(57)【要約】  癌の治療に対する安定なリポソーム製剤。該製剤は、１以上のＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＣを含有するリポソームと、リポソームに封入された１以上の抗癌薬であるシロリムス、ウミロリムス及びエベロリムスとを含む。また、抗癌薬でリポソームを充填するための効率的なリモートフィルムローディング法、及びリポソーム製剤で癌を治療する方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための安定なリポソーム製剤であって、該安定な製剤が、
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）からなる群から選択されるホスファチジルコリン又はそれらの混合物で形成された少なくとも１つの脂質二重層を含有するリポソームと、
該リポソームに封入された薬物と、
を含み、
前記薬物がシロリムス、ウミロリムス又はエベロリムスであり、
前記リポソームは、直径が５０ｎｍ〜２μｍであり、コレステロールを含まない、製剤。
【請求項２】
前記薬物と前記ホスファチジルコリンとの重量比が１：５〜１：１００である、請求項１に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項３】
０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの前記薬物を含有する、請求項２に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項４】
６〜８のｐＨを有する、請求項３に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項５】
前記少なくとも１つの脂質二重層がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に複合化されたリン脂質を更に含む、請求項１に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項６】
前記リン脂質がジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であり、前記ＰＥＧ部分が１５０ｇ／ｍｏｌ〜３０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項５に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項７】
前記薬物と前記ホスファチジルコリンとの重量比が１：５〜１：１００である、請求項６に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項８】
０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの前記薬物を含有する、請求項７に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項９】
６〜８のｐＨを有する、請求項８に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項１０】
前記ホスファチジルコリンがＰＯＰＣであり、前記薬物がウミロリムスであり、該ウミロリムスと該ホスファチジルコリンとの重量比が１：２０であり、前記製剤が１ｍｇ／ｍＬの該ウミロリムスを含有する、請求項９に記載の安定なリポソーム製剤。
【請求項１１】
リポソームに疎水性薬物を充填する方法であって、該方法が、
少なくとも１つの脂質二重層を有するコレステロール不含リポソームを得ることと、
前記少なくとも１つの脂質二重層をわたって実質的に膜電位差が存在しないように、前記コレステロール不含リポソームを水溶液に添加して懸濁液を形成することと、
溶解度向上剤の不在下で疎水性薬物を前記懸濁液に添加して混合物を形成することと、
前記混合物を室温で４時間〜４８時間撹拌することと、
を含み、
それによって、前記コレステロール不含リポソームに前記添加された疎水性薬物の少なくとも８０％を充填する、方法。
【請求項１２】
前記疎水性薬物がシロリムス、ウミロリムス、又はエベロリムスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コレステロール不含リポソームが、直径が８０ｎｍ〜２μｍであり、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）の１以上を含有する多重層ベシクル（ＭＬＶ）を形成すること、及び該ＭＬＶを押し出し、それによって、直径５０ｎｍ〜２μｍのコレステロール不含リポソームを得ることによって得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＬＶが、ポリエチレングリコール複合化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を更に含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
