(57)【要約】  本発明により、標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを有するコンジュゲートを提供する。部分Ｆは式（Ｉ）で示されるものであり、標的化部分Ｔは、腫瘍マーカーに対する親和性を有することを特徴とするもの、例えば、抗体または抗体断片である。コンジュゲートは、腫瘍診断法、例えば、切除手術中における腫瘍結節の光検出のために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを含む蛍光コンジュゲートであって、前記部分Ｆは、式（Ｉ）：
【化１】
2018525329.tif 000010
（式中
Ｙは独立して、各存在の場合でＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｍから選択され、ここで、Ｍは一価のカチオンであり；
ｘ、ｚおよびｙは独立して、１〜８の整数から選択される）
を有するものであり；
前記部分Ｔは腫瘍マーカーに対する親和性を有するものである、
蛍光コンジュゲート。
【請求項２】
Ｙが、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｎａから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
部分Ｆが、式（ＩＩ）：
【化２】
2018525329.tif 000011
を有するものである、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記腫瘍マーカーが腫瘍抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記腫瘍抗原が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
部分Ｔが、抗体、抗体断片、および抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質から選択され；前記抗体が任意選択で、キメラ型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記部分Ｔが、前記ＣＥＡ抗原の１つ以上のエピトープに結合するキメラ型モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
部分Ｆが式（ＩＩ）を有するものであり、前記キメラ型モノクローナル抗体がＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対して指向され、Ｇ１ｍ３アロタイプの重鎖とｋｍ３アロタイプの軽鎖を含むものであり、各重鎖および各軽鎖が少なくとも１つのマウスＩｇＧ１可変ドメインと少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものである、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記キメラ型モノクローナル抗体が配列番号：４の軽鎖の可変領域と配列番号：３の重鎖の可変部を含むものである、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記部分Ｔが非ペプチドリガンドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ｎ個の部分Ｆが１個の部分Ｔにカップリングされており、ｎが１〜４から選択される整数である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む組成物であって、任意選択で、
（ａ）滅菌されており、水性バッファーとＬ−アルギニンを含むものである、および／または
（ｂ）部分Ｆにカップリングされていない部分Ｔを含む化合物を含むものである、
組成物。
【請求項１３】
前記組成物中のコンジュゲートの平均コンジュゲーション度が約０．５〜３である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）式（ＩＩＩ）：
【化３】
2018525329.tif 000012
（式中、Ｙは独立して、各存在の場合で、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｍから選択され、ここで、Ｍは一価のカチオンであり；
ｘ、ｚおよびｙは独立して、１〜８の整数から選択され、
Ｚは、対イオン、水素、スクシンイミジル、スルホスクシンイミジルおよびニトロフェニルから選択される）
を有する蛍光色素を準備する工程、
（ｂ）腫瘍マーカーに対する親和性を有する標的化薬剤を準備する工程；ならびに
（ｃ）前記蛍光色素を前記標的化薬剤とカップリングさせる工程
を含む、蛍光コンジュゲートの調製方法。
【請求項１５】
Ｙが、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｎａから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的化薬剤が、ＣＥＡに対する親和性を有するキメラ型モノクローナル抗体である、および／または前記蛍光色素が、式（ＩＶ）：
【化４】
2018525329.tif 000013
の化合物である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料中の腫瘍細胞の検出のため、あるいは腫瘍の診断および／またはモニタリングのための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の組成物のインビトロ使用。
【請求項１８】
医薬または診断用薬剤としての使用のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
（ａ）腫瘍マーカーを発現している腫瘍巣の検出における使用のため、もしくは前記腫瘍マーカーを発現している腫瘍の位置を患者において調べるため、および／または
（ｂ）前記腫瘍マーカーを発現している腫瘍の切除手術を受けている、もしくは受けたばかりの患者の切除マージンにおける腫瘍細胞もしくは腫瘍組織の検出における使用のための
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記使用が
（ａ）前記コンジュゲートまたは組成物を腫瘍ができている患者に投与する工程；
（ｂ）前記患者に対して腫瘍切除手術を開始する工程；
（ｃ）前記切除手術を受けている前記患者の切除部位の組織に約６６０〜７００ｎｍの波長を有する光を照射する工程
を含むものであり、
工程（ｂ）が、工程（ａ）後、約９６時間以下の時間内に行なわれる、
請求項１８または１９に記載の使用のためのコンジュゲートまたは組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍が、結腸直腸、胃、胆管、膵臓、食道、卵巣、乳房、前立腺、肝臓または肺のがんである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲートまたは組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍が胃腸の悪性腫瘍であり、前記コンジュゲートが請求項８または９に記載のコンジュゲートである、請求項２１に記載の使用のためのコンジュゲートまたは組成物。
【請求項２３】
前記コンジュゲートまたは組成物が吸入によって、または静脈内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内への注射もしくは灌流によって局所投与される、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲートまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学研究の分野におけるものであり、特に、診断法に有用な、例えば、腫瘍のインビトロまたはインビボ診断に有用な化合物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
がんは、現在、世界中の全死亡数のおよそ１３％を占めている。数十年にわたるさかんな研究にもかかわらず、がんは依然として先進国における死因の第２位であり、死亡数のおよそ２５％を占めている。多くの型のがんでは、手術（多くの場合、化学療法、放射線処置または温熱療法との併用で）が治療の主流である。
【０００３】
がんはまた、悪性新生物または悪性腫瘍とも称される。新生物は、組織の異常増殖物である。新生物は、良性新生物（ｎｅｏｐｌａｍ）、前癌性または非浸潤新生物および悪性新生物に区別される。また、多くの（すべてではないが）新生物は腫瘍を形成しており、これは、非罹病組織とは解剖学的に区別され得る充実性または液が充満した病変部である。新生物と同様、腫瘍も良性、前癌性または悪性があり得る。しかしながら、一般的な文言ならびに本発明の説明において、用語「腫瘍」は「悪性腫瘍」と同義的に使用され得る。
【０００４】
がん患者の生命予後は、この疾患が最初に診断されたときのステージに依存する。胃腸のがんができている患者の２０〜３０パーセントは局所領域の再発が固有の再発として起こる。また、上皮性の卵巣腫瘍も、ステージＩＩＩに達している場合、局所領域の進展を示す。数年前に、患者の予後の改善には完全な外科的切除が非常に重要な要素であることが示された。この最大限の腫瘍細胞縮小ストラテジーは、場合によっては温熱療法を伴う全身性または腹腔内化学療法を含む治療プロトコルの一部である。
【０００５】
治癒手術の設定は患者の未来のための主要パラメータである。腫瘍結節全体およびその播種の検出は、術後の予後に影響を及ぼす主要なポイントである。腫瘍と正常組織の区別は常に容易であるとは限らない（特に、患者が術前補助処置を受けた場合）。外科医は、その際、自身の視覚と触覚および自身の経験のみに頼り；現在のところ、腫瘍の広がりの可視化を補助するために利用可能な手術中の手法はない。
【０００６】
がん切除手術はインサイチュ光検出の使用によって改善され得ると提案されている。光検出は、罹病状態かもしれない組織を、腫瘍に対する親和性を有し、選択された波長の光で光学的に可視化させることができる化合物に曝露することに依存するものである。
【０００７】
腫瘍の光検出は、最初に１９８０年代に、フォトフリンなどのヘマトポルフィリン誘導体の使用を伴って開発された。このような分子を用いた光診断の大きな制限は、癌性組織に対する低い選択性と、化学反応を起こして高度な光感作または壊死を誘発する能力である。この後者の制限は、実は、このような化合物が同様に提案された光線力学療法においては利点である。
【０００８】
Ｆｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．は、癌胎児性（ＣＥＡ）抗原に対する抗体とフルオレセインとのコンジュゲートを使用し、結腸直腸癌を有する患者の腫瘍を可視化した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐｐ．７９７３−７９７７，１９９２）。抗ＣＥＡ  ＭＡｂ  ３５Ａ７とインドシアニン（Ｃｙ５）のコンジュゲートを用いた結腸癌ＬＳ１７４Ｔの病変部の免疫学的光検出が、マウスモデルにおいてＧｕｔｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．によって実証された（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１１４２−１１４８，２００１）。
【０００９】
しかしながら、このようなコンジュゲートの臨床的有用性はかなり限定的である。抗体とフルオレセインとのコンジュゲートが有する励起および発光の波長はかなり短く、組織への浸透は少なく、色素成分を励起するために使用されるレーザー光によって誘導される非癌性組織による相当な度合の非特異的自己蛍光がもたらされる。Ｃｙ５コンジュゲートの毒性学は不明であり、文献においてまだ充分に確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐｐ．７９７３−７９７７，１９９２
