(57)【要約】植物のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換方法および組成物を提供する。方法としては、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の株を使用して目的のポリヌクレオチドを植物細胞に導入する方法が挙げられるが、これに限定されない。これらの方法にはＶｉｒＤ２に依存する方法が含まれる。組成物には、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の株、トランスファーＤＮＡ、コンストラクトおよび／またはプラスミドが含まれる。これらの組成物には、１つ以上のビルレンス遺伝子、ボーダー領域および／または複製起点を含むプラスミドを有するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の株が含まれる。本方法で作製される目的ポリヌクレオチドを含む植物細胞、組織、植物および種子もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲＲＬ  Ｂ−６７０７８として寄託されている単離オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１。
【請求項２】
作動可能に結合しているベクターを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１であって、
ａ．目的配列をコードする核酸を植物細胞にＶｉｒＤ２に依存した方法で導入するように作用するｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸と；
ｂ．目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸と
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１。
【請求項３】
前記第１の核酸および前記第２の核酸は、単一のポリヌクレオチド分子上にある請求項２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４】
前記第１の核酸および前記第２の核酸は、別個のポリヌクレオチド分子上にある請求項２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５】
選択マーカー遺伝子をさらに含む請求項２〜４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６】
前記選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子またはａａｄＡ遺伝子である請求項５または６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項８】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子である請求項５〜７のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項９】
前記ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５〜８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１０】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である請求項５〜９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１１】
前記ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５〜１０のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１２】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である請求項５〜１１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１３】
前記ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５〜１２のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１４】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である請求項５〜１３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１５】
前記ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５〜１４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１６】
前記選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である請求項５〜１５のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７】
前記ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５〜１６のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８】
前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項５〜１７のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９】
前記選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない請求項５〜１８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０】
前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項５〜１９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１】
前記対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である請求項２０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１、あるいは、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２〜２１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２３】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、あるいは、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子を含む請求項２〜２１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２４】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、あるいは、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２〜２１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２５】
前記遺伝子ｖｉｒ遺伝子領域は、配列番号１５、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧ、あるいは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２〜２１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２６】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１つ以上を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２〜２１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２７】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６、または変異体および誘導体を有するｖｉｒＡ、あるいは、配列番号７９、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子であり、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２８】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号２０〜２２、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは前記ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号９６〜９８、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２９】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＥ１〜Ｅ３は、それぞれ配列番号２３〜２５、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは前記ｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子は、配列番号１００、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＥ３を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３０】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＨ〜Ｈ１は、それぞれ配列番号４２〜４３、またはその変異体および誘導体を有する請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３１】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＫは、配列番号４５、またはその変異体および誘導体を有する請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３２】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＬは、配列番号４６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３３】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＭは、配列番号４７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３４】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＰは、配列番号４８、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３５】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＱは、配列番号４９、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３６】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３７】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５、およびｖｉｒＥ１−Ｅ３、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項２６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３８】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項２〜３７のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項３９】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する請求項３８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４０】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する請求項３９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４１】
Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項４０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４２】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する請求項３９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４３】
ｐＳＣ１０１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項４２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４４】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する請求項３９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４５】
ｐ１５Ａ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項４４に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４６】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する請求項３９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４７】
Ｒ６Ｋ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項４６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４８】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項２〜４７のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項４９】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項４８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５０】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項４８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５１】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項４８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５２】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する請求項４８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５３】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である請求項５２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５４】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種は、前記ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項５２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５５】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記ｐＶＳ１複製起点に由来する請求項５２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５６】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記ｐＳａ複製起点に由来する請求項５２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５７】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５８】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である請求項４８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項５９】
前記ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項５８に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６０】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項３８〜５９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６１】
前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項６０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６２】
前記複製起点は、前記ｐＲＫ２複製起点に由来する請求項６０または６１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６３】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項６２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６４】
前記複製起点は、前記ｐＳａ複製起点に由来する請求項６０または６１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６５】
前記ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項６４に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６６】
前記複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項６０または６１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６７】
前記ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項６６に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６８】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である請求項６０〜６２のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項６９】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である請求項６０〜６２および６８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７０】
前記ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項６９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７１】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である請求項６０〜６２および６８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７２】
前記ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項７１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７３】
前記ｐＲＫ２複製起点は、前記ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む請求項６０〜６２および６８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７４】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項７３に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７５】
ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む請求項６０〜７４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７６】
前記ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項７５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項７７】
形質転換植物細胞の作製方法であって、
ａ．植物細胞を、作動可能に結合している、ｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸と、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸とを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる工程と；
ｂ．オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が目的配列を前記植物細胞に形質転換させることができる条件下で、前記植物細胞を培養する工程と；
ｃ．ゲノム中に前記目的配列を含む形質転換植物細胞を同定する工程と
を含む方法。
【請求項７８】
ゲノム中に前記目的配列を含む植物を再生する工程をさらに含む請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイロナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、オートムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、前記植物細胞に接触させる前に、アセトシリンゴンまたはｖｉｒもしくはｒ−ｖｉｒ遺伝子機能を誘発する他の化合物の存在下で増殖させる請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎からの外植体に含まれており、前記外植体を前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる請求項７７〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記外植体は、胚性分裂組織、体細胞分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節、または、葉、根もしくは茎の組織を含む請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の非存在下に行われる請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の存在下に前記植物細胞を培養することを含み、前記目的配列は、前記選択剤に対する耐性を与えるか、または前記選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
前記選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、２，４−Ｄまたはジカンバである請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記マーカー遺伝子および前記目的配列は、前記目的配列を含む前記植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、第２の目的配列を含む第３の核酸を含み、前記形質転換細胞は、そのゲノム中に前記第２の目的配列を含む
請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
前記植物細胞からの植物の再生は、前記植物細胞を含む外植体から１つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
再生は、組織形成によって起こる請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７およびオクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）からなる群から選択される請求項７７〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、選択マーカーをさらに含む請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
前記選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子またはａａｄＡ遺伝子である請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１遺伝子である請求項９３〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項９３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である請求項９３〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項９３〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である請求項９３〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項９３〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である請求項９３〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項９３〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である請求項９３〜１０３のいずれか一項に記載の方法。．
【請求項１０５】
前記ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項９３〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項９３〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない請求項９３〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項９３〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１、あるいは、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項７７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、あるいは、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子を含む請求項７７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、あるいは、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有するビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項７７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、配列番号１５、またはその変異体および誘導体を有する、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧ、あるいは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項７７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ｖｉｒ遺伝子領域は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦまたはその変異体および誘導体の１種以上を含み、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項７７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６、または変異体および誘導体を有するｖｉｒＡ、あるいは、配列番号７９、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子であり、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号２０〜２２、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号９６〜９８、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＥ１〜Ｅ３は、それぞれ配列番号２３〜２５、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは前記ｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子は、配列番号１００、またはその変異体および誘導体を有し、前記ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＥ３を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＨ〜Ｈ２は、それぞれ配列番号４２〜４３、またはその変異体および誘導体を有する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５、またはその変異体および誘導体を有する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＬは、配列番号４６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＭは、配列番号４７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＰは、配列番号４８、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＱは、配列番号４９、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５、およびｖｉｒＥ１−Ｅ３、またはその変異体およびフラグメント、あるいは、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項７７〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
ｐＳＣ１０１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１３０に記載の方法。．
【請求項１３２】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３３】
ｐ１５Ａ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３５】
Ｒ６Ｋ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む請求項７７〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４０】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４１】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種は、前記ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記ｐＶＳ１複製起点に由来する請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、前記ｐＳａ複製起点に由来する請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４５】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４６】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項１２６〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記複製起点は、前記ｐＲＫ２複製起点に由来する請求項１４８または１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記複製起点は、前記ｐＳａ複製起点に由来する請求項１４８または１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項１４８または１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である請求項１４９〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である請求項１４９〜１５１および１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である請求項１４９〜１５１および１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ｐＲＫ２複製起点は、前記ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む請求項１４９〜１５１および１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む請求項１３６〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
第１のベクターであって、作動可能に結合している、
ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、
ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点、
ｃ）選択マーカー遺伝子、ならびに
ｄ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ、またはその変異体および誘導体（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含む前記ベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）
を含むベクターと；
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１。
【請求項１６６】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１、あるいは、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１である請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１６７】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２、あるいは、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２である請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１６８】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＤ１〜ｖｉｒＤ２、あるいは、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２である請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１６９】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５、または変異体および誘導体を有するｖｉｒＧ、あるいは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧである請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７０】
リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子、ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１種以上をさらに含む請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７１】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、あるいはその変異体または誘導体に由来する請求項１６５〜１７０のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７２】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する請求項１６５〜１７１のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７３】
Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６５〜１７２のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７４】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する請求項１６５〜１７３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７５】
ｐＳＣ１０１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６５〜１７４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７６】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する請求項１６５〜１７５のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７７】
ｐ１５Ａ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６５〜１７６のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７８】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する請求項１６５〜１７７のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１７９】
Ｒ６Ｋ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６５〜１７８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８０】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項１６５〜１７９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８１】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項１６５〜１７９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８２】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項１６５〜１７９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８３】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する請求項１６５〜１７９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８４】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である請求項１６５〜１７９および１８３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８５】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項１６５〜１７９および１８３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８６】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する請求項１６５〜１７９および１８３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８７】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する請求項１６５〜１７９および１８３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８８】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６５〜１７９および１８３のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１８９】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である請求項１６５〜１７９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９０】
前記ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１８９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９１】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項１６５〜１７０のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９２】
前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項１９１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９３】
前記複製起点は、前記ｐＲＫ２複製起点に由来する請求項１９１または１９２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９４】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１９３に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９５】
前記複製起点は、前記ｐＳａ複製起点に由来する請求項１９１または１９２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９６】
前記ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１９５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９７】
前記複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項１９１または１９２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９８】
