(57)【要約】  本発明は一般には、対象における免疫応答を、先天性免疫の特定のシグナル伝達分子及びシグナル伝達経路を活性化することによって誘発する方法に関する。具体的には、免疫モジュレーター組成物が、先天性免疫のシグナル伝達分子及びシグナル伝達経路を刺激するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答をレシピエント対象において誘発する方法であって、
ａ．少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフ、少なくとも１つの非免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列と、カチオン性リポソームとを含む免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与すること、及び
ｂ．先天性免疫応答に関与するシグナル伝達経路を活性化する免疫監視受容体を活性化すること
を含む方法。
【請求項２】
前記シグナル伝達経路が、ＴＬＲ９、ＴＬＲ２１、ｃＧＡＳ、ＩＦＩ１６、ＤＤＸ４１、ＤＮＡ−ＰＫ、ＤＡＩ、Ｍｒｅ１１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＡＩＭ２、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ／ＲＩＧ−Ｉ、ＳＴＩＮＧ、ＡＳＣ、ＮＦκＢ、ＡＰ１、ＭＡＰＫ、ＩＲＦ３及びそれらの組合せからなる群から選択されるシグナル伝達分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫応答を対象において刺激する方法であって、
ａ．配列番号１の配列との少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列と、リポソーム送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与すること、及び
ｂ．先天性免疫応答に関与するシグナル伝達経路を活性化する免疫監視受容体を活性化すること
を含む方法。
【請求項４】
前記リポソーム送達ビヒクルが、多重膜小胞脂質及び押出し脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロールと、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロールと、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロールと、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロールとからなる群から選択される脂質対を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
投与が、静脈内投与、筋肉内投与、乳房内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、噴霧による投与、エアロゾルによる投与、卵内投与、粘膜投与、経皮投与、浸漬による投与、経口投与、眼内投与、気管内投与及び鼻腔内投与からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫モジュレーター組成物がさらに生物学的作用因を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、感染性因子にさらされる前である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が、感染性因子にさらされた後である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、哺乳動物種、水産養殖種及び鳥類種からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
医薬的に許容され得るキャリアをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
免疫応答を対象において刺激する方法であって、
ａ．配列番号４の配列との少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列と、リポソーム送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与すること、及び
ｂ．先天性免疫応答に関与するシグナル伝達経路を活性化する免疫監視受容体を活性化すること
を含む方法。
【請求項１３】
前記リポソーム送達ビヒクルが、多重膜小胞脂質及び押出し脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロールと、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロールと、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロールと、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロールとからなる群から選択される脂質対を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
投与が、静脈内投与、筋肉内投与、乳房内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、噴霧による投与、エアロゾルによる投与、卵内投与、粘膜投与、経皮投与、浸漬による投与、経口投与、眼内投与、気管内投与及び鼻腔内投与からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫モジュレーター組成物がさらに生物学的作用因を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的作用因が、免疫エンハンサータンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤、及び、どのような組合せであれそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、感染性因子にさらされる前である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、感染性因子にさらされた後である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、哺乳動物種、水産養殖種及び鳥類種からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
医薬的に許容され得るキャリアをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
免疫応答をレシピエント対象において誘発するためにＳＴＩＮＧシグナル伝達経路を調節する方法であって、
ａ．少なくとも１つの免疫賦活性ＣｐＧモチーフ、少なくとも１つの非免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含む核酸配列と、カチオン性リポソームとを含む免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与すること
を含む方法。
【請求項２３】
免疫応答を対象において調節する方法であって、
ａ．配列番号４の配列との少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列と、リポソーム送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与すること、及び
ｂ．免疫応答を調節することに関与するシグナル伝達経路を活性化する免疫監視受容体を活性化すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記免疫監視受容体が、先天性免疫応答を刺激することに関与するシグナル伝達経路を活性化する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫監視受容体が、後天性免疫応答を刺激することに関与するシグナル伝達経路を活性化する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫監視受容体が、炎症性免疫応答を抑制することに関与するシグナル伝達経路を活性化する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ウシ呼吸器病と診断されるウシの体重増加を増大させるための方法であって、
前記対象に、配列番号１との少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列と、脂質送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物との組合せで抗菌剤を投与することを含み、前記組合せにより、体重増加が前記対象において増大する、方法。
【請求項２８】
前記抗菌剤がエンロフロキサシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ウシ呼吸器病と診断されるウシの体重増加を増大させるための方法であって、
前記対象に、配列番号４との少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列と、脂質送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物との組合せで抗菌剤を投与することを含み、前記組合せにより、体重増加が前記対象において増大する、方法。
【請求項３０】
前記抗菌剤がエンロフロキサシンである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／１８５，２３０号（２０１５年６月２６日出願、発明の名称：「細胞質ＤＮＡ監視分子の調節方法」）の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する（その内容はその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０００２】
本発明は一般には、対象における免疫応答を、先天性免疫の特定のシグナル伝達分子及びシグナル伝達経路を活性化することによって誘発する方法に関する。具体的には、免疫モジュレーター組成物が、先天性免疫のシグナル伝達分子及びシグナル伝達経路を刺激するために使用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、先天性免疫のシグナル伝達分子及びシグナル伝達経路を調節するために免疫賦活性プラスミドを使用する方法に関する。前記免疫賦活性プラスミドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又はそれらの組合せの配列との少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含む場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは、配列番号４の配列との少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子を含む場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号１の配列を含む場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号４の配列を含む場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号２の配列を含む場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号３の配列を含む場合がある。
【０００４】
他の態様において、前記免疫賦活性プラスミドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又はそれらの組合せの配列との少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列からなる場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは、配列番号４の配列との少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子からなる場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号１の配列からなる場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号４の配列からなる場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号２の配列からなる場合がある。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは配列番号３の配列からなる場合がある。
【０００５】
いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、完全長の、又は機能的な選択マーカー又はスクリーニングマーカーをコードする核酸配列を含まない。他の態様において、前記免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない選択マーカー又はスクリーニングマーカーをコードする核酸配列を含む。
【０００６】
本発明はまた、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）のいずれかと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬配合物に関する。
【０００７】
本発明はさらに、カチオン性リポソーム送達ビヒクルと、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）のいずれかとを含む免疫モジュレーター組成物に関する。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）の使用する方法に関する。好適な使用方法には、対象への治療的投与が含まれる。そのような治療的投与には、１又は複数の対象の予防的処置、メタフィラクティック（ｍｅｔａｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置及び感染後処置が含まれる。
【０００９】
本発明は、対象における免疫応答を刺激する、又は誘発する方法に関する。いくつかの態様において、前記方法は、対象における免疫応答を、本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与することによって刺激することを含む。いくつかの態様において、前記方法は、対象における免疫応答を、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）を前記対象に投与することによって刺激することを含む。
【００１０】
ウシ呼吸器病と診断されるウシの体重増加を増大させるための方法であって、前記対象に、配列番号１との少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列と、脂質送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物との組合せで抗菌剤を投与することを含み、前記組合せにより、体重が前記対象において増大する方法もまた提供される。
【００１１】
同様に、本明細書中では、ウシ呼吸器病と診断されるウシの体重増加を増大させるための方法であって、前記対象に、配列番号４との少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列と、脂質送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物との組合せで抗菌剤を投与することを含み、前記組合せにより、体重増加が前記対象において増大する方法も提供される。
【００１２】
他の目的及び特徴が、本明細書中下記において一部が明らかであろうし、また、一部が指摘されるであろう。
【００１３】
下記の図面は本明細書の一部となっており、本発明のある特定の態様をさらに説明するために含まれる。本発明は、これらの図面の１つ又は複数を本明細書中に提示される具体的な実施形態の詳細な説明との組合せで参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＭＢ７５．６プラスミド（配列番号２）のマップを示す図である。
【図２】ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミド（配列番号１）のマップを示す図である。
【図３】ｐＬａｃＺ７５．６プラスミド（配列番号４）のマップを示す図である。
【図４】ＩＲＦ−３のＩＦＮα１（青色、菱形）活性化をコントロール（赤色、四角、ＰＢＳコントロール）と比較してグラフにより例示する図である。
【図５】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物又は陽性コントロール（ＩＮＦα１）と接触させた結果をグラフにより例示する図である。免疫モジュレーター組成物には、リポソームキャリア非配合の配列番号２のＤＮＡ（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、及び、リポソームキャリアと配合される配列番号２のＤＮＡ（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）が含まれた。
【図６】ＩＲＦ−３レポーターにより安定的にトランスフェクションされたＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物と接触させた結果をグラフにより例示する図である。免疫モジュレーター組成物には、非配合の配列番号２のＤＮＡ（青色、菱形、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１のＤＮＡ（赤色、四角、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ．２−Ｆ、緑色、三角）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ、紫色、十字）及びＰＢＳ（陰性コントロール、青色、星印）が含まれた。
【図７】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物（１９５ｎｇ／ｍＬ）及び既知の標準的なリガンドツール（２５０ｎｇ／ｍＬ）と接触させた結果をグラフにより例示する図である。免疫モジュレーター組成物には、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆｏｒｍ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆｏｒｍ）、及びＤＯＴＩＭ／コレステロール（配合単独）、ならびにＰＢＳコントロール（陰性コントロール）が含まれた。既知の標準的なリガンドツールには、ＨＳＶ−６０−Ｌｙｏｖｅｃ、ＶＡＣＶ−Ｌｙｏｖｅｃ、ＰＯＬＹ−（ｄＡ／ｄＴ）−Ｌｙｏｖｅｃが含まれた。
【図８】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物（１９５ｎｇ／ｍＬ）及び既知の標準的なリガンドツール（１０００ｎｇ／ｍＬ）と接触させた結果をグラフにより例示する図である。免疫モジュレーター組成物には、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆｏｒｍ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  ＮＯ  １−Ｆｏｒｍ）、及びＤＯＴＩＭ（配合単独）、ならびにＰＢＳコントロール（陰性コントロール）が含まれた。既知の標準的なリガンドツールには、ＨＳＶ−６０−Ｌｙｏｖｅｃ、ＶＡＣＶ−Ｌｙｏｖｅｃ、ＰＯＬＹ−（ｄＡ／ｄＴ）−Ｌｙｏｖｅｃが含まれた。
【図９】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を既知の細胞質ＤＮＡ認識活性化剤（ＨＳＶ−６０：赤色、四角；ＶＡＣＶ７０：緑色、三角；ＰＯＬＹ：紫色、十字；ＰＢＳ陰性コントロール、青色、十字；リポソーム、青色、菱形）と接触させた結果をグラフにより例示する図である。
【図１０】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物と接触させた結果をグラフにより例示する図である。免疫モジュレーター組成物には、配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２、青色、菱形）、配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １、赤色、四角）、配列番号２＋リポソーム（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、緑色、三角）、配列番号１＋リポソーム（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １、紫色、十字）及びＰＢＳ陰性コントロール（青色、十字）が含まれた。
【図１１】ＩＦＮ−α１（青色、菱形）、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２、赤色、四角）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、緑色、三角）及びＰＢＳコントロール（紫色、十字）の用量応答曲線を、ＳＥＡＰシグナルを測定するＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞において１．５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって示す図である。
【図１２】非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２、青色、菱形）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １、赤色、四角）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、緑色、三角）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ、紫色、十字）及びＰＢＳコントロール（黒色、四角）の用量応答曲線を、ＳＥＡＰシグナルを測定するＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞において０．３μｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって示す図である。
