(57)【要約】  本発明は、プレ配列とＣＤ−ＲＡＰとを含むＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質、およびネイティブＣＤ−ＲＡＰの製造における前記ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質の使用に関する。本発明はさらに、ＣＤ−ＲＡＰと正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸とバッファーとを含む組成物、前記組成物を含有する医薬品、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷を治療および／または予防する方法における前記組成物の使用、ならびに前記組成物の製造方法、ならびに前記組成物中でＣＤ−ＲＡＰを保存する方法に関する。本発明はさらに、封入されたＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を含むリポソームを含有する組成物、関節の疾患または損傷を治療する方法における前記組成物の使用、および前記リポソーム組成物の製造方法、および前記リポソーム組成物中でＣＤ−ＲＡＰを保存する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  そのＣ末端に切断部位を含むプレ配列と、
ｂ）  ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と
を含む、ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含有するベクター。
【請求項４】
請求項１記載の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質、請求項２記載の核酸または請求項３記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
ネイティブＣＤ−ＲＡＰの製造方法であって、
ａ）  請求項１記載のＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質を提供するステップと、
ｂ）  前記プレ配列を除去してネイティブＣＤ−ＲＡＰを取得するステップと
を含む方法。
【請求項６】
ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物であって、１０７のアミノ酸の長さを有する配列番号１の成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質を含有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物において、前記ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物中に存在する他のいずれかのＣＤ−ＲＡＰタンパク質に対する前記ＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）の比は、９９重量％以上である、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物。
【請求項７】
ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸と、バッファーとを含む、組成物。
【請求項８】
請求項７記載の組成物の製造方法であって、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するバッファーに、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を加えることを含む方法。
【請求項９】
封入されたＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を含むリポソームを含有する組成物であって、前記リポソームのサイズは、２００ｎｍ未満であり、特に１５０ｎｍ未満であり、特に１２０ｎｍ未満であり、特に１００ｎｍ未満である、組成物。
【請求項１０】
リポソーム製剤の製造方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法により製造可能である、リポソーム製剤。
【請求項１２】
リポソーム製剤中のリポソームのサイズを低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
リポソーム製剤の多分散度を低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
請求項６、請求項７または請求項９記載の組成物を含有する、医薬品。
【請求項１５】
アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するための、請求項６、請求項７または請求項９記載の組成物。
【請求項１６】
ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法であって、請求項７または請求項９記載の組成物中でＣＤ−ＲＡＰを保持することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、プレ配列とＣＤ−ＲＡＰとを含むＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質、およびネイティブＣＤ−ＲＡＰの製造における前記ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質の使用に関する。本発明はさらに、ＣＤ−ＲＡＰと正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸とバッファーとを含む組成物、前記組成物を含有する医薬品、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷を治療および／または予防する方法における前記組成物の使用、ならびに前記組成物の製造方法、ならびに前記組成物中でＣＤ−ＲＡＰを保存する方法に関する。本発明はさらに、封入されたＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を含むリポソームを含有する組成物、関節の疾患または損傷を治療する方法における前記組成物の使用、および前記リポソーム組成物の製造方法、および前記リポソーム組成物中でＣＤ−ＲＡＰを保存する方法に関する。
【０００２】
背景
変形性関節症（ＯＡ）は、非常によく見られる変性関節疾患であり、非常にゆっくりと発現する。ＯＡの特徴は、関節軟骨の破壊（軟骨基質からのプロテオグリカンおよびコラーゲンの喪失）であり、これに伴って下にある骨が損傷され、骨棘（関節縁に沿った骨の突起）が形成され、さらには滑膜が変化して関節炎（滑膜炎）が生じる。全体としてこれらの過程によって、冒された関節の疼痛、不整列および機能喪失が引き起こされる。変形性関節症は、関節軟骨の喪失を特徴とし、典型的には膝および臀部における疼痛および機能喪失を招き、また主要な７つの市場である米国、日本、フランス、ドイツ、イタリアおよびスペインにおいて８１４０万人が罹患している（Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＤＭＨＣ２４９３、２００９年１２月）。米国では、アメリカ疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＣＤＣ）により、全体的に見て２５歳以上の成人の１３．９％、６５歳以上の成人の３３．６％（１２４０万人）がＯＡに罹患したと報告されている（１９９０年には米国の成人の罹患者は２１００万人であったが、２００５年には２６９０万人に増加したと推定される）。平均寿命が延びて高齢化が進み、変形性関節症は２０２０年までに疾病の主因の第４位となることが予想されている（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ．  Ｗｏｏｌｆ  ＆  Ｂｒｕｃｅ  Ｐｆｌｅｇｅｒ，  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ２００３；８１：６４６−６５６）。医学的見地からは、ＯＡは、他の慢性疾患、例えば過体重、糖尿病、高血圧症、脂質異常症および冠動脈疾患にも関連しており、このことから、ＯＡと診断された患者の多罹患率が説明される。
【０００３】
目下、置換術以外にＯＡの治癒法はなく、症状緩和および機能改善を目的とした処置を行うことができる。こうした処置としては、患者に対する教育、理学療法、体重管理と、薬剤（栄養補助食品、単純鎮痛薬、局所ＮＳＡＩＤｓ、経口ＮＳＡＩＤｓ、ｃｏｘ−２阻害薬および経口ステロイド類、関節内投与ステロイド類およびヒアルロン酸）の使用との組合せが挙げられる。
【０００４】
これまでに、軟骨の分解に主に関与する酵素の活性を阻害する試みがいくつかなされてきた。残念ながら、今までほとんど成功していない。抗プロテアーゼ治療は、必要とされる有効性および臨床上の有益性が欠如しており（Ｌｅｗｉｓ  ＥＪ，  Ｂｉｓｈｏｐ  Ｊ，  Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ  ＫＭ，  Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｄ，  Ｂｒｅｗｓｔｅｒ  Ｍ，  Ｂｒｏａｄｈｕｒｓｔ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏ  ３２−３５５５，  ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９７；１２１：５４０−６；  Ｂｒｏｗｎ  ＰＤ．  Ｏｎｇｏｉｎｇ  ｔｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２０００；９：２１６７−７７）、生物学的利用能もしくは経口活性が不十分であり、かつ／または標的酵素に対する特異性が欠如していた。特にＭＭＰ阻害薬には、変形性関節症に冒された関節における関節硬直、関節線維増殖およびＩ型コラーゲン蓄積からなる、用量および使用期間依存性の筋骨格系副作用が見られた（Ｒｅｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｒ，  Ｑｉｕ  Ｌ，  Ｌｅｓｃｈ  Ｃ，  Ｓｕｎ  Ｘ，  Ｄｅｖａｌａｒａｊａ  Ｒ，  Ｃｏｄｙ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍａｒｉｍａｓｔａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００３；  ４８：１７４２−９；  Ｒａｏ  ＢＧ．  Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ２００５；  １１：２９５−３２２）。この疾患に罹った患者数の増加に伴い、侵襲性がより低く、症状の緩和だけでなく疾患または損傷の根本原因、すなわち軟骨の分解を改善する新規治療法が非常に望ましく、またそうした新規治療法が非常に必要とされている。
【０００５】
この疾患に罹った患者数の増加に伴い、侵襲性がより低く、症状の緩和だけでなく疾患または損傷の根本原因、すなわち軟骨の分解を改善する新規治療法が非常に望ましく、またそうした新規治療法が非常に必要とされている。
【０００６】
治療用タンパク質ＣＤ−ＲＡＰは、軟骨の分解を遅延させることができるとともに、損傷した軟骨の再生を改善できることが分かっている。しかし、十分な薬剤供給源としての役割を担うためには、ＣＤ−ＲＡＰには、製造に際して高収率であるという商業的要件を満たすことも必要とされる。したがって、組換えＤＮＡ技術によってＣＤ−ＲＡＰを製造することが望ましい。組換え細菌を用いたプロセスでは、強力な細菌プロモーターの制御下にＣＤ−ＲＡＰをコードする遺伝子を発現させることによりこの問題を解決することができた。細菌の直接的な発現には、翻訳開始のために１位にメチオニンが必要である。ＣＤ−ＲＡＰ配列をコードする配列にコドンを付加しなければならない。ネイティブＣＤ−ＲＡＰは、その配列の３位にメチオニンを含む。発現の際、このメチオニンを翻訳開始に使用することもできた。これによって、２つの発現産物が観察されることになる。一方は、グリシンで始まってネイティブＣＤ−ＲＡＰが生成され、もう一方はプロリンで始まって切断型ＣＤ−ＲＡＰが生成される。従来入手可能なＣＤ−ＲＡＰ調製物を分析したところ、これらの調製物が、実際には少なくとも３つの異なるＣＤ−ＲＡＰ種を含むことが明らかとなった。特に、例えば大腸菌で発現されるＣＤ−ＲＡＰのアミノ末端は分解され易く、これによってＣＤ−ＲＡＰ生成物の約１０％のＮ末端異質性が生じる。大腸菌での発現によって得られるＣＤ−ＲＡＰは、少なくとも以下の３つの異なるタンパク質種を含む：
ａ）  ＣＤ−ＲＡＰ（１０８ＡＡ）。これは、追加のＮ末端メチオニンを有し、すなわち合計で１０８のアミノ酸を有する主要な種（≧９０％）であり、Ｎ末端ＭＧＰＭＰＫＬ・・・を有する。
ｂ）  ＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）。これは、追加のＮ末端メチオニンを有しない成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列からなり、Ｎ末端ＧＰＭＰＫＬ・・・を有する。および
ｃ）  ＣＤ−ＲＡＰ（１０５ＡＡ）。これは、Ｎ末端配列ＭＰＫＬ・・・を有するＮ末端切断型ＣＤ−ＲＡＰであり、すなわち成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列よりもアミノ酸が２つ少ない。
【０００７】
生成物におけるこうした異質性は、望ましくない。なぜなら、さらなる精製ステップが必要となり、これによって収率が低下するためである。Ｎ−メチオニンを翻訳後に定量的に除去しなければ、この異質性はさらに高くなる可能性がある。さらに、ネイティブＣＤ−ＲＡＰは疎水性が高く、その結果、細胞に対するその相対的な毒性ゆえに細菌における発現が制限される。
【０００８】
ＣＤ−ＲＡＰの組換え発現にはさらに、その発現に続いてタンパク質のフォールディングが必要である。しかし、ネイティブＣＤ−ＲＡＰのフォールディング収率は、部分的に、疎水性が高いことから非常に低いことが分かっている。
【０００９】
ＣＤ−ＲＡＰの製造におけるこれらの問題を克服するために、ＣＤ−ＲＡＰとプレ配列との融合タンパク質を設計した。この融合タンパク質によって、この前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質の高い発現収率が得られるが、このことは特に、この前駆体タンパク質の疎水性の低下により生じるものと考えられる。さらに、この融合タンパク質のフォールディングは、ネイティブＣＤ−ＲＡＰのフォールディングよりもはるかに容易であることが判明した。しかし、フォールディング後にネイティブＣＤ−ＲＡＰを構成するためには、酵素による切断によってプレ配列を除去する必要がある。これを達成するために、ネイティブＣＤ−ＲＡＰのアミノ酸配列とプレ配列との間の界面を、切断部位として、特にエンドプロテアーゼの切断部位として設計した。全体的に見ると、プレ配列を用いてＣＤ−ＲＡＰを発現させ、その後このプレ配列を除去した後に、ＣＤ−ＲＡＰの生産性は、プレ配列を用いない発現と比較して最大で６０倍増加する。本明細書に開示されるＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質を用いたＣＤ−ＲＡＰの調製によって、所定の１０７のアミノ酸の長さと、所定のＮ末端とを有するＣＤ−ＲＡＰ調製物の提供が可能となる。このことは、ＣＤ−ＲＡＰ製造における収率向上以外の本質的な利点の１つである。
【００１０】
冒された関節を特異的に標的とし、起こりうる（例えば全身性の）副作用を低減させるためには、ＣＤ−ＲＡＰの関節内投与を可能にする製剤も必要とされる。
【００１１】
これに関連して、静脈内および関節内の投与に適した製剤が望まれる。望ましくはこうした製剤は、賦形剤およびバッファーの組合せ物を含み、これによりＣＤ−ＲＡＰタンパク質の安定化が増大し、ひいては該製剤の長期保存が可能となる。特に、ＣＤ−ＲＡＰがより長期間患側に留まってより効果的に軟骨細胞に到達することを可能にする製剤が望まれる。治療的および／または予防的投与を可能にするためには、そうした製剤には、滅菌可能であるとともに長い保存寿命を示すことが求められ、それによって該製剤の保存が可能となる。それゆえ、関節内投与に適したＣＤ−ＲＡＰのリポソーム製剤を開発した。ろ過による滅菌が可能なほど十分に小さい空のリポソームを作製するための、規模拡張の可能な方法を開発した。製剤の開発試験により、リポソーム生成物におけるＣＤ−ＲＡＰ封入率に影響を及ぼすパラメーターと、凍結乾燥製剤の再構成方法とを特定することができ、ここでこれらのパラメーターは、バッファーの種類および脂質含分であることが判明した。
【００１２】
リポソーム製剤の一般的な製造方法は、以下のステップを含む：水和させて均質化させた脂質混合物を調製することにより空のリポソーム（小型単層小胞：ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＳＵＶ）を調製し、次いでリポソームを押し出すステップと、ＳＵＶ懸濁液とＣＤ−ＲＡＰ水溶液とを混合するステップと、凍結乾燥を行うステップと、注射用水（ＷＦＩ）により再構成を行うステップ。
【００１３】
この方法の終わりの時点ではリポソームの多分散度はかなり大きく（約０．３）、これにより滅菌ろ過の問題が生じる。この方法を簡便化して多分散度を低下させるべく、空のリポソームを調製するための溶媒注入法を開発した。この方法では、脂質混合物を製造する必要がなく、それにより中間生成物の調製を行わなくて済むとともに、プロセスステップが省かれる。溶媒注入は、サイジングステップ、例えば均質化および押出を行わなくて済むだけでなく直接的なスケールアップも可能にする、規模拡張の可能な方法である。
【００１４】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、
ａ）  そのＣ末端に切断部位を含むプレ配列と、
ｂ）  ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と
を含むＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質に関する。
【００１５】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質をコードする核酸に関する。
【００１６】
第３の態様において、本発明は、第２の態様の核酸を含むベクターに関する。
【００１７】
第４の態様において、本発明は、第１の態様の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質、第２の態様の核酸または第３の態様のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１８】
第５の態様において、本発明は、ネイティブＣＤ−ＲＡＰの製造方法であって、
ａ）  第１の態様のＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質を提供するステップと、
ｂ）  プレ配列を除去してネイティブＣＤ−ＲＡＰを取得するステップと
を含む方法に関する。
【００１９】
第６の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物であって、１０７のアミノ酸の長さを有する配列番号１の成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質を含有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物に関する。
【００２０】
第７の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸と、バッファーとを含む組成物に関する。
【００２１】
第８の態様において、本発明は、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するための、第６の態様のタンパク質調製物または第７の態様の組成物に関する。
【００２２】
第９の態様において、本発明は、本発明の第６の態様のタンパク質調製物または本発明の第７の態様の組成物を含有する医薬品に関する。
【００２３】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第７の態様の組成物の製造方法に関する。
【００２４】
第１１の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法に関する。
【００２５】
第１２の態様において、本発明は、封入された（特に配列番号１による）ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を含むリポソームを含有する組成物であって、前記リポソームのサイズは２００ｎｍ未満である組成物に関する。
【００２６】
第１３の態様において、本発明は、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するための、第１２の態様の組成物に関する。
【００２７】
第１４の態様において、本発明は、第１２または第１３の態様の組成物を含有する医薬品に関する。
【００２８】
第１５の態様において、本発明は、リポソーム製剤の製造方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法に関する。
【００２９】
第１６の態様において、本発明は、第１５の態様の方法により製造可能なリポソーム製剤に関する。
【００３０】
第１７の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法であって、本発明の第１６の態様のリポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを保持することを含む方法を提供する。
【００３１】
第１８の態様において、本発明は、リポソーム製剤中のリポソームのサイズを低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法を提供する。
【００３２】
第１９の態様において、本発明は、リポソーム製剤の多分散度を低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１に、ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質からネイティブＣＤ−ＲＡＰを調製する一般的な方法の概略図を示す。
【図２】図２Ａに、切断前のＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質のクロマトグラム（Ｚｏｒｂａｘ  Ｃｏｌｕｍｎ、水からアセトニトリルへの移動相勾配、０．８ｍｌ／分、６０℃のオーブン、波長２１４ｎｍ）を示し、図２Ｂに、切断後のＣＤ−ＲＡＰのクロマトグラムを示す。
【図３】図３に、プレ配列の鎖長が様々であるＣＤ−ＲＡＰ構築物の発酵収量データを示す。
【図４】図４に、プレ配列の鎖長に対してプロットしたＣＤ−ＲＡＰの発酵収量データ［ｇ／Ｌ］を示す。
【図５】図５に、様々なトリプシン濃度（Ｕ／リットルで表し、括弧内にプレＣＤ−ＲＡＰ  １ｍｇのあたりの単位として表す）で切断した後のＣＤ−ＲＡＰの経時的増加を示す。
【図６】図６に、様々なｐＨでのトリプシンによる切断  −  ＣＤ−ＲＡＰの増加  −  を示す。
【図７】図７に、様々な温度でのトリプシンによる切断  −  ＣＤ−ＲＡＰの増加  −  を示す。
【図８】図８に、ＤＳＦによる２つのバッファー系における異なるｒｈＣＤ−ＲＡＰバッチの融解点測定を示す；アッセイ濃度０．５ｍｇ／ｍＬ。
【図９】図９に、１回目に調製した製剤のｐＨおよび重量オスモル濃度を示す。
【図１０】図１０に、１回目に調製した製剤の、Ｔ＝０およびストレス後の外観を示す。
【図１１】図１１に、ＣＤ−ＲＡＰを用いて１回目で得られたＲＰ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図１２】図１２に、３回目の洗浄ステップの後および希ＨＣｌ溶液によるｐＨ調整後の製剤のｐＨを示す。
【図１３】図１３に、２回目に調製した製剤のｐＨおよび重量オスモル濃度を示す。
【図１４】図１４に、２回目に調製した製剤の、Ｔ＝０およびストレス後の外観を示す。
【図１５】図１５に、２回目で得られたＲＰ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図１６】図１６に、ＣＤ−ＲＡＰ医薬製剤バッチＦ５３１−０３−００３ｐ０６４ｂの安定性の結果を示す。
【図１７】図１７に、プラセボバッチＦ５３１−０３−００３ｐ０６３の安定性の結果を示す。
【図１８】図１８に、プロセス構成を示す。
【図１９】図１９に、脂質の溶解度の結果を示す。
【図２０】図２０に、有機相中の脂質濃度が粒子径に及ぼす影響を示す。
【図２１】図２１に、スタティックミキサーの内径がリポソームのサイズに及ぼす影響を示す。
【図２２】図２２に、水性相の流量がリポソームのサイズに及ぼす影響を示す。
【図２３】図２３に、１つのバッチにおける試験パラメーターの組合せを示す。
【図２４】図２４に、バッファーと原薬とを混合した後のリポソームの粒子径を示す。
【図２５】図２５Ａに、凍結乾燥プログラム試験１を示し、図２５Ｂに、凍結乾燥プログラム試験２を示す。
【図２６】図２６に、試験した製剤の概要および得られたＥＥ％を示す。
【図２７】図２７に、脂質含分がＥＥ％に及ぼす影響を示す：図２７Ａ：段階的な再構成；図２７Ｂ：１ステップでの再構成。
【図２８】図２８Ａに、凍結乾燥方法がＥＥ％に及ぼす影響を示し、図２７Ｂに、再構成方法がＥＥ％に及ぼす影響を示す。
【図２９】図２９に、試験した製剤の概要および得られたＥＥ％を示す。
【図３０】図３０Ａに、製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０５６のサブバッチについて得られたＥＥ％の結果を示し、図３０Ｂに、製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０６４のサブバッチについて得られたＥＥ％の結果を示す。
【図３１】図３１に、リポソームＣＤ−ＲＡＰ  Ｐｋバッチについての安定性の結果を示す。
【００３４】
配列表
配列番号１  ＣＤ−ＲＡＰのアミノ酸配列（１０７のアミノ酸）：ＧＰＭＰＫＬＡＤＲＫＬＣＡＤＱＥＣＳＨＰＩＳＭＡＶＡＬＱＤＹＭＡＰＤＣＲＦＬＴＩＨＲＧＱＶＶＹＶＦＳＫＬＫＧＲＧＲＬＦＷＧＧＳＶＱＧＤＹＹＧＤＬＡＡＲＬＧＹＦＰＳＳＩＶＲＥＤＱＴＬＫＰＧＫＶＤＶＫＴＤＫＷＤＦＹＣＱ
配列番号２  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴ
配列番号３  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴ
配列番号４  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧ
配列番号５  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴＧ
配列番号６  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮ
配列番号７  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴＧＮ
配列番号８  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳ
配列番号９  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴＧＮＳ
配列番号１０  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡ
配列番号１１  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴＧＮＳＡ
配列番号１２  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＲ
配列番号１３  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴＲ
配列番号１４  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲ
配列番号１５  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＬＴＧＮＳＡＲ
配列番号１６  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＬＴＴＨＷＨＷＨＧＮＳＡＲ
配列番号１７  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＨＦＱＨＨＨＧＳＬＡＲ
配列番号１８  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＨＦＱＨＨＨＧＳＬＡＲ
配列番号１９  プレ配列のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＥＮＱＱＱＲ
配列番号２０  前駆体タンパク質のアミノ酸配列：ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＥＮＱＱＱＲＧＰＭＰＫＬＡＤＲＫＬＣＡＤＱＥＣＳＨＰＩＳＭＡＶＡＬＱＤＹＭＡＰＤＣＲＦＬＴＩＨＲＧＱＶＶＹＶＦＳＫＬＫＧＲＧＲＬＦＷＧＧＳＶＱＧＤＹＹＧＤＬＡＡＲＬＧＹＦＰＳＳＩＶＲＥＤＱＴＬＫＰＧＫＶＤＶＫＴＤＫＷＤＦＹＣＱ
配列番号２１  ＣＤ−ＲＡＰのアミノ酸配列（１０５のアミノ酸）：ＭＰＫＬＡＤＲＫＬＣＡＤＱＥＣＳＨＰＩＳＭＡＶＡＬＱＤＹＭＡＰＤＣＲＦＬＴＩＨＲＧＱＶＶＹＶＦＳＫＬＫＧＲＧＲＬＦＷＧＧＳＶＱＧＤＹＹＧＤＬＡＡＲＬＧＹＦＰＳＳＩＶＲＥＤＱＴＬＫＰＧＫＶＤＶＫＴＤＫＷＤＦＹＣＱ。
【００３５】
発明の詳細な説明
定義
本発明につき以下に詳説する前に、本発明は、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは様々であってよいものと理解されたい。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態について説明することのみを目的としたものであって、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるものと理解されたい。特に指定がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００３６】
本明細書の文面全体を通して、若干の文献が引用されている。本明細書に引用された各文献（特許明細書、特許出願明細書、科学刊行物、製造業者による仕様書、指示書などすべてを含む）については、前掲・後掲の如何を問わず、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。本明細書に記載のいかなるものも、本発明には先行発明ゆえにかかる開示よりも先行する資格が与えられないことの自認と解釈されるべきではない。本明細書に引用される文献には、「援用される」ものとして特徴付けられるものがある。かかる援用された文献の定義または教示と、本明細書に列挙される定義または教示との間に矛盾が生じた場合には、本明細書の文面が優先される。
【００３７】
以下に、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されるが、これらの要素を任意の様式で任意の数で組合せて追加の実施形態を創作してもよいものと理解されるべきである。様々に記載された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素と組合せた実施形態をサポートしかつこれらを包含するものと理解されるべきである。さらに、文脈上特に指定がない限り、本出願の記載によって、本出願に記載されたすべての要素の任意の順列および組合せ物が開示されているものと考えられるべきである。
【００３８】
本明細書および付属の特許請求の範囲全体を通じて、文脈上別段の解釈が必要でない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる単語および変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された整数またはステップまたは整数群またはステップ群の包含を意味するが、他のいずれの整数またはステップまたは整数群またはステップ群も排除されないものと理解される。
【００３９】
本明細書および付属の特許請求の範囲で用いられる場合に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容上別段の解釈の明示がない限り、複数の指示対象を包含する。
【００４０】
数値と関連して用いられる場合に、「約」なる用語は、示された数値よりも５％小さい下限を有しかつ示された数値より５％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【００４１】
本明細書で用いられる場合の「脂質」なる用語は、任意の脂溶性分子を表す。脂質類は、典型的には脂肪族炭化水素鎖からなり、水に難溶性であるが非極性有機溶媒には溶解する。脂質類は、生存細胞における必須の分子群であり、エネルギー貯蔵において細胞膜の構造成分として重要な役割を果たすとともに、シグナル伝達分子としての役割も果たす。脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、脂肪アシル類、脂肪アルコール類、ステロール脂質類、例えばコレステロール、グリセロ脂質類、例えばモノグリセリド類（モノアシルグリセロール）、ジグリセリド類（ジアシルグリセロール）またはトリグリセリド類（トリアシルグリセロール、ＴＡＧ）、グリセロリン脂質類、サッカロ脂質類、スフィンゴ脂質類、スルホ脂質類、ポリケタイド類、プレノール脂質類が挙げられる。
【００４２】
本明細書で用いられる場合の「脂肪アシル類」なる用語は、マロニル−ＣｏＡ（またはメチルマロニル−ＣｏＡ）基によるアセチル−ＣｏＡプライマーの鎖伸長によって合成され、環式官能基を含むことができかつ／またはヘテロ原子で置換されている多様な分子群を意味する。脂肪アシル類の例としては、これらに限定されるものではないが、脂肪酸類およびコンジュゲート（ＦＡ０１）、例えば直鎖脂肪酸類（ＦＡ０１０１）、分枝脂肪酸類（ＦＡ０１０２）、不飽和脂肪酸類（ＦＡ０１０３）、ヒドロペルオキシ脂肪酸類（ＦＡ０１０４）、ヒドロキシ脂肪酸類（ＦＡ０１０５）、オキソ脂肪酸類（ＦＡ０１０６）、エポキシ脂肪酸類（ＦＡ０１０７）、メトキシ脂肪酸類（ＦＡ０１０８）、ハロゲン化脂肪酸類（ＦＡ０１０９）、アミノ脂肪酸類（ＦＡ０１１０）、シアノ脂肪酸類（ＦＡ０１１１）、ニトロ脂肪酸類（ＦＡ０１１２）、チア脂肪酸類（ＦＡ０１１３）、炭素環式脂肪酸類（ＦＡ０１１４）、複素環式脂肪酸類（ＦＡ０１１５）、ミコール酸類（ＦＡ０１１６）およびジカルボン酸類（ＦＡ０１１７）；オクタデカノイド類（ＦＡ０２）、例えば１２−オキソフィトジエン酸代謝産物（ＦＡ０２０１）、ジャスモン酸類（ＦＡ０２０２）および他のオクタデカノイド類（ＦＡ０２００）；エイコサノイド類（ＦＡ０３）、例えばプロスタグランジン類（ＦＡ０３０１）、ロイコトリエン類（ＦＡ０３０２）、トロンボキサン類（ＦＡ０３０３）、リポキシン類（ＦＡ０３０４）、ヒドロキシ／ヒドロペルオキシエイコサトリエン酸類（ＦＡ０３０５）、ヒドロキシ／ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸類（ＦＡ０３０６）、ヒドロキシ／ヒドロペルオキシエイコサペンタエン酸類（ＦＡ０３０７）、エポキシエイコサトリエン酸類（ＦＡ０３０８）、ヘポキシリン類（ＦＡ０３０９）、レブグランジン類（ＦＡ０３１０）、イソプロスタン類（ＦＡ０３１１）、クラブロン類および誘導体（ＦＡ０３１２）、および他のエイコサノイド類（ＦＡ０３００）；ドコサノイド類（ＦＡ０４）；脂肪アルコール類（ＦＡ０５）；脂肪アルデヒド類（ＦＡ０６）、脂肪エステル類（ＦＡ０７）、例えばワックスモノエステル類（ＦＡ０７０１）、ワックスジエステル類（ＦＡ０７０２）、シアノエステル類（ＦＡ０７０３）、ラクトン類（ＦＡ０７０４）、脂肪アシルＣｏＡ類（ＦＡ０７０５）、脂肪アシルＡＣＰ類（ＦＡ０７０６）、脂肪アシルカルニチン類（ＦＡ０７０７）および脂肪アシルアデニレート類（ＦＡ０７０８）；脂肪アミド類（ＦＡ０８）、例えば第１級アミド類（ＦＡ０８０１）、Ｎ−アシルアミン類（ＦＡ０８０２）、脂肪アシルホモセリンラクトン類（ＦＡ０８０３）およびＮ−アシルエタノールアミン類（エンドカンナビノイド類）（ＦＡ０８０４）；脂肪ニトリル類（ＦＡ０９）；脂肪エーテル類（ＦＡ１０）；炭化水素類（ＦＡ１１）；含酸素炭化水素類（ＦＡ１２）；脂肪アシルグリコシド類（ＦＡ１３）；ならびに他の脂肪アシル類（ＦＡ００）が挙げられる。脂肪酸構造は、生体脂質の最も基本的な構造の１つであり、構造的に比較的複雑な脂質の構成単位として一般的に使用されている。「脂肪酸類」は、カルボン酸基を含む炭化水素鎖から構成され、極性の親水性頭部（例えばグリセロール、スフィンゴシン）と、水に不溶の非極性の疎水性尾部とが分子に付与されている。炭素鎖は、飽和であっても不飽和であってもよく、すなわち２個の炭素原子の間に二重結合を含んでいなくてもよく、また１個または複数個含んでいてもよく、また４〜２８個の炭素原子を有してよく、すなわち４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個または２８個の炭素原子を有してよい。不飽和脂肪酸類中の二重結合は、シス幾何異性またはトランス幾何異性のいずれかとして存在し、これは分子の分子構造に影響を及ぼす。酸素、ハロゲン、窒素および／または硫黄を含むさらなる官能基が結合していてもよい。生存細胞では、脂肪酸合成と呼ばれるプロセスで酵素による脂肪酸合成によりアセチル−ＣｏＡプライマーをマロニル−ＣｏＡまたはメチルマロニル−ＣｏＡ基で鎖伸長することによって脂肪酸類が合成される。飽和脂肪酸類の例としては、これらに限定されるものではないが、カプリル酸（ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ；８：０）、カプリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯＯＨ；１０：０）、ラウリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＯＨ；１２：０）、ミリスチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯＯＨ；１４：０）、パルミチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯＯＨ；１６：０）、ステアリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１６ＣＯＯＨ；１８：０）、アラキン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１８ＣＯＯＨ；２０：０）、ベヘン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）２０ＣＯＯＨ；２２：０）、リグノセリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）２２ＣＯＯＨ；２４：０）およびセロチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）２４ＣＯＯＨ；２６：０）が挙げられる。
【００４３】
不飽和脂肪酸類の例としては、これらに限定されるものではないが、ミリストレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ；１４：１）、パルミトオレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ；１６：１）、サピエン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ；１６：１）、オレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ；１８：１）、エライジン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ、１８：１）、バクセン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）９ＣＯＯＨ；１８：１）、リノール酸（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ；１８：２）、リノエライジン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ；１８：２）およびα−リノレン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ；１８：３）が挙げられる。
【００４４】
「グリセロ脂質類」または「グリセリド」なる用語は、主に一、二および三置換グリセロールから構成されるエステル化グリセロールを意味し、最も代表的な群員は、グリセロールの脂肪酸トリエステル類（いわゆるトリグリセリド類）であり、ここで、グリセロールの３つのヒドロキシル基がそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によりエステル化されている。グリセロ脂質類は、主にエネルギー貯蔵体として機能し、したがって動物組織における貯蔵脂肪の大部分を構成する。グリセロ脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、モノラジルグリセロール類、ジラジルグリセロール類（ＧＬ０２）、トリラジルグリセロール類（ＧＬ０３）、例えばグリセリルトリステアレート（ステアリン）；グリコシルモノラジルグリセロール（ＧＬ０４）、グリコシルジラジルグリセロール類（ＧＬ０５）および他のグリセロ脂質類（ＧＬ００）が挙げられる。
【００４５】
リン脂質類は、細胞膜の主成分ならびに細胞内および細胞間タンパク質の結合部位として働く細胞の脂質二重層の重要な成分である。リン脂質類は、グリセロール（グリセロリン脂質類）またはスフィンゴシン（スフィンゴ脂質類）と、このグリセロールまたはスフィンゴシンにエステル結合を介して結合した脂肪酸と、リン酸基と、単純な有機分子、例えばコリン、セリンまたはエタノールアミンとを含む。
【００４６】
グリセロホスフィノ脂質類は、アルコールとしてグリセロールを含み、このグリセロールのヒドロキシル基が２つの脂肪酸およびホスフィン（ＩＵＰＡＣ名：ホスファン）によりエステル化されている。グリセロホスホノ脂質類は、アルコールとしてグリセロールを含み、このグリセロールのヒドロキシル基が２つの脂肪酸および亜リン酸によりエステル化されている。
【００４７】
真核細胞におけるグリセロリン脂質類の中には、例えばホスファチジルイノシトールおよびホスファチジン酸のように、膜由来のセカンドメッセンジャーの前駆体として機能するものや、直接的にこうしたセカンドメッセンジャーとして機能するものもある。さらに、こうしたグリセロリン脂質類は、代謝および細胞シグナル伝達に関与している。さらに、古細菌には、アルキル結合および１Ｚ−アルケニル結合（プラスマローゲン）グリセロリン脂質類ならびにジアルキルエーテル多様体も存在する。グリセロリン脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、グリセロホスホコリン類（ＧＰ０１）、例えばジアシルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０３）、ジアルキルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０４）、モノアシルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０５）、モノアルキルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０６）、１Ｚ−アルケニルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０７）、１−アシル−２−アルキルグリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０８）および１−アシル−２−（１Ｚ−アルケニル）−グリセロホスホコリン類（ＧＰ０１０９）；グリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２）、例えばジアシルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０３）、ジアルキルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０４）、モノアシルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０５）、モノアルキルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０６）、１Ｚ−アルケニルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０７）および１−アシル−２−アルキルグリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ０２０８）；グリセロホスホセリン類（ＧＰ０３）、例えばジアシルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０３）、ジアルキルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０４）、モノアシルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０５）、モノアルキルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホセリン類（ＧＰ０３０７）；グリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４）、例えばジアシルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０３）、ジアルキルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０４）、モノアシルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０５）、モノアルキルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０６）、１Ｚ−アルケニルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４０７）、ジアシルグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ０４０８）、ジアシルグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ０４０９）、モノアシルグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ０４１０）および１−アシル−２−アルキルグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ０４１１）；グリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５）、例えばジアシルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０３）、ジアルキルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０４）、モノアシルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０５）、モノアルキルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホグリセロホスファート類（ＧＰ０５０７）；グリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６）、例えばジアシルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０３）、ジアルキルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０４）、モノアシルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０５）、モノアルキルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホイノシトール類（ＧＰ０６０７）；グリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７）、例えばジアシルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０３）、ジアルキルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０４）、モノアシルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０５）、モノアルキルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホイノシトールモノホスファート類（ＧＰ０７０７）；
グリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８）、例えばジアシルグリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８０３）、モノアシルグリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８０４）、モノアルキルグリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８０５）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホイノシトールビスホスファート類（ＧＰ０８０６）；グリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９）、例えばジアシルグリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９０３）、モノアシルグリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９０４）、モノアルキルグリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９０５）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホイノシトールトリスホスファート類（ＧＰ０９０６）；グリセロホスファート類（ＧＰ１０）、例えばジアシルグリセロホスファート類（ＧＰ１００１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスファート類（ＧＰ１００２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスファート類（ＧＰ１００３）、ジアルキルグリセロホスファート類（ＧＰ１００４）、モノアシルグリセロホスファート類（ＧＰ１００５）、モノアルキルグリセロホスファート類（ＧＰ１００６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスファート類（ＧＰ１００７）；グリセロピロホスファート類（ＧＰ１１）、例えばジアシルグリセロピロホスファート類（ＧＰ１１０１）およびモノアシルグリセロピロホスファート類（ＧＰ１１０２）；グリセロホスホグリセロホスホグリセロール類（ＧＰ１２）、例えばジアシルグリセロホスホグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ１２０１）、ジアシルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２０２）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ１２０３）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２０４）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ１２０５）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２０６）、モノアシルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２０７）、モノアルキルグリセロホスホグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ１２０８）、モノアルキルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２０９）、１Ｚ−アルケニルグリセロホスホグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ１２１０）、１Ｚ−アルケニルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２１１）、ジアルキルグリセロホスホグリセロホスホジラジルグリセロール類（ＧＰ１２１２）およびジアルキルグリセロホスホグリセロホスホモノラジルグリセロール類（ＧＰ１２１３）；ＣＤＰグリセロール類（ＧＰ１３）、例えばＣＤＰジアシルグリセロール類（ＧＰ１３０１）、ＣＤＰ−１−アルキル−２−アシルグリセロール類（ＧＰ１３０２）、ＣＤＰ−１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロール類（ＧＰ１３０３）、ＣＤＰジアルキルグリセロール類（ＧＰ１３０４）、ＣＤＰモノアシルグリセロール類（ＧＰ１３０５）、ＣＤＰモノアルキルグリセロール類（ＧＰ１３０６）およびＣＤＰ−１Ｚ−アルケニルグリセロール類（ＧＰ１３０７）；グリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４）、例えばジアシルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０１）、１−アルキル−２−アシルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０３）、モノアシルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０４）、モノアルキルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０５）、１Ｚ−アルケニルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０６）およびジアルキルグリコシルグリセロリン脂質類（ＧＰ１４０７）；グリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５）、例えばジアシルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０３）、モノアシルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０４）、モノアルキルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０５）、１Ｚ−アルケニルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０６）およびジアルキルグリセロホスホイノシトールグリカン類（ＧＰ１５０７）；グリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６）、例えばジアシルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０３）、ジアルキルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０４）、モノアシルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０５）、モノアルキルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホノコリン類（ＧＰ１６０７）；グリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７）、例えばジアシルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０１）、１−アルキル−２−アシルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０２）、１−（１Ｚ−アルケニル）−２−アシルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０３）、ジアルキルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０４）、モノアシルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０５）、モノアルキルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０６）および１Ｚ−アルケニルグリセロホスホノエタノールアミン類（ＧＰ１７０７）；ジグリセロールテトラエーテルリン脂質類（カルドアーキオール類）（ＧＰ１８）；グリセリンノニトールテトラエーテルリン脂質類（ＧＰ１９）；酸化グリセロリン脂質類（ＧＰ２０）、例えば酸化グリセロホスホコリン類（ＧＰ２００１）、酸化グリセロホスホエタノールアミン類（ＧＰ２００２）および酸化カルジオリピン類（ＧＰ２００３）；ならびに他のグリセロリン脂質類（ＧＰ００）が挙げられる。
【００４８】
生体膜においては、グリセロリン脂質類としては、これらに限定されるものではないが、ホスファチジン酸（ホスファチダート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスホイノシチド類、例えばホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスファート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスホスファート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリホスファート（ＰＩＰ３）、カルジオリピンおよびリゾリン脂質類が挙げられ、これらが最も代表的である。
【００４９】
天然に存在するリン脂質誘導体の例としては、これらに限定されるものではないが、卵ＰＣ、卵ＰＧ、大豆ＰＣ、水素添加大豆ＰＣおよびスフィンゴミエリンが挙げられる。合成リン脂質誘導体の例としては、これらに限定されるものではないが、ホスファチジン酸（ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＥＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＰＯＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）およびＰＥＧリン脂質（ｍＰＥＧリン脂質、ポリグリセリンリン脂質、官能化リン脂質、末端活性化リン脂質）が挙げられる。
【００５０】
「スフィンゴ脂質類」はスフィンゴイド塩基骨格を含むが、ここで、哺乳動物の主要なスフィンゴイド塩基はスフィンゴシンである。哺乳動物の主なスフィンゴイド塩基類は、ジヒドロスフィンゴシンおよびスフィンゴシンであるが、一方で酵母の主要なスフィンゴイド塩基類は、ジヒドロスフィンゴシンおよびフィトスフィンゴシンである。スフィンゴシン骨格は、典型的に荷電した頭部基、例えばエタノールアミン、セリンまたはコリンにはＯ−結合することができ、アシル基、例えば脂肪酸にはアミド結合することができる。脂肪酸は、典型的には飽和または一不飽和であり、炭素原子１６〜２６個分の鎖長を有する。スフィンゴ脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、スフィンゴイド塩基類（ＳＰ０１）、例えばスフィング−４−エニン類（スフィンゴシン類）（ＳＰ０１０１）、スフィンガニン類（ＳＰ０１０２）、４−ヒドロキシスフィンガニン類（フィトスフィンゴシン類）（ＳＰ０１０３）、スフィンゴイド塩基のホモログおよび多様体（ＳＰ０１０４）、スフィンゴイド塩基１−ホスファート類（ＳＰ０１０５）、リゾスフィンゴミエリン類およびリゾスフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０１０６）、Ｎ−メチル化スフィンゴイド塩基類（ＳＰ０１０７）およびスフィンゴイド塩基のアナログ（ＳＰ０１０８）；セラミド類（ＳＰ０２）、例えばＮ−アシルスフィンゴシン類（セラミド類）（ＳＰ０２０１）、Ｎ−アシルスフィンガニン類（ジヒドロセラミド類）（ＳＰ０２０２）、Ｎ−アシル−４−ヒドロキシスフィンガニン類（フィトセラミド類）（ＳＰ０２０３）、アシルセラミド類（ＳＰ０２０４）およびセラミド１−ホスファート類（ＳＰ０２０５）；ホスホスフィンゴ脂質類（ＳＰ０３）、例えばセラミドホスホコリン類（スフィンゴミエリン類）（ＳＰ０３０１）、セラミドホスホエタノールアミン類（ＳＰ０３０２）およびセラミドホスホイノシトール類（ＳＰ０３０３）；ホスホノスフィンゴ脂質類（ＳＰ０４）；中性スフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０５）、例えば単純なＧｌｃ系（ＳＰ０５０１）、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−（Ｇｌｏｂｏ系）（ＳＰ０５０２）、ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−（Ｇａｎｇｌｉｏ系）（ＳＰ０５０３）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−（Ｌａｃｔｏ系）（ＳＰ０５０４）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−（Ｎｅｏｌａｃｔｏ系）（ＳＰ０５０５）、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−（Ｉｓｏｇｌｏｂｏ系）（ＳＰ０５０６）、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃ−（Ｍｏｌｌｕ系）（ＳＰ０５０７）、ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃ−（Ａｒｔｈｒｏ系）（ＳＰ０５０８）、Ｇａｌ−（Ｇａｌａ系）（ＳＰ０５０９）および他の中性スフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０５００）；酸性スフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０６）、例えばガングリオシド類（ＳＰ０６０１）、スルホスフィンゴ糖脂質類（スルファチド類）（ＳＰ０６０２）、グルクロノスフィンゴ脂質類（ＳＰ０６０３）、ホスホスフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０６０４）および他の酸性スフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０６��０）；塩基性スフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０７）；両性スフィンゴ糖脂質類（ＳＰ０８）；ヒ素スフィンゴ脂質類（ＳＰ０９）；ならびに他のスフィンゴ脂質類（ＳＰ００）が挙げられる。
【００５１】
セラミド類（Ｎ−アシルスフィンゴイド塩基類）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。生物学的に関連のあるセラミド類の例としては、これらに限定されるものではないが、セラミドホスホリルコリン（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒ−ＰＥ）およびセラミドホスホリルグリセロールが挙げられる。哺乳動物の主要なホスホスフィンゴ脂質類は、スフィンゴミエリン類（例えばセラミド、ホスホコリン類）である。「スフィンゴ糖脂質類」は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に連結された１つまたは複数の糖残基から構成される。スフィンゴ糖脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、セレブロシド類およびガングリオシド類が挙げられる。
【００５２】
「サッカロ脂質類」なる用語は、脂肪酸が糖骨格に直接結合して、膜二重層に適合する構造を形成している分子を意味する。サッカロ脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、アシルアミノ糖類（ＳＬ０１）、例えばモノアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０１）、ジアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０２）、トリアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０３）、テトラアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０４）、ペンタアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０５）、ヘキサアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０６）およびヘプタアシルアミノ糖類（ＳＬ０１０７）；アシルアミノ糖グリカン類（ＳＬ０２）；アシルトレハロース類（ＳＬ０３）；アシルトレハロースグリカン類（ＳＬ０４）；他のアシル糖類（ＳＬ０５）；ならびに他のサッカロ脂質類（ＳＬ００）が挙げられる。
【００５３】
グリセロリン脂質類およびスフィンゴ脂質類の他に「ステロール脂質類」も、ホルモンおよびシグナル伝達分子として様々な生物学的役割を果たす細胞膜脂質の重要な成分である。この「ステロール脂質類」は「ステロイド類」とも呼ばれ、例としては、これらに限定されるものではないが、コレステロールおよびその誘導体が挙げられる。ステロイド類は、４つの縮合炭素環のコア構造を有し、このコア構造は、エステル化により炭素鎖に結合していてもよい。炭素数１８の（Ｃ１８）ステロイド類としては、エストロゲンファミリーが挙げられ、一方でＣ１９ステロイド類には、アンドロゲン類、例えばテストステロンおよびアンドロステロンが含まれる。Ｃ２１サブクラスとしては、例えばプロゲストーゲン類および糖質コルチコイド類および鉱質コルチコイド類が挙げられる。セコステロイド類には様々な形態のビタミンＤが含まれ、このセコステロイド類は、コア構造のＢ環の切断を特徴とする。ステロール類の他の例は、胆汁酸およびその抱合体であり、これらは、哺乳動物ではコレステロールの酸化誘導体であり、肝臓で合成される。植物における相当物は、フィトステロール類、例えばβ−シトステロール、スチグマステロールおよびブラシカステロールであり；最後に記載した化合物は、藻類生育のバイオマーカーとしても使用される。真菌細胞膜における主なステロールは、エルゴステロールである。ステロール脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、ステロール類（ＳＴ０１）、例えばコレステロールおよび誘導体（ＳＴ０１０１）、コレステリルエステル類（ＳＴ０１０２）、エルゴステロール類およびＣ２４−メチル誘導体（ＳＴ０１０３）、スチグマステロール類およびＣ２４−エチル誘導体（ＳＴ０１０４）、Ｃ２４−プロピルスチロール類および誘導体（ＳＴ０１０５）、ゴルゴステロール類および誘導体（ＳＴ０１０６）、フロスタノール類および誘導体（ＳＴ０１０７）、スピロスタノール類および誘導体（ＳＴ０１０８）、フロスピロスタノール類および誘導体（ＳＴ０１０９）、シクロアルタノール類および誘導体（ＳＴ０１１０）、カリステロール類およびシクロプロピル側鎖誘導体（ＳＴ０１１１）、カルダノリド類および誘導体（ＳＴ０１１２）、ブファノリド類および誘導体（ＳＴ０１１３）、ブラシノリド類および誘導体（ＳＴ０１１４）、ソラニジン類およびアルカロイド誘導体（ＳＴ０１１５）、およびウィタノリド類および誘導体（ＳＴ０１１６）；ステロイド類（ＳＴ０２）、例えばＣ１８ステロイド類（エストロゲン類）および誘導体（ＳＴ０２０１）、Ｃ１９ステロイド類（アンドロゲン類）および誘導体（ＳＴ０２０２）、およびＣ２１ステロイド類（糖質／鉱質コルチコイド類、プロゲストージン類）および誘導体（ＳＴ０２０３）；セコステロイド類（ＳＴ０３）、例えばビタミンＤ２および誘導体（ＳＴ０３０１）、ビタミンＤ３および誘導体（ＳＴ０３０２）、ビタミンＤ４および誘導体（ＳＴ０３０３）、ビタミンＤ５および誘導体（ＳＴ０３０４）、ビタミンＤ６および誘導体（ＳＴ０３０５）、およびＤ７および誘導体（ＳＴ０３０６）；胆汁酸類および誘導体（ＳＴ０４）、例えばＣ２４胆汁酸類、アルコール類および誘導体���ＳＴ０４０１）、Ｃ２６胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０２）、Ｃ２７胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０３）、Ｃ２８胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０４）、Ｃ２２胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０５）、Ｃ２３胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０６）、Ｃ２５胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０７）、およびＣ２９胆汁酸類、アルコール類および誘導体（ＳＴ０４０８）；ステロイド抱合体（ＳＴ０５）、例えばグルクロニド類（ＳＴ０５０１）、スルファート類（ＳＴ０５０２）、グリシン抱合体（ＳＴ０５０３）、タウリン抱合体（ＳＴ０５０４）および他のステロイド抱合体（ＳＴ０５０５）；ならびに他のステロール脂質（ＳＴ００）が挙げられる。
【００５４】
本明細書で用いられる場合の「ポリケタイド類」なる用語は、構造的に非常に多様な群員を含むファミリーを意味し、それらはすべて、脂肪酸合成と同様のプロセスでマロニル−ＣｏＡ由来の伸長単位の脱カルボキシル縮合によるポリケタイドシンターゼ経路を介して合成される。ポリケタイド類は、次の３つのクラスに大別される：Ｉ型ポリケタイド類（典型的には、多重モジュール型のメガシンターゼにより生成されるマクロライド類）、ＩＩ型ポリケタイド類（典型的には、解離された酵素の反復作用により生成される芳香族分子）およびＩＩＩ型ポリケタイド類（典型的には、真菌種により生成される芳香族小分子）。商業的に使用されるポリケタイドとしては例えば、天然抗生物質、抗真菌剤、細胞増殖抑制剤、抗コレステロール剤、抗寄生虫剤、抗コクシジウム剤、動物成長促進剤および殺虫剤が挙げられる。ポリケタイド類の例としては、これらに限定されるものではないが、線状ポリケタイド類（ＰＫ０１）；ハロゲン化アセトゲニン類（ＰＫ０２）；バンレイシ科（ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）アセトゲニン類（ＰＫ０３）；マクロライド類およびラクトンポリケタイド類（ＰＫ０４）；アンサマイシン類および関連するポリケタイド類（ＰＫ０５）；ポリエン類（ＰＫ０６）；線状テトラサイクリン類（ＰＫ０７）；アングサイクリン類（ＰＫ０８）；ポリエーテルポリケタイド類（ＰＫ０９）；アフラトキシン類および関連物質（ＰＫ１０）；サイトカラシン類（ＰＫ１１）；フラボノイド類（ＰＫ１２）、例えばアントシアニジン類（ＰＫ１２０１）、フラバン類、フラバノール類およびロイコアントシアニジン類（ＰＫ１２０２）、プロアントシアニジン類（ＰＫ１２０３）、ビフラボノイド類およびポリフラボノイド類（ＰＫ１２０４）、イソフラボノイド類（ＰＫ１２０５）、ロテノイドフラボノイド類（ＰＫ１２０６）、プテロカルパン類（ＰＫ１２０７）、イソフラバン類（ＰＫ１２０８）、クメスタンフラボノイド類（ＰＫ１２０９）、ネオフラボノイド類（ＰＫ１２１０）、フラボン類およびフラボノール類（ＰＫ１２１１）、カルコン類およびジヒドロカルコン類（ＰＫ１２１２）、オーロンフラボノイド類（ＰＫ１２１３）、フラバノン類（ＰＫ１２１４）、ジヒドロフラボノール類（ＰＫ１２１５）および他のフラボノイド類（ＰＫ１２１６）；芳香族ポリケタイド類（ＰＫ１３）、例えば単環式芳香族ポリケタイド類（ＰＫ１３０１）、ナフタレン類およびナフトキノン類（ＰＫ１３０２）、ベンゾイソクロマンキノン類（ＰＫ１３０３）、アントラセン類およびフェナントレン類（ＰＫ１３０４）、アントラサイクリノン類（ＰＫ１３０５）、ジベンゾフラン類、グリセオフルビン類、ジベンゾピラン類およびキサントン類（ＰＫ１３０６）、ジフェニルメタン類、アシルフロログルシノール類およびベンゾフェノン類（ＰＫ１３０７）、デプシド類およびデプシドン類（ＰＫ１３０８）、ジフェニルエーテル類、ビフェニル類、ジベンジル類およびスチルベン類（ＰＫ１３０９）、ベンゾフラノイド類（ＰＫ１３１０）、ベンゾピラノイド類（ＰＫ１３１１）および他の芳香族ポリケタイド類（ＰＫ１３１２）；非リボソームペプチド／ポリケタイド融合体（ＰＫ１４）；ならびに他のポリケタイド類（ＰＫ００）が挙げられる。
【００５５】
「プレノール脂質類」または「イソプレノイド類」なる用語は、５つの炭素前駆体イソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸から合成され、主にメバロン酸経路を介して生成される分子を意味する。いくつかの細菌（例えば大腸菌）および植物において、メチルエリスリトールリン酸経路を介してイソプレノイド前駆体が生成される。単純なイソプレノイド類（直鎖状アルコール、ジホスファート類など）は、Ｃ５単位の連続的な付加により形成されるため、イソプレノイド類は、４０個を超える炭素を含む構造（すなわち８イソプレノイド単位）のポリテルペンサブクラスに便宜的に分類される。プレノール脂質類およびそれらのリン酸化誘導体は、膜を横断するオリゴ糖類の輸送において重要な役割を果たす。ポリプレノールリン酸糖類およびポリプレノール二リン酸糖類は、細胞質外でのグリコシル化反応、細胞外での多糖類生合成（例えば細菌におけるペプチドグリカン重合）および真核生物のタンパク質のＮ−グリコシル化において機能する。プレノール脂質類の例としては、これらに限定されるものではないが、イソプレノイド類（ＰＲ０１）、例えばＣ５イソプレノイド類（ヘミテルペン類）（ＰＲ０１０１）、Ｃ１０イソプレノイド類（モノテルペン類）（ＰＲ０１０２）、Ｃ１５イソプレノイド類（セスキテルペン類）（ＰＲ０１０３）、Ｃ２０イソプレノイド類（ジテルペン類）（ＰＲ０１０４）、Ｃ２５イソプレノイド類（セステルテルペン類）（ＰＲ０１０５）、Ｃ３０イソプレノイド類（トリテルペン類）（ＰＲ０１０６）、Ｃ４０イソプレノイド類（テトラテルペン類）（ＰＲ０１０７）、ポリテルペン類（ＰＲ０１０８）およびレチノイド類（ＰＲ０１０９）；キノン類およびヒドロキノン類（ＰＲ０２）、例えばユビキノン類（ＰＲ０２０１）、ビタミンＥ（ＰＲ０２０２）およびビタミンＫ（ＰＲ０２０３）；ポリプレノール類（ＰＲ０３）、例えばバクトプレノール類（ＰＲ０３０１）、バクトプレノールモノホスファート類（ＰＲ０３０２）、バクトプレノールジホスファート類（ＰＲ０３０３）、フィトプレノール類（ＰＲ０３０４）、フィトプレノールモノホスファート類（ＰＲ０３０５）、フィトプレノールジホスファート類（ＰＲ０３０６）、ドリコール類（ＰＲ０３０７）、ドリコールモノホスファート類（ＰＲ０３０８）およびドリコールジホスファート類（ＰＲ０３０９）；ホパノイド類（ＰＲ０４）；ならびに他のプレノール脂質類（ＰＲ００）が挙げられる。
【００５６】
本明細書で用いられる場合の「脂質二重層」なる用語は、脂質の二重層構造を意味し、これは典型的には水性環境中で自発的に形成され、その親水性頭部は二重層の両面で水に面し、疎水性尾部は内部で水から遮断されている。本明細書で用いられる場合に、この用語にはすべての形状の二重層が包含され、こうした二重層としては、これらに限定されるものではないが例えば平面状の二重層および湾曲した二重層が挙げられる。
【００５７】
本明細書で用いられる場合の「ミセル」なる用語は、液体コロイド中に分散された脂質類の凝集体を意味する。水性溶液中の典型的なミセルは、親水性頭部が周囲の溶液と接触しており疎水性尾部がミセルの中心に存在している凝集体を形成する。非極性溶媒中で、ある種の脂質類は逆ミセルも形成しうる。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲全体を通じて用いられる「リポソーム」なる用語は、脂質二重層膜を含む小胞を意味する。ミセルは脂質単層から構成されており、したがってリポソームは、脂質二重層を含む点でミセルと異なる。リポソームの脂質膜は、これらに限定されるものではないが例えば脂質類、タンパク質類および他の膜関連成分などの成分を含むことができる。リポソームの主な種類としては、多層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ、ＭＬＶ）、小型単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ、ＳＵＶ）、大型単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ、ＬＵＶ）、巨大単層小胞（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ、ＧＵＶ）が挙げられる。典型的には、ＳＵＶおよびＬＵＶリポソームの直径は１ｎｍ〜１μｍであり、ＧＵＶリポソームの直径は１μｍ〜３００μｍであり、すなわちＧＵＶリポソームの直径は、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍまたは３００μｍである。典型的には、リポソームは、疎水性膜の内部に液体コア、しばしば水溶液を封入する。溶解された親水性溶質は、この脂質二重層を容易に通過することができないが、疎水性化学物質は、この膜を溶解させてこの膜の内部に入り込むことができる。したがってリポソームは、疎水性分子と親水性分子の双方を含むことができる。リポソームの脂質二重層は、他の二重層、例えば他のリポソームまたは細胞膜と融合しうる。これにより、リポソームは、その内容物を第２のリポソームまたは細胞に送達することができる。したがって、２つの隣接するリポソームの融合を避けるために、これらのリポソームは典型的には、脂質二重層の融合を防止するために互いに一定の距離に保たれる。２つのリポソーム間の距離の程度は、リポソームのサイズ、リポソームの組成および溶媒の化学的性質に依存する。
【００５９】
「核酸」または「核酸分子」なる用語は同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基またはそれら双方の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーと理解される。典型的には、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合を介して核酸が形成される。本発明の文脈において、核酸なる用語は、これらに限定されるものではないが例えばリボ核酸（ＲＮＡ）分子およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を包含する。核酸の一本鎖についての記述によって、相補鎖の配列も（少なくとも部分的に）定められる。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、二本鎖および一本鎖の双方の配列の一部を含んでいてもよい。核酸は、生物学的、生化学的もしくは化学的な合成方法または当技術分野で知られている任意の方法により取得することができる。本明細書で用いられる場合に、「核酸」なる用語は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語を包含する。本発明の異なる態様のうちの１つの文脈において用いられる場合に、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、約５０までのヌクレオチド、例えば２〜約５０のヌクレオチドの長さの核酸を意味する。本発明の異なる態様のうちの１つの文脈において用いられる場合に、「ポリヌクレオチド」なる用語は、約５０を上回るヌクレオチドの長さの核酸を意味し、例えば５１以上のヌクレオチドの長さの核酸を意味する。プローブおよびプライマーとは、標的核酸に（プローブを）ハイブリダイズすることによって、または標的核酸へのハイブリダイゼーションおよび標的核酸の増幅によって、サンプル内またはインビボで核酸を検出するための短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」なる用語は、アミノ酸に翻訳可能なヌクレオチドの配列を意味する。典型的には、こうしたＯＲＦは、開始コドンと、３の倍数のヌクレオチドの長さを通常有する後続の領域とを含むが、所与のリーディングフレームには、終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡ）は含まれない。典型的には、ＯＲＦは、天然に存在するか、人工的に、すなわち遺伝子工学的手段により構築される。ＯＲＦは、該ＯＲＦを翻訳して得ることができるアミノ酸がペプチド結合鎖を形成しているタンパク質をコードする。
【００６０】
アミノ酸は、アミノ（−ＮＨ２）官能基と、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）官能基と、各アミノ酸固有の側鎖とから構成される有機化合物である。典型的には、アミノ酸は、その側鎖の性質によって４つの群に分類される：側鎖によって、アミノ酸は弱酸にも弱塩基にもなりうる。側鎖が極性である場合には親水性であり、側鎖が非極性である場合には疎水性である。標準的なアミノ酸を以下に示す：
【００６１】
【表１】
2018527030.tif 000002
【００６２】
【表２】
2018527030.tif 000003
【００６３】
本発明の様々な態様の文脈において、「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを意味する。ペプチドは、タンパク質と同様の化学（ペプチド）結合を有するが、一般に長さがより短い。最短のペプチドはジペプチドであり、これは、１つのペプチド結合によって結合された２つのアミノ酸からなる。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなども存在しうる。好ましくは、ペプチドは、８、１０、１２、１５、１８または２０までのアミノ酸の長さを有する。ペプチドは、環状ペプチドでない限り、アミノ末端およびカルボキシル末端を有する。
【００６４】
本発明の様々な態様の文脈において、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合により結合してまとまったアミノ酸の単一の直鎖を意味し、これは、好ましくは少なくとも約２１のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、２以上の鎖から構成されるタンパク質の１つの鎖であってもよく、またタンパク質が１つの鎖から構成される場合にはタンパク質自体であってもよい。
【００６５】
本発明の様々な態様の文脈において、「タンパク質」なる用語は、２次および３次構造を再開する１つまたは複数のポリペプチドを含む分子を意味するとともに、さらには、いくつかのポリペプチド、すなわちいくつかのサブユニットから構成されて４次構造を形成しているタンパク質をも指す。本発明の文脈において、タンパク質またはポリペプチドの１次構造とは、ポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列である。タンパク質の２次構造とは、タンパク質の局所セグメントの一般的な３次元形態である。しかしこれは、３次構造と考えられる３次元空間における特定の原子位置を記述するものではない。タンパク質において、２次構造は、主鎖のアミド基とカルボキシル基との間の水素結合のパターンによって定められる。タンパク質の３次構造とは、原子座標によって決定されるタンパク質の３次元構造である。４次構造とは、多重サブユニット複合体中の多重に折りたたまれたまたはコイル状のタンパク質またはポリペプチドの分子の配列である。「アミノ酸鎖」および「ポリペプチド鎖」なる用語は、本発明の文脈において同義語として使用される。
【００６６】
本明細書で用いられる場合の「フォールディング（折りたたみ）」または「タンパク質のフォールディング（折りたたみ）」なる用語は、タンパク質がその３次元形状または立体配座をとるようにするプロセスを意味し、すなわち最初に、これらに限定されるものではないが例えば水素結合、金属配位、疎水性力、ファンデルワールス力、π−π相互作用および／または静電作用といった共有結合によらない相互作用を介して特定の３次元形状が形成されるようにタンパク質を導くプロセスを意味する。次に、フォールディングの過程で２つの分子内ジスルフィド結合が形成される。したがって「折りたたまれた（フォールディング済みの）タンパク質」なる用語は、タンパク質の３次元形状、例えばその２次、３次または４次構造を意味する。
【００６７】
「変性」とは、タンパク質が、そのネイティブ状態で存在するそれらの４次、３次および／または２次構造を失うプロセスであり、それによって典型的にはそれらの生物学的機能が失われる。変性タンパク質は、これらに限定されるものではないが例えば、立体配座の変化、溶解性の損失、凝集または完全な分解といった広範な特性を示しうる。
【００６８】
タンパク質の安定性、すなわちタンパク質がその機能を果たすことを可能にする構造上の３次元的完全性は、いくつかの環境因子に影響を受ける。こうした因子としては、これらに限定されるものではないが例えば、温度、放射線、周囲培地のｐＨ値、ペプチダーゼ／プロテアーゼの存在、タンパク質濃度、塩濃度、溶媒および時間が挙げられる。
【００６９】
本明細書で用いられる場合の「分解」なる用語は、タンパク質がそれらの１次、２次、３次および／または４次構造を失うプロセスを意味する。したがって、「分解」なる用語には、タンパク質の変性、およびペプチド鎖からの単一のアミノ酸もしくは複数のアミノ酸の除去、またはペプチド鎖の２つ以上の断片への切断が包含される。
【００７０】
本明細書で用いられる場合の「凝集」なる用語は、２つ以上のタンパク質がまとまって蓄積および／または集塊化するプロセスを意味する。凝集によって、インタクトなネイティブタンパク質が生じることも、分解タンパク質が生じることもある。タンパク質の凝集は、タンパク質の疎水性基が露出し、次いでこれが蓄積することによって引き起こされることが多い。
【００７１】
ＣＤ−ＲＡＰは、逆平行βシートと２つのジスルフィド結合とを含む、分泌された単一ドメインタンパク質（１０７ａａ成熟タンパク質、１２ｋＤａ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＨ０５９１０．１、ＧＩ：１３５４３５００）である。ＴＡＮＧＯ、ＭＩＡ−２、ＯＴＯＲは、ＣＤ−ＲＡＰ相同タンパク質である（配列同一性は４４％であり、配列相同性は約８０％である）。ＣＤ−ＲＡＰの別名は、自己分泌性メラノーマ腫瘍増殖阻害活性を表すＭＩＡである。Ｂｌｅｓｃｈら（１９９４）は、悪性メラノーマ細胞株ＨＴＺ−１９ｄＭの上清からの新規なタイプの成長調節因子として、ＭＩＡをクローニングした。Ｗｅｉｌｂａｃｈら（１９９０）は、ＭＩＡが成長調節ネットワークの一部であるとの仮説を立てた。それとは別にＤｉｅｔｚおよびＳａｎｄｅｌｌ（１９９６）は、レチノイン酸処理によって発現が下方制御されるタンパク質として、ウシ軟骨細胞からＣＤ−ＲＡＰをクローニングした。レチノイン酸によって軟骨細胞の分化表現型が抑制されるため、軟骨細胞の分化表現型を保持した状態でＣＤ−ＲＡＰ（軟骨由来のレチノイン酸感受性タンパク質）の機能的背景、すなわち軟骨細胞が軟骨基質の合成を維持することが明らかとなった。
【００７２】
ＣＤ−ＲＡＰは、転写因子Ｓｏｘ９の上流で軟骨への分化に必要とされる（Ｍｏｓｅｒ，  Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ，  Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，  Ｓａｎｄｅｌｌ，  Ｆａｓｓｌｅｒ，  Ｂｕｅｔｔｎｅｒ  ２００２．  Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ＭＩＡ／ＣＤ−ＲＡＰ−  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２００２），  ２２（５），  １４３８−１４４５）。ＣＤ−ＲＡＰの存在下で、ヒト間葉系幹細胞は、ペレット培養物において軟骨マーカーアグリカン、オステオカルシンおよびＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡの上方制御を示した（Ｔｓｃｈｅｕｄｓｃｈｉｌｓｕｒｅｎ，  Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ，  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，  Ｖｏｌｌｍｅｒ，  Ａｎｔｏｎ，  Ａｌｔ，  Ｓｃｈｎｅｔｔｌｅｒ，  Ｂｒａｎｄｔ，  Ｐｒｏｅｔｚｅｌ，  ２００６．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＩＡ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００６  Ｊａｎ  １；  ３１２（１）：６３−７２）。ＣＤ−ＲＡＰは、ＢＭＰ−２およびＴＧＦβ３と共同してそれらの表現型を維持することにより軟骨細胞の骨形成分化を防ぎ、それによりそれらのさらなる骨への分化を防ぐ（Ｔｓｃｈｅｕｄｓｃｈｉｌｓｕｒｅｎ，  Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ，  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，  Ｖｏｌｌｍｅｒ，  Ａｎｔｏｎ，  Ａｌｔ，  Ｓｃｈｎｅｔｔｌｅｒ，  Ｂｒａｎｄｔ，  Ｐｒｏｅｔｚｅｌ，  ２００６．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＩＡ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００６  Ｊａｎ  １；３１２（１）：６３−７２）。ＣＤ−ＲＡＰは、フィブロネクチン（多くの細胞外基質に見られる）と相互作用してインテグリンα４β１およびα５β１に直接結合し、インテグリン活性を負に調節すると記載されている。インテグリンは、自身の周囲の基質の変化を検出するための「センサー」として軟骨細胞を提供する。インテグリンα５との相互作用によって、軟骨分化をブロックすることが知られているＥＲＫによるシグナル伝達が調節される（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，  Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｏｐｏｌｋａ，  Ｇｒａｓｓｅｌ，  Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，  Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ，  ２０１０．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＭＩＡ／ＣＤ−ＲＡＰ）．  Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２０１０  Ｍａｒ  ３１；４２（３）：１６６−７４）。
【００７３】
本発明のタンパク質およびポリペプチド（タンパク質誘導体、タンパク質多様体、タンパク質断片、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む）を、化学修飾によりさらに修飾することができる。これは、そのような化学的に修飾されたポリペプチドが、天然に存在する２０のアミノ酸以外の他の化学基を含むことを意味する。このような他の化学基の例としては、これらに限定されるものではないが、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸が挙げられる。ポリペプチドの化学修飾によって、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば安定性の向上、生物学的半減期の延長または水溶性の増加のうちの１つまたは複数が生じうる。本発明において使用できる多様体に適用することができる化学的修飾としては、これらに限定されるものではないが、ＰＥＧ化、非グリコシル化親ポリペプチドのグリコシル化または親ポリペプチド中に存在するグリコシル化パターンの修飾が挙げられる。タンパク質にはまた、例えば補欠分子族または補因子のような非ペプチド基が結合していてもよい。
【００７４】
「発現レベル」なる用語は、特定の時点に身体またはサンプル中に存在する遺伝子産物の量を意味する。例えば、遺伝子から発現されたタンパク質またはｍＲＮＡを用いて発現レベルを測定／定量／検出することができる。例えば、サンプル中に存在する対象となる遺伝子産物の量を、同一サンプルもしくは参照サンプル（例えば、同一個体から同一時間に採取したサンプル、もしくは同一サンプルの同一サイズ（重量、体積）分）中の同一カテゴリー（全タンパク質もしくはｍＲＮＡ）の遺伝子産物の総量で正規化することにより、または所定のサンプルサイズ（重量、体積など）あたりの対象となる遺伝子産物の量を同定することにより、発現レベルを定量することができる。発現レベルの測定または検出を、当技術分野で知られている任意の方法により行うことができ、例えば対象となる遺伝子産物を直接的に検出および定量するための方法（例えば質量分析法）、または対象となる遺伝子産物を間接的に検出および測定するための方法により行うことができ、この間接的に検出および測定するための方法では通常は、対象となる遺伝子産物と、この対象となる遺伝子産物に特異的な１つまたは複数の異なる分子または検出手段（例えば１つまたは複数のプライマー、プローブ、抗体、足場タンパク質）とを結合させることにより行われる。遺伝子コピーのレベルの測定は、（例えば核酸プローブまたはプライマー、例えば定量的ＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存的プローブ増幅（ＭＬＰＡ）ＰＣＲによる）１つまたは複数の断片の存在の有無の決定をも含み、これも当業者に知られている。
【００７５】
本明細書で用いられる「翻訳後」なる用語は、ヌクレオチドトリプレットがアミノ酸へと翻訳され、その配列において進行するアミノ酸に対してペプチド結合が形成された後に生じる事象を意味する。こうした翻訳後事象は、すべてのポリペプチドが形成された後に生じる場合もあり、また早くも翻訳の過程ですでに翻訳されたポリペプチド部分で生じる場合もある。翻訳後事象によって典型的には、得られるポリペプチドの化学的または構造的な特性が変更または改変される。翻訳後事象の例としては、これらに限定されるものではないが、アミノ酸のグリコシル化もしくはリン酸化、または例えばエンドペプチダーゼによるペプチド鎖の切断などの事象が挙げられる。
【００７６】
本明細書で用いられる「同時翻訳」なる用語は、ヌクレオチドトリプレットからアミノ酸鎖への翻訳の過程で生じる事象を意味する。こうした事象によって典型的には、得られるアミノ酸鎖の化学的または構造的な特性が変更または改変される。同時翻訳事象の例としては、これらに限定されるものではないが、翻訳過程を完全に停止させるか、またはペプチド結合形成を中断させて２つの別個の翻訳産物を生成させる事象が挙げられる。
【００７７】
本明細書で用いられる場合に、「多様体」なる用語は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質と比較して、その長さまたは配列が１つまたは複数変化している点で相違するポリペプチドまたはタンパク質と理解されるべきである。ポリペプチド多様体またはタンパク質多様体が由来するポリペプチドまたはタンパク質は、親ポリペプチドまたは親タンパク質としても知られている。「多様体」なる用語は、親分子の「断片」または「誘導体」を含む。典型的には、「断片」は、親分子よりも長さまたはサイズが小さいが、それに対して「誘導体」は、親分子と比較してその配列に１つまたは複数の相違を示す。これらに限定されるものではないが例えば、翻訳後修飾タンパク質（例えばグリコシル化タンパク質、ビオチン化タンパク質、リン酸化タンパク質、ユビキチン化タンパク質、パルミトイル化タンパク質またはタンパク質分解により切断されたタンパク質）などの修飾分子も包含される。多様体は、人工的に、好ましくは遺伝子工学的手段によって構築される場合があるが、一方で親ポリペプチドまたは親タンパク質は、野生型ポリペプチドまたは野生型タンパク質である。しかし、天然に存在する多様体もまた、本明細書で用いられる場合の「多様体」なる用語に包含されるものと理解されるべきである。さらに、本発明において使用可能な多様体は、該多様体が親分子の少なくとも１つの生物学的活性を示す、すなわち機能的に活性である限り、親分子のホモログ、オルソログまたはパラログから誘導されてもよく、また人工的に構築された多様体から誘導されてもよい。
【００７８】
本明細書で用いられる場合の「多様体」は、それが由来する親ポリペプチドまたは親タンパク質とある程度の配列同一性を特徴としうる。より正確には、本発明の文脈におけるタンパク質多様体は、その親ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を示す。「少なくとも８０％の配列同一性」なる用語は、ポリペプチド配列の比較に関連して本明細書全体を通じて使用される。この表記は好ましくは、各参照ポリペプチドまたは各参照ポリヌクレオチドに対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を意味する。好ましくは、該当するポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、該参照ポリペプチドの２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくはそれを上回るアミノ酸の連続的伸長にわたって、または該参照ポリペプチドの全長にわたって、示された配列同一性を示す。
【００７９】
本発明の誘導体は、アミノ酸配列において最大で１００（最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０）の変化（すなわち置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断）の合計数を示しうる。アミノ酸置換は、保存的および／または非保存的であってよい。好ましい実施形態では、本発明の誘導体は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質またはドメインと、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０のアミノ酸の置換、好ましくはアミノ酸の保存的置換の分だけ相違する。
【００８０】
「欠失多様体」および「断片」なる用語は、本明細書では互換的に用いられる。そのような多様体は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断および／または内部欠失を含む。断片は、天然に存在するものであってもよく（例えばスプライス多様体）、また人工的に、好ましくは遺伝子工学的手段によって構築されていてもよい。好ましくは、断片（すなわち欠失多様体）は、親ポリペプチドと比較して、そのＮ末端および／またはそのＣ末端および／または内部に、好ましくはそのＮ末端、そのＮ末端およびＣ末端、またはそのＣ末端に、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００のアミノ酸の欠失を有する。
【００８１】
