(57)【要約】  本発明は、活性剤、第１のコーティング剤、第２のコーティング剤及び第３のコーティング剤を含む、活性剤を動物に送達するための組成物を提供する。活性剤は、第１のコーティングでコーティングされ、第１のコーティング剤は第２のコーティング剤でコーティングされ、第２のコーティング剤は第３のコーティング剤でコーティングされる。活性剤は、第２又は第３のコーティングではなく、第１のコーティングと接触している。第１のコーティング剤は活性剤を第２のコーティング剤から分離し、一方、第２のコーティング剤は第１及び第３のコーティング剤を分離する。第１、第２及び第３のコーティング剤は互いに異なっている。また、組成物の製造方法及び使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性剤、第１のコーティング剤、第２のコーティング剤及び第３のコーティング剤を含む、動物に活性剤を送達するための組成物であって、ここで、活性剤が第１のコーティング剤でコーティングされ、第１のコーティング剤が第２のコーティング剤でコーティングされており、活性剤が第２のコーティング剤及び第３のコーティング剤ではなく第１のコーティング剤と接触しており、第１のコーティング剤は活性剤を第２のコーティング剤から分離しており、第２のコーティング剤は第１のコーティング剤及び第３のコーティング剤を分離し、第１、第２及び第３のコーティング剤は互いに異なり、第１、第２及び第３のコーティング剤の各々は、（ａ）１種以上の腸溶性ポリマーを含む腸溶性ポリマー層、（ｂ）１つ以上の脂肪、１つ以上のタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む脂肪／タンパク質層、及び（ｃ）１つ以上の粘膜接着性ポリマーを含む粘膜接着性ポリマー層からなる群から選択される、上記組成物。
【請求項２】
第１のコーティング剤が粘膜接着性ポリマー層であり、第２のコーティング剤が腸溶性ポリマー層であり、第３のコーティング剤が脂肪／タンパク質層である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第１のコーティング剤が粘膜接着性ポリマー層であり、第２のコーティング剤が脂肪／タンパク質層であり、第３のコーティング剤が腸溶性層である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第１のコーティング剤が脂肪／タンパク質層であり、第２のコーティング剤が粘膜接着性ポリマー層であり、第３のコーティング剤が腸溶性層である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
腸溶性ポリマーが、アルギン酸塩、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）、ポリ−（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
脂肪が、水素化油又は部分水素化油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、ステアリン酸塩、ワックス、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
タンパク質が、乳タンパク質、ゼラチン、卵白、グルテン、大豆タンパク質、ゼイン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
組成物を調製する方法であって、
（ａ）有効量の活性剤を第１のコーティング剤と混合して、第１のコーティング製品を形成するステップであって、ここで、活性剤は、第１のコーティング製品中で第１のコーティング剤でコーティングされるステップ、
（ｂ）第１のコーティング製品を第２のコーティング剤と混合して、第２のコーティング製品を形成するステップであって、ここで、第１のコーティング製品は、第２のコーティング製品中で第２のコーティング剤でコーティングされるステップ、
（ｃ）第２のコーティング製品を第３のコーティング剤と混合して、第３のコーティング製品を形成するステップであって、ここで、第２のコーティング製品は、第３のコーティング製品中で第３のコーティング剤でコーティングされるステップを含む方法であって、それによって組成物が調製され、活性剤が第２及び第３のコーティング剤ではなく第１のコーティング剤と接触しており、第１のコーティング剤が活性剤を第２のコーティング剤から分離しており、第２のコーティング剤は第１のコーティング剤及び第３のコーティング剤を分離し、第１、第２及び第３のコーティング剤は互いに異なり、第１、第２及び第３のコーティング剤の各々は、（ａ）１種以上の腸溶性ポリマーを含む腸溶性ポリマー層、（ｂ）１つ以上の脂肪、１つ以上のタンパク質、又はそれらの組み合わせを含む脂肪／タンパク質層、及び（ｃ）１つ以上の粘膜接着性ポリマーを含む粘膜接着性ポリマー層からなる群から選択される、上記方法。
【請求項９】
乾燥粒子を形成するために第３層のコーティング製品を乾燥させるステップをさらに含み、乾燥粒子は、平均粒径が約０．１μｍ〜１０ｍｍの範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の方法によって調製された組成物。
【請求項１１】
有効量の請求項１〜７及び１０のいずれか１項に記載の組成物を動物に投与することを含む、動物における活性剤の制御放出を提供する方法。
【請求項１２】
約０．１〜３のｐＨを有する胃環境において５０％未満の活性剤を６０分以内に放出させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
５〜８のｐＨを有する腸環境において少なくとも５０％の活性剤を１２０分以内に放出させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
動物の胃の通過中に少なくとも５０〜９０％の活性剤を無傷に保つことをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
動物の腸に少なくとも５０〜９０％の活性剤を送達させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
活性剤が治療薬である、請求項１〜７及び１０のいずれか１項に記載の組成物の有効量を動物に投与することを含む、動物における疾患又は障害を治療又は予防する方法。
【請求項１７】
活性剤が抗原である、請求項１〜７及び１０のいずれか１項に記載の組成物の有効量を動物に投与することを含む、動物にワクチン接種する方法。
【請求項１８】
抗原が、細菌、真菌、ウイルス及び寄生虫からなる群から選択される感染性微生物に由来し、それによって微生物に対する特異的防御免疫応答が動物において誘導される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
活性剤が農薬である、請求項１〜７及び１０のいずれか１項に記載の組成物の有効量を有害生物に投与することを含む有害生物を防除する方法。
【請求項２０】
有害生物が５％未満の生存率を有する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年６月２６日に出願された米国仮出願第６２／１８５，３０２号の利益を主張するものであり、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
薬物、ワクチン又は殺虫剤の投与、特に経口投与は、いくつかの利点をもたらす。投与量は、最小限の拘束と労力で食物又は水を介して多数の動物に投与することができた。拘束はまた、薬物又はワクチン接種の効果を低下させ、感染症のリスクを高め、動物にストレスを与える。肉を生産する動物にとって、経口投与は注射部位反応を回避するという点で別の利点を有する。壊れた針、注射部位の汚染、又は高度に反応性のアジュバントの使用は、屠体及び皮膚を損傷する膿瘍を誘発し得る。これらの反応は、屠殺時の動物の価値を低下させる。これはまた、魚のワクチン接種プログラムの問題であり、この場合、魚をタンクや野外ケージから収穫し、個別に注射する必要がある。口腔接種は迅速かつ効率的であり、その後のブースター接種を管理するために動物を複数回処理する必要性を排除する。経口投与後の有害な免疫反応もまた起こりにくく、従ってより安全である。
【０００３】
薬物、ワクチン又は殺虫剤の投与、特に経口投与の利点にもかかわらず、技術の開発は適切な送達システムの欠如により遅れている。適切な送達システムがない場合、ほとんどの経口薬剤、ワクチン及び農薬は、胃腸（ＧＩ）管で、特に低ｐＨの胃条件下で分解を受け、その結果、中性ｐＨを有する腸内の吸収が制限され、順番に、不十分な治療効果、免疫応答又は農薬効果をもたらす。
【０００４】
腸粘膜組織に薬物、ワクチン及び農薬を送達するための様々なビヒクルが開発されている。ポリ−（ＤＬ−ラクチド）及びポリ−（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）などの生分解性ポリマーは、薬物、ワクチン又は農薬を動物に投与する、特に経口投与するためのポリマー粒子を製造するために使用されてきた。しかしながら、これらのポリマー粒子を製造するには、脆弱な薬剤、ワクチン又は殺虫剤に害を及ぼす可能性がある溶媒の使用が必要である。さらに、溶媒の使用は、それらのポリマー粒子内に弱毒化された生きている生物（例えば、ウイルス又は細菌）の取り込みを妨げる。
【０００５】
適切な送達システムを開発する他の課題には、適切な、例えば、食品又は飼料等級及び生分解性の化合物及びアジュバントのみを選択する必要性、及び持続的で頑強な治療効果、免疫原性又は農薬効果の必要性が含まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、活性剤を動物に送達するための組成物を提供する。この組成物は、活性剤、第１のコーティング剤、第２のコーティング剤、及び第３のコーティング剤を含む。活性剤は、第３のコーティング剤でコーティングされた第２のコーティング剤でコーティングされた第１のコーティング剤でコーティングされる。活性剤は、第２又は第３のコーティング活性薬剤は、第２又は第３のコーティング剤ではなく、第１のコーティング剤と接触している。ではなく、第１のコーティングと接触している。第１のコーティング剤は、活性剤を第２のコーティング剤から分離し、第２のコーティング剤は第１及び第３のコーティング剤を分離する。第１コーティング剤、第２コーティング剤及び第３コーティング剤は互いに異なり、それぞれ１種以上の腸溶性ポリマーを含む腸溶性ポリマー層、１種以上の脂肪、１種以上のタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む脂肪／タンパク質層、及び１つ以上の粘膜接着性ポリマーを含む粘膜接着性ポリマー層からなる群から選択され得る。活性剤は、腸溶性ポリマー層、脂肪／タンパク質層、及び粘膜接着性ポリマー層によって、任意の順序又は順番でコーティングすることができる。組成物中に使用される活性剤及び他の成分の性質に応じて、３つの層の特定の順序又は順番は、動物における活性剤のより有利な放出プロファイル又は生物学的効果を提供し得る。