【図１３】非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）、及びリポソーム／配合単独、ＰＢＳコントロール（陰性コントロール）、ならびに、ＨＳＶ−６０−Ｌｙｏｖｅｃ、ＶＡＣＶ−Ｌｙｏｖｅｃ及びポリ（ｄＡ／ｄＴ）−Ｌｙｏｖｅｃを含む既知の標準的なリガンドツールと接触させられるＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞の刺激をグラフにより例示する図である。
【図１４】非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆｏｒｍ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆｏｒｍ）、及びリポソーム／配合単独、ＰＢＳコントロール（陰性コントロール）、ならびに、ＨＳＶ−６０−Ｌｙｏｖｅｃ、ＶＡＣＶ−Ｌｙｏｖｅｃ及びＰＯＬＹ−（ｄＡ／ｄＴ）−Ｌｙｏｖｅｃを含む既知の標準的なリガンドツールと接触させられるＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞の刺激をグラフにより例示する図である。
【図１５】非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆｏｒｍ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆｏｒｍ）、ＰＢＳコントロール（陰性コントロール）、また、ＨＳＶ−６０−Ｌｙｏｖｅｃ、ＶＡＣＶ−Ｌｙｏｖｅｃ及びＰＯＬＹ−（ｄＡ／ｄＴ）−Ｌｙｏｖｅｃ、Ｌｙｏｖｅｃのみを含む既知の標準的なリガンドツール、ならびに、ＬｙｏＶｅｃと配合される配列番号２、ＬｙｏＶｅｃと配合される配列番号１、また、ＩＦＮ−α１と接触させられるＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞の刺激をグラフにより例示する図である。
【図１６】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞における配列番号２及び配列番号１の用量応答曲線であって、非配合型（配列番号２−ネイクド：緑色三角、及び、配列番号１ネイクド：オレンジ色丸印）、リポソーム配合型（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ：青色菱形、及び、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ：紫色十字）として、また、ＬｙｏＶｅｃ配合型（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−ＬｙｏＶｅｃ：赤色四角、及び、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １  ＬｙｏＶｅｃ：青色星印）としての用量応答曲線示す図である。
【図１７】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞における配列番号２及び配列番号１の用量応答曲線であって、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２／ＬｙｏＶｅｃ（青色、菱形）、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １／ＬｙｏＶｅｃ（赤色、四角）、ＬｙｏＶｅｃのみ（緑色、三角）、ブランク（青色、星印）及びＩＦＮα１（オレンジ色、丸印）を含むＬｙｏＶｅｃトランスフェクション剤と配合される場合の用量応答曲線を示す図である。
【図１８】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞における配列番号２及び配列番号１の用量応答曲線であって、配列番号２／Ｍｉｒｕｓ（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２、青色、菱形）、配列番号１／Ｍｉｒｕｓ（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １、赤色、四角）、Ｍｉｒｕｓのみ（緑色、三角）、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２、紫色、十字）、ブランク（青色、星印）及びＩＦＮα１（オレンジ色、丸印）を含むＭｉｒｕｓトランスフェクション剤と配合される場合の用量応答曲線を示す図である。
【図１９】ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞における配列番号２及び配列番号１の用量応答曲線であって、配列番号２／Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎ（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２／ＸｔｒｅｍｅＧｅｎ、青色、菱形）、配列番号１／Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎ（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １／ｘｔｒｅｍｅＧｅｎ、赤色、四角）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎのみ（緑色、三角）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １、紫色、十字）、ブランク（青色、星印）及びＩＦＮα１（オレンジ色、丸印）を含むＸ−ｔｒｅｍｅＧｅｎトランスフェクション剤と配合される場合の用量応答曲線を示す図である。
【図２０】ＩＦＮα１陽性コントロールによる刺激の後におけるＢ１６  Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞の用量応答を示す図である。
【図２１】ＰＢＳコントロール、ＩＦＮα１、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆｏｒｍ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆｏｒｍ）、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、リポソーム／配合単独（リポソームコントロール）、３’−３’−ｃＧＡＭＰ及びＰＯＬＹ−（ｄＡ／ｄＴ）と接触させられるＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞の刺激をグラフにより例示する図である。
【図２２】ＰＢＳコントロール、ＩＦＮα１、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆｏｒｍ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆｏｒｍ）、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、及びリポソーム／配合単独（リポソームコントロール）と接触させられるＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞の刺激をグラフにより例示する図である。
【図２３】ＰＢＳコントロール、ＩＦＮα１、配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）、配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、及びリポソーム／配合単独（リポソームコントロール）と接触させられるＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＤ−ＳＴＩＮＧ細胞の刺激をグラフにより例示する図である。
【図２４Ａ】配合後の配列番号２（プラスミド−Ｆ）の細胞質ＤＮＡ認識をグラフにより例示する図である。
【図２４Ｂ】配合後の配列番号２（プラスミド−Ｆ）の細胞質ＤＮＡ認識をグラフにより例示する図である。
【図２５Ａ】配合後の配列番号２（プラスミド−Ｆ）の免疫調節機能におけるＳＴＩＮＧの中心的役割をグラフにより例示する図である。
【図２５Ｂ】配合後の配列番号２（プラスミド−Ｆ）の免疫調節機能におけるＳＴＩＮＧの中心的役割をグラフにより例示する図である。
【図２６】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）及び配合後の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）によって引き起こされる免疫調節機能におけるＳＴＩＮＧの中心的役割をグラフにより例示する図である。
【図２７Ａ】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）はインターフェロン放出をブタ末梢血単核細胞において誘導することができることを例示する図である。
【図２７Ｂ】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）はインターフェロン放出をブタ末梢血単核細胞において誘導することができることを例示する図である。
【図２７Ｃ】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）はインターフェロン放出をブタ末梢血単核細胞において誘導することができることを例示する図である。
【図２８Ａ】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）はインターフェロン放出をウシ末梢血単核細胞において誘導することができることを例示する図である。
【図２８Ｂ】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）はインターフェロン放出をウシ末梢血単核細胞において誘導することができることを例示する図である。
【図２８Ｃ】配合後の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）はインターフェロン放出をウシ末梢血単核細胞において誘導することができることを例示する図である。
【図２９】試験経過期間中の測定された直腸温度をグラフにより例示する図である。
【図３０Ａ】動物段階の開始時及び終了時における平均体重をグラフにより例示する図である。
【図３０Ｂ】動物段階の開始時及び終了時における平均体重をグラフにより例示する図である。
【図３１Ａ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３１Ｂ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３１Ｃ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３１Ｄ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３１Ｅ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３１Ｆ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３２Ａ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３２Ｂ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３２Ｃ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３２Ｄ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３２Ｅ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３２Ｆ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ａ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｂ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｃ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｄ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｅ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｆ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｇ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３３Ｈ】ブタ対象から集められた血液学データを示す図である。
【図３４Ａ】処置の前後におけるＩＬ１及びＩＬ２の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を示す図である。
【図３４Ｂ】処置の前後におけるＩＬ１及びＩＬ２の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を示す図である。
【図３４Ｃ】処置の前後におけるＩＬ１及びＩＬ２の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を示す図である。
【図３４Ｄ】処置の前後におけるＩＬ１及びＩＬ２の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を示す図である。
【図３５Ａ】処置の前後におけるＩＬ４及びＩＬ６の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化をグラフにより例示する図である。
【図３５Ｂ】処置の前後におけるＩＬ４及びＩＬ６の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化をグラフにより例示する図である。
【図３５Ｃ】処置の前後におけるＩＬ４及びＩＬ６の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化をグラフにより例示する図である。
【図３５Ｄ】処置の前後におけるＩＬ４及びＩＬ６の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化をグラフにより例示する図である。
【図３６Ａ】処置の前後におけるＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３６Ｂ】処置の前後におけるＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３６Ｃ】処置の前後におけるＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３６Ｄ】処置の前後におけるＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３７Ａ】処置の前後におけるＩＬ１２及びＩＮＦｇの含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３７Ｂ】処置の前後におけるＩＬ１２及びＩＮＦｇの含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３７Ｃ】処置の前後におけるＩＬ１２及びＩＮＦｇの含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３７Ｄ】処置の前後におけるＩＬ１２及びＩＮＦｇの含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３８Ａ】処置の前後におけるＴＮＦａの含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３８Ｂ】処置の前後におけるＴＮＦａの含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３９Ａ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ４の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３９Ｂ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ４の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３９Ｃ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ４の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３９Ｄ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ４の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３９Ｅ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ４の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図３９Ｆ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ４の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４０Ａ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４０Ｂ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４０Ｃ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４０Ｄ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４０Ｅ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４０Ｆ】低用量又は高用量の試験物質の静脈内投与の前後におけるＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０の含有量及び血清サイトカイン含有量の相対的変化を例示する図である。
【図４１Ａ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｂ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｃ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｄ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｅ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｆ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｇ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４１Ｈ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４２Ａ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４２Ｂ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４２Ｃ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４２Ｄ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４３Ａ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４３Ｂ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４３Ｃ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４３Ｄ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ａ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｂ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｃ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｄ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｅ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｆ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｇ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４４Ｈ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ６  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ａ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｂ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｃ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｄ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｅ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｆ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｇ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４５Ｈ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１０  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率をグラフにより例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ａ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｂ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｃ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｄ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｅ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｆ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｇ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４６Ｈ】処置（高用量又は低用量の試験物質によるｉ．ｍ．接種及びｓ．ｃ．接種）の後におけるＩＬ１２  ｍＲＮＡの相対的量及び変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４７Ａ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４７Ｂ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４７Ｃ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４７Ｄ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４７Ｅ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４８Ａ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４８Ｂ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４８Ｃ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４８Ｄ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４８Ｅ】高用量の試験物質の投与（ｉ．ｍ．投与経路とｓ．ｃ．投与経路とが組み合わされる）の後における種々のサイトカインの変化率を例示する図である（量が、接種後１時間、２時間、６時間、２４時間及び４８時間の時点で求められる）。
