(57)【要約】本発明は、胆管前駆細胞（ＣＰ）の効率的な生成に関する。前腸幹細胞（ＦＳＣ）を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地中で培養して、肝芽細胞集団を生成する。次いで、肝芽細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中で培養して、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成する。胆管前駆細胞（ＣＬ）を、総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞の機能的特性を示す胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）へと成熟させ得る。方法、キット、細胞集団、及びこれらの細胞集団の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とＴＧＦβシグナル伝達阻害剤とを含む肝細胞誘導培地中で前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を培養して、肝芽細胞集団を生成する工程、及び
（ｉｉ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中で肝芽細胞を培養して、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成する工程
を含む、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成するための方法。
【請求項２】
肝細胞誘導培地が、ＢＭＰとＴＧＦβシグナル伝達阻害剤とを含む化学的に定義された栄養培地である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝細胞誘導培地が、骨形成タンパク質ＢＭＰ及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の追加された基礎培地からなる、化学的に定義された栄養培地である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ＦＳＣが、肝細胞誘導培地中で２〜６日間培養される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＨＢがＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＴＢＸ３、及びＣＫ１９を発現する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
胆管細胞誘導培地が、ＦＧＦ、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む、化学的に定義された栄養培地である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
胆管細胞誘導培地が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸及びＴＧＦβリガンドの追加された化学的に定義された栄養培地からなる、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ＴＧＦβリガンドがアクチビンである、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ＨＢが、胆管細胞誘導培地中で２〜６日間培養される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ＣＰがＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ及びＳｏｘ９を発現する、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
（ｉｉｉ）上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地中でＣＰを培養して、ＣＬＣ集団を生成する工程
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ＣＰが、胆管細胞成熟培地中、３次元培養で培養される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
胆管細胞成熟培地が、足場マトリックスを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
足場マトリックスが、ヒドロゲルを形成する１つ以上の細胞外マトリック成分を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
胆管細胞成熟培地が、足場マトリックスと、ＥＧＦの追加された化学的に定義された栄養培地からなる、請求項１４又は請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＣＬＣが、胆管細胞成熟培地中で１つ以上のオルガノイドを形成する、請求項１２〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ＣＬＣが、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、ガンマグルタミル−トランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）、ノッチ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩及び胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２を発現する、請求項１２〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ＣＬＣが、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１により媒介される分泌、セクレチン及びソマトスタチンに対する生理学的応答、胆汁酸の排出、ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する生理学的応答、及びＶＥＧＦに応答した増加した増殖を示す、請求項１２〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ＦＳＣ集団が、
（ａ）ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む内胚葉誘導培地中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を培養して、胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）集団を生成する工程；
（ｂ）ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中でＤＥＣを培養し、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を生成する工程
を含む方法によって生成される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ＰＳＣがヒトＰＳＣ細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＰＳＣがＩＰＳＣである、請求項２０又は請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ｉＰＳＣが、個体から得られた前駆細胞から誘導される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
内胚葉誘導培地が、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＧＳＫ−３β阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤の追加された化学的に定義された栄養培地からなる、請求項２０〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
ＴＧＦβリガンドがアクチビンであり、ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、及び／又はＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＤＥＣが、以下の１つ以上の内胚葉関連マーカー：Ｓｏｘ１７、ｆｏｘＡ２、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、エオメソデルミン（エオメス）、Ｍｉｘｌ１、ＨＮＦ−３β、ケルベロス、ＯＴＸ４、グーセコイド、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＨｅｘを発現する、請求項２０〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前腸誘導培地が、ＴＧＦβリガンドの追加された化学的に定義された栄養培地からなる、請求項２０〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ＴＧＦβリガンドがアクチビンである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＦＳＣが、以下の１つ以上のマーカー：ＳＯＸ２、ＨＨＥＸ、ＨＯＸＡ３、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１β、ＧＡＴＡ４、Ｃｅｒ、ＨＮＦ６を発現する、請求項２０〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
分化中の細胞集団における１つ以上の細胞マーカーの発現をモニタリング及び／又は検出する工程を含む、請求項１〜２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を増やす工程を含む、請求項１〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を培養又は維持する工程を含む、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を保存する工程を含む、請求項１〜３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を治療的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、請求項１〜３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項記載の方法によって生成される単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団。
【請求項３６】
ＣＬＣがオルガノイドの形態である、請求項３５記載の単離された集団。
【請求項３７】
ＣＬＣが、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＬ１９、ＨＮＦ１Ｂ、ガンマグルタミル−トランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）、ノッチ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩及び胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２を発現する、請求項３５又は請求項３６記載の単離された集団。
【請求項３８】
ＣＬＣが、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１により媒介される分泌、セクレチン及びソマトスタチンに対する生理学的応答、胆汁酸の排出、ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する生理学的応答、及びＶＥＧＦに応答した増加した増殖を示す、請求項３５〜３７のいずれか一項記載の単離された集団。
【請求項３９】
前記の単離されたＣＰ又はＣＬＣは、疾患に関連した遺伝子型及び／又は表現型を有する、請求項３５〜３９のいずれか一項記載の単離された集団。
【請求項４０】
前記の単離されたＣＰ又はＣＬＣが、該ＣＬＣ集団における異常な胆汁酸輸送；ＡＴＰ又はアセチルコリンに対する異常な応答；増加したアポトーシス；異常な遺伝子発現；ＶＥＧＦに対する異常な応答；タンパク質凝集又は重合；小胞体へのタンパク質の捕捉；ＡＬＰ活性又はＧＧＴ活性；セクレチン又はソマトスタチンに対する異常な応答；低減した又は異常なオルガノイド形成；異常なＣＦＴＲ活性又は異常なＭＤＲ１活性、の１つ以上を示す、請求項３９記載の単離された集団。
【請求項４１】
胆管障害の処置に使用するための請求項３５〜３８のいずれか一項記載の単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団。
【請求項４２】
請求項３５〜３８のいずれか一項記載の単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団をそれを必要とする個体に投与する工程を含む、胆管障害患者の処置法。
【請求項４３】
請求項３５〜４０のいずれか一項記載のＣＰ集団又はＣＬＣ集団を試験化合物と接触させる工程、及び；
該ＣＰ又はＣＬＣに対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対する該ＣＰ又はＣＬＣの効果を決定する工程
を含む、化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４４】
増殖、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１により媒介される分泌、セクレチン及び／又はソマトスタチンに対する応答性、胆汁酸の排出、ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送、並びにＡＴＰ、アセチルコリン、及びＶＥＧＦに対する応答性、の１つ以上に対する試験化合物の効果、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
個体から得られた細胞の試料からｉＰＳＣ集団を生成する工程、
請求項１〜３４のいずれか一項の方法を使用してｉＰＳＣから単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を生成する工程；及び
単離されたＣＰ又はＣＬＣの表現型を決定する工程
を含む、胆管障害について個体を試験する方法であって、単離されたＣＰ又はＣＬＣにおける胆管障害に関連した表現型の存在は、該個体が胆管障害を有することを示す、該方法。
【請求項４６】
異常な胆汁酸の輸送；ＡＴＰ又はアセチルコリンに対する異常な応答；増加したアポトーシス；オルガノイド形成又は管形成の欠如；異常な遺伝子発現；ＶＥＧＦに対する異常な応答；タンパク質凝集又は重合；小胞体へのタンパク質の捕捉；ＡＬＰ活性又はＧＧＴ活性；セクレチン又はソマトスタチンに対する異常な応答；正常な細胞と比較して異常なＣＦＴＲ活性又は異常なＭＤＲ１活性、の１つ以上の存在が、単離されたＣＰ又はＣＬＣにおいて決定される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地、並びに場合により
上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地
を含む、ＣＰ集団又はＣＬＣ集団の生成のためのキット。
【請求項４８】
培養培地のセットが、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞培養培地、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地、並びに場合により
上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地
を含む、ＣＰ又はＣＬＣの生成のための培養培地のセットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、例えば、薬物スクリーニング及び疾患モデリングに使用するための、胆管細胞、胆管前駆細胞、及び胆管細胞様細胞のインビトロにおける生成に関する。
【０００２】
背景
胆管細胞は、遺伝性胆管症（嚢胞性線維症を伴う胆管症）、発達性胆管症（アラジール症候群）、自己免疫性胆管症（原発性胆汁性肝硬変）から、薬物又は毒素により誘発される疾患（１）にわたる、胆管症として知られる多種多様な胆管障害群の主な標的を成す。胆管症は著しい罹患率及び死亡率を有し、成人肝移植の最大３分の１及び小児肝移植の７０％超の主な原因となる（２）。それらの影響にも関わらず、原発組織に近づきにくいこと、インビトロにおいて一次胆管細胞を培養及び維持することが困難であること、並びに動物モデルの生理学的限界により、胆管症の病態生理への洞察は制限される（３）。
【０００３】
ヒト人工多能性幹細胞（ｈＩＰＳＣ）は、このような難題を克服するための独特な機会を提示する（４）。実際に、それらがインビトロにおいて無限に増殖しそして広範な細胞型へと分化することができることにより、それらはインビトロにおける疾患モデリングにとって理想的なものとなる（５）。しかしながら、胆管障害の研究のためのｈＩＰＳＣの橋渡し能は、ｈＩＰＳＣ由来の胆管細胞の生成における難題によって有意に制限される。実際に、現在のプロトコールは低い分化効率（３１％未満）を示し（６）、一方、全遺伝子発現分析は、ｈＩＰＳＣ由来の胆管細胞と一次胆管組織との間のかなりの差を強調する（６）。さらに、インビトロで生成された胆管細胞は、酵素（ガンマグルタミル−トランスフェラーゼ（ＧＧＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））活性、ホルモン刺激（セクレチン及びソマトスタチン）に対する応答、及び塩化物イオン輸送（ＣＦＴＲ機能）などの、それらのインビボにおける相当物の重要な機能を再現できない（６〜８）。これらの特性は、胆管症の病気発生を再現するために又は治療剤の効果を研究するために必須である。最後に、現在の系はインビボにおける胆管の発生を制御する生理学的経路から逸脱し（６〜８）、これが胆管の特異化及び分化の機序を調べる発生研究におけるそれらの価値を制限する。結果として、疾患モデリング及び薬物スクリーニングに対するｈＩＰＳＣ由来胆管細胞の医学的及び薬学的適用はまだ可能ではない。
【０００４】
要約
本発明者らは、総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞の機能的特性を示す胆管前駆細胞（ＣＰ）及び胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）の効率的な生成プロセスを開発した。
【０００５】
本発明の態様は、
（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とＴＧＦβシグナル伝達阻害剤とを含む肝細胞誘導培地中で前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を培養して、肝芽細胞集団を生成する工程、及び
（ｉｉ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中で肝芽細胞を培養して、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成する工程
を含む、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成するための方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様は、（ｉ）ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む内胚葉誘導培地中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を培養して、胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）集団を生成する工程；
（ｉｉ）ＴＧＦβリガンドを含む前腸細胞誘導培地中でＤＥＣを培養し、前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を生成する工程、
（ｉｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地中でＦＳＣ集団を培養し、肝芽細胞（ＨＢ）集団を生成する工程、並びに
（ｉｖ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中でＨＢ集団を培養して、ＣＰ集団を生成する工程
を含む、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成するための方法を提供する。
【０００７】
前記方法はさらに、胆管前駆細胞（ＣＰ）を胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）へと成熟させる工程を含み得る。
【０００８】
本発明の別の態様は、
（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地中でＦＳＣ集団を培養し、肝芽細胞集団を生成する工程、
（ｉｉ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中で肝芽細胞を培養し、ＣＰ集団を生成する工程、並びに
（ｉｉｉ）上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地中でＣＰを培養し、ＣＬＣ集団を生成する工程
を含む、胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）集団を生成するための方法を提供する。
【０００９】
集団中のＣＬＣは、胆管細胞成熟培地中で１つ以上のオルガノイドを形成し得る。
【００１０】
好ましくは、ＣＰを、胆管細胞成熟培地中で３次元培養で培養する。
【００１１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって生成されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を提供する。
【００１２】
本明細書に記載の方法によって生成されたＣＰ又はＣＬＣは、正常な表現型、又は胆管障害の１つ以上の病態、特徴、若しくは特色を含む表現型を示し得る。
【００１３】
本発明の別の態様は、胆管障害の処置に使用するための、本明細書に記載の方法によって生成されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって生成された単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団をそれを必要とする個体に投与する工程を含む、胆管障害患者を処置する方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、
