(57)【要約】  本発明は、ＧＩＴＲに結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に、１つ又は複数のそのような免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又はそれから本質的になるポリペプチド；そのようなポリペプチドをコードする核酸；そのようなポリペプチドを調製するための方法；予防、治療、又は診断目的のためのそのようなポリペプチドを含む医薬組成物に関する。特に、本発明のポリペプチドによってＧＩＴＲの生物学的活性が増強される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００pM未満のＥＣ５０値でグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み、前記ＧＩＴＲへの前記ＩＳＶＤの結合によって免疫応答が増強されるポリペプチド。
【請求項２】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが腫瘍細胞成長を阻害する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＧＩＴＲがヒトＧＩＴＲである、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３〜８８；及び
（ｂ）配列番号７３〜８８のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０〜１１６；及び
（ｄ）配列番号９０〜１１６のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４；並びに
（ｆ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【請求項６】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３〜７５；並びに
（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０〜９８；並びに
（ｄ）配列番号９０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８〜１１９、１２３、及び２８２〜２８４；並びに
（ｆ）配列番号１１８のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【請求項７】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５又は６に記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３；並びに
（ｂ）配列番号７３と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＴがＳに変えられている；
−位置７でＤがＮに変えられている；
−位置８でＳがＡに変えられている；及び／又は
−位置１０でＡがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０；及び
（ｄ）配列番号９０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＨ、Ｔ、又はＧに変えられている；
−位置２でＩがＭに変えられている；
−位置３でＴがＳに変えられている；
−位置６でＧがＳに変えられている；
−位置７でＳがＲ又はＧに変えられている；及び／又は
−位置８でＰがＳ、Ｔ、又はＲに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８；及び
（ｆ）配列番号１１８と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＡがＰに変えられている；
−位置１１でＭがＬ、Ｋ、Ｒ、又はＱに変えられている；及び／又は
−位置１２でＤがＮに変えられている。
【請求項８】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５〜７のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
ｉ）ＣＤＲ１が配列番号７３により表され、ＣＤＲ２が配列番号９０により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１１８により表され；又は
ｉｉ）ＣＤＲ１が配列番号７３により表され、ＣＤＲ２が配列番号９０により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１２３により表される。
【請求項９】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７６〜７８；及び
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９９〜１０３；及び
（ｄ）配列番号９９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２０〜１２３；及び
（ｆ）配列番号１２０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【請求項１０】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５又は９のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７６；及び
（ｂ）配列番号７６と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置７でＤがＮに変えられている；及び／又は
−位置８でＳがＡに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９９；及び
（ｄ）配列番号９９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＳ又はＴに変えられている；
−位置５でＳがＴ、Ｇ、又はＲに変えられている；
−位置６でＴがＫに変えられている；及び／又は
−位置７でＮがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２０；及び
（ｆ）配列番号１２０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＥがＫに変えられている；
−位置４でＡがＴに変えられている；
−位置１１でＩがＭ又はＬに変えられている；及び／又は
−位置１２でＮがＤに変えられている。
【請求項１１】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５、９、又は１０のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：ＣＤＲ１が配列番号７６により表され、ＣＤＲ２が配列番号９９により表され、ＣＤＲ３が配列番号１２０により表される。
【請求項１２】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７９〜８４；及び
（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０４〜１０８；及び
（ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２４〜１２５；及び
（ｆ）配列番号１２４のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【請求項１３】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５又は１２のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：  
（ａ）配列番号７９；及び
（ｂ）配列番号７９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；
−位置３でＶがＩに変えられている；
−位置７でＮがＤに変えられている；
−位置８でＤがＳに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＶ又はＴに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０４；及び
（ｄ）配列番号１０４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＤがＧに変えられている；
−位置５でＲがＡに変えられている；及び／又は
−位置６でＧがＤに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２４；及び
（ｆ）配列番号１２４と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＴがＭに変えられている。
【請求項１４】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５、１２、又は１３のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：ＣＤＲ１が配列番号７９により表され、ＣＤＲ２が配列番号１０４により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１２４により表される。
【請求項１５】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号８５〜８６；及び
（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０９〜１１０；及び
（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は配列番号１２６である。
【請求項１６】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５又は１５のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号８５；及び
（ｂ）配列番号８５と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０９；及び
（ｄ）配列番号１０９と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＴがＳに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は配列番号１２６である。
【請求項１７】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５、１５、又は１６のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：ＣＤＲ１が配列番号８５により表され、ＣＤＲ２が配列番号１０９により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１２６により表される。
【請求項１８】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：ＣＤＲ１が配列番号８７により表され、ＣＤＲ２が配列番号１１１により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１２７により表される。
【請求項１９】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号７７であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１２〜１１３；及び
（ｂ）配列番号１１２のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１２８〜１３０；及び
（ｄ）配列番号１２８のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【請求項２０】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５又は１９のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号７７であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１２；及び
（ｂ）配列番号１１２と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＤがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１２８；及び
（ｄ）配列番号１２８と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＳがＰに変えられている；及び／又は
−位置１３でＴがＡに変えられている。
【請求項２１】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５、１９、又は２０のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：ＣＤＲ１が配列番号７７により表され、ＣＤＲ２が配列番号１１２により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１２８により表される。
【請求項２２】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号８８であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１４〜１１６；及び
（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１３１〜１３２；及び
（ｄ）配列番号１３１のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【請求項２３】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５又は２２のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号８８であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１４；及び
（ｂ）配列番号１１４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、
それにおいて
−位置１でＶをがＩ又はＡに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１３１；及び
（ｄ）配列番号１３１と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、
それにおいて
−位置４でＧがＥに変えられている；及び／又は
−位置５でＲがＱに変えられている。
【請求項２４】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項５、２２、又は２３のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：ＣＤＲ１が配列番号８８により表され、ＣＤＲ２が配列番号１１４により表され、及びＣＤＲ３が配列番号１３１により表される。
【請求項２５】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが免疫グロブリン単一可変ドメインの群より選ばれる、請求項１〜２４のいずれか一項記載のポリペプチドであって、それにおいて：
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７５であり、ＣＤＲ２は配列番号９３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９７であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９８であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１９であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８２であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１００であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２１であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号１０１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２２であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１０３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７９であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８０であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８２であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８４であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０７であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０８であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２５であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１０９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８６であり、ＣＤＲ２は配列番号１１０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１１０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２７であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２９であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３１であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３１であり；並びに
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３２である。
【請求項２６】
ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＥＣ５０が、１９０ｐＭ又はそれ以下、例えば１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１５、１４未満、又はさらにそれ以下、例えば１２pM未満などである、請求項１〜２５のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２７】
Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０が、１９０ｐＭ又はそれ以下、例えば１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０未満、又はさらにそれ以下、例えば３０pM未満などである、請求項１〜２６のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２８】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために適切である免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列から本質的になる、請求項１〜２７のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２９】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１−７１及び２６８−２７５を伴うＩＳＶＤ、又は配列番号１−７１及び２６８−２７５と８０%を上回る配列同一性を有するＩＳＶＤからなる群より選ばれる、請求項１〜２８のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ＧＩＴＲに結合することができる少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ＧＩＴＲに結合することができる少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１〜３０のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３２】
少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＩＳＶＤが同じであっても異なっていてもよい、請求項３０又は３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＩＳＶＤが互いに直接的に連結されている、又は互いにリンカーを介して連結されている、請求項３０〜３２のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３４】
リンカーが配列番号２４７〜２６３を伴うリンカーの群より選択される、請求項３３記載のポリペプチド。
【請求項３５】
リンカーがリンカー９ＧＳ（配列番号２５１）又はリンカー３Ａ（配列番号２４７）を含む、請求項３４記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチドを含む、又は本質的にそれからなり、場合により１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結された１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含む化合物又は構築物。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれか一項記載の対応するポリペプチド自体と比較し、増加した半減期を有する、請求項３６記載の化合物又は構築物。
【請求項３８】
１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位が、請求項１〜３５のいずれか一項記載の対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する、請求項３７記載の化合物又は構築物。
【請求項３９】
増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位が、ポリエチレングリコール、血清タンパク質又はそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、抗体定常領域、及び血清タンパク質に結合することができる小さなタンパク質又はペプチドからなる群より選ばれる、請求項３８記載の化合物又は構築物。
【請求項４０】
増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位が、抗体定常領域又はそのフラグメントからなる群より選ばれ、抗体定常領域又はそのフラグメントが、ヒトＩｇＧ  、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などに由来する、請求項３８又は３９に記載の化合物又は構築物。
【請求項４１】
抗体定常領域が、ＣＨ１重鎖ドメイン、ＣＨ２重鎖ドメイン、ＣＨ３重鎖ドメイン、及び／又はＣＬ軽鎖ドメインを含む、請求項４０記載の化合物又は構築物。
【請求項４２】
ｉ）ポリペプチドがＣＨ１重鎖ドメインに連結されており、その後にそれぞれＣＨ２重鎖ドメイン及びＣＨ３重鎖ドメインが続く、請求項１〜２９のいずれか一項記載のポリペプチド；並びに／或いは
ｉｉ）ポリペプチドがＣＬ軽鎖ドメインに連結されている、請求項１〜２９のいずれか一項記載のポリペプチドを含む化合物又は構築物。
【請求項４３】
配列番号２２９、２３０、２９１、及び２９２の１つに示すアミノ酸配列又は配列番号２２９〜２３０及び２９１〜２９２と８０%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２記載の化合物又は構築物。
【請求項４４】
ＩｇＧ型である、請求項４２又は４３のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項４５】
増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントからなる群より選ばれる、請求項３８又は３９に記載の化合物又は構築物。
【請求項４６】
増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する１つ又は複数の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）に結合することができる結合単位からなる群より選ばれる、請求項３８又は３９に記載の化合物又は構築物。
【請求項４７】
増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する１つ又は複数の他の結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸、ナノボディ、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）に結合することができるＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列、或いは血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）からなる群より選ばれる、請求項４６記載の化合物又は構築物。
【請求項４８】
化合物又は構築物が、配列番号２０６〜２２３及び２８５〜２９０を伴う化合物又は構築物、或いは配列番号２０６〜２２３及び２８５〜２９０と８０%を上回る配列同一性を有する化合物又は構築物からなる群より選ばれる、請求項４７記載の化合物又は構築物。
【請求項４９】
請求項１〜４４のいずれか一項記載の対応するポリペプチドそれ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を上回るより大きな半減期を有する、請求項４６〜４８のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項５０】
請求項１〜３５のいずれか一項記載の対応するポリペプチドそれ自体と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回るなど、又はさらに２４、４８、もしくは７２時間を上回る増加した血清中半減期を有する、請求項４６〜４９のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項５１】
ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上；例えば、少なくとも５日間（例えば約５〜１０日間など）、好ましくは少なくとも９日間（例えば約９〜１４日間など）、より好ましくは少なくとも約１０日間（例えば約１０〜１５日間など）、又は少なくとも約１１日間（例えば約１１〜１６日間など）、より好ましくは少なくとも約１２日間（例えば約１２〜１８日間又はそれ以上など）、又は１４日間を上回る（例えば約１４〜１９日間など）の血清中半減期を有する、請求項４６〜５０のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項５２】
請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸、又は請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物。
【請求項５３】
請求項５２記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５２記載の核酸又は請求項５３記載の発現ベクターを含む宿主又は宿主細胞。
【請求項５５】
請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５２記載の核酸を含む組成物。
【請求項５６】
医薬組成物である、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤或いは賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、場合により１つ又は複数のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
医薬としての使用のための、請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物又は構築物。
【請求項５９】
免疫応答の増強における使用のための、請求項５８記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６０】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化の増強における使用のための、請求項５８記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６１】
腫瘍成長の阻害における使用のための、請求項５８記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６２】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置における使用のための、請求項５８記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６３】
細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置における使用のための、請求項５８記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６４】
ＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態の処置又は予防における使用のための、請求項５５〜６３のいずれか一項記載の組成物、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、又は請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物。
【請求項６５】
癌の予防及び／又は処置における使用のための、請求項５８記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６６】
癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍より選択される、請求項６５記載の組成物、ポリペプチド、又は化合物もしくは構築物。
【請求項６７】
以下の工程を少なくとも含む、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチドを産生するための方法：
ａ）適切な宿主細胞もしくは宿主生物又は別の適切な発現系において、請求項５２記載の核酸配列を発現させること；場合により、以下が続く：  
ｂ）請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【請求項６８】
方法が、医薬的に活性な量の請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を投与することを含む、免疫応答を増強するための方法。
【請求項６９】
方法が、医薬的に活性な量の請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を投与することを含む、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための方法。
【請求項７０】
方法が、医薬的に活性な量の請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を投与することを含む、腫瘍成長を阻害するための方法。
【請求項７１】
方法が、請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置のための方法。
【請求項７２】
方法が、請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための方法。
【請求項７３】
方法が、請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、ＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための方法。
【請求項７４】
方法が、請求項１〜３５のいずれか一項記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構成物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌の予防及び／又は処置のための方法。
【請求項７５】
癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍より選択される、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
方法が以下の１つ又は複数をさらに含む、請求項６８〜７５のいずれか一項記載の方法：
ａ）化学療法を施すこと；
ｂ）放射線療法を施すこと；
ｃ）癌ワクチンを投与すること；及び／又は
ｄ）１つ又は複数の追加の治療薬剤を投与すること。
【請求項７７】
追加の治療薬剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＴＧＦＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、Ｓｉｇｌｅｃｓ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳリガンド、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＶＩＳＴＡ、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２４４、ＣＤ４８、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲファミリメンバー、ＫＩＲ、ＩＬＴ、ＬＩＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＤＯ、ＴＧＦβ、アデノシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＬＦＡ−２、ＬＦＡ−３、ＢＡＦＦＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ２４、ＣＤ３９、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ホスファチジルセリン、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ４７、ＶＥＧＦ、及びニューロピリンのリストより選ばれる、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
免疫応答を増強するための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項７９】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８０】
腫瘍成長を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８１】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８２】
細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８３】
少なくとも１つのＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８４】
癌の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜３５のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項３６〜５１のいずれか一項記載の化合物もしくは構築物、又は請求項５５〜５７のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８５】
癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍より選択される、請求項８４記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＩＴＲに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。特に１つ若しくは複数のそのような免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又は本質的に１つ若しくは複数のそのような免疫グロブリン単一可変ドメインからなるポリペプチドに関する（本明細書においてそれぞれ「本発明のＩＳＶＤ」及び「本発明のポリペプチド」として言及する）。
【０００２】
本発明はまた、そのようなポリペプチドをコードする核酸（本明細書において「本発明の核酸」としても言及する）；そのようなポリペプチドを調製するための方法；そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞；そのようなポリペプチド、核酸、及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に医薬組成物；並びに、特に予防目的及び／又は治療目的（例えば本明細書において言及する予防目的及び／又は治療目的など）のためのポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び／又は組成物の使用に関する。
【０００３】
本発明の他の態様、実施形態、利点、及び適用は、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【背景技術】
【０００４】
癌は世界中で莫大な人的損害をまねく。今日では、世界の主要な死亡原因となっており、心臓疾患及び脳卒中が続く。癌は、世界中で罹患及び死亡の主要な原因の１つであり、２０１２年には約１，４００万例の新症例及び８，２００万例の癌関連死亡があった。新症例の数は今後２０年間で約７０%上昇すると予測されている（情報源：ＷＨＯ  Ｃａｎｃｅｒ）。世界中での癌による早期死亡及び障害の全経済的影響は、２００８年に約９，０００億ドルであったが、世界の国内総生産の１．５%に相当する。
【０００５】
化学療法は長年にわたり癌処置の中心的存在である。いくつかの成功にもかかわらず、化学療法での治癒率は依然として不満足なままであり、これらの処置による重度の副作用が懸念されている。癌と戦う改善療法が切望されている。
【０００６】
相当な努力が、近年、癌を除去するための新たな処置様式としての癌免疫療法に投じられてきた。癌免疫療法では、免疫系を刺激し、腫瘍を拒絶及び破壊することが試みられる。
【０００７】
免疫応答の生成及び維持は、Ｔ細胞共受容体を通じた同時刺激及び同時阻害シグナル伝達の両方により制御される。免疫活性化は、Ｔ細胞により発現される共受容体の２つの主要ファミリーである免疫グロブリン様（Ｉｇ）スーパーファミリー及びＴＮＦＲスーパーファミリーにより調節される。グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）は、後者のファミリーの同時刺激性メンバーである。ヒトＧＩＴＲは三量体として存在し、シグナル伝達は三量体ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）による３つの受容体外部ドメインの動員を含み、３：３の受容体：リガンド複合体形成をもたらす［Chattopadhyay et al. PNAS (2007) 104:19452-19457］。実質的なレベルのＧＩＴＲが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）上に構成的に発現され、これらの細胞により媒介される末梢耐性において重要な役割を果たす。ＧＩＴＲはまた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｔエフェクター細胞）で、低レベルで発現され、その発現は活性化後に迅速に増強される［Nocentini et al. Br. J. Pharmacol. (2012) 165: 2089-2099］。加えて、ＧＩＴＲの発現は、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び単球でも同定されている。そのリガンドＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）は、種々の抗原提示細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージなど）の表面上で、及び内皮細胞上で発現され、同時刺激並びに白血球接着及び遊出を誘発する［Schaer et al J Immunother Cancer (2014) 2: 1-9; Lacal et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. (2013) 347: 164-172］。
【０００８】
ＧＩＴＲ活性化は、エフェクターＴ細胞及び調節性Ｔ細胞の両方を含む広範な免疫機能に関係しており、このように、腫瘍及び感染性因子に対する免疫応答の発生に関与している。特に、ＧＩＴＲ活性化が効果的な抗腫瘍特性を有することを示す前臨床の証拠が蓄積している。今日まで、ＧＩＴＲに対するアゴニストモノクローナル抗体によって、抗腫瘍免疫が促進され［Turk et al., J. Exp. Med. (2004) 200:771-782; Ko et al., J. Exp. Med. (2005) 202:885-891; Ramirez-Montagut et al., J. Immunol. (2006) 176:6434-6442; Zhou et al., J. Immunol. (2007) 179:7365-7375; Cohen et al., PLoS One (2010) 5:e10436; Coe et al., Cancer Immunol. Immunother. (2010) 59:1367-1377; Zhou et al., J. Immunother. (2010) 33:789-797; Cote et al., J. Immunol. (2011) 186:275-283］、癌抗原に対するワクチンとの組み合わせにおいて抗腫瘍免疫が増大され［Cohen et al., Cancer Res. (2006) 66:4904-4912, Ko et al., Cancer Res. (2007) 67:7477-7486, Hoffman et al., J. Immunother. (2010) 33:136-145, Boczkowski et al., Cancer Gene Ther. (2009) 16:900-911］、他の免疫調節療法と相乗作用する［Ko et al., J. Exp. Med. (2005) 202:885-891, Houot et al., Blood (2009) 113:3546-3552, Mitsui, et al. Clin. Can. Res. (2010) 16:2781-2791］、変異した自己を発現する腫瘍の拒絶が増強される［Duan et al., Cancer Res. (2009) 69:3545-3553］、及び養子細胞療法が増強される［Liu et al., Mol Ther. (2009) 17:1274-81, Imai et al., Can. Sci. (2009) 100:1317-25］ことが示されている。さらに、インビボでのＧＩＴＲの標的化によって、また、感染性疾患の処置においていくつかの顕著な結果がもたらされている。マウスにおけるフレンドウイルス感染の間に、ＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体での処置によって、天然Ｔｒｅｇ細胞の効果が逆転し、Ｔｈ１及びＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の増強、ウイルス負荷及び病理の低下、並びにＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性抗腫瘍応答の回復に導かれる［He et al., J. Virol. (2004) 78:11641-1164］。同様に、ＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体でのマウスの処置によって、ヘルペス性角膜炎が減少する［Suvas et al., J. Virol. (2005) (18):11935-11942］。
【０００９】
いくつかの機構が、ＧＩＴＲ媒介性の治療効果に寄与しているように見える。インビボでのＧＩＴＲ活性化によって、例えば、筋肉内調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においてＦｏｘＰ３の発現が損なわれることが示されており、Ｔｒｅｇ系統の安定性の喪失を招き、その後にエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の抑制低下を伴った［Schaer et al Cancer Immunol. Res. (2013) 1: 320-331］。さらに、ＧＩＴＲ調節は、Ｔ細胞増殖及びエフェクター機能を誘導することにより、並びにＴ細胞の生存を促進することにより、Ｔｅｆｆ活性を支持している［Mahoney et al Nat Rev Drug Discov. (2015) 14:561-84］。
【００１０】
ＧＩＴＲは癌免疫療法のための魅力的な標的であると思われるが、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体が、抗腫瘍効果について、それらのＦｃ機能に依存するか否かは不明なままである。Ｐｏｎｔｅらは、抗ＧＩＴＲ抗体のＦｃＲ媒介性架橋が体液性免疫及び細胞性免疫の増強のために要求されないことを実証した［Ponte et al Immunol. (2010) 130, 231-242］。さらに、Ｐｏｎｔｅは、Ｆｃ−無効化抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体がインビトロの肺腫瘍モデルにおいて単独療法として効果的であり、化学療法薬物との組み合わせにおいて、皮下腫瘍モデルにおいて確立された腫瘍に対する抗腫瘍免疫を増強することを示した（Ponte et al. Keystone symposia, April 2011）。対照的に、Bulliardらは、ＦｃγＲの活性化が、抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性のために必須であることを見出した［Bulliard et al J Exp Med. (2013) 210: 1685-1693］。
【００１１】
有効な免疫療法によってＴｒｅｇが阻害され、Ｔｅｆｆが同時に活性化され、バランスが免疫活性化に傾くはずである。しかし、今日までに得られた結果から、ＧＩＴＲが免疫療法のための有用な標的として確立されているが、ＧＩＴＲアゴニストのいずれの特定の特徴が治療目的のために特に有利であるのかは不明なままである。そのようなものとして、ＧＩＴＲアゴニストを治療的に効果的にする特定の機能的特性、ならびに癌及び他の状態（例えば感染性疾患など）を処置する際により効果的である、改善された治療用ＧＩＴＲアゴニストについてさらなる洞察の必要性が当技術分野にある。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、先行技術のアミノ酸配列及び抗体と比較し、他の有利な特性（例えば、改善された調製の簡単さ、良好な安定性、及び／又は低下した商品のコストなど）に加えて、改善された望ましい治療的及び／又は薬理学的特性と関連付けられる特定の機能的特性を伴うＧＩＴＲアゴニストを提供する。
【００１３】
広範なスクリーニング、特徴付け、及びコンビナトリアル戦略に基づき、本発明者らは、驚くべきことに、ＧＩＴＲに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが、先行技術において記載されるＧＩＴＲアゴニスト分子と比較し、ＧＩＴＲ活性を調節するための改善された特性を示すことを観察した。より具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、本発明のポリペプチドが、従来技術の抗体と比較し、同じか又はむしろ低いＥＣ５０値でより高い効力を示すことを観察した。これは、薬物の有効性がその最大効力に依存するため、臨床的に非常に重要である。
【００１４】
したがって、本発明は、２００pM未満のＥＣ５０値でグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドに関し、前記ＧＩＴＲへの前記ＩＳＶＤの結合によって免疫応答が増強される。
【００１５】
特に、ＧＩＴＲ、特にヒトＧＩＴＲに結合することができるポリペプチド（配列番号２３１）を、例えば本明細書においてさらに記載し、定義するように、例えばＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ又はＴ細胞活性化アッセイにより、ＥＣ５０値でとして適切に測定される及び／又は表される生物学的効力により特徴付ける。
【００１６】
一態様では、本発明のポリペプチドは、それらが、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイで決定するように、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１５、１４未満、又はさらにそれ以下、例えば１２pM未満などのＥＣ５０で（ヒト）ＧＩＴＲに結合するようにする。
【００１７】
別の態様では、本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞活性化アッセイで決定するように、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０未満、又はさらにそれ以下、例えば３０pM未満などのＥＣ５０で（ヒト）ＧＩＴＲに結合するようにする。
【００１８】
（ヒト）ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合によって、本明細書において記載するように、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化の増強がもたらされうることが理解されるであろう。
【００１９】
（ヒト）ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合によって、本明細書において記載するように、腫瘍細胞成長の阻害がもたらされうることがさらに理解されるであろう。
【００２０】
本発明のポリペプチドの、及びそれを含む組成物の効力を、含まれる特定の疾患又は障害に依存して、任意の適切なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、及び／又はそれ自体が公知の動物モデル、或いは、それらの任意の組み合わせを使用して試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルが当業者には明らかであろうが、例えば、下の実験部分において及び本明細書において引用する先行技術において使用されるアッセイ及び動物モデルが含まれる。（ヒト）ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合、免疫応答の増強、腫瘍細胞成長の阻害、或いは他のインビボ及び／又はインビトロ効力についてのいくつかの好ましい技術的値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【００２１】
一態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は本明細書において定義するとおりであり、ＦＲ１、ＦＲ２、  ＦＲ３、及びＦＲ４はフレームワーク配列である。したがって、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なるポリペプチドに関し、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３〜８８；及び
（ｂ）配列番号７３〜８８のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０〜１１６；及び
（ｄ）配列番号９０〜１１６のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４；及び
（ｆ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３〜７５；及び
（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０〜９８；及び
（ｄ）配列番号９０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８〜１１９、１２３及び２８２〜２８４；及び
（ｆ）配列番号１１８のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３；及び
（ｂ）配列番号７３と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＴがＳに変えられている；
−位置７でＤがＮに変えられている；
−位置８でＳがＡに変えられている；及び／又は
−位置１０でＡがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０；及び
（ｄ）配列番号９０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＨ、Ｔ、又はＧに変えられている；
−位置２でＩがＭに変えられている；
−位置３でＴがＳに変えられている；
−位置６でＧがＳに変えられている；
−位置７でＳがＲ又はＧに変えられている；及び／又は
−位置８でＰがＳ、Ｔ、又はＲに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８；及び
（ｆ）配列番号１１８と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＡがＰに変えられている；
−位置１１でＭがＬ、Ｋ、Ｒ、又はＱに変えられている；及び／又は
−位置１２でＤがＮに変えられている。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ）ＣＤＲ１を配列番号７３により表し、ＣＤＲ２を配列番号９０により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１１８により表し；又は
ｉｉ）ＣＤＲ１を配列番号７３により表し、ＣＤＲ２を配列番号９０により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２３により表す。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７６〜７８；及び
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９９〜１０３；及び
（ｄ）配列番号９９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２０〜１２３；及び
（ｆ）配列番号１２０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７６；及び
（ｂ）配列番号７６と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置７でＤがＮに変えられている；及び／又は
−位置８でＳがＡに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９９；及び
（ｄ）配列番号９９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＳ又はＴに変えられている；
−位置５でＳがＴ、Ｇ、又はＲに変えられている；
−位置６でＴがＫに変えられている；及び／又は
−位置７でＮがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２０；及び
（ｆ）配列番号１２０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＥがＫに変えられている；
−位置４でＡがＴに変えられている；
−位置１１でＩがＭ又はＬに変えられている；及び／又は
−位置１２でＮがＤに変えられている。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号７６により表し、ＣＤＲ２を配列番号９９により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２０により表す。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７９〜８４；及び
（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０４〜１０８；及び
（ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２４〜１２５；及び
（ｆ）配列番号１２４のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７９；及び
（ｂ）配列番号７９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；
−位置３でＶがＩに変えられている；
−位置７でＮがＤに変えられている；
−位置８でＤがＳに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＶ又はＴに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０４；及び
（ｄ）配列番号１０４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＤがＧに変えられている；
−位置５でＲがＡに変えられている；及び／又は
−位置６でＧがＤに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２４；及び
