(57)【要約】本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを含む細胞を提供し、ここで、その第１および第２のＣＡＲは、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する。その細胞は、がんなどの疾患を処置するための方法において使用され得る。上記リガンドは、可溶性リガンドであり得る。上記リガンドが、サイトカイン、ケモカインまたは代謝産物であり得る。上記各々のＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；および（ｉｉｉ）膜貫通ドメインを含み得、ここで、上記第１および第２のＣＡＲのスペーサーは異なり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを含む細胞であって、ここで、前記第１および第２のＣＡＲは、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する、細胞。
【請求項２】
前記リガンドが、可溶性リガンドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記リガンドが、サイトカイン、ケモカインまたは代謝産物である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；および
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン
を含み、ここで、前記第１および第２のＣＡＲのスペーサーは異なる、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項５】
各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；および
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン
を含み、ここで、前記第１および／または第２のＣＡＲのスペーサーは、三量体または多価である、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項６】
細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲを含む、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項７】
前記第１および／または第２ならびに第３のＣＡＲが、それぞれ、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）エンドドメイン
を含み、ここで、前記リガンドが前記第１および第２のＣＡＲに結合し、かつ細胞表面抗原が前記第３のＣＡＲに結合したとき、細胞の活性化が生じるように、前記第３のＣＡＲのエンドドメインと前記第１および／または第２のＣＡＲのエンドドメインは、相補的である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記第３のＣＡＲが、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み、前記第１および／または第２のＣＡＲが、ＣＤ２８エンドドメインおよびＯＸ４０または４１ＢＢエンドドメインを含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記第３のＣＡＲが、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合し、前記第１および第２のＣＡＲが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合する、請求項６〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
前記第１および第２のＣＡＲが前記リガンドに結合したとき、前記細胞表面抗原に結合する前記第３のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害されるように、前記第１および／または第２のＣＡＲが、阻害性エンドドメインを含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項１１】
前記第１のＣＡＲが、２つの抗原結合ドメインを含み、１つが前記可溶性リガンドに結合し、１つが細胞表面抗原に結合する、請求項２に記載の細胞。
【請求項１２】
前記第１および第２のＣＡＲが、前記可溶性リガンドに結合したとき、前記細胞表面抗原に結合する前記第１のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害されるように、前記第２のＣＡＲが、阻害性エンドドメインを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１３】
前記阻害性エンドドメインが、ＰＴＰＮ６または免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）の触媒ドメインであるかまたはそれを含む、請求項１０または１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記第１および第２のＣＡＲが、ＩＬ−６に結合する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５】
前記第１および／または第２のＣＡＲが、阻害性エンドドメインを含み、
前記リガンドの非存在下では、前記細胞表面抗原に結合する前記第３のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害され；
リガンドの存在下では、前記第１および第２のＣＡＲは凝集して前記第３のＣＡＲから分離し、前記第３のＣＡＲが前記細胞表面抗原に結合したとき、シグナル伝達が生じ得る、
請求項６に記載の細胞。
【請求項１６】
前記阻害性エンドドメインが、ＣＤ４５またはＣＤ１４８のエンドドメインであるかまたはそれを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記第１のＣＡＲが、機能性エンドドメインを欠き、前記第２のＣＡＲが、単量体であって機能性エンドドメインを含み、その結果、前記可溶性リガンドの結合が、前記第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとの共局在を引き起こし、前記第１のＣＡＲが前記細胞表面抗原に結合したとき、Ｔ細胞シグナル伝達を生じさせる、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１８】
前記第２のＣＡＲが、単量体のスペーサーを含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記単量体のスペーサーが、ＣＤ２２由来の１つまたはそれを超えるＩｇドメインを含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記第２のＣＡＲ上の機能性エンドドメインが、前記ＣＤ３−ゼータエンドドメインを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれかにおいて規定されたような第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列；および請求項１から２０のいずれかにおいて規定されたような第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む、核酸構築物。
【請求項２２】
以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、前記第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、前記第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する請求項２１に記載の核酸構築物であって、その核酸構築物は、Ｔ細胞において発現されたとき、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲが該Ｔ細胞表面に共発現されるように、切断部位で切断されるポリペプチドをコードする、
請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、請求項２２に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、請求項２２または２３に記載の核酸構築物。
【請求項２５】
請求項６〜１０、１５および１６のいずれかにおいて規定されたような第３のＣＡＲをコードする核酸配列も含む、請求項２１〜２４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【請求項２８】
ｉ）請求項１〜５のいずれかにおいて規定されたような第１のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）請求項１〜５のいずれかにおいて規定されたような第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【請求項２９】
請求項６において規定されたような第３のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターも含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
請求項１から２０のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、請求項２１〜２５のいずれかに記載の核酸構築物；請求項２６もしくは２７に記載のベクター；または請求項２８もしくは２９に記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項３１】
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から２０のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
【請求項３４】
以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）請求項２１〜２５のいずれかに記載の核酸構築物；請求項２６もしくは２７に記載のベクター；または請求項２８もしくは２９に記載のベクターのキットでの該細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）該被験体に（ｉｉ）からの該細胞を投与すること
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、Ｔ細胞含有試料である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患が、がんである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
疾患の処置および／または予防において使用するための請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における請求項１から２０のいずれかに記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リガンド、例えば、可溶性リガンドを認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、がん処置での使用について記載されている。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。上記分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。
【０００５】
下記の表１に要約されているように、様々なＣＡＲがインビトロおよびインビボの試験において試験されている。
【表１−１】
2018523484.tif 000002
【表１−２】
2018523484.tif 000003
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
分離を介したＴ細胞の活性化
【０００７】
Ｔ細胞の活性化は、動力学的分離（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）として知られるプロセスによって、阻害性分子がサイズに基づいてシナプス部位から排除されるせいで生じる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＡＲは、チロシンのリン酸化を刺激することによってＴ細胞シグナル伝達を引き起こす。静止Ｔ細胞では、このプロセスに関わる分子は、拡散によって繰り返し衝突している。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｌｃｋ（膜結合性チロシンキナーゼ）によって絶えずリン酸化されており、そして続けてＣＤ４５（チロシンホスファターゼ）によって脱リン酸化されている。この連続的なリン酸化／脱リン酸化は、ランダムに起き、結果として、ＴＣＲの全体的なリン酸化は低く、Ｔ細胞の活性化は進まない。
【０００８】
ＴＣＲ／ペプチド−ＭＨＣ複合体またはＣＡＲ−標的細胞リガンド複合体が及ぶ距離は短い。これにより、密接に接触した小領域が形成され、この小領域から、大きすぎてはまらない外部ドメインを有する阻害性ＣＤ４５およびＣＤ１４８ホスファターゼ分子が排除される。
【０００９】
ＣＤ４５の立体排除は、上記の密接に接触した領域内に捕捉されるＴＣＲ／ペプチド−ＭＨＣ複合体またはＣＡＲ−標的細胞リガンド複合体のリン酸化半減期を延長する。ＬｃｋキナーゼによるＩＴＡＭのそのようなリン酸化の延長は、ＺＡＰ−７０のリクルート、リン酸化によるその活性化、およびその後のアダプタータンパク質ＬＡＴおよびＳＬＰ−７６のリン酸化の時間を与え、Ｔ細胞の活性化に至る。
【００１０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化の分離機構の中心にあるものは、ＣＡＲが標的細胞の表面上の抗原に結合して、阻害性ホスファターゼが排除される密接に接触した領域を形成するという事実である。
【００１１】
ゆえに、現在まで、標的（例えば、腫瘍細胞）上の膜結合型抗原を認識するＣＡＲ  Ｔ細胞が開発されただけであった。
【００１２】
可溶性腫瘍抗原
がんの発生は、まず体細胞が起因事象（すなわち、環境損傷）を起こし、次いで、第２の事象または促進事象を起こす、多段階のプロセスとして規定されている。腫瘍微小環境は、この新生物プロセスの第２の部分に関与する欠くことのできないものである。
【００１３】
