(57)【要約】  タバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量の変更方法が、本明細書に記載される。１つの例示的方法は、タバコ材料を、塩、糖、酵素、乳酸菌、酵母、またはそれらの組み合わせを含む組成物と接触させ、全細菌含量を低減させることと、タバコ材料に保存処理を施すことと、１つ以上の微生物の存在下でタバコ材料を発酵させることと、を含む。本方法は、開示される方法ステップに供されていない発酵させたタバコ材料と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン含量を有する発酵させたタバコ材料を提供することができる。ある特定の実施形態では、発酵させたタバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量は、保存処理を施されたタバコ材料のものを超えない。そのように処理されたタバコ材料を含むタバコ含有製品も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量の変更方法であって、
タバコ材料を処理組成物と接触させることであって、前記処理組成物が、塩、糖、酵素、乳酸菌、酵母、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせを含み、前記接触させることが、低減された全細菌含量を有する処理されたタバコ材料を提供する、接触させることと、
前記処理されたタバコ材料に保存処理を施し、保存処理を施されたタバコ材料を得ることと、
１つ以上の微生物の存在下で前記保存処理を施されたタバコ材料を発酵させることであって、前記１つ以上の微生物が、前記保存処理を施されたタバコ材料の外因性量で存在し、処理組成物と接触しておらず、前記微生物の存在下で発酵させていない発酵させたタバコ材料と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン含量を有する発酵させたタバコ材料を提供する、発酵することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記タバコ材料が、タバコ種子、タバコ実生、成熟していない生きた植物、成熟した生きた植物、またはこれらの一部から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理組成物が、塩化物含有塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理組成物が、ＮａＣｌまたはＫＣｌを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タバコ材料が、Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｄｏｌｅ、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ、ＤＦ  ９１１、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７１、ＫＹ  １８０、ＫＹ  １９０、ＫＹ  ３０９、ＫＹ  ＶＡ  ３１２、ＶＡ  ３５５、ＶＡ  ３５９、ＤＦ  ４８５、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるタバコを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の微生物が、硝酸塩から亜硝酸塩への変換を促進しない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の微生物が、前記タバコに在来している１つ以上の硝酸還元微生物との生育競争が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の微生物が、亜硝酸塩吸収源である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の微生物が、亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の微生物が、細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の微生物が、遺伝子組換え細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子組換え細菌が、亜硝酸還元酵素をコードする挿入遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タバコ特異的ニトロソアミンが、約１０％以上低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タバコ特異的ニトロソアミンが、約２０％以上低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タバコ特異的ニトロソアミン含量が、約５０％以上低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記発酵させたタバコ材料の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量が、前記保存処理を施されたタバコ材料の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量を超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵させたタバコ材料の前記塩化物含量が、約０．５重量％〜約３重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記発酵させたタバコ材料を加工し、タバコ製品への組み込みに適した形態の加工されたタバコ材料を提供することと、
前記加工されたタバコ材料を無煙タバコ製品に組み込むことと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記加工されたタバコ材料が、タバコ配合物の形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法に従って調製される、無煙タバコ製品。
【請求項２２】
収穫されたタバコ材料を所望の水分レベルに調節することと、
前記収穫されたタバコ材料から茎を分離し、茎を取ったタバコ材料を得ることと、
前記茎を取ったタバコ材料を切断し、切断された、茎を取ったタバコ材料の形態の前記タバコ材料を提供することと、をさらに含み、
前記接触ステップが、前記切断された、茎を取ったタバコ材料を塩と接触させることと、結果として得られる混合物を加熱することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触ステップが、前記混合物を低温殺菌することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記調節ステップが、前記タバコ材料を約２０％〜約２５％の水分レベルに調節することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記水分レベルが約２２％である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触ステップ及び発酵ステップが、固体発酵容器内で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記発酵ステップが、前記温度、水分、酸素レベル、またはそれらの任意の組み合わせを制御することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓが、約１０６ＣＦＵの量で存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の微生物が、亜硝酸還元酵素をコードする挿入遺伝子を含む、遺伝子組換えＴｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記発酵させたタバコ材料を高温に供することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上の成分を前記発酵させたタバコ材料に添加することをさらに含み、前記１つ以上の成分が、塩、防腐剤、ケーシング混合物、及び水分から成る群から選択される成分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記発酵させたタバコ材料の前記水分レベルを調整することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記発酵させたタバコ材料の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量が、前記切断された、茎を取ったタバコ材料中の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量以下である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物（タバコ等）の生育方法及び収穫方法、収穫された植物及び植物由来製品（タバコ製品等）の調製において使用するための植物材料の取り扱い方法及び処理方法、ならびに特に、いわゆる発酵加工条件に供されると考えられる加工されるタバコに関するそれらの方法への変更に関する。より具体的には、本発明は、タバコから作製されるか、もしくはタバコに由来する、またはさもなければタバコまたはタバコの成分を組み込み、ヒトによる消費を対象とした製品の製造に関連付けられる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバコの多くの用途が提案されている。例えば、タバコはパイプで喫煙されており、またタバコは、紙巻きタバコ及び葉巻等のタバコを燃やす喫煙物品にも組み込まれている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９９）を参照されたい。喫煙の感覚の多くを提供するが、タバコを燃やした結果生じる相当量の不完全燃焼及び熱分解生成物を送達しない様々な方法も提案されている。例えば、Ｂｏｒｓｃｈｋｅらの米国特許第７，７５３，０５６号及びＲｏｂｉｎｓｏｎらの同第７，７２６，３２０号、Ｃｈａｎｇらの米国特許公開第２０１４／００６０５５５号及びＤｅＰｉａｎｏらの同第２０１４／０２７０７３０号、ならびにＡｄｅｍｅらの２０１３年１２月６日出願の米国特許出願第１４／０９８１３７号に記載されている背景技術を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。タバコは、いわゆる「無煙」形態でも楽しまれている。例えば、Ｍｕａらの米国特許公開第２０１４／０２７１９５２号及びＢｙｒｄらの同第２０１２／０２７２９７６号に記載されている背景技術を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
長年にわたり、タバコ製品中で利用されるタバコ材料の全体的特徴または性質を変化させるための様々な処理方法及び添加物が提案されている。例えば、タバコ材料は、添加物を用いて処理されており、それらのタバコ材料の加工中に使用される処理条件は、そのようなタバコ材料から生成される無煙タバコ製品の化学的構造または知覚特性を変化させるために、また喫煙可能なタバコ材料の場合には、そのようなタバコ材料を組み込む喫煙物品によって発生する主流煙の化学的構造または知覚特性を変化させるために、制御されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許公開第２０１４／０２９９１３６号に記載されている、そのタバコの化学組成を変化させる目的でタバコ加工中に用いられる、及び／または制御される酵素及び微生物（例えば、細菌、菌類、及び酵母）のタイプを参照されたい。
【０００４】
ヒトによる消費のために有用な植物由来組成物及び配合物を提供するために、植物の成分の特徴及び性質を変化させるためのさらなる方法を提供することが望ましいだろう。特に、加工されたタバコ、及び具体的には、無煙タバコ製品の生産のために有用な加工されたタバコを提供することが望ましく、それらは、それらの加工されたタバコの化学組成物を制御するか、または変化させる能力を有するプロセスから得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，７５３，０５６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，７２６，３２０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／００６０５５５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１４／０２７０７３０号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１４／０９８１３７号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１４／０２７１９５２号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１２／０２７２９７６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９９）