２つの配列を比較する際に配列同一性％の算出の比較対象となる参照配列が明記されていない場合には、特に指定がない限り、配列同一性は、比較すべき２つの配列のうち長い方の配列を基準として算出されるべきである。参照配列が示されている場合には、特に指定がない限り、配列同一性は、各配列番号により示される参照配列の全長を基準として求められる。例えば、２０のアミノ酸からなるペプチド配列は、配列番号１によるＣＤ−ＲＡＰのアミノ酸配列と比較して、１８．７％（２０／１０７）の最大の配列同一性％を示しうる。一方で、５４のアミノ酸の長さを有する配列は、５０．４６％（５４／１０７）の最大配列同一性％を示しうる。こうしたアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性％を、配列アライメントにより求めることができる。このようなアラインメントは、当技術分野で知られているアルゴリズムを用いて行うことができ、好ましくはＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによる数学的アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−５８７７）を用いて、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）を用いて、または例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／もしくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌもしくはｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｈｔｍｌにて入手可能なＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｔ．  Ｊ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ４６７３−８０）を用いて行うことができる。使用される好ましいパラメーターは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに設定されているデフォルトパラメーターである。例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を用いて配列同一性の程度（配列一致度）を算出することができる。類似のアルゴリズムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。親ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＰプログラムでスコア＝５０、文字長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索が行われる。比較を目的としてギャップありのアライメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２に記載の通りに利用される。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを使用する。配列一致度分析を、例えばＳｈｕ���ｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Ｂｒｕｄｎｏ  Ｍ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３ｂ，  １９  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｉ５４−Ｉ６２）またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術により補完してもよい。本出願において配列同一性％について言及される場合には、特に指定がない限り、これらのパーセンテージは、より長い方の配列の全長を基準として算出される。
【００８２】
それに加えてまたはそれとは異なって、欠失多様体は、上記のような各アミノ酸の構造的欠失に起因してではなく、これらのアミノ酸が阻害されているかまたはさもなくばそれらの生物学的機能を果たすことができないために生じる場合がある。典型的には、そのような機能的欠失は、アミノ酸配列への挿入またはアミノ酸配列における置換により生じ、それによって、得られるタンパク質の機能的特性が変化する。こうした変化の例としては、これらに限定されるものではないが、得られるタンパク質の化学的特性の変更（すなわち疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への置換）、得られるタンパク質の翻訳後修飾（例えば翻訳後の切断もしくはグリコシル化パターン）の変更、または２次もしくは３次タンパク質構造の変更が挙げられる。それに加えてまたはそれとは異なって、機能的欠失は、転写もしくは転写後の（例えばｓｉＲＮＡによる）遺伝子サイレンシング、またはこれらに限定されるものではないが例えばタンパク質インヒビターもしくは阻害抗体などの阻害性分子の存在の有無に起因しても起こりうる。
【００８３】
アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換される半保存的および特に保存的なアミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸の中で、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の中で、酸性残基を有するアミノ酸の中で、アミド誘導体の中で、塩基性残基を有するアミノ酸の中で、または芳香族残基を有するアミノ酸の中で、行われる。典型的な半保存的および保存的置換は、以下の通りである：
【表３】
2018527030.tif 000004
【００８４】
新たなシステインが遊離チオールのままであれば、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変化は半保存的である。さらに、立体的に嵩高い位置にあるグリシンを置換すべきではないこと、およびαヘリックスまたはβシート構造を有するタンパク質の部分にＰを導入すべきではないことが、当業者には理解されるであろう。
【００８５】
本明細書で用いられる場合の「切断部位」なる用語は、例えば切断酵素により認識かつ／または分断されうることから、分断を指示するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。典型的には、ポリペプチド鎖は、アミノ酸を連結する１つまたは複数のペプチド結合の加水分解によって切断され、ポリヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド間の１つまたは複数のホスホジエステル結合の加水分解によって切断される。ペプチド結合またはホスホジエステル結合の切断は、化学的または酵素的な切断に由来しうる。酵素による切断とは、タンパク質分解酵素によって達成される切断を意味し、ここでこのタンパク質分解酵素としては、これらに限定されるものではないが例えば、制限エンドヌクレアーゼ（例えばＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型もしくは人工制限酵素）およびエンドペプチダーゼもしくはエキソペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼもしくはエキソプロテアーゼ（例えばセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ）が挙げられる。典型的には、酵素による切断は、自己切断に起因して生じるかまたは独立したタンパク質分解酵素によって行われる。タンパク質またはポリペプチドの酵素による切断は、同時翻訳後または翻訳後のいずれでも起こりうる。したがって、本明細書で用いられる「エンドペプチダーゼ切断部位」なる用語は、アミノ酸またはヌクレオチド配列内の切断部位であって、この配列がエンドペプチダーゼ（例えばエンテロペプチダーゼまたはＰＡ  ｃｌａｎプロテアーゼ）により切断されるかまたは切断可能である部位を意味する。エンドペプチダーゼの例としては、これらに限定されるものではないがトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモリシン、エンドペプチダーゼＶ８、カテプシン、グルタミルエンドペプチダーゼが挙げられる。
【００８６】
あるいは「切断部位」なる用語は、それぞれアミノ酸またはヌクレオチドの間のペプチド結合またはホスホジエステル結合の形成を妨げるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。例えば、ポリペプチドまたはポリタンパク質の同時翻訳自己プロセシングによって結合の形成を妨げることができ、その結果、単一のオープンリーディングフレームの単一の翻訳事象に由来する連続しない２つの翻訳産物が生じる。典型的には、こうした自己プロセシングは、ペプチド結合を形成せずにあるコドンから次のコドンへと移動するように翻訳複合体を誘導する偽終止コドン（ｐｓｅｕｄｏ  ｓｔｏｐ−ｃｏｄｏｎ）配列により生じる「リボソームスキップ」によって達成される。リボソームスキップを誘導する配列の例としては、これらに限定されるものではないが、ウイルス２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチド（本明細書ではこれら双方をまとめて「２Ａペプチド」または互換的に「２Ａ部位」または「２Ａ切断部位」と呼ぶ）が挙げられ、これらは、例えばピコルナウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス科（Ａｐｈｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、ロタウイルスおよびトリパノソーマといった数種の科のウイルスによって用いられる。最もよく知られているのは、単一のＯＲＦから複数のポリペプチドを生成するために典型的に使用される、ピコルナウイルス科のライノウイルスおよび口蹄疫ウイルスの２Ａ部位である。
【００８７】
したがって、本明細書で用いられる場合の「自己切断部位」なる用語は、アミノ酸またはヌクレオチド配列内の切断部位であって、いずれかのさらなる分子が関与する切断を伴わずにこの配列が切断されるかもしくは切断可能であるか、またはこの配列におけるペプチド結合もしくはホスホジエステル結合の形成が最初の段階で（例えば上記のような同時翻訳自己プロセシングを介して）防がれる部位を意味する。
【００８８】
切断部位は典型的に、（例えば「切断部位」が、タンパク質へ翻訳されないが、翻訳の中断をもたらす場合に）数個のアミノ酸を含むかまたは数個のコドンによりコードされることが理解される。それゆえ、切断部位はペプチドリンカーという目的をも満たし、すなわち切断部位は２つのペプチドを立体的に分離する。したがって、いくつかの実施形態では、「切断部位」は、ペプチドリンカーでもあり、上記の切断機能を提供するものでもある。本実施形態では、切断部位は、さらなるＮおよび／またはＣ末端アミノ酸を包含してもよい。
【００８９】
本明細書で用いられる場合の「親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌ）」または「親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｌｉｃ）」なる用語は、極性溶媒、特に水または他の極性基と相互作用する分子実体または置換基の能力を意味する（ＰＡＣ，  １９９４，  ６６，  １０７７．  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｔｅｒｍｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  １９９４））。典型的には、親水性分子は、水または他の極性溶媒によく溶解する。対照的に、本明細書で用いられる場合の「疎水性」なる用語は、水に引き寄せられないかもしくは水と相互作用しない分子またはそうした分子の部分を意味する。疎水性分子は、非極性である傾向にあり、したがって他の中性分子および非極性溶媒に対して親和性を示し、しばしば水中で集塊化してミセルを形成する。
【００９０】
「疎水性スケール」とは、アミノ酸残基の相対的な疎水性を定める値である。この値が正の方向に大きくなるほど、各アミノ酸の疎水性が高くなる。疎水性の測定に使用される様々な方法に起因して、様々な疎水性スケール間には顕著な差異がある。Ｒｏｓｅらによるスケール［Ｇ．  Ｒｏｓｅ，  Ａ．  Ｇｅｓｅｌｏｗｉｔｚ，  Ｇ．  Ｌｅｓｓｅｒ，  Ｒ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｚｅｈｆｕｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９  （１９８５）  ８３４−８３８］およびＪａｎｉｎによるスケール［Ｊ．  Ｊａｎｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７７  （１９７９）  ４９１−４９２］の双方とも、システインを最も疎水性の高い残基として位置づけている。なぜなら、これらはいずれも、既知の３−Ｄ構造を用いてタンパク質を検査し、疎水特性を、そのタンパク質の表面上ではなくそのタンパク質の内部に認められる残基についての傾向として定めるためである（システインは、球状構造の内部で生じるべきであるジスルフィド結合を形成するため、システインは最も疎水性が高いものとして等級付けされている）。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるスケール［Ｋｙｔｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｒ．Ｆ．  （１９８２）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７，  １０５−１３２］およびＷｏｌｆｅｎｄｅｎによるスケール［Ｒ．  Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  Ｌ．  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｐ．  Ｃｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０  （１９８１）  ８４９−８５５］は、アミノ酸側鎖の物理化学的性質に由来する。これらのスケールは、主にアミノ酸構造の検査によって得られる。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅによれば、個々のアミノ酸は、以下のハイドロパシー値を示す：
【表４】
2018527030.tif 000005
【００９１】
「ＧＲＡＶＹ（ハイドロパシーの総平均）値」は、ポリペプチドまたはタンパク質の疎水性を表す値の１つであり、全アミノ酸のハイドロパシー値の合計をタンパク質の長さで除することによって定められる。ＧＲＡＶＹ値の算出は、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅによるスケールに基づいて行われる。評点が正の方向に大きくなることは、疎水性がより高いことを示す。
【００９２】
本明細書で用いられる場合に、「ベクター」なる用語は、タンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはそれらの混合物であって、細胞への導入が可能であるものか、またはその中に含まれるタンパク質および／もしくは核酸を細胞に導入することが可能であるものを意味する。本発明の文脈においては、導入されるポリヌクレオチドによりコードされる目的の遺伝子が、１つまたは複数のベクターの導入時に細胞内で発現されることが好ましい。適切なベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が挙げられる。１つまたは複数の目的の遺伝子産物をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクターはさらに、発現制御配列を含んでよい。１つまたは複数の目的の遺伝子産物をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現を、１つまたは複数の発現制御配列によって一緒に制御することも別々に制御することもできる。より具体的には、ベクターに含まれる各ポリヌクレオチドを別々の発現制御配列によって制御することも、ベクターに含まれるすべてのポリヌクレオチドを単一の発現制御配列によって制御することもできる。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクターに含まれるポリヌクレオチドは、好ましくはオープンリーディングフレームを形成する。
【００９３】
本明細書で用いられる場合の「宿主細胞」なる用語は、ベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）を宿す細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞）または真核細胞（例えば真菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞）であってよい。細菌細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、大腸菌細胞、例えば大腸菌ＢＬ２１株または大腸菌Ｋ１２株が挙げられる。
【００９４】
本明細書で用いられる場合の「バッファー」または「バッファー溶液」なる用語は、弱酸とその共役塩基（逆もまた同様）との混合物からなる水溶液を意味する。この「バッファー」または「バッファー溶液」に少量または中程度の量の強酸または強塩基を加えてもそのｐＨはほとんど変化しないため、これは溶液のｐＨの変化を防ぐために使用される。バッファー溶液は、ｐＨをほぼ一定の値に保持する手段として様々な用途で使用される。酸性領域のバッファーについては、例えば塩酸などの強酸をバッファーに加えることによりｐＨを所望の値に調整することができる。アルカリ性のバッファーについては、例えば水酸化ナトリウムのような強塩基を加えることができる。あるいは、酸とその共役塩基との混合物からバッファー混合物を製造することもできる。例えば、酢酸と酢酸ナトリウムとの混合物から酢酸バッファーを製造することができる。同様に、塩基とその共役酸との混合物からアルカリ性バッファーを製造することができる。バッファーの例としては、これらに限定されるものではないが、リン酸バッファー（例えばＰＢＳ）、クエン酸バッファー（例えばＳＳＣ）、ヒスチジンバッファー、ＡＰＳバッファー、ビシンバッファー、トリスバッファー、トリシンバッファー、ＴＡＰＳＯバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＴＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、カコジル酸バッファー、ＭＥＳバッファー、コハク酸バッファーが挙げられる。
【００９５】
リン酸緩衝生理食塩水（略してＰＢＳ）は、生物学的試験において一般的に使用されるバッファー溶液である。これは、リン酸ナトリウムと塩化ナトリウムと、製剤によっては塩化カリウムとリン酸カリウムとを含有する塩水溶液である。これらの溶液の浸透圧およびイオン濃度は、人体の浸透圧およびイオン濃度と一致する（等張性）。
【００９６】
クエン酸バッファー溶液としては一般的に使用されるＳＳＣバッファーが挙げられるが、クエン酸バッファー溶液では、ｐＨ７．０の中性を保持するためにクエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムが使用される。
【００９７】
本明細書で用いられる場合の「関節」なる用語は、２つ以上の骨が接触する箇所を意味する。この用語は、可動関節を意味する場合も不動関節を意味する場合もある。さらに関節とは、コラーゲンに富む緻密結合組織によって骨が付着されている繊維性連結であってよく、また骨が軟骨によって結合されている軟骨性連結であってもよい。また関節は、滑膜性連結であってもよい。この滑膜性連結では、骨は、直接結合されておらずに滑膜腔を有し、かつ関節軟骨包によって付着されている。この関節軟骨包は、副靭帯および腱を伴う。滑膜性連結の例としては、これらに限定されるものではないが、臼状関節、例えば股関節または肩関節；楕円関節および平面関節、例えば手首の関節；蝶番関節、例えば肘、膝、足首または指およびつま先の関節；鞍関節、例えば親指の関節；ならびに車軸関節、例えば環椎および軸椎の関節が挙げられる。
【００９８】
「組織の現状（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔａｔｕｓ）」、「組織の現状（ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ）」、「組織の態様（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔａｔｅ）」および「組織の態様（ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ）」なる用語は、本明細書では互換的に用いられ、これらは組織の状態を意味する。組織の態様とは、その組織の特定の形態によって特徴付けることができ、またこれらに限定されるものではないが例えばペプチド、タンパク質および核酸またはそれらの組合せ物などの１つまたは複数の特定の分子の発現によって特徴付けることもできる。組織の現状については、疾病または損傷がなくその固有の機能を効率的に果たしている際のその組織の状態に似ている場合に「健康」または「正常」と考えることができる。その組織が疾病または損傷のためにその機能を果たしていない場合、組織の現状を「変性」、「疾患」または「異常」と考えることができる。それに加えてまたはそれとは異なって、組織の形態またはその分子の発現パターンが正常組織と比較して「変更」または「変化」している場合、その組織の現状を「変性」、「疾患」または「異常」と考えることができる。したがって、組織の形態または組織における特定の分子の発現パターンは、組織の態様の指標となりうる。組織の現状の例としては、これらに限定されるものではないが、組織の分解、例えば軟骨の分解、骨の分解および滑膜の分解、組織の炎症、例えば軟骨の炎症もしくは滑膜の炎症、組織のリモデリング、例えば骨のリモデリングもしくは軟骨のリモデリング、硬化、液体蓄積または増殖性組織、例えば創傷治癒過程における増殖、嚢胞形成における増殖もしくは癌における増殖が挙げられる。
【００９９】
本明細書で用いられる場合の「参照サンプル」なる用語は、対象サンプルと実質的に同一の様式で分析され、その情報が対象サンプルの情報と比較されるサンプルを意味する。それにより、参照サンプルは、対象サンプルから得られた情報の評価を可能にする基準を提供する。参照サンプルは、置換、欠落または追加されうる１つの成分を除いて、対象サンプルと同一であってもよい。例示されるように、本発明の文脈では、参照サンプルは、アグリカン結合部分を含まないことがあり、また対象サンプルとは異なるアグリカン結合部分を含む場合もある。
【０１００】
本明細書で用いられる場合の「参照値」なる用語は、特定の状態を示すことが知られている値を意味する。本発明の文脈において、参照値は、アグリカン結合部分を含まないサンプルにおいて存在することが知られている分解の程度を表す場合がある。あるいは、参照値は、既知の異なるアグリカン結合部分が示しうる結合活性を表す場合もある。あるいは、参照値は、抗原結合部分の非存在下での分解の程度の結合活性の変化を表す場合もある。本発明の文脈において、参照値は、ＣＤ−ＲＡＰがアグリカンに対して示す結合活性である場合がある。あるいは、基準値は、ＣＤ−ＲＡＰの存在下でのアグリカンの分解の程度の変化である場合もある。
【０１０１】
タンパク質の「低下した」または「減少した」レベルなる用語は、サンプル中のそのタンパク質のレベルが、参照体または参照サンプルと比較して低減していることを意味する。タンパク質の「上昇した」または「増加した」レベルなる用語は、サンプル中のそのタンパク質のレベルが、参照体または対照サンプルと比較して高いことを意味する。
【０１０２】
「障害」なる用語は、組織、器官または個体がその機能をもはや効率的に果たすことができない異常な状態、特に異常な医学的状態、例えば疾患または損傷を意味する。
【０１０３】
典型的には、「損傷」とは、身体的傷害によって引き起こされる組織、器官または個体への損害を意味する。損傷の例としては、これらに限定されるものではないが、外傷性損傷、反復運動過多損傷、放射線損傷、中毒、熱傷もしくは凍傷、毒素による損傷または製薬学的薬物の副作用（例えばワクチンによる損傷）および再灌流による損傷が挙げられる。冒された組織または器官に応じて、損傷を相応して分類することもでき、例えば軟骨損傷、骨損傷または関節損傷に分類することができる。
【０１０４】
「疾患」なる用語は、異常な生理学的状態を意味する。疾患の例としては、これらに限定されるものではないが、炎症性疾患、感染性疾患、遺伝的障害、自己免疫疾患、変性疾患および増殖性疾患（例えば様々な種類の癌）が挙げられる。患者において、１つの疾患が、１つまたはいくつかの異なる組織および／または器官を侵す場合がある。冒された組織または器官に応じて、疾患を相応して分類することもでき、例えば軟骨疾患、骨疾患または関節疾患に分類することができる。
【０１０５】
必ずとは限らないが典型的には、疾患または損傷は、その疾患または損傷の存在を示す特定の「症状」または「徴候」を伴う。したがって、その症状または徴候の存在は、疾患または損傷を患っている組織、器官または個体を示しうる。これらの症状または徴候の変化は、その疾患または損傷の進行を示しうる。疾患または損傷の進行は、典型的には、その症状または徴候の増加または減少を特徴とし、こうした増加または減少は、その疾患または損傷の「悪化」または「改善」を示しうる。疾患または損傷の「悪化」は、組織、器官または生物がその機能を効率的に果たす能力の低下を特徴とし、一方で疾患または損傷の「改善」は、典型的には、組織、器官または個体がその機能を効率的に果たす能力の増加を特徴とする。疾患または損傷が「発現するリスク」のある組織、器官または個体は、健康な態様ではあるものの、疾患または損傷の可能性を示す。典型的には、疾患または損傷が発現するリスクは、その疾患の初期のまたは弱い徴候または症状を伴う。そのような場合には、疾患または損傷の発症および／または進行を、なおも治療により予防することができる。
【０１０６】
「関節損傷」なる用語は、関節の物理的損害を意味し、特に、関節の、外傷性損傷、反復運動過多損傷、放射線損傷、中毒、熱傷もしくは凍傷、毒素による損傷または製薬学的薬物の副作用（例えばワクチンによる損傷）および再灌流傷害を意味する。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合の「関節疾患」なる用語は、関節の異常な生理学的状態を意味し、特に変性、炎症、感染または自己免疫を原因とするものを意味する。関節疾患の例としては、これらに限定されるものではないが、関節炎、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、痛風、敗血症性関節炎、乾癬性関節炎および変形性関節症（ＯＡ）、癌、例えば軟骨肉腫、骨肉腫、線維肉腫および多発性骨髄腫、腱炎、滑液包炎、骨折ならびに軟骨または骨への損害が挙げられる。関節疾患は、初期の関節損傷により生じる場合もある。
【０１０８】
変形性関節症は、滑膜関節の構造不全および機能不全を招く一連の障害の臨床的および病理学的な転帰と捉えることができる。この変形性関節症は、関節組織の崩壊と修復との間の動的平衡が乱れた場合に生じる。関節軟骨の構造不全は、生理学的および機械的な歪みの影響下で病的に損なわれた軟骨の変性に加えて、健康な軟骨を損傷する異常な機械的歪みに起因しうる。ＯＡは、関節軟骨の進行性の変性を特徴とし、最終的には冒された関節の機能不能を招く。ＯＡの慢性的な進行の過程で、関節軟骨が破壊されて下にある骨組織が外れ、最終的には冒された関節を外科手術により置換することが必要となる。軟骨の破壊に加えて、滑膜および靭帯の病理学的変性が生じている。炎症は、ＯＡにおいては続発症として生じる。ＯＡにおいて認められる形態学的な変化としては、例えば軟骨の侵食および滑膜炎症の程度の変化が挙げられる。これらの変化は、軟骨の巨大分子、特にＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲンおよびアグリカンの崩壊を招くタンパク質分解酵素を含む生化学的因子の複雑なネットワークに起因する。活性化された滑膜細胞、単核細胞または関節軟骨自体によって生成されるＩＬ−１およびＴＮＦ−αなどのサイトカインは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびサイトカイン遺伝子発現を有意に上方制御し、かつ代償合成経路を鈍らせる。ＯＡの正確な病因は依然として解明されていないが、この疾患の発症および進行には、いくつかの寄与因子が関連している。最も重要な因子は年齢であるが、周期的な過負荷、肥満、関節の弛緩および遺伝的な素因も重要な役割を果たしている。軟骨基質成分の分解は一般に、細胞外プロテアーゼの合成および活性化の増大と、変性プロセスを増幅するサイトカインとによるものであるとされている。ＯＡの診断は一般に、症状および徴候の緩徐な発症を示す患者の関節の臨床検査に基づいており、Ｘ線により診断を確認する。Ｘ線によって観察される典型的な変化としては例えば、関節腔の狭小化、縁辺の骨棘、軟骨下硬化症、軟骨下嚢胞形成、骨のリモデリングおよび関節滲出液が挙げられる。
【０１０９】
疾患の「症状」とは、その疾患を有する組織、器官または生物で知覚されうる疾患を意味し、これらに限定されるものではないが例えば、その組織、器官または個体の疼痛、衰弱、圧痛、緊張、硬直および攣縮が挙げられる。疾患の「徴候」または「シグナル」としては、これらに限定されるものではないが例えば、特定の指標、例えばバイオマーカーもしくは分子マーカーの変化もしくは変更、例えば存在、欠如、増加もしくは上昇、減少もしくは低下、または症状の発現、存在もしくは悪化が挙げられる。疼痛の症状としては、これらに限定されるものではないが例えば、持続的なまたは変化する灼熱痛、拍動痛、痒感を伴う疼痛または刺痛として知覚されうる、不快な感覚が挙げられる。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合の「指標」なる用語は、状態の徴候もしくはシグナルを意味するか、または状態を監視するために用いられる。そのような「状態」とは、細胞、組織もしくは器官の生物学的な現状、または個体の健康および／もしくは疾患の現状を意味する。指標は、これらに限定されるものではないが例えばペプチド、タンパク質および核酸といった分子の存在の有無である場合があり、また細胞、組織、器官または個体におけるそうした分子の発現レベルまたは発現パターンの変化である場合もある。指標は、個体における疾患の発症、発現または存在の徴候である場合があり、またそのような疾患のさらなる進行の徴候である場合もある。また指標は、個体において疾患が発現するリスクの徴候である場合もある。例えば、ＯＡのような関節炎疾患に関する既知の指標としては、これらに限定されるものではないが例えば、転写因子、例えばＳｏｘ−５、Ｓｏｘ−６、Ｓｏｘ−９、Ｎｆａｔ１、ｐｉｔｘ１、ＦｏｘＯ、ＨＩＦ２Ａ、ＳＡＦ−１、ＲＵＮＸ−２、サイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳ、ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢおよびＩＮＦ−γ、ホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、プロテアーゼ、例えばメタロプロテアーゼ（例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４）、アグリカナーゼ（例えばＡＤＡＭ−８、ＡＤＡＭ−１２、ＡＤＡＭ−ＴＳ４、ＡＤＡＭ−ＴＳ５）ならびにシステインプロテアーゼ（例えばカテプシンＢ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カルパイン、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９）、メタロプロテアーゼの組織インヒビター（例えばＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４）、細胞外基質成分、例えばコラーゲン（例えばＩＩ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン）、プロテオグリカン（例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸）、アグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、ＣＤＭＰ、コンドロモジュリンおよびプレイオトロフィンが挙げられる。典型的には、関節炎、特にＯＡに冒されている組織、器官または個体において、これらの指標のうちの１つまたは複数が、関節炎に冒されていない組織、器官または個体よりも高いまたは低いレベルで発現または活性化される。例えば、細胞外基質成分であるＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンならびにアグリカンのレベルは、ＯＡに冒されているかまたはＯＡを発現するリスクのある組織、器官または個体においては、ＯＡに冒されていないかまたはＯＡを発現するリスクのない組織、器官または個体と比較して、低下していることが知られている。さらに、転写因子Ｓｏｘ９ならびにメタロプロテアーゼＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４の組織インヒビターのレベルは、ＯＡに冒されているかまたはＯＡを発現するリスクのある組織、器官または個体においては、ＯＡに冒されていないかまたはＯＡを発現するリスクのない組織、器官または個体と比較して、減少していることが知られている。それとは対照的に、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αな��びにメタロプロテアーゼＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９ならびにホスファターゼＡＬＰのレベルは、ＯＡに冒されているかまたはＯＡを発現するリスクのある組織、器官または個体においては、ＯＡに冒されていないかまたはＯＡを発現するリスクのない組織、器官または個体と比較して、高まっていることが知られている。指標の「低下した」または「減少した」レベルなる用語は、サンプル中のその指標のレベルが、参照体または参照サンプルと比較して低減していることを意味する。指標の「上昇した」または「増加した」レベルなる用語は、サンプル中のその指標のレベルが、参照体または対照サンプルと比較して高いことを意味する。
【０１１１】
本明細書で用いられる場合に、疾患または損傷を「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、以下のことを１つまたは複数達成することを意味する：（ａ）疾患または損傷の重篤度を低下させること；（ｂ）治療される疾患または損傷の特徴的な症状の発現を制限または予防すること；（ｃ）治療される疾患または損傷の特徴的な症状の悪化を阻止すること；（ｄ）疾患または損傷を以前有していた個体において、その疾患または損傷の再発を制限または予防すること；および（ｅ）疾患または損傷の症状を以前示していた個体における症状の再発を制限または予防すること。
【０１１２】
本明細書で用いられる場合に、疾患または損傷を「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、または「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」とは、その疾患または損傷が患者に生じるのを妨げることを意味する。
【０１１３】
「医薬品」、「医薬組成物」、「薬剤」および「薬物」なる用語は、本明細書では互換的に用いられ、疾患または損傷の特定、予防または治療に使用される物質および／または物質の組合せ物を意味する。
【０１１４】
本明細書で用いられる場合に、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」には、インビボ投与と、エキソビボでの組織への直接的な投与、例えば静脈グラフトとが含まれる。投与としては、これらに限定されるものではないが例えば、関節内注射、すなわち膝、股関節、手根中手根関節、中手指節関節、肩、または疾患もしくは損傷に冒された他のいずれかの関節への薬物の適用が挙げられる。透視法により（Ｘ線によりまたはコンピュータ断層撮影法により）操作される椎間板への注射も挙げられる。
【０１１５】
「有効量」または「治療有効量」とは、狙い通りの目的を達成するのに十分な治療薬の量である。所与の治療薬の有効量は、例えば該治療薬の性質、投与経路、該治療薬を受容する動物の大きさおよび種類ならびに投与目的などの因子によって変化することとなる。個々の各事例での有効量は、当技術分野において確立されている方法にしたがって当業者が試験により決定することができる。
【０１１６】
「製薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認を受けているか、または米国薬局方もしくは他の動物、特にヒトにおける使用について一般的に認められている薬局方に記載されていることを意味する。
【０１１７】
「有効成分」なる用語は、医薬組成物または製剤中の物質であって、生物学的に活性である、すなわち医薬的な価値を提供するものを意味する。医薬組成物は、互いに関連してまたは互いに独立して作用しうる１つまたは複数の有効成分を含有しうる。有効成分は、中性または塩の形態として配合されていてよい。製薬学的に許容される塩としては、これらに限定されるものではないが例えば、遊離アミノ基を用いて形成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものと、遊離カルボキシル基を用いて形成されるもの、例えばこれらに限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものとが挙げられる。
【０１１８】
「調製物」および「組成物」なる用語は、有効化合物と、担体としての封入材料とを含んで封入体を提供する製剤を包含することを意図しており、ここで、この封入体においては、他の担体を伴うかまたは伴わない有効成分が担体により取り囲まれており、こうしてこの担体とこの有効成分とがまとまった状態にある。
【０１１９】
本明細書で用いられる場合の「担体」なる用語は、薬理学的に不活性な物質、例えば、これに限定されるものではないが、治療上有効な成分とともに投与される希釈剤、賦形剤またはビヒクルを意味する。こうした製薬学的担体は、液状であっても固体状であってもよい。液状担体の例としては、これらに限定されるものではないが、滅菌液体、例えば生理食塩水および油が挙げられ、この油としては例えば、石油起源のもの、動物起源のもの、植物起源のものまたは合成起源のものが挙げられ、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液は、特に注射液用の液状担体としても使用可能である。生理食塩水は、医薬組成物を静脈内投与する場合の好ましい担体である。適切な製薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０１２０】
適切な製薬学的「賦形剤」としては例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【０１２１】
「アジュバント」なる用語は、有効成分の治療効果を増大、刺激、活性化、強化または調節する薬剤を意味する。こうしたアジュバントの例としては、これらに限定されるものではないが、無機アジュバント（例えば無機金属塩、例えばリン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）、有機アジュバント（例えばサポニンもしくはスクアレン）、油性アジュバント（例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳおよびＩＮＦ−γ）、微粒子状アジュバント（例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、リポソームもしくは生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えばモノホスホリルリピドＡもしくはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログもしくは合成リピドＡ）または合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えばポリアルギニンもしくはポリリシン）が挙げられる。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合に、「患者」とは、本発明から利益を得ることができるあらゆる哺乳動物、爬虫類または鳥類を意味する。好ましくは、患者は、試験用動物（例えばマウス、ラットもしくはウサギ）、家畜（例えばモルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ラクダ、ネコ、イヌ、水生のカメ、陸生のカメ、ヘビもしくはトカゲ）または霊長類、例えばチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびヒトからなる群から選択される。「患者」は、ヒトであることが特に好ましい。
【０１２３】
実施形態
プレ配列を用いてＣＤ−ＲＡＰを発現させた場合、発酵収量および特にフォールディングが有意に増大することが判明した。このプレ配列自体の存在に加えて、プレＣＤ−ＲＡＰの収穫量も、プレ配列の長さが長くなるにつれて高くなる。このタンパク質のフォールディングが成功した後に得られたフォールディング済みのプレＣＤ−ＲＡＰの量についても、同様のことが認められた。
【０１２４】
したがって第１の態様において、本発明は、
ａ）  そのＣ末端に切断部位を含むプレ配列と、
ｂ）  ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と
を含むＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質に関する。
【０１２５】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＣＤ−ＲＡＰである。さらなる実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、配列番号１によるアミノ酸配列またはその多様体を有する。特定の実施形態では、前記多様体は少なくとも８０％の配列同一性を有し、すなわち前記多様体は、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２６】
特定の実施形態では、プレ配列は、ＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを妨害しない。したがって、フォールディング前にプレ配列を除去する必要はない。特定の実施形態では、プレ配列は、ＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを改善する。さらなる実施形態では、化学的または酵素的なシャペロンの非存在下で（すなわち存在しない状態で）ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質のフォールディングを行うことができる。さらなる実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、１次構造、２次構造または３次構造で存在する。
【０１２７】
特定の実施形態では、プレ配列は、５〜５０のアミノ酸の長さを有し、すなわちプレ配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０のアミノ酸の長さを有する。特定の実施形態では、プレ配列は、５〜４０、６〜３５、７〜３３、８〜３０、９〜２５または１０〜２０のアミノ酸の長さを有する。
【０１２８】
第１の態様の特定の実施形態では、プレ配列が有するハイドロパシーの総平均は、ＣＤ−ＲＡＰが有するハイドロパシーの総平均よりも低い。
【０１２９】
特定の実施形態では、プレ配列が有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２未満である。特定の実施形態では、プレ配列が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２〜−１．７であり、特に−０．５〜−１．７であり、特に−０．６〜−１．７であり、特に−０．７〜−１．７であり、特に−０．８〜−１．７である。特に、プレ配列が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２未満、−０．３未満、−０．４未満、−０．５未満、−０．６未満、−０．７未満、−０．８未満、−０．９未満、−１．０未満、−１．２未満、１．３未満、−１．４未満、１．５未満、−１．６未満または−１．７未満である。
【０１３０】
特定の実施形態では、前駆体タンパク質が有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．０３未満である。特定の実施形態では、前駆体タンパク質が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．０３〜−０．３である。特に、前駆体タンパク質が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．３未満、−０．２未満、−０．１未満、−０．０９未満、−０．０８未満、−０．０７未満、−０．０６未満、−０．０５未満、−０．０４未満または−０．０３未満である。
【０１３１】
第１の態様の実施形態では、プレ配列の切断部位は、酵素切断部位である。特定の実施形態では、切断部位は、エンドペプチダーゼ切断部位であり、より具体的には切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位であるか、または混合求核体スーパーファミリーＡ（ＰＡ  ｃｌａｎ）プロテアーゼ切断部位である。特定の実施形態では、切断部位は、Ｒアミノ酸またはＫアミノ酸である。
【０１３２】
さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、システインプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、エンドペプチダーゼは、トリプシンまたはキモトリプシンであり、特にトリプシンである。
【０１３３】
特定の実施形態では、プレ配列は、アフィニティータグを含む。特定の実施形態では、アフィニティータグは、ポリＨｉｓタグである。
【０１３４】
特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＸ１Ｔ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧＮ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧＮＳまたはＭＡＴＴＸ１ＴＧＮＳＡを含み、ここで、Ｘ１は、ＬまたはＳである。したがって特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端に、ＭＡＴＴＳＴ（配列番号２）、ＭＡＴＴＬＴ（配列番号３）、ＭＡＴＴＳＴＧ（配列番号４）、ＭＡＴＴＬＴＧ（配列番号５）、ＭＡＴＴＳＴＧＮ（配列番号６）、ＭＡＴＴＬＴＧＮ（配列番号７）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳ（配列番号８）、ＭＡＴＴＬＴＧＮＳ（配列番号９）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡ（配列番号１０）、ＭＡＴＴＬＴＧＮＳＡ（配列番号１１）、ＭＡＴＴＳＴＲ（配列番号１２）、ＭＡＴＴＬＴＲ（配列番号１３）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲ（配列番号１４）、ＭＡＴＴＬＴＧＮＳＡＲ（配列番号１５）、ＭＡＴＴＳＴＬＴＴＨＷＨＷＨＧＮＳＡＲ（配列番号１６）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＨＦＱＨＨＨＧＳＬＡＲ（配列番号１７）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＨＦＱＨＨＨＧＳＬＡＲ（配列番号１８）およびＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬＨ  ＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＥＮＱＱＱＲ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端に、アミノ酸ＭＡＴＴＳＴ、ＭＡＴＴＳＴＧ、ＭＡＴＴＳＴＧＮ、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳもしくはＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡまたはその多様体を含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端に、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１１、１−１２、１−１３、１−１４、１−１５もしくは１−１６またはその多様体を含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡを含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。さらなる実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬを含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。
【０１３６】
特定の実施形態では、プレ配列のアミノ酸配列は、配列番号１９のアミノ酸配列（ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＥＮＱＱＱＲ）もしくはその多様体を含むかまたはそれからなる。
【０１３７】
特定の実施形態では、前駆体タンパク質は、配列番号２０によるアミノ酸配列またはその多様体を有する。
【０１３８】
第２の態様において、本発明は、上記で詳述した本発明の第１の態様の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質をコードする核酸に関する。
【０１３９】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の核酸を含むベクターに関する。
【０１４０】
特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、細菌胞子または人工染色体である。特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。
【０１４１】
第３の態様のさらなる実施形態では、ベクターは、耐性遺伝子をコードする核酸をさらに含み、特にアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンまたはＧ４１８に対して耐性を示す遺伝子をコードする核酸をさらに含む。
【０１４２】
本発明の第３の態様の特定の実施形態では、ベクターは、調節エレメントをさらに含む。特定の実施形態では、これらの調節エレメントは、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーからなる群から選択される。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーターである。
【０１４３】
特定の実施形態では、プラスミドは、ｐＥＴ−プラスミドであり、特にｐＥＴ−５２ｂ−ＩＩプラスミドである。
【０１４４】
第４の態様において、本発明は、第１の態様の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質、第２の態様の核酸または第３の態様のベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１４５】
特定の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
