(57)【要約】  本発明は、タンパク質修飾ステータスを評価し、細胞シグナル経路にリンクされたバイオマーカーを同定する方法を提供する。本発明は、タンパク質修飾酵素の第１のモジュレーターで処理された第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および同じタンパク質修飾酵素の第２のモジュレーターで処理された第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位を、前記修飾部位上の前記タンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターの効果により、単一のグループへグループ化することを含み、ここで、前記タンパク質修飾酵素の第１と第２のモジュレーターは異なっている、修飾部位のデータセットを作成する方法を提供する。本発明は、データベースを調製する方法、治療法および診断方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質修飾酵素の第１のモジュレーターで処理された第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および同じタンパク質修飾酵素の第２のモジュレーターで処理された第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位を、前記修飾部位上の前記タンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターの効果により、単一のグループへグループ化することを含み、ここで、前記タンパク質修飾酵素の第１と第２のモジュレーターは異なっている、修飾部位のデータセットを作成する方法。
【請求項２】
燐酸化部位、アセチル化部位、グリコシル化部位、メチル化部位および脂質化部位から成るグループから前記修飾部位が選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のサンプルおよび第２のサンプルは、癌細胞株からの細胞であるか、またはこれを含んでいることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
蛋白質燐酸化酵素、プロテインフォスファターゼ、タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、蛋白質メチルトランスフェラーゼおよびタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼから成るグループから前記タンパク質修飾酵素が選ばれることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質修飾酵素は蛋白質燐酸化酵素であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質修飾酵素の前記モジュレーターは小分子、ＲＮＡｉ、治療用ペプチドまたは抗体であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
タンパク質修飾酵素の前記モジュレーターはタンパク質修飾酵素の阻害剤であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
タンパク質修飾酵素の前記阻害剤はキナーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記キナーゼ阻害剤はＡｋｔ、ＣＡＭＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣおよびＲＯＣＫから成るグループから選ばれたキナーゼの阻害剤であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾部位上の前記タンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターの効果は、対照サンプルと比較した、該修飾部位のアバンダンスの低下または増加である、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項記載の方法により修飾部位のデータセットを作成すること、および該データセットをデータベースの中へコンパイルすることを含む、データベースを調製する方法。
【請求項１２】
前記データベースが、修飾部位を含むタンパク質の同一性、修飾のタイプ、修飾部位が存在するサンプルのタイプ、および／または修飾部位で修飾を増加させるか減少させるモジュレーターについての情報を含む、、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下を含む疾病の診断方法を提供する：
（ａ）  以下により修飾部位のテスト・データセットを作成すること：
ｉ．  タンパク質修飾酵素の１つ以上のモジュレーターで被検者からの１つ以上の試験サンプルを処理すること、
ｉｉ．  １つ以上の試験サンプル中の修飾ペプチド上の修飾部位を定量および／または同定すること、
ｉｉｉ．  １つ以上の試験サンプルからの修飾ペプチド上の修飾部位を単一のグループへグループ化し、修飾部位のテスト・データセットを作成すること、および
ｉｖ．  任意にテスト・データベースへテスト・データセットをコンパイルすること、
（ｂ）  テスト・データセットを本発明の第１の態様により作成された修飾部位のデータセットと比較すること、またはテスト・データベースを本発明の第２の態様によって作成されたデータベースと比較すること、
（ｃ）  テスト・データセットまたはテスト・データベースと、対照データセットまたは対照データベースとの間の有意差を見つけること、
（ｄ）  工程（ｃ）で見つけられたデータセットまたはデータベースの間の相違が有意である場合、その病気を持っていると診断すること。
【請求項１４】
前記病気は癌であることを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか１項記載の方法により修飾部位のデータセットを作成すること、または請求項１１または１２によってデータベースを作成することを含み、単一のグループ中の修飾部位がタンパク質修飾酵素の活性のための１つ以上のバイオマーカーとして同定される、タンパク質修飾酵素の活性のための１つ以上のバイオマーカーを同定する方法。
【請求項１６】
検体がタンパク質修飾酵素のモジュレーターであることを決定する方法であって、試験サンプルを試験物質で処理すること、試験サンプル中の修飾ペプチド上の修飾部位を同定および／または定量すること、および試験サンプル中で同定および／または定量された修飾部位から修飾部位のテスト・データセットを作成することを含む方法であって、さらに以下を含む方法：
（ａ）  テスト・データセットを請求項１から１０のいずれか１項記載の方法によって作られた修飾部位のデータセットと比較すること、および／または
（ｂ）  テスト・データベースへ前記テスト・データセットをコンパイルし、テスト・データベースを請求項１１または１２によって作成されたデータベースと比較すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、タンパク質修飾部位（例えばシグナル経路にリンクされる燐酸化部位）のデータベースを調製するために使用することができる、修飾部位のデータセットを作成する方法に関する。これは、部位が特定の薬（たとえば阻害剤）によるモジュレーション（modulation）に応じて修飾された情報を提供するので、有用である。データを含むデータベースは、その後たとえばリン酸化プロテオームのデータのようなデターを分析する他の方法への入力として使用することができ、特定の化合物によって阻害されるか、特定の表現型に関係しているキナーゼのマーカーを識別するために使用することができる。
【０００２】
本発明の背景
細胞シグナル経路は、適切なレスポンスへ細胞外の信号を統合し解読する生化学反応の複合体ネットワークを形成する。これらのネットワークの再構成およびそれらの特性の系統的分析は、システム・レベルの疾病についての我々の分子の理解の前進において重要である。細胞シグナルネットワークのトポロジーおよび可塑性（plasticity）は、基本および疾病生理学において主な役割を果たす。そのような分子の構成を特徴づける試みは、文献からタンパク質相互作用および翻訳後修飾（post-translational modification：ＰＴＭ）についての情報を得る推論アルゴリズムに依存した。(Kholodenko BN,et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(20):12841-12846;Mukherjee S & Speed TP(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(38):14313-14318;Prill RJ,et al(2011)Sci.Signal 4(189):mr7)。
そのようなモデルを使用するネットワーク再構成の正確さはデータの有効性によって制限される（Prill RJ, et al,上掲）。また、信号送信事象は多くの場合細胞型特異性である事実により制限される。その結果、それらは洞察力のあるデータ、異なる細胞タイプを利用した研究からネットワーク・トポロジーを導くモデルおよび複合または平均されたネットワークに帰着する有機体を提供することができるが、それは、必ずしも特定細胞タイプ中の、細胞発達の特定の段階の、または定義された生理学的条件の下でのネットワーク構造を反映するとは限らない(Prill RJ,et al,上掲）。
【０００３】
質量分析（ＭＳ）に基づいたリン酸化プロテオミックス技術（phosphoproteomics techniques）の成熟は、１つの実験当たり数千の燐酸化部位の同時定量化を許可している。また、これらの大規模リン酸化プロテオミックス・データセットからキナーゼ活性を導くアプローチが報告された。(Linding R,et al. (2007) Cell 129(7):1415-1426; Carlson SM, et al. (2011) Sci. Signal. 4(196); Bensimon A, et al (2012) Annu. Rev. Biochem. 81:379-405; Casado P, et al. (2013) Sci. Signal. 6(268):rs6)。キナーゼ基体豊富化分析（Kinase Substrate Enrichment Analysis：ＫＳＥＡ）という名のそのような１つのアプローチは、燐酸化部位がそれぞれキナーゼの触媒能力の結果であるとともに、リン酸化プロテオームのプロファイリングが調査中のシステムで発現されたすべてのキナーゼの活性を捕らえて測定する手段を提供するとの前提に基づく＊。
ＫＳＥＡは、系統的にＭＳに基づいたリン酸化プロテオミックス・データからの蛋白質燐酸化酵素経路活性化を推論する技術で、ＷＯ２０１３／１３２０７５として公表された発明者の特許出願の対象である。しかしながら、ＫＳＥＡ法は、文献、およびデータベース、たとえばPhosphoSite(Hornbeck et al, Proteomics 4, 1551 (Jun, 2004))およびＰｈｏｓｐｈｏＥｌｍ (Dinkel et al, Nucleic Acids Res 39, D261 (Jan, 2011))から分かった燐酸化部位の編集に依存する。
【０００４】
特定のタンパク質上の燐酸化部位の予備的知識のない信号ネットワークを分析する方法に対する必要がある。
【０００５】
発明の要約
本発明者は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲおよびＭＥＫ−ＥＲＫ信号軸の小分子キナーゼ阻害剤によってターゲットとされたキナーゼの下流の燐酸化部位を系統的に識別することにより、キナーゼシグナリングネットトワークを定義するために、ＭＳベースのリン酸化プロテオミックスを最初に使用した。これらの遍在する２つの経路は、ほとんどの癌で規制が緩和される、成長因子、抗原およびインシュリンを規制するネットワークを形成する。その後、発明者は、これらの経路においてキナーゼの小分子阻害剤で慢性的に治療された細胞内の実験的に定義されたキナーゼシグナリングネットワーク内の異なるルートの活性および可塑性を測定した。耐性細胞中のキナーゼ・ネットワークのリモデリングがそれらの発展した表現型にリンクされた、シグナリング活性のパターンを生むことが分かった。
【０００６】
本発明者によって開発された方法は、シグナル経路にリンクされる燐酸化部位のデータセットを作成するために使用することができる。特定の薬（たとえば阻害剤）によるモジュレーションに応じて燐酸化されるか脱燐される部位についての情報を提供するので、これは有用である。その後、データを含んでいるデータベースは、リン酸化プロテオームデータの分析のための他の方法（例えば以前に本発明者によって開発されたＫＳＥＡ法）への入力として使用することができ、特定の化合物によって阻害されるキナーゼのマーカーを識別するために使用することができる。この方法は、燐酸化部位の分析に制限されず、ＭＳに基づいた方法を使用して検知することができるタンパク質修飾部位のデータセットを作成するために使用することができる。
【０００７】
従って、第１の態様では、本発明は修飾部位（modification sites）のデータセットを作成する方法であって、タンパク質修飾酵素の第１のモジュレーターで処理された第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および同じタンパク質修飾酵素の第２のモジュレーターで処理された第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位を、前記修飾部位上の前記タンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターの効果により、単一のグループへグループ化することを含む方法を提供する。ここで、前記タンパク質修飾酵素の第１と第２のモジュレーターは異なっている。
【０００８】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されたように、本発明の方法は、第１および第２のサンプルからの修飾されたペプチドの修飾部位の分析により、修飾部位のデータセットを作成する方法である。ほとんどのタンパク質およびペプチドは、官能基の追加または削除による方法で修飾されている。また、そのような修飾はタンパク質修飾酵素によって達成される。質量分析（ＭＳ）によって検知することができるタンパク質とペプチドの修飾はリン酸化、グリコシレーション、アセチル化、メチル化および脂質化(lipidation)を含んでいる。そのような修飾は翻訳後修飾の例で、細胞の様々な生物学的役割がある。したがって、修飾部位は翻訳後修飾の部位であることができる。例えば、修飾部位は、リン酸化、グリコシレーション、アセチル化、メチル化および脂質化部位であることができる。修飾部位は典型的にタンパク質および／またはペプチド修飾部位である。修飾部位は、官能基（たとえば燐酸基）がペプチドまたはタンパク質に加えられるペプチドまたはタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基であることができる。代替官能基は炭水化物、アセチル基、メチル基および脂質であることができる。「修飾されたペプチド」は、官能基の追加または削除によって修飾されたペプチドとしてここに定義される。「タンパク質修飾酵素（protein modifying enzyme）」は、タンパク質またはペプチドへの官能基の追加または削除に関する反応に触媒作用を及ぼす酵素としてここに定義される。
【０００９】
ここに定義されるような「ペプチド」は短いアミノ酸配列で、オリゴペプチドとポリペプチドを含んでいる。典型的には、そのようなペプチドは、約５〜３０のアミノ酸長、例えば６または７から２５、２６または２７アミノ酸、８、９または１０から２０のアミノ酸、１１または１２から１８のアミノ酸、または１４から１６のアミノ酸、例えば１５のアミノ酸長である。しかしながら、より短いかより長いペプチド、たとえば約２と約５０の間、約３から３５から４０、または約４〜約４５のアミノ酸も使用することができる。典型的には、ペプチドは質量分析に適している。それはペプチドの長さがペプチドの質量分析に適しているからである。分析することができるペプチドの長さは、質量分析計がそのような長さのペプチドをシークエンスする能力によって制限される。ある場合には、３００までのアミノ酸のポリペプチドが分析でき、たとえば５０から２５０のアミノ酸、１００から２００のアミノ酸、または１５０から１７５のアミノ酸を分析することができる。
【００１０】
本発明の方法は、ＭＳに基づいた方法を使用して検知することができるあらゆる翻訳後修飾の分析に適用することができる。そのような修飾は、酵素によって媒介するものを含んでおり、プロテイン・キナーゼ、プロテインフォスファターゼ、タンパク質グリコシル移転酵素、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、蛋白質メチルトランスフェラーゼおよびタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼ(palmitoyltransferases)を含んでいる。これらの酵素の活性は、タンパク質またはペプチド基質のリン酸化、脱燐、アセチル化、グリコシレーション、メチル化および脂質化にそれぞれ帰着する。これらのタンパク質／ペプチド修飾はすべて質量分析によって検知することができる。
