(57)【要約】【要約書】  本発明は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造システムおよび方法に関する。前述の方法は、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、前記少なくとも１つのウキクサ亜科種および前記少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられる前記プロット内で時間間隔を決定するステップと、前記所定の時間間隔で前記ＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップとを含む。本発明は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物であって、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を含み、さらに前記組成物中の前記ビタミンＢ１２含有量が前記ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物をさらに開示する。
2018514221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造方法であって、
ａ．少なくとも１つのウキクサ（Ｌｅｍｎｏｉｄｅａｅ）亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、
ｂ．前記少なくとも１つのウキクサ亜科種および前記少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、
ｃ．ウキクサ亜科植物バイオマスを前記所定の条件で時間に対してプロットするステップと、
ｄ．前記少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を前記所定の条件で時間に対してプロットするステップと、
ｅ．前記ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を前記所定の条件で時間に対してプロットするステップと、
ｆ．最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられる前記プロット内で時間間隔を決定するステップと、
ｇ．前記所定の時間間隔で前記ＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記インキュベートするステップが、（ｉ）前記少なくとも１つのウキクサ亜科種植物の最適な増殖、および（ｉｉ）これと関連した前記ビタミンＢ１２合成細菌の最適な発酵のために設計された前記所定の条件を選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベートするステップが、前記少なくとも１つのウキクサ亜科種および前記少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、前記少なくとも１つの細菌種と前記少なくとも１つのウキクサ亜科種との関連をもたらす所定の条件下で増殖させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記関連を、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記接種するステップが、前記少なくとも１つのウキクサ亜科種および前記少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を回分または連続培養物として増殖させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記接種するステップが、前記一定体積の増殖培地を水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記接種するステップが、前記一定体積の増殖培地をプール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベートするステップが、前記ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための前記所定の条件を、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記鉱物を、Ｍｇ２＋、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、ＣａＣｌ２、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記水処理手順を、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベートするステップが、前記細菌種の共生的な発酵およびビタミンＢ１２合成のための前記所定の条件を、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内のアミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖を、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源を、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アミノ酸またはこれらの混合物を、Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記微量元素を、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌を、Ｐ．アルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｚａ）、Ｐ．マリーナ（Ｐ．ｍｕｒｉｎａ）のようなシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エアロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロトアミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記決定するステップが、前記少なくとも１つのウキクサ亜科種および前記少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の時間に対する増殖曲線を決定し、前記少なくとも１つのウキクサ亜科種の最も高いバイオマスおよび前記少なくとも１つの細菌種の最も高い細菌細胞数により特徴付けられる時間間隔を特定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記バイオマスを、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのウキクサ亜科種を、ランドルティア（Ｌａｎｄｏｌｔｉａ）、レムナ（Ｌｅｍｎａ）、スピロデラ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ）、ウォルフィア（Ｗｏｌｆｆｉａ）、ウォルフィエラ（Ｗｏｌｆｆｉｅｌｌａ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる属群に属する種から選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのウキクサ亜科種を、ウォルフィア・アングスタ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ウォルフィア・アリザ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｒｒｈｉｚａ）、ウォルフィア・アウストラリアナ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｕｓｔｒａｌｉａｎａ）、ウォルフィア・ボレアリス（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ウォルフィア・ブラシリエンシス（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ウォルフィア・コロンビアナ（Ｗｏｌｆｆｉａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ）、ウォルフィア・シリンドラセ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ウォルフィア・エロンガテ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｅｌｏｎｇａｔｅ）、ミジンコウキクサ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｇｌｏｂｏｓｅ）、ウォルフィア・ミクロスコピカ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ）、ウォルフィア・ネグレクタ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｎｅｇｌｅｃｔａ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇのビタミンＢ１２を含むビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物であって、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を含み、さらに前記組成物中の前記ビタミンＢ１２含有量が前記ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物。
【請求項２３】
前記組成物中の前記ビタミンＢ１２含有量が、ビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＤＶ）の少なくとも２０％の所定の割合である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物中の前記ビタミンＢ１２含有量が、１日当たり約０．４μｇ〜約３μｇの範囲内の成人のビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＲＤＩ）標準に従う、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＢ１２産生細菌種が前記少なくとも１つのウキクサ亜科種と関連している、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記関連が、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ｂ１２産生細菌種が、Ｐ．アルギノーザ、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのウキクサ亜科種が、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのウキクサ亜科種が、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属に属する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのウキクサ亜科種が、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法により製造される、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物。