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１１４２−１１４８，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、腫瘍の光検出のこれらおよび他の付随する問題および欠点に対処するものである。本発明の目的の１つは、悪性または前癌性の腫瘍の光検出に有用な改善されたコンジュゲートであって、臨床的に実用可能であり、先行技術の１つ以上の欠点を解消し、以下の特性：高度な腫瘍特異性、例えば非常に小さな腫瘍病変部の検出を可能にする高い感度、良好な臨床的忍容性、高い安定性、他の色素との干渉性がほとんどない、および良好な製造可能性のうちの１つ以上を有するコンジュゲートを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、かかるコンジュゲートを用いた、インビトロおよびインビボの両方における腫瘍診断の改善された方法を提供することである。インビボで使用する場合、かかる診断方法は、新規な処置、例えば改善された腫瘍切除方法の一部となり得る。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、かかるコンジュゲートの調製方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、以下の本発明の説明および本特許の特許請求の範囲に基づいて明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
簡単には、本発明により、標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを含む蛍光コンジュゲートであって、該部分Ｆは、本明細書において以下に規定する式（Ｉ）（式中、Ｙは各存在の場合で、独立して、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｍから選択され；Ｍは一価のカチオンであり；ｘ、ｚおよびｙは独立して、１〜８の整数から選択される）を有するものであり；該部分Ｔは腫瘍マーカーに対する親和性を有するものである、蛍光コンジュゲートを提供する。一実施形態では、蛍光色素部分Ｆは、以下に規定する式（ＩＩ）を有するものであり得る。
【００１６】
標的化部分Ｔが親和性を有する腫瘍マーカーは腫瘍抗原、例えば、特定の腫瘍細胞によって発現または過剰発現される抗原であり得る。かかる抗原の一例は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。標的化部分Ｔ自体は、非ペプチドリガンド、抗体、抗体断片、または抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質であり得る。一実施形態では、標的化部分Ｔは抗体、特に、キメラ型のヒト化またはヒトモノクローナル抗体である。
【００１７】
さらなる一態様では、本発明により、かかるコンジュゲートを任意選択でさらなる活性成分または不活性成分との組合せで含む組成物を提供する。例えば、該組成物は滅菌されており、不活性成分、例えば、注射用水、バッファー成分、１種類以上の安定剤、例えば、アミノ酸、凍結乾燥助剤、例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖、等張剤などを含むものであり得る。また、該組成物は、少量の非コンジュゲート型の形態の標的化部分Ｔも含むものであってもよい。
【００１８】
またさらなる一態様では、本発明により、該コンジュゲートの調製方法を提供する。該方法は、（ａ）以下に規定する式（ＩＩＩ）（式中、Ｙは各存在の場合で、独立して、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｍから選択され；ここで、Ｍは一価のカチオンであり、ｘ、ｚおよびｙは独立して、１〜８の整数から選択され、Ｚは、対イオン、水素、スクシンイミジル、スルホスクシンイミジルおよびニトロフェニルから選択される）を有する蛍光色素を準備する工程；（ｂ）腫瘍マーカーに対する親和性を有する標的化薬剤を準備する工程；ならびに（ｃ）該蛍光色素を該標的化薬剤とカップリングさせる工程を含むものである。一実施形態では、蛍光色素は、以下に規定する式（ＩＶ）を有するものである。
【００１９】
さらに、本発明により、コンジュゲートおよび該コンジュゲートを含む組成物の臨床使用および非臨床使用を提供する。インビトロ使用としては、試料中の腫瘍細胞（１つまたは複数）を検出するため、あるいはインビトロで腫瘍を診断および／またはモニタリングするための使用が挙げられる。臨床的には、該コンジュゲートおよび／または該コンジュゲートを含む組成物は、腫瘍マーカーを発現している腫瘍巣の検出のため、または腫瘍マーカーを発現している腫瘍の位置を患者において調べるために使用され得る。例えば、これらは、切除手術を受けている、または受けたばかりの患者の切除マージンにおける腫瘍細胞もしくは腫瘍組織の検出のために使用され得る。一実施形態では、該コンジュゲートを含む組成物は、標的化部分Ｔが親和性を有する腫瘍マーカーを発現している腫瘍を有する患者に、例えば、静脈内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内への注射もしくは灌流によって、または吸入によって、または局所投与によって（例えば、スプレー剤として）投与され；該患者に対する腫瘍切除手術が、その後、約７２時間以下の時間内に開始され、切除手術を受けている該患者の切除部位の組織に約６６０〜７００ｎｍの波長を有する光が照射される。このようにして、腫瘍の局在（人間の肉眼では通常は見えない非常に小さな結節または病変部の局在を含む）が可視化され、例えば、外科医が腫瘍組織を完全に切除すること、および／または切除の完全性を確認することがガイドされる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、２０μｇの実施例３の蛍光コンジュゲートの投与後、７００ｎｍで可視化した、ＬＳ−１７４Ｔ腹膜癌症マウスモデルの原位置の（Ａ列）および切除した（Ｂ列）腫瘍性微小結節の蛍光を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、３０μｇの蛍光コンジュゲートの投与後４８時間目に撮影した、ＣＥＡを過剰発現しているヒト結腸直腸がん（ＨＴ−２９）の皮下腫瘍マウスモデルの腫瘍の画像を示す（Ａ−実施例３の蛍光コンジュゲート；Ｂ−対照コンジュゲート）。列は、左から右に、白色光、蛍光（７００ｎｍで可視化）で撮影した画像およびオーバーレイの画像を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３０μｇの実施例３の蛍光コンジュゲートの投与後４８時間目に撮影した、ＣＥＡを過剰発現しているヒト結腸直腸がん（ＨＴ−２９）の同所性腫瘍マウスモデルの腫瘍の画像を示す（Ａ−切開前，Ｂ−切開後，Ｃ−腫瘍の曝露後）。列は、左から右に、白色光、蛍光（７００ｎｍで可視化）で撮影した画像およびオーバーレイの画像を示す。
【図３】図３は、５ｍｇの実施例３の蛍光コンジュゲートの投与後４８時間目に患者の原発性膵臓腫瘍の手術中に撮影された画像を示す（Ａは白色光下であり、Ｂは蛍光とのオーバーレイ画像である）。一点鎖線は、可視化と触診のみに基づいて提案される切除マージンを表し、一方で、実線は、蛍光可視化に基づいて提案される切除マージンを示す。点線は、蛍光によって示された腫瘍のおおよその外縁を表す。
【図４】図４は、５ｍｇの実施例３の蛍光コンジュゲートの投与後４８時間目の膵臓がん患者の腹膜転移の画像を示す。Ａ列の画像は手術中にインビボで取得したものであり、Ｂ列の画像は切除後、エキソビボのものである（左の列は白色光下、右の列はオーバーレイ画像としての蛍光である）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
第１の態様において、本発明により、標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを含む蛍光コンジュゲートであって、該部分Ｆは、式（Ｉ）：
【化１】
2018525329.tif 000002
（式中、Ｙは独立して、各存在の場合で、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｍから選択され；Ｍは一価のカチオンであり；ｘ、ｚおよびｙは独立して、１〜８の整数から選択される）
を有するものであり；該部分Ｔは腫瘍マーカーに対する親和性を有するものである、蛍光コンジュゲートを提供する。
【００２２】
一価のカチオンの例としては、限定されないが、Ｎａ、Ｋまたはアンモニウムが挙げられる。好ましい実施形態のうちの１つでは、Ｙが、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｎａから選択される。
【００２３】
本発明の蛍光コンジュゲートの蛍光色素部分Ｆ（これは、蛍光性の色素もしくは標識またはフルオロフォア部分とも称され得る）は、好ましくは紫外、可視スペクトルまたは赤外の波長範囲の電磁エネルギーを吸収して、一般的にはより長波長範囲、好ましくは可視または近赤外範囲の発光をもたらすものである。本明細書において理解されるように、励起波長（単位：ｎｍで表示）という用語は、蛍光色素または標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分を含む蛍光コンジュゲートのピーク、すなわち最大または特定の吸光波長をいう。発光波長（単位：ｎｍで表示）という用語は、蛍光色素または本発明の標的化部分にカップリングされた蛍光色素部分を含む蛍光コンジュゲートのピーク、すなわち最大または特定の発光波長をいう。
【００２４】
蛍光色素部分Ｆは、上記の式（Ｉ）のシアニン誘導体であり、好ましくは６５０〜７５０ｎｍのピーク発光波長範囲を有する遠可視（ｆａｒ  ｖｉｓｉｂｌｅ）または近赤外（ＮＩＲ）スペクトルの発光をもたらすものである。標的化部分Ｔにカップリングさせると、得られるコンジュゲートもまた、好ましくは６５０〜７５０ｎｍのピーク発光範囲の発光をもたらす。
【００２５】
本発明者らは、このような蛍光色素部分が特に好都合な蛍光特性、例えば、消光、量子収率および特に、光退色に対する堅牢性を有しており、抗原に対して活性な標的化部分とのコンジュゲーションにおいて、高い信頼性で使用することが可能であることを見出した。
【００２６】
Ｙに関して、当業者には、コンジュゲートの化学的環境に応じてＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−、ＳＯ３Ｍおよび／またはＳＯ３Ｎａ基はまた、互いに動的に変換されるものであってもよいことが認識されよう。例えば、水性媒体に溶解させた場合、ｐＨおよび他のカチオンの利用可能性に応じて、Ｙで表されるＳＯ３−、ＳＯ３Ｍおよび／またはＳＯ３Ｎａから選択される基はまた、プロトン化されてＳＯ３Ｈの状態になってもよく、別の塩形態に、例えば、ＳＯ３ＮａからＳＯ３Ｋ（またはその逆）に変換されてもよい。したがって、本発明は、式（Ｉ）の化合物のかかる択一的な形態を包含している。
【００２７】
特に好ましいコンジュゲートは、式（ＩＩ）：
【化２】
2018525329.tif 000003
の蛍光色素部分Ｆを含むものである。
【００２８】
蛍光コンジュゲートにおいて、蛍光色素部分Ｆは標的化部分Ｔにカップリングされており；好ましくは、これは標的化部分Ｔに共有結合されている、すなわち、共有結合、例えばアミド結合またはエステル結合によってコンジュゲートされている。
【００２９】
式（Ｉ）の状況において記載のように、式（ＩＩ）も同様に、Ｙで表される基に関して、例えばコンジュゲートを溶解させ得る水性媒体の組成および／またはｐＨ値に応じて、化学平衡下においてインサイチュで生成するＳＯ３ＨまたはＳＯ３Ｋなどの択一的なスルホン酸形態も包含しているなどと解釈されたい。さらに、式（ＩＩ）の４つのスルホン酸基の各々は、Ｎａ塩の形態であっても分子内塩の形態であってもよいこと、および図示した式（ＩＩ）は、該化合物を表す種々の可能性の一例を表しているにすぎないことは理解されよう。
【００３０】
蛍光コンジュゲートの標的化部分Ｔは、腫瘍マーカーに対する親和性を有するものであり、腫瘍マーカーと結合または会合し得るものである。腫瘍マーカーは、腫瘍によって生成されるか、もしくは腫瘍内に存在しているか、または腫瘍の存在に応答して患者の正常な細胞機構によって生成される生成物または分子であると理解されたい。本明細書で用いる場合、具体的な状況から違う意味が明白でない限り、腫瘍は新生物を意味し、これは、異常または制御不能な細胞増殖により生じた一群の細胞もしくは組織または細胞もしくは組織の塊である。特に、腫瘍マーカーは、癌性または悪性である腫瘍によって生成されるものである。
