(57)【要約】レシピエント対象への移植のためのドナー細胞（例えば、ＨＳＣまたはＴ細胞）の免疫適合性を高める組成物および方法、ならびにこれらの方法で使用されるデータベーススキーマが本明細書に開示される。本明細書に記載される方法および組成物によって、細胞の１つまたは複数の免疫原性遺伝子（例えば、ＨＬＡ遺伝子）の対立遺伝子特異的修飾が達成され、これにより、レシピエント対象への移植に好適な細胞（例えば、ドナー細胞）が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫適合性血球を生成する方法であって、以下：
第１の対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と血球を接触させて、前記第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子および前記Ｃａｓ９分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子と結合させ、
これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子を修飾して、前記免疫適合性血球を生成するステップ
を含む方法。
【請求項２】
血球中の内在性免疫原性遺伝子を修飾する方法であって、以下：
データベーススキーマを用いて、第１の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を選択するステップ、ならびに
前記第１の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と前記血球を接触させて、前記対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子および前記Ｃａｓ９分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子と結合させ、これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子を修飾するステップ
を含む方法。
【請求項３】
血球中の内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子の前記細胞表面発現を低減する方法であって、以下：
第１の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と前記血球を接触させて、前記対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子および前記Ｃａｓ９分子を、前記内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子と結合させ、
これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子の前記細胞表面発現を低減するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ハプロタイプ修飾血球を対象に移植する方法であって、以下：
内在性免疫原性遺伝子に第１ハプロタイプを有する第１の対象から血球を単離するステップ、
第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と前記血球を接触させて、前記第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子と結合させ、これにより、前記内在性免疫原性遺伝子の第１の対立遺伝子を修飾するステップ、ならびに
内在性免疫原性遺伝子に第２ハプロタイプを有する第２の対象に前記血球を移入するステップ
を含む方法。
【請求項５】
対立遺伝子特異的遺伝子修飾を有する細胞の集団を含む組成物を製造する生体外の方法であって、以下：
対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と細胞の集団を接触させて、前記対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子および前記Ｃａｓ９分子を、同定可能な遺伝子産物をコードする遺伝子の単一対立遺伝子と結合させるステップ；ならびに
前記同定可能な遺伝子産物を発現するが、前記第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化するステップ
を含む方法。
【請求項６】
前記細胞の集団が、血球の集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記血球が、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の集団が、循環血球の集団、動員血球の集団、骨髄細胞の集団、骨髄系前駆細胞の集団、リンパ球系前駆細胞の集団、リンパ球の集団、複能性前駆細胞の集団、系列特異的前駆細胞の集団、内皮細胞の集団、もしくは間葉系間質細胞の集団、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記血球が、幹細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、リンパ球、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞からなる群から選択される、請求項１〜４、９および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｇＲＮＡ分子が、修飾ｇＲＮＡ分子である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｇＲＮＡ分子が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子中の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞、または細胞の集団を、第２のｇＲＮＡ分子と接触させるステップをさらに含み、ここで、前記第２のｇＲＮＡ分子は、表１６に記載される遺伝子を標的化する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２のｇＲＮＡ分子が、修飾ｇＲＮＡ分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞を第２のＣａｓ９分子と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａｓ９分子が、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｅａＣａｓ９分子が、前記内在性免疫原性遺伝子内に一本鎖切断を生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｅａＣａｓ９分子が、前記内在性免疫原性遺伝子内に二本鎖切断を生成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃａｓ９分子が、野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、分割型Ｃａｓ９、および誘導性Ｃａｓ９からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性は含まない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃａｓ９分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｎ８６３に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃａｓ９分子が、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含まない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｃａｓ９分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｇＲＮＡ分子と前記Ｃａｓ９ポリペプチドが、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｃａｓ９分子が、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾ｇＲＮＡ分子が、５’末端キャップ構造を含む、請求項１または１２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記５’末端キャップ構造が、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾ｇＲＮＡ分子が、３’末端ポリ−Ａテールを含む、請求項１または１２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞、または前記細胞の集団をテンプレート核酸と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記テンプレート核酸が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または組込み欠陥レンチウイルス（ＩＬＤＶ）を用いて、細胞、または細胞の集団に送達される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｓｓＯＤＮが、３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｓｓＯＤＮが、５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞、または前記細胞の集団をトランスジーンと接触させるステップをさらに含み、ここで、前記接触ステップは、前記トランスジーンが、前記細胞の前記ゲノム、または前記細胞の集団の細胞に組み込まれることを可能にする条件下で行う、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記トランスジーンが、免疫同一ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする遺伝子、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である遺伝子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記トランスジーンが、ＨＬＡ遺伝子またはその断片である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞、または前記細胞の集団をｅｉＣａｓ９分子と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｅｉＣａｓ９を転写レプレッサーまたは転写アクチベーターと融合させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、細胞の集団を含む、請求項１〜４、および５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対立遺伝子特異的抗体を用いて、前記細胞の集団を選別することにより、１遺伝子の特定の対立遺伝子を発現する細胞を選択するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝子が、免疫原性遺伝子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞の集団が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫原性マイクロビーズ媒介性細胞選別によって選別される、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記内在性免疫原性遺伝子に第１ハプロタイプを有する第１の対象から前記血球を単離するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記接触ステップ後に、前記内在性免疫原性遺伝子に第２ハプロタイプを有する第２の対象に前記血球を移入するステップをさらに含む、請求項１〜４または５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記接触ステップ後に、生体外で前記細胞または細胞の集団を拡大するステップをさらに含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞補充療法をさらに含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ハプロタイプ修飾血球が、ドナーとレシピエントの細胞間のマッチングの増大に基づく第２の対象による拒絶の低い尤度、ならびに混合リンパ球または白血球反応アッセイにより決定される低い免疫原性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項５５】
前記ハプロタイプ修飾血球が、前記第２の対象により拒絶されない、請求項４に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子を発現するが、前記第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化する前記ステップが、フローサイトメトリーによって前記細胞を選別するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子を発現するが、前記第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化する前記ステップが、前記遺伝子の第１対立遺伝子によりコードされる前記同定可能な遺伝子産物の第１変異体と特異的に結合する第１抗体および前記同定可能な産物の第２変異体と結合する第２抗体と、前記複数の細胞の各々を接触させるステップを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記同定可能な遺伝子産物が、細胞表面マーカーである、請求項５、５６、または５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記同定可能な遺伝子産物が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記遺伝子の第１対立遺伝子が、前記同定可能な遺伝子産物の非機能性変異体をコードする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記遺伝子を発現するが、前記第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化する前記ステップが、前記複数の細胞の各細胞において、前記同定可能な遺伝子産物の機能性変異体と結合した物質またはシグナルを検出するステップを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞または細胞の集団が、一次血球または一次血球の集団である、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法により製造される組成物。
【請求項６４】
薬剤として使用するための請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
移植に使用するための請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法により改変される細胞または細胞の集団。
【請求項６７】
請求項６６に記載の細胞または細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項６８】
対象の疾患を治療または予防する方法であって、修飾細胞または請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法により改変された細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項６９】
内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子に修飾を含む血球であって、前記血球が、第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と接触している血球。
【請求項７０】
内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子に修飾を含む血球の集団であって、前記血球の集団が、第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と接触している血球の集団。
【請求項７１】
前記免疫原性遺伝子が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子である、請求項６９に記載の血球、または請求項７０に記載の血球の集団。
【請求項７２】
データベーススキーマを用いて、第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を選択するステップをさらに含む、請求項１または３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
データベーススキーマを用いて、前記第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を選択するステップが、以下：
コンピューターシステムのインターフェースを介して、第１の対象の前記内在性免疫原性遺伝子の第１の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ；
前記コンピューターシステムのインターフェースを介して、第２の対象の前記内在性免疫原性遺伝子の第２の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ；
前記第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、前記第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子との間で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ；
１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、前記第２の複数の対立遺伝子の前記１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するためにデータベースに問い合わせるステップ；
前記データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、前記１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した前記１つまたは複数のｇＲＮＡ分子を同定するｇＲＮＡ分子のリストを作成するステップ；
ｇＲＮＡ分子のリストをランク付けするステップ；ならびに
前記ｇＲＮＡ分子のランク付けリストを表示するステップ
を含む、請求項２または請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
データベーススキーマをインプリメントするための処理装置による実行の命令を保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、前記データスキーマが、以下：
主要ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル；
ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブル；
前記対立遺伝子テーブルの記録と前記ｇＲＮＡテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記ｇＲＮＡテーブルは、前記対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
複数の系統内で発生するハプロタイプの頻度に関するデータを保存するハプロタイプ−頻度テーブルであって、ここで、前記ハプロタイプテーブルは、前記ハプロタイプ−頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する、テーブル；
系統に関するデータを保存する系統テーブル；
前記ハプロタイプ−頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルであって、ここで、前記ハプロタイプ−頻度テーブルは、前記系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
複数の系統内で発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する、テーブル；ならびに
前記対立遺伝子頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子頻度テーブルは、前記対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有するテーブル
を含む、非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項７５】
前記データスキーマが、以下：
マイナー組織適合性抗原に関するデータを保存するマイナー−抗原テーブル；および
マイナー組織適合性抗原に対するＨＬＡ制限に関するデータを保存する主要−マイナー−制限テーブルをさらに含み、前記マイナー−抗原テーブルは、前記主要−マイナー−制限テーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記対立遺伝子テーブルは、前記主要−マイナー−制限テーブルと１対多のリレーションシップを有する、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項７６】
前記対立遺伝子テーブルが、対立遺伝子ｉｄキー、対立遺伝子属性、遺伝子名属性、および対立遺伝子配列属性を含む、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項７７】
前記ｇＲＮＡテーブルが、ｇＲＮＡｉｄキー、Ｃａｓ変異体属性、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含む）属性、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含まない）属性、鎖属性、直交性スコア属性、およびオフターゲットリスト情報属性を含む、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項７８】
前記対立遺伝子−ガイド−リレーションテーブルが、リレーションｉｄキー、前記対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、および前記ｇＲＮＡテーブルのｇＲＮＡｉｄキーに対応するｇＲＮＡｉｄ属性を含む、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項７９】
前記ハプロタイプテーブルが、ハプロタイプｉｄキー、ＨＬＡ−Ａ−対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／ＤＲＢ４／ＤＲＢ５遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子遺伝子座属性を含む、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８０】
前記ハプロタイプ−頻度テーブルが、ハプロタイプ頻度ｉｄキー、前記ハプロタイプテーブルのハプロタイプｉｄキーに対応するハプロタイプｉｄ属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、アジア系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アジア系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、ユダヤ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性を含む、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８１】
前記対立遺伝子−頻度テーブルが、対立遺伝子頻度ｉｄキー、前記対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、アジア系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アジア系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、ユダヤ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群における対立遺伝子発生のランクの属性を含む、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８２】
前記対立遺伝子−頻度テーブルが、前記対立遺伝子テーブルと依存リレーションシップを有し、前記対立遺伝子テーブルに完全に依存的である、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８３】
前記ハプロタイプ−頻度テーブルが、ハプロタイプテーブルと依存リレーションシップを有し、前記ハプロタイプテーブルに完全に依存的である、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８４】
前記ｇＲＮＡが、ＨＬＡ対立遺伝子を編集するために設計される、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８５】
前記ハプロタイプが、異なるＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子群である、請求項７４に記載の非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【請求項８６】
１つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定するコンピューターシステムを用いて実施される方法であって、以下：
前記コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片レシピエントの第１の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ；
前記コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ；
前記第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、前記第１の複数の対立遺伝子と前記第２の複数の対立遺伝子との間で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ；
１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、前記第２の複数の対立遺伝子の前記１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するためにデータベースに問い合わせるステップ；
前記データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡが、前記１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した前記１つまたは複数のｇＲＮＡを同定するｇＲＮＡのリストを作成するステップ；
前記ｇＲＮＡのリストをランク付けするステップ；ならびに
前記ｇＲＮＡのランク付けリストを表示するステップ
を含む方法。
【請求項８７】
前記ｇＲＮＡのリストからのｇＲＮＡが、前記標的化移植片ドナーの前記第２の複数の対立遺伝子からのミスマッチ対立遺伝子を編集して、前記第１の複数の対立遺伝子と前記第２の複数の対立遺伝子間でマッチする対立遺伝子の数を増加させることができる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ｇＲＮＡのリストからのｇＲＮＡが、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集して、標的化移植片レシピエントに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発生する尤度を低減することができる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１の複数の対立遺伝子の各々について前記ＤＮＡ配列を表示するステップをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記データベースが、１つの人種群に発生する対立遺伝子の尤度を示す数を保存する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
１系統内の前記第１の複数の対立遺伝子の各々の発生頻度を表示するステップをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の複数の対立遺伝子の各々とマイナー組織適合性抗原との制限リレーションシップを表示するステップをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の複数の対立遺伝子が、前記標的化移植片レシピエントの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプであり、前記第２の複数の対立遺伝子が、前記標的化移植片ドナーの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプである、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１の複数の対立遺伝子の一覧が、１つの対立遺伝子、２つの対立遺伝子、３つの対立遺伝子、４つの対立遺伝子、５つの対立遺伝子、６つの対立遺伝子、７つの対立遺伝子、または８つの対立遺伝子を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２の複数の対立遺伝子の一覧が、１つの対立遺伝子、２つの対立遺伝子、３つの対立遺伝子、４つの対立遺伝子、５つの対立遺伝子、６つの対立遺伝子、７つの対立遺伝子、または８つの対立遺伝子を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
前記ｇＲＮＡのリストが、１つのミスマッチ対立遺伝子を編集するための１つのｇＲＮＡを同定する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９７】
前記ｇＲＮＡのリストが、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するための２つ以上のｇＲＮＡを同定する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ｇＲＮＡのリストが、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するための１つのｇＲＮＡを同定する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９９】
前記データベースが、請求項７４に記載のデータベーススキーマを用いてインプリメントされる、請求項８６に記載の方法。
【請求項１００】
データベーススキーマをインプリメントするためのシステムであって、前記システムが、以下：
プロセッサー；および
データベーススキーマを保存するメモリーを含み、このデータスキーマは、以下：
ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル；
ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブル；
前記対立遺伝子テーブルの記録と前記ｇＲＮＡテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記ｇＲＮＡテーブルは、対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有するテーブル；
ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
系統情報に関するデータを保存する系統テーブル；
前記ハプロタイプテーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統ハプロタイプリレーションテーブルであって、ここで、前記ハプロタイプテーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子頻度テーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；ならびに
前記対立遺伝子頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子頻度テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル
を含むシステム。
【請求項１０１】
１つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定するシステムであって、前記システムが、以下：
プロセッサー；および
命令を保存するメモリーを含み、これらの命令は、実行されると以下：
標的化移植片レシピエントの第１の複数の対立遺伝子の一覧を受信すること；
標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子の一覧を受信すること；
前記第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、前記第１の複数の対立遺伝子と前記第２の複数の対立遺伝子との間で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定すること；
データベースに問い合わせて、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、前記第２の複数の対立遺伝子の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定すること；
前記データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した１つまたは複数のｇＲＮＡを同定するｇＲＮＡのリストを作成すること；
ｇＲＮＡのリストをランク付けすること；ならびに
ｇＲＮＡの前記ランク付けリストを表示すること
を前記プロセッサーに行わせるシステム。
【請求項１０２】
処理装置による実行の命令を保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、前記命令の実行によって、前記処理装置は、
前記スキーマに従いデータベースを作成し、前記スキーマは、以下：
ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル；
ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブル；
前記対立遺伝子テーブルの記録と前記ｇＲＮＡテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記ｇＲＮＡテーブルは、前記対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
系統情報に関するデータを保存する系統テーブル；
前記ハプロタイプテーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップの記録を保存する系統ハプロタイプリレーションテーブルであって、ここで、前記ハプロタイプテーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；
複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブルであって、ここで、前記対立遺伝子テーブルは、前記対立遺伝子頻度テーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル；ならびに
前記対立遺伝子頻度テーブルの記録と前記系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブルであって、ここで、前記対立遺伝子頻度テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、前記系統テーブルは、前記対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する、テーブル
を規定する、非一時的コンピューター可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年６月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１７３，３２１号明細書；および２０１６年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２９４，４９３号明細書の優先権を主張するものであり、これら各々の内容全体は、本明細書に参照により明示的に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これは、その内容全体が、本明細書に参照により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年６月９日に作製され、２０１６−０６−０９＿１２６４５４−０１４２０＿ＥＭ０５２ＰＣＴ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズは２２７ＫＢである。
【背景技術】
【０００３】
細胞療法は、疾患の治療を受ける患者に生存細胞を投与するか、またはその患者において特定の細胞集団を成熟させる。例えば、同種異系造血幹／前駆細胞移植（アロ−ＨＳＣＴ）、および同種異系臍帯移植は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）などの多様な後天性、悪性、および遺伝性血液系疾患の有効な治療法である（Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １００（５）：６９６−７０２（２０１５）；Ｋａｍａｎｉ  ＮＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １８（８）：１２６５−７２（２０１２））。
【０００４】
遺伝子療法の出現によって、今日、多種の疾患が、特定の病態（例えば、血液系障害）の原因を治療するように遺伝子改変された細胞を移植することにより治療することが可能であるため、遺伝子改変細胞を用いた細胞療法は、極めて有望である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの発見および哺乳動物細胞へのその適用によって、例えば、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、またはその他のＤＮＡ修復経路を介して、標的遺伝子の有効かつ正確な編集が達成される。任意選択的にドナーＤＮＡ修復テンプレート分子と一緒に、Ｃａｓ９分子および標的特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を共送達すると、ゲノム内での標的配列の遺伝子編集（例えば、疾患関連突然変異）が促進される。従って細胞（例えば、幹細胞）中の遺伝子の修飾を目的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用は、複数の遺伝性疾患を治療する上で有望な戦略である。
レシピエント対象由来ではない細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ若しくはＨＳＰＣ）および／またはＴ細胞）の移植を成功させるために、ドナー細胞が、１つまたは複数の免疫原性遺伝子の遺伝子座で対立遺伝子の高いおよび／または有意なマッチング度を呈示するようなドナーを見出さなければならない。残念ながら、ヒト集団におけるハプロタイプ異質性のために、１つまたは複数の免疫原性遺伝子座でマッチする対立遺伝子を有する好適なドナー細胞の入手可能性は限られている。従って、好適なドナーセルを同定することができないために、最終的に、患者は必要な移植を受けることができないか、または医者が、ミスマッチドナー細胞を使用せざるを得なくなり、これが最終的に免疫拒絶を引き起こし得る。例えば、ヒト白血球抗原遺伝子（ＨＬＡ）は、早期骨髄造血幹／前駆細胞移植（ＨＳＣＴ）臨床治療中に初めて同定された免疫原性遺伝子である。骨髄ＨＳＰＣドナーとレシピエント対象との間のＨＬＡのミスマッチは、免疫反応を引き起こす恐れがあり、その場合、ドナー移植片から発生するリンパ球が、宿主組織に対して免疫応答を開始する。この病状、すなわち移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすドナーＴ細胞同種抗原反応は、皮膚、消化管（ＧＩ）、および肝臓に集中する。ＧＶＨＤは、非再発罹患率および死亡率の主な原因であり、同種異系ＨＳＣＴ対象の約５０％に影響を与える（Ｂｈａｔｉａ  Ｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１１；４（４）：４３７−４５２；Ｇａｒｎｅｔｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ．４（６）：３６６−７８（２０１３））。反対に、レシピエントＴ細胞は、同種異系ＨＳＰＣ細胞表面上に発現若しくは提示されたＨＬＡタンパク質またはドナー特異的抗原を認識することによって、入来したドナー同種異系ＨＳＰＣを外来のものとして認識する可能性があり、最終的に移植片拒絶を引き起こす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １００（５）：６９６−７０２（２０１５）
【非特許文献２】Ｋａｍａｎｉ  ＮＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １８（８）：１２６５−７２（２０１２）
【非特許文献３】Ｂｈａｔｉａ  Ｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１１；４（４）：４３７−４５２
【非特許文献４】Ｇａｒｎｅｔｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ．４（６）：３６６−７８（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
同種異系移植ドナー細胞に対する免疫応答を抑制するための医学分野の進歩にもかかわらず、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、特定の病態の原因を治療するために遺伝子改変されたドナー細胞をはじめとする、ドナー細胞の拒絶を低減し、および／またはその免疫適合性を改善することができる別の方法および組成物が依然として求められている。とりわけ、免疫原性遺伝子ハプロタイプの相違とは関係なく、レシピエント対象に首尾よく移植することができる好適なドナー細胞の利用可能性を向上させることが依然として求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載される方法および組成物は、レシピエント対象への移植のためのドナー細胞（例えば、ＨＳＣおよび／またはＴ細胞）の免疫適合性を高める。本明細書に記載される方法および組成物によって、細胞の１つまたは複数の免疫原性遺伝子（例えば、ＨＬＡ遺伝子）の対立遺伝子特異的修飾が達成され、これにより、レシピエント対象への移植に好適なドナー細胞が得られる。特に、本明細書に記載される細胞を、Ｃａｓ９分子、および内在性免疫原性遺伝子を標的化する少なくとも１つの対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子（例えば、修飾ｇＲＮＡ分子）と接触させることにより、対立遺伝子は、免疫適合性細胞（例えば、免疫適合性血球）を産生するように改変される。本明細書に記載される方法および組成物を用いて産生された細胞は、レシピエント対象に移植されたとき、免疫応答を誘導しにくく、および／またはレシピエント対象の免疫系によって拒絶されにくい。ドナーの免疫原性遺伝子ハプロタイプとは関係なく、あらゆるドナー対象に移植されるようにカスタム化され得るドナー細胞の免疫適合性を改善することができれば、多様な臨床用途の細胞療法の分野で使用することができるドナー細胞のプールの著しい増加をもたらすため、特に有利である。
【０００８】
本明細書には、免疫適合性血球を生成する方法が提供され、これは、第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と血球を接触させて、第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子と結合させ、これにより、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子を修飾して、免疫適合性血球を生成するステップを含む。
【０００９】
また、血球中の内在性免疫原性遺伝子を修飾する方法も本明細書に提供され、これは、データベーススキーマを用いて第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を選択するステップ、ならびに第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と血球を接触させて、対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子と結合させ、これにより、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子を修飾するステップを含む。
【００１０】
さらに、血球中の内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子の細胞表面発現を低減する方法も提供され、これは、第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と血球を接触させて、対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子と結合させ、これにより、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子の細胞表面発現を低減するステップを含む。
【００１１】
ハプロタイプ修飾血球を対象に移植する方法も提供され、本方法は、内在性免疫原性遺伝子に第１ハプロタイプを有する第１の対象から血球を単離するステップ、第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と血球を接触させて、第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子と結合させ、これにより、内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子を修飾するステップ、ならびに内在性免疫原性遺伝子に第２ハプロタイプを有する第２の対象へと血球を移入するステップを含む。
【００１２】
ハプロタイプ修飾血球は、ドナーとレシピエントの細胞間のマッチングの増大、ならびに混合型リンパ球または白血球反応アッセイにより決定される、免疫原性の低減に基づいて、第２の対象による拒絶が低下する傾向を有し得る。
【００１３】
ハプロタイプ修飾血球は、第２の対象により拒絶されない場合もある。
【００１４】
さらに、対立遺伝子特異的遺伝子修飾を有する細胞の集団を含む組成物を製造する生体外の方法も提供され、これは、対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と細胞の集団を接触させて、対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を、同定可能な遺伝子産物をコードする遺伝子の単一対立遺伝子と結合させるステップ；ならびに同定可能な遺伝子産物を発現するが、第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化するステップを含む。
【００１５】
本明細書に記載される方法で、遺伝子を発現するが、第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化するステップは、フローサイトメトリーを用いて、細胞を選別するステップを含み得る。
【００１６】
遺伝子を発現するが、第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化するステップは、遺伝子の第１対立遺伝子によりコードされる同定可能な遺伝子産物の第１変異体と特異的に結合する第１の抗体および同定可能な遺伝子産物の第２変異体に結合する第２の抗体と複数の細胞の各々を接触させるステップを含み得る。
【００１７】
遺伝子を発現するが、第１対立遺伝子は発現しない細胞を富化するステップは、複数の細胞の各細胞において、同定可能な遺伝子産物の機能性変異体と結合した物質またはシグナルを検出するステップを含んでもよい。
【００１８】
細胞の集団は、血球の集団であってよい。血球は、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）であってよい。
【００１９】
細胞の集団は、循環血球の集団、動員血球の集団、骨髄細胞の集団、骨髄系前駆細胞の集団、リンパ球系前駆細胞の集団、リンパ球の集団、複能性前駆細胞の集団、系列特異的前駆細胞の集団、内皮細胞の集団、間葉系間質細胞の集団、またはこれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００２０】
血球は、幹細胞である。幹細胞は、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）である。また、細胞は、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、リンパ球、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、Ｔリンパ球、または間葉系間質細胞からなる群から選択してもよい。
【００２１】
ｇＲＮＡ分子は、修飾ｇＲＮＡ分子であってよい。
【００２２】
ｇＲＮＡ分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子中の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含んでもよい。ＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択され得る。
【００２３】
本方法は、細胞、または細胞の集団を、第２のｇＲＮＡ分子と接触させるステップをさらに含み、ここで、前記第２のｇＲＮＡ分子は、表１６に記載される遺伝子を標的化する。
【００２４】
第２のｇＲＮＡ分子は、修飾ｇＲＮＡ分子であってよい。
【００２５】
本方法は、第２のＣａｓ９分子と細胞を接触させるステップをさらに含む。
【００２６】
Ｃａｓ９分子は、酵素的に活性なＣａｓ９（ｅａＣａｓ９）分子であってよい。ｅａＣａｓ９分子は、内在性免疫原性遺伝子内に一本鎖切断を生成し得る。ｅａＣａｓ９分子は、内在性免疫原性遺伝子内に二本鎖切断を生成し得る。
【００２７】
Ｃａｓ９分子は、野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、分割型Ｃａｓ９、および誘導性Ｃａｓ９からなる群から選択してもよい。
【００２８】
Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性を含むが、ＨＮＨ様ドメイン切断活性はなくてもよい。Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｎ８６３に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含み得る。
【００２９】
Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメイン切断活性を含むが、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン切断活性はなくてもよい。Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置Ｄ１０に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含み得る。
【００３０】
Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドであってもよい。Ｃａｓ９ポリペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドであってもよい。Ｃａｓ９ポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドであってもよい。ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９ポリペプチドは、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されていてもよい。
【００３１】
Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸であってよい。
【００３２】
修飾ｇＲＮＡ分子は、５’末端キャップ構造を含んでもよい。５’末端キャップ構造は、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）である。修飾ｇＲＮＡ分子は、３’末端ポリ−Ａテールを含んでもよい。
【００３３】
本明細書に記載される方法は、細胞、または細胞の集団をテンプレート核酸と接触させるステップをさらに含んでもよい。テンプレート核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってよい。ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。ｓｓＯＤＮは、３’ホスホロチオエート修飾を含む。ｓｓＯＤＮは、５’ホスホロチオエート修飾と３’ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。
【００３４】
テンプレート核酸は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）または組込み欠陥レンチウイルス（ＩＬＤＶ）を用いて、細胞、または細胞の集団に送達してもよい。
【００３５】
本明細書に記載される方法は、細胞、または細胞の集団をトランスジーンと接触させるステップをさらに含んでもよく、ここで、接触ステップは、トランスジーンが、細胞のゲノム、または細胞の集団の細胞に組み込まれることを可能にする条件下で行う。トランスジーンは、細胞のゲノム内のセーフ・ハーバー部位に組み込まれ得る。
【００３６】
トランスジーンは、免疫同一ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする遺伝子、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である遺伝子であってもよい。トランスジーンは、ＨＬＡ遺伝子またはその断片であってもよい。ＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択され得る。
【００３７】
本明細書に記載される方法は、細胞、または細胞の集団をｅｉＣａｓ９分子と接触させるステップをさらに含んでもよい。ｅｉＣａｓ９を転写レプレッサーまたは転写アクチベーターと融合させてもよい。
【００３８】
細胞は、細胞の集団を含んでもよい。
【００３９】
本明細書に記載される方法は、対立遺伝子特異的抗体を用いて、細胞の集団を選別することにより、１遺伝子の特定の対立遺伝子を発現する細胞を選択するステップをさらに含んでもよい。細胞の集団は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫原性マイクロビーズ媒介性細胞選別によって選別してもよい。
【００４０】
遺伝子は、免疫原性遺伝子であってもよい。
【００４１】
本明細書に記載される方法は、内在性免疫原性遺伝子に第１ハプロタイプを有する第１の対象から血球を単離するステップをさらに含んでもよい。
【００４２】
本明細書に記載される方法は、接触ステップ後に、内在性免疫原性遺伝子に第２ハプロタイプを有する第２の対象に血球を移入するステップをさらに含んでもよい。
【００４３】
本明細書に記載される方法は、接触ステップ後に、生体外で細胞または細胞の集団を拡大するステップをさらに含んでもよい。
【００４４】
本明細書に記載される方法は、Ｔ細胞補充療法（ａｄｄ−ｂａｃｋ）をさらに含んでもよい。
【００４５】
同定可能な遺伝子産物は、細胞表面マーカーであってもよい。同定可能な遺伝子産物は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）であってもよい。同定可能な遺伝子産物は、主要組織適合性抗原複合体タンパク質またはマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）（例えば、ケモカイン受容体）であってもよい。
【００４６】
遺伝子の第１対立遺伝子は、同定可能な遺伝子産物の非機能性変異体をコードし得る。
【００４７】
本明細書に記載される方法は、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を用いて、追加遺伝子座を改変（例えば、ノックダウンもしくはノックアウトにより、例えば、不活性化）するステップをさらに含んでもよい。追加遺伝子座は、ケモカイン受容体の遺伝子座、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、またはＣＸＣＲ６であってもよい。
【００４８】
一実施形態では、本方法は、修飾を確認するために細胞の配列を取得するステップをさらに含んでもよい。
【００４９】
細胞または細胞の集団は、一次血球または一次血球の集団であってもよい。細胞または細胞の集団は、ＣＤ３４＋骨髄細胞、ＣＤ３４＋末梢血球、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から産生されたＣＤ３４＋細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、内皮細胞、リンパ球系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、Ｔリンパ球細胞、またはこれらの集団のいずれかであってもよい。細胞の集団は、異質の細胞集団または同種の細胞集団であってもよい。
【００５０】
本明細書に記載される方法を使用して、１つまたは複数の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を用い、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第２、第８、第９、第１０、またはそれ以上の対立遺伝子を改変することができる。本明細書に記載される方法を使用して改変される対立遺伝子は、改変された対立遺伝子（例えば、インデルの挿入による）の不活性化をもたらし得る。
【００５１】
本明細書に記載される方法のいずれかによって作製される組成物も提供される。組成物は、薬剤としての使用を目的とし得る。組成物は、移植での使用を目的とし得る。
【００５２】
本明細書に記載される方法によって改変された細胞または細胞の集団も提供される。
【００５３】
本明細書に記載される細胞または細胞の集団を含む医薬組成物も提供される。
【００５４】
細胞は、表１から選択されるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、表２から選択されるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、表３から選択されるＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、表４から選されるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子、または表５から選択されるＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子を含んでもよい。
【００５５】
第２の対象は、表６〜１５から選択されるハプロタイプを含んでもよい。第２の対象は、遺伝性血液障害、例えば、貧血、免疫不全、または異常ヘモグロビン症、血液疾患、酵素蓄積欠損またはその他の疾患（例えば、遺伝性もしくは後天性血液疾患）を有し得る。第２の対象は、後天性障害、または望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を有し得る。第２の対象は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、または骨髄増殖性疾患を有し得る。第２の対象は、ＨＩＶに感染しているか、または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有し得る。
【００５６】
第１および第２の対象は、異性であってもよく、例えば、第１の対象は男性で、第２の対象は女性であるか、または第１の対象は女性で、第２の対象は男性である。
【００５７】
第１の対象は、第１の対象とは異なる民族的背景または民族であってもよい。第１の対象と第２の対象は、同じ民族的背景または民族であってもよい。民族的背景または民族は、アジア系（例えば、アジア系アメリカ人、例えば、アジア系パシフィックアイランダー）、アフリカ系（例えば、アフリカ系移民、例えば、アフリカ系アメリカ人）、白色人種（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人）、ヒスパニック系（例えば、ラテンアメリカ人、例えば、ヒスパニック系アメリカ人）、ユダヤ人、またはインド亜大陸（亜大陸住民）であってよい。第１の対象は、第１の対象とは異なる民族系統であってもよい。第１の対象と第２の対象は、同じ民族系統であってもよい。
【００５８】
修飾細胞または本明細書に記載される方法のいずれかによって改変された細胞を対象に投与するステップを含む、対象の疾患を治療または予防する方法も提供される。疾患は、表１６に列記される疾患であってよい。
【００５９】
疾患を治療または予防する方法は、修飾細胞または本明細書に記載される方法のいずれかによって改変された細胞の対象への２回目の投与を含み得る。修飾細胞の２回目の投与は、最初の投与から３、６、９、１２、１、または２４ヵ月以内に行ってよい。
【００６０】
対象は、前処置または免疫抑制と相反する病状を有し得る。対象は、複数の併存疾患、重症併存疾患、ＧＶＨＤもしくは移植片拒絶の高いリスク、または発症中、慢性もしくは急性感染症を有し得る。対象の年齢は、５０、５５、６０、６５、７０、または７５歳超であってもよい。対象の年齢は、５、４、３、２、または１歳未満であってもよい。
【００６１】
本方法は、修飾細胞（例えば、修飾ＨＳＰＣ、ＨＰＣ、ＣＢ−ＨＳＰＣ、ＣＤ３４＋細胞、リンパ球系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、またはＴリンパ球）の投与前に、対象を前処置する（例えば、内在性ＨＳＰＣをアブレートするか、または造血空間を形成する）ステップをさらに含んでもよい。
【００６２】
前処置は、修飾細胞において修飾された１つまたは複数の対立遺伝子でマッチしない同種異系細胞の移植の際に用いられる前処置レジメンよりも低毒性となり得る。
【００６３】
本方法は、対象に免疫抑制処置を投与するステップを（例えば、修飾細胞の投与前または後に）含んでもよい。免疫抑制剤は、修飾細胞において修飾された１つまたは複数の遺伝子座で不一致の同種異系細胞の移植の際に用いられる免疫抑制処置よりも低毒性となり得る。
【００６４】
対象は、治療前に妊娠していてもよい。対象は、治療前に輸血が為されていてもよい。
【００６５】
修飾細胞は、治療しようとする障害の発症後に投与してもよい。修飾細胞は、治療しようとする障害の発症前に投与してもよい。
【００６６】
内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子に修飾を含む血球であって、第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と接触させた血球も提供される。血球は、１つまたは複数の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を用いて、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第２、第８、第９、第１０、またはそれ以上の対立遺伝子で、修飾され得る。
【００６７】
内在性免疫原性遺伝子の第１対立遺伝子に修飾を含む血球の集団であって、第１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子と接触させた血球の集団も提供される。血球の集団は、１つまたは複数の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を用いて、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第２、第８、第９、第１０、またはそれ以上の対立遺伝子で、修飾され得る。
【００６８】
免疫原性遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子であってもよい。
【００６９】
本明細書に記載される方法は、データベーススキーマを用いて、第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を選択するステップをさらに含んでもよい。
【００７０】
データベーススキーマを用いて、第１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子を選択するステップは、以下：コンピューターシステムのインターフェースを介して、第１の対象の内在性免疫原性遺伝子の第１の複数の対立遺伝子の一覧を受けるステップ；コンピューターシステムのインターフェースを介して、第２の対象の内在性免疫原性遺伝子の第２の複数の対立遺伝子の一覧を受けるステップ；第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子間の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ；１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、第２の複数の対立遺伝子の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するために好適であるか否かを決定するためにデータベースに問い合わせ（クエリー）するステップ；データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した１つまたは複数のｇＲＮＡ分子を同定するｇＲＮＡ分子のリストを作成するステップ；ｇＲＮＡ分子のリストをランク付けするステップ；ならびにｇＲＮＡ分子のランク付けリストを表示するステップを含み得る。
【００７１】
さらに、データベーススキーマをインプリメントするための処理装置による実行のための命令を保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体も提供され、データベーススキーマは、以下を含む：主要ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル；ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブル；対立遺伝子テーブルの記録とｇＲＮＡテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子−ｇＲＮＡリレーションテーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子−ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、ｇＲＮＡテーブルは、対立遺伝子−ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；複数の系統内に発生するハプロタイプの頻度に関するデータを保存するハプロタイプ−頻度テーブル（ここで、ハプロタイプテーブルは、ハプロタイプ−頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する）；系統に関するデータを保存する系統テーブル；ハプロタイプ−頻度テーブルの記録と系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル（ここで、ハプロタイプ−頻度テーブルは、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する）；ならびに対立遺伝子頻度テーブルの記録と系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子−系統−リレーションテーブル（ここで、対立遺伝子頻度テーブルは、対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）。
【００７２】
データベーススキーマは、マイナー組織適合性抗原に関するデータを保存するマイナー抗原テーブル；およびマイナー組織適合性抗原に対するＨＬＡ制限に関するデータを保存する主要−マイナー−制限テーブルをさらに含んでもよく、ここで、マイナー抗原テーブルは、主要−マイナー−制限テーブルと１対多のリレーションシップを有し、対立遺伝子テーブルは、主要−マイナー−制限テーブルと１対多のリレーションシップを有する。
【００７３】
対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子ｉｄキー、対立遺伝子属性、遺伝子名属性、および対立遺伝子配列属性を含んでもよい。
【００７４】
ｇＲＮＡテーブルは、ｇＲＮＡｉｄキー、Ｃａｓ変異体属性、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含む）属性、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含まない）属性、鎖属性、直交性スコア属性、およびオフターゲットリスト情報属性を含んでもよい。
【００７５】
対立遺伝子−ガイド−リレーションテーブルは、リレーションｉｄキー、対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、ｇＲＮＡテーブルのｇＲＮＡｉｄキーに対応するｇＲＮＡｉｄ属性を含んでもよい。
【００７６】
ハプロタイプテーブルは、ハプロタイプｉｄキー、ＨＬＡ−Ａ−対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／ＤＲＢ４／ＤＲＢ５遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子遺伝子座属性を含んでもよい。
【００７７】
ハプロタイプ−頻度テーブルは、ハプロタイプ頻度ｉｄキー、ハプロタイプテーブルのハプロタイプｉｄキーに対応するハプロタイプｉｄ属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプの発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプの発生のランクの属性、アジア系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アジア系統群におけるハプロタイプの発生のランクの属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプの発生のランクの属性、ユダヤ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群におけるハプロタイプの発生のランクの属性を含んでもよい。
【００７８】
対立遺伝子−頻度テーブルは、対立遺伝子頻度ｉｄキー、対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子の発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子の発生のランクの属性、アジア系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アジア系統群における対立遺伝子の発生のランクの属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子の発生のランクの属性、ユダヤ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ユダヤ人系統群における対立遺伝子の発生のランクの属性を含んでもよい。
【００７９】
対立遺伝子−頻度テーブルは、対立遺伝子テーブルと依存リレーションシップを有し得るため、対立遺伝子テーブルに完全に依存的である。
【００８０】
ハプロタイプ−頻度テーブルは、ハプロタイプテーブルと依存リレーションシップを有し得るため、ハプロタイプテーブルに完全に依存的である。
【００８１】
ｇＲＮＡは、免疫原性遺伝子を編集するために設計してもよい。ｇＲＮＡは、ＨＬＡ対立遺伝子を編集するために設計してもよい。
【００８２】
ハプロタイプは、異なるＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子群であってもよい。
【００８３】
さらに、１つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡ分子を同定するために、コンピューターシステムで実施される方法も提供され、これは、以下：コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片レシピエントの第１の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ；コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップ；第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子との間で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ；データベースに問い合わせて、１つまたは複数のｇＲＮＡが、第２の複数の対立遺伝子の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するステップ；データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した１つまたは複数のｇＲＮＡを同定するｇＲＮＡのリストを作成するステップ；ｇＲＮＡのリストをランク付けするステップ；ならびにｇＲＮＡのランク付けリストを表示するステップを含む。
【００８４】
ｇＲＮＡのリストからのｇＲＮＡは、標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子からのミスマッチ対立遺伝子を編集して、第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子との間でマッチする対立遺伝子の数を増加することができると考えられる。
【００８５】
ｇＲＮＡのリストからのｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集して、標的化移植片レシピエントに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発生する可能性を低減することができると考えられる。
【００８６】
本明細書に記載される方法は、第１の複数の対立遺伝子の各々についてＤＮＡ配列を表示するステップをさらに含んでもよい。
【００８７】
データベースは、ある人種群に発生する対立遺伝子の尤度を示す数を評点してもよい。データベースは、ある民族群に発生する対立遺伝子の尤度を示す数を評点してもよい。
【００８８】
本明細書に記載される方法は、ある系統内に第１の複数の対立遺伝子の各々の発生頻度を表示するステップをさらに含んでもよい。
【００８９】
本明細書に記載される方法は、第１の複数の対立遺伝子の各々とマイナー組織適合性抗原との間の制限リレーションシップを表示するステップをさらに含んでもよい。
【００９０】
第１の複数の対立遺伝子は、標的化移植片レシピエントの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプであり、第２の複数の対立遺伝子は、標的化移植片ドナーの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプである。
【００９１】
第１の複数の対立遺伝子の一覧は、１つの対立遺伝子、２つの対立遺伝子、３つの対立遺伝子、４つの対立遺伝子、５つの対立遺伝子、６つの対立遺伝子、７つの対立遺伝子、８つの対立遺伝子、９つの対立遺伝子または１０の対立遺伝子を含み得る。血球は、１つまたは複数の対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を用いて、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第２、第８、第９、第１０、または第１１以上の対立遺伝子で、修飾され得る。
【００９２】
第２の複数の対立遺伝子の一覧は、１つの対立遺伝子、２つの対立遺伝子、３つの対立遺伝子、４つの対立遺伝子、５つの対立遺伝子、６つの対立遺伝子、７つの対立遺伝子、または８つの対立遺伝子を含み得る。
【００９３】
ｇＲＮＡのリストは、１つのミスマッチ対立遺伝子を編集するための１つのｇＲＮＡを同定し得る。ｇＲＮＡのリストは、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するための２つ以上のｇＲＮＡを同定し得る。
【００９４】
ｇＲＮＡのリストは、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するための１つのｇＲＮＡを同定し得る。
【００９５】
データベースは、本明細書に記載されるデータベーススキーマを用いてインプリメントされ得る。
【００９６】
さらに、データベーススキーマをインプリメントするためのシステムも提供され、このシステムは、プロセッサー；およびデータベーススキーマを保存するメモリーを含み、ここで、データベーススキーマは、以下を含む：ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル；ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブル；対立遺伝子テーブルの記録とｇＲＮＡテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、ｇＲＮＡテーブルは、対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；系統情報に関するデータを保存する系統テーブル；ハプロタイプテーブルの記録と系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統ハプロタイプリレーションテーブル（ここで、ハプロタイプテーブルは、系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子頻度テーブルと１対多のリレーションシップを有する）；ならびに対立遺伝子頻度テーブルの記録と系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブル（ここで、対立遺伝子頻度テーブルは、対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）。
【００９７】
さらに、１つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定するシステムも提供され、このシステムは、プロセッサー；ならびに、実行されると以下のことをプロセッサーに行わせる命令を保存するメモリーを含む：標的化移植片レシピエントの第１の複数の対立遺伝子の一覧を受信する；標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子の一覧を受信する；第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子との間で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定する；データベースに問い合わせて、１つまたは複数のｇＲＮＡが、第２の複数の対立遺伝子の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定する；データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した１つまたは複数のｇＲＮＡを同定するｇＲＮＡのリストを作成する；ｇＲＮＡのリストをランク付けする；ならびにｇＲＮＡのランク付けリストを表示する。
【００９８】
さらに、処理装置による実行の命令を保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体も提供され、命令の実行によって、処理装置はスキーマに従いデータベースを作成し、スキーマは、以下を規定する：ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブル；ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブル；対立遺伝子テーブルの記録とｇＲＮＡテーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、ｇＲＮＡテーブルは、対立遺伝子ｇＲＮＡリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；系統情報に関するデータを保存する系統テーブル；ハプロタイプテーブルの記録と系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する系統ハプロタイプリレーションテーブル（ここで、ハプロタイプテーブルは、系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、系統ハプロタイプリレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）；複数の系統内に発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子頻度テーブル（ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子頻度テーブルと１対多のリレーションシップを有する）；ならびに対立遺伝子頻度テーブルの記録と系統テーブルの記録とのリレーションシップを保存する対立遺伝子系統リレーションテーブル（ここで、対立遺伝子頻度テーブルは、対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、対立遺伝子系統リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する）。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ａは、部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））に由来する（または部分的に配列をモデルにしている）、モジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号３９および４０）。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｂは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４１）。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｃは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４２）。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｄは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４３）。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｅは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（配列番号４４）。
【図１Ｆ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｆは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に部分的に由来するモジュラーｇＲＮＡ分子を二重鎖構造として描写する（それぞれ出現順に配列番号４５および４６）。
【図１Ｇ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｇは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のモジュラーｇＲＮＡ分子のアライメントを描写する（それぞれ出現順に配列番号３９、４５、４７、および４６）。
【図１Ｈ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｈ−１Ｉは、単分子ｇＲＮＡ分子のさらに別の例示的な構造を描写する。図１Ｈは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子の例示的な構造を二重鎖構造として示す（配列番号４２）。
【図１Ｉ】図１Ａ−１Ｉは、いくつかの例示的なｇＲＮＡの描写である。図１Ｈ−１Ｉは、単分子ｇＲＮＡ分子のさらに別の例示的な構造を描写する。図１Ｉは、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に部分的に由来する単分子ｇＲＮＡ分子の例示的な構造を二重鎖構造として示す（配列番号３８）。
【図２Ａ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｅ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｆ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図２Ｇ】図２Ａ−Ｇは、Ｃａｓ９配列（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３）のアライメントを描写する。Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｙ」で示される。他の２つのＲｕｖＣ様ドメインは、枠内に「Ｂ」で示される。ＨＮＨ様ドメインは、枠内に「Ｇ」で示される。Ｓｍ：Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１）；Ｓｐ：Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２）；Ｓｔ：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号４）；Ｌｉ：Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）（配列番号５）。「モチーフ」（配列番号１４）は、４つの配列に基づくコンセンサス配列である。４つ全ての配列に保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され；「＊」は、４つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し；「−」は、非存在を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜９５、１２０〜１２３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｂは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜９５、１２０〜１２３）。図３Ｂの最後の行は、４つの高度に保存された残基を特定する。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜１２３）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインのアライメントを示す（配列番号５２〜１２３）。図４Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｃは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１９８）。図５Ｃの最後行は、保存残基を特定する。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｂは、配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１４１、１４８、１４９、１５１〜１５３、１６２、１６３、１６６〜１７４、１７７〜１８７、１９４〜１９８）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｂは、配列外れ値を除外して、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に開示されるＣａｓ９分子からのＨＮＨ様ドメインのアライメントを示す（配列番号１２４〜１４１、１４８、１４９、１５１〜１５３、１６２、１６３、１６６〜１７４、１７７〜１８７、１９４〜１９８）。図６Ｂの最後の行は、３つの高度に保存された残基を特定する。
【図７】例示的なｇＲＮＡ配列（配列番号４２）を用いたｇＲＮＡドメイン用語を説明する。
【図８】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡおよびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の送達後のＣＣＲ５遺伝子座でのインデルの検出を描写する。
【図９】組み合わせたＣａｓ９ｍＲＮＡ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｓａ  Ｃａｓ９のいずれか）を伴う表示のキャップ／テールなしｇＲＮＡまたはキャップ／テール付加ｇＲＮＡによる電気穿孔後のＣＤ３４＋細胞数増加の動力学を描写する。
【図１０】組み合わせたＣａｓ９ｍＲＮＡ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｓａ  Ｃａｓ９のいずれか）を伴う表示のキャップ／テールなしｇＲＮＡまたはキャップ／テール付加ｇＲＮＡによる電気穿孔から７２時間後の総生存ＣＤ３４＋細胞の倍率変化を描写する。
【図１１】キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡによる電気穿孔後の生存（ヨウ化プロピジウム陰性）ヒトＣＤ３４＋細胞の維持を示す代表的なフローサイトメトリーデータを描写する。
【図１２】キャップおよびテールなしＡＡＶＳ１ｇＲＮＡと比較して、キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの送達後のＣＤ３４＋細胞中に検出された挿入／欠失（インデル）のパーセンテージならびに標的化ＡＡＶＳ１遺伝子座でのそれらの造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）子孫を描写する。
【図１３】キャップ／テール付加ＡＡＶＳ１ｇＲＮＡによる編集後のＣＤ３４＋細胞における造血コロニー形成能（ＣＦＣ）の維持を描写する。キャップ／テールなしＡＡＶＳ１ｇＲＮＡで電気穿孔された細胞のＣＦＣ能力の喪失に留意されたい。
【図１４Ａ】Ｋ５６２赤白血病細胞株中の効率的な標的化遺伝子座編集（％インデル）を描写し、ヒト赤白血病細胞株は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と共にキャップおよびテール付加ＨＢＢｇＲＮＡの送達後に、ＨＳＰＣと同様の特性を有する。
【図１４Ｂ】ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞における表示標的化遺伝子座（ＡＡＶＳ１、ＨＢＢ、ＣＸＣＲ４）でのＣａｓ９媒介性／キャップおよびテール付加ｇＲＮＡ媒介性編集（％インデル）を描写する。右：Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびキャップおよびテール付加ＨＢＢ（配列番号２１７）による電気穿孔後の臍帯血ＣＤ３４＋細胞のＣＦＣ能力（非電気穿孔対照または２もしくは１０μｇＨＢＢ  ｇＲＮＡで電気穿孔された細胞）。細胞は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたは２もしくは１０μｇのｇＲＮＡで電気穿孔された。
【図１４Ｃ】２μｇまたは１０μｇのキャップ／テール付加ＨＢＢｇＲＮＡで電気穿孔された細胞についてのＣＦＣアッセイを描写する。ＣＦＣ：コロニー形成細胞、ＧＥＭＭ：混合造血コロニー顆粒球−赤血球−マクロファージ−単球、Ｅ：赤血球コロニー、ＧＭ：顆粒球−マクロファージコロニー、Ｇ：顆粒球コロニー。
【図１５Ａ】キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１、ＨＢＢ、またはＣＸＣＲ４ｇＲＮＡおよびＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡの送達から７２時間後の臍帯血ＣＤ３４＋細胞における表示の遺伝子座での切断を示す代表的なゲル画像（Ｔ７Ｅ１分析）を描写する。この例示ゲルは、図１４Ｂに示す要約データと対応する。
【図１５Ｂ】７−ＡＡＤおよびアネキシンＶでの共染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび表示のｇＲＮＡの送達から４８時間後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞における細胞生存能力を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｂは、ドナー細胞における単一ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を破壊するためのＣａｓ９および単一ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子によるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の置換を描写する。図１６Ａは、Ａ、Ｂ、およびＤＲＢ１遺伝子座でのドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を示す。この実施例では、造血幹細胞移植片を必要とするアフリカ系アメリカ人レシピエント対象には、完全にマッチするドナーがいない。６対立遺伝子のうち５つがマッチするヨーロッパ系アメリカ人ドナーが同定されている。このミスマッチ対立遺伝子の発現を排除するために、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０２：０１：０１：０１に特異的なＣａｓ９およびｇＲＮＡがドナーＨＳＰＣに送達される。次に、レシピエントと６のうちの６（全マッチ）を達成するために、レシピエントＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０１：０１：０１：０１のｃＤＮＡがドナーＨＳＰＣに導入される。ミスマッチ対立遺伝子は、陰影の付いた枠内に示される。ドナーにおいてＣａｓ９／ｇＲＮＡによる破壊のために標的化される対立遺伝子は、黒い枠内に示され、レシピエントｃＤＮＡ置換は、グレーの枠内の対立遺伝子により示される。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、ドナー細胞における単一ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を破壊するためのＣａｓ９および単一ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子によるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の置換を描写する。図１６Ｂは、トランスジーン発現カセット内でコードされ、ミスマッチドナーＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を同一のレシピエントＨＬＡ−Ａ対立遺伝子で置換するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１破壊細胞に送達される、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１：０１のｃＤＮＡ配列（配列番号３６２）を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ドナー細胞におけるＨＬＡ−Ａ遺伝子座の両アレル破壊のためのＣａｓ９／ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子によるＨＬＡ−Ａの置換を描写する。図１７Ａは、Ａ、Ｂ、およびＤＲＢ１遺伝子座でのドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を示す。この実施例では、造血幹細胞移植片を必要とするヒスパニック系レシピエント対象には、完全にマッチするドナーがいない。ドナー候補とレシピエントの間で６対立遺伝子のうち４つがマッチするヨーロッパ系アメリカ人ＨＳＰＣドナーが同定されている。これらのミスマッチＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の両方の発現を排除するために、Ａ＊０２：０１：０１：０１およびＡ＊２９：０２：０１：０１対立遺伝子の両方を同時に標的化するＣａｓ９および単一ｇＲＮＡがドナーＨＳＰＣに送達される。次に、ドナーとレシピエントの間で６のうちの６（全マッチ）を達成するために、レシピエントＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０１：０１：０１：０１およびＡ＊２３：０１：０１のｃＤＮＡがドナーＨＳＰＣに送達される。ミスマッチ対立遺伝子は、陰影の付いた枠内に示される。ドナーにおいてＣａｓ９／ｇＲＮＡによる破壊のために標的化される対立遺伝子は、黒い枠内に示され、破壊された対立遺伝子を置換するレシピエントｃＤＮＡは、グレーのボックスにより示される。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｂは、ドナー細胞におけるＨＬＡ−Ａ遺伝子座の両アレル破壊のためのＣａｓ９／ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子によるＨＬＡ−Ａの置換を描写する。図１７Ｂは、トランスジーン発現カセット内でコードされ、ミスマッチドナーＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を同一のレシピエントＨＬＡ−Ａ対立遺伝子で置換するために、ＨＬＡ−Ａ−／−破壊細胞に送達される、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１：０１：０１のｃＤＮＡ配列（配列番号３６３）を示す。ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１：０１：０１配列（前の実施例で示す、パネルＢ）もＨＬＡ−Ａ−／−ドナー細胞に送達される。
