(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプル中の標的特異的ＤＮＡプローブを用いて個々の染色体をプロファイリングするための方法及びシステムを含む。本発明は、単独でまたは組み合わせて（多重化）のいずれかの染色体プロファイルの生成に関する。本発明は、妊婦または癌患者の末梢血からの無細胞ＤＮＡのような生物学的サンプルのＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイルの生成を指し得る。本発明は、妊婦、癌患者の末梢血、または人工生殖技術を用いて作製された胚からの個々のインタクトな細胞のＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイルの生成をさらに包含する。本発明はさらに、スペクトルフィルターによる直接蛍光、または蛍光光度計による蛍光強度によるＤＮＡハイブリダイゼーションの検出を含む。あるいは、酵素としてポリＨＲＰを用い、基質として増強ルミノールを用いる酵素−基質反応を間接的に通じてＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するために、化学発光システムを用いてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的特異的ＤＮＡプローブを用いる生物学的サンプル中の染色体の多重プロファイリングのための方法であって：
ａ）インタクトな間期細胞内の少なくとも１つの特異的染色体上の特異的な標的ＤＮＡ配列と多数の特異的ＤＮＡプローブとを関連付けるステップと；
ｂ）最終のＤＮＡプローブが１〜４個の蛍光シグナルを生成するように、複数のＤＮＡプローブの一部に別個のシグナルを発することができる蛍光標識を付着させ、それにより固有のシグナルの組成が、任意の所定の染色体上の標的とは異なるという点で特徴付けられる固有のシグナルを生成するステップと；
ｃ）ＤＮＡプローブを染色体上の標的にハイブリダイズさせるステップと、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記特定の標的ＤＮＡ配列が少なくとも１つの特異的染色体を含むＤＮＡフラグメント上にあること、及びインタクトな間期細胞が無細胞血漿ＤＮＡであるという点で特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイゼーションが、インタクトな間期細胞で１回以上実施されるインサイチュハイブリダイゼーション、及びマルチウェルプレートの１つ以上のウェルで行われる懸濁ハイブリダイゼーションからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイブリダイゼーションが、単一のハイブリダイゼーションにおける２４のヒト染色体のうちの少なくとも１つの上の標的の１つ以上の標的を標的とし得るというという点で特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
蛍光顕微鏡及びＣＣＤカメラに埋め込まれた特定の励起／発光フィルターキューブを用いて、インタクトな間期細胞に蛍光シグナルの個々の位置を登録するステップをさらに包含する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡプローブに結合した蛍光標識が、ＤＥＡＣ  ｄＵＴＰ、ＦＩＴＣ  ｄＵＴＰ、シアニン３−ｄＵＴＰ、シアニン５−ｄＵＴＰ、Ｒｅｄ  ５９４  ｄＵＴＰ、及びそのアナログもしくは誘導体からなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
インタクトな間期細胞内の別個の位置にあるＤＮＡプローブの少なくとも個々の蛍光シグナルを分類し、各染色体の所定の配置に基づいてそれぞれの染色体プロファイルに分類するという点で特徴付けられる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
最終の前記ＤＮＡプローブが化学発光シグナルを生成するように、非蛍光標識を前記複数のＤＮＡプローブの一部に結合させるステップであって、非蛍光標識が酵素にコンジュゲートした特異的リガンドに結合し、酵素−基質反応が化学発光シグナルを生成するという点で特徴付けられるステップをさらに包含する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
蛍光光度計を用いて単一のウェル内で各反応からの各標的について総蛍光光度を登録するステップ、または照度計を用いて単一のウェル内で各反応からの各標的について総化学発光強度を記録するステップをさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡプローブに結合した非蛍光標識が、ビオチン、及びそれらのアナログまたは誘導体からなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
非蛍光標識ビオチンに結合するリガンド−酵素複合体が、アビジン−ポリＨＲＰ酵素であり得るという点で特徴付けられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＲＰ酵素と反応する基質がルミノールであり得るという点で特徴付けられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的のＤＮＡプローブが、ヒト染色体１−２２、Ｘ及びＹからなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記個々の染色体プロファイルを組み合わせて完全な核型を作製し、個々の染色体プロファイルを用いて数値的または構造的染色体異常を検出するという点で特徴付けられる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的サンプルの少なくとも１つの起源が、妊婦由来の末梢血、癌患者由来の末梢血、及び体外受精のような人工生殖技術を用いて作製された胚由来のトロホブラスト細胞からなる群より選択されるという点で特徴付けられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプル中の標的特異的ＤＮＡプローブを用いて個々の染色体をプロファイリングする方法及びシステムに関する。具体的には、本明細書に開示される方法及びシステムは、単独でまたは組み合わせて（多重化）のいずれかで染色体プロファイルを生成することに関する。より具体的には、本明細書中に開示される方法及びシステムは、妊婦の末梢血由来または癌患者由来の無細胞ＤＮＡなどの様々な生物学的サンプルの標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイルの生成を指す；この方法及びシステムはさらに、妊婦の末梢血由来、癌患者由来、または体外受精のような人工生殖技術を用いて作製された胚由来の、個々のインタクトな細胞の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイルの生成をさらに包含する。
【背景技術】
【０００２】
核型は、羊水穿刺または絨毛膜絨毛から得られた妊婦の診断サンプルから胎児染色体状態を特定する。このような侵襲的処置に内在する危険性のため、母体血液中の無細胞胎児ＤＮＡを利用する非侵襲的スクリーニング法が最近ではかなり注目されている。しかし、これらの技術では、核型における均衡型の再編成を特定することはできない。新規の均衡型の再編成は、先天性または発達の後期段階での様々な奇形に関する胎児のリスク増大と関連している。別の種類の均衡型の再構成、すなわち末端動原体型染色体を伴うロバートソン転座は、トリソミーの再発リスクの増大を伴っている。
【０００３】
核型はまた、多くの固形悪性腫瘍（腫瘍）の診断及び予後において主要な役割を果たす。しかし、固形腫瘍から成功した核型を得ることは、高い培養障害のせいで非常に困難な場合が多い。したがって、出生前の状況と同様に、多くの努力が非侵襲的な技術に集中している。無細胞の循環中の腫瘍ＤＮＡを用いることにより、様々な研究者が、特定の遺伝子変異状態を評価することに重点を置いた戦略を開発している。しかし、実際に原発腫瘍の起源は不明であり、従って、集中した研究では限られた情報しか得られない。これは、がんの早期発見において極めて重要となる。さらに、いくつかの腫瘍では、診断的であり、かつインタクトな細胞でしか検出できない特異的な均衡型の転座を有する。
