(57)【要約】  本発明は、生物学的試料からの核酸の単離および／または精製のための高度に自動化可能な方法であって、２５０ｂｐより短い核酸に特に適しており、タンパク質分解性予備消化工程なしに自動化システム内で、好ましくはカートリッジベースシステム内で行なわれ得る方法に関する。さらなる一態様では、本発明によりまた、前記単離および／または精製方法をベースにした自動化された核酸検出方法ならびに前記方法の実施において使用されるバッファーおよびキットを提供する。
2018518171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１種類のカオトロピック化合物と少なくとも１種類のアルコールの存在下で、核酸含有出発物質を核酸結合支持体と接触させることによって、核酸を該核酸結合支持材に結合させる工程；および
（ｂ）任意で行う、結合された該核酸を該核酸結合支持材から溶出バッファーを用いて溶出させる工程
を含む、核酸含有出発物質からの核酸の単離および／または精製のための方法であって；
（ｉ）該アルコールが、４個または５個の炭素原子を有するアルコールであり、工程ａ）において１７％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在すること、および
（ｉｉ）該少なくとも１種類のカオトロピック化合物が工程ａ）において１．５Ｍ〜５Ｍの濃度で存在すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
プロテアーゼを工程ａ）で添加しない、または該核酸含有出発物質を工程ａ）に供する直前にプロテアーゼ（または他の等価なプロテアーゼ前処理）とのインキュベーションを行なわない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
４個または５個の炭素原子を有するアルコールアルコールが、好ましくはｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノール、２，２−ジメチル１−プロパノール、２−メチル２−ブタノール、３−メチル２−ブタノールまたはその混合物からなる群より選択されるモノヒドロキシアルコール；より好ましくはｎ−ブタノール、１−ペンタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはその混合物からなる群より選択されるモノヒドロキシアルコール；最も好ましくはｎ−ブタノールであるモノヒドロキシアルコールである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
４個または５個の炭素原子を有するアルコールが工程ａ）において２０％（ｖ／ｖ）〜５５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２５％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは３０％（ｖ／ｖ）〜４５％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは３５％（ｖ／ｖ）〜４０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該少なくとも１種類のカオトロピック化合物が、チオシアン酸塩、イソシアン酸塩、過塩素酸塩、塩酸塩またはその混合物から選択され；好ましくはチオシアン酸グアニジニウムである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該少なくとも１種類のカオトロピック化合物は、工程ａ）において２Ｍ〜４．５Ｍ、好ましくは２．５Ｍ〜４Ｍ、より好ましくは３Ｍ〜３．５Ｍの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該核酸含有出発物質が、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）および尿からなる群より選択される液体の生物学的試料である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、工程ａ）およびｂ）が取り外し可能なカートリッジにおいて行なわれる自動化システムで行なわれる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（ａ）核酸含有出発物質を自動化システム内に供給する工程；
（ｂ）前記自動化システム内の核酸を、請求項１〜６に記載の単離および／または精製方法に従って単離および／または精製する工程；
（ｃ）前記自動化システム内で、工程（ｂ）で単離および／または精製された標的核酸の増幅を行なう工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された該標的核酸を検出する工程
を含む、標的核酸を検出するための自動診断方法。
【請求項１０】
少なくとも工程（ｂ）と（ｃ）がカートリッジにおいて行なわれる、請求項９に記載の自動診断方法。
【請求項１１】
核酸の単離および／または精製のための水性抽出バッファーであって、
（ｉ）２０％（ｖ／ｖ）〜６５％（ｖ／ｖ）、好ましくは３５％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは４０％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度である４個または５個の炭素原子を有するアルコール、好ましくはｎ−ブタノール、および
（ｉｉ）３．３Ｍ〜６．７Ｍ、好ましくは３．５Ｍ〜５．５Ｍ、最も好ましくは３．７Ｍ〜４．５Ｍの濃度の少なくとも１種類のカオトロピック化合物
を含むバッファー。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抽出バッファーを含み、
核酸含有出発物質から、＜２５０ｎｔの長さを有する細胞外および／または短鎖の核酸の単離および／または精製のためのキット。
【請求項１３】
前記抽出バッファーが、自動システムに取付け可能なカートリッジの内部に供給されている、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
該カートリッジは、さらに、核酸を結合させるのに適した核酸結合支持材を備えている、核酸の単離および／または精製コンパートメントを備えており、前記核酸の単離および／または精製コンパートメントは、該抽出バッファーを収容しているか、または前記抽出バッファーを収容している別のコンパートメントと流体連通している、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
−細胞外核酸の単離および／または精製、
−＜２５０ｎｔ、最も好ましくは＜１００ｎｔの長さを有する短鎖核酸の単離および／または精製、
−ウイルス核酸の単離および／または精製、ならびに
−感染症、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかのための
請求項１〜８のいずれかに記載の方法、請求項１１に記載の抽出バッファーまたは請求項１２〜１４のいずれかに記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的試料からの核酸の単離および／または精製のための高度に自動化可能な方法であって、２５０ｂｐより短い核酸に特に適しており、タンパク質分解性予備消化工程なしに自動化システム内で、好ましくはカートリッジベースシステム内で行なわれ得る方法に関する。さらなる一態様では、本発明によってまた、前記単離および／または精製方法をベースにした自動化された核酸検出方法ならびに前記方法の実施において使用されるバッファーおよびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核酸の単離は、現在、ほとんどの場合、２つの異なる原理のうちの１つに基づいて行なわれる。より以前からの第１のものは、カオトロピック剤と有機系抽出溶媒（通常、フェノールおよび／またはクロロホルム）を含有しているバッファーを生物学的試料に添加する一工程抽出手順を使用するものである。その結果、かくして得られた混合物は２つの相：核酸が保持された水相と、所望のものでない残りの物（これは廃棄され得る）が保持された有機相に分離する。この一工程抽出手順の重要な不都合点は、第１にフェノールおよび／またはクロロホルムなどの毒性の有害な物質を使用すること、および第２に、核酸保持水相の他の水溶性物質による汚染の可能性があることである。このような物質は、さらなる精製工程を行なうことにより除去され得るが、これは多大な時間を必要とする。
【０００３】
第２の原理は、例えばＥＰ０３８９０６３に開示されているような、二酸化ケイ素などの固相支持材上への核酸の選択的な吸着に基づいたものであり、これにより、実質的に上記の不都合点がなく、核酸単離手順がもたらされる。簡単には、この手順は、必要に応じて核酸含有出発物質を溶解させた後、前記物質を支持材と、該核酸が該支持材に結合することを可能にすることを規定した条件下で接触させることを伴うものである。任意に、洗浄および溶出工程は適切な溶液またはバッファーを用いて行なわれてもよい。
【０００４】
「ブームプロトコル」（Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０，２８（３））と称される上記の手順のよく知られた変形型がＥＰ０８１９６９６に開示されている。ブームプロトコルは、核酸を核酸含有出発物質から、前記出発物質をカオトロピックバッファーおよびＤＮＡ結合固相とともにインキュベートすることにより単離することを伴うものである。カオトロピックバッファーは、必要に応じて、出発物質の溶解および核酸の固相との結合の両方に影響を及ぼすものである。
【０００５】
ブームプロトコルおよび当該技術分野で知られたその多くの変形型は、ほとんどが、典型的には３〜１０ｋｂの長さを有する細菌のプラスミドなどの１キロベース（ｋｂ）より大きい核酸の抽出および精製に適したものである。これは、おそらく、短鎖核酸（すなわち、２５０ヌクレオチド（ｎｔ）長未満のもの）の固相支持材への吸着が長鎖核酸のものより劣るためであり得る。とはいえ、一部の特定の用途では、短鎖核酸の単離または短鎖核酸を長鎖核酸よりも濃縮させることが望ましい。例えば、体液中を循環している短鎖の断片化核酸（例えば、がん患者または妊娠中の血液中にみられるいわゆるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ））の単離および検出のためが望ましい。
【０００６】
長鎖核酸よりも短鎖核酸を好ましく精製、濃縮または分離するため、種々のプロトコルが報告されている。そのうちの１つがＷＯ２００９１４６７７６（ＥＰ２２８５８１６）に記載されており、これには、＜１０００ｎｔの長さを有する核酸の単離および／または精製を、該核酸をケイ酸質の支持材に≧２Ｍかつ≦３．５Ｍの濃度の少なくとも１種類のカオトロピック化合物と≧１５％（ｖ／ｖ）かつ≦３２％（ｖ／ｖ）の濃度のイソプロパノールの存在下で結合させることにより行なうことが教示されている。しかしながら、この手順は、前述の条件によって生物学的試料中に存在するタンパク質の急速な沈殿が引き起こされ（これは、適切な前処理をしないと、支持材への核酸の吸着がかなり障害され得る）、また、膜または精製カラムとしてのかかる支持材の目詰まりが引き起こされるという欠点を有する。したがって、ＥＰ２２８５８１６に開示された単離プロトコルの前には、５０〜６０℃より上の温度でのプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）との少なくとも１５〜３０分間のインキュベーションを伴うタンパク質分解処理を行なわなければならず、これは該手順の成功のために必要である。核酸含有出発物質を、カオトロープとイソプロパノールの存在下で支持材と接触させる前にまず予備消化しなければならないことは、プロトコルが、より多大な時間を必要とし、大きな労力を要するものになり、自動システムでの有効な実施を妨げるだけでなく、重要なことには、核酸の分解、特に短鎖核酸だけでなく、特に種々の型のＲＮＡの分解の機会を増大させる。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、タンパク質分解の前処理を必要としない、自動化に適した、核酸を単離および／または精製するための単純で迅速な方法を供給することにより、上記の欠点に対処することである。重要なことには、本発明の方法は、＜２５０ｂｐの長さを有する短鎖核酸を液体生検材料から単離するのに特に好都合であるが、また、種々の細胞内核酸種および細胞外核酸種、例えばウイルス核酸またはマイクロＲＮＡを単離するためにも使用することができる。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、添付の独立項に規定される。好ましい実施形態は従属項に規定される。特に、本発明は：
（ａ）少なくとも１種類のカオトロピック化合物と少なくとも１種類のアルコールの存在下で、核酸含有出発物質を該核酸結合支持体と接触させることによって、核酸を核酸結合支持材に結合させる工程；および
（ｂ）任意で行う、結合された該核酸を該核酸結合支持材から、溶出液、例えば、純水または溶出バッファー、例えばＴＥバッファーを用いて溶出させる工程
を含む、核酸含有出発物質からの核酸の単離および／または精製のための方法であって；
（ｉ）該アルコールが、４個または５個の炭素原子を有するアルコールであり、工程ａ）において１７％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在すること、および
（ｉｉ）該少なくとも１種類のカオトロピック化合物が工程ａ）において１．５Ｍ〜５Ｍの濃度で存在すること
を特徴とする方法に関する。
【０００９】
ブームプロトコルに由来する核酸の単離のための本件技術分野の技術水準の方法は、エタノールまたはイソプロパノールの存在下での固相への核酸の吸着に基づいたものである。このような既知の方法では、カオトロピック剤が高濃度で存在している場合であっても前記条件において起こる相当なタンパク質の沈殿を抑制するために、生物学的試料のタンパク質分解予備消化が必要とされる。４個または５個の炭素原子のアルコールを使用することにより、本発明では、未だ存在する沈殿の問題が実質的に回避され、したがってまた、標準的なタンパク質分解性予備消化工程の使用が余分となる。したがって、特に好都合な一実施形態では、本発明は、プロテアーゼを工程ａ）で添加しない、または核酸含有出発物質を工程ａ）に供する前にプロテアーゼとのインキュベーションもしくは任意の等価な工程を行なわない、核酸の単離および／または精製方法を提供する。このような特徴のおかげで、本発明の方法は自動化様式で行なわれるのに特に適している。
【００１０】
さらなる一態様では、本発明はまた、自動化システムで核酸を検出するための自動診断方法であって：
ａ）核酸含有出発物質を自動化システム内に供給する工程；
ｂ）前記自動化システム内の核酸を、上記の実施形態による単離および／または精製方法に従って単離および／または精製する工程；
（ｃ）前記自動化システム内で、工程（ｂ）で単離および／または精製された標的核酸に対してＰＣＲを行なう工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）のＰＣＲで生成された標的核酸を検出する、好ましくはこれも前記自動化システムにおいて検出する、工程
を含む方法を提供する。
【００１１】