【０１４６】
特定の実施形態では、原核細胞は、細菌細胞であり、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。特定の実施形態では、大腸菌細胞は、大腸菌ＢＬ２１株または大腸菌Ｋ１２株の細胞である。
【０１４７】
特定の実施形態では、真核細胞は、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、真菌細胞は、酵母細胞であり、特にクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  （Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））である。
【０１４８】
第５の態様において、本発明は、ネイティブＣＤ−ＲＡＰの製造方法であって、
ａ）  以下：
ａ）  そのＣ末端に切断部位を含むプレ配列と、
ｂ）  ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と
を含むＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質を提供するステップと、
ｂ）  前記プレ配列を除去してネイティブＣＤ−ＲＡＰを取得するステップと
を含む方法に関する。
【０１４９】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質は、１次立体配座、２次立体配座または３次立体配座で存在しうる。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明の第５の態様の方法は、以下：
ｃ）  前記ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質のフォールディングを行い、適宜、前記フォールディング済みのＣＤ−ＲＡＰを精製するステップと、
ｄ）  前記ネイティブＣＤ−ＲＡＰを精製するステップと
のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【０１５１】
本発明の第５の態様の実施形態では、ステップｂ）においてプレ配列を除去する前かまたはその後に、ステップｃ）においてＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを行う。特定の実施形態では、ステップｃ）を、ステップａ）の後でかつステップｂ）の前に行う。したがって、特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰをフォールディングした後にプレ配列を除去し、すなわちプレ配列を除去する前にＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを行う。
【０１５２】
特に、ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質をステップａ）において１次立体配座または２次立体配座で提供する実施形態では、ステップｃ）においてＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを行い、その後ステップｂ）においてプレ配列を除去する。
【０１５３】
特に、ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質を、ステップａ）において３次立体配座で提供する実施形態では、ネイティブＣＤ−ＲＡＰの取得には、フォールディングステップｃ）は不要である。本発明の第５の態様の実施形態では、前駆体ＣＤ−ＲＡＰを、ステップａ）において生物工学的手段により提供する。特定の実施形態では、前駆体ＣＤ−ＲＡＰを、第４の態様の宿主細胞からの単離により提供する。
【０１５４】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＣＤ−ＲＡＰである。さらなる実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、配列番号１によるアミノ酸配列またはその多様体を有する。特定の実施形態では、前記多様体は少なくとも８０％の配列同一性を有し、すなわち前記多様体は、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１５５】
特定の実施形態では、プレ配列は５〜５０のアミノ酸の長さを有し、すなわちプレ配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０のアミノ酸の長さを有する。特定の実施形態では、プレ配列は、５〜４０、６〜３５、７〜３３、８〜３０、９〜２５または１０〜２０のアミノ酸の長さを有する。
【０１５６】
第５の態様の特定の実施形態では、プレ配列が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、ＣＤ−ＲＡＰが有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）よりも低い。
【０１５７】
特定の実施形態では、プレ配列が有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２未満である。特定の実施形態では、プレ配列が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２〜−１．７であり、特に−０．５〜−１．７であり、特に−０．６〜−１．７であり、特に−０．７〜−１．７であり、特に−０．８〜−１．７である。特に、プレ配列が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２未満、−０．３未満、−０．４未満、−０．５未満、−０．６未満、−０．７未満、−０．８未満、−０．９未満、−１．０未満、−１．２未満、１．３未満、−１．４未満、１．５未満、−１．６未満または−１．７未満である。
【０１５８】
特定の実施形態では、前駆体タンパク質が有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．０３未満である。特定の実施形態では、前駆体タンパク質が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．０３〜−０．３である。特に、前駆体タンパク質が有するハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．３未満、−０．２未満、−０．１未満、−０．０９未満、−０．０８未満、−０．０７未満、−０．０６未満、−０．０５未満、−０．０４未満または−０．０３未満である。
【０１５９】
第５の態様の実施形態では、プレ配列の切断部位は、酵素切断部位である。特定の実施形態では、切断部位は、エンドペプチダーゼ切断部位であり、より具体的には切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位であるか、または混合求核体スーパーファミリーＡ（ＰＡ  ｃｌａｎ）プロテアーゼ切断部位である。特定の実施形態では、切断部位は、Ｒアミノ酸またはＫアミノ酸である。
【０１６０】
さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、システインプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、エンドペプチダーゼは、トリプシンまたはキモトリプシンであり、特にトリプシンである。
【０１６１】
特定の実施形態では、プレ配列は、アフィニティータグを含む。特定の実施形態では、アフィニティータグは、ポリＨｉｓタグである。
【０１６２】
特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＸ１Ｔ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧＮ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧＮＳまたはＭＡＴＴＸ１ＴＧＮＳＡを含み、ここで、Ｘ１は、ＬまたはＳである。したがって特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端に、ＭＡＴＴＳＴ（配列番号２）、ＭＡＴＴＬＴ（配列番号３）、ＭＡＴＴＳＴＧ（配列番号４）、ＭＡＴＴＬＴＧ（配列番号５）、ＭＡＴＴＳＴＧＮ（配列番号６）、ＭＡＴＴＬＴＧＮ（配列番号７）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳ（配列番号８）、ＭＡＴＴＬＴＧＮＳ（配列番号９）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡ（配列番号１０）、ＭＡＴＴＬＴＧＮＳＡ（配列番号１１）、ＭＡＴＴＳＴＲ（配列番号１２）、ＭＡＴＴＬＴＲ（配列番号１３）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲ（配列番号１４）、ＭＡＴＴＬＴＧＮＳＡＲ（配列番号１５）、ＭＡＴＴＳＴＬＴＴＨＷＨＷＨＧＮＳＡＲ（配列番号１６）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＨＦＱＨＨＨＧＳＬＡＲ（配列番号１７）、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＨＦＱＨＨＨＧＳＬＡＲ（配列番号１８）およびＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬＨ  ＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＥＮＱＱＱＲ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端に、アミノ酸ＭＡＴＴＳＴ、ＭＡＴＴＳＴＧ、ＭＡＴＴＳＴＧＮ、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳもしくはＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡまたはその多様体を含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端に、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１１、１−１２、１−１３、１−１４、１−１５もしくは１−１６またはその多様体を含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。特定の実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡを含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。さらなる実施形態では、プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬを含み、かつそのＣ末端に切断部位を含む。
【０１６４】
特定の実施形態では、プレ配列のアミノ酸配列は、配列番号１９のアミノ酸配列（ＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡＲＦＶＮＱＨＬＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＥＮＱＱＱＲ）もしくはその多様体を含むかまたはそれからなる。
【０１６５】
本発明の第５の態様の実施形態では、プレ配列を、ステップｂ）において酵素による切断によって除去する。特に、プレ配列を、エンテロキナーゼによる切断またはエンドペプチダーゼによる切断によって除去する。特定の実施形態では、プレ配列を、ステップｂ）においてトリプシンによる切断によって除去する。
【０１６６】
本発明の第５の態様のさらなる実施形態では、ステップｂ）におけるタンパク質分解酵素、特にトリプシンと前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質との比は、タンパク質１ｍｇあたり酵素が１単位となる比である。
【０１６７】
本発明の第５の態様のさらなる実施形態では、ステップｂ）を０．５〜２０時間にわたって行い、すなわちステップｂ）を、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間または２０時間にわたって行う。特定の実施形態では、ステップｂ）を１６時間未満で行い、すなわちステップｂ）を、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満または１時間未満で行う。特定の実施形態では、ステップｂ）を、０．５〜２０時間、１〜１５時間、２〜８時間または４〜７時間にわたって行う。
【０１６８】
本発明の第５の態様のさらなる実施形態では、ステップｂ）をｐＨ５〜９で行い、すなわちステップｂ）を、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８またはｐＨ９で行う。特定の実施形態では、ｐＨは、７．８および８．８であり、特に８．３である。特定の実施形態では、ステップｂ）を、ｐＨ５〜９、ｐＨ６〜９、ｐＨ７〜８．５、ｐＨ７．５〜８．５またはｐＨ８〜８．５で行う。
【０１６９】
本発明の第５の態様のさらなる実施形態では、ステップｂ）を５〜４０℃の温度で行い、すなわちステップｂ）を、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃または４０℃の温度で行う。特定の実施形態では、ステップｂ）を、５〜４０℃、１０〜３０℃または２０〜２５℃の温度で行う。
【０１７０】
本発明の第５の態様のさらなる実施形態では、ステップｃ）は、
（ｉ）  前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質を変性バッファー中でインキュベートするステップと、
（ｉｉ）  前記ステップ（ｉ）で得られた溶液をフォールディングバッファーに加えるステップと
を含む。
【０１７１】
特定の実施形態では、ステップ（ｉ）における変性バッファーは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する。ＤＴＴの濃度は、溶液中の前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質の濃度が増加するにつれて増加する。特定の実施形態では、変性バッファーは、ＤＴＴを５〜１５ｍＭの濃度で含有し、すなわちＤＴＴを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭまたは１５ｍＭの濃度で含有し、特に１０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、変性バッファーは、ＤＴＴを５〜１５ｍＭの濃度で含有し、すなわちＤＴＴを６〜１４ｍＭ、７〜１３ｍＭ、８〜１２ｍＭ、９〜１１ｍＭの濃度で含有する。
【０１７２】
特定の実施形態では、フォールディングバッファーは、アルギニンを含有する。特定の実施形態では、フォールディングバッファーは、アルギニンを０．５〜１モル／Ｌの濃度で含有し、すなわちアルギニンを０．５モル／Ｌ、０．６モル／Ｌ、０．７モル／Ｌ、０．７５モル／Ｌ、０．８モル／Ｌ、０．９モル／Ｌまたは１モル／Ｌの濃度で含有し、特に０．７５モル／Ｌの濃度で含有する。特定の実施形態では、フォールディングバッファーは、アルギニンを０．５〜１モル／Ｌの濃度で含有し、すなわちアルギニンを０．５５〜０．９モル／Ｌ、０．６〜０．８モル／Ｌ、０．７〜０．８モル／Ｌの濃度で含有する。
【０１７３】
さらなる実施形態では、フォールディングバッファーは、いかなる化学的シャペロンも酵素的シャペロンも含まない。
【０１７４】
特定の実施形態では、変性溶液を、ステップ（ｉｉ）においてフォールディングバッファーにゆっくりと加える。特定の実施形態では、ステップ（ｉｉ）においてフォールディングバッファーを１〜３時間の時間範囲にわたって加え、すなわちステップ（ｉｉ）においてフォールディングバッファーを１時間、１．１時間、１．２時間、１．３時間、１．４時間、１．５時間、１．６時間、１．７時間、１．８時間、１．９時間、２時間、２．１時間、２．２時間、２．３時間、２．４時間、２．５時間、２．６時間、２．７時間、２．８時間、２．９時間または３時間の時間範囲にわたって加える。特定の実施形態では、ステップ（ｉｉ）においてフォールディングバッファーを１〜３時間、特に２〜３時間の時間範囲にわたって加える。
【０１７５】
特定の実施形態では、フォールディングステップｃ）を５〜２５℃の温度で行い、すなわちフォールディングステップｃ）を、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃の温度で行い、特に１０℃の温度で行う。特定の実施形態では、ステップｃ）を、５〜２５℃、５〜２０℃または５〜１５℃の温度で行う。
【０１７６】
本発明の第５の態様の特定の実施形態では、フォールディング済みの前駆体ＣＤ−ＲＡＰを、クロマトグラフィーにより精製する。特定の実施形態では、フォールディング済みの前駆体ＣＤ−ＲＡＰを、ＨＩＣクロマトグラフィーまたはマルチモーダル（ＭＭ）クロマトグラフィーにより精製する。特定の実施形態では、クロマトグラフィーによる精製の前に、ＣＤ−ＲＡＰをろ過する。
【０１７７】
本発明の第５の態様の特定の実施形態では、ネイティブＣＤ−ＲＡＰを、クロマトグラフィーにより精製する。特定の実施形態では、ネイティブＣＤ−ＲＡＰを、ＨＩＣ−クロマトグラフィーにより精製する。
【０１７８】
第６の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物であって、１０７のアミノ酸の長さを有する配列番号１の成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質を含有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物に関する。
【０１７９】
本発明の第６の態様の特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物中に存在する他のいずれかのＣＤ−ＲＡＰタンパク質に対する前記ＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）の比は、９９重量％以上である。特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物中に存在する他のいずれかのＣＤ−ＲＡＰタンパク質に対する前記ＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）の比は、９９．５重量％以上または９９．９重量％以上である。
【０１８０】
特定の実施形態では、本発明の第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物は、１０５のアミノ酸の長さを有する配列番号２１のＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰ（１０５ＡＡ）を含有しない。
【０１８１】
本発明者らにより認識されるように、従来入手可能であるＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物は、Ｎ末端切断型ＣＤ−ＲＡＰであるＣＤ−ＲＡＰ（１０５ＡＡ）をかなりの量で常に含有していた。本明細書に開示されるＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質によって今では、純粋なＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）の調製が可能である。ＣＤ−ＲＡＰ（１０５ＡＡ）を含有しない調製物とは特に、ＣＤ−ＲＡＰ（１０５ＡＡ）の含有量が、該調製物中に存在するＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）タンパク質を基準として１重量％以下、特に０．５重量％以下、特に０．１重量％以下、特に０．０１重量％以下である調製物を意味する。
【０１８２】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物は、４０℃以上の融解温度を示す。特定の実施形態では、本発明のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物は、４０℃以上、特に４５℃以上、特に４８℃以上、特に５０℃以上、特に５２℃以上の融解温度を示す。最も好ましくは、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物は、約５４℃の融解温度を有し、最も好ましくは約５５℃の融解温度を示す。融解点は特に、２００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５のバッファー中で１．０ｍｇ／ｍＬのＣＤ−ＲＡＰ濃度で、ＤＳＦ（示差走査型蛍光定量法）により測定される。
【０１８３】
第７の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰもしくはその多様体または上記で詳述した第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物と、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸と、バッファーとを含む組成物に関する。
【０１８４】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体であり、特に配列番号１によるヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体である。
【０１８５】
特定の実施形態では、前記多様体は、配列番号１によるＣＤ−ＲＡＰに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１８６】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述した本発明の第５の態様の方法によって得られるネイティブＣＤ−ＲＡＰである。
【０１８７】
本発明の第７の態様の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによりＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、ＣＤ−ＲＡＰの凝集を防止する。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される。
【０１８８】
本発明の第７の態様の実施形態では、バッファーは、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによってＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、バッファーは、ＣＤ−ＲＡＰの分解を防止する。特定の実施形態では、バッファーは、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファーおよびトリスバッファーからなる群から選択される。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明の第７の態様の組成物は、糖類またはアミノ糖類をさらに含有する。特定の実施形態では、糖類は、単糖類、二糖類または三糖類であり、特にスクロース、マルトース、トレハロースまたはラフィノースからなる群から選択される。特定の実施形態では、アミノ糖類は、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミンまたはノイラミン酸からなる群から選択される。
【０１９０】
特定の実施形態では、本発明の第７の態様の組成物は、アスコルビン酸および／またはグリシンを含有しない。
【０１９１】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物は、アルギニンを５０〜５００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、アルギニンを５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、アルギニンを１００〜３５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、アルギニンを１００〜２００ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、アルギニンを２００ｍＭの濃度で含有する。
【０１９２】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物は、ヒスチジンを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、ヒスチジンを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒスチジンを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジンを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、ヒスチジンを５０ｍＭの濃度で含有する。
【０１９３】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物は、リン酸バッファーを含有する。組成物がリン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、リン酸ナトリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、リン酸ナトリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸ナトリウムを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、リン酸ナトリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、リン酸ナトリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０１９４】
組成物がリン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、リン酸カリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、リン酸カリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、リン酸カリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、リン酸カリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０１９５】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物は、クエン酸バッファーを含有する。組成物がクエン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、クエン酸塩を水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、クエン酸塩を水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、クエン酸塩を１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、クエン酸塩を２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、クエン酸塩を２０ｍＭの濃度で含有する。
【０１９６】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物は、スクロースをさらに含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、スクロースを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、スクロースを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、スクロースを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、スクロースを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、スクロースを４５ｍＭの濃度で含有する。
【０１９７】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物は、負に荷電したアミノ酸をさらに含有する。特定の実施形態では、負に荷電したアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。特定の実施形態では、組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する。
【０１９８】
組成物がグルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する実施形態では、アルギニンとグルタミン酸との全濃度は５０〜５００ｍＭであり、すなわちアルギニンとグルタミン酸との全濃度は、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を１００〜３５０ｍＭ、特に１００〜２００ｍＭの全濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を、２００ｍＭの全濃度で含有する。
【０１９９】
組成物がアルギニンとグルタミン酸との組合せ物を含有する実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１．２５の比で存在する。さらなる実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、特に１：１．５の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：２の比で存在する。
【０２００】
本発明の第７の態様の実施形態では、組成物のｐＨ値は、５．５〜８．０であり、すなわち組成物のｐＨ値は、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨ値は、６．０〜７．５である。さらなる実施形態では、組成物のｐＨ値は、６．０〜６．５である。特定の実施形態では、組成物のｐＨ値は、６である。
【０２０１】
本発明の第７の態様の実施形態では、リン酸または塩化水素を用いて組成物のｐＨ値を調整する。特定の実施形態では、リン酸を用いて組成物のｐＨ値を調整する。
【０２０２】
本発明の第７の態様の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、すなわちＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰの濃度は、２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
【０２０３】
本発明の第７の態様の特定の実施形態では、組成物は、２ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と、２０ｍＭのクエン酸塩と、２００ｍＭのアルギニンとを水溶液中に含有し、かつ該組成物のｐＨ値は６である。
【０２０４】
第８の態様において、本発明は、患者において関節の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するための、上記で詳述した第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物を提供する。関節の疾患または損傷の特定の実施形態では、軟骨および／または軟部組織が冒されている。特に、関節の疾患または損傷とは、軟骨の疾患もしくは損傷および／または十字靭帯の疾患もしくは損傷および／または側副靭帯の疾患もしくは損傷である。さらなる実施形態では、軟骨は、その分解を招く様式で冒されている。軟骨の分解は、様々な要因によって引き起こされることがある。軟骨の分解は、これらに限定されるものではないが、例えば外傷性損傷または反復運動過多損傷（例えば反復活動による軟骨組織の慢性的な侵食など）といった損傷によって引き起こされまたは誘発される場合がある。軟骨の分解の重篤度は、国際軟骨修復学会の分類によるグレード１からグレード４までの範囲であることができ、すなわち表在性の病変（グレード１）から、骨組織に達する全厚さにわたる病変（グレード４）までの範囲であることができる。軟骨の分解の領域には、初期の軟骨の病変の領域（すなわち外傷性損傷または反復運動過多損傷により生じた病変の領域）に加えて、それ以外の領域における軟骨の病変の領域も包含され、すなわち、上述の損傷が生じた後には、他の関節または同一の関節の他の部分も損傷されることがある。さらなる実施形態では、１つまたは複数の関節が関与する骨折によって軟骨の形態の歪曲も生じることがあり、これによって長期的に軟骨の変性が誘発される。
【０２０５】
それに加えてまたはそれとは異なって、軟骨の分解は、これらに限定されるものではないが例えば、炎症性疾患、感染性疾患、遺伝的障害、自己免疫疾患、変性疾患および増殖性疾患であって、特に慢性関節リウマチ、細菌による滑膜炎、滑膜組織または軟骨自体の肉腫によるものといった疾患によって引き起こされる場合がある。
【０２０６】
第８の態様の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物は、軟骨の分解および／または軟骨への水の流入の増加および／または軟骨におけるＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０２０７】
さらなる実施形態では、軟骨の分解は、プロテオグリカンの分解を含み、特にアグリカンの分解を含む。プロテオグリカンの分解は、プロテアーゼによる切断ゆえに起こりうる。プロテオグリカンの分解に関与するプロテアーゼ、好ましくはアグリカンの分解に関与するプロテアーゼとしては、これらに限定されるものではないが例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ならびにトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）が挙げられる。好ましい実施形態では、プロテオグリカン、好ましくはアグリカンは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、カテプシンＤ、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−８、ＡＤＡＭＴＳ−９、ＡＤＡＭＴＳ−１５、ＡＤＡＭＴＳ−１６およびＡＤＡＭＴＳ−１８からなる群から選択されるプロテアーゼにより分解される。ＡＤＡＭＴＳ−４および／またはＡＤＡＭＴＳ−５が特に好ましい。
【０２０８】
さらなる実施形態では、プロテアーゼによる切断は、アグリカンの球状のＧ１ドメインとＧ２ドメインとの間に位置する切断部位で生じる。さらなる実施形態では、アグリカンのポリペプチド鎖は、Ａｓｎ３４１とＰｈｅ３４２との間のペプチド結合および／またはＧｌｕ３７３とＡｌａ３７４との間のペプチド結合で切断され、好ましくはＧｌｕ３７３とＡｌａ３７４との間のペプチド結合で切断される。
【０２０９】
さらなる実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物は、アグリカンの分解に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。特定の実施形態では、０．５％〜５％のアグリカンが分解され、すなわち０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％のアグリカンが分解される。特定の実施形態では、０．５％超、１％超、１．５％超、２％超、２．５％超、３％超、３．５％超、４％超または４．５％超のアグリカンが分解される。特に、軟骨の分解は、病変のない目立たない軟骨組織と比較して測定されるが、こうした病変のない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、６５〜１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示し、すなわち６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示す。あるいは、病変のない目立たない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒、４５０ミリ秒、５００ミリ秒、５５０ミリ秒、６００ミリ秒、６５０ミリ秒、７００ミリ秒、７５０ミリ秒、８００ミリ秒、８５０ミリ秒、９００ミリ秒、９５０ミリ秒または１０００ミリ秒に相当するプロテオグリカンの密度を示す。特定の実施形態では、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、６５ｍｇ／ｍｌ未満、６０ｍｇ／ｍｌ未満、５５ｍｇ／ｍｌ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、４５ｍｇ／ｍｌ未満、４０ｍｇ／ｍｌ未満、３５ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、２５ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満または５ｍｇ／ｍｌ未満となる。あるいは、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒未満、３５０ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、２５０ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、１５０ミリ秒未満、１００ミリ秒未満または５０ミリ秒未満の密度となる。
【０２１０】
したがって、特定の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、５ｍｇ／ｍｌ超、１０ｍｇ／ｍｌ超、１５ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、２５ｍｇ／ｍｌ超、３０ｍｇ／ｍｌ超、３５ｍｇ／ｍｌ超、４０ｍｇ／ｍｌ超、４５ｍｇ／ｍｌ超、５０ｍｇ／ｍｌ超、５５ｍｇ／ｍｌ超、６０ｍｇ／ｍｌ超または６５ｍｇ／ｍｌ超となる。あるいは、第１の態様の組成物によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における５０ミリ秒超、１００ミリ秒超、１５０ミリ秒超、２００ミリ秒超、２５０ミリ秒超、３００ミリ秒超、３５０ミリ秒超または４００ミリ秒超の密度となる。
【０２１１】
特にアグリカンの分解、すなわち切断されたプロテオグリカンの増加、好ましくは切断されたアグリカンの増加によるインタクトなプロテオグリカンの損失、特にインタクトなアグリカンの損失は、軟骨への水の流入をもたらし、それにより軟骨が膨潤し、ひいては関節が膨潤する。したがって、第２の態様の実施形態では、第１の態様の組成物は、軟骨への水の流入の増加に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０２１２】
ＣＤ−ＲＡＰは、アグリカンと相互作用して、その分解、特にそのタンパク質分解を防止する。ＣＤ−ＲＡＰとアグリカンとの相互作用によって、プロテアーゼ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ならびにトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）がアグリカンペプチド鎖を切断しうることが妨害され、ここで、これらのプロテアーゼは好ましくは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、カテプシンＤ、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−８、ＡＤＡＭＴＳ−９、ＡＤＡＭＴＳ−１５、ＡＤＡＭＴＳ−１６およびＡＤＡＭＴＳ−１８からなる群から選択される。ＣＤ−ＲＡＰの存在が減少することまたはＣＤ−ＲＡＰが完全に存在しなくなることによって、アグリカンの分解が増大する。
【０２１３】
したがって、第８の態様の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物は、関節におけるＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。特定の実施形態では、軟骨においてＣＤ−ＲＡＰの存在が減少する。
【０２１４】
ＣＤ−ＲＡＰの存在の減少は、ＣＤ−ＲＡＰの発現の低減に起因しうる。それとは異なっておよび／またはそれに加えて、ＣＤ−ＲＡＰの存在の減少は、ＣＤ−ＲＡＰが発現細胞内に保持されることに起因して起こりうるものであり、特にＣＤ−ＲＡＰが軟骨細胞内に保持されることに起因して起こりうる。それとは異なっておよび／またはそれに加えて、ＣＤ−ＲＡＰの存在の減少は、ＣＤ−ＲＡＰが発現細胞の内部で、特に軟骨細胞内で、またはＣＤ−ＲＡＰがこれらの細胞から細胞外空間、好ましくは軟骨へと分泌された後に分解されることに起因して起こりうる。
【０２１５】
第８の態様の特定の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物は、ＣＤ−ＲＡＰの発現の低減、細胞内でのＣＤ−ＲＡＰの保持、好ましくは軟骨細胞内でのＣＤ−ＲＡＰの保持、または細胞内でのＣＤ−ＲＡＰの分解、好ましくは軟骨細胞内もしくは細胞外空間でのＣＤ−ＲＡＰの分解に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０２１６】
第８の態様の特定の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物は、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものであり、ここで前記軟骨の疾患は、変形性関節症（ＯＡ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、軟骨形成不全症、軟骨軟化症、軟骨肉腫、変形性椎間板疾患、股関節形成異常症、指の骨関節症、離断性骨軟骨炎および多発性軟骨炎からなる群から選択される。
【０２１７】
特定の実施形態では、変形性関節症は、ケルグレン・ローレンス分類による変形性関節症、変形性足関節症、変形性肘関節症、変形性手指関節症、変形性股関節症、変形性膝関節症、変形性肩関節症、変形性脊椎関節症、変形性足指関節症、変形性手関節症からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＯＡは、早期に発症するＯＡである。
【０２１８】
第８の態様の特定の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物は、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものであり、ここで前記軟骨の損傷は、外傷性損傷または反復運動過多損傷（例えば反復活動による軟骨組織の慢性的な侵食など）である。軟骨の分解の重篤度は、国際軟骨修復学会の分類によるグレード１からグレード４までの範囲であることができ、すなわち表在性の病変（グレード１）から、骨組織に達する全厚さにわたる病変（グレード４）までの範囲であることができる。軟骨の分解の領域には、初期の軟骨の病変の領域（すなわち外傷性損傷または反復運動過多損傷により生じた病変の領域）に加えて、それ以外の領域における軟骨の病変の領域も包含され、すなわち、上述の損傷が生じた後には、他の関節または同一の関節の他の部分も損傷されることがある。さらなる実施形態では、１つまたは複数の関節が関与する骨折によって軟骨の形態の歪曲も生じることがあり、これによって長期的に軟骨の変性が誘発される。
【０２１９】
第８の態様の実施形態では、患者とは、哺乳動物、爬虫類または鳥類である。特定の実施形態では、患者は、試験用動物（例えばマウスもしくはラット）、家畜（例えばモルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、水生のカメ、陸生のカメ、ヘビもしくはトカゲ）または霊長類、例えばチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびヒトからなる群から選択される。特にヒトを指す。
【０２２０】
第８の態様のさらなる実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物によって、患者における軟骨の分解の程度が変更される。特定の実施形態では、第１の態様の組成物によって、患者における軟骨の分解の程度が低下し、より好ましくは患者におけるアグリカンの分解の程度が低下する。特に、本発明の第１の態様の組成物によって、軟骨の分解の程度が、好ましくはアグリカンの分解の程度が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％低下する。特定の実施形態では、０．５％超、１％超、１．５％超、２％超、２．５％超、３％超、３．５％超、４％超または４．５％超のアグリカンが分解する。特に、軟骨の分解は、病変のない目立たない軟骨組織と比較して測定されるが、こうした病変のない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、６５〜１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示し、すなわち６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示す。あるいは、病変のない目立たない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒、４５０ミリ秒、５００ミリ秒、５５０ミリ秒、６００ミリ秒、６５０ミリ秒、７００ミリ秒、７５０ミリ秒、８００ミリ秒、８５０ミリ秒、９００ミリ秒、９５０ミリ秒または１０００ミリ秒に相当するプロテオグリカンの密度を示す。特定の実施形態では、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、６５ｍｇ／ｍｌ未満、６０ｍｇ／ｍｌ未満、５５ｍｇ／ｍｌ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、４５ｍｇ／ｍｌ未満、４０ｍｇ／ｍｌ未満、３５ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、２５ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満または５ｍｇ／ｍｌ未満となる。あるいは、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒未満、３５０ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、２５０ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、１５０ミリ秒未満、１００ミリ秒未満または５０ミリ秒未満の密度となる。
【０２２１】
したがって、特定の実施形態では、第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、５ｍｇ／ｍｌ超、１０ｍｇ／ｍｌ超、１５ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、２５ｍｇ／ｍｌ超、３０ｍｇ／ｍｌ超、３５ｍｇ／ｍｌ超、４０ｍｇ／ｍｌ超、４５ｍｇ／ｍｌ超、５０ｍｇ／ｍｌ超、５５ｍｇ／ｍｌ超、６０ｍｇ／ｍｌ超または６５ｍｇ／ｍｌ超となる。あるいは、アグリカン結合部分によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における５０ミリ秒超、１００ミリ秒超、１５０ミリ秒超、２００ミリ秒超、２５０ミリ秒超、３００ミリ秒超、３５０ミリ秒超または４００ミリ秒超の密度となる。
【０２２２】
本発明の第６、第７または第８の態様のさらなる実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または組成物は、静脈内および／または関節内の投与のためのものである。
【０２２３】
第９の態様において、本発明は、上記で詳述した第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物を含有する医薬品を提供する。特定の実施形態では、上記で詳述した第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物を含有する医薬品は、本発明の第８の態様に関連して上記で上述した患者において関節の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するためのものである。第９の態様のさらなる実施形態では、上記で詳述した第６の態様のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物または第７の態様の組成物を含有する医薬品は、静脈内および／または関節内の投与のためのものである。
【０２２４】
特定の実施形態では、該医薬品は、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、適宜１種または複数種の追加の作用物質とをさらに含有する。
【０２２５】
特定の実施形態では、担体は、液状である。さらなる実施形態では、液状担体としては、これらに限定されるものではないが例えば、滅菌液体、例えば生理食塩水および油が挙げられ、この油としては例えば、石油起源のもの、動物起源のもの、植物起源のものまたは合成起源のものが挙げられ、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液は、特に注射液用の液状担体としても使用可能である。生理食塩水は、医薬組成物を静脈内投与する場合の好ましい担体である。適切な製薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０２２６】
さらなる実施形態では、賦形剤としては、これらに限定されるものではないが例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールが挙げられる。
【０２２７】