【０００７】
本発明による第１の任意の組成物は組成物Ａであり、第１のコーティング剤は粘膜接着性ポリマー層であり、第２のコーティング剤は腸溶性ポリマー層であり、第３のコーティング剤は脂肪／タンパク質層である。
【０００８】
第２の任意の組成物は組成物Ｂであり、第１のコーティング剤は粘膜接着性ポリマー層であり、第２のコーティングは脂肪／タンパク質層であり、第３のコーティング剤は腸溶層である。
【０００９】
第３の任意の組成物は組成物Ｃであり、第１のコーティング剤は脂肪／タンパク質層であり、第２のコーティング剤は粘膜接着性ポリマー層であり、第３のコーティング剤は腸溶性層である。
【００１０】
本発明によれば、活性剤は、溶液、分散液又は乾燥粒子の形態であり得る。粒子は、約０．１μｍ〜１０ｍｍ、好ましくは約１ｍｍ未満、より好ましくは約５００μｍ未満の範囲の平均粒子サイズを有することができる。
【００１１】
組成物は、液体、固体又はスラリーであってもよい。組成物は、乾燥していてもよく又は湿っていてもよい。
【００１２】
組成物は、約１〜４０％の活性剤を含むことができる。活性剤とは別に、組成物は約１〜２０％の粘膜接着性ポリマー、約１〜３０％の腸溶性ポリマー、及び約１〜４０％の脂肪、タンパク質又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【００１３】
活性剤は、生物活性薬剤であってもよい。例えば、活性剤は、治療薬、免疫原、抗ウイルス、抗細菌、抗真菌又は抗寄生虫剤、又は農薬である。殺虫剤は殺鼠剤であってもよい。
【００１４】
腸溶性ポリマーの例には、アルギン酸塩、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）及びそれらの混合物が含まれる。
【００１５】
脂肪／タンパク質層は、１つ以上の脂肪（タンパク質を含まない）を含む脂肪層、１つ以上のタンパク質（脂肪を含まない）を含むタンパク質層、又は１つ以上の脂肪及び１つ以上のタンパク質を含む層であり得る。脂肪は、水素化油又は部分水素化油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、ステアリン酸塩、ワックス、又はそれらの混合物を含み得る。タンパク質は、乳タンパク質、ゼラチン、アルブミン、グルテン、大豆タンパク質、ゼイン又はそれらの混合物を含み得る。
【００１６】
動物は、任意の昆虫又は哺乳動物であり得る。昆虫の例には、ベッドバグ、アリ、ハエ、ハエ、モスキート、ノミ、クモ、ダニ、カブトムシ、ゴキブリ、シロアリ、臭いバクテイ等が含まれる。動物は、水生動物、陸生動物、又は哺乳類であってもよい。水生動物は、魚、又は軟体動物、甲殻類、及び胚盤葉などの甲殻類であり得る。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、シカ、クマ、げっ歯類、コヨーテ、キツネ、リス、ウサギ、アライグマ、スカンク及びコウモリなどの霊長類であってもよい。げっ歯類は、マウス又はラットであってもよい。げっ歯類は、少なくとも約５０、１００、１５０、１９５、５５０又は５００グラムの重量を有してもよい。動物は害虫である可能性がある。
【００１７】
本発明の各組成物について、製造方法が提供される。本方法は、
（ａ）有効量の活性剤を第１のコーティング剤と混合して、第１のコーティング製品を形成するステップであって、ここで、活性剤は、第１のコーティング製品中で第１のコーティング剤でコーティングされるステップ、
（ｂ）第１のコーティング製品を第２のコーティング剤と混合して、第２のコーティング製品を形成するステップであって、ここで、第１のコーティング製品は、第２のコーティング製品中で第２のコーティング剤でコーティングされるステップ、そして
（ｃ）第２のコーティング製品を第３のコーティング剤と混合して、第３のコーティング製品を形成するステップであって、ここで、第２のコーティング製品は、第３のコーティング製品中で第３のコーティング剤でコーティングされるステップを含み、それにより組成物が調製される。
【００１８】
本発明の調製方法は、第３層のコーティング製品を乾燥して乾燥粒子を形成するステップをさらに含んでもよい。粒子は、約０．１μ〜１０ｍｍ、好ましくは約１ｍｍ未満、より好ましくは約５００μｍ未満の範囲の平均粒子サイズを有することができる。粒子は、界面活性剤、乳化剤、防腐剤及び抗酸化剤をさらに含んでもよい。
【００１９】
組成物Ａは、以下のように調製され得る：
（ａ）有効量の活性剤を粘膜接着性ポリマー層でコーティングして、第１のコーティング製品を形成し、ここで、活性剤は第１のコーティング製品中で粘膜接着性ポリマー層でコーティングされ、
（ｂ）第１のコーティング製品を腸溶性ポリマー層でコーティングして、第２のコーティング製品を形成し、ここで、第１のコーティング製品は腸溶性ポリマー層でコーティングされ、ここで、活性剤は第２のコーティング製品中で第１の層の粘膜接着性ポリマー及び第２の層の腸溶性ポリマーでコーティングされ、そして
（ｃ）第２のコーティング製品を脂肪／タンパク質層でコーティングして、第３のコーティング製品を形成し、ここで、第２の層のコーティング製品は脂肪／タンパク質でコーティングされ、ここで、活性剤は第３のコーティング製品中で第１の層の粘膜接着性ポリマー、第２の層の腸溶性ポリマー、及び第３の層の脂肪／タンパク質でコーティングされ、それにより組成物Ａが調製される。
【００２０】
組成物Ｂは、以下のように調製され得る：
（ａ）有効量の活性剤を粘膜接着性ポリマー層でコーティングして、第１のコーティング製品を形成し、ここで、活性剤は第１のコーティング製品中で粘膜接着性ポリマー層でコーティングされ、
（ｂ）第１のコーティング製品を脂肪／タンパク質層でコーティングして、第２のコーティング製品を形成し、ここで、第１のコーティング製品は脂肪／タンパク質層でコーティングされ、ここで、活性剤は第２のコーティング製品中で第１の層の粘膜接着性ポリマー及び第２の層の脂肪／タンパク質でコーティングされ、そして
（ｃ）第２のコーティング製品を腸溶性ポリマー層でコーティングして、第３のコーティング製品を形成し、ここで、第２のコーティング製品は腸溶性ポリマー層でコーティングされ、ここで、活性剤は第３のコーティング製品中で第１の層の粘膜接着性ポリマー、第２の層の脂肪／タンパク質、及び第３の層の腸溶性ポリマーでコーティングされ、それにより組成物Ｂが調製される。
【００２１】
組成物Ｃは、以下のように調製され得る：
（ａ）有効量の活性剤を脂肪／タンパク質層でコーティングして、第１のコーティング製品を形成し、ここで、活性剤は第１のコーティング製品中で脂肪／タンパク質層でコーティングされ、
（ｂ）第１のコーティング製品を粘膜接着性ポリマー層でコーティングして、第２のコーティング製品を形成し、ここで、第２のコーティング製品は粘膜接着性ポリマー層でコーティングされ、ここで、活性剤は第２のコーティング製品中で第１の層の脂肪／タンパク質及び第２の層の粘膜接着性ポリマーでコーティングされ、そして
（ｃ）第２のコーティング製品を腸溶性ポリマー層でコーティングして、第３のコーティング製品を形成し、ここで、第２のコーティング製品は腸溶性ポリマー層でコーティングされ、ここで、活性剤は第３のコーティング製品中で第１の層の脂肪／タンパク質、第２の層の粘膜接着性ポリマー、及び第３の層の粘膜接着性ポリマーでコーティングされ、それにより組成物Ｃが調製される。
【００２２】
本発明の調製方法に従って調製された組成物も提供される。
【００２３】
本発明はまた、動物における活性剤の制御放出又は標的放出を提供するための方法を提供する。この方法は、上記の活性剤を含む有効量の組成物を投与することを含む。該方法は、胃環境で、例えば、約０．１〜３のｐＨ又は約０．１〜２のｐＨで、最初の６０分、３０分又は１５分以内に約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％未満の活性剤を放出することを含み得る。該方法は、腸環境で、例えば、約５〜８のｐＨ、約５．５〜７．５のｐＨ、又は約６．５〜７．５のｐＨで、最初の１２０分、６０分、３０分又は１５分以内に約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％未満の活性剤を放出することをさらに含み得る。この方法は、動物の胃の通過中に活性剤の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、例えば約５０〜９０％を保持することをさらに含み得る。本方法は、動物の腸に少なくとも５０〜９０％の活性剤を送達させることをさらに含み得る。
【００２４】
活性剤は、第１、第２及び第３のコーティング剤の異なる組み合わせを有する本発明の組成物に組み込むことができる。組成物Ａ、組成物Ｂ及び組成物Ｃは、同一の活性剤に対して異なる放出プロファイルを提供することができる。組成物Ａは、組成物Ｂ又はＣよりも活性剤の優れた胃後送達を提供することができる。例えば、組成物Ａは、組成物Ｂ又はＣと比較して、胃環境での活性剤の放出が少なく、腸環境での活性剤のより多くの放出を提供することができる。結果として、組成物Ａは、活性剤の望ましい作用部位が動物において胃後である場合、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、組成物Ｂ又はＣより効果的であり得る。組成物Ｃは、組成物Ａ又はＢよりも腸内でより速い放出プロファイルを提供し、及び／又はより良好な生物活性剤の吸収を提供することができる。例えば、組成物Ｃは、組成物Ａ又はＢと比較して、腸環境での活性剤のより速い放出を提供し、及び動物による腸環境からの活性剤のより多くの吸収を提供することができる。例えば、組成物Ｃは、バイオアベイラビリティーが低く、活性剤の所望の作用部位が動物の腸の上部である場合、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約３０％、化合物Ａ又はＢよりも効果的であり得る。