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、その中に存在するある特定の細菌の量を変更する（例えば、増加及び／または減少させる）ための植物またはその一部の処理方法を提供する。具体的には、開示される方法は、タバコ植物及び材料に適用することができ、いくつかの実施形態では、タバコ植物もしくは材料に関連付けられる全細菌含量の減少、及び／またはタバコ植物もしくは材料に関連付けられるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌含量の増加をもたらすことができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、変更されたある特定の細菌のレベルを有する植物、植物成分、及び植物材料、ならびにそのような変更された細菌レベルを提供するための、保存処理を施されていない、または部分的に保存処理を施された（例えば、緑葉）植物、植物成分、及び植物材料の処理方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、様々な化合物（例えば、タバコ特異的ニトロソアミン、ＴＳＮＡ）の変更されたレベルを有する発酵させた植物、植物成分、及び植物材料を提供する。本発明は、様々な化合物のそのような変更されたレベルを実現するための、植物、植物成分、及び植物材料の発酵方法も提供する。例えば、いくつかの実施形態では、植物、植物成分、及び植物材料は、処理されたタバコ材料中の様々な化合物のそのような変更されたレベルを得るために、外因性量の１つ以上の微生物の存在下で発酵に供される。
【０００９】
本発明の一態様では、タバコ材料（例えば、収穫されていないタバコ材料を含むが、これに限定されない）を処理組成物と接触させることであって、処理組成物が、塩、糖、酵素、乳酸菌、酵母、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせを含み、収穫後に低減された全細菌含量を有する処理されたタバコ材料を提供する、接触させることと、処理されたタバコ材料に保存処理を施し、保存処理を施されたタバコ材料を得ることと、１つ以上の微生物が保存処理を施されたタバコ材料の外因性量で存在する１つ以上の微生物の存在下で保存処理を施されたタバコ材料を発酵させ、処理組成物と接触しておらず、微生物の存在下で発酵させていない発酵させたタバコ材料と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン含量を有する発酵させたタバコ材料を提供することと、を含む、タバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量の変更方法が提供される。
【００１０】
そのような処理に供されるタバコ材料は異なり得、いくつかの実施形態では、タバコ種子、タバコ実生、成熟していない生きた植物、成熟した生きた植物、またはこれらの一部から成る群から選択され得る。いくつかの実施形態では、特定のタバコ材料は、Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｄｏｌｅ、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ、ＤＦ  ９１１、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７１、ＫＹ  １８０、ＫＹ  １９０、ＫＹ  ３０９、ＫＹ  ＶＡ  ３１２、ＶＡ  ３５５、ＶＡ  ３５９、ＤＦ  ４８５、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるタバコを含み得る。いくつかの実施形態では、処理組成物は、塩化物含有塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法において用いられる微生物は、硝酸塩から亜硝酸塩への変換を促進しない微生物であり得る。ある特定の実施形態では、微生物は、タバコに在来している１つ以上の硝酸還元微生物との生育競争が可能である。いくつかの実施形態では、微生物は、亜硝酸塩吸収源である。ある特定の例示的微生物は、亜硝酸還元酵素遺伝子を含む。微生物は、例えば、細菌（例えば、乳酸菌）及び／または耐塩酵母であり得る。いくつかの実施形態では、用いられ得る１つの特定の微生物は、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓである。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法において用いられる１つ以上の微生物は、遺伝子組換え微生物（例えば、細菌）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、そのような微生物（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ菌を含むが、これに限定されない）は、亜硝酸還元酵素をコードする挿入遺伝子を含み得る。
【００１２】
本明細書で開示されるある特定の方法に従って、発酵させたタバコ材料中のタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）含量は、処理組成物と接触しておらず、該微生物の存在下で発酵させていない発酵させたタバコ材料に関して異なるレベルで低減され得る。例えば、ＴＳＮＡ含量は、約１０％以上、約２０％以上、または約５０％以上低減され得る。いくつかの実施形態では、発酵させたタバコ材料のＴＳＮＡ含量は、保存処理を施されたタバコ材料のＴＳＮＡ含量を超えない。ある特定の実施形態では、例えば、塩処理事前収穫の使用により、発酵させたタバコ材料の塩化物含量は、処理されていないタバコ材料と比較して増加し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法に従って提供される発酵させたタバコ材料の塩化物含量は、約０．５乾燥重量％〜約３乾燥重量％である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、上述の方法ステップに加えて、方法は、発酵させたタバコ材料を加工して、タバコ製品への組み込みに適した形態の加工されたタバコ材料を提供することと、加工されたタバコ材料を無煙タバコ製品中に組み込むことと、をさらに含み得る。加工されたタバコ材料は、例えば、タバコ配合物の形態であり得る。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される方法に従って調製される無煙タバコ製品も提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、収穫されたタバコ材料を所望の水分レベルに調節することと、収穫されたタバコ材料から茎を分離し、茎を取ったタバコ材料を得ることと、茎を取ったタバコ材料を切断し、切断された、茎を取ったタバコ材料を提供することと、切断された、茎を取ったタバコ材料を塩と接触させ、結果として得られる混合物を加熱することと、１つ以上の微生物が混合物の外因性量で存在する１つ以上の微生物の存在下で混合物を発酵させ、発酵する前に塩と接触しておらず、該微生物の存在下で発酵させていない発酵させたタバコ材料と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン含量を有する発酵させたタバコ材料を提供することと、を含む、タバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量の変更方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、発酵させたタバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量は、そのような実施形態において、発酵直前のタバコ材料（すなわち、切断された、茎を取ったタバコ材料）のタバコ特異的ニトロソアミン含量を超えない。
【００１５】
接触ステップは、いくつかの実施形態では、混合物を低温殺菌することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、調節ステップは、タバコ材料を約２０％〜約２５％の水分レベルに調節することを含む。ある特定の実施形態では、接触ステップ及び発酵ステップは、固体発酵容器内で行われる。発酵ステップは、いくつかの実施形態では、温度、水分、酸素レベル、またはそれらの任意の組み合わせを制御することをさらに含み得る。そのような方法において使用される１つ以上の微生物は、ある特定の実施形態では、異なる量（例えば、約１０６ＣＦＵを含むが、これに限定されない）でＴｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含み得る。
【００１６】
ある特定の実施形態では、方法は、発酵させたタバコ材料を高温に供することをさらに含み得る。方法は、いくつかの実施形態では、１つ以上の成分を発酵させたタバコ材料に添加することをさらに含み、１つ以上の成分は、塩、防腐剤、ケーシング混合物、及び水分から成る群から選択される成分を含む。ある特定の実施形態では、方法は、発酵させたタバコ材料の水分レベルを調整することをさらに含み得る。
【００１７】
本発明は、限定されないが、以下の実施形態を含む。
【００１８】
実施形態１：タバコ材料を処理組成物と接触させることであって、処理組成物が、塩、糖、酵素、乳酸菌、酵母、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせを含み、低減された全細菌含量を有する処理されたタバコ材料を提供する、接触させることと、処理されたタバコ材料に保存処理を施し、保存処理を施されたタバコ材料を得ることと、１つ以上の微生物が、保存処理を施されたタバコ材料の外因性量で存在する１つ以上の微生物の存在下で保存処理を施されたタバコ材料を発酵させ、処理組成物と接触しておらず、微生物の存在下で発酵させていない発酵させたタバコ材料と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン含量を有する発酵させたタバコ材料を提供することと、を含む、タバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量の変更方法。
【００１９】
実施形態２：タバコ材料が、タバコ種子、タバコ実生、成熟していない生きた植物、成熟した生きた植物、またはこれらの一部から成る群から選択される、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２０】
実施形態３：処理組成物が塩化物含有塩を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２１】
実施形態４：処理組成物がＮａＣｌまたはＫＣｌを含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２２】
実施形態５：タバコ材料が、Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｄｏｌｅ、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ、ＤＦ  ９１１、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７１、ＫＹ  １８０、ＫＹ  １９０、ＫＹ  ３０９、ＫＹ  ＶＡ  ３１２、ＶＡ  ３５５、ＶＡ  ３５９、ＤＦ  ４８５、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるタバコを含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２３】
実施形態６：１つ以上の微生物が、硝酸塩から亜硝酸塩への変換を促進しない、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２４】
実施形態７：１つ以上の微生物が、タバコに在来している１つ以上の硝酸還元微生物との生育競争が可能である、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２５】
