(57)【要約】  末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、患者において悪性固形腫瘍の転移と関連する。ＣＴＣが細胞周期の相変動性を示し、有糸分裂細胞周期相にあるＣＴＣの数と、その細胞が得られた被験体の長期生存見込みとの間に強い相関があるという証拠を本明細書に提示する。また、癌を有する患者に由来するＣＴＣの有糸分裂細胞周期相を決定する方法、及び悪性固形腫瘍をグレード評価する際にその情報を使用する方法、及び患者の生存可能性を予測する方法を本明細書に提示する。【選択図】図２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）ＣＴＣの集団中の各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｃ）ＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することにより、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記生体試料が末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、及び尿からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料が少なくとも７．５ｍＬの末梢血である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１からなる群から選択される１以上のマーカーの不在と、
の１以上を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＴＣが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＥＡ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ２０、ＰＬＺ４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＤＸ−１、ＣＸＣＲ−４、及びＣＤＸ２からなる群から選択される１以上のマーカーの存在を更に特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌腫が、乳房、前立腺、肺、結腸直腸、又は膵臓の腫瘍であり、ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５の不在と、
を特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が黒色腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＤ１４６、メラニン、ＰＡＸ３ｄ、ＭＬＡＮＡ、ＴＧＦβ２、ＭＣＡＭ、ＡＢＣＢ４、ＣＳＰＧ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＧＡＩＮＡｃ−Ｔからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が肉腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチンの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が腎細胞癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ｃ−Ｋｉｔ、及びＥ−カドヘリンからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞周期相が、核染色で前記細胞を染色し、前記細胞周期相を視覚的に判定することによって決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記有糸分裂指数が、有糸分裂細胞周期相にあると決定されたＣＴＣの数を非有糸分裂細胞周期相にあると決定されたＣＴＣの数で除することによって計算される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
癌を有する被験体の生存可能性を予測する方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、
有糸分裂細胞周期相にあると同定された１以上のＣＴＣを有しない同じ癌を有する被験体と比較して、前記被験体がより低い生存可能性を有すると予測し、
それにより癌を有する被験体の生存可能性を予測する、方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、及び尿からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が少なくとも約７．５ｍＬの末梢血である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１からなる群から選択される１以上のマーカーの不在と、
の１以上を特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＴＣが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＥＡ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ２０、ＰＬＺ４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＤＸ−１、ＣＸＣＲ−４、及びＣＤＸ２からなる群から選択される１以上のマーカーの存在を更に特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌腫が、乳房、前立腺、肺、結腸直腸、又は膵臓の腫瘍であり、ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５の不在と、
を特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が黒色腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＤ１４６、メラニン、ＰＡＸ３ｄ、ＭＬＡＮＡ、ＴＧＦβ２、ＭＣＡＭ、ＡＢＣＢ４、ＣＳＰＧ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＧＡＩＮＡｃ−Ｔからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が肉腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチンの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が腎細胞癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ｃ−Ｋｉｔ、及びＥ−カドヘリンからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記有糸分裂細胞周期相が、核染色で前記細胞を染色し、前記細胞周期相を視覚的に判定することによって決定される、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生存可能性が２年超の期間であり、前記生体試料が少なくとも約７．５ｍＬの末梢血である、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する方法であって、
（ａ）悪性固形腫瘍を有する被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、
前記被験体の腫瘍が侵攻性であるとグレード評価され、
それにより被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する、方法。
【請求項２４】
前記生体試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、及び尿からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料が少なくとも約７．５ｍＬの末梢血である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記悪性固形腫瘍が癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１からなる群から選択される１以上のマーカーの不在と、
の１以上を特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＴＣが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＥＡ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ２０、ＰＬＺ４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＤＸ−１、ＣＸＣＲ−４、及びＣＤＸ２からなる群から選択される１以上のマーカーの存在を更に特徴とする、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記癌腫が、乳房、前立腺、肺、結腸直腸、又は膵臓の腫瘍であり、ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５の不在と、
を特徴とする、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記悪性固形腫瘍が黒色腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＤ１４６、メラニン、ＰＡＸ３ｄ、ＭＬＡＮＡ、ＴＧＦβ２、ＭＣＡＭ、ＡＢＣＢ４、ＣＳＰＧ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＧＡＩＮＡｃ−Ｔからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記悪性固形腫瘍が肉腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチンの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記悪性固形腫瘍が腎細胞癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ｃ−Ｋｉｔ及びＥ−カドヘリンからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記有糸分裂細胞周期相が、核染色で前記細胞を染色し、前記細胞周期相を視覚的に判定することによって決定される、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の第１の生体試料から第１のＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第１の集団をスクリーニングすることと、
