(57)【要約】本開示は、(i) 転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列と、(ii) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列；HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列；HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの他の核酸配列とを含む、発現ベクターを提供する。単一の発現ベクター中での上記3つの機構の組み合わせは、HIV-1を阻害する新規な手段を提供する。2018518196.tif 000003
2018518196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列と、
(ii) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列；HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列；HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの他の核酸配列と
を含む、発現ベクター。
【請求項２】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列が、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸である、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項３】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列が、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項４】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iv) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(v) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vi) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vii) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(viii) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項５】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列が、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖が、SEQ ID NO: 6の配列、SEQ ID NO: 14の配列、SEQ ID NO: 22の配列、またはSEQ ID NO: 40の配列の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項６】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(ii) SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(iii) SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、および(iv) SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNAからなる群より選択されるsiRNAである、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項７】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 8の配列を有するshRNA、(ii) SEQ ID NO: 16の配列を有するshRNA、(iii) SEQ ID NO: 24の配列を有するshRNA、および(iv) SEQ ID NO: 42の配列を有するshRNAからなる群より選択されるshRNAである、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項８】
HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列が、二本鎖領域を有するsiRNAまたはshRNAであり、該二本鎖領域の第1の部分が該HIV共受容体の配列の一部と同一である配列を含み、該二本鎖領域の第2の部分が該HIV共受容体の配列の別の部分に相補的である配列を含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項９】
HIV共受容体がCCR5またはCXCR4である、請求項8記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記shRNAがSEQ ID NO: 25の配列を有する、請求項8記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが宿主細胞において発現されるとき、HIV共受容体の阻害剤がHIV共受容体の発現を低下させることができる、請求項8記載の発現ベクター。
【請求項１２】
HIV融合阻害剤タンパク質がC46タンパク質である、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１３】
HIV融合阻害剤タンパク質がSEQ ID NO: 26の配列を有する、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１４】
HIV複製を阻害するタンパク質が、ヒトTRIM5α、アカゲザルTRIM5α、キメラTRIM5α、ヒトTRIM5-シクロフィリン融合タンパク質、シクロフィリン、E3ユビキチン、APOBEC3G、および骨髄間質細胞抗原2(BST-2)からなる群より選択される、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記少なくとも2つの他の核酸配列が、(a) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、(b) HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列またはHIV複製の阻害剤をコードする核酸配列の1つとを含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記少なくとも2つの他の核酸配列が、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記少なくとも2つの他の核酸配列が、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列とを含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１８】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも2つの核酸を含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項１９】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする3つの核酸を含む、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項２０】
ウイルスベクターである、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項２１】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項20記載の発現ベクター。
【請求項２２】
レンチウイルスベクターが自己不活性である、請求項21記載の発現ベクター。
【請求項２３】
宿主細胞において発現されるとき、(1) X4-およびR5-指向性HIV株、(2) 高活性抗レトロウイルス療法(HAART)耐性HIV株、または(3) X4-およびR5-指向性HAART耐性HIV株による感染に対して抵抗性を付与する、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記核酸のそれぞれが別々のプロモーターによって発現される、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記核酸の少なくとも2つが同じプロモーターによって発現される、請求項1記載の発現ベクター。
【請求項２６】
HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列；HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列；およびHIVの5'LTR領域の配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列を含む発現ベクターであって、第3の核酸が、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、発現ベクター。
【請求項２７】
第1の核酸配列が第1のプロモーターに機能的に連結され、第2の核酸配列が第2のプロモーターに機能的に連結され、第3の核酸配列が第3のプロモーターに機能的に連結される、請求項26記載の発現ベクター。
【請求項２８】
第1、第2および第3のプロモーターの少なくとも2つが同じである、請求項27記載の発現ベクター。
【請求項２９】
第1、第2および第3のプロモーターが異なる、請求項27記載の発現ベクター。
【請求項３０】
第4の核酸をさらに含み、第4の核酸が、HIVの5'LTRの配列を標的とする別の核酸；HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択され、第4の核酸が第4のプロモーターに機能的に連結される、請求項26記載の発現ベクター。
【請求項３１】
HIVの5'LTR内の配列を標的とする少なくとも2つのサイレンシング核酸を含む、請求項26記載の発現ベクター。
【請求項３２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
造血前駆細胞/幹細胞、単球、マクロファージ、末梢血単核細胞、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、または樹状細胞である、請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターのいずれかを含む、組成物。
【請求項３５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
エマルションとして製剤化される、請求項34記載の組成物。
【請求項３７】
ミセルまたはナノ粒子を用いて製剤化される、請求項34記載の組成物。
【請求項３８】
ポリマー内にカプセル化される、請求項34記載の組成物。
【請求項３９】
リポソーム内に封入される、請求項34記載の組成物。
【請求項４０】
ミセル、ナノ粒子またはナノカプセル内に封入される、請求項34記載の組成物。
【請求項４１】
HIVに感染した細胞におけるHIV遺伝子転写または複製を阻害する方法であって、有効量の請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターまたは請求項34〜40のいずれか一項記載の組成物を該細胞に接触させる段階を含む、方法。
【請求項４２】
対象におけるHIV感染を治療する方法であって、有効量の請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターまたは請求項34〜40のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項４３】
対象におけるHIV感染を予防または低減する方法であって、有効量の請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターまたは請求項34〜40のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項４４】
HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防または低減する方法であって、有効量の請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターまたは請求項34〜40のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項４５】
(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列；HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列；HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される、少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、
(ii) HIVの5'LTR内の配列を標的とする、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸と
を含む、組成物。
【請求項４６】
前記発現ベクターがレンチウイルスベクターであり、かつHIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列とHIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
HIV共受容体がCCR5であり、HIV融合阻害剤タンパク質がC46である、請求項46記載の組成物。
【請求項４８】
少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸が、(i) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iv) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(v) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vi) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vii) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(viii) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、請求項45記載の組成物。
【請求項４９】
少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸が、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖が、SEQ ID NO: 6の配列、SEQ ID NO: 14の配列、SEQ ID NO: 22の配列、またはSEQ ID NO: 40の配列の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、請求項45記載の組成物。
【請求項５０】
少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸が、(i) SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(ii) SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(iii) SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、および(iv) SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNAからなる群より選択されるsiRNAである、請求項45記載の組成物。
【請求項５１】
少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸が、(i) SEQ ID NO: 8の配列を有するshRNA、(ii) SEQ ID NO: 16の配列を有するshRNA、(iii) SEQ ID NO: 24の配列を有するshRNA、および(iv) SEQ ID NO: 42の配列を有するshRNAからなる群より選択されるshRNAである、請求項45記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項45記載の組成物。
【請求項５３】
HIVに感染した細胞におけるHIV遺伝子転写または複製を阻害する方法であって、有効量の請求項45〜52のいずれか一項記載の組成物を該細胞に接触させる段階を含む、方法。
【請求項５４】
対象におけるHIV感染を治療する方法であって、有効量の請求項45〜52のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項５５】
対象におけるHIV感染を予防または低減する方法であって、有効量の請求項45〜52のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項５６】
HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防または低減する方法であって、有効量の請求項45〜52のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項５７】
対象におけるHIV感染を治療する方法であって、
(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列；HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列；HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む、有効量の発現ベクターと、
(ii)(a) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(b) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(c) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(d) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(e) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(f) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(g) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(h) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、有効量の少なくとも1つのサイレンシング核酸と
を共投与する段階を含む、方法。
【請求項５８】
共投与が同時である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
前記発現ベクターと前記少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントとが、異なる時間に投与される、請求項57記載の方法。
【請求項６０】
前記発現ベクターが、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列とHIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む、請求項57記載の方法。
【請求項６１】
HIV共受容体がCCR5であり、HIV融合阻害剤タンパク質がC46である、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
対象におけるHIV感染を予防または低減する方法であって、
(i) HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列；標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列；HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む、有効量の発現ベクターと、
(ii)(a) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(b) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(c) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(d) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(e) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(f) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(g) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(h) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、有効量の少なくとも1つのサイレンシング核酸と
を共投与する段階を含む、方法。
【請求項６３】
共投与が同時である、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
前記発現ベクターと前記少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントとが、異なる時間に投与される、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
