(57)【要約】本発明は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）および／またはトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）修飾因子を同定するための、細胞ベースの方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）および／またはトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）修飾因子を同定するための細胞ベースの方法：
a. IDO1および／またはTDOを組換え的に発現する細胞を提供する工程であって、該IDO1および／またはTDOの発現が誘導性である、工程；
b. 工程(a)の細胞を被験化合物ならびにIDO1および／またはTDOの基質と接触させる工程；
c. 工程(b)の混合物をキヌレニンセンサーと接触させる工程；ならびに
d. 工程(c)の混合物の蛍光読み取り値を測定する工程であって、ブランクと比較した、候補化合物の存在下での蛍光読み取り値の変化が、IDO1および／またはTDO活性の修飾因子を示す、工程。
【請求項２】
細胞がHepG2細胞である、請求項1記載の細胞ベースの方法。
【請求項３】
誘導性のIDO1および／またはTDOの発現がTet-onシステムによる、請求項1または2記載の細胞ベースの方法。
【請求項４】
キヌレニンセンサーが7-(ジエチルアミノ)-4-エチルスルファニル-2-オキソクロメン-3-カルボアルデヒド（センサー1）である、請求項1〜3のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項５】
蛍光が励起：520〜560nmおよび放射：580〜680nmで測定される、請求項4記載の細胞ベースの方法。
【請求項６】
非誘導細胞がブランクとして使用される、請求項1〜5のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項７】
IDO1および／またはTDOがヒトIDO1およびヒトTDOである、請求項1〜6のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項８】
IDO1および／またはTDOを組換え的に発現する細胞が、安定な細胞株である、請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項９】
工程(d)において工程(c)の混合物の上清の蛍光読み取り値を測定する、請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項１０】
costar 384ウェルプレートにおいて実施される、請求項1〜9のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項１１】
ブランクと比較した、候補化合物の存在下での蛍光読み取り値の減少が、IDO1および／またはTDO阻害剤を示す、請求項1〜10のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項１２】
ブランクと比較した、候補化合物の存在下での蛍光読み取り値の増加が、IDO1および／またはTDO活性化剤を示す、請求項1〜10のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項１３】
IDO1および／またはTDOの基質がトリプトファンである、請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【請求項１４】
自動化された、請求項1〜13のいずれか一項記載の細胞ベースの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）および／またはトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）特異的修飾因子を同定するための、細胞ベーススクリーニングアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）およびトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）は、キヌレニン（Kyn）経路の最初の工程である、トリプトファン（Trp）からN-ホルミルキヌレニン（NFK）への酸化的開裂を触媒する、細胞質のヘム含有酵素である。Trpが枯渇してKyn代謝産物が生成されると、エフェクターT細胞の機能の抑制、および制御性T細胞の分化がもたらされる。腫瘍細胞におけるIDO1および／またはTDOの発現レベルの上昇は、がんの場合の生存に関して予後不良と相関関係にある。IDOはがんの小分子薬物標的として臨床的に実証されてきたが、前臨床研究により、TDOががんの免疫療法の標的となりうることが示されている（総説、Lob et al, 2009; Platten et al, 2014およびその中の文献を参照）。
【０００３】
Pilotte et al, 2012には、IDO1およびTDO阻害剤を試験するための、低処理量の質量分析法および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）アッセイが記載されている。