【請求項３２】
前記所定の条件が、前記ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための条件、前記細菌種の発酵およびビタミンＢ１２合成のための条件、ならびにこれらの組み合わせから選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記一定体積の増殖培地が回分または連続培養物である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記一定体積の増殖培地が水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記一定体積の増殖培地が、プール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための前記所定の条件が、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記鉱物が、Ｍｇ２＋、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、ＣａＣｌ２、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記水処理手順が、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記細菌種の発酵およびビタミンＢ１２合成のための前記所定の条件が、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内のアミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４０】
前記糖が、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源が、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記アミノ酸またはこれらの混合物が、Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記微量元素が、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造システムであって、
ａ．一定体積の増殖培地での培養のための、ウキクサ亜科種の少なくとも１つの接種原およびビタミンＢ１２産生細菌種の少なくとも１つの接種原と、
ｂ．前記少なくとも１つのウキクサ亜科種接種原および前記少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種接種原を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするための、インキュベーション手段と、
ｃ．最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられる前記プロット内で時間間隔を決定するための手段と、
ｄ．前記所定の時間間隔で前記ＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすための手段と、を備える、システム。
【請求項４５】
ａ．ウキクサ亜科植物バイオマスを前記所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、
ｂ．前記少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を前記所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、および
ｃ．前記ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を前記所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段
からなる群から選択される少なくとも１つのプロット手段をさらに備える、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種のビタミンＢ１２富化抽出物を含む組成物であって、さらに前記組成物中の前記ビタミンＢ１２含有量が前記ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には、ビタミンＢ１２富化アオウキクサの産生手段および方法に関する。特に、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物の産生手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＢ１２は、いくつかの食品中に天然に存在し、他の食品に添加され、栄養補助食品および処方箋医薬品として入手可能な、水溶性ビタミンである。ビタミンＢ１２は、いくつかの形態で存在し、鉱物コバルトを含有するので、ビタミンＢ１２活性を有する化合物は集合的に「コバラミン」と呼ばれる。メチルコバラミンおよび５−デオキシアデノシルコバラミンは、ヒトの代謝において活性なビタミンＢ１２の形態である。
【０００３】
ビタミンＢ１２は、赤血球形成、神経機能、およびＤＮＡ合成に必要である。これはメチオニンシンターゼおよびＬ−メチルマロニル−ＣｏＡムターゼの補因子として作用する。メチオニンシンターゼは、ホモシステインのメチオニンへの変換を触媒する。メチオニンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、タンパク質、および脂質を含む、１００近くの異なる基質の万能メチルドナー、Ｓ−アデノシルメチオニンの形成に必要である。Ｌ−メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、脂質およびタンパク質代謝における必須生化学反応である、プロピオン酸エステルの分解においてＬ−メチルマロニル−ＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡに変換する。スクシニル−ＣｏＡもヘモグロビン合成に必要である。
【０００４】
食品中でタンパク質と結合しているビタミンＢ１２は、胃において塩酸および胃プロテアーゼの活性により解放される。合成ビタミンＢ１２が強化食品および栄養補助食品に添加される場合、これはすでに遊離形態であり、よってこの分離ステップを必要としない。遊離ビタミンＢ１２は次に内因子、胃壁細胞により分泌される糖タンパク質と結合し、得られた複合体は受容体介在性エンドサイトーシスにより遠位回腸内で吸収される。ビタミンＢ１２の１ｍｃｇの経口用量の約５６％が吸収されるが、（ビタミンＢ１２の１〜２ｍｃｇで）内因子の容量を超える場合、吸収は大幅に低下する。
【０００５】
内因子の機能不全の影響の一例は悪性貧血であり、これは胃粘膜に影響を及ぼし、胃萎縮を引き起こす自己免疫疾患である。これは壁細胞の破壊、無酸症、内因子の産生不能を引き起こし、ビタミンＢ１２吸収不良をもたらす。悪性貧血を治療せずに放置すると、ビタミンＢ１２の適切な食事摂取があっても、ビタミンＢ１２欠乏症、ひいては巨赤芽球性貧血および神経障害を引き起こす。この特定の症状は、ビタミンＢ１２の適切な食事摂取、すなわち合成形態のビタミンＢ１２の経口摂取による消費が、体内へのビタミンの十分またな適切な吸収を確保しないことを示す。
【０００６】
ビタミンＢ−１２欠乏症は、菜食主義者および完全菜食主義者の間では特に一般的であるが、意外にも肉食主義者にもよく起こる。ビタミンＢ−１２は小腸でしか吸収することができず、高濃度のＢ−１２を消費する多くの肉食主義者は、一般的な腸疾患のため、腸内でこれを吸収することができず、それゆえにビタミンＢ１２欠乏症を患う。
【０００７】
広い意味で、Ｂ１２とは、コバラミンとして知られるコバルト含有ビタマー化合物の群を指し、これらとしてはシアノコバラミン（ヒドロキシコバラミンが精製される場合、常に微量のシアン化物を含有する、活性炭を用いて形成される人工物）、ヒドロキソコバラミン（細菌により産生される、別の医薬形態）、ならびに最後に、ヒト体内で天然に発生するＢ１２の２つの補因子形態、５’−デオキシアデノシルコバラミン（アデノシルコバラミン−ＡｄｏＢ１２）、メチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＵＴ）の補因子、およびメチルコバラミン（ＭｅＢ１２）、ホモシステインのメチオニンへのおよび５−メチルテトラヒドロ葉酸塩のテトラヒドロ葉酸塩への変換に関与する、酵素メチオニンシンターゼの補因子が挙げられる。
【０００８】
シアノコバラミンは、食品中および栄養補助食品に用いられる主要なＢ１２形態である。この形態は、視神経損傷のまれな事例、または体が、喫煙により引き起こされる血中の高シアン化物濃度のため、辛うじてこの形態を用いることができる場合において、望ましくない影響をもたらし得る。疑似ビタミン−Ｂ１２とは、ヒトにおいて生物学的に不活性であり、（動物を含む）多くの食物供給源、ならびにあるいは栄養補助食品および強化食品中でＢ１２とともに存在が確認されている、Ｂ１２様類似体を指す。
【０００９】
ビタミンＢ１２の主な供給源は、食品、栄養補助食品、および処方箋である。
【００１０】
ビタミンＢ１２は、魚、肉、鶏肉、卵、乳、乳製品を含む、動物由来製品中に天然で見られる。しかしながら、卵黄および卵白の結合能は熱処理後に著しく低下する。生物学的に活性なＢ１２の非動物性食物供給源は現在いくつかしか示唆されておらず、これらのいずれにもヒト試験は行われていない。
【００１１】
藻類は、従属栄養細菌との、細菌が固定炭素と引き換えにＢ１２を供給する、共生関係を通してＢ１２を獲得すると考えられる。スピルリナおよび乾物アサクサノリ（ポルフィラ・テネラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｔｅｎｅｒａ））は、生物学的な活性なＢ１２ではなく、ほぼ疑似ビタミンＢ１２を含有することが確認されている。アサクサノリ（ポルフィラテネラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａｔｅｎｅｒａ））は、乾物状態ではほぼ疑似ビタミンＢ１２を含有し、新鮮状態ではほぼ生物学的に活性なビタミンＢ１２を含有することが報告されているが、その新鮮状態のビタミン活性でさえも動物酵素アッセイでは検証されていない。
【００１２】
スサビノリ（ピロピア・イェゾエンシス（Ｐｙｒｏｐｉａ  ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ））として知られる紫色のアマノリ属の海藻は、その新鮮状態で、ラットモデルにおいてＢ１２活性を含有することが報告されており、これはこの供給源がヒトにおいて活性であることを示す。これらの結果は確証されていない。
【００１３】