腫瘍微小環境は、種々の細胞型の間で生じているクロストークの産物である。例えば、上皮の腫瘍では、これらの細胞は、侵襲性の癌およびそのストローマエレメントを含む。極めて重要なストローマエレメントとしては、成長因子およびケモカインの分泌を介して不可欠なコミュニケーションネットワークを提供するがん関連線維芽細胞が挙げられ、このがん関連線維芽細胞は、ＥＣＭの変化を誘導するがゆえにさらなる発がんシグナルを提供してがん細胞の増殖および浸潤を強める。腫瘍関連ストローマ細胞が、がんの進行に積極的に寄与すると認識されている。ストローマエレメントは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、ならびに様々な表現型の線維芽細胞、ならびに免疫細胞および炎症細胞、血管およびリンパ管および神経から構成される骨格からなる。
【００１４】
腫瘍が進行して生命を危うくする実体になるためには、腫瘍は、４つの極めて重要な能力を発揮しなければならない。第１に、移動する能力、第２に、組織マトリックス（ＥＣＭ）を分解する能力、第３に、血液中で生き残る適性、および最後に、新しい組織環境において自身を確立することができる物理的品質。微小環境は、このプロセスの成功にとって極めて重要である。
【００１５】
がん細胞の微小環境は、転写因子をオンにする必須のシグナルを提供する。したがって、必要とされる間葉系の表現型が遠位の組織に浸潤し、新しい環境を確立することを可能にする必要不可欠な転写プログラムをストローマ細胞または非悪性細胞が誘導する。すると、がん細胞は、それらの転写因子プログラムを停止して間葉系から上皮細胞に再変換することになり、ゆえに、原発腫瘍細胞のコアからそれら自体が再形成される。
【００１６】
腫瘍細胞は、成長因子、およびＥＣＭを分解するプロテイナーゼをはじめとした種々のタンパク質を直接分泌するか、またはマトリックスおよびその構成要素の接着分子を分解できる生体分子を宿主が産生するのを誘導する。マトリックスの分解は、腫瘍細胞表面に近い領域で生じ、ここで、活性な分解酵素の量は、マトリックスに存在するかまたは正常細胞によって分泌される天然のプロテイナーゼ阻害剤を超える。ゆえに、腫瘍細胞によってＥＣＭ微小環境に分泌されるタンパク質は、細胞接着、細胞運動性、細胞間コミュニケーションおよび浸潤に関わる。
【００１７】
ゆえに、がんは、腫瘍細胞または周囲の非がん性細胞（例えば、ストローマ細胞）によって分泌されるタンパク質、およびマトリックス分解などのがんの活性の結果として産生される分子をはじめとした数多くの可溶性リガンドが腫瘍微小環境に存在することを特徴とし得る。
【００１８】
そのような可溶性リガンドを標的にするモノクローナル抗体などの作用物質は、現在、臨床開発中であるが、これまでに、細胞免疫療法のアプローチが、この価値ある抗原源に接近できたことはない。
【００１９】
オンターゲットオフ腫瘍（Ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ）毒性
がんは特異性を喪失させ得るため、がんを単一抗原の存在によって効果的に説明することは比較的稀である。
【００２０】
大抵のがんは、単一の抗原に基づいて正常な組織と区別することはできない。ゆえに、かなりの「オンターゲットオフ腫瘍」毒性が生じ、それによって、正常な組織が、治療によって損傷される。例えば、リツキシマブでＢ細胞リンパ腫を処置するためにＣＤ２０を標的にするが、正常なＢ細胞コンパートメント全体が枯渇し、慢性リンパ性白血病を処置するためにＣＤ５２を標的にするが、リンパ系コンパートメント全体が枯渇し、急性骨髄性白血病を処置するためにＣＤ３３を標的にするが、骨髄コンパートメント全体が損傷される、など。
【００２１】
「オンターゲットオフ腫瘍」毒性の予測される問題は、臨床試験によって裏付けられている。例えば、ＥＲＢＢ２を標的にするアプローチは、結腸がんが肺および肝臓に転移した患者を死亡させた。ＥＲＢＢ２は、一部の患者の結腸がんにおいて過剰発現されるが、心臓および正常な脈管構造をはじめとしたいくつかの正常組織上にも発現される。
【００２２】
いくつかのがんにおいて、２つのがん抗原の存在を標的にすることは、より選択的であり得るので、１つを標的にするよりも効果的であり得る。例えば、慢性Ｂリンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、一般的な白血病であり、現在、ＣＤ１９を標的にすることによって処置される。これは、そのリンパ腫を処置するが、Ｂ細胞コンパートメント全体を枯渇させることから、この処置は、かなり有毒な作用を有する。Ｂ−ＣＬＬは、ＣＤ５とＣＤ１９とが共発現されるという点において稀な表現型を有する。ＣＤ５およびＣＤ１９を発現する細胞だけを標的にすることによって、オンターゲットオフ腫瘍毒性をかなり減少させることが可能であり得る。
【００２３】
免疫療法のアプローチを用いて可溶性リガンドを標的にすることが可能であれば、腫瘍組織または非腫瘍組織に特徴的な可溶性リガンド（例えば、ケモカイン、サイトカインまたは代謝産物）の存在と膜抗原の存在との組み合わせに基づいて細胞を標的にすることが可能であり得る。これもまた、オンターゲットオフ腫瘍毒性をかなり減少させると予想され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】可溶性リガンドが単一ＣＡＲ  Ｔ細胞との凝集を引き起こさないことを図示している模式図。
【００２５】
【図２】可溶性リガンドと二重ＣＡＲプラットフォーム（両ＣＡＲが同じリガンドを認識する）との予測される凝集を図示している模式図。
【００２６】
【図３】可溶性リガンドと二重ＣＡＲプラットフォーム（両ＣＡＲが同じリガンドを認識し、一方のＣＡＲは多価である）との予測される凝集を図示している模式図。
【００２７】
【図４】概念証明を示すために用いられたモデルを図示している模式図。使用されたリガンドは、ＲＯＲ−１であり、第１および第２の受容体は、それぞれＲ１２およびＲ１１であった。
【００２８】
【図５】実施例において試験されたモデルシステムを用いたときのＲＯＲ−１との予測される凝集を図示している模式図。
【００２９】
【図６】実施例において試験されたモデルシステム（一方のＣＡＲは多価である）を用いたときのＲＯＲ−１との予測される凝集を図示している模式図。
【００３０】
【図７】可溶性リガンド（ＲＯＲ−１）の存在下におけるＩＬ−２の分泌を示しているグラフ。ＢＷ５  Ｔ細胞に、単一のＣＡＲ（ＦｃまたはＣＤ８ＳＴＫまたはＣＯＭＰスペーサーのいずれかを有するＲ１１またはＲ１２）または２つのＣＡＲを形質導入した。これらのＴ細胞を可溶性ＲＯＲ−１リガンドと共培養し、２４時間後にＩＬ−２を検出した。
【００３１】
【図８】固定化されたリガンドの存在下におけるＩＬ−２の分泌を示しているグラフ。ＢＷ５  Ｔ細胞に、単一のＣＡＲ（ＦｃまたはＣＤ８ＳＴＫまたはＣＯＭＰスペーサーのいずれかを有するＲ１１またはＲ１２）または２つのＣＡＲを形質導入した。これらのＴ細胞を、Ｈｉｓでタグ化された可溶性ＲＯＲ−１リガンドで予めコーティングされた抗Ｈｉｓビーズと共培養し、２４時間後にＩＬ−２を検出した。
【００３２】
【図９−１】「分割」ＣＡＲシステムの例を示している模式図。第３のＣＡＲがＰＳＭＡなどの細胞表面抗原に結合すると、ＴＣＲゼータエンドドメインを介してＴ細胞活性化シグナル１が提供される。第１および第２のＣＡＲがＰＳＡなどの可溶性リガンドに結合すると、ＣＤ２８およびＯＸ４０エンドドメインを介してＴ細胞活性化シグナル２および３が提供される。細胞表面抗原（例えば、ＰＳＭＡ）と可溶性リガンド（例えば、ＰＳＡ）の両方が存在すると、３つすべてのシグナルが提供され、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。
【図９−２】「分割」ＣＡＲシステムの例を示している模式図。第３のＣＡＲがＰＳＭＡなどの細胞表面抗原に結合すると、ＴＣＲゼータエンドドメインを介してＴ細胞活性化シグナル１が提供される。第１および第２のＣＡＲがＰＳＡなどの可溶性リガンドに結合すると、ＣＤ２８およびＯＸ４０エンドドメインを介してＴ細胞活性化シグナル２および３が提供される。細胞表面抗原（例えば、ＰＳＭＡ）と可溶性リガンド（例えば、ＰＳＡ）の両方が存在すると、３つすべてのシグナルが提供され、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。
【００３３】
【図１０−１】第１および／または第２のＣＡＲが第３のＣＡＲからのシグナル伝達を阻害するＣＡＲシステムを示している模式図。第３のＣＡＲが細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合すると、Ｔ細胞シグナル伝達がもたらされる。しかしながら、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンド（例えば、ＩＬ６）に結合すると、凝集によって誘導されるリン酸化、およびシグナル伝達の阻害がもたらされる。
【図１０−２】第１および／または第２のＣＡＲが第３のＣＡＲからのシグナル伝達を阻害するＣＡＲシステムを示している模式図。第３のＣＡＲが細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合すると、Ｔ細胞シグナル伝達がもたらされる。しかしながら、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンド（例えば、ＩＬ６）に結合すると、凝集によって誘導されるリン酸化、およびシグナル伝達の阻害がもたらされる。
【００３４】
【図１１−１】第１のＣＡＲが２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つ（「バインダーＡ」）は細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合し、もう１つ（「バインダーＢ１」）は可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＩＬ−６）に結合する、「ＴａｎＣＡＲ」システムを示している模式図。第２のＣＡＲは、その抗原結合ドメイン（「バインダーＢ２」）を介して可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＩＬ−６）に結合する。第２のＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害するエンドドメインを有する。第１のＣＡＲが細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合すると、Ｔ細胞シグナル伝達がもたらされる。しかしながら、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンド（例えば、ＩＬ６）に結合すると、第２のＣＡＲ上の阻害性エンドドメインが、第１のＣＡＲ上の活性化エンドドメインと共局在して、シグナル伝達が阻害される。
【図１１−２】第１のＣＡＲが２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つ（「バインダーＡ」）は細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合し、もう１つ（「バインダーＢ１」）は可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＩＬ−６）に結合する、「ＴａｎＣＡＲ」システムを示している模式図。第２のＣＡＲは、その抗原結合ドメイン（「バインダーＢ２」）を介して可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＩＬ−６）に結合する。第２のＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害するエンドドメインを有する。第１のＣＡＲが細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合すると、Ｔ細胞シグナル伝達がもたらされる。しかしながら、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンド（例えば、ＩＬ６）に結合すると、第２のＣＡＲ上の阻害性エンドドメインが、第１のＣＡＲ上の活性化エンドドメインと共局在して、シグナル伝達が阻害される。
【００３５】
【図１２−１】第１および／または第２のＣＡＲが、反応速度が速い阻害性エンドドメイン（例えば、ＣＤ１４８エンドドメイン）を含む、「ＡＮＤゲート」システムを示している模式図。可溶性リガンドの非存在下では、その阻害性エンドドメインは、第３のＣＡＲ上の活性化エンドドメインを構成的に阻害する。可溶性リガンドの存在下では、第１および第２のＣＡＲは凝集し、第３のＣＡＲから分離して、Ｔ細胞シグナル伝達を生じさせる。
【図１２−２】第１および／または第２のＣＡＲが、反応速度が速い阻害性エンドドメイン（例えば、ＣＤ１４８エンドドメイン）を含む、「ＡＮＤゲート」システムを示している模式図。可溶性リガンドの非存在下では、その阻害性エンドドメインは、第３のＣＡＲ上の活性化エンドドメインを構成的に阻害する。可溶性リガンドの存在下では、第１および第２のＣＡＲは凝集し、第３のＣＡＲから分離して、Ｔ細胞シグナル伝達を生じさせる。
【００３６】
【図１３−１】第１のＣＡＲが２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つ（「バインダーＡ」）が細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合し、もう１つ（「バインダーＢ１」）が可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＰＳＡ）に結合する、代替的「ＡＮＤゲート」システムを示している模式図。第２のＣＡＲは、その抗原結合ドメイン（「バインダーＢ２」）を介して可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＰＳＡ）に結合する。第１のＣＡＲは、機能的なＴ細胞活性化エンドドメインを含まないのに対して、第２のＣＡＲは、機能的なＴ細胞活性化エンドドメインを含む。可溶性リガンドの非存在下では、ＴＣＲゼータ鎖が存在しないことに起因して、細胞表面抗原の結合は、細胞シグナル伝達をもたらさない。可溶性リガンドの存在下では、第１および第２のＣＡＲが共局在し、第１のＣＡＲが細胞表面抗原に結合すると、細胞シグナル伝達がまさにもたらされる。細胞表面リガンドの非存在下でのシグナル伝達を妨げるために、第２のＣＡＲは、単量体であり得、これは、単量体のスペーサー（例えば、ＣＤ２２に基づくもの）を用いて達成され得る。
