(57)【要約】  本発明は、特定のCD95L抗体に、及びCD95L誘導性シグナル伝達が関与する疾患、例えばがん疾患の処置又は診断におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列RNSKYP、好ましくはRNSKYPQ又はRNSKYPQDを含むヒトCD95Lのエピトープに特異的に結合し、CD95L誘導性シグナル伝達を阻害することにより特徴付けられる、モノクローナル抗CD95L抗体。
【請求項２】
異なる種に由来するCD95L、特にヒトCD95L、並びにサル及びマウスCD95Lの少なくとも一方に特異的に結合する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
CD95Lの受容体結合ドメイン(細胞表面及び可溶性CD95Lにおける)と特異的に相互作用する、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
完全長免疫グロブリン又はFab、Fab'、F(ab')2、Fv、単一鎖抗体(scFv)及び単一ドメイン抗体からなる群から選択される機能的な免疫グロブリン断片である、請求項1から3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号1又は11に示されるCDRH1、配列番号2又は12に示されるCDRH2、及び配列番号3又は13に示されるCDRH3を含む重鎖アミノ酸配列、並びに
配列番号4又は14に示されるCDRL1、配列番号5又は15に示されるCDRL2、及び配列番号6又は16に示されるCDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
(i)配列番号1に示されるCDRH1、配列番号2に示されるCDRH2、及び配列番号3に示されるCDRH3を含む重鎖アミノ酸配列並びに配列番号4に示されるCDRL1、配列番号5に示されるCDRL2、及び配列番号6に示されるCDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列又は
(ii)配列番号11に示されるCDRH1、配列番号12に示されるCDRH2、及び配列番号13に示されるCDRH3を含む重鎖アミノ酸配列並びに配列番号14に示されるCDRL1、配列番号15に示されるCDRL2、及び配列番号16に示されるCDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列
を含む、請求項5に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
少なくとも
配列番号7又は17のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号8又は18のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
配列番号9又は19の重鎖アミノ酸配列、及び
配列番号10又は20の軽鎖アミノ酸配列、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
ヒト化又はヒト抗体である、請求項1から8のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
少なくとも
配列番号30又は31又は32のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号33のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
配列番号59又は配列番号60のヒトIGG1重鎖スキャフォールドに融合した、配列番号30又は31又は32のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号36の軽鎖アミノ酸配列、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
配列番号34又は35の重鎖アミノ酸配列、及び
配列番号36の軽鎖アミノ酸配列、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
少なくとも
配列番号41、42又は43のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
配列番号59又は配列番号60のヒトIGG1重鎖スキャフォールドに融合した、配列番号41又は42又は43のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
配列番号47の軽鎖アミノ酸配列、
又はそれに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
配列番号45又は46の重鎖アミノ酸配列、及び
配列番号47の軽鎖アミノ酸配列、
又は少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
配列番号37、38、39、40、48、49、50又は51から選択される配列を有するモノクローナル単一鎖抗体。
【請求項１７】
標識又はエフェクター基が抗体に共有結合している、請求項1から16のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
(a)請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列、
(b)(a)における配列のいずれか1つに相補的な核酸配列、及び
(c)ストリンジェントな条件下で(a)又は(b)にハイブリダイズする能力のある核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１９】
配列番号21及び22に示される又は配列番号23及び24に示される核酸配列を含む、請求項18に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
請求項18又は19に規定の核酸配列を含むベクター。
【請求項２１】
請求項18若しくは19に規定の核酸配列又は請求項20に規定のベクターを含む宿主若しくは宿主細胞。
【請求項２２】
自己免疫障害、AIDS、心臓障害、例えば、心筋梗塞、移植片対宿主障害、移植拒絶、脳損傷、例えば、発作、脊髄損傷、敗血症、肝炎、炎症、虚血性再潅流傷害、腎臓障害に関連する障害、及び過剰増殖性障害、特にがん、例えば、固形がんから選択される疾患の処置における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は請求項18若しくは19に記載の核酸分子。
【請求項２３】
免疫療法剤、例えば、抗PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及び/又は抗-CTLA-4抗体との組合せのがん処置のための、請求項1から17のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は請求項11若しくは12に記載の核酸分子。
【請求項２４】
請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体又は請求項18若しくは19に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、特定のCD95L抗体、及びCD95L誘導性シグナル伝達が関与する疾患、例えばがん疾患の処置又は診断におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の分野は、がん療法及びがん診断の改善において特に認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2014/177576
【特許文献２】US8147843B2
【特許文献３】US008580273B2
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Harlow and Lane (EDS.)、Antibodies: A Laboratory Manual、CSHL Press、Cold Spring Harbour、N.Y.、1988
【非特許文献２】Hudsonら、Nat. Met. 9: 129〜134頁(2003)
【非特許文献３】Van Dijk and Van De Winkel (Car. Opin. Pharmacol. 5: 368〜74頁(2001))
【非特許文献４】Lonberg (Car. Opin. Immunol. 20: 450〜459頁(2008))
【非特許文献５】Alamagro and Fransson、Front. Biosci. 13: 1619〜1633頁(2008)
【非特許文献６】Reinike W.、Methods Mol. Biol.、2004、248: 443〜63頁
【非特許文献７】Wangら、Int. J. Cancer、2001、June 15、92(6): 871〜6頁
【非特許文献８】Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Ed Harlow and David Lane (1988)
【非特許文献９】Sambrookら、「Expression of cloned Genes in E. coli」  in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、USA
【非特許文献１０】Sambrook、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001、3rd edition)、N.Y
【非特許文献１１】Ausubel、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y. (1994)
【非特許文献１２】Mouellic、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87 (1990)、4712〜4716頁; Joyner、Gene Targeting、A Practical Approach、Oxford University Press
【非特許文献１３】Scopes、「Protein Purification」、Springer-Verlag、N.Y. (1982)
【非特許文献１４】Prestaら、1997
【非特許文献１５】Adamsら、2006
【非特許文献１６】Olafsenら、2004
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、CD95Lの直鎖状エピトープに特異的に結合し、CD95L誘導性シグナル伝達を阻害する能力のある、モノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体が、CD95/CD95Lによって誘導されるシグナル伝達を、CD95/CD95Lの以前から公知のアンタゴニスト、特に他の抗CD95L抗体、可溶性CD95分子又はAPG101様の融合タンパク質よりも、より高い有効性で阻害することが見出されたことは、驚くべきことであった。
【０００６】
したがって、本発明の第1の態様は、アミノ酸配列NSKYPを含むヒトCD95Lのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗CD95L抗体である。
【０００７】
結合エピトープは、多くの異なる種のCD95L中に見出される、アミノ酸配列RNSKYP、好ましくはRNSKYPQを含む。好ましくは、抗体は、アミノ酸配列RNSKYPQD及び/又はRNSKYPEDを含むCD95Lの直鎖状エピトープに結合する。ヒトCD95L並びにカニクイザル(Macaca fascicularis)等のサルからのCD95LはエピトープRNSKYPQDを含むが、マウス(mus musculus)からのマウスCD95LはエピトープRNSKYPEDを含む。本発明の好ましい態様によると、抗体は、異なる種、例えばヒト、サル及びマウスに由来するCD95Lに特異的に結合する能力がある。抗体は、ヒトCD95L、並びにサル(例えば、カニクイザル)及びマウスCD95Lの少なくとも一方に、より好ましくはヒト、サル及びマウスCD95Lに特異的に結合することが好ましい。