（ｃ）前記被験体に癌治療を適用することと、
（ｄ）治療後、前記被験体の第２の生体試料から第２のＣＴＣの集団を得ることと、
（ｅ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第２の集団をスクリーニングすることと、
を含み、
前記第１の集団に対する前記第２の集団の有系分裂ＣＴＣの数の増加、又は前記第１の集団に対する前記第２の集団について計算された有糸分裂指数の増加が、前記治療に効果がないことを示唆する、方法。
【請求項３４】
前記生体試料が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、及び尿からなる群から選択され、前記第１の生体試料と前記第２の生体試料とが同じ供給源に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の生体試料及び前記第２の生体試料が、少なくとも約７．５ｍＬの末梢血である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１からなる群から選択される１以上のマーカーの不在と、
の１以上を特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＴＣが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＥＡ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ２０、ＰＬＺ４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＤＸ−１、ＣＸＣＲ−４、及びＣＤＸ２からなる群から選択される１以上のマーカーの存在を更に特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌腫が、乳房、前立腺、肺、結腸直腸、又は膵臓の腫瘍であり、ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、及びＥｐＣＡＭの存在と、
（ｃ）ＣＤ４５の不在と、
を特徴とする、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が黒色腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ＣＤ１４６、メラニン、ＰＡＸ３ｄ、ＭＬＡＮＡ、ＴＧＦβ２、ＭＣＡＭ、ＡＢＣＢ４、ＣＳＰＧ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＧＡＩＮＡｃ−Ｔからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が肉腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチンの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が腎細胞癌腫であり、前記ＣＴＣが以下の特徴：
（ａ）直径約７ミクロン〜２５ミクロンと、
（ｂ）ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ｃ−Ｋｉｔ、及びＥ−カドヘリンからなる群から選択される１以上のマーカーの存在と、
の１以上を特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記有糸分裂細胞周期相が、核染色で前記細胞を染色し、前記細胞周期相を視覚的に判定することにより決定される、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記有糸分裂指数が、有糸分裂細胞周期相にあると決定されたＣＴＣの数を非有糸分裂細胞周期相にあると決定されたＣＴＣの数で除することにより計算される、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＴＣの集団が、濾過を使用して生体試料から得られる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記濾過が、感光性ドライフィルムを備えるフィルターによるものである、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
腫瘍細胞が原発性悪性固形腫瘍から離脱すると、血液又はリンパの循環に入り込み、最終的には臓器又は組織へと移動して転移を形成することがある。かかる腫瘍細胞は末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれ、癌の種類によって、転移性固形腫瘍を有する患者の最大６５％〜８５％に見られる。
【０００２】
癌関連死の９０％が転移のプロセスによって引き起こされることを考慮すると、ＣＴＣの検出及び特性評価は、とりわけ、医学的介入が患者における癌の広がりを阻む又は遅延するために必要かどうかの決定において重大であることが分かる。しかしながら、循環においてＣＴＣが希少であること、また今は非常に侵攻性の細胞型とそれほど侵攻性でない細胞型とを正確に区別することができないことを含め、様々な理由によりＣＴＣの臨床使用はこれまで制限されている［１〜４］。
【０００３】
幾つかの研究は、癌を有する患者における生存の独立した予後指標としてＣＴＣの計数を使用可能であり、すなわち循環中の多数のＣＴＣは短い患者の生存と一致することを示した［２〜４、１７〜２０］。したがって、ＣＴＣは、末期癌において予後の生存情報及び治療反応と血液試料中のＣＴＣの数が関連し得るという点で臨床的有用性を有する可能性がある［１〜３、１９］。１つの試料当たり５個以上のＣＴＣ閾値を使用してＣＴＣを計数することは予後的に有益であると確立されているが、この情報を解釈して患者の生存の改善のために治療を管理することは困難であった［１、２、１２、２８］。
【０００４】
長年に亘り、ＣＴＣ研究は、ＣＴＣの臨床的有用性の改善のため、突然変異率、プロテオーム、上皮間葉転換等を分析することによって、臨床的に関連するＣＴＣと転移の伝播に役割を果たさないＣＴＣとを区別することを試みてきた［２、１７、１９、２０、２８］。最近、単一のＣＴＣのプロテオミクスの及びゲノムの表現型決定は、ＣＴＣが複数の複雑な表現型の不均一集団であることを示しており［２８、２９］、バイオマーカー不均一性によるＣＴＣのサブタイプ分類は現在進行中の研究領域である。しかしながら、複雑な不均一性、１つの試料当たり少数のＣＴＣ、及び末期患者の２０％〜３５％が測定可能なＣＴＣを有していないという事実はいずれも、臨床的有用性を阻害する交絡因子である［１、２、４、１２、１９］。
【０００５】
癌のグレード評価は形態学的分類の一形態であることから、ＣＴＣ表現型を特性評価することは、癌患者における更なる予後の層別化を提供し得ることが示唆されてきた［３、２１〜２３］。例えば、腫瘍組織生検において有糸分裂指数（ＭＩ：mitotic index）を算定することを含む、細胞分化に関する病理学的グレード評価は、癌の診断、予後判定、及び治療における至適基準であり、腫瘍病期診断アルゴリズムの複雑な部分である［１、５〜９］。濾過された腫瘍細胞の分類は、血液系生検には一般的に使用されないが［３］、尿（膀胱）［１０］、肺吸引物（肺）［２５］、及び脳脊髄液（脳／神経細胞）［２６］を含む幾つかの体液に由来する癌細胞を同定し、グレード評価するため組織病理学者によって現在使用されている。特殊なフィルターを使用して末梢血から単離されたＣＴＣは、詳細な細胞構造を保持し、ＣＴＣのより記述的な評価を可能とすることが最近示された［３、１７、１８、２４］。したがって、かかるグレード評価は、フィルター単離されたＣＴＣに応用される可能性がある。
【０００６】
また、ＣＴＣにおける詳細な細胞学的評価を提供できないため、幾つかのグループはＣＴＣの定量（すなわちＭＩＢ−１、ＰＣＮＡ、Ｋｉ−６７等）［１１〜１４］において増殖指数（ＰＩ：proliferation index）に頼るようになった。しかしながら、癌におけるＰＩバイオマーカーの使用は、強く異議が唱えられ、物議をかもしている問題である［１３、１４］。
【０００７】
疾患のグレードを定義する及び／又は患者の生存と直接相関する追加のＣＴＣ表現型及び特徴の解明を、癌の層別化及び診断を含む重要な方法論において、ＣＴＣ数に関する現在の知識と組み合わせて使用することができる。本発明は、これら及び他の関連する目標に関する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、末梢血等の生体試料から単離された末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が細胞周期の相変動性を有し得ることを初めて示した。すなわち、ＣＴＣの集団が生体試料から単離される場合、細胞の細胞周期相には変動性が存在し、有糸分裂細胞周期相（Ｍ期）（例えば分裂前期、分裂中期、分裂後期、分裂終期又は細胞質分裂）にある細胞もあれば、非有糸分裂細胞周期相（例えば静止期又は間期）にある細胞もある。
【０００９】
また、本発明者らは、ＣＴＣが癌を有する被験体の生体試料から単離される場合、試料中の有糸分裂ＣＴＣの数及び試料中のＣＴＣの有糸分裂指数（ＭＩ）の両方と、被験体の長期生存見込みとの間に強い相関があることを見出した。以下に詳細に説明されるように、ＣＴＣが活発に細胞分裂を行っていることがわかる場合、被験体の長期生存の可能性は低い。したがって、有系分裂ＣＴＣの絶対数、及び癌患者から単離されたＣＴＣのＭＩの両方を使用して、生存についての幾つかの予測及び治療に関する幾つかの決定を行い、また所与の治療の有効性をモニターすることができる。
【００１０】
本発明はこれらの発見に基づき、一群の実施の形態において、ＣＴＣの集団のＭＩを決定する方法に関する。
【００１１】
