(57)【要約】  本発明は、細菌宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法および組成物を提供する。本組成物には、改変もしくは非相同プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチド；改変もしくは非相同プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼを含むポリペプチド；そのようなポリヌクレオチドを含む発現カセット、ＤＮＡ構築物、ベクターおよび染色体；およびそのようなポリヌクレオチドを含む細菌宿主細胞が含まれる。本方法には、細菌宿主細胞（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞）中での成熟プロテアーゼの生成を強化するための方法が含まれる。生成されたプロテアーゼは、クリーニング、動物飼料および繊維加工産業を含むがそれらに限定されない様々な産業において使用するために好適な酵素の工業生産において利用される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）任意選択的に１つのシグナルペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；
（ｂ）１つの非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼの前記プロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域であって、前記プロペプチド領域が配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む第２ポリヌクレオチド領域、および
（ｃ）１つのバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み；
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は前記第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、および前記第２ポリヌクレオチド領域は前記第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号８、配列番号５１、配列番号５２、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択されるサブチリシンの前記プロペプチド領域をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域であって、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む前記変異プロペプチド領域をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞内で発現した場合に前記バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位に対応する前記位置にあり、６位にある前記天然アミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３０位に対応する位置にあり、３０位にある前記天然アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３２位に対応する位置にあり、３２位にある前記天然アミノ酸は、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、前記プロペプチド領域が配列番号８の６位、３０位および３２位から選択された位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号８に規定した前記プロペプチド領域をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）由来のプロテアーゼの前記成熟領域をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
１つのプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）任意選択的に１つのシグナルペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；
（ｂ）バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のプロテアーゼの前記プロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および
（ｃ）１つのバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み；
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は前記第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、および前記第２ポリヌクレオチド領域は前記第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも５０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域であって、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む前記変異プロペプチド領域をコードする、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位に対応する前記位置にあり、６位にある前記天然アミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３０位に対応する前記位置にあり、３０位にある前記天然アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３２位に対応する前記位置にあり、３２位にある前記天然アミノ酸は、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、前記プロペプチド領域が配列番号８の６位、３０位および３２位から選択された位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号８に規定した前記プロペプチド領域をコードする、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）由来のプロテアーゼの前記成熟領域をコードする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）任意選択的に１つのシグナルペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；
（ｂ）第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域；および
（ｃ）第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は前記第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、および前記第２ポリヌクレオチド領域は前記第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える変異プロペプチド領域であって、配列番号７の３４位に対応する位置で１つのアミノ酸置換を含む前記変異プロペプチド領域をコードする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号７の３４位での前記アミノ酸置換は、Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）由来のプロテアーゼの前記成熟領域をコードする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０または配列番号１１の前記Ｂｇｉ０２４４４６成熟領域をコードする、請求項１、１１または１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１２または配１３のＢＳＰ−００１成熟領域をコードする、請求項１、１１または１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４または９との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１、１１または１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号４０の前記アミノ酸配列をコードする第１ポリヌクレオチド領域；
（ｂ）配列番号８の前記アミノ酸配列をコードする、またはＥ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６Ｙ、Ｅ６Ｖ、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０Ｙ、Ｅ３０Ｖ、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を備える配列番号８の配列をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および
（ｃ）配列番号１０または１１の前記アミノ酸配列をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は前記第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、および前記第２ポリヌクレオチド領域は前記第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチド。
【請求項２７】
１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号４０の前記アミノ酸配列をコードする第１ポリヌクレオチド領域；
（ｂ）Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を備える、配列番号７の前記アミノ酸配列をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および
（ｃ）配列番号１０または１１の前記アミノ酸配列をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は前記第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、および前記第２ポリヌクレオチド領域は前記第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記第１ポリヌクレオチド領域が存在し、１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）シグナルペプチドをコードする、請求項１、１１または１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１、１１、１９、２６または２７のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３０】
請求項１、１１、１９、２６または２７のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドを含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドは、染色体に組み込まれている、請求項３０に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１、１１、１９、２６または２７のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年６月１７日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／１８１，１９２号明細書に対する恩典および優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、米国特許規則第１．５２項第ｅ条を順守してＥＦＳを介して提出されている配列表を含有する。「ＮＢ４０９４７ＷＯＰＣＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１６年６月１６日に作成され、サイズは７１．１ＫＢ（７２，４５７バイト）であり、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、細菌宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法および組成物を提供する。本組成物には、改変もしくは非相同プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチド；改変もしくは非相同プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼを含むポリペプチド；そのようなポリヌクレオチドを含む発現カセット、ＤＮＡ構築物、ベクターおよび染色体；およびそのようなポリヌクレオチドを含む細菌宿主細胞が含まれる。これらの方法には、細菌宿主細胞（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞）中での成熟プロテアーゼの生成を強化するための方法が含まれる。生成されたプロテアーゼは、クリーニング、動物飼料および繊維加工産業を含むがそれらに限定されない様々な産業において使用するために好適な酵素の工業生産において利用される。
【背景技術】
【０００４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーであるグラム陽性菌などの微生物は、一部には、それらの培養培地中にそれらの発酵生成物を分泌する能力があるために、大規模工業発酵のために使用されてきた。分泌タンパク質は、細胞膜および細胞壁を越えて輸送され、その後に続いて外部培地中に放出される。
【０００５】
実際に、非相同ポリペプチドの分泌は、工業において広く使用されている技術である。典型的には、細胞は、大量の所望のポリペプチドを生成するために発現させて分泌させられる関心対象の非相同ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換させられる。一部の場合には、宿主細胞の染色体は、そのような非相同ポリペプチドをコードするために改変させられる。所望のポリペプチドの発現および分泌は、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子操作を通して制御されてきた。タンパク質生成方法における様々な進歩にもかかわらず、当分野においては、クリーニング、動物飼料および繊維加工産業を含むがそれらに限定されない様々な工業における使用において利用される、例えばプロテアーゼなどの酵素の生産を増強する目的で細胞外タンパク質を分泌させるためのより効率的な方法を提供するという必要が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細菌宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法および組成物を提供する。本組成物には、改変もしくは非相同プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチド；改変もしくは非相同プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼ配列を含むポリペプチド；そのようなポリヌクレオチドを含む発現カセット、ＤＮＡ構築物、ベクターおよび染色体；およびそのようなポリヌクレオチドを含む細菌宿主細胞が含まれる。これらの方法には、細菌宿主細胞（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞）中での成熟プロテアーゼの生成を強化するための方法が含まれる。生成されたプロテアーゼは、クリーニング、動物飼料および繊維加工産業を含むがそれらに限定されない様々な産業において使用するために好適な酵素の工業生産において利用される。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、改変プロペプチド領域を備えるセリンプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
したがって、所定の実施形態では、本開示は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）１つのシグナルペプチドをコードする任意選択的第１ポリヌクレオチド；（ｂ）非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域であって、プロペプチド領域が配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む第２ポリヌクレオチド領域、および（ｃ）バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。
【０００９】
他の実施形態では、本開示は、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：（ａ）１つのシグナルペプチドをコードする任意選択的第１ポリヌクレオチド領域、（ｂ）バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および（ｃ）バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。
【００１０】
所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．クラウシイ（ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．アルカロフィルス（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（ｌｅｈｅｎｓｉｓ）およびＢ．ノバリス（ｎｏｖａｌｉｓ）からなる群から選択されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする。特定の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のセリンプロテアーゼもしくはサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの野生型プロペプチド領域をコードする。さらに他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域をコードする。
【００１１】
他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂｐａｎ０１７４４、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０、Ｂｐｓ０２００３、Ｂｏｈｎ００５６９、ＢｓｐＡＫ０１３０５、Ｂｐａｎ０４３８２およびＢｓｐＡＬ０３２７９からなる群から選択されるサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。また別の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０およびＢｐａｎ０１７４４からなる群から選択されるサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００のプロペプチド領域をコードする。
【００１２】
所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも５０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも７５％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。また別の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。
【００１３】
所定の他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域であって、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞によるバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域の生成を強化する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００１４】