【００１１】
従って、本発明で使用される修飾されたペプチドは、典型的に燐酸化されたペプチド、脱燐されたペプチド、アセチル化されたペプチド、グリコシル化されたペプチド、メチル化されたペプチドおよび／または脂質化されたペプチドである。修飾されたペプチドは、翻訳後修飾を備えた１つ以上のアミノ酸を含んでいる。それは、修飾を引き起こすタンパク質修飾酵素に特異的である。そのような修飾されたアミノ酸はここに「修飾部位」と呼ばれる。
【００１２】
１つの実施態様では、本発明の方法で使用される修飾されたペプチドは燐酸化されたペプチドである。燐酸化されたペプチドは、燐酸化された（つまり、リン酸塩（ＰＯ４）基がそのアミノ酸に加えられた）１つ以上のアミノ酸を含んでいる。そのような燐酸化されたアミノ酸はここに「燐酸化部位」と呼ばれる。本発明のこの実施態様に関して、用語「燐蛋白質」は燐酸化されたタンパク質を参照するためにここに使用される。また、用語「フォスフォペプチド」は燐酸化されたペプチドを参照するためにここに使用される。
【００１３】
人間のプロテイン・キナーゼは多くのグループに分割することができ、たとえばＡＧＣキナーゼ（例えばプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（Ａｋｔとしても知られている）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）；チロシンキナーゼ、たとえば、レセプター・チロシンキナーゼ（例えば表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））；チロシンキナーゼ様キナーゼ；カルシウム／カルモジュリン依存性のプロテイン・キナーゼ（例えばＣＡＭＫ２）；カゼイン・キナーゼ１グループ；ＣＭＧＣグループ、例えばＣＤＫ、ＭＡＰＫ（たとえば細胞外の信号に関連するキナーゼ（ＥＲＫ）、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）（例えばＭＥＫ）、ＧＳＫ３、ＣＬＫキナーゼ；およびＳＴＥ、ｙｅａｓｔ  Ｓｔｅｒｉｌｅ７、Ｓｔｅｒｉｌｅ  １１，およびＳｔｅｒｉｌｅ  ２０キナーゼの同族体があげられる。
他のキナーゼとしては、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類ターゲット）、ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびｒｈｏ−関連蛋白質キナーゼ（ＲＯＣＫ）、それらのすべてはセリン／トレオニンプロテインキナーゼである、およびホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を含んでいる。
【００１４】
プロテインフォスファターゼはプロテインフォスファターゼ２（ＰＰ２またはＰＰ２Ａ）を含んでいる。
【００１５】
本発明の方法は単一のグループへ、第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位をグループ化することを含んでいる。本発明の方法の中で使用される第１と第２のサンプルは、ペプチドを含んでいるあらゆるサンプルであることができる。サンプルは典型的には生体試料で、生物由来の（例えば人間、動物、植物またはバクテリアから得られた任意のタイプのサンプルであることができる。本発明は、このように人間および人類以外のソースから得られたサンプルの使用を包含する。本発明の方法の中で使用されるサンプルは任意の興味のある種からであることができる。典型的には、サンプルは人間または動物からのものである。動物は、典型的に哺乳動物（例えばげっ歯動物（たとえばマウス、ネズミまたはモルモット））または有蹄動物（たとえば雌牛、羊またはヤギ）である。動物は、さらに鳥（鶏、魚（たとえばゼブラフィッシュ）、線虫（たとえば虫線虫）または昆虫（たとえばミバエ・キイロショウジョウバエ）であることができる。本発明の方法の中で使用されるサンプルはさらに他の生活形（たとえばバクテリアと酵母）からのものであることができる。
【００１６】
本発明の方法の中で使用されるサンプルは、典型的にバクテリア（たとえば大腸菌、サルモネラ菌、肺炎連鎖球菌または黄色ブドウ球菌）、または酵母（パン酵母、ビール酵母菌または分裂酵母分裂酵母）の実験的に重要な種からのサンプルである。本発明の方法の中で使用されるさらなるサンプルは植物または菌類、またはウイルスからであることができる。
【００１７】
例えば、典型的には、生体試料は人間由来で、体液（たとえば尿または血液）のサンプル、または別の組織であることができる。典型的には、生体試料は細胞株または組織からの細胞、典型的には一次組織である。例えば、サンプルは人間または動物からの組織であることができる。人間または動物は健康な病気のものであることができる。組織は癌組織であることができる。例えば、サンプルは腫瘍からのものであることができる。あるいは、サンプルは、健康か病気の人間または動物細胞から由来の細胞株でありうる。
【００１８】
本発明の方法の中で典型的に使用される第１と第２のサンプルは、細胞株（例えば癌細胞株（たとえば乳癌細胞株（例えばＭＣＦ７細胞株）））であるか、またはそれを含んでいる。例えば、多くの癌細胞株が公知技術として知られており、たとえばhttp://www.broadinstitute.org/ccle/homeの、Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)に記載されている。
【００１９】
第１と第２のサンプルは典型的に同じ細胞株からのものであるが異なってもよい。第１と第２のサンプルは同じソース由来のものであることができる。例えば、第１と第２のサンプルは両方とも一人の個人からのものであることができる。第１と第２のサンプルは同じ組織からのものであることができる。第１と第２のサンプルは同じ体液からのものであることができる。
【００２０】
サンプルは本発明の方法の中で使用される別のサンプルと区別するために「試験サンプル」と呼ばれることができる。例えば、サンプルは、対照試料との比較を含む方法において記述するために、試験サンプルと呼ばれることができる。
【００２１】
本発明の方法は生体外の方法であることができ、したがって、生命体（たとえば動物）からサンプルを得るステップを含まない。
【００２２】
修飾されたペプチドはサンプルにおいて修飾されることができる。修飾されたペプチドは生体内で修飾されることができる。修飾されたペプチドは内因的に修飾されるペプチドであることができる。
【００２３】
本発明では、第１と第２のサンプルは、本発明の方法を実行する前にタンパク質修飾酵素のモジュレーターで典型的に処理される。実際上、これは、本発明の方法を実行する前に、タンパク質修飾酵素のモジュレーターで第１と第２のサンプル自体、または第１と第２のサンプルが得られる生物のいずれかが処理されることを意味する。
【００２４】
しかしながら、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、グループ化するステップに先立って、さらにタンパク質修飾酵素の第１のモジュレーターで第１のサンプルを処理し、タンパク質修飾酵素の第２のモジュレーターで第２のサンプルを処理する１または複数のステップを含む。
【００２５】
本発明の方法は、さらに第１のおよび／または第２のサンプルから修飾されたペプチドを得るステップを含んでもよい。例えば、第１および／または第２のサンプルが細胞（例えば細胞株からの）であるかまたはこれを含む時、修飾されたペプチドは細胞を溶解し（スプリッテイングオープン：splitting open）、溶解された細胞からタンパク質を抽出し、ペプチドへタンパク質を開裂すること（分解または消化）により、細胞から得ることができる。細胞は公知技術の中の任意の適切な手段も使用して溶解することができる。例えば、物理的方法（たとえば機械的な細胞融解（例えば、ワーリングブレンダーを使用して）、液体の均質化、超音波処理またはマニュアル細胞融解（例えば、乳棒と乳鉢を使用して）あるいは界面活性剤（ＣＨＡＰＳまたはトリトン−Ｘ）に基づいた方法を使用することができる。典型的には、細胞はデネイチャリングバッファー(denaturing buffer)（たとえば尿素に基づいたバッファー）を使用して溶解される。タンパク質分裂または消化は公知技術の中の任意の作用薬を使用して実行することができ、典型的にはプロテアーゼを使用して実行される。任意の適切なプロテアーゼを使用することができる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、アルギニンＣ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、ＡＳｐ−Ｃおよび／またはＡｓｐＮである。あるいは、タンパク質は、ヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適切な作用薬を使用して、化学的に開裂することができる。
【００２６】
タンパク質修飾酵素は、蛋白質燐酸化酵素、プロテインフォスファターゼ、タンパク質グリコシル移転酵素、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、蛋白質メチルトランスフェラーゼおよびタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼから成るグループから典型的に選ばれる。１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素は蛋白質燐酸化酵素である。
【００２７】
本発明の方法を実行する前に第１と第２のサンプルを処理するために使用されるタンパク質修飾酵素のモジュレーターは、同じタンパク質修飾酵素のモジュレーターである。しかし、第１と第２のサンプルを処理するために使用されるモジュレーターは異なり、典型的には構造的に異なっている。
【００２８】
タンパク質修飾酵素のモジュレーターは、典型的に外因性の化学薬品または薬（たとえば小分子（たとえば小分子阻害剤のような）、ＲＮＡｉ、治療ペプチドまたは抗体である。
【００２９】
タンパク質修飾酵素のモジュレーターは、任意の方法でタンパク質修飾酵素の活性を調整してもよい。１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素のモジュレーターはタンパク質修飾酵素の阻害剤である。１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素の阻害剤はキナーゼ阻害剤である。別の実施態様では、タンパク質修飾酵素のモジュレーターはタンパク質修飾酵素の活性化体である。１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素の阻害剤はキナーゼ活性化体である。
【００３０】
典型的なキナーゼ阻害剤としては、Ａｋｔ、たとえばＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩおよびＭＫ−２２０６、ＣＡＭＫ２の阻害剤、たとえばＫＮ−９３およびＫＮ−６２、ＥＧＦＲの阻害剤、たとえばＰＤ−１６８３９３およびＰＤ−１５３０３５、ＥＲＫの阻害剤、たとえばＥＲＫ阻害剤およびＥＲＫ阻害剤ＩＩ、ＭＥＫの阻害剤、たとえばＧＳＫ−１１２０２１２およびＵ０１２６、ｍＴＯＲの阻害剤、たとえばＫＵ−００６３７９４およびＴｏｒｉｎ−１、ｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤、たとえばＰＦ−４７０８６７１およびＤＧ２、ＰＩ３Ｋの阻害剤、たとえばＧＤＣ−０９４１およびＰＩ−１０３、ＰＫＣの阻害剤、たとえばＧｏ（ウムラウト）−６９７６およびＢＩＭ−１、およびＲＯＣＫの阻害剤、たとえばＨ−１１５２およびＹ−２７６３２が挙げられる。
【００３１】
ＰＩ３Ｋの他の阻害剤はＰＰ２とウォルトマンニンを含む。少なくとも８０のキナーゼ阻害剤が、臨床開発の異なる段階にある (Zhang, J.; et al Nat Rev Cancer 2009, 9, (1), 28-39)。
【００３２】
１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素の阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。
ホスファターゼの阻害剤は、ＰＰ２Ａの阻害剤（たとえばオカダ酸とカンタリジン酸）を含んでいる。
【００３３】
本発明の方法は、単一のグループへ、タンパク質修飾酵素の第１のモジュレーターで処理された第１のサンプルからの修飾されたペプチドの修飾部位と、同じタンパク質修飾酵素の第２のモジュレーターで処理された第２のサンプルからの修飾されたペプチドの修飾部位をグループ化することを含む。「グループ化」により、修飾部位（たとえば燐酸化部位）がグループまたはセットに入れられることが意味される。本発明の方法では、第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位は、修飾部位へのタンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターの効果に基づき、単一のグループに入れられる。言いかえれば、第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位は、タンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターによって同じように影響された修飾部位に基づいて、単一のグループに入れられる。
【００３４】
例えば、修飾部位へのタンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターの影響が、対照試料と比較して、特定の修飾部位のアバンダンス(abundance)（度数(frequency)）の低減または増加でありうる。この実施態様では、第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位は、対照試料と比較して、タンパク質修飾酵素の第１および第２のモジュレーターに応答する特定の修飾のアバンダンスにおける類似する低減または増加に基づいて単一のグループに入れられる。アバンダンスの低減または増加は、典型的に統計的に有意な低減または増加であり、たとえば実施例に述べられてるような任意の適切な統計的手法を使用して計算することができる。
【００３５】
本発明の方法の結果物は、同じタンパク質修飾酵素のモジュレーターによって同じように影響を受ける修飾部位のデータセットであり、したがって、モジュレーターによって影響を受けるタンパク質修飾酵素の活性を示すものである。同じタンパク質修飾酵素をターゲットとする異なる（典型的には構造上別個の）モジュレーターによって阻害された修飾部位の選択は、意図したタンパク質修飾酵素に特異的な修飾部位に豊んだデータセットに帰着する。修飾されたペプチド上の特定の修飾部位のアバンダンスが、同じタンパク質修飾酵素の少なくとも２つの異なるモジュレーターによって低減される場合、それはモジュレーターによって実際に影響を受けるタンパク質修飾酵素のリード−アウト（read-out）を表わす。そのような修飾部位は「化合物−ターゲット活性マーカー(compound-target activity markers)」(CTAM)と呼ばれる。従って、そのような修飾部位はタンパク質修飾酵素の活性のバイオマーカーであると考えられてもよい。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明の方法は２以上のサンプル、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くのサンプルからの、修飾されたペプチド上の修飾部位をグループ化することを含んでいる。その各々は同じタンパク質修飾酵素の異なるモジュレーターで処理されている。この実施態様では、本明細書に記載されたように、本発明の方法は、すべてのサンプルから修飾されたペプチドの修飾部位を、修飾ペプチドに対する同じタンパク質修飾酵素のモジュレーターの各々の影響により、単一のグループへグループ化することを含んでいる。例えば、本発明の方法が３つのサンプルを含んでいる場合、方法は、タンパク質修飾酵素の第１のモジュレーターで処理された第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、同じタンパク質修飾酵素の第２のモジュレーターで処理された第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、同じタンパク質修飾酵素の第３のモジュレーターで処理された第３のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位を、前記修飾部位への前記タンパク質修飾酵素の第１、第２、および第３のモジュレーターの効果により単一のグループへグループ化することを含む、ここで、前記タンパク質修飾酵素の第１、第２および第３のモジュレーターは異なる。例えば、修飾部位に対するタンパク質修飾酵素の第１のモジュレーター、第２のモジュレーターおよび第３のモジュレーターの影響は、対照試料と比較した、特定の修飾部位のアバンダンス（数）の低減または増加であることができる。この実施態様では、第１のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位、および第３のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位は、対照試料と比較して、タンパク質修飾酵素の第１のモジュレーター、第２のモジュレーターおよび第３のモジュレーターに応答する特定の修飾部位のアバンダンスの同様の低減または増加に基づいて単一のグループに入れられる。２より多いサンプルが使用される場合、本発明の実施態様では、試験サンプルの各々が比較される対照サンプルは１つであることができる。