したがって、第１の実施の形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）ＣＴＣの集団中の各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｂ）ＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することにより、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法に関する。
【００１２】
第２の関連する実施の形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）ＣＴＣの集団中の各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｃ）ＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することにより、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法に関する。
【００１３】
第３の関連する実施の形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）被験体の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離すること、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定してＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）（ｂ）のＣＴＣの集団において各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｄ）（ｃ）のＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することによりＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、更なる群の実施の形態において、癌を有する被験体において生存可能性を予測する方法に関する。
【００１５】
したがって、第４の実施の形態では、本発明は、癌を有する被験体の生存可能性を予測する方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、
有糸分裂細胞周期相にあると同定された１以上のＣＴＣを有しない同じ癌を有する被験体と比較して、前記被験体がより低い生存可能性を有すると予測し、
それにより癌を有する被験体の生存可能性を予測する、方法に関する。
【００１６】
第５の関連する実施の形態では、本発明は、癌を有する被験体の生存可能性を予測する方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定してＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、有糸分裂細胞周期相にあると同定された１以上のＣＴＣを有しない同じ癌を有する被験体と比較して、前記被験体がより低い生存可能性を有すると予測し、
それにより癌を有する被験体の生存可能性を予測する、方法に関する。
【００１７】
これらの実施の形態の或る特定の態様では、生存可能性は２年超の期間である。
【００１８】
また、本発明は、更なる群の実施の形態において、被験体の悪性固形腫瘍をグレード評価する方法に関する。
【００１９】
したがって、第６の実施の形態では、本発明は、被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する方法であって、
（ａ）悪性固形腫瘍を有する被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、前記被験体の腫瘍が侵攻性であるとグレード評価され、
それにより被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する、方法に関する。
【００２０】
第７の関連する実施の形態では、本発明は、被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する方法であって、
（ａ）悪性固形腫瘍を有する被験体の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定してＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、前記被験体の腫瘍が侵攻性であるとグレード評価され、
それにより被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する、方法に関する。
【００２１】
また本発明は、更なる群の実施の形態において、癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法に関する。
【００２２】
したがって、第８の実施の形態では、本発明は、癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の第１の生体試料から第１のＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第１の集団をスクリーニングすることと、
（ｃ）前記被験体に癌治療を適用することと、
（ｄ）治療後、前記被験体の第２の生体試料から第２のＣＴＣの集団を得ることと、
（ｅ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第２の集団のスクリーニングすることと、
を含み、
前記第１の集団に対する前記第２の集団の有系分裂ＣＴＣの数の増加、又は前記第１の集団に対する前記第２の集団について計算された有糸分裂指数の増加が、前記治療に効果がないことを示唆する、方法に関する。
【００２３】
第９の実施の形態では、本発明は、癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の第１の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定して第１のＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第１の集団をスクリーニングすることと、
（ｄ）前記被験体に癌治療を適用することと、
（ｅ）治療後、被験体の第２の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｆ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定して第２のＣＴＣの集団を形成することと、
（ｇ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第２の集団のスクリーニングすることと、
を含み、
前記第１の集団に対する前記第２の集団の有系分裂ＣＴＣの数の増加、又は前記第１の集団に対する前記第２の集団について計算された有糸分裂指数の増加が、前記治療に効果がないことを示唆する、方法に関する。
【００２４】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、細胞周期相は、限定されないが、核染色（例えばＤＡＰＩ染料、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料、Ｓｙｔｏｘ染料、及びヨウ化プロピジウム染料）、及び比色分析染色（例えばＨ＆Ｅ、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート染料、メチルグリーン及びメチレンブルー）を含む手段によってＣＴＣ核の形態を調べることにより決定される。
【００２５】
細胞周期相は、有糸分裂細胞周期相（例えば、細胞は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、又は細胞質分裂にある）、又は非有糸分裂細胞周期相（例えば、細胞は静止期又は間期にある）であると決定されてもよい。同様に、有糸分裂細胞周期相は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、又は細胞質分裂であってもよい。有糸分裂期（例えば分裂前期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、又は細胞質分裂）にあると決定されたＣＴＣは、本明細書において「有糸分裂ＣＴＣ」と呼ばれる。非有糸分裂期（例えば静止期又は間期）にあると決定されたＣＴＣは、本明細書において「非有糸分裂ＣＴＣ」と呼ばれる。
【００２６】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、有糸分裂指数（ＭＩ）は試料中の非有糸分裂ＣＴＣに対する有糸分裂ＣＴＣの比である。ＭＩは、有糸分裂期にあると決定されたＣＴＣの数を非有糸分裂期にあると決定されたＣＴＣの数で除することにより計算される。代替的には、有糸分裂期にあると決定されたＣＴＣの数を分析されているＣＴＣの集団中のＣＴＣの総数で除することにより有糸分裂指数を計算する。
【００２７】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、ＣＴＣは、限定されないが、細胞サイズ、細胞形態、核形態、及び選択されたマーカーの発現又は発現の欠如を含む、１以上の特徴に基づいてＣＴＣであると特性評価されるか、又は同定される。ＣＴＣは、由来元の悪性固形腫瘍のアイデンティティーに応じて異なる特徴を有することを理解されたい。
【００２８】
全てのＣＴＣに対する特徴的なサイズは、直径約７ミクロン〜２５ミクロンである。
【００２９】
全てのＣＴＣに対する形態学的特徴として、限定されないが、果粒への核セグメンテーションの欠如が挙げられる。
【００３０】
上皮性腫瘍（すなわち、癌腫）ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＥＡ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ２０、ＰＬＺ４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＤＸ−１、ＣＸＣＲ−４、及びＣＤＸ２の１以上の存在、並びにＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１の１以上の不在が挙げられる。上皮性腫瘍として、限定されないが、乳房、前立腺、肺、結腸直腸、及び膵臓の腫瘍が挙げられる。
【００３１】