次に、本発明はさらに、核酸の単離および／または精製のための水性抽出バッファーであって：
（ｉ）２０％（ｖ／ｖ）〜６５％（ｖ／ｖ）、好ましくは３５％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは４０％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度の４個または５個の炭素原子を有するアルコール、および
（ｉｉ）３．３Ｍ〜６．７Ｍ、好ましくは３．５Ｍ〜５．５Ｍ、最も好ましくは３．７Ｍ〜４．５Ｍの濃度の少なくとも１種類のカオトロピック化合物
を含むバッファーを提供する。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、本発明はまた、少なくとも上記の水性抽出バッファーを備えた、核酸の単離および／または精製のためキットを提供する。好ましい一実施形態では、かかるキットはカートリッジの形態であり得、ここで、前記カートリッジの内部には本発明に係る水性抽出バッファーが供給されている。
【００１３】
また、最後に、
−細胞外核酸の単離および／または精製、
−＜２５０ｎｔの長さを有する短鎖核酸の単離および／または精製、
−ウイルス核酸の単離および／または精製、ならびに
−感染症、および、病理学的状態または生理学的状態の診断
のいずれかにおける、
上記の核酸の単離および／または精製方法、自動診断方法、水性抽出バッファー、ならびに本発明に係るキットの使用を提供する。
【００１４】
定義
用語「核酸」は、本明細書で用いる場合、ヌクレオチドサブユニット間にホスホジエステル結合を含むリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドの重合体をいう。核酸としては、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、断片化核酸、エキソソームまたはミトコンドリアなどの細胞内小器官から得られる核酸、試料上または試料中に存在しているかもしれない微生物またはウイルスから得られる核酸、が挙げられる。核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよく、線状であっても環状であってもよい。
【００１５】
用語「短鎖核酸」は、本明細書で用いる場合、＜２５０ｎｔ未満、好ましくは＜２００ｎｔまたはさらには＜１５０ｎｔで構成されたリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドの重合体をいう。その特に好都合な態様の１つでは、本発明は、がん患者由来の血液および血漿などの液体生検材料におけるがん関連変異の検出のための確かな根拠を提供することを目指している。最近の所見では、がん患者の血液中に循環しているほとんどのセルフリーＤＮＡ断片は１８０〜２００ｂｐと測定されていることが報告されている。このサイズは、ヌクレオソームに巻き付いておりアポトーシスの際に細胞から放出されるＤＮＡの通常サイズと相関していることに注目されたく、また、これは、ｃｆＤＮＡが、死滅中の大量のがん細胞からの受動放出によって血液中に進入していることを示唆している（例えば、Ｊａｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１；Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏ．，２０１４；およびＤｅｖｏｎｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．２０１４参照）。かかる小さい断片の単離が技術的に困難であることおよび診断理由に望ましいことの両方に鑑みて、本発明の解釈上、用語「短鎖核酸（“Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ”および“Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ”）は、上記に明示した２５０ｎｔ未満のサイズの核酸に関するものであると解釈されたい。
【００１６】
本明細書で用いる場合、用語「細胞外核酸（“ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”または“ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ”）」は、細胞中に含有されたものでない核酸であると理解されたく、細胞外ＲＮＡならびに細胞外ＤＮＡおよびその混合物の両方をいう。また、代表的な細胞外核酸は多くの場合、セルフリー核酸（セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）またはセルフリーＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）など）とも称される。したがって、細胞外核酸は通常、細胞の外部または複数の相互に連結している細胞の外部に存在している。典型的な細胞外核酸の例は、例えば、生物学的試料の無細胞画分（または部分）、例えば体液または体液に由来する試料、例えば血漿などにみられ得るものである。細胞外核酸としては限定されないが、哺乳動物の細胞外核酸、例えば、細胞外の腫瘍関連または腫瘍由来のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他の疾患関連の細胞外ＤＮＡおよび／またはＲＮＡなど、後成的に修飾されたＤＮＡ、胎児のＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどの低分子干渉ＲＮＡ、などが挙げられる。かかる哺乳動物の細胞外核酸は、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームとして存在するものであってもよく、核酸結合特性を有するタンパク質によって血液細胞の表面に結合されるものであってもよい。さらに、重要なことには、細胞外核酸としてはまた、非哺乳動物の細胞外核酸（例えば、ウイルス核酸）、原核生物（例えば、細菌）、ウイルスまたは真菌に由来する細胞外核酸集団中に放出された病原性核酸、なども挙げられる。
【００１７】
多くの疾病状態および感染過程では、細胞外および／または短鎖の核酸の存在またはレベルの変化の検出は、スクリーニング、診断、予後、および疾患進行のサーベイランス、潜在的治療標的の同定のため、ならびに処置応答のモニタリングのために重要である。加えて、母体の血液中の高値の胎児ＤＮＡ／ＲＮＡが、例えば性同一性を判定するため、染色体異常を評価するため、および妊娠関連合併症をモニタリングするために使用されている。腫瘍細胞または胎児に由来する哺乳動物の細胞外核酸の他に、細胞外の短鎖核酸を含む試料にはまた、細胞内に含まれていない他の対象核酸、例えば、病原体の核酸、例えばウイルスまたは細菌の核酸も含まれている場合があり得る。また、試料、例えば特に血液試料または血液由来の試料からのウイルスまたは細菌の核酸の効率的な単離も多くの診断用途に重要である。
【００１８】
さらに、本明細書で用いる場合、用語「試料」または「生物学的試料」は、核酸および／または細胞性材料を含有しているさまざまな生物学的供給源を包含していることを意図する。試験対象の細胞に由来する核酸および／または細胞性材料は、特定のマーカーのうちの１種類以上が存在しているかどうかが測定される。包含される試料は、細胞培養物由来の試料、真核生物系微生物、または、体液、体液の沈殿物、灌流被検物、微細針吸引物、生検材料試料、組織試料、がん細胞、患者由来の細胞、疾患または感染について試験および／または処置対象の組織由来の細胞または個体由来のインビトロ培養細胞あるいは法医学的試料などの診断用試料である。体液試料の非限定的な例としては、全血、骨髄、脳脊髄液、腹水、胸膜液、リンパ液、血清、血漿、尿、乳糜、便、精液、痰、乳頭吸引物、唾液、スワブ被検物、洗浄液または灌流液、および／または、ブラシ擦過採取被検物が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態では、核酸含有出発物質は、全血試料、血清試料または血漿試料からなる群より選択される。
