(57)【要約】  選択されたゲノム遺伝子座でのＤＮＡメチル化の変化に基づいて対象において膀胱癌を同定するための方法およびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象において膀胱癌を同定する方法であって、
（ａ）前記対象から採取された尿試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に適用して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得ること、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから配列番号１に記載の遺伝子座を含む少なくとも１つの制限遺伝子座と、制御遺伝子座とを同時に増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成すること、
（ｃ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座と制御遺伝子座のそれぞれの増幅産物のシグナル強度間の比率を算出すること、および
（ｄ）対応する膀胱癌基準比率に関して前記比率の高確率スコアを検出し、それによって前記ヒト対象において膀胱癌を同定することを含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が配列番号５に記載の遺伝子座をさらに含み、対応する膀胱癌の基準比率に関して、前記高確率スコアが配列番号１の比率と配列番号５の比率との高複合確率スコアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が配列番号７に記載の遺伝子座と、配列番号１１に記載の遺伝子座とをさらに含み、対応する膀胱癌の基準比率に関して、前記高確率スコアが前記配列番号１の比率と、前記配列番号５の比率と、配列番号７の比率と、配列番号１１の比率との高複合確率スコアである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５に記載の遺伝子座の群から選択される少なくとも１つの追加の制限遺伝子座をさらに含み、対応する膀胱癌基準比率に関して、前記高確率スコアが前記配列番号１の比率、配列番号５の比率、配列番号７の比率と配列番号１１の比率、および前記少なくとも１つの追加の制限遺伝子座の少なくとも１つの追加の比率の高複合確率スコアである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの追加の制限遺伝子座が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５に記載の遺伝子座を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非ヒトＤＮＡ配列を含む第１および第２の対照コンストラクトを提供することであって、前記第１の対照コンストラクトが前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いたＤＮＡ配列を含み、および前記第２の対照コンストラクトが前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含有し、かつ完全に非メチル化状態であるＤＮＡ配列を含む、対照コンストラクトを提供すること、
前記第１および第２の対照コンストラクトを前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化すること、および
前記第１および第２の対照コンストラクトを増幅することをさらに含み、
前記第１のコンストラクトの適切な増幅と、前記第２のコンストラクトの低増幅または増幅の非存在との同時の検出はＤＮＡ消化が適当であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、Ａｃｉｌ、ＡＣＩＩ、Ａｆｅｌ、Ａｇｅｌ、Ａｐａｌ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓＩＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺｌ７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉｎｆｌ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡｌＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｃＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓａ１１、Ｓａ１Ｉ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＨｈａＩである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１Ｉである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記制御遺伝子座が前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いた遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記制御遺伝子座が配列番号１６に記載の遺伝子座である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）がリアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物を特異的に検出するために蛍光プローブを加えることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記制御遺伝子座のそれぞれの増幅産物のシグナル強度間の比率を前記算出することが各遺伝子座に対する定量化サイクル（Ｃｑ）を決定すること、および２（Ｃｑ制御遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を算出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記対応する膀胱癌基準比率が２（Ｃｑ制御遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）であり、前記基準ＤＮＡが膀胱癌ＤＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
健康な対象由来のＤＮＡ中の少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の健康な基準比率を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
対応する健康な基準比率に関して前記比率の低確率スコアを検出することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記膀胱癌が移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫および小細胞癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記膀胱癌が移行上皮癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
それを必要とする対象において膀胱癌を処置する方法であって、請求項１に記載の方法に従って膀胱癌を同定すること、および前記対象に抗癌療法を実施することを含む、方法。
【請求項２２】
前記抗癌療法が外科手術、放射線療法、化学療法および免疫療法のうちの１または複数を含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そこから由来する生体試料を分析することによって、対象において膀胱癌を同定する方法に関する。より詳しくは、本発明は、尿試料からのＤＮＡを解析することによる膀胱癌の同定に関する。本方法は、正常なＤＮＡと膀胱癌ＤＮＡとの間のＤＮＡメチル化の差異に基づいている。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は、膀胱の細胞から生ずる癌である。大部分の膀胱癌は移行上皮癌であり、膀胱（尿路上皮）の内膜の上皮細胞から生じる。他の種類の膀胱癌としては、扁平上皮癌、腺癌、肉腫および小細胞癌が挙げられる。
【０００３】
膀胱癌の診断は一般に膀胱鏡検査によって行われ、同検査において膀胱は内視鏡（膀胱鏡）を使用して視覚的に検査される。生検は、通常、あらゆる癌細胞の存在を調べるために、異常が疑わしい部位から採取される。
【０００４】
膀胱癌の診断で用いられる別の方法は尿細胞診であり、同細胞診において尿試料を顕微鏡下で分析して、癌細胞の存在を検出する。種々の画像診断方法、例えばＸ線およびコンピューター断層撮影法（ＣＴ）も膀胱癌を診断するために利用されており、その一部として検査組織の可視化を可能にするために、色素を静脈内に注入することが含まれる。
【０００５】
近年、膀胱癌のための付加的な診断手段、例えば尿抗原試験および尿試料中の染色体異常を検出するためのアッセイ（ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標））が利用できるようになった。
【０００６】
現在利用できる方法にはいくつかの弱点があり、一部の方法は侵襲性であり、労力と時間を要し、一部の方法は感度と特異度が不十分である。加えて、病理学検査による診断は手動で行われており、したがって主観的である。同じ試料が異なる病理医によって分析される結果に、および同じ病理医によって異なる時期に分析される結果でさえも差異が生じることもあるので、主観的な結果には問題がある。
【０００７】
本発明の出願者に譲渡された国際公開第２０１１／００１２７４号および第２０１１／０７０４４１号は、それぞれ特異的なゲノム遺伝子座間のシグナル比に基づいて、天然の供給源からＤＮＡを同定する方法と、ＤＮＡ試料を異なる種類の組織にカテゴリー化する方法とを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それを必要とする対象において膀胱癌を診断するために、十分な訓練を受けた病理医を必要としない、特異度が高くかつ感度が高い改善された方法およびキットが未だに対処されず、必要とされている。客観的で使用者に影響されない診断方法がさらに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、一部の態様により、必要としている対象において尿試料からＤＮＡを解析することによって膀胱癌を同定するための方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットは、正常ＤＮＡおよび膀胱癌ＤＮＡで選択された遺伝子座のメチル化について両ＤＮＡ間の差異に基づいている。
【００１０】
より詳しくは、本発明の方法およびキットは、膀胱癌由来のＤＮＡにおいて高度にメチル化されているが、健康な膀胱組織由来のＤＮＡにおいてはメチル化されていないことが予想外に認められ、およびそれによって所定のＤＮＡ試料が膀胱癌患者からのものか、または健康な対象からのものかを決定する際に用いることができる一組のゲノム遺伝子座を利用する。
【００１１】
驚くべきことに、本発明の方法およびキットは、細胞診と比較して、感度が高く、少なくとも９０％の総合感度（膀胱癌の悪性度または病期が区別できない）、浸潤性腫瘍で１００％の感度、および非侵潤性腫瘍で少なくとも８９％の感度を示した。
【００１２】
本発明の方法およびキットによれば、検査対象の尿試料からのＤＮＡは、それがメチル化されていない場合のみ、その認識配列を切断する少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素で消化される。本明細書に開示され、「制限遺伝子座」と表示されている一連のゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素の認識配列を含有し、したがってそのメチル化レベルによって切断（消化）され、メチル化のレベルが高い場合、該酵素による消化は少なくなる。予想外に、健常者からのＤＮＡ試料は、本明細書に開示される一連のゲノム遺伝子座で、癌患者からのＤＮＡ試料よりも広範囲に切断される。したがって、本発明の制限遺伝子座のメチル化が高いＤＮＡ試料と、これらの遺伝子座のメチル化レベルが低いＤＮＡ試料との間の消化効率上の差異により、その後の増幅および定量化のステップにおいて異なる増幅パターンが確立される。驚くべきことに、増幅パターンの差異は、膀胱癌組織からのＤＮＡと正常な膀胱組織からのＤＮＡとを区別することを可能にする。
【００１３】
本発明の方法およびキットによる増幅および定量化のステップは、消化ＤＮＡからの少なくとも１つの制限遺伝子座と制御遺伝子座の同時増幅を含む。制御遺伝子座は、消化ステップで用いられるメチル化感受性制限酵素によって切断されない遺伝子座であり得る。次いで増幅された遺伝子座のシグナル強度は決定され、制限遺伝子および制御遺伝子座各々のシグナル強度間の比率が算出される。ここで初めて開示されることは、膀胱癌ＤＮＡと正常な膀胱ＤＮＡに対して異なるシグナル比が生成され、したがって膀胱癌の同定を可能にすることである。
【００１４】
膀胱癌の同定は、検査対象からのＤＮＡに対して算出されたシグナル比を既知の供給源、すなわち正常人および／または癌患者における同じ制限遺伝子座に対して決定された１または複数の基準比率と比較することによって行われる。この比較に基づいて、検査試料は癌患者由来、または健康な対象由来と同定される。本発明のキットおよび方法が個々の遺伝子座のメチル化レベルそれ自体の決定を必要としないことに留意する必要がある。
【００１５】
本発明の方法およびキットは尿試料を検査することによって、したがって疾患の非侵襲的分子診断法を有利に提供することによって膀胱癌の同定を可能にする。本発明の方法およびキットの別の利点は、尿試料が含み得るＤＮＡが比較的少量にもかかわらず、尿試料中で同定が行われることができることである。本明細書に開示される方法およびキットによる膀胱癌の診断によって付与されるさらなる利点は、この診断法の感度および特異度が高いことである。加えて、本明細書に記載の方法は、使用者に影響されない客観的な結果をもたらす。