実施形態８：１つ以上の微生物が亜硝酸塩吸収源である、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２６】
実施形態９：１つ以上の微生物が、亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２７】
実施形態１０：１つ以上の微生物が細菌を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２８】
実施形態１１：１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００２９】
実施形態１２：１つ以上の微生物が遺伝子組換え細菌を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３０】
実施形態１３：１つ以上の微生物が、亜硝酸還元酵素をコードする挿入遺伝子を含む遺伝子組換え細菌を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３１】
実施形態１４：タバコ特異的ニトロソアミンが、約１０％以上低減される、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３２】
実施形態１５：タバコ特異的ニトロソアミンが、約２０％以上低減される、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３３】
実施形態１６：タバコ特異的ニトロソアミン含量が、約５０％以上低減される、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３４】
実施形態１７：発酵させたタバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量が、保存処理を施されたタバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量を超えない、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３５】
実施形態１８：発酵させたタバコ材料の塩化物含量が、約０．５重量％〜約３重量％である、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３６】
実施形態１９：発酵させたタバコ材料を加工し、タバコ製品への組み込みに適した形態の加工されたタバコ材料を提供すること、加工されたタバコ材料を無煙タバコ製品中に組み込むことと、をさらに含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３７】
実施形態２０：加工されたタバコ材料が、タバコ配合物の形態である、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００３８】
実施形態２１：任意の先行または後続の実施形態の方法に従って調製される無煙タバコ製品。
【００３９】
実施形態２２：収穫されたタバコ材料を所望の水分レベルに調節することと、収穫されたタバコ材料から茎を分離し、茎を取ったタバコ材料を得ることと、茎を取ったタバコ材料を切断し、切断された、茎を取ったタバコ材料の形態のタバコ材料を提供することと、をさらに含み、接触ステップが、切断された、茎を取ったタバコ材料を塩と接触させ、結果として得られる混合物を加熱することを含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４０】
実施形態２３：接触ステップが、混合物を低温殺菌することをさらに含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４１】
実施形態２４：調節ステップが、タバコ材料を約２０％〜約２５％の水分レベルに調節することを含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４２】
実施形態２５：水分レベルが約２２％である、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４３】
実施形態２６：接触ステップ及び発酵ステップが、固体発酵容器内で行われる、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４４】
実施形態２７：発酵ステップが、温度、水分、酸素レベル、またはそれらの任意の組み合わせを制御することをさらに含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４５】
実施形態２８：１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４６】
実施形態２９：１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含み、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓが、約１０６ＣＦＵの量で存在する、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４７】
実施形態３０：１つ以上の微生物が、亜硝酸還元酵素をコードする挿入遺伝子を含む遺伝子組換えＴｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ菌を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４８】
実施形態３１：発酵させたタバコ材料を高温に供することをさらに含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００４９】
実施形態３２：１つ以上の成分を発酵させたタバコ材料に添加することをさらに含み、１つ以上の成分が、塩、防腐剤、ケーシング混合物、及び水分から成る群から選択される成分を含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００５０】
実施形態３３：発酵させたタバコ材料の水分レベルを調整することをさらに含む、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００５１】
実施形態３４：発酵させたタバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量が、切断された、茎を取ったタバコ材料中のタバコ特異的ニトロソアミン含量以下である、任意の先行または後続の実施形態に記載の方法。
【００５２】
本開示のこれらの及び他の特徴、態様、及び利点は、以下に簡潔に記載される、添付の図面と一緒に以下の発明を実施するための形態を読解することによって明らかになるだろう。本発明は、上述の実施形態のうちの２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の任意の組み合わせ、ならびに、そのような特徴または要素が、本明細書に記載される特定の実施形態に明示的に組み込まれるかどうかにかかわらず、本開示に示される任意の２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の特徴または要素の組み合わせを含む。本開示は、開示される発明の任意の分離可能な特徴または要素が、その様々な態様及び実施形態のうちのいずれかにおいて、文脈が別途明らかに指示しない限り、組み合わせ可能であると意図するものと見なされるべきであるように、総合的に読解されることが意図される。本発明の他の態様及び利点は、以下から明らかになるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ここで、本発明は、より完全に以下に記載されるだろう。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に記載される実施形態を制限されると解釈されるべきではなく、むしろ、本開示は徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように、これらの実施形態は提供される。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。「乾燥重量パーセント」または「乾燥重量基準」への言及は、乾燥した含有物（すなわち、水を除く全含有物）の基準に基づく重量を指す。
【００５４】
本発明に従って生育する、収穫される、及び／または加工される例示的な植物は、ニコチアナ種から選択される。ニコチアナ種からの植物の選択は異なり得、より好ましくは、タバコのタイプと特徴付けられる植物である。例えば、Ｌａｗｓｏｎらの米国特許第７，０２５，０６６号及びＭａｒｓｈａｌｌらの同第８，１８６，３６０号、ならびにＭｕａらの米国特許公開第２０１４／０２７１９５１号及びＤｕｂｅらの同第２０１５／００３４１０９号に記載される植物のタイプを参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本発明に従って加工及び使用され得るタバコの好ましい例示的なタイプは、Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｄｏｌｅ、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ、ＤＦ  ９１１、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７１、ＫＹ  １８０、ＫＹ  １９０、ＫＹ  ３０９、ＫＹ  ＶＡ  ３１２、ＶＡ  ３５５、ＶＡ  ３５９、ＤＦ  ４８５、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０として既知であるものを含む。いわゆる、Ｇｒｅｅｎ  Ｒｉｖｅｒ及びＯｎｅ  Ｓｕｃｋｅｒの生育領域において生育するタバコのそれらの例示的なタイプも好ましい。
【００５５】
ある特定の実施形態では、植物は、本明細書で開示されるように、植物が収穫されていない形態にあるとき、及び／または保存処理の黄変／褐変段階（すなわち、タバコが完全に保存処理を施される前）の間中、処理組成物を用いて処理され得る。この期間は、本明細書において、概して「事前保存処理」と称され、そのような処理組成物で処理されるタバコは、本明細書において、概して「保存処理を施されていない、または部分的に保存処理を施された」タバコと称されるだろう。本明細書で開示される第１の事前保存処理方法は、概して、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号に記載されている、処理組成物及び方法のタイプを使用する塩及び／もしくは糖含有組成物、乳酸菌含有組成物、ならびに／または酵素含有組成物（本明細書において「処理組成物」と集合的に称される）のうちの１つ以上とタバコを接触させることによって、そのようなタバコを処理することを含む。
【００５６】
ある特定の実施形態では、処理組成物は、塩（例えば、塩含有溶液の形態である）を含む。例えば、Ｌｉらの米国特許第８，３５３，３００号及び同第８，９０５，０４１号、及びＨｅｍｐｆｆｉｎｇらの同第６，７５５，２００号、ならびにＬｉらの米国特許出願公開第２００８／０２０２５３８号及びＭａｒｓｈａｌｌらの同第２０１２／０２７９５１０号に記載されるような様々なタイプの植物の塩処理が既知であり、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。この目的のため、任意の塩が使用され得るが、食品等級の塩が特に好ましい。例示的な塩には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化アンモニウム、及びそれらの組み合わせ等の塩化物含有塩が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、処理組成物は、塩素または塩化物を含む。処理されたタバコが組み込まれる喫煙製品の風味に悪影響を及ぼすことが述べられていることから、慣例的にタバコの塩化物（塩化物含有塩を含む）処理は避けられていることに留意されたい。しかしながら、ある特定の実施形態では、様々な用途（無煙タバコ製品中及び電子紙巻きタバコ型製品中での使用を含むが、これらに限定されない）に関して、塩化物の存在は望ましくないということはない。実際に、いくつかの実施形態では、塩化物の存在は、保存処理及び後続の発酵後の未処理の植物と比較して、処理された植物中のＴＳＮＡ濃度の低減を含むが、これに限定されない有益な効果を提供し得る。本文脈において用いられ得る、ある特定のタイプの塩組成物に関するさらなる詳細は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号に提供されている。
【００５７】