【図１３−２】第１のＣＡＲが２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つ（「バインダーＡ」）が細胞表面抗原（「リガンドＡ」、例えば、ＰＳＭＡ）に結合し、もう１つ（「バインダーＢ１」）が可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＰＳＡ）に結合する、代替的「ＡＮＤゲート」システムを示している模式図。第２のＣＡＲは、その抗原結合ドメイン（「バインダーＢ２」）を介して可溶性リガンド（「リガンドＢ」、例えば、ＰＳＡ）に結合する。第１のＣＡＲは、機能的なＴ細胞活性化エンドドメインを含まないのに対して、第２のＣＡＲは、機能的なＴ細胞活性化エンドドメインを含む。可溶性リガンドの非存在下では、ＴＣＲゼータ鎖が存在しないことに起因して、細胞表面抗原の結合は、細胞シグナル伝達をもたらさない。可溶性リガンドの存在下では、第１および第２のＣＡＲが共局在し、第１のＣＡＲが細胞表面抗原に結合すると、細胞シグナル伝達がまさにもたらされる。細胞表面リガンドの非存在下でのシグナル伝達を妨げるために、第２のＣＡＲは、単量体であり得、これは、単量体のスペーサー（例えば、ＣＤ２２に基づくもの）を用いて達成され得る。
【００３７】
【図１４】凝集に基づくＡＮＤゲートは、膜結合型抗原（ＣＤ１９）および可溶性リガンド（ＲＯＲ１）の存在下でのみ、シグナル伝達する。
【００３８】
【図１５】可溶性リガンドＰＳＡの存在下におけるＩＬ−２の分泌を示しているグラフ。ＢＷ５  Ｔ細胞に、ＰＳＡの異なるエピトープに結合する２つのＣＡＲを発現するベクターを形質導入した。一方のＣＡＲは、５Ａ５Ａ５に基づく抗原結合ドメインを有し、もう一方のＣＡＲは、５Ｄ３Ｄ１１に基づく抗原結合ドメインを有する（ａＰＳＡ−Ａ５−ＣＤ８ＳＴＫ−ＣＤ２８ＴＭ−ｚ＿ａＰＳＡ−Ｄ１１−ＨＬ−ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍＺまたはａＰＳＡ−Ｄ１１−ＣＤ８ＳＴＫ−ＣＤ２８ＴＭ−ｚ＿ａＰＳＡ−Ａ５−ＨＬ−ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍＺ）。これらのＴ細胞を可溶性ＰＳＡリガンドと共培養し、２４時間後にＩＬ−２を検出した。
【００３９】
本発明の態様の要旨
本発明者らは、２つのＣＡＲ（各々が同じ可溶性リガンド上のエピトープを認識する）を含む細胞を使用することによるＣＡＲアプローチを用いて可溶性リガンドを標的にすることが可能であることを見出した。
【００４０】
それらのＣＡＲは、同じリガンド上の異なるエピトープを認識するので、リガンドが存在すると、細胞の表面上で、リガンドと会合したＣＡＲの凝集が引き起こされる。ゆえに、本発明は、本質的には、Ｔ細胞シグナル伝達を分離ベースのプロセスから凝集ベースのプロセスにする。
【００４１】
したがって、第１の態様において、本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを含む細胞を提供し、ここで、その第１および第２のＣＡＲは、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する。
【００４２】
リガンドは、可溶性リガンド（例えば、サイトカイン、ケモカインまたは代謝産物）であり得る。可溶性リガンドは、例えば、以下の群：トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）から選択され得る。
【００４３】
各ＣＡＲは、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；および
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン
を含み得る。
【００４４】
第１および第２のＣＡＲのスペーサーは、異なってもよい。
【００４５】
第１および／または第２のＣＡＲのスペーサーは、三量体または多価であり得る。
【００４６】
上記細胞は、細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲを含み得る。
【００４７】
本発明の第１の態様は、５つの別個の実施形態も提供し、その各々が、細胞（ｃａｌｌ）表面抗原およびリガンド（例えば、可溶性リガンド）の存在下（または非存在下）でのシグナル伝達の特定の配置に関する。
【００４８】
第１の実施形態において、第１および／または第２のＣＡＲならびに第３のＣＡＲは、それぞれ、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）エンドドメイン
を含み、リガンドが第１および第２のＣＡＲに結合し、かつ細胞表面抗原が第３のＣＡＲに結合したとき、細胞の活性化が生じるように、第３のＣＡＲのエンドドメインと第１および／または第２のＣＡＲのエンドドメインは、相補的である。
【００４９】
この実施形態において、第３のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、第１および／または第２のＣＡＲは、ＣＤ２８エンドドメインおよびＯＸ４０または４１ＢＢエンドドメインを含み得る。
【００５０】
この実施形態において、第３のＣＡＲは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合し得、第１および第２のＣＡＲは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合し得る。
【００５１】
第２の実施形態では、第１および第２のＣＡＲがリガンドに結合したとき、細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害されるように、第１および／または第２のＣＡＲは、阻害性エンドドメインを含む。
【００５２】
第３の実施形態において、第１のＣＡＲは、２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つは可溶性リガンドに結合し；もう１つは細胞表面抗原に結合する。
【００５３】
この実施形態では、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンドに結合したとき、細胞表面抗原に結合する第１のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害されるように、第２のＣＡＲは、阻害性エンドドメインを含む。
【００５４】
第２または第３の実施形態の阻害性エンドドメインは、ＰＴＰＮ６または免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）の触媒ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。
【００５５】
第２または第３の実施形態において、第１および第２のＣＡＲは、ＩＬ−６に結合し得る。
【００５６】
第４の実施形態において、第１および／または第２のＣＡＲは、阻害性エンドドメインを含み、その結果、
リガンドの非存在下では、細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害され；
リガンドの存在下では、第１および第２のＣＡＲが凝集して第３のＣＡＲから分離し、その結果、第３のＣＡＲが細胞表面抗原に結合したとき、シグナル伝達が生じ得る。
【００５７】
第４の実施形態において、阻害性エンドドメインは、ＣＤ４５またはＣＤ１４８のエンドドメインであり得るか、またはそれを含み得る。
【００５８】
第５の実施形態において、第１のＣＡＲは、機能性エンドドメインを欠き、第２のＣＡＲは、単量体であって機能性エンドドメインを含み、その結果、可溶性リガンドの結合が、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとの共局在を引き起こし、第１のＣＡＲが細胞表面抗原に結合したとき、Ｔ細胞シグナル伝達を生じさせる。
【００５９】
第２のＣＡＲは、単量体のスペーサーを含み得、この単量体のスペーサーは、例えば、ＣＤ２２由来の１つまたはそれを超えるＩｇドメインを含み得る。
【００６０】
第５の実施形態において、第２のＣＡＲ上の機能性エンドドメインは、ＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【００６１】
第２の態様において、本発明は、上で規定されたような第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列；および上で規定されたような第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【００６２】
上記核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
その核酸構築物は、Ｔ細胞において発現されるとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがＴ細胞表面に共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする）
を有し得る。
【００６３】
「ｃｏｅｘｐｒ」は、自己切断性ペプチドを含む配列をコードし得る。
【００６４】
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用され得る。
【００６５】
上記核酸構築物は、上で規定されたような第３のＣＡＲをコードする核酸配列も含み得る。
【００６６】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００６７】
そのベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
【００６８】
第４の態様において、本発明は、
ｉ）上で規定されたような第１のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）上で規定されたような第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットを提供する。
【００６９】
そのキットは、上で規定されたような第３のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターも含み得る。
【００７０】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の細胞を作製するための方法を提供し、その方法は、本発明の第２の態様に記載の核酸構築物；本発明の第３の態様に記載のベクター；または本発明の第４の態様に記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む。
【００７１】
本発明の第５の態様の方法において、細胞は、被験体から単離された試料由来であり得る。
【００７２】
第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００７３】
第７の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の第６の態様に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００７４】
上記方法は、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）本発明の第２の態様に記載の核酸構築物；本発明の第３の態様に記載のベクター；または本発明の第４の態様に記載のベクターのキットでの細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）その被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与すること
を含み得る。
【００７５】
上記試料は、Ｔ細胞含有試料であり得る。
【００７６】
上記疾患は、がんであり得る。
【００７７】
第８の態様において、本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明の第６の態様に記載の医薬組成物を提供する。
【００７８】
第９の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第１の態様に記載の細胞の使用を提供する。
【００７９】
上記疾患は、がんであり得る。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
古典的ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位またはリガンドベースの抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。
【００８１】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。
【００８２】
ＣＡＲコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。こうして、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【００８３】
本発明の細胞は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを含む。この細胞は、第３のＣＡＲおよび必要に応じてさらなるＣＡＲも含み得る。
【００８４】
上記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含み得る。エンドドメインは、Ｔ細胞の活性化シグナルを伝達するドメインを含み得るか、またはそれと会合し得る。
【００８５】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの一部である。
【００８６】
数多くの抗原結合ドメインが、当該分野で公知であり、それらとしては、抗体、抗体模倣物およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものが挙げられる。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメインバインダー（例えば、ラクダ科動物のもの）；人工単一バインダー（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｂｉｎｄｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ）（例えば、Ｄａｒｐｉｎ）；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【００８７】
抗原結合ドメインは、下記に規定されるような、可溶性リガンド上または膜結合型リガンド上のエピトープに結合し得る。
【００８８】
用語「リガンド」は、ＣＡＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識および結合される実体を意味する「抗原」の同意語として使用される。
【００８９】
可溶性リガンド