黒色腫ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、ＣＤ１４６、メラニン、ＰＡＸ３ｄ、ＭＬＡＮＡ、ＴＧＦβ２、ＭＣＡＭ、ＡＢＣＢ４、ＣＳＰＧ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＧＡＩＮＡｃ−Ｔの１以上の存在が挙げられる。
【００３２】
肉腫ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、ビメンチンの１以上の存在が挙げられる。
【００３３】
腎細胞癌腫ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ｃ−Ｋｉｔ、及びＥ−カドヘリンの１以上の存在が挙げられる。
【００３４】
ＣＴＣマーカーの有無は、限定されないが、標識抗体、細胞染色、発色性染色、ｉｎ  ｓｉｔｕ染色、及び放射性同位体標識を含む手段を使用して決定され得る。好ましい態様では、ＣＴＣマーカーは、蛍光標識、発色性標識、放射性標識、又は化学発光標識で標識化された抗体を使用して決定される。
【００３５】
関連する実施の形態の特定の態様では、ＣＴＣは上皮性腫瘍ＣＴＣであり、ＥｐＣＡＭ並びにサイトケラチン８、１８及び１９の発現、並びにＣＤ４５の発現の欠如を特徴とする。
【００３６】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、細胞は被験体の生体試料から得られてもよい、及び／又は単離されてもよい。生体試料は、限定されないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿であってもよい。生体試料は、新鮮な試料、又は解凍される凍結保存試料であってもよい。好ましい態様では、生体試料は末梢血である。他の態様では、血液は、前肘静脈血、下大静脈血、又は頚静脈血である。
【００３７】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、生体試料は、約１ｍＬ〜５０ｍＬ、好ましくは約５ｍＬ〜１５ｍＬの容量を有する。或る特定の態様では、生体試料は少なくとも約７．５ｍＬの容量を有する。
【００３８】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、細胞は、サイズ排除方法論、免疫捕獲、赤血球溶解、白血球除去、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、及びマイクロ流体チップからなる群から選択される１以上の手段、又はそれらの組み合わせを使用して、被験体の生体試料から得られてもよい、及び／又は単離されてもよい。特定の態様では、サイズ排除方法論はマイクロフィルターの使用を含む。好適なマイクロフィルターは、様々な孔径及び形を有し得る。或る特定の態様では、孔径は約５ミクロン〜約１０ミクロンの範囲である。孔は、丸、レーストラック（race-track）形、楕円形、正方形、又は長方形の孔形状を有してもよい。マイクロフィルターは精密な孔形状及び一様な孔分布を有してもよい。特定の態様では、細胞は、フィルターが感光性ドライフィルムを備えるＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して単離される。他の態様では、細胞は、物理的サイズによる選別、流体力学的サイズによる選別、グループ化、トラッピング、免疫捕獲、サイズに基づく大きな細胞の濃縮又は小さな細胞の排除に基づいてマイクロ流体チップを使用して単離される。
【００３９】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、生体試料から細胞を収集するため使用される装置において細胞を特性評価することができる。例えば、生体試料から得られる細胞の集団においてＣＴＣを同定している際に、上皮性腫瘍に由来するＣＴＣに関してＥｐＣＡＭ、サイトケラチン８、１８、１９、ＤＡＰＩ、及びＣＤ４５等の細胞マーカーの表現型発現を、装置から細胞を取り出さずに決定することができる。特定の例では、またミクロフィルターを使用して細胞を収集する場合は、細胞をミクロフィルターの表面に置いて特性評価することができる。他の態様及び実施の形態では、細胞を装置から取り出した後、特性評価する。さらに、特性評価する際に、細胞を固定してもよく、固定しなくてもよい。
【００４０】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、被験体は、ヒト、非ヒト霊長動物、トリ、ウマ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル（イヌ、ネコ又は齧歯類等）、又は他の哺乳動物である。
【００４１】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、癌は、リンパ腫、及び癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、肝芽腫、網膜芽細胞腫、又は黒色腫等の（正：such as）悪性固形腫瘍の１以上である。癌腫は上皮起源であり、限定されないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、及び結腸直腸癌が挙げられる。固形腫瘍は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及び／又はステージＩＶであってもよい。
【００４２】
本発明の関連する態様及び実施の形態では、悪性固形腫瘍は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、肝芽腫、網膜芽細胞腫、又は黒色腫であってもよい。特に、固形腫瘍は、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、膵腫瘍、又は結腸直腸腫瘍であってもよい。
【００４３】
上記は、以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解することができるように本発明の特徴及び技術的な利点を幅広く概説した。本発明の追加の特徴及び利点が本明細書に記載され、本発明の特許請求の範囲の主題をなす。本明細書に開示される任意の概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するため他の構造を修飾又は設計するための基礎として容易に利用可能であることが当業者に理解される。また、かかる等価な構築物は、添付の特許請求の範囲に述べられる本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことが当業者によって明確に理解されなければならない。本発明の構成及び操作方法の両方について、本発明の特性と考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点と共に、添付の図面と組み合せて考慮される場合に以下の記載からより良く理解されるであろう。しかしながら、あらゆる記載、図面、実施例等が解説及び説明の目的に対してのみ提供され、本発明の限定を定義することは何ら意図されないことが明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】乳癌患者から単離した有糸分裂（Ｍ期）中のＣＴＣの共通する認識可能な細胞学的所見を示す図である。細胞は、核、サイトケラチン８、１８及び１９、ＥｐＣＡＭ、並びにＣＤ４５に対して染色される。マーカーを個別に示し、また統合されたマーカーを含む画像を示す。間期、すなわち有糸分裂中でない「古典的な」ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣの代表画像（図１Ａ）；（図１Ｂ）核において小さな点に見える凝縮するクロマチンを有する初期の分裂前期ＣＴＣ；（図１Ｃ）核の外部でＤＡＰＩの点に見える凝縮クロマチン及び非常に活性なミトコンドリアを有する分裂前期ＣＴＣ；（図１Ｄ）クロマチンがＣＴＣの中央に凝縮しているのを見ることができる分裂前中期ＣＴＣ；（図１Ｅ）細胞の軸に沿って並ぶ凝縮したクロマチンを有する分裂中期ＣＴＣ；（図１Ｆ）分裂中期／分裂後期移行中のＣＴＣ、２つのクロマチンは細胞板に沿って分離し始めていることがわかる；（図１Ｇ）２つの染色体セットが細胞の極性末端へと移動するのが見られる分裂後期ＣＴＣ；（図１Ｈ）分裂終期ＣＴＣは細胞の中央に２つの別個の細胞外膜及び１つの収縮環を伴って見られる；（図１Ｉ）収縮環が細胞を２個の細胞へと挟んで引っ張るが、クロマチンは凝縮したままである分裂終期の後期／細胞質分裂のＣＴＣ；（図１Ｊ）核膜が再形成され、収縮環がほぼ完了し、クロマチンが拡大したて細胞質分裂の終了。第１列：第２列〜第５列の画像の統合；第２列：ＤＡＰＩによる核染色；第３列：ＣＫ８、１８及び１９に対するサイトケラチン染色；第４列：ＥｐＣＡＭに対する染色；第５列：ＣＤ４５に対する染色。スケールバー＝１５μｍ
【図２】乳癌患者集団における全生存率のカプラン−マイヤー推定値、有系分裂ＣＴＣ数に対する合計ＣＴＣ数（ｎ＝３６）である。図２Ａは、１つの試料当たり５個未満のＣＴＣを有する乳癌患者の全生存率（上の線）対１つの試料当たり５個以上のＣＴＣを有する患者（下実線）のカプラン−マイヤー推定値を提供する。図２Ｂは、１つの試料当たり０個の有糸分裂ＣＴＣを有する乳癌患者の全生存率（上の線）対１つの試料当たり１個以上の有糸分裂ＣＴＣを有する患者（下実線）のカプラン−マイヤー推定値を提供する。試料は７．５ｍＬの末梢血であった。
【図３】図２Ａ（ｎ＝３３）による受容体状態に基づく患者の部分母集団の全生存率のカプラン−マイヤー推定値である。３６名患者のうちの３名は既知の受容体状態を有していなかった。＊全てのハザード比をＬｕｍｉｎａｌ  Ａ患者コホートに基づいて計算した。図３Ａ−「受容体陽性」細胞はＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の各々を発現することがわかった細胞であり、「三種陰性」細胞はＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の発現を欠く細胞である。図３Ｂ−「Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ」及び「Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ」は確立された乳癌サブタイプであり、「三種陰性」細胞はＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の発現を欠く細胞であり、「Ｈｅｒ２＋」細胞はＨＥＲ２を発現する細胞である。