【０００４】
出生前及び癌の両方の状況において、遺伝的情報を得るための同様の試みが、循環しているインタクトな細胞についても同様に行われている。循環している胎児細胞または腫瘍細胞の数は極めて少なく、数ミリリットルの全血から１〜２個しかない場合が多い。したがって、単一の細胞または少数の細胞から２４の染色体全てをプロファイリングすることにより完全な核型を得ることは、極めて有益であろう。
【０００５】
既存のシステムでは、全ての悪性腫瘍の診断である均衡型の転座を検出することができない。彼らはまた、遺伝カウンセリング及び妊婦のリスク評価のために重要なロバートソン転座を検出することもできない。
【０００６】
無細胞ＤＮＡ及びインタクトな細胞を用いる現在のシステムの主な欠点は以下である：１）ＴＡＴが長いこと；２）コストが高いこと；３）異数性の検出の限界；４）異なる染色体異数性検出の間の感度の変動性；５）高いインフラ構築のコスト。
【０００７】
本発明は、標的特異的ＤＮＡプローブに結合されたフルオロフォアの明確な励起及び発光スペクトル特性を有する、特別に設計された蛍光フィルターキューブの使用によって、全ゲノム情報をキャプチャすることができるので、既存の技術を上回る改良である。さらに、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐのような単純なシェルフプログラムからの「レイヤー（ｌａｙｅｒ）」の使用により、当業者は、所望の標的情報を「引き出す」ことができる。複数の標的が間期細胞において互いに重複している場合であっても、個々の標的について予め定義されたパターンを選択的に「呼び出す」（探す）ことにより、当業者は、細胞内の染色体全体を追跡し得る。これにより、さまざまな異常を認識する能力が得られる。
【０００８】
本発明は、無細胞ＤＮＡ中に存在する個々の染色体上の選択された標的をプロファイリングすることによって、母体の血液からの胎児異数性、及び癌患者の末梢血における他の染色体の変化を検出するためのゲノムの大規模な並行配列決定及び他の冗漫な試験様式を行う必要性の問題を解決する。
【０００９】
したがって、染色体を単独でまたは多重モードでプロファイリングするための新規でかつ改良された方法及びシステムが必要とされている。これに関して、本発明はこの必要性を実質的に満たす。この点に関して、本発明による方法及びシステムは、先行技術の従来の概念及び設計から実質的に離れており、それによって、標的特異的ＤＮＡプローブを用いて様々な生物学的サンプルの染色体プロファイリングの目的のために主に開発された装置を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８５７４８３６号明細書
【特許文献２】米国特許第７９４３３０４号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】リー・Ｊ、ハリス・Ｌ、マモン・Ｈら（Li J, Harris L and Mamon H et al.）著、「血漿中の対立遺伝子不均衡の拡大スクリーニングを可能にするプラズマ循環ＤＮＡの全ゲノム増幅（Whole Genome Amplification of Plasma-Circulating DNA Enables Expanded Screening for allelic imbalance in plasma）」ＪＭＤ第８巻第１号、２００６年２月，p.22-30
【非特許文献２】マモン・ｈ、ハーダー・Ｃ、リー・Ｊら（Mamon H, Hader C and Li J et al.）著、「血漿からのアポトーシスのＤＮＡの優先的増幅：循環ＤＮＡにおける軽微な変化の検出を増強する可能性（Preferential amplification of Apoptotic DNA from Plasma: Potential for enhancing detection of minor alterations in circulating DNA）」、臨床化学54:9（Clinical Chemistry 54:9）、２００８、p 1582-1584
【非特許文献３】シュウ・Ｘ、ダウン・Ｍ、ティアラ・Ｂら（Xue X, Dawn M and Teare B et al.）著、「血漿および血清からの循環無細胞ＤＮＡの収率および有用性の最適化（Optimizing the yield and utility of circulating cell- free DNA from plasma and serum）」、クリニカ・ケミカ・アクタ４０４（Clinica Chimica Acta 404）、２００９、p.100-104.
【非特許文献４】ヤハイ・Ｉ、エルシマリ・ＹＩ、カードー・Ｈ、サルキシアン・Ｍら（Yahya I. Elshimali YI, Khaddour H and Sarkissyan M et al.）著、「がん患者の血液中において循環する無細胞ＤＮＡの臨床的利用（ＣＣＦＤＮＡ）（The Clinical Utilization of Circulating Cell Free DNA (CCFDNA)）in Blood of Cancer Patients」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ、２０１３、14, 18925-18958; doi:10.3390/ijmsl40918925.
【非特許文献５】エスプタイン・Ｌ、サンディ・デフリース・Ｓ、ワルドゥマン・ＦＭ（Epstein L, Sandy DeVries S, and Waldman FM）著、「原位置ハイブリッド形成における既にハイブリッド化された蛍光発光の再利用（Reutilization of Previously Hybridized Slides for Fluorescence In Situ Hybridization,）」、サイトメトリー（Cytometry）、１９９５、p.21378-381
【非特許文献６】ギル・Ｒ、ティエン・Ｌ、ソマービル・ＷＲＣら（Gill R, Tian L and Somerville WRC et al.）、「蛍光増強のための高効率プラズモンアンテナとしての銀ナノ粒子凝集体（Silver Nanoparticle Aggregates as Highly Efficient Plasmonic Antennas for Fluorescence Enhancement）」、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ  Ｃ  １１６  ２０１２年、p.16687-16693.
【非特許文献７】リンカーン博士（Lincoln Ph.D.）著、「溶液中の銀ナノ粒子を用いた近赤外表面増強蛍光（Near-Infrared Surface-Enhanced Fluorescence Using Silver Nanoparticles in Solution）」、ネブラスカ大学 - リンカーン（University of Nebraska - Lincoln）、デジタル・コモンス＠ネブラスカ大学 - 学位（DigitalCommons cUniversity of Nebraska -Thesis）、２０１３年１月１２日
【非特許文献８】ジュノー・Ｋ、ボガード・ＰＥ、ファン・Ｓら（Juneau K, Bogard PE and Huang S et al.）、「非侵襲的な出生前検査を改善するマイクロアレイに基づく無細胞ＤＮＡ解析（Microarray-Based Cell-Free DNA Analysis Improves Noninvasive Prenatal Testing）」、胎児診断（Fetal Diagn Ther）、３６、２０１４、p.282-286.
【非特許文献９】ルビオ・ＣＩ、ベルバー・Ｊ、ロドリゴ・Ｌら（Rubio CI , Bellver J and Rodrigo L et al.）著、「反復性移植拒絶および進行した母体年齢の患者における原位置ハイブリッド形成蛍光を用いた着床前遺伝子スクリーニング：２件のランダム化試験（Preimplantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials）」、不妊（Fertil Steril）、２０１３年４月、99(5): 1400-7.