前記ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１９７に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項１９９】
前記複製起点は、前記ｐＲＫ２複製起点に由来する請求項１９１または１９２に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２００】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である請求項１９２〜１９４および１９９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０１】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である請求項１９２〜１９４および１９９〜２００のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０２】
前記ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２０１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０３】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である請求項１９２〜１９４および１９９〜２００のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０４】
前記ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２０３に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０５】
前記ｐＲＫ２複製起点は、前記ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む請求項１９２〜１９４および１９９〜２０４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０６】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項２０５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０７】
ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む請求項１８０〜２０６のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０８】
前記ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２０７に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２０９】
前記選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項１６５〜２０８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１０】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子またはａａｄＡ遺伝子である請求項２０９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１１】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子である請求項２１０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１２】
ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２１１に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１３】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である請求項２１０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１４】
前記ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２１３に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１５】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である請求項２１０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１６】
前記ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２１５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１７】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である請求項２１０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１８】
前記ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２１７に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２１９】
前記選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である請求項２１０に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２０】
前記ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２１９に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２１】
前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項１６５〜２０８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２２】
前記選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない請求項１６５〜２０８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２３】
前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項１６５〜２０８のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２４】
前記対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である請求項２２３に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２５】
前記第１のベクターは、配列番号６１、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項１６５〜２２４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２６】
前記第１のベクターは、配列番号６２、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項１６５〜２２５のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２７】
前記第１のベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項１６５〜２２６のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２８】
前記第１のベクターは、配列番号６３、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項２２７に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２２９】
前記第１のベクターは、配列番号３４、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２３０】
前記第１のベクターは、配列番号３５、またはその変異体およびフラグメントを含まない請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２３１】
前記第１のベクターは、配列番号３６、またはその変異体およびフラグメントを含まない請求項１６５に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２３２】
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１であって、
作動可能に結合している、
ａ．配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、
ｂ．配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖維持のための複製起点、
ｃ．配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに
ｄ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１−Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含むビルレンス遺伝子
を含む第１のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１。
【請求項２３３】
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１であって、
作動可能に結合している、
ａ．配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、
ｂ．配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖維持のための複製起点、
ｃ．配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに
ｄ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１−Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、およびそれぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは、配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む配列
を含む第１のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１。
【請求項２３４】
オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１であって、
作動可能に結合している、
ａ．配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、
ｂ．配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖維持のための複製起点、
ｃ．配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに
ｄ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のビルレンス遺伝子、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１−Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、およびそれぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは、配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、および配列番号２７を有するｖｉｒＪビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む配列
を含む第１のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターと
を含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１。
【請求項２３５】
形質転換植物細胞の作製方法であって、
作動可能に結合している、
ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、
ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点、
ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに
ｄ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１−Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその変異体および誘導体（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）
を含む第１のベクターと、
作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターと
を含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と植物細胞を接触させる工程と；
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が目的配列を前記植物細胞に形質転換させることができる条件下で、前記植物細胞を培養する工程と；
ゲノム中に前記目的配列を含む形質転換植物細胞を同定する工程と
を含む方法。
【請求項２３６】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１は、それぞれ配列番号４〜１４、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１は、それぞれ配列番号８０〜９０、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号１６〜１７、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号９２〜９３、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３８】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜ｖｉｒＤ２は、それぞれ配列番号１８〜１９、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号９４〜９５、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３９】
前記リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧは、配列番号１５、もしくはその変異体および誘導体を有し、またはｒ−ｖｉｒＧは、配列番号９１、もしくはその変異体および誘導体を有する請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４０】
リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１種以上をさらに含む請求項２３５に記載の方法。
【請求項２４１】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、あるいはその変異体または誘導体に由来する請求項２３５〜２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する請求項２３５〜２４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４３】
ＣｏｌＥ１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する請求項２３５〜２４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４５】
ｐＳＣ１０１複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する請求項２３５〜２４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４７】
ｐ１５Ａ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する請求項２３５〜２４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４９】
Ｒ６Ｋ複製起点に由来するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５０】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、高コピー数複製起点である請求項２３５〜２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５１】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、中コピー数複製起点である請求項２３５〜２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５２】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、低コピー数複製起点である請求項２３５〜２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する請求項２３５〜２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５４】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である請求項２３５〜２４９および２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５５】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項２３５〜２４９および２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５６】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する請求項２３５〜２４９および２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５７】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する請求項２３５〜２４９および２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２４９および２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５９】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である請求項２３５〜２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６０】
前記ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２５９に記載の方法。
【請求項２６１】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための前記複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である請求項２３５〜２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６２】
前記複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する請求項２６１１９１に記載の方法。
【請求項２６３】
前記複製起点は、前記ｐＲＫ２複製起点に由来する請求項２６１または２６２に記載の方法。
【請求項２６４】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記複製起点は、前記ｐＳａ複製起点に由来する請求項２６１または２６２に記載の方法。
【請求項２６６】
前記ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６７】
前記複製起点は、前記ｐＲＦＡ１０１０複製起点に由来する請求項２６１または２６２に記載の方法。
【請求項２６８】
前記ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２６７に記載の方法。
【請求項２６９】
前記複製起点は、前記ｐＲＫ２複製起点に由来する請求項２６１または２６２に記載の方法。
【請求項２７０】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である請求項２６２〜２６４および２６９のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）。
【請求項２７１】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である請求項２６２〜２６４および２６９〜２７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７２】
前記ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２７１に記載の方法。
【請求項２７３】
前記ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である請求項２６２〜２６４および２６９〜２７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７４】
前記ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２７３に記載の方法。
【請求項２７５】
前記ｐＲＫ２複製起点は、前記ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む請求項２６２〜２６４および２６９〜２７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７６】
前記ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはその変異体およびフラグメントを含む請求項２７５に記載の方法。
【請求項２７７】
ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む請求項２５０〜２７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７８】
前記ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２７７に記載の方法。
【請求項２７９】
前記選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する請求項２３５〜２７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８０】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子またはａａｄＡ遺伝子である請求項２７９に記載の方法。
【請求項２８１】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子である請求項２８０に記載の方法。
【請求項２８２】
前記ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
前記選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である請求項２８０に記載の方法。
【請求項２８４】
前記ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２８３に記載の方法。
【請求項２８５】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である請求項２８０に記載の方法。
【請求項２８６】
前記ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２８５に記載の方法。
【請求項２８７】
前記選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である請求項２８０に記載の方法。
【請求項２８８】
前記ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
前記選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である請求項２８０に記載の方法。
【請求項２９０】
前記ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９１】
前記選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない請求項２３５〜２７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９２】
前記選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない請求項２３５〜２７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９３】
前記選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である請求項２３５〜２７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９４】
前記対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である請求項２９３に記載の方法。
【請求項２９５】
前記第１のベクターは、配列番号６１、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項２３５〜２９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９６】
前記第１のベクターは、配列番号６２、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項２３５〜２９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９７】
前記第１のベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項２３５〜２９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９８】
前記第１のベクターは、配列番号６３、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない請求項２３５または２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
前記第１のベクターは、配列番号３４、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３００】
前記第１のベクターは、配列番号３５、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０１】
前記第１のベクターは、配列番号３６、またはその変異体およびフラグメントを有する請求項２３５〜２９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０２】
ゲノム中に前記目的配列を含む植物を再生する工程をさらに含む請求項２３５に記載の方法。
【請求項３０３】
前記植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である請求項２３５または３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
前記植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイロナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、オートムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である請求項２３５または３０２に記載の方法。
【請求項３０５】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、前記植物細胞に接触させる前に、アセトシリンゴンまたはｖｉｒもしくはｒ−ｖｉｒ遺伝子機能を誘発する他の化合物の存在下で増殖させる請求項２３５〜３０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０６】
前記植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎からの外植体に含まれており、前記外植体を前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる請求項２３５および３０３〜３０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０７】
前記外植体は、胚性分裂組織、体細胞分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節、または、葉、根もしくは茎の組織を含む請求項３０６に記載の方法。
【請求項３０８】
前記目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の非存在下に行われる請求項２３５に記載の方法。
【請求項３０９】
前記目的配列を含む植物細胞を同定する工程は、選択剤の存在下に前記植物細胞を培養することを含み、前記目的配列は、前記選択剤に対する耐性を与えるか、または前記選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に供給される請求項２３５に記載の方法。
【請求項３１０】
前記選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、２，４−Ｄまたはジカンバである請求項３０９に記載の方法。
【請求項３１１】
前記目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない請求項２３５に記載の方法。
【請求項３１２】
前記マーカー遺伝子および前記目的配列は、前記目的配列を含む前記植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している請求項３１１に記載の方法。
【請求項３１３】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、作動可能に結合している、第２の目的配列を含む第３のベクターをさらに含む請求項２３５に記載の方法。
【請求項３１４】
前記植物細胞からの植物の再生は、前記植物細胞を含む外植体から１つ以上のシュートの形成を誘発し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む請求項３０２に記載の方法。
【請求項３１５】
植物の再生は、組織形成によって起こる請求項３１４に記載の方法。
【請求項３１６】
前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ  Ｈ１）、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７およびオクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）からなる群から選択される請求項２３５〜３１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１７】
（ａ）請求項２〜７６および１６５〜２３４のいずれか一項に記載のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）；および
（ｂ）植物の形質転換に使用するための説明書
を含むキット。
【請求項３１８】
配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む請求項２、１６５、２３２、２３３、２３４および２３５のいずれか一項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は植物バイオテクノロジーの分野に関する。特に本開示は、細菌媒介デリバリーにより、トランスジェニック植物および植物細胞を作製する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１１２６７号の優先権を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルで提出された配列表への参照
配列表の正式な写しは、２０１６年８月２４日に作成のファイル名２０１６０８２６＿６５０２ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔの、８６１ＫＢのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
１９９７年に初めて導入された遺伝子組み換え（ＧＭ）作物は、２０１４年には、米国で作付けされた土地全体の約８０〜９４％を占めるようになった。全世界でＧＭ作物が作られる地球上のヘクタール数は、１９９６年の作付けが１７０万ヘクタールであり、２０１３年の作付けが１億７５００万ヘクタール超であり、１９９６年から２０１３年までに１００倍を超えて増加した。組み換え作物は世界の約３０の国で採用されている。遺伝子組み換え作物の殆どではなくとも、多くは、目的の形質を組み込むためにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を利用して生み出された。しかしながら、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の改変の必要性や、いくつかの経済的に重要な植物の遺伝子型に依存しない形質転換、および導入遺伝子の予測可能で、かつ安定した発現を一貫して実現するという問題など、多くの課題が依然存在する。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、これまで、植物の細菌媒介形質転換の主な手段であったが、目的の植物全てに対して等しく有効であるわけではない。研究によって、他の細菌も植物の形質転換に使用できることが示された。例えば、米国特許第７８８８５５２Ｂ２号明細書には、植物の形質転換にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ではない種の使用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７８８８５５２Ｂ２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今日まで、他の細菌株は、被験植物に使用した条件でアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と比べると、概ね、かなり低い形質転換効率を示した。したがって、植物の形質転換のための、また、植物の形質転換効率を改善するための、さらなる非アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌株および方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
植物のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換方法および組成物を提供する。方法としては、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の株を使用して目的のポリヌクレオチドを植物細胞に導入する方法が挙げられるが、これに限定されない。これらの方法にはＶｉｒＤ２に依存する方法が含まれる。
組成物には、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の株、トランスファーＤＮＡ、ならびにコンストラクトおよび／またはプラスミドが含まれる。これらの組成物には、１つ以上のビルレンス遺伝子、ボーダー領域および／または複製起点を含むプラスミドを有するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の株が含まれる。本方法で作製される目的ポリヌクレオチドを含む植物細胞、組織、植物および種子もまた提供される。
本開示の１つの態様は、単離されたオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を特徴とし、前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）はＮＲＲＬ  Ｂ−６７０７８として寄託されている。
【０００８】
ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、さらに（ａ）Ｔｉプラスミドのｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸であって、ｖｉｒ遺伝子領域は目的配列をコードする核酸をＶｉｒＤ２依存的様式で植物細胞に導入するように作用する第１の核酸；および（ｂ）目的配列に作動可能に結合した１種以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸を含む。
【０００９】
ある態様では、第１の核酸および第２の核酸は、単一のポリヌクレオチド分子上に存在する。
【００１０】
別の態様では、第１の核酸および第２の核酸は、別々のポリヌクレオチド分子上に存在する。
【００１１】
別の態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）はさらに選択マーカーを含む。
【００１２】
別の態様は、形質転換植物細胞を作製する方法であって、（ａ）植物細胞を、Ｔｉプラスミドのｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸、および目的配列に作動可能に連結した１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸を含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させること；（ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が目的配列を植物細胞に導入できる条件下で植物細胞を培養すること；ならびに（ｃ）ゲノム中に目的配列を含む形質転換植物細胞を同定することを含む方法を特徴とする。
【００１３】
ある態様では、方法はゲノム中に目的配列を含む植物を再生させることをさらに含む。
【００１４】
ある態様では、植物細胞は単子葉植物または双子葉植物由来である。
【００１５】
ある態様では、植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ソルガム、オオムギ、カラスムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である。
【００１６】
別の態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を、植物細胞と接触させる前に、アセトシリンゴンまたはｖｉｒ遺伝子の作用を誘導する他の化合物の存在下で培養する。
【００１７】
別の態様では、植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎の外植体に含まれ、その外植体をオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる。
【００１８】
別の態様では、外植体は、萌芽期の分裂組織、体細胞の分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節を含むか、または葉、根もしくは茎の組織を含む。
【００１９】
ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定を、選択剤の非存在下に行う。
【００２０】
別の態様では、目的配列を含む植物細胞の同定は、選択剤の存在下に植物細胞を培養することを含む。ここで、目的配列は、選択剤に対する耐性を与えるか、または選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される。
【００２１】
別の態様では、選択剤は、グリホサート、カナマイシン、ビアラホス、２，４−Ｄまたはジカンバである。
【００２２】
別の態様では、目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない。
【００２３】
別の態様では、マーカー遺伝子と目的配列は、目的配列を含む植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している。
【００２４】
別の態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、第２の目的配列を含む第３の核酸をさらに含み、そのため形質転換細胞はゲノム中に第２の目的配列を含む。
【００２５】
別の態様では、植物細胞からの植物の再生は、植物細胞を含む外植体から１つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む。
【００２６】
別の態様では、再生は器官形成により起こる。
【００２７】
別の態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ  １２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７およびオクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）からなる群から選択される。
【００２８】
ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子、ｒ−ｖｉｒＦビルレンス遺伝子は、配列番号９９、またはその変異体および誘導体を有する。
【００２９】
ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＢＢＲ１複製起点に由来する。
【００３０】
本開示の１つの態様は、単離したオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を特徴とし、前記オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）はＮＲＲＬ  Ｂ−６７０７８として寄託されている。
【００３１】
他の態様では、本開示は、（ａ）ｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸であって、ｖｉｒ遺伝子領域は目的配列をコードする核酸をＶｉｒＤ２依存的様式で植物細胞に導入するように作用する第１の核酸；および（ｂ）目的配列に作動可能に結合した１種以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸
を含む、作動可能に結合しているベクターを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を提供する。ある態様では、第１の核酸および第２の核酸は、単一のポリヌクレオチド分子上に存在する。ある態様では、第１の核酸および第２の核酸は、別々のポリヌクレオチド分子上に存在する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）はさらに選択マーカー遺伝子を含む。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子、またはａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子である。ある態様では、ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である。ある態様では、ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその変異体およびフラグメントを有するＳｐｃＮ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその変異体およびフラグメントを有するａｐｈ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。ある態様では、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子、またはｔｈｙＡ遺伝子である。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１：あるいは、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖ���ｒＣ１〜Ｃ２：あるいは、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２：あるいは、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、配列番号１５、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧ：あるいは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧを含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１つ以上を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６、または変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＡ、あるいは、配列番号７９、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子であり、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号２０〜２２、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号９６〜９８、またはその変異体および誘導体を有し、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＥ１〜Ｅ３は、それぞれ配���番号２３〜２５、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子は、配列番号１００、またはその変異体および誘導体を有し、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＨ−Ｈ１は、それぞれ配列番号４２〜４３、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＫは、配列番号４５、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＬは、配列番号４６、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＭは、配列番号４７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＰは、配列番号４８、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＱは、配列番号４９、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、またはそれらの変異体およびフラグメント、あるいはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの変異体および誘導体であり、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、またはそれらの変異体およびフラグメント、あるいはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの変異体および誘導体であり、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する。ある態様では、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓ��ｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐ１５Ａ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。ある態様では、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、高コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、中コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、低コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａ、またはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための
複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。ある態様では、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、同じ複製起点である。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの変異体およびフラグメントを含む。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む。ある態様では、ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。他の態様では、本開示は、（ａ）ｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸であって、ｖｉｒ遺伝子領域は目的配列をコードする核酸をＶｉｒＤ２依存的様式で植物細胞に導入するように作用する第１の核酸；および（ｂ）目的配列に作動可能に結合した１種以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸を含む、作動可能に結合しているベクターを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を含むキットを提供する。
【００３２】
別の態様では、本開示は、形質転換植物細胞を作製する方法であって、（ａ）植物細胞を、作動可能に連結した、ｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸、および目的配列に作動可能に連結した１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２の核酸を含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させること；（ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が目的配列を植物細胞に導入できる条件下で植物細胞を培養すること；ならびに（ｃ）ゲノム中に目的配列を含む形質転換植物細胞を同定することを含む方法を提供する。ある態様では、本方法は、ゲノム中に目的配列を含む植物を再生させることをさらに含む。ある態様では、植物細胞は単子葉植物または双子葉植物由来である。ある態様では、植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ソルガム、オオムギ、カラスムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を、植物細胞と接触させる前に、アセトシリンゴン、またはｖｉｒ遺伝子もしくはｒ−ｖｉｒ遺伝子の作用を誘導する他の化合物の存在下で培養する。ある態様では、植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎の外植体に含まれ、その外植体をオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる。ある態様では、外植体は、萌芽期の分裂組織、体細胞の分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節を含むか、または葉、根もしくは茎の組織を含む。ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定を、選択剤の非存在下に行う。ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定は、選択剤の存在下に植物細胞を培養することを含む。ここで、目的配列は、選択剤に対する耐性を与えるか、または選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される。ある態様では、選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、２，４−Ｄまたはジカンバである。ある態様では、目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない。ある態様では、マーカー遺伝子および目的配列は、目的配列を含む植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、第２の目的配列を含む、作動可能に結合している第３のベクターをさらに含む。ある態様では、植物細胞からの植物の再生は、植物細胞を含む外植体から１つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む。ある態様では、再生は器官形成により起こる。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７およびオクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）からなる群から選択される。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）はさらに選択マーカーを含む。ある態様では、選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子、またはａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子である。ある態様では、ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である。ある態様では、ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその変異体およびフラグメントを有するＳｐｃＮ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその変異体およびフラグメントを有するａｐｈ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。ある態様では、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子、またはｔｈｙＡ遺伝子である。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１：あるいは、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（���ｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２：あるいは、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２：あるいは、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、配列番号１５、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧ：あるいは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧを含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、ｖｉｒ遺伝子領域は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１つ以上を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６、または変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＡ、あるいは、配列番号７９、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子であり、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号２０〜２２、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号９６〜９８、またはその変異体および誘導体を有し、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビ���レンス遺伝子ｖｉｒＥ１〜Ｅ３は、それぞれ配列番号２３〜２５、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子は、配列番号１００、またはその変異体および誘導体を有し、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＨ−Ｈ２は、それぞれ配列番号４２〜４３、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＫは、配列番号４５、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＬは、配列番号４６、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＭは、配列番号４７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＰは、配列番号４８、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＱは、配列番号４９、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、本方法は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、またはそれらの変異体およびフラグメント、あるいはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態様では、本方法は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、またはそれらの変異体およびフラグメント、あるいはｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの変異体および誘導体を含み、ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む。ある態
様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する。ある態様では、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐ１５Ａ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。ある態様では、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点をさらに含む。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、高コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、中コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、低コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａ、またはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である。ある態様���は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。ある態様では、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、同じ複製起点である。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの変異体およびフラグメントを含む。ある態様では、本方法は、ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む。ある態様では、ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。
【００３３】
別の態様では、本開示は、第１のベクターであって、作動可能に結合している、ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）における増殖および安定した維持のための複製起点、ｃ）選択マーカー遺伝子、ならびにｄ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ、またはその変異体および誘導体（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）を含むベクターと；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を提供する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１：あるいは、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２：あるいは、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２：あるいは、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＧ：あるいは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧである。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１つ以上をさらに含む。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ��における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する。ある態様では、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐ１５Ａ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。ある態様では、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、高コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、中コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、低コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａ、またはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラ��メントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。ある態様では、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの変異体およびフラグメントを含む。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む。ある態様では、ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子、またはａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子である。ある態様では、ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ２遺伝子��、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である。ある態様では、ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその変異体およびフラグメントを有するＳｐｃＮ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその変異体およびフラグメントを有するａｐｈ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。ある態様では、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子、またはｔｈｙＡ遺伝子である。ある態様では、第１のベクターは、配列番号６１、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、配列番号６２、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、配列番号６３、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、配列番号３４、またはその変異体もしくはフラグメントを有する。ある態様では、第１のベクターは、配列番号３５、またはその変異体もしくはフラグメントを有する。ある態様では、第１のベクターは、配列番号３６、またはその変異体もしくはフラグメントを有する。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。別の態様では、本方法は、（ａ）
作動可能に結合している、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点（ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点、（ｃ）選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ、またはその変異体および誘導体（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）を含む第１のベクターと；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と；（ｂ）植物の形質転換に使用するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３４】
別の態様では、本開示は、作動可能に結合している、（ａ）配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、（ｂ）配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有する、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖のための複製起点、（ｃ）配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子の、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１、もしくはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子を含むビルレンス遺伝子を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を提供する。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。別の態様では、本開示は、（ａ）作動可能に結合している、（ａ）配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、（ｂ）配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有する、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖のための複製起点、（ｃ）配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子の、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子を含むビルレンス遺伝子を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と；（ｂ）植物の形質転換に使用するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、作動可能に結合している、（ａ）配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、（ｂ）配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有する、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖のための複製起点（ｃ）配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子の、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１−Ｅ３ビルレンス遺伝子、または配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子の配列を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を提供する。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。別の態様では、本開示は、（ａ）作動可能に結合している、（ａ）配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、（ｂ）配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有する、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖のための複製起点、（ｃ）配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子の、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、または配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号、１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子を含む配列を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と；（ｂ）植物の形質転換に使用するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３６】
別の態様では、本開示は作動可能に結合している、（ａ）配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、（ｂ）配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有する、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖のための複製起点、（ｃ）配列番号１を有する選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子の、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、または配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、または配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、配列番号、１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、および配列番号２７、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＪビルレンス遺伝子を含む配列を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１を提供する。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。別の態様では、本開示は、（ａ）作動可能に結合している、（ａ）配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖のための複製起点、（ｂ）配列番号３、またはその変異体およびフラグメントを有する、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖のための複製起点、（ｃ）配列番号１を有する選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子の、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、または配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、または配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、配列番号、１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、および配列番号２７、またはその変異体および誘導体を有するｖｉｒＪビルレンス遺伝子を含む配列を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と；（ｂ）植物の形質転換に使用するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３７】
別の態様では、本開示は、形質転換植物細胞を作製する方法であって、作動可能に結合している（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、（ｂ）オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点、（ｃ）選択マーカー遺伝子、ならびに（ｄ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子の、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、または配列番号９１、もしくはその変異体および誘導体を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子を含む第１のベクター（ここで、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターは、配列番号１０１、またはその変異体および誘導体を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子をさらに含む）と；作動可能に結合している、目的配列に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む第２のベクターとを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と植物細胞を接触させることと；オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が目的配列を植物細胞に導入できる条件下で植物細胞を培養することと；ゲノム中に目的配列を含む形質転換植物細胞を同定することとを含む方法を提供する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＢ１１は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１は、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号９４〜９５、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧは、配列番号１５、またはその変異体および誘導体を有し、あるいは、ｒ−ｖｉｒＧは、配列番号９１、またはその変異体および誘導体を有する。ある態様では、本方法は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、���ｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体の１つ以上をさらに含む。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡまたはＲ６Ｋ複製起点、およびその変異体または誘導体に由来する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する。ある態様では、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐ１５Ａ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。ある態様では、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号５２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、高コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、中コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、低コピー数複製起点である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＦＳ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａ、またはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点の変異体である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＲＦ���１０１０複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１１２、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。ある態様では、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における増殖および安定した維持のための複製起点、ならびに、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種における増殖および安定した維持のための前記複製起点は、同じ複製起点である。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点、またはｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来するある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。ある態様では、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＦＳ１０１０複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＦＳ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニもしくはミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミクロｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。ある態様では、ミニｐＲＫ２は、配列番号６６、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。ある態様では、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの変異体およびフラグメントを含む。ある態様では、本方法は、ｐａｒ  ＤＥオペロン由来の配列をさらに含む。ある態様では、ｐａｒ  ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ヒグロマイシン、またはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子、ａｐｈ遺伝子、またはａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１���伝子である。ある態様では、ａａｃＣ１遺伝子は、配列番号１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ａａｄＡ遺伝子である。ある態様では、ａａｄＡ遺伝子は、配列番号３９、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ１遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ１遺伝子は、配列番号４０、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｎｐｔ２遺伝子である。ある態様では、ｎｐｔ２遺伝子は、配列番号４１、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である。ある態様では、ｈｐｔ遺伝子は、配列番号６７、またはその変異体およびフラグメントを有する。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその変異体およびフラグメントを有するＳｐｃＮ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその変異体およびフラグメントを有するａｐｈ遺伝子である。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン選択マーカー遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。ある態様では、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。ある態様では、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子、またはｔｈｙＡ遺伝子である。ある態様では、第１のベクターは、配列番号６１、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、配列番号６２、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、配列番号６３、またはその変異体もしくはフラグメントを含まない。ある態様では、第１のベクターは、配列番号３４、またはその変異体もしくはフラグメントを有する。ある態様では、第１のベクターは、配列番号３５、またはその変異体もしくはフラグメントを有する。ある態様では、第１のベクターは、配列番号３６、またはその変異体もしくはフラグメントを有する。ある態様で
は、本方法は、ゲノム中に目的配列を含む植物を再生させることをさらに含む。ある態様では、植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である。ある態様では、植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ソルガム、オオムギ、カラスムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を、植物細胞と接触させる前に、アセトシリンゴン、またはｖｉｒ遺伝子もしくはｒ−ｖｉｒ遺伝子の作用を誘導する他の化合物の存在下で培養する。ある態様では、植物細胞は、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎の外植体に含まれ、その外植体をオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる。ある態様では、外植体は、萌芽期の分裂組織、体細胞の分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節を含むか、または葉、根もしくは茎の組織を含む。ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定を、選択剤の非存在下に行う。ある態様では、目的配列を含む植物細胞の同定は、選択剤の存在下に植物細胞を培養することを含む。ここで、目的配列は、選択剤に対する耐性を与えるか、または選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される。ある態様では、選択剤は、クロルスルフロン、エタメツルフロン、イマザピル、グリホサート、カナマイシン、スペクチノマイシン、ビアラホス、２，４−Ｄまたはジカンバである。ある態様では、目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない。ある態様では、マーカー遺伝子および目的配列は、目的配列を含む植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、第２の目的配列を含む、作動可能に結合している第３のベクターをさらに含む。ある態様では、植物細胞からの植物の再生は、植物細胞を含む外植体から１つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む。ある態様では、再生は器官形成により起こる。ある態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０、ＨＴＧ３−Ｃ−０７およびオクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）からなる群から選択される。ある態様では、ベクターは、配列番号３４、３５、３６、１０６、１１３もしくは１１４、またはその変異体および誘導体のいずれか１つを含む。
【００３８】
別の態様では、本開示は、（ａ）本組成物、本方法または本ベクターのいくつかのオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と；（ｂ）植物の形質転換に使用するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３９】