【００１６】
一態様によれば、本発明はヒト対象において膀胱癌を同定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）対象から採取された尿試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に適用して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得ること、
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから配列番号１に記載の遺伝子座を含む少なくとも１つの制限遺伝子座と、制御遺伝子座とを同時に増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成すること、
（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定すること、
（ｄ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座各々の増幅産物のシグナル強度間の比率を算出すること、および
（ｅ）対応する膀胱癌基準比率に関して前記比率の高確率スコアを検出し、それによってヒト対象における膀胱癌を同定することを含む。
【００１７】
一部の実施形態において、対応する膀胱癌基準比率に関して前記比率の高確率スコアを検出することは、あらかじめ定義された閾値を上回る膀胱癌基準比率に関して確率スコアを検出することを含む。
【００１８】
一部の実施形態において、少なくとも１つの制限遺伝子座は配列番号５に記載の遺伝子座をさらに含み、および対応する膀胱癌基準比率に関して、前記確率スコアは配列番号１の比率と配列番号５の比率との複合確率スコアである。
【００１９】
一部の実施形態において、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号７に記載の遺伝子座と、配列番号１１に記載の遺伝子座とをさらに含み、対応する膀胱癌基準比率に関して、前記確率スコアは前記配列番号１の比率と、前記配列番号５の比率と、配列番号７の比率と、配列番号１１の比率との複合確率スコアである。
【００２０】
一部の実施形態において、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５に記載の遺伝子座の群から選択される少なくとも１つの追加の制限遺伝子座をさらに含み、および対応する膀胱癌基準比率に関して、前記確率スコアは前記配列番号１の比率、配列番号５の比率、配列番号７の比率と配列番号１１の比率、および前記少なくとも１つの追加の制限遺伝子座の少なくとも１つの追加の比率の複合確率スコアである。
【００２１】
一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の制限遺伝子座は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５に記載のすべての遺伝子座を含む。このように、一部の実施形態において、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１〜１５に記載のすべての遺伝子座を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００２２】
一部の実施形態において、本方法は、非ヒトＤＮＡ配列を含む第１および第２の対照コンストラクトを提供することであって、第１の対照コンストラクトがメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いたＤＮＡ配列を含み、および第２の対照コンストラクトがメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含有し、かつ完全に非メチル化状態であるＤＮＡ配列を含む、対照コンストラクトを提供すること；第１および第２の対照コンストラクトをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化すること；および  
第１および第２の対照コンストラクトを増幅することをさらに含み、第１のコンストラクトの適切な増幅と、第２のコンストラクトの低増幅または増幅の非存在との同時の検出はＤＮＡ消化が適当であることを示す  。
【００２３】
一部の実施形態において、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、Ａｃｉｌ、ＡＣＩＩ、Ａｆｅｌ、Ａｇｅｌ、Ａｐａｌ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓＩＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉｎｆｌ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡｌＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｃＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓａｌｌ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００２４】
一部の実施形態において、ステップ（ａ）は１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。一部の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩである。
【００２５】
一部の実施形態において、ステップ（ａ）は１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。一部の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｉｎＰ１Ｉである。
【００２６】
一部の実施形態において、制御遺伝子座はメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いた遺伝子座である。
【００２７】
一部の実施形態において、制御遺伝子座は、配列番号１６に記載の遺伝子座である。
【００２８】
一部の実施形態において、ステップ（ｂ）はリアルタイムＰＣＲを用いて行われる。
【００２９】
一部の実施形態において、ステップ（ｂ）はリアルタイムＰＣＲを用いて行われ、および本方法は少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座の増幅産物を特異的に検出するために蛍光プローブを加えることをさらに含む。
【００３０】
一部の実施形態において、ステップ（ｂ）はリアルタイムＰＣＲを用いて行われ、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座各々の増幅産物のシグナル強度間の比率を前記算出することは、各遺伝子座に対する定量化サイクル（Ｃｑ）を決定すること、および２（Ｃｑ制御遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を算出することを含む。一部の実施形態において、対応する膀胱癌基準比率は、２（基準ＤＮＡ中のＣｑ制御遺伝子座−基準ＤＮＡ中のＣｑ制限遺伝子座）であり、基準ＤＮＡは膀胱癌ＤＮＡである。
【００３１】
一部の実施形態において、本方法は、健康な対象由来のＤＮＡ中の少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の健康な基準比率を提供することをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は対応する健康な基準比率に関して前記比率の低確率スコアを検出することをさらに含む。
【００３２】
一部の実施形態において、前記膀胱癌は、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫および小細胞癌からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００３３】
一部の特定の実施形態において、前記膀胱癌は移行上皮癌である。
【００３４】
別の一態様によれば、本発明は、それを必要とする対象において膀胱癌を処置する方法を提供し、該方法は本発明の方法に従って膀胱癌を同定すること、および前記対象に抗癌療法を実施することを含む。
【００３５】
一部の実施形態において、前記抗癌療法は、外科手術、放射線療法、化学療法および免疫療法のうちの１または複数を含む。
【００３６】
さらに別の一態様によれば、本発明は、膀胱癌を有する疑いのあるヒト対象においてＤＮＡのメチル化比率を測定する方法を提供し、該方法は、（ａ）対象の尿試料からＤＮＡ試料を得ること、およびこのＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけて、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得ること；（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから配列番号１に記載の遺伝子座を含む少なくとも１つの制限遺伝子座と、制御遺伝子座とを同時に増幅し、それによって各遺伝子座に対する増幅産物を生成すること；および（ｃ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座と、前記制御遺伝子座のシグナル強度の比率を膀胱癌ＤＮＡ中の前記遺伝子座の基準比率と比較するため、それによって前記比率が膀胱癌を示すかどうかを評価するためにコンピューターを使用することを含む。
【００３７】
本発明のこれらの態様およびさらなる態様は、以下の発明を実施するための形態、実施例および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】健康な対象からの試料中の制御遺伝子座および２つの制限遺伝子座の代表的な増幅プロットを示す。
【図１Ｂ】癌患者からの試料中の制御遺伝子座および２つの制限遺伝子座の代表的な増幅プロットを示す。
【図２】本発明の一部の実施形態に従って対象において膀胱癌を同定する方法を説明するフローチャートを示す。
【図３Ａ】代表的な試験における９０％の総合感度を表している円グラフである。
【図３Ｂ】代表的な試験における８３％の総合特異度を表している円グラフである。
【図４Ａ】膀胱癌病期に関して代表的な試験における本方法の感度を表す。
【図４Ｂ】膀胱癌悪性度に関して代表的な試験における本方法の感度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、尿試料からのＤＮＡを使用し、所定の遺伝子座でのＤＮＡメチル化の変化を検出することに基づく膀胱癌の同定に関する。
【００４０】
本発明は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素によるＤＮＡの消化に続いて、検査ＤＮＡ試料から同時増幅し、選択した遺伝子座間のシグナル強度比を算出すること、およびこれらの比を、既知の供給源、すなわち健常または膀胱癌由来の複数のＤＮＡ試料から得られた１または複数の基準比と比較することを含む。この比較に基づいて、検査試料は癌患者由来、または健康な対象由来と同定される。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「複数」という用語は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を指す。
【００４２】
本発明の方法は、非侵襲性であり、使用者に影響されない膀胱癌を診断する高感度で特異的な手段を提供し、比較的少量のＤＮＡを含有する尿試料でも実施することができるので、特に有益である。
【００４３】
さらに、癌組織と正常組織を区別するためにメチル化分析を使用し、特定のゲノム遺伝子座で実際のメチル化レベルを決定することを必要とする従来の方法と対照的に、本明細書に記載の方法は絶対的なメチル化レベルを評価することを必要としない。したがって、本明細書に開示される方法は、メチル化レベルそれ自体の決定に関与する標準曲線および／または追加の骨の折れるステップの必要性を排除し、それによって簡単で費用効率が高い手法を提供する。メチル化を分析するための方法に対するさらなる優位性は、本発明の方法で得られるシグナル比によって付与され、該シグナル比は同じ反応混合物（すなわち、同じ反応条件下で）中の同じＤＮＡ鋳型から増幅される遺伝子座間で算出される。これは、本方法を種々の「ノイズ」因子、例えば鋳型ＤＮＡ濃度、ＰＣＲ条件の変化および抑制因子の存在に対して非感受性にする。そのようなノイズは、別々の増幅反応からのシグナルを比較することによって遺伝子座のメチル化レベルの定量化を行う既存の方法にとってつきものである。
【００４４】
一部の実施形態において、対象における膀胱癌を同定する方法を提供し、該方法は、（ａ）対象から採取された尿試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化すること；（ｂ）消化ＤＮＡ試料中の配列番号１に記載の少なくとも制限遺伝子座および制御遺伝子座を増幅すること、ここでは制御遺伝子座が膀胱癌ＤＮＡおよび健康なＤＮＡにおいて同じ消化および増幅プロファイルを示す遺伝子座であり、それによって前記ＤＮＡ試料中の各遺伝子座に対して増幅産物を生成する；（ｃ）各生成された増幅産物に対するシグナル強度を決定すること；（ｄ）前記ＤＮＡ試料中の少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物のシグンル強度間の比率を算出すること；および（ｅ）対応する膀胱癌基準比率に関して、前記比率に対して高確率スコアを検出し、それによってヒト対象において膀胱癌を同定することを含む。
【００４５】
一部の実施形態において、対応する膀胱癌基準比率に関して前記比率に対して高確率スコアを検出することは、あらかじめ定義された閾値を上回る確率スコアを検出することを含む。
【００４６】