【００２５】
活性剤の動物への胃後送達のための方法がさらに提供される。送達方法は、有効量の本発明の組成物を動物に投与することを含む。活性剤の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、例えば約５０〜９０％が動物の腸に到達し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組成物Ｂ又はＣよりも組成物Ａに処方した場合、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％多くの活性剤が動物の腸に到達し、及び／又は組成物Ｂ又はＣよりも組成物Ａに処方した場合、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％多くの活性剤が動物に吸収される。
【００２７】
他の実施形態では、組成物Ａ又はＣよりも組成物Ｂに処方した場合、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％多くの活性剤が動物の腸に到達し、及び／又は組成物Ａ又はＣよりも組成物Ｂに処方した場合、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％多くの活性剤が動物に吸収される。
【００２８】
なお他の実施形態では、組成物Ａ又はＢよりも組成物Ｃに処方した場合、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％多くの活性剤が動物の腸に到達し、及び／又は組成物Ａ又はＢよりも組成物Ｃに処方した場合、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％多くの活性剤が動物に吸収される。
【００２９】
動物における疾患又は障害（例えば、感染症）を治療又は予防するための方法が提供される。治療又は予防方法は、有効量の本発明の組成物を動物に投与することを含む。活性剤は治療薬である。
【００３０】
動物（例えば、水生種又は陸生種）にワクチン接種するための方法もまた提供される。ワクチン接種方法は、有効量の本発明の組成物を動物に投与することを含む。活性剤は抗原であり、感染性微生物、例えば細菌、真菌、ウイルス又は寄生生物に由来し得る。特定の防御免疫応答は、動物の微生物に対して誘導され得る。
【００３１】
有害生物を防除するための方法がさらに提供される。有害生物を防除する方法は、有効量の本発明の組成物を有害生物に投与することを含む。活性剤は殺虫剤、例えば殺鼠剤である。有害生物は、昆虫（例えば、アリ、ファイアット、ゴキブリ、ハエ、シロアリなど）又はげっ歯類（例えば、マウス及びラット）であり得る。げっ歯類は、少なくとも約５０、１００、１５０、１９５、２５０又は５００グラムの平均重量を有する大きなラットであってもよい。処理された有害生物の生存率は、約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％未満、好ましくは約５０％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは５％未満であり得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される活性剤は、組成物Ｂ又は組成物Ｃよりも組成物Ａに処方された場合、より効果的である。例えば、組成物Ａに処方された場合、活性剤の治療的、免疫原性又は殺虫効果は、組成物Ｂ又はＣより少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％良好であり得る。
【００３３】
他の実施形態では、本発明の方法で使用される活性剤は、組成物Ａ又は組成物Ｃよりも組成物Ｂに処方された場合、より効果的である。例えば、組成物Ｂに処方された場合、活性剤の治療的、免疫原性又は殺虫効果は、組成物Ａ又はＣより少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％良好であり得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される活性剤は、組成物Ａ又は組成物Ｂよりも組成物Ｃに処方された場合、より効果的である。例えば、組成物Ｃに処方された場合、活性剤の治療的、免疫原性又は殺虫効果は、組成物Ａ又はＢより少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％良好であり得る。
【００３５】
「有効量」という用語は、所定の目標（例えば、動物における活性剤の制御放出、動物における疾患又は障害の治療又は予防、動物へのワクチン接種、又は害虫防除）を達成するために必要とされる活性剤を含む組成物の量を指す。活性剤を含む組成物の有効量は、所定の目標、動物の身体的特性、疾患又は障害の性質及び重症度、関連又は関連しない病状の存在、活性剤の性質、活性剤を含む組成物、組成物を動物に投与する手段、及び投与経路に応じて変化し得る。所与の動物のための特定の用量は、一般に、医師又は科学者の判断によって設定され得る。組成物は、１回又は複数回投薬で動物に投与することができる。各々の用量は、約０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１〜５００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００３６】
本発明の組成物は、経口、舌下、鼻腔内、眼内、直腸、経皮、粘膜、局所又は非経口投与用に処方することができる。非経口投与には、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、サブＱ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑膜外（関節液領域）、頭蓋内、脊髄内、及び髄腔内（脊髄液）注射又は注入が挙げられ得る。このような投与のために、非経口注射又は薬物製剤の注射若しくは注入に適した任意の装置を使用することができる。例えば、組成物は、無菌の予備充填注射器に含まれていてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書中で他に定義されない限り、本開示において使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解され、使用される意味を有するものとする。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用する「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」という用語は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。他に示さない限り、組成物中の成分のパーセンテージ又は部数は、重量基準である。用語「分散された」とは、懸濁及び／又は溶解を意味する。
【００３８】
「架橋」及びその変種とは、１つ以上の共有結合及び／又は非共有結合（例えば、イオン結合）を介して、２つ以上の材料及び／又は物質（本明細書に開示されるもののいずれかを含む）を連結させることをいう。連結は、自然に（例えば、シスチン残基のジスルフィド結合）又は合成若しくは半合成経路を介して行うことができる。荷電したポリマーの架橋は、反対の電荷の多価対イオンとのイオン結合によって行うことができる。このような架橋により、しっかりとした固体構造、例えばハイドロゲルを調製することができる。
【００３９】
「胃保護」は、胃の破壊及び活動の喪失からの生物活性剤の保護を指す。
【００４０】
「コーティングされている」とは、第１の材料が第２の材料によって取り囲まれているか又は埋め込まれていることを指す。
【００４１】
「有効量」とは、動物において所定の目標（例えば、胃後送達、動物における疾患又は障害の治療又は予防、又は有害生物の防除）を達成するために必要な活性剤を含む組成物の量を指す。活性剤を含む組成物の有効量は、所定の目標、動物の身体的特性、疾患又は障害（例えば、感染）の性質及び重症度、関連又は関連しない病状の存在、活性剤の性質、活性剤を含む組成物、活性剤を動物に投与する手段、及び投与経路に応じて変化し得る。動物用の特定の用量は、一般に、関連する分野の科学者、獣医師又は医師の判断によって設定され得る。組成物は、１回又は複数回投薬で動物に投与することができる。
【００４２】
本発明の組成物は、任意の望ましい順序又は順番で適用することができる、粘膜接着性ポリマー層、腸溶性ポリマー層及び脂肪／タンパク質層を含む３層のコーティングを有する生物活性剤を含む粒状材料を含む。ポリマーが低ｐＨで不溶性のままであり、保護コーティング又は層として無傷のままであるため、動物の胃における低ｐＨ条件への曝露から生物活性を保護する。粒子は、典型的には、１０〜５０００ミクロンの範囲の平均幾何学的サイズ（時には直径と呼ばれる）を有してよく、粉砕、粉砕、又は他の手段によって、そのサイズ範囲に直接適用され得るか、又はそのサイズに縮小され得る。通常、粒子は、１０００ミクロン未満、好ましくは５００ミクロン未満の直径を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、粘膜接着性ポリマー及び生物活性剤は、相互に接触して互いに混合され、順番に腸溶性ポリマー、続く脂肪又はタンパク質の第３のコートでコーティングされた粒子内で一緒に会合される。粘膜接着性ポリマー及び／又は腸溶コーティングポリマーは、架橋されていてもいなくてもよい。
【００４４】