（ｆ）配列番号１２４と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＴがＭに変えられている。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号７９により表し、ＣＤＲ２を配列番号１０４により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２４により表す。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号８５〜８６；及び
（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０９〜１１０；及び
（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が配列番号１２６である。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号８５；及び
（ｂ）配列番号８５と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０９；及び
（ｄ）配列番号１０９と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＴがＳに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が配列番号１２６である。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号８５により表し、ＣＤＲ２を配列番号１０９により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２６により表す。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号８７により表し、ＣＤＲ２を配列番号１１１により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２７により表す。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が配列番号７７であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１１２〜１１３；及び
（ｄ）配列番号１１２のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２８〜１３０；及び
（ｆ）配列番号１２８のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が配列番号７７であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１２；及び
（ｂ）配列番号１１２と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＤがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１２８；及び
（ｄ）配列番号１２８と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＳがＰに変えられている；及び／又は
−位置１３でＴがＡに変えられている。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号７７により表し、ＣＤＲ２を配列番号１１２により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２８により表す。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が配列番号８８であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１１４〜１１６；及び
（ｄ）配列番号１１４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１３１〜１３２；及び
（ｆ）配列番号１３１のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が配列番号８８であり；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１４；及び
（ｂ）配列番号１１４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列  、それにおいて
−位置１でＶがＩ又はＡに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１３１；及び
（ｄ）配列番号１３１と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＧがＥに変えられている；及び／又は
−位置５でＲがＱに変えられている。
【００４０】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号８８により表し、ＣＤＲ２を配列番号１１４により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１３１により表す。
好ましい態様では、少なくとも１つのＩＳＶＤはＩＳＶＤの群より選択され、それにおいて：
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７５であり、ＣＤＲ２は配列番号９３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９７であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９８であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１９であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８２であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１００であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２１であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号１０１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２２であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１０３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７９であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８０であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８２であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８４であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０７であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０８であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２５であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１０９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８６であり、ＣＤＲ２は配列番号１１０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１１０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２７であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２９であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３１であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３１であり；並びに
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３２である。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）より及び重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから（本質的に）なりうる。本発明のポリペプチドは、従来の４本鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列より及び重鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから（本質的に）なりうる。本発明のポリペプチドは、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸）、ｄＡｂ（又はｄＡｂとしての使用のために適切なアミノ酸）、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから（本質的に）なりうる  。好ましい態様では、本発明のポリペプチドは部分的又は完全ヒト化ナノボディ（例えば部分的又は完全ヒト化ＶＨＨなど）から（本質的に）なる。
【００４２】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１〜７１及び２６８〜２７５のいずれかより選択されるか、又は配列番号１〜７１及び２６８〜２７５のいずれかと８０%上回る、好ましくは９０%上回る、より好ましくは９５%上回る、例えば９６%、９７%、９８%、９９%又はそれ以上の配列同一性（本明細書において定義する）を有するポリペプチドである。
【００４３】
本発明により提供するポリペプチド（「本発明のポリペプチド」とも言及する）は、好ましくは、本質的に単離された形態（本明細書において定義する）であり、それらは、１つ又は複数のＩＳＶＤを含みうるか、又はそれから（本質的に）なりうる、及び、場合により、１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン（全てが、場合により、１つ又は複数の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含みうる。
【００４４】
特に、本発明は、ＧＩＴＲに結合することができる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのＩＳＶＤを含む、又は（本質的に）なる多価ポリペプチドを提供し、それにおいて、前記の少なくとも２つ、前記の少なくとも３つ、前記の少なくとも４つ、又は前記の少なくとも５つのＩＳＶＤが同じである、又は異なっていてもよく、及び、前記の少なくとも２つ、前記の少なくとも３つ、前記の少なくとも４つ、又は前記の少なくとも５つのＩＳＶＤが互いに直接連結されているか、又は互いにリンカーを介して連結されている。
【００４５】
限定しないが、適切なリンカーは、配列番号２４７〜２６３を伴うリンカーの群より選択してもよく、そのうちのより短いリンカー長が好ましい。いくつかの特に好ましいリンカーは、１〜２０の間のアミノ酸残基、例えば２〜１０の間のアミノ酸残基、例えば２、３、４、５、６、７、８、又は９などのアミノ酸残基を含む。特に、リンカー９ＧＳ（配列番号２５１）又はリンカー３Ａ（配列番号２４７）が特に好ましい。
【００４６】
別の態様では、本発明は、本発明の１つ又は複数のポリペプチド（又はその適切なフラグメント）を含む又はそれから（本質的に）なる、及び、場合により、１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位（場合により、１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されている）をさらに含む、化合物又は構築物（また、本明細書において「本発明の化合物」又は「本発明の構築物」としてそれぞれ言及する）に関する。本明細書におけるさらなる開示から当業者には明らかになるであろう通り、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、さらなる機能性を本発明のポリペプチドに（及び／又は、それが存在する化合物又は構築物に）提供しうる又は提供しないであろう、及び、本発明のポリペプチドの特性を修飾しうる又は修飾しないであろう。
【００４７】
本発明の特定の一態様では、本発明の化合物又は本発明の構築物は、本発明の対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有しうる。そのような化合物又は構築物のいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例は、本明細書におけるさらなる開示に基づき、当業者には明らかになるであろうが、例えば、化学的に修飾されて（例えば、ペグ化を用いて）、その半減期が増加している本発明のポリペプチド；血清タンパク質（例えば血清アルブミンなど）への結合のための少なくとも１つの追加の結合部位を含む本発明のポリペプチド；又は本発明のポリペプチドの半減期を増加させる少なくとも１つの部分に連結された本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む本発明のポリペプチドを含む。
【００４８】
そのような半減期を延長する部分を含む本発明のポリペプチドの例が、本明細書におけるさらなる開示に基づき、当業者には明らかになるであろう；例えば、限定しないが、本発明のポリペプチドが、１つ又は複数の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適切なフラグメントなど）に、或いは血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の結合単位に適切に連結されたポリペプチド（  例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のための適切なアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のための適切なアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のための適切なアミノ酸、ナノボディ、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）に結合することができるＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列、或いは血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）；本明細書において言及するさらなる記載及び参考文献を参照する；本発明のポリペプチドが、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃなど）又はその適切な部分もしくはそのフラグメントに連結されているポリペプチド；或いは、本発明の１つ又は複数のポリペプチドが、血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の小さなタンパク質又はペプチド（例えば、限定しないが、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、ＷＯ０２／０７６４８９に記載されるタンパク質及びペプチドなど）に適切に連結されているポリペプチドを含む。
【００４９】
一態様では、半減期の増加したポリペプチドを提供する本発明の化合物又は構築物は、抗体定常領域又はそのフラグメントからなる群より選び、それにおいて、抗体定常領域又はそのフラグメントはヒトＩｇＧに由来し、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などである。特に、そのような抗体定常領域は、ＣＨ１重鎖ドメイン、ＣＨ２重鎖ドメイン、ＣＨ３重鎖ドメイン、及び／又はＣＬ軽鎖ドメインを含む。
【００５０】
本発明の特定の一態様では、本発明の化合物又は構築物は以下を含む：
ｉ）本発明の一価ポリペプチドであって、前記一価ポリペプチドがＣＨ１重鎖ドメインに連結されており、その後にそれぞれＣＨ２重鎖ドメイン及びＣＨ３重鎖ドメインが続く；  並びに／或いは
ｉｉ）本発明の一価ポリペプチドであって、前記一価ポリペプチドがＣＬ軽鎖ドメイン（Ｃκ又はＣλなど）に連結されている。
【００５１】
本発明の好ましい重鎖及び／又は軽鎖ドメインはＩｇＧ型であり、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２９１、及び配列番号２９２の１つに記載するアミノ酸配列、又は配列番号２２９〜２３０、配列番号２６６〜２６７、及び配列番号２９１〜２９２のいずれかと８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る配列同一性、例えば９６%、９７%、９８%、９９%又はそれ以上の配列同一性（本明細書において定義する）を有するアミノ酸配列を含む。
【００５２】
一般的に、増加した半減期を伴う本発明の化合物又は構築物は、好ましくは、本発明の対応するポリペプチドそれ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を上回るより大きな半減期を有する。
【００５３】
本発明の好ましいが、しかし、非限定的な態様では、本発明のそのような化合物又は構築物は、本発明の対応するポリペプチドそれ自体と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回るなど、又はさらに２４、４８、もしくは７２時間を上回る増加した血清中半減期を有する。
【００５４】
別の好ましいが、しかし、非限定的な態様では、本発明のそのような化合物又は構築物は、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上の血清中半減期をヒトにおいて示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日間（例えば約５〜１０日間など）、好ましくは少なくとも９日間（例えば約９〜１４日間など）、より好ましくは少なくとも約１０日間（例えば約１０〜１５日間など）、又は少なくとも約１１日間（例えば約１１〜１６日間など）、より好ましくは少なくとも約１２日間（例えば約１２〜１８日間又はそれ以上など）、又は１４日間を上回る（例えば約１４〜１９日間など）半減期を有しうる。
【００５５】
好ましい態様では、本発明は、上に定義する化合物又は構築物に関し、それは、配列番号２０６〜２２３及び２８５〜２９０のいずれかより選択されるか、又は配列番号２０６〜２２３及び２８５〜２９０のいずれかと８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る、例えば９６%、９７%、９８%、９９%又はそれ以上の配列同一性（本明細書において定義する）を有する化合物又は構築物である（表Ａ−１１を参照のこと）。
【００５６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列に関する。そのような核酸はまた、本明細書において「本発明の核酸」として言及し、例えば、遺伝子構築物の形態でありうる（本明細書においてさらに記載する通り）。したがって、本発明はまた、遺伝子構築物の形態である核酸配列又はヌクレオチド配列に関する。
【００５７】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする核酸を連結し、本発明の多価ポリペプチドをコードする核酸を得ることができる。したがって、本発明はまた、本発明の多価ポリペプチドをコードする遺伝子構築物の調製のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の使用に関する。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を発現する（又は、適切な状況下で発現することが可能である）；並びに／或いは、本発明の核酸を含む宿主又は宿主細胞に関する。そのような宿主又は宿主細胞のいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００５９】
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、並びに／或いは本発明の少なくとも１つの核酸、並びに、場合により、即ち、組成物の意図される使用に依存し、それ自体が公知のそのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分を含む又は含む組成物に関する。そのような組成物は、例えば、医薬組成物（本明細書において記載する通り）又は獣医学的組成物でありうる。そのような組成物のいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００６０】
本発明はさらに、本明細書において記載するポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、核酸、宿主細胞、並びに組成物を調製するための方法に関する。本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、核酸、宿主細胞、並びに組成物を産生するための方法は、以下の工程を含みうる：
ａ）適切な宿主細胞もしくは宿主生物又は別の適切な発現系において、本発明の核酸配列又はヌクレオチド配列、或いは、本発明の遺伝子構築物を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ）このようにして得られた本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を単離及び／又は精製すること。
【００６１】
本発明はさらに、本明細書において記載するポリペプチド、化合物及び／又は構築物、核酸、宿主細胞、並びに組成物の適用及び使用、ならびにＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための方法に関する。いくつかの好ましいが、しかし、非限定的な適用及び使用が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００６２】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、免疫応答を増強するために使用することができる。
【００６３】
特に、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するために使用することができる。
【００６４】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、腫瘍成長を阻害するために使用することができる。
【００６５】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置のために使用することができる。
【００６６】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、感染性疾患の予防及び／又は処置のために使用することができる。感染症は、関与する感染性生物又は病原体のカテゴリーに基づき、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫に広く分類することができる。したがって、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のために使用することができる。
【００６７】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、癌の予防及び／又は処置のために使用することができる。本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を使用して成長を阻害することができる例示的な癌としては、典型的には免疫療法に応答性の癌が含まれる。処置のための好ましい癌の非限定的な例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍が含まれる。
【００６８】
そのようなものとして、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、癌の予防及び／又は処置のために使用することができ、それにおいて癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍より選択する。
【００６９】
免疫応答を増強する、特にＴ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための方法及び本明細書において記載する腫瘍成長を阻害する方法は、多種多様のＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態を処置及び予防するために使用することができる。例えば、一態様では、本発明は、本明細書において記載する医薬的に活性な量の少なくとも１つのポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞関連疾患の予防及び／又は処置のための方法を提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、本明細書において記載する医薬的に活性な量の少なくとも１つのポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための方法を提供する。
【００７１】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書において記載する医薬的に活性な量の少なくとも１つのポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、癌の予防及び／又は処置のための方法を提供する。特に、本発明は、癌の予防及び／又は処置のための方法を提供し、それにおいて、癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍より選択される。
【００７２】
本明細書において記載する方法及び組成物は、他の薬剤又は治療様式との組み合わせにおいて使用することができることがさらに理解されるであろう。一態様では、本明細書において記載する方法及び組成物は、化学療法、放射線療法、癌ワクチン、或いは１つ又は複数の追加の治療薬剤、或いは前記のいずれかとの組み合わせにおいて投与する。本発明の方法及び組成物との組み合わせにおいて投与することができる例示的な治療用薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＴＧＦＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、Ｓｉｇｌｅｃｓ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳリガンド、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−１、Ｂ７  −２、ＶＩＳＴＡ、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２４４、ＣＤ４８、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲファミリメンバー、ＫＩＲ、ＩＬＴ、ＬＩＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＤＯ、ＴＧＦβ、アデノシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＬＦＡ−２、ＬＦＡ−３、ＢＡＦＦＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ２４、ＣＤ３９、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ホスファチジルセリン、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ４７、ＶＥＧＦ、及びニューロピリンを含む。
【００７３】
本発明はさらに、免疫応答を増強するための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物の使用に関する。特に、本発明は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物の使用に関する。
【００７４】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害するための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物の使用に関する。
【００７５】
本発明はまた、少なくとも１つのＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物の使用に関する。いくつかの好ましいが、しかし、非限定的な疾患、障害、又は状態が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００７６】
特に、本発明は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物の使用に関する。
【００７７】
本発明はまた、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物の使用に関する。
【００７８】
本発明はまた、癌の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いは本発明の組成物に関し、それにおいて、癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍より選択される。
【００７９】
ポリペプチド及び組成物の他の態様、利点、適用、及び使用は、本明細書におけるさらなる開示から明らかになるであろう。いくつかの文書を本明細書の本文を通して引用する。本明細書において引用する文書（全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、説明書などを含む）の各々が、上記又は下記を問わず、それらの全体における参照により、本明細書により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
図１Ａ〜１Ｄ：マウスＧＩＴＲ（Ａ）、ヒトＧＩＴＲ（Ｂ）、又はカニクイザルＧＩＴＲ（Ｃ）で安定にトランスフェクトされたFlp-In（商標）２９３細胞の及び活性化Ｔ細胞（Ｄ）の品質管理。ＭＦＩ値（平均蛍光強度）を各々の細胞株についてプロットする。二次抗体のみ（即ち、抗ＧＩＴＲ抗体なし）での検出を「／」で示す。
図２Ａ〜２Ｂ：活性化ヒトＴ細胞（Ａ〜Ｂ）上に発現されたヒトＧＩＴＲへの一価抗ＧＩＴＲナノボディの用量依存的結合。ＭＦＩ値（平均蛍光強度）をナノボディの濃度に対してプロットする。
図３：ＨＥＫ２９３＿ＮＦｋＢ−Ｎｌｕｃ２ＰヒトＧＩＴＲ細胞への多価抗ＧＩＴＲナノボディ及び無関係なナノボディ（ＩＲＲ０００７７）の用量依存性結合。ＭＦＩ値（平均蛍光強度）をナノボディの濃度に対してプロットする。
図４Ａ〜４Ｄ：ヒトＧＩＴＲを発現するGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293ルシフェラーゼレポーター細胞におけるＧＩＴＲ活性化。活性化は、発光を測定することにより評価する。ＲＬＵ値（相対光単位）をナノボディの濃度に対してプロットする。
図５Ａ〜５Ｆ：Ｔ細胞活性化に対するＧＩＴＲ活性化の効果。各々のプレート上で、１つのナノボディ構築物及びヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）（R&D Systems 6987-GL-025/CF）の濃度範囲を試験した。各々のグラフは、１つのプレートから回収したデータを表す。活性化は、ＩＦＮ−γ発現をモニターすることにより測定する。
図６Ａ〜６Ｄ：ヒトＧＩＴＲ（Ａ〜Ｄ）を発現するGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293ルシフェラーゼレポーター細胞で評価したナノボディ構築物のリンカー長の効果。構築物Ａ０２３１０００３２及びＡ０２３１０００３５には、９ＧＳリンカーにより連結されたＡ０２３１００５Ａ０３ナノボディ（ファミリー７）がある。構築物Ａ０２３１０００３４及びＡ０２３１０００２２には、３５ＧＳリンカーにより連結されたＡ０２３１００５Ａ０３ナノボディがある。構築物Ａ０２３１０００４５、Ａ０２３１０００８２、及びＡ０２３１０００８５には、３Ａリンカーにより連結されたＡ０２３１００４Ｂ０１ナノボディ（ファミリー２６）がある。構築物Ａ０２３１０００８３及びＡ０２３１０００８４には、９ＧＳリンカーにより連結されたＡ０２３１００４Ｂ０１ナノボディがある。構築物Ａ０２３１０００１４には、３５ＧＳリンカーにより連結されたＡ０２３１００４Ｂ０１ナノボディがある。
図７：ナノボディ−ヒトＩｇＧ１キメラの模式図。
図８Ａ〜８Ｎ：ＤＴＡ−１（図８Ａ）；ＤＴＡ−１＋抗ＰＤ−１ｍＡｂ（図８Ｂ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ用量レベル１（図８Ｃ）；無関係なＮＢ用量レベル１（図８Ｄ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ用量レベル２（図８Ｅ）；無関係なＮＢ用量レベル２（図８Ｆ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ用量レベル１＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図８Ｇ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ用量レベル２＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図８Ｈ）；無関係なＮＢ用量レベル１＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図８Ｉ）；無関係なＮＢ用量レベル２＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図８Ｊ）；抗ＧＩＴＲ  Ｎｂ−ラットＩｇＧ２ｂキメラ（図８Ｋ）；抗ＧＩＴＲ  Ｎｂ−ヒトＩｇＧ１キメラ（図８Ｌ）；抗ＧＩＴＲ  Ｎｂ−ヒトＩｇＧ１キメラ＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図８Ｍ）及び媒質（図８Ｎ）で処置したマウスの群における腫瘍容積の変化により測定した抗腫瘍活性に対する、単独で、又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの組み合わせでの異なる試験化合物の効果。ＣＲは完全退縮を示す。
図９Ａ〜９Ｄ：処置の経過の間での生存に対する、単独で、又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの組み合わせにおける異なる試験化合物の効果。
図１０Ａ〜１０Ｃ：Ｔ細胞活性化アッセイで評価した抗ＧＩＴＲナノボディのインビトロベンチマーク。各々のプレート上で、１つのナノボディ構築物及び臨床段階の３６Ｅ５  ｍＡｂの濃度範囲を試験した。各々のグラフは、１つのプレートから回収したデータを表す。活性化を、ＩＦＮ−γ発現をモニターすることにより測定する。
図１１：ＯＶＡ初回免疫後の第１３日目、及び第１４日目の追加免疫後の第２１日目の、抗ＯＶＡ総ＩｇＧ力価として測定した抗ＧＩＴＲ多価ナノボディＡ０２３１０００３５及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラ（Ａ−０２３１−００＿ＴＰ００８）のアジュバント効果。ＳＤＬ１：単一用量レベル１（０日目及び１４日目）；ＳＤＬ２：単一用量レベル２（０日目及び１４日目）；ＲＤ１：反復投薬計画１（０日目及び１４日目に開始して２日毎に１回の注射で３回注射、Ｑ２Ｄｘ３）；ＲＤ２：反復投薬計画２（２日毎に１回で１１回注射、Ｑ２Ｄｘ１１）。
図１２Ａ〜１２Ｄ：ヒトＧＩＴＲを発現するGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293ルシフェラーゼレポーター細胞における多価配列最適化ナノボディによるＧＩＴＲ活性化。活性化は、発光を測定することにより評価する。ＲＬＵ値（相対光単位）をナノボディの濃度に対してプロットする。
図１３Ａ〜１３Ｇ：Ｔ細胞活性化に対する多価配列最適化ナノボディによるＧＩＴＲ活性化の効果。各々のプレート上で、１つのナノボディ構築物及びヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）（R&D Systems 6987-GL-025/CF）の濃度範囲を試験した。各々のグラフは、１つのプレートから回収したデータを表す。活性化は、ＩＦＮ−γ発現をモニターすることにより測定する。
図１４Ａ〜１４Ｏ：媒質（図１４Ａ）；ＤＴＡ−１（図１４Ｂ）；  ＤＴＡ−１＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図１４Ｃ）；ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照（図１４Ｄ）；ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照＋抗ＰＤ−１（図１４Ｅ）；無関係なＮＢ（図１４Ｆ）；無関係なＮＢ＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図１４Ｇ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ  Ａ０２３１００１０１（図１４Ｈ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ  Ａ０２３１００１０１＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図１４Ｉ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ  Ａ０２３１００１０７（図１４Ｊ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ  Ａ０２３１００１０７＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図１４Ｋ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ  Ａ０２３１００１１８（図１４Ｌ）；抗ＧＩＴＲ  ＮＢ  Ａ０２３１００１１８＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（図１４Ｍ）；抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラ（図１４Ｎ）；抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラ＋抗ＰＤ−１ｍＡｂ（図１４Ｏ）で処置したマウス群（図１４Ａ）における経時的な腫瘍容積の変化により測定した抗腫瘍活性に対する、単独で、又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの組み合わせでの異なる試験化合物の効果。ＣＲは完全退縮を示す。
図１５Ａ〜１５Ｂ：処置の経過の間での生存に対する、単独で、又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの組み合わせでの異なる試験化合物の効果。
【００８１】
詳細な説明
定義
【００８２】
他に示さない又は定義しない限り、使用する全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは、当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd.Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、F. Ausubelら（Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987）、Lewin（Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985）、Oldら（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981）；Roittら（Immunology (6th. Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001）、Roittら（Roitt's Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001）、及びJanewayら（Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005）、ならびに本明細書に引用する一般的な背景技術を参照する。
【００８３】
他に示さない場合、具体的に詳細に記載していない全ての方法、工程、技術、及び操作を実施することができ、それ自体が公知の様式において実施されており、当業者に明かであろう通りである。例えば、ここでも、標準的なハンドブック及び本明細書において言及する一般的な背景技術、並びに本明細書において引用するさらなる参考文献を；ならびに、例えば、以下のレビュー、Presta（Adv. Drug Deliv. Rev.  58 (5-6): 640-56, 2006）、Levin and Weiss（Mol. Biosyst.  2(1): 49-57, 2006）、Irvingら（J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001）、Schmitzら（Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000）、Gonzalesら（Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005）を参照し、それらは、タンパク質工学のための技術、例えば親和性成熟ならびにタンパク質（例えば免疫グロブリンなど）の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術などを記載する。
【００８４】
本明細書において使用する用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、又は「タンパク質配列」などの用語において）、一般的に、文脈がより限定された解釈を要求しない限り、関連するアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解すべきである。
【００８５】
アミノ酸残基を標準的な３文字又は１文字のアミノ酸コードに従って示す。ＷＯ０８／０２００７９の４８頁の表Ａ−２を参照する。
【００８６】
核酸又はアミノ酸は、例えば、それが得られた反応媒質又は培養媒質と比較し、それが、通常は、前記の供給源又は媒質中で関連付けられる少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、又は少なくとも１つの汚染物、不純物、もしくは微量成分から分離されている場合、「（本質的に）単離された（形態）（中）」であると考えられる。特に、核酸又はアミノ酸は、それが、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、及び１０００倍まで又はそれ以上精製されている場合、「（本質的に）単離された」を考える。「（本質的に）単離された形態中」である核酸又はアミノ酸は、好ましくは本質的に均質であり、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術など、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などを使用して決定される通りである。
【００８７】
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を、別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列をそれぞれ「含む」、又は別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「から本質的になる」と言う場合、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、最初に言及したヌクレオチド配列又はアミノ酸配列中にそれぞれ組み入れられていることを意味するが、しかし、より通常は、これは、一般的に、最初に言及したヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、その配列内に、最初に言及した配列が、実際にどのように生成された又は得られたかとは無関係に、同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ後者の配列として有するヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチをそれぞれ含むことを意味する。非限定的な例を用いて、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言う場合、これは、前記の免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列中に組み入れられていることを意味しうるが、しかし、より通常は、これは、一般的に、本発明のポリペプチドが、その配列内に、前記の本発明のポリペプチドがどのように生成された又は得られたかとは無関係に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸配列又はヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むと言う場合、最初に言及した核酸配列又はヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例、ポリペプチド）中に発現される場合、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、前記の発現産物の部分を形成する（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及した、より大きな核酸配列又はヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム中にある）。
【００８８】
「から本質的になる」により、本発明の方法において使用する免疫グロブリン単一可変ドメインが、本発明のポリペプチドと厳密に同じある、又は、限定された数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基など、例えば、１〜１０アミノ酸残基及び、好ましくは１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、又は６アミノ酸残基（免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端に、カルボキシル末端に、又はアミノ末端及びカルボキシル末端の両方に加えられている）などを有する本発明のポリペプチドに対応することを意味する。
【００８９】
２つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを、［第２ヌクレオチド配列中の対応する位置でのヌクレオチドと同一である第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を、［第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］により割り、［１００%］により乗じることにより算出してもよく、それにおいて、第２ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１ヌクレオチド配列と比較し）は、単一ヌクレオチド残基（位置）での違いとして考えられる。あるいは、２つ又はそれ以上のヌクレオチド配列の間での配列同一性の程度は、配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズム（例えばNCBI Blast v2.0など）を使用し、標準的な設定を使用して算出してもよい。配列同一性の程度を決定するためのいくつかの他の技術、コンピューターアルゴリズム、及び設定は、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＥＰ０９６７２８４、ＥＰ１０８５０８９、ＷＯ００／５５３１８、ＷＯ００／７８９７２、ＷＯ９８／４９１８５、及びＧＢ２３５７７６８において記載されている。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のヌクレオチドを伴うヌクレオチド配列を「第１」ヌクレオチド配列として取るが、他のヌクレオチド配列を「第２」ヌクレオチド配列として取る。
【００９０】
２つ又はそれ以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」（また、本明細書において「アミノ酸同一性」として言及する）のパーセンテージを、［第２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸残基と同一である第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］により割り、［１００%］により乗じることにより算出してもよく、それにおいて、第２アミノ酸配列中のアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１アミノ酸配列と比較し）は、単一アミノ酸残基（位置）での違いとして、即ち、本明細書において定義する「アミノ酸の違い」として考えられる。あるいは、２つのアミノ酸配列の間での配列同一性の程度を、公知のコンピューターアルゴリズム（例えば、ヌクレオチド配列についての配列同一性の程度を決定するための、上に言及するものなど）を使用し、再び標準的な設定を使用して算出してもよい。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を伴うアミノ酸配列を「第１」アミノ酸配列として取り、他のアミノ酸配列を「第２」アミノ酸配列として取る。
【００９１】
また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れうるが、それは、一般的に、アミノ酸残基が、同様の化学的構造の別のアミノ酸残基を用いて置換されており、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対する影響がほとんどない又は本質的にないアミノ酸置換として記載することができる。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野において、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＧＢ２３５７７６８、ＷＯ９８／４９１８５、ＷＯ００／４６３８３、及びＷＯ０１／０９３００から周知であり；ならびに、そのような置換の（好ましい）型及び／又は組み合わせは、ＷＯ０４／０３７９９９ならびにＷＯ９８／４９１８５からの及び本明細書において引用するさらなる参考文献からの関連のある教示に基づいて選択してもよい。
【００９２】
そのような保存的置換は、好ましくは、それにおいて、以下の群（ａ）−（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸により置換されている置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｂ）極性、負に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；（ｃ）極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに；ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；  ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎに又はＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに、又はＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに、又はＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに、又はＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；並びに／或いはＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに、又はＬｅｕに。
【００９３】
本明細書において記載するポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、また、Schulzら（Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978）により開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸バリエーションの頻度の分析に、Chou and Fasman（Biochemistry 13: 211, 1974;Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978）により開発された潜在能を形成する構造の分析に、ならびにEisenbergら（Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984;Kyte & Doolittle;J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981）、及びGoldmanら（Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986）により開発されたタンパク質における疎水性パターンの分析に基づきうる（全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。ナノボディの一次、二次、及び三次構造に関する情報を、本明細書における記載において及び上に引用する一般的な背景技術において与える。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造は、例えば、Desmyterら（Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803, 1996）、Spinelliら（Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996）；及びDecanniereら（Structure, Vol. 7, 4, 361, 1999）により与えられる。従来のＶＨドメインにおいて、ＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換をこれらの位置で形成するアミノ酸残基の一部に関するさらなる情報を、上に引用する先行技術において見出すことができる。
【００９４】
アミノ酸配列及び核酸配列は、それらが、それらの全長にわたり１００%配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する場合、「厳密に同じ」であると言う。
【００９５】
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸の違い」は、第２配列と比較した、第１配列の位置での単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１、２、又はそれ以上のそのようなアミノ酸の違いを含むことができることが理解されている。
【００９６】
「アミノ酸の違い」は、任意の１、２、３、又は最大４つの置換、欠失、もしくは挿入、又はそれらの任意の組み合わせでありうるが、それは、本発明のポリペプチドの特性を改善する、或いは、本発明のポリペプチドの所望の特性から又は所望の特性のバランスもしくは組み合わせから少なくとも過剰を減じない。この点において、結果として得られる本発明のポリペプチドは、１つ又は複数のＣＤＲ配列を含むが、１、２、３、又は最大４つの置換、欠失、もしくは挿入を伴わないポリペプチドと比較し、同じ、ほとんど同じ、又はより高い親和性を伴い、ＧＩＴＲに少なくとも結合すべきであり、前記親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴により測定される。
【００９７】
例えば、及び、本発明のポリペプチドを発現させるために使用する宿主生物に依存し、そのような欠失及び／又は置換は、翻訳後修飾のための１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位など）を除去するように設計されうるが、当業者の能力内であろう。
【００９８】
本明細書において使用する「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」、又は「ファミリー」は、同一の長さを有する（即ち、それらの配列内に同じ数のアミノ酸を有する）ナノボディ及び／又はＶＨＨ配列の群を指し、そのうち８位と１０６位（カバット番号付けに従う）の間のアミノ酸配列は、８９%又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９９】
用語「エピトープ」及び「抗原決定基」は、それらを互換的に使用することができ、抗原結合分子（例えば免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又は本発明のポリペプチドなど）により、さらに特に、前記分子の抗原結合部位により認識される、巨大分子（例えばポリペプチド又はタンパク質など）の部分を指す。エピトープは、免疫グロブリンのための最小結合部位を定義し、このように、免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
【０１００】
エピトープを認識する抗原結合分子の部分（例えば免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又は本発明のポリペプチドなど）を「パラトープ」と呼ぶ。
【０１０１】
特定のエピトープ、抗原、又はタンパク質（又は、その少なくとも１つの部分、フラグメント、又はエピトープについて）「に結合する」又は「に特異的に結合する」ことができる、「について親和性を有する」及び／又は「について特異性を有する」ポリペプチド（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は、一般的に、抗原結合分子もしくはそのフラグメントなど）は、前記エピトープ、抗原、又はタンパク質「に対する」又は「に対して向けられた」と言われ、或いは、そのようなエピトープ、抗原、又はタンパク質に関して、「結合」分子である、或いは「抗」エピトープ、「抗」抗原、又は「抗」タンパク質（例、「抗」ＧＩＴＲ）であると言う。