一部の実施形態において、膀胱癌基準比率に関して高確率スコアを検出することは、比率を対応する膀胱癌基準比率と、任意選択で健康な基準比率とを比較すること、およびこの比較に基づいて確率スコアを割り当てることを含み、高確率スコアが癌を示す。
【００４７】
このように、一部の実施形態において、本発明の方法は、膀胱癌基準比率と、任意選択で健康な基準比率を提供することを含む。
【００４８】
一部の実施形態において、ステップ（ｅ）は、比率を、膀胱癌患者および健常者において決定された比率を含む基準スケールと比較することを含み、前記確率スコアは基準スケール内のその相対位置に基づいて前記比率に割り当てられるスコアである。一部の実施形態において、比率の値がより高いほど、より高いスコアがそれに割り当てられる。
【００４９】
一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｂ）において少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅し、それによって少なくとも１つの追加の制限遺伝子座に対して増幅産物を生成すること、および追加の各制限遺伝子座に対してステップ（ｃ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む。一部の実施形態において、ステップ（ｅ）では、複数の個々の確率スコアは、それらの対応する膀胱癌基準比率に関して複数の比率を得られ、各比率は異なった制限遺伝子座と制御遺伝子座との間である。複合確率スコアは、複数の確率スコアに基づいて算出される。
【００５０】
一部の実施形態において、複合スコアは、平均スコアであり得る。他の実施形態において、複合スコアは、個々の確率スコアの加重平均であり得る。一部の実施形態において、複合スコアは、すべての個々の確率スコアの合計であり得る。一般に、複合スコアは、すべての個々の確率スコアを表す任意の数学的値または統計値も包含し得る。
【００５１】
一部の実施形態において、高複合確率スコアを検出することで、ヒト対象において膀胱癌を同定する。一部の実施形態において、高複合確率スコアを検出することは、あらかじめ定義された閾値を上回る複合確率スコアを検出することである。
【００５２】
「からのＤＮＡ」、「由来のＤＮＡ」、「内のＤＮＡ」などの用語は、同じ意味で用いられ、尿試料から得られたＤＮＡ、尿試料から単離されたＤＮＡもしくはすなわち尿試料そのまま、ＤＮＡ含有尿試料、またはそれとともにＤＮＡ試料を指す。このように、これらの用語には、尿試料から単離されたＤＮＡ、ＤＮＡを濃縮した尿試料および非処置尿試料が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
ヒトゲノムにおけるメチル化は、５−メチルシトシンの形で生じ、配列ＣＧの一部であるシトシン残基に限局し、ＣｐＧジヌクレオチド（他の配列の一部であるシトシン残基はメチル化されてない）としても表示される。ヒトゲノムにおける一部のＣＧジヌクレオチドはメチル化状態であり、他はメチル化状態ではない。加えて、メチル化は細胞および組織特異的であり、したがって特異的ＣＧジヌクレオチドは特定の細胞内でメチル化し、同時に異なる細胞内でメチル化されず、または特定の組織内でメチル化し、同時に異なる組織内でメチル化されないことがあり得る。ＤＮＡメチル化は、遺伝子転写の重要な調節因子である。異常なＤＮＡメチル化パターン、すなわち正常組織と比較して高メチル化および低メチル化の両方は、多数のヒト悪性腫瘍と関連していた。
【００５４】
「膀胱癌」という用語は、膀胱内の細胞から生じる癌を指す。本明細書で用いる膀胱癌には、移行上皮癌（ＴＣＣ、尿路上皮細胞癌とも呼ばれる）、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌および肉腫が含まれる。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００５５】
膀胱（尿路上皮）の内膜の上皮細胞から生じるＴＣＣは、症例の９０％以上を占める最も一般的な膀胱癌である。ＴＣＣは一般的に２種類のサブタイプである乳頭状癌および平坦型癌を含み、乳頭状癌は膀胱の内面から中空の中心に向かって細長い指様突出物で増殖する腫瘍であり、平坦型癌は膀胱の中空部に向かって増殖しない腫瘍である。扁平上皮癌および腺癌は、あまり一般的でない種類の膀胱癌であり、小細胞癌および肉腫は比較的まれである。
【００５６】
膀胱癌は一般的に、さらに非浸潤性または浸潤性のいずれかとして分類され、非浸潤性は、癌細胞が移行上皮の内層に限局し、浸潤性は、癌細胞が膀胱の粘膜固有層またはさらに深く筋層内へ増殖する。膀胱癌は、表在性浸潤性または筋層非浸潤性と記述されることもある。これらの用語には、非浸潤性腫瘍ならびに膀胱の主筋層まで増殖しなかったどのような浸潤性腫瘍の両方が含まれる。
【００５７】
膀胱癌の一般的な分類の１つには、主腫瘍が膀胱壁内に（または膀胱壁を越えて）どの程度増幅したかを記述するＴカテゴリーがある。一般的に、膀胱癌は尿路上皮中で発生し、癌が増殖すると、膀胱内の他の層内に浸潤する可能性があり、このようにさらに進行していく。Ｔカテゴリーによる分類は、以下の用語を含む。
Ｔ０：原発腫瘍の所見はない
Ｔａ：非浸潤性乳頭状癌
ＴｉｓまたはＣＩＳ：非浸潤性平坦型癌（平坦型上皮内癌）
Ｔ１：腫瘍は、膀胱の内側を覆っている細胞層から下の結合組織まで拡大している。腫瘍は膀胱の筋層まで拡大していない。
Ｔ２：腫瘍は、筋層まで拡大している。
Ｔ２ａ：腫瘍は、筋層の内側半ばだけに拡大している。
Ｔ２ｂ：腫瘍は、筋層の外側半ばまで拡大している。
Ｔ３：腫瘍は、膀胱の筋層を貫通して、その周囲の脂肪組織層まで拡大している。
Ｔ３ａ：脂肪組織への拡散は、顕微鏡を用いてのみ認められる。
Ｔ３ｂ：脂肪組織への拡散は、画像診断検査で認められる、または外科医によって認められる、もしくは触知されるのに十分な大きさである。
Ｔ４：腫瘍は脂肪組織を越えて、近接臓器または組織まで拡散している。腫瘍は以下のいずれかまで拡大し得る：前立腺の間質（主組織）、精嚢、子宮、膣、骨盤壁または腹壁。
Ｔ４ａ：腫瘍は、前立腺の間質（男性において）に、または子宮および／または膣（女性において）に拡散している。
Ｔ４ｂ：腫瘍は、骨盤壁または腹壁まで拡散している。
【００５８】
膀胱癌をその悪性度（Ｇ）によって記述することも一般的であり、顕微鏡下で見たときの健康な細胞への癌細胞の類似性を表す。健康な組織は、通常、種々の種類のグループ分けした細胞を含有する。癌が健康な組織と類似しているように見え、かつ異なる細胞集団を含有している場合、分化型腫瘍または低悪性度腫瘍と呼ばれる。癌組織が健康な組織と極めて異なるように見える場合、低分化型腫瘍または高悪性度腫瘍と呼ばれる。
【００５９】
泌尿器外科医は、悪性度に基づいて処置を計画するために、以下のカテゴリーを用いて、腫瘍が再発する、または進行する（拡大および拡散する）機会に基づいて腫瘍の悪性度を分類することもある：
乳頭腫（または低悪性度の良性乳頭状尿路上皮性新生物；ＰＵＮＬＭＰ）−再発することもあるが、進行するリスクは低い。
低悪性度：ＰＵＮＬＭＰと比較すると、再発し、進行する可能性がある。
高悪性度：再発し、進行する可能性が最も高い。
【００６０】
膀胱癌は、時には、膀胱の多くの部位に同時に影響を及ぼし得る。２つ以上の腫瘍が見つかった場合、文字ｍを該当するＴカテゴリーに付け加える。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「膀胱癌の同定」、「対象における膀胱癌を同定する」および「対象を膀胱癌を有すると同定する」という用語は、同じ意味で用いられ、対象において膀胱癌を選別すること、膀胱癌の存在を検出すること、膀胱癌の再発を検出すること、膀胱癌に対する感受性を検出すること、膀胱癌の処置に対する抵抗性を検出すること、膀胱癌に対する処置の有効性を検出すること、膀胱癌の病期（重症度）を決定すること、膀胱癌の予後を決定すること、および膀胱癌の早期診断のうちのいずれか１つまたは複数を包含する。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００６２】
本明細書で用いる場合「対象」という用語は、「個人」と同じ意味で用いられ、ヒト対象を指す。対象は、膀胱癌の疑いがあり得る。一部の実施形態において、対象は、例えば、疾患の既往歴、遺伝的素因および／または家族歴に基づいて膀胱癌を発症する危険にさらされていることもあり得、どのような２種類以上の発癌質、職業上の危険、環境破壊に曝されていた対象、および／または癌の疑わしい臨床徴候を示す対象であり得る。一部の実施形態において、対象は膀胱癌の少なくとも１つの症状または特徴、例えば血尿、排尿頻度の変化、貧血、全身の脱力感または過敏症状を示すことがある。他の実施形態において、対象は無症状であり得る。
【００６３】
尿採取および処理
一部の実施形態において、尿試料は従来の採取容器または管を用いて対象から採取されてもよい。
【００６４】
一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、当技術分野で周知の方法によって尿試料から抽出さることができる。代表的な手法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２に記載されている。
【００６５】
ＤＮＡ消化
本発明の方法によれば、尿試料からのＤＮＡは、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えば１、２、３のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受ける。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００６６】
一部の実施形態において、尿試料から抽出される全ＤＮＡは消化ステップで使用される。一部の実施形態において、ＤＮＡは、消化を受ける前に定量化されない。他の実施形態において、ＤＮＡはその消化の前に定量化されることもあり得る。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「制限酵素」と同じ意味で用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」は、制限部位として知られている特定の認識ヌクレオチド配列でまたはその近辺でＤＮＡを切断する酵素を指す。
【００６８】
「メチル化感受性」制限エンドヌクレアーゼは、それがメチル化状態でない（一方、メチル化部位は原形を保っている）場合のみ、その認識配列を切断する制限エンドヌクレアーゼである。このように、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化の程度は、メチル化レベルに依存し、高メチル化レベルは切断から保護され、したがって結果として消化が少ない。
【００６９】
一部の実施形態において、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、Ａｃｉｌ、ＡＣＩＩ、Ａｆｅｌ、Ａｇｅｌ、Ａｐａｌ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓＩＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉｎｆｌ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡｌＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｃＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓａ１１、Ｓａ１Ｉ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択されてもよい。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００７０】
一部の実施形態において、尿試料は１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受けることができる。一部の特定の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｈａＩであり得る。
【００７１】
一部の実施形態において、尿試料は１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化を受けることができる。一部の特定の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１Ｉであり得る。
【００７２】
一部の実施形態において、ＤＮＡ消化は、完全消化まで行われ得る。一部の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり得、完全消化は３７℃で酵素とともに１〜２時間インキュベーションした後に達成され得る。
【００７３】
一部の実施形態において、ＤＮＡ消化は、完全消化まで行われ得る。一部の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｉｎＰ１Ｉであり得、完全消化は３７℃で酵素とともに１〜２時間インキュベーションした後に達成され得る。
【００７４】
ゲノム遺伝子座の増幅
本明細書で用いる場合、「ゲノム遺伝子座」または「遺伝子座」という用語は、同じ意味で用いられ、染色体上の特定の位置でのＤＮＡ配列を指す。特定の位置は、分子位置によって、すなわち染色体上の開始塩基対と終了塩基対の数によって同定されることができる。所定のゲノム位置のＤＮＡ配列の変異体は、対立遺伝子と呼ばれている。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同一の部位に位置する。遺伝子座には、遺伝子配列ならびに他の遺伝因子（例えば、遺伝子間配列）が含まれる。
【００７５】
本明細書で「制限遺伝子座」を用いて、本方法で使用されるメチル化感受性制限酵素の認識配列を含有する遺伝子座を記述する。
【００７６】
「制御遺伝子座」および「内部基準遺伝子座」は、本明細書で同じ意味で用いて、消化ステップで適用される制限酵素による消化が癌の存在または非存在に影響されない遺伝子座を記述する。一部の実施形態において、制御遺伝子座は、膀胱癌および健康な組織において同じ消化および増幅プロファイルを示す遺伝子座である。一部の実施形態において、制御遺伝子座は、消化ステップで適用される制限酵素の認識配列を欠いた遺伝子座である。有利には、制御遺伝子座は内部遺伝子座、すなわち解析されたＤＮＡ試料内の遺伝子座であり、したがって内部／追加の対照試料の必要性をなくす。