本特許または本出願書類は、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を有する本特許または本特許出願公開物のコピーは、請求があり、必要な料金が支払われば、特許庁から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、最尤法による１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づく分子系統解析を示し、矢印は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１（ＥＰ１Ａ０９）の位置を示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、最尤法による１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づく分子系統解析を示し、矢印は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１（ＥＰ１Ａ０９）の位置を示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、タバコの形質転換実験を示す。ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換されたタバコ葉片からの、安定に形質転換されたＤｓＲＥＤを発現するシュート（図２Ｂ）の、ビアラホス３ｍｇ／Ｌ添加培地中で選択してから３週後のものを示す。ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換されたタバコ葉片からの、安定に形質転換されたＤｓＲＥＤを発現するシュート（図２Ｄ）の、ビアラホス３ｍｇ／Ｌ添加培地中で選択してから７週後のものを示す。図２Ａ（図２Ｂの組織を示す）および図２Ｃ（図２Ｄの組織を示す）は、ＤｓＲＥＤフィルターのセットなしで、周囲光で撮像した形質転換タバコのシュートの画像を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ダイズの半切種子の外植体形質転換の結果を示す。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＤｓＲＥＤの一時的発現（図３Ｄ）を示す、ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換されたダイズの半切種子の外植体の、感染から５日後を示す。図３Ｃは、周囲光下での図３Ｄのダイズの半切種子の外植体の組織像を示し、図３Ｄは、ＤｓＲＥＤ５の一時的発現を示す。対照的に、ベクターＰＨＰ７０３６５を含まない、野生型オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換されたダイズの半切種子の外植体は、ＤｓＲＥＤ発現を示さなかった（図３Ｂ）。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｊは、プラスミドＰＨＰ７０３６５（ｐＶＩＲ８）をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を感染させたダイズの形質転換の逐次工程を示す。図４Ａおよび図４Ｂは、形質転換から２〜４週後に観察された、ＤｓＲＥＤ発現（ＦＩＧ．４Ｂ）を示す安定に形質転換されたシュートの開始を示す。図４Ａは、周囲光下での図４Ｂの組織像を示す。図４Ｃは、シュートをさらに伸長させるために外植体を継代培養したシュートの伸長を示す。図４Ｄ〜図４Ｇは、ダイズ組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｄおよび図４Ｆは、周辺光で撮像された。図４Ｅは、図４Ｄの組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｇは、図４Ｆの組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｈおよび図４Ｉは、全植物体がＤｓＲＥＤ発現を示した根を形成した、発根を示す。図４Ｈは、周辺光で撮像された。図４Ｉは、図４Ｈの組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｊは、プラスミドＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を感染させた鉢植えされたダイズ植物を示す。
【図４−２】図４Ａ〜図４Ｊは、プラスミドＰＨＰ７０３６５（ｐＶＩＲ８）をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を感染させたダイズの形質転換の逐次工程を示す。図４Ａおよび図４Ｂは、形質転換から２〜４週後に観察された、ＤｓＲＥＤ発現（ＦＩＧ．４Ｂ）を示す安定に形質転換されたシュートの開始を示す。図４Ａは、周囲光下での図４Ｂの組織像を示す。図４Ｃは、シュートをさらに伸長させるために外植体を継代培養したシュートの伸長を示す。図４Ｄ〜図４Ｇは、ダイズ組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｄおよび図４Ｆは、周辺光で撮像された。図４Ｅは、図４Ｄの組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｇは、図４Ｆの組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｈおよび図４Ｉは、全植物体がＤｓＲＥＤ発現を示した根を形成した、発根を示す。図４Ｈは、周辺光で撮像された。図４Ｉは、図４Ｈの組織のＤｓＲｅｄ発現を示す。図４Ｊは、プラスミドＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を感染させた鉢植えされたダイズ植物を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、プラスミドＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換されたダイズ胚軸植物体を示す。図５Ａは、安定に形質転換されたシュートおよびカルスが、分裂組織部位で、ＤｓＲＥＤ発現（図５Ｂ）を示した、形質転換から２週後に観察されたシュートおよびカルスの発生を示す。図５Ａは、周囲光下での図５Ｂの組織像を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、形質転換から６〜８週で、安定に形質転換された長さ１〜１．５ｃｍのＤｓＲＥＤ陽性シュート（図５Ｄ）が形成された、シュートの伸長を示す。図５Ｃは、周囲光下での図５Ｄの組織像を示す。図５Ａおよび図５Ｂのバーは２ｍｍに相当する。図５Ｃおよび図５Ｄのバーは５ｍｍに相当する。
【図６】図６Ａ〜図６Ｆは、ダイズ品種９３Ｙ２１の半切種子における、感染から５日後の、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８（図６Ｂ）、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）（図６Ｄ）およびオクロバクテリウム・ペコリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｏｒｉｓ）（図６Ｆ）のＤｓＲＥＤの一時的発現の比較を示す。図６Ａ、図６Ｃおよび図６Ｅはそれぞれ、周辺光下での図６Ｂ、図６Ｄおよび図Ｆの組織像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ）科の細菌属である。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株は、直線状、または僅かに湾曲したワンエンドフレーム状の（ｏｎｅ  ｅｎｄ  ｆｌａｍｅ−ｓｈａｐｅｄ）グラム陰性短桿菌である。細胞は幅が約０．６μｍ、長さが約１．２〜２μｍである。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、非胞子形成性であり、また、偏性好気性で、かつ非発酵性である。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種の殆どのゲノムは、多くはプラスミドと結び付いている２つの独立した環状染色体を有する複合体である。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属は、１９８８年にＨｏｌｍｅｓにより記載され（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ３８：４０８）、そして、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）が、この属の基準種として提案された。さらなる研究によって、オクロバクテリウム・シセリ（Ｏ．ｃｉｃｅｒｉ）、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏ．ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ガリニファエシス（Ｏ．ｇａｌｌｉｎｉｆａｅｃｉｓ）、オクロバクテリウム・グリグノネンス（Ｏ．ｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ガングゾウエンス（Ｏ．ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ハエマトフィルム（Ｏ．ｈａｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｍ）、オクロバクテリウム・インターメディウム（Ｏ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏ．ｌｕｐｉｎｉ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏ．ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・ペコリス（Ｏ．ｐｅｃｏｒｉｓ）、オクロバクテリウム・ピツイトスム（Ｏ．ｐｉｔｕｉｔｏｓｕｍ）、オクロバクテリウム・インターメディウム（Ｏ．ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム・シュードグリグノネンス（Ｏ．ｐｓｅｕｄｏｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・リゾスファエラエ（Ｏ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、オクロバクテリウム・チオフェニボランス（Ｏ．ｔｈｉｏｐｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）およびオクロバクテリウム・トリティシ（Ｏ．ｔｒｉｔｉｃｉ）を含む他の種が認められた。
【００４２】
本開示のいくつかの例では、細胞形質転換用オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が提供される。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・グリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）である。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８である。本明細書中、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１、またはＥＰ１Ａ０９と称することがある。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）ベクターは、１つ以上のビルレンス遺伝子、ボーダー領域および／または複製起点を含む。いくつかの例では、ベクターは、植物および細菌の形質転換用の選択マーカーを含む。いくつかの例では、１つ以上のビルレンス遺伝子は、ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥ、ｖｉｒＦ、ｖｉｒＧ、およびその変異体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの例では、１つ以上のビルレンス遺伝子は、ｖｉｒＡ、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＢ１、ｖｉｒＢ２、ｖｉｒＢ３、ｖｉｒＢ４、ｖｉｒＢ５、ｖｉｒＢ６、ｖｉｒＢ７、ｖｉｒＢ８、ｖｉｒＢ９、ｖｉｒＢ１０、ｖｉｒＢ１１、ｖｉｒＧ、ｖｉｒＣ１、ｖｉｒＣ２、ｖｉｒＤ１、ｖｉｒＤ２、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：６２９−６３３、米国特許出願公開第２００５／０２８９６６７号明細書、同２００５／０２８９６７２号明細書）、およびその変異体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの例では、少なくとも２、３、４、５、６、７または８個のビルレンス遺伝子が提供される。いくつかの例では、１つ以上のビルレンス遺伝子は、Ｔｉプラスミド上に提供される。いくつかの例では、１つ以上のビルレンス遺伝子は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）ゲノムに組み込まれる。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、１つ以上のビルレンス遺伝子の２つ以上のコピーを含む。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、Ｔｉプラスミドのｖｉｒ遺伝子領域を含む第１の核酸を含み、そのｖｉｒ遺伝子領域は、目的配列をコードする核酸をＶｉｒＤ２依存的様式で植物細胞に導入するように作用する。ＶｉｒＤ２は、Ｔ−ＤＮＡ上のボーダー領域配列を切断して、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子を生成するのに関与する、ｓｓＤＮＡに共有結合する単一ＶｉｒＤ２タンパク質を有する細菌性エンドヌクレアーゼである（Ｙｏｕｎｇ  ＆  Ｎｅｓｔｅｒ（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ��ｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７０：３３６７−３３７４）。
【００４３】
いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、目的配列をコードする核酸に作動可能に結合する１つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む核酸を含む。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、２つ以上のＴ−ＤＮＡボーダー配列を含む核酸を含む。いくつかの例では、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列は、左ボーダー配列、右ボーダー配列および／または他の配列からなる群から選択される。いくつかの例では、ｖｉｒ遺伝子および目的配列は、単一ポリヌクレオチド配列上に存在する。いくつかの例では、ｖｉｒ遺伝子および目的配列は、別々のポリヌクレオチド配列上に存在する。細菌において機能する任意の複製起点を使用することができる。いくつかの例では、複製起点は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその両方において機能する起点である。いくつかの例では、複製起点は、ｐＶＳ１、ｐＳａ、ＲＫ２、ｐＲｉＡ４ｂ、ｉｎｃＰａ、ｉｎｃＷ、ｃｏｌＥ１、およびそれらの機能的変異体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、ＴｉまたはＲｉプラスミドを含む。いくつかの例では、ＴｉまたはＲｉプラスミドは、ｐＴｉＢｏ５４２、ｐＴｉＣ５８、ｐＴｉＡｃｈ５、ｐＴｉＣｈｒｙｓ５、ｐＴＦ１０１．１、ｐＢＩＮ１９、ｐＵＣＤ２、ｐＣＧＮ、およびそれらの機能的変異体、誘導体またはフラグメントからなる群から選択される。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）はさらに選択マーカーを含む。いくつかの例では、選択マーカーは、目的配列をコードする核酸上に存在する。いくつかの例では、選択マーカーは、目的配列である。
【００４４】
「フラグメント」は、ポリヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、およびしたがってそれによってコードされるタンパク質を意味する。ポリヌクレオチドのフラグメントは、天然タンパク質の生物活性を保持するタンパク質フラグメントをコードし得る。したがって、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約１５個のヌクレオチド、少なくとも約１６個のヌクレオチド、少なくとも約１７個のヌクレオチド、少なくとも約１８個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約７５個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、少なくとも約３００個のヌクレオチド、少なくとも約４００個のヌクレオチド、少なくとも約５００個のヌクレオチド、少なくとも約６００個のヌクレオチドから、使用する完全長のポリヌクレオチドまでの幅がある。
【００４５】
「誘導体」は、参照ポリヌクレオチドの生物活性と実質的に類似した活性を有するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部を意味する。ビルレンス遺伝子ポリヌクレオチドの誘導体は、機能的で、かつビルレンス遺伝子の活性を保持している。
【００４６】
「変異体」は、実質的に類似した配列を意味するものである。ポリヌクレオチドでは、変異体は、天然ポリヌクレオチドの１つ以上の内部部位での１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加および／または置換、ならびに／あるいは天然ポリヌクレオチドの１つ以上の部位での１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。ビルレンス遺伝子ポリヌクレオチドの変異体は、ビルレンス遺伝子活性を維持している。本明細書で使用する場合、「天然の」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドでは、保存的変異体は、遺伝子コードの縮重のため、ビルレンス遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異ポリヌクレオチドはまた、合成により誘導されるポリヌクレオチド、例えば、部位特異的変異誘発によって生成されるが、所望の活性は継続して保持しているものを含む。一般に、特に開示されたポリヌクレオチド（すなわち、ビルレンス遺伝子）の変異体は、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所に記載されたパラメータによって決定された特定のポリヌクレオチドに対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。特に開示されたポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の変異体はまた、変異ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの配列同一性パーセントを比較することによって評価することができる。任意の２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、配列アライメントプログラムおよび本明細書の他の箇所に記載されたパラメータによって算出することができる。使用した開示ポリヌクレオチドの所与の１対を、その２つのポリペプチドによって共有された配列同一性パーセントを比較して評価する場合、コードされる２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ｐＰＨＰ」は、プラスミドＰＨＰを指し、その後にアラビア数字が付く。例えば、ｐＰＨＰ７０３６５は、プラスミドＰＨＰ７０３６５を指す。例えば、ｐＶＩＲ７は、プラスミドｐＶＩＲ７を指す。
【００４８】
表１９は、本開示に示された配列識別番号（配列番号）のリストを示す。
【００４９】
細胞を形質転換する方法もまた提供される。いくつかの例では、細胞は、植物細胞である。いくつかの例では、方法は、細胞を、１つ以上のビルレンス遺伝子、ボーダー領域および／または複製起点と、目的配列とを含むオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させること；オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）が目的配列を細胞に導入できる条件下で植物細胞を培養すること；ならびにゲノム中に目的配列を含む形質転換植物細胞を同定することを含む。いくつかの例では、細胞は植物細胞であり、方法は、ゲノム中に目的配列を含む植物を再生することをさらに含む。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８である。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、オクロバクテリウム・グリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・サイティシ、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）またはオクロバクテリウム・ペクトリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｅｃｔｏｒｉｓ）である。いくつかの例では、植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物由来である。いくつかの例では、植物細胞は、ダイズ、タバコ、ヒマワリ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、アルファルファ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ソルガム、オオムギ、カラスムギ、キビ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタおよびサトウキビからなる群から選択される植物由来である。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を、細胞と接触させる前に、アセトシリンゴンまたはｖｉｒ遺伝子の作用を誘導する他の化合物の存在下で培養する。
【００５０】
いくつかの例では、植物の種子、苗、カルス、細胞懸濁液、子葉、分裂組織、葉、根または茎の外植体に含まれ、その外植体をオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と接触させる。いくつかの例では、外植体は、萌芽期の分裂組織、体細胞の分裂組織、カルス、細胞懸濁液、子葉、子葉節を含むか、または葉、根もしくは茎の組織を含む。いくつかの例では、目的配列を含む植物細胞の同定を、選択剤の非存在下に行う。他の例では、目的配列を含む植物細胞の同定は、選択剤の存在下に植物細胞を培養することを含む。ここで、目的配列は、選択剤に対する耐性を与えるか、または選択剤に対する耐性を与える選択マーカーと共に送達される。いくつかの例では、選択剤は、グリホサート、カナマイシン、ビアラホス、２，４−Ｄまたはジカンバである。いくつかの例では、目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない。これらの例では、マーカー遺伝子と目的配列は、目的配列を含む植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、第２の目的配列を含む第３の核酸をさらに含み、そのため形質転換細胞はゲノム中に第２の目的配列を含む。いくつかの例では、植物細胞からの植物の再生は、植物細胞を含む外植体から１つ以上のシュートの形成を誘導し、少なくとも最初のシュートを稔性植物全体に育成することを含む。いくつかの例では、再生は器官形成により起こる。
【００５１】
バクテリア目のリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）は、一般的な土壌細菌を含み、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種とともに、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メゾリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種およびオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種を含む。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種に加え、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種など、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）の他のメンバーが、植物根と特定の窒素固定根粒において共生することが知られている（例えば、Ｌｏｎｇ（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２５：６９−７２）。植物根、特にマメ科の植物根の宿主特異的根粒形成に加えて、根粒形成がない場合、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）のメンバーによる植物成長促進効果が知られている（例えば、Ｎｏｅｌ  ｅｔ  ａＩ．（１９９６）Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：２７９−２８３）。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種以外の細菌による植物の形質転換を記載した報告書が発表されている（例えば、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａＩ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：６２９−６３３；米国特許出願公開第２００５／０２８９６６７号明細書；同２００５／０２８９６７２号明細書、Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（２００４）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０：２７７９−２７８５；Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（２００５）Ｐｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ５４：７９９−８０５）。植物の形質転換は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科中のアグロバクロテリウム、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）で示されており、一方、ＤＮＡ導入は、フィロバクテリア（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科のメゾリゾニウム（Ｍｅｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）でのみ示されている。
【００５２】
いくつかの態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メゾリゾニウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種の遺伝子である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、メゾリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、フィロバクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種遺伝子である。ある態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。
【００５３】
いくつかの態様では、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子である。ある態様では、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・アルバーティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）の遺伝子である。ある態様では、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。ある態様では、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）である。ある態様では、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。
【００５４】
ＴｉまたはＲｉプラスミドを持った多くの野生型で無毒（非病原性）のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株を、植物への遺伝子導入に使用することができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドを有する野生型アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴ−ＤＮＡに位置している植物ホルモン合成遺伝子は、形質転換後に発現し、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株または種に応じた腫瘍形成または毛状根表現型を引き起こす。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴ−ＤＮＡは、その毒性および病原性決定基の多くを１つ以上の目的遺伝子で置換し（非病原性化により）、その修飾されたＴ−ＤＮＡを植物細胞に導入し、ゲノムに組み込む能力を保持するように遺伝子操作することができる。そのような無毒化されたＴｉプラスミドを含有する株を、植物の形質転換に広く使用することができる。
【００５５】
いくつかの態様では、ベクターコンストラクトは、Ｔｉプラスミド（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））またはＲｉプラスミド（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ））を含む。いくつかの態様では、コンストラクトは、１つ以上のビルレンス遺伝子を含む。ビルレンス遺伝子は、Ｔｉプラスミド由来であり得、本明細書では、配列番号４〜２７および配列番号４２〜４９（本明細書の表１９を参照）で表される。ビルレンス遺伝子は、Ｒｉプラスミド由来であり得、本明細書では、配列番号７９〜１０１で表される。本明細書に開示のＲｉプラスミドビルレンス遺伝子は、ｖｉｒ遺伝子名の前に「ｒ」を用いて表される。例えば、ｒ−ｖｉｒＡ（配列番号７９）、ｒ−ｖｉｒＢ１（配列番号８０）、ｒ−ｖｉｒＢ２（配列番号８１）、ｒ−ｖｉｒＢ３（配列番号８２）、ｒ−ｖｉｒＢ４（配列番号８３）、ｒ−ｖｉｒＢ５（配列番号８４）、ｒ−ｖｉｒＢ６（配列番号８５）、ｒ−ｖｉｒＢ７（配列番号８６）、ｒ−ｖｉｒＢ８（配列番号８７）、ｒ−ｖｉｒＢ９（配列番号８８）、ｒ−ｖｉｒＢ１０（配列番号８９）、ｒ−ｖｉｒＢ１１（配列番号９０）、ｒ−ｖｉｒＧ（配列番号９１）、ｒ−ｖｉｒＣ１（配列番号９２）、ｒ−ｖｉｒＣ２（配列番号９３）、ｒ−ｖｉｒＤ１（配列番号９４）、ｒ−ｖｉｒＤ２（配列番号９５）、ｒ−ｖｉｒＤ３（配列番号９６）、ｒ−ｖｉｒＤ４（配列番号９７）、ｒ−ｖｉｒＤ５（配列番号９８）、ｒ−ｖｉｒＦ（配列番号９９）、ｒ−ｖｉｒＥ３（配列番号１００）およびｒ−ｇａｌｌｓ（配列番号１０１）。本明細書の表１９を参照されたい。本明細書では、ビルレンス遺伝子（ｖｉｒおよびｒ−ｖｉｒ）の種々の組み合わせを使用することができる。ｒ−ｇａｌｌｓ遺伝子（配列番号１０１）は、本明細書に記載のＲｉプラスミドとともに、病原性に必要である。
【００５６】
ある態様では、ベクターはさらに、１種以上のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰもしくはｖｉｒＱ、またはその変異体および誘導体、あるいは１種以上のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその変異体および誘導体、ならびにｒ−ｇａｌｌｓ、またはその変異体および誘導体を含む。
【００５７】
本開示において使用されるオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、例えば、エレクトロポレーションによって導入される核酸を含み得る。導入された核酸は、ＶｉｒＤ２作用、または１つ以上のビルレンス遺伝子に依存しない接合伝達に必要な．ポリヌクレオチドを含み得る。導入された配列は、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）ゲノムへ挿入され得る。別の例では、導入された配列は、１つ以上のプラスミド上にある。別の例では、ポリヌクレオチドは、他の細菌種から接合伝達によってオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）に導入することができる。例えば、Ｔ４ＳＳ依存型Ｔ鎖輸送システムの他に、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、ＩｎｃＱプラスミドｐＲＦＳ１０１０などのプラスミドを接合伝達によって細菌細胞から植物ゲノムに導入し組み込むことができるさらなるプラスミド移動システムを有する（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：１７２−１７５、Ｓｈａｄｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ３０：２７２−２７５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａＩ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：４８３８−４８４５）。さらに、接合伝達タンパク質ＭｏｂＡは、ＲＦＳ１０１０プラスミドのＭｏｂＢタンパク質およびＭｏｂＣタンパク質とともに、ｏｒｉＴ（伝達起点）部位を開裂させ、５’末端に結合し、Ｔ４ＳＳシステムから独立している細胞へｓｓＤＮＡを導入する（Ｂｒａｖｏ−Ａｎｇｅｌ（１９９９）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８１：５７５８−５７６５、およびその中に記載された参考文献）。接合伝達システムは、細菌中に広く存在し、細菌細胞間の遺伝情報を交換する。リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（ここで、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は系統発生的にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と関連するが、それとは異なっている（例えば、Ｓｐａｉｎｋ  ｅｔ  ａＩ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９８；および、Ｆａｒｒａｎｄ  ｅｔ  ａＩ．（２００３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：１６８１−１６８７を参照））では、接合伝達システムは、いくつかの種において、部分的に特徴付けられている（例えば、Ｆｒｅｉｂｅｒｇ  ｅｔ  ａＩ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３９４−４０１；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｅｃｏｌ  ４２：２２７−２３４；Ｔｕｎ−Ｇａｒｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８５：１６８１−１６９２；および、Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｎｄｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６：５７５３−５７６１を参照）。この接合システムは、ニッキング部位としてｏｒｉＴを、また、ニッキング酵素としてＴｒａＡまたはＭｏｂを使用し、従来のＴ−ＤＮＡで使用されるエレメント（それぞれ、ＶｉｒＤ２ならびにＲＢおよびＬＢ部位）とは大きく異なっている。そのＣ末端に植物核ターゲッティングのための核移行シグナル（Ｎ���Ｓ）を有することが分かっているＶｉｒＤ２と異なり、ＴｒａＡにもＭｏｂにも明らかなＮＬＳはない。
【００５８】
Ｔｉ／Ｒｉプラスミド上のＶｉｒ領域は、その集合機能がプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域を切除し、その植物ゲノムへの移行および組み込みを促進することである遺伝子の集まりである。ｖｉｒシステムは、創傷に応えて植物によって作り出されるシグナルによって誘発される。アセトシリンゴン、シリンガアルデヒドまたはアセトバニロンなどのフェノール化合物は、構成的に発現する膜貫通タンパク質である受容体をコードするｖｉｒＡ遺伝子を活性化する。活性化されたｖｉｒＡ遺伝子は、キナーゼとして作用し、ｖｉｒＧ遺伝子をリン酸化する。そのリン酸化された形態で、ｖｉｒＧは、ｖｉｒ遺伝子オペロンを保持する転写活性化因子として作用する。ｖｉｒＢオペロンは、細孔／線毛様構造を作るタンパク質をコードする。ＶｉｒＣは、オーバードライブ配列に結合する。ＶｉｒＤ１およびｖｉｒＤ２は、エンドヌクレアーゼ活性を有し、左ボーダーおよび右ボーダー内に一本鎖切れ目を入れ、ｖｉｒＤ４は共役タンパク質である。ＶｉｒＥは、一本鎖Ｔ−ＤＮＡに結合し、プロセスの輸送段階中のそれを保護する。植物細胞に入ったなら、Ｔ−ＤＮＡの相補鎖が合成される。
【００５９】
これらのｖｉｒ遺伝子や他のｖｉｒ遺伝子はトランスに機能し、したがって、これらの遺伝子のどれもクローニングベクターに含まれている必要はない。例えば、改変アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株は、Ｔ−ＤＮＡ領域が欠失したプラスミド上に必要なＶｉｒ機能の全てを提供することができ、細胞はＴ−ＤＮＡ導入のためのｖｉｒ機能を提供することができる。一例では、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）．Ｇｅｎｅ．２（２）：７５−９３；Ｂｏｌｉｖａｒｅｔａｌ（１９７７）Ｇｅｎｅ２（２）：９５−１１３）の一部をＴ−ＤＮＡ領域の置換に使用し、アンピシリンに対する耐性を与えたＣ５８由来の菌株がある。
【００６０】
形質転換プロセスのためのベクターコンストラクトを設計するにあたり、植物の細胞または組織に導入する１つ以上の遺伝子成分が選択される。遺伝子成分としては、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）組成物および／または方法により、植物の細胞または組織に導入する核酸を挙げ得る。遺伝子成分としては、非植物ＤＮＡ、植物ＤＮＡまたは合成ＤＮＡを挙げ得る。いくつかの例では、遺伝子成分は、次の遺伝子成分の少なくとも１つを含む、組み換え体、二本鎖プラスミドもしくはベクター分子などのＤＮＡ分子に組み込まれる：植物細胞においてＲＮＡ配列の産生を引き起こす働きをするプロモーター；ＲＮＡ配列の産生を引き起こす構造ＤＮＡ配列；およびＲＮＡ配列の３’末端をポリアデ二ル化する３’非翻訳ＤＮＡ配列。
【００６１】
細胞ゲノム中で発現および／または挿入させる１つ以上の目的配列を含むコンストラクトが提供される。コンストラクトは、バイナリーベクター（米国仮特許出願第６２／２５２２２９号明細書、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ターナリーベクターまたはＴ−ＤＮＡベクターなどのベクター内に含まれ得る。コンストラクトとは、種々の機能および／または活性を有する様々なタイプのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を指す。様々なタイプの配列としては、リンカー、アダプター、調節領域、イントロン、制限部位、エンハンサー、インシュレーター、スクリーニングマーカー、選択マーカー、プロモーター、発現カセット、コーディングポリヌクレオチド、サイレンシングポリヌクレオチド、終止配列、複製起点、組み換え部位、切除カセット、リコンビナーゼ、細胞増殖因子、プロモータートラップ、ベクター構築もしくは解析を補助する他の部位、またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、コンストラクトは、１つ以上の発現カセットを含み、そこでは、ポリヌクレオチドは調節配列に作動可能に結合している。作動可能に結合しているとは、２つ以上のエレメント間の機能的結合をいう。例えば、コーディングポリヌクレオチドおよび調節配列間の作動可能な結合は、コーディングポリヌクレオチドを発現させるような機能的結合である。作動可能に結合したエレメントは、隣接していても隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コーディング領域の接合を指すために作動可能に結合しているとの用語を使用する場合、それは、コーディング領域が同じリーディング領域に存在していることを意味する。コーディングポリヌクレオチドには、ポリペプチドをコードするか、または標的遺伝子の発現を減ずるサイレンシングポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。サイレンシングポリヌクレオチドの非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ヘアピン構造などが挙げられる。コンストラクトはまた、植物細胞または組織の形質転換を促進し、また、構造核酸配列の発現を調節する多くの遺伝子成分を含み得る。いくつかの例では、遺伝子成分は、ｍＲＮＡを発現するように配向しており、任意選択により、そのｍＲＮＡはタンパク質に翻訳される。二本鎖形態で存在している植物の構造コーディング配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはたのＤＮＡ）の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの一本鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳、およびその後の核内へのｍＲＮＡ一次転写産物のプロセッシングを含む。このプロセッシングは、ｍＲＮＡの３’末端をポリアデニル化する３’非翻訳領域を含む。
【００６２】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるＴ−ＤＮＡの植物細胞への導入メカニズムはよく知られている。簡潔に言えば、Ｔ−ＤＮＡは２つのボーダー領域配列、右ボーダー（ＲＢ）および左ボーダー（ＬＢ）によって区切られている。これらのボーダーは、ビルレンスタンパク質ＶｉｒＤ２によってニッキングされ、その５’末端にＶｉｒＤ２の共有結合を有する一本鎖トランスファーＤＮＡ（「Ｔ鎖」）を産生する。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＶｉｒＥ２タンパク質もまた含まれるタンパク質−ＤＮＡ複合体は、ビルレンスタンパク質およびｓｓＤＮＡ輸送体を含む４型分泌系によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞から出て、植物細胞に導入される。導入されたＤＮＡは、植物細胞内でさらにプロセッシングを受け、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンスタンパク質と植物因子の助けを得て、植物ゲノムに組み込まれる。ＤＮＡを植物細胞に導入するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在ベクターの使用は、当該技術分野ではよく知られている（例えば、Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａＩ．（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６２９−６３５；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａＩ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３：２５３−２７７；および米国特許第５，５６３，０５５号明細書を参照、これらは参照によりその全体が明細書に組み込まれる）。これらの同じエレメントおよびメカニズムを、植物細胞の形質転換システムの創出に移行させることができる。
【００６３】
いくつかの例では、コンストラクトは、ＴｉまたはＲｉプラスミドを含む。いくつかの例では、コンストラクトは、１つ以上のビルレンス遺伝子を含む。いくつかの例では、ＴｉまたはＲｉプラスミドは、ｐＣ５１０５、ｐＣ５１０６、またはこれらの変異体もしくは誘導体である。いくつかの例では、提供されるコンストラクトは、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）からｖｉｒＤ２に依存しない導入およびＴ−ＤＮＡボーダー配列の欠損に適応可能であり、コンストラクトはｏｒｉＴ配列およびｔｒａＡもしくはｍｏｂ配列を含み、任意選択により、目的配列に作動可能に結合する。そのようなコンストラクトで形質転換されたオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）もまた提供される。いくつかの例では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、Ｔ−ＤＮＡ領域を含有するＴｉプラスミドを含み、目的配列は、そのＴ−ＤＮＡ内に、任意選択により、Ｔ−ＤＮＡの左ボーダーと右ボーダーの間に、位置している。適切なレポーター遺伝子には、ＧＵＳまたは蛍光タンパク質、例えば、限定はされないが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗなどが含まれる。
【００６４】
いくつかの例では、本明細書において提供される形質転換法は、選択剤の非存在下に目的配列で形質転換された植物細胞を選択することを含み得る。目的配列で形質転換された植物細胞の選択は、選択剤の存在下に植物細胞を培養することを含み得る。ここで、目的配列は、選択剤に対する耐性を付与するか、選択剤に対する耐性を付与する他の核酸に作動可能に結合している。そのような選択剤の例としては、グリホサート、グリホサート、ビアラホス、またはジカンバが挙げられる。さらに別の態様では、目的配列は、選択マーカー遺伝子に物理的に結合していない。例えば、マーカー遺伝子と目的配列は、目的配列で形質転換された植物細胞から再生された植物の子孫においては、遺伝子的に分離している。