【図４】７．５ｍＬの末梢血に由来する、各患者についての有糸分裂ＣＴＣに対する各患者におけるＣＴＣ総数の箱ひげ図である。正方形＝２年以内に死亡した患者；菱形＝２年以内に生存している患者。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
Ｉ．定義
特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000(ISBN019879276X)、Kendrew et al.（編）；The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994(ISBN0632021829)、及びRobert A. Meyers（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc.刊行, 1995(ISBN0471186341)、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」は１つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」という単語は、「を含む（comprising）」という単語とともに使用される場合に１つ又は２つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「約」は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考え得る数値の範囲（例えば、列挙した値の±５％〜１０％）を指す。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字まで四捨五入した数値を含み得る。
【００４８】
ＩＩ．本発明
癌のグレード評価は、主として癌診断における使用に対して、疑わしい組織試料から抽出された組織生検材料の病理組織検査によって行われる［１、５〜９］。次に、病理組織検査は、患者の評価及び治療を支援するための組織に由来する細胞の形態（すなわち、細胞グレード）に基づく患者の層別化を可能とする［１、５〜８］。多くの癌は異なるグレード評価システム（例えばＧｌｅａｓｏｎ、Ｂｌｏｏｍ、及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）を使用してグレード評価され、主観性及び腫瘍不均一性に問題があるが、或る特定の態様は、有糸分裂指数（ＭＩ）及び細胞分化等の悪性の病理学的評価において普遍的である［１、５〜９］。細胞分裂（例えば分裂前期、分裂中期、分裂後期、分裂終期）中に生じる特定の細胞現象によって同定される腫瘍細胞のグレード評価における有糸分裂は、主な生存の予測因子、及び治療反応の指標とされる［５〜１０］。
【００４９】
ＣＴＣは、転移性疾患を有する患者の最大６５％〜８５％で見られ、試料中の細胞数の計数により、追加のサブタイプ分類を行わずに、予後判定に使用される（すなわち、多くのＣＴＣはより短い生存期間と一致する）。最近、本発明者らは、ＣＴＣのフィルターによる単離によりＣＴＣの詳細な細胞構造を保持した細胞が得られ、細胞構造の詳細を可視化することができ、形態によってＣＴＣとして分類することが可能になることを見出した。癌のグレード評価が形態学的分類の一形態であることから、本発明者らは、ＣＴＣをグレード評価することは、癌患者における更なる予後の層別化をもたらし、侵攻性のＣＴＣ表現型の同定における支援を提供し得ると考えた。濾過後の腫瘍細胞の分類は、尿（膀胱癌）、肺吸引液（肺癌）及び脳脊髄液（脳／神経細胞の癌）を含む幾つかの体液に由来する癌細胞を従来の方法によって同定し、グレード評価するため組織病理学者によって現在使用されている。本発明者らは、ＣＴＣに同じことが適用可能であることを見出した。
【００５０】
以下の実施例において検討されるように、有糸分裂中の細胞の視覚的な細胞学的評価がＣＴＣに適用可能かどうか判断するために実験を行った。また、ＣＴＣの有糸分裂状態を評価して、計数したＣＴＣの予後値及びそれらの有糸分裂指数を算定した。得られたデータは、試料中の有糸分裂ＣＴＣの数及び／又はＣＴＣの集団の有糸分裂指数に関する組織学に基づく決定を適用することが患者の層別化を高めることができ、治療決定における改善を提供し得ることを示す。
【００５１】
したがって、本発明は、他の重要な実施形態の中でも、（ｉ）ＣＴＣの集団のＭＩを決定する方法、（ｉｉ）癌を有する被験体において生存可能性を予測する方法、（ｉｉｉ）被験体の悪性固形腫瘍をグレード評価する方法、及び（ｉｖ）癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法に関する。
【００５２】
ＣＴＣの集団のＭＩを決定する方法
一群の実施形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数（ＭＩ）を決定する方法に関する。ＣＴＣの集団のＭＩを、癌について被験体をスクリーニングすること、癌転移について被験体をスクリーニングすること、癌の再発について被験体をスクリーニングすること、癌を有する被験体において予後を判定すること、癌治療の有効性をモニタリングすること、腫瘍をグレード評価すること、並びに本明細書で検討される他の手段及び適用を含む、臨床用途に使用することができる。
【００５３】
第１の実施形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）ＣＴＣの集団中の各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｂ）ＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することにより、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法に関する。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）ＣＴＣの集団中の各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｃ）ＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することにより、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法に関する。
【００５５】
更なる実施形態では、本発明は、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定する方法であって、
（ａ）被験体の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定してＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）（ｂ）のＣＴＣの集団において各ＣＴＣの細胞周期相を決定することと、
（ｄ）（ｃ）のＣＴＣの集団について有糸分裂指数を計算することにより、ＣＴＣの集団の有糸分裂指数を決定することと、
を含む、方法に関する。
【００５６】
生存可能性を予測する方法
別の群の実施形態では、本発明は、癌を有する被験体において生存可能性を予測する方法に関する。かかる方法は、癌を有する被験体について生存可能性を予測する際に、単独で使用されてもよく、又は関連する予後の情報を提供する他の手段と組み合わせて使用されてもよい。かかる方法を、単に癌を有する被験体に彼らの状態に関連する追加情報を提供するために使用してもよく、又は臨床医が適切な治療方針に関する決定を行うのを支援するために使用してもよい。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、癌を有する被験体の生存可能性を予測する方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、有糸分裂細胞周期相にあると同定された１以上のＣＴＣを有しない同じ癌を有する被験体と比較して、前記被験体がより低い生存可能性を有すると予測し、
それにより癌を有する被験体の生存可能性を予測する、方法に関する。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、癌を有する被験体の生存可能性を予測する方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定してＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、有糸分裂細胞周期相にあると同定された１以上のＣＴＣを有しない同じ癌を有する被験体と比較して、前記被験体がより低い生存可能性を有すると予測し、
それにより癌を有する被験体の生存可能性を予測する、方法に関する。
【００５９】
生存可能性は、限定されないが、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月、又は３６ヶ月の期間を含む選択される期間に亘って決定されてもよい。特定の態様では、選択される期間は、１年間、２年間、又は３年間である。
【００６０】
悪性固形腫瘍をグレード評価する方法
一群の実施形態では、本発明は、被験体の悪性固形腫瘍をグレード評価する方法に関する。かかる方法を、例えば、臨床医が腫瘍のグレード（例えば侵攻性）に基づいて、適切な治療方針に関する決定を行うのを支援するために使用することができる。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する方法であって、
（ａ）悪性固形腫瘍を有する被験体の生体試料からＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、前記被験体の腫瘍が侵攻性であるとグレード評価され、
それにより被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する、方法に関する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する方法であって、
（ａ）悪性固形腫瘍を有する被験体の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定してＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）有糸分裂細胞周期相の細胞についてＣＴＣの集団をスクリーニングすることと、
を含み、
１以上のＣＴＣが有糸分裂細胞周期相にあると同定される場合に、前記被験体の腫瘍が侵攻性であるとグレード評価され、
それにより被験体において悪性固形腫瘍をグレード評価する、方法に関する。
【００６３】
