
【図９Ｂ】ＤＤＲＤ腫瘍がリンパ球浸潤と関連していることを示す表及び画像である。
【図１０Ａ】ＤＤＲＤサブタイプであるＩ型インターフェロンの図である。
【図１０Ｂ】ＤＤＲＤサブタイプであるＩ型インターフェロンの図である。
【図１１】ＤＮＡ損傷がケモカイン（及び他のＤＤＲＤアッセイ遺伝子）の発現を誘導することを示すグラフである。このデータの統計学的有意性は、＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、及び＊＊＊ｐ値＜０．００１で示す。
【図１２Ａ】ＤＮＡ修復欠損の補正がケモカイン（及び他のＤＤＲＤアッセイ遺伝子）の発現を低減させることを示すグラフ及び画像である。
【図１２Ｂ】ＤＮＡ修復欠損の補正がケモカイン（及び他のＤＤＲＤアッセイ遺伝子）の発現を低減させることを示すグラフ及び画像である。
【図１３Ａ】ＤＤＲＤ陽性細胞が、リンパ球を誘引する条件培地にケモカインを放出することを示す。
【図１３Ｂ】ＤＤＲＤ陽性細胞が、リンパ球を誘引する条件培地にケモカインを放出することを示す。
【図１３Ｃ】ＤＤＲＤ陽性細胞が、リンパ球を誘引する条件培地にケモカインを放出することを示す。
【図１３Ｄ】ＤＤＲＤ陽性細胞が、リンパ球を誘引する条件培地にケモカインを放出することを示す。
【図１３Ｅ】ＤＤＲＤ陽性細胞が、リンパ球を誘引する条件培地にケモカインを放出することを示す。
【図１４Ａ】ＤＤＲＤ遺伝子発現が、ＤＮＡ損傷剤によって誘導されることを示すグラフである。
【図１４Ｂ】ＤＤＲＤ遺伝子発現が、ＤＮＡ損傷剤によって誘導されることを示すグラフである。
【図１４Ｃ】ＤＤＲＤ遺伝子発現が、ＤＮＡ損傷剤によって誘導されることを示すグラフである。
【図１５Ａ】ＤＤＲＤシグネチャー遺伝子の発現は細胞周期が限定されることを示すグラフである。
【図１５Ｂ】ＤＤＲＤシグネチャー遺伝子の発現は細胞周期が限定されることを示すグラフである。
【図１６】ＤＤＲＤ遺伝子の発現が、古典的なＤＮＡ損傷センサーであるＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＤＮＡＰＫから独立していることを示すグラフである。
【図１７Ａ】ＳＴＩＮＧにより活性化される自然免疫経路は、ＤＤＲＤシグネチャー遺伝子と関連していることを示す。
【図１７Ｂ】ＳＴＩＮＧにより活性化される自然免疫経路は、ＤＤＲＤシグネチャー遺伝子と関連していることを示す。
【図１７Ｃ】ＳＴＩＮＧにより活性化される自然免疫経路は、ＤＤＲＤシグネチャー遺伝子と関連していることを示す。
【図１８Ａ】細胞質ＤＮＡセンサーがＤＮＡ損傷によって活性化され、ＤＤＲＤシグナル伝達に必須であることを示す画像及びグラフである。
【図１８Ｂ】細胞質ＤＮＡセンサーがＤＮＡ損傷によって活性化され、ＤＤＲＤシグナル伝達に必須であることを示す画像及びグラフである。
【図１８Ｃ】細胞質ＤＮＡセンサーがＤＮＡ損傷によって活性化され、ＤＤＲＤシグナル伝達に必須であることを示す画像及びグラフである。
【図１９Ａ】Ｓ期のＤＮＡ損傷により細胞質ＤＮＡが増大することを示す画像である。
【図１９Ｂ】Ｓ期のＤＮＡ損傷により細胞質ＤＮＡが増大することを示す画像である。
【図１９Ｃ】Ｓ期のＤＮＡ損傷により細胞質ＤＮＡが増大することを示す画像である。
【図２０Ａ】ＤＤＲＤ＋が乳がんサンプルにおいて有意なレベルのＰＤ−Ｌ１を示すことを示す、表及び画像である。
【図２０Ｂ】ＤＤＲＤ＋が乳がんサンプルにおいて有意なレベルのＰＤ−Ｌ１を示すことを示す、表及び画像である。
【図２１】ＰＤＬ１陽性腫瘍が活性なＤＤＲＤシグナル伝達を有することを示すグラフである。
【図２２】ＰＤＬ１の発現が、特にＤＤＲＤ＋モデルにおいて、リンパ球との共培養によって増大することを示す、グラフである。
【図２３Ａ】ＰＤＬ１の発現がＤＮＡ損傷によって増大することを示すグラフ及び画像である。このデータの統計学的有意性は、＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、及び＊＊＊ｐ値＜０．００１で示す。
【図２３Ｂ】ＰＤＬ１の発現がＤＮＡ損傷によって増大することを示すグラフ及び画像である。このデータの統計学的有意性は、＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、及び＊＊＊ｐ値＜０．００１で示す。
【図２４】代替的な免疫チェックポイント標的であるＩＤＯ１の発現が、ゲノム不安定性によって増大することを示す画像である。
【図２５】ＩＤＯ１の発現が、特にＤＤＲＤ＋モデルにおいて、リンパ球との共培養によって増大することを示す、グラフである。
【図２６】ＤＤＲＤ＋細胞が、リンパ球に媒介される細胞毒性から保護されることを示すグラフである。
【図２７Ａ】ＩＦＮ−γが、ＤＤＲＤ＋においてＰＤＬ−１発現を駆動し、ＰＢＭＣに媒介される細胞毒性から保護することを示す、グラフ及び画像である。
【図２７Ｂ】ＩＦＮ−γが、ＤＤＲＤ＋においてＰＤＬ−１発現を駆動し、ＰＢＭＣに媒介される細胞毒性から保護することを示す、グラフ及び画像である。
【図２７Ｃ】ＩＦＮ−γが、ＤＤＲＤ＋においてＰＤＬ−１発現を駆動し、ＰＢＭＣに媒介される細胞毒性から保護することを示す、グラフ及び画像である。
【図２８】ＰＤＬ−１に対する遮断抗体により、ＤＤＲＤ＋細胞単独においてＰＢＭＣに媒介される細胞毒性に対する耐性が逆転することを示すグラフである。
【図２９Ａ】ＤＤＲＤによるＭＳＩ結腸直腸サンプルの特定を示す。
【図２９Ｂ】ＤＤＲＤによるＭＳＩ結腸直腸サンプルの特定を示す。
【図２９Ｃ】ＤＤＲＤによるＭＳＩ結腸直腸サンプルの特定を示す。
【図３０】ＤＮＡ損傷経路のモデルを図示する。
【図３１】免疫に基づく治療薬（イピリムマブ又はペンブロリズマブなどの免疫チェックポイント調節剤）及び／又はＤＮＡ損傷剤で処置したＤＤＲＤ陽性患者とＤＤＲＤ陰性患者とにおける局所再発生存率の差異を示すカプランマイヤー。ＨＲ＝０．３９［９５％ＣＩ：０．１８−０．８４］、ｐ＝０．０００８。
【図３２】免疫に基づく治療薬（イピリムマブ又はペンブロリズマブなどの免疫チェックポイント調節剤）及び／又はＤＮＡ損傷剤で処置したＤＤＲＤ陽性患者とＤＤＲＤ陰性患者とにおける遠隔再発生存率の差異を示すカプランマイヤー。ＨＲ＝０．４４［９５％ＣＩ：０．１９−０．９９］、ｐ＝０．００９５
【図３３】免疫に基づく治療薬（イピリムマブ又はペンブロリズマブなどの免疫チェックポイント調節剤）及び／又はＤＮＡ損傷剤で処置したＤＤＲＤ陽性患者とＤＤＲＤ陰性患者とにおける全生存率の差異を示すカプランマイヤー。ＨＲ＝０．３１［９５％ＣＩ：０．１２−０．８１］、ｐ＝０．０００６。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性を予測するための方法であって、対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、方法を提供する。本発明の方法のいずれにおいても、１つ又は複数の追加の遺伝子（すなわち、表２Ｂ、２Ａ、又は１に記載されているもの以外の遺伝子）の発現レベルもまた、決定され得、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測するために使用され得る。
【００２２】
本方法において、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性を予測することができる。
【００２３】
本方法は、上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み得、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成することができ、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する。
【００２４】
本方法は、発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップ、組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ、及び組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み得、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される。
【００２５】
本方法は、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される、少なくとも６個の遺伝子、少なくとも７個の遺伝子、少なくとも８個の遺伝子、少なくとも９個の遺伝子、少なくとも１０個の遺伝子、少なくとも１１個の遺伝子、少なくとも１２個の遺伝子、少なくとも１３個の遺伝子、少なくとも１４個の遺伝子、少なくとも１５個の遺伝子、少なくとも１６個の遺伝子、少なくとも１７個の遺伝子、少なくとも１８個の遺伝子、少なくとも１９個の遺伝子、少なくとも２０個の遺伝子、少なくとも２１個の遺伝子、少なくとも２２個の遺伝子、少なくとも２３個の遺伝子、少なくとも２４個の遺伝子、少なくとも２５個の遺伝子、少なくとも２６個の遺伝子、少なくとも２７個の遺伝子、少なくとも２８個の遺伝子、少なくとも２９個の遺伝子、少なくとも３０個の遺伝子、少なくとも３１個の遺伝子、少なくとも３２個の遺伝子、少なくとも３３個の遺伝子、少なくとも３４個の遺伝子、少なくとも３５個の遺伝子、少なくとも３６個の遺伝子、少なくとも３７個の遺伝子、少なくとも３８個の遺伝子、少なくとも３９個の遺伝子、少なくとも４０個の遺伝子、少なくとも４１個の遺伝子、少なくとも４２個の遺伝子、又は少なくとも４３個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００２６】
本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１個のさらなる遺伝子、少なくとも２個のさらなる遺伝子、少なくとも３個のさらなる遺伝子、少なくとも４個のさらなる遺伝子、少なくとも５個のさらなる遺伝子、少なくとも６個のさらなる遺伝子、少なくとも７個のさらなる遺伝子、少なくとも８個のさらなる遺伝子、少なくとも９個のさらなる遺伝子、少なくとも１０個のさらなる遺伝子、少なくとも１１個のさらなる遺伝子、少なくとも１２個のさらなる遺伝子、少なくとも１３個のさらなる遺伝子、少なくとも１４個のさらなる遺伝子、少なくとも１５個のさらなる遺伝子、少なくとも１６個のさらなる遺伝子、少なくとも１７個のさらなる遺伝子、少なくとも１８個のさらなる遺伝子、少なくとも１９個のさらなる遺伝子、少なくとも２０個のさらなる遺伝子、少なくとも２１個のさらなる遺伝子、少なくとも２２個のさらなる遺伝子、少なくとも２３個のさらなる遺伝子、少なくとも２４個のさらなる遺伝子、少なくとも２５個のさらなる遺伝子、少なくとも２６個のさらなる遺伝子、少なくとも２７個のさらなる遺伝子、少なくとも２８個のさらなる遺伝子、少なくとも２９個のさらなる遺伝子、少なくとも３０個のさらなる遺伝子、少なくとも３１個のさらなる遺伝子、少なくとも３２個のさらなる遺伝子、少なくとも３３個のさらなる遺伝子、少なくとも３４個のさらなる遺伝子、少なくとも３５個のさらなる遺伝子、少なくとも３６個のさらなる遺伝子、少なくとも３７個のさらなる遺伝子、又は少なくとも３８個のさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれと一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含むことが好ましい。
【００２７】
本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１個のさらなる遺伝子、少なくとも２個のさらなる遺伝子、少なくとも３個のさらなる遺伝子、少なくとも４個のさらなる遺伝子、少なくとも５個のさらなる遺伝子、少なくとも６個のさらなる遺伝子、少なくとも７個のさらなる遺伝子、少なくとも８個のさらなる遺伝子、少なくとも９個のさらなる遺伝子、少なくとも１０個のさらなる遺伝子、少なくとも１１個のさらなる遺伝子、少なくとも１２個のさらなる遺伝子、少なくとも１３個のさらなる遺伝子、少なくとも１４個のさらなる遺伝子、少なくとも１５個のさらなる遺伝子、少なくとも１６個のさらなる遺伝子、少なくとも１７個のさらなる遺伝子、少なくとも１８個のさらなる遺伝子、少なくとも１９個のさらなる遺伝子、少なくとも２０個のさらなる遺伝子、少なくとも２１個のさらなる遺伝子、少なくとも２２個のさらなる遺伝子、少なくとも２３個のさらなる遺伝子、少なくとも２４個のさらなる遺伝子、少なくとも２５個のさらなる遺伝子、少なくとも２６個のさらなる遺伝子、少なくとも２７個のさらなる遺伝子、少なくとも２８個のさらなる遺伝子、少なくとも２９個のさらなる遺伝子、少なくとも３０個のさらなる遺伝子、少なくとも３１個のさらなる遺伝子、少なくとも３２個のさらなる遺伝子、少なくとも３３個のさらなる遺伝子、少なくとも３４個のさらなる遺伝子、少なくとも３５個のさらなる遺伝子、少なくとも３６個のさらなる遺伝子、少なくとも３７個のさらなる遺伝子、又は少なくとも３８個のさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれと一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含むことが好ましい。
【００２８】
本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１個のさらなる遺伝子、少なくとも２個のさらなる遺伝子、少なくとも３個のさらなる遺伝子、少なくとも４個のさらなる遺伝子、少なくとも５個のさらなる遺伝子、少なくとも６個のさらなる遺伝子、少なくとも７個のさらなる遺伝子、少なくとも８個のさらなる遺伝子、少なくとも９個のさらなる遺伝子、少なくとも１０個のさらなる遺伝子、少なくとも１１個のさらなる遺伝子、少なくとも１２個のさらなる遺伝子、少なくとも１３個のさらなる遺伝子、少なくとも１４個のさらなる遺伝子、少なくとも１５個のさらなる遺伝子、少なくとも１６個のさらなる遺伝子、少なくとも１７個のさらなる遺伝子、少なくとも１８個のさらなる遺伝子、少なくとも１９個のさらなる遺伝子、少なくとも２０個のさらなる遺伝子、少なくとも２１個のさらなる遺伝子、少なくとも２２個のさらなる遺伝子、少なくとも２３個のさらなる遺伝子、少なくとも２４個のさらなる遺伝子、少なくとも２５個のさらなる遺伝子、少なくとも２６個のさらなる遺伝子、少なくとも２７個のさらなる遺伝子、少なくとも２８個のさらなる遺伝子、少なくとも２９個のさらなる遺伝子、少なくとも３０個のさらなる遺伝子、少なくとも３１個のさらなる遺伝子、少なくとも３２個のさらなる遺伝子、少なくとも３３個のさらなる遺伝子、少なくとも３４個のさらなる遺伝子、少なくとも３５個のさらなる遺伝子、少なくとも３６個のさらなる遺伝子、少なくとも３７個のさらなる遺伝子、又は少なくとも３８個のさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれと一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含むことが好ましい。
【００２９】
本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１個のさらなる遺伝子、少なくとも２個のさらなる遺伝子、少なくとも３個のさらなる遺伝子、少なくとも４個のさらなる遺伝子、少なくとも５個のさらなる遺伝子、少なくとも６個のさらなる遺伝子、少なくとも７個のさらなる遺伝子、少なくとも８個のさらなる遺伝子、少なくとも９個のさらなる遺伝子、少なくとも１０個のさらなる遺伝子、少なくとも１１個のさらなる遺伝子、少なくとも１２個のさらなる遺伝子、少なくとも１３個のさらなる遺伝子、少なくとも１４個のさらなる遺伝子、少なくとも１５個のさらなる遺伝子、少なくとも１６個のさらなる遺伝子、少なくとも１７個のさらなる遺伝子、少なくとも１８個のさらなる遺伝子、少なくとも１９個のさらなる遺伝子、少なくとも２０個のさらなる遺伝子、少なくとも２１個のさらなる遺伝子、少なくとも２２個のさらなる遺伝子、少なくとも２３個のさらなる遺伝子、少なくとも２４個のさらなる遺伝子、少なくとも２５個のさらなる遺伝子、少なくとも２６個のさらなる遺伝子、少なくとも２７個のさらなる遺伝子、少なくとも２８個のさらなる遺伝子、少なくとも２９個のさらなる遺伝子、少なくとも３０個のさらなる遺伝子、少なくとも３１個のさらなる遺伝子、少なくとも３２個のさらなる遺伝子、少なくとも３３個のさらなる遺伝子、少なくとも３４個のさらなる遺伝子、少なくとも３５個のさらなる遺伝子、少なくとも３６個のさらなる遺伝子、少なくとも３７個のさらなる遺伝子、又は少なくとも３８個のさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも４つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれと一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも４つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含むことが好ましい。
【００３０】
本方法は、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１個のさらなる遺伝子、少なくとも２個のさらなる遺伝子、少なくとも３個のさらなる遺伝子、少なくとも４個のさらなる遺伝子、少なくとも５個のさらなる遺伝子、少なくとも６個のさらなる遺伝子、少なくとも７個のさらなる遺伝子、少なくとも８個のさらなる遺伝子、少なくとも９個のさらなる遺伝子、少なくとも１０個のさらなる遺伝子、少なくとも１１個のさらなる遺伝子、少なくとも１２個のさらなる遺伝子、少なくとも１３個のさらなる遺伝子、少なくとも１４個のさらなる遺伝子、少なくとも１５個のさらなる遺伝子、少なくとも１６個のさらなる遺伝子、少なくとも１７個のさらなる遺伝子、少なくとも１８個のさらなる遺伝子、少なくとも１９個のさらなる遺伝子、少なくとも２０個のさらなる遺伝子、少なくとも２１個のさらなる遺伝子、少なくとも２２個のさらなる遺伝子、少なくとも２３個のさらなる遺伝子、少なくとも２４個のさらなる遺伝子、少なくとも２５個のさらなる遺伝子、少なくとも２６個のさらなる遺伝子、少なくとも２７個のさらなる遺伝子、少なくとも２８個のさらなる遺伝子、少なくとも２９個のさらなる遺伝子、少なくとも３０個のさらなる遺伝子、少なくとも３１個のさらなる遺伝子、少なくとも３２個のさらなる遺伝子、少なくとも３３個のさらなる遺伝子、少なくとも３４個のさらなる遺伝子、少なくとも３５個のさらなる遺伝子、少なくとも３６個のさらなる遺伝子、少なくとも３７個のさらなる遺伝子、又は少なくとも３８個のさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００３１】
本方法は、表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００３２】
本方法は、表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００３３】
本方法は、
ＣＸＣＬ１０；
ＣＸＣＬ１０及びＭＸ１；
ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１及びＭＸ１；
ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ及びＭＸ１；
ＣＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ及びＭＸ１；
ＣＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ及びＭＸ１；
ＣＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＭＸ１及びＰＲＡＭＥ；
ＣＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＭＸ１及びＰＲＡＭＥ；
ＣＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＭＸ１及びＰＲＡＭＥ；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＭＸ１及びＰＲＡＭＥ；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＭＸ１及びＰＲＡＭＥ；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＭＸ１及びＰＲＡＭＥ；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＯＬＦＭ４、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＡＴ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＡＴＳ２、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＡＴ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＹＰ２Ｂ６、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＡＴＳ２、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＡＴ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＹＰ２Ｂ６、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＡＴＳ２、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＡＴ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；
ＡＣ１３８１２８．１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＮＸＡ１、ＡＰＯＬ３、ＣＤ１０９、ＣＤ２、ＣＤ２７４、ＣＤＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＣＸＣＬ１０、ＣＹＰ２Ｂ６、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＳＲ１、ＥＴＶ７、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＯＳＢ、ＦＹＢ、ＧＢＰ５、ＧＲＢ１４、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＫＺＦ３、ＩＴＧＡＬ、ＫＩＦ２６Ａ、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＬＡＴＳ２、ＬＲＰ４、ＭＦＡＰ５、ＭＸ１、ＮＡＴ１、ＮＬＲＣ５、ＯＬＦＭ４、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＰＩ１５、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ２、ＲＳＡＤ２、ＳＰ１４０Ｌ及びＴＳＰＡＮ７；又は
ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１
のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００３４】
本方法において、それぞれの遺伝子に対する重み値は、表２Ｂに示される通りであってもよく、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値は、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りであってもよい。
【００３５】
本方法は、表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００３６】
本発明は、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性を予測する方法であって、対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性を予測する、方法を提供する。決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤の同時、別個、又は逐次投与（又は使用）に対する応答性を予測することができる。
【００３７】
本方法において、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性を予測することができる。
【００３８】
本方法は、上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み得、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成することができ、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性が予測される。
【００３９】
ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤に対する応答性を予測するための方法は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子のセットのうちのいずれかの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００４０】
本発明は、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定する、方法を提供する。
【００４１】
本方法において、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定することができる。
【００４２】
本方法は、少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み得、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成することができ、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定する。
【００４３】
本方法は、発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップ、組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ、及び組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み得、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、効果的に治療することができるがんが特定される。
【００４４】
阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定するための方法は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子のセットのうちのいずれかの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００４５】
本発明は、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定するための方法であって、対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定する、方法を提供する。決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤の同時、別個、又は逐次投与（又は使用）で効果的に治療することができるがんを特定することができる。
【００４６】
本方法において、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定することができる。
【００４７】
本方法は、上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み得、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成することができ、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定する。
【００４８】
ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤で効果的に治療することができるがんを特定するための方法は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子のセットのうちのいずれかの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００４９】
本発明は、がんの治療を選択するための方法であって、対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択する、方法を提供する。
【００５０】
本方法において、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を使用して、がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択する。
【００５１】
本方法は、上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み得、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成することができ、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）を使用して、がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択する。
【００５２】
本方法は、選択されたアンタゴニスト及び／又はアゴニストを使用してがんを治療するステップをさらに含んでもよい。
【００５３】
本方法は、発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップ、組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ、及び組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み得、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤が使用のために選択される。
【００５４】
がんの治療を選択するための方法は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子のセットのうちのいずれかの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００５５】
本発明は、がんの治療を選択するための方法であって、対象に由来するサンプルにおける、２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択する、方法を提供する。決定された発現レベルを使用して、がんの治療において同時、別個、又は逐次的に使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択することができる。
【００５６】
本方法において、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を使用して、がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択することができる。
【００５７】
本方法は、上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み得、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成することができ、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）を使用して、がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を選択する。
【００５８】
本方法は、アンタゴニスト及び／又はアゴニストなどの選択された調節剤をＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて使用して、がんを治療するステップを含み得る。
【００５９】
本方法は、発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップ、組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ、及び組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み得、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤が使用のために選択される。
【００６０】
本方法において、組合せ試験スコア（又は「シグネチャースコア」）は、式：
【数１】
2018524990.tif 000002
によって導き出され、式中、ｗｉは、各遺伝子の重みであり、ｂｉは、遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは、前処理後の遺伝子発現であり、ｋは、オフセット定数である。
【００６１】
組合せ試験スコアは、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子群のうちのいずれかの発現レベル（複数可）を使用して導き出すことができる。組合せ試験スコアは、１つ又は複数の追加の遺伝子の発現レベルを使用して導き出してもよい。
【００６２】
本発明は、がんを治療する方法であって、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を対象に投与するステップを含み、対象に由来するサンプルが、投与の前に、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈することを特徴とする、方法を提供する。
【００６３】
本発明は、がんを治療する方法であって、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤を、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて対象に投与するステップを含み、対象に由来するサンプルが、投与の前に、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈することを特徴とする、方法を提供する。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤、並びにＤＮＡ損傷治療剤は、同時、別個、又は逐次的に、対象に投与され得る。
【００６４】
がんを治療するための方法は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子のセットのうちのいずれかの発現レベルを決定するステップを含み得る。
【００６５】
本発明は、対象におけるがんの治療に使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤であって、アンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与の前に、対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈する、免疫チェックポイントの調節剤を提供する。
【００６６】
本発明は、対象におけるがんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤であって、アンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与の前に、対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈し、アンタゴニスト及び／又はアゴニストが、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて投与される、免疫チェックポイントの調節剤を提供する。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤、並びにＤＮＡ損傷治療剤は、同時、別個、又は逐次的に、対象に投与され得る。
【００６７】
本発明は、対象におけるがんの治療に使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又はＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤であって、アンタゴニスト及び／又はアゴニスト並びにＤＮＡ損傷治療剤の投与の前に、対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈する、免疫チェックポイントの調節剤を提供する。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイントの調節剤、並びにＤＮＡ損傷治療剤は、対象におけるがんの治療において同時、別個、又は逐次的に使用するためのものであり得る。
【００６８】
発現レベルが決定される遺伝子は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子のセットのうちのいずれかであり得る。
【００６９】
対象は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、治療のために選択され得る。
【００７０】
サンプルは、がん細胞を含み得る。サンプルは、組織サンプル、例えば、固定包埋組織サンプルであり得る。
【００７１】
がんは、白血病、脳のがん、前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、咽喉がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、肺がん、肉腫、子宮頸がん、精巣がん、膀胱がん、内分泌がん、子宮内膜がん、食道がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵臓がん、下垂体がん、腎臓がん、又は頭頸部がんから選択され得る。
【００７２】
阻害性免疫チェックポイントは、免疫応答を阻害する制御性経路、又はそのような経路内の分子であり得る。阻害性免疫チェックポイントは、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞によって発現されるポリペプチドであり得る。阻害性免疫チェックポイントは、阻害性受容体であり得る。阻害性免疫チェックポイントは、膜受容体であり得る。阻害性免疫チェックポイントは、阻害性膜受容体であることが好ましい。阻害性免疫チェックポイントのリガンドは、膜結合型であってもよく、又は可溶性であってもよい。
【００７３】
阻害性免疫チェックポイントは、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡから選択され得る。一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ではない。一部の実施形態において、免疫チェックポイントは、ＩＤＯである。
【００７４】
阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、抗原特異的Ｂ細胞及び／又はＴ細胞応答を増幅させ得る。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、阻害性受容体とそのリガンドとの間の相互作用を阻害し得る。阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、抗体及び阻害性核酸分子から選択され得る。
【００７５】
抗体は、モノクローナル起源又はポリクローナル起源のものであり得る。Ｆａｂ断片、ＳｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、重鎖抗体、アプタマーなどを含むがこれらに限定されない、ペプチド特異的結合機能を保持する断片及び誘導体抗体もまた利用することができ、これらは、「抗体」の定義に含まれる。このような抗体は、本発明の実施において有用である。特異的抗体を生成するための方法は、当業者に公知である。抗体は、ヒト起源又は非ヒト起源（例えば、ラット又はマウスなどの齧歯類）のものであり得、公知の技法によってヒト化されていてもよい（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）  Ｍａｙ  ２９−Ｊｕｎ．４；３２１（６０６９）：５２２−５；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６，９（１０）：８９５−９０４；及びＳｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  Ｗｈｉｌｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ３−Ｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９４，Ｖｏｌ．７，ｐｇ  ８０５）。
【００７６】
阻害性核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。阻害性核酸分子の例としては、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくは前駆体が挙げられる。
【００７７】
阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、ＭＧＡ２７１（Ｂ７−Ｈ３を標的とする）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ、ＣＴＬＡ−４を標的とする）、インドキシモド（ＩＤＯ経路を標的とする）、ＮＬＧ９１９（ＩＤＯ経路を標的とする）、リリルマブ（ＫＩＲを標的とする）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ３を標的とする）、ＢＭＳ−９８６０１６（ＬＡＧ３を標的とする）、ＣＴ−０１１（ＰＤ−１遮断薬）、ニボルマブ／ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１遮断薬）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＰＤＬ１遮断薬）、及びペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＰＤ−１を標的とする）から選択され得る。アンタゴニストは、ペンブロリズマブではないことが好ましい。さらなるアンタゴニストとしては、ＭＧＢ４５３（ＴＩＭ−３を標的とする）、ＬＡＧ５２５（ＬＡＧ−３を標的とする）、及びＰＤＲ００１（ＰＤ１遮断薬）が挙げられる。
【００７８】
刺激性免疫チェックポイントは、免疫応答を活性化する制御性経路、又はそのような経路内の分子であり得る。刺激性免疫チェックポイントは、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞によって発現されるポリペプチドであり得る。刺激性免疫チェックポイントは、膜受容体であり得る。刺激性免疫チェックポイントは、共刺激性受容体であり得る。共刺激性受容体は、Ｔ細胞共刺激性受容体又はＢ細胞共刺激性受容体であってもよい。刺激性免疫チェックポイントのリガンドは、膜結合型であってもよく、又は可溶性であってもよい。
【００７９】
刺激性免疫チェックポイントは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳから選択され得る。
【００８０】
刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、抗原特異的Ｂ細胞及び／又はＴ細胞応答を増幅させ得る。刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、共刺激性受容体とそのリガンドとの間の相互作用を増大させ得る。刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、（共）刺激性受容体に結合するリガンド分子を含み得る。刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、抗体（本明細書に記載される）、リポカリン、及びサイトカインから選択され得る。
【００８１】
リポカリンは、リポカリンを組み込んだ分子であってもよく、又はリポカリンの断片若しくは誘導体であってもよい。刺激性免疫チェックポイントのアゴニストとして作用する機能を保持するそのような分子は、「リポカリン」の定義に含まれる。
【００８２】
サイトカインは、サイトカインを組み込んだ分子であってもよく、又はサイトカインの断片若しくは誘導体であってもよい。刺激性免疫チェックポイントのアゴニストとして作用する機能を保持するそのような分子は、「サイトカイン」の定義に含まれる。
【００８３】
刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７のアゴニスト）、ＮＫＴＲ−２１４（ＣＤ１２２のアゴニスト）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７のアゴニスト）、ＴＲＸ５１８（ＧＩＴＲのアゴニスト）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０アゴニスト）、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、及びＭＥＤＩ６３８３（ＯＸ４０アゴニスト）から選択され得る。
【００８４】
ＤＮＡ損傷治療剤は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復標的化治療薬、ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、及びＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤から選択され得る。
【００８５】
ＤＮＡ損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び放射線から選択され得る。アルキル化剤は、白金含有剤、シクロホスファミド、及びブスルファンから選択され得る。白金含有剤は、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンから選択され得る。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤から選択され得る。トポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン及びトポテカンから選択され得る。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、エトポシド及びアントラサイクリンから選択され得る。アントラサイクリンは、ドキソルビシン及びエピルビシンから選択され得る。放射線は、電離放射線であり得る。
【００８６】
ＤＮＡ修復標的化治療薬は、非相同末端結合の阻害剤、相同組換えの阻害剤、ヌクレオチド除去修復の阻害剤、塩基除去修復の阻害剤、及びファンコーニ貧血経路の阻害剤から選択され得る。非相同末端結合の阻害剤は、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、及びＮＵ７０２６から選択され得る。塩基除去修復の阻害剤は、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ  １阻害剤、ＡＰＥＸ  ２阻害剤、及びリガーゼＩＩＩ阻害剤から選択され得る。
【００８７】
ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤は、ＡＴＭ阻害剤、ＣＨＫ  １阻害剤、及びＣＨＫ  ２阻害剤から選択され得る。ＡＴＭ阻害剤は、ＣＰ４６６７２２及びＫＵ−５５９３３から選択され得る。ＣＨＫ  １阻害剤は、ＸＬ−８４４、ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、及びＰＦ００４７７７３６から選択され得る。ＣＨＫ  ２阻害剤は、ＸＬ−８４４、ＡＺＤ７７６２、及びＰＦ００４７７７３６から選択され得る。
【００８８】
ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤は、Ｗｅｅ１キナーゼ阻害剤、及びＣＤＣ２５ａ、ｂ、又はｃ阻害剤から選択され得る。
【００８９】
ＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び熱ショックタンパク質阻害剤から選択され得る。
【００９０】
熱ショックタンパク質阻害剤は、ゲルダナマイシン及びＡＵＹ９２２から選択され得る。
【００９１】
別途定義されない限り、本明細書に使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法、デバイス、及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法、デバイス、及び材料が、以下に記載されている。
【００９２】
本出願に引用されているすべての刊行物、公開特許文献、及び特許出願は、本出願が属する分野の当業者（複数可）のレベルを示すものである。本明細書に引用されているすべての刊行物、公開特許文献、及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物、公開特許文献、又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という冠詞は、１つ又は１つを上回る（すなわち、少なくとも１つの）その冠詞の文法上の目的物を指して本明細書に使用される。例として、「１つの要素」とは、別途そうでないことが明示的に示されない限り、１つ又は１つを上回る要素を意味する。
【００９４】
がんにおける現在の研究努力の主な目標は、分子パラメーターを臨床治療の決定に組み込むことにより、患者における周術期の全身治療の効力を増大させることである。薬理遺伝学／ゲノミクスは、外来の化合物又は薬物に対する個体の応答に関与する遺伝的要因／ゲノム的要因の研究である。本発明のマーカーの発現に対して刺激性効果又は阻害性効果を有する作用剤又は調節剤は、患者におけるがんを治療（予防的又は治療的に）するために、個体に投与することができる。このような治療と併せて、個体における薬理ゲノミクスを考慮することもまた、理想的である。治療薬の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との関連性を変化させることにより、重大な毒性又は治療失敗を引き起こすおそれがある。したがって、個体の薬理ゲノミクスを理解することにより、予防的治療又は療法的治療に有効な薬剤（例えば、薬物）の選択が可能となる。このような薬理ゲノミクスは、さらに、適切な投薬量及び治療レジメンを決定するために使用することができる。したがって、個体における本発明のマーカーの発現レベルを決定して、それによって、個体の療法的治療又は予防的治療に適した薬剤（複数可）を選択することができる。
【００９５】
本発明は、がん組織において発現される遺伝子又は遺伝子産物のマーカー（本明細書において、以降「バイオマーカー」と称される）の固有な集合を対象とする。異なる態様において、このバイオマーカーのリストは、マイクロアレイ、Ｑ−ＰＣＲ、配列決定（例えば、ＲＮＡ  ｓｅｑ）、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、又はｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現を定量化することができる他の技術など、当該技術分野で公知の方法を使用して提供することができる、単一パラメーター又は多重パラメーターの予測試験の基盤を形成し得る。
【００９６】
本発明はまた、細胞毒性化学療法又はがんのための特定の治療の選択の後の予後診断に有用なキット及び方法にも関する。一部又はすべての転写物が過剰発現又は過少発現される場合に、発現プロファイルが、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対する応答性又は耐性を示すような方法が、提供される。これらのキット及び方法は、がんを有する患者の腫瘍において差次的に発現される遺伝子又は遺伝子産物のマーカーを用いる。本発明の一実施形態において、これらのバイオマーカーの発現プロファイルは、任意選択でＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの１つ又は複数の免疫チェックポイント治療薬に対する応答性と発現プロファイルとを相関付けるデータベース又はモデルを作成するための統計学的方法又は相関モデルの下で、保管組織サンプルにおける臨床転帰（応答又は生存）と相関付けられる。次いで、この予測モデルを、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対する応答性が判明していない患者における応答性を予測するために使用してもよい。多数の他の実施形態において、患者集団は、患者の臨床転帰、予後、又は阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／若しくは刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対する応答性に基づいて、少なくとも２つのクラスに分割することができ、バイオマーカーは、これらの患者クラスの間におけるクラス区分と実質的に相関している。本明細書に記載される生物学的経路は、悪性度及びステージと同様、疾患としてのがんに共通しており、そのため、分類器及び方法は、単一のがん疾患タイプに限定されない。
【００９７】
予測マーカーパネル／発現分類器
がんの治療に使用される阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬といった治療剤に対する応答性又は耐性を判定するのに有用である、がん組織に発現される遺伝子の分類器としての固有なバイオマーカーの集合が、提供される。このような集合は、「マーカーパネル」、「発現分類器」、又は「分類器」と称され得る。
【００９８】
本方法において有用ないくつかのバイオマーカーが、表１に特定されている。これらのバイオマーカーは、治療剤に対する患者の応答又はその欠如を判定するための予測値を有するとして特定される。バイオマーカーの発現は、ある薬剤に対する応答、より詳細には、任意選択でＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対する応答と相関する。腫瘍における特定されたバイオマーカーの集合の発現を調べることにより、どの治療剤又は治療剤の組合せが、がん、及び一部の実施形態においては乳がん細胞又は卵巣がん細胞の増殖速度を低減させる可能性が最も高いかを判定することが可能である。特定された転写物遺伝子マーカー又は遺伝子産物マーカーの集合を調べることにより、どの治療剤又は治療剤の組合せが、がんの増殖速度を低減させる可能性が最も低いかを判定することも可能である。したがって、バイオマーカーの集合の発現を調べることにより、効果がない又は適切でない治療剤を排除することが可能である。重要なことには、ある特定の実施形態において、これらの判定を、患者ごと又は薬剤ごとに行うことができる。したがって、特定の治療レジメンが特定の患者若しくは患者タイプに有益である可能性が高いかどうか、及び／又は特定のレジメンを継続すべきかどうかを判定することができる。
【００９９】
【表１】
2018524990.tif 000003
2018524990.tif 000004
2018524990.tif 000005
2018524990.tif 000006
2018524990.tif 000007
【表２】
2018524990.tif 000008
表１に列挙されているバイオマーカーのすべて又は一部分が、予測バイオマーカーパネルに使用され得る。例えば、表１のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのパネルは、本明細書に提供される方法を使用して生成することができ、表１に記載されているバイオマーカーのうちの１つからすべてを、あらゆる組合せで（例えば、４つの選択されたバイオマーカー、１６個の選択されたバイオマーカー、７４個の選択されたバイオマーカーなど）含み得る。一部の実施形態において、予測バイオマーカーセットは、少なくとも５個、１０個、２０個、４０個、６０個、１００個、１５０個、２００個、又は３００個以上のバイオマーカーを含む。他の実施形態において、予測バイオマーカーセットは、５個以下、１０個以下、２０個以下、４０個以下、６０個以下、１００個以下、１５０個以下、２００個以下、３００個以下、４００個以下、５００個以下、６００個以下、又は７００個以下のバイオマーカーを含む。一部の実施形態において、予測バイオマーカーセットは、表１に列挙される複数のバイオマーカーを含む。一部の実施形態において、予測バイオマーカーセットは、表１に列挙されるバイオマーカーのうち、少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％を含む。選択された予測バイオマーカーセットは、本明細書に記載される方法及び当該技術分野で公知の類似の方法を使用して提供された予測バイオマーカーから構築することができる。一実施形態において、バイオマーカーパネルは、表１の２０３個すべてのバイオマーカーを含む。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表１又は２の４０個又は４４個のバイオマーカーを含む。
【０１００】
予測バイオマーカーセットは、実規模で大きさが変化する対応するスカラー重みと組み合わせて定義され得るが、それらをさらに、線形手段若しくは非線形手段、代数手段、三角手段、又は相関手段により、代数アルゴリズム、統計的学習アルゴリズム、ベイズアルゴリズム、回帰アルゴリズム、又は類似のアルゴリズムを介して組み合わせて、単一のスカラー値が得られる。これらのアルゴリズムを、数学的に導き出されたそのスカラー値に関する決定関数とともに用いて、サンプルからの発現プロファイルを、特定の薬物又は薬物クラスに対して応答するもの又は応答しないもの、耐性であるもの又は耐性でないものという別々のクラスに分解することができる予測モデルが得られる。バイオマーカーメンバーシップを含むそのような予測モデルは、重み学習及び決定閾値により開発され、薬物応答及び／又は耐性が判明している過去の患者サンプルからの代表的な発現プロファイルのセットから、交差検証、ブートストラッピング、又は類似のサンプリング技法に基づいて、感度、特異度、陰性的中率及び陽性的中率、ハザード比、又はそれらの任意の組合せに関して最適化される。
【０１０１】
一実施形態において、バイオマーカーは、それらのシグナルの加重和を形成するために使用されるが、個々の重みは正であっても負であってもよい。結果として得られる和（「決定関数」）が、所定の基準点又は基準値と比較される。基準点又は基準値との比較を使用して、臨床状態又は臨床転帰を診断又は予測することができる。
【０１０２】
上述のように、当業者であれば、表１に提供されている分類器に含まれるバイオマーカーが、治療剤に対する応答性又は耐性に関する分類器では重みが等しくならないことを理解するであろう。したがって、わずか１つの配列を使用して、治療剤に対する応答性などの転帰を診断又は予測することはできるが、特異度及び感度又は診断精度若しくは予測精度は、より多くの配列を使用することで向上し得る。
【０１０３】
本明細書に使用されるとき、「重み」という用語は、統計学的計算における項目の相対的な重要性を指す。遺伝子発現分類器における各バイオマーカーの重みは、当該技術分野で公知の分析方法を使用して、患者サンプルのデータセットで決定され得る。
【０１０４】
一実施形態において、バイオマーカーパネルは、表２Ａに詳述されている４０個のバイオマーカーを、例えば、疾患の環境に応じて、表に詳述されている対応する順位及び重み又は代替的な順位付け及び重み付けとともに、対象とする。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表２Ｂに詳述されている４４個のバイオマーカーを、例えば、疾患の環境に応じて、表に詳述されている対応する順位及び重み又は代替的な順位付け及び重み付けとともに、対象とする。表２Ａ及び表２Ｂは、分類器での重みが高い順に、バイオマーカーを順位付けており、これは、交差検証下で測定される複合決定スコア関数における平均重みの順位として定義される。表２Ｃは、表２Ａ及び２Ｂの遺伝子を表すプローブセットを、それらの配列番号を参照して示す。表２Ｄは、シグネチャー内の遺伝子のアレイに存在していたアンチセンスプローブ配列を示す。
【０１０５】
【表３】
2018524990.tif 000009
2018524990.tif 000010
【表４】
2018524990.tif 000011
2018524990.tif 000012
【表５】
2018524990.tif 000013
2018524990.tif 000014
2018524990.tif 000015
【表６】
2018524990.tif 000016
2018524990.tif 000017
異なる実施形態において、表２Ａ及び表２Ｂに列挙されているバイオマーカーのサブセットを、本明細書に記載の方法で使用することができる。これらのサブセットは、表２Ａ又は表２Ｂの１〜２位、１〜３位、１〜４位、１〜５位、１〜１０位、１〜２０位、１〜３０位、１〜４０位、１〜４４位、６〜１０位、１１〜１５位、１６〜２０位、２１〜２５位、２６〜３０位、３１〜３５位、３６〜４０位、３６〜４４位、１１〜２０位、２１〜３０位、３１〜４０位、及び３１〜４４位の順位のバイオマーカーを含むが、これらに限定されない。一態様において、治療応答性は、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、及びＭＸ１のうちの少なくとも１つと、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において予測され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６に等しい。本明細書に使用されるとき、「バイオマーカー」という用語は、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、又は遺伝子発現レベル若しくはタンパク質産生レベルのいずれかを示す任意の他の核酸配列若しくはポリペプチド配列を指し得る。一部の実施形態において、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、又はＡＬ１３７２１８．１のバイオマーカーに言及する場合、バイオマーカーは、それぞれ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２Ｉ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、又はＡＬ１３７２１８．１のｍＲＮＡを含む。さらなる実施形態又は他の実施形態において、ＭＸ１、ＧＢＰ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＢＩＲＣ３、ＩＧＪ、ＩＱＧＡＰ３、ＬＯＣ１００２９４４５９、ＳＩＸ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＴＡＴ１、ＴＯＢ１、ＵＢＤ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ２ｏｒｆ１４、ＥＰＳＴＩ、ＧＡＬＮＴ６、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＫＩＡＡ１２４４、ＬＯＣ１００２８７９２７、ＬＯＣ１００２９１６８２、又はＬＯＣ１００２９３６７９のバイオマーカーに言及する場合、バイオマーカーは、それぞれ、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＢＩＲＣ３、ＩＧＪ、ＩＱＧＡＰ３、ＬＯＣ１００２９４４５９、ＳＩＸ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＴＡＴ１、ＴＯＢ１、ＵＢＤ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ２ｏｒｆ１４、ＥＰＳＴＩ、ＧＡＬＮＴ６、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＫＩＡＡ１２４４、ＬＯＣ１００２８７９２７、ＬＯＣ１００２９１６８２、又はＬＯＣ１００２９３６７９のアンチセンス転写物を含む。
【０１０６】
さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、及びＭＸ１と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、又はがん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＧＢＰ５と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＩＤＯ１と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＭＸ−１と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９に等しい。
【０１０７】
さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、及びＩＦＩ４４Ｌのうちの少なくとも２つと、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、及びＩＦＩ４４Ｌと、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＣＸＣＬ１０と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＭＸ１と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＩＤＯ１と、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３に等しい。さらなる態様において、個体に由来する生物サンプルにアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーＩＦＩ４４Ｌと、表２Ｂのバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個のさらなるバイオマーカーのうちの１つとに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、がん診断が示され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３に等しい。
【０１０８】
他の実施形態において、表２Ｃに列挙されているプローブ（配列番号８３〜２０２）又はそれらのサブセットは、本明細書に記載の方法において使用することができる。これらのサブセットは、ＧＢＰ５、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＭＸ１、ＩＦ１４４ｌ、ＣＤ２、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、及びＡＰＯＬ３のうちの１つ又は複数に対応する配列番号のサブセットを含むがこれらに限定されない。他の実施形態において、プローブは、バイオマーカーＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のすべてに対応する。それぞれのサブセットが、同じバイオマーカーに対する複数のプローブを含んでもよいことが理解されるべきである。例えば、配列番号１３５、１４０、１４２、及び１９５によって表されるプローブは、すべてがＧＢＰ５を対象とする。したがって、ＧＢＰ５を対象とするプローブ又はＧＢＰ５に対応するプローブを含むサブセットは、配列番号１３５、１４０、１４２、及び１９５のうちの１つ又は複数を含む。ＣＸＣＬ１０を対象とするプローブ又はＣＸＣＬ１０に対応するプローブを含むサブセットは、配列番号１３１及び１６０のうちの１つ又は複数を含む。
【０１０９】
他の実施形態において、特定の核酸増幅アッセイ（例えば、ｑＰＣＲなどのＰＣＲ）を使用して、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子セットのうちの１つ又は複数の発現レベルを決定することができる。遺伝子のうちの１つ又は複数の発現レベル（複数可）は、１つ又は複数の遺伝子の配列とハイブリダイズするプライマー（プライマー対）及び／又はプローブを使用して判定することができる。例示的なプライマー対及びプローブを、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの遺伝子のそれぞれについて、表２Ｅに示す。それぞれの遺伝子について示されているプライマー対及び／又はプローブは、単独で使用してもよく、又はプライマー対及び／若しくはプローブのうちの２つ以上を、本明細書に記載される遺伝子のセットのいずれかに応じて組み合わせて使用してもよい。例えば、表２Ｅに示されるプライマー対及び／又はプローブを使用して、表３〜４５に示される遺伝子シグネチャーのいずれかの発現レベルを決定することができる。例示的なＰＣＲアッセイを、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの遺伝子のそれぞれについて、表２Ｅにまとめる。それぞれの遺伝子について示されているＰＣＲアッセイは、単独で使用してもよく、又はアッセイのうちの２つ以上を、本明細書に記載される遺伝子のセットのいずれかに応じて組み合わせて使用してもよい。例えば、表に示されるＰＣＲアッセイを使用して、表３〜４５に示される遺伝子シグネチャーのいずれかの発現レベルを決定することができる。
【０１１０】
【表７】
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本明細書に記載されるそれぞれの配列の補体を必要に応じて（例えば、プローブ及び／又はプライマー（プライマー対を含む）のハイブリダイゼーションの設計のために）用いてもよいことに留意すべきである。
【０１１１】
４４遺伝子シグネチャーの選択を表すさらなる遺伝子シグネチャーが本明細書に記載されており、本発明のすべての態様に適用可能である。さらなる遺伝子シグネチャーは、（本明細書でさらに説明されるように）最終的なシグネチャースコアを計算する際に利用され得る好適な重み及びバイアススコアとともに、表３〜４５に記載されている。各シグネチャーのｋ値は、当業者には容易に理解されるように、陽性のシグネチャースコアを定義するための閾値が決定されると、設定することができる。同様に、シグネチャー内の各遺伝子の順位は、各遺伝子に与えられた重みを考察することによって容易に判定することができる（重みが大きいことは、シグネチャー内での順位が高いことを示し、４０遺伝子及び４４遺伝子のシグネチャーに関する順位については、それぞれ、表２Ａ及び２Ｂを参照されたい）。
【０１１２】
表３〜４５は、各シグネチャー内のそれぞれの遺伝子についての例示的な重み及びバイアスを示すが、これらの表により示される遺伝子シグネチャーは示された特定の重み及びバイアスに限定されないことが理解される。重みの値は、本発明による陽性のシグネチャースコアを示すために測定される発現の方向性を示し得る。したがって、正の重みは、遺伝子発現の増大が陽性のシグネチャースコア／ＤＤＲＤ生物学的様態の特定に寄与することを示し、逆も同様である。
【０１１３】
表３〜４５に含まれる遺伝子の発現を調査するのに好適なプローブ及びプローブセットは、表２Ｃ及び表２Ｄに示されている。加えて、表３〜４５に含まれる遺伝子の発現を調査するのに好適なＰＣＲアッセイが、表２Ｅに示されている。
【０１１４】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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分類器モデルを使用した遺伝子発現の測定
様々な方法が、バイオマーカーを特定し疾患を診断する試みにおいて用いられてきた。タンパク質に基づくマーカーについては、これらの方法として、２次元電気泳動法、質量分析法、及び免疫アッセイ法が挙げられる。核酸マーカーについては、これの方法として、ｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、メチル化プロファイル、及び大規模遺伝子発現アレイが挙げられる。
【０１１５】
あるバイオマーカーが、個体における異常なプロセス、疾患、又は他の状態を示すか又はそれらの兆候である場合、そのバイオマーカーは、一般に、個体における正常なプロセス、疾患又は他の状態の非存在を示すか又はそれらの兆候であるバイオマーカーの発現レベル又は値と比較して、過剰発現又は過少発現していると説明される。「上方制御」、「上方制御された」、「過剰発現」、「過剰発現された」、及びその任意の変化形は、生物サンプルにおけるバイオマーカーの値又はレベルが、健康又は正常な個体に由来する同様の生物サンプルにおいて典型的に検出されるバイオマーカーの値又はレベル（又は値若しくはレベルの範囲）よりも高いものであることを指して互換的に用いられる。これらの用語はまた、生物サンプルにおけるバイオマーカーの値又はレベルが、特定の疾患の異なるステージで検出され得るそのバイオマーカーの値又はレベル（又は値若しくはレベルの範囲）よりも高いものであることも指し得る。
【０１１６】
「下方制御」、「下方制御された」、「過少発現」、「過少発現された」、及びその任意の変化形は、生物サンプルにおけるバイオマーカーの値又はレベルが、健康又は正常な個体に由来する同様の生物サンプルにおいて典型的に検出されるバイオマーカーの値又はレベル（又は値若しくはレベルの範囲）よりも低いものであることを指して互換的に用いられる。これらの用語はまた、生物サンプルにおけるバイオマーカーの値又はレベルが、特定の疾患の異なるステージで検出され得るそのバイオマーカーの値又はレベル（又は値若しくはレベルの範囲）よりも低いものであることも指し得る。
【０１１７】
さらに、過剰発現又は過少発現されているバイオマーカーは、個体における正常なプロセス又は疾患若しくは他の状態の非存在を示すか又はそれらの兆候であるバイオマーカーの「正常な」発現レベル又は値と比較して「差次的に発現される」又は「差次的レベル」若しくは「差次的値」を有すると称することもできる。したがって、あるバイオマーカーの「差次的発現」は、そのバイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変動と称することもできる。
【０１１８】
「差次的バイオマーカー発現」及び「差次的発現」という用語は、あるバイオマーカーの発現が、特定の疾患を罹患している対象では、正常な対象におけるその発現と比べて、又は特定の治療法に差次的に応答するか若しくは異なる予後を有する患者におけるその発現と比べて、より高いか又はより低いレベルに活性化されている、バイオマーカーを指して互換的に用いられる。これらの用語はまた、発現が、同じ疾患の別のステージではより高いか又はより低いレベルに活性化される、バイオマーカーも含む。差次的に発現されるバイオマーカーは、核酸レベル若しくはタンパク質レベルで活性化若しくは阻害されていてもよく、又は異なるポリペプチド産物をもたらす選択的スプライシングを受けていてもよいことも理解される。そのような差異は、ｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、アンチセンス転写物レベル、又はポリペプチドのタンパク質表面発現、分泌、若しくは他の分配を含む、様々な変化により証明することができる。差次的バイオマーカー発現には、２つ以上の遺伝子若しくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比較、又は２つ以上の遺伝子若しくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比の比較、又はさらには同じ遺伝子の２つの異なって処理された産物の比較が含まれ得、これらは、正常な対象と疾患に罹患している対象との間、又は同じ疾患の様々なステージ間で異なる。差次的発現は、例えば、正常細胞と疾患細胞との間、又は異なる疾患事象若しくは疾患ステージを経験した細胞の間での、バイオマーカーの時間的又は細胞的発現パターンの定量的並びに定性的な差異の両方を含む。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、得られた発現プロファイルは、ゲノム又は核酸の発現プロファイルであり、サンプル中の１つ又は複数の核酸の量又はレベルが決定されている。これらの実施形態において、診断方法又は予後診断方法において用いられる発現プロファイルを生成するためにアッセイされるサンプルは、核酸サンプルである。この核酸サンプルには、分析されている細胞又は組織の表現型決定バイオマーカーの発現情報を含む核酸集団が含まれる。一部の実施形態において、サンプルを得た宿主細胞又は組織の発現情報をサンプルが保持している限り、核酸には、ＲＮＡ核酸又はＤＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが含まれ得る。サンプルは、当該技術分野で公知のように、いくつかの異なる方法で、例えば、細胞からｍＲＮＡを単離することによって調製することができ、ここで、この単離されたｍＲＮＡは、差次的遺伝子発現の分野で公知のように、単離されたままの状態で使用されるか、増幅されるか、又はｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどを調製するために用いられる。したがって、サンプル中のｍＲＮＡのレベルの判定には、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの調製、及びその後のｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの測定が含まれる。サンプルは、典型的には、例えば、組織生検によって、治療を必要とする対象から採取した細胞又は組織から、標準的なプロトコルを使用して調製され、ここで、そのような核酸を生成することができる細胞種又は組織には、疾患細胞又は組織、体液などが含まれるがこれらに限定されない、判定しようとする表現型の発現パターンが存在する任意の組織が含まれる。
【０１２０】
発現プロファイルは、任意の従来的なプロトコルを使用して、最初の核酸サンプルから生成することができる。差次的遺伝子発現／バイオマーカー分析の分野で用いられるものなど、発現プロファイルを生成する様々な異なる様式が公知であるが、発現プロファイルを生成するための１つの代表的で便宜的な種類のプロトコルは、アレイに基づく遺伝子発現プロファイル生成プロトコルである。そのような適用例は、生成するプロファイルにおいてアッセイ／プロファイリングしようとする遺伝子のそれぞれの「プローブ」核酸を示す核酸が用いられるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイにおいて、標的核酸のサンプルは、まず、アッセイされる初期核酸サンプルから最初に調製され、ここで、調製には、標識、例えば、シグナル産生系のメンバーを用いた標的核酸の標識化が含まれ得る。標的核酸サンプルの調製後、サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させ、それによって、アレイ表面に結合したプローブ配列に相補的な標的核酸の間で複合体が形成される。次いで、ハイブリダイズした複合体の存在を、定性的又は定量的に検出する。本主題の方法で用いられる発現プロファイルを生成するために実施され得る特定のハイブリダイゼーション技術としては、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２８８，６４４号、同第５，３２４，６３３号、同第５，４３２，０４９号、同第５，４７０，７１０号、同第５，４９２，８０６号、同第５，５０３，９８０号、同第５，５１０，２７０号、同第５，５２５，４６４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５８０，７３２号、同第５，６６１，０２８号、同第５，８００，９９２号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）、並びに国際公開第９５／２１２６５号、同第９６／３１６２２号、同第９７／１０３６５号、同第９７／２７３１７号、欧州特許第３７３２０３号、及び同第７８５２８０号に記載される技術が挙げられる。これらの方法では、発現をアッセイするバイオマーカーのそれぞれについて１つのプローブを含む「プローブ」核酸のアレイを、上述のように標的核酸と接触させる。接触は、ハイブリダイゼーション条件下、例えば、上述のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において実行し、次いで、未結合の核酸を除去する。結果として得られるハイブリダイズした核酸のパターンは、プローブされたバイオマーカーのそれぞれの発現に関する情報を提供し、ここで、発現情報は、その遺伝子が発現しているかどうか、及び典型的に、発現データ、すなわち、発現プロファイルが、定性的及び定量的の両方であり得る場合には、どのレベルで発現しているかに関するものである。
【０１２１】
バイオマーカー発現分類器の作成
一実施形態において、がん組織におけるバイオマーカーの相対発現レベルを測定して、遺伝子発現プロファイルを形成する。患者組織サンプルから得られたバイオマーカーのセットの遺伝子発現プロファイルを、複合決定スコアの形式でまとめ、患者データの訓練セットから数学的に導き出されたスコア閾値と比較する。スコア閾値により、治療に対する応答性／非応答性などであるがそれらに限定されない様々な特徴に基づいて患者群が分離される。患者訓練セットデータは、予後、再発の可能性、長期生存、臨床転帰、治療応答、診断、がん分類、又は個別化されたゲノミクスプロファイルにより特徴付けられている、がん組織サンプルに由来することが好ましい。患者サンプルから得られた発現プロファイル及び対応する決定スコアは、数学的に得られたスコア決定閾値の同じ側にある訓練セット内の患者サンプルの特徴と相関付けることができる。線形分類器のスカラー出力の閾値は、訓練データセット内で観察される交差検証下における感度及び特異度の合計を最大化するように最適化される。
【０１２２】
所与のサンプルの全体的な発現データを、出発物質の量の差、抽出効率の差及び増幅反応の効率の差などについて補正するために、当業者に公知の方法を用いて正規化する。線形分類器を正規化されたデータに使用して診断判定又は予後判定（例えば、治療剤に対する応答性又は耐性）を行うことは、事実上、データ空間、すなわち、分類器内のすべての遺伝子の発現値のすべての可能性のある組合せを、分離超平面によって２つの交わりを持たない空間に分割することを意味する。この分割は、大きな訓練例セットにおいて、例えば、治療剤に対する応答性又は耐性を示す患者から、経験的に導き出される。一般性を失うことなく、１つを除くすべてのバイオマーカーに対して、ある特定の固定の値のセットを想定することができ、それによってこの残りの１つのバイオマーカーの閾値は自動的に定まるが、決定は、例えば、治療剤に対する応答性か耐性かで変化することになる。この動的閾値を上回る発現の値は、その結果、治療剤に対する耐性（負の重みを有するバイオマーカーについて）又は応答性（正の重みを有するバイオマーカーについて）のいずれかを示すことになる。この閾値の正確な値は、分類器内の他のすべてのバイオマーカーの実際に測定された発現プロファイルに依存するが、ある特定のバイオマーカーの全体的な示度は固定のままである。すなわち、高い値又は「相対的過剰発現」は、常に、応答性（正の重みを有する遺伝子）又は耐性（負の重みを有する遺伝子）のいずれかに寄与する。したがって、全体的な遺伝子発現分類器に関して、相対的発現は、ある特定のバイオマーカーの上方制御又は下方制御が治療剤に対する応答性又は耐性を示すかどうかを示し得る。
【０１２３】
一実施形態において、患者組織サンプルのバイオマーカー発現プロファイルは、線形分類器によって評価される。本明細書に使用されるとき、線形分類器は、個々のバイオマーカー強度の加重和を複合決定スコアにしたもの（「決定関数」）を指す。決定スコアを、次いで、感度及び特異度に関するある特定の設定点に対応する所定のカットオフスコア閾値と比較し、それによって、サンプルがスコア閾値を上回る（決定関数陽性）か、又は下回る（決定関数陰性）かを示す。