【０１０２】
用語「特異性」は、ＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６ページのパラグラフｎ）において、それに与えられる意味を有する；及び、本明細書において言及する通り、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）が結合することができる異なる型の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、ＷＯ０８／０２００７９（参照により本明細書中に組み入れられる）の５３〜５６ページに記載される通り、親和性及び／又は結合力に基づいて決定することができ、それには、また、抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）と関連抗原の間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術が記載されている。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）は、それらの抗原に、１０−５〜１０−１２モル／リットル又はそれ以下、及び、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル又はそれ以下、及び、好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）を伴い（即ち、１０５〜１０１２リットル／モル又はそれ以上、及び、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル又はそれ以上、及び、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）を伴い）結合しうる。１０−４モル／リットルより大きい任意のＫＤ値（又は１０４Ｍ−１より低い任意のＫＡ値）は、一般的に、非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、所望の抗原に、親和性５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば、例、１０nMと５nM又はそれ以下の間などを伴い結合する。抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的な結合は、それ自体が公知の任意の適切な様式（例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイなど）及び当技術分野において公知のその異なる変法；ならびに本明細書において言及する他の技術において決定することができる。当業者に明かであろう通り、及びＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６ページに記載される通り、解離定数は、実際の又は見かけ上の解離定数でありうる。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであろうが、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６ページに言及される技術を含む。
【０１０３】
免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、第１抗原に、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２標的又は抗原に結合する親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、及び、好ましくは、少なくとも１０００倍又はそれ以上良い親和性（上に記載する通りで、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度、及び／又はＫｏｎ速度として適切に表現される）で結合する場合、第２標的又は抗原と比較し、第１標的又は抗原について「特異的」であると言う。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２標的又は抗原に結合するＫＤよりも、少なくとも１０倍少ない、例えば少なくとも１００倍少ない、及び、好ましくは、少なくとも１０００倍少ない又はそれよりさらに少ないＫＤ値を伴い第１標的又は抗原に結合しうる。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドが、第２標的又は抗原と比較し、第１標的又は抗原に「特異的」である場合、それは、前記の第１標的又は抗原に対して向けられるが（本明細書において定義する通り）、しかし、前記の第２標的又は抗原に対しては向けられない。
【０１０４】
用語「（交差）遮断する」、「（交差）遮断した」、「（交差）遮断している」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合している」、及び「（交差）競合」を本明細書において互換的に使用し、所与の標的への他の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合剤の結合と干渉する、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤の能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤が、標的への別のものの結合と干渉することができる程度、及び、従って、それが、本発明に従って交差遮断すると言うことができるか否かは、競合結合アッセイを使用して決定することができる。特に適切な定量的交差遮断アッセイを実施例に記載しており、例えば、  細胞上に発現されたＧＩＴＲを用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイを含む。（交差）遮断の程度は、（低下した）チャネル蛍光により測定することができる。
【０１０５】
以下では、一般的に、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤が、本発明に従って交差遮断する又は交差遮断することが可能であるか否かを決定するための適切なＦＡＣＳアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤のいずれかと使用することができることが理解されるであろう。ＦＡＣＳ機器（例、FACS Canto；Becton Dickinson）を製造業者の推奨に沿って操作する。
【０１０６】
ＧＩＴＲに結合するための２つの結合剤（例えば、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はナノボディ）の間の「（交差）遮断」又は「（交差）競合」を評価するために、ＦＡＣＳ競合実験を、ヒトＧＩＴＲを過剰発現する細胞（例えばFlp-In（商標）−２９３細胞など）及びバックグラウンド細胞株としての親細胞を使用して実施することができる。異なる検出試薬を使用することができ、モノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｆ１８０４）、モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号ＷＨ０００４６０９Ｍ２）、モノクローナル抗ＨＩＳタグ抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号ＳＡＢ１３０５５３８）を含み、各々が異なって標識されている。広範囲のフルオロフォアをフローサイトメトリーにおいて標識として使用することができる（例えばＰＥ（Ｒフィコエリトリン）、７アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、アクリジンオレンジ、種々の形態のアレクサフルオロ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡｍＣｙａｎ、アミノクマリン、ＡＰＣ  Ｃｙ５、ＡＰＣ  Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７、ＡＰＣ／アレクサフルオロ７５０、ＡｓＲｅｄ２、アザミグリーン、アズライト、Ｂ  ＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５セラミド、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、ビス−オキソノールＤｉＢＡＣ２（３）、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、カルセイン、カルセインＡＭ、カロキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、カスケードブルー、カスケードイエロー、細胞トラッカーグリーン、セルリアン、ＣＦＳＥ、クロモマイシンＡ３、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、ＣＹ３．５、ＣＹ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＣｙＰｅｔ、ＤＡＦ−ＦＭ  ＤＡＦ−ＦＭジアセテート、ＤＡＰＩ、ＤＣＦＨ（２’７’ジクロロジヒドロフルオレセイン）、ＤＨＲ、ジヒドロカルセインＡＭ、ジヒドロローダミン、ジヒドロチジウム、ＤｉＬＣ１（５）、ＤｉＯＣ６（３）、ＤｉＯＣ７（３）、ｄＫｅｉｍａレッド、ＤＲＡＱ５、ドロンパグリーン、種々の形態のＤｓＲｅｄ  ｄＴｏｍａｔｏ、種々の形態のＤｙＬｉｇｈｔ、  大腸菌生体粒子ＡＦ４８８、Ｅ２−クリムゾン、Ｅ２−オレンジ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、種々の形態のｅＦｌｕｏｒ、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ＊、エメラルド、ｅｑＦＰ６５０、ｅｑＦＰ６７０、ＥＲ−トラッカーブルーホワイトＤＰＸ、エチジウムブロマイド、エクスプレス２、ＥＹＦＰ、Ｆｃ  ＯｘｙＢｕｒｓｔグリーン、Ｆｃ  ＯｘｙＢｕｒｓｔグリーン１２３、ＦＩＴＣ、フルオ−３、フルオ−４、フルオレセイン、フラ−２、フラ−レッド、ＧＦＰｕｖ、Ｈ２ＤＣＦＤＡ、ＨｃＲｅｄ１、ヘキストブルー（３３２５８）、ヘキストレッド（３３３４２）、ヒドロキシクマリン、ＨｙＰｅｒ、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−１ブルー（低Ｃａ２＋）、Ｉｎｄｏ−１バイオレット（高Ｃａ２＋）、ｉＲＦＰ、Ｊレッド、ＪＣ−１、ＪＣ−９、Ｋａｔｕｓｈｋａ（ＴｕｒｂｏＦＰ６３５）、Ｋａｔｕｓｈｋａ２  Ｋｕｓａｂｉｒａ−オレンジ、ＬＤＳ７５１、リサミンローダミンＢ、種々の形態の生／死、ルシファーイエロー、ルシファーイエローＣＨ、ライソトラッカーブルー、ライソトラッカーグリーン、ライソトラッカーレッド、ｍＡｍｅｒｔｒｉｎｅ、マリーナブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣＦＰ��ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、メトキシクマリン、ｍＨｏｎｅｙＤｅｗ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ミトラマイシン、ミトトラッカーディープレッド、ミトトラッカーグリーン、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーレッド、ミトフロアグリーン、ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）、ｍＫａｔｅ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｉｍａ−レッド、ｍＫＯ、ｍＫＯｋ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、モノクロロビメン、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ１、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴａｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴＦＰ１、ｍＴＦＰ１（ティール）、ＮＢＤ、ＯｘｙＢｕｒｓｔグリーンＨ２ＤＣＦＤＡ、ＯｘｙＢｕｒｓｔグリーンＨ２ＨＦＦ  ＢＳＡ、パシフィックブルー、ＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）、ＰＥ  Ｃｙ５、ＰＥ  Ｃｙ５．５、ＰＥ  Ｃｙ７、ＰＥテキサスレッド、ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル（ｃｈｌｏｒｐｈｙｌｌ）タンパク質）、ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、種々の形態のＱｄｏｔ、レッド６１３、ＲＦＰトマト、Ｒｈｏｄ−２、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、  Ｓ６５Ｔ、一重項酸素センサーグリーン、シリウス、ＳＮＡＲＦ、スーパーフォルダーＧＦＰ、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、Ｔ−サファイア、ＴａｇＢＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、テキサスレッド、チアゾールオレンジ、ＴＭＲＥ、ＴＭＲＭ、トパーズ、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＲＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ  ＴｒｕＲｅｄ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ビーナス、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣｙｃｌｅＤｙｅバイオレット、野生型ＧＦＰ、Ｘ−ローダミン、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、ＹＯＹＯ−１、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｚｙｍｏｓａｎ  Ａ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ  ＡＦ４８８（詳細はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｆｃｎ．ｏｒｇ／ｆｌｏｗ−ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓを参照のこと）。フルオロフォア、又は単純に「フルオ」は、典型的には、ＧＩＴＲを認識する抗体（例、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディなど）又は検出試薬として使用される抗体に付着させる。種々のコンジュゲート抗体、例えば（限定しないが）Alexa Fluor（登録商標）、DyLight（登録商標）、ローダミン、ＰＥ、ＦＩＴＣ、及びＣｙ３にコンジュゲートされた抗体などを利用可能である。各々のフルオロフォアは、特徴的なピーク励起及び発光波長を有する。使用することができる標識の組み合わせは、フルオロフォアを励起するために使用されるランプ又はレーザーの波長及び利用可能な検出器に依存する。
【０１０７】
ＧＩＴＲへの結合のための２つの試験結合剤（Ａ及びＢと呼ぶ）の間での競合を評価するために、コールド（標識を伴わない）結合剤Ａの希釈系列を、標識結合剤Ｂ＊と一緒に細胞に加える。試験混合物中の結合剤Ｂ＊の濃度は、細胞上に発現されたＧＩＴＲ上の結合部位を容易に飽和させるだけ高くなければならない。細胞上に発現されたＧＩＴＲ上のその結合剤のための結合部位を飽和させる結合剤Ｂ＊の濃度は、ＧＩＴＲ細胞上の結合剤Ｂ＊の滴定系列及び結合のためのＥＣ５０値での決定により決定することができる。飽和濃度で作用するために、結合剤Ｂ＊をＥＣ５０濃度の１００×で使用することができる。
【０１０８】
結合剤Ａ及び結合剤Ｂ＊の混合物と細胞のインキュベーション及び細胞の洗浄後、読み出しをＦＡＣＳ上で実施することができる。最初に、散乱プロファイルから決定したインタクト細胞上にゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
【０１０９】
結合剤Ｂ＊の別々の溶液も調製する。この溶液中の結合剤Ｂ＊は、（結合剤Ａ及びＢ＊を用いた）試験混合物中と同じ緩衝液中で、及び同じ濃度である。この別々の溶液も細胞に加える。インキュベーション及び細胞洗浄後、読み取りをＦＡＣＳ上で実施することができる。最初に、散乱プロファイルから決定したインタクト細胞上にゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
【０１１０】
結合剤Ｂ＊の別々の溶液とインキュベートした細胞での蛍光と比較した、結合剤Ａ及びＢ＊の混合物とインキュベートした細胞での蛍光の低下は、結合剤Ａによって、細胞上に発現されたＧＩＴＲへの結合のための結合剤Ｂ＊による結合が（交差）遮断されることを示す。
【０１１１】
本発明に従った交差遮断する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤は、上記のＦＡＣＳ交差遮断アッセイにおいてＧＩＴＲに結合し、アッセイの間に、及び第２の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤の存在において、記録された蛍光が最大蛍光（別々の標識された免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤について測定）の８０%〜０．１%の間（例、８０%〜４%）、具体的には最大蛍光の７５%〜０．１%の間（例、７５%〜４%）、より具体的には最大蛍光（ちょうど上で定義した通り）の７０%〜０．１%の間（例、７０%〜４%）にあるようにするものである。
【０１１２】
ＧＩＴＲへの結合のための２つの試験結合剤（Ａ＊及びＢ＊と呼ぶ）間の競合は、各々が異なるフルオロフォアで標識された両方の結合剤をＧＩＴＲ発現細胞に加えることにより評価することもできる。インキュベーション及び細胞洗浄後、読み取りをＦＡＣＳ上で実施することができる。各々のフルオロフォアについてゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。フルオロフォアの１つの蛍光の低下及び／又は非存在は、細胞上に発現されたＧＩＴＲへの結合のための結合剤による（交差）遮断を示す。
【０１１３】
標的（交差）遮断に対して向けられる免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合剤が、本明細書において定義するように（交差）遮断することが可能である、競合的に結合する、又は（交差）競合的であるか否かを決定するための方法は、例えば、Xiao-Chi Jiaら（Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004）、Millerら（Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011）、及び／又は本明細書において記載する方法（例、実施例７を参照のこと）に記載されている通りである。
【０１１４】
アミノ酸配列は、２つの異なる抗原又は抗原決定基（例えば２つの異なる種の哺乳動物からの血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミン、例えば異なる種の哺乳動物からのＧＩＴＲなど）について「交差反応性」であると言う（それが、これらの異なる抗原又は抗原決定基の両方について特異的（本明細書において定義する通り）である場合）。
【０１１５】
用語「グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体」は、本明細書において後に「ＧＩＴＲ」として言及し、腫瘍壊死性受容体スーパーファミリー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、活性化誘導性ＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ）、ＴＥＡＳＲ、ＣＤ３５７、及び３１２Ｃ２としても公知である。ＧＩＴＲは、全てのＴ細胞サブタイプ及び大半の調節性Ｔ細胞において構成的に発現され、ＴＣＲ刺激及び細胞活性化に続いて、ＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋ＣＤ２５−エフェクター細胞において上方調節される（Nocentini et al. 2007, Eur J Immunol. 37:1165-1169）。ＧＩＴＲは、エフェクターＴ細胞の活性化において共刺激分子として作用し、Ｔｒｅｇ細胞抑制活性を調節する（Esparza et al. 2005, J Immunol. 174:7869-7874）。
【０１１６】
本発明の文脈において、「増強している」又は「増強するために」とは、一般的に、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイ、又はインビボアッセイ（例えば本明細書において言及されるものなど）を使用して測定されるＧＩＴＲの活性を増加、増強、又は刺激することを意味する。特に、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイ、又はインビボアッセイ（例えば本明細書において言及されるものなど）を使用して測定されたＧＩＴＲの活性を、同じ条件下での同じアッセイ（しかし、本発明のポリペプチドの存在を伴わない）におけるＧＩＴＲの活性と比較し、少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などだけ増加又は増強させる。
【０１１７】
２つの化合物の「相乗効果」は、２つの薬剤の組み合わせの効果がそれらの個々の効果の合計よりも大きく、好ましくは対照及び単一薬物と統計的に異なるものである。
【０１１８】
本明細書において使用する用語「Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患」は、Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞（例、ＣＤ８＋細胞）及びヘルパーＴ細胞（例、ＣＤ４＋細胞）を含む）、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞により媒介される任意の疾患を指す。
【０１１９】
「ＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態」は、本明細書に記載のアゴニストＧＩＴＲポリペプチドの使用を介してＧＩＴＲ活性を誘導、刺激、又は増強することにより処置可能な疾患に関連する疾患又は症状を指す。例示的なＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態には、癌及び感染性疾患が含まれるが、これらに限定しない。
【０１２０】
本明細書において使用する「アゴニスト」は、インビトロ又はインビボで対応する標的（例、ＧＩＴＲ）の１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に増加、増強、誘発、又は刺激する化合物を指す。そのようなＧＩＴＲの生物学的活性の例には、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存、増殖、ＮＦ−κＢシグナル伝達、インターロイキン−２産生、及びエフェクター機能の促進、ならびにＴｒｅｇ細胞の抑制効果の抑制又はＴｒｅｇ細胞の生成が含まれる。当業者には明らかであるように、生物学的活性のこのような増加は、任意の適切な様式で、及び／又はそれ自体が公知の任意の適切な（インビトロ、細胞、又はインビボ）アッセイ、例えば本明細書において記載する、又は本明細書において引用する先行技術におけるアッセイなどを使用して決定してもよい。特に、生物学的活性を、同じ条件下での同じアッセイ（しかし、本発明のポリペプチドの存在を伴わない）における生物学的活性と比較し、少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などだけ増加させうる。
【０１２１】
完全アゴニストは、最大受容体刺激（機能的応答）が可能であり、即ち、それらは、受容体の内因性リガンドと実質的に同じレベルの完全応答を誘発する（Ｅ  ＝  Ｅｍａｘ  ＝  １００%）。本明細書において、用語「実質的に同じ」は、試験化合物の有効性が、同じ実験設定で測定し、１００%に設定した前記の内在性リガンドの最大有効性と比較し、７０%〜１５０%、より好ましくは８０%〜１４０%、例えば９０%〜１２０%の範囲である。
【０１２２】
部分アゴニストは、飽和濃度でも受容体の最大活性を誘発することはできない。換言すれば、標的分子（例、ＧＩＴＲ）の完全アゴニストにより産生される機能的応答の最大の大きさは、部分アゴニストの投与量を増加させても、同じ標的分子の部分アゴニストにより産生することはできない。
【０１２３】
用語「免疫応答を増強する」及び「免疫応答を誘導する」は、本明細書において互換的に使用され、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のいずれかの１つ又は複数の細胞応答の活性化、刺激、又は増殖をもたらすプロセスを指す。本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を誘導することが可能である。Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞の活性化を測定するための適切なアッセイが本明細書において記載する当技術分野において公知であり、例えば、Buillard et al. 2013, J. Exp. Med. Vol. 210, 9: 1685-1693；Zhou et al. October 2010, J. Immunother. Vol. 33, No 8；及びHanabuchi 2006, Blood, Vol. 107, No 9: 3617-3623にそれぞれ記載されている通りであり、又は以下の実施例に例示する通りである。
【０１２４】
本明細書において使用する用語「腫瘍細胞成長を阻害する」は、インビトロでの腫瘍細胞の増殖又はインビボでの腫瘍成長における任意の測定可能な減少、例えば、少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などだけの減少を含むことを意図する。
【０１２５】
本明細書において使用する用語「効力」は、薬剤（例えばポリペプチド、ＩＳＶＤ、又はナノボディなど）の測定値、その生物学的活性である。薬剤の効力は、例えば実験セクションに記載する通り、当技術分野において公知の任意の適切な方法により決定することができる。細胞培養ベースの効力アッセイは、しばしば、生物活性を決定するための好ましいフォーマットである。なぜなら、それらによって、薬剤により誘発される生理学的応答が測定され、比較的短時間内に結果を生成することができるからである。種々の型の細胞ベースアッセイを、産物の作用機構に基づいて使用することができ、限定しないが、増殖アッセイ、細胞傷害アッセイ、細胞死アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ）、Ｔ細胞活性化アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、及び活性化又はサイトカイン分泌の公知のマーカーの発現を測定するためのアッセイを含み、これらは全て当技術分野において周知である。
【０１２６】
対照的に、本発明のポリペプチドの「効力」によって、効果自体の最高強度が、飽和ポリペプチド濃度で測定される。効力は、本発明のポリペプチドから達成可能な最高応答を示す。それは、所望の（治療的）効果を産生するためのポリペプチドの能力を指す。本発明のポリペプチドの効力は、インビボモデル、例えばＯＶＡ免疫モデル又は同系ＣＴ−２６結腸癌モデル（例えば、実施例のセクションに示す通り）など使用して評価することができる。
【０１２７】
本発明のポリペプチドの半減期は、一般的に、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）において記載される通りに定義することができ、本明細書において言及する通り、ポリペプチドの血清濃度が、インビボで、例えば、自然の機構による、ポリペプチドの分解及び／又はポリペプチドのクリアランスもしくは隔離に起因して５０%だけ低下するために要する時間を指す。本発明のポリペプチドのインビボでの半減期を、それ自体が公知の任意の様式において、例えば薬物動態解析などにより決定することができる。適切な技術が当業者には明らかであろうが、例えば、一般的には、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）において記載される通りでありうる。また、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）において言及される通り、半減期は、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などを使用して表現することができる。例えば、標準的なハンドブック、例えばKennethら（Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986）及びM Gibaldi and D Perron（"Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982）などを参照する。用語「半減期における増加」又は「増加した半減期」は、また、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページのパラグラフｏ）において定義される通りであり、特に、ｔ１／２ベータにおける増加（ｔ１／２アルファ及び／又はＡＵＣ或いは両方における増加を伴う又は伴わない）を指す。
【０１２８】
他に示さない場合、用語「免疫グロブリン」及び「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体に又は従来の４鎖抗体に言及するために使用されるか否かを問わず、一般的な用語として使用され、完全サイズの抗体、その個々の鎖の両方、ならびにその全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（しかし、限定しないが、抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインなど）を含む。
【０１２９】
用語（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」は、本明細書において使用する通り、その三次元構造を、タンパク質の残りに非依存的に保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性に関与し、多くの場合において、他のタンパク質に、タンパク質の及び／又はドメインの残部の機能の喪失を伴わず、加える、除去する、又は移してもよい。
【０１３０】
用語「免疫グロブリンドメイン」は、本明細書において使用する通り、抗体鎖（例えば、例、従来の４鎖抗体の又は重鎖抗体の鎖など）の球状領域、又はそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持する点において特徴付けられ、それは、場合により、保存されたジスルフィド結合により安定化された、２つのベータ−シート中に配置された約７つの逆平行ベータ−ストランドの２層サンドイッチからなる。
【０１３１】
用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書において使用する通り、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、それらは、当技術分野において、及び本明細書において以下に「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及し；それらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断され、  それらは、当技術分野において、及び本明細書において下に、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及する。このように、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下の通りに示すことができる：ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４。抗原結合部位を持つことにより抗原についての抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
【０１３２】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、「単一可変ドメイン」と互換的に使用され、それにおいて、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、及びそれにより形成される分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを、「従来の」免疫グロブリン又はそれらのフラグメントから離れて設定し、それにおいて、２つの免疫グロブリンドメイン、特に、２つの可変ドメインは、相互作用し、抗原結合部位を形成する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は相互作用し、抗原結合部位を形成する。この場合において、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与し、即ち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位形成に含まれうる。
【０１３３】
上の定義の観点において、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子；当技術分野において公知である）の、又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド結合したＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又はそのような従来の４鎖抗体に由来するダイアボディ（全てが当技術分野において公知である）の抗原結合ドメインは、通常は、免疫グロブリン単一可変ドメインとして見なされないであろう。なぜなら、これらの場合において、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は、通常は、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインにより生じないであろうが、しかし、（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽及び重鎖可変ドメインなどの対により、即ち、免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対（それは、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する）により生じうるからである。
【０１３４】
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく、抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨ又はＶＬドメインにより形成される。故に、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３を上回らないＣＤＲにより形成される。
【０１３５】
そのようなものとして、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）もしくはその適切なフラグメント；又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列又はＶＨＨ配列）もしくはその適切なフラグメントでありうる；それが、単一の抗原結合単位（即ち、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位で、単一の抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用して、機能的な抗原結合単位を形成する必要がないようにする）を形成することが可能である限り。
【０１３６】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）である；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列でありうる。
【０１３７】
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（又は、（単一）ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又は、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸）又はナノボディ（本明細書において定義する通りで、しかし、限定しないが、ＶＨＨを含む）；他の単一可変ドメイン、又はそれらの任意の１つの任意の適切なフラグメントでありうる。
【０１３８】
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（登録商標）（本明細書において定義する通り）又はその適切なフラグメントでありうる。［注意：ナノボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N.V.の登録商標である］ナノボディの一般的な記載について、下のさらなる記載に、ならびに本明細書において引用する、例えば、例、ＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）において記載される先行技術を参照する。
【０１３９】
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体としても公知であり、本来は「重鎖抗体」（即ち、「軽鎖を欠く抗体  」；Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されてきた。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」として言及する）及び従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」として言及する）から区別するために選ばれてきた。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる記載については、Muyldermansによるレビュー文献（Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001におけるレビュー）に、ならびに以下の特許出願を参照し、それらは、一般的な背景技術として言及する：Vrije Universiteit BrusselのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、及びＷＯ９６／３４１０３；UnileverのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１、及びＷＯ０２／４８１９３；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、及びＷＯ０３／０５５５２７；Algonomics N.V.及びAblynx N.VのＷＯ０３／０５０５３１；National Research Council of CanadaによるＷＯ０１／９０１９０；Institute of AntibodiesによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；ならびに、Ablynx N.V.によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７、及びＷＯ０６／１２２８２５ならびにＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．によるさらなる公開特許出願。また、これらの出願において言及されるさらなる先行技術に、特に、国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１〜４３ページに言及される参考文献のリストを参照し、それらのリスト及び参考文献を、本明細書において参照により組み入れる。これらの参考文献において記載される通り、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ又は複数における１つ又は複数の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。ナノボディ（ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化を含む）ならびに他の修飾、部分又はフラグメント、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価構築物（リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む）及びナノボディ及びそれらの調製物の半減期を増加させるための異なる修飾のさらなる記載を、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５及びＷＯ０８／１４２１６４において見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な記載について、本明細書において引用する、例えば、例、ＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）において記載される先行技術を参照する。
【０１４０】
「ドメイン抗体」は、また、「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」、及び「ｄＡｂ」（用語「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」は、商標として企業のGlaxoSmithKlineグループにより使用されている）として公知であり、例、ＥＰ  ０３６８６８４、Wardら（Nature 341: 544-546, 1989）、Holtら（Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003）及びＷＯ０３／００２６０９ならびに、例えば、ＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及びDomantis Ltdの他の公開特許出願において記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ哺乳動物、特に、ヒト４鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合ドメインとして（即ち、ＶＬ又はＶＨドメインとそれぞれ対合することなく）エピトープに結合するために、そのような抗原結合特性についての特定の選択（例、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによる）が要求される。ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、完全ヒト配列に由来する場合、約１３〜約１６kDaの分子量を有し、例えば、ヒトにおける治療的使用のためにヒト化を要求しない。
【０１４１】
それらは哺乳動物由来ではないため、本発明の文脈においてあまり好ましくないが、単一変異ドメインが、サメの特定の種に由来しうることにも注目すべきである（例えば、いわゆる、「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば、ＷＯ０５／１８６２９を参照のこと）。
【０１４２】
このように、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」は、非ヒト供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。それらは、以前に記載された通りにヒト化してもよい。さらに、この用語は、非ラクダ供給源、例、マウス又はヒトに由来するポリペプチドを含み、それは「ラクダ化」されており、例、Davies and Riechmann（FEBS 339: 285-290, 1994;Biotechnol. 13: 475-479, 1995;Prot. Eng. 9: 531-537, 1996）及びRiechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）において記載されている通りである。
【０１４３】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基に、Kabatら（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）により与えられるＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従い番号付けし、ラクダからのＶＨＨドメインに適用された通りであり、例えば、Riechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）の図２において示されている通りである。ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けするための代替方法は、その方法は、類似の様式においてＶＨＨドメインにも適用することができ、当技術分野において公知である。しかし、本明細書の記載、特許請求の範囲、及び図において、上に記載する通りにＶＨＨドメインに適用された、Kabatに従ったナンバリングに従うであろう（他に示さない場合）。
【０１４４】
ＶＨドメインについて及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知である通り、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動しうるが、Kabatナンバリングにより示されたアミノ酸残基の総数に対応しないであろう（すなわち、Kabatナンバリングに従った１つ又は複数の位置が、実際の配列において占められないであろう、又は実際の配列が、Kabatナンバリングにより許される数よりも多いアミノ酸残基を含みうる）ことに注意すべきである。これは、一般的に、Ｋａｂａｔに従ったナンバリングが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応しうる又はしないであろうことを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０の範囲中、しばしば、１１２と１１５の間にありうる。しかし、より小さい、及び、より長い配列も、本明細書において記載する目的のために適切でありうることに注意すべきである。
【０１４５】
ＣＤＲ領域の決定は、また、異なる方法に従って行ってもよい。Kabatに従ったＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は位置１〜３０にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は位置３１〜３５にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は位置３６〜４９にアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は位置５０〜６５にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は位置６６〜９４にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は位置９５〜１０２にアミノ酸残基を含み、及びＶＨＨのＦＲ４は位置１０３〜１１３にアミノ酸残基を含む。
【０１４６】
本願では、しかし、ＣＤＲ配列は、Kontermann及びDubel（Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp.33-51, 2010）に従って決定されうる。この方法に従い、ＦＲ１は位置１〜２５にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置２６〜３５にアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６〜４９にアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は位置５０〜５８にアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置５９〜９４にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５〜１０２にアミノ酸残基を含み、及びＦＲ４は位置１０３〜１１３にアミノ酸残基を含む（Kabatのナンバリングに従う）。
【０１４７】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、ヒト化に供することができる。特に、ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、以前のパラグラフにおいて、それについて一般的に定義される免疫グロブリン単一可変ドメインでありうるが、しかし、それにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基（及び特に少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在し、それは、ヒト化置換（本明細書において定義する通り）である及び／又はそれに対応する。潜在的に有用なヒト化置換は、自然に生じるＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換の１つ又は複数（又はそれらの組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に（それ自体が公知で、本明細書においてさらに記載する任意の様式で）導入することができ、結果として生じるＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の簡単さ及びレベルについて、及び／又は他の所望の特性について試験することができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（又はそれらの適切な組み合わせ）は、当業者により、本明細書における開示に基づき決定することができる。また、先述のものに基づき、免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、部分的にヒト化又は完全にヒト化してもよい。
【０１４８】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディなど（ＶＨＨドメイン及びヒト化ＶＨＨドメインを含む）は、また、１つ又は複数の変化を１つ又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列中に導入することによる親和性成熟に供することができ、それらの変化は、それぞれの親分子と比較し、そのそれぞれの抗原についての結果として生じる免疫グロブリン単一可変ドメインの改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟した免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、当技術分野において公知の方法により、例えば、Marksら（Biotechnology 10: 779-783, 1992）、Barbasら（Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994）、Shierら（Gene 169: 147-155, 1995）、Yeltonら（Immunol. 155: 1994-2004, 1995）、Jacksonら（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、Hawkinsら（J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992）、Johnson及びHawkins（Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996）により記載される通りに調製されうる。
【０１４９】
ポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体又はナノボディなどから開始し、また、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマット化する」として言及し；及び、ポリペプチドの作られた部分である免疫グロブリン単一可変ドメインが「フォーマット化」される又は前記ポリペプチド「のフォーマット中」にあると言う。免疫グロブリン単一可変ドメインをフォーマット化することができる方法の例及びそのようなフォーマットの例は、本明細書における開示に基づき、当業者には明らかであろう；及び、そのようなフォーマット化された免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１５０】
例えば、及び限定しないが、１つ又は複数の免疫グロブリン単一可変ドメインを、ポリペプチドの調製のための「結合単位」、「結合ドメイン」、又は「結合ブロック」（これらの用語は互換的に使用される）として使用してもよく、それらは、場合により、結合単位（即ち、ＧＩＴＲ上の同じもしくは別のエピトープに対する及び／又はＧＩＴＲ以外の１つ又は複数の他の抗原、タンパク質、もしくは標的に対する）として役立ちうる１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。
【０１５１】
一価ポリペプチドは、１つだけの結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含む又はそれから本質的になる。２つ又はそれ以上の結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、また、本明細書において「多価」ポリペプチドとして言及するが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位／免疫グロブリン単一可変ドメインは、また、本明細書において「多価」フォーマット中にあるとして言及する。例えば、「二価」ポリペプチドは、場合によりリンカー配列を介して連結された２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうるのに対し、「三価」ポリペプチドは、場合により２つのリンカー配列を介して連結された３つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうるのに対し；「４価」ポリペプチドは、場合により３つのリンカー配列を介して連結された４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうるのに対し；「５価」ポリペプチドは、場合により４つのリンカー配列を介して連結された５つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうるのに対し；「６価」ポリペプチドは、場合により５つのリンカー配列などを介して連結された６つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる、など。
【０１５２】
多価ポリペプチドにおいて、２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは同じもしくは異なりうるが、同じ抗原もしくは抗原決定基に対して（例えば、同じ部分もしくはエピトープに対して、又は異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられうる、或いは、代わりに、異なる抗原もしくは抗原決定基；又はそれらの任意の適切な組み合わせに対して向けられうる。少なくとも１つの結合単位が第１抗原（即ち、ＧＩＴＲ）に対して向けられており、少なくとも１つの結合単位が第２抗原（即ち、ＧＩＴＲとは異なる）に対して向けられている少なくとも２つの結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドはまた、「多特異的」ポリペプチドとして言及しうるが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）は、また、本明細書において、「多特異的フォーマット」中にあるとして言及する。このように、例えば、本発明の「二重特異的」ポリペプチドは、第１抗原（即ち、ＧＩＴＲ）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び第２抗原（即ち、ＧＩＴＲとは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「三重特異的」ポリペプチドは、第１抗原（即ち、ＧＩＴＲ）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、第２抗原（即ち、ＧＩＴＲとは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第３抗原（即ち、ＧＩＴＲ及び第２抗原の両方とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドである。
【０１５３】
「マルチパラトープポリペプチド」、例えば「バイパラトープポリペプチド」又は「トリパラトープポリペプチド」などは、異なるパラトープを各々有する２つ又はそれ以上の結合単位を含む又はそれから本質的になる（本明細書においてさらに記載する通り）。
【０１５４】
ＧＩＴＲアゴニスト
本発明は、ＧＩＴＲ、好ましくはヒトＧＩＴＲについて特異性を有し、及び／又はそれに結合するポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド」としても言及する）を提供する。ＧＩＴＲは、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＥＡＳＲ、又は３１２Ｃ２としても公知であり、ヒトにおいてＴＮＦＲＳＦ１８遺伝子によりコードされるタンパク質であり、Entrez Geneに従って染色体１上の１ｐ３６．３にマッピングされる。本発明のポリペプチドは、好ましくは、ヒトＧＩＴＲ（配列番号２３１）に結合する。
【０１５５】