【００６５】
植物成長調整剤または植物ホルモンとしては植物の成長に作用する化合物が挙げられる。植物成長調整剤としては、限定はされないが、オーキシン、サイトカイニン、ＡＢＡ，ジベレリン、エチレン、ブラシノステロイドおよびポリアミンが挙げられる。オーキシンは、低濃度ではシュートおよび根を伸長させるが、濃度が高くなると成長を阻害する。汎用されているオーキシンとしては、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸）、２，４−Ｄ（２，４−時クロロフェノキシ酢酸）、ＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、ＮＡＡ（ａ−ナフタレン酢酸）およびジカンバ（３，６−ジクロロアニス酸）が挙げられる。サイトカイニンは、細胞分裂、細胞分化、シュート分化を引き起こす。汎用されているサイトカイニンとしては、キネチン、ＢＡ（６−ベンジルアミノプリン）、２−ｉｐ（２−イソペンテニルアデニン）、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）、チジアズロン（ＴＤＺ）、ゼアチンリボシドおよびゼアチンが挙げられる。
【００６６】
形質転換は、外来性核酸配列を細胞または組織に導入するプロセスを指す。形質転換は一過性または安定であり得る。安定な形質転換では、外来性核酸に一部または全部が核ゲノムＤＮＡ、プラスチドＤＮＡに導入（例えば、組み込み、もしくは安定に保持）されるか、または核もしくはプラスチドにおいて自律複製することができる。
【００６７】
ポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡのみを含む組成物に限定されるものではない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸、ならびに、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびペプチド核酸の組み合わせを含み得る。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドには、天然に存在する分子、合成アナログ、および修飾分子がいずれも含まれる。ポリヌクレオチドはまた、限定はされないが、一本鎖、二本鎖もしくは多数本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造、環状プラスミドなど、あらゆる形態の配列を包含する。
【００６８】
所望の遺伝子成分を含むカセット、プラスミドまたはベクターなどのコンストラクトを調製するための様々な方法および市販のシステムは、当該技術分野においてよく知られている。コンストラクトは、一般に、限定はされないが、プロモーター、リーダー、イントロンおよび終結配列などの調節エレメントを含む、多くの遺伝子成分から構成される。調節エレメントはまた、それらが調節する配列遺伝子に対するエレメントの近接性によって、シス調節エレメントまたはトランス調節エレメントと呼ばれる。
【００６９】
いくつかの例では、コンストラクトは、コーディングポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼおよびコーディング配列の転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、その変異体もしくはフラグメント、または合成により誘導されたものであってもよい。プロモーターという用語は、転写に必要な最小の配列（最小配列）、ならびに、最小配列と、任意の数の追加エレメント、例えば、オペレーター配列、エンハンサー、モジュレーター、制限部位、組み換え部位、最小プロモーターとコーディング配列の間に位置する配列、および、転写されるがポリペプチドには翻訳されない転写領域であり、望ましい方法で転写レベルに影響するかしないかわからない、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列を含む配列を指す。植物プロモーターは、植物から単離されたプロモーター、もしくは植物由来のプロモーター、または植物内で機能する異種プロモーター、例えば、植物ウイルス由来のプロモーターを指す。プロモーターは、所望の結果または発現パターンに基づいて選択することができる（植物プロモーターの再検討には、Ｐｏｔｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ４０：１−２２を参照されたい）。
【００７０】
当該技術分野では、植物細胞内で活性な多くのプロモーターが報告されてきている。環境シグナル、ホルモンシグナル、化学シグナルおよび／または発生シグナルに応じて調節される種々のプロモーター、例えば、熱（例えば、Ｃａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａＩ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８８：９６５−９６８、光（例えば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：４７１−４７８；および、トウモロコシＲｂｃＳプロモーター、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：９９７−１０１２）、アブシジン酸などのホルモン（Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａＩ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６９−９７６）、創傷（例えば、Ｗｕｎｉ  ｅｔ  ａＩ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６１−９６８）、または他のシグナルもしくは化学薬品はまた、植物細胞におけるコンストラクトの発現に使用することができる。プロモーターを記載する例としては、限定はされないが、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第５，６４１，８７６号明細書（コメアクチンプロモーター、ＯｓＡｃｔｌ）、米国特許第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−ｌプロモーター）、米国特許第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第５，３２２，９３８号明細書、同第５，３５２，６０５号明細書、５，３５９，１４２号明細書および同第５，５３０，１９６号明細書（３５Ｓプロモーター、３５Ｓｅｎｈ）、米国特許第６，４３３，２５２（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）、米国特許第６，４２９，３５７号明細書（コメアクチン２プロモーター、およびコメアクチン２イントロン）、米国特許第５，８３７，８４８号明細書（根特異的ｉｆｉｃプロモーター）、米国特許第６，２９４，７１４号明細書（光誘導性プロモーター）、米国特許第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）、米国特許第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）、米国特許第６，１７５，０６０号明細書（リン酸欠乏誘導性プロモーター）、米国特許第６，６３５，８０６号明細書（ガンマコイキシンプロモーター）、および米国特許第７，１５１，２０４号明細書（トウモロコシクロロプラストアルドラーゼプロモーター）が挙げられる。使用し得る他のプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａＩ．（１９８７）ＰＮＡＳ８４：５７４５−５７４９）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発プラスミド）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ  ｅｔ  ａＩ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９：３１５−３２４）などのカリモウイルスプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａＩ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ−プ���モーター（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：６６２４；米国特許第６，０５１，７５３号明細書；同第５，３７８，６１９号明細書）、スクロースシンターゼプロモーター（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａＩ．（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：４１４４−４１４８）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１１７５−１１８３）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター、またはラッカセイクロロティックストリークカリモウイルスプロモーターＰＣｌＳＶ（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）である。いくつかの例では、Ａｔ．Ａｃｔ７（アクセッション番号Ｕ２７８１１）、Ａｔ．ＡＮＴＩ（米国特許出願公開第２００６／０２３６４２０号明細書）、ＦＭｙ’３５Ｓ−ＥＦｌａ（米国特許出願公開第２００５／００２２２６１号明細書）、ｅＩＦ４ＡｌＯ（アクセッション番号Ｘ７９００８）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ０００８７；Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １：５６１−５７３；Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａＩ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：１８４−１８７）、コメ細胞質トリオースリン酸イソメラーゼ（ＯｓＴＰＩ；米国特許第７，１３２，５２８号明細書）、およびコメアクチン１５遺伝子（ＯｓＡｃｔ１５；米国特許出願公開第２００６／０１６２０１０号明細書）プロモーターが使用され得る。いくつかの例では、プロモーターは、５’ＵＴＲおよび／または第１のイントロンを含み得る。
【００７１】
構成的プロモーターとしては、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター、国際公開第１９９９／４３８３８号パンフレットおよび米国特許第６，０７２，０５０号明細書に開示の他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；コメアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ１２：６１９−６３２；およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：３６９−３８５）；ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）プロモーター（Ｄｅｙ  ＆  Ｍａｉｔｉ（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ４０：７７１−７８２；Ｄｅｙ  ＆  Ｍａｉｔｉ（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ  ３：６１−７０）；ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）（国際公開第１９９９／４３７９７号パンフレット）；バナナストリークウイルス（ＢＳＶ）プロモーター（Ｒｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０８：１７７−１８６）；クロリスストリエートモザイクウイルス（ＣＳＭＶ）プロモーター（Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：４９８−５０２）；キャッサバベインモザイクウイルス（ＣＳＶＭＶ）プロモーター（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７：１０５５−１０６７）；ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター（米国特許第６，０１８，１００）；コメアルファ−チューブリン（ＯｓＴＵＢＡ１）プロモーター（Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２３：１００５−１０１４）；コメシトクロムＣ（ＯｓＣＣ１）プロモーター（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２９：１４７３−１４８１）；トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＺｍＡＤＨ１）プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３５３−３５７）；オレオシンプロモーターなどが挙げられる。これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の構成的プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号明細書、同第５，６０８，１４４号明細書、同第５，６０４，１２１号明細書、同第５，５６９，５９７号明細書、同第５，４６６，７８５号明細書、同第５，３９９，６８０号明細書、同第５，２６８，４６３号明細書、同第５，６０８，１４２号明細書および同第６，１７７，６１１号明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照により���の全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
いくつかの例では、誘導プロモーターが本組成物および／または方法において使用され得る。昆虫摂食により引き起こされる損傷に応答し得る傷害誘導性プロモーターとしては、ポテトプロテアーゼインヒビター（ｐｉｎ  ＩＩ）遺伝子プロモーター；米国特許第５，４２８，１４８号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のｗｕｎ１およびｗｕｎ２；システミン；ＷＩＰ１；ＭＰＩ遺伝子プロモーターなどが挙げられる。さらに、病原体誘導性プロモーターを使用することができ、そのような病原体誘導性プロモーターとしては、病原体、例えば、限定はされないが、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼおよびキチナーゼによる感染の後に誘導される感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）由来のものが挙げられる。例えば、国際公開第１９９９／４３８１９号パンフレットを参照されたい。この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる。病原体の感染部位、またはその近傍で、局所的に発現するプロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第５，７５０，３８６（線虫誘導性）（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。発現が病原体フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）によって誘導されるトウモロコシＰＲｍｓ遺伝子の誘導プロモーター。
【００７３】
外因性の化学調節剤の適用によって細胞または植物の遺伝子発現を調節するために、化学調節プロモーターを使用することができる。プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーターであっても、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであってもよい。化学誘導性プロモーターは当該技術分野で知られており、限定はされないが、べンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、発芽前の除草剤として使用されている疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターが挙げられる。他の目的化学調節プロモーターとしては、グルココルチコイド誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーターなどのステロイド反応性プロモーターが挙げられる（例えば、米国特許第５，８１４，６１８号明細書および同５，７８９，１５６号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００７４】
特定の植物組織内での増強ポリペプチド発現のため、組織好適プロモーターを使用することができる。組織好適プロモーターは、当該技術分野で知られており、例えば、弱発現用に改変し得るそのようなプロモーターが挙げられる。葉好適、根好適または根特異的プロモーターは、この分野で知られているものから選択、または各種の適合種から新たに単離することができる。根特異的プロモーターとしては、ダイズグルタミンシンテターゼ遺伝子、サヤマメのＧＲＰ１．８遺伝子中の調節因子、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子、およびサイトゾルグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする完全長ｃＤＮＡクローンのプロモーターが挙げられる。根特異的プロモーターとしては、また、窒素固定非マメ科植物パラスポニア・アンデルソニイ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）および関連窒素固定非マメ科植物トレマ・トメントサ（Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）由来のヘモグロビン遺伝子から誘導されるプロモーター、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の高発現ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ根誘導遺伝子のプロモーター、オクトピンシンターゼの根端特異的プロモーター、ならびにＴＲ２’およびＴＲ１’遺伝子の根端特異的プロモーターが挙げられる。さらなる根好適プロモーターとしては、ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーターおよびｒｏｌＢプロモーターが挙げられる。例えば、米国特許第５，８３７，８７６号明細書、同第５，６３３，３６３号明細書、同第５，４５９，２５２号明細書、同第５，４０１，８３６号明細書、同第５，１１０，７３２号明細書、および同第５，０２３，１７９号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。シロイロナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）根好適配列は、米国特許出願公開第２０１３／０１１７８８３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００７５】
種子好適プロモーターには、種子特異的プロモーター（種子貯蔵タンパク質プロモーターなどの種子の成長中に活性なプロモーター）、および種子発芽プロモーター（種子の発芽時に活性なプロモーター）の両者が挙げられる。そのような種子好適プロモーターとしては、限定はされないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）；ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；およびｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）（米国特許第６，２２５，５２９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ガンマ−ゼインおよびＧｌｂ−１は、胚乳特異的プロモーターである。双子葉植物では、種子特異的プロモーターとして、限定はされないが、クーニッツトリプシンインヒビター３（ＫＴｉ３）、マメβ−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、グリシニン１、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物では、種子特異的プロモーターとして、限定はされないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、γ−ゼイン、ワキシー（ｗａｘｙ）、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）１、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）２、グロブリン１などが挙げられる。双子葉植物においては、種子特異的プロモーターとして、限定はされないが、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の種子コートプロモーター、ｐＢＡＮ；ならびにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の初期種子プロモーター、ｐ２６、ｐ６３およびｐ６３ｔｒが挙げられる（米国特許第７，２９４，７６０号明細書および同第７，８４７，１５３号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））。特定の組織において「好適」発現を有するプロモーターは、少なくとも１つの他の植物組織においてより、その組織でより多く発現する。いくつかの組織好適プロモーターは、特定の組織でほぼ例外なく発現する。
【００７６】
プロモーターキメラはまた、転写活性を高めるように「（米国特許第５，１０６，７３９号明細書）、または、所望の転写活性、誘導性、組織特異性、成長特異性もしくはそれらの組み合わせが同時に出現するように構成することができる。植物で機能するプロモーターとしては、限定はされないが、誘導性、ウイルス性、合成的、構成的、時間制御的、空間制御的および／または時間・空間制御的なプロモーターは挙げられる。組織強化的、組織特異的および／または時間制御的な他のプロモーターもまたこの分野では知られており、本明細書で提示する組成物および／または方法で使用することができる。
【００７７】
ＤＮＡコンストラクト（すなわち、キメラ／組み換え植物遺伝子）で使用されるプロモーターは、必要に応じて、調節または発現特性に影響を及ぼすように改変してもよい。プロモーターは、オペレーター領域によるライゲーション、ランダムもしくは制御した変異導入、または他の方法で得ることができる。さらに、プロモーターは、遺伝子発現の増大を促進するマルチプルエンハンサー配列を含むように変化させてもよい。
【００７８】
転写の終止は、目的配列または他の配列に作動可能に結合した３’非翻訳ＤＮＡ配列によってなされ得る。組み換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物で、ＲＮＡの３’末端へのアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすポリアデ二ル化シグナルを含む。終止領域は、植物細胞で発現する様々な遺伝子から得ることができ、転写開始領域、作動可能に結合したポリヌクレオチドおよび／または宿主細胞に固有のものであってもよく、あるいは、プロモーター、ポリヌクレオチド、宿主細胞、またはそれらの組み合わせと異なるソース（すなわち、外来または異種の）から得られてもよい。オクトピンシンターゼ終止領域およびノパリンシンターゼ終止領域などの使いやすい終止領域は、ポテトプロテアーゼインヒビター（ｐｉｎ  ＩＩ）遺伝子、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドから得ることができる（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａＩ．（１９８３）ＰＮＡＳ  ８０：４８０３−４８０７）。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １５：９６２７−９６３９を参照されたい。エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９；Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａＩ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：１６７１−１６７９）、ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｅ０１３１２）、Ｅ６（アクセッション番号Ｕ３０５０８）、コメグルテリン（Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａＩ．（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１２５７３）およびＴａＨｓｐ１７（小麦低分子量熱ショックタンパク質遺伝子；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１３４３１）由来のポリアデ二ル化分子もまた利用できる。
【００７９】
発現カセットは、さらに、５’リーダー配列を含んでもよい。そのようなリーダー配列は翻訳を強化する働きをすることができる。翻訳リーダーはこの分野では知られており、以下のものが挙げられる：ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルスリーダー、ｆ例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチ病ウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５：２３３−２３８、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ、ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２３７−２５６）；ならびにトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）。Ｄｅｌｌａ  Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８４：９６５−９６８も参照されたい。
【００８０】
コンストラクトは選択マーカーをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。いくつかの態様では、選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織の選択を促進する。選択マーカー配列としては、抗生物質に対する耐性をコードする配列、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、ならびに、除草化合物に対する耐性を付与する配列、例えば、グルコシナートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノンおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）が挙げられる。個的な選択マーカー配列のさらなる例としては、限定はされないが、クロラムフェニコール、メトトレキサート、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ブレオマイシン、スルホンアミド、ブロモキシニル、ホスフィノトリシンおよびグリホサートに対する耐性をコードする配列が挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３４８０号明細書および米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書を参照されたい（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい））。
【００８１】
いくつかの例では、コンストラクトは、リコンビナーゼをコードする配列、および／またはその対応する組み換え部位を含んでもよい。いくつかの例では、リコンビナーゼは２以上の組み換え部位によってフランキングされており、組み換え部位は同じ方向に平行に配向している。平行配向とは、２以上の組み換え配列のその両方もしくは全ては３’から５’に向けて配向しているか、または５’から３’に向けて配向していることを意味する。本明細書に記載されているような、同じ配向で配列している一組の組み換え部位では、それらの組み換え部位間の介在ＤＮＡ配列の反転よりむしろ除去が起こる。反転は、組み換え部位が、逆方向に配向しているか、または配向が混ざっている場合に起こる。
【００８２】
部位特異的リコンビナーゼとも称されるリコンビナーゼは、適合する組換え部位間の保存的部位特異的組み換えを触媒するポリペプチドである。リコンビナーゼには、リコンビナーゼ活性を保持している天然ポリペプチド、変異体および／またはフラグメントが含まれ得る。リコンビナーゼをコードする配列には、リコンビナーゼ活性を保持しているリコンビナーゼをコードする天然ポリヌクレオチド、変異体および／またはフラグメントが含まれ得る。コードされる好適なリコンビナーゼには、天然リコンビナーゼ、または生物学的に活性なリコンビナーゼのフラグメントもしくは変異体、例えば特定の組み換え部位間の保存的部位特異的組み換えを触媒するものなどが含まれる。天然ポリペプチドまたは天然ポリヌクレオチドは、天然に存在するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼおよびその適合部位はリコンビナーゼ系と称し得る。任意のリコンビナーゼ系を使用することができる。いくつかの例では、インテグラーゼおよびリゾルバーゼファミリー由来のリコンビナーゼが使用される。
【００８３】
いくつかの例では、キメラリコンビナーゼを使用し得る。キメラリコンビナーゼは、異なる組み換えシステムから生じる組み換え部位間の部位特異的組み換えを触媒することができる組み換え融合タンパク質である。例えば、一組の組み換え部位がＦＲＴ部位およびＬｏｘＰ部位を含むなら、キメラＦＬＰ／Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはその活性変異体およびフラグメントを使用することができ、あるいは、両リコンビナーゼは別々に提供されてもよい。そのようなキメラリコンビナーゼ、またはその活性変異体およびフラグメントの産生方法および使用方法は、例えば国際公開第９９／２５８４０号パンフレットに記載されており、この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
任意の好適な組み換え部位、または一連の組み換え部位は、Ａ本方法および本組成物において使用することができ、例えば、限定はされないが、ＦＲＴ部位、ＦＲＴ部位の機能的変異体、ＬＯＸ部位およびＬＯＸ部位の機能的変異体、その任意の組み合わせ、または知られている組み換え部位の他の任意の組み合わせが挙げられる。リコンビナーゼ系としては、限定はされないが、ＭｕファージのＧｉｎリコンビナーゼ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）由来のＰｉｎＢ、ＰｉｎＤおよびＰｉｎＦ、ならびにチゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）のＲ／ＲＳ系が挙げられる。
【００８５】
機能的変異体としては、ＬＯＸ部位に融合したＦＲＴ部位などのキメラ組み換え部位が挙げられる。例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ部位特異的組み換え系由来の組み換え部位を使用することができる。そのような組み換え部位としては、例えば、天然ＬＯＸ部位、およびＬＯＸの各種機能的変異体が挙げられる（例えば、米国特許第６，４６５，２５４号明細書および国際公開第０１／１１１０５８号パンフレットを参照（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））。目的ヌクレオチド配列の標的融合、置換、修飾、改変、除去、反転および／または発現を可能にするインビトロおよびインビボでの各種部位特異的組み換え法においては、組み換え誘導の修飾ＦＲＴ組み換え部位を使用することができる。例えば、国際公開第９９／２５８２１号パンフレット、同第９９／２５８５４号パンフレット、同第９９／２５８４０号パンフレット、同第９９／２５８５５号パンフレット、同第９９／２５８５３号パンフレット、および同第２００７／０１１７３３号パンフレット号を参照されたい（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８６】
いくつかの例では、コンストラクトは、１つ以上の細胞増殖因子を含んでもよい。いくつかの例では、細胞増殖因子はＡＰ２／ＥＲＦファミリーのタンパク質由来である。ＡＰ２／ＥＲＦファミリーのタンパク質は、様々な成長プロセスを調節し、ＡＰ２／ＥＲＦ  ＤＮＡ結合ドメインを特徴とする植物特異的類の推定転写因子である。ＡＰ２／ＥＲＦタンパク質は、保存ドメインの存在に基づき、明確なサブファミリーにさらに分類されている。当初、このファミリーは、ＤＮＡ結合ドメインの数に基づいて２つのサブファミリー、１つのＤＮＡ結合ドメインを有するＥＲＦサブファミリーと、２つのＤＮＡ結合ドメインを有するＡＲ２サブファミリーとに分けられた。その後、多くの配列が同定され、ファミリーは５つのサブファミリー：ＡＰ２、ＤＲＥＢ、ＥＲＦ、ＲＡＶおよびその他に分けられた。ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）ファミリーのタンパク質は、限定はされないが、種々の生物学的事象、例えば、限定はされないが、成長、植物再生、細胞分化、胚形成および細胞増殖において機能する。ＡＰ２ファミリーは、限定はされないが、トウモロコシ由来のＡＰ２、ＡＮＴ、グロッシー１５、ＡｔＢＢＭ、ＢｎＢＢＭ、およびＯＤＰ２（ＢＢＭ）が挙げられる。
【００８７】
コンストラクトは、１つ以上の目的配列を含んでもよい。いくつかの例では、目的配列は、形質転換された細胞または植物に形質を付与する。いくつかの例では、目的配列は、昆虫耐性を付与する。昆虫耐性遺伝子は、ルートワーム、ヨトウムシ、アワノメイガ、ダイズシャクトリムシ、ダイズシスト線虫、アブラムシなどの害虫に対する耐性をコードし得る。例としては、結晶タンパク質などのバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタエンドトキシンをコードするポリヌクレオチドが挙げられ、例えば、米国特許第５，１８８，９６０号明細書、同第５，３６６，８９２号明細書、同第５，５９３，８８１号明細書、同第５，６８９，０５２号明細書、同第５，７２３，７５６号明細書、同第５，７３６，５１４号明細書、同第５，７４７，４５０号明細書、同第５，８８０，２７５号明細書、同第５，９８６，１７７号明細書、同第６，０２３，０１３号明細書、同第６，０３３，８７４号明細書、同第６，０６０，５９４号明細書、同第６，０６３，５９７号明細書、同第６，０７７，８２４号明細書、同第６，０８３，４９９号明細書、同第６，１２７，１８０号明細書、同第６，２１８，１８８号明細書、同第６，３２６，３５１号明細書、同第６，３９９，３３０号明細書、同第６，３４０，５９３号明細書、同第６，５４８，２９１号明細書、同第６，６２０，９８８号明細書、同第６，６２４，１４５号明細書、同第６，６４２，０３０号明細書、同第６，２４８，５３５号明細書、同第６，７１３，２５９号明細書、同第６，８９３，８２６号明細書、同第６，９４９，６２６号明細書、同第７，０６４，２４９号明細書、同第７，１０５，３３２号明細書、同第７，１７９，９６５号明細書、同第７，２０８，４７４号明細書、同第７，２２７，０５６号明細書、同第７，２８８，６４３号明細書、同第７，３２３，５５６号明細書、同第７，３２９，７３６号明細書、同第７，３７８，４９９号明細書、同第７，３８５，１０７号明細書、同第７，４７６，７８１号明細書、同第７，４４９，５５２号明細書、同第７，４６２，７６０号明細書、同第７，４６８，２７８号明細書、同第７，５０４，２２９号明細書、同第７，５１０，８７８号明細書、同第７，５２１，２３５号明細書、同第７，５４４，８６２号明細書、同第７，６０５，３０４号明細書、同第７，６９６，４１２号明細書、同第７，６２９，５０４号明細書、同第７，７０５，２１６号明細書、同第７，７７２，４６５号明細書、同第７，７９０，８４６号明細書、同第７，８０３，９４３号明細書、同第７，８５８，８４９号明細書、国際公開第１９９１／１４７７８号パンフレット、同第１９９９／３１２４８号パンフレット、同第２００１／１２７３１号パンフレット、同第１９９９／２４５８１号パンフレット、同第１９９７／４０１６２号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／０１１２４４７号明細書、同第２００６／０１９１０３４号明細書、同第２０１２／０２７８９５４号明細書、同第２０１１／００６４７１０号明細書、および国際公開第ＷＯ２０１２／１３９００４、号明細書を参照されたい（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）。デ���タエンドトキシンの他の例としては、また、限定はされないが、米国特許第８，３０４，６０４号明細書および同第８，３０４，６０５号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＤＩＧ−３もしくはＤＩＧ−１１トキシン（Ｎ末端が欠失した結晶タンパク質のα−ヘリックス１および／またはα−ヘリックス２変異体、例えば、Ｃｒｙ１Ａ）；米国特許第７，０７０，９８２号明細書、同第６，９６２，７０５号明細書、および同第６，７１３，０６３号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ；Ｃｒｙ３Ａタンパク質、例えば、限定はされないが、少なくとも２つの異なる結晶タンパク質の可変領域と保存ブロックの独自の組み合わせを融合することによって作られた改変ハイブリッド殺虫タンパク質（ｅＨＩＰ）（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；米国特許出願公開第２００８／０２９５２０７号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＴＩＣ８０７ｆ；ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３３８６７号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＥＴ２９、ＥＴ３７、ＴＩＣ８０９、ＴＩＣ８１０、ＴＩＣ８１２、ＴＩＣ１２７、ＴＩＣ１２８；ＡＸＭＩタンパク質、例えば、米国特許第８，２３６，７５７号明細書、同第７，９２３，６０２号明細書、同第８，０８４，４１６号明細書、同第８，３３４，４３１号明細書、同第８，３１８，９００号明細書、国際公開第ＷＯ２００６／０８３８９１号パンフレット、同第２００５／０３８０３２号パンフレット、同第２００５／０２１５８５；米国特許出願公開第２００４／０２５０３１１号明細書、同第２００４／０２１６１８６号明細書、同第２００４／０２１０９６５号明細書、同第２００４／０２１０９６４号明細書、同第２００４／０１９７９１７号明細書、同第２００４／０１９７９１６号明細書、国際公開第２００６／１１９４５７号パンフレット、同第２００４／０７４４６２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／００２３１８４号明細書、同第２０１１／０２６３４８８号明細書、同第２０１０／０１９７５９２号明細書、国際公開第２０１１／１０３２４８号パンフレット、同第２０１１／１０３２４７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０２９８２１１号明細書、同第２００９／０１４４８５２号明細書、同第２０１０／０００５５４３（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のもの；ならびに米国特許第８，３１９，０１９号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、改変タンパク質分解部位を有するＣｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａなどの結晶タンパク質が挙げられる。Ｖｉｐ３ＡｂおよびＣｒｙ１Ｆａ（米国特許出願公開第２０１２／０３１７６８２（参照により本明細書に組み込まれる））；Ｃｒｙ１ＢＥおよびＣｒｙ１Ｆ（米国特許出願公開第２０１２／０３１１７４６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））；Ｃｒｙ１ＣＡおよびＣｒｙ１ＡＢ（米国特許出願公開第２０１２／０３１１７４５号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））；Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙＣａ（米国特許出願公開第２０１２／０３１７６８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））；Ｃｒｙ１ＤＡおよびＣｒｙ１ＢＥ（米国特許出願公開第２０１２／０３３１５９０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））；Ｃｒｙ１ＤＡおよびＣｒｙ１Ｆａ（米国特許出願公開第２０１２／０３３１５８９号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））；Ｃｒｙ１ＡＢおよびＣｒｙ１ＢＥ（米国特許出願公開第２０１２／０３２４６０６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））；ならびにＣｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ１ＩまたはＣｒｙ１Ｅ（米国特許出願公開第２０１２／０３２４６０５号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））などの、当業者によく知られている１種以上の殺虫タンパク質もそれぞれ植物で発現することができる。殺虫タンパク質としては、また、米国特許第７，４９１，８６９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載の脂質アシルヒドロラーゼなどの殺虫リパーゼが挙げられる。殺虫タンパク質としては、また、米国特許第５，８７７，０１２号明細書、同第６，１０７，２７９号明細書、同第６，１３７，０３３号明細書、同第７，２４４，８２０号明細書、同第７，６１５，６８６号明細書、および同第８，２３７，０２０号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）などに記載のＶＩＰ（栄養成長期殺虫タンパク質）毒が挙げられる。その他のＶＩＰタンパク質は当業者によく知られている。殺虫タンパク質としては、また、ゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、フォトラブラス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）およびパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）などの生物から得られる毒素複合体（ＴＣ）タンパク質も挙げられる（米国特許第７，４９１，６９８号明細書および同第８，０８４，４１８号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照））。
【００８８】