【０１２４】
事実上、これは、データ空間、すなわち、バイオマーカー発現値のすべての可能性のある組合せのセットを、例えば、一方が治療剤に対する応答性に対応し、他方が耐性に対応する、異なる臨床分類又は予測に対応する２つの相互排他的な空間に分割することを意味する。全体的な分類器に関して、ある特定のバイオマーカーの相対的過剰発現は、決定スコアを増大させ得るか（正の重み）、又はそれを減少させ得（負の重み）、したがって、例えば、治療剤に対する応答性か耐性かの全体的な決定に寄与し得る。
【０１２５】
「曲線下面積」又は「ＡＵＣ」という用語は、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積を指し、これらはいずれも当該技術分野において周知である。ＡＵＣ尺度は、完全なデータ範囲にわたって分類器の精度を比較するのに有用である。ＡＵＣが大きい分類器ほど、未知のものを目的の２つの群（例えば、卵巣がんサンプルと正常又は対照サンプル）の間で正確に分類する能力が高い。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば、治療剤に応答する個体と応答しない個体）の間を区別する際に、特定の特徴（例えば、本明細書に記載されるバイオマーカーのうちのいずれか及び／又はその他の生物医学情報の任意の項目）の性能をプロットするのに有用である。典型的には、集団全体（例えば、症例及び対照）にわたる特徴データは、単一の特徴の値に基づいて昇順に類別される。次いで、その特徴のそれぞれの値について、データに関する真陽性率及び偽陽性率が計算される。真陽性率は、その特徴に関する値を上回る症例数を計数した後、それを症例の総数で除算することにより決定される。偽陽性率は、その特徴に関する値を上回る対照数を計数した後、それを対照の総数で除算することにより決定される。この定義は、特徴が症例において対照と比較して高くなっているシナリオを指すが、この定義は、特徴が症例において対照と比較して低いシナリオにも適用される（そのようなシナリオにおいては、その特徴に関する値を下回るサンプルを計数する）。ＲＯＣ曲線を、単一の特徴について、並びに他の単一の出力について作成することができ、例えば、２つ以上の特徴の組合せを数学的に組み合わせて（例えば、加算、減算、乗算するなど）、単一の合計値を得、この単一の合計値をＲＯＣ曲線としてプロットすることができる。さらに、複数の特徴の任意の組合せ（この組合せにより単一の出力値が導き出さる）を、ＲＯＣ曲線としてプロットすることができる。これらの特徴の組合せは、試験を含んでもよい。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１−特異度）に対する試験の真陽性率（感度）のプロットである。
【０１２６】
この数、すなわち、治療剤に対するカットオフ閾値応答性又は耐性の解釈は、開発段階（「訓練」）において、転帰が判明している患者のセットから導き出される。決定スコアの対応する重み及び応答性／耐性カットオフ閾値は、当業者には公知の方法によって訓練データから事前に確定されている。本発明の方法の好ましい実施形態において、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）が、重みを決定するために使用される。（Ｌ．Ｓｔａｈｌｅ，Ｓ．Ｗｏｌｄ，Ｊ．Ｃｈｅｍｏｍ．１（１９８７）１８５−１９６、Ｄ．Ｖ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｍ．Ｒｏｃｋｅ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８（２００２）３９−５０）。がん分類器の転写物に適用する場合には、当業者には公知の、分類を実施するための他の方法を、本明細書に記載の方法とともに用いてもよい。
【０１２７】
様々な方法を使用して、これらのバイオマーカーで測定された定量データを予後診断又は他の予測的使用に変換することができる。これらの方法としては、パターン認識（Ｄｕｄａら、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）、機械学習（Ｓｃｈｏｅｌｋｏｐｆら、Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｋｅｒｎｅｌｓ，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ２００２，Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９５）、統計学（Ｈａｓｔｉｅら、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）、バイオインフォマティクス（Ｄｕｄｏｉｔら、２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ａｓｓｏｃ．９７：７７−８７、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６５６７−６５７２）、又は計量化学（Ｖａｎｄｅｇｉｎｓｔｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９９８）の分野の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
訓練ステップにおいて、応答性／耐性の両方の事例の患者サンプルのセットを測定し、訓練セット又は将来のサンプルセットを最適に予測するように、この訓練データから固有の情報を使用して予測方法を最適化する。この訓練ステップにおいて、使用される方法は、特定の強度パターンから特定の予測判定までを予測するように訓練又はパラメーター化される。測定されたデータは、予後診断方法又はアルゴリズムにかける前に、好適な変換又は前処理ステップを行ってもよい。
【０１２９】
本発明の好ましい実施形態において、各転写物の前処理済みの強度値の加重和を形成し、これを、訓練セットで最適化された閾値と比較する（Ｄｕｄａら、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）。重みは、限定されるものではないが、部分最小二乗法（ＰＬＳ（Ｎｇｕｙｅｎら、２００２，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８（２００２）３９−５０））又はサポートベクターマシン（ＳＶＭ（Ｓｃｈｏｅｌｋｏｐｆら、Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｋｅｒｎｅｌｓ，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ２００２））などの複数の線形分類法により導き出すことができる。
【０１３０】
本発明の別の実施形態において、データを非線形的に変換してから、上述のように加重和を適用する。この非線形変換は、データの次元数を増加させることを含んでもよい。非線形変換及び加重和を、例えば、カーネル関数の使用によって、暗示的に実施することもできる。（Ｓｃｈｏｌｋｏｐｆら、Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｋｅｒｎｅｌｓ，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ２００２）。
【０１３１】
本発明の別の実施形態において、新しいデータサンプルを、実際に測定された訓練サンプル又は人工的に作出されたプロトタイプのいずれかである、２つ以上のクラスプロトタイプと比較する。この比較は、好適な類似性尺度、例えば、限定されるものではないが、ユークリッド距離（Ｄｕｄａら、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）、相関係数（Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０）などを使用して実施する。次いで、新しいサンプルを、最も近いプロトタイプの予後診断群、又は近傍にあるプロトタイプの数が最も多い予後診断群に割り当てる。
【０１３２】
本発明の別の実施形態においては、決定木（Ｈａｓｔｉｅら、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）又はランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ，Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５：５  ２００１）を使用して、転写物セット又はその産物の測定された強度データから予後診断判定を行う。
【０１３３】
本発明の別の実施形態においては、ニューラルネットワーク（Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９５）を使用して、転写物セット又はその産物の測定された強度データから予後診断判定を行う。
【０１３４】
本発明の別の実施形態においては、限定されるものではないが、線形、対角線形、二次、及びロジスティック判別分析を含む、判別分析（Ｄｕｄａら、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００１）を用いて、転写物セット又はその産物の測定された強度データから予後診断判定を行う。
【０１３５】
本発明の別の実施形態においては、マイクロアレイに関する予測分析（ＰＡＭ（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６５６７−６５７２））を使用して、転写物セット又はその産物の測定された強度データから予後診断判定を行う。
【０１３６】
本発明の別の実施形態においては、クラス類似性のソフト独立モデリング（ＳＩＭＣＡ（Ｗｏｌｄ，１９７６，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎ．８：１２７−１３９））を使用して、転写物セット又はその産物の測定された強度データから予後診断判定を行う。
【０１３７】
治療剤
上述のように、本明細書に記載される方法により、異常なＤＮＡ修復と関連する免疫シグナル伝達が増大した腫瘍を標的とする治療剤に対して応答性又は非応答性として、患者を分類することができる。特に、治療剤は、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬であり得る。一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントは、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡから選択される。一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ではない。一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントは、ＩＤＯである。一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、本明細書に定義される抗体及び阻害性核酸分子から選択される。一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストは、ＭＧＡ２７１（Ｂ７−Ｈ３を標的とする）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ、ＣＴＬＡ−４を標的とする）、インドキシモド（ＩＤＯ経路を標的とする）、ＮＬＧ９１９（ＩＤＯ経路を標的とする）、リリルマブ（ＫＩＲを標的とする）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ３を標的とする）、ＢＭＳ−９８６０１６（ＬＡＧ３を標的とする）、ＣＴ−０１１（ＰＤ−１遮断薬）、ニボルマブ／ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１遮断薬）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＰＤＬ１遮断薬）、及びペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＰＤ−１を標的とする）から選択され、任意選択で、アンタゴニストは、ペンブロリズマブではない。一部の実施形態において、刺激性免疫チェックポイントは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳから選択される。一部の実施形態において、刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、本明細書に定義される抗体、リポカリン、及びサイトカインから選択される。一部の実施形態において、刺激性免疫チェックポイントのアゴニストは、ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７のアゴニスト）、ＮＫＴＲ−２１４（ＣＤ１２２のアゴニスト）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７のアゴニスト）、ＴＲＸ５１８（ＧＩＴＲのアゴニスト）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０アゴニスト）、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、及びＭＥＤＩ６３８３（ＯＸ４０アゴニスト）から選択される。
【０１３８】
一部の実施形態において、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬は、「ＤＮＡ損傷治療剤」と組み合わせて投与され得る。本明細書に使用されるとき、「ＤＮＡ損傷治療剤」は、ＤＮＡを直接的に損傷することが知られている薬剤、ＤＮＡ損傷修復を防止する薬剤、ＤＮＡ損傷シグナル伝達を阻害する薬剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止を阻害する薬剤、及びＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスを阻害する薬剤を含む。がんを治療するために使用される、いくつかの現在のそのような治療剤としては、以下のＤＮＡ損傷治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
１）ＤＮＡ損傷剤：
ａ．アルキル化剤（シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンなどの白金含有剤；シクロホスファミド；ブスルファン）
ｂ．トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン；トポテカン）
ｃ．トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド；ドキソルビシン及びエピルビシンなどのアントラサイクリン）
ｄ．電離放射線
２）ＤＮＡ修復標的化治療薬
ａ．非相同末端結合の阻害剤（ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、ＮＵ７０２６）
ｂ．相同組換えの阻害剤
ｃ．ヌクレオチド除去修復の阻害剤
ｄ．塩基除去修復の阻害剤（ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ１阻害剤、ＡＰＥＸ２阻害剤、リガーゼＩＩＩ阻害剤）
ｅ．ファンコーニ貧血経路の阻害剤
３）ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤
ａ．ＡＴＭ阻害剤（ＣＰ４６６７２２、ＫＵ−５５９３３）
ｂ．ＣＨＫ  １阻害剤（ＸＬ−８４４、ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ００４７７７３６）
ｃ．ＣＨＫ  ２阻害剤（ＸＬ−８４４、ＡＺＤ７７６２、ＰＦ００４７７７３６）
４）ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤
ａ．Ｗｅｅ１キナーゼ阻害剤
ｂ．ＣＤＣ２５ａ、ｂ、又はｃ阻害剤。
５）ＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤
ａ．ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
ｂ．熱ショックタンパク質阻害剤（ゲルダナマイシン、ＡＵＹ９２２）
【０１４０】
疾患及び組織源
本明細書に記載される予測分類器は、がんを治療するための治療剤に対する応答性又は耐性を判定するのに有用である。本明細書に記載される生物学的経路は、悪性度及びステージと同様、がんそのものの特徴であり、そのため、単一のがん疾患タイプに限定されない。したがって、遺伝子又は遺伝子産物の集合を使用して、異なる組織における異なるがんタイプ全体にわたってがん治療薬の応答性を予測することができる。一実施形態において、この遺伝子又は遺伝子産物の集合は、乳がん腫瘍及び卵巣がん腫瘍の両方を評価するのに有用である。
【０１４１】
本明細書に使用されるとき、がんには、白血病、脳のがん、前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、咽喉がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、肺がん、肉腫、子宮頸がん、精巣がん、膀胱がん、内分泌がん、子宮内膜がん、食道がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵臓がん、下垂体がん、腎臓がん、頭頸部がんなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、任意選択でＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復標的化治療薬、ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、及びＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害（すなわち、本明細書に使用される用語「ＤＮＡ損傷治療剤」）と組み合わせて、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬のクラスの化学療法剤で治療されるがんに言及する。
【０１４３】
「生物サンプル」、「サンプル」、及び「試験サンプル」は、個体から得られるか、又はそうでなければ個体に由来する任意の材料、生物体液、組織、又は細胞を指して本明細書に互換的に使用される。これには、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、軟膜、血漿、及び血清を含む）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引物、呼気、尿、精液、唾液、髄液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、腹水、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液が含まれる。これには、前述のあらゆるものの実験により分離された画分も含まれる。例えば、血液サンプルは、血清、又は赤血球若しくは白血球などの特定の種類の血液細胞を含む画分に分画することができる（白血球）。必要に応じて、サンプルは、組織と体液サンプルとの組合せなど、個体に由来するサンプルの組合せであってもよい。「生物サンプル」という用語には、例えば、糞便サンプル、組織サンプル、又は組織生検などに由来する、均一化された固体材料を含有する材料も含まれる。「生物サンプル」という用語には、組織培養物又は細胞培養物に由来する材料も含まれる。生物サンプルを得るための任意の好適な方法を使用することができ、例示的な方法としては、例えば、静脈切開術、スワブ採取（例えば、頬内スワブ採取）、及び微細針吸引生検法が挙げられる。サンプルは、例えば、マイクロダイセクション（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）又はレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹採取（例えば、ＰＡＰ塗抹採取）、又は腸管洗浄によって採取することもできる。個体から得られるか、又は個体に由来する「生物サンプル」には、個体から得られた後、任意の好適な様式で処理されたあらゆるそのようなサンプルが含まれる。
【０１４４】
そのような場合、標的細胞は、腫瘍細胞、例えば、結腸がん細胞又は胃がん細胞であってもよい。標的細胞は、新しく得られたサンプル、凍結サンプル、生検サンプル、体液のサンプル、血液サンプル、パラフィン包埋固定組織サンプル（すなわち、組織ブロック）などの保存組織、又は細胞培養物などであるがこれらに限定されない、ヒト及び動物の組織を含む、任意の組織源に由来する。
【０１４５】
方法及びキット
遺伝子発現分析のためのキット
本明細書に記載される方法を実施するための試薬、器具、及び／又は説明書が、キットにおいて提供され得る。例えば、キットは、がん患者にとって適した治療法を決定するための試薬、器具、及び説明書を含み得る。そのようなキットは、生検などにより患者から組織サンプルを採取するための試薬、及びその組織を処理するための試薬を含み得る。キットには、患者のサンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを決定するための、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、プロテオミック分析、又は免疫組織化学法を行うための試薬など、バイオマーカー発現分析を実施するための１つ又は複数の試薬も含まれ得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマー、ノーザンブロット分析を行うためのプローブ、並びに／又はウエスタンブロット、免疫組織化学法、及びＥＬＩＳＡ分析などのプロテオミック分析を行うための抗体が、そのようなキットに含まれ得る。アッセイのための適切な緩衝液もまた、含まれ得る。これらのアッセイのいずれかに必要な検出試薬もまた、含まれ得る。適切な試薬及び方法は、以下でさらに詳細に説明される。
【０１４６】
本明細書において特徴付けられるキットには、バイオマーカー発現を測定するためのアッセイを実施するための方法を記載した説明書も含まれ得る。説明書はまた、基準コホートにおけるバイオマーカーの発現レベルを決定する方法及び試験患者との比較のための基準を確立するための発現データを集める方法など、基準コホートを決定するための方法に関する指示も含み得る。説明書は、試験患者におけるバイオマーカー発現をアッセイするための指示、及び発現レベルを基準コホートにおける発現と比較し、続いて試験患者に適した化学療法を決定するための指示も含み得る。適切な化学療法を決定するための方法は、上述の通りであり、説明書に詳細に記載され得る。
【０１４７】
キットに含まれる情報資料は、本明細書に記載される方法及び／又は本明細書に記載される方法のための試薬の使用に関する説明資料、指示資料、販売資料、又は他の資料であり得る。例えば、キットの情報資料は、問い合わせ先の情報、例えば、実際の住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、又は電話番号を含み得、そこから、キットの使用者は、遺伝子発現分析の実施及び結果の解釈（特に、結果が、あるヒトの特定の治療剤に対する陽性応答を有する可能性に当てはまる場合）に関する実質的な情報を取得することができる。
【０１４８】
本明細書において特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現から、患者が特定の治療剤に対する陽性応答を有する可能性を推測するために必要なソフトウェアを含んでもよい。
【０１４９】
ａ）遺伝子発現のプロファイリング方法
生物サンプルにおけるｍＲＮＡの測定は、生物サンプルにおける対応するタンパク質のレベルの検出の代わりに使用することができる。したがって、本明細書に記載されるバイオマーカー又はバイオマーカーパネルのいずれも、適切なＲＮＡを検出することによって検出することもできる。遺伝子発現プロファイリングの方法としては、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥ、質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲに続いてｑＰＣＲ）によって測定される。ＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製するために使用される。このｃＤＮＡは、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光が生じるｑＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。標準曲線との比較によって、ｑＰＣＲは、細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数など、絶対的な測定値を生成することができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、侵襲アッセイ、及びキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲはすべて、サンプルにおけるｍＲＮＡの発現レベルを測定するために使用されている。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい。
【０１５１】
ｍｉＲＮＡ分子は、コードはしないが、遺伝子発現を制御することができる低分子ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した方法のうちのいずれかを、対応するｍｉＲＮＡのために使用することもできる。近年、多くの研究室が疾患のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用について研究している。多くの疾患には、幅広い転写制御が関与しており、ｍｉＲＮＡがバイオマーカーとしての役割を有し得ることは驚くことではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾患との関係は、タンパク質レベルと疾患との関係よりもさらに不明確であることが多いが、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの価値は相当なものであり得る。当然ながら、疾患の際に差次的に発現されるいずれのＲＮＡでもそうであるように、インビトロ診断製品の開発が直面する問題には、ｍｉＲＮＡが罹患細胞中で生存し、分析のために容易に抽出されるという要件、又はｍｉＲＮＡが血液若しくは他の基質中に放出され、測定されるために十分に長い間そこで生存しなければならないという要件が含まれるであろう。タンパク質バイオマーカーも同様の要件を有するが、多くの可能性があるタンパク質バイオマーカーは、疾患の際に、パラクリン様式で病理部位及び機能部位において意図的に分泌される。多くの可能性のあるタンパク質バイオマーカーは、内部でこれらのタンパク質が合成されている細胞の外部において機能するように設計されている。
【０１５２】
遺伝子発現はまた、質量分析法を使用して評価することもできる。様々な構成の質量分析計を使用して、バイオマーカーの値を検出することができる。複数の種類の質量分析計が利用可能であるか、又は様々な構成で製造することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素：サンプル注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系、及び装置制御システム、並びにデータシステムを有する。サンプル注入口、イオン源、及び質量分析器の違いにより、一般に、装置の種類及びその能力が決まる。例えば、注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であってもよく、又はマトリックス支援レーザー脱離において使用されるような直接プローブ若しくはステージであってもよい。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレー及びマイクロスプレーを含むエレクトロスプレー、又はマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器としては、四重極マスフィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間質量分析器が挙げられる。さらなる質量分析法は、当該技術分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７  Ｒ−７１６Ｒ（１９９８）、Ｋｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００））を参照されたい）。
【０１５３】
タンパク質バイオマーカー及びバイオマーカー値は、以下のもののいずれかによって検出及び測定することができる：エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）、タンデム飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術（ウルトラフレックスＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれる）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ−（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、並びにイオントラップ質量分析。
【０１５４】
サンプル調製戦略が、タンパク質バイオマーカーの質量分析による特徴付け及びバイオマーカー値の判定の前に、サンプルを標識及び濃縮するために使用される。標識方法としては、相対的定量化及び絶対的定量化のための等質量（ｉｓｏｂａｒｉｃ）タグ（ｉＴＲＡＱ）並びに細胞培養物中のアミノ酸を用いた安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。質量分析の前に候補バイオマーカータンパク質のサンプルを選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬としては、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、選択的抗体足場（例えば、ダイアボディなど）、刷込みポリマー、アビマー、ペプチド模倣物、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、並びにこれらの修飾形態及び断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
前述のアッセイにより、がん治療剤の応答性を予測するための方法において有用であるバイオマーカー値の検出が可能となり、ここで、この方法は、個体に由来する生物サンプルにおいて、表１又は２に提供されるバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれが対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出するステップを含み、以下に詳述されるような、バイオマーカー値を使用した分類により、個体が治療剤に対して応答性であるかどうかを示す。記載されている予測バイオマーカーのうちのある特定のものは、単独で、治療剤に対する応答性を予測するのに有用であるが、２つ以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれが有用であるバイオマーカーの複数のサブセットのグループ化の方法も、本明細書に記載される。したがって、本出願の様々な実施形態は、Ｎが少なくとも３個のバイオマーカーである、Ｎ個のバイオマーカーを含む組合せを提供する。Ｎは、上述の範囲、並びに類似するがより高次の範囲のいずれかに由来する任意の数となるように選択することができることが理解される。本明細書に記載される方法のいずれかに従って、バイオマーカー値を、個別に検出及び分類することができるか、又は例えば多重アッセイ形式で集合的に検出及び分類することができる。
【０１５６】
ｂ）マイクロアレイ法
一実施形態において、本発明は、「オリゴヌクレオチドアレイ」（本明細書において「マイクロアレイ」とも呼ばれる）を利用する。マイクロアレイは、細胞におけるバイオマーカーの発現を分析するため、特に、がん組織のバイオマーカーの発現を測定するために用いることができる。
【０１５７】
一実施形態において、バイオマーカーアレイは、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能に標識されたポリヌクレオチド（例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成された蛍光標識ｃＤＮＡ又は標識化ｃＲＮＡ）をマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより作製される。マイクロアレイは、細胞又は生物のゲノムの遺伝子の多く、好ましくは大半の又はほとんど全ての遺伝子の産物の結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の整列したアレイを有する表面である。マイクロアレイは、当該技術分野で公知のいくつかの方法で作製することができる。どのように作製されたとしても、マイクロアレイはある特定の特性を共有する。アレイは再現性があり、所与のアレイの複数のコピーを作製し、容易に互いを比較することができる。マイクロアレイは、小さいことが好ましく、通常は５ｃｍ２より小さく、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定な材料から作製されている。マイクロアレイにおける所与の結合部位又は結合部位の固有のセットは、細胞内の単一の遺伝子の産物に特異的に結合する。特定の実施形態において、それぞれの位置に配列が判明している付着核酸を含む、位置を特定できるアレイが使用される。
【０１５８】
細胞のＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡを作製し、好適なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズさせる場合、任意の特定の遺伝子に対応するアレイ内の部位へのハイブリダイゼーションのレベルは、その遺伝子／バイオマーカーから転写されるｍＲＮＡの、細胞における占有率を反映することが理解されるだろう。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能に標識された（例えば、フルオロフォアを用いて）ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズさせた場合、細胞内の転写されない遺伝子に対応する（すなわち、遺伝子産物に特異的に結合することができる）アレイの部位は、シグナル（例えば、蛍光シグナル）をほとんど有さないか又は全く有さず、コードされるｍＲＮＡが多く存在する遺伝子は、相対的に強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に「特異的に結合する」又は「特異的にハイブリダイズする」ように、すなわち、プローブが相補的な核酸配列を有する配列アレイ部位にハイブリダイズするか、その部位と二本鎖を形成するか、又はその部位と結合するが、非相補的な核酸配列を有する部位にはハイブリダイズしないように、選択される。本明細書に使用されるとき、一方のポリヌクレオチド配列がもう一方のポリヌクレオチド配列に対して相補的であると考えられるのは、短い方のポリヌクレオチドの長さが２５塩基以下である場合には標準的な塩基対形成規則を使用してミスマッチが存在しないとき、又は短い方のポリヌクレオチドの長さが２５塩基よりも長い場合にはミスマッチが５％以下であるときである。ポリヌクレオチドは、完全に相補的である（ミスマッチがない）ことが好ましい。日常的な実験を使用して陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実行することにより、特定のハイブリダイゼーション条件が、特定のハイブリダイゼーションをもたらすことを実証することができる。
【０１５９】
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識されるプローブ及び固定されるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、オリゴマーか２００塩基より大きいポリヌクレオチドか）及び種類（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）に依存するであろう。核酸の特定の（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメーターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９８７）に記載されており、これは、あらゆる目的でその全体が組み込まれる。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用する場合、典型的なハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳにおいて６５℃で４時間のハイブリダイゼーション、次いで、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）において２５℃での洗浄、続いて高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）において２５℃で１０分間の洗浄である（Ｓｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐ．１０６１４（１９９６）を参照されたい）。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．（１９９３）及びＫｒｉｃｋａ，“Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９２）にも記載されている。
【０１６０】
ｃ）免疫アッセイ法
免疫アッセイ法は、抗体の、その対応する標的又は検体との反応に基づくものであり、特定のアッセイ形式に応じてサンプル中の検体を検出することができる。免疫反応性に基づいてアッセイ法の特異度及び感度を向上させるために、モノクローナル抗体を使用することが多く、これは、この抗体の特異的なエピトープ認識が理由である。ポリクローナル抗体もまた、様々な免疫アッセイでの使用が成功しているが、これは、ポリクローナル抗体が、モノクローナル抗体と比較して、標的に対する親和性が高いためである。免疫アッセイは、広範な生物サンプル基質とともに使用するように設計されている。免疫アッセイの形式は、定性的、半定量的、及び定量的な結果を提供するように設計されている。
【０１６１】
定量的結果は、検出しようとする特定の検体を既知の濃度で用いて作成した標準曲線を使用することで生成することができる。未知のサンプルからの応答又はシグナルを標準曲線にプロットし、未知のサンプル中の標的に対応する量又は値が確立される。
【０１６２】
多数の免疫アッセイ形式が設計されている。ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡは、検体／バイオマーカーの検出に関して、定量的であり得る。この方法は、検体又は抗体のいずれかへの標識の結合によるものであり、標識成分は、直接的又は間接的に、酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、検体の直接的検出、間接的検出、競合的検出、又はサンドイッチ検出用に形式化され得る。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）又は蛍光などの標識によるものである。さらなる技法としては、例えば、凝集法、比ろう法、比濁法、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどが挙げられる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｂｒｉａｎ  Ｌａｗ編、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．出版、２００５年版を参照されたい）。
【０１６３】
例示的なアッセイ形式としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、又は時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）免疫アッセイが挙げられる。バイオマーカーを検出するための手順の例としては、バイオマーカーの免疫沈降、それに続いてゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面エレクトロクロマトグラフィーなど、サイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量的方法が含まれる。
【０１６４】
検出可能な標識又はシグナル生成材料を検出及び／又は定量するための方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素（検出可能な標識が酵素である場合；上記を参照されたい）により触媒される反応の産物は、限定されるものではないが、蛍光、発光、若しくは放射性であり得るか、又はそれらは可視光若しくは紫外光を吸収し得る。そのような検出可能な標識を検出するのに好適な検出器の例としては、限定されるものではないが、ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光計、比色計、蛍光計、発光計、及び密度計が挙げられる。
【０１６５】