【図１８Ａ】図１８Ａ−１８Ｂは、ドナー細胞におけるハプロタイプ（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲＢ１）の多重編集および標的化破壊のためのＣａｓ９／ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子による置換を描写する。図１８Ａは、Ａ、Ｂ、およびＤＲＢ１遺伝子座でのドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を示す。この実施例では、造血幹細胞移植片を必要とするヒスパニック系レシピエント対象には、完全にマッチするドナーがない。ハプロが同一のヨーロッパ系アメリカ人ＨＳＰＣドナーが同定されている。非マッチハプロタイプの発現を排除するために、３つのＭＨＣ遺伝子座（Ａ＊０２：０１：０１：０１、Ｂ＊０８：０１：０１、およびＤＲＢ１＊０３：０１：０１：０１０１）の対立遺伝子を標的化するＣａｓ９および３つのｇＲＮＡがドナーＨＳＰＣに送達される。次に、ドナーとレシピエントの間で６のうちの６（全マッチ）を達成するために、レシピエントハプロタイプＡ＊０３：０１：０１：０１、Ｂ＊０７：０２：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１：０１：０１のｃＤＮＡがドナーＨＳＰＣに送達される。ミスマッチ対立遺伝子は、陰影の付いた枠内に示される。ドナーにおいてＣａｓ９／ｇＲＮＡによる破壊のために標的化される対立遺伝子は、黒い枠内に示され、破壊された対立遺伝子を置換するレシピエントｃＤＮＡは、グレーの枠内に示される。
【図１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｂは、ドナー細胞におけるハプロタイプ（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲＢ１）の多重編集および標的化破壊のためのＣａｓ９／ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子による置換を描写する。図１８Ｂは、同一レシピエントハプロタイプ（Ａ＊０３：０１：０１：０１  １０９８ｂｐ（配列番号３６４）；Ｂ＊０７：０２：０１  １０８９ｂｐ（配列番号３６５）；ＤＲＢ１＊１５：０１：０１：０１  ８０１ｂｐ（配列番号３６６））によるミスマッチドナーハプロタイプの置換のためのｃＤＮＡ配列を示す。
【図１９Ａ】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ａ２６：０１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後にＨＬＡタイピングされたヒト臍帯血ＨＳＣドナー由来の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球における総遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析により検出される）を示す。ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の標的化対立遺伝子は、チャート上部に太字で示される。
【図１９Ｂ】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ａ２６：０１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後にＨＬＡタイピングされたヒト臍帯血ＨＳＣドナー由来の一次ＣＤ８＋Ｔリンパ球における総遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析により検出される）を示す。
【図２０Ａ】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ｂ０７：０２：０１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球における総遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析により検出される）を示す。ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の標的化対立遺伝子は、チャート上部に太字で示される。
【図２０Ｂ】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ｂ０７：０２対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後にフローサイトメトリー分析により決定される、一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＨＬＡ−Ｂタンパク質発現の総ノックダウンを示す。ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の標的化対立遺伝子は、チャート上部に太字で示される。ＨＬＡ−Ｂ発現のノックダウンパーセントは、次の式：（負の対照中の％ＨＬＡ−Ｂ＋−実験サンプル中の％ＨＬＡ−Ｂ）／負の対照中の％ＨＬＡ−Ｂ＋により計算した。例えば、ＨＬＡ−Ｂ＿５１０１：（（９８．９％ＨＬＡ−Ｂ＋−３２．８％ＨＬＡ−Ｂ＋）／９８．９％ＨＬＡ−Ｂ＋）＝ＨＬＡ−Ｂの６６．８％ノックダウン。
【図２０Ｃ】ＨＬＡ−Ｂ０７：０２対立遺伝子特異的抗体を用いて、５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ｂ０７：０２対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＨＬＡ−Ｂタンパク質発現を検出するフローサイトメトリー分析を示す。ＨＬＡ−Ｂの細胞表面発現と比較するために、細胞の１００％近くがＨＬＡ−Ｂを発現することが予想される同じドナー（負の対照）由来の非処理対照（非編集）細胞と、蛍光標識ＨＬＡ−Ｂ抗体で染色されていない同じドナー由来の細胞（従って、０％ＨＬＡ−Ｂ＋（抗体なし））を使用して、ＨＬＡ−Ｂ＋細胞のためのゲートを設定した（上の２パネル）。表示したｇＲＮＡと共にＣａｓ９ＲＮＰで処理した細胞を各フローサイトメトリードットプロットの上部に示す。
【図２１】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球における総遺伝子編集頻度（Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ分析により検出される）を示す。ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の標的化対立遺伝子は、チャート上部に太字で示される。
【図２２Ａ】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ａ２６：０１対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球における総遺伝子編集頻度（ＤＮＡ配列解析により検出される）を示す。ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の標的化対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２）は、チャート上部に太字で示される。ＨＬＡ−Ａ２発現のノックダウンパーセントは、次の式：（負の対照中の％ＨＬＡ−Ａ２０１＋−実験サンプル中の％ＨＬＡ−Ａ２）／負の対照中の％ＨＬＡ−Ａ２＋により計算した。例えば、ＨＬＡ−Ａ２０１＿１：（（９６．１％ＨＬＡ−Ａ２＋−６．８５％ＨＬＡ−Ａ２＋）／９６．１％ＨＬＡ−Ａ２＋）＝ＨＬＡ−Ａ２の９２．９％ノックダウン。
【図２２Ｂ】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。ＨＬＡ−Ａ０２０１の細胞表面発現と比較するために、細胞の１００％近くがＨＬＡ−Ａ２を発現することが予想される同じドナー由来の非処理対照（非編集）細胞（負の対照）と、蛍光標識ＨＬＡ−Ａ２抗体で染色されていない同じドナー由来の細胞（従って、０％ＨＬＡ−Ａ２＋（抗体なし））を使用して、ＨＬＡ−Ａ２＋細胞のためのゲートを設定した（上の２パネル）。
【図２３】５’−ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールを含む異なるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的修飾ｇＲＮＡ分子と複合体化したＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の電気穿孔後の一次ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子および総ＭＨＣクラスＩ（対立遺伝子特異的ではなく、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの共通エピトープを検出する）タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。ＭＨＣクラスＩとＨＬＡ−Ａ２について二重陽性であった細胞（フローサイトメトリープロットの象限［Ｑ］２、すなわちＱ２に入るもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ＿０２０１＿１ＲＮＲで処理された細胞の７．１４％）は、クラスＩおよびＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的遺伝子発現の両方を維持した。ＭＨＣクラスＩについて単一陽性であり、ＨＬＡ−Ａ２については陰性の細胞（フローサイトメトリープロットのＱ１に入るもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ＿０２０１＿１ＲＮＲで処理された細胞の９１．４％）は、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子を除くＭＨＣクラスＩ抗原を維持した（例えば、その対立遺伝子を標的化する遺伝子編集後のＨＬＡ−Ａ２のタンパク質発現を喪失した）。
【図２４】例示的な実施形態に従う、モジュールにインプリメントされたｇＲＮＡ同定システムを示すブロック図である。
【図２５】例示的な実施形態に従う、対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定する例示的な方法を示すフローチャートである。
【図２６】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡをランク付けする例示的な方法を示すフローチャートである。
【図２７Ａ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムのための例示的なデータベーススキーマを高レベルで示す。
【図２７Ｂ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムのための例示的なデータベーススキーマを詳細に示す。
【図２７Ｃ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムのための例示的なデータベーススキーマを詳細に示す。
【図２８Ａ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムへの例示的な対立遺伝子入力を示す。
【図２８Ｂ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムへの例示的な対立遺伝子入力を示す。
【図２８Ｃ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムへの例示的な対立遺伝子入力を示す。
【図２９】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムの出力としての例示的なクエリー／入力および例示的なｇＲＮＡリストを示す。
【図３０】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムの出力としての例示的な対立遺伝子配列を示す。
【図３１Ａ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムの出力としての、米国民における様々な系統群の例示的なハプロタイプおよび対立遺伝子頻度を示す。
【図３１Ｂ】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムの出力としての、米国民における様々な系統群の例示的なハプロタイプおよび対立遺伝子頻度を示す。
【図３２】主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を考慮した例示的なマイナー組織適合性抗原（ｍｉＨＡｇ）制限を示す。
【図３３】例示的な実施形態に従う、ｇＲＮＡ同定システムをインプリメントするためのシステムを描写するネットワーク図を示す。
【図３４】本明細書に記載されるｇＲＮＡ同定システムの例示的な実施形態をインプリメントするために使用することができる例示的なコンピューター装置のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
定義
「標的ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えばＮＨＥＪ媒介性改変によって、改変されると、遺伝子または遺伝子座の不活性化、例えば、切断を引き起こす、遺伝子または遺伝子座、例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子座、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子または遺伝子座内の位置を指す。
【０１０１】
「標的ノックダウン位置」は、本明細書の用法では、例えば本明細書に記載されるｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物によって、標的化されると、遺伝子または遺伝子座からの機能性遺伝子産物の発現の低減または排除を引き起こす、遺伝子または遺伝子座、例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子座、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子または遺伝子座内の位置を指す。
【０１０２】
「標的ノックイン位置」は、本明細書の用法では、遺伝子または遺伝子座、例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子座、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子または遺伝子座の配列の挿入によって修飾されると、遺伝子または遺伝子座からの機能性遺伝子産物の発現をもたらす配列を指す。
【０１０３】
「標的位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載される通り、標的ノックアウト位置、標的ノックダウン位置、または標的ノックイン位置のいずれかを指す。
【０１０４】
「標準ＨＤＲ」、または標準相同組換え修復は、本明細書の用法では、相同性核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外性核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いてＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。標準ＨＤＲは、典型的に、二本鎖切断に有意な切除が存在した場合に作用し、ＤＮＡの少なくとも一本鎖部分を形成する。正常細胞では、ＨＤＲは、典型的に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分割、および結合などの一連のステップを含む。このプロセスには、ＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２が必要であり、相同性核酸は、典型的には二本鎖である。
【０１０５】
「Ａｌｔ−ＨＤＲ」もしくは「代替ＨＤＲ」、または代替相同組換え修復は、本明細書の用法では、相同性核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外性核酸、例えば、テンプレート核酸）を用いてＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。Ａｌｔ−ＨＤＲは、このプロセスが、標準ＨＤＲとは異なる経路を使用し、標準ＨＤＲ媒介物質であるＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２により阻害することができる点で、標準ＨＤＲとは異なる。また、ａｌｔ−ＨＤＲは、切断の修復に一本鎖またはニック相同性核酸を使用する。
【０１０６】
特に断りのない限り、用語「ＨＤＲ」は、本明細書の用法では、標準ＨＤＲおよびａｌｔ−ＨＤＲを包含する。
【０１０７】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、結合媒介性修復および／または非テンプレート媒介性修復を指し、このようなものとして、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存的マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）が挙げられる。
【０１０８】
「対立遺伝子」は、本明細書の用法では、染色体上の同じ位置を占めるＤＮＡの遺伝子または非コード領域のいくつかの代替形態の１つを指す。
【０１０９】
「対立遺伝子特異的遺伝子修飾」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９分子）を用いて核酸を編集するプロセスを指し、ここで、ある特定の対立遺伝子が、特定の対立遺伝子を標的化するｇＲＮＡ分子（すなわち、対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子」）によって、修飾のために標的化される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、優先的に特定の対立遺伝子を標的化する。
【０１１０】
「対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子」は、本明細書の用法では、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９分子）を特定の対立遺伝子に優先的に標的化させるｇＲＮＡ分子を指す。
【０１１１】
「細胞表面発現」は、本明細書の用法では、細胞の細胞膜中でのポリペプチドの利用可能性を指す。いくつかの実施形態では、細胞膜発現は、遺伝子発現により調節される。いくつかの実施形態では、細胞表面発現は、翻訳後機構により調節される。
【０１１２】
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸のセグメントを記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、いずれか特定の機能的特性を有する必要はない。
【０１１３】
「ドナー細胞」は、本明細書の用法では、対象に投与される非自己細胞（例えば、血球）を指す。
【０１１４】
「レシピエント細胞」は、本明細書の用法では、ドナー細胞が投与される対象からの細胞（例えば、血球）を指す。
【０１１５】
２つの配列間の相同性または配列同一性（用語は本明細書で同義的に使用される）の計算は、次のようにして実施される。これらの配列は、最適な比較を目的として整列され（例えば、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップを挿入することができ、非相同配列は、比較のために無視することができる）。最適アライメントは、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスを備えたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして決定される。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、これらの配列によって共有される同一の位置数の関数である。
【０１１６】
「支配ｇＲＮＡ分子」は、本明細書の用法では、細胞または対象に導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素をコードする配列を含んでなる核酸上の標的ドメインと、相補的な標的化ドメインを含んでなる、ｇＲＮＡ分子を指す。支配ｇＲＮＡは、内在性細胞または対象配列を標的化しない。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、以下：（ａ）Ｃａｓ９分子をコードする核酸上；（ｂ）遺伝子（標的遺伝子ｇＲＮＡ）を標的化する標的化ドメインを含むｇＲＮＡをコードする核酸上；または、例えば（ａ）および（ｂ）の双方などの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素をコードする２つ以上の核酸上の標的配列と相補的な標的化ドメインを含んでなる。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９分子または標的遺伝子ｇＲＮＡをコードするなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素をコードする核酸分子は、支配ｇＲＮＡ標的化ドメインと相補的な２つ以上の標的ドメインを含んでなる。支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９分子と複合体化し、例えば、切断によってまたは核酸との結合によって、標的化核酸のＣａｓ９媒介性不活性化がもたらされ、そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素の生成中断または低下が起こると考えられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、２つの複合体：Ｃａｓ９分子と標的遺伝子ｇＲＮＡとを含む複合体で、遺伝子を改変する複合体；およびＣａｓ９分子と支配ｇＲＮＡとを含む複合体で、例えば、Ｃａｓ９分子または標的遺伝子ｇＲＮＡ分子などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素のさらなる生成を妨げるように作用する複合体を形成する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体は、例えば、Ｃａｓ９分子の転写領域、エクソン、またはイントロンをコードする配列である、Ｃａｓ９分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターなどの制御領域配列と結合するか、またはその切断を促進する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体は、例えば、ｇＲＮＡ分子と作動可能に連結するプロモーターの制御領域配列、またはｇＲＮＡ分子をコードする配列などと結合するか、またはその切断を促進する。一実施形態では、例えば、Ｃａｓ９標的化支配ｇＲＮＡ分子、または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化支配ｇＲＮＡ分子などの支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体媒介遺伝子標的化の効果を制限する。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に、時間的制限、発現レベル制限、またはその他の制限を課す。一実施形態では、支配ｇＲＮＡは、オフターゲットまたはその他の望まれない活性を低下させる。一実施形態では、支配ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９システムの構成要素の生成を阻害する、例えば、全体的にもしくは実質的に全体的に阻害することによってその活性を制限するか、またはそれを支配する。
【０１１７】
「ハプロタイプ」は、本明細書の用法では、ハプロイド遺伝子型、すなわち、１染色体上の異なる位置もしくは遺伝子座で見出される対立遺伝子またはＤＮＡ配列の組合せもしくはセットを指し、これらは、典型的には１単位として受け継がれ、結合される。ハプロタイプは、個体の特徴的な遺伝子パターンを提供し得る。ハプロタイプは、１つの遺伝子座、いくつかの遺伝子座、または染色体全体について決定することができる。
【０１１８】
「ハプロタイプ修飾血球」は、本明細書の用法では、１つまたは複数の免疫原性遺伝子で遺伝子修飾されて、細胞のハプロタイプを改変する血球を指す。
【０１１９】
本明細書の用法では、用語「同定可能な遺伝子産物」は、当技術分野で周知の方法（例えば、ＦＡＣＳ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）を用いて検出することができるポリペプチドまたはペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドは、１つまたは複数の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、同定可能な遺伝子産物は、インタクトな細胞上または細胞中（例えば、細胞の表面上または細胞内部）で検出される。
【０１２０】
本明細書の用法では、「免疫原性」は、物質が対象（例えば、ヒト対象）に導入されると、その物質に、検出可能な免疫応答（体液または細胞）を誘導させる特性を指す。
【０１２１】
本明細書の用法では、用語「免疫原性遺伝子」は、主要組織適合性抗原複合体タンパク質またはマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）をコードする遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、免疫原性遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＱからなる群から選択されるプロテインをコードする遺伝子である。
【０１２２】
本明細書の用法では、用語「免疫適合性血球」は、主要組織適合性抗原複合体タンパク質および／またはマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）をコードする遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子を共有する血球を指す。いくつかの実施形態では、免疫適合性血球は、細胞が投与されるレシピエント対象と４つ以上のＨＬＡ対立遺伝子を共有する。いくつかの実施形態では、レシピエント対象への免疫適合性血球の投与は、レシピエント対象において免疫応答を誘導しない。
【０１２３】
本明細書の用法では、用語「混合リンパ球または白血球反応アッセイ」は、２つの同種異系リンパ球集団間で行われる細胞免疫アッセイ、または当業者には周知のいずれか他の類似アッセイを指す。アッセイは、末梢血、胸腺、リンパ節、または脾臓からの細胞を精製するステップ、および刺激細胞集団と共培養するステップを含む。Ｔ細胞も含む刺激細胞集団は、２方向混合リンパ球反応物と呼ばれる。刺激細胞集団は、応答細胞の存在下で複製する。１方向混合リンパ球反応物の場合、刺激細胞は、照射、または細胞複製を妨げるＤＮＡ架橋剤であるミトマイシンＣでの処理によって複製が妨げられる。最大の測定可能な細胞増殖は、５〜７日前後で起こる。混合リンパ球または白血球反応アッセイは、Ｔ細胞機能のインビトロでの相関をもたらす。こうしたアッセイは、当業者にはよく知られている。例えば、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，２０１４，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，８４：４３９；Ｏｌｅｒｕｐ  ａｎｄ  Ｚｅｔｔｅｒｑｕｉｓｔ，１９９２，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，３９：２２５を参照されたい。
【０１２４】
「修飾ｇＲＮＡ分子」または「修飾ｇＲＮＡ」は、本明細書の用法では、細胞に導入された後の非修飾ｇＲＮＡ分子と比較して、細胞に導入された後に向上した半減期を有するｇＲＮＡ分子を指す。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露された（例えば、電気穿孔された）とき、その細胞における自然免疫応答を活性化しない。一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、同型の細胞が非修飾ｇＲＮＡ分子に曝露された際の細胞の自然免疫応答と比較して、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露されたとき、低い自然免疫応答をその細胞で活性化する。別の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、細胞がｇＲＮＡ分子に曝露されたとき、その細胞において、プログラム細胞死経路（例えば、アポトーシス細胞死経路、壊死細胞死経路（例えば、壊死細胞死経路）、オートファジー細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、フェロトーシス細胞死経路、エリプトーシス細胞死経路、アポネクローシス細胞死経路、またはアノイキス細胞死経路）を活性化しない。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、カスパーゼ依存的細胞死経路を活性化しない。別の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、カスパーゼ非依存的細胞死経路を活性化しない。
【０１２５】
一実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、５’末端修飾を含む。一実施形態では、５’末端修飾は、以下：Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）からなる群から選択される。一実施形態では、５’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端修飾を含む。一実施形態では、３’末端修飾は、ポリアデニンテールである。一実施形態では、３’末端修飾は、ホスホロチオエート修飾である。
【０１２６】
「テンプレート核酸」は、本明細書の用法では、標的位置の構造を改変するために、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子と一緒に使用することができる核酸配列を指す。一実施形態では、標的核酸は、典型的には切断部位もしくはその付近で、テンプレート核酸の配列の一部または全部を有するように修飾されている。一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖である。別の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖である。一実施形態では、テンプレート核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。別の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖ＤＮＡである。一実施形態では、テンプレート核酸は、ＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである。一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡと同じベクター骨格、例えば、ＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡにコードされる。一実施形態では、テンプレート核酸は、ベクター骨格から生体内で切除され、例えば、これは、ｇＲＮＡ認識配列によってフランキングされる。一実施形態では、テンプレートＤＮＡは、ＩＬＤＶ中にある。一実施形態では、テンプレート核酸は、外性核酸配列である。別の実施形態では、テンプレート核酸配列は、内在性核酸配列、例えば、内在性相同性領域である。一実施形態では、テンプレート核酸は、核酸配列のプラス鎖に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、テンプレート核酸は、核酸配列のマイナス鎖に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１２７】
「モジュレーター」は、本明細書の用法では、対象分子または遺伝子配列の活性（例えば、酵素活性、転写活性、もしくは翻訳活性）、量、分布、または構造を改変し得る実体、例えば、薬物を指す。一実施形態では、モジュレーション（調節）は、共有もしくは非共有結合の切断、例えば破断、または対象分子との共有もしくは非共有結合、例えば１部分の結合の形成を含む。一実施形態では、モジュレーターは、対象分子の３次元、二次、三次、または四次構造を改変する。モジュレーターは、対象活性を増大、低減、開始、または排除する。
【０１２８】
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｋＤａの分子量を有する分子を指す。大分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる。
【０１２９】
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。一実施形態では、それは、５０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基を有する。
【０１３０】
「多型」は、本明細書の用法では、対立遺伝子変異体を指す。多型は、１つまたは複数の一塩基多型、ならびに配列長さ多型を含んでもよい。多型は、別の対立遺伝子と比較して、１対立遺伝子での１つまたは複数のヌクレオチド置換に起因するか、または核酸における挿入もしくは欠失、重複、逆位およびその他の改変に起因し得る。
【０１３１】
例えば、参照Ｃａｓ９分子または参照ｇＲＮＡなどの「参照分子」は、本明細書の用法では、例えば、修飾または候補Ｃａｓ９分子などである、対象ｇＲＮＡ分子の対象Ｃａｓ９分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子の１０％以下のヌクレアーゼ活性を有するものとして特徴付けられ得る。参照Ｃａｓ９分子の例としては、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子などである、天然起源Ｃａｓ９分子などの天然起源未修飾Ｃａｓ９分子が挙げられる。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、それが比較されるＣａｓ９分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃａｓ９分子である。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配列などの配列である。
【０１３２】
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連する本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することを示すに過ぎない。
【０１３３】
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．７５ｋＤ未満などの約２ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。
【０１３４】
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらかを意味してもよい。この用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は家禽である。本明細書の用法では、対象は、対象が当該民族の者として自己同定する（もしくは、系統を同定する）場合、または第三者支払人、例えば、保険会社、政府機関、または医療供給者、例えば、治療医師もしくは遺伝子カウンセラーが、対象を、選択された民族（もしくは、その系統）の者であると同定する場合、選択された民族の者である。一実施形態では、対象は、混合系統であり、第１の民族由来のハプロタイプおよび第２の民族由来のハプロタイプを有する。
【０１３５】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（こと）（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の治療を意味し、（ａ）疾患を阻害し、すなわち、その発生を停止または予防し；（ｂ）疾患を緩和し、すなわち、病態の退縮を引き起こし；および（ｃ）疾患を治癒させることを含む。
【０１３６】
「遺伝子変換」は、本明細書の用法では、テンプレート核酸として内在性核酸、例えば、姉妹染色分体またはプラスミドを用いて、相同組換え（ＨＤＲ）によりＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２および／またはＲＡＤ５１が、遺伝子変換に関与している。いくつかの実施形態では、内在性核酸は、ＤＮＡ損傷または突然変異の部位に近いＤＮＡの断片と相同性、例えば、有意な相同性を有する核酸配列である。いくつかの実施形態では、テンプレートは、外性核酸ではない。
【０１３７】
「遺伝子修正」は、本明細書の用法では、外性核酸、例えば、供与体テンプレート核酸を用いた相同組換えによりＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、外性核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、外性核酸は、二本鎖である。
【０１３８】
「遺伝子修飾」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、核酸を編集するプロセスを指す。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、遺伝子修正を含む。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、遺伝子変換を含む。
【０１３９】
「予防する」、「予防する（こと）」および「予防」は、本明細書の用法では、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の予防を意味し、（ａ）疾患を回避または排除すること；（２）疾患に対する素因に影響を与えること、例えば、疾患の少なくとも１つの症状を予防するか、または疾患の少なくとも１つの症状の発症を遅らせることを含む。
【０１４０】
「Ｘ」は、アミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
【０１４１】
ＨＬＡ発現プロフィールを改変するための細胞の操作
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関連するリスクおよび潜在的に生命を脅かす合併症のために、後天性、悪性、および遺伝性血液疾患の治療のための移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）の有用性が制限されている。アフリカ系統の人は、骨髄および臍帯血ＨＳＰＣバンクの両方で少数しか存在せず、しかも、独特のハプロタイプとＭＨＣ遺伝子座での特異なヘテロ接合型を有するために、その民族共同体（例えば、ＳＣＤ）に高い頻度で発生する疾患の治療のために、ライフ・キュアリング（ｌｉｆｅ−ｃｕｒｉｎｇ）アロ−ＨＳＣＴを利用することが制限され得る。本明細書に記載される通り、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連の方法および組成物の使用によって、ドナー細胞が、対象（レシピエント）ＨＬＡ遺伝子座と好適にまたは十分にマッチし、これにより、そうでなければＨＬＡがマッチするドナーがいない対象の疾患の治療を目的とする移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）のための好適なドナーを生み出すように、免疫原性遺伝子適合（例えば、ＨＬＡ適合）を増大するためのドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）における１つまたは複数の免疫原性遺伝子遺伝子座（例えば、ＨＬＡ遺伝子座）の改変が可能になる。
【０１４２】
同種異系Ｔ細胞活性化は、宿主およびドナー抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示されるレシピエント抗原の提示によって誘導される。外来抗原としてＴ細胞に提示されるミスマッチＨＬＡタンパク質は、このアロ−免疫応答を活性化する。ＨＬＡは、ヒト染色体６上に位置する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の一部としてコードされる。ＭＨＣ適合は、ＧＶＨＤの発生、強度、および重症度を決定する重要な因子である。ヒトＨＬＡは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原とマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）にさらに分類することができる。例えば、ＭＨＣ  ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座でのミスマッチ対立遺伝子の程度が、ＧＶＨＤの発生および重症度に直接関係する。また、ドナーとレシピエントの性別の違い、輸血歴（例えば、不一致ＨＬＡへの曝露の繰り返しによる同種抗体の産生）、ならびにＭｉＨＡミスマッチなど、その他の因子もＧＶＨＤ病因に寄与し得る。
【０１４３】
ＭＨＣ遺伝子は、クラスＩとクラスＩＩにさらに分類することができる。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃを含むＭＨＣクラスＩは、全ての体細胞の表面上に発現される。ＭＨＣクラスＩ受容体は、可変α鎖と対合する定常β鎖（染色体１１上にコードされるβ２ｍ）から構成される。クラスＩ抗原は、細胞内ペプチド（非移植条件では、ウイルスタンパク質であるが、アロ−ＨＳＣＴの場合には、これらは、外来物として認識される宿主細胞タンパク質を提示する）をＣＤ８Ｔ細胞に提示して、細胞傷害性リンパ球活性化および宿主細胞の殺傷（急性ＧＶＨＤを引き起こす）を誘導する。対照的に、クラスＩＩ抗原（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱ、−ＤＰ）は、細胞外由来の抗原をＣＤ４Ｔ細胞に提示し、一般的にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、樹状細胞、マクロファージ）上に発現されて、宿主抗原に対するＢ細胞媒介性応答を駆動するためにＣＤ４Ｔ細胞ヘルプを活性化する。他のクラスＩＩとレシピエントＨＬＡ（ＤＱ、ＤＰ）間のミスマッチも、ＧＶＨＤに役割を果たし得るが、クラスＩ  ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、およびクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１と比較すれば低い程度である。
【０１４４】
ＭＨＣ遺伝子座の対立遺伝子多様性は、極めて多種の抗原の提示を可能にし、これにより、様々な潜在的病原体に対する包括的な免疫を提供する。ＭＨＣ遺伝子は、メンデルの法則に従いハプロタイプとして遺伝され、各遺伝子の両対立遺伝子は、共優性的に発現される。子供は各々、その親からの同じＨＬＡハプロタイプを遺伝する２５％の可能性を有する。アロ−ＨＳＣＴ対象をＧＶＨＤの発生から防御するために、移植片センターは、クラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）およびクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座での適合を要求する。成体型骨髄が細胞起源であるアロ−ＨＳＣＴの適合基準は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１が含まれる場合、７／８、または９／１０のいずれかである（Ｄｅｈｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１５；２１（１）：１３７−１４１）。臍帯血ＨＳＣＴでは、要求されるドナーとレシピエント間の適合度はより低く、最低限の適合要求は４／６遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲＢ１）である。
【０１４５】
臨床結果に対するミスマッチの影響
マッチする非血縁ドナー（ＭＵＤ）からの移植（例えば、ＨＳＣＴ）は、ドナーとレシピエントのマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）間の反応性のために、依然としてＧＶＨＤを招き得る。ドナーとレシピエントが、６つのＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲ遺伝子座の両対立遺伝子によりコードされる）のうちの１つでミスマッチであれば、急性ＧＶＨＤの発生は６５％であり、こうした対象における死亡率は、５０％である。さらに、ＭＨＣ遺伝子座での１つのミスマッチが、ＧＶＨＤのリスクを大幅に増加し得る。白血病対象におけるアロ−ＨＳＣＴの研究では、１抗原ミスマッチ血縁ドナー細胞（ＭＭＲＤ）の移植後のアロ−ＨＳＣＴ後の臨床結果（無病生存期間および全生存期間）は、マッチ非血縁ドナー（ＭＵＤ）アロ−ＨＳＣＴからの結果と同等であるとみなされた（Ｖａｌｃａｒｃｅｌ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１１；１７（５）：６４０−６４８）。ＭＵＤ  ＨＳＰＣを移植した対象は、より高い慢性（ｃ）ＧＶＨＤの発生率を有し、これは、クオリティオブライフに全体的にマイナスの影響をもたらす。別の研究では、ミスマッチ非血縁ドナーＨＳＰＣ（クラスＩ対立遺伝子でミスマッチ）のレシピエントは、より高いＧＶＨＤ発生率および移植片関連死亡率を有した（Ｈａｕｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２００８；７２（６）：５４９−５５８）。
【０１４６】
より高度に発現されるＭＨＣ遺伝子座（ＨＥＬ）に加えて、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＤＱ（例えば、ＤＱＢ１）、およびＤＰを含む低発現遺伝子座（ＬＥＬ）でのミスマッチも、ＧＶＨＤの発生率および重症度に影響を与える。ＨＥＬでマッチする対象の場合、ＬＥＬミスマッチは、有害な結果に寄与しなかった（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｉｎａ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（２２）：４６０３−４６１０）。しかし、７／８ＨＥＬを有する対象の場合には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１でのミスマッチは、ＬＥＬでの複数のミスマッチを伴った。しかし、７／８ＨＥＬを有する対象の場合、ＨＬＡ−ＤＲＢ１でのミスマッチは、ＬＥＬで複数のミスマッチを伴った。７／８ＨＥＬでマッチしたが、３つ以上のＬＥＬも検出されたドナーＨＳＰＣを移植された対象の場合、これらの対象でＬＥＬがミスマッチし、こうした対象におけるＧＶＨＤは、１つのＬＥＬミスマッチが検出された７／８ＨＥＬマッチドナーＨＳＰＣを移植された対象と比較して、高い死亡率を伴った。総合すると、これらの知見は、ＨＥＬおよびＬＥＬの双方で完全にマッチする血縁ドナーが、移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）関連ＧＶＨＤのリスクおよび重症度を低減し得ることを示している。
【０１４７】
マッチするドナーを見出す統計学
マッチする同胞ドナーを有する対象の確率は、３％前後であり、マッチする非同胞マッチ家族メンバーを有する対象の確率は、１０％近い（Ｏｔｔｉｎｇｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９４；１４  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ３４−３８）。骨髄および臍帯血バンクにおけるＭＵＤの同定は７０％近く、ＭＵＤを用いたときＧＶＨＤを発生するリスクは８０％であり、こうした対象の５０％近くがグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤを発生するが、それは致命的であり得る。非白色人種対象の場合、７／８〜８／８マッチドナーを見出す確率は、ヨーロッパ系アメリカ人（例えば、白色人種）系統の人と比較して低い。全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）は、ＭＵＤが、白色人種の９０％について同定され得るが、アジアまたはアフリカ系統の対象の場合には、７／８〜８／８ＭＵＤを見出す確率は、それぞれ７０％〜６０％に減少する（Ｐｉｄａｌａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（２２）：３６５１−３６５８）と推定する。アフリカ人系統（例えば、アフリカ系アメリカ人）の対象に関しては、血液学的健全性、疾患およびアンメットメディカルニーズは、骨髄および臍帯血バンク登録簿においてマッチするドナーを同定する確率が低いためであり、この集団における鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の比較的高い発生率がさらに悪化させている。ＳＣＤは、米国において５００人に１人または計１０００人のアフリカ系アメリカ人誕生に発生し、この疾患には、１００，０００人のアメリカ人が罹患している（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ）。中央および西部アフリカにおいて、ＳＣＤの発生率がより高い。例えば、ナイジェリアでは、毎年４５，０００〜９０，０００人の誕生にＳＣＤが発生した（ｗｗｗ．ＳｉｃｋｌｅＣｅｌｌＤｉｓｅａｓｅ．ｏｒｇ）。ＳＣＤは、鎌状赤血球突然変異が存在しないマッチドナー（血縁もしくは非血縁）からの骨髄ＨＳＣＴまたはＵＣＴを用いて治癒させることができる。従って、生命を脅かす異常ヘモグロビン症障害の比較的高い発生率と、この疾患および他の血液系疾患を治療するために用いることができる好適なドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）を同定する課題の組合せが、アフリカ系統の対象におけるアンメットメディカルニーズを増大している（Ｄｅｗ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００８；１４（８）：９３８−９４１）。
【０１４８】
ヨーロッパ系アメリカ人とアフリカ系アメリカ人の間のＭＨＣ対立遺伝子の違い
ＭＨＣ遺伝子がハプロタイプとして遺伝されること、ならびにＭＨＣ遺伝子座での高い多型度を考慮すると、共通するハプロタイプも、全く異なる系統のヒトの間で変動すると考えられる。全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＭＤＰ）登録簿に記録されたドナー（Ｄｅｈｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１５；２１（１）：１３７−１４１）によれば、歴史的に、ヨーロッパ系アメリカ人は、８／８マッチ移植片の最も高い割合を有するのに対し、アフリカ系アメリカ人は、最も低い割合を有する。ＮＭＤＰに登録した８百万人のうち、わずか７％がアフリカ系統である。さらに、混合遺伝子バックグラウンドを有する人は、さらにマッチするのが難しい。例えば、混合系統の対象は、アフリカ系アメリカ人に共通する父系ハプロタイプと、ヨーロッパ系アメリカ人に共通する母系ハプロタイプを保有し得る。双方の系統関連ハプロタイプを有するマッチ非血縁ドナーを見出すことはさらに困難である。ＮＭＤＰによれば、より多様なバックグラウンドからのドナー候補の登録を奨励する目的で、供与方法に関して共同体に知らせるためのさらなる教育が必要とされる。今日まで、ＨＬＡ多型に関するほとんどの研究は、限定的な遺伝子混合を有する集団に向けられていた。しかし、ＨＬＡ多様性は、他の大陸からの継続的な移入により、北アメリカの方が顕著である。ある研究では、白人種（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人）、アジア系、ネイティブアメリカン、アフリカ系アメリカ人、およびラテンアメリカ人（例えば、ヒスパニック系）をはじめとする、米国に住んでいる様々な非近交系群に関連する主要ハプロタイプを特性決定することが試みられた（Ｃａｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；６２（９）：１００９−１０３０）。試験された群の間で、アフリカ系アメリカ人は、他の集団試験と比較して、全クラスＩ遺伝子座で最大の異型接合性を示し、しかも、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子間の関連が弱いか、または存在しなかった。さらに、アフリカ系統に関連する最も一般的なハプロタイプは、白人種系統に関連する最も一般的なハプロタイプとは異なった。これらの知見から、異なる民族間でのＨＬＡマッチは、対象が非白人種の場合、好適なマッチまたはハプロが同一のドナーを同定する上で課題を呈することがわかる。近年、ＮＭＤＰは、米国における様々な系統群に検出された最も頻度の高い対立遺伝子およびハプロタイプの最新記録を提供した（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ）Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；６８（９）：７７９−７８８からの論文の延長。これらの群には以下：ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系パシフィックアイランダー、およびヒスパニック系が含まれた。さらにユダヤ系統の人の共通対立遺伝子およびハプロタイプならびに以前の刊行物（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８）からの最新版も入手可能である（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔ��ｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ）。
【０１４９】
表１は、米国民およびユダヤ系集団において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、ヒスパニック系［ラテンアメリカ人］、およびユダヤ系統の人）について、最も頻度の高い対立遺伝子が、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。ユダヤ系の高解像度ＨＬＡ−Ａ頻度は、以下：全米骨髄バンクウェブサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから得たものである。ユダヤ系集団についてのＨＬＡ−Ａデータが、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ−Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８からのドナーサンプルから得られたものであることに留意されたい。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ａについて０２０１ｇが示すのは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ａ＊０２０１ｇは、Ａ＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域において同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野（ｆｉｅｌｄｓ）、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子を指す。
【０１５０】
【表１】
2018523977.tif 000002
【０１５１】
【表２】
2018523977.tif 000003
【０１５２】
表２は、米国民およびユダヤ系集団において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、ヒスパニック系［ラテンアメリカ人］、およびユダヤ系統の人）について、最も頻度の高い対立遺伝子が示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。ユダヤ系の高解像度ＨＬＡ−Ａ頻度は、以下：全米骨髄バンクウェブサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）ＵＲＬ：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから得たものである。ユダヤ系集団についてのＨＬＡ−Ｂデータが、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ−Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８からのドナーサンプルから得られたものであることに留意されたい。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ｂについて０７０２ｇが示すのは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ｂ＊０７０２ｇは、Ｂ＊０７：０２となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１５３】
【表３】
2018523977.tif 000004
【０１５４】
【表４】
2018523977.tif 000005
【０１５５】
【表５】
2018523977.tif 000006
【０１５６】
表３は、米国民において最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、最も頻度の高い対立遺伝子が示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ｃの場合の０７０１ｇは、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ｃ＊０７０１ｇは、Ｃ＊０７：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。接尾辞「Ｎ」は、発現の変化を示すのに用いられる（前述の命名法リンクを参照）。
【０１５７】
【表６】
2018523977.tif 000007
【０１５８】
【表７】
2018523977.tif 000008
【０１５９】
表４は、米国民およびユダヤ系集団において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子を記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、ヒスパニック系［ラテンアメリカ人］、およびユダヤ系統の人）について、最も頻度の高い対立遺伝子が示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物［Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。ユダヤ系の高解像度ＨＬＡ−ＤＲＢ１頻度は、以下：全米骨髄バンクウェブサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）ＵＲＬ：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから得たものである。ユダヤ系集団についてのＨＬＡ−ＤＲＢ１データが、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ−Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８からのドナーサンプルから得られたものであることに留意されたい。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の場合の１５０１は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、ＤＲＢ１＊１５０１は、ＤＲＢ１＊１５：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域において同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子を指す。
【０１６０】
【表８】
2018523977.tif 000009
【０１６１】
【表９】
2018523977.tif 000010
【０１６２】
表５は、米国民において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子を記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、最も頻度の高い対立遺伝子が示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の場合の０２０１ｇは、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、ＤＱＢ１＊０２０１ｇは、ＤＱＢ１＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１６３】
【表１０】
2018523977.tif 000011
【０１６４】
表６は、米国民およびユダヤ系集団において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｂハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、ヒスパニック系［ラテンアメリカ人］、およびユダヤ系統の人）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ−Ｂハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物［Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。ユダヤ系の高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｂハプロタイプ頻度は、以下：全米骨髄バンクウェブサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）ＵＲＬ：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから得たものである。ユダヤ系集団についてのＨＬＡ−Ａ−Ｂハプロタイプ頻度データが、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ−Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８）からのドナーサンプルから得られたものであることに留意されたい。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ａの場合の０２０１ｇは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ａ＊０２０１ｇは、Ａ＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１６５】
【表１１】
2018523977.tif 000012
【０１６６】
【表１２】
2018523977.tif 000013
【０１６７】
表７は、米国民およびユダヤ系集団において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、ヒスパニック系［ラテンアメリカ人］、およびユダヤ系統の人）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物［Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。ユダヤ系の高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプ頻度は、以下：全米骨髄バンクウェブサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）ＵＲＬ：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから得たものである。ユダヤ系集団についてのＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプ頻度データが、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ−Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８からのドナーサンプルから得られたものであることに留意されたい。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の場合の１５０１は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、ＤＲＢ１＊１５０１は、ＤＲＢ１＊１５：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１６８】
【表１３】
2018523977.tif 000014
【０１６９】
【表１４】
2018523977.tif 000015
【０１７０】
【表１５】
2018523977.tif 000016
【０１７１】
【表１６】
2018523977.tif 000017
【０１７２】
表８は、米国民において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｃ−Ｂハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ−Ｃ−Ｂハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ａの場合の０２０１ｇは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ａ＊０２０１ｇは、Ａ＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１７３】
【表１７】
2018523977.tif 000018
【０１７４】
【表１８】
2018523977.tif 000019
【０１７５】
【表１９】
2018523977.tif 000020
【０１７６】
表９は、米国民において検出された最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ａの場合の０２０１ｇは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ａ＊０２０１ｇは、Ａ＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１７７】
【表２０】
2018523977.tif 000021
【０１７８】
【表２１】
2018523977.tif 000022
【０１７９】
【表２２】
2018523977.tif 000023
【０１８０】
【表２３】
2018523977.tif 000024
【０１８１】
表１０は、米国民における最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ａの場合の０２０１ｇは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ａ＊０２０１ｇは、Ａ＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１８２】
【表２４】
2018523977.tif 000025
【０１８３】
【表２５】
2018523977.tif 000026
【０１８４】
【表２６】
2018523977.tif 000027
【０１８５】
表１１は、米国民における最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ａ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ａの場合の０２０１ｇは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ａ＊０２０１ｇは、Ａ＊０２：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１８６】
【表２７】
2018523977.tif 000028
【０１８７】
【表２８】
2018523977.tif 000029
【０１８８】
【表２９】
2018523977.tif 000030
【０１８９】
【表３０】
2018523977.tif 000031
【０１９０】
【表３１】
2018523977.tif 000032
【０１９１】
【表３２】
2018523977.tif 000033
【０１９２】
表１２は、米国民およびユダヤ系集団における最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、ヒスパニック系［ラテンアメリカ人］、およびユダヤ系統の人）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物［Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。ユダヤ系の高解像度ＨＬＡ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプ頻度は、以下：全米骨髄バンクウェブサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）ＵＲＬ：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから得たものである。ユダヤ系集団についてのＨＬＡ−Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプ頻度データが、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ−Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ（Ｋｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４４２−５８）からのドナーサンプルから得られたものであることに留意されたい。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の場合の１５０１は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、ＤＲＢ１＊１５０１は、ＤＲＢ１＊１５：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０１９３】
【表３３】
2018523977.tif 000034
【０１９４】
【表３４】
2018523977.tif 000035
【０１９５】
【表３５】
2018523977.tif 000036
【０１９６】
表１３は、米国民における最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ｃ−Ｂハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ｃ−Ｂハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物（Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８）からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−Ｃの場合の０７０１ｇは、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、Ｃ＊０７０１ｇは、Ｃ＊０７：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。接尾辞「Ｎ」は、発現の変化を示すのに用いられる（前述の命名法リンクを参照）。
【０１９７】
【表３６】
2018523977.tif 000037
【０１９８】
【表３７】
2018523977.tif 000038
【０１９９】
表１４は、米国民における最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物［Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の場合の１５０１は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、ＤＲＢ１＊１５０１は、ＤＲＢ１＊１５：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０２００】
【表３８】
2018523977.tif 000039
【０２０１】
【表３９】
2018523977.tif 000040
【０２０２】
【表４０】
2018523977.tif 000041
【０２０３】
表１５は、米国民における最も頻度の高い高解像度ＨＬＡ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプを記載する。表に示される各系統（例えば、ヨーロッパ系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア系［パシフィックアイランダーを含む］、およびヒスパニック系［ラテンアメリカ人］）について、上位５０の最も頻度の高いＨＬＡ−Ｃ−Ｂ−ＤＲＢ１−ＤＱＢ１ハプロタイプが示され、各列に示す系統群におけるその発生頻度（以前の刊行物［Ｍａｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８：７７９−７８８］からの高解像度頻度の最新版を掲載する全米骨髄バンクウェブサイト（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）（ＵＳ）：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇから編集）に基づいてランク付けされる。使用されるアノテーション（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の場合の１５０１は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１と同じであり、これは、２０１０年のＷＨＯ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍにより採用された新命名法に基づき、（ＨＬＡ接頭辞）−遺伝子＊対立遺伝子群／ファミリー：具体的なＨＬＡタンパク質を示す）ことに留意されたい。例えば、ＤＲＢ１＊１５０１は、ＤＲＢ１＊１５：０１となる。この表に示す名称に関して、コード領域内の同義ＤＮＡ置換を示すのに用いられる分野、非コード領域の違い、ならびに発現の変化を示すのに用いられる接尾辞は示していない（さらに詳しい情報については次のウェブサイトを参照されたい：ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）。この表で、「ｇ」の接尾辞が付いた対立遺伝子名は、刊行物「Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７」の表１に定義される対立遺伝子群を指す。
【０２０４】
【表４１】
2018523977.tif 000042
【０２０５】
【表４２】
2018523977.tif 000043
【０２０６】
ドナー細胞移植を改善するための方法
本明細書に記載される方法、組成物、および細胞を用いて、例えば、生着を高める、ＧＶＨＤおよび移植片拒絶を予防する、前処置および免疫抑制の必要性を低減する、またはこれらの組合せによって、移植の結果（例えば、造血幹細胞移植）を改善することができる。例えば、本明細書に記載される方法、組成物、および細胞は、ＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶を予防または治療する治療法、例えば、１回療法または複数回投与療法を提供する。
【０２０７】
一実施形態では、本療法は、対象、例えば、マッチする、もしくはマッチしない移植（例えばアロ−ＨＳＣＴ）後のレシピエントにおけるＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶の発生を予防、阻害、または低減する。別の実施形態では、本療法は、対象、例えば、マッチする、もしくはマッチしない移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）後のレシピエントにおけるＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶の重症度を予防、阻害、または低減する。例えば、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子もしくは遺伝子座をノックアウトまたはノックダウンすることによる、１つまたは複数のドナーＨＬＡ対立遺伝子の不活性化、ならびに１つまたは複数のレシピエントマッチＨＬＡ対立遺伝子を、例えば、ノックインなどにより、ドナー細胞（例えば、本明細書に記載される細胞、例えば、ＨＳＰＣ）に供給することによって、対象、例えば、マッチする、部分的にマッチする、ハプロタイプが同一である、もしくはミスマッチの移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）後のレシピエントにおけるＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶の発生または重症度を予防、阻害、または低減することができると考えられる。
【０２０８】
一実施形態では、本療法は、対象、例えば、マッチもしくはミスマッチ移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）後のレシピエントにおける骨髄破壊的前処置を予防、減少、またはその必要性をなくす、またはその強度を軽減する。
【０２０９】
一実施形態では、本療法は、対象、例えば、マッチする、もしくはマッチしないアロ−ＵＣＴ後のレシピエントにおけるＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶の発生を予防、阻害、または軽減する。別の実施形態では、本療法は、対象、例えば、マッチする、もしくはマッチしないアロ−ＵＣＴ後のレシピエントにおけるＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶の重症度を予防、阻害、または軽減する。一実施形態では、例えば、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子もしくは遺伝子座をノックアウトまたはノックダウンすることによる、１つまたは複数のドナーＨＬＡ対立遺伝子の不活性化、ならびに１つまたは複数のレシピエントマッチＨＬＡ対立遺伝子を、例えば、ノックインなどにより、ドナー細胞（例えば、本明細書に記載される細胞、例えば、ＨＳＰＣ）に供給することによって、対象、例えば、マッチする、部分的にマッチする、ハプロタイプが同一である、もしくはミスマッチアロ−ＵＣＴ後のレシピエントにおけるＧＶＨＤおよび／もしくは移植片拒絶の発生または重症度を予防、阻害、または軽減することができると考えられる。
【０２１０】
一実施形態では、対象、例えば、マッチもしくはミスマッチ移植（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）後のレシピエントは、疾患、例えば、移植、例えば、ＨＳＣＴから利益を受け得る疾患のために、治療を受けているか、または治療を受けたことがある。例示的な疾患として、限定はしないが、悪性疾患、異常ヘモグロビン症、血液疾患、免疫不全、リソソーム蓄積症、または遺伝性もしくは後天性血液疾患が挙げられる。一実施形態では、対象は、抗がん療法、例えば、化学療法または放射線療法を受けているか、または治療を受けたことがある。
【０２１１】
一実施形態では、本療法は、ＧＶＨＤの尤度を低下させる。一実施形態では、対象は、移植（例えば、ＨＳＣＴ）の前にレシピエント対象が受ける、より少ない用量の移植前（例えば、ＨＳＣＴ前）前処置レジメンを受ける。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って改変された移植（例えば、ＨＳＣＴ）による治療は、移植後の免疫抑制（例えば、タクロリムス、プレドニゾロン、プレドニゾン、および／またはその他のステロイド、ＡＴＧ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＭＭＦ、ラパマイシン）の必要性および／または強度を低減する。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って修飾された移植（例えば、ＨＳＣＴ）による治療は、移植前のレシピエント対象の前処置の排除、またはその部分的な軽減を可能にする。
【０２１２】
一実施形態では、対象は、移植片（例えば、ＨＳＣＴ）で治療することができ、ドナー細胞は、レシピエントに対して延命効果を有することが期待される疾患を有する。一実施形態では、対象は、異常ヘモグロビン症、免疫不全、遺伝性もしくは後天性血液疾患、または悪性疾患を有する。一実施形態では、対象は、抗がん療法、例えば、化学療法または放射線療法を受けているか、または治療を受けたことがある。ドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）が、レシピエント細胞に対して延命効果を有することが期待されると共に、疾患が、悪性疾患（例えば、ＩＬ２ＲＧ−ＳＣＩＤ、ＩＬ７Ｒ−ＳＣＩＤ、ＪＡＫ３−ＳＣＩＤ、またはファンコーニ貧血）ではないいずれかの疾患において、本明細書に記載される方法による治療は、移植前のレシピエントに対し、より低用量の前処置または前処置なしの使用を可能にする。一実施形態では、対象は、他の場合、例えば、以下のいずれかの状態：複数の共存症、重度の共存症、ＧＶＨＤもしくは移植片拒絶の高いリスク、高齢、または進行中の感染症の存在のために、移植には不適格となり得る。
【０２１３】
一実施形態では、対象は、血液悪性疾患の治療ために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。一実施形態では、対象は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄単球性白血病、または多発性骨髄腫を有する。
【０２１４】
一実施形態では、対象は、骨髄異形成症候群または骨髄増殖性腫瘍の治療のために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。
【０２１５】
一実施形態では、対象は、固形腫瘍の治療のために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。一実施形態では、対象は、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫およびグリオーマ、または線維形成性小細胞腫瘍を有する。
【０２１６】
一実施形態では、対象は、非悪性病状の治療のために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。一実施形態では、対象は、異常ヘモグロビン症、血液疾患、サラセミア（例えば、βサラセミアまたはαサラセミア）、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、または先天性骨髄性ポルフィリン症を有する。
【０２１７】
一実施形態では、対象は、免疫不全の治療のために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。一実施形態では、対象は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）（例えば、オーメン（Ｏｍｅｎｎ’ｓ）症候群、ＲＡＧ−１  ＳＣＩＤ、ＩＬ２−ＲＧ  ＳＣＩＤ、ＣＤ３−ＳＣＩＤ、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ、もしくはＪＡＫ３−ＳＣＩＤ）、無ガンマグロブリン血症、ウィスコット・オルドリッチ（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ）症候群、高免疫グロブリンを伴うＸ連鎖免疫不全Ｍ、Ｘ連鎖ブルトン型無ガンマグロブリン血症、露出リンパ球症候群、軟骨毛髪形成不全症、チェディアック・東（Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ）症候群、慢性肉芽腫症、コストマン（Ｋｏｓｔｍａｎ’ｓ）症候群、または白血病粘着不全症を有する。
【０２１８】
一実施形態では、対象は、リソソーム蓄積症の治療のために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。一実施形態では、対象は、αマンノシドーシス、副腎白質ジストロフィー、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症（全タイプ）、ニーマン・ピック（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ）病、またはウォルマン（Ｗｏｌｍａｎｓ）病を有する。
【０２１９】
一実施形態では、対象は、以下：先天性角化不全症、家族性血球貪食性リンパ組織球症、血友病Ａ型、乳児性大理石骨病、骨形成不全症、またはシュワッハマン・ダイアモンド（Ｓｈｗａｃｈｍａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ）症候群から選択される疾患の治療のために、移植片、例えば、ＨＳＣＴを必要とする。
【０２２０】
一実施形態では、対象は、前処置を妨げる進行中の感染症または共存症を有する。一実施形態では、対象は、５０歳を超える年齢であり、移植前の前処置を忍容できない。
【０２２１】
一実施形態では、対象は、後天性血液免疫不全症ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する。一実施形態では、ドナー細胞は、例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子媒介性不活性化（例えば、ノックアウトもしくはノックダウン）により、不活性化された１つまたは複数のＨＩＶ副受容体を有する（例えば、ＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４）。ＨＬＡ修飾ドナー細胞における１つまたは複数のＨＩＶ副受容体の不活性化は、造血再構成後の細胞子孫のＨＩＶ感染を予防することができる。
【０２２２】
本明細書に記載される方法および組成物は、不適合性ＨＬＡを不活性化すると共に、レシピエントマッチＨＬＡを供給して、ドナー細胞（例えば、アロ−ＨＳＰＣ）の移植後の潜在的病原体に対する免疫系の認識および防御における多様性および複雑性を維持するためのドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）の修飾に重点を置く。本明細書に記載される方法および組成物はまた、ＧＶＨＤをさらに予防すること（例えば、ＧＶＨＤを被りやすい組織へのアロ反応性Ｔ細胞遊走を阻止するために、アロ−ＨＳＰＣにおけるケモカイン受容体のノックアウトもしくは抑制）、生着を高め、ならびに／または血液性および非血液性双方の疾患を修正する（例えば、タンパク質置換療法のための分泌タンパク質をコードする遺伝子の導入、生着の向上および／または、万一悪性疾患の再発が将来起こる場合には、より高い用量の化学療法薬の支持のための化学療法耐性遺伝子をコードする遺伝子の導入）ことを目的として、ドナー細胞（例えば、アロ−ＨＳＰＣ）に対する追加的非ＨＬＡ遺伝子修飾を含んでもよい。本明細書に記載される方法および組成物は、対象特異的ＨＬＡ修飾が、対立遺伝子特異的（例えば、染色体６の１つのＨＬＡ遺伝子座での１コピー上での片アレル破壊）となり得るように、バイオインフォマティクスシステムを使用して、現在まで検出および報告されたＨＬＡ対立遺伝子に対する標的特異的ｇＲＮＡを同定および評点する。
【０２２３】
遺伝子または遺伝子座を改変する方法
１つまたは複数の免疫原性遺伝子もしくは遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子もしくは遺伝子座、例えば、ＨＬＡ対立遺伝子、ハプロタイプ、もしくは遺伝子座は、本明細書に記載される方法によって改変することができる。
【０２２４】
移植のためのＨＬＡマッチ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連アプローチ
ヒト対象への移植のためのＨＬＡマッチ細胞（例えば、本明細書に記載される細胞、例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ）は、複数ステップ（例えば、２ステップ）プロセスにより、マッチしない、部分的にマッチする、またはハプロタイプが同一のドナー細胞（例えば、ＨＰＳＣ）から作製することができる。
【０２２５】
一ステップでは、１つまたは複数のミスマッチＨＬＡ対立遺伝子、例えば、部分的にマッチするドナー細胞の発現を不活性化する。例えば、不活性化ステップは、次のステップの１つまたは複数を含み得る：１）ドナーとレシピエントの細胞において、例えば、ＭＨＣ遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−ＤＲＢ１遺伝子座などでの高解像度ＨＬＡタイピングの実施、２）ドナーに存在するが、レシピエント対象には存在しない標的遺伝子座もしくは遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ）で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１）に特異的なｇＲＮＡのバイオインフォマティクスに基づくデザイン、階層化、およびスクリーニング、３）個別のミスマッチＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１）の発現の破壊（例えば、ノックアウトもしくはノックダウン）するためのＣａｓ９および標的特異的ｇＲＮＡの送達、４）標的化遺伝子座での遺伝子破壊の検証、ならびに５）フローサイトメトリーおよびＮＫ細胞溶解アッセイ（ＮＫ細胞は、ＨＬＡクラスＩ抗原を下方制御する細胞を認識し、細胞溶解を誘導する）による細胞表面でのＨＬＡ発現の消失の検証。
【０２２６】
別のステップでは、１つまたは複数のマッチレシピエント対象ＨＬＡ対立遺伝子をコードするＤＮＡ配列をドナー細胞に導入する。例えば、マッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入するステップは、次のステップの１つまたは複数を含み得る：１）標的化遺伝子座のレシピエント対象特異的対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の場合、対立遺伝子変異体ＨＬＡ−Ａ＊３０１）をコードするレシピエント対象からのｃＤＮＡの作製、２）レシピエントの内在性プロモーター（例えば、ＨＬＡ−Ａプロモーター）が、発現の転写調節のためにレシピエント対象特異的ＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊３０１）をコードするＤＮＡ配列の上流に位置するトランスジーン発現カセットのアセンブリー、３）ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）もしくは非ウイルス送達系を用いた、ドナー細胞へのトランスジーン発現カセット（例えば、プロモーターおよびＨＬＡ対立遺伝子ＤＮＡ）の送達。あるいは、一実施形態では、ＨＬＡレシピエント対象対立遺伝子特異的トランスジーン発現カセットは、「セーフ・ハーバー」遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５）または本来の遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ）への組み込みを標的化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてドナー細胞に送達してもよい。
【０２２７】
１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化するステップ、および１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入するステップは、任意の順序で実施することができる。一実施形態では、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化するステップは、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入するステップの前に実施される。別の実施形態では、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化するステップは、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入するステップの後に実施される。また別の実施形態では、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化するステップは、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入するステップと同時に実施される。
【０２２８】
遺伝子編集の前および後に、細胞寿命および細胞（例えば、ＨＳＰＣ）表現型および機能性の維持を促進すると共に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ構成要素への曝露から細胞免疫応答を防御するために最適化された細胞培養条件下で、細胞を培地（例えば、ＨＳＰＣ支持培地）中で培養することができる（実施例を参照されたい）。細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）維持を促進すると共に、分化を阻止するために最適化された条件下で拡大または培養することができる。最適化細胞培養条件については、本明細書で説明する。一実施形態では、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化する前に最適化条件下で拡大または培養する。一実施形態では、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化した後、最適化条件下で拡大または培養する。一実施形態では、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入する前に最適化条件下で拡大または培養する。一実施形態では、細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入した後、最適化条件下で拡大または培養する。一実施形態では、細胞（ＨＳＰＣ）は、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化した後で、かつ１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入する前に、最適化条件下で拡大または培養する。一実施形態では、細胞（ＨＳＰＣ）は、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を導入した後で、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子を不活性化する前に最適化条件下で拡大または培養する。
【０２２９】
マッチしない遺伝子の不活性化およびマッチ遺伝子置換のプロセスは、特定のＨＬＡが欠失した細胞のＮＫ媒介性溶解を阻止し、ＨＬＡ対立遺伝子発現の多様性を維持することにより、移植後の生体内免疫機能を保持すると共に（例えば、アロ−ＨＳＣＴ）、ドナーとレシピエントの対象細胞間のＨＬＡマッチングレベルを高めることにより、ＧｖＨＤの重症度および／または発生を低減することができる。
【０２３０】
ｇＲＮＡのデザインおよびスクリーニング
現在まで記録されたＨＬＡ対立遺伝子変異体を含む一般に入手可能なデータセット（ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）を用いて、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、ＤＲＢ１、−ＤＲＢ３／４／５、および−ＤＱＢ１遺伝子座について報告されている個別の対立遺伝子に高度に特異的なｇＲＮＡ配列を含むデータベースが構築および確立され、これは、全ての対立遺伝子を、これらの個々の対立遺伝子が提示されるヒト対象の系統、人種、または民族バックグラウンドと相互参照する（Ｍａｒｓｈ，Ｓ．Ｇ．Ｅ．（２０１５），Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  ｓｙｓｔｅｍ，ｕｐｄａｔｅ  Ｍａｒｃｈ  ２０１５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔａｎ．１２５８１；Ｍａｉｅｒｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；６８（９）：７７９−７８８）（対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ例および詳細なデータベース設計については、「ｇＲＮＡ」および「実施例」のセクションを参照されたい）。下記の数の対立遺伝子変異体が、データベースに含まれた：ＨＬＡ−Ａ（３０９４対立遺伝子）、ＨＬＡ−Ｂ（３８６５対立遺伝子）、ＨＬＡ−Ｃ（２６１８）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（１７１９）、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５（９５）、ＨＬＡ−ＤＱＢ１（７７７対立遺伝子）。データベースを用いて、データベースに示される数千の対立遺伝子変異体のうちの１つに特異的なｇＲＮＡを選択することができる。さらに、本明細書に記載されるデータベースは、１つまたは複数のｇＲＮＡにより両アレル破壊を可能にする対立遺伝子特異性なしで、個別のＨＬＡ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡを同定し、階層化することもできる。対立遺伝子変異体、ｇＲＮＡ、および系統を既存の臍帯血および骨髄ドナー登録と関連付けることによって、レシピエント対象でマッチするアロ−ＨＳＣＴのために後に修飾することができる部分的にマッチするドナーを相互参照し、同定することができる。
【０２３１】
片アレルおよび両アレルＨＬＡ標的化
１遺伝子座の１対立遺伝子（母系もしくは父系のいずれか）が、ドナー細胞とレシピエント対象の間でマッチしない場合、対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムと一緒に用いて、対立遺伝子特異的遺伝子産物の発現をノックアウトまたはノックダウンすることができる。さらに、細胞ドナーとレシピエント対象がマッチしないか、またはハプロタイプが同一である場合、単一の染色体上の複数のＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、および−ＤＲＢ１）で個別の対立遺伝子の多重ノックアウトまたはノックダウンを、ドナー細胞中のミスマッチ（マッチしない）ハプロタイプを標的化する対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ分子の共送達、続いてレシピエントマッチハプロタイプの供給によって、適用することができる。この多重ゲノム編集の例は、ドナーとレシピエント間のマッチングをそれぞれ３／６または４／８から６／６または８／８に増大し、これによって、ハプロタイプ同一のマッチドナー（例えば、染色体６の１コピーではＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＲＢ１ミスマッチで、第２コピーは染色体６上でマッチ）を完全にマッチするドナーに変換し得る。しかし、１遺伝子座の双方の対立遺伝子（母系および父系）が、ドナーとレシピエントの間でミスマッチである（例えば、ＨＬＡ−Ａの両対立遺伝子）場合には、遺伝子特異的であるが、非対立遺伝子特異的ｇＲＮＡを、遺伝子座の両アレル破壊のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と一緒に用いることができる。いずれのシナリオでも、ノックアウトまたはノックダウンされる遺伝子をレシピエント特異的対立遺伝子で置換することにより、ドナーとレシピエント間のＨＬＡマッチングを高めて、対象におけるＨＬＡ多様性を保持することができる。