本明細書に記載の方法によって生成されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を試験化合物と接触させる工程、並びに；
該ＣＰ若しくはＣＬＣに対する試験化合物の効果、及び／又は試験化合物に対する該ＣＰ若しくはＣＬＣの効果を決定する工程
を含む、化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、
個体から得られた細胞の試料からｉＰＳＣ集団を生成する工程、
上記に示された本発明の態様の方法を使用してｉＰＳＣから単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を生成する工程、及び
単離されたＣＰ又はＣＬＣの表現型を決定する工程
を含む、胆管障害について個体を試験する方法を提供する。
【００１７】
胆管障害に関連した表現型を有する単離されたＣＰ又はＣＬＣの存在は、個体が胆管障害を有することを示し得る。
【００１８】
本発明の別の態様は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地、並びに場合により
上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地
を含む、ＣＰ又はＣＬＣの生成のためのキットを提供する。
【００１９】
本発明の別の態様は、
培養培地のセットが、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地、並びに場合により
上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地
を含む、ＣＰ又はＣＬＣの生成のための培養培地のセットの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｈＩＰＳＣを胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）へと分化させるために使用されるプロトコールの概観を示す。ＤＥ：胚体内胚葉、ＦＰ：前腸前駆細胞、ＨＢ：肝芽細胞、ＨＣ：ＣＰ又はＣＬＣ、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２、ＲＡ：レチノイン酸。
【図２】図２は、胆管細胞の重要な分化段階におけるｈＩＰＳＣ由来細胞及び一次胆管細胞（ＰＣ）の遺伝子発現プロファイルを示す。各分化段階においてｎ＝４の生理学的複写物。ＰＣにおいてはｎ＝３の独立した試料。エラーバーは、標準偏差を示す。アステリスクはＨＢとＣＰとＣＬＣとの間の統計学的有意差を示す（多重比較のためにチューキー補正された一元分散分析）。
【図３】図３は、（左）ＣＬＣオルガノイドの管腔を横断するＭＤＲ１の蛍光基質であるローダミン１２３の蛍光強度測定値、及び、（右）ベラパミルの存在下（＋ＶＥＲ）又は非存在下（−ＶＥＲ）においてバックラウンドに対して正規化された管腔内蛍光強度平均値を示す。ｎ＝５９９回の測定、Ｐ＝２．９９×１０−５（両側ｔ検定）。
【図４】図４は、（左）ＣＬＣオルガノイドの管腔を横断する蛍光胆汁酸コリル−リシル−フルオレセイン（ＣＬＦ）の蛍光強度測定値、及び、（右）バックグラウンドに対して正規化された管腔内蛍光強度平均値を示す。ｎ＝１１６３回の測定、Ｐ＜１×１０−１８（両側ｔ検定）。示されたデータは、３回の異なる実験の代表である。
【図５】図５は、カルシウム指示薬のＦｌｕｏ−４のローディングされたＣＬＣオルガノイドの蛍光強度測定値を示し、これはＡＴＰ及びアセチルコリンを用いての刺激後の細胞内カルシウムレベルの上昇を実証する。ＡＴＰを用いて刺激された播種された一次胆管細胞を陽性対照として使用する。灰色の領域は１ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【図６】図６は、ＶＥＧＦの存在下及び非存在下における開始時の細胞数に対する変化倍数を示し、これはＶＥＧＦがＣＬＣの増殖を促進することを実証する。Ｐｒｉｍ．Ｃｈｏｌ．播種された一次胆管細胞、ｎ＝１０、ｐ＝４．７７×１０−１７（ＣＬＣ）、ｐ＝４．６３×１０−１７（Ｐｒｉｍ．Ｃｈｏｌ．）（両側ｔ検定）。
【図７】図７は、ＣＬＣオルガノイドによって示されるＧＧＴ活性を示す。ＭＥＦ：マウス胚フィーダー、ｎ＝３、全ての比較においてｐ＜０．０００１（多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）。
【図８】図８は、ＳＢ−４３１５４２の存在下及び非存在下においてマトリゲル中でＣＰを培養した後のＣＬＣオルガノイドの数を示し、これはアクチビンシグナル伝達阻害に続発したオルガノイド形成の抑制を実証する。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝４）。
【図９】図９は、ＣＬＣオルガノイド対Ｌ−６８５，４５８の存在下においてマトリゲル中で培養されたＣＰにおける、ＪＡＧ１、ノッチ２、及びノッチの下流標的であるＨＥＳ１の発現の定量ＰＣＲ分析を示し、これはＬ−６８５，４５８に応答したこのマーカーの減少した発現を実証する。ｎ＝４。エラーバーは標準偏差を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（両側ｔ検定）。
【図１０】図１０は、Ｌ−６８５，４５８の存在下及び非存在下においてマトリゲル中でＣＰを培養した後のＣＬＣオルガノイドの数を示し、これはノッチシグナル伝達阻害後のオルガノイド形成の有意な減少を実証する。エラーバーは標準偏差を示す。ｎ＝４。
【図１１】図１１は、ＣＬＣオルガノイド直径に対する、セクレチン（ＳＣ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、オクトレオチド（ＯＣＴ）及びセクレチンとオクトレオチドの組合せの効果を示す。エラーバーは標準誤差を示す。ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）。
【図１２】図１２は、セクレチンによる処置は、ＣＬＣオルガノイド中のｃＡＭＰレベルを増加させるが、ソマトスタチン及びオクトレオチドによる処置は減少させることを示す。エラーバーは標準誤差を示す。ｎ＝３。アステリスクは、統計学的有意差を示す（多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）。
【図１３】図１３は、ＰＬＤ−ＣＬＣにおける胆管マーカーの発現を実証した定量ＰＣＲを示す。アステリスクはＨＢとＣＰとＣＬＣとの間の統計学的有意差を示す（多重比較のためのテューキー補正を含む一元分散分析）。
【図１４】図１４は、オクトレオチド又はセクレチンとオクトレオチドの組合せを用いての処置前及び処置後におけるＰＬＤ−ＣＬＣオルガノイドの直径の測定を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）。示されたデータは３回の異なる実験の代表である。
【図１５】図１５は、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者から得られたｈＩＰＳＣを使用した、インビトロにおけるＣＦ肝疾患のモデリングを示す。左パネルは、ＣＦ−ｈＩＰＳＣから生成されたＣＬＣオルガノイド（ＣＦ−ＣＬＣ）の定量ＰＣＲ分析を示し、これは胆管マーカーの発現を実証する。アステリスクはＨＢとＣＰとＣＬＣとの間の統計学的差を示す（多重比較のためのテューキー補正を含む一元分散分析）。右パネルはＣＦ−ＣＬＣオルガノイドがＧＧＴ活性を示すことを示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）。
【図１６】図１６は、最も低い強度値に対して正規化されたＭＱＡＥの蛍光強度を示す。ＭＱＡＥの蛍光は塩化物イオンの存在下で消光するが、硝酸イオンによっては影響を受けない。細胞外塩化物イオンレベルに応答した細胞内又は管腔内塩化物イオンレベルの変化は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の機能の存在に依存する。ＭＱＡＥの蛍光は、細胞外塩化物イオンを枯渇させる硝酸イオンの負荷に応答して増加し、ＶＸ８０９を用いて処置されたｗｔ−及びＣＦ−ＣＬＣにおいては塩化物イオンに応答して減少し、しかしながら、ＣＦ−ＣＬＣ、及びＶＸ８０９＋ＣＦＴＲ阻害剤−１７２を用いて処置されたＣＦ−ＣＬＣにおいては両方の負荷に応答しない。
【図１７】図１７は、オルガノイド直径平均値に対するＶＸ８０９による処置の効果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。ｎ＝８。Ｐ＝０．００１、（両側ｔ検定）。トリミングされた画像は１つの嚢胞を含むが、代表である。示された全てのデータは３回の異なる実験の代表である。
【図１８】図１８は、（右）ＡＴＰ又はアセチルコリンを通したカルシウム刺激に応答したＣＬＣの比率を示す。ｎ＝４。エラーバーは、標準偏差、及び（左）セクレチン又はソマトスタチンによる刺激に応答したＣＬＣオルガノイドの比率を示す。ｎ＝４。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１９】図１９は、各々の重要なＣＬＣ分化段階についての適切なマーカーを発現している細胞の数を示し、１×１０６個のｈＩＰＳＣの出発集団から５７．８×１０６個の成熟した（ＣＫ７＋／Ｓｏｘ９＋）ＣＬＣが生成されたことを実証する。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、インビトロにおける前腸幹細胞（ＦＳＣ）からの胆管前駆細胞（ＣＰ）の生成に関する。
【００２２】
ＦＳＣ集団は慣用的な入手源から得ることができるか、又はインビトロにおいて多能性幹細胞集団から生成され得る。ＦＳＣを、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地中での培養によって肝芽細胞へと分化させる。次いで、得られた肝芽細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中での培養によってＣＰへと分化させる。得られたＣＰを胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）へと成熟させ得る。
【００２３】
各工程における細胞集団の分化は、一連の分化因子の追加された培養培地中において細胞を培養することによって誘導される。各培養培地について列挙された分化因子のセットは好ましくは網羅的であり、そして培地は、他の分化因子を欠いていてもよい。
【００２４】
分化因子は、哺乳動物細胞における分化を媒介するシグナル伝達経路を調節する、例えば促進又は阻害する因子である。分化因子としては、増殖因子、サイトカイン、及びアクチビン／ノダル、ＦＧＦ、Ｗｎｔ又はＢＭＰシグナル伝達経路の１つ以上を調節する阻害剤が挙げられ得る。分化因子の例としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ、レチノイン酸、ＴＧＦβリガンド、ＧＤＦ、ＬＩＦ、ＩＬ、ＧＳＫ−３阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤が挙げられる。
【００２５】
本明細書に記載の１つ以上の培地に使用される分化因子としては、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、及びレチノイン酸が挙げられる。分化因子は、本明細書に記載の培地中に、培地中で培養された細胞のシグナル伝達経路を調節するのに有効な量で存在し得る。
【００２６】
各工程の最中における細胞集団の分化度は、分化中の細胞の集団における１つ以上の細胞マーカーの発現をモニタリング及び／又は検出することによって決定され得る。例えば、より分化した細胞型に特徴的なマーカーの発現の上昇、又はあまり分化していない細胞型に特徴的なマーカーの発現の減少を決定し得る。細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学法、免疫蛍光法、ＲＴ−ＰＣＲ、イムノブロット、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及び酵素的分析をはじめとする任意の適切な技術によって決定され得る。
【００２７】
各工程後に、その工程によって生成された部分的に分化した細胞の集団は、他の細胞型を全く含まなくても又は実質的に含まなくてもよい。例えば、該集団は、培地中での培養後に、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上の部分的に分化した細胞を含有し得る。好ましくは、細胞集団は、他の細胞型を十分に含まず、よって精製は全く必要とされない。必要であれば、部分的に分化した細胞の集団を、ＦＡＣＳなどの任意の慣用的な技術によって精製してもよい。
【００２８】
本明細書に記載の方法の工程によって生成された部分的に分化した細胞の集団は、次の分化工程の前に培養、維持、又は増やすことができる。部分的に分化した細胞を、任意の慣用的な技術によって増殖させ得る。
【００２９】
細胞は、特記されない限り、フィブロネクチン、ラミニン、又はコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた基材上で、フィーダー細胞の非存在下において、単層で培養され得る。例えば、いくつかの実施態様では、細胞を足場マトリックスに包埋し、そして胆管細胞成熟のために３次元培養条件下で培養し得る。細胞培養に適した技術は、当技術分野において周知である（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451; Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293, Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430) Basic Cell Culture Protocols’ by J. Pollard and J. M. Walker (1997), ‘Mammalian Cell Culture: Essential Techniques’ by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997), ‘Human Embryonic Stem Cells’ by A. Chiu and M. Rao (2003), Stem Cells: From Bench to Bedside’ by A. Bongso (2005), Peterson & Loring (2012)Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide  Academic Press and ‘Human Embryonic Stem Cell Protocols’ by K. Turksen（2006）を参照されたい）。培地及びその成分は業者（例えばギブコ社、ロシュ社、シグマ社、Europa bioproducts社、Ｒ＆Ｄシステムズ社）から得ることができる。上記の培養工程のための標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば、３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素を使用し得る。培地は好ましくは、２日間毎に交換し、そして細胞を重力によって沈殿させた。
【００３０】
本明細書に記載の方法において、ＣＰ及びＣＬＣの集団は、前腸幹細胞（ＦＳＣ）から生成される。ＦＳＣは、膵臓、肝臓及び肺の系統の内胚葉細胞へと分化するその能力において前方原腸管の多能性細胞に似ている自己再生する細胞である。
【００３１】
いくつかの好ましい実施態様では、ＦＳＣは、インビトロにおいて多能性幹細胞（ＰＳＣ）から生成される。適切な方法は当技術分野において公知である（国際公開公報第２０１５０５２１４３号；Hannan et al Stem Cell Reports, 1:293-306（2013）参照）。
【００３２】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、インビトロにおいて自己再生することができ、そして未分化の表現型を示し、そして潜在的には３つのいずれかの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の胎仔又は成体のいずれかの細胞型へと分化することができる。多能性幹細胞は全能性幹細胞とは異なり、そして胚外細胞系統を生じることはできない。ＰＳＣ集団はクローン性であり得、すなわち、単一の共通した祖先細胞に由来する遺伝子的に同一な細胞であり得る。
【００３３】
ＰＳＣは、以下の１つ以上の多能性に関連したマーカーを発現し得る：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４、及びｃ−ｍｙｃ、好ましくはＰＯＵ５ｆ１、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２の中の１つ以上。ＰＳＣは、Ｂｒａ、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、αＦＰ、Ｓｏｘ１、ＮＣＡＭ、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ１及びＣＤＸ２などの特定の分化運命に関連したマーカーを欠失していてもよい。特に、ＰＳＣは、内胚葉運命に関連したマーカーを欠失していてもよい。
【００３４】
好ましくは、ＰＳＣは、ヒトＰＳＣである。
【００３５】
ＰＳＣとしては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び非胚性幹細胞、例えば胎仔幹細胞、成体幹細胞、羊水幹細胞、臍帯幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられ得る。いくつかの実施態様では、ＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞ではない。いくつかの実施態様では、ＰＳＣはヒト胚性細胞ではない。
【００３６】
ＰＳＣを生成するための適切な技術は当技術分野において周知である。
【００３７】
好ましくは、ＰＳＣはｉＰＳＣであり、より好ましくはヒトＩＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【００３８】
ｉＰＳＣは、非多能性の完全に分化した祖先細胞又は前駆細胞から誘導された、多能性細胞である。適切な祖先細胞としては、成体線維芽細胞及び末梢血細胞などの体細胞が挙げられる。祖先細胞は典型的には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＳｏｘ１などの多能性遺伝子又はタンパク質を細胞に導入することによって初期化される。遺伝子又はタンパク質は、プラスミド若しくはより好ましくはウイルスによるトランスフェクション又は直接的なタンパク質送達をはじめとする、任意の適切な技術によって、分化した細胞に導入され得る。他の遺伝子、例えばＫｉｆ遺伝子、例えばＫｉｆ−１、−２、−４及び−５；Ｍｙｃ遺伝子、例えばＣ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、及びＮ−ｍｙｃ；ｎａｎｏｇ；及びＬｉｎ２８も細胞に導入されることにより、導入効率を高めることができる。多能性遺伝子又はタンパク質の導入後、祖先細胞を培養し得る。多能性マーカーを発現している細胞を単離及び／又は精製することにより、ｉＰＳＣ集団を生成し得る。ｉＰＳＣの生成技術は当技術分野において周知である（Yamanaka et al Nature 2007; 448:313-7; Yamanaka 6 2007 Jun 7; 1(1):39-49; Kim et al Nature.2008 Jul 31; 454(7204):646-50; Takahashi Cell.2007 Nov 30; 131(5):861-72. Park et al Nature. 2008 Jan 10; 451(7175):141-6; Kimet et al Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):472-6; Vallier, L., et al. Stem Cells, 2009. 9999(999A): p. N/A）。
【００３９】
ｉＰＳＣは、正常な（すなわち疾患に関連していない）遺伝子型を有する線維芽細胞などの体細胞、例えば正常な遺伝子的バックグラウンドを有する個体、例えば遺伝子障害を有さない個体から得られた細胞から導かれ得る。ｉＰＳＣを使用して、正常な（すなわち疾患に関連していない）遺伝子型を有するＦＳＣを生成し得る。これらのＦＳＣを、例えば治療、モデリング、スクリーニング、又は他の適用のために使用するために、本明細書に記載のようなＣＰ及びＣＬＣへとさらに分化させ得る。
【００４０】
いくつかの実施態様では、ｉＰＳＣは、明確に異なる遺伝子的バックグラウンドを有する個体から得られた体細胞又は他の前駆細胞から導かれ得る。例えば、ｉＰＳＣは、疾患容態を有する個体、高いリスクの疾患容態を有する個体、及び／又は低いリスクの疾患容態を有する個体の細胞から生成され得る。疾患容態としては、胆管障害、例えば胆管症、又は胆管上皮に関連した他の障害が挙げられ得る。明確に異なる遺伝子的バックグラウンドを有する個体から得られた細胞から生成されたｉＰＳＣを使用してＦＳＣを生成し、これをさらに、遺伝子的バックグラウンドを有するＣＰ及びＣＬＣに分化させ得る。これらのＣＰ及びＣＬＣは、胆管障害などの疾患容態の機序を研究するのに、及び治療標的を同定するのに有用であり得る。
【００４１】
慣用的な技術を、ＰＳＣの培養及び維持に使用し得る（Vallier, L. et al Dev. Biol. 275, 403-421 (2004), Cowan, C.A. et al. N. Engl. J. Med. 350, 1353-1356 (2004), Joannides, A. et al. Stem Cells 24, 230-235 (2006) Klimanskaya, I. et al. Lancet 365, 1636-1641 (2005), Ludwig, T.E. et al. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006)）。本発明の方法に使用するためのＰＳＣを、規定の条件において又はフィーダー細胞上で増殖させ得る。例えば、ＰＳＣは、培養皿において、適切な密度（例えば１０５〜１０６個の細胞／６０mm皿）の放射線照射されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞層上で、又はフィーダー馴化培地若しくは限定培地を有する適切な基材上で慣用的に培養され得る。本発明の方法に使用するための多能性細胞を、酵素的又は力学的手段によって継代させ得る。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明に使用するためのＰＳＣは、化学的に定義された培地（ＣＤＭ）中で培養され得る。化学的に定義された培地（ＣＤＭ）は、特定の成分のみ、好ましくは化学構造が既知である成分のみを含有している、細胞培養のための栄養溶液である。ＣＤＭは、未知組成の成分、又は未知組成の成分を含む構成成分、例えば、フィーダー細胞、間質細胞、血清、血清アルブミン、及び複合細胞外マトリックス、例えばマトリゲル（商標）を欠失している。いくつかの実施態様では、化学的に定義された培地はヒト化されている。ヒト化化学的に定義された培地は、ヒト以外の動物に由来するか又はそれから単離された成分若しくは補助物質、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、並びにマウスフィーダー細胞を欠失している。馴化培地は、培養細胞に由来する未知組成の成分を含み、そして化学的に定義されていない。
