(57)【要約】本発明は、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を培養するための液体培地へと再構築することができる、ペレット形態での乾燥細胞培養培地または供給物に関する。各ペレット組成物は、例えば、異なるビタミン、アミノ酸、バッファー、痕跡量の塩類、ｐＨ、イオンキレート化剤など、同じ組成物または異なる組成物を含んでいてもよい。本発明は、異なるペレット組成物の比率を変えることによって乾燥細胞培養培地を製造する方法、またはモジュール乾燥細胞培養培地を製造する方法、またはペレットを用いてある細胞種を増殖させるための培地配合物をカスタマイズする方法にも関する。本発明によると、培地ペレットは、再構築前、運搬中および取り扱い中、および／または再構築中の取り扱いがより容易であろう。培地ペレットを、培地配合物を調製するための滅菌単回使用袋を含む、袋などの任意の容器で使用してもよい。本発明は、培地ペレットを使用するキットおよび培養システムにも関する。2018537113.tif 000014
2018537113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペレット化された細胞培養培地を製造する方法であって、
（ａ）第１の乾燥粉末を、流動床装置内の気体が上方向に移動するカラム中での懸濁と、ディスクローター中でのスピニングとに供する工程と、
（ｂ）ペレットが生成するように、溶媒および／または第２の乾燥粉末を、工程（ａ）の流動床装置に導入する工程と、
（ｃ）前記ペレットを乾燥させる工程と
を含み、
前記第１の乾燥粉末、前記第２の乾燥粉末または前記溶媒が、バインダー、賦形剤、または両方を含む、
方法。
【請求項２】
工程（ａ）の第１の乾燥粉末が、前もって濡らされ、任意で、工程（ｂ）において溶媒が導入されない、請求項１に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項３】
前記第１の乾燥粉末と前記第２の乾燥粉末が同じである、請求項１または２に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項４】
前記第１の乾燥粉末と前記第２の乾燥粉末が異なる、請求項１または２に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項５】
前記第１の乾燥粉末が、培養物中の細胞の培養を補助することができる基本培地粉末、完全培地粉末、供給物、補助物質、培地または供給物濃縮物およびアミノ酸混合物からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項６】
前記第２の乾燥粉末が、培養物中の細胞の培養を補助することができる基本培地粉末、完全培地粉末、供給物、補助物質、培地または供給物濃縮物およびアミノ酸混合物からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項７】
前記バインダーまたは前記賦形剤が、糖、天然物質、合成物質および半合成物質からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項８】
前記天然物質が微晶質セルロースである、請求項７に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項９】
前記糖が、グルコース、ショ糖、トレハロース、単糖、二糖およびオリゴ糖からなる群より選択される、請求項７に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１０】
前記ペレット中のグルコースの組成％が、約０．１〜約１００％である、請求項９に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１１】
前記ペレットの大きさが約０．０５ｍｍ〜７ｍｍである、前記請求項のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１２】
前記ペレットの大きさが、約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．１ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．２ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．３ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．４ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約７ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２ｍｍ、または約１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約１ｍｍ〜約４ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約１ｍｍ〜約７ｍｍである、請求項１１に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１３】
前記ペレットの大きさが、約０．１ｍｍより大きい、または約０．２ｍｍより大きい、または約０．３ｍｍより大きい、または約０．４ｍｍより大きい、または約０．５ｍｍより大きい、または約０．６ｍｍより大きい、または約０．７ｍｍより大きい、または約０．８ｍｍより大きい、または約０．９ｍｍより大きい、または約１ｍｍより大きい、または約２ｍｍより大きい、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１４】
前記ディスクローターが変動可能な速度でスピンする、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１５】
前記溶媒が、接線方向の噴霧、上部噴霧または下部噴霧によって工程（ａ）に導入される、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１６】
前記溶媒が工程（ａ）に導入される速度が、約１ｇｍ／分から約３０ｇｍ／分までである、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１７】
前記溶媒が工程（ａ）に導入される速度が、約５ｇｍ／分である、請求項１６に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１８】
投入気体の温度が約２０℃〜３０℃である、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項１９】
前記投入気体の温度が約２５℃である、請求項１８に記載のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項２０】
前記ペレット温度が約２０℃〜３０℃に維持される、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項２１】
前記ペレットを乾燥させるための温度が約５０℃〜６０℃である、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地を製造する方法。
【請求項２２】
前記ペレットが、含水量が約０．５％〜３％になるまで乾燥される、前記請求項のいずれか一項に記載の培地のペレット化された細胞培養培地または供給物を製造する方法。
【請求項２３】
ペレット化されたベース粉末モジュールを製造する方法であって、
（ａ）第１の乾燥粉末を、流動床装置内の気体が上方向に移動するカラム中での懸濁と、ディスクローター中でのスピニングとに供する工程と、
（ｂ）前記ベース粉末モジュールのペレットが生成するように、溶媒と、任意で第２の乾燥粉末とを、工程（ａ）の流動床装置に導入する工程と、
（ｃ）前記ペレットを乾燥させる工程と
を含み、
前記第１の乾燥粉末、前記第２の乾燥粉末または前記溶媒が、バインダー、賦形剤、または両方を含む、
方法。
【請求項２４】
前記モジュールが、１種類以上の水溶性ビタミン、１種類以上の酸可溶性ビタミン、１種類以上の中性可溶性ビタミン、１種類以上の酸可溶性アミノ酸、１種類以上の塩基可溶性アミノ酸、１種類以上の中性水溶性アミノ酸、１種類以上の水溶性無機塩、１種類以上の酸可溶性無機塩、１種類以上の糖、１種類以上の酸可溶性の痕跡量の元素、１種類以上のアルコール可溶性ポリアミン、１種類以上のアルコール可溶性脂質および１種類以上の緩衝塩からなる群より選択される、請求項２３に記載のペレット化されたベース粉末モジュールを製造する方法。
【請求項２５】
前記水溶性または酸もしくは塩基もしくは中性可溶性のビタミンモジュール、前記水溶性または酸もしくは塩基もしくは中性可溶性のアミノ酸モジュール、あるいは前記水溶性または酸もしくは塩基もしくは中性可溶性の塩類モジュールが、少なくとも１種類の水不溶性賦形剤、水不溶性バインダー、またはその両方を含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載のペレット化されたベース粉末モジュールを製造する方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項によって得られたペレット。
【請求項２７】
１種類以上のアミノ酸、１種類以上のバインダーおよび１種類以上の痕跡量の構成要素を含む、ペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項２８】
ビタミンをさらに含む、請求項２７に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項２９】
前記ビタミンが、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）などのうち１種類以上から選択される、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３０】
塩類をさらに含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３１】
前記塩類が、緩衝塩、鉄、亜鉛、カルシウム、銅、マグネシウム、マンガン、アンモニウム、バナジウムなどの塩類のうち１種類以上から選択される、請求項３０に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３２】
前記アミノ酸が、２０種類のアミノ酸、その塩類または誘導体のうち１種類以上から選択される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３３】
前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、チロシン、システインおよびリシンのうち１種類以上から選択される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３４】
前記バインダーが、糖、天然物質、合成物質および半合成物質、微晶質セルロース、グルコース、ショ糖、トレハロース、単糖、二糖およびオリゴ糖、賦形剤および／または崩壊剤からなる群より選択される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３５】
前記バインダーが、微晶質セルロースおよびグルコースである、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３６】
前記ペレット中のバインダーの組成％が、約０．１〜約１００％である、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３７】
前記ペレット中のバインダーの組成％が、約３０〜約６０％である、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤。
【請求項３８】
２５〜４０％のアミノ酸、２０〜６５％のバインダー、１〜５％のビタミン、２〜１０％の塩類、０．０１〜０．０５％の痕跡量の構成要素のうち１種類以上を含む、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載のペレット化された細胞培養供給物。
【請求項３９】
３１〜３２％のアミノ酸、５９〜６０％のバインダー、２５％のビタミン、６〜７％の塩類、０．０１〜０．０５％の痕跡量の構成要素のうち１種類以上を含む、請求項３８に記載のペレット化された細胞培養供給物。
【請求項４０】
前記バインダーがＤ−グルコースである、請求項３９に記載のペレット化された細胞培養供給物。
【請求項４１】
栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法であって、
乾燥粉末培地、補助物質、培地サブグループまたは培地バッファーを、溶媒および／または粉末に供する工程と、
流動床中の回転ディスクを用いてペレットを作成する工程と
を含み、
前記ペレットが、バインダーまたは賦形剤を含む、
方法。
【請求項４２】
前記バインダーまたは賦形剤が、前記溶媒を介して噴霧されるか、または前記乾燥粉末にブレンドされる、請求項４１に記載の栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法。
【請求項４３】
前記乾燥粉末が、１種類以上の水溶性基、１種類以上の塩基可溶性基、１種類以上の酸可溶性基、１種類以上の酸可溶性反応性基、１種類以上のアルコール可溶性基、１種類以上のアルコール可溶性反応性基および１種類以上のｐＨ調整基からなる群より選択される、請求項４１〜４２のいずれか一項に記載の栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法。
【請求項４４】
前記水溶性基が、ビタミン、大量の無機塩および糖類からなる群より選択される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法。
【請求項４５】
前記糖がＤ−グルコースである、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法。
【請求項４６】
請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法によって得られるペレット。
【請求項４７】
細胞を培養するためのペレットを製造する方法であって、
乾燥粉末培地またはモジュールの微小懸濁物を調製する工程と、
液滴を生成するために、押出成形デバイスによって前記微小懸濁物を押出成形する工程と、
前記液滴をペレットになるまで乾燥させる工程と
を含む、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法によって得られるペレット。
【請求項４９】
細胞を培養するための、前記請求項のいずれか一項に記載の方法から得られるペレットの使用。
