(57)【要約】  本開示は、幹細胞から内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトへの分化方法、器官型血管新生化皮膚若しくは粘膜モデル又は組成物の製造におけるその使用、それに関する方法、医薬品及び／又は化粧料の試験におけるモデル又は組成物の使用、またそれにより開発又は試験された治療及び美容目的の皮膚組成物を含めることに関する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官型血管新生化組織、皮膚、若しくは粘膜等価物又は組成物の調製方法であって、
（ｉ）哺乳動物の多能性幹細胞の調製物を入手し、前記細胞を細胞培養条件下で培養することで、以下の分化細胞型：内皮細胞（ＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞／周皮細胞（ＳＣ−ｖＳＭＣ）、線維芽細胞（ＳＣ−Ｆｉｂ）、及びケラチノサイト（ＳＣ−ＫＣ）の形成を誘導する工程と、
（ｉｉ）パート（ｉ）の前記ＳＣ−ＥＣ、ＳＣ−ｖＳＭＣ、及び任意でＳＣ−Ｆｉｂをスキャフォールド内又は上に播種し、更に前記細胞を細胞培養条件下で培養することで、血管新生化真皮層の形成を誘導する工程と、
（ｉｉｉ）パート（ｉ）の前記ＳＣ−ＫＣを、パート（ｉｉ）の血管新生化真皮層上に播種し、更に前記細胞を細胞培養条件下で培養することで、前記血管新生化真皮層上での角質化表皮の重層化層の形成を誘導して、器官型血管新生化皮膚又は粘膜等価物を得る工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物の多能性幹細胞が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物の多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト胚性生殖細胞（ｈＥＧＣ）、又はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞培養条件が、追加の細胞型、例えば、以下に限定するものではないが、メラノサイト又はマクロファージを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記追加の細胞型が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト胚性生殖細胞（ｈＥＧＣ）、又はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物の内皮細胞（ＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞（ＳＣ−ｖＳＭＣ）、線維芽細胞（ＳＣ−Ｆｉｂ）、及びケラチノサイト（ＳＣ−ＫＣ）が、自己由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物の内皮細胞（ＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞（ＳＣ−ｖＳＭＣ）、線維芽細胞（ＳＣ−Ｆｉｂ）、及びケラチノサイト（ＳＣ−ＫＣ）が、アロジェネイックである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、工程（ｉｉ）の前記細胞を少なくとも１〜２０日間にわたって培養する工程を含み、全１日のインターバルを、合間に、ステップ（ｉｉｉ）の前に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記スキャフォールドが、天然又はハイブリッドポリマー系スキャフォールド、例えば、以下に限定するものではないが、ポリエチレングリコール−フィブリン、フィブリン、コラーゲンタイプ−１、ヒアルロン酸ゲルスキャフォールド等を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スキャフォールドが、生体適合性ポリマー系スキャフォールド、例えば、以下に限定するものではないが、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリ−ｄｌ−乳酸−コ−グリコール酸等を含むポリエステルを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ、及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂを、前記スキャフォールド内に約１０：１：１〜約４０：１：１の比で提供する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物のケラチノサイトを、空気／液体界面で培養する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ケラチノサイトを、前記血管新生化真皮層上に、約１０ｘ１０4〜約４０ｘ１０4細胞／ｃｍ2の播種密度で播種する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ケラチノサイトが、インビトロ血管新生化皮膚等価物作製用のｈＥＳＣ−ＫＣ、又は、インビトロ血管新生化粘膜等価物作製用のｈＥＳＣ−口腔ＫＣである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養条件が、無血清培地を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）で調製された前記器官型血管新生化組織、皮膚、又は粘膜等価物を、細胞培養液中で維持する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜３及び５〜７のいずれか一項に記載の方法で得られた又は得られる、単離された分化哺乳動物内皮細胞（ｈＥＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞／周皮細胞（ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ）、線維芽細胞（ｈＥＳＣ−Ｆｉｂ）、又はケラチノサイト（ｈＥＳＣ−ＫＣ）。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法で得られた又は得られる、器官型血管新生化組織、皮膚、若しくは粘膜等価物又は組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法で得られた又は得られる、器官型組織又は皮膚組成物を含む、治療用組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物。
【請求項２０】
皮膚損傷の治療で使用するための、請求項１９に記載の治療用組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物。
【請求項２１】
感染症、又は、創傷、瘢痕、若しくは熱傷を含めた外傷の結果としての皮膚損傷、又は、がんで又は糖尿病性若しくは非糖尿病性潰瘍の治療で組織を除去した結果必要とされる皮膚移植等の疾患を受けての皮膚損傷の治療で使用するための、請求項２０に記載の治療用組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法で得られた又は得られる器官型皮膚組成物を含む、美容用組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物。
【請求項２３】
請求項１９、２０、又は２１に記載の組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物を、治療対象である哺乳動物の部位に又はその部位内に投与又は移植する工程を含む、治療方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物を、治療対象である哺乳動物の部位に又はその部位内に移植する工程を含む、美容整形方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の器官型組織、皮膚、若しくは粘膜等価物又は組成物を含む、細胞培養容器。
【請求項２６】
前記細胞培養容器が、任意で取り外し可能な、細胞培養インサートを備え、前記細胞培養インサートが、細胞培養培地と接触する流体中に、前記器官型組織、皮膚、又は粘膜等価物を含む、請求項２５に記載の細胞培養容器。
【請求項２７】
試験物質、例えば、以下に限定するものではないが、治療薬、化粧品、化合物、又は生物学的に活性な生体異物性物質を試験するのに使用するための、請求項１８に記載の器官型血管新生化組織、皮膚、若しくは粘膜等価物又は組成物。
【請求項２８】
細胞アレイであって、前記アレイが、請求項２５又は２６のいずれか一項に記載の細胞培養容器を複数備えることを特徴とする、アレイ。
【請求項２９】
試験物質の高スループットスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項２８に記載のアレイを提供する工程と、
（ｉｉ）前記アレイを試験対象である複数の物質と接触させる工程と、
（ｉｉｉ）上の（ｉｉ）に続いて得られた活性データを照合する工程と、
（ｉｖ）前記照合したデータをデータ分析可能形態へと変換する工程と、任意で、
（ｖ）前記分析したデータについてアウトプットをする工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３０】
器官型組織、皮膚、若しくは粘膜等価物又は組成物の作製方法であって、
（ｉ）内皮細胞と、血管平滑筋細胞と、任意で線維芽細胞とをスキャフォールド内又は上に播種することで、血管新生化真皮層を得る工程と、
（ｉｉ）ケラチノサイトをパート（ｉ）の血管新生化真皮層上に播種し、更に前記細胞を細胞培養条件下で培養することで、前記血管新生化真皮層上での角質化表皮の重層化層の形成を誘導して、器官型組織、皮膚、又は粘膜等価物を得る工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３１】