【非特許文献１０】サクセナ・ＳＧ、デサイ・Ｋ、シュウォール・Ｌら（Saxena SG, Desai K and Shewale L et al.）著、「インド民族のカップルにおける蛍光原位置ハイブリッド形成法を用いた移植前遺伝子スクリーニング：領域はあるか？（Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in couples of Indian ethnicity: Is there a scope?）」、Ｊ・ハム・生殖・科学（J Hum Reprod Sci）、２０１４年１〜３月、７（１）p.２５〜２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先行技術に現在存在する種々の染色体異常を検出する公知の種類の遺伝的方法に固有の前述の欠点を考慮して、本発明は、様々な生物学的サンプルのための標的特異的ＤＮＡプローブを用いることにより、染色体をプロファイリングする改良された方法及びシステムを提供し、先行技術の上述の不利益及び欠点を克服する。このように、本発明の普遍的な目的は、後でさらに詳細に記述するが、本明細書において前述した先行技術の全ての利点を有する様々な生物学的サンプルのための標的特異的ＤＮＡプローブを用いることによって、染色体をプロファイリングするための新規かつ改良された方法及びシステム、ならびに先行技術では予測もされず、自明にもされず、示唆もされず、暗示すらされない、標的特異的ＤＮＡプローブを用いることによって染色体をプロファイリングする方法及びシステムをもたらす多くの新規な特徴を、単独でまたはそれらの任意の組合せのいずれかで、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これを達成するために、本発明は、１つの態様において、生物学的サンプル由来の無細胞ＤＮＡを用いて個々の染色体をプロファイリングする方法を本質的に含む。この方法は、以下のステップを包含する：
無細胞のＤＮＡ採血管を用いて、例えば、Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．によって提供される採取管を用いて１０〜２０ｍｌの末梢血を採取し、輸送するステップ；
ＴＨＰプロトコールを用いて血漿ＤＮＡを抽出するステップ；
無細胞ＤＮＡフラグメントのブラントライゲーションにより全ゲノム増幅を一晩行うステップ；
ビオチンで５’末端標識を行うステップ；
ＤＮＡフラグメントをエタノール沈殿させるステップ；
Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓビーズ及びビオチン標識ＤＮＡフラグメントをＢＨＷ緩衝液が有無の９６ウェルプレート中でインキュベートするステップ；
磁石を適用し、結合していないＤＮＡを洗い流すステップ；
磁石を解放し、個々の染色体ごとに特定のフルオロフォアを有する標的特異的ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを行うステップ；
磁石を適用し、ＢＨＷ緩衝液の有無の状態で過剰のプローブを洗い流すステップ；
Ｇｉｌｌｓ紙からＮａＯＨを用い、及び緩衝液の有無の状態で溶出するステップ；
磁石を適用し、新しい９６ウェルプレートに溶出液を移すステップ；
負に荷電した銀粒子及びスペルミンを添加するステップ；
暗所で、室温で１０分間インキュベートするステップ；
蛍光計を用いて、９６ウェルプレートの各ウェルから個々の染色体ごとに全てのフルオロフォアについて読み取り値を得るステップ；
各染色体上の特定の標的ごとに発光曲線を確立するステップ；及び
この値を、全ての染色体上のそれぞれの標的についての確立された正常曲線と比較するステップ。
【００１４】
別の態様では、この方法は、生物学的サンプルから単離、回収、または抽出されたインタクトな細胞上の染色体をプロファイリングするステップをさらに包含する。この方法は、以下のステップを包含する；
インタクトな細胞をマルチチャンバースライドに固定するステップ；
標的特異的ＤＮＡプローブを生成するステップ；
１つの反応で全ての標的についてＦＩＳＨハイブリダイゼーションを行うステップ；
一度に６つの染色体上の標的に対するＦＩＳＨハイブリダイゼーションを行うステップ；
インタクトな細胞のハイブリダイゼーションを必要に応じて複数回繰り返すステップ；
特別に設計されたフィルターキューブを用いてハイブリッド標的の画像をキャプチャするステップ；
各標的を分析し、その所定の数を割り当てるステップ；及び
ハイブリダイゼーションパターンに基づいて染色体プロファイリングを完了するステップ。
【００１５】
いくつかの実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブを構成するＤＮＡ配列に結合した蛍光色素は、フルオレセイン１２ｄＵＴＰであってもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブを構成するＤＮＡ配列に結合した蛍光色素は、シアニン（Ｃｙａｎｉｎ）５５３４５  ｄＵＴＰであってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブを構成するＤＮＡ配列に結合した蛍光色素は、シアニン６５４５５  ｄＵＴＰであってもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブを構成するＤＮＡ配列に結合した蛍光色素は、５９４ｄＵＴＰであってもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブを構成するＤＮＡ配列に結合した蛍光色素は、２００〜１０００ｎｍの範囲の励起及び発光特性を有する任意のフルオロフォアであってもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブを構成するＤＮＡ配列に結合した蛍光色素は、２００〜１０００ｎｍの範囲の励起及び発光特性を有する任意のフルオロフォアの組み合わせであってもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、無細胞ＤＮＡは、妊婦の末梢血由来であってもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、無細胞のＤＮＡは、癌患者の末梢血由来であってもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、インタクトな細胞は、癌患者の末梢血由来であってもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、インタクトな細胞は、妊婦の末梢血由来であってもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、インタクトな細胞は、体外受精のような人工生殖技術を用いて形成された胚の栄養外胚葉由来であってもよい。
【００２６】
さらに別の態様では、生物学的サンプルから生成された全ての個々の染色体プロファイルをプールすることにより、複合核型を生成してもよい。
【００２７】
したがって、以下の詳細な説明をよりよく理解し、かつ本技術への現在の貢献をよりよく理解できるように、本発明のより重要な特徴をむしろ広義に概説した。
【００２８】
本発明の多くの目的、特徴及び利点は、本明細書に記載される以下の詳細な説明を読むことによって当業者に容易に明らかになるであろうが、それにもかかわらず、本発明の実施形態は付随する図面と組わせた場合に、説明に役立つ。この点に関して、本発明の現在の実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されているか、または図面に例示される、構築物の詳細及び構成要素の配置に対するその適用に限定されないことが理解されよう。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施され実行され得る。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明のためのものであり、限定的であると見なされるべきではないことを理解すべきである。