【００７７】
一部の実施形態において、１つの制限遺伝子座または複数の制限遺伝子座は、以下のように、配列番号１〜１５に記載のいずれか１または複数の遺伝子座を含む：
配列番号１は第１７番染色体上の６５６７６３５９〜６５６７６４１８位に対応する（ＫＣＮＪ２遺伝子）；
配列番号２は第９番染色体上の２１９５８４４６〜２１９５８５８５位に対応する（ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子）；
配列番号３は第６番染色体上の３３６８４４〜３３６９０３位に対応する（ＩＲＦ４遺伝子）；
配列番号４は、第２１番染色体上の３３３１９５０７〜３３３１９６３６位に対応する（Ｏｌｉｇ２遺伝子）；
配列番号５は、第６番染色体上の１６６５０２１５１〜１６６５０２２２０位に対応する（遺伝子間領域）；
配列番号６は、第１８番染色体上の８９６９０２〜８９７０３１位に対応する（ＡＤＣＹＡＰ１遺伝子）；
配列番号７は、第５番染色体上の３２７４７８７３〜３２７４８０２２位に対応する（ＮＰＲ３遺伝子）；
配列番号８は、第６番染色体上の２７９４９１９５〜２７９４９２６４位に対応する（遺伝子間領域）；
配列番号９は、第７番染色体上の２７１９１６０３〜２７１９１６７２位に対応する（ＨＯＸＡ９遺伝子）；
配列番号１０は、第１６番染色体上の１７０１７０３０２〜１７０１７０３６１位に対応する（遺伝子間領域）；
配列番号１１は、第１５番染色体上の３０７９７７３７〜３０７９７８７６位に対応する（遺伝子間領域）；
配列番号１２は、第１番染色体上の７９３６７６７〜７９３６８６６位に対応する（遺伝子間領域）；
配列番号１３は、第１番染色体上の１７００７７５６５〜１７００７７６３４位に対応する（ＤＮＭ３遺伝子）；
配列番号１４は、第２番染色体上の１７２７５９２〜１７２７６６１位に対応する（ＰＸＤＮ遺伝子）；および
配列番号１５は、第８番染色体上の７２９１９０９２〜７２９１９２３１位に対応する（ＭＳＣ遺伝子）。
【００７８】
予想外に、配列番号１〜１５に記載の制限遺伝子座は、癌性膀胱組織と正常な膀胱組織との間で特異的にメチル化されることが本発明の本発明者らによって同定された。より詳しくは、これらの遺伝子座は、正常組織と比較して膀胱癌組織でメチル化が増加していた。
【００７９】
これらの遺伝子座の各々は、正常な非癌性膀胱組織からのＤＮＡと比較して、癌性膀胱組織からのＤＮＡにおいてよりメチル化されるＣＧジヌクレオチドを含有する。有利には、特異的にメチル化されたＣＧジヌクレオチドは、メチル化感受性制限酵素の認識部位内に位置する。
【００８０】
一部の実施形態において、これらの遺伝子座の各々はメチル化感受性制限酵素の少なくとも１つの制限部位を含有することができ、そこでＣＧジヌクレオチドは正常細胞中よりも膀胱癌細胞中でよりメチル化され、正常組織と比較すると、癌性組織において、より多くの細胞がこの位置でメチル化を含有することを意味する。一部の実施形態において、これらの遺伝子座の各々は、少なくとも１つのＨｈａＩ制限部位（ＧＣＧＣ）を含有し得る。一部の実施形態において、これらの遺伝子座の各々は、少なくとも１つのＨｉｎＰ１Ｉ制限部位を含有し得る。遺伝子座位がメチル化状態でない場合のみ、メチル化感受性制限酵素は、認識配列を切断する。このように、制限部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化状態であるＤＮＡ分子を高いパーセンテージで含有するＤＮＡ試料は、ＣＧジヌクレオチドがメチル化状態でないＤＮＡ分子を高いパーセンテージで含有するＤＮＡ試料と比較して、比較的低い程度まで消化される。本明細書に開示される方法に基づいて、メチル化感受性制限酵素によるＤＮＡ消化は、正常人（健常者）からのＤＮＡと比較して、膀胱癌患者の尿試料からのＤＮＡに対してより狭い範囲にわたる。驚くべきことに、消化効率の差によって以降の増幅および定量化ステップにおいて異なる増幅パターンが確立され、これにより癌性膀胱組織からのＤＮＡと正常な膀胱組織からのＤＮＡを区別することを可能にすることが判明した。
【００８１】
一部の実施形態において、配列番号１〜１５に記載の遺伝子座の各々は、追加のＣＧジヌクレオチドを含有することができ、該ＣＧジヌクレオチドのメチル化状態はアッセイに関連性または影響がなく、制限酵素（例えばＨｈａＩまたはＨｉｎＰ１Ｉ）の認識配列でのメチル化だけが関連性がある。
【００８２】
一部の実施形態において、制御遺伝子座は配列番号１６に記載されており、第７番染色体上の１２１３８０８５４〜１２１３８０９１３位（遺伝子間領域）に対応する。一部の実施形態において、内部基準遺伝子座とも呼ばれる制御遺伝子座は、制限酵素の認識配列を含有しない。一部の実施形態において、ＤＮＡ試料がメチル化感受性制限酵素で消化される場合、制御遺伝子座の配列は（そのメチル化状態に関係なく）原形を保っている。
【００８３】
一部の実施形態において、制御遺伝子座の配列は、膀胱癌組織および健康な膀胱組織において同じ消化および増幅プロファイルを示す。
【００８４】
一部の実施形態において、制御遺伝子座は配列番号１６に記載の遺伝子座を含み、メチル化感受性制限酵素による消化に続く制御遺伝子座の増幅パターンはメチル化によって影響を受けない。
【００８５】
膀胱癌患者の尿試料と健常者の尿試料を区別するために配列番号１〜１５に記載の制限遺伝子座を用いる利点は、メチル化感受性制限酵素ＨｈａＩとＨｉｎＰ１Ｉを用いて次の通り例示する。ＨｈａＩまたはＨｉｎＰ１Ｉによる消化に続いてこれらの制限遺伝子座および配列番号１６に記載の制御遺伝子座の各々の増幅は、癌患者および健常者の大規模なグループで行った。制限遺伝子座および制御遺伝子座の各々の増幅産物間のシグナル比を算出すると、対照群と比較して、癌群においてかなり高い平均シグナル比（少なくとも一桁高い）を示した。
【００８６】
一部の実施形態において、本方法は、ＤＮＡ試料の消化に続いて少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つのゲノム遺伝子座を増幅することを含む。
【００８７】
本明細書で用いる場合、「少なくとも１つの（制限／制御）遺伝子座」は、単一の遺伝子座または複数の別々の遺伝子座を包含することができ、その結果「配列番号１に記載の遺伝子座および配列番号２に記載の遺伝子座を含む少なくとも１つの制御遺伝子座」などの語句は、少なくともこれらの２つの別々のゲノム遺伝子座が増幅されることを示す。
【００８８】
一部の実施形態において、本方法は、配列番号１に記載の制限遺伝子座と制御遺伝子座、および任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【００８９】
一部の実施形態において、本方法は、配列番号１に記載の制限遺伝子座および配列番号１６に記載の制御遺伝子座を増幅することを含む。
【００９０】
一部の実施形態において、本方法は複数の制限遺伝子座（すなわち、少なくとも２つの制限遺伝子座）および制御遺伝子座を増幅することを含む。
【００９１】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１に記載の制限遺伝子座および配列番号５に記載の制限遺伝子座を含む。一部の実施形態において、本方法は、配列番号１に記載の第１の制限遺伝子座を増幅することを含み、かつ配列番号５に記載の第２の制限遺伝子座を増幅することをさらに含む。
【００９２】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号７および配列番号１１に記載の遺伝子座から選択される少なくとも１つの制限遺伝子座をさらに含む。一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、それぞれ配列番号７および１１に記載の第３および第４の制限遺伝子座をさらに含む。
【００９３】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５から成る群から選択される少なくとも１つの追加の制限遺伝子座をさらに含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００９４】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１に記載の遺伝子座を含み、かつ配列番号２〜１５からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１，１２、１３または１４の追加の制限遺伝子座をさらに含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００９５】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１および５に記載の遺伝子座を含み、かつ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１，１２または１３の追加の制限遺伝子座をさらに含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００９６】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１、５および７に記載の遺伝子座を含み、かつ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１または１２の追加の制限遺伝子座をさらに含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００９７】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１、５、７および１１に記載の遺伝子座を含み、かつ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０または１１の追加の制限遺伝子座をさらに含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００９８】
一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１〜１５に記載の制限遺伝子座を含む。一部の実施形態において、複数の制限遺伝子座は、配列番号１〜１５に記載の制限遺伝子座からなる。一部の実施形態において、本方法は、配列番号１〜１５に記載の複数の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「増幅」とは、興味のある１または複数の特定の核酸標的のコピー数の増加を指す。当技術分野で周知のように、増幅は、一般的に、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ（通常はＴａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、プライマーおよびプローブ（必要に応じて）を補充した適切な緩衝液を含み得るＰＣＲ反応混合物の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。
【０１００】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの多量体型のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を含む。本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語も、一般的には長さが最高１００塩基までのヌクレオチドの多量体型を含む。
【０１０１】
「増幅産物」は、増幅反応で生成され、蓄積される特定の標的配列の核酸分子を集合的に指す。この用語は、一般に、所定の組み合わせの増幅プライマーを用いて、ＰＣＲによって生成される核酸分子を指す。
【０１０２】
本明細書で用いる場合、「プライマー」は、標的配列へのアニーリング（標的配列とハイブリダイズ）が可能であり、それによって適切な条件下でＤＮＡ合成のための開始点となり得る二本鎖領域を作製する、オリゴヌクレオチドを定める。「プライマー対」という用語は、本明細書では、選択した核酸配列をいくつかの種類の増幅プロセスの１つ、好ましくはＰＣＲによって増幅する際に共に用いるように選択される一対のオリゴヌクレオチドを指す。当技術分野で一般的に知られているように、プライマーは、選択された条件下で相補配列に結合するように設計することができる。
【０１０３】
プライマーは、特定のアッセイフォーマットおよび特定のニーズによって、任意の適切な長さであってよい。一部の実施形態において、プライマーは、長さが少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは長さが１９〜２５ヌクレオチドの間を含み得る。プライマーは、選択された核酸増幅系に特に適するように適合させることができる。当技術分野で一般的に知られているように、オリゴヌクレオチドプライマーは、それらの標的配列とのハイブリダイゼーションの融点を考慮して設計することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲書）。
【０１０４】
一部の実施形態において、制限遺伝子座および制御遺伝子座は、当技術分野で周知のように各遺伝子座を特異的に増幅するように設計されている逆方向プライマーと順方向プライマーとの対を用いて同じＤＮＡ試料（消化した試料）から増幅させてもよい。一部の実施形態において、プライマーは、その５’および３’のフランキング配列と共に遺伝子座を増幅するように設計されてもよい。
【０１０５】
一部の実施形態において、５’フランキング配列は、１〜６０の間の塩基を含むことができる。さらなる実施形態において、５’フランキング配列は、１０〜５０の間の塩基を含む。例えば、５’フランキング配列は、遺伝子座のすぐ上流の１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基または５０塩基を含むことができる。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１０６】