検出のための方法のうちの任意のものを、反応物の任意の好適な調製、処理、及び分析を可能にする任意の形式で実施することができる。これは、例えば、複数ウェルのアッセイプレート（例えば、９６ウェル若しくは３８４ウェル）で行ってもよく、又は任意の好適なアレイ若しくはマイクロアレイを使用するものであってもよい。様々な薬剤のストック溶液は、手作業又はロボットにより作製することができ、それに続くピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、サンプル読取り、データ収集、及び分析はすべて、検出可能な標識を検出することができる市販入手可能な分析ソフトウェア、ロボティクス、及び検出装置を用いてロボットで行うことができる。
【０１６６】
ｄ）配列決定
遺伝子発現はまた、様々な次世代シーケンシング技法を含む、配列決定方法を使用して判定することもできる。特定の実施形態においては、ＲＮＡｓｅｑが用いられ得る。
【０１６７】
臨床での使用
一部の実施形態において、治療レジメンに応答性であるがん患者を特定及び／又は選択するための方法が提供される。詳細には、本方法は、任意選択でＤＮＡを直接的又は間接的に損傷する薬剤と組み合わせて阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬を投与することを含む治療レジメンに対して応答性であるがん患者を特定又は選択することを対象とする。治療レジメンに対して非応答性である患者を特定するための方法もまた、提供される。これらの方法には、典型的は、患者の腫瘍（原発性、転移性、又は限定されるものではないが、血液若しくは血液中の成分、尿、唾液、及び他の体液など、腫瘍に由来する他の誘導体）（例えば、患者のがん細胞）における予測マーカーの集合の発現レベルを決定するステップ、その発現レベルを基準発現レベルと比較するステップ、及びサンプルにおける発現が、治療剤に対する応答又は非応答に対応する選択された予測バイオマーカー又はバイオマーカーのセットの発現のパターン又はプロファイルを含むかどうかを特定するステップが含まれる。
【０１６８】
一部の実施形態において、任意選択でＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対する個体の応答性を予測する方法は、以下の：個体から試験サンプルを得るステップ；試験サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップ（この１つ又は複数のバイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、及びＡＰＯＬ３からなる群から選択される）；発現レベルを捕捉する試験スコアを導き出すステップ；試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ；並びに試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み、試験スコアが閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される。当業者であれば、実施例１の教示を含む本明細書に提供される教示を使用して、適切な閾値スコア及び適切なバイオマーカー重み付けを決定することができる。
【０１６９】
他の実施形態において、任意選択でＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対する個体の応答性を予測する方法は、試験サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、ここで、１つ又は複数のバイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される。本方法は、発現レベルを捕捉する試験スコアを導き出すステップ、試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ、及び試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み得、試験スコアが閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される。表２Ａ及び２Ｂは、例示的な遺伝子シグネチャー（又は遺伝子分類器）を示し、ここで、バイオマーカーは、それぞれ、本明細書に列挙される遺伝子産物のうちの４０個又は４４個からなり、閾値スコアは、表に列挙される個々の遺伝子産物の重み付けから導き出される。バイオマーカーが表２Ｂに列挙される４４個の遺伝子産物からなり、バイオマーカーが表２Ｂに示される重み付けと関連している、これらの実施形態のうちの１つにおいて、閾値スコア０．３６８１を上回る試験スコアは、個体が、任意選択でＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対して応答性である可能性を示す。
【０１７０】
がんは、その増殖速度が、治療剤との接触の非存在下におけるその増殖と比較して、治療剤との接触の結果として阻害される場合、治療剤に対して「応答性」である。がんの増殖は、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズ又はその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現を測定することができる。
【０１７１】
がんは、その増殖速度が、治療剤との接触の非存在下におけるその増殖と比較して、治療剤との接触の結果として阻害されないか、又は非常に低い程度で阻害される場合、治療剤に対して「非応答性」である。上述の通り、がんの増殖は、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズ又はその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現を測定することができる。治療剤に対して非応答性であるという性質は、非常に可変的なものであり、異なるがんは、異なる条件下において所与の治療剤に対して異なるレベルの「非応答性」を呈する。なおもさらに、非応答性の尺度は、患者の生活の質、転移の程度などを含め、腫瘍の増殖サイズ以外のさらなる基準を使用して評価することができる。
【０１７２】
この試験の適用により、限定されるものではないが、全生存期間、無増悪生存期間、放射線応答（ＲＥＣＩＳＴによって定義される）、完全応答、部分的応答、疾患の安定、並びにＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、及びＣＡ１９−９などであるがこれらに限定されない血清学的マーカーを含む、エンドポイントを予測する。
【０１７３】
或いは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は免疫組織化学（ＩＨＣ）などを含む、１つ若しくは複数の核酸又はそれら生物学的誘導体、例えばコードされるタンパク質の、サンプルにおけるＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質の検出、定量化、及び定性化のための、アレイに基づくものではない方法を用いてもよい。
【０１７４】
アッセイされるサンプルから発現プロファイルを得た後、発現プロファイルを基準又は対照プロファイルと比較して、サンプルが得られた細胞又は組織、したがって、宿主の治療法応答性表現型に関する診断を行う。発現プロファイルに関連して本明細書に使用される「基準」及び「対照」という用語は、所与の患者の発現分類器を解釈し、予後若しくは予測クラスを割り当てるために使用される、遺伝子若しくは遺伝子産物の発現の標準化されたパターン又はある特定のバイオマーカーの発現レベルを意味する。基準又は対照発現プロファイルは、所望される表現型、例えば、応答性表現型を有することが判明しているサンプルから得られたプロファイルであってもよく、したがって、陽性の基準又は対照プロファイルであってもよい。さらに、基準プロファイルは、所望される表現型を有さないことが判明しているサンプルに由来するものであってもよく、したがって、陰性の基準プロファイルであってもよい。
【０１７５】
１つ又は複数の核酸のレベルを定量する方法として、定量的ＰＣＲを用いる場合、この方法は、二重標識された蛍光性プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によって放出される蛍光の測定を通じてＰＣＲ産物の蓄積を定量する。
【０１７６】
ある特定の実施形態において、得られた発現プロファイルを、単一の基準プロファイルと比較して、アッセイされるサンプルの表現型に関する情報を得る。さらに他の実施形態において、得られた発現プロファイルを、２つ以上の異なる基準プロファイルと比較して、アッセイされるサンプルの表現型に関するより詳細な情報を得る。例えば、得られた発現プロファイルを、陽性及び陰性の基準プロファイルと比較して、サンプルが目的の表現型を有するかどうかに関する確実な情報を得ることができる。
【０１７７】
得られた発現プロファイルと、１つ又は複数の基準プロファイルとの比較は、任意の便宜的な方法を使用して実施することができ、様々な方法、例えば、発現プロファイルのデジタル画像を比較することによるもの、発現データのデータベースを比較することによるものが、アレイの分野の当業者には公知である。発現プロファイルを比較する方法について記載した特許としては、限定されるものではないが、米国特許第６，３０８，１７０号及び同第６，２２８，５７５号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。発現プロファイルを比較する方法は、上記にも説明されている。
【０１７８】
比較ステップにより、得られた発現プロファイルが、１つ又は複数の基準プロファイルとどの程度類似するか又は類似していないかに関する情報が得られ、類似性の情報は、アッセイされるサンプルの表現型を判定するために用いられる。例えば、陽性対照との類似性は、アッセイされるサンプルが応答性基準サンプルと類似する応答性表現型を有することを示す。同様に、陰性対照との類似性は、アッセイされるサンプルが非応答性基準サンプルに対する非応答性表現型を有することを示す。
【０１７９】
バイオマーカーの発現レベルは、さらに、異なる基準発現レベルと比較することができる。例えば、基準発現レベルは、バイオマーカー又はバイオマーカーセットの発現が情報を与えるものであり、患者が応答性であるか又は非応答性であるかを判定するための評価を行うものであるかどうかを評定するための、所定の標準的な基準発現レベルあり得る。さらに、バイオマーカーの発現レベルの判定は、患者が応答性であるか又は非応答性であるかを判定するための評価を行うために、バイオマーカーと同時に測定される内部基準マーカーの発現レベルと比較してもよい。例えば、本発明のバイオマーカーを含まないが、一定の発現レベルを示すことが知られている異なるマーカーパネルの発現を、内部基準マーカーレベルとして評価することができ、バイオマーカー発現のレベルを、この基準と比較して判定する。代替的な例において、非腫瘍サンプルである組織サンプルにおける選択されたバイオマーカーの発現を、内部基準マーカーレベルとして評価してもよい。バイオマーカーの発現レベルは、ある特定の態様において、発現の増大として判定され得る。バイオマーカーの発現レベルは、他の態様において、発現の減少として判定され得る。発現レベルは、基準レベルと比較して、情報を与えるような変化がない発現として判定される場合もある。さらに他の態様において、発現レベルは、本明細書に提供される方法により決定される所定の標準発現レベルに対して判定される。
【０１８０】
本発明はまた、患者の従来的な治療を指導することにも関する。診断試験により、任意選択で組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬に対して応答者であることが判明した患者に、その治療薬を投与することができ、患者及び腫瘍専門医の両方が、患者が利益を得るであろうことを確信できる。診断試験により非応答者であることが示された患者は、その患者に利益を与える可能性がより高い代替的な治療薬が向いていると特定され得る。
【０１８１】
本発明はさらに、任意選択で組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストなどの免疫チェックポイント治療薬のクラスの新規な薬物の臨床試験のための患者を選択することに関する。試験集団に可能性のある応答者を増やすことにより、関連する基準において、その薬物のより完全な評価が促進されるであろう。
【０１８２】
本発明は、なおもさらに、患者を、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）と関連する自然免疫応答が増大したがんを有するとして診断する方法に関する。ＤＤＲＤは、患者の１つ又は複数の細胞が、ＤＮＡ損傷を修復する能力が低下している任意の状態として本明細書に定義され、この低下した能力が、腫瘍の発生又は増殖の原因要素となっている。ＤＤＲＤの診断は、ファンコーニ貧血／ＢＲＣＡ経路における変異と関連し得る。ＤＤＲＤの診断はまた、乳がん又は卵巣がんとも関連し得る。これらの診断方法は、個体から試験サンプルを得るステップ；試験サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップ（この１つ又は複数のバイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、及びＡＰＯＬ３からなる群を含む、表２Ｂ、２Ａ、又は１Ａから選択される）；発現レベルを捕捉する試験スコアを導き出すステップ；試験スコアとがんの診断とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ；及び試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み、試験スコアが閾値スコアを上回る場合、個体ががんを有すると判定される。当業者であれば、実施例１の教示を含む本明細書に提供される教示を使用して、適切な閾値スコア及び適切なバイオマーカー重み付けを決定することができる。
【０１８３】
他の実施形態において、患者を、ＤＤＲＤと関連する自然免疫応答が増大したがんを有し発症しているとして診断する方法は、試験サンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、この１つ又は複数のバイオマーカーは、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦ１４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１からなる群から選択される。本方法は、発現レベルを捕捉する試験スコアを導き出すステップ、試験スコアとがんの診断とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップ、及び試験スコアを閾値スコアと比較するステップを含み得、試験スコアが閾値スコアを上回る場合、個体ががんを有すると判定される。表２Ａ及び２Ｂは、例示的な遺伝子シグネチャー（又は遺伝子分類器）を示し、ここで、バイオマーカーは、それぞれ、本明細書に列挙される遺伝子産物のうちの４０個又は４４個からなり、閾値スコアは、そこに列挙される個々の遺伝子産物の重み付けから導き出される。バイオマーカーが、表２Ｂに列挙される４４個の遺伝子産物からなり、バイオマーカーが、表２Ｂに提供される重み付けと関連する、これらの実施形態のうちの１つにおいて、閾値スコア０．３６８１を上回る試験スコアは、がん又はがんを発症する可能性が高いという診断を示す。
【０１８４】
本発明はまた、以下の付番された付記において定義される。
【０１８５】
１．阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、方法。
【０１８６】
２．上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、付記１に記載の方法。
【０１８７】
３．上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、付記１又は２に記載の方法。
【０１８８】
４．
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される、
付記１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
５．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１９０】
６．ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１９１】
７．表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９２】
８．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
９．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
１０．表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
１１．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
１２．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、付記１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
１３．発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、付記１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
１４．ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、方法。
【０１９９】
１５．上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、付記１４に記載の方法。
【０２００】
１６．上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストに対する応答性を予測する、付記１４又は１５に記載の方法。
【０２０１】
１７．
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、応答性が予測される、
付記１４〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
１８．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
１９．ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
２０．表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
２１．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
２２．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０７】
２３．表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
２４．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記１４〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
２５．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、付記１４〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
２６．発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、付記１４〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２１１】
２７．阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、方法。
【０２１２】
２８．上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、付記２７に記載の方法。
【０２１３】
２９．少なくとも２つ遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、付記２７又は２８に記載の方法。
【０２１４】
３０．
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、効果的に治療することができるがんが特定される、
付記２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
３１．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
３２．ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
３３．表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１８】
３４．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
３５．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２２０】
３６．表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２２１】
３７．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記２７〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２２】
３８．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、付記２７〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０２２３】
３９．発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、付記２７〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２２４】
４０．ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、方法。
【０２２５】
４１．上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、付記４０に記載の方法。
【０２２６】
４２．上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）により、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストで効果的に治療することができるがんを特定する、付記４０又は４１に記載の方法。
【０２２７】
４３．
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、効果的に治療することができるがんが特定される、
付記４０〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
４４．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
４５．ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３０】
４６．表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
４７．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３２】
４８．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
４９．表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３４】
５０．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記４０〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
５１．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、付記４０〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
５２．発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、付記１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
５３．がんの治療を選択するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、表２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、方法。
【０２３８】
５４．上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を使用して、がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、付記５３に記載の方法。
【０２３９】
５５．上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）を使用して、がんの治療において使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、付記５３又は５４に記載の方法。
【０２４０】
５６．選択されたアンタゴニスト及び／又はアゴニストを使用してがんを治療するステップをさらに含む、付記５３〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
５７．
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、使用するための、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが選択される、
付記５３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
５８．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
５９．ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
６０．表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
６１．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
６２．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０２４７】
６３．表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
６４．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記５３〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
６５．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、付記５３〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
６６．発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、付記５３〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
６７．がんの治療を選択するための方法であって、
対象に由来するサンプルにおける、２Ｂ、２Ａ、又は１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、方法。
【０２５２】
６８．上記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を使用して、がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、付記６７に記載の方法。
【０２５３】
６９．上記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを決定するステップを含み、決定された発現レベルを使用して、組合せ試験スコアを生成し、陽性の組合せ試験スコア（一般的には閾値を上回るが、閾値以上であってもよい）を使用して、がんの治療において使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを選択する、付記６７又は６８に記載の方法。
【０２５４】
７０．選択されたアンタゴニスト及び／又はアゴニストをＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて使用して、がんを治療するステップをさらに含む、付記６７〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
７１．
（ｉ）発現レベルを捕捉する組合せ試験スコアを導き出すステップと、
（ｉｉ）組合せ試験スコアと応答性とを相関付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、
（ｉｉｉ）組合せ試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、組合せ試験スコアが閾値スコアを上回る場合、使用するための、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが選択される、
付記６７〜７０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
７２．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７１のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
７３．ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５８】
７４．表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５９】
７５．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７４のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
７６．ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
７７．表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子のそれぞれの発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７１のいずれか１つに記載の方法。７８．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記６７〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
７９．表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての発現レベルを決定するステップを含む、付記６７〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０２６３】
８０．発現レベルを決定するステップが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを用いる、付記６７〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０２６４】
８１．組合せ試験スコア（又は「シグネチャースコア」）が、式：
【数２】
2018524990.tif 000088
によって導き出され、式中、ｗｉは、各遺伝子の重みであり、ｂｉは、遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは、前処理後の遺伝子発現であり、ｋは、オフセット定数である、付記１〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０２６５】
８２．がんを治療する方法であって、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストを対象に投与するステップを含み、対象に由来するサンプルが、投与の前に、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出さた陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈することを特徴とする、方法。
【０２６６】
８３．がんを治療する方法であって、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストをＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて対象に投与するステップを含み、対象に由来するサンプルが、投与の前に、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈することを特徴とする、方法。
【０２６７】
８４．対象におけるがんの治療に使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストであって、上記アンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与の前に、対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈する、対象におけるがんの治療に使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニスト。
【０２６８】
８５．対象におけるがんの治療に使用するための阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニストであって、上記アンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与の前に、対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈し、上記アンタゴニスト及び／又はアゴニストが、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせて投与される、阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又は刺激性免疫チェックポイントのアゴニスト。
【０２６９】
８６．対象におけるがんの治療に使用するためのＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又はＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた刺激性免疫チェックポイントのアゴニストであって、上記アンタゴニスト及び／又はアゴニスト並びにＤＮＡ損傷治療剤の投与の前に、対象に由来するサンプルが、表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも２つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出された陽性の組合せ試験スコア、又は表２Ｂ、２Ａ、若しくは１からの少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの増大を呈する、ＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニスト及び／又はＤＮＡ損傷治療剤と組み合わせた刺激性免疫チェックポイントのアゴニスト。
【０２７０】
８７．組合せ試験スコア（又は「シグネチャースコア」）が、式：
【数３】
2018524990.tif 000089
によって導き出され、式中、ｗｉは、各遺伝子の重みであり、ｂｉは、遺伝子特異的バイアスであり、ｇｅｉは、前処理後の遺伝子発現であり、ｋは、オフセット定数である、付記８２若しくは８３の記載の方法、又は付記８４〜８６のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７１】
８８．組合せ試験スコアが、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも６つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、若しくは８７のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜８７のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７２】
８９．組合せ試験スコアが、ＭＸ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、及びＩＤＯ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、８７、若しくは８８のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜８８のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７３】
９０．組合せ試験スコアが、表１から選択される少なくとも１２個の遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、若しくは８７〜８９のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜８９のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７４】
９１．組合せ試験スコアが、表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＤ２、ＩＴＧＡＬ、ＰＴＰＲＣ、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１、ＣＤ３Ｄ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ５、ＳＴＡＴ１、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ３Ｅ、ＩＲＦ１、ＩＫＺＦ３、及びＩＧＪから選択される少なくとも１つの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、若しくは８７〜９０のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９０のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７５】
９２．組合せ試験スコアが、ＣＸＣＬ１０、ＭＸ１、ＩＤＯ１、ＩＦＩ４４Ｌ、ＣＤ２、ＧＢＰ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＴＧＡＬ、ＬＲＰ４、ＡＰＯＬ３、ＣＤＲ１、ＦＹＢ、ＴＳＰＡＮ７、ＲＡＣ２、ＫＬＨＤＣ７Ｂ、ＧＲＢ１４、ＡＣ１３８１２８．１、ＫＩＦ２６Ａ、ＣＤ２７４、ＣＤ１０９、ＥＴＶ７、ＭＦＡＰ５、ＯＬＦＭ４、ＰＩ１５、ＦＯＳＢ、ＦＡＭ１９Ａ５、ＮＬＲＣ５、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＥＧＲ１、ＣＬＤＮ１０、ＡＤＡＭＴＳ４、ＳＰ１４０Ｌ、ＡＮＸＡ１、ＲＳＡＤ２、ＥＳＲ１、ＩＫＺＦ３、ＯＲ２ｌ１Ｐ、ＥＧＦＲ、ＮＡＴ１、ＬＡＴＳ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＰＰ１Ｒ１Ａ、及びＡＬ１３７２１８．１のそれぞれの決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、若しくは８７〜９１のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９１のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７６】
９３．組合せ試験スコアが、表４〜４５のうちのいずれか１つからの遺伝子の決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、若しくは８７のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜８７のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７７】
９４．それぞれの遺伝子に対する重み値が、表２Ｂに示される通りであるか、又はそれぞれの遺伝子に対する重み値及び／若しくはバイアス値が、表３〜４５のうちのいずれか１つに示される通りである、付記８２、８３、若しくは８７〜９３のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９３のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７８】
９５．組合せ試験スコアが、表１（に記載の残りの遺伝子）から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、又は表２Ｂ（４４遺伝子のパネル）（に記載の残りの遺伝子）からの少なくとも１つのさらなる遺伝子と一緒に、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のうちの少なくとも１つから最大ですべての決定された発現レベルから導き出される、付記８２、８３、若しくは８７〜９４のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９４のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２７９】
