(57)【要約】ＣＤ３と、腫瘍抗原などの他の細胞表面標的抗原、たとえばＣＤ１９、ＣＤＨ３、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＥＧＦＲ抗原とに結合する、二重特異性抗原結合コンストラクト、たとえば薬物にコンジュゲートされた抗体（ＡＤＣ）、及び使用方法を開示する。【選択図】図１Ａ
2018524373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクターＴ細胞の存在下で、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの有効量を標的細胞に接触させることを含む、細胞表面に標的抗原を発現している標的細胞を殺傷する方法であって、
前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトが、
前記エフェクターＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１の重鎖可変（ＶＨ）領域と第１の軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
前記標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
前記抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物と
を含んでおり、
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとが機能的に連結されており、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
（ａ）前記抗原結合コンストラクトが、ＳＰＲもしくはＦＡＣＳ分析により測定すると、前記標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、及び／または
（ｂ）前記抗原結合コンストラクトが、インビトロのアッセイで測定すると、前記標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す、
前記方法。
【請求項２】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの有効量を対象に投与することを含む、前記対象において細胞表面に標的抗原を発現している標的細胞を殺傷する方法であって、
前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトが、
前記対象のＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１のＶＨ領域と第１のＶＬ領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
前記標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
前記抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物と
を含んでおり、
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとが機能的に連結されており、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
（ａ）前記抗原結合コンストラクトが、ＳＰＲもしくはＦＡＣＳ分析により測定すると、前記標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、及び／または
（ｂ）前記抗原結合コンストラクトが、インビトロのアッセイで測定すると、前記標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す、
前記方法。
【請求項３】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の疾患、障害、または状態を治療する方法であって、
前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトが、
前記対象のＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１のＶＨ領域と第１のＶＬ領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
疾患関連標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
前記抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物と
を含んでおり、
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとが機能的に連結されており、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
（ａ）前記抗原結合コンストラクトが、ＳＰＲもしくはＦＡＣＳ分析により測定すると、前記標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、及び／または
（ｂ）前記抗原結合コンストラクトが、インビトロのアッセイで測定すると、前記標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す、
前記方法。
【請求項４】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトからなる組成物であって、前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトが、
Ｔ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１のＶＨ領域と任意で第１のＶＬ領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
標的細胞上に発現した標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と任意で第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、
前記抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物と
を含み、
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとが機能的に連結されており、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
前記標的抗原がＣＤ３ではなく、
（ａ）前記抗原結合コンストラクトが、ＳＰＲもしくはＦＡＣＳ分析により測定すると、前記標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、及び／または
（ｂ）前記抗原結合コンストラクトが、インビトロのアッセイで測定すると、前記標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す、
前記組成物。
【請求項５】
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトがＦａｂであり、前記第２の抗原結合ポリペプチドがｓｃＦｖである；または
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトがｓｃＦｖであり、前記第２の抗原結合ポリペプチドがＦａｂである；または
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクト及び前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトがｓｃＦｖである；または
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクト及び前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトがＦａｂである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原結合コンストラクトが足場をさらに含んでいる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項７】
前記足場が、Ｆｃ、アルブミン、及びスプリットアルブミンから選択される、請求項６に記載の方法または組成物。
【請求項８】
前記足場がＦｃである、請求項７に記載の方法または組成物。
【請求項９】
前記Ｆｃが、
第１のリンカーによってまたは第１のリンカーなしで前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている第１のＦｃポリペプチドと、
第２のリンカーによってまたは第２のリンカーなしで前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている第２のＦｃポリペプチドと
を含むヘテロダイマーＦｃである、
請求項８に記載の方法または組成物。
【請求項１０】
前記第１のリンカー及び前記第２のリンカーが、ポリペプチドであり、任意でＩｇＧ１ヒンジ領域を含んでいる、請求項９に記載の方法または組成物。
【請求項１１】
前記ヘテロダイマーＦｃが、
ヒトＦｃである；ならびに／または
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４  Ｆｃである；ならびに／または
ＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む；ならびに／または
野生型ホモダイマーＦｃに匹敵する安定性のある前記ヘテロダイマーＦｃの形成を促進する１つ以上の修飾を、ＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つに含む；ならびに／または
前記ヘテロダイマーＦｃの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含むＣＨ３領域を含み、かつダイマー化したＣＨ３領域が約６８℃以上の融点（Ｔｍ）を有する；ならびに／または
表Ｃに記載するように、ＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む；ならびに／または
少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む；ならびに／または
１つ以上の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む；ならびに／または
表Ｄもしくは表Ｅに記載するように、ＣＨ２ドメインのうちの少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む；ならびに／または
Ｆｃγ受容体及び／もしくは補体の選択的結合を促進する１つ以上の修飾を含む；ならびに／または
１つ以上の修飾を有するヒンジ領域を含む、
請求項９または１０に記載の方法または組成物。
【請求項１２】
前記抗原結合コンストラクトが、未変性のＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃγ受容体結合の低下及び付随する免疫細胞媒介性エフェクター活性の低下を示す、請求項１１に記載の方法または組成物。
【請求項１３】
両方のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓを含んでいる、請求項１１または１２に記載の方法または組成物。
【請求項１４】
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ＯＫＴ３；テプリズマブ；ブリナツモマブ；ＵＣＨＴ１；ＮＩ０４０１；ビジリズマブ；Ｘ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、ＳＰ３４、及びＦ１０１．０１から選択される抗体またはそれらのヒト化バージョンに由来するか、またはそれとＣＤ３への結合について少なくとも５０％競合する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１５】
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、種交差反応性であり、任意で非チンパンジー霊長類と交差反応性である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１６】
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、
表Ｓ１の、
野生型ＯＫＴ３の６つのＣＤＲ、
ＯＫＴ３の安定化バリアントの６つのＣＤＲ、または
ＯＫＴ３のヒト化バリアントの６つのＣＤＲ
を含む６つのＣＤＲを含んでいる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１７】
前記第１のＶＬ領域が、ＣＤ３に特異的なｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、またはｖ１７１１８のＣＤＲのアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含み、
前記第１のＶＨ領域が、ＣＤ３に特異的なｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、またはｖ１５１９５のＣＤＲのアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含んでいる、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１８】
前記第１のＶＬ領域が、ＣＤ３に特異的なｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、または１７１１８の第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトのＶＬアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記第１のＶＨ領域が、ＣＤ３に特異的なｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、または１７１１８の第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトのＶＨアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項１９】
前記薬物が、毒素、化学療法剤、小分子治療剤、免疫修飾因子、または放射性同位体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２０】
前記毒素が、前記抗原結合コンストラクトにリンカーによって共有結合的に結合している微小管攪乱剤またはＤＮＡ修飾剤である、請求項１９に記載の方法または組成物。
【請求項２１】
前記微小管攪乱剤が、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、またはヘミアステリンである、請求項２０に記載の方法または組成物。
【請求項２２】
前記薬物が、マイタンシノイドであり、任意でＤＭ１またはＤＭ４である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２３】
前記薬物が、オーリスタチンであり、任意でＭＭＡＥである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２４】
前記リンカーが、非切断可能リンカーであり、任意でＳＭＣＣである、請求項２０に記載の方法または組成物。
【請求項２５】
前記リンカーが、切断可能リンカーであり、任意でＳＰＢＤである、請求項２０に記載の方法または組成物。
【請求項２６】
ＤＡＲ（薬物／抗原結合コンストラクト比）が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２７】
前記ＤＡＲが２〜４の範囲である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的抗原が、細菌性疾患、寄生虫性疾患、ウイルス性疾患、がん、自己免疫性状態、または炎症性状態に関連がある、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項２９】
前記標的抗原が、表ＬＬの標的抗原から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３０】
前記標的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤＨ３、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＥＧＦＲから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３１】
前記標的抗原がＣＤ１９である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３２】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ＣＤ１９に特異的であり、かつ、４Ｇ７；Ｂ４；Ｂ４３；ＢＵ１２；ＣＬＢ−ＣＤ１９；Ｌｅｕ−１２；ＳＪ２５−Ｃ１；Ｊ４．１１９、Ｂ４３、ＳＪ２５Ｃ１、ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）ＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）、Ｍｏｒ−２０８、ＭＥＤＩ−５５１、及びＭＤＸ−１３４２からなる群より選択される抗体に由来するか、またはそれとＣＤ３への結合について少なくとも５０％競合する、請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項３３】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、
表Ｓ１の、
野生型ＨＤ３７の６つのＣＤＲ、
ＨＤ３７の安定化バリアントの６つのＣＤＲ、または
ＨＤ３７のヒト化バリアントの６つのＣＤＲ
を含む６つのＣＤＲを含んでいる、請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項３４】
前記第２のＶＬ領域が、ｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、または１７１１８のＣＤ１９結合ポリペプチドコンストラクトのＶＬアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記第２のＶＨ領域が、ｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、または１７１１８のＣＤ１９結合ポリペプチドコンストラクトのＶＨアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有している、
請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項３５】
前記第２のＶＬ領域が、ｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、または１７１１８のＣＤ１９結合ポリペプチドコンストラクトのＶＬアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記第２のＶＨ領域が、ｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５、または１７１１８のＣＤ１９結合ポリペプチドコンストラクトのＶＨアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有している、
請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項３６】
前記抗原結合コンストラクトが、
（ａ）バリアント６７５４、６７５１、１８５３、１０１５１、６４７５、６７４９、１０１５２、１０１５３、６４７６、５８５０、５８５１、５８５２、または６３２５、１６６１、１６５３、１６６２、１６６０、１６６６、１８０１、６７４７、１０１４９、１０１５０、１３８０、１２０４３、１５１９２、１５１９３、１５１９４、１５１９５、及び１７１１９；または
（ｂ）バリアント６７５４、６７５１、１８５３、１０１５１、６４７５、６７４９、１０１５２、１０１５３、６４７６、５８５０、５８５１、５８５２、または６３２５、１６６１、１６５３、１６６２、１６６０、１６６６、１８０１、６７４７、１０１４９、１０１５０、１３８０、１２０４３、１５１９２、１５１９３、１５１９４、１５１９５、または１７１１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するバリアント
から選択される、請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項３７】
Ｂ細胞上で発現しているＣＤ１９抗原に対する前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの親和性が、ＦＡＣＳ分析で決定されるように、約０．５〜１ｎＭ、１〜３ｎＭ、３〜５ｎＭ、５〜７ｎＭ、７〜９ｎＭ、９〜１１ｎＭ、１１〜１３ｎＭ、１３〜１５ｎＭ、１５〜１７ｎＭ、１７〜１９ｎＭ、または１９〜２１ｎＭの範囲であり、
Ｔ細胞上で発現しているＣＤ３に対する前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの親和性が、ＦＡＣＳ分析で決定されるように、約５〜１０ｎｍ、１０〜１５ｎｍ、１５〜２０ｎｍ、２０〜１５ｎｍ、２５〜３０ｎｍ、３０〜３５ｎｍ、３５〜４０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、５０〜５５ｎｍ、５５〜６０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、または９０〜１００ｎｍの範囲である、
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項３８】
前記抗原結合コンストラクトが、バリアント１５１９２、１５１９３、１５１９４、１５１９５、及び１７１１９から選択され、ＳＭＣＣリンカーを用いてＤＭ１にコンジュゲートされている、請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項３９】
前記抗原結合コンストラクトが、バリアント１５１９２、１５１９３、１５１９４、１５１９５、及び１７１１９から選択され、ＳＰＢＤリンカーを用いてＤＭ４にコンジュゲートされている、請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項４０】
前記抗原結合コンストラクトが、バリアント１５１９２、１５１９３、１５１９４、１５１９５、及び１７１１９から選択され、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣリンカーを用いてＭＭＡＥにコンジュゲートされている、請求項３１に記載の方法または組成物。
【請求項４１】
前記標的抗原がＨＥＲ２である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４２】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ＨＥＲ２に特異的であり、かつ表ＫＫに記載のＨＥＲ２抗体に由来する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４３】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ｖ１３７９２のＨＥＲ２に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトの６つのＣＤＲを含んでいる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４４】
前記抗原結合コンストラクトが、ｖ１３７９２と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４５】
前記標的抗原がＨＥＲ３である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４６】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ＨＥＲ３に特異的であり、かつ表ＫＫに記載のＨＥＲ３抗体に由来する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４７】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ｖ１３７９０のＨＥＲ３に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトの６つのＣＤＲを含んでいる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４８】
前記抗原結合コンストラクトが、ｖ１３７９０と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項４９】
前記標的抗原がＥＧＦＲである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５０】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ＥＧＦＲに特異的であり、かつ表ＫＫに記載のＥＧＦＲ抗体に由来する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５１】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ｖ１６３７１のＥＧＦＲに特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトの６つのＣＤＲを含んでいる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５２】
前記抗原結合コンストラクトが、ｖ１６３７１と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５３】
前記標的抗原がＣＤＨ３である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５４】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ＣＤＨ３に特異的であり、かつ表ＫＫに記載の抗体に由来する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５５】
前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ｖ１３８３１のＣＤＨ３に特異的な第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの６つのＣＤＲを含んでいる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５６】
前記抗原結合コンストラクトが、ｖ１３８３１と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項５７】
前記疾患、状態、または障害ががんである、請求項３及び５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記がんが、造血器がん；白血病；リンパ腫；血液がん；Ｂ細胞リンパ腫；非ホジキンリンパ腫；ＣＤ１９溶解性（ｌｙｔｉｃ）抗体、ＣＤ２０溶解性抗体、及びブリナツモマブのうちの少なくとも１つに非応答性のがん；ブリナツモマブでの治療後に退行性のがん細胞；ＡＬＬ；ＣＬＬ；ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；播種性Ｂ細胞疾患；ならびに脳、肺、肝臓、及び／または骨への転移である、請求項３及び５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
ｓｃＦｖ形式である前記ＣＤ３結合ポリペプチドコンストラクトのＴｍが、参照ＣＤ３結合ポリペプチドコンストラクトであるテプリズマブまたはＯＫＴ３よりも２℃、４℃、６℃、８℃、または１０℃高い、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項６０】
前記標的抗原を担持する標的細胞に対する、前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの殺傷能が、コンジュゲートされていない参照抗原結合コンストラクトの殺傷能よりも少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍高い、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項６１】
前記標的抗原を担持する標的細胞に対する、前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの殺傷能が、Ｔ細胞に対する殺傷能よりも、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍もしくはそれ以上高く、及び／または
前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを前記対象に投与しても、前記対象のＴ細胞は実質的に枯渇しない、
請求項２〜６０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項６２】
前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトが、インビトロのアッセイで、参照ブリナツモマブ薬物コンジュゲートほどＰＤ−１発現Ｔ細胞を上方制御しない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項６３】
前記薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの親和性が、
ａ．ＳＰＲで測定すると、前記ＣＤ３抗原に対する親和性が、前記標的抗原に対するよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、もしくは少なくとも１００倍低いこと、及び／または
ｂ．ＦＡＣＳで測定すると、前記標的抗原を担持する標的細胞に対する親和性が１０ｎＭ未満であり、Ｔ細胞に対する親和性が１０ｎＭ〜５００ｎＭの範囲であること、及び／または
ｃ．インビトロのアッセイで測定すると、Ｔ細胞よりも標的細胞への内在化率のほうが高いこと
を示す、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項６４】
前記抗原結合コンストラクトが、インビトロのアッセイで決定されるように、Ｔ細胞再指向性殺傷及び前記薬物の内在化の両方によって前記標的細胞を殺傷できる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項６５】
請求項４〜６４のいずれか１項に記載の薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトと、薬学的担体とを含んでいる、薬学的組成物。
【請求項６６】
前記担体に、バッファー、抗酸化剤、低分子量の分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、キレート剤、安定化剤、または賦形剤が含まれる、請求項６５に記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
請求項４〜６４のいずれか１項に記載の薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを含んでいる、医薬に用いるための薬学的組成物。
【請求項６８】
請求項４〜６４のいずれか１項に記載の薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを含んでいる、がん治療に用いるための薬学的組成物。
【請求項６９】
請求項３〜６４のいずれか１項に記載の抗原結合コンストラクトをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは一式の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記ポリヌクレオチドまたは一式のポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項６９または７０に記載のポリヌクレオチドまたは一式のポリヌクレオチドの１つ以上を含み、任意でプラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、ベクターまたは一式のベクター。
【請求項７２】
請求項６９または７０に記載のポリヌクレオチドまたは一式のポリヌクレオチドを含み、任意でハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞から選択される、単離された細胞。
【請求項７３】
請求項３〜６４のいずれか１項に記載の薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを生産する方法であって、
前記抗原結合コンストラクトを発現させる好適な条件下で、請求項６９または７０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを１つ以上含む宿主細胞を培養することと、
前記コンストラクトを精製することと、
前記コンストラクトを薬物にコンジュゲートさせることと、
前記薬物がコンジュゲートされたコンストラクトを精製することと
を含む、前記方法。
【請求項７４】
請求項４〜６４のいずれか１項に記載の薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトまたは請求項６５〜６８に記載の薬学的組成物と、使用説明書とを含んでいる、キット。
【請求項７５】
ＶＨ領域とＶＬ領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む、ＣＤ３εサブユニットに結合する抗原結合コンストラクトであって、
前記ＶＨ領域が、表Ｓ１のＯＫＴ３のヒト化バリアントのＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含み、
前記ＶＬ領域が、表Ｓ１のＯＫＴ３のヒト化バリアントのＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含んでいる、
前記抗原結合コンストラクト。
【請求項７６】
前記ＶＨ領域が、
（ａ）図４のｈＶＨ１またはｈＶＨ２のアミノ酸配列、及び
（ｂ）図４のｈＶＨ１またはｈＶＨ２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＶＬ領域が、
（ａ）図４のｈＶＬ１またはｈＶＬ２のアミノ酸配列、及び
（ｂ）図４のｈＶＬ１またはｈＶＬ２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、
請求項７５に記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項７７】
標的細胞上に発現している標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトをさらに含み、
前記第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと前記第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとが機能的に連結されている、
請求項７５または７６に記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項７８】
前記標的抗原がＣＤ１９である、請求項７７に記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項７９】
前記第２のＶＨ領域が、
ａ．図２のｈＶＨ２またはｈＶＨ３のアミノ酸配列、及び
ｂ．図２のｈＶＨ２またはｈＶＨ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記第２のＶＬ領域が、
ａ．図２のｈＶＬ２、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）またはｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）のアミノ酸配列、及び
ｂ．図２のｈＶＬ２、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）またはｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、
請求項７８に記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項８０】
薬物にコンジュゲートされている、請求項７５〜７９のいずれか１項に記載の抗原結合コンストラクト。
【請求項８１】
前記ＣＤ３抗原がＣＤ３のＣＤ３εサブユニットである、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の方法または組成物。
【請求項８２】
前記対象が、手術、放射線治療、小分子治療、ホルモン療法、免疫療法、またはそれらの組合せから選択される追加の治療を提供される、請求項２８に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象がヒトである、請求項２または３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
該当なし。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＣＤ３抗原結合ポリペプチドコンストラクト（たとえばＣＤ３結合ドメイン）と、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクト（たとえば腫瘍細胞などの標的細胞上に発現する標的抗原に結合するドメイン）とを含む、薬物がコンジュゲートされた二重特異性抗原結合コンストラクト、たとえば抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
医療用タンパク質の分野では、多価的な標的結合特徴をもつ抗体は、薬物候補設計の優れた足場である。これらの特徴をさらに進化させて設計される二重特異性抗体及び他の融合体としての多特異性治療剤は、二重または多重の標的特異性、及び新たな作用モードを有する薬物を創るチャンスを示すものである。好ましい薬物動態及び機能活性をもつ、そのような多価及び多特異性の治療用タンパク質を開発することが、課題となっている。
【０００４】
Ｔ細胞を腫瘍細胞に向けることができる二重特異性抗体が特定されており、がん治療での有効性が試験されている。ブリナツモマブはＢｉＴＥ（商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）と呼ばれる形式の二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗体の一例であり、再発性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞疾患や慢性リンパ球性白血病の治療剤とされ（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）１２：４９４１−４９４４（非特許文献１））、ＦＤＡからも承認されている。他の腫瘍関連の標的抗原に対するＴ細胞エンゲージャーも製造されており、数種が臨床試験に入っている：肺がん、胃がん、及び結腸直腸がんのＡＭＧ１１０／ＭＴ１１０ＥｐＣＡＭ；消化器腺がんのＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ５６５ＣＥＡ；及び前立腺がんのＡＭＧ２１２／ＢＡＹ２０１０１１２ＰＳＭＡ（Ｓｕｒｕａｄｅｖａｒａ，  Ｃ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１５  Ｊｕｎ；  ４（６）：  ｅ１００８３３９（非特許文献２）を参照されたい）。
【０００５】
ＢｉＴＥ（商標）形式は、２つの異なる抗体由来の可変ドメインを連結している二重特異性の単鎖抗体コンストラクトである。ブリナツモマブは、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）に対する奏効率が８０％以上と非常に有効性が高いものの、患者の多くが治療から間もなくして、または治療中から再発する。さらに、Ｔ細胞エンゲージャーは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）のような悪性病変にはあまり有効でないことがわかっている。より有効で耐久性の高いＴ細胞エンゲージャー治療剤が必要とされている。
【０００６】
Ｔ細胞エンゲージャー抗原結合コンストラクトは、２０１３年７月１３日出願の“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ”というタイトルの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５０４１１（特許文献１）；２０１４年７月１１日出願の“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ３  ａｎｄ  ＣＤ１９  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ”というタイトルの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４６４３６（特許文献２）；２０１５年１月１５日出願の“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ３  ａｎｄ  ＣＤ１９  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ”というタイトルのＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４（特許文献３）で説明されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５０４１１
【特許文献２】ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４６４３６
【特許文献３】ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）１２：４９４１−４９４４
【非特許文献２】Ｓｕｒｕａｄｅｖａｒａ，  Ｃ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１５  Ｊｕｎ；  ４（６）：  ｅ１００８３３９
【発明の概要】
【０００９】
本明細書では、Ｔ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、標的細胞上に発現した疾患関連標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとを含む、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを説明する。第１の抗原結合ポリペプチドと第２の抗原結合ポリペプチドとは機能的に連結されており、抗原結合コンストラクトは薬物（任意で２種の異なる薬物）にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、インビトロで、薬物にコンジュゲートされていない参照抗原結合コンストラクトよりも高い標的細胞の殺傷能を示すが、対象に投与されたとき実質的にＴ細胞を枯渇させない。薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、１種以上の薬物分子を含む。薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、第１のリンカーによってまたは第１のリンカーなしで第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている第１のＦｃポリペプチドと、第２のリンカーによってまたは第２のリンカーなしで第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている第２のＦｃポリペプチドとを含むヘテロダイマーＦｃを含むことができる。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤＨ３である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＨＥＲ２である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤＨ３である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＥＧＦＲである。いくつかの実施形態では、標的抗原は表ＬＬから選択される。
【００１０】
本開示の一態様は、表面に標的抗原を発現している標的細胞を殺傷する方法であり、該方法は、エフェクターＴ細胞の存在下で、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの有効量を該標的細胞に接触させることを含み、該薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、エフェクターＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１の重鎖可変（ＶＨ）領域と第１の軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物とを含んでおり、該第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと該第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとは機能的に連結されており、該標的抗原はＣＤ３ではなく、（ａ）該抗原結合コンストラクトは、ＳＰＲまたはＦＡＣＳ分析により測定すると、該標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、かつ／または（ｂ）該抗原結合コンストラクトは、インビトロのアッセイで測定すると、該標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す。
【００１１】
本開示の別の態様は、対象において表面に標的抗原を発現している標的細胞を殺傷する方法であり、該方法は、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの有効量を該対象に投与することを含み、該薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、該対象のＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１の重鎖可変（ＶＨ）領域と第１の軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物とを含んでおり、該第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと該第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとは機能的に連結されており、該標的抗原はＣＤ３ではなく、（ａ）該抗原結合コンストラクトは、ＳＰＲまたはＦＡＣＳ分析により測定すると、該標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、かつ／または（ｂ）該抗原結合コンストラクトは、インビトロのアッセイで測定すると、該標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す。
【００１２】
本開示の別の態様は、治療を必要とする対象の疾患、障害、または状態を治療する方法であって、該方法は、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの治療有効量を該対象に投与することを含み、該薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、該対象のＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１の重鎖可変（ＶＨ）領域と第１の軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物とを含んでおり、該第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと該第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとは機能的に連結されており、該標的抗原はＣＤ３ではなく、（ａ）該抗原結合コンストラクトは、ＳＰＲまたはＦＡＣＳ分析により測定すると、該標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示し、かつ／または（ｂ）該抗原結合コンストラクトは、インビトロのアッセイで測定すると、該標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す。
【００１３】
本開示の別の態様は、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトからなる組成物であり、該薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、Ｔ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する、第１のＶＨ領域と任意で第１のＶＬ領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、標的細胞上に発現した標的抗原に特異的に結合する、第２のＶＨ領域と任意で第２のＶＬ領域とを含む第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、該抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物とを含み、該第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと該第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとは機能的に連結されており、該標的抗原はＣＤ３ではなく、該標的抗原はＣＤ３ではなく、該抗原結合コンストラクトは、ＳＰＲまたはＦＡＣＳ分析により測定すると、該標的抗原に対してＣＤ３に対するよりも高い親和性を示す。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、インビトロのアッセイで測定すると、標的抗原を担持する標的細胞に対してＴ細胞に対するよりも高い殺傷能を示す。
【００１４】
本開示の別の態様は、ＣＤ３εサブユニットに結合する、ＶＨ領域とＶＬ領域とを含む第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む抗原結合コンストラクトであって、該ＶＨ領域は、表Ｓ１のＯＫＴ３のヒト化バリアントのＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含み、該ＶＬ領域は、表Ｓ１のＯＫＴ３のヒト化バリアントのＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含む。一実施形態では、コンストラクトは、図２のｈＶＨ１またはｈＶＨ２のアミノ酸配列、及び図４のｈＶＨ１またはｈＶＨ２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、図４のｈＶＬ１またはｈＶＬ２のアミノ酸配列、及び図４のｈＶＬ１またはｈＶＬ２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】「星印」で表される薬物にコンジュゲートされている抗原結合コンストラクトの設計の模式図である。抗原結合コンストラクトの一方の結合ドメインはＣＤ３抗原に結合し、他方の結合ドメインは標的細胞の表面に発現した「標的抗原」に結合する。「星印」は１個しか示していないが、コンストラクトは複数の薬物分子を含むこともでき、それらは同じであっても異なっていてもよい。図１Ａ（ｉ）は、例示的抗原結合コンストラクトを表しており、該抗原結合コンストラクトの抗原結合ドメインはどちらもｓｃＦｖであり、各ｓｃＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域はポリペプチドリンカーで接続されている。各ｓｃＦｖはまた、ヘテロダイマーＦｃの１本のポリペプチド鎖にヒンジポリペプチドリンカーで接続されている。抗原結合コンストラクトの２本のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって共有結合的に互いに連結している（太実線で表す）。図１Ａ（ｉｉ）は、図１Ａ（ｉ）と類似の例示的抗原結合コンストラクトを表しているが、ＣＤ３結合ドメインがＦａｂであり、標的抗原結合ドメインがｓｃＦｖである点が異なっている。図１Ａ（ｉｉｉ）も類似の抗原結合コンストラクトを表しているが、ＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖであり、標的抗原結合ドメインがＦａｂである。図１Ａ（ｉｖ）も類似の抗原結合コンストラクトを表しているが、ＣＤ３結合ドメインも標的抗原結合ドメインもＦａｂである。
