(57)【要約】  超高感度アッセイであって、例えば、腫瘍遺伝子材料の血液ベース資源（循環腫瘍細胞または血漿）、または限定量のＤＮＡ、例えば、腫瘍ＤＮＡが利用可能である他の環境からの突然変異の検出のための超高感度アッセイ。本アッセイはエストロゲン受容体において例示されるが、他の遺伝子中の突然変異を標的化するために広くカスタマイズ可能である。
2018518155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）の標的配列中の突然変異を検出する方法であって、
前記ｄｓＤＮＡを含む試料を提供すること；
前記試料を、
第１の半機能的ＮＧＳアダプター配列を含むフォワード遺伝子特異的プライマー、および
場合により１つ以上のロックドヌクレオチドを含むクランピングオリゴヌクレオチドであって、前記フォワードプライマーおよびクランピングオリゴヌクレオチドは、シスであり、前記クランピングオリゴは、１つ以上の突然変異を含むことが疑われる領域中の前記標的遺伝子の野生型配列にハイブリダイズするクランピングオリゴヌクレオチド
と接触させること；
第１の一本鎖プライマー伸長ＰＣＲラウンドを実施して第１のアンプリコンの集団を産生すること；
場合により、前記第１のアンプリコンの集団を精製すること；
前記第１のアンプリコンの集団を、
前記第１の半機能的ＮＧＳアダプター配列の一部に相補的な第１のユニバーサルプライマーであって、前記プライマーによる増幅は、第１の完全機能的ＮＧＳアダプター配列を作出する第１のユニバーサルプライマー、
第２の半機能的ＮＧＳアダプター配列を含むリバース遺伝子特異的プライマーであって、前記リバースプライマーは、前記第１のＮＧＳアダプター配列の一部に相補的な前記プライマーについてトランスであるリバース遺伝子特異的プライマーおよび；
前記リバースプライマー上の前記第２の半機能的ＮＧＳアダプター配列に相補的な第２のユニバーサルプライマーであって、前記第２のユニバーサルプライマーによる増幅は、第２の完全機能的ＮＧＳアダプター配列を作出する第２のユニバーサルプライマー
と接触させること；
第２のＰＣＲラウンド（「ＰＣＲ２」）を実施して第１および第２の完全機能的ＮＧＳアダプター配列の両方を含む第２のアンプリコンの集団の増幅を完了させること；
前記第２のアンプリコンの集団をシーケンシングすること；ならびに
前記第２のアンプリコンの集団の配列を、参照野生型標的配列と比較すること；
を含み、それにより前記標的配列中の突然変異を検出する方法。
【請求項２】
前記ｄｓＤＮＡが、ゲノムＤＮＡであるか、またはゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｄｓＤＮＡが、好ましくは、血漿または尿中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、またはエキソソームからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のアンプリコンの集団を精製することが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズベースクリーンアップを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的配列が、エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）中、好ましくは、リガンド結合ドメイン中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的配列が、ＥＳＲ１野生型配列ＴＧＣＣＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＳＲ１中の突然変異を有する対象を、内分泌療法に対して耐性であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＳＲ１中の突然変異を有する対象を、内分泌療法による治療に応答する可能性が低いと同定することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
内分泌療法を含まない治療法を選択し、場合により、ＥＳＲ１中の突然変異を有すると同定された対象に施与することをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的配列が、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸３−キナーゼ触媒サブユニットアルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）中、場合により、エキソン９および／または２０中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的配列が、ＰＩＫ３ＣＡエキソン９野生型配列：ＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡ（配列番号８）またはＰＩＫ３ＣＡエキソン２０野生型配列：ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡ（配列番号９）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび／またはラパチニブによる治療に対して非応答性であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび／またはラパチニブによる治療に応答する可能性が低いと同定することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
トラスツズマブおよび／またはラパチニブを含まない治療法を選択し、および場合により、ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を有すると同定された対象に施与することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１５年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１４７，８５１号明細書、および２０１５年１０月２９日に出願された同第６２／２４８，１５４号明細書の利益を主張する。上記の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究または開発
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金第ＣＡ１２９９３３号のもと政府支援により作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
超高感度ＰＣＲベースアッセイであって、例えば、腫瘍遺伝子材料の血液ベース資源（循環腫瘍細胞または血漿）、または限定量のＤＮＡ、例えば、腫瘍ＤＮＡが利用可能である他の環境からの突然変異の検出のための超高感度ＰＣＲベースアッセイが記載される。