ある特定の実施形態では、処理組成物は、糖（例えば、糖含有溶液の形態である）を含む。このために食品等級の糖を含む任意の糖が使用され得、例えば、スクロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、及びラクトース、ラムノース、キシロース、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。本文脈において用いられ得る、ある特定のタイプの糖組成物に関するさらなる詳細は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号に提供されている。いくつかの実施形態では、処理組成物は、塩及び糖の両方を含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、処理組成物は、１つ以上のプロバイオティクスまたは１つ以上の乳酸菌を含む。そのような組成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｓｈａｌｌらの米国特許出願公開第２０１３／０２６９７１９号及びＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの同第２０１４／０２９９１３６号に記載されるように調製及び使用され得る。そのような処理において有用であり得る細菌のタイプ、使用される特定の細菌、使用される細菌の量、及びそのような細菌によって提供される特定の特性の識別は、これらの参照文献にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、処理組成物は、１つ以上の酵素を含む。そのような組成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／００２０６９４号及び同第２０１４／０２９９１３６号に記載されるように調製及び使用され得る。そのような処理において有用であり得る酵素のタイプ、使用される特定の酵素、使用される酵素の量、及びそのような酵素によって提供される特定の特性の識別は、これらの参照文献にさらに記載されている。
【００５９】
ある特定の実施形態では、処理組成物は、１つ以上の酵母の種を含む。制限することを意図するものではないが、１つの例示的な酵母は、亜硝酸還元酵素能力を有するＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ酵母である。好ましい実施形態では、１つ以上の耐塩酵母が、単独で、または本明細書で開示される他の処理組成物のうちの１つと組み合わせて用いられる。
【００６０】
事前保存処理組成物は、様々な形態を取ることができる。例えば、いくつかの実施形態では、処理組成物は、液体形態（例えば、本明細書において「処理溶液」と称される溶液、分散液、エマルション等）であり得る。そのような処理溶液の濃度（例えば、固形分）は異なり得る。いくつかの実施形態では、処理組成物は、固体形態（例えば、粉末または粒状形態）であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、様々な他の成分を含み得る。
【００６１】
記載される事前保存処理組成物は、様々な方法において、及び様々な時点で適用され得る。概して、処理組成物は、植物に局所的に（例えば、組成物のうちの１つ以上の成分が、葉、茎、花等を通して植物に供給されるように）適用され得るか、または１つ以上の成分が根系を通して植物に供給されるように適用され得る。液体形態は、例えば、処理される植物もしくはその部分（例えば、葉面適用）、または植物の周りの土壌（土壌適用）の噴霧、霧吹き、または浸漬によって適用され得る。処理組成物の固体形態は、植物もしくはその部分に直接適用され得るか、または植物の周りの土壌に適用され得る（例えば、「追肥」の形態等、土壌表層上に散布される、及び／または土壌中に組み入れられる）。ある特定の実施形態では、処理組成物は、肥料組成物（例えば、塩化物を含有する肥料組成物）の形態で適用され得る。本明細書で開示される処理組成物は、単独で、または他の試薬とともに、例えば、他の肥料、殺虫剤、除草剤等とともに適用され得る。
【００６２】
特に好ましい実施形態では、タバコは、少なくとも２つの異なる処理組成物を用いて、及び／または少なくとも２つの異なる事前保存処理段階において処理される。複数の処理は、連続して（例えば、近接して連続して、もしくはかなり異なる時点で）、または同時に（例えば、２つ以上の異なる組成物を別々にタバコに適用することによって、または組成物を混合し、２つ以上の異なる活性含有物を含む単一の処理組成物を提供して、その単一の処理組成物をタバコに適用することによって）完了され得る。組成物が少なくとも２つの異なる段階で適用される場合、それらは、タバコ植物ライフサイクルの異なる時点で適用され得る（例えば、田畑中の生育植物に適用される組成物及び収穫後に適用される組成物を用いる、または種子に適用される組成物及び田畑中の生育植物に適用される組成物を用いる）。複数の処理は、同じ処理組成物または異なる処理組成物を用いて少なくとも２つの異なる段階で植物を処理することを含み得る。１つの特定の実施形態では、タバコは、塩含有組成物を用いる少なくとも一度の事前保存処理において、及び乳酸菌含有組成物を用いる少なくとも一度の事前保存処理において、処理される。適用のタイミング及び方法に関するさらなる詳細が、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号に提供されている。
【００６３】
この段階において処理組成物を用いる処理は、有利に、様々な利益を提供することができる。特に、タバコ植物は、様々なレベルのそこで関連付けられる細菌を生来有することが知られており（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬａｒｓｓｏｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４：４（２００８）及びＨｕａｎｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８８（２）：５５３（２０１０）を参照されたい）、本明細書に記載される事前保存処理組成物の使用は、タバコ植物、植物成分、及び植物材料に、そこで関連付けられるある特定の細菌の変更されたレベルを提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される保存処理を施されていない、または部分的に保存処理を施された植物、植物成分、もしくは植物材料の処理は、変更された細菌総数、変更された腸内細菌数、変更されたグラム陰性細菌数、及び／または変更されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ数を有する処理されたタバコ植物材料をもたらす。実現可能な変更された数及びそのような数を決定するための方法が、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号に開示されている。
【００６４】
異なる処理は、タバコ植物材料内に存在する様々な細菌のレベルに対する異なる効果を有し得る。上述のように、本明細書に記載される処理は、処理されたタバコの特性に影響を及ぼすことができ、処理されたタバコに保存処理（発酵を含む）を施す前にある特定の細菌の含量を変更するために特に有益であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される事前保存処理は、後の加工ステップのためにさらなる意味合いを有し得る。例えば、処理は、後のタバコ材料の保存処理ステップ、熟成ステップ、及び／または発酵ステップに対する様々な利益を提供することができる。
【００６５】
タバコ植物またはその部分が生存形態である間に事前保存処理が行われる場合、タバコは、一般的に収穫され（事前保存処理の前に既に収穫されていない場合）、保存処理に供される。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの米国特許出願公開第２０１１／０１７４３２３号及びＤｕｂｅらの同第２０１２／０１９２８８０号に示されるようなタバコ植物を収穫する慣例的な技法が用いられ得る。本発明に従って生育される、収穫される、及び加工される収穫されたタバコは、いわゆる、空気で保存処理を施された、または暗室で火力乾燥された（ｄａｒｋ−ｆｉｒｅｄ）タバコを提供することが特徴付けられ得る保存処理プロセスに供されることが、特に好ましい。例えば、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９９）、Ｒｏｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｉｔｒａｇｅ  Ｔａｂａｋｆｏｒｓｃｈ  Ｉｎｔ．，２１，３０５−３２０（２００５）、Ｓｔａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｉｔｒａｇｅ  Ｔａｂａｋｆｏｒｓｃｈ  Ｉｎｔ．，２１，３２１−３３０（２００５）、ならびにＢｅｉｎｈａｒｔらの米国特許第１，３２７，６９２号、Ｈｅｌｊｏの同第２，７５８，６０３号、Ｍａｒｔｉｎの同第５，６７６，１６４号、Ｈｅｍｐｆｌｉｎｇらの同第６，７５５，２００号、Ｐｅｒｆｅｔｔｉらの同第７，２９３，５６４号、Ｇｒｏｖｅｓらの同第７，６５０，８９２号、Ｌｉらの同第８，３５３，３００号、ならびにＭａｒｓｈａｌｌらの米国特許出願公開第２０１０／０１１６２８１号及び同第２０１２／０２７９５１０号、ならびにＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの同第２０１４／０２９９１３６号に示される保存処理プロセスのそれらのタイプを参照されたく、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される処理組成物を用いる事前保存処理で処理された、保存処理を施された及び／または熟成されたタバコは、処理されていない、保存処理を施された／熟成されたタバコ材料と比較して変更されたレベルのある特定の化合物、例えば、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）を有するタバコ材料を提供することができる。そのような方法を通して実現可能なＴＳＮＡの減少量のタイプに関するさらなる情報は、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２９９１３６号に提供されている。
【００６７】
ある特定の実施形態では（例えば、ある特定の無煙タバコ製品において使用するためにタバコ材料が調製されている場合）、保存処理を施されたタバコ材料（上で詳細に開示される処理組成物の事前保存処理を用いる処理を介して任意に処理される）は、次いで発酵させる。発酵は、一般的に、タバコ材料を水（例えば、湿気）及び熱に供されることを必要とする。発酵プロセスは、温度及び水分含量が制御され得るチャンバ内で行われ得る。発酵プロセス中にタバコが曝される高温及び水分含量の結果として、ある特定の成分（例えば、アンモニア）は、タバコから効果的に除去され得る。いくつかの実施形態では、発酵は、ある特定の細菌が、発酵するタバコ材料内に香味料前駆体を生成するように反応する酵素を生成する細菌プロセスである。例えば、Ｓ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｅｄ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ），ａｔ  ｐｇ．９７−１１８を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
タバコのための例示的な発酵プロセスは、Ｂｒｅｎｉｋらの米国特許第２，９２７，１８８号、Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈらの同第４，６６０，５７７号、Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈらの同第４，５２８，９９３号、及びＲｏｔｈらの同第５，３２７，１４９号に提供されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。発酵は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの存在によって強化されると考えられ、その結果として、所与の試料に関連付けられるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌の量の変更（例えば、上に開示される乳酸菌処理組成物による）は、いくつかの実施形態では、その試料の発酵に強い影響を与え得る。その処理されたタバコが後に発酵に供される場合、発酵は、いくつかの実施形態では、はるかに多数のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌の存在によって強化され得る。「強化される」とは、発酵プロセスが、例えば、より迅速及び／またはより均一に進行することを意味する。したがって、保存処理を施されていない、または部分的に保存処理を施されたタバコ植物、植物成分、または植物材料の処理組成物を用いた処理のための本明細書で開示される方法は、発酵するタバコ上の細菌タイプ及び／または細菌数を変更することによって、処理されていない発酵するタバコ上のものと比較して、発酵プロセスにある程度の影響を与え得る。
