(57)【要約】  嫌気性微生物を培養するための装置が提示される。この装置は、防水性基部と、防水性基部に取り付けられた防水性カバーシートと、基部とカバーシートとの間に配置された増殖区画とを含む、本体を備える。増殖区画は、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有する。周辺部の一部分は、防水性シールにより画定される。この部分は、周辺部の５０％超を含む。乾燥した冷水可溶性ゲル化剤は、増殖区画内で基部に接着される。乾燥した第１酸素除去試薬は増殖区画内に配置される。【選択図】図２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
防水性基部と、前記基部に取り付けられた防水性カバーシートと、それらの間に配置された増殖区画とを含む、本体であって、前記増殖区画が、周辺部と、前記増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し、前記周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、前記部分が、前記周辺部の５０％超を含む、本体と、
前記増殖区画内で前記基部に接着された、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤と、
前記増殖区画内に配置された、乾燥した第１酸素除去試薬と、を備える、装置。
【請求項２】
前記増殖区画内に配置された、有効量の、乾燥した二酸化炭素生成試薬を更に含む、請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
前記二酸化炭素生成試薬は１００マイクロメートル以下の直径を有する粒子から本質的になる、請求項１又は２に記載の培養装置。
【請求項４】
前記増殖区画内に配置された、乾燥した還元剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
乾燥した栄養素を更に含んでおり、前記栄養素は前記増殖区画内に配置され、前記栄養素は嫌気性微生物の増殖を促進し、前記栄養素は前記酸素除去試薬ではない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記栄養素が非発酵性有機炭素源を含む、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記増殖区画内に配置された、乾燥した第２酸素除去試薬を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
生存可能な微生物の存在を検出するための指示薬を更に含み、前記指示薬が前記増殖区画内に配置される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記第１酸素除去試薬、前記第２酸素除去試薬、前記還元試薬、前記栄養素、前記指示薬、及び前記成分のうちのいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される第１乾燥成分が、前記基部に接着されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記基部は、前記増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された第１接着剤層を含み、前記第１乾燥成分が、前記増殖区画内で、前記第１接着剤層に接着されている、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
第１キャリアを更に備えており、前記第１乾燥成分が前記第１キャリアに接着され、前記第１キャリアが、前記増殖区画内で、前記第１接着剤層に接着されている、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記第１酸素除去試薬、前記第２酸素除去試薬、前記還元試薬、前記栄養素、前記指示薬、及び前記成分のうちのいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される第２乾燥成分が、前記カバーシートに接着されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記カバーシートが、前記増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された、第３接着剤層を備え、
前記第２乾燥成分が、前記増殖区画内で、前記第３接着剤層に接着されている、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
第２キャリアを更に備えており、前記第２乾燥成分が第２キャリアに接着され、前記第２キャリアが、前記増殖区画内で、前記第２接着剤層に接着されている、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１の平坦な防水性基材は、前記開口部付近に第１の取り外し可能なタブを更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記第１の取り外し可能なタブは、これに接着された第１閉鎖用接着剤を含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記第１閉鎖用接着剤に取り外し可能に接着された第１剥離ライナーを更に含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記カバーシートは、前記開口部付近に第２の取り外し可能なタブを更に含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記第２の取り外し可能なタブは、これに接着された第２閉鎖用接着剤を含む、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記第２閉鎖用接着剤に取り外し可能に接着された第２剥離ライナーを更に含む、請求項１９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その開示が参照によって完全に本明細書に組み込まれている、２０１５年４月２９日出願の米国仮特許出願第６２／１５４，６８４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
［背景］
多数の細菌は酸素に対して感受性があり、酸素存在下では増殖しない。このような嫌気性微生物の生存率を測定することは、種々の環境において有用であり得る。例えば、嫌気性微生物が食品加工施設及び／又は包装施設に存在するかどうかを測定することが重要であり得る。医療環境にて嫌気性微生物の存在を測定すること、例えば、診断検査で病原菌の存在を測定することもまた重要であり得る。別の例として、水処理施設では水のサンプルを試験し、このような微生物の有無を決定している。
【０００３】
微生物培養に利用できる種々の装置が提供されている。例えば、微生物は長きにわたりペトリ皿を使用して培養されてきた。当技術分野において既知のとおり、ペトリ皿とは寒天及び栄養素などの微生物増殖に好適な培地を入れた浅い平底の円形皿である。しかし、寒天培地の使用には手間と時間を要する。例えば、寒天培地はサンプルの添加前に殺菌、溶解、冷却を必要とする。
【０００４】
加えて、ペトリ皿を使用した嫌気性微生物の培養に好適な環境を得ることが困難な場合がある。嫌気性微生物は酸素存在下では繁殖しないため、このような微生物を増殖させるには物理的かつ化学的に煩雑な手法が必要となることがある。典型的には、酸素透過に対する物理的障壁を付与するため、このような装置を修正、すなわち成形又は設計変更する必要がある。
【０００５】
それ以外に、嫌気性培養装置に組み込んだ化学薬剤を使用して酸素を除去する手法が開発されている。一般に、このような装置は、ゲル又は栄養培地に組み込まれた還元剤又は無菌膜片を含む。加えて、米国特許第３，３３８，７９４号は、酸素不透過性フィルム層とそのフィルム間にある栄養培地とから形成され、還元性化合物を含む嫌気性菌培養装置について記載している。
【０００６】
しかし、これらの装置及びその他の装置では、費用が高額であり、簡単に使い捨てすることができない。また、これらの装置は組み立て及び／又は使用に手間がかかる場合がある。好気性環境において嫌気性微生物を培養するための簡易な装置の製造が試みられているが、依然として嫌気性培養装置の改善が必要とされている。
【０００７】
［概要］
広くは、本開示はサンプル中の微生物の検出、及び所望により計数に関する。特に、本開示は、微耐気性、微好気性、偏性嫌気性微生物の増殖及び検出に関する。増殖及び検出を、内蔵型の改変された環境生成培養装置を使用して実施できる。改変された環境生成装置は、低濃度の溶存酸素、及び任意により、高濃度の溶存二酸化酸素を有する、水性増殖培地を生成するために、水性液体で活性化される。
【０００８】
本明細書に開示される本発明の培養装置及び方法は、酸素を含有する（例えば、通常の大気中酸素を含有する）環境で微生物をインキュベートする場合であっても、微耐気性、微好気性、又は偏性嫌気性微生物の増殖、検出、及び鑑別をもたらす。この装置では、嫌気性微生物の培養に典型的に必要とされる、専用のインキュベーション機器及び試薬（例えば、嫌気ジャー、使い捨て嫌気菌用袋、パラジウム触媒、嫌気性グローブボックス）を不要とする点で有利である。加えて、本方法は、個々のコロニーから産生される二酸化炭素ガスの検出を可能にし、それによって純粋培養の単離に要する付加的な培養時間と、ガス産生を検出するための発酵管の使用とを不要にすることにより、細菌の鑑別をもたらす。更に本開示は、サンプル中の微耐気性、微耐気性、微好気性、偏性嫌気性菌の計数に関する。微好気性、及び偏性嫌気性微生物は、成長及び繁殖時に低酸素環境を要するという共通の性質を有する。
【０００９】
一態様では、本開示は、微生物のコロニーを計数するための培養装置を提供する。この装置は、防水性基部と、基部に取り付けられた防水性カバーシートと、基部とカバーシートとの間に配置された増殖区画とを含む、本体を備え得る。増殖区画は、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し得る。周辺部の一部分は、防水性シールにより画定される。この部分は、周辺部の５０％超を含み得る。乾燥した冷水可溶性ゲル化剤は、増殖区画内で基部に接着させることができる。乾燥した第１酸素除去試薬は、増殖区画内に配置されてもよい。
【００１０】
別の態様では、本開示は、嫌気性微生物を培養するための装置をもたらす。装置は、平坦な防水性基材と、冷水可溶性ゲル化剤と、乾燥した第１酸素除去試薬とを備える本体を備える。基材は、周縁部と、離れた第１及び第２区分を有する第１主面と、第１主面の反対側の第２主面と、第１区分を第２区分に対して並置して重ねるように配置するための折り目とを備える。第１区分及び第２区分は、増殖区画の内壁を画定することができ、この増殖区画は、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを備える。周辺部の一部分は、防水性シールによって画定され、この部分は、周辺部の５０％超を含み得る。冷水可溶性ゲル化剤は、増殖区画内で第１区分に接着させることができる。乾燥した第１酸素除去試薬は、微生物増殖区画内に配置されてもよい。
更に別の態様において、本開示はサンプル中の嫌気性微生物を検出する方法を提供する。方法は、サンプルを上記実施形態のいずれかの装置の増殖区画に堆積させる工程と、嫌気性微生物の増殖を促進させる条件下で装置をインキュベートする工程と、増殖区画内の嫌気性微生物のコロニーの指標を検出する工程とを含み得る。
【００１１】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で特定の利益をもたらすことができる本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下で他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲内から排除することを意図するものではない。
【００１２】
「含む（comprises）」という用語及びその変化形は、これらの用語が本明細書及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有しない。
【００１３】
本明細書において使用するとき、「１つ（a、an）」、「その（the）」、「少なくとも１つ（at least one）」及び「１つ以上（one or more）」は、互換的に使用される。したがって、例えば、栄養素は、「１つ又は２つ以上の」栄養素を意味するように、解釈され得る。
【００１４】
「及び／又は」という用語は、列挙される要素のうちの１つ若しくは全て、又は列挙される要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１５】
また本明細書において、端点による数値範囲の記載は、その範囲内に含まれる全ての数が含まれる（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００１６】
用語「微生物」又は「細菌」は、単細胞生物又は多細胞生物であり得るいずれかの微小生物を指す。この用語は一般的に、１種以上の細菌を非制限的に含む好適な培地内で成長及び繁殖することができる、原核又は真核微小生物をさすものとして使用される。本発明の範囲に包含される微生物としては、原核生物、すなわち細菌及び古細菌、並びに原虫、真菌、酵母（例えば、嫌気性酵母）、藻類などを含む様々な形態の真核生物が挙げられる。用語「標的微生物」とは、検出することが望まれるいずれかの微生物を指す。
【００１７】
本明細書では、「嫌気性微生物（anaerobic microorganism）」又は「嫌気性生物（anaerobe）」という用語は、酸素に反応しやすく、酸素の存在下では増殖しない微生物を指す。嫌気性微生物又は嫌気性生物は、成長のために酸素を必要としないあらゆる微生物である。嫌気性微生物は、絶対的嫌気性生物と通性嫌気性生物の両方を含む。絶対的嫌気性生物は、大気レベルの酸素にさらされると死滅する微生物である。通性嫌気性生物は、酸素が存在する場合は好気呼吸を行うことができるが、酸素がない場合は発酵又は嫌気呼吸に切り替えることが可能な微生物である。本発明の方法及びシステムは、絶対的嫌気性生物と通性嫌気性生物の両方の濃縮及び検出に使用することができる。
【００１８】
用語「微好気性微生物（microaerophilic microorganism）」又は「微好気性菌（microaerophile）」とは、本明細書において、微量の酸素の存在下においてのみ増殖するいずれかの微生物を指す。微好気性菌は、酸素を使用するが、非常に低濃度（低いマイクロモル範囲）の、典型的には５〜１５％の濃度の酸素を使用し、通常の酸素濃度、又は約１５％を超える濃度では成長が阻害される。
【００１９】
本明細書では、微生物の「培養」又は「増殖」という用語は、微生物の増殖を促す条件下にある所定の培地内で微生物を繁殖させることによって微生物の数を増大させる方法を指す。より具体的には、これは、微生物の少なくとも１回の細胞分裂を促進するのに好適な培地及び条件を提供する方法である。培地は、微生物の増殖にとって必要な栄養素、及び物理的増殖パラメータを全て含む、固体、半固体、又は液体の培地である。
【００２０】
用語「増菌」とは、特定の微生物の増殖にとって好ましい、特定の既知の属性を有する、培地及び条件を与えることによって、特定の微生物の増殖を選択的に増加させる培養方法を指す。増菌培地環境は、選択される微生物の増殖に肯定的に影響する、及び／又はその他の微生物の増殖に否定的に影響する。
【００２１】
「酸素除去試薬」及び「酸素除去剤」は、所与の環境の酸素を消費する、使う、又はこれと反応することができる、化合物を指すものとして、幅広く使用される。好ましくは、酸素除去試薬は、嫌気性微生物の増殖を遅くしたり阻害したりすることがない。
【００２２】
用語「還元剤」とは、本開示の装置の増殖区画内の乾燥成分の水和によって形成される半固体培地のＥｈ電位を低下させることができる物質を指す。
【００２３】
本発明の上記の概要は、本発明のそれぞれの開示される実施形態又は全ての実施を説明することを目的とするものではない。以下の説明は、例示的実施形態をより具体的に例示する。本出願を通していくつかの箇所において、例のリストによって指針が示されるが、それらの例は様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合にも、記載されたリストは、代表的な群としての役割のみを果たすものであり、排他的な列リストして解釈されるべきではない。
【００２４】