他の実施形態では、生物活性剤は、上記のように油滴内に分散され、これらは粘膜接着性ポリマーでコーティングされる。次いで、得られた粒子を順番に腸溶コーティングポリマーでコーティングする。粘膜接着性ポリマー及び／又は腸溶コーティングポリマーは、架橋されていてもいなくてもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、特定の疾患に対する生物活性剤の水生種及び陸生種への経口投与のための組成物を提供する。組成物は、有効量の生物活性剤を含む。本組成物は、摂取及び粘膜接着を刺激するために、動物の腸粘膜と接触させるための生物活性材料を提示するように設計される。本発明による組成物は、典型的には、食事又は医薬として許容される担体とともに経口的に投与され得て、例えば、水（例えば、動物の飲料水）、錠剤、カプセル、ボーラス剤形、飼料ペレット、又は標的種の胃腸への組成物を運ぶための食品添加物などが挙げられる。
【００４６】
本発明の組成物は、生物活性剤を動物に送達する際にいくつかの利点を提供する。第一に、送達システムを作製する方法は、他の方法による粒子の調製にしばしば必要とされる有機溶媒又は高温及びｐＨの使用を排除する。本組成物の調製中、穏やかなｐＨ条件及び低温で水性環境を維持することにより、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ断片及び抗生物質などの感受性生物活性物質を経口的に送達することができる。第２に、腸溶性コーティングポリマーの追加の層は、胃腸管における分解から生物活性剤を保護する。第３に、生物活性剤を封入する追加の脂肪層又はタンパク質層は、マスキング特性を提供し、タンパク質、ペプチド及び薬物などの小さな生物活性分子が、調製中にならびに消費及び胃曝露中に水性環境に浸出するのを防止する。さらに、送達システムは、水生種と陸生種の両方への効率的な送達のために容易に処方することができる。
【００４７】
好ましくは、本発明の組成物を調製するのに使用される全ての成分は、食品グレード、非毒性及び生分解性で天然に存在する成分である。組成物を調製するために有用な材料の説明は以下の通りである。
【００４８】
生物活性剤
生物活性剤は、１つ以上の物理的、化学的及び／又は生物学的効果を直接的又は間接的に引き出すことができる、天然に存在する、合成又は半合成の材料（例えば、化合物、発酵物、抽出物、細胞構造物）であってもよい。生物活性剤は、例えば、寄生生物を破壊することによって、又は疾患又は異常の影響を制限することなどによって、生体の異常及び／又は病的状態を予防、緩和、処置及び／又は治療することができる。効果及び／又はその適用に依存して、生物活性剤は、医薬品（予防剤又は治療剤など）、診断剤及び／又は美容剤であってよく、限定されないが、ワクチン、薬物、プロドラッグ、親和性分子、合成有機分子、ホルモン、抗体、ポリマー、酵素、低分子量分子、タンパク質性化合物、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、脂質、核酸、炭水化物、それらの前駆体、及びそれらの誘導体を含む。生物活性剤は、栄養補給剤であってもよい。非限定的な栄養補助食品には、タンパク質、炭水化物、水溶性ビタミン（例えば、ビタミンＣ、Ｂ−複合ビタミンなど）、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋなど）、ミネラル、ハーブエキスが含まれる。生物活性剤は、市販されてもよく、及び／又は公知の技術によって調製されてもよい。
【００４９】
本発明における生物活性剤には、限定されないが、ワクチン（ワクチンは、免疫刺激複合体、抗原とコレラ毒素及びＢサブユニット、レクチン及びアジュバントとのコンジュゲートの一部として送達することもできる）、抗生物質、親和性分子、合成有機分子、ポリマー、低分子量タンパク質性化合物、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、脂質、核酸、炭水化物、それらの前駆体、及びそれらの誘導体を含む。生物活性剤はまた、農薬、例えば殺鼠剤であってもよい。
【００５０】
生物活性剤は、免疫原、すなわち、動物において特異的免疫応答を生じさせることができる物質であってもよい。免疫原の例としては、抗原及びワクチンが挙げられる。例えば、免疫原には、免疫原性ペプチド、タンパク質又は組換えタンパク質、例えば、免疫原性ペプチド及び／又はタンパク質及び細菌（例えば、バクテリン）を含む混合物；インタクトな不活性、弱毒化及び感染性のウイルス粒子；インタクトな死滅した、弱毒化した、及び感染性の原核生物；インタクトな死滅した、弱毒化した、及び感染性の原生動物（いずれのライフサイクルの段階のものを含む）；インタクトな死滅した、弱毒化した、及び感染性の多細胞病原体、組換えサブユニットワクチン、及び免疫原性タンパク質（例えば、ＤＮＡワクチン）をコードする遺伝子を送達及び発現するための組換えベクターが含まれる。
【００５１】
１種以上の生物活性剤は、水を除いて、粒子の重量の少なくとも０．１％、又は少なくとも１％、又は少なくとも５％を構成することができる。好ましくは、それらは多くとも４０％、又は多くとも２０％、又は多くとも１０％を構成する。
【００５２】
粘膜接着性ポリマー
粘膜接着性ポリマーは、粘膜組織に特異的に結合するポリマーであり、粘膜のすぐ近くに生物活性剤を保持するのを助け、それによって投与を改善する。適切な例には、合成ポリマー、例えば、ポリ（アクリル酸）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリ（アクリル酸メチル）、カルボン酸官能化ポリマー、硫酸官能化ポリマー、アミン官能化ポリマー、及びそれらの誘導体又は修飾物、ならびに天然に存在するポリマー、例えば、カラギーナン、ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性グアー及びアルギン酸塩が含まれる。天然に存在するポリマーの誘導体化された又は他の方法で修飾されたものも使用することができ、このようなポリマーの多くは当該技術分野において公知である。非限定的な例としては、アルギン酸プロピレングリコール及びペクチン、カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルキトサン、メチルグリコールキトサン、トリメチルキトサンなどが挙げられる。
【００５３】
好ましい粘膜接着性ポリマーは、キトサン及び修飾された又は誘導体化されたキトサンであり、これは、甲殻類の外骨格の主要化合物であるキチンの脱アセチル化によって得ることができる。セルロースに密接に関連するムコ多糖類であるキトサン［α−（１〜４）−２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン］は、分子量、脱アセチル化度、及び粘度によって決定される化学的性質を示す。キトサンは、リン酸イオン、グルタルアルデヒド又は硫酸イオンなどの架橋剤との化学反応によって大量の抗原に結合することができる微粒子及びナノ粒子を形成することができる。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態ではキトサンが使用されるが、同様の粘膜接着機能を達成するために他のポリマーを使用してもよい。これらには、限定されないが、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、ヒアルロン酸、寒天及び耐性デンプンが含まれる。
【００５５】
１つ以上の粘膜接着性ポリマーは、水を除いて、粒子の重量の少なくとも１％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％を構成することができる。好ましくは、それらは多くとも５０％、又は多くとも３０％、又は多くとも２０％を構成する。
【００５６】
いくつかの伝統的な製品では、大量の生物活性剤が、その調製中及び胃通過を通して粒子から浸出することによって水性環境に失われ、特に小分子サイズの生物活性剤、例えばウイルス、タンパク質、薬物、抗生物質がそうである。本発明において、生物活性剤の粒子からの浸出は、油中に分散されているか又は油で被覆されている薬剤を含有する別個の粒子、ドメイン又は相によって大きく排除される。生物活性剤をコーティングするために、植物油、動物油又は合成油などのいずれかのタイプの油、及び液体又は固体形態の脂肪、又はワックスを使用することができる。本発明に用いられる植物起源油としては、限定されないが、ヒマシ油、ヤシ油、ココバター、コーン油、綿実油、オリーブ油、オリーブスクワラン、パーム油、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ油、ステアリン酸塩、カルナバワックス及びそれらの混合物が挙げられる。本発明で使用される動物起源油には、限定されないが、魚油、サメのスクワラン、バター脂肪、蜜ろう、ラノリン、ラードなどが含まれる。ある場合には、分散油は、オリーブ又はサメスクアランと他の種類の油、脂肪又はワックスとの混合物である。油の質量は、生物活性剤と粘膜付着性ポリマーとの合計質量よりも大きくてもよい。
【００５７】
タンパク質コーティング剤
いくつかの従来の製品では、非常に大量の生物活性剤が、その調製中及び胃通過を通して粒子から浸出することによって水性環境に失われ、特に小分子サイズの生物活性剤、例えばウイルス、タンパク質、薬物、抗生物質などがそうである。本発明では、粒子からの生物活性剤の浸出は、タンパク質が分散されているか、又はタンパク質によってコーティングされている薬剤を含有する別個の粒子、ドメイン又は相によって大きく排除される。生物活性剤をコーティングするために、野菜、動物又は酪農タンパク質を含む任意のタイプのタンパク質を使用することができる。本発明で使用される野菜起源タンパク質には、限定されないが、大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質、エンドウタンパク及び任意の他の植物の植物源が含まれる。本発明において使用される動物起源のタンパク質には、限定されないが、魚タンパク質、肉及び血液タンパク質、ウシ及び卵白アルブミンなどが含まれる。本発明において使用される乳由来タンパク質は、限定されないが、カゼイン、乳清タンパク質、ラクトグロブリンなどを含む任意のタイプの乳タンパク質を含む。
【００５８】
腸溶コーティングポリマー
油コーティング層を有する又は有さない粘膜接着性ポリマーでコーティングされた粒子は、胃の保護及び胃後放出又はインタクトな生物活性剤の送達、すなわち腸での放出を提供する腸溶性コーティングポリマーの層でコーティングされる。
【００５９】