【背景技術】
【０００４】
非組織ベース資源からの腫瘍由来遺伝子材料の分析は、癌の管理を大幅に変化させつつある。血漿および尿中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、およびエキソソームを含むがこれらに限定されない、腫瘍由来ＤＮＡの多数の資源が存在する。しかしながら、これらの資源の全てからの腫瘍特異的突然変異の検出は、正常細胞ＤＮＡのバックグラウンドにおけるそれらの例外的な希少性により、複雑化する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
腫瘍ＤＮＡの非侵襲的資源からの突然変異検出の従来の方法は、不十分な感度およびコストにより限定される。本明細書において、それらの欠点に対処するためのＥｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑとして公知の新たなアプローチが記載される。本方法は、ロックド核酸クランプを、広範なインプットＤＮＡに適合し得るライブラリー調製のための新規技術との組合せで使用して突然変異体エンリッチメントを得る。次いで、高度にストリンジェントな多面的生物情報学的アプローチを適用して突然変異コールの最適な特異度を確保する。
【０００６】
したがって、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）の標的配列中の突然変異を検出する方法が提供される。本方法は、ｄｓＤＮＡを含む試料を提供すること；試料を、
第１の半機能的ＮＧＳアダプター配列を含むフォワード遺伝子特異的プライマー、および
場合により１つ以上のロックドヌクレオチドを含むクランピングオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーおよびクランピングオリゴヌクレオチドは、シスであり、クランピングオリゴは、１つ以上の突然変異を含むことが疑われる領域中の標的遺伝子の野生型配列にハイブリダイズするクランピングオリゴヌクレオチド
と接触させること；
第１の一本鎖プライマー伸長ＰＣＲラウンドを実施して第１のアンプリコンの集団を産生すること；
場合により、第１のアンプリコンの集団を精製すること；
第１のアンプリコンの集団を、
第１の半機能的ＮＧＳアダプター配列の一部に相補的な第１のユニバーサルプライマーであって、このプライマーによる増幅は、第１の完全機能的ＮＧＳアダプター配列を作出する第１のユニバーサルプライマー、
第２の半機能的ＮＧＳアダプター配列を含むリバース遺伝子特異的プライマーであって、リバースプライマーは、第１のＮＧＳアダプター配列の一部に相補的なプライマーについてトランスであるリバース遺伝子特異的プライマーおよび；
リバースプライマー上の第２の半機能的ＮＧＳアダプター配列に相補的な第２のユニバーサルプライマーであって、第２のユニバーサルプライマーによる増幅は、第２の完全機能的ＮＧＳアダプター配列を作出する第２のユニバーサルプライマー
と接触させること；
第２のＰＣＲラウンド（「ＰＣＲ２」）を実施して第１および第２の完全機能的ＮＧＳアダプター配列の両方を含む第２のアンプリコンの集団の増幅を完了させること；
第２のアンプリコンの集団をシーケンシングすること；ならびに
第２のアンプリコンの集団の配列を、参照野生型標的配列と比較すること；
を含み、それにより標的配列中の突然変異（野生型配列からの差異）を検出する。
【０００７】
一部の実施形態において、ｄｓＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであるか、またはそれを含む。一部の実施形態において、ｄｓＤＮＡは、例えば、血漿または尿中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、またはエキソソームからのものである。
【０００８】
一部の実施形態において、第１のアンプリコンの集団を精製することは、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズベースクリーンアップを使用することを含む。
【０００９】
一部の実施形態において、標的配列は、エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）中、例えば、リガンド結合ドメイン中、例えば、ＥＳＲ１野生型配列ＴＧＣＣＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１）に存在する。ＥＳＲ１中の突然変異としては、例えば、Ｖ５３４Ｅ（１６０１Ｔ＞Ａ）、Ｐ５３５Ｈ（１６０４Ｃ＞Ａ）、Ｌ５３６Ｒ／Ｐ／Ｑ（１６０７Ｔ＞Ｇ／１６０７Ｔ＞Ｃ／１６０７ＴＣ＞ＡＧ）、Ｙ５３７Ｎ／Ｃ／Ｓ（１６０９Ｔ＞Ａ／１６１０Ａ＞Ｇ／１６１０Ａ＞Ｃ）、またはＤ５３８Ｇ（１６１３Ａ＞Ｇ）を挙げることができる。一部の実施形態において、本方法は、ＥＳＲ１中の突然変異を有する対象を、内分泌療法に耐性であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＥＳＲ１中の突然変異を有する対象を、内分泌療法による治療に応答する可能性が低いと同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、内分泌療法を含まない治療法を選択し、場合により、ＥＳＲ１中の突然変異を有すると同定された対象に施与することを含み；治療オプションは、化学療法または内分泌療法と分子標的療法、例えば、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）またはパルボシクリブ（Ｉｂｒａｎｃｅ）により対象を治療することを含み得る。本方法は、内分泌療法、例として、治験薬、例えば、次世代エストロゲン受容体分解剤、内分泌療法とヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、またはアンドロゲン受容体遮断剤を使用する組合せ療法による治療に対する応答を予測することも含み得る。
【００１０】