これら及び他の実施形態の更なる詳細については、添付図面及び以下の説明において述べる。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、かつ特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】本開示による培養装置の一実施形態の平面図である。
【図１Ｂ】図１Ａの培養装置の直線１Ｂ−１Ｂに沿った、分解側断面図である。
【図２Ａ】本開示による培養装置の別の実施形態の平面図である。
【図２Ｂ】図２Ａの培養装置の分解側面図である。
【図３】本開示による培養装置の更に別の代替的実施形態の平面図である。
【図４Ａ】図３の培養装置の別の実施形態の平面図である。
【図４Ｂ】図４Ａの培養装置の分解側面図である。
【図５Ａ】本開示による培養装置の更に別の代替的実施形態の平面図である。
【図５Ｂ】図５Ａの培養装置の分解側面図である。
【図６】本開示による一体型基部を備える、部分的に組み立てられた培養装置の平面図である。
【図７】図６の部分的に組み立てられた装置の側面図である。
【図８】培養装置を形成するように折り畳まれているときの、図６の部分的に組み立てられた装置の側面図である。
【図９】図６の部分的に組み立てられた装置から形成された培養装置の平面図である。
【図１０】本開示による培養装置に接種するプロセスの一実施形態の概略平面図である。
【図１１Ａ】本開示による培養装置を作製するためのプロセスの一実施形態の様々なプロセスの概略平面図である。
【図１１Ｂ】本開示による培養装置を作製するためのプロセスの一実施形態の様々なプロセスの概略平面図である。
【図１１Ｃ】本開示による培養装置を作製するためのプロセスの一実施形態の様々なプロセスの概略平面図である。
【図１１Ｄ】本開示による培養装置を作製するためのプロセスの一実施形態の様々なプロセスの概略平面図である。
【図１１Ｅ】本開示による培養装置を作製するためのプロセスの一実施形態の様々なプロセスの概略平面図である。
【００２６】
［詳細な説明］
本開示の任意の実施形態を詳しく説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明に述べる又は以下の図面に例示する構成の細部及び構成要素の配置に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行することができる。更に、本明細書で使用される専門用語及び用語は、説明目的のためであり、制限とみなされるべきではないと理解される。本明細書における「含む（including）」、「備える（comprising）」又は「有する（having）」、及びこれらの変形の使用は、その後に挙げられる項目及びその等価物、並びに追加的な項目を包含することを意図される。別段の指示又は限定がない限り、「接続（connected）」及び「結合（coupled）」という用語及びこれらの変形は広義に使用されるものであり、直接的及び間接的な接続及び結合を包含する。更に、「接続」及び「連結」は、物理的又は機械的な接続又は連結に制限されるものでない。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造上又は論理上の変更を加えることもできることを理解されたい。更に、「前」、「後」、「上」、「下」などの用語は、各要素の互いに対する関係を説明するためにのみ用いられるものであり、装置の特定の向きを説明すること、装置に必要とされる又は求められる向きを指示又は示唆すること、あるいは本明細書に記載される発明が、使用時にどのように使用、装着、表示、又は配置されるかを特定することを目的とするものでは決してない。
【００２７】
本開示は、概して、サンプル中の微生物の検出及び所望により計数に関する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、微好気性、微耐気性、又は偏性嫌気性微生物の様々な群の増殖及び検出に関する。様々な群には、乳酸菌（以降、「ＬＡＢ」）として全体的に既知である下位分類が含まれる。微好気性、微耐気性、又は偏性嫌気性微生物の増殖及び検出は、内蔵型の低酸素環境生成培養装置を使用して実施できることが既知である。
【００２８】
特定の微生物は通性嫌気性微生物と考えられている。したがってこれらは、酸素の存在下、又は不在下で増殖し得る。これらの微生物、更に偏性嫌気性微生物は、これらを低酸素、又は嫌気性環境で培養することによって、絶対好気性の微生物に対して選択的に増菌させることができる。本開示の装置は、絶対好気性微生物も含むサンプル内に存在する、通性嫌気性及び偏性嫌気性微生物を選択的に増菌させるために、有利に使用することができる。
【００２９】
現在では、乾燥性の、再水和可能な、内蔵型低酸素環境生成培養装置を作製できることが知られている。培養装置は、培養装置の増殖区画内に配置され、所定体積の水性溶液内で再水和することができる、有効量の実質的に乾燥した酸素除去試薬を含み、再水和した際に酸素除去試薬は、酸素消費反応に関与し得る。更に、現在では酸素消費反応が微耐気性微生物、微好気性微生物、又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進するに足る酸素を消費できることが知られている。更に、培養装置はインキュベーション中、嫌気性環境下に保持され、培養装置は、上記の微生物の増殖を促進するため、最大約８日間にわたり低酸素環境を維持することができる。
【００３０】
対象となる細菌種は、例えば、血液、唾液、接眼レンズ液、滑液、脳脊髄液、膿汁、汗、排出物、尿、粘液、粘膜組織（例えば、頬、歯肉、鼻、眼球、気管、気管支、胃腸、直腸、尿道、尿管、膣、頸部、及び子宮粘膜）、母乳、糞便、又は同等物等の生理的液体のような任意の源に由来することができる試験サンプル内で分析することができる。更に、試験サンプルは、例えば、傷、皮膚、前鼻孔、鼻咽頭腔、鼻腔、前鼻前庭、頭皮、爪、外耳、中耳、口、直腸、膣、腋窩、会陰、肛門、又は他の同様の身体部位に由来することができる。
【００３１】
生理学的な流体に加えて、他の検査サンプルには、他の液体並びに液体媒体中に溶解又は懸濁した固体が含まれてもよい。対象となるサンプルとしては、プロセス流、水、食品、食材、飲料、土壌、植物又はその他の植生、空気、表面（例えば、製造工場、病院、診療所、又は家庭内の壁、床、設備、器具）などが挙げられ得る。
【００３２】
増殖するために酸素分圧の低減環境を必要とする細菌（すなわち微好気性菌）及び／又は許容する細菌（すなわち、耐気性細菌）の非限定的例としては、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター種（例えば、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、Ｃ．フェタス）、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・コンステラータス、ゲメラ・モルビロルム、ラクトバチルス種、及びストレプトコッカス・ピオゲネスが挙げられる。
【００３３】
嫌気性菌は本質的に遍在性を持つ。嫌気性菌は、偏性嫌気性であり得、あるいは通性嫌気性でもあり得る。偏性嫌気性又は通性嫌気性細菌の非限定的な例としては、硫酸還元細菌（ＳＲＢ；例えばデスルフォビブリオ属、及びデスルフォトマクルム属など）、酸生成細菌（ＡＰＢ；例えば、アセトバクテリウム、ペディオコッカス、プロテイニフィラム、ラクトバシラス、スタフィロコッカス、テルモココイデス（Thermococcoides）、及びアシネトバクターなど）、アクチノマイセス種、クロストリジウム種（例えば、Ｃ．パーフリンジェンス、Ｃ．テタニ、Ｃ．スポロゲネス、Ｃ．ボツリヌス、Ｃ．ディフィシル、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．アセトブチリカム）、乳酸菌（例えば、ラクトバシラス種、リューコノストック種、ペディオコッカス種、ラクトコッカス種）、バクテロイデス種（例えば、Ｂフラジリス）、及びペプトストレプトコッカス種（例えば、Ｐ．ミクロス、Ｐ．マグナス、Ｐ．アサッカロリティクス、Ｐ．アネロビウス及びＰ．テトラディウス）が挙げられる。通性嫌気性菌の非限定的例としては、腸内細菌（例えば、大腸菌）、サルモネラ種、シトロバクター・フロインデイ、黄色ブドウ球菌、及びリステリア種（例えばＬ．モノサイトゲネス）が挙げられる。
【００３４】
酵母菌種の多くが通性嫌気性であり、酵母種の一部が偏性嫌気性であるため、本開示の内蔵型嫌気性環境生成培養装置は、酵母菌微生物の増殖及び検出にも有用であることが企図される。
【００３５】
一態様では、本開示は、低酸素環境で増殖する微生物を培養及び検出するための培養装置を提供する。図１Ａ及び図１Ｂを参照し、本開示の培養装置１００は、防水性基部１０と、防水性カバーシート２０と、基部１０とカバーシート２０との間に配置された増殖区画３０とを含む、本体５を備える。基部１０は、内面と、内面の反対側の外面とを有する。カバーシート２０は、内面と、内面の反対側の外面とを有する。いずれかの実施形態において、基部１０の内面は、カバーシート２０の内面と向かい合うように配置される。
【００３６】
増殖区画３０は、開口部３４を含む周辺部３２を有する。開口部３４は、増殖区画３０への液体のアクセスを提供する。周辺部の一部分は、防水性シール４０により画定される。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の５０％超を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の８０％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９０％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９５％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９８％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９９％以上を含む。いずれかの実施形態において、（例えば、装置に接種した後、使用中）この部分は増殖区画３０の周辺部３２の１００％を含む。
【００３７】
基部１０は、好ましくは、水を吸着しない、ないしは別の方法により水による悪影響を受けない材料（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン）で作製された比較的剛性の防水性フィルムである。基部１０は、実質的に気体状酸素を透過しない材料を使用して作製されることが好ましい。基部１０の好適な材料の非限定的例としては、少なくとも約１５μｍ〜少なくとも約１８０μｍ厚のポリエステルフィルム、少なくとも約１００μｍ〜少なくとも約２００μｍ厚のポリプロピレンフィルム、少なくとも約３００μｍ〜約３８０μｍ厚のポリスチレンフィルムが挙げられる。その他の好適な基部としては、エチレンビニルアルコールコポリマーフィルム、ポリビニルアルコールフィルム、及びポリ塩化ビニリデンフィルムが挙げられる。基部１０は透明、半透明であってもよく、又は基部１０を通じてコロニーを観察することが望まれる場合、基部は透明であってもよい。
【００３８】
カバーシート２０は、基部１０に取り付けられて（例えば、接着剤で取り付けられる）、増殖区画３０を画定し、任意により、カバーシートは、輸送、保管、インキュベーション、及び／又はコロニー計数中に増殖区画を観察するために、光学的に透明である。カバーシート２０は、好ましくは、水を吸着しない、ないしは別の方法により水による悪影響を受けない材料（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン）製の比較的剛性の防水性フィルムである。カバーシート２０は、培養装置１０を開かなくても容易にコロニーを計数できるように透明であることが好ましく、微生物及び水蒸気に対して実質的に不透過性である。
【００３９】
一般的に、カバーシートは、基部１０の作製に使用される材料と同様の材料から作製することができる。カバーシート２０は好ましくは、実質的に気体状酸素を透過しない材料を使用して作製される。基部１０の好適な材料の非限定的例としては、少なくとも約１５μｍ〜少なくとも約１８０μｍ厚のポリエステルフィルム、少なくとも約１００μｍ〜少なくとも約２００μｍ厚のポリプロピレンフィルム、少なくとも約３００μｍ〜約３８０μｍ厚のポリスチレンフィルムが挙げられる。その他の好適な基部としては、エチレンビニルアルコールコポリマーフィルム、ポリビニルアルコールフィルム、及びポリ塩化ビニリデンフィルムが挙げられる。図１に示されるように、カバーシート２０は、増殖区画３０の周辺部３２の一部分に沿って延びる、防水性シール４０を介して基部１０に結合される。
【００４０】
当業者であれば、所定の種類のポリマーフィルムを通る酸素ガスの透過性を、ポリマーフィルムの厚さを増加させることにより減少させ得ることが理解されよう。いずれかの実施形態において、本開示の基部及びカバーシートは、気体状酸素を実質的に透過しない好適な厚さを有するポリマーフィルムである。
【００４１】
増殖区画３０は、基部１０とカバーシート２０との間の、培養装置１００内の任意のアクセス可能な場所に存在し得る。好ましくは、増殖区画３０の周辺部３２は、開口部３４を例外として、装置１００の周縁部８０から離れている。
【００４２】
本開示の装置は、増殖区画３０内で基部１０に接着させた、乾燥した、冷水可溶性ゲル化剤を含む。好ましくは、ゲル化剤は、直接的又は間接的に基部１０に接着される。好ましくは、ゲル化剤は、直接的又は間接的に装置１００のカバーシート２０に接着される。いずれかの実施形態において、ゲル化剤は、装置１００の増殖区画３０における、基部１０の内面１０、及び／又はカバーシート２０の内面２０に均一に分布し得る。
【００４３】
いずれかの実施形態において、ゲル化剤は、基部１０に接着された、第１乾燥コーティング１４として、装置に適用することができる。いずれかの実施形態において、第１乾燥コーティング１４は、増殖区画３０内で基部１０に接着された、第１接着剤層１２に接着させることができる。第１乾燥コーティング１４に使用するのに好適なゲル化剤としては、冷水可溶性の天然及び合成ゲル化剤が挙げられる。アルギン、カルボキシメチルセルロース、タラガム、ヒドロキシエチルセルロース、グアーガム、ローカストビーンガム、キサンタンガムなどの天然ゲル化剤、並びにポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、及びこれらの組み合わせなどの合成ゲル化剤が概して好適である。適切なゲル化剤は、本開示並びに米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号の開示における教示にしたがって選択することができる。好ましいゲル化剤には、ローカストビーンガム、グアーガム、キサンタンガムが挙げられる。これらのゲル化剤は、個別で、又は好ましくは互いに組み合わせることにより、有用となる。
【００４４】
したがって、いずれかの実施形態において、本開示の装置１００は、任意により、増殖区画３０内で、基部１０の内面１０の少なくとも一部、又は全部に接着された、第１乾燥コーティング１４を備えてもよい。第１乾燥コーティング１４は、存在する場合、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含んでもよい。任意により、第１接着剤層１２は基部１０に接着され、第１乾燥コーティングの少なくとも一部分が、増殖区画３０内で第１接着剤層に接着される。
【００４５】
カバーシート２０は、いずれのコーティングも含まないことがある（図示されない）。あるいは、装置１００が増殖区画３０において、基部１０の内面１０に接着された第１乾燥コーティング１４を有さない場合、又は装置１００が基部１０に接着された第１乾燥コーティング１４を有する場合、カバーシート２０は、増殖区画内で、カバーシート２０に接着された第２乾燥コーティング２４を備えてもよい。第２乾燥コーティング２４は、存在する場合、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含んでもよい。任意により、第２接着剤層２２はカバーシート２０に接着され、第２乾燥コーティング２４の少なくとも一部分が、増殖区画３０内で第２接着剤層に接着される。いずれかの実施形態において、第２接着剤層２２の一部分を使用して、増殖区画３０の周辺部３２に防水性シールを形成してもよい。
【００４６】