９６．発現レベルが、表２Ｅからの少なくとも１つのプライマー若しくはプライマー対及び／又は表２Ｅからの少なくとも１つのプローブを使用して判定される、付記８２、８３、若しくは８７〜９５のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９５のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８０】
９７．対象が、付記１〜８１のいずれか１つに記載の方法による治療のために選択される、付記８２、８３、若しくは８７〜９６のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９６のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８１】
９８．サンプルが、がん細胞を含む、付記１〜８３若しくは８７〜９７のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９７のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８２】
９９．サンプルが、組織サンプルである、付記１〜８３若しくは８７〜９８のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜９８のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８３】
１００．組織サンプルが、固定包埋組織サンプルである、付記９９に記載の方法、又は付記９９に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８４】
１０１．がんが、白血病、脳のがん、前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、咽喉がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、肺がん、肉腫、子宮頸がん、精巣がん、膀胱がん、内分泌がん、子宮内膜がん、食道がん、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵臓がん、下垂体がん、腎臓がん、又は頭頸部がんから選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１００のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１００のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８５】
１０２．阻害性免疫チェックポイントが、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡから選択され、任意選択で、阻害性免疫チェックポイントが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ではない、付記１〜８３若しくは８７〜１０１のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０１のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８６】
１０３．阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストが、抗体及び阻害性核酸分子から選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１０２のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０２のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８７】
１０４．阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストが、ＭＧＡ２７１（Ｂ７−Ｈ３を標的とする）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ、ＣＴＬＡ−４を標的とする）、インドキシモド（ＩＤＯ経路を標的とする）、ＮＬＧ９１９（ＩＤＯ経路を標的とする）、リリルマブ（ＫＩＲを標的とする）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ３を標的とする）、ＢＭＳ−９８６０１６（ＬＡＧ３を標的とする）、ＣＴ−０１１（ＰＤ−１遮断薬）、ニボルマブ／ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１遮断薬）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＰＤＬ１遮断薬）、及びペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＰＤ−１を標的とする）から選択され、任意選択で、上記アンタゴニストが、ペンブロリズマブではなく、並びに／又は阻害性免疫チェックポイントのアンタゴニストが、ＭＧＢ４５３（ＴＩＭ−３を標的とする）、ＬＡＧ５２５（ＬＡＧ−３を標的とする）、及びＰＤＲ００１（ＰＤ１遮断薬）から選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１０３のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０３のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８８】
１０５．刺激性免疫チェックポイントが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳから選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１０４のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０４のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２８９】
１０６．刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが、抗体、リポカリン、及びサイトカインから選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１０５のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０５のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９０】
１０７．刺激性免疫チェックポイントのアゴニストが、ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７のアゴニスト）、ＮＫＴＲ−２１４（ＣＤ１２２のアゴニスト）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７のアゴニスト）、ＴＲＸ５１８（ＧＩＴＲのアゴニスト）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０アゴニスト）、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、及びＭＥＤＩ６３８３（ＯＸ４０アゴニスト）から選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１０６のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０６のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９１】
１０８．ＤＮＡ損傷治療剤が、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ修復標的化治療薬、ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤、ＤＮＡ損傷により誘導される細胞周期停止の阻害剤、及びＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤から選択される、付記１〜８３若しくは８７〜１０７のいずれか１つに記載の方法、又は付記８４〜１０７のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／又はアゴニスト。
【０２９２】
１０９．ＤＮＡ損傷剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び放射線から選択される、付記１０８に記載の方法、又は付記１０８に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９３】
１１０．アルキル化剤が、白金含有剤、シクロホスファミド、及びブスルファンから選択される、付記１０９に記載の方法、又は付記１０９に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト、
１１１．白金含有剤が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンから選択される、付記１１０に記載の方法、又は付記１１０に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９４】
１１２．トポイソメラーゼ阻害剤が、トポイソメラーゼＩ阻害剤及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤から選択される、付記１０９に記載の方法、又は付記１０９に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９５】
１１３．トポイソメラーゼＩ阻害剤が、イリノテカン及びトポテカンから選択される、付記１１２に記載の方法、又は付記１１２に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９６】
１１４．トポイソメラーゼＩＩ阻害剤が、エトポシド及びアントラサイクリンから選択される、付記１１２に記載の方法、又は付記１１２に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９７】
１１５．アントラサイクリンが、ドキソルビシン及びエピルビシンから選択される、付記１１４に記載の方法、又は付記１１４に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９８】
１１６．放射線が、電離放射線である、付記１０９に記載の方法、又は付記１０９に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０２９９】
１１７．ＤＮＡ修復標的化治療薬が、非相同末端結合の阻害剤、相同組換えの阻害剤、ヌクレオチド除去修復の阻害剤、塩基除去修復の阻害剤、及びファンコーニ貧血経路の阻害剤から選択される、付記１０８〜１１６のいずれか１つに記載の方法、又は付記１０８〜１１６のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３００】
１１８．非相同末端結合の阻害剤が、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、Ｎｕ７４４１、及びＮＵ７０２６から選択される、付記１１７に記載の方法、又は付記１１７に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０１】
１１９．塩基除去修復の阻害剤が、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＧ０１４６９９、ＡＺＤ２２８１、ＡＢＴ−８８８、ＭＫ４８２７、ＢＳＩ−２０１、ＩＮＯ−１００１、ＴＲＣ−１０２、ＡＰＥＸ  １阻害剤、ＡＰＥＸ  ２阻害剤、及びリガーゼＩＩＩ阻害剤から選択される、付記１１７に記載の方法、又は付記１１７に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０２】
１２０．ＤＮＡ損傷シグナル伝達の阻害剤が、ＡＴＭ阻害剤、ＣＨＫ  １阻害剤、及びＣＨＫ  ２阻害剤から選択される、付記１０８〜１１９のいずれか１つに記載の方法、又は付記１０８〜１１９のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０３】
１２１．ＡＴＭ阻害剤が、ＣＰ４６６７２２及びＫＵ−５５９３３から選択される、付記１２０に記載の方法、又は付記１２０に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０４】
１２２．ＣＨＫ  １阻害剤が、ＸＬ−８４４、ＵＣＮ−０１、ＡＺＤ７７６２、及びＰＦ００４７７７３６から選択される、付記１２０に記載の方法、又は付記１２０に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０５】
１２３．ＣＨＫ  ２阻害剤が、ＸＬ−８４４、ＡＺＤ７７６２、及びＰＦ００４７７７３６から選択される、付記１２０に記載の方法、又は付記１２０に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０６】
１２４．ＤＮＡ損傷に誘導される細胞周期停止の阻害剤が、Ｗｅｅ１キナーゼ阻害剤、及びＣＤＣ２５ａ、ｂ、又はｃ阻害剤から選択される、付記１０８〜１２３のいずれか１つに記載の方法、又は付記１０８〜１２３のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０７】
１２５．ＤＮＡ損傷を間接的に引き起こすプロセスの阻害剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び熱ショックタンパク質阻害剤から選択される、付記１０８〜１２４のいずれか１つに記載の方法、又は付記１０８〜１２４のいずれか１つに記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０８】
１２６．熱ショックタンパク質阻害剤が、ゲルダナマイシン及びＡＵＹ９２２から選択される、付記１２５に記載の方法、又は付記１２５に記載の使用のためのアンタゴニスト及び／若しくはアゴニスト。
【０３０９】
１２７．添付の図面を参照して本明細書に記載される方法。
【０３１０】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるものである。
【実施例】
【０３１１】
実施例１
組織の処理、階層的クラスタリング、サブタイプ特定、及び分類器の開発
腫瘍材料
本方法において有用であると判定された遺伝子（表２）は、Ｍａｙｏクリニック、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒから供給された１０７個のマクロダイセクションにより得た乳房腫瘍のＦＦＰＥ組織サンプルのコホートの遺伝子発現分析から特定した。この研究の倫理的承認を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ及びＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｉｒｅｌａｎｄから得た。
【０３１２】
このサンプルコホートは、以下のようにさらに説明することができる：
４７個のサンプルは、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の野生型、すなわち、生物学的に機能性であるＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２タンパク質を発現するものであった。これらのサンプルは、以降、散発性対照と称するものとする。
【０３１３】
３１個のサンプルは、ＢＲＣＡ１変異体、すなわち、生物学的に機能性のＢＲＣＡ１タンパク質を発現しないものであった。
【０３１４】
２９個のサンプルは、ＢＲＣＡ２変異体、すなわち、生物学的に機能性のＢＲＣＡ２タンパク質を発現しないものであった。
【０３１５】
遺伝子発現プロファイリング
マクロダイセクションにより得たＦＦＰＥ腫瘍サンプルからＲｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを、ＮｕＧＥＮ  ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ＦＦＰＥシステム（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して増幅させた。増幅させた一本鎖ｃＤＮＡを、次いで、断片化し、ＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ｃＤＮＡビオチンモジュールＶ２（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用してビオチン標識した。これを、次いで、Ａｌｍａｃ乳がんＤＳＡ（商標）にハイブリダイズさせた。Ａｌｍａｃ乳がんＤＳＡ（商標）研究ツールは、ＦＦＰＥ組織サンプルの分析用に最適化されており、貴重な保管組織バンクの使用が可能である。Ａｌｍａｃ乳がんＤＳＡ（商標）研究ツールは、正常な乳房組織及びがん性の乳房組織の両方におけるトランスクリプトームを提示する革新的なマイクロアレイプラットフォームである。結果として、乳がんＤＳＡ（商標）は、汎用マイクロアレイプラットフォームを使用した場合には得られない、乳房疾患及び組織環境内のトランスクリプトームの包括的提示を提供する。アレイは、Ａｆｆｙｍｅｎｔｒｉｘ  ジーンチップ（Ｇｅｎｅｃｈｉｐ）（登録商標）スキャナー７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してスキャンした。
【０３１６】
データの準備
プロファイリングしたサンプルの品質管理（ＱＣ）は、ＭＡＳ５前処理アルゴリズムを使用して行った。平均ノイズ及びバックグラウンド均一性、発現検出判定（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）の割合（アレイ品質）、シグナル品質、ＲＮＡ品質、並びにハイブリダイゼーション品質などの様々な技術的側面に対処した。対応するパラメーターの分布及び中央絶対偏差を分析し、これを使用して外れ値の可能性があるものを特定した。
【０３１７】
Ａｌｍａｃ卵巣がんＤＳＡ（商標）は、ポリヌクレオチドの３’末端から３００ヌクレオチド以内の領域を主に標的とするプローブを含む。したがって、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＲＮＡ品質基準を適合させ、ハウスキーピング遺伝子について、通常の３’／５’比率に加えて、３’末端プローブセットの強度を、３’末端プローブセット強度と平均バックグラウンド強度との比率とともに、使用した。ハイブリダイゼーション対照を、それらの強度と発現検出判定がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって規定されている要件に確実に合うようにチェックした。
【０３１８】
ＢＲＣＡ１／２変異体及び散発性対照の訓練セットに由来する腫瘍サンプルを、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）の転写物レベルに基づいて２つのデータセットに分割した。各サンプルのｍＲＮＡ発現レベルＥ．ａｖｇを、すべてのＥＳＲ１プローブセット（ＢＲＡＤ．１５４３６＿ｓ＿ａｔ、ＢＲＡＤ．１９０８０＿ｓ＿ａｔ、ＢＲＥＭ．１０４８＿ａｔ、ＢＲＩＨ．１０６４７Ｃ１ｎ２＿ａｔ、ＢＲＩＨ．５６５０Ｃ１ｎ２＿ａｔ、ＢＲＰＤ．１０６９０Ｃ１ｎ５＿ａｔ、ＢＲＲＳ．８１＿ａｔ、及びＢＲＲＳ．８１−２２＿ａｔ）の平均発現によって判定した。ｍＲＮＡ中央値発現（Ｅ．ｍｅｄ．ａｌｌ）を、すべてのサンプルについて計算した。サンプルは、Ｅ．ａｖｇ−Ｅ．ｍｅｄ．ａｌｌが０．５を上回った場合にはＥＲ陽性とし、Ｅ．ａｖｇ−Ｅ．ｍｅｄ．ａｌｌが０．５を下回った場合にはＥＲ陰性とした。
【０３１９】
ロバストマルチアレイ分析（ＲＭＡ）（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２００３）を用いてエクスプレッションコンソールｖ１．１で前処理を行い、それぞれ、５６個及び５１個のサンプルで構成されたＥＲ陽性サンプル及びＥＲ陰性サンプルの２つのデータマトリクスを得た。Ａｌｔｅｒによって説明されているように（Ａｌｔｅｒら、２０００）、さらなる変換を行って、アレイ品質と関連する分散を除去した。
【０３２０】
特徴の選択
バックグラウンド及び分散の組合せフィルタを各データマトリクスに適用して、最も可変性のプローブセットを特定した。バックグラウンドフィルタは、発現Ｅ及び発現分散ｖａｒＥが、バックグラウンド標準偏差σＢｇ及び指定された有意度ａでの標準正規分布の分位点ｚαによって定義された閾値（エクスプレッションコンソールソフトウェアによるもの）よりも高いプローブセットの選択に基づくものであり、プローブセットは、
Ｅ＞ｌｏｇ２（（ｚａσＢｇ））；ｌｏｇ２（（ｖａｒＥ）＞２［ｌｏｇ２（σＢｇ）−Ｅ−ｌｏｇ２（ｌｏｇ（２））］
である場合に保持された（有意度の閾値は、ａ＝６．３．１０−５であった）。選択されたプローブセット及びそれらの遺伝子アノテーションのリストについては表１を参照されたい。
【０３２１】
階層的クラスタリング分析
階層的クラスタリング技法を、卵巣がんＤＳＡ（商標）（疾患特異的アレイ）プラットフォームを使用して分析した１９９個の上皮性漿液性卵巣腫瘍に由来するマイクロアレイデータに適用した（図１）。未加工の発現データを、標準的なロバストマルチチップアルゴリズム（ＲＭＡ）手順を使用して前処理した。データセット内の非生物学的な系統分散を特定し、除去した。発現レベルが腫瘍ごとに著しく変動するプローブセットを特定した。これらのプローブセットにより本質的なリストを形成した。
【０３２２】
２次元クラスター分析（腫瘍、プローブセット）を行って、本質的なリストに基づいて腫瘍の関係性を構築した。階層的凝集型クラスタリングを適用した（ピアソン相関距離及びウォード連結）。最適な分割数を、ＧＡＰインデックスを使用して選択した（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、２００２，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．，６３：４１１−４２３）。サブクラスターで利用可能なすべてのプローブセットを、遺伝子名にマッピングした。
【０３２３】
遺伝子クラスターの機能的分析
プローブセットのクラスターの機能的有意性を確立するために、プローブセットを遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子識別番号）にマッピングし、超幾何関数（偽陽性率を適用（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．５７：２８９：３００））に基づいてエンリッチメント解析を行った。生物学的プロセス及び経路の過剰な現れを、ＧｅｎｅＧｏ（登録商標）からのメタコア（Ｍｅｔａｃｏｒｅ）（商標）単一実験分析ワークフローを使用してＥＲ陽性サンプル及びＥＲ陰性サンプルの両方に対する階層的クラスタリングによって生成された各遺伝子群について分析した。アンチセンスプローブセットは、分析から除外した。超幾何ｐ値を、豊富であったそれぞれの機能的エンティティクラスについて評価した。最も高いｐ値を有する機能的エンティティクラスを、その群の代表として選択し、これらの機能的エンティティを表す一般的な機能的カテゴリを、代表の有意度（すなわち、ｐ値）に基づいて遺伝子クラスターに割り当てた。
【０３２４】
一般的機能タームＩＦＮ／ＤＤが多かったクラスターの遺伝子を、ＤＮＡ損傷応答欠損（ＤＤＲＤ）サンプル群に群分けし、分類器の生成に使用した。一般的機能タームＩＦＮ／ＤＤによって表されるＥＲ陽性データセット及びＥＲ陰性データセットからのサンプルクラスターを、分類に選択し、ＤＤＲＤとラベル付けした。これらの機能タームによって表されないものは、非ＤＤＲＤとしてラベル付けした。
【０３２５】
プローブセットレベルでの分類器の開発
ＤＤＲＤサブグループを形成する腫瘍クラスを特定した後、機能的ＤＤＲＤ遺伝子リスト（表１）に関連して、これらの腫瘍と対比した腫瘍コホート内のその他すべて（非ＤＤＲＤ）の計算による分類を行って、ＤＤＲＤサブグループを分類する精査された遺伝子分類モデルを特定した。これを、以下の選択肢のあらゆる組合せ（合計１８）を使用して評価した。
【０３２６】
３つのサンプルセット
ＥＲ陰性サンプル及びＥＲ陽性サンプルを組み合わせたサンプルセット（組合せサンプルセット）
ＥＲ陰性サンプル単独
ＥＲ陽性サンプル単独
２つの特徴セット
全特徴リスト、７５％分散／強度でフィルタリングし、ＤＤＲＤリストは強制的に含む。ここでは、組み合わせた分散及び強度が最も低いプローブセットのうちの７５％を、両方の平均順位に基づいて除去した。使用される場合、「ＶａｒＩｎｔ」という用語は、この選択肢を指す。
【０３２７】
ＤＤＲＤリストのみ使用される場合、「リストのみ」という用語は、この選択肢を指す。
【０３２８】
３つの分類アルゴリズム
ＰＬＳ（部分最小二乗法）（ｄｅ  Ｊｏｎｇ，１９９３）
ＳＤＡ（縮小（Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）判別分析）（Ａｈｄｅｓｍａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｍｍｅｒ，２０１０）
ＤＳＤＡ（デジタルＳＤＡ）（Ａｈｄｅｓｍａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｍｍｅｒ，２０１０）
ＡＵＣを使用して、異なるモデルの性能を評価した。反復的特徴量削減（ＩＦＥ、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を、各モデルの開発を通して実行した。ここでは、最大ＡＵＣが、交差検証に対する最適な特徴数を選択する際の主な基準であった。特徴全体でＡＵＣに明らかな違いがなかった場合には、最小の特徴長さを選択した。
【０３２９】
遺伝子レベルでの分類器の開発
複数のアレイプラットフォームにまたがった分類器の検証を容易にするために、選択したプローブセット分類器を、遺伝子レベルで再生成した。遺伝子レベルでのプローブセット分類器の再開発には、２つの別個のステップが必要であった。
【０３３０】
１．プローブセット分類器内の固有の遺伝子の発現強度を、アンチセンスプローブセットを除き、各遺伝子にマッピングするプローブセットの中央値から推測した。
【０３３１】
２．分類に使用した分類器パラメーターを、再度推定した。
【０３３２】
閾値は、すべての交差検証予測にわたる最大の感度及び特異度に基づいて選択した。
【０３３３】
同様に、遺伝子レベルで定義した、上位１０個の遺伝子（又は現在の４４遺伝子シグネチャーに存在する任意の数の特徴）の発現強度は、訓練データセットにおける交差検証で分類パラメーターを再推定することによって、これらの１０個の遺伝子（又は現在の４４遺伝子シグネチャーに存在する任意の数の特徴）のみに基づいて分類器を再開発するため、並びにすべての交差検証予測から得られた感度及び特異度の評価及び最大化を行うことによって、閾値を再構築するために、使用することもできた。この手法は、特徴の選択を伴わないことを除き、より大きな特徴セット（上述）から作業する場合に使用される方法と類似しており、特徴は、同じままであるが新しい重みが割り当てられることになる。
【０３３４】
検証データセットの分類器スコアの計算
公的データセット
この分析に使用したデータセットは、ＦＡＣ１［ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ２０２７１（Ｔａｂｃｈｙら、２０１０）］、ＦＡＣ２［ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ２２０９３（Ｉｗａｍｏｔｏら、２０１１）］、ＦＥＣ［ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ６８６１（Ｂｏｎｎｅｆｏｉら、２００７）］、Ｔ／ＦＡＣ１［ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂｄａｔａ．ｈｔｍｌ（Ｈｅｓｓら、２００６）］、Ｔ／ＦＡＣ２［ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ１６７１６（Ｌｅｅら、２０１０）］、及びＴ／ＦＡＣ３［ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ２０２７１（Ｔａｂｃｈｙら、２０１０）］である。ＦＡＣ１データセットとＦＡＣ２データセットとの間で、３１個のサンプルが重複していることに留意しなければならない。これらのサンプルは、ＦＡＣ２データセットから除去したため、ＦＡＣ１データセット、ＦＡＣ２データセット、及びＦＥＣデータセットを組み合わせた分析に一度含まれただけであった。加えて、サンプルＧＳＭ５０８０９２は、転移性リンパ節のサンプルであるため、ＦＡＣ１から除去した。
【０３３５】
すべてのデータセットは、ＲＭＡを使用して前処理した（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、２００３）。それぞれの検証セットについて、アンチセンスプローブセット（該当する場合）を除き、分類器の遺伝子にマッピングするプローブセットを判定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｘ３Ｐ及びＵ１３３Ａアレイのアノテーションは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのウェブサイトから入手可能である。分類器内の各遺伝子にマッピングするすべてのプローブセットの中央値強度を計算し、遺伝子強度マトリクスを得た。分類器を、次いで、このデータマトリクスに適用して、各サンプルの分類器スコア／予測を得た。
【０３３６】
性能測定基準の計算
ＮＰＶ及びＰＰＶを計算するために、各エンドポイントの有病率（ＢＲＣＡ状態／応答）を、対応するデータセットにおける各クラスの割合を使用して推定した。
【０３３７】
一変量分析及び多変量分析
一変量分析及び多変量分析を実行して、ＤＤＲＤ分類器と応答との間の関連性をそれぞれ評価し、関連性がある場合は、それが既知の臨床的予測因子に対して独立していたかを判定した。表４７に示されるｐ値は、一変量分析については、ＭＡＴＬＡＢのロジスティック回帰を使用して計算した。多変量分析については、ステップワイズロジスティック回帰（Ｄｕｐｏｎｔ，２００９）を使用し、この場合のｐ値は、変数の対数尤度を表す。対数尤度は、モデルへの変数の当てはめの重要度の尺度であり、したがって、予測因子として他の予測因子と比べたその独立性を強調するものである。一変量分析及び多変量分析のいずれにおいても、０．０５未満のｐ値を、有意性の基準として使用した。さらに、未知の臨床因子を有するサンプルは、この評価から除外した。
【０３３８】
結果
分類器生成のためのサンプルの選択
この研究の目的は、病原性細胞のＤＮＡ損傷治療剤に対する応答性又は耐性を判定することができるであろう遺伝子のセットを、トランスクリプトームレベルで特徴付けることであった。これを念頭に置き、Ａｌｍａｃ乳がんデータセット内でこの生物学的様態を最もよく表していたサンプルを選択し、分類器生成のために残りのサンプルと比較した（次の節を参照されたい）。ＥＲ−ｖｅサンプルセット内のサンプルクラスター２のサンプルは、ＢＲＣＡ変異体サンプルの割合が最も大きく示され（６４％）、最も優勢な生物学的様態（ＩＦＮ／免疫応答）を呈したため、これらが、この選択に最も関連性のあるサンプルであったと決定した。ＥＲ＋ｖｅサンプルセットからは、サンプルクラスター２及び３のサンプルが、それぞれ、７３％及び６７％のＢＲＣＡ変異体腫瘍を有していたため、これらのサンプルクラスターを選択した。加えて、これらのクラスター内で最も優勢な生物学的様態は、細胞周期、ＤＮＡ損傷応答、及びＩＦＮ／免疫応答に関連していた。免疫シグナル伝達経路及び細胞周期経路は、ＤＮＡ損傷に応答して調節されることが報告されており（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｋ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，１０７１−１０７８（２００９）；Ｒｏｄｉｅｒ，Ｆ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，９７３−９７９（２００９）；Ｘｕ，Ｙ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ６，２６１−２７０（２００６）、これらのサブグループを組み合わせて推定ＤＤＲＤサブグループを形成した。ＥＲ−ｖｅサンプルセットのクラスター２（後述）並びにＥＲ＋ｖｅサンプルセットのクラスター２及び３（後述）内のサンプルには、ＤＤＲＤ（ＤＮＡ損傷応答欠損）のクラスがラベル付けされ（図１Ａを参照されたい）、一方でＥＲ−ｖｅサンプルセットのサンプルクラスター１及び３並びにＥＲ＋ｖｅサンプルセットのサンプルクラスター１、４、５、及び６内のサンプルには、非ＤＤＲＤのクラスがラベル付けされた（図１Ｂを参照されたい）。
【０３３９】
ＥＲ−ｖｅサンプルセット：ＥＲ−ｖｅサンプルセット内では、階層的クラスター分析により、３つのサンプルクラスター及び６つのプローブセットクラスター群が定義された。プローブセットクラスター３が、ＥＲ−ｖｅサンプルセット内で最も有意な生物学的様態として特定され、インターフェロン及び免疫応答シグナル伝達が豊富であった。
【０３４０】
ＥＲ＋ｖｅサンプルセット：ＥＲ＋ｖｅサンプルセット内では、階層分析により、６つのサンプル群及び６つのプローブセットクラスター群が定義された。プローブセットクラスター５が、ＥＲ＋ｖｅサンプルセット内で最も有意な生物学的様態として特定され、細胞外基質再構築が豊富であった。ＥＲ＋ｖｅサンプルセット内で、次に最も有意なプローブセットクラスターは、プローブセットクラスター６であり、これも、インターフェロン及び免疫応答シグナル伝達が豊富であった。
【０３４１】
ＤＤＲＤ分類器モデルの開発及び検証
ＤＤＲＤサブグループを形成する腫瘍クラスを特定した後、機能的ＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）遺伝子リストに関して、これらの腫瘍と腫瘍コホート内のその他すべてとを対比する計算による分類を行って、ＤＤＲＤサブグループを分類する精査された遺伝子分類モデルを特定した。
【０３４２】
分類パイプラインを、ＥＲ−ｖｅ及びＥＲ＋ｖｅの組合せ乳がんサンプルのセットを使用してモデルを導き出すために使用した。分類パイプラインは、一般的に受け入れられている実施基準（ＭＡＱＣ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０）に従って開発されたものである。このプロセスにより、いずれも交差検証のもとで、並行して、１）経験的なデータから遺伝子分類モデルが導き出され、２）そのモデルの分類性能が評価される。分類器生成の実施とその成功は、多数の変化し得るパラメーター、例えば、分類方法又はプローブセットフィルタリングの選択に左右される。これを考慮して、（ｉ）７５％分散／強度でフィルタリングした全特徴リスト（表１のＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）リストを強制的に含む））及び（ｉｉ）ＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）リストのみの２つの特徴セットを評価し、３つの分類アルゴリズム、すなわち、ＰＬＳ（部分最小二乗法）、ＳＤＡ（縮小判別分析）、及びＤＳＤＡ（対角線ＳＤＡ）を評価した。反復的特徴量削減（ＩＦＥ）をモデル開発全体で使用したが、これは、各反復回において最下位の特徴の部分を除去し、最小数の特徴だけが残ると停止する反復手順である。受信者操作特性曲線下面積（ＡＵＣ−ＲＯＣ、ＡＵＣと示される）を使用して、分類性能を評価したが、これは、この尺度がデータ内の群と有病率との間のカットオフから独立しているためである。これは、分類性能の選択の認識されている測定法の１つでもある。このように、各モデルについて最適な数の特徴を、交差検証下において平均ＡＵＣに基づいて選択した。
【０３４３】
まず、最も高い平均ＡＵＣに基づいて各モデルに最適な数の特徴を選択し、次に、ボックスプロットを使用して各モデルの性能を可視化することによって、モデル間の交差比較を行った。これを、図２に示す。左から右に向かって、最初の３つのプロットは、それぞれ、ＰＬＳ、ＳＤＡ、及びＤＳＤＡの分類器を表すが、これらは、最も低い平均分散及び強度を有する７５％を除去するプローブセットの初期フィルタリング（遺伝子リストは強制的に含む）を使用して開発したものである。次の３つのプロットは、ＤＤＲＤ（ＩＦＮ／ＤＮＡ損傷）リストのみを使用して開発したＰＬＳ、ＳＤＡ、及びＤＳＤＡ分類器をそれぞれ表す。
【０３４４】
５３個のプローブセットを含む「ＰＬＳ  ＶａｒＩｎｔ」分類モデルが、最も性能の高いモデルであり、他の５つのモデルの大半よりも有意に高いＡＵＣを有することが、図２から明らかである。続いて、このモデルを、独立した外部データセットで検証するための次の段階へと進め、応答及び診断に関して患者を層別化するＤＤＲＤ分類スコアの能力を評価した。
【０３４５】
検証データセットは異なるアレイプラットフォームを用いた公的データ又は内部データであるため、分類モデルの検証に対しては非正統派のアプローチをとった。一般的に使用されるアプローチは、代替的なアレイプラットフォームに適用できるように設計されておらず、したがって、分類モデルの開発及び独立した検証のための段階的アプローチを続けて行った。
【０３４６】
１．段階Ｉ−プローブセットレベルでモデルを生成し、交差検証下においてＤＤＲＤサブグループを分類するのに最適なモデルを選択する（上述）
２．段階ＩＩ−プローブセットレベルの分類モデルを遺伝子レベルの分類モデルに変換する
３．段階ＩＩＩ−外部データセットを使用して再開発した遺伝子分類モデルを検証する
検証段階に進める候補モデルを選択したら、このモデルを、遺伝子レベルで再構築する必要があった（段階ＩＩ）。これは、分類モデル内のプローブセットを遺伝子レベルにマッピングし、各遺伝子について重みを再計算することを伴った。選択されたモデル内の５３個のプローブセットを、表２Ａに列挙される４０個の遺伝子にマッピングし、続いて、表２Ｂに列挙される４４個の遺伝子にマッピングし、アノテーションパイプラインの精度を、さらなる分析を通じて改善した。
【０３４７】
遺伝子分類モデルの再開発において、遺伝子に関するすべての情報が確実に使用されるように、各遺伝子と関連するすべてのプローブセット（表２Ｃ）の中央値強度を、遺伝子発現値として使用する。これを、すべてのサンプルについて計算し、段階Ｉでモデルの開発及び選択に使用したプローブセット発現データマトリクスとは対照的な遺伝子発現データマトリクスを得た。異なるバッチ全体で強度を安定させるために、各サンプルのすべてのプローブセットの中央値を、そのサンプルの各遺伝子の対応する強度から差し引いた。
【０３４８】
ＰＬＳ回帰を使用して各遺伝子の新しい重みを計算し、異なるアレイプラットフォームからの外部データセットに対する検証（段階ＩＩＩ）に使用することができる、最終的な遺伝子分類器モデル（４０遺伝子及び４４遺伝子の分類器モデル）を得た。
【０３４９】
段階ＩＩＩ、他のアレイプラットフォームからのものであり得るデータセットを使用した分類器の検証において、以下のステップをとった。
【０３５０】
１．分類器内の遺伝子にマッピングする、アンチセンスプローブセット（該当する場合）以外のプローブセットを判定する。
【０３５１】
２．分類器内の各遺伝子に関連するすべてのプローブセットに対して中央値強度を計算し、縮小された遺伝子強度マトリクスを得る。
【０３５２】
ａ．特定のアレイプラットフォームにおいて遺伝子に対するプローブセットが存在しない場合、訓練データから観察された平均を代替として使用する。
【０３５３】
３．各サンプルのすべてのプローブセットの中央値を計算し、縮小された遺伝子強度マトリクスから差し引く。
【０３５４】
４．各遺伝子の値に、シグネチャー内でのその遺伝子の「重み」を乗じる。
【０３５５】
５．シグネチャー内の遺伝子のそれぞれについて４の時点で得られた値を加算して、そのサンプルのシグネチャースコアを生成する。
【０３５６】
６．分類器により各サンプルのスコアが生成され、次いで、これを使用して、患者を、応答する可能性が高いものから応答する可能性が低いものに層別化することができる。
【０３５７】
実施例２
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルのコンピュータによる検証
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの性能を、元々のＡｌｍａｃ乳がんデータセット及び３つの独立したデータセット内でＲＯＣ（受信者操作特性）曲線下面積（ＡＵＣ）によって検証した。ＡＵＣは、観察された疾患スケールに基づいて計算される統計値であり、分類器モデルを用いた表現型の予測の有効性の尺度である（Ｗｒａｙら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６，１−９）。０．５のＡＵＣは、ランダム分類器に典型的であり、１．０のＡＵＣは、クラスの完全な分離を表すであろう。したがって、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルが、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤及びＤＮＡ修復標的化治療薬を含む標準的な乳がん及び卵巣がんの治療薬クラスに対する応答を予測し、それに適した患者を選択することができるかどうかを判定するために、これらのデータセット内での適用後のＡＵＣが０．５を上回り、信頼区間の下限も０．５を上回るという仮説を立てる。
【０３５８】
ＢＲＣＡ変異体と散発性腫瘍とを区別する４４遺伝子の分類器モデルの能力の評価
ＤＤＲＤ状態を予測するための分類器スコアを用いて、ＢＲＣＡ変異体サンプルを散発性サンプルと区別するこのモデルの能力を評価した。この分析は、分類器モデルとＢＲＣＡ変異状態との関係性を評価するために行った。ＢＲＣＡ変異体腫瘍は、機能的ＢＲＣＡ１／２の欠如によるＤＮＡ損傷応答の欠損に起因して、高い度合いのゲノム不安定性を呈する。そのため、ＤＤＲＤ分類器モデルは、ＢＲＣＡ変異体サンプルをＢＲＣＡ野生型散発性サンプルと区別することができるはずだという仮説を立てる。