用語「可溶性リガンド」は、細胞の一部ではないかまたは細胞に付着しておらず、細胞外空間で、例えば、目的の組織の体液中で自由に動く、リガンドまたは抗原を表すために使用される。可溶性リガンドは、個体の血清、血漿または他の体液中において無細胞の状態で存在し得る。
【００９０】
可溶性リガンドは、例えば、サイトカイン、ケモカインまたは代謝産物であり得る。
【００９１】
サイトカインは、細胞シグナル伝達において重要な低分子タンパク質（約５〜２０ｋＤａ）である。サイトカインは、細胞によって放出され、他の細胞の挙動に影響する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカインおよび腫瘍壊死因子が含まれる。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびマスト細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々なストローマ細胞をはじめとした広範囲の細胞によって産生される。
【００９２】
サイトカインは、受容体を通じて作用し、健康および疾患、詳細には、感染に対する宿主の応答、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、がんおよび生殖において重要である。ケモカインは、細胞間の化学誘引（走化性）を媒介する。
【００９３】
サイトカインは、がんに対する免疫応答とがんの病理の両方において鍵となる役割を果たすと考えられている。サイトカインは、腫瘍部位の免疫エフェクター細胞およびストローマ細胞を直接刺激し、細胞傷害性エフェクター細胞による腫瘍細胞の認識を高める。数多くの動物腫瘍モデル研究から、サイトカインが広範な抗腫瘍活性を有することが実証され、これは、がん治療のためのいくつかのサイトカインベースのアプローチに変換された。近年、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１をはじめとしたいくつかのサイトカインが、進行がんを有する患者に対する臨床試験に入った。
【００９４】
抗腫瘍免疫を促進する際のＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの抑制性サイトカインの中和を支持する進行中の前臨床研究が存在する。本発明のＣＡＲ細胞を用いて免疫抑制性サイトカインを標的にする利点は、ＣＡＲが２つの方法で：第１に、疾患に特徴的なサイトカインによって活性化されることによって、および第２に、少なくとも循環サイトカインのタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｏｎ）を隔離することによりその免疫抑制効果を弱めることによって、有効であるという点にある。
【００９５】
可溶性リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。
【００９６】
可溶性リガンドは、がんセクレトーム（ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）、すなわち腫瘍によって分泌される因子のコレクションの一部であり得、がん幹細胞、非幹細胞または周囲のストローマ由来であり得る。可溶性リガンドは、腫瘍細胞によって分泌され得る。可溶性リガンドは、例えば、以下の群：ＴＧＦβ、ＰＳＡ、ＣＥＡおよびＶＥＧＦから選択され得る。
【００９７】
可溶性リガンドは、疾患または罹患組織に特徴的であり得る。可溶性リガンドは、疾患を有する被験体にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において；もしくは健康な組織と比べて罹患組織においてより高いレベルで見られ得る。可溶性リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において；または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで発現され得る。
【００９８】
ＴＧＦベータ
可溶性リガンドは、ＴＧＦβであり得る。
【００９９】
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、増殖、細胞分化、および細胞における他の機能を制御する分泌タンパク質である。トランスフォーミング成長因子ベータは、免疫、ならびにがん、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病、多発性硬化症およびＡＩＤＳをはじめとした様々な疾患において役割を果たすサイトカインである。
【０１００】
ＴＧＦ−βは、他の２つのポリペプチド、潜在型ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）および潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）と複合体化した潜在形で、マクロファージを含む多くの細胞型によって分泌される。プラスミンなどの血清プロテイナーゼは、その複合体からの活性なＴＧＦ−βの放出を触媒する。これは、潜在型ＴＧＦ−β複合体が、ＣＤ３６のリガンドであるトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）を介してＣＤ３６に結合するマクロファージ表面上で生じることが多い。マクロファージを活性化する炎症性刺激は、プラスミンの活性化を促進することによって、活性なＴＧＦ−βの放出を高める。マクロファージはまた、形質細胞によって分泌された、ＩｇＧに結合した潜在型ＴＧＦ−β複合体をエンドサイトーシスによって取り込み、次いで、活性なＴＧＦ−βを細胞外液に放出し得る。
【０１０１】
ＴＧＦ−βは、少なくとも３つのアイソフォーム：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３で存在する。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の配列および特徴に関する情報は、ｏｍｉｍ．ｏｒｇのそれぞれエントリー１９０１８０、１９０２２０および１９０２３０から入手可能である。
【０１０２】
ＴＧＦ−βは、正常な上皮細胞および腫瘍形成の初期において、抗増殖因子として作用する。がん性細胞は、ＴＧＦ−βの産生を増加させ、そのＴＧＦ−βは、周囲の細胞にも作用する。
【０１０３】
正常細胞では、シグナル伝達経路を介して作用するＴＧＦ−βは、細胞周期をＧ１期で停止して、増殖を停止するか、分化を誘導するか、またはアポトーシスを促進する。細胞が、がん細胞に変わると、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の一部は変異して、もはやＴＧＦ−βはその細胞を制御しなくなる。これらのがん細胞は増殖する。周囲のストローマ細胞（線維芽細胞）も増殖する。両方の細胞が、ＴＧＦ−βの産生を増加させる。このＴＧＦ−βは、周囲のストローマ細胞、免疫細胞、内皮細胞および平滑筋細胞に作用する。これにより、免疫抑制および血管新生が生じ、がんをより侵襲性にする。ＴＧＦ−βはまた、正常では炎症（免疫）反応によってがんを攻撃するエフェクターＴ細胞を、その炎症反応をオフにする制御性（サプレッサー）Ｔ細胞に変換する。
【０１０４】
ゆえに、ａ）ＴＧＦ−βのアップレギュレートされた発現は、いくつかのがんに特徴的であるので；およびｂ）ＣＡＲ発現細胞による遊離したＴＧＦ−βの隔離は、循環中のＴＧＦ−βの量ならびに関連する免疫抑制作用、血管新生作用および抗炎症作用を減少させ得るので、ＴＧＦ−βは、可溶性リガンドを認識する本発明のＣＡＲの魅力的な標的である。
【０１０５】
本発明の細胞の第１または第２のＣＡＲは、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）に基づく結合ドメインを含み得る。
【０１０６】
フレソリムマブ（ＧＣ１００８）は、ＴＧＦ−βの全アイソフォームに結合し、それらを阻害するヒトモノクローナル抗体である。フレソリムマブは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、巣状分節状糸球体硬化症、およびがん、例えば、腎臓がんおよびメラノーマの処置において使用されている。
【０１０７】
第１または第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、フレソリムマブ由来の６つのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬドメインを含み得る。
【０１０８】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
可溶性リガンドは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）であり得る。
【０１０９】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、ガンマ−セミノプロテインまたはカリクレイン−３（ＫＬＫ３）としても知られ、ヒトにおいてＫＬＫ３遺伝子によってコードされる糖タンパク質酵素である。ＰＳＡは、カリクレイン関連ペプチダーゼファミリーのメンバーであり、前立腺の上皮細胞によって分泌される。
【０１１０】
ＰＳＡは、健康な前立腺を有する男性の血清中に少量で存在するが、前立腺がんおよび他の前立腺障害を有する個体では増加する。
【０１１１】
ＰＳＡは、２３７残基の糖タンパク質であり、ＫＬＫ２によって活性化される。その生理学的役割は、精液の凝塊成分の液化であり、精子の遊離をもたらす。がんでは、ＰＳＡは、新生物の成長および転移のプロセスに関与し得る。
【０１１２】
ＰＳＡは、典型的なＨｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ三連構造、および他のカリクレイン関連ペプチダーゼの触媒ドメインに類似の触媒ドメインを有するキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。ＰＳＡの結晶構造は、ｉ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）８Ｇ８Ｆ５との複合体として、およびｉｉ）２つのｍＡｂである５Ｄ５Ａ５および５Ｄ３Ｄ１１とのサンドイッチ複合体（Ｓｔｕｒａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１１）４１４：５３０−５４４）として、得られた。
【０１１３】
様々なモノクローナル抗体が知られており、それらとしては、Ｂａｖａｔら、Ａｖｉｃｅｎｎａ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，７：２−７；および．．．Ｌｅｉｎｏｎｅｎ（２００４）２８９：１５７−６７に記載されているクローン２Ｇ２−Ｂ２、２Ｄ８−Ｅ８、ＩｇＧ１／Ｋが挙げられる。
【０１１４】
第１または第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ＰＳＡに結合するｍＡｂ（例えば、８Ｇ８Ｆ５、５Ｄ５Ａ５または５Ｄ３Ｄ１１）由来の６つのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬドメインを含み得る。
【０１１５】
５Ｄ３Ｄ１１および５Ｄ５Ａ５のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を下記に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、太字で強調している。
【化１】
2018523484.tif 000004
【０１１６】
第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ５Ａ５由来の６つのＣＤＲを含み得、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ３Ｄ１１由来の６つのＣＤＲを含み得る。
【０１１７】
第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ５Ａ５またはその変異型由来のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み得；第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ３Ｄ１１またはその変異型由来のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み得る。変異型のＶＨおよびＶＬドメインは、上に示した配列と少なくとも８０、９０、９５または９９％の同一性を有し得るが、但し、ＰＳＡ結合活性を保持する。
【０１１８】
がん胎児抗原（ＣＥＡ）
可溶性リガンドは、ＣＥＡであり得る。
【０１１９】
がん胎児抗原（ＣＥＡ）は、細胞接着に関わる高度に近縁の一連の糖タンパク質を表現している。ＣＥＡは、正常には、胎児発生中の胃腸組織において産生されるが、その産生は、誕生前に停止する。ゆえに、ＣＥＡは、通常、健康な成人の血液中には非常に低いレベルでしか存在しない。しかしながら、いくつかのタイプのがんにおいてその血清レベルが上昇し、これは、それを臨床検査において腫瘍マーカーとして使用できることを意味する。
【０１２０】
ＣＥＡは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の細胞表面糖タンパク質であり、その特殊なシアロフコシル化された（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｓｉａｌｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）グリコフォームは、結腸癌細胞の転移性播種にとって極めて重要であり得る機能的な結腸癌Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンリガンドとして働く。免疫学的には、それらは、ＣＤ６６クラスターの分化のメンバーとして特徴付けられる。
【０１２１】
ＣＥＡおよび関連遺伝子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＣＥＡファミリーを構成する。ヒトにおいて、がん胎児抗原ファミリーは、２９個の遺伝子からなり、そのうち１８個は、通常、発現されている。以下は、がん胎児抗原関連細胞接着タンパク質をコードするヒト遺伝子のリストである：ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ１８、ＣＥＡＣＡＭ１９、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ２１。
【０１２２】
ＣＥＡを標的にする様々な抗体が、ＷＯ２０１１／０３４６６０に記載されている。
【０１２３】
可溶性リガンドは、ＶＥＧＦであり得る。