所定の他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが、しかし同一サブチリシンの野生型プロペプチドをコードする異なる第２ポリヌクレオチド領域を含むポリヌクレオチドと比較して、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する。また別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位に対応する位置にあり、同一位置の天然アミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される。さらにまた別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３０位に対応する位置にあり、同一位置の天然アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される。所定の他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３２位に対応する位置にあり、同一位置の天然アミノ酸は、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される。
【００１５】
所定の他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、プロペプチド領域が配列番号８の６位、３０位および３２位から選択された位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号８に規定したプロペプチド領域をコードする。また別の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の６位で、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６ＹおよびＥ６Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の３０位で、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０ＹおよびＥ３０Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。さらに他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の３２位で、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【００１６】
また別の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５との少なくとも９０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。所定の他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５の配列を含む。また別の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５の６番目、３０番目もしくは３２番目のコドンが異なるアミノ酸をコードするように突然変異していることを前提に、配列番号５に規定した配列を含む。所定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【００１７】
他の実施形態では、本開示は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：（ａ）１つのシグナルペプチドをコードする任意選択的第１ポリヌクレオチド、（ｂ）第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および（ｃ）第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。特定の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼもしくは前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンである。他の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、同一バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。他の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、異なるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。
【００１８】
また別の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。
【００１９】
さらに他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える変異プロペプチド領域であって、配列番号７の３４位に対応する位置で１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域をコードする。所定の他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、プロペプチド領域が配列番号７の３４位で１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号７に規定したプロペプチド領域をコードする。所定の他の実施形態では、前記位置にある天然アミノ酸は、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、ＳおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸で置換される。また別の実施形態では、配列番号７の３４位でのアミノ酸置換は、Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される。
【００２０】
他の実施形態では、アミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞による第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域の生成を強化する。所定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【００２１】
さらに他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号３との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号３との少なくとも９０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。さらにまた他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号３の３４番目のコドンが異なるアミノ酸をコードするように突然変異していることを前提に、配列番号３に規定した配列を含む。
【００２２】
所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号４４に規定した１つのアミノ酸配列を含む非相同もしくは変異プロペプチド領域をコードする。また別の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号６９に規定した１つのアミノ酸配列を含む非相同もしくは変異プロペプチド領域をコードする。
【００２３】
さらに他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）由来のプロテアーゼの成熟領域をコードする。他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンの成熟領域をコードする。また別の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、野生型バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシンの成熟領域をコードする。さらに他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、変異バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシンの成熟領域をコードする。
【００２４】
所定の他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、Ｂｇｉ０２４４６、ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＴＩＩ−５、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＴＩ−１およびＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＨＰ３０２からなる群から選択されるサブチリシンの成熟領域をコードする。また別の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、Ｂｇｉ０２４４４６の成熟領域をコードする。所定の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、Ｂｇｉ０２４４４６（例えば、ＢＳＰ−００８０１）の変異体の成熟領域をコードする。
【００２５】
他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。所定の他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも７５％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。また別の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。所定の他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０、１１、１２または１３の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。所定の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０または１１の配列を含むアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１２または１３の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。
【００２６】
所定の他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４または９との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４または９との少なくとも７５％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４または９との少なくとも９０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。また別の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４または９の配列を含む。他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４の配列を含む。さらに他の実施形態では、第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号９の配列を含む。
【００２７】
所定の他の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）シグナルペプチドをコードする。また別の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、１つのバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シグナルペプチドをコードする。また別の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号４０との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号４０との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。また別の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号４０の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。
【００２８】
所定の他の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号２との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号２との少なくとも９０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
他の実施形態では、本開示は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列をコードする第１ポリヌクレオチド領域、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列をコードする、またはＥ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６Ｙ、Ｅ６Ｖ、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０Ｙ、Ｅ３０Ｖ、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を備える配列番号８の配列をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および（ｃ）配列番号１１または１２のアミノ酸配列をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。
【００３０】
他の実施形態では、本開示は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列をコードする第１ポリヌクレオチド領域、（ｂ）Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を備える、配列番号７のアミノ酸配列をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および（ｃ）配列番号１１または１２のアミノ酸配列をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。
【００３１】
所定の実施形態では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに向けられる。他の実施形態では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含む改変染色体に向けられる。所定の他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを含む発現ベクターもしくは改変染色体は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での遺伝子発現のために好適であるプロモーターをさらに含む。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞に向けられる。したがって所定の他の実施形態では、本開示のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、本開示の発現ベクターもしくは改変染色体を含む。
【００３２】
所定の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【００３３】
所定の他の実施形態では、本開示は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法であって、（ａ）本開示のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する工程、（ｂ）発現ベクターを用いてバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞を形質転換させる工程、および（ｃ）成熟プロテアーゼが宿主細胞によって生成されるような好適な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む方法に向けられる。所定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。他の実施形態では、成熟プロテアーゼは、野生型バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）セリンプロテアーゼ、その変異体またはそれらのホモログである。
【００３４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法の所定の実施形態では、成熟プロテアーゼは、同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが、異なる第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域によってコードされたＢ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの野生型プロペプチド領域をコードする発現ベクターもしくは改変染色体を含む宿主細胞より高レベルで発現する。他の実施形態では、第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域をコードするが、このとき成熟プロテアーゼは、同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが、異なる第２ポリヌクレオチド領域はバチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来の同一サブチリシンの野生型プロペプチド領域をコードする発現ベクターもしくは改変染色体を含む宿主細胞より高レベルで発現する。所定の実施形態では、生成された成熟プロテアーゼは、Ｎ末端位置で２つのグルタミンから始まる。所定の他の実施形態では、生成された成熟プロテアーゼは、配列番号１１または１２との少なくとも９０％の同一性を有する。また別の実施形態では、生成された成熟プロテアーゼは、配列番号１１または１２の配列を含む。
【００３５】
他の実施形態では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに向けられる。したがって、所定の実施形態では、本開示は、改変プロテアーゼを含むポリペプチドであって、プロテアーゼは、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域を含み、プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに向けられる。他の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来である。
【００３６】
他の実施形態では、本開示は、改変プロテアーゼを含むポリペプチドであって、改変プロテアーゼは、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域を含み、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来であるポリペプチドに向けられる。所定の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｈｅｎｓｉｓ）およびバチルス・ノバリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｖａｌｉｓ）からなる群から選択されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。特定の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来である。また別の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンである。また別の実施形態では、プロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの野生型プロペプチド領域である。所定の他の実施形態では、プロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域である。また別の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂｐａｎ０１７４４、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０、Ｂｐｓ０２００３、Ｂｏｈｎ００５６９、ＢｓｐＡＫ０１３０５、Ｂｐａｎ０４３８２およびＢｓｐＡＬ０３２７９からなる群から選択される。また別の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０およびＢｐａｎ０１７４４からなる群から選択される。また別の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００である。さらに他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも５０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。所定の他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも７５％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の配列を含む。