一部の実施形態において、標的配列は、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸３−キナーゼ触媒サブユニットアルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）中、例えば、エキソン９および／または２０中に存在し、例えば、ＰＩＫ３ＣＡエキソン９野生型配列：ＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡ（配列番号８）またはＰＩＫ３ＣＡエキソン２０野生型配列：ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡ（配列番号９）を含む。ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異としては、例えば、Ｅ５４２Ｋ（ｃ．１６２４Ｇ→Ａ）、Ｅ５４５Ｋ／Ｑ／Ｇ／Ｖ（ｃ．１６３３Ｇ→Ａ／１６３３Ｇ＞Ｃ／１６３４Ａ＞Ｇ／１６３４Ａ＞Ｔを挙げることができる。一部の実施形態において、本方法は、ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび／またはラパチニブによる治療に対して非応答性であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を有する対象を、トラスツズマブおよび／またはラパチニブによる治療に応答する可能性が低いと同定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、トラスツズマブおよび／またはラパチニブを含まない治療法を選択し、場合により、ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を有すると同定された対象に施与することを含む。本方法は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路阻害剤による試験的治療法に対する応答を予測することも含み得る。
【００１１】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明における使用のための方法および材料が本明細書に記載され；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、説明のためにすぎず、限定するものではない。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、全体として参照により組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、優先する。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ロックド核酸クランプ配列。カノニカルエストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）リガンド結合ドメイン突然変異に及ぶように設計された例示的なロックド核酸クランプ（配列番号１の一次配列を有する）。（部分的に、Ｓｅｇａｌ  ａｎｄ  Ｄｏｗｓｅｔｔ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ａｐｒｉｌ  １，２０１４  ２０：１７２４−１７２６の図１からの出典）。この図面において、ロックドヌクレオチドは、それらに＋記号が続く。
【図２】例示的なＥｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑ次世代シーケンシングライブラリー調製模式図。ＰＣＲ１において、クランピングＬＮＡ配列についてシスの遺伝子特異的プライマーを、一本鎖プライマー伸長に使用する。遺伝子特異的プライマーは、半機能的ＮＧＳアダプターペイロードも含有する。ＰＣＲ１産物の固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズベースクリーンアップ後、アダプターペイロードの一部に相補的な第１のユニバーサルプライマーおよび別の半機能的ＮＧＳアダプターペイロードを含有する逆鎖上のペアをなす遺伝子特異的リバースプライマーを使用して第２のＰＣＲラウンドを完了させる。リバースプライマー上のアダプターペイロードに相補的な第２のユニバーサルプライマーを使用して完全にインデックス化したアンプリコンの増幅を完了させる。
【図３】ランダム位相オリゴマー。位相３ヌクレオチドランダムオリゴマーを有する遺伝子特異的増幅プライマー（配列番号８３）。
【図４】ＮＧＳライブラリー調製ＰＣＲ条件。ＰＣＲ１は、３０秒間の８０℃における導入ＬＮＡクランプアニーリングステップによる２５回のプライマー伸長サイクルを含む。これに、インキュベーションを延長した０．４×ＳＰＲＩクリーンアップが続く。ＰＣＲ２は、３０サイクルで実施し、それに０．６×標準的ＳＰＲＩクリーンアップが続く。ペアドエンドシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォーム上で行う。
【図５】ＥＳＲ１  Ｅｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑゲノタイピング。実施例は、１５，０００個の正常白血球のバックグラウンド中のヘテロ接合性ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｓ（Ａ＞Ｃ置換）突然変異を保有する３つの細胞をそれぞれ表す１０個のレプリケート試料の試験セットに対するＥＳＲ１  Ｅｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑゲノタイピングから累積する。突然変異は、レプリケートの４つにおいて検出される。これは、１×１０−４のアレル率における４０％の感度を実証する。
【図６】ＣＴＣ  ＥＳＲ１ゲノタイピング。ＥＳＲ１  Ｅｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑは、＞２つの事前の内分泌療法過程に曝露された転移性乳癌を有する２５人の女性の初期コホートにおいて操作した。ＥＳＲ１突然変異は、８／２５人（３２％）の患者において検出された。複数の時点においてＣＴＣ  ＥＳＲ１ゲノタイピングが完了した１０人の患者（太字）において、ゲノタイプは、８／１０人において一致した。２人の患者において、２つの同期するＥＳＲ１突然変異が検出された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
近年、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）中の突然変異が、抗エストロゲン療法により治療された患者からの乳癌試料中に見出されている。前臨床試験において、それらの突然変異は、アロマターゼ阻害剤ならびに選択的エストロゲン受容体モジュレーターおよびエストロゲン受容体アンタゴニストに対する相対的耐性を付与することが観察された。これは、内分泌療法に対する獲得耐性のバイオマーカーとしてのそれらの突然変異における臨床的関心の増加をもたらした。
【００１５】
血液ベースサンプリングを介してエストロゲン受容体突然変異の存在を非侵襲的に検出する技能は、獲得耐性の出現についての連続的なモニタリングを可能とし、悪性腫瘍負荷全体の包括的サンプリングを提供する。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および血漿循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、患者から非侵襲的に得ることができるが、両方とも、正常細胞に由来する遺伝子材料の大きいバックグラウンドにより複雑化する腫瘍由来遺伝子材料を提供する。