【００４３】
ＣＤＭは、無血清培地補助物質及び／又は１つ以上の追加成分、例えばトランスフェリン、１−チオグリセロール、組成が明らかな脂質、Ｌ−グルタミン又は代用物、例えばグルタマックス−１（商標）、ニコチンアミド、デキサメタゾン、セレニウム、ピルビン酸塩、緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム、グルコース及び抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシン、及び場合によりポリビニルアルコール；ポリビニルアルコール及びインシュリン；血清アルブミン；又は血清アルブミン及びインシュリンの追加された化学的に定義された基礎培地を含み得る。
【００４４】
適切な化学的に定義された基礎培地、例えばアドバンストダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Price et al Focus (2003) 25 3-6）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ウィリアムズＥ培地及びＲＰＭＩ−１６４０（Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508；表３参照）が当技術分野において公知であり、そして業者（例えばシグマ−アルドリッチ社、ＭＩ州、米国；ライフテクテクノロジーズ社、米国）から入手できる。他の適切な化学的に定義された基礎培地は当技術分野において公知であり、そして業者（例えばシグマアルドリッチ社、ＭＩ州、米国；ライフテクテクノロジーズ社、米国）から入手できる。
【００４５】
適切な無血清培地補助物質としては、Ｂ２７（Brewer et al Brain Res (1989) 494 65-74; Brewer et al J. Neurosci Res 35 567-576 (1993); Brewer et al Focus 16 1 6-9; Brewer et al (1995) J. Neurosci. Res. 42:674-683; Roth et al J Trace Elem Med Biol (2010) 24 130-137）及びＮＳ２１（Chen et al J. Neurosci Meths (2008) 171 239-247）が挙げられる。無血清培地補助物質、例えばＢ２７及びＮ２１は当技術分野において周知であり、そしていろいろな場所で市販されている（例えばインビトロジェン社；シグマアルドリッチ社）。
【００４６】
適切な化学的に定義された培地としては、ポリビニルアルコール、インシュリン、トランスフェリン、及び組成の明らかな脂質の追加された基礎培地を含む、ＣＤＭ−ＰＶＡ（Johansson and Wiles (1995) Mol Cell Biol 15, 141-151）が挙げられる。例えば、ＣＤＭ−ＰＶＡ培地は、５０％イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）と、グルタマックス−１（商標）を含む５０％Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、又は５０％Ｆ１２ ＮＵＴ−ＭＩＸ（ギブコ社、１％の化学的に定義された脂質濃縮物、４５０μM １−チオグリセロール、１５μg/mlトランスフェリン、１mg/mlポリビニルアルコール、７μg/mlインシュリンが追加されている）からなり得る。他の適切な化学的に定義された栄養培地としては、ＰＶＡを５mg/ml ＢＳＡで置き換えた上記のＣＤＭ−ＰＶＡと同一であるｈＥＳＣ用維持培地（ＣＤＭＡ）；並びにＢ２７及びアクチビン（少なくとも５０ng/ml）の追加されたＲＰＭＩ基礎培地が挙げられる。ＣＤＭ−ＰＶＡ培地は、Vallier et al 2009 PLoS ONE 4: e6082. doi: 10.1371; Vallier et al 2009 Stem Cells 27: 2655-2666, Touboul 2010 51: 1754-1765. Teo et al 2011 Genes & Dev. (2011) 25: 238-250 and Peterson & Loring Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide (2012) Academic Pressに記載されている。
【００４７】
ＰＳＣは、ＰＳＣから胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）への分化、続いてＤＥＣからＦＳＣへの分化を含む２工程プロセスでＦＳＣへと分化され得る。適切な方法は、国際公開公報第２０１５０５２１４３号；Hannan et al Stem Cell Reports, 1:293-306（2013）に記載されている。例えば、ＰＳＣは、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む内胚葉誘導培地中で培養することによってＤＥＣへと分化され得る。得られたＤＥＣは、ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中で培養することによってＦＳＣへと分化され得る。
【００４８】
ＣＰ集団を生成するための方法は、
（ｉ）ＴＧＦβリガンド、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む内胚葉誘導培地中でＰＳＣ集団を培養して、胚体内胚葉細胞（ＤＥＣ）集団を生成する工程、
（ｉｉ）ＴＧＦβリガンドを含む前腸誘導培地中でＤＥＣを培養し、ＦＳＣ集団を生成する工程、
（ｉｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地中でＦＳＣを培養して、肝芽細胞（ＨＢ）集団を生成する工程、及び
（ｉｖ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中でＨＢを培養して、ＣＰ集団を生成する工程
を含み得る。
【００４９】
いくつかの実施態様では、前記方法はさらに、（ｖ）上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地中でＣＰ集団を培養して、成熟したＣＬＣ集団を生成する工程を含み得る。
【００５０】
好ましい実施態様では、内胚葉誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤を含む、化学的に定義された培地である。
【００５１】
ＴＧＦβリガンドは、哺乳動物細胞においてＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３により媒介される細胞内シグナル伝達経路を刺激するＴＧＦβスーパーファミリーのペプチドである。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは特徴的な構造を有し、そして当技術分野において周知である。適切なＴＧＦβリガンドとしては、アクチビン、ＴＧＦβ、ノダル、又はＧＤＦ３が挙げられる。好ましくは、ＴＧＦβリガンドはアクチビンである。
【００５２】
アクチビン（アクチビンＡ：ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６２４、核酸参照配列ＮＭ＿００２１９２．２ ＧＩ：６２９５３１３７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿００２１８３．１ ＧＩ：４５０４６９９）は、アクチビン／ノダル経路の刺激を介して一連の細胞内効果を発揮する二量体ポリペプチドである（Vallier et al., Cell Science118:4495-4509 (2005)）。アクチビンは、業者（例えばステムジェント社、ＭＡ州、米国）から容易に入手できる。簡便には、本明細書に記載の培地中のアクチビンの濃度は、１０〜１０００ng/ml、好ましくは約１００ng/mlであり得る。
【００５３】
ＴＧＦβ（ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：７０４０、核酸参照配列ＮＭ＿０００６６０．４ ＧＩ：２６０６５５６２１、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０００６５１．３ ＧＩ：６３０２５２２２）は、増殖及び分化を調節するホモ二量体ポリペプチドである（Watabe, T. et al (2009). Cell Res. 19:103-115）。組換えヒトＴＧＦβは、業者（例えばステムジェント社、ＭＡ州、米国）から容易に入手できる。簡便には、培地中のＴＧＦβの濃度は、１０〜１０００ng/ml、好ましくは約１００ng/mlであり得る。
。
【００５４】
ＧＤＦ３（ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：９５７３、核酸参照配列ＮＭ＿０２０６３４．１ ＧＩ：１０１９０６６９、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０６５６８５．１ ＧＩ：１０１９０６７０）は、多塩基タンパク質分解プロセシング部位（これは切断されて７個の保存されたシステイン残基を含有している成熟ＧＤＦ３タンパク質を生じる）によって特徴付けられるＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。簡便には、培地中のＧＤＦ３の濃度は、１０〜１０００ng/ml、好ましくは約１００ng/mlであり得る。
【００５５】
ノダル（ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：４８３８、核酸参照配列ＮＭ＿０１８０５５．４ ＧＩ：２２２３５２０９７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０６０５２５．３ ＧＩ：２２２３５２０９８）は、分化を調節するＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである（Hamada et al Nat. Rev. Genet. 3 (2): 103-13）。ノダルは、業者（例えばアブカム社、英国）から容易に入手できる。簡便には、培地中のノダルの濃度は、１０〜１０００ng/ml、好ましくは約１００ng/mlであり得る。
【００５６】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合することによって、細胞の成長、増殖、及び細胞の分化を刺激するタンパク質因子である。適切な線維芽細胞増殖因子としては、ＦＧＦファミリーの任意のメンバー、例えばＦＧＦ１からＦＧＦ１４及びＦＧＦ１５からＦＧＦ２３のいずれか１つが挙げられる。
【００５７】
好ましくは、ＦＧＦは、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦとしても知られる、ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）；ＦＧＦ７（ケラチノサイト増殖因子（又はＫＧＦ）としても知られる、ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）；又はＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）である。最も好ましくは、線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ１０又はＦＧＦ２である。
【００５８】
線維芽細胞増殖因子、例えばＦＧＦ２、ＦＧＦ７、及びＦＧＦ１０は、日常的な組換え技術を使用して生成され得るか、又は業者（例えばＲ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ州；ステムジェント社、米国）から入手できる。
【００５９】
いくつかの実施態様では、ＦＧＦは、上皮増殖因子（ＥＧＦ；ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：１９５０、核酸配列ＮＭ＿００１１７８１３０．１ ＧＩ：２９６０１１０１２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１７１６０１．１ ＧＩ：２９６０１１０１３）によって置き換えられ得る。上皮増殖因子は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することによって、細胞の成長、増殖及び細胞の分化を刺激するタンパク質因子である。ＥＧＦは、日常的な組換え技術を使用して生成され得るか、又は業者（例えばＲ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ州；ステムジェント社、米国）から入手できる。
【００６０】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）に結合し、そしてＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９によって媒介される経路を通して細胞内シグナル伝達を刺激する。適切な骨形成タンパク質としては、ＢＭＰファミリーの任意のメンバー、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７が挙げられる。好ましくは第二のＴＧＦβリガンドはＢＭＰ２（ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：６５０、核酸配列ＮＭ＿００１２００．２ ＧＩ：８０８６１４８４；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１．１ ＧＩ：４５５７３６９）又はＢＭＰ４（ＮＣＢＩ 遺伝子ＩＤ：６５２、核酸配列ＮＭ＿００１２０２．３ ＧＩ：１５７２６５９２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９３．２ ＧＩ：１５７２７６５９３）である。適切なＢＭＰとしてはＢＭＰ４が挙げられる。簡便には、本明細書に記載の培地中の骨形成タンパク質、例えばＢＭＰ２又はＢＭＰ４の濃度は、１〜５００ng/ml、好ましくは約１０ng/mlであり得る。
【００６１】
ＢＭＰは、日常的な組換え技術を使用して生成され得るか、又は業者（例えばＲ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、米国；ステムジェント社、米国）から入手できる。
【００６２】
ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、例えばホスファチジルイノシトール-４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５３）の活性を阻害する。適切なＰＩ３Ｋ阻害剤としては、ウォルトマンニン；ＬＹ３０１４９７（１７−ｂ−ヒドロキシウォルトマンニン）；ＬＹ２９４００２（２−モルホリン−４−イル−８−フェニルクロメン−４−オン：Maclean et al (2007) Stem Cells 25 29-38）；ＣＬＢ１３０９（ＫＮ３０９：（±）−２−（｛１−［７−メチル−２−（モルホリン−４−イル）−４−オキソ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−９−イル］エチル｝アミノ）安息香酸）；ＰＸ−８６６（（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペン−１−イルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ―オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ―ジメチルシクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン）；ＩＣ８７１１４（キノロンピローロピリミジン）；ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）−チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）；ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）、ケルセチン；ＢＥＺ２３５；ＸＬ１４７；ＸＩ７６５；ＰＸ−８６６；ＺＳＴＫ４７４（２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾール−１−イル）４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン）；及びＳＦ１１２６（２−［２−メトキシエチルアミノ］−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）が挙げられる。他のＰＩ３Ｋ阻害剤は当技術分野において入手できる。いくつかの好ましい実施態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２である。簡便には、培地は、１〜１００μM、好ましくは約１０μMのＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばＬＹ２９４００２を含有し得る。
【００６３】
適切なＰＩ３Ｋ阻害剤は、業者（例えばカルバイオケム社、ＣＡ州、米国）から入手できる。
【００６４】
ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、哺乳動物細胞においてＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３により媒介される細胞内シグナル伝達経路を遮断するアクチビン／ＴＧＦβのアンタゴニストである。ＳＢ４３１５４２（４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物；シグマ社、トクリスバイオサイエンス社、ブリストール社、英国）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）及び可溶性タンパク質因子、例えばｌｅｆｔｙ（例えばヒトｌｅｆｔｙ２：ＮＰ＿００３２３１．２ ＧＩ：２７４３６８８１）、ケルベロス（例えばヒトケルベロス１：ＮＰ＿００５４４５．１ ＧＩ：４８８５１３５）又はフォリスタチン（例えばヒトフォリスタチン：ＮＰ＿００６３４１．１ ＧＩ：５４５３６５２）をはじめとする、多くのＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が公知である。簡便には、培地中のＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の濃度は１〜１００μM、好ましくは約１０μMであり得る。
【００６５】
ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、業者（例えばシグマアルドリッチ社、米国；ステムジェント社、米国）から入手できる。
【００６６】
レチノイン酸（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン酸）は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）への結合を通して転写を調節し、そして様々な細胞型における分化を調節する、ビタミンＡの代謝物である。好ましくは、全てトランスのレチノイン酸が本明細書に記載の培地中に使用される。簡便には、培地中のレチノイン酸の濃度は、１〜１０μM、好ましくは約２μMであり得る。
【００６７】
レチノイン酸は、業者（例えばシグマアルドリッチ社、米国；ステムジェント社、米国）から入手できる。
【００６８】
Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子は、哺乳動物細胞において古典的な細胞内Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激する（Logan and Nusse (2004), Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 781-810、及びWodarz and Nusse (1998), Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59-80）。適切なＷｎｔシグナル伝達活性化因子としては、Ｗｎｔリガンド、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤；β−カテニン、及びβ−カテニンの活性化因子が挙げられる。
【００６９】
Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子としては、（ヘテロ）アリールピリミジン（Gilbert et al Bioorg Med Chem Lett. 2010 Jan 1;20(1):366-70）、ＷＡＹ−３１６６０６（Bodine et al Bone. 2009 Jun;44(6):1063-8）、ＩＱ１（Miyabayashi et al PNAS USA 2007 104(13) 5668-5673）、ＱＳ１１（Zhang et al (2007) PNAS USA 104(18) 7444-7448）、及び２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン（Liu et al Angew Chem Int Ed Engl. 2005 Mar 18;44(13):1987-90）が挙げられ得る。
【００７０】
いくつかの好ましい実施態様では、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子は、ＧＳＫ３β阻害剤である。ＧＳＫ３β阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βの活性を阻害する（遺伝子ＩＤ２９３２：ＥＣ２．７．１１．２６）。適切な阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−（（２−（（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル；Ring D. B. et al., Diabetes, 52:588-595 (2003)）、アルステルパウロン、ケンパウロン、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（Sato et al Nat Med. 2004 Jan;10(1):55-63）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、及びＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；Coghlan et al Chem Biol. 2000 Oct;7(10):793-803）が挙げられる。