抗真菌タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた有用である（例えば、米国特許第６，８７５，９０７号明細書、同第７，４９８，４１３号明細書、同第７，５８９，１７６号明細書、同第７，５９８，３４６号明細書、同第８，０８４，６７１号明細書、同第６，８９１，０８５号明細書、および同第７，３０６，９４６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））。真菌病原体に対する植物の防御応答の最初の段階として、キチンフラグメントを認識するＬｙｓＭ受容体様キナーゼをコードするポリヌクレオチド（米国特許出願公開第２０１２／０１１０６９６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる））もまた使用される。他の好適なポリヌクレオチドとしては、疎水性モーメントペプチド、例えば、国際公開第１９９５／１６７７６号パンフレット、および米国特許第５，５８０，８５２号明細書（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載のもの、真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体、ならびに、国際公開第１９９５／１８８５５号パンフレット、および米国特許第５，６０７，９１４号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のもの（病害抵抗性を付与する合成抗微生物ペプチド）をコードするものが挙げられる。他の好適なポリヌクレオチドとしては、例えば、フモニシン、ビューベリシン、モニリホルミンおよびゼアラレノン、ならびにそれらの構造類似誘導体などに対する解毒ペプチドをコードするものが挙げられる。例えば、米国特許第５，７１６，８２０；５，７９２，９３１；５，７９８，２５５；５，８４６，８１２；６，０８３，７３６；６，５３８，１７７；６，３８８，１７１ａｎｄ６，８１２，３８０（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そして、非病原性（ａｖｒ）および病害抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）など。
【００８９】
別の例では、目的配列は、植物、植物組織、植物の一部または種子の組成を変化させてもよい。いくつかの例では、これらの例として、脂肪酸含有量もしくは組成の改変、アミノ酸含有量もしくは組成の改変、炭水化物含有量もしくは組成の改変、繊維含有量もしくは組成の改変、および／または植物もしくはその一部の消化性もしくは加工性の改変などが挙げられる。目的配列の例としては、限定はされないが、デンプンの生成（米国特許第６，５３８，１８１号明細書、同第６，５３８，１７９号明細書、同第６，５３８，１７８号明細書、同第５，７５０，８７６号明細書、同第６，４７６，２９５号明細書）、油生成の改変（米国特許第６，４４４，８７６号明細書、同第６，４２６，４４７号明細書、同第６，３８０，４６２号明細書）、油産生の増大（米国特許第６，４９５，７３９号明細書、同第５，６０８，１４９号明細書、同第６，４８３，００８号明細書、同第６，４７６，２９５号明細書）、脂肪酸含有量の改変（米国特許第６，８２８，４７５号明細書、同第６，８２２，１４１号明細書、同第６，７７０，４６５号明細書、同第６，７０６，９５０号明細書、同第６，６６０，８４９号明細書、同第６，５９６，５３８号明細書、同第６，５８９，７６７号明細書、同第６，５３７，７５０号明細書、同第６，４８９，４６１号明細書、同第６，４５９，０１８号明細書）、タンパク質生成の増大（米国特許第６，３８０，４６６号明細書）、果実の成熟（米国特許第５，５１２，４６６号明細書）、動物およびヒト栄養の強化（米国特許第６，７２３，８３７号明細書、同第６，６５３，５３０号明細書、同第６，５４１２，５９号明細書、同第５，９８５，６０５号明細書、同第６，１７１，６４０号明細書）、バイオポリマー（米国特許ＲＥ第３７，５４３号明細書、同第米国特許第６，２２８，６２３号明細書、同第５，９５８，７４５号明細書および米国特許出願公開第２００３／００２８９１７号明細書）、加工性の改善（米国特許第６，４７６，２９５号明細書）、消化性の改善（米国特許第６，５３１，６４８号明細書）、低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号明細書）、工業用酵素の生産（米国特許第５，５４３，５７６号明細書）、風味の改善（米国特許第６，０１１，１９９号明細書）、窒素の固定（米国特許第５，２２９，１１４号明細書）、ハイブリッド種子の生産（米国特許第５，６８９，０４１号明細書）、繊維の生成（米国特許第６，５７６，８１８号明細書、同第６，２７１，４４３号明細書、同第５，９８１，８３４号明細書、同第５，８６９，７２０号明細書）および生物燃料の生産（米国特許第５，９９８，７００号明細書）に作用する遺伝子が挙げられる（各開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９０】
例えば、ステアロイルＡＣＰの下方制御は、植物のステアリン酸含有量を増大させることができる。国際公開第１９９９／６４５７９号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照；ＦＡＤ−２遺伝子改変によるオレイン酸の増大、および／またはＦＡＤ−３遺伝子改変によるリノレン酸の減少（米国特許第６，０６３，９４７号明細書、同第６，３２３，３９２号明細書、同第６，３７２，９６５号明細書、および国際公開第１９９３／１１２４５号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照）；共役リノレン酸もしくは共役リノール酸の改変（例えば、国際公開第２００１／１２８００号パンフレット（各開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；ＬＥＣ１、ＡＧＰ、Ｄｅｋ１、Ｓｕｐｅｒａｌ１、ｍｉ１ｐｓ、Ｉｐａ１、Ｉｐａ３、ｈｐｔもしくはｈｇｇｔなどの各種Ｉｐａ遺伝子の改変。例えば、国際公開第２００２／４２４２４号パンフレット、国際公開第１９９８／２２６０４号パンフレット、国際公開第２００３／０１１０１５号パンフレット、国際公開第２００２／０５７４３９号パンフレット、米国特許第６，４２３，８８６号明細書、同第６，１９７，５６１号明細書、同第６，８２５，３９７号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号明細書、および同第２００３／０２０４８７０号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照；長鎖多価不飽和脂肪酸を生成するデルタ−８デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチド（米国特許第８，０５８，５７１号明細書および同第８，３３８，１５２号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））および飽和脂肪酸を減少させるデルタ−９デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチド（米国特許第８，０６３，２６９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；脂質および糖の代謝調節に関与するポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるタンパク質、特に、トランスジェニック植物を生産する方法、および脂質、脂肪酸、デンプンまたは種子貯蔵タンパク質を含む種貯蔵化合物の濃度を調節する方法、ならびに、植物の種子の大きさ、種子の数、種子の重量、根の長さおよび葉の大きさを調節する方法に使用される脂質代謝タンパク質（ＬＭＰ）（欧州特許第２４０４４９９号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；植物中の糖誘導性２（ＨＳＩ２）タンパク質の高レベル発現の改変、すなわち植物におけるＨＳＩ２発現の増大もしくは低減。ＨＳＩ２発現の増加により、油含有量が増加し、一方、ＨＳＩ２発現の減少により、アブシジン酸に対する感受性が減少し、かつ／または耐乾性が増大する（米国特許出願公開第２０１２／００６６７９４号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；植物の種子における油含有量を調節する、特に、オメガ−３脂肪酸の濃度を増大させ、オメガ−６脂肪酸とオメガ−３脂肪酸との比を増大させるシトクロムｂ５（Ｃｂ５）単独またはＦＡＤ２との同時発現（米国特許出願公開第２０１１／０１９１９０４号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；ならびに糖代謝を調節するリンクルド１様（ｗｒｉｎｋｌｅｄ１−ｌｉｋｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（米国特許第８，２１７，２２３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））。脂肪酸調節遺伝子はまた、デンプン経路と油経路の相互作用によってデンプンの含有量および／または組成を変えるために使用することができる；抗酸化物質の含有量または組成の改変、例えば、トコフェロールもしくはトコトリエノールの改変。例えば、米国特許第６，７８７，６８３号明細書、米国特許出願公開第２００４００３４８８６号明細書、および国際公開第２０００／６８３９３号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（抗酸化物質レベルの操作を含み、かつホモゲンチシン酸塩ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｇｇｔ）（国際公開第２００３／０８２８９９号パンフレット）による）；および必須種子アミノ酸の改変。例えば、米国特許第６，１２７，６００号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増大させる方法）、米国特許第６，０８０，９１３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（種子中の必須アミノ酸の蓄積を増大させるバイナリー方法）、米国特許第５，９９０，３８９号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（高リシン）、国際公開第１９９９／４０２０９号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第１９９９／２９８８２号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（タンパク質のアミノ酸含有量の改変方法）、米国特許第５，８５０，０１６号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（種子中のアミノ酸組成の改変）、国際公開第１９９８／２０１３３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（必須アミノ酸量を高めたタンパク質）、米国特許第５，８８５，８０２号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（高メチオニン）、米国特許第５，８８５，８０１号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（高スレオニン）、米国特許第６，６６４，４４５号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（植物アミノ酸生合成酵素）、米国特許第６，４５９，０１９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（リシンおよびスレオニンの増加）、米国特許第６，４４１，２７４号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（植物トリプトファンシンターゼベータサブユニット）、米国特許第６，３４６，４０３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（メチオニン代謝酵素）、米国特許第５，９３９，５９９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（高硫黄）、米国特許第５，９１２，４１４号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（メチオニンの増加）、国際公開第１９９８／５６９３５号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（植物アミノ酸生合成酵素）、国際公開第１９９８／４５４５８号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（必須アミノ酸高含有組み換え種子タンパク質）、国際公開第１９９８／４２８３１号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（リシンの増大）、米国特許第５，６３３，４３６号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（含硫アミノ酸含有量の増大）、米国特許第５，５５９，２２３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（合成貯蔵タンパク質）、国際公開第１９９６／０１９０５号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（スレオニンの増大）、国際公開第１９９５／１５３９２号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（リシンの増大）、米国特許出願公開第２００３０１６３８３８号明細書、同第２００３０１５００１４号明細書、同第２００４００６８７６７号明細書、米国特許第６，８０３，４９８号明細書、および国際公開第２００１／７９５１６号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物消化性を付与するポリヌクレオチドもまた有用である。例えば、細胞壁中に存在するキシラン濃度の変更は、キシランシンターゼの発現を調節することによって行うことができる（、例えば、米国特許第８，１７３，８６６号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００９１】
いくつかの例では、目的配列は、雄性不稔性を調節するポリヌクレオチド、例えば、限定はされないが、米国特許第４，６５４，４６５号明細書および同第４，７２７，２１９号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに米国特許第３，８６１，７０９号明細書および同第３，７１０，５１１号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示のものを含む。これらに加えて、米国特許第５，４３２，０６８号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）、には、核雄性不稔性系が記載されている。核雄性不稔性および核雌性不稔性の系および遺伝子のさらなる例については、米国特許第５，８５９，３４１号明細書、同第６，２９７，４２６号明細書、同第５，４７８，３６９号明細書、同第５，８２４，５２４号明細書、同第５，８５０，０１４号明細書、および同第６，２６５，６４０号明細書（これらは全て参照により全体として本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい。
【００９２】
いくつかの例では、本態様において有用な目的配列として、非生物的ストレスに対する抵抗性、例えば、限定はされないが、開花、実および種子の生育、窒素利用効率の強化、窒素反応性の改変、耐乾性、耐寒性および耐塩性、ならびにストレス下での収穫量の増大に作用するポリヌクレオチドが挙げられる。例えば、国際公開第２０００／７３４７５号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（リンゴ酸塩が変化することによって、水利用効率が変化する）；米国特許第５，８９２，００９号明細書、同第５，９６５，７０５号明細書、同第５，９２９，３０５号明細書、同第５，８９１，８５９号明細書、同第６，４１７，４２８号明細書、同第６，６６４，４４６号明細書、同第６，７０６，８６６号明細書、同第６，７１７，０３４号明細書、同第６，８０１，１０４号明細書、国際公開第２０００／０６００８９号パンフレット、同第２００１／０２６４５９号パンフレット、同第２００１／０３５７２５号パンフレット、同第２００１／０３４７２６号パンフレット、同第２００１／０３５７２７号パンフレット、同第２００１／０３６４４４号パンフレット、同第２００１／０３６５９７号パンフレット、同第２００１／０３６５９８、号パンフレット、同第２００２／０１５６７５号パンフレット、同第２００２／０１７４３０号パンフレット、同第２００２／０７７１８５号パンフレット、同第２００２／０７９４０３号パンフレット、同第２００３／０１３２２７号パンフレット、同第２００３／０１３２２８号パンフレット、同第２００３／０１４３２７号パンフレット、同第２００４／０３１３４９号パンフレット、同第２００４／０７６６３８号パンフレット、同第１９９８／０９５２１号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）；国際公開第１９９９／３８９７７号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（植物に対する凍結、高塩分および乾燥の負の効果の緩和に有効で、植物表現型に対する他の好ましい効果を付与するＣＢＦ遺伝子および転写因子を含む遺伝子が記載されている）；米国特許出願公開第２００４／０１４８６５４号明細書、および国際公開第２００１／３６５９６号パンフレット（植物において、アブシジン酸が変化し、収量の増大および／または非生物的ストレスに対する抵抗性の増大などの植物表現型の改善をもたらす）（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）；国際公開第２０００／００６３４１号パンフレット、国際公開第２００４／０９０１４３号パンフレット、米国特許第７，５３１，７２３号明細書および同第６，９９２，２３７号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（サイトカイニンの発現が変化し、耐乾性などのストレスに対する抵抗性が増大し、かつ／または収量が増大した植物が得られる）を参照されたい。また、国際公開第２００２／０２７７６号パンフレット、国際公開第２００３／０５２０６３号パンフレット、特開２００２／２８１９７５号公報、米国特許第６，０８４，１５３号明細書、国際公開第２００１／６４８９８号パンフレット、米国特許第６，１７７，２７５号明細書および米国特許第６，１０７，５４７号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（窒素利用の強化および窒素反応性の改変）を参照；エチレンの改変では、米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１６６１９７号明細書、および国際公開第２０００／３２７６１号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照；非生物的ストレスの植物転写因子または転写制御因子では、例えば、米国特許出願公開第２００４／００９８７６４号明細書または米国特許出願公開第２００４／００７８８５２号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照；収量増大のためのＡＶＰ１などの液胞ピロホスファターゼの発現を増大させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（米国特許第８，０５８，５１５号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；ＨＳＦＡ４もしくはＨＳＦＡ５（Ａ４もしくはＡ５クラスの熱ショック因子）ポリペプチド、オリゴペプチド輸送タンパク質（ＯＰＴ４様）ポリペプチド；プラストクロン２（ｐｌａｓｔｏｃｈｒｏｎ２）様（ＰＬＡ２−様）ポリペプチド、またはＷｕｓｃｈｅｌ関連ホメオボックス１−様（ＷＯＸ１−様）ポリペプチドをコードする核酸（米国特許出願公開第２０１１／０２８３４２０号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；成長力増大のためのプログラム細胞死を調節するポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下方制御（米国特許第８，０５８，５１０号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；耐乾性を付与するためのＤＴＰ２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（米国特許出願公開第２０１１／０２７７１８１号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；成長の調節、ストレスに対する反応の調節、およびストレスに対する抵抗性の調節のためのＡＣＣシンターゼ３（ＡＣＳ３）タンパク質をコードするヌクレオチド配列（米国特許出願公開第２０１０／０２８７６６９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；耐乾性を付与するため、耐乾性表現型（ＤＴＰ）を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（国際公開第２０１２／０５８５２８号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；耐乾性および耐塩性を付与するためのトコフェロールシクラーゼ（ＴＣ）ポリヌクレオチド（米国特許出願公開第２０１２／０２７２３５２号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；ストレス抵抗性のためのＣＡＡＸアミノ末端ファミリータンパク質をコードするポリヌクレオチド（米国特許第８，３３８，６６１号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；ＳＡＬ１コードポリペプチドの変異における変異は、高いストレス抵抗性、例えば、高い耐乾性を有する（米国特許出願公開第２０１０／０２５７６３３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；収量関連特性を増大させる、ＧＲＦポリペプチド、ＲＡＡ１−様ポリペプチド、ＳＹＲポリペプチド、ＡＲＫＬポリペプチドおよびＹＴＰポリペプチドｉからなる群から選択される：ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現（米国特許出願公開第２０１１／００６１１３３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；植物における収量関連特性の増強、特に、種子の収量の増大のためのクラスＩＩＩトレハロースホスフェートホスファターゼ（ＴＰＰ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの植物中の発現の調節（米国特許出願公開第２０１０／００２４０６７号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））。
【００９３】
いくつかの例では、目的配列は、収量、着花、植物の成長および／または植物構造などの、植物の成長および農業形質に影響する他のポリヌクレオチドを含み、例えば、国際公開第１９９７／４９８１１号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＬＨＹ）、国際公開第１９９８／５６９１８号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＥＳＤ４）、国際公開第１９９７／１０３３９号パンフレットおよび米国特許第６，５７３，４３０号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＴＦＬ）、米国特許第６，７１３，６６３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＦＴ）、国際公開第１９９６／１４４１４号パンフレット（ＣＯＮ）、国際公開第１９９６／３８５６０号パンフレット、国際公開第２００１／２１８２２号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＶＲＮ１）、国際公開第２０００／４４９１８号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＶＲＮ２）、国際公開第１９９９／４９０６４号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＧＩ）、国際公開第２０００／４６３５８号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＦＲ１）、国際公開第１９９７／２９１２３号パンフレット、米国特許第６，７９４，５６０号明細書、米国特許第６，３０７，１２６号明細書（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（ＧＡＩ）、国際公開第１９９９／０９１７４号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（Ｄ８およびＲｈｔ）、ならびに国際公開第２００４／０３１３４９号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）（転写因子）を参照されたい。
【００９４】
いくつかの例では、目的配列は収量の増加をもたらすポリヌクレオチドを含む。例えば、１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシレートデアミナーゼ様ポリペプチド（ＡＣＣＤＰ）をコードする核酸で作物を形質転換することができ、作物中での発現により、野生型の様々な植物と比較して、根の成長の増進および／または収量の増大および／または環境ストレスに対する耐性の強化がもたらされた（米国特許第８，０９７，７６９号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；種子好適プロモーターを使用したトウモロコシ亜鉛フィンガータンパク質遺伝子（Ｚｍ−ＺＦＰ１）の過剰発現により、植物の成長が促進され、植物当たりの粒数および全粒重量が増加することが示された（米国特許出願公開第２０１２／００７９６２３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；トウモロコシのｌａｔｅｒａｌ  ｏｒｇａｎ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ（ＬＯＢ）ドメインタンパク質（Ｚｍ−ＬＯＢＤＰ１）の構成的過剰発現により、植物当たりの粒数および全粒重量が増加することが示された（米国特許出願公開第２０１２／００７９６２２号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；植物中での、ＶＩＭ１（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  １の変異体）様ポリペプチド、またはＶＴＣ２様（ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースホスホリラーゼ）ポリペプチド、またはＤＵＦ１６８５ポリペプチド、またはＡＲＦ６様（オーキシン応答因子）ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節することによる植物の収量関連形質の増進（国際公開第２０１２／０３８８９３号パンフレット（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；植物中での、Ｓｔｅ２０様ポリペプチドまたはその相同体をコードする核酸の発現の調節は、対照植物に対してその植物の収量を増大させる（欧州特許第２４３１４７２号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））；そして、植物の根の構造を変えるためのヌクレオシド・ジホスファターゼキナーゼ（ＮＤＫ）ポリペプチドおよびその相同体をコードするポリヌクレオチド（米国特許出願公開第２００９／００６４３７３号明細書（この開示は全て参照により本明細書に組み込まれる））。
【００９５】
除草剤耐性形質は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害するように働く除草剤、特に、スルホニル尿素型除草剤に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、そのような耐性を与える変異、特に、Ｓ４および／またはＨＲＡ変異を含むアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）、ホスフィノトリシンまたはｂａｓｔａなどのグルタミンシンターゼの作用を阻害するように働く除草剤への耐性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）；グリホサート（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子およびｇａｔ遺伝子；例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書および国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット（これらの開示は全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）；あるいは当該技術分野で知られている他のそのような遺伝子を含み得る。ｂａｒ遺伝子は除草剤ｂａｓｔａに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子はアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼをコードし、抗生物質カナマイシン、ネオマイシン、ｇｅｎｅｔｉｃｉｎおよびパロモマイシンに対する耐性を付与し、ＡＬＳ−遺伝子変異体は除草剤クロルスルフロンに対する耐性をコードする。
【００９６】
本開示の一例では、コンストラクトは、選択マーカー遺伝子、スクリーニングマーカー遺伝子またはスコラブルマーカー遺伝子を含有する。選択またはスクリーニング装置として働くＤＮＡは、再生可能な植物組織の中で、そうしなければ毒性を有する化合物に対する耐性を植物組織に与えるような化合物を生成する機能を有し得る。当該技術分野においては、多くのスクリーニングマーカー遺伝子または選択マーカー遺伝子が知られており、使用することができる。選択マーカーおよび遺伝子の例は、Ｍｉｋｉ  ＆  ＭｃＨｕｇｈ（（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０７  １９３−２３２）に記載されている。選択マーカー、スクリーンマーカーまたはスコラブルマーカーとして使用するための目的遺伝子としては、とりわけ、ｇｕｓ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ；ＤｓＲＥＤ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；ＺｓＹＥＬＬＯＷ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、カナマイシン（Ｄｅｋｅｙｓｅｒ  ｅｔ  ａＩ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９０：２１７−２２３）、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８、アミノグリコシド、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシンＢ、ブレオマイシン、フレオマイシン、スルホンアミド、ストレプトスリシン、クロラムフェニコール、メトトレキサート、２−デオキシグルコース、ベタインアルデヒド、Ｓ−アミノエチルＬ−システイン、４−メチルトリプトファン、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、ベンジルアデニン−Ｎ−３−グルクロニダーゼのような抗生物質に対して耐性を与える遺伝子、グリホサート（例えば、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）：Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５７９−５８４；米国特許第５，６２７，０６１号明細書；同第５，６３３，４３５号明細書；同第６，０４０，４９７号明細書；同第５，０９４，９４５号明細書；国際公開第０４／０７４４４３号パンフレットおよび同第０４／００９７６１号パンフレット；グリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ；米国特許第５，４６３，１７５号明細書）；グリホサートデカルボキシラーゼ（国際公開第０５／００３３６２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４／０１７７３９９号明細書）；またはグリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ；米国特許出願公開第２００３／００８３４８０）をコードする遺伝子、ダラポン（例えば、２，２−ジクロロプロピオン酸（ダラポン；国際公開第１９９９／２７１１６号パンフレット）に対する耐性を与える２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼをコードするｄｅｈＩ）、ブロモキシニル（ブロモキシニルに対する耐性を与えるハロアリールニトリラーゼ（Ｂｘｎ）（国際公開第１９８７／０４１８１号パンフレット；米国特許第４，８１０，６４８号明細書；国際公開第１９８９／００１９３Ａ号パンフレット））、スルホニル除草剤（例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジルオキシベンゾエートおよびフタリドなどのアセト乳酸シンターゼ阻害剤に対する耐性を与えるアセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（米国特許第６，２２５，１０５号明細書；同第５，７６７，３６６号明細書、同第４，７６１，３７３号明細書；同第５，６３３，４３７号明細書；同第６，６１３，９６３号明細書；同第５，０１３，６５９号明細書；同第５，１４１，８７０号明細書；同第５，３７８，８２４号明細書；および同第５，６０５，０１１号明細書））；ＡＬＳ、ＧＳＴ−ＩＩをコードする遺伝子）、ビアラホスもしくはホスフィノトリシンまたは誘導体（例えば、ホスフィノトリシンまたはグルフォシネートに対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）（米国特許第５，６４６，０２４号明細書；同第５，５６１，２３６号明細書；同第５，２７６，２６８号明細書；同第５，６３７，４８９号明細書；同第５，２７３，８９４号明細書、および欧州特許第２７５，９５７号明細書）；アトラジン（ＧＳＴ−ＩＩＩをコードする）、ジカンバ（ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ；米国特許出願公開第２００３／０１１５６２６号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１３５８７９号明細書）、ならびにセトキシジム（シクロヘキサンジオン（セトキシジム）およびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸（ハロキシホップ）対する耐性を付与する修飾アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（米国特許第６，４１４，２２２号明細書））のような除草剤に対する耐性を与える酵素をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。マンノースの存在下での増殖を可能にする、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｍａｎＡ遺伝子を使用するなど、ポジティブな選択機構を含む他の選択手順も実施することができる（Ｍｉｋｉ  ＆  ＭｃＨｕｇｈ（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０７  １９３−２３２もまた参照されたい）。
【００９７】
目的配列としてはまた、共抑制、アンチセンス、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡの発現（天然または遺伝子操作）、トランス作用性ｓｉＲＮＡの発現、およびリボザイムの発現などの遺伝子抑制技術により、標的配列の発現を停止または低減するポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号明細書を参照）。ポリリボヌクレオチドは、プロモーターヘアピン、マイクロＲＮＡまたは非コードＲＮＡを含んでもよい。プロモーターヘアピンは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関与し得る、ステム・ループ構造または逆位反復配列などの、二本鎖リボヌクレオチド構造を含むことができる。ヘアピンプロモーターの例は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１９９１００号明細書に記載があり、この全体の開示を参照により本発明に組込む。
【００９８】
ＤＮＡコンストラクトによって作られたｍＲＮＡはまた、５’非翻訳リーダー配列を含んでもよい。この配列は、この遺伝子を発現させるよう選択されたプロモーターから得ることができ、ｍＲＮＡの翻訳を増加または減少させるよう特異的に修飾することができる。５’非翻訳領域はまた、ウイルスＲＮＡから、好適な真核生物遺伝子から、または合成遺伝子配列から得ることができる。得られたｍＲＮＡの翻訳効率を増加または変更させるために、エンハンサー配列を使用してもよい。非翻訳リーダー配列は、その配列のプロモーター／調節領域から、または任意選択により任意の無関係なプロモーターまたは遺伝子から得ることができる（例えば米国特許第５，３６２，８６５号明細書を参照されたい）。リーダー配列の例としては、トウモロコシおよびペチュニアの熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）、ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、ＡｔＡｎｔ１、ＴＥＶ（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｆｒｅｅｄ（１９９０）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４：１５９０−１５９７）、ＯｓＡｃｔ１（米国特許第５，６４１，８７６号明細書）、ＯｓＴＰＩ（米国特許第７，１３２，５２８号明細書）、ＯｓＡｃｔ１５（米国特許出願公開第２００６／０１６２０１０号明細書）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＶ０００８７；Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａＩ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０４：１８４−１８７）が挙げられる。発現を強化する、あるいは遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすように働く他の遺伝子成分も、遺伝子成分として想定される。例えば、イントロン配列は、植物細胞の中で導入遺伝子の発現を助けることが示された。イントロンの例として、アクチンイントロン（米国特許第５，６４１，８７６号明細書）、トウモロコシＨＳＰ７０イントロン（ＺｍＨＳＰ７０；米国特許第５，８５９，３４７号明細書；米国特許第５，４２４，４１２号明細書）、およびコメＴＰＩイントロン（ＯｓＴＰＩ；米国特許第７，１３２，５２８号明細書）が挙げられる。
【００９９】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）介在形質転換では、コンストラクトは、通常、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な宿主に導入され、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）などの他の好適な宿主に移される。あるいは、コンストラクトはコンピテントオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）に直接導入される（例えば、エレクトロポレーションにより）。コンストラクトは、ＴｉまたはＲｉプラスミド上に存在しても、別々に提供されてもよい。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などからの天然のプラスミドであってよく、また、それぞれ腫瘍または毛状根を誘導してもよい（例えば、Ｈｏｏｙｋａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９８：４７７−４８４、およびＷｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０：２７７９−２７８５を参照）。別の例では、ＴｉまたはＲｉプラスミドは、選択的に無毒化されて、植物細胞の増殖を引き起こすことができなくてもよい。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）とアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とは感染のメカニズムが異なるため、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）と植物細胞との接触は、生殖細胞系の形質転換の頻度を増大させることがあり、かつ／あるいは、ＴｉまたはＲｉヘルパープラスミドが導入されたときは、標的細胞または植物に対する形質転換時における有害な影響が軽減される。
【０１００】
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を使用して、１つ以上の遺伝子成分を細胞、組織および／または植物に導入するための組成物および方法を提供する。いくつかの例では、宿主は、腫瘍形成または発根を引き起こす腫瘍遺伝子を含有しない、無毒化ＴｉまたはＲｉプラスミドを含有しており、その誘導体はベクターとして使用され、その後に植物に導入される目的遺伝子を含有する。別の態様では、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、Ｔ４ＳＳに依存しないメカニズム、すなわちｏｒｉＴ媒介接合伝達によってＤＮＡを植物細胞に導入する。Ｔ４ＳＳに依存しないＤＮＡ導入に必要な機能は、導入されるべきＤＮＡを含有するプラスミド上に存在してもよく、あるいはそのような細菌細胞中に存在する、染色体、または、ＴｉもしくはＲｉプラスミドを含む他のプラスミド上に存在してもよい。
【０１０１】
植物組織培養の展開または維持に、必要に応じて、追加の植物成長調節剤、例えば、限定はされないが、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸）、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）およびジカンバ（３，６−ジクロロアニス酸）などのオーキシン；ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）およびキネチンなどのサイトカイニン；ＡＢＡ；ならびにジベレリンを補った任意の好適な植物培地を使用することができる。他の培地添加剤としては、限定はされないが、低融点アガロースまたはｐｈｙｔａｇｅｌなどの、寒天形態などの、適切なゲル化剤を含有または含有しない、アミノ酸、多量要素、鉄、微量要素、イノシトール、ビタミン類および有機物、炭水化物、カゼイン加水分解物などの未定義の培地成分を挙げることができる。当該技術分野では、多様な組織培養培地が知られており、これらは適切に補強されれば植物組織の成長および展開を支え、植物の形質転換および再生に好適である。そのような培地の例としては、限定はされないが、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ（（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９７）、Ｎ６（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｓｉｎｉｃａ  １８：６５９）、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ＆  Ｓｋｏｏｇ（（１９６５）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  １８：１００）、Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ＆  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ（（１９６２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５：４７３）、ガンボーグ培地（Ｇａｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ５０：１５１）、Ｄ培地（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｌａｎｔａ  １６５：３２２−３３２）、ＭｃＣｏｗｎ木質植物培地（ＭｃＣｏｗｎ  ＆  Ｌｌｏｙｄ（１９８１）Ｐｌａｎｔａ  １６５：３２２−３３２）、Ｎｉｔｓｃｈ  ＆  Ｎｉｔｓｃｈ（（１９６９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６３：８５−８７）、およびＳｃｈｅｎｋ  ＆  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２  Ｃａｎ  Ｊ  Ｂｏｔ  ５０：１９９−２０４）、またはこれらの培地に相応に補強した派生物が挙げられる。当該技術分野でよく知られているように、形質転換および再生に使用する、培地ならびに栄養素および成長調節剤などの培地サプリメントは、他の培養条件、例えばインキュベーション中の光の強度、ｐＨおよびインキュベーション温度などとともに、特定の細胞、組織および／または目的植物に合わせて調節または最適化することができる。