コレステロール不含リポソームに封入された疎水性薬物を作製する方法であって、該方法が、
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）の１以上を水性バッファーに懸濁して脂質懸濁液を形成することと、
前記脂質懸濁液を室温で少なくとも３０分間撹拌して多重層ベシクル（ＭＬＶ）を形成することと、
前記ＭＬＶを押し出して５０ｎｍ〜２μｍの直径を有する大単層ベシクル（ＬＵＶ）を形成することと、
前記ＬＵＶをわたって実質的に膜電位差が存在しないように、該ＬＵＶを水溶液に添加して懸濁液を形成することと、
溶解度向上剤の不在下で疎水性薬物を前記懸濁液に添加して混合物を形成することと、
前記混合物を室温で４時間〜４８時間撹拌して薬物充填リポソーム懸濁液を形成することと、
前記薬物充填リポソーム懸濁液を濾過して、封入されていない疎水性薬物を除去することと、
を含み、
それによって、前記コレステロール不含リポソームに前記添加された疎水性薬物の少なくとも８０％を封入する、方法。
【請求項１６】
前記疎水性薬物がシロリムス、ウミロリムス、又はエベロリムスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリエチレングリコール複合化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）もまた、前記懸濁工程において前記水性バッファー中に懸濁される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌の治療に対する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の安定なリポソーム製剤の使用。
【請求項１９】
前記安定なリポソーム製剤が癌細胞の生育を阻害する、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、抗癌薬の分野、特に、疎水性抗癌薬をリポソームに充填する方法、及び該リポソームによる癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シロリムスとしても知られるラパマイシンは、当初は臓器移植患者に対する免疫抑制剤としての使用に対して開発されたマクロライド抗生物質である。その後、ラパマイシンは、平滑筋細胞増殖を阻害することによって、血管形成術後の再狭窄を軽減するように機能する薬物コーティング剤として冠状動脈ステントに使用された。
【０００３】
また、シロリムス及びこの薬物の誘導体は、或る特定の癌の治療にも有効であるとわかった。例えば、シロリムスは抗腫瘍活性を有する。特許文献１を参照されたい。シロリムスの４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）誘導体であるエベロリムスは、進行した腎臓癌、進行したホルモン受容体陽性／ＨＥＲ２陰性乳癌、及び膵神経内分泌腫瘍の治療に対して認可されている。
【０００４】
ウミロリムス、すなわち４０−アルコキシアルキル−ラパマイシン、及びウミロリムス充填ポリマーミセルは、いずれもｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌細胞の生育を阻害することができ、また、該ミセルがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実験的腫瘍の生育を遅らせるのに有効であることが実証された。特許文献２を参照されたい。ウミロリムスのポリマーミセル封入は、この薬物の溶解度及び安定性を著しく改善し、その持続した送達をもたらした。
【０００５】
シロリムス及びその誘導体の薬物送達を改善するため、ポリマーミセルの代わりにリポソームが採用されている。例えば、シロリムス、エベロリムス及びタクロリムスは、２つの受動的充填方法、すなわち薄膜水和及びエタノール注入を使用して、リポソームに封入されている。しかしながら、これらの薬物の低い溶解度及び疎水性により、封入された薬物の量及び薬物封入効率は特に低く、すなわちそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ未満、及び９０％未満である。また、受動的充填技術では、リポソームからの薬物漏出も起こる。
【０００６】