【００７１】
いくつかの好ましい実施態様では、ＧＳＫ３β阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。
【００７２】
適切なグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤は、業者（例えばステムジェント社、ＭＡ州、米国；ケイマンケミカル社、ＭＩ州、米国）から入手できる。例えば、内胚葉誘導培地は、０．３〜３０μM、好ましくは約３μMのＧＳＫ３β阻害剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１を含有し得る。
【００７３】
内胚葉誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤以外の分化因子を欠失していてもよい。
【００７４】
例えば、内胚葉誘導培地は、有効量のＴＧＦβリガンド、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤の追加された化学的に定義された栄養培地からなり得る。ＴＧＦβリガンドはアクチビンであり得、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１であり得、及び／又はＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２であり得る。内胚葉誘導培地は、アクチビン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＣＨＩＲ９９０２１、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＬＹ２９４００２の追加された、化学的に定義された栄養培地、例えばＣＤＭ−ＰＶＡからなり得る。
【００７５】
化学的に定義された栄養培地は、化学的に定義された基礎培地を含み得る。適切な化学的に定義された基礎培地は上記されており、そしてこれにはイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、アドバンストダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Price et al Focus (2003), 25 3-6）、ウィリアムズＥ（Williams, G.M. et al  Exp. Cell Research, 89, 139-142 (1974)）、及びＲＰＭＩ−１６４０（Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508）が挙げられる。
【００７６】
基礎培地は、内胚葉誘導培地中の無血清培養培地補助物質及び／又は追加の成分によって追加され得る。適切な補助物質及び追加の成分は上記されており、そしてこれにはＬ−グルタミン又は代用物、例えばグルタマックス−１（商標）、組成の明らかな脂質、アルブミン、１−チオグリセロール、ポリビニルアルコール、インシュリン、ニコチンアミド、デキサメタゾン、セレニウム、ピルビン酸塩、緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム、グルコース、抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシン、及びトランスフェリンが挙げられ得る。
【００７７】
内胚葉誘導培地に使用するための適切な化学的に定義された栄養培地としては、上記のようなＣＤＭ−ＰＶＡ及びＣＤＭ−ＢＡが挙げられる。
【００７８】
好ましい内胚葉誘導培地は、アクチビン−Ａ（１０ng/mLから１μg/mL、好ましくは１００ng/mL）、ＢＭＰ４（１〜１００ng/mL、好ましくは１０ng/mL）、ｂＦＧＦ（２〜２００ng/ml、好ましくは２０ng/mL）、ＣＨＩＲ９９０２１（０．３〜３０μM、好ましくは３μM）、及びＬＹ２９４００２（１〜１００μM、好ましくは１０μM）の追加された上記のようなＣＤＭ−ＰＶＡからなり得る。
【００７９】
ＰＳＣを、内胚葉誘導培地中で１〜６日間、好ましくは約３日間培養することにより、ＤＥＣ集団を生成し得る。
【００８０】
ＤＥＣは、Ｓｏｘ１７、ｆｏｘＡ２、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、エオメソデルミン（エオメス）、Ｍｉｘｌ１、ＨＮＦ−３β、ケルベロス、ＯＴＸ４、グーセコイド、Ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＨｅｘの１つ以上、好ましくは全てを発現し得る。典型的には、ＤＥＣはＣＸＣＲ４及びＳｏｘ１７の発現によって特徴づけられる。
【００８１】
ＤＥＣは、特定の内胚葉系統に関連したマーカー、例えば腸、膵臓、肝臓、又は肺のマーカーを欠失していてもよい。例えば、ＤＥＣは、ＳＯＸ２（前腸）、ＣＤＸ２（中腸−後腸）、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ａ（膵臓）、ＡＦＰ（肝臓）、Ｎｋｘ２．１又はＴＢＸ１（肺）を発現していなくてもよい。ＤＥＣはまた、多能性に関連したマーカー、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４、及びｃ−ｍｙｃ、並びに、胚外、中胚葉、又は神経外胚葉細胞系統に関連したマーカーを欠失していてもよい。
【００８２】
ＤＥＣ集団を、前腸誘導培地中で培養して、ＦＳＣ集団を生成する。
【００８３】
好ましい実施態様では、前腸誘導培地は、ＴＧＦβリガンドを含む化学的に定義された培地である。
【００８４】
前腸誘導培地は、ＴＧＦβリガンド以外の分化因子を欠失していてもよい。例えば、前腸誘導培地は、有効量のＴＧＦβリガンドの追加された化学的に定義された栄養培地からなり得る。いくつかの実施態様では、前腸誘導培地は、アクチビンなどのＴＧＦリガンドの追加された化学的に定義された栄養培地からなり得る。
【００８５】
適切な化学的に定義された栄養培地は、上により詳細に記載されている。例えば、前腸誘導培地は、Ｂ２７などの無血清培地補助物質の追加された、ＲＰＭＩなどの基礎培地を含み得る。
【００８６】
ＴＧＦβリガンドは、培地中に、有効量で、例えば５〜５００ng/mL、好ましくは５０ng/mLで存在し得る。
【００８７】
好ましい前腸誘導培地は、Ｂ２７及び５０ng/mLのアクチビン−Ａの追加されたＲＰＭＩ基礎培地からなり得る。
【００８８】
ＤＥＣを、前腸誘導培地中で５〜７日間、好ましくは６日間培養して、ＤＥＣをＦＳＣへと分化させ得る。
【００８９】
ＦＳＣは、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭ、ＨＮＦ１β、ＧＡＴＡ４、Ｃｅｒ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１β、ＳＯＸ２、ＨＨＥＸ、及びＨＯＸＡ３の１つ以上、好ましくは全てを発現し得る。例えば、集団中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％がＳＯＸ２、ＨＨＥＸ、及びＨＯＸＡ３を発現し得る。
【００９０】
ＦＳＣは、ＣＤＸ２又はＨＯＸＣ５の発現を欠失していてもよい。ＦＳＣはまた、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４、及びＰＯＵ５ｆ１などの多能性マーカー、並びに内胚葉又は中胚葉系統に関連したマーカーを欠失していてもよい。ＦＳＣは、内胚葉組織マーカー、例えば肺内マーカー、例えばＮＫＸ２．１、肝細胞マーカー、例えばＡＦＰ、又は膵臓マーカー、例えばＰＤＸ１マーカーの発現を欠失していてもよい。
【００９１】
本発明の方法は、インビトロにおけるＦＳＣからＣＰへの分化に関する。ＦＳＣは、２段階プロセスでＣＰへと分化する。まず、ＦＳＣ集団を誘導して、肝芽細胞（ＨＢ）集団へと分化させる。次いで、ＨＢを誘導してＣＰへと分化させる。
【００９２】
肝芽細胞（ＨＢ）集団を生成するために、ＦＳＣ集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地中で培養する。
【００９３】
好ましい実施態様では、肝細胞誘導培地は、ＢＭＰ及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む、化学的に定義された培地である。
【００９４】
肝細胞誘導培地は、ＢＭＰ及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤以外の分化因子を欠失していてもよい。
【００９５】
肝細胞誘導培地は、有効量のＢＭＰ及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の追加された、化学的に定義された栄養培地からなり得る。例えば、肝細胞誘導培地は、ＢＭＰ４及びＳＢ−４３１５４２の追加された化学的に定義された栄養培地からなり得る。
【００９６】
化学的に定義された栄養培地は、上記されているような１つ以上の追加の組成の明らかな成分の追加された、ＲＰＭＩ、アドバンストＤＭＥＭ、又はＨＣＭ（商標）肝細胞培養培地（ロンザ社、米国）などの基礎培地を含み得るか又はからなり得る。肝細胞誘導培地に使用するための適切な化学的に定義された基礎培地は上記されており、そしてこれには、Ｂ２７などの無血清培地補助物質の追加されたＲＰＭＩが挙げられる。好ましい肝細胞誘導培地は、上記のようなＢ２７などの無血清培地補助物質の追加された、ＳＢ−４３１５４２（１〜１００μM、好ましくはμM）及びＢＭＰ４（１〜１００ng/mL、好ましくは５０ng/mL）の追加されたＲＰＭＩからなり得る。
【００９７】
ＦＳＣを肝細胞誘導培地中で２〜６日間、好ましくは約４日間培養して、ＨＢ集団を生成し得る。
【００９８】
ＨＢは、以下の１つ以上、好ましくは全てのマーカーを発現し得る：ＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＴＢＸ３、及びＣＫ１９。好ましくは、ＨＢは二分化能を有し、そして肝臓系統又は胆管系統へと分化することができる。
【００９９】
ＣＰ集団を生成するために、ＨＢ集団を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む、胆管細胞誘導培地中で培養する。
【０１００】
好ましい実施態様において、胆管細胞誘導培地は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む、化学的に定義された培地である。
【０１０１】
胆管細胞誘導培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンド以外の分化因子を欠失していてもよい。例えば、胆管細胞誘導培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドの追加された化学的に定義された栄養培地からなり得る。好ましくは、ＴＧＦβリガンドはアクチビンである。
【０１０２】
化学的に定義された栄養培地は、１つ以上の追加の組成の明らかな成分、例えばポリビニルアルコール、１−チオグリセロール、インシュリン、トランスフェリン、及び組成の明らかな脂質、又は無血清培地補助物質、例えば上記のようなＢ２７の追加された、基礎培地を含み得るか又はからなり得る。胆管細胞誘導培地に使用するのに適した化学的に定義された基礎培地は上記されており、そしてこれには、ＲＰＭＩ、ウィリアムズＥ、アドバンストＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ、又はＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
【０１０３】
好ましい胆管細胞誘導培地は、上記のようなＢ２７などの無血清培地補助物質の追加され、そしてさらにＦＧＦ１０（１〜１００ng/ml、好ましくは５０ng/ml）、アクチビン（１〜１００ng/ml、好ましくは５０ng/ml）及びＲＡ（０．３μM〜３０μM、好ましくは３μM）の追加された、ＲＰＭＩからなり得る。
【０１０４】
ＨＢを胆管細胞誘導培地中で２〜６日間、好ましくは約４日間培養して、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成し得る。
【０１０５】
好ましくは、ＣＰ集団は、同質又は実質的に同質である。例えば、集団中の細胞の５０％超、６０％超、又は７０％超が、肝細胞誘導培地中での培養後にＣＰであり得る。
【０１０６】
ＣＰは、以下の１つ以上、好ましくは全てのマーカーを発現し得る：ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、Ｓｏｘ９、ノッチ２、及びＨｅｓ１。
【０１０７】
ＣＰは、以下の１つ以上、好ましくは全てのマーカーの発現を欠失し得る：ＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ、及びＴＢＸ３。
【０１０８】
ＣＰは、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性を示し得る。
【０１０９】
生成後、ＣＰ集団は、慣用的な技術を使用して維持、増殖、又は保存され得る。
【０１１０】
ＣＰ集団は、例えば、細胞療法のために又は下記のような初期胆管細胞の発生のモデリングのために有用であり得る。
【０１１１】
本発明の方法はさらに、上記のように生成されたＣＰを成熟させて、胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）集団を生成する工程を含み得る。
【０１１２】
ＣＰを、上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地中で培養して、ＣＬＣ集団を生成し得る。
【０１１３】
好ましくは、ＣＰを、胆管細胞成熟培地中、３次元細胞培養で成熟させて、ＣＬＣ集団を生成する。
【０１１４】
例えば、胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）集団を生成するための方法は、
（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤（アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト）を含む肝細胞誘導培地中で前腸幹細胞（ＦＳＣ）集団を培養して、肝芽細胞集団を生成する工程、
（ｉｉ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地中で肝芽細胞を培養して、胆管前駆細胞（ＣＰ）集団を生成する工程、及び
（ｉｉｉ）ＣＰを、上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地中で３次元培養で培養して、ＣＬＣ集団を生成する工程
を含み得る。
【０１１５】
好ましくは、ＣＰから成熟させた胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）集団は、１つ以上のオルガノイド、すなわち、内腔を含む３次元多細胞構造を形成し得る。
【０１１６】
ＣＬＣ−オルガノイドは、本明細書に記載の機能に加えて、電子顕微鏡によって線毛状及び管状の構造を示し得る。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、胆管細胞成熟培地は、化学的に定義された培地であり得る。他の実施態様では、胆管細胞成熟培地は、化学的に定義されたではない１つ以上の成分を含み得る。例えば、培地は、複合タンパク質ヒドロゲルなどの化学的に定義されたではない足場マトリックスを含み得る。
【０１１８】
好ましい実施態様では、胆管細胞成熟培地は、上皮増殖因子の追加された栄養培地を含み得る。
【０１１９】
場合により、胆管細胞成熟培地はさらに、ノッチリガンド及びＴＧＦβリガンドを含み得る。いくつかの実施態様では、培地に、ノッチリガンド及びＴＧＦβリガンドが追加されていてもよい。他の実施態様では、ノッチリガンド及びＴＧＦβリガンドが、組成の明らかではない足場マトリックス、例えば複合タンパク質ヒドロゲル、例えばマトリゲル（商標）に存在し得る。
【０１２０】
例えば、栄養培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の追加された基礎培地からなり得る。
【０１２１】
適切な基礎培地は、１つ以上の追加の成分、例えばニコチンアミド、重炭酸ナトリウム、ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、インシュリン、ヒトトランスフェリン、リノール酸、及びセレン酸（例えばＩＴＳ＋プレミックス）、デキサメタゾン、グルタミン又はＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（例えばグルタマックス（商標））及び抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンの追加された、アドバンストＤＭＥＭ又はウィリアムズＥ培地などの標準的な基礎培地を含み得るか又はからなり得る。
【０１２２】
例えば、基礎培地に、１０mM ニコチンアミド、１７mM 重炭酸ナトリウム、０．２mM ２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、６．３mM ピルビン酸ナトリウム、１４mM グルコース、２０mM ＨＥＰＥＳ、６μg/ml インシュリン、６μg/ml ヒトトランスフェリン、６ng/ml セレン酸、５μg/ml リノール酸、０．１μM デキサメタゾン、２mM Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１００U/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシンを追加し得る。
【０１２３】
好ましくは、胆管細胞成熟培地中の基礎培地は、ウィリアムズＥ培地である。好ましい栄養培地は、上記の補助物質を含むウィリアムズＥ培地からなり得、そしてさらに上皮増殖因子（ＥＧＦ）（２〜２００ng/ml、好ましくは２０ng/ml）が追加され得る。
【０１２４】
ＣＰを、胆管細胞成熟培地中で２次元培養で培養し得る。より好ましくは、ＣＰを、胆管細胞成熟培地中で３次元培養で培養する。
【０１２５】
３次元細胞培養のために、胆管細胞成熟培地はさらに、３次元の細胞の成長及び増殖を支持しそしてオルガノイドの形成を可能とする足場マトリックスを含み得る。
【０１２６】
適切な足場マトリックスは当技術分野において周知であり、そしてこれには、ヒドロゲル、例えばコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、圧縮コラーゲン（例えばＲＡＦＴ（商標）、ＴＡＰバイオシステムズ社）、アルギネート、アガロース、複合タンパク質ヒドロゲル、例えば基底膜抽出物、及び合成ポリマーヒドロゲル、例えばポリグリコール酸（ＰＧＡ）ヒドロゲル、及び不活性マトリックス、例えば多孔性ポリスチレンが挙げられる。
【０１２７】
足場マトリックスは、圧縮コラーゲンヒドロゲルのように化学的に定義されていてもよく、又は、複合タンパク質ヒドロゲルのように化学的に定義されていなくてもよい。
【０１２８】
好ましくは、胆管細胞成熟培地中の足場マトリックスは、複合タンパク質ヒドロゲルである。適切な複合タンパク質ヒドロゲルは、細胞外マトリックス成分、例えばラミニン、コラーゲンＩＶ、エナクチン、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンを含み得る。
【０１２９】
適切な複合タンパク質ヒドロゲルとしては、エンゲルブルス・ホルム・スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の細胞外マトリックスタンパク質のヒドロゲルが挙げられ得る。適切な複合タンパク質ヒドロゲルは業者から入手でき、そしてこれにはマトリゲル（商標）（コーニングライフサイエンシーズ社）又はカルトレックス（Cultrex）（商標）ＢＭＥ２ＲＧＦ（Ａｍｓｂｉｏ（商標）社）が挙げられる。
【０１３０】
胆管細胞成熟培地は、足場マトリックス、及び上記のような上皮増殖因子の追加された栄養培地からなり得る。
【０１３１】
ＣＰを、胆管細胞成熟培地中で５〜１５日間、好ましくは約１０日間培養して、胆管細胞様細胞（ＣＬＣ）集団を生成し得る。
【０１３２】
好ましくは、ＣＬＣ集団は、同質又は実質的に同質である。例えば、集団中の細胞の５０％超、６０％超、又は７０％超が、該培養後にＣＬＣであり得る。
【０１３３】
好ましくは、ＣＬＣ集団は、成熟中に１つ以上のオルガノイドを形成する。
【０１３４】
成熟後、ＣＬＣ集団によって形成された１つ以上のオルガノイドを、２次元細胞培養液に播種し得る。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、１つ以上のオルガノイドを破壊して、ＣＬＣの単離を可能とし得る。これは、本明細書に記載のような、ＦＡＣＳ分析に有用であり得る。適切なオルガノイドの破壊法は、当技術分野において周知である。
【０１３６】
ＣＬＣはＳｏｘ９及びＣＫ７、好ましくはＳＳＴＲ２、ＡＬＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＧＧＴ、及びＳＯＸ９を発現する。
【０１３７】
ＣＬＣは、以下の１つ以上、好ましくは全ての成熟胆管マーカーを発現し得る：ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、ガンマグルタミル−トランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）、ノッチ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩及び胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１、及び陰イオン交換体２。ＣＬＣによって発現される他の胆管マーカーを表２に示す。
【０１３８】
好ましくは、ＣＬＣは、初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞に相当するレベルで成熟胆管マーカーを発現する。
【０１３９】
ＣＬＣは、初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞の遺伝子発現プロファイルに酷似している遺伝子発現プロファイルを示し得る。例えば、表２に示された重要な胆管マーカーである２１個の胆管細胞特異的遺伝子の発現は、ＣＬＣと初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞において類似したレベルであり得る。
【０１４０】
特許請求された方法によって生成されたＣＬＣ集団は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％の大きさのＣＬＣを含有し得る（Glaser et al 2006 World J Gastroenterol., 12:3523-36）。
【０１４１】
ＣＬＣ集団における１つ以上のＣＬＣマーカーの発現をモニタリング及び／又は検出し得る。例えば、ＣＬＣ集団中の上記に示された１つ以上の成熟胆管マーカーの発現又は生成を決定し得る。これは、ＣＬＣ集団中の分化度を決定及び／又はモニタリングすることを可能とする。