【００３７】
本発明の方法の結果物は、タンパク質修飾酵素（たとえばプロテイン・キナーゼの阻害剤）のモジュレーターによって影響を受ける修飾部位（例えば燐酸化部位）のデータセットである。そのような修飾部位についての知識は、キナーゼの活性に対する阻害、および細胞の表現型とのリンクを可能にする。そのような修飾部位についての知識は、さらにシグナル経路の回路類に関する情報を提供する。また、他の実験の中でモニターされた時、そのような修飾部位は、さらにシグナル経路の可塑性を明らかにすることができる；すなわち、決定された実験条件で、または疾患進行中にそれらがどのように変化するかを明らかにすることができる。本発明の方法は、新しいマーカーまたはバイオマーカーを同定し、かつしたがって、特定の阻害剤によってターゲットとされたキナーゼおよび他のタンパク質修飾酵素の活性についての情報を提供するために使用することができる。
【００３８】
本発明の方法、本発明によって生成されたデータセット、および／または本発明によって生成されたデータベースは、疾病の診断および／または疾病の治療法で使用することができる。その病気は癌であることができる。第１サンプルおよび第２のサンプルは被検者からのものであることができる。第１サンプルおよび第２のサンプルは被検者の腫瘍からのものであることができる。第１サンプルおよび第２のサンプルは疾患進行の異なる段階からのものであることができる。診断および／または治療の方法は、第１サンプルおよび第２のサンプルへ、タンパク質修飾酵素の１つ以上のモジュレーターを生体外で適用することを含んでもよい。方法は、個々の患者に関連する治療の抵抗機構の同定を可能にすることができる。診断および／または治療の方法は、さらにタンパク質修飾酵素の１つ以上のモジュレーターに対する細胞の反応を評価することを含むことができる。細胞のレスポンスはたとえば増殖または細胞の生存率であることができる。細胞のレスポンスは、データベースおよび／またはデータセットと関連させることができる。診断および／または治療の方法は、１つ以上の対照試料を備えた被検者からのサンプルから得られたデータセットまたはデータベースの比較を含んでもよい。典型的に、対照試料は健康な組織または健康な被験者から得られる。対照試料は、健康または病変組織、またはから病気の被検者の健康な組織であることができる。対照試料との比較は、１つ以上のタンパク質修飾酵素が対照に対して、被検者の中で規制緩和（deregulate）されることを示してもよい。診断および／または治療の方法は、さらに被検者に関連する治療目標の同定を含んでもよい。診断および／または治療の方法は、さらにタンパク質修飾酵素の有効なモジュレーターを決定することを含んでもよい。治療法は、さらに被検者へのタンパク質修飾酵素の有効なモジュレーターの適用を含んでもよい。
【００３９】
本発明の方法、本発明によって作成されたデータセット、および／または本発明によって作成されたデータベースは、検体がタンパク質修飾酵素のモジュレーターであることを決める方法において使用されることができる。従って、本発明の方法、本発明によって作成されたデータセット、および／または本発明によって作成されたデータベースは、スクリーニングにおいて使用することができる。スクリーニングの方法は、検体がタンパク質修飾酵素のモジュレーターかどうか判断するための、スクリーニングテスト物質のスクリーニング方法であることができる。検体は、外因性の化学薬品または薬（たとえば小分子（たとえば小分子阻害剤）、ＲＮＡｉ、治療のペプチドまたは抗体）であることができる。検体は新規の物質または既知の物質であることができる。検体は組成物であることができる。
【００４０】
したがって、検体がタンパク質修飾酵素のモジュレーターであることを決めることは、検体がタンパク質修飾酵素の阻害剤であることを決めることを含むことができる。あるいは、検体はタンパク質修飾酵素の活性化体であることができる。例えば、検体はキナーゼ阻害剤またはキナーゼ活性化体であると同定されてもよい。
【００４１】
本発明の方法は、ＭＳに基づいた技術を使用して同定された修飾されたペプチド上の修飾部位の分析に基づく。従って、本発明の方法の第一ステップでグループ化される、第１のサンプルおよび第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位は、典型的にはＭＳに基づいた技術を使用して定量および／または同定されたものである。いくつかの実施態様では、したがって、本発明の方法は、第１のサンプルおよび／または第２のサンプルの中の修飾されたペプチド上の修飾部位を質量分析（ＭＳ）を使用して定量および／または同定するステップを含む。本明細書に記載されたように、単一のグループへ、第１のサンプルおよび第２のサンプルからの修飾されたペプチド上の修飾部位をグループ化する次のステップを含む。
【００４２】
修飾されたペプチド上の修飾部位の同定および定量化は任意の適切な方法を使用して実行することができる。典型的には、定量化は質量分析（ＭＳ）（たとえば液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ））を含む任意の方法によって実行することができる。ＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳは典型的にラベルなしのＭＳである。しかし、定量の基礎として同位元素標識を使用する技術も分析の基礎として使用することができる。
【００４３】
本発明の方法では、タンパク質修飾（たとえばリン酸化）の定量化は、ＴＩＱＵＡＳ（ターゲッティド  アンド  イン−デプス  クオンティフィケーション  オブ  シグナリング(targeted and in-depth quantification of signalling)）技術を使用して、典型的に実行される。これは本明細書にその全体が参照されるＷＯ２０１０／１１９２６１（国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００７７０）、およびCasado P, et al. (2013) Genome Biol. 14(4):R37 and Montoya A, et al. (2011) Methods 54(4):370-378に述べられている。この技術は、修飾されたペプチドの敏感で、迅速で、包括的な定量化を可能とする。この方法は、１つの単純な分析で、タンパク質上の何千もの燐酸化部位を同時に測定することができる。ＷＯ  ２０１０／１１９２６１に述べられるように、ＴＩＱＵＡＳ技術を燐酸化されたペプチド以外の修飾されたペプチドを定量するために使用することもできる。実際、ＴＩＱＵＡＳ技術は質量分析によって検知することができるあらゆる修飾を含むペプチドを定量するために使用することができる。
【００４４】
本発明の方法のこの実施態様では、グループ化するステップに先立つ、質量分析（ＭＳ）を使用した修飾されたペプチド上の修飾部位を定量するステップは、下記工程を含む方法を使用して行なわれる：
（ａ）サンプルからペプチドを得ること；
（ｂ）ステップ（ａ）の中で得られたペプチドに参照修飾ペプチドを加え、ペプチドと参照修飾ペプチドとの混合物を生成すること；
（ｃ）  ペプチドと参照修飾ペプチドの前記混合物に質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関係のあるデータを得ること；および
（ｄ）コンピューター・プログラムを使用してサンプル中のペプチドに関するデータと、修飾ペプチドのデータベース中のデータとを比較すること；
ここで、修飾ペプチドのデータベースは、以下を含む方法によりコンパイルされる：
ｉ）サンプルからのペプチドを得ること；
ｉｉ）ステップｉ）で得られたペプチドから修飾されたペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた富化された修飾されたペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
ｉｖ）ステップｉｉｉ）で検知された修飾されたペプチドと、既知のレファレンス・データベースを比較し、修飾されたペプチドを同定すること；および
ｖ）データベースの中へ、ステップｉｖ）で同定された修飾されたペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【００４５】
本発明の方法の１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素は蛋白質燐酸化酵素であり、修飾がリン酸化である場合、グループ化するステップに先立つ、質量分析（ＭＳ）を使用して、修飾されたペプチド上の修飾部位を定量するステップは下記工程を含む方法を使用して行なわれる：
（ａ）サンプルからリン酸化ペプチドを得ること；
（ｂ）ステップ（ａ）の中で得られたペプチドに参照リン酸化ペプチドを加え、リン酸化ペプチドと参照リン酸化ペプチドとの混合物を生成すること；
（ｃ）リン酸化ペプチドと参照リン酸化ペプチドの前記混合物に質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のリン酸化ペプチドに関係のあるデータを得ること；および
（ｄ）コンピューター・プログラムを使用してサンプル中のリン酸化ペプチドに関するデータと、リン酸化ペプチドのデータベース中のデータとを比較すること；
ここで、リン酸化ペプチドのデータベースは、以下を含む方法によりコンパイルされる：
ｉ）サンプルからのペプチドを得ること；
ｉｉ）ステップｉ）で得られたペプチドからリン酸化ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた富化されたリン酸化ペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
ｉｖ）ステップｉｉｉ）で検知されたリン酸化ペプチドと、既知のレファレンス・データベースを比較し、リン酸化ペプチドを同定すること；および
ｖ）データベースの中へ、ステップｉｖ）で同定されたリン酸化ペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【００４６】
本発明のこの実施態様に関して、「ペプチド」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用される。
【００４７】
本発明のこの実施態様のステップ（ａ）はサンプルからペプチドを得ることを含んでいる。ペプチドは公知の技術の任意の適切な方法を使用して、サンプルから得ることができる。
１つの実施態様では、本発明の方法のステップ（ａ）は次のものを含む：
（１）サンプル中の細胞を溶解すること；
（２）ステップ（１）で得られた、溶解された細胞からタンパク質を抽出すること；
および（３）ペプチドへ前記タンパク質を開裂すること。
【００４８】
本発明のこの実施態様のステップ（１）では、サンプル中の細胞は溶解されるか、またはスプリットオープン(split open)される。細胞は公知の任意の適切な手段を使用して溶解することができる。例えば、物理的方法（たとえば機械的な細胞融解（例えば、ワーリングブレンダーを使用して））、液体の均質化、超音波処理またはマニュアル細胞融解（例えば、乳棒と乳鉢を使用して）、あるいは界面活性剤に基づいた方法（ＣＨＡＰＳまたはトリトン−Ｘ）を使用して行うことができる。典型的には、細胞はデネイチャリングバッファー(denaturing buffer)（たとえば尿素に基づいたバッファー）を使用して溶解される。
【００４９】
本発明のこの実施態様のステップ（２）では、タンパク質はステップ（１）で得られた、溶解された細胞から抽出される。言いかえれば、タンパク質は溶解された細胞の他の成分から分けられる。
【００５０】
本発明のこの実施態様のステップ（３）では、溶解された細胞からのタンパク質はペプチドへ開裂される。言いかえれば、タンパク質はより短いペプチドに分解される。タンパク質分解も一般に消化と呼ばれる。
【００５１】
タンパク質分裂は公知技術の任意の適切な作用薬を使用して、本発明で実行することができる。タンパク質分裂または消化は、典型的にはプロテアーゼを使用して実行される。任意の適切なプロテアーゼを本発明の中で使用することができる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃおよび／またはＡｓｐＮである。あるいは、タンパク質は、たとえばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳスカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適切な作用薬を使用して、化学的に開裂することができる。
【００５２】
この実施態様のステップ（ｂ）で、参照修飾ペプチド（典型的に、参照リン酸化ペプチド）はステップ（ａ）で得られたペプチドに加えられ、ペプチドと参照修飾ペプチド（典型的に、参照リン酸化ペプチド）の混合物を生成する。ステップ（ｂ）は、このように１つのサンプル当たりのペプチド（修飾されたものを含む、典型的には燐酸化されたもの）の１つの混合物に帰着する。修飾されたペプチド（典型的には、参照リン酸化ペプチド）はここでは「内部標準」（ＩＳ）として言及される。典型的には、５〜１０、たとえば６から９、または７から８の、参照修飾ペプチド（典型的に、参照はリン酸化ペプチド）が加えられる。
【００５３】
本発明では、参照修飾されたペプチドは典型的に参照リン酸化ペプチドであり、典型的には、しばしば内部標準（ＩＳ）タンパク質と呼ばれる、定義された性質および濃度の比較蛋白質から導かれる。ＩＳは市販のタンパク質（例えばカゼイン）であることができる。あるいは、ＩＳは特異的に本発明で使用するために合成される。本発明のこの実施態様では、参照の燐酸化されたペプチドは、定量化が望まれる燐酸化されたペプチドのうちのいくつかと同じシーケンスで典型的に合成されが、それは炭素と窒素の安定した重同位元素の中で富化される。ペプチドは、アミノ酸鎖またはポリペプチドを形成するために、一度に１つのアミノ酸が加えられる固相化学を使用して、典型的に合成される。典型的には、そのようなペプチドは、一般的な１２Ｃおよび１４Ｎを置換する１３Ｃおよび１５Ｎで富化される。この富化は、質量分析計を使用してそれらを識別することができるように、同じシーケンスで内因的に燐酸化されたペプチドより、およそ６〜１０ダルトン重い参照燐酸化ペプチドに帰着する。
【００５４】
本発明の別の実施態様では、タンパク質修飾酵素がタンパク質アセチルトランスフェラーゼで、アセチル化されたペプチドが定量される場合、参照修飾ペプチドは参照アセチル化ペプチドである。そのような参照アセチル化ペプチドは、典型的にアセチル化されたアミノ酸を含む合成ペプチドである。
【００５５】
参照修飾ペプチド（典型的に、参照リン酸化ペプチド）は、典型的には比較されるサンプルの各々に既知量で加えられる。内因的な修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の信号は、下流の分析で参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の信号に標準化される。
【００５６】
１つの実施態様では、この実施態様のステップ（ｂ）はペプチドおよびステップ（ｂ）で得られた参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の混合物からの修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化し、富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物を生産することをさらに含む。この補足ステップは、したがって１つのサンプル当たり富化した修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の単一の混合物に帰着する。本発明のこの実施態様では、ステップ（ｃ）は、富化した修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物について質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関するデータを得ることを含む。本発明のこの実施態様では、ステップ（ｂ）は典型的には富化した修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物に帰着する。
【００５７】
修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化するステップは典型的にはクロマトグラフィーを使用して行なわれる。１つの実施態様では、クロマトグラフィーは、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィー、および／または酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーである。典型的には、クロマトグラフィーはＩＭＡＣおよびＴｉＯ２クロマトグラフィーである。
【００５８】
あるいは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化するステップは抗体に基づいた方法を使用して行なわれる。
【００５９】