【００２９】
このように、当業者であれば、本開示の基礎となる概念は、本発明のいくつかの目的を実行するための他の構造、方法及びシステムの設計の基礎として容易に利用できることを理解するであろう。したがって、請求項は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない限り、そのような同等の構成を含むとみなされることが重要である。
【００３０】
したがって、本発明の目的は、先行技術の利点の全てを有し、かつ欠点のない標的特異的ＤＮＡプローブを用いて生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための新規で改良された方法及びシステムを提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、容易かつ効率的に製造及び販売され得る標的特異的ＤＮＡプローブを用いて、生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための新規かつ改良された方法及びシステムを提供することである。
【００３２】
本発明のさらに別の目的は、材料及び労力の両方に関して製造コストが低く、したがってそれに応じて公的消費に対する低価格の販売がしやすい、標的特異的ＤＮＡプローブを用いて生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための新規でかつ改良された方法及びシステムを提供することであり、それにより、このような方法及びシステムは、購入者に経済的に利用可能な標的特異的ＤＮＡプローブを用いて生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための方法及びシステムとなる。
【００３３】
本発明のさらに別の目的は、先行技術の装置及び方法においてそのいくつかの利点を提供しながら、同時に通常それにともなういくつかの欠点を克服する、標的特異的ＤＮＡプローブを用いて生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための新しい方法及びシステムを提供することである。
【００３４】
これらは、本発明の他の目的と一緒になって、本発明を特徴付ける新規性の様々な特徴と共に、本開示に添付され、本開示の一部を形成する特許請求の範囲において詳細に指摘される。本発明、その動作上の利点、及びその使用によって達成される特定の目的をより良く理解するために、本発明の実施形態を図示している、添付の図面及び説明事項を参照すべきである。
【００３５】
本発明は、以下の本発明の詳細な説明を考慮することにより、よりよく理解され、上述した以外の目的が明らかになるであろう。そのような説明は添付の図面を参照している。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、特定のフルオロフォアＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＣＹ５、Ｒｅｄを有する標的特異的ＤＮＡプローブが、染色体プロファイルを生成するために用いられ得ることを実証する例示的な実施形態を示す。
【図２】図２は、正常な染色体１のプロファイルを示しており、それぞれのフルオロフォア及び対応する強度を有する全ての標的を示している。
【図３】図３は、染色体の異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示す。図３は、トリソミーを示す異常な染色体１のプロファイルを示す。
【図４】図４は、染色体の異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示す。図４は、モノソミーを示す異常な染色体１のプロファイルを示す。
【図５】図５は、染色体の異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示す。図５は、ショートアームの正味重複を伴う不均衡型の転座を示す異常な染色体１のプロファイルを示す。
【図６】図６は、染色体の異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示す。図６は、末端ショートアームの欠失を示す異常な染色体１のプロファイルを示す。
【図７】図７は、染色体の異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示す。図７は、ロングアームの欠損を示す異常な染色体１のプロファイルを示す。
【図８】図８は、染色体の異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示す。図８は、ロングアームの正味重複及びショートアームの欠失を有するロングアームのアイソクロモソームを示す異常染色体１のプロファイルを示す。
【図９】図９は、インタクトな細胞中の２４の染色体全てのプロファイリングを例示する７０個の標的全てのインサイチュハイブリダイゼーションシグナルパターンに基づく標的マップを示しており、これはさらに転座を実証している。
【図１０】図１０は、フルオロフォアの特定の組み合わせを有する標的特異的ＤＮＡプローブを用いて染色体プロファイルを生成し、この場合の染色体１２と２１との間の転座のような異常を検出することができることを実証する例示的な実施形態を示す。
【図１１】図１１は、以下のフルオロフォア色のスキームを示すａ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体１、Ｙ、１３の多重プロファイリング  ｂ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体Ｘ、１８、２１の多重プロファイリング  ｃ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体２、６、２２の多重プロファイリング  ｄ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体３、７、２０の多重プロファイリング  ｅ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体４、１９、１４の多重プロファイリング  ｆ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体５、８、１７の多重プロファイリング  ｇ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体９、１６、１２の多重プロファイリング  ｈ）標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体１０、１１、１５の多重プロファイリング。
【図１２Ａ】図１２Ａは、染色体１、Ｙ、１３の多重プロファイリングを示しており、トリソミー１３及び染色体１のロングアームを含む均衡型の転座を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、モノソミーＸ及び染色体１８のショートアームの欠損を示す染色体Ｘ、１８、２１の多重プロファイリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ここで図面、特に図１〜図１２を参照すると、本発明の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための方法及びシステムの実施形態が示されている。
【００３８】
上記のように、請求項に係る発明は、母親の血液から胎児異数性及び癌患者の末梢血における他の染色体の変化を検出するためにゲノムの大規模な並行配列決定を行う必要性という問題を解決する。