例示的な腸溶コーティングポリマーは、十分に高いｐＨで水に可溶であるが、低いｐＨでは不溶性のポリマーを含む。これらは、５．０を超えるｐＨでは可溶性であり、４．０未満のｐＨでは不溶性であり得る。適切なポリマーは、動物の腸の比較的穏やかなｐＨ条件下で実質的に可溶性又は消化性であり、この場合、生理活性物質が放出されるが、胃では不溶性で消化不可能であり、この場合、腸溶性コーティングポリマーの外部マトリックスが感受性生物活性剤を劣化から保護する。いくつかの場合において、腸溶性コーティングポリマーは、例えば、二価カチオンで架橋されて、胃における溶解又は消化を防止する。
【００６０】
適切な腸溶コーティングポリマーは、例えば、ポリアクリル酸、ポリ（メタ）アクリレート、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース及び水溶性の天然又は合成の多糖類ガムなどの広範囲の親水性ポリマーのいずれかから選択することができる。代表的な合成腸溶性コーティングポリマーの１つは、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）である。アルギン酸ナトリウム及びペクチンは、その軽度の架橋条件のために、好ましい水溶性ガムである。
【００６１】
アルギン酸塩は、特に固体ゲル組成物の形成における使用の容易さのために、胃に敏感な生物活性剤のための好ましい親水性担体マトリックスを提供する。アルギン酸塩溶液は、二価カチオンと合わせるか又は混合されると固体ゲルを形成する。それにもかかわらず、いくつかの実施形態では、アルギン酸塩は架橋されていないが、胃環境では消化不能及び不溶性のままであり、したがって、動物の胃の低ｐＨ条件下でありながら粒子含有量を保護する。
【００６２】
アルギン酸塩は、様々な割合の１，４−結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）、α−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）及び交互（ＭＧ）ブロックを含む。アルギン酸塩溶液の粘度は、大部分がＭ／Ｇブロックの分子比によって決定される。低粘度のアルギン酸塩は、最低５０％のマンヌロン酸塩単位を含み、その粘度は２０〜２００ｍＰａの範囲である。中位及び高い粘度のアルギン酸塩は、最小５０％のグルロン酸単位を含み、それらの粘度は２００ｍＰａｓを超え得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、腸溶性ポリマーは、アルギン酸塩、ペクチン又はそれらの混合物である。低粘度グレードのアルギン酸塩及び低メトキシペクチンが好ましい。いくつかの低メトキシペクチンは、メチル化度が５０％未満であり、これらはＢａ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｒ又はＺｎのような二価カチオンと架橋していてもよい。
【００６４】
１つ以上の腸溶性コーティングポリマーは、水を除いて、粒子の重量の少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％を構成することができる。それらは、多くとも７０％、又は多くとも５０％、又は多くとも４０％を構成し得る。
【００６５】
任意の成分
いくつかの実施形態では、組成物は、一次生物活性剤に加えて、栄養素、栄養補助食品、飼料誘引物質及び／又は味覚マスキング化合物を任意に含む。浸透増強剤又はアジュバントもまた含まれ得る。
【００６６】
組成物の製造
典型的な手順では、粉末形態の乾燥生理活性物質を粘膜接着性ポリマーの層でコーティングしてもよい。あるいは、生物活性剤を含有する水溶液を粘膜接着性ポリマー溶液に溶解してもよく、必要に応じて、粘膜接着性ポリマー溶液を架橋によって固化させてもよい。例えば、ゼラチン及び寒天ポリマーは、温度を下げるか又はエマルションのｐＨを変えることによって固化される。一方、エマルジョンのｐＨを６．５より上に上昇させることによって、及び／又はトリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）などの対イオンを添加することによって、キトサンを固化させる。固化した架橋溶液を凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥させて乾燥粒状物質を形成する。次いで、乾燥した材料を、均一な被膜が生成されるまで、１重量部の乾燥粒子対１．１〜５重量部の油の比で脂肪層でコーティングされる。均一で安定な被膜の形成を助けるために、非イオン性界面活性剤を添加することができる。適切な非イオン性界面活性剤としては、限定されないが、エトキシル化脂肪族アルコール、ポリオキシエチレン界面活性剤及びカルボン酸エステルなどが挙げられる。
【００６７】
粒子を製造する第１の一般的な方法は以下の通りである。生理活性剤を含む乾燥粉末材料を粘膜接着性ポリマー溶液でコーティングし、次いで乾燥して、粘膜接着性ポリマーを含む第１のコーティング層を有する生物活性剤粒子を形成する。乾燥した粘膜接着性の生物活性物質は、次いで、典型的には、乾燥粒子１部対１．１〜５部の脂肪の比で、第２の脂肪コーティング剤でコーティングされる。次いで、脂肪コーティングされた粒子は、典型的には、腸溶性ポリマーの０．５〜１．５部対生物活性剤の１部の比で腸溶性ポリマーの第３の層でコーティングされる。
【００６８】
第２の一般的な方法では、分散又は溶解した生物活性剤及び粘膜接着性ポリマーを含む水性混合物を噴霧乾燥又は凍結乾燥して、乾燥粘膜接着性生物活性材料を生成する。次いで乾燥材料を脂肪の第２の層でコーティングし、続いて腸溶性ポリマーの第３の層をコーティングする。
【００６９】
第３の一般的な方法では、上記の第１又は第２の一般的方法に従って製造された粘膜接着性生物活性物質は、腸溶性ポリマーの第２のコーティング、続いて脂肪の第３のコーティングでコーティングされる。
【００７０】
第４の一般的な方法では、上記の３つの一般的方法による脂肪層を混合し、又はタンパク質層で置き換える。
【００７１】
組成物の使用
本発明の組成物は、水性懸濁液中に保存することができ、又は当該技術分野で公知の任意の乾燥方法によって乾燥させることができ、有意な活性損失なしに長期間、脱水状態で保存することができる。
【００７２】
本発明の組成物は、飲料水の成分として、食品添加物として、又は医薬として許容される担体及び任意のアジュバントを含有する製剤の一部として経口投与することができる。あるいは、本組成物は、他の標準的な経口剤形に含めることができる。当業者は、組成物を標的動物に送達させるのに適した、当該技術分野において承認されている多種多様の食品、飼料、栄養補助食品又は医薬品剤形及び許容される担体があることを認識する。
【００７３】
本発明による組成物の投与は、単回又は複数回投薬プロトコルで行うことができる。一実施形態では、生物活性組成物は、約３日〜約１０日以上の期間にわたって投与される複数回投薬プロトコルで投与され、標的種が免疫の喪失を示すときに定期的に繰り返すことができる。
【００７４】
ブタ、家禽、ウシ又は水生動物での使用のための飲料水用途には、追加の油又は不活性ポリプロピレン若しくはポリエステル粒子を組成物に組み込んで浮力を増加させる（すなわち密度を減少させる）ことができ、それにより、魚培養タンクにおける送達用の散水デバイスを用いて、本組成物を送達することができる。したがって、組成物は、それらの毎日の食物の成分として、又は飲料水の成分として動物に投与することができる。
【実施例】
【００７５】
実施例１ａ
本発明の組成物の調製
本発明の組成物を以下のように調製した。３ｇの粘膜接着性ポリマー（Ｃｈｉｔｏｓａｎ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）を１００ｍｌの０．５Ｎ氷酢酸溶液に５０℃で溶解した。水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを５．８に調整し、溶液を室温に冷却した。Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び消泡剤（０．５％、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、使用するまでキトサン溶液を４℃に保った。３００ｍｇのオボアルブミン（「ＯＶＡ」、モデルワクチン）を含有する３０ｍｌ溶液をキトサン溶液に添加して混合物を生成した。得られた溶液を、５％Ｓｐａｎ−８０（Ｓｉｇｍａ）を含むオリーブ油１９５ｇに添加し、氷浴中で１０，０００ｒｐｍで３０分間ホモジナイズして、油中水型エマルションを形成した。２０ｍｌの水性トリポリリン酸ナトリウム（５％）及び０．５Ｎ  ＮａＯＨを、連続油相中でオボアルブミン及び架橋キトサン微粒子を含有する生物活性剤エマルジョンに混合しながらゆっくりと添加した。粒子を少なくとも２時間硬化させたが、油相から除去しなかった。
【００７６】
油中の粒子の分散液を、６６ｇのオリゴ糖（インスタントイヌリン、Ｃａｒｇｉｌｌ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、１０ｇのレシチン及び３ｇのＴｗｅｅｎ−８０を含む低粘度グレードのアルギン酸ナトリウム（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）の９％水溶液３３０ｍｌ中に撹拌した。得られた水性分散液を５％ＣａＣｌ2を含有する架橋溶液に注入してアルギン酸塩マトリックスビーズを形成させた。各ビーズにはオボアルブミン及び架橋キトサンの微粒子を含む複数の油滴が含まれていた。ビーズを凍結乾燥し、１５０μｍサイズの粒子より小さく粉砕して、本発明の乾燥組成物を得た。
【００７７】
実施例１ｂ
本発明の組成物を形成する別の方法は、油中の水性生物活性溶液のエマルジョンを利用する。オボアルブミン１００ｍｇを含有する水溶液１０ｍｌを、５％Ｓｐａｎ−８０を含有するキャノーラ油１５ｇと混合し、ホモジナイズして油中水型エマルジョンを形成させた。エマルジョンを３％キトサン水溶液１００ｍｌと混合し、５％トリポリリン酸溶液（５％ＴＰＰ）を含有する架橋溶液に注入した。粒子を少なくとも２時間硬化させた。得られた固体架橋キトサン粒子は、埋め込まれた油滴を含み、これらの油滴の各々は、水性オボアルブミンの１０μｍ未満の小滴を分散して含んでいた。固体粒子を濾過により単離し、９％低粘度グレードのアルギン酸塩の水溶液４００ｍｌに微分散させた。得られた水性分散液を５％ＣａＣｌ2を含有する架橋溶液に注入してアルギン酸塩マトリックスビーズを形成させた。ビーズを凍結乾燥し、１５０μｍサイズの粒子より小さく粉砕して、本発明の乾燥組成物を得た。
