(57)【要約】  腎疾患又は腎障害を処置する方法、及び腎疾患又は腎障害を処置するための薬剤を同定する方法を提供する。本方法は、それを必要とする対象に、対象における骨髄系前駆細胞による可溶性ウロキナーゼ受容体(suPAR)の産生を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む。本方法は、その薬剤を患者に投与することを含み、ここで患者は対照と比較して増加した数のGr-1 low細胞を有する。【選択図】図１Ａ−１Ｄ
2018514515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎疾患又は腎障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、対象における骨髄系前駆細胞による可溶性ウロキナーゼ受容体(suPAR)の産生を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記薬剤が、対象からCD34+細胞を除去する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
腎疾患又は腎障害がタンパク尿を含む、請求項1又は請求項2に記載の方法。
【請求項４】
腎疾患又は腎障害が巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
対象から骨髄系前駆細胞を単離し、骨髄系前駆細胞をマウス宿主に移入し、マウス対照のGr-1lo細胞の対照数と比較したマウス宿主のGr-1lo細胞の数を測定し、及びマウス対照と比較してマウス宿主のGr-1lo細胞の数を増加させる骨髄系前駆細胞を有する対象に前記薬剤を投与することをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
骨髄系前駆細胞が末梢血単核細胞(PBMC)を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
骨髄系前駆細胞がCD34+細胞について濃縮されている、請求項5又は請求項6に記載の方法。
【請求項８】
マウス対照と比較してマウス宿主において増加した数のGr-1lo細胞を有する対象から、CD34+細胞を除去することを含む、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、天然物質、合成物質、又はその組合せを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
腎疾患又は腎障害が、足細胞疾患若しくは障害、タンパク尿、糸球体疾患、膜性腎症、巣状分節性糸球体腎炎、微小変化群、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎病変、膠原血管病、ストレス、激しい運動、良性の起立性(体位性)タンパク尿、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、IgA腎症、IgM腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、サルコイドーシス、アルポート症候群、糖尿病、薬物による腎損傷、ファブリー病、感染症、アミノ酸尿、ファンコーニ症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿症、糖尿病腎症(DN)、ループス腎炎、ウェゲナー肉芽腫症、又は糖原病1型を含む、請求項1〜2及び5〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
腎疾患又は腎障害を処置するための薬剤を同定する方法であって、
前記薬剤を、対照と比較して増加した数のGr-1lo細胞を有するマウス宿主に投与し、
腎疾患又は腎障害の指標に対する前記薬剤の効果を決定し、及び
前記薬剤が対照と比較してマウス宿主における腎疾患の指標を改善する場合、前記薬剤が腎疾患又は腎障害の処置に有用であるとして同定すること
を含む方法。
【請求項１２】
腎疾患又は腎障害の指標がアルブミン対クレアチニン比(ACR)である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
腎疾患又は腎障害の指標がsuPARの量である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
腎疾患又は腎障害の指標がGr-1lo細胞に対するGr-1high細胞の割合である、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
腎疾患又は腎障害の指標が骨髄系細胞でのuPAR発現である、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
腎疾患又は腎障害の指標が足細胞の足突起消失である、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が、マウス宿主におけるsuPAR活性又は発現を投与前の活性又は発現と比較して低下させる、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が、骨髄系前駆細胞によるsuPARの産生を阻害する、請求項11に記載の方法。
【請求項１９】
FSGSを有する対象に由来する骨髄系前駆細胞をマウス宿主に投与して、Gr-1lo細胞の数を対照と比較して増加させることを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
骨髄系前駆細胞をマウス宿主に投与する前に、骨髄系前駆細胞をCD34+細胞について濃縮することを含む、請求項19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2015年3月27日出願の米国仮特許出願第62/139,454号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
1.技術分野
腎疾患又は腎障害を処置する方法、及び腎疾患又は腎障害を処置するための薬剤を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2.背景
巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)は、タンパク尿により、及び形態学的には一部の糸球体における分節性硬化により臨床的に特徴づけられる、一般的な一次性糸球体腎障害である(Winnら2005年、D'Agatiら)。一次性FSGSは最終的には腎不全となり、透析又は腎移植が必要となる(Cravediら)。しかし、移植後の子供でも大人でもFSGSの再発率が高いことから、Shalhoub仮説として知られる、T細胞によって媒介される循環因子が病原であると考えられている(Fogo、Gallonら、Shalhoub、1974年)。
【０００４】
本発明者らは、以前、可溶性ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(suPAR)が、FSGSを引き起こす可能性があるその循環因子の一つであると報告し、suPARが、足細胞の膜上のβ3インテグリンに結合し活性化させることより、足細胞の足突起消失及びタンパク尿を伴う糸球体障壁機能の破綻をもたらすことを証明した(Weiら2008年、Weiら)。循環suPARは、細胞膜結合型のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型の3つのドメイン(DI、DII、及びDIII)タンパク質からの放出により生成される(Thunoら2009年、Blasiら2002年)。SuPARは、選択的スプライシング、タンパク質グリコシル化、成熟タンパク質の酵素切断により、複数の形態として存在する(Smithら)。高い血漿中suPARを有する個体全てがFSGSを発症するわけではないが、suPARの生化学的組成は、疾患の惹起及び重症度の重要な決定因子である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
suPARがヒトFSGSを起こす循環因子であると納得するに足る実験的及び臨床的証拠があるにも関わらず、増加したsuPARの細胞性供給源は未知のままである。さらに、病原性suPARの起源細胞が健常マウスにおいて疾患を引き起こすのに十分であるかどうかについては試験されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
腎疾患又は腎障害を処置する方法が提供される。本方法は、それを必要とする対象に、対象の骨髄系前駆細胞による可溶性ウロキナーゼ受容体(suPAR)の産生を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む。
【０００７】
腎疾患又は腎障害を処置するための薬剤を同定する方法が提供される。本方法は、その薬剤を、対照と比較して増加した数のGr-1lo細胞を有するマウス宿主に投与することを含む。本方法は、腎疾患の指標に対する該薬剤の効果を決定すること、及び薬剤が対照と比較してマウス宿主における腎疾患の指標を改善する場合、該薬剤が腎疾患の処置に有用であると同定することも含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−１Ｄ】図1A〜図1I。suPAR媒介タンパク尿には、骨髄細胞(BMC)が必要である。図1A：造血細胞におけるuPAR発現のフローサイトメトリー分析。対照(PBS処理)マウス及びタンパク尿(LPS処理)マウスからPBL及びBMCを単離し、uPARに特異的な蛍光コンジュゲート抗体、及び骨髄特異的分化抗原Gr-1で標識した(2つの独立した実験からの各群につきマウスn=4〜5)。左図は、(データは未記載であるが、前方散乱光及び側方散乱光を用いて)ゲーティングした骨髄系細胞集団における2色染色(uPAR/Gr-1)の代表的なドットプロットを示す。重層ヒストグラム(右図)は、PB(上方)及びBM(下方)由来のゲーティングした骨髄系細胞上のuPARの発現プロファイルを示す。バックグラウンド蛍光(灰色線)は、無関係なアイソタイプ適合抗体を用いて決定した。青線：PBS、赤線：LPS。図1B〜図1D：NSGマウスにPBS又はLPSを注入し、次いでLPS投与から24時間後に尿及び血液を収集した(2つの独立した実験からの群当たりn=4)。図1B：マウスアルブミンELISA及びクレアチニンアッセイでそれぞれ尿中のアルブミン及びクレアチニンを測定した。その後、アルブミン対クレアチニン比(ACR)を計算し、タンパク尿を決定するパラメータとして利用した。図1C：ELISA法でマウス血清suPARレベルを評価した。図1D：BM骨髄系細胞でのuPAR発現のフローサイトメトリー分析。データは図1Aで示されるものと同様である。
【図１Ｅ−１Ｉ】図1E：タンパク尿の発症及びsuPAR産生時におけるBM骨髄系細胞の役割の研究のための概略実験設計。図1F及び図1G：BALB/cマウスに放射線照射し、又は照射せず、次いで、新たに単離したBMCを注入したか又は注入しなかった。LPS投与から24時間後に尿及び血液を収集した(2つの独立した実験からの群当たりn=5〜8)。図1F：ACR。図1G：血漿中suPARレベル。図1H及び図1I：WT B6マウスに放射線照射し、又は照射せず、次いで、WT又はPlaur-/-(KO、B6バックグラウンド)マウスのBMCを注入した又は注入しなかった。その後、LPS投与から24時間後に尿及び血液を収集した(4つの独立した実験からの群当たりn=9〜11)。図1H：ACR。図1I：血漿中suPARレベル。データは、平均±SD(図1B及び図1C)又は±SEM(図1F〜図1I)として示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001であり、NSは有意でないことを示す。
【図２Ａ−２Ｆ】図2A〜図2I。BM骨髄系前駆細胞が、suPAR媒介タンパク尿の原因である。図2A及び図2B：図1Aの通り処理されたマウス由来のBMCにおけるGr-1発現のフローサイトメトリー分析。図2A：ゲーティングしたBM骨髄系細胞集団中のGr-1high、Gr-1low、及びGr-1neg細胞の割合を示す代表的なドットプロット(データは未記載であるが、前方散乱光及び側方散乱光を用いた)。図2B：Gr-1high(白色の棒)、Gr-1low(黒色の棒)細胞の割合を示す棒グラフ。図2C：LPS(又はPBS)投与後の好中球減少(抗Ly6G抗体注入)マウス及び対照(アイソタイプ抗体注入)マウスのACRレベル(2つの独立した実験からの群当たりn=5〜7)。図2D：LPS(又はPBS)刺激前にG-CSF(又はPBS)で処理したマウスのACRレベル(2つの独立した実験からの群当たりn=6〜7)。図2E：図2Dの通り処理したマウスの血漿中suPARレベル。図2F：LPS投与前にプレリキサホル(plerixafor)(又はPBS)で処理したマウスのACRレベル(2つの独立した実験からの群当たりn=5〜6)。
【図２Ｇ−２Ｉ】図2G〜図2I：WTマウスにLPS又はPBSを注入した。24時間後、BMCを単離し、uPAR、Sca-1、及びGr-1に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識し、次いでフローサイトメトリーで分析した(2つの独立した実験からの群当たりn=4)。図2G：uPAR/Sca-1細胞(左図)のドットプロットからuPAR+Sca-1-細胞(桃色)及びuPAR+Sca-1+細胞(緑色)をゲーティングし、Gr-1/Sca-1(右図)のドットプロット中に示し、LPSタンパク尿マウス中におけるuPAR産生細胞の候補として、Sca-1+Gr-1lowBMCを同定した。図2H：棒グラフはPBS(白色の棒)又はLPS(黒色の棒)注入マウス由来の総BMC中の、uPAR+Sca-1-Gr-1+細胞(桃色の棒)及びuPAR+Sca-1+Gr-1+細胞(緑色の棒)の割合を示す。図2I：グラフはPBS又はLPS注入マウス由来のuPAR陽性BMC中のGr-1の平均蛍光強度(MFI)を示す。データは、平均±SD(図2B、2H及び2I)又は±SEM(図2C〜2F)として示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001であり、NSは有意でないことを示す。