予め形成されたリポソームにシロリムスを捕捉するのに、薬物分解及び溶媒除去の工程を必要とするリモートフィルムローディング（remote film loading）技術が用いられている。この方法は、高い薬物封入効率をもたらすが、充填処置の間、薬物安定性に対して潜在的なリスクがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，８８５，１７１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０１５４３０５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、薬物含有量、脂質に対する薬物の比率、及び薬物封入効率を改善するための疎水性薬物に対する新たなリポソーム充填方法の開発が必要とされている。かかる方法によって、特にウミロリムス及び他のラパマイシン誘導体に対して、既存のリポソームと比較してより高い治療指数を有する薬物充填リポソーム（drug-loaded liposomes）が形成されるはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この要求を満たすため、癌の治療に対する安定なリポソーム製剤が提供される。該安定な製剤は、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）から選択される１以上のホスファチジルコリンで形成される少なくとも１つの脂質二重層を含有するリポソームを含む。該リポソームは直径５０ｎｍ〜２μｍであり、コレステロールを含まない。リポソームに封入されるのは、シロリムス、ウミロリムス、及びエベロリムスから選択される抗癌薬である。
【００１０】
また、リポソームに疎水性薬物を充填する方法が提供される。該方法は、（ｉ）少なくとも１つの脂質二重層を有するコレステロール不含リポソームを得る工程と、（ｉｉ）脂質二重層を越えて実質的に膜電位差が存在しないように、コレステロール不含リポソームを水溶液に添加して懸濁液を形成する工程と、（ｉｉｉ）溶解度向上剤（solubility enhancer）の不在下で疎水性薬物を該懸濁液に添加して混合物を形成する工程と、（ｉｖ）該混合物を室温で４時間〜４８時間撹拌する工程とを含む。該方法は、リポソームへの疎水性薬物の少なくとも８０％の充填をもたらす。或る実施の形態では、該方法はこの段落で述べられた工程からなる。
【００１１】
さらに、コレステロール不含リポソームに封入された疎水性薬物を作製する方法を開示する。該方法は、（ｉ）ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＣの１以上を水性バッファーに懸濁して脂質懸濁液を形成すること、（ｉｉ）該脂質懸濁液を室温で少なくとも３０分間撹拌して多重層ベシクル（ＭＬＶ：multilamellar vesicles）を形成すること、（ｉｉｉ）該ＭＬＶを押し出して直径５０ｎｍ〜２μｍの大単層ベシクル（ＬＵＶ：large unilamellar vesicle）を形成すること、（ｉｖ）ＬＵＶを越えて実質的に膜電位差が存在しないように、該ＬＵＶを水溶液に添加して懸濁液を形成すること、（ｖ）溶解度向上剤の不在下で疎水性薬物を該懸濁液に添加して混合物を形成すること、（ｖｉ）該混合物を室温で４時間〜４８時間撹拌して薬物充填リポソーム懸濁液を形成すること、及び（ｖｉｉ）該薬物充填リポソーム懸濁液を濾過して封入されていない疎水性薬物を除去することによって行われる。該方法は、添加された疎水性薬物の少なくとも８０％の封入を可能とする。別の実施の形態では、該方法はこの段落に述べられた工程からなる。
【００１２】
また、癌を治療する方法が開示される。該方法は、有効量の上に記載される安定なリポソーム製剤を、それを必要とする被験体に投与する工程を必要とする。該有効量は被験体の癌細胞の生育を阻害するのに十分である。
【００１３】
本発明の１以上の実施形態の詳細が明細書、図面及び下記の実施例に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、詳細な説明、図面、及び更には特許請求の範囲から明らかとなる。本明細書で言及される全ての刊行物及び特許文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００１４】
以下に記載される発明は、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウミロリムス（ＵＲＬ）及びリポソームウミロリムス（ＬｉｐｏＵＲＬ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイルのプロットである。
【図２】エベロリムス（ＥＲＬ）及びリポソームエベロリムス（ＬｉｐｏＥＲＬ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイルのプロットである。