【図１Ｂ】抗原結合コンストラクト−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の例示的実施形態の図である。図１Ｂ（ｉ）は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＭＣＣ）−ＤＭ１コンジュゲートを示し、リンカー−毒素は抗原結合コンストラクトのリジン残基を介してコンジュゲートされている。図１Ｂ（ｉｉ）は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）−ＤＭ４コンジュゲートを示し、リンカー−毒素は抗原結合コンストラクトのリジン残基を介してコンジュゲートされている。図１Ｂ（ｉｉｉ）は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ）−ＭＭＡＥコンジュゲートを示し、リンカー−毒素は抗原結合コンストラクトのシステイン残基を介してコンジュゲートされている。「Ａｂ」は抗原結合コンストラクトを表し、図１Ａ〜図１Ｄで示す設計のいずれか１つであり得る。「ｎ」は抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされているリンカー−毒素部分の数を表し、１〜２０である。
【図２】マウスＨＤ３７  ＶＬ配列及びＶＨ配列に基づくヒト化ＣＤ１９  ＶＬ配列及びＶＨ配列を表す図である。ｈＶＬ２、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）、及びｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）の３種のヒト化ＶＬ配列が提供されている。ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）は、ＣＤＲ  Ｌ１においてＤからＥへの置換を含み、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）は、ＣＤＲ  Ｌ１においてＤからＳへの置換を含む。２種のヒト化ＶＨ配列、ｈＶＨ２とｈＶＨ３が提供されている。ＣＤＲ配列をボックスで特定している。この図で特定しているＣＤＲは単なる例示である。当該技術分野では知られているように、各ＣＤＲの特定は、用いられる特定の方法によって異なり得る。表Ｓ１に、抗ＣＤ１９  ＶＬ配列及びＶＨ配列の代替のＣＤＲの定義を示す。これらの配列をヒト化するための野生型マウスＨＤ３７抗体配列についての修飾に下線を付している。
【図３】抗ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体に基づく抗ＣＤ１９  ＶＨ配列及びＶＬ配列の、Ｋａｂａｔによる番号を示す表である。
【図４】マウスＯＫＴ３及びテプリズマブ（既知のヒト化ＯＫＴ３）の各配列に基づくヒト化ＣＤ３  ＶＬ配列及びＶＨ配列の図である。２種のＶＨ配列、ｈＶＨ１とｈＶＨ２が提供されている。２種のＶＬ配列、ｈＶＬ１とｈＶＬ２が提供されている。ＣＤＲ配列をボックスで特定している。この図で特定しているＣＤＲは単なる例示である。当該技術分野では知られているように、各ＣＤＲの特定は、用いられる特定の方法によって異なり得る。表Ｓ１に、抗ＣＤ３  ＶＬ配列及びＶＨ配列の代替のＣＤＲの定義を示す。これらの配列をヒト化するための野生型テプリズマブ抗体配列についての修飾に下線を付している。
【図５】抗ＣＤ３  ＯＫＴ３抗体に基づく抗ＣＤ３  ＶＨ配列及びＶＬ配列の、Ｋａｂａｔによる番号を示す表である。
【図６】親マウス抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ６７５１（左側）とヒト化抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１５１９２（右側）のＳＥＣプロファイルであり、ｖ１５１９２の純度が非常に高いことを示す図である。
【図７】例示的ヒト化抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトを親マウス抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトと比較したＤＳＣサーモグラムであり、ヒト化バリアントのＴｍの増加を示す図である。Ａ及びＢとして示したバリアントは、同じバリアントの別々の生産バッチを表す。
【図８】ヒト化抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１５１９５の（パネルＡ）ＲａｊｉＣＤ１９＋Ｂ細胞への、（パネルＢ）ＪｕｒｋａｔＣＤ３＋Ｔ細胞への結合を示す図である。パネル（Ｃ）は、ｖ１５１９５をヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と一緒にインキュベートしたときに検出されたＴ：Ｂ細胞ペアの割合を示す図である。Ｔ：Ｂ細胞ペアは、ＣＤ２０＋及びＣＤ４＋またはＣＤ８＋の両方として検出した。
【図９】ＳＭＣＣリンカーを用いて毒素ＤＭ１にコンジュゲートした後の抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１２０４３の例示的ＵＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルを示す図である。
【図１０】ＤＭ１またはＤＭ４にコンジュゲートされた選択された例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアントが（Ａ）ＣＤ１９を発現するＲａｍｏｓＢ細胞、（Ｂ）ＣＤ３を発現するがＣＤ１９を発現しないＪｕｒｋａｔＴ細胞、及び（Ｃ）ＣＤ１９を発現するがＣＤ３を発現しないＲａｊｉＢ細胞の増殖を阻害する能力を様々な濃度で試験したアッセイの結果を示す図である。
【図１１】非コンジュゲートバリアントである抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアント  １２０４３、ｖ１２０４３−ＤＭ１、及びｖ１２０４３−ＤＭ４が、様々な濃度で、Ｂ細胞を枯渇させた同種末梢血単核球と一緒に７２時間インキュベートしたＲａｊｉ細胞の培養物中、（Ａ）Ｒａｊｉ細胞、（ＣＤ１９＋）、（Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＣＤ８＋／ＣＤ６９＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図１２】図１１のように実施した第２の実験の結果を示す図である。
【図１３】ＤＭ１がコンジュゲートされた抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアント６７５４及び６７５１、ならびにＤＭ１がコンジュゲートされた対照バリアント（ｖ８９１、ブリナツモマブ、及びｖ４３７２二価単一特異性抗ＣＤ１９抗体）が、様々な濃度で、Ｂ細胞を枯渇させた同種末梢血単核球と一緒に７２時間インキュベートしたＲａｍｏｓ細胞の培養物中、（Ａ）Ｒａｍｏｓ（ＣＤ１９＋）標的Ｂ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＰＤ−１＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図１４】図１３のように実施した第２の実験の結果を示す図である。
【図１５】ＤＭ１にコンジュゲートされた例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ６７５１が、様々な濃度で、ＡＬＬ細胞株のＲａｊｉ、及びＮＨＬ細胞株のＲａｍｏｓ、Ｔ細胞株のＪｕｒｋａｔ、及びＣＤ１９もＣＤ３も発現しない細胞株のＫ５６２に及ぼす細胞傷害効果を示す図である。対照抗体は、ＤＭ１にコンジュゲートされた単一特異的（ｍｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）二価抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢ１２、及びＤＭ１にコンジュゲートされたアイソタイプ非特異的ＩｇＧであった。
【図１６】例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１５１９５、ＤＭ１にコンジュゲートされたｖ１５１９５、及びブリナツモマブが、７２時間の培養後にＲａｊｉ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図１７】ＤＭ１にコンジュゲートされたｖ１５１９５の様々な濃度での様々なＡＬＬ及びＮＨＬ細胞株：ＲＳ４−１１、Ｎａｌｍ−６、Ｄａｕｄｉ、ＳＵＤＨＬ−４、及びＳＵＤＨＬ−６に対する影響を示す図である。
【図１８Ａ】ｖ１５１９５、ＤＭ１にコンジュゲートされたｖ１５１９５、及びブリナツモマブが、ヒトＰＢＭＣと同時培養したＲａｊｉ細胞の培養物中、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＣＤ６９＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図１８Ｂ】ｖ６７５１、ブリナツモマブ、及びＯＫＴ３抗体と一緒にヒトＰＢＭＣ−Ｂ細胞と同時培養したＲａｊｉ細胞の培養物中で観察された増殖を示す図である。
【図１９】例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ６７５１、ＤＭ１にコンジュゲートされたｖ６７５１、及び対照二価単一特異性抗体  抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢＵ１２、及びＤＭ１にコンジュゲートされたｈｕＢＵ１２が、ＰＢＭＣ−Ｂ細胞の培養物中の様々なＴ細胞サブ集団：ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋、及びＣＤ８＋／ＣＤ２５＋に及ぼす影響を示す図である。
【図２０Ａ】ｖ１５１９５及びＤＭ１にコンジュゲートされたｖ１５１９５が、Ｒａｊｉ細胞とＰＢＭＣ−Ｂ細胞の同時培養物中、ＣＤ８＋及びＣＤ８＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図２０Ｂ】７２時間の時点の培養物中のサイトカインＩＦＮｇ、ＩＬ６、及びＩＬ１０のレベルを示す図である。
【図２１】例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１５１９３及びＭＭＡＥにコンジュゲートされたｖ１５１９３が、様々な濃度で、ＰＢＭＣとの同時培養物中、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び標的ＲａｍｏｓＢ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図２２】例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１２０４３（薬物とのコンジュゲーションなし）、ｖ１２０４３−ＤＭ１、及びｖ１２０４３−ＤＭ４の、０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の様々な用量でのヒト化マウスへの単回静脈内投与が、ヒト化ＮＳＧマウスにおける投与から５日後のＢ細胞数及びＴ細胞数に及ぼす影響を示す図である。
【図２３】ＤＭ１にコンジュゲートされた例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトｖ１５１９５の、０．３〜９．０ｍｇ／ｋｇの範囲の様々な用量でのヒト化マウスへの単回静脈内投与が、投与の８日後に脾臓及び末梢血のＣＤ３＋Ｔ細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図２４】ｐＨＡｂ標識した例示的抗原結合コンストラクト抗ＣＤ３−ＣＤ１９  ｖ１５１９５、抗ＣＤ３−ＥＧＦＲ  ｖ１６３７１、及び抗ＣＤ３−ＣＤＨ３  ｖ１３８３１、及び対照抗体（ｖ２１７１  ＵＣＨＴ１抗ＣＤ３単一特異性二価抗体；及び抗ＲＳＶ抗体、シナジス）の細胞への内在化を示す図である。試験した細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ、Ａ４３１、ＳＫＯＶ３、ＨＣＴ−１１６、及びＪＩＭＴ１であった。
【図２５】Ｔ細胞の非存在下での、例示的抗原結合コンストラクト抗ＣＤ３−ＣＤＨ３  ｖ１３８３１、抗ＣＤ３−ＨＥＲ２  ｖ１３７９２、抗ＣＤ３−ＨＥＲ３  ｖ１３７９０（すべてＤＭ１にコンジュゲートされている）の、標的細胞株に対する直接の細胞傷害性／増殖阻害を、非特異的ＩｇＧ対照ｖ６２４９と比較した図である。試験した細胞株はＭＣＦ７、ＳＫＯＶ３、ＪＩＭＴ１、及びＪｕｒｋａｔであった。
【図２６】例示的抗原結合コンストラクト抗ＣＤ３−ＣＤＨ３  ｖ１３８３１、及び抗ＣＤ３−ＨＥＲ２  ｖ１３７９２、ならびにそれらのＤＭ１とのコンジュゲートが、様々な濃度で、ＰＢＭＣと同時培養されたＪＩＭＴ１腫瘍標的細胞に及ぼす影響を示す図である。
【図２７】ＤＭ１がコンジュゲートされたまたはされていない抗ＣＤ３−ＣＤＨ３  ｖ１３８３１または抗ＣＤ３−ＨＥＲ２  ｖ１３７９２を様々な濃度で加えたＪＩＭＴ１腫瘍標的細胞とＰＢＭＣとの同時培養物中の、異なるＴ細胞サブ集団のＴ細胞の増殖及び活性化を示す図である。コンストラクトごとにＣＤ４、ＣＤ４＋ＣＤ６９、ＣＤ４＋ＣＤ２５、ＣＤ８、ＣＤ８＋ＣＤ６９、ＣＤ８＋ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のレベルを評価した。
【図２８】ＪＩＭＴ１腫瘍標的細胞とＰＢＭＣの同時培養物中、ＤＭ１がコンジュゲートされたまたはされていない抗ＣＤ３−ＣＤＨ３の異なるエフェクター対標的細胞比での効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書では、抗体−薬物コンジュゲートまたはＡＤＣと称されることも多い、薬物がコンジュゲートされた二重特異性抗原結合コンストラクト、たとえば抗体を説明する。本明細書では、Ｔ細胞上に発現したＣＤ３抗原に結合し、かつ標的細胞（たとえば腫瘍細胞、自己免疫を担う細胞、または病原体に感染した細胞）の表面に発現した第２の標的抗原に結合する、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを提供する。これらの薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、Ｔ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、標的細胞の表面に発現した別の標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、該抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされた少なくとも１種の薬物分子とを含む。本明細書でさらに説明するが、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインは、互いに機能的に連結されていてもよいし、またはＦｃドメインなどの足場にそれぞれ連結されていてもよい。
【００１７】
本明細書でＡＤＣを生産するために用いられる特定の例示的な二重特異性抗原結合コンストラクトは、免疫シナプス形成によりＣＤ３発現Ｔ細胞とＣＤ１９発現Ｂ細胞を架橋できることが、他の場所で示されている。これらの抗原結合コンストラクトは、インビトロ及びエクスビボのアッセイ、ならびに疾患のインビボモデルで測定すると、Ｔ細胞の誘導によるＢ細胞の枯渇を媒介できた。
【００１８】
本明細書で説明するいくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗ＣＤ３標的抗原の抗原結合コンストラクトは、インビトロの標的腫瘍細胞の枯渇において、薬物を含まない同じ抗原結合コンストラクトよりも高い殺傷能を示す。意外にも、本明細書では、いくつかの例示的な、薬物がコンジュゲートされたＣＤ３標的抗原の抗原結合コンストラクトが、標的抗原を発現している腫瘍細胞に対しインビトロで高い殺傷能を示すが、それと同時にＴ細胞に対しては低い効力を示す。さらに、いくつかの実施形態では、これらのＡＤＣは、最高３ｍｇ／ｋｇの用量でヒト化マウスに投与したとき、インビボで循環Ｔ細胞を有意に減少させないことが示される。Ｔ細胞への影響がないという点で、また理論に縛られるわけでもなく、薬物がコンジュゲートされたＣＤ３標的抗原の抗原結合コンストラクトは、Ｔ細胞が媒介する殺傷と、薬物がコンジュゲートされたＣＤ３標的抗原の抗原結合コンストラクトの内在化の結果としての毒素／小分子が媒介する殺傷という、２つの異なる機構により、標的細胞に影響を及ぼすことができると考えられる。したがって、本明細書で説明する、薬物がコンジュゲートされた抗ＣＤ３標的抗原の抗原結合コンストラクトは、がんなどの疾患の治療において、一般的なＴ細胞エンゲージャー剤（発明者らの知る限り、毒素その他の薬物を組み込んだものはない）よりも利点があり得る。さらに、ＣＤ３及び標的抗原との抗原結合ドメインを含む、薬物がコンジュゲートされた二重特異性抗原結合コンストラクトは、Ｔ細胞及び薬物がそれぞれ媒介する殺傷の機構を組み合わせたことで、がんだけでなく、たとえば自己免疫疾患や炎症性疾患、及び細胞内病原体による疾患を治療できる可能性がある。
【００１９】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを含む薬学的組成物、及び本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを用いて疾患、障害、または状態、たとえばがんを治療する方法も説明する。
【００２０】
本明細書では、Ｔ細胞上に発現したＣＤ３抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、腫瘍細胞の表面に発現した腫瘍抗原などの標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとを含む、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを説明する。第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとは機能的に連結されており、抗原結合コンストラクトは薬物にコンジュゲートされている。薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、インビトロで、標的抗原を担持する標的細胞に対し、薬物にコンジュゲートされていない参照抗原結合コンストラクトよりも高い殺傷能を示す。
【００２１】
抗原結合ポリペプチドコンストラクトは異なる形式を有し得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドと第２の抗原結合ポリペプチドはそれぞれＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトはＦａｂであり、第２の抗原結合ポリペプチドはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトはｓｃＦｖであり、第２の抗原結合ポリペプチドはｓｃＦｖである。他の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、どちらもＦａｂを含んでおり、またはどちらもｓｃＦｖｓを含んでいる。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ポリペプチドコンストラクトはｓｃＦｖであり、標的抗原結合コンストラクトはＦａｂである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトはさらに、第１のリンカーによってまたは第１のリンカーなしで第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている第１のＦｃポリペプチドと、第２のリンカーによってまたは第２のリンカーなしで第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている第２のＦｃポリペプチドとを含むヘテロダイマーＦｃを含む。以下に詳述するが、いくつかの実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、該ヘテロダイマーＦｃの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含む修飾されたＣＨ３ドメインを含み、ダイマー化したＣＨ３ドメインは約６８℃以上の融点（Ｔｍ）を有している。いくつかの実施形態では、非対称アミノ酸修飾は下記の表Ｃから選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＯＫＴ３；テプリズマブ（商標）（ＭＧＡ０３１、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）；ブリナツモマブ；ＵＣＨＴ１；ＮＩ０４０１；ビジリズマブ；Ｘ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＰ３４、ＳＭＣ２、及びＦ１０１．０１；またはそれらのヒト化バージョンから選択される抗体に由来するＣＤ３に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。他のＣＤ３結合部分も可能であり、本明細書で説明する方法で作ることができる。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、表Ｓ１の野生型ＯＫＴ３の６つのＣＤＲ、またはＯＫＴ３の安定化バリアントまたはＯＫＴ３のヒト化バリアントの６つのＣＤＲを有する。
【００２４】
本明細書で説明するいくつかの実施形態では、標的抗原（第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの同族抗原）はＢ細胞抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９である。したがって、腫瘍抗原がＣＤ１９であるいくつかの実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、表Ｓ１に示すＨＤ３７またはＨＤ３７のヒト化バリアントの６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、４Ｇ７；Ｂ４；Ｂ４３；ＢＵ１２；ＣＬＢ−ＣＤ１９；Ｌｅｕ−１２；ＳＪ２５−Ｃ１；Ｊ４．１１９、Ｂ４３、ＳＪ２５Ｃ１、ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）ＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）、Ｍｏｒ−２０８、ＭＥＤＩ−５５１、及びＭＤＸ−１３４２からなる群より選択される抗体に由来するＣＤ１９に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。
【００２５】
他の実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、薬物にコンジュゲートされたバリアント６７５４、６７５１、１８５３、１０１５１、６４７５、６７４９、１０１５２、１０１５３、６４７６、５８５０、５８５１、５８５２、６３２５、１６６１、１６５３、１６６２、１６６０、１６６６、１８０１、６７４７、１０１４９、１０１５０、１３８０、または１２０４３、１５１９１２、１５１９３、１５１９４、１５１９５、１７１１８、または１７１１９のいずれかであり得る。
【００２６】
Ｆｃを有する、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの多くの実施形態では、Ｆｃγ受容体結合を低下させるかまたは除くための修飾がＣＨ２ドメインに存在するので、免疫細胞媒介性エフェクター活性は付随しない。
【００２７】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトのいくつかの実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトのＣＤ３に対する親和性は、ＳＰＲまたはＦＡＣＳ分析により決定されるように、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの標的抗原に対する親和性よりも少なくとも２、５、１０、１５、または２０倍低い。
【００２８】
対象の疾患、障害、または状態を治療する方法もまた提供され、該方法は、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、がんは、造血器がん、白血病、リンパ腫、血液がん、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ＣＤ１９溶解性（ｌｙｔｉｃ）抗体、ＣＤ２０溶解性抗体、及びブリナツモマブのうちの少なくとも１つに非応答性のがん、ブリナツモマブでの治療後に退行性のがん細胞、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、播種性Ｂ細胞疾患、ならびに脳、肺、肝臓、及び／または骨への転移である。いくつかの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。
【００２９】
対象において標的細胞を枯渇させる方法もまた提供され、該方法は、薬物がコンジュゲートされた抗原結合ポリペプチドコンストラクトの有効量を対象に投与することを含み、該コンストラクトは、対象のＴ細胞上に発現したＣＤ３抗原に一価的かつ特異的に結合する第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、標的細胞上に発現した抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとを含み、該第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと該第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトとは機能的に連結されており、該抗原結合コンストラクトは薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍細胞は枯渇するが、Ｔ細胞は実質的に枯渇しない。いくつかの実施形態では、投与によって対象におけるＰＤ−１＋（阻害性）Ｔ細胞の上方制御はもたらされない。
【００３０】
薬物のコンジュゲーションのための二重特異性抗原結合コンストラクト
本明細書では、ＣＤ３及び標的細胞上に発現した第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合コンストラクト、たとえば抗体の、薬物とのコンジュゲートを提供する。抗原結合コンストラクト自体は、２つの抗原結合ポリペプチドコンストラクト、たとえばＣＤ３または標的抗原のどちらかにそれぞれ特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでいる。いくつかの実施形態では、標的抗原は腫瘍と関連のある、たとえばＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤＨ３、またはＥＧＦＲである。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、既知の抗体または抗原結合コンストラクトに由来する。以下に詳述するが、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＦａｂまたはｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）形式を有することができ、Ｆｃを含む場合がある。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクト（抗ＣＤ３）は、第２のＶＬと、第２のｓｃＦｖリンカーと、第２のＶＨとを含む第２のｓｃＦｖを含む場合があり、または第２のＶＬと第２のＶＨとを含むＦａｂを含む場合もある。第２のｓｃＦｖは、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、修飾されたＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾されたＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択することができ、ＯＫＴ３遮断抗体は、ＯＫＴ３のＣＤ３抗原のεサブユニットへの結合を５０％以上遮断する。第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＯＫＴ３；テプリズマブ（商標）（ＭＧＡ０３１、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、ブリナツモマブ；ＵＣＨＴ１；ＮＩ０４０１；ビジリズマブ；Ｘ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、またはＳＰ３４から選択される抗体に由来するＣＤ３に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む場合がある。
【００３２】
いくつかの実施形態では、たとえば、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクト（抗ＣＤ１９）は、第１のＶＬと、第１のｓｃＦｖリンカーと、第１のＶＨとを含むｓｃＦｖを含む場合があり、または第１のＶＬと第１のＶＨとを含むＦａｂを含む場合もある。第１のｓｃＦｖは、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、修飾されたＨＤ３７  ｓｃＦｖ、ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾されたＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択することができ、ＨＤ３７遮断抗体は、ＨＤ３７のＣＤ１９抗原への結合を５０％以上遮断する。あるいは、抗原結合ポリペプチドコンストラクト（抗ＣＤ１９）は、対応するＦａｂを含む場合がある。第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、４Ｇ７；Ｂ４；Ｂ４３；ＢＵ１２；ＣＬＢ−ＣＤ１９；Ｌｅｕ−１２；ＳＪ２５−Ｃ１；Ｊ４．１１９、Ｂ４３、ＳＪ２５Ｃ１、ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）ＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）、Ｍｏｒ−２０８、ＭＥＤＩ−５５１、またはＭＤＸ−１３４２からなる群より選択される抗体に由来するＣＤ１９に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む場合がある。
【００３３】
ヘテロダイマーＦｃは、ダイマー化ＣＨ３ドメインを形成することができる修飾されたＣＨ３配列をそれぞれが含む第１のＦｃポリペプチドと第２のＦｃポリペプチドとを含み、各修飾されたＣＨ３配列は、ヘテロダイマーＦｃの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含んでおり、ダイマー化したＣＨ３ドメインは約６８℃以上の融点（Ｔｍ）を有している。第１のＦｃポリペプチドは第１のヒンジリンカーにより第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されており、第２のＦｃポリペプチドは第２のヒンジリンカーにより第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている。いくつかの実施形態では、以下に説明するように、ＦｃのＣＨ２ドメインは、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトのＦｃ受容体への結合を低下させるかまたは排するように修飾されている。
【００３４】
「抗原結合コンストラクト」という用語は、たとえば抗原に結合することができるポリペプチドまたはポリペプチド複合体などのあらゆる作用物質を指す。いくつかの態様では、抗原結合コンストラクトは、目的の抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合コンストラクトは、モノマー、ダイマー、マルチマー、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体；抗体、抗体断片、またはその抗原結合断片；ｓｃＦｖなどであり得る。抗原結合コンストラクトは、単一特異性、二重特異性、または多特異性のポリペプチドコンストラクトであり得る。いくつかの態様では、抗原結合コンストラクトは、たとえば、１つ以上のＦｃに連結された１つ以上の抗原結合成分（たとえばＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含むことができる。ＡＤＣ用途に好適な抗原結合コンストラクトのさらなる例を以下に説明し、実施例でも提供する。
【００３５】
「二重特異性」という用語は、たとえば抗原結合コンストラクトなどの、それぞれが独自の結合特異性をもつ２つの抗原結合部分（たとえば抗原結合ポリペプチドコンストラクト）を有するあらゆる作用物質を含むものとする。たとえば、第１の抗原結合部分は第１の抗原のエピトープに結合し、第２の抗原結合部分は第２の抗原のエピトープに結合し、該第１の抗原は該第２の抗原と異なる。
【００３６】
たとえば、いくつかの実施形態では、二重特異性の作用物質は、（ａ）細胞表面の標的分子、及び（ｂ）エフェクター細胞表面のＦｃ受容体に結合するかまたはそれらと相互作用することができる。別の実施形態では、作用物質は、（ａ）第１の細胞表面標的分子、及び（ｂ）該第１の細胞表面標的分子とは異なる第２の細胞表面標的分子に結合するかまたはそれらと相互作用することができる。別の実施形態では、作用物質は、２つの細胞に結合し架橋する、すなわち（ａ）第１の細胞上の第１の細胞表面標的分子、及び（ｂ）該第１の細胞表面標的分子とは異なる第２の細胞上の第２の細胞表面標的分子と、相互作用することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合コンストラクトは、免疫シナプスの形成により、かつ／またはＴ細胞誘導によるＢ細胞枯渇の媒介により、ＣＤ３発現Ｔ細胞とＣＤ１９発現Ｂ細胞を架橋する。
【００３８】
単一特異性抗原結合コンストラクトとは、単一の結合特異性をもつ抗原結合コンストラクトを指す。換言すると、両方の抗原結合部分が同一抗原上の同一エピトープに結合する。単一特異性抗原結合コンストラクトの例としては、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３が挙げられる。
【００３９】
抗原結合コンストラクトは、抗体またはその抗原結合部分であり得る。本明細書では、「抗体」または「免疫グロブリン」は、分析物（たとえば抗原）に特異的に結合し認識する、免疫グロブリン遺伝子（単数または複数）により実質的にコードされているポリペプチドまたはその断片を指す。確認されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κかλのいずれかに分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられることもある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４０】
例示的免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、２対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有している。各鎖のＮ末端ドメインは、抗原認識の主たる担い手としての約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を画定している。可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖ドメインと重鎖ドメインをそれぞれ指している。
【００４１】
ＩｇＧ１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向へ順にＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインで構成されている。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向へ順にＶＬドメイン、ＣＬドメインで構成されている。ＩｇＧ１重鎖はＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間にヒンジを含む。
【００４２】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書では、配列が超可変的な、及び／または構造が明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、天然の４本鎖をもつ抗体には、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲが含まれる。ＨＶＲは一般に、超可変ループの及び／または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲは配列可変性が最も高く、及び／または抗原認識に携わる。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれ、これらの用語は本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して交換可能に用いられる。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７  （１９８７）で説明されており、定義を互いに比較すると、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。しかし、どちらかの定義を用いて抗体のＣＤＲまたはそれらのバリアントに言及する場合は、本明細書において同用語を定め使用する範囲内での適用とする。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列とサイズにより変わってくる。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成しているか、ルーチン的に判定することができる。
【００４３】
抗体のＣＤＲ領域は、結合タンパク質、たとえば限定ではないが、抗体、ｓｃＦｖ、ジアボディなどの作製に用いることができる。ある実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、抗体からのＣＤＲ領域を少なくとも１つまたは全部含んでいる。ＣＤＲ配列は、抗体骨格またはその断片に使用することができ、同様に、ヒト化抗体またはヒト化配列を含む抗体を含むこともできる。抗体のＣＤＲ部分を特定する方法は、当該技術分野では周知である。Ｓｈｉｒａｉ，  Ｈ．，  Ｋｉｄｅｒａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｈ．，  Ｈ３−ｒｕｌｅｓ：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＲ−Ｈ３  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４５５（１）：１８８−１９７，  １９９９；及びＡｌｍａｇｒｏ  Ｊ  Ｃ，  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  Ｊ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−３３  （２００８）を参照されたい。
【００４４】
抗原結合ポリペプチドコンストラクト−形式
二重特異性抗原結合コンストラクトは、２つの抗原結合ポリペプチドコンストラクト、たとえば抗原結合ドメインを含む。抗原結合ポリペプチドコンストラクトの形式が、二重特異性抗原結合コンストラクトの機能的特徴を決定する。一実施形態では、二重特異性抗原結合コンストラクトは、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式を有し、すなわち両方の抗原結合ポリペプチドコンストラクトがｓｃＦｖである。別の実施形態では、抗原結合コンストラクトは、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ形式である。別の実施形態では、両方の抗原結合ポリペプチドコンストラクトがＦａｂである。
【００４５】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という形式は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、これらのドメインは１本のポリペプチド鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含んでいる。ｓｃＦｖの概説は、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
【００４６】
他の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの形式としては、Ｆａｂ断片やｓｄＡｂが挙げられる。
【００４７】
「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片とも呼ばれる）は、軽鎖の可変ドメインＶＬと重鎖の可変ドメインＶＨとともに軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。可変ドメインは、抗原結合に携わる相補性を決定するループ（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むいくつかの残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に付加されている点がＦａｂ断片と異なる。
【００４８】
「単一ドメイン抗体」つまり「ｓｄＡｂ」形式は、一個の免疫グロブリンドメインである。ｓｄａｂは、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして、非常に安定して容易に発現させることができる（Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＭ，  Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ  （２００７）．  "Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ"．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７７（１）：  １３−２２）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗原結合コンストラクトは、軽鎖のない抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含んでおり、したがって単一ドメイン抗体を含んでいる。
【００４９】
ｓｃＦｖ形式
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは二重特異性であり、たとえば別々の抗原にそれぞれ特異的に結合できる２つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含んでいる。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトの片方または両方が、ｓｃＦｖ形式である（すなわち、抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーで接続された重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとで構成されている）。一実施形態では、該ｓｃＦｖはヒトである。別の実施形態では該ｓｃＦｖ分子はヒト化されている。ｓｃＦｖは、以下に説明するような修飾によって、タンパク質の発現と収量が最適化されている。
【００５０】
ｓｃＦｖは、その可変ドメインＶＬとＶＨの順を変えることにより最適化され得る。本明細書で説明する抗原結合コンストラクトのｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、軽鎖可変領域のＣ末端が重鎖可変領域のＮ末端に接続されることもあれば、重鎖可変領域のＣ末端が軽鎖可変領域のＮ末端に接続されることもある。
【００５１】
可変領域同士は、機能的抗原結合部分の形成を可能にするリンカーペプチドまたはｓｃＦｖリンカーを介して接続することができる。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖリンカーポリペプチドの組成及び／または長さを変えることによって、タンパク質の発現と収量が最適化される場合がある。典型的なペプチドリンカーは、約２〜２０個のアミノ酸を含み、本明細書で説明されるかまたは当該技術分野で知られている。好適な非免疫原性リンカーペプチドとしては、たとえば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ、またはＧ２（ＳＧ２）ｎリンカーペプチドが挙げられ、式中ｎは一般には１から１０、典型的には２から４の数字である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは以下の表から選択される。
【００５３】
（表Ａ）ｓｃＦｖリンカーポリペプチドの配列
2018524373.tif 000003
【００５４】
ｓｃＦｖ分子は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間に、安定化させるジスルフィド架橋を含むことによって、たとえばＲｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４，  １２３９−１２４５  （１９９６））で説明されているようにして、タンパク質の発現と収量が最適化される場合がある。したがって、一実施形態では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｓｃＦｖ分子を含み、重鎖可変ドメインの１個のアミノ酸及び軽鎖可変ドメインの１個のアミノ酸がシステインで置換されているので、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成できる。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインの４４番目のアミノ酸、及び重鎖可変ドメインの１００番目のアミノ酸が、システインで置換されている（Ｋａｂａｔナンバリング）。
【００５５】
当該技術分野では知られているが、［Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．  ２０１０  Ｊｕｌ；２３（７）：５４９−５７；  Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ．  ２０１１  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：２４３−５；  Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ  ＆  Ｔｅｓｓｉｅｒ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２０１２；３：２６３−８６］でも説明されているように、ｓｃＦｖはＣＤＲ配列の変異によっても安定化させることができる。ｓｃＦｖの形式及び配列に対する上述した修飾の１つ以上を、抗原結合コンストラクトのｓｃＦｖに用いることができる。
【００５６】
ヒト化ＣＤ１９のＶＨ及びＶＬ
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトをさらに安定化させるために、ＨＤ３７抗ＣＤ１９抗体の野生型配列を修飾してヒト化ＶＨ及びＶＬポリペプチド配列を作製することができる。抗原結合コンストラクトのＣＤ１９結合ｓｃＦｖ及びＦａｂに使用できるＶＨ及びＶＬポリペプチド配列を得るために、フレームワーク領域とＣＤＲの両方を修飾する場合がある。いくつかの実施形態では、修飾は図２に示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインのＴｍは、ＨＤ３７結合ドメインのＴｍよりも高い。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインのＴｍは、ＨＤ３７結合ドメインのＴｍよりも、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも１０℃高い。
【００５７】
ヒト化ＣＤ３のＶＨ及びＶＬ
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトをさらに安定化させるために、ＯＫＴ３抗ＣＤＳ３抗体の野生型配列を修飾してヒト化ＶＨ及びＶＬポリペプチド配列を作製する。抗原結合コンストラクトのＣＤ３結合ｓｃＦｖ及びＦａｂに使用できるＶＨ及びＶＬポリペプチド配列を得るために、フレームワーク領域とＣＤＲの両方を修飾する場合がある。いくつかの実施形態では、修飾は図４に示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ結合ドメインのＴｍは、ＯＫＴ３またはテプリズマブ結合ドメインのＴｍよりも高い。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ結合ドメインのＴｍは、ＯＫＴ３またはテプリズマブ結合ドメインのＴｍよりも、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも１０℃高い。
【００５８】
抗原結合ポリペプチドコンストラクト−抗原
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、ＣＤ３抗原及び第２の標的抗原に特異的に結合する。
【００５９】
本明細書では、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分と抗原との複合体を形成する、ポリペプチドマクロ分子上の部位（たとえば連続的アミノ酸の伸長、または非連続的アミノ酸の異なる領域でできている立体構造）を指す。エピトープは、典型的には、ユニークな空間構成の少なくとも３個のアミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープは、直接的に結合に関与するアミノ酸残基と、直接的に結合に関与しない、たとえば特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基などの他のアミノ酸残基を含むことができる。換言すると、このアミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が標的抗原への別の抗体の結合を遮断する能力を明らかにする簡単な免疫アッセイで検証することができる。
【００６０】
「特異的に結合する」、「特異的結合」、または「選択的結合」とは、その結合が抗原選択的であり、不要または非特異的な相互作用と区別できることを意味する。抗原結合コンストラクトが特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で、または当業者にはよく知られている他の方法で、たとえば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７，  ３２３−３２９  （２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，  ２１７−２２９  （２００２））で測定することができる。一実施形態では、抗原結合部分が無関係のタンパク質に結合する程度は、たとえばＳＰＲで測定すると、抗原結合コンストラクトの抗原への結合の約１０％未満である。
【００６１】
特定の実施形態では、抗原に結合する抗原結合コンストラクト、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、＜１μΜ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、または＜０．００１ｎＭ（たとえば１０〜８Ｍ未満、たとえば１０〜８Ｍから１０"１３Ｍ、たとえば１０"９Ｍから１０"１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００６２】
「親和性」とは、分子の１つの結合部位（たとえば受容体）とその結合パートナー（たとえばリガンド）の間の非共有結合的相互作用の強さの総和を指す。特に断らない限り、本明細書では、「結合親和性」は、結合対のメンバー（たとえば抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド）の１対１の相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は一般に、解離と結合の速度定数（それぞれｋＯｆｆとｋｏｎ）の比である解離定数（ＫＤ）で表すことができる。したがって、速度定数比が同じである限り、等しい親和性に異なる速度定数を含むこともあり得る。親和性は、本明細書で説明する方法も含め、当該技術分野で確立されている各方法で測定することができる。親和性を測定する具体的な方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、または目的の抗原を発現する細胞を用いてのホールセル結合アッセイがある。
【００６３】
「結合の低下」、たとえばＦｃ受容体への結合の低下とは、たとえばＳＰＲで測定すると、それぞれの相互作用で親和性が減少していることを指す。明確には、この用語には、親和性がゼロ（または分析法の検出限界未満）まで低下すること、すなわち相互作用が完全になくなることも含まれる。反対に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用の親和性の増加を指す。
【００６４】
「活性化Ｔ細胞抗原」とは、本明細書では、Ｔリンパ球、具体的には細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現した抗原決定基であって、抗原結合分子と相互作用するとＴ細胞活性化を誘発できるものを指す。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用により、Ｔ細胞受容体複合体のシグナルカスケードをトリガーすることによって、Ｔ細胞活性化を誘発することができる。特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００６５】
「Ｔ細胞活性化」とは、本明細書では、Ｔリンパ球の、具体的には細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１つ以上の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘発できる。Ｔ細胞活性化を測定する好適なアッセイは、本明細書で説明する当該技術分野では知られている。
【００６６】