【００３９】
本発明は、それぞれのフルオロフォアから放射された蛍光の総量をキャプチャすることによって、染色体の長さに沿った特定の標的に存在するＤＮＡの量を検出する発光または蛍光の検出方法を利用する。本発明は、特定の蛍光ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントをキャプチャする銀ナノ粒子及びスペルミンの使用によるシグナル増強技術を利用する。本発明はまた、全ての染色体のテロメア及びセントロメア／セントロメア周辺領域のようなゲノムの戦略的領域を標的とするように設計されているビオチン化ＢＡＣ  ＤＮＡプローブとの結合のためのストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ抗体の使用によるシグナル増強技術を利用してもよい。本発明はまた、マイクロタイタープレートの特別にコーティングされたＤＮＡ結合表面に対してアミン修飾された無細胞ＤＮＡを結合させるための固定化技術も利用する。
【００４０】
請求項に係る発明は、現在存在するものとは異なる。既存の方法は全て配列決定に依存しているため、全てに重大な方法の失敗があった。本発明は、シグナルを生成するステップ、蛍光検出を増強するステップの両方において、インサイチュハイブリダイゼーションプラットフォーム及びシグナル増幅技術を使用するので、既存の配列ベースの方法とは異なる。これは、既存の方法論よりも改良されており、以下の利点を有する：１）高速ＴＡＴ；２）低コスト；３）大幅なインフラ構築の支出を伴うことなく、ほとんど全ての実験室設定での使いやすさ；及び４）全ての染色体の異数性の包括的スクリーニング。
【００４１】
上記のように、核型は、羊水穿刺または絨毛膜絨毛から得られた妊婦の診断サンプルから胎児染色体状態を特定する。このような侵襲的処置に内在する危険性のせいで、母体血液中の無細胞胎児ＤＮＡを利用する非侵襲的スクリーニング法が近年、大いに注目されている。しかし、これらの技術は、核型における均衡型の再編成を特定し得ない。新規の均衡型の再編成は、先天性または発達の後期段階での様々な奇形についての胎児のリスク増加を伴っている。別の種類の均衡型の再構成、すなわち末端動原体型染色体に関与するロバートソン転座は、トリソミーの再発リスクの増大を伴っている。
【００４２】
核型はまた、多くの固形悪性腫瘍（腫瘍）の診断及び予後において主要な役割を果たす。しかし、固形腫瘍から首尾よい核型を得ることは、高い培養障害のせいで非常に困難である場合が多い。したがって、出生前の状況と同様に、多くの労力が非侵襲的な技術に集中している。無細胞の循環中の腫瘍ＤＮＡを用いることにより、様々な研究者が、特定の遺伝子変異状態を評価することに重点を置いた戦略を開発している。しかし、実際に原発腫瘍の起源は不明であり、従って、集中研究では限られた情報しか得られない。これは、がんの早期発見において極めて重要となる。さらに、いくつかの腫瘍は診断的であり、かつインタクトな細胞でしか検出されない特異的な均衡型の転座を有する。
【００４３】
出生前及び癌の両方の状況において、遺伝的情報を得るための同様の試みが、循環しているインタクトな細胞についても同様に行われている。循環中の胎児細胞または腫瘍細胞の数は極めて少なく、数ミリリットルの全血から１〜２個であることが多い。したがって、単一または少数の細胞から完全な核型を得ることは、極めて有益であろう。ここで、請求項に係る発明は、この問題を解決する。
【００４４】
請求項に係る発明は、ゲノム全体をプロービングする包括的なアプローチを利用することによって上記の問題を解決する。テロメアやセントロメアなどの染色体上の特定の標識を標的とすること、及びそれらを分子的に異なる（独特の）ものにすることにより、本発明は、全ての均衡型の転座、ならびに妊婦もしくは癌患者の末梢血から、または胚から得られた単一または少数の細胞からの不均衡型の変化を特定し得る。
【００４５】
請求項に係る発明は改良であり、現在存在するものとは異なる。それは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術を利用しており、優れている。なぜなら、全ての染色体上の全ての標的が分子的に区別されるように設計されており、異常について問い合わされて、均衡をとられてもよく、同様に、全ゲノムは単一または少数の細胞から不均衡にされてもよいからである。本発明は、２つの関与する末端動原体型染色体の並置されたセントロメアの目印を認識することによって、特別な種類の再構成、すなわちロバートソン転座でさえ検出する。例えば、これは、ダウン症候群の機序（自立型トリソミー対転座関連トリソミー）を明らかにする。既存のシステムは、疾患特異的検出に集中しているので、ゲノム全体の調査では十分に機能しない。利用可能な材料が単一または少数の細胞のように制限されている場合、ＤＮＡ抽出後の全ゲノム増幅でさえ包括的検出能力を提供することはできない。
【００４６】
本発明は、特別に設計されたＢＡＣ  ＤＮＡプローブの使用によって、別個の励起及び発光スペクトル特性を有する特別に設計された蛍光フィルターキューブの使用によって全ゲノム（核型）情報をキャプチャすることができるので、既存の技術に対する改良である。さらに、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐのような単純なシェルフプログラムからの「レイヤー」の使用により、当業者は、所望の標的情報を「引き出す」ことができる。いくつかの標的が間期細胞において互いに重複している場合でさえ、個々の標的について予め定義されたパターンを選択的に「呼び出す」（探す）ことにより、当業者は、細胞内の染色体全体を追跡し得る。これにより、さまざまな異常を認識する能力が提供される。
【００４７】
本発明の実施形態は、限定するものではないが、以下を包含し得る：
１）末梢血を得て血漿を分離するステップ；必要に応じて採取した血液を試験施設に運ぶための安定剤を用いる；
２）Ｑｉａｇｅｎアンプキットのような市販キット、またはＴｒｉｔｏｎ／Ｈｅａｔ／Ｐｈｅｎｏｌ（ＴＨＰ）プロトコールのような社内のプロトコールを用いて、無細胞の（ｃｆ）ＤＮＡを精製するステップ；
３）（ＢＬＭ−ＰＣＲ）を用いるか、または（ＢＬ−ＷＧＡ）（フラグメントサイズを豊富にする）なしでブラントライゲーション法を用いる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を行うステップ
４）ビオチンで５’末端標識を行うステップ；
５）ＤＮＡフラグメントをエタノール沈殿させるステップ；
６）Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓビーズ及びビオチン標識ＤＮＡフラグメントを、ＢＨＷ緩衝液が有無の状態で９６ウェルプレート中でインキュベートするステップ；
７）磁石を適用し、結合していないＤＮＡを洗い流すステップ；
８）磁石を解放して、個々の染色体ごとに特定のフルオロフォアを有する標的特異的ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを行うステップ；
９）磁石を適用して、ＢＨＷ緩衝液の有無の状態で、過剰なプローブを洗い流すステップ；
１０）ＮａＯＨを用いて、及びＧｉｌｌｓ紙から緩衝液を用いてまたは用いずに溶離するステップ；
１１）磁石を適用し、新しい９６ウェルプレートに溶出液を移すステップ；
１２）負に荷電した銀粒子及びスペルミンを添加するステップ；
１３）暗所で室温で１０分間インキュベートするステップ；
１４）蛍光光度計で蛍光を検出し、各染色体上の各標的に対する確立された標準曲線と比較するステップ；及び
１５）ハイブリダイゼーションパターンに基づく染色体プロファイリングを完了するステップ。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態は、限定するものではないが、以下が挙げられる：