【図４９Ａ】高用量の試験物質を静脈内投与した後で１匹のブタにおいて認められるサイトカインｍＲＮＡ発現の変化を例示する図である（上段パネル）。
【図４９Ｂ】低用量の試験物質を静脈内投与した後で１匹のブタにおいて認められるサイトカインｍＲＮＡ発現の変化を例示する図である（下段パネル）。
【図５０Ａ】Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びコントロールによる処置を受ける去勢子ウシにおけるＢＲＤに起因する肺病変の割合を示す図である。
【図５０Ｂ】Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びコントロールによる処置を受ける去勢子ウシにおけるＢＲＤに起因する死亡率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明によれば、細胞質ＤＮＡ監視分子をレシピエント対象において活性化することができる組成物、同様にまた、使用方法が発見された。具体的には、本発明は、新規な核酸組成物、すなわち、免疫モジュレーター組成物、及びその使用に関する。そのような免疫モジュレーター組成物は、対象の免疫系を調節するために使用されることが発見された。本発明は、様々な微生物によって引き起こされる、例えば、限定されないが、ウイルス、細菌、カビ、真菌、酵母、寄生生物、及び、この技術分野で知られている他の微生物などによって引き起こされる感染性疾患の処置及び防止において特に有用である。免疫モジュレーター組成物を使用する組成物及び方法が下記においてより詳細に議論される。
【００１６】
Ｉ．組成物
本発明において有用である組成物、例えば、本明細書中に記載される組成物などは一般に、感染性疾患のための予防的治療、メタフィラクティック治療又は処置治療として使用することができる。そのような組成物は、本明細書中では免疫モジュレーター組成物として示される。免疫モジュレーター組成物は、細胞質ＤＮＡ監視分子をレシピエント対象において活性化することができる免疫賦活性プラスミド又は免疫賦活性ＤＮＡ配列を少なくとも含む。いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物はまた、リポソーム送達ビヒクルを含む場合がある。
【００１７】
Ａ．核酸
いくつかの態様において、本発明は、感染性疾患の原因となる作用因の処置又は防止のために有用である核酸分子に関する。本明細書中に記載される核酸分子は、線状の二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡ、アミノ酸配列、リボ核酸（ＲＮＡ）又はそれらの組合せとして免疫賦活性プラスミドに含まれる場合がある。いくつかの態様において、本発明は、免疫賦活性プラスミド又は免疫賦活性ＤＮＡ配列を含有する核酸分子、ベクター及び宿主細胞（インビトロ、インビボ又はエクスビボ）に関する。
【００１８】
本明細書中に記載される核酸分子はＣｐＧモチーフに富んでいる。そのようなＣｐＧモチーフにより、免疫刺激が、特異的なＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ９及びＴＬＲ２１など）を介して誘導される場合がある。加えて、本明細書中に記載される核酸分子はまた、ＣｐＧ以外の免疫賦活性モチーフを含有する。いくつかの態様において、核酸分子は、ランダムな核酸配列において予想されるＣｐＧモチーフの頻度を超えて約２％〜２０％のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様において、核酸分子は、ランダムな核酸配列において予想されるＣｐＧモチーフの頻度を超えて約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又はそれ以上のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様において、核酸分子は、ランダムな核酸配列において予想されるＣｐＧモチーフの頻度を超えて約１０％のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様において、脊椎動物のＤＮＡと比較して、１０倍を超えるＣｐＧモチーフの富化が認められる。いくつかの態様において、核酸分子は、脊椎動物のＤＮＡと比較して約２倍〜５０倍又はそれ以上のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様において、核酸分子は、脊椎動物のＤＮＡと比較して約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍又はそれ以上のＣｐＧモチーフを含有する。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含まない免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）に関する。前記プラスミドは、選択マーカー遺伝子又はスクリーニングマーカー遺伝子をどのようなものであっても欠いている場合がある。例えば、本明細書中に記載されるｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドは、完全長の、又は機能的な選択マーカー遺伝子又はスクリーニングマーカー遺伝子をどのようなものであっても含まない。ｐＧＣＭＢ７５．６の配列が配列番号１において提供される。
【００２０】
いくつかの態様において、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドは好ましくは、完全長の、又は機能的な選択マーカー又はスクリーニングマーカーをコードする核酸配列を含まない。いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含まない。例えば、前記プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を含まない。いくつかの態様において、本明細書中に記載されるプラスミドは好ましくは、免疫原をコードしない。
【００２１】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない選択マーカー遺伝子又はスクリーニングマーカー遺伝子をコードする核酸配列を含む場合がある。例えば、本明細書中に記載されるｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドはＬａｃＺ遺伝子をスクリーニングマーカーとして含む。ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のマップが図３において提供され、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列が配列番号４として提供される。図３に示されるように、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６はｐＧＣＭＢ７５．６と類似しており、しかし、ＬａｃＺスクリーニングマーカーを含有する。
【００２２】
ｐＭＢ７５．６プラスミド、ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミド又はｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドのヌクレオチド配列は、それらの免疫賦活性特性に著しい悪影響を与えることなく、ある程度、変化させてもよいことが理解されるであろう。いくつかの態様において、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）との少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）との少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６（配列番号４）の配列を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号２の配列との少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号２の配列との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、配列番号２の配列を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号３の配列との少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号３の配列との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、配列番号３の配列を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）との少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６（配列番号１）の配列からなる。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）との少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６（配列番号４）の配列からなる。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号２の配列との少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号２の配列との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、配列番号２の配列からなる。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号３の配列との少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫賦活性プラスミドに関する。前記免疫賦活性プラスミドは好ましくは、配列番号３の配列との少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも７６％の配列同一性、少なくとも７７％の配列同一性、少なくとも７８％の配列同一性、少なくとも７９％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８１％の配列同一性、少なくとも８２％の配列同一性、少なくとも８３％の配列同一性、少なくとも８４％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８６％の配列同一性、少なくとも８７％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも８９％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様において、前記免疫賦活性プラスミドはより好ましくは、配列番号３の配列からなる。
【００３０】
本発明の別の重要な態様により、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に対して高ストリンジェンシーの条件のもとでハイブリダイゼーションする核酸配列を含む、免疫応答を刺激することができる免疫賦活性ＤＮＡ配列又は免疫賦活性プラスミドが提供される。好適な核酸配列には、本発明の核酸と相同的である核酸配列、本発明の核酸と実質的に類似している核酸配列、又は本発明の核酸と同一である核酸配列が含まれる。いくつかの態様において、相同的な核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも約７５％の配列類似性、７６％の配列類似性、７７％の配列類似性、７８％の配列類似性、７９％の配列類似性、８０％の配列類似性、８１％の配列類似性、８２％の配列類似性、８３％の配列類似性、８４％の配列類似性、８５％の配列類似性、８６％の配列類似性、８７％の配列類似性、８８％の配列類似性、８９％の配列類似性、９０％の配列類似性、９１％の配列類似性、９２％の配列類似性、９３％の配列類似性、９４％の配列類似性、９５％の配列類似性、９６％の配列類似性、９７％の配列類似性、９８％の配列類似性、９９％の配列類似性、もしくは１００％の配列類似性を有するであろうし、又はそれぞれの相補的配列を有するであろう。他の態様において、相同的な核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも約７５％の配列類似性、７６％の配列類似性、７７％の配列類似性、７８％の配列類似性、７９％の配列類似性、８０％の配列類似性、８１％の配列類似性、８２％の配列類似性、８３％の配列類似性、８４％の配列類似性、８５％の配列類似性、８６％の配列類似性、８８％の配列類似性、８９％の配列類似性、９０％の配列類似性、９１％の配列類似性、９２％の配列類似性、９３％の配列類似性、９４％の配列類似性、９５％の配列類似性、９６％の配列類似性、９７％の配列類似性、９８％の配列類似性、９９％の配列類似性、もしくは１００％の配列類似性を有するであろうし、又はそれぞれの相補的配列を有するであろう。他の態様において、相同的な核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも約７５％の配列類似性、７６％の配列類似性、７７％の配列類似性、７８％の配列類似性、７９％の配列類似性、８０％の配列類似性、８１％の配列類似性、８２％の配列類似性、８３％の配列類似性、８４％の配列類似性、８５％の配列類似性、８６％の配列類似性、８８％の配列類似性、８９％の配列類似性、９０％の配列類似性、９１％の配列類似性、９２％の配列類似性、９３％の配列類似性、９４％の配列類似性、９５％の配列類似性、９６％の配列類似性、９７％の配列類似性、９８％の配列類似性、９９％の配列類似性、もしくは１００％の配列類似性を有するであろうし、又はそれぞれの相補的配列を有するであろう。他の態様において、相同的な核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも約７５％の配列類似性、７６％の配列類似性、７７％の配列類似性、７８％の配列類似性、７９％の配列類似性、８０％の配列類似性、８１％の配列類似性、８２％の配列類似性、８３％の配列類似性、８４％の配列類似性、８５％の配列類似性、８６％の配列類似性、８８％の配列類似性、８９％の配列類似性、９０％の配列類似性、９１％の配列類似性、９２％の配列類似性、９３％の配列類似性、９４％の配列類似性、９５％の配列類似性、９６％の配列類似性、９７％の配列類似性、９８％の配列類似性、９９％の配列類似性、もしくは１００％の配列類似性を有するであろうし、又はそれぞれの相補的配列を有するであろう。配列類似性は、この技術分野では知られている数多くのアルゴリズムを使用して、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−１０、１９９０に記載されるＢＬＡＳＴなどを使用して計算される場合がある。核酸は、配列が遺伝暗号の縮重のために上記の核酸と異なる場合がある。一般に、参照配列は比較目的のための組成物の１８ヌクレオチド（より通常的には３０ヌクレオチド又はそれ以上）であろうし、また、比較目的のための組成物の核酸配列全体を含む場合がある。
【００３１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に対してハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列が、本明細書中では意図される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、５０℃以上及び０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）におけるハイブリダイゼーションなどの条件が含まれる。別の一例が、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸及び２０μｇ／ｍｌの変性させた剪断サケ精子ＤＮＡの溶液において４２℃で一晩インキュベーションし、その後、約６５℃で０．１×ＳＳＣにおいて洗浄することである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、上記の具体的な条件と少なくとも約８０％ストリンジェントである、８５％ストリンジェントである、９０％ストリンジェントである、又は９５％ストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件がこの技術分野では知られており、これらもまた、本発明の核酸のホモログを特定するために用いられる場合がある（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ユニット６、発行：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）。
【００３２】
変異体が、本明細書中に記載されるような細胞質ＤＮＡ監視分子を活性化する能力を維持する核酸配列を含む限り、本明細書中に記載されるＤＮＡ分子の変異ヌクレオチドが使用される場合がある。そのような変異を有するＤＮＡ配列は通常、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸によって異なるであろう。配列変化は、置換、挿入、欠失又はそれらの組合せである場合がある。クローン化された遺伝子の変異誘発のための様々な技術がこの技術分野では知られている。部位特異的変異誘発のための様々な方法が、Ｇｕｓｔｉｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：２２、１９９３；Ｂａｒａｎｙ、Ｇｅｎｅ、３７：１１１−２３、１９８５；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９：５３７−９、１９８５；及びＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ｐｐ．１５．３−１５．１０８において見出される場合がある（これらはすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）。まとめると、本発明は、細胞質ＤＮＡ監視分子を対象において活性化することができる核酸配列及びその変化体又は変異体に関する。また、本発明は、記載された核酸配列によってコードされる中間ＲＮＡを包含し、同様にまた、コードされる得られたアミノ酸配列をどのようなものであっても包含する。