【０００８】
「抗体」の用語は、特に、少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖及び少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖を含む分子を指す。各重鎖及び軽鎖は、可変及び定常ドメインを含んでもよい。抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインから形成されてもよい。可変領域(可変ドメインとも呼ばれる)は、相補性決定領域(CDR)、例えばCDR1、CDR2及びCDR3領域並びにCDRに隣接するフレームワーク領域(FR)を含む。
【０００９】
「相補性決定領域」の用語は、当業者によって容易に理解され(例えば、Harlow and Lane (EDS.)、Antibodies: A Laboratory Manual、CSHL Press、Cold Spring Harbour、N.Y.、1988を参照されたい)、主として抗原と接触させ、抗体特異性を決定する、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸のストレッチを指す。この領域は、超可変領域としても公知である。
【００１０】
本発明は、完全長免疫グロブリン並びにFab、Fab'、F(ab')2断片、Fv断片、ディアボディー、単一鎖抗体分子及び単一ドメイン抗体のような機能的な免疫グロブリン断片の両方を包含する。アミノ酸配列「RNSKYP」を含むヒトCD95Lのアミノ酸214〜219、好ましくはアミノ酸配列「RNSKYPQ」を含むアミノ酸214〜220、及び最も好ましくはアミノ酸配列「RNSKYPQD」を含むアミノ酸214〜221を含むエピトープに結合する所望の能力を示す限り、他の断片も含まれる。特定の抗体断片の総説に関して、Hudsonら、Nat. Met. 9: 129〜134頁(2003)を参照されたい。
【００１１】
「ディアボディー」は、二価又は二重特異性であり得る2つの抗原結合部位を有する抗体断片である(例えば、Hudsonら、2003を参照されたい)。「単一鎖抗体」は、抗体の全ての又は一部の重鎖可変ドメイン、又は全ての又は一部の軽鎖可変ドメインを含む抗体断片である。抗体断片は、本明細書に記載される、無傷の抗体のタンパク分解消化並びに組換え宿主(例えば、大腸菌(E-coli)又はファージ)による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作り出され得る。
【００１２】
ヒト抗体も本発明に包含される。「ヒト抗体」の用語は、任意の完全ヒト又はヒト化抗体の包含を意味する。ヒト抗体は、公知の技術に従って遺伝的に操作された動物、例えば異種免疫系を含む動物から又は抗体ディスプレイライブラリーから調製され得る。ヒト抗体は、Van Dijk and Van De Winkel (Car. Opin. Pharmacol. 5: 368〜74頁(2001))並びにLonberg (Car. Opin. Immunol. 20: 450〜459頁(2008))に一般に記載される。
【００１３】
ヒト化抗体は、公知の技術に従って他の種(例えばマウス、ラット、ウサギ)に由来するモノクローナル抗体のヒト化によって調製され得る。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低下させるためヒト化されるが、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持している。ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Alamagro and Fransson、Front. Biosci. 13: 1619〜1633頁(2008)に総説が記述されている。
【００１４】
本発明の抗体は、ヒトCD95Lのアミノ酸配列RNSKYP、好ましくはRNSKYPQ及びより好ましくはRNSKYPQDを含むCD95Lのエピトープに特異的に結合することにより特徴付けられる。この結合エピトープは、CD95L誘導性シグナル伝達を阻害するための適合性に関して独特であることが示されている。このエピトープに結合する抗体は、CD95LのCD95受容体に対する結合と直接的に競合する。アポトーシスに次いで、対応する受容体CD95は、組織及び状態に応じて、炎症を促進する、発癌に寄与する、且つ免疫学的パラメータをモジュレートする(例えば、腫瘍浸潤T細胞集団)、非アポトーシスシグナル(例えば、NF-kB、MAPK又はPI3K)を媒介する。これらの活性の全ては、本明細書に記載される抗体によって潜在的に阻害される。
【００１５】
抗体の「結合(bind)」又は「結合(binding)」の用語は、標的抗原(すなわち、本明細書に記載されるエピトープを含有する、その断片を含むヒトCD95L)との又は標的抗原に対する少なくとも一時的な相互作用又は会合を意味する。特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8Mから10-13M、例えば、10-9Mから1013M)の解離定数(Kd)を有する。Kd値を決定する方法は、当業者に公知である。
【００１６】
一実施形態において、Kdは、目的の抗体のFabバージョン及びその抗原で行われる放射性標識抗原結合アッセイ(ラジオイムノアッセイ、RIA)によって測定される。
【００１７】
別の実施形態によると、Kdは、固定化された抗原での表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。別の実施形態によると、Kdは、固定化された抗原での水晶発振子微量天秤(QCM)によって測定される。本発明の好ましい実施形態によると、抗体は、本明細書に記載される、ヒトCD95Lのエピトープに対するヒトモノクローナル抗体である。
【００１８】
本発明の抗体は、様々な免疫グロブリン(Ig)型のもの、例えば、IgA-、IgD-、IgE-、IgG-又はIgM-型、好ましくは、IgG1-、IgG2-、IgG3-、IgG4-、IgM1及びIgM2-型を含むが、これらに限定されない、IgG-又はIgM-型のものであってもよい。1つの好ましい実施形態において、抗体は、IgG1型のものである。
【００１９】
好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２０】
本発明の特定の実施形態において、抗体は、特異的な重鎖相補性決定領域CDRH1、CDRH2及び/又はCDRH3を含んでもよい。本明細書に記載されるCDR配列は、Kabatスキームを使用して番号付けされる。
【００２１】
一実施形態において、抗体は、
配列番号1又は11に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
配列番号2又は12に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、及び/又は
配列番号3又は13に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域3(CDRH3)を含む重鎖
を含む。
【００２２】
本発明による抗体は、特異的な軽鎖相補性決定領域CDRL1、CDRL2及び/又はCDRL3も含み得る。したがって、一実施形態において、抗体は、
配列番号4又は14に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
配列番号5又は15に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、及び/又は
配列番号6又は16に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)を含む軽鎖
を含む。
【００２３】
好ましい実施形態において、抗体は、特定の組合せのCDRを1つの重鎖内に及び/又は1つの軽鎖内に含む。したがって、本発明の特に好ましい抗体は、
配列番号1又は11に示されるCDRH1、
配列番号2又は12に示されるCDRH2、及び
配列番号3又は13に示されるCDRH3を含む重鎖、並びに
配列番号4又は14に示されるCDRL1、
配列番号5又は15に示されるCDRL2、及び
配列番号6又は16に示されるCDRL3を含む軽鎖
を含む。
【００２４】
配列番号1に示されるCDRH1、配列番号2に示されるCDRH2、及び配列番号3に示されるCDRH3を含む重鎖並びに配列番号4に示されるCDRL1、配列番号5に示されるCDRL2、及び配列番号6に示されるCDRL3を含む軽鎖を含む抗体が好ましい。
【００２５】
配列番号11に示されるCDRH1、配列番号12に示されるCDRH2、及び配列番号13に示されるCDRH3を含む重鎖並びに配列番号14に示されるCDRL1、配列番号15に示されるCDRL2、及び配列番号16に示されるCDRL3を含む軽鎖を含む抗体も好ましい。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、抗CD95L抗体は、配列番号7又は17に示される重鎖可変領域(VH)又は全重鎖可変領域に渡って少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%配列同一性、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%又は99%配列同一性を有する配列を含む。更にまた、本発明の抗体は、配列番号8又は18に示される軽鎖可変領域(VL)又は全軽鎖可変領域に渡って少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%配列同一性、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%又は99%配列同一性を有する配列を好ましくは含む。配列番号7又は17に示される重鎖可変領域及び配列番号8又は18に示される軽鎖可変領域を含む抗体が特に好ましい。
【００２７】
好ましくは、本発明の抗体は、配列番号7に示される重鎖可変領域及び配列番号8に示される軽鎖可変領域又は配列番号17に示される重鎖可変領域及び配列番号18に示される軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
本発明の特に好ましい実施形態によると、本発明の抗体は、配列番号9又は19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して全重鎖アミノ酸配列に渡って少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖並びに配列番号10又は20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して軽鎖アミノ酸配列の全長に渡って少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。重鎖及び軽鎖アミノ酸配列の配列同一性は、配列番号9、10、19及び20に示される配列に対して、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%又は99%である。配列番号9に示される重鎖アミノ酸配列及び配列番号10に示される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体並びに配列番号19に示される重鎖アミノ酸配列及び配列番号20に示される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体が最も好ましい。
【００２９】
本発明の好ましいヒト化抗体
抗体によって認識されるヒトCD95Lにおけるエピトープを決定するため、ヒトCD95Lのアミノ酸配列に由来する短いペプチドの化学的に調製されるアレイを使用して、抗体エピトープの位置を突きとめること及び同定することができる(Reinike W.、Methods Mol. Biol.、2004、248: 443〜63頁)。本発明の抗体によって結合されるヒトCD95L中のエピトープをマップするためのさらなる方法には、Snaps/SELDI (Wangら、Int. J. Cancer、2001、June 15、92(6): 871〜6頁) が含まれ、又は例えばAntibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるルーチンのクロスブロッキングアッセイを行うことができる。