前記発現ベクターが、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列とHIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む、請求項62記載の方法。
【請求項６６】
HIV共受容体がCCR5であり、HIV融合阻害剤タンパク質がC46である、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
対象におけるHIV感染を治療または予防する方法であって、請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターを造血細胞に形質導入する段階、および形質導入された造血細胞を該対象に移植する段階を含み、該形質導入された造血細胞がHIV感染に抵抗性である、方法。
【請求項６８】
HIVに感染した患者を治療するための医薬の製造における請求項34〜40および45〜52のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項６９】
HIVに感染した患者を治療するための医薬の製造における請求項1〜31のいずれか一項記載のウイルス発現ベクターの使用。
【請求項７０】
SEQ ID NO: 25の配列を有するshRNAをコードする第1の核酸と、
C46タンパク質をコードする第2の核酸配列と、
(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、HIVの5'LTRの配列の1つを標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列と
を含む発現ベクターであって、
第1の核酸配列がH1 pol IIIプロモーターに機能的に連結され、第2の核酸配列がユビキチンC pol IIプロモーターに機能的に連結され、第3の核酸配列がU6プロモーターに機能的に連結される、発現ベクター。
【請求項７１】
C46タンパク質をコードする第2の核酸配列が、SEQ ID NO: 26の配列を有する、請求項70記載の発現ベクター。
【請求項７２】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする第3の核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(ii) SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(iii) SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、および(iv) SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNAからなる群より選択されるsiRNAである、請求項70または71記載の発現ベクター。
【請求項７３】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする第3の核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 8の配列を有するshRNA、(ii) SEQ ID NO: 16の配列を有するshRNA、(iii) SEQ ID NO: 24の配列を有するshRNA、および(iv) SEQ ID NO: 42の配列を有するshRNAからなる群より選択されるshRNAである、請求項70または71記載の発現ベクター。
【請求項７４】
第4の核酸配列をさらに含み、
第4の核酸配列が、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、HIVの5'LTRの配列の別のものであり、
第4の核酸配列がU1プロモーターに機能的に連結される、
請求項70または71記載の発現ベクター。
【請求項７５】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする第4の核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(ii) SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(iii) SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、および(iv) SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNAからなる群より選択されるsiRNAである、請求項74記載の発現ベクター。
【請求項７６】
転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする第4の核酸配列が、(i) SEQ ID NO: 8の配列を有するshRNA、(ii) SEQ ID NO: 16の配列を有するshRNA、(iii) SEQ ID NO: 24の配列を有するshRNA、および(iv) SEQ ID NO: 42の配列を有するshRNAからなる群より選択されるshRNAである、請求項74記載の発現ベクター。
【請求項７７】
HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、
HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列であって、T20ではない第2の核酸配列と、
HIVの5'LTR領域の配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列と
を含む発現ベクターであって、
第3の核酸が、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、発現ベクター。
【請求項７８】
HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列が、SEQ ID NO: 26の配列を有する、請求項77記載の発現ベクター。
【請求項７９】
対象におけるHIV感染を治療する方法であって、有効量の請求項70〜78のいずれか一項記載の組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項８０】
HIVに感染したヒト宿主患者を治療する方法であって、該宿主患者の循環血液または骨髄から造血幹細胞を取り出す段階と、該造血幹細胞を請求項1〜31のいずれか一項記載の発現ベクターで処理する段階と、処理された造血幹細胞を同じ宿主患者に投与または移植する段階とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年5月18日に出願された米国仮特許出願第62/163,332号の出願日の恩典を主張するものであり、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、概して、分子生物学およびウイルス学の分野に関する。特に、本開示は、HIV感染の治療および予防に有用な発現ベクター、ならびに組織培養系、動物モデル系およびHIV-1感染者におけるHIV感染および複製を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
HIV-1は、世界中で3000万人ほどが感染している後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因病原体である。HIVは免疫系を機能不全にさせ、日和見感染によって死亡する確率を高める。HIV感染は、世界保健機関によりパンデミックと指定されたことからも明らかなように、世界規模での主要な健康上の問題である。HIVに感染した、特に発展途上国の、多くの人々は最終的にAIDSを発症し、毎年100万人を上回る人々が命を奪われている。
【０００４】
HIV-1は、レトロウイルス科のウイルスに属し、ゲノムが2本の一本鎖RNA分子(ssRNA)からなる、エンベロープを持ったウイルスである。HIV-1の一次標的は、CD4+ T細胞のようなCD4+発現細胞である。HIV-1ウイルスの糖タンパク質は、標的細胞のCD4分子と相互作用し、かつ標的細胞の表面上のケモカイン共受容体CCRSまたはCXCR4と相互作用する。標的細胞への融合および侵入後、ウイルスゲノムを含むヌクレオキャプシドが解離して、ssRNAを含むウイルスの内容物を細胞質に放出する。HIV-1の逆転写(RT)酵素はssRNAゲノムからウイルス二本鎖DNA(dsDNA)を合成する。二本鎖HIV-1 DNA分子の合成後、HIV-1 DNAは宿主ゲノムに組み込まれる。
【０００５】
組み込まれたHIV-1 DNAには、同一の5'および3'ロングターミナルリピート配列(LTR)が隣接しており、該配列からHIV-1は組み込まれたHIV-1ゲノムの転写を開始することができる。ウイルスDNAの転写には、NF-κBのような転写因子が必要であり、こうした因子は活性化されたT細胞においてアップレギュレートされている。結果として、ウイルスの転写は、感染中のような、T細胞の活性化後のT細胞において最も活発である。組み込まれたHIV-1ゲノムの転写から生じるウイルスRNAは、続いて翻訳されてウイルス粒子にパッケージングされ、その後細胞を出て感染性ウイルスになる。
【０００６】
HIV-1感染の治療には、抗レトロウイルス併用療法(cART)が含まれる。cARTは、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、インテグラーゼおよび融合阻害剤の組み合わせを含み、HIVの進行を遅らせる。これは、ひいては、該治療を利用することができる世界の諸地域においてHIV/AIDSの罹患率と死亡率を劇的に減少させる。しかしながら、cARTはHIV/AIDSのあらゆる症状を治癒したり、完全に取り除いたりするわけではない。また、cART療法は、薬剤耐性突然変異によって危険にさらされることがあり、重篤でかつ蓄積性であるようにみえる様々な副作用がある。さらに、cART療法の中断は、ほとんど例外なく、検出可能なウイルスの複製の再発とAIDSへの進行につながり、あらゆる原因による死亡および深刻な非AIDS事象の発生率の上昇と関連することが示されている。これらの理由から、ならびにcARTの高いコストおよび厳密な服薬順守の必要性のために、こうした治療は多くの患者にとって比較的効果が薄い可能性がある。
【０００７】
HIVベースのレンチウイルスベクターは、研究および遺伝子導入の臨床的応用のために選択されるレトロウイルスベクター系に急速になりつつある。静止幹細胞と非分裂性最終分化細胞の両方に形質導入するレンチウイルスベクターの能力の向上は、広範囲の治療用遺伝子送達ベクターの開発、ならびに短鎖ヘアピンRNA(shRNA)遺伝子ノックダウンライブラリーおよび最終分化細胞における多能性の誘導のためのベクターなどの、有望な研究ツールの開発につながった。初期のガンマレトロウイルス臨床遺伝子治療ベクターは、X連鎖重症複合免疫不全症(SCID-X1)の患者の免疫機能を回復させたが、それらは癌原遺伝子のトランス活性化を介して増殖性疾患を引き起こすことがその後判明した。より新しいレンチウイルスベクターの設計はその危険性を大いに減少させる可能性があり、それらは予測された安全性の最終確認のための臨床試験待ちである。この分野は依然として流動的であり、その臨床試験の結果は予測不可能である。
【０００８】
例えば、Trobridge et al., PLoS One, Vol. 4: e7693, 2009(非特許文献1)(以下、「Trobridge」)は、pol III駆動shRNAを、別のプロモーターによって駆動されるC46融合阻害剤遺伝子と同じ発現ベクターに挿入すると、該shRNAを含まないベクターと比較して、C46発現が大幅に低下したことを教示している(Trobridgeの5ページ左欄、第1段落および図3を参照されたい)。その結果、この2剤ベクターは、C46融合阻害剤のみをコードするベクターよりも、HIV感染に対して実質的に有効性が低かった(有効性が27倍超低下した)(同上参照)。さらに、この2剤ベクターは、C46融合阻害剤のみをコードするベクターと比較して、造血細胞へのかなり低い抗HIV遺伝子導入率を示した(6および7ページ、表1および図6参照)。Trobridgeは、C46の弱い発現が、該ベクター中にshRNAをコードする配列を含むことに起因すると考えた(7ページ右欄、第1段落および9ページ左欄、第3段落参照)。また、Trobridgeは、低い遺伝子導入レベルが、抗HIV遺伝子治療の臨床試験における主要な障害であることを開示している(例えば、要約、2ページ左欄、第1段落全体、および8ページ右欄、第2段落全体を参照されたい)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Trobridge et al., PLoS One, Vol. 4: e7693, 2009
【発明の概要】
【００１０】
開示の概要
本開示は、HIV感染を治療、予防および/または低減するための新規な治療アプローチを提供し、このアプローチでは、ウイルス感染の異なる段階の組み合わせが遺伝子治療によって標的とされる。例えば、本開示は、宿主細胞へのウイルス侵入の阻害剤、ウイルス融合の阻害剤および/またはウイルス複製の阻害剤、ならびにHIV-1遺伝子転写の阻害剤をコードするベクターを提供する。
【００１１】
本開示のいくつかの局面には、発現ベクターがある。かくして、本開示の一局面によれば、発現ベクターは、(i) 転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列と、(ii) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの他の核酸配列とを含む。いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸である。いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列(350位から368位までの該配列は、本明細書では「PromA」とも呼ばれる)を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。ある実施態様では、前記少なくとも2つの他の核酸配列は、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む。他の実施態様では、前記少なくとも2つの他の核酸配列は、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列とを含む。
【００１２】
いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は、(i) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iv) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(v) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vi) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vii) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、および(viii) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖は、SEQ ID NO: 6の配列、SEQ ID NO: 14の配列、SEQ ID NO: 22の配列、またはSEQ ID NO: 40の配列の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は、(i) SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(ii) SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(iii) SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、および(iv) SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNAからなる群より選択されるsiRNAである。
【００１４】
いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は、(i) SEQ ID NO: 8の配列を有するshRNA、(ii) SEQ ID NO: 16の配列を有するshRNA、(iii) SEQ ID NO: 24の配列を有するshRNA、および(iv) SEQ ID NO: 42の配列を有するshRNAからなる群より選択されるshRNAである。
【００１５】
いくつかの実施態様では、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列は、二本鎖領域を有するsiRNAまたはshRNAであり、該二本鎖領域の第1の部分はHIV共受容体の配列の一部と同一である配列を含み、該二本鎖領域の第2の部分はHIV共受容体の配列の別の部分に相補的である配列を含む。いくつかの実施態様では、HIV共受容体はCCR5またはCXCR4である。いくつかの実施態様では、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列は、SEQ ID NO: 25の配列を有するshRNAである。いくつかの実施態様では、該ベクターが宿主細胞において発現される場合、HIV共受容体の阻害剤は、HIV共受容体の発現を低下させることができる。いくつかの実施態様では、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質は、C46タンパク質である。いくつかの実施態様では、HIV融合を阻害する該タンパク質は、SEQ ID NO: 26の配列を有する。いくつかの実施態様では、HIV複製を阻害するタンパク質は、ヒトTRIM5α、アカゲザルTRIM5α、キメラTRIM5α、ヒトTRIM5-シクロフィリン融合タンパク質、シクロフィリン、E3ユビキチン、APOBEC3G、および骨髄間質細胞抗原2(BST-2)からなる群より選択される。
【００１６】
いくつかの実施態様において、前記発現ベクターは、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも2つの核酸を含む。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする3つの核酸を含む。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、レンチウイルスベクターは自己不活性である。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、(1) X4-およびR5-指向性HIV株、(2) 高活性抗レトロウイルス療法(HAART)耐性HIV株、または(3) X4-およびR5-指向性HAART耐性HIV株による感染に対して抵抗性を付与する。いくつかの実施態様では、前記核酸のそれぞれは別々のプロモーターによって発現される。いくつかの実施態様では、前記核酸の少なくとも2つは同じプロモーターによって発現される。
【００１７】
本開示の別の局面には、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む発現ベクターがある。いくつかの実施態様では、第1の核酸配列は第1のプロモーターに機能的に連結され、第2の核酸配列は第2のプロモーターに機能的に連結され、第3の核酸配列は第3のプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施態様では、第1、第2および第3のプロモーターの少なくとも2つは同じである。いくつかの実施態様では、第1、第2および第3のプロモーターは異なる。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは第4の核酸をさらに含み、第4の核酸は、HIVの5'LTRの配列を標的とする別の核酸、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択され、第4の核酸は第4のプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、HIVの5'LTRを標的とする少なくとも2つのサイレンシング核酸を含む。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００１８】
本開示の別の局面には、SEQ ID NO: 25の配列を有するshRNAをコードする第1の核酸配列と、C46タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列の1つを標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む発現ベクターがある。第1の核酸配列はH1 pol IIIプロモーターに機能的に連結され、第2の核酸配列はユビキチンC pol IIプロモーターなどのpol IIプロモーターに機能的に連結され、第3の核酸配列はU6、U6.1またはU6.2プロモーター(本明細書では、U6、U6.1およびU6.2を総称して「U6」と呼ぶことがある)の1つに機能的に連結される。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは第4の核酸配列をさらに含み、第4の核酸配列は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列の別のものであり、第4の核酸配列はU1プロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００１９】
本開示の別の局面には、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列であって、T20ではない第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTR領域内の配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む発現ベクターがある。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列は、SEQ ID NO: 26の配列を有する。
【００２０】