第１及び第２乾燥コーティングに関して、これらのコーティングは、冷水復元性があり、酸素除去試薬（以下に記載される）、又はゲル化剤の冷水ゲル化特性と実質的に干渉せず、嫌気性微生物の増殖を補助する、いずれかの栄養素又は栄養培地を所望により含むことができる。培養装置に使用するのに好適な具体的な栄養素（複数可）は、装置内で増殖させる微生物によって異なるが、当業者であれば選択は容易である。概して、このような栄養素は冷水可溶性である。細菌の増殖を促進する好適な栄養素は当業者に既知であり、酵母抽出物、ペプトン、糖類、好適な塩などが挙げられるが、これらに限定されない。いずれかの実施形態において、第１及び／又は第２乾燥コーティングは、別の微生物又は微生物群よりも、特定の嫌気性微生物又は微生物群の増殖を促進する選択的薬剤（例えば、栄養素、抗生物質、及びこれらの組み合わせ）を更に含み得る。当業者には、それ以外の種々の配合物が使用可能であり、それによって本発明の範囲が損なわれないことが理解されるであろう。
【００４７】
好ましくは、第１乾燥コーティング１４が乾燥粉末及び乾燥粉末凝集体を主成分とする場合、第１コーティング１４は、基部１０の内面の少なくとも一部分上に配置される第１接着剤層１２上に配置される。第１乾燥コーティング１４は、例えば米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号（これらは全て、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる）で説明される配合プロセス、接着剤コーティングプロセス、並びに液体コーティングプロセス、及び／又は、乾燥コーティングプロセスを使用して、基部１０上に、又は任意選択の第１接着剤層１２上に堆積させることができる。
【００４８】
好ましくは、第２乾燥コーティング２４が乾燥粉末及び乾燥粉末凝集体を主成分とする場合、第２コーティング２４は、カバーシート２０の内面の少なくとも一部分上に配置される第２接着剤層２２上に配置される。第２乾燥コーティング２４は、例えば米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号（これらは全て、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる）で説明される配合プロセス、接着剤コーティングプロセス、並びに液体コーティングプロセス、及び／又は、乾燥コーティングプロセスを使用して、カバーシート２０上に、又は任意選択の第２接着剤層２２上に堆積させることができる。
【００４９】
増殖区画３０は、基部１０の内面とカバーシート２０の内面との間に配置される容積として定義され、その容積は第１乾燥コーティング１４及び／又は第２乾燥コーティング２４の少なくとも一部分を包含する。したがって、水性液体が増殖区画に分配されるとき、水性液体は第１乾燥コーティング１４（存在する場合）及び／又は、第２乾燥コーティング２４（存在する場合）の少なくとも一部と流体接触する。いずれかの実施形態において、未接種の培養装置の増殖区画３０の厚さは、約０．２ｍｍ〜約３ｍｍであり得る。本開示の接種した増殖装置の増殖区画３０の厚さは、例えば、培養装置内に堆積された水性液体（図示されない）の体積、及びサンプル（図示されない）と関連する固体（例えば、懸濁された粒子、及び／又は膜フィルター）の存在によって様々であり得る。いずれかの実施形態において、接種した培養装置の増殖区画の厚さは、約１ｍｍ〜約５ｍｍであり得る。
【００５０】
本開示の培養装置は、１つ以上の乾燥した酸素除去試薬を有効量で更に含む。本明細書において記載されるように、１種以上の酸素除去試薬が、増殖区画内に配置され、任意により、増殖区画内で接着剤層に接着される。「乾燥した」とは、本明細書において使用するとき、試薬が実質的に水を含まないことを意味する。「実質的に水を含まない」という表現は、試薬を周囲環境と平衡させた後、材料（例えば、粉末として、又は脱水水性コーティングとして供給される）の含水量以下の含水量を有する試薬を指す。
【００５１】
任意により、本開示の培養装置は、緩衝剤、還元剤、指標試薬、及び／又は有効量の二酸化炭素発生試薬の成分などの他の乾燥した、水により再水和可能な成分を更に含むことができる。
【００５２】
少なくとも２種類の乾燥成分（例えば、ゲル化剤、及び１種以上の酸素除去試薬、又は還元剤）は、本明細書において記載されるように、サンプル材料を培養装置の増殖区画に導入（例えば、接種）する前、している間、又はした後に、水性液体で水和される。典型的には、サンプル材料及び／又は水性液体は、周囲条件（すなわち好気ガス環境）にて培養装置の増殖区画に導入される。よって、好気的状況下で増殖区画にサンプルが接種された後、培養装置の増殖領域内の水性液体は、第１溶存酸素濃度を有する。培養装置内の１種以上の酸素除去試薬は、増殖領域内の水性液体中の第１溶存酸素濃度を、第１溶存酸素濃度よりも実質的に低い第２溶存酸素濃度へと低減させるように機能する。このように接種後の培養装置の増殖区画内の溶存酸素濃度が低減されることで、培養装置中の偏性嫌気性又は微好気性微生物の増殖が促進される。
【００５３】
いずれかの実施形態において、１種以上の酸素除去試薬の有効量及びその濃度は、１種以上の酸素除去試薬を、培養装置の増殖区画内の所定体積の水性液体と流体接触させた後約１２０分以内に、第１溶存酸素濃度から第２溶存酸素濃度への低減が生じるように選択される。いずれかの実施形態において、１種以上の酸素除去試薬の有効量及びその濃度は、酸素除去試薬を、培養装置の増殖区画内の所定体積の水性液体と流体接触させた後約６０分以内に、第１溶存酸素濃度から第２溶存酸素濃度への低減が生じるように選択される。いずれかの実施形態において、１種以上の酸素除去試薬の有効量及びその濃度は、酸素除去試薬を、培養装置の増殖区画内の所定体積の水性液体と流体接触させた後約３０分以内に、第１溶存酸素濃度から第２溶存酸素濃度への低減が生じるように選択される。
【００５４】
いずれかの実施形態において、第１溶存酸素濃度から第２溶存酸素濃度への低減は、周囲温度（例えば約２３℃）から約４２℃までの温度（これらの温度を含む）で生じる。よって、本開示による方法のいずれかの実施形態において、酸素除去試薬を、培養装置の増殖区画内の所定体積の水性液体と流体接触させた後、第１溶存酸素濃度から第２溶存酸素濃度へと低減させるために、培養装置を高温（すなわち周囲温度以上）でインキュベートする必要がない。
【００５５】
微生物を培養するために好適な時間内に、本開示の培養装置の増殖区画から取り除かれる酸素の量はとりわけ、培養装置の増殖区画内の１種以上の酸素除去試薬の量に依存することを、当業者であれば理解するであろう。本開示による増殖区画内の酸素除去試薬の量を調節することにより、培養装置は、微耐気性微生物の培養に向けて、又は偏性嫌気性微生物の培養に向けて構成することができる。
【００５６】
例えば、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、酸素消費反応を触媒する酵素、第一鉄塩、硫酸の金属塩、重亜硫酸塩、及びメタ重亜硫酸塩を含む多くの酸素除去試薬が既知である。本開示による好適な酸素除去試薬は、培養装置内で低酸素又は嫌気的局地環境を生成するために十分に酸素を消費し、装置内で培養される微生物と、これらの微生物の成長を実質的に阻害することなく、流体連通し得る、量及び種類の反応生成物を生じる。いずれかの実施形態において、酸素除去試薬は、約１マイクロモル／１０ｃｍ２〜約１５マイクロモル／１０ｃｍ２の量で、増殖区画内に配置されている。
【００５７】
好ましくは、いずれかの実施形態において、１種以上の酸素除去試薬が、乾燥粉末の形態で供給される。より好ましくは、いずれかの実施形態において、１種以上の酸素除去試薬が、１００マイクロメートル以下の直径を有する粒子から本質的になる、粒径部分布を有する粒子群を形成するように粉砕され分類された、乾燥粉末として供給される。有利なことに、１００マイクロメートル以下の直径を有する粒子として供給される酸素除去試薬は、装置に所定体積の水性液体が接種され、任意により開口部が封止されるときに、増殖区画内に嫌気的環境を生成し、維持する（例えば、最大約２４時間のインキュベーション、最大約４８時間のインキュベーション、最大約７２時間のインキュベーション、最大約４日のインキュベーション、最大約５日のインキュベーション、最大約７日のインキュベーション、少なくとも２４時間のインキュベーション、少なくとも４８時間のインキュベーション、少なくとも７２時間のインキュベーション、少なくとも４日のインキュベーション、少なくとも５日のインキュベーション、少なくとも７日のインキュベーション）ために効果的な量で、基部又はカバーシートに接着させる（例えば、基部又はカバーシート上にコーティングされた接着剤層に接着させる）ことができる。
【００５８】
カバーシート２０上に配置される任意選択の接着剤層２２に使用される接着剤は、基部１０上に配置される任意の接着剤層１２に使用される接着剤と同じであっても、異なっていてもよい。加えて、カバーシート２０上に配置された、第２乾燥コーティング２４は、基部１０上に配置される第１乾燥コーティング１４と同じであっても異なっていてもよい。カバーシート２０上のコーティングが、基部に面する全表面を被覆してもよいが、好ましくは、培養装置１００の増殖区画３０の少なくとも一部分を画定する、内面の少なくとも一部を被覆する。
【００５９】
いずれかの実施形態において、選択的薬剤は、装置内で、乾燥コーティング内に配置される、又は任意により、増殖区画内における接着剤層中に溶解させることができる。
【００６０】
所望により、本開示の培養装置は、培養装置中の酸素を示す手段を更に含む。好ましくは、この手段は、装置中に存在する酸素の量（例えば、所定の閾値量又は相対量のいずれか）を示すことができる。有利なことに、この手段は、酸素除去試薬が培養装置の増殖区画内の酸素を、微好気性微生物、微耐気性微生物、又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進する濃度まで適切に低減させたかどうか、あるいは低減させた時点を示すことができる。培養装置内の酸素検出手段は、当技術分野において既知であり、例えば、レドックス色素（例えば、メチレンブルー）及び酸素消光性蛍光色素が挙げられる。
【００６１】
この手段は、装置内部の酸素不存在を示す発光化合物であり得る。好適な酸素指示薬は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８９，４３８号（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。本開示の培養装置用の指示薬として適切な発光化合物は、酸素によって消光される発光を呈する。より正確には、指示薬は、酸素濃度と反比例する放出によって、励起周波数にさらされると発光する。指示薬はコーティング、ラミネート加工、又は装置内の別の層上若しくは別の層の一部分上に押出成形されていてよい。このような層は、増殖区画内に配置されてよく、任意により１つ又は２つ以上の他の酸素透過層によって増殖区画から分離される。酸素を示す好適な化合物としては、オクタエチルポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、テトラベンゾポルフィリン、クロリン、又はバクテリオクロリンの金属誘導体が挙げられる。その他の好適な化合物としては、パラジウムコプロポルフィリン（ＰｄＣＰＰ）、白金及びパラジウムのオクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ、ＰｄＯＥＰ）、白金及びパラジウムのテトラフェニルポルフィリン（ＰｔＴＰＰ、ＰｄＴＰＰ）、カンファーキノン（ＣＱ）、並びにエリトロシンＢ（ＥＢ）などのキサンテン系色素が挙げられる。その他の好適な化合物としては、２，２′−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンなどの配位子を有するルテニウム、オスミウム、及びイリジウム錯体が挙げられる。これらの好適な例としては、トリ（４，７，−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）パークロレート、トリ（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）パークロレート、トリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）パークロレートなどが挙げられる。
【００６２】
本開示の培養装置は任意により、増殖区画内に配置された、有効量の、乾燥した二酸化炭素生成試薬を含む。理論に束縛されることなく、二酸化炭素生成試薬は、増殖区画内の水性液体との接触により活性化すると、溶存種：炭酸、炭酸、及び二酸化炭素の、１つ以上の塩の平衡を確立する。有利なことに、有効量の二酸化炭素生成試薬は、溶存二酸化炭素を、様々な微生物の増殖を促進する濃度まで高めるのに十分である。
【００６３】
好ましくは、いずれかの実施形態において二酸化炭素生成試薬が、乾燥粉末の形態で供給される。より好ましくは、いずれかの実施形態において、二酸化炭素生成試薬が、粉砕されて１００マイクロメートル以下の直径を有する粒子から本質的になる粒径部分布を有する粒子群を形成するように分類された、乾燥粉末として供給される。有利なことに、装置に所定体積の水性液体を接種し、閉じた後、増殖区画内におけるＣＯ２富化環境を生成し、数日間のインキュベーション期間にわたり維持するために有効な量で、１００マイクロメートル以下の直径を有する粒子を、基部又はカバーシートに接着させることができる（例えば、基部又はカバーシートにコーティングした接着剤層に接着させる）。いずれかの実施形態において、二酸化炭素生成試薬は、増殖区画において基部及び／又はカバーシートに接着させた接着剤層に接着させることができる。
【００６４】
本開示の培養装置は、任意により増殖区画内に配置された乾燥緩衝試薬を含み、これは、脱イオン水で水和されると、水を、一定の微生物群を培養し、任意により選択的に増菌させるのに好適な、所定のｐＨにする。例えば、いずれかの実施形態において、所定のｐＨは、約５．２〜約７．８であり得る。いくつかの実施形態において、所定のｐＨは、６．３５以下（例えば、約４．５〜約６．３５）であり得る。この弱酸性のｐＨは、ｉ）酸性環境は、耐酸微生物（例えば、ＬＡＢ）の増殖を、サンプル内に存在し得る、他の微生物よりも選択的に促進すること、及びｉｉ）酸性環境が、炭素生成試薬（存在する場合）の平衡を、より高い溶存ＣＯ２の割合へとシフトさせ得ること、といういくつかの利点をもたらす。これらの利点の双方とも、例えば、培養装置内におけるＬＡＢの増殖を促進することができる。
【００６５】
本開示の装置において使用される緩衝試薬は、約８．０以下のｐＫａを有する、いずれかの微生物学的に適合可能な緩衝材を含む。緩衝試薬の酸性及び塩基性部分は、所定体積の脱イオン水が緩衝試薬と接触するときに、増殖区画内のｐＨが特定の微生物又は微生物群の増殖及び検出に好適になるような比率で、培養装置内に存在する。好適な緩衝試薬としては例えば、金属リン酸塩、金属酢酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム、並びにコハク酸及びコハク酸ナトリウムが挙げられる。当業者には、所定体積の水性液体（例えば、サンプルを含む）が増殖区画内に堆積され、装置が閉じられたときに形成される、水性混合物の所望のｐＨを達成するために、酸性緩衝試薬及び塩基性緩衝試薬の比率を調整してもよいことが認識される。
【００６６】
本開示の培養装置は、任意により指示薬を含む。好適な指示薬（例えば、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ））は、培養装置内に存在する、実質的に全ての微生物を検出し得る。任意により、指示薬は、示差的指示薬であってもよい。すなわち、指示薬は、特定の微生物を他の微生物から区別する。好適な指示薬としては、例えば、微生物の存在を検出するための、ｐＨ指示薬、レドックス指示薬、発色性酵素基質、蛍光性酵素基質が挙げられる。指示薬は、酸素除去試薬と実質的に干渉しないべきである。いずれかの実施形態において、指示薬は、装置内で、乾燥コーティング内に配置される、又は任意により、増殖区画内における接着剤層中に溶解させることができる。
【００６７】
本開示の培養装置は任意により、乾燥した酸素除去試薬の代わりに、又はこれに加えて還元剤を含む。好適な還元剤は、増殖培地の酸化還元電位を下げることにより嫌気性微生物の増殖を促進するために有用である。好適な還元剤としては例えば、チオグリコール酸ナトリウム、Ｌ−システイン、ジチオスレイトール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６８】