さらなる実施形態では、アジュバントによって、有効成分の効果を増大、刺激、活性化、強化または調節する。特にアジュバントは、無機アジュバント（例えば無機金属塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、有機アジュバント（例えばサポニンまたはスクアレン）、油性アジュバント（例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳおよびＩＮＦ−γ）、微粒子状アジュバント（例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、リポソームまたは生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えばモノホスホリルリピドＡまたはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログまたは合成リピドＡ）および合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えばポリアルギニンまたはポリリシン）からなる群から選択される。
【０２２８】
追加の作用物質が存在する実施形態では、この作用物質が、医薬的な価値を提供する有効成分であることが好ましい。特に医薬組成物は、互いに関連してまたは互いに独立して作用しうる１つまたは複数の有効成分を含有しうる。有効成分は、中性または塩の形態として配合されていてよい。製薬学的に許容される塩としては、これらに限定されるものではないが例えば、遊離アミノ基を用いて形成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものと、遊離カルボキシル基を用いて形成されるもの、例えばこれらに限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどから誘導されるものとが挙げられる。
【０２２９】
特定の実施形態では、該医薬品は、本発明の第１０の態様に関連して以下で詳述する、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸とバッファーとをさらに含有する。
【０２３０】
第１０の態様において、本発明は、本発明の第７または第８の態様の組成物の製造方法であって、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するバッファーに、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を加えるステップを含む方法を提供する。
【０２３１】
第１０の態様の特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体であり、特に配列番号１によるヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体である。
【０２３２】
特定の実施形態では、前記多様体は、配列番号１によるＣＤ−ＲＡＰに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２３３】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述した本発明の第５の態様の方法によって得られるネイティブＣＤ−ＲＡＰである。
【０２３４】
本発明の第１０の態様の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによりＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、ＣＤ−ＲＡＰの凝集を防止する。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される。
【０２３５】
本発明の第１０の態様の実施形態では、バッファーは、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによってＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、バッファーは、ＣＤ−ＲＡＰの分解を防止する。特定の実施形態では、バッファーは、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファーおよびトリスバッファーからなる群から選択される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本発明の第１０の態様により製造される組成物は、糖類またはアミノ糖類をさらに含有する。したがって、第１０の態様の方法は、糖類またはアミノ糖類を加えるステップをさらに含む。特定の実施形態では、糖類は、単糖類、二糖類または三糖類であり、特にスクロース、マルトース、トレハロースまたはラフィノースからなる群から選択される。特定の実施形態では、アミノ糖類は、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミンまたはノイラミン酸からなる群から選択される。
【０２３７】
特定の実施形態では、本発明の第１０の態様により製造される組成物は、アスコルビン酸および／またはグリシンを含有しない。
【０２３８】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物は、アルギニンを５０〜５００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、アルギニンを５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、アルギニンを５０〜５００ｍＭの濃度で加えるステップを含み、すなわちアルギニンを５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭの濃度で加えるステップを含む。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、アルギニンを１００〜３５０ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、アルギニンを１００〜３５０ｍＭの濃度で加えるステップを含む。さらなる実施形態では、製造された組成物は、アルギニンを１００〜２００ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、アルギニンを１００〜２００ｍＭの濃度で加えるステップを含む。特定の実施形態では、製造された組成物は、アルギニンを２００ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、アルギニンを２００ｍＭの濃度で加えるステップを含む。
【０２３９】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物は、ヒスチジンを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、ヒスチジンを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、ヒスチジンを５〜１００ｍＭの濃度で加えるステップを含む。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、ヒスチジンを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、ヒスチジンを１０〜５０ｍＭの濃度で加えるステップを含む。さらなる実施形態では、製造された組成物は、ヒスチジンを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、ヒスチジンを２０〜５０ｍＭの濃度で加えるステップを含む。特定の実施形態では、製造された組成物は、ヒスチジンを５０ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、ヒスチジンを５０ｍＭの濃度で加えるステップを含む。
【０２４０】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物は、リン酸バッファーを含有する。したがって、第１０の態様の方法は、リン酸バッファーにＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を加えることを含む。製造された組成物がリン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、リン酸ナトリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、リン酸ナトリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、リン酸ナトリウムを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、製造された組成物は、リン酸ナトリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、該組成物は、リン酸ナトリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２４１】
製造された組成物がリン酸バッファーを含有する実施形態では、該製造された組成物は、リン酸カリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該製造された組成物は、リン酸カリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、該組成物は、リン酸カリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、該組成物は、リン酸カリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２４２】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物は、クエン酸バッファーを含有する。したがって、第１０の態様の方法は、クエン酸バッファーにＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を加えることを含む。製造された組成物がクエン酸バッファーを含有する実施形態では、該製造された組成物は、クエン酸塩を水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該製造された組成物は、クエン酸塩を水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、クエン酸塩を１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、製造された組成物は、クエン酸塩を２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、製造された組成物は、クエン酸塩を２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２４３】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物は、スクロースをさらに含有する。したがって、第１０の態様の方法は、スクロースを加えるステップを含む。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、スクロースを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該製造された組成物は、スクロースを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、スクロースを５〜１００ｍＭの濃度で加えるステップを含む。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、スクロースを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、スクロースを１０〜５０ｍＭの濃度で加えるステップを含む。さらなる実施形態では、製造された組成物は、スクロースを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、スクロースを２０〜５０ｍＭの濃度で加えるステップを含む。特定の実施形態では、製造された組成物は、スクロースを４５ｍＭの濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、スクロースを４５ｍＭの濃度で加えるステップを含む。
【０２４４】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物は、負に荷電したアミノ酸をさらに含有する。したがって、第１０の態様の方法は、負に荷電したアミノ酸を加えるステップを含む。特定の実施形態では、負に荷電したアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。特定の実施形態では、製造された組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する。
【０２４５】
製造された組成物がグルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する実施形態では、グルタミン酸とアスパラギン酸との全濃度は５０〜５００ｍＭであり、すなわちグルタミン酸とアスパラギン酸との全濃度は、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭである。したがって、第１０の態様の方法は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を５０〜５００ｍＭの全濃度で加えるステップを含む。いくつかの実施形態では、製造された組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を１００〜３５０ｍＭ、特に１００〜２００ｍＭの全濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を１００〜３５０ｍＭ、特に１００〜２００ｍＭの全濃度で加えるステップを含む。特定の実施形態では、製造された組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を、２００ｍＭの全濃度で含有する。したがって、第１０の態様の方法は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を２００ｍＭの全濃度で加えるステップを含む。
【０２４６】
製造された組成物がアルギニンとグルタミン酸との組合せ物を含有する実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１．２５の比で存在する。さらなる実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、特に１：１．５の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：２の比で存在する。
【０２４７】
本発明の第１０の態様の実施形態では、製造された組成物のｐＨ値は、５．５〜８．０であり、すなわち該製造された組成物のｐＨ値は、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０である。したがって、第１０の態様の方法は、ｐＨ値を５．５〜８．０に調整するステップを含む。いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨ値は、６．０〜７．５である。さらなる実施形態では、組成物のｐＨ値は、６．０〜６．５である。特定の実施形態では、組成物のｐＨ値は、６である。
【０２４８】
本発明の第１０の態様の実施形態では、リン酸または塩化水素を用いて組成物のｐＨ値を調整する。特定の実施形態では、リン酸を用いて組成物のｐＨ値を調整する。
【０２４９】
本発明の第１０の態様の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、すなわちＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰの濃度は、２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
【０２５０】
本発明の第１０の態様の特定の実施形態では、製造された組成物は、２ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と、２０ｍＭのクエン酸塩と、２００ｍＭのアルギニンとを水溶液中に含有し、かつ該組成物のｐＨ値は６である。
【０２５１】
第１１の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法であって、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するバッファー中でＣＤ−ＲＡＰを保持することを含む方法を提供する。
【０２５２】
第１１の態様の特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体であり、特に配列番号１によるヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体である。
【０２５３】
特定の実施形態では、前記多様体は、配列番号１によるＣＤ−ＲＡＰに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２５４】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述した本発明の第５の態様の方法によって得られるネイティブＣＤ−ＲＡＰである。
【０２５５】
本発明の第１１の態様の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによりＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、ＣＤ−ＲＡＰの凝集を防止する。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される。
【０２５６】
本発明の第１１の態様の実施形態では、バッファーは、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによってＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、バッファーは、ＣＤ−ＲＡＰの分解を防止する。特定の実施形態では、バッファーは、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファーおよびトリスバッファーからなる群から選択される。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、バッファーは、糖類またはアミノ糖類をさらに含有する。特定の実施形態では、糖類は、単糖類、二糖類または三糖類であり、特にスクロース、マルトース、トレハロースまたはラフィノースからなる群から選択される。特定の実施形態では、アミノ糖類は、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミンまたはノイラミン酸からなる群から選択される。
【０２５８】
特定の実施形態では、バッファーは、アスコルビン酸および／またはグリシンを含有しない。
【０２５９】
本発明の第１０の態様の実施形態では、バッファーは、アルギニンを５０〜５００ｍＭの濃度で含有し、すなわちバッファーは、アルギニンを５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、バッファーは、アルギニンを１００〜３５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、バッファーは、アルギニンを１００〜２００ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、アルギニンを２００ｍＭの濃度で含有する。
【０２６０】
本発明の第１０の態様の実施形態では、バッファーは、ヒスチジンを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわちバッファーは、ヒスチジンを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、バッファーは、ヒスチジンを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、バッファーは、ヒスチジンを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、ヒスチジンを５０ｍＭの濃度で含有する。
【０２６１】
本発明の第１１の態様の実施形態では、バッファーは、リン酸バッファーである。バッファーがリン酸バッファーである実施形態では、バッファーは、リン酸ナトリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわちバッファーは、リン酸ナトリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、バッファーは、リン酸ナトリウムを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、バッファーは、リン酸ナトリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、リン酸ナトリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２６２】
バッファーがリン酸バッファーである実施形態では、バッファーは、リン酸カリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわちバッファーは、リン酸カリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、バッファーは、リン酸カリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、リン酸カリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２６３】
本発明の第１１の態様の実施形態では、バッファーは、クエン酸バッファーである。バッファーがクエン酸バッファーを含有する実施形態では、バッファーは、クエン酸塩を水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわちバッファーは、クエン酸塩を水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、バッファーは、クエン酸塩を１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、バッファーは、クエン酸塩を２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、クエン酸塩を２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２６４】
本発明の第１０の態様の実施形態では、バッファーは、スクロースをさらに含有する。いくつかの実施形態では、バッファーは、スクロースを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわちバッファーは、スクロースを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、バッファーは、スクロースを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、バッファーは、スクロースを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、スクロースを４５ｍＭの濃度で含有する。
【０２６５】
本発明の第１０の態様の実施形態では、バッファーは、負に荷電したアミノ酸をさらに含有する。特定の実施形態では、負に荷電したアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。特定の実施形態では、バッファーは、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する。
【０２６６】
バッファーがグルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する実施形態では、グルタミン酸とアスパラギン酸との全濃度は５０〜５００ｍＭであり、すなわちグルタミン酸とアスパラギン酸との全濃度は、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、バッファーは、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を１００〜３５０ｍＭ、特に１００〜２００ｍＭの全濃度で含有する。特定の実施形態では、バッファーは、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を、２００ｍＭの全濃度で含有する。
【０２６７】
バッファーがアルギニンとグルタミン酸との組合せ物を含有する実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１．２５の比で存在する。さらなる実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、特に１：１．５の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：２の比で存在する。
【０２６８】
本発明の第１１の態様の実施形態では、バッファーのｐＨ値は、５．５〜８．０であり、すなわちバッファーのｐＨ値は、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０である。いくつかの実施形態では、バッファーのｐＨ値は、６．０〜７．５である。さらなる実施形態では、バッファーのｐＨ値は、６．０〜６．５である。特定の実施形態では、バッファーのｐＨ値は、６である。
【０２６９】
本発明の第１１の態様の実施形態では、リン酸または塩化水素を用いてバッファーのｐＨ値を調整する。特定の実施形態では、リン酸を用いてバッファーのｐＨ値を調整する。
【０２７０】
本発明の第１１の態様の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、すなわちＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰの濃度は、２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
【０２７１】
本発明の第１１の態様の特定の実施形態では、２ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を、２０ｍＭのクエン酸塩と２００ｍＭのアルギニンとを水溶液中に含有するバッファー中で保存し、かつ該バッファーのｐＨ値は６である。
【０２７２】
第１１の態様の特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰを−８０℃〜４０℃の温度で保存し、特に−２０℃〜２５℃の温度で保存し、特に−２０℃〜５℃の温度で保存する。
【０２７３】
第１１の態様の特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰを最長で６カ月間の期間にわたって保存し、すなわちＣＤ−ＲＡＰを最長で６カ月間、最長で５カ月間、最長で４カ月間、最長で３カ月間、最長で２カ月間、最長で１カ月間、最長で３週間、最長で２週間、最長で１週間、最長で６日間、最長で５日間、最長で４日間、最長で３日間、最長で２日間、最長で１日間の期間にわたって保存する。特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰを最長で３カ月間保存し、特に最長で１カ月間保存する。
【０２７４】
特に、ＣＤ−ＲＡＰを、上記の期間にわたって実質的に凝集も変性も分解も生じさせずに保存する。
【０２７５】
第１２の態様において、本発明は、封入されたＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を含むリポソームを含有する組成物であって、前記リポソームのサイズは２００ｎｍ未満である組成物を提供する。
【０２７６】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体であり、特に配列番号１によるヒトＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体である。特定の実施形態では、前記多様体は、配列番号１によるＣＤ−ＲＡＰに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２７７】
特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述した本発明の第５の態様の方法によって得られるネイティブＣＤ−ＲＡＰである。
【０２７８】
第１２の態様の実施形態では、リポソームのサイズは２００ｎｍ未満であり、すなわちリポソームのサイズは、２００ｎｍ未満、１９０ｎｍ未満、１８０ｎｍ未満、１７０ｎｍ未満、１６０ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１４０ｎｍ未満、１３０ｎｍ未満、１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満または１０ｎｍ未満である。特定の実施形態では、リポソームのサイズは、１５０ｎｍ未満である。さらなる実施形態では、リポソームのサイズは、１２０ｎｍであり、特に１００ｎｍ未満である。
【０２７９】
第１２の態様の実施形態では、全ＣＤ−ＲＡＰの２０％超をリポソームに封入する。特定の実施形態では、全ＣＤ−ＲＡＰの少なくとも３０％をリポソームに封入する。さらなる実施形態では、全ＣＤ−ＲＡＰの少なくとも４０％をリポソームに封入する。いくつかの実施形態では、全ＣＤ−ＲＡＰの４０〜１００％をリポソームに封入し、すなわち全ＣＤ−ＲＡＰの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％をリポソームに封入する。特定の実施形態では、全ＣＤ−ＲＡＰの４０％〜９０％、４０〜８０％、５０〜９０％、５０〜８０％、６０〜９０％、６０〜８０％、７０〜８０％、７０〜９０％または８０〜９０％をリポソームに封入する。
【０２８０】
第１２の態様の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰ対リポソームの比は、１：０．５〜１：１．５であり、すなわちＣＤ−ＲＡＰ対リポソームの比は、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５である。特定の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰ対リポソームの比は、１：１．２である。
【０２８１】
第１２の態様の実施形態では、リポソームの多分散指数（ＰＤＩ）は、０．３未満である。特定の実施形態では、ＰＤＩは０．２未満であり、特に０．１５未満である。特定の実施形態では、ＰＤＩは、０．１３２である。
【０２８２】
第１２の態様の実施形態では、リポソームは、１種または複数種の脂質類から構成される。いくつかの実施形態では、１種または複数種の脂質は、グリセリド類、リン脂質類、グリセロリン脂質類、グリセロホスフィノ脂質類、グリセロホスホノ脂質類、スルホ脂質類、スフィンゴ脂質類、イソプレノイド類、ステロイド類、ステアリン類、ステロール類および炭水化物含有脂質からなる群から選択される。特定の実施形態では、リポソームは、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスホイノシチド類、例えばホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスファート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスホスファート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリホスファート（ＰＩＰ３）、カルジオリピン、リゾリン脂質類およびコレステロールからなる群から選択される脂質類から構成される。いくつかの実施形態では、リポソームは、少なくとも２種の脂質類から構成される。さらなる実施形態では、リポソームは、リン脂質類およびステロールから構成される。特定の実施形態では、リポソームは、ホスファチジルコリンおよびコレステロールから構成される。
【０２８３】
さらなる実施形態では、脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとは、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０：８５：１５または９０：１０の比で存在する。特定の実施形態では、脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとは、７４．８：２５．２の比で存在する。
【０２８４】
第１２の態様の実施形態では、リポソームは、疎水性アスコルビン酸エステルをさらに含有する。特定の実施形態では、疎水性アスコルビン酸エステルは、アスコルビン酸パルミチン酸エステルである。
【０２８５】
さらなる実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９〜１：９９の比で存在し、すなわちアスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９、０．２：９９．８、０．３：９９．７、０．４：９９．６、０．５：９９．５、０．６：９９．４、０．７：９９．３、０．８：９９．２、０．９：９９．１または１．０：９９．０の比で存在する。特定の実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９の比で存在する。
【０２８６】
第１２の態様の実施形態では、ＣＤ−ＲＡＰおよびリポソームは、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するリン酸バッファーまたはクエン酸バッファー中に存在する。
【０２８７】
特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによってＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、ＣＤ−ＲＡＰの分解を防止する。特定の実施形態では、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される。
【０２８８】
さらなる実施形態では、バッファーは、特にＣＤ−ＲＡＰの分解、変性および／または凝集を防止することによってＣＤ−ＲＡＰの安定性を増加させる。特定の実施形態では、バッファーは、ＣＤ−ＲＡＰの分解を防止する。
【０２８９】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物は、アルギニンを２０〜５００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、アルギニンを２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、アルギニンを１００〜３５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、アルギニンを１００〜２００ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、アルギニンを２００ｍＭの濃度で含有する。
【０２９０】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物は、ヒスチジンを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、ヒスチジンを５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒスチジンを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、ヒスチジンを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、ヒスチジンを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２９１】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物は、リシンを０．１％〜１０％含有し、すなわちリシンを０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０％含有する。第１の態様の実施形態では、組成物は、リシンを０．５％〜７．５％含有する。さらなる実施形態では、組成物は、リシンを１．０％〜５．０％含有する。特定の実施形態では、組成物は、リシンを２．０％〜３．０％含有する。本発明の第１の態様の実施形態では、組成物は、リン酸バッファーを含有する。組成物がリン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、リン酸ナトリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、リン酸ナトリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸ナトリウムを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、リン酸ナトリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、リン酸ナトリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２９２】
組成物がリン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、リン酸カリウムを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、リン酸カリウムを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、リン酸カリウムを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、リン酸カリウムを２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２９３】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物は、クエン酸バッファーを含有する。組成物がクエン酸バッファーを含有する実施形態では、該組成物は、クエン酸塩を水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち該組成物は、クエン酸塩を水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、クエン酸塩を１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、クエン酸塩を２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、クエン酸塩を２０ｍＭの濃度で含有する。
【０２９４】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物は、スクロースをさらに含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、スクロースを水溶液中で特に５〜１００ｍＭの濃度で含有し、すなわち組成物は、スクロースを水溶液中で５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭまたは１００ｍＭの濃度で含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、スクロースを１０〜５０ｍＭの濃度で含有する。さらなる実施形態では、組成物は、スクロースを２０〜５０ｍＭの濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、スクロースを４５ｍＭの濃度で含有する。
【０２９５】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物は、負に荷電したアミノ酸をさらに含有する。特定の実施形態では、負に荷電したアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される。特定の実施形態では、組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する。
【０２９６】
組成物がグルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を含有する実施形態では、グルタミン酸とアスパラギン酸との全濃度は５０〜５００ｍＭであり、すなわちグルタミン酸とアスパラギン酸との全濃度は、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を１００〜３５０ｍＭ、特に１００〜２００ｍＭの全濃度で含有する。特定の実施形態では、組成物は、グルタミン酸とアスパラギン酸との組合せ物を、２００ｍＭの全濃度で含有する。
【０２９７】
組成物がアルギニンとグルタミン酸との組合せ物を含有する実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：１．２５の比で存在する。さらなる実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、特に１：１．５の比で存在する。特定の実施形態では、アルギニンとグルタミン酸とは、１：２の比で存在する。
【０２９８】
本発明の第１２の態様の実施形態では、組成物のｐＨ値は、５．５〜８．０であり、すなわち組成物のｐＨ値は、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨ値は、６．０〜７．５である。さらなる実施形態では、組成物のｐＨ値は、６．０〜６．５である。特定の実施形態では、組成物のｐＨ値は、６である。
【０２９９】
本発明の第１２の態様の実施形態では、リン酸または塩化水素を用いて組成物のｐＨ値を調整する。特定の実施形態では、リン酸を用いて組成物のｐＨ値を調整する。
【０３００】
第１３の態様において、本発明は、患者において関節の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するための、上記で詳述した第１２の態様の組成物を提供する。関節の疾患または損傷の特定の実施形態では、軟骨および／または軟部組織が冒されている。特に、関節の疾患または損傷とは、軟骨の疾患もしくは損傷および／または十字靭帯の疾患もしくは損傷および／または側副靭帯の疾患もしくは損傷である。さらなる実施形態では、軟骨は、その分解を招く様式で冒されている。軟骨の分解は、様々な要因によって引き起こされることがある。軟骨の分解は、これらに限定されるものではないが、例えば外傷性損傷または反復運動過多損傷（例えば反復活動による軟骨組織の慢性的な侵食など）といった損傷によって引き起こされまたは誘発される場合がある。軟骨の分解の重篤度は、国際軟骨修復学会の分類によるグレード１からグレード４までの範囲であることができ、すなわち表在性の病変（グレード１）から、骨組織に達する全厚さにわたる病変（グレード４）までの範囲であることができる。軟骨の分解の領域には、初期の軟骨の病変の領域（すなわち外傷性損傷または反復運動過多損傷により生じた病変の領域）に加えて、それ以外の領域における軟骨の病変の領域も包含され、すなわち、上述の損傷が生じた後には、他の関節または同一の関節の他の部分も損傷されることがある。さらなる実施形態では、１つまたは複数の関節が関与する骨折によって軟骨の形態の歪曲も生じることがあり、これによって長期的に軟骨の変性が誘発される。
【０３０１】
それに加えてまたはそれとは異なって、軟骨の分解は、これらに限定されるものではないが例えば、炎症性疾患、感染性疾患、遺伝的障害、自己免疫疾患、変性疾患および増殖性疾患であって、特に慢性関節リウマチ、細菌による滑膜炎、滑膜組織または軟骨自体の肉腫によるものといった疾患によって引き起こされる場合がある。
【０３０２】
第１３の態様の実施形態では、第１２の態様の組成物は、軟骨の分解および／または軟骨への水の流入の増加および／または軟骨におけるＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０３０３】
さらなる実施形態では、軟骨の分解は、プロテオグリカンの分解を含み、特にアグリカンの分解を含む。プロテオグリカンの分解は、プロテアーゼによる切断ゆえに起こりうる。プロテオグリカンの分解に関与するプロテアーゼ、好ましくはアグリカンの分解に関与するプロテアーゼとしては、これらに限定されるものではないが例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ならびにトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）が挙げられる。好ましい実施形態では、プロテオグリカン、好ましくはアグリカンは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、カテプシンＤ、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−８、ＡＤＡＭＴＳ−９、ＡＤＡＭＴＳ−１５、ＡＤＡＭＴＳ−１６およびＡＤＡＭＴＳ−１８からなる群から選択されるプロテアーゼにより分解される。ＡＤＡＭＴＳ−４および／またはＡＤＡＭＴＳ−５が特に好ましい。
【０３０４】
さらなる実施形態では、プロテアーゼによる切断は、アグリカンの球状のＧ１ドメインとＧ２ドメインとの間に位置する切断部位で生じる。さらなる実施形態では、アグリカンのポリペプチド鎖は、Ａｓｎ３４１とＰｈｅ３４２との間のペプチド結合および／またはＧｌｕ３７３とＡｌａ３７４との間のペプチド結合で切断され、好ましくはＧｌｕ３７３とＡｌａ３７４との間のペプチド結合で切断される。
【０３０５】
さらなる実施形態では、第１２の態様の組成物は、アグリカンの分解に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。特定の実施形態では、０．５％〜５％のアグリカンが分解され、すなわち０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％のアグリカンが分解される。特定の実施形態では、０．５％超、１％超、１．５％超、２％超、２．５％超、３％超、３．５％超、４％超または４．５％超のアグリカンが分解される。特に、軟骨の分解は、病変のない目立たない軟骨組織と比較して測定されるが、こうした病変のない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、６５〜１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示し、すなわち６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示す。あるいは、病変のない目立たない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒、４５０ミリ秒、５００ミリ秒、５５０ミリ秒、６００ミリ秒、６５０ミリ秒、７００ミリ秒、７５０ミリ秒、８００ミリ秒、８５０ミリ秒、９００ミリ秒、９５０ミリ秒または１０００ミリ秒に相当するプロテオグリカンの密度を示す。特定の実施形態では、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、６５ｍｇ／ｍｌ未満、６０ｍｇ／ｍｌ未満、５５ｍｇ／ｍｌ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、４５ｍｇ／ｍｌ未満、４０ｍｇ／ｍｌ未満、３５ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、２５ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満または５ｍｇ／ｍｌ未満となる。あるいは、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒未満、３５０ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、２５０ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、１５０ミリ秒未満、１００ミリ秒未満または５０ミリ秒未満の密度となる。
【０３０６】
したがって、特定の実施形態では、第１２の態様の組成物によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、５ｍｇ／ｍｌ超、１０ｍｇ／ｍｌ超、１５ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、２５ｍｇ／ｍｌ超、３０ｍｇ／ｍｌ超、３５ｍｇ／ｍｌ超、４０ｍｇ／ｍｌ超、４５ｍｇ／ｍｌ超、５０ｍｇ／ｍｌ超、５５ｍｇ／ｍｌ超、６０ｍｇ／ｍｌ超または６５ｍｇ／ｍｌ超となる。あるいは、第１２の態様の組成物によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における５０ミリ秒超、１００ミリ秒超、１５０ミリ秒超、２００ミリ秒超、２５０ミリ秒超、３００ミリ秒超、３５０ミリ秒超または４００ミリ秒超の密度となる。
【０３０７】
特にアグリカンの分解、すなわち切断されたプロテオグリカンの増加、好ましくは切断されたアグリカンの増加により、インタクトなプロテオグリカンの損失、特にインタクトなアグリカンの損失は、軟骨への水の流入をもたらし、それにより軟骨が膨潤し、ひいては関節が膨潤する。したがって、第１３の態様の実施形態では、第１２の態様の組成物は、軟骨への水の流入の増加に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０３０８】
ＣＤ−ＲＡＰは、アグリカンと相互作用して、その分解、特にそのタンパク質分解を防止する。ＣＤ−ＲＡＰとアグリカンとの相互作用によって、プロテアーゼ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ならびにトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）がアグリカンペプチド鎖を切断しうることが妨害され、ここで、これらのプロテアーゼは好ましくは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、カテプシンＤ、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭＴＳ−８、ＡＤＡＭＴＳ−９、ＡＤＡＭＴＳ−１５、ＡＤＡＭＴＳ−１６およびＡＤＡＭＴＳ−１８からなる群から選択される。ＣＤ−ＲＡＰの存在が減少することまたはＣＤ−ＲＡＰが完全に存在しなくなることによって、アグリカンの分解が増大する。
【０３０９】
したがって、第１３の態様の実施形態では、第１２の態様の組成物は、関節におけるＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。特定の実施形態では、軟骨においてＣＤ−ＲＡＰの存在が減少する。