【００３０】
上で言及されるように、本発明の抗体は、それらの結合特異性及び生物活性に関して、特にそれらのCD95L誘導性シグナル伝達を阻害する能力に関して有利な特性を示す。
【００３１】
本発明の抗体は、異種性の基、例えば標識又はエフェクター基に結合させてもよい。
【００３２】
エフェクター基に結合させる本発明の抗体を含む抗体コンジュゲートは、治療適用のため特に適切である。本明細書で使用される、「エフェクター基」の用語は、治療基(therapeutic group)、トキシン、細胞傷害性基、抗原又は当技術分野において公知である他のエフェクター基を指す。
【００３３】
標識基(label group)に結合させる本発明の抗体を含む抗体コンジュゲートは、診断適用のため特に適切である。本明細書で使用される、「標識基」の用語は、検出可能なマーカー、例えば放射標識アミノ酸又はビオチン部分、蛍光マーカー、酵素又は当技術分野において公知である任意の他のタイプのマーカーを指す。
【００３４】
本発明はまた、上で開示される抗体をコードする核酸分子に関する。「核酸分子」の用語は、DNA、例えば一本又は二本鎖DNA又はRNAを包含する。DNAは、ゲノム、cDNA又は合成起源のもの、又はその組合せであってもよい。本発明の核酸分子は、発現制御配列、すなわちコード核酸配列の発現に影響するため必要である配列、に対して作動可能な連結にあってもよい。このような発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位及び/又は転写終結配列を含み得る。適切な発現制御配列の特定の例は、当技術分野において公知である。
【００３５】
好ましい実施形態によると、本発明は
(a)上で規定される、抗体、又はその機能的な断片をコードする核酸配列、
(b)(a)における配列のいずれか1つに相補的な核酸配列、及び
(c)ストリンジェントな条件下で(a)又は(b)にハイブリダイズする能力のある核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
【００３６】
本発明の特に好ましい実施形態によると、核酸分子は、抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする配列及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードする配列を含む。代替実施形態において、2つの核酸分子の組合せが提供され、ここで、一方の核酸分子は、抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、他方の核酸分子は、抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードする。本発明の好ましい核酸分子は、配列番号21〜24のいずれか1つに示される核酸配列を含む単離された核酸分子である。例えば、単離された核酸分子は、配列番号21及び22に示される核酸配列又は配列番号23及び24に示される核酸配列を含んでもよい。
【００３７】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」の用語は、2つの核酸断片が、例えば、Sambrookら、「Expression of cloned Genes in E. coli」in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、USAに記載されている標準ハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることを意味する。このような条件は、例えば、約45℃で6.0 x SSC(クエン酸ナトリウム塩溶液)中でのハイブリダイゼーション、続いて50℃で2.0 x SSC、好ましくは65℃で2.0 x SSC又は50℃で0.2 x SSC、好ましくは65℃で0.2 x SSCでの洗浄工程である。
【００３８】
本発明の核酸分子は、複製開始点及び/又は選択マーカー遺伝子を更に含有し得るベクターに位置し得る。ベクターの例は、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等である。したがって、本発明のさらなる実施形態は、本明細書で開示される核酸配列を含むベクターである。好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。前記ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス性又はレトロウイルス性ベクターであってもよい。レトロウイルス性ベクターは、複製可能(replication competent)又は複製欠陥性(replication defective)であってもよい。後者の場合では、ウイルス繁殖は、一般に補完する宿主/細胞においてのみ起こる。
本発明の核酸分子は、宿主における繁殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに連結し得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物若しくは塩化ルビジウム沈殿物等の沈殿物中に又は荷電脂質との複合体中に又はフラーレン等の炭素ベースクラスター中に導入される。ベクターがウイルスであれば、ベクターは宿主細胞への適用前に適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ得る。
【００３９】
好ましくは、本発明のベクターは、核酸分子が、1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結され、原核生物及び/又は真核生物宿主細胞における転写及び任意選択で発現を可能にする、発現ベクターである。前記核酸分子の発現は、好ましくは、翻訳可能なmRNAへの核酸分子の転写を含む。真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞において発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。それらには、転写の開始を確実にする調節配列並びに任意選択で転写の終結及び転写物の安定化を確実にするポリAシグナルが、通常含まれる。追加の調節エレメントは、転写並びに翻訳エンハンサーを含み得る。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシ乳頭腫ウイルス等のウイルスに由来する発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド又はベクターの標的細胞集団への送達のため使用し得る。当業者に周知である方法を使用して、組換えウイルスベクターを構築することができる;例えば、Sambrook、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001、3rd edition)、N.Y.及びAusubel、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y. (1994)に記載される技術を参照されたい。或いは、本発明の核酸分子は、標的細胞に対する送達のためリポソーム中に再構成することができる。
【００４０】
更に、本発明は、上で記載される核酸分子又はベクターを含む宿主を指す。核酸分子又はベクターは、当技術分野において公知である任意の方法に従って形質転換、トランスフェクション又は形質導入によって宿主に導入され得る。
【００４１】
前記宿主は、原核生物若しくは真核生物細胞又は非ヒトトランスジェニック動物であってもよい。宿主中に存在する本発明の核酸又はベクターは、宿主のゲノムに組み込まれ得る又は染色体外で維持され得る。この点で、本発明の核酸分子が、相同的組換えを介して、変異体遺伝子を復元するため又は変異体遺伝子を作出するため、「遺伝子ターゲティング」及び/又は「遺伝子置換」に使用することができることも理解される;例えば、Mouellic、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87 (1990)、4712〜4716頁; Joyner、Gene Targeting、A Practical Approach、Oxford University Pressを参照されたい。
【００４２】
宿主は、任意の原核生物又は真核生物細胞、例えば細菌、昆虫、真菌、植物、動物、哺乳動物、又は好ましくはヒト細胞であってもよい。形質転換された宿主は、至適な細胞成長を達成させるため当技術分野において公知である技術に従って、発酵槽中で成長させ、培養することができる。本発明の抗体、抗体断片又はその誘導体は、次に、成長培地、細胞溶解物又は細胞膜画分から単離することができる。本発明の微生物で又はその他で発現させた抗体、抗体断片又はその誘導体の単離及び精製は、調製用クロマトグラフィー分離及び免疫学的な分離、例えばモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を伴うもの等の、任意の従来の手段によるものでもよい。
【００４３】
本発明の一実施形態によると、宿主は、ヒト、細菌、動物、真菌、両生類又は植物細胞である。好ましい動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、マウス胚性線維芽細胞(NIH-3T3)及びヒト細胞を含むいくつかの他の細胞株を含むが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、前記動物細胞は、CHO細胞である。
【００４４】
特に好ましい実施形態において、前記動物細胞は、ウサギ細胞である。好ましい昆虫細胞には、SF9細胞株からの細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の抗体は、前記抗体が上で本明細書に記載される宿主から得られる、方法によって調製され得る。したがって、本発明のさらなる実施形態は、抗体の調製のため、本発明の宿主細胞を、前記抗体の合成及び前記培養からの前記抗体の回収を可能にする条件下で培養することを含む方法である。
【００４６】
形質転換された宿主は、至適な細胞成長を達成させるため当技術分野における当業者に公知である技術に従って、発酵槽中で成長させ、培養することができる。加えて、効率的な発現及び新しく合成させたタンパク質のプロセシングは、シグナルペプチドのようなさらなるアミノ酸ドメインの存在に依存し得る。さらなる一実施形態において、本発明の抗体は、組換え発現後に宿主細胞からの分泌を可能にする、N末端シグナル配列を含んでもよい。シグナルペプチドが異種性であっても、多くの原核生物及び真核生物シグナルペプチドは機能上交換可能であり、当業者は使用される発現システムに従って適切なシグナルペプチドを選択する手段を知っている。したがって、非限定的な例として、配列番号52のシグナルペプチドを参照する。発現されたら、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は本発明の他の免疫グロブリン形態は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当技術分野の標準手順に従って精製することができる;Scopes、「Protein Purification」、Springer-Verlag、N.Y. (1982)を参照されたい。本発明の抗体又はその対応する免疫グロブリン鎖は、次に、成長培地、細胞溶解物又は細胞膜画分から単離することができる。本発明の例えば微生物で発現させた抗体又は免疫グロブリン鎖の単離及び精製は、調製用クロマトグラフィー分離及び免疫学的な分離、例えば、本発明の抗体の定常領域に対する、モノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を伴うもの等の、任意の従来の手段によるものでもよい。