【００７８】
実施例２
免疫原性組成物の調製
キトサン（３ｇ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）を１００ｍｌの０．５Ｎ氷酢酸溶液に５０℃で溶解した。水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを５．８に調整し、溶液を室温に冷却した。モデルワクチンとしてオボアルブミン（ＯＶＡ）１００ｍｇを含有する１０ｍｌの溶液を、５０ｍｇの免疫刺激剤（ベータグルカン、ＡＨＤ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）と混合し、キトサン溶液に添加した。得られた混合物を、１０，０００ｒｐｍで５％ｗ／ｗのＳｐａｎ−８０を含有する１５０ｇのサメのスクワラン油（Ｊｅｄｗａｒｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で３０分間乳化して、連続油相中のＯＶＡ、キトサン及びベータグルカンの水性液滴のエマルジョンを形成した。このエマルジョンを、オリゴ糖（４０ｇ、インスタントイヌリン）も含有する０．５Ｎ  ＮａＯＨ中の９％低粘度グレードのアルギン酸ナトリウムの水溶液４００ｍｌに撹拌しながら加えた。得られたエマルジョンを５％ＣａＣｌ2溶液に注入してアルギン酸塩を架橋させ、本発明の免疫原性組成物を得た。組成物を凍結乾燥し、２５０μｍ未満の粒子に粉砕した。
【００７９】
実施例３
魚類の寄生虫感染の治療／予防用組成物の調製
魚類における寄生虫侵入を治療するためのタンパク質抗原又は寄生虫駆除化合物を含有する組成物を調製する。上記実施例２に記載のように１０ｍｇの３％キトサン水溶液１０ｍｌに溶解し、７５％オリーブ油、２０％スクワラン油及び５％Ｓｐａｎ−８０を含む１５ｇの油混合物に乳化する。
【００８０】
５％トリポリリン酸ナトリウム、０．５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液１ｍｌを１ｇのオリーブ油に乳化させ、生物活性剤エマルジョンに混合し、生物活性剤及び架橋キトサンを含有する粒子の油中分散液を得る。分散液を２時間放置して、架橋したキトサンを硬化させる。油中の得られた粒子分散液を、低粘度グレードのアルギン酸ナトリウム９％、低メトキシペンテイン１％、インスタントイヌリン３０％及びＴｗｅｅｎ−８０  １％を含有する２０ｍｌの溶液に撹拌しながら添加する。得られた混合物を３％ＣａＣｌ2を含有する架橋溶液に注入して、各々が順番に生物活性及び架橋したキトサンの微粒子を含む、アルギン酸塩−ペクチンマトリックスを含有する包埋分散油滴のビーズを形成する。ビーズを凍結乾燥し、１５０μｍ未満に粉砕して、本発明の乾燥組成物を得る。
【００８１】
実施例４
医薬品を含む組成物の調製
結腸疾患の治療のための医薬品（デキサメタゾン又はメチルプレドニゾロンなどのグルココルチコイド）を含む組成物を調製する。上記の実施例１又は２に記載したようにキトサン溶液に薬物を添加し、９５％スクワラン油と５％スパン−８０との混合物中に乳化する。スクワラン油中の０．５Ｎ  ＮａＯＨ中の５％トリポリリン酸ナトリウムを含有するアルカリエマルジョンを調製し、生理活性エマルジョン中にゆっくりと混合して（２０％ｗ／ｗ）、キトサンを架橋させ、混合物を少なくとも２時間放置して、架橋された粒子を硬化させる。キトサン微粒子の油分散液を、腸溶コーティングポリマー（３０％ｗ／ｗ  ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有する液体中に１：３エマルジョン／Ｅｕｄｒａｇｉｔ液の比で混合し、噴霧乾燥させて本発明お乾燥粒状組成物を形成する。
【００８２】
実施例５
本発明の組成物中の生物活性剤の封入効率
本発明の組成物における追加の油分散及び腸溶コーティングポリマーマトリックスの効果を、オバルブミン（ＯＶＡ）を用いて評価して、典型的なタンパク質薬物又はワクチンをシミュレートした。３つのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ）含有組成物を調製した。組成物１は、１０ｍｌの３％キトサン溶液に１００ｍｇのＯＶＡを溶解し、この溶液を１０％水性ＴＰＰに注入して架橋ビーズを形成し、続いて２時間保持してビーズを硬化させ、その後に硬化させて調製したＯＶＡ結合キトサン微粒子を凍結乾燥及び粉砕した。組成物２は、３％Ｓｐａｎ−８０を含有する１５ｇのスクワラン油中に１００ｍｇのＯＶＡを含有する１０ｍｌの水溶液を乳化し、得られた乳濁液を２０ｍｌの３％キトサン溶液中で混合することによって製造した。次いで、得られたスラリーを１０％ＴＰＰ溶液に注入してビーズを形成し、続いて硬化、凍結乾燥及び粉砕を上記のように行った。組成物３は、実施例２のように調製した本発明のＯＶＡ結合キトサン微粒子からなっていた。
【００８３】
これらの３種類の組成物におけるＯＶＡの封入効率を以下のようにして決定した。５００ｍｇの各組成物を１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液に分散させ、室温で３０分間インキュベートした。懸濁液を５分間ボルテックスし、次いで３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を以下のようにウエスタンブロット分析を用いてＯＶＡ含量についてアッセイした。
【００８４】
ウエスタンブロット：組成物を上記のようにＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、サンプルあたり１２μｇのタンパク質に相当する計算量を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にかけた。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に移し、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の５％脱脂乳で１時間ブロックした。ブロットを適切な一次抗体と１：５０００希釈で室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（３×１０ｍＬ、各５分）で洗浄した後、膜を適切なＨＲＰ結合二次抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ビレリカ）と１：５０００希釈で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（３×１０ｍＬ、各５分）で洗浄した後、化学発光膜をＥＣＬ基質（Ａｍｓｈｅｒａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で展開した。ＯＶＡの封入効率（元のＯＶＡの保持率）を表１に示す。
【００８５】
【表１】
2018525340.tif 000002
【００８６】
結果は、単純な水性環境に対する生物活性剤の浸出（損失）を防止する上で、組成物２及び３における油分散液の保護効果を実証する。しかしながら、以下の実施例７に記載するように、胃条件下で試験した場合、比較組成物２と本発明組成物３との間の有意差が見出された。
【００８７】
実施例６
模擬胃液中の非保護タンパク質抗原活性の低下
典型的な胃暴露後のタンパク質抗原の活性低下を評価するために、カプセル化されていないＯＶＡ（１０ｍｇ）をシェーカーで３７℃で２時間、ｐＨ２で０．０８％ペプシンを含有する模擬胃液１０ｍｌ中でインキュベートした。１５分、３０分、６０分及び１２０分のインキュベーション時間で培地を回収し、上記のようにウエスタンブロット分析を用いて残留ＯＶＡの量を分析した。表２は、模擬胃液中の２時間の曝露に対するＯＶＡの分解を示し、曝露前の活性と比較して残存活性％として示されている。
【００８８】
【表２】
2018525340.tif 000003
【００８９】
これらの結果は、保護されていないタンパク質ベースの抗原又は生物活性剤の活性が動物の消化管において完全に分解されることを示している。
【００９０】
実施例７
本発明の組成物中の生物活性剤の胃保護
胃の曝露後のタンパク質抗原の残存活性を評価するために、３つの組成物を実施例５に記載のように調製した。３つの組成物の各々の５００ｍｇを、ｐＨ−２で０．０８％のペプシンを含有する模擬胃液１０ｍｌ中で、シェーカー上で３７℃でインキュベートした。２時間の曝露の終わりに、胃液を採取し、組成物中のＯＶＡの残存活性を実施例５に記載したように測定した。表３は、模擬胃液への２時間の曝露後の各組成物におけるＯＶＡの残存活性を示す。
【００９１】
【表３】
2018525340.tif 000004
【００９２】
これらの結果は、先行技術の組成物１及び２と比較して、本発明の組成物３の優れた胃保護効果を明らかに示している。
【００９３】
実施例８
胃保護に対する組成物中のアルギン酸塩の粘度グレードの影響
上記実施例２に従って、９％低級粘度のアルギン酸塩（５０ｃＰ）、６％中程度の粘度のアルギン酸塩（３００ｃＰ）及び１％高級粘度のアルギン酸塩（８００ｃＰ）を含む組成物を調製した。３つの組成物を、実施例７に記載したように模擬胃液に曝露し、組成物中のＯＶＡの残存活性を実施例５に記載したように測定した。表４は、模擬胃液への２時間曝露後の各組成物におけるＯＶＡの残存活性を示す。
【００９４】
【表４】
2018525340.tif 000005
【００９５】
これらの結果は、低粘度グレードのアルギン酸塩を含有する組成物が、模擬動物の消化管において、タンパク質ベースの抗原のより高い保護又は生物活性を提供することを実証している。
【００９６】
実施例９
本発明の組成物の最適粒径
この実施例では、模擬胃環境における乾燥し粉砕された本発明の組成物の粒子サイズの保護効果を評価した。実施例５に記載したようにＯＶＡ組成物を調製し、続いて乾燥粉末を２つの粒子サイズに分離した：５０μｍスクリーンを通過した小さな粒子、及び５０μｍスクリーン上に捕捉されたが１００μｍスクリーンを通過した大きな粒子。表５は、模擬胃液中での２時間の曝露後の組成物の各粒子サイズにおけるＯＶＡの残存活性を示す。
【００９７】
【表５】
2018525340.tif 000006