【００３７】
さらに他の実施形態では、プロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域であって、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域である。また別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位に対応する位置にあり、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６ＹおよびＥ６Ｖからなる群から選択される。所定の他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３０位に対応する位置にあり、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０ＹおよびＥ３０Ｖからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３２位に対応する位置にあり、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される。
【００３８】
所定の他の実施形態では、プロペプチド領域は、プロペプチド領域が配列番号８の６位、３０位および３２位から選択された位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号８に規定した配列を含む。他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の６位で、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６ＹおよびＥ６Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。また別の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の３０位で、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０ＹおよびＥ３０Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。所定の他の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の３２位で、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【００３９】
他の実施形態では、本開示は、改変プロテアーゼを含むポリペプチドであって、改変プロテアーゼは、第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域を含むポリペプチドに向けられる。所定の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼもしくは第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンである。所定の他の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、同一バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。また別の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、異なるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。所定の他の実施形態では、変異プロペプチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、変異プロペプチド領域は、配列番号７との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、変異プロペプチド領域は、プロペプチド領域が配列番号７の３４位で１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号７に規定したプロペプチド領域を含む。所定の実施形態では、アミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞による第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域の生成を強化する。他の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。配列番号７の３４位での前記アミノ酸置換は、Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される、請求項［０２５５］に記載のポリペプチド。また別の実施形態では、非相同もしくは変異プロペプチド領域は、配列番号４４に規定した１つのアミノ酸配列を含む。所定の他の実施形態では、非相同もしくは変異プロペプチド領域は、配列番号６９に規定した１つのアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ポリペプチドは、１つのシグナルペプチドをさらに含む。他の実施形態では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに向けられる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ）法を使用して作製された、選択されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロペプチド配列の系統樹を示す図である。
【図２】天然Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド配列を使用して、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）セリンプロテアーゼ（サブチリシン）であるＢｇｉ０２４４６の成熟領域を発現させるために使用された遺伝子カセットを示す図である。
【図３】Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンプロペプチド配列を使用してＢｇｉ０２４４６の成熟領域を発現させるために使用された遺伝子カセットを示す図である。
【図４】図２および３に示した遺伝子カセットにライゲートさせるために使用された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の遺伝子カセットを示す図である。
【図５】アミノ酸残基６位、３０位もしくは３２位で突然変異（すなわち、置換）を備える様々なＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド配列を使用して成熟Ｂｇｉ０２４４６を発現させるために構築されたプラスミドを示す略図である。
【図６】Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド配列を備えるＢＳＰ−００８０１（すなわち、変異Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシン）の成熟領域を発現させるために使用された遺伝子カセットを示す図である。
【図７】アミノ酸残基６位、３４位もしくは３６位で突然変異を備える様々なＢｇｉ０２４４６プロペプチド配列を使用して成熟Ｂｇｉ０２４４６を発現させるために構築されたプラスミドを示す略図である。
【図８】Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６野生型（配列番号５９）およびＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００野生型（配列番号６０）プロペプチド＋各成熟領域のＮ末端の４個のアミノ酸（ボールド体で示されている）のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．０．１０多重配列アラインメントを示す図である。
【図９】Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）（Ｂｇｉ０２４４６）およびＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）（Ｐ２９６００）由来のサブチリシンの野生型プロペプチド領域をコードする核酸配列のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ  １．８１アルゴリズムを用いて実施された。
【図１０】様々なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のセリンプロテアーゼ（サブチリシン）の野生型プロペプチド領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを用いて実施された。
【図１１】図１０に示した多重配列アラインメントの分析から構築されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロペプチド配列モチーフを示す図である。
【図１２】図１０に示したようにＢ．クラウシイ（ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．レヘンシス（ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、ＢｓｐＡＬ０３２４０およびＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）由来のプロペプチドの配列アラインメントの分析から構築されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロペプチド配列モチーフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本開示は、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼを含むポリペプチドおよび微生物中のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼの生成を強化するための方法を提供する。詳細には、改変プロテアーゼは、発現対象のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼの天然プロペプチド、または発現対象のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼの変異プロペプチドの代わりに非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼプロペプチドを含む改変プロペプチド領域を含む。ポリヌクレオチドは、成熟プロテアーゼ配列に連結した非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼプロペプチドもしくは変異プロペプチドをコードする。プロテアーゼもしくはプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドのそのような改変は、驚くべき、および強化されたプロテアーゼ生成レベルを生じさせた。本発明は、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などの微生物中のプロテアーゼの発現を変化させるための方法にさらに関する。
【００４２】
本明細書の他の場所で定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する技術分野における当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４；およびＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ，１９９１を参照されたい）。本発明の実践においては、本明細書に記載の方法および材料に類似しているか同等である方法および材料が利用されるが、本明細書では好ましい方法および物質について記載する。したがって、直下に定義した用語は、本明細書全体を参照することにより、より十分に説明される。さらに、本明細書で使用する単数形「１つの」および「その」は、状況が明白に他のことを指示していない限り、複数形を含む。数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。他に特に指示しない限り、それぞれ核酸は５’から３’への方向で左から右へと記載され、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向へ左から右へと記載される。本発明は、当業者によって使用される状況に依存して、それらは変動する可能性があるので、本明細書に記載した特定の方法、プロトコルおよび試薬には限定されない。
【００４３】
本明細書を通して明示されたあらゆる最高数値限度は、それより低いありとあらゆる数値限度を、そのようなより低い数値限度が本明細書に明示的に記載されたかのように含むことが意図されている。本明細書を通して明示されたあらゆる最低数値限度は、それより高いありとあらゆる数値限度を、そのようなより高い数値限度が本明細書に明示的に記載されたかのように含むであろう。本明細書を通して明示されたあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に含まれるそれより狭いありとあらゆる数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されたかのように含むであろう。
【００４４】
上記および下記の両方において、本明細書で言及したすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明示的に参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
さらに、本明細書に提供した見出しは、本明細書を全体として参照することによって得ることのできる本発明の種々の態様にも実施形態にも限定されない。したがって、直下に定義した用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。それでもなお、本発明の理解を促進するために、下記では多数の用語について定義する。
【００４６】
定義
本明細書で使用する用語「単離（された）」および「精製（された）」は、それが自然に結び付いている少なくとも１つの構成成分から除去されている核酸もしくはアミノ酸（もしくは他の構成成分）を意味する。本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、単離もしくは精製されている。他の実施形態では、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、単離もしくは精製されていない。一部の例では、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、そのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが天然型ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドとは異なるが、それが自然に結び付いている少なくとも１つの構成成分と結び付いているように、遺伝子工学、遺伝子組換え、タンパク質工学、タンパク質改変またはその他の手段によって生成される。
【００４７】
本明細書の用語「改変ポリヌクレオチド」は、「改変」タンパク質をコードする少なくとも１つの突然変異を含有するように変化させられているポリヌクレオチド配列を意味する。一部の例では、用語「ポリヌクレオチド」は、「改変（された）」と結び付けずに使用されるが、これは改変されているポリヌクレオチドの実施形態を排除するものではない。
【００４８】
本明細書で使用する用語「プロテアーゼ」および「タンパク質分解活性」は、ペプチド結合を有するペプチドまたは基質を加水分解する能力を示すタンパク質もしくはペプチドに関する。タンパク質分解活性を測定するためには多数の周知の手法が存在する（Ｋａｌｉｓｚ，‘‘Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ’’，Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８）。例えば、タンパク質分解活性は、生成されたプロテアーゼが商業的基質を加水分解する能力を分析する比較アッセイによって保証することができる。プロテアーゼもしくはタンパク質分解活性のそのような分析において有用な典型的な基質には、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）およびウシケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）が含まれるがそれらに限定されない。これらの基質を利用する比色アッセイは、当分野において周知である（例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９９／３４０１１号パンフレット；および米国特許第６，３７６，４５０号明細書を参照されたい）。ＡＡＰＦアッセイ（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９：３１６−３２０，１９７９またはＥｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６０：６５１８−６５２１，１９８５を参照されたい）もまた成熟プロテアーゼの生成を決定する際に利用される。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質であるスクシニル−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解するにつれてｐ−ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度は、分光光度計上で４１０ｎｍもしくは４０５ｎｍで測定され、活性酵素濃度と比例している。詳細には、本明細書の用語「プロテアーゼ」は、「セリンプロテアーゼ」を意味する。
【００４９】
本明細書で使用する用語「サブチリシン」および「セリンプロテアーゼ」は、ＭＥＲＯＰＳ−Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａ  ｂａｓｅ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３４  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ，Ｄ２７０−２７２，２００６、ウェブサイトｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｅｒｏｐｓ．ｃｇｉ？ｉｄ＝ｓ０８；ａｃｔｉｏｎ＝．）に記載されたＳ８セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを意味する。下記の情報は、２００８年１１月６日現在のＭＥＲＯＰＳ−Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａ  ｂａｓｅ‘‘Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  Ｓ８  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２９０：２０５−２１８，１９９３）から引き出された。サブチラーゼファミリーとしても公知であるＳ８ファミリーは、セリンペプチダーゼの２番目に大きなファミリーであり、サブファミリーＳ８Ａのタイプ例であるサブチリシン（Ｓ０８．００１）およびサブファミリーＳ８Ｂのタイプ例であるケキシン（Ｓ０８．０７０）の２つのサブファミリーに分けることができる。トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＴＰＰ−ＩＩ；Ｓ０８．０９０）は、以前は第３サブファミリーのタイプ例であると考えられていたが、その後は誤分類であったと決定されている。