【０２３２】
例えば、ドナー細胞におけるＨＬＡ−Ａの両アレル破壊後に、２つのレシピエント特異的ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を、従来の非ウイルスまたはウイルス送達方法を用いて、トランスジーン発現カセット内の同種異系ドナー細胞に送達することができる。配列決定、修飾ドナー細胞およびレシピエント細胞の比較タイピング、ならびに発現および機能アッセイによってＨＬＡ置換が確認されたら、ＨＬＡ編集ドナー細胞を造血再構成のためにレシピエントに移植することができ、対象は、移植対象のための医療の現行基準に従って治療される。あるいは、一実施形態では、ドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）におけるミスマッチＨＬＡ対立遺伝子を標的化するＫＲＡＢおよびＤＮＭＴと融合させたｅｉＣａｓ９を用いて、ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子の発現を持続的に抑制することも可能である。
【０２３３】
次に、富化、単離、または精製されたミスマッチＨＬＡ対立遺伝子が欠失した細胞集団（例えば、ＨＳＰＣ）を取得するために、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子が不活性化されるドナー細胞を選別することができる。
【０２３４】
標的化ＨＬＡ遺伝子座の対立遺伝子の不活性化の検証
１つまたは複数のＨＬＡ対立遺伝子がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９活性により不活性化されたことを検証するために、従来の方法（例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、またはフローサイトメトリーの１つまたは複数）を用いて、標的化前および標的化後のドナー細胞を、対立遺伝子配列または対立遺伝子の発現の改変についてアッセイすることができる。一実施形態では、ゲノム編集を含むまたは含まないドナー細胞をＮＫ細胞と一緒に共培養することができ、ドナー細胞に向けられた細胞傷害活性を定量して、ＨＬＡ発現の下方制御を決定する。検証後に、不活性化された１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子および／または導入された１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を有する細胞を未修飾細胞から、従来の選別方法により、富化、単離、または精製することができる。
【０２３５】
マッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子の導入
マッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子をコードする核酸を従来のウイルスまたは非ウイルス送達方法によりドナー細胞に導入することができる。一実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ、例えば、レシピエントｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡである。別の実施形態では、核酸は、ゲノムＤＮＡ配列である。一実施形態では、複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子をコードする核酸を導入する。一実施形態では、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子をそれぞれコードする複数の核酸を導入する。
【０２３６】
一実施形態では、核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）または非ウイルス送達系（例えば、トランスポゾン）に挿入する。一実施形態では、核酸またはベクターは、導入されたＨＬＡ対立遺伝子を転写的に調節するために、ＨＬＡ遺伝子の特定の内在性プロモーター（例えば、レシピエント遺伝子座からクローニングされた）を含む。
【０２３７】
一実施形態では、レシピエントマッチＨＬＡ対立遺伝子をコードする核酸配列は、例えば、トランスジーン発現カセット内のＨＬＡ対立遺伝子配列近傍に配置されるレシピエント内在性ＨＬＡプロモーターと共に、レンチウイルスベクターに送達される。
【０２３８】
一実施形態では、核酸は、ＳＩＮレンチウイルス発現カセット中に挿入され、レンチウイルスベクター粒子内にパッケージされる。ドナー細胞は、レシピエントＨＬＡトランスジーンを含むレンチウイルスベクターで形質導入することができる。形質導入細胞は、レシピエントＨＬＡ対立遺伝子特異的レンチウイルスベクターと接触していないドナー細胞と比較して、レシピエントＨＬＡ対立遺伝子の発現増大に基づいて選別することができる。あるいは、一実施形態では、レシピエントＨＬＡ対立遺伝子ドナーテンプレートは、セーフ・ハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１もしくはＣＣＲ５）へのＣａｓ９媒介性標的化組み込み、または本来の遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ）へのＣａｓ９媒介性遺伝子置換のために、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ分子を伴う代替方法（例えば、電気穿孔もしくは脂質形質移入）によって、ドナー細胞に共送達することができる。
【０２３９】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構成要素および標的特異的ｇＲＮＡ分子、ならびにレシピエントトランスジーン発現カセットをコードするＩＤＬＶを送達する、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶＤＪ）または非ウイルスベクターをドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）に送達することができる。
【０２４０】
ドナー細胞へのレシピエントマッチＨＬＡ対立遺伝子の導入は、必要に応じて、遺伝子座特異的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、またはｑＰＣＲ（例えば、ゲノム当量当たりのプロウイルスコピー数を決定するための）、ならびにＨＬＡの発現増大をアッセイする（例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを検出する従来の方法に基づいて）ことにより、検証することができる。ＨＬＡの発現は、例えば、１つまたは複数のミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子の不活性化の前または後、１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子の導入前または後に、様々な時点でＮＫ細胞溶解アッセイにより決定することもできる。ドナー細胞が、１つまたは複数の不活性化されたミスマッチドナーＨＬＡ対立遺伝子と、１つまたは複数の導入されたマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を有していれば、ＮＫ媒介性細胞溶解は、最小限からゼロとなる。ＨＬＡ遺伝子編集の前後のドナー細胞のＨＬＡタイピングを従来の方法（例えば、遺伝子座のＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によって確認することができる。ＨＬＡ修飾ドナー細胞は、遺伝子発現分析のためにｑＲＴ−ＰＣＲにより分析することもできる。
【０２４１】
次に、従来の臨床プロトコルおよびレジメンを用いて、ＨＬＡ適合、遺伝子編集ドナー細胞をレシピエント対象に移植することができる。例えば、そうでなければ好適なドナーを見出すことができない、全国骨髄および臍帯血幹細胞バンクで少数しか存在しない対象集団のために好適なドナーを生み出すことができる。
【０２４２】
ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座を改変する方法
本明細書には、遺伝子または遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座における標的位置（例えば、標的ノックアウト位置、標的ノックダウン位置、もしくは標的ノックイン位置）を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、遺伝子における１つまたは複数の遺伝子座もしくは対立遺伝子変異体を改変することによって達成することができる。このアプローチでは、ミスマッチ対立遺伝子が１つまたは複数の特定の対立遺伝子変異体とマッチするように、これらの遺伝子を修飾する。例えば、ドナー細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、レシピエント対象に関連する１つまたは複数のＨＬＡ対立遺伝子とマッチするように修飾することができる。本明細書に記載される遺伝子の対立遺伝子変異体の改変は、ドナーとレシピエントの対象細胞間のＨＬＡマッチングの程度を高める。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
【０２４３】
標的位置の改変は、例えば、以下：
（１）遺伝子のノックアウト：
（ａ）遺伝子中の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介性挿入もしくは欠失）、または
（ｂ）遺伝子の少なくとも一部を含む遺伝子配列の欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介性欠失）、あるいは、
（２）遺伝子のプロモーター領域を標的化することによって、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子またはｅｉＣａｓ９融合タンパク質（例えば、転写レプレッサー）により媒介される遺伝子のノックダウン、
（３）遺伝子へのノックイン（例えば、ＨＤＲによる）
によって達成することができる。
【０２４４】
全てのアプローチが、遺伝子の改変をもたらす。
【０２４５】
ＨＬＡ遺伝子座へのインデルまたは欠失の導入によるＨＬＡ遺伝子座のノックアウト
一実施形態では、本方法は、遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子座のコード領域（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内での１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失を導入するステップを含む。本明細書に記載される通り、一実施形態では、本方法は、ＨＬＡ遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子座のコード領域（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内での１つまたは複数の切断（例えば、一本鎖切断もしくは二本鎖切断）の導入を含む。切断のＮＨＥＪ媒介性修復によって、ＨＬＡ遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子座のコード領域（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内でのインデルのＮＨＥＪ媒介性導入が可能になる。
【０２４６】
一実施形態では、本方法は、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の少なくとも１部分（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内の１部分、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内の１部分）を含むゲノム配列の欠失を導入するステップを含む。本明細書に記載される通り、一実施形態では、本方法は、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）に対して（すなわち、隣接して）一方は５’側および他方は３’側の２つの二本鎖切断の導入を含む。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、非分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）の反対側に２つの二本鎖切断を配置するように、設計される。
【０２４７】
一実施形態では、一本鎖切断は、ＨＬＡ遺伝子座、例えば、ＨＬＡ遺伝子座のコード領域（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内に導入される（例えば、１ｇＲＮＡ分子により配置される）。一実施形態では、単一ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼと共に）を用いて、ＨＬＡ遺伝子座内、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰのコード領域内、またはＨＬＡ遺伝子座内の１位置、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域の下流に、一本鎖切断を生成する。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復配列などの反復要素といった不要な標的染色体要素を回避するように配置される。
【０２４８】
一実施形態では、二本鎖切断は、ＨＬＡ遺伝子座内、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域内に導入される（例えば、１ｇＲＮＡ分子により配置される）。一実施形態では、単一ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ以外のＣａｓ９ヌクレアーゼと共に）を用いて、ＨＬＡ遺伝子座内、例えばＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域内に二本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、二本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座内の１位置、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域の上流または下流のいずれかに位置するように設計される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復配列などの反復要素といった不要な標的染色体要素を回避するように配置される。
【０２４９】
一実施形態では、２つの一本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内に導入される（例えば、２つのｇＲＮＡ分子により配置される）。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子（例えば、１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼと共に）を用いて、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内に２つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、一本鎖切断の双方が、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）の上流もしくは下流に位置するように設計される。別の実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子（例えば、２つのＣａｓ９ニッカーゼと共に）を用いて、ＨＬＡ遺伝子座内、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域内に２つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、一方の一本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）の上流に位置し、第２の一本鎖切断がその下流に位置するように設計される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復配列などの反復要素といった不要な標的染色体要素を回避するように配置される。
【０２５０】
一実施形態では、２つの二本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内に導入される（例えば、２つのｇＲＮＡ分子により配置される）。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼではない１つまたは２つのＣａｓ９ヌクレアーゼと共に）を用いて、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域内、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）とフランキングするように２つの二本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、一方の二本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域内、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）の上流に位置し、第２の二本鎖切断がその下流に位置するように設計される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復配列などの反復要素といった不要な標的染色体要素を回避するように配置される。
【０２５１】
一実施形態では、１つの二本鎖切断と２つの一本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内に導入される（例えば、３つのｇＲＮＡ分子により配置される）。一実施形態では、３つのｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ以外の１つのＣａｓ９ヌクレアーゼおよび１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼと共に）を用いて、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）とフランキングするように１つの二本鎖切断と２つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、二本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）の上流もしくは下流に位置し、２つの一本鎖切断が、その対向部位、例えば、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域内の位置の下流もしくは上流に位置するように設計される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復配列などの反復要素といった不要な標的染色体要素を回避するように配置される。
【０２５２】
一実施形態では、４つの一本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）のコード領域内に導入される（例えば、４つのｇＲＮＡ分子により配置される）。一実施形態では、４つのｇＲＮＡ分子を（例えば、１つまたは複数のＣａｓ９ニッカーゼと共に用いて、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の１位置（例えば、コード領域、例えば早期コード領域内、または非コード領域内、例えばＨＬＡ遺伝子座の非コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル内）とフランキングするように４つの一本鎖切断を生成し、例えば、ｇＲＮＡ分子は、第１および第２の一本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座のコード領域（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内の位置の上流に位置し、かつ第３および第４の一本鎖切断が、ＨＬＡ遺伝子座のコード領域（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）内の位置の下流に位置するように設計される。一実施形態では、切断は、例えば、Ａｌｕ反復配列などの反復要素といった不要な標的染色体要素を回避するように配置される。
【０２５３】
一実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子を１つのＣａｓ９分子と共に使用する。別の実施形態では、２つ以上の（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子を２つ以上のＣａｓ９分子と共に使用するとき、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、他のＣａｓ９分子とは異なる種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子を２つのＣａｓ９分子と共に使用するとき、１つのＣａｓ９分子は、１つの種に由来してよく、他のＣａｓ９分子は、異なる種に由来してよい。所望されれば、双方のＣａｓ９種を用いて、一本鎖または二本鎖切断を生成する。
【０２５４】
酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子により媒介されるＨＬＡ対立遺伝子のノックダウン
標的化ノックダウンアプローチは、機能性遺伝子産物、例えば、機能性ＨＬＡ遺伝子産物（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の発現を低減または排除する。本明細書に記載される通り、一実施形態では、標的化ノックダウンは、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子または転写レプレッサードメインもしくはクロマチン修飾タンパク質と融合したｅｉＣａｓ９を標的化して、ＨＬＡ遺伝子の転写を改変する、例えば、その転写を遮断、抑制、または低減することによって媒介される。
【０２５５】
本明細書で論じられる方法および組成物を用いて、ＨＬＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＤＱＢ１、もしくはＨＬＡ−ＤＰ）の発現を改変することもできる。一実施形態では、プロモーター領域を標的化して、ＨＬＡ遺伝子の発現をノックダウンする。標的化ノックダウンアプローチは、機能性ＨＬＡ遺伝子産物の発現を低減または排除する。本明細書に記載される通り、一実施形態では、標的化ノックダウンは、酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）分子または転写レプレッサードメインもしくはクロマチン修飾タンパク質と融合したｅｉＣａｓ９を標的化して、ＨＬＡ遺伝子の転写を改変する、例えば、その転写を遮断、抑制、または低減することによって媒介される。
【０２５６】
一実施形態では、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９を用いて、１つまたは複数の内在性転写因子の結合を遮断することもできる。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９をクロマチン修飾タンパク質と融合させることができる。クロマチン状態を改変することによって、標的遺伝子の発現低下をもたらすことができる。１つまたは複数のクロマチン修飾タンパク質と融合した１つまたは複数のｅｉＣａｓ９を用いて、クロマチン状態を改変することができる。
【０２５７】
遺伝子配列をノックインする方法
本明細書には、遺伝子または遺伝子座、例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子座における標的位置（例えば、標的ノックイン位置）を改変する方法が開示される。一実施形態では、本方法は、標的化組み込みを含む。一実施形態では、本方法は、１つまたは複数のミスマッチＨＬＡ対立遺伝子が位置する本来の位置に１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を送達するステップを含む。一実施形態では、本方法は、「セーフ・ハーバー」遺伝子座に１つまたは複数のマッチレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を挿入するステップを含む。一実施形態では、本方法は、遺伝子中の生体内選択のための化学療法耐性遺伝子を導入するステップをさらに含んでもよい。標的位置の改変は、例えば、遺伝子配列、例えば本明細書に記載の遺伝子配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子の少なくとも１部分をコードするｃＤＮＡ）を、例えばＨＤＲにより、ノックインすることによって達成することができる。本明細書に記載の遺伝子配列のノックインは、レシピエントマッチＨＬＡ対立遺伝子の発現をもたらす。
【０２５８】
ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座の多重化改変
１つまたは複数の同じ細胞における２つ以上の遺伝子もしくは遺伝子座の改変は、本明細書では「多重化」と呼ぶ。多重化は、１つまたは複数の同じ細胞における少なくとも２つの遺伝子もしくは遺伝子座（例えば、ＨＬＡ遺伝子もしくは遺伝子座）の修飾を構成する。２つ以上の遺伝子または遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＭｉＨＡ、およびいずれか他のＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ遺伝子または遺伝子座）を改変のために標的化する場合、２つ以上の遺伝子または遺伝子座を順次もしくは同時に改変することができる。一実施形態では、ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座の改変は、別のＨＬＡ遺伝子または遺伝子座の改変前もしくは改変後に行う。一実施形態では、ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座の改変は、別のＨＬＡ遺伝子または遺伝子座の改変と同時に行う。一実施形態では、２つ以上のＨＬＡ遺伝子または遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１）は、２つの標的位置に関与するゲノム再編集（例えば、転位）を導入する確率を低下させるために、順次改変する。一実施形態では、改変は、片アレルである。別の実施形態では、改変は、両アレルである。一実施形態では、改変の効果は、相乗的である。ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座の多重改変は、移植（例えば、ＨＳＣＴ）を必要とする対象に好適なドナーを提供し、ＧＶＨＤの重症度および発生率を低減する、より高い尤度を達成する。
【０２５９】
標的細胞の最適化
本明細書に記載される細胞、例えば、標的細胞は、例えば、生体外もしくは生体内で、最適化または操作することができる。標的細胞の最適化または操作によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集または調節の維持、拡大、持続、もしくは調節が可能になる。例えば、標的細胞、例えば造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）などの最適化または操作によって、細胞適合性、機能性、自己再生、もしくは増殖能力を保持するか、またはオートファジー、アポトーシス、壊死、もしくは細胞老化による細胞死を阻止することができる。
【０２６０】
標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、もしくは双方、ならびに任意選択的に、ドナーテンプレート核酸との接触前、接触中、もしくは接触後に最適化または操作することができる。一実施形態では、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素との接触前および接触中に最適化または操作することができる。一実施形態では、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素との接触中および接触後に最適化または操作することができる。一実施形態では、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素との接触前もしくは接触後に最適化または操作することができる。一実施形態では、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素との接触前、接触中もしくは接触後に最適化または操作することができる。
【０２６１】
いくつかの異なる最適化または操作ステップを順次、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触に対し特定の時間間隔で、適用することができる。また、いくつかの異なる最適化または操作ステップを同時に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触に対し特定の時間間隔で、適用することもできる。
【０２６２】
例えば、１つまたは複数のトランスジーンを含有するように、標的細胞を最適化または操作することができる。トランスジーンは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連機構によって、標的細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に組み込むことができる。トランスジーンは、拡大および移植前に修飾細胞の富化および／または精製の調節を可能にし得るセイフティ・スイッチをもたらすことができる。また、一実施形態では、生着した細胞が十分に検出されない場合、トランスジーンは、修飾細胞の拡大を生体内で可能にし、あるいは、修飾細胞が機能不全であるか、または白血病性形質転換を被る場合には、修飾細胞の除去を生体内で可能にすると考えられる。また別の例として、標的細胞は、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子と接触させる、例えば、転写レプレッサーまたはアクチベーターと融合させることにより、最適化または操作することができる。
【０２６３】
切断型細胞表面抗原の導入
細胞表面抗原または選択マーカーを発現する修飾標的細胞の精製は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸が、細胞に、例えば、生体外で送達されたことを保証する手段を提供し得る。また、標的化細胞による細胞表面抗原の発現は、修飾標的細胞を生体内で追跡することも可能にする。
【０２６４】
一実施形態では、標的細胞は、細胞表面抗原または選択マーカーをコードする遺伝子を含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、細胞表面抗原または選択マーカーは、切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）である。別の実施形態では、細胞表面抗原または選択マーカーは、切断型ＣＤ２０（ｔＣＤ２０）である。完全長細胞表面受容体ＣＤ１９およびＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に自然に発現される。ＣＤ１９またはＣＤ２０の切断は、細胞質ドメインが除去されていることから、受容体を介した細胞内シグナル伝達を妨げる（Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１３（８）：９１３−２４）。ＣＤ１９またはＣＤ２０の細胞外ドメインの発現は、細胞上での選別と、生体内で細胞の追跡を可能にし得る（例えば、遺伝子編集細胞の生着をモニターするために、採血し、抗ヒトＣＤ１９または抗ヒトＣＤ２０抗体で細胞を染色することにより）。一実施形態では、ｔＣＤ１９またはｔＣＤ２０トランスジーンを供与体テンプレート核酸として送達する。一実施形態では、トランスジーンが組み込まれる領域からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と標的細胞を接触させる。一実施形態では、ｔＣＤ１９またはｔＣＤ２０トランスジーンは、ゲノム中に、例えばセーフ・ハーバー遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。切断型ＣＤ１９またはＣＤ２０細胞表面抗原の導入もしくは同時導入（マルチプレックスゲノム編集）を用いて、ゲノム編集細胞を生体外で精製するか、またはゲノム編集細胞を生体内でモニターすることができる。
【０２６５】
化学療法耐性トランスジーンまたは自殺遺伝子の導入
本明細書に記載される方法は、所望の特性を有する修飾標的細胞を選択もしくは拡大することができるか、または不要な特性（例えば、白血病性形質転換）を有する修飾標的細胞を排除することができるように、標的細胞の調節を生体内または生体外で可能にする。
【０２６６】
一実施形態では、標的細胞は、例えば、生体外もしくは生体内での所望の標的細胞の選択、または例えば、生体外もしくは生体内での不要な標的細胞の排除を可能にするセイフティ・スイッチを含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、セイフティ・スイッチは、自殺遺伝子および／または化学療法選択マーカーをコードする遺伝子を含有する。例えば、標的細胞は、下記の２つの構成要素を含むセイフティ・スイッチを含有することができる：１）ゲノム編集細胞を生体外で選別するために用いることができ、細胞を生体内で追跡するために用いることができ、さらに、リツキシマブ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体療法薬）の患者への投与により生体内で白血病性形質転換が起こった場合に、細胞を排除するためにも用いることができる、切断型細胞表面抗原（ｔＣＤ２０）および誘導性自殺遺伝子；ならびに２）アルキル化化学療法薬（Ｏ６−ベンジルグアニン［Ｏ６ＢＧ］およびＢＣＮＵ）による患者の治療時に、非編集細胞の除去によってゲノム編集細胞を生体内で選択し、これにより、ゲノム編集細胞を含む骨髄の生体内での再増殖を増大する、薬物誘導性化学療法耐性遺伝子（例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型［Ｐ１４０Ｋ  ＭＧＭＴ］）。
【０２６７】
一実施形態では、標的細胞は、自殺遺伝子を含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）をコードする。一実施形態では、標的細胞は、二量体化の化学誘導剤、例えば、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８とさらに接触させる。理論による拘束は望まないが、カスパーゼ−９は、二量体化の化学誘導剤による治療時に、アポトーシスを誘導すると考えられる（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｅｄ，３６５：１６７３−１６８３）。別の実施形態では、自殺遺伝子は、切断型ＣＤ２０（ｔＣＤ２０）をコードする。一実施形態では、標的細胞は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブとさらに接触させる。抗ＣＤ２０抗体は、免疫応答を誘導して、ＣＤ２０を発現する細胞死を引き起こすことができる（Ｒｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｓ０１６１−５８９０（１５）：００３６１−２）。
【０２６８】
一実施形態では、標的細胞は、化学療法選択マーカーをコードする遺伝子を含むか、またはこれと接触させる。一実施形態では、化学療法選択マーカーは、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼの変異型（例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型）である。一実施形態では、標的細胞は、化学療法薬、例えば、Ｏ６ＢＧ／ＢＣＮＵとさらに接触させる。Ｏ６ＢＧ／ＢＣＮＵ化学療法と組み合わせたメチルグアニンメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型の使用は、レンチウイルス形質導入による送達後に、骨髄中の遺伝子修飾造血幹／前駆細胞のレベルを増加する上で有効である（Ｇｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９（８）：１５２３−９；Ｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２０（７）：２３４５−５４）。
【０２６９】
一実施形態では、トランスジーンは、供与体テンプレート核酸上に提供されるか、または供与体テンプレート核酸として送達される。一実施形態では、トランスジーンが組み込まれる領域からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と標的細胞を接触させる。一実施形態では、トランスジーンは、ゲノム中に、例えばセーフ・ハーバー遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる。一実施形態では、トランスジーンは、ｔＣＤ２０−２Ａ−Ｐ１４０Ｋ２シストロン性トランスジーンカセットを含む。
【０２７０】
ｇＲＮＡ分子の修飾
ウイルス−宿主共進化の間に、ｍＲＮＡのキャッピングを模倣するウイルスＲＮＡキャッピングは進化して、ウイルスＲＮＡが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした（Ｄｅｌｃｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５１−６５）。幹細胞（例えば、ＨＳＰＣ）内のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖ＲＮＡの存在を感知する（Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ（２０１５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２６：２０１−２０９）。初期実験の結果から、ＧＦＰｍＲＮＡ単独で電気穿孔された細胞と比較して、非修飾（例えば、５’キャップもしくは３’ポリＡ−テールなしで合成されたｇＲＮＡ）ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９ｍＲＮＡと共に電気穿孔されたヒトＨＳＰＣは、細胞寿命、増殖能、または複能性の低減（例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化能）を招くことが立証された。この課題に取り組むために、細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の標的細胞感知および自然免疫応答の誘導、ならびにこれに続くプログラム細胞死の誘導および増殖および分化能の喪失によるものであった可能性があると仮定された。外来核酸に対する細胞の自然免疫応答を回避するために、ｍＲＮＡを模倣するようにｇＲＮＡ分子を修飾すること（例えば、５’キャップおよび３’ポリＡテールの付加）によって、細胞における自然免疫応答、細胞におけるインターフェロン応答、細胞老化、または外来核酸の感知により起こるプログラム細胞死を阻止することができる。
【０２７１】
一実施形態では、標的細胞は、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡ分子と接触させる。一実施形態では、標的細胞は、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡ分子を含むＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体と接触させる。標的細胞をキャップおよびテール付加ｇＲＮＡ分子と接触させるステップは、修飾標的細胞の寿命を増加し、標的細胞の複能性、増殖能、もしくは生存能力を保持するか、または細胞老化もしくはプログラム細胞死を阻止することができる。
【０２７２】
疾患を治療または予防する方法
本明細書に記載される方法および組成物は、疾患、例えば、本明細書に記載の疾患を治療または予防する治療法、例えば、１回療法または複数回投与療法を提供する。一部の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、細胞、例えば、本明細書に記載される細胞を例えば、生体外または生体内で改変する。疾患に関連するあらゆる型の細胞を本明細書に記載の方法で改変することができる。例えば、細胞は、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞である。別の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、遺伝子、例えば、本明細書に記載される遺伝子を、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性遺伝子編集によって改変する。細胞または遺伝子の改変（例えば、修正、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、または活性化）は、疾患の発症前または疾患の発症後に実施することができる。本明細書に記載される方法により治療または予防することができる例示的な疾患として、限定はしないが、表１６に列記する疾患が挙げられる。本明細書に記載される方法により改変することができる例示的な遺伝子として、限定はしないが、表１６に列記する遺伝子が挙げられる。
【０２７３】
一実施形態では、遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介方法、あるいは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、レンチウイルスベクター、もしくはアデノ関連ウイルスベクターをはじめとするいずれか他のノックインまたは遺伝子送達方法を用いて、幹細胞中のセーフ・ハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー遺伝子座）、例えば、ＨＳＰＣにノックインする。
【０２７４】
一実施形態では、遺伝子は、分泌された可溶性タンパク質をコードする。分泌された可溶性血液タンパク質をコードする遺伝子のノックインを用いて、表１６に列記する疾患をはじめとする疾患、例えば、リソソーム蓄積症、グリコーゲン蓄積症、ムコ多糖症、またはタンパク質の分泌が疾患を改善するいずれかの疾患を治療または治癒することができる。
【０２７５】
一実施形態では、疾患は、循環血液タンパク質の欠乏に関連する。例示的な疾患として、限定はしないが、血友病（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）、Ａ１ＡＴ欠乏症、またはライソゾーム酸性リパーゼ欠損症が挙げられる。欠乏に関連する分泌可溶性血液タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、タンパク質の循環血液レベルを高めることから、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、疾患は、血友病、例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂである。一実施形態では、遺伝子は、凝固因子ＶＩＩＩをコードするＦ８遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｆ８遺伝子をノックインするステップを含み、これによって血友病Ａを治療または治癒する。別の実施形態では、遺伝子は、凝固因子ＩＸをコードするＦ９遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｆ９遺伝子をノックインするステップを含み、これによって血友病Ｂを治療または治癒する。一実施形態では、疾患は、Ａ１ＡＴ欠乏症である。一実施形態では、遺伝子は、α−１−抗トリプシンをコードする、特定遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、またはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列である。一実施形態では、本方法は、特定遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、またはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列をノックインするステップを含み、これによってＡ１ＡＴ欠乏症を治療または予防する。一実施形態では、疾患は、ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症である。一実施形態では、遺伝子は、ライソゾーム酸性リパーゼをコードするＬＡＬ遺伝子であり、これによってライソゾーム酸性リパーゼ欠損症を治療または予防する。
【０２７６】
一実施形態では、疾患は、糖尿病である。一実施形態では、遺伝子は、分泌された可溶性血液タンパク質をコードする。例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下で、分泌された可溶性血液タンパク質をコードする遺伝子のノックインにより、このタンパク質の循環血液レベルを高めることから、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、タンパク質インスリンをコードするＩＮＳ遺伝子である。一実施形態では、遺伝子は、タンパク質グルカゴンをコードするＧＣＧ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下で、ＩＮＳ遺伝子またはＧＣＧ遺伝子をノックインするステップを含み、これによって糖尿病を治療または予防する。
【０２７７】
一実施形態では、疾患は、成長ホルモン欠乏症である。一実施形態では、遺伝子は、成長ホルモンをコードするＧＨ遺伝子である。例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下での、ＧＨ遺伝子のノックインにより、循環成長ホルモンレベルを高めることから、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、本方法は、例えばドラッガブル、誘導可能または選択可能なプロモーターの制御下で、ＧＨ遺伝子をノックインするステップを含み、これによって成長ホルモン欠乏症を治療または予防する。
【０２７８】
一実施形態では、疾患は、がん、例えば、血液のがんである。一実施形態では、遺伝子は、がんにおいて過剰発現される遺伝子である。例えば転写レプレッサーに融合したｅｉＣａｓ９分子による遺伝子のノックダウンが、疾患を改善または治癒する。一実施形態では、遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＧＦＲ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって、がんの進行および転移を治療または予防する。
【０２７９】
一実施形態では、疾患は、遺伝性血液浮腫である。一実施形態では、遺伝子は、遺伝性血液浮腫において低発現される遺伝子である。例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒する。一実施形態では、遺伝子は、Ｃ１ＩＮＨ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｃ１ＩＮＨ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって、血液浮腫を治療または予防する。
【０２８０】
一実施形態では、疾患は、フォン・ヴィレブランド病である。一実施形態では、遺伝子は、フォン・ヴィレブランド病において低発現される。一実施形態では、例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒する。一実施形態では、遺伝子は、ＶＷＦ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＶＷＦ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって、フォン・ヴィレブランド病を治療または予防する。
【０２８１】
一実施形態では、疾患は、遺伝性または後天性貧血である。一実施形態では、遺伝子は、遺伝性または後天性貧血において低発現される遺伝子である。例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒する。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＰＯ遺伝子を一時的に活性化するステップを含み、これによって、遺伝性または後天性貧血を治療または予防する。
【０２８２】
一実施形態では、疾患は、好中球減少症である。一実施形態では、遺伝子は、好中球減少症において低発現される遺伝子である。例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＣＳＦ２遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＣＳＦ２遺伝子を一時的に活性化するステップを含み、これによって、好中球減少症を治療または予防する。
【０２８３】
一実施形態では、疾患は、成長障害である。一実施形態では、遺伝子は、成長障害において低発現される遺伝子である。例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子による、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＧＨ１である。一実施形態では、本方法は、ＧＨ１遺伝子を一時的に活性化するステップを含み、これによって、成長障害を治療または予防する。
【０２８４】
一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、リウマチ性疾患、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする。例えば転写レプレッサーに融合したｅｉＣａｓ９分子（例えば、誘導性ｅｉＣａｓ９分子）により、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする遺伝子を一時的もしくは持続的に下方制御または阻害することによって、疾患が改善または治癒されることができる。一実施形態では、疾患は、血液のがんである。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＰＯＲ遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって血液のがんを治療または予防する。一実施形態では、疾患は、関節リウマチである。一実施形態では、遺伝子は、ＴＮＦ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＴＮＦ遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって関節リウマチを治療または予防する。一実施形態では、疾患は、炎症性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、Ｃ５遺伝子である。一実施形態では、本方法は、Ｃ５遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって炎症性疾患を治療または予防する。
【０２８５】
一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、リウマチ性疾患、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする例えば転写アクチベーターに融合したｅｉＣａｓ９分子（例えば、誘導性ｅｉＣａｓ９分子）により、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする遺伝子を一時的もしくは持続的に上方制御または活性化することによって、疾患が改善または治癒されることができる。一実施形態では、疾患は、多発性硬化症である。一実施形態では、遺伝子は、ＩＦＮＢ１遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＩＦＮＢ１遺伝子を活性化するステップを含み、これによって多発性硬化症を治療または予防する。
【０２８６】
一実施形態では、疾患は、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、リウマチ性疾患、または腫瘍性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質受容体をコードする。例えば、ｅａＣａｓ９分子による、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、または炎症性タンパク質をコードする遺伝子のノックアウトが、疾患を改善または治癒する。一実施形態では、疾患は、ＨＩＶまたはＡＩＤＳである。一実施形態では、遺伝子はＣＣＲ５である。別の実施形態では、遺伝子は、ＣＸＣＲ４遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、または両方のノックアウトを含み、これによってＨＩＶまたはＡＩＤＳを治療または予防する。
【０２８７】
一実施形態では、疾患は、発作または心筋梗塞である。一実施形態では、遺伝子は、可溶性血液タンパク質、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータまたは尿プラスミノーゲンアクチベータをコードする。例えば、転写に融合したｅｉＣａｓ９分子による、例えば、一時的な、遺伝子の上方制御または活性化が、疾患を改善または予防することができる、例えば、虚血を予防する、または血餅を溶解させる。一実施形態では、遺伝子は、ＰＬＡＴ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＰＬＡＴ遺伝子を活性化するステップを含み、これによって発作または心筋梗塞を治療または予防する。
【０２８８】
一実施形態では、疾患は、異常ヘモグロビン症である。一実施形態では、遺伝子は、異常ヘモグロビン症を引き起こす突然変異を含む。一実施形態では、遺伝子は、異常ヘモグロビン症を引き起こす突然変異を含まない。上記遺伝子のノックアウトまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができると考えられる。一実施形態では、突然変異を含む遺伝子は、ＨＢＢ、ＨＢＡ１またはＨＢＡ２である。一実施形態では、本方法は、突然変異したＨＢＢ、ＨＢＡ１またはＨＢＡ２遺伝子を修正するステップを含み、これによって鎌状赤血球症、αサラセミア、またはβサラセミアを治療または予防する。一実施形態では、遺伝子は、ＢＣＬ１１Ａである。一実施形態では、本方法は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックアウトを含み、これによって鎌状赤血球症またはβサラセミアを治療または予防する。
【０２８９】
一実施形態では、疾患は、貧血である。一実施形態では、遺伝子は、例えば赤血球ピルビン酸キナーゼ欠乏による貧血、例えば、溶血性貧血を引き起こす突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正により貧血を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＰＫＬＲである。一実施形態では、本方法は、野生型ＰＫＬＲ遺伝子中のノックインを修正するステップまたは突然変異ＰＫＬＲ遺伝子を修正するステップを含み、これによって、貧血、例えば、溶血性貧血を治療または予防する。
【０２９０】
一実施形態では、疾患は、凝固因子障害、例えば、血友病Ａである。一実施形態では、遺伝子は、凝固因子障害を引き起こす突然変異を含む。上記遺伝子の修正が、凝固因子障害を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、Ｆ８である。一実施形態では、本方法は、突然変異Ｆ８遺伝子を修正するステップを含み、これによって血友病Ａを治療または予防する。
【０２９１】
一実施形態では、疾患は、代謝障害、例えば、ムコ多糖症Ｉ型である。一実施形態では、遺伝子は、代謝障害を引き起こす突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正によって代謝障害を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＩＤＵＡ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＩＤＵＡ遺伝子におけるノックインまたは突然変異ＩＤＵＡ遺伝子の修正を含み、これによってムコ多糖症Ｉ型を治療または予防する。
【０２９２】
一実施形態では、疾患は、免疫不全、例えば、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症である。一実施形態では、遺伝子は、免疫不全を引き起こす突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＩＬ２ＲＧ遺伝子のノックインまたは突然変異ＩＬ２ＲＧ遺伝子の修正を含み、これによってＸ連鎖重症複合免疫不全症を治療または予防する。
【０２９３】
一実施形態では、疾患は、骨髄性免疫不全、例えば、慢性肉芽腫性疾患である。一実施形態では、遺伝子は、骨髄性免疫不全を引き起こす突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＮＣＦ１遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＮＣＦ１遺伝子のノックインまたは突然変異ＮＣＦ１遺伝子の修正を含み、これによって慢性肉芽腫性疾患を治療または予防する。
【０２９４】
一実施形態では、疾患は、βリンパ系または免疫グロブリン欠損症、例えば、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症である。一実施形態では、遺伝子は、βリンパ系または免疫グロブリン欠損症に関連する突然変異を含む。遺伝子のノックインまたは修正が、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＢＴＫ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＢＴＫ遺伝子のノックインまたは突然変異ＢＴＫ遺伝子の修正を含み、これによってＸ連鎖無ガンマグロブリン血症を治療または予防する。
【０２９５】
一実施形態では、疾患は、血球減少症、例えば、先天性無巨核球性血小板減少症Ｉ型である。一実施形態では、遺伝子は、血球減少症に関連する突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正により、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＭＰＬ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＭＰＬ遺伝子のノックインまたは突然変異ＭＰＬ遺伝子の修正を含み、これによって先天性無巨核球性血小板減少症Ｉ型を治療または予防する。
【０２９６】
一実施形態では、疾患は、代謝障害、酵素欠乏、輸送障害、または蓄積症、例えば、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型である。一実施形態では、遺伝子は、代謝障害、酵素欠乏、輸送障害、または蓄積症に関連する突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＳＧＳＨ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、野生型ＳＧＳＨ遺伝子のノックインまたは突然変異ＳＧＳＨ遺伝子の修正を含み、これによってムコ多糖症ＩＩＩＡ型を治療または予防する。
【０２９７】
一実施形態では、疾患は、赤血球系疾患、例えば、原発性家族性先天性赤血球増加症である。一実施形態では、遺伝子は、赤血球系疾患に関連する突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、一時的または持続的のいずれかで、ＥＰＯＲ遺伝子をノックダウンするステップを含み、これによって原発性家族性先天性赤血球増加症を治療または予防する。
【０２９８】
一実施形態では、疾患は、赤血球系疾患、例えば、原発性家族性先天性赤血球増加症である。一実施形態では、遺伝子は、赤血球系疾患に関連する突然変異を含む。上記遺伝子のノックインまたは修正によって、疾患を改善または治癒することができる。一実施形態では、遺伝子は、ＥＰＯＲ遺伝子である。一実施形態では、本方法は、ＥＰＯＲ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンするステップを含み、これによって原発性家族性先天性赤血球増加症を治療または予防する。
【０２９９】
表１６は、本明細書に記載の方法によって治療または予防することができる例示的な疾患と、本明細書に記載の方法によって改変することができる例示的な遺伝子を記載する。
【０３００】
【表４３】
2018523977.tif 000044
【０３０１】
【表４４】
2018523977.tif 000045
【０３０２】
【表４５】
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【０３０３】
【表４６】
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【０３０４】
【表４７】
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【０３０５】
【表４８】
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【０３０６】
【表４９】
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【０３０７】
【表５０】
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【０３０８】
一実施形態では、治療は、疾患発症後の対象において開始される。一実施形態では、治療は、疾患の発症後であるが、例えば、疾患の進行を予防するために、疾患進行過程の早期に（例えば、特定症状の発生前に）対象において開始される。一実施形態では、本方法は、例えば、疾患の進行を遅らせるために、疾患の進行期に対象の治療を開始することを含む。
【０３０９】
一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の疾患を有する対象を治療するために使用される。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載の疾患の発症または進行を予防するか、または遅らせるために使用される。
【０３１０】
一実施形態では、本方法は、１つまたは複数の修飾細胞の生存に対する選択的有利性をもたらす。一実施形態では、標的細胞は、修飾されて、遺伝子ノックアウト、ノックイン、ノックダウンまたは修正を有する。修飾されない疾患細胞は、アポトーシスを被り得る。このように、一実施形態では、本明細書に記載の治療後に、修飾細胞は生存するが、非修飾細胞は死滅する。この選択的有利性は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の修飾細胞を含む細胞の最終的なコロニー形成を駆動することができる。
【０３１１】
一実施形態では、本方法は、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子に突然変異を見出す遺伝子検査を受ける対象において治療を開始するステップを含む。
【０３１２】
一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の疾患についての検査結果が陽性である対象において治療を開始するステップを含む。
【０３１３】
一実施形態では、本方法は、疾患の症状もしくは兆候のいずれかを示す疾患の家族歴を有する、および／または疾患に関連する遺伝子に突然変異を有することが判明した対象において治療を開始するステップを含む。
【０３１４】
一実施形態では、本方法は、疾患と一致するか、または疾患に関連する症状が現れた対象を治療するステップを含む。
【０３１５】
一実施形態では、本方法は、対象から細胞を単離するステップを含む。一実施形態では、細胞を生体外で改変した後、対象に戻す（例えば、移植する）。一実施形態では、対象は、細胞を単離した者と同じ対象である。別の実施形態では、対象は、細胞を単離した者とは異なる対象である。一実施形態では、オートロガス幹／前駆細胞を生体外で改変した後、対象に戻す。別の実施形態では、異種幹／前駆細胞を生体外で改変した後、対象に戻す。
【０３１６】
一実施形態では、治療は、本明細書に記載の細胞へのｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、および任意選択的に、供与体テンプレート核酸の送達を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸は、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター、例えばインテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ）によって送達される。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子リボ核タンパク質複合体として送達される。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、ＲＮＡとして送達される。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的遺伝子の少なくとも１つのエキソンを含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、疾患に関連する突然変異を含まない。一実施形態では、テンプレート核酸は、プロモーター配列を含む。別の実施形態では、テンプレート核酸は、プロモーター配列を含まない。一実施形態では、テンプレート核酸は、スプライスドナーまたはアクセプターを含む。別の実施形態では、テンプレート核酸は、ポリアデニル化シグナルを含む。
【０３１７】
移植のための修飾同種異系ドナーＨＳＣ
遺伝性血液遺伝疾患（例えば、鎌状赤血球症）または悪性疾患（例えば、白血病）を患う対象へのドナー同種異系ＨＳＣの移植は、レシピエント患者に置換機能性造血系を提供し得る。部分的にマッチするドナー候補と、移植片を必要とするレシピエント対象との間のＨＬＡマッチングを増大するために、ドナー細胞が遺伝子修飾される場合。このシナリオでは、次善最適ＨＬＡマッチング（例えば、６遺伝子座のうち３である、ドナー候補とレシピエント対象間のマッチング）に基づいて、好適なドナーとして通常除外されるはずのドナー候補が、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子座の遺伝子編集後（例えば、３／６から４／６、５／６、または６／６までマッチングを増加）にドナーとして適格となり得る。しかし、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子座の１つまたは複数のＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子編集は、ミスマッチを低減し得るため、ＨＳＣ移植を必要とする患者に対するＨＳＣドナーとして適格となるのに好適なレベルのＨＬＡマッチングをもたらす（例えば、ＨＬＡ遺伝子座で４／６、５／６、または６／６マッチング）。マッチングを高めるためのドナーＨＳＣの遺伝子編集がなければ、レシピエントは、好適なドナーを得られなくなる（例えば、ＨＬＡ遺伝子座で３／６マッチング）。治療を目的として、レシピエントについて部分的にマッチするドナー（例えば、３／６）を同定し、データベースに入力すると、これは、１つまたは複数のミスマッチＨＬＡ対立遺伝子の欠失を標的化するために使用することができるｇＲＮＡを出力する。遺伝子編集のための最善の戦略（最も低いオフターゲットプロフィール、最も高いオンターゲットプロフィールを有し、多重化の場合には、対向染色体での標的化対立遺伝子編集を促進するｇＲＮＡ）、ならびに最も好適なドナー候補（例えば、ＨＬＡマッチ対立遺伝子で同型接合、ｍｉＨＡで最大のマッチング度、より近い系統バックグラウンド）が選択される。遺伝子編集の効率は、ドナーＴ細胞で試験される（末梢血Ｔ細胞と比較して供給が限定される、ドナーＨＳＣの修飾前）。ドナーＨＳＣは、マッチングを増加するように遺伝子編集された後、修飾ＨＳＣをレシピエント患者に移植することもできる。手短には、ＨＳＣをドナーから収集し、生体外でゲノム編集して、ミスマッチＨＬＡを欠失または破壊した後、免疫磁気ビーズ戦略（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣもしくはＰｒｏｄｉｇｙ）を用いて選別することにより、ＨＬＡ対立遺伝子陰性画分（例えば、陰性選択のための磁気ビーズに共役したＨＬＡ対立遺伝子特異的抗体を含む）を富化する。次に、レシピエントに対するミスマッチが低減したＨＳＣを患者に注入する。しかし、１つの遺伝子座の２つの異なる対立遺伝子を編集する必要がある場合、もう１つの戦略は、ＨＤＲアプローチによる対立遺伝子置換である。ＨＳＣ生着の後、ＨＳＣは、ＨＳＣ子孫（例えば、血液系列、例えば、骨髄細胞、リンパ球、ミクログリア）が低いＧＶＨＤのリスクを有するように、血液系列を再構成することができる。
【０３１８】
ＨＳＣ生着中の免疫再構成のためのリンパ球間橋としてのＨＬＡ修飾Ｔ細胞補充療法
同種異系ＨＳＣ移植を受けている対象は、移植直後の期間に日和見感染のリスクがある。対象は、ＨＳＣ移植の準備のために骨髄破壊的前処置レジメンを受けるが、これは、感染を予防する働きをするＴ細胞をさらに欠失させる。免疫再構成は、対象において数ヵ月を要し得る。この期間中、ドナー由来のＨＳＣは、Ｔ細胞に分化し、胸腺に移動し、抗原に曝露されて、適応免疫を再構成し始める。
【０３１９】
同種異系ＨＳＣ移植を受けている対象において、移植直後の期間中に修飾Ｔ細胞補充療法を使用すれば、適応免疫リンパ球間橋をもたらすことができる。非悪性疾患の場合、ドナーのＴ細胞およびＨＳＣは、本方法に従って修飾され、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性修飾に付されて、ドナーとレシピエント間でミスマッチであるＨＬＡ遺伝子座でのマッチングを高める。修飾、例えば、ＨＬＡ遺伝子座でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性修飾は、ドナーＴ細胞およびＨＳＣをドナーオートロガス免疫系による潜在的拒絶に対して耐性にする。ＨＬＡ遺伝子編集Ｔ細胞は、骨髄破壊的前処置の直後で、同種異系ＨＳＣ移植の前に対象に投与されるか、またはＨＳＣ移植と一緒に共注入されるか、またはＨＳＣ移植後に投与される。これらのＨＬＡ遺伝子編集Ｔ細胞は、ＨＬＡ修飾ＨＳＣ移植片が生着する間、日和見感染に対する短期免疫を賦与する。リンパ球またはＴ細胞補充療法で用いられる修飾Ｔ細胞は、限定的な寿命を有し得る（約２週間から６０日〜１年）（Ｗｅｓｔｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１３；１２２（１３）：２２０５−２２１２）。移植直後の期間中、これらの細胞は、対象に防御免疫を賦与することができる。移植を必要とする患者が、血液のがん（例えば、白血病、リンパ腫）、および移植片対宿主病（より高いＧＶＨＤのリスクは、より高いＴ細胞用量に関連する）を有する場合、免疫防御と、移植片対白血病効果（ＧＶＬ）を均衡させるように、特定のＨＬＡ編集事象および補充Ｔ細胞の細胞用量を変更することができる（Ｍｏｎｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００６  Ｄｅｃ；１２（１２）：１３１８−２５）。本明細書に記載される方法は、ＨＬＡ編集ドナーＨＳＣ細胞が、生体内でリンパ球生成を再構成するまで、適応免疫を維持すると共に、日和見感染を予防するために、１、２、３または複数回投与することができる。
【０３２０】
同種異系ＨＳＣ移植を受けている対象において、移植直後の期間中にＨＬＡ修飾赤血球骨髄およびＴ細胞補充療法を使用すれば、骨髄および適応免疫リンパ球間橋をもたらすことができる。ドナーＨＳＣは、本方法に従って修飾されて、生体外で赤血球骨髄およびリンパ球系前駆細胞に分化する。分化して、ＨＬＡ編集された赤血球骨髄およびリンパ球は、骨髄破壊的前処置の直後で、かつ同種異系ＨＳＣ移植の前に対象に投与されるか、またはＨＳＣ移植片と一緒に共注入されるか、またはＨＳＣ移植後に投与される。分化ＨＬＡ修飾骨髄およびリンパ球は、一緒に投与されるか、または別々に投与され、例えば、修飾、ＨＬＡ修飾赤血球骨髄系前駆細胞は、一投与レジメンで投与され、修飾、ＨＬＡ修飾リンパ球系前駆細胞は、別の投与レジメンで投与される。ＨＳＣ移植を受けた対象へのＨＬＡ修飾、分化骨髄およびリンパ球の投与は、ＨＬＡマッチ自然および適応免疫細胞の短期赤血球骨髄およびリンパ球間橋を賦与する。これらの細胞は、貧血に対する短期保護と、日和見感染に対する短期免疫を賦与する。これらの細胞は、限定的な寿命を有し得る。移植直後の期間中、これらの細胞は、対象の貧血を改善し、対象に防御免疫を賦与することができる。免疫防御と、移植片対宿主病（より高いＧＶＨＤのリスクは、より高いＴ細胞用量に関連する）を均衡させるように、こうした細胞の用量を変更することができる（Ｍｏｎｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００６  Ｄｅｃ；１２（１２）：１３１８−２５）。本明細書に記載される方法は、ドナーＨＳＣ細胞が、骨髄およびリンパ系列を再構成するまで、赤血球骨髄およびリンパ球数を維持するために、１、２、３または複数回投与することができる。
【０３２１】
対立遺伝子特異的遺伝子修飾を含む細胞が富化された治療組成物
角膜移植拒絶率を低減するためのドナー角膜における１、２もしくは３つのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂおよび／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子の生体外破壊（例えば、ノックアウト）
角膜移植は、米国および世界中で一般的な処置である。毎年米国では、４０，０００人を超える患者が角膜移植を受けている。（Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２０１４  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ．Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｔｏｒｅｓｉｇｈｔ．ｏｒｇ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１５／０３／２０１４＿Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ＿Ｒｅｐｏｒｔ−ＦＩＮＡＬ．ｐｄｆ．Ａｃｃｅｓｓｅｄ：Ｊｕｎｅ  １６，  ２０１５）。角膜移植は、角膜の混濁および視力障害を引き起こす角膜ジストロフィー、感染症および外傷について適用される。
【０３２２】
角膜移植患者の約２０％が、角膜拒絶を示し、米国では毎年約６，０００〜８，０００人の患者が、角膜移植の拒絶を経験している（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｎｅａ  ３３（１０）：１００３−９  （２０１４））。拒絶事象を経験する患者は、一般に、移植不全を起こし、後の角膜移植を必要とする。
【０３２３】
角膜移植拒絶を予防するために、眼の免疫抑制など、現在検証中のアプローチがいくつかある。しかし、角膜移植拒絶率は、依然として高く、多くの場合、移植不全を伴う。
【０３２４】
本開示は、角膜移植片拒絶を低減し、最終的に、角膜移植不全率を低下させるために、非マッチＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１の発現を低減することを目標とする。角膜移植片拒絶のマウスモデルにおいて、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現の低減が、移植片拒絶率を低下させることが立証されている（Ｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．７０（６）：７３７−４３  （２０００））。本方法は、非マッチＭＨＣクラスＩ遺伝子を破壊（例えば、ノックアウト）し、これによって、非マッチＭＨＣクラスＩ抗原の発現を低減する。これによって、本方法は移植片拒絶率を低下させることになる。
【０３２５】
本方法は、以下のようにして、ドナー角膜における１、２もしくは３つのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子をノックアウトする。本方法は、本方法を用いて、角膜上皮細胞および間質細胞、例えば、角膜実質細胞をはじめとする角膜細胞を標的化する以外は、ＨＳＣにおいてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）を標的化するために使用される方法と同じである。
【０３２６】
単一のＨＬＡ対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）、例えば、単一のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１のＫＯは、３／６ＨＬＡ対立遺伝子でレシピエントにドナーをマッチさせ、ここで、１／６ドナー対立遺伝子が発現されず、外来抗原認識に関して有効な４／６適合が達成される。単一対立遺伝子のＫＯは、ミスマッチＨＬＡ抗原の発現を低減し、角膜移植片拒絶のリスクを低下させることになる。
【０３２７】
２つのＨＬＡ対立遺伝子の破壊（例えば、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子とＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子、またはＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子のＫＯ）は、３／６ＨＬＡ対立遺伝子でレシピエントにドナーを適合させ、ここで、２／６ドナー対立遺伝子が発現されず、外来抗原認識に関して有効な５／６適合が達成される。２つの対立遺伝子のＫＯは、ミスマッチＨＬＡ抗原の発現を低減し、角膜移植片拒絶のリスクを低下させることになる。
【０３２８】
３つのＨＬＡ対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）（例えば、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子のＫＯ）は、３／６ＨＬＡ対立遺伝子でレシピエントにドナーをマッチさせ、ここで、３／６ドナー対立遺伝子が発現されず、外来抗原認識に関して有効な６／６適合が達成される。３つの対立遺伝子のＫＯは、ミスマッチＨＬＡ抗原の発現を低減し、角膜移植片拒絶のリスクを低下させることになる。
【０３２９】
特定のＨＬＡ対立遺伝子が、角膜移植において、より高い拒絶率に関連する場合、そのＨＬＡ対立遺伝子は、破壊（例えば、ノックアウト）のために標的化されることになる。
【０３３０】
ノックアウトのために標的化されたＨＬＡ対立遺伝子は、実施例１２：「ＨＬＡ遺伝子型のマッチングを促進するためのＨＬＡ対立遺伝子のノックアウト」に見出されるものと同じである。例えば、ＨＬＡ−遺伝子型：
【０３３１】
【表５１】
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【０３３２】
を有するドナー角膜は、ヨーロッパ系集団における最も一般的なＨＬＡハプロタイプを有する。３つのＨＬＡ対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２ｇ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１のノックアウトは、ヨーロッパ系統の個体において最も一般的なＨＬＡハプロタイプを発現する角膜組織を生成するであろう。この組織は、ヨーロッパ系集団の最も大きな割合とマッチする可能性が非常に高い。特定の集団について最も一般的なハプロタイプを有するドナー角膜組織におけるＨＬＡ対立遺伝子の同じ破壊戦略、例えば、ノックアウトは、実施例１２に説明する通り、アフリカ系アメリカ人、ヒスパニック系、およびアジア系の角膜組織について最も一般的なＨＬＡハプロタイプに適用することができる。
【０３３３】
本方法は、ドナー角膜に生体外で適用することができる。角膜細胞は、ＨＬＡ破壊（例えば、ノックアウト）のために生体外で修飾し、修飾後、ドナーに移植することができる。角膜修飾のために標的化される細胞型としては、角膜上皮細胞、例えば、基底細胞、翼細胞、表面細胞、角膜間質細胞、例えば、実質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞が挙げられる。
【０３３４】
より一般的には、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、対立遺伝子特異的遺伝子修飾を有する細胞が富化された治療組成物（例えば、そうした細胞の精製組成物）の生産に有用である。対立遺伝子特異的遺伝子修飾を有する細胞の富化集団を生産する例示的な方法は、２つの大まかなステップを含み、最初に、同定可能な遺伝子産物、すなわち、直接または間接的のいずれかで、検出することができる遺伝子産物をコードする遺伝子の単一の対立遺伝子と結合し、任意選択的に切断もしくは突然変異させることができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに細胞の集団を暴露するか、それと接触させる、遺伝子編集ステップを含む。第２のステップは、遺伝子産物を発現するが、標的化対立遺伝子によりコードされた遺伝子産物の変異体は発現しない細胞を同定、収集および／または分離する（例えば、こうした細胞を「富化する」）ものである。これらのステップのいずれも、以下にさらに詳しく説明する。
【０３３５】
まず、遺伝子編集ステップに関して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメイン中に、編集が望まれる対立遺伝子に特異的な標的配列と相補的な配列を組み込むことによって、遺伝子の単一の対立遺伝子と結合するように、設計され得る。標的化対立遺伝子の標的配列は、例えば、塩基対の違い、挿入、欠失、逆転、複製などによって、ｇＲＮＡ分子と非標的化対立遺伝子との結合を低減または阻止する任意の好適な様式で、非標的化対立遺伝子の配列とは相違し得る。細胞の集団は、富化ステップの生体外実施を促進するために、身体外部でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに曝露させるのが好ましいが、必ずしも必要というわけではなく、治療に有用なあらゆる細胞型もしくは集団であってよく、例えば、血液もしくは骨髄などの組織からの操作されていないか、または最小限に操作された細胞画分、ＨＳＣなどの細胞の精製画分、またはインビトロで精製、処理および／もしくは拡大された集団であってよい。細胞は、それらが後に再導入される対象から採取してもよいし、あるいは、ドナーから採取してもよい。好適な細胞および細胞の集団は、以下の「標的細胞」で概略的に記載され、そうした細胞または集団にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与する手段は、「送達、製剤化および投与経路」で概略的に説明される。
【０３３６】
編集細胞の富化に関しては、これは、ほとんどの（しかし、全てではない）場合、同定可能な遺伝子産物の検出によって促進される。以下に示す例示的な実施形態では、同定可能な遺伝子産物は、細胞表面マーカーであるか、または細胞表面タンパク質複合体の一部を形成し、例えば、蛍光標識抗体および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、抗体検出により生存細胞中で同定することができる。これらのおよびその他のツールは、当技術分野において公知であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）などをはじめとする様々な供給者により市販されている。
【０３３７】
ＨＬＡ対立遺伝子、ならびにそれに対する抗体が入手可能であるか、または作製することができる細胞表面タンパク質をコードするその他の遺伝子産物の場合、例示的なＦＡＣＳによる富化プロセスは、典型的に、対立遺伝子特異的編集プロセスに事前に付した細胞の集団を２つの蛍光抗体：遺伝子編集ステップで標的化された遺伝子の対立遺伝子によりコードされる同定可能な遺伝子産物の第１の変異体に特異的に標的化させた第１の蛍光抗体、および第１のステップで標的化されていない遺伝子の対立遺伝子によりコードされる同定可能な遺伝子産物の第２の変異体に結合する第２の蛍光抗体と接触させるステップを含む。第２の抗体は、第２の変異体に特異的であってもよいし、または第２の変異体および任意選択的に第１の変異体をはじめとする複数の変異体に対する広範な特異性を有してもよい。ＦＡＣＳ選別の間、第１の抗体からの低もしくは無蛍光シグナルにより同定される、第１の変異体を発現しない細胞、ならびに第２抗体からの高シグナルにより同定される、第２の変異体を発現しない細胞についてゲートを設定した後、これらのゲートに入る細胞を収集して、対立遺伝子特異的遺伝子修飾を含む細胞の富化集団を形成する。
【０３３８】
ＦＡＣＳおよびその他のフローサイトメトリー検出方法に加えて、標的化および非標的化対立遺伝子の両方によりコードされる遺伝子産物の検出を可能にする方法であれば、任意の他の好適な検出方法を用いて、編集細胞を富化することができることに留意すべきである。非限定的な例として、共役磁気ビーズおよび直接顕微鏡操作のいずれを使用して、対立遺伝子特異的遺伝子修飾を含む細胞を富化してもよい。非標的化対立遺伝子の検出は、第２の非標的化対立遺伝子によりコードされる変異体に特異的であるか、またはより広範に遺伝子産物の複数もしくは全ての変異体を検出する試薬を用いて実施してもよい。これらの遺伝子産物を検出する上で有用な試薬として、標識もしくはタグ付き抗体、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、アプタマー、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどが挙げられ、これらは、非標的化対立遺伝子によりコードされる遺伝子産物を発現する個別の細胞を同定および収集する上で十分な解像度で、集団内の細胞上もしくは細胞内で検出することができる。遺伝子産物を直接検出する代替方法として、遺伝子の標的化および非標的化対立遺伝子により促進もしくは阻害される物質または細胞状態を検出することが有用となり得る。
【０３３９】
さらに、前述および本開示全体の実施例は、標的化対立遺伝子の欠失またはノックアウトに焦点を合わせているが、標的化対立遺伝子を第２の対立遺伝子に変えるものをはじめとする、他の編集戦略にも容易に適応可能であり、その場合、第２の対立遺伝子は、第１の検出抗体もしくは試薬（すなわち、非修飾、標的化対立遺伝子に特異的な抗体もしくは試薬）によっては検出されないが、遺伝子の良好に編集された対立遺伝子によりコードされる第２の変異体に結合する第２の抗体もしくは試薬によって検出されるものとする。
【０３４０】
Ｉ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
ｇＲＮＡ分子は、この用語の本明細書の用法では、標的核酸へのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の特異的ターゲティングまたはホーミングを促進する核酸である。ｇＲＮＡ分子は、本明細書では「キメラ」ｇＲＮＡ、もしくはモジュラー（２つ以上、典型的には２つの個別のＲＮＡ分子を含む）と呼ぶことがある単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）であってよい。本明細書に提供されるｇＲＮＡ分子は、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列内またはその付近の標的核酸配列と完全もしくは部分的に相補的な核酸配列を含むか、それから構成されるか、またはほぼ構成される標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、第１の相補性ドメイン、結合ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、テールドメイン、および５’伸長ドメインをはじめとする１つまたは複数の追加ドメインをさらに含む。これらのドメインの各々については、以下にさらに詳しく述べる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する天然に存在する配列と同一の、またはそれと配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３４１】
いくつかの例示的なｇＲＮＡ構造を図１Ａ〜１Ｉに示す。ｇＲＮＡの活性形態の３次元形態、または鎖内もしくは鎖間相互作用に関して、高相補性の領域を図１Ａ〜１Ｉ中の二重鎖および本明細書に提供されるその他の描写に示す場合がある。図７は、配列番号４２のｇＲＮＡ配列を用いたｇＲＮＡドメイン命名法を示し、これは、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域内に１つのヘアピンループを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、この領域に２つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の）ヘアピンループを含んでもよい（例えば、図１Ｈ〜１Ｉ）。
【０３４２】
特定の実施形態では、単分子、またはキメラｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’の方向に以下：特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列内の標的ドメインと相補的な標的化ドメイン；第１の相補性ドメイン；結合ドメイン；第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインと相補的である）；隣接ドメイン；および任意選択的に、テールドメインを含む。
【０３４３】
特定の実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’の方向に以下：特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列内の標的ドメインと相補的な標的化ドメイン；および第１の相補性ドメインを含む第１の鎖と；好ましくは５’から３’の方向に以下：任意選択的に、５’伸長ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；および任意選択的に、テールドメインを含む第２の鎖とを含む。
【０３４４】
標的化ドメイン
標的化ドメイン（あるいは、ガイド配列または相補性領域と呼ばれることもある）は、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列内もしくはその付近の核酸配列と相補的であるか、または部分的に相補的な核酸配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。標的化ドメインの全部もしくは一部が相補的であるか、または部分的に相補的である、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列内もしくはその付近の核酸配列は、本明細書では標的ドメインと呼ぶ。特定の実施形態では、標的ドメインは、標的位置を含む。他の実施形態では、標的位置は、標的ドメインの外部（すなわち、その上流もしくは下流）にある。
【０３４５】
標的化ドメインを選択する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｆｕ  ２０１４；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ２０１４を参照のこと）。本明細書に記載される方法、組成物、およびキットで使用するための好適な標的化ドメインの例として、配列番号２１９〜３６１に記載されているものがある。
【０３４６】
標的ドメインを含む標的核酸の鎖は、それが標的化ドメイン配列と相補的であるため、本明細書では「相補鎖」と呼ばれる。標的化ドメインは、ｇＲＮＡ分子の一部であることから、これは、チミン（Ｔ）ではなく、塩基ウラシル（Ｕ）を含み；反対に、ｇＲＮＡ分子をコードするいずれのＤＮＡ分子も、ウラシルではなく、チミンを含むことになる。標的化ドメイン／標的ドメインペアでは、標的化ドメイン中のウラシル塩基は、標的ドメイン中のアデニン塩基と対合することになる。特定の実施形態では、標的化ドメインと標的ドメイン同士の相補性の程度は、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化することを可能にするのに十分なものである。
【０３４７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、コアドメインと任意選択の二次ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、二次ドメインの３’側に位置し、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’側またはその付近に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端の約８〜約１３ヌクレオチドから構成されるか、またはほぼこれらから構成される。特定の実施形態では、コアドメインだけが、標的ドメインの対応部分と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的であり、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、標的ドメインの対応部分と完全に相補的である。他の実施形態では、二次ドメインも、標的ドメインの一部と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン中のコアドメイン標的と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的であるのに対し、二次ドメインは、標的ドメイン中の二次ドメイン標的と相補的であるか、またはそれと部分的に相補的である。特定の実施形態では、コアドメインと二次ドメインは、標的ドメインのそれぞれの対応部分と同程度の相補性を有する。他の実施形態では、コアドメインとその標的同士の相補性の程度および二次ドメインとその標的同士の相補性の程度は異なっていてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、二次ドメインよりその標的に対する相補性の程度が高いのに対し、他の実施形態では、二次ドメインの方が、コアドメインより相補性の程度が高い。
【０３４８】
特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、または２０〜１００ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインまたはコアドメインは、３〜１５、３〜２０、５〜２０、１０〜２０、１５〜２０、５〜５０、または２０〜５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１０＋／−４、１０＋／−５、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、または１６＋／−２、２０＋／−５、３０＋／−５、４０＋／−５、５０＋／−５、６０＋／−５、７０＋／−５、８０＋／−５、９０＋／−５、あるいは、１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０３４９】
標的化ドメインがコアドメインを含む特定の実施形態では、コアドメインは、３〜２０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、コアドメインは、５〜１５または８〜１３ヌクレオチド長である。標的化ドメインが二次ドメインを含む特定の実施形態では、二次ドメインは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。標的化ドメインが、８〜１３ヌクレオチド長のコアドメインを含む特定の実施形態では、標的化ドメインは、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６ヌクレオチド長であり、二次ドメインは、１３〜１８、１２〜１７、１１〜１６、１０〜１５、９〜１４、８〜１３、７〜１２、６〜１１、５〜１０、４〜９、または３〜８ヌクレオチド長である。
【０３５０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと完全に相補的である。同様に、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含む場合、特定の実施形態では、コアドメインと二次ドメインの一方または両方が、標的ドメインの対応部分と完全に相補的である。他の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと部分的に相補的であり、標的化ドメインがコアドメインおよび／または二次ドメインを含むこれらの実施形態のいくつかでは、コアドメインと二次ドメインの一方または両方が、標的ドメインの対応部分と部分的に相補的である。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインの核酸配列、または標的化ドメイン内のコアドメインもしくは標的化ドメインは、標的ドメインまたは標的ドメインの対応部分と少なくとも８０、８５、９０、または９５％相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアもしくは二次ドメインは、標的ドメインまたはその一部と相補的ではない１または複数個のヌクレオチドを含み、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインおよび／または標的化ドメイン内のコアもしくは二次ドメインは、標的ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、コアドメインは、標的ドメインの対応部分と相補的ではない１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的ではない１または複数個のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの１または複数個は、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的ドメインと相補的ではないその５’末端、３’末端、またはその５’末端と３’末端の両方の５ヌクレオチド内に１、２、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。標的化ドメインが、標的ドメインと相補的ではない２個以上のヌクレオチドを含む特定の実施形態では、前記非相補的ヌクレオチドの２個以上は、互いに隣接しており、これらの実施形態のいくつかでは、２個以上の連続した非相補的ヌクレオチドは、標的化ドメインの５’または３’末端の５ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態では、２個以上の連続した非相補的ヌクレオチドは、いずれも、標的化ドメインの５’および３’末端から６ヌクレオチド以上に位置する。
【０３５１】