【図３】シロリムス（ＳＲＬ）及びリポソームシロリムス（ＬｉｐｏＳＲＬ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイルのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上に言及されるように、癌の治療に関する安定なリポソーム製剤を開示する。上記製剤においてリポソームは、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＣから選択されるホスファチジルコリン、又はこれら３つのホスファチジルコリンの混合物で形成された少なくとも１つの脂質二重層を含有し、コレステロールを含まない。特定の態様では、上記リポソームは１つの脂質二重層を含む。別の態様では、上記リポソームはＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、又はＤＯＰＣのみを含有する。好ましい実施形態では、上記リポソームはＰＯＰＣのみを含有する。
【００１７】
代替的には、リポソームの脂質二重層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に複合化されたリン脂質と共に、ホスファチジルコリンを含む。ＰＥＧ複合化リン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ＰＥＧ）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）］（ＤＯＰＥ−ＰＥＧ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）］（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ＰＥＧ）］（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）；又はそれらの混合物であってもよい。特定の実施形態では、ＰＥＧ複合化リン脂質はＤＳＰＥ−ＰＥＧである。
【００１８】
リポソームがホスファチジルコリンとＰＥＧ複合化リン脂質との両方を含む場合、それらの間の重量比は５：１〜１００：１、例えば５：１、７．５：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１及び１００：１であってもよい。好ましい比率は１０：１である。
【００１９】
リン脂質に複合化されるＰＥＧ部分の分子量は、１５０ｇ／ｍｏｌ〜３０００ｇ／ｍｏｌ、例えば１５０ｇ／ｍｏｌ、２００ｇ／ｍｏｌ、２５０ｇ／ｍｏｌ、３００ｇ／ｍｏｌ、３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌ、１２５０ｇ／ｍｏｌ、１５００ｇ／ｍｏｌ、１７５０ｇ／ｍｏｌ、２０００ｇ／ｍｏｌ、２２５０ｇ／ｍｏｌ、２５００ｇ／ｍｏｌ、２７５０ｇ／ｍｏｌ、３０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は２０００ｇ／ｍｏｌである。
【００２０】
リポソームは、５０ｎｍ〜２μｍ（例えば５０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ、１．５μｍ及び２μｍ）の直径を有してもよい。或る実施形態では、リポソームは５０ｎｍ〜５００ｎｍの直径を有する。好ましい実施形態では、直径は１００ｎｍである。
【００２１】
安定なリポソーム製剤中のリポソームは、癌の治療に対する疎水性薬物を封入する。疎水性薬物は、抗増殖薬、例えばシロリムス、ウミロリムス、又はエベロリムスであってもよい。特定の製剤では、疎水性薬物はウミロリムスである。
【００２２】
リポソーム中の疎水性薬物とホスファチジルコリン成分との重量比は、１：５〜１：１００（例えば１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：７５及び１：１００）であってもよい。或る実施形態では、ホスファチジルコリンに対する薬物の重量比は１：１０である。別の特定の実施形態では、重量比は１：２０である。
【００２３】
安定なリポソーム製剤中の疎水性薬物の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。例えば、上記製剤中の薬物濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。特定の実施形態では、薬物濃度は１ｍｇ／ｍＬである。
【００２４】
さらに、安定なリポソーム製剤は６．０〜８．０のｐＨを有してもよい。好ましい実施形態では、ｐＨは７．４である。
【００２５】
特定の態様では、癌の治療に対する安定なリポソーム製剤は、ＰＯＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のみで形成されたリポソームを含み、該リポソームにはウミロリムスが封入されている。リポソームはコレステロールを含まず、約１００ｎｍの直径を有し、ウミロリムスとＰＯＰＣとの重量比は１：２０である。この特定の製剤は、１ｍｇ／ｍＬのウミロリムスを含み、ｐＨ７．４である。