【０３１０】
ＣＤ−ＲＡＰの存在の減少は、ＣＤ−ＲＡＰの発現の低減に起因しうる。それとは異なっておよび／またはそれに加えて、ＣＤ−ＲＡＰの存在の減少は、ＣＤ−ＲＡＰが発現細胞内に保持されることに起因して起こりうるものであり、特にＣＤ−ＲＡＰが軟骨細胞内に保持されることに起因して起こりうる。それとは異なっておよび／またはそれに加えて、ＣＤ−ＲＡＰの存在の減少は、ＣＤ−ＲＡＰが発現細胞の内部で、特に軟骨細胞内で、またはＣＤ−ＲＡＰがこれらの細胞から細胞外空間、好ましくは軟骨へと分泌された後に分解されることに起因して起こりうる。
【０３１１】
第１３の態様の特定の実施形態では、第１２の態様の組成物は、ＣＤ−ＲＡＰの発現の低減、細胞内でのＣＤ−ＲＡＰの保持、好ましくは軟骨細胞内でのＣＤ−ＲＡＰの保持、または細胞内でのＣＤ−ＲＡＰの分解、好ましくは軟骨細胞内もしくは細胞外空間でのＣＤ−ＲＡＰの分解に苦しむ患者における関節の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０３１２】
第１３の態様の特定の実施形態では、第１２の態様の組成物は、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものであり、ここで前記軟骨の疾患は、変形性関節症（ＯＡ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、軟骨形成不全症、軟骨軟化症、軟骨肉腫、変形性椎間板疾患、股関節形成異常症、指の骨関節症、離断性骨軟骨炎および多発性軟骨炎からなる群から選択される。
【０３１３】
特定の実施形態では、変形性関節症は、ケルグレン・ローレンス分類による変形性関節症、変形性足関節症、変形性肘関節症、変形性手指関節症、変形性股関節症、変形性膝関節症、変形性肩関節症、変形性脊椎関節症、変形性足指関節症、変形性手関節症からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＯＡは、早期に発症するＯＡである。
【０３１４】
第１３の態様の特定の実施形態では、第１２の態様の組成物は、アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰの存在の減少に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷の治療および／または予防に使用するためのものであり、ここで前記軟骨の損傷は、外傷性損傷または反復運動過多損傷（例えば反復活動による軟骨組織の慢性的な侵食など）である。軟骨の分解の重篤度は、国際軟骨修復学会の分類によるグレード１からグレード４までの範囲であることができ、すなわち表在性の病変（グレード１）から、骨組織に達する全厚さにわたる病変（グレード４）までの範囲であることができる。軟骨の分解の領域には、初期の軟骨の病変の領域（すなわち外傷性損傷または反復運動過多損傷により生じた病変の領域）に加えて、それ以外の領域における軟骨の病変の領域も包含され、すなわち、上述の損傷が生じた後には、他の関節または同一の関節の他の部分も損傷されることがある。さらなる実施形態では、１つまたは複数の関節が関与する骨折によって軟骨の形態の歪曲も生じることがあり、これによって長期的に軟骨の変性が誘発される。
【０３１５】
第１３の態様の実施形態では、患者とは、哺乳動物、爬虫類または鳥類である。特定の実施形態では、患者は、試験用動物（例えばマウスもしくはラット）、家畜（例えばモルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、水生のカメ、陸生のカメ、ヘビもしくはトカゲ）または霊長類、例えばチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびヒトからなる群から選択される。特にヒトを指す。
【０３１６】
第１３の態様のさらなる実施形態では、第１２の態様の組成物によって、患者における軟骨の分解の程度が変更される。特定の実施形態では、第１１の態様の組成物によって、患者における軟骨の分解の程度が低下し、より好ましくは患者におけるアグリカンの分解の程度が低下する。特に、本発明の第１１の態様の組成物によって、軟骨の分解の程度が、好ましくはアグリカンの分解の程度が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％低下する。特定の実施形態では、０．５％超、１％超、１．５％超、２％超、２．５％超、３％超、３．５％超、４％超または４．５％超のアグリカンが分解する。特に、軟骨の分解は、病変のない目立たない軟骨組織と比較して測定されるが、こうした病変のない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、６５〜１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示し、すなわち６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌに相当するプロテオグリカンの密度を示す。あるいは、病変のない目立たない軟骨組織は、必ずしもこうであるとは限らないが典型的には、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒、４５０ミリ秒、５００ミリ秒、５５０ミリ秒、６００ミリ秒、６５０ミリ秒、７００ミリ秒、７５０ミリ秒、８００ミリ秒、８５０ミリ秒、９００ミリ秒、９５０ミリ秒または１０００ミリ秒に相当するプロテオグリカンの密度を示す。特定の実施形態では、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、６５ｍｇ／ｍｌ未満、６０ｍｇ／ｍｌ未満、５５ｍｇ／ｍｌ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、４５ｍｇ／ｍｌ未満、４０ｍｇ／ｍｌ未満、３５ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満、２５ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満または５ｍｇ／ｍｌ未満となる。あるいは、軟骨の分解によって、プロテオグリカンの密度は、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における４００ミリ秒未満、３５０ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、２５０ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、１５０ミリ秒未満、１００ミリ秒未満または５０ミリ秒未満の密度となる。
【０３１７】
したがって、特定の実施形態では、第１２の態様の組成物によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、５ｍｇ／ｍｌ超、１０ｍｇ／ｍｌ超、１５ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、２５ｍｇ／ｍｌ超、３０ｍｇ／ｍｌ超、３５ｍｇ／ｍｌ超、４０ｍｇ／ｍｌ超、４５ｍｇ／ｍｌ超、５０ｍｇ／ｍｌ超、５５ｍｇ／ｍｌ超、６０ｍｇ／ｍｌ超または６５ｍｇ／ｍｌ超となる。あるいは、アグリカン結合部分によって軟骨の分解が低減して、プロテオグリカンの密度が、ＤＧＥＭＲＩＣ技術により視覚化されたＴ１値における５０ミリ秒超、１００ミリ秒超、１５０ミリ秒超、２００ミリ秒超、２５０ミリ秒超、３００ミリ秒超、３５０ミリ秒超または４００ミリ秒超の密度となる。
【０３１８】
本発明の第１２または第１３の態様のさらなる実施形態では、組成物は、関節内投与のためのものである。
【０３１９】
第１４の態様において、本発明は、上記で詳述した第１２または第１３の態様の組成物を含有する医薬品を提供する。特定の実施形態では、該医薬品は、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、適宜１種または複数種の追加の作用物質とをさらに含有する。
【０３２０】
特定の実施形態では、担体は、液状である。さらなる実施形態では、液状担体としては、これらに限定されるものではないが例えば、滅菌液体、例えば生理食塩水および油が挙げられ、この油としては例えば、石油起源のもの、動物起源のもの、植物起源のものまたは合成起源のものが挙げられ、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液は、特に注射液用の液状担体としても使用可能である。生理食塩水は、医薬組成物を静脈内投与する場合の好ましい担体である。適切な製薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０３２１】
さらなる実施形態では、賦形剤としては、これらに限定されるものではないが例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールが挙げられる。
【０３２２】
さらなる実施形態では、アジュバントによって、有効成分の効果を増大、刺激、活性化、強化または調節する。特にアジュバントは、無機アジュバント（例えば無機金属塩、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、有機アジュバント（例えばサポニンまたはスクアレン）、油性アジュバント（例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳおよびＩＮＦ−γ）、微粒子状アジュバント（例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、リポソームまたは生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えばモノホスホリルリピドＡまたはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログまたは合成リピドＡ）および合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えばポリアルギニンまたはポリリシン）からなる群から選択される。
【０３２３】
追加の作用物質が存在する実施形態では、この作用物質が、医薬的な価値を提供する有効成分であることが好ましい。特に医薬組成物は、互いに関連してまたは互いに独立して作用しうる１つまたは複数の有効成分を含有しうる。有効成分は、中性または塩の形態として配合されていてよい。製薬学的に許容される塩としては、これらに限定されるものではないが例えば、遊離アミノ基を用いて形成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものと、遊離カルボキシル基を用いて形成されるもの、例えばこれらに限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどから誘導されるものとが挙げられる。
【０３２４】
第１５の態様において、本発明は、リポソーム製剤の製造方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法に関する。
【０３２５】
第１５の態様の実施形態では、本方法は、
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）によって得られたリポソーム製剤と、ＣＤ−ＲＡＰを含有する組成物とを混合するステップ
をさらに含む。その際、予め形成されたリポソームにＣＤ−ＲＡＰを加える。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、ステップａ）の有機溶媒は、クラス３の溶媒である。特にこの溶媒は、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、酢酸プロピルからなる群から選択され、より好ましくは１−プロパノールである。
【０３２７】
第１５の態様の実施形態では、ステップａ）の少なくとも１種の脂質は、グリセリド類、グリセロリン脂質類、グリセロホスフィノ脂質類、グリセロホスホノ脂質類、スルホ脂質類、スフィンゴ脂質類、リン脂質類、イソプレノイド類、ステロイド類、ステアリン類、ステロール類および炭水化物含有脂質からなる群から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスホイノシチド類、例えばホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスファート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスホスファート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリホスファート（ＰＩＰ３）、カルジオリピン、リゾリン脂質類およびコレステロールからなる群から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、２種の脂質類の組合せ物であり、特にリン脂質類とステロールとの組合せ物であり、特にホスファチジルコリンとコレステロールとの組合せ物である。
【０３２８】
第１５の態様の実施形態では、ステップａ）において、２種以上の脂質を有機溶媒に溶解させる。いくつかの実施形態では、１種または複数種のリン脂質と１種または複数種のステロールとを有機溶媒に溶解させる。特定の実施形態では、脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとを有機溶媒に溶解させる。特に、脂質類と有機溶媒との比は、３：１である。
【０３２９】
さらなる実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０２〜０．４ｇ／ｍｌであり、すなわち溶媒中の全脂質濃度は、０．０２ｇ／ｍｌ、０．０３ｇ／ｍｌ、０．０４ｇ／ｍｌ、０．０５ｇ／ｍｌ、０．０６ｇ／ｍｌ、０．０７ｇ／ｍｌ、０．０８ｇ／ｍｌ、０．０９ｇ／ｍｌ、０．１０ｇ／ｍｌ、０．１１ｇ／ｍｌ、０．１２ｇ／ｍｌ、０．１３ｇ／ｍｌ、０．１４ｇ／ｍｌ、０．１５ｇ／ｍｌ、０．１６ｇ／ｍｌ、０．１７ｇ／ｍｌ、０．１８ｇ／ｍｌ、０．１９ｇ／ｍｌ、０．２ｇ／ｍｌ、０．２１ｇ／ｍｌ、０．２２ｇ／ｍｌ、０．２３ｇ／ｍｌ、０．２４ｇ／ｍｌ、０．２５ｇ／ｍｌ、０．２６ｇ／ｍｌ、０．２７ｇ／ｍｌ、０．２８ｇ／ｍｌ、０．２９ｇ／ｍｌ、０．３０ｇ／ｍｌ、０．３１ｇ／ｍｌ、０．３２ｇ／ｍｌ、０．３３ｇ／ｍｌ、０．３４ｇ／ｍｌ、０．３５ｇ／ｍｌ、０．３６ｇ／ｍｌ、０．３７ｇ／ｍｌ、０．３８ｇ／ｍｌ、０．３９ｇ／ｍｌまたは０．４ｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０３〜０．３ｇ／ｍｌ、０．０３〜０．１ｇ／ｍｌ、０．０３〜０．０５ｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０３３ｇ／ｍｌである。
【０３３０】
第１５の態様のさらなる実施形態では、ステップａ）における少なくとも１種の脂質に加えて、疎水性アスコルビン酸エステルを有機溶媒に溶解させる。特定の実施形態では、疎水性アスコルビン酸エステルは、アスコルビン酸パルミチン酸エステルである。
【０３３１】
さらなる実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９〜１：９９の比で存在し、すなわちアスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９、０．２：９９．８、０．３：９９．７、０．４：９９．６、０．５：９９．５、０．６：９９．４、０．７：９９．３、０．８：９９．２、０．９：９９．１または１．０：９９．０の比で存在する。特定の実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９の比で存在する。
【０３３２】
第１５の態様のさらなる実施形態では、１〜１０ｍｌ／分の速度で行い、すなわち１ｍｌ／分、２ｍｌ／分、３ｍｌ／分、４ｍｌ／分、５ｍｌ／分、６ｍｌ／分、７ｍｌ／分、８ｍｌ／分、９ｍｌ／分または１０ｍｌ／分の速度で行う。特定の実施形態では、混合物を５ｍｌ／分の速度で注入する。
【０３３３】
第１５の態様のさらなる実施形態では、水性相は、５００〜３０００ｍｌ／分の速度で循環し、すなわち水性相は、５００ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、７００ｍｌ／分、８００ｍｌ／分、９００ｍｌ／分、１０００ｍｌ／分、１１００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、１３００ｍｌ／分、１４００ｍｌ／分、１５００ｍｌ／分、１６００ｍｌ／分、１７００ｍｌ／分、１８００ｍｌ／分、１９００ｍｌ／分、２０００ｍｌ／分、２１００ｍｌ／分、２２００ｍｌ／分、２３００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、２５００ｍｌ／分、２６００ｍｌ／分、２７００ｍｌ／分、２８００ｍｌ／分、２９００ｍｌ／分または３０００ｍｌ／分の速度で循環する。特定の実施形態では、水性相は、１０００〜２５００ｍｌ／分、１５００〜２５００ｍｌ／分または２０００〜２５００ｍｌ／分の速度で循環する。特定の実施形態では、水性相は、２２００ｍｌ／分の速度で循環する。
【０３３４】
特定の実施形態では、水性相を、せん断誘導装置により循環させる。いくつかの実施形態では、せん断誘導装置は、スタティックミキサーまたは通常のスターラーである。特に、せん断誘導装置は、スタティックミキサーである。第１の態様の実施形態では、スタティックミキサーは１０〜１５ｍｍの内径を有し、すなわちスタティックミキサーは、１０ｍｍ、１１ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍまたは１５ｍｍの内径を有する。特定の実施形態では、スタティックミキサーは、１２〜１３ｍｍの内径を有し、すなわちスタティックミキサーは、１２．０ｍｍ、１２．１ｍｍ、１２．２ｍｍ、１２．３ｍｍ、１２．４ｍｍ、１２．５ｍｍ、１２．６ｍｍ、１２．７ｍｍ、１２．８ｍｍ、１２．９ｍｍまたは１３．０ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態では、スタティックミキサーは、最終体積が１５０〜３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適しており、すなわちスタティックミキサーは、最終体積が１５０ｍｌ、１６０ｍｌ、１７０ｍｌ、１８０ｍｌ、１９０ｍｌ、２００ｍｌ、２１０ｍｌ、２２０ｍｌ、２３０ｍｌ、２４０ｍｌ、２５０ｍｌ、２６０ｍｌ、２７０ｍｌ、２８０ｍｌ、２９０ｍｌまたは３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適している。特に、スタティックミキサーは、最終体積が１７０〜３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適しており、特に最終体積が２００〜２５０ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適している。したがって、特定の実施形態では、スタティックミキサーの内径と混合される脂質製剤の体積との比は、該脂質製剤１５ｍｌあたりの内径が０．７ｍｍ〜１ｍｍとなる比であり、すなわち該脂質製剤１５ｍｌあたりの内径が０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍまたは１．０ｍｍとなる比である。特定の実施形態では、ステップｂ）において、ａ）の混合物をせん断誘導装置の手前で注入する。特定の実施形態では、ａ）の混合物をスタティックミキサーの手前で注入する。
【０３３５】
さらなる実施形態では、ステップｃ）において、ろ過を用いて、特にタンジェンシャルフローろ過を用いて溶媒を除去する。
【０３３６】
さらなる実施形態では、ステップｄ）で混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１〜１０ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有し、すなわちステップｄ）で混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。特定の実施形態では、組成物は、２〜９ｍｇ／ｍｌ、３〜８ｍｇ／ｍｌ、４〜８ｍｇ／ｍｌ、５〜８ｍｇ／ｍｌまたは６〜８ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。特定の実施形態では、組成物は、７ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。さらなる実施形態では、ステップｄ）において混合されるＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述したアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーに含まれる。
【０３３７】
さらなる実施形態では、リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１または１．５：１である。特定の実施形態では、リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は１．２：１である。
【０３３８】
第１５の態様の実施形態では、本方法は、
ｅ）  前記リポソーム製剤を凍結乾燥するステップ
をさらに含む。
【０３３９】
第１５の態様の実施形態では、本方法は、
ｆ）  前記凍結乾燥リポソーム製剤を、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファー中で再構成するステップ
を含む。いくつかの実施形態では、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積を１度に加えて混合することにより、凍結乾燥リポソーム製剤を単一のステップで再構成する。いくつかの実施形態では、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の複数の部分を２つ以上の引き続くステップで加えることにより、２つ以上の引き続くステップで凍結乾燥リポソーム製剤を再構成し、すなわち、第１のステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の半分の体積を加えて混合し、第２のステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積のもう一方の半分を加えて混合することができる。いくつかの実施形態では、再構成は２つのステップを含み、第１のステップで、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の１の体積を加えて混合し、第２のステップで、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の２を加えて混合することができる。いくつかの実施形態では、再構成は３つのステップを含み、各ステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の１を加えて混合することができる。
【０３４０】
第１６の態様において、本発明は、上記で詳述した第１４の態様の方法により製造可能であるかまたは該方法により製造されたリポソーム製剤を提供する。
【０３４１】
第１７の態様において、本発明は、ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法であって、本発明の第１１の態様に関して上記で詳述したリポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを保持することを含む方法を提供する。
【０３４２】
第１７の態様の実施形態では、リポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを−８０℃〜４０℃の温度で保存し、すなわちリポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを、−８０℃、−７５℃、−７０℃、−６５℃、−６０℃、−５５℃、−５０℃、−４５℃、−４０℃、−３５℃、−３０℃、−２５℃、−２０℃、−１５℃、−１０℃、−５℃、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃または４０℃の温度で保存する。第６の態様の実施形態では、リポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを、−２０℃〜２５℃または−１０℃〜１０℃の温度で保存し、特に５℃で保存する。
【０３４３】
第１７の態様の実施形態では、リポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを最長で６カ月間の期間にわたって保存し、すなわちリポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを最長で６カ月間、最長で５カ月間、最長で４カ月間、最長で３カ月間、最長で２カ月間、最長で１カ月間、最長で３週間、最長で２週間、最長で１週間、最長で６日間、最長で５日間、最長で４日間、最長で３日間、最長で２日間、最長で１日間の期間にわたって保存する。第６の態様の実施形態では、リポソーム製剤中でＣＤ−ＲＡＰを最長で３カ月間保存し、特に最長で１カ月間保存する。
【０３４４】
特に、ＣＤ−ＲＡＰを、上記の期間にわたって実質的に凝集も変性も分解も生じさせずに保存する。
【０３４５】
第１８の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に関して上記で詳述したリポソーム製剤中のリポソームのサイズを低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法を提供する。
【０３４６】
第１８の態様の実施形態では、本方法は、
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）によって得られたリポソーム製剤と、ＣＤ−ＲＡＰを含有する組成物とを混合するステップ
をさらに含む。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、ステップａ）の有機溶媒は、クラス３の溶媒である。特にこの溶媒は、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、酢酸プロピルからなる群から選択され、より好ましくは１−プロパノールである。
【０３４８】
第１７の態様の実施形態では、ステップａ）の少なくとも１種の脂質は、グリセリド類、グリセロリン脂質類、グリセロホスフィノ脂質類、グリセロホスホノ脂質類、スルホ脂質類、スフィンゴ脂質類、リン脂質類、イソプレノイド類、ステロイド類、ステアリン類、ステロール類および炭水化物含有脂質からなる群から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスホイノシチド類、例えばホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスファート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスホスファート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリホスファート（ＰＩＰ３）、カルジオリピン、リゾリン脂質類およびコレステロールからなる群から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、２種の脂質類の組合せ物であり、特にリン脂質類とステロール類との組合せ物である。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、ホスファチジルコリンとコレステロールとの組合せ物である。
【０３４９】
第１８の態様の実施形態では、ステップａ）において、２種以上の脂質を有機溶媒に溶解させる。特定の実施形態では、脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとを有機溶媒に溶解させる。特に、脂質類と有機溶媒との比は、３：１である。
【０３５０】
さらなる実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０２〜０．４ｇ／ｍｌであり、すなわち溶媒中の全脂質濃度は、０．０２ｇ／ｍｌ、０．０３ｇ／ｍｌ、０．０４ｇ／ｍｌ、０．０５ｇ／ｍｌ、０．０６ｇ／ｍｌ、０．０７ｇ／ｍｌ、０．０８ｇ／ｍｌ、０．０９ｇ／ｍｌ、０．１０ｇ／ｍｌ、０．１１ｇ／ｍｌ、０．１２ｇ／ｍｌ、０．１３ｇ／ｍｌ、０．１４ｇ／ｍｌ、０．１５ｇ／ｍｌ、０．１６ｇ／ｍｌ、０．１７ｇ／ｍｌ、０．１８ｇ／ｍｌ、０．１９ｇ／ｍｌ、０．２ｇ／ｍｌ、０．２１ｇ／ｍｌ、０．２２ｇ／ｍｌ、０．２３ｇ／ｍｌ、０．２４ｇ／ｍｌ、０．２５ｇ／ｍｌ、０．２６ｇ／ｍｌ、０．２７ｇ／ｍｌ、０．２８ｇ／ｍｌ、０．２９ｇ／ｍｌ、０．３０ｇ／ｍｌ、０．３１ｇ／ｍｌ、０．３２ｇ／ｍｌ、０．３３ｇ／ｍｌ、０．３４ｇ／ｍｌ、０．３５ｇ／ｍｌ、０．３６ｇ／ｍｌ、０．３７ｇ／ｍｌ、０．３８ｇ／ｍｌ、０．３９ｇ／ｍｌまたは０．４ｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０３〜０．３ｇ／ｍｌ、０．０３〜０．１ｇ／ｍｌ、０．０３〜０．０５ｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０３３ｇ／ｍｌである。
【０３５１】
第１８の態様のさらなる実施形態では、ステップａ）における少なくとも１種の脂質に加えて、疎水性アスコルビン酸エステルを有機溶媒に溶解させる。特定の実施形態では、疎水性アスコルビン酸エステルは、アスコルビン酸パルミチン酸エステルである。
【０３５２】
さらなる実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９〜１：９９の比で存在し、すなわちアスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９、０．２：９９．８、０．３：９９．７、０．４：９９．６、０．５：９９．５、０．６：９９．４、０．７：９９．３、０．８：９９．２、０．９：９９．１または１．０：９９．０の比で存在する。特定の実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９の比で存在する。
【０３５３】
第１８の態様のさらなる実施形態では、ステップｂ）において、ａ）の混合物を１〜１０ｍｌ／分の速度で注入し、すなわちａ）の混合物を１ｍｌ／分、２ｍｌ／分、３ｍｌ／分、４ｍｌ／分、５ｍｌ／分、６ｍｌ／分、７ｍｌ／分、８ｍｌ／分、９ｍｌ／分または１０ｍｌ／分の速度で注入する。特定の実施形態では、混合物を５ｍｌ／分の速度で注入する。
【０３５４】
第１７の態様のさらなる実施形態では、水性相は、５００〜３０００ｍｌ／分の速度で循環し、すなわち水性相は、５００ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、７００ｍｌ／分、８００ｍｌ／分、９００ｍｌ／分、１０００ｍｌ／分、１１００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、１３００ｍｌ／分、１４００ｍｌ／分、１５００ｍｌ／分、１６００ｍｌ／分、１７００ｍｌ／分、１８００ｍｌ／分、１９００ｍｌ／分、２０００ｍｌ／分、２１００ｍｌ／分、２２００ｍｌ／分、２３００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、２５００ｍｌ／分、２６００ｍｌ／分、２７００ｍｌ／分、２８００ｍｌ／分、２９００ｍｌ／分または３０００ｍｌ／分の速度で循環する。特定の実施形態では、水性相は、１０００〜２５００ｍｌ／分、１５００〜２５００ｍｌ／分または２０００〜２５００ｍｌ／分の速度で循環する。特定の実施形態では、水性相は、２２００ｍｌ／分の速度で循環する。
【０３５５】
特定の実施形態では、水性相を、せん断誘導装置により循環させる。いくつかの実施形態では、せん断誘導装置は、スタティックミキサーまたは通常のスターラーである。特に、せん断誘導装置は、スタティックミキサーである。
【０３５６】
さらなる実施形態では、スタティックミキサーは１０〜１５ｍｍの内径を有し、すなわちスタティックミキサーは、１０ｍｍ、１１ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍまたは１５ｍｍの内径を有する。特定の実施形態では、スタティックミキサーは、１２〜１３ｍｍの内径を有し、すなわちスタティックミキサーは、１２．０ｍｍ、１２．１ｍｍ、１２．２ｍｍ、１２．３ｍｍ、１２．４ｍｍ、１２．５ｍｍ、１２．６ｍｍ、１２．７ｍｍ、１２．８ｍｍ、１２．９ｍｍまたは１３．０ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態では、スタティックミキサーは、最終体積が１５０〜３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適しており、すなわちスタティックミキサーは、最終体積が１５０ｍｌ、１６０ｍｌ、１７０ｍｌ、１８０ｍｌ、１９０ｍｌ、２００ｍｌ、２１０ｍｌ、２２０ｍｌ、２３０ｍｌ、２４０ｍｌ、２５０ｍｌ、２６０ｍｌ、２７０ｍｌ、２８０ｍｌ、２９０ｍｌまたは３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適している。特に、スタティックミキサーは、最終体積が１７０〜３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適しており、特に最終体積が２００〜２５０ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適している。したがって、特定の実施形態では、スタティックミキサーの内径と混合されるリポソーム製剤の体積との比は、該リポソーム製剤１５ｍｌあたりの内径が０．７ｍｍ〜１ｍｍとなる比であり、すなわち該リポソーム製剤１５ｍｌあたりの内径が０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍまたは１．０ｍｍとなる比である。
【０３５７】
特定の実施形態では、ステップｂ）において、ａ）の混合物をせん断誘導装置の手前で注入する。特定の実施形態では、ａ）の混合物をスタティックミキサーの手前で注入する。
【０３５８】
さらなる実施形態では、溶媒を、ステップｃ）において、ろ過を用いて、特にタンジェンシャルフローろ過を用いて除去する。
【０３５９】
さらなる実施形態では、ステップｄ）で混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１〜１０ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有し、すなわちステップｄ）で混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。特定の実施形態では、組成物は、２〜９ｍｇ／ｍｌ、３〜８ｍｇ／ｍｌ、４〜８ｍｇ／ｍｌ、５〜８ｍｇ／ｍｌまたは６〜８ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。特定の実施形態では、組成物は、７ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。さらなる実施形態では、ステップｄ）において混合されるＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述したアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーに含まれる。
【０３６０】
さらなる実施形態では、リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１または１．５：１である。特定の実施形態では、リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は１．２：１である。
【０３６１】
第１８の態様の実施形態では、本方法は、
ｅ）  前記リポソーム製剤を凍結乾燥するステップ
をさらに含む。
【０３６２】
第１８の態様の実施形態では、本方法は、
ｆ）  前記凍結乾燥リポソーム製剤を、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファー中で再構成するステップ
を含む。いくつかの実施形態では、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積を１度に加えて混合することにより、凍結乾燥リポソーム製剤を単一のステップで再構成する。いくつかの実施形態では、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の複数の部分を２つ以上の引き続くステップで加えることにより、２つ以上の引き続くステップで凍結乾燥リポソーム製剤を再構成し、すなわち、第１のステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の半分の体積を加えて混合し、第２のステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積のもう一方の半分を加えて混合することができる。いくつかの実施形態では、再構成は２つのステップを含み、第１のステップで、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の１の体積を加えて混合し、第２のステップで、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の２を加えて混合することができる。いくつかの実施形態では、再構成は３つのステップを含み、各ステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の１を加えて混合することができる。
【０３６３】
第１９の態様において、本発明は、リポソーム製剤の多分散度を低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法を提供する。
【０３６４】
第１９の態様の実施形態では、本方法は、
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）によって得られたリポソーム製剤と、ＣＤ−ＲＡＰを含有する組成物とを混合するステップ
をさらに含む。その際、予め形成されたリポソームにＣＤ−ＲＡＰを加える。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、ステップａ）の有機溶媒は、クラス３の溶媒である。特にこの溶媒は、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、酢酸プロピルからなる群から選択され、より好ましくは１−プロパノールである。
【０３６６】
第１９の態様の実施形態では、ステップａ）の少なくとも１種の脂質は、グリセリド類、グリセロリン脂質類、グリセロホスフィノ脂質類、グリセロホスホノ脂質類、スルホ脂質類、スフィンゴ脂質類、リン脂質類、イソプレノイド類、ステロイド類、ステアリン類、ステロール類および炭水化物含有脂質からなる群から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスホイノシチド類、例えばホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスファート（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスホスファート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリホスファート（ＰＩＰ３）、カルジオリピン、リゾリン脂質類およびコレステロールからなる群から選択される。特定の実施形態では、この少なくとも１種の脂質は、２種の脂質類の組合せ物であり、特にホスファチジルコリンとコレステロールとの組合せ物である。
【０３６７】
第１９の態様の実施形態では、ステップａ）において、２種以上の脂質を有機溶媒に溶解させる。特定の実施形態では、脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとを有機溶媒に溶解させる。特に、脂質類と有機溶媒との比は、３：１である。
【０３６８】
さらなる実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０２〜０．４ｇ／ｍｌであり、すなわち溶媒中の全脂質濃度は、０．０２ｇ／ｍｌ、０．０３ｇ／ｍｌ、０．０４ｇ／ｍｌ、０．０５ｇ／ｍｌ、０．０６ｇ／ｍｌ、０．０７ｇ／ｍｌ、０．０８ｇ／ｍｌ、０．０９ｇ／ｍｌ、０．１０ｇ／ｍｌ、０．１１ｇ／ｍｌ、０．１２ｇ／ｍｌ、０．１３ｇ／ｍｌ、０．１４ｇ／ｍｌ、０．１５ｇ／ｍｌ、０．１６ｇ／ｍｌ、０．１７ｇ／ｍｌ、０．１８ｇ／ｍｌ、０．１９ｇ／ｍｌ、０．２ｇ／ｍｌ、０．２１ｇ／ｍｌ、０．２２ｇ／ｍｌ、０．２３ｇ／ｍｌ、０．２４ｇ／ｍｌ、０．２５ｇ／ｍｌ、０．２６ｇ／ｍｌ、０．２７ｇ／ｍｌ、０．２８ｇ／ｍｌ、０．２９ｇ／ｍｌ、０．３０ｇ／ｍｌ、０．３１ｇ／ｍｌ、０．３２ｇ／ｍｌ、０．３３ｇ／ｍｌ、０．３４ｇ／ｍｌ、０．３５ｇ／ｍｌ、０．３６ｇ／ｍｌ、０．３７ｇ／ｍｌ、０．３８ｇ／ｍｌ、０．３９ｇ／ｍｌまたは０．４ｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０３〜０．３ｇ／ｍｌ、０．０３〜０．１ｇ／ｍｌ、０．０３〜０．０５ｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、溶媒中の全脂質濃度は、０．０３３ｇ／ｍｌである。
【０３６９】
第１９の態様のさらなる実施形態では、ステップａ）における少なくとも１種の脂質に加えて、疎水性アスコルビン酸エステルを有機溶媒に溶解させる。特定の実施形態では、疎水性アスコルビン酸エステルは、アスコルビン酸パルミチン酸エステルである。
【０３７０】
さらなる実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９〜１：９９の比で存在し、すなわちアスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９、０．２：９９．８、０．３：９９．７、０．４：９９．６、０．５：９９．５、０．６：９９．４、０．７：９９．３、０．８：９９．２、０．９：９９．１または１．０：９９．０の比で存在する。特定の実施形態では、アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９の比で存在する。
【０３７１】
第１９の態様のさらなる実施形態では、ステップｂ）において、ａ）の混合物を１〜１０ｍｌ／分の速度で注入し、すなわちａ）の混合物を１ｍｌ／分、２ｍｌ／分、３ｍｌ／分、４ｍｌ／分、５ｍｌ／分、６ｍｌ／分、７ｍｌ／分、８ｍｌ／分、９ｍｌ／分または１０ｍｌ／分の速度で注入する。特定の実施形態では、混合物を５ｍｌ／分の速度で注入する。
【０３７２】
第１９の態様のさらなる実施形態では、水性相は、５００〜３０００ｍｌ／分の速度で循環し、すなわち水性相は、５００ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、７００ｍｌ／分、８００ｍｌ／分、９００ｍｌ／分、１０００ｍｌ／分、１１００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、１３００ｍｌ／分、１４００ｍｌ／分、１５００ｍｌ／分、１６００ｍｌ／分、１７００ｍｌ／分、１８００ｍｌ／分、１９００ｍｌ／分、２０００ｍｌ／分、２１００ｍｌ／分、２２００ｍｌ／分、２３００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、２５００ｍｌ／分、２６００ｍｌ／分、２７００ｍｌ／分、２８００ｍｌ／分、２９００ｍｌ／分または３０００ｍｌ／分の速度で循環する。特定の実施形態では、水性相は、１０００〜２５００ｍｌ／分、１５００〜２５００ｍｌ／分または２０００〜２５００ｍｌ／分の速度で循環する。特定の実施形態では、水性相は、２２００ｍｌ／分の速度で循環する。
【０３７３】
特定の実施形態では、水性相を、せん断誘導装置により循環させる。いくつかの実施形態では、せん断誘導装置は、スタティックミキサーまたは通常のスターラーである。特に、せん断誘導装置は、スタティックミキサーである。いくつかの実施形態では、スタティックミキサーは１０〜１５ｍｍの内径を有し、すなわちスタティックミキサーは、１０ｍｍ、１１ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍまたは１５ｍｍの内径を有する。特定の実施形態では、スタティックミキサーは、１２〜１３ｍｍの内径を有し、すなわちスタティックミキサーは、１２．０ｍｍ、１２．１ｍｍ、１２．２ｍｍ、１２．３ｍｍ、１２．４ｍｍ、１２．５ｍｍ、１２．６ｍｍ、１２．７ｍｍ、１２．８ｍｍ、１２．９ｍｍまたは１３．０ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態では、スタティックミキサーは、最終体積が１５０〜３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適しており、すなわちスタティックミキサーは、最終体積が１５０ｍｌ、１６０ｍｌ、１７０ｍｌ、１８０ｍｌ、１９０ｍｌ、２００ｍｌ、２１０ｍｌ、２２０ｍｌ、２３０ｍｌ、２４０ｍｌ、２５０ｍｌ、２６０ｍｌ、２７０ｍｌ、２８０ｍｌ、２９０ｍｌまたは３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適している。特に、スタティックミキサーは、最終体積が１７０〜３００ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適しており、特に最終体積が２００〜２５０ｍｌであるリポソーム製剤の混合に適している。したがって、特定の実施形態では、スタティックミキサーの内径と混合されるリポソーム製剤の体積との比は、該リポソーム製剤１５ｍｌあたりの内径が０．７ｍｍ〜１ｍｍとなる比であり、すなわち該リポソーム製剤１５ｍｌあたりの内径が０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍまたは１．０ｍｍとなる比である。特定の実施形態では、ステップｂ）において、ａ）の混合物をせん断誘導装置の手前で注入する。特定の実施形態では、ａ）の混合物をスタティックミキサーの手前で注入する。
【０３７４】
さらなる実施形態では、ステップｃ）において、ろ過を用いて、特にタンジェンシャルフローろ過を用いて溶媒を除去する。
【０３７５】
さらなる実施形態では、ステップｄ）で混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１〜１０ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有し、すなわちステップｄ）で混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。特定の実施形態では、組成物は、２〜９ｍｇ／ｍｌ、３〜８ｍｇ／ｍｌ、４〜８ｍｇ／ｍｌ、５〜８ｍｇ／ｍｌまたは６〜８ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。特定の実施形態では、組成物は、７ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを含有する。さらなる実施形態では、ステップｄ）において混合されるＣＤ−ＲＡＰは、上記で詳述したアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーに含まれる。
【０３７６】
さらなる実施形態では、リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１または１．５：１である。特定の実施形態では、リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は１．２：１である。
【０３７７】
第１９の態様の実施形態では、本方法は、
ｅ）  前記リポソーム製剤を凍結乾燥するステップ
をさらに含む。
【０３７８】
第１９の態様の実施形態では、本方法は、
ｆ）  前記凍結乾燥リポソーム製剤を、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファー中で再構成するステップ
を含む。いくつかの実施形態では、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積を１度に加えて混合することにより、凍結乾燥リポソーム製剤を単一のステップで再構成する。いくつかの実施形態では、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の複数の部分を２つ以上の引き続くステップで加えることにより、２つ以上の引き続くステップで凍結乾燥リポソーム製剤を再構成し、すなわち、第１のステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の半分の体積を加えて混合し、第２のステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積のもう一方の半分を加えて混合することができる。いくつかの実施形態では、再構成は２つのステップを含み、第１のステップで、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の１の体積を加えて混合し、第２のステップで、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の２を加えて混合することができる。いくつかの実施形態では、再構成は３つのステップを含み、各ステップでアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーの全再構成体積の３分の１を加えて混合することができる。
【０３７９】
本発明により、特に以下の実施形態が提供される：
１．  以下：
ａ）  そのＣ末端に切断部位を含むプレ配列と、
ｂ）  （特に配列番号１もしくはその多様体による）ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と
を含む、ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質。
【０３８０】
２．  前記プレ配列は、ＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを妨害せず、特にフォールディング前にプレ配列を除去する必要はない、態様１の前駆体タンパク質。
【０３８１】
３．  前記プレ配列は、ＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを改善する、態様１または２の前駆体タンパク質。
【０３８２】
４．  前記プレ配列は、５〜５０のアミノ酸の長さを有し、特に７〜３３のアミノ酸の長さを有する、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３８３】