ビタミンＢ１２は一般的には植物性食品中には存在しないが、ビタミンＢ１２で強化された食品も、ビタミンはシアノコバラミンのような商業的な細菌産生源から栄養補助食品形態で添加されるので、それらをＢ１２の真の食物供給源とみなすことはできないが、ビタミンの供給源である。Ｂ１２強化食品の例としては、強化朝食シリアル、強化大豆製品、強化エナジーバー、および強化ニュートリショナルイーストが挙げられる。これらのすべてが標示量のビタミン活性を含有し得るわけではない。別の研究では、飲料に添加された補助Ｂ１２は分解し、さまざまな濃度の疑似ビタミン−Ｂ１２を含有することが見出された。
【００１４】
Ｂ１２の非在来型の天然供給源も存在するが、Ｂ１２の食物供給源としてのそれらの有用性は疑わしい。例えば、地面から引き抜かれ、丁寧に洗っていない植物は、周囲の土壌中に存在する細菌からのＢ１２の残留物を含み得る。Ｂ１２は、水が消毒されていない場合、湖でも見られる。シロアリのような特定の昆虫は、反芻動物に類似した方法で、その腸内細菌により産生されるＢ１２を含有する。ヒトの腸管自体は、小腸にＢ１２産生細菌を含有し得るが、栄養要求を満たすのに十分な量のビタミンを産生することができるかは不明である。
【００１５】
栄養補助食品において、ビタミンＢ１２は通常、シアノコバラミン、体が活性形態メチルコバラミンおよび５−デオキシアデノシルコバラミンに容易に変換する形態として存在する。栄養補助食品は、メチルコバラミンおよびビタミンＢ１２の他の形態を含有することもできる。既存の証拠は、吸収またはバイオアベイラビリティについて形態間のいかなる差異も示さない。しかしながら、栄養補助食品からビタミンＢ１２を吸収する体の能力は、内因子の容量により大いに限定される。例えば、５００ｍｃｇの経口栄養補助食品の約１０ｍｃｇのみが実際に健康な人々に吸収される。
【００１６】
経口栄養補助食品に加えて、ビタミンＢ１２は、錠剤またはトローチ剤として舌下製剤で入手可能である。これらの製剤優れたバイオアベイラビリティを有するとしてよく販売されているが、証拠が示すところによると経口および舌下形態の間で有効性に差はない。
【００１７】
ビタミンＢ１２は、シアノコバラミンおよび時にはヒドロキソコバラミンの形態で、処方箋医薬品として、通常は筋肉内注射により、非経口投与することができる。非経口投与は典型的には、悪性貧血により引き起こされるビタミンＢ１２欠乏症ならびにビタミンＢ１２吸収不良および重篤なビタミンＢ１２欠乏症をもたらす他の症状を治療するのに用いられる。
【００１８】
ビタミンＢ１２は、処方箋医薬品として、鼻腔内に塗布されるゲル製剤、患者によっては好まれ得るビタミンＢ１２注射の代替として販売される製品でも入手可能である。この剤形は、ビタミンＢ１２血中濃度］を上昇させるのに効果的であると考えられるが、十分な臨床試験は行われていない。
【００１９】
合成ビタミンＢ１２は、シアノコバラミンを形成するコバルトおよびシアン化物発酵により産生される。よって合成ビタミンＢ１２はシアン化物を含有する。これはごく少量だが、依然として体に対して毒性がある。このビタミンの一般的な合成形態、シアノコバラミンは、天然では発生しないが、その低コストを理由に、多数の医薬品および栄養補助食品において、ならびに食品添加物として用いられている。体内では、これはシアン化物の形成により、生理学的形態、メチルコバラミンおよびアデノシルコバラミンに変換される。シアン化物分子をビタミンから除去し、その後これを体外へ除去するには、（高濃度で心疾患を引き起こす）ホモシステイン濃度の低減のような他の重要な生理活性に必要な体内の分子の「メチル基」を用いる必要がある。より最近では、ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、およびアデノシルコバラミンは、より高価な薬理学的製品および栄養補助食品中に見られる。それらの追加の有用性については現在議論されている。
【００２０】
現行のＢ１２の工業産生は選択された微生物の発酵による。ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）細菌は、長年ビタミンＢ１２の商業的な供給源であった。今日より一般的に用いられているのは、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）およびプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）亜種シェルマニ（ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）である。これらの細菌種は収率を向上させる特別な条件下でたびたび増殖され、これらの種の一方または両方の遺伝子組み換えバージョンがいくつかの会社で使用されている。プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の多数の種は外毒素または内毒素を生成せず、米国の食品医薬品局により一般的に安全とみなされ（ＧＲＡＳ認証を取得し）ているため、それらは現在ＦＤＡにとって好ましいビタミンＢ１２産生のための細菌発酵生物である。
【００２１】
シアノコバラミンは細菌発酵により商業的に調製される。さまざまな微生物による発酵は、メチル−、ヒドロキソ−、およびアデノシルコバラミンの混合物をもたらす。これらの化合物は、亜硝酸ナトリウムおよび熱の存在下でのシアン化カリウムの添加により、シアノコバラミンに変換される。シアノコバラミンの経口使用は、呼吸困難、顔、唇、舌、または喉の腫れのようないくつかのアレルギー反応を引き起こし得る。それほど重篤でない副作用は、頭痛、嘔気、胃もたれ、下痢、関節痛、痒み、または発疹を含み得る。
【００２２】
いくつかの形態の貧血（例えば、巨赤芽球性貧血）の治療において、シアノコバラミンの使用は、貧血解消の際の細胞内カリウム移動により、死に至る場合もある重篤な低ナトリウム血症を引き起こし得る。ビタミンＢ１２で治療される場合、レーベル病を有する患者は急速な視神経萎縮にかかり得る。アオウキクサ種は、世界中で見られる小さな浮葉性水生植物であり、波立たない栄養豊富で新鮮な汽水上で厚い毛布のようなマット状に増殖するものがよく見られる。それらは、間違えて藻と呼ばれることが多いが、植物科ウキクサ科に属する単子葉植物であり、高等植物、または大型植物と分類される。
【００２３】
アオウキクサ、またはウキクサ科（Ｌａｍｎａｃｅａｅ）は、波立たないまたはゆっくり動く新鮮な水体および湿地の表面上またはそのすぐ下に浮く水生顕花植物である。ウキクサ属ウォルフィア（Ｗｏｌｆｆｉａ）の花は、わずか０．３ｍｍ長で最も小さいことが知られる。
【００２４】
アオウキクサは、下水道、集約型畜産または集約型灌漑作物産生から生じる廃水から鉱物汚染物質を除去するというその大きな可能性のため、研究上注目を受けてきた。アオウキクサは、最適な増殖速度を得るには、管理、風からの保護、および最適な密度の維持を必要とする。世界の多くの地域において、アオウキクサは家畜および野生（家禽、魚、草食動物およびヒト）により消費される。最も小さいウキクサ（ウォルフィア・アリザ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｒｒｈｉｚａ））は、ミャンマー、ラオスおよびタイ北部の人々により栄養価の高い野菜として代々用いられている。アオウキクサは素晴らしいサラダの具となり、とてもおいしい。
【００２５】
ウキクサ（属種のほとんど）は、他の水生、陸生植物と比較しても、それらの増殖培地からのさまざまな鉱物（カチオンおよびアニオン）の高い結合能（固定）を有する。この特性は給水の清浄（水の脱汚染）に利用されるが、同時に、この特性はこうした植物をヒト食物代替物の供給源として用いる上で大きな制限となる。
【００２６】
共生的アオウキクサ−細菌培養物は、アオウキクサによる廃水からの栄養分除去（廃水処理）およびデンプン−バイオマス製造（エネルギー／化学原料の製造）を向上させるのに用いられてきた。（ｈｔｔｐ：／／ｄｕｃｋｗｅｅｄ２０１３．ｒｕｔｇｅｒｓ．ｅｄｕ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／１６＿ｔｏｙａｍａ＿ｔａｄａｓｈｉ．ｐｄｆ）。内部共生的桿菌培養物からの抽出物によりコウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ  Ｌ．ｍｉｎｏｒ）に対する除草活性が示されたことがさらに報告された（Ｋ．Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｓｃｈｉｍａｎａ，Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｈ．Ｐ．Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｋａｌｌｅｎｂｏｒｎ，Ｍ．Ｈｏｌｚｅｎｋａｍｐｆｅｒ，Ｐ．Ｋｒａｓｔｅｌ，Ａ．Ｚｅｅｃｋ，Ｊ．Ｖａｔｅｒ，Ａ．Ｈｏｌｔｚｅｌ，Ｄ．Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄ，Ｊ．ＲｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒおよびＫ．Ｄｅｔｔｎｅｒ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｉｌｌｉ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１７（２００２）１９９−２０５。日本国特許第ＪＰＳ６３５２９６０号公報（ＣＯＬＬＥＣＴＩＮＧ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＡＮＥ  ＢＹ  ＷＯＬＦＦＩＡ  ＡＲＲＨＩＺＡ  ＡＮＤ  ＤＵＣＫＷＥＥＤ）は、光合成細菌および微細藻類を有機廃液中で培養し、得られた培養液にワムシおよびミジンコを添加し、ウォルフィア・アリザおよびアオウキクサをそれらとその間の食物連鎖の存在下で培養し、アオウキクサおよびウォルフィア・アリザのデンプン形成能力を利用することによる、デンプン形成植物体からのアルコールの発酵について教示する。
【００２７】