【０３５９】
図３により、４４遺伝子の分類器モデルが、約０．６８のＡＵＣでＢＲＣＡ変異体を散発性サンプルと区別し、信頼区間の下限は両方のモデルに関して約０．５６であること（表４６Ａ）が示され、性能がランダム分類器よりも相当に優れていることを示す。このように、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルにより、ＤＮＡ損傷の修復不能に起因する高いゲノム不安定性を有するサンプルを特定することができることが、この分析により確認される。
【０３６０】
独立したマイクロアレイ臨床データセットへの分類器モデルの適用
独立した乳房マイクロアレイ臨床データセット
（１）ＤＮＡ損傷化学療法に対する４４遺伝子のＤＤＲＤ分類モデルの予測力の評価
ＤＮＡ損傷化学療法薬に対する応答を予測する４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの能力を評価するために、このモデルを、３つの公的に入手可能なデータセットから組み合わせたデータに適用した。各研究において、乳がん患者を、ＤＮＡを直接的に損傷する薬物である、５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、及びシクロホスファミドに基づくネオアジュバントレジメンで治療した。第１のデータセット（Ｔａｂｃｈｙら、２０１０）及び第２のデータセット（Ｉｗａｍｏｔｏら、２０１１）は、それぞれ、フルオロウラシル、ドキソルビシン、及びシクロホスファミド（ＦＡＣ）でのネオアジュバント治療後における８７個及び５０個のＥＲ陽性及びＥＲ陰性の原発性乳房腫瘍サンプルに関する応答データを有していた。第３のデータセット（Ｂｏｎｎｅｆｏｉら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ８，１０７１−１０７８（２００７））は、５−フルオロウラシル、エピルビシン、及びシクロホスファミド（ＦＥＣ）でのネオアジュバント治療後における６６個のＥＲ陰性原発性乳房腫瘍サンプルに関する応答データを有していた。各研究は、病理学的完全応答（ｐＣＲ）又は残存疾患（ＲＤ）をエンドポイントとして使用した。各データセットが比較的小さかったため、データを組み合わせて分析力を向上させた。
【０３６１】
この分析により、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルが、アントラサイクリンに基づく化学療法に対する応答と有意に関連していたことが明らかとなった（相対危険度（ＲＲ）＝４．１３、ＣＩ＝１．９４−９．８７；ＡＵＣ＝０．７８、ＣＩ＝０．７０−０．８５、Ｐ＝０．００１；表４６Ｂ、図４）。この分類器の陰性的中率（ＮＰＶ）は、陽性的中率（ＰＰＶ）よりも大幅に高く（０．９０に対して０．４４、表４６Ｂ）、ＤＤＲＤ陰性腫瘍はＤＮＡ損傷化学療法に応答する可能性が低かったことが示された。
【０３６２】
ステップワイズロジスティック回帰を使用して、臨床的変数を調整した場合に組合せデータセットにおいて応答を予測する４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの能力を判定した（表４７）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルが、一変量分析における最も大きな臨床上の変数であると判定された。多変量分析により、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの的中率が、ステージ、悪性度、及び注目すべきはＥＲの状態から独立していたことを確認した。
【０３６３】
エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びＨＥＲ２受容体が陰性であることが、異常なＤＤＲ、したがってＤＮＡ損傷治療薬及びＤＮＡ修復標的化治療薬に対する応答のバイオマーカーとして、提案されてきた（Ｆｏｕｌｋｅｓら、２０１０）。しかしながら、このアプローチでは、ＥＲ陽性となることが報告されているＢＲＣＡ１変異体腫瘍の２０％及びＢＲＣＡ２変異体腫瘍の４０％を除外してしまう（Ｆｏｕｌｋｅｓら、２００４；Ｔｕｎｇら、２０１０）。対照的に、ここで採用した分析アプローチを利用すれば、ＦＥＣデータセット及びＦＡＣデータセットの組合せ分析において４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器の的中率についての多変量分析によって検証したように、４４遺伝子のＤＤＲＤの分類器により、ＥＲ陽性及びＥＲ陰性の両方の腫瘍においてＤＤＲＤサブグループが検出され、これがＥＲ状態から独立していることが示される。臨床的に言って、これは、このアプローチを、ＥＲの状態に関係なくすべての乳がん患者に適用して、ＤＮＡ損傷治療薬に対する応答性の予測を判定することができることを示唆するため、ＤＤＲＤ分類器のトランスレーショナル適用の重要な側面である。
【０３６４】
（２）タキサンを含む化学療法レジメンに対する４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの予測力の評価
タキサンなどの非ＤＮＡ損傷剤を含む化学療法レジメンに対する応答を予測する４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの能力を評価した。データは、３２１人の原発性乳がん患者に対するパクリタキセル及びＦＡＣ（Ｔ／ＦＡＣ）でのネオアジュバント治療後の応答データを有する３つのデータセットから組み合わされており、応答は、ｐＣＲとして定義されていた（Ｈｅｓｓら、２００６；Ｌｅｅら、２０１０；Ｔａｂｃｈｙら、２０１０）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、いずれも応答と関連していたが（ＡＵＣ＝０．６１、ＣＩ＝約０．５２−０．６９、表４６Ｂ、図５）、この性能は、ＦＡＣ／ＦＥＣのみで治療したサンプル内のものと比較して著しく低かった。加えて、多変量分析により、ＤＤＲＤ分類器は、Ｔ／ＦＡＣに対する応答を予測する能力において他の臨床パラメーターから独立していなかった（Ｐ＝０．２１）ことが示された（表４７）。これは、ＤＤＲＤ分類器によって検出されるサブグループが、ＤＮＡ損傷薬のみのレジメンに対して、抗微小管剤も含むレジメンよりも感受性であることを示唆する。
【０３６５】
独立した卵巣マイクロアレイ臨床データセット
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの性能を別の疾患分野において調査することを決定した。そのため、分類器モデルの性能を、漿液性の組織学を有する２５９個の原発性卵巣がんＦＦＰＥサンプルのセットにおいて評価した。これらのサンプルは、白金アジュバント治療又は白金及びタキサンのアジュバント治療のいずれかを受けた患者に由来しており、卵巣がんＤＳＡ（商標）でプロファイリングした。応答データは、ＲＥＳＩＳＴ及び／又は血清マーカーＣＡ１２５レベルによって判定した。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルをこれらのサンプルに適用することにより、ＡＵＣが約０．６８であり、信頼限界の下限がおよそ０．５９であることから、応答するものと応答しないものとを有意に区別することが証明された（図６）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、ファンコーニ貧血経路／ＢＲＣＡ経路の機能障害を検出する。
【０３６６】
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２を含むファンコーニ貧血／ＢＲＣＡ（ＦＡ／ＢＲＣＡ）経路は、ＤＮＡ修復において一体的な役割を果たし、変異又はエピジェネティックなサイレンシングのいずれかに起因して乳がんにおいて失われている場合がある（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，２００６）。したがって、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルが、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に加えて、この経路のメンバーの機能停止を検出することができるかどうかを判定した。ある範囲の変異をＦＡ／ＢＲＣＡ経路に有する２１人のＦＡ患者及び機能的ＦＡ／ＢＲＣＡ経路を有する１１人の健常対照の骨髄から生成したマイクロアレイデータを用いて、公的データセットを特定した（Ｖａｎｄｅｒｗｅｒｆ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １１４，５２９０−５２９８（２００９）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、０．９０のＡＵＣでＦＡ／ＢＲＣＡ変異体サンプルと正常サンプルとを有意に区別し（ＣＩ＝０．７６−１．００、Ｐ＜０．００１、図７）、複数の機序を通じてＤＤＲＤ分類器とＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能障害との強い相関性を示した。
【０３６７】
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルのコンピュータによる検証のまとめ
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルのコンピュータによる検証により、以下のことが示された。
【０３６８】
（ａ）４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、ＢＲＣＡ変異体乳房腫瘍サンプルと、野生型ＢＲＣＡ（散発性）乳房腫瘍サンプルとを有意に区別することができる。これは、ＤＤＲＤ分類器モデルが、ＢＲＣＡ変異体腫瘍など、高いレベルのゲノム不安定性を有する腫瘍と関連する生物学的様態を検出することができることを暗示する。これらの腫瘍は、典型的に、ＤＮＡ損傷化学療法レジメンにより良好に応答する。
【０３６９】
（ｂ）４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、ＦＡＣ及びＦＥＣ（Ｂｏｎｎｅｆｏｉら、２００７；Ｉｗａｍｏｔｏら、２０１１；Ｔａｂｃｈｙら、２０１０）並びにＴ／ＦＡＣ（Ｈｅｓｓら、２００６；Ｌｅｅら、２０１０；Ｔａｂｃｈｙら、２０１０）を用いたネオアジュバント治療後の３つの独立した乳がんデータセットの組合せにおいて、応答すると定義されたもの（ｐＣＲを示したもの）と応答しないと定義されたもの（ｐＣＲを示さなかったもの）を、有意に区別することができる。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、他の臨床因子から独立しており、ＦＡＣ／ＦＥＣの組合せ分析における応答の最も有意な独立した予測因子であることがわかった。これらの研究は、新鮮凍結（ＦＦ）サンプルを使用し、２つの異なるマイクロアレイプラットフォーム、すなわち、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｘ３Ｐマイクロアレイ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイを使用して行った。これらの結果により、異なるサンプル材料（ＦＦＰＥの代わりにＦＦ）を用いて、また２つの異なるマイクロアレイプラットフォームからのマイクロアレイデータを用いて、独立した乳がんデータセットにおいて４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの性能を検証する。
【０３７０】
（ｃ）４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、白金又は白金／タキサンに基づく治療法を用いたアジュバント治療後の独立したＡｌｍａｃ卵巣データセットにおいて、応答するものと応答しないものとを有意に分離することができる。このデータは、Ａｌｍａｃ卵巣ＤＳＡ（商標）でプロファイリングしたＦＦＰＥサンプルを使用して生成した。
【０３７１】
（ｄ）４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルは、骨髄組織サンプルを使用してＦＡ／ＢＲＣＡ変異体サンプルと正常サンプルとを有意に区別することができ、複数の機序を通じてＤＤＲＤ分類器とＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能障害との間の強い相関性を示す。
【０３７２】
要約すると、ＤＤＲＤ分類器モデルは、３つの異なる疾患領域（乳房、卵巣、及びＦＡ）にわたって性能の堅強さが独立して検証及び実証されており、４つの異なるマイクロアレイプラットフォーム（Ａｌｍａｃ乳房ＤＳＡ（商標）及びＡｌｍａｃ卵巣ＤＳＡ（商標）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｘ３Ｐマイクロアレイ、並びにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイ）からのデータを用いて２つの異なるサンプル型（ＦＦＰＥ及びＦＦ）において４つの異なる化学療法レジメン（ＦＡＣ、ＦＥＣ、Ｔ／ＦＡＣ、及び白金／タキサン）に対して応答するものと応答しないものとを分離する能力が示されている。ＤＤＲＤが、ＤＮＡ損傷治療剤に対する応答の独立した予測因子であり、ＦＡ／ＢＲＣＡ経路における変異を予測することができることが実証された。この柔軟性及び反復可能性の性能は、４４遺伝子の分類器モデルによって特定されたＤＤＲＤサブグループ内で特定された生物学的様態が、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤に対する応答を予測することに有意に強く関連しており、そのため、ＤＮＡを直接的に損傷する薬物、ＤＮＡを間接的に損傷する薬物、又は正常なＤＮＡ損傷シグナル伝達及び／若しくは修復プロセスを阻害する薬物を含む、標準的な乳がん及び卵巣がんの治療薬クラスに対する応答を予測するため、並びにそれに適した患者を選択するために使用することができるサブタイプを特定するという本発明の主張を裏付けることを暗に示す。
【０３７３】
【表５１】
2018524990.tif 000090
【表５２】
2018524990.tif 000091
【０３７４】
実施例３
インビトロでの４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器モデルの検証
４４遺伝子の分類器モデル内に含まれる遺伝子の根底にある生物学的様態を評価するために、乳房細胞株のパネルを使用してインビトロでいくつかの研究を行った。
【０３７５】
方法
細胞株の維持
親ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ１９３７−ＥＶ、及びＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞株は、Ｑｕｅｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｂｅｌｆａｓｔ（ＱＵＢ）のＰａｕｌ  Ｈａｒｋｉｎ教授の好意による寄贈で入手した。これらの細胞株を、通常通り、５０Ｕペニシリン／ｍｌ、５０μｇストレプトマイシン／ｍｌ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に維持した。ＨＣＣ１９３７−ＥＶ及びＨＣＣ９３７−ＢＲ細胞株には、０．２ｍｌ／ｍｇジェネティシンも必要であった。細胞株を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下において３７℃で培養した。
【０３７６】
クローン原性アッセイ−ＰＡＲＰ−１阻害剤の感受性の判定
ＰＡＲＰ−１阻害剤（ＫＵ００５８９４８）に対する感受性測定のために、指数関数的に増殖する細胞を、６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、細胞を、漸増用量の薬物を含有する培地に曝露した。細胞培地は、４〜５日ごとに補充した。１２〜１４日後に、細胞をメタノール中に固定し、クリスタルバイオレットで染色し、計数した。所与の用量についての対照に対する生存の割合は、その用量の定着効率をビヒクル処置細胞の定着効率で除したものとして計算した。生存曲線及び半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値を、グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を使用して計算した。
【０３７７】
細胞生存率アッセイ−シスプラチン感受性の判定
シスプラチンに対する感受性の測定のため、指数関数的に増殖する細胞を、９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後に、細胞を、漸増用量のシスプラチンを含有する培地に曝露した。細胞を、薬物の存在下で９６時間インキュベートし、その後で、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイを使用して、細胞の生存率を評価した。細胞の感受性を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照に対する割合として計算した。生存曲線及び半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値を、グラフパッドプリズムを使用して計算した。
【０３７８】
結果
ＤＤＲＤサブグループを、乳がん細胞株モデルにおいて特定することができる
前臨床モデル系を使用して、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器が、異常なＤＤＲの測定手段であったことを確認した。ＨＣＣ１９３７乳がん細胞株は、ＢＲＣＡ１変異のため、ＤＤＲＤである（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９８）。４４遺伝子の分類器を、ＨＣＣ１９３７の空のベクターの対照細胞（ＨＣＣ１９３７−ＥＶ）及びＢＲＣＡ１機能性を補正したＨＣＣ１９３７細胞（ＨＣＣ１９３７−ＢＲ）に適用した（図８Ａ）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器スコアは、ＨＣＣ１９３７−ＥＶ細胞では、ＨＣＣ１９３７−ＢＲ細胞と比較して高いことがわかり、平均スコアは、それぞれ０．５１１１及び０．１５１６であった（図８Ｂ）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器スコアと一致して、ＨＣＣ１９３７  ＢＲＣＡ１変異体細胞株は、ＢＲＣＡ１補正細胞株と比べて、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＫＵ００５８９４８（図８Ｃ）及びシスプラチン（図８Ｄ）に対してより感受性であった。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器は、ＤＤＲＤ陽性腫瘍細胞において免疫シグナル伝達を測定し、ＤＮＡ損傷剤（シスプラチン）及びＤＮＡ修復標的化剤（ＰＡＲＰ−１阻害剤）の両方に対する応答と相関することが、これらの前臨床データにより示唆される。
【０３７９】
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器は、ファンコーニ貧血／ＢＲＣＡ経路の機能障害を検出する
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２を含むファンコーニ貧血／ＢＲＣＡ（ＦＡ／ＢＲＣＡ）経路は、ＤＮＡ修復において一体的な役割を果たし、変異又はエピジェネティックなサイレンシングのいずれかに起因して乳がんにおいて失われている場合がある（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ａ．Ｄ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，３７９９−３８０８（２００６））。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器が、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に加えて、この経路のメンバーの機能停止を検出することができるかどうかを判定した。ある範囲の変異をＦＡ／ＢＲＣＡ経路に有する２１人のＦＡ患者及び機能的ＦＡ／ＢＲＣＡ経路を有する１１人の健常対照の骨髄から生成したマイクロアレイデータを用いて、公的データセットを特定した（Ｖａｎｄｅｒｗｅｒｆら、２００９）。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器は、０．９０のＡＵＣでＦＡ／ＢＲＣＡ変異体サンプルと正常サンプルとを有意に区別し（ＣＩ＝０．７６−１．００、Ｐ＜０．００１）、複数の機序を通じてＤＤＲＤ分類器とＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能障害との強い相関性を示した。
【０３８０】
結論
４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器スコアは、同系ＢＲＣＡ１補正細胞株と比べて、ＢＲＣＡ１変異体において、したがって、ＤＤＲＤのＨＣＣ１９３７乳がん細胞株において、有意に高かった。４４遺伝子の分類器スコアは、これらの細胞において、ＤＤＲ機能障害と相関するため、これは、ＤＤＲＤ分類器によって検出される免疫シグナル伝達が、細胞に固有のものであり、リンパ球浸潤の機能ではないことを示す。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２は、ＦＡ／ＢＲＣＡ  ＤＤＲネットワークの一部を代表し、このネットワークは、乳がんのおよそ３３％において変異体であるか又は過少発現されることが報告されているいくつかの他のタンパク質を含む（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ａ．Ｄ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４，３７９９−３８０８（２００６）。前述のように、４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器は、ＦＡ変異を有する患者に由来する骨髄サンプルを、正常な対照と有意に分離した。これは、ＤＤＲＤ分類器が、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の機能障害だけを特異的に検出するのではでなく、経路内の任意の異常を検出することができることを示唆する。４４遺伝子のＤＤＲＤ分類器は、ＰＴＥＮ消失、細胞周期チェックポイント機能障害、又は代謝障害に起因する活性酸素種の増加などの他の機序によるＤＤＲ欠損を有する腫瘍を特定できる可能性もある。構造的ＤＮＡ損傷のため、これらの腫瘍は、ＰＡＲＰ−１阻害剤又はＣＨＫ１／２阻害剤などのＤＮＡ修復標的化治療薬に応答する可能性が高い。
【０３８１】
実施例４
内因性及び外因性のＤＮＡ損傷は、ｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧ経路を介して自然免疫遺伝子の発現を活性化する
手法
免疫組織化学法
すべての免疫組織化学法は、ベンタナディスカバリー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（登録商標）−ＸＴ自動染色装置を使用して行った。免疫組織化学的適用を、ＦＦＰＥブロックから採取した４μｍ切片に行った。ＩＨＣのための切片は、回転式ミクロトームで４μｍに切断し、３７℃で一晩乾燥させた後、ＩＨＣアッセイに使用した。前述のＮ０−Ｎ１  ＥＲ陽性及びＥＲ陰性のＦＦＰＥ乳房腫瘍サンプル１９１個のコホートの組織マイクロアレイを、免疫発現分析のための三連にスコア付けした。免疫細胞浸潤の可視化を可能にするために、ＣＤ４（４Ｂ１２、Ｍ７３１０、Ｄａｋｏ）を１：５０で希釈し、ＣＤ８（Ｃ８／１４４Ｂ、Ｍ７１０３、Ｄａｋｏ）を１：５０で希釈した。ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）（Ｒｏｃｈｅ、ＳＰ１４２）を１：４０で希釈し、オプティビュー（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）増幅キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して８分間の増幅ステップを行った。ＣＤ４及びＣＤ８の特徴付けには半定量的スコア付けシステムを利用した。簡単に言うと、スコア３は強力なＣＤ４又はＣＤ８の発現を示し、２は中等度の発現を示し、１は低いか又は弱い発現を示す。ＣＤ４又はＣＤ８の発現がなかった場合には、スコア０を適用した。スコアは、ＴＭＡで可視化されたコアの間質成分及び腫瘍内成分の両方について、２人の独立した評者によって判定した。ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）については、公開済みの＞１％及び＞５％のカットオフを、ＴＭＡでの陽性コアのスコア付けに使用した。ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）染色を、コアの腫瘍及び間質の両方において調べた。
【０３８２】
ｓｉＲＮＡ逆トランスフェクション
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を、製造業者の説明書に従って１００μＭの濃度に再懸濁した。以下の配列をｓｉＲＮＡに使用した：
ＳＴＩＮＧ＿ａ  ５’ＣＡＧＣＧＧＣＵＧＵＡＵＡＵＵＣＵＣＣＵＣＣＣＵＵ  ３’
ＳＴＩＮＧ＿ｂ  ５’ＧＧＵＣＡＵＡＵＵＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＵＵ  ３’
ＴＢＫ１＿ａ  ５’ＧＧＡＡＡＵＡＵＣＡＵＧＣＧＵＧＵＵＡＵＵ  ３’
ＴＢＫ１＿ｂ  ５’ＵＧＧＵＧＣＡＧＣＵＡＧＡＧＡＡＵＵＡＵＵ  ３’
ＩＲＦ３＿ａ  ５’ＣＣＵＣＵＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＵＧＡＡＵＵ  ３’
ＩＲＦ３＿ｂ  ５’ＧＧＡＣＡＡＵＣＣＣＡＣＵＣＣＣＵＵＣＵＵ  ３’
ｃＧＡＳ＿ａ  ５’ＡＧＡＧＡＡＡＵＧＵＵＧＣＡＧＧＡＡＡＵＵ  ３’
ｃＧＡＳ＿ｂ  ５’ＣＡＧＣＵＵＣＵＡＡＧＡＵＧＣＵＧＵＣＡＡＡＧＵＵ  ３’
ＢＲＣＡ１＿ａ  ５’ＣＣＵＡＵＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＧＵＵ  ３’
ＢＲＣＡ１＿ｂ  ５’ＣＡＵＡＣＡＧＣＵＵＣＡＵＡＡＡＵＡＡＵＵ  ３
ＢＲＣＡ２＿ａ  ５’ＧＧＡＣＡＣＡＡＵＵＡＣＡＡＣＵＡＡＡＵＵ  ３’
ＢＲＣＡ２＿ｂ  ５’ＧＧＡＧＧＡＡＵＡＵＣＧＵＡＧＧＵＡＡＵＵ  ３’
ＦａｎｃＤ２＿ａ  ５’ＧＣＡＧＡＵＵＣＡＵＧＡＡＧＡＧＡＡＡＵＵ  ３’
ＦａｎｃＤ２＿ｂ  ５’ＧＧＵＵＡＡＡＧＣＡＣＡＵＵＧＵＡＧＡＵＵ  ３’
６ウェルプレートにおいて、２μＭのｓｉＲＮＡストック２０μｌを、５００μｌの１：１００  Ｏｐｔｉｍｅｍ：リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。これを、次いで、室温で２０分間インキュベートし、その間に、細胞をトリプシン処理し、カウンテス（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ）自動セルカウンター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して計数した。次いで、細胞を、抗生物質不含培地中で所定の濃度に再懸濁し、２４時間で５０％コンフルエンスにし、細胞懸濁液１．５ｍｌを各プレートに添加した。２４時間で培地を交換し、示されている場合はこの時点で薬物処置を追加した。細胞を、次いで、さらに４８時間インキュベートした後、ＲＮＡ及びタンパク質を採取した。
【０３８３】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、逆転写を行った。５００ｎｇのＲＮＡを、製造業者の説明書に従って逆転写した。Ｒｏｃｈｅユニバーサルプローブライブラリーアッセイデザインセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｅｎｔｒｅ）を使用して、エクソンを挟むｑＰＣＲプライマーを設計し、０．５μＭの濃度で使用した。以下のプライマー配列を使用した：
ＣＸＣＬ１０
フォワード  ５’  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  Ａ  ３’
リバース  ５’  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  Ａ  ３’
ＣＣＬ５
フォワード  ５’  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ３’
リバース  ５’  ＣＴＴ  ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  Ｇ  ３’
ＩＤＯ１
フォワード  ５’  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＧ  ３’
リバース  ５’  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ３’
ＰＤＬ１
フォワード  ５’  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  Ａ  ３’
リバース  ５’  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＣＧＴ  ＣＴ  ３’
ＰＵＭ１（ハウスキーピング遺伝子）
フォワード  ５’  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＣＣ  ３’
リバース  ５’  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  Ｃ  ３’
ｑＰＣＲから絶対的定量を行うために、標準曲線法を使用した。各プライマーセットの効率を、以下の等式を使用して標準曲線から導き出した：
Ｅ＝１０＾（−１／傾き）
逆転写の産物を、ヌクレアーゼ不含水（ＮＦＷ）中に１：１０で希釈した。各１０μｌのＰＣＲ反応液は、１０μＭのフォワードプライマー０．５μｌ、１０μＭのリバースプライマー０．５μｌ、２Ｘライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）（登録商標）４８０  ＳＹＢＲグリーンＩマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）５μｌ、ＮＦＷ１．５μｌ、及び希釈した逆転写産物２．５μｌからなった。これらの１０μｌ反応液を、ライトサイクラー（登録商標）４８０マルチウェル９６プレート（Ｒｏｃｈｅ）のウェルにピペットで入れた後、プレートを、透明な接着フィルム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して封止した。プレートを、ライトサイクラー（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）に入れ、以下のプロトコルを実行した。（９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間のサイクルを４５回、プライマー特異性の確認のための融解曲線で終了。Ｒｏｃｈｅ製のライトサイクラー（登録商標）４８０ソフトウェアを使用して、すべてのｑＰＣＲデータを分析した。分析のために、技術的複製物からのＣｐ値を計算し、遺伝子の相対量を、Ｃｐ値と実行中標準曲線とを比べて計算した。各平均値を、次いで、標的遺伝子の濃度をハウスキーピング遺伝子の濃度で除算することによって、対応するサンプルにおけるハウスキーピング遺伝子ＰＵＭ１の平均濃度に対して正規化した。相対発現は、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化されており、関連する対照サンプルと比べて作成された、遺伝子発現レベルを指す。これらの正規化された値から、各遺伝子の倍の変化を計算し、３つの個別の倍変化の平均を、独立した３連の実験から導き出した。グラフパッドプリズム５．０ソフトウェアで利用可能な対応のない両側スチューデントＴ検定を使用して、統計学的有意性を検出した。
【０３８４】
ウエスタンブロット
接着細胞をホスファターゼ阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ阻害剤カクテル、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液中に懸濁して、全細胞溶解物を形成した。次いで、溶解物に回転処理を行って、細胞残屑を除去した。プレートリーダーを使用し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って用いて、タンパク質を定量化した。サンプルごとで同量のタンパク質を、メルカプトエタノールタンパク質ローディング緩衝液中に調製し、４〜１２％の勾配のボルト（Ｂｏｌｔ）（登録商標）トリス−ビス＋ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）又は３〜８％の勾配のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−酢酸ゲル（ＢＲＣＡ１のみ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用してサイズを分離し、エレクトロブロットによりＰＶＤＦ  ０．４５μｍ膜（イモビロン（Ｉｍｍｏｂｌｉｏｎ）−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＰＤＬ１発現を調べるため、膜を、３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中でブロッキングし、１：５００で３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中に希釈した抗ＰＤＬ１抗体（カタログ番号＃１３６８４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で一晩プローブした。ＢＲＣＡ１（ＨＰＡ０３４９６６、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラミンＢ１（ａｂ１６０４８、Ａｂｃａｍ）、ｃＧＡＳ（ＨＰＡ０３１７００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒストンＨ３（ａｂ１７９１、Ａｂｃａｍ）、ＭＨＣクラスＩ／ＨＬＡ  Ａ／ＨＬＡ  Ｂ（ａｂ１３４１８９、Ａｂｃａｍ）、及びＨＬＡ  Ｇ（ａｂ５２４５５、Ａｂｃａｍ）を調べるため、膜を、３％無脂肪ミルク／ＴＢＳＴ中でブロッキングし、１：１０００で３％ミルク／ＴＢＳＴ中に希釈した抗体で一晩プローブした。ＩＤＯ１発現（カタログ番号＃１２００６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を調べるために、膜を、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中にブロッキングし、１：５００で５％  ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中に希釈した抗体で一晩プローブした。ローディング対照については、膜を、３％ミルク／ＴＢＳＴ中でブロッキングし、１：１０，０００で３％ミルク／ＴＢＳＴ中に希釈した抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）又は１：２０００で３％ミルク／ＴＢＳＴ中に希釈したビンクリン（ｓｃ−７３６１４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でプローブした後、適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体を添加した。次いで、結果を可視化し、ルミナタ（Ｌｕｍｉｎａｔａ）クレッシェンド（Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ）ウエスタンＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）及びアルファイメージャーを使用して記録した。
【０３８５】
侵襲アッセイ
細胞分泌の侵襲特性を試験するために、ノックダウンのトランスフェクションあり及びなしで、示された細胞株から条件培地を採取した。０日目に細胞の播種及び／又は処置を行い、１日目に培地をＯｐｔｉｍｅｍに変え、３日目に採取した。次いで、培地を、８００ｇで５分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。５μｍのコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（登録商標）ポリカーボネート膜、２４ウェルの細胞培養インサート（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して、侵襲アッセイを行った。ＰＢＭＣを計数し、Ｏｐｔｉｍｅｍ０．５％ＢＳＡ中に、５×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、５×１０５細胞に等しくなるようにトランズウェルプレートの上部チャンバに入れた。６００μｌの条件培地を、下部チャンバに入れ、アッセイを１６時間インキュベートした。１６時間後に、下部チャンバから１００μｌの培地を取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＰＡ、ＵＳＡ）アッセイを、製造業者の説明書に従って行った。侵襲細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイで生成した標準曲線及びカウンテス（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で計数した細胞のサンプルから導き出した。
【０３８６】
細胞毒性
がん細胞に対するリンパ球の細胞毒性作用を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞媒介性細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ．）を使用して測定した。ＲＫＯ親及びＦａｎｃ  Ｇ細胞をトリプシン処理し、計数し、１ｍｌ当たり２μｌの色素の濃度のＰＢＳ中の緑色蛍光膜色素ＤｉＯＣ１８で染色した。細胞を、３７℃で２０分間、色素とともにインキュベートした後、１ウェル当たり１×１０５細胞の密度で１２ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、ＰＭＢＣを計数し、示される比率でＲＫＯ細胞培養物に添加した。１：１の比については、１×１０５個のＰＢＭＣを添加し、５：１の比については、５×１０５個のＰＢＭＣを添加した。共培養物を４時間インキュベートした後、細胞を、フローサイトメトリーによる分析のために収集した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）をサンプルの分析に使用し、フロージョー（Ｆｌｏｗ  Ｊｏ）ソフトウェアをデータ分析に使用した。細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で１６時間、インターフェロン−γで処置した。細胞を、１００μｇ／ｍｌの濃度で１６時間、ＬＥＡＦ精製抗ヒトＣＤ２７４（クローン２９Ｅ．２Ａ３）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処置した後、ＰＢＭＣを添加した。
【０３８７】
小分子阻害剤及び化学療法剤
サイトカイン発現に対するＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＤＮＡＰＫの効果を分析するために、細胞を、約６０％のコンフルエンシーで６ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、小分子阻害剤であるＡＴＭ（Ｋｕ６００１９、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍ）を１μｍの用量で、ＡＴＲ（ＥＴＰ４６４６４、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍ）を５μｍの用量で、ＤＮＡＰＫ（Ｎｕ７４４１、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍ）を５μｍの用量で添加した。２４時間で、ＲＮＡ及びタンパク質のサンプルを、分析のために得た。サイトカイン発現に対するＤＮＡ損傷剤及びパクリタキセルの効果を分析するために、細胞を、約６０％のコンフルエンシーで６ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、ＩＣ５０用量のシスプラチン及びパクリタキセル（新たに薬局の在庫から入手した）並びにヒドロキシ尿素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２４〜４８時間添加した。適切な時点において、ＲＮＡ及びタンパク質のサンプルを、分析のために得た。
【０３８８】
細胞周期分析
細胞をトリプシン処理し、７０％エタノール中に固定し、ＲＮａｓｅ  Ａ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とともにインキュベートし、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。フロージョーソフトウェアを使用してデータを分析し、細胞周期分析を行った。
【０３８９】
免疫沈降