【００１６】
本明細書において、ＣＴＣおよびｃｔＤＮＡ中の両方の突然変異、例えば、エストロゲン受容体突然変異を検出する超高感度の方法が記載される。本技術は、単一アッセイにおいて複数のＥＳＲｌリガンド結合突然変異を検出するように設計されたユニークロックド核酸配列による突然変異体エンリッチメントを利用する。これにより、大きい野生型バックグラウンドからの希少突然変異アレルを解析することができる。突然変異体エンリッチメントは、アッセイ感度を改善する一方、検出された突然変異の直接的な配列確認も可能として市販のアレル特異的アッセイまたは他の突然変異体エンリッチメントベース技術において見られるよりも高いアッセイ特異度を確保する革新的な次世代シーケンシングライブラリー調製法と組み合わせる。プロトコルの固有のフレキシビリティーは、代替遺伝子中の突然変異へのアッセイの直接的な適合も可能とする。
【００１７】
本技術は、患者、例えば、抗エストロゲン療法により治療されている患者における突然変異、例えば、エストロゲン受容体突然変異のリアルタイム非侵襲的検出を可能とし、治療耐性の出現を予測し、それにより将来的な治療法の選択をガイドし得る。さらに、ＥＳＲＩ突然変異の存在は、治療、例えば、内分泌療法による治療、例として、次世代エストロゲン受容体分解剤に対する応答を予測するための臨床的バイオマーカーとしての評価を保証し得る。
【００１８】
半機能的遺伝子特異的プライマー
本明細書に記載の方法は、半機能的遺伝子特異的プライマーおよび半機能的シーケンシングプライマーを使用して２つのＰＣＲラウンドを実施する２ステップＰＣＲの使用を含む。遺伝子特異的プライマーは、本明細書において「フォワード」および「リバース」と称され、それらは、それらが逆鎖に結合する事実を示すが、「フォワード」プライマーは、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかに結合し得る（「リバース」は、その逆鎖に結合する）。遺伝子特異的プライマーは、少なくとも１つの突然変異を含むことが既知であり、またはそれが疑われる特異的領域を増幅するように設計される。フォワードプライマーは、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシーケンシングプラットフォームによる使用のためのＮＧＳプライマーを付着させるために使用することができる半機能的次世代シーケンシング（ＮＧＳ）アダプター「ペイロード」配列を含む。上記のとおりフォワードプライマーについてトランスであるリバースプライマーも、半機能的ＮＧＳアダプター「ペイロード」配列を含有する。半機能的遺伝子特異的プライマーは、任意の遺伝子標的のために、および任意のＮＧＳプラットフォーム、例えば、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラットフォームに適合するように設計することができる。ＥＳＲ１またはホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸３−キナーゼ触媒サブユニットアルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）中の突然変異の増幅において使用される半機能的遺伝子特異的プライマーとしては、本明細書に記載のものを挙げることができる。
【００１９】
ユニバーサル半機能的シーケンシングプライマーは、二等分の配列を含む可変配列を有し、一方の半等分は、半機能的ＧＳＰ上の「ペイロード」配列に相補的な所与の遺伝子に使用されるプライマーの全てにわたり一致し、他方の半等分は、ＮＧＳアダプター配列を含む。数百個のこれらの後者の配列、例えば、単一反応における複数の試料のインデックス化を可能とするＩｌｌｕｍｉｎａにより公開されたＭｉＳｅｑ配列が存在する。
【００２０】
クランプオリゴヌクレオチド
クランピングオリゴは、任意の遺伝子中のホットスポット突然変異のために作製することができるが、示差的なハイブリダイゼーションおよび得られる相対的突然変異体エンリッチメントは、遺伝学的状況に基づき異なり得る。クランプの長さおよびアニーリング温度は、野生型および突然変異体アレルへのハイブリダイゼーション間の最大ミスマッチ区別を可能とするように、当技術分野において公知の方法（例えば、Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．８  ｅ６０参照）を使用して最適化すべきである。
【００２１】
一部の実施形態において、クランプオリゴは、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子、例えば、例として、［アルファ］−Ｌ−ＬＮＡを含む。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素および４’−炭素間のメチレン架橋により「ロック」されているリボ核酸アナログ、すなわち、少なくとも１つのＬＮＡモノマー、すなわち、１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチドを含有する阻害核酸を含む。ＬＮＡ塩基は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するが、ロックド構成は、塩基対形成反応の率および安定性を増加させる（Ｊｅｐｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，１３０−１４６（２００４））。これらの特性により、ＬＮＡが本明細書に記載の方法に特に有用となる。
【００２２】
ＬＮＡクランプオリゴは、それぞれの鎖中に１０〜３０、例えば、１２〜２４、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含む分子を含み得、鎖の一方は、標的遺伝子中の領域と（例えば、野生型配列と）同一である。ＬＮＡクランプオリゴは、当技術分野において公知の方法を使用して化学合成することができる。
【００２３】