上記を踏まえ、ビタミンＢ１２富化天然由来組成物およびその方法を提供するという、長い間満たされていない必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、本発明の１つの目的は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造方法であって、（ａ）少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、（ｂ）少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｄ）少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｅ）ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｆ）最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するステップと、（ｇ）所定の時間間隔でＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップとを含む、方法を開示することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、（ｉ）少なくとも１つのウキクサ亜科種植物の最適な増殖、および（ｉｉ）これと関連したビタミンＢ１２合成細菌の最適な発酵のために設計された所定の条件を選択するステップをさらに含む、上記で定義される方法を開示することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、少なくとも１つの細菌種と少なくとも１つのウキクサ亜科種との関連をもたらす所定の条件下で増殖させるステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、関連を、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、接種するステップが、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を回分または連続培養物として増殖させるステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、接種するステップが、一定体積の増殖培地を水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、接種するステップが、一定体積の増殖培地をプール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件を、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、鉱物を、Ｍｇ２＋、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、ＣａＣｌ２、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、水処理手順を、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、細菌種の共生的な発酵およびビタミンＢ１２合成のための所定の条件を、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内のアミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、糖を、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源を、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４１】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸またはこれらの混合物を、Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４２】
本発明のさらなる目的は、微量元素を、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４３】
本発明のさらなる目的は、細菌を、Ｐ．アルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｚａ）、Ｐ．マリーナ（Ｐ．ｍｕｒｉｎａ）のようなシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エアロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロトアミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４４】
本発明のさらなる目的は、決定するステップが、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の時間に対する増殖曲線を決定し、少なくとも１つのウキクサ亜科種の最も高いバイオマスおよび少なくとも１つの細菌種の最も高い細菌細胞数により特徴付けられる時間間隔を特定するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４５】
本発明のさらなる目的は、バイオマスを、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４６】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのウキクサ亜科種を、ランドルティア（Ｌａｎｄｏｌｔｉａ）、レムナ（Ｌｅｍｎａ）、スピロデラ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ）、ウォルフィア（Ｗｏｌｆｆｉａ）、ウォルフィエラ（Ｗｏｌｆｆｉｅｌｌａ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる属群に属する種から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４７】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのウキクサ亜科種を、ウォルフィア・アングスタ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ウォルフィア・アリザ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｒｒｈｉｚａ）、ウォルフィア・アウストラリアナ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｕｓｔｒａｌｉａｎａ）、ウォルフィア・ボレアリス（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ウォルフィア・ブラシリエンシス（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ウォルフィア・コロンビアナ（Ｗｏｌｆｆｉａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ）、ウォルフィア・シリンドラセ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ウォルフィア・エロンガテ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｅｌｏｎｇａｔｅ）、ミジンコウキクサ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｇｌｏｂｏｓｅ）、ウォルフィア・ミクロスコピカ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ）、ウォルフィア・ネグレクタ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｎｅｇｌｅｃｔａ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇのビタミンＢ１２を含むビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物であって、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を含み、さらに組成物中のビタミンＢ１２含有量がＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物を開示することである。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、組成物中のビタミンＢ１２含有量が、ビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＤＶ）の少なくとも２０％の所定の割合である、上記で定義される組成物を開示することである。
【００５１】
本発明のさらなる目的は、組成物中のビタミンＢ１２含有量が、１日当たり約０．４μｇ〜約３μｇの範囲内の成人のビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＲＤＩ）標準に従う、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのＢ１２産生細菌種が少なくとも１つのウキクサ亜科種と関連している、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、関連が、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５４】
本発明のさらなる目的は、Ｂ１２産生細菌種が、Ｐ．アルギノーザ、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５５】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのウキクサ亜科種が、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５６】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのウキクサ亜科種が、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属に属する、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５７】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのウキクサ亜科種が、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物を開示することである。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、所定の条件が、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための条件、細菌種の発酵およびビタミンＢ１２合成のための条件、ならびにこれらの組み合わせから選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６０】
本発明のさらなる目的は、一定体積の増殖培地が回分または連続培養物である、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６１】
本発明のさらなる目的は、一定体積の増殖培地が水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６２】
本発明のさらなる目的は、一定体積の増殖培地が、プール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６３】
本発明のさらなる目的は、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件が、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、鉱物が、Ｍｇ２＋、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、ＣａＣｌ２、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６５】
本発明のさらなる目的は、水処理手順が、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６６】