いずれかの実施形態において、増殖区画を、水性液体の体積１ｍＬで水和されるように寸法設定することができる。水は、ミリリットルあたり約０．５４μモルの溶存酸素を含む。したがって、第１乾燥コーティング及び／又は第２乾燥コーティングは好ましくは、約２２℃〜約４２℃において、１２０分以下の時間で、０．５４μモルの酸素を消費するために十分な酸素除去試薬を少なくとも含む。より好ましくは、第１乾燥コーティング及び／又は第２乾燥コーティングは好ましくは、約２２℃〜約４２℃において、１２０分以下の時間で、０．５４μモル超の酸素を消費するために十分な酸素除去試薬を少なくとも含む。いずれかの実施形態において、増殖区画は、水性液体の体積約２〜約１０ｍＬを受け入れ、これにより水和されるように寸法設定することができる。当業者は、これらの状況において、水性サンプル内の酸素を消費するのに必要な、追加的な酸素除去試薬の量を認識する。
【００６９】
いずれかの実施形態において、第１乾燥コーティング及び／又は第２乾燥コーティングは、任意の数の他の成分、例えば、色素（例えば、ｐＨ指示薬）、架橋剤、試薬（例えば、発色性若しくは蛍光性の酵素基質などの選択的試薬若しくは指示薬）、又は上述の成分の２種以上の組み合わせを含み得る。例えば、一部の用途では、微生物増殖の指示薬（例えば、ｐＨ指示薬、発色性酵素基質、レドックス色素）を第１及び／若しくは第２乾燥コーティング内に、又は第１及び／若しくは第２乾燥コーティングを接着させる接着剤中に組み込むことが望ましい。好適な色素には、微生物の成長により代謝されるか、又は別の方法で微生物の成長により反応して、コロニーを着色し又は蛍光させて可視化を容易にするものが挙げられる。このような色素として、トリフェニルテトラゾリウムクロライド、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラトリルテトラゾリウムブルー及び関連する色素、並びに５−ブロモ−４−クロロインドリルホスフェートの二ナトリウム塩が挙げられる。その他の好適な色素としては、微生物の増殖中にｐＨの変化を感知するもの、例えばニュートラルレッドが挙げられる。
【００７０】
少なくとも１つの乾燥コーティングは、ある種の微生物学的試験を行うために必要な試薬を任意に含み得る。例えば、抗生物質感受性試験を実施するため、抗生物質を含有させることができる。微生物を同定するため、特定種の微生物が存在すると色が変化する鑑別試薬を含有させることができる。
【００７１】
本発明の培養装置は、種々の技術を使用して作製することができる。一般的に、装置は、手作業によって、あるいは、例えば本明細書並びに米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号で説明されるように、通常の実験室設備を使用して、作製することができる。
【００７２】
第１接着剤層及び／又は第２接着剤層において使用できる、好適な感圧接着剤の非限定例は、モル比９０／１０の２−メチルブチルアクリレート／アクリル酸のコポリマーである。使用することができる他の好ましい感圧接着剤としては、モル比９５／５又は９４／６のイソオクチルアクリレート／アクリル酸、及びシリコーンゴムが挙げられる。水にさらされると白化（例えば、不透明化）する接着剤は、あまり好ましくないが、不透明な基部と共に、又はコロニーの視認が必要とされない場合には使用することができる。高溶融性基剤上に低溶融性基剤がコーティングされた熱活性接着剤、及び／又は粘着液などの水活性接着剤も知られており、本発明で使用することができる。コロニーの視認を容易にする目的で上記のとおり指示薬を組み込む場合、概して、粉末よりも接着剤又はブロスコーティング混合物内に指示薬を組み込むことが好ましい。
【００７３】
第１接着剤層又は第２接着剤層（例えば、ナイフコーターを使用して）は基部又はカバーシートの上面にコーティングされて接着剤層を形成するが、その厚みは、接着剤に接着する乾燥粉末又は凝集粉末の平均粒径未満であることが好ましい。概して、粒子を基材（例えば、本明細書に記載する第１基材又はカバーシート）に接着させるのに十分だが、粒子が接着剤に完全に埋没しない程度の接着剤をコーティングする。一般的に、厚さ約５μｍ〜約１２μｍの接着層が好適である。
【００７４】
好ましくは、第１乾燥コーティング及び／又は第２乾燥コーティング内にゲル化剤を含有させるとき、ゲル化剤は、所定体積の、例えば１〜３ｍＬ以上の水又は水性サンプルが増殖区画に配置されると、好適な粘度、例えば、ブルックフィールドモデルのＬ  ＶＦ粘度計を使用して２５℃にて６０ｒｐｍで測定したときに約１５００ｃｐｓ以上を有する、ヒドロゲルを形成するような量で含まれる。この粘度のヒドロゲルは、培養中の装置の簡便な取り扱い及び積み重ねを可能にし、その培地に特異的なコロニー形成をもたらす。例えば、０．０２５ｇ〜０．０５０ｇの粉末グアーガムを、２０．３ｃｍ２の表面領域にわたって実質的に均一に広げることで、１〜３ｍＬの水性サンプルにより再構成させたときに、十分な粘性の培地がもたらされる。単位面積当たりのコーティング重量を制御するために、粉末粒径が使用され得る。例えば、１００メッシュのグアーガムが使用される条件下では、重量が約０．０５ｇ／２０．３ｃｍ２になるようコーティングされ、４００メッシュのグアーガムが使用される条件下では、重量が約０．０２５ｇ／２０．３ｃｍ２になるようコーティングされる。
【００７５】
いずれかの実施形態において、第１乾燥コーティング又は第２乾燥コーティングは、微生物の増殖を促進する１種又は２種以上の栄養素を含み得る。コーティングが粉末又は粉末凝集体から本質的になるとき、ゲル化剤と、接着される粉末培地中の栄養素との好ましい比は、装置で増殖させる具体的な微生物により決定される。しかしながら、汎用目的では、約４：１〜約５：１（重量を基準とした合計栄養素に対する合計ゲル化剤）の比率が好ましい。実質的に均一な層の適用に好適な任意の手段によって、接着される粉末培地中の粉末を、接着剤層（第１接着剤層１２及び／又は第２接着剤層２２）に適用することができる。粉末の層を適用するための好適な方法の例として、シェイカー型装置の使用、又は粉末コーターの使用が挙げられる。
【００７６】
当業者は、特定の微好気性、微耐気性、又は偏性嫌気性微生物を増殖及び検出するための、本開示の装置において使用するための好適な栄養素を認識する。好適な栄養素の非限定的な例としては、ペプトン（例えば肉エキス、肉ペプトン）、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、及び炭水化物（例えばマルトース、グルコース、トレハロース、スクロース）の供給源が挙げられる。いずれかの実施形態において、炭水化物は、特定の微生物によってグルコースに発酵される栄養素であり得る。好ましくは、炭水化物は、微生物の増殖（バイオマス生産）を促進するために十分な量で装置内に存在し、任意により、微生物によって発酵されて、検出可能な量のＣＯ２（これは、微生物コロニーと隣接する気泡として検出され得る）を形成する。
【００７７】
本開示の培養装置を使用する場合、存在する微生物のコロニーの正確な計数が望まれる場合がある。したがって、いずれかの実施形態において、本開示の培養装置は、基部に、又はその代わりにカバーシートにグリッドパターンを含んでもよい。グリッドパターンは正方形のグリッドパターン、例えば米国特許第４，５６５，７８３号に開示されるような正方形のグリッドパターンを含んでよい。例えば印刷手段のような任意の好適な処理によって、第１（the first）又はカバーシートにグリッドパターンを形成してもよい。
【００７８】
別の態様において、本開示は、上記実施形態のいずれかの内蔵型嫌気性環境生成培養装置を作製する方法を提供する。方法は、冷水可溶性ゲル化剤を基部の一部に接着させる工程を含む。ゲル化剤は、基部に接着させるときに、乾燥していてもよく（例えば、実質的に水を含まない粒子の形態）、又はゲル化剤は、液体コーティング（例えば、水性液体コーティング）として基部に接着させて、その後乾燥させて実質的に水を含まない状態にしてもよい。方法は、（例えば、感圧接着剤によって）基部をカバーシートに取り付ける工程を更に含む。任意により、基部をカバーシートに取り付ける工程は、防水性シールを形成する工程を更に含む。
【００７９】
基部は、接着させたゲル化剤の少なくとも一部分が、基部とカバーシートとの間に配置された増殖区画に面するように、カバーシートと隣接して位置決めされる。任意により、いずれかの実施形態において、第１接着剤層は（例えば、当該技術分野において既知のコーティングプロセスを使用して）基部に適用されてもよく、冷水可溶性ゲル化剤は、第１接着剤層に接着されてもよい。
【００８０】
別の実施形態において、冷水可溶性ゲル化剤は、ゲル化剤を基部に接着させるための、記載されるプロセスのいずれかを使用して、カバーシートに接着させてもよい。ゲル化剤が液体コーティングされる場合、接着させたゲル化剤の乾燥は、当該技術分野において既知の多くのプロセスによって行うことができる。コーティングは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０１，９９８号に記載のプロセスにしたがって、オーブン（例えば、重力式オーブン、対流式オーブン）で乾燥させることができる。好ましくは、接着させたゲル化剤は実質的に水を含まない状態になるまで乾燥される。本明細書で使用される「実質的に乾燥している」、「実質的に水を含まない」などのフレーズは、いったんそれが周囲環境と平衡化できるようになると、およそ、脱水コーティングの含水量以下の含水量を有するコーティングを指す。
【００８１】
方法は更に、酸素除去試薬、緩衝系、及び二酸化炭素生成試薬を、培養装置の増殖区画内に堆積させることを含む。いずれかの実施形態において、酸素除去試薬のいずれか１つ又は全て、緩衝系の成分、及び二酸化炭素生成試薬のいずれか１つ又は全てが、乾燥粉末として増殖区画内に堆積されてもよい。任意により、酸素除去試薬、緩衝系、及び二酸化炭素生成試薬のいずれか１つ又は全部を、増殖区画内の接着剤（例えば、本明細書において記載される、第１接着剤層、又は第２接着剤層）に接着させてもよい。他の任意の成分（例えば、指示薬、選択的薬剤、栄養素）もまた、増殖区画内に堆積され、任意により、接着剤層に接着させられる。
【００８２】
接着させたゲル化剤が、基部とカバーシートとの間に配置された増殖区画と面するように、基部をカバーシートに隣接するように位置決めすることは、様々な方法で行われ得る。ゲル化剤の一部が、増殖区画と重複するように、基部及びカバーシートを位置決めする代表的な方法が、例えば、図１〜図３に示されている。この重なり合った配置では、操作者が基部とカバーシートとの間に水性液体を堆積させることによって、増殖区画内に存在するゲル化剤、酸素除去試薬、及び他の乾燥成分を流体連通させることができるようになることが分かる。
【００８３】
いずれかの実施形態において、本開示の培養装置は、培養装置の開口部付近の接着剤層に取り外し可能に接着させた、任意選択の取り外し可能タブを備えてもよい。図２Ａ及び図２Ｂは、装置の開口部３４付近で、第１接着剤層１２、及び第２接着剤層２２にそれぞれ接着された、複数の取り外し可能なタブ（それぞれ、タブ５０及び５１）を備える、培養装置２００の一実施形態を示している。取り外し可能なタブは、装置が接種され、タブが操作者によって取り除かれるまで、保存及び取り扱い中に第１及び第２接着剤層が互いに接着する（よって開口部を封止する）のを防ぐ。
【００８４】
取り外し可能なタブ５０及び５１は、タブ材料と接着剤層との間の積極的な接着を防ぐために、剥離コーティング（例えば、低接着バックサイズ）が適用され得る、任意の好適な材料（例えば、紙、ポリマーフィルム）から作製することができる。
【００８５】
本開示による装置の増殖区画は、例えば、図１Ａの矩形の増殖区画など、様々な形状を有することがある。他の好適な形状としては、円形、楕円形、多角形、星形、及び不規則形状の増殖区画が挙げられるが、これらに限定されない。図３は、増殖空画３０の周辺部の約１０％未満を画定する開口部３４を備える多角形増殖区画を有する、培養装置３００の一実施形態を示している。
【００８６】
図４Ａ及び図４Ｂは、図３の培養装置３００の様々な図を示しており、装置３００は、複数の取り外し可能なタブ（それぞれ、タブ５０及び５１）を更に含む。
【００８７】
いずれかの実施形態において、本開示による装置は、乾燥成分（例えば、ゲル化剤、１種以上の酸素除去試薬、還元剤）の少なくとも１つをキャリアに接着させ、その後、キャリアを増殖区画の基部又はカバーシートに接着させることによって作製することができる。図５Ａ及び図５Ｂは、上記キャリアを含む培養装置３００の一実施形態を示している。
【００８８】
装置３００は、上述のように基部１０及びカバーシート２０を有する本体６を備える。上記のように第１接着剤層１２が基部１０に接着される。上記のように第２接着剤層２２がカバーシート２０に接着される。任意のキャリア６０が第１接着剤層１２に接着される。上記のように第１乾燥コーティング１４が、任意選択の第３接着剤層６２を介してキャリア６０に接着される。任意のキャリア７０が第２接着剤層２２に接着される。上記のように第２乾燥コーティング２４が、任意選択の第４接着剤層７２を介してキャリア７０に接着される。いずれかの実施形態において、本開示による装置は、第１キャリア６０（及びその上の乾燥コーティング）、第２キャリア７０（及びその上の乾燥コーティング）、又は第１及び第２キャリアの両方並びにその上のコーティングを含み得る。
【００８９】
第１及び第２キャリアは、基部又はカバーシートの材料として使用するための、本明細書に記載される任意の好適な材料を使用して作製することができる。第３接着剤層及び第４接着剤層は、第１及び第２接着剤層において使用するための、本明細書に記載される任意の好適な接着剤を含むことがある。
【００９０】
図５Ａ及び図５Ｂにおける本発明の装置３００は、基部、カバーシート、及びキャリアのための薄フィルム基材を使用して、ロールトゥロールプロセスを使用して、容易にコーティングし、かつ組み立てられることが現在では分かっている。
【００９１】
本開示による装置は、あるいは、カバーシート及び基部の両方を形成するために、一体型の基材を使用して構成できることが現在では分かっている。これらの実施形態において、このコーティングは、一体型の実質的に平坦な基材に適用され、これはその後、折り畳まれて、防水性シールと、一体型基材の２つの部分の間に配置される増殖区画とが形成される。
【００９２】
図６〜図９は、本開示の装置４００の一実施形態の組み立てのいくつかの段階を例示しており、装置は、一体型基材から構成される。培養装置４００は、下記に記載される、様々な層を含む、平坦な部分的に組み立てた培養装置４０１から形成される。図６〜図８の部分的に組み立てた装置４０１は、防水性基材８０を含む、本体８を備える。裏材は、第１主表面８１と、第１主表面の反対側の第２主表面８７とを有する。第１主面８１は、第１区画８２と、第１区画から離れた第２区画８４とを備える。組み立てた培養装置４００において、本体８は、周縁部８９と、第１区分８２を第２区分８４に対して並置して重ねるように配置するために、組み立て中に折り畳まれる折り畳み領域８６とを更に備える。
【００９３】
第１区分８２及び第２区分８４は、増殖区画３０の内壁を画定し、この増殖区画は、周辺部３２と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部８４とを備える。周辺部３２の一部分は、防水性シール４０により画定され、この部分は、周辺部の５０％超を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の５０％超を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の８０％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９０％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９５％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９８％以上を含む。いずれかの実施形態において、この部分は増殖区画３０の周辺部３２の９９％以上を含む。いずれかの実施形態において、（例えば、装置に接種した後、使用中）この部分は増殖区画３０の周辺部３２の１００％を含む。
【００９４】
乾燥した冷水可溶性ゲル化剤は、増殖区画３０の区分（例えば、第１区分又は第２区分８４）の少なくとも１つに接着される。ゲル化剤は第１コーティング１４の一部として供給されてもよく、これは任意により、第１区分８２に接着された、第１接着剤層１２に接着されてもよい。あるいは、又は加えて、ゲル化剤は第２コーティング２４の一部として供給されてもよく、これは任意により、第２区分８４に接着された、第２接着剤層２２に接着されてもよい。いずれかの実施形態において、第１及び第２接着剤層、並びに第１及び第２コーティングは、上記のとおりである。
【００９５】
乾燥した酸素除去試薬が増殖区画３０内に配置されている。いずれかの実施形態において、酸素除去試薬は、ルースパウダーとして、増殖区画３０内に配置されてもよく、又は酸素除去試薬は、第１区分８２に接着させた第１組成物１４の一部、及び／若しくは、第２区分８４に接着された第２組成物２４の一部であってもよい。