【請求項５０】
前記細胞が、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、酵母からなる群より選択されるか、または前記細胞が、ウイルスまたはウイルス粒子を培養するために使用される、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記細胞が動物細胞である、請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、２９３細胞およびＶＥＲＯ細胞などからなる群より選択される、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
請求項２６〜４０、４６または４８のいずれか一項に記載のペレットから再構築された液体中で細胞を培養する方法であって、
ｉ）適切な液体またはバッファー中で前記ペレットを再構築する工程であって、前記ペレットが、細胞培養培地、供給物、補助物質または濃縮物である、工程と、
ｉｉ）前記細胞の増殖にとって望ましい条件下で再構築された液体中で前記細胞を培養する工程と
を含む、方法。
【請求項５５】
前記細胞が、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、酵母からなる群より選択されるか、または前記細胞が、ウイルスまたはウイルス粒子を培養するために使用される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞培養が、増加した量のポリペプチドを産生するために使用される、請求項５４または５５に記載の細胞を培養する方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項５６に記載の細胞を培養する方法。
【請求項５８】
ペレットから作られていない液体培地を用いた培養と比較して、前記培養によって、産物の産生が増え、細胞増殖が増える、請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の細胞を培養する方法。
【請求項５９】
ｉ）請求項２６〜４０、４６または４８のいずれか一項に記載の１つ以上のペレットを含む第１の容器と、
ｉｉ）前記ペレットを用いるための指示書と
を備える、キット。
【請求項６０】
請求項２６〜４０、４６または４８のいずれか一項に記載のペレットから再構築された液体培地と、細胞とを含むシステム。
【請求項６１】
前記細胞が、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、酵母からなる群より選択されるか、または前記細胞が、ウイルスまたはウイルス粒子を培養するために使用される、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
組換えポリペプチド、ウイルス、分泌タンパク質を産生する細胞を培養するか、または懸濁物中で細胞を培養するか、または接着した細胞を培養するために、前記再構築された液体培地を使用する、請求項６０および６１のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年１２月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／２６９，０３１号の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく恩典を主張する。上述の出願の内容全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞の培養および他のそのような用途に有用な、ペレット化された乾燥細胞培養培地、供給物、補助物質、濃縮物または培地バッファーに関する。本発明は、このようなペレット化組成物を調製するためのプロセスと、ペレットを所望の粒径に調整するための方法に関する。本発明は、タンパク質およびポリペプチドを生成し、それによって細胞増殖およびタンパク質力価を増加させるための、このようなペレット調製物の使用にも関する。 
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様は、ペレット化された細胞培養培地を製造する方法であって、（ａ）第１の乾燥粉末を、流動床装置内の気体が上方向に移動するカラム中での懸濁と、ディスクローターでのスピニングとに供する工程と、（ｂ）ペレットが生成するように、溶媒および／または第２の乾燥粉末を、工程（ａ）の流動床装置に導入する工程と、（ｃ）前記ペレットを乾燥させる工程とを含み、前記第１の乾燥粉末、前記第２の乾燥粉末または前記溶媒が、バインダー、賦形剤、または両方を含む、方法に関する。 
【０００４】
さらなる態様では、工程（ａ）の第１の乾燥粉末は、前もって濡らされていてもよく、任意で、工程（ｂ）で溶媒が導入されなくてもよい。 
【０００５】
いくつかの態様では、第１の乾燥粉末と第２の乾燥粉末は同じであってもよく、他の態様では、第１の乾燥粉末と第２の乾燥粉末は異なっていてもよい。
【０００６】
特定の態様では、第１の乾燥粉末が、培養物中の細胞の培養を補助することができる基本培地粉末、完全培地粉末、供給物、補助物質、培地または供給物濃縮物およびアミノ酸混合物からなる群より選択されてもよい。別の態様では、第２の乾燥粉末が、培養物中の細胞の培養を補助することができる基本培地粉末、完全培地粉末、供給物、補助物質、培地または供給物濃縮物およびアミノ酸混合物からなる群より選択されてもよい。 
【０００７】
本発明の第２の態様は、第１の粉末、第２の粉末、溶媒または任意のもののいずれかに存在し、かつ記載される本方法で使用される、バインダー、賦形剤、または両方を提供する。別の態様では、バインダーまたは賦形剤は、糖、天然物質、合成物質および半合成物質からなる群より選択されてもよい。特定の態様では、天然物質は、例えば、微晶質セルロースであってもよい。
【０００８】
特定の態様では、本発明は、第１の粉末、第２の粉末、溶媒または任意のもののいずれかに存在し、かつ記載される本方法で使用される、糖を提供し、糖は、グルコース、ショ糖、トレハロース、単糖、二糖およびオリゴ糖からなる群より選択されてもよい。さらなる態様では、糖は、グルコースであってもよく、ペレット中のグルコースは、ペレット組成物の０．１〜１００％の濃度であってもよい。特定の実施形態では、糖は、Ｄ−グルコースを含む。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、第１の粉末、第２の粉末、溶媒または任意のもののいずれかに存在し、かつ記載される本方法で使用される、ビタミンを提供する。特定の実施形態では、ビタミンは、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）などのうち１種類以上から選択される。 
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、第１の粉末、第２の粉末または溶媒のいずれかに存在してもよく、かつ記載される本方法で使用される塩類を提供する。一実施形態では、塩類は、緩衝塩、鉄、亜鉛、カルシウム、銅、マグネシウム、マンガン、アンモニウム、バナジウムの塩類などのうち１種類以上から選択される。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明は、第１の粉末、第２の粉末、溶媒または任意のもののいずれかに存在し、かつ記載される本方法で使用される、アミノ酸を提供する。一実施形態では、アミノ酸は、よく知られている２０種類のアミノ酸、その塩類または誘導体のうち１種類以上から選択される。別の実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、チロシン、システインおよびリシンのうち１種類以上から選択される。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、第１の粉末、第２の粉末、溶媒または任意のもののいずれかに存在し、かつ記載される本方法で使用される、バインダーを提供する。いくつかの実施形態では、バインダーまたは賦形剤は、相互に置き換え可能に使用されてもよく、または本明細書全体で一緒に使用されてもよい。一実施形態では、バインダーまたは賦形剤は、糖、天然物質、合成物質および半合成物質、微晶質セルロース、グルコース、ショ糖、トレハロース、単糖、二糖およびオリゴ糖、賦形剤および／または崩壊剤からなる群より選択される。一特定の実施形態では、バインダーは、微晶質セルロースおよびグルコースである。別の実施形態では、ペレット中のバインダーの組成率は、約０．１〜約１００％であってもよい。特定の実施形態では、ペレット中のバインダーの組成％は、約３０〜約６０％であってもよい。
【００１３】
本発明の第３の態様は、種々の大きさのペレットを製造する方法を提供する。ある場合には、ペレットは、大きさが約０．０５ｍｍ〜７ｍｍである。特定の態様では、本発明は、大きさが約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．１ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．２ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．３ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．４ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約７ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２ｍｍ、または約１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約１ｍｍ〜約４ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約１ｍｍ〜約７ｍｍのペレットを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ほとんどのペレットの大きさが約０．１ｍｍより大きくてもよく、または約０．２ｍｍより大きくてもよく、または約０．３ｍｍより大きくてもよく、または約０．４ｍｍより大きくてもよく、または約０．５ｍｍより大きくてもよく、または約０．６ｍｍより大きくてもよく、または約０．７ｍｍより大きくてもよく、または約０．８ｍｍより大きくてもよく、または約０．９ｍｍより大きくてもよく、または約１ｍｍより大きくてもよく、または約２ｍｍより大きくてもよいペレット調製物を提供する。
【００１４】
本発明のペレットを製造する他の態様では、本方法は、変動可能な速度でスピンする処理チャンバー中のディスクローターの使用に関していてもよい。 
【００１５】
他の態様では、第１の乾燥粉末を、流動床装置内の気体が上方向に移動するカラム中での懸濁と、ディスクローター中でのスピニングとに供するときに、工程（ａ）に導入される溶媒は、接線方向の噴霧、上部噴霧または下部噴霧によって導入される。さらなる態様では、溶媒が工程（ａ）に導入される速度は、約１ｇｍ／分から約３０ｇｍ／分までであってもよい。特定の態様では、溶媒が工程（ａ）に導入される速度は、約５ｇｍ／分であってもよい。
【００１６】
本発明の第５の態様は、ペレットを製造する方法を提供し、投入気体の温度は、約２０℃〜３０℃であってもよい。特定の態様では、投入気体の温度は、約２５℃であってもよい。さらなる態様では、ペレット温度が約２０℃〜３０℃に維持されてもよい。さらに別の態様では、ペレットを乾燥させるための温度は、約５０℃〜６０℃であってもよい。ある態様では、ペレットは、含水率が約０．５％〜３％になるまで乾燥されてもよい。
【００１７】
本発明の第６の態様は、ペレット化されたベース粉末モジュールを製造する方法であって、（ａ）第１の乾燥粉末を、流動床装置内の気体が上方向に移動するカラム中での懸濁と、ディスクローター中でのスピニングとに供する工程と、（ｂ）ベース粉末モジュールのペレットが生成するように、溶媒と、任意で第２の乾燥粉末とを、工程（ａ）の流動床装置に導入する工程と、（ｃ）前記ペレットを乾燥させる工程とを含み、前記第１の乾燥粉末、前記第２の乾燥粉末または前記溶媒が、バインダー、賦形剤、または両方を含む、方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、ペレット化されたベース粉末モジュールを製造する方法を提供し、モジュールは、１種類以上の水溶性ビタミン、１種類以上の酸可溶性ビタミン、１種類以上の中性可溶性ビタミン、１種類以上の酸可溶性アミノ酸、１種類以上の塩基可溶性アミノ酸、１種類以上の中性水溶性アミノ酸、１種類以上の水溶性無機塩、１種類以上の酸可溶性無機塩、１種類以上の糖類、１種類以上の酸可溶性の痕跡量の元素、１種類以上のアルコール可溶性ポリアミン、１種類以上のアルコール可溶性脂質および１種類以上の緩衝塩からなる群より選択されてもよい。本発明の一態様では、水溶性または酸もしくは塩基もしくは中性可溶性のビタミンモジュール、水溶性または酸もしくは塩基もしくは中性可溶性のアミノ酸モジュール、または水溶性または酸もしくは塩基もしくは中性可溶性の塩類モジュールは、少なくとも１種類の水不溶性賦形剤、水不溶性バインダー、またはその両方を含む。 
【００１９】
別の態様では、ペレット化されたベース粉末モジュールは、１種類以上の水溶性基、１種類以上の塩基可溶性基、１種類以上の酸可溶性基、１種類以上の酸可溶性反応性基、１種類以上のアルコール可溶性基、１種類以上のアルコール可溶性反応性基および１種類以上のｐＨ調整基からなる群より選択されてもよい。特定の態様では、水溶性基は、ビタミン、大量の無機塩および糖類からなる群より選択されてもよい。 
【００２０】
本発明の第７の態様は、上述のいずれか１つの方法によって得られるか、または得ることができるペレットを提供する。
【００２１】
第８の態様では、本発明は、１種類以上のアミノ酸、１種類以上のバインダーまたは賦形剤、および１種類以上の痕跡量の構成要素を含む、ペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤に関していてもよい。 
【００２２】
一実施形態では、ペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤は、ビタミンをさらに含む。特定の実施形態では、ビタミンは、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）などのうち１種類以上から選択される。 
【００２３】
別の態様では、ペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤は、塩類をさらに含む。一実施形態では、塩類は、緩衝塩、鉄、亜鉛、カルシウム、銅、マグネシウム、マンガン、アンモニウム、バナジウムの塩類などのうち１種類以上から選択される。
【００２４】