ＬＮＡクランプオリゴは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して設計することができ；多数のアルゴリズムが公知であり、市販されている（例えば、インターネット上、例えば、ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ）。例えば、Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３４：ｅ６０（２００６）；ＭｃＴｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：５３８８−４０５（２００４）；およびＬｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３４：ｅ１４２（２００６）参照。例えば、「遺伝子歩行」法は、アンチセンスオリゴを設計するために使用されるものと同様に、ＬＮＡクランプオリゴの配列を最適化するために使用することができ；例えば、標的配列の長さに及ぶ１０〜３０ヌクレオチドの一連の阻害核酸を調製することができ、次いで活性について試験する。場合により、例えば、５〜１０ヌクレオチド以上のギャップをＬＮＡクランプオリゴ間に残して合成および試験される阻害核酸の数を低減させることができる。ＧＣ含有率は、好ましくは、約３０〜６０％である。ＬＮＡクランプオリゴを設計するための一般的指針は当技術分野において公知であり；例えば、ＬＮＡ配列は、他のＬＮＡ配列に極めてタイトに結合するため、それは、ＬＮＡ内の顕著な相補性を回避することが好ましい。５つ以上のＬＮＡ残基の連続ランは、可能であれば回避すべきである（例えば、極めて短い（例えば、約９〜１０ｎｔ）阻害核酸については可能でないことがある）。一部の実施形態において、ＬＮＡは、キシロ−ＬＮＡである（例えば、Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．８  ｅ６０参照）。
【００２４】
ＬＮＡに関する追加の情報については、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，７３４，２９１号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０６０，８０９号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；および同第７，５７２，５８２号明細書；ならびに米国特許出願公開第２０１００２６７０１８号明細書；同第２０１００２６１１７５号明細書；および同第２０１０００３５９６８号明細書；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４，３６０７−３６３０（１９９８）；Ｏｂｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，５４０１−５４０４（１９９８）；Ｊｅｐｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４：１３０−１４６（２００４）；Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  ２（３）：２８７−２９０（２００５）；Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．８  ｅ６０；Ｐｏｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３６（４）：６２９−６４１（２００９）、ならびにそれらに引用される参照文献を参照。
【００２５】
２ステップクランプＰＣＲ
図２に示されるとおり、第１のＰＣＲラウンド（「ＰＣＲ１」）において、クランピングＬＮＡ配列についてシスであるフォワード遺伝子特異的プライマー（クランピングＬＮＡ配列と同一の鎖にハイブリダイズする）を、一本鎖プライマー伸長に使用する。遺伝子特異的プライマーは、半機能的ＮＧＳアダプターペイロードも含有する。例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズベースクリーンアップを使用するＰＣＲ１産物の精製後、アダプターペイロードの一部に相補的な第１のユニバーサルプライマーおよび別の半機能的ＮＧＳアダプターペイロードを含有する逆鎖上のペアをなす遺伝子特異的リバースプライマーを使用して第２のＰＣＲラウンド（「ＰＣＲ２」）を完了させる。リバースプライマー上のアダプターペイロードに相補的な第２のユニバーサルプライマーを使用して完全にインデックス化したアンプリコンの増幅を完了させる。第２のユニバーサルプライマーの使用は、同一の単一遺伝子特異的プライマーを用いる多くの異なるＮＳ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）アダプター配列の使用を可能とする。あるいは、リバースプライマーは、完全機能的ＮＧＳプライマーを含み得；これは、異なるアダプター配列を有する多数の完全機能的リバース配列の合成を要求する。これは、よりコストを要し、任意の所与の時間においてランすることができる試料の数を限定し得る。
【００２６】
シーケンシング
本明細書において使用される「シーケンシング」は、核酸の配列を決定する任意の方法を含む。シーケンシングの任意の方法、例として、鎖ターミネーター（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングおよびダイターミネーターシーケンシングを、本方法において使用することができる。好ましい実施形態において、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、数千または数百万回のシーケンシング反応を並行して実施するハイスループットシーケンシング技術を使用する。異なるＮＧＳプラットフォームは変動するアッセイ化学反応を使用するが、それらは全て、大量のテンプレート上の大量のシーケンシング反応ランからの配列データを同時に生成する。典型的には、配列データは、スキャナーを使用して回収し、次いで生物情報学的にアセンブルおよび分析する。したがって、シーケンシング反応は、並行して実施、リード、アセンブル、および分析する：例えば、米国特許出願公開第２０１４０１６２８９７号明細書、ならびにＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；およびＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６（２００９）参照。ＮＧＳ法は、テンプレート増幅を要求するものあり、要求しないものもある。増幅を要求する方法としては、パイロシーケンシング（例えば、米国特許第６，２１０，８９号明細書および同第６，２５８，５６８号明細書参照；Ｒｏｃｈｅにより市販）；Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（例えば、米国特許第６，８３３，２４６号明細書、同第７，１１５，４００号明細書、および同第６，９６９，４８８号明細書参照）；およびＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；例えば、米国特許第５，９１２，１４８号明細書および同第６，１３０，０７３号明細書参照）が挙げられる。増幅を要求しない方法、例えば、単一分子シーケンシング法としては、ナノポアシーケンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（米国特許第７，１６９，５６０号明細書；同第７，２８２，３３７号明細書；同第７，４８２，１２０号明細書；同第７，５０１，２４５号明細書；同第６，８１８，３９５号明細書；同第６，９１１，３４５号明細書；および同第７，５０１，２４５号明細書）；合成によるリアルタイムシーケンシング（例えば、米国特許第７，３２９，４９２号明細書参照）；ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を使用する単分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシング法；ならびに他の方法、例として、米国特許第７，１７０，０５０号明細書；同第７，３０２，１４６号明細書；同第７，３１３，３０８号明細書；および同第７，４７６，５０３号明細書に記載のもの）が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２０１３０２７４１４７号明細書；米国特許出願公開第２０１４００３８８３１号明細書；Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（１）：３１−４６（２０１０）を参照。