一部の実施形態において、３’フランキング配列は、１〜９０の間の塩基を含むことができる。一部の実施形態において、３’フランキング配列は、５〜８０の間の塩基を含むことができる。一部の実施形態において、３’フランキング配列は、遺伝子座のすぐ下流の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０の塩基を含むことができる。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１０７】
一部の実施形態において、プライマーは、長さが７５〜２２５塩基の間の増幅産物を生成するように設計してもよい。
【０１０８】
一部の実施形態において、本方法は、同じ反応混合物で２つ以上の標的配列（少なくとも１つの制限遺伝子座および１つの制御遺伝子座）の同時増幅、すなわちマルチプレックス増幅または共増幅として知られているプロセスを含む。このプロセスは、複数のプライマー対の同時使用を必要とする。当技術分野で周知のように、プライマーは、増幅中、同じアニーリング温度で機能できるように、設計されてもよい。一部の実施形態において、同様の融解温度（Ｔｍ）を有するプライマーを本明細書に開示する方法において用いる。
約３℃〜５℃の間のＴｍ変動は、プールで用いられるプライマーの許容範囲とみなされる。
【０１０９】
一部の実施形態において、すべての制限遺伝子座および制御遺伝子座は、単一の反応混合物中で増幅されてもよい。他の実施形態において、例えば特定機械装置の技術的な制限のために、消化ＤＮＡ試料はいくつかのアリコートに分割されることもあり、１または複数の制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅のために、各々にプライマー対が補充される。このように、たとえＤＮＡ試料がいくつかのアリコートに分割されても、制御遺伝子座は各アリコートで増幅され、シグナル比の算出は、共に、すなわち同じアリコートから増幅される制御遺伝子座および制限遺伝子座に対して行われる。
【０１１０】
一部の実施形態において、本方法は、消化および増幅ステップ（複数可）において非ヒトＤＮＡ配列を含む対照コンストラクトを用いることもできる。一部の実施形態において、対照コンストラクトは、人工（合成）ＤＮＡ配列を含む。対照コンストラクトは、消化および増幅プロセスを管理する、例えば消化および増幅ステップの有効性と質をモニターするために用いられてもよい。一部の実施形態において、対照コンストラクトおよびＤＮＡ試料は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素によって同時に、任意選択で同じ容器（例えば試験管、バイアルなど）内で消化される。一部の実施形態において、本方法は、対照コンストラクトをＤＮＡ試料と共に、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化にかけるステップを含むことができる。一部の実施形態において、本方法は、対照コンストラクトをＤＮＡ試料に加え、次いで両方を少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化にかけることを含むことができる。
【０１１１】
一部の実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いたＤＮＡ配列を含む第１の対照コンストラクト、およびメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含有し、かつ完全に非メチル化状態であるＤＮＡ配列を含む第２の対照コンストラクトのうちの１つまたは複数と共に消化ステップで用いられるこができ、その結果、第１の対照コンストラクトは原形を保ち、一方第２の対照コンストラクトは完全に、または少なくとも一部消化される。それに続く増幅ステップでは、対照コンストラクトに特異的なプライマー（および任意選択でプローブ）を加えることができる。第１のコンストラクトの適切な増幅と、第２のコンストラクトの十分に低い増幅とが同時に存在することが検出されると、ＤＮＡ消化が適当であることを示す。
【０１１２】
一部の実施形態において、第１のコンストラクトの適切な増幅と、第２のコンストラクトの十分に低い増幅とが同時に存在することを検出することは、リアルタイムＰＣＲにおいて第１および第２の対照コンストラクトの定量化サイクル（Ｃｑ）の間に少なくとも５サイクルの差異を検出することを含み得る。一部の実施形態において、この差異は少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、または少なくとも８サイクルであり得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１１３】
一部の実施形態において、第１および第２の対照コンストラクトは、それぞれ配列番号１７および１８を含み得る。一部の実施形態において、第１の対照コンストラクトを増幅および検出するためのプライマーとプローブは、配列番号１９（順方向）、配列番号２０（逆方向）および配列番号２１（プローブ）を含み得る。一部の実施形態において、第２の対照コンストラクトを増幅および検出するためのプライマーとプローブは、配列番号２２（順方向）、配列番号２３（逆方向）および配列番号２４（プローブ）を含み得る。
【０１１４】
一部の実施形態において、ゲノム遺伝子座の増幅は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）としても知られているリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて行われることができ、このＰＣＲでは増幅産物の同時増幅と検出が行われる。
【０１１５】
一部の実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲにおいて増幅産物の検出は、ポリヌクレオチドプローブ、一般的に蛍光標識ポリヌクレオチドプローブを用いて達成されることができる。
【０１１６】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチドプローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は、同じ意味で用いられ、興味のある遺伝子座の核酸配列内、例えば制限遺伝子座または制御遺伝子座の配列内の特定の部分配列に相補的な標識ポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態において、検出は、リポーター分子とクエンチャー分子の組みわせ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）に基づくＴａｑＭａｎアッセイによって達成される。そのようなアッセイにおいて、ポリヌクレオチドプローブは、その５’末端に結合した蛍光部分（フルオロフォア）と、その３’末端に結合したクエンチャーとを有する。ＰＣＲ増幅中、ポリヌクレオチドプローブは、鋳型上のその標的配列に選択的にハイブリダイズし、ポリメラーゼが鋳型を複製すると、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼの活性により、ポリヌクレオチドプローブも切断する。ポリヌクレオチドプローブが損なわれていない場合、クエンチャーと蛍光部分の間が近接し、通常、バックグラウンド蛍光レベルが低くなる。ポリヌクレオチドプローブが切断されると、クエンチャーは蛍光部分から切り離され、蛍光強度が増加する。蛍光シグナルは、増幅産物の量と相関する、すなわち増幅産物が蓄積されると、シグナルが増加する。
【０１１７】
本明細書で用いる場合、「選択的にハイブリダイズする」（ならびに「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」および「特異的なハイブリダイゼーション」）は、ストリンジェントな条件下で、核酸分子（例えばプライマーまたはプローブ）が特定の相補的なヌクレオチド配列に優先的に結合する、デュプレックスまたはハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸分子がその標的配列に優先的にハイブリダイズし、他の非標的配列にはより少ない程度でハイブイダイズし、またはまったくハイブリダイズしない条件を指す。当技術分野で周知のように、核酸ハイブリダイゼーションと関連して「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、配列依存性であり、異なる条件下では異なってくる。
【０１１８】
ポリヌクレオチドプローブは、長さが変わってもよい。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドプローブは、１５〜３０の間の塩基を含み得る。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドプローブは、２５〜３０の間の塩基を含み得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドプローブは、２０〜３０の間の塩基、例えば、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基を含み得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１１９】
ポリヌクレオチドプローブは、鋳型のいずれかの鎖に結合するように設計されることができる。さらなる考慮点は、例えばポリヌクレオチドプローブのＴｍがあり、好ましくはプライマーのそれと適合するものでなければならない。プライマーおよびプローブを設計するためにコンピューターソフトウェアを使用することができる。
【０１２０】
上で述べたように、本明細書に開示する方法は、同じ反応混合物中で２つ以上の標的配列（少なくとも１つの制限遺伝子座と１つの制御遺伝子座）の同時増幅を含み得る。並行して増幅される複数の標的配列間を区別するために、異なった蛍光色で標識されたポリヌクレオチドプローブを用いてもよい。
【０１２１】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドプローブは、当技術分野で周知のフルオロフォア／クエンチャー対を形成し、例えば、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ−ＢＨＱ１、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ−ＢＨＱ１、ＡＴＴＯ５５０−ＢＨＱ２およびＲＯＸ−ＢＨＱ２が挙げられる。
【０１２２】
一部の実施形態において、色素の組み合わせは、最良のＲＴ−ＰＣＲサーモサイクラーに適合させてもよい。
【０１２３】
一部の実施形態において、蛍光は各ＰＣＲサイクル中、モニターされることができ、サイクル数の関数としてプローブから蛍光シグナルの変化を示す増幅プロットを提示する。
【０１２４】
ＲＴ−ＰＣＲと関連して、以下の用語を使用する。
【０１２５】
「定量化サイクル」（「Ｃｑ」）は、蛍光が閾値を上回って増加するサイクル数を指し、ソフトウェアによって自動的に、または使用者によって手動で設定される。一部の実施形態において、増幅と検出を行う前に、閾値はすべての遺伝子座に対して一定であり得、前もって設定されることができる。他の実施形態において、閾値は、増幅サイクル中、この遺伝子座に対して検出された最大の蛍光レベルに基づいて、実行後、各遺伝子座に対して別々に定めることができる。
【０１２６】
「閾値」とは、Ｃｑ決定で用いる蛍光値を指す。一部の実施形態において、閾値はベースライン蛍光を上回り、および／またはバックグラウンドノイズを上回り、増幅プロットの指数増殖期範囲内の値であり得る。
【０１２７】
「ベースライン」とは、蛍光に変化が全くまたはほとんどないＰＣＲの初期サイクルを指す。
【０１２８】
コンピューターソフトウェアを使用して、増幅プロットを分析し、ベースライン、閾値およびＣｑを決定することができる。
【０１２９】
少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化の後、ＤＮＡ分子が消化から保護されているので、酵素の認識部位中のＣＧジヌクレオチドがメチル化されている遺伝子座は高効率で増幅される。検出可能な増幅産物は比較的少ない（低い）増幅サイクル数の後に示されるので、Ｃｑ値は比較的低い結果となる。反対に、酵素の認識部位中のＣＧジヌクレオチドがメチル化状態でない遺伝子座は、消化ステップの間、広範囲に切断され、したがって増幅および定量化ステップにおいてＣｑ値が高くなる（すなわち、比較的高い増幅サイクル数の後に検出可能な増幅産物を示す）。
【０１３０】
別の実施形態において、増幅産物の増幅および検出は、増幅産物のキャピラリー電気泳動に続いて蛍光標識プライマーを用いる従来のＰＣＲによって行われてもよい。一部の実施形態において、増幅の後、増幅産物がキャピラリー電気泳動法によって分離され、蛍光シグナルは定量化される。一部の実施形態において、サイズ（塩基対）または注入からの時間の関数として蛍光シグナルの変化をプロットする電気泳動図を作成することができ、電気泳動図において各ピークは、単一遺伝子座の増幅産物に対応する。ピークの高さ（例えば、「相対蛍光単位」（ｒＦＵ）を用いて表した）は、増幅遺伝子座からのシグナルの強度を表すことができる。コンピューターソフトウェアを使用して、ピークを検出し、その増幅産物がキャピラリー電気泳動装置上で検出された一連の遺伝子座の蛍光強度（ピ−ク高さ）を算出し、続いてシグナル強度間の比率を算出することができる。
【０１３１】
メチル化感受性制限酵素、例えばＨｈａＩまたはＨｉｎＰ１Ｉにより消化されたＤＮＡ試料に対して、酵素の認識部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化される遺伝子座は、電気泳動図において比較的強いシグナル（高いピーク）を示す。反対に、酵素の認識部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化状態でない遺伝子座は、電気泳動図において比較的弱いシグナル（低いピーク）を示す。
【０１３２】
一部の実施形態において、プライマーの蛍光標識は、フルオレセイン、ＦＡＭ、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＶＩＣおよびＲＯＸのうちのいずれか１つを含む。