【００４７】
本発明の抗体が、本明細書で規定される、他の部分、例えば、薬物ターゲティング及びイメージング適用、すなわちエフェクター基又は標識基に更に結合させることができることは当業者に明らかであろう。このような結合を付着側に対して抗体若しくは抗原を発現させた後に化学的に実施してもよく又は結合産物をDNAレベルで本発明の抗体若しくは抗原へと設計してもよい。DNAは次に適切な宿主システム中で発現され、発現させたタンパク質は収集され、必要に応じてリネーチャーされる。
【００４８】
一実施形態によると、上で記載される組換え細胞は、核酸分子をコードする抗体の発現を可能にする条件下で培養される。抗体は、培養細胞又は培養上清から収集され得る。好ましくは、抗体は、哺乳動物から、特にヒト細胞から調製される。別の好ましい実施形態において、抗体は、CHO細胞から調製される。
【００４９】
本発明のなおさらなる態様は、上で記載される抗体を、任意選択で薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物に関する。本発明によると、医薬組成物は、治療用途のため適合される。
【００５０】
「担体」の用語は、剤、例えば、希釈剤、安定化剤、アジュバント又は他のタイプの賦形剤を含み、これは用いられる用量及び濃度でそれに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。薬学的に許容される担体の例は、当技術分野において周知であり、リン酸緩衝塩溶液、水、エマルジョン剤、例えば油/水エマルジョン剤、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液等を含む。生理的に許容される担体の好ましい例には、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸(しかしながら、本発明の製剤について、リン酸緩衝液が好ましい);アスコルビン酸、低分子量(約10残基未満)ポリペプチドを含む酸化防止剤;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物、キレート剤、例えば、EDTA、糖、アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN、ポリエチレン又はポリエチレングリコールが含まれる。
【００５１】
医薬組成物は、周知の従来の方法、すなわち、活性薬剤と担体及び任意選択で製剤に通常組み入れられる他の剤を混合することによって製剤化され得る。
【００５２】
本発明の別の態様は、少なくとも1つのさらなる活性薬剤を含有する、上で記載される医薬組成物に関する。そのさらなる活性薬剤は、処置される徴候に応じて使用される。例えば、細胞傷害性剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン若しくはカルボプラチン、サイトカイン又は他の抗新生物剤は、がんの処置に使用され得る。特に、がん処置のため、公知の免疫療法剤との組合せが好ましい。この組合せには、抗PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及び抗-CTLA-4抗体のような剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
好ましい実施形態によると、本発明によるモノクローナル抗体又は医薬組成物は、CD95シグナル伝達経路を阻害するため使用することができる。特に、抗体又は組成物は、自己免疫障害、AIDS、心臓障害、例えば、心筋梗塞、移植片対宿主障害、移植拒絶、脳損傷、例えば、発作、脊髄損傷、敗血症、肝炎、NASH、炎症、虚血性再潅流傷害及び腎臓障害に関連する障害から選択される障害の予防及び/又は処置において使用することができる。当然ながら、本明細書に記載される組成物は、がん、好ましくは固形がん並びにリンパ腫の処置のため使用され得る。固形がんは、肉腫及び癌を含む。例えば、処置されるがんは、結腸、肺、乳房、膵臓、腎臓、結腸直腸、肝臓若しくはグリア芽細胞腫等の脳のがん及び/又はその転移であってもよい。或いは、処置されるがんは、リンパ球又は骨髄球起源のがんであってもよい。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、本発明のモノクローナル抗CD95L抗体を患者に投与する工程を含む、がんの処置の方法である。治療用途のため、CD95L抗体は、全身性に、例えば輸液又は注射によって投与することができる。
【００５５】
本発明の治療方法は、患者から得られたがん試料におけるCD95Lの発現を決定する先行する工程を好ましくは含む。このCD95L発現の程度によるがんの診断分類により、CD95Lを発現するがんを患っている患者のため適合させた治療が可能となる。本発明のモノクローナル抗CD95L抗体は、CD95Lの発現が、がん試料において検出されている場合に限り投与されることが好ましい。この戦略は有利である、その理由は、抗CD95L抗体が治療の成功を期待することができる患者のみに投与されるからである。これはCD95Lを発現していないがんを患っている患者に不利ではない、その理由は、これらの患者がCD95L阻害剤での処置からおそらく利益を得ないからである。
【００５６】
CD95Lの発現は、任意の公知の方法によって決定することができる。例えば、CD95L又はCD95L mRNAを決定することができる。適切な方法の好ましい例は、組織学的、組織化学的、免疫組織化学的及び/又はフローサイトメトリーベースの方法である。特に、がん試料におけるCD95Lの発現は、試料を、CD95Lに特異的に結合する剤と接触させることによって決定することができる。例えば、CD95Lに特異的に結合するCD95L阻害剤は、CD95Lの決定のため使用することができる。例示的なCD95L阻害剤は、抗体、可溶性CD95分子、融合タンパク質等を含む。適切な抗体は、公知の方法によって調製することができる。適切な抗体の例は、フローサイトメトリーベースの分析におけるCD95Lの検出のため適切な本発明のモノクローナル抗体である。CD95Lの細胞内エピトープに結合する、抗CD95L特異的抗体又はそのCD95L認識断片も好ましい。特に好ましい実施形態によると、抗CD95L特異的抗体又はそのCD95L認識断片は、ヒトCD95LのN末端13位におけるチロシン(Y)に結合する。特に好ましい実施形態によると、診断上の抗CD95L抗体又はそのCD95L認識断片は、ヒトCD95LのN末端アミノ酸13〜19を含むエピトープを認識する。適切な抗体の例は、WO2014/177576に記載される。
【００５７】
本発明の特に好ましい実施形態によると、本明細書に記載される抗体は、第1の工程においてCD95L発現の決定に使用することができ、CD95L発現が検出される場合、本発明の抗体は、第2の工程において治療目的のため使用することができる。
【００５８】
本発明において、CD95Lの発現は、任意の公知の適切な方法に、本発明の抗体を使用することによって決定される。例えば、決定には、上記の抗CD95L抗体を使用する、組織学的、組織化学的、免疫組織化学的(IHC)又は/及びフローサイトメトリーベースの方法が含まれ得る。免疫組織化学的な方法が特に好ましい。
【００５９】
本明細書に記載されるがんの分類に用いられる試料は、疾患の早期段階において得られ、パラフィン中に包埋され、保管された腫瘍組織、例えばバイオプシー又は手術材料であってもよい。
【００６０】
がん疾患は、CD95L発現のレベルによって、CD95L陽性がん疾患又はCD95L陰性がん疾患に分類することができる。
【００６１】
特に、CD95L陽性がん疾患は、細胞表面にCD95Lを発現する細胞によって特徴付けられる。しかしながら、本明細書に記載される方法も、CD95Lの細胞内エピトープの検出に基づき得る。
【００６２】
がん試料中の少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、又は少なくとも50%の細胞がCD95Lを発現する場合、がんはCD95L陽性とみなすことができる。CD95L陽性細胞の数は、顕微鏡切片中の細胞を計数することによって決定することができる。
【００６３】
CD95Lを発現する細胞が実質的に組織試料中に検出することができない場合又は試料がCD95L陽性試料について本明細書に規定される判定基準を満たさない試料(非陽性試料)である場合、CD95L発現は非存在(CD95L陰性)であると考えられる。CD95L陰性試料において、CD95Lを発現する腫瘍細胞の数は、CD95L陽性試料について本明細書に規定される閾値未満であってもよく、例えば、腫瘍細胞の1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、又は10%未満である。
【００６４】
CD95Lが、組織切片中の腫瘍組織の領域の少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、又は少なくとも50%において検出することができる場合、がんはまたCD95L陽性とみなすことができる。この値は、本明細書中で「腫瘍組織の%CD95L陽性領域」と称される。非腫瘍組織は、この分析において除外される。組織切片は、公知の方法によって調製することができる。CD95Lの検出に関して適切な方法は、WO2014/177576に記載される。例示的な方法及びCD95L陽性腫瘍組織の領域の決定についての例は、WO2014/177576に与えられる。CD95Lが実質的に組織試料中に検出することができない場合又は腫瘍組織の%CD95L陽性領域の値がCD95陽性試料について規定される閾値未満、例えば、腫瘍領域の1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、又は10%未満である場合、CD95L発現は非存在(CD95L陰性)であると考えられる。
【００６５】
CD95L発現(例えば、組織切片中の細胞数又は表面の観点で)は、組織切片の自動化分析に基づく方法による等の公知の方法によって決定することができる。
【００６６】
本発明の方法によって、任意のタイプのがん、特に固形腫瘍組織は、CD95Lの発現に関して診断することができる。診断される又は/及び処置されるがんはまた、リンパ球又は骨髄球起源のがんであってもよい。
【００６７】
CD95Lの発現に基づく診断は、CD95L発現サブタイプを含み、したがって、診断されたCD95L発現サブタイプに適合させた特定の治療を必要とするがんタイプの診断及び処置について特に重要である。本発明において同定されるグリア芽細胞腫のCD95L発現サブタイプの例は、本明細書に記載される、CD95L陽性グリア芽細胞腫及びCD95L陰性グリア芽細胞腫である。本明細書に提供される解決法には、本発明において同定されるCD95L発現サブタイプの診断に基づく特定の治療が含まれる。
【００６８】
任意のタイプのがん、特に固形腫瘍組織を、CD95L発現陽性又はCD95L発現陰性であると決定することができる。がんは、侵襲性成長によって特徴付けることができる。本発明に従ってCD95L陽性がん又はCD95L陰性がんと診断されるがん疾患は、脳がん、結腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、乳房がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん又は/及びその転移性疾患からなる群から選択することができる。特に、がん疾患は、神経膠腫、より詳細にはグリア芽細胞腫である。
【００６９】
例えば、本発明によると、今までに公知の診断方法による脳腫瘍の診断は、本明細書に記載されるように、腫瘍試料におけるCD95L発現の決定の結果に基づき、CD95L陽性脳腫瘍又はCD95L陰性脳腫瘍であると特定することができる。このような公知の診断方法には、公知の組織学的な又は組織病理学的な方法、例えば組織染色の公知の方法及び公知の免疫組織化学的な方法が含まれる。
【００７０】
本発明のさらなる別の態様は、CD95L発現のレベルに従ってがん疾患を分類することに使用するための本発明のモノクローナル抗体である。この態様において、がん疾患は、CD95L発現のレベルによって、CD95L陽性がん疾患又はCD95L陰性がん疾患に分類することができる。CD95L発現のレベルは、本発明の抗体を使用する免疫組織化学法において好ましくは決定される。