本発明により提供するポリペプチドは、ＧＩＴＲアゴニストであり、このように、ＧＩＴＲシグナル伝達を誘導、増加、刺激、又は増強することができる。ＧＩＴＲ生物学的経路を活性化することによって、Ｔ細胞の活性化が調節され、免疫応答が増強される。したがって、本発明により提供するポリペプチドは、本明細書においてさらに定義するように、種々の免疫療法的な用途、例えば種々の癌、免疫障害、及び感染性疾患の処置などに使用することができる。
【０１５６】
広範なスクリーニング、特徴付け、及び組み合わせ戦略に基づき、本発明者らは、驚くべきことに、ＧＩＴＲに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドによって、先行技術に記載されるＧＩＴＲアゴニスト分子と比較し、ＧＩＴＲ活性を調節するための改善された特性が示されることを観察した。より具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、本発明のポリペプチドによって、従来技術の抗体と比較し、等効力又はさらに低いＥＣ５０値でより高い効力が示されることを観察した。これは、薬物の有効性がその最大効力に依存するため、臨床的に非常に重要である。
【０１５７】
したがって、本発明は、従来技術のアミノ酸配列及び抗体と比較し、他の有利な特性（例えば、調製の改善された簡単さ、良好な安定性、及び／又は低下した製品のコスト）に加えて、改善された及び望ましい治療的及び／又は薬理学的特性につながる特定の機能特性を伴うＧＩＴＲアゴニストを提供する。
【０１５８】
ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合は、結合アッセイにおいて測定することができる。典型的なアッセイには、ＧＩＴＲが細胞表面（例えばFlp-In（商標）２９３細胞又はGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293細胞など）上に曝露されるアッセイが（限定しないが）含まれる。ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合を測定するための好ましいアッセイは、ＦＡＣＳアッセイであり、例えば、実施例において記載するＦＡＣＳアッセイなどであり、それにおいて、Flp-In（商標）２９３細胞及び／又は活性化Ｔ細胞上に発現されたＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合が決定される。ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合のためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０１５９】
そのようなＦＡＣＳ結合アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−８M又はそれ以下、より好ましくは１０−９M又はそれ以下、又はさらには１０−１０M又はそれ以下、例えば１０−１１MなどのＥＣ５０値を有しうる。例えば、そのようなＦＡＣＳ結合アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−１１M〜１０−８Mの間、例えば１０−９M〜１０−８Mの間、１０−１０M〜１０−９Mの間、又は１０−１１M〜１０−１０Mの間などのＥＣ５０値を有しうる。
【０１６０】
本発明のポリペプチドはＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲの活性を調節する（即ち、増加させる、増強させる、刺激する、又は強める）ことができる。特に、本発明のポリペプチドは、免疫応答を増強しうる。
【０１６１】
したがって、一態様では、本発明は、２００pM未満のＥＣ５０でＧＩＴＲに特異的に結合するポリペプチドに関し、前記ＧＩＴＲへの前記ポリペプチドの結合によって、免疫応答が増強される。特に、本発明のポリペプチドによって、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化が増強される。
【０１６２】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化は、種々のアッセイ（増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、細胞死滅アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ）、Ｔ細胞活性化アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、及び活性化又はサイトカイン分泌の公知のマーカーの発現を測定するためのアッセイを含むが、これらに限定しない）により決定することができ、これらは全て当技術分野において周知である。
【０１６３】
例えば、免疫細胞活性化の測定値としてサイトカイン産生（例えばＩＦＮ−γ及びインターロイキンなど）をモニターするためのいくつかの従来のアッセイの任意の１つを使用することができる。例えば、Ｔ細胞活性化を追跡するために、インターロイキン−２をマーカーとして用いることができ、これはProc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1333 (1989)に記載されている通りにアッセイすることができる。
【０１６４】
また、免疫蛍光及びフローサイトメトリーを用いて細胞ベースでのサイトカイン産生をモニターし、細胞活性化状態を反映する細胞表面マーカーをモニターすることもできる。そのようなマーカーの宿主が公知であり、検出抗体は広く市販されており、マーカーは当技術分野において周知である。
【０１６５】
Ｔ細胞増殖についての一般的なアッセイは、トリチウム化チミジン取り込みを測定することを伴う。Ｔ細胞の増殖は、培養細胞の複製ＤＮＡ中に取り込まれた３Ｈ標識チミジンの量を測定することによりインビトロで測定することができる。従って、ＤＮＡ合成の速度、次に細胞分裂速度を定量化することができる。
【０１６６】
本発明のポリペプチドによりＧＩＴＲを活性化するためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドによって、実施例１０に記載する通り、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３で刺激された活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイにおいてＩＦＮ−ガンマ産生が増強される。このＴ細胞活性化アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、１０−７M又はそれ以下、好ましくは１０−８M又はそれ以下、より好ましくは１０−９M又はそれ以下、１０−１０M又はそれ以下、又はさらには１０−１１M又はそれ以下のＩＦＮ−ガンマ産生を増強するためのＥＣ５０値を有する。特に、このＴ細胞活性化アッセイにおいて、本発明のポリペプチドによって、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０未満、又はさらにそれ以下、例えば３０pM未満などのＥＣ５０値でＩＦＮ−ガンマ産生が増強される。
【０１６８】
したがって、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合するポリペプチドに関し、前記ＧＩＴＲへの前記ポリペプチドの結合によって、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３で刺激した活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた細胞活性化アッセイにおいて測定された通り（実施例１０に記載）、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０未満、又はさらにそれ以下、例えば３０pM未満などのＥＣ５０値でＴ細胞中でのＩＦＮ−ガンマ産生が増強される。
【０１６９】
いくつかの実施形態にでは、本発明のポリペプチドによって、実施例９及び１８に記載する通り、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて核因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の活性が増強される。ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイはBuillard et al. 2013, J. Exp. Med. Vol. 210, 9: 1685-1693に記載されている。本発明のポリペプチドによるＧＩＴＲを活性化するためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０１７０】
ＮＦ−κＢは、炎症、免疫応答、及び細胞増殖において重要な役割を果たす。このアッセイは、具体的には、培養細胞におけるＮＦ−κＢ調節シグナル伝達経路の活性をモニターするために設計されている。このＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、本発明のポリペプチドによって、１０−７M又はそれ以下の、好ましくは１０−８M又はそれ以下の、より好ましくは１０−９M又はそれ以下の、１０−１０M又はそれ以下の、或いはさらに１０−１１M又はそれ以下のＥＣ５０値で、Nano-Glo（商標）試薬（Promega＃Ｎ１１２０）の添加後に発光により測定したＮＦ−κＢ活性が増強される。特に、このＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、本発明のポリペプチドによって、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１５、１４未満、又はさらにそれ以下、例えば１２pM未満などのＥＣ５０値でＮＦ−κＢ活性が増強される。
【０１７１】
したがって、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合するポリペプチドに関し、それにおいて、前記ＧＩＴＲへの前記ポリペプチドの結合は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ（実施例９及び１８に記載）において測定する通り、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１５、１４未満、又はさらにそれ以下、例えば１２pM未満などのＥＣ５０値でＮＦ−κＢ活性が増強される。
【０１７２】
本発明のポリペプチドの治療効果は、インビボモデルにおいて、例えばマウス、ラット、ブタ、及び／又は霊長類などにおいてさらに評価することができる。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６モデルは同系インビボ試験システムを提供し、それは免疫療法的な概念を開発し、試験するために頻繁に使用される（Fearon et al. Cancer Res. 48: 2975-2980, 1988）。例えば、実施例１３、１４、及び２１に記載する同系ＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて、本発明のポリペプチドによって腫瘍細胞成長が阻害されうる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドによって、腫瘍細胞成長が阻害され、腫瘍の重量又は容積の増加が阻害又は予防され、及び／又は少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などだけ腫瘍の重量又は容積における減少が起こる。
【０１７３】
したがって、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合するポリペプチドに関し、それにおいて、前記ＧＩＴＲへの前記ポリペプチドの結合によって、同系ＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて腫瘍細胞成長が阻害される（実施例１３、１４、及び２１に記載）。
【０１７４】
本発明の一価ポリペプチド
本発明は、ＧＩＴＲに結合するために特に適切であるアミノ酸残基（配列番号７３〜８８、配列番号９０〜１１６、並びに配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４；表Ａ−１０）のストレッチを提供する。特に、本発明は、ＧＩＴＲに結合するアミノ酸残基のストレッチを提供し、前記ＧＩＴＲへの前記ストレッチの結合によって免疫応答が増強される（上に記載）。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、特に、それらが、本発明のポリペプチドの抗原結合部位（の部分）を形成するような方法において、本発明のポリペプチド中に存在する、及び／又はその中に組み入れられてもよい。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、重鎖抗体のＣＤＲ配列又はＧＩＴＲに対して産生されたＶＨＨ配列として生成されている。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、また、本明細書において「本発明のＣＤＲ配列」として（即ち、それぞれ「本発明のＣＤＲ１配列」、「本発明のＣＤＲ２配列」、及び「本発明のＣＤＲ３配列」として）言及する。
【０１７５】
しかし、本発明は、アミノ酸残基のこれらのストレッチによって、本発明のポリペプチドが、特定の親和性及び効力（本明細書において定義する通り）でＧＩＴＲに結合することが許される限り、その最も広い意味において、アミノ酸残基のこれらのストレッチが本発明のポリペプチド中に有しうる特定の構造的役割又は機能に限定されないことに注意すべきである。このように、一般的に、本発明は、その最も広い意味において、特定の指定された親和性、結合力、有効性、及び／又は効力を伴いＧＩＴＲに結合することが可能である、ならびに、本明細書において記載する通りの１つ又は複数のＣＤＲ配列、特に２つ又はそれ以上のそのようなＣＤＲ配列の適切な組み合わせを含み、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を介して互いに適切に連結され、ポリペプチド全体が、ＧＩＴＲに結合することが可能である結合ドメイン及び／又は結合単位を形成するようにする、一価ポリペプチド（また、本明細書において、「本発明の一価ポリペプチド」として言及される）を提供する。しかし、本発明の一価ポリペプチド中でのわずか１つのそのようなＣＤＲ配列の存在が、それ自体が既に、本発明の一価ポリペプチドに、ＧＩＴＲへの結合の能力を提供するために十分でありうることに注意すべきである；例えば、ＷＯ０３／０５０５３１に記載されている、いわゆる「促進（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）フラグメント」を参照する。
【０１７６】
特定の、しかし非限定的な態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７３〜８８；及び  
（ｂ）配列番号７３〜８８のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号９０〜１１６；及び
（ｄ）配列番号９０〜１１６のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４；並びに
（ｆ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０１７７】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７３〜７５；及び
（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号９０〜９８；及び
（ｄ）配列番号９０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１１８〜１１９、１２３及び２８２〜２８４；並びに
（ｆ）配列番号１１８のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０１７８】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７３；及び
（ｂ）配列番号７３と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＴがＳに変えられている；
−位置７でＤがＮに変えられている；
−位置８でＳがＡに変えられている；及び／又は
−位置１０でＡがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号９０；及び
（ｄ）配列番号９０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＨ、Ｔ、又はＧに変えられている；
−位置２でＩがＭに変えられている；
−位置３でＴがＳに変えられている；
−位置６でＧがＳに変えられている；
−位置７でＳがＲ又はＧに変えられている；及び／又は
−位置８でＰがＳ、Ｔ、又はＲに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１１８；及び
（ｆ）配列番号１１８と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＡがＰに変えられている；
−位置１１でＭがＬ、Ｋ、Ｒ、又はＱに変えられている；及び／又は
−位置１２でＤがＮに変えられている。
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７３；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号９０；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１１８、或いは
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７３；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号９０；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２３。
【０１７９】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７６〜７８；及び
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号９９〜１０３；及び
（ｄ）配列番号９９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１２０〜１２３；及び
（ｆ）配列番号１２０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７６；及び
（ｂ）配列番号７６と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置７でＤがＮに変えられている；及び／又は
−位置８でＳがＡに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号９９；及び
（ｄ）配列番号９９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＳ又はＴに変えられている；；
−位置５でＳがＴ、Ｇ、又はＲに変えられている；
−位置６でＴがＫに変えられている；及び／又は
−位置７でＮがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１２０；及び
（ｆ）配列番号１２０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＥがＫに変えられている；
−位置４でＡがＴに変えられている；
−位置１１でＩがＭ又はＬに変えられている；及び／又は
−位置１２でＮがＤに変えられている。
【０１８１】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７６；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号９９；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２０。
【０１８２】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７９〜８４；及び
（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号１０４〜１０８；及び
（ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１２４〜１２５；及び
（ｆ）配列番号１２４のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０１８３】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号７９；及び
（ｂ）配列番号７９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；
−位置３でＶがＩに変えられている；
−位置７でＮがＤに変えられている；
−位置８でＤがＳに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＶ又はＴに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号１０４；及び
（ｄ）配列番号１０４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＤがＧに変えられている；
−位置５でＲがＡに変えられている；及び／又は
−位置６でＧがＤに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｅ）配列番号１２４；及び
（ｆ）配列番号１２４と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＴがＭに変えられている。
【０１８４】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７９；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号１０４；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２４。
【０１８５】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号８５〜８６；及び
（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号１０９〜１１０；及び
（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２６．
【０１８６】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列：
（ａ）配列番号８５；及び
（ｂ）配列番号８５と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ｃ）配列番号１０９；及び
（ｄ）配列番号１０９と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＴがＳに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２６．
【０１８７】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号８５；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号１０９；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２６。
【０１８８】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号８７；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号１１１；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２７。
【０１８９】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７７；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ａ）配列番号１１２〜１１３；及び
（ｂ）配列番号１１２のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｃ）配列番号１２８〜１３０；及び
（ｄ）配列番号１２８のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０１９０】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７７；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ａ）配列番号１１２；及び
（ｂ）配列番号１１２と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＤがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｃ）配列番号１２８；及び
（ｄ）配列番号１２８と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＳがＰに変化させえられている；及び／又は
−位置１３でＴがＡに変えられている。
【０１９１】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号７７；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号１１２；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１２８。
【０１９２】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号８８；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ａ）配列番号１１４〜１１６；及び
（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｃ）配列番号１３１〜１３２；及び
（ｄ）配列番号１３１のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０１９３】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号８８；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
（ａ）配列番号１１４；及び
（ｂ）配列番号１１４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＶがＩ又はＡに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
（ｃ）配列番号１３１；及び
（ｄ）配列番号１３１と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＧがＥに変えられている；及び／又は
−位置５でＲがＱに変えられている。
【０１９４】
さらなる態様では、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれる、アミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：
（ｉ）ＣＤＲ１配列、配列番号８８；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２配列、配列番号１１４；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列、配列番号１３１。
【０１９５】
特に、本発明の一価ポリペプチドは、１つの抗原結合部位を含む一価ポリペプチドでありうるが、それにおいて、前記抗原結合部位は、上に記載するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列（又はそれらの任意の適切な組み合わせ）からなる群より選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含む。しかし、好ましい態様では、本発明の一価ポリペプチドは、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列、及び／又は本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選ばれたアミノ酸残基の１を上回る、例えば２つ又はそれ以上のストレッチを含む。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、それぞれ、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列、及び本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選ばれたアミノ酸残基の３つのストレッチを含む。本発明の一価ポリペプチドについて好ましいとして、本明細書において言及するＣＤＲの組み合わせを表Ａ−１０中に列挙する。
【０１９６】
本発明が、本発明の一価ポリペプチドの（又は、それを発現させるために使用された、本発明の核酸の）起源に関して、また、本発明の一価ポリペプチド又は核酸が生成又は入手される（されてきた）方法に関して、限定されないことにさらに注意すべきである。このように、本発明の一価ポリペプチドは、（任意の適切な種から）自然に生じる一価ポリペプチド又は合成もしくは半合成一価ポリペプチドでありうる。
【０１９７】
さらに、また、上で言及するＣＤＲの１つ又は複数を、他の「スキャフォールド」（しかし、限定しないが、ヒトスキャフォールド又は非免疫グロブリンスキャフォールドを含む）上に「移植」することが可能であることが、当業者には明らかであろう。そのようなＣＤＲ移植のための適切なスキャフォールド及び技術は、当業者に明かであり、当技術分野において周知であり、例えば、ＵＳ  ７，１８０，３７０、ＷＯ０１／２７１６０、ＥＰ  ０６０５５２２、ＥＰ  ０４６０１６７、ＵＳ  ７，０５４，２９７、Nicaiseら（Protein Science 13: 1882-1891, 2004）、Ewertら（Methods 34: 184-199, 2004）、Kettleboroughら（Protein Eng. 4: 773-783, 1991）、O'Brien and Jones（Methods Mol.Biol. 207: 81-100, 2003）、Skerra（J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000）、及びSaerensら（J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005）ならびに本明細書において引用するさらなる参考文献を参照のこと。例えば、マウス又はラットＣＤＲを、ヒトフレームワーク及びスキャフォールド上に移植するための、それ自体が公知の技術を類似の様式において使用し、本発明の一価ポリペプチドについて本明細書において定義するＣＤＲ配列の１つ又は複数及び１つ又は複数のヒトフレームワーク領域又は配列を含むキメラタンパク質を提供することができる。アミノ酸配列を提示するための適切なスキャフォールドが、当業者には明らかでありうるが、例えば、限定しないが、免疫グロブリンに基づく又はそれに由来する結合スキャフォールド（即ち、本明細書において既に記載した免疫グロブリン配列以外）、プロテインＡドメインに由来するタンパク質スキャフォールド（例えばAffibodies（商標）など）、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計されたアンキリン反復、アビマー及びＰＤＺドメイン（Binz et al.Nat.Biotech., 23: 1257, 2005）、ならびにＤＮＡ又はＲＮＡに基づく結合部分（しかし、限定しないが、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーを含む）（Ulrich et al.Comb.Chem. High Throughput Screen 9: 619-32, 2006）を含む。
【０１９８】
本発明の前記の一価ポリペプチドにおいて、ＣＤＲを、さらなるアミノ酸配列に連結してもよく、及び／又は、アミノ酸配列を介して互いに連結してもよく、それにおいて、前記アミノ酸配列は、好ましくは、フレームワーク配列である、又は、フレームワーク配列として作用する、もしくはＣＤＲを提示するためのスキャフォールドを一緒に形成するアミノ酸配列である。
【０１９９】
好ましいが、しかし、非限定的な実施形態に従い、本発明の一価ポリペプチドは、少なくとも２つのフレームワーク配列に連結された少なくとも３つのＣＤＲ配列を含み、それにおいて、好ましくは、３つのＣＤＲ配列の少なくとも１つがＣＤＲ３配列であり、他の２つのＣＤＲ配列はＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列であり、好ましくは、１つのＣＤＲ１配列及び１つのＣＤＲ２配列である。１つの特に好ましいが、しかし、非限定的な実施形態に従い、本発明の一価ポリペプチドは構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、それにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、本発明の一価ポリペプチドについて本明細書において定義する通りであり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４は、フレームワーク配列である。本発明のそのような一価ポリペプチドにおいて、フレームワーク配列は任意の適切なフレームワーク配列でありうるが、適切なフレームワーク配列の例が、例えば、標準的なハンドブックならびに本明細書において言及するさらなる開示及び先行技術に基づき当業者に明かであろう。
【０２００】
したがって、本発明の一価ポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３〜８８；及び
（ｂ）配列番号７３〜８８のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０〜１１６；及び
（ｄ）配列番号９０〜１１６のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４；及び
（ｆ）配列番号１１８〜１３２及び２８２〜２８４のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
さらに好ましいＣＤＲ配列を表Ａ−１０に示す。
【０２０１】
結果として得られた結合体の配列分析によって、さらに、８つの別個のファミリー、即ち、ファミリー７、ファミリー２６、ファミリー８２、ファミリー１０９、ファミリー８５、ファミリー３８、ファミリー１１０、及びファミリー１０８の同定をもたらした。対応する整列をそれぞれ表Ａ−１、表Ａ−２、表Ａ−３、表Ａ−４、表Ａ−５、表Ａ−６、表Ａ−７、及び表Ａ−８に提供する。異なるファミリーへの分類は、ＣＤＲにおける配列類似性及び相違に基づいた。ファミリー７は２１のクローン（配列番号１〜２１）を含み、ファミリー２６は１１のクローン（配列番号２２〜３２）を含み、ファミリー８２は２３のクローン（配列番号３３〜５５）を含み、ファミリー１０９は６のクローン（配列番号５６〜６１）を含み、ファミリー８５及び１０８はそれぞれ１つのクローン（それぞれ配列番号６２及び配列番号７２）により表し、ファミリー３８は６つのクローン（配列番号６３〜６８）を含み、ファミリー１１０は３つのクローン（配列番号６９〜７１）を含む。全てのファミリーの代表を、ＧＩＴＲへの高親和性結合及びヒトＴ細胞活性化に基づいて単離した（実施例５）。一般的に、ファミリー７、ファミリー２６、及びファミリー１０９の代表が最良のＥＣ５０値を実証した。
【０２０２】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３〜７５；及び
（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０〜９８；及び
（ｄ）配列番号９０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８〜１１９、１２３、及び２８２〜２８４；並びに
（ｆ）配列番号１１８のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０２０３】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７３；及び
（ｂ）配列番号７３と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＴがＳに変えられている；
−位置７でＤがＮに変えられている；
−位置８でＳがＡに変えられている；及び／又は
−位置１０でＡがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９０；及び
（ｄ）配列番号９０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＨ、Ｔ、又はＧに変えられている；
−位置２でＩがＭに変えられている；
−位置３でＴがＳに変えられている；
−位置６でＧがＳに変えられている；
−位置７でＳがＲ又はＧに変えられている；及び／又は
−位置８でＰがＳ、Ｔ、又はＲに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１１８；及び
（ｆ）配列番号１１８と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＡがＰに変えられている；
−位置１１でＭがＬ、Ｋ、Ｒ、又はＱに変えられている；及び／又は
−位置１２でＤがＮに変えられている。
【０２０４】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ）ＣＤＲ１を配列番号７３により表し、ＣＤＲ２を配列番号９０により表し、ＣＤＲ３を配列番号１１８により表し；又は
ｉｉ）ＣＤＲ１を配列番号７３により表し、ＣＤＲ２を配列番号９０により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２３により表す。
【０２０５】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７６〜７８；及び
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９９〜１０３；及び
（ｄ）配列番号９９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２０〜１２３；及び
（ｆ）配列番号１２０のアミノ酸配列と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０２０６】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７６；及び
（ｂ）配列番号７６と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、
−位置７でＤがＮに変えられている；及び／又は
−位置８でＳがＡに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号９９；及び
（ｄ）配列番号９９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＡがＳ又はＴに変えられている；
−位置５でＳをがＴ、Ｇ、又はＲに変えられている；
−位置６でＴがＫに変えられている；及び／又は
−位置７でＮがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２０；及び
（ｆ）配列番号１２０と４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置１でＥがＫに変えられている；
−位置４でＡがＴに変えられている；
−位置１１でＩがＭ又はＬに変えられている；及び／又は
−位置１２でＮがＤに変えられている。
【０２０７】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号７６により表し、ＣＤＲ２を配列番号９９により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２０により表す。
【０２０８】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７９〜８４；及び
（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０４〜１０８；及び
（ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２４〜１２５；及び
（ｆ）配列番号１２４のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０２０９】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号７９；及び
（ｂ）配列番号７９と３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、
−位置２でＳがＮに変えられている；
−位置３でＶがＩに変えられている；
−位置７でＮがＤに変えられている；
−位置８でＤがＳに変えられている；及び／又は
−位置９でＭをＶ又はＴに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０４；及び
（ｄ）配列番号１０４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、
−位置１でＤがＧに変えられている；
−位置５でＲがＡに変えられている；及び／又は
−位置６でＧがＤに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１２４；及び
（ｆ）配列番号１２４と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＴがＭに変えられている。
【０２１０】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号７９により表し、ＣＤＲ２を配列番号１０４により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２４により表す。
【０２１１】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号８５〜８６；及び
（ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０９〜１１０；及び
（ｄ）配列番号１０９のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は配列番号１２６である。
【０２１２】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号８５；及び
（ｂ）配列番号８５と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置２でＳがＮに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１０９；及び
（ｄ）配列番号１０９と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＴがＳに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は配列番号１２６である。
【０２１３】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号８５により表し、ＣＤＲ２を配列番号１０９により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２６により表す。
【０２１４】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号８７により表し、ＣＤＲ２を配列番号１１１により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２７により表す。
【０２１５】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号７７であり；並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１２〜１１３；及び
（ｂ）配列番号１１２のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１２８〜１３０；及び
（ｄ）配列番号１２８のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０２１６】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号７７であり；並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１２；及び
（ｂ）配列番号１１２と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置４でＤがＧに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１２８；及び
（ｄ）配列番号１２８と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
−位置９でＳがＰに変えられている；及び／又は
−位置１３でＴがＡに変えられている。
【０２１７】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号７７により表し、ＣＤＲ２を配列番号１１２により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１２８により表す。
【０２１８】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号８８であり；並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１１４〜１１６；及び
（ｄ）配列番号１１４のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｅ）配列番号１３１〜１３２；及び
（ｆ）配列番号１３１のアミノ酸配列と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列。
【０２１９】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
（ｉ）ＣＤＲ１は配列番号８８であり；並びに／或いは
（ｉｉ）ＣＤＲ２が、以下からなる群より選ばれる：
（ａ）配列番号１１４；及び
（ｂ）配列番号１１４と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、
それにおいて、
−位置１でＶがＩ又はＡに変えられている；及び／又は
−位置９でＭがＩに変えられている；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３が、以下からなる群より選ばれる：
（ｃ）配列番号１３１；及び
（ｄ）配列番号１３１と２つ又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、
それにおいて、
−位置４でＧがＥに変えられている；及び／又は
−位置５でＲがＱに変えられている。
【０２２０】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：ＣＤＲ１を配列番号８８により表し、ＣＤＲ２を配列番号１１４により表し、及びＣＤＲ３を配列番号１３１により表す。
【０２２１】
好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明は、本明細書において記載する一価ポリペプチドに関し、それにおいて、前記の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインはＩＳＶＤの群より選ばれ、それにおいて：
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７５であり、ＣＤＲ２は配列番号９３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９７であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号９８であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１９であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８２であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり；及びＣＤＲ３は配列番号２８４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１００であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２１であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号１０１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２２であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１０３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１１８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号９９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２３であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７９であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８０であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８２であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８４であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０７であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０８であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２４であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１０４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２５であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１０９であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８６であり、ＣＤＲ２は配列番号１１０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１１０であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２６であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１１であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２７であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２８であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１２９であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１３であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１２であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３０であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１４であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３１であり；
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１５であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３１であり；並びに
−ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１１６であり；及びＣＤＲ３は配列番号１３２である。
上に記載するＣＤＲを有する本発明の代表的なポリペプチドを表Ａ−１０に示す。
【０２２２】
一態様では、一価ポリペプチドは、配列番号１〜２１の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号１〜２１の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号１〜２１の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号１〜２１の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドはファミリー７に属し、配列番号１〜２１の任意の１つより選択される一価ポリペプチドである。
【０２２３】
一態様では、一価ポリペプチドは、配列番号２２〜３２の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号２２〜３２の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号２２〜３２の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号２２〜３２の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドはファミリー２６に属し、例えば配列番号２２〜３２の任意の１つより選択される一価ポリペプチドなどである。
【０２２４】
一態様では、一価ポリペプチドは、配列番号３３〜５５の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号３３〜５５の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号３３〜５５の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号３３〜５５の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドはファミリー８２に属し、例えば配列番号３３〜５５の任意の１つより選択される一価ポリペプチドなどである。
【０２２５】
一態様では、一価ポリペプチドは、配列番号５６〜６１の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号５６〜６１の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号５６〜６１の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号５６〜６１の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドはファミリー１０９に属し、例えば配列番号５６〜６１の任意の１つより選択される一価ポリペプチドなどである。
【０２２６】
一態様では、一価ポリペプチドは、配列番号６３〜６８の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号６３〜６８の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号６３〜６８の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号６３〜６８の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドはファミリー３８に属し、例えば配列番号６３〜６８の任意の１つより選択される一価ポリペプチドなどである。
【０２２７】
一態様では、一価ポリペプチドは、配列番号６９〜７１の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有する。別の態様では、一価ポリペプチドは、配列番号６９〜７１の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。好ましくは、一価ポリペプチドは、配列番号６９〜７１の任意の１つと比較し、その配列内に同数のアミノ酸を有し、一価ポリペプチドは、配列番号６９〜７１の任意の１つと比較して８９%又はそれ以上の配列同一性を有する、８位と１０６位（Kabatのナンバリングに従って）の間のアミノ酸配列を有する。別の好ましい態様では、一価ポリペプチドはファミリー１１０に属し、例えば配列番号６９〜７１の任意の１つより選択される一価ポリペプチドなどである。
【０２２８】
上で特定したアミノ酸残基のストレッチの１つ又は複数を含む一価ポリペプチドは、ＧＩＴＲの活性を調節（即ち、増加、増強、刺激、又は増強）しうる。特に、本発明の一価ポリペプチドは免疫応答を増強しうる。そのようなものとして、本発明のこれらのポリペプチドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強しうる。
【０２２９】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化は、種々のアッセイ（増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、細胞死滅アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ）、Ｔ細胞活性化アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、及び活性化又はサイトカイン分泌の公知のマーカーの発現を測定するためのアッセイを含むが、これらに限定しない）により決定することができ、これらは全て当技術分野において周知である。
【０２３０】