【０１３３】
シグナル比
本明細書で用いる場合、「比率」または「シグナル比」という用語は、単一ＤＮＡ試料中の（同じ反応混合物中の）ゲノム遺伝子座対の同時増幅、特に制限遺伝子座および制御遺伝子座の同時増幅から得られたシグナルの強度間の比率を指す。
【０１３４】
本明細書で用いる場合、「配列番号Ｘ比率」とは、本明細書に詳述するように制限酵素により消化されたＤＮＡ試料中のこの遺伝子座対の同時増幅の後、配列番号Ｘに記載の遺伝子座のシグナル強度と、制御遺伝子座のシグナル強度との間の比率を指す。
【０１３５】
本明細書で用いる場合、「シグナル強度」という用語は、遺伝子座の原形を保っているコピーの初期量に対応する遺伝子座特異的増幅産物の量を反映する測定尺度を指す。しかし、シグナル強度は増幅産物／原形を保つ遺伝子座の実際の量を示さないこともあり、および増幅産物／原形を保つ遺伝子座の何らかの絶対量の算出を含まないこともある。したがって、アンプリコンシグナルの比率を算出するために、実際のＤＮＡ濃度またはＤＮＡメチル化レベルそれ自体を算出することは不必要なので、標準曲線または基準ＤＮＡは必要とされないこともある。
【０１３６】
一部の代表的な実施形態において、増幅産物の増幅および検出は、ＲＴ−ＰＣＲによって行われ、特定の遺伝子座のシグナル強度はこの遺伝子座のために算出されたＣｑによって表すことができる。この場合、シグナル比は、次の計算によって表すことができる：２（制御遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）。
【０１３７】
さらなる代表的な実施形態において、増幅産物の検出は、特定の遺伝子座のシグナル強度がその対応するピークの相対蛍光単位（ｒｆｕｓ）の数である、キャピラリー電気泳動法によって行われる。シグナル比は、各制限遺伝子座のピーク高さを制御遺伝子座のピーク高さで割ることによって算出することができる。
【０１３８】
一部の実施形態において、ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比率を算出することは、（ｉ）制限遺伝子座の増幅産物のシグナル強度を決定すること；（ｉｉ）制御遺伝子座の増幅産物のシグナル強度を決定すること；および
（ｉｉｉ）これらの２つのシグナル強度間の比率を算出することを含む。
【０１３９】
一部の実施形態において、ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比率を算出することは、各遺伝子座のＣｑを決定すること、および制御遺伝子座のＣｑと制限遺伝子座のＣｑとの間の差異を算出することを含む。一部の実施形態において、算出することは次の式を適用することをさらに含む：２∧（制御遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）。
【０１４０】
一部の実施形態において、シグナル比を算出することは、各制限遺伝子座と制御遺伝子座との間の複数のシグナル比を算出することであり得る。
【０１４１】
一部の実施形態において、シグナル比を算出することは、配列番号１に記載の制限遺伝子座と制御遺伝子座との間の比率を算出することであり得る。
【０１４２】
一部の実施形態において、配列番号１〜１５に記載の遺伝子座の中で複数の遺伝子座が増幅され、この方法は、配列番号１〜１５に記載の各遺伝子座と、制御遺伝子座との間、例えば配列番号１に記載の遺伝子座と、制御遺伝子座との間、配列番号２に記載の遺伝子座と、制御遺伝子座との間などの比率を算出することを含む。
【０１４３】
一部の実施形態において、増幅産物のシグナル強度間の比率を算出するためにコンピューターソフトウェアを使用することができる。
【０１４４】
基準比率
「基準比率」または「基準シグナル比」という用語は、同じ意味で用いられ、既知の供給源からのＤＮＡで決定されたシグナル強度比を指す。制限遺伝子座と制御遺伝子座の所定の対の基準比率はいくつかの方法で表すことができる。一部の実施形態において、遺伝子座の所定の対の基準比率は、単一比率であり得る。一部の実施形態において、遺伝子座の所定の対の基準比率は、統計値、例えば既知の供給源からの大量の一連のＤＮＡ試料から得られた大量の一連の基準比率の平均値、例えば癌患者の大規模なグループで決定された平均値、または健常者の大規模なグループで決定された平均値であり得る。
【０１４５】
他の実施形態において、遺伝子座の所定の対の基準比率は、複数の比率、例えば既知の供給源からの大量の一連のＤＮＡ試料中のこの対の遺伝子座に対して決定された比率の分布であり得る。一部の実施形態において、基準比率は基準スケールであり得る。
【０１４６】
一部の実施形態において、遺伝子座の所定の対の基準スケールは、同じ基準供給源からの複数のＤＮＡ試料中の遺伝子座のこの対に対して測定されたシグナル比を含み得る。例えば、基準膀胱癌患者の基準スケールまたは基準健常者の基準スケール。他の実施形態において、遺伝子座の所定の対の基準スケールは、健常者と病人の両方からのシグナル比、すなわち両供給源からの基準比率を組み合わせた単一スケールを含み得る。一般に、単一スケールが使われる場合、健常者からの値がスケールの一端に、例えばカットオフ値よりも下になるように、一方癌患者からの値はスケールの他端に、例えばカットオフ値よりも上になるように値は分布される。一部の実施形態において、未知の供給源からの検査ＤＮＡ試料に対して算出されるシグナル比は、健康な基準スケールおよび癌の基準比率と比較されることもあり、確率スコアは該スケール範囲内のその相対的な位置に基づいて、算出されるシグナル比に割り当てられるスコアであり得る。一部の実施形態において、算出されたシグナル比が高いほど、それに割り当てられルスコアは高くなり、したがって膀胱癌に関する確率は高い。
【０１４７】
「膀胱癌基準比率」または「膀胱癌ＤＮＡの基準比率」という用語は、同じ意味で用いられ、膀胱癌患者の尿試料からのＤＮＡ中の所定の制限遺伝子座と所定の制御遺伝子座との間で測定されるシグナル強度比を指す。膀胱癌基準比率は、膀胱癌ＤＮＡ、すなわち癌性膀胱組織からのＤＮＡにおけるシグナル強度比を表す。上で詳述されるように、膀胱癌基準比率は、単一比率、統計値または複数の比率（例えば分布）であり得る。
【０１４８】
「健康な基準比率」、「正常な基準比率」または「健康なＤＮＡでの基準比率」という用語は、同じ意味で用いられ、正常人からの尿試料中の所定の制限遺伝子座と所定の制御遺伝子座との間で測定されるシグナル強度比を指す。「健常者」または「正常人」とは、本明細書では、従来の診断方法によって決定される膀胱癌を含む膀胱疾患または症状、膀胱関連疾患が検出されない個人と定義される。健康な基準比率は、正常な膀胱ＤＮＡ、すなわち、正常な、非癌性膀胱組織からのＤＮＡにおけるシグナル強度比を表す。上で詳述されるように、健康な基準比率は単一比率、統計値または複数の比率（例えば分布）であり得る。
【０１４９】
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、癌性膀胱ＤＮＡからの基準比率の事前決定を含む。一部の実施形態において、本発明の方法は、正常な膀胱ＤＮＡからの基準比率の事前決定を含む。
【０１５０】
上で述べたように、シグナル比は種々の方法によって決定されることができ、例えばキャピラリー電気泳動の後のピークの測定またはＲＴ−ＰＣＲの後のＣｑの算出が挙げられる。膀胱癌を決定するために、未知の供給源の検査試料に対する基準比率および測定された比率は、本明細書に開示する方法を用いて得られることを理解すべきである。
【０１５１】
膀胱癌の決定
一部の実施形態において、本明細書に開示する方法は、膀胱癌を同定するために、基準比率と比較して、未知の供給源の尿試料からのＤＮＡに対して算出されたシグナル比を評価することに基づいている。
【０１５２】
一部の実施形態において、算出されたシグナル比は、そのＤＮＡが膀胱癌ＤＮＡであることを示す。
【０１５３】
当業者は、検査試料に対して算出されたシグナル比と、対応する基準シグナル比率の比較は種々の統計的手段を使用していくつかの方法で行うことができることを認識するだろう。
【０１５４】
一部の実施形態において、遺伝子座の所定の対に対して算出された検査シグナル比を基準シグナル比と比較することは、単一基準値に対して検査シグナル比を比較することを含む。単一基準値は、癌患者または健常者の大集団からの基準シグナル比のために得られた平均値に対応し得る。他の実施形態において、遺伝子座の所定の対に対して算出された検査シグナル比を基準シグナル比と比較することは、複数の基準シグナル比の分布またはスケールに対して検査シグナル比を比較することを含む。
【０１５５】
既知の統計的手段は、所定の制限遺伝子座と制御遺伝子座との間で算出されたシグナル比が膀胱癌基準比率に、または正常な基準比率に対応するかどうかを決定するために使用されることができる。一部の実施形態において、膀胱癌基準比率に対する算出比率の近似値を検出することで、対象が膀胱癌患者であると同定する。反対に、一部の実施形態において、正常な基準比率に対する算出比率の近似値を検出することで、対象が膀胱癌患者でないと同定する。
【０１５６】
一部の実施形態において、本方法は、算出シグナル比が膀胱癌比率である可能性を反映する確率スコアを求めるために、算出シグナル比をその対応する膀胱癌基準比率と（すなわち膀胱癌において遺伝子座の同じ対のために決定されたシグナル比と）比較することを含む。基準比率に対する算出シグナル比の近似値がより良好になるほど、確率スコア、したがって算出シグナル比が膀胱癌比率である可能性はより高くなる。一部の実施形態において、確率スコアは、膀胱癌基準比率の分布内での算出シグナル比の相対的位置に基づく。
【０１５７】
一部の実施形態において、本方法は、制御遺伝子座に関して複数の制御遺伝子座に対して算出された複数のシグナル比をそれらの対応する膀胱癌基準比率と比較することを含む。
【０１５８】
一部の実施形態において、シグナル比のパターンは、それが膀胱癌のパターンまたは正常で健康なパターンを表しているかを決定するために、統計的手段およびコンピューター化されたアルゴリズムを使用して分析されることができる。代表的なアルゴリズムは、例えば本発明の出願者に譲渡された国際公開第ＷＯ２０１１／０７０４４１号に開示されている。アルゴリズムには機械学習およびパターン認識アルゴルズムが含み得るが、これらに限定されない。
【０１５９】
一部の代表的な実施形態において、各算出比率（限定遺伝子座と制御遺伝子座の各対に対する）は、癌患者および癌に罹患していない個人の両方からの大量の一連の尿試料からのこの対に対して生成された基準比率のスケールと比較されることができる。このスケールは、癌患者および正常人からの多数の試料中の制限遺伝子座対と制御遺伝子座との間で算出されたシグナル比を表し得る。スケールは閾値を示すこともあるが、またこれ以降、「カットオフ」もしくは「あらかじめ定義された閾値」とも称され、膀胱癌に対応するそれを上回るおよび下回る基準比率は、健常者またはその逆の個人に対応する基準比率である。
【０１６０】
一部の実施形態において、スケールの最下位および／またはカットオフを下回る低い比率は、正常人（健常者、すなわち膀胱癌に罹患していない）の試料からのものであり得るが、一方スケールの最上位および／または所定のカットオフを上回る高い比率は癌患者からのものであり得る。各比率（各制限遺伝子座と制御遺伝子座との間）に対して、スコアは、スケールのその相対的な位置に基づいて示されることができ、各遺伝子座に対する個々のスコアを組み合わせて単一スコアを示す。一部の実施形態において、個々のスコアを合計して、単一スコアを表してもよい。他の実施形態において、個々のスコアを平均して、単一スコアを表してもよい。一部の実施形態において、単一スコアは、対象が癌を有しているかどうかを決定するために用いられてもよく、あらかじめ定義された閾値を上回るスコアは膀胱癌を示す。
【０１６１】
一部の実施形態において、スコアは、算出シグナル比が膀胱癌比率であるという確率を反映して０〜１００の間の数であり、０は最も低い確率で、１００は最も高い確率である。一部の実施形態において、閾値スコアは決定され、等しいかまたは上回るスコアは膀胱癌を示す。閾値は、例えば、４０、５０、６０または７０であり得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１６２】
さらなる代表的な実施形態において、各算出比率（各制限遺伝子座と制御遺伝子座との間）に対して、膀胱癌ＤＮＡを表す確率は、対応する膀胱癌基準比率および正常な基準比率との比較に基づいて決定されてもよく、スコア（確率スコア）は割り当てられてもよい。したがって、各比率（各遺伝子座に対する）に対して算出された個々の確率スコアを組み合わせて（例えば合計または平均して）、複合スコアを示す。複合スコアは、対象が癌を有しているかどうかを決定するために用いられてもよく、あらかじめ定義された閾値を上回る複合スコアは膀胱癌を示す。
【０１６３】
このように、一部の実施形態において、閾値すなわちカットオフスコアは決定され、上回る（または下回る）スコアによって対象が膀胱癌を有すると同定される。閾値スコアは、健康な対象の集団を非健康な対象の集団と区別する。
【０１６４】
一部の実施形態において、本発明の方法は、閾値スコアを提供することを含む。
【０１６５】
一部の実施形態において、閾値スコアを決定することは、健康であるかまたは膀胱癌を有する対象の大集団においてシグナル比を測定することを含む。
【０１６６】
一部の実施形態において、閾値は統計的に有意な値である。統計的有意性は、２つ以上の集団を比較して、信頼区間（ＣＩ）および／またはｐ値を決定することによって、決定されることが多い。一部の実施形態において、統計的に有意な値は約９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％とおよび９９．９９％の信頼区間（ＣＩ）を指し、一方好ましいｐ値は約０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００１未満である。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、閾値スコアのｐ値は、多くても０．０５である。
【０１６７】