「標的細胞抗原」または「標的抗原」とは、本明細書では、標的細胞、たとえば腫瘍のＢ細胞、たとえばがん細胞または腫瘍間質の細胞などの表面に提示された抗原決定基を指す。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上に発現した標的細胞抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原または  は、腫瘍細胞上に過剰発現している場合もある。本明細書では、抗原結合部分などに関する「第１の」及び「第２の」という用語を、各タイプの部分が複数ある場合に区別しやすいように用いている。これらの用語を用いたからといって、特に明言しない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に特定の順位や方向を設ける意図はない。
【００６７】
「異種間結合」または「種間結合」または「種交差反応性の」という用語は、本明細書では、本明細書で説明する結合ドメインが、ヒトと他の生物、たとえば限定ではないが非チンパンジー霊長類で同じ標的分子に結合することを意味する。したがって、「異種間結合」または「種間結合」は、異種において発現する同一分子「Ｘ」（すなわちホモログ）に対する（ただし「Ｘ」以外の分子にではない）種間の反応性と理解すべきである。たとえばヒトＣＤ３εを認識するモノクローナル抗体の、非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε、たとえばマカクＣＤ３εに対する異種間特異性は、たとえばＦＡＣＳ分析で判定することができる。ＦＡＣＳ分析は、各モノクローナル抗体の、ヒトＣＤ３ε抗原を発現しているヒト細胞との、及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３ε抗原を発現している非チンパンジー霊長類細胞、たとえばマカク細胞との結合を試験するように実施される。適切なアッセイを下記の実施例で示す。上述の主題は、ＣＤ１９にも準用される。ＦＡＣＳ分析は、各モノクローナル抗体の、ヒトＣＤ３またはＣＤ１９抗原を発現しているヒト細胞との、及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３またはＣＤ１９抗原を発現している非チンパンジー霊長類細胞、たとえばマカク細胞との結合を試験するように実施される。
【００６８】
ＣＤ３
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、ＣＤ３抗原に特異的に結合する。
【００６９】
本明細書で説明する「ＣＤ３」または「ＣＤ３複合体」は、成熟Ｔリンパ球中で、互いに及びＴ細胞受容体とも非共有結合的に結合した、少なくとも５膜結合型ポリペプチドの複合体である。ＣＤ３複合体は、γ鎖、δ鎖、ε鎖、及びζ鎖（これらはサブユニットとも呼ばれる）を含む。これらの鎖のいくつかに対する非ヒトモノクローナル抗体が開発されており、例としてマウス抗体ＯＫＴ３、ＳＰ３４、ＵＣＨＴ１または６４．１などがある。（たとえばＪｕｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６：３９４５−３９５２  （１９８６）；  Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：１０９７−１１００  （１９８６）；及びＨａｙｗａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６４：８７−９２  （１９８８）を参照されたい。）たとえば固定化抗ＣＤ３抗体によってＣＤ３がＴ細胞上でクラスター化すると、Ｔ細胞受容体の結合と同様の、ただしそのクローンの典型の特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化がもたらされる。ほとんどの抗ＣＤ３抗体はＣＤ３ε鎖を認識する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖまたはＦａｂは、既知の抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂであるか、または既知の抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂに由来する、たとえば修飾されたバージョンである。本明細書で説明する二重特異性抗原結合コンストラクトで用いられる可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を提供するヒトＣＤ３に対する抗体は当該技術分野で知られており、ＯＫＴ３（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ−ＯＫＴ３（商標）（ムロモナブ−ＣＤ３）が挙げられる。さらなる抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３抗原のεサブユニットへのＯＫＴ３の結合を５０％以上遮断する「ＯＫＴ３遮断抗体」が挙げられる。例としては、限定ではないが、テプリズマブ（商標）（ＭＧＡ０３１，  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）；ＵＣＨＴ１（Ｐｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３５（１１）：１３２９−３８）  ＮＩ０４０１（ＷＯ２００７／０３３２３０）；及びビジリズマブ（ＵＳ２５８３４５９７）が挙げられる。
【００７１】
一実施形態では、二重特異性抗原結合コンストラクトは、一価的かつ特異的にＣＤ３抗原に結合するＣＤ３抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、該ＣＤ３抗原結合ポリペプチドコンストラクトはＯＫＴ３（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ−ＯＫＴ３（商標）（ムロモナブ−ＣＤ３）に由来する。一実施形態では、二重特異性抗原結合コンストラクトは、一価的かつ特異的にＣＤ３抗原に結合するＣＤ３抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、該ＣＤ３抗原結合ポリペプチドのＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＣＤ３ε特異的抗体ＯＫＴ３に由来している。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３のεサブユニットに特異的な第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの結合親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、または、たとえば２ｎＭ超、３ｎＭ超、４ｎＭ超、５ｎＭ超、６ｎＭ超、７ｎＭ超、８ｎＭ超、９ｎＭ超、１０ｎＭ超、２０ｎＭ超、３０ｎＭ超、４０ｎＭ超、５０ｎＭ超、６０ｎＭ超、７０ｎＭ超、８０ｎＭ超、または９０ｎＭ超である。
【００７３】
ＯＫＴ３抗体が結合するＣＤ３εサブユニット上のエピトープは、ＣＤ３εに結合したＯＫＴ３の結晶構造を分析することによって特定される（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：  ７６７５−７６８０）。ＣＤ３εのポリペプチド配列を以下の表に示す。
【００７４】
（表Ｂ）ＣＤ３εの配列
2018524373.tif 000004
【００７５】
表Ｂの配列を参照すると、この構造の分析は、ＯＫＴ３抗体のＣＤＲがヒトＣＤ３εの残基５６〜５７（ＳＥ）、６８〜７０（ＧＤＥ）、及び１０１〜１０７（ＲＧＳＫＰＥＤ）に接触することを示している。これら残基の結合ホットスポットに下線を引いてある。これらの残基は、ＯＫＴ３が結合するエピトープと考えられる。したがって、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、このエピトープに特異的に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む場合がある。
【００７６】
本明細書では、少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体に結合する少なくとも１つのＣＤ３結合ポリペプチドコンストラクトを含む抗原結合コンストラクトを提供し、該ＣＤ３発現細胞はＴ細胞である。特定の実施形態では、ＣＤ３発現細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３発現細胞は非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００７７】
本明細書で提供する抗原結合コンストラクトの特定の実施形態では、該コンストラクトは、Ｔ細胞の細胞傷害活性をＢ細胞などの標的細胞に対して活性化させ、そちらに誘導（リダイレクト）することができる。特定の実施形態では、該誘導は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／またはＴ細胞の特異性とは無関係である。
【００７８】
標的抗原
ＣＤ１９
Ｂ細胞抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９、また、Ｂ細胞表面抗原Ｂ４、Ｌｅｕ−１２；Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ＃Ｐ１５３９１としても知られる）は、プレＢ細胞の発生初期から形質細胞への最終分化にかけて発現するヒト汎Ｂ細胞表面マーカーである。ＣＤ１９は、成熟Ｂ細胞の増殖及び生存を促進する。ＣＤ１９は、細胞表面でＣＤ２１と結合して複合体となる。また、ＣＤ８１及びＬｅｕ−１３とも結合し、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナリングを増強する。ＢＣＲとともに、ＣＤ１９は、Ｂ細胞のクローン増殖及び体液性免疫に重要な、内在性かつ抗原受容体誘発性のシグナリングの閾値を調節する。ＣＤ１９は、ＣＤ２１と協働して、適応免疫系と自然免疫系を関連づける。活性化すると、ＣＤ１９の細胞質側末端はリン酸化され、それによってＳｒｃ−ファミリーキナーゼによる結合及びＰＩ−３キナーゼの動員がもたらされる。ＣＤ１９はまた、大多数の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞ならびに白血病細胞にも発現する。
【００７９】
Ｂ細胞は免疫系の制御において重要な役割を果たすので、Ｂ細胞の制御不全は多様な障害と関連づけられる。Ｂ細胞障害は、本明細書ではＢ細胞関連疾患とも呼ばれるが、過剰または制御不能な増殖（リンパ腫、白血病）と、Ｂ細胞発生／免疫グロブリン産生不全（免疫不全）とに分けられる。
【００８０】
ＣＤ１９のアミノ酸配列は以下のとおりである。
2018524373.tif 000005
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、ＣＤ１９抗原（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖまたはＦａｂ）に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖまたはＦａｂは、既知の抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂであるか、または既知の抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂに由来する、たとえば修飾されたバージョンである。本明細書で説明する二重特異性抗原結合コンストラクトで用いられる可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を提供するＣＤ１９に対する抗体は当該技術分野で知られており、ＨＤ３７ハイブリドーマにより提供されるＨＤ３７が挙げられる（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ  （１９９７），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８，  ２７９３−９）。さらなる抗ＣＤ１９抗体としては、ＨＤ３７のＣＤ１９抗原への結合を５０％以上遮断する「ＨＤ３７遮断抗体」が挙げられる。例としては、限定ではないが、ＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ，  １９８９；及びＰｅｚｚｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３８（９）：２７９３−２７９９  （１９８７））；４Ｇ７（Ｍｅｅｃｋｅｒ  （１９８４）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３，  ３０５−２０）；Ｂ４（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  （１９８７）  Ｂｌｏｏｄ  ７０，  ４１８−２７）；Ｂ４３（Ｂｅｊｃｅｋ  （１９９５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５，  ２３４６−５１）、及びＭｏｒ−２０８（Ｈａｍｍｅｒ  （２０１２）  Ｍａｂｓ４：５，  ５７１−５７７）が挙げられる。
【００８３】
一実施形態では、該ＶＨ（ＣＤ１９）領域及びＶＬ（ＣＤ１９）領域（またはＣＤＲなどのそれらの一部）は、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７に由来し、ＨＤ３７ハイブリドーマにより提供される（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ  （１９９７），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８，  ２７９３−９）。
【００８４】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの標的抗原に対する結合親和性は、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、または５．０ｎＭ未満、４．０ｎＭ未満、３．０ｎＭ未満、２．０ｎＭ未満、１．０ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、．０９ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、または０．２ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの、ＣＤ１９＋標的細胞表面のＣＤ１９に対する結合親和性は、ＦＡＣＳ分析で測定すると、０．１〜０．５ｎＭ、０．５〜１ｎＭ、１〜３ｎＭ、３〜５ｎＭ、５〜７ｎＭ、７〜９ｎＭ、９〜１１ｎＭ、１１〜１３ｎＭ、１３〜１５ｎＭ、１５〜１７ｎＭ、１７〜１９ｎＭ、または１９〜２１ｎＭの各範囲である。
【００８５】
特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、Ｂ細胞上のＣＤ１９に結合するｓｃＦｖまたはＦａｂコンストラクトである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖまたはＦａｂコンストラクトは哺乳類である。一実施形態では、該ｓｃＦｖまたはＦａｂコンストラクトはヒトである。別の実施形態では、該ｓｃＦｖまたはＦａｂコンストラクトはヒト化である。さらに別の実施形態では、該ｓｃＦｖまたはＦａｂコンストラクトは少なくとも１つのヒト重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【００８６】
特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、Ｂ細胞の表面に発現した少なくとも１種の抗原との異種間結合を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトの抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、少なくとも１種の哺乳類ＣＤ１９に結合する。特定の実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ヒトＣＤ１９に結合する。
【００８７】
ＣＤＨ３
いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、ＣＤＨ３に対する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを有する場合がある。ＣＤＨ３はまた、ＣＡＤＨ３；カドヘリン３、１型またはＰカドヘリン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ＃Ｐ２２２２３）としても知られており、細胞−細胞接着において選択的に同種親和的に相互作用する細胞接着タンパク質カドヘリン・ファミリーの一員である。ＣＤＨ３の過剰発現は、いくつかの種類のがんと関連がある。いくつかの実施形態では、表ＫＫの抗ＣＤＨ３抗体を用いて、ＣＤＨ３に特異的な抗原結合ポリペプチドコンストラクトを誘導する。
【００８８】
（表ＫＫ）
2018524373.tif 000006
2018524373.tif 000007
【００８９】
ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＥＧＦＲ
ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＥＧＦＲは、ＨＥＲ受容体である。「ＨＥＲ受容体」は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、及びＨＥＲ４受容体などがある。ＨＥＲ受容体は一般に、ＨＥＲリガンドに結合できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼ・ドメイン；及びリン酸化されていてもよいいくつかのチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナリング・ドメインを含む。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＥＧＦＲは、多くの種類のがんで過剰発現する。いくつかの実施形態では、表ＫＫの抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体は、抗原結合ポリペプチドコンストラクトを誘導するのに用いられる。
【００９０】
他の標的抗原
いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、表ＬＬに示す標的抗原のうちの１つに特異的な第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は病原体由来抗原である。ある実施形態では、標的抗原はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は真菌抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は細菌抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は寄生虫抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は血液がんと関連がある。いくつかの実施形態では、標的抗原は固形腫瘍上に発現する。いくつかの実施形態では、標的抗原は自己免疫疾患と関連がある。
【００９１】
（表ＬＬ）標的抗原
2018524373.tif 000008
2018524373.tif 000009
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【００９２】
足場
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、足場を含む。足場は、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、ナノ粒子、または他の化学部分であってよい。足場がＦｃまたはダイマーＦｃである実施形態では、抗原結合コンストラクトの抗原結合ポリペプチドコンストラクト（複数可）は、足場のＮ末端またはＣ末端に連結されている場合がある。ダイマーＦｃは、ホモダイマーでもヘテロダイマーでもよい。
【００９３】
足場がペプチドまたはポリペプチドである実施形態では、抗原結合コンストラクトまたは抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ポリペプチドリンカーによって、またはポリペプチドリンカーなしで、遺伝子融合により足場に連結されている場合がある。足場がポリマーまたはナノ粒子である他の実施形態では、抗原結合コンストラクトは、化学結合（コンジュゲート）により足場に連結されている場合がある。いくつかの実施形態では、足場は、アルブミンポリペプチドまたはスプリット・アルブミンポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドコンストラクトの足場としてのスプリット・アルブミンポリペプチドの使用は、ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０１３１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５０４０８、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５０４１１で十分に説明されており、これらの全文を参照により本明細書に援用する。
【００９４】
抗原結合コンストラクトのＦｃ
Ｆｃポリペプチドは、抗原結合ポリペプチドコンストラクトの優れた足場になる。本明細書で説明する特定の抗原結合コンストラクトは、Ｆｃ、たとえばダイマーＦｃを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、修飾されたＣＨ３配列をそれぞれが含む第１のＦｃポリペプチドと第２のＦｃポリペプチドとを含むヘテロダイマーＦｃであり、各修飾されたＣＨ３配列は、ヘテロダイマーＦｃの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含み、ダイマー化したＣＨ３ドメインは約６８℃以上の融点（Ｔｍ）を有し、該第１のＦｃポリペプチドは第１のヒンジリンカーにより該第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結され、該第２のＦｃポリペプチドは第２のヒンジリンカーにより該第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている。
【００９５】
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端側領域を定めるのに用いられる。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域が含まれる。本明細書で特に断らない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリング・システム、別名ＥＵインデックスにしたがい、これはＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ，  １９９１で説明されている。ダイマーＦｃの「Ｆｃポリペプチド」とは、本明細書では、ダイマーＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち免疫グロブリン重鎖のＣ末端側定常領域を含み、安定な自己会合ができるポリペプチドを指す。たとえば、ダイマーＩｇＧ  ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３の定常ドメイン配列を含む。
【００９６】
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインか、またはＣＨ３ドメインとＣＨ２ドメインの両方を含む。ＣＨ３ドメインは、ダイマーＦｃの２つのＦｃポリペプチドから１つずつ、２つのＣＨ３配列を含む。ＣＨ２ドメインは、ダイマーＦｃの２つのＦｃポリペプチドから１つずつ、２つのＣＨ２配列を含む。
【００９７】
いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ３配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つ以上のリンカーによって、またはリンカーなしに、第１の抗原結合コンストラクト及び／または第２の抗原結合コンストラクトに連結されている。いくつかの態様では、ＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様では、ＦｃはヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの態様では、ＦｃはヘテロダイマーＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ２配列を含む。
【００９８】
いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ３配列のうちの少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ２配列うちの少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは１つのポリペプチドである。いくつかの態様では、Ｆｃは複数のペプチド、たとえば２つのポリペプチドである。
【００９９】
いくつかの態様では、Ｆｃは、２０１１年１１月４日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８、または２０１２年１１月２日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０で説明されているＦｃであり、両出願の開示全体をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する。
【０１００】
修飾されたＣＨ３ドメイン
いくつかの態様では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、非対称に修飾されている修飾済みＣＨ３ドメインを含むヘテロダイマーＦｃを含む。ヘテロダイマーＦｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド、つまり第１のＦｃポリペプチドと第２のＦｃポリペプチドとを含むことができ、これらはＦｃが１つの第１のＦｃポリペプチドと１つの第２のＦｃポリペプチドとを含む場合は交換可能に用いることができる。一般に、第１のＦｃポリペプチドは第１のＣＨ３配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは第２のＣＨ３配列を含む。
【０１０１】
非対称的に導入された１つ以上のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、ダイマー化すると、一般にはホモダイマーではなくヘテロダイマーＦｃになる。本明細書では、「非対称アミノ酸修飾」は、第１のＣＨ３配列の特定の位置のアミノ酸が、第２のＣＨ３配列の同位置のアミノ酸と異なっている任意の修飾を指し、第１のＣＨ３配列と第２のＣＨ３配列は選択的に対合してホモダイマーではなくヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマー化は、各配列の同じアミノ酸位置の２つのアミノ酸のうちのどちらか一方だけの修飾、または第１のＣＨ３配列と第２のＣＨ３配列それぞれの同じアミノ酸位置のアミノ酸両方の修飾の結果であり得る。ヘテロダイマーＦｃの第１と第２のＣＨ３配列は、１つまたは２つ以上の非対称アミノ酸修飾を含むことができる。
【０１０２】
表Ｃに、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応するヒトＩｇＧ１のＦｃ配列のアミノ酸配列を示す。アミノ酸２３１〜２３８は下方ヒンジとも呼ばれる。ＣＨ３配列は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
【０１０３】
典型的には、１つのＦｃは、ダイマー化できる２つの連続する重鎖配列（Ａ及びＢ）を含むことができる。本明細書で説明する抗原結合コンストラクトに関しては、いくつかの実施形態では、第１のｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの鎖Ａに連結され、第２のｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの鎖Ｂに連結されている。いくつかの実施形態では、第２のｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの鎖Ａに連結され、第１のｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの鎖Ｂに連結されている。
【０１０４】
いくつかの態様では、Ｆｃの片方または両方の配列は、ＥＵナンバリングによる位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００、及び／またはＮ３９０の１つ以上の変異または修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、表Ｘに示すミュータント配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、バリアント１Ａ−Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、バリアント２Ａ−Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、バリアント３Ａ−Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、バリアント４Ａ−Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、バリアント５Ａ−Ｂの変異を含む。
【０１０５】
（表Ｃ）ＩｇＧ１のＦｃ配列及びバリアント
2018524373.tif 000015
【０１０６】
第１のＣＨ３配列及び第２のＣＨ３配列は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に関して、本明細書で説明するアミノ酸変異を含むことができる。一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、位置Ｆ４０５及びＹ４０７のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３９４のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含む。一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含む。
【０１０７】
一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３配列と第２のＣＨ３配列のうちの一方はさらに、位置Ｑ３４７のアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列はさらに、位置Ｋ３６０のアミノ酸修飾を含んでいる。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３配列と第２のＣＨ３配列のうちの一方はさらに、位置Ｑ３４７のアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列はさらに、位置Ｋ３６０のアミノ酸修飾を含んでおり、該ＣＨ３配列の片方または両方がさらに、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含んでいる。
【０１０８】
一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含み、該第１のＣＨ３配列と第２のＣＨ３配列のうちの一方はさらに、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つ以上を含んでいる。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含み、該第１のＣＨ３配列と第２のＣＨ３配列のうちの一方はさらに、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、及びＫ３９２Ｄのうちの１つ以上を含んでおり、該ＣＨ３配列の片方または両方がさらに、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含んでいる。
【０１０９】
一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含み、該ＣＨ３配列の片方または両方がさらに、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸修飾を含んでいる。
【０１１０】
一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、以下のアミノ酸修飾を含む修飾されたＣＨ３ドメインを含み、以下の「Ａ」は第１のＣＨ３配列のアミノ酸修飾を、「Ｂ」は第２のＣＨ３配列のアミノ酸修飾を表す。Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び／またはＢ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。
【０１１１】
１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロダイマーＣＨ３ドメインが野生型ホモダイマーＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有するヘテロダイマーＦｃの形成を促進する。ある実施形態では、１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロダイマーＦｃドメインが野生型ホモダイマーＦｃドメインに匹敵する安定性を有するヘテロダイマーＦｃドメインの形成を促進する。ある実施形態では、１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロダイマーＦｃドメインの形成を促進し、該ヘテロダイマーＦｃドメインは、示差走査熱量測定での融点（Ｔｍ）を介して安定性が観察され、該融点は、対応する対称的野生型ホモダイマーＦｃドメインで観察される融点の４℃以内である。いくつかの態様では、Ｆｃは、野生型ホモダイマーＦｃに匹敵する安定性を有するヘテロダイマーＦｃの形成を促進する１つ以上の修飾をＣＨ３配列のうちの少なくとも１つに含む。
【０１１２】
一実施形態では、ＣＨ３ドメインの安定性は、たとえば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって、ＣＨ３ドメインの融点を測定することで評価することができる。したがって、さらなる実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上の融点を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融点を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７２℃以上の融点を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融点を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融点を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７８℃以上の融点を有する。いくつかの態様では、ダイマー化したＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃以上の融点（Ｔｍ）を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、発現産物において、修飾されたＣＨ３配列を含むヘテロダイマーＦｃは、ホモダイマーＦｃと比べて少なくとも約７５％の純度で形成され得る。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、約８０％よりも高い純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、約８５％よりも高い純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、約９０％よりも高い純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、約９５％よりも高い純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、約９７％よりも高い純度で形成される。いくつかの態様では、Ｆｃは、発現させると、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％よりも高い純度で形成されているヘテロダイマーである。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一細胞により発現させると、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％よりも高い純度で形成されているヘテロダイマーである。
【０１１４】
ヘテロダイマーＦｃの形成を促進するようにモノマーＦｃポリペプチドを修飾するさらなる方法は、当該技術分野で知られている。たとえば、国際特許公開ＷＯ９６／０２７０１１（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８５，  １９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄａｖｉｓ，  ＪＨ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ；２３（４）：  １９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  （ＳＥＥＤ）  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ１  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．］  Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ，  Ｍｅｅｓｔｅｒｓ  ＪＩ，  ｄｅ  Ｇｏｅｉｊ  ＢＥ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｍｅｒ  ＥＴ，  Ｎｅｉｊｓｓｅｎ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｋａｍｐｅｎ  ＭＤ，  Ｓｔｒｕｍａｎｅ  Ｋ，  Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ  Ｓ，  Ｋｕｎｄｕ  Ａ，  Ｇｒａｍｅｒ  ＭＪ，  ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ  ＰＨ，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ＪＧ，  Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ，  Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１３  Ｍａｒ  ２６；１１０（１３）：５１４５−５０を参照されたい。
【０１１５】
ＣＨ２ドメイン
上述したように、いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトのＦｃは、ＣＨ３ドメインに加えてＣＨ２ドメインを含む。一例として、ＩｇＧ１  ＦｃのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列は、表Ａに示す配列のアミノ酸２３９〜３４０と特定されている。ＦｃのＣＨ２ドメインはＦｃ受容体及び補体に結合するので、エフェクター細胞機能の媒介に関与している。
【０１１６】
「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するのに用いられ、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）及び新生児受容体ＦｃＲｎを含む。
【０１１７】
一般に、ＩｇＧ抗体に結合するのはＦｃγＲ（γ受容体）であり、ヒトのＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体、これらの受容体のアレル・バリアントや選択的スプライシング形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体にはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）とＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）があり、これらのアミノ酸配列は類似しているが、その細胞質ドメインに主要な違いがある。他のアイソタイプの免疫グロブリンも、何らかのＦｃＲにより結合させることができる（たとえばＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  ＮＹ）  （４ｔｈ  ｅｄ．，  １９９９）を参照されたい）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含んでいる。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含んでいる（Ｄａｅｒｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３−２３４  （１９９７）で概説されている）。ＦｃＲについては、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）；  Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４  （１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０−４１  （１９９５）で概説されている。将来同定される他のＦｃγＲも、本明細書の「ＦｃＲ」に包含される。ＦｃγＲは、限定ではないがマウス、ラット、ウサギ、及びサルといった他の生物にも見られる。マウスＦｃγＲとしては、限定ではないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）が挙げられる。ＦｃγＲは、ＮＫ細胞またはＢ細胞などのエフェクター細胞によって発現される。
【０１１８】
補体の活性化には、補体タンパク質Ｃ１ｑの抗原抗体複合体への結合が必要である。ＦｃのＣＨ２ドメインの残基が、Ｃ１ｑとＦｃ間の相互作用に関与する。
【０１１９】
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトのいくつかは、ＦｃＲｎに結合できる。当該技術分野で知られているように、ＦｃＲｎとの結合により、飲食作用を受けた抗体はエンドソームから血流中にリサイクルされる（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；  Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６）。このプロセスは、全長分子のサイズが大きいため腎臓での濾過が阻止されることと合わせて、１〜３週間という好ましい抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合はまた、抗体輸送でも主要な役割を果たす。ＦｃＲｎは、母親のＩｇＧを胎児に伝える役割がある（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）；及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））。ＦｃＲｎのＩｇＧへの結合には、ＦｃのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの残基が関与している。
【０１２０】
ＣＨ２ドメイン内の修飾は、ＦｃＲのＦｃへの結合に影響し得る。上述したように、ＦｃのＣＨ２ドメインは、ダイマーＦｃの２つのＦｃポリペプチドそれぞれに１つずつ、つまり２つのＣＨ２配列を含む。一般に、ＣＨ２ドメインに対する修飾は対称的なので、Ｆｃポリペプチドの両方のＣＨ２配列で同じである。しかし、ヘテロダイマー化を強化するＣＨ３ドメインの変異の存在下では、非対称の変異も可能である。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲまたはＣ１ｑの結合及び／またはエフェクター機能を低下させるような修飾を含む。
【０１２１】
エフェクター機能を低下させる修飾
ＦｃγＲ及び／または補体の結合及び／またはエフェクター機能を低下させるＦｃ修飾は、当該技術分野で知られている。最近の出版物では、エフェクター活性が低下または抑制された抗体の設計に用いられているストラテジーを説明している（Ｓｔｒｏｈｌ，  ＷＲ  （２００９），  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０：６８５−６９１，及びＳｔｒｏｈｌ，  ＷＲ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈｌ  ＬＭ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”  Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：  Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  （２０１２），  ｐｐ  ２２５−２４９を参照されたい）。これらのストラテジーには、グリコシル化修飾によるエフェクター機能の低下、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４足場の使用、またはＦｃのヒンジもしくはＣＨ２領域への変異の導入が含まれる。たとえば、米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開ＷＯ２００６／１０５３３８（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＳｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ  （（２０１２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４２０：  ２０４−２１９）は、ＦｃγＲまたは補体のＦｃへの結合を低下させるための具体的な修飾を説明している。
【０１２２】
ＦｃγＲまたは補体のＦｃへの結合を低下させるための、既知の対称的アミノ酸修飾の具体的な非限定例としては、以下の表に特定されているものが挙げられる。
【０１２３】
（表Ｄ）ＦｃγＲまたは補体のＦｃへの結合を低下させる修飾
2018524373.tif 000016
【０１２４】
一実施形態では、Ｆｃは、上記の表で特定する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５のうちの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５のアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓのアミノ酸修飾を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃは、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０５０７で説明されているように、Ｆｃの下方ヒンジ領域に１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含む。そのようなＦｃγＲの結合を低下させる非対称のアミノ酸修飾の例を表Ｅに示す。
【０１２６】
（表Ｅ）ＦｃγＲの結合を低下させる非対称の変異
2018524373.tif 000017
【０１２７】
ヒンジリンカー
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトでは、第１のＦｃポリペプチドは第１のヒンジリンカーによって第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結され、第２のＦｃポリペプチドは第２のヒンジリンカーによって第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトに連結されている。ヒンジリンカー配列の例は当業者には周知であり、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトに使用することができる。あるいは、既知のヒンジリンカーの修飾バージョンを使用することもできる。
【０１２８】
ヒンジリンカー・ポリペプチドは、抗原結合コンストラクトの機能活性を維持または最適化できるように選択される。好適なリンカーポリペプチドは、上方ヒンジ配列及びコアヒンジ配列も含めてたとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４から選択されるような、ＩｇＧヒンジ領域を含む。上方ヒンジ配列及びコアヒンジ配列に対応するアミノ酸残基はＩｇＧのタイプにより様々であることは当該技術分野で知られており、当業者であれば所与のＩｇＧタイプのそのような配列を容易に特定できる。これらの例示的リンカーの修飾バージョンが使用される場合もある。たとえば、ＩｇＧ４ヒンジの安定性を向上させる修飾が当該技術分野では知られている（たとえば、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７，  ７６７−７７１を参照されたい）。ヒンジリンカー配列の例は以下の表に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、該コンストラクトの効力を改変または最適化するような修飾をヒンジ領域に有する。
【０１２９】
（表Ｆ）ヒンジリンカーのポリペプチド配列（配列番号）
2018524373.tif 000018
【０１３０】
解離定数（ＫＤ）及び最大結合度（Ｂｍａｘ）
いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、限定ではないが解離定数及び最大結合度といった機能的特徴により説明される。
【０１３１】
「解離定数（ＫＤ）」という用語は、本明細書では、特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数を指すものとする。本明細書では、リガンド−タンパク質相互作用とは、限定ではないが、タンパク質−タンパク質相互作用または抗体−抗原相互作用を指す。ＫＤは、２種のタンパク質（たとえばＡＢ）が、可逆的に解離してより小さい成分（Ａ＋Ｂ）になる傾向を測定し、これは結合速度に対する解離速度の比と定義され、「オフ比（ｋｏｆｆ）」、または「オン比（ｋｏｎ）」とも呼ばれる。したがって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎと等しく、モル濃度（Ｍ）で表される。ＫＤが小さいほど、結合親和性は強いということになる。したがって、１ｍＭのＫＤのほうが、１ｎＭのＫＤよりも結合親和性が弱いことがわかる。抗原結合コンストラクトのＫＤ値は、当該技術分野で確立された方法で決定できる。抗原結合コンストラクトのＫＤ値を決定するひとつの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を使うこと、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサー・システムを使うことである。別の決定法としては、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いることができる。
【０１３２】
「Ｂｍａｘ」または最大結合度という用語は、抗原結合コンストラクトの飽和濃度での、細胞上の最大の抗原結合コンストラクト結合レベルを指す。このパラメーターは、相対比較の任意単位ＭＦＩで報告されるか、または標準的曲線を用いて、細胞と結合した抗原結合コンストラクト数に対応する絶対値に変換される場合もある。
【０１３３】
抗原結合コンストラクトの結合特徴は、様々な技法により決定することができる。そのうちのひとつは、抗原を発現している標的細胞への結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、蛍光表示式細胞分取）により測定することである。一般に、そのような実験では、目的の抗原を発現する標的細胞を異なる濃度の抗原結合コンストラクトとともにインキュベートし、洗い、抗原結合コンストラクトを検出するための二次因子とともにインキュベートし、洗い、フローサイトメーターで分析して、細胞上の検出シグナルの強さを表す蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を測定するが、これは細胞に結合した抗原結合コンストラクトの数に関連している。次に、抗原結合コンストラクト濃度対ＭＦＩのデータを飽和結合式に当てはめて、２種の主要な結合パラメーターであるＢｍａｘと見かけＫＤを得る。
【０１３４】
見かけＫＤまたは見かけ平衡解離定数は、半最大細胞結合が観察される抗原結合コンストラクト濃度を表す。当然ながら、ＫＤ値が小さいほど、最大細胞結合度に達するのに必要な抗原結合コンストラクト濃度は低く、したがって抗原結合コンストラクトの親和性はより高い。見かけＫＤは、細胞上に発現した異なる受容体レベルやインキュベーション条件などの細胞結合実験条件に依存するので、見かけＫＤは通常はＳＰＲやＩＴＣなどの細胞フリーの分子実験から決定されるＫＤ値とは異なる。とはいえ、方法が異なっても結果は概ね一致する。
【０１３５】