１以上の有糸分裂ＣＴＣが見られる場合に侵攻性であると腫瘍をグレード評価することに加え、代替的には腫瘍をグレードＩＩＩ又はグレードＩＶの腫瘍と評価することができる。
【００６４】
癌治療の有効性をモニタリングする方法
一群の実施形態では、本発明は、癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法に関する。かかるモニタリングを、例えば現行の治療方針を継続すべきかどうか、又はそれが十分であるかどうか、またその後に方針の異なる治療を行うべきかどうかに関して決定する際に、臨床医を支援するために使用することができる。これらの方法は、治療前後に被験体から得られた試料中に存在する有糸分裂ＣＴＣの総数の変化、若しくは治療前後に被験体から得られた試料中に存在するＣＴＣの集団について計算された有糸分裂指数の変化、又は両方を利用することができる。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の第１の生体試料から第１のＣＴＣの集団を得ることと、
（ｂ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第１の集団をスクリーニングすることと、
（ｃ）前記被験体に癌治療を適用することと、
（ｄ）治療後、前記被験体の第２の生体試料から第２のＣＴＣの集団を得ることと、
（ｅ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第２の集団のスクリーニングすることと、
を含み、
前記第１の集団に対する前記第２の集団の有系分裂ＣＴＣの数の増加、又は前記第１の集団に対する前記第２の集団について計算された有糸分裂指数の増加が、前記治療に効果がないことを示唆するか、又は別様に示す、方法に関する。別の実施形態では、本発明は、癌を有する被験体において治療の有効性をモニタリングする方法であって、
（ａ）癌を有する被験体の第１の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定して第１のＣＴＣの集団を形成することと、
（ｃ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第１の集団をスクリーニングすることと、
（ｄ）前記被験体に癌治療を適用することと、
（ｅ）治療後、被験体の第２の生体試料から約７ミクロン〜２５ミクロンの直径を有する細胞を単離することと、
（ｆ）（ａ）の細胞において各ＣＴＣを同定して第２のＣＴＣの集団を形成することと、
（ｇ）有糸分裂細胞周期相の細胞について前記第２の集団のスクリーニングすることと、
を含み、
前記第１の集団に対する前記第２の集団の有系分裂ＣＴＣの数の増加、又は前記第１の集団に対する前記第２の集団について計算された有糸分裂指数の増加が、前記治療に効果がないことを示唆するか、又は別様に示す、方法に関する。
【００６６】
被験体に由来する第１及び第２の生体試料は特徴（例えば量、起源、保存条件、治療条件、分析手段）において可能な限り類似すべきであるが、試料中の有糸分裂ＣＴＣの数、及びＭＩの計算の点で、小さな変動があったとしても意味のある結果をもたらすということを理解されたい。
【００６７】
本明細書に記載される本発明の実施形態及び態様を、以下の詳細によってより良く理解することができる。
【００６８】
本明細書で使用される細胞周期相は、特定の細胞が見られる細胞発生の相である。細胞周期は、一般に休止／静止／老化期、間期、及び細胞分裂期を含む。本明細書では静止期及び間期は共に、「非有糸分裂期」又は「非有糸分裂細胞周期相」と呼ばれる。細胞分裂期は、有糸分裂（例えば分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、及び分裂終期）及び細胞質分裂の様々な段階を含み、本明細書では共に「有糸分裂期」又は「有糸分裂細胞周期相」と呼ばれる。
【００６９】
細胞が有糸分裂期又は非有糸分裂期にあるかどうか判断するため、細胞核の形態を調べることにより、選択された細胞について細胞周期相を決定してもよい。限定されないが、核染色法（例えばＤＡＰＩ染料、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料、Ｓｙｔｏｘ染料、及びヨウ化プロピジウム染料）、及び比色分析染色（例えばＨ＆Ｅ、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート染料、メチルグリーン、及びメチレンブルー）に続いて、肉眼的又は電子的な手段に関わらず、細胞の顕微鏡検査を含む、細胞核を調べるための多くの確立された手段が存在する。
【００７０】
細胞周期相は、有糸分裂細胞周期相（例えば、細胞は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、又は細胞質分裂にある）、又は非有糸分裂細胞周期相（例えば、細胞は静止期又は間期にある）であると決定されてもよい。同様に、有糸分裂細胞周期相は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、又は細胞質分裂であってもよい。有糸分裂期（例えば分裂前期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、又は細胞質分裂）にあると決定されたＣＴＣは、本明細書において「有糸分裂ＣＴＣ」と呼ばれる。非有糸分裂期（例えば静止期又は間期）にあると決定されたＣＴＣは、本明細書において「非有糸分裂ＣＴＣ」と呼ばれる。
【００７１】
有糸分裂指数（ＭＩ）は試料中の非有糸分裂ＣＴＣに対する有糸分裂ＣＴＣの比である。ＭＩは、有糸分裂期にあると決定されたＣＴＣの数を非有糸分裂期にあると決定されたＣＴＣの数で除することにより計算されてもよい。代替的には、有糸分裂期にあると決定されたＣＴＣの数を分析されているＣＴＣの集団中のＣＴＣの総数で除することにより有糸分裂指数を計算してもよい。
【００７２】
本発明の関連する態様及び実施形態では、ＣＴＣは、限定されないが、細胞サイズ、細胞形態、核形態、及び選択されたマーカーの発現又は発現の欠如を含む、１以上の特徴に基づいてＣＴＣであると特性評価されるか、又は同定される。ＣＴＣは、由来元の悪性固形腫瘍のアイデンティティーに応じて異なる特徴を有することから、特定の細胞をＣＴＣとして同定することが困難である場合がある。すなわち、被験体における癌のアイデンティティーに応じて、細胞マーカーの種々組み合わせを生体試料中のＣＴＣを同定するために使用する。しかしながら、癌の種類に関わらず、全てのＣＴＣに特徴的なサイズは直径約７ミクロン〜２５ミクロンである。したがって、本明細書に定義されるＣＴＣは、約７ミクロン〜２４ミクロン、７ミクロン〜２３ミクロン、７ミクロン〜２２ミクロン、７ミクロン〜２１ミクロン、７ミクロン〜２０ミクロン、７ミクロン〜１９ミクロン、７ミクロン〜１８ミクロン、７ミクロン〜１７ミクロン、７ミクロン〜１６ミクロン、７ミクロン〜１５ミクロン、７ミクロン〜１４ミクロン、７ミクロン〜１３ミクロン、７ミクロン〜１２ミクロン、７ミクロン〜１１ミクロン、８ミクロン〜２４ミクロン、９ミクロン〜２４ミクロン、１０ミクロン〜２４ミクロン、１１ミクロン〜２４ミクロン、１２ミクロン〜２４ミクロン、１３ミクロン〜２４ミクロン、１４ミクロン〜２４ミクロン、１５ミクロン〜２４ミクロン、１６ミクロン〜２４ミクロン、１７ミクロン〜２４ミクロン、１８ミクロン〜２４ミクロン、１９ミクロン〜２４ミクロン、２０ミクロン〜２４ミクロン、２１ミクロン〜２４ミクロン、２２ミクロン〜２４ミクロン、及び２３ミクロン〜２４ミクロンの平均径を有する細胞を含む。また、全てのＣＴＣに対する形態学的特徴は、果粒への核セグメンテーションの欠如を含む。
【００７３】
上皮性腫瘍（すなわち、癌腫）ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、サイトケラチン（ＣＫ）８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＥＡ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ１４、ＣＫ１６、ＣＫ１７、ＣＫ２０、ＰＬＺ４、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＤＸ−１、ＣＸＣＲ−４、及びＣＤＸ２の１以上の存在、並びにＣＤ４５、ＣＤ１４、及びＣＤ３１の１以上の不在が挙げられる。上皮性腫瘍として、限定されないが、乳房、前立腺、肺、結腸直腸、及び膵臓の腫瘍が挙げられる。
【００７４】
黒色腫ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、ＣＤ１４６、メラニン、ＰＡＸ３ｄ、ＭＬＡＮＡ、ＴＧＦβ２、ＭＣＡＭ、ＡＢＣＢ４、ＣＳＰＧ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＧＡＩＮＡｃ−Ｔの１以上の存在が挙げられる。
【００７５】
肉腫ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、ビメンチンの１以上の存在が挙げられる。
【００７６】
腎細胞癌腫ＣＴＣに対するマーカーとして、限定されないが、ビメンチン、ＣＤ１０、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ｃ−Ｋｉｔ、及びＥ−カドヘリンの１以上の存在が挙げられる。
【００７７】
ＣＴＣマーカーの有無は、限定されないが、標識抗体、細胞染色、発色性染色、ｉｎ  ｓｉｔｕ染色、及び放射性同位体標識を含む標識手段を使用して決定され得る。好ましい態様では、ＣＴＣマーカーは、蛍光標識、発色性標識、放射性標識、又は化学発光標識で標識化された抗体を使用して決定される。選択された標識手段に細胞又は細胞の集団を曝露した後、肉眼的又は電子的な手段に関わらず、標識の有無を、細胞の顕微鏡検査によって決定することができる。
【００７８】
関連する実施形態の特定の態様では、ＣＴＣは上皮性腫瘍ＣＴＣであり、ＥｐＣＡＭ並びにサイトケラチン８、１８及び１９の発現、並びにＣＤ４５の発現の欠如を特徴とする。
【００７９】
分析される細胞は被験体の生体試料から得られてもよい、及び／又は単離されてもよい。生体試料は、限定されないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿であってもよい。生体試料が組織、又は他の固体若しくは半固体の物質である場合、試料中に含まれる細胞が放出するように処理してもよい。生体試料は、新鮮な試料、又は解凍される凍結保存試料であってもよい。好ましい態様では、生体試料は末梢血である。他の態様では、血液は、前肘静脈血、下大静脈血、又は頚静脈血である。分析方法の一環として、細胞を通常の慣習的な処理、すなわち固定に供してもよい。