【００６９】
本開示のある特定の実施形態では、発酵中のタバコにおける細菌タイプ及び／または細菌数は、発酵直前または発酵中にタバコを１つ以上の微生物（例えば、細菌、酵母、菌類等）で処理することによってさらに変更され得る。発酵直前または発酵中にこの様式において処理されるタバコは、有利には、本明細書に記載される１つ以上の処理組成物（すなわち、塩、糖、乳酸菌、酵母、及び／または酵素を含む）を用いて以前に処理されたタバコであり得る。しかしながら、本明細書に記載されるように発酵直前または発酵中に処理され得るタバコは、制限されず、他の実施形態では、発酵中または発酵直前に処理されるタバコは、上述の処理組成物を用いて以前に処理されていないタバコであってもよい。
【００７０】
本文脈における１つ以上の微生物を用いる処理は、概して、１つ以上の微生物をタバコ材料に適用し、発酵するタバコに関連付けられる微生物（例えば、細菌、酵母、菌類等）の量及び／またはタイプを変更することを含む。そのような処理ステップにおいて用いられる微生物のタイプは異なり得るが、好ましくは、発酵反応を促進することができるが、硝酸塩に対する親和性をほとんどまたは全く呈さない微生物である。ある特定の微生物（例えば、特定の細菌株または特定の菌類）は、特に、硝酸塩から亜硝酸塩への変換の促進（典型的には硝酸塩還元酵素の生成によるが、それに限定されない）が可能であることが知られている。タバコの発酵中にそのような細菌によって促進される硝酸塩から亜硝酸塩への変換は、発酵させたタバコ材料中においてある特定のＴＳＮＡの形成をもたらし得る前駆体を生成することがさらに認識されている。本開示に従って、硝酸塩から亜硝酸塩へのこの変換は、有利に発酵プロセス中に最小化される（例えば、部分的または完全に排除される）。
【００７１】
したがって、有利には、いくつかの実施形態では、発酵直前または発酵中に１つ以上の微生物を用いるタバコの処理は、発酵後にＴＳＮＡの変更された（例えば、減少した）レベルを呈するタバコを提供することができる。具体的には、ＴＳＮＡの減少したレベルは、本明細書においてより完全に記載される１つ以上の特定のタイプの微生物を用いて発酵直前または発酵中にタバコを処理することによって実現される。
【００７２】
有利には、硝酸塩から亜硝酸塩への変換を実質的に促進しない（すなわち、硝酸塩に対する親和性をほとんどまたは全く有しない）微生物（例えば、細菌、酵母、及び／または菌類）、「亜硝酸塩吸収源」として作用し得る微生物、及び／または亜硝酸還元酵素遺伝子を有する微生物が、ここで開示される方法に従って使用される。したがって、ある特定の実施形態では、発酵ステップ中に本開示に従って特に有用な微生物は、典型的なもの（発酵処理されていない材料）と比較して、発酵させた材料中に減少した亜硝酸塩濃度を提供する。そのような添加される微生物は、タバコ材料に在来していてもよく、またはタバコ材料に在来していなくてもよい。典型的には、この段階でタバコ材料に添加される微生物は、外因性量で添加される、すなわち、それらは、処理されていないタバコ上に典型的に存在するレベルと比較して、変更された、すなわち上昇したレベルのそのような微生物を提供するように添加される。
【００７３】
本開示によって企図される微生物のタイプは、タバコに関連付けられる１つ以上の硝酸還元微生物との生育競争が可能である微生物を含む。Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘ．５０（３−４），２０１２，ｐｐ．９４２−９４８を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、硝酸還元微生物のタバコとの関連は、タバコ上の微生物の生息集団（すなわち、在来微生物）の結果であり得るか、加工条件（例えば、そのような微生物をその上に有する設備と接触させることによって、微生物がタバコ材料中に導入される条件）の結果であり得るか、またはその前の処理ステップ（例えば、タバコが、乳酸菌を含む処理組成物による事前保存処理で処理されるステップ）の結果であり得る。ある特定の実施形態では、効果的に最小化されるある特定のタイプのタバコに在来している例示的な硝酸還元微生物には、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ及び／またはＰａｎｔｏｅａ属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
発酵中にタバコに添加され得る例示的な微生物には、Ｋｏｇａの米国特許第７，５４９，４２５号に記載されているＦｌａｖｉｍｏｎａｓ属に属する細菌（例えば、Ｆｌａｖｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）、ＫｏｇａのＷＯ２００３／０９４６３９に記載されているＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｌｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、酵母（例えば、Ｖｉｇｌｉｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，７５：６３３−６４５に開示されている酵母株Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ  ＴＯＢ−Ｙ７）、ならびに細菌属Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、及びＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒの微生物が含まれるが、これらに限定されない亜硝酸還元酵素遺伝子を含有する微生物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｙｏｓｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（５）：３１５２−３１５７（２００４）、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ４３：３４９−３５７（２００３）、及びＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２６（２）：７３１−７４１（２００１）を参照されたい。発酵中に添加され得る別の例示的な微生物は、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓである。様々な微生物を記載する前述の書面は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、タバコ材料に関連付けられる細菌の量を減少させるために、Ｘｕらの米国特許出願公開第２０１４／０２６１４７８号に記載されるもの等のミクロファージ（例えば、バクテリオファージ）が用いられてもよく、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
ある特定の実施形態では、微生物は、遺伝子組換え微生物であってもよく、例えば、遺伝子組換えＴｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ菌が挙げられるが、これに限定されない。遺伝子組換えは、例えば、微生物のＤＮＡ内への亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子の挿入を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）が、本明細書で開示される方法において使用され、微生物は、それらが亜硝酸還元酵素を生成できるように遺伝子を組換えられる（ある特定の実施形態では、亜硝酸還元酵素遺伝子を含むように組換えられたＴｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ菌を含む）。
【００７６】
これらの微生物は、発酵に関連して（すなわち、発酵直前または発酵中に適用される）記載されているが、このタイミングは、制限することを意図するものではないことに留意されたい。例えば、いくつかの実施形態では、タバコ処理の他の段階（例えば、収穫直前、保存処理の早期段階中、保存処理中、保存処理の直後、及び／または保管のためのタバコ材料の調製中）にそのような微生物を適用することが有利であり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、この処理ステップでの使用のために有利に選択される微生物のタイプ（複数可）は、用いられる事前保存処理組成物（存在する場合）のタイプに影響を及ぼされる。例えば、塩（例えば、塩化物塩）を用いる事前保存処理において処理される場合、そのような塩条件と良好に機能する微生物を選択することが重要であり得る。
【００７８】
一般的に、添加される微生物の量、特定の微生物の特定の株（または株の組み合わせ）は異なり得（例えば、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓの様々な株が、単独または２つ以上の株の混合物で用いられ得る）、加工方法は異なり得、また発酵する混合物に添加される他の含有物も異なり得る。有利には、そのようなパラメータは、所望に応じて、亜硝酸塩の存在を減少させる、タバコ特異的ニトロソアミンの生成を最小化する、及びタバコ材料の風味特性に影響を与えるように変更され得る。
【００７９】
発酵ステップの直前または発酵ステップ中に添加される微生物は、典型的には発酵プロセスを促進するのに十分な量で添加される。概して、Ｓ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｅｄ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ），ａｔ  ｐｇ．９７−１１８に記載されている細菌促進性発酵の考察を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では有利に、本開示に従って、微生物は、それらが添加されるタバコ中またはタバコ上に存在する在来微生物と少なくともある程度競合するのに十分な量で添加され得る。添加される微生物の典型的な量は、少なくとも約１×１０３ＣＦＵの量である（例えば、約１×１０３ＣＦＵ〜約１×１０９ＣＦＵまたは約１×１０３ＣＦＵ〜約１×１０８ＣＦＵ等の約１×１０３ＣＦＵ〜約１×１０１０ＣＦＵ。いくつかの実施形態では、より高い濃度で微生物（複数可）を提供することは、発酵の速度を著しく上昇させることができるが、しかしながら、いくつかの実施形態では、上昇がほとんど観察されない。いくつかの実施形態では、微生物はファージ耐性であり、発酵プロセス中に複数の種が交替して用いられてもよい。ある特定の実施形態では有利に、タバコに関連付けられる内在性細菌、酵母、及び／または菌類は、比較的一定して留まり、発酵中、熱により死滅させられ得るか、及び／またはファージによって競争的に抑制され得る。ある特定の実施形態では、そのような内在性微生物は、適切な処理条件（例えば、内在性微生物の競争力がなくなるｐＨ及び／または塩濃度レベル）の使用に対して選択され得る。
【００８０】
発酵直前または発酵中の微生物の添加方法も異なり得る。例えば、いくつかの実施形態では、タバコ材料は、微生物の溶液もしくは懸濁液（例えば、水中）を噴霧され得るか、またはタバコ材料は、微生物を含有する粉末と接触させられ得る。
【００８１】