前記工程（ｉ）〜（ｉｉ）で作製された前記器官型組織、皮膚、又は粘膜等価物を、細胞培養液中で維持する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、幹細胞から内皮細胞、血管平滑筋細胞（及び／又は周皮細胞）、線維芽細胞及びケラチノサイトへの分化方法、器官型の（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ）任意で血管を新生させた組織、皮膚若しくは粘膜等価物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）又は組成物の製造におけるそれらの使用、それらに関する方法、医薬品及び／又は化粧料の試験における等価物又は組成物の使用、またそれらにより開発又は試験された治療及び美容目的の皮膚組成物を含めることに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は、病原体及び微生物の侵入から内臓を守るための第一線である。そのため、皮膚は、ヒトの身体にとって、水分の喪失、潜在的な外因性の機械的及び化学的な危険に対して不可欠な保護層としての役割を果たす。皮膚及び口腔粘膜の上皮面は、互いに密に接着され且つ多数の別個の層（基底層、有棘細胞、顆粒及び角質化層）状に配列された細胞から成る重層化扁平上皮組織である。皮膚の最外部は、複数層の分化したケラチノサイトから構成され、表皮と呼ばれる自己角質化構造体を形作っている。表皮は、真皮層と呼ばれる線維芽細胞の支持下層と結合している。
【０００３】
加齢及び疾患により皮膚のバリア機能は崩壊するため、皮膚治療製品の開発には大きな関心が集まっている。更に、これに関し及び皮膚に本来備わっているバリア機能を考えると、治療用化合物の効果的な局所送達には、組織表面の透過性バリアを越えた浸透が必要である。新しい治療薬を成功裡に移動させるには、試験薬を現実的なモデル系において皮膚及び粘膜経由の送達について評価できなくてはならない。正常な組織の適当な機械的特性及び透過性を再現できるインビトロモデル又は等価物の開発が治療用化合物の調製及び送達並びに皮膚及び口腔粘膜の保護面のバリア特性の研究には欠かせず、また前臨床試験にとって及び治療用化合物の臨床使用への移行を促進するための重要なツールとなる。
【０００４】
エクスビボヒト組織生検又は外科的検体を含め、皮膚及び口腔粘膜の透過性及びバリア特性を研究するための様々な皮膚モデルが存在するが、それらには倫理的な問題、供給及び実験の変動性を含め数多くの難点がある。加えて、有用であると証明されてはいるものの、バリア特性を研究するための動物を用いた研究には、生来の異種間変動性により、多数の短所がある。薬剤の動物試験をやめたいというのもある。角質化及び重層化した組織の現行のインビトロ器官型モデルはインビボで観察される構造的な特徴の一部を示す場合もあるものの、高価で変動が激しく、また親組織のバリア特性を再現しない。
【０００５】
或いは、細胞及び組織培養モデルには、組織の入手性、コスト及び安全性の観点から利点がある。しかしながら、現行の細胞培養単層はインビボでは皮膚組織の重層化を伴う分化を示さないため、正常な組織のバリア特性を示さない。
【０００６】
重層化、分化したヒトの上皮を成長させて器官型の三次元培養物を形成することで、細胞単層の不利な点を克服できる可能性がある。三次元培養系は、生化学的及び生理学的にインビボの組織により近い。しかしながら、実際には、正常な皮膚の外植片のバリア機能を効果的に再現できる器官培養物を成長させるのは容易ではない。例えば、器官型皮膚培養物の透過性を測定したところ、多種多様な化合物に対する透過性が正常な皮膚より３〜１００倍高いことが判明した（Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ，２００２；Ｂａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。更に、現行の技法では、これらのモデルのために、好ましくないことに個体から外科的な方法でもって皮膚の生検試料を採取し、得られた細胞を実験室条件下で増やすことで十分な数の細胞を得ることを必要とするが、これだと細胞の形態及び機能性が失われる可能性がある。更に、これらの技法では動物由来のタンパク質（血清）の使用（臨床での利用ができず、使用する血清のバッチによっては工程の再現性に影響する可能性がある）、異なるドナーからの細胞の使用（細胞の入手しやすさの限界、ドナー間の変動性及び免疫原性に関わる問題のせいで、このテクノロジーの臨床的有用性を制限する）、複雑な作製工程を伴うミクロ流体スキャフォールドの開発及び臨床的有用性を制限する遺伝子組み換え細胞の使用も必要とする。
【０００７】
従って、現行モデルは高価な上、バッチによる変動の影響を受ける。全層皮膚モデルの場合、これらの問題は悪化する。全層皮膚モデルでは２種の異なるタイプの細胞（即ち、真皮及び表皮）が求められるからである。
【０００８】
従って、ヒトの皮膚の特徴を忠実に反復し、治療薬及び化粧料の同定と皮膚疾患の研究を促進することができる代表的且つ再現可能な器官型の皮膚モデルが必要とされているが、まだ需要は満たされていない。
【０００９】
本開示は、全層であり、任意ではあるが有利には血管が新生され確実に分化して、より典型的な、即ちヒトの組織／皮膚に形態学的及び機能的により近い等価物となる器官型皮膚／粘膜組織等価物モデル又は等価物に関する。更に、この等価物は、公知の遺伝的起源の材料を使用して作製され、即ち機能的に安定しており、偶発的な伝染性物質の侵入を制限し、既存の等価物より優れた安定性及び寿命が得られ、化粧品、医薬品及び治療薬のスクリーニング、開発及び有効性評価に応用できる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明のある態様において、器官型血管新生化（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）組織、皮膚若しくは粘膜等価物又は組成物の作製方法を提供し、この方法は、
（ｉ）哺乳動物の多能性幹細胞の調製物を入手し、細胞を細胞培養条件下で培養することで以下の分化細胞型：内皮細胞（ＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞及び／又は周皮細胞（集合的にＳＣ−ｖＳＭＣと称する）、線維芽細胞（ＳＣ−Ｆｉｂ）及びケラチノサイト（ＳＣ−ＫＣ）の形成を誘導するステップと、
（ｉｉ）パート（ｉ）のＳＣ−ＥＣ、ＳＣ−ｖＳＭＣ及び任意でＳＣ−Ｆｉｂをスキャフォールド内又は上に播種し、更に細胞を細胞培養条件下で培養することで血管新生化真皮層の形成を誘導するステップと、
（ｉｉｉ）パート（ｉ）のＳＣ−ＫＣをパート（ｉｉ）の血管新生化真皮層上に播種し、更に細胞を細胞培養条件下で培養することでこの血管新生化真皮層上での角質化表皮の重層化層の形成を誘導して器官型血管新生化皮膚又は粘膜等価物を得るステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）で作製した器官型血管新生化皮膚又は粘膜等価物を細胞培養液中で維持するステップとを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、ケラチノサイトは皮膚ケラチノサイト（ＳＣ−ＫＣ）及び／又は口腔粘膜ケラチノサイト（ＳＣ−口腔−ＫＣ）であり、皮膚ケラチノサイトだけを使用する前者では皮膚モデルが得られ、口腔ケラチノサイトだけを使用する後者では口腔モデルが得られる。
【００１２】
特定の実施形態において、哺乳動物の多能性幹細胞は胚起源、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又はヒト胚性生殖細胞（ｈＥＧＣ）である。或いは又は加えて、哺乳動物の多能性幹細胞は人工多能性幹細胞、例えばヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。有利には、このことは、潜在的に無制限の皮膚細胞ソースを供給することで、必要なバリア特性を備えた、真皮及び表皮細胞から構成される一貫した表皮及び全層皮膚又は粘膜等価物を作り出すことを可能にする。更に、ヒトｈＥＳＣ／ｈＥＧＣ／ｈｉＰＳＣ由来細胞株を皮膚等価物（ＳＥ）に組み入れることで、インビボで観察される細胞表現型をより正しく反映できる。
【００１３】
本明細書における細胞培養条件への言及には、本発明による細胞、特には幹細胞又は幹細胞由来の細胞の成長を支援するように設計された培地への言及が含まれる。数多くの異なるタイプの化学培地を使用して、培養中の幹細胞若しくは前駆細胞又はそれら由来の細胞の成長を支援でき、例えば、以下に限定するものではないが、ウシ胎仔血清又は血清代用品を補充したフィーダー支援系培地及び定義された培養培地を補充したフィーダーフリー系、例えばｍＴｅＳＲ（商標）１及びＴｅＳＲ（商標）８である。
【００１４】
しかしながら、請求の方法に関連して用いる全ての細胞培養物は任意で無血清細胞培養物、また任意でフィーダーフリー（動物由来の細胞及びタンパク質の使用が最低限）になり得る。特定の実施形態においては、無血清培地が血清代用物及びフィーダーフリー系の成長サプリメントを補充した基本培地から構成される方法を利用する。
【００１５】
更に、更なる特定の方法においては、細胞培養培地は、正常な細胞生存、代謝又は分化の支援に有用な少なくとも１つの他の化合物、物質又は薬剤、例えば、以下に限定するものではないが、レチノイン酸、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、アスコルビン酸、塩化カルシウム、インスリン、アプロチニン、グリコーゲン合成酵素−３阻害剤（以下に限定するものではないが、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＣＨＩＲ−９８０１４を含む）又は骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む。
【００１６】
特定の方法において、細胞培養条件は追加の細胞型、例えば、以下に限定するものではないが、メラノサイト又はマクロファージを含む。細胞をメラノサイトと共培養すると色素沈着を示す上皮性皮膚等価物が得られ、紫外線への曝露及び紫外線防止物質の皮膚への作用を評価できる。また同様に、マクロファージの使用により、薬剤の免疫感作を試験し、インビトロ疾患等価物を確立するための免疫適格性のインビトロ皮膚等価物の開発が可能となる。特定の実施形態において、この追加の細胞型は自己由来又は幹細胞由来である。
【００１７】
加えて、特定の方法において、追加の細胞型はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来である。
【００１８】