【００１９】
次に図面について具体的に言及するが、図示した具体物は一例であり、本発明の種々の実施形態の例証的論考の目的のためのものにすぎないことを強調しておく。これらは、本発明の原理および概念的態様の最も有用な説明であると考えられるものを提供する目的のために提示している。これに関連して、本発明の基本的な理解に必要であるのを超えて詳細には本発明の詳細事項を示す試みは行なっていない。本説明は、当業者に対して、どのようにして本発明のいくつかの形態が実際に具体化され得るかを説明する役割を果たし、以下にまとめた図面は本説明をサポートする役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、生物学的試料および高い容量モル濃度で存在するカオトロピック剤と混合状態のアルコールの型に依存性のタンパク質の沈殿レベルの差を示す。
【図２】図２は、カオトロピック塩濃度の関数としての、アルコールの型に依存性のケイ酸質の結合材に対するＤＮＡ結合特性の差を示す。
【図３】図３は、ＧｕＳＣＮ濃度の関数としての、４４％のｎ−ブタノールの存在下での５０ｂｐ（薄い色のバー）および１５０ｂｐ（濃い色のバー）の短いＤＮＡ断片の抽出速度を示す。
【図４】図４は、プロテアーゼ処理なしで完全自動核酸抽出プロトコルを用いて血漿またはＣＳＦ臨床試料から単離された細胞外核酸に対して行なわれたＢＲＡＦ変異解析の結果を示す。
【図５】図５は、全血試料からのウイルスＲＮＡの抽出および解析時の異なるアルコールの能力を示す。
【図６】図６は、エボラウイルスＲＮＡの完全自動化検出でのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は：
（ａ）少なくとも１種類のカオトロピック化合物と少なくとも１種類のアルコールの存在下で、核酸含有出発物質を該核酸結合支持体と接触させることによって、核酸を核酸結合支持材に結合させる工程；および
（ｂ）任意で行う、結合された該核酸を該核酸結合支持材から、溶出液、例えば、純水または溶出バッファー（例えばＴＥバッファー）を用いて溶出させる工程
を含む、核酸含有出発物質からの核酸の単離および／または精製のための方法であって；
（ｉ）該アルコールが、４個または５個の炭素原子を有するアルコールであり、工程ａ）において１７％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在すること、および
（ｉｉ）該少なくとも１種類のカオトロピック化合物が工程ａ）において１．５Ｍ〜５Ｍの濃度で存在すること
を特徴とする方法に関する。
【００２２】
４個または５個の炭素原子を有するアルコール、特に、ブタノールおよびペンタノールなどのモノヒドロキシのものは、生物学的試料中に自然に存在する水への溶解度が制限され、二相系が形成されて分離する。この理由のため、このようなアルコールは、核酸単離手順において、ずっとより一般的な、水性環境で充分に混合されるエタノールおよびイソプロパノールほど高頻度には使用されない。上記のことに鑑み、本発明は、予期しない２つの観察結果：第１に、５０％の水と５０％のブタノールまたはペンタノールの混合物で自然に形成される二相系が、カオトロピック化合物を前記混合物におよそ１．５Ｍ以上の容量モル濃度まで添加した場合、安定で一様な単相溶液（ＳＴＰ（標準温度および標準圧力）下）になることに基づいたものである。第２に、上記の条件下で、ブタノールまたはペンタノールは、シリカへの核酸の結合を可能にするだけでなく、生物学的試料中に存在するタンパク質の即時の凝集および沈殿が抑制（または少なくとも相当低速化）されるのに充分に疎水性の条件ももたらすことが観察された。
【００２３】
本発明は、実質的にタンパク質の沈殿がなく、同時に、核酸が一般的な核酸結合材に結合することを可能にする核酸抽出条件を提供する。第１に、これにより、多大な時間を必要とする試料のタンパク質分解予備消化（これをしなければ核酸結合表面をブロックする大量の沈殿に苦しむことになるであろう）を行なう必要性がなくなる。第２に、かくして得られる該手順の加速と単純化のおかげで、本発明の方法はまた、容易に自動化することができる。そのため、特に好ましい一実施形態では、本発明の方法は、プロテアーゼを工程ａ）で全く添加せずに、または核酸含有出発物質を工程ａ）に供する直前にプロテアーゼとのインキュベーションを全く行なわずに行なわれ得る。
【００２４】
典型的には、本発明の本方法における核酸の結合はシリカ吸着によって行なわれる。したがって、一般的な実施形態では、核酸結合支持材は、シリカ、好ましくは以下のケイ酸質材料：シリカゲル、二酸化ケイ素、ガラス、ゼオライト、カオリン、シリカゲル、セラミック、シリカ膜または樹脂（カラム中のものなど）およびシリカまたはガラスの表面を有する磁性粒子のいずれかから選択されるもの、を含む。該結合支持材は、当該技術分野で知られた任意の形態であり、例えば、粒子、微粒子、ゲル、繊維、ビーズ、膜、カラムならびに他の支持体（例えば試験管およびマイクロウェル）であり得る。好ましくは膜またはカラムである。
【００２５】
典型的な一実施形態では、本発明による方法は通常、さらに、工程ａ）とｂ）との間に少なくとも１回、場合によってはそれ以上の洗浄工程を含むものである。当業者であれば認識されるように、固定化された核酸のかかる洗浄工程は当該技術分野でよく知られており、慣用的には、異なる濃度、通常、５０％、７０％または７５％のエタノール溶液が使用されるが、他の洗浄液またはバッファーもまた使用され得る。
【００２６】
本発明において、核酸結合支持体に結合された核酸は、次いで、当該技術分野で知られた任意の様式でさらに加工または解析され得る。例えば、計画された後続の工程にもよるが、支持材に結合された核酸を溶出せずに使用することが可能である。この理由のため、本発明の方法の工程ｂ）を任意で行うと記載している。
【００２７】
本明細書に示した方法の好ましい実施形態では、４個または５個の炭素原子を有するアルコールはモノヒドロキシアルコール、すなわち、ブタノールまたはペンタノールであり、その任意のアイソフォームを含む。したがって、４個または５個の炭素原子を有するアルコールは好ましくは、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノール、２，２−ジメチル１−プロパノール、２−メチル２−ブタノール、３−メチル２−ブタノールまたはその混合物からなる群より選択される。これらのブタノールおよびプロパノールのアイソフォームの一部のものは特に良好に機能することが観察された；したがって、より好ましくは、４個または５個の炭素原子を有するアルコールは、ｎ−ブタノール、１−ペンタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはその混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、４個または５個の炭素原子を有するアルコールはおそらくｎ−ブタノールであろう。
【００２８】
好ましい実施形態では、工程ａ）における４個または５個の炭素原子を有するアルコールの濃度は２０％（ｖ／ｖ）〜５５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２５％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは３０％（ｖ／ｖ）〜４５％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは３５％（ｖ／ｖ）〜４０％（ｖ／ｖ）である。