【００２６】
また、安定なリポソーム製剤は、溶液中で疎水性薬物の安定性を改善する。例えば、上記製剤中の疎水性薬物は、水性懸濁液中の薬物と比較して、５℃で保存した場合、７日間〜１４日間にわたって安定となり得る。ここでは、安定性は、製剤中の薬物の開始量の５％以下の喪失として定義される。
【００２７】
有利には、投与後、長期にわたって上記製剤中のリポソームから疎水性薬物を放出することができる。すなわち、該製剤は持続放出製剤である。例えば、該製剤の投与後、最長３ヶ月、例えば７日間、１４日間、２１日間、並びに１ヶ月、２ヶ月、及び３ヶ月の期間に亘って継続して疎水性薬物をリポソームから放出することができる。
【００２８】
上に言及されるように、リポソームに疎水性薬物を充填する方法が提供される。該方法は、最初にリポソームを得て、その後に疎水性薬物をリポソームに充填する、改善されたリモートフィルムローディング技術である。
【００２９】
上記充填方法に使用されるリポソームは、コレステロールを含まず、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＣの１以上を含有する少なくとも１つの脂質二重層を有し、５０ｎｍ〜２μｍの直径を有する。或る実施形態では、リポソームはＰＯＰＣのみを含有する。
【００３０】
代替的には、コレステロール不含リポソームは、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＯＰＣの１以上を含有し、またＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ及びＤＭＰＥ−ＰＥＧから選択されるＰＥＧ複合化リン脂質を含有する少なくとも１つの脂質二重層を有する。
【００３１】
リン脂質に複合化されるＰＥＧ部分の分子量は、１５０ｇ／ｍｏｌ〜３０００ｇ／ｍｏｌ、例えば１５０ｇ／ｍｏｌ、２００ｇ／ｍｏｌ、２５０ｇ／ｍｏｌ、３００ｇ／ｍｏｌ、３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌ、１２５０ｇ／ｍｏｌ、１５００ｇ／ｍｏｌ、１７５０ｇ／ｍｏｌ、２０００ｇ／ｍｏｌ、２２５０ｇ／ｍｏｌ、２５００ｇ／ｍｏｌ、２７５０ｇ／ｍｏｌ、３０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は２０００ｇ／ｍｏｌである。
【００３２】
特定の態様では、リポソームはＰＯＰＣのみを含有する。別の実施形態では、リポソームはＰＯＰＣ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のみを含有する。
【００３３】
リポソームは、１以上のＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、及び任意にＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含有するＭＬＶを形成すること、及び該ＭＬＶを押し出して直径５０ｎｍ〜２μｍのコレステロール不含リポソームを得ることによって得ることができる。より具体的には、１以上のＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ及び任意にＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を水性バッファーに懸濁して脂質懸濁液を形成し、該懸濁液を室温で少なくとも３０分間撹拌してＭＬＶを形成する。
【００３４】
ＭＬＶを押し出しプロセスによって大単層ベシクル（ＬＵＶ）に変換する。例えば、ＭＬＶを３回〜２０回、３層ポリカーボネートフィルタを通して押し出すことができる。好ましい押し出しプロセスでは、ＭＬＶを１０回押し出す。
【００３５】
ポリカーボネートフィルタは５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の孔径を有してもよい。特定の実施形態では、孔径は１００ｎｍである。ここでも、得られるＬＵＶ、すなわちリポソームは５０ｎｍ〜２μｍの直径を有してもよい。
【００３６】
その後、上に記載されるコレステロール不含リポソームを水溶液に添加して懸濁液を形成する。重要なことは、使用される水溶液は、リポソームの脂質二重層を越えて実質的に膜電位差が存在しないように、コレステロール不含リポソームを産生するために使用されるものと同じ溶液であるか、それに類似しなければならない。例えば、イオン勾配、ｐＨ勾配又は浸透勾配がリポソーム膜を越えて存在しないように、イオン強度、ｐＨ及びモル浸透圧濃度は厳密に一致させなければならない。これは、例えば、ＰＢＳを使用してコレステロール不含リポソームを形成し、またリポソームをＰＢＳ中に希釈して懸濁液を形成することにより保証され得る。