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、IDO/TDO特異的修飾因子を同定するための、高処理量の適合性アッセイを提供することである。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）および／またはトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）修飾因子を同定するための細胞ベースの方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
a. IDO1および／またはTDOを組換え的に発現する細胞を提供する工程であって、IDO1および／またはTDOの発現が誘導性である、工程；
b. 工程(a)の細胞を被験化合物ならびにIDO1および／またはTDOの基質と接触させる工程；
c. 工程(b)の混合物をキヌレニンセンサーと接触させる工程；ならびに
d. 工程(c)の混合物の蛍光読み取り値を測定する工程であって、ブランクと比較した、候補化合物の存在下での蛍光読み取り値の変化が、IDO1および／またはTDO活性の修飾因子を示す、工程。
【０００６】
本発明の特定の態様において、細胞はHepG2細胞である。
【０００７】
本発明の特定の態様において、誘導性のIDO1および／またはTDOの発現はTet-onシステムによる。
【０００８】
本発明の特定の態様において、キヌレニンセンサーは7-(ジエチルアミノ)-4-エチルスルファニル-2-オキソクロメン-3-カルボアルデヒド（センサー1）である。
【０００９】
本発明の特定の態様において、蛍光はEx:520〜560nmおよびEm:580〜680nmで測定される。
【００１０】
本発明の特定の態様において、非誘導細胞がブランクとして使用される。
【００１１】
本発明の特定の態様において、IDO1および／またはTDOはヒトIDO1およびヒトTDOである。
【００１２】
本発明の特定の態様において、IDO1および／またはTDOを組換え的に発現する細胞は、安定な細胞株である。
【００１３】
本発明の特定の態様において、工程(d)において工程(c)の混合物の上清の蛍光読み取り値を測定する。
【００１４】
本発明の特定の態様において、本方法はマイクロタイタープレートにおいて実施される。
【００１５】
本発明の特定の態様において、ブランクと比較した、候補化合物の存在下での蛍光読み取り値の減少は、IDO1および／またはTDO阻害剤を示す。
【００１６】
本発明の特定の態様において、ブランクと比較した、候補化合物の存在下での蛍光読み取り値の増加は、IDO1および／またはTDO活性化剤を示す。
【００１７】
本発明の特定の態様において、IDO1および／またはTDOの基質はトリプトファンである。
【００１８】
記載されるアッセイは、腫瘍微小環境内で免疫寛容を壊すのに役立ちかつ免疫監視や破壊からの腫瘍エスケープを防ぐ可能性のある免疫療法剤である新規の非常に強力なIDO／TDO選択的修飾因子および／または双方の修飾因子を、スクリーニング／プロファイリングし発見することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のIDO1／TDO細胞ベーススクリーニングアッセイを図示する。
【図２】図2Aは、HepG2-Tet-on-IDO1 *29細胞における、IDO1の用量依存的誘導を示す。マウス抗IDO1 mAbを有するHepG2-Tet-on-IDO1 *29由来の全細胞可溶化物の免疫ブロット（*UM500091、Origene）。示した濃度のドキシサイクリンで24時間細胞を処理した。図2Bは、HepG2-Tet-on-IDO1 *25細胞における、TDOの用量依存的誘導を示す。マウス抗TDO2 mAbを有するHepG2-Tet-on-TDO *25由来の全細胞可溶化物の免疫ブロット（*TA504730、Origene）。示した濃度のドキシサイクリンで24時間細胞を処理した。
【図３】図3A：示した濃度のドキシサイクリンで24時間、HepG2-Tet-on-IDO1 *29細胞を処理した。「アッセイ法」に記載のようにINCB024360を用いたアッセイを行った。INCB024360＝(Z)-N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-4-(2-スルファモイルアミノ)エチルアミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミドアミド。WO2010005958の実施例1。図3B：示した濃度のドキシサイクリンで24時間、HepG2-Tet-on-TDO *25細胞を処理した。「アッセイ法」に記載のようにINCB024360を用いたアッセイを行った。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の態様の詳細な説明
IDOおよび／またはTDO修飾因子に関する化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングに適したIDO1／TDO活性を測定するため、新規の細胞ベースの蛍光アッセイを確立した。このアッセイは重要な2つの薬物標的の阻害剤を発見するための、化合物空間の新たな領域を開いた。これは蛍光性化学センサー（センサー1）による、アッセイ媒体において産生されるキヌレニンの量の定量化（Klockow and Glass, 2013）に依存し、標準的な低処理量の質量分析法および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）アッセイ法（Pilotte et al, 2012）を補完する。