他の方法において、ｉＰＳＣを使用する場合、細胞は自己由来であるため、器官型、理想的には血管が新生された皮膚又は粘膜等価物を特定の人物用にあつらえられる。
【００１９】
特定の他の方法において、この方法は、ステップ（ｉｉ）の細胞をステップ（ｉｉｉ）に先立って少なくとも１〜２０日又は２〜１４日又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４日を含む群から選択される日数にわたって培養することを含む。
【００２０】
他の方法においては、内皮細胞（ｈＥＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞及び／又は周皮細胞（集合的にｈＥＳＣ−ｖＳＭＣと称する）、線維芽細胞（ｈＥＳＣ−Ｆｉｂ）及びケラチノサイト（ｈＥＳＣ−ＫＣ）を含む群から選択される分化細胞型の形成を誘導するための哺乳動物の多能性幹細胞の分化は、本明細書の方法セクション、特にはそのパート１〜４に記載されるような細胞培養培地及び／又は本明細書の方法セクション、特にはそのパート１〜４に記載されるような方法を用いることを含み、記載の範囲、特には用いられている典型的な量／濃度／比を含む。
【００２１】
他の方法において、皮膚ケラチノサイト及び口腔ケラチノサイトは、それぞれ方法セクションのパート２及び３に記載の細胞培養培地及び／又は方法を用いて作製され、記載の範囲、特にはそこで用いられている典型的な量／濃度／比を含む。
【００２２】
更なる方法において、スキャフォールド内又は上へのパート（ｉ）のＳＣ−ＥＣ、ＳＣ−ｖＳＭＣ及び任意のＳＣ−Ｆｉｂの播種、更なるこれらの細胞の細胞培養条件下での培養による血管新生化真皮層の形成の誘導は、本明細書の方法セクション、特にはそのパート６及び７に記載されるような細胞培養培地及び／又は本明細書の方法セクション、特にはそのパート６及び７に記載されるような方法を用いることを含み、記載の範囲、特にはそこで用いられている典型的な量／濃度／比を含む。
【００２３】
本明細書におけるスキャフォールドとは、細胞接着、細胞内シグナル伝達及び拡散並びに機械的支持を含めた生体内の細胞環境を再現することで三次元の組織細胞培養を支持可能な材料のことである。当業者ならわかるように、多数の異なるタイプのスキャフォールドが存在し、本明細書に記載の方法に従って使用でき、例えば細胞播種並びに細胞及び栄養素の両方の構造全体にわたる拡散を円滑にするための必要な多孔性を有する細胞培養スキャフォールドである。
【００２４】
細胞培養スキャフォールドの例は米国特許出願公開第２０１０／０４８４１１号明細書に開示されており、その内容は参照により本願に援用される。これらの基材は「ｐｏｌｙＨＩＰＥ」ポリマーと称される微孔性ポリマー材料を含む。これらのポリマーは細孔の網状構造体を形成し、互いに相互連結され、細胞が接着及び増殖できる基材となっている。ｐｏｌｙＨＩＰＥの形成方法は、７５〜９７％の細孔体積で細孔体積を正確に制御できる。細孔サイズは０．１〜１０００ミクロン、相互連結している構造体の直径は数ミクロン〜１００ミクロンになり得る。更に、ｐｏｌｙＨＩＰＥは、細胞増殖及び／又は分化を促進する追加の構成要素と組み合せ得る。従って、ｐｏｌｙＨＩＰＥは、細胞培養系においてその上で細胞が接着及び増殖できる用途が広い基材である。ｐｏｌｙＨＩＰＥの調製方法は当該分野で周知であり、また国際公開第２００４／００５３５５号パンフレット及び国際公開第２００４／００４８８０号パンフレットに開示されている。ｐｏｌｙＨＩＰＥは市販されており、例えば油相モノマースチレン、ジビニルベンゼン及び界面活性剤、例えばＳｐａｎ８０ソルビタンモノオレエートを含む。加えて、ｐｏｌｙＨＩＰＥの加工中に生成されるポリマーの剛性は、モノマー、例えば２−エチルヘキシルアクリレートの含有に影響され得る。エマルションからのｐｏｌｙＨＩＰＥの生成方法は、触媒、例えば過硫酸アンモニウムの添加から始まる。
【００２５】
特定の方法において、スキャフォールドは生体適合性ポリマー系スキャフォールドを含み、例えば、以下に限定するものではなないが、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリ−ｄｌ−乳酸−コ−グリコール酸等を含めたポリエステルである。細胞支持基材は分解性又は非分解性になり得る。
【００２６】
他の方法において、スキャフォールドはフィブリン系スキャフォールドであり、他の公開されている及び市販の皮膚等価物での限界、例えば皮膚の収縮、短期培養及び血液供給の欠如を克服できて有利である。
【００２７】
他の方法において、スキャフォールドはゲルスキャフォールドであり、例えば、以下に限定するものではないが、ポリエチレングリコール−フィブリン、フィブリン、コラーゲンタイプ−Ｉゲルスキャフォールド等である。スキャフォールドは、本明細書の方法セクション、特にはそのパート６に記載されるような及び／又は本明細書の方法セクション、特にはそのパート６に記載の通りに用意した細胞培養培地で培養し得て、記載の範囲、特にはそこで用いられている典型的な量／濃度／比を含む。
【００２８】
特定の実施形態において、ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂは、スキャフォールドに、約１０：１：１〜約４０：１：１、約１０：１：１〜約３５：１：１、約１０：１：１〜約３０：１：１、約１０：１：１〜約２５：１：１、約１５：１：１〜約２５：１：１、約１７：１：１〜約２５：１：１、約１７：１：１〜約２２：１：１、約１８：１：１〜約２２：１：１、約１８：１：１〜約２１：１：１又は約１９：１：１〜約２１：１：１の比で播種される。特定の実施形態において、ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂは、スキャフォールドに約２０：１：１の比で播種される。特定の実施形態において、スキャフォールドはＰＥＧ−フィブリンゲルスキャフォールドである。
【００２９】
後出の実施例においては、ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂを播種したＰＥＧ−フィブリンゲルに三次元血管新生化培地（後述）で１０日間にわたって栄養を供給し、培地は２４時間毎に交換した。１０日後、上の三次元三重培養期間ステップ（ｉｉｉ）を行った。
【００３０】
更に別の方法において、パート（ｉｉ）の血管新生化真皮層上へのパート（ｉ）のｈＥＳＣ−ＫＣの播種及び細胞培養条件下での更なる細胞培養による血管新生化真皮層上での角質化表皮の重層化層の形成誘導により器官型血管新生化皮膚又は粘膜等価物を得ることは、本明細書の方法セクション、特にはそのパート７及び８に記載されるような無血清細胞培養培地の使用及び／又は本明細書の方法セクション、特にはそのパート７及び８に記載されるような方法を用いることを含み、記載の範囲、特にはそこで用いられている典型的な量／濃度／比を含む。
【００３１】
特定の実施形態において、ケラチノサイトは、血管新生化真皮層上に播種密度約１０ｘ１０4〜約４０ｘ１０4、約１０ｘ１０4〜約３５ｘ１０4、約１０ｘ１０4〜約３０ｘ１０4、約１５ｘ１０4〜約３０ｘ１０4、約２０ｘ１０4〜約３０ｘ１０4、約２０ｘ１０4〜約２９ｘ１０4、約２１ｘ１０4〜約２９ｘ１０4、約２１ｘ１０4〜約２８ｘ１０4、約２２ｘ１０4〜約２８ｘ１０4、約２２ｘ１０4〜約２７ｘ１０4、約２３ｘ１０4〜約２７ｘ１０4、約２３ｘ１０4〜約２６ｘ１０4又は約２４ｘ１０4〜約２６ｘ１０4で播種し得る。特定の実施形態において、ケラチノサイトは、血管新生化真皮層上に播種密度２５ｘ１０4細胞／ｃｍ2で播種し得る。インビトロ血管新生化皮膚等価物を作製する場合はｈＥＳＣ−ＫＣを播種し得て、インビトロ血管新生化粘膜等価物を作製する場合はｈＥＳＣ−口腔ＫＣを播種し得る。このケラチノサイト培養段階で、ＰＥＧ−フィブリンゲルには三次元上皮培地（後出）で２〜３日間にわたって栄養を供給し、培地は２４時間毎に交換した。
【００３２】
他の方法においては、哺乳動物のケラチノサイトを空気／液体界面で培養する。これは、培養物を（例えば、１２ウェル）ディープウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ社）に移し、培地を底面のみから供給することで実行できる（上面は空気に曝露したまま）。この段階で使用する培地は、理想的には、４ｍＬ／ウェルの三次元角化培地（後述）になり得る。空気／液体界面を用いた培養３週間目終了時に等価物は完成した。
【００３３】
本明細書における用語「空気／液体界面（ＡＬＩ）」とは、基底膜が液体と接触し又は液体に浸漬し、頂端膜が空気と接触するような細胞培養のことである。有利には、ケラチノサイトは必然的にその分化において頂端側／基底側極性を示し、結果的にインビボで見られるような機能する角質化面が発達する。
【００３４】
更なる態様において、本発明の方法で得られた又は本発明の方法で得た場合の又は本発明の方法で得られる単離された分化内皮細胞（ｈＥＳＣ−ＥＣ）、血管平滑筋細胞及び／又は周皮細胞（集合的にｈＥＳＣ−ｖＳＭＣと称する）、線維芽細胞（ｈＥＳＣ−Ｆｉｂ）又はケラチノサイト（真皮又は口腔）（ｈＥＳＣ−ＫＣ）を提供する。
【００３５】
更なる態様において、本発明の方法で得られた又は本発明の方法で得た場合の又は本発明の方法で得られる単離された器官型血管新生化組織、皮膚又は粘膜等価物を提供する。
【００３６】
更なる態様において、器官型組織若しくは皮膚若しくは粘膜等価物又は組成物の作製方法を提供し、この方法は、
（ｉ）内皮細胞及び血管平滑筋細胞／周皮細胞及び任意で線維芽細胞をスキャフォールド内又は上に播種することで血管新生化真皮層を得るステップと、
（ｉｉ）ケラチノサイトをパート（ｉ）の血管新生化真皮層上に播種し、更に細胞を細胞培養条件下で培養することで血管新生化真皮層上での角質化表皮の重層化層の形成を誘導して器官型皮膚又は粘膜等価物を得るステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）〜（ｉｉ）で作製した器官型組織、皮膚又は粘膜等価物を細胞培養液中で維持するステップとを含む。
【００３７】
特定の実施形態において、ケラチノサイトは皮膚ケラチノサイト（ＳＣ−ＫＣ）及び／又は口腔粘膜ケラチノサイト（ＳＣ−口腔−ＫＣ）であり、皮膚ケラチノサイトだけを使用する前者では皮膚等価物が得られ、口腔ケラチノサイトだけを使用する後者では口腔等価物が得られる。
【００３８】
特定の方法において、細胞は自己由来であるため、器官型組織、皮膚又は粘膜等価物を特定の人物用にあつらえられる。