本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトのいくつかの実施形態では、一方の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、他方よりも、その同族抗原に対し高い親和性を有する。薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトのほとんどの実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＣＤ３に対し、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトが標的抗原に対し有する親和性よりも低い親和性を有する。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、ＳＰＲで測定すると、ＣＤ３抗原に対し、標的抗原に対するよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍低い親和性を有し、かつ／または、ＦＡＣＳで測定すると、標的抗原を担持する標的細胞に対し１０ｎＭ未満の親和性を有し、Ｔ細胞に対し１０ｎＭ〜５００ｎＭの親和性を有する。
【０１３６】
多くの実施形態では、ＣＤ３に対する親和性は、標的抗原に対する親和性よりも低くなる。薬物がコンジュゲートされたＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトの一実施形態では、ＣＤ３に対する親和性は、ＣＤ１９に対する親和性よりも低い。さらなる実施形態では、ＣＤ３に対する親和性は、ＣＤ１９に対する親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍低い。ある特定の実施形態では、薬物がコンジュゲートされたＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトの親和性は、ＣＤ１９に対して２ｎＭ、ＣＤ３に対して３０ｎＭである。親和性はＳＰＲにより決定することができる。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳ分析で決定されるように、Ｂ細胞上に発現したＣＤ１９抗原に対する第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの親和性は、約０．５〜１、１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１１、１１〜１３、１３〜１５、１５〜１７、１７〜１９、または１９〜２１ｎＭの範囲であり、Ｔ細胞上に発現したＣＤ３に対する第１の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの親和性は、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜１５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｍの範囲である。
【０１３７】
抗原結合コンストラクトを調製する方法
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、たとえば米国特許第４，８１６，５６７号で説明されている組換え法及び組成物を用いて生産することができる。
【０１３８】
一実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトをコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗原結合コンストラクトのＶＬ及び／またはＶＨ（たとえば抗原結合コンストラクトの軽鎖及び／または重鎖）をそれぞれ構成するアミノ酸配列をコードすることができる。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（たとえば発現ベクター）が提供される。一実施形態では、核酸は、多シストロンのベクター内に提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗原結合コンストラクトのＶＬを構成するアミノ酸配列及び抗原結合ポリペプチドコンストラクトのＶＨを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗原結合ポリペプチドコンストラクトのＶＬを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターと及び抗原結合ポリペプチドコンストラクトのＶＨを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターとを含む（たとえばそれらで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は真核生物、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球細胞（たとえばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗原結合コンストラクトを作製する方法が提供され、該方法は、上述したような抗原結合コンストラクトをコードする核酸を含む宿主細胞を抗原結合コンストラクトの発現に好適な条件下で培養すること、及び任意で宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗原結合コンストラクトを回収することを含む。
【０１３９】
抗原結合コンストラクトの組換え生産では、たとえば上述したような抗原結合コンストラクトをコードする核酸を単離し、１つ以上のベクターに挿入して、宿主細胞内でさらにクローニングし、かつ／または発現させる。そのような核酸は、従来の手順により（たとえば、抗原結合コンストラクトの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド・プローブを用いて）容易に単離し配列決定することができる。
【０１４０】
抗原結合コンストラクトをコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、本明細書で説明する原核生物細胞または真核生物細胞が挙げられる。
【０１４１】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」とは、たとえば直接吸収、形質導入、ｆ接合、または他の当該技術分野で知られている組換え宿主細胞作製法などの挿入方法に関わらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来ポリヌクレオチドは、非組込みベクターとして、たとえばプラスミドとして維持してもよいし、あるいは宿主ゲノムに組み込んでもよい。
【０１４２】
本明細書では、「真核生物」という用語は、真核生物の系統ドメインに属する生物、たとえば（限定ではないが、哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類などの）動物、繊毛虫、（限定ではないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類などの）植物、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などを指す。
【０１４３】
本明細書では、「原核生物」という用語は、原核生物を指す。たとえば非真核生物は、（限定ではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などの）真正細菌の系統ドメイン、または（限定ではないが、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、たとえばハロフェラックス・ボルカニイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロベクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ＮＲＣ−１、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピュロコックス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）などの）古細菌の系統ドメインに属する場合もある。
【０１４４】
たとえば、抗原結合コンストラクトは、特にグリコシル化やＦｃエフェクター機能が必要ない場合は、細菌内で生産される場合がある。抗原結合コンストラクト断片及びポリペプチドの細菌内発現については、たとえば米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２４８  （Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  ２００３），  ｐｐ．  ２４５−２５４の大腸菌内の抗体断片の発現についての説明も参照されたい。）抗原結合コンストラクトは発現後、細菌細胞ペーストから可溶画分に単離され、さらに精製される場合もある。
【０１４５】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物は、抗原結合コンストラクトをコードするベクターの好適なクローニングまたは発現宿主であり、これにはグリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株も含まれ、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンをもつ抗原結合コンストラクトが生産される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２２：１４０９−１４１４  （２００４）、及び  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２４：２１０−２１５  （２００６）を参照されたい。
【０１４６】
グリコシル化された抗原結合コンストラクトの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションで、昆虫細胞と一緒に用いられる。
【０１４７】
植物細胞培養物も宿主として用いることができる。たとえば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗原結合コンストラクトを生産するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を説明している）を参照されたい。
【０１４８】
脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。たとえば、懸濁液中で増殖するようにされた哺乳類細胞株は有用であり得る。他の有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児由来腎臓株（たとえばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９  （１９７７）で説明されている２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（たとえばＭａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１  （１９８０）で説明されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；たとえばＭａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８  （１９８２）で説明されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６  （１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗原結合コンストラクトの生産に好適な特定の哺乳類宿主細胞株の概説としては、たとえばＹａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２４８  （Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．），  ｐｐ．  ２５５−２６８  （２００３）を参照されたい。
【０１４９】
一実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、少なくとも１個の安定な哺乳類細胞に抗原結合コンストラクトをコードする核酸を所定の比率でトランスフェクトすることと、及び該核酸を該少なくとも１個の哺乳類細胞内で発現させることとを含む方法によって、安定な哺乳類細胞内で生産される。いくつかの実施形態では、核酸の所定の比率は、発現産物に占める抗原結合コンストラクトの割合が最も高くなるような入力核酸の相対比率を決定するための一過性のトランスフェクション実験で決定される。
【０１５０】
所望であれば、抗原結合コンストラクトは、発現後に精製または単離してもよい。タンパク質は当業者に知られている多様な方法で単離または精製することができる。標準的な精製法としては、クロマトグラフィー法が挙げられ、ＦＰＬＣやＨＰＬＣといったシステムを用いて大気圧または高圧で実施されるイオン交換法、疎水性相互作用法、アフィニティー法、サイズ排除法またはゲル濾過法、及び逆相法が含まれる。精製法としてはまた、電気泳動法、免疫学的方法、沈降法、透析法、及び等電点電気泳動法も挙げられる。限外濾過法及びダイアフィルトレーション法をタンパク質濃縮と一緒に用いても有用である。当該技術分野で周知のように、多様な天然のタンパク質はＦｃ及び抗体に結合するが、これらのタンパク質を本発明で抗原結合コンストラクトの精製に用いることができる。たとえば、細菌性プロテインＡ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌性プロテインＬは、一部の抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は、特定の融合パートナーによって可能となることが多い。たとえば、抗体は、ＧＳＴ融合を用いる場合はグルタチオン樹脂を用いて、Ｈｉｓタグを用いる場合はＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーで、またはｆｌａｇタグを用いる場合は固定化抗ｆｌａｇ抗体を用いて、精製することができる。好適な精製法の概括的な手引きは、たとえばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ，  １９９４（全文を参照により援用）を参照されたい。必要な純度は抗原結合コンストラクトの用途によって変わってくる。場合によっては精製は不要である。
【０１５１】
特定の実施形態では、抗原結合コンストラクトは、限定ではないが、Ｑ−セファロースカラム、ＤＥＡＥセファロースカラム、ｐｏｒｏｓ  ＨＱカラム、ｐｏｒｏｓ  ＤＥＡＦカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥカラム、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ及びＤＥＡＥカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｑ及びＤＥＡＥカラムのクロマトグラフィーなどのアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０１５２】
特定の実施形態では、本明細書で説明するタンパク質は、限定ではないが、ＳＰ−セファロースカラム、ＣＭセファロースカラム、ｐｏｒｏｓ  ＨＳカラム、ｐｏｒｏｓ  ＣＭカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭカラム、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ及びＣＭカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓ及びＣＭカラム、ならびにそれらの等価物及び同等物を用いて精製される。
【０１５３】
さらに、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、当該技術分野で知られている技法により化学合成することもできる（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  １９８３，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｎ．Ｙ及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１０：１０５−１１１  （１９８４）を参照されたい）。たとえば、あるポリペプチドの断片に相当するポリペプチドを、ペプチド・シンセサイザーを用いて合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学アミノ酸アナログを、ポリペプチド配列への置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定ではないが、一般的なアミノ酸のＤ−アイソマー、２，４ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、」−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸たとえば」−メチルアミノ酸、Ｃ」−メチルアミノ酸、Ｎ」−メチルアミノ酸、及びアミノ酸アナログ全般が挙げられる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）の場合もある。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、実質的に精製されている。「実質的に精製されている」という用語は、本明細書で説明するコンストラクトまたはそのバリアントであって、通常はその自然発生環境すなわち天然細胞で、または組換え生産の抗原結合コンストラクトの場合は宿主細胞で、そのタンパク質に随伴または相互作用する成分を実質的にまたは基本的に含まず、特定の実施形態では、汚染タンパク質を約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量）有するタンパク質調製物を含む細胞材料を実質的に含まない、コンストラクトまたはそのバリアントを指す。抗原結合コンストラクトまたはそのバリアントが宿主細胞により組換え生産される場合、タンパク質は、特定の実施形態では、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％またはそれ以下で存在する。抗原結合コンストラクトまたはそのバリアントが宿主細胞により組換え生産される場合、タンパク質は、特定の実施形態では、培養培地中に、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌまたはそれ以下で存在する。特定の実施形態では、本明細書で説明する方法で生産された「実質的に精製されている」抗原結合コンストラクトは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法で決定されるように、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベルを有し、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベルを有し、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度レベルを有する。
【０１５５】
翻訳後修飾
特定の実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、翻訳中または翻訳後に差別的に修飾される。
【０１５６】
本明細書では「修飾されている」という用語は、所与のポリペプチドに加えられるあらゆる変化、たとえばポリペプチド長、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学構造、翻訳時修飾、または翻訳後修飾の変化を指す。「（修飾されている）」という記述様式は、論じられているポリペプチドが任意で修飾されていること、つまり当該ポリペプチドは修飾されていても修飾されていなくてもよいことを意味する。
【０１５７】
「翻訳後修飾されている」という用語は、そのアミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれてから生じるような天然または非天然のアミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語には、単に例示として、翻訳時インビボ修飾、翻訳時インビトロ修飾（たとえば無細胞翻訳系で）、翻訳後インビボ修飾、及び翻訳後インビトロ修飾が包含される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、修飾は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質切断、及び抗体分子または抗原結合コンストラクトまたは他の細胞リガンドへの連結のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、限定ではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；及びツニカマイシンの存在下での代謝合成を含む既知の技法により化学修飾されている。
【０１５９】
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトのさらなる翻訳後修飾としては、たとえば、Ｎ連結またはＯ連結糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の付着、Ｎ連結またはＯ連結糖鎖の化学修飾、及び原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、タンパク質の検出及び単離ができるように、酵素、蛍光、同位体、または親和性標識などの検出可能標識で修飾されている。特定の実施形態では、好適な酵素標識の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としてはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の一例としてはルミノールが挙げられ、バイオ発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としてはヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトを、放射性金属イオンと結合する大環状キレーターに付着させている。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスか、または当該技術分野で周知の化学修飾によって修飾されている。特定の実施形態では、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同タイプの修飾が同じかまたは様々な程度で存在する場合もある。特定の実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトからのポリペプチドは、たとえばユビキチン化の結果として分岐しており、いくつかの実施形態では、分岐ありまたはなしの環状である。環状、分岐、及び分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスの結果であるか、または合成法により作製される。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ｈｅｍｅ部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ、硫酸化、転移ＲＮＡ媒介のアミノ酸のタンパク質への付加たとえばアルギニル化、及びユビキチン化が挙げられる。（たとえば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；  ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ．  １−１２  （１９８３）；  Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８２：６２６−６４６  （１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ６６３：４８−６２  （１９９２）を参照されたい）。
【０１６２】
特定の実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトを固相に付着させており、これは本明細書で説明するタンパク質が結合する、または該タンパク質に結合する、または該タンパク質と結合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。そのような固相としては、限定ではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられる。
【０１６３】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの機能活性及び機能測定アッセイ
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、本明細書で説明するアッセイだけでなく当該技術分野で知られるアッセイを用いるかまたはルーチン的に改変して、その機能活性（たとえば生物学的活性）を検定することができる。
【０１６４】
本明細書で説明する抗原結合コンストラクト及び薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの生物学的活性を試験する方法は、実施例で説明するような様々なアッセイにより測定することができる。そのような方法としては、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトによって特異的に結合される標的抗原を担持する標的細胞のＴ細胞媒介性殺傷を測定するインビトロのアッセイが挙げられる。たとえば、該当する標的抗原を担持する標的細胞の殺傷は、エフェクターＴ細胞の供給源としてのヒト全血、ＰＢＭＣ、またはＢ細胞を除去したＰＢＭＣ（本明細書では「ＰＢＭＣ−Ｂ」とする）を含む培養物で測定することができる。そのようなアッセイは、精製Ｔ細胞培養物でも実施できる。このタイプのアッセイは、標的抗原を担持する標的細胞のＴ細胞媒介性殺傷と、薬物がコンジュゲートされたコンストラクトの標的細胞による内在化により生じるあらゆる殺傷の両方を検出する。したがって、本明細書で説明するいくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗ＣＤ３−ＣＤ１９、ＣＤ３−ＣＤＨ３、ＣＤ３−ＨＥＲ２、ＣＤ３−ＨＥＲ３またはＣＤ３−ＥＧＦＲなどの抗原結合コンストラクトの、標的抗原を担持する標的細胞に対する殺傷能は、薬物がコンジュゲートされていない参照コンストラクトよりも高いことが観察される。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、同じＣＤＲ及び結合親和性をもつが薬物がコンジュゲートされていない参照抗原結合コンストラクトよりも高い、ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓ腫瘍Ｂ細胞殺傷率を示す。
【０１６５】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトの直接の細胞傷害性は、コンストラクトを、第２の抗原結合ポリペプチドコンストラクトの対象である標的抗原を担持する標的細胞と一緒に培養することによって決定することができる。本明細書で説明するいくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、またはＣＤＨ３であり、細胞傷害性は、コンストラクトを、たとえば実施例２２で説明されているように、該当する標的抗原を担持する標的細胞と一緒に培養することで決定される。このタイプのアッセイでは、Ｔ細胞媒介性殺傷の非存在下で、薬物の内在化による細胞殺傷が  であるかどうかを評価することができる。
【０１６６】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトがＴ細胞に及ぼす影響は、いくつかの方法で測定することができる。コンストラクトのＴ細胞への内在化は、たとえばＪｕｒｋａｔＴ細胞を用いた実施例２１で説明されるように、色素または他の検出可能な剤をコンストラクトに結合させ、それをＴ細胞と一緒に培養し、Ｔ細胞内で蓄積する色素の量をモニタリングすることで測定することができる。これを、同じ実験で、標的抗原を担持する標的細胞へのコンストラクトの内在化と比較することができる。本明細書で説明するいくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされたコンストラクトのＴ細胞への内在化率は、標的抗原を担持する標的細胞への内在化率よりも低い。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞への内在化率は、標的抗原を担持する標的細胞への内在化率よりも、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍低い。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＪｕｒｋａｔ細胞である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＥＧＦＲであり、コンストラクトはＴ細胞よりも標的細胞のほうに少なくとも１０〜５０倍多く内在化される。いくつかの実施形態で、標的抗原はＥＧＦＲであり、コンストラクトはＪｕｒｋａｔＴ細胞よりも標的細胞のほうに少なくとも１０〜５０倍多く内在化される。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤＨ３であり、コンストラクトはＪｕｒｋａｔＴ細胞よりも標的細胞のほうに少なくとも１０〜５０倍多く内在化される。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９であり、コンストラクトはＪｕｒｋａｔＴ細胞よりも標的細胞のほうに少なくとも１０〜５０倍多く内在化される。
【０１６７】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトがＴ細胞に及ぼす影響はまた、ヒト血液（ＰＢＭＣ）からのＴ細胞を、標的抗原を担持する標的細胞と一緒にまたはなしで、コンストラクトと一緒に培養し、培養物中に得られるＴ細胞サブ集団をＦＡＣＳにより分析してＴ細胞表面マーカーＰＤ１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ４５を検出することによって、評価することができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、実施例１４、実施例１５、または実施例１６のように実施される。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、阻害性ＰＤ１＋細胞の数を増加させない。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３−ＣＤ１９薬物コンジュゲートがもたらす阻害性（ＰＤ−１＋）Ｔ細胞の活性化は、ブリナツモマブよりも低い。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓ腫瘍Ｂ細胞の殺傷には高効力を、Ｊｕｒｋａｔ腫瘍Ｔ細胞の殺傷には低効力を示す。いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトのＢ細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれよりも高い。特定の実施形態では、ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトのＲａｍｏｓＢ細胞に対する効力は約０．５ｎＭであり、Ｔ細胞に対する効力は約２３ｎＭである。いくつかの実施形態では、標的細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも２倍高い。別の実施形態では、標的細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも４倍高い。別の実施形態では、標的細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも６倍高い。別の実施形態では、標的細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも８倍高い。別の実施形態では、標的細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも１０倍高い。別の実施形態では、標的細胞に対する効力は、Ｔ細胞に対するよりも少なくとも１５倍高い。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは切断可能リンカーを有しており、アッセイすると、非切断可能リンカーをもつ参照コンストラクトまたは薬物にコンジュゲートされていない参照コンストラクトよりもＴ細胞数を低下させない。
【０１７０】
薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトがＴ細胞に及ぼす影響は、実施例１８及び実施例１９で実施したように、インビボで評価することもできる。いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、ヒト化ＮＳＧマウスに０．１ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したとき、循環Ｔ細胞の数も脾臓Ｔ細胞の数も低下させなかった。いくつかの実施形態では、試験したコンストラクトは抗ＣＤ３−ＣＤ１９薬物コンジュゲートであった。いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、ヒト化ＮＳＧマウスの末梢血において、５日間にわたり、ＣＤ４５＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルに実質的に影響を及ぼさなかった。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトは、ＦＡＣＳ及び／または顕微鏡観察でアッセイすると、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞とＪｕｒｋａｔＴ細胞間のシナプス形成及び架橋が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、ブリナツモマブよりも低い、阻害性（ＰＤ−１＋）Ｔ細胞の活性化を示す。
【０１７２】
特定の実施形態では、アッセイは下記の実施例で説明するものである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する二重特異性抗原結合コンストラクトの機能的特徴を参照抗原結合コンストラクトと比較する。参照抗原結合コンストラクトが何であるかは、測定される機能的特徴または比較される相違点による。たとえば、例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９二重特異性抗原結合コンストラクトの機能的特徴を比較する場合、参照抗原結合コンストラクトは、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７及び／または抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３またはテプリズマブであり得る。他の実施形態では、参照抗原結合コンストラクトは、本明細書で説明するコンストラクト、たとえばｖ８９１（ブリナツモマブ）または二価抗ＣＤ１９（ｖ４３７１）である。いくつかの実施形態では、参照抗原結合コンストラクトは、薬物がコンジュゲートされていない同じバリアントであり、たとえば、ｖ１２０４３と、ＳＭＣＣリンカーでＤＭ１にコンジュゲートされているｖ１２０４３との比較である。
【０１７４】
抗体が、参照抗体たとえばＯＫＴ３またはＨＤ３７への結合をどの程度遮断するかは、ＯＫＴ３またはＨＤ３７抗体（参照抗体）の標的抗原への特異的結合を被験抗体が阻害または遮断することができる競合アッセイで、評価することができる（たとえばアッセイの例については、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０：１４９５，  １９９０；  Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：  １５５０−１５５８；米国特許第６，９４９，２４５号を参照されたい）。被験抗体は、競合結合アッセイで測定すると、過剰量の被験抗体（たとえば少なくとも２ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、または１００ｘ）が、たとえば少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％だけ参照抗体の結合を阻害または遮断する場合、参照抗体と競合する。競合アッセイで特定される被験抗体（遮断抗体）としては、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び立体障害を生じさせるほど参照抗体が結合するエピトープに十分近接した隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。
【０１７５】
たとえば、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトが抗原に結合する能力、または抗原への結合を別のポリペプチドと競う能力、またはＦｃ受容体及び／または抗アルブミン抗体に結合する能力をアッセイする一実施形態では、当該技術分野で知られている様々な免疫アッセイを使用することができ、限定ではないが、競合及び非競合のアッセイ・システムであって、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー免疫アッセイ（たとえばコロイド金、酵素、または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（たとえばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いるものが挙げられる。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体の標識を検出することによって、検出される。別の実施形態では、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することによって、検出される。さらなる実施形態では、二次抗体は標識されている。当該技術分野では免疫アッセイで結合を検出する多くの手段が知られており、それらは本発明の範囲内である。
【０１７６】
特定の実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトに含まれる抗原結合ドメインの結合パートナー（たとえば受容体またはリガンド）を特定する場合、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトによる該結合パートナーへの結合が、たとえば還元及び非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質親和性クロマトグラフィー、及び親和性ブロッティングなどの当該技術分野で周知の手段によって、アッセイされる。概要は、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５９：９４−１２３  （１９９５）を参照されたい。別の実施形態では、抗原結合コンストラクトタンパク質の生理学的相関物が、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトの抗原結合ポリペプチドコンストラクトの基体（複数可）に結合する能力を、当該技術分野で知られている技法によりルーチン的にアッセイすることができる。
【０１７７】
抗原結合コンストラクト−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本明細書の多くの実施形態では、抗原結合コンストラクトは薬物、たとえば毒素、化学療法剤、小分子治療剤、免疫修飾因子たとえばサイトカイン、または放射性同位体にコンジュゲートされている。ＡＤＣ（抗体−薬物コンジュゲートまたは抗原結合コンストラクト−薬物コンジュゲート）を調製する多くの方法が当該技術分野では知られており、たとえば米国特許第８，６２４，００３号（ポット方法）、同第８，１６３，８８８号（ワンステップ）、及び同第５，２０８，０２０号（ツーステップ方法）で説明されている。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、薬物は、マイタンシン、オーリスタチン、カリチアマイシン、またはそれらの誘導体から選択される。他の実施形態では、薬物は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されるマイタンシンである。さらなる例を以下で説明する。
【０１７９】
特定の実施形態では、抗原結合コンストラクトは、リンカーを介して薬物にコンジュゲートされている。リンカーは、切断可能または非切断可能であり得る。リンカーの非限定的な例を以下で説明する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、１つの薬物分子が抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされているが、他の実施形態では、複数の薬物分子が同じ抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされている場合もある。薬物対抗原結合コンストラクトの比（ＤＡＲ）は、たとえば、１．０〜６．０、または３．０〜５．０、または２．０〜４．０の範囲であり得る。本明細書で説明するいくつかの実施形態では、ＤＡＲは２．２〜３．５の範囲である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０である。
【０１８１】
特定の実施形態では、ＡＤＣは、一般式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ  （Ｉ）
（式中、Ａは本明細書で説明する抗原結合コンストラクトであり；Ｌはリンカーであり；Ｄは薬物であり；ｍは１〜約１０の整数であり、ｎは１〜約２０の整数である）を有する。特定の実施形態では、ｍは約１〜約５であり、または１〜２である。いくつかの実施形態では、ｍは１である。いくつかの実施形態では、ｎは１〜１０、たとえば、１〜８、２〜８、２〜６、または２〜４である。いくつかの実施形態では、Ｌは存在しない場合もある。
【０１８２】
薬物
ＡＤＣの薬物部分は、細胞分裂抑制性または細胞傷害性効果を有する化合物または部分であってもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、細胞傷害剤にコンジュゲートされている。「細胞傷害剤」という用語は、本明細書では、細胞の機能を阻害もしくは予防する、かつ／または細胞破壊をもたらす物質を指す。この用語には、放射性同位体（たとえば２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、及び１７７Ｌｕ）、化学療法剤、及び毒素、たとえば細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素、ならびにそれらの断片及び／またはバリアントが含まれるものとする。当業者であれば、これらの薬物のカテゴリーには重複するものもあり、したがって相互排除するものではないことを理解しよう。たとえば、毒素は、がん治療に使用できる化学物質という意味では、化学療法剤とみなすこともできる。いくつかの実施形態では、薬物は、自然発生する毒素のアナログまたは誘導体である。そのような自然発生する毒素の例としては、限定ではないが、マイタンシン、オーリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、ヘミアステリン、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアザペン、アマトキシン、カンプトテシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、脱グリコシル化リシンＡ（ｄｇＡ）、及びゲロニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、薬物は、ペプチジル足場を有する自然発生する毒素のアナログまたは誘導体である。そのような毒素の非限定的な例としては、オーリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、ヘミアステリン、及びアマトキシンが挙げられる。
【０１８３】
特定の実施形態では、ＡＤＣに含まれる薬物は、毒素、または毒素誘導体もしくはアナログであり、該毒素、誘導体、またはアナログは、微小管攪乱剤またはＤＮＡ修飾剤である。微小管攪乱剤の毒素の例としては、限定ではないが、マイタンシン、オーリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、ヘミアステリン、ならびにそれらのアナログ及び誘導体が挙げられる。ＤＮＡ修飾剤の毒素の例としては、限定ではないが、カリチアマイシン及び他のエンジイン抗生物質、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアザペン、アマトキシン、カンプトテシン、ならびにそれらのアナログ及び誘導体が挙げられる。
【０１８４】
マイタンシン
上述したように、いくつかの実施形態では、薬物はマイタンシン、またはマイタンシンのアナログもしくは誘導体（「マイタンシノイド」）である。例示的マイタンシノイドとしては、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、エムタンシン、Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン）、ＤＭ３（Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）マイタンシン）、及びＤＭ４（ラブタンシン、ソラブタンシン、Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）マイタンシン）が挙げられる（米国特許公開第２００９／０２０２５３６号を参照されたい）。他の自然発生する合成及び半合成マイタンシノイドの例は、Ｃａｓｓａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ５２（１）：１−２６、及び米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３０７，０１６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６４，８６６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３２２，３４８号、及び同第４，３７１，５３３号で説明されている。結合の種類に応じて、マイタンシン化合物の多くの位置が結合位置として有用であることがわかっている。たとえば、エステル結合を形成する場合はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位はすべて好適である。
【０１８５】
特定の実施形態では、ＡＤＣに含まれる薬物は、一般式（ＩＩ）：
2018524373.tif 000019
（式中、Ｙは−（ＣＲ２）ｍ−であり、各Ｒは独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ｍは１、２、または３であり、
2018524373.tif 000020
はリンカーＬの付着点を表す）を有するマイタンシノイドである（米国特許第５，２０８，０２０号、ＲＥ３９１５１、ＷＯ２００７／０５６５５０、及びＷｉｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ４９：４３９２−４４０８を参照されたい）。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ＡＤＣに含まれる薬物は、一般式（ＩＩ）（式中、Ｙは−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２である）を有するマイタンシノイドである。本明細書で説明するＡＤＣでは、マイタンシン薬物部分の全ステレオアイソマー、すなわちキラル炭素の立体配置ＲとＳのあらゆる組合せが意図される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ＡＤＣに含まれる薬物は、以下の立体化学（一般式（ＩＩＡ））：
2018524373.tif 000021
（式中、Ｙは一般式（ＩＩ）で先に定義したとおりである）を有するマイタンシノイドである。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＡＤＣに含まれる薬物は、一般式（ＩＩ）または（ＩＩＡ）（式中、Ｙは、−ＣＨ２ＣＨ２−（たとえばＤＭ１）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−（たとえばＤＭ３）、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−（たとえばＤＭ４）である）を有するマイタンシノイドである。いくつかの実施形態では、ＡＤＣに含まれる薬物は、一般式（ＩＩ）または（ＩＩＡ）（式中、Ｙは、−ＣＨ２ＣＨ２−（たとえばＤＭ１）または−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−（たとえばＤＭ４）である）を有するマイタンシノイドである。
【０１８９】
ドラスタチン及びオーリスタチン
いくつかの実施形態では、薬物はドラスタチンまたはオーリスタチン、たとえばオーリスタチンＥ（当該技術分野ではドラスタチン−１０の誘導体としても知られる）またはオーリスタチンＦ、またはそれらのアナログもしくは誘導体である。オーリスタチンは、たとえば、オーリスタチンＥとケト酸の間に形成されたエステルの場合もある。たとえばオーリスタチンＥを、パラアセチル安息香酸と反応させてオーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）を、またはベンゾイル吉草酸と反応させてオーリスタチンＥＶＢ（ＡＥＶＢ）を生成することができる。他の典型的なオーリスタチンとしては、オーリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、及びモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が挙げられる。例示的オーリスタチンの合成と構造は、米国特許第６，８８４，８６９号、同第７，０９８，３０８号、同第７，２５６，２５７号、同第７，４２３，１１６号、同第７，４９８，２９８号、及び同第７，７４５，３９４号で説明されており、これらすべての全文をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する。
【０１９０】
ドラスタチンまたはオーリスタチンは、該薬物分子のアミノ（Ｎ）末端またはカルボキシ（Ｃ）末端を介して抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされることができる。いくつかの実施形態では、薬物は、オーリスタチンまたはそのアナログもしくは誘導体であり、該薬物分子のアミノ（Ｎ）末端を介して抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされている。薬物分子のＮ末端を介するコンジュゲートに好適なオーリスタチンのアナログの例としては、米国特許第７，４９８，２９８号、及び同第７，６５９，２４１号で説明されているものが挙げられる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、薬物はＭＭＡＥまたはＭＭＡＦである。いくつかの実施形態では、薬物はＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、以下に示すように薬物分子のＮ末端を介して抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされており、
2018524373.tif 000022
は、リンカーＬへの付着点を示している。
2018524373.tif 000023
【０１９２】
いくつかの実施形態では、薬物はオーリスタチン、またはそのアナログもしくは誘導体であり、該薬物分子のＣ末端を介して抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされている。薬物分子のＣ末端を介するコンジュゲートに好適なオーリスタチンアナログの例としては、国際特許公開ＷＯ２００２／０８８１７２及び同ＷＯ２０１６／０４１０８２で説明されているものが挙げられる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、薬物は、一般式（ＩＩＩ）：
2018524373.tif 000024
（式中、
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ６アルキル、アリール、アリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ４〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びヘテロシクリルから選択され、それぞれＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、アミノ、アミノ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ−アリール、アミノ−Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、アリール、カルボキシアミド、カルボキシル、シアノ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、及びチオ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ３）−であるか、またはＸは不存在であり；
Ｒ３は、アリール、ヘテロアリール、及びＣ３〜Ｃ７シクロアルキルから選択され、それぞれアミノ及びヒドロキシルから選択される１置換基で置換されていてもよく、
Ｒ４とＲ５は、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）のオーリスタチンである。
【０１９４】