５．  前記プレ配列は、アフィニティータグを含み、特にポリＨｉｓタグを含む、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３８４】
６．  プレ配列が有するハイドロパシーの総平均は、ＣＤ−ＲＡＰが有するハイドロパシーの総平均よりも低い、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３８５】
７．  前記前駆体タンパク質が有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．０３未満であり、かつ／または前記プレ配列が有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによるハイドロパシーの総平均（ＧＲＡＶＹ）は、−０．２未満である、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３８６】
８．  前記切断部位は、酵素切断部位であり、特にエンドペプチダーゼ切断部位であり、特にエンテロキナーゼ切断部位であるか、または混合求核体スーパーファミリーＡ（ＰＡ  ｃｌａｎ）プロテアーゼ切断部位であり、特にＲアミノ酸またはＫアミノ酸である、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３８７】
９．  前記エンドペプチダーゼは、システインプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼからなる群から選択され、好ましくはトリプシンまたはキモトリプシンであり、より好ましくはトリプシンである、態様８の前駆体タンパク質。
【０３８８】
１０．  前記プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＸ１Ｔ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧＮ、ＭＡＴＴＸ１ＴＧＮＳまたはＭＡＴＴＸ１ＴＧＮＳＡを含み、ここで、Ｘ１は、ＬまたはＳである、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３８９】
１１．  前記プレ配列は、そのＮ末端にアミノ酸ＭＡＴＴＳＴ、ＭＡＴＴＳＴＧ、ＭＡＴＴＳＴＧＮ、ＭＡＴＴＳＴＧＮＳもしくはＭＡＴＴＳＴＧＮＳＡまたはそれらの多様体を含む、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３９０】
１２．  前記プレ配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１８、配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列もしくはその多様体を含むか、または該アミノ酸配列もしくはその多様体からなる、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３９１】
１３．  前記前駆体タンパク質は、配列番号２０によるアミノ酸配列もしくはその多様体を含むか、または該アミノ酸配列もしくはその多様体からなる、先行する態様のいずれかの前駆体タンパク質。
【０３９２】
１４．  態様１から１３までのいずれかの前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質をコードする核酸。
【０３９３】
１５．  態様１４の核酸を含有するベクター。
【０３９４】
１６．  態様１から１３までのいずれかの前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質、態様１４の核酸または態様１５のベクターを含む宿主細胞。
【０３９５】
１７．  前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である、態様１６の宿主細胞。
【０３９６】
１８．  前記宿主細胞は、細菌細胞であり、特に大腸菌細胞である、態様１６の宿主細胞。
【０３９７】
１９．  ネイティブＣＤ−ＲＡＰの製造方法であって、
ａ）  態様１から１３までのいずれかのＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質を提供するステップと、
ｂ）  前記プレ配列を除去してネイティブＣＤ−ＲＡＰを取得するステップと
を含む方法。
【０３９８】
２０．  以下：
ｃ）  前記ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質のフォールディングを行い、適宜、前記フォールディング済みのＣＤ−ＲＡＰを精製するステップと、
ｄ）  前記ネイティブＣＤ−ＲＡＰを精製するステップと
のうちの１つまたは複数をさらに含む、態様１９の方法。
【０３９９】
２１．  ステップａ）において提供される前記ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質は、その１次立体配座、２次立体配座または３次立体配座で存在する、態様１９または２０の方法。
【０４００】
２２．  ステップｂ）において前記プレ配列を除去する前かまたはその後に、特にステップｂ）において前記プレ配列を除去する前に、ステップｃ）においてＣＤ−ＲＡＰのフォールディングを行う、態様１９から２１までの方法。
【０４０１】
２３．  前記前駆体ＣＤ−ＲＡＰを、ステップａ）において生物工学的手段により、特に態様１７から１９までの宿主細胞から提供する、態様１９から２２までの方法。
【０４０２】
２４．  ステップｂ）において、前記プレ配列を、酵素による切断によって除去し、特にエンテロキナーゼによる切断によって、またはエンドペプチダーゼによる切断によって、特にトリプシンによる切断によって除去する、態様１９から２３までのいずれかの方法。
【０４０３】
２５．  前記タンパク質分解酵素、特にトリプシンと前記前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質との比は、タンパク質１ｍｇあたり酵素が０．５〜１．５単位となる比である、態様２４の方法。
【０４０４】
２６．  ステップｂ）を、０．５〜２０時間にわたって行い、特に０．５〜１６時間にわたって行い、特に４〜７時間にわたって行う、態様１９から２７までのいずれかの方法。
【０４０５】
２７．  ステップｂ）を、ｐＨ７〜９で行い、特にｐＨ８〜８．５で行い、特にｐＨ８．３で行う、態様１９から２６までのいずれかの方法。
【０４０６】
２８．  ステップｂ）を、５〜４０℃の温度で行い、特に２０〜２５℃の温度で行う、態様１９から２７までのいずれかの方法。
【０４０７】
２９．  ステップｃ）を、ステップａ）の後でかつステップｂ）の前に行う、態様２０から２９までのいずれかの方法。
【０４０８】
３０．  ステップｃ）は、
（ｉ）  前駆体ＣＤ−ＲＡＰタンパク質を変性バッファー中でインキュベートするステップと、
（ｉｉ）  前記ステップ（ｉ）で得られた溶液をフォールディングバッファーに加えるステップと
を含む、態様１９から２９までのいずれかの方法。
【０４０９】
３１．  前記変性バッファーは、ＤＴＴを特に１０ｍＭの濃度で含有する、態様３０の方法。
【０４１０】
３２．  前記フォールディングバッファーは、アルギニンを特に０．５〜１モル／ｍＬの濃度で含有し、特に０．７５モル／ｍＬの濃度で含有する、態様３０または３１の方法。
【０４１１】
３３．  前記ステップ（ｉ）で得られた溶液を、前記フォールディングバッファーに少量ずつ、特に１〜３時間の時間範囲にわたって加える、態様３０から３２までのいずれかの方法。
【０４１２】
３４．  前記ステップ（ｉ）で得られた溶液を、前記フォールディングバッファーに毎時０．５〜２体積％の速度で加え、特に毎時１．５体積％の速度で加える、態様３０から３２までのいずれかの方法。
【０４１３】
３５．  前記フォールディングステップｃ）を、５〜２５℃の温度で行い、特に１０℃で行う、態様３０から３４までのいずれかの方法。
【０４１４】
３６．  前記フォールディング済みの前駆体ＣＤ−ＲＡＰをクロマトグラフィーにより精製し、特にＨＩＣクロマトグラフィーまたはマルチモーダル（ＭＭ）クロマトグラフィーにより精製する、態様３０から３５までのいずれかの方法。
【０４１５】
３７．  前記ネイティブＣＤ−ＲＡＰをクロマトグラフィーにより精製し、特にイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはＨＩＣクロマトグラフィーにより精製する、態様３０から３６までのいずれかの方法。
【０４１６】
３８．  ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物であって、１０７のアミノ酸の長さを有する配列番号１の成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質を含有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物において、前記ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物中に存在する他のいずれかのＣＤ−ＲＡＰタンパク質に対する前記ＣＤ−ＲＡＰ（１０７ＡＡ）の比は、９９重量％以上である、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物。
【０４１７】
３９．  ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物であって、前記ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物は、１０７のアミノ酸の長さを有する配列番号１の成熟ＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰタンパク質（１０７ＡＡ）を含有するが、１０５のアミノ酸の長さを有する配列番号２１のＣＤ−ＲＡＰ配列を有するＣＤ−ＲＡＰ（１０５ＡＡ）を含有しない、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物。
【０４１８】
４０．  前記ＣＤ−ＲＡＰタンパク質は、４０℃以上の融解温度を示す、態様３８または３８のＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物。
【０４１９】
４１．  ＣＤ−ＲＡＰもしくはその多様体または態様３８から４１までのいずれかによるＣＤ−ＲＡＰタンパク質調製物と、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸と、バッファーとを含む、組成物。
【０４２０】
４２．  前記正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、ＣＤ−ＲＡＰの凝集を防止する、態様４１の組成物。
【０４２１】
４３．  前記正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジンおよびプロリンからなる群から選択される、態様４１または４２の組成物。
【０４２２】
４４．  前記バッファーは、ＣＤ−ＲＡＰの分解を防止する、態様４１から４３までのいずれかの組成物。
【０４２３】
４５．  前記バッファーは、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファーおよびトリスバッファーからなる群から選択される、態様４１から４４までのいずれかの組成物。
【０４２４】
４６．  糖類またはアミノ糖類をさらに含む、態様４１から４４までのいずれかの組成物。
【０４２５】
４７．  前記糖類は、単糖類、二糖類または三糖類であり、特にスクロース、マルトース、トレハロースまたはラフィノースである、態様４６の組成物。
【０４２６】
４８．  前記アミノ糖類は、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミンまたはノイラミン酸である、態様４６の組成物。
【０４２７】
４９．  アスコルビン酸および／またはグリシンを含有しない、態様４１から４８までのいずれかの組成物。
【０４２８】
５０．  アルギニンを５０〜５００ｍＭの濃度で含有し、特に１００〜３５０ｍＭの濃度で含有し、特に１００〜２００ｍＭの濃度で含有し、より具体的には２００ｍＭの濃度で含有する、態様４１から４９までのいずれかの組成物。
【０４２９】
５１．  ヒスチジンを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、特に１０〜５０ｍＭの濃度で含有し、特に２０〜５０ｍＭの濃度で含有し、より具体的には５０ｍＭの濃度で含有する、態様４１から５０までのいずれかの組成物。
【０４３０】
５２．  リン酸ナトリウムを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、特に１０〜５０ｍＭの濃度で含有し、特に２０〜５０ｍＭの濃度で含有し、より具体的には２０ｍＭの濃度で含有する、態様４１から５１までのいずれかの組成物。
【０４３１】
５３．  リン酸二水素ナトリウムを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、特に１０〜５０ｍＭの濃度で含有し、特に２０〜５０ｍＭの濃度で含有し、より具体的には２０ｍＭの濃度で含有する、態様４１から５２までのいずれかの組成物。
【０４３２】
５４．  クエン酸塩を５〜１００ｍＭの濃度で含有し、特に１０〜５０ｍＭの濃度で含有し、特に２０〜５０ｍＭの濃度で含有し、より具体的には２０ｍＭの濃度で含有する、態様４１から５３までのいずれかの組成物。
【０４３３】
５５．  スクロースを５〜１００ｍＭの濃度で含有し、特に１０〜５０ｍＭの濃度で含有し、特に２０〜５０ｍＭの濃度で含有し、より具体的には４５ｍＭの濃度で含有する、態様４１から５４までのいずれかの組成物。
【０４３４】
５６．  負に荷電したアミノ酸をさらに含有し、好ましくはグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される負に荷電したアミノ酸をさらに含有する、態様４１から５５までのいずれかの組成物。
【０４３５】
５７．  組合せ物は、アルギニンとグルタミン酸とを５０〜５００ｍＭの全濃度で含有し、特に１００〜３５０ｍＭの全濃度で含有し、特に１００〜２００ｍＭの全濃度で含有し、より具体的には２００ｍＭの全濃度で含有する、態様５６の組成物。
【０４３６】
５８．  アルギニンとグルタミン酸との、１：１の比での、特に１：１．２５の比での、特に１：１．５の比での、より具体的には１：２の比での組合せ物を含有する、態様５６または５７の組成物。
【０４３７】
５９．  前記組成物のｐＨ値は、５．５〜８．０であり、特に６．０〜７．５であり、特に６．０〜６．５であり、より具体的には６である、態様４１から５８までのいずれかの組成物。
【０４３８】
６０．  リン酸または塩化水素を用いて、特にリン酸を用いて前記組成物のｐＨ値が調整されている、態様５９の組成物。
【０４３９】
６１．  ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体の濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、特に２〜５ｍｇ／ｍｌである、態様４１から６０までのいずれかの組成物。
【０４４０】
６２．  ２ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体と、２０ｍＭのクエン酸塩と、２００ｍＭのアルギニンとを含有し、かつｐＨ値が６である、態様４１から６１までのいずれかの組成物。
【０４４１】
６３．  アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するための、態様４１から６２までのいずれかの組成物。
【０４４２】
６４．  静脈内および／または関節内の投与のための、態様４１から６０までのいずれかの組成物。
【０４４３】
６５．  態様４１から６４までのいずれかの組成物の製造方法であって、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するバッファーに、ＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を加えることを含む方法。
【０４４４】
６６．  ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法であって、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するバッファー中でＣＤ−ＲＡＰを保持することを含む方法。
【０４４５】
６７．  ＣＤ−ＲＡＰを−８０℃〜４０℃の温度で保存し、特に−２０℃〜２５℃の温度で保存し、特に−２０℃〜５℃の温度で保存する、態様６６の方法。
【０４４６】
６８．  ＣＤ−ＲＡＰを最長で６カ月間の期間にわたって保存し、特に最長で３カ月間の期間にわたって保存し、特に最長で１カ月間の期間にわたって保存する、態様６６または６７の方法。
【０４４７】
６９．  態様４１から６４までのいずれかの組成物を含有する、医薬品。
【０４４８】
７０．  封入されたＣＤ−ＲＡＰまたはその多様体を含むリポソームを含有する組成物であって、前記リポソームのサイズは、２００ｎｍ未満であり、特に１５０ｎｍ未満であり、特に１２０ｎｍ未満であり、特に１００ｎｍ未満である、組成物。
【０４４９】
７１．  全ＣＤ−ＲＡＰの２０％超が前記リポソームに封入されており、特に全ＣＤ−ＲＡＰの少なくとも３０％が前記リポソームに封入されており、特に全ＣＤ−ＲＡＰの少なくとも４０％が前記リポソームに封入されており、特に全ＣＤ−ＲＡＰの４０％〜８０％が前記リポソームに封入されている、態様７０の組成物。
【０４５０】
７２．  ＣＤ−ＲＡＰ対リポソームの比は、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５である、態様７０から７１までのいずれかの組成物。
【０４５１】
７３．  前記リポソームの多分散指数（ＰＤＩ）は、０．３未満であり、特に０．２未満であり、特に０．１５未満であり、特に０．１３２である、態様７０から７２までのいずれかの組成物。
【０４５２】
７４．  前記ＣＤ−ＲＡＰおよび前記リポソームは、正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸を含有するリン酸バッファーまたはクエン酸バッファー中に存在する、態様７０から７３までのいずれかの組成物。
【０４５３】
７５．  前記正に荷電した少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンからなる群から選択される、態様７４の組成物。
【０４５４】
７６．  ヒスチジンは、５０〜５００ｍＭの量で存在し、特に１００〜４００ｍＭの量で存在し、特に２０ｍＭの量で存在する、態様７５の組成物。
【０４５５】
７７．  前記クエン酸バッファー中のクエン酸の量は、１０〜１００ｍＭであり、特に１０〜５０ｍＭであり、特に２０ｍＭである、態様７４から７６までのいずれかの組成物。
【０４５６】
７８．  前記リポソームは、グリセリド類、グリセロリン脂質類、グリセロホスフィノ脂質類、グリセロホスホノ脂質類、スルホ脂質類、スフィンゴ脂質類、リン脂質類、イソプレノイド類、ステロイド類、ステアリン類、ステロール類および炭水化物含有脂質からなる群から選択される脂質類から構成され、特にホスファチジルコリンおよびコレステロールから構成される、態様７０から７７までのいずれかの組成物。
【０４５７】
７９．  前記脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとは、７４．８：２５．１の比で存在する、態様７８の組成物。
【０４５８】
８０．  前記リポソームは、疎水性アスコルビン酸エステルをさらに含有し、特にアスコルビン酸パルミチン酸エステルをさらに含有する、態様７８または７９の組成物。
【０４５９】
８１．  前記アスコルビン酸エステルは、リン脂質類およびステロール類の量に対して０．１：９９．９の比で存在する、態様７８から８０までのいずれかの組成物。
【０４６０】
８２．  アグリカンの分解および／または軟骨への水の流入の増加および／またはＣＤ−ＲＡＰ発現の低減に苦しむ患者における軟骨の疾患または損傷を治療および／または予防する方法において使用するための、態様７０から８１までのいずれかの組成物。
【０４６１】
８３．  関節内投与のための、態様７０から８２までのいずれかの組成物。
【０４６２】
８４．  態様７０から８３までのいずれかの組成物を含有する、医薬品。
【０４６３】
８５．  リポソーム製剤の製造方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法。
【０４６４】
８６．  以下：
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）によって得られたリポソーム製剤と、ＣＤ−ＲＡＰを含有する組成物とを混合するステップ
をさらに含む、態様８５の方法。その際、予め形成されたリポソームにＣＤ−ＲＡＰを加える。
【０４６５】
８７．  前記有機溶媒は、クラス３の溶媒であり、好ましくは、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、酢酸プロピルからなる群から選択され、より好ましくは１−プロパノールである、態様８５または８６の方法。
【０４６６】
８８．  前記少なくとも１種の脂質は、グリセリド類、グリセロリン脂質類、グリセロホスフィノ脂質類、グリセロホスホノ脂質類、スルホ脂質類、スフィンゴ脂質類、リン脂質類、イソプレノイド類、ステロイド類、ステアリン類、ステロール類および炭水化物含有脂質からなる群から選択され、特にホスファチジルコリンおよびコレステロールである、態様８５から８７までのいずれかの方法。
【０４６７】
８９．  ステップａ）において、２種以上の脂質を前記有機溶媒に溶解させる、態様８５から８８までのいずれかの方法。
【０４６８】
９０．  前記脂質であるホスファチジルコリンとコレステロールとを、前記有機溶媒に特に３：１の比で溶解させる、態様８９の方法。
【０４６９】
９１．  前記溶媒中の全脂質濃度は、０．０２〜０．４ｇ／ｍｌであり、特に０．０３〜０．３ｇ／ｍｌであり、特に０．０３３ｇ／ｍｌである、態様８５から９０までのいずれかの方法。
【０４７０】
９２．  ステップａ）における少なくとも１種の脂質に加えて、疎水性アスコルビン酸エステルを前記有機溶媒に溶解させ、特にアスコルビン酸パルミチン酸エステルを前記有機溶媒に溶解させる、態様８５から９１までのいずれかの方法。
【０４７１】
９３．  前記アスコルビン酸エステルは、前記少なくとも１種の脂質に対して０．１：９９．９の比で存在する、態様９２の方法。
【０４７２】
９４．  ステップｂ）において、ａ）の混合物を１〜１０ｍｌ／分の速度で注入し、特に５ｍｌ／分の速度で注入する、態様８５から９３までのいずれかの方法。
【０４７３】
９５．  前記水性相は、５００〜３０００ｍｌ／分の速度で循環し、特に１０００〜２５００ｍｌ／分の速度で循環し、特に２２００ｍｌ／分の速度で循環する、態様８５から９４までのいずれかの方法。
【０４７４】
９６．  前記水性相を、せん断誘導装置により循環させ、特にスタティックミキサーにより循環させ、特に１０〜１５ｃｍの直径を有するスタティックミキサーにより循環させ、特に１２．６ｃｍの直径を有するスタティックミキサーにより循環させる、態様８５から９５までのいずれかの方法。
【０４７５】
９７．  ステップｂ）において、ａ）の混合物をせん断誘導装置の手前で注入し、特にスタティックミキサーの手前で注入する、態様８５から９６までのいずれかの方法。
【０４７６】
９８．  前記溶媒を、ステップｃ）においてろ過を用いて除去し、特にタンジェンシャルフローろ過を用いて除去する、態様８５から９７までのいずれかの方法。
【０４７７】
９９．  ステップｄ）において混合されるＣＤ−ＲＡＰの組成物は、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、特に７ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰを、特にアルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファー中に含有する、態様８５から９８までのいずれかの方法。
【０４７８】
１００．  前記リポソーム製剤とＣＤ−ＲＡＰとの比は、１．２：１である、態様９９の方法。
【０４７９】
１０１．  以下：
ｅ）  前記リポソーム製剤を凍結乾燥するステップ
をさらに含む、態様８５から１００までのいずれかの方法。
【０４８０】
１０２．  以下：
ｆ）  前記凍結乾燥リポソーム製剤を、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファー中で再構成するステップ
をさらに含む、態様１０１の方法。
【０４８１】
１０３．  態様８５から１０２までのいずれかの方法により製造可能であるリポソーム製剤。
【０４８２】
１０４．  ＣＤ−ＲＡＰを保存する方法であって、態様７０から８３までのいずれかに記載のリポソーム組成物中でＣＤ−ＲＡＰを保持することを含む方法。
【０４８３】
１０５．  ＣＤ−ＲＡＰを−８０℃〜４０℃の温度で保存し、特に−２０℃〜２５℃の温度で保存し、特に５℃で保存する、態様１０４の方法。
【０４８４】
１０６．  ＣＤ−ＲＡＰを最長で６カ月間の期間にわたって保存し、特に最長で３カ月間の期間にわたって保存し、特に最長で１カ月間の期間にわたって保存する、態様１０４または１０５の方法。
【０４８５】
１０７．  リポソーム製剤中のリポソームのサイズを低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法。
【０４８６】
１０８．  リポソーム製剤の多分散度を低下させる方法であって、
ａ）  少なくとも１種の脂質を有機溶媒に溶解させるステップと、
ｂ）  ステップａ）の前記混合物を循環水性相に注入するステップと、
ｃ）  前記溶媒を除去するステップと
を含む方法。
【０４８７】
本発明を、実施例および図面においてより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものと理解されるべきではない。
【０４８８】
実施例
例１：ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質の製造および単離
プレ配列を含む軟骨由来レチノイン酸タンパク質ＣＤ−ＲＡＰの以下の構築物を設計する：
【表５】
2018527030.tif 000006
【０４８９】
ａ）  発現
大腸菌ＢＬ２１型株を使用した。この大腸菌ＢＬ２１型株は、上記の（すなわち、それぞれのプレ配列と配列番号１によるＣＤ−ＲＡＰの配列とを含む）ＣＤ−ＲＡＰ前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列とアンピシリン耐性とを含むｐＥＴ−５２ｂ−ＩＩプラスミドを含有していた。この菌株を、ＬＢ中の予備培養物内と、最少培地を入れた３７℃、ｐＨ７．０の発酵槽内のグルコース供給済みの主培養物内とで培養した。
【０４９０】
ｂ）  細胞溶解、溶解およびプレＣＤ−ＲＡＰの捕捉
上述の細胞を収穫し、フレンチプレスで２回溶解させ、封入体内の融合タンパク質を含有する溶解物を水で２回洗浄し、遠心分離した。
【０４９１】
変性のために、約２７ｇ／Ｌのこの融合タンパク質２８．５ｇをビーカーに入れ、次いで６ＭのＧｕａ−ＨＣｌと、２ｍＭのＥＤＴＡと、１０ｍＭのＤＴＴと、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌとのｐＨ８．３の混合物を加え、これを周囲温度で２時間撹拌した。この溶液は、暗褐色で、多少混濁していた。
【０４９２】
ｃ）  プレＣＤ−ＲＡＰのフォールディング
リフォールディングステップのために、０．７５Ｍのアルギニンと、１ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭの還元型グルタチオンと、０．５ｍＭの酸化型グルタチオンとのｐＨ８．３の混合物を調製した。この混合物に、変性させたプレＣＤ−ＲＡＰを含有する溶液をゆっくりと注ぎ、次いでこれを周囲温度で１６時間撹拌した。０．６１ｇ／Ｌのフォールディング済みのプレＣＤ−ＲＡＰが得られた。
【０４９３】
ｄ）  プレＣＤ−ＲＡＰの捕捉
導電率が８０ｍＳ／ｃｍに達するまで、硫酸アンモニウムを加えた。深層ろ過と、０．２μｍのろ過とを行った。捕捉ステップ自体は、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより行った。カラムの直径は２．６ｃｍであり、このカラムに高さ２６ｃｍまで吸着剤Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０（東ソー社）を充填した。このカラムに、ろ液０．９０Ｌを付与した。平衡バッファーは、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＮａＨＰＯ４／０．５ＭのＮＨ４ＳＯ４を含有する水であり、溶出バッファーは、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＮａＨＰＯ４を含有する水であった。溶出体積を、複数の画分に集めた。プレＣＤ−ＲＡＰを含有するこれらの画分を合したところ、このプールの体積は、０．３５Ｌであった。このプールにおけるプレＣＤ−ＲＡＰの濃度は、０．７０ｇ／Ｌであった。キャプチャークロマトグラフィー後の収率は、４７％であった。
【０４９４】
ｅ）  プレ配列の除去
ＨＩクロマトグラフィーの溶出液（ｐＨ４．５の酢酸Ｎａ）をＮａＯＨによりｐＨ８．３に調整し、この中で酵素による切断を行った。この切断には、大腸菌で組換えにより製造したエンドプロテアーゼトリプシン（ブタトリプシン）を使用した。（中にプレＣＤ−ＲＡＰＡＰが溶解している）キャプチャークロマトグラフィー溶出液のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．３に調整し、この中で上述の切断を行った。タンパク質１ｍｇあたりの酵素を１単位とすることを目的として、この溶液に１６４μＬのトリプシン溶液を加えた。この溶液を、周囲温度で１６時間撹拌した。
【０４９５】
この切断をＨＰＬＣクロマトグラフィーにより評価したところ、ＣＤ−ＲＡＰとは別のピークが示された（図２参照）。
【０４９６】
プレ配列の長さに応じて様々な全濃度のネイティブＣＤ−ＲＡＰが得られたが、その際、ＣＤ−ＲＡＰ構築物に含まれるプレ配列が長いほど、こうしたＣＤ−ＲＡＰ構築物から得られる収量が高かった（図３および図４参照）。
【０４９７】
例２：切断パラメーター
前駆体ＣＤ−ＲＡＰの切断に最適なパラメーター設定を見出すために、以下のパラメーターを調べた：
ａ）  酵素濃度
切断とトリプシン濃度との相関関係を調べるために、試験を行って、様々なトリプシン濃度での切断をモニタリングした。
【０４９８】
既知の濃度４４１．８ｍｇ／ＬのプレＣＤ−ＲＡＰを、ＮａＯＨによりｐＨ４．１からｐＨ８．３に調整して使用した。次いでこの溶液を１０個の部分に分け、これらを周囲温度（２３〜２５℃）で振とうした。各部分に異なる量のトリプシン（５０Ｕ／Ｌ、１００Ｕ／Ｌ、１５０Ｕ／Ｌ、２００Ｕ／Ｌ、２５０Ｕ／Ｌ、３００Ｕ／Ｌ、４００Ｕ／Ｌ、６００Ｕ／Ｌ、１０００Ｕ／Ｌまたは２０００Ｕ／Ｌ）を加え、サンプルを採取して、ＨＰＬＣにより切断をモニタリングした。結果を図５に示す。
【０４９９】
ｂ）  ｐＨ値
濃度２５０Ｕ／ｍＬのトリプシン（トリプシン溶液の初期活性値９６１５Ｕ／ｍＬを用いて算出）と、０．２４ｇ／ＬのプレＣＤ−ＲＡＰ含分とを用いて、ｐＨ値が切断に及ぼす影響を調べた。この溶液の９つの部分を、ＨＣｌおよびＮａＯＨにより、ｐＨ３、４、５、６、７、８、９、１０および１１に調整した。この切断物を、ファルコンチューブ内で２５℃で撹拌した。ＨＰＬＣによる試験のために、様々な間隔でサンプルを採取した。図６に、様々なｐＨ値でのプレＣＤ−ＲＡＰ含分（ＨＰＬＣピーク面積として表される）の減少を示す。この切断はｐＨ５以下では作用せず、ｐＨ６では切断は生じるがゆっくりであることが見てとれる。ｐＨ８．３以上ではこの切断は速いが、ＣＤ−ＲＡＰの量は、最大値をとった後に低下する。これは、おそらくトリプシンによるＣＤ−ＲＡＰの消化が原因であり、これは、トリプシン切断部位の露出によって起こりうる。これらのトリプシン切断部位は、ｐＨ値が比較的低い場合にはタンパク質の立体構造の内部に隠れている。結論として、切断ステップのｐＨは７〜８が理想的であると言える。切断を比較的短時間で行うことが望ましい場合には、約８．０〜８．３のｐＨが好ましいが、この場合には、トリプシンを１０時間以内に除去するように留意すべきである。そうしないと、ＣＤ−ＲＡＰが消化されてしまう可能性がある。この切断を比較的長時間にわたって行うことが望ましい場合には、ｐＨ値を７．０とし、２０時間後にトリプシンを除去することが好ましい。
【０５００】
ｃ）  温度
温度がトリプシン切断に及ぼす影響を試験した。同一のプレＣＤ−ＲＡＰ溶液を使用し、溶液１ｍＬあたり１．２５単位のトリプシンを付与した。唯一変動させたものは温度であり、５℃刻みで５℃から４０℃まで変更した。この試験を、温度調節可能なシェーカーにおいて２．０ｍＬチューブ内で行った。切断の進行を、ＨＰＬＣによって様々な時間間隔でモニタリングした。結果を以下の図に示す。図７は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプレＣＤ−ＲＡＰピークの面積の減少を示す。いずれの温度でも減少が生じる（しかしこの減少は、例えば沈殿などの他の理由によっても生じることがある）。この減少は、温度が高いほど速くなる。比較的高温では、約２４時間後にプレＣＤ−ＲＡＰの完全な消失が認められたが、低温では、２倍の時間が経過した後にも、プレＣＤ−ＲＡＰのある程度の残留が持続するようである。総括すると、適用した条件では、比較的低温の方が収率が高いが、こうした収率に達するまでには比較的長い時間を要するようである。このデータの結果から、２０〜２５℃の切断温度が良好な作業範囲であると考えられる。
【０５０１】
例３：様々なＣＤ−ＲＡＰ構築物の安定性
その１次配列およびその処方が異なる様々なｒｈＣＤ−ＲＡＰ構築物について、その熱安定性およびストレス安定性に関して物理化学的に特性決定を行った。
【０５０２】
【表６】
2018527030.tif 000007
【０５０３】
異なるｒｈＣＤ−ＲＡＰ構築物の作用を識別するために、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）による融解点の測定を行った。この測定では、Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅの存在下でのタンパク質の変性過程で蛍光強度を温度に対して記録する。タンパク質のアンフォールディングによって疎水性パッチが露出し、これらのパッチに結合した色素分子によって、６１０ｎｍの強い蛍光が放出される。タンパク質のアンフォールディングの程度を、ＨＥＸチャネルによってモニタリングする。このＨＥＸチャネルでは、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅとアンフォールディングしたタンパク質との複合体のスペクトル特性を捉える（励起５１５〜５３５ｎｍ、発光５６０〜５８０ｎｍ）。
【０５０４】
様々なｒｈＣＤ−ＲＡＰ構築物のサンプルを、２つのバッファー系（透析チャンバ：Ｄ−ｔｕｂｅ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ  Ｍｉｄｉ、ＭＷＣＯ  ６〜８ｋＤａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｎｏ．７１５０７−３）内で一晩透析し、対応するバッファーで希釈することにより濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに固定した。
【０５０５】
バッファー調製：
３５０ｍＭのＬ−アルギニンリン酸塩、ｐＨ７．５
１２１．９４ｇのＬ−アルギニンを約１．８Ｌの水で希釈し、８５％のリン酸でｐＨを７．５に調整し、純水で満たして、最終体積を２Ｌとした。
【０５０６】
２００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５
６９．６８ｇのＬ−アルギニンと１５．６０ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏとを、約１．８Ｌの水に希釈し、８５％のリン酸でｐＨを７．５に調整し、純水で満たして、最終体積を２Ｌとした。
【０５０７】
各バッファーを、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ色素と混合した（２μＬの色素＋４８μＬのバッファー＝２００×Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ）。各ｒｈＣＤ−ＲＡＰサンプル（１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＣＤ−ＲＡＰ）を希釈して終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬとし、これらそれぞれに、１０倍濃度のＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅを用いて３つの複製物を準備した。
【０５０８】
すべてのサンプルについて、３つの複製物をそれぞれ用いて１度に測定を行った。リアルタイムＰＣＲ検出システムＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、タンパク質を、２５℃〜９５℃の温度勾配で１℃刻みで３０秒の保持間隔でインキュベートした。タンパク質のアンフォールディングの程度を、ＨＥＸチャネルによってモニタリングする。このＨＥＸチャネルでは、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅとアンフォールドタンパク質との複合体のスペクトル特性を捉える（励起５１５〜５３５ｎｍ、発光５６０〜５８０ｎｍ）。ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによりデータを分析し、１次導関数スペクトルを用いて融解温度を求めた。
【０５０９】
驚くべきことに、生成物ＣＭＣ−Ｂ−００５２では、５３℃という著しくより低い融解温度が検出されたのに対して、試験した他のｒｈＣＤ−ＲＡＰバッチ（Ｆ−ＭＰＬ．１２０００４．００１およびＧ２５−Ｑ１３１  ＃００３）では、約５４℃〜５６℃という、より高い融解点が示された。この３℃の差は、２つの異なる製剤で実証された。結果を、以下の表２および図８に示す。
【０５１０】
【表７】
2018527030.tif 000008
【０５１１】
例４：５ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰ濃度で、５種の製剤を調製した。製剤化していない非濃縮ＣＤ−ＲＡＰを、対照標準（製剤０）として分析に含めた。これらの製剤の組成の概要を、表３に示す。
【０５１２】
【表８】
2018527030.tif 000009
【０５１３】
調製したバッファーを、表４に示す。各バッファーを、以下のように調製した：
−  ６０ｍｌの適切なバッファーを、１００ｍｌのガラス瓶またはガラスビーカーに注ぎ入れた。
【０５１４】
−  適宜、必要体積のＡｒｇ／Ｇｌｕ溶液を加えた（表４参照）。
【０５１５】
−  適宜、必要量のアルギニン塩酸塩を加えた（粉末、表４参照）。
【０５１６】
−  適宜、必要量のスクロースを加えた（粉末、表４参照）。
【０５１７】
−  ｐＨを、目標値＋／−０．１に調整した。
【０５１８】
注：いずれの場合にも、１ＭのＮａＯＨでｐＨを調整した。
【０５１９】
−  この溶液をメスフラスコに移し、適切なバッファーを標線まで加え、最終ｐＨを測定した。バッファーを、０．２μｍのフィルターでろ過した。
【０５２０】
【表９】
2018527030.tif 000010
【０５２１】
Ａｍｉｃｏｎ４チューブ（ＭＷカットオフ  ３ｋＤａ）を用いたろ過遠心分離により、バッファー交換を行った。予め秤量しておいたチューブにＣＤ−ＲＡＰ原薬（２ｍｌ）を移し、適切なバッファーを等体積加えた。これらのチューブを遠心分離（４０００ｇ、１５℃）し、透過液および濃縮液の秤量により洗浄プロセスをモニタリングした。４回の洗浄サイクルを行った。最後の遠心分離の際に、５ｍｇ／ｍｌのＣＤＲＡＰを得るために、わずかに濃縮（約１０％）を行った（この回で使用したバッチＦ−ＡＫＯ−１２００１８Ａの補正後の含分は、４．７ｍｇ／ｍｌであった）。バッファーの交換後、ストレス試験のためにサンプルの一部を２Ｒガラスバイアルに分注し、残分は、ｔ＝０の分析を待つ間に５℃で保存した。
【０５２２】
Ｔ＝０のサンプルを、方法２〜３；５〜９（表５）を用いて分析した。ｔ＝０の分析を、製剤調製後４８時間以内に行った。すべての製剤（対照標準製剤を含む）に、４０℃で７日間ストレスを与えた。バイアルを安定性キャビネットに入れることによってこれを行った。さらに、凍結／解凍により製剤にストレスを与えた。バイアルを−２０℃で保存することによってこれを行った。２４時間後、バイアルを周囲温度で１時間解凍させ、次いで再び２４時間凍結させた。このようにして、５回の凍結・解凍サイクルを行った。凍結・解凍後、分析を待つ間、これらのバイアルを５℃で保存した。ストレスを与えたサンプルをすべて、方法２〜３；５〜７（表５）により一緒に（すなわち双方のストレステストが完了した後に）分析した。いずれの分析も、ストレス試験終了後４８時間以内に行った。
【０５２３】
【表１０】
2018527030.tif 000011
【０５２４】
これらの製剤のｐＨおよび重量オスモル濃度を、Ｔ＝０で測定した。結果を図９に示す。製剤１のｐＨ、特に製剤２および製剤３のｐＨは、目標であるｐＨ６．５を上回っていた（それぞれ６．７、７．１および７．０）ことが見てとれる。このことは、アルカリ性（ｐＫａ  ９．３〜１０．３）を示すタンパク質の存在下でｐＨを６．５に維持するには、２０ｍＭのバッファー濃度では低すぎる可能性があることを示している。クエン酸バッファーおよびヒスチジンバッファーの場合には、ｐＨ６．５は、これらのバッファーの緩衝能範囲の端部に位置する。したがって、これらのバッファーを選択する場合には、製剤のｐＨを低下させることが有益でありうる。例えばｐＨを６．０とすれば、クエン酸塩およびヒスチジンの緩衝能でもおそらく十分であろうと考えられ、それによってバッファー濃度を２０ｍＭに保つことができる。
【０５２５】
調製した製剤の大部分は、Ａｒｇ／Ｇｌｕ混合物を含有する製剤４を除いて高張性であった。興味深いことに、ＳＣＩＬにより調製した対照標準製剤も高張性であった。予想通り、製剤へのスクロースの添加は、重量オスモル濃度に大きな影響を及ぼした（製剤５）。製剤２および製剤３において目標ｐＨが得られなかったため、（得られた他の結果に基づいて重要であると判断される場合には）これらの製剤を、２回目で繰り返す。１回目の目的は主に、様々な賦形剤がＣＤ−ＲＡＰの安定性に及ぼす影響を評価することであったため、この１回目の製剤を調製する際には、これらの製剤の重量オスモル濃度を考慮しなかった。
【０５２６】
これらの製剤の外観を、図１０に示す。Ｔ＝０では、いずれの製剤も無色透明であった。熱ストレスを７日間与えた後では、いずれの製剤も混濁していたが、製剤４が最も混濁していた。いずれの製剤においても、時間が経つとバイアルの底に沈殿物が沈んだ。このことは、この沈殿物が大きな不溶性タンパク質凝集体で構成されていることを示している。また、スクロースを含有する製剤５は、ごく薄い黄色であった。５回の凍結・解凍サイクルの後、これらの製剤は、Ｔ＝０と同様の外観を有していた。
【０５２７】
主ピークについてＣＤ−ＲＡＰを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより得られた結果を、図１１に示す。
【０５２８】
この過程で、１０〜１５％のタンパク質の損失が生じた。これは、Ａｍｉｃｏｎチューブの膜へのＣＤ−ＲＡＰの吸着または透過液における（すなわち膜孔を通じた）タンパク質の損失が要因であった可能性がある。様々な製剤について、含分は同等であった（３．４〜３．８ｍｇ／ｍｌ）。このことは、タンパク質の損失が、製剤の組成にもそれらのｐＨにも関連しないことを示している。
【０５２９】
４０℃で７日間ストレスを与えたサンプルについて得られた結果を見ると、これらの製剤の性能を以下のように（最も良好から最も劣悪まで）評価できることが分かる：製剤０＝２＞１＝３＞４＝５。したがって、クエン酸バッファー中の製剤２は、対照標準製剤０と同様に作用した。それぞれＡｒｇ／Ｇｌｕおよびスクロースを含有する製剤４および５は、Ｔ＝０と比較して、ストレス後のＣＤ−ＲＡＰの主ピークの回収率が最も低かった。製剤５は、熱ストレス後のＣＤ−ＲＡＰ純度が大幅に最も低かった（図１１の１１．６％）。
【０５３０】
凍結・解凍ストレスを与えた後では、熱ストレス後に観察されたほど顕著ではないものの、変化が認められた。これらの製剤の性能を、以下のように（最も良好から最も劣悪まで）評価することができた：３＞１＝２＝４＝５＜０。総括すると、これらの結果は、製剤０（対照標準）が最も劣悪であり、他の製剤は総じて同等であったことを示している。したがって、リン酸ナトリウムバッファーは、凍結・解凍ストレス時に最も劣悪な性能を示しており、バッファー濃度と相関関係にあるという傾向を見てとることができた（２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する製剤１は、この５０ｍＭのバッファーを含有する製剤０よりも良好に作用した）。この原因はおそらく、凍結時にこのバッファーにより生じるｐＨのシフトであろう。ブランクでは存在しなかったクロマトグラムのピークをすべて積分することによって、ストレス後に回収した全タンパク質含分が得られた（図１１の最後の３つの列）。したがって、ストレス後に得られた回収物は、サンプルからＨＰＬＣカラムによりフィルターで除去されなかった物質を表す。熱ストレス後、全ＣＤ−ＲＡＰ含分は５０〜７２％で変動したことが見てとれるが、製剤４は明らかな例外であり、これについてはわずか２０％の物質しか回収されなかったことが分かる。このことは、この製剤において生じた沈殿が比較的多かったことを示す透明性の結果と一致している。凍結・解凍ストレス後に得られた全ＣＤ−ＲＡＰ量は、熱ストレス後に得られた全ＣＤ−ＲＡＰ量よりもはるかに高く、Ｔ＝０で測定したものと同等であった。これらのサンプルでは沈殿が観察されなかったため、これは予想していたことであった。例外が１つあり、これは対照標準製剤であった。この対照標準製剤は、凍結・解凍ストレス後に全回収率が８０％であった。このサンプルでは沈殿が見られなかったため、このことは、可溶性凝集物の形成によって説明がつくものと考えられる。
【０５３１】
例５：
１回目で得られた結果に基づき、５ｍｇ／ｍｌの目標ＣＤ−ＲＡＰ濃度で６種の製剤を調製した。さらに、製剤化していない非濃縮ＤＳ（１回目と同様、製剤０ａ）と、バッファー交換プロセスに供した製剤化していない非濃縮ＤＳ（製剤０ｂ）との、２つの対照標準製剤を含めた。これらの製剤の組成の概要を、表６に示す。
【０５３２】
【表１１】
2018527030.tif 000012
【０５３３】
２回目には、以下のファクターについて調べた：
・  ５０ｍＭ、ｐＨ６．５のバッファーの種類の影響（リン酸ナトリウム対リン酸カリウム対クエン酸塩対ヒスチジン）、
・  酸化防止剤（アスコルビン酸）の存在の影響。
【０５３４】
１回目と比較して、バッファー濃度を５０ｍＭに増加させた。これは、製剤の緩衝能を向上させるために行ったものである。Ｓａｎｏｆｉで得られた新たなデータから、ｐＨが酸性であるとＣＤ−ＲＡＰタンパク質はより安定となることが判明したため、調製したすべての製剤のｐＨを６．５に設定した。安定剤（アルギニン）濃度を、２００ｍＭに維持した。この回では、アルギニン塩基をすべての製剤に使用した。
【０５３５】
２回目では、バッファーを、１回目とは異なって調製した。１回目では、リン酸ナトリウムバッファーおよびヒスチジンバッファーを、まずは追加の賦形剤なしで調製して、それらのｐＨをＨＣｌまたはリン酸で調整した。次いで、他の賦形剤（アルギニン塩酸塩、Ａｒｇ／Ｇｌｕ、スクロース）を加え、１ＮのＮａＯＨでｐＨを再度調整して、目標ｐＨとした。２回目では、賦形剤添加前のバッファーのｐＨを、緩衝塩で調整した。これにより、強酸を用いたｐＨ調整ステップを最後に１度だけ行うこととなり、このステップを、賦形剤の添加後に行った。このようにバッファーを調製することで、１回目ではかなり高かった製剤の重量オスモル濃度に有益な影響が及ぶことが予想された。より具体的には、２回目のバッファーを以下のように調製した：
・リン酸カリウムバッファーについては、ＫＨ２ＰＯ４塩の溶液を調製した。この溶液を、ｐＨ６．５に達するまでＫ２ＨＰＯ４溶液で滴定した。所定の体積のバッファー溶液を取り出し、アルギニン（塩基）を加え、そして（適宜）アスコルビン酸を加えた。リン酸でｐＨを調整して、ｐＨを６．５に戻した。次いで、このバッファーをメスフラスコに移し、標線まで水を加えた。
【０５３６】
・クエン酸バッファーについては、クエン酸溶液を調製した。この溶液を、ｐＨ６．５に達するまで１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で滴定した。アルギニン（塩基）を加え、そして（適宜）アスコルビン酸を加えた。塩酸（ＨＣｌ）でｐＨを調整して、ｐＨを６．５に戻した。次いで、このバッファーをメスフラスコに移し、標線まで水を加えた。
【０５３７】
・ヒスチジンバッファーについては、ヒスチジンが単一の塩で構成されていることから最初の滴定ステップを行わなかったことを除いては、他の２つのバッファーに用いたのと同じ手順であった。クエン酸バッファーと同様に、ヒスチジンバッファーのｐＨをＨＣｌで調整した。
【０５３８】
調製後、各バッファーの最終ｐＨを測定し、これらの溶液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。
【０５３９】
例４に記載したのと同一の方法を用いて製剤を調製した。バッファー交換前に、製剤０ａ以外の製剤をすべて、それらの対応するバッファーで希釈して、濃度を５．５ｍｇ／ｍｌとした。この濃度は、１回目のＲＰ−ＨＰＬＣによって得られたＴ＝０の結果により示唆された、プロセス中に生じた１０％のタンパク質の損失が補われるように選択したものである。３回目の洗浄ステップの後（例えば最後の２ｍｌのバッファーを加えた後）、希ＨＣｌ溶液でこれらの製剤のｐＨを調整して、目標値とした。使用すべき適切なＨＣｌ濃度を決定するために、予備試験をこれらのバッファーについて行った。インプロセスでのｐＨ調整の結果を、図１２に示す。
【０５４０】
Ｔ＝０のサンプルを、方法２〜３；５；７〜９（表５）を用いて分析した。ｔ＝０の分析を、製剤調製後４８時間以内に行った。１回目の場合と同様にストレス試験を行ったが、ただし、熱ストレス（４０℃）を７日間ではなく２日間与えた点で相違していた。これは、１回目で観察されたタンパク質の大量の沈殿を防ぐ目的で行ったものである。ストレス期間の後、分析を待つ間にこれらのサンプルを５℃で保存した。ストレスを与えたサンプルをすべて、方法２〜３；５；７（表５）を用いて一緒に（すなわち双方のストレステストが完了した後に）分析した。いずれの分析も、最後の凍結・解凍サイクルの４８時間以内に行った。