さらに別の態様では、ペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤は、よく知られた２０種類のアミノ酸、その塩類または誘導体のうち１種類以上から選択されるアミノ酸を含む。一実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、チロシン、システインおよびリシンのうち１種類以上から選択される。
【００２５】
第９の態様では、本発明は、バインダーまたは賦形剤を含む、特許請求の範囲に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤に関していてもよく、バインダーまたは賦形剤は、相互に置き換え可能に使用されてもよく、または本明細書全体で一緒に使用されてもよい。一実施形態では、バインダーまたは賦形剤は、糖、天然物質、合成物質および半合成物質、微晶質セルロース、グルコース、ショ糖、トレハロース、単糖、二糖およびオリゴ糖、賦形剤および／または崩壊剤からなる群より選択される。一特定の実施形態では、バインダーは、微晶質セルロースおよびグルコースである。別の実施形態では、ペレット中のバインダーの組成％は、約０．１〜約１００％であってもよい。特定の実施形態では、ペレット中のバインダーの組成％は、約３０〜約６０％であってもよい。
【００２６】
第１０の態様では、本発明全体で記載される組成物は、２５〜４０％のアミノ酸、２０〜６５％のバインダー、１〜５％のビタミン、２〜１０％の塩類、０．０１〜０．０５％の痕跡量の構成要素のうち１種類以上を含む、特許請求の範囲に記載のペレット化された細胞培養培地、供給物、補助物質または添加剤に関していてもよい。特定の実施形態では、ペレット組成物は、３１〜３２％のアミノ酸、５９〜６０％のバインダー、２５％のビタミン、６〜７％の塩類、０．０１〜０．０５％の痕跡量の構成要素のうち１種類以上を含む。好ましい組成物では、バインダーは、Ｄ−グルコースである。 
【００２７】
第１１の態様では、本発明は、栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法であって、乾燥粉末培地、補助物質、培地サブグループまたは培地バッファーを、溶媒を用いて凝集させる工程と、流動床中の回転ディスクを用いてペレットを作成する工程とを含み、ペレットが、バインダーまたは賦形剤を含む、方法を提供する。
【００２８】
本発明の別の態様は、バインダーまたは賦形剤が、溶媒を介して噴霧されてもよく、またはペレット化する前に乾燥粉末にブレンドされてもよい、栄養培地ペレット、栄養培地補助物質ペレット、栄養培地サブグループペレットまたはバッファーペレットを製造する方法を提供する。特定の実施形態では、バインダーは、糖であってもよく、好ましい実施形態では、糖は、Ｄ−グルコースを含む。バインダー（例えば、グルコースに関して）の割合は、ペレットの異なる大きさ、または様々なバルク密度、または様々な安息角、または様々な粘着性または乾燥度のペレットを達成するために変えることができる。例えば、いくつかの実施形態では、この量は、望ましい特性を達成するために、０〜６０％、または１０〜１６％、または２０〜６０％、好ましくは３０〜４０％、４０〜５０％、３０〜３５％、３０〜４５％、４０〜５０％、４０〜５５％など変動してもよい。
【００２９】
別の態様では、本発明は、上述の全ての変形において、上述のいずれか１つの方法によって得られるか、または得ることができるペレットに関していてもよい。 
【００３０】
第１２の態様では、本発明は、細胞を培養するためのペレットを製造する方法であって、乾燥粉末培地またはモジュールの微小懸濁物を調製する工程と、液滴を生成するために、押出成形デバイスによって微小懸濁物を押出成形する工程と、前記液滴をペレットになるまで乾燥させる工程とを含む、方法を提供する。ある態様は、これによって得られるペレットに関していてもよい。
【００３１】
第１３の態様は、細胞を培養するための、上述のいずれかの特許請求の範囲に記載の方法によって得られるペレットの使用に関していてもよい。ある実施形態では、細胞は、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、酵母からなる群より選択されてもよく、またはウイルスまたはウイルス粒子を培養するために細胞を使用してもよい。特定の実施形態では、細胞は、動物細胞であってもよい。さらに別の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、２９３細胞およびＶＥＲＯ細胞などからなる群より選択されてもよい。
【００３２】
第１４の態様では、本発明は、上述の方法によって得られるか、または得ることができるいずれかのペレットから再構築された液体中で細胞を培養する方法であって、（ｉ）適切な液体またはバッファー中でペレットを再構築する工程であって、前記ペレットが、細胞培養培地、供給物、補助物質または濃縮物であってもよい、工程と、（ｉｉ）前記細胞の増殖にとって望ましい条件下で再構築された液体中で細胞を培養する工程とを含む、方法を提供する。一実施形態では、細胞は、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、酵母からなる群より選択されてもよく、またはウイルスまたはウイルス粒子を培養するために細胞を使用してもよい。別の実施形態では、増加した量のポリペプチドを産生するために、培養を行ってもよい。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、組換えポリペプチドであってもよい。別の実施形態では、ペレットから作られていない液体培地を用いた培養と比較して、本培養によって、産物の産生が増え、細胞増殖が増える。
【００３３】
第１４の態様では、本発明は、（ｉ）上述の方法によって得られるか、または得ることができるペレットを含み、前記ペレットが、細胞培養培地、供給物、補助物質または濃縮物であってもよい、第１の容器と、（ｉｉ）ペレットを用いるための指示書とを備える、キットを提供する。他の態様では、キットは、さらなる容器をさらに備えており、それぞれが、培養するための細胞、バッファー、および他の培地（液体または乾燥粉末、ＡＧＴ形態）、添加剤、供給物、抗体などを含む他の構成要素を含んでいてもよい。 
【００３４】
第１５の態様では、本発明は、上述のいずれか１つの方法によって得ることができる上述のペレットから再構築された液体培地／供給物／補助物質／添加剤と、細胞とを含むシステムを提供する。一実施形態では、細胞は、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、酵母からなる群より選択されてもよく、またはウイルスまたはウイルス粒子を培養するために細胞を使用してもよい。別の実施形態では、ペレットから再構築された液体培地／供給物／補助物質／添加剤を使用して、組換えポリペプチド、ウイルス、分泌タンパク質を産生する細胞、または懸濁物中の細胞または付着した細胞を培養してもよい。
【００３５】
参照による援用
本明細書で述べられる全ての刊行物、特許および特許明細書は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許明細書が具体的かつ個々に参照により組み込まれるように示されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書に従う。本明細書中の任意の参考文献の引用または特定は、このような参考文献を本発明に対する従来技術として利用することができることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本発明の新規特徴を、添付の特許請求の範囲において具体的に記載する。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を利用する具体的な実施形態を示す下記の詳細な記載を参照することによって得られるだろう。当業者は、ここに記載した図面が単なる説明のためのものであり、本教示の範囲をいかなる様式にも限定することを意図したものではないことを理解するだろう。 
【００３７】
【図１Ａ】手動で調製されたペレットまたはビーズ（ペレット供給物１）をここに示す。詳細な調製方法を実施例１に記載する。
【図１Ｂ】ペレット供給物１の視覚的な大きさの概算。
【図１Ｃ】ペレットまたはビーズ供給物１の視覚的な大きさの比較。
【図２Ａ】手動で調製されたペレット供給物１の補助物質と、液体補助物質との、細胞生存率アッセイの比較。手動で調製したペレット供給物１（試験サンプル）の生存率を、ビーズ１、２、３の曲線に示す。液体（ポジティブコントロール）の生存率を、液体１、２、３に示す。補助物質を含まないもの（ネガティブコントロール）の生存率をネガティブコントロール１、２、３に示す。ペレット供給物１を追加した細胞培養物（３個ずつ行った：１、２、３）は、液体を追加した細胞培養物（３個ずつ：１、２、３）と比較して、特に８〜１６日目に良好な生存率％を示した。
【図２Ｂ】手動で調製されたペレット供給物１の補助物質と、液体補助物質との、細胞増殖アッセイの比較。ペレット供給物１を追加した細胞培養物（３個ずつ：１、２、３）は、液体を追加した細胞培養物（３個ずつ：１、２、３）と比較して、培養物中、１５日間にわたって遜色ない細胞増殖を示した。
【図２Ｃ】抗体産生についての、手動で調製されたペレット供給物１の補助物質と、液体補助物質との、細胞性能またはタンパク質力価アッセイの比較。手動のペレットのタンパク質力価（細胞性能）を、ビーズ１、２、３の曲線に示す。液体（ポジティブコントロール）のタンパク質力価を、液体（３個ずつ：１、２、３）に示す。補助物質を含まないもの（ネガティブコントロール）のタンパク質力価をネガティブコントロール（３個ずつ：１、２、３）に示す。ビーズ／ペレットを追加した細胞培養物１、２、３は、培養１５日間にわたり、約３２５μｇ／ｍｌ（産生）のＩｇＧ産生を示し、これは、ポジティブ液体コントロールＥＦＢ（３個ずつ：１、２、３）を用いて約４２５μｇ／ｍｌで産生したＩｇＧよりもわずかに低かった。補助物質が追加されていないネガティブコントロールは、供給物１のビーズ（試験）を追加した細胞培養物と比較して、かなり低いＩｇＧ産生を示した（約１００μｇ／ｍｌ）。
【図３Ａ】ローターディスク技術を用いて調製された、粉砕した粉末（出発物質）からペレット供給物２（図面／明細書では供給物２と呼ばれることもある）への、自動化されたペレット調製またはビーズの顕微鏡拡大写真。詳細な調製方法を実施例に記載する。
【図３Ｂ】ローターディスク技術によって調製されたペレット供給物２の粒径の概算。
【図３Ｃ】自動化されたペレット供給物２と、液体補助物質との、細胞増殖アッセイの比較。ビーズ／ペレットを追加した細胞培養物は、液体を追加した細胞培養物と比較して、培養物中、１５日間にわたって遜色ない細胞増殖を示した。ペレット供給物２は、ポジティブコントロール供給物を追加した細胞培養物（約８×１０ｅ６）よりわずかに多い約１０×１０ｅ６細胞／ｍｌ（増殖）の生存可能な細胞数を示した。
【図４Ａ】ローターディスク技術を用いて調製された、粉砕した粉末（出発物質）からペレット供給物３（図面／明細書では供給物３と呼ばれることもある）への、自動化されたペレット調製またはビーズの顕微鏡拡大写真。詳細な調製方法を実施例に記載する。
【図４Ｂ】ローターディスク技術によって調製されたペレット供給物３の粒径の概算。
【図４Ｃ】自動化されたペレット供給物３と、液体補助物質との、細胞増殖アッセイの比較。ペレット供給物３を追加した細胞培養物は、特に、ネガティブコントロールと比較して（７日目以降）、培養物中、１４日間にわたって、ポジティブコントロールと遜色ない細胞増殖を示した。ペレット供給物３は、ポジティブコントロール供給物を追加した細胞培養物（約８×１０ｅ６）よりわずかに大きな約９×１０ｅ６細胞／ｍｌ（増殖）の生存可能な細胞数を示した。
【図５Ａ】ローターディスク技術を用いて調製された、粉砕した粉末（出発物質）からペレット供給物４への、自動化されたペレット調製またはビーズの顕微鏡拡大写真。出発物質となる乾燥ベース粉末は、セルロースバインダーを含んでいた。図面／明細書では供給物４と呼ばれることもある。詳細な調製方法を実施例に記載する。
【図５Ｂ】ローターディスク技術によって調製されたペレット供給物４の粒径の概算。出発物質となる乾燥ベース粉末は、セルロースバインダーを含んでいた。ペレット供給物４のグラフは、出発組成物をセルロースで（水溶解度を下げるために）化学的に変化させたときの結果を示す。ペレットの粒径は、供給物２および３と比較して小さかった。
【図５Ｃ】自動化されたペレット供給物４と、液体補助物質との、細胞増殖アッセイの比較。ペレット供給物４を追加した細胞培養物は、特に、ネガティブコントロールと比較して（７日目以降）、培養物中、１４日間にわたって、ポジティブコントロールと遜色ない細胞増殖を示した。
【図６Ａ】ローターディスク技術を用いて調製された、粉砕した粉末（出発物質）からペレット供給物５への、自動化されたペレット調製またはビーズの顕微鏡拡大写真。ペレット化プロセスで使用する前に、出発物質となる乾燥ベース粉末を、まず、もっと小さな粒径へと微粉化した。図面／明細書では供給物５と呼ばれることもある。詳細な調製方法を実施例に記載する。
【図６Ｂ】ローターディスク技術によって調製されたペレット供給物５の粒径の概算。出発物質となる乾燥ベース粉末を、まず、もっと小さな粒径へと微粉化した。グラフは、出発組成物を物理的に変化させた（粒径を小さくした）ときの結果を示す。粒径は、さらに均一であった。
【図７Ａ】ペレット供給物の生物学的評価。ペレット供給物２、３、および４について生存率アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した。グラフからわかるように、供給物２、３、および４は、特に６日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。ペレット供給物５の細胞生存率アッセイは、供給物２、３、および４と同様の結果を与えた（データは示していない）。
【図７Ｂ】ペレット供給物の生物学的評価。ペレット供給物２、３、および４について細胞性能（抗体産生）アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した。グラフからわかるように、供給物２、３、および４は、特に４日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。ペレット供給物２（約２２９μｇ／ｍｌ）を追加した細胞培養物は、ポジティブコントロール供給物を用いて産生した約２２８μｇ／ｍｌ（１４日目）のＩｇＧと遜色ないＩｇＧ産生度を示した。ペレット供給物３（約２４３μｇ／ｍｌ）を追加した細胞培養物は、ポジティブコントロール供給物を用いたものよりもわずかに高いＩｇＧ産生度を示した。ペレット供給物４（約２００μｇ／ｍｌ）を追加した細胞培養物は、ポジティブコントロール供給物を用いたものよりもわずかに低いＩｇＧ産生度を示した。補助物質を追加していない細胞培養物アッセイ（ネガティブコントロール）は、任意のペレット供給物２、３または４を追加した細胞培養物と比較して、かなり低いＩｇＧ（約１００μｇ／ｍｌ）を示した。ペレット供給物５の細胞性能（抗体産生）アッセイは、供給物２、３、および４と同様の結果を得た（データは示していない）。