一般式（ＩＩＩ）に関しては、「アリール」という用語は、６〜１２員単環または二環炭化水素環系（少なくとも１つの環が芳香族）から誘導される遊離基を指し、「アリール−アルキル」という用語は、１つのアリール置換基で置換されているアルキル基を指し、「シクロアルキル−アルキル」という用語は、１つのシクロアルキル置換基で置換されているアルキル基を指し、「ヘテロアリール」という用語は、６〜１２員単環または二環環系（ここで少なくとも１つの環原子がＯ、Ｎ、またはＳなどのヘテロ原子であり、少なくとも１つの環が芳香族である）から誘導される遊離基を指し、「ヘテロアリール−アルキル」という用語は、１つのヘテロアリール置換基で置換されているアルキル基を指し、「ヘテロシクリル」という用語は、３〜１２員単環または二環非芳香族環系（ここで少なくとも１つの環原子がＯ、Ｎ、またはＳなどのヘテロ原子である）から誘導される遊離基を指し、「アルコキシカルボニル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキルを指し、「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＨ−アルキルを指し、「アミノ−アルキル」という用語は、１つのアミノ置換基で置換されているアルキル基を指し、「アミノ−アリール」という用語は、１つのアミノ置換基で置換されているアリール基を指し、「アミノ−シクロアルキル」という用語は、１つのアミノ置換基で置換されているシクロアルキル基を指し、「カルボキシアミド」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指し、「ハロアルキル」という用語は、１つ以上のハロ置換基で置換されているアルキル基を指し、「ハロアルコキシ」という用語は、−Ｏ−ハロアルキルを指し、「チオ−アルキル」という用語は、−Ｓ−アルキルを指す。
【０１９５】
特定の実施形態では、薬物は一般式（ＩＩＩ）のオーリスタチンであり、Ｒ２基を介して抗原結合部分にコンジュゲートされている。
【０１９６】
ツブリシン
いくつかの実施形態では、薬物はツブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）である。自然発生するツブリシンとしては、たとえばツブリシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、及びＺが挙げられる。
2018524373.tif 000025
ツブリシンＡ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＢ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＣ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＤ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２；Ｒ３＝Ｈ
ツブリシンＥ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２；Ｒ３＝Ｈ
ツブリシンＦ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３；Ｒ３＝Ｈ
ツブリシンＧ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＨ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３；Ｒ３＝Ｈ
ツブリシンＩ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＵ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ツブリシンＶ：Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ツブリシンＷ：Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＸ：Ｒ１＝Ａｃ；Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＯＨ
ツブリシンＺ：Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＯＨ
【０１９７】
治療に有用なツブリシンのアナログ及び誘導体も説明されている（たとえば国際特許公開ＷＯ２０１４／１２６８３６及び米国特許公開第２０１６／０１３０２９９号を参照されたい）。
【０１９８】
ツブリシン、またはツブリシンアナログもしくは誘導体は、遊離ヒドロキシル基により抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされていてもよく、または、米国特許公開第２０１６／０１３０２９９号で説明されているように、コンジュゲートに用いることができるアミン基を含むように修飾されていてもよい。
【０１９９】
ヘミアステリン
いくつかの実施形態では、薬物は、ヘミアステリン、またはそのアナログもしくは誘導体である。抗有糸分裂活性をもつ様々なヘミアステリンのアナログ及び誘導体が説明されている（たとえば、国際特許公開ＷＯ１９９６／３３２１１及び同ＷＯ２００４／０２６２９３を参照されたい）。米国特許第７，５７９，３２３号は、強力な抗有糸分裂活性があり臨床試験でがん治療について評価されている、ＨＴＩ−２８６として言及されるヘミアステリンアナログを説明している。特定の実施形態では、薬物はＨＴＩ−２８６またはその誘導体である。
2018524373.tif 000026
【０２００】
ヘミアステリンアナログのさらなる例が、国際特許公開ＷＯ２０１４／１４４８７１で説明されている。
【０２０１】
特定の実施形態では、薬物は、一般式（ＩＶ）：
2018524373.tif 000027
（式中、
Ｒ２６は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、及び置換されていてもよいヘテロアリールから選択され；
Ｒ２７は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、及び置換されていてもよいヘテロアリールから選択され；
Ｒ１６とＲ１７は、それぞれ独立してＨまたはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ１８はＣ１〜６アルキルまたは−ＳＨである）を有するヘミアステリンアナログまたは誘導体である。
【０２０２】
一般式（ＩＶ）に関しては、「アルキル」という用語は、炭素原子と水素原子だけからなる、飽和または不飽和の、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の置換基を指し、「アルキルアミノ」という用語は、式−ＮＨＲａまたは−ＮＲａＲａ（各Ｒａは独立して、１〜１２個の炭素原子を有するアルキル置換基である）の置換基を指し、「シクロアルキル」という用語は、炭素原子と水素原子だけからなる、縮合または架橋環系を含む場合もある、３〜１０個の炭素原子を有する安定な非芳香族単環または多環炭化水素置換基を指し、「アリール」という用語は、水素、６〜１８個の炭素原子、及び少なくとも１つの芳香族環を含む炭化水素環置換基を指し、「ヘテロシクリル」という用語は、２〜１２個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、及びＳから選択される１〜６個のヘテロ原子からなる安定な３〜１８員非芳香族環置換基を指し、「ヘテロアリール」という用語は、水素原子、１〜１３個の炭素原子、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１〜６個のヘテロ原子、及び少なくとも１つの芳香族環を含む５〜１４員環系置換基を指す。
【０２０３】
特定の実施形態では、薬物は、一般式（ＩＶ）のヘミアステリンであり、Ｒ２６置換基を介して抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、薬物は、一般式（ＩＶ）のヘミアステリンであり、Ｒ２７置換基を介して抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされている。
【０２０４】
カリチアマイシン
いくつかの実施形態では、薬物は、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、またはそのアナログもしくは誘導体である。抗原結合コンストラクトへのコンジュゲートに好適なカリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）の様々なアナログ及び誘導体が説明されている（たとえば、国際特許公開ＷＯ２０１５／０６３６８０、米国特許第５，７７３，００１号、同第５，７１４，５８６号、及び同第５，７７０，７０１号を参照されたい）。
【０２０５】
デュオカルマイシン
いくつかの実施形態では、薬物は、デュオカルマイシン、またはそのアナログもしくは誘導体である。自然発生するデュオカルマイシンとしては、たとえば、デュオカルマイシンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、及びＳＡ、ならびにＣＣ−１０６５が挙げられる。デュオカルマイシンの様々なアナログ及び誘導体が説明されており、アドゼレシン、ビゼレシン、及びｃｅｎｔａｎａｍｙｃｉｎが挙げられる。他のアナログ及び誘導体が、米国特許第４，９１２，２２７号、同第５，０７０，０９２号、同第５，０８４，４６８号、同第５，３３２，８３７号、同第５，６４１，７８０号、同第５，７３９，３５０号、及び同第８，８８９，８６８号で説明されている。デュオカルマイシン分子上の様々な基を、抗原結合コンストラクトへコンジュゲートできるように修飾することができる。非限定的な例が、Ｅｌｇｅｒｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  １２：１８１３−１８３５で提供されている。
【０２０６】
ピロロベンゾジアザペン
いくつかの実施形態では、薬物は、ピロロベンゾジアザペン（ＰＢＤ）、またはそのアナログもしくは誘導体、たとえばＰＢＤダイマーである。様々なＰＢＤダイマーが説明されており、たとえば米国特許第６，８８４，７９９号、同第７，０４９，３１１号、同第７，５１１，０３２号、同第７，５２８，１２６号、同第７，５５７，０９９号、及び同第９，０５６，９１４号で説明されているものが挙げられる。いくつかの実施形態では、薬物は、ＰＢＤダイマー、またはそのアナログもしくは誘導体である。ＰＢＤダイマーの構造は、ＤＮＡの結合部位での適合（ｆｉｔ）を向上させると考えられている。ＰＢＤダイマーは、該ＰＢＤダイマー上の５員ピロロ環、ＰＢＤ単位間のテザー、Ｎ１０−Ｃ１１イミン基、またはＣ２位などのいくつかの可能な結合部位のうちの１つによって、抗原結合コンストラクトにコンジュゲートされることができる（たとえば、国際特許公開ＷＯ２００７／０８５９３０、同ＷＯ２００９／０１６５１６、同ＷＯ２０１１／１３０５９８、同ＷＯ２０１１／１３０６１３及び同ＷＯ２０１１／１３０６１６；米国特許公開第２０１１／０２５６１５７号を参照されたい）。
【０２０７】
アマトキシン
いくつかの実施形態では、薬物は、アマトキシン、たとえばα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、もしくはε−アマニチン、またはそのアナログもしくは誘導体である。いくつかの実施形態では、薬物は、α−アマニチン、またはそのアナログもしくは誘導体である。アマトキシンは、８つのアミノ酸で構成されている環状ペプチドなので、いくつかの可能な結合部位を示す。様々なアマトキシン及びそのアナログが説明されている（たとえば、欧州特許ＥＰ１  ８５９  ８１１号、米国特許第９，２３３，１７３号、及び国際特許公開ＷＯ２０１４／０４３４０３を参照されたい）。
【０２０８】
カンプトテシン
いくつかの実施形態では、薬物は、カンプトテシン（ＣＰＴ）、またはそのアナログもしくは誘導体、たとえばイリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、１０−ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ、９−アミノカンプトテシン、または９−ニトロカンプトテシンである。ＣＰＴアナログ及び誘導体の他の例としては、７−ブチル−１０−アミノ−カンプトテシン、及び７−ブチル−９−アミノ−１０，１１−メチレンジオキシ−カンプトテシン（米国特許公開第２００５／０２０９２６３号を参照されたい）、ならびにＢｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９），  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ２０（６）：１２４２−１２５０で説明されているような、これらの化合物のアニリン含有誘導体が挙げられる。カンプトテシン、及びそのアナログまたは誘導体の抗原結合コンストラクトへのコンジュゲートは、薬物分子の様々な基の修飾により実現することができる。非限定的な例が、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９），  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ２０（６）：１２４２−１２５０  ａｎｄ  Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １１：２２４−２３４で提供されている。
【０２０９】
化学療法剤
いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、化学療法剤にコンジュゲートされる。例としては、限定ではないが、シスプラチン及びラパチニブが挙げられる。「化学療法剤」はがん治療に有用な化合物である。
【０２１０】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ｂｅｎｚｏｄｏｐａ、カルボコン、ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ、及びｕｒｅｄｏｐａなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、及びトリメチロールオメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）などのエチレンイミン及びメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ、アザセリン、ブレオマイシン、ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ、カリチアマイシン、ｃａｒａｂｉｃｉｎ、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ、ピュロマイシン、ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ、ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの副腎皮質ホルモン合成阻害剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；ｅｄａｔｒａｘａｔｅ；ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ；デメコルチン；ジアジクオン；ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２’，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキサン、たとえばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）及びｄｏｘｅｔａｘｅｌ（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ社、仏国アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及びそれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害する働きのある抗ホルモン剤も含まれ、たとえば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）などの抗エストロゲン；及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；及びそれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン（ダウノマイシンとしても知られている）、ネモルビシンなどのアントラサイクリン、またはそれらのアナログもしくは誘導体である。アントラサイクリン分子内の様々な基を、抗原結合コンストラクトへのコンジュゲートのために修飾することができる。たとえば、抗体へのコンジュゲートのためのダウノルビシン及びドキソルビシンの誘導体化が説明されている（たとえば、Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １３：４７７−５２３；米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）。
【０２１２】
リンカー
いくつかの実施形態では、薬物は、抗原結合コンストラクト、たとえば抗体に、リンカーによって連結されている。リンカーは、１種以上の薬物を抗原結合コンストラクトに連結できる二官能性または多官能性部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１種の薬物を抗原結合コンストラクト上の１つの部位に連結するように二官能性（または一価）の場合がある。いくつかの実施形態では、リンカーは、２種以上の薬物を抗原結合コンストラクト上の１つの部位に連結するように多官能性（または多価）の場合がある。多官能性リンカーは、いくつかの実施形態では、１種の薬物を抗原結合コンストラクト上の２つ以上の部位に連結するのに用いられる場合もある。
【０２１３】
抗体または他の抗原結合コンストラクトへのリンカーの付着は多様な方法で、たとえば酸化糖に還元的に結合する表面リジンにより、及び鎖間ジスルフィド結合の還元により遊離するシステイン残基により、実現することができる。あるいは、抗原結合コンストラクトへのリンカーの付着は、さらなるシステイン残基を含むように（たとえば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，４５５，６２２号、及び同第９，０００，１３０号を参照されたい）、または反応性ハンドルを提供する非天然アミノ酸、たとえばセレノメチオニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ホルミルグリシン、またはｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（たとえば、Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８：１２０４７−１２０５７；  Ａｘｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  ＰＮＡＳ  １０９：１６１０１−１６１０６；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  ＰＮＡＳ  １０６：３０００−３００５；  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ２５：３５１−３６１を参照されたい）を含むように抗原結合コンストラクトを修飾することによって実現させて、部位特異的なコンジュゲートを可能にすることもできる。
【０２１４】
リンカーは、抗原結合コンストラクト上の標的基（単数または複数）と反応できる官能基と、薬物上の標的基と反応できる１つ以上の官能基とを含む。好適な官能基は当該技術分野で知られており、たとえば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｇ．Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  ２０１３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）で説明されているものが挙げられる。遊離システインまたはチオールと反応する官能基の非限定的な例としては、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセチル、活性化エステルたとえばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸クロリド、スルホニルクロリド、イソシアナート、及びイソチオシアナートが挙げられる。ここではまた、Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２：１０５９−１０６２でも説明されている「自己安定化」マレイミドも有用である。表面リジン及びアミンと反応する官能基の非限定的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）エステルまたはスルホ−ＮＨＳエステルなどの活性化エステル、Ｔｒａｕｔ試薬などのイミドエステル、イソチオシアナート、アルデヒド、及びジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）などの酸無水物が挙げられる。他の例としては、スクシンイミド−１，１，３，３−テトラ−メチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）、及びベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）が挙げられる。抗原結合コンストラクトまたは薬物上の求電子基（アルデヒドまたはケトンカルボニル基など）と反応できる官能基の非限定的な例としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシラート、及びアリールヒドラジドが挙げられる。
【０２１５】
特定の実施形態では、抗体結合コンストラクト上の２つの鎖間システインの架橋を可能にする官能基を含むリンカーが用いられる場合があり、たとえばＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ（商標）リンカー（Ｂａｄｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２５：１１２４−１１３６）、ジチオマレイミド（ＤＴＭ）リンカー（Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  １２：３９８６−３９９８）、ジチオアリール（ＴＣＥＰ）ピリダジンジオンを含むリンカー（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ７：７９９−８０２）、またはジブロモピリダジンジオンを含むリンカー（Ｍａｒｕａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１５）  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６：６６４５）などが挙げられる。
【０２１６】
薬物を抗体または他の抗原結合コンストラクトに連結する多様なリンカーが当該技術分野では知られており、ヒドラゾンを含むリンカー、ジスルフィドを含むリンカー、及びペプチドを含むリンカーが挙げられる。
【０２１７】
好適なリンカーは一般に、細胞内部よりも外部の条件に対して化学的により安定しているが、薬物が選択的薬物つまり標的をもつ薬物であって正常細胞に対する毒性は低い、などの特定の状況では、安定性が低いリンカーも考慮に入れることができる。好適なリンカーとしては、たとえば切断可能な、及び非切断可能なリンカーが挙げられる。切断可能リンカーは一般に、細胞内条件下での、たとえばリソソームプロセスによる切断が可能である。例としては、プロテアーゼ感受性、酸感受性、または還元感受性のリンカーが挙げられる。一方、非切断可能リンカーは、細胞内の抗体分解に依存し、その典型的な結果として、アミノ酸−リンカー−細胞毒素部分が解除される。
【０２１８】
好適な切断可能リンカーとしては、たとえば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼで切断可能なペプチド含有リンカーが挙げられる。例示的実施形態では、リンカーは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）リンカーなどのジペプチド含有リンカーの場合がある。リンカーに含まれる好適なジペプチドの他の例としては、
2018524373.tif 000028
が挙げられる。いくつかの実施形態では、トリペプチドＭｅｔ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ、（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓもしくは（Ｄ）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、またはテトラペプチドＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＧｌｙもしくはＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕなど、リンカーはもっと長いペプチド配列を有する場合もある。
【０２１９】
好適な切断可能リンカーとしては、ジスルフィド含有リンカーもある。ジスルフィド含有リンカーの例としては、限定ではないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＢＤ）、及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＢＤ）が挙げられる。ジスルフィド含有リンカーは、リンカーの細胞外安定性を高めるために、任意選択で、たとえばジェミナルなジメチル基の挿入など、さらなる基を含んで、ジスルフィド結合に隣接する立体障害を提供することができる。他の好適なリンカーとしては、特定のｐＨでまたはｐＨ範囲で加水分解可能な、ヒドラゾンリンカーなどのリンカーが挙げられる。これらの官能基の組合せを含むリンカーも有用であり得、たとえば、ヒドラゾンとジスルフィド両方を含むリンカーが当該技術分野では知られている。
【０２２０】
切断可能リンカーのさらなる例は、β−グルクロニド（リソソーム及び腫瘍間質に存在する酵素、β−グルクロニダーゼで切断可能）を含むリンカーである（たとえば、Ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  ８：１３９１−１４０３を参照されたい）。
【０２２１】
切断可能リンカーは、さらに任意で、自壊性及び自己脱離性の基、ストレッチャー、または親水性部分などの１つ以上の追加の官能基を含んでいてもよい。
【０２２２】
リンカーに用いられる自壊性及び自己脱離性基としては、たとえば、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）基及びｐ−アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）基、及びメチル化エチレンジアミン（ＭＥＤ）が挙げられる。自壊性基の他の例としては、限定ではないが、ＰＡＢＣ基やＰＡＢＥ基と電子的に類似の芳香族化合物、たとえばヘテロ環状誘導体、たとえば米国特許第７，３７５，０７８号で説明されている２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体が挙げられる。他の基の例としては、アミド結合加水分解で環化する基、たとえば置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３−２２７）及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５５：５８６７−５８７７）が挙げられる。自壊性／自己脱離性基は、単独または組合せで、ペプチドを含むリンカーに含まれることが多いが、他のタイプのリンカーにも含まれることがある。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上の自壊性及び自己脱離性基、たとえば、１つのＰＡＢＣ基、１つのＰＡＢＥ基、または１つのＰＡＢＣ基もしくはＰＡＢＥ基と１つのＭＥＤの組合せを含む場合がある。
【０２２３】
ＡＤＣのリンカーで用いることができるストレッチャーとしては、たとえば、アルキレン基、及び脂肪酸、二酸、アミン、またはジアミンをベースにしたジグリコラート、マロナート、カプロアート、カプロアミドなどのストレッチャーが挙げられる。他のストレッチャーとしては、たとえば、グリシンをベースにしたストレッチャー、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）ストレッチャーが挙げられる。ＰＥＧ及びｍＰＥＧストレッチャーも親水性部分として機能し、特に疎水性薬物では有用であり得るが、いくつかの実施形態では、他の薬物とのリンカーでの使用も意図されている。
【０２２４】
特定の実施形態では、本開示のＡＤＣに含まれるリンカーは、一般式（ＶＩ）：
2018524373.tif 000029
（式中、
Ｚは、抗原結合コンストラクト上の標的基と反応できる官能基であり；
Ｓｔｒはストレッチャーであり；
ＡＡ１とＡＡ２は、それぞれ独立してアミノ酸であり、ここでＡＡ１−［ＡＡ２］ｍはプロテアーゼ切断部位を形成しており；
Ｘは自壊性基であり；
Ｄは薬物であり；
ｎは０または１であり；
ｍは１、２、または３であり、
ｏは０、１、または２である）の、ペプチドを含むリンカーである。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｚは
2018524373.tif 000030
である。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｓｔｒは
2018524373.tif 000031
であり、
式中、
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｐは、２〜１０の整数であり、
ｑは、１〜１０の整数である。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｓｔｒは、
2018524373.tif 000032
であり、
式中、ｐとｑは、上記で定めたとおりである。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｓｔｒは、
2018524373.tif 000033
であり、
式中、ｐは、２〜６の整数であり、
ｑは、２〜８の整数である。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、
2018524373.tif 000034
から選択される。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
ｍは１である（すなわちＡＡ１−［ＡＡ２］ｍはジペプチドである）。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、及びＴｒｐ−Ｃｉｔから選択されるジペプチドである。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
各Ｘは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、ｐ−アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、及びメチル化エチレンジアミン（ＭＥＤ）から独立して選択される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
ｎは１である。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
ｏは、１または２である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、
Ｚは
2018524373.tif 000035
であり；
Ｓｔｒは
2018524373.tif 000036
であり、式中、ｐは２〜６の整数であり、ｑは２〜８の整数であり；
ｍは１であり、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍはＶａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、及びＴｒｐ−Ｃｉｔから選択されるジペプチドであり；
各Ｘは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、ｐ−アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、及びメチル化エチレンジアミン（ＭＥＤ）から独立して選択される。
ｎは１であり、
ｏは１または２である。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド含有リンカーであり、ＡＤＣは、一般式（ＶＩＩ）：
2018524373.tif 000037
（式中、
Ａは抗原結合コンストラクトであり；
Ｄは薬物であり；
Ｙは、−（ＣＨ２）ｐ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−であり、式中、ｐとｑは、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり；
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｎは１、２、または３であり、
式中、
2018524373.tif 000038
は、リンカーと抗原結合コンストラクト上の表面リジンのε−アミノ基の間に形成されたアミド結合を表している）を有している。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）において、
ｐとｑは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）において、
Ｙは−（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐは１〜４の整数である。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）において、
各Ｒは、独立して、ＨまたはＭｅである。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）において、
ｎは１または２である。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）において、
Ｙは−（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐは１〜４の整数であり；
各Ｒは、独立して、ＨまたはＭｅであり、
ｎは１または２である。
【０２４２】
いくつかの実施形態で本開示のＡＤＣに用いることができる、広く使用されている切断可能リンカーの例としては、限定ではないが、ＳＰＢＤ、スルホ−ＳＰＢＤ、ヒドラゾン、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、マレイドカプロイル（ＭＣまたはｍｃ）、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、ｍｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、またはｍｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣを含むリンカーが挙げられる。
【０２４３】
薬物を標的部分に連結する、本開示のＡＤＣで有用であり得る様々な非切断可能リンカーが、当該技術分野で知られている。非切断可能リンカーの例としては、細胞結合剤と反応するＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分ならびに薬物と反応するマレイミドまたはハロアセチルを含む部分、あるいはその逆を有するリンカーが挙げられる。そのような非切断可能リンカーの例は、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）に基づく。スルホ−ＳＭＣＣのコンジュゲーションは、典型的には、薬物部分のスルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して生じ、スルホ−ＮＨＳエステルは（リジン及びタンパク質またはペプチドのＮ末端に見られる）１級アミンへの反応性がある。そのようなリンカーの他の非限定的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロアート）（「長鎖」ＳＭＣＣまたはＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチラート（ＳＭＰＢ）、及びＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート（ＰＭＰＩ）を含むものが挙げられる。他の例としては、たとえば、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセタート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセタート（ＳＢＡ）、及びＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオナート（ＳＢＡＰ）などのハロアセチルを含む官能基を含むものが挙げられる。
【０２４４】
非切断可能リンカーの他の例としては、マレイミドカプロイル（ＭＣ）などのマレイミドカルボン酸が挙げられる。
【０２４５】
特定の実施形態では、抗原結合コンストラクトは、国際特許公開ＷＯ２０１５／０９５９５３で説明されているようなスルホンアミド含有リンカーを介して薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、一般式（ＶＩＩＩ）：
2018524373.tif 000039
（式中、
Ｒは、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいヘテロアリール、−ＣＯＲ２７−、−ＣＳＲ２７−、−ＯＲ２７−、及び−ＮＨＲ２７−から選択され、各Ｒ２７は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、及び置換されていてもよいヘテロアリールから独立して選択され；
Ｐ３は、薬物または薬物の一部分であり；
Ｌ３は、リンカーまたはリンカーの一部分であり；
Ａは抗原結合コンストラクトである）を有するリンカーを介して薬物にコンジュゲートされている。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、一般式（ＩＸ）：
2018524373.tif 000040
（式中、−Ｌ３−Ａは、構造：
2018524373.tif 000041
を有し、
Ｐ３は、薬物の残りの部分であり；
Ｒ’に結合している−ＮＨ−基は、（ＡＡ）１とペプチド結合を形成し（接合部ペプチド結合またはＪＰＢ）；
Ｒ’は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいヘテロアリール、−ＣＯＲ２７−、−ＣＳＲ２７−、−ＯＲ２７−、及び−ＮＨＲ２７−から選択され、各Ｒ２７は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、及び置換されていてもよいヘテロアリールから独立して選択され；
各ＡＡは独立してアミノ酸であり、ここで（ＡＡ）１−（ＡＡ）ｘは一緒に、ＪＰＢの切断を促進できるアミノ酸配列を含み；
ｘは０〜２５の整数であり；
Ｌ’はリンカーの残りの部分であるか、または存在せず；
Ａは抗原結合コンストラクトである）を有するリンカーを介して薬物にコンジュゲートされている。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、切断可能リンカー、たとえばＳＰＢＤリンカーまたはマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ）リンカーを介して、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、非切断可能リンカー、たとえばＳＭＣＣまたはスルホ−ＳＭＣＣを用いて形成されたＭＣＣリンカーを介して、薬物にコンジュゲートされている。
【０２４８】
所与のＡＤＣにとって適切なリンカーの選択は、当分野の知識があって、抗原結合コンストラクトへの付着部位、薬物の構造上の制約、及び薬物の疎水性などの関連要因を考慮する当業者には容易である（たとえばＮｏｌｔｉｎｇ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１３，  Ｄｕｃｒｙ  （Ｅｄ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒの概説を参照されたい）。多数の特異的リンカー−毒素の組合せが記述されており、特定の実施形態では、ＡＤＣを調製するために本明細書で説明する抗原結合コンストラクトと一緒に用いることができる。例としては、限定ではないが、ＭＭＡＥやＭＭＡＦなどのオーリスタチン、ＳＮ−３８などのカンプトテシン、デュオカルマイシン、及びＰＢＤダイマーと組みあわせた切断可能なペプチド含有リンカー；オーリスタチンＭＭＡＦ及びＭＭＡＥと組み合わせた非切断可能なＭＣ含有リンカー；カリチアマイシン及びドキソルビシンと組み合わせた酸不安定性のヒドラゾン含有リンカー；ＤＭ１やＤＭ４などのマイタンシノイドと組み合わせたジスルフィド含有リンカー、ならびにマイタンシノイドＤＭ１と組み合わせたビス−マレイミド−トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）含有リンカーが挙げられる（たとえば、Ｐｅｔｅｒｓ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，  （２０１５）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ｅ００２２５；  Ｄｏｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９：３５−６５；米国特許公開第２０１５／０３７４８４７号を参照されたい）。
【０２４９】
ＡＤＣの調製
ＡＤＣは、当業者に知られている有機化学の反応、条件、及び試薬を用いて、当該技術分野で知られているいくつかのルートのうちの一つによって調製することができる（たとえば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｇ．Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  ２０１３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。たとえば、（１）抗体の求核基または求電子基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合により抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成し、次いで活性化された薬物部分Ｄと反応させること；または（２）薬物部分の求核基または求電子基をリンカー試薬と反応させて、共有結合により薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成し、次いで抗体の求核基または求電子基と反応させることにより、コンジュゲーションを実現することができる。コンジュゲーションの方法（１）及び（２）は、本明細書で説明するＡＤＣを調製するために、多様な抗体、薬物部分、及びリンカーと一緒に用いることができる。様々な調製済みリンカー、リンカー成分、及び毒素は市販されている場合もあるし、または標準的な合成有機化学の技法により調製することもできる（たとえば、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｍａｒｃｈ，  ２００６，  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ）；  Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６７：１８６６−１８７２；  Ｆｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ７：１８０−１８６；  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｇ．Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  ２０１３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。さらに、選択された抗原結合コンストラクトとの反応に好適な予め形成された薬物−リンカーも多数市販されており、たとえば、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、またはデュオカルマイシンＳＡを含むリンカー−毒素がＣｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＬａｂｓ社（ニューヨーク州シャーリー）から入手できる。
【０２５０】
ＡＤＣの調製法のいくつかの具体的な例が当該技術分野では知られており、米国特許第８，６２４，００３号（ポット方法）、同第８，１６３，８８８号（ワンステップ）、及び同第５，２０８，０２０号（ツーステップ方法）で説明されている。他の方法も当該技術分野では知られており、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１３，  Ｄｕｃｒｙ  （Ｅｄ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒで説明されているものが挙げられる。さらに、Ｌｏｎｚａ社（ニュージャージー州アレンデール）、Ａｂｚｅｎａ  ＰＬＣ社（英国ケンブリッジ）、ＡＤＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（英国セントアサフ）、Ｂａｘｔｅｒ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、イリノイ州ディアフィールド）、及びＰｉｒａｍｅｌ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（英国グランジマウス）など各社の様々な抗体−薬物コンジュゲート関連サービスを利用することもできる。
【０２５１】
抗原結合コンストラクトにコンジュゲートした薬物の平均数（薬物抗体比、またはＤＡＲ）は、ＵＶ／ＶＩＳ分光分析、ＥＬＩＳＡに基づく技法、クロマトグラフィー法、たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＳ）、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどの標準的な技法により決定できる。さらに、薬物連結体の分布（たとえば、薬物を０（ゼロ）種、１種、２種、３種、その他含有する抗原結合コンストラクトの割合）も任意で分析することができる。そのような分布を測定する様々な技法が当該技術分野では知られており、（クロマトグラフィー分離ステップを伴うかまたは伴わない）ＭＳ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、または等電点ゲル電気泳動（ＩＥＦ）（たとえば、Ｗａｋａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  ｍＡｂｓ  ３：１６１−１７２を参照されたい）が挙げられる。
【０２５２】
薬学的組成物
本明細書では、本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトを含む薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、コンストラクトと薬学的に許容される担体とを含む。
【０２５３】
「薬学的に許容される」という用語は、動物、具体的にはヒトでの使用が、連邦政府または州政府の監理当局によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水や油などの滅菌済みの液体の場合があり、これには石油、動物、植物由来のまたは合成の油、たとえば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油なども含まれる。いくつかの態様では、担体は天然には存在しない人工の担体である。薬学的組成物が静脈内投与されるときは、担体として水を使用する場合がある。生理食塩水、デキストロース水溶液、及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射液用に用いることができる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望により、組成物は、少量の湿潤剤か乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含む場合がある。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続放出剤などの形態をとり得る。組成物は、一般的な結合剤及び担体たとえばトリグリセリドと一緒に坐薬として製剤される場合がある。経口剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含む場合がある。好適な薬学的担体の例がＥ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ著"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"で説明されている。そのような組成物は、好ましくは精製された形態の治療有効量の化合物を好適な量の担体とともに含有して、患者に適切に投与できる形態とされている。製剤は投与モードに合わせるべきである。
【０２５４】
特定の実施形態では、コンストラクトを含む組成物は、人間の静脈内投与用の薬学的組成物のルーチン手順にしたがい製剤される。一般に、静脈内投与用の組成物は、滅菌済み等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤や、注射部位の痛みを和らげるリグノカインなどの局所麻酔剤も含む場合がある。一般に、各成分は別々に、または単位剤形中に混合されて、たとえば、凍結乾燥粉末として、または水を含まない濃縮製剤として、活性剤の量を記したアンプルやサシェなどの気密容器内に密封されて供給される。組成物を点滴投与する場合は、滅菌医薬品等級の水または食塩水を収容した点滴瓶を用いて投薬することができる。組成物を注射投与する場合は、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを準備して、投与前に成分が混合できるようにしてもよい。
【０２５５】
特定の実施形態では、本明細書で説明する組成物は、中性または塩の形態で製剤される。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される陰イオンを用いて形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される陽イオンを用いて形成される塩が挙げられる。
【０２５６】
治療方法
本明細書では、疾患または障害を治療する方法も説明し、該方法は、そのような治療、予防、または寛解が望ましい対象に、該疾患または障害を治療し、予防し、または寛解させる効果がある量の本明細書で説明する抗原結合コンストラクトを投与することを含む。
【０２５７】
障害と疾患は、交換可能に用いられ、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトまたは方法での治療の恩恵を受けるあらゆる状態を指す。これには慢性及び急性の障害または疾患が含まれ、哺乳類をその障害に罹りやすくする病理学的状態も含まれる。いくつかの実施形態では、障害はがんである。
【０２５８】
「対象」という用語は、治療、観察、または実験の対象である動物を指す。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物（たとえばイヌ、ネコなど）、家畜（たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験動物（たとえばラット、マウス、モルモットなど）の場合がある。
【０２５９】
「哺乳類」という用語は、本明細書では、限定ではないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含む。
【０２６０】
「治療」とは、治療される個体または細胞が辿る自然の経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防としてでも、臨床的病態経過の途中でも、実施され得る。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発の予防、症状軽減、疾患のあらゆる直接的または間接的な病態結果の軽減、転移予防、疾患進行率の低下、疾患状態の寛解または緩和、及び予後の軽快または改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、疾患または障害の発生を遅らせるのに用いられる。一実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクト及び方法は、腫瘍縮小をもたらす。一実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクト及び方法は、腫瘍／がんの増殖阻害をもたらす。
【０２６１】
治療の望ましい効果としては、限定ではないが、疾患の発症または再発の予防、症状軽減、疾患のあらゆる直接的または間接的な病態結果の軽減、転移予防、疾患進行率の低下、疾患状態の寛解または緩和、及び予後の軽快または改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明するコンストラクトは、疾患の発生を遅らせるか、または疾患の進行を緩慢にするのに用いられる。
【０２６２】