【００３３】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドのヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４において提供される配列と異なる場合、当該プラスミドにおけるＣｐＧジヌクレオチドは好ましくは無傷のままである。代替において、プラスミドのヌクレオチド配列が、ＣｐＧジヌクレオチドが排除されるように変更されるならば、プラスミドの配列は、当該プラスミドにおけるＣｐＧジヌクレオチドの総数が依然として同じであるように別の場所において変更される場合がある。ｐＧＣＭＢ７５．６又はｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列に既に存在しているＣｐＧジヌクレオチドに加えて、さらなるＣｐＧジヌクレオチドがまた、当該プラスミドに導入される場合がある。したがって、例えば、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドは好ましくは、少なくとも約２００対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２２０対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２４０対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２６０対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２７０対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２７５対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２８０対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２８３対のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも約２８５対のＣｐＧジヌクレオチド、又は少なくとも約２８８対のＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、免疫賦活性プラスミドは２８３対のＣｐＧジヌクレオチドを含むことができる。
【００３４】
いくつかの態様において、免疫賦活性プラスミドのヌクレオチド配列が本明細書中に提供される配列と異なる場合、プラスミドにおけるＣｐＧモチーフタイプが、細胞質ＤＮＡ監視分子の生じる活性化を調節するために変化させられる。例えば、免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数が、免疫賦活性プラスミド／ＤＮＡの特定の閾値に対して応答性を有する特定の細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化を増大させるために増やされる場合がある。さらなる例として、免疫非刺激性ＣｐＧモチーフの数が、特定の細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化を低下させるために、かつ／又は他のＤＮＡ監視分子の活性化を増大させるために増やされる場合がある。
【００３５】
特に、本発明は、本明細書中に記載される様々な免疫賦活性プラスミド又は免疫賦活性ＤＮＡ配列のいずれかと、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬配合物に関する。
【００３６】
Ｂ．免疫モジュレーター
本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドと一緒に使用されるための好適な免疫モジュレーター組成物が米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１号（Ａ１）及び同第２０１３／０２９５１６７号（Ａ１）に記載される（これらの両方の内容は本明細書によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
免疫モジュレーター組成物は、リポソーム送達ビヒクルと、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）の少なくとも１つとを含む。
【００３８】
好適なリポソーム送達ビヒクルは、核酸分子を処置された対象の組織に送達することができる脂質組成物を含む。リポソーム送達ビヒクルは好ましくは、核酸分子及び／又は生物学的作用因を送達するための十分な時間にわたって対象において安定なままであることが可能である。例えば、リポソーム送達ビヒクルは、少なくとも約５分間にわたって、又は少なくとも約１時間にわたって、又は少なくとも約２４時間にわたってレシピエント対象において安定である。
【００３９】
本発明のリポソーム送達ビヒクルは、細胞内への核酸分子の送達を容易にすることができる脂質組成物を含む。核酸分子が１つ又は複数のタンパク質をコードするとき、核酸：リポソーム複合体は好ましくは、トランスフェクション効率が、１マイクログラム（μｇ）の送達核酸につき、１ミリグラム（ｍｇ）の総組織タンパク質あたり少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）の発現タンパク質である。例えば、核酸：リポソーム複合体のトランスフェクション効率は、１μｇの送達核酸につき、１ｍｇの総組織タンパク質あたり少なくとも約１０ｐｇの発現タンパク質、又は、１μｇの送達核酸につき、１ｍｇの総組織タンパク質あたり少なくとも約５０ｐｇの発現タンパク質であることが可能である。複合体のトランスフェクション効率が、１μｇの送達核酸につき、１ｍｇの総組織タンパク質あたり少なくとも１フェムトグラム（ｆｇ）もの少ない発現タンパク質である場合があり、だが、上記量がより好ましい。
【００４０】
本発明の好ましいリポソーム送達ビヒクルは直径が約１００ナノメートル（ｎｍ）〜５００ナノメートル（ｎｍ）の間である。例えば、リポソーム送達ビヒクルは直径が約１５０ｎｍ〜４５０ｎｍの間又は約２００ｎｍ〜４００ｎｍの間であることが可能である。
【００４１】
好適なリポソームには、どのようなリポソームであっても含まれ、例えば、当業者に知られている様々な遺伝子送達方法において一般に使用されるリポソームなどが含まれる。好ましいリポソーム送達ビヒクルは多重膜小胞（ＭＬＶ）脂質及び押出し脂質を含む。ＭＬＶを調製するための様々な方法がこの技術分野では広く知られている。より好ましいリポソーム送達ビヒクルは、ポリカチオン性脂質組成物（すなわち、カチオン性リポソーム）を有するリポソーム、及び／又は、ポリエチレングリコールにコンジュゲート化されたコレステロール骨格を有するリポソームを含む。例示的なカチオン性リポソーム組成物には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロール、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロール、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロール、ならびにそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。送達ビヒクルとして使用するための最も好ましいリポソーム組成物は、ＤＯＴＩＭ及びコレステロールを含む。
【００４２】
好適な核酸分子には、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドのどれもが含まれる。コード核酸配列はタンパク質又はペプチドの少なくとも一部をコードし、一方で、非コード配列はタンパク質又はペプチドのどのような部分もコードしない。本発明によれば、「非コード」核酸は、転写ユニットの調節領域（例えば、プロモーター領域など）を含むことができる。用語「空ベクター」は用語「非コード」と交換可能に使用することができ、具体的には、タンパク質コード部分が存在しない核酸配列（例えば、遺伝子挿入物を含まないプラスミドベクターなど）を示す。本明細書中に記載されるプラスミドによってコードされるタンパク質の発現は、細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化のためには要求されない；したがって、本明細書中に記載されるプラスミドは、転写制御配列に機能的に連結されるコード配列をどのようなものであっても含む必要はない。しかしながら、さらなる利点が、免疫原及び／又はサイトカインをコードする核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を組成物に含むことによって得られる場合がある（すなわち、抗原特異的な免疫性及び増強された免疫性）。免疫原及び／又はサイトカインをコードするそのような核酸配列が、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドに含まれる場合があり、あるいは、免疫原及び／又はサイトカインをコードするそのような核酸配を別個の核酸（例えば、別個のプラスミド）で組成物に含むことができる。
【００４３】
リポソームを本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドと複合体化することが、この技術分野における標準的な方法を使用して、又は米国特許第６，６９３，０８６号（その内容は本明細書によりその全体が参照によって組み込まれる）に記載されるように達成される場合がある。リポソームに加えるためのプラスミドの好適な濃度には、十分な量のプラスミドを対象に送達し、その結果、全身的な免疫応答が誘発されるようにするために効果的である濃度が含まれる。例えば、約０．１μｇ〜約１０μｇのプラスミドを約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせることができ、約０．５μｇ〜約５μｇのプラスミドを約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせることができ、又は、約１．０μｇのプラスミドを約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせることができる。組成物におけるプラスミド対脂質の比率（μｇプラスミド：ｎｍｏｌ脂質）は、少なくとも約１：１のプラスミド：脂質（例えば、１μｇプラスミド：１ｎｍｏｌ脂質）であることが可能である。例えば、プラスミド対脂質の比率は、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、又は少なくとも約１：２０であることが可能である。本明細書中において表される比率は組成物におけるカチオン性脂質の量に基づいており、組成物における脂質の総量には基づいていない。本発明の組成物におけるプラスミド対脂質の比率は好適には、重量比で約１：１〜約１：８０のプラスミド：脂質であり、重量比で約１：２〜約１：４０のプラスミド：脂質であり、重量比で約１：３〜約１：３０のプラスミド：脂質であり、又は重量比で約１：６〜約１：１５のプラスミド：脂質である。
【００４４】
Ｃ．生物学的作用因
本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物のどれもがさらに、本明細書中に記載されるリポソーム送達ビヒクルと、本明細書中に記載されるプラスミドの少なくとも１つとに加えて、少なくとも１つの生物学的作用因を含むことができる。
【００４５】
好適な生物学的作用因は、疾患を防止すること、又は処置することにおいて効果的である作用因である。そのような生物学的作用因には、免疫エンハンサータンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤、又は、どのような組合せであってもそれらの組合せが含まれる。好適な免疫エンハンサータンパク質が、免疫を増強することが知られているそのようなタンパク質である。非限定的な一例として、サイトカイン（これには、一群のタンパク質が含まれる）が、知られている免疫増強タンパク質ファミリーである。好適な免疫原が、対象への当該免疫原の投与により、免疫原特異的な免疫応答が、当該対象の組織の内部において遭遇する同じタンパク質又は類似したタンパク質に対して開始されるように体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘発するタンパク質である。免疫原には、細菌、ウイルス、寄生生物又は真菌によって発現される病原性抗原が含まれる場合がある。好ましい抗原には、感染性疾患を対象において引き起こす生物に由来する抗原が含まれる。本発明によれば、免疫原は、天然に存在するタンパク質であろうと、又は合成的に誘導されたタンパク質であろうと、タンパク質のどのような部分であれ、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘発する部分である場合がある。そのようなものとして、抗原又は免疫原のサイズは、間のどのようなサイズも含めて、約５アミノ酸〜１２アミノ酸ほどの小さいサイズ、及び、全長タンパク質ほどの大きいサイズである場合がある。抗原は多量体タンパク質又は融合タンパク質である場合がある。抗原は、精製された抗原である場合がある。代替において、免疫エンハンサータンパク質又は免疫原は、免疫賦活性プラスミドによって、又は免疫モジュレーター組成物に含まれる別の核酸によってコードされることが可能である。免疫エンハンサータンパク質又は免疫原が免疫モジュレーター組成物における核酸分子によってコードされる場合、免疫エンハンサータンパク質又は免疫原をコードする核酸配列は転写制御配列に機能的に連結され、その結果、免疫原が対象の組織において発現され、それにより、非特異的な免疫応答に加えて、免疫原特異的な免疫応答を当該対象において誘発するようにされる。免疫原性（例えば、病原体抗原免疫原性又はサイトカイン活性など）についてスクリーニングするための様々な技術が当業者には知られており、これらには、様々なインビトロアッセイ及びインビボアッセイが含まれる。
【００４６】
生物学的作用因がワクチンである場合、ワクチンには、生の感染性のウイルスワクチン、細菌ワクチンもしくは寄生生物ワクチン、又は、死菌化され、不活性化されたウイルスワクチン、細菌ワクチンもしくは寄生生物ワクチンが含まれる場合がある。１つ又は複数のワクチン（弱毒化ウイルスワクチン又は死菌化ウイルスワクチン）が本発明の免疫モジュレーター組成物との組合せで使用される場合がある。好適なワクチンには、鳥類又はウシ属の種のためにこの技術分野で知られているワクチンが含まれる。
【００４７】
生物学的作用因は抗菌剤であることが可能である。好適な抗菌剤には、キノロン系抗菌剤、好ましくはフルオロキノロン系抗菌剤、β−ラクタム系抗菌剤、及び、マクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミン（ＭＬＳ）抗生物質が含まれる。
【００４８】
好適なキノロン系抗菌剤には、ベノフロキサシン（ｂｅｎｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、ビンフロキサシン、シノキサシン（ｃｉｎｏｘａｃｉｎ）、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、ゲミフロキサシン、イバフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、プラドフロキサシン（ｐｒａｄｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、ペフロキサシン（ｐｅｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン及びトスフロキサシンが含まれる。好ましいフルオロキノロン系抗菌剤には、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、エンロフロキサシン、モキシフロキサシン及びプラドフロキサシンが含まれる。好適なナフチリドン系抗菌剤には、ナリジクス酸が含まれる。
【００４９】
好適なβ−ラクタム系抗菌剤には、ペニシリン系抗菌剤（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、コアモキシクラブ（ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖ）［すなわち、アモキシシリン／クラブラン酸］、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェノキシメチルペニシリン、ピペラシリン、プロカインペニシリン、テモシリン及びチカルシリン）、セファロスポリン系抗菌剤（例えば、セファクロル、セファロニウム、セファマンドール、セファプリン（ｃｅｆａｐｒｉｒｉｎ）、セファゾリン、セフェピム、セフィキシム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフキノム、セフタジジム、セフチオフル、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、セファロチン及びセフォテタン（ｄｅｆｏｔｅｔａｎ））、カルバペネム系抗菌剤及びペネム系抗菌剤（例えば、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム及びメロペネム）、モノバクタム系抗菌剤（例えば、アズトレオナム、ノカルジシンＡ、タブトキシニン（ｔａｂｔｏｘｉｎｉｎｅ）−β−ラクタム及びチゲモマム（ｔｉｇｅｍｏｎａｍ））、ならびに、β−ラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラン酸、スルバクタム及びタゾバクタム）が含まれる。好ましいβ−ラクタム系抗菌剤には、セファロスポリン系抗菌剤が含まれ、具体的にはセファゾリンが含まれる。
【００５０】
好適なＭＬＳ抗生物質には、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシン、及び、どのようなマクロライド系抗生物質も含まれる。好ましいリンコサミド抗生物質がピルリマイシンである。
【００５１】
他の抗菌剤には、アミノグリコシド系抗菌剤、クロピドール、ジメトリダゾール系抗菌剤、エリスロマイシン、フラマイセチン、フラゾリドン、ハロフギノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）、２−ピリドン系抗菌剤、ロベニジン、スルホンアミド系抗菌剤、テトラサイクリン系抗菌剤、トリメトプリム、様々なプロイロムチリン（ｐｌｅｕｒｏｍｕｔｉｌｉｎ）系抗菌剤（例えば、チアムリン及びバルネムリン（ｖａｌｎｅｍｕｌｉｎ））、及び、様々なストレプトマイシン（例えば、モネンシン、ナラシン及びサリノマイシン）が含まれる。
【００５２】
ウシ呼吸器病又はウシ呼吸器病症候群（ＢＲＤ）は畜牛産業における経済的損失の主要な原因である。ウシがストレス要因にさらされると、その先天性免疫機能及び後天性免疫機能が損なわれ、これにより、ウシの気道の正常な細菌叢の一部である微生物が繁殖し、下気道に定着することが可能となる。下気道系は典型的には無菌の領域であり、したがって、微生物の増殖は、重篤な病気、また、死さえも引き起こす可能性がある。
【００５３】
本発明の免疫モジュレーター組成物が、ＢＲＤに対して効果的である抗菌剤に加えて投与される併用療法が、免疫応答を刺激するために、同様にまた、病原体に対して直接に作用するために行われる場合がある。この併用療法は、予防的に施されるならば、回復時間を短縮することができ、又は感染を防止することさえできる。罹患率の減少は、肥育動物の増大した生産性をもたらすことができる。「生産性」は、本明細書中で使用される場合、体重増加をもたらす肥育動物によって行われる様々な活動を示す。「体重増加」は、本明細書中で使用される場合、動物あたりの平均１日増加及び／又は平均体重における増大を示す場合がある。病気に罹っている動物及び苦しんでいる動物は体重を増やすかもしれないが、併用療法を受ける動物において認められる体重増加は、病気に罹っている動物の体重増加を上回る場合がある。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、対象における体重を増大させるための方法であって、配列番号１との少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列と、脂質送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物との組合せで前記対象に抗菌剤を投与することを含み、前記組合せにより、前記対象における体重が増大する方法を提供する。いくつかの態様において、抗菌剤は、抗生物質、例えば、上記で列挙される抗生物質などである。いくつかの態様において、抗菌剤はエンロフロキサシンである。
【００５４】
他の態様では、対象における体重増加を増大させるための方法であって、配列番号４との少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列と、脂質送達ビヒクルとを含む免疫モジュレーター組成物との組合せで前記対象に抗菌剤を投与することを含み、前記組合せにより、前記対象における体重が増大する方法が提供される。いくつかの態様において、抗菌剤は、抗生物質、例えば、上記で列挙される抗生物質などである。いくつかの態様において、抗菌剤はエンロフロキサシンである。
【００５５】
ＩＩ．方法
本発明の目的は、非感染の対象に対する防御免疫、感染後の対象に対する防御免疫、非感染の対象に対する強化された免疫、感染後の対象に対する強化された免疫、感染後の対象に対する治療的免疫、又はそれらの組合せを提供するために細胞質ＤＮＡ監視分子を活性化する免疫モジュレーター組成物、免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）及び方法を提供することである。そのようなものとして、本発明の組成物は、対象を予防的に免疫化するために使用される場合があり、又は、対象を処置するために使用される場合がある。本明細書中に記載される方法は、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（又はＤＮＡ配列）を対象に投与し、細胞質ＤＮＡ監視分子を前記対象において活性化することを含む。
【００５６】
Ａ．細胞質ＤＮＡ監視分子を活性化する方法
本発明は、細胞質ＤＮＡ監視分子をレシピエント対象において活性化する方法に関する。この方法は、細胞質ＤＮＡ監視分子を活性化するための本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物の効果的な量を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物により、細胞質ＤＮＡ監視分子が活性化される。いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物により、少なくとも１つの生物学的作用因（例えば、ワクチンなど）の働きが、免疫モジュレーター組成物がそのようなワクチンに先立って投与されたときに、ワクチンと一緒に投与されるときに、ワクチン接種後に投与されるときに、又はワクチンと混合されたときに高まる。いくつかの態様において、上記方法は、レシピエント対象を感染性疾患から保護するための、また、感染性疾患を有する集団を処置するための新しい処置戦略を提供する。いくつかの態様において、上記方法は、免疫モジュレーターがワクチンとの組合せで使用されるとき、免疫モジュレーター組成物を伴わない前記ワクチンの使用と比較して、より迅速で、より長い、かつ、より良好な、疾患からの防御を提供する。
【００５７】