【００５０】
本明細書の用語「親プロテアーゼ」は、組み合わせて自然に発現するプレ、プロおよび成熟領域を含む全長プロテアーゼを意味する。一部の実施形態では、親プロテアーゼのプレおよび／またはプロおよび／または成熟領域は、前駆プロテアーゼのプレおよび／またはプロおよび／または成熟領域を作り出すために機能する。
【００５１】
本明細書の用語「前駆プロテアーゼ」は、シグナルペプチド、プロ（もしくはプロペプチド）領域および成熟領域を含む未改変もしくは改変全長プロテアーゼを意味する。前駆プロテアーゼは、天然型（すなわち、野生型）プロテアーゼ、変異プロテアーゼ、改変プロテアーゼまたは突然変異プロテアーゼから引き出すことができる。本発明の一部の実施形態では、前駆プロテアーゼは、改変プロテアーゼを生成するために改変される前駆プロテアーゼのプロ領域である。一部の実施形態では、前駆プロテアーゼのプレ領域は改変されている。一部の実施形態では、前駆体は、１つの親プロテアーゼ由来であるプロ領域および成熟領域を含む。他の実施形態では、前駆プロテアーゼは、１つ以上の親プロテアーゼに由来するプレもしくはプロ領域および異なる親プロテアーゼに由来する成熟領域を含むキメラタンパク質である。
【００５２】
タンパク質に関連して使用する用語「キメラ」もしくは「融合」は、本明細書では、別個のタンパク質もしくはタンパク質断片を最初にコードした２つ以上のポリヌクレオチドの接合を介して作製されるタンパク質に関する。この融合ポリヌクレオチドの翻訳は、元のタンパク質それぞれに由来する機能的特性を備える単一キメラポリペプチドを生じさせる。組換え融合タンパク質は、組換えＤＮＡテクノロジーおよび融合／キメラポリヌクレオチドの発現によって生成できる。組換え融合タンパク質は、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成によって生成することもできる。「キメラポリペプチド」もしくは「キメラ」は、２つ以上のポリペプチド由来の配列を含有するタンパク質を意味する。改変プロテアーゼは、それが１つ以上の他のプロテアーゼ由来の１つ以上の部分、領域もしくはドメインに融合した１つのプロテアーゼ由来の部分、領域もしくはドメインを含有するという意味においてキメラであってよい。一例として、キメラプロテアーゼは、また別のプロテアーゼのプロペプチドに連結した１つのプロテアーゼの成熟領域を含む可能性がある。当業者であれば、キメラポリペプチドおよびプロテアーゼがタンパク質配列の実際的融合によって作製される必要はなく、むしろ、キメラポリペプチドもしくはプロテアーゼを発現させるためにも使用できる対応するコーディング配列を備えるポリヌクレオチドによって作製できることを理解できるであろう。
【００５３】
本明細書の「天然型」もしくは「野生型」は、自然に見いだされるものと同一の未改変アミノ酸配列を有するプロテアーゼ、またはそのようなプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。天然型酵素には、特定の微生物内で自然に発現する、または見いだされる酵素である天然酵素が含まれる。野生型もしくは天然型である配列は、自然に見いだされる配列と同一である、または配列に由来する配列を意味する。野生型配列は、最初に同定されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列と同一ではない、自然に発生する変異体、ホモログもしくはヘテロログ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ）の配列を含む、またはコードする可能性がある。天然型もしくは野生型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然型もしくは野生型ポリヌクレオチド自体であってよい、または天然型もしくは野生型ポリペプチドと同一であるタンパク質配列をコードする改変ポリヌクレオチドであってよい。
【００５４】
本明細書で使用する「変異」タンパク質もしくはタンパク質領域は、Ｃ末端およびＮ末端のいずれかまたは両方への１個以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つまたは多数の異なる部位での１個以上のアミノ酸の置換、タンパク質のいずれかまたは両方の末端またはアミノ酸配列内の１つ以上の部位での１個以上のアミノ酸の欠失および／またはタンパク質のアミノ酸配列内の１つ以上の部位での１個以上のアミノ酸の挿入を意味する。変異タンパク質は、天然型変異体および遺伝子組換え変異タンパク質を含む。本発明の状況における変異タンパク質は、非天然型変異体を意味しており、天然型タンパク質Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＢｇｉ０２４４６の変異体であるＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＢＳＰ−００８０１によって例示される。ＢＳＰ−００８０１の成熟領域の２つの形態の配列は配列番号１２および配列番号１３に示したが、Ｂｇｉ０２４４６の２つの形態の配列は配列番号１０および配列番号１１に示した。配列番号１２および１３は、配列番号１１および１０それぞれとは１０個のアミノ酸置換によって異なる。
【００５５】
本明細書で使用する「ホモログ」および「相同タンパク質」は、関心対象のタンパク質（例えば、また別の起源由来のプロテアーゼ）と類似の作用および／または構造を有するタンパク質（例えば、プロテアーゼ）を意味する。ホモログが進化的に必ず関連していることは意図されていない。したがって、この用語は、異なる種から得られる同一もしくは類似の酵素（すなわち、構造および機能に関して）を含むことが意図されている。
【００５６】
用語「〜に由来する」および「〜から得られる」は、問題の生物の系統によって生成される、または生成可能なプロテアーゼだけではなく、例えばそのような菌株から単離されたＤＮＡ配列、およびそのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で生成されるＤＮＡ配列によってコードされるプロテアーゼもまた意味する。さらに、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされる、および問題のプロテアーゼの識別特徴を有するプロテアーゼを意味する。例示するために、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するプロテアーゼ」は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）によって自然に生成されるタンパク質分解活性を有する酵素、ならびに遺伝子工学技術の使用を通して前記セリンプロテアーゼをコードする核酸を用いて形質転換された非バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）生物によって生成されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）起源によって生成されるプロテアーゼのようなセリンプロテアーゼを意味する。
【００５７】
「改変全長プロテアーゼ」および「改変前駆プロテアーゼ」は、１つ以上の親もしくは前駆プロテアーゼに由来するシグナルペプチド、プロ（もしくはプロペプチド）領域および成熟領域を含む全長プロテアーゼを意味するために互換的に使用されるが、このときプロ領域もしくはプレ領域または両方は、少なくとも１つの改変もしくは突然変異を含有するように改変されている。他方、本明細書で使用する用語「改変プロテアーゼ」は、１つ以上の親プロテアーゼに由来する少なくとも１つのプロ領域および成熟領域を備える全長もしくは部分プロテアーゼを意味するが、このときプロ領域は、少なくとも１つの改変もしくは突然変異を含有するように改変されている。一部の実施形態では、プロ領域および成熟領域は、同一親プロテアーゼに由来する。他の実施形態では、プロ領域および成熟領域は、異なる親プロテアーゼ由来である。改変プロテアーゼは、非相同プロテアーゼのプロ領域を含有するように、または少なくとも１つの突然変異を備える同一親プロテアーゼのプロ領域域を含有するように改変されているプロ領域を含む。改変プロテアーゼは、野生型ではない、少なくともプロテアーゼコーディング遺伝子の全長にわたっては野生型ではない改変ポリヌクレオチドによってコードされる。改変プロテアーゼのアミノ酸配列は、親アミノ酸配列のプロ領域内に少なくとも１つの突然変異、例えば、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を導入する工程によって、または全親アミノ酸配列のプロ領域を非相同プロテアーゼのプロ領域と置換する工程によって、親プロテアーゼアミノ酸配列から「生成される」と言われる。一部の実施形態では、前駆プロテアーゼのプロ領域の１個以上のアミノ酸は、改変全長プロテアーゼを生成するために置換される。そのような改変は、前駆プロテアーゼ自体の操作ではなくむしろ「前駆」プロテアーゼのアミノ酸配列をコードする「前駆」ＤＮＡ配列の改変である。例えば、改変全長プロテアーゼは、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）サブチリシンＡｐｒＥのシグナルペプチド、野生型Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンＰ２９６００のプロペプチド配列およびＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシン変異体ＢＳＰ−００８０１の成熟配列を含む配列番号５８によって表される。配列番号５８の改変全長プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１４に示した。
【００５８】
プロテアーゼポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに関連して使用される場合の用語「未改変」は、本明細書では、少なくとも１つの突然変異、例えば１つの置換を含むように修飾されていないプロ領域を含むプロテアーゼを意味する。
【００５９】
本明細書の用語「全長タンパク質」および「プレプロタンパク質」は、シグナルペプチド、プロ配列および成熟配列を含む遺伝子産物を意味する。
【００６０】
用語「シグナル配列」、「シグナルペプチド」もしくは「プレ領域」は、タンパク質の成熟形もしくは前駆体形の分泌に関係する可能性があるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は、タンパク質の分泌の遂行に関係するタンパク質遺伝子のＮ末端部分によってコードされるすべてのそれらのアミノ酸配列を含むことが意図される機能的配列である。例示するために、本発明のプロテアーゼのプレペプチドは、配列番号５８の全長プロテアーゼのアミノ酸１〜２９に相当する配列番号４０のアミノ酸配列を少なくとも含む。
【００６１】
下記に提示するように、配列番号５８は、改変全長プロテアーゼのアミノ酸配列を含むが、このとき下線を引いたアミノ酸残基は１つのＡｐｒＥシグナルペプチド（すなわち、配列番号５８の残基１〜２９）を含み、イタリック体のアミノ酸残基はＢ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００プロペプチド（すなわち、配列番号５８の残基３０〜１１３）を含み、大文字のアミノ酸残基は成熟ＢＳＰ−００８０１変異プロテアーゼ（すなわち、配列番号５８の残基１１４〜３８２）を含む。
【化１】
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【００６２】
用語「プロ配列」、「プロ領域」、「プロペプチド」、「プロペプチド配列」または「プロペプチド領域」は、プロテアーゼのフォールディング、分泌および／または生成のために不可欠であるシグナル配列と成熟プロテアーゼとの間のアミノ酸配列である。プロプロテアーゼからのプロ配列の開裂は、成熟活性プロテアーゼを生じさせるであろう。例示するために、本発明のプロテアーゼのプロ領域は、配列番号５８の全長プロテアーゼのアミノ酸３０〜１１３に相当する配列番号８のアミノ酸配列を少なくとも含む。
【００６３】
本明細書で使用する「非相同プロペプチド領域」は、関心対象の成熟プロテアーゼに対して天然ではない、または関心対象の成熟プロテアーゼと同一の前駆プロテアーゼの一部として最初に発現するのではないプロペプチド領域を意味する。非相同プロペプチド領域もしくは非相同プロテアーゼのプロペプチド領域は、関心対象の成熟プロテアーゼの天然プロペプチド領域との少なくとも１つのアミノ酸の相違を有する。
【００６４】
プロテアーゼの用語「成熟形」もしくは「成熟領域」は、プロテアーゼの最終機能部分を意味する。例示するために、本発明のプロテアーゼの成熟形は、それぞれ配列番号５８の全長プロテアーゼのアミノ酸１１４〜３８２もしくは１１５〜３８２に相当する配列番号１２または１３のアミノ酸配列を含む。この状況において、「成熟形」は、全長プロテアーゼ「からプロセシングされる」が、このとき全長プロテアーゼのプロセシングは、シグナルペプチドの除去およびプロ領域の除去を含む。
【００６５】
本明細書の用語「プロタンパク質」、「プロポリペプチド」および「プロプロテアーゼ」は、プロポリペプチドに機能的に連結した成熟形を含むタンパク質を意味する。「プロポリペプチド」は、「プロポリヌクレオチド」によってコードされる。
【００６６】
本明細書で使用する用語「非相同タンパク質」は、天然タンパク質とは対照的に、例えば、天然タンパク質が発生する同一の宿主細胞もしくは宿主菌株内では自然には発生しないタンパク質もしくはポリペプチドを意味する。同様に、「非相同ポリヌクレオチド」は、天然ポリヌクレオチドが発生する同一の宿主細胞もしくは宿主菌株内で自然には発生しないポリヌクレオチドを意味する。非相同ポリペプチドおよび／または非相同ポリヌクレオチドには、天然ポリペプチドおよび／または非相同ポリヌクレオチドが発生する宿主細胞もしくは宿主菌株とは異なる宿主細胞もしくは宿主菌株内で自然に発生する全長もしくは部分野生型ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが含まれる。それらはさらに、任意の公知の天然宿主細胞もしくは宿主菌株、例えば遺伝子組換えポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド内で自然には発生しない全長もしくは部分ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが含まれる。それらには、全長、部分またはキメラポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが含まれる。非相同タンパク質は、天然タンパク質と同一、類似または同等の機能および／または構造を有するタンパク質であってよい、または極めて異なる機能および／または構造を備えるタンパク質であってよい。非相同タンパク質は、天然タンパク質とは異なる少なくとも１個のアミノ酸を有する。
【００６７】
本明細書で使用する「置換（された）」および「置換」は、親配列内のアミノ酸残基もしくは核酸塩基の取り換えを意味する。一部の実施形態では、置換は、天然型残基もしくは塩基の取り換えを包含する。本明細書の改変プロテアーゼは、前駆プロテアーゼのプロ領域内の全アミノ酸中の任意の１つと細菌中で自然に発生する残りの１９個のアミノ酸の任意の１つ、または非天然型アミノ酸による前駆プロテアーゼとの置換を含む。
【００６８】
例えば、配列番号８の野生型Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンＰ２９６００配列の６位のグルタミン酸の置換（「Ｅ６」と略記される）は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（ｔｈｒｙｐｔｏｐｈａｎ）（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるいずれか１つで置換する／取り換えることができる。同一位置にある任意の他のアミノ酸との１個のアミノ酸の置換（例えば、Ｅ６）はＥ６Ｘによって表示されるが、このときＸは、６位でＥと置換する残り１９個のアミノ酸のうちの１つである。一部の実施形態では、２個以上のアミノ酸は、アミノ酸置換の組み合わせを含む改変プロテアーゼを生成するために置換される。例えば、６位でのアミノ酸Ｅのアミノ酸Ａとの置換と３０位でのアミノ酸Ｅのアミノ酸Ｔとの置換との組み合わせは、Ｅ６Ａ−Ｅ３０と表示される。一部の実施形態では、プロ領域における置換に対するアミノ酸位置は、配列番号８のプロ領域内のナンバリングされた位置に対応してナンバリングされる。一部の実施形態では、プロ領域における置換に対するアミノ酸位置は、配列番号７のプロ領域内のナンバリングされた位置に対応してナンバリングされる。
【００６９】
本明細書で使用する「〜との対応により」、「〜に対応して」または「〜と同等である」は、タンパク質もしくはペプチド内の列挙した位置にある残基、またはタンパク質もしくはペプチド内の列挙された残基と類似、相同または同等である残基を意味する。本明細書で使用する「対応領域」は、一般に、関連タンパク質もしくは参照タンパク質に沿った類似位置に関する。参照タンパク質内の列挙した残基に対応する位置にあるタンパク質内の天然アミノ酸は、参照タンパク質内の残基と同一であっても異なっていてもよい。
【００７０】
本明細書の用語「プレポリヌクレオチド」、「プロヌクレオチド」および「成熟ポリヌクレオチド」は、タンパク質、例えばプロテアーゼのプレ、プロおよび成熟領域をそれぞれコードするポリヌクレオチド配列を意味する。
【００７１】
プロテアーゼに関する用語「生成」は、全長プロテアーゼの２つのプロセシング工程であって：（１）タンパク質分泌中に発生することが公知であるシグナルペプチドの除去；および（２）酵素の活性形を作成する、および成熟工程中に発生することが公知であるプロ領域の除去を含む（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：３１６５−３１７１，１９９８；Ｐｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：３０９６−３１００，１９８６）。本明細書の用語「強化された生成」は、改変全長プロテアーゼからプロセシングされる、および未改変全長プロテアーゼからプロセシングされた場合の同一成熟プロテアーゼの生成のレベルより高いレベルで発生する成熟プロテアーゼの生成を意味する。
【００７２】
成熟プロテアーゼに関する用語「プロセシングされた」は、全長タンパク質、例えば全長プロテアーゼが活性成熟酵素になるために受ける成熟工程に関する。
【００７３】
酵素に関する「活性」は「触媒活性」を意味しており、例えば活性の速度、活性の量または比活性などの酵素活性の任意の容認可能な尺度を含んでいる。触媒活性は、例えば特異的化学結合の加水分解などの特異的化学反応を触媒する能力に関する。当業者であれば理解するように、酵素の触媒活性は、さもなければ緩徐な化学反応の速度を加速するだけである。酵素は触媒としてのみ作用するので、反応自体によって生成されることも消費されることもない。当業者であれば、さらにポリペプチド全てが触媒活性を有するのではないことも理解するであろう。「比活性」は、全タンパク質もしくは酵素の単位当たりの酵素の活性の尺度である。したがって、比活性は、酵素の単位重量（例えば、グラム当たり、もしくはミリグラム当たり）または単位容積（例えば、１ｍｌ当たり）によって表示することができる。さらに、比活性は、酵素の純度の尺度を含むことができる、または例えば、活性の標準物質が公知である、または比較のために入手可能である場合には、純度の指標を提供することができる。活性の量は、測定される酵素を発現する宿主細胞によって生成される酵素の量を反映する。
【００７４】
用語「相対活性」もしくは「生成率」は、本明細書では改変プロテアーゼからプロセシングされた成熟プロテアーゼの酵素活性対未改変プロテアーゼからプロセシングされた成熟プロテアーゼの酵素活性の比率を互換的に意味するために使用される。生成率は、改変前駆体からプロセシングされたプロテアーゼの活性値を未改変前駆体からプロセシングされた場合の同一プロテアーゼの活性値で割ることによって決定される。相対活性は、パーセンテージとして表示される生成率である。
【００７５】
本明細書で使用する用語「発現」は、それによりポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程を意味する。このプロセスには、転写および翻訳の両方が含まれる。
【００７６】
用語「同一性率（％）」は、前駆体配列（すなわち、親配列）のアミノ酸残基／ヌクレオチド残基と同一である候補配列中のアミノ酸／ヌクレオチド残基のパーセンテージであると定義されている。アミノ酸配列同一性（％）値は、適合する同一残基の数をアライメント領域の「より長い」配列の残基の総数で割ることにより決定される。アミノ酸配列は、アミノ酸が参照配列と比較して主題配列内で置換されている、欠失しているまたは挿入されている場合は「同一」ではない。タンパク質については、配列同一性率は、好ましくは後翻訳改変と比較して類似状態にある配列間で測定される。典型的には、主題タンパク質の「成熟配列」、すなわちシグナル配列を除去するためのプロセシング後に残留する配列が、参照タンパク質の成熟配列と比較される。他の例では、主題ポリペプチド配列の前駆体配列が参照配列の前駆体と比較されてよい。