特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／もしくは二次ドメイン、またはそれらの中の１または複数個のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾をはじめとする修飾を有する。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１または複数個のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、標的化ドメイン、コアドメイン、および／または二次ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化ドメインおよび／または標的化ドメインを含むｇＲＮＡを分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、それぞれの５’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾および／またはそれぞれの３’末端の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび／またはコアもしくは二次ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３５２】
標的化ドメインが、コアおよび二次ドメインを含む特定の実施形態では、コアおよび二次ドメインは、同じ数の修飾を含む。これらの実施形態のいくつかでは、いずれのドメインも修飾を含まない。他の実施形態では、コアドメインは、二次ドメインより多くの修飾を含むか、あるいは、その逆である。
【０３５３】
特定の実施形態では、コアまたは二次ドメイン内を含め、標的化ドメインにおける１または複数個のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、この効率は、以下に記載されるシステムを用いて、候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を備えた候補標的化ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補標的化ドメインは、選択した標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３５４】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの全部が、標的ドメイン中に存在する対応ヌクレオチドと相補的であり、かつそれらとハイブリダイズすることができる。別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８個以上のヌクレオチドが、標的ドメイン中に存在する対応ヌクレオチドと相補的であり、かつそれらとハイブリダイズすることができる。
【０３５５】
第１および第２の相補性ドメイン
第１および第２の相補性（それぞれ、ｃｒＲＮＡ由来のヘアピン配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ由来のヘアピン配列と呼ばれることもある）ドメインは、互いに完全または部分的に相補的である。特定の実施形態では、相補性の程度は、２つのドメインが少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分である。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメイン同士の相補性の程度は、ｇＲＮＡの他の特性と共に、Ｃａｓ９分子の標的核酸への標的化を可能にする上で十分である。第１および第２の相補性ドメインの例は、図１Ａ〜１Ｇに示す。
【０３５６】
特定の実施形態では（例えば、図１Ａ〜１Ｂを参照）、第１および／または第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインとの相補性が不足した１つまたは複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、対応する相補性ドメインと相補的ではない１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含む。例えば、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメイン中の対応ヌクレオチドと対合しない１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、対応する相補性ドメインと相補的ではない第１または第２の相補性ドメイン上のヌクレオチドは、第１および第２の相補性ドメインの間に形成される二重鎖からループアウト（ｌｏｏｐ  ｏｕｔ）する。これらの実施形態のいくつかでは、不対ループアウトは、第２の相補性ドメイン上に位置し、これらの実施形態のいくつかでは、不対領域は、第２の相補性ドメインの５’末端から、１、２、３、４、５、または６番目のヌクレオチドで開始する。
【０３５７】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインは、５〜３０、５〜２５、７〜２５、５〜２４、５〜２３、７〜２２、５〜２２、５〜２１、５〜２０、７〜１８、７〜１５、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、第１の相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインは、５〜２７、７〜２７、７〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、７〜２０、５〜２０、７〜１８、７〜１７、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、第２の相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、各々独立して、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１５＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２、２１＋／−２、２２＋／−２、２３＋／−２、または２４＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインよりも、例えば、２、３、４、５、または６個分長い。
【０３５８】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、５’から３’方向に、５’サブドメイン、中心サブドメイン、および３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインおよび３’サブドメインは、第２の相補性ドメインの３’サブドメインおよび５’サブドメインそれぞれ、と完全または部分的に相補的である。
【０３５９】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの５’サブドメインは、４〜９ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’サブドメインは、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの５’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’ドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの中心サブドメインは、１、２、または３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの中心サブドメインは、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの３’サブドメインは、３〜２５、４〜２２、４〜１８、または４〜１０ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、３’サブドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの３’サブドメインは、４〜９、例えば、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長である。
【０３６０】
第１および／または第２の相補性ドメインは、天然起源のもしくは参照の第１および／または第２の相補性ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、天然起源のもしくは参照の第１および／または第２の相補性ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、もしくは６個以下のヌクレオチドが異なる。これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の相同性を有し得る。
【０３６１】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインもしくはそれらの中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾をはじめとする修飾を有する。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２メチル化を含んでよい。特定の実施形態では、標的化ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、第１および／もしくは第２の相補性ドメインならびに／または第１および／もしくは第２の相補性を含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、そのそれぞれの５’末端、３’末端、またはその５’末端および３’末端の両方の５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。他の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメインは、各々独立して、そのそれぞれの５’末端、３’末端、またはその５’末端および３’末端の両方の５ヌクレオチド以内に修飾を一切含まない。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインの一方または両方は、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３６２】
特定の実施形態では、第１および／または第２の相補性ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムを用いて、候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する候補第１または第２の相補性ドメインを有するｇＲＮＡ分子は、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補相補性ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３６３】
特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインによって形成される二重鎖領域は、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２塩基対長である（あらゆるループアウトまたは不対ヌクレオチドを除く）。
【０３６４】
特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１１の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号４８のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１５の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５０のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、１６の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号５１のｇＲＮＡを参照のこと）。特定の実施形態では、第１および第２の相補性ドメインは、二重鎖化すると、２１の対形成ヌクレオチドを含む（例えば、配列番号２９のｇＲＮＡを参照のこと）。
【０３６５】
特定の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、第１および第２の相補性ドメインの間で交換されて、ポリ−Ｕ配列が除去される。例えば、配列番号４８のｇＲＮＡのヌクレオチド２３と４８またはヌクレオチド２６と４５が交換されて、それぞれ、配列番号４９または３１のｇＲＮＡを生成することができる。同様に、配列番号２９のｇＲＮＡのヌクレオチド２３と３９は、ヌクレオチド５０および６８と交換されて、配列番号３０のｇＲＮＡを生成することができる。
【０３６６】
連結ドメイン
単分子またはキメラｇＲＮＡ中では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインの間に配置されて、これらを結合する働きをする。図１Ｂ〜１Ｅは、結合ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、連結ドメインの一部は、ｃｒＲＮＡ由来領域から、別の部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来領域からのものである。
【０３６７】
特定の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを共有結合する。特定の実施形態では、連結ドメインは、共有結合から構成されるか、またはこれを含む。他の実施形態では、連結ドメインは、第１および第２の相補性ドメインを非共有的に結合する。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０以下のヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、連結ドメインは、１０を超えるヌクレオチド長、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、２〜５、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、または２０〜２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、連結ドメインは、１０＋／−５、２０＋／−５、３０＋／−５、３０＋／−１０、４０＋／−５、４０＋／−１０、５０＋／−５、５０＋／−１０、６０＋／−５、６０＋／−１０、７０＋／−５、７０＋／−１０、８０＋／−５、８０＋／−１０、９０＋／−５、９０＋／−１０、１００＋／−５、または１００＋／−１０ヌクレオチド長である。
【０３６８】
特定の実施形態では、連結ドメインは、天然起源の配列、例えば、第２の相補性ドメインの５’側にあるｔｒａｃｒＲＮＡの配列と相同性を共有するか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、結合ドメインは、本明細書に記載される結合ドメイン、例えば図１Ｂ〜１Ｅの結合ドメインと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％の相同性を有するか、またはそれらと１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドしか違わない。
【０３６９】
特定の実施形態では、連結ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、連結ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、以下に記載する修飾などの修飾を有する。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、連結ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、連結ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、連結ドメインおよび／または連結ドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、連結ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、連結ドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、連結ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３７０】
特定の実施形態では、連結ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムを用いて候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性の程度、または修飾の程度を有する候補連結ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムで評価することができる。候補連結ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３７１】
特定の実施形態では、連結ドメインは、典型的に、第１の相補性ドメインの３’末端、および／または第２の相補性ドメインの５’末端に隣接するか、またはそれから１、２、または３ヌクレオチド以内である、二重鎖領域を含む。これらの実施形態のいくつかでは、連結領域の二重鎖領域は、１０＋／−５、１５＋／−５、２０＋／−５、または３０＋／−５塩基対の長さである。特定の実施形態では、連結ドメインの二重鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対の長さである。特定の実施形態では、二重鎖領域を形成する配列は、完全に相補的である。他の実施形態では、二重鎖領域を形成する配列の一方または両方は、他方の二重鎖配列と相補的ではない１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド）を含む。
【０３７２】
５’伸長ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーｇＲＮＡは、５’伸長ドメイン、すなわち、第２の相補性ドメインの５’側に１つまたは複数の追加ヌクレオチドを含む（例えば、図１Ａを参照）。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、２〜１０以上、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長以上である。
【０３７３】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインヌクレオチドは、例えば、セクションＶＩＩＩで提供されるタイプの修飾などの修飾を含まない。しかし、特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、分解の影響を受けにくくする、または例えば、より低い免疫原性などより生体適合性にする修飾などの１つまたは複数の修飾を含む。一例として、５’伸長ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで、または以下に記載のその他の修飾で、修飾され得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインのヌクレオチドは、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、または以下に記載のその他の修飾などの２’修飾（例えば、リボース上の２’位置での修飾）を含み得る。
【０３７４】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、１、２、３、４、５、６、７または８程度の数の修飾を含み得る。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその５’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、モジュラーｇＲＮＡ分子中などのその３’末端の５ヌクレオチド以内に、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
【０３７５】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドに、修飾を含む。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態では、５’伸長ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、５’伸長ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または５’伸長ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れたクレオチドは、修飾されていない。
【０３７６】
５’伸長ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価されるｇＲＮＡ分子効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補５’伸長ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステム中で評価され得る。候補５’伸長ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０３７７】
特定の実施形態では、５’伸長ドメインは、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の５’伸長ドメインと、本明細書、例えば、図１Ａ〜１Ｇに記載される５’伸長ドメインなどの参照５’伸長ドメインと、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９５％の相同性を有し、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３７８】
隣接ドメイン
図１Ａ〜１Ｇは、隣接ドメインの例を提供する。特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、６＋／−２、７＋／−２、８＋／−２、９＋／−２、１０＋／−２、１１＋／−２、１２＋／−２、１３＋／−２、１４＋／−２、１４＋／−２、１６＋／−２、１７＋／−２、１８＋／−２、１９＋／−２、または２０＋／−２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、隣接ドメインは、５〜２０、７〜１８、９〜１６、または１０〜１４ヌクレオチド長である。
【０３７９】
特定の実施形態では、隣接ドメインは、天然起源の隣接ドメインと相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、本明細書に開示される隣接ドメイン、例えば、図１Ａ〜１Ｇに記載されるものを含む、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの天然起源の隣接ドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３８０】
特定の実施形態では、隣接ドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、隣接ドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、本明細書に記載される修飾などの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、隣接ドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、隣接ドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、隣接ドメインおよび／または隣接ドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、隣接ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、隣接ドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３８１】
特定の実施形態では、隣接ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるシステムで候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補隣接ドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムで評価することができる。候補隣接ドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３８２】
テールドメイン
多様なテールドメインが、本明細書に開示されるｇＲＮＡ分子での使用に好適である。図１Ａおよび図１Ｃ〜１Ｇは、そのようなテールドメインの例を提供する。
【０３８３】
特定の実施形態では、テールドメインは、存在しない。他の実施形態では、テールドメインは、１〜１００ヌクレオチド長、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインは、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜５０、１０〜１００、２０〜１００、１０〜９０、２０〜９０、１０〜８０、２０〜８０、１０〜７０、２０〜７０、１０〜６０、２０〜６０、１０〜５０、２０〜５０、１０〜４０、２０〜４０、１０〜３０、２０〜３０、２０〜２５、１０〜２０、または１０〜１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールドメインは、５＋／−５、１０＋／−５、２０＋／−５、２５＋／−１０、３０＋／−１０、３０＋／−５、４０＋／−１０、４０＋／−５、５０＋／−１０、５０＋／−５、６０＋／−１０、６０＋／−５、７０＋／−１０、７０＋／−５、８０＋／−１０、８０＋／−５、９０＋／−１０、９０＋／−５、１００＋／−１０または１００＋／−５ヌクレオチド長である。
【０３８４】
特定の実施形態では、テールドメインは、天然起源のテールドメインもしくは天然起源のテールドメインの５’末端と相同性を共有するか、またはそれに由来し得る。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、本明細書に開示される天然起源のテールドメイン、例えば、図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｇに記載されるものを含む、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）テールドメインと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性を有するか、またはそれと１、２、３、４、５、または６個以下のヌクレオチドが異なる。
【０３８５】
特定の実施形態では、テールドメインは、互いに相補的で、しかも、少なくともいくつかの生理学的条件下で二重鎖領域を形成する配列を含む。これらの実施形態のいくつかでは、テールドメインは、テール二重鎖領域を形成しうるテール二重鎖ドメインを含む。特定の実施形態では、テール二重鎖領域は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２塩基対長である。特定の実施形態では、テールドメインは、二重鎖を形成しないテール二重鎖ドメインの３’側に一本鎖ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、一本鎖ドメインは、３〜１０ヌクレオチド長、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または４〜６ヌクレオチド長である。
【０３８６】
特定の実施形態では、テールドメインは、修飾を一切含まない。他の実施形態では、テールドメインまたはその中の１つまたは複数のヌクレオチドは、限定はしないが、本明細書に記載される修飾などの修飾を含む。特定の実施形態では、テールドメインの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’修飾（例えば、リボース上の２’位の修飾）、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化を含んでもよい。特定の実施形態では、テールドメインの骨格をホスホロチオエートで修飾することができる。特定の実施形態では、テールドメインの１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、テールドメインおよび／またはテールドメインを含むｇＲＮＡを、分解に対して低感受性にするか、または、より生体適合性、例えば低免疫原性にする。特定の実施形態では、テールドメインは、１、２、３、４、５、６、７、または８つ以上の修飾を含み、これらの実施形態のいくつかでは、テールドメインは、その５’末端および／または３’末端から５ヌクレオチド以内に１、２、３、もしくは４つの修飾を含む。特定の実施形態では、テールドメインは、２個以上の連続したヌクレオチドに修飾を含む。
【０３８７】
特定の実施形態では、テールドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾は、標的化効率を妨げないように選択され、これは、以下に記載されるように候補修飾を試験することにより、評価することができる。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補テールドメインを有するｇＲＮＡは、以下に記載されるシステムを用いて評価することができる。候補テールドメインは、選択された標的について機能性であることがわかっているｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子システム中に、単独で、または１つまたは複数のその他の候補変化と一緒に配置し、評価することができる。
【０３８８】
特定の実施形態では、テールドメインは、生体外または生体内転写法に関連する、３’末端のヌクレオチドを含む。ｇＲＮＡの生体外転写のためにＴ７プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡテンプレートの３’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。生体内転写のためにＵ６プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵＵＵ配列であってもよい。転写のためにＨ１プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、ＵＵＵＵ配列であってもよい。交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチドは、例えば、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナルに応じて様々な数のウラシル塩基であってもよいし、または交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）塩基を含んでもよい。
【０３８９】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒に、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載される配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。
【０３９０】
ｇＲＮＡの生体内およびインビトロ転写
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、転写を開始するためにＧを必要とすることを考慮すれば、Ｔ７プロモーターは、プロモーター下流のｇＲＮＡ配列全体の転写を確実にするために、典型的にはその３’末端に２つのＧを有する（例えば、
【化１】
2018523977.tif 000053
、２つの３’末端Ｇは下線で示す（配列番号２０９））。しかし、その結果、生成される転写物は、プロモーター配列由来の少なくとも１つのＧ、そうでなければ両方を含有し得ることになり、これによって、ｇＲＮＡ特異性またはｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質同士の相互作用が改変され得る。ｇＲＮＡ標的配列がＧで開始する（例えば、Ｔ７プロモーターを用いたインビトロ転写により調製しようとするｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが、次の標的化ドメイン配列：
【化２】
2018523977.tif 000054
を含む場合のこの懸念事項に対処するため、Ｔ７プロモーターの３’末端のＧの１つだけが除去されるように、ｇＲＮＡ  ＰＣＲテンプレート内でコードされるＴ７プロモーター配列を修飾することができる：（修飾Ｔ７プロモーター配列：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号２１１）。従って、ｇＲＮＡＰＣＲテンプレートの５’センスプライマーを
【化３】
2018523977.tif 000055
としてを設計することができる（ここで、修飾Ｔ７プロモーター配列は、下線で示す）。Ｇで開始しないｇＲＮＡ標的配列（例えば、Ｔ７プロモーターを用いたインビトロ転写により調製しようとするｇＲＮＡ分子の標的化ドメインが、次の標的化ドメイン配列：
【化４】
2018523977.tif 000056
を含む）については、Ｔ７プロモーターの３’末端のＧの１つだけが除去されるように、ｇＲＮＡ  ＰＣＲテンプレート内でコードされるＴ７プロモーター配列を修飾することができる：（修飾Ｔ７プロモーター配列：
【化５】
2018523977.tif 000057
【０３９１】
Ｔ７プロモーター配列および修飾Ｔ７プロモーター配列は、本明細書に記載される配列に限定されない。例えば、Ｔ７プロモーター配列（およびその修飾物）は、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓの「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７」（ｈｔｔｐ：／／  ａｄｄｒｅｓｓ：ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７に位置する）に示される配列の少なくともいずれかであってよい。本開示は、本明細書で開示されるｇＲＮＡが、本明細書で記載される修飾Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡテンプレートからの生体外転写により生成され、ここで、３’末端のＧの１つまたは複数が除去される（例えば、配列
【化６】
2018523977.tif 000058
が、その５’末端でＧが欠失する標的化ドメインのすぐ上流に位置するか、または配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号２１１）が、その５’末端にＧを有する標的化ドメインのすぐ上流に位置する）方法を包含することは理解すべきである。これらの修飾Ｔ７プロモーターに対する他の改変は、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓの「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７」（ｈｔｔｐ：／／  ａｄｄｒｅｓｓ：ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ｔ７に位置し、その全体が参照により本明細書で援用される）に示される配列の少なくともいずれかを含む他のＴ７プロモーター配列に基づいて、当業者によって認識されるであろう。
【０３９２】
例示的な単分子／キメラｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラｇＲＮＡは、５’［標的化ドメイン］−［第１の相補性ドメイン］−［連結ドメイン］−［第２の相補性ドメイン］−［隣接ドメイン］−［テールドメイン］−３’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、１０〜５０ヌクレオチド長であり；
第１の相補性ドメインは、５〜２５ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第１の相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
連結ドメインは、１〜５ヌクレオチド長であり；
第２の相補性ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第２の相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
隣接ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補性ドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有し；
および
テールドメインは非存在であり、またはヌクレオチド配列は、１〜５０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の相同性を有する。
【０３９３】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子ｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に以下；例えば、１０〜５０ヌクレオチドを含む標的化ドメイン；例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドなどを含む第１の相補性ドメイン；連結ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３９４】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する。
【０３９５】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０３９６】
特定の実施形態では、第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０３９７】
特定の実施形態では、第１の相補性ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０３９８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部分と相補的であるか、もしくは部分的に相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的化ドメインの全長、標的ドメインの全長、または双方にわたって標的ドメインと相補的である。
【０３９９】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラのｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む）は、配列番号４２に記載されるアミノ酸配列を含み、そこで、標的化ドメインは、２０個のＮ（残基１〜２０）として列記されるが、それは、１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であってよく、その中で最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルを表すが、それは存在しなくても、またはより少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子、またはキメラのｇＲＮＡ分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０４００】
特定の実施形態では、本明細書に開示される単分子またはキメラｇＲＮＡ分子（標的化ドメイン、第１の相補性ドメイン、連結ドメイン、第２の相補性ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む）は、配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含み、そこで、標的化ドメインは、２０個のＮ（残基１〜２０）として列記されるが、それは、１６〜２６ヌクレオチド長の範囲であってよく、その中で最後の６つの残基（残基９７〜１０２）は、Ｕ６プロモーターの終結シグナルを表すが、それは存在しなくてもよいし、またはより少数であってもよい。特定の実施形態では、単分子またはキメラｇＲＮＡ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡ分子である。
【０４０１】
例示的なキメラｇＲＮＡの配列および構造も図１Ｈ〜１Ｉに示す。
【０４０２】
例示的なモジュラーｇＲＮＡ
特定の実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３方向に以下；例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含む標的化ドメイン；第１の相補性ドメインを含む第１鎖と；好ましくは、５’から３方向に以下：任意選択的に５’伸長ドメイン；第２の相補性ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインを含む第２鎖とを含み、
式中、
（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；
（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；または
（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４０３】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）からの配列は、天然起源ｇＲＮＡの対応する配列と、または本明細書に記載されるｇＲＮＡと、少なくとも６０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を有する。
【０４０４】
特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドを含む。
【０４０５】
特定の実施形態では、第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、または５３ヌクレオチドがある。
【０４０６】
特定の実施形態では、第１の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補的ドメインの最後のヌクレオチドに対して３’に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインとの相補性を有する、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６連続ヌクレオチド）を含み、それを有し、またはそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチド長である。
【０４０７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインまたはその一部分と相補的である、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなる。これらの実施形態のいくつかでは、標的化ドメインは、標的ドメインの全長、標的ドメインの全長、または双方にわたって標的ドメインと相補的である。
【０４０８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１６ヌクレオチド（例えば、１６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１６ヌクレオチド長である。これらの実施形態の特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４０９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１７ヌクレオチド（例えば、１７連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１７ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１８ヌクレオチド（例えば、１８連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する１９ヌクレオチド（例えば、１９連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１２】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２０ヌクレオチド（例えば、２０連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２１ヌクレオチド（例えば、２１連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２２ヌクレオチド（例えば、２２連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２３ヌクレオチド（例えば、２３連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１６】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２４ヌクレオチド（例えば、２４連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２５ヌクレオチド（例えば、２５連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメインと相補性を有する２６ヌクレオチド（例えば、２６連続ヌクレオチド）を含むか、それからなるか、またはほぼそれからなり、例えば、標的化ドメインは、２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、（ａ）隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドを含み；（ｂ）第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３１、３５、４０、４５、４９、５０、もしくは５３ヌクレオチドがあり；ならびに／または（ｃ）第１の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第２の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの３’側に、少なくとも１６、１９、２１、２６、３１、３２、３６、４１、４６、５０、５１、または５４ヌクレオチドがある。
【０４１９】
ｇＲＮＡ送達
本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、もしくは４つ）のｇＲＮＡ分子の送達を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ｇＲＮＡ分子は、肝臓内注射、肝臓への実質内注射、肺への実質内注射、門脈への静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または吸入により送達される。
【０４２０】
ＩＩ．ｇＲＮＡをデザインする方法
標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法をはじめとする、ｇＲＮＡをデザインする方法が本明細書に記載される。例示的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込むことができる。
【０４２１】
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法は、例えば、以下Ｍａｌｉ  ２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１（９）：８２７−３２；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（２）：１２２−３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載されている。
【０４２２】
例えば、ソフトウェアツールを用いて、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性の最小化など、使用者の標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を使用するそれぞれの可能なｇＲＮＡ選択のために、上記ツールは、特定数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）以下のミスマッチ塩基対を含有するゲノム全域で、全てのオフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭのどちらかに先行する）を同定することができる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを使用して予測することができる。次に、考えられるｇＲＮＡが各々、その全予測オフターゲット切断に従って格付けされ；最高位のｇＲＮＡは、最大のオンターゲットと最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものを表す。例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動化された試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイ用のプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザインなどのその他の機能もまた、ツールに包含され得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書のセクションＩＶに記載されるようにして、評価することができる。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９と共に使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを用いて同定された。ガイドＲＮＡデザインは、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して実施された（参照：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：Ｃａｓ９ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼの潜在的オフターゲット部位を検索する高速多用途アルゴリズム、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４  Ｆｅｂ  １７．Ｂａｅ  Ｓ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｋｉｍ  ＪＳ．ＰＭＩＤ：２４４６３１８１）。前記特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から７つのミスマッチに至るマッチが、１７〜２４の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に判定されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約された。ＰＡＭ配列に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０４２３】
同定の後、ｇＲＮＡが、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の配列を標的化する頻度に基づいてｇＲＮＡを分類した。「頻度」は、例えば、本明細書に記載されるデータベースに開示されているように、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１について、対立遺伝子変異体の総数に対して、ｇＲＮＡが標的化する対立遺伝子変異体の数を指す。例えば、ｇＲＮＡが、ある遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体の全てを標的化する場合、ｇＲＮＡは、１００％の頻度で特定の遺伝子座の対立遺伝子変異体を標的化する。
【０４２４】
これに続いて、ＲＮＡは、標的部位に対するそれらの距離、それらの直交性または５’Ｇの存在に基づいて階層にランク付けされた（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合は、ＮＧＧ  ＰＡＭ、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合は、ＮＮＧＲＲＮ（配列番号２０３）（例えばＮＮＧＲＲＴ（配列番号２０４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２０５））ＰＡＭ、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）の場合は、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号２１２）またはＮＮＮＮＧＣＴＴ（配列番号２１３）ＰＡＭなどの妥当な（ｒｅｌｅｖａｎｔ）ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づく）。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を有さず、または標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を有さない、２０量体ｇＲＮＡを指してもよい。良好な直交性がある標的化ドメインが選択されて、オフターゲットＤＮＡ切断が最小化される。
【０４２５】
一例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）標的について、１７量体、または２０量体ｇＲＮＡがデザインされた。別の例として、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）標的については、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、および２４量体ｇＲＮＡがデザインされている。本明細書に開示される標的化ドメインは、１７量体を含み得る。１８以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、１７量体を含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、１８量体を含み得る。１９以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、１８量体を含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、１９量体を含み得る。２０以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、１９量体を含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、２０量体を含み得る。２１以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、２０量体を含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、２１量体を含み得る。２２以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、２１量体ｇＲＮＡを含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、２２量体を含み得る。２３以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、２２量体を含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、２３量体を含み得る。２４以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、２３量体を含み得る。本明細書に開示される標的化ドメインは、２４量体を含み得る。２５以上のヌクレオチドの標的化ドメインは、２４量体ｇＲＮＡを含み得る。
【０４２６】
一例として、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素を用いて使用するためにｇＲＮＡが設計された。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）についてｇＲＮＡが同定され、４つの階層にランク付けされた。階層１のｇＲＮＡ分子のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、（２）高レベルの直交性、および（３）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層２のｇＲＮＡ分子のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、および（２）高レベルの直交性に基づいて選択された。階層３のｇＲＮＡ分子のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、および（２）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層４のｇＲＮＡ分子のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離に基づいて選択された。
【０４２７】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）についてｇＲＮＡが同定され、妥当な（ｒｅｌｅｖａｎｔ）ＰＡＭが、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶであるとき、５つの階層にランク付けされた。階層１のｇＲＮＡ分子のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、（２）高レベルの直交性、（３）５’Ｇの存在、および（４）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択された。階層２のｇＲＮＡ分子のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、（２）高レベルの直交性、（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択された。階層３のｇＲＮＡ分子のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、（２）５’Ｇの存在、および（３）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択された。階層４のｇＲＮＡ分子のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離および（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴであることに基づいて選択された。階層４のｇＲＮＡ分子のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離および（２）ＰＡＭがＮＮＧＲＲＶであることに基づいて選択された。
【０４２８】
Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）についてｇＲＮＡが同定され、４つの階層にランク付けされた。Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）についてｇＲＮＡが同定され、４つの階層にランク付けされた。階層１のｇＲＮＡ分子のＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、（２）高レベルの直交性、および（３）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層２のｇＲＮＡ分子のＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、および（２）高レベルの直交性に基づいて選択された。階層３のｇＲＮＡ分子のＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、（１）標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離、および（２）５’Ｇの存在に基づいて選択された。階層４のｇＲＮＡ分子のＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９酵素と一緒に使用される標的化ドメインは、標的部位（例えば、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列のコード配列を標的化する）に対する距離に基づいて選択された。
【０４２９】
一実施形態では、単一ｇＲＮＡ分子を用いて、Ｃａｓ９ニッカーゼを標的化することにより、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列に一本鎖切断を生成する。
【０４３０】
一実施形態では、単一ｇＲＮＡ分子を用いて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的化することにより、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列に二本鎖切断を生成する。
【０４３１】
一実施形態では、二重標的化を用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列に２つの二本鎖切断を生成する。一実施形態では、２つのｇＲＮＡを用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列内の１位置の上流または下流いずれかを標的化する。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡを用いて、２つのＣａｓ９ヌクレアーゼを標的化してフランキングさせ、例えば、第１のｇＲＮＡを用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列内の１位置の上流を標的化すると共に、第２のｇＲＮＡを用いてその下流を標的化する。
【０４３２】
一実施形態では、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のゲノム配列を欠失させるために、二重標的化を用いて、１つの二本鎖切断と１ペアの一本鎖切断を生成する。一実施形態では、第１、第２および第３のｇＲＮＡを用いて、１つのＣａｓ９ヌクレアーゼと２つのＣａｓ９ニッカーゼを標的化してフランキングさせ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと一緒に使用されることになる第１のｇＲＮＡを用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列内の１位置の上流または下流いずれかを標的化すると共に、Ｃａｓ９ニッカーゼペアと一緒に使用されることになる第２および第３のｇＲＮＡを用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列内の上記位置の反対側を標的化する。
【０４３３】
一実施形態では、突然変異を含むゲノム配列を欠失させるために、４つのｇＲＮＡ（例えば、２ペア）を用いて、４つのＣａｓ９ニッカーゼを標的化して４つの一本鎖切断を生成する場合、ｇＲＮＡの第１ペアおよび第２ペアを用いて、４つのＣａｓ９ニッカーゼを標的化してフランキングさせ、例えば、ｇＲＮＡの第１ペアを用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列内の１位置の上流を標的化すると共に、ｇＲＮＡの第２ペアを用いて、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１などの対立遺伝子変異体配列のコード配列内の下流を標的化する。
【０４３４】
単一ｇＲＮＡヌクレアーゼ切断および二重ｇＲＮＡ対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの双方で、ｇＲＮＡが同定された。ｇＲＮＡを選択する基準、およびそれに対してｇＲＮＡが使用され得るストラテジーの判定はいくつかの考察に基づく：
ｇＲＮＡ対は、ＤＮＡ上で、ＰＡＭ上が外側を向き、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断が、５’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。
【０４３５】
二重ニッカーゼ対による切断が、妥当な出現頻度で全介在配列の欠失をもたらすという仮説。しかし、それはまた、ｇＲＮＡの１つのみの部位にインデル変異を頻繁にもたらすことになる。候補ペア構成要素は、１つのｇＲＮＡの部位にインデル変異を引き起こす場合と比較して、全配列をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
【０４３６】
本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込むことができる。
【０４３７】
ＩＩＩ．Ｃａｓ９分子
多様な生物種のＣａｓ９分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのＣａｓ９タンパク質をベースとする、Ｃａｓ９分子もまた使用され得る。これらは、例えば、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）からのＣａｓ９分子を含む。
【０４３８】
Ｃａｓ９ドメイン
２つの異なる天然細菌Ｃａｓ９分子について、結晶構造が決定されている。非結合状態のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造が、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４  Ｍａｒ  １４；３４３（６１７６）：１２４７９９７に記載されている。単一のｇＲＮＡを有する複合体におけるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造は、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５  Ｊｕｎ  ２６；３４８（６２４２）：１４７７−８１に開示されている。単一のｇＲＮＡとの複合体としてのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物）とその標的ＤＮＡは、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４  Ｆｅｂ  ２７；１５６（５）：９３５−４９；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｓｅｐ  ２５；５１３（７５１９）：５６９−７３に記載されている。単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体としてのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の結晶構造とその二本鎖ＤＮＡ標的は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５  Ａｕｇ  ２７；１６２（５）：１１１３−２６に開示されている。
【０４３９】
天然Ｃａｓ９分子は、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブの２つのローブを含んでなり；その各々が、本明細書に記載されるドメインをさらに含む。Ｃａｓ９ドメインは、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４  Ｍａｒ  １４；３４３（６１７６）：１２４７９９７；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５  Ｊｕｎ  ２６；３４８（６２４２）：１４７７−８１；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４  Ｆｅｂ  ２７；１５６（５）：９３５−４９；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｓｅｐ  ２５；５１３（７５１９）：５６９−７３；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５  Ａｕｇ  ２７；１６２（５）：１１１３−２６に記載されている。本開示全体を通じて使用されるドメイン命名法および各ドメインに包含されるアミノ酸残基の番号付与は、以前記載されている通りである（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４  Ｆｅｂ  ２７；１５６（５）：９３５−４９）。アミノ酸残基の番号付与は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９を参照する。
【０４４０】
ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を有せず、それがＣａｓ９特異的機能ドメインであることが示唆される。ＢＨドメインは、長いαらせんおよびアルギニンに富む領域であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸６０〜９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡまたはａｔｒａｃｒＲＮＡなどの反復：抗反復二本鎖の認識に重要であり、したがって標的配列を認識することでＣａｓ９活性に重要である。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸９４〜１７９および３０８〜７１７に、２つのＲＥＣ１モチーフを含む。これらの２つのＲＥＣ１ドメインは、直鎖一次構造内ではＲＥＣ２ドメインによって隔てられるが、三次構造に構築されてＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメインまたはその部分はまた、反復：抗反復二本鎖の認識における役割を有してもよい。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１８０〜３０７を含む。
【０４４１】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリー構成要素との構造類似性を有して、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にある、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩ、当該技術分野で一般にＲｕｖＣＩドメイン、またはＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、およびＲｕｖＣＩＩＩドメインと称されることが多い）から構築される。ＲＥＣ１ドメインと同様に、３つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内ではその他のドメインによって直線的に隔離されるが、三次構造内では、３つのＲｕｖＣモチーフに構築されてＲｕｖＣドメインが形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼとの構造的類似性を有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖などの一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ〜ＩＩＩモチーフの間にあり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列のアミノ酸７７５〜９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９．配列のアミノ酸１０９９〜１３６８を含む。
【０４４２】
ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメイン
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ様ドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインを含み、これらの特定の実施形態では、切断活性は、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインに依存する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインのドメインの１つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン、および／または例えば、以下に記載されるＨＮＨ様ドメインなどのＨＮＨ様ドメインなどのＲｕｖＣ様ドメインを含む。
【０４４３】
ＲｕｖＣ様ドメイン
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８アミノ酸長であるが、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長以下である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、約１５アミノ酸長などの約１０〜２０個のアミノ酸のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。
【０４４４】
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
いくつかの天然Ｃａｓ９分子は、２つ以上のＲｕｖＣ様ドメインを含み、切断はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに依存する。したがって、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。代表的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、以下に記載される。
【０４４５】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｉ、
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２０）
のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、およびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ４は、Ｓ、Ｙ、Ｎ、およびＦ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｓ、およびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｖ、およびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、Ｍ、およびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、または不在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｍ、およびＲから選択され、または、例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０４４６】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２０の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４４７】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がある。他の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、切断能力がない。
【０４４８】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ｄ−Ｘ１−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２１）
のアミノ酸配列を含む、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＬおよびＴから選択され（例えば、Ｉ、Ｖ、およびＬから選択され）；
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｔ、およびＦから選択され（例えば、Ｖ、ＩおよびＬから選択され）；
Ｘ６は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、ＳおよびＬ（例えば、Ｗ）から選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＶおよびＧから選択され（例えば、ＡおよびＳから選択され）；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、ＭおよびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在である（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、ＭおよびＲから選択されるか、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０４４９】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２１の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４５０】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＩＩ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｘ２−Ｘ３−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｘ８−Ｘ９（配列番号２２）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ２は、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、およびＬから選択され（例えば、Ｔ、Ｖ、およびＩから選択され）；
Ｘ３は、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、およびＦ（例えば、ＡまたはＮ）から選択され；
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭおよびＨから選択され（例えば、Ｖ、Ｉ、ＭおよびＬから選択され）；
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在であり（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Δ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、ＭおよびＲから選択されるか、または例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびΔから選択される）。
【０４５１】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２２の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４５２】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＩＶ：
Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｔ−Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ａ−Ｖ−Ｘ（配列番号２３）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Ｘは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＴから選択される（例えば、Ｃａｓ９分子は、図２Ａ〜２Ｇに示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る（Ｙとして示される））。
【０４５３】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号２３の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４５４】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図３Ａ〜３Ｂにおいて、本明細書で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図３Ａ〜３Ｂで同定された高度に保存された残基のうち、１つ、２つ、３つまたは全部が存在する。
【０４５５】
特定の実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、図４Ａ〜４Ｂにおいて、本明細書で開示されるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図４Ａ〜４Ｂで同定された高度に保存された残基のうち、１つ、２つ、３つまたは全部が存在する。
【０４５６】
追加的ＲｕｖＣ様ドメイン
Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに加えて、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、１つまたは複数の追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、２つの追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、例えば、１５未満のアミノ酸長、例えば、５〜１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長などの少なくとも５アミノ酸長である。
【０４５７】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式Ｖ：
Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｅ−Ｘ３−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１５）
のアミノ酸配列を含んでよく、
式中、
Ｘ１は、ＶまたはＨであり；
Ｘ２は、Ｉ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）であり；
Ｘ３は、ＭまたはＴである。
【０４５８】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩ：
Ｉ−Ｖ−Ｘ２−Ｅ−Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号１６）
のアミノ酸配列を含んでなり、
式中、
Ｘ２は、Ｉ、ＬまたはＶ（例えば、ＩまたはＶ）である（例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに示される、追加的ＲｕｖＣ様ドメインを含み得る（Ｂとして示される））。
【０４５９】
追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、式ＶＩＩ：
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｘ１−Ｄ−Ａ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１７）
のアミノ酸配列を含んでもよく、
式中、
Ｘ１は、ＨまたはＬであり；
Ｘ２は、ＲまたはＶであり；
Ｘ３は、ＥまたはＶである。
【０４６０】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、
Ｈ−Ｈ−Ａ−Ｈ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｌ（配列番号１８）
のアミノ酸配列を含む。
【０４６１】
特定の実施形態では、追加的ＲｕｖＣ様ドメインは、配列番号１５〜１８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４６２】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインの側面に位置する配列は、式ＶＩＩＩ：Ｋ−Ｘ１’−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｚ−Ｔ−Ｄ−Ｘ９’−Ｙ（配列番号：１９）のアミノ酸配列を有し、
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＰから選択され、
Ｘ２’はＶ、Ｌ、Ｉ、およびＦ（例えばＶ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ３’は、Ｇ、Ａ、およびＳ（例えば、Ｇ）から選択され；
Ｘ４’はＬ、Ｉ、Ｖ、およびＦ（例えば、Ｌ）から選択され；
Ｘ９’は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱから選択され；
Ｚは、例えば、上述されるような、例えば、５〜１２アミノ酸を有するＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインである。
【０４６３】
ＨＮＨ様ドメイン
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、または２５アミノ酸長であるが、４０、３５または３０以下のアミノ酸長であり、例えば、２０〜３５アミノ酸長、例えば、２５〜３０アミノ酸長である。代表的なＨＮＨ様ドメインは、以下に記載される。
【０４６４】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＩＸ：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２５）のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、およびＮ（例えば、ＤおよびＥ）から選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ７は、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｔ、およびＫ（例えば、ＳおよびＡ）から選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、およびＴ（例えば、Ｄ）から選択され；
Ｘ１２は、Ｄ、Ｎ、およびＳから選択され；
Ｘ１３は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＲ（例えば、Ｓ）から選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１６は、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、およびＦ（例えば、Ｌ、Ｒ、およびＫ）から選択され；
Ｘ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、およびＴから選択され；
Ｘ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＡ（例えば、ＬおよびＩ）から選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０４６５】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２５の配列と、少なくとも１つであるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４６６】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がある。特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、切断能力がない。
【０４６７】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式Ｘ、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｈ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２６）
のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含み、
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ２は、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｍ、およびＫから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ、およびＬ（例えば、Ａ、Ｉ、およびＶ）から選択され；
Ｘ５は、Ｖ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷ（例えば、Ｖ、Ｉ、およびＬ）から選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ１９は、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｅ、Ｓ、およびＡ（例えば、ＴおよびＶ）から選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０４６８】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２６の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０４６９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩ、
Ｘ１−Ｖ−Ｘ３−Ｈ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｘ６−Ｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｎ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＨＮＨ様ドメインを含む。
式中、
Ｘ１は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ６は、Ｑ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｉ、Ｌ、およびＷから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＱ（例えば、Ｆ）から選択され；
Ｘ９は、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋ、Ｆ、およびＧから選択され；
Ｘ１０は、Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、およびＳから選択され；
Ｘ１４は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｗ、Ｄ、Ｋ、およびＨ（例えば、Ｉ、Ｌ、およびＦ）から選択され；
Ｘ１５は、Ｄ、Ｓ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｍ、Ｇ、Ｙ、およびＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｃ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ｑ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、およびＡから選択され；
Ｘ２１は、Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、およびＬから選択され；
Ｘ２２は、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、およびＹから選択され；
Ｘ２３は、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｃ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、およびＦから選択される。
【０４７０】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２７の配列と、１、２、３、４、または５つの残基が異なる。
【０４７１】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩ、Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｈ−Ｉ−Ｘ５−Ｐ−Ｑ−Ｘ７−Ｆ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｘ１２−Ｓ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｘ１６−Ｖ−Ｌ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｓ−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｎ（配列番号２８）
のアミノ酸配列を有するＨＮＨ様ドメインを含む。
式中、
Ｘ２は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ５は、ＩおよびＶから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ９は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ１０は、ＫおよびＴから選択され；
Ｘ１２は、ＤおよびＮから選択され；
Ｘ１６は、Ｒ、Ｋ、およびＬから選択され；Ｘ１９は、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ２０は、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ２２は、Ｋ、Ｄ、およびＡから選択され；
Ｘ２３は、Ｅ、Ｋ、Ｇ、およびＮから選択される（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなＨＮＨ様ドメインを含み得る）。
【０４７２】
一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、配列番号２８の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。
【０４７３】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、式ＸＩＩＩ、
Ｌ−Ｙ−Ｙ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｘ１’−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｘ２’−Ｘ３’−Ｘ４’−Ｘ５’−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｘ６’−Ｘ７’−Ｌ−Ｓ−Ｘ８’−Ｙ−Ｚ−Ｎ−Ｒ−Ｘ９’−Ｋ−Ｘ１０’−Ｄ−Ｘ１１’−Ｖ−Ｐ（配列番号２４）
のアミノ酸配列を含む。
式中、
Ｘ１’は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ２’は、ＶおよびＴから選択され；
Ｘ３’は、ＧおよびＤから選択され；
Ｘ４’は、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され；
Ｘ５’は、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ６’は、Ｄ、Ｎ、およびＨから選択され；
Ｘ７’は、Ｙ、Ｒ、およびＮから選択され；
Ｘ８’は、Ｑ、Ｄ、およびＮから選択され；Ｘ９’は、ＧおよびＥから選択され；
Ｘ１０’は、ＳおよびＧから選択され；
Ｘ１１’は、ＤおよびＮから選択され；および
Ｚは、例えば、上述されるようなＨＮＨ様ドメインである。
【０４７４】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２４の配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる、アミノ酸配列を含む。
【０４７５】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図５Ａ〜５Ｃなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。特定の実施形態では、図５Ａ〜５Ｃで同定された高度に保存された残基のうち、片方または双方が存在する。
【０４７６】
特定の実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、例えば、図６Ａ〜６Ｂなどの本明細書で開示されるＨＮＨ様ドメインの配列と、１つ程度であるが、２、３、４、または５つ以下の残基が異なる。一実施形態では、図６Ａ〜６Ｂで同定された高度に保存された残基のうと、１つ、２つ、または３つ全てが存在する。
【０４７７】
分断Ｃａｓ９分子および遺伝子編集システム
いくつかの実施形態では、国際公開第１５／０８９４２７号および同第１４／０１８４２３号パンフレット（その各々の全内容を参照により本明細書に明示的に組み込む）にさらに詳述されているように、Ｃａｓ９融合分子は、分断Ｃａｓ９分子を含む。分断Ｃａｓ９分子については以下に簡単にまとめる。
【０４７８】
一態様では、非天然または改変された誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９酵素が本明細書に開示され、これは、以下：誘導性二量体の第１半分に結合された第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物と、誘導性二量体の第２半分に結合された第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含んでなり、ここで、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、１つまたは複数の核局在化シグナルに作動可能に連結され、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、１つまたは複数の核輸出シグナルに作動可能に連結されており、ここで、誘導物質エネルギー源との接触によって、誘導性二量体の第１および第２半分が一緒にされ、誘導性二量体の第１および第２半分が一緒にされることによって、第１および第２ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が機能性遺伝子編集システムを構成することが可能になる。
【０４７９】