【０１０２】
当業者は植物形質転換プロセスの代表的な工程を知っている。使用するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、グリセロールストックから直接液体培地に植菌するか、または、グリセロールストックから固体培地上に細菌をストリーキングし、適切な選択条件下で細菌を増殖させることによって調製することができる。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）は、形質転換を促進する量でアセトシリンゴンを含む、栄養または培養条件下で増殖させることにより予め誘導してもよい。当業者は、細菌の増殖法および好適な培養条件、ならびにその後の植菌方法について精通している。植菌に使用する細菌培養物の密度および外植体組織の量に対する細菌細胞の数の比は、システムごとに変化し得るので、いかなる形質転換法であっても、これらのパラメータの最適化が求められる。
【０１０３】
形質転換プロセスの次の段階は植菌である。この段階では、適切に調製された植物、植物組織または外植体と細菌細胞の懸濁液とを混合する。植菌の時間および条件、ならびに細菌細胞の密度は、植物の形質転換システムに応じて変化するであろう。形質転換用細菌の増殖または植菌は、アセトシリンゴン、または他の既知の、ＴｉもしくはＲｉプラスミド上に存在するビルレンス遺伝子の発現誘発剤の存在下に行ってもよい。
【０１０４】
植菌後、過剰の細菌懸濁液を除去することができ、細菌と標的植物物質は共培養される。共培養とは、植菌後から任意選択による遅延培地または選択培地へ移すまでの時間を指す。共培養工程では、任意の数の植物組織培養培地を使用することが得きる。植菌後の植物組織は、液体または半固体培地で培養してもよい。共培養は、通常、約１〜４日間行われる。
【０１０５】
細菌と共培養した後、植菌された植物組織または外植体は、任意選択により直接選択培地に移すことができる。あるいは、細菌と共培養した後、それらを選択剤を含まない培地に移し、その後、選択培地に移すことができよう。当業者は、植物システムおよび選択剤に応じて変化し得る、選択レジーム、培地および増殖条件について数多くの変更が可能なことを知っている。代表的な選択剤としては、ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）、カナマイシンもしくはパロモマイシンなどの抗生物質、または除草剤グリホサート、グリフォシネートもしくはジカンバが挙げられるが、これらに限定されない。細菌の増殖を抑えるために、さらなる適切な培地成分を選択培地または遅延培地に加えることができる。そのような培地成分としては、カルベニシリンまたはセフォタキシムなどの抗生物質を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１０６】
その後、培養物は形質転換小植物の回収に適した培地に移される。当業者は、形質転換植物を回収する多くの方法を知っている。植物の形質転換およびトランスジェニック植物の回収のために、培地および導入についての様々な要件を各植物システム用として実行し、最適化することができる。したがって、本明細書中に開示し提供するそのような培地および培養条件は、栄養上等価な成分で、またはトランスジェニック体の選択および回収のための類似のプロセスで変更または置き換えることができ、依然、本発明の範囲内とすることができる。
【０１０７】
生成した形質転換体およびその子孫は、その後、形質転換ベクターが含有する特定の目的配列、または目的配列の送達により生成した分子表現型の有無を決定するために分析することができる。分子の分析には、サザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分析、核酸配列の決定、酵素活性の分析、免疫診断手法、タンパク質の発現分析、発現プロファイル分析、代謝分析および／またはプロファイル、表現型検査、実地評価などを含むことができるが、これらに限定されない。開示した方法により生じた遺伝子型、表現型および／または細胞、組織、植物、種子などの安定性を確認するために、これらおよび他のよく知られた方法を実施することができる。
【０１０８】
植物という用語は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、果実、根など）、種子、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、ならびに花、茎、果実、葉、根および子孫を含む。トランスジェニック植物は、現在または過去に、核酸により形質転換された植物であり、したがって少なくとも部分的にトランスジェニック細胞からなる。植物部分には、植物細胞、植物プロトプラスト、そこから植物が再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、および植物または植物部分の中で損傷を受けていない、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、さや、柄、根、根端、葯などの植物細胞が含まれる。植物細胞には、限定はされないが、プロトプラストおよび種子の細胞、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子が含まれる。緑色組織は、光周期を含む条件下で栽培されるとき、クロロフィルを含有し、光合成する植物部分を指す。緑色組織は、複数のシュートの分裂組織様構造を有する、再生組織、カルス組織およびインビトロで培養された組織を含むことができる。これらの組織は、持続的な細胞分裂が可能な細胞を高い割合で有しており、長期にわたって再生能力を有する。
【０１０９】
本方法および本組成物は、限定はされないが、単子葉植物および双子葉植物を含む、いかなる植物にも好適であり得る。対象植物には、対象種子を提供する穀物植物、油糧種子植物およびマメ科植物が含まれる。対象植物種の例としては、限定はされないが、マメ、キャノーラ、トウモロコシ（ズィー・メイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、特に種油のもととして有用なアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニクム・ミラセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ））、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、コムギ（トリーティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、グリシン・ソヤ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｊａ））、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ））、ワタ（ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、サツマイモ（イポモエア・バタツス（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ））、カッサバ（マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コフィア（Ｃｏｆｆｅａ）種）、ココナッツ（ココス・ヌキフェラ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ））、カンキツ樹（シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））、チャノキ（カメリアシネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ））、グァバ（プシディウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエア（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイア（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ））、カシュー（アナカルジウム・オクシ��ンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミア・インテルグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、テンサイ（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ（サッカルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、およびコニファーが挙げられる。
【０１１０】
野菜としては、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ナス、フェンネル、ソラマメ、ダイコン、ウリ、ニラネギ、ハクサイ、オクラ、ニンニク、エンドウ、コショウ、カボチャ、スピナッチ、カボチャ、スイートコーン、レタス（例えばラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ））、インゲンマメ（ファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、リママメ（ファセオルス・リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ））、サヤエンドウ（ラチルス（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種）、およびキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属のメンバー、例えば、キュウリ（ククミス・サティウス（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ））、メロン、スイカ、カンタロープ（ククミス・カンタルペンシス（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ））、およびマスクメロン（ククミス・メロ（Ｃ．ｍｅｌｏ））が挙げられる。観賞植物としては、アザレア（ロードデンドロン（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種）、アジサイ（マクロフィラ・ハイドランジア（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ））、ハイビスカス（ハイビスカス・ローザシネンシス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ））、バラ（ロサ（Ｒｏｓａ）種）、チューリップ（チューリパ（Ｔｕｌｉｐａ）種）、ラッパズイセン（ナルキスス（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種）、ペチュニア（ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ））、カーネーション（ジアンサス・カリオフィルス（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ポインセチア（ユーフォルビア・プルケリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））およびキクが挙げられる。
【０１１１】
使用できるコニファー類としては、例えば、マツ、例えばテーダマツ（ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ））、スプラッシュパイン（ピヌス・エリオッティ（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ピヌス・ポンデローサ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（ピヌス・コントルタ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ））、およびモントレーマツ（ピヌス・ラジアータ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ））；ダグラスモミ（シュードツガ・メンジエシイ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；アメリカツガ（ツガ・カナデンシス（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；ベイトウヒ（ピケア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ））；アメリカスギ（セコイアセンペルビレンズ（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；トドマツ、例えばヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ））およびバルサムモミ（アビエス・バルサメア（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ））；ならびにヒマラヤスギ、例えばベイスギ（ツヤ・プリカータ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ））およびアラスカイエローシーダー（カマエキパリス・ノットカテンシス（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））が挙げられる。
【実施例】
【０１１２】
当業者は、本明細書で提供される方法および組成物が多くの利点を有することを認識するであろう。以下の実施例により、詳細な特定の、研究、方法および組成物を提供するが、当業者は開示された特定の実施例に多くの変更を加え得ること、そして本開示の精神と範囲から逸脱することなく、同様の、または類似の結果が得られることを認識するであろう。本明細書で引用した全ての参考文献は、それらが本明細書で使用された方法論、手法または組成物について、補完し、説明し、それらの背景を提供し、それらを教示する限り、参照によりそれら参考文献の全体を本明細書に組込むものとする。
【０１１３】
実施例１−プラスミドの構築
プラスミドｐＶｉｒ８（ＰＨＰ７０３６５；配列番号１０６）はｖｉｒ遺伝子、および標準の分子生物学手法を用いてエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に構築されたＴ−ＤＮＡを有する３８．８ｋｂのベクターである。これは、広範囲の細菌中で安定な複製のために２つの複製起点（ＣｏｌＥ１、ｐＶＳ１）を有し、抗生物質ゲンタマイシン耐性をコードする。これは、高毒性ｐＴｉＢｏ５４２  Ｔｉプラスミドからの約２７ｋｂのｖｉｒ遺伝子ならびに植物を対象とする選択ｂａｒ（除草剤ビアラホス耐性遺伝子）マーカーおよび目視で赤色の蛍光タンパク質マーカーをコードするＴ−ＤＮＡを含有する。ＰＣＲを用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＧＬ１株（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：９６３−９６７）に含まれるｐＴｉＢｏ５４２  Ｔｉプラスミド（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ０５８７６４およびＮＣ＿０１０９２９）からＶｉｒ遺伝子の複製物を単離した。Ｖｉｒ遺伝子には次のものが含まれた：ｖｉｒＡ、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＢ１−Ｂ１１、ｖｉｒＧ、ｖｉｒＣ１−Ｃ２、ｖｉｒＤ１−Ｄ５およびｖｉｒＥ１−Ｅ３。安定性の向上とサイズの削減のために、ｖｉｒＡおよびｖｉｒＪ間の挿入配列ＩＳ６６ならびにｖｉｒＪおよびｖｉｒＢ１間の領域それぞれを削除した。
【０１１４】
これらのＶｉｒ遺伝子の機能的変異体または誘導体を使用することによっても、さらなる改良が可能であり得る。ＰＣＲのオーバーラップ生成物を単離し、アセンブルした。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での複製のために、１．２ｋｂのｐＢＲ３２２  ＣｏｌＥＩ複製起点（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｇｅｎｅ  ２：９５−１１３）を含めた。多様な細菌宿主中での安定な複製のために、広域宿主複製起点ｐＶＳ１の一バージョン（Ｈｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  １３：２３２−２３７）を含めた。ゲンタマイシン耐性（Ｐｏｔｅｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４１：２６１−２６４）のために、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＴｎ１６９６からのａａｃＣ１遺伝子を含めた。プラスミドＲＶ０１３６８４（配列番号１１３）は、目的ベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）であり、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）およびＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組み換えクローニング技術（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用してＴ−ＤＮＡ組成を変更するための構築中間体として働く。このプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの右側および左側境界中にＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＡＴＴＲ４およびＡＴＴＲ３リコンビナーゼ部位を有する。このことによって、このＴ−ＤＮＡ領域を、隣接ＡＴＴＬ４およびＡＴＴＬ３部位を含有するエントリー型ベクター中に構築された他のＴ−ＤＮＡ領域で容易に置換できるようになる。
【０１１５】
形質転換ベクターシステムの最適化の試みの中で、追加のプラスミドのいくつかのシリーズを同様に構築した。これには、Ｖｉｒ遺伝子およびＴ−ＤＮＡ遺伝子を別々のヘルパープラスミドおよびバイナリープラスミドへと分離し、それぞれ「共生」システムを形成することが含まれた。上記ＰＨＰ７０３６５に類似の「共組み込み」設計物も構築し、試験した。異なる複製起点は、植物における単一コピーの発生頻度に影響を及ぼし得る（Ｚｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ；３４：７４５−７５４）ことが知られている；したがって、共生および共組み込みプラスミドの両者に対して多様な複製起点を構築し、試験し、下記のものを含めた。これらのまたは別の複製起点の機能的変異体または誘導体を使用することによっても、さらなる改良が可能であり得る。
【０１１６】
Ｔ−ＤＮＡを含め、次の成分を含んだ：オーバードライブ配列を有するオクトピン右側境界部、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ユビキチン１０プロモーター、５’ＵＴＲ、およびＤｓＲＥＤ２ＩＮＴを発現させるイントロン１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿２０２７８７）（この中で、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）種の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をコードする配列の最初の３６３ｂｐはＳＴ−ＬＳ１  ＩＮＴＲＯＮ２の挿入によって割り込まれ、次いでＤｓＲｅｄの最後の３１５ｂｐが続く。除草剤Ｂａｓｔａまたはビアラホス耐性のために、ダイズグリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）コドンを使用して、ストレプトミケス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）からのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＢａｒ遺伝子を含めた。表１Ａに示すように、プラスミドＰＨＰ７２２７７、ＰＨＤ４６７３およびＰＨＤ４６７４は、ＰＨＰ７０３６５と同一のＤＮＡバックボーンを有したが、Ｔ−ＤＮＡの発現カセットは異なった。
【０１１７】
表１Ａに示すように、プラスミドＰＨＰ８１１８５はＰＨＰ７０３６５のＴ−ＤＮＡと同一のＤＮＡバックボーンおよび発現カセットを有したが、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）Ｋ５９９  Ｒｉプラスミドからのｖｉｒ遺伝子のコピー数が異なった。アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株Ｋ５９９  ＮＣＰＰＢ２６５９はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎｄ  Ｈｕｔｔｏｎ，Ｙｏｒｋ  ＹＯ４１  １ＬＺ  Ｅｎｇｌａｎｄ（ｗｗｗ．ｎｃｐｐｂ．ｃｏｍ）から入手した。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
表１Ｂに示すように、共組み込みベクターＰＨＰ７９７５２（ＢＢＲ１ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６５（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ７９７６７（ＰＶＳ１ＯＲＩ）、ＰＨＰ８１０９２（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ）、ＰＨＰ８１０９３（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ８１０９４（ＲＫ２ｆｕｌｌ）、およびＰＨＰ８１０９５（ＰＳＡ  ＯＲＩ＋ＰＡＲＤＥ）は同じＤＮＡバックボーンとＴ−ＤＮＡを有したが、複製の起点が異なった。表１Ｂに示すように、ヘルパーベクターＰＨＰ７９０７７（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ７９７５９（ＢＢＲ１ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６０（ＲＦＳ１０１０ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６１（ＰＶＳ１ＯＲＩ）、ＰＨＰ８０３９８（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ）、ＰＨＰ８０３９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ＋ＰＡＲＤＥ）、ＰＨＰ８０４０２（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ８０４０３（ＲＫ２ｆｕｌｌ）、ＰＨＰ８０５６６（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ＋ＰＡＲＤＥ）、ＲＶ００５３９３（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）にはＴ−ＤＮＡが無いが、同じＤＮＡバックボーンおよび異なる複製起点を有した。表１Ｂに示すように、バイナリーベクターＰＨＰ７９７６３（ＢＢＲ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６４（ＲＦＳ１０１０  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ８０４０４（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）、ＰＨＰ８０５６９（ＲＫ２ｆｕｌｌ）、ＲＶ００５１９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＲＶ００５２００（ＰＳＡ  ＯＲＩ＋ＰＡＲＤＥ）およびＲＶ００５２０１（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ）は同じＤＮＡバックボーンとＴ−ＤＮＡを含有したが、複製起点は異なった。表１Ｂの空白のマスは、プラスミド成分が存在しなかったことを表す。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
実施例２−タバコＢＹ−２懸濁培養においてＤｓＲＥＤの一過性発現を使用する細菌のスクリーニング
タバコＢＹ−２細胞は、日本国文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを通して理化学研究所バイオリソースセンターから提供された。タバコＢＹ−２懸濁培養のメンテナンス方法は、基本的には、Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ（１９９２）１３２：１−３０）により報告されており、修正ＢＹ−２懸濁細胞法（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：７０１−７１４）を用いてＤｓＲＥＤの一過性発現を行った。
【０１２５】
ライカ実態顕微鏡で観察すると、ＰＨＰ７０３６５で形質転換されたゲンタマイシン耐性株から、２４種の細菌株がＢＹ−２細胞において様々なレベルのＤｓＲＥＤ発現を示した。
【０１２６】
実施例３−１６Ｓ  ｒＤＮＡのＤＮＡ抽出およびＰＣＲ
各種の分析を行い、植物の形質転換に使用したオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の種を決定した。最初に、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号ＭＣＤ８５２０１、Ｅｐｉｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。２４種の細菌から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＴＣ−１００ＴＭ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＰＣＲを行った。増幅に用いたプライマーは：
配列番号１０２  １６Ｓ−Ｆ  ５’  ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ  ３’
配列番号１０３  １６Ｓ−Ｒ  ５’  ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ  ３’であった。
【０１２７】
ＰＣＲ混合物は、５μＬ（１００〜２００ｎｇ）の細菌ＤＮＡ、１．２５μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）、２．５μＬの１０×Ｔａｑバッファー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０μＭのプライマーそれぞれ０．５μＬおよび１５μＬの滅菌蒸留水からなる。試料を９４℃に１分間加熱し、続いて９４℃（３０秒間）、５０℃（３０秒間）、７２℃（９０秒間）そして７２℃で１０分間のサイクルを３０回実施した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＨＴＳ  ＰＣＲ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（カタログ番号ＭＳＮＵ０３０１０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＰＣＲ産物をクリーニングした。
【０１２８】
得られたＰＣＲ産物は、Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により配列が決定され、これらの配列を使用してＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースを検索した。ＥＰ１Ａ０９（配列番号１０５）のの１，３１８ｂｐの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を使用したＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＢＬＡＳＴ検索の最初のヒットを表２に示す。検索結果から、ＥＰ１Ａ０９は各種のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種と非常に高い１６Ｓ  ｒＤＮＡ相同性を有することが示された（表２）。
【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
実施例４−１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）解析およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間（ＴＯＦ）法によるさらなる細菌の同定
ＥＰ１Ａ０９種を同定する試みで、以下の方法を用いた：（配列番号１０４）の詳細な１６Ｓ  ｒＤＮＡの相同性検索、抽出した微生物脂肪酸エチルエステル（ＦＡＭＥ）のガスクロマトグラフィー分析およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化法を使用する飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）。これらの分析はＭＩＤＩ  Ｌａｂｓ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、ＵＳＡ）によって行われた。
【０１３１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、純粋な細菌コロニーから単離したゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。使用したプライマーは、０００５Ｆおよび０５３１Ｒ位に対応するユニバーサル１６ｓプライマーである。過剰のプライマーおよびｄＮＴＰから増幅産物を精製し、産物の一部をアガロースゲル上で泳動させることにより質と量をチェックした。ＤＮＡポリメラーゼとダイターミネーターの化学を用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物のサイクルシークエンスを実施した。その後、過剰の色素標識ターミネーターをシークエンス反応物から除去した。３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２（２００１）ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、試料を電気泳動させた。ＥＰ１Ａ０９株の４６９ｂｐの１６ＳｒＤＮＡ配列はＭＩＤＩ  Ｌａｂｓの有効なライブラリーと一致しなかったが、表３に示すようにＧｅｎＢａｎｋと比べると、オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）に対して属のレベルで９９％の一致を示した。
【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
ＭＩＤＩ  Ｌａｂｓの標準手法（Ｓａｓｓｅｒ（１９９０）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．Ｋｌｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ１９９−２０４、Ａｄａｄｅｍｉａｉ、Ｋｉａｄｏ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ；Ｎｏｒｍａｎ＆Ｙｕｅｎ（１９９８）Ｃａｎ  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０：１７１−１７５）にしたがい、ガスクロマトグラフィー分析システムを用いて脂肪酸（ＦＡＭＥ）解析を行い、その結果、ＭＩＤＩ  ＬａｂｓにおけるＦＡＭＥライブラリーで唯一のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種である、オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏ．ａｎｔｈｒｏｐｉ）に対して種のレベルで一致することが示された（Ｔａｂｌｅｓ４）。
【０１３４】
【表８】
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【０１３５】
【表９】
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【０１３６】
標準手法（Ｂｉｚｚｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  ５：１５４９−１５５４）にしたがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを行い、その結果、複数の株オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏ．ａｎｔｈｒｏｐｉ）、オクロバクテリウム・ガリニファエシス（Ｏ．ｇａｌｌｉｎｉｆａｅｃｉｓ）、オクロバクテリウム・グリグノネンセ（Ｏ．ｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・インターメディウム（Ｏ、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種およびオクロバクテリウム・トリティシ（Ｏ．ｔｒｉｔｉｃｉ）を含有するＭＩＤＩ  ＬａｂｓのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦライブラリーのオクロバクテリウム・グリグノネンセ（Ｏ．ｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）に対して種のレベルで一致することが示された（表５）。それぞれの一致についてのスコアの評価はスコア値の凡例を用いて行った。
【０１３７】
【表１０】
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【０１３８】
【表１１】
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【０１３９】
実施例５−ゲノムアセンブリおよびオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）単離物の、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列間の進化的分岐を推定することにより行ったキャラクタリゼーション
ＩＤが既知の数種のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）培養回収株と共に、新規のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株のドラフトゲノムアセンブリを構築した（表６）。Ｉｌｌｕｍｉｎａが開発したライブラリー構築手順に従ってゲノムＤＮＡを調整し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを使用して配列を決定した。要約すれば、ＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２２０装置でせん断した後、得られたＤＮＡフラグメントの末端修復を行い、Ａ−塩基の付加のためにそれらの３’末端を処理した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ特異的アダプターのライゲーションおよびゲルベースのサイズ選択の後、アダプター連結ＤＮＡフラグメントをＩｌｌｕｍｉｎａ特異的ＰＣＲプライマーと共に制限ＰＣＲ増幅に供した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの指示に従いＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにより、増幅ＤＮＡフラグメントのクラスター形成およびペアエンドシーケンスを行った。シングルフローセルに菌株からのＤＮＡフラグメントを供給した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの画像解析およびベースコール用パイプラインソフトウェアにより、配列および品質スコアを生成させた。最初のベースコールおよび処理の後、Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインにより生成した配列ファイルをＦＡＳＴＱフォーマットに変換し、追加のカスタム品質フィルタリングを行うことにより、リードが３’末端に品質スコア＜１５の、１つまたはそれより多くの塩基を有する場合、そのリードを除去した。既定のｋｍｅｒ値を使用して、ペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａリード（２×１５０ｂｐ）をＳＰＡｄｅｓ  ３．１．１（Ｂａｎｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ  １９：４５５−４７７）によりアセンブルした。さらに、ＳＰＡｄｅｓパイプライン・オプションにより、リードエラーの修正およびミスマッチ／ショートＩＮＤＥＬの修正を行った。アセンブルした、５００ｂｐより小さいコンティグは最終出力から除去した。
【０１４０】
【表１２】
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【０１４１】
ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにおける配列間の配列当たりの不一致塩基数と進化解析をＭＥＧＡ６（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３０：２７２５−２７２９）により行った。配列の各ペア間の不一致数を１６Ｓ  ｒＤＮＡの１，３３７ｂｐで除すことにより、一致百分率を計算した（表７〜９）。
【０１４２】
【表１３】
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【０１４３】
【表１４】
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【０１４４】
【表１５】
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【０１４５】
【表１６】
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【０１４６】
実施例６−オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株の多座配列タイピング
Ｒｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９に記載されているスキームを用いて、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株の多座配列解析（ＭＬＳＡ）を行った。以下は、ＭＬＳＡスキームで使用した７つの遺伝子座である：
（１）＞ｇｉ｜２５６８０９８２７｜ｇｂ｜ＡＣＶ３１０１４．１｜コリスミ酸シンターゼ、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］；
（２）＞ｇｉ｜２５６８０９６９９｜ｇｂ｜ＡＣＶ３０９５０．１｜７０ｋＤａ熱ショックタンパク質、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］；
（３）＞ｇｉ｜２５６８０９６４７｜ｇｂ｜ＡＣＶ３０９２４．１｜グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］；
（４）＞ｇｉ｜２５６８０９４５５｜ｇｂ｜ＡＣＶ３０８２８．１｜２５ｋＤａ外膜タンパク質、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］；
（５）＞ｇｉ｜２５６８０９２８７｜ｇｂ｜ＡＣＶ３０７４４．１｜リコンビナーゼＡ、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］；
（６）＞ｇｉ｜２５６８０９１３５｜ｇｂ｜ＡＣＶ３０６６８．１｜ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニット、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］；および
（７）＞ｇｉ｜２５６８０８９９１｜ｇｂ｜ＡＣＶ３０５９６．１｜アントラニル酸シンターゼ、部分的［オクロバクテリウム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ  ４９１８８］。
【０１４７】
Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデル（Ｔａｍｕｒａ  ＆  Ｎｅｉ（１９９３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １０：５１２−５２６）に基づく最尤法を使用して進化の歴史を推測した。１００の複製から推論されたブートストラップコンセンサスツリーを使用して、分析したこの分類群の進化の歴史を示す（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８５）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３９：７８３−７９１）。５０％未満のブートストラップ複製で再現された区分に該当する分枝は折り畳んだ。ブートストラップ試験（１００複製）で関連した分類群が一緒にクラスター化された複製樹の百分率を、これらの枝の隣に示す。発見的検索のための最初のツリーは、近隣結合およびＢｉｏＮＪアルゴリズムを、最大複合尤度法（ＭＣＬ）アプローチを用いて推定したペアワイズ距離のマトリックスに適用し、その後優位なログ尤度値を有する樹形を選択することにより自動的に得られた。この分析は４２のヌクレオチド配列を対象にした。コドン位置には、１番目＋２番目＋３番目＋コーディングなしが含まれた。ギャップおよび欠損データを含有する全ての位置を削除した。最終のデータセットには全部で３４５６の位置が含まれた。ＭＥＧＡ６により進化の分析を行った（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３０：２７２５−２７２９）。図１Ａおよび図１Ｂに示すように、最終のツリーをＦｉｇＴｒｅｅプログラムで描いた（ｔｒｅｅ−ｄｏｔ−ｂｉｏ−ｄｏｔ−ｅｄ−ｄｏｔ−ａｃ−ｄｏｔ−ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／からオンラインで入手可能）。得られたこの系統樹は、単離したＥＰ１Ａ０９がオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の新種であることを示している。この新規の単離物、ＥＰ１Ａ０９は２０１５年１０月７日にアクセッション番号ＮＲＲＬＢ−６７０７８として、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）に寄託され、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１と命名されている。
【０１４８】
実施例７−タバコの安定な形質転換
基本的にＧａｌｌｏｉｓおよびＭａｒｉｎｈｏ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９５）４９：３９−４８）に記載のようにしてタバコのリーフディスク形質転換を行った。タバコ植物（ニコチナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）栽培品種Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１、カタログ番号ＮＴ−０２−２０−０１、Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ、Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ、ＴＸ）を１．５％の蔗糖および０．３％のＧｅｌｒｉｔｅを含む１／２濃度ムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地を含有する無菌ポリプロピレン容器（カタログ番号０７０１、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  Ｃｏｒｐ、Ｓｅｖｅｒｎ、ＭＤ）中、２４℃で１６時間の光照射（８０〜１１０μＥ／ｍ２／ｓの冷白色蛍光ランプ）を行いながらインビトロにて無菌培養する。４〜６週ごとに、１つの節を有する茎を培養小植物体から切除し、その後、同一の環境条件下の新鮮な１／２濃度ＭＳに移した。