【００７７】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、下流遺伝子の転写を指示するように機能する核酸配列を意味する。一部の実施形態では、プロモーターは、その中で標的遺伝子が発現させられる宿主細胞にとって適切である。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子を発現させるために必要である。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列ならびにエンハンサーもしくはアクチベーター配列が含まれるがそれらに限定されない。
【００７８】
核酸もしくはポリペプチドは、それがまた別の核酸もしくはポリペプチド配列それぞれとの機能的関係に置かれている場合には「機能的に連結」している。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合は、コーディング配列と機能的に連結している；リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進できるように位置している場合はコーディング配列と機能的に連結している；または改変もしくは非相同プロ領域は、それが酵素の成熟活性形を生成する全長プロテアーゼのプロセシングを可能にする場合は、プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している。一般に、「機能的に連結した」は、連結されるＤＮＡもしくはポリペプチド配列が隣接していることを意味する。一部の例では、「機能的に連結した」は、間接的連結を含む。
【００７９】
「宿主細胞」は、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターに対して宿主として機能する好適な細胞を意味する。好適な宿主細胞は、天然型もしくは野生型宿主細胞であってよい、または変化した宿主細胞であってよい。１つの実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性菌である。一部の実施形態では、この用語は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細胞に関する。
【００８０】
本明細書で使用する「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種」には、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．クラウシイ（ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ノバリス（ｎｏｖａｌｉｓ）、Ｂ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．プミリス（ｐｕｍｉｌｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．ハロデュランス（ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（ｌａｕｔｕｓ）およびＢ．チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むがそれらに限定されない、当業者には公知である「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」に含まれるすべての種が含まれる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再構成を受け続けることは認識されている。したがって、この属には、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称される「Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むがそれらに限定されない、再分類されている種が含まれることが意図されている。酸素の存在下で抵抗性内生胞子の生成は、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」の重要な特徴であると考えられるが、この特徴は、さらに、最近名付けられたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、テルモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属にも当てはまる。
【００８１】
本明細書で互換的に使用する用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を意味する。これらの用語には、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然、化学的、生化学的改変、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドの非限定的例には、遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、ＥＳＴ、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。遺伝子コードの縮重の結果として、所定のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が生成される可能性があることは理解されるであろう。
【００８２】
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ構築物」および「形質転換ＤＮＡ」は、宿主細胞もしくは生物内に配列を導入するために使用されるＤＮＡを意味するために互換的に使用される。ＤＮＡ構築物は、ＰＣＲによって、または当業者には公知の他の好適な技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、関心対象の配列（例えば、１つの改変プロテアーゼをコードする配列）を含む。一部の実施形態では、この配列は、例えば制御要素（例えば、プロモーターなど）の追加の要素に機能的に連結している。ＤＮＡ構築物は、選択可能なマーカーをさらに含むことができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体にとって相同である配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、非相同配列を含む。ＤＮＡ構築物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられると、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体の１領域に突然変異を起こさせる（すなわち、内因性配列を非相同配列と置換する）ために使用することができる。
【００８３】
本明細書で使用する用語「発現カセット」は、標的細胞中の特定核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて組換え的または合成的に生成される核酸構築物を意味する。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスもしくは核酸断片などのベクター内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列およびプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞中で非相同ＤＮＡ断片を組み込んで発現させる能力を有する。多数の原核生物および真核生物発現ベクターは、市販で入手できる。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内に含まれる。用語「発現カセット」は、本明細書ではＤＮＡ構築物およびそれらの文法上の同等物と互換的に使用される。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内に含まれる。
【００８４】
本明細書で使用する用語「非相同ＤＮＡ配列」は、宿主細胞中で自然には発生しないＤＮＡ配列を意味する。一部の実施形態では、非相同ＤＮＡ配列は、調節要素を含む、様々な遺伝子の部分を含むキメラＤＮＡ配列である。
【００８５】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型に導入するように設計されているポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクターおよびプラスミドが含まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、全長プロテアーゼ（例えば、改変プロテアーゼもしくは未改変プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含む。本明細書で使用する用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用される、および一部の真核生物もしくは単核生物内で特別な染色体自己複製遺伝要素を形成する、または宿主染色体内に統合する環状二本鎖ＤＮＡ構築物を意味する。
【００８６】
核酸配列を細胞中に導入する状況において本明細書で使用する用語「導入（された）」は、核酸配列を細胞中に移すために好適な任意の方法に関する。導入のためのそのような方法には、プロトプラスト融合法、トランスフェクション法、形質転換法、コンジュゲーション法および形質導入法が含まれるがそれらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，’’ｉｎ  Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ｐａｇｅｓ５７−７２，１９８９を参照されたい）。
【００８７】
本明細書で使用する用語「形質転換（された）」および「安定性に形質転換（された）」は、そのゲノム内に統合された、または少なくとも２世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとしての非天然（非相同）ポリヌクレオチド配列を有する細胞に関する。
【００８８】
改変プロテアーゼ
本発明は、細菌宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法および組成物を提供する。本組成物には、生成対象のプロテアーゼの天然プロ領域内の非相同プロ領域もしくは少なくとも１つの突然変異を有する改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド；そのようなポリヌクレオチドによってコードされた改変セリンプロテアーゼ；改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、ＤＮＡ構築物、ベクターおよび染色体；ならびにベクターを用いて形質転換された、もしくは本発明の染色体を含む細菌宿主細胞が含まれる。これらの方法には、細菌宿主細胞、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞中での成熟プロテアーゼの生成を強化するための方法が含まれる。生成されたプロテアーゼは、クリーニング、動物飼料および繊維加工産業を含むがそれらに限定されない様々な産業において使用するために好適な酵素の工業生産において利用される。
【００８９】
それによりタンパク質が膜を越えて輸送される基本的機序は、細菌と真核生物との間で保存された重要な特徴を備えて普遍的であると思われる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、所定のタンパク質を大量の増殖培地中に分泌することができるので、例えばアルカリ性セリンプロテアーゼなどの酵素の工業的生産のために使用される。プロテアーゼは、プロテアーゼのシグナルペプチドとしても公知であるプレ領域、プロ領域および成熟領域を含むプレプロプロテアーゼとして公知である前駆プロテアーゼからｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞エンベロープを越えるタンパク質分泌は、前駆タンパク質の膜内への挿入および膜を越えるタンパク質の転座を含む複雑なプロセスである。プレ領域は、膜を越えるタンパク質分泌のためのシグナルペプチドとして機能し、シグナルペプチダーゼによって加水分解される。成熟プロセスの細胞外部分は、酵素の活性成熟形を作成するためのプロプロテアーゼのフォールディング、プロ領域の自己プロセシングおよびプレ領域の分解を含む（Ｎａｇａｒｊａｎ  Ｖ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ‘‘Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ’’Ｃｈ．４９，ｐ７１３−７２６，１９９３；Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：８５６２−８５７１，２００９）。
【００９０】
一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、アルカリ性セリンプロテアーゼである。所定の実施形態では、改変プロテアーゼは、サブチリシンである。
【００９１】
一部の実施形態では、本発明は、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域を含む改変プロテアーゼを提供する。一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域からなる、または本質的になる。一部の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）のメンバーではないバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域を含む。所定の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、同一バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種もしくは同一菌株由来である。他の実施形態では、第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、異なるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種もしくは菌株由来である。
【００９２】
一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼ（生成対象のプロテアーゼ）のプロペプチド領域コーディング核酸配列（天然プロポリヌクレオチド）を非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域をコードする核酸配列（非相同プロポリヌクレオチド）と取り換える工程によって生成される。
【００９３】
プロペプチド領域
本発明の改変プロテアーゼの一部の実施形態では、プロペプチド領域は、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ由来のプロペプチド領域（例えば、非バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼ、または成熟領域の配列を提供する天然種もしくは菌株由来の異なるＢ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）種もしくはＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）の異なる菌株由来のプロテアーゼ）である。非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ由来のプロペプチド領域は、成熟領域の配列を提供するプロテアーゼの天然プロペプチド領域とは異なる少なくとも１個のアミノ酸を有する。一部の実施形態では、プロペプチド領域は、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼ由来の非天然型の変異プロペプチド領域である。
【００９４】
様々なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来の非相同プロテアーゼは、タンパク質配列をコードするアミノ酸もしくはヌクレオチドの形態にある改変プロテアーゼのプロペプチド領域のための配列を提供するため、もしくは配列を引き出すために使用することができる。例えば、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・ノバリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｖａｌｉｓ）由来のセリンプロテアーゼまたはそれらの関連種は、全て使用できる。一部の実施形態では、改変プロテアーゼのプロペプチド領域は、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来である。野生型もしくは変異非相同プロテアーゼは、どちらも使用できる。非相同プロテアーゼの例には、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂｐａｎ０１７４４、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０、Ｂｐｓ０２００３、Ｂｏｈｎ００５６９、ＢｓｐＡＫ０１３０５、Ｂｐａｎ０４３８２およびＢｓｐＡＬ０３２７９が含まれるがそれらに限定されない。
【００９５】
例えば、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２のプロペプチド配列は配列番号４２に規定し、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０のプロペプチド配列は配列番号４３に規定し、Ｂｐｓ０２００３のプロペプチド配列は配列番号４８に規定し、ＢｓｐＱ０１２１１のプロペプチド配列は配列番号４９に規定し、Ｂｐｓ０２５９２のプロペプチド配列は配列番号５０に規定し、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００のプロペプチド配列は配列番号８に規定し、ＢｓｐＡＬ０３２４０のプロペプチド配列は配列番号５１に規定し、Ｂｐａｎ０１７４４のプロペプチド配列は配列番号５２に規定し、Ｂｏｈｎ００５６９のプロペプチド配列は配列番号５３に規定し、ＢｓｐＡＫ０１３０５のプロペプチド配列は配列番号５４に規定し、Ｂｐａｎ０４３８２のプロペプチド配列は配列番号５５に規定し、およびＢｓｐＡＬ０３２７９のプロペプチド配列は配列番号５６に規定した。
【００９６】
Ｂ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロペプチド領域（バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの非相同および変異プロペプチド領域を含む）が使用される実施形態では、そのようなバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの例としては、本明細書に参照により組み込まれる、それらの全部が国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットに開示されているＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）菌株ＤＳＭ８７２２（Ｂｇｉ０２４４６もしくはＡｐｒＢＧと指名されたプロテアーゼ）、ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０およびＤＳＭ９７３１由来のサブチリシンが含まれるがそれらに限定されない。これらのＤＳＭ菌株セリンプロテアーゼのプロペプチド配列は同一である。
【００９７】
そのようなバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの他の例には、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＴＩＩ−５（国際公開第２００３／０５４１８５号パンフレット、Ｄｅｒｗｅｎｔ特許索引アクセッション番号ＣＡＥ４８４２４）、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＴＩ−１（国際公開第２００３／０５４１８４号パンフレット、Ｄｅｒｗｅｎｔ特許索引アクセッション番号ＣＡＥ４８４２１）、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＨＰ３０２（国際公開第２００７／１３１６５７号パンフレット、Ｄｅｒｗｅｎｔ特許索引アクセッション番号ＣＡＳ９１３８５および国際公開第２００８／０８６９１６号パンフレット、Ｄｅｒｗｅｎｔ特許索引アクセッション番号ＣＡＶ３３５９４）が含まれるがそれらに限定されない。