【００３７】
これに関連して「実質的に膜電位差が存在しない」の文言は、そのレベルを下回ると薬物がリポソームに積極的に充填されない膜電位差のレベルを意味する。例えば、Akbarzadeh et al., Nanoscale Research Letters 2013, 8:102を参照されたい。
【００３８】
疎水性薬物を水溶液中のリポソームの懸濁液に添加して混合物を形成する。疎水性薬物は、シロリムス、ウミロリムス、又はエベロリムスであってもよい。特定の方法では、薬物はウミロリムスである。この段階で充填方法は、水溶液中の疎水性薬物を可溶化するために溶解度向上剤、例えばシクロデキストリンの使用を必要としない。実際、これは必要ではないか、又は望ましくない。
【００３９】
理論に束縛されるものではないが、水溶液に懸濁されたリポソームに添加されることから、疎水性薬物は、該薬物の疎水性の性質によりリポソームの脂質尾部と強く相互作用し、リポソームの脂質二重層内部での封入をもたらすと考えられる。
【００４０】
リポソームと疎水性薬物との混合物を室温で４時間〜４８時間撹拌し、コレステロール不含リポソームへの添加された疎水性薬物の少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％及び１００％）の充填をもたらす。
【００４１】
また、上に記載される安定なリポソーム製剤を使用して癌を治療する方法も、本出願の範囲に含まれる。該方法は、シロリムス、ウミロリムス又はエベロリムスから選択される抗癌薬を含有する安定なリポソーム製剤を有効量、癌患者に投与することを必要とする。該有効量とは、患者において癌細胞の生育を阻害するものである。
【００４２】
当業者は、癌患者に投与されるべき安定なリポソーム製剤の有効量を容易に決定することができる。例えば、ＭＲＩ又はＣＴスキャンによって腫瘍サイズを測定することにより経時的な薬物用量に対する反応を追跡することができる。
【００４３】
安定なリポソーム製剤を任意の従来の方法によって癌患者に投与することができ、任意の従来の方法としては、限定されないが、腹腔内注射、静脈内注射、腫瘍への直接注入、腫瘍上流の動脈循環への注入、及び鼻腔吸入が挙げられる。また、上に記載される安定なリポソーム製剤を経口投与用の丸剤又はカプセル剤に形成してもよい。
【００４４】
上記の安定なリポソーム製剤を投与することによって治療可能な癌の種類として、限定されないが、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎癌、成人軟部肉腫、肛門癌、再生不良性貧血、基底細胞及び扁平上皮細胞の癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、男性における乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼の癌、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド、胃腸間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭の癌、小児白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、黒色腫皮膚癌、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、腎細胞癌腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚リンパ腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺の癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００４５】
更に精緻化することなく、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本発明を最大限利用することができると考えられる。そのため下記の特定の実施例は単に説明するものであり、いかなる場合も本開示の他の記載を限定するものとしては解釈されない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ウミロリムス充填リポソームの作製
種々のホスファチジルコリン、すなわちＥｇｇＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、又はＤＯＰＣを各々含有する、４つの２００ｍＬのバッチのリポソームを作製した。簡潔には、６０００ｍｇの各ホスファチジルコリンを別々の５００ｍＬ容の脱パイロジェンガラス瓶内の２００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に添加した。混合物を室温で少なくとも３０分間撹拌して多重層ベシクル（ＭＬＶ）を形成した。ベンチトップ押し出し成形機（カナダのNorthern Lipids Inc.）を使用して、３重（3-stack）ポリカーボネートフィルタ膜（孔径１００ｎｍ）を通した押し出しによってＭＬＶのサイズを減少した。１０回の押し出し通過の後、約１００ｎｍの平均サイズを有する大単層ベシクル（ＬＵＶ）が得られた。