【００２１】
「IDO1」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類種由来のインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1の天然配列、およびIDO1変種（以下でさらに定義する）を意味する。
【００２２】
「天然配列IDO1」とは、その調製方式にかかわらず、天然に存在するIDO1ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。天然配列IDO1は自然界から単離するか、または組換え法および／もしくは合成法により調製してもよい。「天然配列IDO1」という用語は、具体的には、IDO1の、天然に存在する切断型または分泌型、天然に存在する変種形態（例えば、選択的スプライシング型）、および天然に存在する対立遺伝子変種を包含する。ヒトIDO1ポリペプチドのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 1に記載する。
【００２３】
「IDO1変種」という用語は、天然配列IDO1のアミノ酸配列変種であって、天然配列中に1つまたは複数のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含む変種を意味する。アミノ酸配列変種は一般的に、天然配列IDO1のアミノ酸配列と少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、もっとも好ましくは少なくとも約95％の配列同一性を有する。
【００２４】
「TDO」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類種由来のインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼの天然配列、およびTDO変種（以下でさらに定義する）を意味する。
【００２５】
「天然配列TDO」とは、その調製方式にかかわらず、天然に存在するTDOポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。天然配列TDOは自然界から単離するか、または組換え法および／もしくは合成法により調製してもよい。「天然配列TDO」という用語は、具体的には、TDOの、天然に存在する切断型または分泌型、天然に存在する変種形態（例えば、選択的スプライシング型）、および天然に存在する対立遺伝子変種を包含する。ヒトTDOポリペプチドのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 2に記載する。
【００２６】
「TDO変種」という用語は、天然配列TDOのアミノ酸配列変種であって、天然配列中に1つまたは複数のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含む変種を意味する。アミノ酸配列変種は一般的に、天然配列TDOのアミノ酸配列と少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、もっとも好ましくは少なくとも約95％の配列同一性を有する。
【００２７】
「化合物」という用語は、本明細書では、本発明のアッセイに関連して記載される「被験化合物」または「薬物候補化合物」の文脈で用いられる。従って、これらの化合物は、合成で得られたまたは天然源由来の、有機または無機化合物を含む。化合物には、比較的低分子量であることを特徴とする、ポリヌクレオチド、脂質、またはホルモン類似体のような、無機または有機化合物が含まれる。他の生体高分子の有機被験化合物には、約2〜約40アミノ酸を含むペプチドや、約40〜約500アミノ酸を含むより長いポリペプチド、例えば抗体または抗体コンジュゲートが含まれる。
【実施例】
【００２８】
キヌレニンセンサー 7-(ジエチルアミノ)-4-エチルスルファニル-2-オキソ-クロメン-3-カルボアルデヒド（センサー1）の合成
キヌレニンを検出するためのセンサー1の合成および開発について、記載されている（Klockow and Glass, 2013）。
2018532406.tif 000002
【００２９】
ドキシサイクリン依存的様式でのヒトIDO1またはヒトTDO2の誘導発現を可能にするHepG2安定細胞株の作製
HepG2細胞はMEM (1×) + GlutaMax（*41090、Gibco（登録商標）、Building 92-stock）、10％FBS （*16000-044、Gibco（登録商標））において培養した。プラスミドpTet-On（*631018、Clontech）およびLipofectamine 2000（*11668019、Life Technology）を用いて安定な形質移入の第1段階を行い、リバーステトラサイクリン依存性トランス活性化因子を発現する細胞を確立した。10cmディッシュ中のHepG2細胞に10μgのpTet-Onを形質移入し、続いて400μg/mlのG418で21日間選択を行い、耐性コロニーをクローニングリングで単離した。Tet-Onプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を有するレポータープラスミドであるpTRE2-Luc（*S1496、Clontech）を一過性に形質移入することにより、リバーステトラサイクリン依存性トランス活性化因子の発現について個々のクローンを試験した。