【００９８】
本明細書に記載したバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼのプロペプチド領域の配列は、配列番号７（Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド）、配列番号４５（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ＿ＴＩＩ−５プロペプチド）、配列番号４６（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ＿ＨＰ３０２プロペプチド）および配列番号４７（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ＿ＴＩ−１プロペプチド）に規定した。
【００９９】
上記のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のサブチリシン由来のプロペプチド領域間の関係を比較および可視化するために、代表的な配列の系統樹を生成し、図１に規定した。このプロペプチドアミノ酸配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｓｕｉｔｅ内に入力され、樹形図はＮＪ（近隣結合）法（Ｓａｉｔｏｕ  ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ，４：４０６−４２５，１９８７）を使用して作成された。
【０１００】
ＮＪ法は、分析対象の全配列対間の距離行列上に機能する。これらの距離は、配列間の相違度に関連している。樹形図は、配列がアラインメントされた後に計算される。樹の構成は、下記のパラメーター：配列間距離およびギャップを備える位置の無視についてのＫｉｍｕｒａの補正を使用して計算した。系統樹を表示するためには、ＭＥＧＡ６プログラムを使用した。デフォルトパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０，１９９４）を使用して作成されたより詳細な配列アラインメントＡを表示し、下記の実施例１３に規定した。
【０１０１】
改変プロテアーゼの一部の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域または非相同プロペプチド配列は、配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域または非相同プロペプチド配列は、配列番号８との少なくとも４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％もしくは７０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、非相同プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来の変異プロペプチド領域であって、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置にある。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞）によるバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する。
【０１０４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが第２ポリヌクレオチド領域は同一サブチリシンの野生型プロペプチドをコードするポリヌクレオチドと比較して、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する。
【０１０５】
一部の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備えるバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域を含む。一部の実施形態では、変異プロペプチド領域は、配列番号７との少なくとも６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％もしくは９８％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域は、配列番号７の３４位に対応する位置で１つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞）によるバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域の生成を強化する。
【０１０７】
一部の実施形態では、非相同もしくは変異プロペプチド領域のプロペプチド領域は、配列番号４４に規定した（図１１に示し、さらに実施例１３に記載したアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各「Ｘ」は、任意のアミノ酸であってよい。一部の実施形態では、１位、２２〜５１位および９１位にある「Ｘ’ｓ」は、個別もしくは集合的に非存在であってよい。特定の実施形態では、配列番号４４中のアミノ酸「Ｘｓ」は、下記の表１に規定した可能性のあるアミノ酸から選択することができる。
【０１０８】
【表１】
2018518185.tif 000004
【０１０９】
【表２】
2018518185.tif 000005
【０１１０】
他の実施形態では、非相同もしくは変異プロペプチド領域のプロペプチド配列は、図１２に示した配列番号６９に規定した１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、各Ｘは、任意のアミノ酸であってよい。特定の実施形態では、配列番号４４中のアミノ酸「Ｘ’ｓ」は、下記の表２に規定した可能性のあるアミノ酸から選択することができる。
【０１１１】
【表３】
2018518185.tif 000006
【０１１２】
改変プロテアーゼの一部の実施形態では、非相同もしくは変異バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域は、配列番号４４もしくは６９との少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
成熟領域
一部の実施形態では、本発明の改変プロテアーゼの成熟領域は、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼ由来である。バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）メンバーの様々な種もしくは菌株が同定されている。多数のバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）メンバーのセリンプロテアーゼもしくはサブチリシンの配列は、それらの全部が参照により本明細書に組み込まれるＤｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１９７−２０８）、ＰＣＴ国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレット、同第２０１６／０６９５６３号パンフレットおよび同第２０１６／０６９５６９号パンフレットを含む刊行物もしくは特許出願に報告もしくは開示されている。
【０１１４】
下記には、少数例のバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）メンバーおよびそれらのセリンプロテアーゼ前駆体／プレプロ酵素配列を規定する。シグナル配列は下線を引いてボールド体で、プロ配列はイタリック体で記載され、他方、予想成熟酵素配列は、通常フォントで記載されている。しかし、少なくとも一部の予想成熟領域配列は、自然に生成可能であるとは確証されていない。
【０１１５】
ＡｐｒＢＧとしても公知であるバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）菌株ＤＳＭ８７２２（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）のＢｇｉ０２４４６ならびに菌株ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０およびＤＳＭ９７３１によってコードされた相同サブチリシン酵素は、全部が重要な配列同一性を共有し、サブチリシン系統樹の同一領域内で集団を形成する（ＰＣＴ国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットを参照されたい）。それらは、サブチリシンのＢ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）の基礎を形成する。
【０１１６】
プレプロ酵素Ｂｇｉ０２４４６のアミノ酸配列は配列番号６１に規定し、Ｂｇｉ０２４４６の予想成熟領域のアミノ酸配列は、配列番号１１に規定した。
【化２】
2018518185.tif 000007
【０１１７】
下記の実施例６に規定するように、配列番号１１の配列（Ｎ末端で２つのグルタミン（ＱＱ）を有する）を含むＢｇｉ０２４４６の予想成熟領域は、それに機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域を使用して生成した。Ｂｇｉ０２４４６の天然プロペプチド領域がＢｇｉ０２４４６の成熟領域を発現させるために使用された場合は、配列番号１０に規定した配列である、Ｎ末端で１つのグルタミン（Ｑ）しか有していない、異なる形態の成熟領域配列が生成された。
【０１１８】
ＤＳＭ９７２８プレプロ酵素のアミノ酸配列は、配列番号６２として規定した。
【化３】
2018518185.tif 000008
【０１１９】
ＤＳＭ９７２９プレプロ酵素のアミノ酸配列は、配列番号６３に規定した。
【化４】
2018518185.tif 000009
【０１２０】
ＤＳＭ９７３０プレプロ酵素のアミノ酸配列は、配列番号６４に規定した。
【化５】
2018518185.tif 000010
【０１２１】
少数の他のセリンプロテアーゼであるバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシンメンバーもまた、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）下に分類される。例えば、天然型Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＢｇｉ０２４４６の変異体であるＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＢＳＰ−００８０１もまた、本明細書ではバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）下に分類される。このタンパク質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年６月１７日に出願された‘‘Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−Ｃｌａｄｅ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ’’と題する米国仮特許出願第６２／１８０，６７３号明細書にも開示されている。ＢＳＰ−００８０１の成熟領域の２つの形態の配列は、配列番号１２および配列番号１３に示した。米国仮特許出願第６２／１８０，６７３号明細書に開示されたＢｇｉ０２４４６の他の変異体は、さらに本発明の改変プロテアーゼのための成熟領域を提供するためにも使用できる。
【０１２２】
ＤＳＭ９７３１プレプロ酵素のアミノ酸配列は、配列番号５７に規定した。
【化６】
2018518185.tif 000011
【０１２３】
少数の他のセリンプロテアーゼが同定されており、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）下に分類することができる。例えば、全部がＨｅｎｋｅｌ  ＡＧ＆Ｃｏ．によって開示された、ＰＣＴ国際公開第２００８／０８６９１６号パンフレットに開示された、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシン（Ｄｅｒｗｅｎｔ特許索引アクセッション番号ＣＡＶ３３５９４）、同第２００３／０５４１８５号パンフレットに開示されたＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＴＩＩ−５（アクセッション番号ＣＡＥ４８４２４）、同第２００３／０５４１８４号パンフレットに開示されたＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＴＩ−１（アクセッション番号ＣＡＥ４８４２１）および同第２００７／１３１６５７号パンフレットに開示されたＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）サブチリシンＨＰ３０２（アクセッション番号ＣＡＳ９１３８５）。これらの配列の予想成熟領域を抽出して下記に示した。
【０１２４】
ＷＯ２００３／０５４１８４−ＣＡＥ４８４２１の予想成熟領域のアミノ酸配列は配列番号６５として規定し、ＷＯ２００３／０５４１８５−ＣＡＥ４８４２４の予想成熟領域のアミノ酸配列は配列番号６６として規定し、ＷＯ２００７／１３１６５７−ＣＡＳ９１３８５の予想成熟領域のアミノ酸配列は配列番号６７に規定し、ＷＯ２０００８／０８６９１６−ＣＡＶ３３５９４の予想成熟領域のアミノ酸配列は配列番号６８として規定した。
【０１２５】
一部の実施形態では、本発明の改変プロテアーゼの成熟領域は、野生型バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシン由来である。他の実施形態では、本発明の改変プロテアーゼの成熟領域は、突然変異もしくは変異バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシン由来である。一部の実施形態では、改変プロテアーゼの成熟領域は、Ｂｇｉ０２４４６、ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＴＩＩ−５（ＷＯ２００３／０５４１８５−ＣＡＥ４８４２４）、（ＷＯ２００３／０５４１８４−ＣＡＥ４８４２１）に開示されたＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＴＩ−１、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＨＰ３０２（ＷＯ２００７／１３１６５７−ＣＡＳ９１３８５およびＷＯ２００８／０８６９１６−ＣＡＶ３３５９４）からなる群から選択されるサブチリシン由来である。所定の実施形態では、改変プロテアーゼの成熟領域は、Ｂｇｉ０２４４４６サブチリシン由来である。他の実施形態では、改変プロテアーゼの成熟領域は、Ｂｇｉ０２４４４６サブチリシンの変異体由来である。所定の実施形態では、成熟領域は、ＢＳＰ−００８０１由来である。
【０１２６】
本発明の改変プロテアーゼの一部の実施形態では、成熟領域は、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）下に分類することはできないが、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシンと相同であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ由来である。所定の他の実施形態では、成熟領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、成熟領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％もしくは７９％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、成熟領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、成熟領域は、配列番号１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、染色体および宿主細胞
１つの態様では、本発明は、非相同プロ領域または生成対象のプロテアーゼの天然プロ領域内に少なくとも１つの突然変異を有する改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１２８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載した改変プロテアーゼをコードする。
【０１２９】
一部の実施形態では、本発明は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：
（ａ）任意選択的に１つのシグナルペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；
（ｂ）非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域であって、前記プロペプチド領域が配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む第２ポリヌクレオチド領域；および
（ｃ）バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼを含み；
ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドを提供する。
【０１３０】
一部の実施形態では、本発明は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）任意選択的に１つのシグナルペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；
（ｂ）バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および
（ｃ）バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み；
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドを提供する。
【０１３１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチド領域を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチド領域を含まない。
【０１３２】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする。
【０１３３】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｈｅｎｓｉｓ）およびバチルス・ノバリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｖａｌｉｓ）からなる群から選択されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする。
【０１３４】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来のプロテアーゼのプロペプチド領域をコードする。
【０１３５】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のセリンプロテアーゼもしくはサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。
【０１３６】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの野生型プロペプチド領域をコードする。
【０１３７】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域をコードする。
【０１３８】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂｐａｎ０１７４４、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０、Ｂｐｓ０２００３、Ｂｏｈｎ００５６９、ＢｓｐＡＫ０１３０５、Ｂｐａｎ０４３８２およびＢｓｐＡＬ０３２７９からなる群から選択されるサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。
【０１３９】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０およびＢｐａｎ０１７４４からなる群から選択されるサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。