【図３Ａ−３Ｇ】図3A〜図3L。マウス又はヒトFSGSのマウスへの移入。図3A〜図3C：WT及びPlaur-/-(KO)マウスをLPSで24時間チャレンジし、次いでこれらのマウスからBMCを単離し、NSGマウスに移入した。ACR及びsuPARレベルを時間経過とともにモニターした(2つの独立した実験からの群当たりn=6)。図3A：概略実験設計。図3B：ACR。図3C：血清suPARレベル。図3D〜図3F：Sca-1+細胞がsuPAR媒介タンパク尿に関係しているか検査するため、LPSチャレンジWTマウスの全体又はSca-1+細胞枯渇(Sca-1neg)BMCをNSGマウスに養子移入した。ACR及びsuPARレベルを時間経過とともにモニターした(3つの独立した実験からの群当たりn=8〜9)。図3E：ACR。図3F：血清suPARレベル。図3G：腎臓の足細胞損傷によるタンパク尿を患うマウスのBMCがタンパク尿を起こすことができるか検査するため、タンパク尿の二重トランスジェニック(dTG、NEF-rtTAxRac1)マウス及び正常対照(Rac1)マウスのBMCをNSGマウスに養子移入した。タンパク尿を誘発するため、二重トランスジェニック(dTG、NEF-rtTAxRac1)マウスにDOXを給餌した。単一トランスジェニック(Rac1)マウスを対照として使用した(2つの独立した実験からの群当たりn=3〜6)。陽性対照として、LPSチャレンジBMCもNSGマウスに移入した。時間経過とともにレシピエントNSGマウスから収集した尿サンプルからACRを測定した。
【図３Ｈ−３Ｌ】図3H〜図3L：異種移植マウスを作製するため、異なるFSGS患者2名及び健常ドナーからヒトPBMCを単離し、次いで、0日目にNSGマウスに注入した。血液及び尿中のモニタリングにより、タンパク尿、高いsuPARレベルといったFSGS様表現型の発生に対して移植マウスを経時的にモニターした。90日目にヒト化NSGマウスから尿、血液、及び腎臓を採取した。図3H：概略実験設計。図3I：ヒト細胞の移植率は移植から12週間後におけるNSGマウスの血液及びBM中のヒトCD45+細胞の割合により決定した。図3J：ヒトPBMCの移植から12週間後の代表的なヒト化マウスの写真。健常なPBMCを移植したマウスにおいてタンパク尿を呈するものはなかった。群当たりn=2。図3K：ACR。図3L：血漿中suPARレベル。データは、平均±SD(図3G、図3I、図3K、及び図3L)又は±SEM(図3B〜図3F)として示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05であり、NSは有意でないことを示す。
【図４Ａ−４Ｅ】図4A〜図4G。FSGS CD34+細胞は、Gr-1lowMPCの増殖を引き起こし、発病に至る。図4A〜図4F：健常ドナー由来の(i)非枯渇(全)又は(ii)CD34+細胞枯渇(CD34-)PBMC、FSGS患者由来の(iii)全又は(iv)CD34-PBMCを、0日目にNSGマウスに注入することにより、異種移植マウスを作製した。血液及び尿中のモニタリングにより、タンパク尿、高いsuPARレベルといったFSGS様表現型の発生に対してマウスを経時的にモニターした。移植から10週間後にNSGマウスから尿、血液、及び腎臓を採取した。図4A：代表的なヒト化マウスの写真(群当たりn=2〜5)。図4B：ACR。図4C：血漿中suPARレベル。図4D：ヒト化マウスのBM骨髄系細胞におけるGr-1発現のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Gr-1high(白色の棒)及びGr-1low(黒色の棒)集団の割合を示す。図4E：ヒト化マウスのBM骨髄系細胞でのuPAR発現のフローサイトメトリー分析。棒グラフはuPAR染色のMFI値を示す。健常な全PBMCを移植したNSGマウスのBM骨髄系細胞由来のMFIを100%とした。
【図４Ｆ−４Ｇ】図4F：ヒト化マウス由来のホルマリン固定腎糸球体の切片をH&E及びPASで染色した。スケールバーは50μmである。透過型及び走査型電子顕微鏡(TEM10,000倍、及びSEM15,000倍)によるヒト化マウスの腎糸球体の分析。足細胞の足突起を示すTEM画像を拡大、強調した。SEM画像は、足細胞の細胞体、一次突起及び指状足突起を示す。スケールバーは2μmである。図4G：病原性骨髄系前駆細胞が病原性suPARの産生を通じて腎疾患の過程を制御することを示す仮説モデル。
【図５】図5A〜図5B。BM骨髄系細胞が、タンパク尿発症の原因である。図5A： i)PBS、ii)LPS、iii)放射線放射+LPS、及びiv) LPS(又はPBS)投与から24時間後に放射線照射+BMC+LPSを与えたマウスから尿サンプルを収集した。マウスの尿1マイクロリットルを10%SDS-PAGEゲルで分画した。尿タンパク質をゲルコードブルー(Gelcode Blue)で染色する。ウシ血清アルブミン(BSA)を標準試薬として使用した。図5B：各々の群のアルブミン/クレアチニン比(ACR)を示す棒グラフ。デンシトメトリー解析により、バンド強度を測定した。BSA標準曲線(n=2)を用いて尿由来のアルブミンレベルを計算した。
【図６Ａ−６Ｃ】図6A〜図6E。亢進した骨髄造血がタンパク尿を促進した。図6A及び図6B：好中球減少(抗Ly6G抗体注入)及び対照(アイソタイプ抗体注入)マウスからPBL及びBMCを単離した。図6A：対照IgG又は抗Ly6G抗体注入マウス由来のPBL及びBMCの代表的なフローサイトメトリープロット。前方散乱光(FSC)及び側方散乱光(SSC)特性に基づき、骨髄系細胞集団(赤い円)をゲーティングした(n=4)。図6B：棒グラフはフローサイトメトリーにより測定された骨髄系細胞数の定量分析を示す(n=4)。図6C〜図6E。LPS(又はPBS)刺激前に、2日間連続してG-CSF(又はPBS)でBALB/cマウスを処理した。LPS投与から24時間後に、血液及び骨(大腿骨及び脛骨)を収集した。図6C：棒グラフはHemavetを用いて決定した白血球(WBC)数の定量分析を示す(n=3)。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、**P<0.01、***P<0.001である。
【図６Ｄ】図6C〜図6E。LPS(又はPBS)刺激前に、2日間連続してG-CSF(又はPBS)でBALB/cマウスを処理した。LPS投与から24時間後に、血液及び骨(大腿骨及び脛骨)を収集した。図6D：PBL及びBMCを単離し、Gr-1特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識した。(前方散乱光及び側方散乱光を用いて)ゲーティングした骨髄系細胞集団におけるGr-1high、Gr-1low、及びGr-1neg細胞の割合を示す代表的なドットプロット。
【図６Ｅ】図6E：棒グラフは定量分析を示す。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、**P<0.01、***P<0.001である。
【図７Ａ−７Ｂ】図7A〜7D。Sca-1+BMCは、suPAR媒介タンパク尿に関係している。図7A：LPS又はPBSで処理したWT及びKO(Plaur-/-)マウスから全BMCを単離した。BMCをSca-1及びc-kitに特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析した。Sca-1及び/又はc-kit陽性BMCの割合を棒グラフで表した(2つの独立した実験からの群当たりn=4)。図7B：完全なSca-1+細胞枯渇BMCのフローサイトメトリー分析を用いたSca-1+細胞枯渇の確認。LPSで処理したWTマウスからBMCを単離した。磁気分離により全BMCからSca-1+細胞を除去した。FITCコンジュゲート抗Sca-1又はアイソタイプ対照抗体で細胞を染色した。代表的なヒストグラムはSca-1の発現プロファイルを示している(n=2)。青色の破線は、陽性Sca-1シグナルのカットオフを示す。Sca-1陽性細胞を赤で丸く囲む。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、**P<0.01、***P<0.001である。
【図７Ｃ−７Ｄ】図7C：Sca-1+細胞がsuPAR媒介タンパク尿に関係するかを検査するための概略実験設計。LPSチャレンジWTマウスからBMCを単離した。枯渇キットを用いてSca-1+細胞枯渇(Sca-1neg)BMCを調製した。NSGマウスに全BMC又はSca-1negBMCを投与した。ACR及びsuPARレベルを経過観察した(3つの独立した実験からの群当たりn=8〜9)。図7D：腎足細胞損傷によりタンパク尿を患うマウスのBMCがタンパク尿を引き起こす能力があるか検査するための概略実験設計。タンパク尿を誘発するため、二重トランスジェニック(dTG、NEF-rtTAxRac1)マウスにDOXを給餌した。単一トランスジェニック(Rac1)マウスを対照として使用した。タンパク尿のdTG及び通常の対照(Rac1)マウスからBMCを単離し、NSGマウスに移入した(2つの独立した実験からの群当たりn=3〜6)。陽性対照として、LPSチャレンジBMCもNSGマウスに移入した。
【図８Ａ−８Ｃ】図8A〜図8D。異種移植マウスにおける腎機能。図8A〜図8D：FSGS患者及び正常個体由来の非枯渇(全)又はCD34+細胞枯渇(CD34-)PBMCをNSGマウスに移入した。移植から10週間後にNSGマウスから血液及び腎臓を採取した(群当たりn=2〜5)。図8A：尿中suPARレベル。図8B：比色分析キット(BioAssay Systems)を用いて、ヒト化マウス由来の血清サンプル中の血中尿素窒素(BUN)を腎機能のマーカーとして測定した。図8C：腎重量。データは平均±SDとして示す。
【図８Ｄ】図8D：ヒト化マウスの糸球体全体の代表的なSEM画像。スケールバーは10μmである。
【図９Ａ−９Ｆ】図9A〜図9J。BM骨髄系細胞が、suPAR媒介タンパク尿に必要である。(図9A〜図9C：)線量9.5Gyの放射線照射及び1×107ドナーBM細胞の眼窩注入を通じた再構築によりBMキメラマウスを作製した。抗生物質で処理した水をマウスに投与し、BMTから6週間後に実験に使用した。BMキメラマウス(WT→KO及びKO→KO)にLPSを注入した。LPS注入から24時間後に血液及び尿サンプルを収集した。(図9A:)血清suPARレベル。(図9B:)尿中suPARレベル。(図9C:)マウスアルブミンELISA及びクレアチニンアッセイでそれぞれ尿中アルブミン及びクレアチニンを測定した。その後、アルブミン対クレアチニン比(ACR)を計算し、タンパク尿を決定するパラメータとして利用した。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05、***P<0.001である。(図9D〜図9F：)NSGマウスにPBS又はLPSを注入し、LPS投与から24時間後に尿及び血液を収集した(2つの独立した実験からの群当たりn=4)。(図9D：)血清suPARレベル。(図9E：)尿中suPARレベル。(図9F：)タンパク尿。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05である。
【図９Ｇ−９Ｊ】(図9G：)造血細胞におけるuPAR発現のフローサイトメトリー分析。対照(PBS処理)マウス及びタンパク尿(LPS処理)マウスからPBL及びBMCを単離し、uPAR及び骨髄細胞特異的分化抗原Gr-1に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識した(2つの独立した実験からの群当たりn=4〜5マウス)。重層ヒストグラムは、PB(上方)及びBM(下方)由来の(データは未記載であるが、前方散乱光及び側方散乱光を用いて)ゲーティングした骨髄系細胞上のuPARの発現プロファイルを示す。バックグラウンド蛍光(灰色線)は、無関係なアイソタイプ適合抗体で決定した。青線：PBS、赤線：LPS。(図9H〜図9J：)BALB/cマウスに放射線照射し、又は照射せず、次いで、新たに単離したBMCを注入した、又は注入しなかった。LPS投与から24時間後に尿及び血液を収集した(2つの独立した実験からの群当たりn=5〜8)。(図9H：)概略実験設計。(図9I：)タンパク尿。(図9J：)血漿中suPARレベル。データは平均±SEMとして示す。一元配置分散分析とその後のテューキーの多重比較検定では、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001である。
【図１０】図10A〜図10G。Gr-1loBM細胞の増殖がsuPAR関連タンパク尿に関係している。(図10A及び図10B：)G-CSFR欠損(KO)及びWTマウスにLPS又はPBSを注入し、24時間後、BM細胞及びタンパク尿のGr-1発現を評価した(2つの独立した実験からの群当たりn=5〜7)。(図10A：)棒グラフはBM中のGr-1lo細胞の割合を示す。(図10B：)タンパク尿。データは平均±SEMとして示す。一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定で、**P<0.01、***P<0.001であり、NSは有意でないことを示す。(図10C〜図10F：)LPSモデル及び足細胞損傷の遺伝モデルPod-Rac1のタンパク尿、suPARレベル及びGr-1loBM骨髄系細胞の検査。(図10C：)タンパク尿。(図10D：)血清suPAR。(図10E：)尿中suPAR。(図10F：) BM中のGr-1lo細胞の割合。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、**P<0.01、***P<0.001であり、NSは有意でないことを示す。(図10G：)3つの異なるタンパク尿動物モデルである、i)アルブミンTGFβ1トランスジェニック(TGFβ1Tg)マウス、ii)腎毒性(NTS)腎炎、iii)BTBR ob/ob糖尿病性腎障害(DN)モデルにおける、タンパク尿、suPARレベル及びGr-1loBM骨髄系細胞の検査。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001であり、NSは有意でないことを示す。