【００９８】
これらの結果は、乾燥組成物が５０μｍを超える粒径に粉砕されるときに最適な胃保護が提供されることを示す。
【００９９】
実施例１０
ＯＶＡ組成物のマウスへの経口投与
オボアルブミンはマウスに経口投与され、免疫応答を誘導する際の本発明の組成物の有効性を試験する。
動物：１０週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用する。マウスは自由に飼育される。各実験群は、別々のケージ内に収容される。
【０１００】
オボアルブミン組成物：オボアルブミン（オボアルブミン１ｍｇ／ｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を実施例５に記載したように本発明の組成物に組み込む。４匹のマウスからなる３つの群にそれぞれ以下を接種する：１）オボアルブミン（ＯＶＡ）、２）皮下投与されたＯＶＡ溶液（ＳＣ）、３）経口投与された無抗原組成物。マウスに０及び３週間接種する。各用量は、乾燥組成物／油の１：２ｗ／ｗの比でトウモロコシ油と混合した乾燥組成物の総量１００ｍｇを飼料ペレットにコーティングして投与する。４週目に各マウスを安楽死させ、血清及び脾臓細胞を採取する。
【０１０１】
免疫学的検定：血清は、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ及びＩｇＡについて検定される。ＥＬＩＳＡは、ポリスチレンプレートに吸収されたＯＶＡを用いて行われる。試料を、血清について１：２５希釈で３重にウェルに入れる。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウス抗体、続いてオルトフェニレンジアミン基質（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用する。各ウェルの光学密度は、プレートをマイクロタイタープレート分光光度計に置き、４９０ｎｍでプレートを読み取ることによって決定する。脾臓細胞は、以前に記載された技術を用いて、ＯＶＡに特異的な抗体分泌細胞（ＡＳＣ）について試験される。
【０１０２】
ＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体は、経時的な光学密度の増加を測定することによって定量する。ＯＶＡを接種した各マウスのＯＶＡ特異的血清及びＩｇＡ  ＩｇＧ及びＡＳＣ分泌細胞は、ＯＶＡを注射し、本発明の組成物を経口投与したマウスで等しく増加すると予想される。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ又はＩｇＡ抗体は、無抗原組成物を与えたマウスでは検出されないと予想される。したがって、組成物は、経口投与の際に免疫応答を誘導するのに有効であると予想される。
【０１０３】
実施例１１
抗原を含む組成物のニワトリへの経口投与
サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）は、ニワトリを飼育する際の病気の主要原因である。感染症は生産を減少させ、群れの死亡率を増加させる。さらに、Ｓ．エンテリティディスは、卵を通過して幼鳥に感染し、その後の世代又は感染した卵を消費するヒトに感染することができる。この細菌が腸粘膜に付着して侵入することによって感染が始まり、長期感染は腸リンパ組織の感染を伴うため、粘膜免疫の刺激はこの疾患を制御するために不可欠である。
【０１０４】
本発明のワクチン組成物によるニワトリのワクチン接種の有効性を評価するために、重要な免疫原であるサルモネラ・エンテリティディスのフラジェリンを、実施例２の組成物に組み込む。但し、ワクチンエマルジョンをアルカリ性アルギン酸ナトリウム相に１：２ｗ／ｗの比であり、スラリーは噴霧乾燥される。乾燥組成物は飼料に上塗りされ、雛に経口投与される。１０週齢のニワトリには、Ｓ．エンテリティディスのフラジェリン抗原又はウシ血清アルブミンの３００μｇのいずれかを負荷した組成物の２週間間隔で３回の経口投与を受ける。抗原の最後の経口投与の１週間後、血清及び腸液を収集し、ＥＬＩＳＡによってフラジェリン特異的抗体についてアッセイする。結果は、経口ワクチン接種されたニワトリが血清中のフラジェリン特異的抗体を有意に増加させたことを示すことが期待される。
【０１０５】
実施例１２
抗原を含む組成物の仔ウシへの経口投与
仔ウシの肺における免疫応答を刺激するために本発明に従って調製された経口投与されたオボアルブミン含有組成物の有効性が実証される。
【０１０６】
オボアルブミンは、実施例１ａに記載されるように組成物に組み込まれる。仔ウシへの経口投与のために、４０μｇのオボアルブミン／ｍｇの用量を含有する組成物を飼料中に投与する。実験群ごとに４匹の子牛を使用し、それぞれの子牛は５日間連続して５ｍｇのオボアルブミン／投薬を受ける。
【０１０７】
経口投与されたオボアルブミンが特異的な免疫応答を誘導する有効性を評価するために、２群の仔ウシを使用する。第１群には、不完全フロイントアジュバント中で３週間離れて皮下（ＳＣ）注射によってオボアルブミンを２回投与する。このグループは、非経口コントロールとして機能し、ワクチン接種の方法は任意のワクチンに日常的に使用される。グループ２は、３週間離れたオボアルブミンを含む組成物の２回の経口レジメンを受ける。オボアルブミンに対するアイソタイプ抗体応答について血清を評価する。結果は、ＯＶＡ含有組成を有する経口摂食された仔ウシにおいて有意な量のＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが産生されることを示すことが期待される。期待される非常に高いレベルの血清ＩｇＡは、ウシの全身免疫反応を刺激する高い有効性を予測する。
【０１０８】
実施例１３
ビブリオ抗原を含む組成物の魚類への経口投与
ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、水産養殖における深刻な細菌感染であり、特にニジマスでは重篤である。それは現在、深刻な経済的損失を引き起こす可能性があるすべてのマス生産国では風土病である。主に淡水成長期にある養殖されたサーモンのより重要な病原体になっているが、海洋でも損失を引き起こすことが報告されている。ワクチン接種は、サケ科動物の飼育サイクルのどの段階においても、Ｖ．アルギノリチカスが大きな影響を及ぼさないよう予防することができる。典型的なワクチン接種プログラムには、１〜５グラムの一次ワクチン接種と、一次ワクチン接種の４〜６ヶ月後の経口ブースターワクチン接種を伴う。しかしながら、理想的なワクチン接種プログラムは、培養期間全体を通して魚の血清中に有効な抗体力価を維持するために、魚に定期的に与えられる１つのタイプのワクチン接種のみを含む。
【０１０９】
実験設計：本発明に従って調製した経口投与ＥＲＭワクチン含有組成物の、マス血清中の免疫応答を刺激する有効性を実証する。
【０１１０】
弱毒化されたＶ．アルギノリチカスは、実施例１ｂに記載の組成物内に組み込まれる。魚への経口投与のために、１ｍｇあたり２μｇのＶ．アルギノリチカスワクチンの用量を含有する組成物を飼料中に投与する。実験群あたり平均サイズ５ｇで魚２０匹を使用し、各魚は５日間連続して飼料でアルギノリチカスワクチンのワクチン１回分を摂取する。
【０１１１】
３つの群の魚を使用して、注射による標準ワクチン接種と比較して免疫応答を誘導する経口投与されたＶ．アルギノリチカスワクチンの有効性を評価する。１群は、注射プロトコルによるワクチン接種を用いてワクチン接種される。この群は、任意のワクチンに日常的に使用されるワクチン接種の方法である非経口コントロールとして機能する。２群は、Ｖ．アルギノリチカスワクチンを含有する組成物の１つの経口レジメンを受ける。３群は、ワクチンを含まない組成物の１回の経口レジメンを受ける。血清はワクチン接種の６週間後にＶ．アルギノリチカスに対するアイソタイプ抗体応答について評価される。
結果は、有意な量のＶ．アルギノリチカス特異的ＩｇＡが、Ｖ．アルギノリチカス含有組成物を有する経口給餌された魚において産生されることを示すことが期待される。経口及び注射したワクチン接種魚の血清中の免疫応答は同等であると予想される。予想される非常に高いレベルの血清ＩｇＡは、魚における全身免疫応答の刺激において高い有効性を予測する。
【０１１２】
実施例１４
殺鼠剤を含む組成物
ａ）この実施例は、マスキング剤として働く脂肪でコーティングされた寄生生物化合物を含有する乾燥組成物の調製、及び動物用飼料の嗜好性を改善し、続いて腸溶性ポリマーの追加のコートを改善することを記載する。ＣＥＢＥＳ  ２７−７０（Ａａｒｈｕｓ  Ｕｎｉｔｅｄ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔ  Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ  ａｎｄ  １７−Ｓｔｅａｒｉｎｅ（Ｌｏｄｒｅｓ  Ｃｒｏｋｌａａｎ  Ｎ．Ａｍｅｒｉｃａ  ＬＬＣ．，Ｃｈａｎｎａｈｏｎ，ＩＬ））の３５０ｇ混合物（１：１ｗ／ｗ比）を４５℃で融解した。乾燥粉末の形態の殺鼠剤３５０ｇを、４５℃及び撹拌下で、溶融脂肪中でゆっくりと混合した。この物質を撹拌しながら室温まで冷却し、最終粒状物質を凍結し、粉砕し、４００ミクロンのふるいで分けた。固化した生物活性脂肪混合物を、撹拌しながら９％低粘度アルギン酸塩（Ｓｉｇｍａ）溶液３５０ｇで最初にコーティングして、粒状粉末上にアルギン酸塩層の堆積を形成させた。この物質を風乾し、５００ミクロンのふるいで分けた。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｅｓｓｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）１０５０ｇを撹拌した材料上にゆっくりと噴霧し、材料を空気乾燥させ、６００ミクロンのふるいで分けた。
【０１１３】