本発明のさらなる目的は、細菌種の発酵およびビタミンＢ１２合成のための所定の条件が、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内のアミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６７】
本発明のさらなる目的は、糖が、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６８】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源が、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００６９】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸またはこれらの混合物が、Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００７０】
本発明のさらなる目的は、微量元素が、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
【００７１】
本発明のさらなる目的は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造システムであって、（ａ）一定体積の増殖培地での培養のための、ウキクサ亜科種の少なくとも１つの接種原およびビタミンＢ１２産生細菌種の少なくとも１つの接種原と、（ｂ）少なくとも１つのウキクサ亜科種接種原および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種接種原を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするための、インキュベーション手段と、（ｃ）最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するための手段と、（ｄ）所定の時間間隔でＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすための手段とを備える、システムを開示することである。
【００７２】
本発明のさらなる目的は、（ａ）ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、（ｂ）少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、および（ｃ）ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段からなる群から選択される少なくとも１つのプロット手段をさらに備える、上記で定義されるシステムを開示することである。
【００７３】
本発明のさらなる目的は、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種のビタミンＢ１２富化抽出物を含む組成物であって、さらに組成物中のビタミンＢ１２含有量がＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物を開示することである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
ここで図面を参照しながら本発明について説明する。
【００７５】
【図１】従来技術において知られる典型的な細菌増殖曲線または動的曲線の概略図である。
【図２】本発明の一実施形態としての、例示的なアオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）増殖曲線またはプロファイルの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
下記の説明では、本発明のさまざまな態様について記載する。本発明の十分な理解を提供するため、説明を目的として具体的な詳細を記載する。その本質的な性質に影響を及ぼすことなく、詳細が異なる本発明の他の実施形態が存在することは、当業者には明らかである。したがって本発明は、図面で例示され、明細書で説明されるものではなく、添付の特許請求の範囲において、この特許請求の範囲の最も広い解釈によってのみ決定される適切な範囲をもって、指示されるものとしてのみ限定される。
【００７７】
本発明の本質は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）の、その培養、増殖および維持のための、新規アオウキクサ−細菌共生または関連システムおよびプロトコルの確立による、提供である。前述のシステムおよびプロトコルは、Ｂ１２合成細菌の産生性の高い培養と組み合わせたアオウキクサバイオマスの最適な増殖のために設計される。ビタミンＢ１２はアオウキクサにより、またはその中で産生することができないことが強調されるべきであるが、本発明によって、前述の細菌による合成後にアオウキクサ植物中に効果的に吸収またはアオウキクサバイオマスと関連させることができることが示される。得られたビタミンＢ１２富化ＤＢＣは、ビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＲＤＩ）標準の所定の割合として、ヒト消費のための天然由来ビタミンＢ１２供給源として用いられる。好ましくは、ビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物は、ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００μｇのビタミンＢ１２を含有する。
【００７８】
本発明は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造方法であって、（ａ）少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、（ｂ）少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｄ）少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｅ）ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｆ）最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するステップと、（ｇ）所定の時間間隔でＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップとを含む、方法を提供する。
【００７９】
本明細書において用いられるとおり、「約」の語は以下、参照値の２５％下または上の範囲を指す。
【００８０】
「アオウキクサ」の語は以下、水および湿地の表面上またはそのすぐ下に浮く、水生顕花植物を指す。これらはサトイモＡｒａｃｅａｅ）科に属し、したがってサトイモ科内のウキクサ（Ｌｅｍｎｏｉｄｅａｅ）亜科と分類されることが多い。他の分類によると、これらは独立したウキクサ（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）科として分類される。
【００８１】
ウキクサ科の最も知られた属種を次に挙げる。
【００８２】
レムナ（ＬＥＭＮＡ）（例えば、Ｌギバ（Ｌ  ｇｉｂｂａ）、Ｌ．ディスペルマ（Ｌ．ｄｉｓｐｅｒｎａ）、Ｌギバ（Ｌ  ｇｉｂｂａ）、Ｌジャポニカ（Ｌ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｌミニマ（Ｌ  ｍｉｎｉｍａ）、Ｌミノル（Ｌ  ｍｉｎｏｒ）、Ｌミニスキュラ（Ｌ  ｍｉｎｕｓｃｕｌａ）、Ｌポーシコスタタ（Ｌ  ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ）、Ｌペルプシラ（Ｌ  ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）、Ｌポリリザ（Ｌ  ｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ）、Ｌツリオニフェラ（Ｌ  ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ）、Ｌトリスルカ（Ｌ．ｔｒｉｓｕｌｃａ）、Ｌヴァルジヴィアナ（Ｌ  ｖａｌｄｉｖｉａｎａ））。
【００８３】
スピロデラ（ＳＰＩＲＯＤＥＬＡ）（例えば、Ｓ．ビペルフォラタ（Ｓ．ｂｉｐｅｒｆｏｒａｔａ）、Ｓ．インテルメディア（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｓ．オリゴリザ（Ｓ．ｏｌｉｇｏｒｒｈｉｚａ）、Ｓ．ポリリザ（Ｓ．ｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ）、Ｓ．プンクタタ（Ｓ．ｐｕｎｃｔａｔａ））。
【００８４】
ウォルフィア（ＷＯＬＦＦＩＡ）（例えば、Ｗ．アリザ（Ｗ．ａｒｒｈｉｚａ）、Ｗ．アウストラリアナ（Ｗ．ａｕｓｔｒａｌｉａｎａ）、Ｗ．コロンビアナ（Ｗ．Ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ）、Ｗ．ミクロスコピア（Ｗ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉａ）、Ｗ．ネグレクタ（Ｗ．ｎｅｇｌｅｃｔａ）、ウォルフィア・アングスタ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、ウォルフィア・ボレアリス（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ウォルフィア・ブラシリエンシス（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ウォルフィア・シリンドラセ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、
【００８５】
ウォルフィア・エロンガタ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、ウォルフィア・グロボサ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｇｌｏｂｏｓａ）、およびウォルフィア・ミクロスコピカ（Ｗｏｌｆｆｉａ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ））。
【００８６】
ウォルフィエラ（ＷＯＬＦＦＩＥＬＬＡ）（例えば、Ｗ．カウダタ（Ｗ．ｃａｕｄａｔｅ）、Ｗ．デンティクラタ（Ｗ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔｅ）、Ｗ．リングラタ（Ｗ．ｌｉｎｇｕｌａｔａ）、Ｗ．オブロンガ（Ｗ．ｏｂｌｏｎｇａ）、Ｗ．ロツンダ（Ｗ．ｒｏｔｕｎｄａ））。
【００８７】
「新鮮重量」の語は以下、含水量が９３〜９７重量％の範囲内で含まれる、新鮮野菜の形態のアオウキクサ植物を指す。
【００８８】
「乾物重量」の語は以下、含水量が２〜８重量％の範囲内で含まれる、乾物野菜の形態のアオウキクサ植物を指す。
【００８９】