本開示の別の局面には、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む発現ベクターを含む宿主細胞がある。いくつかの実施態様では、該宿主細胞は、造血前駆細胞/幹細胞、単球、マクロファージ、末梢血単核細胞、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、または樹状細胞である。
【００２１】
本開示の他の局面には、発現ベクターを含む組成物、または発現ベクターと別の核酸分子を含む組成物などの、組成物がある。こうして、本開示の別の局面によれば、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む発現ベクターを含む、薬学的組成物などの、組成物がある。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、該組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施態様では、該組成物はエマルションとして製剤化される。いくつかの実施態様では、該組成物はミセル、ナノ粒子またはナノカプセルを用いて製剤化される。いくつかの実施態様では、該組成物はポリマー内にカプセル化される。いくつかの実施態様では、該組成物はリポソーム内に封入される。いくつかの実施態様では、該組成物はミニ細胞(minicell)内に封入される。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００２２】
本開示の別の局面には、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む組成物がある。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００２３】
いくつかの実施態様では、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸は、(i) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(iv) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(v) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vi) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(vii) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(viii) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖は、SEQ ID NO: 6の配列、SEQ ID NO: 14の配列、SEQ ID NO: 22の配列、またはSEQ ID NO: 40の配列の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸は、(i) SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(ii) SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、(iii) SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNA、および(iv) SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むsiRNAからなる群より選択されるsiRNAである。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸は、(i) SEQ ID NO: 8の配列を有するshRNA、(ii) SEQ ID NO: 16の配列を有するshRNA、(iii) SEQ ID NO: 24の配列を有するshRNA、および(iv) SEQ ID NO: 42の配列を有するshRNAからなる群より選択されるshRNAである。いくつかの実施態様では、前記組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００２４】
本開示のさらに他の局面には、(i) HIV転写を阻害する方法、(ii) HIV複製を阻害する方法、(iii) HIV感染を治療する方法、(iv) HIV感染を予防する方法、(v) HIV感染を低減する方法、および(vi) HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防および/または低減する方法を含む、方法がある。これらの方法は、細胞に、本明細書に記載の発現ベクター、発現ベクターおよび/または他の成分もしくは活性剤を含む組成物を投与するか、接触させることによって、あるいは(a)発現ベクターを含む組成物と、(b)別の成分または活性剤とを共投与することによって実施される。
【００２５】
したがって、本開示の別の局面によれば、HIVに感染した細胞におけるHIV遺伝子転写を阻害する方法があり、この方法は、該細胞に有効量の発現ベクターを接触させることを含み、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含み、第3の核酸は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。
【００２６】
本開示の別の局面によれば、HIVに感染した細胞におけるHIV遺伝子複製を阻害する方法があり、この方法は、該細胞に有効量の発現ベクターを接触させることを含み、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含み、第3の核酸は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００２７】
本開示の別の局面によれば、対象におけるHIV感染を治療する方法があり、この方法は、該対象に有効量の発現ベクターを投与することを含み、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含み、第3の核酸は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を治療するための医薬の製造における前記発現ベクターの使用をも包含する。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００２８】
本開示の別の局面には、対象におけるHIV感染を予防および/または低減する方法があり、この方法は、該対象に有効量の発現ベクターを投与することを含み、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含み、第3の核酸は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を予防および/または低減するための医薬の製造における前記発現ベクターの使用をも包含する。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００２９】
本開示の別の局面には、HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防および/または低減する方法があり、この方法は、該対象に有効量の発現ベクターを投与することを含み、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含み、第3の核酸は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。あるいは、本開示は、HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防および/または低減するための医薬の製造における前記発現ベクターの使用をも包含する。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００３０】
本開示の別の局面には、HIVに感染した細胞におけるHIV遺伝子転写を阻害する方法があり、この方法は、該細胞に有効量の組成物を接触させることを含み、該組成物は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む。
【００３１】
本開示の別の局面には、HIVに感染した細胞におけるHIV遺伝子複製を阻害する方法があり、この方法は、該細胞に有効量の組成物を接触させることを含み、該組成物は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００３２】
本開示の別の局面には、対象におけるHIV感染を治療する方法があり、この方法は、該対象に有効量の組成物を投与することを含み、該組成物は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を治療するための医薬の製造における前記組成物の使用をも包含する。
【００３３】
本開示の別の局面には、対象におけるHIV感染を低減および/または予防する方法があり、この方法は、該対象に有効量の組成物を投与することを含み、該組成物は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を予防および/または低減するための医薬の製造における前記組成物の使用をも包含する。
【００３４】
本開示の別の局面には、HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防および/または低減する方法があり、この方法は、該対象に有効量の組成物を投与することを含み、該組成物は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む。あるいは、本開示は、HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防および/または低減するための医薬の製造における前記組成物の使用をも包含する。
【００３５】
本開示の別の局面には、対象におけるHIV感染を治療する方法があり、この方法は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む、有効量の発現ベクターと、(ii)(a) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(b) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(c) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(d) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(e) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(f) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(g) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(h) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、有効量の少なくとも1つのサイレンシング核酸とを共投与することを含む。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、共投与することは同時である。いくつかの実施態様では、該発現ベクターと該少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントは、異なる時間に投与される。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む。いくつかの実施態様では、HIV共受容体はCCR5であり、かつHIV融合阻害剤タンパク質はC46である。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００３６】
本開示の別の局面には、対象におけるHIV感染を低減および/または予防する方法があり、この方法は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む、有効量の発現ベクターと、(ii)(a) SEQ ID NO: 1の配列を標的とするサイレンシング核酸、(b) SEQ ID NO: 9の配列を標的とするサイレンシング核酸、(c) SEQ ID NO: 17の配列を標的とするサイレンシング核酸、(d) SEQ ID NO: 36の配列を標的とするサイレンシング核酸、(e) SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(f) SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、(g) SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸、および(h) SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、有効量の少なくとも1つのサイレンシング核酸とを共投与することを含む。いくつかの実施態様では、該発現ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、共投与することは同時である。いくつかの実施態様では、該発現ベクターと該少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントは、異なる時間に投与される。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列とを含む。いくつかの実施態様では、HIV共受容体はCCR5であり、かつHIV融合阻害剤タンパク質はC46である。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００３７】
本開示の別の局面には、造血細胞に発現ベクターを形質導入する段階と、形質導入された造血細胞を対象に移植する段階とを含む、対象におけるHIV感染を治療する方法があり、形質導入された造血細胞はHIV感染に抵抗性であり、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、造血細胞(例えば、HPSC、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球または単球/マクロファージ)に本開示の発現ベクターを形質導入する段階と、形質導入された細胞を患者に移植する段階を含み、該形質導入された細胞はHIV感染に抵抗性である。いくつかの実施態様では、造血細胞は、患者への移植後にHIV感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成する造血前駆細胞/幹細胞(HPSC)である。いくつかの実施態様では、HPSCは自己のCD34陽性細胞である。いくつかの実施態様では、形質導入されたHPSCは、HIVのR5およびX4指向性株による感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成することができる。いくつかの実施態様では、形質導入されたHPSCは、cARTに耐性を示すHIV株による感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成することができる。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を治療および/または予防するための医薬の製造における前記細胞の使用をも包含する。
【００３８】
本開示の別の局面には、造血細胞に発現ベクターを形質導入する段階と、形質導入された造血細胞を対象に移植する段階とを含む、対象におけるHIV感染を予防および/または低減する方法があり、形質導入された造血細胞はHIV感染に抵抗性であり、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、造血細胞(例えば、HPSC、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球または単球/マクロファージ)に本開示の発現ベクターを形質導入する段階と、形質導入された細胞を患者に移植する段階を含み、形質導入された細胞はHIV感染に抵抗性である。いくつかの実施態様では、造血細胞は、患者への移植後にHIV感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成する造血前駆細胞/幹細胞(HPSC)である。いくつかの実施態様では、HPSCは自己のCD34陽性細胞である。いくつかの実施態様では、形質導入されたHPSCは、HIVのR5およびX4指向性株による感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成することができる。いくつかの実施態様では、形質導入されたHPSCは、cARTに耐性を示すHIV株による感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成することができる。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を治療および/または予防するための医薬の製造における前記細胞の使用をも包含する。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【００３９】
本開示の別の局面には、本明細書に記載の発現ベクターを作製する方法、ならびに新規な発現ベクターを含む薬学的組成物がある。いくつかの実施態様では、細胞中に存在する場合に、細胞へのHIVの結合を阻害しかつ細胞へのHIV融合またはHIV複製を阻止することができるウイルス発現ベクターを作製する方法は、細胞へのHIV融合またはHIV複製を阻止することができるタンパク質を発現する遺伝子のcDNAを合成する段階；合成されたcDNAをウイルスベクター中の制限部位にクローニングする段階；およびHIV共受容体の発現をダウンレギュレートすることができる発現ユニットを該ベクター中の制限部位に挿入する段階を含む。
【００４０】
本開示のさらに別の局面は、本開示の発現ベクターを含むキットを提供する。このキットは、それを必要とする対象に投与するための他の活性医薬成分と組み合わせることができる。
【００４１】
本開示は、一部には、非HIV遺伝子および/またはタンパク質(すなわち、宿主細胞の遺伝子および/またはタンパク質)を標的とする治療アプローチが、阻害剤に耐性の新しいHIV株の出現可能性を低下させる、という認識に基づいている。未処理のCD34+造血幹細胞(HPSC)および/またはCD4+ T細胞では、HIVがCD4およびCCR5に結合し、その後細胞膜と融合する。融合の後、ウイルスRNAが導入され、二本鎖になるcDNAへの逆転写に続いて、それは宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そこで転写されて、より多くのHIVを産生する。(組合せ)処理されたCD34+ HSCおよび/またはCD4+ T細胞では、HIVはCCR5への結合および細胞膜との融合をブロックされる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、たとえHIVがこれら2つのブロックを克服し、ウイルスRNAが導入されてDNAとして宿主細胞ゲノムに組み込まれるとしても、本開示の発現ベクター内に含まれる転写遺伝子サイレンシング(TGS)誘導性shRNAがHIV DNAを転写的に不活性にさせるので、転写がブロックされると考えられる。
【００４２】
さらに、Trobridgeの教示を考慮すると、当業者は、阻害性核酸分子をコードする核酸配列と同じベクター中に、融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列を含めることから遠ざけられていたであろう。ましてや転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする第3の核酸配列を含めることはあり得ないことである。HIV複製を阻害する上で、2剤組合せベクターが融合阻害剤タンパク質のみをコードするベクターよりも実際に効果が低かったことをTrobridgeが明確に示しているという理由だけで、当業者は遠ざけられていたであろう。そこでは、2剤ベクターにより示された造血細胞への遺伝子導入の非常に低いレベルからも、当業者は、単一の核酸をコードするベクターを、追加の核酸配列を組み込むように改変することを妨げられたであろう。なぜならば、そのような低い遺伝子導入レベルは、臨床試験において遺伝子治療が失敗する主な理由になっているからである。このことを考慮すると、Trobridgeの読者である当業者は、本明細書に開示されるような、3剤組合せベクターまたは4剤組合せベクターが機能しないで、単剤ベクターまたは2剤ベクター系よりも確実に効果が低いことを、明確に予測したであろう。
【００４３】
本発明者らは、Trobridgeと比較したとき、本開示が優れた結果をもたらすことを提示する。実際に、本発明者らは、CCR5標的指向shRNA (sh5)およびC46の発現を可能にするように、CD4+ Tリンパ球およびCD34+ HSPCなどの種々の造血細胞にLVsh5/C46(本明細書では「Cal-1」とも呼ばれる)を安定に導入できることを実証した。実際に、本発明者らは、LVsh5/C46ベクターで標的細胞を処理しても、毒性の兆候が何も示されなかったことを実証した(例えば、Wolstein et al., "Preclinical Safety and Efficacy Of An Anti-HIV-1 Lentiviral Vector Containing A Short Hairpin RNA To CCR5 and The C46 Fusion Inhibitor," Molecular Therapy-Methods & Clinical Development (2014) 1, 11; doi:10.1038/mtm.2013.11を参照されたい；また、Burke, et al. "Engineering Cellular Resistance To HIV-1 Infection In Vivo Using A Dual Therapeutic Lentiviral Vector," Molecular Therapy-Nucleic Acids (2015) 4, e236; doi:10.1038/mtna.2015.10も参照されたい；これらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【００４４】