【００２９】
さらに好ましい態様では、該少なくとも１種類のカオトロピック化合物は強力なカオトロピック化合物、すなわち、任意の強力なカオトロピックアニオン基、例えば、ＳＣＮ−、ＮＣＳ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−もしくはＣｌ３ＣＣＯＯ−を含むもの；および／または任意の強力なカオトロピックカチオン基、例えば、グアニジニウムを含むものである。好ましくは、カオトロピック化合物は、チオシアン酸塩、イソシアン酸塩、過塩素酸塩またはその混合物から選択される。最も好ましくは、これはチオシアン酸グアニジニウムまたはイソチオシアン酸グアニジニウムである。しかしながら、代替的に、これはまた弱いカオトロープ、例えば、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム  塩酸グアニジニウム、酢酸リチウムなどであってもよい；ただし、高濃度にする。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明の方法の工程ａ）におけるカオトロピック化合物の濃度は２Ｍ〜４．５Ｍ、一部の実施形態では好ましくは２．５Ｍ〜４Ｍ、またはより好ましくは３Ｍ〜３．５Ｍである。
【００３１】
＜２５０ｂｐより短い核酸の効率的な単離のための条件を提供することができる能力のため、本発明の方法はまた、セルフリー循環核酸（例えば、アポトーシス細胞または壊死細胞に由来するか、あるいは細胞内シグナル伝達中に種々の細胞型によって意図的に排出させた二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ）の効率的な単離／精製様式ももたらされる。このような短鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば液体生検材料中において検出され得、生理学的状態または病理学的状態、例えば妊娠、進行中の例えばウイルス感染、炎症またはがんを示し得る。したがって、好ましい一実施形態では、本発明の方法は、本明細書において２５０ｎｔ未満（＜２５０ｎｔ）の長さ、好ましくは約２００ｎｔ未満のサイズを有するものであると規定する短鎖核酸の単離および／または精製のために使用される。
【００３２】
このような内容を踏まえて、好ましい実施形態では、本発明の方法に供される核酸含有出発物質は生物学的試料、好ましくは、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、涙、唾液、汗、嘔吐物、便、精子またはバフィーコートからなる群より選択される液体の生物学的試料である。上記のものはすべて、かかる試料のセルフリーマトリックス中に存在しているか、または細胞内マトリックス中に懸濁状態の細胞間に存在する前記細胞内マトリックス中に存在しているか、またはかかる細胞の表面上に存在しているかのいずれかである細胞外核酸の存在／型についてスクリーニングするために容易に使用され得る。最も好ましい実施形態では、該材料は、全血、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）および尿からなる群より選択される。
【００３３】
しかしながら、考えられ得る実施形態において、本発明の方法ではまた、細胞内核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ、種々の細胞内ＲＮＡ型、低分子ＲＮＡ（特にマイクロＲＮＡなど）ならびにウイルスまたは原生動物（例えばプラスモジウム属）などの細胞内病原体の核酸を単離することも可能であることに注意されたい。かかる実施形態では、本発明の方法に供される核酸含有出発物質は任意の細胞供給源（例えば、組織試料、細胞ペレット）であり得、好ましくは任意の液体中（例えばＰＢＳまたは他のバッファー中）の細胞懸濁液である。
【００３４】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法はまた、病原性ウイルス核酸、特に、セルフリー画分中またはなお宿主細胞内部中のいずれかの哺乳動物の体液中に存在するものの検出のために使用され得る。本発明の方法に従って行なわれる核酸の単離／精製後に検出され得る病原性ウイルスの例は、エンベロープを有するマイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばエボラウイルスである。したがって、考えられ得る一実施形態では、核酸含有出発物質は全血であり、本発明の方法は、エボラウイルスのＲＮＡを単離および／または精製するために行なわれる。
【００３５】
本発明の具体的な一態様では、本発明の方法の工程ａ）、より好ましくは工程ａ）とｂ）との両方が、≧４℃かつ≦４０℃、好ましくは≧１５℃かつ≦２５℃の温度で行なわれる。本質的に、反応は特に温度感受性ではなく、したがって当該技術分野で既知の単離手順と比べてさらなる利点がもたらされる。これにより、該方法を、熱帯地域であってもなんら特殊な温度調節システムの存在なしで常温の室温で行なうことが可能である。
【００３６】
したがって、本発明の方法は、室温範囲の温度（約２０℃）にてロバストで実行可能であるという利点を有するだけでなく、完全自動化に容易に適合可能でもある。したがって、必要とされる取扱いが最小限であり高度な実験技能が必要とされない好都合な一実施形態では、本発明の方法が自動化システムで行なわれる。好適な自動化システムは当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｂｉｏｃａｒｔｉｓ  ＮＶのプラットフォームＩｄｙｌｌａが挙げられる。したがって、さらなる好都合な一実施形態では、工程ａ）およびｂ）が、かかる自動化システムに取付け可能で、該システムから取り外し可能なカートリッジにおいて好ましく行なわれる方法を提供する。かかるカートリッジの一例はＥＰ１９０４２３４に認められる。
【００３７】
このような内容を踏まえて、さらなる一態様では、本発明は、自動化システムで核酸を検出するための自動診断方法であって：
ａ）核酸含有出発物質を自動化システム内に供給する工程；
ｂ）前記自動化システム内の核酸を、上記の実施形態による単離および／または精製方法に従って単離および／または精製する工程；
（ｃ）前記自動化システム内で、工程（ｂ）で単離および／または精製された標的核酸の増幅を行なう工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された該標的核酸を、好ましくはこれも前記自動化システムにおいて検出する工程
を含む方法を提供する。
【００３８】
好ましい実施形態では、工程（ｃ）での増幅はＰＣＲを用いて行なわれる。しかしながらまた、代替的な核酸増幅方法、例えば、より近代的な等温アプローチ、例えば、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ループ媒介性増幅、核酸配列ベース増幅、鎖置換増幅または多置換増幅を用いて行なってもよい。あるいはまた、工程（ｃ）は、標的核酸の増幅を伴うものではなく、前記工程（ｂ）で単離および／または精製された標的核酸からのシグナルの発生ならびに前記シグナルを当該技術分野で知られた任意の手法により増幅させることを伴うものであってもよい。かかる場合では、以下の工程（ｄ）は、工程（ｃ）で増幅されたシグナルを、好ましくはこれも前記自動化システムにおいて検出することを伴うものになりえる。本発明による方法の前述の実施形態と適合性のかかるシグナル増幅手法の一例は分岐ＤＮＡアッセイ（ｂＤＮＡ）であり、これは、例えば試料中のウイルス量を評価するために使用され得る。
【００３９】