例えば、免疫細胞活性化の測定値としてサイトカイン産生（例えばＩＦＮ−γ及びインターロイキンなど）をモニターするためのいくつかの従来のアッセイの任意の１つを使用することができる。例えば、Ｔ細胞活性化を追跡するために、インターロイキン−２をマーカーとして用いることができ、これはProc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1333 (1989)に記載されている通りにアッセイすることができる。
【０２３１】
また、免疫蛍光及びフローサイトメトリーを用いて細胞ベースでのサイトカイン産生をモニターし、細胞活性化状態を反映する細胞表面マーカーをモニターすることもできる。そのようなマーカーの宿主は公知であり、検出抗体は広く市販されており、マーカーは当技術分野において周知である。
【０２３２】
Ｔ細胞増殖についての一般的なアッセイは、トリチウム化チミジン取り込みを測定することを伴う。Ｔ細胞の増殖は、培養細胞の複製ＤＮＡ中に取り込まれた３Ｈ標識チミジンの量を測定することによりインビトロで測定することができる。従って、ＤＮＡ合成の速度、次に細胞分裂速度を定量化することができる。
【０２３３】
ＧＩＴＲへの本発明の一価ポリペプチドの結合は、結合アッセイにおいて測定することができる。典型的なアッセイには、ＧＩＴＲが細胞表面（例えばFlp-In（商標）２９３細胞又はGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293細胞など）上に曝露されるアッセイが（限定しないが）含まれる。ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合を測定するための好ましいアッセイは、ＦＡＣＳアッセイであり、例えば、実施例において記載するＦＡＣＳアッセイなどであり、それにおいて、Flp-In（商標）２９３細胞及び／又は活性化Ｔ細胞上に発現されたＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合が決定される。ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合のためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０２３４】
そのようなＦＡＣＳ結合アッセイにおいて、本発明の一価ポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−８M又はそれ以下の、より好ましくは１０−９M又はそれ以下の、或いはさらに１０−１０M又はそれ以下のＥＣ５０値を有しうる。例えば、そのようなＦＡＣＳ結合アッセイにおいて、本発明の一価ポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−１０M〜１０−８Mの間、例えば１０−９M〜１０−８Mの間又は１０−１０M〜１０−９Mの間などのＥＣ５０値を有しうる。
【０２３５】
本発明はまた、配列番号１〜７１のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%のアミノ酸同一性（又は本明細書において定義する配列同一性）、好ましくは少なくとも８５%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０%のアミノ酸同一性、例えば９５%、９６%、９７%、９８%、９９%のアミノ酸同一性又はそれ以上など、或いは、さらに（本質的に）１００%のアミノ酸同一性を有する一価ポリペプチドに関する。
【０２３６】
特定の、しかし、非限定的な一態様では、本発明の一価ポリペプチドは、免疫グロブリン折り畳みを含む一価ポリペプチド又は、適切な条件（例えば生理学的条件など）下で、免疫グロブリン折り畳みを形成する（即ち、折り畳みにより）ことが可能である一価ポリペプチドでありうる。とりわけ、Halabyら（J. Protein Eng. 12: 563-71, 1999）によるレビューを参照のこと。好ましくは、免疫グロブリン折り畳みを形成するように、適当に折り畳まれた場合、アミノ酸残基のストレッチは、ＧＩＴＲに結合するための抗原結合部位を適当に形成することが可能でありうる。したがって、好ましい態様において、本発明の一価ポリペプチドは免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなどである。
【０２３７】
したがって、フレームワーク配列は、好ましくは、免疫グロブリンフレームワーク配列又は免疫グロブリンフレームワーク配列に由来しているフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）である（例えば、配列最適化、例えばヒト化又はラクダ化などによる）。例えば、フレームワーク配列は、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば軽鎖可変ドメイン（例、ＶＬ配列）などに及び／又は重鎖可変ドメイン（例、ＶＨ配列）に由来するフレームワーク配列でありうる。特に好ましい一態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列に由来しているフレームワーク配列（それにおいて、前記フレームワーク配列は、場合により、部分的に又は完全にヒト化されている）である、又は、ラクダ化されている従来のＶＨ配列（本明細書において定義する通り）のいずれかである。
【０２３８】
フレームワーク配列は、好ましくは、本発明の一価ポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体（又は、ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸配列）など；単一ドメイン抗体（又は、単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）；「ｄＡｂ」（又は、「ｄＡｂ」としての使用のために適切であるアミノ酸）；ナノボディ（登録商標）；ＶＨＨ配列；  ヒト化ＶＨＨ配列；ラクダ化ＶＨ配列；又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であるようにしうる。再び、適切なフレームワーク配列が、標準的なハンドブックならびに本明細書において言及するさらなる開示及び先行技術に基づき、当業者に明かであろう。
【０２３９】
特に、本発明の一価ポリペプチド中に存在するフレームワーク配列は、本発明の一価ポリペプチドがナノボディであるように、１つ又は複数のホールマーク残基（ＷＯ０８／０２００７９（表Ａ−３〜Ａ−８）中で定義される通り）を含みうる。そのようなフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）いくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例の一部は、本明細書におけるさらなる開示から明らかになるであろう（例、表Ａ−１０を参照のこと）。一般的には、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分的にヒト化したナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ又は複数における１つ又は複数の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる（例、ＷＯ０８／０２００７９、６１ページ、２４行から９８ページ、３行においてさらに記載される通り）。
【０２４０】
特に、本発明は、以下の（一般的な）構造を伴うアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供する：
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４
それにおいて、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、それにおいて、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を指し、これらは
ｉ）配列番号１−７１（表Ａ−９参照）のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%、より好ましくは９０%、さらにより好ましくは９５%のアミノ酸同一性を有し、それにおいて、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する。この点に関して、表Ａ−１０も参照し、そこでは、配列番号１−７１（表Ａ−９参照）の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号１３４〜１５２）、フレームワーク２配列（配列番号１５３〜１６２）、フレームワーク３配列（配列番号１６３〜２００）、及びフレームワーク４配列（配列番号２０１〜２０５）を列挙しており；又は
ｉｉ）表Ａ−１０に示すフレームワーク配列の組み合わせ；
及び、それにおいて
ｉｉｉ）好ましくは、Kabatのナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８の１つ又は複数のアミノ酸残基が、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ−３〜表Ａ−８に言及するホールマーク残基より選ばれる。
本発明は、多数の配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメインも提供する。
【０２４１】
特に、配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメインは、以前のパラグラフにおいて免疫グロブリン単一可変ドメインについて一般的に定義されるアミノ酸配列でありうるが、しかし、それにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基が（及び特にフレームワーク残基の少なくとも１つにおいて）存在し、それは、ヒト化置換（本明細書において定義する通り）である及び／又はそれに対応する。いくつかの好ましいが非限定的なヒト化置換（及びそれらの適切な組み合わせ）は、本明細書における開示に基づいて当業者には明らかになるであろう。また、又は代わりに、他の潜在的に有用なヒト化置換は、自然に生じるＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換の１つ又は複数（又はそれらの組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に（それ自体が公知の任意の様式において、本明細書にさらに記載される通りに）導入することができ、結果として生じるヒト化ＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の簡単さ及びレベルについて、並びに／或いは他の所望の特性について試験することができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（又はそれらの適切な組み合わせ）は、当業者により、本明細書における開示に基づき決定することができる。また、先述のものに基づき、免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）は、部分的にヒト化又は完全にヒト化してもよい。
【０２４２】
本発明はまた、安定性試験の間での保存時に発現の改善及び／又は安定性の増加を示しうる多数の配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。本発明のアミノ酸配列は、Ｎ末端のピログルタミン酸翻訳後修飾の低下を示し、故に、産物の安定性が増加しうる。また、本発明のアミノ酸配列は、それらの対応する親アミノ酸配列と比較して、他の改善された特性、例えば、より少ない免疫原性、ＧＩＴＲについての結合特性の改善（ＫＤ値（実際の又は見掛け上の）、ＫＡ値（実際の又は見掛け上の）、Ｋｏｎ速度及び／又はＫｏｆｆ速度、或いは、代わりに、ＩＣ５０値として適切に測定し、及び／又は表現し、本明細書にさらに記載する通りである）、ＧＩＴＲについての親和性の改善及び／又は結合力の改善、並びに／或いはＧＩＴＲに拮抗するための有効性及び／又は効力の改善などを示しうる。
【０２４３】
本発明のいくつかの特に好ましい配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１−７１の免疫グロブリン単一可変ドメインの配列最適化されたバリアントであり；配列番号２６８〜２７５のアミノ酸配列は、いくつかの特に好ましい例である。
【０２４４】
このように、本発明のいくつかの他の好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＧＩＴＲに結合することができる（本明細書においてさらに定義する）ナノボディであり、そられは：
ｉ）配列番号１〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの配列最適化されたバリアントであり；並びに／或いは
ｉｉ）配列番号１〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つ及び／又は配列番号２６８〜２７５の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し（表  Ａ−９を参照）、それにおいて、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する；この点に関して、表Ａ−１０も参照し、そこでは、配列番号１−７１及び２６８−２７５（表Ａ−９を参照）の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号１３４〜１５２、２７６及び２７８）、フレームワーク２配列（配列番号１５３〜１６２）、フレームワーク３配列（配列番号１６３〜２００、２７７及び２７９−２８１）、及びフレームワーク４配列（配列番号２０１〜２０５）を列挙しており；又は
ｉｉｉ）表Ａ−１０に示すフレームワーク配列の組み合わせ；
それにおいて、
ｉｖ）好ましくは、Kabatのナンバリングによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８のアミノ酸残基の１つ又は複数を、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ−３から表Ａ−８において言及するホールマーク残基より選ぶ。
【０２４５】
本発明の免疫グロブリン（特に免疫グロブリン単一可変ドメイン）はまた、以下の同時係属中の米国仮出願（全てが「改善された免疫グロブリン可変ドメイン」と題する）に記載される特定の変異／アミノ酸残基を含みうる：ＵＳ  ６１／９９４５５２（２０１４年５月１６日出願）；ＵＳ  ６１／０１４，０１５（２０１４年６月１８日出願）；ＵＳ  ６２／０４０，１６７（２０１４年８月２１日出願）；及びＵＳ  ６２／０４７，５６０（２０１４年９月８日出願）（全てがAblynx N.V.に譲渡）並びにこれらの仮出願に基づき、２０１５年１１月１９日に公開された国際出願ＷＯ２０１５／１７３３２５。
【０２４６】
特に、本発明の免疫グロブリン（特に免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、（ｉ）１１２位のＫもしくはＱ；又は（ｉｉ）１１位のＶと組み合わせた１１０位のＫもしくはＱ；又は（ｉｉｉ）８９位のＴ；又は（ｉｖ）１１０位のＫもしくはＱを伴う８９位のＬ；又は（ｖ）１１位のＶ及び８９位のＬ；又は（ｉ）〜（ｖ）の任意の適切な組み合わせを含みうる。
【０２４７】
前記の同時係属中の米国仮出願にも記載されている通り、本発明の免疫グロブリンが上記（ｉ）〜（ｖ）の１つ（又はそれらの適切な組み合わせ）に従う変異を含む場合：
−１１位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ｌ、Ｖ、又はＫ（そして最も好ましくはＶ）より選び；及び
−１４位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ａ又はＰより適切に選び；及び
−４１位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ａ又はＰより適切に選び；及び
−８９位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ｔ、Ｖ、又はＬより適切に選び；及び
−１０８位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ｑ又はＬより適切に選び；及び
−１１０位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ｔ、Ｋ、又はＱより適切に選び；及び
−１１２位のアミノ酸残基を、好ましくは、Ｓ、Ｋ、又はＱより適切に選ぶ。
【０２４８】
前記の同時係属中の米国仮出願において言及されている通り、前記変異は、本発明の免疫グロブリン及び化合物への、いわゆる「既存の抗体」の結合を防止する又は低下させる際に効果的である。この目的のために、本発明の免疫グロブリンはまた、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４、又は５など（及び、好ましくは、１又は２、例えば１など）である；各々のＸは（好ましくは自然に生じる）アミノ酸残基であり、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）からなる群より非依存的に選ばれる）を含みうるが、それらについては、ここでも、前記の米国仮出願ならびにＷＯ１２／１７５７４１を参照する。特に、本発明の免疫グロブリンは、それが、タンパク質、ポリペプチド、又はそれを含む他の化合物又は構築物のＣ末端を形成する場合、そのようなＣ末端伸長を含みうる（ここでも、前記の米国仮出願ならびにＷＯ１２／１７５７４１においてさらに記載されている通り）。
【０２４９】
そのような変異及び／又はそのようなＣ末端伸長を含む本発明の免疫グロブリンのいくつかの特に好ましいが、しかし、限定しない例を、配列番号２６８〜２７５及び２８５〜２９０に与える。
【０２５０】
好ましい態様では、本発明は、配列番号１〜７１及び２６８〜２７５のいずれかより選択される免疫グロブリン又は一価ポリペプチドを提供する。
【０２５１】
本発明はまた、ＧＩＴＲへの、配列番号１〜７１及び２６８〜２７５を伴う免疫グロブリンの少なくとも１つの結合を交差遮断する、並びに／或いは、配列番号１−７１及び２６８〜２７５の免疫グロブリンの少なくとも１つによるＧＩＴＲへの結合が交差遮断される、ＧＩＴＲに対して向けられた一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【０２５２】
本発明はさらに、本発明の一価ポリペプチドにより、特に配列番号１〜７１及び２６８〜２７５を伴う一価ポリペプチドにより結合されるのと同じエピトープに結合する、ＧＩＴＲに対して向けられた一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【０２５３】
特定の態様では、本発明は、ファミリー７、ファミリー２６、ファミリー８２、ファミリー８５、及びファミリー３８に属する本発明の一価ポリペプチドにより、特に配列番号１〜５５、６２〜６８及び２６９〜２７５を伴う一価ポリペプチドにより結合されるのと同じエピトープに結合する、ＧＩＴＲに対して向けられた一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【０２５４】
別の特定の態様では、本発明は、ファミリー１０９及びファミリー１１０に属する本発明の一価ポリペプチドにより、特に配列番号５６〜６１、６９〜７１及び２６８を伴う一価ポリペプチドにより結合されるのと同じエピトープに結合する、ＧＩＴＲに対して向けられた一価ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【０２５５】
ここでも、そのような一価ポリペプチドは、任意の適切な様式において、任意の適切な供給源から由来する免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなどでありうるが、例えば、自然に生じるＶＨＨ配列（即ち、ラクダの適切な種からの）又は合成もしくは半合成アミノ酸配列（「ヒト化」（本明細書において定義する通り）ナノボディ又はＶＨＨ配列、「ラクダ化」（本明細書において定義する通り）免疫グロブリン配列（及び特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）を含むが、これらに限定しない）、ならびに、技術、例えば親和性成熟（例えば、合成、無作為、又は自然に生じる免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲ移植、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列から由来するフラグメントの組み合わせ、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリー、及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術；又は、本明細書においてさらに記載する通りの前述のもののいずれかの任意の適切な組み合わせなどにより得られたナノボディでありうる。また、免疫グロブリンがＶＨＨ配列を含む場合、前記の免疫グロブリンを適切にヒト化してもよく（本明細書においてさらに記載する通り）、本発明の１つ又は複数のさらなる（部分的又は完全）ヒト化免疫グロブリンを提供するようにする。同様に、免疫グロブリンが合成又は半合成配列（例えば部分的にヒト化された配列など）を含む場合、前記の免疫グロブリンは、場合により、さらに適切にヒト化してもよく（ここでも、本明細書において記載する通り）、ここでも、本発明の１つ又は複数のさらなる（部分的又は完全）ヒト化免疫グロブリンを提供するようにする。
【０２５６】
本発明のこれらの一価ポリペプチド、及び特に本発明のＣＤＲ配列を含む免疫グロブリンは、多価ポリペプチドの調製のための構築ブロック又は結合単位としての使用のために特に適する。
【０２５７】
したがって、ＧＩＴＲに結合する本発明の一価ポリペプチドは、本質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）でありうる、或いは、それらはタンパク質又はポリペプチドの部分を形成しうる、それらは、ＧＩＴＲに結合する１つ又は複数の一価ポリペプチドを含みうる又はそれから本質的になり、場合により、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列（全てが、場合により、１つ又は複数の適切なリンカーを介して連結される）をさらに含みうる。本発明はまた、本発明の１つ又は複数の一価ポリペプチド（又はその適切なフラグメント）を含む又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドに関する。
【０２５８】
本発明の１つ又は複数の一価ポリペプチドは、このように、そのようなタンパク質又はポリペプチドにおいて結合単位又は構築ブロックとして使用され、それぞれ、本発明の一価、多価、又はマルチパラトープポリペプチドを提供するようにする（全てが、本明細書において記載する通り）。本発明は、このように、また、本発明の１つの一価ポリペプチドを含む又はそれから本質的になる一価構築物であるポリペプチドに関する。本発明は、このように、また、本発明の２つ又はそれ以上の一価ポリペプチドを含む又はそれから本質的になる多価ポリペプチド、例えば二価、三価、四価、五価、又は六価ポリペプチドなどであるポリペプチドに関する（１つ又は複数のＶＨＨドメインを含む多価及び多特異的ポリペプチドならびにそれらの調製については、Conrathら（J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001）、ならびに、例えば、ＷＯ９６／３４１０３、ＷＯ９９／２３２２１、及びＷＯ２０１０／１１５９９８を参照する）。
【０２５９】
本発明の多価ポリペプチド
【０２６０】
本発明はさらに、ＧＩＴＲ、好ましくはヒトＧＩＴＲに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（又はその適切なフラグメント）及び１つの追加の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又は（本質的に）それからなる多価ポリペプチド（本明細書において本発明の「多価ポリペプチド」としても言及する）に関する。
【０２６１】
好ましい態様では、本発明の多価ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又は本質的にそれからなる。２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、場合により、１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結してもよい。
【０２６２】
本発明の多価ポリペプチドにおいて、２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、同じもしくは異なりうるが、同じ抗原もしくは抗原決定基に対して（例えば、同じ部分もしくはエピトープに対して、又は異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられうる、又は、代わりに、異なる抗原もしくは抗原決定基；又はそれらの任意の適切な組み合わせに対して向けられうる。例えば、本発明の二価ポリペプチドは（ａ）２つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；（ｂ）タンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディとは異なる、前記タンパク質又は抗原の同じ抗原決定基に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；（ｃ）タンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び前記第１の抗原決定基とは異なる、前記タンパク質又は抗原の別の抗原決定基に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；或いは（ｄ）第１のタンパク質又は抗原に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び第２のタンパク質又は抗原（即ち、前記第１のタンパク質又は抗原とは異なる）に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含みうる。同様に、本発明の三価ポリペプチドは、例えば、これに限定しないが、（ａ）３つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；（ｂ）タンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び同じタンパク質又は抗原の異なる抗原決定基に対して向けられた第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；（ｃ）タンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び前記の第１のタンパク質又は抗原とは異なる第２のタンパク質又は抗原に対して向けられた第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；（ｄ）第１のタンパク質又は抗原の第１の抗原決定基に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、前記の第１の抗原決定基とは異なる、前記の第１のタンパク質又は抗原の第２の抗原決定基に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び前記の第１のタンパク質又は抗原とは異なる第２のタンパク質又は抗原に対して向けられた第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；（ｅ）第１のタンパク質又は抗原に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、前記の第１のタンパク質又は抗原とは異なる第２のタンパク質又は抗原に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、並びに前記の第１及び第２のタンパク質又は抗原とは異なる第３のタンパク質又は抗原に対して向けられた第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む。
【０２６３】
少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はナノボディを含む本発明のポリペプチド、それにおいて、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、第１抗原に対して（即ち、ＧＩＴＲに対して）向けられ、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、第２抗原（即ち、ＧＩＴＲとは異なる）に対して向けられ、また、本発明の「多特異的」ポリペプチドとして言及され、そのようなポリペプチド中に存在する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディはまた、本明細書において、「多特異的フォーマット」中にあるとして言及する。このように、例えば、本発明の「二重特異的」ポリペプチドは、第１の抗原（即ち、ＧＩＴＲ）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ及び第２の抗原（即ち、ＧＩＴＲとは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「三重特異的」ポリペプチドは、第１の抗原（即ち、ＧＩＴＲ）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、第２の抗原（即ち、ＧＩＴＲとは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び第３の抗原（即ち、ＧＩＴＲ及び第２抗原の両方とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ；などを含むポリペプチドである。
【０２６４】
したがって、一態様では、その最も単純な形態において、本発明の多価ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及びＧＩＴＲに対して向けられた同一の第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む本発明の二価ポリペプチドであり、それにおいて、前記の第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、リンカー配列（本明細書において定義する）を介して連結されていてもよい；その最も単純な形態において、本発明の多価ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、ＧＩＴＲに対して向けられた同一の第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及びＧＩＴＲに対して向けられた同一の第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の三価ポリペプチドでありうるが、それにおいて、前記の第１、第２、及び第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ又は複数の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２６５】
別の態様では、本発明の多価ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び第２の抗原に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の二重特異的ポリペプチドであってもよく、それにおいて、前記の第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、リンカー配列（本明細書において定義する）を介して連結されていてもよいのに対し；本発明の多価ポリペプチドはまた、ＧＩＴＲに対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、第２の抗原に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ、及び第３の抗原に対して向けられた第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の三重特異的ポリペプチドでありうるが、それにおいて、前記の第１、第２、及び第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ又は複数の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２６６】
好ましい態様では、本発明のポリペプチドは三価の二重特異的ポリペプチドである。その最も単純な形態における本発明の三価の二重特異的ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対する２つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ及び別の抗原（例、血清アルブミン）に対して向けられた第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の三価ポリペプチド（本明細書において定義する）でありうるが、それにおいて、  前記の第１、第２、及び第３の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ又は複数の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。本発明に従った特に好ましい三価の二重特異的ポリペプチドは、本明細書において記載する実施例及び表Ａ−１１において示すものである。
【０２６７】
別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは四価の二重特異的ポリペプチドである。その最も単純な形態における本発明の四価の二重特異的ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対する３つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ及び別の抗原（例、血清アルブミン）に対して向けられた第４の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の四価ポリペプチド（本明細書において定義する）  でありうるが、それにおいて、前記の第１、第２、第３、及び第４の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ又は複数の、特に３つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。本発明に従った特に好ましい四価の二重特異的ポリペプチドは、本明細書において記載する実施例及び表Ａ−１１において示すものである。
【０２６８】
別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは五価の二重特異的ポリペプチドである。その最も単純な形態における本発明の五価の二重特異的ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対する４つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ及び別の抗原（例、血清アルブミン）に対して向けられた第５の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の五価ポリペプチド（本明細書において定義する）  でありうるが、それにおいて、前記の第１、第２、第３、第４、及び第５の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ又は複数の、特に４つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２６９】
別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは六価の二重特異的ポリペプチドである。その最も単純な形態における本発明の六価の二重特異的ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対する５つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ及び別の抗原（例、血清アルブミン）に対して向けられた第６の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディを含む、本発明の六価ポリペプチド（本明細書において定義する）  でありうるが、それにおいて、前記の第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディは、場合により、１つ又は複数の、特に５つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２７０】
さらなる態様では、本発明のポリペプチドは、マルチパラトープポリペプチド（本明細書において「本発明のマルチパラトープポリペプチド」としても言及する）、例えば、例、（ａ）「本発明のバイパラトープポリペプチド」又は「本発明のトリパラトープポリペプチド」などである。本明細書において使用する用語「マルチパラトープ」（抗原）結合分子又は「マルチパラトープ」ポリペプチドは、少なくとも２つの（即ち、２つ又はそれ以上の）免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、それにおいて、「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＧＩＴＲに対して向けられており、「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＧＩＴＲに対して向けられており、それにおいて、これらの「第１」及び「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインは異なるパラトープを有する。したがって、マルチパラトープポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、又はそれからなり、それにおいて、少なくとも１つの「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＧＩＴＲ上の第１のエピトープに向けられており、少なくとも１つの「第２」の免疫グロブリン単一ドメインは、ＧＩＴＲ上の第１のエピトープとは異なる、ＧＩＴＲ上の第２のエピトープに向けられている。
【０２７１】
さらなる態様では、本発明のポリペプチドはバイパラトープポリペプチドである。本明細書において使用する用語「バイパラトープ」（抗原）結合分子又は「バイパラトープ」ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＧＩＴＲに対して向けられた「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、それにおいて、これらの「第１」及び「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインは異なるパラトープを有する。したがって、バイパラトープポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又はそれからなり、それにおいて、「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＧＩＴＲ上の第１のエピトープに対して向けられ、「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメイン  は、ＧＩＴＲ上の第１のエピトープとは異なる、ＧＩＴＲ上の第２のエピトープに対して向けられる。
【０２７２】
別のさらなる態様では、本発明のポリペプチドはトリパラトープポリペプチドである。本明細書において使用する用語「トリパラトープ」（抗原）結合分子又は「トリパラトープ」ポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ＧＩＴＲに対して向けられた「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及びＧＩＴＲに対して向けられた「第３」の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、それにおいて、これらの「第１」、「第２」、及び「第３」の免疫グロブリン単一可変ドメインは異なるパラトープを有する。したがって、トリパラトープポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた３つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又はそれからなり、それにおいて、「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＧＩＴＲ上の第１のエピトープに対して向けられ、「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメイン  は、ＧＩＴＲ上の第１のエピトープとは異なる、ＧＩＴＲ上の第２のエピトープに対して向けられ、「第３」の免疫グロブリン単一可変ドメイン  は、ＧＩＴＲ上の第１及び第２のエピトープとは異なる、ＧＩＴＲ上の第３のエピトープに対して向けられる。
【０２７３】
本発明の多価ポリペプチド中に存在する２つ又はそれ以上（例えば２、３、４、５、又は６など）の免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）からなりうる；それらは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列からなりうる。好ましい態様では、それらは、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸）、ナノボディ（登録商標）（ＶＨＨを含むが、これに限定しない）、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列；又は親和性成熟により得られたＶＨＨ配列からなる。２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的に又は完全にヒト化されたナノボディ或いは部分的に又は完全にヒト化されたＶＨＨからなりなる。本発明の好ましい態様では、本発明の多価ポリペプチド中に包含される免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書において定義する、本発明の１つ又は複数の一価ポリペプチドである。
【０２７４】
ＧＩＴＲへの本発明の多価ポリペプチドの結合は、結合アッセイにおいて測定することができる。典型的なアッセイには、ＧＩＴＲが細胞表面（例えば、例、Flp-In（商標）２９３細胞又はGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293細胞など）上に曝露されるアッセイが（限定しないが）含まれる。ＧＩＴＲへの本発明の多価ポリペプチドの結合を測定するための好ましいアッセイは、ＦＡＣＳアッセイであり、例えば、実施例において記載するＦＡＣＳアッセイなどであり、それにおいて、Flp-In（商標）２９３細胞及び／又は活性化Ｔ細胞上に発現されたＧＩＴＲへの本発明の多価ポリペプチドの結合が決定される。ＧＩＴＲへの本発明のポリペプチドの結合のためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０２７５】
そのようなＦＡＣＳ結合アッセイにおいて、本発明の多価ポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−８M又はそれ以下、より好ましくは１０−９M又はそれ以下、又はさらには１０−１０M又はそれ以下、例えば１０−１１MなどのＥＣ５０値を有しうる。例えば、そのようなＦＡＣＳ結合アッセイにおいて、本発明の多価ポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−１１M〜１０−８Mの間、例えば１０−１１M〜１０−１０Mの間、１０−１０M〜１０−９Mの間、又は１０−１１M〜１０−１０Mの間などのＥＣ５０値を有しうる。特に、ファミリー７、２６、８２、８５、及び１０９に属する２つ又はそれ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲに結合する際、１０−１１M〜１０−９Mの間、例えば１０−１１M〜１０−１０Mの間などのＥＣ５０値を有しうる。
【０２７６】
本発明の多価ポリペプチドは、ＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲの活性を調節する（即ち、増加させる、増強させる、刺激する、又は強める）ことができる。特に、本発明のポリペプチドは、免疫応答を増強する、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強しうる。
【０２７７】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化は、種々のアッセイ（増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、細胞死滅アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ（例、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ）、Ｔ細胞活性化アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、及び活性化又はサイトカイン分泌の公知のマーカーの発現を測定するためのアッセイを含むが、これらに限定しない）により決定することができ、これらは全て当技術分野において周知である。
【０２７８】
例えば、免疫細胞活性化の測定値としてサイトカイン産生（例、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０）をモニターするためのいくつかの従来のアッセイの任意の１つを使用することができる。例えば、Ｔ細胞活性化を追跡するために、インターロイキン２をマーカーとして用いることができ、これはProc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1333 (1989)に記載されている通りにアッセイすることができる。
【０２７９】
また、免疫蛍光及びフローサイトメトリーを用いて細胞ベースでのサイトカイン産生をモニターし、細胞活性化状態を反映する細胞表面マーカーをモニターすることもできる。そのようなマーカーの宿主は公知であり、検出抗体は広く市販されており、マーカーは当技術分野において周知である。
【０２８０】
Ｔ細胞増殖についての一般的なアッセイは、トリチウム化チミジン取り込みを測定することを伴う。Ｔ細胞の増殖は、培養細胞の複製ＤＮＡ中に取り込まれた３Ｈ標識チミジンの量を測定することによりインビトロで測定することができる。従って、ＤＮＡ合成の速度、次に細胞分裂速度を定量化することができる。
【０２８１】
本発明の多価ポリペプチドによりＧＩＴＲを活性化するためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本発明の多価ポリペプチドによって、実施例１０に記載する通り、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３で刺激された活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイにおいてＩＦＮ−ガンマ産生が増強される。このＴ細胞活性化アッセイにおいて、本発明の多価ポリペプチドは、１０−７M又はそれ以下、好ましくは１０−８M又はそれ以下、より好ましくは１０−９M又はそれ以下、１０−１０M又はそれ以下、又はさらには１０−１１M又はそれ以下のＩＦＮ−ガンマ産生を増強するためのＥＣ５０値を有する。特に、ファミリー７、２６、及び１０９に属する２つ又はそれ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１１M〜１０−９Mの間、例えば１０−１１M〜１０−１０Mの間のＩＦＮ−ガンマ産生を増強するためのＥＣ５０値を有しうる。好ましくは、このＴ細胞活性化アッセイにおいて、本発明の多価ポリペプチドによって、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０未満、又はさらにそれ以下、例えば３０pM未満などのＥＣ５０値でＩＦＮ−ガンマ産生が増強される。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本発明の多価ポリペプチドは、実施例９に記載するＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおける核因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の活性を増強する。ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイは、Buillard et al. 2013, J. Exp. Med. Vol. 210, 9: 1685-1693において記載されている。本発明のポリペプチドによりＧＩＴＲを活性化するためのいくつかの好ましいＥＣ５０値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【０２８４】
ＮＦ−κＢは、炎症、免疫応答、及び細胞増殖において重要な役割を果たす。このアッセイは、具体的には、培養細胞におけるＮＦ−κＢ調節シグナル伝達経路の活性をモニターするために設計されている。このＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、本発明の多価ポリペプチドによって、１０−７M又はそれ以下の、好ましくは１０−８M又はそれ以下の、より好ましくは１０−９M又はそれ以下の、１０−１０M又はそれ以下の、或いはさらに１０−１１M又はそれ以下のＥＣ５０値で、Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｎ１１２０）の添加後に発光により測定したＮＦ−κＢ活性が増強される。特に、ファミリー７、２６、３８、８２、８５、及び１０９に属する２つ又はそれ以上の一価ポリペプチドを含む本発明の多価ポリペプチドは、１０−１１M〜１０−９Mの間、例えば  １０−１１M〜１０−１０Mの間でＮＦ−κＢ活性を増強するためのＥＣ５０値を有しうる。好ましくは、このＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、本発明の多価ポリペプチドによって、２００pM又はそれ以下、例えば１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００未満、又はさらにそれ以下、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１５、１４未満、又はさらにそれ以下、例えば１２pM未満などのＥＣ５０値でＮＦ−κＢ活性が増強される。
【０２８５】
本発明の多価ポリペプチドの治療効果を、インビボモデルにおいて、例えばマウス、ラット、ブタ、及び／又は霊長類などにおいて評価することができる。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６モデルは同系インビボ試験システムを提供し、それは、免疫療法的な概念を開発し、試験するために頻繁に使用される（Fearon et al. Cancer Res. 48: 2975-2980, 1988）。例えば、実施例１３、１４、及び２１に記載する同系ＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて、本発明の多価ポリペプチドは、腫瘍細胞成長を阻害しうる。いくつかの実施形態では、本発明の多価ポリペプチドは、腫瘍細胞成長を阻害し、腫瘍の重量又は容積の増加を阻害又は防止し、並びに／或いは、腫瘍の重量又は容積における少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などの減少を起こす。
【０２８６】
本発明の化合物、構築物、及び／又はポリペプチド
【０２８７】
本発明の一価ポリペプチド及び本発明の多価ポリペプチドは、１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含んでも、含まなくてもよい（これらの一価ポリペプチドならびに多価ポリペプチドは、追加の基、残基、  部分、又は部分の有無を問わず、全てを「本発明の化合物」、「本発明の構築物」、及び／又は「本発明のポリペプチド」として言及する。存在する場合、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、さらなる機能性を免疫グロブリン単一可変ドメインに（及び／又は、それが存在するポリペプチドに）提供しうる、又は提供しないであろう、及び、免疫グロブリン単一可変ドメインの特性を改変しうる、又は改変しないであろう。
【０２８８】
例えば、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、１つ又は複数の追加のアミノ酸配列でありうるが、ポリペプチドは、（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるようにする。好ましいが、しかし、非限定的な態様では、前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位は免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸、ナノボディ（例えば、例、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列など）からなる群より選ばれる免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【０２８９】
上に記載する通り、追加の結合単位、例えば異なる抗原特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインなどを連結して多重特異的ポリペプチドを形成することができる。２つ又はそれ以上の特異性の免疫グロブリン単一可変ドメインを組み合わせることにより、二重特異的、三重特異的などの構築物を形成することができる。例えば、本発明に従ったポリペプチドは、ＧＩＴＲに対して向けられた１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び別の標的に対する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。そのような構築物及びその改変は、当業者が容易に予想することができ、本明細書において使用する用語「本発明の化合物、本発明の構築物、及び／又は本発明のポリペプチド」により全てが包含される。
【０２９０】
上に記載する化合物、構築物、及び／又はポリペプチドにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つ又は複数の基、残基、部分、又は結合単位を互いに直接的に、並びに／或いは１つ又は複数の適切なリンカー又はスペーサーを介して連結してもよい。例えば、１つ又は複数の基、残基、部分、又は結合単位がアミノ酸配列である場合、リンカーもアミノ酸配列でよいが、結果として生じるポリペプチドが融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）であるようにする。
【０２９１】
１つ又は複数のさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、任意の適切な及び／又は所望のアミノ酸配列でありうる。さらなるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドの（生物学的な）特性を変化させうる、もしくは変化させないであろう、変えうる、もしくは変えないであろう、又は、そうでなければ、影響しうる、もしくは影響しないであろう、及び、さらなる機能性を本発明のポリペプチドに加えうる、もしくは加えないであろう。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、それが、１つ又は複数の所望の特性又は機能性を本発明のポリペプチドに与えるようにする。
【０２９２】
そのようなアミノ酸配列の例は当業者に明かであろうが、一般的には、従来の抗体及びそれらのフラグメント（しかし、限定しないが、ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）に基づくペプチド融合体において使用される全てのアミノ酸配列を含みうる。例えば、Holliger and Hudson（Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005）によるレビューを参照する。
【０２９３】
例えば、そのようなアミノ酸配列は、半減期、溶解性、もしくは吸収を増加させ、免疫原性もしくは毒性を低下させ、望ましくない副作用を除去又は減弱させ、並びに／或いは、本発明のポリペプチド自体と比較して、本発明の化合物、構築物、及び／又はポリペプチドに、他の有利な特性を与える、及び／又はその非所望の特性を低下させるアミノ酸配列でありうる、又はないであろう。そのようなアミノ酸配列のいくつかの非限定的な例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えば、ＷＯ００／２７４３５を参照のこと）又はハプテン分子（例えば、循環抗体により認識されるハプテン、例えば、ＷＯ９８／２２１４１を参照のこと）などである。
【０２９４】