【図８】ペレット製造プロセス：ペレット化は、流動化ローターにおいて乾燥粉末を濡らすことによって起こる。例示的なペレットプロセスでは、処理前の相互作用を制限するため、培地構成要素をグループに分けて計量する。乾燥粉末に使用されるグループ分けは、流動化粉末に噴霧される構成要素とは隔離されている。乾燥粉末または噴霧溶液、または両方がバインダーを含むだろう。噴霧された溶液を配合し、乾燥粉末の構成要素を粉砕し、均質になるまでブレンドする。ここで、ローター技術を用いて粉末から直接的にペレット化する。
【図９Ａ】モジュール培地、供給物または補助物質ペレットを製造するための例示的な構成要素またはグループ分け。カテゴリーは、可溶性などの溶解度、または他の構成要素と有害な反応をする傾向に基づいて行われる。一般的に、有害な反応剤は、最終段階まで分離したまま保たれ、それらを一緒に添加するときは、液体を用いてペレットを最終的に再構築する場合に、沈殿または付加物の生成（生成物が無駄なものになり得る）を防ぐように注意深く添加される。例示的なカテゴリーは、中性可溶性の構成要素、塩基可溶性の構成要素、酸可溶性の構成要素である。
【図９Ｂ】モジュール培地、供給物または補助物質ペレットを製造するための例示的な構成要素またはグループ分け。カテゴリーは、可溶性などの溶解度、または他の構成要素と有害な反応をする傾向に基づいて行われる。一般的に、有害な反応剤は、最終段階まで分離したまま保たれ、それらを一緒に添加するときは、液体を用いてペレットを最終的に再構築する場合に、沈殿または付加物の生成（生成物が無駄なものになり得る）を防ぐように注意深く添加される。例示的なカテゴリーは、中性可溶性の構成要素、塩基可溶性の構成要素、酸可溶性の構成要素である。
【図１０】酸可溶性（大量）の物質を最初に添加し、その後、塩基中性物質、最後に、痕跡量の金属物質を添加する、モジュール培地を製造するための例示的な方法。一実施形態では、各物質（酸可溶性、塩基可溶性または中性可溶性）は、別個にペレット化されてもよい。別の実施形態では、これらの物質を粉末として連続して添加し、次いで、一緒にペレット化し、複合物ペレットを作成する。さらに他の実施形態では、個々の酸可溶性物質もしくは酸可溶性物質の組み合わせ（特定の酸可溶性アミノ酸など）、またはアミノ酸の組み合わせ、または個々の塩基可溶性物質もしくは塩基可溶性物質の組み合わせ、または個々の中性可溶性物質もしくは中性可溶性物質の組み合わせからペレットを作成してもよい。なお、本明細書に記載する連続した添加の順序（酸可溶性を最初に、次に塩基可溶性、または最後に中性可溶性）は、単なる例である。添加または混合の順序は、所望なように変えることができ、その配合物、または有害な反応を起こす構成要素の存在に依存するだろう。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、乾燥粉末培地を生産する方法に関する。乾燥粉末培地は、本開示で述べられる場合、乾燥粉末培地（基本培地または完全培地）、乾燥濃縮細胞培養培地、乾燥粉末供給物または補助物質、乾燥粉末濃縮供給物または補助物質、乾燥バッファー粉末を指していてもよく、これらは、細胞を培養する際に組み合わせて使用されてもよく、または部分的に、またはそれ自体で（完全培地であるとき）使用されてもよい。一般的に、培養とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を培養することを指す。本発明のペレット化された培地または供給物の方法を以下に記載する。
【００３９】
細胞培養による生物治療薬の産生における典型的なワークフローは、解放空気の分注、乾燥粉末培地の再構築、さらなる配合工程、その後、ｐＨ／等張性の調節、濾過、およびバイオリアクターへの移動を必要とする。この複数工程の方法は、誤った配合によるリスク、または望ましくない偶発的な物質（例えば、細菌、ウイルス、マイコプラズマなど）による汚染によるリスクを高める可能性がある。 
【００４０】
上述の問題に対する望ましい解決策は、乾燥形態で追加するための完全細胞培養培地または供給物を提供することであり、その結果、培地または供給物を、バイオリアクターに添加される前に「閉じた系」で水和することができる。本発明は、このような「閉じた系」で容易に使用することができるペレットまたはマイクロペレットの形態を調製するための流動床ペレット化基本細胞培養培地粉末または完全細胞培養培地粉末、供給物粉末、補助物質粉末、バッファー粉末、ビタミン粉末、添加剤粉末などに関する。粉末化した細胞培養培地粉末を、小型の「マイクロペレット」として適用すると、良好な流動特性によって、周囲に飛び散り、物質のロスが生じる微粉末粒子を含む乾燥粉末よりも、生物医薬の生産に使用するための液体へと再構築するのがかなり容易になるだろう。
【００４１】
流動床ペレット化プロセスは、医薬産業から転用されてもよく、医薬組成物は、組成物中に一対から数種類までの成分を含む。例えば、医薬組成物は、１種類から最大で１０種類の構成要素を含んでいてもよい。一方、細胞、特に、動物細胞、より具体的には哺乳動物細胞、さらにより具体的には、組換えタンパク質およびワクチンを産生するための組換え細胞の培養のために使用される細胞培養培地粉末、供給物粉末、補助物質粉末は、非常に複雑であり、一般的に、８０〜１００種類の個々の構成要素を含み、それぞれが正確な量で必要とされる。塩類または金属イオンなどの培地構成要素のいくつかが、製造プロセス中に反応性である場合があり、付加物、または得られる組成物中の細胞培養にとって望ましくない他の物質を生成し得る。したがって、任意の製造工程の後に得られた培地について、物理的評価、化学的評価および生物学的評価（細胞培養の増殖および性能）を厳格に評価してもよい。したがって、医薬産業からの任意のペレット化方法を細胞培養培地組成物に適用することは、簡単ではなかった。細胞培養培地のペレットまたはマイクロペレットを手動または自動化された方法によって製造することは、この方法に関連する複雑さに起因して、以前には行われていなかった。実際に、培地ペレット化での本願発明者らの初期の試みでさえ、流動性が低い過剰に濡れた培地材料の状態で、望ましくない粘着性のタフィー状の物質が得られた。医薬ペレット方法（少ない化学物質、薬物のために設計されている）の実際の使用は、得られる培地または供給物を役に立たないものにしてしまう場合があり、良好なマイクロペレット／ペレットが可能であっても、ペレットが細胞の生存率および増殖を維持することができない場合、または細胞性能を維持する／高めることができない場合には、最終目的が達成されない。したがって、本発明までは、ペレット培地組成物、およびペレット化された細胞培養組成物（培地、供給物、補助物質、添加剤など）を製造する方法が依然として必要であった。
【００４２】
本明細書に記載されるペレット化された培地は、アミノ酸、糖類、ビタミン、痕跡量の金属塩類、バッファーを含む混合した粉末状培地構成要素を、回転可能な処理チャンバー内で顆粒化することによって得ることができ、さらなる粉末状培地構成要素および／または溶媒を、中程度の温度で徐々に導入してもよい。混合した粉末状培地構成要素を顆粒化したものに導入される溶媒は、穏やかな霧、蒸気、しずく、噴霧、微細な液滴、または液体−気体界面の形態であってもよい。
【００４３】
一実施形態では、培地／供給物ペレットは、手動工程によって製造されてもよい。例示的な手動方法を実施例１および２に記載し、これらは本教示の単なる一例であってもよく、培地／供給物ペレットをどのようにして手動で製造することができるかの範囲を限定するものと解釈すべきではない。 
【００４４】
別の実施形態では、培地／供給物ペレットは、自動化された工程によって製造されてもよい。自動化された工程において、流動床装置（本明細書では、処理チャンバーとも呼ばれる）にローター技術を使用することができる。当業者には明らかなように、任意のローター／回転手段を使用してもよく、または流動化処理チャンバーに適合されてもよい。「ローターディスク」または「ローター技術」または「アトマイザローター」という用語の使用は、限定する様式で解釈すべきではない。多くの等価な技術が、同様の結果を達成することができる。例えば、「回転ディスク」「回転ディスク濾過」、「迅速回転ペレット化ディスク」などを適用してもよく、当業者は、これに応じて原理を適用するだろう。回転を可能にする「ローター」の構造は、いずれかの様式に限定されるものと解釈すべきではない。ローラーは、同様の結果を達成するような任意の様式で、流動床装置に取り付けられてもよい。 
【００４５】
理論によって束縛されないが、流動化システムによって、流動化チャンバー（または処理チャンバー）内で綿毛状の培地／供給物粒子を生成することができる。培地シード粒子を用いてペレットの生成を開始することは必要ではないが、必要な場合には使用してもよい。チャンバー内での粒子のさらなる回転工程によって、粒子と、容器の壁および／または容器のバッフルとを接触させ、綿毛状の粒子の上に粉末を蓄積させ、ペレットを生成する。これは、丘を転がり落ちる雪玉の蓄積と似ており、雪崩ではさらに多くの粉末状の雪が蓄積し、次々と蓄積して大きくなる。乾燥粉末粒子が回転するにつれて、正しい条件であれば、良好な大きさのペレットが生成する。例示的な実施形態では、Ｇｌａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＪ製の流動化ローターチャンバーを使用し、培地／供給物ペレットを製造した。ローター／流動床チャンバーを用いるペレット化技術は、医薬産業でよく知られている。しかし、以下に示すように、医薬組成物は、組成物中に一対から数種類までの成分を含む。例えば、医薬組成物は、１種類から最大で１０種類の構成要素を含んでいてもよい。一方、細胞、特に、動物細胞、より具体的には哺乳動物細胞、さらにより具体的には、組換えタンパク質およびワクチンを産生するための組換え細胞の培養のために使用される細胞培養培地粉末、供給物粉末、補助物質粉末は、非常に複雑であり、一般的に、８０〜１００種類の個々の構成要素を含み、それぞれが正確な量で必要とされる。塩類または金属イオンなどの培地／供給物の構成要素のいくつかが、製造プロセス中に反応性である場合があり、付加物や、望ましくない他の物質を生成し得る。したがって、医薬産業からの任意のペレット化方法を細胞培養培地組成物に適合させるのは、簡単ではなかった。細胞培養培地のペレットまたはマイクロペレットを手動または自動化された方法によって製造することは、この方法に関連する複雑さに起因して、以前には行われていなかった。実際に、培地ペレット化での本願発明者らの初期の試みでさえ、流動性が低い過剰に濡れた培地材料の状態で、望ましくない粘着性のタフィー状の物質が得られた。さらに、医薬ペレット方法（少ない化学物質、薬物のために設計されている）は、得られる培地または供給物を役に立たないものにしてしまう場合があり、良好なマイクロペレット／ペレットを与え得るものであっても、ペレットが細胞の生存率および増殖を維持することができない場合、または細胞性能を維持する／高めることができない場合には、最終目的が達成されない。したがって、本発明までは、ペレット培地組成物、およびペレット化された細胞培養組成物を製造する方法が依然として必要であった。   
【００４６】
本明細書に記載するペレット化された培地／供給物は、上述の凝集した培地や、バッフルおよび粒径を大きくする方法を向上させるための他の手段を備えているか、または備えていない回転チャンバー中、ローター技術（回転、粒径を大きくする）に起因してペレット化されるどこかの箇所に述べた（および参照により組み込まれた）開示内容とは異なっている。
【００４７】
本明細書に記載するペレット組成物のためのバインダーは、粘着性であってもよく、ペレットに対する結合特性を付与してもよい。バインダーは、糖類、任意の天然バインダー、または合成または半合成のポリマーであってもよい。糖類は、乾燥形態または液体形態で使用することができ、さらに、限定されないが、グルコース（任意の異性体Ｄ−またはＬ−）、ショ糖（任意の異性体Ｄ−またはＬ−）、任意の単糖、二糖、オリゴ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、または任意の芳香族糖が挙げられる。天然バインダーを、乾燥形態、濡れた形態またはペースト形態に使用してもよく、限定されないが、セルロース、デンプン、アルファデンプン化デンプン、アカシア、ゼラチン、アルギン酸、トラガカントなどの非糖、および当該技術分野で知られている他のものが挙げられる。合成または半合成のポリマーとしては、限定されないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および当該技術分野で知られている他のものが挙げられる（バインダーは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｉｎｆｏ．ｎｅｔ／ｂｉｎｄｅｒｓに記載されており、相互に置き換え可能に使用されてもよく、本明細書に参考として組み込まれる）。特定の場合に、「賦形剤」は、ペレットを製造する前に、ベース粉末に添加されてもよい。賦形剤は、細胞に対し、培地中の他の有用な物質を与えるために賦形剤として役立つことができる、不活性物質（すなわち、細胞の増殖または培養に影響を与えない）である。賦形剤は、溶解度改質剤として、崩壊剤として、培地粒子をコーティング（例えば、フィルムコーティング、不活性物質など）するための障壁として作用してもよい。賦形剤の例としては、限定されないが、ポリマーまたは微晶質セルロース、結晶性塩類、糖、バッファーなどが挙げられる。ある種の物質は、バインダーまたは賦形剤であると考えられてもよく、したがって、バインダーおよび賦形剤という用語は、本開示では相互に置き換え可能に使用されてもよいが、当業者には理解されるだろう。特定の実施形態では、崩壊剤は、乾燥粉末または溶媒を介し、ペレットに導入されてもよく、ペレット粒子の１〜１０％を形成していてもよく、崩壊剤としては、限定されないが、クロスポビドン、クロスナトリウムカルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられ得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、噴霧速度は、乾燥粉末培地または供給物からペレットを生成するための因子であり得る。細胞培養供給物、特に、培地は、複数の成分を含む（１００構成要素まで）。これらの成分の一部は、きわめて水溶性であり、一方、他の成分は、ほとんど水溶性ではなく、さらに他の成分は、粘着性であるか、または接着性である。この化学特性の組み合わせは、（医薬では、数種類の組み合わせであるのに対し）供給物または培地のペレット生成にとって課題となる。例えば、特定の配合物について、乾燥培地／供給物粉末に多すぎる水が噴霧され得る場合、または他の配合物において、噴霧速度が速すぎる場合、その中の水溶性の高い化合物が溶解し始める場合があり、これがペレット生成を妨げる場合がある。ペレット生成に初期の最適な溶解レベルが必要な場合があるが、初期に混合物を濡らすと、粉末が粘着性になる場合がある。ここでも、最適であれば、粘着性によって、良好なペレットを得ることができる。しかし、特定の場合には、粘着性が大きすぎると（過剰な溶媒、または迅速な噴霧速度などに起因して、特定の配合物にのみ適用可能）、ペレットの代わりに、乾燥細胞培養構成要素のタフィー状の一体化した物質が得られる場合がある。例えば、ある失敗した実施形態では、微晶質セルロース（４０％）を含むベース粉末は、噴霧速度４０ｇｍ／分を使用し、ペレットの代わりに、乾燥細胞培養構成要素のタフィー状の一体化した物質が得られた。ここに記載した教示に基づき、当業者は、その制限事項を理解し、詳細に記載され、例示される教示を用い、培地／供給物のペレット化された形態を得ることができる。 