本明細書で用いる場合、「約」という用語は、測定可能な値を指すとき、規定値から±１０％の変動、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、およびさらに好ましくは±０．１％の変動を包含する。
【０１６８】
一部の実施形態において、本方法は、確率スコアを求めるために、所定の制限遺伝子座と制御遺伝子座との間で算出されたシグナル比をその対応する正常な膀胱基準比率と比較することをさらに含み、対応する健康な基準比率に関して前記比率の低確率スコアを検出することは、対象が膀胱癌を有していることを示す。
【０１６９】
一部の実施形態において、本明細書に開示する方法の感度は、少なくとも約７５％であり得る。一部の実施形態において、本方法の感度は、少なくとも約８０％であり得る。一部の実施形態において、本方法の感度は、少なくとも約８５％であり得る。一部の実施形態において、本方法の感度は、少なくとも約９０％であり得る。
【０１７０】
一部の実施形態において、本明細書で用いる場合。診断検査の「感度」とは、検査で陽性反応を示す病人のパーセンテージ（「真の陽性」のパーセント）を指す。したがって、検査によって検出されない病人は、「偽陰性」である。罹患していなく、かつ検査で陰性反応を示す対象は、「真の陰性」と称される。診断検査の「特異度」は、１マイナス偽陽性率であり、「偽陽性」率は、検査で陽性反応を示す、その疾患に罹っていない人の割合と定義される。特定の診断法が病態の確定診断を提供することはできないが、本方法が診断を補助する陽性表示を提供するならば、それは十分である。
【０１７１】
一部の実施形態において、本明細書に開示する方法の特異度は、少なくとも約６５％であり得る。一部の実施形態において、本方法の特異度は、少なくとも約７０％であり得る。一部の実施形態において、本方法の特異度は、少なくとも約７５％であり得る。一部の実施形態において、本方法の特異度は、少なくとも約８０％であり得る。
【０１７２】
膀胱癌処置
一部の実施形態において、膀胱癌を処置する方法が提供され、本発明の方法によって膀胱癌を同定すること、および前記対象に抗癌療法を実施することを含む。
【０１７３】
膀胱癌を処置する方法は、次のうちの１つまたは複数を含み得る：当技術分野で周知のように、腫瘍、膀胱の部分、またはより重篤な症例において膀胱全体を摘出する外科手術；
放射線療法（外部または内部）；化学療法（全身または局所）；および免疫療法。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１７４】
キット
一部の実施形態において、ヒト対象において膀胱癌の同定のためのキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、本発明の方法による膀胱癌の同定のためのものである。一部の実施形態において、キットは少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素；少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座の増幅のためのプライマー対；少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座の増幅産物を検出するための手段；および膀胱癌の同定を行うための取扱説明書を含む。一部の実施形態において、取扱説明書は電子取扱説明書であり得る。
【０１７５】
一部の実施形態において、取扱説明書は、膀胱癌基準比率および任意選択で健康な基準比率を示し得る。
【０１７６】
一部の実施形態において、取扱説明書は、上記の方法ステップを行うための説明書を含み得る。
【０１７７】
一部の実施形態において、取扱説明書は、シグナル比（複数可）と、膀胱癌基準比率（複数可）および任意選択で健康な基準比率（複数可）との間の相関性に関する説明書を含み得る。
【０１７８】
一部の実施形態において、取扱説明書は、マーカースコア、すなわち所定の制限遺伝子座の対するスコアを算出するための説明書を提供し得る。一部の実施形態において、取扱説明書は、複数のマーカースコアに対して総スコアを算出するための説明書を提供し得る。
一部の実施形態において、取扱説明書は膀胱癌を決定するための閾値スコアを示すことができ、該閾値スコアを上回ると、対象は癌を有すると同定される。他の実施形態において、取扱説明書は膀胱癌を決定するための閾値スコアを示すことができ、該閾値スコアを下回ると、対象は癌を有すると同定される。
【０１７９】
一部の実施形態において、キットは単一メチル化感受性エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、ＨｈａＩである。
【０１８０】
一部の実施形態において、キットは単一メチル化感受性エンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１Ｉである。
【０１８１】
一部の実施形態において、キットはコンピューターソフトウェアをさらに含み得る。一部の実施形態において、コンピューターソフトウェアは、少なくとも１つのシグナル強度、シグナル比およびマーカースコアを算出するコンピューターソフトウェアであり得る。
【０１８２】
一部の実施形態において、キットは以下を含む：ＨｈａＩ；本明細書に記載の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座と相補的なプライマー対；および少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座と相補的な蛍光ポリヌクレオチドプローブ。
【０１８３】
一部の実施形態において、キットは以下を含む：ＨｉｎＰ１Ｉ；本明細書に記載の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座と相補的なプライマー対；および少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの制御遺伝子座と相補的な蛍光ポリヌクレオチドプローブ。
【０１８４】
配列番号１〜１５に記載の制限遺伝子座を増幅するための代表的なプライマーは、以下のように配列番号２５〜１５５に記載する（ｆｏｒ＝順方向、ｒｅｖ＝逆方向）：
遺伝子座１ｆｏｒ：配列番号２５〜２９；遺伝子座１ｒｅｖ：配列番号３０〜３５
遺伝子座２ｆｏｒ：配列番号３６〜３８；遺伝子座２ｒｅｖ：配列番号３９〜４２
遺伝子座３ｆｏｒ：配列番号４３〜５１；遺伝子座３ｒｅｖ：配列番号５２〜６１
遺伝子座４ｆｏｒ：配列番号６２〜６４；遺伝子座４ｒｅｖ：配列番号６５〜６７
遺伝子座５ｆｏｒ：配列番号６８〜７０；遺伝子座５ｒｅｖ：配列番号７１〜７３
遺伝子座６ｆｏｒ：配列番号７４〜７６；遺伝子座６ｒｅｖ：配列番号７７〜７９
遺伝子座７ｆｏｒ：配列番号８０〜８５；遺伝子座７ｒｅｖ：配列番号８６〜８９
遺伝子座８ｆｏｒ：配列番号９０〜９２；遺伝子座８ｒｅｖ：配列番号９３〜９５
遺伝子座９ｆｏｒ：配列番号９６〜９９；遺伝子座９ｒｅｖ：配列番号１００〜１０２
遺伝子座１０ｆｏｒ：配列番号１０３〜１０６；遺伝子座１０ｒｅｖ：配列番号１０７〜１１２
遺伝子座１１ｆｏｒ：配列番号１１３〜１１６；遺伝子座１１ｒｅｖ：配列番号１１７〜１２０
遺伝子座１２ｆｏｒ：配列番号１２１〜１２５；遺伝子座１２ｒｅｖ：配列番号１２６〜１３０
遺伝子座１３ｆｏｒ：配列番号１３１〜１３５；遺伝子座１３ｒｅｖ：配列番号１３６〜１４０
遺伝子座１４ｆｏｒ：配列番号１４１〜１４５；遺伝子座１４ｒｅｖ：配列番号１４６〜１５１
遺伝子座１５ｆｏｒ：配列番号１５２〜１５３；遺伝子座１５ｒｅｖ：配列番号１５４〜１５５。
【０１８５】
配列番号１６に記載の制御遺伝子座を増幅するための代表的なプライマーは、以下のように配列番号１５６〜１６７に記載する：
制御順方向：配列番号１５６〜１６１：
制御逆方向：配列番号１６２〜１６７。
【０１８６】
一部の実施形態において、キットは、第１の対照コンストラクトおよび第２の対照コンストラクトのうちの少なくとも１つを含み、各々は上述のように非ヒト／人工ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、キットは、上述のように第１および第２の対照コンストラクトの両方を含む。
【０１８７】
一部の実施形態において、キットは、少なくとも１つのヌクレオチドプライマー対で満たされた２つ以上の容器を含む。一部の実施形態において、本発明のキットに含まれている各ヌクレオチドプライマー対は、配列番号１〜１５に記載の制限遺伝子座から選択される制限遺伝子座内の部分配列と、またはそのフランキング配列と相補的なプライマーを含むことができ、前記各ヌクレオチドプライマー対は遺伝子座に含まれるゲノムの断片を選択的に増幅するように設計される。
【０１８８】
一部の実施形態において、キットは、上述の遺伝子座の組み合わせを選択的に増幅するためのプライマー対を含み得る。
【０１８９】
一部の実施形態において、キットは、第１および第２の人工の対照コンストラクトを選択的に増幅するためのヌクレオチドプライマー対をさらに含み得る。
【０１９０】
一部の実施形態において、キットは、キットに含まれているプラマーを使用し、増幅した遺伝子座の増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得る。各オリゴヌクレオチドプローブは遺伝子座内の部分配列と相補的であり得、およびそれにハイブリダイズすることができ得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光標識されていてもよい。
【０１９１】
一部の実施形態において、キットは、ＤＮＡ消化、遺伝子座増幅および増幅産物の検出のために必要とされる少なくとも１つの追加成分、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドミックスをさらに含み得る。
【０１９２】
一部の実施形態において、キットは、膀胱癌同定を行うために、消化と増幅のための好適な反応緩衝液、および膀胱癌の同定を行うための書面によるプロトコルをさらに含み得る。書面によるプロトコルは、本明細書に開示するいずれかのステップを行うための指示、これに限定されないが例えば、ＤＮＡ消化パラメータ、ＰＣＲサイクリングパラメータ、シグナル比分析および基準比率との比較を含み得る。
【０１９３】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより詳細に例示するために示す。しかし、これらの実施例は、本発明の幅広い範囲を限定するものとして決して解釈されてはならない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示する原理の変更および修正を多容易に考案することができる。
【実施例】
【０１９４】
実施例１−膀胱癌の検出のためのゲノム遺伝子座
１５のヒトゲノム遺伝子座は、膀胱癌組織において、正常組織と比較してメチル化が増加していることを同定した（本明細書の以下の表１、配列番号１〜１５）。これらの遺伝子座は、膀胱癌患者からのＤＮＡと、正常人（膀胱癌に罹患していない）のＤＮＡとを区別することが可能であることがわかった。
【０１９５】
【表１】
2018518959.tif 000002
2018518959.tif 000003
【０１９６】
実施例２−ゲノム遺伝子座のパネルの検査
尿試料は６９名の膀胱癌患者と、膀胱癌に罹患していない４０名の健康な対象から採取した。膀胱癌患者集団には男性５５名および女性１４名が含まれ、年齢は４１〜９２歳（平均７２歳）の範囲であった。６９症例の癌のすべては、ＴＣＣ（移行上皮癌）であり、病期分布は次の通りであった：Ｔａ（非浸潤乳頭状癌）−４２患者、Ｔ１−１０患者、Ｔ２−１０患者、ＣＩＳ（上皮内癌）８患者。健康な集団には男性３３名および女性７名が含まれ、年齢は５５〜８８歳（平均７０歳）の範囲であった。ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ血液ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してすべての尿試料から抽出した。
【０１９７】
各試料中のＤＮＡは、図２に概要を述べたように処理した。手短に言えば、各試料から抽出したＤＮＡは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ（ＨｈａＩまたはＨｉｎＰ1Ｉ）による消化を受けた。消化反応（総量１２０マイクロリットル）には、すべての抽出ＤＮＡ（定量化してない）と、消化緩衝液中のＨｈａＩまたはＨｉｎＰ1Ｉとが含まれていた。消化作用を３７℃で２時間、行った。
【０１９８】
次に、消化したＤＮＡ試料上で定量的リアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲを行い、各ＤＮＡ試料中の上記表１に詳述した１５の制限遺伝子座と、配列番号１６（表１を参照されたい）に記載の制御遺伝子座とを増幅した。制御遺伝子座は、ＨｈａＩまたはＨｉｎＰ１Ｉの認識配列を含まない遺伝子座であり、ＤＮＡ試料がそのメチル化状態に関係なく、制限酵素で消化されるとき、原形を保ったままである。この制御遺伝子座は内部基準遺伝子座とも称され、ＨｈａＩまたはＨｉｎＰ１Ｉによる消化後メチル化によって影響を受けない増幅パターンを有する。
【０１９９】
特に、各消化ＤＮＡ試料を１０マイクロリットルの消化ＤＮＡを含有する８のアリコートに分けた。７のアリコートには、１５の制限遺伝子座からの２つと、制御遺伝子座（この制御遺伝子座は各アリコートで増幅されることになる）との増幅用のプライマー対を補充した。８番目のアリコートに、残りの制限遺伝子座位と制御遺伝子座との増幅用のプライマー対を補充した。７５〜２２５塩基の間のアンプリコンを増幅し、各アンプリコンは５〜８０塩基の５’フランキング配列および３’フランキング配列に沿って１６遺伝子座のうちの１つを含有した。
【０２００】
各増幅反応（総量２５マイクロリットル）は、ｄＮＴＰおよび反応緩衝液をさらに含有した。増幅中、増幅産物の検出を可能にするために、蛍光標識ポリヌクレオチドプローブ（各遺伝子座に対して１つ）を増幅反応に加えた。以下の蛍光ラベルを使用した：ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸおよびＣＹ５。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下のＰＣＲプログラムによりＡＢＩ７５００  ＦａｓｔＤｘ装置で行った：９５℃での酵素の初期活性化を１０分間、続いて９５℃で１５秒間を４５サイクル、続いて６０℃で１分間。