本発明の１つの実施態様の中で、タンパク質修飾酵素が蛋白質燐酸化酵素で、定量化されるペプチドが燐酸化されたペプチドである場合、燐酸化されたアミノ酸（たとえばチロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジン）への親和性を備えた抗体は、固体のマトリックスにリンク（不動化）される。燐酸化されたペプチドは、これらの抗体が特異的にリン酸化ペプチドに特異的に結合する能力によって富化される。その後、燐酸化されていないペプチドは洗浄除去され、燐酸化されたペプチドが抗体がコーティングされたマトリックス上で保持される。不動化された抗体からのリン酸化ペプチドの溶離は、典型的には低ｐＨ溶剤を使用して実行されるか、または抗体とリン酸化ペプチドの間の相互作用をデネイチャーする他の適当な方法で行われる。
【００６０】
本発明の別の実施態様の中で、タンパク質修飾酵素がタンパク質アセチルトランスフェラーゼであり、定量されるペプチドがアセチル化されたペプチドである場合、アセチル化されたペプチドは、アセチル化されたアミノ酸残基に対する特異性抗体の使用によって富化される。そのような抗体は固体のマトリックスにリンクされ、次に、抗体がアセチル化されたアミノ酸残基を特異的に結合する能力によって富化される。その後、アセチル化されていないペプチドは洗浄除去され、アセチル化されたペプチドは不動化された抗体上で保持される。
【００６１】
この実施態様のステップ（ｃ）では、質量分析（ＭＳ）がステップ（ｂ）の中で得られたペプチドおよび参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の混合物に対して実行され、サンプル中のペプチドに関係のあるデータを得る。典型的には、このデータは、サンプル用のＭＳのデータファイルの形をしている。本発明の１つの実施態様の中で、この実施態様のステップ（ｂ）がペプチドとステップ（ｂ）の中で得られた参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）との混合物から修飾ペプチドを富化して修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物を生産することを含む場合、ステップ（ｃ）は富化した修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の前記混合物に質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチドに関するデータ、典型的にはサンプル用のＭＳのデータファイルとして得ることを含む。典型的には、質量分析は液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）である。ステップ（ｃ）は、このようにＬＣ−ＭＳデータファイル（各サンプルからのもの）に典型的には帰着する。
【００６２】
サンプル中のペプチドに関するデータは、典型的には質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間を含む。
【００６３】
この実施態様のステップ（ｄ）では、サンプル中のペプチドに関するデータ（典型的にはＭＳのデータファイルの形式、およびより典型的にはＬＣ−ＭＳデータファイルの形式で）は、コンピューター・プログラムを使用して、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のデータベース中のデータと比較される。例えば、サンプル中のペプチドの質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間は、データベース中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間と比較される。これは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のデータベースを使用して、サンプルの個々の修飾されたペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定および定量化を可能にする。
【００６４】
典型的には、コンピューター・プログラムは、ＰＥＳＣＡＬ(Cutillas, P. R.; Vanhaesebroeck, B. Mol Cell Proteomics 6(9), 1560-73, 2007)と名付けられたプログラムである。ＰＥＳＣＡＬは、比較されることになっているすべてのサンプルにわたるデータベースの中にある修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の各々のために抽出されたイオン・クロマトグラム（ＸＩＣ、すなわち溶出プロファイル）を構築する。これは、同定され修飾されるペプチド（典型的に燐酸化された）（すなわち手続きの第一段階で造られたデータベースの中にある）のｍ／ｚ、および保持時間にＸＩＣをセンタリング(centring)することにより行われる。ＰＥＳＣＡＬは、ペプチドの荷電も考慮して同一性の正確な指定を支援する。プログラムは、さらに各ＸＩＣのピーク高さおよび曲線下面積を計算する。データは、参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の読み強度で、分析される各修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の読み強度（ピーク面積または高さ）を割ることにより規格化される。
【００６５】
この実施態様では、修飾ペプチドのデータベースは下記工程を含む方法によってコンパイルされる：
ｉ）サンプルからのペプチドを得ること；
ｉｉ）ステップｉ）で得られたペプチドから修飾されたペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた富化された修飾されたペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
ｉｖ）ステップｉｉｉ）で検知された修飾されたペプチドと、既知のレファレンス・データベースを比較し、修飾されたペプチドを同定すること；および
ｖ）データベースの中へ、ステップｉｖ）で同定された修飾されたペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【００６６】
この実施態様のステップｉ）はサンプルからペプチドを得ることを含んでいる。ペプチドは、公知の技術およびここに記述された任意の適切な方法を使用して、サンプルから得ることができる。ステップｉ）のサンプルは第３のサンプルであることができる。
【００６７】
サンプルは典型的に生体試料で、先に記述されたように、生物ソースから得られた任意のタイプのサンプルであることができる。典型的には、サンプルは細胞株または組織である。
【００６８】
本発明のいくつかの実施態様中で、ステップｉ）の中で使用されるサンプルが細胞株である場合、サンプルはステップｉ）を実行する前に阻害剤で処理される。阻害剤は任意の適切なタイプの阻害剤であることができる。典型的に、燐酸化されたペプチドが定量される場合、阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。ホスファターゼ阻害剤での処理は、リン酸化の化学量論を増加させて、データベースに含むことができる多くのリン酸化ペプチドに帰着する。さらに、目的がメチル化またはアセチル化されたペプチドを定量することである場合、それぞれメチル基転移酵素阻害剤またはアセチルの加水分解酵素阻害剤を使用することができる。
【００６９】
１つの実施態様では、本発明の方法のこの実施態様のステップｉは、以下を含む：
（１）サンプル中の細胞を溶解すること；
（２）ステップ（１）で得られた溶解された細胞からタンパク質を抽出すること；および
（３）ペプチドへ前記タンパク質を開裂すること。
【００７０】
本発明のこれらの態様は上に記述された通りである。しかしながら、ステップ（３）は上に記述されたステップ（ａ）と同じ方法を使用して、典型的に実行される。
【００７１】
この実施態様のステップｉｉでは、修飾されたペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）はステップｉの中で得られたペプチドから富化される。ステップｉｉは、このように修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）中で富化されたいくつかのフラクションに帰着する。
【００７２】
ステップｉｉの中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の富化は、多次元クロマトグラフィーを使用して、典型的に実行される。１つの実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、強陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される。別の実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される。本発明のこれらの実施態様では、クロマトグラフ技術は連続して実行される。
【００７３】
あるいは、上に記述されるように、ステップｉｉの中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の富化は抗体に基づいた方法を使用して実行される。
【００７４】
この実施態様のステップｉｉｉでは、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、ステップｉｉの中で得られた富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）上で行なわれる。
【００７５】
この実施態様のステップｉｖでは、ステップｉｉｉで検知された修飾されたペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）は、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を同定するために既知のレファレンス・データベースと比較される。このステップは市販のサーチエンジンを使用して、典型的に行なわれ、たとえば（しかし制限されない）が、ＭＡＳＣＯＴ、ProteinProspectorまたはＳｅｑｕｅｓｔサーチエンジンを使用して行われる。
【００７６】
この実施態様のステップｖでは、ステップｉｖで同定された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）に関するデータは、データベースへ収集される。このデータベースは、後の生物学的実験中のリン酸化ペプチドの定量化に必要とされたパラメーターをすべてリストする。典型的には、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）に関係のあるデータは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定、質量電荷比（ｍ／ｚ）、電荷および／または相対保持時間を含む。これはサンプル中のペプチドに関係のあるデータ、典型的にはサンプル内のペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）、電荷（Ｚ）および相対保持時間を、データベース中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）についての値と比較することを許容し、したがってサンプル中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定および定量化を許容する。
【００７７】
この実施態様では、本発明の方法と同時にデータベースの編集を実行する必要はない。データベースの編集は、サンプル中の修飾されたペプチド上の修飾部位を定量するために本発明の方法の中で使用されているＴＩＱＵＡＳ技術の前に、別々に実行することができる。
【００７８】
ＴＩＱＵＡＳ技術の基礎は、ＬＣ−ＭＳによって検知され定量することができる修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のデータベースの構築である。このデータベースは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定、質量電荷比（ｍ／ｚ）、電荷（Ｚ）および相対保持時間を含む、後の生物学的実験において修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の定量化のために必要なすべてのパラメーターをリストする。データベースは、多次元クロマトグラフィー（たとえば強陽イオン交換、ＩＭＡＣおよびＴｉＯ２）を使用して、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化することにより構築することができる。その後、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のフラクションを分析することができる。
【００７９】
ＰＥＳＣＡＬ(Cutillas and Vanhaesebroeck, Molecular & Cellular Proteomics 6, 1560-1573 (2007)の名称のコンピュータ・プログラムは、生物学的実験から得られた修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のＬＣ−ＭＳ実行でのデータベースにリストされた修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の各々の定量化を自動化する。これらの生物学的実験については、細胞溶解物中のタンパク質はトリプシンまたは他の適切なプロテアーゼを使用して消化される。参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）であるペプチド（たとえばフォスフォペプチド）内部標準は、比較されるすべてのサンプル中に既知量でスパイクされる。得られたペプチド混合物中の修飾されたペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）はシンプル−トウ−パーフォームＩＭＡＣ(simple-to-perform IMAC)またはＴｉＯ２抽出ステップを使用して富化される。富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）は、シングルＬＣ−ＭＳで分析される。典型的には約１２０分（サイクルの合計）であるが、これには制限されない。その後、ＰＥＳＣＡＬは、比較されることになっているすべてのサンプルにわたるデータベースの中にある修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の各々のために抽出されたイオン・クロマトグラム（ＸＩＣ、すなわち溶出プロフィール）を構築する。プログラムは、さらに各ＸＩＣのピーク高さおよび曲線下面積を計算する。データは、修飾されたペプチド（典型的にフォスフォペプチド）の内部標準読み強度で、それぞれの修飾されたペプチド（典型的にフォスフォペプチド）分析物の読み強度（ピーク面積または高さ）を割ることにより標準化される。
【００８０】
本発明の方法においてＴＩＱＵＡＳ技術を使用することの代わりに、リン酸化のような修飾の定量化を、アイソトープ・ラベルを定量化（たとえば代謝の標識化（例えば、培養中の安定同位体でラベルされたアミノ酸（ＳＩＬＡＣ））を使用するＭＳの技術を使用して実行することができる。Olsen, J.V. et al. Cell 127, 635-648 (2006))，およびchemical derivatization (e.g., iTRAQ (Ross, P. L. ; et al. Mol Cell Proteomics 2004, 3, (12), 1154-69), ICAT (Gygi, S.P. et al. Nat Biotechnol 17, 994-999 (1999)), TMT (Dayon L et al, Anal Chem. 2008,Apr 15; 80(8):2921-31)。本発明の方法では、タンパク質修飾はフラグメントにされていないイオンの強度を測定するＬＣ−ＭＳ技術、またはフラグメントイオンの強度を測定するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術（たとえばマルチリアクションモニタリング（ＭＲＭ）という名でも呼ばれるセレクティドリアクションモニタリング（ＳＲＭ））で定量することができる。
【００８１】
本発明者は先に、系統的にＭＳベースのリン酸化プロテオミックス・データから蛋白質燐酸化酵素経路活性化を推論するための技術を考案した。この技術はキナーゼ基体富化分析（ＫＳＥＡ）と名付けられ、Casado P, et al,上掲およびＷＯ２０１３／１３２０７５として公表された特許出願に述べられている。
【００８２】
ＷＯ  ２０１３／１３２０７５に述べられているように、ＫＳＥＡ法は、以下を含むサンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法である：
（ｉ）  以下のパラメーターのうちの１つにより、単一のグループへ第１のサンプルからの修飾ペプチドおよび第２のサンプルからの修飾ペプチドをグループ化すること：
（ａ）同じタンパク質修飾酵素によって修飾される修飾部位がある修飾ペプチド；あるいは（ｂ）同じ修飾モチーフの一部である修飾部位がある修飾ペプチド；