また、本明細書でさらに述べるように、高活性抗レトロウイルス療法(例えば、cART)は、HIV複製を効果的に抑制しかつ耐性の発生を軽減するために、2〜3種の活性医薬成分を使用する。本発明者らは、本明細書に開示するような3剤または4剤組合せベクターが同様にHIVの治療および/または抑制のための有効な手段を提供し得ると考えている。したがって、特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、3剤または4剤組合せベクターが、比較的優れた結果を提供しながら、2剤ベクター構築物と同程度に安全であり得ると考えている。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本開示の新規な組合せベクターがHIVをどのように阻害し得るかを示す。HIV感染を防御する際に複合LV構築物によって標的とされる機構のモデル。
【図２】TGS誘導性si/shRNAの位置を示す。Nuc-0およびNuc-1の位置、ならびに本発明者らのリード候補si/shRNAの標的配列を含む5'LTRのモデル。これらは、タンデムNF-kB結合部位内の配列(PromA)およびnuc-0の領域中の上流の配列(si143)を標的とする。これらは同様のエピジェネティックな変化を誘導する。本発明者らは、こうした分子がAgo1動員とその後のHDAC 1および2sならびにHMT類(例えば、Enhancer of Zeste)を介して核内に作用することを示した。
【図３】サブタイプA〜UにわたるHIV-1 5'LTRプロモーターにおけるsiRNA 143、136、205およびPromA標的配列の保存を示す。
【図４】Calimmune社のCal-1骨格ベクター(米国特許出願公開第US2012/0201794号を参照されたい；その開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)に基づいた、ウイルスゲノムの組み込みを可能にするが該ゲノムの発現を可能にしない改変LTRを含む自己不活性化レンチウイルスベクターを示す。これらのベクターは、H1 (H1プロモーター)および/またはU6 (U6プロモーター)および/またはU1 (U1プロモーター)；sh5 (短鎖ヘアピンRNA CCR5)；またはshPrA (短鎖ヘアピンRNA PromA)；および/またはsh143 (短鎖ヘアピンRNA 143)；UbC (ユビキチンCプロモーター)；およびC46 (C46融合阻害剤)からなる。構築物の発現を測定するために、全ての改変構築物は高感度緑色蛍光タンパク質EGFPを含む。TGS誘導性shRNAの結果。これらの結果は一連の図として示される。
【図５】図5aは、143、136、205およびPromA siRNAによって標的とされたHIV-1 5'LTR内の領域を示す略図である。矢印は転写開始部位を示し、下線を引いた配列はタンデムリピートNF-κB結合部位を示し、siPromA-M2およびsi143Tは特異性対照として使用される不活性変異体である。図5bは、si136T-、si143-、si205S-およびsiPromA-トランスフェクト培養物が、不活性変異体対照と比較して、感染15日後にHIV-1 SF162ウイルス転写の強力な抑制を示すグラフである。* HIV-1 NL4.3株と同一のsiRNA標的。** HIV-1 SF162株と同一のsiRNA標的。全体として、図5a〜bは、HIV LTR標的指向siRNAがHIV転写を強力に抑制することを示す。HIV 5'LTRを標的とするsiRNAがHIV-1転写を強力に抑制できたことを実証するために、HeLa T4+細胞に個々のsiRNAをトランスフェクトし、HIV-1 SF162株を感染させ、長期の感染期間にわたって逆転写酵素(RT)アッセイを実施した。siRNA 143標的配列は、SF162株と同一である。単一のミスマッチが抑制効果を低減させる上で決定的に重要であるかどうかを確認するために、本発明者らは、SF162株と比較して単一のTミスマッチを有するsiRNA 143Tをも含めた。このミスマッチsiRNA 143Tは、GenBank(アクセッション番号M65024.1)で入手可能なSF162 3'LTR配列に対応する。また、配列特異性対照siPromA-M2も含まれていた。完全にマッチしたsiRNAである143およびPromAの両方は、HIV-1 SF162株による増殖性感染を強力に抑制し、モックトランスフェクト細胞と比較して、RT活性の1000倍超の低下を示した。興味深いことに、143Tは、ウイルス感染を143およびPromAに匹敵するレベルに感染後6日目まで抑制したが、その後はウイルス抑制を維持することができなかった。
【図６】siRNAで抑制されたHIV-1培養物においてヘテロクロマチンマークが観察されたことを示す。LTR標的指向siRNAの抑制効果が転写遺伝子サイレンシング(TGS)機構を介して起こっていたことを確認するために、siRNA 143、136、205およびPromAトランスフェクション後のHIV-1が抑制されたHeLa T4+培養物、またはモックトランスフェクション後のHIV転写が活発な培養物において、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを行った。TGSと一致するヘテロクロマチンマークは、感染後6日目にsiRNA 143、136、205およびPromA-トランスフェクト培養物において観察され、これらの培養物は、モックトランスフェクト培養物と比較して、ヒストン3リジン27トリメチル化(H3K27me3)の富化、およびヒストン3リジン9アセチル化(H3K9Ac)の低下を含んでいた。ヘテロクロマチンマークのChIP分析はまた、si143-およびsiPromA-トランスフェクト細胞におけるH3K9me3の富化およびAgo1の動員を明らかにした。ヘテロクロマチンマークは、図6に示されるように、siRNAで抑制されたHIV-1培養物において観察された。ヘテロクロマチンマークのChIP分析は、si143-およびsiPromA-トランスフェクト細胞におけるH3K27me3の富化およびH3K9Acの低下を示した。
【図７】再活性化刺激に対するshRNAによる強い抵抗性を示す。HIV-1潜伏モデルにおけるsiRNA 143標的配列の効果を調べるために、レンチウイルスベクターを用いて短鎖ヘアピン(sh)143および/またはshPromAをJ-Lat 9.2細胞に安定に形質導入した。組み込まれた潜伏HIV-1の再活性化は、様々な濃度のSAHA、TNFまたはSAHA/TNFの組み合わせを用いてJ-Lat 9.2細胞において試み、GFP発現をHIV転写の読み取り値として48時間で測定した。sh143および/またはshPromAを形質導入されたJ-Lat 9.2細胞は、生理学的濃度のSAHA、TNFまたはSAHA/TNFの組み合わせからの再活性化に対して大いに抵抗性であることが観察され(Cillo et al., 2014 PNAS; De Pablo-Bernal et al., 2014 J Antimicrob Chemother)、超生理学的薬物濃度でさえも低レベルの再活性化を示した。一方、shRNA対照を形質導入されたものは、非常に高いGFP発現を示して、潜伏HIV-1感染の再活性化を示唆する。重要なことには、2剤sh143/shPromA形質導入J-Lat 9.2細胞株は、再活性化刺激からのやや良好な防御を示すようであった。これらのデータから、HIV-1潜伏モデルJ-Lat 9.2細胞は、sh143および/またはshPromAを形質導入された場合、薬物処理による再活性化に対して大いに抵抗性であることが実証される。これらの知見は、患者が様々な免疫・炎症刺激に曝される可能性がある場合に、遺伝子治療の適用との関連において重要である。再活性化刺激に対するshRNAによる強力な抵抗性は、図7に示される。sh143およびshPromAを形質導入されたJ-Lat 9.2細胞は、再活性化時に増加するGFP発現によって示される対照細胞と比較して、特に生理学的薬物濃度で、組合せTNF/SAHA処理による再活性化を受けにくい。
【図８】図8aは、細胞内HIV-1 DNAの分析を示す。図8bは、HIV-1特異的LTR mRNAの分析を示す。
【図９】図9aは、PM-1細胞中の組み込まれたHIV-1 DNAの分析を示す。図9bは、HIV-1特異的gag mRNAの分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
概して、本開示は、発現ベクター、発現ベクターを含む組成物、およびそのような発現ベクターまたは組成物を投与することによって対象を治療する方法を提供する。
【００４７】
本明細書で使用する用語の単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、「および」を含むことが意図される。
【００４８】
用語「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する(having)」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む(comprises)」、「含む(includes)」、「有する(has)」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、これらの用語の各々は、米国特許法の「含む(comprising)」の共通の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下のもの」を意味するオープン・タームであると解釈され、追加の特徴、限定、局面などを排除しないとも解釈される。かくして、例えば、「部品a、bおよびcを有するデバイス」は、該デバイスが少なくとも部品a、bおよびcを含むことを意味する。同様に、「段階a、bおよびcを含む方法」という語句は、該方法が少なくとも段階a、bおよびcを含むことを意味する。さらに、段階およびプロセスは特定の順序で本明細書に記載されるが、当業者は、段階およびプロセスの順序付けが変わり得ることを認識するであろう。
【００４９】
本明細書で使用する「HIVに感染した細胞」とは、HIVゲノムが細胞ゲノムに組み込まれた細胞を意味し、HIVウイルスを産生する細胞およびHIVに潜伏感染した細胞を含む。本明細書で使用する場合、HIVに潜伏感染した細胞は、HIVゲノムが宿主細胞ゲノムに組み込まれているが、転写的に不活性であって、転写活性状態に再活性化できる細胞である。
【００５０】
本明細書で使用する「細胞に接触させる」とは、実効性のある成果を生む(すなわち、HIV感染、転写または複製を低減、軽減または排除する)やり方で、組成物、製剤または薬剤を細胞に接触させることを指す。細胞に接触させることはまた、組成物、製剤または薬剤を細胞に導入することを含む。
【００５１】
本明細書で使用する語句「HIV転写を阻害する」とは、細胞における感染性HIVウイルス粒子の形成が低減、軽減または排除される程度にまで、1つ以上のHIV遺伝子の転写を低減または阻止することを指す。
【００５２】
本明細書で使用する語句「HIV複製を阻害する」とは、細胞における感染性HIVウイルス粒子の形成が低減、軽減または排除される程度にまで、1つ以上のHIV遺伝子の複製を低減または阻止することを指す。
【００５３】
本明細書で使用する用語「HIV」は、HIV-1だけでなく、HIV-1の様々な株(例えば、BaL株またはSF162株)およびHIV-1の種々のサブタイプ(例えば、サブタイプA、B、C、D、F、G、H、JおよびK)をも含む。
【００５４】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖もしくは二本鎖のDNA、RNA、またはその改変型、例えばペプチド核酸およびロックド核酸(LNA)、を指す。
【００５５】
本明細書で使用する「サイレンシング核酸」とは、特定の配列と相互作用して遺伝子発現を阻害することができる任意のポリヌクレオチドを指す。サイレンシング核酸の例には、RNA二本鎖(例えば、siRNA、shRNA)、LNA、アンチセンスRNA、siRNAもしくはshRNAのセンスおよび/またはアンチセンス配列をコードするDNAポリヌクレオチド、DNAザイム(DNAzyme)、またはリボザイムが含まれる。遺伝子発現の阻害は、必ずしも特定の列挙された配列からの遺伝子発現である必要はなく、例えば、その特定の配列によって制御された配列からの遺伝子発現であってもよい。
【００５６】
本明細書で使用する「転写遺伝子サイレンシングエレメント」は、HIV(HIV-1を含む)の5'ロングターミナルリピート(LTR)の領域内の配列を標的とするサイレンシング核酸配列である。
【００５７】
発現ベクター
本開示は、少なくとも3つの核酸配列を含む発現ベクターを提供し、ここで、少なくとも3つの核酸は、HIVの5'LTRの配列を標的とする転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸配列；HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列；標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列；HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列；およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される。本明細書で使用する「発現ベクター」または「ベクター」とは、関心対象の核酸が細胞によって発現されるように、細胞の内部に該核酸を送達するために使用することができる組成物(composition of matter)を指す。多数のベクターが当技術分野で公知であり、例えば、限定するものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターの例としては、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター(レンチウイルスベクターを含む)などが挙げられる。一実施態様では、前記発現ベクターはウイルスベクターである。好ましくは、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。
【００５８】
他の実施態様には、少なくとも第1、第2、および第3の核酸配列を含む発現ベクターがあり、ここで、第1の核酸配列は、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸配列を含み、第2および第3の核酸配列は、HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される。第2および第3の核酸配列は異なるものである。
【００５９】
さらに他の実施態様には、(i) 転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列と、(ii) HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの他の核酸配列とを含む発現ベクターがある。いくつかの実施態様では、該核酸配列のそれぞれは、発現ベクター上の異なるプロモーターから発現される。いくつかの実施態様では、プロモーターのそれぞれは、同じであっても互いに異なっていてもよい。例えば、転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列は第1のプロモーターから発現され、少なくとも2つの他の核酸配列のそれぞれは別々のプロモーター(例えば、第2および第3のプロモーター)から発現される。他の実施態様では、3つの核酸配列のうちの2つ(すなわち、第1および第2の核酸配列、または第2および第3の核酸配列)は、単一のプロモーターから転写される。さらに他の実施態様では、3つの核酸配列が単一のプロモーターから転写される。
【００６０】
さらなる実施態様では、プロモーター(例えば、第1、第2、第3および任意に第4のプロモーター)のそれぞれは、RNAポリメラーゼI(pol I)、ポリメラーゼII(pol II)、またはポリメラーゼIII(pol III)のプロモーターであり得る。プロモーターは、当業者に知られている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。いくつかの実施態様では、プロモーターは、HIV LTRの少なくとも一部(例えば、TAR)を含み、HIV感染によって誘導可能である。特定の実施態様では、第1のプロモーターはRNA pol IIIプロモーターである。本開示の発現ベクターで使用するのに適したRNA pol IIIプロモーターには、ヒトU6、マウスU6、ヒトH1などが含まれるが、これらに限定されない。一実施態様では、第1のプロモーターはH1 RNA pol IIIプロモーターである。他の実施態様では、第2のプロモーターはRNA pol IIプロモーターである。特定の実施態様では、第2のプロモーターはユビキチンC pol IIプロモーターである。第2のプロモーターは、いくつかの実施態様では、組織特異的プロモーターであり得る。例えば、適切な組織特異的プロモーターには、マクロファージ特異的プロモーター(例えば、MPG-1など)およびT細胞プロモーター(例えば、CD4など)が含まれる。一実施態様では、第3のプロモーターはRNA pol IIプロモーターである。別の実施態様では、第3のプロモーターはユビキチンC pol IIプロモーターである。第3のプロモーターは、いくつかの実施態様では、組織特異的プロモーターであり得る。第1、第2および第3のプロモーターは、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの組み合わせであり得る。特定の実施態様において、核酸配列がsiRNAまたはshRNAのような阻害性RNA分子をコードする場合には、RNA pol IIIプロモーターが好ましい。他の実施態様において、核酸配列がタンパク質をコードする場合には、RNA pol IIプロモーターが好ましい。
【００６１】
いくつかの実施態様では、発現ベクターはウイルスベクターである。ある実施態様では、ウイルスベクターは、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターである。他の実施態様では、ウイルスベクターは、やはり本明細書に記載されるレトロウイルスベクターである。
【００６２】
「レトロウイルス」は、RNAゲノムを持つウイルスであり、このRNAゲノムは、宿主細胞ゲノムに組み込まれるcDNAコピーにレトロウイルス逆転写酵素によって逆転写される。レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを作製する方法は、当技術分野で公知である。簡潔に述べると、レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損型のウイルスを生じさせる。ビリオンを産生するために、gag、polおよびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する(Mann et al., Cell, Vol. 33:153-159, 1983)。この細胞株に、レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともに、cDNAを含有する組換えプラスミドを導入すると、パッケージング配列は組換えプラスミドのRNA転写産物がウイルス粒子へとパッケージングされるのを可能にし、続いてウイルス粒子は培地に分泌される。その後、組換えレトロウイルスを含む培地は回収され、任意に濃縮されて、遺伝子導入のために使用される。
【００６３】
「レンチウイルス」は、分裂細胞と非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例としては、以下が挙げられる：ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の病原体であるHIV(ヒト免疫不全ウイルス：HIV 1型およびHIV 2型を含む)；ヒツジに脳炎(visna)または肺炎(maedi)を引き起こすビスナ・マエディ(visna-maedi)；ヤギに免疫不全、関節炎および脳症を引き起こすヤギ関節炎・脳炎ウイルス；ウマに自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス(FIV)；ウシにリンパ節症、リンパ球増加症、およびおそらく中枢神経系感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス(BIV)；および類人猿に免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス(SIV)。
【００６４】
レンチウイルスゲノムは、一般に5'ロングターミナルリピート(LTR)、gag遺伝子、pol遺伝子、env遺伝子、アクセサリー遺伝子(nef、vif、vpr、vpu)および3'LTRに構造化される。ウイルスLTRは、U3、RおよびU5と呼ばれる3つの領域に分けられる。U3領域はエンハンサーおよびプロモーターエレメントを含む。U5領域はポリアデニル化シグナルを含む。R(リピート)領域はU3領域とU5領域を分離しており、R領域の転写された配列はウイルスRNAの5'末端と3'末端の両方に出現する。例えば、"RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann編, Oxford University Press, (2000)); O Narayan and Clements (1989) J. Gen. Virology, Vol. 70:1617-1639; Fields et al. (1990) Fundamental Virology Raven Press.; Miyoshi H, Blamer U, Takahashi M, Gage F H, Verma I M. (1998) J Virol., Vol. 72(10):8150 7; および米国特許第6,013,516号を参照されたい。
【００６５】