【図１１Ａ−１１Ｄ】図11A〜図11I。BM骨髄系前駆細胞は病気を伝搬させる能力を有する。(図11A：)ドナーNOD-scid IL2rγnull(NSG)マウスにLPS又はPBSを24時間チャレンジし、それらのマウスから骨髄細胞(BMC)を単離し、非チャレンジレシピエントNSGマウスに移入した(2つの独立した実験からの群当たりn=4〜7)。BMC移入前(0時間)並びに移入の6、12、及び24時間後にレシピエントマウスから尿サンプルを収集した。レシピエントNSGマウスにおいてタンパク尿を評価した。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05である。(図11B：)異なる2つのタンパク尿マウスモデル(LPS及びPod-Rac1)由来のBM細胞の養子移入。ドナーマウスにタンパク尿を誘発させるため、i)WT C57BL/6マウスにLPS又はPBSを注入し、ii)Pod-Rac1二重トランスジェニック(dTG、NEF-rtTAxRac1)又は単一トランスジェニック(Rac1)マウスにドキシサイクリン(doxycycline)(DOX)を12日間給餌した。BM細胞移入から12時間後、レシピエントNSGマウスにおいてタンパク尿を評価した(群当たりn=5)。データは平均±SEMとして示す。一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定で、**P<0.01であり、NSは有意でないことを示す。(図11C：)全BM細胞(赤色)における3色染色(uPAR/Sca-1/Gr-1)の代表的なドットプロット。対照(PBS処理)マウス及びタンパク尿(LPS処理)マウスからBM細胞を単離し、uPAR、Gr-1、及びSca-1に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識した。uPAR+細胞(青色)をゲーティングし、これらのドットプロット中に示した。(図11D：)図11Cで示されるuPAR+Sca-1loGr-1lo細胞の定量化。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、***P<0.001である。
【図１１Ｅ−１１Ｉ】(図11E及び図11F：)uPAR野生型マウスからBM細胞を単離し、PBS又は様々な濃度のLPS(0.1、1、及び10μg/ml)で処理した。CO2インキュベーター(5%)中、37℃で24時間インキュベーションした後、細胞及び培養上清を収集した。(図11E：)uPAR、Sca-1、及びGr-1に対してBM細胞を染色した。3色フローサイトメトリー分析により、総BM細胞中のuPAR+Sca-1loGr-1lo細胞のin vitro誘導を決定した。(図11F：)suPAR ELISAにより、培養培地のsuPARレベルを測定した。データは平均±SEMとして示す。一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定で、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001である。(図11G〜図11I：)Sca-1+細胞がsuPAR媒介タンパク尿に関係しているか検査するため、LPSチャレンジWTマウス由来の全BMC又はSca-1+細胞枯渇(Sca-1Δ)BMCをNSGマウスに養子移入した。タンパク尿及びsuPARレベルを経過観察した(3つの独立した実験からの群当たりn=8〜9)。(図11G:)タンパク尿。(図11H：)血清suPAR。(図11I：)尿中suPAR。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05である。
【図１２】図12A〜図12G。hFSGS CD34+PBMCの移植が、suPAR媒介タンパク尿を発症させ、Gr-1loBM細胞を増加させた。(図12A〜図12F：)FSGSの異種移植モデル。(図12A：)概略実験設計。異種移植マウスを作製するため、再発したFSGS患者及び健常ドナーからヒトPBMCを単離し、0日目に非枯渇(全体)又はCD34+細胞枯渇(CD34Δ)PBMCをレシピエントNSGマウスに移入した。血液及び尿中の記録をとることにより、タンパク尿、高いsuPARレベルといったFSGS様表現型の発生に対して移植マウスを経時的にモニタリングした。移植から10〜12週間後にNSGマウスから尿、血液、及び腎臓を採取した(2つの独立した実験からの群当たりn=4〜5)。(図12B：)タンパク尿。(図12C：)血漿中suPAR。(図12D：)は尿中suPAR。(図12E：)BM中のGr-1lo細胞の割合。データは平均±SEMとして示す。テューキーの多重比較検定後の一元配置分散分析では、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001である。(図12F：)ヒト化マウスの腎糸球体の透過型及び走査型電子顕微鏡(TEM 10,000倍、及びSEM 15,000倍)分析。足細胞の足突起を表示するTEM画像を拡大、強調した。SEM画像は、足細胞の細胞体、一次突起及び指状足突起を示す。スケールバーは2μmである。(図12G：)suPAR誘発足細胞損傷/タンパク尿におけるGr-1loBM骨髄系細胞の役割を示すモデルである。LPS、hFSGS異種移植、TGFβ1トランスジェニック(繊維化を伴う腎炎症)、NTS(血清腎炎)、及びBTBR ob/ob(糖尿病性腎障害)のような全身免疫的タンパク尿モデルは、BM及び高い血中suPARレベルにおけるGr-1lo細胞の増殖の点で収束する。
【図１３】図13A〜図13D。suPARへの長期的暴露は、suPARトランスジェニックマウスにおいて足細胞損傷及びタンパク尿を引き起こした。(図13A：)脂肪細胞からマウスの全長suPAR(NP_035243相当、GPIアンカーを持たないDIDIIDIII)の発現を引き起こし、結果として循環系へのその放出をもたらすsuPARトランスジェニックマウス(suPAR-Tg)モデルを作製した。suPAR産生を刺激するため、マウスが少なくとも2か月齢となった時、通常の齧歯類飼料を高脂肪食に置き換えた。高脂肪食への切り替えから2か月後に、suPARトランスジェニックマウス(suPAR-Tg、n=6)及びその同腹の対照(対照、n=17)から血液及び尿サンプルを収集した。(図13B：)血漿中suPARレベル。(図13C：)タンパク尿の発症。(図13D：)足細胞の足突起を表示するTEM画像(10,000倍)を拡大、強調した。スケールバーは1μmである。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05、***P<0.001である。
【図１４】図14。BMキメラマウスにおけるドナー細胞の移植率。放射線照射したuPAR欠損マウス(uPAR KO、CD45.2)にuPAR WT(B6.SJL、CD45.1)又はuPAR KO(CD45.2)BM細胞を投与した。BM移植から6週間後に、CD45.1(uPAR WT)及びCD45.2(uPAR KO)に対する蛍光コンジュゲート抗体で染色した末梢血白血球のフローサイトメトリー分析により、ドナー細胞の移植を評価した。
【図１５】図15A〜図15B。BM骨髄系細胞が、タンパク尿発症の原因である。(図15A：) i)PBS、ii)LPS、iii)放射線照射+LPS、及びiv) LPS(又はPBS)投与から24時間後に放射線照射+BMC+LPSを与えたマウスから尿サンプルを収集した。マウスの尿1マイクロリットルを10%SDS-PAGEゲルで分画した。尿タンパク質をゲルコードブルーで染色する。ウシ血清アルブミン(BSA)を標準試薬として使用した。(図15B：)各々の群におけるアルブミン/クレアチニン比(ACR)を示す棒グラフ。定量分析により、バンド強度を測定した。BSA標準曲線を使用して尿由来のアルブミンレベルを計算した(n=2)。
【図１６】図16A〜図16B。LPS刺激は、BM中のGr-1lo細胞の割合を上昇させた。対照(PBS処理)マウス及びタンパク尿(LPS処理)マウスからBM細胞を単離し、Gr-1に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識した(2つの独立した実験からマウス群当たりn=4〜5)。(図16A：)ゲーティングしたBM骨髄系細胞集団におけるGr-1high、Gr-1low、及びGr-1neg細胞の割合を示す代表的なドットプロット(データは未記載であるが、前方散乱光及び側方散乱光を用いた)。(図16B：)棒グラフはGr-1high(白色の棒)、Gr-1low(黒色の棒)細胞の割合を示す。データは平均±SDとして示す。スチューデントのt検定で、***P<0.001である。
【図１７】図17A〜図17G。骨髄造血の亢進によりLPS誘発タンパク尿が促進された。(図17A〜図17C：)好中球減少(抗Ly6G抗体注入)及び対照(アイソタイプ抗体注入)マウスからPBL及びBMCを単離した。(図17A：)対照IgG又は抗Ly6G抗体注入マウス由来のPBL及びBMCの代表的なフローサイトメトリープロット。前方散乱光(FSC)及び側方散乱光(SSC)の特性に基づき、骨髄系細胞集団(赤の円)をゲーティングした(n=4)。(図17B：)棒グラフはフローサイトメトリーにより測定された骨髄系細胞の数の定量分析を示す(n=4)。(図17C：)ACRレベルである(2つの独立した実験からの群当たりn=5〜7)。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、**P<0.01、***P<0.001である。(図17D〜図17G：) LPS(又はPBS)刺激前に、2日間連続してG-CSF(又はPBS)でBALB/cマウスを処理した。LPS投与から24時間後に、血液及び骨(大腿骨及び脛骨)を収集した。(図17D：)PBL及びBMCを単離し、Gr-1に特異的な蛍光コンジュゲート抗体で標識した。棒グラフは、(前方散乱光及び側方散乱光を用いて)ゲーティングした骨髄系細胞集団におけるGr-1high及びGr-1low細胞の割合を示す。(図17E：)Hemavet(n=3)を用いて決定した白血球(WBC)数の定量分析を示す。(図17F：)ACRレベル。(図17G：)血漿中suPARレベル。データは平均±SD(図17E)又は±SEM(図17F及び図17G)として示す。スチューデントのt検定で、*P<0.05、**P<0.01である。
【図１８】図18A〜図18D。アドリアマイシン(ADR)誘発腎症におけるタンパク尿は、Gr-1loBM細胞の増加率だけでなく上昇したsuPARレベルとも関連しなかった。(図18A〜図18D：)BALB/c雄性マウスに体重kg当たり11mgの用量でADRを尾静脈を通して注入した。ADR注入から6日後に、尿及び血液サンプルを収集し、屠殺したマウスから大腿骨及び脛骨を採取した。(図18A：)タンパク尿。(図18B:）血漿中suPARレベル。(図18C：)尿中suPARレベル。(図18D：）Gr-1loBM骨髄系細胞の割合。データは平均±SEMとして示す。スチューデントのt検定で、***P<0.001であり、NSは有意でないことを示す。
【図１９】図19A〜19F。異種移植マウスにおける腎機能。(図19A：)最初の発表と現在の研究とのヒト化方法の比較。(図19B：)再発したFSGSを有する異なる患者2名及び健常ドナーからヒトPBMCを単離し、NSGマウスに注入した。移植から12週間後に、NSGマウスの血液及びBM中のヒトCD45+細胞の割合により、ヒト細胞の移植率を決定した(群当たりn=2)。(図19C〜図19F：)再発したFSGSを有する患者及び健常個体由来の非枯渇(全体)又はCD34+細胞枯渇(CD34Δ)PBMCをNSGマウスに移入した。移植から10週間後にNSGマウスから血液及び腎臓を採取した(群当たりn=2〜5)。(図19C：)異種移植マウス由来のホルマリン固定腎糸球体の切片をH&E及びPASで染色した。スケールバーは50μmである。(図19D：)比色分析キット(BioAssay Systems)を用いて、ヒト化マウス由来の血清サンプル中の血中尿素窒素(BUN)を腎機能のマーカーとして測定した。(図19E：)腎重量。(図19F：）異種移植マウスの糸球体全体の代表的なSEM画像。スケールバーは10μmである。
【図２０】図20A〜図20C。GVHDは異種移植マウスで観察される腎不全の主要因ではない。(図20A：)異種移植マウスの体重(g)。(図20B：)ヒトIgG(緑色)、シナプトポディン(synaptopodin)(糸球体マーカー、赤色)、及びDAPI(青色)により染色した糸球体の代表的な免疫蛍光像。(図20C：)異種移植マウス由来のH&E染色した皮膚及び肝臓切片の代表画像。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下で開示される実施形態は、網羅的である意図はなく、以下の記載においてまさにその形態へ開示範囲を限定するものでもない。むしろ他の当業者がこの教示を利用できるように例として実施形態を選択し記載する。
【００１０】
本発明の実施形態は、腎疾患又は腎障害を処置する方法、及び腎疾患を処置するための薬剤を同定する方法に関する。
【００１１】