【００２７】
あるいは、ハイブリダイゼーションベース配列法または他のハイスループット法、例えば、マイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、または他のシーケンシングプラットフォームを使用することもできる。
【００２８】
Ｅｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑを使用するＥＳＲ１およびＰＩＫ３ＣＡ突然変異分析
乳癌の約７０％が、エストロゲン受容体α（ＥＲ）陽性であり、内分泌療法により治療される。ＥＳＲ１のＬＢＤ中の突然変異は、内分泌療法に対する耐性の発生に関連することが示されている。例えば、Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ；１２（１０）：５７３−８３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１３  Ｓｅｐ  ２６；４（６）：１０．１０１６参照。ＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異は、トラスツズマブおよび／またはラパチニブに対する非応答性に関連している（例えば、Ｍａｊｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１５；３３（１２）：１３３４−１３３９参照。本方法は、癌、例えば、乳癌を有するか、または有すると疑われると診断された対象（例えば、ヒト対象）からの、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、またはエキソソームからの二本鎖ＤＮＡ中の、例えば、乳癌関連突然変異を検出するために使用することができる。例えば、本方法は、乳癌を有するか、または有すると疑われる対象におけるＥＳＲ１のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、またはＰＩＫ３ＣＡのエキソン９もしくは２０中の突然変異を検出するために使用することができる。
【００２９】
ＰＩＫ３ＣＡエキソン９野生型配列：ＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡ（配列番号８）；ＰＩＫ３ＣＡエキソン２０野生型配列：ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡ（配列番号９）；またはＥＳＲ１野生型配列ＴＧＣＣＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１）中の突然変異を検出するための、これらの方法において有用な例示的な遺伝子特異的プライマーおよびＬＮＡクランプが、本明細書において示される。本方法は、対象からのＣＴＣまたはｃｔＤＮＡを含む試料を得ること、および本明細書に記載の２ステップクランプＰＣＲ法を使用して突然変異を検出することを含み得る。好ましくは、本方法は、ＥＳＲ１および／またはＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異を検出することを含み、単一非分割反応において、すなわち、単一チューブ中で実施する。
【００３０】
ＥＳＲ１中の１つ以上の突然変異（例えば、Ｖ５３４Ｅ（１６０１Ｔ＞Ａ）、Ｐ５３５Ｈ（１６０４Ｃ＞Ａ）、Ｌ５３６Ｒ／Ｐ／Ｑ（１６０７Ｔ＞Ｇ／１６０７Ｔ＞Ｃ／１６０７ＴＣ＞ＡＧ）、Ｙ５３７Ｎ／Ｃ／Ｓ（１６０９Ｔ＞Ａ／１６１０Ａ＞Ｇ／１６１０Ａ＞Ｃ）、またはＤ５３８Ｇ（１６１３Ａ＞Ｇ））の検出時、本方法は、対象を、内分泌療法に対して耐性であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含み得る。内分泌療法としては、エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェンおよびラロキシフェン；ＬＨ遮断剤、例えば、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ）；アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）、またはレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ））；ＧｎＲＨアゴニスト；およびＥＲ分解剤（例えば、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ））が挙げられ、例えば、Ｌｕｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１１；１８（４）：５１３−２２；Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４；３２（２１）：２２５５−２２６９参照。ＥＳＲ１突然変異の検出により内分泌耐性が同定されたら、治療オプションは、化学療法または内分泌療法と、分子標的療法、例えば、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）またはパルボシクリブ（Ｉｂｒａｎｃｅ）により対象を治療することを含み得る。本方法は、内分泌療法、例として、治験薬、例えば、次世代エストロゲン受容体分解剤、内分泌療法とヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋ経路阻害剤、またはアンドロゲン受容体遮断剤を使用する組合せ療法による治療に対する応答を予測することも含み得る。
【００３１】