本発明の特定の一態様では、本発明の対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを調製する。そのような半減期延長部分を含む、本発明のポリペプチドの例は、例えば、限定しないが、免疫グロブリン単一可変ドメインが、１つ又は複数の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適切なフラグメントなど）或いは血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の結合単位（例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸、ナノボディ、血清アルブミン（例えば血清アルブミンなど（例えばヒト血清アルブミンなど）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）、トランスフェリン、又は、ＷＯ０４／００３０１９において列挙されている他の血清タンパク質に結合することができるＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列）に適切に連結されているポリペプチド；免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃなど）、抗体定常領域（例えばＩｇＧ由来の抗体定常領域など）、又はその適切な部分もしくはフラグメントに連結されているポリペプチド；或いは、１つ又は複数の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の小さなタンパク質又はペプチド（例えば、限定しないが、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、又はＷＯ０２／０７６４８９に記載されているタンパク質及びペプチドなど）に適切に連結されているポリペプチドを含む。また、ＷＯ０３／００２６０９及びＷＯ０４／００３０１９において記載されるｄＡｂ、並びにHarmsenら（Vaccine 23: 4926-42, 2005）；ＥＰ０３６８６８４、ならびにＷＯ０８／０２８９７７、ＷＯ０８／０４３８２１、ＷＯ０８／０４３８２２（Ablynx N.V.による）及びＷＯ０８／０６８２８０を参照する。
【０２９５】
本発明の特定の、しかし、非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチドは、ＧＩＴＲ対する１つ又は複数の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドの他、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。ヒト血清アルブミンに対するこれらの免疫グロブリン単一可変ドメインは、上で引用するAblynx N.V.（例えば、ＷＯ０４／０６２５５１を参照のこと）による出願に一般的に記載されうる。増加した半減期を提供し、本発明のポリペプチドにおいて使用することができるいくつかの特に好ましいナノボディは、ＷＯ０６／１２２７８７（表ＩＩ及びＩＩＩを参照のこと）に開示されているナノボディＡＬＢ−１〜ＡＬＢ−１０、そのうち、ＡＬＢ−８（ＷＯ０６／１２２７８７中の配列番号６２）が特に好ましく、ならびにＷＯ２０１２／１７５４００（ＷＯ２０１２／１７５４００の配列番号１−１１）に開示されているナノボディ、「改善された免疫グロブリン単一可変ドメイン」と題された同時係属中の米国仮出願第６２／０４７，５６０号（出願日：２０１４年９月８日、譲受人：Ａｂｌｙｎｘ  ＮＶ）に開示されている配列番号１０９を伴うナノボディ及び「改善された血清アルブミン結合剤」と題された同時係属中の米国仮出願第６２／２５６，８４１号（出願日：２０１５年１１月１８日、譲受人：Ablynx N.V.）に開示されているナノボディ、そのうちＡｌｂ９２及びＡｌｂ２２３が特に好ましい（それぞれＵＳ  ６２／２５６，８４１の配列番号１０及び配列番号６３）。
【０２９６】
本発明の特に好ましいが非限定的な態様では、本発明は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含み；本明細書において記載する１つ又は複数（好ましくは１つ）の血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（例、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ８、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２、又はＡｌｂ２２３の血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン）をさらに含む、本発明のポリペプチドを提供する（表Ａ−１４参照）。
【０２９７】
したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（好ましくは、ＧＩＴＲに対する本発明の一価ポリペプチド）及び（ヒト）血清アルブミンに対して向けられた第４の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、四価の二重特異的ポリペプチドでありうるが、前記の第１、第２、第３、及び第４の免疫グロブリン単一可変ドメインは、場合により、１つ又は複数、特に３つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２９８】
別の態様に従い、本発明の１つ又は複数のポリペプチドは、１つ又は複数の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の部分として使用することができる／Ｆｃ部分を形成するための２つ又は３つの定常ドメイン）に、Ｆｃ部分に、ＩｇＧ型の抗体定常領域に、並びに／或いは、１つもしくは複数のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与する、及び／又は１つもしくは複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与する１つ又は複数の抗体部分、フラグメント又はドメインに連結してもよい。例えば、この目的のために、これらに限定しないが、例えば重鎖抗体（本明細書において記載する通り）から、より好ましくは従来のヒト４鎖抗体からの抗体の１つ又は複数のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含みうる；並びに／或いは、例えば、ＩｇＧからの（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からの）、ＩｇＥからの、又は別のヒトＩｇ（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＭなど）からのＦｃ領域（の部分）を形成しうる。例えば、ＷＯ９４／０４６７８には、ラクダ科ＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（即ち、ナノボディ）（それにおいて、ラクダ科ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインがヒトＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインにより置換されている）を含む重鎖抗体が記載されており、免疫グロブリンがＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインにより提供されるエフェクター機能を有し、免疫グロブリンが軽鎖の存在なしに機能することができる、ナノボディ並びにヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（しかし、ＣＨ１ドメインはない）を各々含む２つの重鎖からなる免疫グロブリンを提供するようにする。本発明のより好ましい態様では、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、好ましくは従来の４鎖抗体からの抗体又はそのフラグメントの１つ又は複数のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／又はＣＬドメインを含みうる；並びに／或いは、例えば、ＩｇＧからの（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からの）、ＩｇＥからの、又は別のヒトＩｇ  （例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭなど）からのヒト抗体定常領域（の部分）を形成しうるが、ｉ）各々がナノボディ並びにヒトＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３重鎖ドメインを含む２つの重鎖（それにおいて、ＣＨ１重鎖ドメインがナノボディのＣ末端部分に直接連結されている）並びにｉｉ）各々がナノボディ及びヒトＣＬ軽鎖ドメイン（例えばＣκ又はＣλなど）を含む２つの軽鎖（それにおいて、ＣＬ軽鎖ドメインがナノボディのＣ末端部分に直接連結されている）からなる化合物又は構築物（例えばナノボディ−ＩｇＧキメラなど）を提供するようにする（図７を参照のこと）。特に、そのような化合物又は構築物はＩｇＧ型であり、配列番号２２９、２３０、２９１、及び２９２の１つに示すアミノ酸配列、或いは配列番号２２９〜２３０及び２９１〜２９２のいずれかと８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る、例えば９７%、９８%、９９%又はそれ以上などの配列同一性（本明細書において定義する）を有するアミノ酸配列を含む。
【０２９９】
エフェクター機能を提供するために本発明のポリペプチドに適切に連結することができる他のアミノ酸配列は、当業者には明らかであり、所望のエフェクター機能に基づいて選んでもよい。例えば、ＷＯ０４／０５８８２０、ＷＯ９９／４２０７７、ＷＯ０２／０５６９１０、及びＷＯ０５／０１７１４８、ならびにＨｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ（上記）による総説；ＷＯ０９／０６８６２８を参照する。Ｆｃ部分又は抗体定常領域への本発明のポリペプチドのカップリングはまた、本発明の対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期をもたらしうる。
【０３００】
本発明の１つ又は複数のポリペプチド及びインビボで増加した半減期を伴う１つ又は複数の定常ドメインを含む他の適切な構築物が、当業者には明らかであり、例えば、場合によりリンカー配列を介してＣＨ３ドメインに連結されたポリペプチドを含みうる。一般的に、増加した半減期を伴う任意の融合タンパク質又は誘導体は、好ましくは、腎臓吸収についてのカットオフ値である５０kDを上回る分子量を有する。
【０３０１】
別の特定の、しかし、非限定的な態様では、本発明のポリペプチドは、二量体に自己会合する低下した（即ち、本質的にない）傾向（即ち、従来の４本鎖抗体において自然に生じる定常ドメインと比較して）を有する、自然に生じる、合成又は半合成の定常ドメイン（又は類似体、バリアント、変異体、部分、もしくはそのフラグメント）に（場合により、適切なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結してもよい。そのような単量体（即ち、自己会合しない）Ｆｃ鎖バリアント又はそのフラグメントは当業者には明らかであろう。例えば、Helmら（J. Biol. Chem. 271: 7494, 1996）には、本発明のポリペプチド鎖において使用することができる単量体Ｆｃ鎖バリアントが記載されている。
【０３０２】
また、そのような単量体Ｆｃ鎖バリアントは、それらが、好ましくは、相補体又は関連するＦｃ受容体に（それらが由来するＦｃ部分に依存して）依然として結合することが可能であるようにし、並びに／或いは、それらは、それらが由来するＦｃ部分のエフェクター機能の一部又は全てを（又は意図された使用のために依然として適切な低下レベルで）依然として有するようにする。あるいは、本発明のそのようなポリペプチド鎖において、単量体Ｆｃ鎖を使用してポリペプチド鎖に増加した半減期を付与してもよく、この場合では、単量体Ｆｃ鎖は、また、エフェクター機能を全く又は本質的に有さないであろう。
【０３０３】
一般的に、増加した半減期を伴う本発明のポリペプチドは、好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドそれ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を上回る半減期を有する。
【０３０４】
一般的には、増加した半減期を伴う本発明のポリペプチドは、好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドそれ自体と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回るなど、又はさらに２４、４８、もしくは７２時間を上回る増加した半減期を有する。
【０３０５】
別の好ましいが、しかし、非限定的な態様では、本発明のそのようなポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日間（例えば約５〜１０日間など）、好ましくは少なくとも９日間（例えば約９〜１４日間など）、より好ましくは少なくとも約１０日間（例えば約１０〜１５日間など）、又は少なくとも約１１日間（例えば約１１〜１６日間など）、より好ましくは少なくとも約１２日間（例えば約１２〜１８日間又はそれ以上など）、又は１４日間を上回る（例えば約１４〜１９日間など）半減期を有しうる。
【０３０６】
さらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させうる、もしくは変化させないであろう、変えうる、もしくは変えないであろう、又は、そうでなければ、影響しうる、もしくは影響しないであろう、及び、さらなる機能性を本発明のポリペプチドに加えうる、もしくは加えないであろう。例えば、そのようなアミノ酸残基は：
ａ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基を、例えば、異種宿主細胞又は宿主生物における発現の結果として含むことができ；
ｂ）合成時に宿主細胞からのポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列又はリーダー配列を形成しうる（例えば、本発明のポリペプチドを発現させるために使用する宿主細胞に依存して、本発明のポリペプチドのプレ、プロ、又はプレプロ形態を提供する）。適切な分泌リーダーペプチドは当業者には明らかであろうし、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。通常、そのようなリーダー配列はポリペプチドのＮ末端に連結されるであろうが、本発明は、その最も広い意味において、それに限定されない；
ｃ）「タグ」、例えば、アミノ酸配列又は残基（例えば、前記配列又は残基に対して向けられた親和性技術を使用してポリペプチドの精製を可能にする又は促進する）を形成してもよい。その後、前記配列又は残基を除去し（例、化学的又は酵素的切断により）、ポリペプチドを提供しうる（この目的のために、タグは、場合により、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列もしくはポリペプチド配列に連結してもよく、又は切断可能なモチーフを含んでもよい）。そのような残基のいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びｍｙｃタグ、例えばＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡなどである；
ｄ）官能化されている及び／又は官能基の付着のための部位として役立ちうる１つ又は複数のアミノ酸残基でありうる。適切なアミノ酸残基及び官能基は当業者には明らかであろうが、しかし、限定しないが、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書において言及するアミノ酸残基及び官能基を含む。
【０３０７】
本発明の多価ポリペプチドは、一般的に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドを、場合により１つ又は複数の適切なリンカーを介して、本発明の１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドに適切に連結する工程を少なくとも含む方法により調製することができ、本発明の多価ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、また、一般的に、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供し、前記核酸を適切な様式において発現させ、及び本発明の発現ポリペプチドを回収する工程を少なくとも含む方法により調製することができる。そのような方法は、それ自体が公知の様式において実施することができ、それは、当業者には明らかであろうが、例えば、本明細書においてさらに記載する方法及び技術に基づく。
【０３０８】
本発明の多価ポリペプチドを調製するための方法は、本発明の２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドと、例えば１つ又は複数のリンカーを適切な様式で一緒に連結する工程を少なくとも含みうる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び一価ポリペプチド（及びリンカー）は、当技術分野において公知の及び本明細書においてさらに記載する通りの任意の方法により共役させることができる。好ましい技術は、一価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製するための、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチド（及びリンカー）をコードする核酸配列の連結を含む。アミノ酸又は核酸を連結するための技術は当業者には明らかであろうが、ここでも、上に言及する、標準的なハンドブック、例えば  Sambrook et al.及びAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を参照する。
【０３０９】
したがって、本発明はまた、本発明の多価ポリペプチドを調製する際での本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドの使用に関する。多価ポリペプチドの調製のための方法は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドと、本発明の少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドを、場合により１つ又は複数のリンカーを介して連結することを含む。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドを次に、２つ（例、二価ポリペプチド中）、３つ（例、三価ポリペプチド中）、４つ（例、四価ポリペプチド中）、５つ（例、五価ポリペプチド中）、６つ（例、六価ポリペプチド中）又はそれ以上（例えば、多価ポリペプチド中）の結合単位を含む多価ポリペプチドを提供及び／又は調製する際での結合ドメイン又は結合単位として使用する。この点において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドは、本発明の多価、例えば、２、３、４、５、６又はそれ以上の結合単位を含む二価、三価、四価、五価、又は六価ポリペプチドを提供及び／又は調製する際での結合ドメイン又は結合単位として使用することができる。
【０３１０】
したがって、本発明はまた、多価ポリペプチドを調製する際での本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は特に一価ポリペプチド（本明細書において記載する）の使用に関する。多価ポリペプチドの調製のための方法は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドと、本発明の少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチドとの、場合によりリンカーを介した連結を含む。
【０３１１】
本発明の多価ポリペプチドにおける使用のための適切なスペーサー又はリンカーは当業者には明らかであり、一般的に、アミノ酸配列を連結するために当技術分野において使用される任意のリンカー又はスペーサーでありうる。好ましくは、前記リンカー又はスペーサーは、医薬的な使用について意図されるポリペプチドを構築する際での使用のために適切である。
【０３１２】
いくつかの特に好ましいスペーサーは、抗体フラグメント又は抗体ドメインを連結するために当技術分野において使用されるスペーサー及びリンカーを含む。これらは、上で引用した一般的な背景技術において言及するリンカー、ならびに、例えば、ダイアボディ又はＳｃＦｖフラグメントを構築するために当技術分野において使用されるリンカーを含む（この点において、しかし、ダイアボディにおいて、及びＳｃＦｖ  において、使用されるリンカー配列は、関連するＶＨドメイン及びＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することを可能にする長さ、柔軟性、及び他の特性を有するべきであるのに対し、各々の免疫グロブリン単一可変ドメインそれ自体が完全な抗原結合部位を形成するため、本発明のポリペプチドにおいて使用されるリンカーの長さ又は柔軟性に関する特別な制限はないことに注意すべきである）。
【０３１３】
例えば、リンカーは、適切なアミノ酸配列、特に、１〜５０アミノ酸残基、好ましくは１〜３０アミノ酸残基、例えば１〜１０アミノ酸残基などのアミノ酸配列でありうる。そのようなアミノ酸配列のいくつかの好ましい例は、例えば、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３など（ＷＯ９９／４２０７７に記載される）、ヒンジ様領域、例えば天然に生じる重鎖抗体又は類似配列など（例えば、ＷＯ９４／０４６７８に記載されている）を含む。
【０３１４】
いくつかの他の特に好ましいリンカーを表Ａ−１５中に言及しており、そのうちＧＳ９（配列番号２５１）が特に好ましい。
【０３１５】
他の適切なリンカーは、一般的に、有機化合物又はポリマー、特に医薬的な使用のためのタンパク質中での使用のために適切であるものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が抗体ドメインを連結するために使用されており、例えば、ＷＯ  ０４／０８１０２６を参照のこと。
【０３１６】
使用するリンカーの長さ、柔軟性、及び／又は他の特性（通常はＳｃＦｖフラグメント中で使用されるリンカーについて重要ではないが）が、本発明の最終ポリペプチドの特性（ＧＩＴＲ、或いは１つ又は複数の他の抗原についての親和性、特異性、又は結合力を含むが、これに限定しない）に対して特定の影響を有しうることを本発明の範囲内に包含する。本明細書の開示に基づいて、当業者は、場合により、特定の限定されたルーチン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０３１７】
使用されるリンカーが、本発明のポリペプチドに１つ又は複数の他の好ましい特性又は機能性を付与し、及び／又は誘導体の形成、及び／又は  官能基の付着のための１つ又は複数の部位を提供することは、本発明の範囲内である（例、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書において記載する通り）。例えば、１つ又は複数の荷電アミノ酸残基を含むリンカーは、改善された親水性特性を提供することができるのに対し、小さなエピトープ又はタグを形成又は含むリンカーは、検出、同定、及び／又は精製の目的のために使用することができる。ここでも、本明細書における開示に基づき、当業者は、場合により、いくつかの限定されたルーチン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０３１８】
最後に、２つ又はそれ以上のリンカーが本発明のポリペプチドにおいて使用される場合、これらのリンカーは同じであっても異なっていてもよい。ここでも、本明細書における開示に基づき、当業者は、場合により、いくつかの限定されたルーチン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０３１９】
通常、発現及び産生の簡単さのために、本発明のポリペプチドは線状ポリペプチドである。しかし、その最も広い意味での本発明はそれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３つ又はそれ以上のアミノ酸配列又はナノボディを含む場合、リンカーの使用により、それらを３つ又はそれ以上の「アーム」と連結することが可能であり、各々の「アーム」はアミノ酸配列又はナノボディに連結され、「星型」構造を提供する。それも可能であるが、通常は円形構造を使用することはあまり好ましくない。
【０３２０】
本発明の免疫グロブリン又はポリペプチドを含み、タグ又は他の機能的部分（例えば毒素、標識、放射性化学物質など）をさらに含む化合物、構築物、及び／又はポリペプチドも本発明に包含する。
【０３２１】
あるいは、追加の基、残基、部分、又は結合単位は、例えば、化学的な基、残基、部分でありうるが、それらは、それ自体が、生物学的に及び／又は薬理学的に活性であってもなくてもよい。例えば、限定しないが、そのような基は、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリン単一可変ドメインに連結してもよく、本発明のポリペプチドの「誘導体」を提供する。
【０３２２】
したがって、その最も広い意味での本発明はまた、本発明のポリペプチドの誘導体である化合物、構築物、及び／又はポリペプチドも含む。そのような誘導体は、一般的に、本発明のポリペプチドの、及び／又は本発明のポリペプチドを形成するアミノ酸残基の１つ又は複数の修飾により、特に、化学的及び／又は生物学的（例、酵素的）修飾により得ることができる。
【０３２３】
そのような修飾の例、ならびにそのような様式で（即ち、タンパク質骨格上、しかし、好ましくは、側鎖上のいずれかで）修飾することができるポリペプチド配列内のアミノ酸残基の例、そのような修飾を導入するために使用することができる方法及び技術、ならびにそのような修飾の潜在的な使用及び利点が当業者には明らかであろう（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013も参照のこと）。
【０３２４】
例えば、そのような修飾は、本発明のポリペプチド中への又は上への１つ又は複数の官能基、残基、又は部分の導入、ならびに、特に、本発明のポリペプチドに１つ又は複数の所望の特性又は機能性を付与する１つ又は複数の官能基、残基、又は部分の導入（例、共有結合的連結による又は任意の他の適切な様式において）を含みうる。そのような官能基の例は当業者には明らかであろう。
【０３２５】
例えば、そのような修飾は、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性、及び／又は吸収を増加させる、本発明のポリペプチドの免疫原性及び／又は毒性を低下させる、本発明のポリペプチドの任意の望ましくない副作用を除去又は減弱させる、並びに／或いは本発明のポリペプチドに他の有利な特性を付与する及び／又は本発明のポリペプチドの非所望の特性を低下させる１つ又は複数の官能基（例、共有結合的連結による又は任意の他の適切な様式において）；或いは、先行するものの２つ又はそれ以上の任意の組み合わせの導入を含みうる。そのような官能基の及びそれらを導入するための技術の例は、当業者には明らかであろうが、一般的に、本明細書において上に引用する一般的な背景技術において言及する全ての官能基及び技術、ならびに医薬的タンパク質の修飾のための、及び、特に、抗体又は抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）の修飾のための、それ自体が公知の官能基及び技術を含みうるが、それらについて、例えば、Remington（Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980）を参照する。そのような官能基は、例えば、本発明のポリペプチドに直接的に（例えば、共有結合的に）又は、場合により、適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結してもよく、ここでも、当業者に明かであろう通りである。
【０３２６】
１つの特定の例は、ポリペプチドが、化学的に修飾されて（例えば、ペグ化を用いて）、その半減期が増加されている本発明の誘導体ポリペプチドである。これは、医薬的タンパク質の半減期を増加させる及び／又は免疫原性を低下させるための最も広く使用されている技術の１つであり、適切な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧなど）などの付着を含む。一般的に、ペグ化の任意の適切な形態を使用することができる（例えば、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含む）のために当技術分野において使用されるペグ化など）；例えば、Chapman（Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002）、Veronese及びHarris（Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003）、Harris及びChess（Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003）及びＷＯ０４／０６０９６５を参照する。タンパク質のペグ化のための種々の試薬も、例えば、Nektar Therapeutics, USAから市販されている。
【０３２７】
好ましくは、部位特異的ペグ化を、特に、システイン残基を介して使用する（例えば、Yangら（Protein Engineering 16: 761-770, 2003）を参照のこと）。例えば、この目的のために、ＰＥＧを、本発明のナノボディにおいて自然に生じるシステイン残基に付着してもよく、本発明のナノボディを修飾し、ＰＥＧの付着のために１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入してもよく、又は、ＰＥＧの付着のために１つ又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端に融合してもよく、全てで、当業者にそれ自体が公知のタンパク質操作の技術が使用される。
【０３２８】
好ましくは、本発明のポリペプチドについて、ＰＥＧを、５０００ダルトンを上回る、例えば１０，０００を上回る及び２００，０００未満、例えば１００，０００未満など；例えば、２０，０００〜８０，０００の範囲中の分子量で使用する。
【０３２９】
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、本発明のポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存して、通常は翻訳中及び／又は翻訳後修飾の部分としてＮ連結又はＯ連結グリコシル化を含む。
【０３３０】
さらに別の修飾は、本発明の標識されたポリペプチドの意図される使用に依存して、１つ又は複数の検出可能な標識又は他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含みうる。それらを付着させ、使用し、検出するための適切な標識及び技術は当業者には明らかであり、例えば、限定しないが、蛍光標識（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、及びフルオレサミン並びに蛍光金属、例えば１５２Ｅｕ又はランタニド系列の他の金属など）、燐光標識、化学発光標識又は生物発光標識（例えばルミナール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタン又はＧＦＰ及びその類縁体）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅ）、金属、金属キレート又は金属カチオン（例えば金属カチオン、例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａなど、インビボ、インビトロ、又はインサイチュ診断及び撮像における使用に特に適切な他の金属又は金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅなど））並びに発色団及び酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩリン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼなど）を含む。他の適切な標識が当業者には明らかであり、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲ分光法を使用して検出することができる部分を含む。
【０３３１】
本発明のそのような標識ポリペプチドは、例えば、特定標識の選択に依存して、インビトロ、インビボ、又はインサイチュアッセイ（それ自体が公知のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、及び他の「サンドイッチアッセイ」などを含む）ならびにインビボ診断及び撮像目的のために使用してもよい。
【０３３２】
当業者に明かであろう通り、別の修飾は、キレート基の導入を含みうるが、例えば、上で言及する金属又は金属陽イオンの１つをキレート化する。適切なキレート基は、例えば、限定しないが、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。
【０３３３】
さらに別の修飾は、特定の結合対、例えばビオチン（ストレプト）アビジン結合対などの１つの部分である官能基の導入を含みうる。そのような官能基を使用し、本発明のポリペプチドを別のタンパク質、ポリペプチド、又は化学的化合物（結合対の他の半分に、即ち、結合対の形成を通じて結合されている）に連結してもよい。例えば、本発明のポリペプチドをビオチンに共役し、別のタンパク質、ポリペプチド、化合物、又は担体（アビジン又はストレプトアビジンに共役されている）に連結してもよい。例えば、そのような本発明の共役ポリペプチドを、レポーターとして、例えば、診断システムにおいて使用してもよく、そこでは、検出可能なシグナル産生薬剤をアビジン又はストレプトアビジンに共役する。そのような結合対を、例えば、また使用し、本発明のポリペプチドを担体（医薬的な目的のために適切な担体を含む）に結合してもよい。１つの非限定的な例は、CaoとSuresh（Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000）により記載されているリポソーム製剤である。そのような結合対を、また使用し、治療的に活性な薬剤を本発明のポリペプチドに連結してもよい。
【０３３４】
他の潜在的な化学的及び酵素的修飾が、当業者には明らかであろう。そのような修飾はまた、研究目的のために（例、機能−活性関係を試験するために）導入されうる。例えば、LundbladとBradshaw（Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997）を参照する。
【０３３５】
好ましくは、化合物、構築物、ポリペプチド、及び／又は誘導体は、それらが、本明細書において定義する（即ち、本発明のポリペプチドについて定義する）親和性（ＫＤ値（実際又は見掛け上）、ＫＡ値（実際又は見掛け上）、Ｋｏｎ速度及び／又はＫｏｆｆ速度として、或いは、代わりにＩＣ５０値として適切に測定及び／又は表現される）でＧＩＴＲに結合するようにする。そのような誘導体は、通常、本明細書において定義するＧＩＴＲの有効性及び／又は効力も有する。
【０３３６】
本発明のそのような化合物、構築物、及び／又はポリペプチド並びにそれらの誘導体は、また、本質的に単離された形態（本明細書において定義する）でありうる。
【０３３７】
本発明はさらに、本明細書において記載する化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び組成物を調製するための方法に関する。
【０３３８】
本発明のポリペプチド及び核酸は、それ自体が公知の様式において調製することができ、本明細書におけるさらなる記載から、当業者には明らかであろう通りである。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製のために、及び特に抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の調製のために、それ自体が公知の任意の様式において調製することができる。ポリペプチド及び核酸を調製するためのいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な方法は、本明細書において記載する方法及び技術を含む。
【０３３９】
本発明のポリペプチドを産生するための方法は、以下の工程を含みうる：
−  適切な宿主細胞もしくは宿主生物（また、本明細書において「本発明の宿主」として言及する）における、又は本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（また、本明細書において「本発明の核酸」として言及する）の別の適切な発現系における発現、  場合により、以下が続く：
−  このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。特に、そのような方法は、以下の工程を含みうる：
−  本発明の前記宿主が、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現及び／又は産生する条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持すること；  場合により、以下が続く：
−  このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【０３４０】
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列に関する（また、「本発明の核酸」として言及する）。本発明の核酸は、一本又は二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの形態でありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、意図する宿主細胞又は宿主生物における発現のために特に適応されているコドン使用を伴うＤＮＡなど）でありうる。
【０３４１】
本発明の一実施形態に従い、本発明の核酸は、本明細書において定義する通り、本質的に単離形態である。本発明の核酸は、また、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣなど）の形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、それは、ここでも、本質的に単離形態でありうる。
【０３４２】
本発明の核酸は、本明細書において与える本発明のポリペプチドに関する情報に基づき、それ自体が公知の様式において調製する又は得ることができ、並びに／或いは適切な自然の供給源から単離することができる。また、当業者には明らかであろう通り、本発明の核酸を調製するために、また、いくつかのヌクレオチド配列、例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又は一価ポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸及び、例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸を、適切な様式において一緒に連結することができる。
【０３４３】
本発明の核酸を生成するための技術は、当業者には明らかであろうが、例えば、しかし、限定しないが、自動ＤＮＡ合成；  部位特異的変異誘発；２つ又はそれ以上の自然に生じる及び／又は合成配列（或いは、それらの２つ又はそれ以上の部分）を組み合わせること、切断発現産物の発現に導く変異の導入；１つ又は複数の制限部位の導入（例、適切な制限酵素を使用して簡単に消化及び／又は連結されうるカセット及び／又は領域を作製すること）、及び／又は、１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応を用いた変異の導入を含みうる。これら及び他の技術は、当業者には明らかであろうが、ここでも、上に言及する、標準的なハンドブック、例えば  Sambrookら及びAusubelらなど、ならびに下の実施例を参照する。
【０３４４】
本発明の核酸は、また、遺伝子構築物の形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、当業者には明らかであろう通りである。そのような遺伝子構築物は、一般的に、場合により、それ自体が公知の遺伝子構築物の１つ又は複数のエレメント、例えば、１つ又は複数の適切な調節エレメント（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び本明細書において言及する遺伝子構築物のさらなるエレメントなどに連結された本発明の少なくとも１つの核酸を含む。本発明の少なくとも１つの核酸を含むそのような遺伝子構築物はまた、本明細書において、「本発明の遺伝子構築物」として言及する。
【０３４５】
本発明の遺伝子構築物はＤＮＡ又はＲＮＡでありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、意図する宿主細胞又は宿主生物の形質転換のための適切な形態で、意図する宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への組込みのための適切な形態で、或いは、意図する宿主生物における非依存的な複製、維持、及び／又は遺伝のための適切な形態でありうる。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンなどの形態でありうる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、発現をインビトロ及び／又はインビボで（例、適切な宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）提供することができるベクターでありうる。
【０３４６】
好ましいが、しかし、非限定的な実施形態では、本発明の遺伝子構築物は以下を含む  ａ）本発明の少なくとも１つの核酸；以下に動作可能に接続されている
ｂ）１つ又は複数の調節エレメント、例えばプロモーター及び、場合により、適切なターミネーターなど；及び、場合により、  また、
ｃ）それ自体が公知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなるエレメント；
それにおいて、用語「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「動作可能に接続された」は、当技術分野において、それらの通常の意味を有する（本明細書においてさらに記載する通り）；及び、それにおいて、遺伝子構築物中に存在する前記の「さらなるエレメント」は、例えば、３’又は５’ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は、形質転換又は組込み（の効率）を促進又は増加しうるエレメントでありうる。そのような遺伝子構築物のためのこれらの及び他の適切なエレメントは、当業者には明らかであろうが、例えば、使用する構築物の型；意図する宿主細胞又は宿主生物；目的の本発明のヌクレオチド配列を発現させる様式（例、構成的、一過性、又は誘導的発現を介する）；及び／又は使用すべき形質転換技術に依存しうる。例えば、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の発現及び産生のためのそれ自体が公知の調節配列、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に類似の様式において使用してもよい。
【０３４７】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、本発明の前記の少なくとも１つの核酸及び前記の調節エレメント、並びに、場合により、前記の１つ又は複数のさらなるエレメントを、互いに「動作可能に連結」し、それにより、一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターが、コード配列の転写及び／又は発現を開始する、或いは、そうでなければ、制御／調節することができる場合、コード配列に「動作可能に連結されている」と考えられる（それにおいて、前記コード配列は、前記プロモーター「の制御下」にあるとして理解すべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列を動作可能に連結する場合、それらは同じ方向にある、及び、通常は、また、同じリーディングフレーム中にある。それらは、通常は、また、本質的に連続的であるが、これも要求されないであろう。
【０３４８】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節及びさらなるエレメントは、それらが、意図された宿主細胞又は宿主生物においてそれらの意図された生物学的機能を提供することが可能であるようにする。
【０３４９】
例えば、プロモーター、エンハンサー、又はターミネーターは、意図された宿主細胞又は宿主生物において「動作可能」であるべきであり、それにより、（例えば）前記プロモーターが、ヌクレオチド配列、例、動作可能に連結されている（例、本明細書に定義する）コード配列の転写及び／又は発現を開始する、又は、そうでなければ制御／調節することが可能であるべきである。
【０３５０】
いくつかの特に好ましいプロモーターは、限定しないが、本明細書に言及する宿主細胞中での発現のためのそれ自体が公知のプロモーター；並びに、特に細菌細胞中での発現のためのプロモーター、例えば本明細書に言及するもの及び／又は実施例で使用するものなどである。
【０３５１】
選択マーカーは、適切な選択条件下で、本発明のヌクレオチド配列で（成功裏に）形質転換された宿主細胞及び／又は宿主生物が、（成功裏に）形質転換されなかった宿主細胞及び／又は宿主生物と区別されることを可能にしなければならない。そのようなマーカーのいくつかの好ましいが、非限定的な例は、抗生物質（例えばカナマイシン又はアンピシリンなど）に対して耐性を提供する遺伝子、温度耐性を提供する遺伝子、或いは、宿主細胞又は宿主生物が、形質転換されていない細胞又は生物の生存のために不可欠な培地中の特定の因子、化合物、及び／又は（食物）成分の非存在において維持されることを可能にする遺伝子である。
【０３５２】
リーダー配列は、意図された宿主細胞又は宿主生物において、所望の翻訳後修飾を可能にするようにし、及び／又は転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又は細胞小器官に向けるようにしなければならない。リーダー配列はまた、前記細胞からの発現産物の分泌を可能にしうる。そのようなものとして、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物において動作可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列でありうる。例えば、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の発現及び産生のためのそれ自体が公知のリーダー配列を、本質的に類似の様式において使用してもよい。
【０３５３】
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、宿主細胞又は宿主生物において、遺伝子構築物（上に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現の検出を可能にするようにすべきである。発現マーカーは、場合により、例えば、細胞の特定の部分もしくは細胞小器官における、及び／又は（ａ）多細胞生物の特定の細胞、組織、器官、又は部分における発現産物の局在化も可能にしうる。そのようなレポーター遺伝子はまた、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドとのタンパク質融合物として発現されうる。いくつかの好ましいが、非限定的な例には蛍光タンパク質（例えばＧＦＰなど）が含まれる。
【０３５４】
適切なプロモーター、ターミネーター、及びさらなるエレメントのいくつかの好ましいが、非限定的な例には、本明細書に言及する宿主細胞中での発現のために使用することができるものが含まれる；特に細菌細胞中での発現のために適切であるもの、例えば本明細書に言及するもの及び／又は以下の実施例で使用するものなどである。プロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及び本発明の遺伝子構築物中に存在し／それにおいて使用されうるさらなるエレメント（例えば、ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー及び／又は組込み因子など）のいくつかの（さらなる）非限定的な例については、上で言及する一般的なハンドブック（例えばSambrookら及びAusubelらなど）、並びにＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９６／２３８１０、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９５／２１１９１、ＷＯ９７／１１０９４、ＷＯ９７／４２３２０、ＷＯ９８／０６７３７、ＷＯ９８／２１３５５、ＵＳ７，２０７，４１０、ＵＳ５，６９３，４９２、及びＥＰ１０８５０８９に与えられる例を参照する。他の例が当業者には明らかであろう。上で引用した一般的な背景技術及び本明細書において引用したさらなる参考文献も参照する。
【０３５５】
本発明の遺伝子構築物は、一般的に、例えば、上で言及する一般的なハンドブック（例えばSambrookら及びAusubelらなど）に記載されている技術を使用して、本発明のヌクレオチド配列を、上に記載する１つ又は複数のさらなるエレメントに適切に連結することにより提供しうる。
【０３５６】
しばしば、本発明の遺伝子構築物は、それ自体が公知の適切な（発現）ベクター中に本発明のヌクレオチド配列を挿入することにより得られる。適切な発現ベクターのいくつかの好ましいが、非限定的な例は、以下の実施例で使用するもの、ならびに本明細書に言及するものである。
【０３５７】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物を使用し、宿主細胞又は宿主生物を、即ち、本発明のポリペプチドの発現及び／又は産生のために形質転換してもよい。適切な宿主又は宿主細胞が当業者には明らかでありうるが、例えば、任意の適切な真菌細胞、原核細胞もしくは真核細胞又は細胞株、或いは任意の適切な真菌生物、原核生物、又は（非ヒト）真核生物でありうるが、例えば：
−  細菌株、しかし、限定しないが、グラム陰性株、例えば大腸菌の；プロテウスの、例えば、プロテウス・ミラビリスの；シュードモナスの、例えば、シュードモナス・フルオレッセンスの株など；及び、グラム陽性株、例えばバチルス、例えば、バチルス・サブチリスの又はバチルス・ブレビスの；ストレプトミセスの、例えば、ストレプトミセス・リビダンスの；スタフィロコッカスの、例えば、スタフィロコッカス・カルノサスの；及び、ラクトコッカスの、例えば、ラクトコッカス・ラクティスの株などを含み；
−  真菌細胞、しかし、限定しないが、トリコデルマの種からの、例えば、トリコデルマ・リーゼイからの；ニューロスポラの、例えば、ニューロスポラ・クラッサからの；ソルダリアの、例えば、ソルダリア・マクロスポラからの；アスペルギルスの、例えば、アスペルギルス・ニガーからの又はアスペルギルス・ソーヤからの；又は他の糸状菌からの細胞を含み；
−  酵母細胞、しかし、限定しないが、サッカロマイセスの、例えば、サッカロマイセス・セレビシエの；シゾサッカロミセスの、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベの；ピキアの、例えば、ピキア・パストリスの又はピキア・メタノリカの；ハンゼヌラの、例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファの；クルイベロマイセスの、例えば、クルイベロマイセス・ラクティスの；アークスラの、例えば、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の；ヤロウィアの、例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の種からの細胞を含み；
−  両生類細胞又は細胞株、例えばアフリカツメガエル卵母細胞など；
−  昆虫由来の細胞又は細胞株、  例えば鱗翅目由来の細胞／細胞株（しかし、限定しないが、スポドプテラＳｆ９細胞及びＳｆ２１細胞を含む）など、又はショウジョウバエ由来の細胞／細胞株、例えばシュナイダー細胞及びＫｃ細胞など；
−  植物又は植物細胞、例えば、タバコ植物中；並びに／或いは
−  哺乳動物細胞又は細胞株、例えば、ヒト由来の細胞又は細胞株、哺乳動物からの細胞又は細胞株（しかし、限定しないが、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ＢＨＫ細胞、及びヒト細胞又は細胞株、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｃａｋｉ細胞、及びＨＥＫ２９３Ｈ細胞などを含む）；
ならびに、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の発現及び産生のための、それ自体が公知の全ての他の宿主細胞又は（非ヒト）宿主、それらは、当業者には明らかであろう。本明細書の上に引用する一般的な背景技術、ならびに例えば、ＷＯ９４／２９４５７；ＷＯ９６／３４１０３；ＷＯ９９／４２０７７；Frenkenら（Res Immunol. 149: 589-99, 1998）；Riechmann and Muyldermans (1999)(上記);van der Linden（J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000）；Joostenら（Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003）；Joostenら（Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005）；及びそれらにおいて引用されているさらなる参考文献も参照する。
【０３５８】
本発明のポリペプチドはまた、例えば、ＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９５／２２６１８、及びＵＳ７，００４，９４０；ＷＯ０３／０１４９６０において；Cattaneo and Biocca（“Intracellular Antibodies: Development and Applications” Landes and Springer-Verlag, 1997）において；並びにKontermann（Methods 34: 163-170, 2004）において記載されているような、いわゆる「イントラボディ」として発現されてもよい。
【０３５９】
本発明のポリペプチドは、例えば、また、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中で、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ、又はヒツジの乳汁中で（例えば、哺乳動物中にトランスジーンを導入するための一般的な技術については、ＵＳ  ６，７４１，９５７、ＵＳ  ６，３０４，４８９、及びＵＳ  ６，８４９，９９２を参照のこと）、植物又は植物の部分中で（しかし、限定しないが、それらの葉、花、果実、種子、根、又は塊茎を含む）（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファにおいて）、或いは、例えば、カイコＢｏｍｂｉｘ  ｍｏｒｉの蛹中で産生することもできる。
【０３６０】
さらに、本発明のポリペプチドを、また、無細胞発現系において発現及び／又は産生することができ、そのような系の適切な例は当業者に明かであろう。いくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例は、小麦胚芽系における；ウサギ網状赤血球ライセートにおける；又は大腸菌Ｚｕｂａｙ系における発現を含む。
【０３６１】
好ましくは、本発明において、本発明のポリペプチドを、医薬的使用のために適切である形態において提供する（インビボ又はインビトロ）発現系（例えば細菌発現系など）を使用し、そのような発現系は、ここでも、当業者に明かであろう。また、当業者に明かであろう通り、医薬的使用のための適切な本発明のポリペプチドは、ペプチド合成のための技術を使用して調製することができる。
【０３６２】
工業規模での産生のために、免疫グロブリン単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド治療薬の（工業）産生のための好ましい異種宿主は、大規模発現／産生／発酵のために、及び特に大規模な医薬的な発現／産生／発酵のために適切である大腸菌、ピキア・パストリス、Ｓセレビシエの株を含む。そのような株の適切な例が当業者には明らかであろう。そのような株及び産生／発現系は、また、企業、例えばＢｉｏｖｉｔｒｕｍ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）などにより利用可能になる。
【０３６３】
あるいは、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模発現／産生／発酵のために、及び特に大規模な医薬的な発現／産生／発酵のために使用することができる。再び、そのような発現系／産生系が、また、上に言及する企業の一部により利用可能になる。
【０３６４】
特定の発現系の選択は、部分的には、特定の翻訳後修飾、より具体的には、グリコシル化についての要求に依存しうる。グリコシル化が望ましい又は要求される免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組換えタンパク質の産生には、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物の発現宿主の使用が必要とされうる。この点において、得られたグリコシル化パターン（即ち、付着した残基の種類、数、及び位置）が、発現のために使用される細胞又は細胞株に依存しうることが当業者には明らかであろう。好ましくは、ヒト細胞又は細胞株のいずれかを使用し（即ち、ヒトのグリコシル化パターンを本質的に有するタンパク質に導く）、或いは、別の哺乳動物細胞を使用するが、それは、ヒトのグリコシル化と本質的に及び／又は機能的に同じである、或いは、ヒトのグリコシル化を少なくとも模倣するグリコシル化パターンを提供することができる。一般的に、原核生物の宿主（例えば大腸菌など）は、タンパク質をグリコシル化する能力を有さず、より低い真核生物（例えば酵母など）の使用は、通常、ヒトのグリコシル化とは異なるグリコシル化パターンに導く。それにもかかわらず、全ての先行する宿主細胞及び発現系を、得るべき所望のポリペプチドに依存し、本発明において使用することができることを理解すべきである。
【０３６５】
このように、本発明の非限定的な一実施形態に従い、本発明のポリペプチドをグリコシル化する。本発明の別の非限定的な実施形態に従い、本発明のポリペプチドは非グリコシル化である。
【０３６６】
本発明の好ましいが、しかし、非限定的な一実施形態に従い、本発明のポリペプチドは、細菌細胞、特に、大規模な医薬品産生のために適切な細菌細胞（例えば上に言及する株の細胞など）中で産生させる。
【０３６７】