【０１４２】
本明細書に記載のように生成されたＣＬＣは、一次総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞の１つ以上の機能的特性を示し得る。例えば、ＣＬＣは、表１に示されそして以下に記載されている１つ以上、好ましくは全ての特性を示し得る。
【０１４３】
ＣＬＣは、一次総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞の形態又は生理学的特徴を示し得る。ＣＬＣオルガノイドは、線毛状及び／又は管状の構造を含み得る。形態及び生理学的特徴は、標準的な顕微鏡手順によって決定され得る。
【０１４４】
ＣＬＣは、胆汁酸の輸送、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性及び／又はガンマ−グルタミル−トランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性を示し得る。ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性の量は、一次総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示されるＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性の量に相当し得る。ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性は、例えば、本明細書に記載のように決定され得る。
【０１４５】
ＣＬＣは、能動的な分泌、例えば多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ１）によって媒介される分泌を示し得る。これは、本明細書に記載のように、ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルの存在下及び非存在下においてＣＬＣオルガノイドの管腔内へのローダミン１２３などのＭＤＲ１蛍光基質の蓄積を測定することによって決定され得る。
【０１４６】
ＣＬＣは、セクレチン及びソマトスタチンに対する応答を示し得る。例えば、ＣＬＣは、セクレチンに応答して増加した分泌活性、及びソマトスタチンに応答して減少した活性を示し得る。これは、ＣＬＣオルガノイドのサイズの変化を測定することによって決定され得る。例えば、セクレチンは、ＣＬＣオルガノイドのサイズを増加させ得、そしてソマトスタチンは減少させ得る。
【０１４７】
ＣＬＣは、胆汁酸の能動輸送、例えば頂端側塩及び胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）によって媒介される輸送を示し得る。胆汁酸輸送活性は、例えば、本明細書に記載のように、ＦＩＴＣなどの別の蛍光化合物と比較して、ＣＬＦなどの蛍光胆汁酸塩の能動輸送を測定することによって決定され得る。
【０１４８】
ＣＬＣは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）活性を示し得る。ＣＦＴＲ活性は、例えば本明細書に記載のような塩化物イオン蛍光指示薬であるＮ−（６−メトキシキノリル）アセトエチルエステル（ＭＱＡＥ）などの塩化物イオンを様々な濃度で含む培地に応答した細胞内及び管腔内塩化物イオン濃度を測定することによって決定され得る。
【０１４９】
ＣＬＣは、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する応答を示し得る。例えば、ＣＬＣ内の細胞内Ｃａ２＋レベルは、ＡＴＰ又はアセチルコリンに応答して増加し得る。細胞内Ｃａ２＋レベルは、標準的な技術を使用して決定され得る。
【０１５０】
ＣＬＣは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ６などの分裂促進因子、及びエストロゲンに対する応答を示し得る。例えば、ＣＬＣは、ＶＥＧＦに応答して増加した増殖を示し得る。
【０１５１】
ＣＬＣは、ルマカフトール（ＶＸ８０９）などの薬物に対する応答を示し得る。例えば、ＣＬＣ内のオルガノイドサイズ、ＣＦＴＲ活性、及び／又は管腔内液分泌は、ルマカフトールに応答して増加し得る。ルマカフトールに対する応答を決定するための適切な方法は、以下に記載されている。
【０１５２】
特許請求された方法によって生成されるＣＬＣの応答及び／又は活性の量は、一次総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示される応答及び／又は活性の量に相当し得る。
【０１５３】
上記のように、胆管障害を有する個体に由来するｉＰＳＣを使用して、胆管障害に関連した表現型を示すＣＬＣを生成し得る。例えば、ＣＬＣは、アラジール症候群に関連した未分化表現型を示し得る。未分化表現型は、オルガノイド形成又は管形成の欠如によって特徴付けられ得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様では、胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣを生成する方法は、
胆管障害に特異的なｉＰＳＣから生成されたＦＳＣ集団を準備する工程、
インビトロにおいてＦＳＣからＣＰへの胆管細胞の分化を誘導する工程、及び
本明細書に記載のように、ＣＰをＣＬＣへと成熟させる工程、
これにより、胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣ集団を生成する工程
を含み得る。
【０１５５】
他の実施態様では、胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣを生成する方法は、
正常なｉＰＳＣから生成されたＦＳＣ集団を準備する工程、
インビトロにおいてＦＳＣからＣＰへの胆管細胞の分化を誘導する工程、及び
本明細書に記載のように、ＣＰをＣＬＣへと成熟させる工程、及び
ＣＬＣを、細胞内において胆管障害に関連した表現型を誘導する化合物を用いて処置する工程、
これにより、胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣ集団を生成する工程
を含み得る。
【０１５６】
胆管障害に関連した表現型を誘導する化合物は、胆管障害に関連した細胞内経路を調節、例えば活性化又は阻害し得る。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、ＣＬＣを１つ以上の他の細胞型と共培養して、胆管障害に関連した表現型を誘起し得る。例えば、ＣＬＣをＴ細胞などの免疫細胞と共培養して、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）などの自己免疫性胆管障害に関連した表現型を誘起し得る。
【０１５８】
胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣは、一旦生成されると、例えばスクリーニングに使用するために、培養、増殖、及び維持され得る。
【０１５９】
胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣは、胆管障害に特徴的な１つ以上の特性、特色、又は病態を示し得る。
【０１６０】
胆管障害としては、胆管症、例えば遺伝性胆管症、発達性胆管症、自己免疫性胆管症、及び環境により誘発される胆管症、例えば嚢胞性線維症に関連した胆管症、アラジール症候群、多嚢胞肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、エイズ関連胆管症、消失胆管症候群、及び胆道閉塞症が挙げられ得る。
【０１６１】
上記のような胆管障害に関連した表現型を有するＣＬＣ集団を生成した後に、方法は、集団内の１つ以上の疾患−病態を検出又は測定する工程を含み得る。
【０１６２】
疾患病態は、異常な胆汁酸輸送；ＡＴＰ又はアセチルコリンに対する異常な応答；増加したアポトーシス；オルガノイド形成又は管形成の欠如；異常な遺伝子発現；ＶＥＧＦに対する異常な応答；タンパク質凝集又は重合；小胞体へのタンパク質の捕捉；ＡＬＰ活性又はＧＧＴ活性；セレクチン又はソマトスタチンに対する異常な応答；正常な細胞と比較して、異常なＣＦＴＲ活性又は異常なＭＤＲ１活性、の１つ以上を含み得る。
【０１６３】
機能的な特性及び疾患病態を測定するに適した方法は本明細書の何処かに記載されている。
【０１６４】
本明細書に記載のように生成されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団は、実質的に他の細胞型を含まない場合がある。例えば、該集団は、培地中での培養後に、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のＣＰ又はＣＬＣを含有し得る。該集団中のＣＰ又はＣＬＣの存在又は比率は、上記のような胆管マーカーの発現を通して決定され得る。
【０１６５】
好ましくは、ＣＰ集団又はＣＬＣ集団は、十分に他の細胞型を含まず、よって全く精製が必要とされない。必要であれば、ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を、ＦＡＣＳをはじめとする任意の慣用的な技術によって精製してもよい。
【０１６６】
本明細書に記載のように生成されたＣＬＣ集団は、オルガノイド又は個々の細胞の形態であり得る。
【０１６７】
本明細書に記載のように生成されたＣＰ又はＣＬＣが１つ以上の胆管細胞の機能を遂行する能力をモニタリング及び／又は決定し得る。例えば、細胞が１つ以上のＭＤＲ１機能（胆汁酸の輸送；ＶＥＧＦ、アセチルコリン、又はＡＴＰに対する応答；ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送；又はセクレチン若しくはソマトスタチンに対する応答）を遂行する能力をモニタリング及び／又は決定し得る。
【０１６８】
本明細書に記載のように生成されたＣＰ、ＣＬＣ及びＣＬＣ−オルガノイドは、標準的な哺乳動物細胞培養技術を使用して増殖、培養、又は維持され得る。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のように生成されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団は、例えば凍結乾燥及び／又は凍結保存によって保存され得る。
【０１７０】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を、他の試薬、例えば緩衝液、担体、希釈剤、保存剤、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は生分解性の細胞用足場と混合し得る。適切な試薬は以下により詳細に記載されている。本明細書に記載の方法は、ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を治療的に許容される賦形剤及び／又は生分解性の細胞用足場と混合する工程を含み得る。
【０１７１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって生成された単離されたＣＰ集団若しくはＣＬＣ集団、又は本明細書に記載の方法によって生成されたＣＬＣを含むオルガノイドを提供する。
【０１７２】
前記集団は、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のＣＰ又はＣＬＣを含有し得る。
【０１７３】
本明細書に記載のように生成されたＣＬＣは、オルガノイド又は単離された細胞の形態であり得る。
【０１７４】
本明細書に記載の方法によって生成されたＣＬＣは、一次総胆管の胆管細胞に特異的な１つ以上の機能又は機能的特徴を示し得る。例えば、ＣＬＣは、一次総胆管の胆管細胞の、ＭＤＲ１機能（胆汁酸の輸送；ＶＥＧＦ、アセチルコリン、又はＡＴＰに対する応答；ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送；ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性；セクレチン若しくはソマトスタチンに対する応答、又は薬物に対する応答）を示し得る。
【０１７５】
治療的適用のために、ＣＰ又はＣＬＣは好ましくは臨床等級の細胞である。処置に使用するためのＣＬＣ集団は、化学的に定義された胆管細胞成熟培地を使用して、本明細書に記載のようなＣＰから好ましくは生成される。個体に投与されるＣＰは、インビボにおいてＣＬＣへと分化し得る。
【０１７６】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団を、個体に移植、注入、又は別の方法で投与し得る。好ましくは、ＣＰ又はＣＬＣを、投与のための生分解性の足場に組み込む。適切な技術は当技術分野において周知である。
【０１７７】
ＣＰ集団又はＣＬＣ集団は、個体（すなわち自己細胞）から得られた細胞から誘導されたｉＰＳＣから生成され得る。いくつかの実施態様では、ｉＰＳＣ内の疾患関連突然変異又は遺伝子異常を、上記のように、ＣＰ又はＣＬＣへと分化する前に修正し得る。
【０１７８】
本発明の態様は、ヒト又は動物の体の処置法に、例えば胆管症などの胆管障害の処置に使用するためのＣＰ集団又はＣＬＣ集団；例えば上記の胆管障害などの胆管障害の処置に使用するための医薬品の製造におけるＣＰ集団又はＣＬＣ集団の使用を提供し；そして、胆管障害の処置法は、単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団をそれを必要とする個体に投与する工程を含み得る。
【０１７９】
本発明の態様はまた、本明細書に記載のように生成されたＣＰ又はＣＬＣを含む医薬組成物、医薬品、薬物、又は他の組成物、このようなＣＰ又はＣＬＣを例えば上記のような胆管障害の処置（これは予防的処置を含み得る）のために患者に投与する工程を含む方法、及びこのようなＣＰ又はＣＬＣを薬学的に許容される賦形剤、ビヒクル、担体、又は生分解性の足場、及び場合により１つ以上の他の成分と混合する工程を含む医薬組成物を製造する方法に拡張される。
【０１８０】
特に、胆管障害としては、胆管への損傷又は破壊、異常な胆管又は胆管の欠如、例えば消失性胆管症候群、胆道閉塞症、又はアラジール症候群によって特徴付けられる障害が挙げられ得る。
【０１８１】
本発明に従って生成されたＣＰ又はＣＬＣを含有している医薬組成物は、１つ以上の追加の成分を含み得る。医薬組成物は、ＣＰ又はＣＬＣに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、生分解性の足場、又は当業者には周知である他の材料を含み得る。このような材料は無毒性であるべきであり、そしてＣＰ又はＣＬＣの活性を妨害すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存するだろう。
【０１８２】
液状医薬組成物は、一般的に、液状担体、例えば水、石油、動物油又は植物油、鉱油、又は合成油を含む。生理食塩水、組織培養培地又は細胞培養培地、デキストロース又は他のサッカリド溶液又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールも含められ得る。
【０１８３】
前記組成物は、発熱物質非含有でかつ適切なｐＨ、等張度及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲル注射液、又は乳酸リンゲル注射液を使用して、適切な溶液を良好に調製することができる。組成物は、人工的な脳脊髄液を使用して調製されてもよい。
【０１８４】
ＣＰ若しくはＣＬＣ又はＣＰ若しくはＣＬＣを含む足場を、当技術分野において公知である任意の技術によって患者に埋め込み得る（例えば、Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7; Freed, C.R., et al., (1997) Cell Transplant, 6, 201-202; Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118-1124; Freed, C.R.,(1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555, Le Blanc et al, Lancet 2004 May 1;363(9419):1439-41）。特に、細胞懸濁液を、患者の胆管、門脈、及び肝臓に注射し得る。
【０１８５】
本発明による組成物の投与は好ましくは「予防有効量」又は「治療有効量」であり（場合によっては、予防は治療であると判断され得る）、これは、個体に利点を示すのに十分である。投与される実際の量、並びに投与速度及び時間経緯は、処置される個体の性質及び重症度に依存するだろう。処置の処方、例えば投与量の決断などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。
【０１８６】
ＣＰ又はＣＬＣを含む組成物は、処置しようとする容態に依存して、単独で又は他の処置と併用して、同時に又は順次のいずれかで投与され得る。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のように生成された集団内のＣＰ又はＣＬＣは、正常な表現型を示し得る。例えば、細胞を、胆管障害を有する個体から得ることができ、これを使用してｉＰＳ細胞を生成することができる。いくつかの実施態様では、ｉＰＳ細胞は突然変異又は遺伝子異常を含有し得、そしてこの突然変異又は異常を、慣用的な組換え技術を使用して修正して、正常な表現型を有するｉＰＳ細胞を生成することができる。あるいは、正常な表現型を有するｉＰＳ細胞を、胆管障害を有する個体から得ることができる。正常な表現型を有するＣＰ又はＣＬＣを、本明細書に記載のようなこれらのｉＰＳ細胞から生成し得、そしてこれを患者に埋め込んで、障害を修復又は寛解することができる。
【０１８８】
他の実施態様では、本明細書に記載のように生成された集団中のＣＰ又はＣＬＣは、疾患表現型を示し得る。例えば、細胞を、胆管障害を有する個体から得ることができ、そしてこれを使用して疾患特異的なｉＰＳ（ｄｓ−ＩＰＳ）細胞を生成することができる。疾患表現型を有するＣＰ前駆細胞又はＣＬＣ前駆細胞を、本明細書に記載のようなこれらのｉＰＳ細胞から生成し得る。次いで、これらの細胞を処置することにより、正常な表現型を回復させることができる。例えば、疾患表現型に関与する遺伝子突然変異又は遺伝子異常をインビトロにおいて修正し得る。単離された哺乳動物細胞内の遺伝子突然変異又は遺伝子異常を修正するために様々な技術を利用することができる。一旦異常又は突然変異が修正されそして正常な表現型が回復されれば、ＣＰ又はＣＬＣを患者に埋め込むことにより、障害を修復又は寛解することができる。
【０１８９】
上記のように生成された単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団は、試験化合物と胆管細胞の相互作用をモデリングするのに、例えば毒性スクリーニングに、胆管障害のモデリングに、又は治療効果を有する可能性がある化合物についてスクリーニングするのに有用であり得る。
【０１９０】
モデリング及びスクリーニングに使用するためのＣＬＣは、オルガノイド、又は例えばＣＬＣオルガノイドの破壊によって生成された単離された細胞の形態であり得る。
【０１９１】
スクリーニング及びモデリングに使用するのに適した単離されたＣＰ又はＣＬＣとしては、正常な遺伝子型及び表現型を有する細胞、並びに疾患に関連した遺伝子型又は表現型、例えば胆管障害に関連した遺伝子型又は表現型を有する細胞が挙げられる。
【０１９２】
化合物をスクリーニングする方法は、
本明細書に記載のように生成された単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を、試験化合物と接触させる工程、並びに；
該ＣＬＣ若しくはＣＰに対する試験化合物の効果、及び／又は試験化合物に対する該ＣＬＣ若しくはＣＰの効果を決定する工程
を含み得る。
【０１９３】
ＣＰ又はＣＬＣの増殖、成長、生存能、若しくは胆汁酸に対する抵抗性、又は分化能若しくは１つ以上の細胞機能を遂行する能力は、試験化合物の非存在下と比較して存在下において決定され得る。
【０１９４】
分化、増殖、成長、生存能、又は１つ以上の細胞機能を遂行する能力の減少は、前記化合物が毒性作用を有することを示し、そして成長、生存能、又は１つ以上の細胞機能を遂行する能力の増加は、該化合物がＣＰ又はＣＬＣに対して寛解効果を有することを示す。
【０１９５】
ＣＰ又はＣＬＣは、正常な表現型又は疾患表現型を示し得る。
【０１９６】
遺伝子発現は、試験化合物の非存在下と比較して存在下において決定され得る。例えば、表２に列挙された１つ以上の遺伝子の発現が決定され得る。発現の複合減少は、前記化合物が毒性作用を有するか又はＣＰ若しくはＣＬＣの機能的状態を改変し得ることを示す。遺伝子発現は、例えばＲＴ−ＰＣＲによって核酸レベルで、又は例えばＥＬＩＳＡなどの免疫学的技術によって、若しくは活性アッセイによってタンパク質レベルで決定され得る。チトクロムｐ４５０アッセイ、例えば発光アッセイ、蛍光アッセイ、又は発色アッセイは当技術分野において周知であり、そして業者から入手できる。
【０１９７】
いくつかの実施態様では、ＰＳＣなどの胆管障害についてリスクのある遺伝子座の発現が決定され得る。
【０１９８】
ＣＰ又はＣＬＣによる試験化合物の代謝、分解、又は崩壊が決定され得る。いくつかの実施態様では、試験化合物及び／又は該試験化合物の代謝物の量又は濃度の変化が、経時的に、連続的又は１つ以上の時点においてのいずれかで決定又は測定され得る。例えば、試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び／又は該試験化合物の代謝物の量若しくは濃度の増加が決定又は測定され得る。いくつかの実施態様では、試験化合物及び／又は代謝物の量又は濃度の速度変化が決定され得る。試験化合物又は代謝物の量を測定するのに適した技術としては質量分析が挙げられる。
【０１９９】
これは、試験化合物のインビボにおける半減期、毒性、有効性、又は他のインビボにおける特性を決定するのに有用であり得る。
【０２００】
ＣＰ又はＣＬＣの１つ以上の機能は、試験化合物の非存在下と比較して存在下において決定及び／又は測定され得る。例えば、ＣＬＣが１つ以上のＭＤＲ１機能（胆汁酸の輸送；ＶＥＧＦ、アセチルコリン又はＡＴＰに対する応答；ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送；ＧＧＴ活性、ＡＬＰ活性、又はセレクチン若しくはソマトスタチンに対する応答）を遂行する能力が決定及び／又は測定され得る。ＣＰがＣＬＣ又はＣＬＣ−オルガノイドへと成熟する能力が決定され得る。
【０２０１】
試験化合物の非存在下と比較して存在下において、ＣＬＣ又はＣＰが１つ以上のこれらの機能を遂行する能力の減少は、該化合物が毒性作用を有することを示す。試験化合物の非存在下と比較して存在下において、ＣＬＣ又はＣＰが１つ以上のこれらの機能を遂行する能力の増加は、該化合物が胆管誘発効果を有する（例えばそれは胆管の特異化を促進する）ことを示す。例えば、胆管障害に関連した遺伝子異常を有するＣＬＣ又はＣＰにおいて、胆管誘発効果を有する試験化合物が同定され得る。
【０２０２】
胆管障害の処置に有用な化合物をスクリーニングする方法は、