【０１４０】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００のプロペプチド領域をコードする。
【０１４１】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも５０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１４２】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも７５％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１４３】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１４４】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号８の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１４５】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域であって、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域をコードする。
【０１４６】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞によるバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する。一部の実施形態では、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【０１４７】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、前記同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが第２ポリヌクレオチド領域は同一サブチリシンの野生型プロペプチドをコードするポリヌクレオチドと比較して、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する。
【０１４８】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位に対応する位置にあり、前記位置の天然アミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される。
【０１４９】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３０位に対応する位置にあり、前記位置の天然アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される。
【０１５０】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３２位に対応する位置にあり、前記位置の天然アミノ酸は、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸と置換される。
【０１５１】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、前記プロペプチド領域が配列番号８の６位、３０位および３２位から選択された位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号８に規定したプロペプチド領域をコードする。
【０１５２】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の６位で、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６ＹおよびＥ６Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【０１５３】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の３０位で、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０ＹおよびＥ３０Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【０１５４】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の３２位で、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【０１５５】
第２ポリヌクレオチドが非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域をコードし、プロペプチド領域が配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む本発明のポリヌクレオチドの所定の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号８の６位に対応する位置でＤ、ＰおよびＷからなる群から選択される任意のアミノ酸を含まない。所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチドによってコードされるプロペプチド領域は、配列番号８の６位に対応する位置でＤ、Ｃ、Ｙ、ＰおよびＷからなる群から選択される任意のアミノ酸を含まない。所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチドによってコードされるプロペプチド領域は、配列番号８の６位に対応する位置でＮ、Ｈ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、Ｃ、Ｐ、ＹおよびＷからなる群から選択される任意のアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、第２ポリヌクレオチドによってコードされるプロペプチド領域は、配列番号８の３０位に対応する位置でＩ、ＰおよびＹからなる群から選択される任意のアミノ酸を含まない。所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチドによってコードされるプロペプチド領域は、配列番号８の３２位に対応する位置でアミノ酸Ｑを含まない。所定の実施形態では、第２ポリヌクレオチドによってコードされるプロペプチド領域は、配列番号８の３２位に対応する位置でＮ、Ｌ、ＰおよびＱからなる群から選択される任意のアミノ酸を含まない。
【０１５６】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。
【０１５７】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５との少なくとも９０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。
【０１５８】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５の配列を含む。
【０１５９】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号５の６番目、３０番目もしくは３２番目のコドンが異なるアミノ酸をコードするように突然変異していることを前提に、配列番号５に規定した配列を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、本発明は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：
ａ）任意選択的に１つのシグナルペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；
ｂ）第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域をコードする第２ポリヌクレオチド領域；および
ｃ）第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、
ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドを提供する。
【０１６１】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼもしくは前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンである。
【０１６２】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、同一バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。
【０１６３】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、第前記１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、異なるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。
【０１６４】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１６５】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１６６】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える変異プロペプチド領域であって、配列番号７の３４位に対応する位置で１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域をコードする。
【０１６７】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、前記プロペプチド領域が配列番号７の３４位で１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号７に規定したプロペプチド領域をコードする。一部の実施形態では、前記位置にある天然アミノ酸は、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、ＳおよびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号７の３４位での前記アミノ酸置換は、Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される。
【０１６８】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記アミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞による第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域の生成を強化する。一部の実施形態では、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【０１６９】
第２ポリヌクレオチドが第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域をコードする本発明のポリヌクレオチドの所定の実施形態では、プロペプチド領域は、配列番号７の３４位に対応する位置でＡ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される任意のアミノ酸を含まない。所定の実施形態では、変異プロペプチド領域は、配列番号７の６位もしくは３６位に対応する位置で１つの置換アミノ酸を含まない。
【０１７０】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号３との少なくとも６０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。
【０１７１】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号３との少なくとも９０％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。
【０１７２】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号３の３４番目のコドンが異なるアミノ酸をコードするように突然変異していることを前提に、配列番号３に規定した配列を含む。
【０１７３】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号４４に規定した１つのアミノ酸配列を含む非相同もしくは変異プロペプチド領域をコードする。
【０１７４】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、本明細書の前記第２ポリヌクレオチド領域は、配列番号６９に規定した１つのアミノ酸配列を含む非相同もしくは変異プロペプチド領域をコードする。
【０１７５】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）由来のプロテアーゼの成熟領域をコードする。
【０１７６】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンの成熟領域をコードする。
【０１７７】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、野生型バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシンの成熟領域をコードする。
【０１７８】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、変異バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）サブチリシンの成熟領域をコードする。
【０１７９】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、Ｂｇｉ０２４４６、ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０、ＤＳＭ９７３１、Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ  ＴＩＩ−５（ＷＯ２００３／０５４１８５−ＣＡＥ４８４２４）、Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ  ＴＩ−１（ＷＯ２００３／０５４１８４−ＣＡＥ４８４２１）、Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ  ＨＰ３０２（ＷＯ２００７／１３１６５７ト−ＣＡＳ９１３８５）およびＷＯ２００８／０８６９１６−ＣＡＶ３３５９４からなる群から選択されるサブチリシンのプロペプチド領域をコードする。
【０１８０】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、Ｂｇｉ０２４４４６の成熟領域をコードする。
【０１８１】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、Ｂｇｉ０２４４４６の変異体の成熟領域をコードする。
【０１８２】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０、１１、１２または１３との少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０、１１、１２または１３の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１０または１１の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号１２または１３の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１８３】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４または９との少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、前記第３ポリヌクレオチド領域は、配列番号４もしくは９の配列を含む。
【０１８４】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第１ポリヌクレオチド領域が存在し、１つのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）シグナルペプチドをコードする。一部の実施形態では、前記第１ポリヌクレオチド領域が存在し、１つのバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シグナルペプチドをコードする。一部の実施形態では、前記第１ポリヌクレオチド領域は、配列番号４０との少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、前記第１ポリヌクレオチド領域は、配列番号４０の配列を含む１つのアミノ酸配列をコードする。
【０１８５】
ポリヌクレオチドの一部の実施形態では、前記第１ポリヌクレオチド領域が存在し、配列番号２との少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を備える１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、前記第１ポリヌクレオチド領域は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、本発明は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列をコードする第１ポリヌクレオチド領域；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列をコードする、またはＥ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６Ｙ、Ｅ６Ｖ、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０Ｙ、Ｅ３０Ｖ、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を備える配列番号８の配列をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および
（ｃ）配列番号１１または１２のアミノ酸配列をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、
ここで第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドを提供する。
【０１８７】
一部の実施形態では、本発明は、１つの改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドであって：
ａ）配列番号４０のアミノ酸配列をコードする第１ポリヌクレオチド領域；
ｂ）Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を備える、配列番号７のアミノ酸配列をコードする第２ポリヌクレオチド領域、および
ｃ）配列番号１１または１２のアミノ酸配列をコードする第３ポリヌクレオチド領域を含み、
ここで前記第１ポリヌクレオチド領域は第２ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しており、第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドを提供する。
【０１８８】
１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０１８９】
また別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む改変染色体を提供する。染色体は、宿主細胞ＤＮＡ構築物に、染色体に統合されている本発明のポリヌクレオチドを導入することによって変化させることができる。染色体は、外来ＤＮＡ構築物を用いずにｉｎ  ｓｉｔｕ突然変異させることもできる。
【０１９０】
一部の実施形態では、発現ベクターもしくは改変染色体は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内での遺伝子発現のために好適であり、第１ポリヌクレオチド領域に機能的に連結しているプロモーターをさらに含む。
【０１９１】
１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターもしくは改変染色体を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、前記宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【０１９２】