【００８０】
本発明の関連する態様及び実施形態では、生体試料は約０．１ｍＬ〜１００ｍＬの容量を有する。当業者は、生体試料の容量が本明細書に開示される方法には重大ではないと理解するであろう。７．５ｍＬの都合のよい容量を本明細書に記載される実験で使用することにより、７．５ｍＬが適切なデータを提供することを示した。しかしながら、生体試料の所与の容量において（正：in）少数のＣＴＣ（例えば約５個未満）が見られる場合、本明細書に開示される方法の趣旨及び範囲から逸脱することなく、試料の容量を増加してもよい。他の有用な容量として、約１ｍＬ〜１００ｍＬ、１ｍＬ〜９０ｍＬ、１ｍＬ〜８０ｍＬ、１ｍＬ〜７０ｍＬ、１ｍＬ〜６０ｍＬ、１ｍＬ〜５０ｍＬ、１ｍＬ〜４０ｍＬ、１ｍＬ〜３０ｍＬ、１ｍＬ〜２２．５ｍＬ、１ｍＬ〜２０ｍＬ、１ｍＬ〜１５ｍＬ、１ｍＬ〜１０ｍＬ、１ｍＬ〜９．５ｍＬ、１ｍＬ〜９ｍＬ、１ｍＬ〜８．５ｍＬ、１ｍＬ〜８ｍＬ、１ｍＬ〜７．５ｍＬ、１ｍＬ〜７ｍＬ、１ｍＬ〜６．５ｍＬ、１ｍＬ〜６ｍＬ、１ｍＬ〜５．５ｍＬ、１ｍＬ〜５ｍＬ、１ｍＬ〜４．５ｍＬ、１ｍＬ〜４ｍＬ、１ｍＬ〜３．５ｍＬ、１ｍＬ〜３ｍＬ、１ｍＬ〜２．５ｍＬ、及び１ｍＬ〜２ｍＬが挙げられる。好ましい態様では、上記容量は５ｍＬ〜１５ｍＬである。特定の態様では、生体試料は、少なくとも約２２．５ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ、９．５ｍＬ、９ｍＬ、８．５ｍＬ、８ｍＬ、７．５ｍＬ、７ｍＬ、６．５ｍＬ、６ｍＬ、５．５ｍＬ、５ｍＬ、４．５ｍＬ、４ｍＬ、３．５ｍＬ、３ｍＬ、２．５ｍＬ、２ｍＬ、１．５ｍＬ、１ｍＬ、又は０．５ｍＬの容量を有する。
【００８１】
細胞は、限定されないが、サイズ排除方法論、免疫捕獲、赤血球溶解、白血球除去、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、及びマイクロ流体チップ、又はそれらの組み合わせを含む当該技術分野で既知の手段を使用して、被験体の生体試料から得られてもよい、及び／又は単離されてもよい。特定の態様では、サイズ排除方法論はマイクロフィルターの使用を含む。好適なマイクロフィルターは、様々な孔径及び形を有し得る。或る特定の態様では、孔径は約５ミクロン〜約１０ミクロンの範囲である。孔は、丸、レーストラック形、楕円形、正方形、又は長方形の孔形状を有してもよい。マイクロフィルターは精密な孔形状及び一様な孔分布を有してもよい。特定の態様では、細胞は、フィルターが感光性ドライフィルムを備えるＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して単離される。他の態様では、細胞は、物理的サイズによる選別、流体力学的サイズによる選別、グループ化、トラッピング、免疫捕獲、サイズに基づく大きな細胞の濃縮又は小さな細胞の排除に基づいてマイクロ流体チップを使用して単離される。
【００８２】
生体試料から細胞を収集するため使用される装置において細胞を特性評価することができる。例えば、生体試料から得られる細胞の集団においてＣＴＣを同定している際に、上皮性腫瘍に由来するＣＴＣに関してＥｐＣＡＭ、サイトケラチン８、１８、１９、ＤＡＰＩ、及びＣＤ４５等の細胞マーカーの表現型発現を、装置から細胞を取り出さずに決定することができる。特定の例では、またミクロフィルターを使用して細胞を収集する場合は、細胞をミクロフィルターの表面に置いて特性評価することができる。他の態様及び実施形態では、細胞を装置から取り出した後、特性評価する。さらに、特性評価する際に、細胞を固定してもよく、固定しなくてもよい。
【００８３】
本明細書で使用される被験体はヒトである。
【００８４】
本発明の関連する態様及び実施形態では、癌は、リンパ腫、及び癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、肝芽腫、網膜芽細胞腫、又は黒色腫等の悪性固形腫瘍の１以上である。癌腫は上皮起源であり、限定されないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、及び結腸直腸癌が挙げられる。悪性固形腫瘍は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及び／又はステージＩＶであってもよい。
【００８５】
本発明の関連する態様及び実施形態では、悪性固形腫瘍は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、肝芽腫、網膜芽細胞腫、又は黒色腫であってもよい。特に、固形腫瘍は、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、膵腫瘍、又は結腸直腸腫瘍であってもよい。
【実施例】
【００８６】
ＩＩＩ．実施例
血液試料の収集．２０１１年〜２０１３年の間フォックスチェイス癌センター（ＦＣＣＣ）又はメリーランド大学ボルティモア校（ＵＭＢ）のいずれかで、以前に確認されたステージＩＩＩ又はステージＩＶの乳癌に対して治療を積極的に受けている女性から、将来に備えて３６名の末梢全血試料を採血した。研究群の特徴は表１からわかる。書面のインフォームドコンセントと共に、また各研究機関のＩＲＢの承認に従ってＦＣＣＣとＵＭＢとの共同研究協定により、匿名の末梢血試料が供給された。さらに、中央年齢５２歳の健康な女性ボランティアが、書面のインフォームドコンセント及び西部治験審査委員会によるＩＲＢ承認と共に血液試料（ｎ＝１６）を寄贈した。全ての匿名血液試料をＣｅｌｌＳａｖｅ防腐剤チューブ（商標）（約９ｍＬ、Janssen Diagnostics）に採った。ＵＭＢ、ＦＣＣＣ又はCreatv MicrotechにおいてＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）精密濾過（Creatv MicroTech Inc.）を使用し、７．５ｍＬの血液を使用してＣＴＣを計数した。研究施設からの結果及び患者の識別は、研究の完了まで共有されず、伝えられなかった。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）低流量精密濾過手順．低圧真空システム［１８］を使用して、ＦＣＣＣ、ＵＭＢ又はCreatv MicroTechにおいて、試料にＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）精密濾過アッセイ（Creatv MicroTech Inc.）を実行した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）精密濾過アッセイは、サイズ排除（７ミクロン超）に基づいてＣＴＣを単離し、その後、訓練された細胞学者が形態学的特徴、並びにＥｐＣＡＭ、サイトケラチン８、１８、１９、ＣＤ４５、及びＤＡＰＩの表現型の発現／発現の欠如に基づいてＣＴＣを同定する（図１）。簡潔には、フィルターホルダーアッセンブリ上で感光性ドライフィルムを使用するリソグラフィー法によって製造されたＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）マイクロフィルターを備える低圧真空システムを廃棄装置（waste apparatus）に置いた。ＣｅｌｌＳａｖｅ防腐剤チューブ（商標）に収集した末梢全血（７．５ｍＬ）を予め固定し、フィルターに通し（約３分間）、ＰＢＳで洗浄し、後固定し、透過処理を行った。フィルターをＦＩＴＣ標識抗サイトケラチン８、１８、１９、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＥｐＣＡＭ、及びＣｙ５標識抗ＣＤ４５抗体の抗体カクテルで染色した［３、１７、１８］。フィルターを洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩ（Southern Biotech）によりスライドをマウントした。病理学的に定義可能なＣＴＣ（ＰＤＣＴＣ）を、以前に記載される［３］、予め確立された細胞学的特徴を使用して、形態学的に同定した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ及びＺｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Carl Zeiss）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を使用して細胞を撮像した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩは、試料を「マウント」するためカバーガラスを加える前に最後の工程として追加される、ＤＡＰＩを含むマウンティング溶液である。ＤＡＰＩシグナルは凝集し、核酸と接して蛍光性となる。
【００８９】
ＣＴＣの計数．病理学的に定義可能な特徴（ＰＤＣＴＣ）を有する無傷の細胞のみを、以前に記載された［３］ように、この研究のＣＴＣとして数えた。これは、ＣＤ４５陰性であり、強い糸状のサイトケラチンシグナルを有し、悪性の病理学的基準によりＤＡＰＩ陽性の核を有するＣＴＣを含む。ＰＤＣＴＣは、訓練された細胞学者によって同定され、撮像されて、病理学者によって確認された［３］。アポトーシス性ＣＴＣ、上皮間葉転換を経ているＣＴＣ（すなわちサイトケラチンの不在）、及び悪性と細胞学的に同定することができなかったＣＴＣは研究には含めなかった［３、２４］。
【００９０】
有糸分裂増殖のグレード評価．有糸分裂は訓練された細胞学者によって同定され、ＣＴＣにおいて病理学者によって確認された。核酸（nucleic）をＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ及びＺｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Carl Zeiss）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を使用して撮像した。分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、及び細胞質分裂を含む活発な有糸分裂の段階は、全て核及びサイトケラチン構造の両方を使用して十分に説明される［５〜８］。細胞学者がＭ（有糸分裂）期段階、すなわち、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期、分裂終期、及び細胞質分裂の１以上にあると細胞を同定することができた場合のみ、ＣＴＣを有糸分裂として数えた。他の場合には、ＣＴＣを非有糸分裂として数えた（図１）。