【００３９】
更なる態様において、本発明の方法で得られた又は本発明の方法で得た場合の又は本発明の方法で得られる器官型組織、皮膚又は粘膜等価物を提供する。
【００４０】
更なる態様において、本発明の方法で得られた又は本発明の方法で得た場合の又は本発明の方法で得られる器官型皮膚組成物を含む治療用組織片（ｇｒａｆｔ）／植皮片又は組織移植物（ｉｍｐｌａｎｔ）／皮膚移植物を提供する。
【００４１】
本発明の更に別の態様において、皮膚損傷の治療で使用するための本発明による器官型組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物を提供する。
【００４２】
特定の実施形態において、皮膚損傷は、感染症又は外傷（創傷、瘢痕又は熱傷を含む）により引き起こされる、或いはがんで又は糖尿病性若しくは非糖尿病性潰瘍の治療で組織を除去した結果必要とされる皮膚移植等の疾患を受けての損傷を含む。
【００４３】
更なる態様において、本発明の方法で得られた又は本発明の方法で得られる器官型皮膚組成物を含む美容用組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物を提供する。
【００４４】
更なる態様において、本発明の方法による組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物を治療対象である哺乳動物のある部位又はある部位内に投与又は移植することを含む治療方法を提供する。
【００４５】
更に別の態様において、本発明の方法による組織片／植皮片又は組織移植物／皮膚移植物を治療対象である哺乳動物のある部位内に移植することを含む美容整形方法を提供する。
【００４６】
更なる態様において、本発明による器官型組織、皮膚又は粘膜等価物を含む細胞培養容器を提供する。
【００４７】
特定の実施形態において、細胞培養容器は、任意で取り外し可能な、器官型組織、皮膚又は粘膜等価物が入った、細胞培養培地と流体接触する細胞培養インサートを備える。
【００４８】
特定の実施形態において、培養容器は、本明細書に記載の方法で説明されているような細胞培養培地を備える。
【００４９】
更なる態様において、試験物質、例えば、以下に限定するものではないが、治療薬、薬剤、皮膚軟膏、口腔／歯科用製品、化粧品、化合物又は生物学的に活性な生体異物性物質を皮膚細胞機能及び透過性について試験するのに使用するための本発明による器官型組織、皮膚又は粘膜等価物を提供する。
【００５０】
本明細書における「生体異物性物質」という語の定義は広く、化合物だけではなく気体状物質も含む。典型的には、生体異物性物質は、人間及び動物用の医薬品並びに人間用の化粧品で使用される医薬的に活性な物質を包含する。
【００５１】
更に特定の実施形態において、試験物質は細胞培養物に、試験物質を細胞培養培地に添加することで接触し得る。或いは、試験物質は細胞培養物に、試験物質を器官型等価物の頂端側面に添加することで接触し得る。有利には、これは、可溶性の試験物質に加えて、蒸気、気体及び乾燥した浮遊粉末を含めた試験物質の送達を可能にし、これは皮膚上皮が多種多様な異なる物質からの防御の最前線の１つであるインビボで起きる事象をよりよく表している。
【００５２】
更なる態様において、細胞アレイを提供し、このアレイは本発明による細胞培養容器を複数備える。
【００５３】
多数の物質のスクリーニングでは、細胞の取り扱い及び物質投与のための細胞アレイの用意を必要とする。アッセイ装置は例えば、典型的には自動ローディング及びロボット操作システムへの適合性ゆえに使用される、例えば６、１２、２４、４８、９６及び３８４ウェルのフォーマットの標準的なマルチウェルマイクロタイタープレートを含む。典型的には、高スループットスクリーニングでは、物質と指標化合物（変換又は修飾されてシグナルを発する）との均質な混合物を使用する。このシグナルを適切な手段（例えば、蛍光発光、吸光度又は放射能の検出）で測定し、続いて細胞、物質及び指標化合物が入った各ウェルからのシグナルを統合する。
【００５４】
特定の実施形態において、哺乳動物のケラチノサイトは空気／液体界面で培養する。
【００５５】
更なる態様において、試験物質の高スループットスクリーニング方法を提供し、この方法は、
（ｉ）本発明によるアレイを用意するステップと、
（ｉｉ）このアレイを試験対象である複数の物質と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）上の（ｉｉ）に続いて得られた活性データを照合するステップと、
（ｉｖ）照合したデータをデータ分析可能形態へと変換するステップと、任意で、
（ｖ）分析したデータについてアウトプットをするステップ
とを含む。
【００５６】
特定の方法において、器官型等価物は、少なくとも１種の治療薬、化粧品、化合物又は生体異物性物質と接触する。
【００５７】
特定の方法において、哺乳動物のケラチノサイトは空気／液体界面で培養する。
【００５８】
本発明の培養方法では、安定した真皮層を細胞支持基材において有利に形成し得る。更に、線維芽細胞／支持基材真皮層上でのケラチノサイトの空気／液体界面培養はその分化において頂端／基底極性を示すケラチノサイトにつながり得て、結果的にインビボで見られるような表皮が重層化した機能する角質化又は非角質化面が発達する。加えて、線維芽細胞を封止された基材内に包埋しなくても皮膚層間の細胞相互作用を探求できることが判明している。従って、再建を目的とした皮膚外科手術に応用できる、優れた安定性及び寿命を有する信頼性が高く現実的な皮膚等価物が形成される。
【００５９】
更なる態様は、特定の実施形態において、上記の特徴のいずれをも含み得る又は特徴とし得る。
【００６０】
本明細書において、数値との関連で用いる「約」という語は、その数値の±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％又は±０％を包含し且つ含む数値を意味する。
【００６１】
本明細書の本文及び請求項全体を通して、「含む／備える」及び「含有する」という語並びにこれらの派生語、例えば「含んでいる／備えている」及び「含み／備え」は、「含むがそれらに限定されない」を意味し、他の部分、付加物、構成要素、整数又はステップを排除しないものとする（及び排除しない）。
【００６２】
本明細書の本文及び請求全体を通して、文脈に反しない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞を用いる場合、明細書は、文脈に反しない限り、単数だけでなく複数も想定していると理解されたい。
【００６３】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と共に記載される特色、整数、特徴、化合物、化学的部分又は基は、不適合でない限り、本明細書に記載の他の態様、実施形態又は実施例に適用可能であると理解されたい。
【００６４】
更に、別段の定めがない限り、本明細書で開示の特色は、同一又は類似した目的を果たす代替の特色で置き換え得る。
【００６５】
本明細書で言及する文献が先行技術であると認めるということではない。更に、先行技術が当該分野における一般的な共通知識の一部であると認めるということではない。
【００６６】
ここで、本発明の実施形態を、単なる例として、以下の図を参照しながら説明していく。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】マトリゲル上で培養したｈＥＳＣの多能性状態の分析。左上の顕微鏡写真は、マトリゲル及びｍＴｅＳＲ１上で培養された、密集し、輪郭がはっきりした形態のｈＥＳＣコロニーを示す。免疫蛍光顕微鏡写真は、多能性マーカーＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現を示す。スケールバー：５００μｍ。
【図２】（ａ）４８時間にわたるＢＭＰ４、レチノイン酸（ＲＡ）及びアスコルビン酸（ＡＡ）とそれに続くＲＡ及びＡＡによる定義されたケラチノサイト無血清培地（ＤＫＳＦＭ）における連続処理によるｈＥＳＣからｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞への分化の概略図。ｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞をコラーゲン−ＩＶ（１μｇ／ｃｍ2）／０．１％ゼラチンコートプレートへと継代培養し、ＤＫＳＦＭにおいて増殖させてｈＥＳＣ−ＫＣを得た。（ｂ）ｈＥＳＣ、ｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞及びｈＥＳＣ−ＫＣの位相差像を示す代表的な顕微鏡写真。（ｃ）ケラチノサイトマーカーＫ１４及びｐ６３について染色したｈＥＳＣ−ＫＣの免疫蛍光画像を示す代表的な顕微鏡写真。スケールバー：（ｂ）では２００μｍ、（ｃ）では１００μｍ。
【図３】（ａ）４８時間にわたるレチノイン酸（ＲＡ−１μＭ）及びアスコルビン酸（ＡＡ−５０μｇ／ｍｌ）とそれに続くＲＡ（０．５μＭ）及びＡＡ（５０μｇ／ｍｌ）による定義されたケラチノサイト血清無血清培地（ＤＫＳＦＭ）における連続処理によるｈＥＳＣからｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞への分化の概略図。ＦＡＣＳでソートしたα６−インテグリン高及びＣＤ７１低個体群をコラーゲン−ＩＶ（１μｇ／ｃｍ2）／０．１％ゼラチンコートプレートへと継代培養し、ＤＫＳＦＭにおいて増殖させてｈＥＳＣ−口腔ＫＣを得る。（ｂ）ｈＥＳＣ、α６−インテグリン高及びＣＤ７１低個体群並びにｈＥＳＣ−口腔ＫＣの位相差像を示す代表的な顕微鏡写真。（ｃ）ケラチノサイトマーカーＫ１４及びｐ６３について染色したｈＥＳＣ−口腔ＫＣの免疫蛍光画像を示す代表的な顕微鏡写真。スケールバー：（ｂ）では２００μｍ、（ｃ）では１００μｍ。
【図４】（ａ）ＣＨＩＲ９９０２１（＋ＧＳＫｉ）、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦでの連続処理によるｈＥＳＣからｈＥＳＣ−内皮前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞）への分化の概略図。ｈＥＳＣ由来内皮前駆細胞を、分化から５日後にフローサイトメトリを用いてソートし、更にｈＥＳＣ−ＥＣへと分化させた。（ｂ、ｃ）フローサイトメトリをベースとしたｈＥＳＣ−内皮前駆細胞のＣＤ３１＋ＣＤ３４＋ＰＤＧＦＲβ−細胞のソーティング。（ｄ）顕微鏡写真は、位相差顕微鏡法でのｈＥＳＣ−ＥＣの丸石様の形態を示す。内皮（ｅ）及びｖＳＭＣ（ｆ）系列に関する転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（ｇ）内皮細胞系列関連マーカーの発現、レクチンＵＥＡ−Ｉへの結合及びＰＤＧＦＲβ発現の欠如を示すフローサイトメトリヒストグラムオーバーレイ。（ｈ）ＣＤ３１及びＶＥ−ＣＡＤの表面発現、ｖＷＦの細胞質発現及びマトリゲル上での管様構造体の形成を示す免疫蛍光顕微鏡写真。スケールバー：１００μｍ。