発酵が行われる特定の条件は異なり得、いくつかの実施形態では、そのような条件の選択は、発酵させるタバコ製品の特性に影響を与え得る。例えば、ある特定の実施形態では、特定の条件（例えば、温度、時間、水分レベル、酸素レベル、ｐＨ、エアレーション時間、他の添加物）は、生成されるＴＳＮＡの量に影響を及ぼし得る。したがって、これらの条件は、有利には、生成されるＴＳＮＡの量を最小化するように選択される。発酵の適切な条件も、少なくとも部分的に、使用される特定の微生物（複数可）に基づいて決定される。例えば、微生物は、異なる条件で異なって働くことが知られている。例えば、いくつかの微生物は、ある特定のｐＨ値、塩濃度、及び温度で他のものよりも良好に働く。したがって、ある特定の実施形態では、特定の微生物の選択は、発酵が行われ得る条件を制限し得る。いくつかの実施形態では、条件は、所与の微生物（複数可）に適切な条件を提供するように調整され得ることに留意されたい。例えば、タバコ材料のｐＨが低く、微生物がより高いｐＨ値でのみ良好に機能することが既知である場合、タバコ材料のｐＨが調整され得る（例えば、塩基の添加によって）。発酵条件の変更方法は、例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙらの米国特許第７，９４６，２９５号に記載されているように既知であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。発酵は、タバコ材料の部分的または完全な発酵が実現されるように行われ得る。例えば、ある特定の実施形態では、発酵プロセスは、監視され得（例えば、リンゴ酸変換を監視することによって）、タバコは、所与の割合のリンゴ酸変換でさらに加工され得る。
【００８２】
ある特定の実施形態では、以下の詳述される特定のプロセスに従って、タバコを処理及び発酵させる。タバコ材料が受領され、任意に、少なくとも約１年間、例えば約１〜約３年間等の所与の期間にわたって所与の水分レベル（例えば、約１３〜１８％の水分）で保管され得る。タバコ材料は、一般的に、所与の温度（例えば、約１００°Ｆ以上の温度、約１１０°Ｆ以上の温度、約１２０°Ｆ以上の温度、または約１３０°Ｆ以上の温度で、例えば、約１２０°Ｆ〜約１５０°Ｆまたは約１３０°Ｆ〜約１５０°Ｆの範囲内、例えば、１つの実施形態では約１４０°Ｆ）で、タバコ材料の水分レベルを所与の水分範囲内（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１５％〜約３０％、または約２０％〜約２５％、例えば１つの実施形態では約２２％の水分）に抑えるように水分を用いて処理される。特に有益な値は、処理されるタバコのタイプに左右され得、このため、これらの値は、それに従って調整され得ることに留意されたい。
【００８３】
制限することを意図するものではないが、特定の実施形態では、タバコは、直接筒調節装置において調節され得る。調節後、調節されたタバコは、概して、いくつかの部分に分離される（例えば、茎がタバコ材料の残りの部分から除去される）。この分離は、例えば、空気分離を備えた脱穀ミルを使用して達成され得る。このために用いられ得る例示的な設備は、例えば、Ｃａｒｄｗｅｌｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）またはＭａｃＴａｖｉｓｈ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃｈｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，ＶＡ）によって提供され得る。好ましくは、そこから茎が除去された、分離されたタバコ材料は、直ちに発酵に供されてもよく、またはいくつかの実施形態では、例えば、事前ブレンドサイロ内に運ばれてもよい。典型的には、異なるタイプのタバコは別個に加工され、各タイプが異なる事前ブレンドサイロに運ばれる。
【００８４】
いくつかの用途では、２つ以上のタイプのタバコを組み合わせることが望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、タバコは、２つ以上の供給源（例えば、２つ以上の事前ブレンドサイロ）から所望の比率で組み合わせられ得る。ある特定の実施形態では、例えば、事前ブレンドサイロからのタバコは、組み合わせるために秤量ベルトによって事前ブレンドサイロから運ばれ得る（例えば、ブレンドバルカー内において）。いくつかの実施形態では、タバコ材料（単一のタイプのタバコまたは本明細書で開示されるように配合された形態）は、次いで、取り出されて切断され、所望の長さ及び幅のタバコ材料ストランドを提供し得る。そのような長さ及び幅は異なり得、例えば、長さ及び幅は、典型的に「ファインカット」、「ロングカット」等で指定される。
【００８５】
この切断されたタバコは、例えば、本明細書に概して記載されるように、発酵に供される。いくつかの実施形態では、発酵は、有利には、ミキサー、例えば、Ｐｌｏｗ  Ｍｉｘｅｒ（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ，Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＫＹ）製）等の固体発酵（ＳＳＦ）容器内で行われ得る。発酵容器内において、水分レベル、塩分濃度、及び温度を含むパラメータは、有益に変更され得る。例えば、いくつかの実施形態では、タバコの水分レベルは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、例えば、約２０％〜約５０％または約３０％〜約４５％等の水分レベルを確実にするように最初に変更される。いくつかの実施形態では、タバコの塩分濃度は、乾燥重量基準で少なくとも約１％、例えば、約１％〜約６％等の塩分濃度を確実にするように最初に変更される。
【００８６】
容器内の温度は、典型的には、タバコ材料に関連付けられる細菌（すなわちＢａｃｉｌｌｕｓ種）を形成する任意の休眠胞子の少なくとも一部分の胞子形成が生じるように第１の高温に上昇する。この第１の高温は異なり得るが、概して、約８５°Ｆ〜約１０５°Ｆの範囲内等、少なくとも約８０°Ｆまたは少なくとも約８５°Ｆである。この第１の高温は、胞子形成が生じることを可能にするのに十分な期間にわたって維持される（例えば、約５〜約６０分間等、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約１５分間、または少なくとも約３０分間）。いくつかの実施形態では、次いで、温度は、植物性細菌を熱殺菌するために第２の高温にさらに上昇する。この第２の高温は異なり得るが、概して、約１６０°Ｆ〜約２１２°Ｆの範囲内等少なくとも約１５０°Ｆまたは少なくとも約１６０°Ｆである。この温度は、生存している植物性細菌の数の低減を提供するのに十分な期間にわたって維持される（例えば、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約１５分間、または少なくとも約３０分間）。しかしながら、ある特定の実施形態では、この期間は有利に、実質的なタバコ特異的ニトロソアミン形成が生じないことを確実にするように制御される。いくつかの実施形態では、例えば、この期間は、約５〜約６０分間であり得る。
【００８７】
タバコ材料は、その後、例えば、約８５°Ｆ〜約１００°Ｆ等、約１００°Ｆ以下に冷却される。これらの加熱加工ステップによって実現される細菌性ノックダウンは異なり得る。いくつかの実施形態では、この様式でのタバコ材料の処理は、所望の細菌性ノックダウンレベルを提供することができる。他の実施形態では、これらの加熱加工ステップの１サイクルは、所望の細菌性ノックダウンを実現するのに不十分である。いくつかの実施形態では、したがって、これらの加熱加工ステップの一方または両方は、所望の細菌性ノックダウンを実現するために、必要に応じて、独立して、または２回以上の組み合わせで繰り返され得る。所望の細菌性ノックダウンは、概して、発酵プロセス中のＴＳＮＡ形成を実質的に防ぐのに十分な量である。この目的を実現するために必要とされる特定の値は、ｐＨ、接種速度、水分活性等の様々な要因に左右され得る。いくつかの実施形態では、ログ１超、ログ２超、ログ３超、またはログ５超のノックダウンが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、ログ１超の残存内在性細菌レベルが必要とされる。
【００８８】
低減された細菌レベルを有するタバコ材料は、次いで、本明細書で開示される１つ以上の微生物を用いて処理される。１つの実施形態では、タバコ材料は、特定のｐＨをタバコ材料に提供するために、まず緩衝溶液を用いて処理される。いくつかの実施形態では、ｐＨは有利には、約７〜約８（例えば、約７．４）である。緩衝液は異なり得、いくつかの実施形態では、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせの水溶液を含み得る。ある特定の実施形態では、そのような緩衝溶液は、その中にタバコ材料が保持される容器に接続される混合タンク内で調製され得る。次いで、緩衝溶液は、ポンプシステムを通してタバコ材料に適用され得る。緩衝溶液をタバコ材料に適用するための他の方法が既知であり、同様に本明細書に包含されることが意図される。好ましくは、例えば、タバコ材料と緩衝液との間の適切かつ均等な混合を確実にするようにミキサーを用いることによって、緩衝液はタバコ材料と完全に混合される。
【００８９】
次いで、本明細書で開示される１つ以上の微生物は、緩衝化した材料に適用される。微生物は、例えば、溶液の形態で適用されてもよく、緩衝溶液と同様の様式で適用されてもよい。関連微生物には、非硝酸塩還元細菌及び／または酵母、例えば、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含むが、これらに限定されない上述のものが挙げられる。接種速度は異なり得るが、代表的な接種速度は、約１０３ＣＦＵ〜約１０９ＣＦＵである。微生物の導入に続いて、及び続く発酵プロセスの間、いくつかの実施形態では、発酵全体を通してタバコ材料の水分は調整され得る。発酵するタバコの水分は、有利には、約３５％水分〜約５０％水分の範囲内、理想的には発酵全体を通して約４０％〜約４５％の範囲内で維持される。
【００９０】
同様に、発酵するタバコの温度は、有利には、発酵プロセス全体を通して制御される（例えば、維持される）。タバコ材料が維持される例示的な温度は、約８０°Ｆ〜約９５°Ｆの範囲内である。温度を制御するための方法は、概して既知である。いくつかの実施形態では、温度は、その中で発酵が行われるＳＳＦ容器に関連付けられる加熱／冷却ジャケットによって制御され得る。発酵するタバコの酸素レベルも、発酵全体を通して有益に制御される。容器内の酸素含量の制御のための方法は、既知であり、空気がそこを通して容器内に通過できる高性能微粒子アレスタンス（ａｒｒｅｓｔａｎｃｅ）（ＨＥＰＡ）フィルタを用いること、及び／または発酵中タバコ材料を攪拌する、さもなければ動かす（例えば、混合容器内の回転歯によって、１週間に１回以上等、例えば、１週間に約１〜約３回）ことが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
これらの条件下でタバコ材料が維持される時間は異なり得る。典型的には、タバコ材料は、望ましい発酵のレベルが実現されるまでこれらの条件下で維持される。いくつかの実施形態では、発酵は、例えば、発酵中に枯渇されるリンゴ酸及びクエン酸のレベルを評価することによって監視され得る。制限することを意図するものではないが、例示的な発酵時間は、少なくとも約２週間または少なくとも約３週間、例えば、約３〜約４週間であり得る。これらの値は、例えば、接種速度、水分、温度、ｐＨ、塩分濃度、及びエアレーション等のパラメータに応じて異なり得る。成功した発酵後の最終ｐＨは、約７．６〜７．９であるべきである。
【００９２】
所望の程度まで発酵が完了するとき、発酵させたタバコ材料は、典型的には熱で処理される。いくつかの実施形態では、この熱処理は、発酵を停止し、あらゆる活動中の植物性微生物を熱殺菌するのに十分であり得る。この発酵後熱処理は、例えば、発酵前の熱処理に関して上述されるものと同様の様式で実現され得る。いくつかの実施形態では、次いで、様々な成分が熱処理された発酵させたタバコ材料に添加され得る。例えば、防腐剤、ケーシング、水分、及び塩分濃度は、熱処理された発酵させたタバコ材料への適切な成分の添加を通して調整され得る（例えば、そのような成分を発酵容器に直接添加することによって）。あるいはいくつかの実施形態では、ある特定の成分は、発酵前に試薬のプールを調整することが有利である場合、発酵前に添加され得る。ある特定の実施形態では、上に開示される方法に続いて、熱処理されたタバコ材料は、保管及び輸送のために乾燥され得る（例えば、約１５％〜約２０％の水分レベル、例えば、約１８％水分まで）。そのような熱処理されたタバコ材料は、その後、例えば、最終塩分濃度、防腐剤、ケーシング、及び水分含量を調整することによって、加工され得る。
【００９３】
本明細書に記載されるタイプの処理は、独立して実施され得るか、または本明細書に記載される処理は、組み合わせて実施され得る。例えば、本明細書に記載される事前保存処理方法は、保存処理プロセスの終了前に１回、２回、３回、またはそれ以上用いられてもよい。そのような処理は、同じまたは異なる処理組成物を用いることができる。いくつかの実施形態では、タバコ材料は、保存処理の完了前に塩及び１つ以上の乳酸菌の両方を用いて処理される。同様に、本明細書で開示される発酵処理は、発酵プロセス中に１回または複数回行われ得る（すなわち、発酵プロセス中に１回または複数回１つ以上のタイプの微生物をタバコ材料に添加することによって）。微生物が発酵中に複数回添加される場合、添加される微生物のタイプ（複数可）は、同じであっても、異なってもよい。