上記のように生成されたＣＬＣ集団又はＣＰ集団を試験化合物と接触させる工程、及び；
該ＣＬＣ又はＣＰに対する試験化合物の効果を決定する工程
を含み得る。
【０２０３】
ＣＬＣ又はＣＰは、胆管障害表現型を示し得る。ＣＬＣ又はＣＰにおける１つ以上の疾患病態に対する試験化合物の効果が決定され得る。例えば、細胞増殖、遺伝子発現、オルガノイド形成若しくは管形成、タンパク質凝集若しくは重合；ＧＧＴ活性、ＡＬＰ活性、ＭＤＲ１機能；胆汁酸の輸送；ＶＥＧＦ、アセチルコリン若しくはＡＴＰに対する応答；ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送；セクレチン若しくはソマトスタチンに対する応答、又はＣＬＣ若しくはＣＰによる抗原提示、の１つ以上に対する試験化合物の効果が決定され得る。試験化合物の効果を決定するのに適した技術は当技術分野において周知であり、そしてこれには免疫染色法、質量分析法、ウェスタンブロット、及び酵素的アッセイが挙げられる。
【０２０４】
好ましくは、ＣＬＣ集団を試験化合物と接触させる。
【０２０５】
試験化合物の非存在下と比較して存在下において、ＣＰ又はＣＬＣにおける１つ以上の疾患病態の減少又は寛解は、試験化合物が胆管障害の処置に有用であり得ることを示す。胆管障害の例は上記に提供される。
【０２０６】
いくつかの実施態様では、ＣＰ集団又はＣＬＣ集団におけるＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオン輸送の増加は、試験化合物が嚢胞性線維症又はＣＦ関連胆管症の処置に有用であり得ることを示す。
【０２０７】
いくつかの実施態様では、ＣＰ集団における胆管への特異化の増加は、試験化合物がアラジール症候群（ＡＧＳ）などの胆管の発達の減少に関連した胆管障害の処置に有用であり得ることを示す。
【０２０８】
本明細書に記載のような方法は、ＣＬＣ又はＣＰにおける１つ以上の疾患病態を減少又は寛解する試験化合物を同定する工程を含み得る。疾患病態を減少させる化合物は、胆管障害の処置用の治療薬の開発において有用であり得る。
【０２０９】
他の実施態様では、ＣＬＣ又はＣＰは正常な表現型を示し得、そしてこれは例えば、一般的な集団と比較して、胆管障害の高いリスクを有するか又は高い易罹患性を有する個体に由来し得る。細胞増殖、又は例えば表２に示された遺伝子の発現などの遺伝子発現の１つ以上に対する試験化合物の効果が決定され得る。ＣＬＣの１つ以上の機能に対する試験化合物の効果が決定され得る。例えば、ＣＬＣがＭＤＲ１機能；胆汁酸の輸送；ＶＥＧＦ、アセチルコリン、又はＡＴＰに対する応答；ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送；及びセクレチン又はソマトスタチンに対する応答の１つ以上を遂行する能力が、試験化合物の非存在下と比較して存在下において決定及び／又は測定され得る。
【０２１０】
試験化合物の非存在下と比較して存在下における、遺伝子発現、増殖、オルガノイド形成効率及び／又は１つ以上の機能の増加は、該化合物が胆管障害の処置に有用であり得ることを示し得る。
【０２１１】
ＣＬＣにおける１つ以上の疾患病態を減少又は寛解する化合物の同定後、該化合物を改変してその薬学的特性を最適化し得る。これは、当技術分野において周知であるモデリング技術を使用して実施され得る。
【０２１２】
１回以上の初期の選別を使用して、ＣＬＣにおける１つ以上の疾患病態を減少又は寛解する能力を有するとして同定された試験化合物をさらに、１回以上の二次選別を使用して評価し得る。二次選別は、インビトロ及び／又はインビボにおいて、例えば動物モデルにおいて生物学的機能又は活性について試験することを含み得る。例えば、疾患動物モデルにおける胆管障害に関連した１つ以上の症状又は病態を試験化合物が減少又は寛解する能力が決定され得る。
【０２１３】
ＣＬＣ又はＣＰにおける１つ以上の疾患病態を減少又は寛解する試験化合物を同定した後、該化合物を単離及び／若しくは精製しても、又は代替的にはそれを、慣用的な組換え発現技術若しくは化学合成を使用して合成してもよい。さらに、それは製造され得、及び／又は調製に、すなわち、医薬品、医薬組成物若しくは薬物などの組成物の製造若しくは製剤化に使用され得る。これらは胆管障害の処置のために個体に投与され得る。
【０２１４】
上記のように生成された単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団はまた、例えば個体における胆管障害の存在を同定するための、診断検査法において有用であり得る。
【０２１５】
胆管障害について個体を試験する方法は、
個体から得られた細胞の試料からｉＰＳＣ集団を生成する工程、
上記の方法を使用してｉＰＳＣから単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を生成する工程；及び
単離されたＣＰ又はＣＬＣの表現型を決定する工程
を含み得る。
【０２１６】
ＣＰ又はＣＬＣにおける疾患関連表現型の存在は、個体が胆管障害又は他の障害を有することを示し得る。例えば、細胞増殖、遺伝子発現、タンパク質凝集若しくは重合；オルガノイド形成若しくは管形成、ＧＧＴ活性、ＡＬＰ活性、ＭＤＲ１機能；胆汁酸の輸送；ＶＥＧＦ、アセチルコリン若しくはＡＴＰに対する応答；ＣＦＴＲにより媒介される塩化物イオンの輸送；セクレチン若しくはソマトスタチンに対する応答、又は抗原提示、の１つ以上における欠損症又は異常の存在は、個体が胆管障害を有することを示し得る。いくつかの実施態様では、ＰＢＣについてリスクのある遺伝子座における遺伝子発現が決定され得る。
【０２１７】
いくつかの実施態様では、前記方法は、出生前スクリーニングに有用であり得る。例えば、アラジール症候群についての出生前検査法は、
出生していない胎児から得られた細胞の試料からｉＰＳＣ集団を生成する工程、
上記の方法を使用してｉＰＳＣから単離されたＣＰ集団又はＣＬＣ集団を生成する工程；及び
単離されたＣＰ又はＣＬＣがオルガノイドを形成する能力を決定する方法
を含み得る。
【０２１８】
ＣＰ又はＣＬＣによるオルガノイドの形成不全又は形成欠陥は、出生していない胎児におけるアラジール症候群の存在を示し得る。
【０２１９】
本発明の他の態様は、上記の方法を使用してＣＰ集団及びＣＬＣ集団を生成するために使用するキット及び試薬を提供する。
【０２２０】
ＣＰ又はＣＬＣの生成のためのキットは
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地、並びに場合により
上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地
を含み得る。
【０２２１】
キットはさらに、上記のような内胚葉誘導培地及び前腸誘導培地を含み得る。
【０２２２】
キットはさらに、足場マトリックス、例えばマトリゲル（商標）を含み得る。足場マトリックスは、胆管細胞成熟培地の一部として提供されても、又は別々に提供されてもよい。
【０２２３】
本発明の態様はまた、ＣＬＣの生成のための培養培地のセットの使用を提供し、培地のセットは、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む肝細胞誘導培地、
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、レチノイン酸、及びＴＧＦβリガンドを含む胆管細胞誘導培地、並びに場合により
上皮増殖因子を含む胆管細胞成熟培地
を含む。
【０２２４】
培地のセットはさらに、上記のような内胚葉誘導培地及び前腸誘導培地を含み得る。
【０２２５】
適切な肝細胞誘導培地、胆管細胞誘導培地、胆管細胞成熟培地、内胚葉誘導培地、及び前腸誘導培地が上により詳細に記載されている。
【０２２６】
培地に、本明細書の何処かで記載されているような、上記に示された分化因子の有効量が追加され得る。
【０２２７】
１つ以上の培養培地は、脱イオンし蒸留した水中で製剤化され得る。１つ以上の培地は典型的には、使用前に、例えば紫外線、加熱、放射線照射、又はろ過により滅菌されることにより、汚染が防止されるだろう。１つ以上の培地は、保存又は輸送のために凍結（例えば−２０℃又は−８０℃）され得る。１つ以上の培地は、汚染を防止するために１つ以上の抗生物質を含有し得る。
【０２２８】
１つ以上の培地は、１倍の製剤又はそれ以上濃縮された製剤、例えば２倍から２５０倍の濃縮培地製剤であり得る。１倍の製剤では、培地中の各成分は、細胞培養を目的とした濃度であり、例えば上記に示された濃度である。濃縮製剤では、１つ以上の成分が、細胞培養を目的としたものよりも高い濃度で存在する。濃縮培養培地は当技術分野において周知である。培養培地は、公知の方法を使用して、例えば塩沈降又は選択的ろ過によって濃縮され得る。濃縮培地は、使用のために水（好ましくは脱イオンし蒸留した水）又は任意の適切な溶液、例えば食塩水溶液、水性緩衝液、又は培養培地で希釈され得る。
【０２２９】
キット内の１つ以上の培地は、密封容器に含有され得る。密封容器は、汚染を防止するために、培養培地の輸送又は保存に好ましくあり得る。容器は、任意の適切な容器、例えばフラスコ、プレート、瓶、広口瓶、バイアル、又はバッグであり得る。
【０２３０】
ルマカフトール（ＶＸ８０９）は本明細書において胆管障害の状況においてＣＦ疾患表現型を救出することが示されている。
【０２３１】
本発明の別の態様は、必要とする個体における、胆管障害、例えばＣＦ関連胆管症などの胆管症の処置に使用するための、ルマカフトール（ＶＸ８０９；３−｛６−｛［１−（２，２−ジフルオロ−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）シクロプロパンカルボニル］アミノ｝−３−メチルピリジン−２−イル｝安息香酸）を提供する。
【０２３２】
胆管障害は、上により詳細に記載されている。個体は、嚢胞性線維症又はＣＦＴＲ活性に関連した他の障害を患っている可能性がある。
【０２３３】
本発明の他の態様及び実施態様は、「含んでいる」という用語が「からなる」という用語に置き換えられた上記の態様及び実施態様、並びに「含んでいる」という用語が「実質的にからなる」という用語に置き換えられた上記の態様及び実施態様を提供する。
【０２３４】
本出願は、特記されない限り、上記の態様及び上記の実施態様のいずれかと互いとの全ての組合せを開示すると理解されたい。同様に、本出願は、特記されない限り、好ましい特色及び／又は任意選択の特色の全ての組合せを、単独で又は他のいずれかの態様と一緒に開示する。
【０２３５】
上記の実施態様の改変、さらに他の実施態様及びその改変は、本開示を読めば当業者には明らかであり、したがって、これらは本発明の範囲内である。
【０２３６】
本明細書に記載された全ての文書及び配列データベースエントリは全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３７】
本明細書において使用する場合の「及び／又は」は、２つの各々の明記された特色又は成分が、一緒に又は他方を伴わずに具体的に開示されていると捉えられる。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうど各々が本明細書に個々に示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）ＡとＢ、のそれぞれが具体的に開示されていると捉えられる。
【０２３８】
本発明の特定の態様及び実施態様はこれから、実施例を用いて及び上記の図面を参照して説明されるだろう。
【０２３９】
表１は、Dianat et al（6）によって生成されたＣＬＣとｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌ細胞との間の比較の要約を示す。「ＣＢＤ」は総胆管の胆管細胞を意味する。
【０２４０】
表２は、Dianat et al（6）によって生成されたＣＬＣとｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌにおける重要な胆管マーカーについての２１個の遺伝子の発現の順位付けを示し、これは、ＣＬＣにおけるより高い発現を示す（最も高い発現：順位＝１）。
【０２４１】
実験
方法
ｈＩＰＳＣ株の生成
使用された全てのｈＩＰＳＣ株は、本発明者らの研究室（９）によって以前に誘導されそして特徴付けられ、それ故、本研究のために新規なｈＩＰＳＣ株を全く誘導しなかった。簡潔に言えば、使用された株は、以前に記載されているように、山中アプローチ（４、９）を使用して、ヒト皮膚線維芽細胞及び末梢血から生成した（それぞれ、倫理審査委員会による参照番号０８／Ｈ０３１１／２０１及び０９/Ｈ０３０４/７７）。ＣＦ線維芽細胞をコーリエル細胞レポジトリから入手した。株は、ＳＮＩＰアレイを使用して確証され、そしてマイコプラズマ汚染について定期的に検査され陰性であった。
【０２４２】
ｈＩＰＳＣの培養
ヒトｉＰＳ細胞を、アクチビン−Ａ（１０ng/ml）及びｂ−ＦＧＦ（１２ng/ml）を使用して、以前に記載されているような（９、１０、４６）規定の培養条件で維持した。
【０２４３】
ｈＩＰＳＣから胆管前駆細胞への分化
ｈＩＰＳＣを、以前に記載（４６）されているように前腸前駆細胞（ＥＰ）へと分化した。ＳＢ−４３１５４２（１０μM、トクリスバイオサイエンス社）及びＢＭＰ４（５０ng/ml）の追加されたＲＰＭＩ（ギブコ社、インビトロジェン社）＋Ｂ２７中でＦＰを４日間培養することによって、二分化能を有する肝芽細胞を生成した。胆管への特異化を誘導するために、肝芽細胞を、ＦＧＦ１０（５０ng/ml、ペプロテック社）、アクチビン−Ａ（５０ng/ml）及びＲＡ（３μM、シグマアルドリッチ社）の追加されたＲＰＭＩ（ギブコ社、インビトロジェン社）＋Ｂ２７の存在下でさらに４日間培養した。
【０２４４】
胆管前駆細胞から胆管細胞様細胞への成熟及び３次元培養におけるオルガノイドの形成
ヒトＣＰを、細胞解離緩衝液（ギブコ社、ライフテクノロジーズ社）を使用して継代し、そして１０mM ニコチンアミド（シグマアルドリッチ社）、１７mM 重炭酸ナトリウム（シグマアルドリッチ社）、０．２mM ２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩（シグマアルドリッチ社）、６．３mM ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社）、１４mM グルコース（シグマアルドリッチ社）、２０mM ＨＥＰＥＳ（インビトロジェン社）、ＩＴＳ＋プレミックス（ＢＤバイオサイエンシーズ社）、０．１μM デキサメタゾン（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、２mM グルタマックス（インビトロジェン社）、１００μg/ml ストレプトマイシン毎に１００U/ml ペニシリン、及び２０ng/ml ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）の追加された、４０％マトリゲル（ＢＤバイオサイエンシーズ社、カタログ番号：３５６２３７）及び６０％ウィリアムズＥ培地（ギブコ社、ライフテクノロジーズ社）の混合物中に、８×１０４個の細胞/mlの密度で懸濁した。５０μLの液滴の細胞懸濁液を、２４ウェルプレートのそれぞれのウェルの中心に加え；ゲルを３７℃で２時間かけて固化させ、次いで、補助物質を含むウィリアムズＥ培地で覆った。培地を４８時間毎に交換し、そして細胞を計１０日間培養した。重要なことには、同じ方法を使用して、本発明者らは６から９６ウェルプレートまでの複数のフォーマットにＣＬＣオルガノイドを培養することができた。多数のＣＬＣオルガノイドを生成するために、数回の５０μLの液滴を、６ウェルプレートのウェルに又は１０cm皿に加えた。ハイスループットスクリーニング及び大規模実験に適合した多数のウェルを提供するために、３０μLの液滴を９６ウェルプレートのウェルに加えた。両方の場合において、ゲルを３７℃で２時間かけて固化させ、そして次いで補助物質を含むウィリアムズＥ培地で覆った。
【０２４５】
３次元培養におけるアクチビン及びノッチシグナル伝達の阻害、並びにオルガノイド形成の評価
ヒトＣＰを、上記のような補助物質を含む４０％マトリゲル及び６０％ウィリアムズＥ培地（ギブコ社、ライフテクノロジーズ社）の混合物中で、８×１０４個の細胞/mlの密度で懸濁した。細胞懸濁液を３つの等容量の分取液へと分配した。１つの分取液はさらに他の補助物質を全く受けず、そしてこれを陽性対照として使用した。第二の分取液に、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達の阻害のために１０μM ＳＢ−４３１５４２をさらに追加した。５０μM Ｌ−６８５，４５８（トクリスバイオサイエンシーズ社）を、ノッチシグナル伝達阻害のために第三の分取液に加えた。各分取液を２４ウェルプレートフォーマットに分配した。同じ濃度の阻害剤を、１日１回、マトリゲルを覆っている培地に加えた。３次元培養で計１０日間の後、２４ウェルプレートの中の４つの無作為に選択したウェルにおける嚢胞の総数は、ブラインド化されている研究者によって各条件について計数された。エラーバーは標準偏差を示す。
【０２４６】
フローサイトメトリー分析
ＨＩＰＳＣ、ＦＰ、ＨＢ、及びＣＰを、細胞解離緩衝液（ライフテクノロジーズ社）を使用して単一の細胞へと解離した。続いて、細胞を血球計を使用して計数し、そして４％ＰＦＡを使用して４℃で２０分間かけて固定した。細胞染色及びフローサイトメトリー分析を、以前に記載（４７）されている通りに実施した。
【０２４７】
ＣＬＣオルガノイドをＰＢＳを用いて１回洗浄し、そして２４ウェルプレートの１ウェルあたり１mlの氷冷ディスパーゼを加えた。マトリゲルを力学的に解離させ、ファルコンチューブに移し、そして氷上に保持して、低温とディスパーゼによる消化の組合せによりマトリゲルの液化を可能とした。１０分後、細胞を１６００rpmで３分間遠心分離にかけ、そして上清を吸引した。ペレットをＰＢＳを用いて１回洗浄し、そして遠心分離工程を繰り返した。上清を吸引し、そしてオルガノイドが解離して単一の細胞となるまで、１mlのＴｒｙｐＩＥ（ライフテクノロジーズ社）を３〜５分間かけて加えた。最後に、単一細胞懸濁液を１６００rpmで３分間遠心分離にかけ、そして４％ＰＦＡを使用して４℃で２０分間かけて固定した。細胞染色及びフローサイトメトリー分析を、以前に記載（４７）されている通りに実施した。
【０２４８】
初代胆管細胞
総胆管に由来する凍結させた初代ヒト胆管細胞を、セルプロジェン社（カタログ番号３６７５５−１１）から入手した。細胞を製造業者の説明書に従って解凍し、そしてＲＮＡ抽出のために溶解した。
【０２４９】
初代胆管組織
初代胆管組織（胆管）を臓器ドナーから入手した。ドナーからの肝臓及び膵臓を移植のために回収した。ドナーの家族から書面による同意を得た後、胆管の切片を多臓器回収手術中に切り出した（ＲＥＣ参照番号：０９／Ｈ０３０６／７３）。組織を組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズし、そしてＲＮＡを以前に記載（９）されている通りに抽出した。
【０２５０】
免疫蛍光法、ＲＮＡ抽出、及び定量リアルタイムＰＣＲ
免疫蛍光法、ＲＮＡ抽出、及び定量ＰＣＲを以前に記載（７）されている通りに実施した。使用された一次抗体及び二次抗体の完全なリストを補足表５に提供する。使用されたプライマーの完全なリストを、補足表６に提供する。全ての定量ＰＣＲデータは、４回の独立した生物学的複写物の平均値として提示されるが、セルプロジェン社製の初代ＣＤＢ胆管細胞を除く（ここでは３回の独立した試料が使用された）。エラーバーは標準偏差を示す。
【０２５１】
３次元マトリゲル培養における免疫蛍光法のために、オルガノイドを４％ＰＦＡを含むマトリゲル中で室温で２０分間かけて固定し、マトリゲルの液化を回避した。試料に透過性処理を行ない、そしてそれぞれ０．１％トリトン−Ｘ及び１０％ロバ血清を用いて３０分間かけて遮断し、そして１％ロバ血清中の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、試料をＰＢＳを用いて１回あたり４５分間かけて３回洗浄し、１％ロバ血清中の二次抗体と共に室温で６０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで再度３回洗浄した。ヘキスト３３２５８を１回目の洗浄に加えた。３次元マトリゲル培養液におけるＲＮＡの抽出のために、オルガノイドをＰＢＳを用いて１回洗浄し、そして２４ウェルプレートの１ウェルあたり１mlの氷冷ディスパーゼを加えた。マトリゲルを力学的に解離させ、ファルコンチューブに移し、そして氷上に保持して、低温とディスパーゼによる消化の組合せによりマトリゲルの液化を可能とした。１０分後、細胞を１６００rpmで３分間遠心分離にかけ、そして上清を吸引した。ペレットをＰＢＳを用いて１回洗浄し、そして遠心分離工程を繰り返した。最後に、上清を吸引し、そしてＲＮＡ溶解緩衝液 ３５０μLをペレットに加えた。ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、キット（シグマアルドリッチ社）を使用して溶解液から抽出した。
【０２５２】
マイクロアレイ
全細胞ＲＮＡ ５００ngを増幅し、そしてイルミナトータルプレップ−９６ＲＮＡ増幅キット（ライフテクノロジーズ社）を使用して製造業者の説明書に従って精製した。各条件につき３つの生物学的複写物を分析した。次いで、ビオチンで標識されたｃＲＮＡを１５０ng/μlの濃度に対して正規化し、そして７５０ngをイルミナヒト−１２ｖ４ビーズチップに５８℃で１６時間（一晩）かけてハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、ビーズチップを洗浄し、そしてストレプトアビジン−Ｃｙ３（ＧＥヘルスケア社）を用いて染色した。次いで、ビーズチップを、ビーズアレイ解読器を使用して走査し、そして次いで画像データをゲノムスタジオソフトウェア（イルミナ社）を使用して処理した。生のマイクロアレイデータ及び処理されたマイクロアレイデータは、アレイエクスプレス（アクセッション番号：Ｅ−ＭＴＡＢ−２９６５）において入手可能である。
【０２５３】
マイクロアレイ分析
全てのアレイに対するプローブサマリーは、「プローブサマリーの作成」法を使用して生データから得られた。これらの数値は（分散安定化）変換され、そしてＲ／Bioconductorパッケージｌｕｍｉ（４７）を使用して分位数正規化された。標準的なｌｕｍｉＱＣ手順を適用し、そして外れ値は全く同定されなかった。条件の対の間の発現差を、Ｒ／Bioconductorパッケージｌｉｍｍａ（４８）を使用して評価した。線形モデルフィットを適用し、そして上位の発現差を有する遺伝子を、各々を対比するために、Benjamini及びHochbergの方法を使用して表にして、ｐ値を修正した（４９）。両方の条件においてバックグラウンドを上回り蛍光を発生しなかったプローブは除去された。発現差を有するプローブは、調整済みｐ値が０．０１未満及び絶対変化倍数が２倍超のカットオフ値を使用して選択された。ｈＩＰＳＣとＣＬＣ、又はｈＩＰＳＣとＨＢ（ＣＬＣ及びＨＢの凝集物の転写「サイン」を示す）との間で発現差を有するプローブを、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェア（ＭａｘＱｕａｎｔ）を使用してユークリッド階層的クラスタリングのために選択した。様々な条件間の対数正規化されたプローブ発現値の標準的なスコア（ｚスコア）を計算し、そしてこの分析のために使用した。
【０２５４】
ローダミン１２３の輸送アッセイ