本明細書において、「処置を必要とする対象」は、タンパク尿により特徴づけられる障害を患うか、腎不全の恐れがある若しくは起こしているか、腎移植を受けたか、又はそのいずれかの組合せを有する、ヒト又は他の哺乳類を含む対象を指す。タンパク尿により特徴づけられる障害として、例えば、腎疾患又は糸球体疾患、膜性腎症、巣状分節性糸球体腎炎、微小変化群(minimal change disease)、ネフローゼ症候群、子癇前症、子癇、腎病変、膠原血管病、ストレス、激しい運動、良性の起立性(体位性)タンパク尿、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、IgM腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、末期腎不全、サルコイドーシス、アルポート症候群、糖尿病、薬物による腎損傷、ファブリー病、感染症、アミノ酸尿、ファンコーニ症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿、多発性骨髄腫、ミオグロビン尿症、癌、ウェゲナー肉芽腫症、及び糖原病1型が含まれる。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「タンパク尿」は、損傷を受けている足細胞又は通常はタンパク質を通過させない足細胞を介した障壁をタンパク質が通過することを指す。このような構造的損傷はin vitro又はin vivoで視覚化できる。対象の体内において、「タンパク尿」は、尿中の過剰量の血清タンパク質(例えば、アルブミン)の存在を指し得る。タンパク尿は、腎症候群、泌尿器症候群、及びネフローゼ症候群(つまり、日に3.5グラムを超えるタンパク尿)、子癇、中毒性腎病変、膵臓損傷の症状であってよく、またしばしば糖尿病の症状である。深刻なタンパク尿では、全身的な低タンパク血症を発症する可能性があり、それは膠質浸透圧の低下を引き起こす(腹水、浮腫、水胸症)。
【００１３】
タンパク尿は、主に、濾過作用の細胞学的機構に関係する構造タンパク質の1つ以上の変化により引き起こされうる。タンパク尿の病理生態学的要因は、主に次の群に分類することができる：(1)糸球体基底膜、足細胞、又はスリット膜のような「糸球体濾過ユニット」を形成する構造の遺伝的に決定される攪乱、(2)自己免疫プロセスにより直接引き起こされる、又は病原菌により間接的に誘発される炎症プロセス、(3)薬剤により引き起こされる糸球体の損傷、又は(4)最終的にネフロン全体の機能喪失をもたらす進行性の尿細管間質障害の最終結果。
【００１４】
「骨髄系前駆細胞」は、終末分化した骨髄系列細胞のいずれかへ最終的に発生できるが、リンパ系細胞には一般的に分化しない、多能性又は単能性の前駆細胞を指す。そのため、「骨髄系前駆細胞」は、骨髄系のいずれかの前駆細胞を指す。骨髄系特化前駆細胞としては、本明細書で定義される寡能性(oligopotent)CMP、GMP、及びMEPを含むが、単能性の赤血球前駆細胞、巨核球前駆細胞、顆粒球前駆細胞、及びマクロファージ前駆細胞も包含する。骨髄系前駆細胞の異なる細胞集団は、その分化能、及び特徴的な細胞マーカーセットの存在により、他の細胞と区別できる。いくつかの実施形態において、骨髄系前駆細胞は、骨髄由来の骨髄系前駆細胞である。
【００１５】
本発明の文脈内における「処置すること(treating)」、「処置する(treat)」又は「処置(treatment)」は、障害若しくは疾患に関連する症状の緩和、その症状の更なる進行若しくは悪化の阻止、又は疾患若しくは障害の予防又は防止を意味する。いくつかの実施形態において、成功裏の処置は、腎疾患又は腎障害に関連する症状の緩和を含み得る。例えば、本発明の文脈における成功裏の処置は、腎疾患若しくは腎障害に関連する症状の緩和、又は腎疾患若しくは腎障害の進行の阻止を含み得る。同様に、化合物の治療有効量は、処置される状態に関連する少なくとも1つの症状を低減又は緩和するために十分な量である。「治療有効量」は、本発明のように使用される場合、妥当な利益/リスク比に見合った、過度に有害な副作用(毒性、刺激感、又はアレルギー反応等)を起こさない望ましい治療応答を生じるために十分な成分量を指す。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「被験物質」又は「候補治療用薬剤」又は「薬剤」はここでは区別なく使用され、その用語は、疾患又は他の医学的状態を予防、改善、又は治療する能力を有する任意の分子、化学実体、組成物、薬物、治療用薬剤、化学療法薬、又は生物学的薬剤を包含することを意味する。その用語は、低分子化合物、アンチセンス試薬、siRNA試薬、抗体、酵素、ペプチド、有機又は無機分子、天然又は合成化合物等を含む。臨床試験中、前臨床試験中、又はFDA認可後のいかなる段階でも本発明の方法に従い、被験物質又は薬剤をアッセイできる。
【００１７】
処置方法
腎疾患又は腎障害を処置する方法を提供する。本方法は、それを必要とする対象に、対象における骨髄系前駆細胞による可溶性ウロキナーゼ受容体(suPAR)の産生を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む。
【００１８】
uPARは、3つの細胞外ドメインを有するグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型タンパク質である。GPIアンカーの切断により、suPARが生成する。suPARは、腎疾患患者の血清中で上昇することが判明している。
【００１９】
いくつかの実施形態において、薬剤は、対象からCD34+細胞を除去する。本明細書で使用される場合、「CD34」という用語は、特定の造血幹細胞及び非造血幹細胞上で見られ、遺伝子名CD34を有する細胞表面マーカーを指す。「枯渇」及び「除去」という用語は、サンプルから特定のタイプの細胞(例えば、CD34+)の大多数(つまり半分を超える)を除去することを指す。
【００２０】
本発明に従うCD34+細胞の除去は、いくつかの実施形態において、免疫学的技法を用いて達成され、またいくつかの実施形態において、CD34抗体で対象を処理することを伴う。いくつかの実施形態において、CD34抗体は磁気ビーズと結合し、それは磁気細胞分離装置を用いて、対象、例えばその血液から、CD34+細胞の分離を可能にする。非制限的な例として、本発明における使用のための磁気ビーズは、Miltenyi Biotec Inc.、Auburn、CAが販売する超常磁性マイクロビーズを含む。CD34+細胞を除去する他の方法を使用してもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、処置方法は、薬剤を投与する対象を特定することを含む。対象を特定することは、対象から骨髄系前駆細胞を単離することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、対象から血液サンプル又は他の組織サンプルを収集することにより、対象から骨髄系前駆細胞を単離してもよい。血液サンプルにおいて、当業者に既知のいずれかの技法を用いて末梢血単核細胞を単離してもよい。いくつかの実施形態において、抗体及び磁気ビーズを用いる上述と同様の技法を用いCD34+細胞を保持することにより、骨髄系前駆細胞をCD34+細胞について濃縮してもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、単離した骨髄系前駆細胞をマウス宿主に移入してもよい。いくつかの実施形態において、マウス宿主は、免疫抑制宿主であってもよい。細胞を宿主に移入した後、マウス宿主のGr-1lo細胞の数を測定してもよい。いくつかの実施形態において、細胞を宿主に移入した後、マウス宿主のSca-1+/Gr-1lo細胞の数を測定してもよい。いくつかの実施形態において、測定は、細胞の宿主への移入後数時間、数日、数週間、又は数か月にわたってもよい。Gr-1lo細胞の数を対照の細胞の数と比較する。その骨髄系前駆細胞がマウス対照と比較してマウス宿主のGr-1lo細胞の数の増加を引き起こしている対象に治療用薬剤を投与する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、薬剤は抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、天然物質、合成物質、又はその組合せであってよい。いくつかの実施形態において、薬剤は、骨髄系前駆細胞による可溶性ウロキナーゼ受容体の産生を阻害できる、化学化合物、天然又は合成分子、特に、植物、細菌、ウイルス、動物、真核生物、合成又は半合成起源の有機又は無機分子である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、処置は、化合物の経口投与を含んでよい。いくつかの実施形態において、対象に投与される化合物の用量は、患者に対して一日につき約500mgから2000mgの範囲内であり得る。いくつかの実施形態において、単独又は併用療法で例えばヒト等の温血動物に投与される化合物の用量は、好ましくは一日につき約0.01mg/kg〜約1000mg/kgであり、さらに好ましくは約1mg/kg〜約100mg/kgであり、例えば同量であってよい1〜3回の単回投与に分割するのが好ましい。通常、子供は成人1用量の半分を与えられ、そのため、子供の阻害剤に対する優先用量範囲は、一日につき0.5mg/kg〜約500mg/kgであり、同量であってよい1〜3回の単回投与に分割するのが好ましい。
【００２５】
化合物は、単独で、又は別の自食作用活性化剤との併用で投与することができ、配合薬の形態をとる併用療法、又は化合物と他の阻害剤の交互の投与、又は互いに独立した投与が可能である。同様に、長期治療も可能であり、先に記載される通り、他の処置戦略における補助治療も可能である。他のありうる処置は、症状改善後に対象の状態を維持する処置、又は例えばリスクのある対象に対する予防的処置である。
【００２６】
本明細書で記載される化合物の有効量は、一般的に、神経変性障害の1つ以上の症状を、検出可能に改善するために、又は腎疾患若しくは腎障害の症状の阻害若しくは緩和を検知することにより、十分な任意の量を含む。単回投与剤形を作製するために担体物質と組み合わせ得る有効成分の量は、処理対象の宿主及び個別の投与方法に応じて変動する。しかし、いずれかの個別の対象に対する特定の用量レベルは、採用される特定化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄率、薬物の組み合わせ、及び治療を受ける個別の病気の重症度を含む様々な要因に依存することは理解されるだろう。特定の状況に対する治療有効量は、通常の実験で容易に決定でき、一般的な臨床医学者の技術及び判断の範囲内にある。
【００２７】
本発明の処置方法によれば、望ましい結果を得るために必要な量及び時間で薬剤を対象に投与することにより、ヒト又はより下等な哺乳類等の対象における腎疾患又は腎障害を低減又は予防する。
【００２８】
しかし、本発明の化合物及び組成物の日常の総用量は、主治医の慎重な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されるだろう。いずれかの個別の対象に対する特定の治療有効量レベルは、処置対象の障害、障害の重症度、採用される特定化合物の活性、採用される具体的な組成物、年齢、体重、全身の健康、対象の性別及び食事、投与時間、投与経路、採用される特定化合物の排泄率、処置時間、併用された、又は採用される特定化合物と同時に使用する薬物、医療の当業者に既知の要因などを含む様々な要因に依存する。
【００２９】
本発明の方法における活性薬剤投与のための組成物は、混合、破砕、均質化、懸濁、溶解、乳化、分散、及び適切な場合、選定された賦形剤、希釈剤、担体、及び補助剤との活性薬剤の混合を含む、(獣医学的及び薬学的組成物の分野のような)組成物調製の技術分野で既知の手段により調製してよい。
【００３０】
経口投与について、組成物は、錠剤、薬用ドロップ、丸薬、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、凍結乾燥粉末などの粉剤、液剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、及びチンキ剤の形態であってよい。持続放出型又は遅延放出型の剤形を、例えば被覆粒子、多層タブレット、又は微粒剤の形態で調製してもよい。
【００３１】
経口投与のための固体剤形は、ヒト及び獣医学上の薬学的実務で許容可能な結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味料、被覆剤、保存剤、滑沢剤、及び/又は遅延剤を含んでよい。適切な結合剤として、アラビアガム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、又はポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味料として、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、又はサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤として、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、又は寒天が挙げられる。適切な希釈剤として、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、又はリン酸二カルシウムが挙げられる。適切な香味料として、ペパーミント油、冬緑油、チェリー、オレンジ又はラズベリー香料が挙げられる。適切な被覆剤として、アクリル酸及び/若しくはメタクリル酸及び/若しくはそのエステルのポリマー若しくはコポリマー、ワックス、脂肪族アルコール、ゼイン、シェラック、又はグルテンが挙げられる。適切な保存剤として、安息香酸ナトリウム、ビタミンE、α-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、又は亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、又は滑石が挙げられる。適切な遅延剤として、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【００３２】