【００９４】
１つの特定の実施形態では、タバコ植物は、収穫前に塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を用いて処理され、その後、１つ以上の乳酸菌または耐塩酵母を用いる事前保存処理が続き（例えば、保存処理の早期段階中）、その後、発酵中１つ以上の微生物を用いる処理が続く。ある特定の実施形態では、事前保存処理のための塩処理は、保存処理プロセス及び発酵プロセス全体を通してタバコ材料中に塩化物の存在をもたらすことができ、いくつかの実施形態では、塩化物は、発酵中の硝酸塩の望ましくない低減を減速させるか、及び／または望ましくないＴＳＮＡの形成を原則させると考えられている。
【００９５】
本明細書に記載される様式でのタバコの処理は、いくつかの実施形態では、初期のタバコ材料（例えば、収穫直後の材料）と比較して同等のレベルのＴＳＮＡを有する処理されたタバコ材料を提供することができる。有利には、本明細書で開示されるようにタバコを処理し、発酵させ、発酵に供されるタバコ材料のＴＳＮＡレベル以下のＴＳＮＡレベルを有する発酵させたタバコ材料を提供することができる。換言すると、ある特定の実施形態では、発酵プロセスは、発酵プロセス中にＴＳＮＡがほとんど形成されない（実質的にＴＳＮＡを含まない及びＴＳＮＡを含まない場合を含む）ことを確実にするように本明細書で開示されるように制御される。いくつかの実施形態では、タバコを処理及び発酵させ、収穫直後のタバコのＴＳＮＡレベル以下のＴＳＮＡレベルを有する発酵させたタバコ材料を提供することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される１つ以上のステップは、処理されていないタバコと比較してＴＳＮＡの減少したレベルをもたらすことができる（ＴＳＮＡの著しく減少したレベルを含む）。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるように処理されるタバコ中のＴＳＮＡの量は、（処理されていない）発酵させたタバコに典型的に含有される量の約７５％以下、約５０％以下、約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、発酵させたタバコ材料中のＴＳＮＡの量は、約２０μｇ以下、約１５μｇ以下、約１２μｇ以下、または約１０μｇ以下であり得る。望ましくは、発酵前のタバコ中のＴＳＮＡの量は最小であり（例えば、上述の範囲内に収まる）、発酵後のタバコ中のＴＳＮＡの量は、大きく増加しない（例えば、発酵させたタバコ中のＴＳＮＡの量は、発酵直前のタバコ中のＴＳＮＡの量以下である）。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処理方法は、処理されたタバコ材料により多い塩含量（いくつかの実施形態では、より多い塩化物を含む）を提供することができる。有利には、本明細書に記載されるように処理されるタバコ材料の塩化物含量は、乾燥重量基準で０％〜約４％、例えば、約０．１％〜約３％または約０．５％〜約３重量％である。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるように処理されるタバコ材料の塩化物含量は、約４重量％未満、約３重量％未満、または約２重量％未満である。ある特定の用途では、増加した塩／塩化物含量は有害であり得るが、いくつかの実施形態では、増加した塩／塩化物の存在は有害でない場合もあり、またある特定の実施形態では、望ましい。例えば、そのような処理された材料は、タバコ材料の燃焼が生じる喫煙物品における使用に望ましくない場合がある。いくつかの実施形態では、増加した塩／塩化物含量は、以下でより十分に記載されるタバコ材料が燃焼されない用途（例えば、無煙タバコ製品中及び／または電子喫煙物品中）において、より許容可能であるか、及び／または望ましい場合がある。
【００９８】
本明細書に記載されるタイプの処理において、他の利益が生じ得ることに留意されたい。例えば、ある特定の実施形態では、微生物が存在しない処理において発酵を経験するタバコのプロファイルと比較して、微生物の存在下での様々な発酵段階において、変更された風味及び／または芳香プロファイルを得ることができる。
【００９９】
本開示に従って提供される処理されたタバコ材料は、当該技術分野で一般的に知られる方法で、さらに加工及び使用され得る。例えば、Ｂｙｒｄらの米国特許出願公開第２０１２／０２７２９７６号及びＭｏｌｄｏｖｅａｎｕらの同第２０１４／０２９９１３６号を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。様々な実施形態では、処理されたタバコは、喫煙物品、無煙タバコ製品、及び電子喫煙物品中で用いられ得る。本明細書に記載されるある特定の処理されたタバコ材料は、例えば、塩及び／もしくは塩化物含量が製品の特性に悪影響を与えない、ＴＳＮＡ含量が有利に最小化される、ならびに／または発酵させた材料が有益に用いられる製品中で使用され得る。
【０１００】
特定の対象は、本明細書に記載されるように処理されるタバコ材料を含む無煙タバコ製品であり、その構成は異なり得る。例えば、Ｍｕａらの米国特許第８，０６１，３６２号及びＨｏｌｔｏｎ，Ｊｒ．らの米国特許公開第２００７／００６２５４９号、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｊｒ．らの同第２００７／０１８６９４１号、ならびにＤｕｂｅらの同第２００８／００２９１１０号に記載されているそれらの代表的な成分、成分の組み合わせ、それらの成分及び含有物のタバコに対する相対量、ならびにそれらの成分を用いる様式及び方法を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、例えば、（単独でまたは他のタイプのタバコ材料と組み合わせて）処理される発酵させたタバコ材料を含むが、これに限定されない本明細書で開示されるタイプの処理されたタバコ材料を含む、スヌース製品または嗅ぎ型製品（例えば、密閉された小袋内に組み込まれる粉砕されたタバコ材料）が提供される。そのようなスヌース製品の例示的な実施形態は、例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌらの米国特許出願公開第２０１２／０２７９５１０号に例示及び記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。スヌース製品及びその成分の様々な成分の説明も、Ｌｕｎｄｉｎらの米国特許公開第２００４／０１１８４２２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｌｉｎｄｅｎの米国特許第４，６０７，４７９号、Ｎｉｅｌｓｅｎの同第４，６３１，８９９号、Ｗｙｄｉｃｋらの同第５，３４６，７３４号、及びＤｅｒｒの同第６，１６２，５１６号、ならびにＨａｎｓｓｏｎらの米国特許公開第２００５／００６１３３９号及びＢｒｉｎｋｌｅｙらの同第２０１０／００１８５３９号も参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
本明細書に提供される考察は、大部分がタバコの処理に着目しているが、様々な他の植物（果物、野菜、草花、及びそれらの成分を含む）が本明細書に提供される方法に従って処理され、そこに関連付けられるある特定の化合物の変更されたレベルを有する、そこから生成される植物、植物成分、ならびに材料及び製品を供給できることに留意されたい。
【実施例】
【０１０３】
実験
本発明は、以下の実施例によってより完全に例示され、それらは本発明を例示するために記載され、本発明を制限するとは解釈されない。別途記載されない限り、全ての部及びパーセントは重量によるものであり、全ての重量パーセントは、別途指示されない限り、水含量を除くことを意味する乾燥基準で表される。
【０１０４】
実施例１：処理溶液を用いる事前保存処理を施されるタバコの処理
日干し（Ｄａｒｋ−ａｉｒ）保存処理を施されるタバコを、プロバイオティクス細菌溶液、酵素溶液、及び／または３％塩化ナトリウム塩溶液のうちの１つ以上を用いて収穫前に５時間処理する。溶液は、背負式噴霧機を使用して適用される。溶液は、１エーカー当たり１００ガロン溶液を基準としており、推奨される栽植距離及び植物１つ当たりの用量が以下に提供される。処理されたタバコを収穫し、細菌総数、腸内細菌数、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ数に関して、軸中央の葉の試料を分析する。１０グラムの各処理されたタバコ試料をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに入れ、１０−２〜１０−８回水で希釈する。処理されたタバコ試料の希釈物を、好気性細菌総数に関してプレートカウント寒天（ＰＣＡ）に、グラム陰性細菌数に関してバイオレットレッド胆汁寒天（ＶＲＢＡ）に、及び嫌気性細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）数に関してＭＲＳに適用する。拡大下で視覚化された細菌コロニーの数を計測し、１グラム当たりのコロニー形成単位、ＣＦＵ／ｇの総数を推定する。
【０１０５】
ＣＶＳから利用可能なプロバイオティクス溶液（１植物当たり６．００×１０９ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後９１％の総細菌の低減、処理後４０％の腸内細菌の低減、及び処理後４６％のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの低減を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１０６】
Ｗａｌｇｒｅｅｎｓから利用可能なプロバイオティクス溶液（１植物当たり６．４０×１０９ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後９６％の総細菌の低減、処理後５８％の腸内細菌の低減、及び処理後４２％のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの低減を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１０７】
界面活性剤（Ｄｒｅｘｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣｏｍｐａｎｙのＳｕｒｆ−Ａｃ（登録商標））と組み合わせたＣＶＳから利用可能なプロバイオティクス溶液（１植物当たり６．００×１０９ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後９５％の総細菌の低減、処理後６６％の腸内細菌の低減、及び処理後５７％のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増加を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１０８】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍプロバイオティクス溶液（１植物当たり６．６４×１０１０ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後９５％の総細菌の低減、処理後７５％の腸内細菌の低減、及び処理後４３％のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増加を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１０９】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓプロバイオティクス溶液（１植物当たり２．７２×１０１０ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後９３％の総細菌の低減、処理後２０％の腸内細菌の低減、及び処理後３３％のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの低減を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１１０】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓプロバイオティクス溶液（１植物当たり４．１６×１０１０ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後８２％の総細菌の低減、処理後２５％の腸内細菌の低減、及び処理後１６％の低減Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１１１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓプロバイオティクス溶液（１植物当たり５．２０×１０９ＣＦＵを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後９７％の総細菌の低減、処理後３９％の腸内細菌の低減、及び処理後４００％を超えるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増加を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１１２】