【００４９】
バインダーおよび／または賦形剤を、粉砕したベース粉末とブレンドしてもよく、および／または処理チャンバー内で粉末と共に噴霧してもよい。限定するものと考えない場合がある本明細書に提供される例では、種々の条件を使用してペレットを得た。例えば、ペレット供給物２、ペレット供給物３、ペレット供給物４、およびペレット供給物５は、以下に詳細に記載するように得られた。このようにして得られたペレットを、これらのアッセイで評価した。１）物理的特徴（顕微鏡写真と粒度分布を参照：例えば、図３ＡおよびＢ、４ＡおよびＢ、５ＡおよびＢ、ならびに６ＡおよびＢを参照）；２）ペレット化前後の内容物の分析。この分析は、ＨＰＬＣによって行った。すなわち、アミノ酸含有量、水溶性ビタミン含有量、疎水性アミノ酸含有量などの培地構成要素を、ペレット化前後に分析した（データは示していない）。供給物２、３、４、および５それぞれについての分析データは、ペレット化前とペレット化後の分析データが有意な変化を示さないような、遜色ないものであった。３）これらの生物学的活性について、細胞培養物中の性能（図３〜７、それぞれの供給物のペレットについて、適用可能な場合にはサブセクションＣを参照）。
【００５０】
培地または供給物のペレットは、細胞培養において種々の用途を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物に使用するための水系培地／供給物懸濁物の調製に、０ミクロンから約５００ミクロン未満の範囲の粒径のペレット粒子を使用してもよい。他の実施形態では、約８００〜約５００ミクロンの範囲の粒径のペレット粒子を、細胞培養物に使用するための複数粒子の培地／供給物錠剤の調製に使用してもよい。さらに別の実施形態では、約５００〜約２０００ミクロンの範囲の粒径のペレット粒子を、細胞培養物に使用するための培地／供給物カプセルの調製に使用してもよい。
【００５１】
応用：本発明のペレット／マイクロペレットは、広範囲の真核生物および細菌細胞の培養物における潜在的な有用性を有する。本発明のペレット／マイクロペレットは、いくつかの新規な送達選択肢を与える。例えば、供給−バッチシステムで使用するための１回分の単位用量単位を与える能力、かん流システムで使用するための計量した用量の栄養素のための能力、複数のグループのペレット化された栄養素（例えば、ビタミンペレット、アミノ酸ペレットなど）で構成されるモジュラーキットを製造する新しい可能性、または制御放出用途で使用するために、ペレット組成物を（ポリマー膜で）表面コーティングする能力。いくつかの実施形態では、種々の用途のためにペレット粒子の粒径を制御することができる。例えば、細胞培養物に使用するための水系培地／供給物懸濁物の調製に、０ミクロンから約５００ミクロン未満の範囲の粒径のペレットを使用してもよい。他の実施形態では、約８００〜約５００ミクロンの範囲の粒径のペレット粒子を、細胞培養物に使用するための複数粒子の培地／供給物錠剤の調製に使用してもよい。さらに別の実施形態では、約５００〜約２０００ミクロンの範囲の粒径のペレット粒子を、細胞培養物に使用するための培地／供給物カプセルの調製に使用してもよい。
【００５２】
本発明の一態様は、ペレット化が行われた乾燥粉末配合物を提供する。本発明の別の態様は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を容易にする、必要な栄養因子を全て含む細胞培養培地配合物を提供する。本発明のいくつかの実施形態は、これらのペレット化された培地配合物を製造する方法および手段を提供する。本発明のいくつかの実施形態は、これらの培地配合物または他の培地配合物に補助物質を追加する方法および手段を提供する。
【００５３】
本発明の細胞培養培地は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を維持および／または補助する、構成要素の任意の混合物であってもよい。細胞培養培地は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を維持および／または補助するのに必要な構成要素のいくつか、一部または全てを含んでいてもよい。細胞培養培地が、いくつかの構成要素しか含んでいない場合、さらなる構成要素を別個に添加する。本発明の細胞培養培地の例は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を維持および／または補助するのに必要な全ての構成要素を含む完全培地、培地補助物質または供給物である。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、完全培地であってもよい。新しい形態の乾燥粉末培地の必要性が存在する。
【００５４】
本発明の細胞培養培地は、皿、フラスコ、バイオリアクターまたは任意の細胞培養システムまたは入れ物、例えば、使い捨ての袋における細胞の増殖を維持および／または補助することができる。好ましい実施形態では、細胞培養培地は、化学的に定義された細胞培養培地であってもよい。化学的に定義された細胞培養培地は、化学的に定義されていない物質を含まない細胞培養培地である。このことは、培地を製造するために使用される各化学物質の化学組成および構造が、量および属性において知られ得るものであることを意味する。化学的に定義された培地は、植物、動物、酵母、真菌由来の抽出物または加水分解物を含まない。または、血清、血清画分、馴化培地、消化物、細胞抽出物、フィーダー細胞、または培地中の任意の構成要素の化学的同一性が不十分であることに寄与し得る成分を含まない。時に、化学的に定義された培地は、追跡可能な、由来の定義されたペプチドまたは定義されたタンパク質を既知の量で含むものであると定義されてもよい。
【００５５】
定義
「ペレット」または「マイクロペレット」という用語は、本明細書で使用される場合、任意のペレット化工程によって圧縮され、その外観、混合特性が向上し、粒径が大きくなり、粉塵化を回避し、さらに密な材料を調製し、培地構成要素の隔離を減らし、一般的に、微細な培地粉末の物理特性および化学特性を高める「細胞培養培地組成物」を指す。乾燥ペレットは、さらに、粉末の流動性を高め、任意の培地容器（例えば、バイオリアクター、培地袋、培地シャトルまたは培地混合装置など）の入口および出口の詰まりなどの望ましくない特性を除いてもよい。
【００５６】
「粉末」または「乾燥粉末」という用語は、本明細書で使用される場合、乾燥顆粒形態で存在する細胞培養のための培地粉末または粉末状培地組成物を指し、その肉眼での外観は、自由に流動するものであってもよい。「粉末」という用語は、凝集した粉末を含む。「ベース粉末」または「乾燥ベース粉末」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的には、ペレット化され得る前の出発物質の乾燥粉末組成物を指す。「ベース粉末」または「乾燥ベース粉末」または「乾燥粉末」という用語は、相互に置き換え可能に使用されてもよく、その内容に依存して、ペレット化され得る前の出発物質の乾燥粉末を指していてもよい。しかし、または、単純に、本明細書で使用される「乾燥粉末」は、単純に、そのものを指す。特に示されていない限り、材料が、錯体化した溶媒または凝集した溶媒をまったく含み得ないことは意味しないだろう。 
【００５７】
「細胞培養培地組成物」または「粉末状培地組成物」または「培地粉末」または「乾燥粉末配合物」または「培地配合物」という用語は、相互に置き換え可能に使用されてもよく、広くは、例えば、本発明の培地、培地補助物質、培地サブグループまたはバッファーを含み、基本培地、完全培地、培地供給物、培地補助物質、培地添加剤、濃縮培地、濃縮補助物質および供給物、アミノ酸またはアミノ酸群、短いペプチド、ビタミン、バッファー、塩類、痕跡量の構成要素などに限定され得ない。これらの用語は、一般的に、細胞培養中に添加される構成要素を指し、当業者は、これらの用語をいつ、どのように使用するかを明確に理解しているだろう。 
【００５８】
「成分」という用語は、化学物質であるか、または生体由来であるかによらず、細胞の増殖の成長を維持するか、または促進するために細胞培養培地に使用することができる任意の化合物を指す。「構成要素」、「栄養物」、および「成分」という用語は、相互に置き換え可能に使用することができ、全て、このような化合物を指すことを意味している。細胞培養培地に使用される典型的な成分としては、アミノ酸、塩類、金属、糖、炭水化物、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞の培養を促進または維持する他の成分は、特定の必要性に従って、当業者が選択することができる。
【００５９】
「細胞培養培地」、「培地」および「培地配合物」（それぞれの場合に、複数形の「培地（ｍｅｄｉａ）」）という句は、細胞の培養および／または増殖を補助する栄養溶液を指す。これらの句は、相互に置き換え可能に使用されてもよい。細胞培養培地は、基本培地（細胞の増殖を補助するためにさらなる成分を必要とする一般的な培地）、または細胞増殖を補助するための全ての構成要素またはほとんど全ての構成要素を含む完全培地であってもよい。細胞培養培地は、血清を含まないもの、タンパク質を含まないものであってもよく（片方または両方）、効率的な安定した細胞性能のために、成長因子、添加剤、供給物、補助物質などのさらなる構成要素を必要としてもよく、または必要としなくてもよい。
【００６０】
「合わせる」という用語は、細胞培養培地配合物中の成分を混合するか、または混ぜることを指す。  液体または粉末の形態で、または１種類以上の粉末および１種類以上の液体を用いて、合わせてもよい。別の例において、２種類以上の粉末状構成要素を混ぜ、次いで、凝集させ、培地、培地補助物質、培地サブグループまたはバッファーなどの複雑な混合物を生産してもよい。     
【００６１】
「接触させる」という用語は、培養容器内で培養される細胞と、その細胞が培養される培地とを配置することを指す。「接触させる」という用語は、特に、細胞と培地とを混合すること、細胞に培地をかん流させること、培養容器中、細胞の上に培地をピペットで追加すること、および細胞を培地に沈めることを包含する。「供給−バッチ」は、試薬の濃度が、その試薬の個々の添加を足し合わせたものであるように、本発明の組成物を細胞に供給する方法を規定する。
【００６２】
供給物または補助物質は、標準的な培養物の状態で細胞に添加されるとき、その管理、または拡張、または増殖、または生存率にとって有利であり得、またはその細胞性能に影響を与え、または培養物の寿命を延ばし、または産物の発現が続く疑固定相に細胞を維持し、または最終的な生成物の力価を顕著に増加させる。供給物または補助物質は、本開示で相互に置き換え可能に使用されてもよく、培養物中の細胞の増殖または性能、または細胞培養システムの均衡を保つか、回復または調整するために必要な１種類以上のアミノ酸、糖類、ビタミン、バッファー、時には、ペプチド、加水分解物、画分、成長因子、ホルモンなどを含む、培地構成要素の粉末形態および液体形態（凝集した形態を含む）を指す。供給物または補助物質は、細胞を培養することができる細胞培養培地に添加されるという点で、細胞培養培地とは区別されてもよい。当業者には理解されるだろうが、供給物／補助物質は、時には、主に、培養物中の細胞の増殖または性能、または細胞培養システムの均衡を保つか、回復または調整するために必要なアミノ酸、糖類、ビタミン、バッファーなどを含んでいてもよい。供給物または補助物質は、濃縮されていてもよく、または濃縮されていなくてもよく、または特定の構成要素のみが部分的に濃縮されていてもよい。「供給物」または「補助物質」という用語は、標準的な細胞培養培地に添加されるとき、細胞の増殖、培養物の寿命、および産物の発現を向上させる。補助物質が、抗体の産生に特に効果的であり得ることを示す例が与えられる。または、供給物または補助物質は、ハイブリドーマ細胞株、ワクチン産生のためのウイルスを培養する細胞株などに使用されてもよい。 
【００６３】
「細胞性能」という用語は、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、限定されないが、細胞生存率、細胞カウント／数、タンパク質発現、ＤＮＡ推定、タンパク質力価測定、組換えポリペプチドまたはタンパク質の産生、ポリペプチドまたはタンパク質の産生分泌、ウイルスまたはウイルス粒子の産生、分泌タンパク質、細胞が目的のタンパク質を産生／分泌したかどうか、細胞マーカーの検出、細胞が懸濁状態にあるか、または付着した細胞であるかなどのうち１つ以上の測定を含む、当業者に知られている任意の標準的なパラメータによって評価することを意味する。一般的に、細胞性能は、添加または形態の変化（例えば、ペレット、制御状態にある（液体）形態、供給物を含む培養物または供給物を含まない培養物など）に起因して、最終産物が増加し得るときに評価される。 
【００６４】
溶媒とは、水（蒸留水および／または脱イオン水、高品質であってもよいＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  （ＷＦＩ）ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、米国薬局方（ＵＳＰ）および欧州薬局方（ＥＰ）の両方に適合する細胞培養グレードの水）、バッファー、酸または塩基（ｐＨ調整剤）を意味し、これらはいずれも、１種類以上のさらなる構成要素（例えば、塩類、多糖、イオン、洗剤、安定化剤など）を含有していてもよい。  
【００６５】