（ｉｉ）グループ中の第２のサンプルからの修飾ペプチドと比較して、第１サンプルからの修飾ペプチドの富化を計算すること；および
（ｉｉｉ）前記富化の統計的有意差を計算すること；
ここで、統計的に有意な富化は、第２のサンプルと比較して、第１サンプル中で活性化されているタンパク質修飾酵素を示す。
【００８３】
同じタンパク質修飾酵素によって修飾される修飾部位がある修飾ペプチドを同定するために、ＫＳＥＡ方法は、文献およびデータベース（たとえばPhosphoSite (Hornbeck et al, Proteomics 4, 1551 (Jun, 2004)) およびPhosphoElm (Dinkel et al, Nucleic Acids Res 39, D261 (Jan, 2011)）に知られているリン酸化部位のコンパイルに基づく。しかしながら、そのようなデータベースは包括的ではない。本発明は、そのようなデータベースに基づかず、ＫＳＥＡ方法のために入力として使用することができるタンパク質修飾部位のデータベースの生成を許容する。特に、本発明の方法によって生産された修飾部位のデータセットを使用してコンパイルすることができるデータベースは、入力として上に記述されたＫＳＥＡ方法のステップ（ｉ）（ａ）に使用することができる。
【００８４】
本発明は修飾部位のデータセットを作成する方法であって、タンパク質修飾酵の第１のモジュレーターで処理された第１のサンプルからの修飾ペプチドと、同じタンパク質修飾酵の第２のモジュレーターで処理された第２のサンプルからの修飾ペプチドを、前記タンパク質修飾酵の第１および第２のモジュレーターの該修飾ペプチドへの効果により単一のグループにすることを含み、ここで該タンパク質修飾酵の第１および第２のモジュレーターは異なるものである。
１つの特定の実施態様では、本発明の方法は、以下を含む：
（ａ）キナーゼのパネルに対する阻害剤でサンプル（例えば細胞株からの細胞）を処理すること；
（ｂ）ＭＳベースのリン酸化プロテオミックス（phosphoproteomics）を使用して、リン酸化の結果として生じる変化を測定すること；
（ｃ）少なくとも１つのキナーゼ阻害剤によってアバンダンスが著しく低減される燐酸化部位を同定すること；
（ｄ）  燐酸化部位のグループ化を、同じキナーゼに対する阻害剤で処理した際の挙動に基づいて行うこと。
【００８５】
この方法の結果は、意図したキナーゼに特異的な燐酸化部位で富化されたデータセットである。
【００８６】
その後、本発明の第１の態様によって作成された修飾部位のデータセットは、データベースを形成するために使用することができる。従って、第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法による修飾部位のデータセットを作成すること、およびデータベースの中へ前記データセットをコンパイルすることを含むデータベースの形成方法を提供する。
【００８７】
データベースは、例えば、修飾部位を含むタンパク質の同一性、修飾のタイプ、修飾部位が存在するサンプルのタイプ、および／または修飾部位で修飾を増加させるか減少させるモジュレーターをはじめとする情報を含むことができる。次いでデータベースは、データ（たとえばリン酸化プロテオームデータ（例えば以前に本発明者によって考案されたＫＳＥＡ法））を分析する他の方法への入力として使用することができ、特定の化合物によって阻害されるか、修飾部位が見つけられる細胞の特定の表現型に関係しているキナーゼのマーカーまたはバイオマーカーを同定するために使用することができる。
【００８８】
第３の態様によれば、本発明は、以下を含む疾病の診断方法を提供する：
（ａ）  以下により修飾部位のテスト・データセットを作成すること：
ｉ．  タンパク質修飾酵素の１つ以上のモジュレーターで被検者からの１つ以上の試験サンプルを処理すること、
ｉｉ．  １つ以上の試験サンプル中の修飾ペプチド上の修飾部位を定量および／または同定すること、
ｉｉｉ．  １つ以上の試験サンプルからの修飾ペプチド上の修飾部位を単一のグループへグループ化し、修飾部位のテスト・データセットを作成すること、および
ｉｖ．  任意にテスト・データベースへテスト・データセットをコンパイルすること、
（ｂ）  テスト・データセットを本発明の第１の態様により作成された修飾部位のデータセットと比較すること、またはテスト・データベースを本発明の第２の態様によって作成されたデータベースと比較すること、
（ｃ）  テスト・データセットまたはテスト・データベースと、対照データセットまたは対照データベースとの間の有意差を見つけること、
（ｄ）  工程（ｃ）で見つけられたデータセットまたはデータベースの間の相違が有意である場合、その病気を持っていると診断すること。
【００８９】
疾病を診断する方法は典型的に生体外の方法である。
【００９０】
ステップ（ｂ）および（ｃ）は任意の適切な手段により行なわれることができる。ステップ（ｂ）は、本発明の第１の態様によって作られた修飾部位のデータセットに関する１つ以上の試験サンプルからの修飾ペプチド上の修飾部位のアバンダンスの増加または低減を計算すること、または本発明の第２の態様によって作成したデータベースとテストデータベースとを比較することを含むことができる。アバンダンスの低減または増加は、典型的に統計的に有意な低減または増加であり、たとえば実施例に述べられるような任意の適切な統計的手法を使用して計算することができる。
【００９１】
いくつかの実施態様では、その病気は癌である。
【００９２】
本発明は、さらに本発明の第３の態様により病気を診断すること、およびその病気を持っていると診断された対象者へタンパク質修飾酵素のモジュレーターを適用することをさらに含む治療法を提供する。第４の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様の方法により修飾部位のデータセットを作成すること、または本発明の第２の態様によってデータベースを作成することを含む、タンパク質修飾酵素の活性のための１つ以上のバイオマーカーを同定する方法を提供する。ここで単一のグループ中の修飾部位は、タンパク質修飾酵素の活性のための１つ以上のバイオマーカーであると確認されている。
【００９３】
第５の態様によれば、本発明は、検体がタンパク質修飾酵素のモジュレーターであることを決定する方法であって、試験サンプルを試験物質で処理すること、試験サンプル中の修飾ペプチド上の修飾部位を同定および／または定量すること、および試験サンプル中で同定および／または定量された修飾部位から修飾部位のテスト・データセットを作成することを含む方法であって、さらに以下を含む方法を提供する：
（ａ）  テスト・データセットを本発明の第１の態様の方法によって作られた修飾部位のデータセットと比較すること、および／または
（ｂ）  テスト・データベースへ前記テスト・データセットをコンパイルし、テスト・データベースを本発明の第２の態様によって作成されたデータベースと比較すること。
【００９４】
本発明の第２の態様およびさらなる態様のための好ましい特徴は、第１の態様に関するものを準用する。
【００９５】
以下において本発明は、例示のみのために示される以下の例への言及によりさらに記述される。例において、以下の多くの図が言及される：
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】リン酸化プロテオミックス・データは、キナーゼ阻害剤の関係を解明する。（Ａ）  実験計画法。ｉｈｎ、阻害剤。（Ｂ）  研究の中で使用されるキナーゼ阻害剤。（Ｃ）  そのアバンダンスが少なくとも１つの阻害剤治療によって有意に（調整されたＰ＜０．０５）低減された４，６５１燐酸化部位の主成分分析（ＰＣＡ）上に書いた数は（Ｂ）に記載された阻害剤の処理を表わすＰＣ、主成分。controlは対照。（Ｄ）  下部の三角形：阻害剤処理の各々間のピアーソン相関係数(Pearson correlation coefficients)既知のキナーゼ・キナーゼ関係は、白色の点線付きの箱で強調される。上部の三角形：各阻害剤の組み合わせにつき、４，６５１の燐酸化部位のｌｏｇ２倍比率(log2 fold-ratios)の対の配列。各箱の中のラインは、線形モデルが２つの変数間で形成されることを示す；各箱の中の楕円は、両方のディメンジョンの平均からの１つの標準偏差を表わす。（Ｅ）  フィルターされた４，６５１の燐酸化部位中に表わされた、共通リン酸化モチーフを含むペプチドについての平均ｌｏｇ２比率のアンスーパーバイズド階層的クラスタリング(unsupervised, hierarchical clustering)（Pearson相関距離メトリック）。
【００９７】
【図２】リン酸化プロテオミックス・データからのキナーゼ・シグナリング・ネットワーク・トポロジーの推論。（Ａ）  ２つのＡｋｔ阻害剤についての燐酸化部位ｌｏｇ２倍比率（対ＤＭＳＯコントロール）；ＭＫ−２２０６およびＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ点線は、ＣＴＡＭ同定用のしきい値を表わす。グラフ（左下）のマイナスの四分区域の中でより暗い印刷を使用して示された燐酸化部位は、Ａｋｔについて同定された化合物−目標の活性マーカー(compound-target activity markers:CTAM)を表わす。左端の点線の左側および下の水平の点線より下の暗く陰を付けられたデータポイント、両方の阻害剤について、ＦＲ≦−１．０，ａｄｊ．Ｐ≦０．１右端の点線の左側および上の水平の点線より下の暗く陰を付けられたデータポイント、両方の阻害剤について、ＦＲ≦−０．７５、ａｄｊ．Ｐ≦０．０５；阻害剤間の混合しきい値からのデータも示される。（Ｂ）  少なくとも１つのキナーゼのための化合物−目標の活性のマーカーであるとして同定された６１０の燐酸化部位。（Ｃ）  ＣＴＡＭグループへ分けられた燐酸化部位の実例。＊  ＦＲ≦−０．７５、ａｄｊ．Ｐ≦０．０５；＊＊  ＦＲ≦−１．０、ａｄｊ．Ｐ≦０．１；＊＊＊  ＦＲ≦−１．０、ａｄｊ．Ｐ≦０．０１．（Ｂ）でのように陰が付けられる（Ｄ）  未指向、ビパータイトネットワーク・グラフ(undirected, bipartite network graph)は、同定された活性マーカーをすべて示す。ネットワーク・グラフのレイアウトは、フォース−ディレクティド描画アルゴリズム（force-directed drawing algorithm)に基づく。大きなノードは、実験中でターゲットとされたキナーゼを表わす（ＭＡＰＫ−関連（ＥＧＦＲ、ＭＥＫ、ＥＲＫ）；ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ−関連（ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋ）；混合アソシエーション（Ａｋｔ、ＣＡＭＫ２、ＲＯＣＫ、ＰＫＣ））。より小さなノードは個々の燐酸化部位を表わす。灰色の端は、燐酸化部位はそれが接続されるキナーゼのＣＴＡＭかどうかを示す。
【００９８】
【図３】成長因子刺激へのＣＴＡＭグループ挙動の動力学。（Ａ）  成長因子で処理された細胞の各々の選択されたＣＴＡＭグループの一時的なプロフィール（ＥＧＦ：左パネル；ＩＧＦ−１：右パネル；ｍ＝ＣＴＡＭグループ中で定量された燐酸化部位の数）。データポイントは平均±標準偏差（ＳＤ）を表わす。＊＊＊  Ｐ＜０．００１；＊＊  Ｐ＜０．０１；＊  Ｐ＜０．０５．（Ｂ）  データセット中で表わされたＣＴＡＭグループの各々のための一時的なプロフィール（ｍ≧２）。データポイント・サイズは、平均ｌｏｇ２倍比率（対ｔ＝０分）に比例し、富化の統計的有意差にしたがつて陰がつけられる。アンスーパーバイズド階層的クラスタリングは、ユークリッドの距離メトリックに基づいた。（Ｃ）  各々の時間ポイントにおける定量化されたＣＴＡＭグループの各々についての変化の係数の分布。鉛直線はメジアンを示す。
【００９９】
【図４】ｍＴＯＲＣ１／２とＰＩ３Ｋの阻害剤に耐性の細胞内のシグナリング・ネットワーク活性の進化。ＧＤＣ−０９４１（Ａ）またはＫＵ−００６３７９４（Ｂ）が存在する状態での親と薬抵抗性ＭＣＦ７細胞培養の成長。データポイントは平均±ＳＤを表わす。（Ｃ）  親の（ｐａｒ．）細胞株と比較された耐性（ｒｅｓ．）細胞株の各々についてのＣＴＡＭグループ（ｍ≧２）プロフィール。ドットサイズは、未修飾のタンパク質アバンダンスに対して標準化された、親の細胞株に対する個々のＣＴＡＭグループの平均ｌｏｇ２倍比率を表わす。陰影は、富化の著しさを表わす。ＣＴＡＭグループの階層的クラスタリングはユークリッドの距離メトリックに基づいた。（Ｄ）  Ｃで示されるリン酸化プロテオームのデータのＰＣＡ。（Ｅ）  キナーゼ阻害剤（詳細な付録、図１４Ａに示される）のパネルでの処理の関数としての細胞の生存率データ（ＭＴＳによって測定された）のＰＣＡ。（Ｆ）  （Ｅ）のようにして、細胞の生存率は、クリスタルバイオレット染色（詳細な付録、図１４Ｂに示される）によって測定された。
【０１００】
【図５】ネットワークを定義するキナーゼ阻害剤で処理されたフォスフォプロテオメスについてのデータ要約。これは、図１および２に示されるデータの品質管理分析である。（Ａ）  フォスフォペプチド・イオン・データベース（１３，４０５ユニークエントリー）内のｑ−値の分布を示すヒストグラム。（Ｂ）  各サンプルについてのプレ四分位点正規化(quantile normalization)（上のパネル）およびポスト四分位点正規化（下のパネル）フォスフォペプチド・イオンｌｏｇ２強度分布を示すボックスプロット（Ｃ）保持時間を予測し説明するための、２つのサンプル間のエノラーゼ・ペプチド標準保持時間（ｔＲ）の例を示す（Ｄ）  個々の対のペプチド標準配列間で形成された線形モデルのためのピアソン相関係数（ｒ）の分布を示すヒストグラム。（Ｅ）  サンプル・アレイにわたるエノラーゼ・ペプチド標準保持時間の安定性を示すライン・プロット。各ラインの陰影は、単一のエノラーゼ・ペプチド・イオン（キーの中で表示されたとおり）に特有である。
【０１０１】
【図６】阻害剤処理間の相関の統計的有意差。各阻害剤処理間の相関の有意性を示すヒートマップ（図１Ｃでのように、少なくとも１つの阻害剤ペアによって著しくダウンレギュレートされることが見いだされた、４，６５１のフォスフォペプチド・イオンに基づく）。有意性は、Ｐ−値で示され（ピアソンのｒから計算され、Ｈｏｌｍプロシージャーを使用して、複数の試験のために調節された）、シェイデングによりコード化される。既知のキナーゼ・キナーゼ関係は、１Ｃでのような白の点線のボックスで協調して示される。
【０１０２】
【図７】選択された統計のしきい値の関数としての同定されたＣＴＡＭの数。棒は、示されたしきい値条件の下で同定されたＣＴＡＭの数を表わす。ＦＲ＝ｌｏｇ２倍比率；ａｄｊ。Ｐ＝Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正されたＰ−値を示す。デルタ＝マスコット・デルタ（δ）スコア。
【０１０３】
【図８】ＭＳの生データの例。生のＭＳのデータは、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ＰＩ３Ｋ  ＣＴＡＭグループのメンバーとしてＡＫＴ１Ｓの同定を支援する。生のＭＳのデータは、ｍ／ｚ  ６９８．３５８８（±７ｐｐｍ）でＡＫＴ１Ｓ（Ｓ１８３）を表わすフォスフォペプチドについてイオン・クロマトグラム（ＸＩＣ）抽出した。ラインはキーで概説されるような第１のアイソトープ、第２のアイソトープおよび第３のアイソトープの一時的な溶出プロフィルを表わす（各例では、最も高いピークが第１のアイソトープを表わし、２番目に高いピークが第２のアイソトープを表わし、最低のピークが第３のアイソトープを表わす）。点線は、各サンプルでフォスフォペプチドについて予測された保持時間を表わす。Ａｋｔ１（Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ）；Ａｋｔ２、ＭＫ−２２０６；ｍＴＯＲ１、ＫＵ−００６３７９４；ｍＴＯＲ２、Ｔｏｒｉｎ−１；ＰＩ３Ｋ１、ＧＤＣ−０９４１；ＰＩ３Ｋ２、ＰＩ−１０３。
【０１０４】
【図９】定義されたネットワークのトポロジーの無作為化。（Ａ）  図２Ｄの中で示されるような経験的に定義されたキナーゼ・シグナリング・ネットワーク。（Ｂ）  オリジナルに最も似ていないネットワークを生産するのに必要なスイッチングすステップの数の最適化。鉛直線は、後のネットワーク無作為化の試みの中で使用されるスイッチングステップの数。（Ｃ）  １０，０００の無作為化されたネットワーク（５０，０００スイッチングステップを使用して生産された）のうちの１つの例。（Ｄ）  無作為化されたネットワーク中の示されたキナーゼ間のＣＴＡＭオーバーラップの分布。曲線は、１０，０００の無作為化されたネットワークの中で観察されたオーバーラップの確率密度関数（Ｃのように）；鉛直線（実際のネットワークの中で観察されたオーバーラップ（Ａのように）。
【０１０５】
【図１０】成長因子でのＭＣＦ７細胞の刺激についてのデータ要約。これは、図３に示されたデータの品質管理分析である。（Ａ）  フォスフォペプチド・イオン・データベース（１４，５５９ユニークエントリー）内のｑ−値の分布を示すヒストグラム。（Ｂ）  各サンプルについてのプレ四分位点正規化(quantile normalization)（上のパネル）およびポスト四分位点正規化（下のパネル）フォスフォペプチド・イオンｌｏｇ２強度分布を示すボックスプロット（Ｃ）  保持時間のシフトを予測し説明するために、ネットワークを定義する実験（図５−実験１）および成長因子刺激実験（実験２）からの２つのサンプルの間の、エノラーゼ・ペプチド標準保持時間（ｔＲ）の例を示す。（Ｄ）  ネットワークの定義と成長因子実験の両方の実験中の、それぞれの対のペプチド標準配列間で形成された線形モデルについてのピアソン相関係数（ｒ）の分布を示すヒストグラム。（Ｅ）  サンプル・アレイにわたるエノラーゼ・ペプチド標準保持時間の安定性。各ラインのシェイデングは、単一のエノラーゼ・ペプチド・イオンに特有である（キーの中で表示される）。