ｂ）第２の例は、最初に腸溶性ポリマーでコーティングされた抗原ワクチン又は殺寄生虫化合物と、マスキング剤として作用する脂肪の追加の被膜とを含み、動物飼料の嗜好性を改善する乾燥組成物の調製を記載する。乾燥粉末の形態の殺鼠剤３５０ｇを撹拌しながら９％低粘度アルギン酸塩（Ｓｉｇｍａ）溶液３５０ｇと混合して凝集させ、粒子状粉末上にアルギン酸塩層の堆積を形成させた。材料を風乾し、２５０ミクロンのふるいで分けた。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｅｓｓｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）１０５０ｇを撹拌した材料上に噴霧し、材料を空気乾燥させ、４００ミクロンのふるいにかける。ＣＥＢＥＳ  ２７−７０（Ａａｒｈｕｓ  Ｕｎｉｔｅｄ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔ  Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ  ａｎｄ  １７−Ｓｔｅａｒｉｎｅ（Ｌｏｄｒｅｓ  Ｃｒｏｋｌａａｎ  Ｎ．Ａｍｅｒｉｃａ  ＬＬＣ．，Ｃｈａｎｎａｈｏｎ，ＩＬ））の３２０ｇ混合物（１：１ｗ／ｗ比）を４５℃で融解した。次いで、４５℃で撹拌しながら乾燥粉末中でゆっくりと混合する。この物質を撹拌を継続しながら室温に冷却させ、最終粒状物質を６００ミクロンのふるいで分けた。
【０１１４】
ｃ）第３の例は、腸溶性ポリマーでコーティングされた抗原ワクチン又は寄生虫性化合物の乾燥粉末の調製、続いてマスキング剤として働き、動物飼料の嗜好性を改善するタンパク質のさらなるコートを記載する。乾燥粉末形態の乾燥した殺鼠剤３５０ｇを攪拌しながら９％低粘度のアルギン酸塩（Ｓｉｇｍａ）溶液３５０ｇと混合して凝集させ、粒子状粉末上にアルギン酸塩層の堆積を形成させた。材料を風乾し、２５０ミクロンのふるいで分けた。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｅｓｓｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）１０５０ｇを撹拌した材料上に噴霧し、材料を風乾し、４００μｍのふるいで分けた。次いで、撹拌を続けながら、カニューレ（Ｓｉｇｍａ）１６％を含む２０００ｇの溶液をＥｕｄｒａｇｉｔで記載したのと同じ方法で適用し、最終粒状物質を空気乾燥させ、６００ミクロンのふるいで分けた。
【０１１５】
実施例１５
マウスの出生制御
ワルファリンは、ラット及びマウスの感染を制御するために使用される最も一般的な殺鼠剤である。ワルファリンを含有する餌を摂取した齧歯動物は、１５〜３０分で明らかな中毒症状を示し、１〜２時間で無意識になる。しかしながら、その作用効果が速いため、げっ歯類は典型的には亜致死量のワルファリンを摂取し、回復は８時間以内に起こる。ワルファリンを封入すると症状の発症が遅れ、完全致死量の摂取が可能になる。
【０１１６】
実験方法：１０週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用する。マウスは自由に飼育される。各実験群は、別々のケージ内に収容される。
【０１１７】
本発明のワルファリン組成物：ワルファリン（組成物４００ｍｇ／ｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、実施例１４ａに一般的に記載されている組成物に組み込む。４匹のマウスの３群は各々、以下のように自由に飼育される：１）本発明のワルファリン組成物、４％ワルファリン活性の餌に混合されたもの、２）未封入ワルファリン、４％活性の飼料餌に混合されたもの、３）下記の組成を含有する餌実施例１４ａ、ワルファリン又は他の生物活性物質を含まない。マウスの飼料摂取及び殺傷効果をモニターする。
【０１１８】
結果は、１群及び３群の飼料摂取量は類似しているが、２群（未封入ワルファリン）の飼料摂取量は２５％少ない。１群の全てのマウスは、摂食から８時間後に死亡し、一方、全ての２群マウスは、摂食から８時間後に生存していると予想される。
【０１１９】
実施例１６
ラット侵襲制御
実験方法：２５０〜５００ｇのラットを使用する。ラットは自由に飼育される。各実験群は、別々のケージ内に収容される。
【０１２０】
本発明のワルファリン組成物：ワルファリン（組成物４００ｍｇ／ｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、実施例１４ｂに一般的に記載されるように組成物に組み込む。４匹のマウスの３群は各々、以下のように自由に飼育される：１）本発明のワルファリン組成物、４％ワルファリン活性の餌に混合したもの、２）未封入ワルファリン、４％活性の飼料を混合したもの、３）ワルファリン又は他の生物活性を含まない、実施例１４ｂに記載されるような組成物を含む餌。ラットの飼料摂取及び殺傷効果をモニターする。
【０１２１】
結果は、１群及び３３の飼料摂取量は類似しているが、２群（未封入ワルファリン）の飼料摂取量は２５％少ない。１群の全てのラットは摂食から８時間後に死亡し、一方、全ての２群のラットは摂食から８時間後に生存していると予想される。
【０１２２】
実施例１７
モデルタンパク質の胃保護
この実施例は、タンパク質の模擬胃液（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）における放出プロフィールを記載する。異なるｐＨ放出プロファイル（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）ＦＳ３０Ｄ及びＬ３０Ｄ５５）を有する２つの腸溶性コーティングポリマーを使用して、タンパク質を実施例１５ａに記載のようにカプセル化した。インビトロ放出試験は、すなわち、模擬胃液（ｐＨ＝２）を用いて行った。封入されたタンパク質サンプル０．５ｇを模擬胃液１０ｍｌ中に懸濁させ、回転シェーカー上で１５０ｒｐｍで３７℃で２時間インキュベートした。５９５ｎｍでの分光光度測定のために、３０分後及び１２０分後のインキュベーションの後にサンプルを回収した。表６の結果は、高ｐＨ放出Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄ（約ｐＨ６．５）の第２のコーティング剤を有する生物活性が、低ｐＨ放出Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ５５（約ｐＨ５．５）の第２のコーティング剤を有する生物活性よりも胃曝露において有意により良好に保護されたことを実証する。
【０１２３】
【表６】
2018525340.tif 000007
【０１２４】
実施例１８
モデルタンパク質の胃及び腸の放出
この実施例は、タンパク質（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）の模擬胃液及び腸液中の放出プロフィールを記載する。実施例１６に記載のように、異なるｐＨ放出プロファイル（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）ＦＳ３０Ｄ及びＬ３０Ｄ５５）を有する２つの腸溶コーティングポリマーを用いて、実施例１５ａに記載したようにタンパク質をカプセル化した。インビトロ放出試験を模擬胃液及び腸液（それぞれｐＨ２及びｐＨ＝６．８）を用いて行った。封入されたタンパク質試料０．５ｇを３０ｍｌ又は１２０分間の模擬胃液１０ｍｌ中に懸濁させた後、腸液中でそれぞれ同じインキュベーション期間をおいた。すべてのインキュベーションは、１５０ｒｐｍの回転シェーカー上で３７℃で行った。試料を５９５ｎｍでの分光光度測定のために、３０分及び１２０分のインキュベーション後に回収した。表７の結果は、高ｐＨ放出Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄ（約ｐＨ６．５）の第２のコーティング剤を有する生物活性が、腸内の２時間の曝露にわたって徐々に放出される一方で、低ｐＨ放出Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ５５（約ｐＨ５．５）の第２のコーティング剤を有する生理活性の大部分は、胃における曝露の最初の３０分以内に放出された。全体的に、実施例２及び３の結果は、本発明の組成物が、２０％未満の活性損失で動物の胃環境における生物活性を効果的に保護するが、腸環境では完全に放出されることを示している。
【０１２５】
【表７】
2018525340.tif 000008
【０１２６】
実施例１９
第２のコーティング剤の層厚の最適化
胃及び腸の放出に対する第２のコーティング剤の層厚の影響を評価するために、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄの５０％又は１００％コーティング剤のいずれかを用いて実施例１５ａに記載のように組成物を調製した。インビトロ放出試験を、実施例１６及び１７に記載のように行った。表８の結果は、１００％又はわずか５０％の第２のコーティングを有する組成物からの生物活性の放出プロファイルを示す。これは、より少量の腸溶性ポリマーコーティング剤で、良好な放出プロフィールがより良好に達成され得ることを示す。
【０１２７】
【表８】
2018525340.tif 000009
【０１２８】
実施例２０
飼料ペレット化曝露中の組成物の安定性
実施例１５ａに記載したように、カプセル化モデルタンパク質を調製した。
組成物は、水浴中で８０℃で５分間インキュベートし、続いて１トンの圧力下で錠剤プレスで錠剤化することによって、模擬工業用飼料ペレット化条件に供した。錠剤化した組成物を１０ｍｌの水に懸濁して粉砕し、放出されたタンパク質の量を分光光度計により５９５ｎｍで評価した。タンパク質の６８．４％が過酷なペレット化曝露後に組成物中に無傷のままであることが判明した。
【０１２９】
量、パーセントなどのような測定可能な値を指すときに本明細書で使用する「約」という用語は、そのような変動が適切である場合、指定値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
【０１３０】
本明細書に引用される全ての文書、書籍、マニュアル、論文、特許、公開特許出願、ガイド、要約及び他の参考文献は、その全体が参考として援用される。本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書に開示された本発明の実施から当業者に明らかになるであろう。本明細書及び実施例は、例示のみとして考えられ、本発明の真の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【国際調査報告】
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