経口投与のための液体剤形は、上記薬剤に加え、液状担体を含んでよい。適切な液状担体として、水、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ラッカセイ油、ヤシ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪族アルコール、トリグリセリド、又はそれらの混合物が挙げられる。
【００３３】
経口投与のための懸濁剤は、分散剤及び/又は懸濁化剤をさらに含んでよい。適切な懸濁化剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、又はアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤として、レシチン、ステアリン酸等の脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ若しくはジオレエート、ステアレート、又はラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ若しくはジオレエート、ステアレート、又はラウレート等が挙げられる。
【００３４】
経口投与のための乳剤は、1つ以上の乳化剤をさらに含んでよい。適切な乳化剤として、上で例証した分散剤、又はグアーガム、アラビアガム、又はトラガカントガム等の天然ガムが挙げられる。
【００３５】
薬剤を同定する方法
腎疾患又は腎障害を処置するための薬剤を同定する方法を開示する。本方法は、薬剤をマウス宿主に投与することを含む。マウス宿主において、Gr-1lo細胞の数の増加、又はいくつかの実施形態ではSca-1+/Gr-1loの数の増加が生じる。腎疾患の指標に対する薬剤の効果を決定し、薬剤が対照と比較して宿主において腎疾患の指標を改善する場合、薬剤が処置に有用であると同定する。いくつかの実施形態において、腎疾患又は腎障害の指標は、アルブミン対クレアチニン比(ACR)、suPARの量、Gr-1lo細胞に対するGr-1high細胞の割合、又は足細胞の足突起消失の測定であるが、腎疾患又は腎障害の他の指標を使用してもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、FSGSを有する対象に由来する骨髄系前駆細胞をマウス宿主に投与して、Gr-1lo細胞の数を対照に対して増加させることを含んでよい。いくつかの実施形態において、骨髄系前駆細胞をCD34+細胞について濃縮してよい。
【００３６】
本発明の被験化合物は、当技術分野で既知の数多くの手法のいずれかを用いて得ることができる。いくつかの実施形態において、被験化合物は、被験化合物のライブラリーの１つのメンバーである。「被験化合物のライブラリー」は、多様な被験化合物を含む一群を指す。有機小分子の分子ライブラリーの合成法は記載されている(Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059、Carellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061)。本発明の化合物は、生物学ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー、解析を要する合成ライブラリー法、「1粒子1化合物」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法などの、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くの手法のいずれかを用いて取得できる。生物学ライブラリー手法は、ペプチドライブラリーに制限され、他の4つの手法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam、K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。当技術分野において、分子ライブラリーの合成のための他の典型的な方法を見出すことができ、例えば、Erbら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422、Horwellら(1996) Immunopharmacology 33:68-、及びGallopら(1994) J. Med. Chem. 37:1233-である。溶液中(例えば、Houghten(1992) Biotechniques 13:412〜421)、又はビーズ上(Lam(1991) Nature 354:82〜84)、チップ上(Fodor(1993) Nature 364:555〜556)、細菌上(Ladner USP 5、223、409)、胞子上(Ladner USP '409)、プラスミド上(Cullら(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865〜1869)又はファージ上(Scott及びSmith(1990) Science 249:386〜390)、(Devlin(1990) Science 249:404〜406)、(Cwirlaら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378〜6382)、(Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301〜310)の化合物ライブラリーを提示できる。さらに別の実施形態において、cDNAライブラリーからコンビナトリアルポリペプチドが生成される。活性をスクリーニングできる典型的な化合物として、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子、天然抽出物のライブラリーが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【実施例】
【００３７】
考察
活性化好中球(Pliyevら、2009、Pliyev、Menshikow)、単球(Dekkersら、2000)、造血幹/前駆細胞(HSPC)(Tjwaら、2009)において、(s)uPARの発現及び分泌の増加が以前に観察されているため、本発明者らのFSGSのリポ多糖(LPS)タンパク尿マウスモデルにおいて病原性suPARの起源を特定するために、末梢血白血球(PBL)及び骨髄細胞(BMC)を含む造血細胞中のuPAR発現を調べた。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で処理した対照マウスと比較して、骨髄(BM)由来の骨髄系細胞(Gr-1+)のみが、LPS誘発タンパク尿マウスにおいてuPAR発現を増大させ、末梢血(PB)由来では増大しなかった(図1A)。BM骨髄系細胞がsuPAR媒介タンパク尿に関係している可能性があるかどうかを評価するため、成熟T、B、及びNK細胞を欠くが、骨髄系細胞の産生は損なわれていないNOD-scid IL2rγnull(NSG)マウス(Shultzら、2005)にPBS又はLPSを注入した。実際、LPS注入は、これらのマウスにおいてタンパク尿(図1B)を起こし、血中suPARレベルを上昇させ(図1C)、さらに、BM骨髄系細胞におけるuPAR発現を増大させた(図1D)。これらのデータは、BM骨髄系細胞を病原性suPARの起源とすることと整合する。
【００３８】
骨髄破壊がタンパク尿を予防するか決定するため、LPS注入前にBALB/cマウスに放射線照射した(図1E)。放射線照射したマウスは、タンパク尿の程度(図1F並びに図5A及び図5B)及び血漿中suPARレベル(図1G)に有意な低下を示した。しかし、放射線照射後であるがLPS注入前のレシピエントマウスに、正常BMCを移入することにより、再度、血漿中suPARレベルの上昇を伴うタンパク尿を引き起こす結果となった(図1F及び1G)。そのため、LPS誘発タンパク尿及び関連する血漿中suPARの上昇にBMCが必要である。
【００３９】
タンパク尿の発症におけるBMC由来suPARの役割をより深く理解するため、野生型C57BL/6マウス由来と同系uPAR欠損(Plaur-/-)マウス由来の骨髄を比較しながら、BMC移入実験を繰り返した。上述の通り、放射線照射はタンパク尿を有意に減少させ、LPSに応答したsuPAR産生を制限した一方で、WT BMCの移入により放射線照射したレシピエントにおけるタンパク尿を再発させることができたが、Plaur-/-BMCではできなかった(図1H及び1I)。血漿中suPARレベルもWT BMCの移入により部分的に戻ったが、Plaur-/-BMCの移入では、いずれのBMCも投与されなかった放射線照射マウスと比較して、suPARレベルは穏やかではあるが有意ではない上昇を示した(図1I)。B6(耐性)及びBALB/c(感受性)マウス(Duran-Struuckら、2009)間の放射線感受性の系統特異的差異のため、放射線照射B6マウスにおける残存WT BMCが、本モデルのLPSへの応答で見られる血漿中suPARのわずかな上昇の起源であると推測される。
【００４０】
BM骨髄系(大部分がGr-1lo)細胞におけるuPAR発現の増大に加え、PBS処理対照マウスと比較して、このLPS誘発タンパク尿マウスにおけるGr-1hi(成熟)BM骨髄系細胞に対するGr-1lo(成熟不足又は未成熟)BM骨髄系細胞の比の著しい上昇も観察された(図2A及び図2B)。そのため本発明者らは、BMにおける未成熟骨髄系細胞集団の反応性増殖が、病原性腎臓プロセスに寄与すると仮定した。抗Ly6G抗体を用いてin vivoで成熟末梢血好中球を根絶することによりこれを検査し、LPSチャレンジマウスにおけるタンパク尿の増加を観察した(図2C並びに図5A及び図5B)。同様に、骨髄造血(図5C〜図5E)を刺激するG-CSFでの処理は、LPS単独(図2D及び図2E)と比較して、タンパク尿を加速させ、血漿中suPARレベルを上昇させた。G-CSFは骨髄造血を亢進させるが、BMから循環系へのHSPCの動員も促進できる(Basuら、2002)ため、LPSチャレンジマウスにおいてHSPCの動員単独でタンパク尿を促進できるか調査した。この可能性を扱うため、LPSによるチャレンジ前に、CXCR4拮抗物質でありHSPC動員物質であるプレリキサホルを注入した。G-CSFと異なり、プレリキサホルによる処理は、タンパク尿を亢進させなかった(図2F)。そのため、uPARを発現するBM未成熟骨髄系細胞が、suPARの主な起源でありタンパク尿の発症に必要である。
【００４１】
過去の報告(Tjwaら、2009)と一致するように、Plaur-/-マウスは、WTマウスと比較して、LPSに応答してBM Sca-1+集団の鈍い増殖を示した(図6A)。幹細胞抗原1(Sca-1)は、他の細胞種の中でHSPC集団上で発現し、増殖刺激に対する高い反応性を示す。suPAR媒介タンパク尿におけるBM Sca-1+集団の役割を調査するため、まずuPARを発現するBMCにおけるSca-1発現を調査した。LPSによる処理は、uPARを発現するBMCの中でSca-1+Gr-1lo骨髄系前駆細胞(MPC)の集団が増加したことが観察された(図2G〜図2I)。
【００４２】
次に、suPARが単なる結果ではなく病気の原因であるならば、病原性suPARの細胞性起源が、移入されるときに健常マウスに病気を伝搬させることができると仮定した。これに取り組むために、免疫抑制NSGレシピエントマウスに対するLPSチャレンジドナーマウスのBMCの養子移入を評価した(図3A)。LPSチャレンジしたWT BMCの移入は、タンパク尿及びsuPARレベルを誘導した(図3B及び3C)。注目すべきこととして、Plaur-/-BMCを移入したとき、これらの効果は無効になった(図3B及び3C)。同様に、移入前にドナーNSGマウスにLPSをチャレンジした場合、レシピエントNSGマウスはタンパク尿を発症したが、PBSによるチャレンジでは発症しなかったが、このことはBM骨髄系細胞が病気の伝搬に十分であることを示す(図3D)。
【００４３】
Sca-1+Gr-1loMPCを健常マウスに注入したときに病気を伝搬できるかさらに評価するために、NSGマウスへの移入前に磁気分離によりLPSチャレンジBMCからSca-1+細胞を枯渇させた(図7B及び7C)。Sca-1+BMCの除去は、非枯渇対照BMCと比較して、タンパク尿(図3E)及びsuPARレベル(図3F)双方を低下させた。代替的手段により引き起こされるタンパク尿が二次的に造血細胞を変化させ、当該細胞をタンパク尿誘発性とするかどうかを評価するため、腎臓の足細胞損傷により引き起こされたタンパク尿を患うマウス由来のBMCを養子移入した(図7D)。ドキシサイクリン(DOX)による誘発後、足細胞特異的に活性Rac1を構成的に発現するトランスジェニックマウス(Nef-rtTAxRac1)は、重度のタンパク尿を呈する(Yuら)。これらのタンパク尿マウス由来のBMCをNSGレシピエントマウスに移入したところ、タンパク尿を起こさなかった。対照的に、LPSタンパク尿マウス由来のBMCはタンパク尿を誘発した(図3G)。総合すると、これらの結果は、suPAR産生調節及びタンパク尿発症におけるBM MPCの重要な一次的役割を強調している。
【００４４】
健常マウスへの導入の際に、FSGS患者のCD34+細胞又はFSGSマウス由来のマウスBMC/HSPCが疾患(及び結果として起こるタンパク尿)を導入できること(Sellier-Leclercら、2007、Nishimuraら、1994)を考慮し、FSGS患者のPBMCが正常マウスにおいてタンパク尿を誘発できるか検査した。FSGS患者由来及び正常個体由来のPBMCをNSGマウスに注入した。FSGS患者で観察されるものと同様の症状を示すか決定するため、疾患の発症についてこれらの免疫不全マウスをモニタリングした(図3H)。移植から12週間後に、NSGマウスの血中及びBM中にヒト(hCD45+)細胞が残存していることを見出した(図3I)。実際、異なるFSGS患者2名に由来するPBMCをNSGマウスに移植した結果、タンパク尿を起こし(図3K)、マウスの血中suPARレベルを上昇させた(図3L)一方で、健常PBMCを移植したマウスで移植から12週間後にタンパク尿を示したものはいなかった。
【００４５】