【００３１】
腫瘍マーカーは、例えば、タンパク質、糖タンパク質、受容体、ホルモン、酵素、抗原または癌遺伝子もしくはその産物の形態であり得る。腫瘍マーカーは、正常細胞と比べて腫瘍細胞によって過剰発現されるものであってもよく、腫瘍細胞によって固有に産生される腫瘍特異的物質であってもよい。標的化部分Ｔによって標的化または指向され得る特に好ましい腫瘍マーカーは、腫瘍細胞表面上に提示される細胞表面タンパク質もしくは受容体であるもの、および／または上皮細胞内あるいは充実性腫瘍（例えば、癌もしくは肉腫）内において特に発現されているものである。
【００３２】
本発明の好ましい一実施形態では、腫瘍マーカーは腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、腫瘍細胞に特異的であるか、または腫瘍細胞と関連している（例えば、腫瘍細胞において過剰発現されている）分子または生成物であって、免疫機構の反応、例えば、抗体の産生ならびにＴ細胞および／またはＢ細胞の応答を誘発または刺激し得るものである。腫瘍抗原はタンパク質または脂質であってもよく、これらを含むものであってもよい。これは、グリコシル化されていてもよく（例えば、糖タンパク質）、１つ以上のエピトープ（すなわち、抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞が好ましくは結合し得るか、または特定の親和性を有する対象である領域またはドメイン）を有するものであってもよい。
【００３３】
例示的な腫瘍抗原としては、腫瘍ウイルスのタンパク質に由来するか、もしくは該タンパク質から生成される腫瘍抗原、胎児の発育中にのみ、通常、高レベルで生成される腫瘍胎児抗原、正常細胞と比べて腫瘍細胞によって過剰発現もしくは蓄積される抗原、または変異型であるか、もしくは翻訳後に改変された抗原が挙げられる。好ましくは、腫瘍マーカーは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）およびヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ２）から選択される腫瘍抗原である。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態では、腫瘍抗原は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。ＣＥＡは、１８０〜２００ｋＤａの分子量を有し、上皮細胞において発現される腫瘍胎児糖タンパク質である。ＣＥＡは、特に、結腸および直腸の悪性腫瘍（結腸直腸がんの９５％で過剰発現されている）ならびに胃、小腸、膵臓、肝臓、乳房、卵巣、子宮頚部、膀胱、胆嚢および肺の悪性腫瘍の細胞表面上に高レベルで発現される。ＣＥＡは典型的には局在しておらず、細胞表面全体ならびに腺内小腺腔および細胞内小腺腔に発現され得る。ＣＥＡ抗原は、ＧＯＬＤ−１〜ＧＯＬＤ−５（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９（４９）４８５２−４８５８）に定義）に分類される５つの主要エピトープを含み、これらに対して抗ＣＥＡ抗体もしくは抗体断片または融合タンパク質が結合特異性を有し得る。
【００３５】
好ましい実施形態のうちの１つでは、本発明の蛍光コンジュゲートの標的化部分Ｔは、結腸、直腸、胃、小腸、膵臓、肝臓、乳房、卵巣、子宮頚部、膀胱、胆嚢、肺および食道から選択される患者の１つ以上の組織または器官に存在し得るＣＥＡ抗原発現腫瘍を標的化してこれに結合するものである。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、蛍光コンジュゲートの標的化部分Ｔは、受容体である腫瘍マーカーに結合し得るものである。該受容体は、腫瘍細胞に特異的であってもよく、腫瘍細胞において過剰発現されており、高レベルで存在しているものであってもよい。標的化部分Ｔは、かかる受容体に対するリガンドとしての機能を果たすものであり得、非ペプチド小分子、すなわち、アミノ酸配列が全く組み込まれていない、もしくは含まれていない化学的実体または化合物であり得る。
【００３７】
好ましい一実施形態では、本発明の蛍光コンジュゲートは、式（Ｉ）または（ＩＩ）の蛍光色素と、非ペプチドリガンド、抗体、抗体断片および抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質から選択される標的化部分Ｔとを含むものである。好ましくは、いずれか１つのかかる標的化部分は、腫瘍抗原、例えば、ＣＥＡ、ＨＥＲ２またはＥＧＦＲに特異的に結合し得るものである。具体的な一実施形態では、蛍光コンジュゲートは、式（Ｉ）または（ＩＩ）の蛍光色素と、非ペプチドリガンド、抗体、抗体断片および抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質から選択される標的化部分Ｔとを含み、該標的化部分がＣＥＡに特異的に結合するものである。
【００３８】
特定の一実施形態では、標的化部分Ｔが抗体もしくは抗体断片または抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質である。この場合、抗体、抗体断片または融合タンパク質の抗体の少なくとも１つの可変領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭ免疫グロブリンのアイソタイプまたはクラスのいずれかに由来するもの、またはこれらに属するものであり得る。完全長の抗体は典型的には、Ｆｃ（結晶性断片）ドメインとＦａｂ（抗原結合断片）ドメインを含むＹ形状の糖タンパク質である。これは、ジスルフィド結合によって相互に連結された１対の重鎖（Ｈ）と軽鎖（Ｌ）のポリペプチド構造で構築されており、Ｙ形状の構造を形成している。各鎖は可変領域（Ｖ）と定常領域（Ｃ）を含むものである。重鎖は、可変鎖領域（ＶＨ）と種々の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２などと略記される）を含むものであり；一方、軽鎖は、可変鎖領域（ＶＬ）と定常領域（ＣＬ）のみを含むものである。可変領域は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の認識と結合特異性に関与しており、抗原結合Ｆａｂドメインを形成している。
【００３９】
抗体断片は、特異的に抗原と相互作用および結合し得る抗体の任意の領域、鎖もしくはドメインまたはその任意の構築物、安定化形態もしくはコンジュゲートをいう。例示的な抗体断片としては、抗原結合ドメインの断片（ＦａｂまたはＦａｂ’）、Ｆａｂ構築物、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、ＶＨＨ、ミニボディ、ダイアボディなどが挙げられる。融合タンパク質は、別の生物活性タンパク質またはポリペプチドと融合させた抗体断片を含む構築物をいう。
【００４０】
好ましい一実施形態では、本発明の蛍光コンジュゲートの標的化部分Ｔはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。これは、当該技術分野で知られた方法によって作製され得る。キメラ型モノクローナル抗体が特に好ましい。これは、１種類より多くの種に由来する、例えば、ヒト抗体とマウス抗体に由来する重鎖または軽鎖のドメインまたは領域を含むものであるハイブリッドモノクローナル抗体である。任意選択で、蛍光コンジュゲートの標的化部分Ｔは、ヒト化抗体（一般的には、大部分が少なくとも８５〜９５％のヒト由来配列を含むもの）またはヒト生殖細胞系の抗体配列のみに由来するヒト抗体であり得る。
【００４１】
好ましくは、いずれか１つのかかる標的化部分Ｔは、腫瘍抗原ＣＥＡに特異的に結合し得るものである。
【００４２】
一実施形態では、式（Ｉ）の蛍光色素部分Ｆを含むものである蛍光コンジュゲートの標的化部分Ｔは、ＣＥＡ抗原のエピトープの１つ以上、例えば、ＧＯＬＤ−１、ＧＯＬＤ−２、ＧＯＬＤ−３、ＧＯＬＤ−４またはＧＯＬＤ−５エピトープに対する結合特異性を有するキメラ型モノクローナル抗体である。特定の一実施形態では、標的化部分Ｔは、ＧＯＬＤ−２エピトープに対する親和性および／または特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｔｙ）を有するものである。さらなる一実施形態では、かかるコンジュゲートの蛍光色素部分Ｆは上記の式（ＩＩ）のものである。
【００４３】
特に好ましい一実施形態では、本発明により、標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを含む蛍光コンジュゲートであって、該部分Ｆが式（ＩＩ）を有するものであり、部分Ｔが、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対して指向され、Ｇ１ｍ３アロタイプの重鎖とｋｍ３アロタイプの軽鎖を含むものであり、各重鎖および各軽鎖が少なくとも１つのマウスＩｇＧ１可変ドメインと少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものであるキメラｍＡｂである蛍光コンジュゲートを提供する。このキメラ型モノクローナル抗体は、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対する結合特異性（当該技術分野で知られた競合的結合／阻害試験によって測定される）を有するものである。
【００４４】
特に、該蛍光コンジュゲートは、発現されたＣＥＡに対して指向され、以下のヌクレオチド配列から調製されるキメラｍＡｂにカップリングされ得る：
（Ａ）重鎖（配列番号：１）：
GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAG GGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGC TCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGG ATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC GTGACAGTGTCATCTGCTAGC
（Ｂ）軽鎖（配列番号：２）：
GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG
【００４５】
上記の重鎖の可変部のヌクレオチド配列（Ａ）は、５’末端および３’末端に、それぞれ、ＫｐｎＩ制限部位およびＮｈｅＩ制限部位の配列を含む。軽鎖の可変部のヌクレオチド配列（Ｂ）は、配列の５’末端および３’末端に、それぞれ、ＳａｌＩ制限部位およびＢＳｉＷＩ制限部位の配列を含む。
【００４６】
このｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列は以下の配列に対応する：
（Ａ）重鎖（配列番号：３）：
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His Trp
Ile Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser
Thr Ile Tyr Phe Ala Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
Ala Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
Val Thr Val Ser Ser
（Ｂ）軽鎖（配列番号：４）：
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val
Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala Val Ala Trp
Tyr Gln Gin Thr Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Tyr
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He
Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態では、該蛍光コンジュゲートは、標的化部分Ｔにカップリングされた式（ＩＩ）を有する部分Ｆを含むものであり、該Ｔが、ＣＥＡに対して指向される配列番号：４の軽鎖の可変領域と配列番号：３の重鎖の可変部を含むキメラｍＡｂであるものであり得る。
【００４８】
本発明の蛍光コンジュゲートは、１個の標的化部分Ｔにコンジュゲートされた１個より多くの蛍光性部分Ｆ、例えば、１個の標的化部分Ｔに対して１〜約１０個の部分Ｆを含むものであってもよい。好ましくは、１個の標的化部分Ｔにカップリングされている蛍光色素部分Ｆの数は１〜４から選択される。換言すると、かかる好ましいコンジュゲートの１個の分子内ではｎ個の部分Ｆが１個の部分Ｔにカップリングされており、ｎが１〜４から選択される整数である。
【００４９】
個々のコンジュゲート分子は、整数であるｎを特徴とするものであるが、複数のコンジュゲート分子を含む化合物が、整数でなくてもよいが好ましくは約１〜約４の範囲の任意の値であるコンジュゲーション度または部分Ｔ１つあたりの部分Ｆの平均個数を有していてもよい。
【００５０】
これとの関連において、標的化部分Ｔは好ましくは、抗体、抗体断片および抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質から選択され、式（Ｉ）の１〜４個の蛍光色素部分Ｆがこれにコンジュゲートされる。本発明の一実施形態では、標的化部分Ｔは、式（ＩＩ）のｎ個の蛍光色素部分Ｆにカップリングされたキメラ型の抗ＣＥＡモノクローナル抗体であり、ここでｎは１〜４の範囲である。
【００５１】
本発明のさらなる一態様は、上記の蛍光コンジュゲートを含む組成物を包含している。
【００５２】
一実施形態では、該組成物は、単に、または主にコンジュゲーション度が異なる種々の蛍光コンジュゲートの混合物を含むものである。別の具体的な実施形態では、該組成物は少なくとも３つまたは４つのコンジュゲートの混合物を含むものであり、該コンジュゲートはすべて、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対する親和性を有するキメラｍＡｂにカップリングされた式（ＩＩ）を有する蛍光色素部分Ｆを含むものであり、該少なくとも３つまたは４つのコンジュゲートは、１個の標的化部分Ｔにカップリングされている蛍光色素部分Ｆの数がそれぞれ１、２および３であるか；またはそれぞれ１、２、３および４であるという点で互いに異なっている。
【００５３】
該組成物は、さらに、非コンジュゲート型の形態の標的化部分Ｔ（または理論的には、置換度がゼロのコンジュゲート）である化合物を含むものであってもよい。例えば、先に記載の実施形態との組合せで、かかる組成物は、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対する親和性を有する非コンジュゲート型のキメラｍＡｂを、それぞれ式（ＩＩ）による１、２、３個、任意選択で４個以上の蛍光色素部分Ｆとカップリングされた同じｍＡｂの該少なくとも３つまたは４つのコンジュゲートとともに含むものである。この混合物のコンジュゲート集団は当該技術分野で知られた方法によって、例えば質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって測定され得る。
【００５４】
組成物中のコンジュゲートの平均コンジュゲーション度は好ましくは約０．５〜約３である。コンジュゲーション度は抗体に対する蛍光色素のモル比であり、これは分光測光により求めることができる。したがって、数値は、組成物中に存在しているコンジュゲートと任意の非コンジュゲート型の抗体の平均コンジュゲーション度を反映していると理解されたい。別の実施形態では、平均置換度は約１〜約２である。本発明者らは、置換度が高い方が可視化の改善がもたらされ得るが、腫瘍マーカーに対する標的化部分の親和性は、コンジュゲートされている蛍光色素部分の数の増加に伴って低下することを見出した。約０．５〜約３の置換度が、特に、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対する親和性を有するキメラｍＡｂと式（ＩＩ）による蛍光色素とのコンジュゲートを含む組成物で、手術中、ＣＥＡを発現している腫瘍の小さな結節であっても優れた可視化が可能であるため最良に奏功すると判断された。
【００５５】
本発明の組成物には、さらに、賦形剤、例えば、バッファー、安定剤、凍結防止剤および等張剤、ｐＨ調整剤が含められ得る。特に好ましい賦形剤は、塩基性アミノ酸、例えばＬ−アルギニンおよびその塩、塩、例えばクエン酸塩、ナトリウムもしくはカリウムのリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、例えばトレハロース、マンニトール、マルトース、スクロースもしくはデキストラン、または非イオン界面活性剤、例えばポリソルベートもしくはポロキサマーである。該組成物のｐＨは好ましくは５．２〜７．２である。好ましくは、該組成物は、当該技術分野で知られた滅菌条件下で調製され、滅菌される。
【００５６】
特定の一実施形態では、上記に規定した任意の蛍光コンジュゲートを含む組成物は滅菌されており、さらに水性バッファーとＬ−アルギニンを含むもの、および／または部分Ｆにカップリングされていない部分Ｔを含む化合物を含むものである。さらなる一実施形態では、上記に規定した任意の蛍光コンジュゲートを含む組成物は滅菌されており、約６．０のｐＨに調整された水性バッファー、Ｌ−アルギニン塩酸塩およびポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０を含むものである。また、このような組成物に糖、例えばトレハロース、マンニトール、マルトースまたはスクロースも任意選択で含めてもよい。
【００５７】
別の特定の実施形態では、組成物中の蛍光コンジュゲートの濃度は、標的化部分、例えば抗ＣＥＡ  ｍＡｂの含有量（当該技術分野で知られた分光測光法またはＨＰＬＣ法によって測定）に対して１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００５８】
本発明のまたさらなる一態様により、
（ａ）式（ＩＩＩ）：
【化３】
2018525329.tif 000004
（式中、Ｙは独立して、各存在の場合で、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｍから選択され、ここで、Ｍは一価のカチオンであり；ｘ、ｚおよびｙは独立して、１〜８の整数から選択され、Ｚは、対イオン、水素、スクシンイミジル、スルホスクシンイミジルおよびニトロフェニルから選択される）
を有する蛍光色素を準備する工程；（ｂ）腫瘍マーカーに対する親和性を有する標的化薬剤を準備する工程；ならびに（ｃ）該蛍光色素を該標的化薬剤とカップリングさせる工程を含む、蛍光コンジュゲートの調製方法を提供する。
【００５９】
一価のカチオンの例としては、限定されないが、Ｎａ、Ｋまたはアンモニウムが挙げられる。好ましい実施形態のうちの１つでは、Ｙが、ＳＯ３−およびＳＯ３Ｎａから選択される。
【００６０】
標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを含むものであり、該部分Ｆが式（Ｉ）を有するものであり、該標的化部分Ｔが腫瘍マーカーに対する親和性を有するものである本発明の蛍光コンジュゲートは、かかる調製方法によって得られ得るものであり得る。
【００６１】
先のいずれかの段落のコンジュゲート自体の状況において記載した標的化部分Ｔおよび蛍光色素部分Ｆに関するものと同じ任意選択例および優先例が、該方法において使用される標的化薬剤および蛍光色素にも適用される。したがって、標的化薬剤は好ましくは、該コンジュゲートの標的化部分Ｔを含む化合物であり、該方法に使用される蛍光色素は好ましくは、該コンジュゲートの蛍光色素部分Ｆを含む、または該部分Ｆをもたらす化合物である。標的化薬剤は好ましくは、腫瘍抗原、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する親和性を有するものである。ＣＥＡに対する親和性は、その既知のエピトープのいずれか１つ、例えばＧＯＬＤ−２エピトープに対するものであり得る。特に好ましい一実施形態では、標的化薬剤は、ＣＥＡに対する親和性を有するキメラ型モノクローナル抗体である。
【００６２】
ＣＥＡに対する親和性を有するキメラ型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、該キメラｍＡｂをコードしている発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞による発現によって作製され得る。好ましくは、発現ベクターは、ヒト抗体の定常ドメインとマウスの抗ＣＥＡ抗体の可変ドメイン、好ましくは上記の配列を有する可変ドメインとをコードしているヌクレオチド配列を含むものである。
【００６３】
該コンジュゲートの調製に有用な蛍光色素は、ＵＳ８，０３４，６２６に記載の図Ｉａの反応スキームおよび方法と同様に調製され得る。例えば、蛍光色素は、必要なスルホネート置換部と（アルキル）オキシ置換部を含む２つのインドレニン誘導体の縮合により合成され得、ここで、一方のインドレニン誘導体はアセトアニリド（ａｃｅｔａｎｉｌｏｄｏ）誘導体の形態である。一実施形態では、インドレニン中間体は、アミノ芳香族前駆物質から、ジアゾ化（ｄｉａｚｏｔａｔｉｏｎ）／還元の工程後、スルホン化、ヒドロキシル化、ケトンを用いたフィッシャー環化によりインドレニンにする、ヒドロキシル置換基のカルボキシル（ｃａｒｂｏｘｙｌｙ）アルキル化およびスルトンでの４級化の工程によって調製され得る。
【００６４】
別の実施形態では、蛍光色素が、式（ＩＶ）：
【化４】
2018525329.tif 000005
の化合物である。
【００６５】
本発明の蛍光色素は、標的化部分Ｔとのコンジュゲーションのために、好ましくは活性エステル（例えば、スクシンイミジルエステル）として活性化され得る。一実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の蛍光色素は標的化部分Ｔにアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合またはカルバメート結合によって、当該技術分野で知られた共有結合性カップリング法を用いてカップリングされる。本発明の別の実施形態では、標的化部分Ｔが抗体、抗体断片またはペプチド配列である場合、蛍光色素は好ましくは、標的化部分Ｔの遊離アミノ基によってアミド結合によってコンジュゲートされる。
【００６６】
本発明の別の態様により、腫瘍マーカーに対する親和性を有する標的化部分Ｔにカップリングされた蛍光色素部分Ｆを含むものであり、該部分Ｆが式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）を有するものである蛍光コンジュゲートのインビトロ使用、または試料中の腫瘍細胞の検出のため、あるいは腫瘍の診断および／またはモニタリングのための前記蛍光コンジュゲートを含む組成物のインビトロ使用を提供する。
【００６７】
特に、該蛍光コンジュゲートは、腫瘍抗原、例えばＣＥＡを発現している腫瘍細胞および腫瘍の検出のために使用され得る。かかる場合において、標的化部分Ｔは好ましくは、非ペプチドリガンド、抗体、抗体断片および抗体の少なくとも１つの可変領域を含む融合タンパク質、例えば、先に記載の任意の優先例および任意選択例に規定したものから選択される。該蛍光コンジュゲートは、腫瘍細胞の検出のために使用してもよく、患者から採取した体液、例えば血清または組織生検材料由来の試料のインビトロ試験によってがん状態を診断するため、または診断を補助するために使用してもよい。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸、直腸、胃、腸、胆管、膵臓、食道、卵巣、乳房、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、肝臓または肺から採取された、またはこれらに由来する組織の充実性腫瘍である。さらに、該蛍光コンジュゲートは、例えば、切除手術および／または化学療法処置後、任意の残留腫瘍細胞または腫瘍組織についての評価のために、腫瘍の存在または進行についてモニタリングするのに有用であり得る。