前記自動診断方法の特に好ましい実施形態では、工程ａ）とｂ）の間または工程ｂ）中にプロテアーゼとのインキュベーションは行なわれない。
【００４０】
好ましい一実施形態では、本発明の自動診断方法の工程ｃ）で行なわれるＰＣＲは定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、上記の実施形態に適合して、少なくとも工程（ｂ）と（ｃ）が、該自動化システムに取付け可能で、該システムから取り外し可能なカートリッジにおいて行なわれる自動診断方法を提供する。
【００４２】
一実施形態では、本発明の自動診断方法では、細胞外核酸、例えばウイルス核酸または腫瘍由来ＤＮＡまたは胎児の循環ＤＮＡを検出することが可能である。
【００４３】
後者の例を踏まえて、第２の好ましい実施形態において、該自動診断方法ではまた、＜２５０ｎｔ、好ましくは約２００ｎｔ以下の長さを有する短鎖核酸、例えば、マイクロＲＮＡまたは短い二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片、例えば、前述の腫瘍由来ＤＮＡまたは胎児の循環ＤＮＡの検出も可能である。
【００４４】
代替的な一実施形態において、本発明の自動診断方法では、核酸含有出発物質の細胞内画分ならびに細胞外画分の両方に存在しているかもしれないウイルス核酸を検出することが可能である。前記自動診断方法の特に好ましい一実施形態では、検出される核酸はエボラウイルスの核酸である。好都合な一実施形態では、エボラウイルスの核酸はエボラＲＮＡである。かかる実施形態では、工程ｃ）で行なわれるＰＣＲは好ましくは逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、最も好ましくは定量逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。このような場合、核酸含有出発物質は最も好ましくは全血である；しかしながら、例えば、嘔吐物、便、尿、汗、精液などの別の体液であってもよい。
【００４５】
ＧｕＳＣＮなどのカオトロピック塩はブタノールまたはペンタノールに溶解しない。したがって、本発明の核酸の単離／精製条件を得るためには、カオトロピック化合物を直接、血漿、血清またはＣＳＦなどの液体試料に溶解させるのがよく、その後、４個または５個の炭素原子の適切なアルコールを添加するのがよい。しかしながら、より簡便には、該単離／精製条件は、生物学的試料を、カオトロープと４個もしくは５個の炭素原子を有するアルコールを高濃度で含む水性抽出バッファーと混合すること、または該試料を該バッファー中に懸濁させることにより作出される。
【００４６】
したがって、さらなる一態様では、本発明はまた、核酸の単離および／または精製のための水性抽出バッファーであって、
（ｉ）２０％（ｖ／ｖ）〜６５％（ｖ／ｖ）、好ましくは３５％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは４０％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度の４個または５個の炭素原子を有するアルコール、および
（ｉｉ）３．３Ｍ〜６．７Ｍ、好ましくは３．５Ｍ〜５．５Ｍ、最も好ましくは３．７Ｍ〜４．５Ｍの濃度の少なくとも１種類のカオトロピック化合物
を含むバッファーを提供する。
【００４７】
本発明の方法において使用されるこの水性抽出バッファーとしては、記載した好ましい４個または５個の炭素原子のアルコールおよびカオトロープと同じものがこの場合も適用される。したがって、４個または５個の炭素原子を有するアルコールは、好ましくはｎ−ブタノール、１−ペンタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはその混合物からなる群より選択され、最も好ましくはｎ−ブタノールである。同様に、本発明の抽出バッファー中に含められる該少なくとも１種類のカオトロピック化合物は好ましくはチオシアン酸塩、イソシアン酸塩、過塩素酸塩、塩酸塩またはその混合物から選択され；最も好ましくはチオシアン酸グアニジニウムまたはイソチオシアン酸グアニジニウムである。
【００４８】
次の一態様では、本発明によりまた、少なくとも本発明による抽出バッファーを備えた、核酸含有出発物質からの核酸、好ましくは短鎖および／または細胞外の核酸あるいはウイルス核酸の単離および／または精製のためのキットを提供する。本発明に係るキットはまた、キットの使用のための使用説明書のような典型的なさらなる要素も備えていてもよいが、好適には、さらに、
（ａ）核酸を結合させるのに適した核酸結合支持材、例えば、ケイ酸質材料；
（ｂ）洗浄液、例えば、洗浄バッファー；および
（ｃ）溶出液、例えば、溶出バッファー
のうちのいずれか、またはすべてを備えている。
【００４９】
好ましい一実施形態では、キットは、第一選択の自動システムに取付け可能なカートリッジを備えており、ここで、該カートリッジの内部には少なくとも本発明の抽出バッファーが供給されている。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、カートリッジがさらに、核酸結合支持材を備えている核酸の単離および／または精製コンパートメントを備えており、ここで、前記核酸の単離および／または精製コンパートメントは、前記抽出バッファーを収容もしくは保持しているか、または前記抽出バッファーを収容している別のカートリッジコンパートメントと流体連通している。好ましくは、かかるカートリッジがさらに、核酸の単離および／または精製コンパートメントと流体連通しているさらなるコンパートメントを備えており、前記さらなるコンパートメントには、例えば洗浄液または溶出液などが含まれている。
【００５１】
最後に、別の態様では、本発明により、
−細胞外核酸、例えば、とりわけ、ウイルスなどの病原体由来、エキソソーム由来の核酸、および、胎児の核酸または腫瘍由来の核酸の単離および／または精製；
−＜２５０ｎｔ、最も好ましくは約２００ｎｔ以下の長さを有する短鎖核酸の単離および／または精製；
−ウイルス核酸、例えばエボラＲＮＡの単離および／または精製；ならびに
−感染症（例えば、ウイルス性、細菌性、真菌性もしくは原生動物性）、病理学的状態（例えば、がん）または生理学的状態（例えば、妊娠）の診断
のいずれかにおける
本発明の単離／精製方法、上記の抽出バッファーおよびキットの使用を提供する。
【００５２】
しかしながら、さらなる適用分野は、診断の領域外、例えば、短鎖核酸の精製が極めて重要な法医学または他の分野においても見出され得る。
【００５３】
好ましい一実施形態では、上記の使用は、液体生検材料試料、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、ＣＳＦ試料から選択される核酸含有出発物質に対して適用されるか；または異なる型の液体生物学的試料、例えば尿試料に対して適用される。
【００５４】
上記のことを踏まえて、本発明の核酸の単離／精製方法、抽出バッファーおよびキットが自動システム（例えば、カートリッジシステム）で使用されることは、本発明の具体的な一態様の範囲に含まれる。
【実施例】
【００５５】
実施例
本発明は、エタノールおよびイソプロパノールより疎水性であり、通常、水と混ざらないアルコールが、少なくとも１．５Ｍより高い容量モル濃度のカオトロピック剤の存在下でシリカ吸着ベースの核酸抽出を行なうのに特に適しているという予期しない所見に基づいたものである。
【００５６】
シリカへの核酸の結合がエタノールまたはイソプロパノールなどのアルコールの存在下で有利であることは既に、ブームプロトコルにより知られている。しかしながら、これらのアルコールはどちらも、必要とされる濃度で存在させた場合、タンパク質の即時の凝集を引き起こし、シリカ膜の不可逆的な目詰まりおよび核酸の非特異的閉じ込めをもたらす。そのため、典型的なブームプロトコルでは、ペプチドの長さを充分に低減させ、したがってこの障害を防ぐためにかなりのプロテアーゼ消化が必要とされる。