【００９１】
統計学的方法．カプラン−マイヤー推定値及びコックス比例ハザード回帰分析は、全てのサブタイプ及び既知の患者の集団に由来する計数されたＣＴＣを使用して、Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２０１３Ａソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  ＬＡＢｏｒａｔｏｒｙ；マサチューセッツ州ネイティックのMathworks）により行われた。生存率分析について、死亡までの時間を、血液試料が得られた時から死亡まで、又は最後の外来通院によって打ち切られるまでの間の期間として定義した。ＥＲ（エストロゲン受容体）、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、及びＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）の状態を地域ガイドラインに従って決定した。ＨＥＲ２を２＋以上の値で陽性とした（図３Ｂ及び表１）。癌サブタイプ、ホルモン状態、及びステージを、血液が得られた時に判定した。検定力分析（１−β＝０．９、α＝０．０５）は、３０名の患者の試料サイズが先のＣＴＣデータ分析に基づく患者のコホートを層別化するのに十分であると特定した［３］。
【００９２】
結果．患者試料の８３％においてＣＴＣが見られ、健康な対照試料ではいずれも見られず、公開された研究と一致する（すなわち、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）は、末期の乳癌の約６５％〜８０％でＣＴＣを同定する）［１、２、４、１９、２０］。サイトケラチン＋、ＤＡＰＩ＋、及びＣＤ４５陰性の分染法によって同定されたＣＴＣの大半（約９１％）は、悪性の外観、すなわち、高い核細胞質比、高い多形性、及び十分構造化した糸状サイトケラチンを有した（図１）［３、４、１７〜２０］。
【００９３】
患者生存を決定するため、１つの試料当たり５個以上のＣＴＣ（試料は７．５ｍＬであった）の標準的臨床カットオフを使用して、患者のコホートを部分集合に分けた［１〜４、１７〜２０］。具体的には、３６名の患者のうち２３名（６４％）は、５個未満のＣＴＣを有し、２４ヶ月超の生存期間中央値であった。一方で、３６名の患者のうち１３名（３６％）は、５個以上のＣＴＣを有し、１０．０ヶ月の生存期間中央値、ハザード比５．２であった（図２Ａ及び表２）。このハザード比は、公開された比の信頼区間内にあり、患者の評価に対する最適なカットオフとして５個以上のＣＴＣを確立した（すなわち、２６％〜４９％の末期乳癌患者は、１試料当たり５個以上のＣＴＣと共に、１０．１ヶ月〜１５ヶ月の範囲の報告される生存期間中央値を有する［１〜４、１７〜２０］）。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
その後、Ｍ期表現型の細胞学的な同定に基づいて、全てのＣＴＣを細分類した［１〜４、１７〜２０、２７］。患者コホートに由来する有糸分裂の全ての段階、すなわち図１Ａ〜図１ＪにおいてＣＴＣを同定した［５、６、８、２７］。具体的には、３６名の患者のうちの２３名（６４％）は有糸分裂ＣＴＣを有しておらず、生存期間中央値２４ヶ月超を有した。対照的に、３６名の患者のうちの１３名（３６％）は１以上の有糸分裂現象を有し、生存期間中央値５．７ヶ月、ハザード比１１．１を有した（図２Ｂ及び図４、表２）。注目すべきことに、有糸分裂現象は、５個未満のＣＴＣを有した４名の患者において検出され、５個以上のＣＴＣを有する４名の患者では検出されなかった（図４）。これらのデータは、ＣＴＣ計数単独と比較して、ＣＴＣにおける有糸分裂の追加の視覚的な特性評価が、生存に対する予後的相関に関して、乳癌患者の層別化を高めることを示唆する。再度層別化されたコホートでは、有糸分裂ＣＴＣを有しない患者の１３％に対して、少なくとも１個の有糸分裂ＣＴＣを有する患者の９２％が２年間の観察期間の間に死亡し、患者リスクの１１倍の増加を表した（表２及び図２）。
【００９６】
図３Ａは、受容体の状態に基づく患者の部分母集団（ｎ＝３３）の全生存率のカプラン−マイヤー推定値のプロットである。乳癌は、受容体、すなわちエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の状態、及び三種陰性によってサブタイプに分けられる。３６名患者のうちの３名は、既知の受容体の状態を有していなかった。図３Ｂは、分子サブタイプ、すなわちＬｕｍｉｎａｌ  Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ、ＨＥＲ２の状態、及び三種陰性の患者に基づいた、患者の部分母集団の全生存率のカプラン−マイヤー推定値である。Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ乳癌サブタイプは、一般的には、ＥＲ陽性及び／又はＰＲ陽性、ＨＥＲ２陰性、及び低Ｋｉ６７を特徴とする。Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ乳癌サブタイプは、一般的には、ＥＲ陽性及び／又はＰＲ陽性、ＨＥＲ２陽性（又は高Ｋｉ６７と共にＨＥＲ２陰性）を特徴とする。Ｋｉ６７分子マーカーは、多くの癌細胞において活発な細胞分裂の指標である。全てのハザード比をＬｕｍｉｎａｌ  Ａ患者コホートに基づいて計算した。
【００９７】
図４は、７．５ｍＬの末梢血に由来する各患者に関する有糸分裂ＣＴＣに対する、各患者におけるＣＴＣの総数のプロットである。正方形＝２年後に死亡した患者；菱形＝２年後に生存している患者。１名の特定の患者では、試料中にＣＴＣが２個だけ検出されたが、それらのうちの１つは有糸分裂であった（ＭＩ＝０．５）。また、この患者は２年以内に死亡した。これらの結果は、有糸分裂ＣＴＣの数が、生存の決定において単なるＣＴＣの総数よりも重要であることを実証する。また、これは、有糸分裂指数がＣＴＣ数よりも重要であることを示す。
【００９８】
１５５個の同定された有糸分裂現象のうち、分裂前期が最も一般的に観察され（有糸分裂ＣＴＣの７８％、すなわち１２１個の細胞）、続いて分裂終期／細胞質分裂（１５％、すなわち２３個の細胞）が観察された。分裂中期及び分裂後期は、ほとんど観察されず、分裂後期は４個、分裂中期は６個のみであり、それぞれ２．６％及び３．９％であった。興味深いことに、有糸分裂現象の数は、期待されたより一般的であり、全ＣＴＣの９．３％であった。
【００９９】
適切に患者コホートを層別化するために十分な試料サイズを使用することにより、これらの結果は、ＣＴＣ数は事実上患者の生存の予後指標であるが、細胞学的な有糸分裂中のＣＴＣに基づいて同じ集団をサブタイプに分けることによって、ハザードが１１．１まで劇的に増加したことを実証する。計算された患者の生存と合わせてＣＴＣの細胞学的評価を使用することにより、これらの観察は、腫瘍領域の外で見られる有糸分裂中の無傷なＣＴＣの定量可能な集団（追及される（the sought after）可能性のある臨床的に関連するＣＴＣ集団）が存在することを暗示する。これらのＣＴＣが循環において活発に分裂しているのか、又は分裂しているＣＴＣが単に循環系へと腫瘍を引きちぎっているのかどうかを特定することはできないが、末期乳癌患者においてこれらの細胞を見つけることは、興味深いことである。有糸核分裂細胞がそれほど安定ではなく、構造崩壊を生じやすいことを考慮すると、循環の負荷は、直観的に有糸分裂ＣＴＣの頻度を減少させて、単離の前に細胞を破壊するべきであるが、これは起こらなかった［５〜８］。生物学的にこれらの現象は、転移カスケードに含まれる侵攻性の細胞サブタイプをほのめかし、また、本明細書に提示される観察は、腫瘍領域の外に見られる有糸分裂期中のＣＴＣの定量可能な集団が存在することを暗示する。
【０１００】
小さなコホートであるにもかかわらず、患者集団は、種々のホルモン状態（表１及び表２）、及び明らかなコホート分離を伴う乳癌の不均質な群を表し、一般に乳癌に対して、そして更には他の形態の癌に対しても適用可能であることを示した。有糸分裂ＣＴＣの存在及びリスク増加との関連は、侵攻性の癌サブタイプを有する統計学的に有意なコホートの存在を示す。
【０１０１】
循環系を通過する有糸分裂癌細胞の追跡は、腫瘍進行が進むにつれて、患者の治療を計画することを支援することができる、非常に侵攻性の腫瘍細胞に関して臨床的に関連する情報を集めるための単純で非侵襲的な方法を提供する。一方、腫瘍のオミックスプロファイリングは、個別化された治療医学の将来を約束し、現在、疾患の広がり（すなわちステージ）に続く疾患の侵攻性（すなわちグレード）は、依然として患者の生存及び治療の第１及び第２の最も重要な因子である。ＣＴＣ評価に有糸分裂指数を組み込むことは患者をより良好に予後群へと層別化し、医師に腫瘍進展をより良好に通知し、血液に基づく生検を使用してより侵攻性の癌標的を同定し得る。
【０１０２】
さらに、分裂期のＣＴＣの数とともに経時的な分裂期のＣＴＣ数の変動を分析することは、患者にどの治療を適用するか、患者が特定の治療に対して反応するかどうか、及び患者が一連の治療の間又は治療の後に反応しているかどうかを決定するために使用することができる、臨床的に有用な情報を提供する。したがって、ＣＴＣの有糸分裂期もまた、治療に対する反応の予測因子である。例えば、有糸分裂ＣＴＣの数の増加は、患者が治療に反応していないという指標となり得る。同様に、有糸分裂指数の増加もまた患者が治療に反応していないという指標となり得る。
【０１０３】
本発明はその或る特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修飾を行い得ることを理解する。添付の特許請求の範囲は、記載される具体的な実施形態に限定されない。
【０１０４】
参考資料
本明細書で言及される全ての特許及び出版物は、本発明の属する技術分野の当業者の技術水準の指標である。各々の引用される特許及び出版物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。以下の参考資料は、全て本出願で引用されている。
【表３】
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【図１Ａ−Ｅ】
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【図１Ｆ−Ｊ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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