レンチウイルスベクターは、造血前駆細胞/幹細胞(HPSC)に感染させるために使用されている数種を含めて、当技術分野で公知である。そのようなベクターは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる以下の刊行物に見出すことができる：Evans et al., Hum Gene Ther., Vol. 10:1479-1489, 1999; Case et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 96:2988-2993, 1999; Uchida et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 95:11939-11944, 1998; Miyoshi et al., Science, Vol. 283:682-686, 1999; およびSutton et al., J. Virol., Vol. 72:5781-5788, 1998。一実施態様では、発現ベクターは改変レンチウイルスであり、したがって分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる。このようなレンチウイルスベクターは、HIV共受容体の阻害剤をコードする第1の核酸配列と、標的細胞へのHIV融合またはHIV複製を阻害するタンパク質をコードする第2の核酸配列とを含む改変レンチウイルスゲノムを含む。さらに、改変レンチウイルスゲノムは、好ましくは、ウイルス複製に必要なレンチウイルスタンパク質の遺伝子を欠き、したがって、標的細胞内での複製のような、望ましくない複製が阻止される。改変されたゲノムの複製のために必要なタンパク質は、好ましくは、組換えレトロウイルス(または特にレンチウイルス)の産生の間にパッケージング細胞株においてトランスに提供される。一実施態様では、パッケージング細胞株は293T細胞株である。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスの5'および3'ロングターミナルリピート(LTR)由来の配列を含む。一実施態様では、ウイルス構築物は、レンチウイルスの5'LTR由来のRおよびU5配列、ならびにレンチウイルス由来の不活性化または自己不活性化3'LTRを含む。LTR配列は、任意の種または株を含めて、任意のレンチウイルスに由来するLTR配列であり得る。例えば、LTRはHIV、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)またはウシ免疫不全ウイルス(BIV)由来のLTR配列であり得る。好ましくは、LTR配列はHIV LTR配列である。
【００６６】
転写遺伝子サイレンシングエレメント
いくつかの実施態様において、本開示の発現ベクターは、HIVの5'LTRの配列を標的とする1つ以上の転写遺伝子サイレンシングエレメントを含む。いくつかの実施態様では、発現ベクターは、HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも2つのサイレンシング核酸を含む。特定の理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に記載のHIVの5'LTR配列内の領域を標的とするサイレンシング核酸は、HIVゲノムの転写を阻害するのに有効であり、したがってHIV複製を阻害できる方法に相当すると考えられる。本開示全体を通して、サイレンシング核酸の番号付けは、サブタイプB HXB2株(アクセッション番号K03455)の5'LTR U3開始部位に基づいている(Wong-Staal, F. 1985, Nature 313:277-284)。
【００６７】
いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの標的配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。他の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を標的とする。さらなる実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を標的とする。さらに別の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 1の配列に対して約100％の同一性を有する配列を標的とする。
【００６８】
いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの標的配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。さらに他の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を標的とする。さらなる実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 9の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を標的とする。さらに別の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 9の配列に対して約100％の同一性を有する配列を標的とする。
【００６９】
いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの標的配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。他の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を標的とする。さらなる実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 17の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を標的とする。さらに別の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 17の配列に対して約100％の同一性を有する配列を標的とする。
【００７０】
いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの標的配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とする。他の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を標的とする。さらなる実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 36の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を標的とする。さらに別の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 36の配列に対して約100％の同一性を有する配列を標的とする。
【００７１】
当業者には理解されるように、HIV-1の株またはサブタイプ間には5'LTR領域の配列に変異が存在することがあり、それゆえHIV-1の標的配列には何らかの変異が存在する可能性がある。いくつかの実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4もしくはSEQ ID NO: 5の配列、またはSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4もしくはSEQ ID NO: 5の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列から選択される1つ以上の配列を標的とする。他の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12もしくはSEQ ID NO: 13の配列、またはSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12もしくはSEQ ID NO: 13の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列から選択される1つ以上の配列を標的とする。さらに他の実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21もしくはSEQ ID NO: 33の配列、またはSEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21もしくはSEQ ID NO: 33の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列から選択される1つ以上の配列を標的とする。さらなる実施態様では、サイレンシング核酸は、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38もしくはSEQ ID NO: 39の配列、またはSEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38もしくはSEQ ID NO: 39の1つに対して少なくとも95％の同一性を有する配列から選択される1つ以上の配列を標的とする。
【００７２】
いくつかの実施態様では、HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 6の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。他の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 6の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を含む。さらなる実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 6の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を含む。さらに別の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 6の配列に対して約100％の同一性を有する配列を含む。
【００７３】
いくつかの実施態様では、HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 14の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。他の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 14の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を含む。さらなる実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 14の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を含む。さらに別の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 14の配列に対して約100％の同一性を有する配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施態様では、HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 22の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。他の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 22の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を含む。さらなる実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 22の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を含む。さらに別の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 22の配列に対して約100％の同一性を有する配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施態様では、HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの標的配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を標的とするサイレンシング核酸は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 40の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。他の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 40の配列に対して少なくとも97％の同一性を有する配列を含む。さらなる実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 40の配列に対して少なくとも99％の同一性を有する配列を含む。さらに別の実施態様では、該サイレンシング核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むRNA二本鎖であり、該センス鎖はSEQ ID NO: 40の配列に対して約100％の同一性を有する配列を含む。
【００７６】
どのRNA二本鎖のアンチセンス鎖も、センス鎖に相補的な配列を含む。本明細書で使用する「センス鎖に相補的な配列」は、該配列の少なくとも一部がセンス鎖と二本鎖を形成できるならば、センス鎖に対して100％未満の相補性を有するにもかかわらず、二本鎖を形成することができるだろう。いくつかの実施態様では、アンチセンス鎖はセンス鎖に対して少なくとも95％相補的である。他の実施態様では、アンチセンス鎖はセンス鎖に対して少なくとも97％相補的である。さらなる実施態様では、アンチセンス鎖はセンス鎖に対して少なくとも99％相補的である。さらに別の実施態様では、アンチセンス鎖はセンス鎖に対して約100％相補的である。RNA二本鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖間の同一性の程度は、センス鎖とそれぞれの標的配列間の同一性の程度と異なっていてよいことが理解されるであろう。
【００７７】
RNA二本鎖を形成する2本の鎖は、1つのより大きなRNA分子の異なる部分であるか、または別個のRNA分子とすることができる。RNA二本鎖の鎖が別個のRNA分子から形成される場合、そのRNA二本鎖は「低分子干渉RNA」(「siRNA」)であり得る。「低分子干渉RNA」または「siRNA」は、それがホモロジー(相同性)を共有している遺伝子の発現を阻止することができる二本鎖RNA分子である。ホモロジーが配列にわたって存在する遺伝子または他のヌクレオチド配列の領域は、「標的領域」として知られている。2本の鎖が1つのより大きな分子の一部であり、したがってRNA二本鎖の一方の鎖の3'末端と他方の鎖の5'末端との間でヌクレオチドの鎖によって連結される場合、そのRNA二本鎖は「短鎖ヘアピンRNA」(「shRNA」)である。
【００７８】
いくつかの実施態様では、RNA二本鎖はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むsiRNAである。一実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを有するsiRNAである(本明細書では「si143」または「siRNA143」と呼ばれる)。別の実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを有するsiRNAである(本明細書では「si136」または「siRNA136」と呼ばれる)。さらなる実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを有するsiRNAである(本明細書では「si205」または「siRNA205」と呼ばれる)。さらに別の実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを有するsiRNAである(本明細書では「siRNA PromA」または「siPromA」と呼ばれる)。
【００７９】
他の実施態様では、RNA二本鎖はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むshRNAである。一実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 6の配列を有するセンス鎖(またはSEQ ID NO: 6の配列に対して少なくとも95％の同一性を有するセンス鎖)とSEQ ID NO: 7の配列を有するアンチセンス鎖とを含むshRNAである。さらに別の実施態様では、該shRNAはSEQ ID NO: 8の配列を有する(本明細書では「sh143」または「shRNA143」と呼ばれる)。別の実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 14の配列を有するセンス鎖(またはSEQ ID NO: 14の配列に対して少なくとも95％の同一性を有するセンス鎖)とSEQ ID NO: 15の配列を有するアンチセンス鎖とを含むshRNAである。さらに別の実施態様では、該shRNAはSEQ ID NO: 16の配列を有する(本明細書では「sh136」または「shRNA136」と呼ばれる)。さらなる実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 22の配列を有するセンス鎖(またはSEQ ID NO: 22の配列に対して少なくとも95％の同一性を有するセンス鎖)とSEQ ID NO: 23の配列を有するアンチセンス鎖とを含むshRNAである。さらに別の実施態様では、該shRNAはSEQ ID NO: 24の配列を有する(本明細書では「sh205」または「shRNA205」と呼ばれる)。さらに別の実施態様では、RNA二本鎖は、SEQ ID NO: 40の配列を有するセンス鎖(またはSEQ ID NO: 40の配列に対して少なくとも95％の同一性を有するセンス鎖)とSEQ ID NO: 41の配列を有するアンチセンス鎖とを含むshRNAである。さらに別の実施態様では、該shRNAはSEQ ID NO: 42の配列を有する(本明細書では「shPromA」または「shRNA PromA」と呼ばれる)。
【００８０】
他の実施態様において、前記少なくとも1つのサイレンシング核酸は、アンチセンスRNA、DNAまたはそれらの混合物；DNAザイム；およびリボザイムからなる群より選択される核酸であり、それらは、SEQ ID NO: 1の配列、SEQ ID NO: 9の配列、SEQ ID NO: 17の配列、またはSEQ ID NO: 36の配列の少なくとも1つを標的とする。アンチセンスRNAおよびDNA分子、リボザイムならびにDNAザイムの調製および使用方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Jakobsen et al, 2007, Retrovirology 4: 29-41に記載されており、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８１】
他の実施態様では、前記サイレンシング核酸は、siRNAまたはshRNAのセンスおよび/またはアンチセンス配列をコードするDNAポリヌクレオチドであり得る。このようなDNA配列は、細胞内でsiRNAまたはshRNAの発現を達成するために、プラスミド、ウイルスベクターなどのベクターに挿入することができる。siRNAの場合には、siRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖は、同じベクターから発現させてもよいし、異なるベクターから発現させてもよい。
【００８２】
HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列
いくつかの実施態様において、HIV共受容体の阻害剤は、siRNA、shRNA、アプタマー、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性核酸である。したがって、いくつかの実施態様では、発現ベクターの核酸配列は、HIV共受容体を標的とする阻害性核酸をコードする。「標的とする」とは、HIV共受容体をコードする内因性転写産物に結合しかつ/またはそれを妨害する阻害剤の能力を指す。例えば、阻害性核酸は、HIV共受容体をコードする核酸に実質的に相補的な配列を有することができ、その結果、阻害性核酸はHIV共受容体をコードする核酸に結合し、それによって、その発現をブロックするか、または共受容体核酸の分解を開始する。したがって、いくつかの実施態様では、HIV共受容体の阻害剤は、該阻害剤をコードする発現ベクターが宿主細胞で発現される場合に、HIV共受容体の発現を低下させることができる。
【００８３】
いくつかの実施態様では、本開示の発現ベクターは、HIV共受容体をコードする核酸配列の少なくとも一部に実質的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列を含む。HIV共受容体の例としては、CCR5および/またはCXCR4が挙げられる。本明細書で使用する「実質的に相補的」とは、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％相補的である配列を指す。一実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CCR5またはCXCR4をコードする核酸配列の少なくとも一部に100％相補的な配列を有する。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約15〜約30ヌクレオチドの長さであり得る。他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約19〜約25ヌクレオチドの長さであり得る。
【００８４】
特定の実施態様では、発現ベクターの核酸配列は、ステム・ループ構造を有するshRNAをコードし、該ステムまたは二本鎖領域は、HIV共受容体の配列の一部と同一である配列を有する二本鎖領域の第1の部分を含み、該二本鎖領域の第2の部分は、HIV共受容体の配列の別の部分に相補的である配列を含む。いくつかの実施態様では、該shRNAのループ領域は約2〜約19ヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施態様では、第1の核酸配列はSEQ ID NO: 25の配列を含むshRNAをコードする。別の特定の実施態様では、該shRNAのループ構造はSEQ ID NO:43の配列を含む。