１６）ビオチンでＤＮＡプローブを標識するステップ；
１７）間接的酵素法、例えばアビジン−ポリＨＲＰ複合体を通じてシグナルを生成するステップ；
１８）ポリＨＲＰ酵素の基質として強化ルミノールを用いるステップ；及び
１９）照度計を用いてシグナルを検出するステップ。
【００４９】
本発明のさらに追加の実施形態としては、限定するものではないが、以下が挙げられ得る：
２０）循環中の胎児細胞または末梢血からの腫瘍細胞または胚からトロホブラスト細胞を単離するステップ；
２１）インタクトな細胞を複数のチャンバースライドに固定するステップ；
２２）標的特異的ＤＮＡプローブを生成するステップ；
２３）１反応で全ての標的についてＦＩＳＨハイブリダイゼーションを行うステップ；
２４）一度に６つの染色体上の標的についてＦＩＳＨハイブリダイゼーションを行うステップ；
２５）インタクトな細胞でのハイブリダイゼーションを必要に応じて複数回繰り返すステップ；
２６）特別に設計されたフィルターキューブを用いて、ハイブリダイズした標的の画像をキャプチャするステップ；
２７）各標的のハイブリダイゼーションパターンを分析するステップ；及び
２８）ハイブリダイゼーションパターンに基づいて染色体プロファイリングを完了するステップ。
【００５０】
図面には、以下に限定されないが、プローブ標識及びシグナル検出の別の描写が含まれ得ることが理解される。
【００５１】
図１はまた、フルオロフォアオレンジ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５を有する標的特異的ＤＮＡプローブが、染色体プロファイルを生成するために用いられ得ることを実証する例示的な実施形態を示し得る。
【００５２】
図３〜図８はまた、異常を示す２４の染色体のいずれかの異常プロファイルを示す例示的な実施形態を示し得る。
【００５３】
図１１はまた、２４のヒト染色体のうちの３つの任意の組み合わせの多重プロファイリングのフルオロフォアカラースキームを示し得る。
【００５４】
図１２はまた、任意の種類の異常を示す染色体の任意の組み合わせの多重プロファイリングを示し得る。
【００５５】
非侵襲的な方法で染色体プロファイリングを通じて遺伝的異常を検出するために、まず血漿を全血から分離し、次のステップで無細胞ＤＮＡを抽出する。精製されたＤＮＡは、ステップ３で増幅される。ステップ４は、ステップ３の不可欠な部分であり、ここではゲノムＤＮＡフラグメントは、ビオチンで末端標識される。ステップ４は、ＤＮＡがエタノール沈殿されるステップ５の前提条件である。工程６では、ストレプトアビジンビーズ及びビオチン標識ゲノムＤＮＡフラグメントを、適切な緩衝液を含む９６ウェルプレート中でインキュベートする。次のステップでは、ビーズの磁気分離後に未結合のＤＮＡを洗い流す。これは、ステップ８で行われるＦＩＳＨハイブリダイゼーションの前提条件である。磁場からビーズを除去した後、特異的フルオロフォアの組み合わせで標識した標的特異的ＤＮＡプローブを、ステップ６で形成されたアビジン−ビオチン複合体を通じて磁性ビーズ上のアビジン分子に結合したゲノムフラグメントに対してハイブリダイズする。ビーズを磁場から解放した後、過剰のＤＮＡプローブを洗い流し、ハイブリダイズしたプローブを、適切な緩衝液中でＮａＯＨで溶離する。ビーズの磁気分離の後、個々の溶出物を新しい９６ウェルプレートに移す。ステップ１２では、負に荷電した銀ナノ粒子と正に荷電したスペルミンとの間に蛍光プローブが閉じ込められ、これが銀の凝集体を形成するのに役立つ。これによって、室温で暗所で１０分間インキュベートした後に蛍光シグナル増幅が促進される。次のステップでは、個々の蛍光読み取り値が、蛍光計によって自動的に登録される。最後に、染色体プロファイルの一部となるこれらの読み取り値を標準的な正常染色体プロファイルと比較して、遺伝的異常を決定する。
【００５６】
非侵襲的な方法で染色体プロファイリングを通じて遺伝的異常を検出するために、血漿ＤＮＡを用いることに加えて、インタクトな細胞もまた用いられる。単離された細胞が顕微鏡スライド上に固定される次のステップのためには、循環中の胎児細胞または末梢血から腫瘍細胞または胚からトロホブラスト細胞を単離することが前提条件である。次のステップで生成された標的特異的ＢＡＣプローブは、ＦＩＳＨハイブリダイゼーションには、１回の反応で全ての染色体または一度に６回の染色体を標的として用いられる。以下のステップでは、全てのゲノム標的のハイブリダイゼーションを完了するのに必要な回数、ハイブリダイゼーションを繰り返す。次のステップでは、ハイブリッドされた標的の画像をキャプチャして、これを次のステップで分析に用いる。最後のステップでは、所定の基準を用いて、観察された標的が正常または異常状態を構成すると決定される。
【００５７】
以下は、本発明の実施形態がどのように機能し得るかの例である。
【００５８】
血漿中の無細胞ＤＮＡの保存は、十分に確立された防腐剤を用いることによって達成することができ、サンプルは無細胞ＤＮＡの分解なしに世界中の実験室に輸送することができる。高分子量ＤＮＡを抽出及び精製するための複数の方法論が存在する。サンプルを最適に調達し、無細胞ＤＮＡを調製することにより、当業者は、多くの全ゲノム増幅技術のいずれかを利用して、全ての染色体の異数性及び他の異常を評価するのに十分な量を生成することができる。換言すれば、当業者は、無細胞ＤＮＡを用いて分子核型を生成することができる。これを達成するためには、増幅工程の後に、ビオチンによる５’末端標識を用いてＤＮＡを修飾しなければならない。これらのＤＮＡフラグメントを固体表面上にトラップするにはいくつかの方法が存在する。最も効率的な方法は、ストレプトアビジン磁気ビーズをビオチン化ＤＮＡフラグメントと共にインキュベートすることであろう。特定のフルオロフォアを有する標的特異的ＤＮＡプローブの生成は、標準的なニックトランスレーションプロトコールによって達成され得る。一旦、所望のプローブが生成されると、個々の染色体ＦＩＳＨ反応を、適切なハイブリダイゼーション緩衝液中のマイクロタイタープレート中のビーズ上で行うことができる。ハイブリダイズしたプローブを溶出させて、新鮮なマイクロタイタープレートに移してもよい。蛍光を増強するために、複数の増幅技術が利用可能である。そのような方法の１つは、スペルミンと組み合わせた銀ナノ粒子の使用である。特定の蛍光光度は、各ウェル（染色体）から記録することができる。この新規アプローチの主な適用は、正常な女性または癌でないの対照個体における無細胞ＤＮＡ量の確立された曲線を参照して、ゲノム標的のレベルの増大または低下を検出することであろう。上術のステップの組み合わせにより、当業者は、染色体異数性、ならびに欠失及び重複などの他の変化をスクリーニングし得る。換言すれば、母体の血液及び全癌患者由来の血液由来の無細胞ＤＮＡを用いて、この新規の方法で分子核型を生成することができる。したがって、上記の方法を用いて、癌患者の末梢血からの無細胞ＤＮＡを用いて、固形癌に関連する染色体の変化を検出してもよい。
【００５９】
末梢血から胎児細胞または腫瘍細胞のいずれかを分離して濃縮するにはいくつかの方法が存在する。所望の細胞を最適に獲得することにより、当業者は、それらを顕微鏡スライドの表面に固定することができる。プリセットされた色の組み合わせ（図１１）を有する標的特異的ＤＮＡプローブの生成は、標準ニックトランスレーションプロトコールによって達成することができる。一旦、所望のプローブが生成されると、全てのゲノム標的のハイブリダイゼーションを顕微鏡スライド上で迅速に行うことができる。必要に応じてハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、２４の染色体全てを２４時間以内にプロファイリングすることができる。
【００６０】