非常に高いテトラサイクリン誘導性ルシフェラーゼ活性および検出不可能な基礎ルシフェラーゼ活性を示す1つのクローン株を選び、IDO1またはTDO2発現プラスミドによる2回目の形質移入に使用した。これらのプラスミドは、ヒトIDO1またはTDO2のcDNA（どちらもOrigeneから購入）のいずれかをpTRE2hyg発現ベクター（*631014、Clontech）に挿入することにより構築した。第2の安定な形質移入および400μg/mlハイグロマイシンによる選択の後、個々の耐性コロニーをクローン化し、400μg/mlのG418および400μg/mlのハイグロマイシンを用いる長期培養で維持した。クローンをウエスタンブロッティングによりスクリーニングし、1μg/mlのドキシサイクリンと共に24時間細胞培養した後にはIDOまたはTDOタンパク質が高度に誘導されるが非誘導条件下では検出不能であることに基づいて、2つの安定なクローンを選択し、HepG2-Tet-on-IDO1 *29およびHepG2-Tet-on-TDO *25とした。
【００３０】
INCB024360化合物＝(Z)-N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-4-(2-スルファモイルアミノ)エチルアミノ)-1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシイミドアミド。INCB024630は、WO2010005958における実施例1である。
【００３１】
アッセイ法
細胞プレートに10,000細胞／ウェルで細胞を播き、95％加湿細胞培養インキュベーター中で37℃、5％CO2でインキュベートした。その後、細胞を1μg/mlのドキシサイクリンを用いて24時間誘導し、IDOまたはTDOを十分発現させた。非誘導細胞は100％阻害対照として用いた。60μlの1×HBSS（37℃）で3回洗浄した後、細胞を細胞培養インキュベーター中で30分間、60μlの1×HBSSで平衡化した。60μlの1×HBSS（37℃）でさらに3回洗浄した後、基質であるL-トリプトファンを終濃度が80μMになるよう加える前に、細胞を化合物で10分間処理した。本アッセイは細胞培養インキュベーター中で37℃、5％CO2で4時間行った。その後、アッセイプレートに30μl／ウェルの上清を移すことにより反応を止めた。10μl／ウェルの30％（w/v）TCAを加え、続いてセンサー1を終濃度が10μMになるよう添加した。短い遠心分離の後、Paradigm（Molecular devices）プレートリーダーを用いて、Ex:546、Em:586nmで蛍光を測定した。
2018532406.tif 000003
2018532406.tif 000004
【００３２】
アッセイ材料：
プレート
アッセイプレート  Costar 384ウェル、オールクリア、NT、*3702
細胞プレート  Costar 384ウェル、オールクリア、PDLコート、*356662
細胞および緩衝液
2018532406.tif 000005
【００３３】
本発明は、IDOまたはTDOの誘導発現を可能にする、社内で確立したHepG2安定細胞株を用いた、新規のHTS適合性細胞ベースアッセイに関する。HepG2細胞は内在性のIDO1もTDOも発現しないため（Pilotte et al, 2012）、ウエスタンブロッティングによって実証されるように（図2Aおよび図2B）、厳格に制御されたドキシサイクリン用量依存的様式で、これらの酵素を誘導することができた。誘導されたIDO1またはTDOはトリプトファンをN-ホルミル-キヌレニンに変換し、これは続いて豊富に存在するホルムアミダーゼによってキヌレニンへと代謝される。生成されたキヌレニンの大部分は培地に放出され、これを蛍光性の「センサーI」プローブにより分析する（図1）。文献（Liu et al, 2010）からの報告を確認すると、（先行技術の生化学的TDOではなく）先行技術の生化学的IDO1のアッセイは、酵素アッセイから細胞ベースアッセイへとつなぐものである。基準化合物であるINCB024360でのTDO酵素活性においては、IC50が生化学的アッセイから細胞ベースアッセイにかけて100倍を超えて右方移動するのが観察される。したがって、化合物のIC50を決定する際に、細胞ベースアッセイはより生物学的に関連性があり信頼できる。
【００３４】
本発明のアッセイは、IDOまたはTDOのための新規なHTS適合性細胞ベースアッセイであるだけでなく、文献（Liu et al., 2010）と比較して、より信頼できるアッセイウィンドウももたらす。図3Aおよび図3Bに示すように、IC50ではなく、アッセイウィンドウは、細胞におけるIDOおよびTDOの発現レベルに依存する。大部分の哺乳類細胞における内在性またはウイルスプロモーター媒介性発現と比較して、Tet-on誘導性システムがはるかに高い導入遺伝子発現を可能にすることは周知である（Gossen et al, 1995）。
【００３５】
参考文献
2018532406.tif 000006
【図１】
2018532406.tif 000007
【図２】
2018532406.tif 000008
【図３】
2018532406.tif 000009
【配列表】
2018532406000001.app
【国際調査報告】
2018532406.tif 000010
2018532406.tif 000011
2018532406.tif 000012
2018532406.tif 000013