【００７１】
この態様において、がんは、本明細書に記載される、任意のがんであってもよい。特に、がん疾患は、脳がん、結腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、乳房がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん又は/及びその転移性疾患からなる群から選択される。より詳細には、がん疾患は、神経膠腫、最も詳細にはグリア芽細胞腫である。
【００７２】
本発明の別の態様は、CD95L発現のレベルによって患者のがん疾患を分類することによって、がん患者における全生存期間又は/及び無再発生存期間(relapse-free survival time)についての予後を提供することにおける使用のための、本発明の抗CD95L抗体である。CD95L発現のレベルは、本発明の抗体を使用する免疫組織化学法において好ましくは決定される。
【００７３】
この態様において、がんは、本明細書に記載される、任意のがんであってもよい。特に、がん疾患は、脳がん、結腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、乳房がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん又は/及びその転移性疾患からなる群から選択される。より詳細には、がん疾患は、神経膠腫、最も詳細にはグリア芽細胞腫である。
【００７４】
本発明において、全生存期間(OS)は、がんを患っている個体の群について生き続ける見込みを表す。それは、特定の期間後に生きている可能性がある群における個体のパーセンテージを表す。
【００７５】
本発明のさらなる別の態様は、がん患者における全生存期間又は/及び無再発生存期間についての予後を提供する方法であり、前記方法は
(a)本発明の抗体を使用してがん試料中のCD95L発現を決定する工程、及び
(b)CD95L発現のレベルによって、患者の生存期間又は/及び無再発生存期間についての予後を提供する工程であって、CD95L発現は患者の生存期間と負に相関する工程
を含む。
【００７６】
本発明は、以下の図面及び実施例によって更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】抗CD95L抗体クローン119-4でのペプチドアレイ(A)及び前記アッセイに由来する強度プロット(B)を示す図である。
【図２Ａ】抗CD95L抗体クローン145-12でのペプチドアレイを示す図である。
【図２Ｂ】前記アッセイに由来する強度プロットを示す図である。
【図３Ａ】抗CD95L抗体クローン103-7でのペプチドアレイを示す図である。
【図３Ｂ】前記アッセイに由来する強度プロットを示す図である。
【図４】抗体119-4、145-12及び103-7を使用するCD95Lのフローサイトメトリーベースの検出を示す図である。破線のヒストグラム:ウサギアイソタイプ対照;黒塗りのヒストグラム:サブクローン上清
【図５】特異的なコンペティターAPG296での競合ELISAを示す図である。
【図６】非特異的なコンペティターAPG707での競合ELISAを示す図である。
【図７】サブクローン119-4、103-7及び145-12によるCD95Lに結合するAPG101の中和を示す図である。
【図８】3つの異なる種からのCD95Lに対するサブクローンの結合を評価するELISAを示す図である。
【図９】CD95Lブロッカーの生物活性:Jurkat A3細胞におけるヒトCD95L誘導性アポトーシスの拮抗作用を示す図である。
【図１０】CD95Lブロッカーの生物活性:Jurkat A3細胞における固定化されたヒトCD95L誘導性アポトーシスの拮抗作用を示す図である。
【図１１】CD95Lブロッカーの生物活性:Jurkat A3細胞における固定化されたサルCD95L誘導性アポトーシスの拮抗作用を示す図である。
【図１２】CD95Lブロッカーの生物活性:Jurkat A3細胞における固定化されたマウスCD95L誘導性アポトーシスの拮抗作用を示す図である。
【図１３】エピトープマッピング119-4ペプチドELISAを示す図である。
【図１４】エピトープマッピング145-12ペプチドELISAを示す図である。
【図１５】エピトープマッピング103-7ペプチドELISAを示す図である。
【図１６】抗体119-4及び145-12に関するKDの決定を示す図である。
【図１７】オリジナルの又は改変されたCDR-Hのどちらかのウサギモノクローナル抗体145-12と使用されたヒトVHコンセンサスフレームワーク(humIII、重鎖サブグループIII)を含む3つのヒト化可変重鎖(VH)ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。相補性決定領域(CDR)は、括弧中にある。レシピエントhumIIIのCDRは、イタリック体でプリントされ、重要な重鎖フレームワーク残基はマークされる(H28、H31a、H50、H71)。ヒト化手順に記載される全ての改変は、小文字でプリントされ、下線が引かれる。配列番号53のHumIII;配列番号30のhuVH145_A;配列番号31のhuVH145_B及び配列番号32のhuVH145_Cが示される
【図１８】オリジナルの又は改変されたCDR-Hのどちらかのウサギモノクローナル抗体119-4と使用されたヒトVHコンセンサスフレームワーク(humIII、重鎖サブグループIII)を含む3つのヒト化可変重鎖(VH)ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。相補性決定領域(CDR)は、括弧中にある。レシピエントhumIIIのCDRは、イタリック体でプリントされ、重要な重鎖フレームワーク残基はマークされる(H28、H31a、H50、H71)。ヒト化手順に記載される全ての改変は、小文字でプリントされ、下線が引かれる。配列番号53のHumIII;配列番号41のhuVH119_A;配列番号42のhuVH119_B及び配列番号43のhuVH119_Cが示される
【図１９】ウサギモノクローナル抗体119-4及び154-12並びにヒトVLコンセンサスフレームワークのヒト化可変軽鎖(VL)ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。相補性決定領域(CDR)は、括弧中にある。レシピエント配列のCDRは、イタリック体でプリントされる。配列番号54のhu_k1;配列番号44のhu119_4及び配列番号33のhu145_12が示される
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００７８】
抗CD95Lに関する免疫/スクリーニング戦略
CD95L抗体の生成に関して、ウサギを、組換えCD95L(APG296;配列番号26)で免疫した。ELISAによってCD95L(APG296)に対して高い血清力価を示す動物を、ウサギモノクローナル抗体の生成に関して選択した。この手順に関して、リンパ球を、ウサギ脾臓から単離し、ウサギミエローマ細胞と融合した。成長しているハイブリドーマ細胞を、細胞培養上清中の抗体の存在に関してスクリーニングし、引き続いてCD95Lを認識するそれらの特異性に関して試験した。要約すると、成長しているハイブリドーマの163の上清を、一次スクリーニングとしてELISAベースのアッセイにおいてCD95Lの検出に関して試験した。約70クローンが、CD95Lとの相互作用を示し、ELISA、IHC、ウエスタンブロット及びFACS分析によって詳細に更に特徴付けられた。3つのクローン(103、119及び145)を、選択し、単一クローン性を保証するため限界希釈を介してサブクローニングした。(サブ)クローン103-7、119-4、145-12を、さらなる特徴付けのため最終的に選択した。
【実施例２】
【００７９】
ペプチドアレイ
ペプチドアレイの前染色を、主なアッセイに干渉できるバックグラウンド相互作用を調査するため1:5000の希釈で二次ヤギ抗ウサギIgG(H+L) DyLight680抗体で行った。インキュベーション緩衝液中で1:1000及び1:100(103-7及び145-12)の希釈でウサギモノクローナル抗体クローン103-7、119-4及び145-12でペプチドマイクロアレイを引き続きインキュベーションし、続いて二次ヤギ抗ウサギIgG(H+L) DyLight680抗体で染色し、蛍光強度を読み取った。
【００８０】
スポット強度の定量及びペプチドアノテーションを、PepSlide(登録商標)Analyzerで行い、Excelファイルに列挙した。ソフトウェアアルゴリズムにより、各スポットの蛍光強度を未処理シグナル、フォアグラウンドシグナル及びバックグラウンドシグナルに分解し、フォアグラウンド中間強度の標準偏差を計算した。平均化したフォアグラウンド中間強度に基づいて、強度マップを生成し、ペプチドマップ中のバインダーを強調した。
【００８１】
アッセイの平均化したスポット強度を、N末端からC末端のヒトCD95L配列に対してウサギモノクローナル抗体103-7、119-4及び145-12でプロットし、全スポット強度及びシグナル対ノイズ比を可視化した(図1、図2及び図3を参照されたい)。強度プロットを、最終的にペプチド及び強度マップと相関させ、またマイクロアレイスキャンの目視検査も行い、モノクローナル抗体試料と相互作用するペプチド及びコンセンサスモチーフを同定した。
【実施例３】
【００８２】
ウサギモノクローナル抗体のエピトープマッピング
1:1000(左)の希釈でウサギモノクローナル抗体119-4とペプチドマイクロアレイの1つをインキュベーションし、続いて二次ヤギ抗ウサギIgG(H+L) DyLight680抗体で染色した。本発明者らは、隣接したペプチドの列によって形成された強く明確な三重のスポットパターンを観察した。これは、ペプチドマイクロアレイの上部に10aaペプチド、中央に12aaペプチド、及び下部に15aaペプチドを有するペプチドマップ中に示されるマイクロアレイレイアウトと一致した。
【００８３】
データを定量し、続いてペプチド及び強度マップ並びに強度プロットを生成した。マイクロアレイスキャンと一致して、本発明者らは、強く明確な三重のエピトープ様スポットパターンを、インキュベーション緩衝液中で1:1000の希釈でウサギモノクローナル抗体119-4とのインキュベーションの後に観察した。全てのペプチド長で隣接したスポットの列は、ウサギモノクローナル抗体119-4のエピトープを形成する、コンセンサスモチーフと相関した(図1)。類似するアレイを、抗体145-12及び103-7について行った(図2及び図3)。
【００８４】
抗体119-4及び145-12に関して、アミノ酸RNSKYPQDをコードするコンセンサスエピトープを割り当てることができた。
【００８５】
エピトープは、クローン103-7に関して割り当てることができなかった。対応する抗体は、非直鎖状構造エピトープを有する。
【実施例４】
【００８６】
CD95L発現のFACS分析
CD95L発現のフローサイトメトリー分析を、KFL9細胞で行った。一次抗体とのインキュベーションの前に、細胞を、FACS緩衝液(PBS、5%FCS、1/100 Gammunex)でブロックした。引き続いて、一次抗体103-7、119-4及び145-12(又はそれぞれのアイソタイプ対照抗体)を、加え、30分間インキュベートした。PBSでの3回の洗浄工程後に、二次ヤギ抗ウサギビオチン抗体を加えた。詳細には、結合抗体を、PEコンジュゲートストレプトアビジンの付加によって検出した。全プロトコールを、氷上で又は4℃で行った。フローサイトメトリー分析を、Guava EasyCyte Miniによって行った。図4のヒストグラムは、ウサギアイソタイプ対照抗体(破線)と比較したクローン103-7、119-4及び145-12の蛍光強度を示す。全てのクローンは、KFL9細胞の細胞表面においてCD95Lを特異的に検出する同等の能力がある。
【実施例５】
【００８７】
特異的なコンペティターAPG296での競合ELISA