【００８５】
HIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列
いくつかの実施態様において、本開示の発現ベクターは、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質は、C46タンパク質である。C46は、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域と融合されたHIV gp41のC末端ヘプタッドリピート(heptad repeat)およびCD34膜貫通ドメインから誘導された膜固定型の融合阻害剤である。C46は強力なHIV融合阻害剤であり、当業者は、ある意味で、FDA認可された可溶性薬物エンフュービルタイド(enfuvirtide)(T20)に類似していることを理解するであろう。類似しているが、C46タンパク質はT20ではない(例えば、C46ペプチドはT20より長さが約10アミノ酸長い)(例えば、Petit et al. Human Gene Therapy Methods. August 2014, 25(4): 232-240. doi:10.1089/hgtb.2014.034; およびFelix et al. Mutations in gp120 Contribute to the Resistance of Human Immunodeficiency Virus Type 1 to Membrane-Anchored C-Peptide maC46, J Virol. 2009 May; 83(10): 4844-4853を参照されたい；その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。当業者はまた、HIV融合を阻害するタンパク質(例えば、C46またはT20)をコードする核酸配列が、CCR5またはCXCR4共受容体結合とは異なるHIVライフサイクルの時点で作用することも、理解するであろう。いくつかの実施態様では、C46の安全性は、C46レトロウイルスベクターを形質導入された自己T細胞を患者に注入する第I相臨床治験において試験された。特定の理論に縛られることを望むものではないが、その研究では、患者が遺伝子治療に関連した副作用を示さず、かつ明らかな抗C46免疫反応を生じなかったことが示された。
【００８６】
いくつかの実施態様では、本開示の発現ベクターは、T20以外の、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列を含み、すなわち、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20ではない。
【００８７】
一実施態様では、発現ベクターの核酸配列は、SEQ ID NO: 26の配列を含むC46タンパク質をコードする。
【００８８】
別の実施態様では、発現ベクターの核酸配列は、SEQ ID NO: 27の配列を含む。
【００８９】
当業者は、標的細胞へのHIV融合を阻害する他の適切なタンパク質が、本開示の発現ベクター中で核酸配列によってコードされ得、こうした他のタンパク質には、限定するものではないが、T20とその関連タンパク質、エンフュービルタイド、CP32M、およびシフュービルタイド(sifuvirtide)が含まれることを理解するであろう(例えば、PCT/US2010/036247を参照されたい；その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
【００９０】
HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列
いくつかの実施態様において、本開示の発現ベクターは、HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列を含む。ある実施態様では、該核酸配列はトリパータイトモチーフ(tripartite motif)含有5α(TRIM5α)タンパク質またはその誘導体もしくは融合体をコードする。他の実施態様では、該核酸配列はキメラTRIM5αをコードする。「キメラTRIM5α」は、2つ以上の種から得られるTRIM5αタンパク質由来のドメインまたは断片を含むTRIM5αタンパク質を指す。いくつかの実施態様では、キメラTRIM5αは、ヒトTRIM5αタンパク質由来のアミノ末端ドメインを含み、カルボキシ末端PRYSPRYドメインはアカゲザルTRIM5αタンパク質由来である。
【００９１】
いくつかの実施態様において、該核酸配列はTRIM5-シクロフィリン融合タンパク質をコードする。ある実施態様では、TRIM5-シクロフィリン融合タンパク質は、ほぼ全長のヒトシクロフィリンAに直接融合されたヒトTRIM5αのアミノ酸1〜約309を含む。他の実施態様では、TRIM5-シクロフィリン融合タンパク質は、ほぼ全長のヒトシクロフィリンAに直接融合されたヒトTRIM5αのアミノ酸1〜約322を含む。さらに他の実施態様では、TRIM5-シクロフィリン融合タンパク質は、ほぼ全長のヒトシクロフィリンAに直接融合されたヒトTRIM5αのアミノ酸1〜約331を含む。第2の核酸配列によってコードされ得るHIV複製を阻害するさらなる適切なタンパク質としては、限定するものではないが、シクロフィリン、E3ユビキチン、APOBEC3G、および骨髄間質細胞抗原2(BST-2)が挙げられる。ある実施態様では、該発現ベクターは、SEQ ID NO:28によって提供されるヒトTRIM5αタンパク質をコードする核酸配列を含む。他の実施態様では、該発現ベクターは、SEQ ID NO:29の配列を有する核酸配列を含む。
【００９２】
発現ベクターの例
いくつかの実施態様において、本開示は、HIV共受容体の阻害剤をコードする第1の核酸配列、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする第2の核酸配列、およびHIV-1遺伝子転写を阻害するためにHIV-1の5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸を含む発現ベクターを提供し、ここで、第1の核酸配列は第1のプロモーターに機能的に連結され、第2の核酸配列は第2のプロモーターに機能的に連結され、第3の核酸は第3のプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施態様では、第3の核酸は、HIV-1遺伝子転写を阻害するために、HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列、HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列、HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列、またはHIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列の1つを標的とする。ある実施態様では、第1および第2の核酸配列は、単一のプロモーターから転写される。他の実施態様では、3つの核酸配列のうちの2つが単一のプロモーターから転写される。いくつかの実施態様では、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする第2の核酸配列は、T20以外のタンパク質から選択され、すなわち、該タンパク質はT20ではない。いくつかの実施態様では、T20以外の該タンパク質はC46である。
【００９３】
他の実施態様において、本開示は、CCR5と実質的に同一かつ相補的である配列を有する二本鎖領域を含むsiRNAまたはshRNA分子をコードする第1の核酸配列と、C46タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIV遺伝子転写を阻害するためにHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む発現ベクターを提供し、ここで、第1の核酸配列は第1のプロモーターに機能的に連結され、第2の核酸配列は第2のプロモーターに機能的に連結され、第3の核酸は第3のプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施態様では、第3の核酸は、HIV-1遺伝子転写を阻害するために、HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列、HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列、HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列、またはHIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列の1つを標的とする。ある実施態様では、第1および第2の核酸配列は、単一のプロモーターから転写される。他の実施態様では、3つの核酸配列のうちの2つが単一のプロモーターから転写される。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、別の転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸配列のような、第4の核酸配列を含む。
【００９４】
さらに他の実施態様において、本開示は、第1、第2、第3および第4の核酸配列を含む発現ベクターを提供し、ここで、第1の核酸配列はHIV共受容体の阻害剤(例えば、CCR5またはCXCR4に対するshRNA)をコードし、第2の核酸配列は融合阻害剤(例えば、C46)をコードし、第3の核酸配列はHIV複製の阻害剤(例えば、TRIM5αタンパク質またはその誘導体もしくは融合体)をコードし、第4の核酸配列は、HIV-1遺伝子転写を阻害するために、HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列、HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列、HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列、またはHIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列の1つを標的とするサイレンシング核酸をコードする。本開示のいくつかの実施態様では、HIV-1遺伝子転写の阻害剤、HIV共受容体の阻害剤、および標的細胞へのHIV融合の阻害剤またはHIV複製の阻害剤は、該発現ベクター上の異なるプロモーターから発現される。一実施態様では、HIV共受容体(例えば、CCR5またはCXCR4)の阻害剤はRNAポリメラーゼIIIプロモーターから発現され、一方HIV融合および/または複製の阻害剤はRNAポリメラーゼIIプロモーターから発現される。当業者であれば、2つの異なる阻害剤を異なる比率で発現構築物から発現させることができることを理解するであろう。
【００９５】
本開示の発現ベクターの他の例は、図4に示される。図4には、発現ベクターの各核酸が機能的に連結される特定のプロモーターも例示される。
【００９６】
組成物および薬学的組成物
本開示はまた、本明細書に開示される1つ以上の発現ベクターを含む、医薬組成物などの、組成物を提供する。例として、組成物は、HIVの5'LTR内の配列を標的とする転写遺伝子サイレンシングエレメントを含む第1の核酸と、標的細胞へのHIV融合またはHIV複製を阻害するタンパク質をコードする第2の核酸と、HIV共受容体の阻害剤をコードする第3の核酸とを含む発現ベクターを含み得る。別の例として、いくつかの実施態様では、組成物は、CCR5(またはCXCR4)を標的とするshRNAをコードする第1の核酸配列と、C46タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とする第3の核酸、すなわちサイレンシング核酸とを有する発現ベクターを含む。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本開示はまた、(i)米国特許出願公開第2012/0201794号(その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に開示される発現ベクターまたは組成物と、(ii)本明細書に開示されるHIVの5'LTR内の配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントとを含む組成物を提供する。例えば、いくつかの実施態様では、そのような組成物は、(i) HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸配列を含む発現ベクターと、(ii)少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメント、または少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントを含む発現ベクター、細胞もしくは組成物とを含み得る。例として、そのような組成物は、(i) CCR5(またはCXCR4)を標的とするshRNAをコードする第1の核酸配列およびC46タンパク質をコードする第2の核酸配列を有する発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸とを含むことができる。
【００９８】
いくつかの実施態様において、薬学的組成物は、有効量の、少なくとも1つの本明細書に記載の発現ベクターまたは組成物および薬学的に許容される担体を含む。例えば、特定の実施態様では、薬学的組成物は、有効量の発現ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する「有効量」は、HIV遺伝子発現の阻害を引き起こすのに十分な量である。有効量は、身体の大きさ、体重、年齢、健康状態、対象の性別、民族性、およびウイルス力価などの要因に基づいて、当業者が容易に決定することができる。
【００９９】
本明細書に開示される発現ベクター(またはそれらの組み合わせ)はいずれも、薬学的組成物として製剤化され得る。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与したとき、副作用、アレルギー反応、または他の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。例えば、サイレンシング核酸は薬学的に許容される担体を用いて製剤化され得る。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、ヒトへの投与に適した医薬品などの、医薬品の製剤化に使用するのに容認される溶媒、緩衝剤、溶液、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。薬学的担体を用いて化合物を製剤化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, (第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985); およびGoodman & Gillman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics (第11版, McGraw-Hill Professional, 2005)に記載される；それぞれの開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１００】
薬学的組成物は、本明細書に開示される発現ベクターまたは組成物(またはそれらの組み合わせ)のいずれかを、投与されたサイレンシング核酸が約0.1mg/kg〜約1mg/kgの範囲の濃度を達成することを可能にする任意の濃度で、含むことができる。薬学的組成物は、発現ベクター(またはそれらの組み合わせ)を約0.1重量％〜約99.9重量％の量で含み得る。薬学的組成物中に含めるのに適した薬学的に許容される担体には、水、緩衝水、塩類溶液、例えば生理食塩水または平衡塩類溶液(ハンクスまたはアールの平衡塩溶液など)、グリシン、ヒアルロン酸などが含まれる。薬学的組成物は、静脈内、筋肉内または皮下投与などの非経口投与用に製剤化することができる。非経口投与用の薬学的組成物は、薬学的に許容される滅菌した水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、ならびに滅菌注射液または分散液へと再調製するための無菌粉末を含み得る。適切な水性および非水性の担体、溶媒、希釈剤またはビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、カルボキシメチルセルロースとそれらの混合物、植物油(オリーブ油など)、注射用有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が含まれる。
【０１０１】
薬学的組成物は、本明細書に開示される発現ベクターのいずれか(またはそれらの組み合わせ)をカプセル化形態で含み得る。例えば、発現ベクターは、ポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ(オルトエステル)およびポリ(酸無水物)などの生分解性ポリマーによってカプセル化されるか、またはリポソームもしくはマイクロエマルションに封入される。リポソームは、例えば、リポフェクチンまたはリポフェクタミンであり得る。別の例は、無核の細菌性ミニ細胞の中または上に本明細書に開示される発現ベクター(またはそれらの組み合わせ)を含み得る(Giacalone et al, Cell Microbiology 2006, 8(10): 1624-33)。本明細書に開示された発現ベクター(またはそれらの組み合わせ)は、ナノ粒子と組み合わせることもできる。
【０１０２】
薬学的組成物は経口投与用に製剤化することができる。経口投与用の固体剤形には、例えば、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸薬、および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形では、該組成物は、少なくとも1種の薬学的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムおよび/またはリン酸二カルシウム、および/または充填剤もしくは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸など；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、アカシアなど；保湿剤、例えばグリセロールなど；崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、炭酸ナトリウムなど；湿潤剤、例えばアセチルアルコール、グリセロールモノステアレート；吸収剤、例えばカオリン、ベントナイト粘土など；および/または滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物を含むことができる。経口投与用の液体剤形には、例えば、薬学的に許容される乳濁液剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および/または乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(例えば、綿実油、トウモロコシ油、胚芽油、ヒマシ油、オリーブ油、ゴマ油など)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルなど、およびそれらの混合物を含むことができる。
【０１０３】
薬学的組成物は、それらの送達を増強するための浸透促進剤を含み得る。浸透促進剤には、脂肪酸、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート(dicaprate)、レクリネート(reclineate)、モノオレイン、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル1-モノカプレート、モノおよびジ-グリセリド、およびその生理学的に許容される塩が含まれる。該組成物は、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸、サリチル酸塩(例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸塩、ホモバニレート(homovanilate))などをさらに含むことができる。本明細書に開示される発現ベクター(またはそれらの組み合わせ)は、ミニ細胞またはナノ粒子と組み合わせて送達され得る。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、前記組成物はナノカプセルとして製剤化することができる。ナノカプセル構造は、コア-シェル配置で形成されたナノ小胞系からなる。典型的なナノカプセルのシェルは、ポリマーの膜またはコーティングでできている。いくつかの実施態様では、ナノカプセルは生分解性または生体浸食性(bioerodable)ポリマー材料から誘導される。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、ナノカプセルは酵素的に分解可能なナノカプセルである。ある実施態様では、ナノカプセルは、単一タンパク質コアと、ペプチドによって架橋された薄いポリマーシェルとからなる。いくつかの実施態様では、ナノカプセルは、それがプロテアーゼによって特異的に認識されかつ切断され得るように選択される。いくつかの実施態様では、切断可能な架橋剤は、プロテアーゼもしくは他の酵素の基質であるペプチド配列またはペプチド構造を含む。適切なナノカプセル、合成方法、および/または封入方法は、米国特許出願公開第2011/0274682号にさらに開示されており、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