別の態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、誘導性二量体は、誘導性ヘテロ二量体であるか、またはこれを含むか、またはこれからほぼ構成されるか、またはこれから構成される。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、誘導性ヘテロ二量体の第１半分または第１部分または第１断片は、ＦＫＢＰ、任意選択的にＦＫＢＰ１２であるか、またはこれを含むか、またはこれから構成されるか、またはこれからほぼ構成される。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、誘導性ヘテロ二量体の第２半分または第２部分または第２断片は、ＦＲＢであるか、またはこれを含むか、またはこれから構成されるか、またはこれからほぼ構成される。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、第１ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳであるか、またはこれを含むか、またはこれから構成されるか、またはこれからほぼ構成される。別の態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、第１ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、ＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳであるか、またはこれを含むか、またはこれから構成されるか、またはこれからほぼ構成される。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、第２ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、Ｃ末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳであるか、またはこれを含むか、またはこれからほぼ構成されるか、またはこれから構成される。別の態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、第２ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、ＮＬＳ−Ｃ末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳであるか、またはこれを含むか、またはこれから構成されるか、またはこれからほぼ構成される。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、Ｃａｓ９部分を誘導性二量体の半分または部分または断片から隔てるリンカーがあってもよい。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、誘導物質エネルギー源は、ラパマイシンであるか、またはこれを含むか、またはこれからほぼ構成されるか、またはこれから構成される。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、誘導性二量体は、誘導性ホモ二量体である。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９である。遺伝子編集システムの一態様では、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９に従って、またはＳｐＣａｓ９を参照にして、以下の分断点のいずれか１つで２つの部分に分断される：２０２Ａ／２０３Ｓ間の分断位置；２５５Ｆ／２５６Ｄ間の分断位置；３１０Ｅ／３１１Ｉ間の分断位置；５３４Ｒ／５３５間の分断位置；５７２Ｅ／５７３Ｃ間の分断位置；７１３Ｓ／７１４Ｇ間の分断位置；１００３Ｌ／１０４Ｅ間の分断位置；１Ｇ５４Ｇ／１Ｑ５５Ｅ間の分断位置；１１１４Ｎ／１１１５Ｓ間の分断位置；１１５２Ｋ／１１５３Ｓ間の分断位置；１２４５Ｋ／１２４６Ｇ間の分断位置；または１０９８および１０９９間の分断位置。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、１つまたは複数の機能性ドメインが、Ｃａｓ９酵素の一方または両部分、例えば、転写アクチベーター、転写またはｆｏｋ１ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを任意選択的に含む機能性ドメインと結合している。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、機能性遺伝子編集システムは、標的配列と結合し、酵素は、不活性型Ｃａｓ９（ｄｅａｄＣａｓ９）であり、これは、任意選択的に、少なくとも１つの突然変異を含まないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、少なくとも９７％もしくは１００％低減したヌクレアーゼ活性（または３％以下、有利には０％）のヌクレアーゼ活性）を有する。一態様では、誘導性遺伝子編集システムにおいて、不活性型Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ酵素）は、２つ以上の突然変異を含み、ここで、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって２つ以上のＤＩＧ、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、もしくはＤ９８６またはいずれかの対応するオーソログまたはＳａＣａｓ９タンパク質に従うＮ５８０が突然変異しているか、あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、例えば、ここで、少なくともＨ８４０が突然変異している。本開示はさらに、本明細書に開示されるような誘導性遺伝子編集システムをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０４８０】
さらに、本明細書において、誘導性二量体の第１半分または部分または断片と結合され、１つまたは複数の核局在化シグナルと作動可能に連結された第１ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の送達のためのベクターも開示される。一態様では、本明細書には、誘導性二量体の第２半分または部分または断片と結合され、１つまたは複数の核輸出シグナルと作動可能に連結された第２ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の送達のためのベクターも開示される。
【０４８１】
Ｃａｓ９機能
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断（またはその他の性質）を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドを提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書でｅａＣａｓ９分子（酵素的に活性なＣａｓ９）またはｅａＣａｓ９ポリペプチドと称される。
【０４８２】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
特定の実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力；
エンドヌクレアーゼ活性；
エキソヌクレアーゼ活性；および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
【０４８３】
特定の実施形態では、酵素的に活性またはｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、双方のＤＮＡ鎖を切断して、二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、それに対してｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡとハイブリダイズする鎖と相補的な鎖などの１本の鎖のみを切断する。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性を含む。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨドメインと、不活性のまたは切断能力がないＲｕｖＣドメインとを含む一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性のまたは切断能力がないＨＮＨドメインと、活性のまたは切断能力があるＲｕｖＣドメインとを含む。
【０４８４】
標的化およびＰＡＭ
Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドはｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメイン、および特定の実施形態では、ａＰＡＭ配列を含む部位に局在する。
【０４８５】
特定の実施形態では、標的核酸と相互作用して切断するｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種からのｅａＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧ，ＮＡＧ、ＮＧＡを認識して、その配列から、例えば、３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｍａｌｉ  ２０１３を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮ（配列番号１９９）および／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）（配列番号２００）を認識して、これらの配列の例えば、３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列の切断を誘導する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ２０１０；Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０１））を認識して、この配列の例えば、３〜５ｂｐなど１〜１０ｂｐ上流で、標的核酸配列切断を誘導する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ２００８を参照されたい）。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０２）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐ上流などの１〜１０ｂｐの標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０３）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０４）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐなどの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｅａＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２０５）を認識して、例えば、その配列から３〜５ｂｐ上流などの１〜１０ｂｐ上流の標的核酸配列の切断を誘導する。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、上記（Ｊｉｎｅｋ  ２０１２）に記載される形質転換アッセイを使用して判定され得る。前述の実施形態では、Ｎは、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかの任意のヌクレオチド残基であり得る。
【０４８６】
本明細書で考察されるように、Ｃａｓ９分子は遺伝子操作されて、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性が改変され得る。
【０４８７】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子は、上述されている（例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３を参照されたい）。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科、またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。
【０４８８】
代表的な天然起源Ｃａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリチカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクイヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４株）、Ｓ．ディスガラクチアエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ１２４株）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、Ｓ．アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。
【０４８９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、
配列番号１、２、４〜６、または１２と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し；
比較すると、２、５、１０、１５、２０、３０、または４０％以下のアミノ酸残基が異なり；
少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸であるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、または生物種に由来するＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子配列と同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号１〜４あるいはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ２０１３に記載される）。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
【０４９０】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇのコンセンサス配列のアミノ酸配列のいずれかを含んでなり、その中では、「＊」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９分子のアミノ酸配列中の対応する位置に存在する任意のアミノ酸を示し、「−」は、非存在を示す。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも１個、但し２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、配列番号２の配列と、少なくとも１個、但し２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のアミノ酸残基が異なる。
【０４９１】
いくつかのＣａｓ９分子の配列の比較は、特定領域が保存されていることを示唆する。これらは、次のように同定される。
領域１（残基１〜１８０、または領域１の場合は残基１２０〜１８０）
領域２（残基３６０〜４８０）；
領域３（残基６６０〜７２０）；
領域４（残基８１７〜９００）；および
領域５（残基９００〜９６０）。
【０４９２】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１〜６を含み、十分な追加的Ｃａｓ９分子配列と共に、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの活性を有するＣａｓ９分子などの生物活性分子を提供する。一実施形態では、領域１〜６のそれぞれは、独立して、例えば、図２Ａ〜２Ｇからの配列などの本明細書に記載されるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドの対応する残基と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する。
【０４９３】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１と称されるアミノ酸配列を含んでなり：
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（番号付与は図２のモチーフ配列に準拠する；図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と、少なくとも１、２、５、１０または２０個のアミノ酸、但し９０、８０、７０、６０、５０、４０または３０個以下のアミノ酸が異なり；または
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８０と同一である。
【０４９４】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域１’と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２の４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸１２０〜１８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の１２０〜１８０と同一である。
【０４９５】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域２と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２の４つのＣａｓ９配列中の残基の５２％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸３６０〜４８０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列の３６０〜４８０と同一である。
【０４９６】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域３と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２の４つのＣａｓ９配列中の残基の５６％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸６６０〜７２０と同一である。
【０４９７】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域４と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の５５％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸８１７〜９００と同一である。
【０４９８】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、領域５と称されるアミノ酸配列を含んでなり、この領域は、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し（図２Ａ〜２Ｇの４つのＣａｓ９配列中の残基の６０％が保存されている）；
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と、少なくとも１、２、または５個のアミノ酸、但し３５、３０、２５、２０または１０個以下のアミノ酸が異なり；あるいは、
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、またはＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９のアミノ酸配列のアミノ酸９００〜９６０と同一である。
【０４９９】
遺伝子操作または改変Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド
本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に結合する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそれに局在する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
【０５００】
Ｃａｓ９分子は、遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドを含む（遺伝子操作は、この文脈の用法では、単にＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが参照配列と異なることを意味して、プロセスまたは起源制限を暗示しない）。遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、（天然またはその他の標準Ｃａｓ９分子と比較して）改変されたヌクレアーゼ活性、または改変されヘリカーゼ活性などの改変された酵素的性質を含み得る。本明細書で考察されるように、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性（二本鎖ヌクレアーゼ活性との対比で）を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、１つまたは複数のまたは任意のＣａｓ９活性に対する顕著な影響なしに、例えば、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失などの、そのサイズを変化させる改変を有し得る。一実施形態では、遺伝子操作Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含み得る。例えば、遺伝子操作Ｃａｓ９分子は、内在性野生型ＰＩドメインによって認識されるもの以外のＰＡＭ配列を認識するように改変され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と、配列が異なり得るが、１つまたは複数のＣａｓ９機能に顕著な改変を有しない。
【０５０１】
所望の性質があるＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドなどの親ポリペプチドの改変などの、いくつかの様式で生成されて、所望の性質を有する改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが提供され得る。例えば、例えば、天然または遺伝子操作Ｃａｓ９分子などの親Ｃａｓ９分子との１つまたは複数の変異または差異が導入され得る。このような変異および差異としては、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失が挙げられる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、親Ｃａｓ９分子などの標準と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異であるが、２００、１００、または８０未満の変異などの１つまたは複数の変異または差異を含み得る。
【０５０２】
特定の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有しない。他の実施形態では、単数の変異または複数の変異は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９活性などのＣａｓ９活性に対する実質的効果を有する。
【０５０３】
非切断および修飾切断Ｃａｓ９
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、例えば、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖核酸切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
【０５０４】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、以下の機能の１つまたは複数を含む：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
【０５０５】
特定の実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、活性のまたは切断能力があるＨＮＨ様ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＨＮＨ様ドメイン、例えば、配列番号２４〜２８）と、不活性なまたは切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。代表的な不活性の、または切断能力がないＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにアスパラギン酸の突然変異を有してよく、例えば、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の９位のアスパラギン酸、または配列番号２の１０位のアスパラギン酸が、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインにおいて野性型とは異なり、標的核酸を切断しないか、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１もしくは．１％未満などの有意に低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレリウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であってよい。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０５０６】
一実施形態では、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、不活性の、または切断能力がないＨＮＨドメインと、活性の、または切断能力があるＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含んでなる（例えば、配列番号１５〜２３などの本明細書に記載されるＲｕｖＣ様ドメイン）。代表的な不活性の、または切断能力がないＨＮＨ様ドメインは、以下の１つまたは複数に突然変異を有し得る：例えば、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の位置８５６に示されるヒスチジンなどのＨＮＨ様ドメインのヒスチジンが、例えば、アラニンで置換されてよく；例えば、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の位置８７０および／または図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の位置８７９に示されるアスパラギンなどのＨＮＨ様ドメイン内の１つまたは複数のアスパラギンが、例えば、アラニンで置換され得る。一実施形態では、ｅａＣａｓ９は、ＨＮＨ様ドメインにおいて野性型とは異なり、標的核酸を切断しないか、または例えば、本明細書に記載されるアッセイによる測定で、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１もしくは０．１％未満などの有意に低い効率で切断する。参照Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレリウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子のような、天然Ｃａｓ９分子などの天然未修飾Ｃａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然Ｃａｓ９分子である。
【０５０７】
特定の実施形態では、代表的なＣａｓ９機能は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の９つまたは複数を含む。変異は、例えば、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣドメインなどの１つまたは複数のＲｕｖＣドメイン；ＨＮＨドメイン；ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン外の領域に存在し得る。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインに存在する。一実施形態では、変異（ｓ）は、ＨＮＨドメインに存在する。一実施形態では、変異は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方に存在する。
【０５０８】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列に関してＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインに起きてもよい代表的変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列に関してＲｕｖＣドメインに実施され得る例示的な突然変異として、Ｎ５８０Ａがある（例えば、配列番号１１を参照）。
【０５０９】
例えば、置換などの特定の配列が、標的化活性、切断活性などの１つまたは複数の活性に影響を及ぼしてもよいかどうかは、例えば、変異が保存的であるかどうかを評価することで、評価または予測され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用されるような「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効化することなく、またはより好ましくは、実質的に改変することなく、例えば、ｅａＣａｓ９分子のような天然起源Ｃａｓ９分子などのＣａｓ９分子の野生型配列から改変され得る残基である一方で、「必須」アミノ酸残基の変更は、実質的な活性（例えば、切断活性）喪失をもたらす。
【０５１０】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然Ｃａｓ９分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Ｃａｓ９分子と異なる。例えば、Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子と、次のように異なり得る：例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖切断の切断（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；例えば、天然Ｃａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断（ニッカーゼ活性）の低下または増大を調節するその能力；または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。特定の実施形態では、ニッカーゼは、配列番号１０（Ｄ１０Ａ）または配列番号１１（Ｎ５８０Ａ）の配列を含むＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９由来のニッカーゼである（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ２０１５）。
【０５１１】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子は、以下の機能の１つまたは複数を含む、ｅａＣａｓ９分子である：ＲｕｖＣドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＲｕｖＣドメインに関連する切断活性。
【０５１２】
特定の実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、以下：
図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列の固定配列に対応する配列が、図２Ａ〜２Ｇで開示されるコンセンサス配列中の固定残基と１、２、３、４、５、１０、１５、または２０％以下異なり；
図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって同定される残基に対応する配列が、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、または、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９分子などの天然Ｃａｓ９分子の対応する配列からの「＊」残基と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％以下異なる、配列を含んでなる。
【０５１３】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって表示される、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０５１４】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって表示される、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０５１５】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって表示される、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０５１６】
一実施形態では、改変Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、図２Ａ〜２Ｇに開示されるＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含んでなる、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドであり、１つまたは複数の残基（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、７０、８０、９０、１００、もしくは２００アミノ酸残基）に、図２Ａ〜２Ｇに開示されるコンセンサス配列中の「＊」によって表示される、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）の配列とは異なる、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、置換）を有する。
【０５１７】
特定の実施形態では、改変されたＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチド、例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、２つ以上の異なるＣａｓ９分子、例えば、２つ以上の異なる種の天然起源のＣａｓ９分子の融合物であってよい。例えば、１つの生物種の天然Ｃａｓ９分子断片が、第２の生物種のＣａｓ９分子断片に融合され得る。一例として、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の断片が、ＨＮＨ様ドメインを含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の生物種（例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子の断片に融合され得る。
【０５１８】
ＰＡＭ認識が改変されたまたはＰＡＭ認識がないＣａｓ９
天然起源Ｃａｓ９分子は、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）について、上に記載されるＰＡＭ認識配列などの特定のＰＡＭ配列を認識し得る。
【０５１９】
特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、天然Ｃａｓ９分子と同一ＰＡＭ特異性を有する。その他の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、それに最も近い配列相同性を有する天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性、または天然Ｃａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然Ｃａｓ９分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識が改変されて、例えば、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが認識するＰＡＭ配列が改変されて、オフターゲット部位が減少されおよび／または特異性が改善され；またはＰＡＭ認識要求が排除される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増加する、および／またはＣａｓ９特異性を高レベルの同一性（例えば、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列同士の９８％、９９％もしくは１００％のマッチ）まで向上させる、例えば、オフターゲット部位を減少させる、および／または特異性を増大するように、改変することができる。特定の実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。一実施形態では、Ｃａｓ９特異性は、ｇＲＮＡとＰＡＭ配列同士の少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を要求する。異なるＰＡＭ配列を認識し、かつ／またはオフターゲット活性が低下したＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドは、指向性進化を使用して作製することができる。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用することができる例示的な方法およびシステムは、記載されている（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ２０１１を参照のこと）。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、以下に記載される方法によって評価され得る。
【０５２０】
サイズ最適化Ｃａｓ９
本明細書に記載される遺伝子操作Ｃａｓ９分子および遺伝子操作Ｃａｓ９ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子認識などの所望のＣａｓ９特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含む、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、１つまたは複数の欠失および任意選択的に１つまたは複数のリンカーを含む、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Ｃａｓ９分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるＣａｓ９分子を生成する方法、およびこのようなＣａｓ９分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
【０５２１】
例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子などの欠失があるＣａｓ９分子は、例えば、低下したアミノ酸数を有するなど、対応する天然Ｃａｓ９分子よりも小型である。Ｃａｓ９分子のより小さなサイズは、送達方法の融通性を増大させ、その結果ゲノム編集の有用性を高める。Ｃａｓ９分子は、結果として生じる本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性に実質的に影響を及ぼさず、またはそれを低下させない、１つまたは複数の欠失を含み得る。本明細書に記載される欠失を含むＣａｓ９分子中で維持される機能としては、ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力で、一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力；ならびに例えば、標的核酸またはｇＲＮＡなどの核酸分子の認識活性。
【０５２２】
本明細書に記載されるＣａｓ９分子の活性は、本明細書または当該技術分野で記載される、活性アッセイを使用して評価することができる。
【０５２３】
欠失に適する領域を同定する
Ｃａｓ９分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。様々な細菌種に由来する天然オルソロガスＣａｓ９分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造にモデル化され得て（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４）、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたＣａｓ９オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの境界面などのＣａｓ９活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Ｃａｓ９活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
【０５２４】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅａＣａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。代表的Ｃａｓ９分子をコードする核酸またはＣａｓ９ポリペプチドは、上述されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ２０１３；Ｗａｎｇ  ２０１３；Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ２０１２を参照されたい）。
【０５２５】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるようにして、化学修飾され得る。一実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、（例えば、以下の全てなどの１つまたは複数の特性を有する：それは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換される。
【０５２６】
それに加えてまたは代案としては、合成核酸配列は、コドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンあまり一般的でないコドンは、一般的コドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
【０５２７】
さらに、または代案としては、ａＣａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
【０５２８】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号３に記載されている。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている。
【０５２９】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号７〜９に記載されている。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列は、配列番号６に記載される。
【０５３０】
Ｎ．メニンジチディス・アウレリウス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列は、配列番号１３に記載されている。Ｎ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列は、配列番号１２に記載される。
【０５３１】
上記Ｃａｓ９配列のいずれかが、Ｃ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合する場合、停止コドンは除外されるものと理解される。
【０５３２】
その他のＣａｓ分子およびＣａｓポリペプチド
本明細書で開示される方法を実施するために、様々なタイプのＣａｓ分子またはＣａｓポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。その他の実施形態では、その他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、上述されている（例えば、Ｈａｆｔ  ２００５およびＭａｋａｒｏｖａ  ２０１１を参照されたい）。代表的なＣａｓ分子（およびＣａｓシステム）は、表１７にもまた示される。
【０５３３】
【表５２】
2018523977.tif 000059
【０５３４】
【表５３】
2018523977.tif 000060
【０５３５】
【表５４】
2018523977.tif 000061
【０５３６】
【表５５】
2018523977.tif 000062
【０５３７】
その他のヌクレアーゼ
本明細書に開示される教示内容を用いて当業者には理解されるように、ｇＲＮＡ分子を選択し、デザインするための本明細書に記載の方法およびデータベーススキーマは、Ｃｐｆ１システム、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムなどの他のシステムのために使用することもできる。例えば、Ｃｐｆ１は、クラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  １６３，１−１３を参照）の単一ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種由来のＴＡＬＥと制限エンドヌクレアーゼ、ＦｏｋＩの融合物である。ＴＡＬＥのアミノ酸反復配列を修飾することにより、当業者は標的ＤＮＡに特異的に結合して、ＴＡＬ結合部位の間に切断を導入するように、ＴＡＬＥＮシステムをカスタマイズすることができる。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ切断ドメインとしてＦｏｋＩヌクレアーゼを使用し、特定のジンクフィンガーが、異なるヌクレオチドトリプレットを認識して、ＦｏｋＩヌクレアーゼを二量体化することにより、２つの異なるジンクフィンガー結合部位の間に二本鎖切断の導入を達成する。
【０５３８】
ＩＶ．候補分子の機能解析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載されている。
【０５３９】
結合および切断アッセイ：Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃａｓ９タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃａｓ９分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
【０５４０】
代案としては、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成され、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃａｓ９（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μｌでプレインキュベートされる。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μｌのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応物がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
【０５４１】
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃａｓ９分子の適合性が評価され得る。
【０５４２】
結合アッセイ：Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃａｓ９分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載されている。
【０５４３】
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μｌで実施される。Ｃａｓ９タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイメージングによって視覚化される。
【０５４４】
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性を測定する技術
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）およびその他の技術によって検知することができる。タンパク質の熱安定性は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る。従って、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを決定する上で有用である。
【０５４５】
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ＤＳＦは、タンパク質の熱安定性を測定するために用いることができる技術である。このアッセイは、いくつかの方法で適用することができる。例示的なプロトコルとして、限定はしないが、ＲＮＰ形成のための所望の溶液条件を判定するプロトコル（アッセイ１、以下を参照）、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質の最良の化学量論比を試験するプロトコル（アッセイ２、以下を参照）、Ｃａｓ９分子、例えば、野生型もしくは突然変異型Ｃａｓ９分子について有効なｇＲＮＡ分子をスクリーニングするプロトコル（アッセイ３、以下を参照）、ならびに標的ＤＮＡの存在下でＲＮＰ形成を調べるプロトコル（アッセイ４）が挙げられる。
【０５４６】
アッセイ１
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Ｃａｓ９の２μＭ水溶液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が３８４ウェルプレート内に分注される。次に、様々なｐＨの溶液中で希釈された等モル量のｇＲＮＡ、および塩が添加される。室温で１０分間インキュベートし、２０００ｒｐｍで遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０５４７】
アッセイ２
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のｇＲＮＡ分子と２ｕＭ  Ｃａｓ９を混合して、３８４ウェルプレート内で、室温で１０分間インキュベートすることを含む。等容積の最適緩衝液と１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートはＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ粘着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための２０００ｒｐｍでの遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０５４８】
アッセイ３
第３のアッセイでは、対象Ｃａｓ９分子（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、例えば、Ｃａｓ９変異タンパク質）を精製する。変異ｇＲＮＡ分子のライブラリーを合成し、２０μＭの濃度まで再懸濁させる。５×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）の存在下で予定緩衝液中に各々１μＭの最終濃度で、Ｃａｓ９分子をｇＲＮＡ分子と一緒にインキュベートする。室温で１０分間インキュベートしてから、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃ずつ昇温しながら、２０℃から９０℃への勾配を実行する。
【０５４９】
アッセイ４
第４のアッセイでは、次のサンプル：Ｃａｓ９タンパク質単独、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ、ならびにＣａｓ９タンパク質と標的ＤＮＡを用いて、ＤＳＦ実験を実施する。構成要素を混合する順序は、反応溶液、Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの順である。反応溶液は、ＭｇＣｌ２の非存在または存在下で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃ずつ昇温しながら、２０℃から９０℃への勾配を実行する。
【０５５０】
Ｖ．ゲノム編集アプローチ
例えば、本明細書に記載される遺伝子などの遺伝子の突然変異は、本明細書で考察されるアプローチの１つを用いて修正することができる。一実施形態では、遺伝子中の突然変異は、細胞外供給テンプレート核酸を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）により修正される（以下を参照）。別の実施形態では、遺伝子中の突然変異は、細胞外供給テンプレート核酸を用いずに、相同組換え修復（ＨＤＲ）により修正される（以下を参照）。
【０５５１】
さらに、ＮＨＥＪを用いた遺伝子の１つまたは両方の対立遺伝子の標的化破壊（例えば、ノックアウト）方法も本明細書に記載される。別の実施形態では、遺伝子の標的化ノックダウンのための方法が提供される（以下を参照）。
【０５５２】
ＨＤＲ修復、ＨＤＲ媒介性ノックインおよびテンプレート核酸
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、ゲノム中の標的配列を改変し、突然変異を修正（例えば、修復もしくは編集）することができる。標的配列の改変は、細胞外供給ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）によって起こる。例えば、供与体テンプレートまたはテンプレート核酸は、標的配列の改変を可能にする。プラスミド供与体は、相同組換えのためのテンプレートとして使用できると考えられる。さらに、一本鎖供与体テンプレートは、標的配列と供与体テンプレートとの間の相同組換え修復の代替（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）方法（例えば、一本鎖アニーリング）による標的配列の改変のためのテンプレートとして使用できることも考えられる。供与体テンプレートを用いて実施される標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含み得る。本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、細胞外供給ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸なしで、標的配列を改変し、ゲノム中の突然変異を修正（例えば、修復もしくは編集）することができる。標的配列の改変は、細胞外供給ドナー配列を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）によって起こる。例えば、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列の改変を可能にする。一実施形態では、内在性ゲノム供与体配列を、標的配列と同じ染色体上に位置させることが検討される。さらに、別の実施形態では、内在性ゲノム供与体配列は、標的配列とは異なる染色体上に位置させることが検討される。内在性ゲノム供与体配列による標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含み得る。
【０５５３】
テンプレート核酸を用いた、もしくは内在性ゲノムドナー配列を用いたＨＤＲにより修正することができる突然変異として点突然変異がある。一実施形態では、点突然変異は、１つの二本鎖切断または２つの一本鎖切断のいずれかによって修正することができる。一実施形態では、点突然変異は、以下のものによって修正することができる：（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）標的位置の両側でそれぞれ起こる切断を含む２つの二本鎖切断、（４）標的位置の両側で起こる二本鎖切断と２つの一本鎖切断を含む、１つの二本鎖切断と２つの二本鎖切断、（５）標的位置の両側でそれぞれ起こる１対の一本鎖切断を含む、４つの一本鎖切断、または（６）１つの一本鎖切断。
【０５５４】
一本鎖テンプレート核酸が用いられる一実施形態では、標的位置は、代替ＨＤＲによって改変することができる。
【０５５５】
標的位置の供与体テンプレートを用いて実施される改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、ニック、二本鎖切断、または２つの一本鎖切断、例えば、標的核酸の各鎖に１つずつを含み得る。標的核酸への切断の導入後、切断末端に切除が起こり、これによってＤＮＡ領域にオーバーラップする一本鎖が生じる。
【０５５６】
標準ＨＤＲでは、標的核酸に対する相同配列を含む二本鎖供与体テンプレートを導入するが、これは、標的核酸に直接組み込むか、または標的核酸の配列を修正するためのテンプレートとして使用する。切断における切除後、修復は、様々な経路、例えば、ダブルホリデイジャンクションモデル（ｄｏｕｂｌｅ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）（もしくは二本鎖切断修復、ＤＳＢＲ、経路）または合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）経路によって進行し得る。ダブルホリデイジャンクションモデルでは、供与体テンプレート中の相同配列に対する標的核酸の２つの一本鎖オーバーハングによる鎖浸潤が起こり、これによって、２つのホリデイジャンクションを含む中間体が形成される。これらのジャンクションは、新たなＤＮＡが、浸潤鎖の末端から合成されているため、移動して、切除によって生じた間隙を充填する。新たに合成されたＤＮＡの末端は、切除された末端と連結し、ジャンクションは分解されて、標的核酸の修正、例えば、対応する標的位置での供与体テンプレートの修正配列の組み込みが起こる。供与体テンプレート核酸との交差が、ジャンクションの分解時に起こり得る。ＳＤＳＡ経路では、唯一の一本鎖オーバーハングが供与体テンプレートを浸潤し、新たなＤＮＡが浸潤鎖の末端から合成されて、切除によって生じた間隙を充填する。新たに合成されたＤＮＡは、次に、残る一本鎖オーバーハングとアニールし、新たなＤＮＡが合成されて間隙を充填した後、鎖が連結されて、修正ＤＮＡ二重鎖を生成する。
【０５５７】
代替ＨＤＲでは、一本鎖供与体テンプレート、例えば、テンプレート核酸を導入する。所望の標的位置を改変するための標的核酸でのニック、一本鎖切断、または二本鎖切断は、例えば、本明細書に記載されるものなどのＣａｓ９分子によって媒介され、切断における切除が起こって、一本鎖オーバーハングが露出する。標的核酸の標的位置を修正または改変するためのテンプレート核酸の配列の組み込みは、典型的に、前述した通り、ＳＤＳＡ経路によって起こる。
【０５５８】
ＨＤＲ経路、例えば、標準ＨＤＲもしくはａｌｔ−ＨＤＲを促進する方法は、本明細書のセクションＶＩに記載される。
【０５５９】
テンプレート核酸についてのさらに詳細は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７９０５号の「テンプレート核酸（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」と題するセクションＩＶに記載されている。
【０５６０】
テンプレート核酸を用いた、もしくは内在性ゲノムドナー配列を用いたＨＤＲにより修正（例えば、改変）することができる、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列の配列中の突然変異が含まれる。また、テンプレート核酸、例えば、本明細書に記載されるテンプレート核酸を用いたＨＤＲによって、特定の遺伝子座、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、もしくはＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子変異体配列の配列にＡ１ＡＴ配列を挿入することもできる。
【０５６１】
二本鎖切断媒介性修復またはノックイン
一実施形態では、二本鎖切断は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性と、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子、例えば、野生型Ｃａｓ９によって実施される。このような実施形態は、単一のｇＲＮＡを必要とする。
【０５６２】
一本鎖切断媒介性修復またはノックイン
いくつかの実施形態では、１つの一本鎖切断、またはニックは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９ニッカーゼによって実施される。ニック標的核酸は、ａｌｔ−ＨＤＲ用の基質となり得る。
【０５６３】
他の実施形態では、２つの一本鎖切断、またはニックは、例えば、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性、またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性などのニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子によって実施される。このような実施形態は、通常、２つのｇＲＮＡを、すなわち各一本鎖切断の配置に１つずつ必要とする。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断するが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断しない。一実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断しないが、その代わり、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖は切断する。
【０５６４】
一実施形態では、ニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣ活性を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０に突然変異を有するＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異などＨＮＨ活性を有する。Ｄ１０Ａは、ＲｕｖＣを不活性化し；従って、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上にＮＧＧ  ＰＡＭを有していない相補鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｈ８４０、例えばＨ８４０Ａ、突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして用いることができる。Ｈ８４０Ａは、ＨＮＨを不活性化し；従って、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、その配列が、ｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｎ８６３、例えば、Ｎ８６３Ａ突然変異、突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｎ８６３Ａは、ＨＮＨを不活性化することから、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、かつその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｎ５８０突然変異、例えば、Ｎ５８０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｎ５８０Ａは、ＨＮＨを不活性化することから、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、かつその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。ニッカーゼおよび２つのｇＲＮＡを用いて、２つの一本鎖ニックを配置する一実施形態では、１つのニックは、標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは、その−鎖上にある。ＰＡＭは、外側を向いてもよい。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ同士が、約０〜５０、０〜１００、または０〜２００ヌクレオチドによって隔てられるように選択することができる。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的な標的配列の間にオーバーラップはない。一実施形態では、ｇＲＮＡは、オーバーラップせずに、５０、１００、または２００ヌクレオチド程によって隔てられている。一実施形態では、２つのｇＲＮＡの使用は、例えば、オフターゲット結合を低減することによって、特異性を増大することができる（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３；１５４（６）：１３８０−１３８９）。
【０５６５】
一実施形態では、単一のニックを用いて、ＨＤＲ、例えば、ａｌｔ−ＨＤＲを誘導することができる。本明細書では、単一のニックを用いて、所与の切断部位でのＨＲとＮＨＥＪの比を増加し得ることが検討される。一実施形態では、前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが相補的である標的核酸の鎖中に一本鎖切断を形成する。他の実施形態では、前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが相補的である鎖以外の標的核酸の鎖中に一本鎖切断を形成する。
【０５６６】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
鎖の一方における二本鎖切断または一本鎖切断は、改変が所望の領域内で生じる、例えば、突然変異の修正が起こるように、標的位置に十分接近させるべきである。一実施形態では、距離は、５０、１００、２００、３００、３５０もしくは４００ヌクレオチド以下である。標的位置が、末端切除中にエキソヌクレアーゼ媒介性除去を受ける領域内にあるように、切除は標的位置に十分接近させるべきであると考えられる。標的位置と切断の間の距離が大きすぎると、改変しようとする突然変異体または他の配列が末端切除に包含されず、従って、修正されない場合がある。というのは、供与体配列（細胞外供給供与体配列または内在性ゲノム供与体配列のいずれも）は、いくつかの実施形態では、末端切除領域内の配列を修正するためだけに使用されるからである。
【０５６７】
一実施形態では、標的化ドメインは、切断事象、例えば、二本鎖もしくは一本鎖切断が、改変しようとする領域、例えば、突然変異から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくは２００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。切断、例えば、二本鎖切断または一本鎖切断は、改変しようとする領域、例えば、突然変異の上流または下流に配置することができる。いくつかの実施形態では、切断は、改変しようとする領域、少なくとも２つの突然変異ヌクレオチドにより画定される領域内に配置される。いくつかの実施形態では、切断は、改変しようとする領域に直接隣接して、例えば、突然変異のすぐ上流または下流に位置する。
【０５６８】
一実施形態では、一本鎖切断には、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的一本鎖切断が伴う。例えば、標的化ドメインは、例えば、２つの一本鎖切断などの切断事象が、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ヌクレオチド内に位置するように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼを誘導すると、一本鎖切断が、前記第２のｇＲＮＡによって配置される互いに十分に近い追加的一本鎖切断を伴い、所望する領域の改変をもたらすように構成される。一実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｃａｓ９がニッカーゼである場合、第２のｇＲＮＡによって配置される一本鎖切断が、前記第１のｇＲＮＡ分子によって配置される切断の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内であるように構成される。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド内に、切断を配置させるように設計されて、例えば、二本鎖切断を本質的に模倣する。
【０５６９】
ＨＤＲ媒介性修正を誘導するために、ｇＲＮＡ（単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）およびＣａｓ９ヌクレアーゼが、二本鎖切断を誘導する一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜２００塩基対（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００塩基対）離れている。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜１００塩基対（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５、または７５〜１００塩基対）離れている。
【０５７０】
複数の実施形態では、ニッカーゼを用いることでＨＤＲを促進して、オーバーハングを含む切断を生成することができる。オーバーハングの一本鎖性質は、例えば、ＮＨＥＪとは反対に、ＨＤＲによって切断を修復する細胞の可能性を増大することができる。特に、いくつかの実施形態では、第１のニッカーゼを第１の標的配列に標的化する第１のｇＲＮＡと、第１の標的配列とは反対側のＤＮＡ鎖上にあり、しかも第１のニックからずれている第２の標的配列に第２のニッカーゼを標的化する第２のｇＲＮＡとを選択することによって、ＨＤＲを促進する。
【０５７１】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ヌクレオチドが改変されないように、予め選択したヌクレオチド、例えば、コード領域のヌクレオチドから十分遠くに、切断事象が位置するように設計される。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、エキソン配列の改変または不要なスプライシング事象を回避するために、イントロン切断事象が、イントロン／エキソン境界または天然起源のスプライスシグナルから十分遠くに位置するように設計される。ｇＲＮＡ分子は、以下に記載するように、第１、第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子であってよい。
【０５７２】
第１の切断および第２の切断同士の配置
一実施形態では、二本鎖切断は、下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０５７３】
一実施形態では、二本鎖切断は、第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０５７４】
一実施形態では、第１および第２の一本鎖切断は、第３のｇＲＮＡ分子および第４のｇＲＮＡ分子によって配置される２つの追加的二本鎖切断を伴い得る。
【０５７５】
２つ以上のｇＲＮＡを用いて、標的核酸内に２つ以上の切断事象、例えば、二本鎖または一本鎖切断を配置する場合、同じまたは異なるＣａｓ９タンパク質によって２つ以上の切断事象を実施し得ることが検討される。例えば、２つのｇＲＮＡを用いて、２つの二本鎖切断を配置する場合、単一のＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて、双方の二本鎖切断を生成することができる。２つ以上のｇＲＮＡを用いて、２つ以上の一本鎖切断（ニック）を配置する場合、単一のＣａｓ９ニッカーゼを用いて、２つ以上のニックを生成することができる。２つ以上のｇＲＮＡを用いて、少なくとも１つの二本鎖切断と少なくとも１つの一本鎖切断を配置する場合、２つのＣａｓ９タンパク質、例えば、１つのＣａｓ９ヌクレアーゼと１つのＣａｓ９ニッカーゼを用いることができる。２つ以上のＣａｓ９タンパク質を用いる場合、２つ以上のＣａｓ９タンパク質を順次送達することにより、標的核酸の所望の位置で、一本鎖切断に対して二本鎖の特異性を制御し得ることが検討される。
【０５７６】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向鎖と相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側に向くように設計される。
【０５７７】
特定の実施形態では、互いに予め選択した距離にある２つの位置のＣａｓ９媒介性切断を指令するように、２つのｇＲＮＡを選択する。複数の実施形態では、２つの切断点は、標的核酸の対向鎖上にある。いくつかの実施形態では、２つの切断点は、平滑末端切断を形成し、他の実施形態では、これらは、ＤＮＡ末端が、１つまたは２つのオーバーハング（例えば、１つまたは複数の５’オーバーハングおよび／または１つまたは複数の３’オーバーハング）を含むようにずれている。複数の実施形態では、各切断事象は、ニックである。いくつかの実施形態では、ニックは、二本鎖切断機構により認識される切断を形成するように、互いに十分接近している（例えば、ＳＳＢｒ機構により認識されるのとは反対に）。複数の実施形態では、ニックは、それらが、ＨＤＲの基質であるオーバーハングを生成する、すなわち、切断の配置が、いくつかの切除を被ったＤＮＡ基質を模倣するように、十分離れている。例えば、いくつかの実施形態では、ニックは、プロセッシブ切除のための基質であるオーバーハングを生成するように隔てられている。いくつかの実施形態では、２つの切断は、互いに２５〜６５ヌクレオチド以内で隔てられている。２つの切断は、例えば、互いに約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。２つの切断は、例えば、互いに少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。２つの切断は、例えば、互いに多くとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、２つの切断は、互いに約２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、または６０〜６５ヌクレオチドであってよい。
【０５７８】
いくつかの実施形態では、切除された切断を模倣する切断は、３’末端オーバーハング（例えば、ＤＳＢおよびニックによって生成され、ここで、ニックは３’オーバーハングを残す）、５’オーバーハング（例えば、ＤＳＢおよびニックによって生成され、ここで、ニックは５’オーバーハングを残す）、３’および５’オーバーハング（例えば、３つの切断によって生成される）、２つの３’オーバーハング（例えば、互いにずれている２つのニックによって生成される）、または２つの５’オーバーハング（例えば、互いにずれている２つのニックによって生成される）を含む。
【０５７９】
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する２つのｇＲＮＡ（独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）が、ＨＤＲ媒介性修正を誘導する目的で、２つの一本鎖切断を誘導する一実施形態では、より近傍のニックは、標的位置から互いに０〜２００塩基対（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００塩基対）離れており、２つのニックは、理想的には互いに２５〜６５塩基対（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５塩基対、４５〜５０塩基対、５０〜５５塩基対、５５〜６０塩基対、６０〜６５塩基対）以内にあり、ならびに互いから１００塩基対以下（例えば、互いから９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５塩基対）離れている。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜１００塩基対（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５または７５〜１００塩基対）離れている。
【０５８０】
一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように設計される。代替の実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に、二本鎖切断（すなわち、ｃａｓ９ヌクレアーゼと１つのｇＲＮＡの複合体）と２つの一本鎖切断または対合一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼと２つのｇＲＮＡの複合体）を配置するように設計される。別の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立して、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置の両側に２対の一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼと２対の２つのｇＲＮＡの複合体）を生成するように設計される。二本鎖切断または１対において２つの一本鎖ニックの近い方は、理想的には標的位置の０〜５００塩基対以内（標的位置から、例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼを使用する場合、１対の２つのニックは、複数の実施形態では、互いに２５〜６５塩基対（例えば、２５〜５５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、４０〜４５塩基対、４５〜５０塩基対、５０〜５５塩基対、５５〜６０塩基対、または６０〜６５塩基対）以内にあり、ならびに互いから１００塩基対以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０塩基対以下）離れている。
【０５８１】
２つのｇＲＮＡ分子を用いて、Ｃａｓ９分子を切断に標的化する場合、Ｃａｓ９分子の様々な組み合わせが考えられる。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡを用いて、第１のＣａｓ９分子を第１の標的位置に標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて、第２のＣａｓ９分子を第２の標的位置に標的化する。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９分子は、標的核酸の第１鎖にニックを生成し、第２のＣａｓ９分子は、対向鎖上にニックを生成し、これによって、二本鎖切断（例えば、平滑末端切断またはオーバーハングを含む切断）が生じる。
【０５８２】
１つの一本鎖切断を一方の鎖に、また第２の一本鎖切断を対向鎖に標的化するために、ニッカーゼの様々な組み合わせを選択することができる。組み合わせを選択する際、１つの活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼと、１つの活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼがあることを考慮に入れることができる。一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、標的核酸分子の非相補的鎖を切断する。一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、一本鎖相補的ドメイン、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖を切断する。一般的に、双方のＣａｓ９分子は、同じ活性ドメインを有し（例えば、双方が活性ＲｕｖＣドメインを有するか、または双方が活性ＨＮＨドメインを有する）、標的の対向鎖に２つの結合するｇＲＮＡを選択することになる。さらに詳細には、いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼに結合して、第１のｇＲＮＡと非相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第２鎖をニッカーゼに切断させ；第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２鎖と相補的であり、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するニッカーゼに結合して、第２のｇＲＮＡと非相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第１鎖をニッカーゼに切断させる。反対に、いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、標的核酸の第１鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼに結合して、第１のｇＲＮＡと相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第１鎖をニッカーゼに切断させ；第２のｇＲＮＡは、標的核酸の第２鎖と相補的であり、活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼに結合して、第２のｇＲＮＡと相補的な鎖、すなわち、標的核酸の第２鎖をニッカーゼに切断させる。別の実施形態では、１つのＣａｓ９分子が活性ＲｕｖＣ様ドメインを有し、他方のＣａｓ９分子が活性ＨＮＨドメインを有する場合、双方のＣａｓ９分子のｇＲＮＡは、標的核酸の同じ鎖と相補的であり得るため、活性ＲｕｖＣ様ドメインを有するＣａｓ９分子は、非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインを有するＣａｓ９分子は、相補鎖を切断することになり、これによって二本鎖切断が生じる。
【０５８３】
供与体テンプレートの相同性アームの長さ
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、供与体テンプレート内の相補的領域を見出すことができるように、末端切除が起こり得る領域と少なくとも同じくらい遠くまで延在すべきである。その全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメーターによって限定され得る。一実施形態では、相同性アームは、反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復配列またはＬＩＮＥ反復配列中に延在しない。
【０５８４】
例示的な相同性アーム長さとしては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、相同性アーム長さは、５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、または４０００〜５０００ヌクレオチドである。
【０５８５】
標的位置は、本明細書の用法では、Ｃａｓ９分子依存的プロセスにより修飾される標的核酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、標的核酸の修飾Ｃａｓ９分子切断および標的位置のテンプレート核酸指向性修飾、例えば、修正であり得る。一実施形態では、標的位置は、１つまたは複数のヌクレオチドが付加される標的核酸上の２つのヌクレオチド、例えば、隣接ヌクレオチド間の部位であってよい。標的位置は、テンプレート核酸により改変、例えば修正される１つまたは複数のヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）内にある。一実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の上流または下流である。
【０５８６】
テンプレート核酸は、この用語が本明細書で使用される場合、標的位置の構造を改変するために、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子と一緒に使用することができる核酸配列を指す。一実施形態では、標準核酸は、典型的に、切断部位またはその付近で、テンプレート核酸の配列の一部もしくは全部を有するように、改変される。一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖である。一実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖である。一実施形態では、テンプレート核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。他の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖ＤＮＡである。一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡと同じベクター骨格、例えば、ＡＡＶゲノム、プラスミドＤＮＡ上にコードされる。一実施形態では、テンプレート核酸は、生体内でベクター骨格から切除され、例えば、これは、ｇＲＮＡ認識配列によりフランキングされる。一実施形態では、テンプレート核酸は、内在性ゲノム配列を含む。
【０５８７】
一実施形態では、テンプレート核酸は、相同組換え修復事象に参加することによって、標的位置の構造を改変する。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を改変する。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸への修飾、または非天然塩基の組み込みをもたらす。
【０５８８】
典型的に、テンプレート配列は、標的配列による切断媒介性または触媒組換えを受ける。一実施形態では、テンプレート核酸は、ｅａＣａｓ９媒介切断事象によって切断される標的配列上の１部位に対応する配列を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、第１のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第１部位と、第２のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第２部位の両方に対応する配列を含む。
【０５８９】
一実施形態では、テンプレート核酸は、翻訳配列のコード配列に改変をもたらす配列、例えば、突然変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に形質転換する、野生型対立遺伝子を突然変異対立遺伝子に形質転換する、および／もしくは停止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス突然変異などの、例えば、タンパク質産物中の１アミノ酸の別のアミノ酸による置換をもたらす配列を含み得る。
【０５９０】
他の実施形態では、テンプレート核酸は、非コード配列の改変、例えば、エキソンあるいは５’もしくは３’非翻訳または非転写領域での改変をもたらす配列を含み得る。このような改変として、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの改変、およびシス作用もしくはトランス作用制御エレメントの改変が挙げられる。
【０５９１】
例えば、本明細書に記載される遺伝子などの遺伝子中の標的位置との相同性を有するテンプレート核酸を用いて、標的配列の構造を改変することができる。テンプレート配列を用いて、不要な構造、例えば、不要なまたは突然変異ヌクレオチドを改変することができる。
【０５９２】
テンプレート核酸は、典型的に、以下の構成要素：
［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］
を含む。
【０５９３】
相同性アームは、染色体への組換え、従って、置換配列による、望ましくないエレメント、例えば、突然変異またはシグネチャの置換を提供する。一実施形態では、相同性アームは、最も遠位の切断部位とフランキングする。
【０５９４】
一実施形態では、５’相同性アームの３’末端は、置換配列の５’末端に隣接する位置である。一実施形態では、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド５’側に延在し得る。
【０５９５】
一実施形態では、３’相同性アームの５’末端は、置換配列の３’末端に隣接する位置である。一実施形態では、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド３’側に延在し得る。
【０５９６】
一実施形態では、突然変異を修正するために、相同性アーム、例えば、５’および３’相同性アームは、各々、最も遠位のｇＲＮＡ（例えば、突然変異の両側の１０００塩基対（ｂｐ）の配列にフランキングする約１０００ｂｐの配列を含み得る。
【０５９７】
本明細書では、特定の配列反復エレメント、例えば、Ａｌｕ反復エレメントまたはＬＩＮＥエレメントの含有を回避するために、一方または双方の相同性アームを短縮し得ることが考慮される。例えば、配列反復エレメントを回避するために、５’相同性アームを短縮してよい。他の実施形態では、配列反復エレメントを回避するために、３’相同性アームを短縮してもよい。いくつかの実施形態では、特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、５’および３’相同性アームの双方を短縮してもよい。
【０５９８】
本明細書では、突然変異を修正するためのテンプレート核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として使用するためにデザインされ得ることが検討される。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’および３’相同性アームは、約２００塩基対（ｂｐ）長、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００塩基対長の範囲であってよい。オリゴヌクレオチド合成の改善が継続して実施されるため、より長い相同性アームもｓｓＯＤＮに検討される。いくつかの実施形態では、より長い相同性アームは、化学合成以外の方法、例えば、長い二本鎖核酸を変性させた後、例えば、固体支持体に固定させた鎖特異的配列に対するアフィニティにより鎖の一方を精製することによって実施される。
【０５９９】
いくつかの実施形態では、ａｌｔ−ＨＤＲは、テンプレート核酸が、ニックの５’側に（すなわち、ニック鎖の５’方向に）延在する相同性を有するとき、より効率的に進行する。従って、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、長い相同性アームと短い相同性アームを有し、ここで、長い方の相同性アームが、ニックの５’側にアニールすることができる。いくつかの実施形態では、ニックの５’側にアニールすることができるアームは、ニックから、または置換配列の５’もしくは３’末端から、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ニックの５’側にアニールすることができるアームは、ニックの３’側にアニールすることができるアームより、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％長い。いくつかの実施形態では、ニックの５’側にアニールすることができるアームは、ニックの３’側にアニールすることができるアームより、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍長い。ｓｓＤＮＡテンプレートが、インタクトな鎖または切断鎖にアニールすることができるか否かに応じて、ニックの５’側にアニールする相同性アームは、それぞれｓｓＤＮＡテンプレートの５’末端またはｓｓＤＮＡテンプレートの３’末端に位置し得る。
【０６００】
同様に、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、テンプレート核酸が、ニックの５’側に延在する相同性を有するように、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを有する。例えば、５’相同性アームと３’相同性アームは、実質的に同じ長さであってよいが、置換配列は、ニックの３’側よりもニックの５’側で、より遠くに延在し得る。いくつかの実施形態では、置換配列は、ニックの３’末端よりもニックの５’末端側に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、２倍、３倍、４倍、または５倍遠くに延在する。
【０６０１】
いくつかの実施形態では、ａｌｔ−ＨＤＲは、テンプレート核酸がニックの中心に位置するとき、より効率的に進行する。従って、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ほぼ同じサイズである２つの相同性アームを有する。例えば、テンプレート核酸の第１の相同性アームは、テンプレート核酸の第２の相同性アームの１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内の長さを有し得る。
【０６０２】
同様に、いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、テンプレート核酸が、ニックの両側でほぼ同じ距離だけ延在するように、５’相同性アーム、置換配列、および３’相同性アームを有する。例えば、相同性アームは、異なる長さを有してよいが、置換配列は、これを補償するように選択され得る。例えば、置換配列は、ニックの３’側よりもニックの５’側で、より遠く延在し得るが、ニックの５’側の相同性アームは、これを補償するために、ニックの３’側の相同性アームより短い。その逆も可能であり、例えば、置換配列は、ニックの５’側よりもニックの３’側で、より遠くに延在し得るが、ニックの３’側の相同性アームは、これを補償するために、ニックの５’側の相同性アームより短い。
【０６０３】
線状核酸テンプレート系の例示的な配置
一実施形態では、核酸テンプレート系は、二本鎖である。一実施形態では、核酸テンプレート系は、一本鎖である。一実施形態では、核酸テンプレート系は、一本鎖部分と二本鎖部分を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび／または置換配列の両側に、約５０〜１００、例えば、５５〜９５、６０〜９０、６５〜８５、または７０〜８０塩基対の相同性を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックもしくは置換配列の５’側、ニックもしくは置換配列の３’側、またはニックもしくは置換配列の５’および３’側の双方に約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基対の相同性を含む。
【０６０４】
一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび／または置換配列の３’側に約１５０〜２００塩基対、例えば、１５５〜１９５、１６０〜１９０、１６５〜１８５、もしくは１７０〜１８０塩基対の相同性を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の３’側に約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、もしくは２００塩基対の相同性を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、もしくは１０塩基対未満の相同性を含む。
【０６０５】
一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび／または置換配列の５’側に約１５０〜２００塩基対、例えば、１５５〜１９５、１６０〜１９０、１６５〜１８５、もしくは１７０〜１８０塩基対の相同性を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側に約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、もしくは２００塩基対の相同性を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の３’側に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、もしくは１０塩基対未満の相同性を含む。
【０６０６】
例示的なテンプレート核酸
一実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖核酸である。別の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、１つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、これは、標的核酸に付加されるか、または標的核酸中の変化をテンプレートする。他の実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置を改変するのに用いられ得るヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、例えば標的位置などの標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
【０６０７】
テンプレート核酸は、置換配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、５’相同性アームを含む。他の実施形態では、テンプレート核酸は、３’相同性アームを含む。
【０６０８】
複数の実施形態では、テンプレート核酸は、直鎖二本鎖ＤＮＡである。長さは、例えば、約１５０〜２００塩基対、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対であってよい。長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対であってよい。いくつかの実施形態では、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００塩基対以下である。いくつかの実施形態では、二本鎖テンプレート核酸は、約１６０、例えば、１５５〜１６５、１５０〜１７０、１４０〜１８０、１３０〜１９０、１２０〜２００、１１０〜２１０、１００〜２２０、９０〜２３０、または８０〜２４０塩基対の長さを有する。
【０６０９】