競合ELISAに関して、96ウェルマイクロタイタープレートを、10μg/ml APG296(CD95L-RB69;配列番号26)でコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、特異的なコンペティターAPG296(0、0.1、1、10又は100μg/ml)の非存在又は存在下で1:200の最終希釈でサブクローン119-4、103-7及び145-12からの抗体でインキュベートした。ウサギモノクローナル抗体の結合を、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した(図5)。
【００８８】
クローン119-4、103-7及び145-12からの抗体に関して、ELISAシグナルの用量依存的な競合を、特異的なコンペティターの存在下で観察した。試験された最高濃度(100μg/ml)で、ELISAシグナルは、バックグラウンドレベルに低下した。
【実施例６】
【００８９】
非特異的なコンペティターAPG707での競合ELISA
競合ELISAに関して、96-ウェルマイクロタイタープレートを、10μg/ml APG296(CD95L-RB69)でコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、非特異的なコンペティターAPG707(LIGHT-RB69;配列番号27; 0、10又は100μg/ml)の非存在又は存在下で1:200の最終希釈でサブクローン119-4、103-7及び145-12からの抗体でインキュベートした。ウサギモノクローナル抗体の結合を、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した(図6)。
【００９０】
競合は、非特異的なコンペティターの存在下でサブクローン119-4、103-7及び145-12からの抗体に関して認められなかった。高濃度のAPG707でさえも、ELISAシグナルの有意な競合は示さなかった。
【実施例７】
【００９１】
サブクローン119-4、103-7及び145-12からの抗体によるCD95Lに結合するCD95(受容体)の中和
APG101は、ヒトIgG1のFc部分及びCD95の細胞外「リガンド結合ドメイン」を含む融合タンパク質である。APG101は、CD95Lに対する強い結合を示し、CD95L/CD95相互作用に干渉するCD95L抗体の能力を分析するため特に適する:
【００９２】
サブクローン119-4、103-7及び145-12によるCD95Lに対するAPG101の結合の中和を、ELISAによって評価した。96ウェルマイクロタイタープレートを、5μg/ml StrepMabImmo(IBA社)でコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、StrepMabImmoによって捕捉されるStrepTagを含有する1μg/ml CD95L-T4(APG293)でインキュベートした。ウェルを、次に1:10、1:50及び1:250の希釈でのサブクローン119-4、103-7及び145-12でインキュベートした。次のインキュベーション工程において、APG101を1μg/mlの濃度で加えた。CD95Lに対するAPG101の結合を、ヤギ抗ヒトIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した。データは相対ELISAシグナルとして表され、100%値はCD95Lに対するAPG101の結合の中和がないことを示し、0%値はCD95Lに対するAPG101の結合の完全な中和を示す(図7)。
【００９３】
サブクローン103-7及び145-12からの抗体は、用量依存的な様式におけるAPG101結合の中和を示した。比較して、サブクローン119-4からの抗体は、APG101結合のより効率的な中和を示した。
【実施例８】
【００９４】
3つの異なる種からのCD95Lに対する抗体サブクローンの結合を評価するELISA
3つの異なるサブクローンの種特異性を評価するELISAに関して、96ウェルマイクロタイタープレートを、0.5μg/ml  ヒトCD95L-T4(黒色)又は0.5μg/ml  カニクイザルCD95L-T4(暗灰色)又は0.5μg/ml  マウスCD95L-T4(灰白色)でコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、1:200の最終希釈でサブクローン119-4、103-7及び145-12でインキュベートした。ウサギモノクローナル抗体の結合を、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した(図8)。
【００９５】
クローン119-4は、全ての試験した種からのCD95Lに対して強い結合を示す。クローン103-7及び119-4からの抗体は、ヒト及びサルCD95Lに対して強い結合並びにマウスに由来するCD95Lに対して僅かに弱い結合を示した。
【実施例９】
【００９６】
CD95Lブロッカーの生物活性:Jurkat A3細胞におけるヒトCD95L誘導性アポトーシスの拮抗作用
APG101と比較した3つの異なるサブクローン(103-7、119-4、145-12)の生物活性を評価する細胞アッセイに関して、96ウェルマイクロタイタープレートに、ウェル当たり100000個のJurkat A3細胞をピペットで移した。次に、ウェルを、定常濃度の最終250ng/ml APG293(ヒトCD95L-T4;配列番号25)及びx軸に示される通りのCD95Lアンタゴニストの滴定で補充した。37℃で3時間インキュベーション後に、細胞を溶解緩衝液(250mM HEPES、50mM MgCl2、10mM EGTA、5% Triton-X-100、100mM DTT、10mM AEBSF、pH7.5)で溶解し、プレートを氷上に30分間から2時間置いた。カスパーゼ基質Ac-DEVD-AFCの切断を使用して、アポトーシスの程度を決定した:20μl細胞溶解産物を、黒色96ウェルマイクロタイタープレートに移した;50mM HEPES、1%スクロース、0.1% CHAPS、50μM Ac-DEVD-AFC、及び25mM DTT、pH7.5を含有する80μl緩衝液の付加後に、プレートをTecan社マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度における増加をモニターした(励起400nm、発光505nm)(図9)。
【００９７】
全ての4つのCD95Lアンタゴニストは、カスパーゼ誘導の用量依存的な阻害を示す。3つの抗体(サブクローン103-7、119-4、145-12)は、APG101と比べて、より高いアンタゴニスト性活性を現した。
【実施例１０】
【００９８】
CD95Lブロッカーの生物活性:固定化されたヒトCD95LによるJurkat A3細胞において誘導されたアポトーシスの拮抗作用
APG101と比較した3つの異なるサブクローン(103-7、119-4、145-12)の生物活性を評価する細胞アッセイに関して、96ウェルStrepTactinマイクロタイタープレート(IBA社)を、そのStrep-Tagを介して固定化されたStrepTactinによって捕捉された、250ng/ml  ヒトCD95L-RB69(APG296)で1時間インキュベートした。プレートの洗浄後に、x軸に示される通りの異なる濃度でCD95Lアンタゴニストを、1時間インキュベートした。洗浄後に、ウェル当たり100000個のJurkat A3細胞を加えた。37℃で3時間インキュベーション後に、細胞を溶解緩衝液(250mM HEPES、50mM MgCl2、10mM EGTA、5% Triton-X-100、100mM DTT、10mM AEBSF、pH7.5)で溶解し、プレートを氷上に30分間から2時間置いた。カスパーゼ基質Ac-DEVD-AFCの切断を使用して、アポトーシスの程度を決定した:20μl細胞溶解産物を、黒色96ウェルマイクロタイタープレートに移した;50mM HEPES、1%スクロース、0.1% CHAPS、50μM Ac-DEVD-AFC、及び25mM DTT、pH7.5を含有する80μl緩衝液の付加後に、プレートをTecan社マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度における増加をモニターした(励起400nm、発光505nm)(図10)。
【００９９】
全ての試験した抗体は、組換えヒトCD95L(APG296)によって誘導されたアポトーシスの効率的な阻害を示した。公知のCD95LアンタゴニストAPG101と比べて、抗体は、かなり高い有効性を示した。
【実施例１１】
【０１００】
CD95Lブロッカーの生物活性:固定化されたサルCD95LによるJurkat A3細胞において誘導されたアポトーシスの拮抗作用
APG101と比較した3つの異なるサブクローン(103-7、119-4、145-12)の生物活性を評価する細胞アッセイに関して、96ウェルStrepTactinマイクロタイタープレート(IBA社)を、そのStrep-Tagを介して固定化されたStrepTactinによって捕捉された、250ng/ml  サルCD95L-RB69(カニクイザル; APG1249)で1時間インキュベートした。プレートの洗浄後に、x軸に示される通りの異なる濃度でCD95Lアンタゴニストを、1時間インキュベートした。洗浄後に、ウェル当たり100000個のJurkat A3細胞を加えた。37℃で3時間インキュベーション後に、細胞を溶解緩衝液(250mM HEPES、50mM MgCl2、10mM EGTA、5% Triton-X-100、100mM DTT、10mM AEBSF、pH7.5)で溶解し、プレートを氷上に30分間から2時間置いた。カスパーゼ基質Ac-DEVD-AFCの切断を使用して、アポトーシスの程度を決定した:20μl細胞溶解産物を、黒色96ウェルマイクロタイタープレートに移した;50mM HEPES、1%スクロース、0.1% CHAPS、50μM Ac-DEVD-AFC、及び25mM DTT、pH7.5を含有する80μl緩衝液の付加後に、プレートをTecan社マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度における増加をモニターした(励起400nm、発光505nm)(図11)。
【０１０１】
全ての試験した抗体は、組換えサルCD95L(APG1249)によって誘導されたアポトーシスの効率的な阻害を示した。公知のCD95LアンタゴニストAPG101と比べて、抗体は、かなり高い有効性を示した。
【実施例１２】
【０１０２】
CD95Lブロッカーの生物活性:固定化されたマウスCD95LによるJurkat A3細胞において誘導されたアポトーシスの拮抗作用
APG101と比較した3つの異なるサブクローン(103-7、119-4、145-12)の生物活性を評価する細胞アッセイに関して、96ウェルStrepTactinマイクロタイタープレート(IBA社)を、そのStrep-Tagを介して固定化されたStrepTactinによって捕捉された、250ng/ml  マウスCD95L-RB69(マウス;APG1250)で1時間インキュベートした。プレートの洗浄後に、x軸に示される通りの異なる濃度でCD95Lアンタゴニストを、1時間インキュベートした。洗浄後に、ウェル当たり100000個のJurkat A3細胞を加えた。37℃で3時間インキュベーション後に、細胞を溶解緩衝液(250mM HEPES、50mM MgCl2、10mM EGTA、5% Triton-X-100、100mM DTT、10mM AEBSF、pH7.5)で溶解し、プレートを氷上に30分間から2時間置いた。カスパーゼ基質Ac-DEVD-AFCの切断を使用して、アポトーシスの程度を決定した:20μl細胞溶解産物を、黒色96ウェルマイクロタイタープレートに移した;50mM HEPES、1%スクロース、0.1% CHAPS、50μM Ac-DEVD-AFC、及び25mM DTT、pH7.5を含有する80μl緩衝液の付加後に、プレートをTecan社マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度における増加をモニターした(励起400nm、発光505nm)。