ペレットの粒径は、レーザー光散乱または相対的なメッシュサイズの較正したふるいでの機械的な隔離によって定量されてもよい。一般的には、粒径は、標準化されたＵＳ測定に従って、ミクロン、ミリメートル、またはメッシュサイズで表されてもよい。比較変換表を以下に提示する。本開示に記載される方法によって得られるペレットは、種々の大きさを有していてもよい。ある場合には、ペレットは、大きさが約０．０５ｍｍ〜７ｍｍである。特定の態様では、本発明は、大きさが約０．０５ｍｍ〜約０．５ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．１ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．２ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．３ｍｍ、または約０．０５ｍｍ〜約０．４ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約６ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約７ｍｍ、または約１ｍｍ〜約２ｍｍ、または約１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約１ｍｍ〜約４ｍｍ、または約１ｍｍ〜約５ｍｍ、または約１ｍｍ〜約６ｍｍ、または約１ｍｍ〜約７ｍｍのペレットを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ほとんどのペレットの大きさが約０．１ｍｍより大きく、または約０．２ｍｍより大きく、または約０．３ｍｍより大きく、または約０．４ｍｍより大きく、または約０．５ｍｍより大きく、または約０．６ｍｍより大きく、または約０．７ｍｍより大きく、または約０．８ｍｍより大きく、または約０．９ｍｍより大きく、または約１ｍｍより大きく、または約２ｍｍより大きくてもよいペレット調製物を提供する。
【００６６】
（表１）ＵＳ粒径
2018537113.tif 000003
【００６７】
ペレット化される培地、培地供給物／補助物質および培地サブグループ、および多くの他の一般的に使用される動物細胞培養培地の配合は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＳｉｇｍａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（Ｓｉｇｍａ；セントルイス、ミズーリ）の中に見出され得る。
【００６８】
凝集した培地およびその調製物、特に、細胞培養に使用するためのものは、十分に記載されてきた。流動床技術によって、出発物質とは異なる特徴（特に、例えば、溶解度）を有する凝集した粉末を生成する。この技術の一般的な応用では、空気が上方向に移動するカラム中で粉末を懸濁させるのと同時に、制御された所定量の液体が、粉末の流れへと注入され、湿った状態の粉末を生成してもよい。次いで、穏やかな加熱を使用して、材料を乾燥させ、凝集した粉末を生産してもよい。凝集した培地／供給物、栄養粉末、補助物質などの調製、それらの特性、凝集した培地／供給物、栄養粉末、補助物質などをｐＨおよび等張性を自動化して調製する方法は、従来の出願／特許に詳細に記載されている。例えば、米国出願番号０９／０２３，７９０号；１１／６６９，８２７号；１３／９８４，２６３号；ＰＣＴ／ＵＳ  ２０１２／０２４１９４号；ＥＰ出願１０１７５９１４．０号；ＥＰ公開２７７８２２１号。これらの開示は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。凝集した培地のバルク密度、安息角、粒径を分析するための方法は、例えば、米国出願１１／６６９，８２７号に十分に記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。 
【００６９】
ペレット化される培地／供給物は、液体培地のｐＨを調整する必要なく、細胞の培養または増殖を補助するのに最適であり得るｐＨを有していてもよい。この種の培地は、本明細書では、「自動的にｐＨを調整する培地」として定義され、したがって、再構築した後に培地にバッファーを添加し、バッファーを溶解した後に培地のｐＨを調節するという時間がかかり、間違いやすい工程が不要になり、米国出願１１／６６９，８２７号に十分に記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。例えば、これらの方法に従って調製された哺乳動物細胞培養培地は、再構築すると、ｐＨが約７．１〜約７．５、より好ましくは約７．１〜約７．４、最も好ましくは約７．２〜約７．４または約７．２〜約７．３であってもよい。自動ｐＨ培地は、培地自体に存在するバッファー系（例えば、共役酸−塩基アミノ酸の対向する形態）を調節することによって与えられてもよい。培地中のこのようなバッファーのｐＨの対向する形態を調節することによって、本発明は、自動ｐＨ培地を生成し、培地を再構築する前、または再構築するときと、使用前に、適切なｐＨレベルを達成するために、さらなるバッファーまたはｐＨ調整剤を添加する必要が回避される。  例えば、ナトリウムＨＥＰＥＳ（ｐＨを上げる）およびＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨを下げる）は、ｐＨの対向する形態の例である。一塩基性、二塩基性および／または三塩基性のバッファー塩は、ｐＨの対向する形態の他の例である。典型的には、一塩基性、二塩基性および三塩基性のリン酸塩が使用されるが、他の塩も適切な比率で使用されてもよい。
【００７０】
「微小懸濁物」：細胞培養培地の構成要素またはベース粉末は、ペレット化のために使用する前に、所望な濃度で、溶媒に溶解されるか、懸濁されるか、コロイド化されるか、または他の方法で導入されてもよい（実施例１を参照）。
【００７１】
培養開始時に培地に含まれていてもよく、または供給−バッチまたは連続した様式で添加されてもよい、本明細書に記載する培地補助物質を使用して細胞を増殖させる方法。得られた培地を、限定されないが、固定フラスコ、撹拌したフラスコ、スピナーフラスコ、撹拌した培養器、エアーリフト培養器、膜反応器（中空繊維、平坦な膜板、外部ループかん流を含む）、固体支持体上に保持された細胞を含む反応器、微孔性ビーズに固定／補足された細胞を含む反応器、および所望な細胞株の増殖または管理に適した任意の他の構造を含む種々の細胞培養ハードウェアを用い、限定されないが、バッチ、供給−バッチ、ケモスタットおよびかん流を含む種々の培養方法に使用してもよい。
【００７２】
ペレットから再構築された液体培地中で増殖させることができる細胞株は、真核生物、原核生物、動物、植物、真菌、海藻、昆虫、または酵母細胞、またはウイルスまたはウイルス粒子の培養に使用される細胞であってもよい。例示的な細胞としては、限定されないが、ケラチノサイト、内皮細胞、肝細胞、メラノサイト、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ハイブリドーマ、造血細胞、胚細胞、神経細胞などが挙げられる。
【００７３】
本発明の培地に少量添加されるさらなる構成要素は、必要な場合に含まれていてもよく、または含まれていなくてもよく、例えば、血清または血清画分、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＮＧＦ、インスリンなど）、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、接続因子、細胞外マトリックス要素（例えば、コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、グリソアミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなど）、脂質（例えば、リン脂質、コレステロール、ウシコレステロール濃縮物、脂肪酸、スフィンゴ脂質など）、ペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）、精製されたタンパク質または組換え発現されたタンパク質（例えば、組換えアルブミン、組換えインスリン）、加水分解物（例えば、コメ、酵母、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物）などである。 
【実施例】
【００７４】
特に、添付の特許請求の範囲と共に、本発明の新規な特徴を記載する。  本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を利用する以下の実施例を参照することによって得られるだろう。当業者は、ここに記載した実施例が本教示の単なる態様であり、本教示の範囲をいかなる様式にも限定することを意図したものではないことを理解するだろう。 
【００７５】
細胞培養培地、供給物、補助物質またはバッファーのペレットの製造
本明細書には、細胞培養培地、供給物、バッファーまたは補助物質の乾燥粉末からペレットを製造するための例示的なプロトコルが記載される。本明細書で述べられるこれらの手順および装置で使用される原理は、任意のペレット組成物を得るために当業者によって広く適用されてもよい。
【００７６】
実施例１：微小懸濁物からペレットを製造する手動方法
押出成形プロセスを用いて供給物をペレット化する手動方法をここに提示する。 
１）この実施例では、カタログ生成物Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ  ＡＧＴ（図１および２において、供給物１とも呼ばれる）［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号、凝集物、Ａ２５３０番］が、出発物質となる粉砕したベース粉末であった。３０ｇのＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ  ＡＧＴ（ここではリン酸ナトリウムを使用しなかった）を計量して乳鉢に入れる。配合物にはリン酸塩が含まれている場合がある。 
２）１２．５ｍｌのＷＦＩ（水）を添加する。
３）緑色のプラスチックの柔軟なスパチュラを用い、粉末が濡れ、水を「取り込み」、ペーストを生成し始めるまで混ぜる。均質化のために、ペーストを十分に迅速に混合する。
４）粘性ではあるが流動可能な混合物を製造することが必要な場合には、ＷＦＩを微小懸濁物に加え、十分に混合する。必要な場合には、乳棒と乳鉢を用いて湿式粉砕する。湿式粉砕によって、微小懸濁物がさらに均質になり、激しい混合によって生じる気泡が減る。
５）容器に集める。スパチュラを使用し、最後の量の微小懸濁物を容器に「こそげ取る」（容積は約２９〜３０ｍｌであろう）。 
６）プランジャーが完全に下げられたときに、切断部がプランジャー末端の位置と同じ位置まで離れていないことを確実にしながら、ハサミを用いて末端を約１／６４インチまで切断することによって、０．５ｍｌシリンジを備えるＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｒｅｐｅａｔｅｒ−Ｐｌｕｓを準備する。
７）位置０．５（５μｌ）に設定された、０．５ｍｌシリンジを備えるＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｒｅｐｅａｔｅｒ−Ｐｌｕｓを用い、微小懸濁物をシリンジへとゆっくりと引き上げる。粘性の微小懸濁物中に空気が残って送達される量を変えないように、シリンジの中に空気を吸入しないことを確実にする。 
８）Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆレバーを数回押し下げ、シリンジを準備する。微小懸濁物がシリンジ末端から流出したら、シリンジ末端を拭き取る。次いで、固体疎水性表面（例えば、パラフィンまたはワックス紙）に垂直に近い位置にシリンジ末端を保持し、レバーを押し下げ、この表面に液滴を穏やかに置く。すぐに持ち上げ、レバーを再び押し下げ、これを繰り返す。非常に迅速な様式で、何回か行ってもよい。
９）ドラフトチャンバーに１８〜２４時間入れる。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび凡例を参照。
１０）ペレットを集め、計量皿に入れ、ＣａＳＯ４の上の減圧乾燥チャンバーに置く。 
１１）ペレットを４８〜７２時間乾燥させる。この得られたペレットは、ペレット供給物１、または供給物１、または供給物１のペレットと呼ばれ、これらは時には、相互に置き換え可能に使用される。３．０ｍｌのＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ補助物質から、０．１５６ｇのビーズを製造した。ペレットの写真については、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを参照。ビーズの大きさは、均一のようであり、ミリメートル範囲で測定した。実施例４に記載する生存率、増殖および性能（タンパク質力価）アッセイに、このビーズを使用した。
【００７７】
実施例２：手動で調製した供給物１のペレットの生物学的評価
供給物１のビーズを調製し（実施例１を参照）、細胞生存率、増殖および性能（タンパク質力価）アッセイに使用した。供給物１のペレット／ビーズの結果を、液体補助物質（ポジティブコントロール、すなわち、使用前に液体で再構築され、滅菌濾過されたＡ２５３０番）と比較した。このアッセイのために、ＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株をＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２６８１）の中で増殖させた。培養物は、ペレット形態（時にはビーズと呼ばれる）で、または液体（ポジティブコントロール）として、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（ＥＦＢ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ２５３０）または供給物１が追加されていた／追加されていなかった（示されている通り）。細胞を３日間で３回継代培養し、各継代培養物を用い、細胞を３×１０ｅ５個の生存可能な細胞／ｍｌに分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行った。各条件を３個ずつ実施した（すなわち、曲線１、２、３が、それぞれの種類の補助物質についての３個である）。図２Ａにおいて、手動で調製したペレット（試験サンプル）の生存率を、ビーズ１、２、３の曲線に示す。液体（ポジティブコントロール）の生存率を、液体１、２、３に示す。補助物質を含まないもの（ネガティブコントロール）の生存率をネガティブコントロール１、２、３に示す。ＥＦＢビーズ／ペレットの濃度は、ＥＦＢ液体フォーマットと比較して、等モル濃度であった。図２Ａからわかるように、ビーズ／ペレットＥＦＢを追加した細胞培養物（１、２、３）は、液体ＥＦＢを追加した細胞培養物（１、２、３）と比較して、特に８〜１６日目に良好な生存率％を示した。
【００７８】