ＰＩＫ３ＣＡ中の１つ以上の突然変異（例えば、エキソン９中のＥ５４２Ｋ（ｃ．１６２４Ｇ→Ａ）、Ｅ５４５Ｋ／Ｑ／Ｇ／Ｖ（ｃ．１６３３Ｇ→Ａ／１６３３Ｇ＞Ｃ／１６３４Ａ＞Ｇ／１６３４Ａ＞Ｔ）および／またはＨ１０４７Ｒ（ｃ．３１４０Ａ→Ｇ）、Ｈ１０４７Ｌ（ｃ．３１４０Ａ→Ｔ））の検出時、本方法は、対象を、トラスツズマブおよび／またはラパチニブに応答しないエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌を有するか、またはその発症リスクがあると同定することを含み得る。本方法は、トラスツズマブおよび／またはラパチニブを含まない治療法により対象を治療することを含み得る。本方法は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路阻害剤による試験的治療法に対する応答を予測することも含み得る。
【実施例】
【００３２】
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
【００３３】
方法
以下の方法を以下に記載の実施例において使用した。
【００３４】
Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  ＫｉｔまたはＱｉａｇｅｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔを、それぞれ製造業者のプロトコルに従って使用して循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ＤＮＡテンプレートを新たな半機能的遺伝子特異的プライマーと組み合わせ、遺伝子特異的ＬＮＡクランプおよびＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をマッチングさせ、突然変異体エンリッチメントのための重要なステップを表す２５回のプライマー伸長ラウンドを実施することにより、半機能的シーケンシングライブラリーを調製した。
【００３５】
次に、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って用いて、２０分間のインキュベーションに改変し、３１．５ｕＬのヌクレアーゼフリー水により溶出させ、０．４×固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズベースクリーンアップを実施した。次いで、相補的半機能的遺伝子特異的プライマー、シーケンシングアダプター、およびＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＰＣＲ増幅の追加の３０サイクルを実施することにより、ライブラリーをシーケンシングのために完全にコンピテントにした。次に、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って用いて０．６×ＳＰＲＩビーズクリーンアップを実施した。ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、得られた完全機能化ライブラリーを定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａペアドエンドシーケンシング法を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのために処理した。未加工ＦＡＳＴＡシーケンシングデータを脱多重化して試料データを分離した。個々の試料データを処理してペアドエンドコンセンサスリードを生成した。ＦＬＡＳＨオープンソースツールを使用するペアドエンドリードの完全なマッチングが要求された。次いで、ＢＷＡ−ＭＥＭオープンソースツールを使用してペアドコンセンサスリードをヒト参照ゲノムに対してアラインした。得られたアラインメントを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）においてレビューし、および／またはＳＡＭｔｏｏｌｓおよびＶａｒＳｃａｎツールを使用して分散を求めた。
【００３６】
半機能的遺伝子特異的プライマー
本実施例における半機能的遺伝子特異的プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上でのシーケンシングに適合するように設計した。以下の融合プライマーを使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列をイタリックで示し、「ヒンジ」相配列（それがＩｌｌｕｍｉｎａアダプターペイロードおよびプライマーの遺伝子特異的部分間に存在するため、そう呼ばれる）を太字のＮとして示し、プライマーの遺伝子特異的部分を普通文字で示す。
【００３７】
【表１】
2018518155.tif 000003
【００３８】
ＬＮＡクランププライマー
本実施例において、以下のＬＮＡを使用した：
【００３９】
【表２】
2018518155.tif 000004
【００４０】
【表３】
2018518155.tif 000005
【００４１】
【表４】
2018518155.tif 000006
【００４２】
【表５】
2018518155.tif 000007
【００４３】
実施例１
Ｅｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑを使用するＥＳＲ１およびＰＩＫ３ＣＡ突然変異分析
本実施例は、ロックド核酸クランプを、広範なインプットＤＮＡに適合し得るライブラリー調製のための新規技術との組合せで使用する突然変異体エンリッチメントを得るＥｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑとして本明細書に記載のアプローチの開発および例示的実行を記載する。次いで、高度にストリンジェントな多面的生物情報学的アプローチを適用して突然変異コールの最適な特異度を確保する。
【００４４】
この技術の開発のため、本発明者らは最初に、エストロゲン受容体アルファ遺伝子ＥＳＲ１中の反復突然変異が近年検出され、内分泌療法に対する耐性を付与すると考えられるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌にフォーカスした（１〜５）。内分泌療法を受けている転移性乳癌を有する女性の非侵襲的モニタリングを介するＥＳＲ１突然変異の同定は、治療耐性の早期同定を可能とし得、タイムリーな治療法の変更を可能とする。ＥＳＲ１中の突然変異は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）中でクラスター化すると考えられるため、本発明者らは、ＥＳＲ１  ＬＢＤ中のほとんどの突然変異部位に及ぶ野生型ＥＳＲ１配列に強固にハイブリダイズするロックド核酸（ＬＮＡ）含有オリゴヌクレオチドを設計した（図１）。このＬＮＡクランプは、完全にマッチした野生型ＥＳＲ１配列およびミスマッチ突然変異配列への示差的なハイブリダイゼーションを利用して突然変異アレルの区別およびしたがって突然変異体ＤＮＡテンプレートのエンリッチ増幅を可能とする。本発明者らは、野生型および９つの異なるＥＳＲ１突然変異体アレルへのハイブリダイゼーション間の最大ミスマッチ区別を許容するようにこのＥＳＲ１クランプのアニーリング温度を最適化し、高度に効率的な多重化アッセイ設計フレームワークを作製した。
【００４５】