【００６８】
さらなる一態様では、本発明により、医薬としての本明細書に記載のコンジュゲートおよび／または該コンジュゲートを含む組成物の使用を提供する。本明細書で用いる場合、医薬は、なんらかの医学目的で、例えば、ヒト被験体または動物の疾患または病状の診断または処置（予防的処置を含む）のために投与される物質または生成物を意味する。特に、本発明により、診断用の医薬または薬剤としての本明細書に記載のコンジュゲートおよび／または該コンジュゲートを含む組成物の使用を提供する。該使用は、該コンジュゲートまたは該組成物を、それを必要とする被験体に単回投与または反復投与することを含むものである。一実施形態では、該コンジュゲートまたは組成物を必要とする被験体は、がんが発生しているか、またはがんが発生するリスクのある被験体である。
【００６９】
本発明により、さらに、腫瘍マーカーを発現している腫瘍巣の検出における、または腫瘍マーカーを発現している腫瘍の位置を患者において調べるための該蛍光コンジュゲートおよび／またはその組成物の使用を提供する。該使用は、疾患の進行、例えば、再発、転移または播種を特徴とするがんを患っている患者において特に好都合であり得る。かかるがんの進行は、腫瘍の細胞塊または組織塊のより広範な分布をもたらし得る。特に、該蛍光コンジュゲートまたは該組成物は、病巣の検出のため、または腫瘍マーカーもしくは腫瘍抗原、すなわち、部分Ｔが親和性を有する対象であり、好ましくは細胞表面上に腫瘍マーカーを発現している腫瘍の位置を調べるために使用され得る。本明細書において理解されるように、病巣という用語は、腫瘍または腫瘍に進展するかもしれない病変部を画定しており、周囲の正常組織から識別される細胞または組織の群または集団を意味する。
【００７０】
好ましい一実施形態では、腫瘍はＣＥＡを発現しているものである。別の好ましい実施形態では、患者は結腸直腸がんまたは胃腸のがんを有する患者である。かかるがんの進行状態の症状発現では、患者は腹膜癌症を有している場合があり得、このとき、腹腔の内膜に癌性腫瘍の広範な転移が起こっている。本発明の特定の一実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の蛍光色素部分とキメラ型モノクローナル抗体である標的化部分Ｔとを含む蛍光コンジュゲートは、ＣＥＡを発現している腫瘍巣の検出のため、またはＣＥＡを発現している腫瘍の位置を患者において調べるために使用される。
【００７１】
腫瘍組織の外科的切除中、外科医は、腫瘍組織と正常組織を区別するのに外観と触診に頼る。外科的切除は、患者の組織、構造部または器官に存在している腫瘍組織の完全または部分的のいずれかでの外科的除去である。癌性および悪性の腫瘍組織はしばしば、小さな（例えば、ミリメートル未満のサイズの）結節または病変部で存在している場合があり得、これは肉眼では見えない。完全な腫瘍切除は多くの場合、患者の予後に極めて重要であり、そのため、外科医が悪性腫瘍組織を正しく特定し、その境界およびマージンを健常組織のものと識別して前記腫瘍組織を切除できるとともに、患者の腫瘍の外科的除去および／または腫瘍細胞縮小外科処置中に健常組織または構造部に対する不要な除去または損傷を回避できることは重要である。
【００７２】
上記の蛍光コンジュゲートおよび／またはかかるコンジュゲートを含む組成物は、腫瘍マーカーを発現している腫瘍の切除手術を受けている、もしくは受けたばかりの患者における切除マージンの腫瘍細胞または腫瘍組織の検出に特に有用であることがわかった。本明細書において理解されるように、切除マージンという用語は、腫瘍組織の周囲の組織のマージンまたは周縁部をいう。切除された腫瘍の周囲の組織のマージンは、通常、すべての悪性腫瘍組織の充分な除去を確実にするために腫瘍とともに切除された非癌性組織であるが、上記のように、マージンの範囲および／または腫瘍と正常組織の範囲を決定することは困難であり得る。また、任意選択で、切除マージンは、意図された切除マージンでもあると理解してよく、これは、本発明の方法の使用に基づいて決定または加減され得る。
【００７３】
切除マージンまたはその付近の腫瘍細胞または腫瘍組織を、腫瘍マーカー（好ましくは、該腫瘍マーカーは腫瘍抗原である）を発現している腫瘍の切除手術を受けている、または受けたばかりの患者において、本発明の蛍光コンジュゲートまたはその組成物を用いて検出する方法は、手術（例えば、腫瘍細胞縮小手術）中および術後に、すべての腫瘍組織が除去されること、およびクリーン（または陰性）マージン、すなわち腫瘍細胞が検出されないマージンが得られ得ることが確実になるように外科医を補助するのに有用である。好ましい一実施形態では、切除手術は、ＣＥＡを発現または過剰発現している腫瘍のものである。
【００７４】
先のいずれかの段落に記載した本発明の蛍光コンジュゲートまたは組成物は、腫瘍細胞または腫瘍組織の検出、例えば腫瘍巣の検出および／またはその位置（１つもしくは複数）の決定とともに患者の外科的切除中または切除後での患者の腫瘍の切除マージンの決定のために使用され得、ここで、患者は結腸直腸、胃、胆管、膵臓、食道、卵巣、乳房、前立腺、肝臓または肺のがんを有する患者である。検出または位置特定の対象の腫瘍細胞または腫瘍組織は、ＣＥＡを発現している癌または肉腫の形態であり得る。好ましくは、該蛍光コンジュゲートは、例えば、腹膜癌症に苦しんでいる患者において、ミリメートル未満のサイズ範囲の腫瘍の結節または病変部の検出のために使用される。
【００７５】
腫瘍細胞もしくは腫瘍組織を検出もしくは位置特定するため、または切除手術中もしくは術後に腫瘍の切除マージンを検出するための本発明の蛍光コンジュゲートまたは組成物の使用の特定の一実施形態では、腫瘍が胃腸の悪性腫瘍であり、蛍光コンジュゲートが、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対して指向され、Ｇ１ｍ３アロタイプの重鎖とｋｍ３アロタイプの軽鎖を含むものであり、各重鎖および各軽鎖が少なくとも１つのマウスＩｇＧ１可変ドメインと少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものであるキメラ型モノクローナル抗体である標的化部分Ｔにカップリングされた式（Ｉ）または好ましくは式（ＩＩ）の蛍光色素部分Ｆを含むものである。胃腸の腫瘍は、胃腸管の任意の部分、例えば、食道、胃、小腸、大腸、直腸ならびに消化に関連している器官、例えば膵臓、肝臓および胆嚢に存在している腫瘍を示すものであり得、ミリメートル未満のサイズ範囲のものであり得る。かかる使用に特に好ましいのは、前記キメラ型モノクローナル抗体が配列番号：４の軽鎖の可変領域と配列番号：３の重鎖の可変部を含むものであるコンジュゲートである。
【００７６】
腫瘍細胞もしくは腫瘍組織を検出もしくは位置特定するため、または切除手術中もしくは術後に腫瘍の切除マージンを検出するための本発明の蛍光コンジュゲートの使用の別の特定の実施形態では、腫瘍が（悪性）乳房腫瘍であり、使用される蛍光コンジュゲートが、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対して指向され、Ｇ１ｍ３アロタイプの重鎖とｋｍ３アロタイプの軽鎖を含むものであり、各重鎖および各軽鎖が少なくとも１つのマウスＩｇＧ１可変ドメインと少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものであるキメラ型モノクローナル抗体である標的化部分Ｔにカップリングされた式（Ｉ）または好ましくは式（ＩＩ）の蛍光色素部分Ｆを含むものである。かかる使用に特に好ましいのは、前記キメラ型モノクローナル抗体が配列番号：４の軽鎖の可変領域と配列番号：３の重鎖の可変部を含むものであるコンジュゲートである。乳房腫瘍は、本明細書で用いる場合、乳房または乳房組織、例えば腺または管組織と関連している任意の組織に存在している腫瘍を示すものであり得、所属リンパ節（腋窩にみられるものなど）もまた包含され得る。かかる腫瘍はミリメートル未満のサイズ範囲のものであり得る。
【００７７】
さらなる一態様では、例えば、腫瘍病巣の検出およびその位置の決定のため、または腫瘍の切除手術を受けている、もしくは受けたばかりの患者における切除マージンの腫瘍細胞もしくは腫瘍組織の検出のための本発明の蛍光コンジュゲートまたは組成物の使用が：
（ａ）該コンジュゲートまたは組成物を腫瘍ができている患者に投与する工程；
（ｂ）前記患者に対して腫瘍切除手術を開始する工程；
（ｃ）切除手術を受けている該患者の切除部位の組織に約６６０〜７００ｎｍの波長を有する光を照射する工程
を含むものであり、
工程（ｂ）が、工程（ａ）後、約９６時間または７２時間以下の時間内に行なわれる。
【００７８】
また、本明細書に記載のコンジュゲートまたは組成物の使用はすべて、択一的に、方法、特に、患者の診断方法または処置方法を表現している場合があり得る。例えば、腫瘍マーカーを発現している腫瘍巣の検出における使用または腫瘍マーカーを発現している腫瘍の位置を患者において調べるための使用はまた、腫瘍マーカーを発現している腫瘍巣の検出方法または腫瘍マーカーを発現している腫瘍の位置を患者において調べる方法でもあると理解してよい。
【００７９】
また、さらなる択一例の１つとして、本明細書に記載のコンジュゲートまたは組成物の診断的および／または治療的使用はすべて、指定された診断的および／または治療的使用のための（該使用に有用な）医薬または診断用薬剤の製造における該コンジュゲートまたは組成物の使用を表現している場合があり得る。
【００８０】
腫瘍ができている患者の処置方法の工程（ａ）では、蛍光コンジュゲートまたはその組成物は、当該技術分野で知られた注射または灌流法によって投与され得る。特に、該コンジュゲートまたは組成物は、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内への注射または灌流によって投与され得る。あるいはまた、該蛍光コンジュゲートまたはその組成物は吸入によって、または局所に投与され得る。これとの関連において、局所投与は、皮膚または外側もしくは内側の粘膜への直接投与を包含している。吸入は、呼吸器系、例えば肺に腫瘍ができている患者の処置に有用であり得る。局所投与する場合、該蛍光コンジュゲートまたはその組成物は、好ましくはスプレー剤の形態で投与される。
【００８１】
該コンジュゲートは好ましくは、患者に０．１〜５０ｍｇの用量または５ｍｇ〜１００ｍｇの用量で投与される。これとの関連において、用量は、例えば外科処置または診断処置の前に投与される、コンジュゲートと（存在している場合は）非コンジュゲート型の抗体との量を意味する。用量は、任意選択で、分割して間隔をあけて投与してもよい。切除手術を受けている結腸直腸、胃、胆管、膵臓、食道、卵巣、乳房、前立腺、肝臓または肺のがんを有する患者に注射によって投与する場合、用量は、好ましくは約０．２〜１５ｍｇ、例えば０．５〜１０ｍｇまたは５〜１５ｍｇの範囲である。好ましくは、投与される用量は少なくとも５ｍｇである。このような用量範囲は特に、上記の好ましい置換度を有するコンジュゲートおよび組成物に適用される。
【００８２】
好ましくは、工程（ｂ）は、工程（ａ）後、約９６時間以下の時間内に行なわれる。他の実施形態では、工程（ｂ）は、工程（ａ）の終了後、７２時間以下または４８時間以下または３６時間以下または２４時間以下または１２時間以下の時間内に行なわれる。
【００８３】
該方法の工程（ｃ）では、切除手術を受けている患者の切除部位の組織に、近赤外領域内の波長で照射する。工程（ｃ）で使用される照射のための光学デバイスは、好ましくは、蛍光コンジュゲートの励起波長を好ましくは６６０〜７００ｎｍの波長にするものである。該方法の一実施形態では、工程（ｃ）は、切除手術を受けている患者の切除部位の組織に６８０ｎｍの励起波長で照射することにより行なわれる。
【００８４】
腫瘍ができている患者の処置方法の特に好ましい一実施形態では、腫瘍が胃腸の悪性腫瘍であり、蛍光コンジュゲートが、ＣＥＡのＧＯＬＤ−２エピトープに対して指向され、Ｇ１ｍ３アロタイプの重鎖とｋｍ３アロタイプの軽鎖を含むものであり、各重鎖および各軽鎖が少なくとも１つのマウスＩｇＧ１可変ドメインと少なくとも１つのヒト定常ドメインを含むものであるキメラ型モノクローナル抗体である標的化部分Ｔにカップリングされた式（Ｉ）または好ましくは式（ＩＩ）の蛍光色素部分Ｆを含むものである。
【００８５】