他の実施態様において、前記組成物は、遺伝子操作された微生物によって産生されるナノサイズのカプセルである、バイオナノカプセルとして製剤化することができる。バイオナノカプセルとしては、ウイルスタンパク質由来または改変型ウイルスタンパク質由来の粒子、例えばウイルス表面抗原粒子(例：B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)粒子)、を用いることが可能である。また、バイオナノカプセルとして、脂質二重層膜と、ウイルスタンパク質由来または改変型ウイルスタンパク質由来の粒子、例えばウイルス表面抗原粒子(例：B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)粒子)、とを含むナノサイズのカプセルを用いることもできる。このような粒子は、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの真核細胞から精製され得る。使用できるカプセルのサイズは、約10nm〜500nm、好ましくは20nm〜250nmであり、最も好ましくは80nm〜150nmが使用される。
【０１０７】
治療方法
一般に、本開示は、様々な方法を提供し、(i) HIV転写を阻害する方法、(ii) HIV複製を阻害する方法、(iii) HIV感染を治療する方法、(iv) HIV感染を予防する方法、(v) HIV感染を低減する方法、(vi) HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防または低減する方法、(vii) HIV共受容体への結合を阻害する方法、および(viii) HIVの標的細胞への融合を阻害する方法を含む。これらの方法は、細胞に、本明細書に記載の発現ベクター、発現ベクターおよび/または他の成分もしくは活性剤を含む組成物を投与するか、接触させることによって、あるいは(a)発現ベクターを含む組成物と、(b)別の成分または活性剤とを共投与することによって、実施または達成される。本開示はまた、対象におけるHIV感染を治療または予防するための医薬の製造における、HIV遺伝子転写、HIV共受容体への結合、HIVの標的細胞への融合またはHIV複製を阻害する本発明の発現ベクター、発現ベクターなどを含む組成物の使用を提供する。
【０１０８】
より具体的には、本開示は、治療または療法を必要とするような患者または対象におけるHIV感染を治療、予防および/または低減する方法を提供する。本明細書で使用する「治療する」とは、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得るために対象、組織または細胞に影響を及ぼすことを意味し、その状態を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること、またはその状態の結果を軽減、緩和または改善すること、すなわち、その状態の結果の逆転または退行を引き起こすことを含む。「低減する」とは、ある状態を起こす危険性がある細胞または対象において、その状態が起こる程度または強度を低下させることを意味する。本明細書で使用する「予防する」とは、ある状態を起こす危険性がある細胞または対象において、その状態が起こるのを防止することを意味するが、状態が最終的に発生しないこと、または対象が最終的に状態を発症しないことを必ずしも意味しない。予防することは、細胞または対象における状態の発症を遅延させることを含む。一実施態様では、治療は、HIV複製を予防または低減するという結果を達成する。治療はまた、対象レシピエントにおける潜伏HIV1ウイルスの再活性化を防止するという結果を達成し得る。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、対象におけるHIV感染を予防および/または低減することは、HIV感染に罹患している対象におけるHIV感染を予防および/または低減することを含む。本明細書で使用する表現「HIV感染に罹患している対象におけるHIV感染を予防または低減する」とは、すでにHIVに感染した対象において感染性HIVウイルスの産生を排除、低減または遅延させ、その結果、対象における未感染組織のHIVによる感染が予防、低減または遅延されることを意味する。別の実施態様では、対象におけるHIV感染を予防および/または低減することは、HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防または低減することを含む。本明細書で使用する「HIV感染に罹患していない対象における増殖性HIV感染を予防または低減する」とは、以前にHIVに感染したことがない対象のHIV感染の発生を防止または低減することをいう。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「対象」は、ヒト、マウスまたは霊長類のような、HIV感染症を起こしやすい哺乳動物を指す。典型的には、哺乳動物はヒト(ホモサピエンス)である。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「投与する」とは、本明細書に記載の治療を含めて、治療を必要とする対象に組成物、製剤または特定の薬剤を供給することを意味する。
【０１１２】
特定の対象に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は、変動してよく、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性と作用時間、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与様式と投与時期、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の病態の重症度、治療を受けている宿主を含めて、様々な要因に左右されることが理解されよう。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、本明細書に開示される方法は、有効量の、本明細書で提供される発現ベクターまたは発現ベクターを含む薬学的組成物を対象に投与することを含む。このような組成物の投与は、HIVのR5およびX4指向性株による感染に対する抵抗性を付与することができる。ある実施態様では、対象はヒトである。対象はHIV陰性でもHIV陽性でもよい。ある実施態様では、対象はcART療法を受けていないか、cART療法を受けているか、cART療法に失敗しているか、または失敗した者であり得る。他の実施態様では、対象はAIDSに進行していても、AIDS指標疾患(例えば、エイズ/リンパ腫)を有していてもよい。
【０１１４】
例として、いくつかの実施態様では、前記方法は、対象に発現ベクターを含む薬学的組成物を投与することを含み、ここで、該発現ベクターは、CCR5(またはCXCR4)を標的とするshRNAをコードする第1の核酸配列、C46タンパク質をコードする第2の核酸配列、およびHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施態様には、対象に有効量の発現ベクターまたは発現ベクターを含む組成物を投与することを含む、対象におけるHIV感染を治療する方法があり、ここで、該発現ベクターは、(i)転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列と、(ii) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの他の核酸配列を含む。他の実施態様には、対象に有効量の発現ベクターまたは発現ベクターを含む組成物を投与することを含む、対象におけるHIV感染を予防および/または低減する方法があり、ここで、該発現ベクターは、(i)転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする少なくとも1つの核酸配列と、(ii) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの他の核酸配列を含む。
【０１１６】
他の実施態様には、対象に有効量の発現ベクターまたは発現ベクターを含む組成物を投与することを含む、対象におけるHIV感染を治療、予防および/または低減する方法があり、ここで、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含み、ここで、第3の核酸は、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、HIV融合阻害剤をコードする核酸はT20以外である。
【０１１７】
他の実施態様には、対象に有効量の組成物を投与することを含む、対象におけるHIV感染を治療、予防および/または低減する方法があり、該組成物は、(i) HIV共受容体を阻害する核酸分子をコードする核酸配列、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする核酸配列、HIV複製の阻害剤をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸配列を含む発現ベクターと、(ii) HIVの5'LTRの配列を標的とする少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする核酸とを含む。
【０１１８】
さらに他の実施態様では、対象におけるHIV感染を治療する方法は、(i) HIV共受容体の阻害剤をコードする核酸配列、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、HIV複製を阻害するタンパク質をコードする核酸配列、およびウイルス侵入の阻害剤をコードする核酸配列からなる群より選択される少なくとも2つの核酸を含む、有効量の発現ベクター、発現ベクターを含む薬学的組成物、または細胞と、(ii) HIVの5'LTR中の配列を標的とする、有効量の少なくとも1つのサイレンシング核酸を共投与することを含む。ある実施態様では、共投与することは同時である。他の実施態様では、該発現ベクターと該少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントは、異なる時間に投与される。
【０１１９】
さらに別の実施態様では、対象におけるHIV感染を治療、予防および/または低減する方法は、(i)米国特許出願公開第2012/0201794号に開示されるような、有効量の発現ベクター、発現ベクターを含む薬学的組成物、または細胞('794公報からの発現ベクターは本明細書では「Cal-1」と呼ばれる)と、(ii)有効量の、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメント、少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントを含む組成物もしくはコンジュゲート、または少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントを含む細胞を共投与することを含む。いくつかの実施態様では、転写遺伝子サイレンシングエレメントは、2015年8月28日に出願されたPCT/AU2015/050507に記載されたものから選択され、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ある実施態様では、共投与することは同時である。他の実施態様では、該発現ベクターと該少なくとも1つの転写遺伝子サイレンシングエレメントは、異なる時間に投与される。当業者は、発現ベクターと転写遺伝子サイレンシングエレメントを共投与するための適切な投薬レジメンおよび/またはスケジュールを提供することができるであろう。
【０１２０】
さらに別の実施態様には、造血細胞に発現ベクターを形質導入する段階と、形質導入された造血細胞を対象に移植する段階とを含む、対象におけるHIV感染を治療および/または予防する方法があり、ここで、形質導入された造血細胞はHIV感染に抵抗性であり、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、造血細胞(例えば、HPSC、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、または単球/マクロファージ)に本開示の発現ベクターを形質導入する段階と、形質導入された細胞を患者に移植する段階を含み、該形質導入された細胞はHIV感染に抵抗性である。ある実施態様では、造血細胞は、患者への移植後にHIV感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成する造血前駆細胞/幹細胞(HPSC)である。ある実施態様では、HPSCは自己のCD34陽性細胞である。いくつかの実施態様では、形質導入されたHPSCは、HIVのR5およびX4指向性株による感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成することができる。いくつかの実施態様では、形質導入されたHPSCは、cARTに耐性を示すHIV株による感染に対して抵抗性である顆粒球、単球/マクロファージおよびリンパ球を生成することができる。あるいは、本開示は、対象におけるHIV感染を治療および/または予防するための医薬の製造における前記細胞の使用をも包含する。
【０１２１】
HIVに感染したヒト宿主患者を治療する方法は、該宿主患者の循環血液または骨髄から造血幹細胞を取り出す段階と、該造血幹細胞を本明細書に開示される発現ベクター(または発現ベクターを含む組成物)で処理する段階と、処理された造血幹細胞を同じ患者に再投与または移植する段階を含む。いくつかの実施態様では、該発現ベクターは、HIV共受容体の発現を低下させることができる阻害性核酸をコードする第1の核酸配列と、HIV融合阻害剤タンパク質をコードする第2の核酸配列と、(i) HIV-1の5'LTRの約143位から約161位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(ii) HIV-1の5'LTRの約136位から約154位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、(iii) HIV-1の5'LTRの約205位から約223位までの配列を標的とするサイレンシング核酸、および(iv) HIV-1の5'LTRの約350位から約368位までの配列を標的とするサイレンシング核酸からなる群より選択されるHIVの5'LTRの配列を標的とするサイレンシング核酸をコードする第3の核酸配列とを含む。
【０１２２】
宿主細胞および宿主細胞を作製する方法
本開示はまた、本開示の新規な発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」または「標的細胞」は、本開示の方法および発現ベクターを用いて形質転換されるべき細胞を意味する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、該発現ベクターを発現することができる哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ヒト細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞(例えば、アカゲザル細胞)、ヒト前駆細胞または幹細胞、293細胞、HeLa細胞、D17細胞、MDCK細胞、BHK細胞、およびCf2Th細胞が挙げられる。特定の実施態様では、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞は、造血細胞、例えば、造血前駆細胞/幹細胞(例：CD34陽性造血前駆細胞/幹細胞(HPSC))、単球、マクロファージ、末梢血単核細胞、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、または樹状細胞である。ある実施態様では、宿主細胞はCCR5+造血細胞である。他の実施態様では、宿主細胞は、患者由来の宿主細胞または患者に適合した宿主細胞であり得る。特定の実施態様では、本開示の発現ベクターを形質導入された宿主細胞は、HAART耐性株を含めて、X4またはR5指向性HIV株による感染に対して抵抗性である。
【０１２３】
本開示の発現ベクターを形質導入される造血細胞(例えば、HPSC、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、および/または単球/マクロファージ)は、同種異系または自己由来であり得る。HPSCは、ある実施態様では、CD34陽性であり、患者の骨髄または末梢血から分離することができる。分離されたCD34陽性HPSC(および/または本明細書に記載の他の造血細胞)は、いくつかの実施態様では、本明細書に記載の発現ベクターが形質導入される。例えば、一実施態様において、該発現ベクターは、HIV共受容体の阻害剤をコードする第1の核酸配列と、標的細胞へのHIV融合を阻害するタンパク質をコードする第2の核酸配列と、HIVの5'LTR内の配列を標的とする転写遺伝子サイレンシングエレメントをコードする第3の核酸配列とを含む。
【０１２４】
造血細胞(例えば、FIPSC、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、または単球/マクロファージ)に本明細書に開示した発現ベクターを形質導入した後、その形質導入細胞は、患者に再導入または移植して戻される。形質導入された細胞は、患者に非経口的に注入されるか、または当技術分野で公知の他の経路によって再導入され得る。ある実施態様では、形質導入された造血細胞は患者に静脈内注射される。いくつかの実施態様では、造血細胞はHPSCであり、有効用量はHIV耐性細胞で免疫系を少なくとも部分的に再構成するのに十分な量である。該用量は1回以上の投与で投与することができ、患者体重1kgあたり約0.5×106〜約1×109個のHPSCであり得る。別の実施態様では、造血細胞はCD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、または単球/マクロファージであり、有効用量は患者あたり約1×109〜1×1011個の細胞であり得る。しかしながら、有効用量と考えられるものの正確な決定は、患者のサイズ、年齢、HIV感染の重症度(例えば、ウイルス力価)、およびウイルス感染以後の時間量を含めて、各患者に個別の要因に基づくことができる。当業者、特に医師は、過度の実験を行うことなく、有効用量に相当する形質導入された造血細胞の数を決定することができるであろう。
【０１２５】
キット
いくつかの実施態様には、本明細書に記載の発現ベクターまたは発現ベクターを含む組成物を含むキットがある。このキットは容器を含むことができ、その容器は発現ベクターまたは組成物を経口または非経口剤形で含む瓶であり得る。各剤形は発現ベクターまたは発現ベクターを含む組成物の単位用量を含む。該キットは、本方法に従って対象を治療することを示す、ラベルなどを含んでいてもよい。
【０１２６】
詳細な方法論
合成。本開示はまた、宿主細胞において発現された場合に、HIVの細胞への結合を阻害し、かつ細胞へのHIV融合および/またはHIV複製を阻止することができるウイルス発現ベクターを作製する方法を含む。一実施態様では、この方法は、細胞へのHIV融合またはHIV複製を阻止することができるタンパク質を発現する遺伝子のcDNAを合成する段階；合成されたcDNAをウイルスベクター中の制限部位にクローニングする段階；およびHIV共受容体の発現をダウンレギュレートすることができる発現ユニットを該ベクター中の制限部位に挿入する段階を含む。該cDNAは、本明細書に記載の融合または複製阻害剤タンパク質のいずれかを発現する任意の遺伝子に由来し得る。ある実施態様では、該cDNAはC46 cDNAである。別の実施態様では、該cDNAはTRIM5α cDNAまたはそのシクロフィリン融合体である。HIV共受容体の発現をダウンレギュレートすることができる発現ユニットは、該共受容体を標的とするsiRNA、shRNA、またはアンチセンスのような、本明細書に記載の阻害性RNA分子のいずれかであり得る。一実施態様では、該発現ユニットはCCR5を標的とするshRNAである。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、HIV-1プロモーターを標的とするshRNAは、CCR5を標的とするshRNAおよび/またはC46を発現するベクターのような、既存のベクターにクローニングされる。いくつかの実施態様では、既存のプラスミドを制限酵素で切断する。次いで、融合(in-fusion)酵素を使用して、4組以上のDNAセグメントを相同組換えによって融合させることができる；該4組以上のDNAセクションは、約15bpの相同配列を含むように操作され、個々のGブロックの組換えを可能にする。第1のGブロック、すなわちGブロック1は、U1プロモーター配列と、shPromA配列の半分を含む。第2のGブロック、すなわちGブロック2は、shPromA配列の残りの半分を含む。組換えの後に、抗生物質選択を用いて大腸菌(E. coli)の形質転換を行う。
【０１２８】
RNA二本鎖。二本鎖のRNA二本鎖は、HIV-1の5'LTR領域を標的とするように設計し、Invitrogen社で合成した。各siRNA構築物は19bpの長さであり、3'TTオーバーハングを持つように設計した。
【０１２９】
細胞培養。細胞培養のための培地および試薬はGibco社から購入した。HeLa T4+細胞を、10％ウシ胎児血清、5U/mlのペニシリンおよび50mg/mLのストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(補充DMEM)中で増殖させ、5％CO2の加湿インキュベーター内で37℃にてインキュベートした。HeLa T4+細胞は、それぞれG418(500μg/mL)およびハイグロマイシン(300μg/mL)による選択下で維持した。
【０１３０】
生存HIV-1感染およびsiRNAトランスフェクション。複製可能なウイルスを使用する経時変化実験のための細胞培養では、5×104個のHeLa T4+細胞を播種し、一晩インキュベートした後に、50pMの適切なsiRNAパネルをトランスフェクトした。翌日、siRNAトランスフェクトされたHeLa T4+培養物に、140pg/μLを用いてHIV-1 SF162株を感染させた。下記の逆転写酵素(RT)アッセイを用いるウイルス産生の分析のために、上清を15日間にわたって回収した。ChIP実験のための培養では、2×105個のHeLa T4+細胞を播種し、一晩インキュベートした後に、1000pg/μLを用いてHIV-1 SF162株を感染させ、その感染を3日間進行させた。ChIPアッセイのための採取に先立って、感染した培養物に300pMのsiRNA 143、136、205、PromAを48時間トランスフェクトするか、またはモックトランスフェクトした。トランスフェクションは、RNAiMax (Invitrogen, Life Technologies社)を用いてメーカーの説明書に従って実施した。