ＣＬＣオルガノイドを、１００μM ローダミン１２３（シグマアルドリッチ社）と共に３７℃で５分間インキュベートし、そしてウィリアムズＥ培地を用いて３回洗浄した。補助物質を含む新鮮なウィリアムズＥ培地を、３回目の洗浄後に加えた。オルガノイドを３７℃でさらに４０分間インキュベートした。ローダミン１２３の輸送が実際に、膜チャネル多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）の活性を反映したことを実証するために、ＣＬＣを１０μM ベラパミル（シグマアルドリッチ社）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、そしてローダミンアッセイを繰り返した。各実験の完了後、共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影した。オルガノイドの内部と外部の間で複数回（約１０００回）の蛍光測定を行なった。オルガノイド管腔におけるローダミン１２３の蛍光を、周辺の外部領域において測定されたバックグラウンドに対して正規化した。各実験を３回繰り返した。エラーバーは標準偏差を示す。蛍光強度平均値の比較を、両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。
【０２５５】
コリル−リシル−フルオレセイン輸送アッセイ
ＣＬＣオルガノイドに、５μM コリル−リシル−フルオレセイン（ＣＬＦ、コーニングインコーポレイテッド社）を３７℃で３０分間かけてローディングし、そしてライボビッツ培地（ライフテクノロジーズ社）を用いて３回洗浄した。３回目の洗浄の完了後、共焦点顕微鏡を使用してコマ撮り撮影を１０分間かけて撮影した。観察されたＣＬＦ蛍光強度の変化が、オルガノイド管腔からのＣＬＦの能動的排出に続発して起こったことを実証するために、実験を、５μMのコンジュゲートしていないフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（シグマアルドリッチ社）を対照として用いて繰り返した。オルガノイドの内部と外部との間で複数回（約１０００回）の蛍光測定を行なった。オルガノイド管腔内の蛍光を、周辺の外部領域において測定されたバックグラウンドに対して正規化した。各実験を３回繰り返した。エラーバーは標準偏差を示す。蛍光強度平均値の比較を、両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。
【０２５６】
細胞内カルシウムレベルの測定
アセチルコリン及びＡＴＰなどの刺激によって調節される細胞内カルシウムシグナル伝達は、胆管細胞のための重要な二次メッセンジャーをなす（１８）。ＣＬＣオルガノイドを２５μMのカルシウム指示薬のＦｌｕｏ−４ＡＭ（ライフテクノロジーズ社）と共に３７℃で６０分間インキュベートし、そしてウィリアムズＥ培地を用いて３回洗浄した。補助物質を含む新鮮なウィリアムズＥ培地を、３回目の洗浄後に加えた。オルガノイドを、１μM アセチルコリン（シグマアルドリッチ社）又は３０μM ＡＴＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて刺激し、その間にコマ撮り画像を撮影した。各測定を３回繰り返した。刺激に応答する細胞数を計算するために、Ｆｌｕｏ−４ＡＭをローディングされた細胞数を、実験開始前に２人の異なる研究者によって計数した。ＡＴＰ又はアセチルコリンを用いて刺激した後、応答している細胞の数（蛍光の増加）も計数し、そして応答性をＦｌｕｏ−４ＡＭをローディングされた細胞の総数に対する応答している細胞の比として表現した。データを平滑化しそして信頼限界のためにバンドをプロットするための統計学的アプローチについては「統計学的分析」を参照下さい。
【０２５７】
増殖アッセイ
５０μlの液滴のマトリゲル（各々、４０，０００個の細胞を含有している）を、２４ウェルプレートの中の２０ウェルに分配した。５０ng/mlの濃度のＶＥＧＦをウェルの半分に加え、どの培地も交換した。５日間培養した後、マトリゲルを上記のように（ＲＮＡ抽出の章）ディスパーゼを用いて消化し、そしてオルガノイドを力学的に解離して単一の細胞とした。次いで、各ウェルの細胞数を血球計を使用して計数した。ブラインド化された研究者によって２５回の異なる測定が行なわれた。１２ウェルプレートの中の６ウェルに分配された一次胆管細胞を陽性対照として使用した。３つのウェルが、５０ng/mlの濃度のＶＥＧＦを受け、どの培地も５日間で交換し、その後、各ウェルの細胞数を上記のように計数した。エラーバーは標準偏差を示す。細胞数平均値の比較を、両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。
【０２５８】
ＧＧＴ活性
ＧＧＴ活性を、製造業者の説明書に基づいてマックスディスカバリー（商標）ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）酵素アッセイキット（バイオサイエンティフィック社）を使用して３回測定した。マウス胚性フィーダーを陰性対照として使用した。等価な血清中ＧＧＴ活性（IU/L）を、製造業者の説明書に従って、１０分間にわたる吸光度増加の平均値に３５３を乗じることによって計算した。エラーバーは標準偏差を示す。複数の吸光度平均値の比較（ＣＬＣ対基質、ＣＬＣ対ＭＥＦ、ＣＬＣ対ヒト血清）を、多重比較のためのダネット補正を有する一元分散分析を使用して実施した。
【０２５９】
アルカリホスファターゼ染色
アルカリホスファターゼを、製造業者の説明書に従ってＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）（プロメガ社）を使用して実施した。
【０２６０】
オルガノイドサイズに対する、セクレチン、ソマトスタチン、オクトレオチド、及びＶＸ８０９の効果
ＣＬＣオルガノイドの画像を、セクレチン（１００nM、シグマアルドリッチ社）、ソマトスタチン（１００nM、シグマアルドリッチ社）、オクトレオチド（１００nM、シグマアルドリッチ社）、陰性対照としての役目を果たす胚移植用水を０．５〜２分間隔で添加する前及び添加した後に、オルガノイドのサイズが安定化するまで、５倍の拡大率を使用して撮影した。セレクチンの効果に対するオクトレオチドの影響を探索するために、細胞をオクトレオチドと共に３〜１０分間プレインキュベートした。続いて、１００nMのセクレチン（シグマアルドリッチ社）を培地に加え、そして実験を上記のように実施した。オルガノイドサイズに対するＶＸ８０９の効果を評価するために、ＶＸ８０９（３０mM、セレック社）又は陰性対照としての役目を果たす胚移植用水の添加前及び添加から６時間後に画像を撮影した。処置前及び処置後に８つの無作為に選択されたオルガノイドについて３つの無作為に選択された直径を測定した。グラフ測定値は、オルガノイド直径平均値の差の比率を示す。エラーバーは標準偏差を示す。統計学的有意性は、多重比較のためのダネット補正を有する一元分散分析を使用して計算された。オンライン補足データとして入手可能なビデオが、オルガノイドサイズが安定化されるまで、２分間間隔で処置前及び処置後に画像を撮影することによって作成された。
【０２６１】
ｃＡＭＰレベル
ｃＡＭＰレベルを、製造業者の説明書に基づいたｃＡＭＰ−Ｇｌｏアッセイキット（プロメガ社）及びＰ４５０−グロマックス９６マイクロプレートルミノメーター（プロメガ社）を使用して３回測定した。エラーバーは標準偏差を示す。統計学的有意性は、多重比較のためのダネット補正を有する一元分散分析を使用して計算された。
【０２６２】
ＣＦＴＲ活性
ＣＦＴＲ活性を以前に記載のように測定した。簡潔に言えば、ＭＱＡＥは、塩化物イオンの存在によって消光するが、他の陰イオン又はｐＨ変化によっては影響されない蛍光色素である（３６）。胆管細胞の細胞膜を横断する塩化物イオンの輸送は、主にＣＦＴＲによって調節される。それ故、機能的ＣＦＴＲを有する細胞は、細胞内（及びオルガノイドの場合には管腔内）塩化物イオン濃度を急速に上昇させ、これによりＭＱＡＥ蛍光を消光することによって塩化物イオンによる負荷に応答するだろう。硝酸塩イオン溶液を使用した塩化物イオンの枯渇は、逆の作用を有するだろう。細胞を、８mM ＭＱＡＥ蛍光色素（ライフテクノロジーズ社）及び５μM フォルスコリンと共に３７℃で４時間インキュベートした。ＭＱＡＥの蛍光は、塩化物イオンの存在下において消光する。ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ、ＭｇＣｌ、グルコース、及びｈｅｐｅｓを含有している標準的なリンゲル液を使用して、機能的ＣＦＴＲの存在下において細胞内塩化物イオンレベルを上昇させることが予想される塩化物イオンの負荷を与えた。ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＣａＮＯ３、ＭｇＮＯ３、グルコース、及びｈｅｐｅｓからなる改変リンゲル液を使用して、塩化物イオンの流出を促進し、そして細胞内塩化物イオンを枯渇させた。各溶液が添加されると１分毎にライブ写真を撮影した。ＣＦＴＲの機能に対するＶＸ８０９の効果を実証するために、ＣＬＣオルガノイドを３０mMのＶＸ８０９（セレック社）と共に４８時間インキュベートした。アッセイを上記のように７μMのＣＦＴＲ阻害剤−１７２（シグマアルドリッチ社）の存在下及び非存在下において繰り返し、ＣＦＴＲに対する化合物の特異性を確認した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して各オルガノイドの壁から無作為に選択された３つの領域の細胞内蛍光強度を測定し、そして各領域についての最小蛍光値に対して正規化した。エラーバーは標準偏差を示す。
【０２６３】
チトクロムｐ４５０活性
Ｃｙｐ３Ａ４活性を、製造業者の説明書に記載のｐ４５０−Ｇｌｏアッセイキット（プロメガ社）及びＰ４５０−グロマックス９６マイクロプレートルミノメーター（プロメガ社）を使用して測定した。
【０２６４】
ＣＬＣオルガノイドに対する実験の時期
ＣＬＣに関する全ての実験及び特徴付けは、特記されない限り、１０日間の３次元培養後にＣＬＣ−オルガノイドに対して実施された。
【０２６５】
統計学的分析
全ての統計学的分析は、グラフパッドプリズム６又はＲ統計の環境を使用して実施された。２つの平均値間の比較のために、両側スチューデントｔ検定を使用して、統計学的有意性を計算した。複数の数値の間で比較するために、一元分散分析を、複数の数値を互いに（例えばＱＰＣＲプロット）比較する場合には多重比較のためのチューキー補正と共に、又は複数の数値を単一の数値と比較する場合（例えば数値を陰性対照と比較する機能的アッセイ）には多重比較のためのダネット補正と共に使用した。本発明者らの数値の正規分布を、適宜、コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して確認した。本発明者らのデータの統計学的分析に関するさらなる情報を補足表７に提供する（各実験／分析に使用される検定、検定統計量、自由度、Ｐ値）。図３ｇの曲線を作成するために本発明者らのデータを平滑化するために、本発明者らはＲパッケージ「ｆｄａ」に実行された機能的データ分析理論（５０）を使用した（http://cran.rproject.org/web/packages/fda/index.html）。まず、本発明者らは、６０個の等距離のＢ−スプライン基底関数及び二次導関数における粗さペナルティを使用して、本発明者らのデータ値（各々の蛍光強度測定を３回行なう）を提示した（λ＝１）。本発明者らは、１〜１００秒間の間隔で関数creat.bspline.basis及びsmooth.fdを使用した。次いで、本発明者らは、Ｒ関数mean.fd及びsd.fdを使用して関数データオブジェクトの平均値及び標準偏差を評価した。
【０２６６】
結果
ｈＩＰＳＣから胆管前駆細胞を生成するための規定の培養系
本発明者らの主な目的は、生理学的胆管発生を再現する胆管分化プラットフォームを生成することであった（６）（図１）。これを達成するために、本発明者らは本発明者らのすでに確立された肝分化プロトコールを適応させた（９〜１０）。この方法を用いて１２日間の分化後に生成された細胞は、ＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＴＢＸ３、及びＣＫ１９をはじめとする一連の肝芽細胞マーカーを発現し（図２）、そして肝臓系統及び胆管系統の両方へと分化する能力を示す（図２）。結果として、これらの細胞は、二分化能を有する肝芽細胞様集団を示し、本発明者らの実験のための理想的な出発点を提供する。次いで、本発明者らはｈＩＰＳＣ由来の肝芽細胞様細胞からヒト胆管前駆細胞（ＣＰ）への分化に集中した。本発明者らは初期胆管特異化を制御すると報告された経路を調べ（１１）、そしてレチノイン酸と組み合わせたアクチビンが、ＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ及びＴＢＸ３の発現を抑制したが、ＦＧＦ１０の添加はＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、及びＣＫ１９の発現を誘導し（図２）、その結果、７５．１％の分化効率でＣＫ１９＋／Ｓｏｘ９＋細胞のほぼ均質な集団が得られたことを実証した。フローサイトメトリー分析は、残りの細胞の大半が、Ｓｏｘ９−／ＡＦＰ＋肝芽細胞であると同定し、これは本発明者らの培養液中の減少しているが検出可能なＡＦＰレベルの存在を説明する。セレクチン受容体（ＳＣＲ）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、アクアポリン１、及び陰イオン交換体２（ＡＥ２）などの成熟胆管マーカーは発現されなかった（図２）。結果として、ＦＧＦ１０、ＲＡ、及びアクチビンは、肝芽細胞様細胞から初期胆管細胞様細胞又は胆管前駆細胞（ＣＰ）への分化を促進する。
【０２６７】
３次元培養条件において増殖させたＣＰは、胆管細胞様細胞へと分化する
ｈＩＰＳＣ由来ＣＰをさらに特徴付けるために、本発明者らはオルガノイド形成を通して胆管細胞成熟を促進することが知られる３次元培養条件を使用することを決断した（６〜８）。これらの条件において増殖させたＣＰは急速に増殖し、４８〜７２時間後に環様構造を構成し、そして５〜７日間以内に嚢胞状のオルガノイドと、初代胆管細胞と類似した一次線毛を有する分岐状の管状構造とを生じた。さらに、得られたオルガノイドは、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、ガンマグルタミル−トランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）、ノッチ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、アクアポリン１、及び陰イオン交換体２（図２）をはじめとする多種多様な成熟胆管細胞マーカーを、初代胆管細胞と同等なレベルで発現し（図２）、ｈＩＰＳＣ由来ＣＬＣは、その初代対応物と重要な特徴を共有するという示唆を与える。
【０２６８】
本発明者らは、総胆管（ＣＤＢ）の一次組織及び本発明者らの分化プロトコールの重要な段階を調べるトランスクリプトーム分析を実施した（補足表Ｓ２、図２ｅ）。ユークリッド階層的クラスタリングは、ＣＬＣが前発達段階とは転写的に明確に異なり、そしてそれらは一次総胆管（ＣＢＤ）の胆管細胞の近くでクラスター形成することを明らかとした（ＣＬＣ対ＣＢＤのピアソン相関係数、ｒ＝０．７４７、ＣＬＣ対ＨＢ、ｒ＝０．５７６、ＣＬＣ対ｈＩＰＳＣ：ｒ＝０．４７４）。さらに、ＣＬＣは、重要な成熟胆管細胞マーカー（ＳＳＴＲ２、ＡＬＰ、ＫＲＴ７）を発現しているが、胎仔（ＳＯＸ９）胆管細胞マーカーも発現し、これにより以前の定量ＰＣＲ分析が確認された。総合して判断すると、これらの結果は、ＣＰを３次元培養で増殖させると、ＣＰは胆管上皮細胞と酷似した細胞へと分化することができることを確認する。重要なことには、本発明者らは、１×１０６個のｈＩＰＳＣから出発すると、本発明者らの分化プロトール終了時に、本発明者らは７４．４×１０６個の細胞を生成し、その中の５７．８×１０６個が成熟胆管細胞マーカーを発現していた（図１９）。より具体的には、結果として得られた細胞の７４．５％が、胆管細胞マーカーのＳｏｘ９及び成熟胆管細胞マーカーのＣＫ７を共発現し、これによりほぼ均質な胆管細胞集団の生成が確認された。細胞の中のさらに他の７．５％はＳｏｘ９のみを発現したがＣＫ７は発現せず、これは未成熟な胆管細胞と一致した。注目すべきは、細胞の１５％がＡＦＰ及びアルブミンを共発現し、これは本発明者らの培養条件において僅かな割合のＣＰ又はＣＬＣの存在を示し、そして定量ＰＣＲ分析における低レベルのＡＦＰの検出を説明する（図２）。細胞の残りの３％はさらに特徴付けられなかった。これらの結果は、３つの独立したｈＩＰＳＣ株において確認された。概して、これらの観察は、本発明者らの系が、大規模な適用に必要とされる効率で大量のＣＬＣの生成を可能とすることを実証する。
【０２６９】
胆管細胞様細胞による適切な胆管マーカーの発現が確立されたので、本発明者らは、生成されたオルガノイドの機能の特徴付けに焦点を当てた。インビボにおいて、胆管細胞は胆汁酸を再吸収し（１２）、そして細胞内カルシウムシグナル伝達（１４）によって調節される一連の分泌及び再吸収プロセス（１３）を通して毛細胆管の胆汁の組成を改変する。さらに、天然胆管上皮細胞はアルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）及びＧＧＴ活性を発現し、そして血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの刺激に応答して増殖する。インビトロにおいて生成された胆管細胞様細胞の分泌能は、胆管細胞表面糖タンパク質の多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ１）に対する蛍光基質であるローダミン１２３を使用して確認された（１５、１６）。ローダミン１２３は、ＣＬＣオルガノイドの管腔内に能動的に分泌されたが；しかしながら、管腔内への色素の蓄積は、ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルによって妨げられ（図３）、これによりＭＤＲ１依存性のローダミン１２３の輸送が確認された。頂端側塩及び胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）を通して胆管細胞様細胞が胆汁酸と相互作用する能力（１２）はまた、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のローディングされた対照と比較して、コリル−リシル−フルオレセイン（ＣＬＦ）のローディングされたオルガノイドの管腔からの蛍光胆汁酸ＣＬＦの能動的な排出を示すことによって実証された（図４）。ＡＳＢＴの発現は、定量ＰＣＲ及びＩＦ分析を通して確認された。ＣＦＴＲ活性並びにセクレチン及びソマトスタチンによる刺激に対する応答をはじめとする、胆管細胞様細胞の分泌機能の追加の態様もまた検証された（以下参照）。さらに、細胞内カルシウムレベルを上昇させることによってアセチルコリン及びＡＴＰの刺激に応答した胆管細胞様細胞は（図５）、ＶＥＧＦによる刺激に応答して増加した増殖を示し（増殖倍数が５１％増加、Ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定）（図６）、そして一次対照と同等なＧＧＴ活性及びＡＬＰ活性を示した（ＧＧＴ活性：ヒト血清の１６０％、ｐ＜０．０００１、多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）（図７）。総合して判断すると、これらの観察は、ｈＩＰＳＣ由来ＣＰが、天然の胆管上皮に対して特異的である一連の機能を示している胆管細胞様細胞を発生させることができることを確認する。
【０２７０】
ｈＩＰＳＣから胆管細胞様細胞への分化は、ヒト胆管系の胚発生を研究するための新規なモデルを示す
発生研究への本発明者らの系の適用可能性を調べるために、本発明者らは、インビトロにおいてオルガノイド形成を制御するシグナル伝達経路、及びどのように天然の管の発生と比較するかを特徴付けた。まず、本発明者らは生理学的な胆管特異化及び胆管形成におけるアクチビン／ＴＧＦβの中心的な役割の観点からアクチビン／ＴＧＦβシグナル伝達を調べた（１１、１７、１８）。これを達成するために、本発明者らは、アクチビン受容体阻害剤のＳＢ−４３１５４２を使用して、マトリゲルに通常含有されるＴＧＦβの活性を遮断した。ＳＢ−４３１５４２は、オルガノイド形成を完全に打ち消し（図８）、これにより、本発明者らの系におけるオルガノイド形成の重要な調節因子としてのアクチビン／ＴＧＦβシグナル伝達の役割が確認された。
【０２７１】
類似の分析を、ノッチシグナル伝達においても実施し、その脱調節はアラジール症候群（ＡＧＳ）と関連し、これは胆管の欠乏によって特徴付けられる障害である（１９）。ノッチシグナル伝達の役割を研究するために、本発明者らはまず、インビトロにおける肝芽細胞からＣＰ及びオルガノイドの形成までの胆管特異化の最中のこの経路の活性を評価した。ノッチ活性化により、その細胞内ドメインの切断及び核移行が生じる（２０、２１）。活性（切断）型のノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）に対する抗体を用いての免疫蛍光法（ＩＦ）により、活性なＮＩＣＤの存在が確認され、ＣＰ及びＣＬＣオルガノイドにおける核内局在化が増加していた。ノッチ２並びにそのリガンドであるＪＡＧ１及びその下流標的であるＨＥＳ１の発現もまた、肝芽細胞と比較して両方の段階において増加し、これは経路の活性化と一致する（ＣＰ対ＨＢ：ノッチ２：Ｐ＜０．００１、ＪＡＧ１：Ｐ＜０．００１、ＨＥＳ１：Ｐ＜０．０５；ＣＬＣ対ＣＰ又はＨＢ：Ｐ＜０．０００１）（図２）。ガンマ−セクレターゼ阻害剤であるＬ−６８５，４５８を使用した３次元培養条件におけるノッチシグナル伝達阻害は、ＮＩＣＤの切断を遮断し、ＨＥＳ１、ノッチ２、及びＪＡＧ１の発現を抑制し（図９）、そしてオルガノイド形成を遮断し（図１０）、これにより本発明者らの系に管腔空間を組み込んだオルガノイドの生成におけるノッチシグナル伝達の重要性が確認された。総合して判断すると、これらの結果は、ヒト胆管細胞特異化におけるこれらのシグナル伝達経路の重要性を実証することによってマウスにおいて得られた以前の所見を補強し（２２）、そしてインビトロにおいてヒト胆管の発生をモデリング及び研究する上で本発明者らの培養系の可能性を強調する。
【０２７２】
ｈＩＰＳＣ由来ＣＬＣは、多嚢胞性肝障害のための薬物検証を可能とする