「有効量」という用語は、本明細書では、投与されているコンストラクトの、上記の方法のゴールを達成する、たとえば治療中の疾患、状態、または障害の１つ以上の症状をある程度軽減する量を指す。治療用タンパク質の異常発現及び／または活性に関連する疾患または障害の治療、阻害、及び予防に効果のある、本明細書で説明する組成物の量は、標準的な臨床技法により決定することができる。さらに、インビトロのアッセイを任意で用いて、最適な用量範囲の特定に役立てることもできる。製剤に用いる正確な用量は、投与経路や、疾患または障害の重症度にも左右されるので、医師の判断及び患者ごとの状況により決定すべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの実験系から導かれた用量応答曲線から推定される。
【０２６３】
治療用途
一態様では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクト及び薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、抗体治療に用いられ、該治療には、抗原結合コンストラクト、または抗原結合コンストラクトをコードする核酸を患者に投与して１種以上の疾患、障害、または状態を治療することが含まれる。そのような障害、疾患、及び状態としては、限定ではないが、（血液、固形腫瘍、または転移性の）がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染した宿主の細胞表面に抗原を発現させる病原体、たとえばウイルス、細菌、寄生虫、または真菌による疾患が挙げられる。これらのコンストラクトで有用な標的を表ＬＬに記載する。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、該コンストラクトが投与される対象のＴ細胞を実質的に枯渇させない。本明細書では、Ｔ細胞を「実質的に枯渇させる」とは、Ｔ細胞数を投与前の数の約７５％よりも少ない、約５０％よりも少ない、または約２５％よりも少ない数にまで低下させることを意味する。
【０２６５】
特定の実施形態では、がんの予防、治療、または寛解の方法が提供され、該方法は、そのような予防、治療、または寛解を必要とする対象に、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトを含む薬学的組成物を投与することを含む。
【０２６６】
特定の実施形態では、治療を必要とする哺乳類のがんを治療する方法であり、該方法は、該哺乳類に、本明細書で説明する薬学的組成物の有効量を含む組成物を、任意で他の薬剤活性のある分子と併用で、投与することを含む。特定の実施形態では、がんはリンパ腫または白血病である。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、がんはリンパ腫または白血病またはＢ細胞悪性腫瘍であり、あるいはＣＤ１９を発現するがん、あるいは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）またはリツキシマブもしくはＣＨＯＰ（シトキサン（商標）／アドリアマイシン（商標）ビンクリスチン／プレドニゾン治療）耐性Ｂ細胞がん、またはブリナツモマブ耐性または抵抗性Ｂ細胞がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ球が浸潤しにくい非炎症性腫瘍である。
【０２６８】
さらなる態様では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクト及び薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、医薬の製造または調製に使用される。一実施形態では、医薬はがん治療用である。特定の実施形態では、医薬は、リンパ腫または白血病の治療用である。他の実施形態では、医薬は上述のがんの治療用である。別の実施形態では、医薬は、がんを治療する方法に使用され、該方法は、がん患者に有効量の医薬を投与することを含む。
【０２６９】
特定の実施形態では、本明細書で説明する方法及び用途はさらに、患者に、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤、たとえば細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心保護剤、免疫賦活剤、免疫抑制剤、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）抑制剤、他の抗体、Ｆｃ融合体、または免疫グロブリン、または他の治療剤を投与することを含む。
【０２７０】
特定の実施形態では、追加の治療剤は、がんの予防及び／または治療用である。そのような併用治療は、併用投与（２種以上の治療剤が同じまたは別の製剤に含まれる）、及び別投与を包含し、その場合、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトの投与は、追加の治療剤及び／またはアジュバントの投与前、投与と同時、及び／または投与後であってよい。
【０２７１】
本明細書で説明する抗原結合コンストラクト及び薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトは、単独または他の種類の治療（剤）（たとえば放射線治療、化学治療、ホルモン治療、免疫治療、及び抗腫瘍剤）と併用で投与することができる。
【０２７２】
治療または予防活性の実証
本明細書で説明する薬物がコンジュゲートされた抗原結合コンストラクトまたは薬学的組成物をヒトに使用する前に、所望の治療または予防活性について、インビトロで、次いでインビボで試験する。たとえば、化合物または薬学的組成物の治療または予防実用性を実証するインビトロのアッセイには、化合物が細胞株または患者組織検体に及ぼす影響も含まれる。化合物または組成物が細胞株及び／または組織検体に及ぼす影響は、限定ではないが、ロゼット形成アッセイ及び細胞溶解アッセイなどの当業者に知られている技法を使って決定することができる。
【０２７３】
治療／予防的投与及び組成物
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトまたは薬学的組成物の有効量を対象に投与することによって、治療、阻害、及び予防する方法を提供する。ある実施形態では、抗原結合コンストラクトは、実質的に精製されている（たとえば、その効果を制限する、または望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。特定の実施形態では、対象は、動物であり、限定ではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられ、特定の実施形態では、哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。
【０２７４】
様々な送達システム、たとえばリポソームへの封入、微小粒子、微小カプセル、抗原結合コンストラクトを発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（たとえばＷｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２  （１９８７）を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の作製などが知られており、本明細書で説明する抗原結合コンストラクト剤の投与に用いることができる。導入の方法としては、限定ではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、及び経口の各経路が挙げられる。抗原結合コンストラクトは、任意の便利な経路で投与することができ、たとえば点滴またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の裏層（たとえば口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）からの吸収により、及び他の治療剤と一緒に、投与される場合がある。投与は全身でも局所でもよい。好適な投与経路としては、脳室内及びくも膜下腔内注射が挙げられ、脳室内注射は、たとえば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルにより容易になる場合がある。たとえば吸入器または噴霧吸入器の使用、及びエアロゾル化剤を用いて製剤することによって、肺投与することもできる。
【０２７５】
特定の実施形態では、本明細書で説明する抗原結合コンストラクトまたは組成物を、治療を要する領域に局所投与するのが望ましい。このことは、たとえば限定ではないが、手術中の局所点滴によって、たとえば術後の傷ドレッシングと共に局所塗布によって、注射によって、カテーテルを使って、坐薬を使って、または移植片を使って実現することができ、該移植片は、多孔性または非多孔性またはゼラチン材の、ｓｉａｌａｓｔｉｃメンブレンなどのメンブレンまたはファイバーなどの移植片である。好ましくは、本発明の抗体などのタンパク質を投与するときは、該タンパク質を吸収しないような材料を使うように注意しなければならない。
【０２７６】
別の実施形態では、抗原結合コンストラクトまたは組成物は、ベシクル中、具体的にはリポソーム中で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３  （１９９０）；  Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  （ｅｄｓ．），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３５３−３６５  （１９８９）；  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，  同書．，  ｐｐ．  ３１７−３２７；全体として同書を参照されたい）。
【０２７７】
さらに別の実施形態では、抗原結合コンストラクトまたは組成物を放出制御システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いる場合がある（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；  Ｓｅｆｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１  （１９８７）；  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７  （１９８０）；  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４  （１９８９）を参照されたい）。別の実施形態では、高分子材料を用いる場合がある（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９７４）；  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  （ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４）；  Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３：６１  （１９８３）を参照されたい。また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０  （１９８５）；  Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５：３５１  （１９８９）；  Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７１：１０５  （１９８９）も参照されたい）。  さらに別の実施形態では、放出制御システムは、治療標的、たとえば脳の付近に配置されるので、全身用量のほんの一部しか必要としない（たとえばＧｏｏｄｓｏｎ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  前掲，  ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．  １１５−１３８  （１９８４）を参照されたい）。
【０２７８】
他の放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３  （１９９０））で概説されている。
【０２７９】
キット及び製品
本明細書では、本明細書で説明する１種以上の抗原結合コンストラクトを含むキットも説明する。キットの個々の構成要素は、別々の容器に梱包されることになり、そのような容器に付随して、その医薬品またはバイオ製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関が定めた書式の注意書きがある場合もあり、この注意書きは、当局がその製造、使用、または販売を承認したことを表す。キットはまた、抗原結合コンストラクトの用法または投与計画を概説する使用説明書または指示書（「添付文書」と呼ばれることもある）を任意で含むこともできる。
【０２８０】
キットの１種以上の構成要素が溶液、たとえば水溶液または滅菌水溶液として提供される場合、容器は、自体が吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器、またはそのような他の、溶液がそこから対象に投与または塗布され、キットのその他の構成要素と混合される器具であり得ることを意味する。
【０２８１】
キットの構成要素は、乾燥または凍結乾燥形態で提供されることもあり、キットは該凍結乾燥の構成要素を再構成するための好適な溶媒をさらに含む場合がある。容器の数や種類に関わらず、本明細書で説明するキットは、組成物を患者に投与するのを補助する器具を含む場合もある。そのような器具は、吸入器、鼻内噴霧デバイス、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点眼器、または類似の医療用送達運搬体であり得る。
【０２８２】
本明細書で説明する別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用なものを収容する製品が提供される。製品には、容器、及び容器に貼付または付随のラベルまたは添付文書が含まれる。好適な容器としては、たとえば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶバッグなどが挙げられる。容器は、ガラスやプラスチックなど、多様な材料で形成され得る。容器は、単独または別の組成物と併用で、状態の治療、予防、及び／または診断に有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有する場合がある（たとえば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静注バッグまたはバイアルの場合がある）。組成物中、少なくとも１種の活性剤が、本明細書で説明するＴ細胞活性化抗原結合コンストラクトである。ラベルまたは添付文書は、該組成物が、選択された状態の治療に使用されることを示す。さらに、該製品には、（ａ）本明細書で説明する抗原結合コンストラクトが含まれる組成物が収容された第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性または他の治療剤が含まれる組成物が収容された第２の容器とが含まれる場合がある。本明細書で説明するこの実施形態の製品にはさらに、組成物が特定の状態の治療に使用できることを示す添付文書が含まれる場合がある。あるいは、またはそれに加えて、製品にはさらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及びデキストロース液などの薬学的に許容されるバッファーが入った第２の（または第３の）容器が含まれる場合がある。商業的立場及びユーザーの立場から望ましい他の物質、たとえば他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジがさらに含まれる場合もある。
【０２８３】
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書で説明する抗原結合コンストラクトは、少なくとも１種のポリペプチドを含む。本明細書ではまた、本明細書で説明するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明する。これらのポリペプチド及びポリヌクレオチドは、一般には単離されている。
【０２８４】
本明細書では、「単離されている」とは、天然の細胞培養環境から同定され、分離され、かつ／または回収されている因子（たとえばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。その天然環境の汚染成分は、抗原結合コンストラクトの診断または治療用途を阻害することになる物質であり、これには酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。単離されている、とはまた、合成により生産された、たとえば人的介入により生産された因子も指す。
【０２８５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。すなわち、ポリペプチドについての説明は、同様にペプチドの説明及びタンパク質の説明にも適用され、その逆もまた然りである。これらの用語は、自然発生するアミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が非自然的にコードされているアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書では、これらの用語は、全長タンパク質を含めあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は共有結合的ペプチド結合により連結されている。
【０２８６】
「アミノ酸」という用語は、自然発生及び非自然発生のアミノ酸、ならびに自然発生のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣体を指す。自然界でコードされるアミノ酸は、２０種の一般的アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）及びピロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸アナログとは、自然発生のアミノ酸と同じ基本化学構造をもつ化合物、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、及びホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合した炭素を指す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（たとえばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸への言及には、たとえば、自然発生するタンパク質新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学修飾されたアミノ酸たとえばアミノ酸バリアント及び誘導体；自然発生する非タンパク質新生アミノ酸たとえばβ−アラニン、オルニチンなど；及び当該技術分野でアミノ酸の特徴として知られる属性をもつ、化学合成された化合物が含まれる。非自然発生のアミノ酸としては、限定ではないが、α−メチルアミノ酸（たとえばα−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（たとえば２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に１つ追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖のカルボン酸官能基がスルホン酸基（たとえばシステイン酸）で置換されているアミノ酸が挙げられる。合成の非天然アミノ酸などの非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つ以上のＤ−アミノ酸を本発明のタンパク質に組み込むことは、いくつかの異なる点で利点となり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチドなどは、Ｌ−アミノ酸含有の等価物と比べてインビトロまたはインビボで高い安定性を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸が組み込まれたペプチドなどの作製は、高い細胞内安定性が望ましいかまたは必要な場合に特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチドなどは、内在性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに抵抗性があるので、必要に応じて分子の生物学的利用性を高めたり、インビボで長く生存させたりすることができる。さらに、Ｄ−ペプチドなどは、主要組織適合性複合体クラスＩＩに制限されるヘルパーＴ細胞への提示のために効率的にプロセスされないので、生物全身の体液性免疫応答を誘導しにくい。
【０２８７】
本明細書では、アミノ酸は、広く知られている、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ推奨の３文字または１文字の記号で言及される場合もある。同様にヌクレオチドも、広く認められている１文字のコードで言及される場合もある。
【０２８８】
本明細書では、抗原結合コンストラクトのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明する。「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続的伸長を示すものとする。ヌクレオチド配列は、ゲノムの、ｃＤＮＡの、ＲＮＡの、半合成もしく合成起源の、またはそれらの任意の組合せの配列であり得る。
【０２８９】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、及びそれらの単鎖または二本鎖形態のポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、自然発生するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。特に限定しない限り、この用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やアンチセンス技術で使用されるＤＮＡアナログ（ホスホロチオアート、ホスホロアミダート他）などのオリゴヌクレオチドアナログも指す。特に断らない限り、ある特定の核酸配列は、明記された配列だけでなく、その保存的修飾バリアント（たとえば限定ではないが、縮重コドン置換も含む）及び相補配列も潜在的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８  （１９９４））。
【０２９０】
「保存的修飾バリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列について、「保存的修飾バリアント」は、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は基本的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のせいで、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される位置ならどこでも、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、記載した対応するどのコドンにでも変更することができる。そのような核酸のバリエーション（変異）は「サイレント・バリエーション」つまり１種の保存的修飾バリエーションである。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、その核酸のすべての可能なサイレント・バリエーションも説明している。当業者であれば、核酸の各コドン（ただし、ふつうはメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧと、ふつうはトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧは除く）は、機能的に同一である分子を得るために修飾できることを認識しよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント・バリエーションが、記載の各配列に含まれている。
【０２９１】
アミノ酸配列については、当業者であれば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する、１アミノ酸またはコード配列中のアミノ酸のわずかなパーセンテージを改変、付加、または削除する個々の置換、欠失、または付加は、改変の結果として１アミノ酸の欠失、１アミノ酸の付加、または１アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸との置換がもたらされる「保存的修飾バリアント」であることを認識しよう。機能的に類似のアミノ酸を記載した保存的置換の各表が、当業者には知られている。そのような保存的修飾バリアントは、本明細書で説明する多形バリアント、種間ホモログ、及びアレルを排除するのではなくそれらに追加されるものである。
【０２９２】
機能的に類似のアミノ酸を記載した保存的置換の各表が、当業者には知られている。以下の８つのグループはそれぞれ、互いに対し保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（複数可）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（たとえばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９３年１２月）を参照されたい）。
【０２９３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する「同一」または「同一性」％という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズム（もしくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）により測定して比較窓または指定領域を比較・アラインメントして、または手動でアラインメントし視認して、最大対応率を求めたときに、配列同士が同じパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（すなわち、特定の領域の同一性が約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一である）場合、「実質的に同一」である。この定義は、被験配列の相補配列にも当てはまる。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、または７５〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、または特に指定されていなければ、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列全体にわたって、存在し得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト以外の種からのホモログを含め、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で説明するポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識化プローブを用いてライブラリーのスクリーニングをするステップ、及び、該ポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップを含むプロセスによって得ることができる。そのようなハイブリダイゼーション法は、当業者には周知である。
【０２９４】
配列比較では、一般に、１つの配列を参照配列とし、それに対し被験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列と参照配列とがコンピューターに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムのプログラム・パラメーターが指定される。デフォルトのプログラム・パラメーターを使うこともできるし、または別のパラメーターを指定することもできる。次いで、このプログラム・パラメーターに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する被験配列の配列同一率を計算する。
【０２９５】
「比較窓」には、本明細書では、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より一般には約１００〜約１５０からなる群より選択されるいずれかひとつの数の連続位置のセグメントへの参照が含まれ、ある配列を、同数の連続位置の参照配列に対し最適にアラインメントした後、これら２つの配列を比較する。比較のため配列をアラインメントする方法は、当業者には知られている。比較のための最適な配列アラインメントは、限定ではないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２ｃのローカル・ホモロジー・アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３のホモロジー・アラインメント・アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  サイエンスＤｒ．，  ウィスコンシン州マディソン）によって、または手動アラインメント及び視認（たとえばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって、実施することができる。
【０２９６】
配列同一率及び配列類似率の決定に好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２とＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０で説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎがワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで公開している。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、及びＸでアラインメントの感度とスピードを決める。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして、両ストランドを比較する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、文字列長さ３、及び期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして、両ストランドを比較する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは一般には「ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ」フィルターをオフにして実行される。
【０２９７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計分析も行う（たとえばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性測定値のひとつに、最小和蓋然度（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））があり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列同士の一致が偶然生じる確率を示すものである。たとえば、参照核酸に対する被験核酸の比較で最小和蓋然度が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満の場合、その核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【０２９８】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が混合物（限定ではないが、全細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡなどの）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該配列だけに分子が結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。
【０２９９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野で知られているように、低イオン強度と高温の条件下でのＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは他の核酸、またはそれらの組合せの配列のハイブリダイゼーションを指す。一般に、ストリンジェントな条件下で、プローブは核酸の複合物（限定ではないが、全細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡなどの）中の標的部分配列にハイブリダイズするが、該複合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列依存性なので、状況が異なれば変わってくる。長い配列ほど、高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについては、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”  （１９９３）に詳しい手引きが見られる。
【０３００】
本明細書では、「改変する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、改変すること（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という用語は、自然発生のまたは組換えポリペプチドまたはその断片のあらゆるペプチド骨格操作または翻訳後修飾を含むものとされる。改変には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびにこれらのアプローチの組合せが含まれる。改変されたタンパク質は、標準的な分子生物学的技法によって発現及び生産される。
【０３０１】
「単離された核酸分子またはポリヌクレオチド」とは、天然環境から回収された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図している。たとえば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、単離されている、とみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種の宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されているポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドとしては、通常収容されている細胞に収容されているが、染色体外または本来の染色体上位置とは異なる染色体上位置に存在しているポリヌクレオチド分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、インビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物、ならびにプラス鎖形態、マイナス鎖形態、及び二本鎖形態が含まれる。本明細書で説明する単離されたポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、たとえばＰＣＲまたは化学合成で人工的に生産されたそのような分子を含む。さらに、特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素を含む。
【０３０２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は一般に、たとえば米国特許第４，６８３，１９５号で説明されているように、所望のヌクレオチド配列をインビトロで増幅する方法を指す。概してＰＣＲ法には、テンプレート核酸に選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのプライマー伸長合成の反復サイクルが含まれる。
【０３０３】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくともたとえば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり最高５つの点変異を含む場合があることを除き、参照配列と同一であるものを意図している。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列のヌクレオチドの最高５％が削除されるかまたは別のヌクレオチドで置換されるか、あるいは参照配列の全ヌクレオチドの最高５％を占めるある数のヌクレオチドが参照配列に挿入される場合がある。このような参照配列の改変は、参照ヌクレオチド配列の５'末端位置か３'末端位置で、またはそれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列の残基の間に個別にまたは１つ以上の連続する基として点在させることにより参照配列内で生じさせることができる。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラム、たとえばポリペプチドについて上述したもの（たとえばＡＬＩＧＮ−２）などを使って従来どおりに決定することができる。
【０３０４】
ポリペプチドの誘導体またはバリアントは、該誘導体またはバリアントのアミノ酸配列が、もとのペプチドの１００アミノ酸の配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、そのペプチドと「相同性」がある、または「相同的」である、といわれる。特定の実施形態では、誘導体またはバリアントは、該誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたは該ペプチドの断片と少なくとも７５％同じである。特定の実施形態では、誘導体またはバリアントは、該誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたは該ペプチドの断片と少なくとも８５％同じである。特定の実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、該誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたは該ペプチドの断片と少なくとも９０％同じである。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、該誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたは該ペプチドの断片と少なくとも９５％同じである。特定の実施形態では、誘導体またはバリアントは、該誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたは該ペプチドの断片と少なくとも９９％同じである。
【０３０５】
本明細書では「修飾されている」という用語は、所与のポリペプチドに加えられるあらゆる変化、たとえばポリペプチド長、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学構造、翻訳時修飾、または翻訳後修飾の変化を指す。「（修飾されている）」という形式の用語は、論じられているポリペプチドが修飾されていてもよいこと、つまり、当該ポリペプチドは修飾されていても修飾されていなくてもよいことを意味する。
【０３０６】
いくつかの態様では、抗原結合コンストラクトが、本明細書で開示の表（複数可）または受託番号（複数可）に示す関連アミノ酸配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、単離された抗原結合コンストラクトが、本明細書で開示の表（複数可）または受託番号（複数可）に示す関連ヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０３０７】
特に別途定めない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、特許請求の主題が属する業界の当業者によって通常理解されるものと同じ意味をもつ。本明細書中の用語に複数の定義がある場合は、このセクションでの定義が優先する。ＵＲＬまたは他のそういった識別子もしくはアドレスを参照している箇所については、そういった識別子は変更されることもあり、インターネット上の特定の情報は入れ替わりもあるが、インターネット検索で等価の情報を見つけることが可能であることを理解されたい。それらへの言及は、そのような情報が入手可能であり一般に普及していることを明示している。抗体技術分野の当業者によって理解される各用語は、本明細書で明確に異なって定義しない限り、当該技術分野で獲得した意味が付与される。
【０３０８】
一般的な説明及び以下の詳細な説明は、単に例示し説明をするものであって、特許請求の主題を何ら制限するものではないことを理解されたい。
【０３０９】
本願では、特に断らない限り、単数形を使用する場合は複数形も含むものとする。
【０３１０】
本明細書では、特に断らない限り、すべての濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲は、その範囲に記載のすべての整数、及び適宜それらの分数（たとえばある整数の１０分の１や１００分の１）の値を含むものと理解されたい。本明細書では「約」とは、特に断らない限り、記載の範囲、値、配列、または構造の±１０％を意味する。本明細書では、用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、特に断らない限り、または文脈から明白でない限り、挙げられた構成要素の「１つ以上」を指すものと理解すべきである。選択語（たとえば「または」）の使用は、いずれか一方、両方、または選択肢の任意の組合せを意味すると理解すべきである。本明細書では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義的に用いられる。また、本明細書で説明する構造物や置換基の様々な組合せから誘導される個々の単鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリンコンストラクトは、各単鎖ポリペプチドまたはヘテロダイマーが個別に記載されていると同様に本願で開示される、ということも理解すべきである。したがって、個々の単鎖ポリペプチドまたはヘテロダイマーを形成するための具体的な構成要素の選択は、本開示の範囲内である。
【０３１１】
本明細書で使用するセクション見出しは、構成上のまとまりとするだけであって、説明している主題を制限するものと解釈してはならない。
【０３１２】
本明細書で説明する方法及び組成物は、本明細書で説明する特定の方法、プロトコル、細胞株、コンストラクト、及び試薬に限定されず、したがって様々であり得ることを理解されたい。また、本明細書で用いる術語の目的は、具体的な実施形態を説明することだけなので、本明細書で説明する方法及び組成物の範囲を限定するものではなく、その範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【０３１３】
本願で引用するすべての文書、または文書の一部、たとえば限定ではないが、特許文献、特許出願、文献、書籍、マニュアル、及び論文などは、その全文をあらゆる目的で参照により本明細書に明白に援用するものとする。本明細書に記載のすべての出版物及び特許文献は、本明細書で説明する方法、組成物、及び化合物に関連して用いることが可能な、それらの出版物で説明されているたとえばコンストラクトや方法を説明し開示するという目的で、それらの全文を参照により本明細書に援用するものである。本明細書で論じる出版物は、本願の出願日よりも前に開示されたものだけが提供されている。本明細書中の記載で、そういった開示が先行発明またはその他の理由により先行すると発明者らが認める、と解釈すべきものは一切ない。
【実施例】
【０３１４】
以下の具体的で非限定的な実施例は、単なる説明であって、本開示をいかようにも限定しない、と解釈すべきである。それ以上説明しなくとも、当業者であれば、本明細書の説明に基づき本開示を最大限活用できよう。本明細書で引用するすべての出版物は、全文を参照により本明細書に援用するものとする。ＵＲＬまたは他のそういった識別子もしくはアドレスを参照している箇所については、そういった識別子は変更されることもあり、インターネット上の特定の情報は入れ替わりもあるが、インターネット検索で等価の情報を見つけることが可能であることを理解されたい。それらへの言及は、そのような情報が入手可能であり一般に普及していることを明示している。
【０３１５】
例示的な二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９、抗ＣＤ３−ＣＤＨ３、抗ＣＤ３−ＨＥＲ２、抗ＣＤ３−ＨＥＲ３、及び抗ＣＤ３−ＥＧＦＲ抗原結合コンストラクトを、以下に説明するようにして作製した。これらのタイプのコンストラクトの例示的な模式図を図１Ａ〜図１Ｄに示す。これらの形式はすべて、ＣＨ３ドメイン中の既知の変異により作製されたヘテロダイマーＦｃに基づく（Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ．  ２０１３  ５（５）：６４６−５４）。例示的薬物ＤＭ１、ＤＭ４、及びＭＭＡＥを用い、例示的コンストラクトをこれら薬物にコンジュゲートさせてＡＤＣを作製した。
【０３１６】
実施例１．二重ｓｃＦｖ形式のＡＤＣに有用な二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３抗原結合コンストラクトの説明、発現、及び精製
ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４で説明されているＣＤ３及びＣＤ１９に対する二重特異性抗体を設計し、発現させ、特徴付けた。簡単に説明すると、該抗体の重軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳類発現用に最適化されたコドンを用いて、遺伝子合成により作製した。ｓｃＦｖ−Ｆｃ配列を、既知の抗ＣＤ３及びＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＢｉＴＥ（商標）抗体（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９８，  Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ：  ７７，７６３−７７２）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｄｒｕｇ  Ｂａｎｋリファレンス：ＤＢ０００７５）から生成した。作製した二重（ｄｕａｌ）ｓｃＦｖバリアントを表１で説明している。
【０３１７】
（表１）二重ｓｃＦｖバリアント
2018524373.tif 000042
2018524373.tif 000043
【０３１８】
- Ｈｅｔ  Ｆｃ１＝鎖Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（ＩｇＧ１  ＦｃのＥＵナンバリング・システム）
【０３１９】
- Ｈｅｔ  Ｆｃ２＝鎖Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ
【０３２０】
- ＦｃγＲ  ＫＯ  １＝鎖Ａ：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ；鎖Ｂ：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ
【０３２１】
- ＦｃγＲ  ＫＯ  ２＝鎖Ａ：Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ；鎖Ｂ：Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ
【０３２２】
- αＣＤ１９＿ＨＤ３７  ｓｃＦｖ−特に断らない限り、可変領域のＮ末端からＣ末端の順は、ＶＬ／ＶＨである。
【０３２３】
- αＣＤ３＿ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ−特に断らない限り、可変領域のＮ末端からＣ末端の順は、ＶＬ／ＶＨである。ＶＬＶＨは、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーで接続されている。
【０３２４】
- αＣＤ３＿ＢｉＴＥ  ｓｃＦｖ−可変領域のＮ末端からＣ末端の順は、ＶＨ／ＶＬであり、リンカー及び組成物はブリナツモマブと同一である。
【０３２５】
- （ＶＬＶＨ  ＳＳ）または（ＶＨＶＬ  ＳＳ）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬ間にジスルフィド結合を導入する、公表されている位置ＶＨ４４及びＶＬ１００（Ｋａｂａｔナンバリング・システムによる）を用いての、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖを示す［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：１２３９−１２４５  （１９９６）］。
【０３２６】
- （ＣＤＲ  Ｃ−＞Ｓ）−以下で参照するＯＫＴ３のＨ３  ＣＤＲの変異を示す。
【０３２７】
- （ＶＨＶＬリンカー）−リンカー
2018524373.tif 000044
によるＶＨとＶＬの接続を示す。
【０３２８】
Ｆｃのナンバリングは、ＥＵ抗体のナンバリングに言及しているＫａｂａｔのＥＵインデックスによる（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）；Ｆａｂまたは可変ドメインのナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９１；  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  −  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２，  ｐ  ６４７  （１９９１））による。
【０３２９】
表１で説明しているバリアントには、基本設計のバリアント８７５が含まれ、これを開始点として用いて収量及び生物物理学的特性が改良された抗原結合コンストラクトを生成した。修飾には、ＶＬＶＨジスルフィド改変及び／または安定化ＣＤＲ変異の付加によるｓｃＦｖの安定化が含まれる。全バリアントがヘテロダイマーＦｃ（Ｈｅｔ  Ｆｃ  １またはＨｅｔ  Ｆｃ  ２）を含み、Ｆｃエフェクター活性を無効にするＣＨ２ドメインの変異（ＦｃγＲ  ＫＯ  １またはＦｃγＲ  ＫＯ  ２）を有してまたは有さずに発現させることができる。Ｆｃにこの修飾を含むバリアントは、Ｆｃノックアウトを有する、またはＦｃ  ＫＯとして言及される。
【０３３０】
バリアント８７５、１６６１、１６５３、１６６２、１６６０、１６６６、１８０１、及び１３８０は、開発されたＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトの初期設計であり、バリアント６７４７、１０１４９、及び１２０４３は、ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトの収量及び生物物理学的特性をさらに改良するように設計された修飾を含む例示的設計である（さらなる詳細は実施例３〜実施例４を参照されたい）。バリアントＮ１、Ｎ３、及びＮ１０も設計されており、これらのバリアントの生物物理学的及び機能的特徴は本明細書で提供するデータから予測可能である。
【０３３１】
ＣＤ３  ｓｃＦｖとＣＤ１９  ｓｃＦｖ両方のＶＨＶＬジスルフィド改変ストラテジーは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬ間にジスルフィド結合を導入する、公表されている位置ＶＨ４４及びＶＬ１００（Ｋａｂａｔナンバリング・システムによる）を用いた［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：１２３９−１２４５  （１９９６）］。αＣＤ３  ＯＫＴ３  ｓｃＦｖのＨ３  ＣＤＲのＣからＳへの変異は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：  ４４５−４５３  （１９９７）のＫｉｐｒｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．で説明されているようにして、生じさせた。
【０３３２】
最終遺伝子産物を哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、カナダ国）にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞内で発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，  Ｙ．，  Ｐｅｒｒｅｔ，  Ｓ．  ＆  Ｋａｍｅｎ，  Ａ．  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，  Ｅ９  （２００２））。
【０３３３】
ＣＨＯ細胞の対数増殖期（細胞１５０万〜２００万個／ｍＬ）に、１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａのポリエチレンイミン水溶液（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を２．５：１のＥＩ：ＤＮＡ比で用いて、トランスフェクトした（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ５５（１）：４４−５１  （２０１１））。ヘテロダイマーを形成する最適濃度を決定するために、ＤＮＡを、ヘテロダイマー形成を可能にする重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）と重鎖Ｂ（ＨＣ−Ｂ）の最適ＤＮＡ比（たとえばＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／比＝５０：５０％）でトランスフェクトした。５〜６日後、トランスフェクト細胞を採取し、４０００ｒｐｍでの遠心分離後に培養培地を回収し、０．４５μｍのフィルターを用いて清澄化した。