【００４７】
ＬＵＶにウミロリムスを充填するため、４本の５０ｍＬ容の脱パイロジェンガラス瓶の各々に、１本の瓶当たり１０ｍＬの４つのＬＵＶ調合剤のうちの１つと共に、５０ｍｇの薬物を添加した。ガラス瓶に蓋をし、温度２５℃の水浴に入れた。混合物を２４時間撹拌した。封入されていないウミロリムスを除去するため、得られたウミロリムス充填リポソームの溶液を、０．２μｍの孔径を有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）シリンジフィルタを通して濾過した。
【００４８】
充填後のリポソーム溶液のウミロリムス含有量を逆相ＨＰＬＣによって特定した。５０μｌの各リポソーム溶液の試料と１．０ｍｌのアセトニトリルとを混合することによってリポソームを破壊した。ウミロリムスの標準溶液をメタノール中０．０５ｍｇ／ｍＬで作製した。試料をＨＰＬＣによって分析し、標準溶液と比較し、リポソーム中のウミロリムスの量を定量した。
【００４９】
Zetasizer Nano装置（英国のMalvern Instruments）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によってリポソームの強度平均径（intensity mean diameter）及び分布の多分散性指数（ＰＤＩ）を特定した。検査した試料をそれぞれ０．９％塩化ナトリウム溶液中１：２５に希釈した。次のパラメーター：粘度＝１．０１８３ｃｐ、屈折率＝１．３３２、温度＝２３℃により、少なくとも５分間のスキャンを使用して、１７２度の散乱角での粒子径測定を行った。ウミロリムス充填の前及び後にリポソームのサイズを測定し、記録した。薬物充填の結果を下記表１に要約する。
【００５０】
【表１】
2018527335.tif 000003
【００５１】
ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ及びＤＯＰＣで形成されるリポソームに充填されたウミロリムスの量は、２．７ｍｇ／ｍＬを超えていた。予想外に、これら３つのリポソームに充填されたウミロリムスの量はＥｇｇＰＣで形成されたリポソームに充填したものより多かった。
【００５２】
実施例２：ポリエチレングリコール複合化リン脂質を含有するウミロリムス充填リポソームの作製
５００ｍＬ容の脱パイロジェンガラス瓶内の２００ｍＬのＰＢＳ中で１８００ｍｇのＰＯＰＣと２００ｍｇのＤＳＰＥ  ＰＥＧ−２０００とを合わせることにより、ポリエチレングリコール複合化（ＰＥＧ化）リン脂質を含有するリポソームを作製した。混合物を室温で少なくとも３０分間撹拌してＭＬＶを形成した。ベンチトップ押し出し成形機（カナダのNorthern Lipids Inc.）を使用して、３重ポリカーボネートフィルタ膜（孔径１００ｎｍ）を通した押し出しによってＭＬＶのサイズを減少した。１０回の押し出し通過の後、およそ１００ｎｍの平均サイズを有するＰＥＧ化ＬＵＶが得られた。
【００５３】
ＰＥＧ化ＬＵＶにウミロリムスを充填するため、５０ｍｇの薬物を５０ｍＬのＬＵＶと共に５００ｍＬ容の脱パイロジェンガラス瓶に添加した。ガラス瓶に蓋をし、温度２５℃の水浴に入れた。混合物を最長２４時間撹拌した。１ｍＬの試料を撹拌の開始から１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後及び２４時間後に収集してＰＥＧ化リポソームへのウミロリムスの充填を評価した。封入されていないウミロリムスを除去するため、各試料を、０．２μｍの孔径を有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）シリンジフィルタを通して濾過した。各試料のウミロリムス含有量を上記実施例１に記載されるようにＨＰＬＣによって評価した。
【００５４】
結果は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、及び２４時間の撹拌後にＰＥＧ化リポソームに組み込まれたウミロリムスのパーセンテージが、充填に使用したウミロリムスの初期量基準で、それぞれ５９％、６７％、７７％、８２％、８７％、９１％、及び１０２％であったことを示した。上記充填方法を行うことは、予想外にも、２４時間以内のＰＥＧ化リポソームへの本質的に全てのウミロリムスの充填をもたらした。
【００５５】