多嚢胞性肝疾患（ＰＬＤ）は、胎仔胆管細胞から生じた肝臓内の複数の嚢胞性病変の存在によって特徴付けられる（２３〜２４）。本発明者らは、ＰＬＤにおける嚢胞サイズを低減させる化合物をスクリーニングするためのｈＩＰＳＣ由来ＣＬＣオルガノイドの能力を探索することを決断した。生理学的には、胆管細胞分泌活性はセクレチンによって増加し、そしてソマトスタチン及びその合成類似体であるオクトレオチドよって減少し、その結果、それぞれ管のサイズが変化する（２６〜２９）。胆管細胞様細胞オルガノイドは、セクレチン受容体（ＳＣＲ）及びソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）の両方を発現し（図２）、このことはこれらの経路が本発明者らの細胞において機能的であり得ることを示唆する。したがって、セクレチンは、未処置対照と比較して、オルガノイドサイズを増加させたが（６．１％の直径平均値の増加、Ｐ＜０．０１、多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）、ソマトスタチン及びオクトレオチドはオルガノイドサイズを減少させた（それぞれ７．９％及び４．９％の直径平均値の減少、それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５、多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）（図１１）。さらに、オクトレオチドはセクレチンの効果を打ち消し、そして細胞内ｃＡＭＰレベルを減少させ（ソマトスタチン応答の４５％、Ｐ＝０．００１、多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）、これは以前の研究と一致する（２６、３０）（図１２）。疾患特異的ＣＬＣに対するオクトレオチドの効果をさらに試験するために、多嚢胞性肝疾患（ＰＬＤ）患者由来のｈＩＰＳＣを、ＰＬＤ−ＣＬＣへと分化させた（図１３）。オクトレオチドによる処置は、ＰＬＤオルガノイドサイズを減少させ（４．８６％、Ｐ＜０．０００１、多重比較のためのダネット補正を含む一元分散分析）（図１４）、これはインビトロにおける薬物の効果を再現する。総合して判断すると、これらの観察は、ｈＩＰＳＣ由来の胆管細胞オルガノイドは、生理学的な分泌刺激に対して応答し、そして本発明者らのインビトロにおける分化プラットフォームを使用して、ＰＬＤの状況における管サイズに影響を及ぼす薬物をスクリーニングすることができるという原理証明を提供する。
【０２７３】
ｈＩＰＳＣ由来ＣＬＣを使用した嚢胞性線維症肝疾患のモデリング
本発明者らの培養系の臨床適用をさらに探索するために、本発明者らは、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者由来のｈＩＰＳＣを使用してインビトロにおいて胆管疾患をモデリングすることを決断した。ｈＩＰＳＣは、最も一般的なＣＦ突然変異であるΔＦ５０８についてホモ接合型である患者の皮膚線維芽細胞から生成され（ＣＦ−ｈＩＰＳＣ）、次いで胆管細胞様細胞へと分化させた。ＣＦ−ｈＩＰＳＣ由来の胆管細胞様細胞（すなわちＣＦ−ＣＬＣ）はマーカーを発現し（図１５）、そして胆管上皮細胞に特徴的な機能を示した（図１５）。ＣＦＴＲ遺伝子の転写は、定量ＰＣＲを使用して確認されたが（図１５）、ＩＦ分析では最小限のＣＦＴＲタンパク質の発現しか検出されず、これは小胞体におけるミスフォールドタンパク質の非常に急速な分解を報告した研究と一致する（３５）。最後に、本発明者らは、ＣＦＴＲを通して生理学的に調節されている、細胞内及び管腔内塩化物イオン濃度をモニタリングするために蛍光塩化物イオン指示薬のＮ−（６−メトキシキノリル）アセトエチルエステル（ＭＱＡＥ）（３６）を使用した。野生型（ＷＴ）ＣＬＣオルガノイドは、変動する塩化物イオン濃度を有する培地に応答して細胞内塩化物イオンを適切に改変したが、ＣＦ−ＣＬＣにおいては変化は全く観察されず（図１６）、これによりこれらの細胞において機能的ＣＦＴＲが存在しないことが確認された。概して、これらの結果は、ＣＦ−ＣＬＣがインビトロにおいてＣＦの重要な態様を再現し、そしてしたがってＣＦによって誘発される胆管疾患をモデリングするための独特な系を提供することを実証する。インビトロにおいてＣＦ肝疾患の表現型を再現したので、本発明者らは胆管疾患の状況における疾患表現型を救出する上でのＶＸ８０９の有効性を調査することを決断した。現在、ＣＦ肝疾患の処置は症候性である（３７）。しかしながら、ΔＦ５０８突然変異を有する患者においてＣＦＴＲを安定化させかつフォールディング異常を修正する新規化合物が近年、肺症状を処置するために開発された。ＶＸ８０９は肺細胞内のＣＦＴＲ機能（３９）を増加させることが報告されているこのような化合物（３８）である。ＣＦ−ＣＬＣを、ＶＸ８０９と共に４８時間増殖させ、次いでＣＦＴＲ機能をＭＱＡＥを使用して分析した。結果として得られた細胞は、ＷＴ ＣＬＣと同等な増加したＣＦＴＲ機能を示し、これにより、胆管細胞に対するＶＸ８０９の有効性が確立された。この効果は、ＣＦＴＲ阻害剤−１７２の存在下において打ち消され、これによりＶＸ８０９によるＣＦ−ＣＬＣの表現型救出が実際に、ＣＦＴＲ機能の増加に続発して起こったことが確認された（図１６）。胆管細胞における塩化物イオンの分泌と液体の分泌との間の関連の観点から（３１）、本発明者らは、オルガノイドサイズに対するＶＸ８０９の影響を調べた。ＶＸ８０９を用いて処置されたＣＦ−ＣＬＣオルガノイドは、それらの未処置の相当物と比較してサイズの増加を示した（５．６％の２３個の直径平均値の増加、Ｐ＝０．００１、両側ｔ検定）（図１７）。これらの観察は、ＶＸ８０９がＣＦＴＲの機能を増加させ、そして管腔内液の分泌を改善することを確認し、したがって、ＣＦ肝疾患の状況におけるこの薬物に関する以前���は報告されていない治療効果を示唆する。総合して判断すると、これらの結果は、インビトロにおける胆管障害のモデリングのためのＣＬＣオルガノイドの可能性を実証し、そしてＣＦ関連胆管症の管理におけるＶＸ８０９の新規な役割を支持する。
【０２７４】
ＣＬＣと既存のプロトコールからの細胞との比較
以前の報告は、ヒトＰＳＣからの胆管細胞の生成が実行可能であり得ることを示唆した（６〜８）。特に関心の高いことには、Dianat及び同僚によって生成された細胞は、これまでに最も良く特徴付けられていた（６）。しかしながら、これらの全ての方法はかなりの限界を示し、そしてこれらの系を通して生成された細胞は、重要な胆管マーカーの発現及び機能的特性を欠失している。以前の方法を上回る本発明者らのプラットフォームの進歩をより良好に評価するために、本発明者らは、ＣＬＣと、他のプロトコールによって生成された細胞との間の系統的な比較を実施した（表１）（６）。
【０２７５】
ＣＬＣの転写プロファイルは、初代胆管細胞とのより大きな重複を示す
まず、本発明者らは、本発明者らのＣＬＣの遺伝子発現プロファイルを、Dianat et al（６）によって生成されたもの（ｈＥＣＳ−Ｃｈｏｌ）と、本発明者らのマイクロアレイデータ及びＧＥＯにアップロードされたそれらのデータを使用して遺伝子レベル及びプローブセットレベルの両方において比較することを決断した。本発明者らは、本発明者らのプロトコールを用いて生成された胆管細胞様細胞と初代胆管組織との間に（複写物間のｚ−スコアのスピアマン順位相関係数の中央値、ｐＣＬＣ＝０．８６；ｎ＝１４９３９）、、Dianat et alによって生成されたｈＥＳＣ由来胆管細胞（ｐｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌ＝０．５１）よりも類似した転写サインを観察した。正規化された試料の階層的クラスター分析（ユークリッド距離、完全な連結法）及び発現プロファイル間の非線形距離のエントロピー尺度である相互情報量（ＭＩ）により、この結果が確認された（ＭＩＣＬＣ＝０．６２及びＭＩｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌ＝０．５４、複写物間の中央値；補足方法を参照）。これらの結果は、本発明者らのＣＬＣが、他者（６）によって生成された細胞と比較して、初代胆管の胆管細胞により類似していることを示す。
【０２７６】
プローブの代わりに共通の参照遺伝子セットにおいて繰り返した類似した分析は、同じ結論を解明する（ｐ’ＣＬＣ＝０．８３；ｐ’ｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌ＝０．６２；ＭＩ’ＣＬＣ＝０．８０；ＭＩ’ｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌ＝０．７３；ｎ＝１５９５４）。データセット間、遺伝子間とプローブ間の両方の類似性を測定するために１つを超える測定基準（スピアマン相関及び相互情報量）を使用した結果は全て、比較すると本発明者らの細胞が優れているということに一致した。
【０２７７】
さらに、ＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６、ノッチ、ＨＥＳ１、ＧＧＴ、ＡＬＰ、ＣＦＴＲ、ＡＳＢＴをはじめとする、重要な胆管マーカーである２１個の胆管細胞特異的遺伝子の発現は、代替的なプロトコールと比較して、本発明者らのＣＬＣにおいてより高いレベルに順位付けられた（表２）。
【０２７８】
遺伝子発現値に関する類似度メトリクスに加えて、本発明者らは、重複遺伝子オントロジー（ＧＯ）ターム（生物学的プロセス）に基づいて機能的レベル（４）において試料間で最も高度に発現している遺伝子の類似度を評価するために重複機能の比率（ＰＯＦ）分析を実施した。ＰＯＦ分析を使用した複数のプラットフォーム間のマイクロアレイデータセットの機能的比較により、ＣＬＣと一次対照との間で最も高度に発現されている遺伝子の有意に濃縮されたと順位付けされたＧＯターム（ｐ＜０．０５、ボンフェローニによる調整）間のより高い類似性が判明した（ＣＬＣのＰＯＦ平均値は７１．８２％、ｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌでは６６．０８％、肝芽細胞（ＨＢ）では６２．９４％、ｈＰＳＣでは５３．６４％）。総合すると、これらの結果は、本発明者らのプロトコールが、代替的なプロトコール（６）よって得られた細胞と比較した場合、それらのインビボにおける相当物とより酷似した胆管細胞様細胞の生成を可能とすることを証明する。
【０２７９】
ＣＬＣは、胆管細胞を特徴付ける独特な一団の増強された機能を示す
本研究においてＣＬＣについて実証された機能的特性の大半は、以前のプロトコールに報告されておらず、これにより直接的な比較は妨げられる。これらは、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性（図７）及びＣＦＴＲ活性（図１６）、セクレチン（９６％）（図１１）及びＶＥＧＦ（図６）に対する応答を含む。この限界を克服するために、本発明者らは、本発明者らのマイクロアレイデータ及びDianat et al.（６）によってＧＥＯにアップロードされたデータを使用してこれらの機能を制御する酵素、受容体、又は膜タンパク質の発現を比較した。本発明者らの比較により、ＡＬＰ、ＧＧＴ、ＣＦＴＲ、ＳＣＴＲ、ＳＳＴＲ２などの関連遺伝子がDianat et alによって生成された細胞においてより低いレベルで発現されていることが判明し（表２）、これはＣＬＣにおいて実証された機能的特性がなぜ以前に全く報告されなかったのかに関する説明を提供する。
【０２８０】
さらに、本発明者らは、両方の細胞型の間に共有される機能的特徴を直接比較した。ソマトスタチンによる処置は、ＣＬＣオルガノイドの９４％（図１８）においてサイズ（直径）の減少を誘導し、これに対してｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌ（６）では３１％の応答であった。ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する応答は、ＣＬＣ（図１８）においてそれぞれ９５％及び９６％であると計算されたが、これに対してｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌにおいてはそれぞれ７０％及び４０％であった。重要なことには、本発明者らは、ＣＬＣが蛍光胆汁酸をオルガノイド管腔から押し出して、それらを輸送する能力を実証した（図４）。胆汁酸（ＢＡ）の輸送はまたDianat et al（６）によっても記載されているが；しかしながら、ｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌは、胆汁酸を押し出すのではなくむしろオルガノイド管腔内に胆汁酸を蓄積するという逆説的な応答を示す（５〜７）。この観察は、毛細胆管空間に胆汁酸を分泌することが知られている（８）、かなり混入している肝芽細胞集団の存在によって説明され得る。総合して判断すると、これらのデータは、本発明者らのプロトコールによって生成されたＣＬＣは、重要な機能的マーカーの機能及び発現の点において当分野におけるかなりの進歩をなすことを確認する。
【０２８１】
増強された分化効率及び大規模な適用能力
本発明者らの分化方法の効率は、成熟したＣＫ７＋／Ｓｏｘ９＋ＣＬＣの生成において７５％であり、機能的細胞は９４％超である（セクレチン、ソマトスタチン、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する応答性に基づき）。類似の分析は、どの以前の研究においても実施されなかった。Dianat et al.（６）のみが、残念なことに胆管組織に対する特異性を欠失している（９）（ＣＦＴＲ）の発現についてフローサイトメトリー分析を使用してそれらの細胞集団を特徴付けている。この限定された特徴付けに因り、分化の同質性を正確に評価することは困難であるが、ＳＳＴ応答性に基づいて最大でも３１％であり得る（６）。さらに、本発明者らの系は、成熟ＣＬＣの生成において５７倍の増殖能を示す（図１９）。他のどの研究も、細胞増殖についてのそのような能力を報告しておらず、このことは分化効率に限界があることを示唆する。したがって、本発明者らのプロトコールは、以前には実証されていなかった特有の大規模な適用能力と共に、得られた集団の分化効率及び同質性の点における有意な改善をなす。
【０２８２】
化学的に定義された条件下における胆管前駆細胞の生成は、発生研究を可能とする
以前のプロトコールはいずれも、自発的な分化（７、８）、未知組成の製品、例えば血清（６）及び／又はインビボにおいて胆管分化を増強することが報告されていない増殖因子（ＧＨ、ＩＬ６、タウロコール酸ナトリウム）（６）に依拠し、胆管細胞特異化を駆動する経路の同定に焦点を当てた発生研究においてかなりの難題を課している。逆に、肝芽細胞から胆管前駆細胞（これを含む）への分化では、本発明者らの系は、インビボにおいて胆管特異化を促進することが示されている化学的に定義された条件及び因子（ＦＧＦ１０及びアクチビン）（１８、４０）に依拠し、これにより初期胆管前駆細胞の高度に同質な集団（７５％のＣＫ１９＋／Ｓｏｘ９＋細胞）の生成が可能となり、これは以前には報告されていなかった。
【０２８３】
さらに、本発明者らの培養系における胆管オルガノイドの形成は、胆管発生障害であるＡＧＳ（１９、２２）に関連している、ノッチシグナル伝達などの、インビボにおいて胆管の管形成を指示すると報告されている経路によって制御される。ノッチシグナル伝達についての同じような必要性は以前に実証されていなかった。これは、以前の系におけるノッチ及びその下流標的であるＨＥＳ１の低い発現によって証明される、限定された経路活性に起因する可能性がある（６）（表２）。要するに、これらの観察は、胆管発生及びＡＧＳなどの発達性胆管障害の病気発生を制御する基礎的な機序を研究する際の本発明者らの培養系の増強された能力を説明する。
【０２８４】
ＣＬＣは、疾患モデリング及び薬物スクリーニングのための初めてのｈＩＰＳＣに基づいたプラットフォームを提供する
疾患モデリング及び薬物スクリーニングなどの、胆管障害の状況におけるｈＩＰＳＣの医学的及び薬学的適用は以前に報告されてこなかった。このような適用に対するDianat et al.（６）によって生成された細胞の能力を調べるために、本発明者らは、胆管症の病気発生に関与しているか、又は胆管細胞に対する医薬化合物の効果を媒介している重要な遺伝子の発現を、ＣＬＣとｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌとの間で、直接比較した。これらは、ＣＦＴＲ（ＣＦの病気発生に関与しそしてＶＸ８０９の効果を媒介している）、ＰＫＤ（多嚢胞性肝疾患及び腎疾患）、ノッチ及びＨＥＳ１（ＡＧＳ）、ＳＳＴＲ２（オクトレオチドの効果を媒介）（表２）を含む。本発明者らの結果は、ＣＬＣと比較してｈＥＳＣ−Ｃｈｏｌにおけるこれらの重要な遺伝子の減少した発現を実証し、これは細胞集団の異質性、並びに／又は胆管症の病気発生及び治療剤に対する応答において重要な役割を果たす機能的特性の減少（ＣＦＴＲ活性の欠乏、ノッチシグナル伝達の必要性が全くないこと、ＳＳＴに対する３０％の応答）によって説明され得る。これらのデータは、本発明者らの系が、疾患モデリング及び薬物スクリーニングなどの複数の橋渡し適用のための独特なプラットフォームを提供し、これはさもなくば、他の公表されているプロトコールを用いて分化された胆管細胞を使用すれば非現実的で得られなかったであろうことを示す。
【０２８５】
ｈＩＰＳＣからの胆管細胞様細胞の生成のための進歩したプラットフォームの開発が上記されている。このプラットフォームは、薬物スクリーニング及び胆管疾患モデリングのための橋渡し能を実証する。幹細胞からの胆管細胞の誘導のための方法が記載されているが（６〜８）、これらは低い分化効率（３１％）（６）及び得られた細胞の限定された機能によって有意に制限される。
【０２８６】
本発明者らのプラットフォームはこれらの難題を克服し、ほぼ均質な成熟したＣＬＣ集団を生成し（７５％のＣＫ７＋／Ｓｏｘ９＋細胞）、転写サインは一次胆管組織と酷似している（スピアマン相関係数は、以前のプロトコール（６）の０．６１４≦ｐ≦０．６２２に対して０．８３０≦ｐ≦０．８３３）。実際に、全遺伝子発現分析は、ＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６、ノッチ、ＨＥＳ１、ＧＧＴ、ＡＬＰをはじめとする重要な胆管マーカーが、代替的なプラットフォーム（６）を通して生成された細胞と比較して、ＣＬＣにおいてはより高いレベルに順位していることを確認する。機能的アッセイはさらに、ＣＦＴＲ活性、ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性（ヒト血清値の１６０％）、胆汁酸輸送、並びにＶＥＧＦ、ＳＣＲ（９６％）、ＳＳＴ（９４％）、アセチルコリン（９６％）及びＡＴＰ（９５％）に対する応答性などの、重要な機能的特性において、ＣＬＣと天然胆管細胞との間にかなりの定性的な重複を示す。合わせて判断すると、これらのデータは、本発明者らの分化プラットフォームは、ｈＩＰＳＣから胆管細胞への分化を、発生研究、正確な疾患モデリング及び薬物スクリーニングなどの複数の下流適用を可能とし得る機能的に意義あるものへと前進させることを実証する。
【０２８７】
これらの前進は、自然な胆管発生の重要な段階を復元する培養系の開発を通して達成された（図１）。重要なことには、本発明者らの方法は初めて、化学的に定義された条件下において肝芽細胞から高度に同質な初期胆管前駆細胞集団（７５％のＣＫ１９＋／Ｓｏｘ９＋細胞）への分化を可能とする。この分化段階は、以前の研究と比較して本発明者らのプロトコールの特有の特色をなし、成熟ＣＬＣオルガノイドの生成のための最適な出発集団を与え、そして一部には本発明者らの培養系の特徴的な効率を説明する。さらに、インビトロにおけるＣＬＣオルガノイドの生成は、ノッチシグナル伝達によって調節される、天然の胆管発生中に起こる管形成プロセスに似ている。実際に、管形成におけるＪＡＧ−ノッチ経路の役割は十分に記載されているが（１、１１、２２、４１〜４５）、ＡＧＳに関連したノッチ活性の異常により胆管は欠乏する（１９）。それにも関わらず、以前の方法はこのような分析を妨げるので、インビトロにおけるオルガノイド形成におけるノッチの重要性は依然として実証されていない。それ故、ノッチシグナル伝達の必要性に関する本発明者らの観察は、発生研究が、胆管発生及びＡＧＳの最中のこの経路の調節を解明することを可能とし得るだろう。しかしながら、本発明者らは、本発明者らの系が、肝臓を構成している様々な細胞型の間の複雑な相互作用をモデリングできず、また、胆管細胞が発生しそして成熟する場所であるニッチを完全に模倣することもできないことを留意する。結果として、ＡＧＳ由来のｈＩＰＳＣを使用してインビボ及びインビトロの両方においてこれらの所見を検証するためにさらなる研究が必要とされる。
【０２８８】
以前のプロトコールと比較して本発明者らの細胞の機能的特性は、本発明者らの系を、これらの重要な機能の破壊によって引き起こされた胆管障害をモデリングするための最適なプラットフォームとする。したがって、ＣＬＣ内のＣＦＴＲの活性に基づいて、本発明者らのプラットフォームが胆管症をモデリングする能力は、ＣＦ肝疾患患者由来のｈＩＰＳＣ（ＣＦ−ｈＩＰＳＣ）を使用して実証された。ＣＦ−ＣＬＣオルガノイドを使用して、本発明者らは、実験化合物であるＶＸ８０９がインビトロにおいて疾患表現型を救出することができることを実証することによって、ＣＦ関連胆管症の新規な可能性ある処置を同定することができた。興味深いことに、ＶＸ８０９はＣＦＴＲプロセシング異常を修正することが報告されていたが（３８）、胆管細胞及びＣＦ肝疾患（ＣＦＬＤ）の状況におけるその効果は以前に記載されていなかった。本発明者らの所見は、ＶＸ８０９がすでに第ＩＩａ相臨床試験（３９）を終了したという事実を考えると特に重要であり、それ故、最小限の遅れで肝疾患の状況における臨床試験に使用できる可能性があり得る。概して、これらの結果は、インビトロにおいてＣＦＬＤのモデリングにおける本発明者らのプラットフォームの適用を実証し、そしてＣＦＬＤのための新規な治療用化合物を同定するための得られたモデルの能力を示す。
【０２８９】
胆管症の状況における治療剤を試験及び開発するための本発明者らの培養系の能力はさらに、２つの化合物（ベラパミル及びオクトレオチド）の効果を再現することによって実証された。大量のほぼ同質な機能的ヒトＣＬＣ集団の生成のための本発明者らのプラットフォームの特有の能力と組み合わせて、本発明者らの方法は、薬物スクリーニングなどのハイスループット適用のための可能性を開拓する。
【０２９０】
総合して判断すると、これらの所見は、薬物検証のための胆管細胞様細胞の適切性に関する原理証明を提供し、これは医薬品の試験のための代替的なプラットフォームの限界に鑑みて特に重要となる。
【０２９１】
結論すると、本発明者らの培養系は、インビトロにおける疾患モデリング、発生研究、薬物スクリーニング、及び標的検証のために、多数の自己の疾患特異的胆管組織を提供することによって、胆管症の分野における研究を前進させるであろう増強された強力なツールを示す。より重要なことには、ｈＩＰＳＣ由来胆管細胞は、組織工学操作に関する近年の進歩を補完し得、そしておそらく胆管系を取り込んだ３次元肝臓オルガノイドの生成に寄与し、これにより再生医薬（末期の疾患の処置のための個別化された臓器の作製）という究極的な目標へと一歩近づける。
【０２９２】
参考文献
【表０】
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【０２９３】
【表１】
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【０２９４】
【表２】
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【０２９５】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月22日(2018.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
分野
本発明は、例えば、薬物スクリーニング及び疾患モデリングに使用するための、胆管細胞、胆管前駆細胞、及び胆管細胞様細胞のインビトロにおける生成に関する。
本発明をもたらす研究は、欧州連合第７次枠組みプログラム（ＦＰ７／２００７−２０１７）  ＥＲＣ助成契約２８１３３５に基づき欧州研究会議から資金を受けている。
【国際調査報告】
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