【００５７】
本発明では、タンパク質含有出発物質および核酸含有出発物質からの核酸の単離および／または精製のための方法であって、前記タンパク質含有出発物質および核酸含有出発物質を核酸結合支持材と、１．５Ｍ〜５Ｍの濃度の少なくとも１種類のカオトロピック化合物と１７％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度の４個または５個の炭素原子を有する少なくとも１種類のアルコールの存在下で接触させる方法を供給することにより、プロテアーゼ処理工程の必要性が回避される。
【００５８】
この容量モル濃度範囲内のカオトロピック剤の役割は、第１に、４個または５個の炭素原子のアルコールと水（核酸含有出発物質、例えば生物学的試料に添加されたもの、またはこれに存在しているもののいずれか）との混合をもたらすこと、および第２に、核酸含有出発物質中に存在するタンパク質を変性させ、したがってある程度不活性にするために、充分なカオトロピック作用をもたらすことである。後者は、単離される核酸がＲＮＡである場合、特に重要である（ＲＮＡは、ほとんどの生物学的試料中の大量のＲＮアーゼによって即時に標的化され、消化され得る）。
【００５９】
他方において、４個または５個の炭素原子を有するアルコール（好ましくはブタノールまたはペンタノールである）の役割は、第１に、支持材（通常、シリカ）への核酸結合を可能にする条件を提供すること；および第２に、その一方で支持体への核酸の効率的な結合が妨害されないようにするため、変性中のタンパク質を充分に可溶性に維持することである。したがって、所与の核酸単離条件におけるブタノールおよび／またはペンタノールの選択的な使用により、タンパク質の沈殿が相当低減され、したがってプロテアーゼでの前処理が余分となる。
【００６０】
上記の能力は、図１によく示されており、この図は、高量のチオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）と混合し、１ｍｌずつ三連に分け、次いで、これを（１）エタノール（「ｅｔＯＨ」と表示）、（２）イソプロパノール（「ｐｒｏｐＯＨ」と表示）および（３）ブタノール（「ｂｕｔＯＨ」と表示）から選択されるそれぞれのアルコールで２倍に希釈した血漿試料を示す。それぞれのアルコールを５０％の終濃度まで添加した後、三連のこれらの最終ＧｕＳＣＮ濃度を約２Ｍにした。図１からわかるように、エタノールまたはイソプロパノールのいずれかと混合した血漿−ＧｕＳＣＮ溶液は、室温でのほぼ即時で重度のタンパク質の沈殿のため視認可能に濁った。逆に、試料が入ったチューブの目盛が容易に視認可能であることから示されるように、ブタノールでは血漿−ＧｕＳＣＮ混合物中に沈殿物は形成されなかった。後者のことは一般的に、上記に明示した濃度範囲内のＧｕＳＣＮ／ブタノールまたはペンタノールミックス、例えば、２．９ＭのＧｕＳＣＮと５０％のｎ−ブタノール、２．９Ｍと５１％のｔｅｒｔ−ブタノール、３．７ＭのＧｕＳＣＮと３２％の１−ペンタノール、３．２ＭのＧｕＳＣＮと３８％の１−ペンタノール、２．９ＭのＧｕＳＣＮと４６％の３−ペンタノールなどで試験した他の場合（水と血漿または全血を用いた）にもあてはまった。これらの溶液中に形成された沈殿物（視認可能な場合）の型は、当然、試験対象の生物学的試料中のタンパク質がどれだけ濃密であるかに依存した（例えば、全血は血漿よりも扱いにくい材料である）。しかしながら、一般には透明であり、場合によっては遠心分離後にのみ視認できた。
【００６１】
次の工程は、異なる濃度のカオトロピック剤で処理した血漿試料中に存在している核酸が、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールの存在下でケイ酸質の支持材に結合する能力を比較するためのものであった。それを行なうため、いくつかの血漿試料をまずプールし、５８％アルコール（３種類のうちの１種類）と１．１Ｍ、２．２Ｍ、３．３Ｍ、４．４Ｍおよび５．５Ｍから選択される異なる濃度のＧｕＳＣＮとを含有する同型試料に分けた。各アルコールについて、血漿と５８％アルコールの第一選択の試料の１つをＧｕＳＣＮの添加なしの結合対照として維持した（試料「０．０」）。次いで、調製した前記の血漿／ＧｕＳＣＮ／アルコールミックスの各々に、異なる蛍光色素（テキサスレッドおよびＡｔｔｏ６４７Ｎ）で標識した５０ｂｐおよび１５０ｂｐの低分子オリゴをスパイクし、ボルテックスした。各混合物の蛍光値を測定した後、すべての混合物をシリカカラムでの核酸単離に供した。シリカに吸着された核酸を次いで、ＴＥバッファー中に溶出させた後、第２の蛍光測定をフロースルーで行なった。図２は、ＴＥに対して標準化した、試験した試料（ｘ軸）の第１の測定に対する第２の測定の相対蛍光値（ｙ軸）を示す。結果は、少なくとも５０％のエタノールまたはプロパノールが存在している限り、ＤＮＡがシリカ膜を通過するのにカオトロピック剤が実は必要でないことを示す。これらのアルコールでは、大量の沈殿がすべてのＧｕＳＣＮ濃度で観察され、ＤＮＡ収率は、ＧｕＳＣＮなしまたは沈殿が最も少ない１．１Ｍ  ＧｕＳＣＮで最も高かった。他方、ブタノールでは、２つの別個の液相がＧｕＳＣＮなしおよび１．１Ｍ  ＧｕＳＣＮでもなお観察され、これは、カラムでの不充分な抽出効率の説明となり得る。しかしながら、２．２Ｍ以上のＧｕＳＣＮ濃度では、血漿−ブタノール混合物は一様で透明な溶液であり、対応するエタノールまたはイソプロパノール混合物と比べてずっと良好なＤＮＡ抽出速度がもたらされた。後者はおそらく、エタノールおよびイソプロパノール試料中における高ＧｕＳＣＮ濃度での大量のタンパク質の沈殿により、おそらくタンパク質複合体中への核酸の閉じ込めおよびシリカ膜の目詰まりが引き起こされるためと説明され得る。対照的に、ブタノール処理血漿では、少なくとも４．４ＭのＧｕＳＣＮ濃度までタンパク質の沈殿は観察されなかった。
【００６２】
カオトロピック剤濃度の関数としてのシリカ膜への短鎖ＤＮＡの結合効率を調べるため、異なる濃度のＧｕＳＣＮ（０．６Ｍ〜２．５Ｍ）を含有する８つの血漿／４４％ｎ−ブタノール試料を上記のようにして調製し、少量の５０ｂｐ（テキサスレッドで標識）および１５０ｂｐ（Ａｔｔｏ６４７Ｎで標識）のサイズの２つの異なる標識オリゴをスパイクした。試料を直接（すなわち、プロテアーゼ処理なしで）シリカカラムにローディングした後、結合された核酸を５００ｕｌのＴＥで溶出させた。フロースルーで回収された５０ｂｐのオリゴ断片と１５０ｂｐのオリゴ断片を識別するため、試料を、アガロースゲル電気泳動を用いてサイズによって分割した。各断片について蛍光を適切な発光波長で測定し、ＴＥでの入力蛍光に対して両断片を標準化することにより、図３に示すように相対蛍光の結果として表示した。図において、薄い方の色のバーは短い方の５０ｂｐ断片の回収および濃い方の色のバーはわずかに長い方の１５０ｂｐ断片の回収を示す。場合によっては１００％より高い値が観察されるが、単に、標準化およびこれらの両方の蛍光測定の実験変動性の結果である。しかしながら：結果は、カオトロピック剤の濃度が高くなるにつれて短い方の５０ｂｐ断片および１５０ｂｐ断片の結合量が増加することを示しているという傾向が明白にわかる。同様の所見が、短い方の断片の優先的単離に同様に好都合なアルコール濃度の漸増でも観察された（データは示さず）。
【００６３】