【００９６】
いずれかの実施形態では、装置４００は、本明細書で上述されたような、乾燥した還元剤、指示薬、二酸化炭素生成試薬、栄養素及び／又は緩衝試薬を更に備え得る。
【００９７】
いずれかの実施形態において、装置４００の第１コーティング１４、及び／又は第２コーティング２４は、上記のように、キャリア（図示されない）に接着させてもよい。
【００９８】
図１１Ａ〜図１１Ｅは、本開示による装置を作製する方法の一実施形態を例示する。いずれかの実施形態において、実質的に平坦な基材１０が、主面上にコーティングされた感圧接着剤１２の第１層を有する。好適な基部及び接着剤は上記に記載されている。第１接着剤層１２の上にコーティングを適用する前に、シート状マスク９５が、基部１２の第１接着剤層１２に適用される（例えば、積層される）。マスク９５は、周縁部と、中央開口領域と、開口領域から周辺部３４へと延びる空隙とを有する。基材１０上に配置されると、マスク９５の開口部及び空隙は、第１接着剤層１２の一部を露出させる。円形の形状を有するものとして示すが、開口領域は、多数の好適な形状（例えば、円形、正方形、楕円形、長円形、矩形、多角形など）のいずれかを有してもよいことが想定される。
【００９９】
マスク９５は、例えば、紙又はプラスチックフィルムのシートを含む様々な材料から製造することができる。好ましくは、マスク９５は、第１接着剤１２に接して配置される側が、低接着性バックサイズでコーティングされる。低接着性バックサイズ（図示されない）は、接着剤と基材との間の接合を妨げることなく接着剤からマスクを取り除き易くする。マスク９５が第１接着剤１２に接着された後、第１乾燥コーティング１４（例えば、ゲル化剤、酸素除去試薬、及び／又は上記の他の乾燥した成分などの、粉末材料のコーティング）が、露出した接着剤に適用される。図４Ｃは、接着剤の、マスク９５によって被覆されていない部分に第１乾燥コーティング１４が接着していることを示す。
【０１００】
第１乾燥コーティング１４を適用した後、任意選択で、余分な粉末を（例えば、振動により）取り除くことができ、マスク９５が取り除かれる。マスク９５を取り除くことで、図１１Ｄに示すように、基部１０上に残っている、被覆されていない第１接着剤層１２が露出される。本開示による装置の作製を完了させるために、図１１Ｅに示すように、露出した第１接着剤層１２を被覆するように寸法設定されたカバーシート２０が、接着剤に（例えば、図示しないがローラを使用して）積層される。装置は、装置の縁部に沿って、開口部３４を通じて液体サンプル（図示されない）が内部に導入される、増殖区画３０を備える。
【０１０１】
更に別の態様では、本開示は、微生物を検出する方法を提供する。方法は、上記の実施形態のいずれか１つの培養装置のいずれかの実施形態を使用する。
【０１０２】
いずれかの実施形態において、方法は、開口部を通じて所定体積の水性液体を含むサンプルを増殖区画内に堆積する工程と、任意により開口部を封止する工程と、増殖区画内で微生物コロニーが形成されるのを可能にするために、十分な時間にわたり培養装置をインキュベートする工程と、微生物コロニーを検出する工程とを含む。いずれかの実施形態において、所定体積の水性液体を含むサンプルを増殖区画内に堆積する工程は、培養装置の増殖区画内に囲まれた（例えば、外部気体環境から隔離された）半固体微生物培地を形成する工程を含む。
【０１０３】
いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される水性液体の所定の体積は、約０．１ミリリットル〜約１００ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される水性液体の所定の体積は、約１ミリリットル〜約２０ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される所定体積の水性液体は、約１ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される所定体積の水性液体は、約２ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される所定体積の水性液体は、約３ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される所定体積の水性液体は、約４ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される所定体積の水性液体は、約５ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置での水和及び／又は接種に使用される所定体積の水性液体は、約１０ミリリットルである。いずれかの実施形態において、培養装置の増殖領域の水和に使用される水性液体は領域全体に分布し、結果的に増殖領域の２０．３ｃｍ２あたり約１ミリリットルの液体となる。
【０１０４】
方法のいくつかの実施形態において、所定体積を、増殖区画内に配置する工程は、サンプルを増殖区画内に同時に配置する工程を含む。例えば、サンプルは液体であってもよく（例えば、微生物汚染を試験する、水又は飲料サンプル）、又はサンプルは、液体キャリア若しくは希釈剤中に懸濁される固体又は半固体サンプルであってもよい。
【０１０５】
あるいは、いずれかの実施形態において、所定体積を、増殖区画内に配置する工程は、サンプルを増殖区画内に同時に配置する工程を含まない。例えば、サンプルは、所定体積の（好ましくは無菌の）液体キャリア又は希釈剤が、培養装置の増殖区画内に配置される前又は後に、増殖区画内に配置される、液体、固体、又は半固体材料を含み得る。
【０１０６】
本培養装置は、好気性環境（すなわち、空気中）で水和及び／接種が可能である点で有利である。通常、装置の水和に使用される水性液体（試験対象のサンプル材料を含む場合がある）は、基部とカバーシートとの間の増殖区画にピペットで移される。所定体積の水性液体が、増殖区画内に堆積された後、培養装置は任意により、（例えば、開口部を封止するために使用され得る接着剤層を露出するために、１つ以上の取り外し可能なタブ（存在する場合）を取り除くことによって）封止される。任意により、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ培養装置の接種に使用されるものと類似した、平らな又は凹状のスプレッダーを使用して、増殖区画全体に、水性液体を均等に分布させることができる。
【０１０７】
方法のいずれかの実施形態において、所定体積を、増殖区画内に配置する工程は、サンプルを増殖区画内に同時に配置する工程を含み得る。これらの実施形態において、サンプルは、水性液体を含んでもよく、及び／又はサンプルは、水性液体（例えば、緩衝剤又は無菌培地）内に希釈されるか、若しくは懸濁されてもよい。
【０１０８】
あるいは、いずれかの実施形態において、所定体積を、増殖区画内に配置する工程は、サンプルを増殖区画内に同時に配置する工程を含まない。これらの実施形態において、所定体積の水性液体９０は、サンプルを増殖区画内に配置する前又は後に、増殖区画３０内に配置する（例えば、図１０に示されるように、培養装置５００の開口部３４を通じてピペットで移す）ことができる。例えば、サンプルは、ゲル化剤が水性液体で水和される前又は後に、増殖区画内に配置される、メンブレンフィルター（図示されない）に捕捉され得る。
【０１０９】
方法のいずれかの実施形態において、サンプルを増殖区画内に配置する工程は、１種以上の添加剤を増殖区画内に配置する工程を含む。１種以上の添加剤は、サンプルと共に、又は別個に、増殖区画に配置することができる。１種以上の添加剤は、本方法の種々の機能を実現することができる。例えば、いずれかの実施形態において、１種以上の添加剤が、装置内の微好気性、微耐気性、又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進する栄養素又は栄養培地を含んでもよい。このような栄養素又は栄養培地は当該技術分野で周知されており、培養する具体的な微生物に基づいて選択してもよい。栄養素、及び栄養培地は、酸素除去試薬と実質的に干渉するべきではない。これは、本明細書にその全容を参照によって援用するＰＣＴ国際出願第２０１５／０６１２１３号の実施例２〜３に記載されるように、酸素センサを使用して容易に試験することができる。
【０１１０】
あるいは、又は加えて、いずれかの実施形態において、添加剤は、ある微生物の増殖にとって、少なくとも１種の他の微生物よりも有利となる１種以上の選択的薬剤（例えば、抗生物質、塩）を含む。一実施形態において、選択的薬剤は、サンプル中に存在する、ある微生物の増殖にとって、他の微生物よりも有利に働く。あるいは、又は加えて、いずれかの実施形態において、添加剤は、微生物の存在を検出するための指示薬（例えば、ｐＨ指示薬、レドックス指示薬、発色性酵素基質、蛍光性酵素基質）を含む。特定の微生物の検出に有用である選択的薬剤及び指示薬を当業者は理解するであろう。選択的薬剤及び／又は指示薬は、酸素除去試薬と実質的に干渉しないべきである。これは上記の酸素センサを使用して容易に試験することができる。
【０１１１】
増殖区画内の水性液体と接触させることによって、乾燥成分（例えば、酸素除去試薬、緩衝系の成分、二酸化炭素生成試薬、栄養素、指示薬、及び還元剤、及び／又は選択的薬剤）、及び水性液体は、第１濃度の溶存酸素、及び第１濃度の溶存二酸化炭素を含む混合物を形成する。
【０１１２】
いずれかの実施形態において、増殖区画内の水性混合物内の溶存酸素の第１濃度は、偏性嫌気性微生物、微好気性微生物、及び／又は微耐気性微生物の増殖を実質的に阻害する濃度であり得る。これらの実施形態では、それらの成分を水性流体連通させると、酸素除去反応が開始されることにより、増殖区画内の水性液体中での第１溶存酸素の濃度は、その第１濃度よりも低い（例えば、第１濃度よりも、少なくとも約５０％低い、少なくとも約６０％低い、少なくとも約７０％低い、少なくとも約８０％低い、少なくとも約９０％低い、少なくとも約９５％低い、少なくとも約９８％低い、少なくとも約９９％低い、又は９９％超低い）第２濃度まで低減される。
【０１１３】
いずれかの実施形態において、溶存酸素の第１濃度を溶存酸素の第２濃度まで低減させることは、増殖区画内の水性混合物内の溶存酸素を、嫌気性微生物（例えば、微耐気性菌、又は偏性嫌気性菌）の増殖を促進するのに十分な低さの第２濃度にまで低減させることを含み得る。
【０１１４】
いずれかの実施形態において、溶存酸素の第１濃度を溶存酸素の第２濃度まで低減させることは、増殖区画内の水性混合物内で、溶存酸素を第２濃度まで、混合物の形成後、約１２０分以内に低減させることを含み得る。いずれかの実施形態において、溶存酸素の第１濃度を溶存酸素の第２濃度まで低減させることは、増殖区画内の水性混合物内で、溶存酸素を第２濃度まで、混合物の形成後、約９０分以内に低減させることを含み得る。いずれかの実施形態において、溶存酸素の第１濃度を溶存酸素の第２濃度まで低減させることは、増殖区画内の水性混合物内で、溶存酸素を第２濃度まで、混合物の形成後、約６０分以内に低減させることを含み得る。いずれかの実施形態において、溶存酸素の第１濃度を溶存酸素の第２濃度まで低減させることは、増殖区画内の水性混合物内で、溶存酸素を第２濃度まで、混合物の形成後、約４５分以内に低減させることを含み得る。いずれかの実施形態において、溶存酸素の第１濃度を溶存酸素の第２濃度まで低減させることは、増殖区画内の水性混合物内で、溶存酸素を第２濃度まで、混合物の形成後、約３０分以内に低減させることを含み得る。
【０１１５】
いずれかの実施形態において、本開示の装置は任意により、二酸化炭素生成試薬を含む。いずれかの実施形態において、増殖区画内の水性混合物内の溶存二酸化炭素の第１濃度は、微生物の増殖を実質的に促進する濃度であり得る。しかしながら、サンプル内の微生物の一部又は全部は、ＣＯ２富化環境において、バイオマスをより早く累積することがある。したがって、いくつかの実施形態において、この成分を、任意選択の二酸化炭素生成試薬と流体連通させることによって、二酸化炭素生成反応が開始され、よって、増殖区画内の水性混合物内の利用可能な二酸化炭素の第１濃度が、第１濃度よりも高い第２濃度へと増加する。本開示の培養装置が接種及びインキュベートされるとき、追加的に利用可能な二酸化炭素は、増殖区画内に形成されるヒドロゲル中に、巨視的な形成物（すなわち、１ｍｍ以上の直径の気泡）を生じない。むしろ二酸化炭素生成試薬は、水性混合物内の溶存二酸化炭素の濃度を増加させる。したがって、二酸化炭素生成試薬を含む培養装置は、発酵性炭水化物のＣＯ２ガスへの発酵（これは、コロニー近傍に気泡として蓄積する）の検出を含む方法において使用することができる。
【０１１６】
サンプル材料を装置内に配置する前に培養装置を水和させる場合は、装置を再度開いて培養材料を接種する前に、所望により冷水可溶性ゲル化剤を水和させ、数分間から約３０分以上かけて（例えば、室温で）ゲルを形成することができる。ゲル化剤が水和されゲルを形成するまでの期間、酸素除去試薬は、水和されたゲル化剤中の溶存酸素の濃度を第１濃度から、上記のように、微耐気性、又は偏性嫌気性微生物の増殖を促進する第２濃度へと低減させる。
【０１１７】
培養装置の増殖区画の水和前後に、当技術分野において既知である種々の方法でサンプル材料を増殖区画と接触させることができる。いずれの実施形態でも、サンプル材料は増殖区画内にサンプル材料を堆積させることにより増殖区画と接触する。例えば、これは、ピペット操作、増殖区画を、サンプル材料を得るために用いたスワブと（例えば、開口部を通じて）接触させること（例えば、スワブによる表面塗抹）、増殖区画と白金耳又はニードルとの接触（例えば、画線平板法を使用する）、又はサンプル採取装置（例えば、スワブ、スポンジ、又はメンブレンフィルター）を増殖領域に直接配置することによって行うことができる。サンプルを堆積させ、（培養装置中に肉眼で視認可能な気泡が混入しないように注意して）培養装置が任意により閉じられた後、酸素除去試薬は増殖区画内の溶存酸素を消費する。
【０１１８】
方法のいずれかの実施形態において、サンプルが増殖区画内に配置され、任意により封止された後、培養装置を一定時間（例えば、所定の期間）インキュベートする。当業者には周知であるように、インキュベーションの条件（例えば、インキュベーション温度）は、微生物の増殖の速さに影響する場合がある。例えば、低温でのインキュベーション（例えば、約２５℃）は、低温微生物の検出を可能にし得る。より高い温度でのインキュベーション（例えば、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃）では、ある種の中温性微生物のより速い増殖を促進する場合がある。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、インキュベーション後、培養装置は、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、又は少なくとも約４８時間の間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、培養装置は、約２４時間以下、約４８時間以下、又は約７２時間以下の間インキュベートされ得る。ある種の実施形態では、培養装置は、約２４時間〜約４８時間培養される。いずれかの実施形態において、培養装置はインキュベートされ、増殖区画内で増殖する微生物コロニーを検出又は計数する前に、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約７日間、又は約８日間の間、その低酸素環境を維持することができる。いずれかの実施形態において、微生物コロニーの形成が可能になるまで一定時間にわたり培養装置をインキュベートすることは、好気的環境中で一定期間にわたり培養装置をインキュベートすることを含む（すなわち、培養装置は、インキュベーションのために低酸素容器又はグローブボックス内に配置されていない）。
【０１２０】
本方法では、接種済み培養装置をインキュベートした後、微生物のコロニーを検出することを更に含む。微生物のコロニーは、当技術分野において既知である種々の手法によって培養装置内で検出することができる。好適な培養期間後、観察可能なコロニーの不在、増殖指示薬（例えば、ｐＨ指示薬、発色性酵素基質、ＴＴＣなどのレドックス指示薬、蛍光性酵素基質）内での変化の不在、及び増殖培地内の発酵性炭化水素の代謝に付随する気泡の不在によって、培養装置中の微生物の不存在を検出できる。
【０１２１】
微生物のコロニーに付随する酸性域は、目視及び／又は撮像装置の使用により検出することができる。例えば、培地がｐＨ指示薬としてブロムクレゾールパープルを含む方法では、培地はほぼ中性ｐＨ時には紫色又は灰色の外観を示す。微生物が増殖して、培地内の炭化水素（例えば、グルコース）を発酵させるにつれ、ブロムクレゾールパープル指示薬は、増殖している細菌コロニー近傍で黄変する。例えば、培地がｐＨ指示薬としてクロロフェノールレッドを含む方法では、培地はほぼ中性ｐＨ時には赤色又はバイオレットの外観を示す。微生物が培地内の炭化水素を発酵させるにつれ、クロロフェノールレッド指示薬は、増殖している微生物のコロニー近傍で黄変する。