【０１２４】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、細胞によって産生される、血管発生および血管新生を刺激するシグナルタンパク質である。血管内皮成長因子は、血液循環が不十分であるとき、組織への酸素供給を回復させる系の一部である。ＶＥＧＦの血清濃度は、気管支喘息および真性糖尿病において高い。ＶＥＧＦの通常の機能は、胚発生中に新しい血管を作ること、損傷後に新しい血管を作ること、運動後に筋肉を作ること、および遮断された脈管を迂回する新しい脈管（側副血行路）を作ることである。
【０１２５】
ＶＥＧＦは、過剰発現されると、疾患に寄与し得る。固形がんは、十分な血液の供給がないと、限られたサイズを超えて成長できない；ＶＥＧＦを発現し得るがんは、成長でき、転移できる。
【０１２６】
ＶＥＧＦは、シスチン−ノット成長因子の血小板由来成長因子ファミリーのサブファミリーである。それらは、血管発生（胎児の循環器系のデノボ形成）と血管新生（既存の脈管構造からの血管の成長）の両方に関わる重要なシグナル伝達タンパク質である。
【０１２７】
ＶＥＧＦファミリーは、哺乳動物において５つのメンバーを含む：ＶＥＧＦ−Ａ、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ。
【０１２８】
ＶＥＧＦに対する様々な抗体（例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）およびラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ））が知られている。
【０１２９】
膜結合型リガンド
用語「膜結合型リガンド」は、細胞の一部であるかまたは細胞に付着しているリガンドまたは抗原を表すために使用される。このリガンドは、標的細胞の表面に発現されていることがある。このリガンドは、例えば、膜貫通タンパク質であり得る。
【０１３０】
抗原結合ドメインは、細胞、例えば、がん細胞上に低密度で発現されたＴＡＡに結合し得る。低密度で発現されたＴＡＡとは、例えば、細胞１つあたり１０ｓ〜１０００ｓ分子のレベルで発現されたＴＡＡのことを指し得る。
【０１３１】
ある特定のがんにおいて低密度で発現されると知られているＴＡＡの例としては、ＣＬＬにおけるＲＯＲ１、メラノーマにおけるＴｙｐｒ−１およびミエローマにおけるＢＣＭＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
これらのＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｍＡｂ）は、例えば、以下の表１に示されているように以前に報告された。
【表１−３】
2018523484.tif 000005
【０１３３】
スペーサー
本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、抗原結合ドメインをエンドドメインと空間的に分離する、スペーサー配列を含み得る。フレキシブルスペーサーは、抗原結合ドメインが、抗原結合を可能にする種々の方向に向くことを可能にする。
【０１３４】
第１のＣＡＲのスペーサーは、第２のＣＡＲのスペーサーと異なってもよい。
【０１３５】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含み得る。リンカーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を二者択一的に含み得る。
【０１３６】
ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更され得る。
【０１３７】
これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を下記に示す：
【化２】
2018523484.tif 000006
【０１３８】
コイルドコイルドメイン
本発明の細胞の第１および／または第２のＣＡＲは、コイルドコイルスペーサードメインを含み得る。
【０１３９】
コイルドコイルは、２〜７個のアルファ−ヘリックスがロープの子縄のように一緒に巻かれた構造モチーフである（図６）。多くの内在性タンパク質が、コイルドコイルドメインを組み込んでいる。コイルドコイルドメインは、タンパク質の折り畳みに関わり得る（例えば、同じタンパク質鎖内のいくつかのアルファヘリックスモチーフと相互作用する）か、またはタンパク質間相互作用に関与し得る。後者の場合、コイルドコイルは、ホモまたはヘテロオリゴマー構造を惹起し得る。
【０１４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「多量体」および「多量体化」は、「オリゴマー」および「オリゴマー化」と同義であり、相互交換可能である。
【０１４１】
コイルドコイルドメインの構造は、当該分野で周知である。例えば、Ｌｕｐａｓ  ＆  Ｇｒｕｂｅｒが記載したとおり（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２００７；７０；３７−３８）。
【０１４２】
コイルドコイルは通常、ヘプタッドリピートと称される、疎水性アミノ酸残基（ｈ）および荷電アミノ酸残基（ｃ）の反復パターンｈｘｘｈｃｘｃを含む。このヘプタッドリピート内の位置は、通常、ａｂｃｄｅｆｇと標識され、ここで、ａおよびｄは、疎水性の位置であり、イソロイシン、ロイシンまたはバリンが占めることが多い。この反復パターンを有する配列がアルファ−ヘリックス二次構造に折り畳まれることにより、疎水性残基が、そのへリックスに左回りでゆるく巻きつく「縞」として提示され、両親媒性の構造が形成される。そのような２つのヘリックスがそれら自体を細胞質に配置する最も好ましい方法は、親水性アミノ酸の間に挟まれた疎水性鎖を互いに逆らって巻くことである。したがって、疎水性表面の埋没こそが、オリゴマー化のための熱力学的駆動力を提供する。コイルドコイル界面における充填は、例外的に緊密であり、ａ残基の側鎖とｄ残基の側鎖との間にほぼ完全なファンデルワールス接触がある。
【０１４３】
α−ヘリックスは、平行であっても逆平行であってもよいが、通常、左巻きのスーパーコイルをとる。好まれないが、いくつかの右巻きのコイルドコイルも、天然においておよび設計されたタンパク質において観察されている。
【０１４４】
コイルドコイルドメインは、コイルドコイルドメインを含むＣＡＲの複合体が形成されるようにコイルドコイル多量体を形成できる任意のコイルドコイルドメインであってよい。
【０１４５】
コイルドコイルドメインの配列と折り畳まれた最終的な構造との関係性は、当該分野で十分理解されている（Ｍａｈｒｅｎｈｏｌｚら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；２０１１；１０（５）：Ｍ１１０．００４９９４）。したがって、コイルドコイルドメインは、合成的に生成されたコイルドコイルドメインであってもよい。
【０１４６】
コイルドコイルドメインを含むタンパク質の例としては、キネシンモータータンパク質、Ｄ型肝炎デルタ抗原、古細菌のボックスＣ／Ｄ  ｓＲＮＰコアタンパク質、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド終結因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサーまたはアポリポタンパク質Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
様々なコイルドコイルドメインの配列を下記に示す：
キネシンモータータンパク質：平行ホモ二量体（配列番号８）
【化３】
2018523484.tif 000007
Ｄ型肝炎デルタ抗原：平行ホモ二量体（配列番号９）
【化４】
2018523484.tif 000008
古細菌ボックスＣ／Ｄ  ｓＲＮＰコアタンパク質：逆平行ヘテロ二量体（配列番号１０）
【化５】
2018523484.tif 000009
マンノース結合タンパク質Ａ：平行ホモ三量体（配列番号１１）
【化６】
2018523484.tif 000010
コイルドコイルセリンリッチタンパク質１：平行ホモ三量体（配列番号１２）
【化７】
2018523484.tif 000011
ポリペプチド終結因子２：逆平行ヘテロ三量体
【化８】
2018523484.tif 000012
ＳＮＡＰ−２５およびＳＮＡＲＥ：平行ヘテロ四量体
【化９】
2018523484.tif 000013
Ｌａｃリプレッサー：平行ホモ四量体
【化１０】
2018523484.tif 000014
アポリポタンパク質Ｅ：逆平行ヘテロ四量体
【化１１】
2018523484.tif 000015
【０１４８】
コイルドコイルドメインは、オリゴマー化が可能である。コイルドコイルドメインは、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を形成することができ得る。
【０１４９】
２つを超えるコイルドコイルドメインを含む多量体を形成することができるコイルドコイルドメインの例としては、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド終結因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサーまたはアポリポタンパク質Ｅに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない（上記の配列番号１１〜２０を参照のこと）。
【０１５０】
コイルドコイルドメインは、ＣＯＭＰコイルドコイルドメインであり得る。
【０１５１】
ＣＯＭＰは、本質的に最も安定なタンパク質複合体の１つであり（０℃〜１００℃および広範囲のｐＨで安定）、４〜６Ｍ塩酸グアニジンでしか変性できない。ＣＯＭＰコイルドコイルドメインは、五量体を形成することができる。ＣＯＭＰは、通常、細胞外空間に発現される、内因性に発現されるタンパク質でもある。これは、合成スペーサーと比べて免疫原性のリスクを低下させる。さらに、ＣＯＭＰコイルドコイルモチーフの結晶構造が解析されており、それによって、スペーサーの長さに関する正確な推定がもたらされる。ＣＯＭＰ構造は、（約８．１ｎｍであるヒトＩｇＧ由来のヒンジおよびＣＨ２ＣＨ３ドメインに対して）約５．６ｎｍ長である。
【０１５２】
コイルドコイルドメインは、配列番号２１として示されている配列またはそのフラグメントからなり得るか、またはそれを含み得る。
配列番号２１
【化１２】
2018523484.tif 000016
【０１５３】
ＣＯＭＰコイルドコイルドメインをＮ末端で切断し、表面発現を保持することが可能である。ゆえに、このコイルドコイルドメインは、Ｎ末端で切断された配列番号２１の切断バージョンを含み得るか、またはそれからなり得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号２１のＣ末端の５つのアミノ酸、すなわち、配列ＣＤＡＣＧを含み得る。切断型ＣＯＭＰは、５〜４４個のアミノ酸、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のアミノ酸を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号２１のＣ末端に対応し得る。例えば、２０個のアミノ酸を含む切断型ＣＯＭＰは、配列ＱＱＶＲＥＩＴＦＬＫＮＴＶＭＥＣＤＡＣＧを含み得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体化に関わるシステイン残基を保持し得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体を形成する能力を保持し得る。
【０１５４】
様々なコイルドコイルドメインが知られており、それらは、六量体（例えば、ＨＩＶに由来するｇｐ４１）、およびＮ．Ｚａｃｃａｉら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，（７）９３５−９４１）が報告した六量体コイルドコイルをデザインした人工タンパク質を形成する。ＧＣＮ４−ｐ１ロイシンジッパーの変異体型は、七量体のコイルドコイル構造を形成する（Ｊ．Ｌｉｕ．ら（２００６）ＰＮＡＳ（１０３）１５４５７−１５４６２）。
【０１５５】
本コイルドコイルドメインは、上に記載されたコイルドコイルドメインの１つの変異型を含み得るが、但し、その変異型の配列は、コイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持する。例えば、本コイルドコイルドメインは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号８〜２１として示されている配列の変異型を含み得るが、但し、その変異型の配列は、コイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持する。
【０１５６】
２つのポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に測定され得る。
【０１５７】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性をもたらすＣＤ２８に由来し得る。
【０１５８】
シグナルペプチド
本発明のＣＡＲはシグナルペプチドを含み得、その結果、それらがＴ細胞などの細胞において発現されるとき、新生タンパク質を小胞体、それに続いて細胞表面へと指向させ、そこで発現される。
【０１５９】
シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
【０１６０】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。
【０１６１】
シグナルペプチドは、配列番号２２、２３もしくは２４に示される配列、または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するそれらの変異型を含み得るが、ただし、そのシグナルペプチドは、ＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすようになおも機能する。
【化１３】
2018523484.tif 000017
【０１６２】
配列番号２２のシグナルペプチドは、小型であり高効率であり、ＴＣＲβ鎖に由来する。末端グリシンの後で約９５％の切断をもたらすことから、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。
【化１４】
2018523484.tif 000018
【０１６３】
配列番号２３のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
【化１５】
2018523484.tif 000019
【０１６４】
配列番号２４のシグナルペプチドは、ＣＤ８ａに由来する。
【０１６５】
エンドドメイン