細胞質ＤＮＡ監視分子を、本明細書中に記載されるリポソーム送達ビヒクルのいずれかと、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミド（ＤＮＡ配列用）のいずれかと、場合により、本明細書中に記載される生物学的作用因のいずれかとを含む免疫モジュレーター組成物の効果的な量を投与することによってレシピエント対象において活性化することができる。生物学的作用因は免疫モジュレーターと混合される場合があること、あるいは、免疫モジュレーターと一緒に共投与される場合があること、又は、免疫モジュレーターとは独立して共投与される場合があることが意図される。独立した投与は免疫モジュレーターの投与の前又は後である場合がある。免疫モジュレーター又は生物学的作用因の２回以上の投与が使用され得ることもまた意図される。さらには、２つ以上の生物学的作用因が免疫モジュレーターと一緒に共投与される場合があり、免疫モジュレーターの投与に先立って投与される場合があり、免疫モジュレーターの投与の後に投与される場合があり、又は免疫モジュレーターと同時に投与される場合がある。
【００５８】
この技術分野において知られているどのような細胞質ＤＮＡ監視分子であっても、又は、未だ発見されていないどのような細胞質ＤＮＡ監視分子であっても、本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物を使用して調節又は活性化される場合がある。当業者は、そのような細胞質ＤＮＡ監視分子は非常に多数であるので、本明細書中に列挙することはできないことを理解するであろう。そのようなものとして、本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物は、本明細書中に記載される組成物の少なくとも１つの免疫モジュレーター成分を認識することができる細胞質ＤＮＡ監視分子をどのようなものであっても活性化又は調節するために使用される場合がある。例として、限定されないが、そのような細胞質ＤＮＡ監視分子には、ＡＩＭ２、ＡＰ１、ＡＳＣ、Ａｔｇ９ａ、Ｂ−カテニン、カスパーゼ−１、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、ＤＡＩ、ＤＤＸ４１、ＤＥＣ２０５  ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＮＡ−ＰＫ、ＥＲＩＳ、ＩＦＩ１６、ＩＫＫ複合体、ＩＫＫε、ＩＰＳＩ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＳＲＥ１／７、ＩＳＲＥ７、ＪＮＫ、Ｋｕ７０、ＬＧＰ２、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＰＫ、ＭＤＡ−５、ＭＩＴＡ、ＭＫＫ３／６、ＭＰＹＳ、Ｍｒｅ１１、Ｍｘ１、ＭｙＤ８８、ＮＡＰ１、ＮＦＡＴ、ＮＦ−ＫＢ、ＮＬＲＣ５、ＯＡＳ−３／ＯＡＳ−Ｌ、プロカスパーゼ−１、ｐ３８、ＲＩＧ−Ｉ、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＴＩＮＧ、ＴＡＮＫ、ＴＢＫ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２．１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＬＲ２１、ＴＭＥＭ１７３、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＴＲＩＦ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ５６、この技術分野で知られている他のインターフェロン応答因子、及びそれらの組合せが含まれる。
【００５９】
本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物のいずれかの効果的な量が対象に投与される場合がある。効果的な量は、少なくとも１つの細胞質ＤＮＡ監視分子をレシピエント対象において活性化するために十分である。そのような効果的な量は、少なくとも１つの細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化をレシピエント対象において引き起こす量で、どのような量でもある。そのような活性化を測定する様々な方法がこの技術分野では知られている。また、当業者は、効果的な量が、対象の年齢、体重及び種、ならびに感染の段階、同様にまた、この技術分野で知られている他の因子に依存するであろうことを認識するであろう。好適な効果的な量が対象あたり約０．１μｇから１，０００μｇまでの範囲である場合がある。いくつかの態様において、効果的な量が、約０．１μｇから約１０μｇまでの範囲、約０．１μｇから約５μｇまでの範囲、約０．５μｇから約５μｇまでの範囲、約０．２５μｇから約５μｇまでの範囲、約０．０５μｇから約１０μｇまでのまでの範囲、約５μｇから約１５μｇまでの範囲、約１０μｇから約１５μｇまでの範囲、約１０μｇから約２０μｇまでの範囲、約２０μｇから約３０μｇまでの範囲、約３０μｇから約４０μｇまでの範囲、約４０μｇから約５０μｇまでの範囲、約５０μｇから約７０μｇまでの範囲、約７０μｇから約９０μｇまでの範囲、約５０μｇから約１００μｇまでの範囲、約１００μｇから約１５０μｇまでの範囲、約１５０μｇから２００μｇまでの範囲、約２００μｇから約２５０μｇまでの範囲、約２５０μｇから約３００μｇまでの範囲、約３００μｇから約３５０μｇまでの範囲、約３５０μｇから約４００μｇまでの範囲、約４００μｇから約４５０μｇまでの範囲、約４５０μｇから約５００μｇまでの範囲、約５００μｇから約５５０μｇまでの範囲、約５５０μｇから約６００μｇまでの範囲、約６００μｇから約６５０μｇまでの範囲、約６５０μｇから約７００μｇまでの範囲、約７００μｇから約７５０μｇまでの範囲、約７５０μｇから約８００μｇまでの範囲、約８００μｇから約８５０μｇまでの範囲、約８５０μｇから約９００μｇまでの範囲、約９００μｇから約９５０μｇまでの範囲、約９５０μｇから約１０００μｇまでの範囲である場合がある。好ましくは、いくつかの態様において、効果的な量は約０．５μｇから約１０μｇまでの範囲である。それにもかかわらず、好ましくは他の態様において、効果的な量は約５０μｇから約１００μｇまでの範囲である。そして、好ましくは他の態様において、効果的な量は約４０μｇから約７０μｇまでの範囲である。
【００６０】
Ｂ．免疫応答を調節する方法
本明細書に開示される免疫モジュレーター組成物は、レシピエント対象によって開始される免疫応答を調節するために特に有用である。免疫応答を対象において調節するそのような方法は、効果的な量の本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物を前記対象に投与し、これにより、免疫応答を調節することに関与するシグナル伝達経路を活性化する免疫監視受容体を活性化することを含む。いくつかの態様において、そのような方法は、先天性免疫応答を刺激するために使用される場合がある。いくつかの態様において、そのような方法は、後天性免疫応答を刺激するために使用される場合がある。いくつかの態様において、そのような方法は、炎症性免疫応答を抑制するために使用される場合がある。いくつかの態様において、そのような方法は、炎症を免疫応答の期間中において抑制するために使用される場合がある。いくつかの態様において、そのような方法は、先天性免疫応答を刺激し、かつ、炎症をその先天性免疫応答の期間中において抑制するために使用される場合がある。いくつかの態様において、そのような方法は、後天性免疫応答を刺激し、かつ、炎症をその後天性免疫応答の期間中において抑制するために使用される場合がある。いくつかの態様において、そのような方法は、先天性免疫応答及び後天性免疫応答を刺激し、その一方で、炎症もまた抑制するために使用される場合がある。
【００６１】
Ｃ．使用のための状態
本発明の方法は、少なくとも１つの細胞質ＤＮＡ監視分子を対象において活性化し、その結果、前記対象が、免疫応答の誘発を受け入れる疾患から保護されるようにする。本明細書中で使用される場合、表現「疾患から保護される」は、当該疾患の症状を軽減すること、当該疾患の発生を低下させること、当該疾患の臨床的重篤度もしくは病理学的重篤度を軽減すること、又は、疾患を引き起こす病原体の流出を減少させることを示す。対象を保護することは、本発明の治療組成物が対象に投与されたときの、本発明の治療組成物の能力で、疾患が生じることを防止する能力、病気が治る能力、及び／又は、疾患症状、臨床的徴候、病理もしくは原因を緩和又は軽減する能力を示すことができる。そのようなものとして、対象を疾患から保護することは、疾患の発生を防止すること（予防的処置）と、疾患を有する対象を処置すること（治療的処置）との両方を包含する。用語「疾患」は、対象の正常な健康状態からの逸脱をどのようなものであっても示し、用語「疾患」には、疾患の症状が存在する状態、同様にまた、逸脱（例えば、感染、遺伝子変異、遺伝的欠陥など）が生じており、しかし、症状が未だ現れていない状態が含まれる。
【００６２】
本発明の方法は、疾患の防止、疾患に対するエフェクター細胞免疫の刺激、疾患の排除、疾患の緩和、及び、原発性疾患の存在から生じる二次的疾患の防止のために使用される場合がある。
【００６３】
いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法は、ワクチンの単独投与に対して、ワクチンと共投与されたときの対象の後天性免疫応答を改善するために使用される場合がある。一般には、一度投与されたワクチンは、後天性免疫を刺激するためには時間がかかるので、対象を直ちには保護しない。用語「改善する」は本発明においては、ワクチンが対象を保護し始めるまで、かつ／又は、後天性免疫を介して、ワクチンによって与えられる保護期間を延長し始めるまで対象において先天性免疫応答を誘発することを示す。
【００６４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、広範囲の様々な病原体の感染から保護するために組成物を投与することを含む。投与される組成物は、特異的応答を誘発するための特異的な抗原を含む場合があり、又は含まない場合がある。本発明の方法は、ウイルス、細菌、真菌及び寄生生物（これらに限定されない）を含む様々な感染性微生物因子から生じる疾患からレシピエント対象を保護するであろうことが意図される。当業者は、本明細書中に記載されるような免疫モジュレーター組成物が、列挙するには多すぎる数多くの感染性因子に対して効果的であることを認識するであろうし、また、理解するであろう。本明細書中において提供される感染因子は例示目的のために提供されており、使用範囲を限定することなく提供される。
【００６５】
Ｄ．投与
様々な投与経路が利用可能である。選択される具体的な様式は、当然のことではあるが、選択される具体的な生物学的作用因、対象の年齢及び全身の健康状態、処置される具体的な状態、ならびに、治療効力のために要求される投薬量に依存するであろう。本発明の方法は、細胞質ＤＮＡ監視分子の効果的なレベルの活性化を、臨床的に受け入れられない有害作用を引き起こすことなくもたらす投与様式をどのようなものであっても使用して実施される場合がある。組成物は好都合には単位投薬形態で提供される場合があり、また、この技術分野では広く知られている方法のいずれかによって調製される場合がある。
【００６６】
免疫モジュレーター組成物は、静脈内投与により、筋肉内投与により、乳房内投与により、皮内投与により、腹腔内投与により、皮下投与により、噴霧により、羽嚢法による卵内投与により、経口投与により、眼内投与により、気管内投与により、鼻腔内投与により、粘膜投与により、直腸内投与により、経皮投与により、浸漬（水生種への投与）により、又は、この技術分野において知られている他の方法により投与される場合がある。１つの態様において、免疫モジュレーターは皮下投与される。別の態様において、免疫モジュレーターは筋肉内投与される場合がある。別の態様において、免疫モジュレーターは噴霧剤として投与される。別の態様において、免疫モジュレーターは経口投与される場合がある。別の態様において、免疫モジュレーターは皮下投与される場合がある。
【００６７】
１つのある点において、免疫モジュレーターは抗原負荷（又は感染）に先立って対象にそれだけで投与される場合がある。別の態様において、免疫モジュレーターは抗原負荷（又は感染）の後において対象にそれだけで投与される場合がある。別の態様において、免疫モジュレーターは抗原負荷（又は感染）と同時にそれだけで投与される場合がある。
【００６８】
いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物は、抗原負荷に先立つワクチン接種と同時に共投与される場合がある。いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物は、抗原負荷（又は感染）と同時でのワクチン接種と同時に共投与される場合がある。いくつかの態様において、共投与には、ワクチン及び免疫モジュレーターを、対象における同じ概略的場所において、互いに隣接する２つの異なる部位で投与すること（すなわち、注射を対象の頸部において互いに隣接して施すこと）、同じ概略的場所における対象の相対する部位で投与すること（すなわち、１つを頸部のそれぞれの部位に投与すること）、又は、同じ対象の異なる場所で投与することが含まれる場合がある。いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物はワクチン接種及び抗原負荷に先立って投与することができる。いくつかの態様において、免疫モジュレーター組成物は、ワクチン接種後において、しかし、抗原負荷に先立って投与される場合がある。免疫モジュレーター組成物は、抗原負荷（又は感染）に先立ってワクチン接種された対象に対して抗原負荷後に投与することができる。
【００６９】
当業者は、投与経路が対象及び対象の健康又は状態に依存して変化し得ることを認識するであろう。鳥類及びウシ属の種のために提供される上記投与経路は例示目的のためであり、限定されることなく提供される。
【００７０】
鳥類種へのワクチン接種が、どのような年齢であっても行われる場合がある。ワクチン接種が、生きている微生物については１８日齢の胚（卵内）及びそれ以降に、また、不活性化微生物又は他のタイプのワクチンについては３週間以降に施される場合がある。卵内ワクチン接種については、ワクチン接種が発達の最後の四半期において施される場合がある。ワクチンは、皮下投与により、羽嚢法により、噴霧により、経口投与により、眼内投与により、気管内投与により、鼻腔内投与により、卵内投与により、又は、この技術分野において知られている他の方法により投与される場合がある。経口ワクチンが飲料水において投与される場合がある。さらには、本発明の方法は、日常的なワクチン接種スケジュールに基づいて使用され得ることが意図される。
【００７１】
免疫モジュレーター組成物はまた、鳥類種に皮下投与により、羽嚢法により、噴霧により、眼内投与により、気管内投与により、鼻腔内投与により、卵内投与により、又は、この技術分野において知られている他の方法により投与される場合がある。例えば、免疫モジュレーター組成物は卵内投与することができる。代替において、免疫モジュレーター組成物は噴霧剤として投与することができる。
【００７２】
免疫モジュレーター組成物はトリの胚にその発達の最後の四半期において卵内投与することができる。例えば、免疫モジュレーター組成物は１８日齢又は１９日齢の胚に卵内投与することができる。卵への投与は抗原負荷（又は感染）の前又は抗原負荷の後である場合がある。
【００７３】
免疫モジュレーターは、鳥類又はウシ属の種の動物に抗原負荷の約１日前から１４日前まで、又は抗原負荷の約１日後から約１４日後まで投与することができる。例えば、免疫モジュレーターは抗原負荷の約１日前から約７日前まで、又は抗原負荷の約１日後から約７日後まで投与することができる。免疫モジュレーターは好適には、抗原負荷の１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前に、又は抗原負荷の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後に投与される。
【００７４】
ウシ属の種へのワクチン接種が、どのような年齢であっても行われる場合がある。ワクチンは、静脈内投与により、筋肉内投与により、皮内投与により、腹腔内投与により、皮下投与により、噴霧により、経口投与により、眼内投与により、気管内投与により、鼻腔内投与により、粘膜投与により、直腸内投与により、経皮投与により、又は、この技術分野において知られている他の方法により投与される場合がある。さらには、本明細書中に記載される方法は、日常的なワクチン接種スケジュールに基づいて使用され得ることが意図される。
【００７５】
他の送達システムには、徐放性送達システム、遅延放出送達システム又は持続放出送達システムが含まれる場合がある。そのようなシステムでは、組成物の反復した投与を避けることができ、したがって利便性を増大させることができる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者には知られている。それらには、ポリマーに基づくシステム、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ無水物などが含まれる。薬物を含有する前述ポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載される。
【００７６】
送達システムにはまた、ステロール類（例えば、コレステロールなど）、コレステロールエステル及び脂肪酸又は天然脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドなど）を含む脂質である非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、シラスティックシステム、ペプチド型システム、ワックス被覆物、従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠剤、ならびに、部分融合インプラントなどが含まれる。具体的な例には、本発明の薬剤がマトリックス内の形態で含有される侵食性システム、例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号及び同第５，７３６，１５２号に記載される侵食性システムなど、ならびに、活性な成分がポリマーから制御された速度で浸透する拡散性システム、例えば、米国特許第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号及び同第５，４０７，６８６号に記載される拡散性システムなどが含まれるが、これらに限定されない。加えて、ポンプに基づくハードウェア送達システムを使用することができ、そのうちのいくつかが埋め込みのために適合化される。
【００７７】
様々な変化が、本発明の範囲から逸脱することなく、上記の組成物、製造物及び方法において行うことが可能であるかもしれないので、上記の説明において、また、下記に示される実施例において含まれるすべての事項は、限定的な意味ではなく、例示であるとして解釈されなければならないことが意図される。
【００７８】
定義
用語「効果的な量」は、所望の生物学的効果を実現するために必要である量又は十分である量を示す。例えば、感染性疾患を処置するための、又は防止するための免疫モジュレーターの効果的な量は、微生物にさらされたときに免疫応答の発達を引き起こすために必要である、したがって、対象の体内の微生物の量における低下を引き起こすために必要である、好ましくは当該微生物の根絶を引き起こすために必要であるそのような量である。どのような適用であっても、特定の適用のための効果的な量は、処置されている疾患又は状態、対象のサイズ、又は疾患もしくは状態の重篤度のような要因に依存して変化し得る。当業者は、免疫モジュレーターの効果的な量を、過度の実験を必要とすることなく、経験により決定することができる。
【００７９】
用語「サイトカイン」は免疫増強タンパク質ファミリーを示す。サイトカインファミリーには、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー分子及びケモカイン（すなわち、細胞（特に食細胞）の遊走及び活性化を調節するタンパク質）が含まれる。例示的なサイトカインには、限定されないが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−α（ＩＦＮα）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）が含まれる。
【００８０】
用語「誘発する」は、活性化する、刺激する、生じさせる、又はアップレギュレーションするという用語と交換可能に使用することができる。
【００８１】
対象において「免疫応答を誘発する」という用語は、免疫応答の活性を特異的に制御すること、又は、免疫応答の活性に特異的に影響を及ぼすことを示し、この用語には、（例えば、あるタイプの免疫応答を誘発し、これにより、今度は、対象における優勢的なタイプの免疫応答を、有害又は無効であるタイプの免疫応答から、有益又は保護的であるタイプの免疫応答に変化させることなどによって）免疫応答を活性化すること、免疫応答をアップレギュレーションすること、免疫応答を増強すること、及び／又は免疫応答を変化させることが含まれ得る。
【００８２】
用語「機能的に連結された」は、核酸分子を、当該分子が宿主細胞にトランスフェクションされたとき（すなわち、形質転換されたとき、形質導入されたとき、又はトランスフェクションされたとき）に当該分子が発現され得るような様式で転写制御配列に連結することを示す。転写制御配列は、転写の開始、伸長及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列が、転写開始を制御する配列であり、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列及びリプレッサー配列などである。様々なそのような転写制御配列が当業者には知られている。好ましい転写制御配列には、鳥類、魚類、哺乳類、細菌、ウイルス、植物及び昆虫の細胞において機能する転写制御配列が含まれる。どのような転写制御配列であっても本発明と一緒に使用され得るが、そのような転写制御配列には、免疫原又は免疫刺激タンパク質をコードする配列に自然界では付随する天然に存在する転写制御配列が含まれる場合がある。
【００８３】