【０１０６】
【図１１】ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒの下流の燐酸化部位の原動力の例。次に成長因子のどちらかでの刺激を行う、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒの下流として知られているいくつかの燐酸化部位についてのｌｏｇ２倍比率（ｔ＝０に対して）を示すヒートマップマスコット・デルタ・スコア≧１０を示す燐酸化部位は、タンパク質名、ペプチド・チャージ（ｚ）±他のペプチド修飾として表される。マスコット・デルタ・スコア≦１０を示すものは、タンパク質名、燐酸化部位が存在する残基、ペプチド・チャージおよび予測された修飾として表わされる。凡例の中で概説されるように、アスタリスクは統計的有意差（調整されたＰ−値）を示す。（Ｂ）  Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ経路を活性化する既知のＥＧＦ／ＩＧＦ感受性の燐酸化部位についてのウェスタンブロット。
【０１０７】
【図１２】耐性細胞株および親の細胞の量的リン酸化プロテオミックスおよびプロテオミクス比較のためのデータ要約。これは、図４に示されるデータの品質管理分析である。（Ａ）  フォスフォペプチド・イオン・データベース（１５，３２５ユニークエントリー）内のｑ−値の分布を示すヒストグラム。（Ｂ）  各サンプルについてのプレ四分位点正規化（上のパネル）およびポスト四分位点正規化（下のパネル）フォスフォペプチド・イオンｌｏｇ２強度分布を示すボックスプロット（Ｃ）  保持時間のシフトを予測し説明するために、ネットワークを定義する実験（図５−実験１）および成長因子刺激実験（実験３）からの２つのサンプルの間の、エノラーゼ・ペプチド標準保持時間（ｔＲ）の例を示す。（Ｄ）  ネットワークの定義と成長因子実験の両方の実験中の、それぞれの対のペプチド標準配列間で形成された線形モデルについてのピアソン相関係数（ｒ）の分布を示すヒストグラム。（Ｅ）  サンプル・アレイにわたるエノラーゼ・ペプチド標準保持時間の安定性。各ラインのシェイデングは、単一のエノラーゼ・ペプチド・イオンに特有である（キーの中で表示される）。
【０１０８】
【図１３】阻害剤で処理された耐性細胞株中のＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲＣ１／２の下流にあることが報告された燐酸化部位の例。ＰＩ３ＫとｍＴＯＲＣ１／２の下流であると知られているいくつかの燐酸化部位の親の細胞株と、ｌｏｇ２化学量論比率（燐酸化部位のｌｏｇ２倍比率／タンパク質のｌｏｇ２倍比率）を示すヒートマップマスコット・デルタ・スコア≧１０を示す燐酸化部位は、タンパク質名、ペプチド・チャージ（ｚ）±他のペプチド修飾として表される。マスコット・デルタ・スコア≦１０を示すものは、タンパク質名、燐酸化部位が存在する残基、ペプチド・チャージおよび予測された修飾として表わされる。  凡例の中で概説されるように、アスタリスクは統計的有意差（調整されたＰ−値）を示す。（Ｂ）  Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ＰＩ３Ｋ経路活性の既知のマーカーについてのウェスタンブロット。
【０１０９】
【図１４】キナーゼ阻害剤のパネルで処理された抵抗性細胞株および親細胞株についての細胞の生存率データ。棒は、各キナーゼ阻害剤について、阻害剤単独と耐性細胞ラインとの組み合わせについて細胞の生存率（ＤＭＳＯ対する）の平均ｌｏｇ２倍比率を示す。（ＭＣＦ７Ｇ、中実、暗いシェイディング、上のパネル（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３）；ＭＣＦ７−Ｋ、中実、明るいシェイディング、下のパネル（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）；ＭＣＦ７Ｐ、点線の白い棒（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）。ＭＴＳ（Ａ）とクリスタルバイオレット分析（Ｂ）により決定された。エラーバーは、各場合（ｎ  ＝  ３）の平均からの標準偏差を表わす。これらのデータは、図４Ｅの中で示されたＰＣＡのための入力だった。ＰＩ３Ｋｉ＝１μＭ  ＧＤＣ−０９４１；ｍＴＯＲ−ｉ＝１μＭ  ＫＵ−００６３７９４；Ａｋｔ−ｉ＝１μＭ  ＭＫ−２２０６；ＣＡＭＫ２＝ｉ＝５μＭ  ＫＮ−９３；ＥＧＦＲｉ＝１μＭ  ＰＤ−１５３０３５；ＭＥＫｉ＝０．５μＭ  ＧＳＫ−１１２０２１２。
【０１１０】
実施例
方法
細胞株
親のＭＣＦ７細胞株およびＭＣＦ７−Ｇ１、ＭＣＦ７−Ｇ２、ＭＣＦ７−Ｇ３、ＭＣＦ７−Ｋ１、ＭＣＦ７−Ｋ２およびＭＣＦ７−Ｋ３耐性細胞は、５％のＣＯ２の湿潤大気中の３７℃でＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清および１００Ｕ．ｍＬ−１ペニシリン／ストレプトマイシンで補われた）中で培養された。処理の後に、テキスト中で示されるように、細胞は尿素細胞融解バッファー中で溶解され、タンパク質はトリプシンで消化された。
質量分析ベースのリン酸化プロテオミックス。リン酸化ペプチドは、以前に記述された方法(Casado et al. (2013) Sci.Signal. 6(268):rs6., Montoya et al (2011) Methods 54(4):370-378)にいくつかの修飾を備えた方法でＴｉＯ２ビーズ(GL Sciences)を使用して富化され、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された。ペプチドは、SwissProt human protein データベースに対するマスコット検索によって同定された。ペプチド定量化は先に記載されたように(Casado et al. (2013) Sci. Signal. 6(268):rs6.)Pescaｌを使用して達成された。
【０１１１】
統計分析。
データの四分位点正規化  (Bolstad et al (2003) Bioinformatics 19(2):185-193)に続き、条件間での違いの大きさおよび統計的有意差は、Ｒ計算環境でのリメラパッケージを使用した標準偏差の経験的なＢａｙｅｓ収縮を使用して計算された (Smyth (2004) Stat. Appl. Genet. Molec. Biol. 3(1):Article3)、(Smyth (2005) Limma:マイクロアレイデータ用の線型モデル (Springer New York); R Core Team (2013) R: 統計計算のための言語と環境(R Foundation for Statistical Computing))。先に述べたように、ＣＴＡＭのアバンダンスは系統的にＫＳＥＡ（キナーゼ基体富化分析）を使用してモニターされた(Casado et al. (2013) Sci. Signal. 6(268):rs6; Casado et al. (2013) Genome Biol. 14(4):R37; Montoya et al (2011) Methods 54(4):370-378; Alcolea et al (2012) Mol. Cell. Proteomics 11(8):453-466)。
【０１１２】
これらの方法の詳細な記述は詳細な材料および方法中で提供される。
詳細な材料および方法
試薬
Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ、ＫＵ−００６３７９４、ＧＤＣ−０９４１、ＰＩ−１０３およびＹ−２７６３２は、Ｃｈｅｍｄｅａから得られた。ＫＮ−９３、ＫＮ−６２、ＰＤ−１６８３９３およびＰＤ−１５３０３５  ＥＲＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤ＩＩ、Ｕ０１２６、ＰＦ−４７０８６７１、ＤＧ２、Ｇｏ（ウムラウト）−６９７６、ビスインドーリルマレイミド−１、オカダ酸、カンタリジン酸およびＨ−１１５２は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）から得られた。ＧＳＫ−１１２０２１２およびＭＫ−２２０６はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから得られた。Ｔｏｒｉｎ−１はＡｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍから得られた。ヒト組み換えのＥＧＦ（ＡＦ−１００−１５）およびＩＧＦ−１（１００−１１）はＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入された。
【０１１３】
細胞株
ＭＣＦ７細胞（遺伝子型決定分析によって同一性が確認された）は、５％のＣＯ２の湿潤大気中の３７℃でＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清および１００のＵ．ｍＬ−１ペニシリン／ストレプトマイシンで補われた）の中でルーチンとして維持された。オリジナルの親の細胞由来の抵抗性ＭＣＦ７細胞株は、およそ６か月の期間、ＧＤＣ−０９４１またはＫＵ−００６３７９４濃度（最高１μＭまで１００  ｎＭからスタート）を徐々に増加させることにより得られた。結果として生ずるクローン（ＭＣＦ７−Ｇ１：Ｇ３およびＭＣＦ７−Ｋ１：Ｋ３）はその後、ＭＣＦ７ＧおよびＭＣＦ７Ｋ細胞についてそれぞれ、１μＭ  ＧＤＣ−０９４１またはＫＵ−００６３７９４（ＤＭＳＯ中）のいずれかが存在する状態で、ルーチンとして維持された。
【０１１４】
溶菌およびタンパク質消化。
細胞は実験の７２時間前に、４×１０５ｃｅｌｌｓ．ｐｌａｔｅ−１で分割され接種された。各プレート中のミディアムは実験の２４時間前に交換された。実験はそれぞれ生物学の二重反復試験で行なわれた。ネットワーク定義実験については、細胞は１時間阻害剤またはビヒクル（ＤＭＳＯ）の各々で処理された（表１）。成長因子刺激実験については、細胞は２４ｈ間飢えさせ、０、５、１０、３０、または６０分間５０ｎｇ．ｍＬ−１  ＥＧＦまたはＩＧＦのいずれかで続いて処理された。耐性細胞ライン実験については、後処理は行なわれなかった。ＭＣＦ７Ｐおよび−Ｇ１：３細胞株のリワイヤリング実験(rewiring experiments)については、細胞は２４ｈ間飢えさせ、続いて、０、３０、６０、または１２０分間、５０ｎｇ．ｍＬ−１  ＥＧＦで処理された。処理に続いて、細胞は、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および１ｍＭ  ＮａＦで補われた氷冷燐酸塩緩衝食塩水で３回洗われ、尿素細胞融解バッファー［１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ２Ｐ２Ｈ２Ｏ７および１ｍＭβ中の８Ｍ尿素−グリセリンリン酸で補われた２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）中の８Ｍ尿素］で溶解された。溶解物はプローブ超音波処理（３つの１０ｓパルス）によってさらに均質化され、ついで不溶性の材料が遠心分離によって除去された。タンパク濃度はＢｒａｄｆｏｒｄまたはＳｍｉｔｈ分析を使用して評価された。一般的なタンパク濃度（２５０または５００μｇ）へ各条件を標準化した後に、サンプルはそれぞれ、暗所中で、室温で３０分、１０ｍＭジチオトレイトールおよび１６．６ｍＭヨードアセトアミドでの連続するインキュベーションによって還元されアルキル化された。タンパク質消化については、尿素濃度は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）の追加によって低減された。不動化されたトシル−リジン・クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）−トリプシン［２０  ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニン  メチルエステル（ＴＡＭＥ）ｕｎｉｔｓ．ｍｇ−１］が加えられ、３７℃で一晩サンプルをインキュベートした。トリプシン・ビーズは遠心分離により除去され、結果として生ずるペプチド溶液は真空マニホールドを使用して、３０ｍｇオアシス−ＨＬＢカートリッジ(Waters, Manchester, UK)で脱塩された。簡潔に、オアシス・カートリッジはアセトニトリル（ＡＣＮ）でコンディショニングされ、洗浄溶液（０．１％ＴＦＡ、１％ＡＣＮ）で平衡にされた。ペプチドはカートリッジにロードされ、１ｍＬ洗浄溶液で洗われた。最後に、ペプチドは、グリコール酸バッファー１（１Ｍグリコール酸、５％ＴＦＡ、５０％ＡＣＮ）で溶出された。全蛋白を分析する時、親およびオリジナルの耐性細胞ライン溶解物のアリコートが得られ、上記のように、サンプルは６０％のＡＣＮ（４０％のＨ２Ｏ）を備えたＯＡＳＩＳカートリッジから溶出されたことを除いて処理され、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥され、さらなる分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０１１５】
フォスフォペプチド富化
リン酸化ペプチドは、先の詳細な方法で概説されたいくつかの変更を加えて（１，２）、ＴｉＯ２(GL Sciences)を使用して富化された。簡潔に、ペプチド溶離剤は、グリコール酸バッファー２（１Ｍグリコール酸、５％ＴＦＡ、８０％ＡＣＮ）で標準化され、室温で５分、ＴｉＯ２（１％ＴＦＡ中の５０％スラリー）の５０μＬでインキュベートされた。
ビーズは遠心分離によってペレットにされ、上澄みの８０％が除去され、氷の上で貯蔵された。残りの溶液にビーズが再懸濁され、遠心分離によって下洗いされた空の、ＰＥろ過されたスピンチップ（Ｇｌｙｇｅｎ、ＭＤ、アメリカ）内に詰められた。残余のビーズはさらにグリコール酸バッファー２で再懸濁され、チップに詰められた。残りのペプチド溶液は、氷から取り除かれ、遠心分離によってパックされたＴｉＯ２ビーズの上で洗われた。その後、パックされたチップは、グリコール酸バッファー２、酢酸アンモニウム・バッファー（１００ｍＭ酢酸アンモニウム；２５％ＡＣＮ）および１０％ＡＣＮで連続して洗われた後、３回繰り返された。フォスフォペプチドは遠心分離され溶出され、１０％ＡＣＮ中の５％ＮＨ４ＯＨで４回連続して洗浄された。結果として生じるフォスフォペプチド溶液はスナップ凝固(snap-frozen)され、ＳｐｅｅｄＶａｃの中で乾かされ、−８０℃で格納した。
【０１１６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳリン酸化プロテオミックス分析。
乾燥したフォスフォペプチド・抽出物は、２０  ｆｍｏｌ．μＬ−１のエノラーゼ消化物(Waters, Manchester, UK)を含む０．１％ＴＦＡ（５％のＡＣＮ）の２０μＬの中で再懸濁された。個々の技術的な複製については、各サンプルの３．０μＬが、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−Ｖｅｌｏｓ質量分析計(Thermo Fisher Scientific)にオンラインでつながれた、Dionex Ultimate nRSLC 3000 LＣシステム（Thermo Fisher Scientific)にロードされた。サンプルは、Acclaim PepMap RSLC カラム（２５ｃｍ  ｘ  ７５μｍ、２μｍ、１００オングストローム）上の５および３５％ＡＣＮの間で８５分の直線濃度勾配で分離された、各ＭＳ１走査で最も強度の大きな多価イオンのトップ７つが選択され、衡突−誘起解離切断(collision-induced dissociation fragmentation)（多段活性化可能）に供された。ＭＳ１の解像度は３０，０００ＦＷＨＭにセットされた。サンプルはそれぞれ３回繰り返して分析された。
【０１１７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクス分析。
乾燥したペプチド抽出物は、０．１％ＴＦＡ、３％ＡＣＮ中の、０．５μｇ．μＬ−１の終末濃度に再懸濁された。個々の技術的な複製については、各サンプルの４．０μＬが上に記述されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムにロードされた。サンプルは、３および３２％のＡＣＮの間の１２０分の直線濃度勾配で分離された、また、各ＭＳ１走査で最も強度の大きい多価イオンのトップ１０が、衡突−誘起解離切断に選ばれた。ＭＳ１の解像度は３０，０００ＦＷＨＭにセットされた。サンプルはそれぞれ２回分析された。
【０１１８】
フォスフォペプチド同定および定量化