【図５】（ａ）フィーダーフリー及び無血清条件下でのｈＥＳＣのｈＥＳＣ−沿軸中胚葉前駆細胞、次にｈＥＳＣ−周皮細胞への分化についての略図。（ｂ）ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβの発現、（ｃ）ＣＤ３４、ＣＤ３１及びＰＤＧＦＲβの共発現並びにＰＤＧＦＲβ＋ＣＤ３４−ＣＤ３１−細胞のソーティングの代表的なフローサイトメトリオーバーレイ。（ｄ）ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣの紡錘状形態を示す位相差顕微鏡写真。ｖＳＭＣ／周皮細胞（ｅ）及び内皮細胞（ｆ）系列に関する転写物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（ｇ）内皮細胞系列（ＣＤ３４、ＣＤ３１）、ｖＳＭＣ／周皮細胞系列（ＰＤＧＦＲβ、ＮＧ２）及び間葉細胞系列（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）関連表面マーカーの発現を示すフローサイトメトリオーバーレイ。（ｈ）ｖＳＭＣ系列関連細胞質細胞骨格タンパク質の発現を示すフローサイトメトリヒストグラムオーバーレイ。（ｉ）αＳＭＡ及びカルポニン（ＣＮＮ１）の細胞質発現を示す免疫蛍光顕微鏡写真。スケールバー：１００μｍ。
【図６】（ａ）三次元インビトロ血管新生化皮膚のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ−Ｅ）染色片の代表的な顕微鏡写真。表皮はケラチノサイトの重層化層及び角化から成り、真皮は微小血管系及び線維芽細胞の存在を示す。（ｂ）Ｋ１４の発現を示す三次元インビトロ血管新生化皮膚のホルマリン固定パラフィン包埋片の免疫蛍光顕微鏡写真。（ｃ）微小血管チャネルの存在を示す三次元インビトロ血管新生化皮膚の真皮層のＨ−Ｅ染色片の顕微鏡写真。（ｄ）それぞれｈＥＳＣ−ＥＣ及びｈＥＳＣ−ｖＳＭＣによるｖＷＦ及びＣＮＮ１の発現がある管腔化微小血管チャネルの存在を示す三次元インビトロ血管新生化皮膚のホルマリン固定パラフィン包埋片の免疫蛍光顕微鏡写真。
【図７】（ａ）三次元インビトロ血管新生化粘膜等価物のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ−Ｅ）染色片の代表的な顕微鏡写真。組織等価物は、非角質化扁平上皮の重層化層とその下の血管が新生した組織から成る。矢印は微小血管系の存在を指している。（ｂ）Ｋ１４及びＫ１０の発現を示す三次元インビトロ血管新生化粘膜のホルマリン固定パラフィン包埋片の免疫蛍光顕微鏡写真。（ｃ）コラーゲンタイプ−ＩＶ（Ｃｏｌ−ＩＶ）及びフィブロネクチンの発現での管腔化微小血管チャネル（矢印）の存在を示す三次元インビトロ血管新生化粘膜のホルマリン固定パラフィン包埋片の免疫蛍光顕微鏡写真。
【図８】（Ａ）線維芽細胞におけるビメンチン、内皮細胞におけるフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、平滑筋細胞／周皮細胞における平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、口腔−ケラチノサイトにおけるＫ１９及び皮膚−ケラチノサイトにおけるＫ１４を示す初代細胞の免疫蛍光染色を示す。（Ｂ）血管新生化前粘膜（ｐｒｅ−ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ｍｕｃｏｓａ）及び血管新生化前皮膚組織（ｐｒｅ−ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ）等価物のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色片の顕微鏡画像。組織等価物は、非角質化重層化層（粘膜モデル）及び角質化重層化層（皮膚モデル）から成る。矢印は、血管の存在を表している。
【図９】（ａ）ＰＥＧ−フィブリンゲルにおける１、４及び６日間にわたる三次元培養後のｈＥＳＣ−ＥＣ（ｈＥＳＣ−周皮細胞なし）により形成された微小血管網の代表的な三次元映像共焦点ｚスタック画像。一連の画像は、培養４日後に吻合索を形成するが６日後には退縮するＥＣの出芽を示す。（ｂ）ＰＥＧ−フィブリンゲルにおける１、４、６、９、１２、１５及び２１日間にわたる三次元共培養後のｈＥＳＣ−ＥＣ（緑）及びｈＥＳＣ−周皮細胞（赤）により形成された微小血管網の代表的な三次元映像共焦点ｚスタック画像。一連の画像は、培養４〜６日後に吻合索を形成し、培養が長くなるにつれて内皮細胞網の厚さ及び相互接続性の点で成熟するＥＣの出芽を示す。スケールバー：２００μｍ。（ｃ）棒グラフは、ｈＥＳＣ−ＥＣの播種密度の変化に伴う血管パラメータの変化を示す。エラーバー：標準偏差（ｎ≧３）。*ｐ＜０．０５。
【図１０】インビトロでの血管透過性の評価。（ａ〜ｃ）微小血管チャネルはデキストラン分子（赤）不透過性であり、即ちデキストラン分子は血管壁の外に見られ、管腔は透明である。（ｄ〜ｆ）しかしながら、血管チャネルをヒスタミンとプレインキュベートすると、デキストラン分子が微小血管チャネルの管腔（白色の矢印）内へと透過し、これはヒスタミンに応答した漏出性を示す。微小血管の断面図は、管腔内のデキストランの存在（黄色の矢印）を示す。スケールバー：５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
材料及び方法
１．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の増殖：ｈＥＳＣ細胞株を、完全ｍＴｅＳＲ（商標）１培地中、マトリゲルをコートした組織培養プレート上で培養した。細胞株のキャラクタリゼーションをルーチンで多能性マーカーＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４及びアルカリホスファターゼの発現について行った。５〜７日毎に、１ｍｇ／１ｍｌのディスパーゼに５〜１０分間にわたって３７℃で曝露することで細胞を継代培養した。ｈＥＳＣコロニーを回収し、丁寧なピペット作業により小さなコロニー片に分割し、マトリゲルをプレコートしたプレートに１０ｃｍ2あたり５〜６コロニーでプレーティングした。
【００６９】
２．ｈＥＳＣのｈＥＳＣ−ＫＣへの分化：ｈＥＳＣを上述したように増殖させた。ｈＥＳＣのｈＥＳＣ−ＫＣへの分化を無血清培地条件下で行った。ケラチノサイト分化培地を、定義されたケラチノサイト無血清培地（ＤＫＳＦＭ）中のＢＭＰ４（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、典型的には２５ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１〜１μＭ、典型的には０．５μＭ）及びアスコルビン酸（１０〜１００μｇ／ｍｌ、典型的には５０μｇ／ｍｌ）のカクテルで用意した。分化培地を分化の最初の４８〜９６時間、典型的には４８時間にわたって供給し、その間、神経外胚葉系列は阻害され、その後、培地を、新たに用意した、ＢＭＰ４を含有しない分化培地と交換した。分化工程を更に７〜８日間にわたって継続し、培地を４８時間毎に交換した1、2。コンフルエンスが８０％に達したら、細胞を１：３の比に分け、タイプ−ＩＶコラーゲン（０．５〜２μｇ／ｃｍ2、典型的には１μｇ／ｃｍ2）又は０．１％ゼラチンコートプレート上に播種した。細胞を、ＤＫＳＦＭを使用して培養し、増殖させた。２〜４継代後、成熟したケラチノサイト（ｈＥＳＣ−ＫＣ）のキャラクタリゼーションを免疫蛍光染色により行い、更なる機能的な研究に使用した。
【００７０】
３．ｈＥＳＣのｈＥＳＣ−口腔ＫＣへの分化：ｈＥＳＣを上述したように増殖させた。ｈＥＳＣのｈＥＳＣ−口腔ＫＣへの分化を無血清培地条件下で行った。ケラチノサイト分化培地を、ＤＫＳＦＭ中のレチノイン酸（０．１〜２μＭ、典型的には１μＭ）及びアスコルビン酸（１０〜１００μｇ／ｍｌ、典型的には５０μｇ／ｍｌ）のカクテルで用意した。分化培地を分化の最初の４８〜７２時間、典型的には４８時間にわたって供給し、その間、神経外胚葉系列は阻害され、その後、培地を、新たに用意したレチノイン酸（０．１〜２μＭ、典型的には０．５μＭ）及びアスコルビン酸（１０〜１００μｇ／ｍｌ、典型的には５０μｇ／ｍｌ）を含有するケラチノサイト分化培地と交換した。分化工程を更に７〜８日間にわたって継続し、培地を４８時間毎に交換した1、2。分化から１０日後、細胞を、フローサイトメトリ支援ソーティング（ＦＡＣＳ）でα６−インテグリン高及びＣＤ７１低細胞個体群についてソートした。ソートしたα６−インテグリン高及びＣＤ７１低細胞個体群をタイプ−ＩＶコラーゲン上に播種した（１μｇ／ｃｍ2）。細胞をＤＫＳＦＭ中で培養し、タイプ−ＩＶコラーゲン（１μｇ／ｃｍ2）又は０．１％ゼラチンコートプレート上で増殖させた。２〜４継代後、成熟した口腔ケラチノサイト（ｈＥＳＣ−口腔ＫＣ）のキャラクタリゼーションをリアルタイムＰＣＲ、免疫蛍光染色で行い、更なる機能的な研究に使用した。
【００７１】
４．ｈＥＳＣの線維芽細胞への分化：ｈＥＳＣを、発明者のグループ3、4がこれまでに説明したようにｈＥＳＣ−Ｆｉｂに分化させた。
【００７２】