この異種移植疾患モデルを用いて、さらに病原性suPARの産生及びタンパク尿の発症におけるマウスMPCの役割を調査した。Sca-1は、既知のヒト相同体がないマウス特異的細胞表面マーカーであるが、CD34抗原は、ヒトにおける未成熟BMCの画分の同定に広く使用されている。FSGS患者及び正常個体由来の全PBMC又はCD34+細胞枯渇(CD34-)PBMCをNSGマウスに移入した。特に、患者のCD34+PBMCが投与されたマウスは、高い血漿中suPARレベル(図4C)を伴うタンパク尿を発症した(図4B)が、CD34-PBMCの投与では発症しなかった。これらのマウスのBMは、LPSタンパク尿マウスモデルで見られる通り、Gr-1lo集団を増加させ(図4D)、骨髄系細胞上のuPAR発現も増大させた(図4E)。組織学的に、ほとんどの糸球体は正常のように見えたが、FSGS PBMCを受容したマウスにおいて軽度の糸球体硬化症が観察された(図4F)。電子顕微鏡研究により、FSGS PBMCを受容したマウスにおいて、大規模な足細胞の足突起消失(癒合)を伴う糸球体構造の変化が明らかとなり(図4F)、それは腎臓の濾過機能の破壊を暗示する。これらの観察結果と一致するように、これらのマウスは、血液尿素窒素(BUN)レベルの上昇、腎重量の増加、及び肥大化し緩く構成された糸球体も示した(図8A〜図8C)。特に、FSGS患者由来のCD34-PBMCを受容するNSGマウスにはFSGSの形跡がなく、FSGSの病原性において患者CD34+細胞が主要調節因子であることが示された。これは、PBMCのうちCD34+細胞がたった0.05〜0.2%の低頻度で存在する希少性を考慮すると驚くべきことである。過去の観察結果(Sellier-Leclercら、2007、Nishimuraら、1994)と一致するように、FSGS CD34+細胞がFSGS誘発に重要であることを本発明者らは証明した。本発明者らの結果は、患者CD34+細胞がマウスの病原性Gr-1loMPCの増殖を引き起こし、それがFSGSを引き起こすsuPAR(おそらく病理形態)の産生の増加につながることを示唆している(図5G)。FSGS患者由来のCD34+細胞がマウスの病原性BMCの増殖を引き起こし、タンパク尿をもたらす機構は不明のままである。
【００４６】
本研究は、FSGSが一次性BM前駆細胞疾患として生じることを証明している。2つの分析モデル系、マウスLPS刺激及びヒト由来CD34+PBMCは、病原性MPCの増殖に収束する。これらのSca-1+Gr-1lo細胞は、ヒトFSGSに特徴的な足細胞障害を引き起こす腎病原性suPARの全身放出をもたらす。これらの知見は、FSGSの原因の説明の一助となる上、BM前駆体が可溶性伝達物質を通じて臓器機能を調節する他の疾患の病原性に対する原型としても役立つ。この観点において、他の「特発性」障害は、類似又は異なる伝達物質を通して発達し、古典的な炎症反応から外れる可能性がある。
【００４７】
suPAR産生及びタンパク尿における造血細胞の役割を評価するため、骨髄(BM)キメラマウスを作製した。uPAR欠損(Plaur-/-、KO)マウスに放射線照射し、uPAR野生型(Plaur+/+、WT)又はKOマウスのBM細胞を用いて再構成した。全てのキメラマウス(WT→KO及びKO→KO)は、移植から6週間後にドナー細胞の上首尾な移植率を示した(図S2、WT→KO、94.6%±3.7、KO→KO、99.3%±0.7)。期待される通り、KO→KOキメラマウスは、LPS刺激の際にタンパク尿を発症せず(図1C)、重度のsuPAR産生不全(図1A及び図1B)を示した。対照的に、造血細胞内で選択的にuPARを発現するキメラマウス(WT→KO)は、タンパク尿だけでなく(図9C)、血中及び尿中双方において、suPARレベルの上昇を呈した(図9A及び図9B)。これらの結果は、このモデルにおけるsuPAR産生及びタンパク尿発症に造血細胞が必須であることを示唆する。
【００４８】
造血細胞が骨髄系細胞及びリンパ系細胞に分類されることを考慮して、次に、成熟リンパ球を欠くが、骨髄系細胞の産生は損なわれていないNOD-scid IL2rγnull(NSG)マウス(Shultzら)を用いて、どの細胞系列がsuPAR媒介タンパク尿に関係しているか調査した。リンパ球集団の欠損にかかわらず、LPS刺激により血中及び尿中双方のsuPARレベルが上昇し(図9D及び図9E)、タンパク尿を引き起こした(図9F)。これらのデータは、骨髄系細胞はsuPAR媒介タンパク尿に必須であるが、リンパ系細胞は必須ではないことを示唆する。次に、末梢血だけでなくBM中の骨髄系細胞上のuPAR発現を調査した。LPS処理動物において、BM骨髄系細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)処理マウスと比較したとき、膜上のuPARレベルの上昇を呈したが、末梢血骨髄系細胞では呈することはなかった(図9G)。
【００４９】
BM骨髄系細胞がsuPAR産生及びタンパク尿の発症に必要であるという本発明者らの仮説をさらに検証するために、放射線照射を通じた骨髄破壊がLPS処理後のsuPAR媒介タンパク尿を防止することができると推論した。LPS注入前にBALB/cマウスに放射線照射した(図9H)。放射線照射により、血漿中suPARレベル(図9J)だけでなく、タンパク尿の度合も有意に低下した(図9I並びに図15A及び図15B)。しかし、放射線照射後、LPS注入前のレシピエントマウスへの正常BM細胞のの移入は、再度、血漿中suPARレベルの上昇を伴うタンパク尿を引き起こした(図9I及び図9J)。総合すると、これらの結果は、BM骨髄系細胞がLPS誘発タンパク尿及び関連する血漿中suPARの増加に必要であることを示す。
【００５０】
BM骨髄系細胞の特性を定義するため、顆粒球分化抗原Gr-1の発現を調査した。Gr-1の表面発現は、骨髄系細胞の成熟状態を代表する(Basuら、2002)。BMにおいて、Gr-1発現レベルは骨髄系前駆体又は未成熟細胞で低く、それらが顆粒球へ成熟するにつれ上昇する。WTマウスにおいて、LPS刺激によりBM中のGr-1lo細胞の割合が有意に上昇した(図19A並びに図16A及び図16B)。しかし、骨髄造血の主要調節因子(Liuら、1996)である顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体(G-CSFR)の喪失は、LPS処理の際のGr-1loBM骨髄系細胞の増殖を弱め(図10A)、従ってタンパク尿のレベルを低下させる(図10B)。そのため、BMにおける未成熟骨髄系細胞集団の反応性増殖が、病原性腎臓プロセスに寄与すると仮定した。抗Ly6G抗体を用いてin vivoで成熟末梢血好中球を根絶することによりこれを検査し、LPSチャレンジマウスにおいてタンパク尿の増大を観察した(図17A〜図17C)。同様に、骨髄造血を刺激するG-CSF処理(図17D及び図17E)は、LPS単独と比較して、タンパク尿を加速し血漿中suPARレベルを上昇させた(図17F及び図17G)。
【００５１】
CKDにおける危険因子としてのsuPARに関する最近のデータ(Hayekら、2015)を考慮して、Gr-1loBM骨髄系細胞の増殖がsuPAR関連タンパク尿の共通の特徴でありうると推論した。そのため、5つの異なるタンパク尿動物モデルにおいてsuPARとGr-1loBM骨髄系細胞のレベルを調査した。i)ドキシサイクリン(DOX)食により足細胞特異的プロモーター(NEF-rtTA x Rac1)からRac1活性変異体が構成的に発現される足細胞損傷遺伝モデル(以下Pod-Rac1という)(Yuら、2013)、ii)アドリアマイシン(ADR)誘発腎障害、サイトトキシン媒介足細胞ミトコンドリア損傷モデル(Papetaら、2010)、iii)重度の繊維化腎疾患を発症するアルブミンTGFβ1トランスジェニック(TGFβ1Tg)マウスモデル(Koppら、1996、Schifferら、2001)、iv)ネフロトキシン血清(NTS)腎炎、糸球体腎炎(GN)の動物モデル(Kistlerら、2013)、及びv)BTBR ob/obマウス、糖尿病性腎症(DN)のマウスモデル(Hudkinsら、2010)である。検査された動物は全て、それぞれの誘発の後、タンパク尿を呈した(図10C及び図10G、図18A)。LPSモデルと異なり、Pod-Rac1及びADRモデルは、足細胞が損傷の直接の標的であるが、循環系又は尿中のsuPARレベルの上昇は見られなかった(図10D及び図10E、図18B及び図18C)。BM中のGr-1lo骨髄系細胞の割合も有意な上昇は見られなかった(図10F、図18D)。反対に、TGFβ1Tg、NTS、及びBTBR ob/obマウスは、LPSモデルで見られるのと同様に、Gr-1loBM骨髄系細胞における増殖を伴うsuPARレベルの上昇を示した(図10G)。総合すると、これらの結果は、Gr-1loBM骨髄系細胞の増殖はタンパク尿の免疫学的関連形態において共通の上流現象であり、全身のsuPARの上昇、足細胞損傷、及びタンパク尿の発症を引き起こすことを示唆する。
【００５２】
次に、タンパク尿マウスから採取したGr-1loBM骨髄系細胞が、健常な動物に注入されるとき、タンパク尿を誘発できるか評価した(図11A及び図11B)。これを検査するため、PBS又はLPS注入NSGマウスから単離したBM(一次性骨髄系)細胞を非チャレンジNSGレシピエントマウスに養子移入した。実際には、LPSチャレンジBM細胞の移入は、健常なレシピエントマウスにおいてタンパク尿を誘発した(図11A)。同様に、LPSチャレンジWT C57BL6マウスのBM細胞は、レシピエントマウスにおいてタンパク尿を誘発できた。しかし、Pod-Rac1タンパク尿マウスのBM細胞はタンパク尿を引き起こすことはなく(図11B)、足細胞損傷自体はGr-1loBM骨髄系細胞を誘発し腎病原性となるわけではないことが示唆される。この解釈は、Pod-Rac1タンパク尿マウスのBMにおける低い全身suPARレベル及び低いGr-1lo骨髄系細胞の割合と一致する。
【００５３】
BM中のGr-1lo骨髄系細胞は不均一であるため、uPARを発現するGr-1lo細胞のどの部分集団がタンパク尿発症の原因であるか決定しようとした。幹細胞抗原1(Sca-1)が他の細胞種のうちマウス造血幹/前駆細胞(HSPC)集団で発現されること、及び増殖刺激への高い反応性を示すこと(Holmesら、2007)を考慮して、uPARを発現するGr-1loBM細胞におけるSca-1の発現を調査した。LPS刺激は、uPARを発現するBM細胞集団Sca-1loGr-1lo(図11Cで青色で示される)を増加させたが、このことから、uPARを発現する細胞は骨髄系統特化前駆細胞(骨髄系前駆細胞MPCを定義する)であることが示唆される(図11C及び図11D)。
【００５４】
uPARを発現するMPCがsuPARの分泌能を有するか検査するため、LPS刺激下におけるin vitro BM細胞物を用いてsuPAR分泌を調査した。in vivoの研究結果と一致するように、LPSは培地へのsuPAR分泌(図11F)だけでなくuPARを発現するMPCの増殖(図11E)も用量依存的に刺激した。さらに、MPCを健常マウスに注入した場合、病気を伝搬させられるか評価するために、NSGマウスへの移入前に磁気分離によりLPSチャレンジBM細胞からSca-1+細胞を枯渇させた(図7B)。Sca-1+BM細胞の除去は、非枯渇対照BM細胞と比較して、タンパク尿(図11G)及びsuPARレベル(図11H及び図11I)双方を低下させた。これらの結果は、suPAR産生調節及びタンパク尿発症におけるBM MPCの主要な役割を強調する。
【００５５】
この知見をヒトに転用する試みにおいて、ヒト化マウス手法を利用した(Schultzら、Brehmら、Itoら)。使用する共通モデルは、末梢血単核細胞(PBMC)又は造血幹/前駆細胞(HSPC)等、ヒト造血細胞を移植した免疫不全マウスである。Sellier-Leclerc及びその同僚は、糸球体疾患患者由来のCD34+HSPCを健常マウスに移入することにより、アルブミン尿を誘発できることを記載したが、その知見において機構は提示されなかった(Sellier-Leclercら2007)。本発明者らは、再発したFSGS(及び高いsuPARレベル)を有する患者から単離したヒトCD34+細胞は、suPAR誘発型足細胞損傷を通じてタンパク尿を誘発すると仮定した。この仮説を検証するため、改変法を用いて(図19A)、FSGS患者又は健常個体由来の全PBMC又はCD34+細胞枯渇PBMC(CD34ΔPBMC)をNSGマウスに導入した(図12A)。レシピエント動物の血中及び骨髄(BM)中ヒトCD45+細胞の割合により、ヒト細胞の移植率を決定した(図19B)。特に、患者の全PBMCを受容したマウスは、血中及び尿中双方における高いマウスsuPARレベル(図12C及び図12D)とともにタンパク尿(図4B)を発症したが、CD34Δ PBMCを受容したマウスでは発症しなかった。これらのマウスにおいて、suPAR関連タンパク尿動物モデルで観察されたものと同様に、BM中のGr-1lo集団の割合も上昇した(図12E)。この疾病表現型は、患者由来のCD34+細胞の枯渇により防止された(図12E)。患者の全PBMCを受容したマウスのタンパク尿は、軽度の糸球体硬化症(図19C)及び大規模な足細胞の足突起消失(図12F)を伴った。これらのマウスは、血液尿素窒素(BUN)レベルの増加、腎重量の増加、及び肥大化し緩く構成された糸球体も呈した(図19D〜図19F)。FSGS患者由来のCD34+細胞を枯渇させたものだけでなく、健常個体由来のPBMCも腎障害を引き起こさなかったため、観察された腎機能障害は移植片対宿主病(GVHD)によるものではないようである。異種移植マウスも体重低下を示さなかった(図20A)。さらに、異種移植マウスの皮膚及び肝臓(図20C)における非常に軽度のリンパ球浸潤とともに、ヒトIgGの無視できるほどの糸球体への沈着が観察されただけであった。総合すると、これらのデータは、再発したFSGS患者由来のCD34+細胞のNSGマウスへの移植が、Gr-1loBM骨髄系細胞の増殖を引き起こし、タンパク尿をもたらすsuPAR誘発型足細胞損傷に至ることを示唆している。
【００５６】