エンドドメインは、膜の細胞内の側に位置する古典的ＣＡＲの一部である。
【０１６６】
エンドドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原結合ドメインによる抗原認識の後、個々のＣＡＲ分子クラスター、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。
【０１６７】
本明細書中で規定されるような第１、第２または第３のＣＡＲのエンドドメインは、細胞内のシグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。代替の実施形態では、本ＣＡＲのエンドドメインは、細胞質に存在する細胞内のシグナル伝達分子と相互作用することができ、シグナル伝達をもたらし得る。
【０１６８】
上記細胞内のシグナル伝達ドメインまたは別個の細胞内のシグナル伝達分子は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。
【０１６９】
最も一般的に使用されるシグナル伝達成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータエンドドメインのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。
【０１７０】
本ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータエンドドメインのみを含み得るか、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０のエンドドメインとともにＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得るか、またはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【０１７１】
エンドドメインは、以下のうちの１つまたはそれを超えるものを含み得る：ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＢＴＬＡエンドドメイン、ＣＤ３０エンドドメイン、ＧＩＴＲエンドドメインおよびＨＶＥＭエンドドメイン。
【０１７２】
エンドドメインは、配列番号２５〜３３に示された配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【化１６】
2018523484.tif 000020
【化１７】
2018523484.tif 000021
【０１７３】
変異型の配列は、配列番号２５〜３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、但し、その配列は、有効な細胞内のシグナル伝達ドメインを提供する。
【０１７４】
さらなるＣＡＲ
上記で規定された第１および第２のＣＡＲに加えて、本発明の細胞は、第３のＣＡＲおよび必要に応じてさらなるＣＡＲ（第４、第５、第６など）を含み得る。
【０１７５】
第３のＣＡＲは、例えば、腫瘍関連抗原などの細胞表面抗原に結合し得る。
【０１７６】
以下の表２に示されているように、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が知られている。第３のＣＡＲまたはさらなるＣＡＲの抗原結合ドメインは、これらのＴＡＡのうちの１つに結合することができるドメインであり得る。
【表２】
2018523484.tif 000022
【０１７７】
核酸
【０１７８】
本発明はさらに、本発明の第１の態様に関連して規定されたような第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列；および本発明の第１の態様に関連して規定されたような第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【０１７９】
核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０１８０】
核酸構築物が、Ｔ細胞などの細胞において発現されるとき、それは、第１および第２のＣＡＲが細胞表面で共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする。
【０１８１】
核酸構築物が、３つのＣＡＲをコードする場合、それは、構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｂＢ３−スペーサー３−ＴＭ３−エンド３
を有し得る。
【０１８２】
エンドドメインは、細胞内の細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、または別個の細胞シグナル伝達ドメインと細胞内で会合し得る。
【０１８３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いと同義であると意図されている。
【０１８４】
遺伝暗号の縮重の結果として、数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードできることは、当業者によって理解される。さらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、当業者は、日常的な手法を用いて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチドの置換を行うことがあることが理解されるべきである。
【０１８５】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当該分野で公知である。これらには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載されるような使用の目的において、それらのポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性を高めるためまたは寿命を延長するために行われ得る。
【０１８６】
ヌクレオチド配列に関する用語「変異型」、「ホモログ」または「誘導体」は、その配列からのまたはその配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変更、修飾、置換、欠失または付加を含む。
【０１８７】
上記の構造において、「ｃｏｅｘｐｒ」は、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲの両方の共発現を可能にする核酸配列である。それは、切断部位をコードする配列であり得、その結果、核酸構築物は、切断部位によって連結された２つまたはそれを超えるＣＡＲを生成し含む。切断部位は、自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが生成されると、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに個々のペプチドに切断される。
【０１８８】
切断部位は、第１および第２のＣＡＲが分断されるようになるのを可能にする任意の配列であってよい。
【０１８９】
用語「切断」は、便宜上、本明細書中で使用されるが、切断部位は、上記ペプチドを古典的な切断以外の機構によって個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断性ペプチド（下記を参照のこと）の場合、「切断」活性を説明する様々なモデルが提案されている：宿主細胞のプロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク分解または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、それらのタンパク質を別個の実体として発現させる限り、そのような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要でない。
【０１９０】
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。
【０１９１】
フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な生成物にプロセシングするプロタンパク質コンバターゼである。フューリンは、前駆体タンパク質をそれらの対になった塩基性アミノ酸プロセシング部位で効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンの基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ−ベータ−セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブラント因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ装置において濃縮される。
【０１９２】
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の切断部位であり得る。
【０１９３】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であるので、インビトロとインビボの両方において、融合タンパク質の制御された切断のために使用されることが多い。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓである（ここで、「＼」は、切断されるペプチド結合を表す）。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外来性ＴＥＶプロテアーゼは、哺乳動物細胞においても発現されなければならない。
【０１９４】
切断部位は、自己切断性ペプチドをコードし得る。
【０１９５】
「自己切断性ペプチド」とは、そのポリペプチドが当該タンパク質を構成し、かつ自己切断性ペプチドが生成されると、そのポリペプチドは、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに「切断」されるか、または異なる不連続の第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドのことを指す。
【０１９６】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断性ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの最初の２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端で「切断」する２Ａによって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルス）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸という短いセクションであり、それは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）とともに、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントになる（上記のようなＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０１９７】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐの中の反復配列および細菌の配列（上記のようなＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））において見られる。切断部位は、これらの２Ａ様配列のうちの１つ、例えば：
【化１８】
2018523484.tif 000023
【化１９】
2018523484.tif 000024
を含み得る。
【０１９８】
切断部位は、配列番号３９（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示される２Ａ様配列を含み得る。
【０１９９】
本発明は、本発明の第１の態様に記載の第１および第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれを超える核酸配列を含むキットも提供する。
【０２００】
分割ＣＡＲシステム
本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞を刺激するエンドドメインは、可溶性リガンドを認識する第１および第２のＣＡＲと、細胞表面抗原を認識する第３のＣＡＲとの間で「分割」されている（図９を参照のこと）。
【０２０１】
このような分割ＣＡＲシステムの利点は、それが、Ｔ細胞の「シャドーボクシング」、すなわち、存在しない何かを殺そうとする可能性を回避するという点である。これは、例えば、可溶性リガンドがＴ細胞の近傍に存在するが、可溶性リガンドを分泌した腫瘍細胞が遠すぎて活性化Ｔ細胞によって殺されない場合に生じ得る。
【０２０２】
このシステムでは、エンドドメインは、例えば、以下の表に示されているような、可溶性リガンドに結合する第１および／または第２のＣＡＲと；細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲとの間で分割され得る：
【表３】
2018523484.tif 000025
【０２０３】
本発明のこの実施形態において、第３のＣＡＲならびに第１および／または第２のＣＡＲのエンドドメインは、それらが一緒になって、シグナル１および２または１、２および３を提供して、細胞の活性化をもたらすという意味において「相補的」である。ゆえに、可溶性リガンドが第１および第２のＣＡＲに結合し、かつ細胞表面抗原が第３のＣＡＲに結合したとき、最適なＴ細胞の活性化が生じる。
【０２０４】
この実施形態において、第３のＣＡＲは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合し得、第１および第２のＣＡＲは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に結合し得る。
【０２０５】
凝集に基づく阻害性ＣＡＲシステム
本発明の第２の実施形態では、第１および第２のＣＡＲによるリガンドのライゲーションが、第３のＣＡＲの阻害を引き起こす。リガンド（例えば、可溶性リガンド）の非存在下において細胞表面抗原に第３のＣＡＲが結合すると、細胞の活性化がもたらされる。対照的に、リガンド（例えば、可溶性リガンド）の存在下において細胞表面抗原に第３のＣＡＲが結合すると、細胞の活性化はもたらされないか、または細胞の活性化が低下する（図１０を参照のこと）。
【０２０６】