用語「核酸分子」及び用語「核酸配列」は交換可能に使用することができ、これらの用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらかの誘導体が含まれる。これらの用語にはまた、オリゴヌクレオチド及びより長い配列、例えば、プラスミド（例えば、本明細書中に記載される免疫賦活性プラスミドなど）などが含まれ、また、タンパク質又はその断片をコードする核酸分子と、調節領域、イントロン又は他の非コードＤＮＡもしくは非コードＲＮＡを含む核酸分子との両方が含まれる。典型的には、オリゴヌクレオチドは約１ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの核酸配列を有しており、より典型的には長さが少なくとも約５ヌクレオチドである。核酸分子は、哺乳動物起源、魚類起源、細菌起源、昆虫起源、ウイルス起源、植物起源、合成起源又はそれらの組合せを含めて、どのような起源からであっても由来することができる。核酸分子を、この技術分野において一般に知られている様々な方法によって、例えば、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）又は化学合成などによって製造することができる。核酸分子には、天然の核酸分子及びそのホモログが含まれ、これらには、天然の対立遺伝子変化体、ならびに、改変された核酸分子であって、そのような改変が、本発明の方法において有用である免疫応答を誘発する核酸分子の能力を実質的に妨げないような様式でヌクレオチドが挿入されている、欠失させられている、置換されている、又は逆位にされている改変された核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。核酸ホモログが、当業者に知られている数多くの方法を使用して製造される場合がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）を参照のこと、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００８４】
用語「選択マーカー」及び用語「選択マーカー遺伝子」は、所与の遺伝子であって、この遺伝子を発現する生物を、通常の場合には当該生物を殺傷するであろう、又はその成長を阻害するであろう選択薬剤（例えば、抗生物質）又は状態から保護する産物をコードする遺伝子を示す。選択マーカー遺伝子は最も一般的には抗生物質耐性遺伝子である（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）。したがって、例えば、大腸菌細胞が、カナマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドを導入するために形質転換手順に供され、その後、カナマイシンを含有する培地表面又は培地中で成長させられるとき、当該プラスミドを首尾良く取り込み、カナマイシン耐性遺伝子を発現している大腸菌細胞のみが生き残るであろう。用語「選択マーカー」及び用語「選択マーカー遺伝子」にはまた、生物の成長に必須である化合物の合成に関与する酵素をコードする遺伝子が含まれる。必須化合物を合成することができない栄養要求性生物に導入されたとき、そのような遺伝子により、当該生物は、当該必須化合物が補充された培地において成長することができる。例えば、リジンの生合成に関与する酵素における変異又は当該酵素の欠如のためにアミノ酸のリジンに対して栄養要求性である細菌細胞は通常、リジンが補充されていない培地では成長することができない。そのような細菌が、リジン生合成に関与する酵素をコードするプラスミドを導入するために形質転換手順に供されたとき、当該プラスミドを首尾良く取り込み、当該酵素を発現している細菌が、リジンが補充されていない培地で成長させられるときに生き残るであろう。用語「選択マーカー」及び用語「選択マーカー遺伝子」にはさらに、毒物／解毒薬選抜を可能にする遺伝子が含まれる。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、ＤＮＡジャイレース（すなわち、細胞分裂のための必須酵素）に結合するタンパク質をコードする。ＤＮＡジャイレースに結合すると、ｃｃｄＢ遺伝子産物は遺伝子複製を損ない、細胞死を誘導する。したがって、ｃｃｄＢ遺伝子産物を発現する細菌は生き残ることができない。ｃｃｄＡ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子産物の天然の阻害剤として作用するタンパク質（「解毒薬」）をコードする。したがって、ｃｃｄＢ遺伝子をその細菌ゲノムに有する細菌が、ｃｃｄＡ遺伝子産物をコードするプラスミドを導入するために形質転換手順に供されたとき、当該プラスミドを首尾良く取り込み、ｃｃｄＡ遺伝子を発現する細胞のみが生き残るであろう。
【００８５】
用語「スクリーニングマーカー」及び用語「スクリーニングマーカー遺伝子」は、スクリーニングマーカー遺伝子を発現する細胞と、スクリーニングマーカー遺伝子を発現しない細胞とを識別することを観察者に可能にする産物をコードする遺伝子を示す。様々なスクリーニングマーカー遺伝子システムがこの技術分野では広く知られており、これらには、例えば、ｌａｃＺ遺伝子、及び、蛍光性タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）又はシアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）など）をコードする遺伝子が含まれる。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、中枢神経系を有する生きている生物を示す。具体的には、対象には、ヒト対象又はヒト患者及びコンパニオンアニマルが含まれるが、これらに限定されない。例示的なコンパニオンアニマルには、飼い慣らされた哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、著しい商業的価値を有する哺乳動物（例えば、鳥類種、ウシ属種、乳牛、肉牛、競技用動物）、著しい科学的価値を有する哺乳動物（例えば、絶滅危惧種の捕獲標本又は非拘束標本）、又は、別途価値を有する哺乳動物が含まれる場合がある。好適な対象にはまた、マウス、ラット、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ及びヤギなど）、ウサギ目動物（例えば、ウサギ及びノウサギなど）、他の齧歯類、及び、霊長類（例えば、サル、チンパンジー及び類人猿など）が含まれる。対象は、飼い慣らされたものであろうと、又は野生のものであろうと、鳥類種のどのようなメンバーであってもよく、繁殖、肉生産又は卵生産のために商業的に飼育される場合がある。例示的な鳥類種には、限定されないが、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、カモ、キジ、ウズラ、ハト、ダチョウ、かごに入れられた鳥類、動物学コレクション及び鳥類飼育場における鳥類などが含まれる。対象は、飼い慣らされたものであろうと、又は野生のものであろうと、ウシ属種のどのようなメンバーであってもよく、繁殖、肉生産又はミル（ｍｉｌ）生産のために商業的に飼育される場合がある。例示的なウシ属種には、限定されないが、アンテロープ、スイギュウ、ヤク、ウシ及びバイソンなどが含まれる。ウシの種には、限定されないが、雌牛、（去勢しない）雄牛、（去勢された食用）雄牛、（未産の若い）雌牛、（食用・荷役用の去勢された）雄牛、肉牛及び乳牛などが含まれる。対象は水産養殖種のどのようなメンバーであってもよく、これらには、限定されないが、淡水又は塩水において生息する魚類、甲殻類、軟体動物のどのような種であっても含まれる。いくつかの態様において、対象は感染性疾患と診断される場合があり、又は、感染性疾患について危険性がある場合があり、又は、感染性疾患に罹っている場合がある。対象は、子宮内、新生児、青年期、成体、中年又は老年を含めて、どのような年齢であってもよい。
【００８７】
［実施例］
下記の限定されない実施例は、本発明をさらに例示するために提供される。
【００８８】
［実施例１］
単球細胞株を使用する免疫モジュレーター組成物による細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化。
【００８９】
本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物を、インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ−３）活性化するために、すなわち、ＤＮＡ監視分子によって活性化される転写因子を活性化するために使用した。１名の急性単球性白血病患者に由来するヒトマクロファージ様（単球）細胞株（ＴＨＰ−１）が単球機能のためのモデル系として使用される。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）誘導性の分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター構築物の安定的組込みによって作製された（ＩＲＦ−ＴＨＰ１細胞）。ＴＨＰ−１細胞は、細胞質ＤＮＡ認識受容体と同様に、機能的なＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路分子を内因的に含有する。ＳＴＩＮＧは、ＩＲＦ−３を介して作用する細胞質ＤＮＡ監視分子からのシグナルを受け取り、また、それ自体が、ＩＲＦ−３を介して細胞質ＤＮＡ監視分子である。ＳＴＩＮＧの活性化により、ＳＥＡＰ産生が引き起こされ、このＳＥＡＰ産生がその後、培養上清において検出可能である。したがって、ＩＲＦ−３レポーターＳＥＡＰ構築物の活性化はＳＴＩＮＧ経路の活性化と相関する。
【００９０】
安定的にトランスフェクションされたＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞株をＩＦＮ−α１（これは種々のＩＲＦ経路の包括的な活性化因子である）によってその機能性について試験した。ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を、ＩＲＦ−３活性化のための陽性コントロールとしてのヒトインターフェロンα１（ＩＦＮα１）と接触させた。特異的なＳＥＡＰシグナルが、ＩＦＮ−α１投薬に依存して検出され、明確な用量応答関係性が認められた。図４は、ＩＲＦ−３のＩＦＮα１活性化をグラフにより例示する。ＩＲＦ依存的なシグナル伝達軸がＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞株において機能的である。
【００９１】
配列番号２を非配合のプラスミドとして、また、リポソームと配合されたプラスミド（図５、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）として用いた初期実験では、非配合の配列番号２は特異的なシグナルを非常に高い濃度（５０μｇ／ｍＬ）においてさえ誘発しないことが示唆された。対照的に、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆは、ＳＥＡＰシグナルをＩＦＮ−α１コントロールと同程度の大きさでｎｇ／ｍＬの範囲において生じさせている（図５）。
【００９２】
ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物と接触させた。免疫モジュレーター組成物には、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、リポソーム（ＤＯＴＩＭ／コレステロール）キャリアと配合された配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）、リポソーム（ＤＯＴＩＭ／コレステロール）キャリアと配合された配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）、及び、ＰＢＳ（陰性コントロール）が含まれた。ＤＮＡ単独（これはリポソーム成分を含まない）はＩＲＦ−３を活性化しなかった（図６）。ＤＮＡ／リポソーム組成物はＩＲＦ−３を最も低い濃度で活性化した（図６）。
【００９３】
ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を、本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物と、また、コントロールと接触させた。免疫モジュレーター組成物には、非配合の配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）、非配合の配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １）、リポソーム（ＤＯＴＩＭ）キャリアと配合された配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）、及び、リポソーム（ＤＯＴＩＭ）キャリアと配合された配列番号１（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）が含まれた。コントロールには、ＰＢＳ（陰性コントロール）、リポソーム成分（配合単独）、ＨＳＶ−６０−Ｌｙｏｖｅｃ（既知の細胞質ＤＮＡ認識活性化剤）、ＶＡＣＶ−Ｌｙｏｖｅｃ（既知の細胞質ＤＮＡ認識活性化剤）及びポリ（ｄＡ／ｄＴ）−Ｌｙｏｖｅｃ（既知の細胞質ＤＮＡ認識活性化剤）が含まれた。ＤＮＡ単独（これはリポソーム成分を含まない）はＩＲＦ−３を活性化しなかった（図７及び図８）。ＤＮＡ／リポソーム組成物はＩＲＦ−３を活性化した（図７及び図８）。リポソーム成分はそれ自身では、ＩＲＦ３レポーター遺伝子発現に対する影響を有していなかった（図７及び図８）。
【００９４】
本明細書中に記載される免疫モジュレーター組成物は、細胞質ＤＮＡ監視分子を既知の細胞質ＤＮＡ認識活性化剤による活性化と同様に活性化し、場合によっては既知の細胞質ＤＮＡ認識活性化剤による活性化よりも良好に活性化した（図９及び図１０）。
【００９５】
非配合のプラスミドとしての配列番号２、及び、リポソームと配合されたプラスミドとしての配列番号２（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）の用量応答曲線により、「ネイクド」プラスミド（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２）は、検討された濃度範囲全体にわたってＰＢＳ希釈コントロールと同一であること（図１１；１．５６２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）、したがって、刺激性でないことが確認された。対照的に、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−ＦはＳＥＡＰシグナルを最大希釈（１．５６２５μｇ／ｍｌ及び３．１２５μｇ／ｍｌ）において生じさせ、その一方で、より高い濃度は、ＰＢＳコントロールを下回ることさえあるが、ＳＥＡＰ分泌能の喪失を引き起こした。顕微鏡検査により、より高い濃度におけるＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆの細胞傷害性がこの結果の理由であるかもしれないことが示唆される。陽性コントロールのインターフェロン−α１は用量依存的な応答を生じさせた。
【００９６】
非配合のプラスミドとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １、ならびに、リポソームと配合されたプラスミドとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）の用量応答曲線により、非配合のプラスミドの両方が、特異的なシグナルを検討された濃度範囲全体（０．３９μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）にわたって示さないことが確認された（図１２）。対照的に、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−ＦはＳＥＡＰシグナルを最大希釈（０．３９μｇ／ｍｌ、０．７８μｇ／ｍｌ及び１．５６２５μｇ／ｍｌ）において生じさせ、その一方で、より高い濃度は、ＰＢＳコントロールを下回ることさえあるが、ＳＥＡＰ分泌能の喪失を引き起こした。顕微鏡検査により、より高い濃度におけるＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆの細胞傷害性がこの結果の理由であるかもしれないことが示唆される。
【００９７】
非配合のプラスミドとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １は、２５μｇ／ｍｌにおいてさえ、ＰＢＳバックグラウンドを上回る特異的なシグナルを何ら示さない（図１３）。対照的に、リポソームと配合されたプラスミド（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）は顕著な刺激を１９５ｎｇ／ｍｌにおいて示し、その一方で、リポソームコントロールはシグナルを何ら示さなかった。ＳＴＩＮＧ経路に対処する標準的なリガンドのＨＳＶ−６０−ＬｙｏＶｅｃ及びＶＡＣＶ−７０−ＬｙｏＶｅｃと比較して、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆは、より強い刺激能を示した。いくつかの異なる細胞質内の認識経路に対処するポリ（ｄＡ／ｄＴ）／ＬｙｏＶｅｃは、より高い濃度であるにもかかわらず、この試験系における最も強いシグナルを示した。
【００９８】
非配合のプラスミドとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １は、ＰＢＳバックグラウンドを上回る特異的なシグナルを何ら示さない。対照的に、リポソームと配合されたプラスミド（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）は顕著な刺激を同一の濃度で示し、その一方で、リポソームコントロールはシグナルを何ら示さなかった（図１４）。ＳＴＩＮＧ経路に対処する標準的なリガンドのＨＳＶ−６０−ＬｙｏＶｅｃ及びＶＡＣＶ−７０−ＬｙｏＶｅｃ、同様にまた、ポリ（ｄＡ／ｄＴ）／ＬｙｏＶｅｃと比較して、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆは、類似した濃度で適用されたとき、より強い刺激能を示した。
【００９９】
図１４に示されるように、非配合のプラスミドとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １は、ＰＢＳバックグラウンドを上回る特異的なシグナルを何ら示さない。対照的に、リポソームと配合されたプラスミド（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）は顕著な刺激を同一の濃度で示し、その一方で、リポソームコントロールはシグナルを何ら示さなかった。ＳＴＩＮＧ経路に対処する標準的なリガンドのＨＳＶ−６０−ＬｙｏＶｅｃ、同様にまた、ポリ（ｄＡ／ｄＴ）／ＬｙｏＶｅｃと比較して、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆは、類似した濃度で適用されたとき、より強い刺激能力を示した（図１５）。トランスフェクション剤ＬｙｏＶｅｃはそれだけでは、ＩＲＦ−ＴＨＰ−１細胞を刺激しない。非配合プラスミドのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １が共複合体形成成分としてのＬｙｏＶｅｃと一緒に適用されるとき、ＩＲＦ経路の刺激が明らかである。
【０１００】
ＩＲＦ−ＴＨＰ−１レポーター遺伝子システムにおける、非配合のものとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １、リポソームと配合されたものとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）、ならびに、ＬｙｏＶｅｃと配合されたものとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １の用量応答曲線を、サブμｇ／ｍｌの濃度範囲において作製した（図１６）。非配合のプラスミドは不活性であり、その一方で、リポソームと配合されたものは、ＬｙｏＶｅｃ配合物よりも優れた用量応答を示した。このことから、リポソームは低濃度範囲では優れた配合物であることが示唆された。
【０１０１】
ＩＲＦ−ＴＨＰ−１レポーター遺伝子システムにおける、非配合のものとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １、トランスフェクション剤と配合されたものとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １（ＬｙｏＶｅｃ（図１７）、Ｍｉｒｕｓ（図１８）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎ（図１９））の用量応答曲線を、サブμｇ／ｍｌの濃度範囲において作製した。非配合のプラスミドは不活性であり、その一方で、トランスフェクション剤と配合されたものは、明確な用量応答を伴うＩＲＦ刺激シグナルを示した。このことは、ＴＨＰ−１細胞の細胞質内のＤＮＡ認識機構に対するこれらのプラスミドの刺激能についてのさらなる証拠を示すものである。
【０１０２】
［実施例２］
メラノーマ細胞株を使用する免疫モジュレーター組成物による細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化。
【０１０３】
Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞は、マウスＢ１６  Ｆ１メラノーマ細胞株に由来した。Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞は、多量体ＩＳＲＥによって強化されるＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターから構成されるＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの制御のもとにおいて分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞が、様々なＩＦＮ、環状ジヌクレオチド（例えば、ｃＧＡＭＰなど）又はＩ型ＩＦＮ誘導因子（例えば、トランスフェクションポリ（ｄＡ：ｄＴ）など）により刺激されると、Ｉ−ＩＳＧ５４プロモーターの活性化及びＳＥＡＰの産生が誘発される。
【０１０４】
Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞株をＩＦＮ−α１（これは種々のＩＲＦ経路の包括的な活性化剤である）によってその機能性について調べた。特異的なＳＥＡＰシグナルがＩＦＮ−α１投薬に依存して検出され、明確な用量応答関係性が明らかであった（図２０）。この実験では、ＩＲＦ依存的なシグナル伝達軸がこの細胞株では機能的であることが示唆された。
【０１０５】
Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞を、リポソームと配合されたプラスミドのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆによって６２５ｎｇ／ｍｌにおいて刺激したが、非配合のプラスミドは、特異的なシグナルをＰＢＳコントロールと比較して８倍高い濃度（５μｇ／ｍｌ）において示さなかった（図２１）。同様に、リポソーム配合物は単独では刺激性でなかった。コントロールの３’，３’−ｃＧＡＭＰ及びポリｄＡ／ｄＴは、予想された特異的なシグナルを示した。
【０１０６】
［実施例３］
ＳＴＩＮＧノックアウト細胞株を使用する免疫モジュレーター組成物による細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化。
【０１０７】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＤ−ＳＴＩＮＧ細胞をＳＴＩＮＧ遺伝子発現のノックダウンによりＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞から作製した。結果として、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＤ−ＳＴＩＮＧ細胞はＳＴＩＮＧ発現のかなりの低下を示す。
【０１０８】
比較実験では、ＩＲＦへのそのシグナル伝達がＳＴＩＮＧに依存していないので、インターフェロン−α１（ＩＦＮ−α１）をコントロールとして使用した。他の試験化合物のシグナルを、１として設定されるＩＦＮ−α１シグナルに対して正規化した。非配合のプラスミドとしてのＳｅｑ  Ｎｏ  ２及びＳｅｑ  Ｎｏ  １、ならびに、リポソーム配合単独は、ＰＢＳバックグラウンドを超える特異的なシグナルを５μｇ／ｍｌにおいて、ＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞において（図２２）、又は、ＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＳＴＩＮＧ細胞において（図２３）、そのどちらにおいても示さなかった。これに対して、リポソームと配合されたプラスミド（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）はＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞の顕著な刺激を３１２．５ｎｇ／ｍｌにおいて示し、その一方で、ＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＳＴＩＮＧでは、このシグナルは６７％（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）〜９１％（Ｓｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆ）のダウンレギュレーションを受けた。これらの結果は、ＳＴＩＮＧ媒介経路が、本明細書中に記載される免疫モジュレーターによって活性化される１つの細胞質ＤＮＡ監視経路であることを示している。
【０１０９】
［実施例４］
ヒト単球性細胞株及びマウスメラノーマ細胞株を使用する免疫モジュレーター組成物による細胞質ＤＮＡ認識の活性化。
【０１１０】
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２免疫モジュレーターの細胞質ＤＮＡ認識を、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株及びＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を使用して詳しく調べた。細胞培養物を、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、非配合のＳｅｑ  Ｎｏ  ２、又は適切なコントロール組成物により処理した。
【０１１１】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を、リポソームと配合されたＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆによって刺激した。  Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆにより処理された細胞についてのＳＥＡＰシグナルは、ＳＥＡＰシグナルを生じさせるための陽性コントロールにより処理された細胞の場合よりもおよそ４倍大きかった。しかしながら、非配合のプラスミドにより処理されたＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は特異的なシグナルを試験されたどのような濃度においても示さなかった（図２４Ａ）。
【０１１２】
同様に、Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株もまた、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ処理によって刺激されたが、非配合のプラスミドでは刺激されなかった。Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆによる刺激は、より低い濃度では、陽性コントロールによる刺激よりも大きなシグナルを生じさせた（図２４Ｂ）。これらの結果は、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆが細胞質ＤＮＡ認識のための強力な活性化リガンドであることを示している。
【０１１３】
［実施例５］
ＳＴＩＮＧノックアウト細胞株及びＳＴＩＮＧノックダウン細胞株を使用する免疫モジュレーター組成物による細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化。
【０１１４】
Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞をＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞株から、すなわち、マウスＢ１６−Ｆ１メラノーマに由来する細胞株から、ＳＴＩＮＧ遺伝子の安定的ノックアウトにより作製した。Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞は、多量体ＩＳＲＥによって強化されるＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターから構成されるＩ−ＩＳＧ５４プロモーターの制御のもとにおいて分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。これらの細胞は、細胞質ＤＮＡ、ＤＭＸＡＡ、標準ＣＤＮ及び非標準ＣＤＮには応答せず、その一方で、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩ型ＩＦＮに対する応答能を保持している。これらの細胞がＩＦＮにより刺激されると、Ｉ−ＩＳＧ５４プロモーターの活性化及びＳＥＡＰの産生が誘発される。
【０１１５】
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−ＦによるＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＤ−ＳＴＩＮＧ細胞及びＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞の処理を比較した。ノックダウン細胞において生じたＳＥＡＰシグナルは、ＴＨＰ−１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞において生じたシグナルの５０％未満であった（図２５Ａ）。Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−ＦによるＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ−ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞の処理もまた、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−ＦによるＢ１６−Ｂｌｕｅ（商標）の処理と比較した。Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）細胞の処理では、陽性コントロールのＳＥＡＰシグナルと同様なＳＥＡＰシグナルが生じた（図２５Ｂ）が、ノックアウト細胞の処理では、ＰＢＳコントロールのシグナルを超えるシグナルは生じなかった（図２５Ｂ）。
【０１１６】
これらの結果は、ＩＲＦ経路のＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ活性化がＳＴＩＮＧ依存性であることを示唆している。
【０１１７】
［実施例６］
ＳＴＩＮＧノックアウト細胞株及びＳＴＩＮＧ野生型細胞株を使用する免疫モジュレーター組成物による細胞質ＤＮＡ監視分子の活性化の比較。
【０１１８】
ＳＴＩＮＧノックアウト細胞株及びＳＴＩＮＧ野生型細胞株を使用して、ＳＴＩＮＧが、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆの認識のために必須であるかどうかを明らかにした。
【０１１９】
これらの細胞株を最初に、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）とのインキュベーションによって、すなわち、本発明者らの実験において得られた観察結果ではあるが、シグナル伝達経路がＳＴＩＮＧ遺伝子の欠損によって影響されないはずであるサイトカインとのインキュベーションによって検証した。図２６を参照して、既知のＳＴＩＮＧ経路活性化剤、すなわち、ＬｙｏＶｅｃと複合体化される単純ヘルペスウイルスＤＮＡ（ＨＳＶ−ＬｙｏＶｅｃ）と、環状ジヌクレオチドの２’，３’−ｃＧＡＭＰとを使用して、細胞株の性質を検証した。両方の薬剤が、有意なシグナルを親のＢ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞株において生じさせたが、これらのシグナルはＢ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ−ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞では完全に取り消された。
【０１２０】
複合体化されていないＳｅｑ  Ｎｏ  ２プラスミド又はＳｅｑ  Ｎｏ  １プラスミドを適用すると、両方の細胞株において、ＰＢＳコントロールと比較して、シグナルが全く得られなかったか、又は、ほんのわずかしか得られなかった。リポソームと複合体化された配列番号２（配列番号２−Ｆ）及び配列番号１（配列番号１−Ｆ）は、強いシグナルを親のＢ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ細胞株においてもたらし、その一方で、シグナルが、Ｂ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＳＧ−ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞では何ら認められなかった。
【０１２１】
まとめると、これらのデータは、少なくとも、インターフェロン応答エレメントの読み出しを有するマウスＢ１６メラノーマ細胞においては、ＳＴＩＮＧ経路が、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及びＳｅｑ  Ｎｏ  １−Ｆの認識のために必須であることを示唆している。
【０１２２】
［実施例７］
ブタにおけるインターフェロン放出のエクスビボ誘導。
【０１２３】
この研究の目的は、ブタから単離される末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるインターフェロン産生に対するＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆの影響を明らかにすることであった。
【０１２４】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）細胞溶解アッセイを、単離されたＰＭＢＣにおける１型インターフェロンの発現を検出するために用いた。ＶＳＶアッセイを、３頭の別個のブタから単離されるＰＭＢＣに対して行った。ＰＭＢＣを共刺激剤（ＵＶ不活性化ヘルペスウイルス）の存在下及び非存在下の両方において配合後のＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆにより処理した。表１を参照して、分析を、２日、４日及び６日の経過にわたって、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２の異なる濃度において行った。
【表１】
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2018518511.tif 000003
【０１２５】
新たに単離されたＰＭＢＣの刺激挙動を凍結保存細胞に対して比較するために、別のＶＳＶアッセイ（試験ＩＶ）を、ブタから得られる凍結されたＰＢＭＣを用いて行った。このために、ブタ（ｎｏ．２００８）の新鮮な細胞及び凍結保存細胞を直接比較のために使用した。
【０１２６】
結果
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆは、ＰＭＢＣにおけるインターフェロン放出の非常に効果的な刺激剤であることが見出された。さらなる共刺激は、付加的な影響が検出できなかったので、インターフェロン放出におけるさらなる増大をもたらさなかった。放出されたインターフェロンの生物学的活性が実験ユニット（ＥＵ）に換算して記載された。実験ユニットを５０％のＣＰＥによって定義した。ｍｌにおけるＥＵ単位の計算を、２ｘ×１０＝ＥＵ／ｍｌの式によって行った。
【０１２７】
毒性／不耐性
表１を参照して、配列番号２の最高濃度（１００μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）は、免疫モジュレーターに関連づけられる不耐性と、インターフェロン放出の欠如又は低下したインターフェロン放出とをもたらした。細胞の顕微鏡分析では、毒性を示唆する形態学的変化が検出された。インターフェロン放出についてのアッセイもまた、３μｇ／ｍｌから０．００３μｇ／ｍｌにまで及ぶ配列番号２のより低い濃度を用いて行った。より低い濃度のどれもが、より高い濃度において見られる毒性と類似する毒性を示さなかった。
【０１２８】
インターフェロン放出
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆの投与はインターフェロン放出をもたらした。３頭すべてのブタ（試験Ｉ、試験ＩＩ及び試験ＩＩＩ）において、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−ＦはＩＦＮ放出を用量依存的様式で誘導した（図２７Ａ〜図２７Ｃ）。放出されたＩＦＮの量はそれぞれの動物において個々に異なった。
【０１２９】
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆにより処理される凍結保存されたＰＢＭＣはＩＦＮを放出した；しかしながら、放出されたＩＦＮの平均量が、新たに単離された細胞から放出されるＩＦＮよりもおよそ４倍低かった（表１、試験Ｉ及び試験ＩＶを参照のこと）。
【０１３０】
［実施例８］
ウシにおけるＩＦＮ放出のエクスビボ誘導。
【０１３１】
この研究の目的は、ウシから単離される末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）におけるインターフェロン産生に対する配合後のＳｅｑ  Ｎｏ  ２の影響を明らかにすることであった。
【０１３２】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）細胞溶解アッセイを、１型インターフェロンの発現を検出するためにを用いた。ＶＳＶアッセイ（試験Ｉ、試験ＩＩ及び試験ＩＩＩ）を、３頭の別個のウシから単離されるＰＭＢＣに対して行った。ＰＭＢＣを共刺激剤（ＵＶ不活性化ヘルペスウイルス）の存在下及び非存在下の両方において配合後のＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆにより処理した。表２を参照して、分析を、２日及び４日の経過にわたって、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆの異なる濃度（３μｇ／ｍｌ〜０．００３μｇ／ｍｌ）において行った。
【表２】
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【０１３３】
新たに単離されたＰＭＢＣの刺激挙動を凍結保存細胞に対して比較するために、ＶＳＶアッセイ（試験ＩＶ）を、試験Ｉで使用されるウシ由来の凍結されたＰＢＭＣを用いて行い、その結果、凍結保存細胞と、ウシから新たに単離された細胞との間における直接比較を行った。
【０１３４】
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆは、ＰＭＢＣにおけるインターフェロン放出の非常に効果的な刺激剤であることが見出された。さらなる共刺激は、付加的な影響が検出されなかったので、インターフェロン放出におけるさらなる増加をもたらさなかった。Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆの投与はＩＦＮ放出をもたらした。３頭すべてのウシ（試験Ｉ、試験ＩＩ及び試験ＩＩＩ）において、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆは、ＩＦＮ放出を、図２８Ａ〜図２８Ｃに例示されるように用量依存的様式で誘導した。放出されたＩＦＮの量はそれぞれの動物において個々に異なった。Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆにより処理される凍結保存されたＰＢＭＣはＩＦＮを放出した；しかしながら、放出されたＩＦＮの平均量が、新たに単離された細胞から放出されるＩＦＮよりもおよそ５倍低かった（表２、試験Ｉ及び試験ＩＶを参照のこと）。
【０１３５】
［実施例９］
免疫モジュレーター用量及び投与経路のクロスオーバー研究
クロスオーバー研究を、免疫モジュレーター投薬量及び投薬方法がブタにおけるサイトカイン発現に及ぼす影響を比較するために行った。
【０１３６】
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを、４週間の期間にわたって、高用量もしくは低用量での皮下投与、又は、高用量もしくは低用量での筋肉内投与のどちらかにより週に１回（７日間隔）与えた。２頭のブタにおいて、試験物質を５週目において高用量又は低用量でゆっくりと静脈内投与した。ラテン方格設計に従うスケジュールが表３に示される。
【０１３７】
ブタを、皮下又は筋肉内のどちらかで投与される高用量又は低用量のＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆのどちらかにより処置した。処置の１時間前、ならびに、処置の２時間後、６時間後、２４時間後及び４８時間後に、血清及び全血球を集めて、血清サイトカインレベルと、循環する血液細胞におけるサイトカインのｍＲＮＡ発現とを調べた。処置を、表３に示されるように、動物を交替して４回繰り返した。処置間の間隔が７日であった。
【表３】
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【０１３８】
最後の試験製造物投与の２日後、ブタを安楽死させ、肉眼的病理の期間中における注入部位を調べた。注入部位の組織標本を組織学的検査のためにサンプル採取した。
【０１３９】
動物
ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、離乳後多臓器消耗症候群、マイコプラズマ・ハイオニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を有しない高健康状態ブタ群（ＶＯＦ  Ｇ．ｖ．Ｂｅｅｋ、Ｒｕｎｄｅｒｗｅｇ  １０、８２１９  Ｌｅｌｙｓｔａｄ）に由来するブタ。到着時の獣医学検査により、ブタは、肺炎、下痢、皮膚又は尾の炎症性変化、あるいは病気の他の徴候がないことが明らかにされた。
【０１４０】
服用計画、頻度及び継続期間
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを処置スケジュールに従って単回注射で投与した。筋肉内又は皮下投与のための高用量は２ｍｌの体積において２０５μｇであり、低用量は２０μｇであった。静脈内投与のための高用量は５ｍｌにおいて５０μｇであった。低用量は５ｍｌの体積において１０μｇである。
【０１４１】
観察
体温を、免疫モジュレーター投与前の−１日目、ならびに、投与後の６時間、２４時間及び４８時間において記録した。体重を、−７日目に手術に先立って、また、２３日目（４頭のブタ）又は３０日目（２頭のブタ）に剖検に先立ってそれぞれ記録した。
【０１４２】
分析方法
血液学：ＷＢＣ数、鑑別血球組成（リンパ球、単核細胞及び顆粒球）、赤血球数、ヘモグロブリン、ヘマトクリット、平均血球値を、標準的な実験室技術によって評価した。
【０１４３】
血清サイトカイン分析：下記のブタサイトカインをタンパク質アレイ技術（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｓｅａｒｃｈ  ｌｉｇｈｔ（登録商標））によって測定した：ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＦＮγ、ＴＮＦａ。Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔプロテオソームアッセイは、ウェルあたり最大１６個のタンパク質を測定する多重化アッセイである。ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔアレイが、異なるモノクローナル抗体を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルにスポットすることによって作製される。
【０１４４】