供給物１のペレット／ビーズを、細胞増殖アッセイにおいて、液体補助物質（ポジティブコントロール）と比較した（図２Ｂ）。ここでも、ＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２６８１）中のＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株を使用した。細胞を継代培養し、２Ａについて上述したように分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行った。各条件を３個ずつ実施した（すなわち、曲線１、２、３が、それぞれの条件についての３個である）。図２Ｂでは、手動のペレット（試験サンプル）の増殖を、ビーズ１、２、３の曲線に示す。液体（ポジティブコントロール）の増殖曲線を、液体１、２、３に示す。補助物質を含まないもの（ネガティブコントロール）の増殖曲線をネガティブコントロール１、２、３に示す。ＥＦＢビーズ／ペレットの濃度は、ＥＦＢ液体フォーマットと比較して、等モル濃度であった。図２Ｂからわかるように、ビーズ／ペレットを追加した細胞培養物（１、２、３）は、液体を追加した細胞培養物（１、２、３）と比較して、培養１５日間にわたり、遜色ない細胞増殖を示した。
【００７９】
細胞性能またはタンパク質力価アッセイ（抗体産生を測定する）において、供給物１のペレット／ビーズを、液体補助物質（ポジティブコントロール）と比較した（図２Ｃ）。ここでも、ＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２６８１）中のＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株を使用した。細胞を継代培養し、２Ａについて上述したように分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行い、ＩｇＧ産生をモニタリングした。各条件を３個ずつ実施した（すなわち、曲線１、２、３が、それぞれの条件についての３個である）。図２Ｃからわかるように、手動のペレットのタンパク質力価（細胞性能）を、ビーズ１、２、３の曲線に示す。液体（ポジティブコントロール）のタンパク質力価を、液体１、２、３に示す。補助物質を含まないもの（ネガティブコントロール）のタンパク質力価をネガティブコントロール１、２、３に示す。図２Ｃからわかるように、ビーズ／ペレットを追加した細胞培養物１、２、３は、培養１５日間にわたり、約３２５μｇ／ｍｌ（産生）のＩｇＧ産生を示し、これは、ポジティブ液体コントロールＥＦＢ（１、２、３）を用いて約４２５μｇ／ｍｌで産生したＩｇＧよりもわずかに低かった。補助物質が追加されていないネガティブコントロールは、ＥＦＢビーズを追加した細胞培養物（試験）と比較して、かなり低いＩｇＧを示した（約１００μｇ／ｍｌ）。
【００８０】
実施例３：例示的な自動化された流動床ペレット化プロセス
ペレットを製造するための例示的な自動化されたプロセスをここに示す。ここで、ローター技術を流動床装置／処理チャンバー（例えば、Ｇｌａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＪ）に使用した。流動床を取り付けた任意のスピニング処理チャンバーを、細胞培養培地ペレットを製造するように適合させることができる。出発物質となる乾燥粉末（細胞培養培地、供給物など）を、回転によって移動する流動床装置のローターディスクに投入し、流動床装置に空気を流した。この場合、制御された速度で、時には断続的に、制御された温度で注意深く液体を導入し（例えば、微細な噴霧、霧、蒸気、しずく、凝縮または小さな液滴）、その結果、乾燥粉末のペレット生成が起こった。典型的には、ペレットを製造するために、他の自動装置も使用可能である。これらの装置としては、限定されないが、粉砕装置、微粉化装置、流動床プロセッサ、スピニングディスクローター、溶媒のための噴霧機などが挙げられる。培地をペレット化するための例示的なワークフローについては、図８を参照。特定の実施形態では、ペレットを以下のように作成した。 
ａ．粉砕された乾燥ベース粉末（顆粒化していない）から出発する。任意で、ベース粉末は、適切な溶媒で前もって濡らされていてもよい。乾燥粉末は、バインダーおよび／または賦形剤を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。これに加え、噴霧される溶媒は、バインダーおよび／または賦形剤を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。
ｂ．バインダーおよび／または賦形剤が乾燥ベース粉末中に存在しない場合、または、（ベース粉末に存在するよりも）もっと多くのバインダーおよび／または賦形剤が、ペレットを作成するために必要な場合には、噴霧される溶媒溶液は、適切な量のおよび／または賦形剤を含むだろう。  
ｃ．細胞培養供給物のペレットを得るための例示的なプロセスパラメータを本明細書に記載する。これらのパラメータは、試験される配合物について選択された。 
ｉ．噴霧速度：最も好ましくは５ｇｍ／分（噴霧速度の範囲：配合物に依存して、約１ｇｍ／分から約３０ｇｍ／分まで）
ｉｉ．入口温度  ２５℃（２０〜２５℃）
ｉｉｉ．生成物の温度  （２０〜３０℃）（培地／供給物が、温度感受性の構成要素を含むため）
ｉｖ．空気の容積  （３０〜４０ｍ３／ｈｒ）
ｖ．霧化空気圧  ２ｂａｒ 
ｖｉ．流動床プロセッサの中のペレットのための乾燥温度（５０〜６０℃）（培地が、温度感受性の構成要素を含むため）。
【００８１】
実施例４：自動化されたペレット化プロセスに使用される例示的な培地の調製
以下の培地組成物を使用し、自動化されたシステムでペレットを調製した。これらの組成物は、単なる例として役立ち、限定するものと解釈すべきではない。
【００８２】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ生成物ＰＬ００２６１６Ｐ１は、ペレット供給物２、ペレット供給物３、ペレット供給物４およびペレット供給物５を調製するための出発物質となる乾燥ベース粉末であった。以下に記載する例示的な供給物を、ペレット化のために試験した。
2018537113.tif 000004
【００８３】
ペレットは、バインダーおよび／または賦形剤を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよく、これを粉砕したベース粉末とブレンドしてもよく、および／またはこの粉末を用い、処理チャンバーへと噴霧してもよい。以下のペレットを得るために種々の条件を使用した。以下に詳細に記載されるペレット供給物２、ペレット供給物３、ペレット供給物４、およびペレット供給物５。このようにして得られたペレットを、３種類のアッセイで評価した。１）物理的特徴（顕微鏡写真と粒度分布を参照：図３ＡおよびＢ、４ＡおよびＢ、５ＡおよびＢ、ならびに６ＡおよびＢ）；２）ペレット化前後の内容物の分析。供給物のペレットを、化学組成についてＨＰＬＣによって試験し、粉砕した粉末出発物質と比較した。アミノ酸含有量、水溶性ビタミン含有量、疎水性アミノ酸含有量などの培地構成要素のためのＨＰＬＣ分析（データは示していない）は、供給培地中の複数の成分が、ペレット化の間に行った工程と乾燥工程の後に、許容範囲内で残っていることを示していた。供給物２、３、４、および５それぞれについてのペレット化前とペレット化後の分析データは、遜色ないものであった。３）これらの生物学的活性について、細胞培養物中の性能（図３〜７、それぞれの供給物のペレットについて、適用可能な場合にはサブセクションＣを参照）。
【００８４】
培地または供給物のペレットは、細胞培養において種々の用途を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物に使用するための水系培地／供給物懸濁物の調製に、０ミクロンから約５００ミクロン未満の範囲の粒径のペレット粒子を使用してもよい。他の実施形態では、約８００〜約５００ミクロンの範囲の粒径のペレット粒子を、細胞培養物に使用するための複数粒子の培地／供給物錠剤の調製に使用してもよい。さらに別の実施形態では、約５００〜約２０００ミクロンの範囲の粒径のペレット粒子を、細胞培養物に使用するための培地／供給物カプセルの調製に使用してもよい。このようなペレット化された供給物を調製するための例示的な配合を以下に提示する。
2018537113.tif 000005
【００８５】
実施例５：粉末の物理的特徴を測定するための例示的な方法
フロー分析手順のための例示的な方法
この手順を、フロー分析に使用することができ、決定することができる測定値としては、ＦＲＩ（フローレート指数）；ＦＤＩ（供給密度指数）；ＢＤＩ（容器密度指数）およびＳＰＩ（バネ密度指数）が挙げられる。
１．サンプルカップの底部にある支持インサートの上にクランプで固定した適切なメッシュふるいを配置することによって、インジサイザー（ｉｎｄｉｃｉｚｅｒ）（任意のフレーレートインジサイザーシステム、例えば、Ｊｏｈａｎｓｏｎ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ、サンルイスオビスポ、ＣＡ製）のサンプル容器を組み立てる。 
２．適切な秤で、インジサイザーのサンプル容器の風袋を計量する。 
３．約１００グラムのサンプルを適切な容器に入れ、サンプルをスプーンまたはウィスクを用いて混合することによって空気を含ませる。 
４．スパチュラを用い、サンプルの一部を取り出し、そのサンプルを、サンプルが圧縮されるのを避けつつ、組み立てたインジサイザーのサンプル容器に穏やかに入れる。 
５．ペレットサンプルが溢れる／インジサイザーのサンプル容器より上になるまで、サンプルの添加を繰り返す。 
６．過剰量をかき取ることによって、ペレットサンプルの高さを、インジサイザーのサンプル容器の上部と穏やかに合わせる。 
７．既に風袋を計量した秤を用い、インジサイザーのサンプル容器中のペレットサンプルのサンプル重量を計量し、記録する。 
８．サンプル容器をインジサイザーに入れ、サンプル容器に送気管を接続する。 
９．容器角度（Ｂｉｎ  Ａｎｇｌｅ）、出口の直径（Ｏｕｔｌｅｔ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）、容器の直径（Ｂｉｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）について、インジサイザーに対して処理パラメータを設定する。試験が終了した後、インジサイザーの出力を記録する。
【００８６】
安息角を測定するための例示的な手順
１．約５０グラムのサンプルを適切な容器に入れ、サンプルをスプーンまたはウィスクを用いて混合することによって空気を含ませる。 
２．支持プラットフォームの上に長方形の粉末床ボックスをセットする。 
３．支持プラットフォームを０（ゼロ）°に確実に設定し、プラットフォームの底部で読み取る。 
４．材料がこのボックスの少なくとも１つの側壁に接触し、円錐形を形成するまで、漏斗を介し、材料を長方形の粉末床ボックスに注ぐ。 
５．可能な限りなめらかな移動を確保する支持スクリューを用い、サンプル床ボックスとプラットフォームをゆっくりと一定速度で上昇させる。 
６．材料のピークがシフトしたらすぐに、支持スクリューの回転を止め、デバイスの分度器を用いて安息角を測定し、支持プラットフォームの基部で分度器の角度を読み取る。
【００８７】
実施例６：ローター技術を用いた流動床自動ペレット化−ペレット供給物２の生産
供給物２のペレット／ビーズを、以下に記載する自動化されたプロセスで調製した。
１．粉砕された乾燥ベース粉末（顆粒化していない）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１−９５０．０ｇ（正味の重量）を用いて開始する。任意で、ベース粉末は、特定の実施形態では、前もって濡らされていてもよい（ここではしていない）。
２．ローターディスクを取り付けた流動床プロセッサに粉末を入れる。
３．流動床プロセッサの電源を入れ、あらかじめ設定した条件（研究試行の間に特定した）にし、粉末からの直接的なペレット化を開始する。パラメータを制御する（例えば、空気の容積、霧化空気圧、流速、入口温度、出口温度、生成物温度、溶媒噴霧速度、ローターディスクの速度、ディスクギャップ、ディスク形状の空気容積、霧化空気圧流速、入口温度、出口温度、生成物温度、溶媒噴霧速度、ローターディスクの速度、ディスクギャップ、ディスク形状など）。
４．処理中にサンプルを測定する（例えば、顕微鏡  図３Ａ、他の物理的特性＝表２、粒径  図３Ｂおよび以下の表３）ことによって、ペレット形成をモニタリングし、いつ処理が終了するかを決定する。
５．流動床プロセッサから濡れたペレット（合計重量８０５．０ｇ）を取り出す。
６．濡れたペレットを乾燥させ、物理特性分析を行う（表２）。 
７．粒径測定のために約５０．０ｇのペレットを取り出す（表３）。 
【００８８】
自動化方法によるペレット供給物２の物理的特徴の評価
【００８９】
（表２）ペレット供給物２：物理的特徴
2018537113.tif 000006
【００９０】
安息角が５０°より小さい（３４．７）ことは、ペレット供給物２が良好な流動性を有することを示す。バルク密度は、所望な場合には、粒子を圧縮することができることを示す。
【００９１】
（表３）ペレット供給物２：粒径分析
2018537113.tif 000007
【００９２】
供給物２の粒径分析は、粒子の約９５％が６０メッシュより大きく、一方、粒子の約８７．８％が４０メッシュより大きく、すなわち、約８７．８％＞０．４ｍｍであることを示す。
【００９３】
次いで、供給物２のビーズを、細胞生存率、増殖および性能（タンパク質力価）アッセイで評価した。供給物２のペレット／ビーズの結果を、液体補助物質（ポジティブコントロール）、すなわち、使用前に液体で再構築され、滅菌濾過されたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１と比較した。このアッセイのために、ＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株をＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２４９０）の中で増殖させた。培養物に、ペレット形態（時にはビーズと呼ばれる）で、または液体（ポジティブコントロール）として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１を追加した（示されている通り）／追加しなかった。細胞を、３日間かけて第３継代まで培養し、各継代を用い、細胞を３×１０ｅ５個の生存可能な細胞／ｍｌに分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行った。 
【００９４】
自動化された供給物２のペレット／ビーズを、細胞増殖アッセイにおいて、液体補助物質（ポジティブコントロール）と比較した（図３Ｃ）。ビーズ／ペレットを追加した細胞培養物は、液体を追加した細胞培養物と比較して、培養１５日間にわたり、遜色ない細胞増殖を示した。ペレット供給物２は、ポジティブコントロール供給物を追加した細胞培養物（約８×１０ｅ６）よりわずかに大きな約１０×１０ｅ６細胞／ｍｌ（増殖）の生存可能な細胞数を示した。
【００９５】