本発明のまたさらなる一態様では、上記のいずれかの実施形態で取り上げた蛍光コンジュゲートはまた、放射性同位体、放射性標識または放射性トレーサーを含むもの、またはこれらが組み込まれたものであってもよい。放射性標識された蛍光コンジュゲートは、例えば、該コンジュゲートを直接放射性標識することによって、またはコンジュゲーションの前に標的化部分Ｔに放射性標識を適用することによって得られ得る。放射性標識された蛍光コンジュゲートおよびその組成物は、治療用途および／または診断用途における医薬として使用され得る。一実施形態では、放射性標識されたコンジュゲートまたはその組成物を投与する被験体は、がんが発生しているか、またはがんが発生するリスクのある被験体である。
【実施例１】
【００８６】
実施例
実施例１−キメラ型の抗ＣＥＡモノクローナル抗体の調製
遺伝子の設計および合成
それぞれ天然のマウスＶＨおよびＶＬ可変ドメインをコードしている以下のヌクレオチド配列（Ａ）および（Ｂ）をマウス抗ＣＥＡ抗体ハイブリドーマから得て、デノボ合成し、宿主ｐＶＶＳ  Ｔａｎｄｅｍ発現ベクター内にクローニングする。これらの配列には、最適なクローニングおよびＣＨＯ細胞内での最適な発現を確実にするためのいくつかのヌクレオチド修飾（天然のタンパク質の配列を変化させない）が組み込まれている。ＫｐｎＩ制限部位およびＮｈｅＩ制限部位が、それぞれ、ＶＨドメインをコードしている配列の５’末端および３’末端に挿入されている。同様に、２つの制限部位の配列ＳａｌＩおよびＢＳｉＷＩを、それぞれ、ＶＬドメインをコードしている配列の５’末端および３’末端に挿入した。
（Ａ）重鎖（配列番号：１）：
GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGG GCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTC CAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCC GGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG 
AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC GTGACAGTGTCATCTGCTAGC
（Ｂ）軽鎖（配列番号：２）：
GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG
【００８７】
ベクターの合成
ＶＨおよびＶＬの遺伝子の宿主ベクターとして使用するために選択したｐＶＶＳ  Ｔａｎｄｅｍベクターを、Ｓａｌｌ／ＢｓｉＷＩおよびＫｐｎＩ／ＮｈｅＩを用いた逐次二重消化によって調製した。この発現ベクターは、重鎖はヒトＩｇＧ１アロタイプＧ１ｍ３の定常ドメインおよびヒトＩｇＧ１アロタイプＫｍ３の配列をコードしている。このベクターに、さらに、以下の機能性エレメント：ｐＣＭＶプロモーター（重鎖と軽鎖の両方）、このプロモーターと翻訳のための開始コドンの間にキメラ型イントロン、ｐＵＣ複製起点、ＢＧＨポリアデニル化部位、ＨＳ４  ＴＫポリＡインシュレータ（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、ＳＶ４０プロモーターならびにベクターの増幅中およびトランスフェクション後の細胞の選択のためのカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を含める。消化後、得られたベクターの主鎖断片を、ゲル精製を用いて回収した。
【００８８】
上記の天然のマウスＶＨおよびＶＬドメインをコードしている合成のＶＨおよびＶＬの遺伝子挿入物を含む挿入断片を、それぞれのＰＶＶＳタンデム発現ベクターから、それぞれＫｐｎＩ／ＮｈｅＩおよびＳａｌｌ／ＢｓｉＷＩを用いて抜き出し、ゲル精製によって回収する。
【００８９】
回収されたすべての断片を一緒にプールし、ライゲートして、トランスフェクション用の最終ベクターを作製した。
【００９０】
トランスフェクション／選択
上記のベクターによってトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手したＣＨＯ（タンパク質フリー）細胞株（整理番号００１０２３０７，ロット０２Ｋ／００８）に由来するものである。この細胞株（最初にＥＣＡＣＣが１９８５年に取得）は、ハムスター卵巣組織に由来し、Ｐｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９５８）によって最初に確立された親ＣＨＯ細胞株のサブクローンである。
【００９１】
ＥＣＡＣＣバイアル由来のバンク登録物をＢｋ１９９８と命名した。細胞を、ウシ胎仔血清なしで増殖するように適合させ、次いで限定希釈によってクローニングした。サブクローンＰＦ  ３Ｂ９を、増殖特性とトランスフェクション能に基づいて選択し、バンク登録した（細胞バンク物Ｂｋ４１６４）。細胞バンク物ＢＫ４１６４（抗体の抗体産生用細胞基材を作製するために使用）は、Ｂｋ２１１４６のバイアルから調製した。
【００９２】
サブクローン３Ｂ９から得られたＣＨＯ細胞を最初に、４ｍＭのＬ−グルタミンを補給したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地中で解凍し、３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気にて、オービタルシェーカー内で増殖させた。トランスフェクションを、５回目の継代後２日目に行なった。上記のようにして調製した発現ベクターを、ＳＷａＩ制限酵素での消化によって線状化した。トランスフェクションは三連で、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）（Ａｍａｘａ）により、１０μｇのＤＮＡを用いて行ない、３７℃、５％ＣＯ２で振盪なしで３日間インキュベートした。３日間の回復期間後、ジェネティシン（０．５ｇ／Ｌ）の添加によって選択を開始した。ＤＮＡなしでＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）条件に供した細胞を抗生物質による選択の対照として使用した。
【００９３】
細胞バイアビリティがジェネティシン選択圧下で少なくとも８０％に達した後、限定希釈クローニングを行なった。３つのトランスフェクションプールの各々を、４０個の９６ウェルプレートに０．５個の細胞／ウェルの目標細胞密度で播種した。これらのプールから、単一の細胞に由来する４７５個のクローンを作製した。およそ１８日間の培養後、抗体濃度をＥＬＩＳＡによって評価し、１５０個の最良産生クローンを２４ウェルプレートでのスケールアップのために選択した。細胞が充分な密度に達したら、これを６ウェルプレートに移した。振盪フラスコでのスケールアップのため、１０日間のバッチ反応速度論およびｍＡｂ産生（ＦａｓｔＥＬＩＳＡによって評価）に基づいて、さらなる選択を行なった。フェドバッチ反応速度論およびｍＡｂ産生（プロテインＡ  ＨＰＬＣによって評価）に基づいたさらなる選択（２Ｌ容バイオリアクターにスケールアップ）により抗体産生用のリードクローンを選択した。
【００９４】
抗体産生
リードクローンの細胞を解凍し、リバイタライゼーション培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地，４ｍＭのＬ−グルタミン）に移す。バイアブル細胞の密度を測定し、遠心分離後、細胞ペレットを培地中に２×１０６細胞／ｍＬの密度で、７５ｃｍ２フラスコへの播種後に再懸濁させる。細胞を３７℃±１℃、８％±２％ＣＯ２にてオービタルシェーカー内で増殖させる。２日目から、培養を、容量を上げた振盪フラスコ内にてスケールアップする（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地，４ｍＭのＬ−グルタミン，３７℃±１℃、８％±２％  ＣＯ２でオービタルシェーカー内）。細胞バイアビリティ、密度および増殖を各継代時に評価し、夾雑物が無いことを顕微鏡検査によって確認する。１７日目、７回の継代後、振盪フラスコ内の内容物をプールする。細胞をカウントし、２つの１５Ｌ容バイオリアクターに０．５×１０６バイアブル細胞／ｍＬの密度で７Ｌの容量にて播種するために使用する。細胞を、フェドバッチ培養にてＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地，５ｍＭのＬ−グルタミン，０．２％のプルロニック中、３７℃で、ｐＨと酸素の調節下にて２０日間、増殖させる。ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  ３、グルコースおよびＬ−グルタミンを必要に応じて添加する。細胞密度、バイアビリティ、ｐＨを毎日評価し；また、試料を６日目から毎日採取してグルコース濃度を測定し、１０日目から抗体濃度を評価する（プロテインＡ  ＨＰＬＣ）。
【００９５】
２０日目に、各バイオリアクターの細胞懸濁液を３つのデプスフィルターにパラレルで通し、次いで直接、０．２μｍフィルターに通すことにより清澄化を行なう。清澄化されたバルク収集物を集め、抗体含有量（プロテインＡ  ＨＰＬＣにより）、組換えタンパク質の同定（ウエスタンブロット解析により）、バイオバーデン、マイコプラズマおよびスピラプラズマ汚染について試験する。バルク収集物を２Ｌ容ＰＥＴボトル内に分配し、−７０℃〜−９０℃で保存する。
【００９６】
バルク収集物のさらなる加工処理を以下のようにして行なう：清澄化されたバルク収集物を１５〜２５℃で２４時間解凍し、種々のボトルの内容物をプールし、磁気撹拌によってホモジナイズする。プールしたバルク収集物をまず、５０ｍＭリン酸ナトリウム，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０  バッファーで平衡化したプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムで精製する。平衡バッファー、次いで２５ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０のバッファーでの洗浄後、抗体を、２５ｍＭ酢酸ナトリウムのｐＨ３．５のバッファーを用いて溶出させる。ピーク（２８０ｎｍにおける溶離剤の吸光度に基づいて）の抗体を収集し、抗体溶出液を、ｐＨ調整工程の前に１５〜２５℃で維持する。
【００９７】
抗体溶出液のｐＨを、０．２Ｍクエン酸を用いてｐＨ３．８に調整し、撹拌下、１５〜２５℃で６０〜６５分間インキュベートする。０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４でｐＨ６．５に中和後、溶液を０．２μｍフィルターで濾過し、収集し、２〜８℃で保存する。
【００９８】
ｐＨ不活化抗体溶液を、スルホネートリガンド樹脂を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する。溶液のｐＨを、０．２Ｍクエン酸を用いて５．０に調整し、事前に２５ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０のバッファーで平衡化したカラムにロードする。平衡バッファーでの洗浄後、抗体を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム，１９５．２ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．０のバッファーを用いて溶出させる。収集は、２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて行なう。
【００９９】
得られた抗体溶液を、２４ｍＭリン酸ナトリウム，５３．４ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０のバッファー中で平衡化した第４級アンモニウムイオン交換膜を用いたアニオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する。カチオン交換クロマトグラフィー溶出液のｐＨを、０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ７．０に調整し、最終導電率が１１ｍＳ／ｃｍになるように２５ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０のバッファーで希釈する。この溶液を膜上にロードし、抗体を、２８０ｎｍにおける吸光度に基づいてフロースルー中に収集する。収集された溶液を０．２μｍフィルターで、滅菌した使い捨てＰＥＴ容器内に濾過し、２〜８℃で保存する。