全ての試験した抗体は、組換えマウスCD95L(APG1250)によって誘導されたアポトーシスの効率的な阻害を示した。公知のCD95LアンタゴニストAPG101と比べて、抗体は、かなり高い有効性を示した。しかしながら、唯一サブクローン119-4が、マウスCD95Lによって誘導されたカスパーゼ活性をベースラインレベルまで低下させることができる(図12)。
【実施例１３】
【０１０３】
エピトープマッピング119-4ペプチドELISA
クローン119-4のエピトープを評価するELISAに関して、96ウェルマイクロタイタープレートを、2μg/ml  ヒトCD95L(APG296)又は2μg/ml  ヒトLIGHT(APG707)又はヒトCD95Lの細胞外アミノ酸配列の一部を含むBSA又は卵白アルブミンに固定化されたペプチドでコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、クローン119-4で濃度2μg/mlでインキュベートした。ウサギモノクローナル抗体の結合を、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した(図13)。
【０１０４】
抗体119-4は、ペプチド「C-YMRNSKY」を除き、APG296に及び全ての試験したペプチドに対する結合を示す。それぞれの結合パターンは、アミノ酸「NSKYPQ」を含む最小のエピトープを示す。
【実施例１４】
【０１０５】
エピトープマッピング145-12ペプチドELISA
クローン145-12のエピトープを評価するELISAに関して、96ウェルマイクロタイタープレートを、2μg/ml  ヒトCD95L(APG296)又は2μg/ml  ヒトLIGHT(APG707)又はヒトCD95Lの細胞外アミノ酸配列の一部を含むBSA又は卵白アルブミンに固定化されたペプチドでコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、クローン145-12で濃度2μg/mlでインキュベートした。ウサギモノクローナル抗体の結合を、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した(図14)。
【０１０６】
抗体145-12は、APG296に対する特異的な結合を示す。しかしながら、試験したペプチドに対する結合は、弱い又は非存在である(ペプチド「C-YMRNSKY」)。抗体がクローン119-4(ペプチドアレイによって示される)と同じエピトープを共有するにもかかわらず、CD95Lの他の可能な構造上の構成要素が145-12抗体の完全なエピトープを規定するため必要とされることが考えられ得る。
【実施例１５】
【０１０７】
エピトープマッピング103-7ペプチドELISA
クローン103-7のエピトープを評価するELISAに関して、96ウェルマイクロタイタープレートを、2μg/ml  ヒトCD95L(APG296)又は2μg/ml  ヒトLIGHT(APG707)又はヒトCD95Lの細胞外アミノ酸配列の一部を含むBSA又は卵白アルブミンに固定化されたペプチドでコーティングした。StartingBlockでのブロッキング後に、ウェルを、クローン103-7で濃度2μg/mlでインキュベートした。ウサギモノクローナル抗体の結合を、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ(Sigma社;希釈1:5000)とのインキュベーション及び変換されたペルオキシダーゼ基質TMBoneのELISAリーダーにおける450nmの波長での引き続く検出によって検出した(図15)。
【０１０８】
抗体103-7は、APG296に対する特異的な結合を示す。全てのペプチドベースの直鎖状エピトープは、抗体103-7によって検出されず、CD95Lの三次元構造によって規定されるエピトープであることが示された。
【実施例１６】
【０１０９】
抗体119-4及び145-12に関するKDの決定
エピトープ含有ペプチド「YMRNSKYPQD」に対する抗体119-4及び145-12の平衡結合定数(KD)を、自動バイオセンサーシステム(Attana社A100)で決定された動力学的な結合データ(kon及びkoff)に基づいて計算した。A100は、水晶発振子微量天秤(QCM)技術に基づき、リアルタイムでの分子相互作用の調査を可能にする。この目的に関して、それぞれのエピトープ含有ペプチドを、BSAに結合させ、引き続いてカルボキシル活性化QCMチップの表面に固定化した。抗体119-4及び145-12を、異なる濃度で可溶性分析物として使用した。結合(kon)及び解離(koff)をリアルタイムで分析し、それぞれのKDを計算した(図16中の表を参照されたい)。
【０１１０】
抗体119-4は、抗体145-12と比較して、エピトープ含有ペプチドに向けてより高い親和性を示す。KDは、選択された設定でクローン103-7に関しては分析できなかった(データ示さず)。
【０１１１】
免疫及び分析に使用したタンパク質:
ヒト、マウス及びサルCD95L(CD95L-RBD)の受容体結合ドメインを、C末端に配置した安定化ドメインを有するホモ三量体融合タンパク質として発現させた。CD95L由来配列に関しては同一であるが、安定化ドメインの分子レイアウトにおいては異なっている2つのバージョンのヒトCD95L-RBDを生成した(APG293、配列番号25及びAPG296、配列番号26)。スキャフォールド特異的なmABの同定及び/又は除外(deselection)に関して、同じ三量体化スキャフォールドを含むTNFスーパーファミリーからの構造上関連するタンパク質を使用した(APG707、配列番号27)。結合分析に関して、サルCD95L-RBD(APG1249、配列番号28)並びにマウスCD95L-RBD(APG1250、配列番号29)を、同じ融合タンパク質技術で発現させた。それらの産生に関して上記のタンパク質及び例の一般的なレイアウトは、US8147843B2及びUS008580273B2に記載されている。
【実施例１７】
【０１１２】
インシリコでのヒト化
以下において、残基番号付けは、Kabat式の数え方に従う。ウサギmAB 119-4(配列番号7及び配列番号8)及びmAB 145-12(配列番号17及び配列番号18)に由来するウサギVH及びVL抗体断片のヒト化に関して、以下の戦略を使用した:個々のドナーVH/VLウサギ配列に対して高い類似性を有する個々のヒトVH/VL生殖系列配列を探索する代わりに、ヒトレシピエントVH/VLドメイン対(VHサブグループIII、配列番号53及びVLカッパサブグループI配列番号54)を選択し、これはアクセプターフレームワークとしてマウスVH/VLドメインのヒト化手順のため頻繁に使用される(Prestaら、1997、Adamsら、2006)。
両方の抗体のウサギVL断片のヒト化に関して、何らかの変化を伴うことなく、ヒトVLカッパサブグループIフレームワーク鋳型(配列番号54)へのウサギCDR-Lの直接的なインシリコ移植を行った(図19を参照されたい)。mAB145-12の生じるヒト化VLドメインは、配列番号33を有し、mAB119-4の生じるヒト化VLドメインは配列番号44を有する。
両方の抗体のウサギVH断片のヒト化に関して、ヒトフレームワーク鋳型へのウサギCDR-Hのインシリコ移植を行い、3つのヒト化VH配列バリアントを各ドナーウサギVHドメインについて作出した(図17及び図18を参照されたい)。両方のヒト化バリアントA配列において、位置H28、H71及びH73をレシピエント(H28-T、H71-R、H73-N)からドナー配列残基(H28-S、H71-K、H73-S)に切り替えた。バリアントAは、バリアントBにおいて生じるさらなる改変のための鋳型であった。両方のヒト化バリアントB配列において、フレームワーク残基H28、H71及びH73の上記の変異に加えて、CDR-H2のCDR-H2位置H61、H62及びH63をウサギドナー(H61-S、H62-W、H63-A)からヒトアクセプター残基(H61-D、H62-S、H63-V)に変異させた。バリアントBは、バリアントCにおいて生じるさらなる改変のための鋳型であった。両方のヒト化バリアントC配列において、バリアントB変異に加えて、ウサギCDR-H1(位置H35a)におけるシステインをセリンに変異させ、ウサギCDR-H2(位置H50)におけるシステインをアラニンに変異させた、その理由は、システインがヒトVHドメイン中のそれらの位置で稀であるからである。両方のヒト化バリアントC配列における隣接するフレームワーク位置H49をアラニンからセリンに変異させ、バリアントCにおいて改変されたCDR-H2の良好な構造上の支持を潜在的に与えた。mAB145-12の生じるヒト化VHドメインは、配列番号30(バリアントA)、配列番号31(バリアントB)及び配列番号3(バリアントC)を有する。mAB119-4の生じるヒト化VHドメインは、配列番号41(バリアントA)、配列番号42(バリアントB)及び配列番号43(バリアントC)を有する。
VHの場合では、Prestaらは、構造上の側面によってCDR-H1を規定して、重鎖残基H26-H35を含ませたが、CDR-H1の配列ベースの規定は残基H31-H35(Kabat式の数え方)を含む。位置H26-H30にはCDR-H1ループコンホメーションが関与し、位置H28は表面が曝露するので、残基H28はドナー配列に変異させられる可能性がある。加えて、重鎖の位置H69、H71及びH73は、一般に、VHサブグループIIIのCDR-Hループのコンホメーションに関して重要であることが公知である。選択されたヒトVH/VLレシピエントドメイン対に関して、ヒトからドナー残基への置換が、上記の位置におけるマウスCDRの機能的な移植を可能にするため、必須であることが発見された(Adamsら、2006)。
モノクローナルウサギ抗体に由来するFab断片(pdbエントリー4ZT0、H鎖、配列番号61)の結晶構造を視覚的に検査することにより、ウサギVHドメインフレームワーク及びウサギCDR-Hの追加の一般的な特色を発見した。まず第1に、配列番号61のウサギVHのCDR-H2は、抗原認識に関与する表面でN末端CDR-H2コンホメーションを支持するVHスキャフォールド構造において側部に配置される残基H60-H65によって形成されるループを係留するC末端トリプトファン(残基H62-W)を含む。その相対位置が表面に対して近いことにより、このH62-トリプトファン含有配列モチーフは、治療目的のため意図されるヒト化抗体において潜在的に免疫原性である可能性がある。類似するCDR-H2ループ形成配列は、mAb119-4の並びにmAb145-12の一部である。したがって、本発明者らは、配列番号31、配列番号32、配列番号42及び配列番号43に施行されているように、ヒトにおいて生じる抗体断片の免疫原性リスクを低下させるため、上で記載されるように、ヒト残基H61-H63でウサギ残基H61-H63を置換した。上記の構造中に観察される追加の構造上の特色は、ウサギ残基H35a及びH50によって形成されるジスルフィドブリッジである。興味深いことに、このジスルフィドブリッジは、ウサギVH/VLドメイン界面中に埋まっており、ドメインの2つの逆平行ベータバレルを連結する。これらのベータバレルはCDR-H1及びCDR-H2を支持するので、共有結合性の連結がCDR-H1とCDR-H2の構造上の可動性を潜在的に制限する。これにより、認識された抗原の結合を可能にする及び/又は増強する構造上の特色をもたらすことができた。H35a及びH50システインが存在するmAB119-4及びmAB145-12に関する本仮説を証明するために、これらのシステイン残基が置換されたヒトVHバリアントC(配列番号32及び配列番号43)を作出した。
【実施例１８】
【０１１３】
m145-12及び119-4のヒト化VH及びVLドメインの機能的なスクリーニング