サイトカインｍＲＮＡ分析：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２の発現をｑＰＣＲ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって評価した。総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｒｅｄａ、オランダ）を製造者の説明書に従って使用して単離した。残りのＲＮＡを５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水に溶解し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＩＪｓｓｅｌｓｔｅｉｎ、オランダ）を使用して分光光度法により定量した。ｃＤＮＡ合成及びＱ−ＰＣＲ条件を標準的な実験室手順に従って行った。使用したプライマーに関する情報が表４に示される。微量のゲノムＤＮＡの増幅を減らすために、プライマーは異なるエクソンに位置させた。発現安定性及び対毎の変動を評価するための計算を、自由に入手できるＧｅＮｏｒｍプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｊｖｄｓｏｍｐ／ｇｅｎｏｒｍ）を用いて行った。
【０１４５】
すべてのサイトカインｍＲＮＡ発現をアクチンＢ（ＡＣＴＢ）の発現と比較した。すべてのサイトカインｍＲＮＡ発現を、サイトカインｍＲＮＡの量／ＡＣＴＢ  ｍＲＮＡの量を計算することによって相対的な量として表される。
【表４】
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【０１４６】
統計学分析
記述的分析を行った。サイトカインｍＲＮＡ発現の予備的な推測統計学分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ分析（時間；処理）を行うことによって行った。すべての統計学データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ、米国）を用いて分析した。
【０１４７】
結果
臨床反応が、試験物質の免疫モジュレーターを投与した後では何ら認められなかった。直腸体温が図２９に示される。体温はブタの正常な温度範囲の範囲内であった。１頭の動物（ｎｏ．７８４０）が、３回目の処置日において、発熱に近い温度への上昇を示し、しかし、この温度上昇は処置に関連していなかった。
【０１４８】
差が、試験期間中の体重増加に関してブタ間において何ら見られなかった（図３０Ａ及び図３０Ｂ）。
【０１４９】
血液学データが、図３１Ａ〜図３１Ｆ、図３２Ａ〜図３２Ｆ、及び図３３Ａ〜図３３Ｈに示される。一般に、血液学データは、処置の前後で、正常範囲にあることが見出された。際立ったことが、処置後における赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロブリン（ＨＢ）及びヘマトクリットの平均が低下していることであり、しかしながら、平均は生理学的範囲の範囲内にとどまっていた。平均赤血球体積（ＭＣＶ）、血小板、リンパ球、及び単核／顆粒球数はほぼ一定のままであった。
【０１５０】
血清サイトカインタンパク質アレイからのデータが（セクション１２から）表５に示される。平均の計算及びグラフ表示のために、「検出限界未満」のすべての値が０．２ｐｇ／ｍｌの最低検出可能レベルに変換された。特定のサイトカインが血清において一貫して検出されなかった。すなわち、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ及びＴＮＦがブタの２／３超において検出されず、これに対して、ＩＬ−２及びＩＬ−１２がブタの１／２において検出されただけであり、ＩＬ−６は、１つの例外（４回目の処置日でのブタ（ｎｏ．７８４０））を除いて、検出されなかった。これらの結果が、反復測定（高用量、低用量、筋肉内、皮下）に関しては図３４Ａ〜図３４Ｄ、図３５Ａ〜図３５Ｄ、図３６Ａ〜図３６Ｄ、図３７Ａ〜図３７Ｄ、ならびに図３８Ａ及び図３８Ｂに、静脈内投与後の単回測定に関しては図３９Ａ〜図３９Ｆ、図４０Ａ〜図４０Ｆ、及び図４１Ａ〜図４１Ｈにグラフにより示される。グラフには、試験物質を投与した後における種々のサイトカインの平均含有量、そして、また、サイトカイン含有量の変化率が示される。処置前の測定値と比較しての著しい変化が、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ及びＴＮＦについては何ら認められなかった。２倍を超える平均増加が、ＩＬ−１については、試験物質の免疫モジュレーターの高用量を筋肉内投与した後に認められ、ＩＬ−２については、試験物質の免疫モジュレーターの高用量による筋肉内処置及び皮下処置の後に認められた。
【０１５１】
表５：ブタサイトカインタンパク質アレイによって測定される処置の前後における血清サイトカイン含有量
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１５２】
血液細胞におけるサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２）のｍＲＮＡの相対的量が図４１〜図４８に示される。ベースライン値と比較しての最大３００％へのＩＬ−１の増大が、高用量及び低用量の筋肉内投与の後、ならびに、高用量の皮下投与の後において認められた。処置後の４８時間後には、ｍＲＮＡ含有量がベースライン値に戻り、（予備的な）二元配置ＡＮＯＶＡ分析（時間、処置）により、変動の原因としての時間についての傾向が明らかにされた（ｐ値、０．０７）。ＩＬ−２及びＩＬ−６の発現レベルに対する明確な影響が何ら認められなかった。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現レベルが２００％又は３００％に増大することが、筋肉内投与後のブタにおいては処置後６時間から始まってすべての処置群で認められ、皮下処置されたブタにおいては処置後２４時間で認められた。（予備的な）二元配置ＡＮＯＶＡ分析の結果から、時間が変動源として明らかにされた（ｐ＜０．０５）。一貫した所見が、ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現レベルにおける変化については何ら認められなかった。
【０１５３】
投与経路にかかわらず、高用量投与と低用量投与とを比較すると、より強い用量関連の影響が、ＩＬ−１及びＩＬ−１０の変化については存在すると思われる（図４７及び図４８）。
【０１５４】
試験物質の高用量又は低用量を静脈内投与した影響を１頭のブタにおいてそれぞれ調べた。その影響が図４９Ａ及び図４９Ｂに示される。
【０１５５】
クロスオーバー研究において、高用量及び低用量の筋肉内投与及び皮下投与の後における脂質−ＤＮＡ複合体（Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ）の影響を、血液細胞での種々のサイトカインのｍＲＮＡ発現における変化、血清サイトカイン含有量における変化、血液学的所見、臨床的徴候の出現、及び成績判定基準を調べることによって評価した。影響が、一連の異なるサイトカインについての血清サイトカイン含有量に対しては何ら見られなかったが、ＩＬ−１及びＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現の分析では、循環する血液細胞において、処置後における（用量依存的な）増大が明らかにされた。ＩＬ−１は、多数の異なる細胞タイプによって産生され、また、多数の異なる細胞タイプに作用する炎症促進性サイトカインである。炎症促進性メディエーターの機能は別にして、ＩＬ−１は強力なＴｈ２刺激因子である。ＩＬ−１０は、最も重要な抗炎症性サイトカインの１つであると考えられており、Ｔｈ１サイトカイン類の強力な阻害剤であり、また、単球／マクロファージの炎症促進性サイトカイン合成の不活性化剤として知られている。
【０１５６】
臨床的徴候が試験物質のどのような投与の後でも認められなかったので、処置は有害反応をもたらさなかった。また、ＷＢＣ又は分画血球算定に対する影響が何ら認められなかった。赤血球数、ヘモグロブリン及びヘマトクリットの記載された変化が試験物質自体又は試験物質の投与に関連づけられるかどうかは結論に達していないままである。だが、ストレス状況は、カテーテルを使用することによって処置段階の期間中においてできる限り排除された。
【０１５７】
［実施例１０］
免疫モジュレーター投与のタイミング
この研究の目的は、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを感染前に投与し、その後、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを投与することが、マンヘイミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）感染及びＢＲＤに対して効果的であるかを明らかにすることであった。
【０１５８】
Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを、４０頭の３ヶ月齢のホルスタイン去勢牛に、１０８ＣＦＵ／ｍＬのマンヘイミア・ヘモリチカの６０ｍＬによる接種の１日前及び１日後に投与した。剖検を抗原負荷の５日後に行った。
【０１５９】
結果は、処置を接種の１日前及び１日後に受ける去勢牛における肺病変の割合が、コントロールと比較しておよそ１０％少なかったことを示す（およそ１０％及び２７％、それぞれ）（図５０Ａ）。ＢＲＤに起因する死亡率が、コントロールと比較して、処置を受ける去勢牛では有意に低下した。コントロール去勢牛の２０％と比較して、処置された去勢牛の２．５％のみが、ＢＲＤに起因して死亡した（図５０Ｂ）。このことは、最初の処置をマンヘイミア・ヘモリチカ曝露の前に行い、２回目の曝露を曝露の１日後に行うことが、肺病変及び病気に対する保護効果を有することを示唆している。
【０１６０】
［実施例１１］
ＢＲＤと診断されたウシのための併用療法
この研究の目的は、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、抗生物質、及び、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ及び前記抗生物質を含む併用療法によるウシにおけるＢＲＤ処置の効力及び正味の復帰を比較することであった。
【０１６１】
研究対象母集団
ＢＲＤについて危険性が高いと考えられた、体重が平均して４００ポンド〜５００ポンドの間である２１２頭の離乳直後の雌牛を参加のために選択した。これらの雌牛を３つの処置群に分けた。診断後、第１の群（ｎ＝７８）は、皮下注射される５．７ｍｌ／ｃｗｔのＢａｙｔｒｉｌ（登録商標）１００（エンロフロキサシン）を受けた。Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）１００は、ＢＲＤの処置において使用される抗菌剤である。第２の群（ｎ＝７７）は、筋肉内送達される２ｍＬのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを受けた。第３群（ｎ＝５７）は、皮下送達される５．７ｍｌ／ｃｗｔのＢａｙｔｒｉｌ（登録商標）１００と、筋肉内送達される２ｍｌのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆとを受けた。診断後の３日間の猶予の後、これらの雌牛を診断後６０日まで観察した。
【０１６２】
３日間の猶予の後のどのようなときにおいても、子ウシが依然としてＢＲＤ診断の臨床要件を満たしたならば、この子ウシは研究から抜き出され、Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標）（ツラスロマイシン）が投与されるであろう。この子ウシがこの２回目の処置に応答しなかったならば、この子ウシは再び抜き出され、３度目はＢｉｏ−Ｍｙｃｉｎ（登録商標）２００（オキシテトラサイクリン）により処置されるであろう。３回の処置の後において、子ウシは慢性ＢＲＤを有すると見なされ、処置が中止されるであろう。
【０１６３】
結果
表６を参照して、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆと、Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）１００との組合せは、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ単独又はＢａｙｔｒｉｌ（登録商標）１００単独のどちらとも比較して、ＢＲＤ致死割合を有意に低下させた。併用療法を受ける雌牛についての平均体重増加もまた、比較用の単独治療群を有意に上回った。組合せ治療を受ける群と、Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）１００処置を単独で受ける群とは、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆのみを受ける群と比較して、子ウシがその後の処置のために引く抜かれる割合が低くなっていた。組合せ治療を受ける群はまた、それ以外の群と比較して、慢性ＢＲＤの割合が低くなっていた。この差は統計学的には有意でなかったにもかかわらず、併用療法群における子ウシの１８．９％のみが慢性ＢＲＤを発症し、その一方で、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを単独で受ける子ウシの３８．７％が慢性ＢＲＤを発症した。
【表８】
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【０１６４】
これらの結果は、本発明の免疫モジュレーターをＢＲＤに対して効果的な抗生物質と組み合わせることにより、群の健康状態が改善され得ることを示す。そのうえ、これらの改善は、１頭あたりおよそ１１０ドルの経済的利点を有すること、したがって、費用効果的な強固な併用療法を生産者に提供することが示された。
【０１６５】
［実施例１２］
ＢＲＤの中程度の危険性を有するウシのためのメタフィラキシス
この研究の目的は、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆが、ＢＲＤを肥育ウシにおいて抑制するために投与されたとき、市販の抗生物質（Ｍｉｃｏｔｉｌ）よりも劣っているかを明らかにすることであった。
【０１６６】
研究対象母集団
平均体重が５９０ポンドであり、ＢＲＤについて中程度の危険性があると明らかにされる離乳後の肉牛子ウシをこの研究のために選択した。診断時に、第１の群（ｎ＝１００２）には２ｍｌ／ｃｗｔのＭｉｃｏｔｉｌを投与し、第２の群（ｎ＝１００２）には２ｍｌのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを投与した。３日間の猶予を含めて、子ウシを５６日間にわたって観察した。
【０１６７】
結果
罹患率、死亡率、平均１日増量（ＡＤＧ）、乾物摂取量（ＤＭＩ）及び飼料対体重増加比を測定し、研究群の間で比較した。劣っていると見なされるためには、これら２つの群でのＢＲＤ罹患率における１０％の差が必要であった。Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを受ける群と、Ｍｉｃｏｔｉｌを受ける群との間でのＢＲＤ罹患率の累積発生率における差が、誤差の許容範囲が±１．３％未満によりおよそ約６％であった。表７を参照して、測定されたほぼすべての他の臨床パラメーターもまた、有意差がなかった。１つの例外が、ＢＲＤ処置までの時間が、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを受ける群では、Ｍｉｃｏｔｉｌを受ける群よりも有意に少なかったことであった。
【表９】
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【０１６８】
この研究では、免疫モジュレーターのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆは抗生物質のＭｉｃｏｔｉｌに劣っていないことが明らかにされたことが示される。抗生物質治療に対する耐性は、群れの健康状態に対する、また、畜産事業の持続可能性に対する潜在的な危険性であるので、効果的な非抗生物質抗菌剤治療は、生産者のための有益な選択肢の１つである。
【０１６９】
［実施例１３］
ＢＲＤと診断されたウシのための併用療法
この研究の目的は、ＢＲＤと診断されたウシにおける、Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標）、Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標）及びＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ、又はＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ単独の有効性を比較することであった。
【０１７０】
研究群
この研究のために、平均体重が６２５ポンドである離乳後の肉牛子ウシを３つの処置群に分けた。第１の群には、１．１ｍｌ／ｃｗｔのＤｒａｘｘｉｎ（登録商標）を診断時に皮下に投与した。第２の群には、１．１ｍｌ／ｃｗｔのＤｒａｘｘｉｎ（登録商標）を皮下に、２ｍｌのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを筋肉内に投与した。第３の群には、２ｍｌのＳｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆを筋肉内に投与した。３日間の猶予に続いて処置を行い、研究を診断後５６日で終了した。
【０１７１】
結果
表８を参照して、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆと、Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標）との組合せは、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ単独による処置と比較して、ＢＲＤ罹患率を有意に低下させた（２１．８％及び４５．８％、それぞれ）。この併用療法はまた、Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標）単独による処置と比較して、より低いＢＲＤ罹患率をもたらした（２１．８％及び２９．２％、それぞれ）。慢性ＢＲＤのウシの割合が、併用療法（２．９％）については、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ療法単独（８．９％）又はＤｒａｘｘｉｎ（登録商標）療法単独（４．０％）のどちらの場合よりも低かった。ＢＲＤに起因すると考えられる死亡もまた、Ｓｅｑ  Ｎｏ  ２−Ｆ単独による処置又はＤｒａｘｘｉｎ（登録商標）単独による処置と比較して、併用療法を受ける群では低下していた。
【０１７２】
併用療法にはまた、単独療法アプローチよりも大きい生産が伴っていた。併用療法では、Ｄｒａｘｘｉｎ（登録商標）のみの処置と比較して、およそ３４ドル／頭の経済的利点がもたらされたので、平均１日増加及び平均体重増加が併用療法についてはより大きかった。
【表１０】
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【０１７３】
本発明の要素又はその好ましい（１又は複数の）実施形態を導入するとき、“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”及び“ｓａｉｄ”の冠詞は、当該要素の１つ又は複数が存在することを意味することが意図される。用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）、用語“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”（含む、包含する）及び用語“ｈａｖｉｎｇ”（有する）は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外のさらなる要素が存在し得ることを意味する。
【０１７４】
上記を考慮して、本発明のいくつかの目的が達成され、他の好都合な結果が得られることが理解されるであろう。
【０１７５】
様々な変化が、本発明の範囲から逸脱することなく、上記の製造物、組成物及び方法において行うことが可能であるかもしれないので、上記の説明において含まれる、また、添付された図面において示されるすべての事項は、限定的な意味ではなく、例示であるとして解釈されなければならないことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３３Ｈ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４１Ｆ】
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【図４１Ｇ】
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【図４１Ｈ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４４Ｆ】
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【図４４Ｇ】
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【図４４Ｈ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４５Ｅ】
2018518511.tif 000128
【図４５Ｆ】
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【図４５Ｇ】
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【図４５Ｈ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４６Ｆ】
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【図４６Ｇ】
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【図４６Ｈ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４７Ｅ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４８Ｅ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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