この実施形態において、可溶性リガンドは、正常な組織によって放出されるががん性組織によって放出されない、サイトカインなどの実体であり得る。リガンドは、例えば、ＩＬ−６であり得る。このように、可溶性ＣＡＲによってもたらされる阻害性シグナルは、サイトカイン放出症候群またはマス活性化症候群（ｍａｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などのＣＡＲに関連する問題に対して負のフィードバックループを提供するために使用され得る。
【０２０７】
第１および／または第２のＣＡＲは、「ライゲーション−オン」阻害性エンドドメインを含み、その結果、第１および第２のＣＡＲがリガンドに結合すると、細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害される。
【０２０８】
「ライゲーション−オン」阻害性エンドドメインは、可溶性リガンドの非存在下では第３のＣＡＲによるＴ細胞の活性化を有意に阻害しないが、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンドに結合すると、第３のＣＡＲによるＴ細胞の活性化を阻害する。
【０２０９】
「ライゲーション−オン」阻害性エンドドメインは、第３のＣＡＲだけがその（細胞表面）抗原に結合したときには、ＴＣＲシグナル伝達を阻害しない、リン酸化されたＩＴＡＭに対して十分に遅い触媒速度を有するチロシンホスファターゼであり得るかまたはそれを含み得るが、第１および第２のＣＡＲの凝集によって阻害性エンドドメインがシナプスで濃縮されると、ＴＣＲシグナル伝達応答を阻害することができる。
【０２１０】
阻害性エンドドメインは、ＰＴＰＮ６などのタンパク質チロシンホスファターゼの全部または一部を含み得る。
【０２１１】
タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は、細胞の成長、分化、有糸分裂周期および癌化をはじめとした種々の細胞プロセスを制御するシグナル伝達分子である。このＰＴＰのＮ末端部分は、２つのタンデムなＳｒｃホモログ（ＳＨ２）ドメインを含み、そのドメインは、タンパク質ホスホ−チロシン結合ドメインとして作用し、このＰＴＰとその基質との相互作用を媒介する。このＰＴＰは、主に造血細胞において発現され、造血細胞における複数のシグナル伝達経路の重要な制御因子として機能する。
【０２１２】
阻害性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ドメインは、ＰＴＰＮ６のすべて（配列番号４６）またはホスファターゼドメインのみ（配列番号４７）を含み得る。
配列番号４６−ＰＴＰＮ６の配列
【化２０】
2018523484.tif 000026
配列番号４７−ＰＴＰＮ６のホスファターゼドメインの配列
【化２１】
2018523484.tif 000027
【０２１３】
あるいは、阻害性エンドドメインは、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）含有エンドドメイン、例えば、ＣＤ２２、ＬＡＩＲ−１、キラー細胞阻害性受容体ファミリー（ＫＩＲ）、ＬＩＬＲＢ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡなどに由来するものであり得る。ＩＴＩＭは、リン酸化されると、そのＳＨ２ドメインを通じて内在性ＰＴＰＮ６をリクルートする。ＩＴＡＭ含有エンドドメインと共局在する場合、脱リン酸化が生じ、ＣＡＲの活性化が阻害される。
【０２１４】
ＩＴＩＭは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞質テイルに見られる保存されたアミノ酸配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）である。当業者は、ＩＴＩＭを含むタンパク質ドメインを容易に見つけることができる。ヒトのＩＴＩＭ含有タンパク質候補のリストが、全プロテオームスキャンによって生成された（Ｓｔａｕｂら（２００４）Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１６，４３５−４５６）。さらに、コンセンサス配列が周知であり、二次構造はほとんど必要とされないとみられるので、当業者は、人工的なＩＴＩＭを生成し得る。
【０２１５】
ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３由来のＩＴＩＭエンドドメインを、それぞれ配列番号４８〜５７に示す。
【化２２】
2018523484.tif 000028
【化２３】
2018523484.tif 000029
【０２１６】
あるいは、阻害性エンドドメインは、融合タンパク質と共発現されるＩＴＩＭ含有エンドドメインであり得る。その融合タンパク質は、タンパク質チロシンホスファターゼの少なくとも一部および受容体様チロシンホスファターゼの少なくとも一部を含み得る。その融合は、タンパク質チロシンホスファターゼ由来の１つまたはそれを超えるＳＨ２ドメインを含み得る。例えば、その融合は、ＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとＣＤ４５エンドドメインとの間またはＰＴＰＮ６  ＳＨ２ドメインとＣＤ１４８エンドドメインとの間に存在し得る。ＩＴＩＭドメインは、リン酸化されると、その融合タンパク質をリクルートし、非常に強力なＣＤ４５またはＣＤ１４８ホスファターゼを、活性化を阻止する活性化エンドドメインに近づける。例証的な融合タンパク質の配列を配列番号５８および５９として示す。
【化２４】
2018523484.tif 000030
【０２１７】
阻害性エンドドメインは、配列番号４６または４７の全部または一部を含み得る。阻害性エンドドメインは、配列番号４８〜５７の全部または一部を含み得る。阻害性エンドドメインは、配列番号５８または５９と共発現される配列番号４８〜５７の全部または一部を含み得る。少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の変異型が、第１および第２のＣＡＲのライゲーションの際に第３のＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達を阻害する能力を保持する限り、阻害性エンドドメインは、その変異型またはその一部を含み得る。
【０２１８】
共局在に基づく阻害性ＣＡＲシステム
本発明の第３の実施形態では、第１のＣＡＲは、２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つは可溶性リガンドに結合し；もう１つは細胞表面抗原に結合する。この結合ドメインのタンデム配置（ＴａｎＣＡＲシステム）は、図１１に模式的に図示されている。
【０２１９】
第１のＣＡＲが、Ｔ細胞などの細胞の表面に発現されると、細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメインは、細胞膜に対して遠位になり得、可溶性リガンドに結合する抗原結合ドメインは、細胞膜に対して近位になり得る。
【０２２０】
このシステムでは、第２のＣＡＲは、阻害性エンドドメインを含み得、その結果、第１および第２のＣＡＲが、可溶性リガンドに結合すると、細胞表面抗原に結合する第１のＣＡＲによって引き起こされる細胞の活性化が阻害される。
【０２２１】
阻害性エンドドメインは、「ライゲーション−オン」阻害性エンドドメインであり、その結果、第２のＣＡＲは、可溶性リガンドの非存在下では第１のＣＡＲによるＴ細胞の活性化を有意に阻害しないが、第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンドに結合すると、第１のＣＡＲによるＴ細胞の活性化を阻害する。
【０２２２】
阻害性エンドドメインは、反応速度が遅いホスファターゼ（例えば、先のセクションで規定されたようなＰＴＰＮ６の触媒ドメインまたはＩＴＩＭを含むもの）であり得るか、またはそれを含み得る。
【０２２３】
本発明のこの実施形態において、第１および第２のＣＡＲは、ＩＬ−６に結合し得る。
【０２２４】
凝集に基づくＡＮＤゲート
本発明の第４の実施形態では、細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲは、活性化エンドドメインを含み、第１および／または第２のＣＡＲは、「ライゲーション−オフ」阻害性エンドドメインを含む（図１２を参照のこと）。
【０２２５】
この実施形態は、Ｔ細胞活性化の動力学的分離モデル（ＫＳ）に基づく。これは、実験データによって裏付けられた機能的なモデルであり、Ｔ細胞受容体による抗原認識が、どのようにして下流の活性化シグナルに変換されるのかを説明する。簡潔には、基底状態では、Ｔ細胞膜上のシグナル伝達の構成要素は、動的ホメオスタシスの状態であり、それにより、脱リン酸化されたＩＴＡＭが、リン酸化されたＩＴＡＭよりも好まれる。これは、ｌｃｋなどの膜結合型キナーゼよりも膜貫通ＣＤ４５／ＣＤ１４８ホスファターゼの高い活性に起因する。Ｔ細胞が、同族抗原のＴ細胞受容体（またはＣＡＲ）の認識を介して標的細胞と会合すると、密接な免疫学的シナプスが形成する。このＴ細胞と標的膜との近接によって、そのシナプスに収まらない大きな外部ドメインに起因してＣＤ４５／ＣＤ１４８が排除される。ホスファターゼの非存在下において、そのシナプスに高濃度のＴ細胞受容体関連ＩＴＡＭおよびキナーゼが分離することにより、リン酸化されたＩＴＡＭが好まれる状態がもたらされる。ＺＡＰ７０は、リン酸化されたＩＴＡＭの閾値を認識し、Ｔ細胞の活性化シグナルを広める。このＴ細胞の活性化に関する高度な理解を本発明は利用する。特に、本発明は、異なる長さおよび／またはかさ高さおよび／または電荷および／または配置および／またはグリコシル化の外部ドメインが、どのようにしてシナプス形成の際に異なって分離するのかというこの理解に基づく。
【０２２６】
本発明の実施形態の凝集に基づくＡＮＤゲートにおいて、細胞表面抗原に結合する第３のＣＡＲは、活性化エンドドメインを含み、可溶性リガンドに結合する第１および／または第２のＣＡＲは、阻害性エンドドメインを含む。阻害性ＣＡＲは、第３のＣＡＲを構成的に阻害するが、可溶性リガンドに結合したとき、活性化ＣＡＲのその阻害を解除する。このように、Ｔ細胞は、細胞表面抗原（図１２におけるリガンドＡ）および可溶性抗原（図１２におけるリガンドＢ）の存在下でのみ誘発するように操作され得る。この挙動は、ＩＴＡＭドメインを含む活性化エンドドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータのエンドドメインを含む第３のＣＡＲ、およびＩＴＡＭを脱リン酸化できるホスファターゼ（例えば、ＣＤ４５またはＣＤ１４８）由来のエンドドメインを含む阻害性ＣＡＲによって達成される。第３のＣＡＲだけがライゲートされるときは、阻害性エンドドメインを有する第１および／または第２のＣＡＲは、Ｔ細胞表面上で溶解状態にあり、シナプスの内外において拡散し得、ＣＡＲの活性化を阻害し得る。第１および第２のＣＡＲが可溶性リガンドに結合すると、それらは凝集して、第３のＣＡＲから分離し、第３のＣＡＲがＴ細胞活性化を誘発することを可能にする。
【０２２７】
共局在に基づくＡＮＤゲート
本発明の第５の実施形態では、第１のＣＡＲは、２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの１つは可溶性リガンドに結合し；もう１つは細胞表面抗原に結合する。この結合ドメインのタンデム配置（ＴａｎＣＡＲシステム）は、上に記載された本発明の第３の（ｔｈｉｒｓ）実施形態と類似している。
【０２２８】
この共局在に基づくＡＮＤゲートでは、第１のＣＡＲは、機能性エンドドメインを欠く。それは、不活性なエンドドメインまたは切断型エンドドメインを含み得る。このエンドドメインは、抗原が結合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する任意のＩＴＡＭまたは十分な数のＩＴＡＭを欠くことがある。
【０２２９】
第２のＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達を誘発することができる１つまたはそれを超えるＩＴＡＭを含む機能性エンドドメインを含む。可溶性リガンドの結合は、第１および第２のＣＡＲの共局在を引き起こし、第１のＣＡＲが細胞表面抗原に結合したとき、Ｔ細胞シグナル伝達を生じさせる。第２のＣＡＲは、例えば、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得る。
【０２３０】
第２のＣＡＲは、単量体であり得、それにより、リガンドＡの非存在下でのシグナル伝達が回避され得る。これは、単量体のスペーサーを含む第２のＣＡＲによって達成され得る。
【０２３１】
１つまたはそれを超えるＩｇドメインを含むＣＤ２２の切断バージョンが、単量体のスペーサーとして使用され得る。
【０２３２】
ベクター
本発明は、本発明の第１の態様に記載の第１および第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれを超える核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。そのようなベクターは、本発明の第１の態様に記載の第１および第２のＣＡＲを発現するようにそ（れら）の核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【０２３３】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２３４】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトすることまたは形質転換することができ得る。
【０２３５】
細胞
本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを含む細胞を提供し、その第１および第２のＣＡＲは、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する。
【０２３６】
上記細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。
【０２３７】
上記細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性の免疫細胞であり得る。
【０２３８】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０２３９】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０２４０】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０２４１】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２４２】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２４３】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０２４４】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分  