ウミロリムス充填ＰＥＧ化リポソーム製剤の安定性を５℃±３℃での透明ガラスバイアル内での保存中に評価した。一定温度条件を保証するため継続的に試料温度をモニターし、記録した。２週間、３週間、４週間、６週間、及び８週間の保存の後、上記実施例１に記載されるように、溶液をウミロリムス含有量、ベシクルサイズ、及びＰＤＩについて分析した。安定性の結果を下記表２に示す。
【００５６】
【表２】
2018527335.tif 000004
【００５７】
結果は、５℃で保存した場合、ウミロリムス充填ＰＥＧ化リポソームの溶液は少なくとも８週間安定していることを示す。
【００５８】
実施例３：ウミロリムス充填リポソーム製剤の薬物封入効率の測定
リポソーム溶液から遊離薬物を除去するためのゲル濾過技術を使用し、リポソームによってウミロリムスの封入効率を特性評価するためアッセイを開発した。以下の等式を使用して、ＰＤ−１０架橋デキストランゲル（ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５）脱塩カラムにリポソーム製剤を流す前及び後にリポソーム製剤の脂質に対する薬物の比率を特定した。
薬物封入％＝薬物：脂質の最終比率（ＰＤ−１０カラムを通過させた試料）／薬物：脂質の初期比率（ＰＤ−１０分離前の試料）×１００％
【００５９】
上記実施例１及び実施例２にそれぞれ記載されるようにウミロリムス充填ＰＯＰＣリポソーム及びウミロリムス充填ＰＯＰＣ  ＰＥＧ化リポソームを作製した。薬物封入効率を下記表３に示す。
【００６０】
【表３】
2018527335.tif 000005
【００６１】
驚いたことに、ウミロリムス充填ＰＯＰＣリポソーム及びウミロリムス充填ＰＯＰＣ  ＰＥＧ化リポソームのいずれの封入効率も９５％を超えていた。
【００６２】
実施例４：シロリムス及びエベロリムス充填リポソームの作製
ＰＯＰＣ  ＬＵＶを上記実施例１に記載されるように作製した。５０ｍｇのシロリムス又はエベロリムスを１０ｍＬのＰＯＰＣ  ＬＵＶと共に５０ｍＬ容の脱パイロジェンガラス瓶に添加した。ガラス瓶に蓋をし、温度２５℃の水浴に入れた。混合物を室温で２４時間撹拌した。薬物充填リポソーム溶液を０．２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルタを通して濾過し、封入されていない薬物を除去した。
【００６３】
両方のリポソーム製剤について、封入後の薬物含有量、リポソームの強度平均径、及びＰＤＩを上記実施例１に記載されるように特定した。結果を下記表４に示す。
【００６４】
【表４】
2018527335.tif 000006
【００６５】
上記結果は、シロリムス及びエベロリムスが高い効率でＰＯＰＣリポソームへの封入に成功したことを示した。
【００６６】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出研究
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出アッセイを使用してウミロリムス、シロリムス及びエベロリムスの放出プロファイルを決定した。ウミロリムス充填リポソームを上記実施例１に記載されるように作製し、シロリムス充填及びエベロリムス充填のリポソームを上記実施例４に記載されるように作製した。
【００６７】
各薬物に対して、１５％アセトニトリル及び８５％水を含有する溶液５ｍＬ中に１．０ｍｇの薬物を含有する対照製剤を作製した。５ｍＬの対照製剤及び各薬物に対するリポソーム製剤を、５０ｋＤａｌの分子量カットオフを有する別々の透析チューブに充填した。
【００６８】
充填した透析チューブを、それぞれ４０ｍＬの放出媒質（１５％アセトニトリル及び０．５％ＳＤＳ）の入った個別の５０ｍＬ容のチューブに入れた。各チューブ内の放出媒質を１時間後、２時間後、５時間後、７時間後、２４時間後、３０時間後、及び４８時間後にサンプリングし、放出媒質中の薬物濃度を上記実施例１に記載されるようにＨＰＬＣによって特定した。累積薬物放出パーセンテージ対放出時間を全ての試料に対ついてプロットした。結果をウミロリムス、エベロリムス及びシロリムスについて図１、図２及び図３にそれぞれ示す。
【００６９】
上記結果は、ウミロリムス、エベロリムス、及びシロリムスの開始量の６７％、１００％、及び８４％がそれぞれ４８時間以内に透析チューブから拡散したことを示した。
【００７０】
対照的には、リポソーム封入薬物は、より遅い速度で透析チューブから拡散した。封入されたウミロリムス、エベロリムス、及びシロリムスの４８時間後の累積放出は、それぞれ薬物の開始量の６７％、５９％、及び５４％であった。
【００７１】
上記結果は、ウミロリムス、エベロリムス及びシロリムスのリポソーム製剤が持続した薬物送達に有効であることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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