インシリコでのヒト化手順の化合物ベースの検証に関して、scFvミニボディフォーマットを選択した。mAb145-12及びmAb119-4特異的なCDRを提示するヒト化VH/VL対を含有する、ヒンジのないscFvミニボディを、Olafsenら  2004に従って作出した。以下の改変を施行した:scFvを、より短い16残基(GGGS)x4リンカーとともにVH-VL配向に生成した。ヒトVHのC末端セリン及びヒトVLのC末端アルギニンは、構築物中に存在しない。使用したCH3スキャフォールドは、N末端の5残基リンカーエレメント及び中性pHでの効率的なアフィニティー精製目的のためC末端のStreptag-IIを含む。対照として、mAb 145-12及びmAb 119-4のVH/VLドメインを含む対応するscFvミニボディを、産生した。ウサギVLドメインにおいて、ウサギカッパ定常ドメインに対してジスルフィドブリッジを形成する単一のシステイン(singular cysteine)をセリンに変異させた。哺乳動物ベースの分泌経路ベースの産生に関して、目的のscFvミニボディに対してインフレームの適切なシグナルペプチドをコードする合成cDNAカセットを生成し、哺乳動物細胞における安定な発現のため適切な発現ベクターにクローニングした。scFvミニボディの産生を、以下に記載される方法によって行った。産生された全てのscFvミニボディをサイズ排除クロマトグラフィーによって最終的に精製し、さらなる分析前の多量体及び凝集体の枯渇化を確実にし、それによって、引き続き行われる活性アッセイにおいてアビディティー効果を除く。SEC精製した抗CD95L特異的なscFvミニボディを、Jurkat A3細胞においてCD95L誘導性アポトーシスを中和するそれらの能力に関して分析した。mAB145-12又はmAB119-4 CDRで作出したヒト化scFvミニボディにおけるCD95Lエピトープ認識の機能的な再構成は、ウサギドナーVH/VLドメインを含むウサギ対照scFvミニボディのEC50値に匹敵する又はより低いEC50値で直接的に変化すると推定された。
【実施例１９】
【０１１４】
組換え完全長抗体又は抗体断片のクローニング、発現及び精製の方法
上記の完全長抗体又は抗体断片は、通常2つの異なる真核生物宿主細胞において組換え発現された:
上記の完全長抗体又は抗体断片の初期分析に関して、10%FBS、100単位/mlペニシリン及び100[mu]g/mlストレプトマイシンを補充したDMEM + GlutaMAX(GibCo)において成長させたHek293T細胞は、ブラストサイジン、ピューロマイシン又はハイグロマイシン耐性遺伝子を含む機能的な発現カセット等の、組換えポリペプチド及び適切な選択マーカーのための発現カセットを含有するプラスミドを一過性にトランスフェクトされた。複数のポリペプチド鎖が最終的な産物(例えば、完全フォーマット抗体)を達成するため必要な場合では、発現カセットは、トランスフェクションの間に、1つのプラスミドで組み合わされた又は異なるプラスミドに配置された。組換え融合ポリペプチドを含有する細胞培養上清は、トランスフェクション3日後に収穫され、300xgでの遠心分離によって清澄され、続いて0.22μm無菌フィルターを通して濾過された。
インビボで使用される上記の完全長抗体又は抗体断片の大規模発現に関して、上記のタンパク質をコードする合成DNAカセットが、適切な選択マーカー(例えば、ブラストサイジン、ピューロマイシン又はハイグロマイシン耐性遺伝子を含む機能的な発現カセット)及び宿主細胞ゲノム内の転写的に活性な挿入部位の数を増大させるため適切な遺伝的エレメント、例えばヒトβグロビンマトリックス付着領域(MAR)を含む真核生物性発現ベクターに挿入された。配列が検証された発現ベクターが、エレクトロポレーションによって懸濁に適合させたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-S、Invitrogen社)に導入された。適切な淘汰圧を、トランスフェクション3日後に、トランスフェクトされた細胞に対して適用した。ベクターに由来する耐性遺伝子を保有する生存している細胞が、淘汰圧下での引き続く培養によって回収された。回転振盪機インキュベーター(100rpm、50mm振盪距離)における37℃及び7%CO2雰囲気での化学的に規定された培地(PowerCHO2-CD、Lonza社)中での選択された細胞プールの安定な成長の後に、個々の上清は、上記のタンパク質を検出するELISAアッセイによって分析され、最高の特異的生産性を有する細胞プールが、タンパク質産生前に振盪フラスコ(回転振盪機、100rpm、振盪距離50mm)中で増殖された。
研究室スケールのタンパク質産生に関して、個々の細胞プールは、Waveバイオリアクター20/50EHT(GE-Healthcare社)において37℃及び7%CO2雰囲気で化学的に規定された培地(PowerCHO2-CD、Lonza社)中で7〜12日培養された。基礎培地は、4mM Glutamaxを補充したPowerCHO2-CDである。Wave培養は、(5又は10リットルバッグについて)、0.3〜0.4 x 10e6細胞/mlの生細胞濃度及び以下の設定で開始された:振盪頻度18rpm、振盪角度7°、ガス流0.2〜0.3L/分、7%CO2、36.5℃。Wave行程の間に、細胞培養は、PowerFeed A(Lonza社)を2回、2日目(20%フィード)及び5日目(30%フィード)に与られた。第2のフィード後に、振盪頻度は22rpmに、並びに振盪角度は8°に増加された。
バイオリアクターは、細胞生存度が80%未満に降下したとき、7日目から12日目の間に通常収穫される。最初に、培養上清は、手動式深層ろ過システム(Millipore社Millistak Pod、MC0HC 0.054m2)を使用して清澄された。Strepタグを付けたタンパク質に関して、アビジンは0.5mg/Lの終濃度まで加えた。最終的に、上記の完全長抗体又は抗体断片を含有する培養上清は、ボトルトップフィルター(0.22μm、PES、Corning社)を使用して滅菌濾過し、さらなる処理まで2〜8℃で保管された。
アフィニティー精製に関して、StrepTactin Sepharoseは、カラム(ゲルベッド1ml)に充填され、15ml緩衝液W(100mM Tris-HCI、150mM NaCI、pH8.0)又はPBS pH7.4で平衡化され、細胞培養上清は流速4ml/分でカラムに適用された。引き続いて、カラムは15ml緩衝液Wで洗浄され、結合ポリペプチドは7 x 1ml緩衝液E(100mM Tris HCI、150mM NaCI、2.5mMデスチオビオチン、pH8.0)の付加によって段階的に溶出された。或いは、この工程について、2.5mMデスチオビオチンを含有するpH7.4のPBSを使用することができる。
StrepTactin Sepharoseベースの方法と交互に、アフィニティー精製は、アフィニティーリガンドとして固定化されたプロテインAを有するカラム及びAktaクロマトグラフィーシステム(GE-Healthcare社)を用いて行われた。融合タンパク質のFCドメインに関して高親和性を有する固相材料は、MABSelect Sure(商標)(GE Healthcare社)が選択された。簡潔には、清澄された細胞培養上清は、洗浄緩衝液1(20mM Pi、95mM NaCl、pH7.2)中で平衡化したHiTrap MabSelectSureカラム(CV=5ml)にロードされたが、カラムベッド1ml当たり10mg融合タンパク質のロード量は超えない。カラムは、10カラム体積(10CV)の上記の平衡緩衝液、続いて4カラム体積(4CV)の洗浄緩衝液2(20mM Pi、95mM NaCl、pH8.0)で洗浄して、宿主細胞タンパク質及び宿主細胞DNAを枯渇させた。カラムは次に溶出緩衝液(20mM Pi、95mM NaCl、pH3.5)で溶出させ、溶出液は10画分まで収集され、各画分はカラムベッド体積(5ml)と等しい体積を有する。各画分は、等体積の上記の洗浄緩衝液2で中和された。線速度は150cm/hに設定され、上記のアフィニティークロマトグラフィー法の間に一定に保った。
溶出液画分のタンパク質量が定量され、ピーク画分が限外濾過によって濃縮され、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって更に精製された。
SECは、Aktaクロマトグラフィーシステム(GE-Healthcare社)を使用してSuperdex200 10/300GL又はHiLoad26/60カラムで行われた。カラムはリン酸緩衝塩溶液で平衡化され、濃縮され、アフィニティー精製されたポリペプチドはSECカラムにロードされたが、試料体積はカラム体積の2%(v/v)を超えない。Superdex200 10/300 GLカラム(GE Healthcare社)の場合では、毎分0.5mlの流速が適用された。HiLoad26/60 Superdex200カラムの場合では、毎分2.5mlの流速が適用された。ポリペプチドの溶出プロファイルは、280nmでの吸光度によってモニターされた。
【実施例２０】
【０１１５】
CD95Lブロッカーの作用強度
実施例9に従って、標準作用強度アッセイを使用して、scFvミニボディフォーマットにおけるヒト化VH/VLドメインのアンタゴニスト性CD95L活性を分析した。mAB145-12又はmAB119-4 CDRで作出したヒト化scFvミニボディにおけるCD95Lエピトープ認識の機能的な再構成は、ウサギ対照scFvミニボディのEC50値に匹敵する又はより低いEC50値で直接的に変化すると推定される(配列番号37はmAb145-12特異性を表し、配列番号48はmAb119-4特異性を表す)。選択されたヒト化戦略により、配列番号38及び配列番号49を有するscFvミニボディにおいて例示される未改変CDRによって表される、初期ウサギ抗体の範囲で活性を保存させることが可能とされた。驚くべきことに、配列番号39において例示されるmAB145-12のCDR-H2の脱免疫化(deimmunisation)により、作用強度が増加された。scFvミニボディ配列番号50の相対活性は、配列番号49を有するscFVミニボディと比べて匹敵するので、mAb119-4のCDRH2の脱免疫化も機能した。対照的に、CDRH1中のH35a及びCDRH2中のH50における改変は、配列番号40及び配列番号51ベースのscFvミニボディで実証される作用強度を有意に減少させた。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
Table (表1)は、異なるCD95L中和試薬の生物学的インビトロ活性を示す。活性は、Jurkat A3細胞における250ng/ml可溶性CD95L-T4のアポトーシス誘導に関する化合物の拮抗性活性として決定された。アポトーシス誘導は、カスパーゼ3/7による基質Ac-DEVD-AFCの切断として測定された。値は、ng/mlにおけるEC50として表現された。
【実施例２１】
【０１１８】
完全長抗体フォーマットの生成
完全長ヒト抗体フォーマットは、抗体定常領域を含む適切なスキャフォールドにヒト化VH及びVLドメインを融合することによって生成することができる。ヒト定常カッパ軽鎖についての適切な配列例は、配列番号58に与えられる。IGG1定常重鎖領域についての適切な配列例は、配列番号59及び配列番号60に与えられる。例として、カッパ定常軽鎖に対してmAb145-12(配列番号33)のヒト化VLを融合することにより、mAb145-12特異性を有する完全フォーマットのヒト抗体を生成するため適切である完全長カッパ軽鎖を表す配列番号36が生じる。したがって、カッパ定常軽鎖配列番号58に対してmAb119-4(配列番号44)のヒト化VLを融合することにより、mAb119-4特異性を有する完全フォーマットのヒト抗体を生成するため適切である完全長カッパ軽鎖を表す配列番号47が生じる。同様に、必要なヒト重鎖は、配列番号42と配列番号59又は配列番号60を融合することによって作出され、mAb119-4特異性を有する完全フォーマットのヒト抗体の生成のため適切である完全長ヒト重鎖(配列番号46及び配列番号45)が生じる。
したがって、配列番号31と配列番号59又は配列番号60を融合することにより、mAb145-12特異性を有する完全フォーマットのヒト抗体の生成のため適切である完全長ヒト重鎖(配列番号35及び配列番号34)が生じる。哺乳動物細胞培養において完全フォーマットの組換え抗体を産生する発現技術は、当技術分野において十分に確立されている。
当技術分野における通常の当業者に関して、他の抗体スキャフォールド技術を、ヒト化VH/VLドメインを用いることによって適用して、所望の抗体特異性を有する異なるフォーマットを生成することができることは自明である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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