子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０２４５】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０２４６】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０２４７】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０２４８】
本発明のＣＡＲ細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０２４９】
本保圧名の第１の態様にキシアのＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。
【０２５０】
あるいは、本発明の第１の態様によるＴまたはＮＫ細胞は、ＴまたはＮＫ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボでの分化から得られ得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化されたＴ細胞株が使用され得る。
【０２５１】
これらのすべての実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つにより第１および第２のＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０２５２】
本発明のＣＡＲ細胞は、被験体由来のエキソビボのＴまたはＮＫ細胞であり得る。そのＴまたはＮＫ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様によるＣＡＲを提供する分子または本発明の第２の態様によるＣＡＲシグナル伝達系の構成要素をコードする核酸を形質導入される前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、活性化および／または拡大され得る。
【０２５３】
本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上に列挙された他の起源からのＴまたはＮＫ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）第１および第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれを超える核酸配列によるＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって作製され得る。
【０２５４】
次いで、それらのＴまたはＮＫ細胞は、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて精製され得、例えば、選択され得る。
【０２５５】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の第１の実施態様による複数の細胞を含む医薬組成物に関する。
【０２５６】
医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０２５７】
処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の細胞（例えば、上に記載されたような医薬組成物中の本発明の細胞）を被験体に投与する工程を含む。
【０２５８】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中において、それらの細胞は、既存の疾患に関連する少なくとも１つの症候を和らげるか、減少させるか、もしくは改善するため、および／またはその疾患の進行を減速させるか、減少させるか、もしくは阻止するために、その疾患または症状を有する被験体に投与され得る。
【０２５９】
疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書中において、そのような細胞は、まだ疾患にかかっていないおよび／またはいかなる疾患の症候も示していない被験体に、その疾患を予防するためもしくはその疾患の原因を弱めるため、またはその疾患に関連する少なくとも１つの症候を減少させるためもしくはその発生を予防するために、投与され得る。被験体は、その疾患の素因を有し得るか、またはその疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
【０２６０】
上記方法は、
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）そのような細胞に、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターを形質導入するか、またはそのような細胞を、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターでトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与する工程
を含み得る。
【０２６１】
ＴまたはＮＫ細胞含有試料は、被験体または他の起源、例えば、上に記載されたような起源から単離され得る。ＴまたはＮＫ細胞は、被験体自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植の状況（第二者）、または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）から単離され得る。
【０２６２】
本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明のＣＡＲ細胞を提供する。
【０２６３】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明のＣＡＲ細胞の使用にも関する。
【０２６４】
本発明の方法によって処置および／または予防される疾患は、がん性疾患（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵がん、前立腺がんおよび甲状腺がん）であり得る。
【０２６５】
可溶性リガンドがＰＳＡである場合、がんは、前立腺がんであり得る。
【０２６６】
本発明のＣＡＲ細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができ得る。標的細胞は、標的細胞の近傍に可溶性リガンドが存在することを特徴とし得る。標的細胞は、標的細胞表面における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現とともに、可溶性リガンドが存在することを特徴とし得る。
【０２６７】
本発明のＣＡＲ細胞は、低密度のＴＡＡを発現するがん細胞などの標的細胞を殺すことができ得る。ある特定のがんにおいて低密度で発現されると知られているＴＡＡの例としては、ＣＬＬにおけるＲＯＲ１、メラノーマにおけるＴｙｐｒ−１およびミエローマにおけるＢＣＭＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６８】
本発明のＣＡＲ細胞および医薬組成物は、上に記載された疾患の処置および／または予防において使用するためであり得る。
【０２６９】
本発明のＣＡＲ細胞および医薬組成物は、上に記載された任意の方法において使用するためであり得る。
【０２７０】
本発明は、実施例によってさらに説明され、この実施例は、本発明を実施する際に当業者を助けるように機能すると意味されており、本発明の範囲を決して限定しないと意図されている。
【実施例】
【０２７１】
実施例１−可溶性リガンドによるＴ細胞の活性化の誘発
通常、ＣＡＲは、単量体の可溶性リガンドで活性化されない。なぜなら、そのリガンドは、会合した受容体の分離を引き起こさずに、受容体に結合するだけであるからである（図１）。可溶性リガンドに受容体を凝集させるために、２つの非競合的エピトープに結合する少なくとも２つのＣＡＲを有することが必要である（図２）。ＣＡＲは、典型的にはホモ二量体であるが、三量体または多価の受容体が、改善された成績を示し得る（図３）。
【０２７２】
概念証明として、可溶性の単量体のＲＯＲ−１をリガンドとして使用した（図４）。Ｒ１２およびＲ１１と名付けられた、ＲＯＲ−１リガンド上の相互排他的なエピトープに結合する２つのＣＡＲを使用した。凝集モデルに従って、Ｒ１１またはＲ１２を発現しているＴ細胞は、可溶性リガンドによって活性化しないが、Ｒ１２とＲ１１の両方を発現しているＴ細胞は、可溶性リガンドの存在下において活性化すると予測された。Ｒ１２およびＲ１１  ＣＡＲが互いに相互結合する（ヘテロ二量体を引き起こす）のを妨げるために、Ｒ１２をＣＤ８ＳＴＫスペーサー上に置き、Ｒ１１をＦｃスペーサー上に置いた（図５）。コントロールとして、二重ＣＡＲを発現するＴ細胞を使用し、ここで、両ＣＡＲが、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含む（一方はＣＤ８ＳＴＫ上であり、他方はＦｃスペーサー上である）。それらのＣＡＲのうちの１つを多価ＣＡＲとして有する効果を調べるために、１つのシステムにおいて、Ｒ１２  ＣＡＲをＣＤ８ＳＴＫスペーサー上に置き、Ｒ１１をＣＯＭＰスペーサー上に置いた（図６）。
【０２７３】
マウスＴ細胞株（ＢＷ５細胞）に、Ｒ１２  ｓｃＦｖをＣＤ８ＳＴＫスペーサー上もしくはＦｃスペーサー上に含む単一ＣＡＲ、またはＲ１１  ｓｃＦｖをＦｃスペーサー上もしくはＣＯＭＰスペーサー上に含む単一ＣＡＲを形質導入した。さらに、Ｒ１２−ＣＤ８ＳＴＫが陽性のＢＷ５細胞に、Ｒ１１−Ｆｃ、Ｒ１１−ＣＯＭＰ、またはコントロールとしてのＲ１２−Ｆｃである第２のＣＡＲを形質導入して発現させた。この実験において使用されたすべてのＣＡＲが、細胞内ＴＣＲｚドメイン（第１世代）を有した。これらの細胞を、可溶性ＲＯＲ−１（Ｈｉｓでタグ化されたもの）を含む上清で刺激し、ＩＬ−２を２４時間後に計測した（図７）。
【０２７４】
Ｒ１１  ＣＡＲとＲ１２  ＣＡＲの両方を発現するＴ細胞だけが、可溶性リガンドの存在下において刺激できたことが見出された。重要なことには、２コピーのＲ１２を発現しているＴ細胞は、可溶性リガンドで刺激できなかった。
【０２７５】
これらのＴ細胞を、固定化されたリガンドで刺激できることを試験するためのさらなるコントロールとして、これらのＴ細胞を、種々の濃度の可溶性ＲＯＲ−１  ｈｉｓタグで予めコーティングされた抗Ｈｉｓビーズで刺激した（図８）。この図は、固定化されたリガンドですべてのＴ細胞を刺激できたことを示しており、この実験において使用されたすべてのＴ細胞がシグナルを伝達することができたが、しかしながら、２つの相互排他的なエピトープに対する二重ＣＡＲだけでは、可溶性リガンドで刺激できなかったことが示唆された。
【０２７６】
実施例２−膜結合型リガンドと可溶性リガンドの両方の存在下でＴ細胞の活性化を誘発するための凝集に基づくＡＮＤゲートの使用
【０２７７】
「分割」ＣＡＲシステムの実行可能性を実証するために、ＢＷ５細胞に、
ｉ）ａＣＤ１９−ＣＤ８ＳＴＫ−ＴＣＲｚ−２Ａ−Ｒ１２−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１４８または
ｉｉ）ａＣＤ１９−ＣＤ８ＳＴＫ−ＴＣＲｚ−２Ａ−Ｒ１２−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１４８およびＲ１１−ＩｇＭＦｃ−ＣＤ１４８
を発現するベクターを形質導入し、トランスフェクトされていないＳｕｐＴ１標的細胞またはＣＤ１９を発現しているＳｕｐＴ１標的細胞に曝露した。種々の濃度の可溶性ＲＯＲ−１上清とともに、４：１の標的対エフェクター比で共培養を行った。
【０２７８】
結果を図１４に示す。Ｔ細胞の活性化は、膜結合型抗原（ＣＤ１９）と可溶性リガンド（ＲＯＲ１）の両方の存在下において最大である。膜結合型抗原を発現しない標的（ＮＴ）は、Ｔ細胞を刺激しなかった。
【０２７９】
実施例３−ＰＳＡに結合するｍＡｂ（５Ｄ５Ａ５および５Ｄ５Ｄ１１）に基づく２ＣＡＲシステムを用いたとき、可溶性リガンドＰＳＡによって、凝集の誘導およびその後のＴ細胞の活性化が生じる
【０２８０】
ＢＷ５Ｔ細胞に、
ｉ）Ａ５−Ｄ１１（ａＰＳＡ−Ａ５−ＣＤ８ＳＴＫ−ＣＤ２８ＴＭ−ｚ＿ａＰＳＡ−Ｄ１１−ＨＬ−ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍＺ）または
ｉｉ）Ｄ１１−Ａ５（ａＰＳＡ−Ｄ１１−ＣＤ８ＳＴＫ−ＣＤ２８ＴＭ−ｚ＿ａＰＳＡ−Ａ５−ＨＬ−ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍＺ）
を発現するベクターを形質導入し、次いで、３００ｐｇ／ｍＬのＰＳＡの存在下においてインキュベートして、その２ＣＡＲシステムの構築物内のＰＳＡ抗原結合ドメインが、凝集およびその後のＣＡＲの活性化を誘導するかを判定した。グラフ（図１５）は、Ａ５−Ｄ１１構築物とＤ１１−Ａ５構築物の両方が、ＢＷ５  Ｔ細胞に有意なレベルのＩＬ−２を分泌させたことを示しており、Ｔ細胞の活性化が示唆される。
【０２８１】
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2018523484.tif 000031
【図２】
2018523484.tif 000032
【図３】
2018523484.tif 000033
【図４】
2018523484.tif 000034
【図５】
2018523484.tif 000035
【図６】
2018523484.tif 000036
【図７】
2018523484.tif 000037
【図８】
2018523484.tif 000038
【図９−１】
2018523484.tif 000039
【図９−２】
2018523484.tif 000040
【図１０−１】
2018523484.tif 000041
【図１０−２】
2018523484.tif 000042
【図１１−１】
2018523484.tif 000043
【図１１−２】
2018523484.tif 000044
【図１２−１】
2018523484.tif 000045
【図１２−２】
2018523484.tif 000046
【図１３−１】
2018523484.tif 000047
【図１３−２】
2018523484.tif 000048
【図１４】
2018523484.tif 000049
【図１５】
2018523484.tif 000050
【配列表】
2018523484000001.app
【国際調査報告】
2018523484.tif 000051
2018523484.tif 000052
2018523484.tif 000053