要約すると、本研究は、高いsuPARを伴うタンパク尿症は一次性BM前駆細胞障害として生じ得ることを示唆している。局所的な足細胞損傷モデル(例えば、足細胞特異的遺伝子の遺伝的変異)と異なり、ヒトFSGSの全身免疫モデル(LPS、TGFβ1Tg、NTS、及びBTBR ob/obマウスモデル)及び異種移植マウスモデルは、BM中のGr-1lo細胞の増殖及び高いsuPARレベルに収束する。Gr-1loBM細胞の増殖は、タンパク尿の発症及びおそらくはCKDにおいてsuPAR誘導型足細胞損傷へ至る共通の上流現象だろう。さらに、本発明者らの知見は、現在「特発性」と分類される、BM前駆体が可溶性伝達物質を通じて臓器機能を調節するが、むしろ類似又は異なる伝達物質を通して発達し、古典的炎症反応から外れる可能性もある他の疾患の病原性に対する原型としても役立つ。
【００５７】
方法
ヒト対象。ラッシュ大学医療センターの治験審査委員会の人間対象研究及び認可に関するガイドラインに従い、健常ボランティア及びFSGS患者から末梢血を採血した。血液ドナーから告知に基づく同意を得た。
【００５８】
マウス。10〜12週齢BALB/c、C57BL/6、Plaur-/-(uPAR KO)、B6.SJL(CD45.1)、csf3r-/-(G-CSFR null)、BTBR/obヘテロ接合体(BTBRob+/-、BTBR.V(B6)-Lepob/WiscJ)、及びNOD-scid IL2rγnull(NSG)、補体受容体3(CR3)ヌルマウスを使用した(ジャクソン研究所提供、米国)。Plaur-/-マウスは、元々C57BL/6が75%及び129が25%の異種交雑のバックグラウンドを持つが、使用前に10世代超にわたりC57BL/6マウスに戻し交雑した。EGFP_CA-Rac1トランスジェニック、及びNphs1-rtTA(NEF-rtTA)マウスは、親切にもAndrey S. Shaw氏(ワシントン大学医学部、ミズーリ州)から提供頂いた(Yuら)。アルブミンTGFβ1トランスジェニック及び同腹マウスは、親切にもMarkus Bitzer氏(ミシガン大学)から提供頂いた(Koppら)。国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従い動物実験を実施し、ラッシュ大学動物実験委員会(IACUC)の認可を受けた。
【００５９】
アルブミンクレアチニン比(ACR)の測定。マウス尿サンプルを収集し、製造者のプロトコルに従い、マウスアルブミンELISA(Bethyl Labs)及びクレアチニン分析キット(Cayman chemical)により尿アルブミン及びクレアチニンを測定した。その後、尿アルブミン対クレアチニンの比を計算した。
【００６０】
循環系及び尿中suPARレベルの検出。製造者のプロトコルに従い、酵素結合免疫吸着法(ELISA)キット(R&D systems)により、血漿(及び/又は血清)並びに尿由来のマウスsuPARレベルを評価した。
【００６１】
suPARトランスジェニックマウスの作製。脂肪細胞からマウスの全長suPAR(NP_035243に相当、GPIアンカーを持たないDIDIIDIII)の発現を引き起こし、結果として循環系への放出を伴うsuPARトランスジェニックマウス(suPAR-Tg)モデルを作製した。suPAR産生を刺激するため、マウスが少なくとも2か月齢となったとき、通常の齧歯類飼料を高脂肪食へ置き換えた。高脂肪飼料への切り替えから2か月後のものである。
【００６２】
BMキメラマウスの作製。uPAR欠損マウス(uPAR KO、CD45.2)に線量9.5Gyで放射線照射し、uPAR WT(B6.SJL、CD45.1)又はuPAR KO(CD45.2)マウスの1X107 BM細胞を用いて眼窩注入を通じて再構成した。抗生物質で処理した水をマウスに投与し、BM移植から6週間後に実験に使用した。CD45.1(uPAR WT)及びCD45.2(uPAR KO)に対する蛍光コンジュゲート抗体で染色した末梢血白血球のフローサイトメトリー分析により、ドナー細胞の移植を評価した。
【００６３】
ヒトPBMCのNSGマウスへの移植。標準的ficoll分離により、健常ボランティア及び再発したFSGS患者の末梢血からPBMCを単離した。腹腔内注入を通して、0日目のNSGマウスに精製したPBMCを移入した(マウス毎に5X106細胞)。血液及び尿中のモニタリングにより、タンパク尿及び高いsuPARレベルである、FSGS様表現型の発現に対して移植マウスを経時的に観察した。本実験条件において凍結融解PBMCは乏しい移植性を示したので、新たに単離したPBMCを移入に使用した。ヒト細胞の再構成率の測定のため、移植から10〜12週後のマウスから末梢血サンプルを採血し、ヒトCD45及びマウスCD45に対する蛍光コンジュゲート抗体で血液白血球を染色した。RBCの溶解の後、フローサイトメトリーで細胞を分析した。
【００６４】
タンパク尿動物モデル。i)LPS注入マウス。以前に記載された通り、LPSの単回注入によりタンパク尿を誘発した(Weiら、2008、Weiら)。簡潔に言うと、体重kg当たり用量10mgでマウスにLPS(Sigma)を腹腔内注入した。PBSを注入したマウスを対照として使用した。LPS処理から24時間後、尿及び血液サンプルを収集し、屠殺したマウスから腎臓、大腿骨及び脛骨を採取した。
【００６５】
ii)Pod-Rac1、誘発性EGFP_CA-Rac1トランスジェニックマウス。EGFP_CA-Rac1トランスジェニックマウスをNphs1-rtTA(NEF-rtTA)誘導マウスと交配させ、二重トランスジェニック(dTG、NEF×Rac1)マウスを作製した。雄性マウスを本研究で使用した。導入遺伝子の発現を誘導するため、通常の飼料をドキシサイクリン(DOX)添加飼料(2,000ppm、TestDiet)に置き換えた。単一トランスジェニック(EGFP_CA-Rac1)マウスを対照として使用した。DOX飼料への切り替えから12日後、尿及び血液サンプルを収集し、屠殺したマウスから腎臓、大腿骨及び脛骨を採取した。iii)アドリアマイシン(ADR)注入マウス。以前に記載された通り、ADRの単回注入により、タンパク尿を誘発した(Wangら)。簡潔に言うと、体重kg当たり用量11mgでBALB/c雄性マウスにADR(ドキソルビシン塩酸塩、Sigma)を尾静脈注入した。ADR注入から6日後、尿及び血液サンプルを収集し、屠殺したマウスから腎臓、大腿骨及び脛骨を採取した。iv)TGFβ1トランスジェニックマウス。以前に記載された通り、マウスアルブミンプロモーターの制御下でTGFβ1活性型を発現するトランスジェニックマウスは、タンパク尿を発症した(Koppら)。導入遺伝子はY染色体上にあるため、重度の表現型を有する雄性マウス(4週齢未満)を使用した。同腹の雌性マウスを対照として使用した。v)腎毒性血清(NTS)腎炎モデル。以前に記載された通り、NTSの注入により、タンパク尿が誘発された(Kistlerら)。簡潔に言うと、体重kg当たり用量500mgで雄性C57BL6マウスにヒツジ抗ウサギ糸球体基底膜抗体を連日、腹腔内注入した。PBSを注入したマウスを対照として使用した。注入から7日後、尿及び血液サンプルを収集し、屠殺したマウスから腎臓、大腿骨及び脛骨を採取した。vi)BTBR ob/ob糖尿病性腎症(DN)モデル。以前に記載された通り、ob/obレプチン欠損変異体を有するマウス系統BTBRは、重いタンパク尿を伴う重度の2型糖尿病を発症した(Hudkinsら)。ヘテロ接合型(BTBR ob+/-)マウスを交配させることにより、野生型(BTBR ob+/+)、ヘテロ接合型(BTBR ob+/-)、及びホモ接合型(BTBR ob-/-)マウスを得た。DNモデルに対して、16週齢のホモ接合型(BTBR ob-/-)を使用した。野生型(BTBR ob+/+)又はヘテロ接合型(BTBR ob+/-)の同腹子を対照として使用した。
【００６６】
マウスPBL及びBMCの精製。血液を収集するため、マウスを麻酔し、下大静脈からクエン酸デキストロース(ACD、Sigma)溶液を含む1ml注射器に血液を採取した。赤血球(RBC)の溶解後、血液白血球を洗浄し計数した。BMC精製について、大腿骨及び脛骨を取り出し、0.1%ウシ血清アルブミン及び20mM HEPES(pH7.4)を含むハンクス平衡塩溶液(HBSS、Life Technologies)を充填した注射器で洗浄した。RBCの溶解後、40μmセルストレーナー(Falcon)を通してBM細胞懸濁液を濾過した。
【００６７】
BMCの養子移入。タンパク尿マウスのsuPAR産生におけるBMCの役割を調査するため、Gammacell40を用いて、BALB/cマウスに9.5Gyの致死的な放射線を照射した。次の日、カルセインAM(Life Technologies)で標識した同系ドナーのBMCを眼窩経路でこれらのマウスに与えた(マウス毎に5×106細胞)。タンパク尿を誘発するため、BMCの移入から1時間後にLPSをレシピエントマウスに注入した。LPS処理から24時間後に、尿及び血液サンプルを収集し、屠殺したマウスから腎臓、大腿骨及び脛骨を採取した。タンパク尿の発症におけるBM由来suPARの役割をより深く理解するため、WT(C57BL/6)又はPlaur-/-マウスからドナーBMCを採取し、致死的な放射線(12Gy)を照射したWTマウスに移入した。LPSチャレンジから24時間後に、収集した尿及び血液サンプルを用いてACR及びsuPARレベルを測定した。
【００６８】
タンパク尿動物モデル由来のBM細胞のNSGマウスへの移入。タンパク尿の発症に対するBMCの能力を直接検査するため、ドナー(WT又はPlaur-/-)マウスにLPSを注入し、24時間後、BMCを単離しNSGレシピエントマウスに移入した。ACR及びsuPARレベルを経過観察した。suPAR媒介タンパク尿にSca-1+細胞が必要であるか決定するため、LPSチャレンジWTマウスからBMCを単離し、全BMC及びSca-1+細胞枯渇BMCの2集団に分割した。さらに、これらの細胞をNSGマウスに移入した。ACR及びsuPARレベルを経過観察した。
【００６９】
タンパク尿を患うマウス由来のGr-1loBM骨髄系細胞がタンパク尿を誘発できるか評価するため、様々なタンパク尿動物モデルからBM細胞を単離し、NSGマウスに移入した。ドナーBM細胞の移入から12時間後、レシピエントマウスの尿サンプルからACRを測定した。suPAR媒介タンパク尿にSca-1+細胞が必要であるか決定するため、LPSチャレンジWTマウスからBM細胞を単離し、全BM細胞及びSca-1+細胞枯渇BM細胞の2集団に分割し、これらの細胞をNSGマウスに移入した。ACR及びsuPARレベルを経時的に観察した。
【００７０】
in vivo枯渇。LPS注入の48時間前及び1時間前に、抗Ly6Gモノクローナル抗体(1A8、BioXcell)又は対照ラットIgG2a抗体(2A3、BioXcell)をマウスに腹腔内注入した(マウス毎に500μg)。フローサイトメトリー分析により好中球の枯渇を確認した。
【００７１】
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)による処理。体重20g当たり用量4μgでBALB/cマウスに組換えマウスG-CSF(Shenandoah Biotechology INC)を2日間続けて腹腔内注入によって毎日投与した。Hemavet 950FS(Drew Scientific)を用いて血液細胞の数(カウント)を決定した。
【００７２】
プレリキサホル処理。体重20g当たり用量100μgでBALB/cマウスにプレリキサホル(AMD3100、Sigma)を2日間続けて腹腔内注入によって毎日投与した。
【００７３】
細胞枯渇方法。Sca-1+細胞枯渇BMCの養子移入を試験するため、EasySep(商標)マウス細胞単離キット(Stemcell technologies)を用いて、全BMCからSca-1+細胞を除去した。簡潔には、LPSチャレンジWT BMCを単離し、ビチオン化抗マウスSca-1抗体で標識し、ストレプトアビジン磁気マイクロビーズとともにインキュベーションした。磁場中で非結合細胞を収集することにより、Sca-1+細胞枯渇BMCを調製した。ヒト化研究のため、EasySep(商標)ヒトCD34ポジティブセレクションキット(Stemcell technologies)を用いて、FSGS患者及び健常ドナーから得たPBMCからヒトCD34+細胞を枯渇させた。
【００７４】
フローサイトメトリー分析。単離したPBL又はBMCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁した後、単一細胞懸濁液をまずラット抗マウスCD16/CD32(BD biosciences)とともに氷上で30分間インキュベーションし、Fc受容体をブロックした。氷上において、Gr-1-アロフィコシアニン(APC)、uPAR-フィコエリトリン(PE)、Sca-1-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、c-kit-APC、及び無関連のIgGアイソタイプ対照抗体である蛍光コンジュゲート抗体で細胞を30分間標識した。Accuri C6フローサイトメーター(BD biosciences)により、データの獲得及び分析を実施した。
【００７５】
in vitroにおける、単離したBM細胞へのLPS刺激。C57BL6 WTマウスからBM細胞を単離し、PBS又は様々な濃度のLPS(0.1、1、及び10μg/ml)で処理した。CO2インキュベーター(5%)中、37℃で24時間インキュベーションした後、細胞及び培養上清を収集した。uPAR、Sca-1、及びGr-1に対して細胞を染色した。3色フローサイトメトリー分析により、総BM細胞中のuPAR+Sca-1loGr-1lo細胞のin vitro誘導を測定した。suPARの測定には培養上清を使用した。
【００７６】
組織学。マウスから腎臓を切除した。腎組織をホルマリンで一晩固定し、パラフィン中に包理した。切片を3〜4μmの厚さに切り、ヘマトキシリン・エオジン(H&E)及び過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色した。
【００７７】