ＰｒｅｖｅｎｔＡＳｅ（商標）酵素溶液（１植物当たり３．２ｍＬのアスパラギナーゼを提供するように調製された溶液）を用いて処理されたタバコは、処理後８８％の総細菌の低減、処理後７５％の腸内細菌の低減、及び処理後４３％のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの低減を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１１３】
３％ＮａＣｌ溶液を用いて処理されたタバコは、処理後９４％の総細菌の低減、処理後７６％の腸内細菌の低減、及び処理後４００％を超えるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増加を呈した（全て処理前後の細菌総数に基づく）。
【０１１４】
データは、全ての処理溶液が処理されたタバコ材料に関連付けられる総細菌の減少（処理前のタバコ材料と比較して）を提供したことを例示する。塩（ＮａＣｌ）で処理されたタバコ材料は、望ましいＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌の著しい増加を呈した。この発見は、そのようなＮａＣｌ（及び他の塩）で処理されたタバコ材料を、さらなる発酵プロセス及び無煙タバコ製品中へのそのような発酵させたタバコ材料の組み込みに特に好適にし得る。さらに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓで処理されたタバコ材料は、処理後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌の実質的な増加を呈した。いくつかの増加は、処理溶液中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌の存在から予想され得たが、この増加は、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプロバイオティクス溶液で処理されたタバコ材料に対して記載されるものをはるかに上回る（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍを用いて処理されたタバコは、たった４３％の増加を呈し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを用いて処理されたタバコは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌の３３％の減少を呈した）。結果として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓで処理されたタバコ材料は、さらなる発酵プロセス及び同様に無煙タバコ製品中へのそのような発酵させたタバコ材料の組み込みに特によく適している場合がある。
【０１１５】
実施例２：微生物を用いるタバコの処理
タバコ（例えば、実施例１において上で提示される方法のうちのいずれかによって処理されるタバコ）を、タバコを湿らせることによって（例えば、タバコを多湿条件に供することによって）発酵に供する。タバコを発酵させ、ＴＳＮＡ前駆体の形成を防ぐために、発酵プロセス中、適切な水分活性、ｐＨ、塩分濃度、及び温度条件を選択及び維持し、種菌または所望の内在性微生物（複数可）に適切な条件を提供することによって、内在性細菌、酵母、及び菌類の制御が制御される。細菌（例えば、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）単独、または酵母と組み合わせた溶液を発酵するタバコに適用され、約１〜６週間の期間にわたってそのような条件下でタバコを発酵させる。実施例１に記載されるように処理されたが、発酵中Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを用いて処理されていないタバコにおいて、発酵させたタバコと比較して減少したＴＳＮＡ含量が観察される。
【０１１６】
本発明の多くの修正及び他の実施形態が、前述の説明に示される教示の利益を有して、本発明に関連する当業者によって想起されるだろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に制限されず、その修正及び他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。特定の用語が本明細書で用いられるが、それらは包括的及び説明的な趣旨で使用されるに過ぎず、制限するためではない。
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月16日(2018.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ材料のタバコ特異的ニトロソアミン含量の変更方法であって、
タバコ材料を処理組成物と接触させることであって、前記処理組成物が、塩、糖、酵素、乳酸菌、酵母、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせを含み、前記接触させることが、低減された全細菌含量を有する処理されたタバコ材料を提供する、接触させることと、
前記処理されたタバコ材料に保存処理を施し、保存処理を施されたタバコ材料を得ることと、
前記保存処理を施されたタバコ材料に１つ以上の微生物を添加することであって、前記１つ以上の微生物が、前記保存処理を施されたタバコ材料の外因性量で存在する、添加することと、
前記保存処理を施されたタバコ材料を発酵させ、処理組成物と接触しておらず、前記微生物の存在下で発酵させていない発酵させたタバコ材料と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン含量を有する発酵させたタバコ材料を提供することと、を含む、方法。
【請求項２】
収穫されたタバコ材料を所望の水分レベルに調節することと、
前記収穫されたタバコ材料から茎を分離し、茎を取ったタバコ材料を得ることと、
前記茎を取ったタバコ材料を切断し、切断された、茎を取ったタバコ材料の形態の前記タバコ材料を提供することと、をさらに含み、
前記接触ステップが、前記切断された、茎を取ったタバコ材料を塩と接触させることと、結果として得られる混合物を加熱することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タバコ材料が、タバコ種子、タバコ実生、成熟していない生きた植物、成熟した生きた植物、またはこれらの一部から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理組成物が、塩化物含有塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記処理組成物が、ＮａＣｌまたはＫＣｌを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タバコ材料が、Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｄｏｌｅ、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ、ＤＦ  ９１１、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７１、ＫＹ  １８０、ＫＹ  １９０、ＫＹ  ３０９、ＫＹ  ＶＡ  ３１２、ＶＡ  ３５５、ＶＡ  ３５９、ＤＦ  ４８５、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるタバコを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の微生物が、硝酸塩から亜硝酸塩への変換を促進しない、及び／または前記１つ以上の微生物が、前記タバコに在来している１つ以上の硝酸還元微生物との生育競争が可能である、及び／または前記１つ以上の微生物が、亜硝酸塩吸収源である、及び／または前記１つ以上の微生物が、亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の微生物が、細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の微生物が、遺伝子組換え細菌を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子組換え細菌が、亜硝酸還元酵素をコードする挿入遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タバコ特異的ニトロソアミンが、約１０％以上、約２０％以上、または約５０％以上低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵させたタバコ材料の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量が、前記保存処理を施されたタバコ材料の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量を超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記発酵させたタバコ材料の前記塩化物含量が、約０．５重量％〜約３重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発酵させたタバコ材料を加工し、タバコ製品への組み込みに適した形態の加工されたタバコ材料を提供することと、
前記加工されたタバコ材料を無煙タバコ製品に組み込むことと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記加工されたタバコ材料が、タバコ配合物の形態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法に従って調製される、無煙タバコ製品。
【請求項１８】
前記接触ステップが、前記混合物を低温殺菌することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記調節ステップが、前記タバコ材料を約２０％〜約２５％の水分レベルに調節することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触ステップ及び発酵ステップが、固体発酵容器内で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵ステップが、前記温度、水分、酸素レベル、またはそれらの任意の組み合わせを制御することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の微生物が、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを含み、前記Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓが、約１０６ＣＦＵの量で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵させたタバコ材料を高温に供すること、及び／または
１つ以上の成分を前記発酵させたタバコ材料に添加することであって、前記１つ以上の成分が、塩、防腐剤、ケーシング混合物、及び水分から成る群から選択される成分を含む、添加すること、及び／または
前記発酵させたタバコ材料の前記水分レベルを調整することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記発酵させたタバコ材料の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量が、前記切断された、茎を取ったタバコ材料中の前記タバコ特異的ニトロソアミン含量以下である、請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
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