【０３３４】
清澄化した培養培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）プロテインＡカラムにロードし、１０カラム体積のｐＨ７．２のＰＢＳバッファーで洗った。抗体を１０カラム体積のｐＨ３．６のクエン酸バッファーで溶離し、プールした抗体含有画分をｐＨ１１のＴＲＩＳで中和した。Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてタンパク質を脱塩した。
【０３３５】
場合によっては、タンパク質をさらにゲル濾過により精製した。３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬまで濃縮し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣにより流量１ｍＬ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーを流量１ｍＬ／分で用いた。精製抗体に相当する画分を回収し、約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３３６】
プロテインＡの精製後、以下の方法によりプロテインＬクロマトグラフィーを用いてさらに精製ステップを実施することができる。カプトＬ樹脂をＰＢＳを用いて平衡化し、樹脂にバリアントを加えて室温で３０分インキュベートした。樹脂をＰＢＳで洗い、結合したタンパク質を０．５ｍｌ  ０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３）を用いて溶離した。
【０３３７】
最終産物の純度及び収量は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４で詳述されているようにして、ＬＣ／ＭＳ及びＵＰＬＣ−ＳＥＣで評価した。全バリアントが発現し、ホモダイマーの汚染なしに、９５％を上回るヘテロダイマー純度にまで精製された。
【０３３８】
各二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトに対応するクローンを表ＸＸ（実施例セクションの最後）に示し、各クローンの対応する配列組成を表ＹＹに示す。バリアントに用いたＣＤＲ配列を表Ｓ１に示す。
【０３３９】
（表Ｓ１）ＣＤ３及びＣＤ１９抗原結合コンストラクトのＣＤＲ配列
2018524373.tif 000045
2018524373.tif 000046
2018524373.tif 000047
【０３４０】
実施例２．ハイブリッド・ヘテロダイマーＦｃ形式またはフルサイズ抗体形式の例示的二重特異性抗原結合抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンストラクトの説明、発現、及び精製
さらなる二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクト１８５３、６７５４、１０１５１、６７５０、６７５１、６４７５、６７４９、１０１５２、１０１５３、及び６５１８を、実施例１で説明したようにして調製した。これらのコンストラクトは、バリアント８７５と同じ抗原結合ドメインに基づくが、収量及び生物物理学的特性が改良されるように改変されている。修飾には、一方または両方のｓｃＦｖを同等のＦａｂ形式に変えること、及び／またはＶＬ−ＶＨジスルフィド改変及び安定化ＣＤＲ変異によるｓｃＦｖの安定化が含まれる。バリアント組成の詳細を表２に示す。
【０３４１】
（表２）バリアント及び組成のまとめ
2018524373.tif 000048
【０３４２】
＊全バリアントは、鎖１：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖２：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４ＷのＣＨ３変異を有する。括弧内のバリアントは、さらなる変異Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａを両重鎖に含む、同等のＦｃノックアウトバリアントを指す。これにより、ＦｃはＦｃγＲに結合できなくなる。
【０３４３】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの各配列を上述のようにして生成した。抗ＣＤ１９  Ｆａｂ（ＨＤ３７  Ｆａｂ）は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させたＨＤ３７のＶＨ配列とＶＬ配列を用いるキメラＦａｂである。このｓｃＦｖまたはＶＨ−ＣＨドメインを、ヘテロダイマーＦｃの１本の鎖に融合させる。抗ＣＤ３  Ｆａｂ（テピズマブ（ｔｅｐｉｚｕｍａｂ）Ｆａｂ）は、ヒト化ＯＫＴ３抗体テプリズマブの既知の配列から生成した（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）。このＶＨ−ＣＨドメインを、ヘテロダイマーＦｃの１本の鎖に融合させた。
【０３４４】
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ両方のｓｃＦｖジスルフィド改変ストラテジー（ＶＨＶＬ  ＳＳ）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬ間にジスルフィド結合を導入する、公表されている位置ＶＨ４４及びＶＬ１００（Ｋａｂａｔナンバリング・システムによる）を用いた［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：１２３９−１２４５  （１９９６）］。
【０３４５】
以下のバリアントは、既に報告されているように、安定性及び収量を改良するような、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの変異を含む［Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  １０（４）：４４５−４５３  （１９９７）］。ｖ１６５３、ｖ６４７５、及びｖ１０１５３は、ＶＨ  ＣＤＲ３の１００Ａの位置にシステインからセリンへの変異を有する抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を有する。
【０３４６】
ハイブリッド及びフルサイズの抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトのクローニング、発現、及び特徴付けの詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４６４３６で提供されている。
【０３４７】
各二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９及び抗原結合コンストラクトに対応するクローンを表ＸＸに示し、各クローンの対応する配列組成を表ＹＹに示す。
【０３４８】
対照
ｖ８９１は、ブリナツモマブ（ＢｉＴＥ（商標））と同一のポリペプチド配列を有し、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを含む（５０ｋＤａ）。
【０３４９】
バリアント４３７１は、二価単一特異性抗ＣＤ１９抗体である（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＳＧＮ−１９Ａ  デニンツズマブ  マフォドチン（ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）として知られる抗ＣＤ１９抗体−薬物コンジュゲートに使用されている）。
【０３５０】
一部の実験では、ポリクローナルヒトＩｇＧを対照として使用し、ｖ６２４９と呼ぶ。
【０３５１】
実施例３．抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１９抗体のヒト化及び安定化
既知のマウス及びヒト化抗ＣＤ３及びＣＤ１９抗体のＢｉＴＥ（商標）抗体（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９８，  Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ：  ７７，７６３−７７２）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｄｒｕｇ  Ｂａｎｋリファレンス：ＤＢ０００７５）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体テプリズマブ（Ｄｒｕｇ  Ｂａｎｋリファレンス：ＤＢ０００７５）、及び抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＨＤ３７（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９８，  Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ：  ７７，７６３−７７２；  Ｐｅｚｚｕｔｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ．  Ｖｏｌ．２．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．  ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇｌＮｅｗＹｏｒｋ．  Ｐ．  ３９１．）は、低い生産収量及び生物物理学的安定性を示す。
【０３５２】
ＨＤ３７及びＯＫＴ３に基づく抗体の収量及び生物物理学的特性を改良するため、ヒト化及び安定化の構造情報に基づくアプローチを用いた。このアプローチは、Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４  （２００４）  １８４−１９９）で説明されているヒト化及び安定化の方法に基づくものであり、さらにＶＨ／ＶＬ三次元構造の詳細分析を含んで、低安定性の一因となり得るＶＨ／ＶＬフレームワーク位置を特定する。さらに、それらのフレームワーク及びＣＤＲ配列を、脱アミド化、アスパラギン酸異性化、及びプロテアーゼ切断などの翻訳後修飾が可能な位置について分析する。
【０３５３】
改変されたヒト化抗ＣＤ３のＶＬ配列及びＶＨ配列と既知の親マウス抗体ＨＤ３７に対する配列アラインメントを図２に、抗ＣＤ１９のＶＬ配列及びＶＨ配列と既知の親マウス抗体ＯＫＴ３及びヒト化テプリズマブに対する配列アラインメントを図４に示す。図２及び図４では、構造情報に基づくヒト化及び安定化アプローチにより特定された重要な位置に下線を引き、太字で強調している。ｈＶＨ／ｈＶＬと示される改変されたヒト化配列を用いて、実施例４で説明するような二重特異性バリアントを作製した。
【０３５４】
実施例４．収量及び生物物理学的特性が改良された二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３抗原結合コンストラクトの発現及び精製
収量及び生物物理学的安定性が改良されるように設計された二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗体を、表３及び実施例３で説明したようにして作製した。バリアントｖ１０１４９及びｖ６７５１は、ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトの初期マウス二重ｓｃＦｖヘテロダイマーＦｃ及びハイブリッド・ヘテロダイマーＦｃ設計である（さらなる説明は実施例１及び実施例２を参照されたい）。バリアントｖ１２０４３及びｖ１５１９２〜ｖ１５１９５は、ＣＤ３及びＣＤ１９抗原結合コンストラクトの収量及び生物物理学的特性をさらに改良するように設計された可変ドメインフレームワーク及びＣＤＲ修飾を含むヒト化設計の例示である。
【０３５５】
抗ＣＤ１９マウスＨＤ３７  ｓｃＦｖは実施例１で説明しており、Ｆａｂ抗ＣＤ１９マウスＨＤ３７は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させたＨＤ３７のＶＨ配列とＶＬ配列を用いたキメラＦａｂである。ヒト化ＨＤ３７  Ｆａｂは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させたヒト化ＨＤ３７のＶＨ配列ｈＶＨ２とＶＬ配列ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）（図２）で構成されるＦａｂである。ヒト化ＨＤ３７  ｓｃＦｖは、ヒト化ＨＤ３７のＶＨ配列ｈＶＨ２及びＶＬ配列ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）（図２）で構成され、ｖ１０１４９について上述したのと同じＶＨ／ＶＬの向き及びリンカーを有する。マウス抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、親バリアントｖ８７５のｓｃＦｖと同じであり（表１）、ヒト化抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、図４及び表３で説明している改変されたＶＨ配列及びＶＬ配列から生成された。
【０３５６】
- （ＶＬＶＨ  ＳＳ）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬ間にジスルフィド結合を導入する、公表されている位置ＶＨ４４及びＶＬ１００（Ｋａｂａｔナンバリング・システムによる）を用いての、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖを示す［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：１２３９−１２４５  （１９９６）］。
【０３５７】
（表３）バリアント及び組成のまとめ
2018524373.tif 000049
【０３５８】
ヒト化Ｆａｂ及びｓｃＦｖの配列を、実施例１及び実施例２で親マウスバリアントについて説明したようにして、ヘテロダイマーＦｃ鎖に融合させる。すべてのバリアントが、重鎖Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；重鎖Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４ＷのＣＨ３変異を有している。各重鎖ＣＨ３変異は、抗ＣＤ１９鎖または抗ＣＤ３鎖上に存在することができる。すべてのバリアントが、さらに、追加の変異Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａを両重鎖に含んで、ＦｃがＦｃγＲに結合できなくしている。
【０３５９】
Ｆｃのナンバリングは、ＥＵ抗体のナンバリングに言及しているＫａｂａｔのＥＵインデックスによる（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）；Ｆａｂまたは可変ドメインのナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９１；  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  −  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２，  ｐ  ６４７  （１９９１））による。
【０３６０】
マウスＨＤ３７及びＯＫＴ３の配列をヒト化し、収量及び安定性が改良されるように次の変化によってさらに修飾した：ｉ）ヒト化抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、ＶＨ  ＣＤＲ３の１００Ａの位置で、公表されているシステインからセリンへの変異を用いることができ［Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  １０（４）：４４５−４５３  （１９９７）］、バリアントｖ１５１９２〜ｖ１５１９５及びｖ１７１１９（表３）は安定性が改良されるようにセリン変異を含み、ｉｉ）ヒト化抗ＣＤ１９  ＣＤＲの配列は、２８番目の位置に、抗原結合に影響し得る可能なアスパラギン酸異性化部位を除去する修飾がなされ、ｉｉｉ）安定性及び収量に影響し得る特定のＶＨＶＬフレームワーク位置が特定された（実施例３）；図２及び図４で、これらの位置に下線を引き、太字で強調している。
【０３６１】
各二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９及び抗原結合コンストラクトに対応するクローンを表ＸＸに、各クローンの対応する配列組成を表ＹＹに示す。
【０３６２】
表挿入
【０３６３】
ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４、実施例１及び実施例２で説明されているように、ＣＤ３及びＣＤ１９に対する二重特異性抗体を設計し、発現させ、特徴付けた。
【０３６４】
実施例１で説明されているように、これら二重特異性抗体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、次いでゲル濾過により、精製した。図６及び表４は、分取ＳＥＣ精製の結果、及び初期親マウスバリアントｖ６７５１及び改変されたヒト化バリアントの最終的な精製後の収量を示す。
【０３６５】
初期マウスバリアントｖ６７５１は、プロテインＡ精製後、ほぼ５０％もの分子凝集塊と低い総収量を示したが、改変されたバリアントは、最低限の凝集塊と２〜３倍増の収量を示した。最終的な精製後収量は陽性対照の市販抗体に匹敵する。
【０３６６】
（表４）ヒト化バリアント生産収量
2018524373.tif 000050
【０３６７】
実施例５．改変された二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３抗原結合コンストラクトの熱安定性
安定性が改変された二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクトの熱安定性について、マウス親バリアントと比較して示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で評価した。
【０３６８】
すべてのＤＳＣ実験は、ＧＥ社のＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ装置を用いて行った。タンパク質はバッファーをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換し、０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬまで希釈して、０．１３７ｍＬを試料細胞にロードし、昇温速度を１℃／分として２０℃〜１００℃で測定した。データはＯｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で、ＰＢＳバッファーのバックグラウンドを差し引いて分析した。
【０３６９】
表５は、親マウス対安定性改変ヒト化コンストラクトの各抗ＣＤ３及び抗ＣＤ１９  Ｆａｂ及びｓｃＦｖについて推定される融点（Ｔｍ）のリストである。
【０３７０】
（表５Ａ）改変された抗ＣＤ１９結合ドメインの熱安定性
2018524373.tif 000051
【０３７１】
（表５Ｂ）改変された抗ＣＤ３結合ドメインの熱安定性
2018524373.tif 000052
（＊）ＤＳＣはＩｇＧ形式バリアントで測定した。ＣＨ２の重複により、ＦａｂとｓｃＦｖは同じような融点で変化する。具体的なＴｍは推定しかできなかった（図７を参照されたい）。
【０３７２】
抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３  Ｆａｂ及びｓｃＦｖは、上述（実施例１及び実施例４）のようにして作製し、二重特異性または単一特異性Ｆｃコンストラクトとして発現させ、精製したコンストラクトは上述のようにしてＤＳＣ測定した。図７は、選択された改変バリアント対親マウス対照の代表的なＤＳＣサーモグラムを示す。表５でまとめた個々のドメインの融解変化は、改変体対親マウスのＤＳＣサーモグラムの比較により推定した。
【０３７３】
表５及び図７の結果は、改変された可変ドメインを有するヒト化コンストラクトは、それらのマウス親コンストラクトよりも安定性が増加していることを示す。最終的な安定化ハイブリッド・バリアントｖ１５１９２〜ｖ１５１９５は、熱融点が７２℃を上回り、市販のＩｇＧ抗体のＦａｂに匹敵した。
【０３７４】
表４及び表５に記載するように、構造情報に基づく安定性の改変により、発現及び熱安定性の大幅な改良がもたらされた。さらに、ヒト化テプリズマブとの比較から、収量及び安定性の改良は、配列のヒト化とは無関係であり、むしろ発明者らの構造情報に基づくアプローチによりＦａｂ／ｓｃＦｖの安定性にとって重要であると特定したＶＨ／ＶＬ位置の特定の変化によると考えられることがわかる。
【０３７５】
結論として、発明者らの構造情報に基づくヒト化及び安定化アプローチは、収量及び安定性が大幅に改良された新規のヒト化ＯＫＴ３及びＨＤ３７  ＶＨ／ＶＬ配列を特定した。低い発現率及び安定性を示す既知のマウス及びヒト化ＨＤ３７及びＯＫＴ３のｓｃＦｖとの違いは、発明者らの改変バリアントは、市販のＩｇＧに匹敵する収量及び安定性を示すこと、したがって治療抗体としての開発が可能であることである。
【０３７６】
実施例６．改変された二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３抗原結合コンストラクトの抗原結合
改変された二重特異性コンストラクトｖ１５１９２〜ｖ１５１９５が親マウスコンストラクトｖ６７５１と同等にＣＤ１９及びＣＤ３抗原に結合するかどうかを決定するために、ＣＤ１９及びＣＤ３への結合親和性を以下に説明するようにしてＳＰＲ及びホールセルＦＡＣＳで測定した。
【０３７７】
すべてのＳＰＲ結合実験は、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置を用いて、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、及びｐＨ７．４の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて実施した。組換えＣＤ３ε／δＦｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．ｃｏｍ／ＣＤ３Ｄ−ＣＤ３−Ｄｅｌｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｇ−１０１８２．ｈｔｍｌ）を抗Ｆｃ捕捉センサーチップ上で捕捉した。バッファーを注入して安定ベースラインを確立した後、精製された抗体が２５μＬ／分で２４０秒間注入され（約５００ＲＵとなる）、組換えＣＤ３融合タンパク質に結合することにより間接的にセンサーチップ上で捕捉された。結果のＫＤ値は、独立した３回の昇温の平均としての報告値を用いてＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｆｉｔモデルを使用して結合等温線から求めた。
【０３７８】
表６は、改変されたヒト化二重特異性コンストラクトｖ１５１９２〜ｖ１５１９５のＳＰＲ結合の結果をまとめている。すべての改変コンストラクトが親マウスコンストラクトｖ６７５１と同等にＣＤ１９及びＣＤ３抗原に結合する。安定性が改変されたヒト化コンストラクトは、親ｖ６７５１と比較すると、同等にＣＤ３抗原に結合する。
【０３７９】
（表６）改変抗ＣＤ１９−ＣＤ３バリアントの組換えＣＤ３へのＳＰＲ結合
2018524373.tif 000053
【０３８０】
実施例７．ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びＣＤ３＋ＪｕｒｋａｔＴ細胞及びヒトＰＢＭＣへのホールセル結合
ヒト化二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクトがＣＤ３発現細胞及びＣＤ１９発現細胞に結合する能力を、先に説明されているように（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４）してホールセルＦＡＣＳ結合分析により評価した。バリアントｖ１５１９５のＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞（ＡＴＣＣ：  ＣＣＬ−８６；  Ｐｕｌｖｅｒｔａｆｔ，  Ｌａｎｃｅｔ  １９６４）及びＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｗｅｉｓｓ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８４）への結合、及び見かけ結合親和性を図８Ａ及び図８Ｂに示す。
【０３８１】
二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクト（図８のｖ１５１９５により例示する）は、ヒトＲａｊｉＣＤ１９＋ＮＨＬ  Ｂ細胞に高い親和性（見かけ親和性２．４ｎＭ）で結合し、ヒトＣＤ３＋ＪｕｒｋａｔＴ細胞に低い親和性（見かけ親和性４４．７ｎＭ）で結合した。
【０３８２】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーがＴ細胞と標的Ｂ細胞を架橋する能力は活性のための必要条件である。したがって、図８Ａ及び図８Ｂに示す単離Ｂ細胞株及びＴ細胞株への結合の評価に加えて、発明者らは、二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクトがヒトＰＢＭＣの自家Ｂ細胞とＴ細胞を架橋する能力を試験した。新しく単離されたヒトＰＢＭＣをｖ１５１９５と一緒に氷中インキュベートし、Ｂ細胞：Ｔ細胞ペアの割合をＦＡＣＳ分析して、Ｂ細胞とＴ細胞を架橋する濃度依存性能力を決定した。Ｔ：Ｂペアの割合は、ＣＤ２０＋ＳＳＣが低い集団内のＦＳＣ−Ｗが高い細胞と定められた。特定されたペアの７５％超がＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり、これらがＴ細胞とのペアを形成したことが示された。
【０３８３】
図８Ｃに示すように、ヒトＰＢＭＣにおけるＢ細胞：Ｔ細胞ペアの分析から、ｖ１５１９５は、ヒトＰＢＭＣのＢ細胞とＴ細胞を濃度依存的に、１ｎＭを下回る濃度で架橋することが明らかになった。
【０３８４】
まとめると、このデータは、二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクトが、２ｎＭを下回る濃度で選択的にＢ細胞に結合しＢ細胞とＴ細胞を架橋するが、単離Ｔ細胞には４０ｎＭを上回る相当に低い濃度で結合することを示している。このように低濃度でＢ細胞に選択的に結合しＢ細胞とＴ細胞を架橋するが、単離Ｔ細胞には低濃度でしか結合しないことは、選択的にＢ細胞に結合してＴ細胞を活性化するが、単離Ｔ細胞には影響を及ぼさない二重特異性抗体−薬物コンジュゲートの開発を可能にするものである。
【０３８５】
実施例８．二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３抗原結合コンストラクトと薬物とのコンジュゲーション
例示的な抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクト−薬物コンジュゲートを図１に模式的に示す。抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクトは、以下に説明するように、非切断可能リンカーＳＭＣＣによりＤＭ１にコンジュゲートされ、または切断可能リンカーＳＰＢＤによりＤＭ４にコンジュゲートされた。バリアントはワンステップ法によりＤＭ１またはＤＭ４にコンジュゲートされた。まず、出発タンパク質試料をＰＤ−１０カラムを用いて５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２ｍＭのＥＤＴＡで構成されるバッファーに交換し、タンパク質濃度を２〜１０ｍｇ／ｍｌに調節した。次いで、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解させたＳＭＣＣ−ＤＭ１（Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  ＵＳ社、カリフォルニア州サンディエゴ）またはＳＰＢＤ−ＤＭ４（Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  ＵＳ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の１０ｍＭ溶液を７．５モル当量のタンパク質試料に加えた。最終濃度１０％ｖ／ｖになるまでＤＭＡをさらに加え、試料を手短に混合した。反応混合物を撹拌しながら２５℃で一晩インキュベートした。次にこの産物をＰＤ−１０カラムを用いて２０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で構成されるバッファーに交換し、タンパク質濃度と薬物抗体比（ＤＡＲ）を２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度に基づき計算した。バッファーは最終組成が２０ｍＭのコハク酸ナトリウム、６％ｗ／ｖトレハロース、及び０．０２％ｗ／ｖポリソルベート２０（ｐＨ５．０）となるように調節した。高速液体クロマトグラフィー−分子ふるいクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）を実施して、Ｔｏｓｏｈ  Ｇ３０００−ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）を用い、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中、流量１ｍｌ／分で、ＡＤＣ純度を決定した。
【０３８６】
ｖ１２０４３、ｖ６７５４、６７５１、１５１９５、及び４３７２のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは、表７にまとめているように、収量７０％超、純度＞８５％、及び薬物／抗体比（ＤＡＲ）２．２〜３．５であった。ｖ１２０４３のＳＰＢＤ−ＤＭ４コンジュゲートは、収量７０％、純度８２％であった。
【０３８７】
（表７）二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアントのコンジュゲーション
2018524373.tif 000054
【０３８８】
図９は、コンジュゲーション後のｖ１２０４３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の例示的ＵＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルを示す。他のバリアントも同様の挙動を示した。
【０３８９】
実施例９．抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合薬物コンジュゲートのＢ腫瘍細胞株及びＴ腫瘍細胞株に対するインビトロの活性への二特異形式の影響
抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートの標的Ｂ細胞及びＴ細胞に対する細胞傷害性及び効力を試験するために、同じＣＤＲを有するが、抗原結合形式がｓｃＦｖかＦａｂで異なる選択された二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートを、増殖阻害アッセイで、Ｂ腫瘍細胞株及びＴ腫瘍細胞株を用いて試験した。図１０及び表８の選択されたバリアントは、ＣＤ１９及びＣＤ３に対し同様の結合親和性があることが既にわかっているものである。すべての選択されたバリアントは、ＣＤ１９に対しては約２ｎＭの親和性、ＣＤ３εに対しては約４０ｎＭの親和性を有する。
【０３９０】
細胞傷害性の程度を、ＣＤ１９＋ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓ（ＡＴＣＣ：  ＣＲＬ−１５９６；  Ｋｌｅｉｎ，  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９７５）非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）標的Ｂ細胞株及びＣＤ３＋ＪｕｒｋａｔＴ細胞株の細胞培養物で、非特異的ＩｇＧ  ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート（ｖ６２４９）と陽性対照としてのＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲートされた単一特異性抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢＵ１２（ｖ４３７１）と比較して測定した。単一特異性抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢＵ１２は現在、ＭＣ−ＭＭＡＦ薬物コンジュゲート（デニンツズマブ  マフォドチン）として、ＮＨＬ及びＢ−ＡＬＬの第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験で評価中である（Ｇｅｒｂｅｒ，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；  Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＴＭ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ：  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１４）。ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのオフターゲットの細胞傷害性の可能性について、ＣＤ１９もＣＤ３も発現しない標的細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４３）に対し測定した。選択された抗体を培地で希釈し、標的のＲａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｊｕｒｋａｔ、またはＫ５６２細胞に三連で加え、２４時間インキュベートした。細胞を洗い、培地を交換し、３７℃で３日間インキュベートしてから細胞生存率を測定した。細胞生存率は、標準的な手順にしたがい、スルホローダミンＢを用いて、５１０ｎｍと５４０ｎｍで吸光度を読み取り測定した。データを未処理対照に対し正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムで分析した。
【０３９１】
すべての抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートは、非特異的ＩｇＧ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照ｖ６２４９と同様に、ＣＤ１９もＣＤ３も発現しない細胞株Ｋ５６２に対し、オフターゲットの活性を示さなかった（データ省略）。
【０３９２】
（表８）選択された抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアントのＢ細胞及びＴ細胞に対する細胞傷害性
2018524373.tif 000055
【０３９３】
増殖阻害の結果は、図１０及び表８に示すように、意外にも、すべての一価抗ＣＤ１９二重特異性抗体の標的Ｂ細胞に対する細胞傷害活性は、二価単一特異性抗ＣＤ１９−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照ｖ４３７１に匹敵するかまたはそれよりも良好であった。コンジュゲートされたバリアント６７５１はＲａｍｏｓＢ細胞に対し０．４５ｎＭの効力を有し、二価単一特異性陽性対照ｖ４３７１コンジュゲートは約６ｎＭの効力を有している。
【０３９４】
増殖阻害の結果はさらに、種々のハイブリッド及び二重ｓｃＦｖ抗ＣＤ３−ＣＤ１９−ＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート間の意外な差異を示唆している。バリアント６７５１−ＭＣＣ−ＤＭ１（抗ＣＤ３はｓｃＦｖ形式であり、抗ＣＤ１９はＦａｂ形式である）は、Ｂ細胞についてはＥＣ５０が０．４５ｎＭと高活性であるが、ＪｕｒｋａｔＴ細胞については、非特異的対照のｖ４３７１及びｖ６２４９と同様、活性は非常に低い。これに対し、バリアントｖ６７５４（抗ＣＤ３はＦａｂ形式であり、抗ＣＤ１９はｓｃＦｖ形式である）は、標的Ｂ細胞にもＴ細胞にも同様の効力を有する。Ｔ細胞には影響を及ぼさずに標的Ｂ細胞を殺傷する治療窓の可能性を計算したものを表８に示す。データから、バリアント６７５１及び１２０４３については治療窓及びＴ細胞に影響を及ぼさない標的Ｂ細胞の殺傷が示唆されるが、６７５４については示唆されない。
【０３９５】
これらの結果は、意外にも、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー薬物コンジュゲートは、標的Ｂ細胞に選択的に結合し殺傷するが、Ｔ細胞に影響を及ぼさないように開発することが可能であることを示している。この選択的な結合及び活性の結果として、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー薬物コンジュゲートは、ｉ）Ｂ細胞殺傷へのＴ細胞誘導、及びｉｉ）コンジュゲートされた毒素ペイロードの内在化によるＢ細胞殺傷、という作用の二重機構を有する可能性がある。
【０３９６】
さらにデータが示唆するのは、この選択的な挙動が、二重特異性の以下の１つまたは全部の特徴に依存することである：（ｉ）ＣＤ３抗原を単一特異的に標的とすること、（ｉｉ）ＣＤ３抗原への低親和性結合、及び（ｉｉｉ）二重特異性の形式及び幾何学的形状。結論として、これらの結果は、二重特異性ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー薬物コンジュゲートの開発で最適化すべき重要なパラメーターとしての、（Ｆａｂ対ｓｃＦｖ、及びハイブリッド対二重ｓｃＦｖ、またはフルサイズのＩｇ二重特異性及びＩｇアイソタイプ、及びヒンジも含めた）二特異形式及びＣＤ３ｅ親和性の特定を可能にしている。
【０３９７】
この結論及び種々の形式のバリアントの順位は、実施例１０で説明する初代Ｔ細胞を用いた活性アッセイで、また腫瘍細胞株及びＴ細胞株を用いた内在化アッセイ（実施例２１）でも確認されている。
【０３９８】
実施例１０．初代ヒト血液試料における例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクト薬物コンジュゲートのインビトロの有効性
Ｔ細胞及びＴ細胞活性に影響を及ぼさない選択的な標的Ｂ細胞の殺傷をさらに試験するため、選択されたバリアントを同種Ｒａｍｏｓ及びＲａｊｉリンパ腫細胞株と一緒に初代血液培養物で試験した。このアッセイは、二重特異性のＴ細胞誘導活性により媒介される同種標的Ｂ細胞に対する抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートの細胞傷害活性、及び標的Ｂ細胞による抗原結合コンストラクトの内在化により送達されるコンジュゲートされた薬物の細胞傷害活性を反映する。コンジュゲートがＴ細胞集団に及ぼす影響を測定するため、Ｔ細胞の活性、活性化、及び増殖を分析した。Ｔ細胞総数の関連マーカーとして、ＣＤ４及びＣＤ８が測定されているが、ＣＤ８  Ｔ細胞とＣＤ４  Ｔ細胞のＴ細胞活性化は、それぞれ早期と後期のＴ細胞活性化マーカーとして確立されているＣＤ６９とＣＤ２５により測定された。
【０３９９】
さらに、Ｔ細胞疲弊マーカーＰＤ−１を測定して、Ｔ細胞の阻害及び疲弊効果の可能性を評価した。ＰＤ−１（プログラムされた細胞死タンパク質１）は免疫チェックポイントとして機能し、Ｔ細胞の活性化を阻止しＴ細胞アポトーシスを促進しながら、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）のアポトーシスを抑制することにより免疫系を負に制御する重要な役割を果たしている（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＬＭ，  Ｓａｇｅ  ＰＴ，  Ｓｈａｒｐｅ  ＡＨ  （Ｊｕｌ  ２０１０）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３６：  ２１９−４２）。
【０４００】
各実験用にヒト血液（１２０〜１４０ｍＬ）を複数のドナーから採取し、ＰＢＭＣを新しく単離した。ＰＢＭＣをさらに処理して自家Ｂ細胞を含まないサブ集団（ＰＢＭＣ−Ｂ）を誘導した。休止ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓヒトＢ細胞を標的細胞として用い、Ｔ細胞の同種ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓＢ細胞に対する比をＥ：Ｔ比５：１になるように調節した。Ｂ細胞集団及びＴ細胞集団は、０日目に、ＦＡＣＳにより決定した。排他的Ｂ細胞マーカーとしてはＣＤ１９及びＣＤ２０が含まれた。Ｔ細胞集団はＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８により測定し、Ｔ細胞活性化及び可能な疲弊は上述したようにＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＰＤ１によりそれぞれ測定した。各対照条件及び実験条件について四連ウェルでプレート培養し、同時培養物を５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、７２時間後に止めた。培養物中のＴ細胞とＢ細胞の割合をＦＡＣＳで評価した。回収した培養細胞を染色しＣＤ４５、ＣＤ２０、及び７−ＡＡＤをＦＡＣＳ検出した。ＦＡＣＳ分析は、ＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏを用いて以下のようにして実施した。細胞サブ集団の分析にＧｕａｖａ  ８ＨＴフローサイトメーターを用いた。ＦＳＣ／ＳＳＣ及び補正（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）ウェル５，０００イベントと、実験ウェル３０，０００イベント間でサイトメトリー分析した。デブリとＲＢＣを省くように閾値を設定した。全Ｂ細胞がＣＤ１９とＣＤ２０ダブルポジティブであることを０日目に確認しており、したがってＣＤ２０を適切なＢ細胞マーカーとして、モニタリングできた。対照実験では、ＰＢＭＣを含まないＲａｊｉ及びＲａｍｏｓ細胞培養物をバリアントと一緒にインキュベートし、７２時間後にＢ細胞の細胞傷害性について分析した。
【０４０１】
図１１及び図１２は、２ドナーのＰＢＭＣ及び同種ＲａｊｉＢ細胞を用いたｎ＝２リピートの結果を示す。非コンジュゲートバリアントｖ１２０４３は、両ドナーでＲａｊｉ標的Ｂ細胞に＜０．０５ｎＭの効力があり、同様の効力でＴ細胞の増殖及び活性化を誘発した。この非コンジュゲートバリアントｖ１２０４３は、Ｔ細胞誘導機構により、標的Ｂ細胞の約５０％を枯渇させることができる。これに対し、薬物コンジュゲートは０．５ｎＭ未満の濃度で、Ｔ細胞が媒介する同等のＢ細胞枯渇を示すが、さらに、０．５ｎＭよりも高い濃度で標的ＲａｊｉＢ細胞を枯渇させることができる。意外にも、このコンジュゲートは、５０ｎＭという最高濃度でのみＴ細胞の増殖への影響を示すが、それよりも低い濃度では影響しない。このことは、図１０及び表８に示すデータと一致する。
【０４０２】
図１３及び図１４は、図１２と同じドナーからの新鮮なＰＢＭＣを使用しＲａｊｉ及びＲａｍｏｓ標的Ｂ細胞を用いた、ハイブリッド・バリアントｖ６７５１及びｖ６７５４の別のリピート実験の結果を示す。抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアントの活性を、陽性対照のブリナツモマブ及び抗ＣＤ１９単一特異性コンジュゲートと比較する。図１３及び図１４の結果は、標的Ｂ細胞枯渇について、非コンジュゲートｖ６７５１及びｖ６７５４と比べて、コンジュゲートのより高い濃度での同様のさらなる活性を示している。図１０の増殖阻害アッセイにより示唆されるように、このアッセイでは、Ｔ細胞に対するｖ６７５１コンジュゲートとｖ６７５４コンジュゲートの意外な差異、つまりｖ６７５４コンジュゲートは標的Ｂ細胞の有効な殺傷を媒介するがＴ細胞には影響がないことが確認されている。
【０４０３】
先の実験でのＢ細胞枯渇及びＴ細胞数の測定（図１１及び図１２）に加えて、ＰＤ−１の上方制御を測定した。ＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を阻止し、Ｔ細胞アポトーシスを促進することにより、免疫系の負の制御に重要な役割を果たしている（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＬＭ，  Ｓａｇｅ  ＰＴ，  Ｓｈａｒｐｅ  ＡＨ  （Ｊｕｌ  ２０１０）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３６：  ２１９−４２）。ＰＤ−１の上方制御は、Ｔ細胞誘導治療に対する抵抗機構と考えられている［Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  （２０１４）  ５５６１−７１；  Ｋｏｈｎｋｅ，  ２０１５］。図１４にＰＢＭＣ及び同種Ｒａｊｉ細胞とともに示すように、陽性対照のブリナツモマブも含め全バリアントがＴ細胞の８０％超でＰＤ−１の上方制御を誘発し、非コンジュゲートバリアントは有意なＢ細胞枯渇を示さなかった。コンジュゲートされたバリアントはより高い濃度でＲａｊｉＢ細胞を枯渇させることができたが、非コンジュゲートバリアントはできなかった。さらに、抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートは、非コンジュゲート比較物と比較して、より高い濃度で、ＰＤ−１発現Ｔ細胞がより低い割合となることを示す。
【０４０４】
ブリナツモマブの臨床及び前臨床経験は、Ｔ細胞誘導応答はドナー依存性が高く、Ｔ細胞免疫抑制機構により制限され得ることを示している（Ｋｏｈｎｋｅ，  ２０１５）。上記で説明したように、試験したすべての二重特異性コンジュゲート（ブリナツモマブも含む）は、ＰＤ１の上方制御を誘発し、ドナーによっては非コンジュゲート二重特異性コンジュゲートは標的Ｂ細胞の枯渇において有効ではなかった。これに対し、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーコンジュゲートはこれらの培養物において活性を示し、作用の二重機構によって、Ｔ細胞免疫抑制が高い患者における有効性の限界を克服できる可能性を示唆している。
【０４０５】
実施例１１．Ｔエフェクター細胞なしで培養し増殖させたＡＬＬ、ＮＨＬ腫瘍細胞株に対する二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの細胞傷害性
生物物理学的特性を改良したヒト化二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９バリアント（実施例３〜実施例５を参照されたい）の細胞傷害性及び効力を試験するために、選択されたバリアントを、実施例８で説明したようにしてＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲートさせた。ｖ６７５１、ｖ１５１９２、ｖ１５１９３、ｖ１５１９４、ｖ１５１９５のすべてのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは、同様の７０％超の収量、純度＞９０％、及び薬物／抗体比（ＤＡＲ）３．１〜３．５であった。
【０４０６】
細胞傷害性の程度を、異なるＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）と急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）腫瘍Ｂ細胞株の細胞培養物で、非特異的ＩｇＧ  ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート（アイソタイプＤＭ１）とオーリスタチンがコンジュゲートされた単一特異性抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢＵ１２を陽性対照として比較して、測定した。単一特異性抗ＣＤ１９抗体ｈｕＢＵ１２は、現在、ＭＣ−ＭＭＡＦ薬物コンジュゲート（デニンツズマブ  マフォドチン）として、ＮＨＬ及びＢ−ＡＬＬの第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験で評価中である（Ｇｅｒｂｅｒ，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；  Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＴＭ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ：  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１４）。
【０４０７】
Ｔ細胞に対する影響を、ＣＤ３＋ＪｕｒｋａｔＴ細胞で試験する。ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのオフターゲットの細胞傷害性の可能性を、ＣＤ１９もＣＤ３も発現しない標的細胞株Ｋ５６２に対し測定した。この実験は、実施例９で詳述したようにして実施した。
【０４０８】
図１５は、選択したサブセットの標的細胞株の結果を示し、表９は、抗ＣＤ１９抗体陽性対照との比較の結果をまとめている。
【０４０９】
（表９）Ｔ細胞なしで培養し増殖させたＡＬＬ、ＮＨＬ腫瘍細胞株に対するＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの細胞傷害性
2018524373.tif 000056
【０４１０】
＊を付した結果は、５ポイントの濃度曲線しか測定していないので、Ｋｄを信頼区間に当てはめることができなかったことを表す。たとえば、＜５という結果は、濃度５ｎＭで５０％超の細胞が枯渇したことを表す。＊＊を付した結果は、マウスｖ６７５１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートについて収集したデータであることを表す。
【０４１１】
表９に示すように、二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９薬物コンジュゲートは、ＮＨＬ及びＡＬＬ腫瘍Ｂ細胞株の強力な殺傷を示すが、ＪｕｒｋａｔＴ細胞の増殖には有意な影響を及ぼさない。すべての抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートは、ＣＤ１９もＣＤ３の発現しない細胞株Ｋ５６２に対しオフターゲットの活性を示さず、非特異的ＩｇＧ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１対照と類似していた（データ省略）。
【０４１２】
さらに、その効力は陽性対照ｈｕＢＵ１２−ＭＣＣ−ＤＭ１に匹敵するかまたはそれよりも高く、ｖ１５１９５−ＭＣＣ−ＤＭ１はヒトがん細胞株全体で標的細胞の広範な細胞傷害性殺傷を示した。
【０４１３】
実施例１２．Ｔ細胞と一緒に培養し増殖させた腫瘍細胞株に対する、二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲート及び二重特異性非コンジュゲート抗ＣＤ１９−ＣＤ３の細胞傷害性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされた、またはコンジュゲートされていないバリアントｖ１５１９５の標的Ｂ細胞傷害活性を、承認済み治療抗体ブリナツモマブと比較してさらに評価した。二重特異性バリアントｖ１５１９５を選択したのは、ブリナツモマブと比べてＴ細胞誘導効力が１００倍以上低いからである。このような低いＴ細胞媒介効力は、インビトロ及びインビボで標的Ｂ細胞殺傷を媒介するのに十分であるが、１０００倍低い濃度で、Ｔ細胞活性化及び増殖がブリナツモマブよりも低くなる（実施例１４を参照されたい）。重要なことに、この低い効力で、Ｔ細胞誘導性とＤＭ１媒介性の細胞傷害効力は両立し、作用の二重機構が可能になる。
【０４１４】
二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートの細胞傷害活性を、抗ＣＤ３−ＣＤ１９非コンジュゲートバリアント及び陽性対照のブリナツモマブ（商標）（ブリナツモマブ、ＢｉＴＥ（商標））と比べて測定した。コンジュゲートがＴ細胞集団に及ぼす影響を測定するために、Ｔ細胞活性、活性化、及び増殖について、実施例１３で説明したようにしてさらに分析した。アッセイはｎ＝４の初代血液ドナーを用いて実施し、実験の設定は実施例１１〜実施例１４で上述したようにして実施した。
【０４１５】
図１６に示すように、非コンジュゲートｖ１５１９５の活性とＤＭ１がコンジュゲートされたｖ１５１９５の活性の比較から、抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートの同種標的Ｂ細胞に対する細胞傷害活性は、二重特異性コンストラクトのＴ細胞誘導活性により媒介され得るのみならず、標的Ｂ細胞による抗原結合コンストラクトの内在化により送達されるコンジュゲートされた薬物によっても媒介され得ることが裏付けられる。
【０４１６】
さらにこの結果は、有効濃度の非コンジュゲートｖ１５１９５も陽性対照のブリナツモマブもＴ細胞媒介活性はドナー依存性が高く、このアッセイでは９０％超の標的Ｂ細胞を殺傷するのに十分ではなかったことから、二重機構の利点を示している。
【０４１７】
実施例１３．Ｔ細胞と一緒に培養し増殖させた腫瘍細胞株に対する二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの細胞傷害性
二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの活性をさらに試験するために、細胞傷害性の程度を、異なるＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）腫瘍Ｂ細胞株と初代Ｔ細胞と同時培養して測定した。
【０４１８】
バリアントｖ１５１９５−ＭＣＣ−ＤＭ１を、同種ＮＨＬまたはＡＬＬ細胞株を含む初代血液培養物で試験した。実験の設定は実施例１２で上述したようにして実施した。
【０４１９】
図１７は、二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートによる異なるＮＨＬ標的Ｂ細胞株とＡＬＬ標的Ｂ細胞株の強力な殺傷を示し、Ｔ細胞には影響を及ぼさない選択的な標的Ｂ細胞の殺傷を裏付けている。Ｔ細胞数は、試験の最高濃度５０ｎＭまで影響を受けない（データ省略）。
【０４２０】