５．ｈＥＳＣの血管細胞への分化：フィーダーフリー条件下で増殖させたｈＥＳＣをフィブロネクチンプレコートプレート上に播種した。ｈＥＳＣコロニーの接着に２４時間かけた。その後、培養培地をＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ培地（化学的に定義された動物成分非含有培地）に変更した。ｈＥＳＣを、ＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３）経路をＢＩＯ／ＣＨＩＲ９８０１４又はＣＨＩＲ９９０２１（２〜６μＭ、典型的には５μＭ）を使用して阻害することで原条に向かわせると、多能性及び外胚葉マーカーが下方制御された。続いて、細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、典型的には５０ｎｇ／ｍｌで２４時間にわたって処理することで分化を行い、その後、細胞をＶＥＧＦ（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、典型的には５０ｎｇ／ｍｌ）と７２時間にわたってインキュベートした。分化から５日目、細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞（ｈＥＳＣ−内皮前駆細胞）及びＰＤＧＦβ＋ＣＤ３４−ＣＤ３１−細胞（ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ前駆細胞）についてＦＡＣＳでソートした。ＦＡＣＳでソートしたｈＥＳＣ−内皮前駆細胞をフィブロネクチンプレコートプレート（１〜５μｇ／ｃｍ2、典型的には１．５μｇ／ｃｍ2）上に播種し、ＶＥＧＦ（２０〜２５ｎｇ／ｍｌ、典型的には０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（０〜５０ｎｇ／ｍｌ、典型的には１０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（０〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には５ｎｇ／ｍｌ）を補充した内皮無血清培地（ＥＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）で２〜５継代培養した。同様に、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ前駆細胞をＦＡＣＳでソートし、フィブロネクチンプレコートプレート上に播種し（１〜５μｇ／ｃｍ2、典型的には１．５μｇ／ｃｍ2）、ＰＤＧＦｂｂ（１〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（０〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には１０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（０〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には５ｎｇ／ｍｌ）を補充した平滑筋細胞無血清培地で３〜１０継代培養した5、6。２〜４継代培養した後、ｈＥＳＣ−ＥＣ及びｈＥＳＣ−ｖＳＭＣのキャラクタリゼーションをそれぞれ内皮及びｖＳＭＣマーカーの発現について行い、機能的な研究に使用した。ｈＥＳＣ−ＥＣのインビトロ機能性を、発明者のグループが過去に発表した通り、マトリゲル管形成アッセイを用いて調査した5。
【００７３】
６．ＰＥＧ−フィブリンゲルの調製：ポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）−フィブリンゲルを、公開されているプロトコル7を改変して調製した。ヒト又はウシ血漿由来のフィブリノゲン、ＰＥＧ−４−ａｒｍスクシンイミジルグルタレート末端、トロンビン及び塩化カルシウムを使用した。４種の化学物質全ての作業溶液を、製造業者の指示にしたがって調製した。簡単に説明すると、フィブリノゲンを、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中の濃度８０ｍｇ／ｍｌで再構成し（ｐＨ８．３）、１時間にわたって室温で軽く振盪することで混合し、アリコート後に原液を−８０℃で保存した。ＰＥＧを濃度８ｍｇ／ｍｌで再構成し、アリコートを−２０℃で保存した。ヒト又はウシトロンビンを濃度１００Ｕ／ｍｌでアリコートし、−２０℃で保存した。ＰＥＧ−フィブリノゲンを１０：１〜５０：１、典型的にはフィブリノゲン及びＰＥＧの最終濃度をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌと考えて４０：１の比で混合することでスキャフォールドを作製した。この混合物を３７℃で２０〜３０分間にわたってインキュベートした。トロンビン及びＣａＣｌ2（４０ｍＭ）をそれぞれ１：３の比で混合し、氷上に２０〜３０分間にわたって置いた。必要な様々な細胞型をＰＥＧ−フィブリノゲン溶液に添加した。等体積のトロンビン−ＣａＣｌ2及びＰＥＧ−フィブリノゲン−細胞懸濁液を、血管新生化真皮等価物の作製のために混合した。３７℃での１０分間のインキュベーション後、三次元細胞スキャフォールドに三次元血管新生化皮膚培地で栄養を供給した。
【００７４】
７．三次元血管新生化皮膚培地：
異なる培養ステージを考慮し、培養培地を３つの異なる培地に分割する。
【００７５】
（Ａ）三次元血管新生化培地：基本培地としての無血清内皮培地から成り、血管増殖サプリメント、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ、典型的には２０ｎｇ／ｍｌ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ  １〜２５ｎｇ／ｍｌ、典型的には２０ｎｇ／ｍｌ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ、１〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には１０ｎｇ／ｍｌ）を抗生物質と共に添加した。アプロチニン（２５〜２００ＫＩＵ／ｍｌ、典型的には１００ＫＩＵ／ｍｌ）も含め、これはフィブリンの劣化を阻害する。
【００７６】
（Ｂ）三次元上皮培地：この培地を、血管新生化真皮等価物上へのｈＥＳＣ−ＫＣの播種時に培養物に添加した。この培地は、ＶＥＧＦ（５〜５０ｎｇ／ｍｌ、典型的には２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１〜２５ｎｇ／ｍｌ、典型的には２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には１０ｎｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５〜２００ＫＩＵ／ｍｌ、典型的には１００ＫＩＵ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０〜１００μｇ／ｍｌ、典型的には５０μｇ／ｍｌ）、インスリン（５〜２０μｇ／ｍｌ、典型的には１０μｇ／ｍｌ）、セレニウム（１〜１０μｇ／ｍｌ、典型的には５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１〜１０μｇ／ｍｌ、典型的には５．５μｇ／ｍｌ）及び抗生物質を含有する無血清内皮培地から成る。
【００７７】
（Ｃ）三次元角化培地：この培地は、血管新生化皮膚等価物の空気／液体界面での培養に使用した。この培地は、ＶＥＧＦ（５〜５０ｎｇ／ｍｌ、典型的には２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１〜２５ｎｇ／ｍｌ、典型的には２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１〜２０ｎｇ／ｍｌ、典型的には１０ｎｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５〜２００ＫＩＵ／ｍｌ、典型的には１００ＫＩＵ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０〜１００μｇ／ｍｌ、典型的には５０μｇ／ｍｌ）、インスリン（５〜２０μｇ／ｍｌ、典型的には１０μｇ／ｍｌ）、セレニウム（１〜１０μｇ／ｍｌ、典型的には５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１〜１０μｇ／ｍｌ、典型的には５．５μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2（１〜１．８ｍＭ、典型的には１．２ｍＭ）、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、典型的には（０．５μｇ／ｍｌ）、トリ−ヨードＬ−チロニン（１〜５ｎＭ、典型的には２ｎＭ）及び抗生物質を含有する無血清内皮培地から成る。
【００７８】
８．インビトロ三次元血管新生化皮膚／粘膜の形成
三次元インビトロ構築物を、ＰＥＧ−フィブリンヒドロゲルをスキャフォールドに見立てて発達させた。スキャフォールドは、細胞がその中及び上で成長するためのプラットフォームとしての役割を果たす。このインビトロ血管新生化皮膚等価物は、血管新生化真皮等価物に続いて表皮を連続的に発達させることで作製した。血管新生化真皮等価物は、ｈＥＳＣ−ＥＣ（１〜５ｘ１０6、典型的には２．５ｘ１０6個のｈＥＳＣ−ＥＣ／ｍＬのＰＥＧ−フィブリンゲル）、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂ（比１０：１：１〜４０：１：１、ＥＣの濃度は１〜５ｘ１０6個のｈＥＳＣ−ＥＣ／ｍＬ、典型的には比２０：１：１）をＰＥＧ−フィブリンゲルに封入することで作製した。簡単に説明すると、ヒト又はウシ血漿由来のフィブリノゲン、ＰＥＧ−４−ａｒｍスクシンイミジルグルタレート末端、ヒトトロンビン及び塩化カルシウムを使用した。４種の化学物質全ての作業溶液を、製造業者の指示にしたがって調製した。フィブリノゲンを、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中の濃度８０ｍｇ／ｍｌで再構成し（ｐＨ８．３）、１時間にわたって室温で軽く振盪することで混合し、アリコート後に原液を−８０℃で保存した。ＰＥＧを濃度８ｍｇ／ｍｌで再構成し、アリコートを−２０℃で保存した。ヒト又はウシトロンビンを滅菌蒸留水中の濃度１００Ｕ／ｍｌで再構成し、アリコートを−２０℃で保存した。ＰＥＧ−フィブリノゲンをフィブリノゲン濃度を１０ｍｇ／ｍｌに固定して１０：１〜５０：１、典型的にはフィブリノゲン及びＰＥＧの最終濃度をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌと考えて４０：１の比で混合することでスキャフォールドを作製した。この混合物を３７℃で２０〜３０分間にわたってインキュベートした。トロンビン（１００Ｕ／ｍｌ）及びＣａＣｌ2（４０ｍＭ）をそれぞれ１：３の比で混合し、氷上に置いた。