ペレット供給物２について生存率アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した（図７Ａ）。７Ａのグラフからわかるように、供給物２、３、および４は、特に６日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。 
【００９６】
ペレット供給物２について細胞性能（抗体産生）アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した（図７Ｂ）。グラフ７Ｂからわかるように、供給物２は、特に４日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。ペレット供給物２（約２２９μｇ／ｍｌ）を追加した細胞培養物は、ポジティブコントロール供給物を用いて産生した約２２８μｇ／ｍｌ（１４日目）のＩｇＧと遜色ないＩｇＧ産生度を示した。補助物質を追加していない細胞培養物アッセイ（ネガティブコントロール）は、ペレット供給物２を追加した細胞培養物と比較して、かなり低いＩｇＧ（約１００μｇ／ｍｌ）を示した。
【００９７】
実施例７：ローター技術を用いた、自動化された流動床ペレット化−ペレット供給物３の生産
供給物３のペレット／ビーズを、以下に記載する自動化されたプロセスで調製した。
１．粉砕された乾燥ベース粉末（顆粒化していない）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１−９５０．０ｇ（正味の重量）を用いて開始する。任意で、ベース粉末は、特定の実施形態では、前もって濡らされていてもよい（ここではしていない）。
２．ローターディスクを取り付けた流動床プロセッサに粉末を入れる。
３．流動床プロセッサの電源を入れ、あらかじめ設定した条件（研究試行の間に特定した）にし、粉末からの直接的なペレット化を開始する（例えば、空気の容積、霧化空気圧、流速、入口温度、出口温度、生成物温度、溶媒噴霧速度、ローターディスクの速度、ディスクギャップ、ディスク形状など）。
４．処理中にサンプルを測定する（例えば、顕微鏡  図４Ａ、他の物理的特性＝表４、粒径  図４Ｂおよび以下の表５）ことによって、ペレット形成をモニタリングし、いつ処理が終了するかを決定する。流動床プロセッサから濡れたペレット（合計重量７７０．０ｇ）を取り出す。
５．濡れたペレットを乾燥させ、物理特性分析を行う（表４）。 
６．粒径測定のために約５０．０ｇのペレットを取り出す（表５）。
【００９８】
（表４）ペレット供給物３：粒径分析
2018537113.tif 000008
【００９９】
安息角が５０°より小さい（３４．９）ことは、ペレット供給物３が良好な流動性を有することを示す。バルク密度は、所望な場合には、粒子を圧縮することができることを示す。
【０１００】
（表５）ペレット供給物３：粒径分析
2018537113.tif 000009
【０１０１】
供給物３の粒径分析は、粒子の約８８．７％が６０メッシュより大きく、一方、粒子の約６９．９％が４０メッシュより大きく、すなわち、約６９．９％＞０．４ｍｍであることを示す。
【０１０２】
次いで、供給物３のビーズを、供給物２とまったく同じように、細胞生存率、増殖および性能（タンパク質力価）アッセイで評価した。供給物３のペレット／ビーズの結果を、液体補助物質（ポジティブコントロール、すなわち、使用前に液体で再構築され、滅菌濾過されたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１）と比較した。このアッセイのために、供給物２とまったく同じように、ＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株をＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２４９０）の中で増殖させた（供給物２のペレット＝ペレット化試行１、供給物３のペレット＝ペレット化試行２）。細胞を、３日間かけて第３継代まで培養し、各継代を用い、細胞を３×１０ｅ５個の生存可能な細胞／ｍｌに分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行った。 
【０１０３】
自動化された供給物３のペレット／ビーズを、細胞増殖アッセイにおいて、液体補助物質（ポジティブコントロール）と比較した（図４Ｃ）。ペレット供給物３を追加した細胞培養物は、特に、ネガティブコントロールと比較して（７日目以降）、培養物中、１４日間にわたって、ポジティブコントロールと遜色ない細胞増殖を示した。ペレット供給物３は、ポジティブコントロール供給物を追加した細胞培養物（約８×１０ｅ６）よりわずかに大きな約９×１０ｅ６細胞／ｍｌ（増殖）の生存可能な細胞数を示した。
【０１０４】
ペレット供給物３について生存率アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した（図７Ａ）。７Ａのグラフからわかるように、供給物２、３は、特に６日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。 
【０１０５】
ペレット供給物２、３、および４について細胞性能（抗体産生）アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した（図７Ｂ）。グラフからわかるように、供給物３は、特に４日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。ペレット供給物３（約２４３μｇ／ｍｌ）を追加した細胞培養物は、ポジティブコントロール供給物を用いたものよりもわずかに高いＩｇＧ産生度を示した。補助物質を追加していない細胞培養物アッセイ（ネガティブコントロール）は、ペレット供給物３を追加した細胞培養物と比較して、かなり低いＩｇＧ（約１００μｇ／ｍｌ）を示した。
【０１０６】
実施例８：ローター技術を用いた、自動化された流動床ペレット化−ペレット供給物４の生産
供給物４のペレット／ビーズを、以下に記載する自動化されたプロセスで調製した。
１．バインダー、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（正味の重量４００．０ｇ）ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ  Ｔｙｐｅ  ＰＨ−１０１、Ｌｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１１４８２６５４８とブレンドした、粉砕された乾燥ベース粉末（顆粒化していない）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１−６００．０ｇ（正味の重量）を用いて開始した。  
２．ローターディスクを取り付けた流動床プロセッサに、ブレンドした粉末を入れた。
７．流動床プロセッサの電源を入れ、あらかじめ設定した条件（研究試行の間に特定した）にし、粉末からの直接的なペレット化を開始した（例えば、空気の容積、霧化空気圧、流速、入口温度、出口温度、生成物温度、溶媒噴霧速度、ローターディスクの速度、ディスクギャップ、ディスク形状など）。
３．処理中にサンプルを測定する（例えば、顕微鏡  図５Ａ、他の物理的特性＝表６、分析：粒径  図５Ｂおよび以下の表７）ことによって、ペレット形成をモニタリングし、いつ処理が終了するかを決定する。 
４．流動床プロセッサから濡れたペレット（合計重量８２４．１ｇ）を取り出す。
５．濡れたペレットを乾燥させ、物理特性分析を行う（表６）。 
６．粒径測定のために約５０．０ｇのペレットを取り出す（表７）。
【０１０７】
（表６）ペレット供給物４：物理的特徴
2018537113.tif 000010
【０１０８】
安息角が５０°より小さい（４３）ことは、ペレット供給物４が良好な流動性を有することを示す。バルク密度は、所望な場合には、粒子を圧縮することができることを示す。
【０１０９】
（表７）ペレット供給物４：粒径分析
2018537113.tif 000011
【０１１０】
供給物４の粒径分析は、粒子のわずか約３８．５％が６０メッシュより大きく、一方、粒子のわずか約１５％が４０メッシュより大きく、すなわち、約１５％のみ＞０．４ｍｍであることを示す。粒径の広がりは大きく、多くの粒子が、小さい粒径を有していた。
【０１１１】
供給物４のビーズを、供給物２および供給物３とまったく同じように、細胞生存率、増殖および性能（タンパク質力価）アッセイで評価した。供給物４のペレット／ビーズの結果を、液体補助物質（ポジティブコントロール、すなわち、使用前に液体で再構築され、滅菌濾過されたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１）と比較した。このアッセイのために、ＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株をＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２４９０）の中で増殖させた。細胞を、３日間かけて第３継代まで培養し、各継代を用い、細胞を３×１０ｅ５個の生存可能な細胞／ｍｌに分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行った。 
【０１１２】
さらなるバインダー（結晶性セルロース）を含む自動化された供給物４のペレット／ビーズを、細胞増殖アッセイにおいて、液体補助物質（ポジティブコントロール）と比較した（図５Ｃ）。ペレット供給物４を追加した細胞培養物は、特に、ネガティブコントロールと比較して（７日目以降）、培養物中、１４日間にわたって、ポジティブコントロールと遜色ない細胞増殖を示した。 
【０１１３】
ペレット供給物４について生存率アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した（図７Ａ）。７Ａのグラフからわかるように、供給物２、３、および４は、特に６日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりも良好であり、十分に遜色ないものであった。 
【０１１４】
ペレット供給物４（バインダーセルロースを含む）について細胞性能（抗体産生）アッセイを行い、ポジティブコントロール（液体供給物を追加）またはネガティブコントロール（液体またはペレット補助物質の追加がない）と比較した（図７Ｂ）。グラフからわかるように、供給物４は、特に４日後に、ポジティブコントロールと同様、ネガティブコントロールよりもはるかに良好であり、十分に遜色ないものであった。ペレット供給物４（約２００μｇ／ｍｌ）を追加した細胞培養物は、ポジティブコントロール供給物を用いたものよりもわずかに低いＩｇＧ産生度を示した。一方、補助物質を追加していない細胞培養物アッセイ（ネガティブコントロール）は、任意のペレット供給物４を追加した細胞培養物と比較して、かなり低いＩｇＧ（約１００μｇ／ｍｌ）を示した。
【０１１５】
実施例９：ローター技術を用いた、自動化された流動床ペレット化−ペレット供給物５の生産
供給物５のペレット／ビーズを、以下に記載する自動化されたプロセスで調製した。
１．粉砕された乾燥ベース粉末Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１−９５０．０ｇ（正味の重量）を用いて開始した。
２．ローターディスクを取り付けた流動床プロセッサに粉末を入れた。
３．流動床プロセッサの電源を入れ、あらかじめ設定した条件（研究試行の間に特定した）にし、粉末からの直接的なペレット化を開始した（例えば、空気の容積、霧化空気圧、流速、入口温度、出口温度、生成物温度、溶媒噴霧速度、ローターディスクの速度、ディスクギャップ、ディスク形状など）。
４．処理中にサンプルを測定する（例えば、顕微鏡  図６Ａ、他の物理的特性＝表８、粒径  図６Ｂおよび以下の表９）ことによって、ペレット形成をモニタリングし、いつ処理が終了するかを決定する。 
５．流動床プロセッサから濡れたペレット（合計重量８２４．１ｇ）を取り出す。
６．濡れたペレットを乾燥させ、物理特性分析を行う（表８）。 
７．粒径測定のために約５０．０ｇのペレットを取り出す（表９）。
【０１１６】
（表８）ペレット供給物５：物理的特徴
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【０１１７】
安息角が５０°より小さい（３４．９）ことは、ペレット供給物５が良好な流動性を有することを示す。バルク密度は、所望な場合には、粒子を圧縮することができることを示す。
【０１１８】
（表９）ペレット供給物５：粒径分析
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【０１１９】
供給物５の粒径分析は、粒子の約８３．７％が６０メッシュより大きく、一方、粒子の約２７．３％が４０メッシュより大きく、すなわち、約２７．３％＞０．４ｍｍであることを示す。
【０１２０】
次いで、供給物５のビーズを、供給物２、３、４とまったく同じように、細胞生存率、増殖および性能（タンパク質力価）アッセイで評価した（データは示していない）。このアッセイのために、ＤＧ４４−ＩｇＧ細胞株をＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２４９０）の中で増殖させた。細胞を、３日間かけて第３継代まで培養し、各継代を用い、細胞を３×１０ｅ５個の生存可能な細胞／ｍｌに分けた。第４継代で、毎日の細胞数計測を行った。供給物５のペレット／ビーズの結果を、液体補助物質（ポジティブコントロール、使用前に液体で再構築され、滅菌濾過されたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＬ００２６１６Ｐ１）と比較した。 
【０１２１】
ペレット供給物５を追加した細胞培養物は、供給物２、３、および４の結果と同様に、培養物中、１４日間にわたって、ポジティブコントロールと同様の細胞増殖アッセイ、細胞生存率アッセイ、細胞性能（抗体産生）アッセイを得た（データは示していない）。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、当業者にとって、このような実施形態が、単なる例として与えられていることは明らかであろう。多くの改変、変形および置き換えが、本発明から逸脱することなく、当業者によってなされるだろう。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する種々の変更を本発明を実施する際に使用してもよいことが理解されるべきである。  以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、およびこれらの等価物が、特許請求の範囲によって包含されることを意図している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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