「ビタミンＢ１２」の語は以下、Ｂ１２またはビタミンＢ−１２の語を指し、コバラミンとも呼ばれる。ビタミンＢ１２は、適切な赤血球形成、神経機能、およびＤＮＡ合成に必要な水溶性ビタミンである。これは通常、特にＤＮＡ合成および制御に影響を及ぼすヒトの体の各細胞の代謝、また脂肪酸代謝およびアミノ酸代謝に関与する。ビタミンＢ１２は、いくつかの形態で存在し、鉱物コバルトを含有するので、ビタミンＢ１２活性を有する化合物は集合的に「コバラミン」と呼ばれる。
【００９０】
真菌も、植物または動物も、ビタミンＢ１２を産生することができない。細菌および古細菌のみがその合成に必要な酵素を有するが、多くの食物は細菌共生によってＢ１２の天然供給源である。このビタミンは、最も大きく最も構造的に複雑なビタミンであり、細菌発酵−合成によってのみ工業的に産生することができる。
【００９１】
メチルコバラミンおよび５−デオキシアデノシルコバラミンは、ヒト代謝において活性なビタミンＢ１２の形態であることがさらに認識されている。
【００９２】
栄養補助食品において、ビタミンＢ１２は通常、シアノコバラミン、体が活性形態メチルコバラミンおよび５−デオキシアデノシルコバラミンに容易に変換する形態として存在する。栄養補助食品は、メチルコバラミンおよびビタミンＢ１２の他の形態を含有することもできる。しかしながら、栄養補助食品からビタミンＢ１２を吸収する体の能力は、内因子の容量により大いに限定される。例えば、５００ｍｃｇの経口栄養補助食品の約１０ｍｃｇのみが実際に健康な人々に吸収される。
【００９３】
疑似ビタミン−Ｂ１２とは、ヒトにおいて生物学的に不活性であり、ヒト、（動物を含む）多くの食物供給源、ならびにあるいは栄養補助食品および強化食品においてＢ１２とともに存在が確認されている、Ｂ１２様類似体を指す。
【００９４】
「ビタミンＢ１２産生細菌種」の語は以下、それが発酵により細胞内または細胞外でビタミンＢ１２を産生することができる細菌種を指す。本明細書では、下記属、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、およびキサントモナスの種はＢ１２を合成することが知られることが認識されている。
【００９５】
ビタミンＢ１２産生細菌種の非限定的な例として、Ｐ．アルギノーザ、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられることは、本発明の範囲内である。
【００９６】
「アオウキクサ細菌培養物」または「ＤＢＣ」の語は以下、一定体積の増殖培地における少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種のいずれかのタイプの増殖を指す。前述の共培養は、本明細書に開示される、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種の間のいずれかのタイプの相互作用、関連または関連相互作用を含む。
【００９７】
本明細書において用いられる「関連相互作用」または「関連」または「共生」の語は一般的には以下、２つ以上の異なる生物種間の密接で長期の相互作用を指す。この語は、これらに限定されないが、共生、永続的な相利共生、および相利的、片利的、または寄生的な共生のような永続的な生物相互作用を含む、いずれかのタイプの種相互作用を指す。
【００９８】
特定の態様では、種間の関係は絶対的であり、両方の共生体が生存について完全に互いに依存していることを意味する。あるいは、それらは条件的であり、他の生物と共生することができるが、そうしなくてもよいことを意味する。種間の関係が、一方が他方の上で生活する関連、すなわち外部共生、または一方のパートナーが他方の内部で生活する関連、すなわち内部共生を含むことは、さらに本発明の範囲内である。より具体的には、内部共生とは、一方の共生体が他方の、細胞内または細胞外の、組織内で生活するいずれかの共生関係である。また、外部共生とは、共生体が、消化管または外分泌腺の導管の内表面を含む、宿主の体表上で生活する、いずれかの共生関係である。
【００９９】
ここで、両方の個体が利益を得る、異なる種の個体間の関係を指す、相利共生または種間の相互利他現象を参照する。相利共生的な関係とは、両種にとって絶対的であっても、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的でも、両種にとって条件的でもよい。特定の態様によると、相利的な共生中、宿主細胞は栄養素のいくつかを欠き、これは内部共生体により提供される。結果として、宿主は、いくつかの特殊化細胞を提供することにより、自身の内部での内部共生体の増殖プロセスを助け得る。これらの細胞は、増加する内部共生体数を制御するため、宿主の遺伝子組成に影響を及ぼし得、これらの遺伝子変化が垂直伝播によって子孫に継承されることを確保する。
【０１００】
ここで、一方が利益を得て、他方が顕著な危害も援助も受けない、２つの生体間の関係を表す、片利共生を参照する。
【０１０１】
ここで、関連の一方のメンバーが利益を得て、他方が危害を受ける、寄生関係を参照する。この語は、敵対的または対立的な共生としても知られる。寄生的な共生が、宿主の体内で生活する内部寄生から、その体表上で生活する外部寄生まで多数の形態を含んでもよいことは、さらに本発明の範囲内である。また、寄生体が、その宿主を殺すことを意味する死体栄養性であっても、宿主の生存に依存することを意味する生体栄養性であってもよいことは、本発明の範囲内である。
【０１０２】
ここで、一方の種が阻害または完全に抹消され、一方が影響を受けない場合に存在するタイプの関係である、片害作用を参照する。２つのタイプの片害作用、競争および抗生があることは、本発明の範囲内である。競争とは、より大きいまたは強い生物がより小さいまたは弱い生物から資源を奪う場合である。抗生とは、一方の生物がもう一方により化学分泌物によって損傷または殺傷される場合に起こる。
【０１０３】
ここで、種間の相互作用が関与する両方の生物にとって有害である、共死を参照する。これは、相互作用が最終的には死をもたらすので、短命な条件である。
【０１０４】
種間の相互作用または関連を生物の物理的な接続により分類してもよいことは、さらに本発明の範囲内である。生物が身体的な結合を有する相互作用は接続的と称され、結合していない相互作用は離接的な共生と称される。
【０１０５】
「バイオマス」の語は以下、生物の総質量、すなわち所定の面積または体積の少なくとも１つのウキクサ亜科種を指し、体積、新鮮重量、乾物重量、またはアオウキクサ植物の増殖に関するいずれかの従来の測定値を指し得る。
【０１０６】
「細菌数」の語は以下、細菌数のいずれかの定量決定または細菌増殖および細胞数の指数（バイオマス）を指す。これは、これらに限定されないが、細菌数を決定するための２つの広く用いられる方法、すなわち標準、または可変、平板計数法および分光光度（比濁）分析を含む。平板計数の非限定的な例は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）法である。分光光度（比濁）分析は培養物中の濁度の増加を参照してもよい。分光光度計を用いることにより、細胞数が増加すると透過光の量が減少する。透過光は電気エネルギーに変換され、これは検流計上に表示される。吸光度または光学密度と呼ばれる指示値は、間接的に細菌数を反映する。
【０１０７】
「増殖培地」の語は以下、これらに限定されないが、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の窒素、リン、カリウム、カルシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、マグネシウム、尿素、亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニア、（デキストロース、グルコース、ラクトースのような）糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内の（酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物のような）アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の（Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリンのような）アミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の（塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムのような）微量元素、ビタミン、（ＮＨ４）２Ｓ０４、Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、ＣｏＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｉｔｒａｔ、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２０、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＦｅＴａｒｔｒａｔ、Ｈ２ＭｏＯ４．４Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、Ｈ３ＰＯ４、ＫＩ、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、無機（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、Ｈ３ＰＯ４、ＫＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、Ｋ２ＣＯ３、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｚｎ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、肥料、尿素、Ｎａ２ＥＤＴＡ、ハトナー、ホーグランド−Ａ、ホーグランド−Ｂ、Ｐｉｒｓｏｎ、ホーグランド−Ｃ、スタインバーグ、シェンク・ヒルデブラント、ムラシゲ、およびこれらのいずれかの組み合わせのような成分を補充した水を指す。
【０１０８】
いくつかの実施形態によると、増殖培地は、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、含水量および（脱窒、機械的、濾過のような）処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせのような所定の条件およびパラメータを達成するように制御および操作される。
【０１０９】
「食事摂取基準」もしくは「ＤＲＩ」または「推奨１日摂取量」もしくは「ＲＤＩ」の語は以下、健康な個体を維持するための必要量を満たすのに十分であると考えられる栄養素の１日摂取レベルに関するいずれかの標準を指す。ＲＤＩ標準は、非限定的な例において、推奨食事許容量（ＲＤＡ）、推定平均必要量（ＥＡＲ）、適正摂取量（ＡＩ）、および上限摂取量（ＵＬ）標準を含み得る。
【０１１０】
本明細書では、ビタミンＢ１２食事摂取基準が１日当たり０．４〜約３μｇの範囲内であることが認識されている。特定の実施形態では、成人のビタミンＢ１２食事摂取基準は米国保健機関によると１日当たり約２〜約３μｇの範囲内であり、英国保健機関によると１日当たり約１．５μｇである。比較的新しい研究によると、ＤＲＩは１日当たり約４〜約７μｇとするべきである。
【０１１１】