【０１３１】
ウイルス定量。培養上清中の逆転写酵素(RT)活性は、以前に記載されたように測定した(Suzuki, K., Craddock, B. P., Okamoto, N., Kano, T., Steigbigel, R. T., J Virol Methods, 44: 189-98, 1993)。HIV-1 mRNAは、以前に記載されたようにHIV-gagに特異的なリアルタイムRT-PCRアッセイを用いて定量した(Suzuki et al., J RNAi Gene Silencing, 2005)。簡潔に述べると、RT-PCR反応は、0.4μMのセンスおよびアンチセンスの両プライマーと0.1μMの配列特異的蛍光発生Taqmanプローブを用いたSuperScript One-step RT-PCR (Invitrogen社)により行った。標準曲線は、HIV-1のためのゲノムHIVプラスミドpNL4-3およびβ-アクチンのTAクローン化PCR断片を用いて作成した(Invitrogen社, Mount Waverley, オーストラリア)。使用するプライマーおよびプローブは、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、およびSEQ ID NO: 35により提供される。
【０１３２】
薬物処理。J-Lat 9.2潜伏細胞モデル培養物を、種々の濃度のSAHA(0〜100μM)、TNF(0〜100ng/mL)またはSAHA/TNFの組み合わせ(0〜25μM、0〜100ng/mL)で48時間処理した。GFP発現をフローサイトメトリー(LSRFortessa-BD)により測定して、組み込まれたHIV-1プロウイルスの再活性化を検出し、FlowJoを用いて解析した。
【０１３３】
クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ。HeLa T4+細胞(5×105個)をT-25フラスコに播種し、24時間後上記のようにHIV-1 SF162株を感染させた。感染後3日目に、この培養物に300pmolの各siRNA 143、143T、136、205および現在のリードsiRNAであるPromAをトランスフェクトするか、または上記のように対照培養物としてモックトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、ChIPアッセイのためにEZ Magna A/G ChIPキット(Millipore社, オーストラリア)を用いてメーカーの説明書に従って培養物を採取した。ペレットを、5％デューティサイクル：強度4、バースト/サイクル200のCOVARIS 5ソニケーター中で20分間(1分オフ、1分オン)超音波処理し、タンパク質をメーカーの説明書に従って単離した。免疫沈降は、Merck Millipore社から得られたヒストンH3K27me3 (#17-622)およびH3K9Ac (#17-658)に特異的な5μg/mlの各抗体を用いて、各2×106細胞等価物に対して行った。
【０１３４】
統計分析。ChIPデータは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー(Mann-Whitney)検定を用いて有意性について試験し、平均±SEMとして表した。＜0.05のp値を統計的に有意とみなした。全ての分析は、Graphpad Prismバージョン6.0 (Graphpad Software社, San Diego, CA)を用いて行った。
【実施例】
【０１３５】
実施例1：U3領域を標的とするsiRNAはHIV-1抑制を誘導することができる。
サブタイプB株のHIV-1 SF162を用いてHeLa T4+培養物に感染させ、上清を長期間にわたって回収し、逆転写酵素(RT)を測定した。単一のミスマッチが抑制効果を減少させ得るかどうかを確認するために、単一のTミスマッチを含むsiRNA 143Tを含めた。というのは、それがHIV-1サブタイプA、D、F、G、U(図5)およびHIV-1 SF162の3'LTR GenBank配列(アクセッション番号M65024.1)にわたって16位で共通した変異に対応するからである。siRNA 143、136T、205SおよびPromAは、HIV-1 SF162増殖性感染を強力に抑制し、感染後15日目にモックトランスフェクト細胞と比較して、RT活性の＞1000倍低下を示した。興味深いことに、siRNA 143Tは、感染後6日目までsiRNA 143およびPromAと同様にウイルス感染を抑制したが、この時点を過ぎてウイルス抑制を維持することはできなかった。これらのデータは、単一の標的ミスマッチが、長期のsiRNA誘導HIV-1ウイルス抑制を破壊するのに十分であることを示す。
【０１３６】
siRNA 143、136および205の配列保存性を確認するために、HIV-1サブタイプA〜GおよびUにわたる配列アラインメントを行って、シークエンスロゴ(sequence logo)を作成した(図3)(Crooks, Hon, Chandonia, & Brenner, 2004, Genome Res 14: 1188-90; Schneider, & Stephens, 1990, Nucleic Acids Res 18, 6097-100)。例えば、siRNA 143の配列保存性は、19ヌクレオチド位置にわたって94.9％の同一性中央値を示し、ここで、9/19ヌクレオチドの同一性範囲は＞95％の保存性を有し、13/19ヌクレオチドは＞90％の保存性を有し、18/19ヌクレオチドは＞80％の保存性を有していた。以前に報告されたように、siPromAは、サブタイプCでの1bpの欠失を除いて、全てのサブタイプにわたって高度に保存されており、19ヌクレオチド位置にわたって98.4％の同一性中央値を示した(図3)。
【０１３７】
実施例2：新規siRNA候補143およびPromAにより抑制されたHIV-1培養物においてヘテロクロマチンマーカーが観察された。
siRNA 143媒介HIV-1抑制が、PromAについて記載されたようなヘテロクロマチンマークと関連するかどうかを確認するために、トランスフェクションの48時間後に、5'LTRにおけるエピジェネティック修飾についてChIPアッセイを行った。有意な増加がH3K27me3において観察された；モックトランスフェクト培養物と比較して、siRNA 143トランスフェクト培養物では約10倍(p＜0.0001)、siRNA PromAトランスフェクト培養物では＞5倍(p＜0.0001)(図6a)。有意な増加はH3K9me3でも観察された；モックトランスフェクト培養物と比較して、siRNA 143-およびsiRNA PromA-トランスフェクト培養物の両方において約5倍(p＜0.001)(図6b)。モックトランスフェクト培養物と比較して、Ago1の有意な動員がsiRNA 143-およびsiPromA-トランスフェクト培養物の両方において観察された(図6d)。ヒストンアセチル化マーカーH3K9Acの有意な減少はsiRNA 143-およびPromA-トランスフェクト培養物で観察された(4倍および6倍、両方ともp＜0.05)(図6e)。同様に、モックトランスフェクト培養物と比較して、H3K27me3の有意な増加がsiRNA 136およびsi205-トランスフェクト培養物において報告された(図6f)。最後に、モックトランスフェクト培養物と比較して、有意な減少がsiRNA 136-およびsi205-トランスフェクト培養物において報告された(図6g)。まとめると、これらのデータは、siRNA 143、136および205模倣物が全て、TGS機構を介してHIVをサイレンシングすることを強く示唆する。
【０１３８】
実施例3：5'LTRを標的とするshRNAは潜伏HIV-1 J-Lat 9.2細胞において薬物処理により誘導される再活性化を弱める。
本発明者らの研究を拡張し、HIV-1潜伏モデルにおけるsiRNA 143標的配列の効果を調べるために、短鎖ヘアピンsh143もしくはshPromAを安定して形質導入された、または別々のレンチウイルスベクターを用いてshPromAとsh143の両方を形質導入されたJ-Lat 9.2細胞を作製した。次いで、様々な濃度のSAHA、TNFまたはSAHA/TNFの組み合わせを用いて、J-Lat 9.2細胞中の組み込まれた潜伏HIV-1を再活性化しようと試み、GFP発現をHIV転写の読み取り値として48時間で測定した。sh143、shPromAまたは2剤sh143/shPromAを形質導入されたJ-Lat 9.2細胞は、生理学的濃度でのSAHA、TNFまたはSAHA/TNFからの再活性化に対して大いに抵抗性であることが観察され、超生理学的薬物濃度でさえも低レベルの再活性化を示したが、shRNA対照を形質導入されたものは、非常に高いGFP発現を示して、潜伏HIV-1感染の再活性化を示唆する(図7)。重要なことには、2剤sh143/shPromA形質導入J-Lat 9.2細胞株は、再活性化刺激から防御する上でやや優れた効果を示すようであった。これらのデータから、HIV-1潜伏モデルJ-Lat 9.2細胞は、sh143および/またはshPromAを形質導入された場合、薬物処理による再活性化に対して大いに抵抗性であることが実証される。
【０１３９】
実施例4：抗HIVレンチウイルストランスジーンを用いた細胞内ウイルスDNAおよびmRNA分析 - Cal-1およびTGS誘導性shRNAレンチウイルス構築物の例
(1) HIV-1侵入阻害剤に基づくCal-1レンチウイルスベクター
MOLT-4に基づくインビトロ感染実験。3組のサンプルをMOLT-4細胞に基づいて調製した：
a.  Cal-1レンチウイルスの形質導入なしのMOLT-4細胞のみ；
b.  Cal-1形質導入なしのMOLT-4細胞80％とCal-1形質導入MOLT-4細胞20％の混合物。形質導入された細胞の程度は、C46発現のフロー解析により測定した。この実験設定は、非形質導入MOLT-4細胞(80％)とCal-1形質導入MOLT-4細胞(20％)の混合集団のトランスジーン効果をモニターするためのものである；
c.  フローサイトメトリーでC46発現を測定したとき、Cal-1レンチウイルスにより100％Cal-1形質導入されたMOLT-4。
【０１４０】
約50万個のこれらの細胞にHIV-1 BaLを感染させ、細胞内DNAおよびウイルスmRNAの分析のためにサンプルを4、7、10、14日目に採取した。
【０１４１】
細胞内HIV-1 DNAの分析(図8a)：組み込まれたHIV DNAを、HIV-1 LTR領域のプライマーおよびプローブセットを用いて分析した。
【０１４２】
MOLT-4細胞中の組み込まれたHIV-1 DNAを分析した(図8a)。HIV-1 DNAレベルの有意な増加が時間経過の間にMOLT-4細胞において観察された。これは、MOLT-4細胞中の高レベルのHIV-1の組み込みを示している。
【０１４３】
20％のCal-1形質導入を有する混合MOLT-4細胞培養物は、HIV-1 DNAが10日目と14日目に検出されたことを示した。しかし、観察されたHIV-1 DNAのレベルは、非形質導入MOLT-4細胞と比較して10〜50倍低かった。100％Cal-1形質導入されたMOLT-4細胞ではHIV-1 DNAが検出されなかった。
【０１４４】
HIV-1の細胞間RNAレベルを検出するために、HIV-1特異的LTR mRNAを分析した(図8b)。培養期間中、異常に上昇したHIV-1特異的な細胞関連HIV-1 LTR mRNAがMOLT-4細胞(黒丸)において検出された。
【０１４５】
対照的に、HIV-1細胞関連HIV-1 LTR mRNAの有意な減少が、100％Cal-1形質導入されたMOLT-4細胞(黒四角)において観察された。こうしたレベルは、1000倍超減少することが観察された。Cal-1の20％形質導入効率を有する混合MOLT-4細胞(黒三角)におけるHIV-1細胞関連HIV-1 LTR mRNAのこの実験群での減少レベル(10〜100倍)は、HIV感染からの部分的防御を示している。これらの観察から、Cal-1レンチウイルスベクターは、MOLT-4細胞においてHIV転写の1000倍超の減少を誘導し得ることが実証される。
【０１４６】
Cal-1形質導入されたMOLT-4細胞ではHIV-1 DNAレベルが検出されなかったにもかかわらず、HIV-1細胞関連LTR-mRNAは図8bにおいて依然として検出可能であった(黒四角)。これは、MOLT-4細胞中の組み込まれたHIV-1 DNAの極めて少数の集団から、ごくわずかなレベルのRNA転写が起こっていたことを示している。
【０１４７】
このDNA PCRあたりの推定細胞数は、1回のPCR反応あたり約1〜2×10e5細胞同等量のDNAであった。したがって、このアッセイフォーマットでのHIV-1検出感度は、1〜2×10e5細胞あたり2コピーである。HIV-1 DNAの組み込み頻度が1〜2×10e5細胞あたり2コピー未満であった場合には、該アッセイはこのフォーマットでHIV-1 DNAを検出することができないであろう。
【０１４８】
観察されたHIV-1 LTR-mRNAレベルは、Cal-1の形質導入に失敗したほんのわずかなMOLT-4細胞の結果であった可能性がある。
【０１４９】
(2) TGS誘導性shRNAレンチウイルスベクター
PM-1に基づくインビトロ感染実験。3組のサンプルをPM-1 CD4+ T細胞株に基づいて調製した：
a.  shRNAレンチウイルスの形質導入なしのPM-1細胞；
b.  shPromA (HIV-1プロモーター領域を標的とするshRNA)を形質導入されたPM-1細胞(shPromA構築物の詳細は、Suzuki K, et.al, Mol Ther Nucleic Acids 2013, 2:e137に記載される)；
c.  shPromA-Scrambled対照を形質導入されたPM-1細胞。
【０１５０】
約50万個のこれらの細胞にHIV-1 JR-FL株を感染させ、細胞内DNAおよびウイルスmRNAの分析のためにサンプルを10日目に採取した。
【０１５１】
PM-1細胞中の組み込まれたHIV-1 DNAを分析した(図9a)。3組の実験条件は、比較的類似した量のHIV-1 DNAを含んでいた。
【０１５２】
HIV-1の細胞間RNAレベルを検出するために、HIV-1特異的gag mRNAを分析した(図9b)。shPromA形質導入されたPM-1細胞中のHIV-1 DNAの存在にもかかわらず(図9a)、HIV-1転写は大幅に抑制された。具体的には、非形質導入PM-1モック感染対照およびshPromA-Scrambled対照と比較して、約1000倍の減少が観察された。これらの観察から、shPromAはPM-1細胞モデルを用いてHIV-1転写の約1000倍の減少を誘導できることが示される。
【０１５３】
上記のデータに基づいて、Cal-1およびTGS誘導性shRNAを含む組合せアプローチは、非形質導入モック感染と比較して、形質導入されたT細胞株において106のオーダーを上回る抑制を引き起こすと予測される。したがって、この3剤および/または4剤組合せ抗HIVレンチウイルスベクターシステムによるHIV-1転写の発現の完全な抑制が観察されると期待される。
【０１５４】
実施例5
本発明者らは、本開示による3剤または4剤組合せベクターが、本明細書に記載のCal-1などの2剤ベクター構築物と少なくとも同程度に安全で有効であると考えている。本発明者らは、Cal-1レンチウイルスベクターを利用する自己移植が、安全であり、かつ遺伝子改変細胞の選択方法なしに、骨髄破壊的前処置(myeloablative conditioning)を用いて、1回の移植後にマカクザル末梢血における安定な遺伝子マーキングを媒介することを明らかにした。本発明者らはまた、Cal-1形質導入CD34+細胞を移植された動物が遺伝子マーキングされた細胞の長期間の多系統生着を示し、こうした細胞がエクスビボおよびインビボでSHIVチャレンジに抵抗できることを明らかにした。実際に、エクスビボアッセイは、CD34+細胞のCal-1形質導入効率が感染前に測定された移植動物の末梢血および組織における遺伝子マーキングレベルと相関すること、Cal-1移植動物由来のCD4+細胞がエクスビボSHIV感染に抵抗性であること、ならびに遺伝子マーキングされた細胞がウイルス依存性の正の選択を受けることを示す。本発明者らはまた、サブセット選別実験において、SHIV感受性サブセットに、すなわちT細胞コンパートメントに、マーキングの優先的な増加が存在することを示した。
【０１５５】
少なくともこれらの知見に基づいて、本発明者らは、1つ以上の転写遺伝子サイレンシングエレメントを既存のCal-1ベクターに組み入れることにより、Cal-1と少なくとも同じくらい安全かつ有効である(または1つ以上の転写遺伝子サイレンシングエレメントを含むベクターと少なくとも同じくらい安全かつ有効である)3剤または4剤構築物ベクターが得られると考えている。かくして、3剤および4剤組合せレンチウイルス(LV)構築物(図10参照)の総合的な効力および毒性は、一連のインビトロおよびインビボ実験で試験されるが、その際の具体的な目標は、CCR5に対するshRNAおよび/またはC46融合阻害剤を含む発現ベクターの効果と、同じレンチウイルスベクターから転写遺伝子サイレンシング(TGS)を誘導するshRNAの効果との組み合わせが、ウイルスリザーバー(reservoir)の制御の点で相補的であるか、または相乗的でさえあるかを実証することである。目下、このような多剤構築物が、H1、U6およびU1プロモーターの組み合わせを用いて、複数のshRNAを効率的に発現しプロセシングできることを示す証拠が増えつつある。
【０１５６】
2a)  ひとたび本開示のレンチウイルス構築物が合成されると、本発明者らは、TGS誘導性およびCCR5阻害性shRNAのそれぞれの有効かつ期待される発現レベルが存在し、それらが効果的に発現されてプロセシングされることを実証するであろう。
【０１５７】
2b)  本発明者らは、CXCR4指向性ウイルス(NL4.3)およびVZV-G偽型ウイルスによる感染の動態をモニターすることによって、本開示のレンチウイルス構築物が、転写遺伝子サイレンシングエレメント単独と同様に効率よくTGSを誘導し得ることを実証するであろう。これらのウイルスは両方ともCCR5 shRNAを回避し、かつ後者はC46を回避して、本開示の構築物から発現されるshRNA誘導TGSを介して達成されるサイレンシングの程度を、他の核酸成分(例えば、CCR4および/またはC46などに向けられた核酸成分)の影響から独立してインビトロで評価することを可能にする。並行して、β-ラクタマーゼ(BLAM)受容体アッセイを用いて、本発明者らは、本開示の構築物が米国特許出願公開第2012/0201794号に記載の構築物と同等の効力を有することを実証するために、ウイルスを用いたCCR5の侵入阻害を実証するであろう。これは、これらの培養物における相対的なレンチウイルスマーキングおよびHIV-1 DNAを定量することによって確認される。これらの実験からは、標準(単剤/2剤構築物)または複合(3剤/4剤)レンチウイルス構築物によって送達された場合の個々のshRNAの発現および効力の同等性が実証される。
【０１５８】
2c)  ひとたびこれが実証されたら、PCT/AU2015/050507に記載されたものと同様の実験を行って、(1)米国特許出願公開第2012/0201794号に記載される発現ベクター/構築物、(2)PCT/AU2015/050507からのリードTGS候補、および(3)本開示の構築物の間のオフターゲット効果の効力および程度が比較される。これらの実験からは、本開示の構築物のいずれかが、米国特許出願公開第2012/0201794号またはPCT/AU2015/050507に記載されるものよりも大きな効果を有するかどうかが実証され、特に、それらがライフサイクルの異なる段階で作用するので、その効果が相加的であるか、または相乗的でさえあるかが実証される。
【０１５９】
2d)  ひとたびインビトロ実験で本発明のLVの1つの少なくとも相加的効果が実証されたら、それらは、その有効性を、PCT/AU2015/050507、米国特許出願公開第2012/0201794号からのリードTGS LV構築物および空のベクターと直接比較する4アーム実験において、上記のようにBLTマウスモデルでの有効性のインビボ評価のために利用される。一次エンドポイントは、脾臓からのCD4+ T細胞中の組み込まれたHIVリザーバーのサイズである。二次エンドポイントには、pVLおよびCD4+ T細胞のカウント数が含まれる。
【０１６０】
2e)  ひとたび本開示のLV構築物の潜在的な利点がインビボで実証されると、CD34+ HSC形質導入およびチャレンジに加えて、本発明者らは、HIV感染ドナーから得られた形質導入CD4+ T細胞を有するBLTマウスを再構築して、確立されたウイルスリザーバーの存在下で、本開示のリードLV構築物が既存の組み込まれたウイルスを効果的にサイレンシングし得ることを実証するであろう。
【０１６１】
成果：本発明者らは、LV構築物viii）がa)〜c)の成果を最もよく達成し、複数のウイルス標的のために、抑制効果が少なくとも相加的であることを期待する。インビボ研究では、ウイルスリザーバーであるpVLウイルスのより強力でより長期の制御とCD4+ T細胞数の維持を、末梢および組織の両方において確認することが期待される。予備毒性データも得られるであろう。
【０１６２】
産業上の利用可能性の記述
本開示は、医学、例えば遺伝子治療の分野において利用可能である。
【０１６３】
本明細書で言及された全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。当業者には、広範に記載された本開示の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施態様に示されるように、本開示に対して多くの変形および/または修飾をなし得ることが理解されるであろう。したがって、本実施態様は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【０１６４】
本明細書中の開示は特定の実施態様に関連して記載されているが、これらの実施態様は、本開示の原理および適用の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示的な実施態様に対して多くの変更を行うことができ、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の精神および範囲から逸脱することなく、他の構成を考案し得ることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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