実施例１４．二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートのＴ細胞活性化及び増殖効果の、ブリナツモマブ及びＯＫＴ３抗体との比較
市販の治療抗体ブリナツモマブの臨床用量は、Ｔ細胞が媒介する、Ｔ細胞の増殖及び活性化の程度と関連があると考えられる毒性により制限されている（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ，  １９８６；  Ａｂｒａｍｏｗｉｃｚ，  １９８９；  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ，  ２０１１；  Ｂａｒｇｏｕ，  ２００８；  Ｔｏｐｐ，  ２０１１；  Ｋｌｉｎｇｅｒ，  ２０１０；国際特許公開ＷＯ２０１１０５１３０７Ａ１；  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  ＭＥ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１６；  Ｔｏｐｐ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１５）。
【０４２１】
ｖ１５１９５の潜在的な治療指数を評価するため、ｖ１５１９５がＴ細胞活性化及び増殖を誘発する能力を、ＲａｊｉがんＢ細胞とヒトＰＢＭＣの同時培養物で評価し、臨床的に耐容される曝露と同等の濃度のブリナツモマブのインビトロ活性と比較した（第１相ｒ／ｒ−ＮＨＬ臨床試験でのブリナツモマブの最大耐量（ＭＴＤ）は、６０μｇ／ｍ２／日（Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  ＭＥ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１６）であり、ブリナツモマブの安全な用量及び曝露と比較するため、ブリナツモマブの濃度は０．０５ｎＭ、または４０μｇ／ｍ２／日の用量での曝露に等しい濃度を選択した）。
【０４２２】
同時培養実験は、以下のようにして実施した。０日目に４ドナーからそれぞれ血液を採取し、ＰＢＭＣを新たに単離した。ＰＢＭＣをさらに処理してＢ細胞を含まないＰＢＭＣのサブ集団（ＰＢＭＣ−Ｂ）を誘導した。休止ＰＢＭＣ−Ｂをエフェクター細胞として用い、ＲａｊｉヒトＢ細胞を標的細胞として用い、Ｔ細胞の同種ＲａｊｉＢ細胞に対する比をＥ：Ｔ比５：１になるように調節した。混合物を抗体コンストラクトと一緒に３日間インキュベートし、その後回収した初代細胞を染色しＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ２５をＦＡＣＳ検出した。異なる集団のＦＡＣＳ分析は、ＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏを用いて以下のようにして実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及び補正ウェル５，０００イベントと、実験ウェル３０，０００イベント間でサイトメトリー分析した。デブリとＲＢＣを省くように閾値を設定した。
【０４２３】
図１８Ａは、４ドナーからの、７２時間インキュベーションした後の、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団についての結果を示す。この分析は、誘発されたＴ細胞の増殖の間接的な測定値であるＣＤ８＋Ｔ細胞の総数、及びそれぞれ早期と後期のＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９とＣＤ２５（実施例１０を参照されたい）により測定されるＴ細胞活性化の程度を示している。
【０４２４】
この結果は、ｖ１５１９５が、インビトロＥＣ５０よりも１００〜１０００倍高い有効な濃度で（図１６及び実施例１２を参照されたい）、臨床的に耐容されるブリナツモマブの濃度よりも低いＴ細胞の増殖及び活性化を誘発したことを示す。
【０４２５】
誘発されたＴ細胞の増殖及び活性化のＦＡＣＳを用いた分析に加えて、図１８Ｂに示すように、ｖ１５１９５が誘発したＴ細胞の増殖を、ＰＢＭＣ培養物のチミジン細胞増殖アッセイで評価した。チミジンを用いるアッセイは、ＰＢＭＣ培養物で誘発された全増殖の可能性の測定なので、Ｔ細胞の増殖及び活性化についての別の測定となる。チミジン分析は、上述のＦＡＣＳを用いる方法を補完する手段を提供する。図１８Ｂで説明するアッセイでは、ｖ１５１９５のもともとの親マウスバリアントであるｖ６７５１を用いた（表３を参照されたい）。
【０４２６】
ＰＢＭＣ培養物のチミジン細胞増殖アッセイは、以下のようにして実施した。１日目に３ドナーからそれぞれ血液を採取し、ＰＢＭＣを新しく単離した。試験項目を最終濃度０．３ｎＭ及び１００ｎＭで調製し、ＰＢＭＣと合わせ、２５万細胞／ウェルでプレート培養した。混合物を３日間インキュベートした後、滴定したチミジンを、細胞を収容しているウェルに、最終濃度０．５μＣｉチミジン／ウェルとして加え、プレートをさらに１８時間インキュベートした後、凍結した。全インキュベーション時間は４日であった。プレートを濾過し、βカウンターで計測した（ＣＰＭ）。平均値から刺激指標（ＳＩ）を以下のように計算し、データを表にした：試験項目の平均ＣＰＭ／培地のみの平均ＣＰＭ。健常ドナーから採取したヒトＰＢＭＣの平均Ｅ：Ｔ比は、ＣＤ３＋Ｔ細胞対ＣＤ１９＋Ｂ細胞が約１０：１であった。
【０４２７】
図１８Ｂに示すように、ブリナツモマブ及びＯＫＴ３との比較は、１０００倍高い濃度でも、ｖ６７５１の培養物における全細胞増殖率が低いことを示している。このことは、二重特異性ＣＤ１９−ＣＤ３薬物コンジュゲートは、最高評価濃度ではＴ細胞に影響を及ぼさないこと、さらに、その治療指標はブリナツモマブよりも高い可能性があることを示唆している。
【０４２８】
実施例１５．ヒトＰＢＭＣにおける二重特異性ヘテロダイマーバリアントによるＴ細胞活性化の標的Ｂ細胞依存性
例示的抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１二重特異性バリアントｖ１５１９５がＴ細胞活性化を標的Ｂ細胞に依存するかどうかをヒトＰＢＭＣで判定した。この実験は以下のようにして実施した。
【０４２９】
ヒト血液（１２０〜１４０ｍＬ）をドナーから採取し、ＰＢＭＣをドナーから新しく単離した。ＰＢＭＣをさらに処理して、Ｂ細胞を含まないＰＢＭＣのサブ集団を誘導した（ＰＢＭＣ−Ｂ）。各対照条件及び実験条件は四連ウェルでプレート培養し、ＰＢＭＣ培養物を５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、７２時間後に止めた。Ｔ細胞集団をＦＡＣＳで評価した。細胞ペレットを様々な抗体のカクテル中に再懸濁させて、フローサイトメトリー分析に供した。Ｇｕａｖａ  ８ＨＴフローサイトメーターを用いて細胞サブ集団を分析した。陰性対照として抗ＣＤ１９二価単一特異性抗体（ｈｕＢ１２；実施例１１を参照されたい）及び未処理培養物を用いた。結果を図１９に示す。
【０４３０】
結果は、ｖ１５１９５が、Ｂ細胞を含まないＰＢＭＣ培養物ではＴ細胞を活性化しないが、標的Ｂ細胞の存在下ではＴ細胞を活性化することを示している。バリアントｖ１５１９５は、厳密に標的依存性のＴ細胞活性化を示す。
【０４３１】
実施例１６．二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートｖ１５１９５のＴ細胞活性化、増殖、及びサイトカイン放出の、非コンジュゲートｖ１５１９５との比較
ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされたまたはされていない二重特異性コンストラクトがＴ細胞の増殖及び活性化を誘発する能力を以下に説明する２つの異なるアッセイで評価した。アッセイはｎ＝４の初代血液ドナーを用いて実施し、実験の設定は実施例１２及び実施例１４と同様にして実施した。
【０４３２】
Ｒａｊｉ／ＰＢＭＣ−Ｂ培養物におけるＴ細胞の増殖／活性化のＦＡＣＳ分析：０日目に、４ドナーからそれぞれ血液を採取し、ＰＢＭＣを新しく単離した。ＰＢＭＣをさらに処理してＢ細胞を含まないＰＢＭＣサブ集団（ＰＢＭＣ−Ｂ）を誘導した。休止ＰＢＭＣ−Ｂをエフェクター細胞として用い、ＲａｊｉヒトＢ細胞を標的細胞として用い、Ｔ細胞の同種ＲａｊｉＢ細胞に対する比をＥ：Ｔ比５：１になるように調節した。混合物を抗体コンストラクトと一緒に３日間インキュベートし、その後回収した初代細胞を染色しＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ２５をＦＡＣＳ検出した。
【０４３３】
Ｒａｊｉ／ＰＢＭＣ−Ｂ同時培養上清のサイトカイン分析：Ｒａｊｉ同時培養実験は上述のように設定し、３日間のインキュベーション後、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０のレベルをルミネックスにより評価した。
【０４３４】
ＰＢＭＣ−Ｂ／Ｒａｊｉ同時培養物におけるＴ細胞の増殖及び活性化のＦＡＣＳを用いた分析の結果を図２０Ａに示す。サイトカイン産生を図２０Ｂに示す。
【０４３５】
図２０Ａ及び図２０Ｂの結果は、ｖ１５１９５のＳＭＣＣ−ＤＭ１とのコンジュゲートにより、コンジュゲートされていないｖ１５１９５と比べて、低濃度でＴ細胞の増殖及び活性化が増大したことを示す。また、ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされたｖ１５１９５は、コンジュゲートされていないｖ１５１９５と比べて、炎症促進性サイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ−６の産生を増大させた。ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされたｖ１５１９５は抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のわずかな増加を誘発しただけだったが、非コンジュゲート形式は用量依存的増加をもたらした。
【０４３６】
Ｔ細胞活性化及び特にサイトカイン・プロファイルの差異は、意外だが妥当な結果である。というのは、たとえばＩＬ１０の放出はＴ細胞抑制機構と関連づけられており（たとえば制御性Ｔ細胞の増殖）、それによってＴ細胞エンゲージャーの有効性が制限されるからである。したがって、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー薬物コンジュゲートは、Ｔ細胞抑制機構の影響を受けにくい可能性がある。それに加えて、Ｔ細胞及びマクロファージの活性化の主要な制御因子である炎症促進性サイトカインＩＮＦγの放出の増加は、Ｔ細胞誘導活性と協働しそれを増大させる可能性がある。
【０４３７】
Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出のこの差異は、用量依存性であって、ＤＭ１が媒介する標的細胞枯渇の用量応答と相関しており、このことから該効果は薬物コンジュゲートの活性により媒介されていることが示唆される。先に報告されているように、ＤＭ１及びＤＭ１−ＡＤＣは、免疫原性細胞死を媒介することができ、抗ＰＤ１や抗ＣＴＬＡ４のような免疫調節剤との相乗作用性が高い（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１５）。この結果は、ＤＭ１のような毒素の付加は、免疫原性／炎症促進性細胞死を誘発することによって、抗ＣＤ１９−ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を高める可能性があることを示唆している（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１５）。
【０４３８】
実施例１７．Ｔ細胞と一緒に培養し増殖させた腫瘍細胞株に対する二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３  ＭＭＡＥコンジュゲートの細胞傷害性
Ｔ細胞には影響を及ぼさない標的Ｂ細胞の選択的殺傷をさらに試験するために、切断可能リンカー（マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ））を用いてｖ１５１９３を毒素ＭＭＡＥにコンジュゲートした。この二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートの細胞傷害活性を、同種Ｒａｍｏｓリンパ腫細胞株を含む初代血液培養物中、抗ＣＤ３−ＣＤ１９非コンジュゲートバリアントと比較して測定した。切断可能リンカーを用いての薬物コンジュゲーションの結果としての、Ｔ細胞に対する細胞傷害性の可能性も評価した。
【０４３９】
抗体薬物コンジュゲートを調製するために、まず、抗体を、コンジュゲーション用抗体を固定化する専用樹脂である「Ｌｏｃｋ−Ｒｅｌｅａｓｅ」樹脂（ＡＤＣＲ０１，  ＡＤＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に、１ｍｇ／１００μＬの樹脂ローディングでコンジュゲートさせた。次に、この結合抗体に２ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を該結合抗体に対しＴＣＥＰ６モル当量で加え、混合物を連続的に撹拌しながら２０℃で１２０分インキュベートすることによって、抗体ジスルフィド結合を還元した。余分なＴＣＥＰをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗って除去した。
【０４４０】
コンジュゲーションのため、まず、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ含有ＰＢＳ中、結合抗体に対し６モル当量のリンカー−毒素に相当するｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（ＡＤＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、以下の構造式を参照されたい）（ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中１０ｍＭ原液）の溶液を調製した。このリンカー−毒素液を結合抗体に加え、混合物を連続的に撹拌しながら２０℃で６０分間インキュベートした。
ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ：
2018524373.tif 000057
【０４４１】
コンジュゲーション後、樹脂を１４８００ｒｐｍで２分間遠心分離にかけて、余分なリンカー−毒素液を除去した。次いで樹脂を５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ含有ＰＢＳで３回洗って残留リンカー−毒素を除去し、その後ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗って残りのＤＭＡ共溶媒を除去した。抗体薬物コンジュゲートは、樹脂をＲｅｌｅａｓｅバッファー（ＡＤＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）中１５分インキュベートしてから、１４８００ｒｐｍで２分間遠心分離にかけて、樹脂から外した。次いで濾過液をＧ２５ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社  Ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＮＡＰ（商標）−５カラム）により、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、９％スクロース（ｐＨ５．０）を含有するバッファー中に脱塩し、次いで滅菌０．２２μｍＰＥＳメンブレンで濾過した。
【０４４２】
最終的な抗体薬物コンジュゲートの純度を、高速液体クロマトグラフィー−分子ふるいクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）によって、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ７．８ｍｍ  ｘ  ３０ｃｍ、５μｍカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、１０％ＩＰＡ、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５Ｍの塩化カリウム（ｐＨ６．９５）中、流量０．５ｍＬ／分で、評価した。抗体薬物コンジュゲートの薬物抗体比（ＤＡＲ）を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ＨＰＬＣによって、ブチル−ＮＰＲ  ４．６ｍｍ   ｘ  ３．５ｃｍ、２．５μｍカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、Ａ−１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２５ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．９５）及びＢ−２５ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．９５）、２５％ＩＰＡの１２分の直線勾配で０．８ｍＬ／分で実施し、決定した。
【０４４３】
ｖ１５１９３−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥコンジュゲートの最終収量は３９％、純度＞９８％、平均ＤＡＲは３．７であった。
【０４４４】
コンジュゲートのＴ細胞集団に対する影響を測定するために、Ｔ細胞活性、活性化、及び増殖を、実施例１４で説明したようにしてさらに分析した。このアッセイは、ｎ＝１の初代血液ドナーを用いて実施し、実験の設定は実施例１２で説明したようにして実施した。
【０４４５】
図２１に示すように、ＭＭＡＥがコンジュゲートされていない二重特異性バリアントと、ＭＭＡＥがコンジュゲートされた二重特異性バリアント（ｖ１５１９３対ｖ１５１９３−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（「ｖ１５１９３−ｖｃ−ＭＭＡＥ」））の活性の比較から、抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートの同種標的Ｂ細胞に対する細胞傷害活性は、二重特異性コンストラクトのＴ細胞誘導活性により媒介され得るが、標的Ｂ細胞による抗原結合コンストラクトの内在化により送達されるコンジュゲートされた薬物によっても媒介され得ることを裏付けている。
【０４４６】
さらに、この結果は、意外にも、ｖ１５１９３−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥがＴ細胞数にほとんどまたはまったく影響しなかったことを示しており、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー薬物コンジュゲートは非切断可能リンカー（上述したような）を用いても、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣなどの切断可能リンカーを用いても、開発できることを示唆している。
【０４４７】
実施例１８．ヒト化ｈｕ（ＣＤ３４＋）ＮＳＧマウスにおける例示的抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクト薬物コンジュゲートに対するインビボの応答
抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートがＴ細胞集団及び活性に及ぼす影響をさらに評価するため、選択されたバリアントをヒト化マウスのインビボ実験で分析した。インビボのＢ細胞枯渇、及び自家Ｔ細胞の活性化及び分布変化（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を、ヒト化（ＣＤ３４＋）ＮＳＧマウス（Ｅ：Ｔは約１：５）で、ｖ１２０４３  ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの単回用量のＩＶ注射後、非コンジュゲートｖ１２０４３と比較して、測定した。
【０４４８】
マウスのヒト化は、２週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ  ｓｃｉｄγ，ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスにヒト胎児肝臓（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）からのヒト（ＣＤ３４＋）ＨＳＣを注射した。ヒト化（ＣＤ３４＋）ＮＳＧマウスは１２週間以内にヒトＴ細胞系統及びＢ細胞系統を発生させる。ヒト化（ＣＤ３４＋）ＮＳＧの平均的なＴ細胞対Ｂ細胞比は約１：５から１：１である。
【０４４９】
ヒト化（ｈＣＤ３４＋）ＮＳＧに、０日目（０．３ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇの用量で）１回静脈内（ＩＶ）ボーラス注射をし、自家循環Ｂ細胞集団及びＴ細胞集団を注射後４８時間と、５日目の実験終了後に、以前に説明されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４）のと同様に分析した。Ｔ細胞集団とＢ細胞集団は、ＦＡＣＳ分析した。分析した具体的なＢ細胞マーカー及びＴ細胞マーカーは、実施例１０で上述したように、ヒトＣＤ４５、ＣＤ２０、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ６９であった。
【０４５０】
表５に示すバリアントのインビボの血清曝露は、ＮＳＧマウスの以前のデータから推定した（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４を参照されたい）。
【０４５１】
（表１０）ｖ１２０４３の推定血清曝露
2018524373.tif 000058
【０４５２】
図２２は、ｖ１２０４３と、ｖ１２０４３  ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＳＰＢＤ−ＤＭ４コンジュゲートの単回注射後の、血行路のＢ細胞数及びＴ細胞数への影響を示す。すべてのバリアント及び用量レベルが循環Ｂ細胞（ＣＤ２０＋Ｂ細胞）の枯渇に有効であったが、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＣＤ６９発現により測定したＴ細胞数及びＴ細胞活性化には群間有意差がなかった。
【０４５３】
表１０の血清曝露の推定は５０ｎＭに近いＣｍａｘを示しているが、これは初代血液培養物のインビトロのアッセイで使用した最高濃度であった。このインビボの単回投与実験では、最高用量の０．３ｍｇ／ｋｇで、５０ｎＭに近いＣｍａｘでも、抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートはＴ細胞に負の影響を及ぼさないことが裏付けられた。さらに、該コンジュゲートは、Ｔ細胞活性化及びＢ細胞に対するＴ細胞誘導活性を低下させない。
【０４５４】
実施例１９．抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合コンストラクト薬物コンジュゲートのｈｕ（ＣＤ３４＋）ＮＳＧマウスにおけるインビボ応答
抗ＣＤ３−ＣＤ１９コンジュゲートが、高用量及び３００ｎＭを上回る最大曝露でＴ細胞及びＴ細胞活性化に及ぼす影響をさらに評価するため、ｖ１５１９５−ＭＣＣ−ＤＭ１をヒト化マウスのインビボ実験で分析した。９ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び０．３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ注射後、自家Ｔ細胞のインビボの活性化及び分布変化（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を、ヒト化（ＣＤ３４＋）ＮＳＧ−ＳＧＭ３（ＮＳＧ系統：ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ  Ｔｇ（ＣＭＶ−ＩＬ３，ＣＳＦ２，ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウス（Ｅ：Ｔ＜１：５）で測定した。対照として、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖなしの、ヘテロダイマーＦｃに接続された抗ＣＤ１９  Ｆａｂだけのバリアント（ｖ１５７６０）を用いた。この単一特異性抗ＣＤ１９対照バリアントｖ１５７６０を、実施例８で説明したようにして純度＞９０％、ＤＡＲ３．５でＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲートした。
【０４５５】
ヒト化（ＣＤ３４＋）マウスは、マウスモデルでヒトＴ細胞の活性化、分布変化、及び増殖を評価する良好なモデル系となるが、これらのモデルはヒトＢ細胞の増殖及び成熟については一部欠陥もある（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１２；  ９：  ２０８−２１４；  Ｂｒｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．  ２０１０；  １７（２）：  １２０−１２５）。したがって発明者らは、コンジュゲートされた薬物ＤＭ１がヒトＢ細胞に及ぼす有意な影響が観察できるとは期待しないが、これらのモデルはヒトＴ細胞の活性化及び増殖についてはしっかりと樹立されているので、この実験の主な目的は、抗ＣＤ３−ＣＤ１９二重特異性薬物コンジュゲートがＴ細胞の活性化及び増殖に及ぼす影響を評価することとする。
【０４５６】
この実験は、先に実施例１８及びＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４で説明されているようにして実施した。簡単に説明すると、ヒト化（ｈＣＤ３４＋）ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスをＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９  ＡＤＣのｖ１５１９５−ＭＣＣ−ＤＭ１を０日目に（０．３ｍｇ／ｋｇ、１、３ｍｇ／ｋｇ、及び９ｍｇ／ｋｇの用量で）１回静脈内（ＩＶ）ボーラス注射し、８日目の実験終了後、末梢血中及び単離脾臓中の循環自家Ｂ細胞集団及びＴ細胞集団を、以前に説明されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４）のと同様に分析した。Ｔ細胞集団とＢ細胞集団は、ＦＡＣＳ分析した。分析した具体的なＢ細胞マーカー及びＴ細胞マーカーは、実施例１０及び実施例１８で上述したように、ヒトＣＤ４５、ＣＤ２０、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ６９であった。
【０４５７】
図２３は、単回用量の注射後８日目の末梢血中及び単離脾臓中のＣＤ３＋  Ｔ細胞の総数を示す。この結果は、選択された最高用量の９ｍｇ／ｋｇでのみ、血行路中及び脾臓中のＴ細胞に対する有意な影響が観察されたことを示している。３ｍｇ／ｋｇ以下の用量では、Ｔ細胞数にも活性化にも影響は観察されなかった。
【０４５８】
表１１に示すｖ１５１９５のインビボの血清曝露は、ＮＳＧマウスにおける非コンジュゲートバリアントの以前のデータから推定した（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４）。
【０４５９】
表１１の血清曝露の推定は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー−ＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートが、自家Ｔ細胞に長期の影響を及ぼすことなく少なくとも３ｍｇ／ｋｇの用量まで、及びそれに関連する３００ｎＭを上回るＣｍａｘまで投与できることを示唆している。これは、臨床開発される他のＳＭＣＣ−ＤＭ１抗体薬物コンジュゲートと同様の曝露及びＣｍａｘなので、Ｔ細胞エンゲージャー薬物コンジュゲートが他の臨床開発の−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣで標準的な用量レベルで開発できるということになる（Ｊｕｍｂｅ  ａｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ  （２０１０）  ３７：２２１−２４２；  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  （２０１４）  ７４：３９９−４１０）。
【０４６０】
（表１１）推定血清曝露
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【０４６１】
実施例２０．固形腫瘍に効能がある二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３抗原結合コンストラクトの発現及び精製
ＣＤ３、及びＣＤＨ３、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＥＧＦＲに対する二重特異性抗体をＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４で説明されているようにして設計し、発現させ、特徴付けた。簡単に説明すると、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳類での発現用に最適化されたコドンを用いて遺伝子合成により作製した。ｓｃＦｖ−Ｆｃ配列を既知の抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ＢｉＴＥ（商標）抗体（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９８，  Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ：  ７７，７６３−７７２）と抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｄｒｕｇ  Ｂａｎｋリファレンス：ＤＢ０００７５）から生成した。ＣＤＨ３  Ｆａｂ配列は既知の抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００７３３３）から生成した。ＨＥＲ２  Ｆａｂ配列はトラスツズマブ（ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０２６２６６、  Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：  ５８，２８２５−３１）から生成し、ＨＥＲ３  Ｆａｂ配列は既知の抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体から生成した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７００６２、Ｍｉｒｓｃｈｂｅｒｇｅｒ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：  ７３，  ５１８３−９４）。ＥＧＦＲ配列はセツキシマブから生成した（ＰＣＴ／ＵＳ１９９６／００９８４７、Ｐｒｅｗｅｔｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：  １９，４１９−２７）。作製したＦａｂ−ｓｃＦｖバリアントを表１２で説明している。
【０４６２】
ヒト化抗ＣＤ３  ＯＫＴ３  ｓｃＦｖを、上述したマウスＯＫＴ３バリアントｖ８７５またはヒト化ＯＫＴ３バリアントｖ１５１９５の抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと同じように生成した。抗ＣＤ３  ＢｉＴＥｘ−ＩＣ２  ｓｃＦｖを、（ＵＳ２０１１０２７５７８７  Ａ１）で説明されているようにＶＨ配列及びＶＨ配列から生成した。これは非チンパンジー霊長類ＣＤ３と交差反応性である。ヒト化ＯＴＫ３  ｓｃＦｖまたはＢｉＴＥｘ−ＩＣ２  ｓｃＦｖをヘテロダイマーＦｃの１本の鎖に融合させた。抗ＣＤＨ３モノクローナル、Ｃｌｏｎｅ＃６  Ｆａｂは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させたマウスＣｌｏｎｅ＃６  のＶＨ配列とＶＬ配列を用いたキメラＦａｂである。抗ＨＥＲ２モノクローナルＦａｂは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させたトラスツズマブのヒト化ＶＨ配列とＶＬ配列からなる。抗ＨＥＲ３モノクローナルのＦａｂは、ルムレツズマブのヒト化ＶＨ配列とＶＬ配列をヒトＩｇＧ１  ＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させている（ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７００６２；  Ｍｉｒｓｃｈｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ７３：５１８３−９４）。抗ＥＧＦＲモノクローナル、セツキシマブＦａｂは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ配列とＣＬ配列にそれぞれ融合させたマウスセツキシマブＶＨ配列とＶＬ配列を用いたキメラＦａｂである。どの場合も、抗体のＶＨ−ＣＨドメインをヘテロダイマーＦｃの第２の鎖に融合している。
【０４６３】
（表１２）バリアントと組成のまとめ
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【０４６４】
すべてのバリアントが、重鎖Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；重鎖Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４ＷのＣＨ３変異を有している。鎖Ａまたは鎖Ｂは、抗ＣＤ３抗原鎖または抗腫瘍抗原鎖上にあり得る。
【０４６５】
Ｆｃのナンバリングは、ＥＵ抗体のナンバリングに言及しているＫａｂａｔのＥＵインデックスによる（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）；Ｆａｂまたは可変ドメインのナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９１；  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  −  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２，  ｐ  ６４７  （１９９１））による。
【０４６６】
各二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３及び抗原結合コンストラクトに対応するクローンを表ＸＸに示し、各クローンの対応する配列組成を表ＹＹに示す。
【０４６７】
ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６６４ならびに実施例１及び実施例２で説明されているように、ＣＤ３、及びＣＤＨ３、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＥＧＦＲに対する二重特異性抗体を設計し、発現させ、特徴付けた。
【０４６８】
これらの二重特異性抗体は、実施例１で説明されているように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの後ゲル濾過して精製された。
【０４６９】
実施例２１．固形腫瘍細胞株及びＪｕｒｋａｔＴ細胞株での二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３  ｐＨＡｂ−コンジュゲートのインビトロの内在化
ｐＨＡｂ色素を抗体にコンジュゲートさせることは、所与の抗体が細胞に内在化されたかどうかを評価する方法である。これらの色素は、エンドソーム／リソソームなどのような低ｐＨ条件でのみ蛍光発光して、抗体の内在化を示す。例示的二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３抗原結合コンストラクトｐＨＡｂコンジュゲートは以下のようにして作製した。溶液中抗体コンジュゲーションのメーカー・プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にしたがって、各バリアントをｐＨＡｂアミン反応性色素にコンジュゲートした。
【０４７０】
まず、出発タンパク質試料を脱塩カラムを用いて１０ｍＭの炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中で交換した。次に、１：１のＤＭＳＯ−水混合物に溶解させたｐＨＡｂアミン反応性色素溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を抗体試料に２０モル過剰で加えた。反応混合物を撹拌しながら６０分間インキュベートした。未反応色素を脱塩カラムを用いて除去した。２８０ｎｍ及び５３２ｎｍで吸光度を測定してから抗体濃度及びＤＡＲを計算した。高速液体クロマトグラフィー−分子ふるいクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）を実施し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（８．６μｍ、５ｘ１５０ｍｍ）を用いて、Ｄ−ＰＢＳ＋０．０１％ポリソルベート２０中、流量０．２５ｍｌ／分で、コンジュゲートの純度を決定した。
【０４７１】
ｐＨＡｂがコンジュゲートされたｖ１３８３１及びｖ１６３７１は、収量６０％超、ＨＰＬＣ−ＳＥＣでは純度＞９０％、及び薬物／抗体比（ＤＡＲ）１．５〜３．３であった。
【０４７２】
内在化の程度を、いくつかの腫瘍細胞株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ７７）、Ａ４３１（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５５５）、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４７）、及びＪＩＭＴ１（ＡｄｄｅｘＢｉｏ  ＃Ｃ０００６００５）で、非特異的ＩｇＧ  ｐＨＡｂコンジュゲート（ｖ１５１９５）及びｐＨＡｂがコンジュゲートされた抗ＣＤ３ｍＡｂのｖ２１７１（ＵＣＨＴ１，  Ｂｅｖｅｒｌｅｙ  ＰＣ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｒｄ  ＲＥ．，  １９８１，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１：  ３２９−３４；  ＰＣＴ／ＵＳ１９９３／００７８３２）と比較して測定した。抗ＲＳＶ抗体のシナジス（ＰＣＴ／ＵＳ１９９１／００２６６８）を陰性対照として用いた。Ｔ細胞に対する影響をＣＤ３＋ＪｕｒｋａｔＴ細胞で試験した。選択された抗体を培地で希釈し標的細胞に三連で加え、１時間インキュベートした。細胞を洗い、培地を交換し、標準の手順でＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓを用いて抗体内在化を評価した。データを未処理対照に対し正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムで分析した。
【０４７３】
図２４及び表１３に示す内在化の結果は、ｐＨＡｂがコンジュゲートされたｖ１３８３１及びｖ１６３７１はＳＫＯＶ３、Ａ４３１、ＨＣＴ−１１６、及びＪＩＭＴ１細胞に速やかに内在化され、ｎＭ範囲のＫｄ値及びバリアントの内在化率は標的抗原の発現に依存することを示している。意外にも、これらのバリアントのＪｕｒｋａｔＴ細胞株による内在化率は低い。さらに、ｐＨＡｂがコンジュゲートされた二価抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ｖ２１７１、ＵＣＨＴ１）はほぼ２ｎＭでＪｕｒｋａｔ細胞に内在化されたが、わずかに異なるＣＤ３ｅエピトープを標的とする２つの異なる抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ（ＯＫＴ３とｘＢｉＴＥ）に基づく二重特異性抗体は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞への内在化率は低かった（それぞれ７２ｎＭと＞１００ｎＭ）。
【０４７４】
したがって、このデータは、二重特異性腫瘍−ＣＤ３抗体は、ＣＤ３＋細胞よりも腫瘍細胞のほうに選択的に内在化され、これらの二重特異性抗体のＡＤＣバージョンが、ＣＤ３アームにより結合されているＴ細胞に対し、毒性を示しにくいことを示唆している。
【０４７５】
（表１３）ｐＨＡｂがコンジュゲートされた二重特異性腫瘍−ＣＤ３バリアントの腫瘍細胞株による差別的内在化
2018524373.tif 000061
【０４７６】
＊推定ＥＣ５０。１００ｎＭよりも高い抗体濃度ではバックグラウンド・レベルが増加するため、正確なパラメーターの当てはめは不可能であった（比較は図２４を参照されたい）。
【０４７７】
この結果はさらに、実施例１〜実施例１４でＣＤ１９−ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）について確立した二機能性の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＡＤＣのコンセプトは、異なる固形腫瘍抗原及び固形腫瘍を標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーにも拡大可能であることを示している。Ｔ細胞には影響せずに腫瘍を選択的に標的とすることは、ＣＤ１９抗原に特有というわけではなく、実施例９で説明したような二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＡＤＣの設計のコンセプトは、異なる腫瘍標的にも転用可能である。さらに、Ｔ細胞への影響が少ないことは、ＣＤ３ｅの特定のエピトープに特有というわけではなく、むしろ実施例９で説明したように二重特異性抗体の形式及び幾何学的形状に依存すると考えられる。
【０４７８】
実施例２２．Ｔ細胞なしで培養し増殖させた乳房腫瘍細胞株、卵巣腫瘍細胞株に対する二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの細胞傷害性
二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３バリアントの細胞傷害性及び効力を試験するため、実施例８で説明したように、選択されたバリアントをＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲートさせた。ｖ１３８３１、ｖ１３７９２、及びｖ１３７９０のすべてのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは一様に、７０％超の収量、純度＞９０％、及び薬物／抗体比（ＤＡＲ）３．１〜３．５であった。
【０４７９】
細胞傷害性の程度を、異なる乳房腫瘍細胞株（ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−２２）及びＪＩＭＴ１）と卵巣（ＳＫＯＶ３）腫瘍細胞株の細胞培養物で、非特異的ＩｇＧ  ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート（アイソタイプＤＭ１）と比較して測定した。Ｔ細胞への影響はＣＤ３＋ＪｕｒｋａｔＴ細胞で試験する。実験は実施例９で詳述したようにして実施した。
【０４８０】
図２５は、選択されたサブセットの標的細胞株の結果を示し、表１４はＩｇＧ−ＤＭ１対照と比較した結果をまとめている。
【０４８１】
図２５及び表１４に示す細胞傷害性実験の結果は、ＤＭ１がコンジュゲートされたバリアントｖ１３８３１、ｖ１３７９２、及びｖ１３７９０は、乳房腫瘍細胞株及び卵巣腫瘍細胞株の強力な殺傷を示すが、ＪｕｒｋａｔＴ細胞の増殖には有意な影響を及ぼさないことを示している。この腫瘍細胞株の選択的な殺傷は、実施例２２で示した腫瘍細胞株による選択的なバリアント内在化と類似している。非特異的バリアントのｖ６２４９−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、１００ｎＭを上回る濃度で使用されるまでは、腫瘍細胞株でもＪｕｒｋａｔＴ細胞でも有意な殺傷を示さない。このことは、抗腫瘍−ＣＤ３二重特異性抗体の活性における標的特異性が果たす役割を強調している。
【０４８２】
（表１４）Ｔ細胞なしで培養し増殖させた乳房腫瘍細胞株、卵巣腫瘍細胞株に対するＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの細胞傷害性
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【０４８３】
したがって、このデータが示唆することは、ＣＤ１９−ＣＤ３二重特異性のような二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３薬物コンジュゲートは、ＣＤ３＋細胞よりも腫瘍細胞のほうを選択的に殺傷することである。このことはさらに、二重特異性ＡＤＣは強力な抗腫瘍活性をもちながらも、ＣＤ３アームにより結合されているＴ細胞に対し、ほとんどまたはまったく毒性を示さないという結論を裏付けるものである。
【０４８４】
実施例２３．Ｔ細胞と一緒に培養し増殖させた腫瘍細胞株に対するＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない抗腫瘍−ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害性
Ｔ細胞及びＴ細胞活性に影響を及ぼさない選択的な標的腫瘍細胞の殺傷をさらに試験するため、選択されたバリアントを同種ＪＩＭＴ１細胞株と一緒に初代血液培養物で試験した。二重特異性抗ＣＤ３−腫瘍コンジュゲートの細胞傷害活性を、非コンジュゲート抗ＣＤ３−腫瘍バリアントと比べて測定した。コンジュゲートがＴ細胞集団に及ぼす影響を測定するため、実施例２３で説明したようにしてＴ細胞の活性、活性化、及び増殖をさらに分析した。アッセイはｎ＝１の初代血液ドナーを用いて実施し、実験の設定は、実施例５で上述したものに以下で説明する少々の変更を加えて実施した。
【０４８５】
具体的には、０日目に、ＪＩＭＴ１細胞をまずはＣｅｌｌＴｒａｃｅｒバイオレット（生／死細胞の染色）で標識した。ＪＩＭＴ１標的細胞の標識後、エフェクター細胞として用いるためにＰＢＭＣを単離した。休止ＰＢＭＣを標識ＪＩＭＴ１細胞と、Ｔ細胞対同種ＪＩＭＴ１細胞の比がＥ：Ｔ比２：１になるように調節し混合した。混合物を抗体コンストラクトと一緒に４日間インキュベートしてから、ＪＩＭＴ１細胞を回収し、ＣＴＶレベルのＦＡＣＳ分析により生存率を評価した。これはＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏを用いて以下のようにして実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及び補正ウェル５，０００イベントと、実験ウェル３０，０００イベント間でサイトメトリー分析した。デブリとＲＢＣを省くように閾値を設定した。
【０４８６】
図２６に示すように、バリアントｖ１３８３１とｖ１３７９２それぞれのＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート形式と非コンジュゲート形式はどちらも、ＪＩＭＴ１細胞に対し強力な細胞傷害活性を示した。この結果は、同種標的腫瘍細胞に対するこの細胞傷害活性は、該二重特異性バリアントのＴ細胞誘導活性によって媒介され得ることを示している。興味深いことに、バリアントｖ１３８３１及びｖ１３７９２のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲーションにより、０．０５ｎＭよりも高い濃度で、これらのバリアントの非コンジュゲートバージョンと比べて、腫瘍細胞殺傷が増大した。このことは、抗原結合コンストラクトの内在化による標的腫瘍細胞への薬物送達の結果と考えられる。
【０４８７】
さらに、この結果は、非コンジュゲートバリアントのＴ細胞媒介活性はドナー依存性が高く、このアッセイでは９０％超の標的腫瘍細胞を殺傷するのに十分ではなかったことから、二重機構の利点を示している。
【０４８８】
実施例２４．二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートのＴ細胞の増殖及び活性化の、ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされていない抗腫瘍−ＣＤ３二重特異性抗体との比較
ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされた二重特異性抗体、抗ＣＤＨ３−ＣＤ３と抗ＨＥＲ２−ＣＤ３、及び非コンジュゲート親コンストラクトがＴ細胞の活性化及び増殖を誘発する能力を、以下のようにして評価した。
【０４８９】
０日目に４ドナーからそれぞれ血液を採取し、ＰＢＭＣを新たに単離した。休止ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ＪＩＭＴ１細胞を標的細胞として用い、Ｔ細胞の同種ＪＩＭＴ１細胞に対する比をＥ：Ｔ比２：１になるように調節した。混合物を抗体コンストラクトと一緒に４日間インキュベートし、その後回収した初代細胞をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、及びＣＤ２５について染色した。異なる集団のＦＡＣＳ分析は、ＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏを用いて以下のようにして実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及び補正ウェル５，０００イベントと、実験ウェル３０，０００イベント間でサイトメトリー分析した。デブリとＲＢＣを省くように閾値を設定した。
【０４９０】
ＰＢＭＣ／ＪＩＭＴ１同時培養物におけるＴ細胞の増殖及び活性化をＦＡＣＳ分析した結果を図２７に示す。この結果は、有効な濃度で、ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされたバリアントは、コンジュゲートされていない親バリアントと比べて、すべてのＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞集団のわずかな増加を誘発したことを示している。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の総数は、誘発されたＴ細胞の増殖を間接的に測定するものであり、毒素を抗腫瘍−ＣＤ３二重特異性抗体にコンジュゲートさせることで、コンジュゲートされていない二重特異性抗体よりも、Ｔ細胞の増殖を増大できることを示唆している。同様に、同時培養物をＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートバリアントで刺激したとき、非コンジュゲートバリアントと比べて、ＣＤ２５＋とＣＤ６９＋（それぞれ早期と後期のＴ細胞活性化マーカー）Ｔ細胞もわずかな増加を見せ、Ｔ細胞の活性化が増加していることが示唆された。
【０４９１】
実施例２５．二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートのＴ細胞の増殖及び活性化の、ＳＭＣＣ−ＤＭ１がコンジュゲートされていない抗腫瘍−ＣＤ３二重特異性抗体との比較−標的に対し高・中・低のエフェクター比
二重特異性抗腫瘍−ＣＤ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１薬物コンジュゲートの各作用機構、つまりＴ細胞誘導による殺傷とコンジュゲートされた毒素ペイロードの内在化による殺傷の役割をさらに記述するために、抗ＣＤ３−ＣＤＨ３コンジュゲートｖ１３８３１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の細胞傷害活性を、その非コンジュゲート親ｖ１３８３１と比較して測定した。バリアントを、同種ＪＩＭＴ１細胞株を含む初代血液培養物中３つの異なるＥ：Ｔ比で試験した。アッセイはｎ＝１の初代血液ドナーで実施した。
【０４９２】
０日目に、ＪＩＭＴ１細胞をまずはＣｅｌｌＴｒａｃｅｒバイオレット（生／死細胞の染色）で標識した。ＪＩＭＴ１標的細胞の標識後、エフェクター細胞として用いるためにＰＢＭＣを単離した。休止ＰＢＭＣを標識ＪＩＭＴ１細胞と、Ｔ細胞対同種ＪＩＭＴ１細胞の比がＥ：Ｔ比５：１、１：５、及び１：５０になるように調節し混合した。混合物を抗体コンストラクトと一緒に４日間インキュベートしてから、ＪＩＭＴ１細胞を回収し、ＣＴＶレベルのＦＡＣＳ分析により生存率を評価した。これはＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏを用いて以下のようにして実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及び補正ウェル５，０００イベントと、実験ウェル３０，０００イベント間でサイトメトリー分析した。デブリとＲＢＣを省くように閾値を設定した。
【０４９３】
図２８に示す結果は、Ｅ：Ｔ比が高いほど（たとえば５：１）、二重特異性抗ＣＤＨ３−ＣＤ３抗体ｖ１３８３１の同種標的腫瘍細胞に対する細胞傷害活性が、該二重特異性抗体のＴ細胞誘導活性により媒介され得ることを示唆している。したがって、Ｅ：Ｔ比１：５及び１：５０のように、Ｔエフェクター細胞の数が減少すると、腫瘍細胞の殺傷はほぼなくなる。非コンジュゲートバリアントと違って、ｖ１３８３１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１はその第２の作用モード、つまり抗原結合コンストラクトの内在化による標的腫瘍細胞への薬物送達の結果として、低いＥ：Ｔ比（１：５及び１：５０）でも有効であった。したがって、このデータは、非コンジュゲートバリアントのＴ細胞媒介活性はドナー依存性が高く、このアッセイでは特にＴエフェクター細胞濃度が低いときは９０％超の標的腫瘍細胞を殺傷するのに十分ではなかったことから、作用の二重機構の利点をさらに支持するものである。このことは、腫瘍のＴ細胞浸潤性が低い場合の適応に特に重要であり得る。
【０４９４】
（表ＸＸ）
2018524373.tif 000063
2018524373.tif 000064
【０４９５】
（表ＹＹ）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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