テンプレート核酸は、直鎖一本鎖ＤＮＡであり得る。複数の実施形態では、テンプレート核酸は、（ｉ）標的核酸の切断鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉ）標的核酸のインタクトな鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉｉ）標的核酸の転写鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、（ｉｖ）標的核酸の非転写鎖にアニールすることができる直鎖一本鎖ＤＮＡ、またはこれらの２つ以上である。長さは、例えば、約１５０〜２００ヌクレオチド、例えば、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドであってよい。長さは、例えば、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、長さは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態では、一本鎖テンプレート核酸は、約１６０ヌクレオチド、例えば、約１５５〜１６５、１５０〜１７０、１４０〜１８０、１３０〜１９０、１２０〜２００、１１０〜２１０、１００〜２２０、９０〜２３０、または８０〜２４０ヌクレオチドの長さを有する。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、環状二本鎖ＤＮＡ、例えば、プラスミドである。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列および／またはニックの両側に、約５００〜１０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいは、ニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対以下の相同性を含む。
【０６１１】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、アデノウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされることを可能にする長さおよび配列のｓｓＤＮＡ分子である。ベクターは、例えば、５ｋｂ未満であってよく、キャプシド中へのパッケージングを促進するＩＴＲ配列を含んでもよい。ベクターは、組み込み欠陥であってもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列および／またはニックの両側に、約１５０〜１０００ヌクレオチドの相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、約１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、多くとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチドを含む。
【０６１２】
いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、レンチウイルスベクター、例えば、ＩＤＬＶ（組み込み欠陥レンチウイルス）である。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、置換配列および／またはニックの両側に、約５００〜１０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいはニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、少なくとも３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対の相同性を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、ニックまたは置換配列の５’側、ニックまたは置換配列の３’側、あるいは、ニックまたは置換配列の５’および３’側の双方に、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００塩基対以下の相同性を含む。
【０６１３】
一実施形態では、テンプレート核酸は、Ｃａｓ９がテンプレート核酸を認識してこれを切断するのを妨げる１つまたは複数の突然変異、例えば、サイレント突然変異を含む。テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０のサイレント突然変異を含んでもよい。複数の実施形態では、テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、多くとも２、３、４、５、１０、２０、３０、または５０のサイレント突然変異を含む。一実施形態では、ｃＤＮＡは、Ｃａｓ９がテンプレート核酸を認識してこれを切断するのを妨げる１つまたは複数の突然変異、例えば、サイレント突然変異を含む。テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０のサイレント突然変異を含んでよい。複数の実施形態では、テンプレート核酸は、改変しようとする細胞のゲノム中の対応する配列に対して、多くとも２、３、４、５、１０、２０、３０、または５０のサイレント突然変異を含む。
【０６１４】
一実施形態では、テンプレート核酸は、相同組換え修復事象に参加することによって標的位置の構造を改変する。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的位置の配列を改変する。一実施形態では、テンプレート核酸は、標的核酸への修飾または非天然塩基の組み込みをもたらす。
【０６１５】
典型的に、テンプレート配列は、標的配列による切断媒介性または触媒による組換えを受ける。一実施形態では、テンプレート核酸は、ｅａＣａｓ９媒介性切断事象によって切断される標的配列上の１部位に対応する配列を含む。一実施形態では、テンプレート核酸は、第１のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第１部位と、第２のＣａｓ９媒介性事象で切断される標的配列上の第２部位の両方に対応する配列を含む。
【０６１６】
一実施形態では、テンプレート核酸は、翻訳配列のコード配列に改変をもたらす配列、例えば、突然変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に形質転換する、野生型対立遺伝子を突然変異対立遺伝子に形質転換する、および／もしくは停止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス突然変異などの、例えば、タンパク質産物中の１アミノ酸の別のアミノ酸による置換をもたらす配列を含み得る。
【０６１７】
他の実施形態では、テンプレート核酸は、非コード配列の改変、例えば、エキソンあるいは５’もしくは３’非翻訳または非転写領域に改変をもたらす配列を含み得る。このような改変として、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの改変、およびシス作用もしくはトランス作用制御エレメントの改変が挙げられる。標的位置の相同性を有するテンプレート核酸を用いて、標的配列の構造を改変することができる。テンプレート配列を用いて、不要な構造、例えば、不要なまたは突然変異ヌクレオチドを改変することができる。
【０６１８】
下の表１８は、例示的なテンプレート核酸を記載する。一実施形態では、テンプレート核酸は、表１８の１列の５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む。別の実施形態では、第１列からの５’相同性アームを表１８の３’相同性アームと組み合わせることができる。各実施形態において、５’および３’相同性アームの組合せは、置換配列を含む。
【０６１９】
【表５６】
2018523977.tif 000063
【０６２０】
【表５７】
2018523977.tif 000064
【０６２１】
遺伝子ターゲッティングのためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して、標的遺伝子特異的破壊（例えば、ノックアウト）を標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪはまた、対象遺伝子中の配列を除去する（例えば、欠失させる）のにも使用することができる。
【０６２２】
一実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する；しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。
【０６２３】
ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失物の長さは、幅広く変動し得て；最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、それらは１００〜２００ｂｐを超える範囲に達し得る。挿入物はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む配列の短い重複を含む。しかし、大きな挿入物を得ることが可能であり、こうした場合、挿入配列は、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされていることが多い。
【０６２４】
ＮＨＥＪは、変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、これは、小規模な配列モチーフ（例えば、長さ５０ヌクレオチド以下のモチーフ）を欠失させるのにも使用することができる。二本鎖切断が、標的配列の近くで標的化される場合、ＮＨＥＪ修復によって引き起こされる欠失変異は、不要のヌクレオチドに及ぶことから、それらを除去する。より大型のＤＮＡセグメントの欠失の場合には、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断を導入することにより、介在配列全体が除去され、末端同士の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。このようにして、数百キロベースという大型のＤＮＡセグメントを切断することができる。これらのアプローチの双方を使用して、特定のＤＮＡ配列が欠失され得る；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位に依然としてインデル変異を生成し得る。
【０６２５】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルが生成され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に標的化されるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち発現排除）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、または開始コドンの５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の開始コドン直後の配列を含む。
【０６２６】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じる一実施形態では、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子などのｇＲＮＡが、１つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている。
【０６２７】
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的でＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する２つのｇＲＮＡが、２つの一本鎖切断を誘導する一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡが、標的位置のヌクレオチドにＮＨＥＪ修復を提供するように、２つの一本鎖切断を配置させるように構成される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、切断を異なる鎖上の同一位置に、または互いに少数のヌクレオチド以内に、配置させるように構成されて、二本鎖切断が本質的に模倣される。特定の実施形態では、より近いニックは、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れており、２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。一実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖切断を標的位置のヌクレオチドのどちらかの側に配置させるように構成される。
【０６２８】
二本鎖切断ｅａＣａｓ９分子と、一本鎖、またはニッカーゼ、ｅａＣａｓ９分子との双方を本明細書に記載される方法および組成物で使用して、標的位置の両側に切断が生成され得る。二本鎖または対形成一本鎖切断は、標的位置の両側に生成されて、２つの切断で核酸配列が除去されてもよい（例えば、２つの切断間の領域が欠失される）。一実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである２つのｇＲＮＡは、二本鎖切断を標的位置の両側に配置させるように構成される。代替の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである３つのｇＲＮＡは、二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体形成する）と、２つの一本鎖切断または対の一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）とが、標的位置の両側に配置されるように構成される。別の実施形態では、例えば、独立して、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡである４つのｇＲＮＡは、２対の一本鎖切断（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体形成する）が、標的位置の両側に生じるように構成される。二本鎖切断、または対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にある。ニッカーゼが使用される場合、対の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間）であり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【０６２９】
標的化ノックダウン
遺伝子をＤＮＡレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Ｃａｓ９タンパク質の双方のＤＮＡ切断ドメインで重要な残基を変異させることは（例えば、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異）、触媒能のないＣａｓ９（死滅Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９分子としてもまた知られているｅｉＣａｓ９）の生成をもたらす。触媒能のないＣａｓ９はｇＲＮＡと複合体形成して、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって特定化されたＤＮＡ配列に局在するが、それは標的ＤＮＡを切断しない。ｄＣａｓ９と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、ｇＲＮＡによって特定化された任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にする。酵素的に活性な（ｅｉＣａｓ９）Ｃａｓ９分子それ自体は、コード配列中の早期領域に動員された場合に、転写をブロックすることができるが、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤまたはＥＲＤ）をＣａｓ９に融合させて、転写抑制ドメインを、標的ノックダウン位置、例えば、開始コドンの配列３’の１０００塩基対または遺伝子の開始コドンのプロモーター領域５’の５００塩基対内に動員することによって達成され得る。プロモーターのＤＮＡｓｅＩ高感受性領域（ＤＨＳ）は、Ｃａｓ９タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子のための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、恐らくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされ得る。特に遺伝子抑制については、内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。一実施形態では、１つまたは複数の内在性転写因子の結合をブロックするために、１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子を用いてもよい。別の実施形態では、ｅｉＣａｓ９分子をクロマチン改変タンパク質に融合させてもよい。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。クロマチン状態を改変するために、１つまたは複数のクロマチン改変タンパク質に融合した１つまたは複数のｅｉＣａｓ９分子を用いてもよい。
【０６３０】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、既知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）に、および／または標的ＤＮＡの発現を調節できることが疑われる未知のまたは既知の機能がある配列に、標的化され得る。
【０６３１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックダウンを使用して、望まれない対立遺伝子または転写物の発現を低下させ得る。本明細書で検討されるのは、遺伝子の恒久的な破壊が、理想的でない筋書きである。これらの筋書きでは、部位特異的抑制を使用して、発現が一時的に低下または排除されてもよい。ヌクレアーゼが任意のＤＮＡ配列を切断して変異を引き起こし得るのに対し、Ｃａｓリプレッサーは、活発に転写される遺伝子のプロモーター領域に標的化された場合にのみ効果を有してもよいので、Ｃａｓリプレッサーのオフターゲット効果が、Ｃａｓヌクレアーゼのものよりも重篤性が低いこともまた本明細書で検討される。しかし、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトが恒久的である一方で、抑制は、Ｃａｓリプレッサーが細胞内に存在する場合に限り持続してもよい。リプレッサーがもはや存在しなくなると、内在性転写因子および遺伝子制御要素は、発現をその天然状態に復元する可能性が高い。
【０６３２】
一本鎖アニーリング
一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、標的核酸中に存在する２つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のＤＮＡ修復プロセスである。ＳＳＡ経路によって使用される反復配列は、一般に３０ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをＲＰＡタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいＤＮＡ合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがＤＮＡ二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、２つの反復間のＤＮＡ配列が欠失する。欠失の長さは、使用される２つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
【０６３３】
ＨＤＲ経路とは対照的に、ＳＳＡは、標的核酸配列を改変または修正するのにテンプレート核酸を必要としない。それに代えて、相補的反復配列が使用される。
【０６３４】
その他のＤＮＡ修復経路
ＳＳＢＲ（一本鎖切断修復）
ゲノム内の一本鎖切断（ＳＳＢ）は、上で論じたＤＳＢ修復機序とは別個の機序であるＳＳＢＲ経路によって修復される。ＳＳＢＲ経路は、ＳＳＢ検出、ＤＮＡ末端プロセッシング、ＤＮＡギャップ充填、およびＤＮＡライゲーションの４つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，６１９−６３１（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０６３５】
ＳＳＢが形成する第１段階では、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識して修復機構を動員する。ＤＮＡ切断におけるＰＡＲＰ１の結合および活性は一過性であり、損傷におけるＳＳＢｒタンパク質複合体の巣状滞留または安定性を促進することで、ＳＳＢｒを加速するようである。議論の余地はあるが、これらのＳＳＢｒタンパク質中で最重要であるのはＸＲＣＣ１であり、これは、ＤＮＡの３’および５’末端のクリーニングに関与するタンパク質をはじめとする、ＳＳＢｒプロセスの複数の酵素的構成要素と相互作用して、安定化し刺激する分子スキャフォールドとして機能する。例えば、ＸＲＣＣ１は、末端プロセッシングを促進するいくつかのタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼβ、ＰＮＫ、および３つのヌクレアーゼ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、およびＡＰＬＦ）と相互作用する。ＡＰＥ１は、エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＡＰＬＦは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ機能を示す。ＡＰＴＸは、エンドヌクレアーゼおよび３’から５’方向エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０６３６】
全部ではないとしても大多数のＳＳＢの３’および／または５’末端は損傷を受けているため、この末端プロセッシングはＳＳＢＲの重要な段階である。末端プロセッシングは、一般に、末端がライゲーションできるように、損傷を受けた３’末端をヒドロキシル化状態に回復させ、およびおよび／または損傷を受けた５’末端をリン酸部分に、回復させることを伴う。損傷を受けた３’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、およびＴＤＰ１が挙げられる。損傷を受けた５’末端をプロセスできる酵素としては、ＰＮＫＰ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびＡＰＴＸが挙げられる。ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼＩＩＩ）はまた、末端プロセッシングにも関与する。ひとたび末端がクリーニングされたら、ギャップ充填が起こり得る。
【０６３７】
ＤＮＡギャップ充填段階では、典型的に存在するタンパク質は、ＰＡＲＰ１、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＸＲＣＣ１、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｃｕｌｅａｓｅ）１）、ＤＮＡポリメラーゼδ／ε、ＰＣＮＡ、およびＬＩＧ１である。短いパッチ修復および長いパッチ修復の２つのギャップ充填様式がある。短いパッチ修復は、欠損している単一ヌクレオチドを挿入することを伴う。いくつかのＳＳＢでは、「ギャップ充填」は、２つ以上のヌクレオチドを転置し続けるかもしれない（最高１２塩基の転置が報告されている）。ＦＥＮ１は、転置された５’残基を除去するエンドヌクレアーゼである。Ｐｏｌβをはじめとする複数のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＳＢの修復に関与し、ＤＮＡポリメラーゼの選択は、ＳＳＢの起源とタイプによって影響を受ける。
【０６３８】
第４段階では、ＬＩＧ１（リガーゼＩ）またはＬＩＧ３（リガーゼＩＩＩ）などのＤＮＡリガーゼが、末端の連結を触媒する。短いパッチ修復はリガーゼＩＩＩを利用して、長いパッチ修復はリガーゼＩを利用する。
【０６３９】
時に、ＳＳＢＲは、複製−共役する。この経路には、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、ＥＲＣＣ１、およびＦＥＮ１の１つまたは複数が関与し得る。ＳＳＢＲを促進してもよい追加的要素としては、ａＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＧ、ＸＲＣＣ１、ＤＮＡポリメラーゼｂ、ＤＮＡポリメラーゼｄ、ＤＮＡポリメラーゼｅ、ＰＣＮＡ、ＬＩＧ１、ＰＮＫ、ＰＮＫＰ、ＡＰＥ１、ＡＰＴＸ、ＡＰＬＦ、ＴＤＰ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＣｔＩＰ、ＭＲＮ、およびＥＲＣＣ１が挙げられる。
【０６４０】
ＭＭＲ（ミスマッチ修復）
細胞は、ＭＭＲ、ＢＥＲ、およびＮＥＲの３つの切除修復経路を包含する：切除修復経路は、典型的に、ＤＮＡの１本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ／エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、ＤＮＡポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、１〜３０ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像は、Ｌｉ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）１８：８５−９８に記載され、概要は、本明細書で提供される。
【０６４１】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、誤対合ＤＮＡ塩基上で機能する。
【０６４２】
ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体は、どちらもミスマッチ認識および修復開始に重要な役割を果たすＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２／６が、塩基−塩基ミスマッチを優先的に認識して、１または２ヌクレオチドの誤対合を同定する一方で、ＭＳＨ２／３は、より大型のＩＤ誤対合を優先的に認識する。
【０６４３】
ｈＭＬＨ１は、ｈＰＭＳ２とヘテロ二量体化して、ＡＴＰアーゼ活性を有しＭＭＲの複数の段階で重要であるｈＭｕｔＬαを形成する。これは、ＥＸＯ１が関与する３’ニック誘導ＭＭＲにおいて重要な役割を果たす、ＰＣＮＡ／複製因子Ｃ（ＲＦＣ）依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。（ＥＸＯ１は、ＨＲおよびＭＭＲの双方に参加する。）これは、ミスマッチが誘発する切除の終了を制御する。リガーゼＩは、この経路の関連リガーゼである。ＭＭＲを促進してもよい追加的要素としては、ＥＸＯ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ｄ、ＲＰＡ、ＨＭＧＢ１、ＲＦＣ、およびＤＮＡリガーゼＩが挙げられる。
【０６４４】
塩基切除修復（ＢＥＲ）
塩基切除修復（ＢＥＲ）経路は、細胞周期全体を通じて活性であり；それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路（次のセクションで考察される）は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９，６１９−６３１（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）に記載され、概要は本明細書に記載される。
【０６４５】
ＤＮＡ塩基損傷に際して、塩基切除修復（ＢＥＲ）が開始されて、プロセスは、５つの主要な段階に簡略化され得る：（ａ）損傷を受けたＤＮＡ塩基の除去；（ｂ）後続の塩基部位の切開；（ｃ）ＤＮＡ末端のクリーンアップ；（ｄ）修復ギャップ内への修正ヌクレオチド挿入；および（ｅ）ＤＮＡ骨格内の残りのニックのライゲーション。これらの最終段階は、ＳＳＢＲと類似する。
【０６４６】
第１段階では、損傷特異的ＤＮＡグリコシラーゼが、塩基を糖リン酸骨格に結合するＮグリコシド連結の切断を通じて、損傷を受けた塩基を切除する。次に、関連リアーゼ活性があるＡＰエンドヌクレアーゼ−１（ＡＰＥ１）または二機能性ＤＮＡグリコシラーゼがリン酸ジエステル骨格を切開して、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じた。ＢＥＲの第３段階は、ＤＮＡ末端のクリーンアップを伴う。ＢＥＲの第４段階は、新規相補的ヌクレオチドを修復ギャップ内に付加するＰｏｌβによって実施され、最終段階で、ＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩがＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールする。これで、損傷を受けたＤＮＡ塩基の大部分（約８０％）が修復される、短いパッチＢＥＲ経路が完了する。しかし、段階３の５’末端が、末端プロセッシング活性に対して抵抗性であれば、Ｐｏｌβによる１個のヌクレオチド挿入に続いて、ポリメラーゼは複製的ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌδ／εに切り替わり、次にそれは、ＤＮＡ修復ギャップに約２〜８個のヌクレオチドを付加する。これは、５’フラップ構造を作り出し、それは、処理能力要素である増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合する、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）によって認識され切除される。次にＤＮＡリガーゼＩが、ＤＮＡ骨格内の残りのニックをシールして、長いパッチＢＥＲを完了する。ＢＥＲ経路を促進してもよい追加的要素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰＥ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ、Ｐｏｌｅ、ＸＲＣＣ１、リガーゼＩＩＩ、ＦＥＮ−１、ＰＣＮＡ、ＲＥＣＱＬ４、ＷＲＮ、ＭＹＨ、ＰＮＫＰ、およびＡＰＴＸが挙げられる。
【０６４７】
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）
ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）は、ＤＮＡから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。ＮＥＲに関する加的な詳細は、Ｍａｒｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，４６５−４８１（２０１４）にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路ＮＥＲは、２つのより小型の経路である、全ゲノムＮＥＲ（ＧＧ−ＮＥＲ）と、転写と共役する修復ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）とを包含する。ＧＧ−ＮＥＲおよびＴＣ−ＮＥＲは、ＤＮＡ損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
【０６４８】
ひとたび障害が認識されたら、細胞は、損傷を含有する短い一本鎖ＤＮＡ断片を除去する。エンドヌクレアーゼＸＰＦ／ＥＲＣＣ１およびＸＰＧ（ＥＲＣＣ５によってコードされる）は、損傷のどちらかの側で損傷を受けた鎖を切断し、２２〜３０ヌクレオチドの一本鎖ギャップを生成することで、損傷を除去する。次に、細胞は、ＤＮＡギャップ充填合成およびライゲーションを実行するこのプロセスに関与するのは、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  ＰｏｌεまたはＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびＤＮＡリガーゼＩまたはＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩである。ライゲーションステップの実行のために、自己複製細胞が、ＤＮＡ  ＰｏｌεおよびＤＮＡリガーゼＩを利用する傾向がある一方で、非自己複製細胞は、ＤＮＡ  Ｐｏｌδ、ＤＮＡ  Ｐｏｌκ、およびｔｈｅＸＲＣＣ１／リガーゼＩＩＩ複合体を利用する傾向がある。
【０６４９】
ＮＥＲは、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、およびＬＩＧ１の要素を伴い得る。転写共役ＮＥＲ（ＴＣ−ＮＥＲ）は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＧ、ＥＲＣＣ１、およびＴＴＤＡの要素を伴い得る。ＮＥＲ修復経路を促進してもよい追加的要素としては、ＸＰＡ−Ｇ、ＰＯＬＨ、ＸＰＦ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＡ−Ｇ、ＬＩＧ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＴＴＤＡ、ＵＶＳＳＡ、ＵＳＰ７、ＣＥＴＮ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＵＶ−ＤＤＢ、ＣＡＫ部分複合体、ＲＰＡ、およびＰＣＮＡが挙げられる。
【０６５０】
鎖間架橋（ＩＣＬ）
ＩＣＬ修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるＤＮＡ鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ＩＣＬ修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）、およびＨＤＲである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のＩＣＬを切除するように動員される一方で、ＴＬＳおよびＨＤＲは、協調して切断された鎖を修復する。ＩＣＬ修復は、以下の要素を伴い得る：例えば、ＸＰＦおよびＲＡＤ５１Ｃなどのエンドヌクレアーゼ、ＲＡＤ５１などのエンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、ＦａｎｃＪなどのファンコーニ貧血（ＦＡ）タンパク質。
【０６５１】
その他の経路
哺乳類には、いくつかのその他のＤＮＡ修復経路が存在する。
【０６５２】
損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断の修復経路であり、例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌζおよびＲｅｖ１などの損傷乗り越えポリメラーゼが関与する。
【０６５３】
誤りのない複製後修復（ＰＲＲ）は、欠陥複製事象後に残される一本鎖切断修復の別の経路である。
【０６５４】
ＶＩ．標的細胞
Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体など）および任意選択的にドナーテンプレート核酸を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞を操作することができる。
【０６５５】
一実施形態では、細胞は、標的遺伝子を編集することによって、例えば、標的遺伝子のノックアウトにより、操作される。別の実施形態では、細胞は、標的遺伝子を編集することによって、例えば、標的遺伝子中の変異を修正することにより、操作される。また別の実施形態では、細胞は、標的遺伝子の発現を調節することによって、例えば、標的遺伝子のノックダウンまたは活性化により、操作される。さらにまた別の実施形態では、細胞は、遺伝子を導入することによって、例えば、遺伝子、例えば、標的化された遺伝子座のノックインにより、操作される。一実施形態では、細胞は、生体外で操作される。別の実施形態では、細胞は、生体内で操作される。
【０６５６】
本明細書に記載されるＣａｓ９、ｇＲＮＡ、および任意選択的にドナーテンプレート核酸分子は、標的細胞に送達することができる。一実施形態では、標的細胞は、循環血球、例えば、網状赤血球、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、造血幹／前駆細胞、または内皮細胞である。一実施形態では、標的細胞は、骨髄細胞（例えば、骨髄系前駆細胞、例えば、リンパ球系前駆細胞、例えば、赤血球系前駆細胞、例えば、造血幹／前駆細胞、例えば、内皮細胞、例えば、間葉系幹細胞）である。一実施形態では、標的細胞は、骨髄系前駆細胞（例えば、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）または顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞）である。一実施形態では、標的細胞は、リンパ球系前駆細胞、例えば、リンパ球系共通前駆細胞（ＣＬＰ）である。一実施形態では、標的細胞は、赤血球系前駆細胞（例えば、巨核球・赤芽球前駆（ＭＥＰ）細胞）である。一実施形態では、標的細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期造血幹／前駆細胞（ＬＴ−ＨＳＰＣ）、短期造血幹／前駆細胞（ＳＴ−ＨＳＰＣ）、複能性前駆（ＭＰＰ）細胞、系列特異的前駆（ＬＲＰ）細胞）である。一実施形態では、標的細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋、またはＣＤ１３３＋細胞である。一実施形態では、標的細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞または胎盤造血ＣＤ３４＋細胞である。一実施形態では、標的細胞は、動員末梢血造血ＣＤ３４＋細胞（動員剤、例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＰｌｅｒｉｘａｆｏｒで患者が処置された後）である。一実施形態では、標的細胞は、末梢血内皮細胞である。
【０６５７】
一実施形態では、標的細胞は、生体外で操作された後、対象に投与される。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。さらに、生体外操作のための標的細胞の起源として、例えば、異種ドナー血液、臍帯血、または骨髄も挙げられる。
【０６５８】
一実施形態では、骨髄系前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この骨髄系前駆細胞は対象に戻される。一実施形態では、赤血球系前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この赤血球系前駆細胞は対象に戻される。一実施形態では、リンパ球系前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、このリンパ球系前駆細胞は対象に戻される。一実施形態では、複能性前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この造血幹細胞は対象に戻される。一実施形態では、造血幹／前駆細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、この造血幹／前駆細胞は対象に戻される。一実施形態では、ＣＤ３４＋造血幹細胞が対象から採取され、前述のように生体外で操作された後、このＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞は対象に戻される。
【０６５９】
好適な細胞としては、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞またはｉＰＳ細胞由来の細胞、例えば、対象から作製されるｉＰＳ細胞であり、これらは、変異を誘導するために修飾されて、骨髄系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、赤血球系前駆細胞、複能性前駆細胞、または造血幹／前駆細胞などの臨床的に重要な細胞に分化される。また、好適な細胞には、造血幹細胞に分化される内皮細胞または羊膜細胞も含まれ得る。
【０６６０】
一実施形態では、ウイルスベクターを用いて、標的細胞に形質導入する。一実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６およびＡＡＶＤＪ）を標的細胞に形質導入する。一実施形態では、レンチウイルスベクターまたは組み込み欠陥レンチウイルスベクターを用いて、標的細胞に形質導入する。一実施形態では、リボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子をコードするｍＲＮＡ）を用いて、標的細胞を形質移入する。一実施形態では、タンパク質（例えば、Ｃａｓ９分子）およびリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ分子）を用いて、標的細胞を形質移入する。一実施形態では、リボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）を用いて、標的細胞を形質移入する。一実施形態では、デオキシリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、または双方をコードするＤＮＡ）を用いて、標的細胞を形質移入する。
【０６６１】
本明細書に記載される方法により生成される細胞は即座に使用してもよい。あるいは、細胞を凍結し（例えば、液体窒素で）、後の使用まで保存してもよい。細胞は、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般に用いられている溶液などいずれか他の溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍するために当該技術分野で公知の方法で解凍される。また、細胞は、長期保存のために熱安定化（例えば、４℃で）してもよい。
【０６６２】
ＶＩＩ．送達、製剤化および投与経路
例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体）などの構成要素、ならびに供与体テンプレート核酸、または３つ全ては、多様な形態で送達、製剤化、または投与することができ、例えば、表１９および２０を参照されたい。一実施形態では、１つのＣａｓ９分子と２つ以上（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の異なるｇＲＮＡ分子は、例えば、ＡＡＶベクターによって送達される。一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする配列と、２つ以上（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の異なるｇＲＮＡ分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター上に存在する。Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ構成要素が送達され、ＤＮＡにコードされる場合、このＤＮＡは、典型的に、発現を実施するための制御領域（例えば、プロモーターを含む）を含むであろう。Ｃａｓ９分子配列に有用なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＳＦＦＶ、ＥＦＳ、ＥＦ−１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、およびＣＢＨプロモーターが挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。ｇＲＮＡの有用なプロモーターとしては、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、Ｕ６、およびｔＲＮＡプロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度を有するプロモーターを選択して、構成要素の発現を調整することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、例えば、ＳＶ４０ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする配列は、少なくとも２つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
【０６６３】
表１９に、構成要素を製剤化、送達、または投与する方法の例を記載する。
【０６６４】
【表５８】
2018523977.tif 000065
【０６６５】
【表５９】
2018523977.tif 000066
【０６６６】
表２０は、例えば、本明細書に記載されるようなＣａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステム構成要素の様々な送達方法を要約する。
【０６６７】
【表６０】
2018523977.tif 000067
【０６６８】
Ｃａｓ９分子およびもしくは１つまたは複数のｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）、ｇＲＮＡ分子をコードする核酸、供与体テンプレート核酸、またはそれら（例えば、２つもしくは全て）の任意の組み合わせは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に、または細胞内に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ならびに供与体テンプレート核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはそれらの組み合わせによって、送達することができる。
【０６６９】
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子）および／またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸は、標的細胞（例えば、肝細胞）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）と共役させることができる。供与体テンプレート分子も、標的細胞（例えば、肝細胞）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）と共役させることができる。
【０６７０】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
【０６７１】
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／もしくはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含み得る。
【０６７２】
ベクターはまた、例えば、Ｃａｓ９分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０からの）を含み得る。
【０６７３】
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、調節されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。別の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【０６７４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０６７５】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。他の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こす。他の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
【０６７６】
一実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化され；細胞型特異的受容体で改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、もしくは成長因子などの標的化リガンドを組み込むための１つまたは複数のウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または一端がウイルス糖タンパク質を認識すると共に、他端が標的細胞表面の１部分（例えば、リガンド−受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチンおよび化学共役）を認識する二重特異性を有する分子架橋を有するように改変され得る。
【０６７７】
代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０６７８】
代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０６７９】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレトロウイルスによって送達される。いくつかの実施形態では、レトロウイルス（例えば、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするものなどの逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。別の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されるか、または欠失される。
【０６８０】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レトロウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０６８１】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えレンチウイルスによって送達される。一実施形態では、ドナーテンプレート核酸は、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０６８２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えアデノウイルスによって送達される。一実施形態では、ドナーテンプレート核酸は、組換えアデノウイルスによって送達される。一部の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおける免疫を低下させるように改変される。
【０６８３】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードする核酸配列および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、組換えＡＡＶによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、組換えＡＡＶによって送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、本明細書に記載されるような標的細胞などの宿主細胞のゲノムに、そのゲノムを組み込まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。
【０６８４】
一実施形態では、本明細書に記載される方法で用いることができるＡＡＶキャプシドは、血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１、またはＡＡＶ７ｍ８由来のキャプシド配列である。
【０６８５】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、またはＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１由来のキャプシド配列と５０％以上、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列相同性を有する、再改変ＡＡＶキャプシドで送達される。
【０６８６】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、キメラＡＡＶキャプシドによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、キメラＡＡＶキャプシドによって送達される。例示的なキメラＡＡＶキャプシドとしては、限定はしないが、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、またはＡＡＶ８Ｇ９が挙げられる。
【０６８７】
一実施形態では、ＡＡＶは、例えば、共にアニールされて二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶなどの、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。
【０６８８】
一実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドなどのハイブリッドウイルスによって送達される。一実施形態では、ハイブリッドウイルスは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、Ｂ１９ウイルス、ブタＡＡＶ、ガチョウＡＡＶ、ネコＡＡＶ、イヌＡＡＶ、またはＭＶＭと、ＡＡＶ（例えば、任意のＡＡＶ血清型の）とのハイブリッドである。
【０６８９】
パッケージング細胞が使用されて、標的細胞を感染させる能力があるウイルス粒子が形成される。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージし得る２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと（妥当な場合）引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばＣａｓ９などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、「Ｔｒｉｐｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」に記載されているように、パッケージング細胞株および／またはアデノウイルス由来のＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ遺伝子を含有するプラスミド、ならびにＡＡＶ由来のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子をコードするプラスミドによってトランスで供給することができる。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。実施形態では、ウイルスＤＮＡは、アデノウイルス由来のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ遺伝子を含有するプロデューサー細胞株にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスもしくはＨＳＶ）またはヘルパープラスミドは、ＡＡＶベクター複製と、ＩＴＲを有するヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
【０６９０】
一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損型ＳＩＮレンチウイルスである。一実施形態では、ＬＶまたはＩＤＬＶをＶＳＶ−Ｇエンベロープでシュードタイプ化する。遺伝子療法用の分裂および非分裂細胞を効率的に形質導入するための自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ＬＶ）の使用は、例えば、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（１５）：１４５０９−１４５１９に記載されている。ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターは、約１０ｋｂ一本鎖陽性センスＲＮＡゲノムの２つのコピーを含む、複製能力のない包膜レトロウイルスである。様々なプラスミドの中からの構造タンパク質および酵素タンパク質をコードするウイルス遺伝子の分離、ならびにＲＮＡゲノムからの特定のアクセサリー遺伝子の排除によって、レンチウイルスベクターは、形質導入細胞内で複製することができなくなる（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；９（５）：４５７−４６３）。一実施形態では、パッケージングシグナルは、トランスジーン発現カセットをコードする輸送ベクター（例えば、レシピエント内存性ＨＬＡプロモーターにより調節されるレシピエントＨＬＡ対立遺伝子）に制限され、これによって、ＬＶ構造および酵素コード遺伝子のパッケージングを妨げる。ウイルスを産生するために、トランスジーンを含む輸送ベクターは、トランスジーン発現カセットとエンベロープタンパク質をパッケージするのに必要なウイルスタンパク質をコードする個別のプラスミドで共形質移入することができる。一実施形態では、ウイルスのトピズムを拡大するために、水胞性口炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質−Ｇ［ＶＳＶ−Ｇ］）が使用されている。
【０６９１】
一実施形態では、ＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて、トランスジーン（例えば、マッチＨＬＡ対立遺伝子）をドナーＨＳＰＣに輸送する。Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、およびウィスコット・オルドリッチ（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ）症候群を治療するために、生体外で造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を遺伝子修飾するために用いられる組換えレンチウイルスの組み込みの使用については、例えば、Ｃａｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００９  Ｎｏｖ  ６；３２６（５９５４）：８１８−２３；Ｂｉｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３４１（６１４８）：１２３３１５８−１２３３１５８；Ａｉｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３４１（６１４８）：１２３３１５１−１２３３１５１に記載されている。白血病および膠芽腫を治療することを目的とした、がん特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔリンパ球生産のためのレンチウイルスベクターの臨床使用については、例えば、Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ，ＳＬ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７−１５１７；およびＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；７（２７５）：２７５ｒａ２２−２７５ｒａ２２に記載されている。
【０６９２】
一実施形態では、インテグラーゼ欠損型レンチウイルス（ＩＤＬＶ）を用いて、例えば、本来のＨＬＡ遺伝子座またはセーフ・ハーバー遺伝子座中に、レシピエントマッチＨＬＡトランスジーンの標的化組み込みおよび／もしくはノックインのために、トランスジーン（例えば、レシピエント同一ＨＬＡ対立遺伝子）送達用のドナーＣａｓ９、ｇＲＮＡ、および／もしくはドナー修復テンプレートＤＮＡを送達する。ＩＤＬＶは、一次ヒト細胞に形質導入することができるが、遺伝子カーゴを宿主細胞ゲノムに組み込むことはできない。レンチウイルスベクターのパッケージ容量（約１０ｋｂ）を考慮すると、ＩＤＬＶは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によるゲノム編集戦略用のＣａｓ９、ｇＲＮＡ、およびドナー修復テンプレートを送達するための有用なツールである（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００１；１２（１５）：１８９３−１９０５）。ＩＤＬＶは、生体外および生体内での一次標的細胞の部位特異的修飾用のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびドナー修復テンプレートを送達するために使用されている（Ｌｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００７；２５（１１）：１２９８−１３０６；Ｊｏｇｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３；２１（９）：１７０５−１７１７；Ｈｏｌｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（５）：ｅ６３；Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１４；２１（５）：５２９−５３２）。一実施形態では、細胞は、分裂細胞または高速分裂細胞である。別の実施形態では、細胞は、静止細胞または低速分裂細胞（例えば、長期ＨＳＰＣ、ニューロン、または肝細胞）である。
【０６９３】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織タイプ認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【０６９４】
一実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性調節によって媒介され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ）などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）核エンベロープの分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
【０６９５】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載される通り）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０６９６】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、細胞がＣａｓ９および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０６９７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。一実施形態では、供与体テンプレート核酸は、ベクターと非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）とリポソームを結合させ、これによって、例えば、呼吸上皮細胞中に、ウイルスまたはリポソーム法単独のいずれよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【０６９８】
一実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。一実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。例示的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子内のペイロードの捕捉）。代表的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質コーティングで被覆されたプロタミン核および酸複合体に加えて、カチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
【０６９９】
遺伝子移入のための代表的脂質は、下で表２１に示される。
【０７００】
【表６１】
2018523977.tif 000068
【０７０１】
遺伝子移入のための代表的なポリマーは、下で表２２に示される。
【０７０２】
【表６２】
2018523977.tif 000069
【０７０３】
一実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮａｃ））、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞アップデートが増大される。一実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。一実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために）。一実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
【０７０４】
一実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。一実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定組織を標的化する細菌；修飾表面タンパク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。一実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれた標的化リガンドを有する）。一実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスの生体外構築によって）。ビヒクルはまた改変されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。一実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象（すなわち、患者）由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る）である。
【０７０５】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などの、Ｃａｓシステムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数と同時に、送達される。一実施形態では、核酸分子は、Ｃａｓシステムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。一実施形態では、核酸分子は、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素などのＣａｓシステムの構成要素の１つまたは複数とは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子は、例えば、組み込み欠陥レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達することができ、Ｃａｓ９分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができるように、電気穿孔によって送達することができる。一実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質などの治療タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、本明細書ＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。
【０７０６】
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子）をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載される通りに、例えば、本明細書に記載される標的細胞などの細胞内に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載される通り）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Ｃａｓ９をコードするおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子）と共役させることができる。
【０７０７】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、ドナーテンプレート核酸分子と一緒に、もしくはそれなしで、細胞をＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡと混合し、規定の時間および振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結させた容器内で、ドナーテンプレート核酸分子と一緒に、もしくはそれなしで、細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間および振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
【０７０８】
Ｃａｓ９分子タンパク質の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９分子）は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載される通りに、細胞内に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載される通り）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡを伴い得る。Ｃａｓ９タンパク質は、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
【０７０９】
一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、ドナー核酸と一緒に、もしくはそれなしで、細胞をＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子と混合し、規定の時間および振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含んでなる。一実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えば、ポンプ）と連結させた容器内で、ドナー核酸と一緒に、もしくはそれなしで、細胞がＣａｓ９分子（例えば、ｅａＣａｓ９分子、ｅｉＣａｓ９分子またはｅｉＣａｓ９融合物タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子と混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間および振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書に記載される標的細胞）による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
【０７１０】
Ｃａｓ９タンパク質をｇＲＮＡ分子と組み合わせて、当該技術分野で公知の方法により、もしくは本明細書に記載のように、対象に投与されるか、または細胞に送達されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体を細胞に直接送達すれば、核酸からの発現（例えば、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドの形質移入）の必要がなくなる。これはまた、核酸送達から生じるＤＮＡセグメントの不要な組み込み（例えば、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドの形質移入）も排除した。従って、これは、迅速な作用、高速ターンオーバー、高いオンターゲット修飾率、低いオフターゲット効果および細胞に対する低い毒性を提供する代替送達アプローチである。これは、細胞を形質移入するのが難しい（例えば、一次および多能性幹細胞を形質移入するのが難しい）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を送達するために使用することもできる。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、通常、投与前に形成される（すなわち、事前に形成される）。複数の（例えば、２つ以上の）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が必要とされる場合、これらは、同時または順次送達（例えば、投与）することができる。一実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、電気穿孔によって細胞に送達される。
【０７１１】
投与経路
全身投与方法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路として、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、肝細胞、肝臓オーバル細胞、マクロファージまたは単球を標的化するように、修飾または製剤化することもできる。
【０７１２】
局所投与方法として、例えば、肝臓への実質内送達、肝臓内動脈注入および門脈への注入が挙げられる。一実施形態では、極めて少量の構成要素（全身アプローチと比較して）は、全身（例えば、静脈内）に投与する場合と比較して、局所（例えば、肝実質中に直接）投与すれば、効果を及ぼし得る。局所投与方法は、治療有効量の構成要素を全身投与する場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減または排除することができる。
【０７１３】
投与は、定期的なボーラス（例えば、静脈内）として、または内部レザバーもしくは外部レザバー（例えば、静脈内バッグもしくは埋め込みポンプ）からの連続的注入として提供してもよい。構成要素は、例えば、肝臓に埋め込まれた徐放性薬物送達装置からの連続的放出によって局所投与してもよい。
【０７１４】
さらに、構成要素は、長期間にわたる放出を可能にするように、製剤化してもよい。放出系は、生分解性材料、または組み込まれた構成要素を拡散によって放出する材料からなるマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内に均一または不均一に分布することができる。多様な放出系が有用であるが、適切な系の選択は、具体的な適用により要求される放出速度に応じて変わり得る。非分解性および分解性放出系の双方を用いることができる。好適な放出系として、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または無機および有機賦形剤および希釈剤、例えば、限定はしないが、炭酸カルシウムおよび糖（例えば、トレハロース）などが挙げられる。放出系は、天然または合成のいずれであってもよい。しかしながら、一般的に、信頼性および再現性が高く、しかもより明確な放出プロフィールを生み出すことから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、様々な分子量を有する構成要素が、上記材料を介した拡散、またはその分解により放出されるように選択することができる。
【０７１５】
代表的な合成生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸グリコール酸共重合体、およびポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；ならびにこれらの化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。代表的な合成非生分解性ポリマーとして、例えば、以下のものが挙げられる：ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、その他のアリキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸などのビニルポリマー−ポリアクレートおよびポリメタクリレート、ならびにポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（酢酸ビニル）などのその他；ポリ（ウレタン）；アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および様々な酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；ポリシロキサン；ならびにこれらの任意の化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により常用的に実施されるその他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物。
【０７１６】
また、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ミクロスフェアも使用することができる。典型的に、ミクロスフェアは、乳酸およびグリコール酸のポリマーからなり、中空のスフェアを形成するような構造をしている。スフェアは、直径が約１５〜３０ミクロンであってよく、本明細書に記載される構成要素をロードすることができる。
【０７１７】
構成要素の２モードまたは差次的送達
Ｃａｓシステムの構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素の個別の送達、より具体的には、差次的モードによる構成要素の送達は、例えば、組織特異性および安全性を改善することによって、性能を高めることができる。
【０７１８】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なるモード、または本明細書で差次的モードと呼ぶことがあるモードによって送達される。異なるまたは差次的モードは、本明細書の用法では、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、テンプレート核酸、またはペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学または薬物動態特性を付与する送達モードを指す。例えば、これらの送達モードにより、例えば、選択したコンパートメント、組織、または臓器において、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。
【０７１９】
例えば、細胞、または細胞の子孫において持続する核酸ベクターによる送達、例えば自立複製または細胞核酸への挿入による送達など、いくつかの送達モードは、構成要素のより持続的発現および存在をもたらす。例として、例えば、アデノ関連ウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスによる送達がある。
【０７２０】
例として、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子などの構成要素は、送達される構成要素の、身体、または特定のコンパートメント、組織もしくは臓器において達成される半減期または持続性に関して異なるモードによって送達することができる。Ｃａｓ９分子構成要素は、身体、または特定のコンパートメントまたは組織もしくは臓器に対して、より低い持続性または曝露をもたらすモードによって送達することができる。
【０７２１】
より一般的には、一実施形態では、第１の送達モードを用いて、第１の構成要素を送達し、第２の送達モードを用いて、第２の構成要素を送達する。第１の送達モードは、第１の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。第２の送達モードは、第２の薬力学的または薬物動態特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織もしくは臓器における、構成要素、または構成要素をコードする核酸の分布、持続性、または曝露であってよい。
【０７２２】
一実施形態では、例えば、分布、持続性、または曝露などの第１の薬力学的または薬物動態特性は、第２の薬力学的または薬物動態特性より限定されている。
【０７２３】
一実施形態では、第１の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最小にするなど、最適化するように選択される。
【０７２４】
一実施形態では、第２の送達モードは、例えば、分布、持続性、または曝露などの薬力学的または薬物動態特性を例えば、最大にするなど、最適化するように、選択される。
【０７２５】
一実施形態では、第１の送達モードは、例えば、核酸、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウイルスなどの比較的持続的な要素の使用を含む。このようなベクターは比較的持続的であるため、それらから転写された産物も比較的持続的となる。
【０７２６】
一実施形態では、第２の送達モードは、比較的一過性の要素、例えば、ＲＮＡ分子またはタンパク質を含む。
【０７２７】
一実施形態では、第１の構成要素は、ｇＲＮＡを含み、送達モードは、比較的持続的であり、例えば、ｇＲＮＡ分子は、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶもしくはレンチウイルスから転写される。これらの遺伝子は、タンパク質産物をコードせず、ｇＲＮＡは、単独で作用することができないため、これらの遺伝子の転写には生理学的結果がほとんどない。第２の構成要素であるＣａｓ９分子は、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、一過性様式で送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、短い期間だけ存在し、活性である。
【０７２８】
さらに、構成要素は、互いに補完して、安全性および組織特異性を高める異なる分子形態で、または異なる送達ベクターを用いて送達することができる。
【０７２９】
差次的送達モードの使用によって、性能、安全性および効率を高めることができ、例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減することができる。細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドは、ＭＨＣ分子による細胞の表面に展示されるため、低持続性モードによる、例えばＣａｓ９分子などの免疫原性構成要素の送達は免疫原性を低減し得る。二部送達システムは、これらの問題を軽減し得る。
【０７３０】
差次的送達モードを用いて、異なっているが、オーバーラップする標的領域に構成要素を送達することができる。活性複合体の形成は、標的領域のオーバーラップの外側で最小にされる。従って、一実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ分子などの第１の構成要素は、第１の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第１の送達モードによって送達される。例えば、Ｃａｓ９分子などの第２の構成要素は、第２の空間的（例えば、組織など）分布をもたらす第２の送達モードによって送達される。一実施形態では、第１のモードは、リポソーム、例えばポリマーナノ粒子などのナノ粒子、および例えばウイルスベクターなどの核酸から選択される第１の要素を含む。第２のモードは、上記の群から選択される第２の要素を含む。一実施形態では、第１の送達モードは、例えば、細胞特異的受容体もしくは抗体などの第１の標的化要素を含み、第２の送達モードは、その要素を含まない。実施形態では、第２の送達モードは、例えば、第２の細胞特異的受容体もしくは第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。
【０７３１】
Ｃａｓ９分子をウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子で送達する場合、単一の組織を標的化することだけが望ましいと考えられるとき、複数の組織への送達および複数の組織での治療活性の可能性がある。二部送達系は、この課題を解決し、組織特異性を高めることができる。異なっているが、オーバーラップする組織屈性を有する別々の送達ビヒクル中にｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子をパッケージする場合、双方のベクターによって標的化された組織には、完全に機能性の複合体だけが形成される。
【０７３２】
生体外送達
いくつかの実施形態では、表１９に記載される構成要素を細胞に導入した後、これらの細胞を対象に導入する。構成要素を導入する方法は、表２０に記載される送達方法のいずれかを含み得る。
【０７３３】
ＶＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にｇＲＮＡなどの核酸中に存在し得るが、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡなどのその他の形態のＲＮＡにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
【０７３４】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
【０７３５】
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。一実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。一実施形態では、単分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
【０７３６】
一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。一実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【０７３７】
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
【０７３８】
一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生体内および生体外双方の細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。一実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、生体内および生体外双方の細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
【０７３９】
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
【０７４０】
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【０７４１】
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
【０７４２】
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０７４３】
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
【０７４４】
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０７４５】
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
【０７４６】
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
【０７４７】
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
【０７４８】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。一実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
【０７４９】
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。一実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
【０７５０】
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
【０７５１】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
【０７５２】
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
【０７５３】
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
【０７５４】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
【０７５５】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。一実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
【０７５６】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
【０７５７】
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
【０７５８】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
【０７５９】
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
【０７６０】
ウラシル
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウ���ジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【０７６１】
シトシン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０７６２】
アデニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０７６３】
グアニン
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０７６４】
代表的修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。本明細書に記載されるｇＲＮＡのいずれでも、このセクションに従って修飾され得るものと理解される。本明細書で考察されるように、一過性発現核酸または送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を被りやすい。従って、一態様では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する１つまたは複数の修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを含んでもよい。本明細書に記載されるこれらの、またはその他の修飾ｇＲＮＡは、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞などの循環細胞）について増強された安定性を呈示し、それが、認められる改善の原因ではないかと考えられる。
【０７６５】
例えば、本明細書で考察されるように、ｇＲＮＡの５’末端が、真核細胞ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログの含有により修飾されると、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞）における遺伝子の生体外編集の改善が認められた。本開示は、５’キャッピングｇＲＮＡで観察された改善が、その他の様式で修飾されたｇＲＮＡに拡張されて、同一タイプの構造的または機能的結果が達成され得るという認識を包含する（例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの組み入れによって、または生体外転写ｇＲＮＡが仔ウシ腸管アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによる処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される場合など）。本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する（例えば、修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチドおよび／または３’ポリＡテールの含有により）１つまたは複数の修飾（例えば、修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチド）を含有してもよい。
【０７６６】
従って、一態様では、本明細書で考察される方法および組成物は、その５’末端またはその付近（例えば、それらの５’末端の１〜１０、１〜５、または１〜２ヌクレオチド以内）で修飾されているｇＲＮＡを用いることによって特定の細胞の遺伝子編集（例えば、生体外遺伝子編集）するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、標的化ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインの５’末端は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインを含み、標的化ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠失している。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’キャップを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインを含み、標的化ドメインの５’末端は、５’キャップを含む。
【０７６７】
一実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、限定はしないが、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））の含有により修飾される。特定の実施形態では、５’キャップは、修飾グアニンヌクレオチドを含み、これは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りと連結されている。いくつかの実施形態では、５’キャップは、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含み、これらは、５’−５’三リン酸結合を介して連結されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【０７６８】
【化７】
2018523977.tif 000070
（式中、
Ｂ１およびＢ１’の各々は、独立して
【化８】
2018523977.tif 000071
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは６員ヘテロアリールにより置換されたＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、もしくはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ’およびＹ’の各々は、独立して、ＯまたはＣＨ２である）
を有する。
【０７６９】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７７０】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０７７１】
一実施形態では、Ｂ１’は、
【化９】
2018523977.tif 000072
である。
【０７７２】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７７３】
一実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、Ｏである。
【０７７４】
一実施形態では、Ｘ’およびＹ’は、Ｏである。
【０７７５】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１０】
2018523977.tif 000073
を有する。
【０７７６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１１】
2018523977.tif 000074
を有する。
【０７７７】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１２】
2018523977.tif 000075
を有する。
【０７７８】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１３】
2018523977.tif 000076
を有する。
【０７７９】
一実施形態では、Ｘは、Ｓであり、ＹおよびＺは、Ｏである。
【０７８０】
一実施形態では、Ｙは、Ｓであり、ＸおよびＺは、Ｏである。
【０７８１】
一実施形態では、Ｚは、Ｓであり、ＸおよびＹは、Ｏである。
【０７８２】
一実施形態では、ホスホロチオエートは、Ｓｐジアステレオマーである。
【０７８３】
一実施形態では、Ｘ’は、ＣＨ２であり、Ｙ’は、Ｏである。
【０７８４】
一実施形態では、Ｘ’は、Ｏであり、Ｙ’は、ＣＨ２である。
【０７８５】
一実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’四リン酸結合を介して連結される、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含む。
【０７８６】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１４】
2018523977.tif 000077
（式中、
Ｂ１およびＢ１’の各々は、独立して
【化１５】
2018523977.tif 000078
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは６員ヘテロアリールにより置換されたＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、もしくはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、独立して、ＯまたはＣＨ２である）
を有する。
【０７８７】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７８８】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０７８９】
一実施形態では、Ｂ１’は、
【化１６】
2018523977.tif 000079
である。
【０７９０】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０７９１】
一実施形態では、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、Ｏである。
【０７９２】
一実施形態では、Ｘ’  Ｙ’、およびＺ’の各々は、Ｏである。
【０７９３】
一実施形態では、Ｘ’は、ＣＨ２であり、Ｙ’およびＺ’は、Ｏである。
【０７９４】
一実施形態では、Ｙ’は、ＣＨ２であり、Ｘ’およびＺ’は、Ｏである。
【０７９５】
一実施形態では、Ｚ’は、ＣＨ２であり、Ｘ’およびＹ’は、Ｏである。
【０７９６】
一実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’五リン酸結合を介して連結される、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含む。
【０７９７】
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子の５’末端は、化学式：
【化１７】
2018523977.tif 000080
（式中、
Ｂ１およびＢ１’の各々は、独立して
【化１８】
2018523977.tif 000081
であり、
各Ｒ１は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは６員ヘテロアリールにより置換されたＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、もしくはＯ−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、独立して、ＯまたはＣＨ２である）