ここで、ビタミンＢ１２の現行ＲＤＡマイクログラム（ｍｃｇ）をまとめる、表１を参照する。０〜１２か月の乳児について、全米アカデミーズ（旧全米科学アカデミー）の医学研究所（ＩＯＭ）の食品栄養委員会（ＦＮＢ）は、健康な哺乳中の乳児におけるビタミンＢ１２の平均摂取量に等しい、ビタミンＢ１２の適正摂取量（ＡＩ）を確立した。
【表１】
2018514221.tif 000003
【０１１２】
本発明の１つの実施形態により、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造方法であって、（ａ）少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、（ｂ）少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｄ）少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｅ）ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、（ｆ）最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するステップと、（ｇ）所定の時間間隔でＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップとを含む方法が開示される。
【０１１３】
インキュベートするステップが、（ｉ）少なくとも１つのウキクサ亜科種植物の最適な増殖、および（ｉｉ）これと関連したビタミンＢ１２合成細菌の最適な発酵のために設計された所定の条件を選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１１４】
インキュベートするステップが、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を、少なくとも１つの細菌種と少なくとも１つのウキクサ亜科種との関連をもたらす所定の条件下で増殖させるステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１１５】
関連を、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１１６】
接種するステップが、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を回分または連続培養物として増殖させるステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１１７】
接種するステップが、一定体積の増殖培地を水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１１８】
接種するステップが、一定体積の増殖培地をプール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１１９】
インキュベートするステップが、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件を、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２０】
鉱物を、Ｍｇ２＋、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、ＣａＣｌ２、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２１】
水処理手順を、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２２】
インキュベートするステップが、細菌種の共生的な発酵およびビタミンＢ１２合成のための所定の条件を、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内のアミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２３】
糖を、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２４】
アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源を、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２５】
アミノ酸またはこれらの混合物を、Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２６】
微量元素を、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２７】
細菌を、Ｐ．アルギノーザ、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２８】
決定するステップが、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の時間に対する増殖曲線を決定し、少なくとも１つのウキクサ亜科種の最も高いバイオマスおよび少なくとも１つの細菌種の最も高い細菌細胞数により特徴付けられる時間間隔を特定するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１２９】
バイオマスを、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１３０】
少なくとも１つのウキクサ亜科種を、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる属群に属する種から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１３１】
少なくとも１つのウキクサ亜科種を、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１３２】
ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇのビタミンＢ１２を含むビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１３３】
本発明は、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物であって、少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種を含み、さらに組成物中のビタミンＢ１２含有量がＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物をさらに提供する。
【０１３４】
１つの実施形態により、組成物中のビタミンＢ１２含有量が、ビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＤＶ）の少なくとも２０％の所定の割合である、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１３５】
１つの実施形態により、組成物中のビタミンＢ１２含有量が、１日当たり約０．４μｇ〜約３μｇの範囲内の成人のビタミンＢ１２推奨１日摂取量（ＲＤＩ）標準に従う、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１３６】
別の実施形態により、少なくとも１つのＢ１２産生細菌種が少なくとも１つのウキクサ亜科種と関連している、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１３７】
別の実施形態により、関連が、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１３８】
別の実施形態により、Ｂ１２産生細菌種が、Ｐ．アルギノーザ、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１３９】
別の実施形態により、少なくとも１つのウキクサ亜科種が、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１４０】
別の実施形態により、少なくとも１つのウキクサ亜科種が、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属に属する、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１４１】
別の実施形態により、少なくとも１つのウキクサ亜科種が、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
【０１４２】
上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される、ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）を含む組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４３】
所定の条件が、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための条件、細菌種の発酵およびビタミンＢ１２合成のための条件、ならびにこれらの組み合わせから選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４４】
一定体積の増殖培地が回分または連続培養物である、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４５】
一定体積の増殖培地が水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４６】
一定体積の増殖培地が、プール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４７】
ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件が、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、ｐＨ、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４８】
鉱物が、Ｍｇ２＋、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、ＣａＣｌ２、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１４９】
水処理手順が、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５０】
細菌種の発酵およびビタミンＢ１２合成のための所定の条件が、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの範囲内の糖濃度、約０．０１〜３．０％ｗ／ｖの濃度範囲内のアミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約０．０００１〜０．３ｇ／ｌの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５１】
糖が、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５２】