【０１２２】
気泡は、増殖区画内に存在し、微生物のコロニーと関与する場合（例えば、コロニーに接触している、又はコロニーから約１ｍｍ以下の距離にある）、視覚的に、及び／又は画像下システムの使用により、検出することができる。目視可能なコロニー及び／又は微生物のコロニー近傍の領域内でｐＨ指示薬の色変化により検出可能である酸性域は、気泡を伴う場合がある。気泡は、例えば、炭化水素の嫌気発酵により生成される二酸化炭素を含む場合がある。
【０１２３】
上記実施形態のいずれかにおいて、本方法は、培養装置の画像を得る工程を更に含み得る。これらの実施形態では、ＬＡＢの有無を検出する工程は、培養装置の画像を表示する、印刷する、又は分析することを含む。撮像システムは撮像装置を含み、また、プロセッサを含んでもよい。いくつかの実施形態において、撮像装置は、ラインスキャナ又はエリアスキャナ（例えば、カメラ）を含み得る。撮像装置は、単色の（例えば、白黒）又は多色の（例えば、色付き）スキャナを含み得る。有利には、単色の撮像システムは、より解像度の高い画像を準備することができ、結果の精度を向上させる及び／又は培養器具内の微生物の存在を検出するのに必要な時間を低減することが可能である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、撮像システムは、照明システムを更に含む。照明システムは、少なくとも１つの広域スペクトル可視光（例えば、「白色」光）源を含み得る。いくつかの実施形態において、照明システムは、少なくとも１つの狭スペクトル可視光源（例えば、例えば、赤色光、緑色光、又は青色光といった比較的狭帯域幅の可視光を放射する発光ダイオード）を含み得る。特定の実施形態において、照明システムは、発光ピークが事前選択された波長（例えば、約５２５ｎｍ）である狭スペクトル可視光源（例えば、発光ダイオード）を含み得る。
【０１２５】
画像は、培養装置の増殖区画内の要素（例えば、微生物のコロニー、増殖培地、及び指示薬）によって反射された光から得ることができ、又は画像は培養装置の増殖区画内の成分を透過した光から得ることができる。好適な撮像システム、及び対応する照明システムは、例えば、国際公開第２００５／０２４０４７号、並びに米国特許出願公開第２００４／０１０１９５４号及び同第２００４／０１０２９０３号で説明されており、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。好適な画像システムの非限定例としては、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰＰＲ）、Ｓｐｉｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）から入手可能なＰＥＴＲＩＳＣＡＮ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、並びに、Ｓｙｎｂｉｏｓｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）から入手可能なＰＲＯＴＯＣＯＬ及びＡＣＯＬＹＴＥプレートスキャナーが挙げられる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、画像を得ることは、波長バイアス画像（wavelength−biased image）を得ることを含む。例えば、撮像システムは、撮像装置が収集した光にバイアスをかけるバイアス・フィルタを含み得る。フィルタエレメントは当該技術分野において既知であり、「カットオフ」フィルター（即ち、ある特定の波長より大きい又は小さいのいずれかの光波長を通すことができるフィルター）及び「バンドパス」フィルター（即ち、ある特定の上限値と下限値との間の光波長を通すことができるフィルター）の両方を包含する。バイアス・フィルタは、照明光源と培養器具との間に位置付けることができる。あるいは、又はこれに加えて、バイアス・フィルタは、培養器具と撮像装置との間に位置付けることができる。
【０１２７】
［例示的な実施形態］
実施形態Ａは、
防水性基部と、基部に取り付けられた防水性カバーシートと、それらの間に配置された増殖区画とを含む、本体であって、増殖区画が、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し、
周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、この部分が、周辺部の５０％超を含む、本体と、
増殖区画内で基部に接着された、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤と、
増殖区画内に配置された、乾燥した第１酸素除去試薬と、を備える、装置である。
【０１２８】
実施形態Ｂは、本体が実質的に二次元である、実施形態Ａに記載の装置である。
【０１２９】
実施形態Ｃは、増殖区画内に配置された、有効量の、乾燥した二酸化炭素生成試薬を更に含む、実施形態Ａ又はＢに記載の装置である。
【０１３０】
実施形態Ｄは、二酸化炭素生成試薬が１００マイクロメートル以下の直径を有する粒子から本質的になる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の培養装置である。
【０１３１】
実施形態Ｅは、増殖区画内に配置された、乾燥した還元剤を更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１３２】
実施形態Ｆは、乾燥した栄養素を更に含んでおり、栄養素は増殖区画内に配置され、栄養素は嫌気性微生物の増殖を促進し、栄養素は酸素除去試薬ではない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１３３】
実施形態Ｇは、栄養素が有機炭素源を含む、実施形態Ｆに記載の装置である。
【０１３４】
実施形態Ｈは、有機炭素源が、非発酵性である、実施形態Ｇに記載の装置である。
【０１３５】
実施形態Ｉは、増殖区画内に配置された、乾燥した第２酸素除去試薬を更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１３６】
実施形態Ｊは、生存可能な微生物の存在を検出するための指示薬を更に含み、指示薬が増殖区画内に配置される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１３７】
実施形態Ｋは、第１酸素除去試薬、第２酸素除去試薬、還元試薬、栄養素、指示薬、及び上記成分のうちのいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される第１乾燥成分が、基部に接着されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１３８】
実施形態Ｌは、基部が、増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された第１接着剤層を含み、第１乾燥成分が、増殖区画内で、第１接着剤層に接着されている、実施形態Ｋに記載の装置である。
【０１３９】
実施形態Ｍは、
カバーシートが、増殖区画の少なくとも一部分において、その上に配置された、第２接着剤層を備え、
第２乾燥成分が、増殖区画内で、第２接着剤層に接着されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１４０】
実施形態Ｎは、第１キャリアを更に備えており、第１乾燥成分が第１キャリアに接着され、第１キャリアが、増殖区画内で、第１接着剤層に接着されている、実施形態Ａ〜Ｌのいずれか１つに記載の装置である。
【０１４１】
実施形態Ｏは、第１キャリアが、その上にコーティングされた第３接着剤層を含み、第１乾燥成分が第３接着剤層に接着されている、実施形態Ｎに記載の装置である。
【０１４２】
実施形態Ｐは、第１酸素除去試薬、第２酸素除去試薬、還元試薬、栄養素、指示薬、及び上記成分のうちのいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される第２乾燥成分が、カバーシートに接着されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１４３】
実施形態Ｑは、第２キャリアを更に備えており、第２乾燥成分が第２キャリアに接着され、第２キャリアが、増殖区画内で、第２接着剤層に接着されている、実施形態Ａ〜Ｌのいずれか１つに記載の装置である。
【０１４４】
実施形態Ｒは、第２キャリアが、その上にコーティングされた第４接着剤層を含み、第２乾燥成分が第４接着剤層に接着されている、実施形態Ｑに記載の装置である。
【０１４５】
実施形態Ｓは、第１の平坦な防水性基材が、開口部付近に第１の取り外し可能なタブを更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１４６】
実施形態Ｔは、第１の取り外し可能なタブが、これに接着された第１閉鎖用接着剤を含む、実施形態Ｓに記載の装置である。
【０１４７】
実施形態Ｕは、第１閉鎖用接着剤に取り外し可能に接着された第１剥離ライナーを更に含む、実施形態Ｔに記載の装置である。
【０１４８】
実施形態Ｖは、カバーシートが、開口部付近に第２の取り外し可能なタブを更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１４９】
実施形態Ｗは、第２の取り外し可能なタブが、これに接着された第２閉鎖用接着剤を含む、実施形態Ｖに記載の装置である。
【０１５０】
実施形態Ｘは、第２閉鎖用接着剤に取り外し可能に接着された第２剥離ライナーを更に含む、実施形態Ｗに記載の装置である。
【０１５１】
実施形態Ｙは、
周縁部と、
離間した第１区分及び第２区分を備える、第１主面と、
第１主面の反対側の第２主面と、
第１区分を、第２区分に対して並置して重ねるように配置するための折り目と、を含む防水性基材を備える本体であって、
第１区分及び第２区分は、増殖区画の内壁を画定し、この増殖区画は、周辺部と、増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを含み、
周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、この部分が、周辺部の５０％超を含む、本体と、
増殖区画内で基部に接着された、冷水可溶性ゲル化剤と、
前記増殖区画内に配置された、乾燥した第１酸素除去試薬と、を備える、装置である。
【０１５２】
実施形態Ｚは、本体が実質的に二次元である、実施形態Ｙに記載の装置である。
【０１５３】
実施形態ＡＡは、増殖区画内に配置された、乾燥した還元剤を更に含む、実施形態Ｙ又は実施形態Ｚに記載の装置である。
【０１５４】
実施形態ＡＢは、乾燥した栄養素を更に含んでおり、栄養素は増殖区画内に配置され、栄養素は嫌気性微生物の増殖を促進し、栄養素は酸素除去試薬ではない、実施形態Ｙ〜ＡＡのいずれか１つに記載の装置である。
【０１５５】
実施形態ＡＣは、栄養素が有機炭素源を含む、実施形態ＡＢに記載の装置である。
【０１５６】
実施形態ＡＤは、有機炭素源が、非発酵性である、実施形態ＡＣに記載の装置である。
【０１５７】
実施形態ＡＥは、増殖区画内に配置された、乾燥した第２酸素除去試薬を更に含む、実施形態Ｙ〜ＡＤのいずれか１つに記載の装置である。
【０１５８】
実施形態ＡＦは、生存可能な微生物の存在を検出するための指示薬を更に含み、指示薬が増殖区画内に配置される、実施形態Ｙ〜ＡＥのいずれか１つに記載の装置である。
【０１５９】
実施形態ＡＧは、第１酸素除去試薬、第２酸素除去試薬、還元試薬、栄養素、指示薬、及び上記成分のうちのいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される第１乾燥成分が、平坦な防水性基部の第１区分に接着されている、実施形態Ｙ〜ＡＦのいずれか１つに記載の装置である。
【０１６０】
実施形態ＡＨは、平坦な防水性基部が、第１区分の少なくとも一部の上に配置された第１接着剤層を含み、第１乾燥成分が、増殖区画内で、第１接着剤層に接着されている、実施形態ＡＧに記載の装置である。
【０１６１】
実施形態ＡＩは、第１キャリアを更に備えており、第１乾燥成分が第１キャリアに接着され、第１キャリアが、増殖区画内で、第１接着剤層に接着されている、実施形態ＡＧに記載の装置である。
【０１６２】
実施形態ＡＪは、第１キャリアが、その上にコーティングされた第２接着剤層を含み、第１乾燥成分が第２接着剤層に接着されている、実施形態ＡＩに記載の装置である。
【０１６３】
実施形態ＡＫは、第１酸素除去試薬、第２酸素除去試薬、還元試薬、栄養素、指示薬、及び上記成分のうちのいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される第２乾燥成分が、平坦な防水性基材の第２区分に接着されている、実施形態Ｙ〜ＡＪのいずれか１つに記載の装置である。
【０１６４】
実施形態ＡＬは、
防水性基材が、第２区分の少なくとも一部の上に配置された第３接着剤層を含み、
第２乾燥成分が、増殖区画内で、第３接着剤層に接着されている、実施形態ＡＫに記載の装置である。
【０１６５】
実施形態ＡＭは、第２キャリアを更に備えており、第２乾燥成分が第２キャリアに接着され、第２キャリアが、増殖区画内で、第２接着剤層に接着されている、実施形態ＡＫに記載の装置である。
【０１６６】
実施形態ＡＮは、第２キャリアが、その上にコーティングされた第４接着剤層を含み、第２乾燥成分が第４接着剤層に接着されている、実施形態ＡＭに記載の装置である。
【０１６７】
実施形態ＡＯは、上記部分が、周辺部の少なくとも８０％を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１６８】
実施形態ＡＰは、上記部分が、周辺部の少なくとも９０％を含む、実施形態ＡＯに記載の装置である。
【０１６９】
実施形態ＡＱは、上記部分が、周辺部の少なくとも９５％を含む、実施形態ＡＰに記載の装置である。
【０１７０】
実施形態ＡＲは、上記部分が、周辺部の１００％を含む、実施形態ＡＱに記載の装置である。
【０１７１】
実施形態ＡＳは、冷水可溶性ゲル化剤が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キサンタンガム、グアーガム、ローカストビーンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１７２】
実施形態ＡＴは、第１酸素除去試薬が水溶性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１７３】
実施形態ＡＵは、第１酸素除去試薬が、硫酸第二鉄アンモニウム、塩化第二鉄、第二鉄塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１７４】
実施形態ＡＶは、第２酸素除去試薬が水溶性である、実施形態Ｉ〜ＡＵのいずれか１つに記載の装置である。
【０１７５】
実施形態ＡＷは、第２酸素除去試薬が、アスコルビン酸及びその塩、並びに、分子状酸素を消費する反応を触媒することができる酵素からなる群から選択される、実施形態ＡＶに記載の装置である。
【０１７６】
実施形態ＡＸは、還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、チオグリコール酸の塩、及び前述のいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１７７】
実施形態ＡＹは、防水性シールが接着剤を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１７８】
実施形態ＡＺは、接着剤が、感圧性接着剤を含む、実施形態ＡＹに記載の装置である。
【０１７９】
実施形態ＢＡは、基部の内面が実質的に平坦である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１８０】
実施形態ＢＢは、カバーシートの内面が実質的に平坦である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の装置である。
【０１８１】
実施形態ＢＣは、
サンプルを、先行する請求項のいずれか一項の装置の増殖区画内に堆積する工程と、
嫌気性微生物の増殖を促進させる条件下で装置をインキュベートする工程と、
増殖区画内の嫌気性微生物のコロニーの指標を検出する工程と、を含む、方法である。
【０１８２】
実施形態ＢＤは、水性液体を増殖区画内に堆積させる工程を更に含む、実施形態ＢＣに記載の方法である。