を有する。
【０７９８】
一実施形態では、各Ｒ１は、独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【０７９９】
一実施形態では、Ｒ１は、−ＣＨ３である。
【０８００】
一実施形態では、Ｂ１’は、
【化１９】
2018523977.tif 000082
である。
【０８０１】
一実施形態では、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３’の各々は、独立して、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−ＣＨ３である。
【０８０２】
一実施形態では、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、Ｏである。
【０８０３】
一実施形態では、Ｗ’、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、Ｏである。
【０８０４】
本明細書の用法では、用語「５’キャップ」は、伝統的なｍＲＮＡ５’キャップ構造を含むが、これらのアナログも含むと理解すべきである。例えば、上に示される化学構造によって含まれる５’キャップ構造に加えて、例えば、メチレン−ビス（リン酸）部分を有する四リン酸アナログ（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ，Ａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ７（２２）：４７６３−７６を参照）、非架橋酸素のイオウによる置換を有するアナログ（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，（２００７）ＲＮＡ  １３（１０）：１７４５−１７５５を参照）、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸アナログ（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＲＮＡ  １０（９）：１４７９−１４８７を参照）、またはアンチリバースキャップアナログ（例えば、米国特許第７，０７４，５９６号明細書およびＪｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＲＮＡ  ９（９）：１  １０８−１  １２２  およびＳｔｅｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ  ７（１０）：１４８６−１４９５を参照）を使用してもよい。本出願はさらに、ＯＨまたはＯＭｅの代わりにハロゲン基を含むキャップアナログ（例えば、米国特許第８，３０４，５２９号明細書を参照）；少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むキャップアナログ（例えば、米国特許第８，１５３，７７３号明細書およびＫｏｗａｌｓｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＲＮＡ  １４（６）：１  １  １９−１１３１を参照）；および少なくとも１つのボラノホスフェートまたはホスホロチオエート結合を含むキャップアナログ（例えば、米国特許第８，５１９，１１０号明細書を参照）；ならびにアルキニル誘導体化５’キャップアナログ（例えば、米国特許第８，９６９，５４５号明細書を参照）の使用も包含する。
【０８０５】
通常、５’キャップは、ｇＲＮＡの化学合成または生体外転写のどちらかの間に組み入れ得る。一実施形態では、５’キャップは使用されず、ｇＲＮＡ（例えば、生体外転写ｇＲＮＡ）が代わりにホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される。
【０８０６】
本明細書で考察される方法および組成物は、３’ポリＡテールを含むｇＲＮＡを用いることによって遺伝子編集するための方法および組成物も提供する。こうしたｇＲＮＡは、例えば、ｇＲＮＡ分子前駆体のインビトロ転写後に、ポリアデノシンポリメラーゼを用いてｇＲＮＡ分子前駆体にポリＡテールを付加することにより、調製することができる。例えば、一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリメラーゼを用いて、ポリＡテールを酵素的に付加することができる。また、ポリＡテールを含むｇＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写によっても調製され得る。一実施形態では、限定的長さのポリＡテールがＤＮＡテンプレート上にコードされて、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなど）を介してｇＲＮＡと共に転写される。ポリＡテールを含むｇＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼ（ｇＲＮＡ分子前駆体およびポリＡオリゴヌクレオチドと相補的なスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは含まない）を用いたインビトロ転写後に、ポリＡオリゴヌクレオチドをｇＲＮＡ分子前駆体と連結させることによって調製することもできる。例えば、一実施形態では、限定的長さのポリＡテールは、合成オリゴヌクレオチドとして合成され、ｇＲＮＡの３’末端で、ＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼ（ガイドＲＮＡおよびポリＡオリゴヌクレオチドに相補的なスプリントオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは含まない）のいずれかと連結される。ポリＡテールを含むｇＲＮＡは、１部または複数部として合成により調製することも可能であり、これらは、１つまたは複数のスプリントＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むか、もしくは含まないＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかによって互いに連結される。
【０８０７】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５０アデニンヌクレオチド未満、例えば、４５アデニンヌクレオチド未満、４０アデニンヌクレオチド未満、３５アデニンヌクレオチド未満、３０アデニンヌクレオチド未満、２５アデニンヌクレオチド未満または２０アデニンヌクレオチド未満を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５〜５０アデニンヌクレオチド、例えば、５〜４０アデニンヌクレオチド、５〜３０アデニンヌクレオチド、１０〜５０アデニンヌクレオチド、または１５〜２５アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、約２０アデニンヌクレオチドを含む。
【０８０８】
さらに、本明細書で考察される方法および組成物は、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡを用いることにより、遺伝子編集（例えば、生体外遺伝子編集）のための方法および組成物も提供する。
【０８０９】
このセクションで考察される例示的な修飾のいくつかは、ｇＲＮＡ配列内のどの位置に含有させてもよいが、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその付近（例えば、その５’末端の１〜１０、１〜５、もしくは１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその付近（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜５、もしくは１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその付近の修飾とその３’末端またはその付近の修飾の双方を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、真核生物細胞に発現される遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含み、ここで、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端で修飾され、３’末端ポリＡテールを含む。ｇＲＮＡ分子は、例えば、５’三リン酸基が欠失してもよい（例えば、標的化ドメインの５’末端は、５’三リン酸基が欠失している）。一実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、５’三リン酸基を除去し、かつ本明細書で記載するような３’ポリＡテールを含むように、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）での処理により修飾される。あるいは、ｇＲＮＡ分子は、５’キャップを含んでもよい（例えば、標的化ドメインの５’末端は、５’キャップを含む）。一実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡ）は、本明細書に記載されるような５’キャップ構造またはキャップアナログと３’ポリＡテールの双方を含む。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｇＲＮＡ分子の残りと連結される修飾グアニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’キャップは、任意選択的に修飾された５’−５’三リン酸結合を介して連結された、２つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含む（例えば、前述されるように）。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５〜５０アデニンヌクレオチド、例えば、５〜４０アデニンヌクレオチド、５〜３０アデニンヌクレオチド、１０〜５０アデニンヌクレオチド、１５〜２５アデニンヌクレオチド、３０アデニンヌクレオチド未満、２５アデニンヌクレオチド未満、または約２０アデニンヌクレオチドを含む。
【０８１０】
さらに別の実施形態では、本開示は、真核生物細胞で発現される遺伝子からの標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子は、３０アデニンヌクレオチド未満（例えば、２５アデニンヌクレオチド未満、１５〜２５アデニンヌクレオチド、または約２０アデニンヌクレオチド）を含む３’ポリＡテールを含む。いくつかの実施形態では、これらのｇＲＮＡ分子は、さらにその５’末端でも修飾される（例えば、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、５’リン酸基を除去するためにホスファターゼでの処理により修飾されるか、または５’キャップを含有するように修飾される）。
【０８１１】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３’末端Ｕリボースで修飾してもよい。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される（下に示される）修飾ヌクレオシドをもたらす：
【化２０】
2018523977.tif 000083
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。別の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
【０８１２】
【化２１】
2018523977.tif 000084
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。
【０８１３】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。この実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシン、シチジンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの８位に修飾がある修飾アデノシン、シチジンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシン、シチジンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
【０８１４】
いくつかの実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、ＳＨ、ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（ＣＮ）から選択される基によって置換される。いくつかの実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾；または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルをはじめとする２’−フルオロ修飾；グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
【０８１５】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては「ロックド」核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、その中では、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の４’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。
【０８１６】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとしては、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）が挙げられる。
【０８１７】
一般に、ｇＲＮＡ分子としては、酸素を有する５員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾ｇＲＮＡｓとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は２’位置に局在するが、４’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。
【０８１８】
いくつかの実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡ分子に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
【０８１９】
ｍｉＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡｓ）は、天然細胞性１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。それらは、例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲなどで、適切なｍｉＲＮＡ結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。下方制御は、核酸分子安定性の低下または翻訳阻害のどちらかである。例えば、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡなどの本明細書で開示されるＲＮＡ種は、例えば、その３’ＵＴＲなどに、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、選択された細胞型内の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ）の下方制御を促進するように選択され得る。一例として、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２に対する結合部位の組み込みは、肝臓における対象遺伝子の発現を阻害し得る。
【０８２０】
ＩＸ．ｇＲＮＡ同定システムおよびデータベース
本明細書には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、対立遺伝子の編集用のｇＲＮＡを同定するためのシステム、方法およびコンピューター可読媒体が記載される。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、対立遺伝子の編集用のｇＲＮＡを同定するデータベーススキーマを実行もしくは作成するためのシステム、方法およびコンピューター可読媒体が本明細書に記載される。ｇＲＮＡ同定システムは、ユーザー（例えば、医師もしくは医療専門家、臨床コーディネーター、医師、または対立遺伝子配列決定検査技師）が、特定の対立遺伝子を編集するのに好適なｇＲＮＡを同定することを可能にする。本明細書に記載されるように、ユーザーは、標的化移植片レシピエントと標的化移植片ドナー間の対立遺伝子マッチの数を増加するために、対立遺伝子を編集することを望む場合がある。ｇＲＮＡ同定システムは、レシピエント由来の対立遺伝子およびドナー候補由来の対立遺伝子に関するデータを受信し、入力からミスマッチ対立遺伝子を同定する。次に、ｇＲＮＡ同定システムは、データに問い合わせて、ドナー候補由来の対立遺伝子を編集するのに好適なｇＲＮＡのリストを作成する。１つまたは複数の基準に基づいてｇＲＮＡのリストをランク付けする。ｇＲＮＡ同定システムはまた、例えば、対立遺伝子、ｇＲＮＡ、ハプロタイプ、および系統情報に関するデータを保存する様々なテーブルを含むデータベーススキーマの実行も包含する。
【０８２１】
データベースは、現在まで記録された全てのＨＬＡ対立遺伝子変異体を保存するように構築される。これらのＨＬＡ対立遺伝子変異体の記録は、一般に入手可能であり、例えば、以下を参照されたい：（ｈｔｔｐ：／／ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ／ａｌｌｅｌｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｊ，Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ＪＡ，Ｈａｙｈｕｒｓｔ  ＪＨ，Ｆｌｉｃｅｋ  Ｐ，Ｐａｒｈａｍ  Ｐ，Ｍａｒｓｈ  ＳＧＥ，Ｔｈｅ  ＩＰＤおよびＩＭＧＴ／ＨＬＡ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ａｌｌｅｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）４３：Ｄ４２３−４３１）。ＨＬＡ対立遺伝子の記録が更新されると、データベースも更新され得る。このデータセットを用いて、ＭＨＣ遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、ＤＲＢ１、−ＤＲＢ３／４／５、および−ＤＱＢ１）の１つで存在し得る特定の単一対立遺伝子を標的化するｇＲＮＡ配列が設計される。一般に入手可能なデータベース（全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ＨＬＡ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−ＨＬＡ−Ａｌｌｅｌｅｓ−ａｎｄ−Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ−ｉｎ−ｔｈｅ−ＵＳ−Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ／；ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ＨＬＡ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／Ｊｅｗｉｓｈ−Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／）を用いて、データベースは、個々の対立遺伝子およびハプロタイプを、これらの個々の対立遺伝子が同定されるヒト対象の異なる系統バックグラウンド（すなわち、系統、人種、民族バックグラウンド）の人に共通して存在し、かつ特異的である対立遺伝子およびハプロタイプと相互参照する。一実施形態例では、データベースは、以下の数またはそれ以上の対立遺伝子変異体を含む（同定される変異体の数は、時間が経過するにつれ、新たな患者と共に増加するため；遺伝子座当たりの対立遺伝子変異体の現在の数は、ＭＨＣ遺伝子座での高い多型度の一例を示すために列記される）：ＨＬＡ−Ａ（３，０９４対立遺伝子）、ＨＬＡ−Ｂ（３，８６５対立遺伝子）、ＨＬＡ−Ｃ（２，６１８対立遺伝子）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（１，７１９対立遺伝子）、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５（９５対立遺伝子）、ＨＬＡ−ＤＱＢ１（７７７対立遺伝子）。これらの対立遺伝子（ならびに、恐らく数の増加に伴いそれ以上の対立遺伝子）について、少なくとも１０６，２３４のｇＲＮＡがこのデータベースに含まれ得る。一実施形態例では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と一緒に用いられるｇＲＮＡの標的化ドメインの長さは、１７または２０ヌクレオチドである。一実施形態例では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と一緒に用いられるｇＲＮＡの標的化ドメインの長さは、２０または２４ヌクレオチドである。別の実施形態では、用いようとするｇＲＮＡの標的化ドメインの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。データベースには、ヨーロッパ系アメリカ人（例えば、白色人種）、アフリカ系アメリカ人、アジア系（パシフィックアイランダーを含む）、ヒスパニック系（例えば、ラテン系）集団およびユダヤ系統の人に検出される対立遺伝子頻度および共通のハプロタイプも含まれ得る。
【０８２２】
データベースを用いて、数千の対立遺伝子変異体（もしあれば）のうちの単一対立遺伝子に高度に特異的なｇＲＮＡを選択して、オフターゲット効果（対立遺伝子特異的ｇＲＮＡが、ヒト染色体配列内の他のゲノム遺伝子座の他の対立遺伝子に誤って標的化する可能性があるかどうか）を見出すことができる。さらに、データベースは、同じｇＲＮＡによる両アレル破壊を支持し得る対立遺伝子特異性を含まない個別のＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ）を標的化するｇＲＮＡを同定することができる。一実施形態例では、ミスマッチ、部分的マッチ、もしくはハプロタイプ同一のＨＳＰＣドナーを相互参照して、同定するために、データベースからの対立遺伝子変異体、ｇＲＮＡ、および系統データを、一般に入手可能な全国および国際臍帯血および骨髄ドナー造血幹／前駆細胞バンクと関連付けることができる。ミスマッチ、部分的マッチ、もしくはハプロタイプ同一のＨＳＰＣドナー細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により編集して、ドナー細胞が、疾患の治療のために同種異系ＨＳＰＣ移植を必要とするが、ミスマッチまたは部分的マッチドナー細胞を編集することなく、マッチするドナー細胞を同定することができないレシピエント対象と後にマッチするように、ＨＬＡ遺伝子型を改変することができる。
【０８２３】
ユーザー（例えば、医師もしくは医療専門家、臨床コーディネーター、医師、または対立遺伝子配列決定検査技師）は、レシピエントの全ハプロタイプと関連する具体的な対立遺伝子変異体を同定するために、ＨＬＡタイピング、例えば、標的化移植片レシピエントのＭＨＣ遺伝子座の両ＨＬＡハプロタイプのＤＮＡ配列決定を提供する。公式または非公式の幹細胞ドナーデータベースから最も高いＨＬＡマッチング度（両染色体コピー上でマッチする最多数の対立遺伝子）を有するドナー候補を検索するために、完全なＨＬＡハプロタイプ情報を臍帯血および骨髄幹細胞バンクに入力してもよい。公式／非公式データベースから見出された移植片レシピエントとの最も高いマッチング度を有する利用可能なドナーに基づいて、ユーザーまたはシステムは、ＨＬＡマッチングのレベルを高めるために編集する必要がある対立遺伝子を決定することができる。一旦編集されたら、ドナー細胞は、同種異系ＨＳＣＴの基準を満たす可能性があり、ＧＶＨＤ発生の尤度および／または重症度が低い。ｇＲＮＡ同定システムは、ユーザーが、ドナーのゲノムＤＮＡに存在する他の対立遺伝子を標的化することなく、特定の対立遺伝子を編集することができるｇＲＮＡを見出すことを可能にする。ｇＲＮＡ同定システムは、対立遺伝子を編集するために使用することができるｇＲＮＡのリストを作成する。ユーザーは、リスト上の１つまたは複数のｇＲＮＡを用いて、マッチしない対立遺伝子を破壊またはノックアウトし、次に、マッチしない対立遺伝子をドナー細胞中のレシピエント特異的対立遺伝子でノックインまたは置換することができる。
【０８２４】
２つのドナー候補が類似レベルのＭＨＣマッチング（例えば、４／６）を有し、ドナーとレシピエント間のマッチングを向上させる（例えば、５／６マッチまで）目的でミスマッチＭＨＣ対立遺伝子の修正のためにいずれを選択することもできる場合、ユーザーは、ＭＨＣ制限された系統データベースにおいて最も一般的なマイナー組織適合性抗原（ｍｉＨＡｇ）を相互参照することができる。ｍｉＨＡｇは、当該技術分野ではよく知られている。例えば、Ｓｐｉｅｒｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３（６）：１１０８−１１１９，２００７；Ｓｐｉｅｒｉｎｇｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，８４：３４７−３６０，２０１４；およびＳｐｉｅｒｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９：１２４４−１２５３，２０１３）を参照されたい。ユーザーは、系統データベースを使用して、潜在的に「修正された」ＭＨＣ抗原に制限されたｍｉＨＡｇ（例えば、ドナー細胞中に存在する「修正済」ＭＨＣ受容体により制限され得るため、宿主対移植片拒絶を招き得るドナーｍｉＨＡｇ）を有する潜在的「修正済」ＭＨＣハプロタイプを相互参照することができる。これらのｍｉＨＡｇは、系統群の間で存在の仕方が異なるため、系統群中でｍｉＨＡを有する２人のドナー候補を相互参照することによって、ユーザーは、より好適なドナーを修正および選択するために、より良いＭＨＣ対立遺伝子を選択することができる。この例では、ユーザーが、２つの対立遺伝子のうちの１つを修正のために選択する選択肢に直面する場合、ユーザーは、ｇＲＮＡ同定システムの系統データベースの情報を使用して、以下：１）移植片レシピエントの系統群に見出される最も一般的なＭＨＣ遺伝子座、および２）ドナー／レシピエントミスマッチＭＨＣ全体でＭＨＣ制限されていないｍｉＨＡに基づき、ＭＨＣ修正のためにどちらのドナーを選択すべきかについて自己決定を下すことができる。これは、ｍｉＨＡでのドナーとレシピエント間の遺伝的相違も同種異系ＨＳＣＴの結果に影響を与える点で重要である。予測されるマイナー組織適合性抗原ミスマッチ度は、特に非破壊的アロ−ＨＳＣＴに関して、あまり好ましくない臨床結果と相関することがわかっている（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１０），１６（１０：１３７０−８１）。従って、特定の系統群で共通するｍｉＨＡｇに制限されるＭＨＣハプロタイプを示す系統データベースを有する両方のドナーＭＨＣハプロタイプを相互参照すれば、アロ−ＨＳＣＴの結果をさらに向上させることができる。
【０８２５】
現在まで記録されたＨＬＡ対立遺伝子変異体を含む一般に入手可能なデータセット（ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ）を用いて、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、ＤＲＢ１、−ＤＲＢ３／４／５、および−ＤＱＢ１遺伝子座について報告されている個別の対立遺伝子について設計されたｇＲＮＡ配列、ならびにこれらの個別の対立遺伝子が提示されるヒト対象の系統に対する全ての対立遺伝子の相互参照を含むデータベースが構築および確立された（Ｍａｒｓｈ，Ｓ．Ｇ．Ｅ．（２０１５），Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  ｓｙｓｔｅｍ，ｕｐｄａｔｅＭａｒｃｈ  ２０１５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔａｎ．１２５８１；Ｍａｉｅｒｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；６８（９）：７７９−７８８）（対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ例および詳細なデータベース設計については、「ｇＲＮＡ」および「実施例」のセクションを参照されたい）。下記の数の対立遺伝子変異体（例えば、現在まで発見された対立遺伝子の総数。追加の対立遺伝子が、新たな変異体が同定されるたびに追加され得る）が、データベースに含まれた：ＨＬＡ−Ａ（３，０９４対立遺伝子）、ＨＬＡ−Ｂ（３，８６５対立遺伝子）、ＨＬＡ−Ｃ（２，６１８対立遺伝子）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（１，７１９対立遺伝子）、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５（９５対立遺伝子）、ＨＬＡ−ＤＱＢ１（７７７対立遺伝子）。データベースを用いて、データベースに示される数千の対立遺伝子変異体のうちの１つに特異的なｇＲＮＡ（もしあれば）を選択することができる。さらに、本明細書に記載されるデータベースは、１つまたは複数のｇＲＮＡにより両アレル破壊を可能にする対立遺伝子特異性なしで、個別のＨＬＡ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡを同定し、階層化することができる。対立遺伝子変異体、ｇＲＮＡ、および系統を既存の臍帯血および骨髄ドナー登録簿と関連付けることによって、レシピエント対象において十分にマッチしたアロ−ＨＳＣＴを形成するために、後に修飾することができる部分的マッチドナーを相互参照し、同定することができる。
【０８２６】
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子と共に使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して同定することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）設計は、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく、特定用途向けガイドＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して実施される（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０（１０）：１４７３−５）。特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ｇＲＮＡをスコアする。典型的には、完全なマッチから７つのミスマッチまでのマッチが、長さ１７〜２４のガイドについて検討される。一旦オフターゲット部位が計算により決定されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約される。ＰＡＭ配列に隣接するｇＲＮＡ部位候補を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、各ＭＨＣ遺伝子座のゲノム配列全体を通して、選択されたｇＲＮＡ部位とは１、２、３つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから取得し、配列は、一般に入手可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを用いて、反復要素についてスクリーニングした。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、入力ＤＮＡ配列を検索する。その結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。
【０８２７】
遺伝子編集のための対象のＭＨＣ対立遺伝子を標的化するｇＲＮＡを同定した後、ｇＲＮＡは、以下の基準：１）標的部位との距離、２）５’Ｇの存在、および３）直交性スコア、あるいは、関連する（ｒｅｌｅｖａｎｔ）ＰＡＭ（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合はＮＧＧＰＡＭ、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合は、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ  ＰＡＭ、およびＮ．メニンジチディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓｓ）の場合は、ＮＮＮＮＧＡＴＴまたはＮＮＮＮＧＣＴＴ  ＰＡＭなど）を含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づいて、さらに階層化される。直交性は、標的配列に対する最小数のミスマッチを含有するヒトゲノム中の配列数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に意図される標的以外の同一配列を含まず、しかも標的配列中に１つまたは２つのミスマッチを含有する任意の配列を含まない、２０量体ｇＲＮＡを指してもよい。良好な直交性がある標的化ドメインを選択することによって、オフターゲットＤＮＡ切断を最小化する。
【０８２８】
従って、本発明に記載されるｇＲＮＡ同定システムの例示的な実施形態は、ユーザーが、例えば、６つのＨＬＡ遺伝子座の対立遺伝子などの他の対立遺伝子を標的化することがない単一対立遺伝子を標的化するｇＲＮＡを検索することを可能にする。さらに、ｇＲＮＡ同定システムを使用して、クエリー入力を特定の対立遺伝子識別子に変更することにより、特定の対立遺伝子を問い合わせることもできる。例示的な実施形態は、対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定するシステムおよび方法を提供する。例示的な実施形態はまた、ｇＲＮＡ同定システムのデータベーススキーマをインプリメントするための非一時的コンピューター可読記憶媒体およびシステムも提供する。
【０８２９】
非一時的コンピューター可読記憶媒体は、以下に記載されるデータベーススキーマをインプリメントするための処理装置による実行のための指示を保存する。データベーススキーマをインプリメントするシステムは、プロセッサー、および以下に記載されるデータベーススキーマを保存するメモリーを含む。非一時的コンピューター可読媒体は、処理装置による実行のための命令を保存し、ここで、命令の実行は、以下に記載されるデータベーススキーマに従い、処理装置にデータベースを作成させる。
【０８３０】
データベーススキーマは、主要なＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する対立遺伝子テーブルと、ｇＲＮＡに関するデータを保存するｇＲＮＡテーブルを含む。データベーススキーマはさらに、対立遺伝子テーブルの記録とｇＲＮＡテーブルの記録のリレーションシップを保存する対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルも含み、ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、ｇＲＮＡテーブルは、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する。データベーススキーマはまた、ハプロタイプに関するデータを保存するハプロタイプテーブルも含み、ここで、対立遺伝子テーブルは、ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する。データベーススキーマはさらに、複数の系統内で発生するハプロタイプの頻度に関するデータを保存するハプロタイプ−頻度テーブルも含み、ここで、ハプロタイプテーブルは、ハプロタイプ−頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する。また、系統に関するデータを保存する系統テーブルもデータベーススキーマに含まれる。
【０８３１】
データベーススキーマはまた、ハプロタイプ−頻度テーブルの記録と系統テーブルの記録のリレーションシップを記録する系統−ハプロタイプ−リレーションシップテーブルも含み、ここで、ハプロタイプ−頻度テーブルは、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する。データベーススキーマはさらに、複数の系統内で発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する対立遺伝子−頻度テーブルも含み、ここで、対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する。データベーススキーマはまた、対立遺伝子頻度テーブルの記録と系統テーブルの記録のリレーションシップを記録する対立遺伝子−系統−リレーションテーブルも含み、ここで、対立遺伝子頻度テーブルは、対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有し、系統テーブルは、対立遺伝子−系統−リレーションテーブルと１対多のリレーションシップを有する。
【０８３２】
データベースはまた、マイナー組織適合性抗原に関するデータを保存するマイナー抗原テーブル、およびマイナー組織適合性抗原に対するＨＬＡ制限に関する主要−マイナー−制限テーブルも含む。マイナー抗原テーブルは、主要−マイナー−制限テーブルと１対多のリレーションシップを有し、対立遺伝子テーブルは、主要−マイナー−制限テーブルと１対多のリレーションシップを有する。
【０８３３】
対立遺伝子テーブルは、対立遺伝子ｉｄキー、対立遺伝子属性、遺伝子名属性、および対立遺伝子配列属性を含む。ｇＲＮＡテーブルは、ｇＲＮＡｉｄキー、Ｃａｓ変異体属性、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含む）属性、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含まない）属性、鎖属性、直交性スコア属性、およびオフターゲットリスト情報属性を含む。対立遺伝子−ガイド−リレーションテーブルは、リレーションｉｄキー、対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、およびｇＲＮＡテーブルのｇＲＮＡｉｄキーに対応するｇＲＮＡｉｄ属性を含んでもよい。ハプロタイプテーブルは、ハプロタイプｉｄキー、ＨＬＡ−Ａ−対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／ＤＲＢ４／ＤＲＢ５遺伝子座属性、およびＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子遺伝子座属性を含んでもよい。
【０８３４】
ハプロタイプ−頻度テーブルは、ハプロタイプ頻度ｉｄキー、ハプロタイプテーブルのハプロタイプｉｄキーに対応するハプロタイプｉｄ属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、アジア系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、アジア系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、ヒスパニック系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性、ユダヤ人系統群におけるハプロタイプの発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群におけるハプロタイプ発生のランクの属性を含む。
【０８３５】
対立遺伝子−頻度テーブルは、対立遺伝子頻度ｉｄキー、対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、アジア系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、アジア系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、ヒスパニック系統群における対立遺伝子発生のランクの属性、ユダヤ人系統群における対立遺伝子の発生頻度の属性、およびユダヤ人系統群における対立遺伝子発生のランクの属性を含んでもよい。
【０８３６】
対立遺伝子−頻度テーブルは、対立遺伝子テーブルと依存リレーションシップを有し、対立遺伝子テーブルに完全に依存的である。ハプロタイプ−頻度テーブルは、ハプロタイプテーブルと依存リレーションシップを有し、ハプロタイプテーブルに完全に依存的である。
【０８３７】
１つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定するシステムは、プロセッサー、および実行されると、以下に記載される方法をプロセッサーにインプリメントさせる命令を保存するメモリーを含む。本方法は、１つまたは複数の対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定するコンピューターシステムを用いて実施してもよい。
【０８３８】
本方法は、以下：コンピューターシステムのインターフェースを介して、標的化移植片レシピエントの第１の複数の対立遺伝子の一覧、標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子の一覧を受信するステップを含む。この方法は、続いて、第１および第２の複数の対立遺伝子の一覧を処理して、第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子との間で１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するステップ、次に、データベースに問い合わせて、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が、第２の複数の対立遺伝子の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するステップを含む。データベースからの１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるという決定に応じて、好適であることが判明した１つまたは複数のｇＲＮＡを同定するｇＲＮＡ分子のリストが作成される。ｇＲＮＡのリストはランク付けされて、表示される。
【０８３９】
本方法はまた、第１の複数の対立遺伝子の各々についてＤＮＡ配列を表示するステップを含んでもよい。データベースは、ある人種群に発生する対立遺伝子の尤度を示す数をスコアする。本方法はまた、ある系統内の第１の複数の対立遺伝子の各々の発生頻度を表示するステップを含んでもよい。本方法は、第１の複数の対立遺伝子の各々とマイナー組織適合性抗原との間の制限リレーションシップを表示するステップをさらに含んでもよい。第１の複数の対立遺伝子が、標的化移植片レシピエントの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプで、第２の複数の対立遺伝子が、標的化移植片ドナーの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプであってもよい。第１の複数の対立遺伝子の一覧は、１つの対立遺伝子、２つの対立遺伝子、３つの対立遺伝子、４つの対立遺伝子、５つの対立遺伝子、６つの対立遺伝子、７つの対立遺伝子、または８つの対立遺伝子を含む。第２の複数の対立遺伝子の一覧は、１つの対立遺伝子、２つの対立遺伝子、３つの対立遺伝子、４つの対立遺伝子、５つの対立遺伝子、６つの対立遺伝子、７つの対立遺伝子、または８つの対立遺伝子を含む。
【０８４０】
ｇＲＮＡのリストは、１つのミスマッチ対立遺伝子を編集するために１つのｇＲＮＡを同定し得る。ｇＲＮＡのリストは、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するために２つ以上のｇＲＮＡを同定し得る。ｇＲＮＡのリストは、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子を編集するために１つのｇＲＮＡを同定し得る。
【０８４１】
ｇＲＮＡのリストからのｇＲＮＡは、標的化移植片ドナーの第２の複数の対立遺伝子からのミスマッチ対立遺伝子を編集して、第１の複数の対立遺伝子と第２の複数の対立遺伝子間でマッチする対立遺伝子の数を増加させることができる。ｇＲＮＡのリストからのｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集して、標的化移植片レシピエントに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発生する尤度を低減することができる。
【０８４２】
図２４は、一実施例に従って、モジュール内にインプリメントされたｇＲＮＡ同定システム２４００を示すブロック図である。これらのモジュールは、図３３に示す装置１０１０内にインプリメントすることもできる。モジュールは、入力モジュール２４１０、クエリーモジュール２４２０、ランク付けモジュール２４３０、およびデータベース管理モジュール２４４０を含み得る。モジュールは、様々な回路、回路系、および１つまたは複数のソフトウェア構成要素、プログラム、アプリケーション、または装置１０１０に含まれる１つまたは複数のプロセッサーにより実行されるように設計されたその他のコードベースもしくは命令ユニットを含み得る。他の実施形態では、モジュール２４１０、２４２０、２４３０、２４４０の１つまたは複数がサーバー１０２０内に含まれてもよく、モジュール２４１０、２４２０、２４３０、２４４０の残りは、装置１０１０内またはデータベース管理システム１０４０の一部として提供される。モジュール２４１０、２４２０、２４３０、および２４４０は、図２４には個別のモジュールとして示されるが、モジュール２４１０、２４２０、２４３０、および２４４０が、図示されるよりも少ない、もしくは多いモジュールとしてインプリメントされ得ることは理解すべきである。モジュール２４１０、２４２０、２４３０、および２４４０のいずれも、装置３３１０、サーバー３３２０、データベース管理システム３３４０もしくはデータベース３３５０などのシステム３３００（図３３）に含まれる１つまたは複数の構成要素と連絡し得ることは理解すべきである。
【０８４３】
入力モジュール２４１０は、装置、例えば、装置３３１０に付属するインターフェースから受信される入力を管理し、解析するように、設計され得る。入力は、標的化移植片レシピエントの第１の対立遺伝子群の一覧と、標的化移植片ドナーの第２の対立遺伝子群の一覧とを含み得る。入力はまた、標的化移植片レシピエントおよび／または標的化移植片ドナーのハプロタイプに関する情報、標的化移植片レシピエントおよび／または標的化移植片ドナーの系統情報も含み得る。入力モジュール２４１０はまた、標的化移植片レシピエントと標的化移植片ドナー間の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定するように設計することもできる。
【０８４４】
クエリーモジュール２４２０は、入力およびミスマッチ対立遺伝子を解析し、データベースに問い合わせて、データベース中の１つまたは複数のｇＲＮＡが、ミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定するように設計され得る。クエリーモジュール２４２０はまた、同定された１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適な、データベースからのｇＲＮＡのリスクを作成するように設計することもできる。
【０８４５】
ランク付けモジュール２４３０は、ｇＲＮＡのリストを解析し、様々な基準に基づいてリストをランク付けするように設計され得る。例えば、ｇＲＮＡのリスト中の個々のｇＲＮＡは、非標的化対立遺伝子に対するそれぞれのオフターゲット効果に基づいてランク付けされ得る。データベース管理モジュール２４４０は、対立遺伝子、ハプロタイプ、ｇＲＮＡ、系統、およびその他の情報を保存するデータベースにアクセスし、それを管理するように設計され得る。
【０８４６】
図２５は、一実施形態例に従って、対立遺伝子を編集するためのｇＲＮＡを同定する例示的な方法２５００を示すフローチャートである。方法２５００は、図２４に示されるｇＲＮＡ同定システム２４００内のモジュールを用いて実施され得る。例示的な方法２５００は、ステップ２５０２で、標的化移植片レシピエントの第１の対立遺伝子群の一覧を受信する入力モジュール２４１０から開始する。一実施形態例では、第１の対立遺伝子群は、標的化移植片レシピエントの母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプ、または標的化移植片レシピエントの父系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプであってよい。ハプロタイプは、本明細書の用法では、異なるＨＬＡ遺伝子についての１つの対立遺伝子群を指す。
【０８４７】
ステップ２５０４で、入力モジュール２４１０は、標的化移植片ドナーの第２の対立遺伝子群の一覧を受信する。一実施例では、第２の対立遺伝子群は、ＨＳＣドナー候補を遺伝子編集するために標的化される、母系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプ（例えば、一方の染色体上にＨＬＡ−Ａ／−Ｂ／−ＤＲＢ１を含むＭＨＣ遺伝子座の群）、または父系遺伝性主要ＨＬＡハプロタイプ（例えば、他方の染色体上にＨＬＡ−Ａ／−Ｂ／−ＤＲＢ１を含むＭＨＣ遺伝子座の群）であってもよい。移植片レシピエントについて入力として受信される情報のタイプが、移植片ドナーについて入力として受け取られる情報のタイプを決定し、逆も同様である。
【０８４８】
いくつかの実施形態では、入力モジュール２４１０は、移植片レシピエントおよびドナーの系統情報、移植片レシピエントおよびドナーの性別、および年齢情報に関する入力を受信する場合もある。
【０８４９】
例示的な方法２５００は、ステップ２５０６に進み、ここで、入力モジュール２４１０は、受信した入力を処理して、第１の対立遺伝子群と第２の対立遺伝子群同士の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を同定する。ミスマッチ対立遺伝子は、第１の対立遺伝子群と第２の対立遺伝子群からの対立遺伝子の各々の比較に基づいて同定することができる。ミスマッチ対立遺伝子は、本明細書の用法では、移植片レシピエントの対応する対立遺伝子とは異なる移植片ドナー由来の対立遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、１つのミスマッチ対立遺伝子が存在し得る。他の実施形態では、複数のミスマッチ対立遺伝子が存在し得る。入力モジュール２４１０は、さらなる処理のために同定されたミスマッチ対立遺伝子の記録を保存し得る。
【０８５０】
ステップ２５０８で、クエリーモジュール２４２０は、データベースに問い合わせて、データベースからのｇＲＮＡが、移植片ドナーの１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定する。一実施形態例では、以下に詳しく説明する図２７Ａ、２７Ｂおよび２７Ｃに関して記載されるデータベーススキーマ２７００および２７００’に従って、データベースをインプリメントすることができる。データベースは、対立遺伝子およびｇＲＮＡに関する情報を保存することができる。前述したように、ｇＲＮＡ同定システムは、ドナー対立遺伝子が、移植片レシピエントの対立遺伝子とマッチすることができるように、移植片ドナーの１つまたは複数の対立遺伝子を編集するのに好適なｇＲＮＡを同定するのを補助する。ステップ２５１０で、クエリーモジュール２４２０は、ｇＲＮＡが、移植片ドナーの１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適であるか否かを決定する。ｇＲＮＡが好適であれば、これは、ステップ２５１２で作成された好適なｇＲＮＡのリストに加えられる。データベースにより多くのｇＲＮＡがある（ステップ２５１４）場合、プロセスが反復され、データベースに、データベース中の各ｇＲＮＡに関して問い合わせがなされて、ドナー対立遺伝子が、移植片レシピエントの対立遺伝子とマッチすることができるような移植片ドナーの１つまたは複数の対立遺伝子の編集に、ｇＲＮＡが好適であるか否かが決定される。同定されるいずれの好適なｇＲＮＡも作成リストに加えられる。いくつかの実施形態では、ミスマッチドナー対立遺伝子を編集するために、複数のｇＲＮＡが利用可能である。他の実施形態では、ミスマッチドナー対立遺伝子を編集するために、１つまたは０のｇＲＮＡが利用可能である。一実施例では、２つ以上のミスマッチ対立遺伝子が存在する場合、クエリーモジュール２４２０は、最初に、ミスマッチ対立遺伝子の全てを編集することができるｇＲＮＡを同定する。次に、クエリーモジュール２４２０は、ミスマッチ対立遺伝子の少なくとも１つを編集することができるｇＲＮＡを同定する。このようにして、全てのミスマッチ対立遺伝子を編集するために複数のｇＲＮＡを必要とするのではなく、１つのｇＲＮＡを用いて全てのミスマッチ対立遺伝子を編集することができる場合、ｇＲＮＡ同定システム２４００は、効率的なｇＲＮＡオプションをユーザーに提供することができる。全ての好適なｇＲＮＡが作成リストに加えられたら、ランク付けモジュール２４３０は、ステップ２５１６の特定の基準に基づいてｇＲＮＡのリストをランク付けする。例えば、ｇＲＮＡは、それらのオフターゲット効果、またはオフターゲット効果がないこと、非標的化対立遺伝子に基づいてランク付けされ得る。ランク付けプロセスについては、図２６を参照にして以下に詳しく説明する。
【０８５１】
ステップ２５１８では、好適なｇＲＮＡのランク付けリストが、例えば、図３３を参照に説明される画面表示装置３４１８などの表示装置を介してユーザーに表示される。一実施形態例では、レシピエントの対立遺伝子各々のＤＮＡ配列も表示される。別の実施形態例では、一系統内のレシピエントの対立遺伝子（第１の対立遺伝子群）の各々の発生頻度が表示される。別の例示的実施形態では、レシピエントのＭＨＣおよびドナーのＭＨＣにより制限されるｍｉＨＡｇが表示される。
【０８５２】
非限定的な例では、レシピエント（第１の対立遺伝子群）とドナー（第２の対立遺伝子群）の間に１つ（単一もしくは特異な）のミスマッチ対立遺伝子が存在し得る。この場合、ｇＲＮＡ同定システムは、１つのミスマッチ対立遺伝子を編集するために１つのｇＲＮＡを同定し得る。別の非限定的な例では、レシピエント（第１の対立遺伝子群）とドナー（第２の対立遺伝子群）の間に２つ以上のミスマッチ対立遺伝子が存在し得る。この場合、ｇＲＮＡ同定システムは、複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するために複数のｇＲＮＡを同定し得る。この例では、ミスマッチ対立遺伝子は、連続的または不連続的のいずれでもよい。別の非限定的な例では、レシピエント（第１の対立遺伝子群）とドナー（第２の対立遺伝子群）の間に２つ以上のミスマッチ対立遺伝子が存在し得る。この場合、ｇＲＮＡ同定システムは、複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するために１つ（単一もしくは特異な）のｇＲＮＡを同定し得る。この例では、ミスマッチ対立遺伝子は、連続的または不連続的のいずれでもよい。
【０８５３】
図２６は、例示的実施形態に従って、ｇＲＮＡをランク付けするための例示的な方法を示すフローチャートである。方法２６００は、ステップ２６０２で、ミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適な、同定されたｇＲＮＡ候補（図２５を参照にして説明した通り）を有するｇＲＮＡ同定システム２４００から開始する。ステップ２６０４では、ランク付けモジュール２４３０が、各ｇＲＮＡ候補についてデータベースからのミスマッチ、挿入／欠失（インデル）、クロマチン状態などに基づき事前に決定されたオフターゲットスコアを検索する。ステップ２６０６では、ランク付けモジュール２４３０は、ミスマッチ、挿入／欠失（インデル）、クロマチン情報などの検索されたオフターゲットスコアに基づいてｇＲＮＡをランク付けする。ランク付けされたｇＲＮＡのリストは、ステップ２６０８で、例えば、図３４を参照に説明される画面表示装置３４１８などの表示装置を介してユーザーに表示される。
【０８５４】
一例示的実施形態では、ランク付けモジュール２４３０は、データベースに保存されたｇＲＮＡの各々につて、ミスマッチ、挿入／欠失（インデル）、クロマチン情報などに基づいてオフターゲットスコアを決定する。このスコアは、ｇＲＮＡに関連し、ランク付けプロセス中に検索できるように保存される。いくつかの実施形態では、オフターゲットスコアは、ｇＲＮＡ配列をヒトゲノムとアラインメントして、ヒトゲノムとｇＲＮＡ配列同士のミスマッチを決定することによって取得される。
【０８５５】
例えば、ｇＲＮＡ同定システムを用いて、ゲノム全体の総オフターゲット活性を最小にするように、ユーザーの標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化することができる。一実施形態例では、オフターゲットスコアを決定するアルゴリズムは、ミスマッチの数の他に、Ｃａｓ９により認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の変更も可能にする。例えば、潜在的オフターゲット部位を決定するとき、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭの同義性が報告され得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、このアルゴリズム例は、最初に、対象のｓｇＲＮＡ配列および５’−ＮＲＧ−３’ＰＡＭ配列に対応する２０−ｂｐ配列から構成される全ての２３−ｂｐ  ＤＮＡ配列を収集する。次に、上記アルゴリズム例は、収集された配列をクエリー配列と比較して、２０−ｂｐ  ｓｇＲＮＡ配列中のミスマッチ塩基の数を計数する。Ｂａｅ  Ｓ．，Ｐａｒｋ  Ｊ  ＆  Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｓ．Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：Ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｈａｔ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０，１４７３−１４７５（２０１４）を参照されたい。
【０８５６】
別の実施形態では、オフターゲットスコアは、ヒトゲノムのクロマチン状態を考慮に入れて決定され得る。ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｅｔａｈ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／  ＡｄｌｉＬａｂ／ＣＲＯＰ−ＩＴ／ａｂｏｕｔ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【０８５７】
また別の実施形態では、考えられるＣＲＩＳＰＲガイド（例えば、ＰＡＭ配列：ＮＧＧが続く２０ヌクレオチド）について配列を操作した後、選択されたゲノム全体を通じて考えられるオフターゲットマッチについて操作してもよい。例えば、オフターゲットスコアは、ミスマッチの総数、ミスマッチ絶対位置（ＰＡＭ部位に接近するミスマッチの比較的高い妨害に対応するため）、およびミスマッチ同士の平均ペアワイズ距離（ガイドＤＮＡ相互作用を破壊する上での接近するミスマッチの立体作用を説明するため）を考慮に入れて計算してもよい。ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照されたい。
【０８５８】
別の例示的実施形態では、オフターゲットスコアを決定するプロセスは、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供される既存のゲノムインデキシングプログラム）を用いて、同定されたｇＲＮＡ配列を残りの生物染色体ＤＮＡにマッピングすることによって特異性を検証する。ｇＲＮＡを別の配列にマッピングすることができれば、これは、オフターゲットを有する。一実施形態例では、オフターゲットスコア計算は、配列の５’末端側の最初の６塩基のオフターゲットに許容されるミスマッチの数も考慮に入れてよい。また別の実施形態例では、オフターゲットスコア計算は、標的配列までの許容編集距離（すなわち、オフターゲットに許容されるミスマッチおよびインデルの数）も考慮に入れてよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ−ＣＲＩＳＰ／ａｂｏｕｔｐａｇｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【０８５９】
ユーザーは、本明細書に記載されるｇＲＮＡ同定システムを使用して、造血幹細胞移植を必要とする将来のレシピエント患者に対して部分的ＨＬＡマッチドナーを評価することができる。ユーザーは、入手可能な骨髄および臍帯血データベースを用いて、部分的マッチドナー候補を同定するか、または移植片レシピエントに生物学的に近縁の個体をスクリーニングすることができる。ユーザーは、ＭＨＣ遺伝子座でマッチする多数の対立遺伝子を有する数人のドナー候補から１人のドナーを選択することができる。異なる民族系統／起源の人は、ｍｉＨＡｇの頻度が異なり、これは、ＭＨＣ制限されるため、類似する民族系統／起源のドナーが好ましい。同じ系統内に数人のドナー候補がいる場合、ユーザーは、本明細書に記載されるｇＲＮＡ同定システムを用いて、ＭＨＣの頻度を見つけることができ、ドナーｍｉＨＡｇを配列決定して、最も類似するｍｉＨＡｇプロフィール（例えば、１０のｍｉＨＡｇ遺伝子座）を有するドナーを選択する。ドナーが、「修正」ＭＨＣ（レシピエントＭＨＣに従い）によって制限されるｍｉＨＡｇを有する場合、このドナーを選択することはできない。
【０８６０】
図２７Ａは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムのための例示的なデータベーススキーマ２７００を示す。例示的なデータベーススキーマ２７００は、対立遺伝子テーブル２７０５、ｇＲＮＡテーブル２７１０、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブル２７１５、ハプロタイプテーブル２７２０、ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５、系統テーブル２７３０、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル２７３５、対立遺伝子−頻度テーブル２７４０、および対立遺伝子−系統−リレーションテーブル２７４５を含む。いくつかの実施形態では、例示的なデータベーススキーマ２７００はまた、マイナー抗原テーブル２７５０および主要−マイナー−制限テーブル２７５５も含む。例示的なデータベーススキーマ２７００は、図２７Ａには、１１のテーブルを含むものとして示されるが、データベーススキーマ２７００は、これより少ないか、または多いテーブル数を含み得ることは理解すべきである。
【０８６１】
図２７ＢおよびＣは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムのための例示的なデータベーススキーマ２７００’を詳細に示す。例示的なデータベーススキーマ２７００’は、ＭｙＳＱＬを用いて示される。データベース内のテーブルの各々は、キーおよび１つまたは複数の属性を含む。例示的なデータベーススキーマ２７００’は、対立遺伝子テーブル２７０５、ｇＲＮＡテーブル２７１０、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブル２７１５、ハプロタイプテーブル２７２０、ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５、系統テーブル２７３０、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル２７３５、対立遺伝子−頻度テーブル２７４０、および対立遺伝子−系統リレーション−テーブル２７４５を含む。いくつかの実施形態では、例示的なデータベーススキーマ２７００はまた、マイナー抗原テーブル２７５０および主要−マイナー−制限テーブル２７５５も含む。例示的なデータベーススキーマ２７００は、図２７Ｂおよび２７Ｃには、１１のテーブルを含むものとして示されるが、データベーススキーマ２７００は、これより少ないか、または多いテーブル数を含み得ることは理解すべきである。
【０８６２】
一実施形態例では、ｇＲＮＡ（ガイド）テーブルは、ｇＲＮＡ  ＩＤ、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含まないｇＲＮＡ標的配列、ＰＡＭを含むｇＲＮＡ標的配列、Ｃａｓ変異体タイプ（一部のｇＲＮＡは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的であり、これらのＣａｓ９変異体に特異的な標的化ドメイン長さを含む）、標的化ｇＲＮＡが指令されて結合するゲノムＤＮＡ鎖（例えば、＋もしくは−鎖）、直交性スコア（ヒトゲノムのオフターゲットヒットスコアの加重合計）、ならびにオフターゲット数（ｇＲＮＡが、異なる数のミスマッチもしくはインデルを含む標的化遺伝子座として同定されない他のゲノム遺伝子座上で標的化またはヒットする回数）を含む。対立遺伝子テーブルの一例は、以下のカテゴリーおよび関連データを含む：対立遺伝子ＩＤ、対立遺伝子識別子（ＨＬＡ命名法）、遺伝子（遺伝子座）名、および対立遺伝子配列。対立遺伝子−頻度テーブルの一例は、ＮＢＭＰデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ＨＬＡ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−ＨＬＡ−Ａｌｌｅｌｅｓ−ａｎｄ−Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ−ｉｎ−ｔｈｅ−ＵＳ−Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ／；ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ＨＬＡ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／Ｊｅｗｉｓｈ−Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／）に注記されているように、ヨーロッパ系アメリカ人（白色人種）、アフリカ系アメリカ人、アジア系、ヒスパニック系、およびユダヤ系集団内の頻度記録ＩＤ、対立遺伝子識別子、頻度およびランクを含む。
【０８６３】
対立遺伝子テーブル２７０５は、主要ＨＬＡ対立遺伝子に関するデータを保存する。一実施形態例では、対立遺伝子テーブル２７０５は、一般に入手可能なＨＬＡ対立遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｌａ．ａｌｌｅｌｅｓ．ｏｒｇ／ａｌｌｅｌｅｓ／ｔｅｘｔ＿ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍに見出される）からのデータを用いて構成される。いくつかの実施形態では、対立遺伝子テーブル２７０５は、ＨＬＡ対立遺伝子の変異体の配列に関するデータを保存する。対立遺伝子テーブル２７０５は、対立遺伝子ｉｄキー、対立遺伝子属性、遺伝子名属性、および対立遺伝子配列属性を含む。
【０８６４】
ｇＲＮＡテーブル２７１０は、ｇＲＮＡに関するデータを保存する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、前述したような対立遺伝子を編集するために設計される。一実施形態では、ｇＲＮＡテーブル２７１０は、ｇＲＮＡｉｄキー、ｇＲＮＡタイプ属性、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含むｇＲＮＡ配列、ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含まない）属性、鎖属性、直交性スコア属性、およびオフターゲットリスト情報属性を含む。
【０８６５】
対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブル２７１５は、対立遺伝子テーブル２７０５の記録とｇＲＮＡテーブル２７１０の記録との間のリレーションシップを保存する。例示的データベーススキーマ２７００では、対立遺伝子テーブル２７０５は、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブル２７１５と１対多のリレーションシップを有する。ｇＲＮＡテーブル２７１０は、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブル２７１５と１対多のリレーションシップを有する。一実施形態では、対立遺伝子−ｇＲＮＡ−リレーションテーブルは、リレーションｉｄキー、対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、ｇＲＮＡテーブルのｇＲＮＡｉｄキーに対応するｇＲＮＡｉｄ属性を含む。
【０８６６】
ハプロタイプテーブル２７２０は、ハプロタイプに関するデータを保存する。ハプロタイプは、片方の親から一緒に遺伝された遺伝子または対立遺伝子群である。対立遺伝子テーブル２７０５は、ハプロタイプテーブルと１対多のリレーションシップを有する。ハプロタイプテーブル２７２０は、ハプロタイプｉｄキー、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／ＤＲＢ４／ＤＲＢ５遺伝子座属性、ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子遺伝子座属性を含む。
【０８６７】
ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５は、ある系統内で発生するハプロタイプの頻度に関するデータを保存する。ハプロタイプテーブル２７２０は、ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５と１対１のリレーションシップを有する。一実施形態では、ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５は、ハプロタイプ頻度ｉｄキー、ハプロタイプテーブル２７２０のハプロタイプｉｄキーに対応するハプロタイプｉｄ属性、ヨーロッパ系統群内のハプロタイプの発生頻度の属性、およびヨーロッパ系統群内のハプロタイプ発生のランクの属性を含む。ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５はまた、アフリカ系アメリカ人系統群内のハプロタイプの発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群内のハプロタイプ発生のランクの属性、アジア系統群内のハプロタイプの発生頻度の属性、アジア系統群内のハプロタイプ発生のランクの属性、ヒスパニック系統群内のハプロタイプの発生頻度の属性、ヒスパニック系統群内のハプロタイプ発生のランクの属性、ユダヤ系統群内のハプロタイプの発生頻度の属性、およびユダヤ系統群内のハプロタイプ発生のランクの属性も含み得る。ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５は、ハプロタイプテーブル２７２０と依存リレーションシップを有し、ハプロタイプテーブル２７２０に完全に依存的である。
【０８６８】
系統テーブル２７３０は、複数の民族系統または起源に関するデータを保存する。一実施形態例では、系統テーブル２７３０は、ヨーロッパ系統群、アフリカ系アメリカ人系統群、アジア系統群、ヒスパニック系統群、およびユダヤ系統群に関するデータを保存する。系統起源テーブル２７３０は、系統ｉｄキー、および系統名属性を含む。
【０８６９】
系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル２７３５は、ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５の記録と系統テーブル２７３０の記録の間のリレーションシップを保存する。ハプロタイプ−頻度テーブル２７２５は、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル２７３５と１対多のリレーションシップを有する。系統テーブル２７３０は、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル２７３５と１対多のリレーションシップを有する。一実施形態では、系統−ハプロタイプ−リレーションテーブル２７３５は、ｉｄキー、系統テーブル２７３０の系統ｉｄキーに対応する系統ｉｄ属性、およびハプロタイプ−頻度テーブル２７２５のハプロタイプｉｄキーに対応するハプロタイプｉｄ属性を含む。
【０８７０】
対立遺伝子−頻度テーブル２７４０は、ある系統内で発生する対立遺伝子の頻度に関するデータを保存する。対立遺伝子テーブル２７０５は、対立遺伝子頻度テーブルと１対１のリレーションシップを有する。一実施形態では、対立遺伝子−頻度テーブル２７４０は、対立遺伝子頻度ｉｄキー、対立遺伝子テーブルの対立遺伝子ＩＤに対応する対立遺伝子属性、ヨーロッパ系統群内の対立遺伝子の発生頻度の属性、ヨーロッパ系統群内の対立遺伝子発生のランクの属性、アフリカ系アメリカ人系統群内の対立遺伝子の発生頻度の属性、アフリカ系アメリカ人系統群内の対立遺伝子発生のランクの属性、アジア系統群内の対立遺伝子の発生頻度の属性、アジア系統群内の対立遺伝子発生のランクの属性、ヒスパニック系統群内の対立遺伝子の発生頻度の属性、ヒスパニック系統群内の対立遺伝子発生のランクの属性、ユダヤ系統群内の対立遺伝子の発生頻度の属性、およびユダヤ系統群内の対立遺伝子発生のランクの属性を含む。対立遺伝子−頻度テーブル２７４０は、対立遺伝子テーブル２７０５と依存リレーションシップを有し、対立遺伝子テーブル２７０５に完全に依存的である。
【０８７１】
対立遺伝子−系統−リレーションテーブル２７４５は、対立遺伝子−頻度テーブル２７４０の記録と系統テーブル２７３０の記録の間のリレーションシップを保存する。対立遺伝子−頻度テーブル２７４０は、対立遺伝子−系統−リレーションテーブル２７４５と１対多のリレーションシップを有する。系統テーブル２７３０は、対立遺伝子−系統−リレーションテーブル２７４５と１対多のリレーションシップを有する。一実施形態では、対立遺伝子−系統−リレーションテーブル２７４５は、対立遺伝子−系統ｉｄキー、対立遺伝子−頻度テーブル２７４０の対立遺伝子ｉｄキーに対応する対立遺伝子ｉｄ属性、および系統テーブル２７３０の系統ｉｄキーに対応する系統ｉｄ属性を含む。
【０８７２】
マイナー−抗原テーブル２７５０は、マイナー組織適合性抗原（ｍｉＨＡｇ）に関するデータを保存する。一実施形態では、マイナー−抗原テーブル２７５０は、ｍｉＨＡｇｉｄキー、ｍｉＨＡｇ名属性、ｍｉＨＡｇ遺伝子属性、染色体属性、免疫原性対立遺伝子属性、非免疫原性対立遺伝子属性、および免疫原性表現型属性を含む。
【０８７３】
主要−マイナー−制限テーブル２７５５は、ｍｉＨＡｇに対するＨＬＡ制限に関するデータを保存する。マイナー−抗原テーブル２７５０は、主要−マイナー−制限テーブル２７５５と１対多のリレーションシップを有する。対立遺伝子テーブル２７０５は、主要−マイナー−制限テーブル２７５５と１対多のリレーションシップを有する。一実施形態では、主要−マイナー−制限テーブル２７５５は、主要−マイナーｉｄキー、対立遺伝子テーブル２７０５の対立遺伝子ｉｄキーに対応する主要ｉｄ属性、およびマイナー−抗原テーブル２７５０のｍｉＨＡｇｉｄキーに対応するマイナーｉｄ属性を含む。
【０８７４】
テーブル２７０５、２７１０、２７１５、２７２０、２７２５、２７３０、２７３５、２７４０、２７４５、２７５０および２７５５の各々は、特定のキーと特定の属性を有するものとして説明されるが、テーブルの各々が、異なるキーもしくは異なる数のキー、および／または異なる属性もしくは異なる属性の数を有するように設計され得ることは理解すべきである。
【０８７５】
表１〜１２は、図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃに関して説明されたデータベーススキーマ２７００または２７００’の１つまたは複数のテーブル、例えば、ハプロタイプテーブル２７２０および／またはハプロタイプ頻度テーブル２７２５に保存され得る例示的なデータを示す。
【０８７６】
図２８Ａは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムに入力される例示的な対立遺伝子を示す。第１の対立遺伝子群、すなわち、標的化移植片レシピエントの対立遺伝子は、対立遺伝子２８０２であってよい。第２の対立遺伝子群、すなわち、標的化移植片ドナーの対立遺伝子は、対立遺伝子２８０４であってよい。図２８Ａからわかるように、対立遺伝子２８０２と対立遺伝子２８０４の間にミスマッチが存在し、これは、枠２８０５により示される。図示されるように、ドナー対立遺伝子Ａ＊０２：０１：０１：０１は、レシピエント対立遺伝子Ａ＊０１：０１：０１：０１とマッチしない。ｇＲＮＡ同定システムを用いて、レシピエント対立遺伝子にマッチするようにこれらのミスマッチドナー対立遺伝子を編集することができるｇＲＮＡを同定することができる。この入力／シナリオ例は、「単一対立遺伝子のノックアウト」と呼ばれることもある。前述のように、ｇＲＮＡ同定システムは、単一対立遺伝子をノックアウトするための１つのｇＲＮＡを同定することができる。
【０８７７】
図２８Ｂは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムに入力される例示的な対立遺伝子を示す。この実施例では、第１の対立遺伝子群、すなわち、レシピエントの対立遺伝子は、対立遺伝子２８１２であってよい。第２の対立遺伝子群、すなわち、標的化移植片ドナーの対立遺伝子は、対立遺伝子２８１４であってよい。図２８Ｂからわかるように、対立遺伝子２８０２と対立遺伝子２８０４の間に複数のミスマッチが存在し、これは、枠２８１５、２８１７および２８１９により示される。図示されるように、ドナー対立遺伝子Ａ＊０２：０１：０１：０１−Ｂ＊０８：０１：０１：０１−ＤＲＢ１＊０３：０１は、レシピエント対立遺伝子Ａ＊０３：０１：０１：０１−Ｂ＊０７：０２：０１−ＤＲＢ１＊１５：０１：０１：０１とマッチしない。ｇＲＮＡ同定システムを用いて、レシピエント対立遺伝子にマッチするようにこれらのミスマッチドナー対立遺伝子を編集することができるｇＲＮＡを同定することができる。この入力／シナリオ例は、「複数対立遺伝子のノックアウト」と呼ばれることもある。前述のように、ｇＲＮＡ同定システムは、複数の対立遺伝子をノックアウトするための単一のｇＲＮＡもしくは複数のｇＲＮＡを同定することができる。
【０８７８】
図２８Ｃは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムに入力される例示的な対立遺伝子を示す。この実施例では、第１の対立遺伝子群、すなわち、レシピエントの対立遺伝子は、対立遺伝子２８２２であってよい。第２の対立遺伝子群、すなわち、標的化移植片ドナーの対立遺伝子は、対立遺伝子２８２４であってよい。図２８Ｃからわかるように、対立遺伝子２８０２と対立遺伝子２８０４の間に複数のミスマッチが存在し、これは、枠２８２５および２８２７により示される。図示されるように、ドナー対立遺伝子Ａ＊０２：０１：０１：０１およびＡ＊２９：０２：０１：０１は、レシピエント対立遺伝子Ａ＊０１：０１：０１：０１およびＡ＊２３：０１：０１とマッチしない。ｇＲＮＡ同定システムを用いて、レシピエント対立遺伝子にマッチするようにこれらのミスマッチドナー対立遺伝子を編集することができるｇＲＮＡを同定することができる。この入力／シナリオ例は、「両アレル破壊」と呼ばれることもある。前述のように、ｇＲＮＡ同定システム用いて、両アレル破壊のための単一ｇＲＮＡもしくは複数のｇＲＮＡを同定することができる。
【０８７９】
このようにして、ｇＲＮＡ同定システムは、単一のミスマッチ対立遺伝子（図２８Ａ）、複数の連続的ミスマッチ対立遺伝子（図２８Ｂ）、または複数の不連続的ミスマッチ対立遺伝子（図２８Ｃ）を有するドナー対立遺伝子およびレシピエント対立遺伝子を受信することができる。
【０８８０】
図２９は、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムの例示的なクエリーまたは入力、ならびにｇＲＮＡ同定システムの出力としての例示的なｇＲＮＡリスト２９５０を示す。前述したように、ユーザーは、ドナーの対立遺伝子群およびレシピエント／患者の対立遺伝子群をはじめとするクエリーを入力することができる。前述したように、ｇＲＮＡ同定システムは、ドナー対立遺伝子の１つまたは複数のミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適なｇＲＮＡのリストを出力する。図２９に示すように、ユーザーが、クエリー２９００を入力すると、ｇＲＮＡ同定システムは、出力としてｇＲＮＡリスト２９５０を作成する。クエリーに基づいて、ｇＲＮＡ同定システムは、遺伝子編集のために好適なｇＲＮＡを決定すると、ミスマッチドナー対立遺伝子を標的化して、ミスマッチ対立遺伝子を除外する。この実施例では、Ａ＊０２：０１：０１：０１およびＡ＊２９：０２：０１：０１がドナーと患者との間のミスマッチ対立遺伝子であるため、ｇＲＮＡ同定システムは、これらを標的化し、対立遺伝子Ｂ＊０８：０１：０１、ＤＲＢ１＊０３：０１：０１：０１、Ｂ＊４４：０３：０１およびＤＲＢ１＊０７：０１：０１：０１はドナーと患者との間で一致することから、これらを排除する。図２９に示すように、オフターゲットスコア（２９１０）がｇＲＮＡの各々について表示され、これらのリストが、オフターゲットスコアに基づいてランク付けされる。また、ｇＲＮＡ配列（２９０５）も表示される。さらに、各ｇＲＮＡと一緒に用いられるＣａｓ９分子のタイプが「タイプ」として表示される（２９１５）。「ｓａ」は、Ｓ．アウレリウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９分子を指し、「ｓｐｙ」は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９分子を指す。また、列記されるｇＲＮＡの各々が結合する鎖は、−鎖および＋鎖としても表示される（２９２０）。
【０８８１】
前述したように、ｇＲＮＡ同定システムは、ミスマッチ対立遺伝子を編集するのに好適なｇＲＮＡのリストに加えて、他の出力も提供し得る。図３０は、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムの出力として対立遺伝子配列を示す例示的な表３０００を示す。対立遺伝子配列は、レシピエントもしくはドナーまたは双方の１つまたは複数の対立遺伝子のものであってもよい。
【０８８２】
図３１Ａは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムの出力としてハプロタイプ頻度を示す例示的な表３１００を示す。ハプロタイプの発生頻度は、系統に基づいて示す。図３１Ｂは、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムの出力として対立遺伝子頻度を示す例示的な表３１５０を示す。対立遺伝子の発生頻度は、系統に基づいて示す。図３２は、ｇＲＮＡ同定システムの出力としての主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を考慮したマイナー組織適合性抗原（ｍｉＨＡｇ）制限を示す例示的な表３２００を示す。
【０８８３】
データベースおよびｇＲＮＡ同定システムの例示的な使用では、ユーザーは、ドナーの限定的なＨＬＡ遺伝子型情報と共にクエリーを入力してもよい。例えば、限定的なＨＬＡ遺伝子型情報は、対立遺伝子群および具体的なＨＬＡタンパク質についての情報を含み得る。別の実施例では、限定的なＨＬＡ遺伝子型情報は、対立遺伝子群、具体的なＨＬＡタンパク質、およびコード領域内の同義ＤＮＡ置換についての情報を含み得る。限定的なＨＬＡ遺伝子型情報に、ユーザーは、非コード領域の相違を示す情報を含めない場合がある。
【０８８４】
こうした限定的なＨＬＡ遺伝子型情報がクエリーとしてデータベースに送られると、ｇＲＮＡ同定システムは、アラインメントなどのさらなる調査のために標的対立遺伝子の全サブタイプの配列を検索結果として提供し得る。別の実施形態では、ｇＲＮＡ同定システムは、特定のガイドについてオンターゲットもしくはオフターゲット部位を有する標的対立遺伝子のサブタイプの数またはパーセンテージを検索結果として提供する場合もあり、これは、このｇＲＮＡが、どれくらいドナーにおける未知の標的ＨＬＡサブタイプを編集する見込みがあるかを示し得る。また別の実施例では、ｇＲＮＡ同定システムは、特定のｇＲＮＡについてオンターゲットもしくはオフターゲット部位を有する、除外された対立遺伝子のサブタイプの数またはパーセンテージを検索結果として提供する場合もあり、これは、このｇＲＮＡが、どれくらいドナーにおける未知の除外ＨＬＡサブタイプにオフターゲット効果を有する見込みがあるかを示し得る。
【０８８５】
図３３は、一実施形態例に従って、ｇＲＮＡ同定システムをインプリメントするためのシステム３３００を描写するネットワーク図を示す。システム３３００は、ネットワーク３３０５、装置３３１０、サーバー３３２０、データベース管理システム３３４０、およびデータベース３３５０を含み得る。構成要素３３１０、３３２０、３３４０、および３３５０の各々は、ネットワーク３３０５と連絡している。
【０８８６】
一実施形態例では、ネットワーク３３０５の１つまたは複数の部分は、アドホックネットワーク（ａｄ  ｈｏｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ）、イントラネット、エクストラネット、バーチャル・プライベート・ネットワーク（ＶＰＮ）、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）、無線ＬＡＮ（ＷＬＡＮ）、ワイド・エリア・ネットワーク（ＷＡＮ）、無線ワイド・エリア・ネットワーク（ＷＷＡＮ）、メトロポリタン・エリア・ネットワーク（ＭＡＮ）、インターネットの１部分、公衆交換電話ネットワーク（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｗｉｔｃｈｅｄ  Ｔｅｌｅｐｈｏｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＰＳＴＮ）の１部分、携帯電話ネットワーク、無線ネットワーク、ＷｉＦｉネットワーク、ＷｉＭａｘネットワーク、その他のあらゆるタイプのネットワーク、またはこうしたネットワークの２つ以上の組合せであってよい。
【０８８７】
装置３３１０は、限定はしないが、ワークステーション、コンピューター、汎用コンピューター、インターネットアプライアンス、携帯用デバイス、ワイアレスデバイス、ポータブルデバイス、ウェアラブルコンピューター、携帯もしくは移動電話、携帯型情報端末（ＰＤＡ）、スマートフォン、タブレット、ウルトラブック、ネットブック、ラップトップ、デスクトップ、マルチプロセッサーシステム、マイクロプロセッサベースのもしくはプログラム可能な家庭用電化製品、ミニコンピューターなどを含み得る。装置３３１０は、図３４に示すコンピューター３４００に関して記載される１つまたは複数の構成要素を含んでよい。
【０８８８】
装置３３１０は、有線または無線接続を介してネットワーク３３０５に接続され得る。装置３３１０は、限定はしないが、ウェブブラウザーアプリケーション、データベース管理システム、および本明細書に記載のｇＲＮＡ同定システムなどの１つまたは複数のアプリケーションまたはソフトウェアシステムを含み得る。
【０８８９】
一例示的実施形態では、装置３３１０は、本明細書に記載される全ての機能を実施することも可能である。他の実施形態では、ｇＲＮＡ同定システムは、装置３３１０に搭載されてもよく、サーバー３３２０が、本明細書に記載される機能を実施する。また別の実施形態では、装置３３１０は、一部の機能を実施することができ、サーバー３３２０が、本明細書に記載される他の機能を実施する。
【０８９０】
サーバー３３２０、データベース管理システム３３４０、およびデータベース３３５０は、有線接続を介してネットワーク３３０５に接続されている。あるいは、サーバー３３２０、データベース管理システム３３４０、およびデータベース３３５０の１つまたは複数が、無線接続を介してネットワーク３３０５に接続されてもよい。サーバー３３２０は、ネットワーク３３０５を介して、装置３３１０、データベース管理システム３３４０、およびデータベース３３５０と連絡するように設計された１つまたは複数のコンピューターまたはプロセッサーを含む。サーバー３３２０は、装置３３１０によりアクセスされる１つまたは複数のアプリケーションもしくはウェブサイトを提供する、および／またはデータベース３３５０のコンテンツへのアクセスを促進する。データベース管理システム３３４０は、データベース３３５０へのアクセスを促進するように設計された１つまたは複数のコンピューターもしくはプロセッサーを含む。データベース３３５０は、装置３３１０またはサーバー３３２０による使用のためのデータおよび／または命令（もしくはコード）を保存するための１つまたは複数の記憶装置を含む。データベース３３５０はまた、図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃに関して説明したデータベーススキーマ２７００または２７００’に従って、データを保存し得る。データベース管理システム３３４０、データベース３３５０、および／またはサーバー３３２０は、互いにまたは装置３３１０から地理的に分散された１つまたは複数の位置に配置してもよい。あるいは、データベース３３５０をサーバー３３２０内に搭載してもよい。
【０８９１】
図３４は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ同定システム２４００の例示的実施形態をインプリメントするために使用することができる例示的なコンピューター３４００のブロック図である。コンピューター３４００は、１つまたは複数のコンピューター実行可能命令または例示的な実施形態をインプリメントするためのソフトウェアを保存するための１つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体を含む。非一時的コンピューター可読媒体としては、限定はしないが、１または複数タイプのハードウエアメモリー、非一時的有形的表現媒体（例えば、１つまたは複数の磁気記憶ディスク、１つまたは複数の光ディスク、１つまたは複数のフラッシュドライブ）などを含み得る。例えば、コンピューター３４００に組み込まれたメモリー３４０６は、コンピューター可読およびコンピューター実行可能命令、またはｇＲＮＡ同定システム２４００の例示的な実施形態をインプリメントするためのソフトウェアを保存し得る。コンピューター３４００はまた、コンピューター可読およびコンピューター実行可能命令、またはメモリー３４０６に保存されたソフトウェア、ならびにシステムハードウエアを制御するための他のプログラムを実行するために、構成可能および／またはプログラム可能プロセッサー３４０２と付属コア３４０４、ならびに任意選択的に、１つまたは複数の追加的構成可能および／またはプログラム可能プロセッサー３４０２’と付属コア３４０４’も含む（例えば、複数のプロセッサー／コアを備えるコンピューターシステムの場合）。プロセッサー３４０２およびプロセッサー３４０２’は、各々、単一コアプロセッサーまたは複数のコア（３４０４および３４０４’）プロセッサーであってもよい。
【０８９２】
コンピューター内のインフラストラクチャーおよびリソースが動的に共有され得るように、コンピューター３４００に可視化を使用してもよい。複数のプロセッサーで実行中のプロセスに対処して、プロセスが、複数のコンピューターリソースではなく、ただ１つのコンピューターリソースを使用していることがわかるようにするために、ビジュアル・マシン３４１４を設置してもよい。
【０８９３】
メモリー３４０６は、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＥＤＯ  ＲＡＭなどのコンピューターシステムメモリーまたはランダムアクセスメモリーを含んでもよい。メモリー３４０６は、その他のタイプのメモリー、またはそれらの組合せを同様に含んでもよい。
【０８９４】
ユーザーは、コンピューター・モニターなどの画面表示装置３４１８によって、コンピューター３４００と相互作用することができ、画面表示装置は、例示的な実施形態に従って設置され得る１つまたは複数のグラフィカル・ユーザー・インターフェイス３４２２を表示することができる。コンピューター３４００は、ユーザーからの入力を受信するための他のＩ／Ｏデバイス、例えば、キーボードもしくは任意の好適なマルチタッチインターフェース３４０８、ポインティング装置３４１０（例えば、マウス）、マイクロフォン３４２８、および／または画像取り込み装置３４３２（例えば、カメラもしくはスキャナー）を含んでもよい。マルチタッチインターフェース３４０８（例えば、キーボード、ピンパッド、スキャナー、タッチスクリーンなど）およびポインティング装置３４１０（例えば、マウス、スタイラスペンなど）は、画面表示装置３４１８に接続してもよい。コンピューター３４００は、他の好適な通常のＩ／Ｏ周辺機器を含んでもよい。
【０８９５】
コンピューター３４００は、コンピューター可読およびコンピューター実行可能命令および／または本明細書に記載のｇＲＮＡ同定システム２４００の例示的な実施形態をインプリメントするためのソフトウェアを保存するために、ハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、またはその他のコンピューター可読媒体などの１つまたは複数の記憶装置３４２４も含み得る。例示的な記憶装置３４２４は、例示的な実施形態をインプリメントするのに必要な任意の好適な情報を保存するための１つまたは複数のデータベースをさらに含んでもよい。例えば、例示的な記憶装置３４２４は、システム２４００およびデータベーススキーマ２７００、２７００’によって使用される情報、例えば、対立遺伝子配列、ｇＲＮＡ配列、ハプロタイプ、系統情報、ｍｉＨＡｇ情報、ＭＨＣ情報オフターゲットスコア、および／またはその他の情報を保存するための１つまたは複数のデータベース３４２６を保存することができる。データベースは、任意の好適な時点で手動もしくは自動的に更新されて、データベース内の１つまたは複数のアイテムを追加、削除、および／または更新し得る。
【０８９６】
コンピューター３４００は、１つまたは複数のネットワーク装置３４２０を介して、１つまたは複数のネットワーク、例えば、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）、ワイド・エリア・ネットワーク（ＷＡＮ）またはインターネットとインターフェース接続するように設計されたネットワークインターフェース３４１２を含むことができ、これは、多様な接続、限定はしないが、標準電話回線、ＬＡＮもしくはＷＡＮリンク（例えば、８０２．１１、Ｔ１、Ｔ３、５６ｋｂ、Ｘ．２５）、ブロードバンド接続（例えば、ＩＳＤＮ、フレーム・リレー、ＡＴＭ）、無線接続、コントローラー・エリア・ネットワーク（ＣＡＮ）、またはこれらのいずれかもしくは全部の組合せを通して行われる。例示的な実施形態では、コンピューター３４００は、コンピューター３４００とネットワーク間の無線連絡（例えば、ネットワークインターフェースを介した）を促進するために、１つまたは複数のアンテナ３４３０を含むことができる。ネットワークインターフェース３４１２は、搭載型ネットワークアダプター、ネットワークインターフェースカード、ＰＣＭＣＩＡネットワークカード、カードバスネットワークアダプター、無線ネットワークアダプター、ＵＳＢネットワークアダプター、モデムまたは、コミュニケーション可能で、かつ本明細書に記載の操作を実施することができる任意のタイプのネットワークにコンピューター３４００をインターフェース接続するのに好適ないずれか他の装置を含んでもよい。さらに、コンピューター３４００は、例えば、ワークステーション、デスクトップコンピューター、サーバー、ラップトップ、携帯型コンピューター、タブレットコンピューター（例えば、ｉＰａｄ（登録商標）タブレットコンピューター）、モバイルコンピューターもしくはコミュニケーション・デバイス（例えば、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）コミュニケーション・デバイス）、ＰＯＳ端末装置、企業内デバイス、またはコミュニケーション可能で、かつ本明細書に記載の操作を実施する上で十分なプロセッサー能力およびメモリー容量を有するその他の形態のコンピューターもしくは電気通信デバイスなど、あらゆるコンピューターシステムであってよい。
【０８９７】
コンピューター３４００は、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）操作システム、Ｕｎｉｘ（登録商標）およびＬｉｎｕｘ（登録商標）操作システムの様々なリリース、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューター用ＭａｃＯＳ（登録商標）のあらゆるバージョン、あらゆる組み込み操作システム、あらゆるリアルタイム操作システム、あらゆるオープンソース操作システム、あらゆる専有操作システム、または本明細書に記載のコンピューターで実行することができ、かつ本明細書に記載の操作を実施することができる任意の他の操作システムなど、あらゆる操作システム３４１６を実行し得る。例示的な実施形態では、操作システム３４１６は、ネイティブモードまたはエミュレートモードで実行し得る。例示的実施形態では、操作システム３４１６は、１つまたは複数のクラウドマシンインスタンスで実行し得る。
【０８９８】
以下の説明は、当業者が、対立遺伝子に対するｇＲＮＡを同定するコンピューターシステム構成ならびに関連方法および製品を作製し、使用することを可能にするために呈示される。本明細書に記載されるデータベーススキーマは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子と共に使用するｇＲＮＡを同定するために例示されるが、当業者には、本明細書に記載されるデータベーススキーマおよびｇＲＮＡ同定方法を用いて、他のヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥＮ、Ｃｐｆ１、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ）と共に使用することができる配列を同定し、選択し得ることは容易に明らかであろう。これらの実施形態例に対する様々な変更が当業者には容易に明らかとなり、本明細書で定義される一般的原理は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、他の実施形態および用途に適用することができる。さらに、以下の説明において、説明の目的で多くの具体的事項が記載される。しかし、当業者であれば、本発明が、こうした具体的事項を使用しなくても実施され得ることは理解されよう。他の事例では、不必要な細部によって本発明の説明を不明瞭にしないために、公知の構造およびプロセスはブロック図で示される。従って、本開示は、示される実施形態に限定するのではなく、本明細書に開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲と一致させることが意図される。
【０８９９】
例示的実施形態の説明に際して、明瞭化のために特定の技術用語が使用される。説明を目的として、具体的用語は各々、類似の目的を達成するために類似の様式で作動するあらゆる技術的および機能的同等物を少なくとも含むことが意図される。さらに、特定の例示的実施形態が、複数のシステム要素を含むいくつかの事例では、デバイス構成要素または方法ステップ、それらの要素、構成要素もしくはステップは、単一の要素、構成要素もしくはステップに代えることも可能である。同様に、単一の要素、構成要素もしくはステップを、同じ目的を果たす複数の要素、構成要素もしくはステップに代えることもできる。さらに、例示的実施形態は、それらの特定の実施形態を参照にして図示および説明してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、形態および細部に様々な代用および改変を加えられることは理解されよう。さらにまた、他の実施形態、機能および利点も本発明の範囲内である。