電子顕微鏡検査。ヒト化マウスから腎臓を切除した。腎組織を2〜3mmの切片に切断した。SEMのため、組織をTrumps Fixative(EMS、cat.#11750)で固定し、等級エタノールで脱水し、850臨界点乾燥機(EMS)を用いて乾燥し、108オートスパッタコーター(Cressington)で金めっきした。TEMのため、腎組織を前述の通り固定し、1% OsO4で1時間、後固定した。組織を洗浄、脱水し、Epon812に包理した。EM UC7超ミクロトーム(Leica)上で得られた超薄腎切片(70nm)をフォルムバールコートNiスロットグリッド(EMS、cat.#FF-2010-Ni)に配置し、5%酢酸ウラニル及び0.1%クエン酸鉛で染色した。Sigma HDVP電子顕微鏡(Zeiss)で電子顕微鏡写真を撮影した。
【００７８】
免疫蛍光法。凍結した異種移植マウスの腎組織を厚さ4μmに切断し、氷冷アセトンで5分間固定した。ブロッキング溶液(PBS中2.5%ロバ正常血清及び2.5%ウシ胎児血清(FBS))でサンプルを1時間ブロックした後、サンプルをブロッキング溶液で300倍に希釈したヤギ抗マウスシナプトポディン(sc-21537、Santa Cruz Biotechnology)を用いて染色し、さらにブロッキング溶液で1000倍に希釈したAlexa Fluor 546コンジュゲートロバ抗ヤギIgG(Molecular Probes)を用いて染色した。洗浄後、さらに、ブロッキング溶液で300倍に希釈したAlexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG(109-545-006、Jackson ImmunoResearch)とともにサンプルをインキュベーションした。洗浄後、DAPIを加えたProLong(登録商標)Gold褪色防止用封入剤で染色サンプルをマウントした(Molecular Probes)。Carl Zeiss LSM 700共焦点顕微鏡を利用することにより、画像を得て分析した。
【００７９】
統計分析。データは平均±SD又は±SEMとして示す。GraphPad Prism 5.0により、統計分析を評価した(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。スチューデントの不対両側t検定を用いて、2集団間の差異の有意性を評価した。多集団比較について、テューキーの多重比較検定を伴う一元配置分散分析を実施した。
【００８０】
上述の図及び開示は例証を意図するものであり、網羅的なものではない。本記載は、一般的な当業者に対して多くの変形例及び別の実施例を提案するだろう。このような変形例及び別の実施例は全て、添付の特許請求の範囲の対象範囲に含まれる意図がある。当技術に精通するものは、本明細書に記載される特定の実施形態と同等の他のものに対して、いずれの同等のものも添付の特許請求の範囲に含まれる意図があると認められるだろう。
【００８１】
参考文献
1.  M. P. Winn et al., Science 308, 1801 (Jun 17, 2005).
2.  V. D. D'Agati, F. J. Kaskel, R. J. Falk, N Engl J Med 365, 2398 (Dec 22).
3.  P. Cravedi, J. B. Kopp, G. Remuzzi, Am J Transplant 13, 266 (Feb).
4.  A. B. Fogo, Mechanisms of progression of chronic kidney disease. Pediatr Nephrol 22, 2011-2022 (2007).
5.  L. Gallon, J. Leventhal, A. Skaro, Y. Kanwar, A. Alvarado, N Engl J Med 366, 1648 (Apr 26).
6.  R. J. Shalhoub, Lancet 2, 556 (Sep 7, 1974).
7.  C. Wei et al., Modification of kidney barrier function by the urokinase receptor. Nat Med 14, 55-63 (2008).
8.  C. Wei et al., Circulating urokinase receptor as a cause of focal segmental glomerulosclerosis. Nat Med 17, 952-960.
9.  M. Thuno, B. Macho, J. Eugen-Olsen, Dis Markers 27, 157-172 (2009).
10.  F. Blasi, P. Carmeliet, Nat Rev Mol Cell Biol 3, 932-943 (Dec, 2002).
11.  H. W. Smith, C. J. Marshall, Nat Rev Mol Cell Biol 11, 23-36 (Jan).
12.  B. K. Pliyev, Mol Cell Biochem 321, 111 (Jan, 2009).
13.  B. K. Pliyev, M. Y. Menshikov, Inflammation 33, 1 (Feb).
14.  P. E. Dekkers, T. ten Hove, A. A. te Velde, S. J. van Deventer, T. van Der Poll, Infect Immun 68, 2156 (Apr, 2000).
15.  M. Tjwa et al., J Clin Invest 119, 1008 (Apr, 2009).
16.  L. D. Shultz et al., J Immunol 174, 6477 (May 15, 2005).
17.  R. Duran-Struuck, R. C. Dysko, J Am Assoc Lab Anim Sci 48, 11 (Jan, 2009).
18.  S. Basu, G. Hodgson, M. Katz, A. R. Dunn, Blood 100, 854-861 (Aug 1, 2002).
19.  H. Yu et al., Rac1 activation in podocytes induces rapid foot process effacement and proteinuria. Mol Cell Biol 33, 4755-4764 (2013).
20.  A. L. Sellier-Leclerc et al., A humanized mouse model of idiopathic nephrotic syndrome suggests a pathogenic role for immature cells. J Am Soc Nephrol 18, 2732-2739 (2007)
21.  M. Nishimura et al., J Exp Med 179, 1053 (Mar 1, 1994).
22. S. S. Hayek et al., Soluble Urokinase Receptor and Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 373, 1916-1925 (2015).
23.  D. Cathelin et al., Administration of recombinant soluble urokinase receptor per se is not sufficient to induce podocyte alterations and proteinuria in mice. J Am Soc Nephrol 25, 1662-1668 (2014).
24.  J. M. Spinale et al., A reassessment of soluble urokinase-type plasminogen activator receptor in glomerular disease. Kidney Int 87, 564-574 (2015).
25.  M. Alfano et al., Full-length soluble urokinase plasminogen activator receptor down-modulates nephrin expression in podocytes. Sci Rep 5, 13647 (2015).
26.  L. D. Shultz, M. A. Brehm, J. V. Garcia-Martinez, D. L. Greiner, Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nat Rev Immunol 12, 786-798.
27.  F. Liu, H. Y. Wu, R. Wesselschmidt, T. Kornaga, D. C. Link, Impaired production and increased apoptosis of neutrophils in granulocyte colony-stimulating factor receptor-deficient mice. Immunity 5, 491-501 (1996).
28.  N. Papeta et al., Prkdc participates in mitochondrial genome maintenance and prevents Adriamycin-induced nephropathy in mice. J Clin Invest 120, 4055-4064 (2010).
29.  J. B. Kopp et al., Transgenic mice with increased plasma levels of TGF-beta 1 develop progressive renal disease. Lab Invest 74, 991-1003 (1996).
30.  M. Schiffer et al., Apoptosis in podocytes induced by TGF-beta and Smad7. J Clin Invest 108, 807-816 (2001).
31.  A. D. Kistler et al., Transient receptor potential channel 6 (TRPC6) protects podocytes during complement-mediated glomerular disease. J Biol Chem 288, 36598-36609 (2013).
32.  K. L. Hudkins et al., BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 21, 1533-1542 (2010).
33.  C. Holmes, W. L. Stanford, Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells 25, 1339-1347 (2007).
34.  M. A. Brehm, L. D. Shultz, D. L. Greiner, Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 17, 120-125.
35.  R. Ito, T. Takahashi, I. Katano, M. Ito, Current advances in humanized mouse models. Cell Mol Immunol 9, 208-214.
36.  Y. Wang, Y. P. Wang, Y. C. Tay, D. C. Harris, Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int 58, 1797-1804 (2000).
【図１Ａ−１Ｄ】
2018514515.tif 000003
【図１Ｅ−１Ｉ】
2018514515.tif 000004
【図２Ａ−２Ｆ】
2018514515.tif 000005
【図２Ｇ−２Ｉ】
2018514515.tif 000006
【図３Ａ−３Ｇ】
2018514515.tif 000007
【図３Ｈ−３Ｌ】
2018514515.tif 000008
【図４Ａ−４Ｅ】
2018514515.tif 000009
【図４Ｆ−４Ｇ】
2018514515.tif 000010
【図５】
2018514515.tif 000011
【図６Ａ−６Ｃ】
2018514515.tif 000012
【図６Ｄ】
2018514515.tif 000013
【図６Ｅ】
2018514515.tif 000014
【図７Ａ−７Ｂ】
2018514515.tif 000015
【図７Ｃ−７Ｄ】
2018514515.tif 000016
【図８Ａ−８Ｃ】
2018514515.tif 000017
【図８Ｄ】
2018514515.tif 000018
【図９Ａ−９Ｆ】
2018514515.tif 000019
【図９Ｇ−９Ｊ】
2018514515.tif 000020
【図１０】
2018514515.tif 000021
【図１１Ａ−１１Ｄ】
2018514515.tif 000022
【図１１Ｅ−１１Ｉ】
2018514515.tif 000023
【図１２】
2018514515.tif 000024
【図１３】
2018514515.tif 000025
【図１４】
2018514515.tif 000026
【図１５】
2018514515.tif 000027
【図１６】
2018514515.tif 000028
【図１７】
2018514515.tif 000029
【図１８】
2018514515.tif 000030
【図１９】
2018514515.tif 000031
【図２０】
2018514515.tif 000032
【国際調査報告】
2018514515.tif 000033
2018514515.tif 000034