【０１００】
次いで、抗体溶液を限外濾過によって濃縮し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２のバッファーに対して３０ｋＤＡカットオフ膜を用いてダイアフィルトレーションする。濾過の保持液を収集し、１５〜２５℃で保存する。
【０１０１】
次いで、保持液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．２のバッファーを用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．２μｍフィルターに通した後、ナノフィルトレーションを行なう（Ｐｌａｎｏｖａ  １５  Ｎ膜）（事前に同じバッファーで平衡化）。濾液を１５〜２５℃で保存する（ｓｔｏｒｅｄ  ａｔ  ｓｔｏｒｅｄ  ａｔ）。最終工程では、得られた精製バルク抗体溶液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、滅菌したＰＥＴボトルに分配し、−７０〜９０℃で保存する。
【０１０２】
プロテインＡ  ＨＰＬＣによる抗体濃度の測定のための試料を各精製工程中に採取する。
【０１０３】
得られた抗体産物を、当該技術分野で知られた方法、例えばＵＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳによって特性評価した。抗体の分子量は１４８．６ｋＤＡである（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による測定時）。
【実施例２】
【０１０４】
実施例２−式（ＩＶ）の蛍光色素の調製
アセトアニリド中間体（Ｂ）：
【化５】
2018525329.tif 000006
スルホン化インドレニンＡを１，４−ブタンスルトンと反応させる。得られた中間体をβ−アニリノアクロレインと反応させ、アセトアニリド中間体Ｂを得る。
【０１０５】
中間体化合物（Ｄ）：
【化６】
2018525329.tif 000007
中間体Ｄは、ウィリアムソン縮合によりインドレニン前駆物質Ｃのカルボキシアルキルオキシ誘導体を形成した後、１，４−ブタンスルトンで４級化することによって調製される。インドレニンＣは、アミノ化芳香族前駆物質のジアゾ化／還元の後、スルホネート形成、ヒドロキシル化およびケトンを用いたフィッシャー環化によって得られる。
【０１０６】
式（ＩＶ）の蛍光色素：
【化７】
2018525329.tif 000008
化合物Ｂをインドール化合物Ｄと縮合させる。得られたジカルボシアニン化合物を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化させ、式（ＩＶ）の蛍光色素を得た。
【実施例３】
【０１０７】
実施例３−蛍光色素と抗ＣＥＡキメラｍＡｂとのコンジュゲーション
精製した実施例１の抗体を１５〜２５℃でおよそ２４時間解凍する。バッファー交換（０．１Ｍナトリウムリン酸塩／炭酸塩，ｐＨ９．３）を行なうための限外濾過／ダイアフィルトレーション（３０ｋＤａカットオフ膜を使用）。蛍光色素（実施例２の式（ＩＶ））をＤＭＦに２．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で、１５〜２５℃での一晩の撹拌によって溶解させる。ＤＭＦを抗体溶液（０．１Ｍナトリウムリン酸塩／炭酸塩バッファー，ｐＨ９．３を用いて終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈）に添加し、終濃度を１０％ｖ／ｖにする。次いで、この蛍光色素溶液を抗体溶液に、２０ｍＬ／分の流速にて４．５のモル過剰で添加する。得られた反応混合物をオービタルシェーカー内で周囲温度にておよそ４５分間インキュベートする。
【０１０８】
２回目の限外濾過／ダイアフィルトレーション工程（３０ｋＤａカットオフ膜）を、まず、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦを補給したＰＢＳ−１３５ｍＭ  Ｌ−アルギニン、続いてフォーミュレーションバッファーＰＢＳ−１３５ｍＭ−Ｌ−アルギニンを用いて行ない、ＤＭＦを除去する。次いで、保持液を終濃度（分光測光解析による測定時）１．０〜１．１ｍｇ／ｍＬまで、フォーミュレーションバッファーを用いて希釈し、濾過する（０．２μｍ）。
【０１０９】
得られた蛍光コンジュゲートを０．５Ｌ容ＰＥＴボトル内に充填して高密度ポリエチレンキャップで封止し、琥珀色のビニール袋に挿入し、−２０℃±５℃で保存する。
【０１１０】
蛍光色素／抗体のモル比を分光測光法によって測定する。１．５〜１．６の平均コンジュゲーション比が観察される。
【０１１１】
蛍光色素と抗体とのコンジュゲーションは、択一的に、ＤＭＳＯをコンジュゲーション溶媒として用いて行なわれ得る。蛍光色素を４のモル過剰で抗体（１ｍｇ／ｍＬの溶液濃度）に、ＤＭＳＯの最終反応濃度１０％ｖ／ｖおよび５〜１２０分間の反応時間で添加すると、１．５〜１．６の平均コンジュゲーション比（分光測光法による測定時）を有するコンジュゲートが得られた。ＤＭＳＯ中で調製したこのような蛍光コンジュゲートで得られた蛍光発光強度、光退色および量子収率の測定値に関して、同様の濃度および条件下でＤＭＦ中にて調製したコンジュゲートと比べて有意差は観察されなかった。
【実施例４】
【０１１２】
実施例４−フォーミュレーション
実施例３に従って調製した蛍光コンジュゲートのフォーミュレーションに使用されるバッファーは、必要に応じて、本発明の範囲内の使用および方法のために適合させてもよい。例えば、該蛍光コンジュゲートは、好ましくは、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ＶＷＲ  Ｐｒｏｌａｂｏ）１０ｍＭクエン酸Ｎａ３／クエン酸（Ｆｌｕｋａ），３００ｍＭアルギニンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ），０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｍｅｒｃｋ）を含むバッファー（このときｐＨは６．０に調整する）でフォーミュレーションが行なわれ得る。
【実施例５】
【０１１３】
実施例５−コンジュゲートの特性評価
蛍光試験
式（ＩＶ）の蛍光色素および実施例３に従って調製した蛍光コンジュゲートの消光、光退色および蛍光量子収率を、臨床使用に関連する波長である６８０ｎｍの励起波長（光学デバイスＦｌｕｏｂｅａｍ７００を用いて供給）で測定した。
【０１１４】
ＤＭＦ中の式（ＩＶ）の蛍光色素の試料およびＰＢＳ  １３５ｍＭ−アルギニン中の実施例３の蛍光コンジュゲートの試料を、０．０５〜５００μＭの範囲の種々の濃度で調製した。
【０１１５】
消光、すなわち、特定の濃度での蛍光色素自体による放射蛍光の自己阻害）の検出前の蛍光色素の最大蛍光強度と最大濃度を、蛍光光度計を用いて測定した。
【０１１６】
蛍光値は、バッファーのバックグラウンド蛍光値を差し引いた後に得た。蛍光コンジュゲートでは、最大蛍光強度は７０ＡＵ（任意単位）であると測定され、消光前に５μＭの最大濃度が観察される。蛍光色素では、最大蛍光強度は１２０ＡＵであると測定され、最大濃度は１０μＭであった。
【０１１７】
吸収光の発光への変換効率の尺度としての量子収率を、６８０ｎｍの臨床波長で５μＭの濃度の試料について計算した。非コンジュゲート型の式（ＩＶ）の蛍光色素では、量子収率が０．２６であると求められたが、コンジュゲート型の蛍光色素では、０．１５の量子収率が観察され、４３％のみの低下ということになる。
【０１１８】
臨床使用に関して、特に腫瘍切除手術中、蛍光コンジュゲートの蛍光色素は、できるだけ長時間、安定で充分なレベルの蛍光強度を維持しているのがよい。
【０１１９】
また、光退色または蛍光活性の低下を、６８０ｎｍの臨床励起波長で、蛍光色素およびコンジュゲート、ならびに市販のカルボシアニン蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０（これは、式（ＩＶ）の蛍光色素のものと同様の最大の吸光波長および発光波長（最大吸光は６７９ｎｍおよび最大発光は７０２ｎｍ）を有する遠赤色発光色素である）の試料について評価した。また、光退色を、実施例３に記載のコンジュゲーション方法と同様にして調製した、実施例１の抗ＣＥＡキメラｍＡＢとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０とのコンジュゲート（抗体に対して蛍光色素が約１．４６の平均比率が得られた）についても評価した。これらのコンジュゲートの試料はＰＢＳ  １×中で調製した。
【０１２０】
試料を５μＭの濃度で調製し、６８０ｎｍの光に曝露した。放射された蛍光の強度は、０時間、３０分、１時間、１．５時間および２時間の間隔での露光で測定した。
【０１２１】
表１：経時的な蛍光発光（λｅｘ＝６８０ｎｍ）
【表１】
2018525329.tif 000009
【０１２２】
６８０ｎｍの臨床波長で３０分間の連続曝露後、蛍光コンジュゲートの蛍光はおよそ７０％であるが、同じ抗体にコンジュゲートさせた市販の色素の放射蛍光は約９％だけである。１時間後、市販の色素ならびにそのコンジュゲートの蛍光強度はほとんど無いが、蛍光コンジュゲートおよび非コンジュゲート型の蛍光色素の蛍光はまだ維持されている。
【０１２３】
組織の交差反応性
ビオチン標識コンジュゲートを用いて実施例３の場合のようにして調製した蛍光コンジュゲートの組織の交差反応性試験を、無関連の３例の個体に由来する４２例のヒト凍結組織および血液塗抹のパネルにおいて、標準的な免疫組織化学的手法を用いて行なった。抗体コンジュゲートの特異的染色は、ＣＥＡを発現していると文献で報告されていた消化管およびいくつかの他の組織の上皮成分（主に、頂端細胞の境界部または腔側）に限定されていることがわかり、オンターゲットのみの抗体結合が確認された。
【０１２４】
抗原親和性
また、実施例３で調製した蛍光コンジュゲートの標的癌胎児性抗原に対する親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００デバイスで測定した。癌胎児性抗原をＣＭ５チップに、チオール基によってカップリングさせた（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｈｉｏｌ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；使用説明２２−０６１８−１０ＡＢ）。会合速度と解離速度を、フロー中で６つの異なる濃度（５０ｎＭ〜１．５ｎＭ）の実施例１のキメラ型モノクローナル抗体、モノクローナル抗体ｍ５１１（実施例１のキメラ型モノクローナル抗体の可変領域のベースの元のマウス抗体）および蛍光コンジュゲートを用いて測定した。データ収集およびパラメータ計算は、ＢｉａソフトウェアおよびＢｉａ評価プログラムを用いて行なった。実施例１のキメラ型モノクローナル抗体のＣＥＡ（３．２７×１０〜１１ｎＭ）に対する親和性は、親マウス５１１抗体のもの（３．８２×１０〜１１ｎＭ）に非常に近い状態が維持され、近赤外蛍光色素での標識後、変更されなかった（実施例３の蛍光コンジュゲートのＫＤは３．２１×１０〜１１ｎＭと測定された）。
【実施例６】
【０１２５】
実施例６−インビボ試験
実施例３の蛍光コンジュゲートの有効性を、ヒトＣＥＡを発現している４つの異なるマウスモデルにおいてインビボで評価した。
【０１２６】
蛍光コンジュゲートの組織分布を、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を用いた放射能測定により、確立されたプロトコルに従って構築したＬＳ−１７４Ｔ腹膜癌症マウスモデルにおいて評価した。免疫抑制状態のＮＭＲＩヌードマウスを、ＣＥＡ過剰発現ＬＳ−１７４Ｔ細胞の腹腔内注射によってＬＳ−１７４Ｔ細胞移植に供した。このマウスに、１０日後、３０および５０μｇの１２５Ｉ放射性標識した蛍光コンジュゲート（これは、該蛍光コンジュゲートと放射性標識ヨウ素化試薬とのインキュベーションによって調製した）を静脈内注射した。５０μｇのコンジュゲートでの処置後４８時間目のマウスの器官映像化（Ｎａｎｏ−ＳＰＥＣＴ−ＣＴ（Ｂｉｏｓｃａｎ（登録商標））カメラを用いて実施）により、放射能が本質的に、マウスの腹腔内に存在している腫瘍結節に限定されていることが示された。この結果は、この動物の致死後に採取した種々の器官内の放射能の体内分布測定と一致していた。