【０１８３】
実施形態ＢＥは、サンプルが水性液体中に堆積される、実施形態ＢＤに記載の方法である。
【０１８４】
実施形態ＢＦは、水性液体を増殖区画内に堆積する工程が、所定体積の水性液体を堆積する工程を含む、実施形態ＢＤ又はＢＥに記載の方法である。
【０１８５】
実施形態ＢＧは、所定体積を堆積する工程は、約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬを堆積することを含む、実施形態ＢＦに記載の方法である。
【０１８６】
実施形態ＢＨは、方法が開口部を封止する工程を更に含む、実施形態ＢＣ〜ＢＧのいずれか１つに記載の方法である。
【０１８７】
実施形態ＢＩは、装置をインキュベートする工程が、７日間以下の期間にわたって装置をインキュベートする工程を含む、実施形態ＢＣ〜ＢＨのいずれか１つに記載の方法である。
【０１８８】
実施形態ＢＪは、装置をインキュベートする工程が、９６時間以下の期間にわたって装置をインキュベートする工程を含む、実施形態ＢＩに記載の方法である。
【０１８９】
実施形態ＢＫは、装置をインキュベートする工程が、７２時間以下の期間にわたって装置をインキュベートする工程を含む、実施形態ＢＪに記載の方法である。
【０１９０】
実施形態ＢＬは、装置をインキュベートする工程が、４８時間以下の期間にわたって装置をインキュベートする工程を含む、実施形態ＢＪに記載の方法である。
【０１９１】
実施形態ＢＭは、装置をインキュベートする工程が、２４時間以下の期間にわたって装置をインキュベートする工程を含む、実施形態ＢＪに記載の方法である。
【０１９２】
実施形態ＢＮは、サンプルを堆積する前に、増殖区画が、内部に冷水可溶性ゲル化剤、第１酸素除去試薬、第２酸素除去試薬、還元剤、栄養素、指標試薬、及び上記乾燥成分のいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される乾燥成分を含む、実施形態ＢＣ〜ＢＭのいずれか１つに記載の方法である。
【０１９３】
実施形態ＢＯは、
防水性基部と、基部に取り付けられた防水性カバーシートと、それらの間に配置された増殖区画とを含む、本体であって、増殖区画が、周辺部と、前記増殖区画への液体のアクセスを提供する開口部とを有し、
周辺部の一部分が、防水性シールによって画定され、この部分が周辺部の５０％超を含む、本体と、
増殖区画内で基部に接着された、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤と、
増殖区画内に配置された、乾燥した二酸化酸素生成試薬と、を備える、装置である。
【０１９４】
以下の実施例によって本発明の目的及び利点を更に例示するが、これらの実施例において詳述する特定の材料及びその量、並びに他の条件及び細部は、本発明を不当に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９５】
実施例１：装置構成体（単一面のパターンコーティング）
７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）は、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。シリコーンでコーティングされた紙剥離ライナー（Ｄ＃６３  ＢＬ  ＫＦＴ  Ｈ／Ｏ  ５４８４４０／０００；Ｌｏｐｒｅｘ  ＧｍｂＨ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中央から７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）平方を取り除いたものが、接着剤の境界をマスクするために使用された。露出した接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬／還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた（表１）。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれ、その後、剥離ライナーが除去された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、フィルムの粉末コーティングされた部分の７．６２ｃｍ（３インチ）の辺の１つの上の接着剤に接着された。１２５μｍ（５ミル）ＰＥＴフィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）はその後、残っている露出した接着剤へと積層され、剥離ライナーが一方の端部を封止するのを防いでいるパウチが形成された。
【０１９６】
実施例２：装置構成体（両面のパターンコーティング）
７５μｍ（３．０ミル）ミルポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）は、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。中央から７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）平方を取り除いたシリコーンコーティングした紙剥離ライナーが、接着剤の境界をマスクするために使用された。露出した接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬／還元剤（表１）の様々な混合物で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれ、その後、剥離ライナーが除去された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、フィルムの粉末コーティングされた部分の７．６２ｃｍ（３インチ）の辺の１つの上の接着剤に接着された。剥離ライナーが接着された２枚の粉末コーティングしたフィルムが、このような方法で作製され、粉末コーティングされた部分が向かい合って重複し、接着された剥離ライナーも同様に重複するようにして、互いに積層された（図２参照）。
【０１９７】
実施例３：装置構成体（単一面の、粉末コーティングされたキャリア基材）
７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）は、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬／還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた（表１）。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングされたフィルムは、７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）の矩形に切断され、接着剤でコーティングされたＰＥＴの１０．１６ｃｍ×１２．７ｃｍ（４インチ×５インチ）の断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、粉末コーティングされたキャリアフィルムの７．６２ｃｍ（３インチ）の辺の１つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。１２５μｍ（５ミル）ＰＥＴフィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）はその後、残っている露出した接着剤へと積層され、剥離ライナーが一方の端部を封止するのを防いでいるパウチが形成された。
【０１９８】
実施例４：装置構成体（両面の、粉末コーティングされたキャリア基材）
７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）は、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬／還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた（表１）。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングされたフィルムは、７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）の矩形に切断され、接着剤でコーティングされたＰＥＴの１０．１６ｃｍ×１２．７ｃｍ（４インチ×５インチ）の断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、粉末コーティングされたキャリアフィルムの７．６２ｃｍ（３インチ）の辺の１つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。２つの構成体が、このような方法で作製され、粉末コーティングされたキャリアフィルムが向かい合って重複し、接着された剥離ライナーも同様に重複するようにして、互いに積層された（図５参照）。
【０１９９】
実施例５：装置構成体（両面、一方が粉末で、一方がブロスでコーティングされたキャリア）
構成体の１つ目は、７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）を、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングすることによって作製された。接着剤は、冷水可溶性ゲル化剤、及び酸素除去試薬／還元剤の様々な混合物で粉末コーティングされた（表１）。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングされたフィルムは、７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）の矩形に切断され、接着剤でコーティングされたＰＥＴの１０．１６ｃｍ×１２．７ｃｍ（４インチ×５インチ）の断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、粉末コーティングされたキャリアフィルムの７．６２ｃｍ（３インチ）の辺の１つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。
【０２００】
構成体の２つ目は、７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）を、培地配合物（ＢＤ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ／Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ  １０ｇ／Ｌ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、ＢＤ  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  ２ｇ／Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ４ｇ／Ｌ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、６０％乳酸ナトリウム  シロップ  ８ｍｌｓ／Ｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、酢酸ナトリウム  ５ｇ／Ｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、ＮＨ４Ｃｌ  ０．２ｇ／Ｌ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）、Ｍ１５０  Ｇｕａｒ  ８ｇ／Ｌ、ＮａＯＨによりｐＨ〜７．３、高せん断で混合される）で、厚さ３００μｍ（１２．０ミル）でコーティングし、その後溶媒炉（solvent oven）内に１８０℃で、１０分間放置することによって作製された。ブロスコーティングされたＰＥＴの７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）断片が切断されて、接着剤コーティングされたＰＥＴの１０．１６ｃｍ×１２．７ｃｍ（４インチ×５インチ）断片の中央に配置された。シリコーンコーティングされた紙剥離ライナーのストリップは、ブロスコーティングされたキャリアフィルムの７．６２ｃｍ（３インチ）の辺の１つの上の、接着剤コーティングされたフィルムに接着された。
【０２０１】
構成体の１つ目及び２つ目は、粉末コート及びブロスコートを合わせるようにして、接着された剥離ライナーも同様に重複するようにして、積層された（図５参照）。これにより、内部微生物増殖区画を備え、粉末コーティング面とブロスコーティング面とが対向しており、剥離ライナーによって一方の側で開いたままである、パウチ構成体が得られた。
【０２０２】
実施例６：硫酸塩還元細菌ストック培地の増殖及び維持
ＳＲＢ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７７；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７９；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）のストック培地が、改変された乳酸ナトリウム培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  １ｇ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、ＮＨ４Ｃｌ  ０．４ｇ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０１ｇ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、ＮａＣｌ  ５ｇ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、アスコルビン酸ナトリウム０．１ｇ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、乳酸ナトリウム（６０％）４ｍｌｓ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ＮａＯＨによりｐＨ〜７．３）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ブチルゴムストッパー、及びアルミニウムクリンプを使用して、Ｂａｌｃｈ  ｔｕｂｅ内で９７％窒素／３％水素雰囲気において、オートクレーブした直後にチューブに入れられた）が増殖及び維持された。培地は、気体入りの１ｍＬシリンジを使用して、改変された乳酸ナトリウム培地のチューブに、１／１００に希釈することによって、毎週継代させた。培地は３０℃で４８時間インキュベートされ、その後５日にわたり、４℃に維持された。６度目の継代の後、培地は破棄されて、冷凍庫から新たに接種された。
【０２０３】
実施例７：装置の接種
実施例１〜５の装置が以下のように接種された。サンプル（５又は１０ｍｌｓ）は、これらを直接注いで、又は１０ｍＬ無菌ピペットを使用して、装置内に配置された。剥離ライナーが取り除かれて、サンプルを増殖ゾーンの上部へと押して空気を排除するために、装置を２枚の平行なプレキシガラスプレートの間で摺動させた。このとき装置の口部で露出したＰＳＡは、シールを形成するために互いに押し付けられ、装置はインキュベーションするために平らに配置された。インキュベーションは、細菌の増殖を可能にする時間、最大１０日間、３０℃で行われた。コロニーは、細菌硫化水素生成物と、培地中に存在する鉄との組み合わせから沈殿する、不溶性硫化鉄の生成により生じる、小さな黒い斑点として視覚化された。
【０２０４】
実施例８：両面粉末構成体における、アスコルビン酸塩を用いた、硫酸還元菌の増殖
実施例４の装置は、表１の粉末コーティング混合物１〜９を使用して構成された。実施例６の、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７７）、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７９）のストック培地が、表２に記載の好気性培地内で順次希釈された。５ｍｌｓの量の１０−６希釈物が接種され、装置は、実施例７に詳述されるようにインキュベートされた。９６時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検され、結果は表３に報告されている。
【０２０５】
実施例９：両面粉末構成体における、第一鉄を用いた、硫酸還元菌の増殖