ＥＳＲ１  ＬＮＡ設計の最適化後、本発明者らは、ＬＮＡベースエンリッチメント化学反応を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリー調製法と組み合わせてアッセイの特異度および感度をさらに改善することを進めた。アッセイを超低感度に最適化するため、本発明者らは、突然変異体テンプレート希釈系列または統計的方法の技術的不確実性を回避して感度を推定し、試験の間にバリアントアレル率を確実に確認することができる方法を用いた。本発明者らは、ユニーク実験用資源、ＥＳＲ１  ＬＢＤ突然変異、Ｙ５３７Ｓを保有するＣＴＣ由来細胞系を利用した（５）。マイクロマニピュレーションを使用してこの細胞系からの個々の細胞を単離し、続いて正常白血球のバックグラウンド中に配置して技術的最適化のための目的アレル率を確実に反映させた。例えば、単一突然変異ＥＳＲ１  Ｙ５３７Ｓアレル（ヘテロ接合性）を有するこの細胞系からの単一細胞は、１５，０００個の白血球のバックグラウンド中に配置されると、０．０１％の突然変異体アレル率を反映する。
【００４６】
ＮＧＳライブラリー調製への本発明者らのアプローチの適合の第１の構成要素は、ＬＮＡクランプ配列をフランキングするＥＳＲ１増幅プライマーの設計であった。改良型Ｐｒｉｍｅｒ３アルゴリズムを使用して最適なプライマーを選択した。多ステップＰＣＲアプローチの一部としての半機能的シーケンシングアダプターペイロードを有する遺伝子特異的プライマーを設計した（図２）。本発明者らのアレル特異的増幅プールの低い複雑性を考慮して、最初に、遺伝子特異的プライマーを位相３ヌクレオチドランダムオリゴマー（図３）について試験した。ＬＮＡクランプを用いるエンリッチメントの状況において、これは、非特異的増幅の増加および無差別のアダプター組換えをもたらし、したがって、３つの位相ヌクレオチドを有するオリゴマーを廃棄し、単一の位相ヌクレオチドを有するオリゴマーを選択した。増幅プライマー設計の仕上げ後、特異的ＰＣＲ条件に留意を向けた。アニーリングおよび伸長温度を最適化し、その後、ＰＣＲ１において導入ＬＮＡクランプアニーリングステップを追加した。ＰＣＲ１および２についての複数のサイクル数を次に試験した。最も確率の低いＰＣＲエラー導入とバランスの取れた最良の突然変異体エンリッチメントを有するサイクリング条件を、ＰＣＲ１および２について選択した。ＰＣＲ１および２後の固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズクリーンアップ条件は、ＰＣＲ１からのアダプターキャリーオーバーおよびＰＣＲ２後の最終ライブラリープールへの流入からの非特異的アンプリコンを低減させるための多数のＳＰＲＩ比ならびにインキュベーション時間を試験することにより調整した。ＰＣＲ２における第２のＬＮＡクランプの使用は、追加の突然変異体エンリッチメントについて評価した。突然変異体テンプレートエンリッチメントが顕著に増加したが、それはアッセイ特異度を代償として生じ、プロトコルから排除した。仕上げ済みライブラリー調製ＰＣＲ条件を図４にまとめる。
【００４７】
ＬＮＡエンリッチライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａペアドエンドシーケンシング法を使用してシーケンシングした。未加工ＦＡＳＴＡシーケンシングデータを脱多重化して試料データを分離した。個々の試料データを処理してペアドエンドコンセンサスリードを生成した。ペアドエンドリードの完全なマッチングは、ＦＬＡＳＨオープンソースツールを使用して実施した。次いで、ＢＷＡ−ＭＥＭオープンソースツールを使用してペアドコンセンサスリードをヒト参照ゲノムに対してアラインした。得られたアラインメントを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）においてレビューし、および／またはＳＡＭｔｏｏｌｓおよびＶａｒＳｃａｎツールを使用して分散を求めた。
【００４８】
上記の大規模な最適化後、上記のとおり正常白血球のバックグラウンド中に配置された関連ＥＳＲ１突然変異を保有する個々の細胞を使用してアッセイバリデーションを実施した。検出限界を超える０．０１％のアレル率において、アッセイ感度は４０％であると決定された。同一のアレル率における特異度は、１００％である（図５）。
【００４９】
上記の最適化およびアッセイバリデーション後、ＭＧＨ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて少なくとも２つの内分泌療法の過程を受けた後に疾患進行を有したＥＲ陽性転移性乳癌を有する２５人の女性のパイロットコホートから単離されたＣＴＣに対してＥｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑを使用するＥＳＲ１ゲノタイピングを行った。ＥＳＲ１突然変異は、８／２５人（３２％）の患者において検出され、２人の患者においては、同期するＥＳＲ１突然変異が検出された（図６）。同一の患者における複数のＥＳＲ１突然変異の検出は、標準的な組織ベースＥＳＲ１ゲノタイピングのいかなる刊行物においても報告されてこなかった血液ベースゲノタイピングのユニークな利点であり、依然として探索すべき内分泌耐性の程度についての臨床上の意義を有し得る。
【００５０】
上記のとおり、Ｅｎｒｉｃｈ−Ｓｅｑは、依然として、ＬＮＡベース突然変異体エンリッチメントおよび次世代ライブラリー調製化学反応を組み合わせることにより、１０，０００個の野生型アレルのバックグラウンド中の単一バリアントアレルを検出することがバリデードされた唯一の多重化ＥＳＲ１ゲノタイピングアッセイである。さらに、これは、本発明者らの見識では、ＣＴＣゲノタイピングにおける使用についてバリデードされた唯一のＥＳＲ１ゲノタイピングアッセイであり；それは、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈプラットフォームを使用するＣＴＣ計数と特に関連し、例えば、転移性乳を有する女性における予後診断のためのＦＤＡ承認診断試験である。
【００５１】
参照文献：
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５．Ｙｕ  Ｍ，Ｂａｒｄｉａ  Ａ，Ａｃｅｔｏ  Ｎ，Ｂｅｒｓａｎｉ  Ｆ，Ｍａｄｄｅｎ  ＭＷ，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；３４５：２１６−２０．
【００５２】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2018518155.tif 000008
【図２】
2018518155.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2018518155000001.app
【国際調査報告】
2018518155.tif 000014
2018518155.tif 000015