【０１２７】
また、インビボ蛍光可視化試験を、放射性標識していない蛍光コンジュゲートを、ＣＥＡを過剰発現しているＬＳ−１７４Ｔヒト腫瘍細胞の腹腔内注射後に腹膜癌症を発症した免疫抑制状態のＮＭＲＩヌードマウスに注射することによっても実施した。癌症発症の１２日後、動物に２０または３０μｇの蛍光コンジュゲートを静脈内投与した。４８時間後、動物を致死させ、蛍光を、励起波長および発光波長がそれぞれ６８０ｎｍおよび７００ｎｍの光プローブを用いて可視化した。どちらの用量でも、蛍光分布は明瞭に腹腔内腫瘍に限定されており、腹腔内（膵臓領域を含む）の微小結節の明瞭な可視化が可能であった（図１，Ａ列，７００ｎｍで可視化した原位置の腫瘍）。１ｍｍ未満で重量が１ｍｇ未満（０．２〜１．７ｍｇ）の結節が特定可能であり蛍光性であった（図１，７００ｎｍで可視化したＡ列に取り上げた同じ動物の個別の切除腫瘍を示すＢ列）。対照として健常動物への蛍光コンジュゲートの注射および無関連の蛍光コンジュゲート（ＰＸ抗体、すなわち、マウス骨髄腫ＭＯＰＣ２１から精製したＩｇＧ１モノクローナル抗体との）（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７６（６）２９２）参照）の注射では、なんら特異的な染色は誘導されなかった。
【０１２８】
注目すべきことに、蛍光コンジュゲートにより、腫瘍結節の位置に関係なく、ＣＥＡを過剰発現している腫瘍結節の可視化が可能であり、したがって臨床症状が模倣される。
【０１２９】
ヒトＣＥＡを発現しているヒト結腸直腸がんの同所性マウスモデル（Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２００７（１０）４８４）をベースにしたモデルを使用した。ＣＥＡを過剰発現しているＨＴ２９細胞を、免疫抑制状態の６週齢のＣＤ１−Ｆ０ｘｎｌｎｕ雌マウスの背部の４つの部位に皮下注射し、皮下にヒト結腸腫瘍の進展を誘導した。次いで、腫瘍の小断片（およそ３ｍｍの直径）を取り出し、この動物の盲腸壁内に移植し、同所性腫瘍の進展を誘導した。免疫反応を誘導するため、および腫瘍細胞の浸潤を助長するために盲腸壁にわずかな傷をつけた。この腫瘍の進展後、３０μｇの本発明による蛍光コンジュゲート（または対照として無関連のＰＸ抗体との蛍光コンジュゲート）を動物に静脈内注射した。注射後０、４、２４および４８時間目に近赤外（７００ｎｍ）における蛍光シグナルを、皮下腫瘍についてはＰＥＡＲＬイメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または同所性腫瘍についてはＦＬＡＲＥ術中イメージングシステム（Ｃｕｒａｄｅｌ）を用いて測定した。
【０１３０】
その結果、皮下および同所のどちらの位置でも、７００ｎｍにおいて腫瘍の術中免疫光検出が明瞭に観察された（それぞれ、図２Ａおよび図２Ｂ）。皮下腫瘍の蛍光は、抗体の注射後４８時間において動物の皮膚を通して見えるくらい高レベルであった（図２Ａ．Ａ列）。
【０１３１】
また、ＣＥＡを過剰発現しているヒト腫瘍の肝臓転移も、本発明の蛍光コンジュゲートを用いて観察した。ＬＳ−１７４Ｔ細胞またはＬｏＶｏヒト結腸腺癌細胞を、公表されたプロトコル（Ｔｉｂｂｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  １９９３，（７１），３１５−２１参照）に記載の免疫抑制状態のＢａｌｂ／ｃヌードマウスの脾臓内に注射した。どちらの細胞型もＣＥＡを過剰発現しており、肝臓転移への進展を誘導するが、異なるパターンに従う。ＬｏＶｏ細胞は多くの小さな転移の播種を肝臓表面全体に誘導するが、ＬＳ−１７４Ｔ細胞は少数のみの大きな転移の形成を誘導する。マウス被験体には３０μｇの蛍光コンジュゲートを投与し、４８時間後に７００ｎｍの蛍光で可視化した。対照として、マウスにＰＸ抗体ベースの無関連のコンジュゲートを注射した。肝臓表面上の非常に小さいサイズの腫瘍結節、例えば微小転移（これは検出可能でなかった、すなわち肉眼では見えなかった）が、蛍光コンジュゲートを注射したマウスにおいて蛍光下で検出でき、これにより、このような腫瘍の外縁が画定されることがわかった。さらに、肝臓転移の可視化は、腫瘍結節（ｍｏｄｕｌｅ）の細胞株に関係なく可能であることが確立された。対照では腫瘍の検出は観察されなかった。
【０１３２】
同様の試験を、膵臓腫瘍モデルで実施した。６週齢の免疫抑制状態の胸腺欠損ＣＤｌ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ雌マウスを試験に使用し、腫瘍移植およびイメージングの処置中はイソフルランで麻酔した。同所性膵臓腫瘍を、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ，２００９，４，１６７０−８０に記載のようにして採取した。動物の脾臓および膵臓をともに、側方切除（ｌａｔｅｒａｌ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）によって側方に外面化（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚｅ）し、膵臓を全長にわたって露出させた。微細針を膵臓内に脈管構造に平行に通し、ここから５０００００個のＢＸＰＣ−３−ｌｕｃ２細胞（ルシフェラーゼトランスフェクト細胞株）を注射した。同所性腫瘍の増殖を毎週、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によってモニタリングし、イメージングは、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン溶液（ＳｙｎＣｈｅｍ，Ｉｎｃ）（ＰＢＳ中）を５０μＬの総容量で１０分間、腹腔内注射した後、ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてイメージングすることによって実施した。同所性腫瘍がＢＬＩによって検出可能になったら、３０μｇの蛍光コンジュゲートを動物の尾静脈から静脈内注射した。動物を注射後４８時間目に致死させ、７００ｎｍの近赤外下で検査した。同所性膵臓腫瘍の明瞭な可視化が観察された。非特異的コンジュゲートまたは蛍光色素単独を注射した対照マウスでは可視化は観察されなかった。
【０１３３】
シグナル−バックグラウンド比を、Ｐｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅ小動物イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて測定したＮＩＲ蛍光シグナルを用いて計算した。画像を正規化し、解析のための関心領域を選択した。平均腫瘍特異的シグナルを周囲組織由来の平均シグナルで除算し、信号対ノイズ比の平均値を得た。ボンフェローニ補正を用いた２元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用し、すべての時点における異なる群の有意なシグナル−バックグラウンド比を評価した。１に近いシグナル−バックグラウンド比の値を有した単独の蛍光色素または無関連の対照コンジュゲートとは対照的に、蛍光コンジュゲートのシグナル−バックグラウンド比は３より大きかった。
【０１３４】
ＢＸＰＣ−３皮下腫瘍の切除物のヘマトキシリン−エオシン染色を用いた免疫組織化学的解析により、蛍光コンジュゲートは腫瘍に結合されるのに対して、対照は、腫瘍細胞周囲に非特異的染色としてみられるにすぎないことが確認された。
【０１３５】
要約すると、例えば実施例３に従って調製した蛍光コンジュゲートでは、ＣＥＡを過剰発現している腫瘍結節のインビボ特定が、腫瘍の位置および腫瘍の起源（すなわち、結腸直腸か膵臓か）に関係なく可能であることがわかり、蛍光コンジュゲートの標的化能力が確認された。高レベルの信号対ノイズ比（ｓｉｇｎａｌ  ｏｆ  ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）が観察され、肉眼では見えない非常に小さい結節の検出が可能であった。
【０１３６】
また、蛍光コンジュゲートの静脈内投与の安全性と毒性を評価するための薬理学的試験では、Ｗｉｓｔａｒラットの中枢神経系および末梢神経系に対しても、ビーグル犬の心血管機能および呼吸機能に対しても有意な有害効果は認められないこと、ならびにコンジュゲートは、ラットでは４０ｍｇ／ｋｇ／日（意図される臨床用量の８５倍）まで、およびイヌでは５ｍｇ／ｋｇ（意図される臨床用量の１０倍）までの試験した最大用量レベルまで耐容性が良好であることが示された。
【実施例７】
【０１３７】
実施例７−臨床試験
（ａ）腹膜癌症−実施例３のコンジュゲートの安全性と機能性を、消化器起源の腹膜癌症（転移性腫瘍）を有する１５名のヒト患者において評価するための臨床試験．
５〜１５ｍｇの範囲の用量の実施例３の蛍光コンジュゲートを静脈内注射によって投与した。予備調査結果は、これらのいずれの用量でも有害反応は観察されないことを示す。
【０１３８】
（ｂ）結腸直腸がんおよび膵臓がん−実施例３の蛍光抗体コンジュゲートの安全性と機能性を、直腸または膵臓のがんを有する３０名のヒト患者において評価するための臨床試験．
５ｍｇ用量の蛍光コンジュゲート（手術の４８時間前に静脈内注射）を用いた試験を実施した。試験した患者において、これまでのところ、投与中または投与直後の有害効果は報告されなかった。一般に、ベースライン値からのバイタルサインの臨床的に有意な変化は観察されなかった。
【０１３９】
予備調査結果は、腫瘍と疑われる部位における非常に明瞭な蛍光の局在化を示す。術中可視化を、適宜、この蛍光コンジュゲート用に設定したＡｒｔｅｍｉｓ  Ｏｐｅｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて行なった。
【０１４０】
１名の膵臓がん患者では、蛍光コンジュゲートの使用により、膵臓本体に局在する原発腫瘍の周囲の、通常であれば、目視検査と触診のみに基づいて腫瘍のない切除マージンとみなされる（すなわち、腫瘍組織が保持されることになる）であろう領域に存在する腫瘍細胞の特定に至った（図３−目視検査と触診のみによって決定される提案される切除マージンを一点鎖線で示す。これは、腫瘍組織に近すぎるようであり、腫瘍組織塊を点線で示す。蛍光によって決定される提案される切除マージンを実線で示す）。多くの腹膜転移が存在するため、診査と進行度分類のみを行なった、すなわち、転移したものだけを、手術室のバックテーブルでの生検およびさらなる解析のために切除した。蛍光コンジュゲートにより、インビボおよびエキソビボ（切除後の摘出腫瘍）の両方で、病巣の明瞭な境界線ならびに転移のマージンがもたらされた（図３，Ａ列：インビボでの白色光下および蛍光下（オーバーレイ画像）の転移部の画像；図３，Ｂ列：  エキソビボでの白色光下および蛍光下（オーバーレイ画像）の摘出された転移部の画像）。
【０１４１】
同様の結果が、蛍光コンジュゲートの投与後の別の膵臓がん患者でも観察された。膵頭部付近に存在している腫瘍と疑われる輪郭を明瞭に示す蛍光が観察された。
【０１４２】
結腸直腸転移と診断された患者において、切除の４８時間前に５ｍｇ用量の蛍光コンジュゲートを投与した。この用量は耐容性が良好であり、有害事象は観察されなかった。明瞭な蛍光シグナルが、転移が疑われる左腸骨傍リンパ節（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｐａｒａ−ｉｌｉａｃａｌ  ｌｅｆｔ  ｓｉｔｅ）において検出され、転移部の輪郭が示された。好成績の切除が行なわれた。
【０１４３】
また、局所進行直腸癌を有する患者にも５ｍｇ用量の蛍光コンジュゲートを投与した。この用量は耐容性が良好であり、有害事象は検出されなかった。腹腔鏡下低位前方切除を行なった。切除した直腸組織を手術室のバックテーブルで可視化した。切除した組織において腫瘍組織の明瞭な輪郭が観察された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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