全細胞溶解物を、ウエスタンブロットの節にあるように、調製し、定量化した。免疫沈降については、５００μｇのタンパク質に、４℃で一晩、２μｇのＴＢＫ１（ｓｃ−５２９５７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はＩＲＦ３（カタログ番号＃４３０２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに回転処理を行った。適切な二次抗マウス又は抗ウサギダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＲＩＰＡ緩衝液で予備洗浄し、等量をサンプルに添加した。４℃で２時間回転処理を行った後、ダイナマグ（Ｄｙｎａｍａｇ）磁気ラックを使用してサンプルをＲＩＰＡで洗浄した。サンプルを、次いで、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＮｕＰＡＧＥ還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で９５℃で１５分間煮沸した。等量の還元サンプルを、４〜１２％の勾配のＢｏｌｔ登録商標トリス−ビス＋ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）を使用してサイズで分離した。ウエスタンブロット手順は、前述の通りであった。膜を、５％  ＢＳＡ／ＴＢＳＴにおいて室温で１時間ブロッキングし、４℃で一晩、ｐＴＢＫ１（Ｓｅｒ１７２）（カタログ番号＃５４８３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はｐＩＲＦ３（Ｓｅｒ３９６）（カタログ番号＃４９４７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のいずれかでプローブした。次いで、膜を、適切なＨＲＰコンジュゲート二次（ｐＴＢＫ１については、抗ウサギＩｇＧ、カタログ番号＃７０７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐＩＲＦ３については抗ウサギ軽鎖特異的ＩｇＧ、２１１−０３２−１７１、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）でプローブした。次いで、結果を可視化し、ルミナタクレッシェンドウエスタンＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）及びアルファイメージャーを使用して記録した。
【０３９０】
細胞分画
細胞を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４；１．５ｎＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤）及び緩衝液Ｃ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４；１．５ｎＭ  ＭｇＣｌ２、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤）を使用して分画した。細胞を、約７０％のコンフルエンシーで培養した。次いで、細胞を、セルスクレーパを使用してＰＢＳ中に取り出し、エッペンドルフに移した。４℃で５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞ペレットを、３５０μｌの緩衝液Ａ中に再懸濁させた。細胞を、２０分間氷上で溶解させ、その後、サンプルを、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を取り出し、さらに２回、１２０００ｒｐｍで２分間回転処理を行った。上清（細胞質画分）を注意深く取り出し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用し、プレートリーダーを用いて定量化するまで、−８０℃で保管した。残りのペレットを、緩衝液Ａ中で１回洗浄した後、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。ペレットを、緩衝液Ｃ中に再懸濁させ、１０分間氷上で溶解させ、２０Ｋサイクル／秒で３０秒間超音波処理した。次いで、サンプルを、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、屑を取り除き、上清（核画分）を、上述のように定量化まで−８０℃で保管した。
【０３９１】
共免疫沈降
細胞質画分を、上述のように調製した。５００μｇのタンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＩＰ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した２μｇのヒストンＨ３抗体（ａｂ１７９１、Ａｂｃａｍ）とともに、４℃で一晩回転処理を行った。二次抗ウサギダイナビーズ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＩＰ溶解緩衝液で予備洗浄し、等量をサンプルに添加した。４℃で２時間回転処理を行った後、ダイナマグ磁気ラックを使用してＰｉｅｒｃｅ  ＩＰ溶解緩衝液でサンプルを洗浄した。サンプルを、次いで、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＮｕＰＡＧＥ還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で９５℃で１５分間煮沸した。等量の還元サンプルを、４〜１２％の勾配のボルト（登録商標）トリス−ビス＋ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）を使用してサイズで分離した。ウエスタンブロット手順は、前述の通りであった。膜を、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴにおいて室温で１時間ブロッキングし、４℃で一晩、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中のｃＧＡＳ抗体（ＨＰＡ０３１７００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でプローブした。膜を、ＨＲＰコンジュゲート二次（抗ウサギＩｇＧ、カタログ番号＃７０７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブした。次いで、結果を可視化し、ルミナタクレッシェンドウエスタンＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）及びアルファイメージャーを使用して記録した。
【０３９２】
結果
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＤＤＲＤアッセイ陽性腫瘍と関連している。
【０３９３】
既に観察されているように、ＤＤＲＤ腫瘍にはＴ細胞特異的リガンドを含むインターフェロン関連遺伝子の上方制御があり、これらが、Ｔ細胞免疫応答と関連していたかどうかを調べた。腫瘍内ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の存在は、乳がんにおける予後として既に説明されている。腫瘍内及び間質ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の存在を、０〜３の半定量的スコアを使用してＩＨＣによって評価した。スコアが高いほど存在するＴリンパ球の数が多いことを表す。１９１個のＮ０−Ｎ１  ＥＲ陽性及びＥＲ陰性の乳房のコホート全体が、ＤＤＲＤアッセイを使用してＤＤＲＤ陽性又は陰性のスコアであった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋腫瘍内腫瘍浸潤リンパ球（ｉＴＩＬ）及び間質腫瘍浸潤リンパ球（ｓＴＩＬ）と、ＤＤＲＤ陽性との有意な関連性が、特定された（図９）。これは、ＤＤＲＤ陽性ＣＤ８＋（ＤＤＲＤ陽性ＣＤ８）及びＤＤＲＤ陽性ＣＤ４＋（ＤＤＲＤ陽性ＣＤ４）集団においてＩＨＣスコアが高い腫瘍サンプルコアの割合が高かったことによって示される（ｐ＜０．０００１）（図９Ａ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球とＤＤＲＤ陽性との間の関連性を、ＩＨＣ画像によって確認した。染色強度が高いことは、腫瘍内にｉＴＩＬ及びｓＴＩＬの存在が多いことを示す（図９Ｂ）。
【０３９４】
ケモカイン産生は、ＤＮＡ損傷修復欠損と関連している。
【０３９５】
ＣＸＣＬ１０は、ＤＤＲＤアッセイにおいて最も際立った遺伝子であり、これまでに、乳がんにおける予後因子として報告されている１。ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）は、ＤＤＲＤ陽性ＥＲ陰性腫瘍において、上位の差次的に発現する遺伝子として特定されている（表４８）。差次的に発現する遺伝子の大半は、０．５を上回る曲線下面積（ＡＵＣ）によって示されるインターフェロン反応性として特定されていた。これは、ケモカインリッチ炎症性腫瘍微小環境でも一致している（図１０Ａ）。差次的に発現する遺伝子のインターフェロームをさらに分析することにより、これらの遺伝子の５３．１％が、インターフェロン由来であり、主にＩ型インターフェロンと関連していたことが示された（図１０Ｂ）。ＣＸＣＬ１０／ＣＸＣＲ３軸は、炎症の部位に対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の走化性の鍵として報告されている２。ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の過剰発現は、黒色腫、胃がん、及び結腸直腸がんにおけるＣＤ８＋リンパ球の存在と関連している３〜５。したがって、ＤＮＡ損傷修復欠損腫瘍におけるこれらの鍵となるケモカイン、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の産生機序の特定を試みた。
【０３９６】
【表５３】
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次に、ＤＮＡ損傷応答の消失が、観察されたＤＤＲＤアッセイ免疫応答をもたらし得るかどうかを調べた。本質的なＤＮＡ損傷修復欠損の役割を把握し、そこでのケモカイン産生におけるＤＤＲＤ生物学的様態を把握するために、Ｔ４７Ｄ細胞においてｓｉＲＮＡノックダウンコンストラクトを使用して、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、及びＦＡＮＣＤ２機能を阻害した。ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５が、ＤＮＡ修復タンパク質の消失に応答して有意に上方制御されることを特定した。ＢＲＣＡ１（ＢＲＣＡ１＿ａ／ｂ  ｓｉＲＮＡを使用）、ＢＲＣＡ２（ＢＲＣＡ２＿ｃ／ｄ  ｓｉＲＮＡを使用）、及びＦＡＮＣＣ（ＦａｎｃＣ＿１／２  ｓｉＲＮＡ）を阻害した場合に、Ｔ４７Ｄ細胞における対照スクランブル配列ｓｉＲＮＡ（ＡＳ）と比較して、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の相対発現が増大したことにより、ＤＮＡ損傷に誘導されるケモカインの発現が確認された（図１１）。同系細胞株であるＨＣＣ１９３７  ＥＶ（ＤＤＲＤ陽性）及びＨＣＣ１９３７＋ＢＲＣＡ１（ＤＤＲＤ陰性）；並びにＭＤＡ−４３６  ＥＶ（ＤＤＲＤ陽性）及びＭＤＡ−４３６＋ＢＲＣＡ１（ＤＤＲＤ陰性）を使用して、再度、ＤＮＡ損傷修復欠損細胞において、それらの修復補正株と比較してＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の有意な上方制御を観察した。したがって、図１２Ａは、ＢＲＣＡ１の再発現によりＤＮＡ修復欠損を補正した場合、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の両方の相対発現が有意に減少したことを示す（図１２Ａ）。ウエスタンブロットにより、空のベクター（ＥＶ）対応同等物と比べて補正細胞株モデルの両方において、ＢＲＣＡ１のタンパク質発現を確認した（図１２Ｂ）。ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の上方制御が、リンパ球浸潤に寄与するかどうかを把握するため、ＭＤＡ４３６−ＥＶ及び＋ＢＲＣＡ１細胞からの条件培地を用いて活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の遊走アッセイを使用した（図１３Ａ及びＢ）。４時間の共培養の後、ＤＮＡ損傷修復欠損株から条件培地へのＰＢＭＣの遊走の有意な増大を確認した。ＤＤＲＤ陽性であるＭＤＡ４３６−ＥＶ（ＤＤＲＤ＋ｖｅ）は、ＤＤＲＤ陰性であるＢＲＣＡ１を発現する補正細胞株対応物（ＤＤＲＤ−ｖｅ）と比較して、細胞侵襲により大きな倍変化を示した（図１３Ｃ）（ｐ＜０．００１）。したがって、内因性ＤＮＡ損傷修復欠損は、ケモカイン産生及びそれに続く免疫細胞浸潤を引き起こす。ＤＤＲＤ陽性であるＭＤＡ４３６−ＥＶ（ＤＤＲＤ＋ｖｅ）は、ＤＤＲＤ陰性であるＢＲＣＡ１を発現する補正細胞株対応物（ＤＤＲＤ−ｖｅ）と比較して、細胞侵襲により大きな倍変化を示した（図１３Ｄ）（ｐ＜０．００１）。加えて、ｓｉＲＮＡに媒介されるＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５のノックダウンにより、ＰＢＭＣ遊走が低減され、リンパ球浸潤にとってのそれらの重要性が示された（ｐ＜０．０５、図１３Ｅ）。
【０３９７】
ケモカイン発現は、細胞周期特異的な様式で制御される。
【０３９８】
ＨｅＬａ、ＨＣＣ１９３７  ＥＶ、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３６  ＥＶ細胞を、ＩＣ−５０用量のＤＮＡ損傷剤シスプラチン及びヒドロキシ尿素、並びに微小管安定剤パクリタキセルで処置した。ＤＭＳＯ対照と比較して増大した相対発現によって示されるように、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の発現の上方制御が、シスプラチン及びヒドロキシ尿素での処置後にすべての細胞株で刺激された。しかしながら、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の発現は、いずれの細胞株モデルにおいてもパクリタキセルでの処置では有意に増大しなかった（図１４）。シスプラチン及びヒドロキシ尿素での処置は、Ｓ期の細胞の割合の増大をもたらした（図１４）。しかしながら、さらなる抗有糸分裂剤ノコダゾールでの処置は、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現が低減されたことにより観察されるように、細胞周期のＭ期での停止をもたらした（図１５Ａ）。Ｍ期での遮断は、図１５に示される細胞周期プロファイルにおける変化によって確認した（図１５Ｂ）。これらのデータを合わせると、ＤＮＡ損傷に対する免疫応答の活性化のシグナルがＳ期特異的であることが裏付けられる。
【０３９９】
ケモカインの発現は、ＤＮＡ損傷センサーであるＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＤＮＡＰＫから独立している。
【０４００】
キナーゼ血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）、ＡＴＭ及びＲＡＤ３関連（ＡＴＲ）、並びにＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）は、ＤＮＡ損傷に応答して活性化される。ＡＴＭの活性化は、免疫遺伝子の上方制御をもたらすことがこれまでに報告されており、ＡＴＭが、ＤＮＡ損傷修復欠損に応答したケモカイン産生に必要であり得ることを示唆している６。ＤＤＲＤ陽性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６  ＥＶ）を、小分子阻害剤ＡＴＭ（Ｋｕ６００１９）、ＡＴＲ（ＥＴＰ−４６４６４）、及びＤＮＡＰＫ（Ｎｕ７４４０）で処置した。ＡＴＭ阻害剤（ＡＴＭｉ）、ＡＴＲ阻害剤（ＡＴＲｉ）、又はＤＮＡＰＫ阻害剤（ＤＮＡＰＫｉ）で処置した場合に、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５のケモカイン産生に、ＤＭＳＯ対照と比較して有意な減少は特定されなかった（図１６）。しかしながら、ＤＮＡＰＫ（ＤＮＡＰＫｉ）の阻害は、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５のケモカイン発現レベルを、ＤＭＳＯ対照と比較して有意に増大した（図１６）。これらのデータをあわせると、これらのＤＮＡ損傷応答キナーゼは、内因性ＤＮＡ損傷修復欠損に対するインターフェロン応答に必須ではないことが示される。
【０４０１】
ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３経路は、ＤＤＲＤ腫瘍細胞において構成的に活性である。
【０４０２】
次に、転写因子分析を行って、ＤＤＲＤ腫瘍において上方制御される遺伝子を活性化し得るものを特定した。ＩＲＦ（インターフェロン制御因子）遺伝子標的が、このリスト内で有意に豊富であった。加えて、自然免疫経路ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３の刺激（図１７Ａ）は、ＣＸＣＬ１０の発現を駆動するものとして報告されている７。ＩＲＦ３は、ＤＮＡ損傷剤に応答して活性となることが認識されており８、したがって、ＩＲＦ３は、ＤＤＲＤ陽性細胞において活性であるという仮説を立てた。ＢＲＣＡ１欠損細胞ＭＤＡ−４３６  ＥＶ及びＨＣＣ１９３７  ＥＶの全細胞溶解物から、それらのＢＲＣＡ１を補正した同系株（ＭＤＡ−４３６＋ＢＲＣＡ１及びＨＣＣ１９３７＋ＢＲＣＡ１）と比較して増強されたＩＲＦ３リン酸化（ｐＩＲＦ３）を観察し、これを裏付けた（図１７Ｂ）。同様に、ＴＢＫ１の構造的リン酸化が、修復補正ＤＤＲＤ陰性細胞株（ＢＲＣＡ１）と比較して、修復欠損細胞（ＥＶ）において観察された（図１７Ｂ）。ｓｉＲＮＡに媒介されるノックダウンを使用して、ＭＤＡ−４３６細胞及びＨＣＣ１９３７細胞の両方において、ＳＴＩＮＧ（Ｓｔｉｎｇ＿ａ／ｂ）、ＴＢＫ１（ＴＢＫ１＿ａ／ｂ）、及びＩＲＦ３（ＩＲＦ３＿ａ／ｂ）の機能を阻害した。対照（ＡＳ）と比較した場合に、ＳＴＩＮＧ、ＴＢＫ１、及びＩＲＦ３のノックダウンは、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の両方の相対発現を有意に低減させた（図１７Ｃ）。
【０４０３】
これらのデータは、ＤＮＡ損傷応答欠損に対する免疫応答のためにＳＴＩＮＧ、ＴＢＫ１、及びＩＲＦ３が必要であることを実証する。
【０４０４】
内因性又は外因性のＤＮＡ損傷は、細胞質ＤＮＡの増大をもたらす
細胞質ＤＮＡセンサーｃＧＡＳは、ＳＴＩＮＧ経路の最も強力な活性化因子として説明されている。したがって、細胞質ＤＮＡが、Ｓ期特異的ＤＮＡ損傷に対する免疫応答の観察と関連していたかどうかを調べた９。共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）を使用して、ｃＧＡＳを、ＤＤＲＤ陽性細胞ＭＤＡ−４３６  ＥＶ及びＨＣＣ１９３７の細胞質画分においてヒストンＨ３に結合したとして特定した（図１８Ａ、ブロットの上部パネル）。ｃＧＡＳへの二本鎖ＤＮＡの結合は、ｃＧＡＭＰを介したＳＴＩＮＧの活性化、及び免疫遺伝子発現をもたらす。加えて、シスプラチン（Ｃｉｓｐ）又はヒドロキシ尿素（ＨＵ）で処置したＨｅＬａ細胞において、ｃｏ−ＩＰにより、ｃＧＡＳがここでもヒストンＨ３に結合したことが示された。ヒストンＨ３へのｃＧＡＳの結合は、ＤＭＳＯ処置対照では観察されなかった（図１８Ｂ、ブロットの上部パネル）。ＭＤＡ−４３６細胞及びＨＣＣ１９３７細胞の両方におけるｓｉＲＮＡに媒介されるノックダウンコンストラクト（ｃＧＡＳ＿ａ／ｂ）を使用したｃＧＡＳ機能の停止は、内因性ＤＤＲＤの関連及びＤＮＡ損傷剤に対する応答において、ＣＸＣＬ１０及びＣＣＬ５の両方のケモカインの相対発現レベルに有意な低減をもたらした（図１８Ｃ）。したがって、ｃＧＡＳは、ＤＮＡ損傷に応答した腫瘍細胞からのケモカインの発現に必要である。
【０４０５】
細胞質ＤＮＡは、内因性及び外因性のＤＮＡ損傷に応答して存在する。
【０４０６】
ＤＤＲＤ陽性細胞であるＭＤＡ−４３６−ＥＶ及び＋ＢＲＣＡ１細胞、並びにＨＣＣ１９３７−ＥＶ及び＋ＢＲＣＡ１細胞の細胞質画分を、ヒストンＨ３の存在に関してプローブし、ヒストンＨ３タンパク質発現が、修復欠損株（ＥＶ）において増大していたことを見出した（図１９Ａ、ブロットの上部パネル）。シスプラチン（Ｃｉｓｐ）及びヒドロキシ尿素（ＨＵ）で処置したＨｅＬａ細胞においては、ＤＭＳＯ対照処置と比較して、ＤＮＡ損傷に応答して増大した、ヒストンＨ３タンパク質のレベルも確認した（図１９Ｂ、ブロットの上部パネル）。ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）蛍光色素を使用して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）を検出した。ＩＣ５０用量のＤＮＡ損傷剤シスプラチンで処置したＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ＋シスプラチンＩＣ５０）及びＩＣ５０用量のＤＮＡ損傷剤ヒドロキシ尿素で処置したＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ＋ヒドロキシ尿素ＩＣ５０）は、共焦点顕微鏡法によって調べた場合に、細胞質ＤＮＡの増大が判明した。この細胞質ＤＮＡの増大は、しかしながら、パクリタキセルでの処置（ＨｅＬａ＋パクリタキセルＩＣ５０）に応答して観察されることはなかった（図１９Ｃ）。
【０４０７】
ＤＤＲＤ陽性腫瘍は、ＰＤＬ１の発現と関連している。
【０４０８】
ＤＤＲＤ陽性腫瘍における化学誘引物質の上方制御とそれに続くリンパ球浸潤との明らかな矛盾は、免疫チェックポイント標的ＰＤＬ１の上方制御によって説明できる可能性がある。この標的は、リンパ球疲弊を引き起こすことが知られており、がん細胞に対する細胞毒性免疫応答を効果的に消失させる。ＲｏｃｈｅのＰＤＬ１に対するＳＰ１４２抗体を使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球浸潤に関して以前にスコア付けした元の乳房腫瘍コホートに、ＩＨＣ分析を行った。既に報告済みのカットオフ＞１％及び＞５％を使用して、浸潤腫瘍免疫細胞及び腫瘍細胞ＰＤＬ１の両方の発現について、ＰＤＬ１陽性率を定義した１０（図２０）。所定のカットオフのいずれにおいても、ＰＤＬ１発現の有意な関連が、ＤＤＲＤ陽性腫瘍において特定され、ＤＤＲＤが陽性の腫瘍集団（ＤＤＲＤ陽性）及びＰＤＬ１が陽性の腫瘍集団（ＰＤＬ１陽性）の両方が、それぞれ、＞１％及び＞５％において４６．２％及び２１．５％の陽性率により示される（ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．０００４）（図２０Ａ、腫瘍）。加えて、浸潤免疫細胞のＰＤＬ１陽性もまた、それぞれ、＞１％及び＞５％の両方において７５．４％及び４０％のリンパ球陽性率によって示されるように、ＤＤＲＤ陽性率と関連していた（ｐ＜０．０００１）（図２０Ａ、リンパ球）。免疫組織化学染色によって、腫瘍内での強力なＰＤＬ１発現が確認され、染色パターン及び強度によって示されるように、リンパ球浸潤を伴うさらなるＰＤＬ１発現があった（図２０Ｂ）。合わせると、腫瘍細胞のＰＤＬ１陽性率と浸潤免疫細胞のＰＤＬ１発現のいずれも、ＤＤＲＤ陽性率と有意に関連していた（図２０）。
【０４０９】
さらに、ＤＤＲＤ陽性サブグループ及びＤＤＲＤ陰性サブグループのそれぞれに、所定の遺伝子シグネチャー内のカットオフ値に基づいて各腫瘍サンプルを割り当てたＤＤＲＤスコアに基づいて腫瘍を分析した。所定の＞１％及び＞５％のカットオフを使用した、凝集腫瘍及びリンパ球染色に基づくＰＤＬ１陽性コホート（ＰＤＬ１陽性）のＤＤＲＤスコアは、ＰＤＬ１陰性コホート（ＰＤＬ１陰性）よりも有意に高いＤＤＲＤスコアを示した（ｐ＜０．００１）（図２１）。このデータは、ＰＤＬ１タンパク質の発現が、陽性のＤＤＲＤアッセイ結果と関連しており、同様に、ＰＤＬ１陽性腫瘍が、活性なＤＤＲＤシグナル伝達を有することを示唆する。
【０４１０】
ＤＮＡ損傷修復欠損細胞株は、ＰＢＭＣとの共培養に応答してＰＤＬ１を発現するように刺激される
ＭＤＡ−４３６  ＥＶ及びＭＤＡ−４３６＋ＢＲＣＡ１細胞（修復補正）を、活性化ＰＢＭＣとともに共培養した。共培養内で、ＰＤＬ１の相対発現レベルは、修復欠損細胞（４３６  ＥＶ＋Ａｃｔ）（ｐ＝０．０００１）及びＢＲＣＡ１修復補正ＭＤＡ−４３６細胞（４３６  ＢＲＣＡ１＋Ａｃｔ）（ｐ＝０．０３５９）の両方において有意に上方制御された。さらに、ＰＤＬ１発現レベルの増大は、共培養時のＤＤＲＤ陽性細胞モデル（４３６  ＥＶ＋Ａｃｔ）において、ＤＤＲＤ陰性細胞（４３６  ＢＲＣＡ１＋Ａｃｔ）と比較して、より増強された（ｐ＝０．００３３）（図２２）。したがって、ＰＤＬ１の発現は、特に、ＤＤＲＤ陽性モデルにおいて、リンパ球との共培養によって増大する。
【０４１１】
ＤＮＡ損傷は、ＰＤＬ１の発現を誘導する
ＤＮＡ損傷シスプラチン（Ｃｉｓｐ）又はヒドロキシ尿素（ＨＵ）で処置したＨＨＣ１９３７  ＥＶ、ＭＤＡ−ＭＢ４３６  ＥＶ、及びＨｅＬａ細胞の処置は、Ｑ−ＰＣＲ分析によりＣＤ２７４（ＰＤＬ１）の発現を誘導するが、パクリタキセルで処理したものは誘導しない（図２３Ａ）。この作用は、ウエスタンブロット分析により、タンパク質レベルで確認した（図２３Ｂ）。
【０４１２】
他の可能性のある免疫チェックポイント標的は、ＤＮＡ損傷に応答して活性化される。
【０４１３】
他の可能性のある免疫チェックポイント標的の関与を判定するために、ＭＤＡ−４３６及びＨＣＣ１９３７同系細胞株対応物において代替的な免疫チェックポイント標的ＩＤＯ１のタンパク質発現を調べた。その結果、ＤＤＲＤ陽性細胞（ＭＤＡ−４３６  ＥＶ及びＨＣＣ１９３７  ＥＶ）は、補正ＤＤＲＤ陰性の同系対応物（ＭＤＡ−４３６＋ＢＲＣＡ１及びＨＣＣ１９３７＋ＢＲＣＡ１）と比較して、増大したＩＤＯ１タンパク質レベルを示した（図２４、ブロットの上部パネル）。さらに、リンパ球との共培養内で、ＩＤＯ１の相対発現レベルは、修復欠損細胞（４３６  ＥＶ＋Ａｃｔ）（ｐ＝０．０００２）及びＢＲＣＡ１修復補正ＭＤＡ−４３６細胞（４３６  ＢＲＣＡ１＋Ａｃｔ）（ｐ＝０．０６６０）の両方において有意に上方制御された。さらに、ＩＤＯ１発現レベルの増大は、共培養時のＤＤＲＤ陽性細胞モデル（４３６  ＥＶ＋Ａｃｔ）において、ＤＤＲＤ陰性細胞（４３６  ＢＲＣＡ１＋Ａｃｔ）と比較して、より増強された（ｐ＝０．００１３）（図２５）。したがって、ＰＤＬ１と同様に、ＩＤＯ１の発現もまた、特に、ＤＤＲＤ陽性モデルにおいて、リンパ球との共培養によって増大する。
【０４１４】
ＤＤＲＤ＋細胞は、リンパ球に媒介される細胞毒性から保護される。
【０４１５】
ＰＢＭＣを、ＲＫＯ親及びＲＫＯ  ＦＡＮＣＧ−／−とともに４時間共培養し、死滅したがん細胞及びＰＢＭＣを標識するための７−ＡＡＤと組み合わせて、５−（６）−カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）での標識によって、がん細胞を標識した。ＲＫＯ  ＦＡＮＣＧ−／−は、細胞毒性の割合が低いことによって示されるように、いずれの比においても（ＦＡＮＣＧ−／−  １：１及びＦＡＮＣＧ−／−  ５：１）、ＲＫＯ親細胞（親１：１及び親５：１）と比較して、低減されたリンパ球媒介性毒性を呈した。この毒性の低減は、これらの細胞におけるＰＤＬ１の発現と合致する。ＤＤＲＤ陽性細胞が、リンパ球媒介性毒性に対する保護を呈することは明らかである（図２６）。さらに、インターフェロン−γでのがん細胞の予備処置（Ｆａｎｃ  Ｇ  ＩＦＮ  ５：１）は、ＲＫＯ  ＦＡＮＣＧ−／−細胞とＲＫＯ親細胞の間で差次的な細胞毒性を展開する（ｐ値＜０．０５）（図２７Ａ）。加えて、ＲＫＯ細胞をインターフェロン−γで処置することにより、ＲＫＯ  Ｐａｒ  ＩＦＮ、ＲＫＯ  Ｆａｎｃ  Ｃ  ＩＦＮ、及びＲＫＯ  Ｆａｎｃ  Ｇ  ＩＦＮの倍変化の差異によって示されるように、ＰＤＬ１遺伝子発現レベルが著しく増大する（図２７Ｂ）。インターフェロン−γで予備処置した場合のＰＤＬ１レベルの増強は、ウエスタンブロットによるタンパク質レベルで確認した（ＲＫＯ  Ｐａｒ  ＩＦＮ及びＲＫＯ  Ｆａｎｃ  Ｇ  ＩＦＮ）（図２７Ｃ、上部パネル）。合わせると、これらのデータは、ＤＤＲＤ陽性細胞が、実質的に、リンパ球に媒介される細胞死からＤＤＲＤ陽性細胞を保護するＰＤＬ１を過剰発現することを示唆する。
【０４１６】
ＰＤＬ１機能の遮断により、リンパ球に媒介される細胞毒性に対するＤＤＲＤ耐性が逆転する。
【０４１７】
リンパ球に媒介される毒性に対する保護特性をさらに評価するために、ＰＤＬ１遮断抗体を導入して、ＰＤＬ１機能を阻害した。ＰＢＭＣを使用した細胞毒性アッセイの前に、ＰＤＬ１遮断抗体と組み合わせて、インターフェロン−γでＲＫＯ親細胞及びＲＫＯ  ＦＡＮＣＧ−／−細胞を予備処置することにより、ＤＤＲＤ陽性ＲＫＯ  ＦＡＮＣＧ−／−においてさらに著しい細胞毒性が生じた。これは、インターフェロン−γ及びＰＤＬ１抗体の両方で処置したＦａｎｃ  Ｇ（Ｆａｎｃ  Ｇ  ＩＦＮ  ５：１＋ＰＤＬ１  ＡＢ）の細胞毒性の割合が、インターフェロン−γ単独で処置したＦａｎｃ  Ｇ（Ｆａｎｃ  Ｇ  ＩＦＮ  ５：１）と比較して増強したことによって実証された（ｐ＜０．０１）（図２８）。注目すべきことに、ＩＦＮで処置した親ＲＫＯ（Ｐａｒ  ＩＦＮ  ５：１）と、ＩＦＮ及びＰＤＬ１抗体の組合せで処置した親ＲＫＯ（Ｐａｒ  ＩＦＮ  ５：１＋ＰＤＬ１  ＡＢ）との間には、細胞毒性に有意な差異は観察されなかった（図２８）。
【０４１８】
ＤＤＲＤサブタイプは、複数の適応症において複数の免疫チェックポイント標的の上方制御を有する。
【０４１９】
他の免疫チェックポイント標的が上方制御されていたかどうか、したがって、免疫媒介性細胞毒性からＤＤＲＤ陽性腫瘍を保護していたかを評価するために、２つの乳がんデータセット１１、公的に入手可能な結腸直腸がんデータセット１２、及び黒色腫データセット１３の差次的遺伝子発現分析を行った。各事例において、乳がん開発コホートから特定したＤＤＲＤ遺伝子を使用した階層的クラスタリングを使用して、クラスラベルを定義した。ＰＤＬ１、ＩＤＯ１、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、及びＣＴＬＡ４を含むいくつかの追加の免疫チェックポイント標的が、ＤＤＲＤ陽性腫瘍において、ＤＤＲＤ陰性腫瘍と比較した場合に、上方制御されていた（表４９）。これらの免疫チェックポイント遺伝子のいくつかは、それらの治療標的が特定されている。
【０４２０】
【表５４】
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ＤＤＲＤ生物学的様態は、マイクロサテライト不安定（ＭＳＩ）結腸直腸がんにおいて有意に豊富である
現時点で唯一知られている、ＰＤＬ１阻害に対する応答の遺伝子層別化は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）１４であり、これは、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）の障害から生じる。ＤＤＲＤ生物学的様態が、ＭＳＩがんを表し、改善された層別化ツールとして使用できるという仮説を立てた。乳がん分析から導き出された本質的なＤＤＲＤ生物学的様態を使用して、公的遺伝子発現データセット（Ｍａｙｏクリニックデータ、Ｍａｒｉｓａデータセット）に半教師つきクラスタリングを行った。このプロセスにより、ＤＤＲＤ生物学的様態の活性化を有する結腸直腸サンプルの群が特定され、これは、ＭＳＩ腫瘍において高度に豊富であった（図２９Ａ、ボックス内に概説）。この特定された群の中で、特に、ＭＳＩ腫瘍の８０％が、欠損ＭＭＲ（ｄＭＭＲ）を有する症例の割合によって示されるように、ＤＤＲＤ陽性群内に存在していた（図２９Ｂ）。以前にプロファイリングした１５ステージＩＩの結腸直腸がんサンプルのコホートの別個の分析により、既知のＭＳＩ状態（ＭＳＩ−Ｈ）を有するサンプルが、マイクロサテライト安定型（ＭＳＳ）サプルよりも有意に高いＤＤＲＤスコアを有した（ｐ＞０．０５）ことが示された（図２９Ｃ）。
【０４２１】
我々の現在のモデルでは、内在性又は外来性のＤＮＡ損傷は、細胞質ＤＮＡの蓄積を引き起こし、これが、ＤＮＡ損傷修復欠損乳房腫瘍において炎症性微小環境をもたらすケモカイン産生を担う自然免疫ＳＴＩＮＧ媒介経路の活性化を引き起こす。ＰＤ−Ｌ１の発現はまた、ＤＮＡ損傷修復が欠損している腫瘍と関連しており、Ｔ細胞に媒介される細胞毒性を防止する（図３０）。
【０４２２】
考察
ＤＤＲＤ分子サブタイプは、ＤＮＡ損傷及び細胞周期Ｓ期におけるＤＮＡ複製停止に対する主な応答機序であるＦＡ／ＢＲＣＡ経路の機能喪失を有する腫瘍を表す。我々の新たなデータにより、機能的ＦＡ／ＢＲＣＡ経路の不在下において、又は外因性Ｓ期ＤＮＡ損傷の結果として、細胞質ＤＮＡの蓄積がＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ１／ＩＲＦ３自然免疫応答を活性化する機序が存在することが示唆される。
【０４２３】
これまでの研究により、ゲノム不安定性が新生抗原の産生を通じて免疫シグナル伝達を活性化し得ることが示唆されている３。我々のモデルは、細胞質ＤＮＡを、細胞周期のＳ期におけるＤＮＡ損傷に応答する重要な免疫刺激因子として提案する。この免疫シグナルは、細胞の上皮成分から生じ、異常なタンパク質の免疫認識を必要としない。Ｓ期のＤＮＡ損傷が細胞質ＤＮＡをもたらすことになる理由はわかっていないが、これは複製フォークプロセシングの副生成物であり得るという仮説を立てた。実際に、細胞が、ＤＮＡ断片を核外へ積極的に輸送し、ゲノムＤＮＡに誤って取り込まれることを防いでいる可能性があるという根拠がいくつか存在する１６。通常、細胞質ＤＮＡは、細胞質ＤＮａｓｅ  ＩＩによってプロセシングされるが、内因性ＤＮＡ損傷に対する応答の失敗によってか、又は外因性ＤＮＡ損傷がありそれによってｃＧＡＳ媒介型自然免疫応答が生じることによって、この機序が制圧されるという可能性がある。実際に、細胞質ＤＮＡの異常な蓄積に応答して、ＳＴＩＮＧ経路の同様な活性化が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）疾患において観察されている１７。
【０４２４】
我々のＤＤＲＤ遺伝子アッセイは、治療的標的を表す２つの免疫チェックポイント遺伝子、ＰＤ−Ｌ１及びＩＤＯ１を含む。ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１軸の阻害は、黒色腫及び非小細胞肺がんを含む、進行型固形腫瘍を有する患者のサブセットにおいて、劇的な応答をもたらした１８。重要なことに、ＤＤＲＤ陽性腫瘍がＰＤ−Ｌ１発現と関連するという我々の観察は、この分子サブグループにおける免疫チェックポイント治療の探索の論理的根拠を提供する。単離リンパ球を使用して、ＰＤ−Ｌ１の遮断がＤＤＲＤ陽性腫瘍においてリンパ球に媒介される毒性の有意な増大を引き起こすことを実証した。
【０４２５】
このアプローチのさらなる裏付けは、ミスマッチ修復欠損結腸直腸がんにおけるＰＤ−Ｌ１阻害剤の活性に関する近年の報告である（ＲＥＦ  ＡＳＣＯ）。ミスマッチ修復タンパク質は、我々の研究が示唆するＳ期の複製フォーク停止に対する応答において役割を有することが報告されており１９、ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ／ＩＲＦ３経路を活性化し、ＰＤ−Ｌ１発現を上方制御するはずである。重要なことに、我々は、ＤＤＲＤアッセイが結腸直腸ＭＳＩ腫瘍の検出に感受性であることを実証した。
【０４２６】
免疫シグナルのＳ期に特異的な性質はまた、免疫チェックポイント阻害剤との組合せ治療に関して潜在的に重要な問題ももたらす。合成環状ジヌクレオチド分子を使用したＳＴＩＮＧ経路の直接活性化は、ＰＤ１抗体に対する応答を増強させることが報告されていることは興味深く、これは、我々のデータと一致する２０。別の論理的組合せは、シスプラチンなどのＳ期特異的ＤＮＡ損傷剤とＰＤ−Ｌ１阻害剤である。抗微小管剤は、しかしながら、有糸分裂期に細胞周期停止を引き起こし、それによってＳＴＩＮＧ媒介性免疫応答を防止することによって、ＰＤ−Ｌ１阻害剤をアンタゴナイズする可能性がある。加えて、ＤＤＲＤ陽性腫瘍においていくつかの追加の免疫チェックポイント標的の活性化を示したように、これらの作用がＰＤ−Ｌ１に特異的ではないことも予想される。
【０４２７】
まとめると、我々は、ＤＮＡ修復が欠損した乳房腫瘍における免疫応答機序を特定した。自然免疫ＳＴＩＮＧ媒介経路の活性化は、インビトロにおいてＤＮＡ損傷に応答してケモカイン産生を担い、ＤＮＡ損傷修復欠損乳房腫瘍において炎症性微小環境をもたらす。ＰＤ−Ｌ１の発現は、ＤＮＡ損傷修復が欠損した腫瘍と関連しており、内因性又は外因性のＳ期ＤＮＡ損傷に関する免疫治療の役割を調査する論理的根拠を提供する。
【０４２８】
参考文献
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【０４２９】
実施例５
４４遺伝子シグネチャーに再帰的特徴除去を行って、単一の遺伝子から最大４３個の遺伝子を含む、シグネチャーのサブセットを定義した。
【０４３０】
サンプル
ＤＤＲＤ状態が判明している１０７個のサンプルを含むＤＤＲＤ訓練セットを、この分析に使用した。
【０４３１】
方法
長さ４４のＤＤＲＤシグネチャーを、この分析の開始点として使用し、ここでは、４４個の遺伝子の絶対的な重みを、個々の遺伝子を順位付けるための手段と考えた。最も低い順位の遺伝子、すなわち、絶対的な重みが最も低い遺伝子を、シグネチャーから除去し、ＤＤＲＤクラスラベルに対する４３遺伝子の発現データに部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰を使用して、モデルのパラメーターを再訓練した。４３遺伝子シグネチャーの重み付けパラメーターを使用して、前述のようにシグネチャーを遺伝子１個分減らし、このプロセスを、残った遺伝子が１個になるまで反復した。１個抜き交差検証を使用して、評価したそれぞれのシグネチャー長について、性能推定値を計算できるようにした。シグネチャーの性能は、受信者操作特徴曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して測定したが、この曲線は、考えられる各特徴の長さにおいて、ＤＤＲＤ陽性サンプルとＤＤＲＤ陰性サンプルとを区別するシグネチャーの能力を評価するものである。部分シグネチャーのそれぞれの詳細は、表３〜４５に示されている。
【０４３２】
結果
表５０は、最小で１個から最大で４３個の遺伝子を使用した、サブタイプの予測に関するＡＵＣ性能を示す（部分シグネチャーの詳細については表３〜４５を参照されたい）。最小１個の遺伝子で、ＡＵＣ性能は、０．５よりも有意に高く、したがって、最小１個の遺伝子で、偶然よりも有意に高い確率でＤＤＲＤ分子サブグループを予測することが可能である。
【０４３３】
【表５５】
2018524990.tif 000095
2018524990.tif 000096
【０４３４】
実施例６
免疫チェックポイント調節剤及び／又はＤＮＡ損傷剤で処置した黒色腫患者のコホートにおけるＤＤＲＤアッセイのコンピュータによる検証
方法
この研究で、皮膚黒色腫を有する４７４人の患者のＴＣＧＡコホートからのＲＮＡｓｅｑ遺伝子発現データを分析した。レベル３の正規化した遺伝子発現データを、ＴＣＧＡデータポータルからダウンロードし、ＤＤＲＤ遺伝子のみを含むようにデータマトリクスを縮小した。データマトリクスにおけるゼロカウントを除去するために、定数０．０１をすべての遺伝子発現値に加算し、結果として得られたデータマトリクスを対数変換した（自然対数を使用）。
【０４３５】
ＤＤＲＤアッセイスコアを生成し（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、２０１４において記載されているように）、サンプルの７５％（ＤＤＲＤスコアが高い方）がＤＤＲＤ陽性として分類され、サンプルの２５％（ＤＤＲＤスコアが低い方）がＤＤＲＤ陰性として分類されるように、二分割した。
【０４３６】
免疫に基づく治療薬（イピリムマブ又はペンブロリズマブなどの免疫チェックポイント調節剤）及び／又はＤＮＡ損傷剤を受容した患者を、続いて、ＤＤＲＤ分類に基づく生存転帰における差異に関して分析した。カプランマイヤープロットを使用して、ＤＤＲＤ陽性の生存確率とＤＤＲＤ陰性の生存確率との差異を可視化し、ログランク検定を使用して、生存曲線が有意に異なるかどうかを評価した。ＤＤＲＤ陰性群と比較してＤＤＲＤ陽性において事象が生じる相対危険度を推定するために、ＤＤＲＤアッセイのハザード比も計算した。この分析に使用したエンドポイントは、局所再発までの時間、遠隔再発までの時間、死亡までの時間（全生存期間）であった。
【０４３７】
結果
図３１、３２、及び３３は、それぞれ、局所再発までの時間（図３１）、遠隔再発までの時間（図３２）、及び全生存期間（図３３）について、ＤＤＲＤ状態による生存確率の差異を示すカプランマイヤーの生存グラフである。結果として得られた各エンドポイントの分析により、免疫に基づく治療薬（イピリムマブ又はペンブロリズマブなどの免疫チェックポイント調節剤）及び／又はＤＮＡ損傷剤で処置したコホートにおいて、ＤＤＲＤ陽性群の患者は、ＤＤＲＤ陰性群の患者と比較して、治療後に事象が生じる危険性が有意に低いことが示された：
局所再発までの時間：ＨＲ＝０．３９［９５％ＣＩ：０．１８−０．８４］、ｐ＝０．０００８
遠隔再発までの時間：ＨＲ＝０．４４［９５％ＣＩ：０．１９−０．９９］、ｐ＝０．００９５
全生存期間：ＨＲ＝０．３１［９５％ＣＩ：０．１２−０．８１］、ｐ＝０．０００６
まとめ
このデータは、ＤＤＲＤアッセイが、黒色腫における使用が認可されている免疫に基づく治療薬（イピリムマブ又はペンブロリズマブなどの免疫チェックポイント調節剤）及び／又はＤＮＡ損傷剤で治療した後に有意に改善された生存を有する黒色腫患者の群を特定することを示す。
【０４３８】
参考文献
Mulligan JM, Hill LA, Deharo S, et al. Identificationand validation of an anthracycline/cyclophosphamide-based chemotherapy responseassay in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt335. doi:10.1093/jnci/djt335 [doi].