細胞（ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂ）を１００μｌのＰＥＧ−フィブリノゲン溶液に懸濁させ、１００μｌのトロンビン−塩化カルシウム溶液と混合し、速やかに１２ウェル培養インサート内へとピペットで移すことでＰＥＧ−フィブリンゲルを形成し、培養すると血管新生化真皮等価物が形成される。ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−Ｆｉｂを含有するＰＥＧ−フィブリンに三次元血管新生化培地（上述）で１０日間にわたって栄養を供給し、培地を２４時間毎に交換した。１０日間にわたる三次元三重培養期間後、ケラチノサイトを血管新生化真皮等価物上に播種密度１０〜４０ｘ１０4ｃｍ2、典型的には２５ｘ１０4個の細胞／ｃｍ2で播種した。インビトロ血管新生化皮膚等価物を作製するためにｈＥＳＣ−ＫＣを播種し、インビトロ血管新生化粘膜等価物を作製するためにｈＥＳＣ−口腔ＫＣを播種した。このケラチノサイト培養段階では、ＰＥＧ−フィブリンゲルに三次元上皮培地で２〜３日間にわたって栄養を補給し、培地は２４時間毎に交換した。次に、三次元共培養物を、培養インサートを１２ウェルディープウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ社）に移し、培地を底面のみから供給することで空気／液体界面培養した（上面は空気に曝露したまま）。この段階で使用した培地は、４ｍＬ／ウ���ルの三次元角化培地であった。空気／液体界面で培養３週間目が終了したら、三次元培養物を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を４℃で使用して一晩固定し、パラフィン包埋した。ホルマリン固定したパラフィン包埋サンプル片を、血管マーカー及び上皮マーカーについてのヘマトキシリン／エオシン染色及び免疫蛍光染色を用いたルーチンの組織学的解析に使用した。同様に、別の実験装置において、ＰＥＧ−フィブリンスキャフォールドを、三次元血管新生化皮膚／粘膜を形成するために、初代細胞、即ち内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、皮膚ケラチノサイト及び口腔ケラチノサイトと共に、初代細胞をベースとしたモデルをコントロール三次元皮膚／粘膜モデルと見なして作製した（図８に図示）。
【００７９】
結果
１．ｈＥＳＣの培養及びキャラクタリゼーション
マトリゲル上で培養したｈＥＳＣのルーチンのキャラクタリゼーションを、図１に図示するように多能性マーカーについて行った。
【００８０】
２．ｈＥＳＣからｈＥＳＣ−ＫＣへの分化
上述し、図２に図示したようにｈＥＳＣはｈＥＳＣ−ＫＣに分化した。図２ａに図示するように、マトリゲルコートプレート上、ＤＫＳＦＭで成長させたｈＥＳＣのＢＭＰ４、レチノイン酸（ＲＡ）及びアスコルビン酸（ＡＡ）での連続処理によりｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞のコロニーが出現した。ｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞の解離及びコラーゲンタイプ−ＩＶ又はゼラチンコートプレート上への連続的な継代によりｈＥＳＣ−上皮前駆細胞はｈＥＳＣ−ＫＣへと成熟した（図２ｂ）。これらのｈＥＳＣ−ＫＣは基底ケラチノサイトマーカーＫ１４及びｐ６３について陽性であり、ケラチノサイト系列が同定された（図２ｃ）。
【００８１】
３．ｈＥＳＣのｈＥＳＣ−口腔ＫＣへの分化
上述し、図３に図示したようにｈＥＳＣはｈＥＳＣ−ＫＣに分化した。図３ａに図示するように、マトリゲルコートプレート上、ＤＫＳＦＭで成長させたｈＥＳＣのレチノイン酸（ＲＡ）及びアスコルビン酸（ＡＡ）での連続処理により、ｈＥＳＣ由来上皮前駆細胞のコロニーが出現した。これらの前駆細胞をα６−インテグリン高及びＣＤ７１低個体群についてＦＡＣＳでソートし、コラーゲンタイプ−ＩＶコートプレート上に播種し、ＤＫＳＦＭ中で培養した。コラーゲンタイプ−ＩＶ又はゼラチンコートプレート上への連続的な継代によりｈＥＳＣ−口腔ＫＣへと成熟した（図３ｂ）。これらのｈＥＳＣ−口腔ＫＣは基底ケラチノサイトマーカーＫ１４及びｐ６３について陽性であり、ケラチノサイト系列が同定された（図３ｃ）。
【００８２】
４．ｈＥＳＣからｈＥＳＣ−ＥＣへの分化：
図４に図示したようにｈＥＳＣはｈＥＳＣ−ＥＣへと分化した。発明者は、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦ６の調節を通じて側部及び沿軸中胚葉サブタイプに誘導し得るグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ３）の短期阻害を通じたｈＥＳＣの原条様段階（ＰＳ）への分化を効率的に推進する新規なプロトコルを以前に確立している。発明者は、図４ａで略述したように、基質としてのヒト血漿フィブロネクチン（マトリゲルの代わり）上でのｈＥＳＣの分化、またＶＥＧＦを使用した血管系列（側板中胚葉派生物）への誘導に先立った短期ｂＦＧＦパルス（２４時間）を介した中胚葉に向けたｈＥＳＣ由来ＰＳ細胞の分化（ＣＨＩＲ９９０２１を使用した２４時間にわたるＧＳＫ３阻害）の推進により以前のプロトコルを改変した。分化から５日後、ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋細胞（ｈＥＳＣ−内皮前駆細胞）をＦＡＣＳでソートし、フィブロネクチンコートプレート上に播種し、更にｈＥＳＣ−ＥＣへと、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを補充したＥＳＦＭにおいて分化させた（図４ｂ〜ｃ）。最終分化した細胞は丸石形態となり、内皮マーカーＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン及びフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）を発現した（図４ｄ〜ｈ）。加えて、ＥＣは、自己組織化して血管索（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｒｄ）様構造体をマトリゲル上で形成する能力を示した（図４ｈ）。要約すると、これらの発見は、フィーダーフリー及び無血清条件下でのｈＥＳＣからｈＥＳＣ−ＥＣへの分化を示している。
【００８３】
５．ｈＥＳＣのｈＥＳＣ−ｖＳＭＣへの分化：
図５に図示したように、ｈＥＳＣはｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ（又はｈＥＳＣ−周皮細胞）へと分化した。図５ａで略述したように、ｈＥＳＣは血管系列に向かって、ＣＨＩＲ９９０２１（５μＭ）、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦでの連続的な処理を介して分化した。分化から５日後、ＰＤＧＦＲβ＋ＣＤ３４−ＣＤ３１細胞（ｈＥＳＣ−沿軸中胚葉前駆細胞）をＦＡＣＳでソートし（図５ｂ〜ｃ）、フィブロネクチンコートプレート上に播種し、更にｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ／周皮細胞へと、ＰＤＧＦｂｂ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを補充したＳＦＭにおいて分化させた。最終分化した細胞は紡錘形状の形態となり、ｖＳＭＣマーカーアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及びカルポニン（ＣＮＮ１）を発現した（図５ｄ〜ｉ）。要約すると、これらの発見は、フィーダーフリー及び無血清条件下でのｈＥＳＣからｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ（又はｈＥＳＣ−周皮細胞）への分化を示している。
【００８４】
６．三次元インビトロ血管新生化皮膚等価物の作製
方法セクションで言及したように、三次元インビトロ血管新生化皮膚等価物を、血管新生化真皮等価物、続いて表皮を連続的に発達させることで作製した。血管新生化真皮等価物は、ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−ＦｉｂをスキャフォールドとしてのＰＥＧ−フィブリンゲル内に閉じ込めることで作製した。次に、血管新生化真皮等価物をｈＥＳＣ−ＫＣの播種により上皮で覆い、空気／液体界面で培養した。空気／液体界面での３週間にわたる培養後、三次元共培養物をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ−Ｅ）染色した断面は表皮及び真皮の存在を示した。表皮はケラチノサイトの重層化層及び角化から成り、真皮は微小血管系及び線維芽細胞の存在を示した（図６ａ）。三次元インビトロ血管新生化皮膚等価物のホルマリン固定パラフィン包埋断面の免疫蛍光染色は、Ｋ１４の発現を示した（図６ｂ）。血管系の存在を視覚化するために、三次元インビトロ血管新生化皮膚等価物を真皮側で横方向に切断した。これらの横方向切断片のＨ−Ｅ染色は、微小血管チャネルの相互接続網の存在を示した（図６ｃ）。更に、これらの横方向切断片の免疫蛍光染色は、微小血管チャネルの周囲に沿ったｖＷＦ発現ｈＥＳＣ−ＥＣ及び真皮の細胞外マトリックスの微小血管チャネル外側でのカルポニン（ＣＮＮ１）発現ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣの存在を示した（図６ｄ）。
【００８５】
７．三次元インビトロ血管新生化粘膜等価物の作製：
方法セクションで言及したように、三次元インビトロ血管新生化粘膜等価物を、血管新生化組織等価物、続いて粘膜上皮を連続的に発達させることで作製した。血管新生化組織等価物は、上述したように、ｈＥＳＣ−ＥＣ、ｈＥＳＣ−ｖＳＭＣ及びｈＥＳＣ−ＦｉｂをスキャフォールドとしてのＰＥＧ−フィブリンゲル内に閉じ込めることで作製した。次に、血管新生化組織等価物をｈＥＳＣ−口腔ＫＣの播種により上皮で覆い、空気／液体界面で培養した。空気／液体界面での３週間にわたる培養後、三次元共培養物をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ−Ｅ）染色した断面は、口腔粘膜を代表する、角質化していない重層化した扁平上皮の存在を示した。上皮の下の組織は微小血管系及び線維芽細胞の存在を示す（図７ａ）。三次元インビトロ血管新生化粘膜等価物のホルマリン固定パラフィン包埋断面の免疫蛍光染色は、Ｋ１４及びＫ１０の発現を示した（図７ｂ）。血管系の存在を視覚化するために、三次元インビトロ血管新生化粘膜等価物を、基底膜マーカーコラーゲンタイプ−ＩＶ及びフィブロネクチンについて免疫染色した。免疫蛍光染色は、微小血管チャネルの壁に沿った及び上皮と上皮下組織との接合部でのコラーゲン−ＩＶ及びフィブロネクチンの発現を示した（図７ｃ）。