ペプチド同定は、マスコット・サーバー・バージョン２．３を利用してＵｎｉｐｒｏｔ−Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのヒト蛋白質データベース（２０，２３３のエントリーを含んでいる２０１２年１０月のリリース）への、デアイソトープされたＭＳ／ＭＳのデータとのマッチングにより行なわれた。Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒバージョン２が、マスコットジェネリックフォーマットでのピーク・リストを生成するために使用された。サンプルは、先のデータベースのスクランブルドバージョンに対しても探索された。質量許容差は、前駆物質とフラグメントイオンのそれぞれについて１０ｐｐｍおよび６００ｍｍｕにセットされた。リン酸化プロテオミックス実験については、許容された修飾変化はフォスホ−Ｓｅｒ、フォスホ−Ｔｈｒ、フォスホＴｙｒ、ピロ−Ｇｌｕ（Ｎ末端）、および酸化−Ｍｅｔだった。サンプルの各々からの同定されたフォスフォペプチドが収集され、照合された。また、フォルスディスカバリーレイト(FDR:false-discovery rate)はインハウスのスクリプトを使用して、計算した（スクランブルドデータベースとの比較によって）。ＦＤＲ＜５％のユニークなフォスフォペプチド・イオンはインキュベートされ、その後の分析に含まれた。これらのセッティングを使用して、＞９５％のペプチドが、ＦＤＲ＜１％の確率を持っていた（図５）。同定された活性マーカーの追加を保証するために、成長因子および耐性細胞ライン実験からのデータベースは、オリジナルのネットワーク発見データベースと融合された。我々のグループ（１−４）と第３者（５，６）によって以前に記述されたようにして、ペプチド定量化が行なわれた。簡潔に、Ｐｅｓｃａｌソフトウェア（Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ２．７で書かれた）が、データベース中のフォスフォペプチド・イオンの各々の抽出されたイオン・クロマトグラムのピーク高さを得るために比較されているサンプルのすべてにわたり使用された。各サンプル中の各フォスフォペプチド・イオンの保持時間は、各サンプル内にエノラーゼ標準ペプチドをスパイクさせアラインメントすることにより予測した。これはイン−ハウスの線形モデル化アルゴリズムを使用して、各サンプル内の各フォスフォペプチドについての抽出されたイオン・クロマトグラムから得られたクロマトグラフィーのピークの積算により行われた。このアプローチは、多重選択された反応モニタリングにおけるアラインされた保持時間について報告された実験に類似する（７）。質量−荷電（ｍ／ｚ）および保持時間（ｔＲ）の寛容度は、それぞれ７ｐｐｍおよび１．５分にセットされた。プロテオミクス・データは上記のように処理された；しかしながら、タンパク質同定は、マスコット・ペプチド・スコア≧２０，およびマスコット蛋白質スコア≧６０の２以上のペプチドについてのみ推測された。
【０１１９】
統計分析およびデータ視覚化。
データの四分位点正規化（８）に続き、リン酸化変化の大きさと有意性を評価するための統計分析が、線形のモデル化戦略および標準偏差の経験的なＢａｙｅｓ収縮を使用して行なわれた（９）。得られたＰ値は、Benjamini-Hochberg手続きを使用して、複数の試験のために修正された。記述された分析はすべて、Ｒ統計計算環境（ｖ３．０．０）内のｌｉｍｍａパッケージ（ｖ３．１６．２）を使用して行なわれた（１０，１１）。データセットは個々のＲパッケージの組み合わせを使用して視覚化された：すなわち、ｇｇｐｌｏｔ２、ｇｐｌｏｔｓ、ｒｅｓｈａｐｅ２、ｉｇｒａｐｈおよびＲＣｙｔｏｓｃａｐｅを使用した（１２−１６）。ネットワーク・グラフはＣｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェア・パッケージ（ｖ２．８．３）（１７）の内に構築され、ＢｉＲｅｗｉｒｅ  Ｒパッケージ（１８）を使用して無作為化された。Ｌｏｇ２倍化学量論比率は、個々の燐酸化部位のｌｏｇ２倍比率（対コントロール）から全蛋白の計算されたｌｏｇ２比率（対コントロール）を引くことにより計算された。
【０１２０】
キナーゼ基体富化分析およびモチーフ分析  
同定されたマーカーの各々のアバンダンスは、先に記述した（１）ように、系統的にＫＳＥＡ（キナーゼ基体富化分析）を使用してモニターされた。簡潔には、先にＣＴＡＭであると同定された成長因子および耐性細胞ライン実験内で同定されたフォスフォペプチド・イオンが、データセットから系統的に抽出された。各ＣＴＡＭグループを表わす燐酸化部位のｌｏｇ２倍比率（対コントロール）の平均は、その後各平均について標準偏差（δ）とともに計算された。その後、富化の有意性は、Ｚスコアに基づいたアプローチを使用し、下記式を使用して、Ｐ値として表現されて決定された：Ｚ（Ｓｍ−μｔ）＝ｍ１／２／δｔ；ここでＳｍ＝ＣＴＡＭグループｌｏｇ２倍比率の平均である；μｔ＝合計のデータセットｌｏｇ２倍比の平均である；ｍ＝ＣＴＡＭグループ内の個々のフォスフォペプチドの数；δｔ＝合計のデータセットｌｏｇ２比率（対コントロール）の標準偏差（１９）。（１）でのように、モチーフ分析が行なわれた。簡潔には、調査中のフォスフォペプチドは、それらが示すコンセンサス／共通モチーフに従って最初にグループ化された。平均ｌｏｇ２倍比率（対ＤＭＳＯコントロール）は、次いで各条件の下での各モチーフ・グループについて計算された。
【０１２１】
ＣＴＡＭ同定アルゴリズム
燐酸化部位は最初にフィルターにかけられ、マスコットδ−スコア≧５を有するもののみを含むようにされた。各キナーゼ阻害剤の活性マーカーは、次いでｌｏｇ２倍比率≦１（すなわちアバンダンスの５０％の線形減少）を備えた燐酸化部位の選択により同定され、Ｐ値は≦０．１、または各阻害剤についてより小さな変化（ｌｏｇ２倍比率≦  ０．７５）で、大きな有意性（Ｐ≦０．０５に調整された）を有するものが同定された。同じキナーゼをターゲットとする両方の阻害剤処理の下での上記のしきい値に適合する燐酸化部位は、化合物−目標活性のマーカー（ＣＴＡＭ）であると同定された。
【０１２２】
細胞の生存率分析
Ｐａｒｅｎｔａｌ  ＭＣＦ７，  Ｇ１：３  および  Ｋ１：３  セル−ラインがウエルあたりほぼ５，０００  細胞の密度で９６−ウエルにシードされた。実験は３回行われた。
２４時間後、細胞は、ＧＤＣ−０９４１、ＫＵ−００６３７９４、ＭＫ−２２０６、ＫＮ−９３、ＰＤ−１５３０３５、ＧＳＫ−１１２０２１２またはＤＭＳＯの示された濃度／組み合わせで処理された（表１）。阻害剤で４８時間処理した後、細胞増殖がＭＴＳ分析(Promega, WI, USA)またはクリスタルバイオレット染色で決定された。ＭＴＳ分析のために、各々のウエルの吸光度（４９０ｎｍ）を分光測光器で測定し、次いで試薬とともに１２０分のインキュベーションを行った。実験は２回行われた。クリスタルバイオレット染色については、細胞は、氷の上で３０分、１００μＬ．ｗｅｌｌ−１のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中の４％ｗ／ｖ）で固着され、室温で１０分、１００μＬ．ｗｅｌｌ−１のクリスタルバイオレット（２０％ＭｅＯＨ中の０．５％ｗ／ｖ）で染色され、ｄｄＨ２Ｏで２度洗われた。洗浄に続いて、クリスタルバイオレットは、１００μＬ．ｗｅｌｌ−１  Ｓｏｒｅｎｓｅｎバッファー（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、５０％ＥｔＯＨ、ｐＨ  ４．２）を使用して、再懸濁された。また、各々のウエルの吸光度（５４０ｎｍ）が２回測定された。その後、各濃度データポイントの吸光度対コントロール（ＤＭＳＯ）処理された細胞の吸光度の比率を計算し、対数変換し、それぞれの２回のセットの平均を計算した。
表１  実験で使用された小分子阻害剤
【０１２３】
【表１−１】
2018518954.tif 000002
【０１２４】
【表１−２】
2018518954.tif 000003
【０１２５】
【表１−３】
2018518954.tif 000004
【０１２６】
細胞増殖分析。
Ｐａｒｅｎｔａｌ  ＭＣＦ７，Ｇ１：３およびＫ１：３セル−ラインがウエルあたりほぼ８０，０００  細胞の密度で１２−ウエルプレートにシードされた。実験は３回行われた。
示された時間の後、細胞はＰＢＳで洗われ、トリプシン処理され、Beckman Coulter Vi-CELＬ  ＸＲ細胞カウンタを使用して数えた。Ｒ（ｖ３．０．０）内にｇｇｐｌｏｔ２パッケージ（ｖ０．９．３．１）を使用して、２次元多項式にデータフィットした。
【０１２７】
イムノブロッティング
細胞は、細胞融解バッファー（５０のｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ７．４］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００；１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭβ−グリセリンリン酸、２．５ｍＭ  Ｎａ２Ｐ２Ｈ２Ｏ７、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル［シグマＡｌｄｒｉｃｈ］）が補足されたものの中で溶解された。サンプルは、１２％または４−１５％の勾配プレキャストゲル  （ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。タンパク質は、メーカーの指示に従い、BioRad Trans-Blot Turbo システムを使用して、ＰＶＤＦ薄膜に転送された。一旦転送されたならば、薄膜は、０．１％のトゥイーン−２０で補われたトリス緩衝食塩水中の５％ｗ／ｖ脱脂粉乳でブロックされた。ブロックされた薄膜は、第１および第２の抗体とともにインキュベートされ、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific）で展開された。第１の抗体は１：５００または１：１０００稀釈で使用された。また第２の抗体は１：５０００稀釈で使用された。
【０１２８】
補足の参照（これらは詳細な資料および方法にのみ当てはまる）
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【０１２９】
結果
我々は、燐酸化部位を、細胞シグナリングの阻害剤に反応したモジュレーションのパターンによって定義されたグループに分類した。我々はキナーゼのパネルに対して単一の小分子阻害剤でＭＣＦ７細胞を処理し、ＭＳベースのリン酸化プロテオミックスを使用して、リン酸化の結果として生じる変化を測定した（図１Ａ）。２０の構造上別個のキナーゼ阻害剤、２つのホスファターゼ阻害剤またはＤＭＳＯビヒクル対照は、実験に使用された状態だった（図１Ｂ）。実験中でターゲットとされたキナーゼおよび使用される阻害剤は、成長因子および代謝のシグナリングへのそれらの既知の関与、およびそれらの現在の治療の可能性に基づいて選ばれた。
【０１３０】
ＭＳの実験は、１つの条件当たり６つの分析的な複製（３つの技術的、また２つの生物学的）にわたり合計１３，４０５のユニークなフォスフォペプチド・イオンの同定に帰着した。これらのデータの品質管理の要約は図５に示される。フォスフォペプチドはそれぞれ先に記述されたラベルなしの方法論（１８，１９）を用いて、すべての実験条件にわたり定量され、１，９３０，３２０のデータポイントを生成した。
【０１３１】
リン酸化プロテオミックス・データは、それらが阻害する目標に基づいたキナーゼ阻害剤の分類を許可する。
我々は、少なくとも１つのキナーゼ阻害剤（Ｐ≦０．０５に調整された）によって、４，６５１の燐酸化部位でのアバンダンスが著しく低減されることを観察した。これらの部位に対する阻害剤のグローバルな影響を評価するために、我々は主成分分析（ＰＣＡ）を使用した。この多変量解析方法は、基礎資料の全体の構造に基づいた実験条件の分離を許可する。阻害剤で処理されたフォスホプメテオムズのＰＣＡは、阻害剤の残りに対するよりも主成分スペースで互いに同じキナーゼに対する阻害剤が互いに接近していることを実証し、同じキナーゼに対する阻害剤がグローバルなリン酸化に対する同様の影響を生じたことを示した。この観察のただ一つの例外はＥＲＫ阻害剤だった；これらはサイズ的にＰＣ２ではなくＰＣ１に近く、フォスホプメテオムズに対してわずかに異なる量的効果があったことを示唆する。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナリング軸（ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋ）と関係するものから、ＭＡＰＫシグナリング・カスケード（ＥＧＦＲ、ＭＥＫおよびＥＲＫ）と関係するキナーゼに対する阻害剤が分離され、Ａｋｔの阻害剤は、その有名な上流の活性化体であるＰＩ３Ｋの阻害剤によりもＥＧＦＲとＣＡＭＫ２の阻害剤とより緊密にあった。期待されるように、ＰＰ２Ａ（プロテインフォスファターゼ）をターゲットとする阻害剤は、キナーゼ阻害剤から良好に分離される。相関行列を使用する分析は、ｍＴＯＲ、ＡｋｔおよびＰＩ３Ｋ阻害剤、並びにＥＧＲＦ、ＥＲＫおよびＭＥＫ阻害剤ペアの間で観察された関係を強化した（図１Ｄ）。各相関の統計的有意差は図６に示される。モチーフ分析（１４）は、強く相関する阻害剤ペアは、特定のリン酸化モチーフへ衝撃を与え、図１Ｃおよび１Ｄ（図１Ｅ）に見られる関係を鏡のように写す。ともに、これらのデータは、同じキナーゼに対する阻害剤は、残りの阻害剤よりもフォスホプロテオムスとより類似する変化をもたらしたことを示す。Ａｋｔは例外であり、同じ標準的な経路に対するものは、燐酸化部位の共通のセットに影響した。
【０１３２】
リン酸化プロテオミックス・データからの阻害剤目標の誘導活性マーカー(Deriving activity markers)
データセットに追加レベルの分類を提供するために、我々は、同じキナーゼに対する阻害剤での処理の下のそれらの行動に基づいて燐酸化部位をさらにグループ化した。この段階で選択された燐酸化部位の数は、選択に使用されたしきい値に厳格に依存した（図７）。最も重要なことには、我々は、同じキナーゼをターゲットとする両方の阻害剤処理での必要な統計的しきい値に達した燐酸化部位だけを選択した。同じキナーゼをターゲットとする構造上別個の化合物によって阻害された燐酸化部位の選択は、意図したキナーゼに特異的な燐酸化部位で富化したデータセットに帰着するに違いない。これは図２Ａで説明される。これは２つの異なるＡｋｔ阻害剤（ＭＫ−２２０６およびＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ）によって調整された燐酸化部位について、それは両方の阻害剤によって阻害された燐酸化部位を示す（図２Ａの下の水平な点線より下および左端の点線の左の暗いデータ点）（ＦＲ≦−１．０）。並びに１つの化合物によって特異的に阻害されるが他の化合物によっては阻害されない部位（下の水平な点線より上および２番目に高い水平な点線の下の暗いデータ点；左端の垂直な点線の右の暗いデータ点および左から２番目の垂直な点線の左の暗いデータ点を示す（図２Ａ中の−０．７５＜ＦＲ＞−１．０））。
【０１３３】
我々は、Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩによっては阻害されないがＡｋｔ阻害剤ＭＫ−２２０６によって抑制される部位、およびその逆の部位は、オフ−ターゲット効果であり、両方の化合物によって阻害される部位がより真にＡｋｔの下流であるとの仮説を立てた。この分析は、研究（図１Ａ）でターゲットとされた１０キナーゼの各々のために行なわれ、少なくとも１つの阻害剤ペア（つまり同じキナーゼに対する両方の阻害剤による）によってアバンダンスが低減された６１０の燐酸化部位を明らかにした。直接意図した目標キナーゼによって必ずしも直接燐酸化されないが、下流に作用するキナーゼ、または密接に関連するキナーゼによって燐酸化することができたので、これらの部位は阻害剤／化合物によって影響を受けた実際のキナーゼの読み出しであり、したがって我々はそれらを化合物−目標活性のマーカー（compound-target activity markers:CTAM)と呼ぶ。
【０１３４】
リン酸化プロテオミックス・データからのシグナリング・ネットワーク・トポロジーの推論
６１０の同定されたＣＴＡＭ燐酸化部位の視覚化は、多くのそれらが１つ以上の化合物−目標ペアののマーカーであると確認されることを同時に明らかにした（図２Ｂ）。したがって、阻害剤ペアの関係をさらに調査し、かつデータからシグナリング・ネットワーク・トポロジーの推論を許可するために、６１０のＣＴＡＭ燐酸化部位はこれらが１つ以上の阻害剤ペアによって阻害されたかどうかに基づいて、さらに分類された。キナーゼ・シグナリング・トポロジーの多くの既知のパターンは、この分析から出現した（図２Ｃ）。例えば、我々は、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６ＫおよびＰＩ３Ｋに対する阻害剤ペアによって阻害された４１の燐酸化部位を同定した（図２Ｃ）。予備知識と一致して、これらの部位は、ＢＡＤのもの、ＫＳ６Ｂ１（ｐ７０Ｓ６Ｋ１）のＳｅｒ４２７およびＲＩＣＴＯＲのＴｈｒ１１３５を含んでいた（図２Ｃ）（２０−２２）。これらとともに、まだ機能的に注釈されていない部位もこのグループの中にあった。また、これらの４１の部位は、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ＰＩ３Ｋ−ｐ７０Ｓ６Ｋ  ＣＴＡＭグループのメンバーとして分類された。同様にＡｋｔ、ｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋ阻害剤ペアによって調整されたが、ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤ペアでは調整されない部位としては、Ｓｅｒ９のＧＳＫ３β、Ｓｅｒ６２のＭｙｃ、およびＳｅｒ１８３のＡＫＴＳ１（さらにＰＲＡＳ４０として知られている）を含む；