実施例４の装置は、表１の粉末コーティング混合物１、及び１０〜１２を使用して構成された。実施例６の、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７９）のストック培地が、表４に記載の好気性培地内で順次希釈された。５ｍｌｓの量の１０−５希釈物が接種され、装置は、実施例７に詳述されるようにインキュベートされた。７２時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検され、結果は表３に報告されている。
【０２０６】
実施例１０：別のキャリアウェブ形状を有する装置構成体
実施例３の装置は、図３に示される別のキャリアウェブ形状で構成された。
【０２０７】
実施例１１：別のキャリアウェブ形状を有する装置構成体
実施例４の装置は、図３に示される別のキャリアウェブ形状で構成された。
【０２０８】
実施例１２：別のキャリアウェブ形状を有する装置構成体
実施例５の装置は、図３に示される別のキャリアウェブ形状で構成された。
【０２０９】
実施例１３：両面粉末／ブロス構成体における、第一鉄を用いた、硫酸還元菌の増殖
実施例５の装置は、表１の粉末コーティング混合物１１を使用して構成された。実施例６の、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７９）のストック培地が、リン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ）内で順次希釈された。５ｍｌｓの量の１０−５、１０−６、及び１０−７希釈物が接種され、装置は、実施例７に詳述されるようにインキュベートされた。１２０時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検され、結果は表３に報告されている。
【０２１０】
実施例１４：異なるゲル強度を用いた硫酸還元細菌の増殖
実施例３の装置は、表１の粉末コーティング混合物２を使用して構成された。実施例６の、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７７）、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７９）のストック培地が、表２の好気性培地内で順次希釈された。２、３、４、５ｍｌｓの量の１０−７希釈物が接種され、装置は、実施例７に詳述されるようにインキュベートされた。７２時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検され、結果は表５に報告されている。
【０２１１】
比較例１：トータルカウント薄フィルム培養装置の構成体
７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）は、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。接着剤は、表１の混合物２で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングしたフィルムは、７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）矩形に切断された。２つの矩形が、粉末付きの面が向かい合うようにして、両面テープを使用して、７．６２ｃｍ（３インチ）の一辺に沿って接合された。
【０２１２】
比較例２：スペーサを備える、薄フィルム培養装置の構成体
７５μｍ（３．０ミル）ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（Ｍｅｌａｎｅｘ  ４５４，Ｔｅｋｒａ，Ｎｅｗ  Ｂｅｒｌｉｎ，ＷＩ）は、米国特許番号第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。接着剤は、表１の混合物２で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれた。粉末コーティングしたフィルムは、７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）矩形に切断された。
【０２１３】
１００μｍ（４ミル）ミルポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（ＬＡＢプレート下部フィルム？）は、米国特許第５，４０９，８３８号の実施例１に記載される、イソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（ＰＳＡ）でコーティングされた。直径６センチメートルの円が取り除かれた、シリコーンコーティングした紙剥離ライナーを使用して、接着剤をマスクした。露出した接着剤は、表１の混合物２で粉末コーティングされた。粉末は均等に適用され、過剰な粉末は、フィルムを手で揺することによって接着剤層から取り除かれ、その後、剥離ライナーが除去された。直径６１ｍｍの円形開口部を備える、フォームスペーサ（ポリスチレンフォーム；７６ｍｍ幅×１０２ｍｍ長さ×０．５７ｍｍ厚さ）が、接着剤によって、第１層の接着剤コーティングされた面に積層された。スペーサを接着させた粉末コーティングしたフィルムは、７．６２ｃｍ×１０．１６ｃｍ（３インチ×４インチ）矩形に切断された。
【０２１４】
上記の２枚のフィルムが、粉末付きの面が向かい合うようにして、両面テープを使用して、７．６２ｃｍ（３インチ）の一辺に沿って接合された。
【０２１５】
比較例３：薄フィルム培養装置におけるＳＲＢの増殖
比較例１の装置が構成され、実施例６のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７７）のストック培地に、アスコルビン酸オキシダーゼ（Ｃａｌｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  ＬｕｉｓＯｂｉｓｐｏ，ＣＡ）が追加され、最終的な濃度が４Ｕ／ｍＬになるように、表２に記載の好気性培地内で順次希釈された。３ｍＬの１０−５、１０−６、及び１０−７希釈物が、上部フィルムを持ち上げ、下部フィルムの中央にサンプルを分配し、上部フィルムを静かに戻すことによって接種された。プレートは周囲温度で、又は９７％のＮ２  ３％のＨ２の気体でパージした嫌気性チャンバ内で、３０℃でインキュベートされた。７２時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検され、結果は表６に報告されている。
【０２１６】
比較例４：薄フィルム培養装置におけるＳＲＢの増殖
比較例２の装置が構成され、実施例６のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７７）のストック培地に、アスコルビン酸オキシダーゼ（Ｃａｌｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）が追加され、最終的な濃度が４Ｕ／ｍＬになるように、表２に記載の好気性培地内で順次希釈された。３ｍｌｓの量の１０−５、１０−６、及び１０−７希釈物が、上部フィルムを持ち上げ、下部フィルムの中央にサンプルを分配し、上部フィルムを静かに戻すことによって接種された。プレートは周囲温度で、又は９７％のＮ２  ３％のＨ２の気体でパージした嫌気性チャンバ内で、３０℃でインキュベートされた。７２時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検され、結果は表６に報告されている。
【０２１７】
実施例１５：構成体、及びパウチ状培養装置の使用
実施例３の装置が構成されたが、ただし、バッキングフィルムは、７５μｍ（３ミル）ＰＥＴの代わりに、４８ｇａ  ＰＥＴ／９８ｇａ  ＷＯＰＰ／０．０００３５インチホイル／２ｍｉｌ  Ｂａｒｅｘ（Ｔｅｃｈｎｉｐａｑ，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｌａｋｅ，ＩＬ）であり、粉末コーティング混合物は以下であった；Ｍ１５０  Ｇｕａｒ  ５ｇ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｄａｎｉｓｃｏ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｆｏｒｔｅｆｉｂｅｒ  ＨＢ  Ｕｌｔｒａ  ８９．３ｇ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０  ３ｇ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）、アスコルビン酸ナトリウム  ０．６０ｇ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、チオグリコール酸ナトリウム：１．５ｇ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣａＳＯ４：０．６０ｇ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）。表１のように、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、及びアスコルビン酸ナトリウムが粉砕された。実施例６の、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７７）、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ＃２９５７９）のストック培地が、以下の好気性培地内で順次希釈された；Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５６ｇ／Ｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１１ｇ／Ｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、ＮＨ４Ｃｌ  １．０ｇ／Ｌ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ３．０ｇ／Ｌ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、６０％Ｎａ  Ｌａｃｔａｔｅ  ４．０ｍＬ／Ｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １．０ｇ／Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １ｇ／Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ：１ｍｇ／Ｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、ＡＴＣＣ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ  １０ｍＬ／Ｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＡＴＣＣ  Ｔｒａｃｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｉｘ  １０ｍＬ／Ｌ。ｐＨは、水酸化ナトリウムにより７．３に調節され、フィルター滅菌された。５ｍｌｓの量の１０−６、及び１０−７希釈物が接種され、装置は、実施例７に詳述されるようにインキュベートされた。９６時間後、装置はＳＲＢの増殖を点検された。この時点において、両方の株菌は、容易に数えられる単一のコロニーで良好に増殖した。
【０２１８】
表１．粉末コーティング配合物。全ての値はグラムで表わされる。Ｃ６Ｈ７ＮａＯ６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及びＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）が結晶の形態で得られ、混合及び粉末コーティングの前に、１００μｍ未満の平均粒径まで粉砕された。ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース；Ｆｏｒｔｅｆｉｂｅｒ  ＨＢ  Ｕｌｔｒａ）は、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）から入手した。
【表１】
2018514214.tif 000003
【０２１９】
表２．ＳＲＢ培地配合。ｐＨは水酸化ナトリウムによって７．３に調節され、フィルター滅菌された。
【表２】
2018514214.tif 000004
【０２２０】
表３．アスコルビン酸又は第一鉄を用いた、装置内におけるＳＲＢの増殖。ＳＲＢの多数の希釈物が所与の装置において接種される場合の、希釈率は括弧内に示されている。
【表３】
2018514214.tif 000005
【０２２１】
表４．ＳＲＢ培地配合。ｐＨは水酸化ナトリウムによって７．３に調節され、フィルター滅菌された。
【表４】
2018514214.tif 000006
【０２２２】
表５．様々なゲル強度を有する、装置内のＳＲＢの増殖。
【表５】
2018514214.tif 000007
【０２２３】
表６．典型的なペトリフィルム構成内におけるＳＲＢの増殖。
【表６】
2018514214.tif 000008
【０２２４】
実施例１６．二酸化炭素富化培養条件における装置の構成体
【０２２５】
実施例１５に記載される装置と同様の装置が構成され得るが、ただし、粉末コーティング混合物は、アスコルビン酸ナトリウムの代わりに０．６ｇの重炭酸ナトリウムを含み得る。培地は、ＳＲＢの代わりに乳酸菌を増殖させるように選択され得る。ゲル化剤をコーティングするために使用される接着剤は、米国特許第４，５６５，７８３号に記載されるように、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）を含み得る。この装置には、ホモ発酵性又はヘテロ発酵性の乳酸菌の希釈懸濁液、又はそれらの混合物を接種することができる。接種済みの装置は、３７℃で約４８時間にわたってインキュベートすることができる。装置は、視認可能な赤いコロニー（ＴＴＣの酸化（osidation）による）に関して観察することができ、一部はグルコースの発酵により気泡を伴っている。
【０２２６】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願及び公報、並びに電子的に入手可能な資料の全開示が参照によって組み込まれる。本出願の開示と参照によって本明細書に組み込まれている文書の開示との間に矛盾が存在する場合には、本出願の開示が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、理解しやすいように示したものにすぎない。それによって不要な限定がなされるものと理解すべきではない。本発明は図示及び記載された細部そのものに限定されず、当業者に明白な変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる。
【０２２７】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであり、明記しない限り、見出しに続く文の意味を限定するために使用されるものではない。
【０２２８】
本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことが可能である。これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。
【図１Ａ】
2018514214.tif 000009
【図１Ｂ】
2018514214.tif 000010
【図２Ａ】
2018514214.tif 000011
【図２Ｂ】
2018514214.tif 000012
【図３】
2018514214.tif 000013
【図４Ａ】
2018514214.tif 000014
【図４Ｂ】
2018514214.tif 000015
【図５Ａ】
2018514214.tif 000016
【図５Ｂ】
2018514214.tif 000017
【図６】
2018514214.tif 000018
【図７】
2018514214.tif 000019
【図８】
2018514214.tif 000020
【図９】
2018514214.tif 000021
【図１０】
2018514214.tif 000022
【図１１Ａ】
2018514214.tif 000023
【図１１Ｂ】
2018514214.tif 000024
【図１１Ｃ】
2018514214.tif 000025
【図１１Ｄ】
2018514214.tif 000026
【図１１Ｅ】
2018514214.tif 000027
【国際調査報告】
2018514214.tif 000028
2018514214.tif 000029
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