【０５４１】
２回目に調製した製剤のｐＨおよび重量オスモル濃度の結果を、図１３に示す。どちらのパラメーターも、Ｔ＝０で測定したものである。１回目とは対照的に、いずれの製剤のｐＨも狙い通りであったことが見てとれる。このことは、３回目の洗浄ステップの後に導入したインプロセスのｐＨ調整ステップの結果である。リン酸カリウムバッファー中での製剤１および２の重量オスモル濃度は、高めではあるが許容できるものであった。５０ｍＭのリン酸カリウムバッファーの重量オスモル濃度は、１回目で調製した２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーの重量オスモル濃度よりも低かった。２回目に単一のｐＨ調整ステップを導入し、かつアルギニン塩酸塩の代わりにアルギニン塩基を使用することにより、バッファーの重量オスモル濃度が改善された。それぞれクエン酸バッファーおよびヒスチジンバッファー中で調製した製剤３および４ならびに製剤５および６の重量オスモル濃度は、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの許容値を超えていた。５０ｍＭのクエン酸バッファーの場合、このことは、以下の事実から予想されていたことであった：
・ｐＨ６．５は、緩衝能の上方範囲（すなわち、大抵は共役塩基であるクエン酸三ナトリウムが存在する）であること。
【０５４２】
・  ｐＨ調整前に、クエン酸三ナトリウムのイオン化度は４であり、すなわち５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム＝２００ｍＭのイオンであり、これにＡｒｇの２００ｍＭを加算すると、４００ｍＯｓｍ／ｋｇとなること。
【０５４３】
クエン酸バッファーおよびヒスチジンバッファーの重量オスモル濃度が高いことを説明する他の理由は、これらのバッファーのｐＨを、リン酸の代わりにＨＣｌで調整したことにある。文献から、アルギニンとリン酸イオンとの間には強いイオン相互作用が生じることが知られている。この相互作用は、実質的には共有結合による相互作用と考えられ、質量分析により衝突誘起解離を行うことによる断片化にも耐えることができる。この複合体の形成ゆえ、リン酸でのｐＨ調整が重量オスモル濃度に及ぼす影響は、はるかに低くなる。塩化物イオンはこの複合体を形成しない。それゆえ、図１３に見られるように、ｐＨ調整をＨＣｌで行った製剤３〜６の重量オスモル濃度は高かった。クエン酸バッファーおよびヒスチジンバッファーにＨＣｌを使用した目的は、製剤に追加のイオン（リン酸イオン）が導入されないようにすることであった。選択した最終製剤がこれらのバッファーのうちのいずれかに含まれる場合には、ｐＨの調整にはリン酸が考慮されることになろう。
【０５４４】
製剤の外観を、図１４に示す。ｔ＝０では、薄桃色であった製剤６以外は、いずれの製剤も無色透明であった。この変色は、すでにバッファー中で観察されており、調製後数時間で帯黒赤色を呈した。これはおそらく、アスコルビン酸の酸化によって生じたものと思われる。バッファーを３回調製したが、バッファーを遮光状態にしていたにもかかわらず、こうした変色が毎回観察された。アスコルビン酸とヒスチジンとが非相溶性を示す旨の記載は文献にはないため、アスコルビン酸を含有する他のバッファーがこうした急激な変色を示さないことの理由は不明である。４０℃で２日間ストレスを与えた後、いずれの製剤も混濁していた。しかし１回目と比較して、沈殿物は、バイアルの底には沈まずに、懸濁液中に留まった。このことは、生じた沈殿物がより少ないことを示している。アスコルビン酸を含有する製剤（２、４および６）はいずれも変色を示し、この変色は、製剤６において比較的顕著であった。この製剤は、最も混濁したもののうちの１つでもあった。
【０５４５】
５回の凍結／解凍サイクルの後で、これらの製剤は、ｔ＝０の時点と同一の外観を示した。
【０５４６】
ＲＰ−ＨＰＬＣによって得られた結果を、図１５に示す。ｔ＝０での製剤の含分は若干のばらつきを示し、製剤０ａ、１、４、そして特に６は、目標のＣＤ−ＲＡＰ濃度である５ｍｇ／ｍｌを上回り、製剤０ｂはこれを下回っている。このことは、Ａｍｉｃｏｎチューブにおけるバッファー交換プロセスの制御が困難であり、正確な含分を得るにはこのプロセスの際にＩＰＣを導入すべきであることを示している。熱ストレスを２日間与えた後、アスコルビン酸を含有する製剤（２、４および６）では、ｔ＝０と比較してＣＤ−ＲＡＰの含分および純度の有意な低下が観察された。興味深いことに、この純度の低下は、すでに製剤４および６においてｔ＝０で存在していた。これらの３つの製剤では、５回の凍結・解凍サイクルの後にも、熱ストレス後の程度よりは低いものの、純度の低下が見られた。
【０５４７】
例６：
温度の影響下でのＣＤ−ＲＡＰタンパク質の経時的な安定性を評価するために、６カ月の安定性試験を行った。この化合物を、−８０℃、−２０±５℃および５±３℃（特に５℃）で保存することを予定する。これらの製剤を、様々な保存条件（−８０℃、−２０℃、５℃、２５℃および４０℃）で保存した。この安定性試験では、２つのバッチを使用した。一方は医薬製剤（ＤＰ）バッチであり、もう一方は、このＤＰバッチに対応するプラセボバッチである。これら２つのバッチを、表７〜９に示す：
【表１２】
2018527030.tif 000013
【０５４８】
【表１３】
2018527030.tif 000014
【０５４９】
【表１４】
2018527030.tif 000015
【０５５０】
これらの製剤を、長期／リアルタイムの保存条件（−８０℃、−２０℃および５℃）および促進保存条件（２５℃および４０℃）で試験した。−８０℃、−２０℃、５℃および２５℃での安定性を、６カ月間モニタリングした。４０℃での安定性を、１カ月間モニタリングした。６カ月間の本試験の間に、これらのサンプルの色および透明性、ｐＨ、重量オスモル濃度、主バンドのＭＷおよび主バンドの純度は、時点を変えても保存温度を変えても変化しなかった。様々な温度で６カ月間保存している間中ずっと、いずれの安定性サンプルにおいても凝集物は観察されなかった。ＣＤ−ＲＡＰ医薬製剤（ＤＰ）に対応するプラセボは、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＰＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＤＰとの干渉を示さなかった。放出時のサンプルの総好気性生菌数（ＴＶＡＣ）もまた、標準規定内であった。
【０５５１】
製剤を、−８０℃、−２０±５℃、５±３℃、２５±２℃および４０±２℃の様々な安定性キャビネット内で直立位置で安定性キャビネット内で保存した。指示された時点で、サンプルをこれらのキャビネットから取り出し、２週間以内に分析した。分析を待つ間、サンプルを５℃で保存した。以下の表１０に示すパラメーターおよび試験方法を用いて、これらのバッチの安定性を評価した。
【０５５２】
【表１５】
2018527030.tif 000016
【０５５３】
結果を、図１６および図１７に示す。
【０５５４】
目視検査（視認可能な粒子、色および透明性）を、Ｐｈ．Ｅｕｒ．により（すなわち、白黒の背景の手前で）行った。しかし、入手可能なサンプルの量では、標準化されたＰｈ．Ｅｕｒ．チューブに移すことができなかったため、検査をバイアル内で直接行った。視認可能な粒子、透明性および色についての目視検査を、２人の作業者が行った。
【０５５５】
どちらの製剤においても、様々な温度で６カ月間保存した後に、色および透明性の有意な変化は観察されなかった。これらのサンプルでは、色および透明性が保存温度と相関関係を示すという傾向は観察されなかった。これらのサンプルの色は、注射用水と同様に無色であったため、「Ｂ９／ＢＹ７／Ｙ７よりも強い着色を示さない」と報告した。これらのサンプルの透明性は、注射用水と同様に透明であったため、「＜Ｒｅｆ  Ｉ」と報告した。プラセボバッチＦ５３１−０３−００３Ｐ０６３は、いずれの保存温度および時点においても、視認可能な粒子を実質的に含んでいなかった。しかし、ＤＰバッチＦ５３１−０３−００３Ｐ０６４Ｂは、視認可能な粒子が保存温度および時間と相関関係にあるという傾向を示した。放出時に、このサンプルは、視認可能な粒子を実質的に含んでいなかった。−２０℃および５℃で保存したＤＰサンプルは、ｔ＝１カ月では、視認可能な粒子をまだ実質的には含んでいなかった。ｔ＝３カ月およびｔ＝６カ月の時点では、−２０℃および５℃で保存したサンプルにおいて５〜１０個の繊維様粒子が観察された。しかしこの量は１０個未満であったため、これを、視認可能な粒子を実質的に含まないものとして報告した。興味深いことに、−２０℃および５℃で保存したサンプルで検出された粒子の数は、ｔ＝３カ月からｔ＝６カ月までの期間に増加しなかった。これらの粒子が−２０℃および５℃でのＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰバッチの不安定性の指標であることを確認するためには、粒子の性質（すなわち、タンパク質性または非タンパク質性）の特定に加えて、比較的長期間保存したバイアルの目視検査が必要となるものと考えられる。−８０℃で保存したサンプルは、６カ月間保存した後に繊維様粒子を２０〜３０個示したが、これは、−２０℃で同一の期間保存したサンプルで検出されたものよりも多かった。したがって、−８０℃での保存には、−２０℃での保存に比べて利点はない。２５℃では、ｔ＝１カ月では、サンプルには視認可能な粒子はまだ実質的に含まれていなかった。ｔ＝３カ月およびｔ＝６カ月では、これらのサンプルは、それぞれ２０個および１０〜２０個の繊維様粒子を示した。４０℃では、サンプルは、ｔ＝１カ月で１０個超の繊維様の白色粒子を示した。総括すると、このことは、４０℃で１カ月間保存した後および２５℃で３カ月間保存した後にＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰが不安定性を示すことの指標となりうる。全体として、視認可能な粒子についての結果から、ＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰは、−２０℃および５℃で６カ月間保存した後に最も安定であると考えられることが判明した。
【０５５６】
様々な温度で６カ月間保存した後のｐＨの変化は、どちらの製剤においても観察されなかった。サンプルのｐＨは、６．０〜６．１のままであった。
【０５５７】
ＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰバッチおよびプラセボバッチの重量オスモル濃度を、放出時およびｔ＝６カ月で分析した。この試験全体を通してこれらの製剤の重量オスモル濃度の変化はなく、ＤＰバッチおよびプラセボバッチでそれぞれ、３１５〜３１９ｍＯｓｍ／ｋｇおよび３０９〜３１３ｍＯｓｍ／ｋｇであった。重量オスモル濃度は、通常は安定性を示すパラメーターではないが、これは予想されたものである。
【０５５８】
プラセボバッチのピークは、いずれのサンプルにおいてもＲＰ−ＨＰＬＣによりＤＰバッチとの干渉を示さなかった。「そのままの」ＣＤ−ＲＡＰ含分の段階的な低下およびＣＤ−ＲＡＰ純度の段階的な低下が、保存温度および時間との相関関係を示すものとして観察された。これに、Ｏｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９のパーセンテージの増加と、Ｏｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９以外の最大の不純物のパーセンテージの増加とを組み合わせた。−８０℃では、Ｏｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９のパーセンテージと、Ｏｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９以外の最大の不純物のパーセンテージはどちらも、放出時に得られた値と比較して、６カ月間の保存後に（それぞれ６．６％から７．０％へ、および１．５％から１．９％への）０．４％の増加を示した。−２０℃でも、同一の期間にわたって同様の傾向が観察された（どちらの種類の不純物についても、放出と比較して０．６％および０．４％の増加）。試験全体の間に、全体的なＣＤ−ＲＡＰ純度の低下は、約１％（ｔ＝０カ月での８５．０％からｔ＝６カ月での８３．９％まで）であり、「そのままの」ＣＤ−ＲＡＰ含分は、どちらの保存温度でも２．２ｍｇ／ｍｌから２．０ｍｇ／ｍｌへと減少した。５℃では、この温度でＯｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９のパーセンテージの増加がより大きかった（放出時の６．６％からｔ＝６カ月での７．５％）ことを除いては、−８０℃および−２０℃で観察されたのと同様の傾向が観察された。これに伴い、ＣＤ−ＲＡＰ純度が（８５．０％から８３．５％へと）１．５％低下した。２５℃では、Ｏｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９のパーセンテージは、放出時の６．６％から、３カ月間および６カ月間の保存後にそれぞれ８．２％および８．９％に増加した。その温度でｔ＝６カ月で得られたＯｘ−Ｍｅｔのパーセンテージは、４０℃で１カ月間保存した後のサンプルで得られたもの（９．１％）とほぼ同等であった。Ｏｘ−Ｍｅｔ−ＳＡＲ３９６０４９以外の最大の不純物のパーセンテージも、放出時の１．５％から、２５℃で６カ月間保存した後に２．８％へと増加した。視認可能な粒子について観察されたのと同様に、これらの結果は、２５℃で３カ月以上保存した場合および４０℃で１カ月間保存した場合にＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰが不安定性を示すことの現れであると考えられる。
【０５５９】
ＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰバッチＦ５３１−０３−００３Ｐ０６４Ｂでは、いずれの保存温度でも６カ月超ではＨＰＳＥＣにより凝集物が観察されなかった。プラセボのピークは、いずれのサンプルにおいてもＤＰバッチとの干渉を示さなかった。
【０５６０】
この試験で得られた結果に基づいて、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質溶液は、−２０℃および５℃で保存した場合に最も安定であると結論付けることができる。−８０℃での保存には、−２０℃での保存に比べて明らかな利点はなかった。
【０５６１】
例７：空のリポソームを生成する溶媒注入法の確立
この試験の目的は、リポソームの調製に現在用いられている方法を改良し、かつリポソーム製剤の組成（例えば脂質）を変更することによって、関節内投与に適した凍結乾燥可能なＣＤ−ＲＡＰのリポソーム製剤を開発することであった。
【０５６２】
溶媒注入法を用いて空のリポソームを調製するための一般的な方法のスキームを、図１８に示す。脂質を含有する有機溶媒混合物を、制御された様式で蠕動ポンプを使用して水相に注入した。図１８に示すように、２つの液体を混合するための装置にスタティックミキサーを組み込んだ。リポソーム形成にとって好ましい条件である乱流を増大させるために、この注入を、スタティックミキサーの手前で行った。リポソームをすぐに形成させることができるようにするために、注入後の有機溶媒の量は、１０％（ｖ／ｖ）であった。この方法を、周囲温度で行った。脂質の注入後、１０％の有機溶媒を含有する水中の空のリポソームが得られた。この空のリポソーム懸濁液を水で洗浄して、有機溶媒を除去した。これを、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって行った。この方法によって、９９．５％超の有機溶媒を除去することができる。
【０５６３】
ｐＨ７．３〜７．４のアルギニン−リン酸ナトリウム（ａｒｇ−リン酸）バッファー（３５０ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、リン酸でｐＨ調整済み）中で、約５ｍｇ／ｍｌのＣＤ−ＲＡＰ濃度でＣＤ−ＲＡＰ溶液を製造した。
【０５６４】
溶媒注入法を試験する前に、すべての脂質を可溶化させうる溶媒混合物を見出すために、脂質を用いて溶解度試験を行った。方法を簡便なままとするため、周囲温度で脂質を可溶化させうる溶媒混合物を見出さなければならなかった。以下の脂質および溶媒を試験した：
脂質：−  大豆ＰＣ、−  アスコルビン酸パルミチン酸エステル、−  コレステロール、
溶媒：−  エタノール（９６％）、−  ＴＢＡ（９５％）、−  アセトン、−  ＤＭＳＯ、−  ＤＭＡ。
【０５６５】
大豆ＰＣおよびアスコルビン酸パルミチン酸エステルの溶解度を、エタノールおよびＴＢＡ中で試験した。コレステロールを、アセトン、ＤＭＳＯおよびＤＭＡ中で試験した。いずれの場合にも、脂質を秤量し、付与可能な溶媒を加えた。透明になった（すなわち、中に脂質が溶解した）混合物に、さらなる脂質を加えた。透明にならなかった混合物には、追加の溶媒を加えた。目視により溶解度を評価した。
【０５６６】
この試験の結果を、図１９に示す。大豆ＰＣとアスコルビン酸パルミチン酸エステルは、エタノール（９６％）に溶解可能であり、一方でＤＭＡは、コレステロールの最良の溶媒であると結論付けられた。アスコルビン酸パルミチン酸エステルの溶解度は、ＴＢＡ（９５％）中の方が高かったが、複数の脂質に対して１種の溶媒を使用する方が、より都合がよい。周囲温度で透明な１つの脂質溶液を得るために、２つの脂質溶液であるエタノール：ＤＭＡを、３：１の比率で混合した。このエタノール／ＤＭＡ混合物中にすべての脂質を含有する最終脂質溶液は、周囲温度で透明であった。
【０５６７】
大豆レシチンおよびアスコルビン酸パルミチン酸エステルをエタノール（９６％）に溶解させ、コレステロールをＤＭＡに溶解させた。ＤＭＡはクラス２の溶媒であるため、クラス３の溶媒に切り替えることが好ましい。コレステロールを溶解させることができたとともに、他の脂質と混合した際に周囲温度で透明な溶液を形成することができたクラス３の溶媒は、１−プロパノールであった。溶媒の使用量は、変更しなかった。
【０５６８】
【表１６】
2018527030.tif 000017
【０５６９】
脂質有機溶液の濃度の影響
有機溶媒中の脂質濃度は、溶媒注入後の粒子径に影響を及ぼしうる。溶媒注入法は、有機溶媒を水相で希釈して約１０％（ｖ／ｖ）とすることに基づいているため、脂質濃度が高くなるほど、必要な水が少なくなるとともに、形成されるリポソームの希釈度合いが低くなることを意味する。一方で、有機相中の脂質濃度が高くなるほど、粒子（リポソーム）のサイズが大きくなりうる。同一の注入パラメーターを用いて様々な濃度の脂質を注入することによって、脂質濃度の影響を調べた。
【０５７０】
図２０は、有機相中の脂質濃度の影響を明確に示している。脂質濃度が低下するとともに、形成されるリポソームの粒子径が減少し、また粒子の分布が狭くなる（ＰＤＩが低くなる）。脂質濃度が減少するにつれてリポソームはより高度に希釈され、その結果、濃縮係数が高くなる。濃縮係数とは、ＣＤ−ＲＡＰタンパク質との混合前に目的の脂質含分を得るのに必要な、注入後のバルクリポソーム懸濁液の濃縮回数を示す。
【０５７１】
スタティックミキサーのサイズの影響
スタティックミキサーを用いて、溶媒注入時に水と有機相とを混合した。様々なミキサーを、様々な構成で利用することができる。これらの構成の１つに、ミキサーの内径が挙げられる。内径を変化させることで内部体積が変化し、これにより有機相と水相との混合比が変化する。
【０５７２】
各バッチに対して異なるスタティックミキサーを用いて、２つのバッチを調製した。
【０５７３】
小型スタティックミキサー：内径５．３ｍｍ。
【０５７４】
大型スタティックミキサー：内径１２．６ｍｍ。
【０５７５】
他の注入パラメーターはいずれも、各バッチについて同一であった。ミキサーの内径が粒子径に及ぼす影響を、図２１に示す。図２１に示す結果から、スタティックミキサーの内径が大きいほど、そうしたスタティックミキサーを用いて調製したリポソームは、サイズが小さくなるとともにＰＤＩが低くなると結論付けることができる。
【０５７６】
水性相の流量の影響
水性相の流量の変化は、スタティックミキサー内で生じるせん断と、注入される有機溶媒の希釈とに影響を及ぼす。このパラメーターを試験するために、２つのバッチを準備した。水性相の流量が多い場合には大型スタティックミキサーがより適しているため、大型スタティックミキサーを使用した。どちらのバッチも、水性相の流量以外の注入パラメーターはすべて同一であった。結果を図２１に示す。水性相の流量を５５０ｍｌ／分から１１００ｍｌ／分に増加させたところ、粒子径およびＰＤＩが有意に減少した。Ｚ平均は１４７ｎｍから１０６ｎｍに減少し、ＰＤＩは０．２１３から０．１９３に減少した。
【０５７７】
溶媒注入速度を５ｍｌ／分またはさらには１０ｍｌ／分に増加させ、これに比較的高い水性相速度である２２００ｍｌ／分を組み合わせると、１ｍｌ／分の注入速度で調製したバッチに見られるものと同等の粒子径データが得られる。したがって、最大で１０ｍｌ／分という、比較的高い注入速度が実現可能であった。
【０５７８】
組合せ
上記で試験したパラメーターの最良の設定値を組み合わせることにより、バッチを調製した。上記の節での最適な設定値は、以下の通りであった：有機相中の脂質濃度：０．０３３（ｇ／ｍｌ）；スタティックミキサーの内径：大型（１２．６ｍｍ）；水性相の流量：１１００（ｍｌ／分）。結果を図２３に示す。試験したすべてのパラメーターの最良の設定値を組み合わせることにより、粒子径が７２ｎｍでＰＤＩが０．１３２であるリポソームバッチが得られた。
【０５７９】
例８：リポソームとＣＤ−ＲＡＰタンパク質との混合
リポソームを調製し、そして（適宜）ＤＳバッファーを交換／濃縮した後、双方の液体を、５５：４５のリポソーム：ＣＤ−ＲＡＰ比で混合した。バッファー（プラセボとして使用）と混合した後と、ＣＤ−ＲＡＰと混合した後の、リポソームの粒子径を分析した。図２４に見られるように、ＣＤ−ＲＡＰと混合した後のリポソームの粒子径に変化はなかった。
【０５８０】
例９：凍結乾燥および再構成
凍結乾燥の２つの試験を、図２５Ａおよび図２５Ｂに示すプログラムにしたがって行った。（図２５Ｂに示す）試験２では、１次乾燥を、（図２５Ａに示す）試験１で行った＋５℃の代わりに−１０℃で行った。図２５Ａに示すプログラムにしたがって凍結乾燥を行ったところ、得られたケークには大きなクラックがあった。このケークを再構成した後、再構成を行った後に相分離が観察された。図２５Ｂに示すプログラムにしたがって凍結乾燥を行ったところ、クラックなしのケークが得られた。このケークを再構成した後、相分離は観察されなかった。
【０５８１】
ケークの再構成は、バイアルを５℃の冷蔵庫から取り出し、全再構成体積（１ｍＬ）の水を周囲温度で段階的にまたは１度に加えて３０秒間振とうさせることでこのケークを直ちに再構成することによって行った。
【０５８２】
例１０：封入率
いずれのパラメーターによって最良の封入率（ＥＥ％）が得られるかを調べる目的で、様々なパラメーターがＥＥおよび再構成の容易性に及ぼす影響を、一連のバッチについて評価した。表１２に、調製したすべての製剤の概要を示す。
【０５８３】
【表１７】
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【０５８４】
【表１８】
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【０５８５】
【表１９】
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【０５８６】
【表２０】
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【０５８７】
【表２１】
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【０５８８】
【表２２】
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【０５８９】
【表２３】
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【０５９０】
パラメーター調査  −  製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０２７、Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０３１およびＦ５３１−０３−００８Ｐ０３３
試験した製剤は、標準の脂質含分かまたは２倍の脂質含分のいずれかを有していた。バイアルを、１ステップで（すなわち全再構成体積を１度に加えることによって）、または段階的に再構成した。リポソームへの分子のより高度の封じ込めを促進する方法として、文献には段階的な再構成方法が記載されている。この方法を用いた場合、再構成は次のように進行する：１）  全再構成体積の３０％を加え、バイアルを手で渦状に回し、ラボベンチ上で３０分間静止させる。２）  ステップ１を繰り返す。３）  再構成体積の残分を加え、バイアルを手で渦状に回し、ラボベンチ上で３０分間静止させる。
【０５９１】
この段階的な再構成方法を用いた場合、脂質含分が標準的である製剤はいずれも、最後の再構成ステップを行った後に均質であった。脂質含分が２倍である製剤は、ラボベンチ上での合計２時間の静止期間後に均質であった。しかし、１ステップでの再構成方法を用いた場合には、いずれの製剤においても、製剤の脂質含分にかかわらず再構成の直後に塊状物は視認できなかった。したがって、１ステップでの再構成方法によって、製剤の再構成がより容易になるものと考えられる。
【０５９２】
再構成後、リポソーム懸濁液をアルギニン−リン酸バッファーで２０倍に希釈し、直接ＶｉｖａＳｐｉｎ法（遠心分離４０００ｇ、５分）で処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ろ液の遊離タンパク質含分を分析した。バッチ（Ｆ−ＭＰＬ−１２０００４）の調製に使用したＤＳ中のタンパク質含分に、ピペットでバイアルに入れたＤＳ溶液の量を乗じて得られたバイアル１本あたりのＣＤ−ＲＡＰの理論量を対照標準として用いて、ＥＥ％を算出した。ケーク体積の影響はこの試験計画の後半に判明したため、これらのバッチでは、再構成した生成物の体積を測定しなかったことに留意すべきである。そうではあっても、脂質含分が同一であるバッチの再構成後の体積は同等であることから、これらのバッチのＥＥ％値を互いに比較することができる。
【０５９３】
試験した製剤および得られたＥＥ％の概要を、図２６に示す。得られたＥＥ％は、１７〜５３％で様々であった。調査した各パラメーターの影響については、以下の節でより詳細に論じる。
【０５９４】
同一の方法で再構成した同一のバッチの２本または３本のバイアルを評価することにより、ＥＥ％の結果の再現性について試験した。脂質含分が標準的である製剤において、再現性のあるデータが得られた。脂質含分が２倍である製剤Ｐ０３３Ａについて得られた結果は、よりばらつきが多い。
【０５９５】
脂質含分の影響を比較した。ケーク体積の補正を行わなかったため、ここでは、ＥＥ％の結果について注意深く解釈すべきである。どちらの再構成方法を用いても、脂質含分が高いほど、得られるＥＥ％も高くなった。凍結乾燥前のリポソームと再構成時のリポソームと（Ｐ０２７ＫとＰ０２７Ｆとを比較）では、濃縮の影響はなかった。製剤Ｐ０２７Ｈについては、標準的な脂質含分を用いたが、ただしＣＤ−ＲＡＰ溶液の添加体積を半分にすることよって調製を行った。これにより、脂質：タンパク質比も高くなった。タンパク質含分が減少するとＥＥ％が低下することが判明した。このことは、リポソームがＣＤ−ＲＡＰで飽和されていなかったことを示している。なぜならば、利用可能なタンパク質が最大量封入されていた場合、タンパク質含分が減少するとＥＥ％は増加したであろうと考えられるためである。
【０５９６】
脂質含分が、再構成した生成物中のリポソームの粒子径に及ぼす影響についても調査した。しかし、脂質含分は、再構成後のリポソームの粒子径にも粒子径分布にも影響を及ぼさなかった。
【０５９７】
凍結乾燥方法の影響を、図２８Ａに示す。脂質含分が標準的であり、かつ凍結乾燥を制御したサンプルについては、Ｃｈｒｉｓｔにより凍結乾燥を行った場合よりも良好なＥＥ％が得られた。この傾向は、脂質含分が２倍であるサンプルにおいては逆である。制御した凍結乾燥に供したサンプルをアニーリングステップにも供したことを考慮すると、ここでは比較が困難であった。
【０５９８】
再構成方法が、再構成した生成物中のリポソームの粒子径に及ぼす影響についても調査した。図２８Ｂにおいて見てとれるように、１ステップでの再構成によって、粒子径分布が狭くなる。
【０５９９】
パラメーター調査  −  製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０４１およびＦ５３１−０３−００８Ｐ０５０
試験された製剤は、脂質含分が２倍、３倍または４倍のいずれかであった。バイアルを、１ステップ法で（すなわち全再構成体積を１度に加えることによって）再構成した。この方法を用いて、すべての製剤を再構成することができた。再構成後、リポソーム懸濁液を、それらの対応するバッファーで２０倍に希釈し、直接ＶｉｖａＳｐｉｎ法（遠心分離４０００ｇ、５分）で処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ろ液の遊離タンパク質含分を分析した。バッチ（Ｆ−ＭＰＬ−１２０００４またはＦ−ＡＫＯ−１２０００６）の調製に使用したＤＳ中のタンパク質含分に、ピペットでバイアルに入れたＤＳ溶液の量を乗じて得られたバイアル１本あたりのＣＤ−ＲＡＰの理論量を対照標準として用いて、ＥＥ％を算出した。ケーク体積の影響はこの試験計画の後半に判明したため、これらのバッチでは、再構成した生成物の体積を測定しなかったことに留意すべきである。そうではあっても、脂質含分が同一であるバッチの再構成後の体積は同等であることから、これらのバッチのＥＥ％値を互いに比較することができる。
【０６００】
以下のことについて評価するために、２倍の脂質含分で、第１の製剤系列（Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０４１Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ）を調製した：
−  １ステップで再構成した後の高脂質含分サンプルにおけるＥＥ％の反復性および再現性、
−  凍結乾燥方法（制御対Ｃｈｒｉｓｔ）がＥＥ％に及ぼす影響、
−  脂質含分が２倍であるバッチについての、再構成後の静止期間の必要性、
−  バイアルのサイズおよび充填体積が、ケークの外観、再構成およびＥＥ％に及ぼす影響。
【０６０１】
第２の製剤系列（Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０５０Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｊ／Ｌ）では、リポソームと混合したタンパク質溶液は、アルギニン−リン酸バッファーまたはアルギニン−クエン酸バッファーのいずれかの中に存在していた。すべてのバッチを、ＩＳＯに準拠した２Ｒバイアルに充填し、制御された凍結乾燥機内で凍結乾燥させた。これらのバッチを用いて、以下のパラメーターの影響について評価した：
−  １ステップで再構成した後の高脂質含分サンプルにおけるＥＥ％の反復性および再現性、
−  （高脂質含分を得るための）充填体積が、ケークの外観および再構成に及ぼす影響、
−  脂質濃度がＥＥ％に及ぼす影響、
−  タンパク質のバッファーの種類がＥＥ％に及ぼす影響。
【０６０２】
製剤の概要を、図２９に示す。得られたＥＥ％は、３９〜６２％で様々であった。同一のバッチからの２本または３本のバイアルを評価することにより、ＥＥ％の結果の再現性について試験した。１０ＲバイアルにＤＰを３ｍｌ充填した場合には、小型バイアル（３ｍｌおよび６ｍｌ）にＤＰをより少量充填した場合と比較して、より大きなばらつきが得られた。このことは、大型バイアルよりも小型バイアルの方が、よりしっかりとした再現性のある再構成が生じることが要因となっている可能性がある。この方法は、脂質含分が高い製剤について反復可能であった。３ｍｌのバイアルでは、ＲＳＤ％または差分％は、１０％未満であった。ＲＳＤ％または差分％が１０％未満である場合、ＲＰ−ＨＰＬＣ法によって得られる遊離タンパク質含分の差は、０．３ｍｇ／ｍｌ未満である。８．２．１バイアルのサイズおよび充填量の影響。バイアルのサイズおよび充填量がＥＥ％に及ぼす影響を、表７１で比較することができる。充填体積が異なるサンプルおよびバイアルのサイズが異なるサンプルについて、脂質含分が２倍である製剤についてのＥＥ％の有意差は得られなかった。バイアルのサイズが６ｍｌおよび３ｍｌである場合と比較して、バイアルのサイズが１０ｍｌである場合に、ＥＥ％のより多くのばらつきが得られた。
【０６０３】
脂質含分が２倍であるサンプルのＥＥ％について、１時間インキュベーションした後のサンプルと、インキュベーションなしのサンプルとでは、有意差は得られなかった。したがって、脂質含分が２倍であるサンプルを再構成した後の静止期間は、不要であった。
【０６０４】
脂質含分が２倍であるサンプルのＥＥ％について、Ｃｈｒｉｓｔによる凍結乾燥と制御された凍結乾燥との間に、有意差を観察することはできなかった。
【０６０５】
脂質含分の影響についても比較することができる。しかし、ケーク体積の補正を行わなかったため、ここでは、ＥＥ％の結果について注意深く解釈すべきである。アルギニン−リン酸バッファー中のＤＰバッチでは、脂質含分に応じて比較的高いＥＥ％が得られた（脂質量が２倍になると、４０％から６２％となる）。アルギニン−クエン酸バッファー中のＤＰバッチでは、脂質含分が２倍であるサンプルのＥＥ％と、脂質含分が３倍であるサンプルのＥＥ％とに、差はなかった。しかし、脂質含分が２倍または３倍から４倍となると、ＥＥ％は４０％から５１％に増加した。
【０６０６】
脂質含分が２倍であるＤＰバッチでは、２つの異なる種類のバッファーについてＥＥ％に有意差はなかった。しかし、脂質含分が３倍であるＤＰバッチおよび脂質含分が４倍であるＤＰバッチでは、アルギニン−リン酸バッファー中の製剤について、より高いＥＥ％が得られた。
【０６０７】
パラメーター調査  −  製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０５６およびＦ５３１−０３−００８Ｐ０６４
試験したバッチは、凍結乾燥前に４倍の脂質含分を有していた。この脂質濃度は過度に高く、これによってリポソームの滅菌ろ過の際に問題が生じた。再構成後、これらのバッチは、４倍、６倍または８倍の脂質含分を有していた。これらのバッチをアルギニン−クエン酸バッファー中で調製し、凍結乾燥を制御した状態で凍結乾燥させ、そして１ステップ法で再構成した。再構成後、これらのリポソーム懸濁液をクエン酸バッファーで２０倍に希釈し、直接ＶｉｖａＳｐｉｎ法（遠心分離４０００ｇ、５分）で処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ろ液の遊離タンパク質含分を分析した。これらのバッチでは、ＥＥ％を評価する際に、再構成した生成物の体積を考慮した。
【０６０８】
以下のパラメーターの影響を評価するために、製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０５６Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｊ／Ｌ／Ｍを調製した：
−  脂質含分（４倍／６倍／８倍）、
−  凍結乾燥前の充填体積、
−  バイアルのサイズ（６Ｒバイアル／２Ｒバイアル）。
【０６０９】
脂質含分の影響を確認し、かつ凍結乾燥中の凍結速度の影響を評価するために、製剤Ｆ５３１−０３−００８Ｐ０６４Ｅ１／Ｅ２／Ｆ１／Ｆ２を調製した。いずれのパラメーターによって最良のＥＥ％が得られるかを確認することだけではなく、最終バッチのバイアルのサイズ／脂質含分／充填体積／凍結速度を選択することも、これらのバッチの目的であった。
【０６１０】
【表２４】
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【０６１１】
【表２５】
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【０６１２】
凍結乾燥後、Ｐ０５６系列のバッチは、凍結乾燥試験中に生じた問題が原因でケークの浮上および相分離を示した。したがって、そのバッチについては、再構成およびＥＥ％の結果を注意深く解釈しなければならない。しかし、様々なパラメーターの影響を比較することができる。６Ｒバイアル中のサンプルはいずれも、容易に再構成することができた。塊状物は観察されなかった。しかし、製剤Ｐ０５６Ｈ／Ｌ（２Ｒバイアル中で脂質含分は６倍および８倍である）は、再構成することができなかった。これらの知見から、脂質含分が６倍および８倍である場合には、バイアルサイズが６Ｒであることが望ましいことが実証された。
【０６１３】
Ｐ０６４系列のバッチを、低速および高速の２つの異なる凍結速度で凍結乾燥した。この試験を行うために、低速での凍結に供するバイアルを凍結乾燥機の棚に載置し、０．３℃／分の速度で−４０℃まで凍結させた。これらのバイアルが凍結したらすぐに、高速での凍結に供するバイアルを、すでに−４０℃である棚に載置した。凍結乾燥後、Ｐ０６４系列のバッチはいずれも、良好なケークを示した。他のサンプルはいずれも、１分間渦状に回すことにより再構成することができた。塊状物は観察されなかった。これらの結果から、脂質含分が８倍であると、実現可能な生成物を生じさせることができないことが判明した。
【０６１４】
Ｐ０５６系列のバッチのＥＥ％の結果を、図３０に示す。バイアルのサイズによって差が生じることはないことが分かる。しかし、脂質含分は少し影響を及ぼすようであった。したがって、脂質含分の増加が影響を及ぼすことが確認された。しかしこれは、観察されたものと比べてはるかに重大性が低い。全体として、３０％のＥＥを達成することができる。
【０６１５】
例１１：安定性
リポソームＣＤ−ＲＡＰ製剤の安定性と、その対応するプラセボの安定性とを、３カ月間の安定性試験で試験した。薬物動態（ＰＫ）試験での使用が予定されている製剤を、長期／リアルタイムの保存条件（−８０℃、−２０℃および５℃）および促進保存条件（２５℃）で試験した。いずれの保存温度についても、安定性を３カ月間モニタリングした。本試験の３カ月間に、ケークの外観、ｐＨ、粒子径、主バンドのＭＷおよび主バンドの純度（ＳＤＳ−Ｐａｇｅにより測定）は、時点を変えても保存温度を変えても変化しなかった。ＣＤ−ＲＡＰ製剤に対応するプラセボは、ＣＤ−ＲＡＰ製剤との干渉を示さなかった。全体的に、本試験で得られた結果は、−８０℃、−２０℃および５℃で保存した場合に凍結乾燥したリポソームＣＤ−ＲＡＰが安定であったことを示している。−８０℃および−２０℃での保存は、５℃での保存に比べて明らかな利点を示さなかった。
【０６１６】
表１５、１６および１７に示すように、医薬製剤（ＤＰ）の製剤１つと、このＤＰ製剤に対応するプラセボ製剤１つと、の２つの製剤を、安定性試験に供した。
【０６１７】
【表２６】
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【０６１８】
【表２７】
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【０６１９】
【表２８】
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【０６２０】
安定性サンプルの保存条件および調製
製剤を、安定性キャビネットに入れた。これらの製剤を、−８０℃、−２０±５℃、５±３℃および２５±２℃の様々な安定性キャビネット内で直立位置で保存した。指示された時点で、サンプルをこれらのキャビネットから取り出し、２週間以内に分析した。分析を待つ間、サンプルを５℃で保存した。表１８に示すパラメーターおよび試験方法を用いて、これらのバッチの安定性を評価した。
【０６２１】
【表２９】
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【０６２２】
放出時に、ＤＰバッチおよびプラセボバッチのいずれも、再構成後に均質な懸濁液であった。
【０６２３】
ＣＤ−ＲＡＰ製剤およびプラセボ製剤のそれぞれについて、すべての安定性の結果を図３１に示す。
【０６２４】
１カ月間保存した後、プラセボバッチの５℃で保存したバイアルのうちの１つと、プラセボバッチの２５℃で保存したバイアルのうちの１つと、ＣＤ＿ＲＡＰ製剤の２５℃で保存した双方のバイアルにおいて、塊状物が観察された。これらの結果は、保存温度が再構成の容易性に影響を及ぼすことを示唆している。
【０６２５】
３カ月間保存した後、−８０℃で保存したサンプルは、いかなる塊状物を示さなかった。このことは、−２０℃で保存したプラセボバッチのバイアルについても同様であった。これとは対照的に、−２０℃で保存したＤＰバイアルでは塊状物が観察された。５℃および２５℃では、２本のうちそれぞれ１本のバイアルにおいて塊状物が認められ、ＤＰバッチおよびプラセボバッチの双方のバイアルにおいて塊状物が認められた。
【０６２６】
総じて、試験した生成物は再構成が困難であり、得られた懸濁液は粘稠であった。したがって、再構成後にしばしば観察される懸濁液の不均質性を、時間および温度に応じた生成物の不安定性の結果として生じたものであると結論付けることは、困難である。
【０６２７】
粒子径
再構成後のリポソームの粒子径を、放出時にのみＤＬＳにより測定した。ｚ平均は、ＤＰバッチおよびプラセボバッチではそれぞれ、２．９μｍおよび３．６μｍであった。これは、レーザー回折法によって得られた結果（ＤＰバッチおよびプラセボバッチについてそれぞれＤ（０．５）３．９μｍおよび４．０μｍ）と同様の範囲である。粒子径分布は、ＤＰバッチＰ０８２Ｋの２峰性分布を示していた。プラセボバッチＰ０８２Ｌの場合には、粒子径分布からさらに、分析した２本のバイアルのうちの一方に小さなリポソームが存在することが分かった。多分散指数（ＰｄＩ）はブロードであり（双方のバッチで０．４）、これは常に、多峰性粒子径分布であることの証拠となる。放出時の粒子径は、ＤＰバッチとプラセボバッチとで類似しており、試験全体を通して一定のままであった。このことは、再構成後の塊状物の存在（上記参照）が、バッチの粒子径に影響を与えなかったことを示唆している。
【０６２８】
ｐＨ
様々な温度で６カ月間保存した後のｐＨの変化は、どちらの製剤においても観察されなかった。サンプルのｐＨは、ＣＤ−ＲＡＰ製剤およびプラセボ製剤についてそれぞれ６．２および６．１のままであった。
【０６２９】
全タンパク質含分
抽出法により求めた全タンパク質含分
試験中、生成物を−８０℃、−２０℃および５℃で保存した際の全ＣＤ−ＲＡＰ含分は、３．９±０．２ｍｇ／ｍｌであった。１つの例外は、−２０℃で１カ月間保存したバイアルであり、これは、２．８ｍｇ／ｍｌという、比較的低い全タンパク質含分を示していた。この結果は、異常値である可能性がある。実際に、全ＣＤ−ＲＡＰ含分は、ｔ＝３カ月で３．９ｍｇ／ｍｌに戻った。さらに、ケーク体積法を用いて同一のバイアル中で測定した全ＣＤ−ＲＡＰ含分は、放出時に得られた結果（３．８ｍｇ／ｍｌ）と同等の結果を示した。
【０６３０】
２５℃で保存したサンプルは、より低温で保存したサンプルよりも低い全タンパク質含分（３．５ｍｇ／ｍｌ）を示した。所与のバッチにおいては全タンパク質含分は一定のままであるはずのため、「そのままの」含分の減少は、ＣＤ−ＲＡＰの分解によってしか生じえない結果であり、これによってＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％が減少する。本試験で得られた結果は、これが事実であったことを示している。所与の時点での、−２０℃で保存したサンプルのＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％と、２５℃で保存したサンプルのＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％とを比較すると、ＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％は、ｔ＝１カ月で７６％から７０％に減少し、ｔ＝３カ月で７０％から６３％に減少したことが判明した。
【０６３１】
ケーク体積法により求めた全タンパク質含分
全ＣＤ−ＲＡＰ含分は、試験全体を通じて３．９±０．３ｍｇ／ｍｌであった。抽出法で得られた結果とは対照的に、保存温度は全ＣＤ−ＲＡＰ含分に影響を及ぼさなかった。このことは、この方法では「そのままの」含分を用いはするが、対照標準として理論上のＣＤ−ＲＡＰ濃度を用いるという事実を考慮すると、予想されたものである。この理論上の濃度は、バイアル１本あたりに充填されるタンパク質溶液の量と、再構成体積とに依存する。
【０６３２】
遊離ＣＤ−ＲＡＰ含分
生成物を−８０℃、−２０℃および５℃で保存した場合、遊離ＣＤ−ＲＡＰ含分は、試験全体を通じて２．６±０．３ｍｇ／ｍｌであった。
【０６３３】
２５℃で保存したサンプルは、より低温で保存したサンプルよりも低い遊離タンパク質含分（２．２〜２．３ｍｇ／ｍｌ）を示した。抽出法で得られた全タンパク質含分の結果で観察されたのと同様に、「そのままの」遊離タンパク質含分の減少は、ＣＤ−ＲＡＰの分解によって生じた結果であり、これによって、ＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％が減少する。このことは特に、３カ月間保存した後について該当し、この場合、遊離タンパク質含分は、５℃での２．７ｍｇ／ｍｌ（ＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積７７％）から、２５℃での２．３ｍｇ／ｍｌ（ＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積６９％）に減少した。これらの結果は、全タンパク質含分法で得られた結果を支持するとともに、凍結乾燥したリポソームＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰが、５℃以下の温度で少なくとも３カ月間安定であるが、２５℃で保存した場合には１カ月未満しか安定でないことを示唆している。
【０６３４】
封入率
以下の式を用いて、封入率（ＥＥ％）を算出した：
ＥＥ％＝１００−［遊離タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）／全タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）×１００］。
【０６３５】
この算出では、全タンパク質含分を、抽出法またはケーク体積法のいずれかによって得ることができる。遊離タンパク質含分、全タンパク質含分および図３０に示すＥＥ％値は、各時点で分析した２本のバイアルから得られた平均値であることに留意すべきである。このため、図３０に示す平均データを用いたＥＥ％の算出によって、示されたデータとわずかに異なる結果が生じる場合がある。
【０６３６】
抽出法に基づく全タンパク質含分を用いたＥＥ％
放出時、ＥＥ％は、３３％であった。このＥＥ％は、−２０℃で１カ月間保存して１１％という比較的低いＥＥ％を示したバイアルを除いて、試験全体を通じて一定（３０〜３８％）のままであった。この比較的低いＥＥ％は、これらのサンプルで得られた全タンパク質含分が比較的低かったことの結果として生じたものであり、異常値である可能性がある。ＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％の減少が観察された、２５℃で保存したサンプルであっても、ＥＥ％は一定のままであった。このことは、これらのサンプルでは遊離タンパク質含分と「そのままの」全タンパク質含分とがどちらも減少し、その結果、比較的ＥＥ％に変化が見られなかったという事実によって説明がつく。
【０６３７】
ケーク体積法に基づく全タンパク質含分を用いたＥＥ％
放出時に、ＥＥ％は、３３％であった。このＥＥ％は、生成物を−８０℃、−２０℃および５℃で保存した場合に、試験全体を通じて一定（３０〜３７％）のままであった。１つの例外は、−８０℃で３カ月間保存したバイアルであり、これは、比較的低い２０％というＥＥ％を示した。このことは、遊離ＣＤ−ＲＡＰがわずかに高い（２．９ｍｇ／ｍｌ）ことと、全ＣＤ−ＲＡＰがわずかに低い（３．６ｍｇ／ｍｌ）こととが組み合わさることによって生じた可能性があり、これによって、封入されるタンパク質のレベルが低下する。
【０６３８】
２５℃で保存したサンプルでは、放出と比較してより高いＥＥ％が得られた（ｔ＝１カ月およびｔ＝３カ月でそれぞれ４０％および４４％）。このことは、これらのサンプル中の「そのままの」遊離ＣＤ−ＲＡＰ含分が低い（２．２〜２．３ｍｇ／ｍｌ）ことと、「そのまま」測定されるわけではない全タンパク質含分との組み合わせによって生じた結果である。その結果、ＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％の減少による遊離ＣＤ−ＲＡＰの減少は、全ＣＤ−ＲＡＰの減少によっても補償されず、より高いＥＥ％が得られた。
【０６３９】
総括すると、これらの結果は、ＥＥ％の結果が、全タンパク質含分を得るために使用する分析方法に依存することを示している。不安定性が観察された場合（すなわちＣＤ−ＲＡＰ主ピーク面積％が減少する場合）には、抽出に基づく全タンパク質含分法によって、より正確なＥＥ％の結果が得られる。なぜならば、測定される含分は、遊離タンパク質含分について観察されるものと同様に「そのまま」低下するためである。
【０６４０】
全体として、本試験で判明したＥＥ％の変化は、方法上のばらつきおよび／または全タンパク質含分の分析方法の選択によって生じたものであり、全体として見ると、ＥＥ％の変化は、いずれの温度でも３カ月間観察されなかったと結論付けることができる。
【０６４１】
重量オスモル濃度
リポソームＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰバッチおよびプラセボバッチの重量オスモル濃度を、放出時にのみ分析した。結果は、ＤＰバッチおよびプラセボバッチについて、それぞれ２７０ｍＯｓｍ／ｋｇおよび２５３ｍＯｓｍ／ｋｇであった。
【０６４２】
残留含水率
凍結乾燥させたリポソームＣＤ−ＲＡＰ  ＤＰバッチおよびプラセボバッチの残留含水率を、放出時およびｔ＝３カ月に分析した。含水率は、保存温度および時間と相関関係にある傾向を示した。放出時に認められた値（ＤＰバッチおよびプラセボバッチについてそれぞれ０．１５％および０．１１％）は、ｔ＝３カ月でわずかに増加した。この増加の程度は、保存温度と相関関係にあった。３カ月後、−８０℃および−２０℃で保存したサンプルは、ｔ＝０と比較して有意差を示さなかった。しかし、５℃および２５℃で保存したサンプルは、同一の期間にそれぞれ０．０８％および０．１６〜０．１７％の含水率の増加を示した。本試験で使用した容器は水蒸気を透過させないことが知られているため、これらの結果についての考えうる説明の１つとして、栓の中に存在する水がケークに拡散したことが挙げられる。これを防ぐために、より十分に乾燥させた栓を使用して、この後のバッチを調製することができる。全体として、含水率の増加はわずかであり、３カ月後に含水率は最大で０．３％であった。
【０６４３】
ＴＶＡＣ
混釈平板法を用いて、放出時にのみＴＶＡＣを測定した。ＤＰバッチおよびプラセボバッチについての結果は、１ＣＦＵ／１ｍｌ未満および１ＣＦＵ／５ｍｌ未満であり、これは標準規定内であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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