【００８６】
８．初代細胞株ベースモデル：
図８（Ａ）は初代細胞の単層の免疫蛍光染色を表したものであり、線維芽細胞におけるビメンチン、内皮細胞におけるフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、平滑筋細胞／周皮細胞における平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、口腔−ケラチノサイトにおけるＫ１９及び皮膚−ケラチノサイトにおけるＫ１４の発現を強調している。図８（Ｂ）は、血管新生化前粘膜及び血管新生化前皮膚組織等価物のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色片の顕微鏡画像である。組織等価物は、非角質化重層化層（粘膜モデル）及び角質化重層化層から成る（皮膚モデル）。矢印は血管の存在を表し、組織に血管が新生されたことを示す。
【実施例】
【００８７】
９．
実施例１：内皮細胞の退縮を研究するためのモデルとしてのインビトロ血管新生化組織等価物
血管の発達において、壁細胞（周皮細胞）のリクルートメントの不在は、早期内皮血管の退縮と関連がある9。内皮退縮を調査及びモデル化するために、発明者はｈＥＳＣ−ＥＣ（ｅＧＦＰ標識）だけをＰＥＧ−フィブリンゲル内で培養した。これは後出の形態学的な変化と関連づけられた（図９ａ）。培養から１日後、殆どのｈＥＳＣ−ＥＣがおおむね丸くなるが、わずかな比率のＥＣは細長い細胞質を示し、これは内皮発芽を意味している。しかしながら、培養から４日後、ｈＥＳＣ−ＥＣはＥＣの短い吻合索を細胞間組織化を通じて形成し、培養６日目には、内皮索の数、長さ及び複雑性が減少し始め、小さい内皮索及び円形細胞はごくわずかとなった（図９ｂ）。培養８、９日目には、共焦点顕微鏡で可視化できる細胞は見えなくなり、これは血管チャネルの形成を支えるｈＥＳＣ−ＥＣの欠如を示し、内皮索の退縮を実証している。従って、このインビトロヒト血管新生化組織等価物モデルは、胚発生及び腫瘍血管新生で観察される内皮退縮を研究するための道を開く。
【００８８】
実施例２：血管発達の動態の実証
発達中の内皮血管への壁細胞のリクルートメントは、血管網の形成、成熟化及び安定化にとって極めて重要であることは知られている9。血管発達の動態を研究するために、ｈＥＳＣ−ＥＣ（ｅＧＦＰ標識）をｈＥＳＣ−周皮細胞（ＤｓＲｅｄ２標識）とＰＥＧ−フィブリンゲル内で共培養し、共焦点顕微鏡を使用して３週間にわたって撮像した。共培養ゲルにおいて、ｈＥＳＣ−ＥＣはしっかりとした微小血管網を形成し、これは４日目までの数の少ない細長い内皮索として始まり、続いて、数、長さ、枝、吻合及び複雑性が培養日数が増えるにつれ目に見えて増加した（図９ｃ）。更に、これらの二細胞微小血管網は、ほぼ連続的で連結された管腔の形成のエビデンスを有し、また培地で３週間にわたって安定していた（図９ｂ）。従って、このインビトロヒト血管新生化組織等価物モデルは、血管発達の動態を研究する道を開く。更に、血管新生を標的にした薬物（阻害剤／刺激剤）の血管発達及び形態形成の動態への影響を研究するのに使用し得る。まとめると、これらの発見は、微小血管網のフラクタル次元を量的及び質的に評価するためのインビトロモデルとしての三次元インビトロ血管新生化組織等価物の有用性を立証している。インビトロ三次元血管オルガノイドは、インビトロでの新規の血管新生促進性及び阻害性化合物の高スループットスクリーニング用の組織微小血管系の生理学的三次元モデルとして利用できる可能性がある。
【００８９】
実施例３：内皮細胞が血管発達に及ぼす影響の調査
発明者は、ｈＥＳＣ−ＥＣ対ｈＥＳＣ−周皮細胞比を一定に維持しつつ（２０：１）ｈＥＳＣ−ＥＣの播種密度を変化させることで、内皮細胞が血管形態形成に及ぼす影響も分析した。ＥＣ対ｖＳＭＣ／周皮細胞比は、身体における組織に応じて１：１〜１００：１であると報告されている10。この研究において、発明者は、全ての実験に固定比２０：１（ＥＣ対周皮細胞）を用いた。ｈＥＳＣ−ＥＣは、約６日以内に器官型の微小血管チャネルの吻合網を形成した。ｈＥＳＣ−ＥＣの最初の播種密度に応じて、微小血管構造体は延び、分岐し、吻合して微小血管網となった。更なる実験のために、血管網の全長、管総数及び微小血管網内の分岐点数を含めた微小血管網に関する様々なパラメータを用いて、ｈＥＳＣ−ＥＣの最適な密度を絞った。内皮細胞播種密度の研究から、管の全長、管数及び分岐点数は、最初のｈＥＳＣ−ＥＣ播種密度の上昇に伴って著しく増加することが判明した（図９ｃ）。３ｘ１０6のｈＥＳＣ−ＥＣ／ｍＬの濃度で、ｈＥＳＣ−ＥＣは多数の長く細い索を形成したが、培養４日を超えては生存せず、マトリックスは崩壊の兆候を示した。これらの観察結果は明らかに、増殖因子及び栄養分をめぐっての競合、またｈＥＳＣ−血管細胞によるマトリックスの過剰な再構築に起因するものであろう。他方、低濃度（＜１０００００個の細胞／ｍＬ）では、マトリックス全体の特定の領域に限定された、血管構造体の限局的な成長だけが観察された。
【００９０】
全体として、これらの結果は、これらのインビトロ血管新生化組織等価物モデルを使用してヒトの血管発達をインビトロで研究できることを実証している。これらの応用例は、これらの血管新生化組織等価物の、血管新生を標的にした薬物（阻害剤及び刺激剤）を試験するための新規なインビトロツールとしての能力を実証している。
【００９１】
実施例４：血管透過性の調査
ＥＣの重要な役割はしっかりとした動的障壁を維持することで、血管の腔内及び腔外コンパートメント間での流体、分子及び細胞の輸送を調節することである。ＥＣの単層は比較的巨大分子（１〜１００ｋＤａ）に対して不透過性であり、＜１％フラックスである11。移植した微小血管の透過性をインビボで評価するために、研究では、蛍光トレーサー及び／又は非侵襲的ライブイメージングを用いる12。透過性試験のインビトロ等価物では典型的には、トランスウェルシステムにおいて、ＥＣの２次元単層（サポートする壁細胞の存在なし）を挟んでの経内皮抵抗性を測定する13。あるいは、蛍光／放射性同位体標識化学物質の透過を用いることで、内皮単層を挟んでの化学物質の動きを評価し得る。
【００９２】
１０．三次元血管新生化組織等価物内での血管チャネルの透過性を評価するという概念実証として、発明者は、逆透過性の原理を利用した。逆透過性の原理とは、成熟した微小血管は、分子量６５ｋＤａを超えるデキストランを透過せず、トレーサーは漏出性の血管チャネルの管腔内に進入できるかもしれないが、成熟した適格な細胞間内皮接合部を備えた血管チャネルには進入できないというものである。巨大分子に対する内皮透過性は、ヒスタミン、プロスタグランジンＥ２、スフィンゴシン−２−ホスフェート及び環状アドレノメデュリン等の多種多様な化合物に曝露されると大幅に上昇する。発明者は、逆透過性法を適合させることでｈＥＳＣ由来インビトロ三次元血管新生化組織等価物内での微小血管網の障壁特性を評価した。テキサスレッド（７０ｋＤａ）にコンジュゲートさせたデキストランを、微小血管の透過性を評価するためのトレーサー色素として使用した。トレーサー色素とのインキュベーション後の三次元構築物の共焦点イメージングは、赤色トレーサー色素が血管外空間（血管の外側）に制限されたことで実証されるように、微小血管の殆どが色素に対して不透過性であることを明らかにした（図１０ａ〜ｃ）。他方、構築物をヒスタミンとプレインキュベートしたところ、血管管腔内のトレーサー色素凝集体の存在により立証されるように、微小血管チャネルの透過性は著しく上昇した（図１０ｄ〜ｆ）。微小血管チャネルのトレーサー色素に対する不透過性及びヒスタミン等の生理学的な刺激に応答した漏出性の上昇は、三次元インビトロ血管新生化組織等価物の成熟度及び機能性も明らかにしている。まとめると、これらの発見は、血管透過性を質的に評価するためのインビトロモデルとしての三次元インビトロ血管新生化組織等価物の有用性を立証しており、血管関係薬物の高スループットスクリーニング用の組織微小血管系の生理学的三次元モデルとして利用できる可能性がある。
【００９３】
結論
結論として、ＰＥＧ−フィブリンゲルにおける１つのソース（ｈＥＳＣ）から分化した４つの異なる細胞型の共培養を用いて、発明者は、三次元インビトロ血管新生化皮膚及び粘膜等価物を作製できることを実証した。ｈＥＳＣ起源の三次元インビトロ血管新生化皮膚及び粘膜等価物を開発したのは発明者が最初である。第二に、三次元インビトロ血管新生化皮膚及び粘膜等価物の作製に必要な４つの異なる細胞型を培養できることを実証したのは発明者が最初である。加えて、発明者は、自らのモデルを初代細胞株ベースモデルと比較し、ｈＥＳＣベースの三次元組織等価物のほうがより信頼性が高く、良好な組織生理機能が得られることを証明している。発明者は、このテクノロジーを初代細胞、ヒト成体幹細胞及び人工多能性幹細胞でシミュレートできると固く信じている。
【００９４】
［参考文献］
2018518970.tif 000003
【図１】
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【図２】
2018518970.tif 000005
【図３】
2018518970.tif 000006
【図４】
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【図５】
2018518970.tif 000008
【図６】
2018518970.tif 000009
【図７】
2018518970.tif 000010
【図８】
2018518970.tif 000011
【図９】
2018518970.tif 000012
【図１０】
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【国際調査報告】
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2018518970.tif 000015
2018518970.tif 000016
2018518970.tif 000017
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