合計５５の燐酸化部位が、阻害のこのパターンを持つと分かり、ｐ７０Ｓ６Ｋに依存しないＡｋｔ−ｍＴＯＲ−ＰＩ３Ｋグループを定義した。これらの公知のキナーゼ・カスケードに加えて、我々は、さらが阻害剤によりターゲットとされるキナーゼおよび／または阻害剤自体の間の、キナーゼのまだ特徴づけられていない関係の存在を立証する証拠を見いだした；例としては、Ａｋｔまたはｐ７０Ｓ６Ｋの関与のないｍＴＯＲとＰＩ３Ｋの阻害剤ペアによって調整された部位を含む（３７基体、図２Ｂ−Ｃ）。さらに、図２Ｂ−Ｃに示されるように、我々は、両方のＡｋｔ阻害剤によって阻害されるが、ＰＩ３Ｋおよび他の阻害剤（２８４基体）に影響されず、ＡｋｔおよびｍＴＯＲ（３３の基体）に依存しないＰＩ３Ｋの部位の存在の証拠を見いだした。全体として、この研究（表１）で見つかった６１０の燐酸化部位活性マーカーは、５５のＣＴＡＭグループへグループ化された。
【０１３５】
二つに分けられ、方向付けられていないネットワーク・グラフ（図２Ｄ）としてデータをさらに視覚化することは、シグナリングネットワーク内で互いに関係するキナーゼ阻害剤の調査方法を明らかにした。予想通りに、また公表されたデータおよびそれらの１群の関連中で、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ｐ７０Ｓ６ＫおよびｍＴＯＲ阻害剤ペアは多くの共通の燐酸化部位に影響し、従って一緒のグループとした。同様に、ＭＡＰＫ経路（ＥＧＦＲ、ＭＥＫおよびＥＲＫ）をターゲットとする阻害剤ペアは、ＣＡＭＫ２とともに１つのグループとされた（図２Ｄ）。ネットワークのトポロジーの無作為化は、これらの群が偶然生じていないだろうということを明らかにした（図９）。したがって、これらのデータは、キナーゼ間の１群の関連性は我々のデータセット（例えばＥＧＦＲ−ＭＥＫ−ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）においてよく示されたが、Ａｋｔと無関係のＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲシグナリングの存在を含むこれらのデータから予期しないシグナリング・ルートの存在がさらに出現したことを示す。さらに、この分析は、これらのキナーゼ間の高度の接続性(connectivity)を実証した。
【０１３６】
同定されたＣＴＡＭグループの行動のキャラクタリゼーションおよびネットワーク可塑性のプロービング
我々は、次にネットワーク内の経路の生化学の活性化の測定にＣＴＡＭグループを使用することができるかどうかを確認しようと努力し、かつしたがって、所定の状態の下で、任意の時間にネットワークの活性化ステータスのスナップショットを提供するために努力した。万一これらのグループがネットワーク枝活性(network branch activity)の信頼できる読み出しを提供すれば、ネットワークがよくキャラクタライズされた実験条件の下で乱されるか刺激される場合、ＣＴＡＭグループはそれぞれ予期された行動変化を示すだろう。さらに、我々は、各グループ内の個々のメンバーが、互いに同様の量的行動を示すだろうと推論した。
【０１３７】
我々は、このように独立した５つの時間ポイントでＥＧＦまたはＩＧＦ−１のいずれかで処理された細胞についてＣＴＡＭグループのリン酸化の動力学をモニターした。このデータセットのための品質管理の要約は図１０に示される。我々は、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒシグナリング（各場合で０分のコントロールとの比較）に一般に関連したＣＴＡＭグループの一時的なリン酸化の動力学が、キナーゼ・シグナリングへのＥＧＦおよびＩＧＦ−１の以前に報告された影響に従うことを観察した（図３Ａ）（２３、２４）。ＭＡＰＫ経路活性化の既知の一時的な動力学と一致して、例えば、６０分でより低いレベルに傾き始める前に、ＥＧＦＲ−ＭＥＫグループは５分間両方の成長因子で刺激されると有意に急速なアップレギュレーションを示した（図３Ａ−Ｂ）。これらのデータは、正統なＥＧＦＲ応答性のＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびＡｋｔ部位（Ｓｅｒ４７３）のための個々のＭＳおよびウエスタンブロットデータと一致していた（図１１）。ＣＴＡＭグループ内の個々の燐酸化部位の中央相対標準偏差（つまり変化の係数）は、ＥＧＦおよびＩＧＦ−１についてそれぞれ０．４５４と０．５１８で、それにより、２つの成長因子で細胞刺激した際に同様の挙動が作用したと考えられた（図３Ｃ）。総合すれば、図３に示されるデータは、ＣＴＡＭグループがネットワーク内の枝の機能的な活性化の読み出しだという概念を支持する証拠を提供する。
【０１３８】
キナーゼ阻害剤への獲得抵抗性のモデル中のネットワーク可塑性(network plasticity)の分析
さらに我々のＣＴＡＭ−定義されたシグナリング・ネットワーク中のキナーゼ・シグナリング可塑性を調査するために、我々は、臨床の開発での２つのキナーゼ阻害剤、すなわちＧＤＣ−０９４１（パンクラスＩ  ＰＩ３Ｋ阻害剤）およびＫＵ−００６３７９４（ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤）（２５、２６）、の獲得抵抗性の癌細胞ライン・モデルにおけるネットワークを定義する燐酸化部位を測定した。それらが由来する親の細胞と比較された時、我々は阻害剤の各々に対する抵抗性の６つの独立した細胞株を得た（１つの薬当たり３：  それぞれＧＤＣ−０４１およびＫＵ−００６３７９４に抵抗性のＭＣＦ７ＧおよびＭＣＦ７−Ｋ）。これを達成するために、我々は、最高１μＭまでの阻害剤の増加する濃度に細胞を暴露した。細胞は、本質的に耐性細胞についての抵抗性の選択にバイアスをかけないように、各薬の低濃度（１００  ｎＭ）で最初に試験された。結果として生ずる細胞ラインは阻害剤の１μＭが存在する状態で増殖することができた。しかし、親細胞は同じ条件の下で増殖することができなかった（図４Ａ−Ｂ）。我々は、これらの細胞のフォスホプロテオムズを定量し、同時にプロテオムの合計を分析することにより全蛋白へのこれらの測定を標準化した。量的・質のデータの要約は図１２に示される。
【０１３９】
阻害剤が存在する状態でのキナーゼ・ネットワークの分析は、ｍＴＯＲを含む大多数のＣＴＡＭグループが、ｍＴＯＲ阻害剤耐性（ＭＣＦ７−Ｋ）細胞ライン（図４Ｃで緑・オレンジの矢）のすべてにおいてダウンレギュレートされたことを示した。同様に、ＰＩ３Ｋを含むＣＴＡＭのグループは、ＰＩ３Ｋ阻害剤耐性（ＭＣＦ７Ｇ）細胞ライン（図４Ｃで緑の矢）のすべてにおいてダウンレギュレートされた。我々は、経路活性な公知のマーカーを測定することによりこれらのデータを確認した。ウエスタンブロット（図１３）によって決定されたように、それらは我々の結果がＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）のこれらの経路を管理する重要な規定燐酸化部位(key regulatory phosphorylation sites)のレベルと一致していたことを示した。これらのデータは、阻害剤によってターゲットとされた経路は、薬が存在する状態で耐性細胞の中で阻害され続けることを示唆した。したがって、他の研究（２７）と一致して、我々は、抵抗性が耐性細胞がどのように阻害剤を新陳代謝させたかの差の結果ではなく、抵抗性はキナーゼ・シグナリングのリワイヤリング(rewiring）の結果として発生したと推論した。興味のあることに、ＭＣＦ７−ＫとＭＣＦ７Ｇ細胞ライン（図４Ｃ）の間でリワイヤリングは著しく相違し、ｍＴＯＲ阻害剤に対して発展した抵抗機構は、ＰＩ３Ｋ阻害剤に応じて発展したものと異なることを示唆した。この仮説は、標準化されたリン酸化プロテオミックス・データのバイアスのない多変量解析の使用を通じて強化された。これらは親および耐性細胞の間の差、および主成分スペース（図４Ｄ）で明白に分けられるように、ＭＣＦ７−ＫおよびＭＣＦ７Ｇ細胞のリワイヤリング間の差を強調した。しかしながら予想外にも、同じ阻害剤に抵抗性の細胞はＰＣスペースでも分離される。これは、同じ継代数で、同一の実験条件に同一時間暴露された同じ親の株由来のものにもかかわらず、個々の抵抗性ライン（図４Ｃ−Ｄ）間で、シグナリング・ネットワークの活性化状態が異なることを示唆する。
【０１４０】
耐性細胞ラインが、親の細胞および互いに比較してそれらのシグナリング・ネットワークをリワイヤリングした方法が異なるように想われる（図４Ｃ−Ｄ）ので、我々はそれらの細胞ラインは小分子キナーゼ阻害剤パネル単独とそれらの組み合わせとでは異なるように応答するだろうという仮説を立てた。それらの応答はシグナリング・ネットワークの活性の関数だろうからである。この予測をテストするために、我々は、小分子阻害剤（ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ＣＡＭＫ２、Ａｋｔ、ＭＥＫおよびＥＧＦＲをターゲットとして）のパネルで細胞ラインの各々を処理し、ＭＴＳとクリスタルバイオレット分析を使用して、それらの相対的な細胞の生存率を測定した（図１４ＡおよびＢ）。耐性細胞のうちのいくつかにおいて親細胞に比較してそれらが関連するキナーゼのＣＴＡＭのアバンダンスが増加され、れらのキナーゼが抵抗性表現型に含まれることを示唆するので、これらの阻害剤は選ばれた（図４Ｃ）。結果のデータのバイアスされていない多変量解析は、それらがＰＣスペースで分離されるので、抵抗性および親細胞は阻害剤に対して異なって応答することを明らかにした。さらに、この分析はＭＣＦ７Ｇおよび−Ｋ細胞、および個々の耐性細胞ラインを互いに、リン酸化プロテオミックス・データのＰＣＡの中での観察を反映する方法で分離した（図４Ｅ−Ｆ）。総合すれば、これらのデータは、ＣＴＡＭ分析（図４Ｃ）によって観察された耐性細胞中のシグナリング・ネットワークのヘテロジニアスなリワイヤリングは、ネットワークへのパーターベイション(perturbations)に細胞が応答する態様の機能の相違に帰着することを示す。
【０１４１】
議論
この研究では、我々は、ＰＩ３ＫＭＥＫキナーゼ・ネットワークのノード間に存在する接続の完全な分析を最初に行なった（図１および２）。この最初の研究は、キナーゼ、シグナル経路、およびそれらをターゲットとする薬物の間の予期したものと予期しないものとの両方のリンクを明らかにした。例えば、既知のＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲおよびＭＥＫ−ＥＲＫの関係は、我々のデータの中でよく表わされた；しかしながら、我々は、Ａｋｔの関与のないｍＴＯＲ−ＰＩ３Ｋ群、およびＡｋｔ阻害剤−依存性だがＰＩ３Ｋ阻害剤−独立部位によって定義されたもののような、キナーゼ阻害剤目標間のまだ特徴づけられていない接続を立証する証拠を見つけた。全体として、我々のデータは、シグナリング・ネットワーク中のキナーゼの複雑な関係を例証し、この複雑さについての我々の知識がまだ非常に制限されていることを示す。
【０１４２】
文献（２８、２９）からの情報をコンパイルするアプローチとは対照的に、定義されたシステムから導かれた１組の実験データを使用して、シグナリング・ルートを定義するという利点は、細胞シグナリング事象が多くの場合細胞型および−コンテキストに依存する（３０）ということである。したがって、正統なシグナル経路概略図の中で示されるように、異種の細胞タイプおよび生物由来の「平均の」シグナリング・ネットワークは、ネットワークが実際にどのように特定の細胞システムでワイヤリングする方法を代表しない。これらの平均されたネットワーク上に経験的な転写のデータを重ねる努力がなされたが（３１）、我々の研究の重要な態様は、我々はまだキャラクタライズされていないシグナリングルートを提供しただけではなく、我々の細胞ラインモデルに特有のそのようなルート活性の燐酸化部位マーカ−を同定する。これらは、その後、系統的な方法でキナーゼ・ネットワークの動力学および回路を測定するために使用することができた。シグナリング・ネットワーク枝を定義するＣＴＡＭアプローチ（その後、それは後の実験の中で測定することができる）は、系統的な遺伝子不活性化実験から得られたプロフィールの大要と、そのようなパターンがどのように関連するか調べることによる遺伝子発現パターンからの細胞の生物学的情報を引き出すアプローチと、概念的な類似点がある（３２）。ＣＴＡＭグループが予期された動力学を備えた成長因子によって調整されたという観察（２３、２４、図３）、およびこれらの変更はそのようなグループ（図３）のメンバーと類似し、これらのＣＴＡＭグループがシグナリング活性の生化学的読み出しであることを示唆する証拠を提供する。
【０１４３】
シグナリング・ネットワークは静的ではない。外部刺激に応じて非常に可塑性で有り、非常に動的な構造である。親と、ＰＩ３ＫまたはｍＴＯＲＣ１／２の阻害剤に抵抗性の細胞の間でのネットワークの比較は、１つの阻害剤当たり３つの別個の耐性細胞株中のＣＴＡＭグループ・アバンダンスの広範囲な差を明らかにした（図４Ｃ）。したがって、我々のデータは、慢性のキナーゼ抑制に応じてキナーゼ・シグナリングが再形成されることを示す、公表された研究（３３、３４）と一致している。我々の分析の深さにより、しかしながら、我々のデータは、シグナリング・ネットワークが単一ノードの慢性的な抑制を克服するために全体として調整される範囲を強調する。これらの観察と同時に、多変量解析を使用した各細胞ラインについての、ネットワーク・ステータス（リン酸化プロテオミックス）および表現型（阻害剤に対する反応）のデータの比較は、シグナリング・ネットワークの活性が細胞の新しく獲得した表現型の反映であることを示した。これはデータのすべての異種のセットのＰＣＡ中で証拠づけられ、親の細胞から耐性細胞を分け、同様の方法（図４Ｄ−Ｆ）でＭＣＦ７Ｇ細胞からＭＣＦ７−Ｋ細胞を分けた。したがって、我々のデータはＰＩ３ＫとｍＴＯＲＣ１／２の複雑な関係を強調し、２つの阻害剤で処理された細胞がそれらのシグナリングを違った風に変更したので、２つの阻害剤に応答する抵抗性の異なる機構を示唆する（図４Ｄ−Ｆ）。ＰＩ３ＫとｍＴＯＲが同じ正統のシグナル経路にしばしば置かれるので、これは予期外の事象である。しかしながら、これらのデータは、ｍＴＯＲＣ１／２またはＰＩ３Ｋの阻害剤によって調整された燐酸化部位は部分的にのみオーバーラップすることが観察された（図２Ｅ）。いくつかのシステムにおけるＰＩ３ＫからのｍＴＯＲの独立を強調する最近の研究（３５）と一致している。培養中の細胞の単純なメンテナンスは、図４に示される細胞ネットワークの進化に寄与するだろう；しかしながら、ｍＴＯＲＣ１／２またはＰＩ３Ｋの阻害剤への長期暴露がネットワーク・リモデリングの著しい差を生んだという観察は、そのような選択された圧力の適用のない長期培養の結果観察されるものよりも、シグナリングがどのように発展したかに薬物曝露がより大きな効果があったと主張する。
【０１４４】
最近の出版物は、与えられた療法についての獲得抵抗性の単一の機構があるのではなく、これらが標的療法に抵抗性になる時に、シグナリング・ネットワークが癌細胞の中でリワイヤリングすることができる多くの方法があることを示す（３６、３７）。しかしながら、癌細胞が抵抗性を発現する方法が、プレゼンテーション時（すなわち抵抗性表現型が起こる前）に癌細胞の分子インプリンティングによってあらかじめ決定されるかどうかは知られていない。この理解は癌治療学にとって潜在的な意味合いを持つ。抵抗性獲得へ導く進化の経路が、プレゼンテーション時に腫瘍細胞の中にあるゲノムまたは他の分子の要因に頼っているとしたら、癌細胞の初期条件の分析は、少なくとも原理的には、そのような腫瘍に生じるであろう抵抗機構を予測するために使用することができるだろう。
【０１４５】
このアイデアに反して、我々のデータは、プレゼンテーション時に分子レベルでそれを分析することにより、与えられた腫瘍の抵抗性の特定の機構を予言することが可能ではないかもしれないことを示唆する。確かに、我々の研究では、同じ細胞ラインは６つの同一の個体群へ分割された。その後、それは、同じ時間および継代数で同じオペレーターによって阻害剤の同じ濃度で維持された。予想外にも、ＣＴＡＭネットワーク・プロファイルは、同じ化合物に抵抗性の細胞にわたり高度にヘテロジニアスだった（図４Ｃ−Ｄ）。ネットワーク・ステータスでのこのヘテロジニアスは、細胞増殖（図４Ｅ−Ｆ）のレベルで、シグナリングの阻害剤に対して、同じ化合物に対する細胞抵抗性は異なる応答をするという機能的な結果を有する。初期のクローンシステムのイントラ−腫瘍のヘテロジニアスと進化の分岐は、哺乳類およびバクテリアの両方のシステムで遺伝のレベルで記載された（３８、３９）。長期的な細胞培養のインパクトを全く除外することはできないが、我々の研究はターゲットとされたキナーゼ阻害剤での慢性的治療がキナーゼ・ネットワーク・シグナリングの分岐に非常に影響を及ぼすことを示唆する。したがって、同一の実験条件が、恐らく確率的影響により、別個のシグナリング・ネットワーク（図４Ｃ−Ｄ）および薬剤抵抗性表現型（図４Ｅ−Ｆ）の進化に帰着する場合があり、システムの初期条件により抵抗性に導くことがある進化のルートの正確な予言はできないかもしれない。したがって、抵抗性獲得が本当に非決定論的であり、疾病の攻撃に際して予測することができない場合、抵抗性が生じた後の個々の患者に関連する抵抗機構の同定には、シグナリングが療法の結果どのようにリワイヤリングされたかの先入観なしで、個々の腫瘍のシグナリング・ネットワークを測定する能力が必要とされる。
【０１４６】
参照（これらは上記の詳細な材料および方法セクションを除き、例に当てはまる）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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