【０１４９】
対数期のオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８培養物の、植物形質転換ベクターＰＨＰ７０３６５を含むもの、および含まないものを、１，５００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の細胞ペレットを、２ｍｇ／ＬのＮ６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、１％のブドウ糖および２００μＭのアセトシリンゴンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．２）からなる液体共培地により希釈してＯＤ６００ｎｍを０．５とした。インビトロで栽培した３〜４週齢のタバコ植物からリーフディスクを採取した。無菌のタバコの葉を植物体から切り取り、１００×２５ｍｍのペトリ皿中で、液体共培地中の２０ｍＬのＥＰ１Ａ０９（ＯＤ＝０．５）（オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８）に５分間浸漬した。その後、葉を３×３ｍｍの断片に裁断し、次いで２０ｍＬのオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）中に葉片を５分間完全に沈めた。葉の断片を加圧滅菌したフィルターペーパー上にブロットし、その後、２ｍｇ／ＬのＢＡ、１％のブドウ糖、２００μＭのアセトシリンゴンおよびＰｈｙｔｏａｇａｒ（カタログ番号Ａ１７５、ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）を含むＭＳ培地（ｐＨ５．２）からなる固体共培地上、２４℃で、１６時間の光照射（８０〜１１０μＥ／ｍ２／ｓ、冷白色蛍光ランプ）を行ってインキュベートした。３日間の共培養の後、２０個の葉の断片／プレートを２ｍｇ／ＬのＢＡ、３％の蔗糖、０．３％のＧｅｌｒｉｔｅ、３ｍｇ／Ｌのビアラホスおよび２５０μｇ／ｍＬのＣｅｆｏｔａｘｉｍｅを含むＭＳ固体培地（ｐＨ５．７）からなるシュート誘導培地に移した。ＤｓＲＥＤ蛍光タンパク質の発現レベルを励起用に５３０〜５６０ｎｍ、発光用に５９０〜６５０ｎｍのフィルターセットを装備したＬｅｉｃａ蛍光実態顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。共培養後の３日間、ＤｓＲＥＤ蛍光輝点の一過性発現が観察され、形質転換から３週後に安定なＤｓＲＥＤを発現するビアラホス耐性カルスおよびシュートの芽が観察された（図２Ｂ）。シュートの増殖のために、そして形質転換から７週後（図２Ｄ）にＤｓＲＥＤ発現により可視化される結果のために、新鮮なシュート誘導培地にビアラホス耐性カルスおよびシュートを移した。図２Ｄによって、ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８は、タバコ植物を安定に形質転換できることが示された。
【０１５０】
ワタのカルスをＣｏｋｅｒ３１２から作り、ＰＨＰ７２４７７を宿すオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８培養物で形質転換させた。
【０１５１】
実施例８−ダイズ半切種子の形質転換
基本的にＰａｚ  ｅｔ  ａｌ．（（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２５：２０６−２１３）および米国特許第７，４７３，８２２号明細書に記載のようにしてダイズの形質転換を行った。Ｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １５：７４６−７５０）の記載のように、１２ＮのＨＣｌ３．５ｍＬと１００ｍＬの市販漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）を混合して製造した塩素ガスを使用して、ダイズ株の成熟した種子の表面を１６時間殺菌した。殺菌した種子を室温で１６時間、無菌蒸留水に浸漬した（２５×１００ｍｍのペトリ皿に１００個の種子）。ダイズの半切種子の形質転換に使用した各種培地の組成および植物の再生を表１０にまとめる。
【０１５２】
３００μＭのアセトシリンゴンを含有する感染培地中に、ＯＤ６００＝０．５のベクターＰＨＰ７０３６５（配列番号１０６）懸濁液をさらに含む体積１０ｍＬのオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を浸漬した種子に加えた。その後、子葉を分離するために、へそに沿って縦方向に種子を切断することにより分割し、種皮、第１シュートおよび胚軸をオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８懸濁液中で除去し、そうすることにより半切種子の外植体を生成させた。半切種子の外植体の平面側を下にし、４ｍＬの新鮮なオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）／感染培地が入った深底プレート中に子葉が重ならないように置いた。パラフィルム（「Ｐａｒａｆｉｌｍ  Ｍ」  ＶＷＲ  Ｃａｔ＃５２８５８）でプレートに封をし、その後、３０秒間超音波（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ−ＶＷＲ  ｍｏｄｅｌ  ５０Ｔ）処理を行った。超音波処理後、半切種子の外植体を、共培養固体培地上の加圧滅菌処理した単層フィルターペーパー（ＶＷＲ＃４１５／カタログ番号２８３２０−０２０）に移した（プレート当たり１８〜２２個の外植体；平面側を下にして）。Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅテープ（カタログ番号１５３０−０、３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ））でプレートに封をし、２１℃で弱い光（５〜１０μＥ／ｍ２／ｓ、冷白色蛍光ランプ）を１６時間照射して５日間インキュベートした。
【０１５３】
共培養後、液体シュート誘導（ＳＩ）培地中で半切種子外植体を１回洗浄し、その後、０．７％の寒天で固体化したシュート誘導培地上で外植体を選択せずに培養した。外植体の基部（すなわち、胚軸が除去された外植体の部分）を上に向けて培地に埋め込んだ。Ｐｅｒｃｉｖａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ中、光周期を１８時間、光の強度を１３０〜１６０μＥ／ｍ２／ｓとし、２４℃でシュートの誘導を行った。１４日後、外植体を３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する新鮮なシュート誘導培地に移した。２週ごとに半切種子外植体を新鮮な培地に移した。シュート誘導培地での４週間の培養後、外植体を５ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有するシュート伸長（ＳＥ）培地に移した（表１０）。６〜１０週後、伸長したシュート（＞１〜２ｃｍ）を分離し、１ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する発根培地に移した（表１０）。
【０１５４】
【表１７】
2018527931.tif 000018
【０１５５】
【表１８】
2018527931.tif 000019
【０１５６】
ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換した外植体におけるＤｓＲＥＤの一過性発現は、共培養から５日後に得られたが、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８プラスミド不含（ベクターを欠く）で形質転換したダイズ外植体はＤｓＲＥＤの発現を示さなかった（ＦＩＧ．３Ｂ）。ＤｓＲＥＤ−陽性シュートは、Ｊａｃｋ  ａｎｄ  ＤｕＰｏｎｔ  Ｐｉｏｎｅｅｒ選別品種において、Ｏオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（ｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８（ＰＨＰ７０３６５）による形質転換後、３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する発芽培地上で２〜３週後に観察された（図４Ｂ）。安定に形質転換された、大きさが１〜２ｃｍのＤｓＲＥＤ−陽性シュートが、ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８による形質転換から１０〜１２週後に観察され（図４Ｃ〜図４Ｇ）、これらは首尾よく発根することができた（図４Ｈ〜図４Ｉ）。その後、これらのＴ０小植物を土に移した（図４Ｊ）。
【０１５７】
ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８のＤｕＰｏｎｔ  Ｐｉｏｎｅｅｒダイズ選別品種における形質転換効率を表１１に要約した。ＤｓＲＥＤ陽性シュートは、１００個の感染子葉当たり平均１．６個が回収された。これらのＤｓＲＥＤ陽性植物のうちの約７０％が、ビアラホス発根培地での発根に成功した。
【０１５８】
さらにＰＨＰ７０３６５を含有するオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換した、ＤｓＲＥＤ陽性でビアラホス耐性ダイズ系統の葉の組織から、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブの中でＰｅｌｌｅｔ乳棒（カタログ番号Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用し、粗抽出物を調製した。ＡｇｒａＳｔｒｉｐ（登録商標）ＬＬｓｔｒｉｐ（カタログ番号７８０００１９、Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ、Ｕｎｉｏｎ、ＭＯ、ＵＳＡ）を各抽出試料に挿入し、結果が出るまで２〜１０分を要する。全てのＤｓＲＥＤ陽性系統はＡｇｒａＳｔｒｉｐ（登録商標）ＬＬ試験で陽性反応を示し、ｂａｒ遺伝子が発現されたことを示すが、形質転換されていないコントロール（ＷＴ）植物はマイナスの結果（ｂａｒ遺伝子は不発現）を示した。
【０１５９】
【表１９】
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【０１６０】
実施例９−トランスジェニックダイズの植物表現型およびＴ１種子の分離
ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換した、遺伝子導入小植物を、湿らせたＪｉｆｆｙ−７ピートペレット（Ｊｉｆｆｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ、Ｓｈｉｐｐａｇａｎ、Ｃａｎａｄａ）に移し、６０〜１００μＥ／ｍ２／ｓで１６時間の光周期、昼／夜温度を２６℃／２４℃とする条件のＰｅｒｃｉｖａｌインキュベータ中で気候順応するまで、透明プラスチック製トレーボックスに収容した（図４Ｊ）。硬化小植物を湿らせたＳｕｎＧｒｏ  ７０２培養土（７７０  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、ＡＧＡＷＡＭ、ＭＡ  ０１００１）を含有した２ガロンのポットに植え、温室内で成熟して収穫できるまでに栽培した。トランスジェニック植物のうち５本は携帯的に正常に見えたが、１本は恐らくはＤｓＲＥＤの過剰発現のために成長が阻止された。インビトロでまたは温室内で、ＤｓＲＥＤ過剰発現トランスジェニックダイズ植物のＤｓＲＥＤ毒性もしくは再生能力低下の兆候または表現型の効果を、形質転換していない野生型植物と比較して観察した。温室におけるＴ０植物の葉の組織を採取し、ｑＰＣＲ分析を行い、ＰＨＰ７０３６５Ｔ−ＤＮＡ（ＲＢ−ＡＴＵＢＱ１０：ＤｓＲＥＤ：ＰＩＮＩＩ  Ｔｅｒｍ−ＧＭＵＢＱ：ＢＡＲ  ＧＭＯＴ：ＵＢＱ１４Ｔｅｒｍ−ＬＢ）のコピー数を決定した。５種のＴ０系統のうち４種（系統番号２７７７９３８９１、２７９１６１３０６、２７９１６１３８８および２７８７２８４３０）は、ＰＨＰ７０３６５のＴ−ＤＮＡからのＤｓＲＥＤおよびＢＡＲ発現カセットの単一コピーを含有し（表１２）、系統２７４７４９４４６はいくつかの導入配列について１コピーより多くを有した。
【０１６１】
【表２０】
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【０１６２】
５本のＴ０植物の全てが正常に花をつけ、Ｔ１種子ができた。これらの５系統のＴ１種子は、蛍光顕微鏡および周囲光の両方の下で強いＤｓＲＥＤ発現を示した。５種のトランスジェニック系統において、ＤｓＲＥＤ不発現Ｔ１種子に対する発現種子の比は、それぞれ３９１：１４６、１６２：４８、９８：２６、１１９：４９および１７０：６６であることが観察され、これは単一遺伝子座での優性遺伝子に対するメンデルの分離比３：１に一致する（表１３）。
【０１６３】
【表２１】
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【０１６４】
実施例１０−ダイズの形質転換
成熟乾燥種子を塩素ガスで消毒し、暗所において、５ｇ／ｌの蔗糖および６ｇ／ｌの寒天を含有する半固体培地上、室温で水を吸収させた。終夜のインキュベーション後、暗所でさらに３〜４時間、室温で種子を蒸留水に浸漬させた。完全な胚軸をメスの刃で子葉から分離した。実施例９に記載の手順により、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介胚軸形質転換を行った。ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換した、胚軸の分裂組織部位の一過性のＤｓＲＥＤ発現は、共培養してから３〜４日後に観察された。ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換してから２〜３週間後、分裂組織部位におけるＤｓＲＥＤ陽性のシュート原基およびカルスが３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する発芽培地上で観察された（図５Ｂ）。ＰＨＰ７０３６５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換してから６〜８週間後、安定に形質転換されたＤｓＲＥＤ陽性シュートは１〜１．５ｃｍの大きさに成長した（図５Ｄ）。
【０１６５】
実施例１１−植物細胞を形質転換する代替オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株
表１４に示すように、１６種のオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、２株はＤｒ．Ｔａｍａｓ  Ｔｏｒｏｋ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）から入手したものであり、これらの株は、供給者からの指示通りに培養した。１６株全てが１００ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンに敏感であったが、８株（オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏ．ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏ．ｏｒｙｚａｅ）、オクロバクテリウム・ペコリス（Ｏ．ｐｅｃｔｏｒｉｓ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、ＬＢＮＬ１２４−Ａ−１０およびＨＴＧ３−Ｃ−０７）のみは、エレクトロポレーション後のゲンタマイシン選択によりＰＨＰ７０３６５による形質転換が可能であった。これらの８株およびオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８について、タバコＢＹ−２細胞（ｕｓｉｎｇＰＹＦＰ発現カセットを有するＰＨＰ７２２７７を使用して）およびダイズ半切種子（ｕｓｉｎｇＤｓＲＥＤカセットを有するＰＨＰ７０３６５を使用して）を遺伝子学的に形質転換するそれらの能力を試験した。オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏ．ｃｙｔｉｓｉ）およびオクロバクテリウム・ペコリス（Ｏ．ｐｅｃｔｏｒｉｓ）はＢＹ−２細胞（表１４）およびダイズ外植体（図６）を形質転換することができた。オクロバクテリウム・デジョネンス（Ｏ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクテリウム・ルピネ（Ｏ．ｌｕｐｉｎｅ）、オクロバクテリウム・オリゼ（Ｏ．ｏｒｙｚａｅ）およびオクロバクテリウム・トリティシ（Ｏ．ｔｒｉｔｉｃｉ）もまた、タバコＢＹ−２細胞を形質転換することができたが、それらの形質転換の有効性はオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８、オクロバクテリウム・サイティシ（Ｏ．ｃｙｔｉｓｉ）およびオクロバクテリウム・ペコリス（Ｏ．ｐｅｃｔｏｒｉｓ）より有意に（１０〜５０倍）低かった。表１４で、「Ｘ」は、プラスミドＰＨＰ７０３６５で形質転換されたコロニーは得られなかったこと意味する。「Ｏ」はプラスミドＰＨＰ７０３６５で形質転換されたコロニーが得られたこと意味する。「ＮＤ」は決定されていないことを意味する。＋が多いほど一過性の蛍光タンパク質の発現がより強いことを示す。
【０１６６】
【表２２】
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【０１６７】
実施例１２−シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の形質転換
実施例３に記載のようにして、プラスミドＰＨＤ４６７３をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を、ゲンタマイシン１００ｍｇ／Ｌを含有する５０ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、２８℃、２５０ｒｐｍで１８〜２４時間培養した。ＰＨＤ４６７３をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８培養物を２０℃、４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを、新たに調製した、０．０２％（体積／体積）のＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７界面活性剤（Ｈｅｌｅｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ２２５Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  Ｂｌｖｄ．Ｃｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ、ＴＮ３８０１７）を含む５％の蔗糖７５ｍＬ中に再懸濁させた。修正フローラルディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ  ＆  Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ１６：７３５−７４３）を使用して、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−０の形質転換を行った。ＰＨＤ４６７３をさらに含有するオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８でフローラルディップした後、植物栽培室において、２１℃、６０〜１００μＥ／ｍ２／ｓでの１６時間の光周期で植物を栽培し、鞘が茶色になった後、種子を収集した。層流フードの下、９５％エタノールで１分間、２０％漂白剤プラス１滴のＴｗｅｅｎ−２０で１５分間、種子の表面を消毒し、無菌水で３回洗浄した。３０ｍｇの無菌の種子を、１５０×２５ｍｍのペトリ皿（カタログ番号３５１０１３、Ｆａｌｃｏｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｐｅｔｒｉ  Ｄｉｓｈｅｓ、ＶＷＲ）中、ビタミンを含む１×ＭＳ塩、１％蔗糖（ｐＨ５．７）、０．８％ＴＣ寒天、１００ｍｇ／Ｌのチメンチンおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンからなる寒天選択培地に蒔いた。層流下、プレートを乾燥させ、パラフィルムで封をし、発芽および成長のために、２１℃、６０〜１００μＥ／ｍ２／ｓでの１６時間の光周期で培養した。カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ培地での選択から９日後、発芽し、緑色になった遺伝子が導入されたと推定される系統を数え、蛍光顕微鏡下でＤｓＲＥＤの発現を観察した。カナマイシン耐性およびＤｓＲＥＤ陽性の発芽苗を示す形質転換効率は、０．５３〜１％であり、平均の形質転換効率は０．７７％であった（表１５）。さらに成長させ、分析を行うために、カナマイシン耐性およびＤｓＲＥＤ陽性発芽苗を土壌に移植した。
【０１６８】
【表２３】
2018527931.tif 000024
【０１６９】
実施例１３−ソルガムの葉ディスクにおける一過性の発現
終夜培養したＯオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８プラスミド不含（ベクターを欠く）およびＰＨＤ４６７４をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８を４，０００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離し、ペレットを４００μＭアセトシリンゴンを含む１０ｍＭのＭｇＳＯ４に再懸濁させ、細胞濃度をＯＤ６００で１．０近くにした。２色ソルガムのＤｕＰｏｎｔ  Ｐｉｏｎｅｅｒ  ＴＸ４３０植物を栽培室中、３７５〜４５０μＥ／ｍ２／ｓでの１６時間の光周期、昼は２６℃、夜は２２℃で栽培した。Ｋａｐｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ（１９９７）１２２：１０１−１０８）およびＳｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０１４）１６６：１１６２−７６．）に記載のようにして、インフィルトレーションを行った。一過性ＤｓＲＥＤ発現のために、５週齢のソルガム植物の葉をオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８プラスミド不含、およびオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８（ＰＨＤ４６７４）でインフィルトレーションし、インフィルトレーション後４日目（ｄｐｉ）にＬｅｉｃａ蛍光顕微鏡により一過性のＤｓＲＥＤ発現を吟味した。ＰＨＤ４６７４をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８でインフィルトレーションしたソルガムの葉にはＤｓＲＥＤの発現が見られたが、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８プラスミド不含からのものはそうでなかった。ＤｓＲＥＤの発現に成功したことを蛍光顕微鏡で最初に確認したのはインフィルトレーション後４日目（ｄｐｉ）であったが、定量化は遺伝子産物をさらに蓄積させるために７ｄｐｉまで遅らせた。処理した全試料についてＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（可変モードイメージャ）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ６４３０６５  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ１５２６４−３０６５によりＤｓＲＥＤを定量した。スキャンの前に、抽出物の細胞破片をろ過し、ブラッドフォード法により、測定試料ごとにＣＣＬＲバッファー１００μＬ中１５０μｇの可溶性トータルタンパク質に正規化し、その後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ画像解析ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ６４３０６５  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ１５２６４−３０６５）により最終スキャンを解析した。ＰＨＤ４６７４をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８でインフィルトレーションした、ソルガム葉抽出物の相対蛍光単位の平均は、オクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃ���ｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８プラスミド不含からのそれより３．５〜２３倍高かった。この結果は、ＰＨＤ４６７４をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１がソルガム細胞中にＤＮＡを送達し、発現させることができることを明確に示すものである。
【０１７０】
【表２４】
2018527931.tif 000025
【０１７１】
実施例１４−ＰＨＰ７０３６５（Ｔｉ  ｖｉｒコンストラクト）対ＰＨＰ８１１８５（Ｒｉ  ｖｉｒコンストラクト）の比較
実施例１０に記載のようにして、ダイズの形質転換を行った。ＰＨＰ７０３６５またはＰＨＰ８１１８５を宿すオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換した、胚軸の分裂組織部位の一過性のＤｓＲＥＤ発現は、共培養してから７日後に観察された。両コンストラクトに感染した外植体は、同レベルのＤｓＲｅｄ一過性発現を示した。ＰＨＰ７０３６５またはＰＨＰ８１１８５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８で形質転換してから６〜８週間後、安定に形質転換されたＤｓＲＥＤ陽性シュートは１〜１．５ｃｍの大きさに成長した。ＰＨＰ７０３６５またはＰＨＰ８１１８５をさらに含むオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１  ＮＲＲＬ寄託Ｂ−６７０７８による安定な形質転換の効率は、表１７に示したものと類似であった。
【０１７２】
【表２５】
2018527931.tif 000026
【０１７３】
実施例１５−各共組み込みおよびコハビテーティング（ｃｏ−ｈａｂｉｔａｔｉｎｇ）ベクターシステムにおける種起源のレプリコンの比較
表１Ｂおよび表１８に掲げた、共組み込みベクターならびにヘルパーおよびバイナリーベクターの組み合わせをオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１に導入し、実施例２に記載のようにタバコＢＹ−２懸濁細胞の修正法を使用して赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の一過性発現を実施した。ＲＦＰの発現は感染から７日目にＬｅｉｃａ蛍光実態顕微鏡下で観察された。タバコＢＹ−２細胞でＲＦＰ発現を示すプラスミドを表１８に要約する。
【０１７４】
共組み込みベクターＰＨＰ７９７６２（ＢＢＲ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６７（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）およびＰＨＰ８１０９２（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ）は、複製の起源が異なるものの、ｐＶｉｒ  ８とアイソジェニックである。複製の起源は、各プラスミドＰＨＰの後ろに（  ）で表されている。これらのベクターは全て一過性のＲＦＰ発現を示した。上記全ての複製起源は、植物形質転換用として機能した。
【０１７５】
次に、プラスミドＰＨＰ番号に関わらず、ヘルパープラスミドは、複製起源は異なるもののアイソジェニックである。同様に、バイナリーベクターは、複製起源は異なるもののアイソジェニックである。複製の起源は、各プラスミドＰＨＰの後ろに（  ）で表されている。コハビターティングベクターシステムの次の組み合わせ、（１）ヘルパープラスミドＰＨＰ７９７５９（ＢＢＲ１  ＯＲＩ）とバイナリーベクターＰＨＰ７９７６３（ＢＢＲ１  ＯＲＩ）、ＲＶ００５１９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ８０５６９（ＲＫ２ｆｕｌｌ）およびＰＨＰ８０４０４（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）、（２）ヘルパープラスミドＰＨＰ８０４０２（ＰＳＡ  ＯＲＩ）とバイナリーベクターＰＨＰ８０５６９（ＲＫ２ｆｕｌｌ）およびＰＨＰ８０４０４（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）、（３）ヘルパープラスミドＰＨＰ８０３９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ＋ＰＡＲＤＥ）とバイナリーベクターＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ８０５６９（ＲＫ２ｆｕｌｌ）およびＰＨＰ８０４０４（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）、（４）ヘルパープラスミドＰＨＰ７９７６１（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）とバイナリーベクターＲＶ００５１９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ７９７６４（ＲＦＳ１０１０  ＯＲＩ）、ＰＨＰ８０５６９（ＲＫ２ｆｕｌｌ）およびＰＨＰ８０４０４（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）、（５）ヘルパープラスミドＰＨＰ７９７６０（ＲＦＳ１０１０  ＯＲＩ）とバイナリーベクターＲＶ００５１９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）、ＰＨＰ７９７６４（ＲＦＳ１０１０  ＯＲＩ）およびＰＨＰ８０４０４（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）、（６）ヘルパープラスミドＲＶ００５３９３（ＲＫ２ｆｕｌｌ＋ＰＡＲＤＥ）とバイナリーベクターＲＶ００５１９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）およびＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）、（７）ヘルパープラスミドＰＨＰ８０３９８（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ）とバイナリーベクターＲＶ００５１９９（ＰＳＡ  ＯＲＩ）、ＰＨＰ７９７６６（ｒｅｐＡＢＣ）およびＲＶ００５２０１（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ）ならびに（８）ヘルパープラスミドＰＨＰ８０５６６（ＲＫ２ｍｉｃｒｏ＋ＰＡＲＤＥ）とバイナリーベクターＰＨＰ７９７６８（ＰＶＳ１  ＯＲＩ）の全ては、各種レベルのＲＦＰ発現を示した。上記全ての複製起源は、植物形質転換用として機能した。
【０１７６】
【表２６】
2018527931.tif 000027
【０１７７】
【表２７】
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【０１７８】
【表２８】
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【０１７９】
【表２９】
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【０１８０】
実施例１６：オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）による植物の形質転換
オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）による植物の形質転換は、植物の遺伝子の改良にも使用し得る。ランダムなオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｕｒｍ）媒介形質転換は、ヘルパープラスミドを有する、または有しないＴ−ＤＮＡバイナリーベクター上に目的の遺伝子を含有する発現カセットの送達に使用し得る。これらのランダム形質転換に有用な植物物質は、ヒマワリ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ベニバナ、ダイズ、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）およびワタなどの双子葉植物、またはトウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、カラスムギ、ソルガム、キビおよびサトウキビなどの単子葉植物であり得る。
【０１８１】
実施例１７：オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の部位特異的導入
本明細書で開示するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）による形質転換は、リコンビナーゼ媒介部位特異的遺伝子ターゲッティングに使用し得る。オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｕｒｍ）による形質転換は、標的遺伝子座を提供する、１つまたはそれより多くの非同一組み換え部位を含有する株の創出に使用し得る。そうすると、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｕｒｍ）による形質転換は、標的遺伝子座における部位特異的導入（ＳＳＩ）を使用することができ、米国仮特許出願第６２／２９６６３９号明細書（この全体を参照により本明細書に組込む）の記載のようにして、１つまたはそれより多くのコンストラクトを含有するトランスファーカセットの送達を可能にする。
【０１８２】
実施例１８：オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）によるヌクレアーゼ媒介ゲノム修飾
本明細書で開示したオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）により媒介される形質転換は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ仲介によるゲノム修飾に使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ媒介ゲノム修飾を行う方法は、国際公開第２０１３／１４１６８０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、および国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに記載があり、これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組込まれる。
【０１８３】
実施例１９：トランスファーカセットおよび／または異なる複製起源を有するヘルパープラスミドを使用して、ＳＳＩ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ媒介ゲノム修飾を向上させる、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の形質転換での代替複製起源（Ｏｒｉ）
異なる起源のベクターを用いるオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の形質転換はＳＳＩおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集の向上に使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ媒介ゲノム修飾を行う方法は、国際公開第２０１３／１４１６８０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、および国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに記載があり、これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組込まれる。異なる細菌Ｏｒｉｓを含み、様々なプラスミドコピー数を与える、ＲｅｐＡＢＣ、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ＲＫ２などを含むトランスファーカセットは、ＳＳＩおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集で使用する植物細胞に送達されるＤＮＡ分子の量を調節するために使用することができる。あるいは、異なるＯｒｉｓを宿すトランスファーカセットは、さらに別の毒性遺伝子を有するヘルパープラスミドと組み合わせることができる。これらのヘルパープラスミドは、様々なプラスミドコピー数を有する、異なる細菌性の複製起源を有し得る（表１Ｂ）。
【０１８４】
実施例２０：配列識別番号（配列番号）
【０１８５】
【表３０】
2018527931.tif 000031
【０１８６】
【表３１】
2018527931.tif 000032
【０１８７】
【表３２】
2018527931.tif 000033
【０１８８】
【表３３】
2018527931.tif 000034
【０１８９】
【表３４】
2018527931.tif 000035
【０１９０】
【表３５】
2018527931.tif 000036
【０１９１】
【表３６】
2018527931.tif 000037
【０１９２】
寄託
いくつかの態様では、細菌株は、アクセッション番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７０７８として２０１５年１０月７日にＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４、（ｎｒｒｌ．ｎｃａｕｒ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ、ここには「ｗｗｗ」の接頭語を付けてワールドワイドウェブ上でアクセスできる）へ寄託されたオクロバクテリウム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１株の生物学的に純粋な培養物である。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で維持される予定である。これらの寄託は単に当業者の便宜のためになされたものであり、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条で寄託が求められているからということではない。この申請の係属中は、Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓの長官および申請に対して長官がその権利を有すると認めた者がこの寄託物を入手できる。申請のいずれかのクレームが特許査定されたとき、出願人は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８０８条に従って、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４に寄託したサンプルを公衆が利用できるようにするであろう。この寄託物は、３０年間、または最新の請求から５年間、または特許の権利行使可能期間の、より長いいずれかの期間、公共の保管者であるＮＲＲＬの保管場所で維持され、その期間にそれが生きられなくなれば更新されるであろう。特許証が交付されれば、公衆は、取り消し不能の形でかつ無制限または無条件に寄託物を入手できるであろう。さらに、出願人は、寄託時に試料の生存率を提示することを含め、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８０１条〜１．８０９条の全ての要件を満足させている。出願人は、生物物質の移動またはその商業的な輸送に対して法が課す制限を撤回する権限を有しない。出願人は、この特許で与えられる権利の侵害を放置することはない。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の行為により与えられた特許権から逸脱して、主題の開示の実施を許諾するものではないことは理解されるべきである。
【０１９３】
本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により別途明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という言及は、そのような細胞を複数含み、「タンパク質（ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という言及は、１種またはそれより多くのタンパク質および当業者に知られたその同等物などを含む。特に明示されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【０１９４】
本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願または他の文献は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献が、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれることを個別に示すのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【０１９５】
明確さと理解のために、前記本発明を幾分詳細に説明してきたが、本開示を一読すれば、形態および詳細における各種の変更を、本発明の真の範囲から逸脱することなく行えることは当業者には明らかであろう。例えば、上記の全ての手法、方法、組成物、装置およびシステムは、各種の組み合わせで使用し得る。明確さと理解のために、実例や実施例により前記本開示を幾分詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲内でいくつかの変更と修正を行い得る。
【図１Ａ】
2018527931.tif 000038
【図１Ｂ】
2018527931.tif 000039
【図２Ａ】
2018527931.tif 000040
【図２Ｂ】
2018527931.tif 000041
【図２Ｃ】
2018527931.tif 000042
【図２Ｄ】
2018527931.tif 000043
【図３Ａ】
2018527931.tif 000044
【図３Ｂ】
2018527931.tif 000045
【図３Ｃ】
2018527931.tif 000046
【図３Ｄ】
2018527931.tif 000047
【図４Ａ】
2018527931.tif 000048
【図４Ｂ】
2018527931.tif 000049
【図４Ｃ】
2018527931.tif 000050
【図４Ｄ】
2018527931.tif 000051
【図４Ｅ】
2018527931.tif 000052
【図４Ｆ】
2018527931.tif 000053
【図４Ｇ】
2018527931.tif 000054
【図４Ｈ】
2018527931.tif 000055
【図４Ｉ】
2018527931.tif 000056
【図４Ｊ】
2018527931.tif 000057
【図５Ａ】
2018527931.tif 000058
【図５Ｂ】
2018527931.tif 000059
【図５Ｃ】
2018527931.tif 000060
【図５Ｄ】
2018527931.tif 000061
【図６Ａ】
2018527931.tif 000062
【図６Ｂ】
2018527931.tif 000063
【図６Ｃ】
2018527931.tif 000064
【図６Ｄ】
2018527931.tif 000065
【図６Ｅ】
2018527931.tif 000066
【図６Ｆ】
2018527931.tif 000067
【配列表】
2018527931000001.app
【国際調査報告】
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