本発明の別の好ましいが、しかし、非限定的な実施形態に従い、本発明のポリペプチドは、酵母細胞中で、特に、大規模な医薬品産生のために適切な酵母細胞（例えば上に言及する種の細胞など）中で産生させる。
【０３６８】
本発明のさらに別の好ましいが、しかし、非限定的な実施形態に従い、本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞中で、特に、ヒト細胞中で又はヒト細胞株の細胞中で、さらに特に、ヒト細胞中で又は大規模な医薬品産生のために適切なヒト細胞株（例えば、本明細書において上で言及する細胞株など）の細胞中で産生させる。
【０３６９】
宿主細胞中での発現を使用して本発明のポリペプチドを産生する場合、本発明のポリペプチドを、細胞外で（例、サイトゾル中で、ペリプラズム中で、又は封入体中で）産生し、次に宿主細胞から単離し、場合により、さらに精製することができる；又は、細胞外で（例、宿主細胞を培養した培地中で）産生し、次に培養培地から単離し、場合により、さらに精製することができる。真核生物宿主細胞を使用する場合、細胞外産生が通常好ましいが、なぜなら、これによって、得られるポリペプチドのさらなる単離及び下流プロセシングが大幅に促進されるためである。細菌細胞（例えば上で言及する大腸菌株など）は、いくつかのクラスのタンパク質（例えば毒素及び溶血素など）を除き、通常は細胞外にタンパク質を分泌しないが、大腸菌における分泌産生は、内膜を横切ったペリプラズム空間へのタンパク質の転位を指す。ペリプラズム産生は、サイトゾル産生を上回るいくつかの利点を提供する。例えば、分泌産物のＮ末端アミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一でありうる。また、ペリプラズムでは、細胞質よりもずっと少ないプロテアーゼ活性があるように見える。また、タンパク質精製は、ペリプラズム中でのタンパク質の混入がより少ないため、より簡単である。別の利点は、ペリプラズムが、細胞質よりも、より酸化的な環境を提供するため、正確なジスルフィド結合が形成されうることである。大腸菌で過剰発現されるタンパク質は、しばしば、不溶性凝集体、いわゆる封入体中に見出される。これらの封入体は、サイトゾル中又はペリプラズム中に位置しうる；これらの封入体からの生物学的に活性なタンパク質の回収には、変性／再折り畳みプロセスが要求される。多くの組換えタンパク質（治療用タンパク質を含む）が封入体から回収される。あるいは、当業者には明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のポリペプチドを分泌するように遺伝子改変された細菌の組換え株を使用することができる。
【０３７０】
このように、本発明の非限定的な一実施形態に従い、本発明のポリペプチドは、細胞外で産生された、及び、宿主細胞から、特に細菌細胞から、又は細菌細胞中の封入体から単離されたポリペプチドである。本発明の別の非限定的な実施形態に従い、本発明のポリペプチドは、細胞外で産生された、及び、宿主細胞を培養した培地から単離されたポリペプチドである。
【０３７１】
これらの宿主細胞との使用のためのいくつかの好ましいが、しかし、非限定的なプロモーターには、以下が含まれる：
−  大腸菌での発現用：ｌａｃプロモーター（及びその誘導体、例えばｌａｃＵＶ５プロモーター）；アラビノースプロモーター；ファージラムダの左方向（ＰＬ）及び右方向（ＰＲ）プロモーター；ｔｒｐオペロンのプロモーター；ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）；Ｔ７−プロモーター（より具体的にはＴ７ファージ遺伝子１０のもの）及び他のＴファージプロモーター；Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター；外来性の調節オペレーター配列の１つ又は複数のコピーを含む上記プロモーターの改変バリアント；
−  Ｓセレビシエでの発現用：構成的：ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（シトクロムｃイソ１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）；調節的：ＧＡＬ１、１０、７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコールデヒドロゲナーゼ２）、ＰＨＯ５（酸性ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）；異種：ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）。
−  ピキア・パストリスにおける発現用：ＡＯＸ１プロモーター（アルコールオキシダーゼＩ）；
−  哺乳動物細胞での発現用：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター；プロモーターがＴｅｔリプレッサーにより調節することができるように２つのテトラサイクリンオペレーター配列を含むヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターバリアント；ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＲＳＶ  ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター；ヒト、チンパンジー、マウス、又はラットからの伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ−１長末端反復プロモーター；βアクチンプロモーター；
これらの宿主細胞との使用のためのいくつかの好ましいが、しかし、非限定的なベクターには、以下が含まれる：
−  哺乳動物細胞での発現用のベクター：ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）、及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）、ならびにウイルスベースの発現系、例えばアデノウイルスに基づくものなど；
−  細菌細胞での発現用のベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）
−  酵母又は他の真菌細胞での発現用のベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びピキア発現ベクター（Invitrogen）
−  昆虫細胞での発現用のベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター
−  植物又は植物細胞での発現用のベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルスに基づくベクター、アグロバクテリウムの適切な株、又はＴｉプラスミドベースのベクター。
これらの宿主細胞との使用のためのいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な分泌配列には、以下が含まれる：
−  細菌細胞（例えば大腸菌など）での使用のため：ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢなど；ＴＡＴシグナルペプチド、溶血素Ｃ末端分泌シグナル；
−  酵母での使用のため：α交配因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）など；
−  哺乳動物細胞での使用のため：標的タンパク質が真核生物起源の場合における固有シグナル；マウスＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド；等
【０３７２】
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するための適切な技術が、当業者には明らかであろうが、意図される宿主細胞／宿主生物及び使用される遺伝子構築物に依存しうる。ここでも、上に言及するハンドブック及び特許出願を参照する。
【０３７３】
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物を用いて成功裏に形質転換されているそれらの宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択するための工程を実施してもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子構築物中に存在する選択可能なマーカーに基づく選択工程又は本発明のポリペプチドの検出（例、特異的抗体を使用する）を含む工程でありうる。
【０３７４】
形質転換された宿主細胞（それは、安定な細胞株の形態でありうる）又は宿主生物（それは、安定な変異体系統又は株の形態でありうる）は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０３７５】
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、それらが、本発明のポリペプチド（宿主生物の場合において：その少なくとも１つの細胞、部分、組織、又は器官において）を発現する、又は発現することが（少なくとも）可能である（例、適した条件下で）ようにする。本発明はまた、例えば、細胞分裂により又は有性生殖もしくは無性生殖により得られうる、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代、及び／又は子孫を含む。
【０３７６】
本発明のポリペプチドの発現を産生する／得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物を、一般的に、本発明の（所望の）ポリペプチドを発現／産生する条件下で保ち、維持し、及び／又は培養してもよい。適切な条件は当業者には明らかであろうが、通常、使用する宿主細胞／宿主生物に、ならびに本発明の（関連）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに依存しうる。ここでも、本発明の遺伝子構築物に関するパラグラフにおいて上に言及するハンドブック及び特許出願を参照する。
【０３７７】
一般的に、適切な条件は、適切な培地の使用、食物の適切な供給源及び／又は適切な栄養物の存在、適切な温度の使用、ならびに、場合により、適切な誘導因子又は化合物の存在（例、本発明のヌクレオチド配列が誘導可能なプロモーターの制御下にある場合）を含みうるが；それらの全てが当業者により選択されうる。ここでも、そのような条件下で、本発明のポリペプチドを、構成的な様式において、一過性の様式において、又は適切に誘導された場合だけ発現されうる。
【０３７８】
また、本発明のポリペプチドを、（最初に）未成熟形態（上に言及する通り）において生成してもよく、それを次に、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、翻訳後修飾に供してもよいことが当業者には明らかであろう。また、本発明のポリペプチドを、ここでも、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、グリコシル化してもよい。
【０３７９】
本発明のポリペプチドを次に、宿主細胞／宿主生物から及び／又は前記宿主細胞又は宿主生物を培養した培地から、それ自体が公知のタンパク質単離及び／又は精製技術、例えば（調製的）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、分別沈殿技術、親和性技術（例、本発明のポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用して）、及び／又は調製的な免疫学的技術（即ち、単離すべきポリペプチドに対する抗体を使用して）を使用して単離してもよい。
【０３８０】
本発明の組成物
【０３８１】
一般的に、医薬的使用のために、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、化合物、及び／又は構築物並びに少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又はアジュバント、ならびに、場合により、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、医薬的調製物又は組成物として製剤化されうる。非限定的な例を用いて、そのような製剤は、経口投与のため、非経口投与のために（例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射又は静脈内注入などによる）、局所投与のために、吸入による、皮膚パッチによる、インプラントによる、座剤などによる投与のための適切な形態でありうるが、それにおいて、非経口投与が好ましい。そのような適切な投与形態（それは、投与の様式に依存して、固形、半固形、又は液体でありうる）ならびに方法及びその調製物中での使用のための担体が、当業者には明らかであろうが、本明細書においてさらに記載する。そのような医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において、「医薬組成物」として言及する。非ヒト生物における使用のための医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において、「獣医用組成物」として言及する。
【０３８２】
このように、さらなる態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、本発明の少なくとも１つの化合物、本発明の少なくとも１つの構築物、又は本発明の少なくとも１つ核酸、及び少なくとも１つの適切な担体、希釈剤、又は賦形剤（即ち、医薬的使用のために適切）、及び、場合により、１つ又は複数のさらなる活性物質を含む医薬組成物に関する。特定の態様では、本発明は、配列番号１〜７１、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２７５、及び２８５〜２９２の少なくとも１つ、及び少なくとも１つの適切な担体、希釈剤  又は賦形剤（即ち、医薬的使用のために適切である）、及び、場合により、１つ又は複数のさらなる活性物質を含む医薬組成物に関する。
【０３８３】
一般的に、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、それ自体が公知の任意の適切な様式において製剤化及び投与することができる。例えば、上に引用する一般的な背景技術（ならびに特にＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６７、及びＷＯ０８／０２００７９に）ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；又はHandbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２〜２５５ページを参照のこと）などを参照する。
【０３８４】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）ならびに他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体が公知の任意の様式で製剤化及び投与してもよい。それを調製するためのそのような製剤及び方法は、当業者には明らかであろうが、例えば、非経口投与（例、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内、又はくも膜下腔内投与）のために又は局所（即ち、経皮又は皮内）投与のために適切な調製物を含む。
【０３８５】
非経口投与のための調製物は、例えば、注入又は注射のために適切である滅菌溶液、懸濁液、分散液、又は乳濁液でありうる。そのような調製物のための適切な担体又は希釈剤は、例えば、限定しないが、ＷＯ０８／０２００７９の１４３ページに言及されるものを含む。通常、水性溶液又は懸濁液が好ましいであろう。
【０３８６】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、遺伝子治療からの公知の送達の方法を使用して投与することができ、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。それは、参照により、その遺伝子治療の送達方法のために組み入れられる。送達の遺伝子治療方法を使用し、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物をコードする遺伝子を用いてトランスフェクトした初代細胞を、追加で、組織特異的プロモーターとトランスフェクトし、特定の器官、組織、移植片、腫瘍、又は細胞を標的とすることができ、加えて、細胞内での局在化した発現のためのシグナル配列及び安定化配列を用いてトランスフェクトすることができる。
【０３８７】
このように、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、全身的に、例えば、医薬的に許容可能な媒質（例えば不活性希釈剤又は同化可能な食用担体など）との組み合わせにおいて経口的に投与してもよい。それらは、硬質又は軟質シェルゼラチンカプセル中に封入してもよく、錠剤中に圧縮してもよく、又は患者の食事の食物と直接的に組み入れてもよい。経口的な治療的投与のために、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、１つ又は複数の賦形剤と組み合わせてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態において使用してもよい。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１%の本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を含むべきである。組成物及び調製物中のそれらのパーセンテージは、もちろん、変動しうるが、便利には、所与の単位投与形態の重量の約２〜約６０%の間でありうる。そのような治療的に有用な組成物中での本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の量は、効果的な投与量レベルが得られるようにする。
【０３８８】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、また、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤及び甘味剤又は香味剤、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１４３〜１４４ページに言及されるものを含みうる。単位投与形態がカプセルである場合、それは、上の型の材料に加えて、液体担体（例えば植物油又はポリエチレングリコールなど）を含みうる。種々の他の材料が、コーティングとして存在しうる、又は、そうでなければ、固形の単位投与形態の物理的形態を修飾しうる。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラック、又は糖などを用いてコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシルは、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及び香料（例えばチェリー又はオレンジフレーバーなど）を含みうる。もちろん、任意の単位投与形態を調製する際に使用される任意の材料は、医薬的に許容可能であり、用いられる量で実質的に非毒性であるべきである。また、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、持続放出調製物及びデバイス中に組み入れてもよい。
【０３８９】
経口投与のための調製物及び製剤はまた、本発明の構築物が、胃環境に耐性であり、腸中へ通過することを可能にする腸溶コーティングを伴い提供してもよい。より一般的には、経口投与のための調製物及び製剤を、胃腸管の任意の所望の部分中への送達のために適切に製剤化してもよい。また、適切な坐剤を、胃腸管中への送達のために使用してもよい。
【０３９０】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物はまた、注入又は注射により静脈内又は腹腔内に投与してもよい。特定の例は、ＷＯ０８／０２００７９の１４４ページ及び１４５及びＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２９７５（全文書）中にさらに記載されている通りである。
【０３９１】
局所投与のために、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を純粋な形態（即ち、それらが液体である場合）で適用してもよい。しかし、一般的には、それらを皮膚に組成物又は製剤として、皮膚科学的に許容可能な担体（それは、固体又は液体でありうる）との組み合わせにおいて投与することが望ましいであろう。特定の例は、ＷＯ０８／０２００７９の１４５ページにさらに記載されている通りである。
【０３９２】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の有用な投与量を、それらのインビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における効果的な投与量をヒトに外挿するための方法が当技術分野に公知である。例えば、ＵＳ  ４，９３８，９４９を参照のこと。
【０３９３】
一般的に、液体組成物（例えばローションなど）中での本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ−%から、好ましくは約０．５〜１０ｗｔ−%からでありうる。半固形又は固形組成物（例えばゲル又は粉末など）中での濃度は、約０．１〜５ｗｔ−%、好ましくは約０．５〜２．５ｗｔ−%でありうる。
【０３９４】
処置における使用のために要求される本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の量は、選択された特定のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物だけでなく、しかし、また、投与の経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態に伴い変動しうるが、究極的には、担当医又は臨床医の判断による。また、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の投与量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片、又は器官に依存して変動する。
【０３９５】
所望の用量は、便利には、単一用量中で又は適当な間隔で投与される分割用量として（例えば、２、３、４又はそれ以上のサブ用量／日として）提示してもよい。サブ用量自体は、さらに、例えば、多数の別個の大まかに間隔を置いた投与中に分割してもよい。
【０３９６】
投与計画は、長期間の毎日の処置を含みうる。「長期間」により、少なくとも２週間及び好ましくは、数週、数ヶ月、又は数年の持続期間を意味する。この投与量の範囲における必要な改変が、当業者により、本明細書において与える教示の通常の実験だけを使用して決定されうる。投与量はまた、任意の合併症の事象において個々の医師により調整されることができる。
【０３９７】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用
【０３９８】
本発明はさらに、本明細書において記載するポリペプチド、化合物及び／又は構築物、核酸、宿主細胞並びに組成物の適用及び使用、ならびにＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態（種々の癌及び感染性疾患など）の予防及び／又は処置のための方法に関する。いくつかの好ましいが、しかし、非限定的な適用及び使用が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【０３９９】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、一般的に、免疫応答を増強するために使用することができる。特に、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、適切なアッセイ（例えば本明細書において記載するものなど）により決定される通り、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の非存在におけるＴ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の活性化状態と比較し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などだけ増強させることができる。
【０４００】
別の態様では、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、適切なアッセイ（例えば本明細書において記載するものなど）により決定される通り、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の非存在における個体での腫瘍、無憎悪生存期間、及び／又は全生存期間と比較し、少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、少なくとも１５%、少なくとも２０%、少なくとも２５%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、  少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%又はそれ以上、例えば１００%などだけ腫瘍を有する個体において腫瘍成長を阻害し、腫瘍退縮を誘導し、無増悪生存期間を増加させる及び／又は全生存期間を延長させる。
【０４０１】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのＧＩＴＲ関連疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４０２】
本発明の文脈において、用語「予防及び／又は処置」は、疾患を予防及び／又は処置することを含むだけでなく、しかし、また、一般的に、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅らせる又は逆転させること、疾患に関連付けられる１つ又は複数の症状の発症を予防する又は遅らせること、疾患に関連付けられる１つ又は複数の症状を低下及び／又は軽減すること、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度及び／又は持続時間を低下させること、並びに／或いは、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度におけるさらなる増加を予防すること、疾患により起こされる任意の生理学的な傷害を予防、低下、又は逆転させること、ならびに、一般的に、処置されている患者に有益である任意の薬理学的な作用を含む。
【０４０３】
処置すべき被験体は任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、特にヒトである。当業者には明らかであろう通り、処置される被験体は、特に、本明細書において言及する疾患、障害、及び状態に苦しむ、又はそのリスクがある人であろう。
【０４０４】
本発明は、ＧＩＴＲに関連する少なくとも１つの疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための方法に関し、その生物学的又は医薬的な活性を伴い、及び／又はＧＩＴＲが含まれる生物学的な経路又はシグナル伝達を伴い、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。特に、前記の医薬的に効果的な量は、ＧＩＴＲ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＧＩＴＲが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を刺激、増強、又は拮抗するのに十分な量；並びに／或いはＧＩＴＲ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＧＩＴＲが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を刺激、増強、又は拮抗するのに十分な循環中の、本発明の構築物のレベルを提供する量でありうる。
【０４０５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、及び／又は本発明のポリペプチドの患者への投与により予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は状態の予防及び／処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４０６】
特に、本発明は、本明細書において列挙する疾患、障害、及び状態からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は状態の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４０７】
本発明はまた、免疫応答を増強するための方法に関する。
【０４０８】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための方法に関する。
【０４０９】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害するための方法に関する。
【０４１０】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１１】
特に、本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１２】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１３】
本発明はまた、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１４】
本発明はまた、癌の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１５】
特に、本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための方法に関し、前記方法は、医薬的に活性な量の配列番号１〜７１、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２５５、及び２８５〜２９２の少なくとも１つ、並びに／或いはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１６】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害するための方法に関し、前記方法は、医薬的に活性な量の配列番号１〜７１、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２５５、及び２８５〜２９２の少なくとも１つ、並びに／或いはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１７】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー媒介性疾患の予防及び／又は処置のための方法であって、前記方法は、医薬的に活性な量の配列番号１〜７１、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２５５、及び２８５〜の少なくとも１つ、並びに／或いはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４１８】
本発明はまた、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、医薬的に活性な量の配列番号１〜７１、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２５５、及び２８５〜２９２の少なくとも１つ、並びに／或いはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。感染症は、含まれる感染性生物又は病原体のカテゴリーに基づき、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫に広く分類することができる。感染を起こす細菌、真菌、ウイルス、及び寄生虫の例は、当技術分野において周知である。
【０４１９】
本発明の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの好ましいが非限定的な例は、梅毒、クラミジア、リケッチア細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ）、髄膜炎菌及び淋菌（ｃｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒症、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、及びライム病細菌を含む。
【０４２０】
本発明の方法により処置可能な感染症を起こす病原性ウイルスのいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣ）、ヘルペスウイルス（例、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタインバーウイルスを含む）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、及びエボラウイルス（例、ＢＤＢＶ、ＥＢＯＶ、ＲＥＳＴＶ、ＳＵＤＶ、及びＴＡＦＶ）を含む。
【０４２１】
本発明の方法により処置可能な感染を起こす病原性真菌のいくつかの好ましいが、しかし、非限定的な例は、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリスなど）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガタス、ニガーなど）  、ムコラエ属（ムコール、アブシディア、リゾプス）、スポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチディス、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス、コクシジオイデス・イミチス、及びヒストプラスマ・カプスラタムを含む。
【０４２２】
本発明の方法により処置可能な感染症を起こす病原性寄生虫のいくつかの好ましい例は、赤痢アメーバ、バルランジジウムコリ、ネグレリア・フォウレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属、ジアルディアランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属、カリニ肺炎、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、ブルース・トリパノソーマ、クルーズ・トリパノソーマ、ドノバン・リーシュマニア、トキソプラズマ、及びニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を含む。したがって、本発明は、これらの細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫病原体を伴う感染症の予防及び／又は処置のための方法に関する。
【０４２３】
本発明はまた、癌の予防及び／又は処置のための方法であって、前記方法は、医薬的に活性な量の配列番号１〜７１、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２５５、及び２８５〜２９２の少なくとも１つ、並びに／或いはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４２４】
特に、本発明は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍の予防及び／又は処置のための方法に関する。
【０４２５】
別の特定の態様では、本発明は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍の予防及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、医薬的に活性な量の配列番号１〜７２、２０６〜２２３、２２９〜２３０、２６６〜２７５、及び２８５〜２９２の少なくとも１つ並びに／或いはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４２６】
さらなる態様では、本発明は、免疫療法のための方法であって、その方法は、本明細書に言及する疾患及び障害に罹患しているか、又はそのリスクがある被験体に、医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドの、本発明の化合物の、本発明の構築物の、及び／又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０４２７】
上の方法において、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、並びに／或いはそれを含む組成物を、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、任意の適切な様式において投与することができる。このように、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、並びに／或いはそれを含む組成物を、例えば、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、経口、腹腔内（例、静脈内、皮下、筋肉内、又は胃腸管内を回避する他の任意の投与経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所、坐剤を用いて、吸入により投与することができる。臨床医は、そのような投与において使用される適切な投与経路及び適切な医薬的製剤又は組成物を、予防又は処置すべき疾患、障害、又は状態及び臨床医に周知である他の因子に依存して選択することができるであろう。
【０４２８】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、並びに／或いはそれを含む組成物を、予防又は処置すべき疾患、障害、又は状態を予防及び／又は処置するために適切である処置計画に従って投与する。臨床医は、一般的に、適切な処置計画を、因子、例えば、予防又は処置すべき疾患、障害、又は状態、処置すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用すべき本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、使用すべき特定の投与経路及び医薬的製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、ならびに臨床医に周知の同様の因子などに依存して決定することができるであろう。
【０４２９】
一般的に、処置計画は、本発明の１つ又は複数のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の、或いはそれを含む１つ又は複数の組成物の、１つ又は複数の医薬的に効果的な量又は用量での投与を含みうる。投与される特定の量又は用量は、臨床医により、ここでも上に引用する因子に基づき決定することができる。
【０４３０】
一般的に、処置される特定の疾患、障害、又は状態、使用される本発明の特定のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の効力、特定の投与経路、及び使用される特定の医薬製剤又は組成物に依存して、臨床医は適切な一日用量を決定することができる。
【０４３１】
通常、上記方法において、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を使用する。しかし、本発明の２つ又はそれ以上のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を組み合わせて使用することは本発明の範囲内である。
【０４３２】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて、即ち、組み合わせ処置計画として使用してもよく、それは、相乗効果に導きうる又は導かないであろう。
【０４３３】
ここでも、臨床医は、上で引用する因子及び彼の専門家の判断に基づいて、そのようなさらなる化合物又は成分、ならびに適切な併用処置計画を選択することができる。
【０４３４】
特に、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を、本明細書において引用する疾患、障害、及び状態の予防及び／又は処置のために使用する又は使用することができる他の医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて使用してもよく、その結果として、相乗効果が得られうる又は得られないであろう。そのような化合物及び成分、ならびにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬的製剤又は組成物の例が、臨床医には明らかであろう。
【０４３５】
特に、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、化学療法、放射線療法、癌ワクチン、並びに／或いは１つ又は複数の追加の治療薬剤と同時投与してもよい。他のそのような薬剤又は治療様式との同時投与又は処置のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY；Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA；Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PAを参照のこと。
【０４３６】
例えば、一実施形態では、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、１つ又は複数の追加の治療薬剤との組み合わせにおいて投与する。そのような薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＴＧＦＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、Ｓｉｇｌｅｃｓ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳリガンド、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−１、Ｂ７  −２、ＶＩＳＴＡ、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２４４、ＣＤ４８、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲファミリメンバー、ＫＩＲ、ＩＬＴ、ＬＩＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＤＯ、ＴＧＦβ、アデノシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＬＦＡ−２、ＬＦＡ−３、ＢＡＦＦＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ８３リガンド、ＣＤ２４、ＣＤ３９、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ７、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ホスファチジルセリン、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ４７、ＶＥＧＦ、及びニューロピリンを含む。
【０４３７】
別の実施形態では、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合フラグメントとの組み合わせにおいて投与するのに対し、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物と同時に、或いは本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の投与に先立ち又はその後に投与する。実施例１４及び２１に示す通り、マウスへの抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の投与は、腫瘍成長を阻害する際に相乗効果を有した。
【０４３８】
別の実施形態では、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、抗ＣＴＬＡ−４抗体又はその抗原結合フラグメントとの組み合わせにおいて投与するのに対し、抗ＣＴＬＡ−４抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物と同時に、或いは本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の投与に先立ち又はその後に投与する。
【０４３９】
別の実施形態では、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントとの組み合わせにおいて投与するのに対し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物と同時に、或いは本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の投与に先立ち又はその後に投与する。
【０４４０】
さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合フラグメント）及び５−ＦＵとの組み合わせにおいて投与する。
【０４４１】
２つ又はそれ以上の物質又は成分を組み合わせ処置計画の部分として使用する場合、それらを同じ投与経路を介して、又は異なる投与経路を介して、本質的に同じ時間に又は異なる時間に（例、本質的に同時に、連続的に、又は代わりの計画に従って）投与することができる。物質又は成分を同じ投与経路を介して同時に投与すべき場合、それらを異なる医薬的製剤もしくは組成物又は組み合わせた医薬的製剤もしくは組成物の部分として投与してもよく、当業者には明らかであろう通りである。
【０４４２】
また、２つ又はそれ以上の活性物質又は成分を組み合わせ処置計画の部分として使用する場合、物質又は成分の各々を、化合物又は成分をそれ自体で使用する場合に使用される同じ量で、及び同じ計画に従って投与してもよく、そのような組み合わせ使用は相乗効果に導きうる又は導かないであろう。しかし、２つ又はそれ以上の活性物質又は成分の組み合わせ使用が相乗効果に導く場合、投与すべき物質又は成分の１つ、それ以上、又は全ての量を低下させ、依然として所望の治療的作用を達成することも可能でありうる。これは、例えば、物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連付けられる任意の不要な副作用を回避、限定、又は低下させるために有用であろう（それらを、それらの通常の量で使用した場合、依然として所望の医薬的効果又は治療的効果が得られる）。
【０４４３】
本発明に従って使用される処置計画の有効性は、含まれる疾患、障害、又は状態についてそれ自体が公知である任意の様式で決定及び／又は追跡してもよく、臨床医に明らかであろう通りである。臨床医はまた、適当な場合、及びケースバイケースに基づき、特定の処置計画を変化又は改変することができ、所望の治療的効果を達成し、不要な副作用を回避、限定、又は低下させ、並びに／或いは、一方で所望の治療的効果を達成し、他方で不要な副作用を回避、限定、又は低下させる適当なバランスを達成するようにする。
【０４４４】
一般的に、処置計画には、所望の治療的効果が達成されるまで及び／又は所望の治療的効果が維持される限り従う。ここでも、これは、臨床医により決定されることができる。
【０４４５】
別の態様では、本発明は、ＧＩＴＲに関連する疾患、障害、及び状態の少なくとも１つの予防及び／又は処置のため；並びに／或いは、本明細書において言及する処置の方法の１つ又は複数における使用のための医薬組成物の製造における本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４４６】
本発明はまた、ＧＩＴＲ、並びに／或いはＧＩＴＲが含まれるシグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答関連する疾患、障害、及び状態の少なくとも１つの予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための；並びに／或いは本明細書において記載する方法の１つ又は複数における本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４４７】
本発明はまた、ＧＩＴＲ、その生物学的又は薬学的活性、並びに／或いはＧＩＴＲが含まれる生物学的経路又はシグナル伝達を刺激、増強、又は拮抗することにより予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４４８】
本発明は、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を患者に投与することにより予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患、障害、又は状態の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４４９】
特に、本発明は、免疫応答を増強するための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５０】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強するための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５１】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害するための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５２】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５３】
本発明はまた、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５４】
本発明はまた、癌の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５５】
特に、本発明は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物の使用に関する。
【０４５６】
本発明はさらに、少なくとも１つのＧＩＴＲ関連疾患、障害、及び／又は状態の予防及び／又は処置における使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４５７】
本発明はさらに、ＧＩＴＲ、その生物学的又は薬学的活性、並びに／或いはＧＩＴＲが含まれる生物学的経路又はシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は状態の予防及び／又は処置における使用のための本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４５８】
本発明はさらに、ＧＩＴＲ、その生物学的又は薬学的活性、並びに／或いはＧＩＴＲが含まれる生物学的経路又はシグナル伝達を刺激、増強、又は拮抗することにより予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の予防及び／又は処置のための医薬組成物の製造のための本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４５９】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物を患者に投与することにより予防及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患、障害、及び／又は状態の予防及び／又は処置における使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。特に、本発明はまた、免疫応答を増強する際での使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６０】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞の増殖又は活性化を増強する際での使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６１】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害する際での使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６２】
本発明はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はナチュラルキラー細胞媒介性疾患の予防及び／又は処置における使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６３】
本発明はまた、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫感染性疾患の予防及び／又は処置における使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６４】
本発明はまた、癌の予防及び／又は処置における使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６５】
特に、本発明は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、腎臓癌（例えば腎細胞癌、及びウィルムス腫瘍など）、膠芽腫、神経膠腫、前立腺癌、精巣癌、胃腸癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、小腸癌又は虫垂癌、子宮癌又は子宮内膜癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、上咽頭癌、基底細胞癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、メルケル細胞癌及び他の血液悪性腫瘍の予防及び／又は処置における使用のための、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物或いはそれを含む医薬組成物に関する。
【０４６６】
処置すべき被験体は、任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、より特にヒトである。獣医学的な適用において、処置すべき被験体は、商業的な目的のために産生された又はペットとして飼われている任意の動物を含む。当業者には明らかであろう通り、処置される被験体は、特に、本明細書において言及する疾患、障害、及び状態に苦しむ、又はそのリスクがある人であろう。
【０４６７】
ここでも、そのような医薬組成物において、本発明の１つ又は複数のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物、或いはそれをコードするヌクレオチド、及び／或いはそれを含む医薬組成物を、また、１つ又は複数の他の活性成分（例えば本明細書において言及するものなど）と適切に組み合わせてもよい。
【０４６８】
本発明はまた、インビトロ（例、インビトロ又は細胞アッセイにおいて）又はインビボ（例、単一細胞又は多細胞生物において、特に哺乳動物において、及び、さらに特にヒトにおいて、例えば、本発明の疾患、障害、又は状態のリスクがある又はそれに苦しむヒトにおいて）のいずれかでの使用のための組成物（例えば、限定しないが、本明細書においてさらに記載する医薬組成物又は調製物など）に関する。
【０４６９】
本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、同系のＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて腫瘍細胞成長を阻害する。それらの作用様式に基づき、本発明のポリペプチド、化合物、及び／又は構築物は、他のＧＩＴＲ関連疾患（しかし、限定しないが、種々の型の癌及び感染症を含む）の処置において有用でありうる。
【０４７０】
処置への参照は、他に明記されない限り、確立された症状の処置及び予防的処置の両方を含むことを理解すべきである。
【０４７１】
本発明を、本明細書において、以下の非限定的な好ましい実施例及び図面を用いてさらに記載する。
【０４７２】
本願を通じて引用する参考文献（参考文献、発行された特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全ての内容全体を、本明細書により、参照により、特に本明細書において上に参照する教示について明確に組み入れる。
【実施例】
【０４７３】
実施例１：ＧＩＴＲ発現細胞株並びに組換えｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ及びｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ−Ｆｃの作製
【０４７４】
１．１  ＧＩＴＲ発現細胞株
ヒトＧＩＴＲ、カニクイザルＧＩＴＲ、及びマウスＧＩＴＲの組換え過剰発現を伴う安定なFlp-In（商標）２９３細胞（Life technologies  Ｒ７５０−０７）及びGloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293（Promega  ＣＳ１８８８０１）を作製した。このために、ＧＩＴＲのコード配列をｐｃＤＮＡ３．１由来ベクター中のＣＭＶプロモーターの下流にクローニングした。ヒトＧＩＴＲ及びマウスＧＩＴＲの配列をＵｎｉｐｒｏｔＫＢから回収した（ヒトＧＩＴＲ：Ｑ９Ｙ５Ｕ５［配列番号２３１］、マウスＧＩＴＲ：Ｏ３５７１４［配列番号２３２］）。カニクイザルＧＩＴＲについての配列をＮＣＢＩデータベースから回収した（ＸＰ＿００５５４５１８０、配列番号２３３）。ヒトＧＩＴＲの細胞表面発現を、ヒト化ＩｇＧ１抗ヒトＧＩＴＲ抗体（ＨｕＱ６Ｃ８−Ａｇｌｙ、ＷＯ０６１０５０２１を参照のこと）及びマウスＩｇＧ１抗ヒトＧＩＴＲクローン＃１１０４１６（R&D Systems  ＭＡＢ６８９）を使用して、カニクイザルＧＩＴＲ発現を、ＨｕＱ６Ｃ８−Ａｇｌｙを用いて、マウスＧＩＴＲ発現を、ラットＩｇＧ２ｂ抗マウスＧＩＴＲクローンＤＴＡ−１（eBioscience＃１６−５８７４）を用いて確認した（図１Ａ〜Ｃ）。
【０４７５】
１．２  組換えカニクイザルＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ
カニクイザルＧＩＴＲの細胞外ドメインをＨＩＳタグ又はヒトＩｇＧ１  Ｆｃのいずれかを用いて伸長させ、それぞれのｃＤＮＡ配列を哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。結果として得られたプラスミドをＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクションし、タンパク質を、ＩＭＡＣ及びプロテインＡクロマトグラフィー、その後、ＰＢＳ緩衝液への脱塩工程により収集した細胞上清からそれぞれ精製した。
【０４７６】
実施例２：ヒトＧＩＴＲを用いたラマの免疫、重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニング、及びファージの調製
【０４７７】
２．１  免疫
倫理委員会（Ablynx NV、Ｂｅｌｇｉｕｍ  −  ＥＣ２０１２＃２）の承認後、６頭のラクダ科動物を、ヒトＧＩＴＲをコードするＣＭＶプロモーターベースのＤＮＡベクターを用いて免疫した。加えて、１頭のラクダ科動物を、組換えマウスＧＩＴＲ−Ｆｃ（R&D Systems、５２４−ＧＲ−０５０）を用いて免疫した。
【０４７８】
２．２  重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニング及びファージの調製。
動物１頭当たり、血液サンプルを、１種類の免疫抗原を注射した後に採取した。これらの血液サンプルから、製造者の指示（Amersham Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）に従い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用してＰＢＭＣを調製した。各々の免疫ラマについて、特定のサブセットの免疫スケジュールに由来する、即ち、一種類の免疫抗原の後にサンプルから単離された全ＲＮＡをプールすることにより、ライブラリーを構築した。要するに、ＰＣＲ増幅されたＶＨＨレパートリーを、特定の制限部位を介して、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを容易にするように設計されたベクター中にクローニングした。ベクターはｐＵＣ１１９に由来した。ＶＨＨコード配列を伴うフレームにおいて、ベクターはＣ末端３×ＦＬＡＧ及びＨＩＳ６タグをコードする。ファージを、標準的なプロトコール（例えば、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８並びに他の先行技術及び本明細書において引用するＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．を参照のこと）に従って調製した。
【０４７９】
実施例３：ファージディスプレイを介したＧＩＴＲ特異的ＶＨＨの選択
【０４８０】
全てのラマから得られ、ファージライブラリーとしてクローニングされたＶＨＨレパートリーは、多数の選択条件が適用して、異なる選択戦略において使用した。変量として以下を含む：（ｉ）ＧＩＴＲの提示形態（異なる背景での）、ｉｉ）種の供給源（ヒト／カニクイザル／マウスＧＩＴＲ）の交互、ｉｉｉ）抗原濃度、ｉｖ）選択ラウンドの回数、ｖ）特異的なＧＩＴＲエピトープの遮蔽。簡単には、細胞（実施例１を参照のこと）又は可溶性抗原（ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ（Enzo Life Sciences、ＡＬＸ−５２２−０６１−Ｃ０５０）、カニクイザルＧＩＴＲ（自家）、カニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ（自家）、マウスＧＩＴＲ（R&D Systems、５２４−ＧＲ−０５０）を、ファージライブラリーを用いて１時間〜２時間インキュベートし、その後、十分に洗浄し；結合したファージを、トリプシン（１mg/mL）を用いて１５分間にわたり溶出し、次にプロテアーゼ活性を、０．８mMプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することにより即時に中和した。対照として、親細胞株を用いた、又は抗原を用いない選択を並行して実施した。
【０４８１】
ファージ出力を使用し、個々のＶＨＨクローンの分析のために大腸菌を感染させた。ペリプラズム抽出物を、標準的なプロトコール（例えば、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１並びに他の先行技術及び本明細書において引用するAblynx N.V.による出願を参照のこと）に従って調製した。
【０４８２】
実施例４：ナノボディ−ＩｇＧキメラの構築
【０４８３】
４．１  ナノボディ−ヒトＩｇＧ１キメラの構築
ナノボディ−ヒトＩｇＧ１キメラは、２つの重鎖及び２つの軽鎖で構成された。重鎖は、ヒトＩｇＧ１定常ドメインＣＨ１−ＣＨ３に融合された抗ＧＩＴＲナノボディを含んだ。軽鎖は、ヒト軽鎖ＣＬ（カッパ）の定常ドメインに融合された同じ抗ＧＩＴＲナノボディからなった。ナノボディ−ヒトＩｇＧ１キメラの略図を図７に示す。
【０４８４】
それぞれのｃＤＮＡ配列を、２つの別々の発現カセットにおいて哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。結果として得られたプラスミドをＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクションし、タンパク質を、タンパク質Ａクロマトグラフィー及びＰＢＳ緩衝液への脱塩により収集した細胞上清から精製した。
【０４８５】
４．２  ナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラの構築
ナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラは、２つの重鎖及び２つの軽鎖で構成された。重鎖は、ラットＩｇＧ２ｂ定常ドメインＣＨ１−ＣＨ３に融合された抗ＧＩＴＲナノボディを含んだ。軽鎖は、ラット軽鎖ＣＬ（ラムダ）の定常ドメインに融合された同じ抗ＧＩＴＲナノボディからなった。
【０４８６】
それぞれのｃＤＮＡ配列を、２つの別々の発現カセットにおいて哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。結果として得られたプラスミドをＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクションし、タンパク質を、タンパク質Ａクロマトグラフィー及びＰＢＳ緩衝液への脱塩により収集した細胞上清から精製した。
【０４８７】
実施例５：スクリーニング
【０４８８】
５．１  結合ＥＬＩＳＡにおけるＧＩＴＲ結合ナノボディのスクリーニング
【０４８９】
ペリプラズム抽出物を、結合ＥＬＩＳＡにおいてヒトＧＩＴＲ（Enzo Life Sciences、ＡＬＸ−５２２−０６１−Ｃ０５０）及びカニクイザルＧＩＴＲ（自家）上でスクリーニングした。この目的のために、マイクロタイタープレートをヒト又はカニクイザルＧＩＴＲ（０．５μg/ml）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ中７５μl  １%カゼインを用いて室温で１時間にわたりブロッキングした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ペリプラズム抽出物（０．１%カゼイン＋０．０５%Ｔｗｅｅｎを伴うＰＢＳ中で１／５又は１／８０００希釈）を室温で少なくとも１時間にわたりインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、その後、ＶＨＨの結合を、０．１%カゼイン＋０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ中の抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、Ａ８５９２）ｍＡｂ  １／５０００で検出した。染色は基質ｅｓＴＭＢ（ＳＤＴ試薬）を用いて実施し、シグナルを４５０nMで１５分後に測定した。
【０４９０】
結合ＥＬＩＳＡにおいて陽性とスコア化されたナノボディを配列決定した。配列分析は、８つの異なるファミリー、即ち、ファミリー７、ファミリー２６、ファミリー８２、ファミリー１０９、ファミリー８５、ファミリー３８、ファミリー１１０、及びファミリー１０８の同定をもたらした。対応する整列を表Ａ−２、表Ａ−３、表Ａ−４、表Ａ−５、表Ａ−６、表Ａ−７、及び表Ａ−８、それぞれに提供する。異なるファミリーへの分類は、ＣＤＲにおける配列類似性及び相違に基づくものであった。各々のファミリーの代表に対する配列変動性を以下の表に示す。
【０４９１】
ファミリー７については、クローンＡ０２３１００５Ａ０３のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、それに対して、全ての他のファミリー７クローンのＣＤＲを比較した。Ａ０２３１００５Ａ０３に対する配列変動性を以下に示す。
【表１】
2018537421.tif 000002
【０４９２】
ファミリー２６については、クローンＡ０２３１００４Ｂ０１のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、それに対して、全ての他のファミリー２６クローンのＣＤＲを比較した。Ａ０２３１００４Ｂ０１に対する配列変動性を以下に示す。
【表２】
2018537421.tif 000003
【０４９３】
ファミリー８２については、クローンＡ０２３１０３４Ａ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、それに対して、全ての他のファミリー８２クローンのＣＤＲを比較した。Ａ０２３１０３４Ａ０８に対する配列変動性を以下に示す。
【表３】
2018537421.tif 000004
【０４９４】
ファミリー１０９については、クローンＡ０２３１０５２Ｅ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、それに対して、全ての他のファミリー１０９クローンのＣＤＲを比較した。Ａ０２３１０５２Ｅ０８に対する配列変動性を以下に示す。
【表４】
2018537421.tif 000005
【０４９５】
ファミリー８５については、クローンＡ０２３１０３３Ｂ０２のＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表に示す。
【表５】
2018537421.tif 000006
【０４９６】
ファミリー３８については、クローンＡ０２３１００３Ｄ１１のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、それに対して、全ての他のファミリー３８クローンのＣＤＲを比較した。Ａ０２３１００３Ｄ１１に対する配列変動性を以下の表に示す。
【表６】
2018537421.tif 000007
【０４９７】
ファミリー１１０については、クローンＡ０２３１０５２Ａ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、それに対して、全ての他のファミリー１１０クローンのＣＤＲを比較した。Ａ０２３１０５２Ａ０８に対する配列変動性を以下の表に示す。
【表７】
2018537421.tif 000008
【０４９８】
ファミリー１０８については、クローンＡ０２３１０５１Ｅ０１のＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表に示す。
【表８】
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【０４９９】
５．２  一価ナノボディの精製
代表的なナノボディを選択し、トリプルＦｌａｇ、ＨＩＳ６タグ付きタンパク質として大腸菌ＴＧ１で発現させた。発現を１mM  ＩＰＴＧにより誘導し、４時間にわたり３７℃で継続させた。細胞培養物をスピンさせた後、ペリプラズム抽出物を、ペレットをＤ−ＰＢＳ中で凍結融解することにより調製した。ペリプラズム抽出物を濾過し（０．２０μm）、イミダゾールを最終濃度２０mMまで加えた。これらのペリプラズム抽出物中のナノボディを、ＩＭＡＣを介して精製し、Zebaspin（Fisher Scientific）を介して脱塩した。
【０５００】
実施例６：一価抗ＧＩＴＲナノボディの動態分析
【０５０１】
親和性をProteon XPR36で決定した。簡潔には、ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ（Enzo Life Sciences、ＡＬＸ−５２２−０６１−Ｃ０５０）を、アミンカップリングを介してＧＬＣチップ上に固定化した後、６濃度の範囲の異なる一価ナノボディ（各々のファミリーを代表する）を注入した。ＫＤ値を、算出された会合速度及び解離速度定数を使用することにより決定した（表１）（ProteOn Manager 3.1.0、バージョン３．１．０．６（２０１１））。
【表９】
2018537421.tif 000010
【０５０２】
実施例７：Flp-In（商標）２９３細胞及び活性化Ｔ細胞上で発現させたＧＩＴＲへの抗ＧＩＴＲナノボディの結合
【０５０３】
活性化Ｔ細胞上で発現させたヒトＧＩＴＲへの精製一価抗ＧＩＴＲナノボディの結合を、フローサイトメトリーにおいて評価した。この目的のために、健常ドナーからのＰＢＭＣをDynabeads（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28（Gibco-Life Technologies＃１１１３１Ｄ）と、１／２ビーズ／細胞の比率で７日間にわたり培養した。活性化後、＞９８%Ｔ細胞からなる細胞集団を得た。これらのＴ細胞は高度に活性化され（ＣＤ２５ｈｉｇｈ、ＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞）、ＧＩＴＲの良好な発現を示した（図１Ｄ）。
【０５０４】
１μＭから開始するナノボディの希釈系列を細胞に適用した。ナノボディをＦＡＣＳ緩衝液（１０%ＦＢＳ及び０．０５%アジドを添加したＰＢＳ）中で、４℃で３０分間にわたり会合させた。細胞を遠心分離により洗浄し、抗ＦＬＡＧ抗体（Sigma F1804）を用いて４℃で３０分間にわたりプローブし、結合したナノボディを検出した。検出はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch＃１１５−１１６−０７１）を用いて４℃で３０分間にわたり行った。細胞を洗浄し、ＴＯＰＲＯ３とインキュベートして死細胞について染色し、その後、ゲーティング手順の間に除去した。細胞を次にBD FACSArrayを介して分析した。結果を図２Ａ〜２Ｂに示す。
【０５０５】
用量応答曲線から得られたＥＣ５０値でを表２に示す。
【０５０６】
【表１０】
2018537421.tif 000011
【０５０７】
実施例８：多価構築物の生成及び結合
【０５０８】
８．１  多価ナノボディ構築物の構築
効力及び／又は有効性を増加させるために、多価分子を遺伝子操作により構築した。複数のナノボディを３Ａ、９ＧＳ、又は３５ＧＳリンカーと一緒に遺伝的に連結した。全ての多価ＧＩＴＲナノボディ構築物がＣ末端アルブミン結合ナノボディを担持し、その後、標準的な条件に従ってピキア・パストリスにおいて発現させた。ＦＬＡＧ３−ＨＩＳ６タグを伴う構築物を、ＩＭＡＣを使用して精製し、タグなし構築物を、プロテインＡ結合を介して精製した。異なる多価ＧＩＴＲ構築物を、表Ａ−１１に列挙する通りに作製した。
【０５０９】
８．２  ＦＡＣＳにより決定した、ＮＦｋＢ−Ｎｌｕｃ２Ｐ  ＨＥＫ２９３細胞上に発現させたヒトＧＩＴＲへの多価抗ＧＩＴＲナノボディの結合
ヒトＧＩＴＲへの多価構築物の結合をＦＡＣＳにより決定した。簡潔には、ナノボディをＦＡＣＳ緩衝液（１０%ＦＢＳ及び０．０５%アジドを添加したＰＢＳ）中で、４℃で３０分間にわたり会合させた。細胞を遠心分離により洗浄し、４℃で３０分間にわたり自家抗ＡＬＢ１１抗体でプローブし、結合したナノボディを検出した。検出は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch＃１１５−１１６−０７１）を用いて４℃で３０分間にわたり行った。細胞を洗浄し、ＴＯＰＲＯ３とインキュベートし、死細胞について染色し、その後、ゲーティング手順の間に除去した。細胞を次にBD FACSArrayを介して分析した。結合曲線を図３に示す。用量反応曲線から得られたＥＣ５０値でを表３に示す。
【０５１０】
【表１１】
2018537421.tif 000012
【０５１１】
実施例９：ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて評価した抗ＧＩＴＲナノボディによるＧＩＴＲの活性化
【０５１２】
精製した多価ナノボディの機能性を、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて評価した。この目的のために、GloResponse（商標）NF-κB-Nluc2P HEK293細胞株（Promega  ＣＳ１８８８０１）を、ヒトＧＩＴＲを用いて安定にトランスフェクトした。抗ＧＩＴＲナノボディの活性化能力を評価するために、ＧＩＴＲ発現細胞を、白色の組織培養処理した９６ウェルプレート（Costar＃３９１７）中に１０，０００個細胞／ウェルで播種した。抗ＧＩＴＲナノボディの段階希釈物を加えて、５%ＣＯ２の３７℃インキュベーター中で５時間にわたり相互作用させた。ＮＦ−ｋＢ活性を、Nano-Glo（商標）試薬（Promega＃Ｎ１１２０）の添加後に発光を測定することにより評価した。表４Ａに示す結果は、異種ＧＩＴＲ発現を伴う細胞のプールに対する抗ＧＩＴＲナノボディ及びＨｕＱ６Ｃ８−Ａｇｌｙの効果を例証する。表４Ｂ−Ｃに示す結果は、単一細胞クローンに対する抗ＧＩＴＲナノボディ、ＨｕＱ６Ｃ８−Ａｇｌｙ、及び３６Ｅ５の効果を例証する。例証的な活性化曲線を図４Ａ〜Ｄに示す。
【０５１３】
【表１２】
2018537421.tif 000013
【０５１４】
【表１３】
2018537421.tif 000014
【０５１５】
【表１４】
2018537421.tif 000015
【０５１６】
実施例１０：抗ＧＩＴＲナノボディのヒトＴ細胞活性化能力
【０５１７】
精製した多価単一特異的抗ＧＩＴＲナノボディの機能性をヒトＴ細胞活性化アッセイにおいて評価した。ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec＃１３０−０９６−５３３）を使用して健康なドナーからのBuffy Coatsから単離し、１０%ＦＢＳ及び１%Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ−１６４０（Life Technologies-Gibco＃７２４００）中で培養した。単離したＣＤ４＋  Ｔ細胞を、その後、Dynabeads（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies-Gibco＃１１１３１Ｄ）を用いて１／５ビーズ／細胞の比率で１０日間、１／１の比率で追加の４日間にわたり活性化した。活性化状態を、ＣＤ２５発現（抗ＣＤ２５−ＰＥ−BD Bioscience＃５５７１３８）、ＣＤ４５ＲＡ発現（抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ−BD Bioscience＃５５０８５５）、及びＣＤ４５ＲＯ発現（抗ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ−BD Bioscience＃５５５４９３）を測定することにより、フローサイトメトリーにより評価した。ＧＩＴＲ発現を、マウス抗ヒトＧＩＴＲクローン１１０４１６（R&D Systems＃ＭＡＢ６８９）を用いた検出により確認した。
【０５１８】
抗ＧＩＴＲナノボディの活性化能力を評価するために、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、１０%ヒトＡＢ血清及び１%Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。細胞を、抗ＧＩＴＲナノボディの存在下又は非存在下において、１２５ng/ml（ＩＦＮ−γ産生）又は８ng/ml（増殖）で抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３（eBioscience＃１６−００３７−８５）を用いてコーティングしたプレートに加えた。ＩＦＮ−γ産生は、５%ＣＯ２の３７℃インキュベーター中での３日間のインキュベート後にＥＬＩＳＡにより測定した。増殖測定のために、細胞を３日間にわたりインキュベートし、１８時間３Ｈ−チミジンでパルスした後、細胞を収集して計数した。
【０５１９】
ＩＦＮ−γ産生に対する多価抗ＧＩＴＲナノボディの効果を図５Ａ〜Ｄに例示する。ナノボディＡ０２３１０００３５は、個々の構築ブロック間に９ＧＳリンカーを伴う四価ナノボディ（ファミリー７）であり、完全アゴニストとして作用し、試験された濃度範囲全体にわたって天然リガンドと実質的に同じ有効性（Ｅｍａｘとして定義する）を示す。図５Ｅ及び５Ｆは、それぞれ参照化合物３６Ｅ５及びＨｕＱ６Ｃ８−Ａｇｌｙについて得られたデータを示す。これらの抗体は、より低い最大有効性を示す部分アゴニストとして作用し、濃度の増加と共にさらに減少する。
【０５２０】
表５は、天然リガンドと比較した、ＩＦＮ−γ産生に対する多価ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。ＥＣ５０値はナノボディの効力を反映する。Ｅｍａｘ（天然リガンドにより誘導される最大応答）のパーセンテージとしての最大有効性も提示する。ナノボディＡ０２３１０００３５は、１００%に設定された、天然リガンドと同程度の有効性を明確に示す。
【０５２１】
【表１５】
2018537421.tif 000016
【０５２２】
実施例１１：リンカー長多価ナノボディ構築物
【０５２３】
リンカー長の影響を、実施例９に記載する通り、ヒトＧＩＴＲ  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて評価した。９ＧＳリンカーを伴うナノボディ構築物は、３５ＧＳリンカーを伴うナノボディ構築物よりも高い有効性を示した（表６Ａを参照のこと）。これは、異なるナノボディ構築物を使用して確認された（表６Ｂを参照のこと）。また、３Ａリンカーを伴うナノボディ構築物は、９ＧＳ連結構築物と同程度の有効性を有することが示された。
【０５２４】
ＮＦ−κＢ活性に対する異なるリンカー長を伴う多価抗ＧＩＴＲナノボディ構築物の効果も図６Ａ〜Ｄに例示する。予想外に、本発明者らは、加えて、リンカーの長さを短縮することによって、ＧＩＴＲナノボディ構築物の機能的特性をさらに改善することができることを示した。
【０５２５】
【表１６】
2018537421.tif 000017
【０５２６】
【表１７】
2018537421.tif 000018
【０５２７】
実施例１２：ＯＶＡ免疫モデルにおけるインビボ概念実証
【０５２８】
ＯＶＡ免疫モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生理食塩水又はアジュバント中の１００μｇオボアルブミンの皮下（ｓ．ｃ．）投与により０日目（Ｄ０）に免疫し、Ｄ１４に生理食塩水又はアジュバント中の同じ皮下用量を用いた追加免疫が続いた。アジュバント中のＯＶＡを受けたマウスには、ミョウバン又はフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）との１：１の混合物中のＯＶＡを投与する。
【０５２９】
ＯＶＡへの体液性免疫応答に対する抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラのアジュバント効果を評価し、抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラの免疫増強効果を反映する。
【０５３０】
ＯＶＡへの体液性応答に対する抗ＧＩＴＲ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラの効果を評価するために、抗ＧＩＴＲナノボディ又は無関係な対照ナノボディを、最初の投薬日に１×１５mg/kgの負荷用量で、次の２回の投薬日に２×１０mg/kgの維持用量で、３連続日にわたり一次（Ｄ０）又は追加（Ｄ１４）免疫で腹腔内投与する。抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラをＤ０又はＤ１４に３連続日にわたり２５mg/kgで腹腔内投与する。抗ＯＶＡ血清力価を、Ｄ７、Ｄ１３、及びＤ２１にＥＬＩＳＡにより決定する。Ａｌｕｍ又はＩＦＡと混合したＯＶＡを比較のために含める。抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラ処置動物における全抗ＯＶＡ  ＩｇＧレベルの有意な増加が、無処置対照動物及び無関係な対照動物と比較して予測される。
【０５３１】
実施例１３：同系ＣＴ−２６結腸癌モデルにおけるインビボでの概念証明
【０５３２】
抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラの腫瘍有効性を、同系のＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて実証する。
【０５３３】
このモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＢＡＬＢ／ｃ由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ２６細胞）を接種する。０日目（Ｄ０）に、腫瘍を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部中に２００μLのＲＰＭＩ１６４０中の１×１０６個のＣＴ２６細胞を皮下注射することにより誘導する。腫瘍が平均容積５０〜１００mm3に達する際、動物を、表７に示す処置計画に従って処置する。
【０５３４】
腫瘍成長に対する抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ１ｂキメラのインビボでの有効性を評価し、無関係な対照ナノボディと比較する。マウスを、単独療法又は抗ＰＤ−１抗体（Ａｂ）もしくは抗ＰＤ−１  Ａｂ  ＋  ５−フルオロ−ウラシル（５ＦＵ）との併用療法のいずれかにおいて、抗ＧＩＴＲナノボディ又は抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラを用いて処置する。抗ＣＴＬＡ−４抗体で処置したマウスを陽性対照群として含む。抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラの有効性を、単独療法として、又は抗ＰＤ−１抗体との併用療法において、ＤＴＡ−１とさらに比較する。
【０５３５】
【表１８】
2018537421.tif 000019
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【０５３６】
生存率、行動、及び体重を記録する。腫瘍の長さ及び幅を、キャリパーを用いて週２回測定し、腫瘍容積を以下の式により推定する：
【表１９】
2018537421.tif 000021
【０５３７】
ナノボディ又はナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラを標的とするＧＩＴＲを用いた有意な抗腫瘍活性は、腫瘍発生又は完全な腫瘍拒絶の発症における著しい遅延を反映する。
【０５３８】
ＣＴ２６細胞を用いた再攻撃を行い、皮下ＣＴ２６腫瘍を拒絶したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗腫瘍記憶の確立を評価する。
【０５３９】
４９日目（Ｄ４９、即ち、最初のＣＴ２６細胞のＳＣ注射の４９日後）に、１×１０６個のＣＴ２６細胞を、群２、３、４、５、７、及び９からの動物の左脇腹中に２００μLのＲＰＭＩ１６４０中で皮下注射する  最初のＣＴ２６腫瘍が処置の効果により排除されたマウスだけに、２回目のＣＴ２６腫瘍細胞を注射する。
【０５４０】
さらに、免疫記憶の非存在におけるＣＴ２６腫瘍成長を実証するために、１×１０６個のＣＴ２６細胞を、９匹の無感作マウスの左脇腹中に２００μLのＲＰＭＩ１６４０中で皮下注射する。
【０５４１】
動物のモニタリングは、上に記載した通りに実施する。
【０５４２】
ナノボディ又はナノボディ−ラットＩｇＧ２ｂキメラを標的とするＧＩＴＲを用いた腫瘍発生又は完全な腫瘍拒絶の発症の著しい遅延が予測される。
【０５４３】
実施例１４：アゴニスト抗ＧＩＴＲナノボディ単独又は抗ＰＤ−１抗体との組み合わせによって、同系ＣＴ−２６結腸癌マウスモデルにおいて腫瘍退縮が起こり、生存時間が増加する。
【０５４４】
アゴニスト抗ＧＩＴＲナノボディ（Ｎｂ）の抗腫瘍有効性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＢＡＬＢ／ｃ由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ−２６細胞）を用いて接種した同系ＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて実証した。ＣＴ−２６細胞を、１０%熱不活性化ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μL容量のＲＰＭＩ１６４０中の１×１０６個のＣＴ−２６細胞を右脇腹中に皮下注射した。腫瘍の長さ及び幅を、キャリパーを使用して測定し、腫瘍容積（mm3）＝  ０．５×長さ×幅２の式（式中、長さはより長い寸法である）を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍攻撃後８日目に、マウスを、個々の腫瘍容積に従って、等しい平均腫瘍サイズ８９mm3を伴う１４の処置群に無作為化し、投与を、表８に提示する処置計画に従って開始した。腫瘍容積を週２回記録した。生存は毎日記録した。腫瘍が正常体重の１０%を超えた際にマウスを安楽死させた。
【０５４５】
マウスを、単独療法として、又は抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ；BioXCellクローンＲＰＭ１−１４）との組み合わせにおいて、抗ＧＩＴＲナノボディを用いて、又はラットＩｇＧ２ｂアイソタイプもしくはヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＧＩＴＲナノボディ−ＩｇＧキメラを用いて処置した。抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂであるＤＴＡ−１（BioXCell）を単独で、又は抗ＰＤ−１ｍＡｂとの組み合わせで用いて処置したマウスを、陽性参照対照群として含めた。対照マウス（媒質群１４）の１群を未処置のままにした。全ての処置を、腫瘍攻撃後８日目に開始して腹腔内注射（ＩＰ）を介して施した。ＤＴＡ−１を受けたマウスの群を、２５mg/kgの単回投与（群１及び２）で処置した。抗ＧＩＴＲナノボディを受けたマウスの群を、１５mg/kgの単回負荷用量及び１０mg/kgの維持用量（用量レベル１；群３及び７）又は３０mg/kgの単回負荷用量及び２０mg/kgの維持用量（用量レベル２；群５及び８）のいずれかで、２日毎に１回のＩＰ注射を用いて反復処置した。無関係な対照ナノボディを、それぞれ用量レベル１（群４及び９）及び用量レベル２（群６及び１０）の複数の投薬計画で投与した。ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＧＩＴＲ  ＮＢ−ＩｇＧキメラを、それぞれ５mg/kg（群１１）及び２５mg/kg（群１２及び１３）の単回用量として投与した。併用療法を受けているマウスの群に、抗ＰＤ−１ｍＡｂを用いて、１０mg/kgの用量レベルでの５日毎に１回の注射で合計３回のＩＰ注射を投与した（群２、７、８、９、１０、及び１３）。
【０５４６】
抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ＩｇＧキメラの抗腫瘍有効性を評価し、それぞれの対照群と比較した。腫瘍成長の阻害、腫瘍成長の遅延、及び腫瘍退縮は、動物の生存と一緒に、抗腫瘍有効性のための読み出し値として役立った。
【０５４７】
図８に示す通り、抗ＧＩＴＲナノボディと抗ＰＤ−１ｍＡｂ（群７及び８；図８Ｇ及び８Ｈ）との組み合せは、７／１０匹及び８／１０匹の動物と相乗効果をもたらし、媒質群１４（図８Ｎ）と比較した場合、それぞれの対照群（群９及び１０；図８Ｉ及び８Ｊ）の１／１０匹及び２／１０匹の動物に対して、それぞれナノボディ用量レベル１及び２について腫瘍発生の遅延を示した。
【０５４８】
抗ＧＩＴＲナノボディを用いた単独療法は、それぞれの対照群５及び６と比較した場合、用量レベル１及び２でそれぞれ３／１０匹及び４／１０匹の動物において腫瘍発生の遅延をもたらした。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＧＩＴＲナノボディ−ＩｇＧキメラと抗ＰＤ−１ｍＡｂとの組み合わせは、８／１０匹の動物における腫瘍発生の遅延及び５０%完全退縮（ＣＲ）（群１３）により示される強力な相乗効果をもたらした。ヒトＩｇＧ１アイソタイプキメラを用いた単独療法は、６／１０匹の動物において腫瘍成長の遅延をもたらし、１／１０匹の動物が完全腫瘍退縮を示した（群１２）。ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプキメラを用いた単独療法は、媒質群と比較して、６／１０匹の動物（群１１）において腫瘍成長の遅延をもたらした。参照抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ、ＤＴＡ−１を用いた処置は、単独療法（群１）について、及び抗ＰＤ−１ｍＡｂ（群２）と組み合わせにおいて、それぞれの対照群と比較し、それぞれ８／１０匹及び６／１０匹の動物について腫瘍発生の遅延をもたらした。単独療法及び併用療法の両方が２０%の完全退縮をもたらした。
【０５４９】
また、図９に示す通り、媒質群の生存期間の中央値（腫瘍注射の日から算出した開始）は２３日間（群１４）であった。参照抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ、ＤＴＡ−１単独で処置した群についての生存期間の中央値は４４．５日間であり、４０%の動物が処置後４０日目に依然として生存していたのに対し、ＤＴＡ−１及び抗ＰＤ−１ｍＡｂを用いた併用療法では生存期間の中央値は３４日間であり、３０%の動物が処置後４０日目に依然として生存していた。抗ＰＤ−１ｍＡｂとの組み合わせで無関係なナノボディを受けた対照群での生存期間の中央値は、無関係なナノボディの用量レベル１及び２でそれぞれ２１．５日間及び２３日間であった。抗ＧＩＴＲナノボディを用いた単独療法は、両方の用量レベル（グループ３及び５）について２３日間の生存期間の中央値に対応したのに対し、無関係なナノボディを用いて処置したそれぞれの対照群は、両方の用量レベル（群４及び６）について２０日間の生存期間の中央値を示した。抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＰＤ−１ｍＡｂの組み合わせを用いて処置した群での生存期間の中央値は、ナノボディの用量レベル１（群７）で３０日間であり、２０%が処置後４０日目に依然として生存していたが、ナノボディの用量レベル２（群８）では２８．５日間であった。ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗ＧＩＴＲナノボディキメラを用いた単独療法を受けた動物（群１１）は、２７日間の生存期間の中央値を提示し、１０%が処置後４０日目に依然として生存していた。
【０５５０】
ヒトＩｇＧ１アイソタイプ（グループ１２）の抗ＧＩＴＲナノボディキメラの単独療法で処置した動物は、２７日間の生存期間の中央値を有し、３０%が処置後４０日目に生存していたのに対し、ヒトＩｇＧ１アイソタイプキメラ及び抗ＰＤ−１  ｍＡｂの組み合わせで処置された動物の６０%が、処置後４０日目に依然として生存していた（群１３）。要約すると、本発明のアゴニスト抗ＧＩＴＲナノボディは、関連する腫瘍モデルにおいて統計的に有意な効果を示す。これらの結果を、得られたデータの別々の独立した統計分析によりさらに確認し、それは、いわゆるトビット回帰モデル（Dagne&Huang、2012）の拡張バージョンであった。
【０５５１】
【表２０】
2018537421.tif 000022
2018537421.tif 000023
【０５５２】
実施例１５：Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＧＩＴＲナノボディのインビトロベンチマーク
【０５５３】
Ｔ細胞実験を、実施例１０に記載する通りに実施した。結果を図１０Ａ〜１０Ｃに示す。これらの実験は、試験した抗ＧＩＴＲ化合物が、臨床段階の３６Ｅ５  ｍＡｂと同様の効力（ＥＣ５０）を有することを示す。しかし、ナノボディ構築物Ａ０２３１０００３５及びＡ−０２３１−００＿ＴＰ００８は、３６Ｅ５と比較し、より高い最大有効性を明確に示す。これは、薬物の有効性がその最大有効性に依存するため、臨床的に非常に重要である。ナノボディＡ０２３１０００１４は、３６Ｅ５とは対照的に、高濃度で維持される、３６Ｅ５と比較して同等の最大有効性を示す。
【０５５４】
実施例１６：ＯＶＡ免疫モデルにおけるＡ０２３１０００３５及びＡ−０２３１−００＿ＴＰ００８のインビボでの概念実証
【０５５５】
ＯＶＡへの体液性免疫応答に対する抗ＧＩＴＲ多価ナノボディ（Ａ０２３１０００３５）及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラ（Ａ−０２３１−００＿ＴＰ００８）のアジュバント効果を実証したが、抗ＧＩＴＲアゴニストナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラの免疫増強効果を反映していた。
【０５５６】
ＯＶＡ免疫モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生理食塩水中又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を伴う１：１混合物中の１００μgのＯＶＡ皮下（ｓｃ）投与によりゼロ日目（０日目）に免疫し、続いて  １４日目に生理食塩水又はＩＦＡ中の同じ皮下用量で追加免疫した。
【０５５７】
ＯＶＡへの体液性応答に対する抗ＧＩＴＲナノボディの効果を評価するために、抗ＧＩＴＲナノボディを、異なる投薬計画で腹腔内投与した：即ち、１５mg/kg（単回用量レベル１、ＳＤＬ１）又は３０mg/kg（ＳＤＬ２）での初回（０日目）及び追加（１４日目）免疫の日での投与を伴う単回投薬計画；投与を０日目及び１４日目に開始し、１５mg/kgの負荷用量レベル及び１０mg/kgの２つの維持用量レベル（Ｑ２Ｄｘ３；反復投薬計画１、ＲＤ１）を伴う反復投薬計画；投与を０日目から開始する、１５mg/kgの負荷用量レベル及び１０mg/kgの１０の維持用量レベル（Ｑ２Ｄｘ１１；ＲＤ２）を伴う反復投薬計画。無関係な対照ナノボディを、抗ＧＩＴＲナノボディのそれぞれの投薬計画に対応する投薬計画で投与した。抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラを、０日目及び１４日目に２０mg/kgの用量レベルで単回用量として投与し、同じ投薬計画及びレベルで与えられた無関係なヒトＩｇＧ１  ｍＡｂ（Synagis）と比較した。抗マウスＧＩＴＲアゴニストｍＡｂ（ＤＴＡ−１；BioXCell）を陽性参照対照として含み、そのそれぞれのアイソタイプ対照（抗ＫＬＨ、クローンＬＴＦ−２、BioXCell）と比較したが、両方を、単回投薬計画で０日目及び１４日目に、２０mg/kgの用量レベルで投与した。０日目及び１４日目に、処置をＯＶＡ免疫に先立ち与えた。ＩＦＡと混合したＯＶＡを対照比較として含めた。
【０５５８】
抗ＯＶＡ全ＩｇＧ血清力価を、初回免疫後１３日目及び２１日目にＥＬＩＳＡにより決定した。図１１に示す通り、１３日目に、ＯＶＡ力価が、連続反復投薬計画ＲＤ２に供した動物において有意に増加し、平均ｌｏｇ１０力価はそのそれぞれの対照（３．３２５±０．１０４；ｐ＜０．０００１）に対して４．２７３（±０．２８４）であった。２１日目に、ＯＶＡ力価は６．０７１（０．２７７）にさらに増加し、対照（４．９６２±０．２２５；ｐ＜０．０００１）に対して有意に異なった。ＳＤＬ１、ＳＤＬ２、及びＲＤ１で抗ＧＩＴＲナノボディを受けた動物において、２１日目の最高力価が、そのそれぞれの対照（５．０９０±０．２０６；ｐ＜０．０００１）に対してＲＤ１（６．７４４±０．１５１）により及びそのそれぞれの対照（５．１５６±０．３６８；ｐ＜０．０００１）に対してＳＤＬ１（６．６２８±０．１２５）により誘導された。ＳＤＬ１と同様に、ＳＤＬ２での抗ＧＩＴＲナノボディは、ＯＶＡ力価の増加（６．２２５±０．４７３）をもたらし、そのそれぞれの対照（４．７９９±０．０８１；ｐ＜０．０００１）と比較して有意に異なった。２１日目に、抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラは、５．９０３（±０．２４９）のＯＶＡ力価増加をもたらし、そのアイソタイプ対照（５．３２６±０．２３７）と比較して有意に異なった。同様に、処置動物対対照動物の力価における差は、ＤＴＡ−１を用いた処置時に有意であった（それぞれ５．５３０±０．３４３対４．９７１±０．２８１；ｐ  ＝  ０．０００２）。
【０５５９】
実施例１７：抗ＧＩＴＲナノボディの配列最適化
【０５６０】
１７．１  配列最適化：配列解析
親の野生型ナノボディ配列を変異させて、ヒトＶＨ３−ＪＨ生殖系列コンセンサス配列とより同一のナノボディ配列をもたらした。ナノボディとヒトＶＨ３−ＪＨ生殖系列コンセンサスの間で異なるフレームワーク領域中の特定のアミノ酸を、タンパク質構造、活性、及び安定性が完全に保たれるようにヒト対応物に変化させた。ナノボディＡ０２３１００４Ｂ０１については、５つの変異Ｌ１１Ｖ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｋ１０５Ｑを含むバリアント（Ａ０２３１０００６１、配列番号２６９）を生成した（Ｋａｂａｔに従ったナンバリング）。Ａ０２３１００５Ａ０３については、同じ５つの変異（Ｌ１１Ｖ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ、Ｋ１０５Ｑ）を伴うバリアント（Ａ０２３１０００７８、配列番号２７１）を生成した。また、位置１００ｅのメチオニンを、ロイシン（Ａ０２３１０００９０、配列番号２７２）、リジン（Ａ０２３１０００９１、配列番号２７３）、アルギニン（Ａ０２３１０００９２、配列番号２７４）、又はグルタミン（Ａ０２３１０００９３、配列番号２７５）によりさらに置換した。Ａ０２３１０３４Ａ０８については、５つの変異Ｄ１０Ｇ、Ｌ１１Ｖ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌを伴うバリアント（Ａ０２３１０００６３、配列番号２７０）を生成した。そして最後に、ナノボディＡ０２３１０５２Ｅ０８については、９つの次の変異：Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｓ６０Ａ、Ａ７４Ｓ、Ｍ７８Ｌ、Ｋ８３Ｒ、Ａ８７Ｔ、Ｇ８８Ａ、Ｖ８９Ｌを伴うバリアント（Ａ０２３１０００５０、配列番号２６８）を生成した。
【０５６１】
１７．２  多価の配列最適化された抗ＧＩＴＲナノボディ構築物の構築、発現、及び精製
バリアントＡ０２３１０００６１及びＡ０２３１０００９０については、表Ａ−１１（配列番号２８５〜２９０）に列挙する通り、異なる構築物を作製した。全ての多価ナノボディ構築物がＣ末端アルブミン結合Ｎｂ（Ａｌｂ９２）を有し、その後、標準的な条件に従ってピキア・パストリスにおいて発現させた。構築物を、プロテインＡ結合を介して精製した。
【０５６２】
実施例１８：ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて評価した配列最適化された抗ＧＩＴＲ多価ナノボディによるＧＩＴＲの活性化。
【０５６３】
配列最適化されたフォーマット化ナノボディの機能性を、実施例９に記載する通りにＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて決定した。
【０５６４】
ＥＣ５０値で及び有効性を表９に示す。例示的な活性化曲線を図１２Ａ〜Ｄに示す。
【０５６５】
【表２１】
2018537421.tif 000024
【０５６６】
実施例１９：配列最適化された抗ＧＩＴＲナノボディのヒトＴ細胞活性化能力
【０５６７】
配列最適化されたフォーマット化ナノボディの機能性も、ヒトＴ細胞活性化アッセイにおいて評価した。実験を実施例１０に記載する通りに実施した。
【０５６８】
表１０は、天然リガンドと比較した、ＩＦＮ−γ産生に対する多価抗ＧＩＴＲナノボディ及び抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。ＥＣ５０値では、ナノボディの効力を反映する。Ｅｍａｘ（天然リガンドにより誘導される最大応答）のパーセンテージとしての最大有効性も提示する。全てのナノボディ構築物は、１００%に設定した、天然リガンドと同程度の有効性を示す。例示的な活性化曲線を図１３Ａ〜Ｇに示す。
【０５６９】
【表２２】
2018537421.tif 000025
【０５７０】
実施例２０：ＯＶＡ免疫モデルにおける配列最適化された抗ＧＩＴＲ多価ナノボディのインビボでの概念実証
【０５７１】
ＯＶＡへの体液性免疫応答に対する抗ＧＩＴＲ多価ナノボディ（Ａ０２３１００１０１、Ａ０２３１００１０７、Ａ０２３１００１１８）のアジュバント効果を評価し、抗ＧＩＴＲアゴニストナノボディの免疫増強効果を反映する。
【０５７２】
ＯＶＡ免疫モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生理食塩水中又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を伴う１：１混合物中での１００μgのＯＶＡの皮下（ｓｃ）投与によりゼロ日目（０日目）に免疫し、１４日目に生理食塩水又はＩＦＡ中での同じ皮下用量を用いた追加免疫が続く。
【０５７３】
ＯＶＡへの体液性応答に対する抗ＧＩＴＲ多価ナノボディの効果を評価するために、抗ＧＩＴＲナノボディを、用量レベル０．５〜２０mg/kgの範囲で、ＯＶＡ免疫に先立つ単回投薬計画で、初回（０日目）及び追加（１４日目）ＯＶＡ免疫の日に腹腔内投与する。無関係な対照ナノボディを、１５mg/kgの用量レベルで、同様の単回投薬計画で投与する。抗マウスＧＩＴＲアゴニストモノクローナル抗体（ＤＴＡ−１；BioXCell）を陽性参照対照として含み、そのそれぞれのアイソタイプコントロール（抗ＫＬＨ、クローンＬＴＦ−２、BioXCell）と比較し、両方を、単回投薬計画で０日目及び１４日目に２０mg/kgの用量レベルで投与した。ＩＦＡと混合したＯＶＡを参照比較として含む。
【０５７４】
抗ＯＶＡ全ＩｇＧ血清力価を、初回免疫後１３日目及び２１日目にＥＬＩＳＡにより測定する。抗ＧＩＴＲナノボディ処理動物における全抗ＯＶＡ  ＩｇＧレベルの有意な増加が、未処置動物及び対照動物と比較して予測される。
【０５７５】
実施例２１：同系ＣＴ−２６結腸癌マウスモデルにおけるアゴニスト配列最適化された抗ＧＩＴＲ多価ナノボディの単独又は抗ＰＤ−１抗体との組み合わせにおける抗腫瘍効果
【０５７６】
抗ＧＩＴＲアゴニスト多価ナノボディ（Ｎｂ）及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラの抗腫瘍有効性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＢＡＬＢ／ｃ由来の結腸直腸癌細胞（ＣＴ−２６細胞）を接種した同系ＣＴ−２６結腸癌モデルにおいて実証した。ＣＴ−２６細胞を、１０%熱不活性化ウシ胎仔血清及び２mM  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μＬ容量のＲＰＭＩ１６４０中の１×１０６個のＣＴ−２６細胞を右脇腹中に皮下注射した。腫瘍の長さ及び幅を、キャリパーを使用して測定し、腫瘍容積を、式、腫瘍容積（mm3）＝０．５×長さ×幅２（式中、長さはより長い寸法）を使用して決定した。腫瘍攻撃後７日目に、マウスを、それらの個々の腫瘍容積に従って、平均腫瘍容積が５５±１９mm3である１０匹の動物の１５処置群に無作為化した。投薬を、表１１に提示する処置計画に従って開始した。腫瘍容積を週２回記録した。生存率、行動、及び体重を毎日記録した。動物を処置開始後４２日目までモニターした。
【０５７７】
マウスを、単独療法として、又は抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）との併用療法のいずれかで、抗ＧＩＴＲ多価ナノボディ（Ａ０２３１００１０１、Ａ０２３１００１０７、Ａ０２３１００１１８）又は抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラ（Ａ−０２３１−００＿ＴＰ０１１）を用いて処置した。抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ  ＤＴＡ−１単独又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせで処置したマウスを、陽性対照群として含めた。対照マウスの１群（群１）を未処理のままにした。全ての処置を、腫瘍攻撃後７日目に開始した腹腔内注射（ＩＰ）を介して施した。ＤＴＡ−１を受けたマウスの群を、２５mg/kgの単回用量で処置した（群２及び群３）。抗ＧＩＴＲナノボディを受けたマウスの群を、１つの負荷用量及び９つの維持用量からなる、１８日間の２日間毎に１回のＩＰ注射を伴う複数投薬計画を介して処置した。抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０１で処置した群は、１５mg/kgの負荷用量及び１０mg/kgの維持用量を受けた（群８及び群９）。抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０７を、１８．７mg/kgの負荷用量及び１２．５mg/kgの維持用量で投与した（群１０及び１１）。抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１１８を、２２．５mg/kg負荷用量及び１４mg/kg維持用量で投与した（群１２及び１３）。後者の２つの抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０７及びＡ０２３１００１１８の用量レベルは、抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０１と等モルになるように設定した。無関係な対照ナノボディは、抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０１と同様に投与した。抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラを２５mg/kg（群１４及び１５）の単回用量としてそれぞれ投与した。併用療法を受けているマウス群には、抗ＰＤ−１ｍＡｂを用いて合計３回ＩＰ注射し、１０mg/kgの用量レベルで５日毎に１回注射した（群３、５、７、９、１１、１３、１５）。
【０５７８】
抗ＧＩＴＲ多価ナノボディ及び抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラの抗腫瘍有効性を評価し、それぞれの対照群と比較した。腫瘍の成長及び生存は、抗腫瘍有効性についての読み出し値として役立った。処理開始後４２日目に相当する、腫瘍攻撃後４９日目まで、動物をモニターした。
【０５７９】
図１４に示す通り、抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０１（群８）及びＡ０２３１００１１８（群１２）は、それらのそれぞれの対照群（無関係なナノボディ、群６）と比較して、１／１０匹の動物について腫瘍成長における遅延傾向を示したのに対し、  ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０７（群１０）は、無関係なナノボディと比較して、腫瘍成長の発生を有意に阻害した（ｐ＝０．３２３）。抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラ（群１４）は、そのそれぞれの対照（ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ、群４）と比較して、腫瘍成長の有意な阻害をもたらし（ｐ＜０．０００１）、５／１０匹及び３／１０匹の動物が腫瘍成長の発生及び完全な腫瘍退縮を示した。同様に、抗腫瘍有効性がＤＴＡ−１  ｍＡｂについて確認され、腫瘍成長発生の有意な阻害を示し（ｐ＜０．０００１）、３／１０匹の動物が完全退縮を伴った。抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせた抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０１（群９；ｐ＜０．００２２）及びＡ０２３１００１０７（群１１；ｐ＜０．０００７）との相乗的腫瘍成長阻害が、対応する抗ＰＤ−  １  ｍＡｂ対照群（群７）と比較して観察された。群９において、腫瘍成長の遅延を伴う６匹の動物のうち１匹において、完全退縮が観察されたのに対し、群１１においては、腫瘍成長の遅延を伴う５匹の動物うち２匹が完全退縮を示した。抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラと抗ＰＤ−１ｍＡｂ（群１５）との組み合わせは、ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照（群５）と比較して、有意な腫瘍成長阻害をもたらした（ｐ＜０．０００１）。同様に、抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせたＤＴＡ−１  ｍＡｂは、群７と比較して、有意な抗腫瘍効果を示し、５匹の動物が完全退縮を示したためである（ｐ＜０．０００１）。
【０５８０】
図１５に示す通り、媒質群１の生存期間の中央値（治療開始から）は１５日間であり、２１日目から１００%の死亡率であった。ＤＴＡ−１単独での処置時の生存期間の中央値は３４．５日間であり、処置後４２日目には４０%の生存率であったのに対し（ｐ＜  ０．０００１）、ＤＴＡ−１及び抗ＰＤ−１  ｍＡｂを用いた併用療法は３４日間の生存の中央値をもたらし、６０%の動物が治療後４２日目に依然として生存していた（ｐ＝０．０００３）。抗ＰＤ−１  ｍＡｂ対照群５及び７についての生存の中央値は１９．５日間であった。抗ＧＩＴＲナノボディ単独療法の生存分析は、Ａ０２３１００１０７について有意であり（ｐ＜０．０３９１）、生存期間の中央値は１９．５日間であり、４２日目の生存率は２０%であった。抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、生存分析は抗ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１０１（群９；ｐ＝０．００２６）及びＡ０２３１００１０７（群１０；ｐ＝０．００５６）について有意であり、それぞれ４２日目に５０%及び３０%の生存率を示した。抗ＰＤ−１ｍＡｂとの組み合わせにおける抗−ＧＩＴＲナノボディＡ０２３１００１１８（群１３）は、２８日間の生存期間の中央値をもたらした。抗ＧＩＴＲナノボディ−ｈｕＩｇＧ１キメラを用いた単独療法（群１４）は、３４．５日間の生存期間の中央値及び４２日目の４０%の生存率を示したのに対し（ｐ＜０．０００１）、抗ＰＤ−１ｍＡｂを用いた併用療法（群１５）は、２９．５日間の生存期間の中央値及び治療後４２日目の３０%の生存率をもたらした。
【０５８１】
【表２３】
2018537421.tif 000026
【０５８２】
【表２４】
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2018537421.tif 000028
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【０５８３】
【表２５】
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【０５８４】
【表２６】
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【０５８５】
【表２７】
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【０５８６】
【表２８】
2018537421.tif 000055
【０５８７】
【表２９】
2018537421.tif 000056
【０５８８】
【表３０】
2018537421.tif 000057
【０５８９】
等価物
前述の文書による明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。本発明は、提供する実施例により、範囲において限定されない。なぜなら、実施例は、本発明の特定の態様及び実施形態の例証として意図されるからである。他の機能的に等価の実施形態が、本発明の範囲内にある。本発明の種々の改変が、本明細書において示し、記載するものに加えて、前述の記載から当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入るであろう。本発明の利点及び目的は、本発明の各々の実施形態により必ずしも包含されない。
【図１−１】
2018537421.tif 000058
【図１−２】
2018537421.tif 000059
【図２】
2018537421.tif 000060
【図３】
2018537421.tif 000061
【図４−１】
2018537421.tif 000062
【図４−２】
2018537421.tif 000063
【図５−１】
2018537421.tif 000064
【図５−２】
2018537421.tif 000065
【図６−１】
2018537421.tif 000066
【図６−２】
2018537421.tif 000067
【図７】
2018537421.tif 000068
【図８−１】
2018537421.tif 000069
【図８−２】
2018537421.tif 000070
【図８−３】
2018537421.tif 000071
【図８−４】
2018537421.tif 000072
【図８−５】
2018537421.tif 000073
【図９−１】
2018537421.tif 000074
【図９−２】
2018537421.tif 000075
【図１０】
2018537421.tif 000076
【図１１】
2018537421.tif 000077
【図１２−１】
2018537421.tif 000078
【図１２−２】
2018537421.tif 000079
【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
2018537421.tif 000082
【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５】
2018537421.tif 000088
【配列表】
2018537421000001.app
【国際調査報告】
2018537421.tif 000089
2018537421.tif 000090
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