特別に設計された蛍光フィルターセット及びカメラの使用により、当業者は、画像をキャプチャし得る。このデータセットは、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐのレイヤーを用いて個々の標的を分析するための基礎として役立つ。個々の染色体状態の決定は、これらの上述のステップの組み合わせによって可能である。一旦、個々の染色体が特定されると、完全な核型を生成することは、当業者にとって標準的な手順である。
【００６１】
以下は、当業者が本発明の実施形態をどのように使用できるかの例示である。
【００６２】
いくつかの遠心分離法が、妊娠した母親から採取した全血から血漿成分を分離するために利用可能である。同様に、当業者が利用するためには、複数のＤＮＡ抽出及び精製技術が存在する。市販のキットをこのステップに用いてもよく、またはＴＨＰプロトコールのような自家製方法が極めて有用である。いくつかの全ゲノム増幅キットが市販されている。これらのうち、フラグメントサイズの濃縮の有無があるブラントライゲーション増幅法は、胎児異数性の研究に最適である。
【００６３】
ビオチンによる末端標識のために、いくつかのキットが市販されている。ストレプトアビジン磁気ビーズは、複数の業者から容易に入手可能である。
【００６４】
標的特異的ＤＮＡプローブを生成するための特異的ＢＡＣライブラリー及びフルオロフォアは市販されている。銀ナノ粒子及びスペルミンは、商業的に容易に入手可能である。いくつかの蛍光光度計は、この新規な方法で用いるために市販されている。
【００６５】
胎児細胞を単離することに関して文献にはいくつかのストラテジーが存在する。これらのうち、有核胎児赤血球の分離及び濃縮は、いくつかの利点をもたらす。簡単な手順は、ＣＤ７１／Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａに対するモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いることであろう。磁場を用いて、これらの細胞を分離し濃縮してもよい。腫瘍細胞を単離するための多くのシステムのうち、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌによるフィルターシステムが最も簡単で最も経済的である。このシステムはまた、胎児細胞を分離するためにも用いてもよい。次いで、それらを、標準的なニックトランスレーション及び図１１に概略を示したスキームを用いて生成された標的特異的ＤＮＡプローブを用いて、顕微鏡スライド上のＦＩＳＨに用いてもよい。各々の標的についてこれらのプローブを作成するのに必要な蛍光標識は、市販されている。合計で、４つのスペクトル的に別個のフルオロフォアが、図示のように組み合わせて用いられる（図１１）。蛍光顕微鏡システムは、本発明で用いるために市販されている。励起／発光フィルターセットのいくつかの商業供給源のうち、Ｓｅｍｒｏｃｋ及びＣｈｒｏｍａは、全ての色を検出するのに最適なフィルターの組み合わせを提供する。画像は、単一のフィルターセットまたはフィルターセットの組み合わせのいずれかを用いてキャプチャしてもよい。この全プロセスはまた、市販のシステムを用いて自動化してもよい。デフォルトアプローチは、世界中の多くの研究所にとって最も手頃な方法であるので、常に手動である。一旦、適切な画像がキャプチャされれば、さらなる分析のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐにアップロードしてもよい。この種の分析には、市販のソフトウェアプログラムが利用可能である；しかし、前のステップと同様に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐなどのオフシェルフプログラムの使用が極めて経済的である。次いで、当業者は、マニュアルまたは自動化されたプロトコールを用いて個々の染色体上の各々の分子的に別個の標的を分析して、染色体プロファイルを生成し得る。
【００６６】
母親の血液から胎児異数性をスクリーニングするために、当業者は以下の作業を行うであろう：
末梢血から血漿を分離する；
無細胞ＤＮＡを抽出して精製する；
無細胞のＤＮＡの小片をライゲーションして、ランダムヘキサプライマーを用いて全ゲノム増幅を行う；
ビオチンを用いてフラグメントを末端標識する；
ストレプトアビジン磁気ビーズとともにインキュベートする；
特定のフルオロフォアを有する標的特異的ＤＮＡプローブを生成する；
９６ウェルプレート中でＦＩＳＨを行う；
銀ナノ粒子及びスペルミンとともにインキュベートする；そして
蛍光光度計を用いてそれぞれの蛍光強度を記録する。
【００６７】
標的特異的ＤＮＡプローブに関連する各フルオロフォアについて確立された標準曲線と比較することにより、当業者は、様々な染色体について胎児異数性が存在するか否かを決定するであろう。さらに、末端及び間隙の両方の大きな欠失及び重複は、この増強された蛍光法を用いて検出され得る（図２〜８）。
【００６８】
原発性固形腫瘍からの染色体異常を検出するために、当業者は、末梢血からの無細胞ＤＮＡを用い、確立された正常曲線を有する癌患者からの結果を比較する。
【００６９】
少量の胎児ＤＮＡサンプルであっても、またこの方法で処理することができる。無細胞のＤＮＡの胎児部分は、全無細胞ＤＮＡの一定割合、すなわち約２０％であり、染色体の１コピーの差は約１０％であるにもかかわらず、このシステムで放射される蛍光の絶対量は、銀ナノ粒子−スペルミン複合体のせいで１０％の差よりも実質的に高い。したがって、このアッセイの感度は、現在採用されている大規模な並列配列決定法よりも有意に優れている。また、これによって以下が生み出され得る：１）母体血液からの胎児異数性の検出のためのより速い方法；２）ごくわずかの商業的実体でしか提供されない既存の方法論とは異なり、ほとんど全ての実験室で使用できる、さらに現実的なアプローチ。
【００７０】
同じ原理がまた、癌の検出にも適用される。
【００７１】
単一のインタクトな循環中の胎児細胞、腫瘍細胞、またはトロホブラスト細胞から均衡型の転座を特に特定するために完全な核型を決定するために、当業者は以下の作業を行う：
１．循環中の胎児細胞または腫瘍細胞またはトロホブラスト細胞を単離／抽出する；
２．顕微鏡スライド上に細胞を固定する；
３．図１１及び表１のスキームに従って標的特異的ＤＮＡプローブを生成する；
４．ＦＩＳＨハイブリダイゼーションを行う；
ａ）１つのハイブリダイゼーションにおける全ての染色体；または
ｂ）修正されたスキームに従って、一度に６つの染色体；
５．特別に設計されたフィルターキューブを用いてハイブリッド標的の画像をキャプチャする；
６．各標的を分析し、図１１のスキームに従って所定の位置を割り当てる；
７．染色体異常を特定し、核型を規定する。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
追加の細胞が利用可能であれば、クローン性を異常性に関して確立することができる。さらに、クローン進化及び腫瘍異質性も研究することができる。追加の細胞が利用できない場合、同じ患者の血漿サンプルからの無細胞の循環中のＤＮＡでのＰＣＲのような他のＤＮＡに基づく方法を用いて転座を確認してもよい。
【００７４】
５つの末端動原体型染色体、すなわちロバートソン転座を含む特別な均衡型の転座を検出するために、上記のステップ３で概説した方法を用いる場合、５つの動原体標的のうちの２つの並置を探す。必要に応じて、ロバートソン転座を検出するためにＩｎｔｅＧｅｎ  ＬＬＣから市販のプローブセットを利用して、反復ハイブリダイゼーションを行ってもよい。
【００７５】
別の用途は、上記の反復ハイブリダイゼーションアプローチを用いる正常細胞と比較して、テロメアの長さ及び癌細胞における会合を決定するための標的特異的ＤＮＡプローブの使用であろう。
【実施例１】
【００７６】
（無細胞血漿ＤＮＡ上の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイリングによる母体血液からの胎児核型の確立）