【０４３９】
配列表
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NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCAAATGAGTGATGCATTGACCGTTCGTAATTCTTGGATGCAAAAGTAGAACTCAAGCTACTTAATAACAATCATGGTGGCATGGGCACCAGCAAGTCAGGGTGGACAACAGCCATAGTTCTGGAGCATGGTCCTCAAGACTACCTTTTGTATGCAGAGTATTAACACTTTAACTCTTAGATCCTTGGAACATAAGGAAGAGAGGCTGGAACAAAAAGGGGTTGGCATTTGGAGGTGGAGAGGTAGTGTAAGGCACAACTGTTTATCAACTGGTATCTAAGTATTTCAGGCCAGACACGTGGCTCACACCTCTAATCCCAGCACTTTGGGAGCTGAGCCAGGAGGATTGCTTGAGTCTAGGAGTTCAAGACCGGTCTGGGCAACATGGTGAAACCCTGTCTCTACAAAAAAATACAAAAATTAGCCAGGTGTGGTGGGGCACGCCTATGGTCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGATGGGAGGATCCACCTGAGC
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GTAATATGTTTATAATCCTTTAGATCTTATAAATATGTGGTATAAGGAATGCCATATAATGTGCCAAAAATCTGAGTGCATTTAATTTAATGCTTGCTTATAGTGCTAAAGTTAAATGATCTTAATTCTTTGCAATTATATATGAAAAATGACTGATTTTTCTTAAAATATGTAACTTATATAAATATATCTGTTTGTACAGATTTTAACCATAA
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GTATCCTTGAACTGGAAACCATCCACGATCGAGTATCGAGTCATTCAACACTATCAATTCCTGGGTGACTTTTTGAAAAAGTAGTATCTCTTGTTGCAAGAAATGCTCCATCTGTGAGTCCATGTCTCTCACTGGAATTGGATGGAAGTGGTGAATTTCAGCCAAAGTGGCCAAAGAAATCCTGTTCCTGTGATTCTGACGTCATCAGCCTCTGCACCTCTGTCTTCCCTTCTGCCACATGTTGCCTGTTCTCCGTGACTTTGGTAAGA
Hs522202.0C1n6_at (SEQ ID NO:197)
GAGAGAGTGATCACGCTGCTGTGCCCACCTATGCGGTAGACCTTGTTCCTGGGTTGGGAGATGTTTTATGATCAGGGTGCAGTAGAAAGAGCACACTAGTAGCAGTAAAGAGAGGTGACCCTGGCTGCAGTTCTGCCTCTAACTTCCTGAGTGACCTCAGGCTAGTCACACAGTGACTGCTCCCCACATTTCTTTTTGTAAGCTGCAAGGATTGAATCAGACAATAGCCTCTAAGTTTCTTCTGAACTCTCATACTCAGGGATGCCAA
Hs524348.0CB1n97_at (SEQ ID NO:198)
TTCCCTCCCACTAATTTGTTGGCCTTTAACAGCAATTTTGAAAACTGGGTCTTCTGGTTATGTTTTTGTTTTAAAATCTTTAAATTAGAGGATGCTGTGCCATTGAGTACTTTAAGTTAATATGAGGTTCTGGTTCAAGGAAAACTTACGTTGGATCTGAACCAATGAGCAGATATTTTGATATGTGCCACTCTTGCATATACATCTCAGTCCTAACTAAAGGTTCTAGTGGCATCCAGGACCTTTAGGGAGGCATTT
Hs524348.2C1n5_s_at (SEQ ID NO:199)
CACTGCGTCTGGCAATAATGTAACTTTGAAGCTTAAAAATTAATCCCAGTTTGTAGCAATAACAGAAGACTATCTACAACGGAAGAAAGAAGCAACTGCCTTACAGTTCTGTAAAGAATTGGCAAGAAAATAAAGCCTATAGTTGCC
Hs528836.0C1n3_s_at (SEQ ID NO:200)
CCCTTACTTACATACTAGCTTCCAAGGACAGGTGGAGGTAGGGCCAGCCTGGCGGGAGTGGAGAAGCCCAGTCTGTCCTATGTAAGGGACAAAGCCAGGTCTAATGGTACTGGGTAGGGGGCACTGCCAAGACAATAAGCTAGGCTACTGGGTCCAGCTACTACTTTGGTGGGATTCAGGTGAGTCTCCATGCACTTCACATGTTACCCAGTGTTCTTGTTACTTCCAAGGAGAACCAAGAATGGCTCTGTCACACTCGAAGCCAGGTTTGATC
Hs591893.1C1n4_s_at (SEQ ID NO:201)
CCTCCTTTCTAAATGCAGCGACCTGTGTTCTTCAGCCCTATCCCTTTCTATTCCTCTGACCCCGCCTCCTTTCTAAATGCAGCGACCTCTGTTCTTCAGCCCTATCCCTTTCTATTCCTCTGACCCCGCCTCCTTTCTAAATGCAGCGACCTCTG
Hs7155.0CB1n102_at (SEQ ID NO:202)
GGCGTCGGCGCCTAGGGCGAAGTGAGCCAGGGTGCAGTCGGGAAGCTCCAGGACGAAGCGGCGCGGCGGAGCCATGGCCCCAGCGCAGACCCCGCGCCGCCCGAGCAGCGGCCCCGACAGTGGCCCGCGCAGGAGCCGGCGGGCGAAGGCCATGGGCGCCTCAGCGACGCCGCCCTCGGCCCCGCCTCGGAAACGAAACCTGGCGGGAGCCAGGCGCCGGCGGGAAACGAAACCCGGAGGGAGCCAGGCGCCAGCGGGAAACGAAAGCGAAGCGT
IDO_F1 (SEQ ID NO:203)
AGAGACATCTGTATGCATTCCTG
IDO_R1 (SEQ ID NO:204)
GGTATTTTGAGGTCTTTTGTATTGC
IDO_P1 (SEQ ID NO:205)
ACCCATTGTAACAGAGCCACAAACT
CD2_F1 (SEQ ID NO:206)
TCTCAGGTCATGTGTAGATGCG
CD2_R1 (SEQ ID NO:207)
CTCCAGAGTCTCTTAAGCAGATAGG
CD2_P1 (SEQ ID NO:208)
AGACCCAGGCACACCAATCACTTGA
GBP5_F1 (SEQ ID NO:209)
AACAACAGATGCAGGAACAGG
GBP5_R1 (SEQ ID NO:210)
AGTCCTCTGGGCGTGCTG
GBP5_P1 (SEQ ID NO:211)
CACAGCTCAGCACAACATTCCAAGC
PRAME_F1 (SEQ ID NO:212)
CTGCATACTTGGACACTAAAGCC
PRAME_R1 (SEQ ID NO:213)
ATGTTTTCCTCACTCACACTGAAC
PRAME_P1 (SEQ ID NO:214)
AGCAACAAAGCAGCCACAGTTTCAG
ITGAL_F1 (SEQ ID NO:215)
ACAGAAAGACTGAGCTCAAGGTG
ITGAL_R1 (SEQ ID NO:216)
TGCAGGCACTGTGCTTGG
ITGAL_P1 (SEQ ID NO:217)
AACCACGTCTGCTAACTTGGAGCCC
LRP4_F1 (SEQ ID NO:218)
TGTAAAAAGCAAAATCTCTCTGTCC
LRP4_R1 (SEQ ID NO:219)
AGTCCAATCTCTCCAGTGAGTAAC
LRP4_P1 (SEQ ID NO:220)
AATGGAAGCGATTCTCCCATGCTCA
APOL3_F1 (SEQ ID NO:221)
GACCAGGTGTCTCTAAAAACCC
APOL3_R1 (SEQ ID NO:222)
TTGCCTGCTGTATATGAGTAATGAG
APOL3_P1 (SEQ ID NO:223)
CCTGGAGAGTATGCGAGAACCTACC
CDR1_F1 (SEQ ID NO:224)
GAAGACGTGGATTTTCCTGGAAG
CDR1_R1 (SEQ ID NO:225)
TCCAAGTCTTCCAGTAAATCAAGTC
CDR1_P1 (SEQ ID NO:226)
TCCAGCAAATCCAGTCTTCCAGCAA
FYB_F1 (SEQ ID NO:227)
AACAAATCATCAACTTCCACTGGTC
FYB_R1 (SEQ ID NO:228)
TGGAGGGAATCTTTGGAGATTAGTG
FYB_P1 (SEQ ID NO:229)
TCTAATCTTGGGGCCTCAGACACCC
TSPAN7_F1 (SEQ ID NO:230)
GACATTGAGGACCTCATCCAAAC
TSPAN7_R1 (SEQ ID NO:231)
GACAGAGGCATTACTTTTGAAGATC
TSPAN7_P1 (SEQ ID NO:232)
TTGACTTGTTCCCCCTTCACACTCA
RAC2_F1 (SEQ ID NO:233)
CTCAGTTCTCCTCTTTTGGAACAAC
RAC2_R1 (SEQ ID NO:234)
TTGAACCCAGATTTTCCATTGGC
RAC2_P1 (SEQ ID NO:235)
TCTACGCCTCTGGGGATATCTGCTC
KLHDC7B_F1 (SEQ ID NO:236)
TGGCACTGTGGATTCTCAAGG
KLHDC7B_R1 (SEQ ID NO:237)
CTGGGGGTATGGGCAGGAG
KLHDC7B_P1 (SEQ ID NO:238)
CACCAGCGGACCAGTTTCAGAGGCA
GRB14_F1 (SEQ ID NO:239)
CTAATACAGCTGGTGGAGTTCTATC
GRB14_R1 (SEQ ID NO:240)
AGCAATCCTAGCACAATAATGTTTC
GRB14_P1 (SEQ ID NO:241)
ACTCAATAAGGGCGTTCTTCCTTGC
KIF26A_F1 (SEQ ID NO:242)
AGGAATTTTTACCAAAACCACAAGC
KIF26A_R1 (SEQ ID NO:243)
AACAGAACCTTTACAAAACCCTACC
KIF26A_P1 (SEQ ID NO:244)
AACAGACCACCACGACCAACAACA
CD274_F1 (SEQ ID NO:245)
TTGGTGTGACAGTGTTCTTTGTG
CD274_R1 (SEQ ID NO:246)
AGGAGGAGTTAGGACTTAGGAATAG
CD274_P1 (SEQ ID NO:247)
TGCCTTGCTCAGCCACAATTCTTGC
CD109_F1 (SEQ ID NO:248)
TGTGGATTTGAATGTGTGTACAAGC
CD109_R1 (SEQ ID NO:249)
GGCACCATAAAGCCACTTAATAGG
CD109_P1 (SEQ ID NO:250)
AAGAGCCATGCCACTCCTACCCGG
ETV7_F1 (SEQ ID NO:251)
CCCTCACTGAGCCTCAGATTTC
ETV7_R1 (SEQ ID NO:252)
GCCGCCTGGAAGCACTAAC
ETV7_P1 (SEQ ID NO:253)
TCCCATTTCCTGCCTCAGCCCATTT
MFAP5_F1 (SEQ ID NO:254)
GGCTGGTCTGCCCCCTAG
MFAP5_R1 (SEQ ID NO:255)
ACCATTGGGTCTCTGCAAATCC
MFAP5_P1 (SEQ ID NO:256)
ACTCCGTCGCTCCAATTACTTCCGA
OLFM4_F1 (SEQ ID NO:257)
AGGACGAGCTATAGAAAAGCTATTG
OLFM4_R1 (SEQ ID NO:258)
CATTCAAAAGCACAGAAGCACATC
OLFM4_P1 (SEQ ID NO:259)
CACCAGCAAGGTTTCCAACTACTGC
PI15_F1 (SEQ ID NO:260)
TTTTCCAGGCTAAAGCAAATGAAAG
PI15_R1 (SEQ ID NO:261)
CTATCCTAGCACCATTGTTGCATG
PI15_P1 (SEQ ID NO:262)
TTGCTGGTATCAACACAGCCTGCCA
FOSB_F1 (SEQ ID NO:263)
TGAGTGAGACTGAGGGATCGTAG
FOSB_R1 (SEQ ID NO:264)
GTGGTTGGCAGGAGCAAGC
FOSB_P1 (SEQ ID NO:265)
CACACTCTCACACTCGCACCCAGAA
CXCL10_F1 (SEQ ID NO:266)
ACCAGAGGGGAGCAAAATCGA
CXCL10_R1 (SEQ ID NO:267)
TGCCTCTCCCATCACTTCCC
CXCL10_P1 (SEQ ID NO:268)
CCTCTGTGTGGTCCATCCTTGGAAGCA
MX1_F1 (SEQ ID NO:269)
CAGCACCTGATGGCCTATCAC
MX1_R1 (SEQ ID NO:270)
CAGTTCTTCATGCTCCAGACGTAC
MX1_P1 (SEQ ID NO:271)
CGCATCTCCAGCCACATCCCTTTGA
IFI44L_F1 (SEQ ID NO:272)
CCTCTTGAGGAAACTGGTGCAATTG
IFI44L_R1 (SEQ ID NO:273)
TGATTCTGACATTTGGCCCAGC
IFI44L_P1 (SEQ ID NO:274)
TCTCAAATGCAGGGCTGTAACGCTCTC
AC138128.1_F1 (SEQ ID NO:275)
GCTAGAGCAGGACTTCGTCTCC
AC138128.1_R1 (SEQ ID NO:276)
GAGAAGATCTGGCCTTATGCCCA
AC138128.1_P1 (SEQ ID NO:277)
TCTCTGGAACAGCTCATCGCCGCAT
FAM19A5_F1 (SEQ ID NO:278)
GGAAGGCTGCGACTTGTTAATCAA
FAM19A5_R1 (SEQ ID NO:279)
CTCCTGACAAACACAGCCCC
FAM19A5_P1 (SEQ ID NO:280)
CCGTGGTGGTCTTTATCCTCCCGCC
NLRC5_F1 (SEQ ID NO:281)
GAGAGTGGACCTGGAGAAGAATCAG
NLRC5_R1 (SEQ ID NO:282)
TAGCATCCAAGTCATCCGCCT
NLRC5_P1 (SEQ ID NO:283)
AGTCCTTCAGCCAGGAGCCAGGC
PRICKLE1_F1 (SEQ ID NO:284)
GTTCGGGATTCGATGGATTCTTTGG
PRICKLE1_R1 (SEQ ID NO:285)
CCAAGGCCATCATTGTATTCTCTGC
PRICKLE1_P1 (SEQ ID NO:286)
TCTCCATCCACCGAAGCCCCTGT
EGR1_F1 (SEQ ID NO:287)
GCAGCACCTTCAACCCTCAG
EGR1_R1 (SEQ ID NO:288)
TCTCTGAACAACGAGAAGGTGCT
EGR1_P1 (SEQ ID NO:289)
CCTACGAGCACCTGACCGCAGAGT
CLDN10_F1 (SEQ ID NO:290)
AGCCGCTCTGTTTATTGGATGG
CLDN10_R1 (SEQ ID NO:291)
TCTGACAACAACAAAACACCCAGA
CLDN10_P1 (SEQ ID NO:292)
ACACCACCAATTATGCACAGTGAGGCT
ADAMTS4_F1 (SEQ ID NO:293)
TGGCTCCAAGAAGAAGTTTGACAAG
ADAMTS4_R1 (SEQ ID NO:294)
TCCTTCAGGAAATTCAGGTACGGAT
ADAMTS4_P1 (SEQ ID NO:295)
CCTGACTGCTTGCTGCAACCAGAACC
SP140L_F1 (SEQ ID NO:296)
AGTGGAGGGGTTTGTACAAGACA
SP140L_R1 (SEQ ID NO:297)
CAAATGGGACTTAGACTGGAGGCT
SP140L_P1 (SEQ ID NO:298)
CGCCTCATCTTCCAGAACCACAGGG
ANXA_F1 (SEQ ID NO:299)
CCACAAGCAAACCAGCTTTCTTTG
ANXA_R1 (SEQ ID NO:300)
TGATCAGGATTATGGTTTCCCGTTC
ANXA_P1 (SEQ ID NO:301)
TGGCGAGTTCCAACACCTTTCATGGC
RSAD2_F1 (SEQ ID NO:302)
GGAAGAGGACATGACGGAACAGA
RSAD2_R1 (SEQ ID NO:303)
GTGTTCCAGTGCCTCTTAATTGAGG
RSAD2_P1 (SEQ ID NO:304)
CAAAGCACTAAACCCTGTCCGCTGGAA
ESR1_F1 (SEQ ID NO:305)
CTGCAGCAGCAGCACCAG
ESR1_R1 (SEQ ID NO:306)
CATCAGGCACATGAGTAACAAAGGC
ESR1_P1 (SEQ ID NO:307)
CCCAGCTCCTCCTCATCCTCTCCC
IKZF3_F1 (SEQ ID NO:308)
GCAGAGATGGGAAGTGAAAGAGC
IKZF3_R1 (SEQ ID NO:309)
TCAATGCCTCAGAAATTCATTGGTG
IKZF3_P1 (SEQ ID NO:310)
TGCCACATTGCTTGCTAATCTGTCCAG
EGFR_F1 (SEQ ID NO:311)
GACAGCTTCTTGCAGCGATACAG
EGFR_R1 (SEQ ID NO:312)
CCTTCCTCCCAGTGCCTGA
EGFR_P1 (SEQ ID NO:313)
TCGTCTATGCTGTCCTCAGTCAAGGCG
NAT1_F1 (SEQ ID NO:314)
AGAGCACTTCCTCATAGACCTTGG
NAT1_R1 (SEQ ID NO:315)
TTCAAGCCAGGAAGAAGCAGC
NAT1_P1 (SEQ ID NO:316)
TGCATTCAGTCTAGTTCCTGGTTGCCG
LATS2_F1 (SEQ ID NO:317)
GCAAGATGGGCTACCTGGAC
LATS2_R1 (SEQ ID NO:318)
TTAAGCAGACCTCCCCAGGA
LATS2_P1 (SEQ ID NO:319)
ACCCGCACAATCTGCTCATTCCTCG
CYP2B6_F1 (SEQ ID NO:320)
TCTCCTTAGGGAAGCGGATTTGTC
CYP2B6_R1 (SEQ ID NO:321)
TTCTTCACCACCATCCTCCAGA
CYB2B6_P1 (SEQ ID NO:322)
CATCGCCCGTGCGGAATTGTTCCT
PTPRC_F1 (SEQ ID NO:323)
CTGGCCATCTGCAAGCTGAG
PTPRC_R1 (SEQ ID NO:324)
CAGTTCAGCCTTCAGTTGGTGG
PTPRC_P1 (SEQ ID NO:325)
AGCAAGGAAGCCAATCCAAGTCACCAA
PPP1R1A_F1 (SEQ ID NO:326)
ACCCATATACCACCACTGGATTCC
PPP1R1A_R1 (SEQ ID NO:327)
CAGTTTGGGAATGCATGGACACC
PPP1R1A_P1 (SEQ ID NO:328)
ACCTCCTCCTCTCTCAGACCGAGTTGG
STING_a (SEQ ID:329)
CAGCGGCUGUAUAUUCUCCUCCCUU
STING_b (SEQ ID:330)
GGUCAUAUUACAUCGGAUAUU
TBK1_a (SEQ ID:331)      
GGAAAUAUCAUGCGUGUUAUU
TBK1_b (SEQ ID:332)
UGGUGCAGCUAGAGAAUUAUU
IRF3_a (SEQ ID:333)
CCUCUGAGAACCCACUGAAUU
IRF3_b (SEQ ID:334)
GGACAAUCCCACUCCCUUCUU
cGAS_a (SEQ ID:335)
AGAGAAAUGUUGCAGGAAAUU
cGAS_b (SEQ ID:336)
CAGCUUCUAAGAUGCUGUCAAAGUU
BRCA1_a (SEQ ID:337)
CCUAUCGGAAGAAGGCAAGUU
BRCA1_b (SEQ ID:338)
CAUACAGCUUCAUAAAUAAUU
BRCA2_a (SEQ ID:339)
GGACACAAUUACAACUAAAUU
BRCA2_b (SEQ ID:340)
GGAGGAAUAUCGUAGGUAAUU
FancD2_a (SEQ ID:341)
GCAGAUUCAUGAAGAGAAAUU
FancD2_b (SEQ ID:342)
GGUUAAAGCACAUUGUAGAUU
CXCL10 Forward (SEQ ID NO:343)
GGCCATCAAGAATTTACTGAAAGCA
CXCL10 Reverse (SEQ ID NO:344)
TCTGTGTGGTCCATCCTTGGAA
CCL5 Forward (SEQ ID NO:345)
TGCCCACATCAAGGAGTATTT
CCL5 Reverse (SEQ ID NO:346)
CTTTCGGGTGACAAAGACG
IDO1 Forward (SEQ ID NO:347)
CATCTGCAAATCGTGACTAAG
IDO1 Reverse (SEQ ID NO:348)
CAGTCGACACATTAACCTTCCTTC
PDL1 Forward (SEQ ID NO:349)
GGCATCCAAGATACAAACTCAAAGA
PDL1 Reverse (SEQ ID NO:350)
AGTTCCAATGCTGGATTACGTCT
PUM1 (Housekeeping gene) Forward (SEQ IDNO:351)
CCAGAAAGCTCTTGAGTTTATTCC
PUM1 (Housekeeping gene) Reverse (SEQ IDNO:352)
CATCTAGTTCCCGAACCATCTC
OR2I1P_F1(SEQ ID NO:353)
CTCAACCCGCTCATCTACAC
OR2I1P_R1(SEQ ID NO:354)
TCCTTGGGTTCTGGCTTAATAC
OR2I1P_P1(SEQ ID NO:355)
TCGCTGCCCCCTTCACTTTCTTATT
AL137218.1_F1  (SEQ ID NO:356)
TGCTTCATGTTAGTCCCCAG
AL137218.1_R1 (SEQ ID NO:357)
GGGTCTCACTATATTGCTCTGG
AL137218.1_P1 (SEQ ID NO:358)
CCTCAGCCTTCCAAAACCAGGTGT
【図１Ａ−１】
2018524990.tif 000099
【図１Ａ−２】
2018524990.tif 000100
【図１Ｂ−１】
2018524990.tif 000101
【図１Ｂ−２】
2018524990.tif 000102
【図２Ａ】
2018524990.tif 000103
【図２Ｂ】
2018524990.tif 000104
【図２Ｃ】
2018524990.tif 000105
【図２Ｄ】
2018524990.tif 000106
【図３】
2018524990.tif 000107
【図４】
2018524990.tif 000108
【図５】
2018524990.tif 000109
【図６】
2018524990.tif 000110
【図７】
2018524990.tif 000111
【図８】
2018524990.tif 000112
【図９Ａ】
2018524990.tif 000113
【図９Ｂ】
2018524990.tif 000114
【図１０Ａ】
2018524990.tif 000115
【図１０Ｂ】
2018524990.tif 000116
【図１１】
2018524990.tif 000117
【図１２Ａ】
2018524990.tif 000118
【図１２Ｂ】
2018524990.tif 000119
【図１３Ａ】
2018524990.tif 000120
【図１３Ｂ】
2018524990.tif 000121
【図１３Ｃ】
2018524990.tif 000122
【図１３Ｄ】
2018524990.tif 000123
【図１３Ｅ】
2018524990.tif 000124
【図１４Ａ】
2018524990.tif 000125
【図１４Ｂ】
2018524990.tif 000126
【図１４Ｃ】
2018524990.tif 000127
【図１５Ａ】
2018524990.tif 000128
【図１５Ｂ】
2018524990.tif 000129
【図１６】
2018524990.tif 000130
【図１７Ａ】
2018524990.tif 000131
【図１７Ｂ】
2018524990.tif 000132
【図１７Ｃ】
2018524990.tif 000133
【図１８Ａ】
2018524990.tif 000134
【図１８Ｂ】
2018524990.tif 000135
【図１８Ｃ】
2018524990.tif 000136
【図１９Ａ】
2018524990.tif 000137
【図１９Ｂ】
2018524990.tif 000138
【図１９Ｃ】
2018524990.tif 000139
【図２０Ａ】
2018524990.tif 000140
【図２０Ｂ】
2018524990.tif 000141
【図２１】
2018524990.tif 000142
【図２２】
2018524990.tif 000143
【図２３Ａ】
2018524990.tif 000144
【図２３Ｂ】
2018524990.tif 000145
【図２４】
2018524990.tif 000146
【図２５】
2018524990.tif 000147
【図２６】
2018524990.tif 000148
【図２７Ａ】
2018524990.tif 000149
【図２７Ｂ】
2018524990.tif 000150
【図２７Ｃ】
2018524990.tif 000151
【図２８】
2018524990.tif 000152
【図２９Ａ】
2018524990.tif 000153
【図２９Ｂ】
2018524990.tif 000154
【図２９Ｃ】
2018524990.tif 000155
【図３０】
2018524990.tif 000156
【図３１】
2018524990.tif 000157
【図３２】
2018524990.tif 000158
【図３３】
2018524990.tif 000159
【配列表】
2018524990000001.app
【国際調査報告】
2018524990.tif 000160
2018524990.tif 000161
2018524990.tif 000162