血漿にスパイクされた短鎖（５０ｂｐおよび１５０ｂｐ）のオリゴ断片の上記の単離は、本発明の方法により、非常に短鎖の核酸であっても複雑な生物学的試料からの有効な回収が可能になることを示すだけでなく、本件技術分野の技術水準のプロトコルが核酸結合支持体の目詰まりや、別の様式での閉塞を回避するために必要とするプロテアーゼ処理をなくすことも可能になることを示す。したがって、後者により、高温での多大な時間を必要とするプロテアーゼ消化（多くの場合、約１時間）が必須の既知のエタノールまたはイソプロパノールベースの核酸抽出と比べて大きな利点がもたらされる。その結果、本発明による核酸の単離および／または精製方法ならびに本明細書において提供する抽出バッファーおよびキットはまた、自動化システム、例えばカートリッジベースシステムでの完全に自動化されたＤＮＡまたはＲＮＡの抽出のためにも使用され得る。
【００６４】
上記のことを試験するため、４４％のｎ−ブタノールと３．７ＭのＧｕＳＣＮを含む水性抽出バッファーを、市販のＩｄｙｌｌａ  ＢＲＡＦ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔカートリッジに現在存在している標準溶解バッファーの代わりにＢｉｏｃａｒｔｉｓ  Ｉｄｙｌｌａ  ＢＲＡＦ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔのマイクロ流体カートリッジの内部に入れた。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を有することが確認されている黒色腫患者から採取された１ｍｌの血漿および１ｍｌのＣＳＦを、２つのかかる変形Ｉｄｙｌｌａ  ＢＲＡＦ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔカートリッジのそれぞれの試料受容コンパートメント内に供給した後、カートリッジを密封し、Ｉｄｙｌｌａ自動化プラットフォーム内に入れ、後続のすべての工程を自動で行なった。特に、ＢＲＡＦ  Ｔｅｓｔカートリッジはどちらも、５．５ｍｌの４４％のｎ−ブタノールおよび３．７ＭのＧｕＳＣＮ抽出バッファーとそれぞれの臨床試料とが試料溶解／核酸抽出工程中に混合されるように構成した。膜に結合された核酸を、９０％エタノールを含む洗浄バッファーで洗浄し、膜から１×ＰＣＲバッファー（５０ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．６，２５℃）を用いて溶出させ、野生型ＢＲＡＦ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ／Ｒが検出されるように設計されたマルチプレックスｑＰＣＲに供した。並行して、Ｉｄｙｌｌａカートリッジでの腫瘍由来循環ＤＮＡの上記の自動核酸抽出の効率を評価するため、同じ試料から核酸をまた、効率的な市販のＧｕＳＣＮ／イソプロパノールベースの核酸抽出キットを用いて抽出した。抽出は：（ｉ）前記プロトコルに使用される容量がカートリッジの容量を超えるため、また、（ｉｉ）プロテイナーゼＫ消化なしでは、大量の沈殿によってカラムまたは膜の目詰まりが引き起こされるために抽出が進行し得ないため、カラムで製造業者の使用説明書に従って６０℃で１時間のプロテイナーゼＫとのインキュベーションを含めて手動により行なった。手動での抽出後、血漿およびＣＳＦから精製された核酸を直接、ＢＲＡＦ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔカートリッジにローディングし、ｑＰＣＲによって上記のようにして解析した。血漿試料およびＣＦＳ試料において行なった両方の抽出ストラテジーの結果を図４に示す。カートリッジでの完全自動化解析および半自動化（ベンチトップ型の手動抽出の後、カートリッジでのｑＰＣＲ解析）プロトコルでは、どちらも同等の結果が得られ、血漿中ならびにＣＳＦ中の両方においてＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を検出することに成功した。
【００６５】
上記の結果は、前記試料をプロテアーゼで前処理する必要のないシリカ吸着原理を用いた、ヒト試料からの非常に短い細胞外ＤＮＡの単離に対する本発明の方法の好適性を示す。通常、高温で行なわれるプロテアーゼ処理をなくすことは、ＤＮＡと比べてずっと分解され易いＲＮＡを単離および／または精製することを目的としたプロトコルに特に望ましい。したがって、本発明の方法を、ヒト全血試料中のエボラウイルスの一本鎖ＲＮＡの単離および検出についても試験した。
【００６６】
それを行なうため、第１工程として、４個または５個の炭素原子を含有する異なるアルコールと異なる濃度のＧｕＳＣＮを含む異なる抽出バッファーを試験した。出発物質としての血液は、タンパク質含有量が高いこと、また、種々の錯体、例えばヘム基のため極めて複雑であることに注目されたい。また、血液にはＲＮアーゼも多量に含まれており、このことにより、目的のウイルスＲＮＡを保護するために速やかなタンパク質の変性がもたらされるように抽出バッファーは好ましくは高濃度のカオトロープを有するものであるのがよいと判断される。試験した異なるアルコール−ＧｕＳＣＮ溶液は（１）５７％のｎ−ブタノールと３．３ＭのＧｕＳＣＮ；（２）３７％の１−ペンタノールと４．２ＭのＧｕＳＣＮ；（３）４３％の１−ペンタノールと３．７ＭのＧｕＳＣＮ；（４）５６％の３−メチル−１−ブタノール（イソアミルアルコール）と２．８ＭのＧｕＳＣＮ；（５）５８％のｔｅｒｔ−ブタノールと３．３ＭのＧｕＳＣＮ；および（６）５３％の３−ペンタノールと３．５ＭのＧｕＳＣＮを含むものであった。まず、１．５ｍｌの前記抽出バッファーの各々を２００ｕｌのヒト血液試料と混合した後、抽出バッファー／血液ミックスを、カラムの長さ全体における対応するミックスの流動を調節するために真空設備を有するシリカスピンカラムにローディングした。以前に試験されたエタノールまたはイソプロパノール／ＧｕＳＣＮミックスとは対照的に、イソアミルアルコール含有ミックスを除いて、カラムの目詰まりは起こらなかった。ある程度の目詰まりが起こったイソアミルアルコール含有ミックスに関して、これが最も低いＧｕＳＣＮ濃度を含むミックスであったことに注目されたい。次いで、カラムに結合された核酸を、ＲＮアーゼ無含有水を用いて溶出させた後、エボラ特異的プライマーとプローブを用いた逆転写酵素定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）に供した。上記の核酸抽出条件での未加工ＲＴ−ｑＰＣＲ曲線を図５に示し、これは本発明の方法がＲＮＡ単離に等しく適していることを示す。
【００６７】
次の工程として、エボラＲＮＡ単離および検出プロトコルを、Ｉｄｙｌｌａプラットフォームでの完全自動化設定において試験した。プロトコルは、感染しているかもしれない血液試料に対して行なわれるすべての加工工程が単一の使い捨てのプラスチック製カートリッジ内において限定されるように設計した。まず、約２００ｕｌの試験対象の全血試料をカートリッジ内に供給した後、カートリッジを密閉してＩｄｙｌｌａ機器にローディングする。機器内のカートリッジの内部では、試料が、４ＭのＧｕＳＣＮと２２％のｂｕｔＯＨを含有する過剰の水性抽出バッファーと混合される。この条件下で、試料成分、例えば該試料中に含まれているかもしれないウイルス粒子が溶解され、核酸がシリカ抽出膜上に吸着される。続いて過剰の細胞残屑およびタンパク質がシリカ膜から洗い流され、次いで核酸がＲＮアーゼ無含有水を用いて溶出される。続いて、かくして精製されたＲＮＡがなおカートリッジ内でｃＤＮＡに逆転写され、次いでこれがエボラ特異的プライマーとプローブを用いたｑＰＣＲに供される。上記のプロトコルにより得られた結果を図６に示す。図において、左側のパネルは、エボラ陰性試料で得られた未加工ｑＰＣＲ曲線を示し、一方、右側のパネルはエボラ陽性対照の曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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