アミノ酸および／またはペプチドおよび／またはビタミン供給源が、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５３】
アミノ酸またはこれらの混合物が、Ｌ−アルギニンｏＨＣｌ、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンｏＨＣｌｏＨ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンｏＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａｏ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５４】
微量元素が、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５５】
ビタミンＢ１２富化アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）組成物の製造システムであって、（ａ）一定体積の増殖培地での培養のための、ウキクサ亜科種の少なくとも１つの接種原およびビタミンＢ１２産生細菌種の少なくとも１つの接種原と、（ｂ）少なくとも１つのウキクサ亜科種接種原および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種接種原を、アオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす所定の条件下でインキュベートするための、インキュベーション手段と、（ｃ）最も高いビタミンＢ１２含有量を有するＤＢＣにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するための手段と、（ｄ）所定の時間間隔でＤＢＣを採取し、これによりビタミンＢ１２富化ＤＢＣ組成物をもたらすための手段とを備えるシステムを開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５６】
（ａ）ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、（ｂ）少なくとも１つのＢ１２産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、および（ｃ）ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段
からなる群から選択される少なくとも１つのプロット手段をさらに備える、上記で定義されるシステムを開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５７】
少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのＢ１２産生細菌種のビタミンＢ１２富化抽出物を含む組成物であって、さらに組成物中のビタミンＢ１２含有量がＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇの範囲内である、組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
【０１５８】
ここで、従来技術において知られる典型的な細菌増殖曲線または動的曲線を示す、図１を参照する。この曲線は一般的には、選択された増殖培地への細菌の接種後の時間に対する細菌増殖期を表す。明らかなとおり、増殖曲線における第１段階は、誘導期と呼ばれる適応期間である。誘導期中、細菌は増殖培地に適応する。これは、個別の細菌が成熟中であり、まだ分裂できない期間である。細菌増殖サイクルの誘導期中は、ＲＮＡ、酵素および他の分子の合成が起こる。
【０１５９】
誘導期後、生物の増殖速度は順調に増加する。この期間は対数期である。対数期は細胞複製により特徴付けられる期間である。複製速度は特定の細胞数に比例する。増殖が制限されない場合、倍加は一定の速度で継続するので、細胞数および細胞数増加速度の両方は、連続時間毎に倍加する。このタイプの対数増殖について、時間に対して細胞数の自然対数をプロットし、直線をもたらす。この線の傾斜は生物の比増殖速度であり、単位時間当たりの細胞毎の分裂数の指標である。この増殖の実際の速度（すなわち図の線の傾斜）は、細胞分裂事象の頻度および両娘細胞の生存可能性に影響を及ぼす、増殖条件に依存する。対数増殖は、培地の栄養素が枯渇し、廃棄物が豊富になるので、無限に継続することはできない。
【０１６０】
よって、特定の時間の対数期後、栄養素の濃度の連続的な低下および／または毒性物質の濃度の連続的な増加（蓄積）のため、増殖速度は遅くなる。増殖増加が停止するこの期は、静止または定常期と呼ばれる。バイオマスは、培養物中の特定の蓄積された化学物質が細胞を溶解する場合（化学分解）を除き、一定のままである。よって、静止期は、必須栄養素の枯渇のような増殖限定因子、および／または有機酸のような阻害生成物の形成による。静止期は、増殖速度および死滅速度が等しい状況からもたらされる。作製された新しい細胞の数は増殖因子により制限され、結果として細胞増殖速度は細胞死滅速度と一致する。曲線の水平直線部が静止期中の結果である。
【０１６１】
他の微生物が培養物を汚染しない限り、化学構成は変わらないままである。培地中の栄養素のすべてが消費される場合、または毒素の濃度が高すぎる場合、細胞は老化し、死滅しはじめ得る。この死滅期において、バイオマスの総量は低下しない場合があるが、生存生物の数は低下する。死滅期では、（死滅期）細菌は死滅する。これは栄養素の欠如、高すぎるまたは低すぎる温度、等のためであり得る。
【０１６２】
本発明の主要な態様によると、高い細菌ビタミンＢ１２濃度の時間間隔は、図１に例示される細菌増殖曲線に従って特定されている。より高いビタミンＢ１２濃度の期間は、栄養素の濃度の連続的な低下および／または毒性物質の濃度の連続的な増加（蓄積）によって増殖速度が遅くなる、対数期および静止期の間の間隔で特定されることがわかる。この間隔で、増殖速度の増加が確認される。より高いビタミンＢ１２濃度の別の期間または時間間隔は、静止期の終了および死滅期の開始前の間で特定される。
ここで、本発明の一実施形態として、例示的なアオウキクサ−細菌培養物（ＤＢＣ）増殖曲線またはプロファイルを示す、図２を参照する。少なくとも１つのウキクサ亜科種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種が、（ｉ）ウキクサ亜科種バイオマスの最大有効な増殖、ならびに（ｉｉ）細菌種の最大かつ有効な発酵およびビタミンＢ１２合成のための所定の条件下で増殖されることは、本発明の範囲内である。図示されるとおり、最大Ｂ１２産生およびアオウキクサバイオマスの時間間隔が特定される。これらの時間間隔は、最大ＤＢＣＢ１２産生により特徴付けられる。換言すると、これらの時間間隔で、富化ビタミンＢ１２濃度を有するＤＢＣが採取される。この栄養価の高いビタミンＢ１２供給源は、ヒト消費のための高濃度の天然ビタミンＢ１２により特徴付けられる新鮮または乾燥物質として用いてもよい。
【０１６３】
本発明のいくつかの実施形態では、上記ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量は、ビタミンＢ１２食事摂取基準（ＤＲＩ）標準の所定の割合である。
【０１６４】
本発明の他の実施形態では、上記ＤＢＣ中のビタミンＢ１２含有量は、ビタミンＢ１２の１日摂取量（ＤＶ）の所定の割合である。
【０１６５】
本明細書では、ビタミンＢ１２および他の栄養素の推奨摂取量は、全米アカデミーズの医学研究所（ＩＯＭ）の食品栄養委員会（ＦＮＢ）により開発された、食事摂取基準（ＤＲＩ）で提供されると認識されている。「ＤＲＩ」の語は、本明細書では一般的には、健康な人々の栄養摂取を計画、評価するのに用いられる一連の基準値を指す。これらの値は、年齢および性別によって異なり、下記を含む。
【０１６６】
ほぼすべて（９７％〜９８％）の健康な個体の栄養所要量を満たすのに十分な平均１日摂取レベルと定義される、推奨食事許容量（ＲＤＡ）。
【０１６７】
ＲＤＡを展開するには証拠が不十分である場合に確立され、適正栄養量を確保すると仮定されるレベルで設定される、適正摂取量（ＡＩ）。
【０１６８】
健康への悪影響を引き起こす可能性の低い最大１日摂取量と定義される、許容上限摂取量（ＵＬ）。
【０１６９】
成人のビタミンＢ１２の食事摂取基準（ＤＲＩ）は、米国では１日当たり０．４〜３μｇの範囲内であり、英国では１日当たり約１．５μｇであることがさらに認識されている。しかし最近の研究によると、ＤＲＩは１日当たり４〜７μｇとするべきである。なお、食品安全応用栄養センターは、成人および４歳以上の子どもについて、２，０００カロリーのカロリー摂取量に基づき、１日当たり６μｇを推奨している。
【０１７０】
ビタミンＢ１２は、推奨食事許容量（ＲＤＡ）を超えない量で経口使用される場合、安全であると考えられることがさらに知られている。
【０１７１】
いくつかの態様によると、ビタミンＢ１２推奨食事許容量（ＲＤＡ）は、１４歳以上について１日２．４マイクログラムであり、妊娠中の女性について１日２．６マイクログラムであり、授乳中の女性について１日２．８マイクログラムである。５０歳を超える年齢の成人は、Ｂ１２強化食品を食べる、またはビタミンＢ１２サプリメントを摂ることにより、ＲＤＡを満たすべきである。高齢の人々においてビタミンＢ１２レベルを維持するためには、１日２５〜１００マイクログラムの補足が用いられていることが報告された。
【０１７２】
ここでビタミンＢ１２の１日摂取量（ＤＶ）を参照する。本明細書では、ＤＶは、消費者が標準的な１食分中のさまざまな栄養素のレベルをそのおよそ必要量に関して決定するのを助けるため、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により開発されたことが認識されている。ビタミンＢ１２のＤＶは６．０ｍｃｇである。しかしながら、ＦＤＡは、食品がこの栄養素で強化されてない限り、食品ラベルにビタミンＢ１２含有量を含めることを求めていない。ＤＶの２０％以上をもたらす食品は、栄養素の高または富化供給源であると考えられるが、もたらすＤＶの割合が低い食品も健康的な食事に貢献している。
【０１７３】
本発明は、予め設計された条件でアオウキクサ細菌培養物（ＤＢＣ）をもたらす、少なくとも１つのウキクサ亜種および少なくとも１つのビタミンＢ１２産生細菌種を含むビタミンＢ１２富化アオウキクサバイオマス組成物の製造手段および方法を提供する。ビタミンＢ１２富化組成物は、１日当たり約０．４ｍｃｇ〜約３ｍｃｇの推奨ビタミンＢ１２食事摂取基準（ＤＲＩ）を満たすため、所定の用量の上記組成物を１日当たり１回以上摂取することにより消費することができる。
【０１７４】
特定の態様によると、本発明の組成物は、ビタミンＢ１２ＤＶの２０％以上をもたらし、よってこの重要な栄養素の高または富化供給源であると考えられる。
【０１７５】
他の態様によると、本発明の組成物は、ＤＢＣ１００ｇ当たり約０．０１〜約１００μｇのビタミンＢ１２を含む。
【０１７６】
上述したとおり、ビタミンＢ１２富化組成物が、単回用量の組成物中で高濃度のビタミンＢ１２を得るため、好ましくは乾燥物質として提供されることは、本発明の範囲内である。
【図１】
2018514221.tif 000004
【図２】
2018514221.tif 000005
【国際調査報告】
2018514221.tif 000006