【０２０１】
ＲＴ−ＰＣＲの後に、サイクル数の関数としてプローブからの蛍光シグナルの変化を示す定量的ＰＣＲプロットを分析して、各遺伝子座に対する定量化サイクル（Ｃｑ）を算出した。
【０２０２】
図１Ａおよび１Ｂは、癌患者（図１Ｂ）および健康な対象（図１Ａ）からの試料中の制御遺伝子座と２つの制限遺伝子座の例示的な定量的ＰＣＲプロットを示す。制限遺伝子座のメチル化が高レベルであり、したがってＨｈａＩで消化されると大部分は原形を保っていた癌患者からの試料において、２つの制限遺伝子座を高効率で増幅した。すなわちそれらの増幅は制御遺伝子座（まったく切断されてない）よりもおよそ１サイクル遅れて上昇した。制限遺伝子座のメチル化が低レベルであることを特徴とし、したがってＨｈａＩで消化されると極めて広範囲に切断された、健康な試料において、増幅効率は制御遺伝子座の増幅効率よりもはるかに低かった。図に示すように、制限遺伝子座のＣｑ値は、癌患者と健康な対象との間で異なる。
【０２０３】
各試料に対して、制限遺伝子座１〜１５（配列番号１〜１５）各々のシグナル強度と、制御遺伝子座（配列番号１６）のシグナル強度との間で比率を次のように算出した：Ｃｑを各制限遺伝子座および制御遺伝子座に対して決定した。Ｃｑ値を以下の式で用いた：
２（制御遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）
【０２０４】
この算出は同じアリコート中で同時増幅された制限遺伝子座および制御遺伝子座に対して行われたと理解すべきである。
【０２０５】
制御遺伝子座に関して各制限遺伝子座に対して得られた数値は、この制限遺伝子座と制御遺伝子座との間のシグナル比を表す。
【０２０６】
まとめると、１５の比率（すなわち、上記の式による１５の算出）を各試料に対して算出した。表２は、癌群および対照群における制御遺伝子座に関して各遺伝子座の平均比率と標準偏差（Ｓｔｄ）とを要約する。表に示すように、膀胱癌の試料から抽出されたＤＮＡに対して得られた比率は、健康な（膀胱癌でない）ボランティアの試料から抽出されたＤＮＡに対して得られた比率と有意に異なる。具体的には、対照群と比較して、癌群における各遺伝子座に対してかなり高い比率（少なくとも一桁高い）が認められ、膀胱癌患者の尿試料と正常人／健常者の尿試料を区別するためにこれらの遺伝子座を用いる際の利点に光を当てている。
【０２０７】
【表２】
2018518959.tif 000004
【０２０８】
次に、膀胱癌の同定に関して感度、特異度およびＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を配列番号１に記載の遺伝子座に対して、および遺伝子座のいくつかの組み合わせまたはサブセットに対して算出した。データを表３に要約する。
【０２０９】
【表３】
2018518959.tif 000005
【０２１０】
実施例３−膀胱癌の既往歴のある患者の診断
通常のサーベイランスを受けている膀胱癌の既往歴のある２２２名の患者から排泄尿試料を採取した。４０名の患者（１８％）のサブグループは、再発性膀胱癌が生検で確認された。病期分布は次の通りであった：Ｔａ−１６症例、Ｔ１−１３症例、Ｔ２−３症例、ＣＩＳ−１２症例、および悪性度分布は、ＬＧ−１９症例、ＨＧ−２６症例であった。一部の試料が複数の病期／悪性度（例えば、同じ患者においてＣＩＳと共に病期Ｔ１腫瘍）を示しているので、病期および悪性度を類別した試料の数は４０以上に加算されたことに留意されたい。
【０２１１】
前述の実施例２に記載のように、ＤＮＡの抽出、消化、増幅を行った。
【０２１２】
各試料に対して、制限遺伝子座１〜１５（配列番号１〜１５）各々のシグナル強度と、制御遺伝子座（配列番号１６）のシグナル強度との間で比率を上述のように算出した。
【０２１３】
メチル化比率の基準群（最高は１００、最低は０）に対して正規化され、「ＥｐｉＳｃｏｒｅ」とも称される平均メチル化比率は、ＬＧ腫瘍の患者とＨＧ腫瘍の患者に対してそれぞれ６９と８５であり、したがって腫瘍悪性度と有意に相関関係があった（ｐ＝０．００６）。
【０２１４】
病期毎の平均ＥｐｉＳｃｏｒｅを表４に記載する。コルモゴロフ−スミルノフ検定を使用した統計分析は、Ｔａ  ＥｐｉＳｃｏｒｅとＴ２  ＥｐｉＳｃｏｒｅｓとの間で統計有意差（ｐ＝０．００７７）およびＴａとＣＩＳとの間で統計有意差（ｐ＝０．０１５５）を示した。
【０２１５】
【表４】
2018518959.tif 000006
【０２１６】
全体的な感度と特異度はそれぞれ９０％と８３％であった（図３Ａおよび３Ｂ）。病期および悪性度毎の感度をそれぞれ図４Ａおよび４Ｂに示す。このコホート研究の陰性適中率は９７．４％であった。
【０２１７】
細胞診の結果はこれらの症例のうち１７３で得ることができた。細胞診の実施は感度４０％と特異度９６％の結果であった。
【０２１８】
１７３試料のうち１５は、腫瘍患者からであった。細胞診によって検出された６腫瘍のすべては、本明細書に開示する方法によっても検出され、本方法が見逃した２腫瘍は細胞診によっても見逃された。驚くべきことに、７腫瘍は本発明の方法によってのみ検出された。
【０２１９】
この結果は、本明細書に開示する方法が排泄尿試料中で膀胱癌を検出するための技術者に影響されない高感度で特異的なアッセイであることを示す。さらに、細胞診と比較すると、本明細書に開示する方法は、特異度がわずかに低く、感度がかなり高い。したがって、本発明の方法は、膀胱癌患者のモニタリングにおいて再発を見逃すリスクがなく、十分に尿細胞診に代わることができる。
【０２２０】
具体的な実施形態についての前述の説明により、本発明の一般的性質が十分に明らにされるので、当業者は種々の用途のために過度の実験を行うことなく、および一般的な概念から逸脱することなく、現在の知識を適用することによって、そのような具体的な実施形態を容易に修正および／または適応することが可能であり、したがってそのような適応および修正は開示されている本実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるものと意図すべきであり、意図される。本明細書で用いた語法または用語は限定のためではなく説明のためであることを理解すべきである。種々の開示した化学構造と機能を実施するための手段、物質およびステップは、本発明を逸脱することなく様々な代替の形態を取ることができる。
【図１Ａ】
2018518959.tif 000007
【図１Ｂ】
2018518959.tif 000008
【図２】
2018518959.tif 000009
【図３Ａ】
2018518959.tif 000010
【図３Ｂ】
2018518959.tif 000011
【図４Ａ】
2018518959.tif 000012
【図４Ｂ】
2018518959.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月19日(2018.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象において膀胱癌を同定するための方法であって、
（ａ）前記対象から採取された尿試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化に適用して、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを得ること、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡから、配列番号１に記載の遺伝子座を含む少なくとも１つの制限遺伝子座と制御遺伝子座とを同時に増幅し、それによって各遺伝子座の増幅産物を生成すること、
（ｃ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座と制御遺伝子座のそれぞれの増幅産物のシグナル強度間の比率を算出すること、および
（ｄ）対応する膀胱癌基準比率に関して前記比率の高確率スコアを検出し、それによって前記ヒト対象において膀胱癌を同定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が配列番号５に記載の遺伝子座をさらに含み、対応する膀胱癌の基準比率に関して、前記高確率スコアが配列番号１の比率と配列番号５の比率との高複合確率スコアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が配列番号７に記載の遺伝子座と配列番号１１に記載の遺伝子座とをさらに含み、対応する膀胱癌の基準比率に関して、前記高確率スコアが前記配列番号１の比率と前記配列番号５の比率と配列番号７の比率と配列番号１１の比率との高複合確率スコアである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５に記載の遺伝子座の群から選択される少なくとも１つの追加の制限遺伝子座をさらに含み、対応する膀胱癌基準比率に関して、前記高確率スコアが前記配列番号１の比率、配列番号５の比率、配列番号７の比率および配列番号１１の比率ならびに前記少なくとも１つの追加の制限遺伝子座の少なくとも１つの追加の比率の高複合確率スコアである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの追加の制限遺伝子座が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５に記載の遺伝子座を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非ヒトＤＮＡ配列を含む第１および第２の対照コンストラクトを提供することであって、前記第１の対照コンストラクトが、前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いたＤＮＡ配列を含み、前記第２の対照コンストラクトが、前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含有するＤＮＡ配列であって完全に非メチル化状態であるＤＮＡ配列を含む、対照コンストラクトを提供すること、
前記第１および第２の対照コンストラクトを前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化すること、および
前記第１および第２の対照コンストラクトを増幅すること、
をさらに含み、前記第１のコンストラクトの適切な増幅と前記第２のコンストラクトの低増幅または増幅の非存在との同時の検出は、ＤＮＡ消化が適切であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、Ａｃｉｌ、ＡＣＩＩ、Ａｆｅｌ、Ａｇｅｌ、Ａｐａｌ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓＩＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺｌ７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉｎｆｌ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡｌＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｃＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓａ１１、Ｓａ１Ｉ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が、１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＨｈａＩであるか、または
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１Ｉである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記制御遺伝子座が、前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠いた遺伝子座であり、好ましくは前記制御遺伝子座が、配列番号１６に記載の遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）が、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物を特異的に検出するために蛍光プローブを加えることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記制御遺伝子座のそれぞれの増幅産物のシグナル強度間の比率を前記算出することが、各遺伝子座についての定量化サイクル（Ｃｑ）を決定することと２（Ｃｑ制御遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を算出することとを含み、好ましくは前記対応する膀胱癌基準比率が２（Ｃｑ制御遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）であり、前記基準ＤＮＡが膀胱癌ＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
健康な対象由来のＤＮＡ中の少なくとも１つの制限遺伝子座および制御遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の健康な基準比率を提供することをさらに含み、好ましくは、対応する健康な基準比率に関して前記比率の低確率スコアを検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記膀胱癌が、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫および小細胞癌からなる群から選択されるか、または前記膀胱癌が移行上皮癌である、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018518959000001.app
【国際調査報告】
2018518959.tif 000014
2018518959.tif 000015
2018518959.tif 000016