一実施形態では、胎児核型は、妊娠した母親の血漿から抽出され、増幅され、ビオチンで標識されている無細胞ＤＮＡフラグメントを研究することによって確立することができる。フラグメントは、アビジン−ビオチン複合体のコンジュゲーションを通じて磁気ストレプトアビジンビーズに結合させることができる。ＤＮＡフラグメントは、標的特異的フルオロフォア標識ＤＮＡプローブを通じてそれらの相補的配列にハイブリダイズされ得る。ハイブリダイズされたプローブは、蛍光を増強するために、銀ナノ粒子とスペルミン複合体との間で溶出されて、サンドイッチされてもよい。
【００７７】
各フルオロフォアの強度は、蛍光光度計によって記録されてもよく、ＤＮＡ量を反映する個々の強度曲線を作成してもよい。これらの曲線を、確立された正常曲線と比較して、任意の異常の存在及び種類を決定してもよい。上記のステップに従って、個々の染色体プロファイルを生成してもよく、２４の染色体プロファイルを全て組み合わせることにより、胎児核型を確立してもよい。
【実施例２】
【００７８】
（無細胞血漿ＤＮＡ上の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイリングによる患者の血液からの固形腫瘍診断の確立）
別の実施形態では、腫瘍核型は、癌患者の血漿から抽出し、増幅し、ビオチンで標識される無細胞ＤＮＡフラグメントを研究することによって達成され得る。フラグメントは、アビジン−ビオチン複合体のコンジュゲーションを通じて磁気ストレプトアビジンビーズに結合させることができる。ＤＮＡフラグメントは、標的特異的フルオロフォア標識ＤＮＡプローブを通じてそれらの相補的配列にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズされたプローブは、それらの蛍光を増強するために、銀ナノ粒子とスペルミン複合体との間で溶出され、サンドイッチされてもよい。各フルオロフォアの強度は、蛍光光度計によって記録してもよく、ＤＮＡ量を反映する個々の強度曲線を生成してもよい。これらの曲線は、確立された正常曲線と比較して、異常の存在及び種類を決定してもよい。上記のステップに従って、個々の染色体プロファイルを生成してもよく、２４の染色体プロファイルを全て組み合わせることにより、核型を確立してもよい。その核型の結果に基づいて、特定の腫瘍診断を確立してもよい。
【実施例３】
【００７９】
（インタクトな循環中の胎児細胞上の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイリングによる母親の血液からの胎児核型の確立）
別の実施形態では、胎児核型は、標的特異的ＤＮＡプローブをインタクトな循環中の胎児細胞にハイブリダイズさせることによって確立してもよい。胎児細胞は、様々な確立された技術によって母親の血液から単離し得る。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、１つの反応で全ての染色体標的に対して行ってもよいし、または各反応において６つの染色体から標的を評価してもよい。この後に、インタクトな細胞上で必要な回数の反復ハイブリダイゼーションを続けてプロファイリングを完了してもよい。個々の染色体ハイブリダイゼーションパターンを記録し、予想される正常パターンと比較して、異常の存在及び種類を決定してもよい。上記のステップに従って、胎児核型を確立してもよい。
【実施例４】
【００８０】
（インタクトな循環中の腫瘍細胞上の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイリングによる患者の血液からの固形腫瘍診断の確立）
別の実施形態では、標的特異的ＤＮＡプローブをインタクトな循環中の腫瘍細胞にハイブリダイズさせることによって、特定の腫瘍診断を確立し得る。腫瘍細胞は、様々な確立された技術によって患者の血液から単離し得る。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、１つの反応で全ての染色体標的に対して行ってもよく、または各反応において６つの染色体からの標的を評価してもよい。この後に、インタクトな細胞上で必要な回数の反復ハイブリダイゼーションを続けてプロファイリングを完了してもよい。個々の染色体ハイブリダイゼーションパターンを記録して、予想される正常パターンと比較して、異常の存在及び種類を決定してもよい。上記の手順に従うことにより、特定の腫瘍診断を確立し得る。
【実施例５】
【００８１】
（栄養外胚葉層のインタクトな細胞上の標的特異的ＤＮＡプローブを用いる染色体プロファイリングによる胚核型の確立）
別の実施形態において、胚核型は、標的特異的ＤＮＡプローブをインタクトな胎児細胞にハイブリダイズすることによって確立してもよい。胎児細胞は、様々な確立された技術によって、胚の栄養外胚葉層から単離してもよい。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、１つの反応で全ての染色体標的に対して行ってもよいし、または各反応において６つの染色体由来の標的を評価してもよい。この後に、インタクトな細胞上で必要な回数の反復ハイブリダイゼーションを続けてプロファイリングを完了してもよい。個々の染色体ハイブリダイゼーションパターンを記録し、予想される正常パターンと比較して、異常の存在及び種類を決定してもよい。上記のステップに従って、体外受精を考慮した任意の胚について核型を確立してもよい。
【００８２】
本発明は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、本発明の実施形態は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態及び／または使用ならびにその改変及び等価物に拡張されることが当業者には理解されよう。
【００８３】
本発明の実施形態では、多くの変形及び代替の要素が開示されている。当業者には、なお更なる変形及び代替の要素が明らかであろう。限定されないこれらの変形の中には、個々の染色体をプロファイリングするための標的特異的ＤＮＡプローブ中のフルオロフォアの特定の数及び／または種類がある。本発明の様々な実施形態は、これらの変形または要素のいずれを含んでもよいし、または除外してもよい。
【００８４】
さらに、本明細書を通じて、多数の参照が特許及び刊行物に対してなされている。上術の引用文献の各々は、参照によりその全体が個々に本明細書に組み込まれる。
【００８５】
最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることを理解されたい。使用することができる他の改変も本発明の範囲内であり得る。したがって、限定ではなく例であるが、本発明の代替の構成要素を本明細書の教示に従って利用してもよい。したがって、本発明の実施形態は、図示及び説明したものに厳密に限定されるわけではない。
【００８６】
標的特異的ＤＮＡプローブを用いて生物学的サンプル中の染色体をプロファイリングするための方法及びシステムの実施形態を詳細に記載してきたが、それらに対する改変及び変形が可能であることは明らかであるはずであり、それらの全てが本発明の真の趣旨及び範囲内におさまる。従って、上記の説明に関して、サイズ、材料、形状、形態、機能、ならびに操作、組立及び使用の方式にける変化を含む本発明の部品の最適な寸法関係は、当業者には、容易に明らかであるものとみなされ、かつ自明であり、図面に示され明細書に記載されているものとの同等の関係は全て本発明に包含されるものとする。
【００８７】
したがって、上記は、本発明の原理の例示にすぎないと考えられる。さらに、当業者には多数の改変及び変更が容易に行われるので、本発明を図示及び説明した正確な構成及び操作に限定することは望ましくなく、従って、全ての適切な改変及び等価物は、本発明の範囲内におさまるものとされるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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