【０９００】
説明の目的で例示的なフローチャートが提供され、これらは、方法の非限定的な例である。当業者であれば、例示的な方法が、例示的なフローチャートに示されるものより多いもしくは少ないステップを含み得ること、ならびに例示的なフローチャート中のステップは、例示的フローチャートに示される順序とは異なる順序で実施され得ることを認識されよう。
【実施例】
【０９０１】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
【０９０２】
実施例１：ｇＲＮＡのクローニングおよび最初のスクリーニング
候補ｇＲＮＡの適合性は、本実施例に記載されるように評価され得る。キメラｇＲＮＡについて記載されるが、アプローチはまた、モジュラーｇＲＮＡを評価するのにも使用され得る。
【０９０３】
ベクターにｇＲＮＡをクローニングする
各ｇＲＮＡ毎に、１対の重複オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラｇＲＮＡの上流Ｕ６プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のＤＮＡを生成するために準備される。交互の（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ）プロモーターを使用して、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。
【０９０４】
直鎖ｄｓＤＮＡ分子中でｇＲＮＡをクローニングする（ＳＴＩＴＣＨＲ）
各ｇＲＮＡ毎に、単一オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。Ｕ６プロモーターおよびｇＲＮＡスキャフォールド（例えば、第１の相補的ドメイン；連結ドメイン；第２の相補的ドメイン；隣接ドメイン；およびテールドメインをはじめとする、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに由来する配列をはじめとする、標的化ドメイン以外の全てを含む）は、別々にＰＣＲ増幅されて、ｄｓＤＮＡ分子として精製される。ｇＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化された標的化ドメインによって連結する、Ｕ６およびｇＲＮＡスキャフォールドを縫い合わせる。結果として生じるｄｓＤＮＡ分子（ＳＴＩＴＣＨＲ生成物）は、形質移入のために精製される。交互の（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ）プロモーターを使用して、生体内転写（例えば、Ｈ１プロモーター）または生体外転写（例えば、Ｔ７プロモーター）が駆動されてもよい。任意のｇＲＮＡスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するＣａｓ９と適合性のｇＲＮＡが生成されてもよい。
【０９０５】
最初のｇＲＮＡスクリーニング
試験される各ｇＲＮＡは、プラスミド発現Ｃａｓ９および小量のＧＦＰ発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、９３Ｔ、Ｋ５６２またはＵ２ＯＳなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的（例えば、赤血球系細胞）に関連があってもよい。可能な治療標的細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内在性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子標的化比率に関する重要な情報を提供してもよい。
【０９０６】
形質移入は、（リポフェクタミンまたはＦｕｇｅｎｅなどの）脂質移入を使用して、または（ロンザヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（商標）などの）電気穿孔によって実施されてもよい。形質移入に続いて、ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーのどちらかによって判定され、一貫した高レベルの形質移入が確認され得る。これらの予備形質移入は、異なるｇＲＮＡおよび異なる標的化アプローチ（１７量体、２０量体、ヌクレアーゼ、二重ニッカーゼなど）を含み、いずれのｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ組み合わせが最大活性を与えるかが判定され得る。
【０９０７】
各ｇＲＮＡの切断効率は、Ｔ７Ｅ１タイプアッセイまたは配列決定によって、標的遺伝子座におけるＮＨＥＪ誘導インデル形成を測定することで、評価されてもよい。代案としては、ＣｅｌＩ／Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼなどのその他のミスマッチ感受性酵素もまた使用されてもよい。
【０９０８】
Ｔ７Ｅ１アッセイでは、ＰＣＲアンプリコンは、およそ５００〜７００ｂｐであり、意図される切断部位は、アンプリコン中に非対称的に配置される。ＰＣＲ産物の増幅、精製、およびサイズ検証に続いて、９５℃に加熱して、次に、緩慢に冷却することで、ＤＮＡは変性され再ハイブリダイズされる。ハイブリダイズＰＣＲ産物は、次に、非完全にマッチするＤＮＡを認識して切断する、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（またはその他のミスマッチ感受性酵素）で消化される。最初のテンプレートＤＮＡ中にインデルが存在する場合、アンプリコンは変性されて再アニールされ、それは異なるインデルを有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションをもたらし、ひいては完全にはマッチしない二本鎖ＤＮＡをもたらす。消化産物は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動法によって視覚化されてもよい。切断されたＤＮＡの割合（切断および比切断密度で除した分解産物密度）を使用して、次の方程式を使用して、パーセントＮＨＥＪが推定されてもよい：％ＮＨＥＪ＝（１−（１−切断割合）１／２）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２〜５％ＮＨＥＪに至るまで感受性である。
【０９０９】
Ｔ７Ｅ１アッセイの代わりに、またはそれに加えて、配列決定が使用されてもよい。サンガー配列決定では、精製ＰＣＲアンプリコンがプラスミド骨格にクローン化され、形質転換されて、単一プライマーでミニプレップされて配列決定される。Ｔ７Ｅ１によってＮＨＥＪ比率を判定した後に、サンガー配列決定を使用して、インデルの正確な性質が判定されてもよい。
【０９１０】
配列決定はまた、次世代配列決定技術を使用して実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは３００〜５００ｂｐであってもよく、意図される切断部位は非対称的に配置される。ＰＣＲに続いて、例えば、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上の）ハイスループット配列決定で使用される次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびインデクス）が、アンプリコンの末端に付加されてもよい。この方法は、非常に低いＮＨＥＪ比率の検出を可能にする。
【０９１１】
実施例２：ＮＨＥＪによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
【０９１２】
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、ゲノムＤＮＡが形質移入細胞の混合集団から単離されてもよく、ＰＣＲを使用して標的領域が増幅されてもよい。ＰＣＲに続いて、所望の変異体（標的遺伝子のノックアウトまたは標的配列モチーフの除去のどちらか）を生成する遺伝子標的化効率が、配列決定によって判定されてもよい。サンガー配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、５００〜７００ｂｐ長であってもよい。次世代配列決定では、ＰＣＲアンプリコンは、３００〜５００ｂｐ長であってもよい。遺伝子機能のノックアウトが目的である場合、配列決定を使用して、遺伝子機能を破壊することが予期されるフレームシフトまたは大規模な欠失または挿入をもたらすＮＨＥＪ誘導インデルを、対立遺伝子の何パーセントが受けたかが評価されてもよい。特定の配列モチーフの除去が目的であれば、配列決定を使用して、この配列に広がる対立遺伝子の何パーセントが、ＮＨＥＪ誘導欠失を受けたかが評価されてもよい。
【０９１３】
実施例３：ＨＤＲによる遺伝子標的化の評価
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのＮＨＥＪを誘導するｇＲＮＡを選択することができる。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
【０９１４】
形質移入に続いて（通常は形質移入の２〜３日後）、形質移入細胞の混合集団からゲノムＤＮＡを単離してもよく、ＰＣＲを使用して標的領域を増幅してもよい。ＰＣＲに続いて、遺伝子標的化効率を、いくつかの方法によって判定することができる。
【０９１５】
遺伝子標的化の頻度の決定は、細胞外から提供された供与体テンプレートまたは内在性ゲノム供与体配列を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）を受け、したがって、所望の修正を組み込んでいる対立遺伝子のパーセンテージを測定することを含む。所望のＨＤＲ事象が、制限酵素部位を生成または破壊する場合、遺伝子標的化の頻度は、ＲＦＬＰアッセイにより決定してもよい。制限部位が生成または破壊されない場合、配列決定を用いて、遺伝子標的化頻度を決定することもできる。ＲＦＬＰアッセイを使用する場合、やはり配列決定を用いて、所望のＨＤＲ事象を確認し、他の変異が存在しないことを確実にすることも可能である。細胞外から提供される供与体テンプレートを使用する場合、プライマーの少なくとも１つを相同性アームに含まれる領域外側の内在性遺伝子配列内に配置し、これによって、細胞中にまだ存在する供与体テンプレートの増幅を防止する。したがって、供与体テンプレート内に存在する相同性アームの長さは、ＰＣＲアンプリコンの長さに作用し得る。ＰＣＲアンプリコンは、供与体領域全体（相同性アームの外側に位置する双方のプライマー）に広がるか、またはこれらのアンプリコンは、供与体領域の一部のみと、供与体および内在性ＤＮＡ同士の単一結合とに広がる（１つの内部プライマーと１つの外部プライマー）。アンプリコンの広がりが、ドナー全体に満たない場合、２つの異なるＰＣＲを用いて、５’および３’結合の双方を増幅し、配列決定すべきである。
【０９１６】
ＰＣＲアンプリコンが短い（６００ｂｐ未満）場合、次世代配列決定を使用することが可能である。ＰＣＲの後、次世代配列決定アダプターおよびバーコード（例えば、Ｉｌｕｕｍｉｎａマルチプレックスアダプターおよびインデックス）を、例えば、ハイスループット配列決定（例えば、Ｉｌｕｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上の）に使用するために、アンプリコンの末端に付加してもよい。この方法は、非常に低い遺伝子標的化率の検出を可能にする。
【０９１７】
ＰＣＲアンプリコンが次世代配列決定には長すぎる場合、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定を実施することができる。サンガー配列決定のためには、精製されたＰＣＲアンプリコンをプラスミド骨格にクローニングし（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングされたＴＯＰＯ）、形質転換し、ミニプレップした後、配列決定する。
【０９１８】
前述した同じまたは類似のアッセイを用いて、内在性ゲノム供与体配列によるＨＤＲを受け、従って、所望の修正を組み込んでいる対立遺伝子のパーセンテージを測定することができる。
【０９１９】
実施例４：ＣＣＲ５遺伝子座に標的化されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の試験
野生型ＣＣＲ５遺伝子産物の発現を阻止するように遺伝子修飾されたオートロガスＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、通常、ＨＩＶ感染を受けやすいＨＩＶウイルスＨＳＰＣ子孫（例えば、マクロファージおよびＣＤ４Ｔリンパ球）の侵入を阻止する。臨床的に、ＣＣＲ５ケモカイン受容体のコード配列に遺伝子変異を含むＨＳＰＣの移植は、ＨＩＶ感染を長期間制御することが証明されている（Ｈｕｅｔｔｅｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９；３６０（７）：６９２−６９８）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームを用いたゲノム編集は、例えば、編集された遺伝子座での遺伝子発現の阻害をもたらし得る標的化切断部位にインデルを生成することによって、内在性遺伝子標的を正確に改変する。この実施例では、セクションＩＩ（ｇＲＮＡをデザインする方法）に記載される基準に基づいて選択された１１のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ｇＲＮＡ（表２３）を用いた遺伝子編集。
【０９２０】
ヒト２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡと、Ｕ６プロモーターから標的細胞において転写される別のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドで形質移入した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、製造者の指示に従って）。形質移入に対して４８および７２時間の時点でゲノムＤＮＡを単離し、ＣＣＲ５遺伝子座ＰＣＲをｇＤＮＡで実施した後、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイによりインデルを分析した。表示する数値は、２つの反復測定値の平均値＋／−ｓ．ｄ．である（図８）。ＣＣＲ５遺伝子座のインデルを検出するために、形質移入からのゲノムＤＮＡサンプルから増幅したＣＣＲ５遺伝子座特異的ＰＣＲ産物についてＴ７Ｅ１アッセイを実施した後、ＣＣＲ５遺伝子座で検出されたインデルのパーセンテージを計算した。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＲ５ｇＲＮＡおよびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９プラスミドＤＮＡと接触させた細胞において、最大４０％のインデルが検出された。
【０９２１】
【表６３】
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【０９２２】
実施例５：５’キャップおよび３’ポリＡテールの付加によるｇＲＮＡの修飾は、標的ゲノム遺伝子座でのゲノム編集を増加すると共に、ＣＤ３４＋細胞生存能力および生存期間を改善する
ウイルス−宿主共進化の間に、ｍＲＮＡのキャッピングを模倣するウイルスＲＮＡキャッピングは進化して、ウイルスＲＮＡが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした（Ｄｅｌｃｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５１−６５）。造血幹／前駆細胞中のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖ＲＮＡの存在を感知する（Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，２０１５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２６：２０１−２０９）。初期実験の結果から、ＧＦＰｍＲＮＡ単独を用いて電気穿孔された細胞と比較して、非修飾標的特異的ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡを用いて電気穿孔されたヒト造血幹／前駆細胞は、細胞寿命、増殖能、複能性の低減（例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化）を招くことが立証された。この課題に取り組むために、細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の標的細胞感知および自然免疫応答の誘導、さらにはこれに続くプログラム細胞死の誘導ならびに増殖能および分化能の喪失に起因すると仮定された。
【０９２３】
造血／幹前駆細胞におけるゲノム編集の最適化のために、ならびにこの仮定を検証する目的で、動員末梢血および骨髄由来のヒトＣＤ３４＋細胞を、５’キャップおよび３’ポリＡテールの付加と共に、または付加なしで、インビトロ転写されたＨＢＢ（ＨＢＢ−８ｇＲＮＡ；配列番号２１７）またはＡＡＶＳ１（ｇＲＮＡ  ＡＡＶＳ１−１；配列番号２１８）標的化ｇＲＮＡと共送達されるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡで（Ｍａｘｃｙｔｅ装置を用いて）電気穿孔した。
【０９２４】
図９〜１１に示すように、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡの電気穿孔は、ヒトＣＤ３４＋細胞寿命および生存能力を高めた。ＣＤ３４＋細胞は、それぞれＣａｓ９ｍＲＮＡ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｓａ）Ｃａｓ９）と組み合わせた表示のキャップ／テールなしｇＲＮＡまたはキャップ／テール付加ｇＲＮＡで電気穿孔した。対照サンプルは、ＧＦＰｍＲＮＡ単独で電気穿孔された細胞または電気穿孔されていないが、表示の時間枠で培養した細胞を含む。
【０９２５】
単一のキャップおよびテールなしＨＢＢまたはＡＡＶＳ１ｇＲＮＡとそれぞれ組み合わせたＣａｓ９で電気穿孔したヒトＣＤ３４＋細胞は、５’キャップおよび３’ポリＡテールを含むようにインビトロで転写された同じｇＲＮＡ配列で電気穿孔した細胞と比較して、培養中の３日にわたって低い増殖能を示した（図９）。Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒に送達された他のキャップおよびテール付加ｇＲＮＡ（ＨＢＢ（ＨＢＢ−８ｇＲＮＡ；配列番号２１７）、ＡＡＶＳ１（ＡＡＶＳ１−１ｇＲＮＡ；配列番号２１８）、ＣＸＣＲ４（ＣＸＣＲ４−２３１ｇＲＮＡ；配列番号２１４）およびＣＣＲ５（ＣＣＲ−Ｕ４３ｇＲＮＡ；配列番号２１６）遺伝子座）に標的化されている）は、送達後３日にわたる生存ＣＤ３４＋細胞の総数の倍率増加の比較によって決定される通り、ＨＳＰＣ生存能力、増殖、または複能性にマイナスに影響を及ぼさなかった。重要なことには、ＧＦＰｍＲＮＡと接触させた細胞または非処理の細胞と比較して、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡと接触させたＣＤ３４＋細胞の増殖能に差はなかった。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡとの接触後７２時間時点での細胞生存能力の分析（７−アミノアクチノマイシンＤまたはヨウ化プロピジウムのいずれかとアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ抗体の同時染色、それに続くフローサイトメトリー分析による）から、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡと接触した細胞は、培養中に拡大して、生存能力を維持したが、キャップおよびテールなしｇＲＮＡと接触させたＨＳＣは、生存細胞数に減少を示すことが判明した（図１０）。また、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡと接触した生存細胞（ヨウ化プロピジウム陰性）は、ＣＤ３４細胞表面マーカーの発現も維持した（図１１）。
【０９２６】
図１２、１３、１４Ａ〜１４Ｂ、１５Ａおよび１５Ｂに示すように、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびキャップおよびテール付加ｇＲＮＡの電気穿孔は、ヒトＣＤ３４＋細胞における効率的な編集およびそれらの子孫を支持した。
【０９２７】
改善された生存期間に加えて、キャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡと接触した標的細胞は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびキャップ／テールなしｇＲＮＡと接触した細胞と比較して、より高いオンターゲットゲノム編集率（％インデル）も示した（図１２）。さらに、キャップ／テール付加ｇＲＮＡを含むＣａｓ９ｍＲＮＡと接触したＣＤ３４＋細胞の子孫の方が、キャップ／テールなしｇＲＮＡを含むＣａｓ９ｍＲＮＡと接触したＣＤ３４＋細胞の子孫と比較して、より高いレベルの標的化編集が検出された（図１２、ＣＦＣ）。キャップ／テールなしｇＲＮＡの送達は、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイで決定される通り、ＣＤ３４＋細胞の生体外造血能も低下した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒に、キャップおよびテールなしｇＲＮＡと接触した細胞は、総コロニー形成能（例えば、力価）の喪失およびコロニーサブタイプの多様性の減少（例えば、赤血球および前駆細胞能の喪失ならびに子孫における骨髄マクロファージ表現型への歪み）を示した（図１３）。対照的に、キャップおよびテール付加ｇＲＮＡと接触した細胞は、ＣＤ３４＋細胞から分化したコロニーの総数およびコロニー多様性（混合造血コロニー［ＧＥＭＭ］および赤血球コロニー［Ｅ］の検出）の双方に関してＣＦＣ能力を維持した。
【０９２８】
次に、キャップおよびテール付加ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡをいずれかのＣａｓ９ｍＲＮＡと共送達するか、またはＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）と複合体化した後、ＨＳＰＣの特定の特徴を模倣することが明らかにされた赤白血病細胞株であるＫ５６２細胞に電気穿孔した。キャップおよびテール付加ｇＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡまたはＲＮＰを共送達すると、ＨＢＢ遺伝子座ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１アッセイ分析によって決定される通り、ＨＢＢ遺伝子座で高レベルのゲノム編集がもたらされた（図１４Ａ）。次に、３つの異なるキャップおよびテール付加ｇＲＮＡ（ＨＢＢ、ＡＡＶＳ１、およびＣＸＣＲ４遺伝子座を標的化する）をＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒に、臍帯血（ＣＢ）から単離されたＣＤ３４＋細胞に共送達した。この場合、様々な量のｇＲＮＡ（２もしくは１０μｇのｇＲＮＡおよび１０μｇのＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）を細胞中に電気穿孔し、遺伝子座ＰＣＲ産物のＴ７Ｅ１アッセイ分析により標的遺伝子座でのゲノム編集のパーセンテージを評価した。対照的に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒にキャップおよびテールなしＨＢＢ  ｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞からのゲノムＤＮＡにはＨＢＢ遺伝子座に切断が検出されなかった。この結果は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡとキャップおよびテール付加ｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、増殖能およびコロニー形成能を維持することを示した。５〜２０％のインデルが標的遺伝子座で検出され、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加ｇＲＮＡの量は、標的化編集のパーセンテージに影響しなかった（図１４Ｂ）。Ｔ７Ｅ１アッセイを実施した後の表示の遺伝子座特異的ＰＣＲ産物の代表的なゲル画像は、電気穿孔（Ｍａｘｃｙｔｅ装置）によりＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加遺伝子座特異的ｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ１、ＨＢＢ、およびＣＸＣＲ４ｇＲＮＡ）の送達から７２時間後のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の標的化遺伝子座に切断を示している（図１５Ａ）。重要なことには、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡと接触しなかった細胞（すなわち、非処理対照）と比較して、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡ、ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡ、もしくはＣＸＣＲ４特異的ｇＲＮＡで電気穿孔された細胞の生存能力に差はなかった。フローサイトメトリー分析により決定される通り、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶについてのネガティブ染色法によって生存細胞が示される（フローサイトメトリープロットの左下部、図１５Ｂ）。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共送達されたキャップおよびテール付加ＡＡＶＳ１特異的ｇＲＮＡ、ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡ、またはＣＸＣＲ４特異的ｇＲＮＡで電気穿孔されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、ＣＦＣアッセイにより決定される通り、生体外造血コロニー形成能を維持した。ＨＢＢ特異的ｇＲＮＡおよびＣａｓ９と接触した細胞についてのＣＦＣアッセイにおける生体外造血能のグラフを図１４Ｃに示す。
【０９２９】
実施例６：ドナー細胞中の単一ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子を破壊するためのＣａｓ９／ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対立遺伝子によるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の置換
この実施例では、アフリカ系アメリカ人レシピエント対象がＨＳＣＴを必要とする。レシピエントのＨＬＡタイピングを従来の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定）により行った後、骨髄および臍帯血ドナー登録簿で利用可能なドナー遺伝子型と比較する。完全にマッチするドナーは、全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）登録簿、全米臍帯血バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ）登録簿、またはその他の幹細胞もしくは臍帯血バンク登録簿でも見出すことができない。しかし、部分的にマッチする臍帯血ヨーロッパ系アメリカ人（白色人種）ドナーが同定されており、その場合、アロ−ＵＣＴの要件を満たす臍帯血（ＣＢ）マッチングのために、遺伝子座の６対立遺伝子の５つが要求される（すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）（図１６Ａ〜１６Ｂ）。ドナー候補とレシピエント間のマッチングのレベルを高める目的で、Ａ＊０２：０１：０１対立遺伝子に特異的なＣａｓ９および１つまたは複数のｇＲＮＡを、その特定の対立遺伝子の標的化破壊（片アレル遺伝子編集）のために、ドナー臍帯血ＨＳＰＣに送達する。１つまたは複数の恐らく修飾された（例えば、キャップ／テール付加）ｇＲＮＡを、破壊しようとする特定のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のために作製された上位階層ｇＲＮＡから選択する（表２４）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで対立遺伝子を破壊した後、Ｔ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列解析によって、対立遺伝子の破壊を確認する。ＨＬＡ−Ａｌｏ、例えば、ＨＬＡ−Ａ＋／−、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１陰性細胞（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１片アレル破壊が成功している細胞）を選別により精製する。ミスマッチレシピエントＨＬＡ−Ａ対立遺伝子（例えば、Ａ＊０１：０１：０１：０１）ＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡ、図１７Ａ〜１７Ｂ）を作製し、レンチウイルスベクターにクローン化する。レシピエント細胞におけるこの対立遺伝子を調節する内在性プロモーター配列を配列決定し、さらに、Ａ＊０１：０１：０１：０１ｃＤＮＡ配列上流のレンチウイルスベクターにクローン化する。次に、このＨＬＡ−Ａトランスジーン発現カセット（例えば、マッチＨＬＡ対立遺伝子を調節するＨＬＡプロモーター）をレンチウイルスベクター粒子にパッケージする。選別されたドナーＨＬＡ−Ａｌｏ、例えば、ＨＬＡ−Ａ＋／−、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１陰性細胞をレンチウイルスベクター粒子と接触させて、細胞中にＡ＊０１：０１：０１：０１トランスジーン発現カセットを遺伝子移入する。次に、形質導入された細胞を、細胞表面上のＨＬＡ−Ａの発現増大（形質導入されていないＨＬＡ−Ａｌｏ細胞と比較して）に基づいて選別する。ＨＬＡ−Ａ片アレル遺伝子置換の後、ＨＬＡ修飾臍帯血ドナーＨＳＰＣは、６ＨＬＡ遺伝子座の６つがレシピエント対象とマッチする。マッチするドナー臍帯血ＨＳＰＣを従来の臍帯血移植片臨床プロトコルに従って、レシピエント対象に移植する。
【０９３０】
【表６４】
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【０９３１】
実施例７：ドナー細胞中のＨＬＡ−Ａ遺伝子の両アレル破壊のためのＣａｓ９／ｇＲＮＡの標的化と、レシピエント対象の同一ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子による２つのドナーミスマッチＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の置換
この実施例では、ヒスパニック系（ラテンアメリカ人）レシピエント対象がＨＳＣＴを必要とする。レシピエントのＨＬＡタイピングを従来の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定）により行った後、骨髄および臍帯血ドナー登録簿で利用可能なドナー遺伝子型と比較する。完全にマッチするドナーは、全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）登録簿、全米臍帯血バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ）登録簿、またはその他の幹細胞もしくは臍帯血バンク登録簿でも見出すことができない。しかし、部分的にマッチする臍帯血ヨーロッパ系アメリカ人（白色人種）ドナーが同定されており、その場合、アロ−ＵＣＴの要件を満たす臍帯血（ＣＢ）マッチングのために、遺伝子座の６対立遺伝子の４つが要求される（すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）（図１８Ａ〜１８Ｂ）。ドナー候補とレシピエント間のマッチングのレベルを高める目的で、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を標的化する（例えば、ドナー細胞中の両方のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子に共通の配列を標的化する）Ｃａｓ９および１つまたは複数のｇＲＮＡを、その遺伝子の標的化破壊（両アレル遺伝子編集）のために、ドナー臍帯血ＨＳＰＣに送達する。１つまたは複数のｇＲＮＡ（恐らく修飾されたｇＲＮＡ、例えば、キャップ／テール付加）を、遺伝子座で破壊しようとするＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のために作製された上位階層ｇＲＮＡから選択する（表２５）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによる遺伝子座の両アレル破壊後、Ｔ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列解析によって、対立遺伝子の破壊を確認する。ＨＬＡ−Ａ−／−、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１およびＡ＊２９：０２：０１：０１陰性細胞（例えば、両アレル破壊が成功している細胞）を選別により精製する。初めドナー細胞中に存在しなかったレシピエント対象同一ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のＤＮＡ配列）（例えば、ｃＤＮＡ）（例えば、Ａ＊０１：０１：０１：０１およびＡ＊２３：０１：０１を作製し、レンチウイルスベクターにクローン化する。レシピエント対象細胞中のこれらの対立遺伝子を調節する内在性プロモーター配列を配列決定し、さらに、Ａ＊０１：０１：０１：０１およびＡ＊２３：０１：０１ｃＤＮＡ配列上流の１つまたは複数のレンチウイルスベクターに、対立遺伝子を調節する各々のプロモーター（対象細胞中のプロモーター／対立遺伝子組合せに対応する）を用いて、クローン化する。このＨＬＡ−Ａトランスジーン発現カセットをレンチウイルスベクター粒子にパッケージする。選別されたドナーＨＬＡ−Ａ−／−、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１およびＡ＊２９：０２：０１：０１陰性細胞（例えば、両アレル破壊が成功している細胞）をレンチウイルスベクター粒子と接触させて、レシピエント細胞中にＡ＊０１：０１：０１：０１およびＡ＊２３：０１：０１トランスジーン発現カセットの両方を遺伝子移入する。次に、形質導入された細胞を、細胞表面上のＨＬＡ−Ａの発現増大（形質導入されていないＨＬＡ−Ａ−／−細胞と比較して）に基づいて選別する。ＨＬＡ−Ａ両アレル遺伝子置換の後、ＨＬＡ修飾臍帯血ドナーＨＳＰＣは、６ＨＬＡ遺伝子座の６つがレシピエント対象とマッチする。マッチしたドナー臍帯血ＨＳＰＣを従来の臍帯血移植片臨床プロトコルに従って、レシピエント対象に移植する。
【０９３２】
【表６５】
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【０９３３】
実施例８：ミスマッチＨＬＡハプロタイプの破壊による多重ゲノム編集のためのＣａｓ９およびｇＲＮＡの標的化と、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１のそれぞれ１コピーの遺伝子置換
この実施例では、ヒスパニック系（ラテンアメリカ人）レシピエント対象がＨＳＣＴを必要とする。レシピエントのＨＬＡタイピングを従来の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定）により行った後、骨髄および臍帯血ドナー登録簿で利用可能なドナー遺伝子型と比較する。完全にマッチするドナーは、全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）登録簿、全米臍帯血バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ）登録簿、またはその他の幹細胞もしくは臍帯血バンク登録簿でも見出すことができない。しかし、ハプロタイプ同一の臍帯血ヨーロッパ系アメリカ人（白色人種）ドナーが同定されており、その場合、アロ−ＵＣＴの要件を満たす臍帯血（ＣＢ）マッチングのために、遺伝子座（例えば、ハプロタイプ同一の）の６対立遺伝子の３つが要求される（すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）（図１８Ａ〜１８Ｂ）。ドナー候補とレシピエント間のマッチングのレベルを高める目的で、ドナーＨＳＰＣにおいてマッチしないハプロタイプ中の対立遺伝子（例えば、Ａ＊０２：０１：０１：０１、Ｂ＊０８：０１：０１、およびＤＲＢ１＊０３：０１：０１）を標的化する、Ｃａｓ９および複数のｇＲＮＡ（例えば、恐らく修飾されたｇＲＮＡ、例えば、キャップ／テール付加ｇＲＮＡ）を、複数の遺伝子座の標的化片アレル破壊（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の多重遺伝子編集）のために、ドナー臍帯血ＨＳＰＣに送達する。１つまたは複数の恐らく修飾されたｇＲＮＡ（例えば、キャップ／テール付加）を、上記の特定の遺伝子座で破壊しようとするＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１ドナー特異的対立遺伝子（レシピエントとマッチしない）のために作製された上位階層ｇＲＮＡから選択する（表２６）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによる遺伝子座の標的化片アレル破壊後、Ｔ７Ｅ１アッセイおよびＤＮＡ配列解析によって、対立遺伝子の破壊を確認する。ＨＬＡ−Ａ＋／−、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１陰性；ＨＬＡ−Ｂ＋／−、例えば、Ｂ＊０８：０１：０１陰性；およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＋／−、例えば、ＤＲＢ１＊０３：０１：０１：０１陰性細胞（例えば、３つの遺伝子座で片アレル破壊が成功している細胞）を選別により精製する。初めハプロタイプ同一ドナー細胞中に存在しなかったミスマッチレシピエント対象ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子（例えば、Ａ＊０３：０１：０１：０１、Ｂ＊０７：０２：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１：０１：０１）を配列決定してから、ＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡ）は、レシピエント細胞中のこれらの対立遺伝子に隣接するＤＮＡを配列決定することによって決定されたそれらの内在性プロモーター上流の１つまたは複数のレンチウイルスベクターにクローン化する。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−ＤＲＢ１トランスジーン発現カセットをレンチウイルスベクター粒子にパッケージする。選別されたドナーＨＬＡ−Ａ＋／−、ＨＬＡ−Ｂ＋／−、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＋／−細胞、例えば、（例えば、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲＢ１の多重片アレル破壊が成功している細胞）をレンチウイルスベクター粒子と接触させて、レシピエント細胞中にＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−ＤＲＢ１トランスジーン発現カセットを遺伝子移入する。次に、形質導入された細胞を、細胞表面上のＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−ＤＲＢ１の発現増大（形質導入されていないＨＬＡ−Ａ＋／−、ＨＬＡ−Ｂ＋／−、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＋／−細胞と比較して）に基づいて選別する。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−ＤＲＢ１遺伝子置換の後、ＨＬＡ修飾臍帯血ドナーＨＳＰＣは、６ＨＬＡ遺伝子座の６つがレシピエント対象とマッチする。マッチするドナー臍帯血ＨＳＰＣを従来の臍帯血移植片臨床プロトコルに従って、レシピエント対象に移植する。
【０９３４】
【表６６】
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【０９３５】
【表６７】
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【０９３６】
【表６８】
2018523977.tif 000090
【０９３７】
以下の実施例９〜１１では、ゲノムＤＮＡの増幅、続いてＤＮＡ配列に基づくタイピングおよび／または配列特異的プライマー／プローブにより、数人のドナーからのヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）をＨＬＡタイピングした（Ｋａｓｈｉ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。３人のＨＳＣドナー由来の一次ヒト細胞、臍帯血ＭＮＣを前述のようにＨＬＡタイピングした後、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子について４桁タイピング報告を作成した（表２７）。最も高い対立遺伝子マッチング数に基づいて、サンプルを、部分的にマッチするドナーとレシピエントとしてペア形成した。各々の推定ドナーとレシピエントのペアについて、ミスマッチ対立遺伝子を同定して、こうした遺伝子座の編集によって、ドナー候補とレシピエント間の対立遺伝子ミスマッチ数を減らすようにした。データベースを用いて、対立遺伝子特異的様式で標的化遺伝子座の編集に使用するために適切なｇＲＮＡを検索した。ＨＬＡタイピングの８つの数字のうち４つ（４分野のうちの２つ）は、表示される対立遺伝子のいずれのサブタイプであってもよい（例えば、ＨＬＡ−Ａ０２：０１は、ＨＬＡ−Ａ０２：０１：０１：０１であり得る）。標的対立遺伝子の全サブタイプのオンターゲット部位にマッチするｇＲＮＡについて、データベースを検索した。同定されたｇＲＮＡが、ドナー細胞中の他のＨＬＡ対立遺伝子のどのサブタイプ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）も標的化しないように、検索を調整した。データベースはまた、同定されたｇＲＮＡ各々に対するオンターゲット特異性を有する標的対立遺伝子のサブタイプの計数／パーセンテージも提供した。このプロセスでは、ユーザーが、同時に複数の対立遺伝子を表示する場合、データベースは、まず、全ての標的遺伝子座においてオンターゲット部位を有するｇＲＮＡを検索し、他の対立遺伝子にオンターゲット部位を有するｇＲＮＡは回避された。同定された適切なｇＲＮＡを取得した後、データベースはさらに、参照として使用される全てのドナー対立遺伝子のサブタイプの配列を提供する。前のステップで同定されたｇＲＮＡのオン／オフターゲット部位が、これらのドナー対立遺伝子サブタイプ配列に対して検索される。ｇＲＮＡ選択の最終ステップは、最初のステップからのデータ（標的対立遺伝子のサブタイプのより高い計数／パーセンテージ、除外対立遺伝子のより低いオフターゲット計数／パーセンテージ、全ゲノムの低いオフターゲット計数／パーセンテージ、など）に基づくｇＲＮＡ選択を含む。
【０９３８】
【表６９】
2018523977.tif 000091
【０９３９】
実施例９：一次ヒトＴ−リンパ球におけるミスマッチＨＬＡ−Ａ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２６：０１）の破壊によるゲノム編集のためのＣａｓ９およびｇＲＮＡの標的化
レシピエントに対して６対立遺伝子でのＨＬＡマッチングが不適レベル（３遺伝子座、３／６ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子）であるドナー候補とのマッチングのレベルを高めるために、本明細書に記載のデータベースを用い、Ｃａｓ９および特異的に同定されたｇＲＮＡを使用して、標的化対立遺伝子特異的遺伝子編集を実施した。その結果、ミスマッチドナー（表２７、患者１）からの細胞同士のＨＬＡマッチングのレベルが、遺伝子破壊（表２８）によって、レシピエント患者候補（表２７、患者２）への移入に好適となった（ＨＬＡミスマッチを２／６ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子に低減することにより）。
【０９４０】
【表７０】
2018523977.tif 000092
【０９４１】
患者１（ドナー）は、患者２（レシピエント）と、６タイプのＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１；表２８）のうちの３つでミスマッチであった。ＨＬＡ−Ａ２６：０１の標的化破壊は、ドナー候補（患者１）とレシピエント（患者２）同士のＨＬＡミスマッチを低減し得る。従って、ドナー中に存在する他のＨＬＡ対立遺伝子で予測される低いオフターゲット特異性と共に、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２６：０１に対して予測される高いオンターゲット特異性を有するｇＲＮＡをデータベースから同定し、選択した（表２９）。ｇＲＮＡをＰＣＲテンプレートからインビトロで転写した後、５’および３’末端修飾（例えば、５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールなどの修飾）を有するように改変したが、これらの修飾は、上記タイプの一次血球において高い遺伝子編集度を維持しながら、修飾ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）と複合体化したＣａｓ９タンパク質による処理後にＴリンパ球およびＨＳＣ生存能力を向上させることがこれまでに証明されている。
【０９４２】
ドナー細胞における対立遺伝子特異的遺伝子編集を評価するために、一次Ｔリンパ球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）を臍帯血（ＣＢ）単位から単離した後、表２９に挙げるｇＲＮＡをこれらの細胞中でスクリーニングした。手短には、修飾ＨＬＡ−Ａ２６：０１対立遺伝子特異的ｇＲＮＡをＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と事前に複合体化して、ドナーＴリンパ球に電気穿孔されたＲＮＰを取得した（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）。ＲＮＰ送達から３〜４日後の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を抽出ｇＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析を用いて、遺伝子編集を評価することによって、Ａ＊２６：０１の対立遺伝子特異的編集のために最も有効なｇＲＮＡを同定する（図１９Ａ〜１９Ｂ）。患者１からの一次ヒト造血細胞において、試験した他のｇＲＮＡと比較して、ＨＬＡ−Ａ２６：０１＿２ｇＲＮＡが最も高いレベルのオンターゲット活性を有した。要約すると、この実施例は、一次ヒト血球中のＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子標的化遺伝子破壊を示す。
【０９４３】
【表７１】
2018523977.tif 000093
【０９４４】
実施例１０：一次ヒトＴ−リンパ球におけるミスマッチＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ｂ  ５１：０１）の破壊による多重ゲノム編集のためのＣａｓ９およびｇＲＮＡの標的化
レシピエントに対して６対立遺伝子でのマッチングが不適レベル（３遺伝子座、４／６ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子）であるドナー候補とのマッチングのレベルを高めるために、本明細書に記載のデータベースを用い、Ｃａｓ９および特異的に同定されたｇＲＮＡを使用して、ミスマッチ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ  ５１：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２の多重遺伝子破壊（表３０）を実施した。その結果、ミスマッチドナー（表３０、患者３）からの細胞同士のＨＬＡマッチングのレベルが、レシピエント患者候補（表３０、患者２）への移入に好適となった（ＨＬＡミスマッチを２／６ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子に低減）。
【０９４５】
【表７２】
2018523977.tif 000094
【０９４６】
患者３（ドナー）は、患者２（レシピエント）と、６タイプのＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１；表３０）のうちの３つでミスマッチであった。ＨＬＡ−Ｂ  ５１：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２の標的化破壊は、ドナー候補（患者３）とレシピエント（患者２）間のＨＬＡミスマッチを低減し得る。従って、ドナー中に存在する他のＨＬＡ対立遺伝子で予測される低いオフターゲット特異性（表３０）と共に、対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ  ５１：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２に対して予測される高いオンターゲット特異性を有するｇＲＮＡをデータベースから同定し、選択した（表３１および３２）。ｇＲＮＡをＰＣＲテンプレートからインビトロで転写した後、５’および３’末端修飾（例えば、５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールなどの修飾）を有するように改変したが、これらの修飾は、高度の遺伝子編集を維持しながら、修飾ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）と複合体化したＣａｓ９タンパク質による処理後にＨＳＣ生存能力を向上させることがこれまでに証明されている。
【０９４７】
【表７３】
2018523977.tif 000095
【０９４８】
【表７４】
2018523977.tif 000096
【０９４９】
ドナー細胞における対立遺伝子特異的遺伝子編集を評価するために、一次Ｔリンパ球（ＣＤ４＋Ｔ細胞）をＣＢ単位から単離した後、表３１および表３２に列記するｇＲＮＡをこれらの細胞中でスクリーニングした。手短には、修飾ＨＬＡ−Ｂ  ５１：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２対立遺伝子特異的ｇＲＮＡ（表３１および３２）をＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と事前に複合体化して、ドナーＴリンパ球に電気穿孔されたＲＮＰを取得した（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）。ＲＮＰ送達から３〜４日後の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を抽出ｇＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析を用いて、遺伝子編集を評価することによって、Ｂ＊５１：０１の対立遺伝子特異的編集で最も有効なｇＲＮＡを同定した（図２０Ａ）。Ｃａｓ９ＲＮＰででされたＴ細胞が、編集後に高い生存能力（＞８０％）を示し、これらを培養して拡大した。遺伝子破壊の結果、細胞表面で低減したＨＬＡ−Ｂタンパク質発現（抗ヒトＨＬＡ−Ｂ−ＦＩＴＣ）を定量するために、編集細胞は、フローサイトメトリー分析によっても評価した（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼを用いて決定される高レベルの遺伝子破壊を支持したｇＲＮＡも、ＨＬＡ−Ｂの細胞表面発現の高いパーセンテージ減少または低下を示した。例えば、ＨＬＡ−Ｂ  ５１０１＿１ｇＲＮＡは、４３％遺伝子破壊と、ＨＬＡ−Ｂ発現の６７％のノックダウンを支持した。ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子特異的抗体およびＭＨＣクラスＩ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７共役抗ヒトＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ３１１４１６）で共染色した細胞は、２つの画分：ＨＬＡ−Ｂｌｏｗ／−およびＭＨＣクラスＩ＋である細胞と、ＨＬＡ−Ｂ＋／ＭＨＣクラスＩ＋である細胞にさらに分けることができた。ＭＨＣクラスＩ細胞表面の相対発現における２つの集団のこの相違は、１つのＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子特異的発現が欠如しているが、他の全てのクラスＩ細胞表面抗原は維持する細胞の精製集団を取得するためのＦＡＣＳまたは免疫磁気選別による単離を支持する。同じ細胞において、修飾（キャップおよびテール付加）ＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２標的化ｇＲＮＡをＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（ＲＮＰ）と複合体化し、細胞に電気穿孔して、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の対立遺伝子特異的遺伝子破壊を評価した。これらの細胞から抽出したｇＤＮＡのＴ７Ｅ１分析から、一次ヒトＴリンパ球においてＤＲＢ１  ０４：０２の実質的な対立遺伝子特異的破壊が明らかにされた（図２１）。要約すると、この実施例は、一次ヒト血球中の複数のＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子特異的ノックダウンを示す。
【０９５０】
実施例１１：一次ヒトＴ−リンパ球およびＨＳＣにおけるミスマッチＨＬＡ−Ａ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１）およびＨＬＡ−ＤＲＢ１（０４：０２）の破壊による多重ゲノム編集のためのＣａｓ９およびｇＲＮＡの標的化
レシピエントに対して６対立遺伝子でのＨＬＡマッチングが不適レベル（３遺伝子座、４／６ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子）のドナー候補とのマッチングのレベルを高めるために、本明細書に記載のデータベースを用い、Ｃａｓ９および特異的に同定されたｇＲＮＡを使用して、ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２のミスマッチ対立遺伝子の多重遺伝子破壊（表３３）を実施した。その結果、ミスマッチドナー（表３３、患者３）からの細胞同士のＨＬＡマッチングのレベルが、レシピエント患者候補（表３３、患者１）への移入に好適となった（ＨＬＡミスマッチを２／６ミスマッチＨＬＡ対立遺伝子に低減することにより）。
【０９５１】
【表７５】
2018523977.tif 000097
【０９５２】
患者３（ドナー）は、患者１（レシピエント）と、６タイプのＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１）のうちの４つでミスマッチであった。ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２の標的化破壊は、ＨＳＣドナー（患者３）とレシピエント（患者１）間のＨＬＡミスマッチを低減し得る。従って、ドナー中に存在する他のＨＬＡ対立遺伝子で予測される低いオフターゲット特異性と共に、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２に対して予測される高いオンターゲット特異性を有するｇＲＮＡをデータベースから同定し、選択した（表３４および３２）。ｇＲＮＡをＰＣＲテンプレートからインビトロで転写した後、５’および３’末端修飾（例えば、５’ＡＲＣＡキャップおよび３’ポリＡ［２０Ａ］テールなど）を有するように改変したが、これらの修飾は、高度の遺伝子編集を維持しながら、修飾ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）と複合体化したＣａｓ９タンパク質による処理後にＨＳＣ生存能力を向上させることがこれまでに証明されている。
【０９５３】
【表７６】
2018523977.tif 000098
【０９５４】
ドナー細胞における対立遺伝子特異的遺伝子編集を評価するために、一次Ｔリンパ球（ＣＤ４＋Ｔ細胞）をＣＢ単位から単離した後、表３４に挙げるｇＲＮＡをこれらの細胞中でスクリーニングした。手短には、修飾ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２対立遺伝子特異的ｇＲＮＡをＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と事前に複合体化して、ドナーＴリンパ球に電気穿孔されたＲＮＰを取得した（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）。ＲＮＰ送達から３〜４日後の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を抽出ｇＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ分析（図２２Ａ）、ならびにＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的抗体（ＦＩＴＣ共役および抗ヒトＨＬＡ−Ａ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ３４３３０３）を用いたフローサイトメトリー分析（図２２Ｂ）により、遺伝子編集を評価することによって、Ａ＊０２：０の対立遺伝子特異的編集で最も有効なｇＲＮＡを同定した。フローサイトメトリー分析から、生存ヒトＴ細胞の表面上のＨＬＡ−Ａ２タンパク質発現の最大９２％低減が明らかにされた（図２２Ｂ）。これは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を標的化するＡ＊０２：０１対立遺伝子標的化ｇＲＮＡが、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子に対して特異的であることを示している。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的抗体およびＭＨＣクラスＩ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７共役抗ヒトＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ３１１４１６）で共染色した細胞は、２つの画分：ＨＬＡ−Ａ２（対立遺伝子特異的遺伝子発現のノックダウン）およびＭＨＣクラスＩ＋である細胞と、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＨＣクラスＩ＋である細胞にさらに分けることができた。ＭＨＣクラスＩ細胞表面抗原の相対発現における２つの集団のこの相違は、１つのＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子特異的発現が欠如しているが、他の全てのクラスＩ細胞表面抗原は維持する細胞の精製集団を取得するためのＦＡＣＳまたは免疫磁気選別による単離を支持する（図２３）。ＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０４：０２対立遺伝子を標的化するＴリンパ球においてもオンターゲット対立遺伝子特異的編集を実施したところ、表２１Ｃに示す同じ結果が得られた。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子特異的抗体およびＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）で共染色した細胞は、２つの画分：ＨＬＡ−Ａ２−およびＭＨＣクラスＩ＋である細胞と、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＨＣクラスＩ＋である細胞にさらに分けることができた。ＭＨＣクラスＩ細胞表面の相対発現における２つの集団のこの相違は、１つのＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子特異的発現が欠如しているが、他の全てのクラスＩ細胞表面抗原は維持する細胞の精製集団を取得するためのＦＡＣＳまたは免疫磁気選別による単離を支持する。要約すると、この実施例は、一次ヒト血球中の複数のＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子特異的ノックダウンを示す。
【０９５５】
実施例１２：ＨＬＡ遺伝子型のマッチングを促進するためのＨＬＡ対立遺伝子のノックアウト
移植されたＨＬＡ遺伝子ミスマッチ同種異系細胞（例えば、ＨＳＣ）の拒絶の尤度を低減するために、移植を必要とするレシピエント対象を６つのＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１で各々２つずつの対立遺伝子）でＨＬＡタイピングする（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１多型を決定する）。理想的には、６／６ＨＬＡ対立遺伝子マッチは、移植後にＧＶＨＤを発生するリスクが低いことから、レシピエント遺伝子型は、同じ６／６ＨＬＡ対立遺伝子を有するドナーとマッチする。６／６ＨＬＡ対立遺伝子を有するドナーは利用可能ではない（例えば、骨髄もしくは臍帯血ＨＳＣドナー登録簿、または近縁の家族メンバーから）が、５／６、４／６、３／６もしくは２／６ＨＬＡ対立遺伝子マッチを有する部分的にマッチするドナーが利用可能である場合、本明細書に記載の方法を用いて、部分的マッチドナーとレシピエント間のミスマッチを低減することができる。必要に応じて、本明細書に記載される遺伝子編集方法を用いて単一対立遺伝子または複数の対立遺伝子（２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの対立遺伝子）を破壊して、移植レシピエントにおけるＧＶＨＤ発生のリスクおよび／または疾患の重症度を低減することができる。以下の実施例におけるドナーとレシピエント間のＨＬＡ遺伝子マッチングを記載する全ての事例において、分子はマッチ対立遺伝子の数を示し、分母は発現された対立遺伝子の数を示す。
【０９５６】
本明細書に記載される方法を用いて、ドナー血球（例えば、ＨＳＣとＴ細胞）を修飾して、免疫適合性血球を作製することができる。例えば、本方法を用いて、ドナーＨＳＣにおける１つ、２つもしくは３つのＨＬＡ対立遺伝子を破壊（例えば、ノックアウト）して、特定の集団に存在する頻度が最も高いＨＬＡ遺伝子型とマッチする細胞を作製することができる。例えば、北アメリカにおける４つの民族群に最も一般的な１０のハプロタイプを表３５〜３８に列記する（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｅｔｈｅｍａｔｃｈｃｌｉｎｉｃａｌ．ｏｒｇ／ｈｌａ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ／；Ｂｕｒｄｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４（１０  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ６（２００３）で入手可能な全米骨髄バンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）ＨＬＡハプロタイプ頻度データを参照されたい）。
【０９５７】
【表７７】
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【０９５８】
【表７８】
2018523977.tif 000100
【０９５９】
【表７９】
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【０９６０】
【表８０】
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【０９６１】
レシピエントに対して３／６ＨＬＡ対立遺伝子マッチを有するドナーの場合、単一ＨＬＡ対立遺伝子、２つのＨＬＡ対立遺伝子、または３つのＨＬＡ対立遺伝子を破壊することによって、ＨＬＡマッチング度を高める、例えば、ＨＬＡマッチングをそれぞれ４／６、５／６もしくは６／６対立遺伝子マッチまで高めることができる。
【０９６２】
以下に示すように、本明細書に記載される方法は、レシピエントに対して３／６ＨＬＡ対立遺伝子でマッチするいずれのドナー細胞にも適用することができる。例えば、ドナーとレシピエントが、以下に挙げるＨＬＡ遺伝子型（表３９）を有しており、ここで、ドナーＨＬＡ遺伝子型が、２つの最も一般的なヨーロッパ系アメリカ人ハプロタイプを含み、かつレシピエントが、対立遺伝子１にハプロタイプマッチを、また対立遺伝子２にいずれかの非マッチハプロタイプを有する場合、本明細書に記載される方法を用い、以下によってＨＬＡマッチング度を高めることができる：
（ａ）単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１）の破壊（例えば、ノックアウト）による４／６マッチの生成。
（ｂ）２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１ｇとＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２とＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による５／６マッチの生成。
（ｃ）３つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による６／６マッチの生成。
【０９６３】
【表８１】
2018523977.tif 000103
【０９６４】
例えば、ドナーとレシピエントが、以下に挙げるＨＬＡ遺伝子型（表４０）を有しており、ここで、ドナーＨＬＡ遺伝子型が、２つの最も一般的なアフリカ系アメリカ人ハプロタイプを含み、かつレシピエントが、対立遺伝子１にハプロタイプマッチを、また対立遺伝子２にいずれかの非マッチハプロタイプを有する場合、本明細書に記載される方法を用い、以下によってＨＬＡマッチング度を高めることができる：
（ａ）単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の破壊（例えば、ノックアウト）による４／６ＨＬＡマッチの生成。
（ｂ）２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇとＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇ、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による５／６マッチの生成。
（ｃ）３つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による６／６マッチの生成。
【０９６５】
【表８２】
2018523977.tif 000104
【０９６６】
例えば、ドナーとレシピエントが、以下に挙げるＨＬＡ遺伝子型（表４１）を有しており、ここで、ドナーＨＬＡ遺伝子型が、２つの最も一般的なアジア系ハプロタイプを含み、かつレシピエントが、対立遺伝子１にハプロタイプマッチを、また対立遺伝子２にいずれかの非マッチハプロタイプを有する場合、本明細書に記載される方法を用い、以下によってＨＬＡマッチング度を高めることができる：
（ａ）単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊４６０１またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１）の破壊（例えば、ノックアウト）による４／６ＨＬＡマッチの生成。
（ｂ）２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７ｇとＨＬＡ−Ｂ＊４６０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４６０１とＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による５／６マッチの生成。
（ｃ）３つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊４６０１、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による６／６マッチの生成。
【０９６７】
【表８３】
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【０９６８】
例えば、ドナーとレシピエントが、以下に挙げるＨＬＡ遺伝子型（表４２）を有しており、ここで、ドナーＨＬＡ遺伝子型が、２つの最も一般的なヒスパニック系／ラテンアメリカ人ハプロタイプを含み、かつレシピエントが、対立遺伝子１にハプロタイプマッチを、また対立遺伝子２にいずれかの非マッチハプロタイプを有する場合、本明細書に記載される方法を用い、以下によってＨＬＡマッチング度を高めることができる：
（ａ）単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の破壊（例えば、ノックアウト）による４／６ＨＬＡマッチの生成。
（ｂ）２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇとＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇ、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による５／６マッチの生成。
（ｃ）３つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７ｇ、ＨＬＡ−Ｂ＊４６０１、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の多重破壊（例えば、ノックアウト）による６／６マッチの生成。
【０９６９】
【表８４】
2018523977.tif 000106
【０９７０】
以下に示すように、本明細書に記載される方法は、レシピエントに対して４／６ＨＬＡ対立遺伝子でマッチするいずれのドナー細胞にも適用することができる。例えば、ドナーとレシピエントが、以下に挙げるＨＬＡ遺伝子型（表４３）を有しており、ここで、ドナーＨＬＡ遺伝子型が、２つの最も一般的なヒスパニック系／ラテンアメリカ人ハプロタイプを含み、かつレシピエントが、対立遺伝子１にハプロタイプマッチを、また対立遺伝子２（例えば、ＨＬＡ−Ａ）にいずれかの非マッチハプロタイプを有する場合、本明細書に記載される方法を用いて、以下によりＨＬＡマッチング度を高めることができる：
（ａ）単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の破壊（例えば、ノックアウト）による５／６マッチの生成。
（ｂ）２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１ｇとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）のＴ多重破壊（例えば、ノックアウト）による６／６マッチの生成。
【０９７１】
【表８５】
2018523977.tif 000107
【０９７２】
以下に示すように、本明細書に記載される方法は、レシピエントに対して５／６ＨＬＡ対立遺伝子でマッチするいずれのドナー細胞にも適用することができる。例えば、ドナーとレシピエントが、以下に挙げるＨＬＡ遺伝子型（表４４）を有しており、ここで、ドナーＨＬＡ遺伝子型が、２つの最も一般的なヒスパニック系／ラテンアメリカ人ハプロタイプを含み、かつレシピエントが、対立遺伝子１にハプロタイプマッチを、また対立遺伝子２の３つのＨＬＡ遺伝子座の２つでマッチするいずれかのハプロタイプを有する場合、本明細書に記載される方法を用い、以下によってＨＬＡマッチング度を高めることができる：
（ａ）単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１）の破壊（例えば、ノックアウト）による６／６マッチの生成。
【０９７３】
【表８６】
2018523977.tif 000108
【０９７４】
実施例１６：マイノリティまたは少数集団において、マッチしない可能性が非常に高いＨＬＡ遺伝子座のマッチングを促進するすためのＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子破壊（例えば、ノックアウト）
以下の記述および表は、ドナー組織またはＨＳＣＴを必要とするレシピエントで最も一般的にマッチしないＨＬＡハプロタイプにおいて向上したＨＬＡマッチを生成するための、ドナー細胞中の１、２もしくは３ＨＬＡ遺伝子座のノックアウトを説明する。
【０９７５】
例えば、下記のＨＬＡハプロタイプは、アジア系統の個体に一般的であり、全米骨髄バンク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＭＤＰ）におけるその他全ての対象では稀である（表４５）。従って、アジア系統および／または下記ハプロタイプのいずれかを有するレシピエントは、ＮＭＤＰ内で６／６ＨＬＡマッチを見出すことはできない。
【０９７６】
【表８７】
2018523977.tif 000109
【０９７７】
例えば、下記のＨＬＡハプロタイプは、アフリカ系アメリカ人系統の個体に共通し、全米骨髄バンク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＭＤＰ）におけるその他全ての対象では稀である（表４６）。従って、アフリカ系アメリカ人系統および／または下記ハプロタイプのいずれかを有するレシピエントは、ＮＭＤＰ内で６／６ＨＬＡマッチを見出すことはできない。
【０９７８】
【表８８】
2018523977.tif 000110
【０９７９】
例えば、下記のＨＬＡハプロタイプは、ヒスパニック系ラテンアメリカ人系統の個体に共通し、全米骨髄バンク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＭＤＰ）におけるその他全ての対象では稀である（表４７）。従って、ヒスパニック系ラテンアメリカ人系統および／または下記ハプロタイプのいずれかを有するレシピエントは、ＮＭＤＰ内で６／６マッチを見出すことはできない。
【０９８０】
【表８９】
2018523977.tif 000111
【０９８１】
表４５、４６および４７に列記されるＨＬＡハプロタイプは、特定の集団内で共通であるが、ドナープール、特に、全米骨髄バンク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＭＤＰ）の大部分を占める白色人種個体のドナープールでは、稀である。表５６、５７または５８に列記されるハプロタイプを有するレシピエントは、ＮＭＤＰにおいて６／６マッチを見出す可能性がより少ない。ドナー細胞中の１つ、２つもしくは３つのＨＬＡ対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）のために本明細書に記載の方法を用いて、特に表４５、４６および４７に列記されるＨＬＡハプロタイプを有するレシピエントをはじめとするレシピエントに対するＨＬＡマッチングを向上させることができる。
【０９８２】
表４８〜５０は、最も一般的にマッチしないマイノリティハプロタイプ（例えば、表４５、４６および４７に列記されるハプロタイプ）に適用することができるドナー細胞のための適切なＨＬＡ−遺伝子破壊（例えば、ノックアウト）の例を記載する。表４８〜５０には、マイノリティ集団（ドナープールにおいて少数しか存在しないため、理想的な６／６ＨＬＡマッチが見出されないリスクがある）で最も一般的なハプロタイプの各々について、最も一般的なハプロタイプマッチが示され、ここで、ドナー細胞中の単一ＨＬＡ遺伝子座の遺伝子破壊（例えば、ノックアウト）がＨＬＡマッチングを向上させる。
【０９８３】
【表９０】
2018523977.tif 000112
【０９８４】
【表９１】
2018523977.tif 000113
【０９８５】
【表９２】
2018523977.tif 000114
【０９８６】
一般的に存在するハプロタイプを、例えば、１つ、２つ、もしくは３つのＨＬＡ対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）による修飾のために選択することによって、少数しか存在しないレシピエントとマッチする尤度が高められる。別のＮＭＤＰベースのデータベースを作成して、例えば、１つ、２つもしくは３つのＨＬＡ対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）による最も適切なＨＬＡ修飾の決定を容易にすることができ、これは、極めて多数のレシピエントへの移植に使用することができる。方法およびドナー細胞は、ドナー組織の利用可能性、レシピエントハプロタイプ、および特異的ＨＬＡノックアウトの予測効果に基づいて選択される。
【０９８７】
例えば、遺伝子型ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−１５０３；ＨＬＡ−Ａ０１０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ０８０１ｇ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１を有するアフリカ系アメリカ人レシピエントが、ＨＳＣＴを必要とする場合、遺伝子型ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ５３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２；ＨＬＡ−Ａ０１０１ｇ、ＨＬＡ−Ｂ０８０１ｇ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０３０１を有する白色人種ドナーが利用可能であると考えられる。何故なら、これらのハプロタイプは、白色人種ドナープールにおいて、それぞれ、１８５番目および１番目に一般的なハプロタイプであるからである。本明細書に記載される方法を用いて、ドナー細胞中のミスマッチＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２対立遺伝子の遺伝子破壊（例えば、ノックアウト）によって、有効な６／６ＨＬＡマッチが生成されるであろう。あるいは、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座での遺伝子破壊が望ましい（例えば、高い生存率または低いＧＶＨＤ発生率のために）場合には、別のドナーを選択してもよい。遺伝子型ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−ＤＱ−１５０３；ＨＬＡ−０１０１ｇ、ＨＬＡ−０８０１ｇ、ＨＬＡ−ＤＱ−０３０１を有するドナーＨＳＣにおける生体外ＨＬＡ−Ｂ７遺伝子破壊（例えば、ノックアウト）は、これらのハプロタイプが、アフリカ系アメリカ人ドナープールにおいて、それぞれ、２４番目および２番目に一般的なハプロタイプであるため、これらを使用してもよい。
【０９８８】
ＮＭＤＰデータベース、または任意の臓器ドナーデータベースから、共通のＨＬＡハプロタイプを見出すこともでき、これらのハプロタイプを、１つまたは複数の遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−ＤＲＢ１）で破壊（例えば、ノックアウト）すれば、最大集団のためのマッチドナー細胞が得られるであろう。あるいは、ＮＭＤＰデータベース、または任意の臓器ドナーデータベースから、共通のＨＬＡハプロタイプを見出すこともでき、これらのハプロタイプを、単一遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−ＤＲＢ１）で破壊（例えば、ノックアウト）すれば、マッチするドナー組織もしくはＨＳＣを見出す可能性が最も低いレシピエントのためのマッチドナー細胞が得られるであろう。
【０９８９】
例えば、３／６ＨＬＡ対立遺伝子でマッチを有することが判明しているレシピエントの場合、本明細書に記載される方法を用いて、以下のことができる：
（ａ）ドナー細胞の単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−ＤＲＢ１）を破壊（例えば、ノックアウト）して、外来抗原認識に関して有効な４／６マッチのために）、３／６ＨＬＡ対立遺伝子（１／６ドナー対立遺伝子は発現されない）でレシピエントに対するドナーのＨＬＡマッチを生成する。単一ＨＬＡドナー対立遺伝子の破壊は、４／６マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
（ｂ）ドナー細胞の２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子とＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子、もしくはＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子）を破壊（例えば、ノックアウト）して、外来抗原認識に関して有効な５／６マッチのために、３／６ＨＬＡ対立遺伝子（２／６ドナー対立遺伝子は発現されない）でレシピエントに対するドナーのＨＬＡマッチを生成する。２つのＨＬＡドナー対立遺伝子の破壊は、５／６マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
（ｃ）ドナー細胞の３つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子）を破壊（例えば、ノックアウト）して、外来抗原認識に関して有効な６／６マッチのために、３／６ＨＬＡ対立遺伝子（３／６ドナー対立遺伝子は発現されない）でレシピエントに対するドナーのＨＬＡマッチを生成する。３つのＨＬＡドナー対立遺伝子の破壊は、６／６マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
【０９９０】
例えば、４／６ＨＬＡ対立遺伝子でマッチを有することが判明しているレシピエントの場合、本明細書に記載される方法を用いて、以下のことができる：
（ａ）ドナー細胞の単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−ＤＲＢ１）を破壊（例えば、ノックアウト）して、外来抗原認識に関して有効な５／６マッチのために）、４／６ＨＬＡ対立遺伝子（１／６ドナー対立遺伝子は発現されない）でレシピエントに対するドナーのＨＬＡマッチを生成する。単一ＨＬＡドナー対立遺伝子の破壊は、５／６マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
（ｂ）ドナー細胞の２つの対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子とＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子、もしくはＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子）を破壊（例えば、ノックアウト）して、外来抗原認識に関して有効な６／６マッチのために、４／６ＨＬＡ対立遺伝子（２／６ドナー対立遺伝子は発現されない）でレシピエントに対するドナーのＨＬＡマッチを生成する。２つのＨＬＡドナー対立遺伝子の破壊は、６／６マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
【０９９１】
例えば、レシピエントが、遺伝子型ＨＬＡ−Ａ２  ＨＬＡ−Ｂ４６  ＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０９０１：ＨＬＡ−Ａ３３  ＨＬＡ−Ｂ４４  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２を有し、かつ遺伝子型ＨＬＡ−Ａ２  ＨＬＡ−Ｂ６２  ＨＬＡ−ＤＲＢ１  ０９０１：ＨＬＡ−Ａ３３  ＨＬＡ−Ｂ５８  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２を有するドナーが見出された場合、ドナーとレシピエントの間で４／６ＨＬＡ対立遺伝子がマッチする。ドナー細胞中のＨＬＡ−Ｂ６２の破壊（例えば、ノックアウト）によって、４／６マッチ対立遺伝子、１つの非発現（ヌル）対立遺伝子、および１つのミスマッチ対立遺伝子が生成される。こうした状況において有効なＨＬＡマッチは、５／６であり、これは、４／６ＨＬＡマッチと比較して、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
【０９９２】
例えば、５／６ＨＬＡ対立遺伝子でマッチを有することが判明しているレシピエントの場合、本明細書に記載される方法を用いて、以下のことができる：
（ｃ）ドナー細胞の単一対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−ＤＲＢ１）を破壊（例えば、ノックアウト）して、外来抗原認識に関して有効な６／６マッチのために）、５／６ＨＬＡ対立遺伝子（１／６ドナー対立遺伝子は発現されない）でレシピエントに対するドナーのＨＬＡマッチを生成する。単一ＨＬＡドナー対立遺伝子の破壊は、６／６マッチを有効に生成し、これは、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
【０９９３】
例えば、レシピエントが、ハプロタイプＨＬＡ−Ａ２  ＨＬＡ−Ｂ４６  ＨＬＡ−ＤＲ  ０９０１：ＨＬＡ−Ａ３３  ＨＬＡ−Ｂ４４  ＨＬＡ−ＤＲ１３０２を有し、かつハプロタイプＨＬＡ−Ａ２  ＨＬＡ−Ｂ６２  ＨＬＡ−ＤＲ  ０９０１：ＨＬＡ−Ａ３３  ＨＬＡ−Ｂ４４  ＨＬＡ−ＤＲ１３０２を有するドナーが見出された場合、ドナーとレシピエントの間で５／６ＨＬＡ対立遺伝子がマッチする。ドナー細胞中のＨＬＡ−Ｂ６２の破壊（例えば、ノックアウト）によって、５／６マッチ対立遺伝子と、１つの非発現（ヌル）対立遺伝子が生成される。こうした状況において有効なＨＬＡマッチは、６／６であり、これは、５／６ＨＬＡマッチと比較して、レシピエントにおけるＧＶＨＤの発生リスクおよび／またはその重症度を低減し得る。
【０９９４】
例えば、遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１  ２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２  ４６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１  ０９０１を有するアジア系レシピエントは、ドナー細胞中のＨＬＡ−Ｂ６２の体外破壊（例えば、ノックアウト）後に、次の遺伝子型：ＨＬＡ−Ａ＊３００１  ２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２  ６２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１  ０９０１を有するドナーからのドナーＨＳＣ移植を受けることができる。ドナー細胞は、レシピエント遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１  ２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２  ４６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１  ０９０１との有効な６／６マッチのために、遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１  ２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２／−、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１  ０９０１を有することになる。ハプロタイプＨＬＡ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１を有するドナーＨＳＣは、ＮＭＤＰで利用可能な白色人種系統のハプロタイプの中で１０番目に頻度の高いＨＬＡハプロタイプである。ハプロタイプＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ６２、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１を有するドナーＨＳＣは、ＮＭＤＰで利用可能な白色人種系統のハプロタイプの中で６２番目に頻度の高いＨＬＡハプロタイプである。従って、ドナー遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１  ２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２  ６２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１  ０９０１のドナー遺伝子型が、レシピエントへの供与に利用可能であると考えられる。
【０９９５】
例えば、遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１；ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ４６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１を有するアジア系レシピエントは、ドナー細胞中のＨＬＡ−Ｂの体外破壊（例えば、ノックアウト）後に、次の遺伝子型：ＨＬＡ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１；ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１を有するドナーからのドナーＨＳＣ移植を受けることができる。ドナー細胞は、レシピエント遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１；ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ４６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１との有効な６／６マッチのために、遺伝子型Ａ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１；ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１を有することになる。ハプロタイプＨＬＡ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１を有するドナーＨＳＣは、ＮＭＤＰで利用可能な白色人種系統のハプロタイプの中で１０番目に頻度の高いＨＬＡハプロタイプである。ハプロタイプＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ６０、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１を有するドナーＨＳＣは、ＮＭＤＰで利用可能なアジア系統のハプロタイプの中で１９番目に頻度の高いＨＬＡハプロタイプである。従って、ドナー遺伝子型ＨＬＡ−Ａ＊３００１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７０１、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０９０１のドナー遺伝子型が、レシピエントへの供与に利用可能であると考えられる。
【０９９６】
【表９３】
2018523977.tif 000115
【０９９７】
【表９４】
2018523977.tif 000116
【０９９８】
【表９５】
2018523977.tif 000117
【０９９９】
【表９６】
2018523977.tif 000118
【１０００】
【表９７】
2018523977.tif 000119
【１００１】
【表９８】
2018523977.tif 000120
【１００２】
【表９９】
2018523977.tif 000121
【１００３】
また、本明細書に記載される方法を用いて、いくつかの異なるドナー由来の細胞（例えば、ＨＳＣ）において少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）のＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子）を体外破壊（例えば、ノックアウト）し、ドナー細胞（遺伝子破壊前または破壊後）をプールして、特定のレシピエントに対する１つまたは複数のマッチＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ−／ｃｏｍｍｏｎ  ａｌｌｅｌｅ、ＨＬＡ−Ｂ−／ｃｏｍｍｏｎ  ａｌｌｅｌｅ、ＨＬＡ−ＤＲ‐／ｃｏｍｍｏｎ  ａｌｌｅｌｅ遺伝子型）を有するドナー細胞を生成することもできる。これらの細胞を最も一般的なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−ＤＲ）遺伝子型のために作製して、１または複数のレシピエントに使用するために維持してもよい。
【１００４】
当業者は、これらの方法を用いて、他のＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＱ）を破壊（例えば、ノックアウト）することもできることは容易に見極められよう。例えば、ドナーと８／１０ＨＬＡマッチを有する特定のＨＬＡハプロタイプを有するレシピエントの場合、近縁の非マッチドナー対立遺伝子をノックアウトして、ドナー−レシピエントマッチを実質的に９／１０にすることができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲでハプロタイプがマッチするが、単一ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子ではマッチしなかったドナー組織における単一ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト）を実施して、有効な９／１０ハプロタイプマッチを生成することができ、ミスマッチＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子は発現されないため、これは、ドナー−レシピエントＨＬＡマッチを実質的に１０／１０にすることができる。
【１００５】
参照による援用
本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書のあらゆる定義を含め、本出願が優先される。
【１００６】
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2018523977.tif 000122
【図１Ｂ】
2018523977.tif 000123
【図１Ｃ】
2018523977.tif 000124
【図１Ｄ】
2018523977.tif 000125
【図１Ｅ】
2018523977.tif 000126
【図１Ｆ】
2018523977.tif 000127
【図１Ｇ】
2018523977.tif 000128
【図１Ｈ】
2018523977.tif 000129
【図１Ｉ】
2018523977.tif 000130
【図２Ａ】
2018523977.tif 000131
【図２Ｂ】
2018523977.tif 000132
【図２Ｃ】
2018523977.tif 000133
【図２Ｄ】
2018523977.tif 000134
【図２Ｅ】
2018523977.tif 000135
【図２Ｆ】
2018523977.tif 000136
【図２Ｇ】
2018523977.tif 000137
【図３Ａ】
2018523977.tif 000138
【図３Ｂ】
2018523977.tif 000139
【図４Ａ】
2018523977.tif 000140
【図４Ｂ】
2018523977.tif 000141
【図５Ａ】
2018523977.tif 000142
【図５Ｂ】
2018523977.tif 000143
【図５Ｃ】
2018523977.tif 000144
【図６Ａ】
2018523977.tif 000145
【図６Ｂ】
2018523977.tif 000146
【図７】
2018523977.tif 000147
【図８】
2018523977.tif 000148
【図９】
2018523977.tif 000149
【図１０】
2018523977.tif 000150
【図１１】
2018523977.tif 000151
【図１２】
2018523977.tif 000152
【図１３】
2018523977.tif 000153
【図１４Ａ】
2018523977.tif 000154
【図１４Ｂ】
2018523977.tif 000155
【図１４Ｃ】
2018523977.tif 000156
【図１５Ａ】
2018523977.tif 000157
【図１５Ｂ】
2018523977.tif 000158
【図１６Ａ】
2018523977.tif 000159
【図１６Ｂ】
2018523977.tif 000160
【図１７Ａ】
2018523977.tif 000161
【図１７Ｂ】
2018523977.tif 000162
【図１８Ａ】
2018523977.tif 000163
【図１８Ｂ】
2018523977.tif 000164
【図１９Ａ】
2018523977.tif 000165
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
2018523977.tif 000167
【図２０Ｂ】
2018523977.tif 000168
【図２０Ｃ】
2018523977.tif 000169
【図２１】
2018523977.tif 000170
【図２２Ａ】
2018523977.tif 000171
【図２２Ｂ】
2018523977.tif 000172
【図２３】
2018523977.tif 000173
【図２４】
2018523977.tif 000174
【図２５】
2018523977.tif 000175
【図２６】
2018523977.tif 000176
【図２７Ａ】
2018523977.tif 000177
【図２７Ｂ】
2018523977.tif 000178
【図２７Ｃ】
2018523977.tif 000179
【図２８Ａ】
2018523977.tif 000180
【図２８Ｂ】
2018523977.tif 000181
【図２８Ｃ】
2018523977.tif 000182
【図２９】
2018523977.tif 000183
【図３０】
2018523977.tif 000184
【図３１Ａ】
2018523977.tif 000185
【図３１Ｂ】
2018523977.tif 000186
【図３２】
2018523977.tif 000187
【図３３】
2018523977.tif 000188
【図３４】
2018523977.tif 000189
【配列表】
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【国際調査報告】
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