上述したように、一部の実施形態では、本発明は、上記の改変ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、その中で本発明の改変プロテアーゼをコードする改変ポリヌクレオチド配列が効率的な遺伝子発現のために必要とされる追加のセグメント（例えば、関心対象の遺伝子に機能的に連結しているプロモーター）に機能的に連結している発現ベクターである。一部の実施形態では、これらの必要な要素は、それが認識される（すなわち、宿主によって転写される）場合は遺伝子の固有の相同プロモーター、および外因性またはプロテアーゼ遺伝子の内因性終結因子領域によって供給される転写終結因子として供給される。一部の実施形態では、例えば抗菌物質含有媒体中での増殖によってプラスミド感染宿主細胞の連続的培養維持を可能にする抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子もまた含まれる。
【０１９３】
一部の実施形態では、発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡに由来する、または代替実施形態では、両方の要素を含有する。典型的なベクターには、ｐＸＸ、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０，ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ，ｃｈａｐｔｅｒ  ３；  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｔｈｏｓｅ  ｌｉｓｔｅｄ  ｏｎ  ｐａｇｅ  ９２；Ｐｅｒｅｇｏ，Ｍ．（１９９３）  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｐ．６１５−６２４；Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）が含まれるがそれらに限定されない。
【０１９４】
細胞中での関心対象のタンパク質、例えばプロテアーゼの発現および生成のためには、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含む、および好ましくは複数のコピーを含む少なくとも１つの発現ベクターは、プロテアーゼを発現させるために好適な条件下で細胞内に形質転換させられる。一部の特定の実施形態では、プロテアーゼをコードする配列（ならびにベクター内に含まれる他の配列）は、宿主細胞のゲノム内に統合されるが、他の実施形態では、プラスミドは依然として自立染色体外要素として細胞中に残留する。したがって、本発明は、染色体外要素ならびに宿主細胞ゲノム内に統合されている入来配列の両方を提供する。本明細書に記載したベクターのそれぞれは、本発明において利用されることが意図されている。一部の実施形態では、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド構築物は、改変ポリヌクレオチドの細菌染色体内への統合および任意選択的な増幅を可能にする統合ベクター（例えば、ｐＪＨ−ＧＧ３６；図４）上に存在する。統合のための部位の例としては、ａｐｒＥ、ａｍｙＥ、ｖｅｇまたはｐｐｓ領域が挙げられるがそれらに限定されない。実際に、当業者には公知である他の部位が本発明において利用されるであろうことは企図されている。一部の実施形態では、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆プロテアーゼのための野生型プロモーターであるプロモーターによって達成される。一部の他の実施形態では、プロモーターは、前駆プロテアーゼにとって非相同であるが、宿主細胞内では機能的である。詳細には、細菌宿主細胞中で使用するために好適なプロモーターの例としては、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子のプロモーター、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、Ｂ．クラウシイ（ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、Ｂ．プミリス（ｐｕｍｉｌｉｓ）キシロシダーセ遺伝子、Ｂ．チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡおよびＢ．リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９５】
追加のプロモーターには、Ａ４プロモーターならびにファージラムダＰＲもしくはＰＬプロモーターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターが含まれるがそれらに限定されない。
【０１９６】
前駆および改変プロテアーゼは、細菌および真菌を含む任意の好適なグラム陽性細菌の宿主細胞内で生成される。例えば、一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、真菌および／または細菌起源の宿主細胞内で生成される。一部の実施形態では、宿主細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種である。一部の実施形態では、改変プロテアーゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞によって生成される。本発明の改変タンパク質の生成において利用されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞の例としては、Ｂ．リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．プミリス（ｐｕｍｉｌｉｓ）、Ｂ．チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．クラウシイ（ｃｌａｕｓｉｉ）およびＢ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属内の他の生体が挙げられるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞が利用される。米国特許第５，２６４，３６６号明細書および同第４，７６０，０２５（ＲＥ３４，６０６）号明細書は、本発明において利用される種々のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株について記載しているが、本発明では他の好適な菌株も利用される。
【０１９７】
本発明において利用される数種の産業用菌株には、非組換え（すなわち、野生型）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種菌株ならびに天然型菌株および／または組換え菌株の変異体が含まれる。一部の実施形態では、宿主菌株は、組換え菌株であって、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主に導入されている組換え菌株である。一部の実施形態では、宿主菌株は、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株、特に、組換えバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株である。１Ａ６（ＡＴＣＣ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ３９，０８７）、ＡＴＣＣ２１３３２、ＡＴＣＣ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ１１０およびＰＥＰ２１１菌株を含むがそれらに限定されない数多くのＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が公知である（例えば、それらのそれぞれが全体として参照により組み込まれるＨｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７３：２１５−２２８，１９７３；米国特許第４，４５０，２３５号明細書；同第４，３０２，５４４号明細書；および欧州特許第０１３４０４８号明細書を参照されたい）。発現宿主としてのＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の使用は、当分野において周知である（例えば、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１−８７，１９８２；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６−８０４，１９８６；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９−４７，１９８８を参照されたい）。
【０１９８】
一部の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主は、以下の遺伝子：ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲおよびｄｅｇＱのうちの少なくとも１つにおける突然変異もしくは欠失を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種である。好ましくは、突然変異はｄｅｇＵ遺伝子中にあり、より好ましくは、突然変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。（例えば、Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８２４−８３４，１９９０およびＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５３：５６２−５６７，１９９７を参照されたい）。好ましい宿主菌株は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２突然変異を有するバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。一部のまた別の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７３２９−７３４０，２００１を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１４０７−１４１５，１９９９を参照されたい）；および／またはｏｐｐＡもしくはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３−１８５，１９９１を参照されたい）における突然変異もしくは欠失を含む。実際に、ｏｐｐＡ遺伝子における突然変異と同一の表現型を生じさせるｏｐｐオペロンの任意の突然変異は、本発明の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株の一部の実施形態で利用されるであろうと企図されている。一部の実施形態では、これらの突然変異は単独で発生するが、他の実施形態では、突然変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、本発明の改変プロテアーゼを生成するために使用できる改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、上述の遺伝子の１つ以上における突然変異を既に含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株である。さらに、内因性プロテアーゼ遺伝子の突然変異および／または欠失を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞が利用される。一部の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、ａｐｒＥおよびｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、５種のプロテアーゼ遺伝子の欠失を含むが（米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号明細書を参照されたい）、他の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、９種のプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む（米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号明細書を参照されたい）。
【０１９９】
宿主細胞は、当分野において公知の任意の好適な方法を使用して本発明の改変プロテアーゼをコードする改変ポリヌクレオチドを用いて形質転換させられる。改変ポリヌクレオチドがベクター内に組み込まれても、またはプラスミドＤＮＡの存在を伴わずに使用されても、改変ポリヌクレオチドは、一部の実施形態では、微生物、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞もしくはコンピテントバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入される。プラスミド構築体、およびプラスミドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内への形質転換を包含する、ＤＮＡをバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入するための方法は、周知である。一部の実施形態では、プラスミドは引き続いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離され、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内に形質転換させられる。しかし、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの介在微生物を使用することは必須ではなく、一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物もしくはベクターは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主内に直接的に導入される。
【０２００】
当業者であれば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内にポリヌクレオチド配列を導入するための好適な方法を明確に承知している（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，’’ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，１９８９，ｐａｇｅｓ  ５７−７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８−７２６，１９８４；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５−１９３７，１９６７；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５，１９８６；ならびにＨｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７，１９８５；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１−１１５，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３，１９８０；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７，１９８１およびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３，１９８４を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質変換および会合、形質導入、ならびにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法は知られており、本発明での使用に適している。本発明によって提供されるＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するためには、形質転換方法が使用される。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を形質転換させるための当分野において公知の方法には、部分的に相同の常在プラスミドを有するコンピテント細胞によるドナープラスミドの取込みを含む、プラスミドマーカー救済形質転換などの方法が含まれる（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ２：５５５−５７１，１９７９；Ｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３：１８５−１９１，１９９０；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：１０７７−１０８７，１９８３；およびＷｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：１２０５−１２１１，１９８７を参照されたい）。この方法では、入来ドナープラスミドは、染色体形質転換を模倣する方法において常在「ヘルパー」プラスミドの相同領域と再結合する。
【０２０１】
一般に使用される方法に加えて、一部の実施形態では、宿主細胞は直接的に形質転換させられる（すなわち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡ構築物を増幅させるために、またはさもなければプロセシングするために中間細胞が使用されない）。ＤＮＡ構築物の宿主細胞内への導入には、プラスミドもしくはベクター内へ挿入することなくＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当分野において知られている物理的および化学的方法が含まれる。そのような方法には、塩化カルシウム沈澱法、エレクトロポレーション法、裸のＤＮＡ法、リポソーム法などが含まれるがそれらに限定されない。追加の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換させられる。また別の実施形態では、選択的マーカーは、当分野において公知の方法によって、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から欠失させられる（例えば、Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１−４１８，１９８４およびＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５−２６４，２０００を参照されたい）。
【０２０２】
一部の実施形態では、本発明の形質転換細胞は、従来型栄養培地中で培養される。例えば、温度、ｐＨなどの好適な特異的培養条件は、当業者には公知である。さらに、一部の培養条件は、例えばＨｏｐｗｏｏｄ（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ；Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの科学的文献において見いだすことができる。
【０２０３】
一部の実施形態では、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、本プロテアーゼの発現を許容する条件下で好適な栄養培地中で培養され、その後に結果として生じるプロテアーゼが培養から回収される。細胞を培養するための培地は、例えば最小培地もしくは適切な補給物を含有する天然培地などの宿主細胞を増殖させるために好適な任意の従来型培地を含む。好適な培地は商業的供給業者から入手可能である、または（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中で）公開された製法にしたがって調製することができる。一部の実施形態では、細胞によって生成されるプロテアーゼは、遠心分離もしくは濾過によって培地から宿主細胞を分離する方法、塩（例えば、硫酸アンモニウム）による上清もしくは濾液のタンパク質性成分の沈降、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、親和性など）を含むがそれらに限定されない従来型手法によって培養培地から回収される。したがって、本発明においては、本発明のプロテアーゼを回収するために好適な任意の方法が利用される。実際に、本発明が任意の特定精製法に限定されることは意図されていない。
【０２０４】
本発明の改変プロテアーゼを含む組換え宿主細胞によって生成されたタンパク質は、培養培地中に分泌される。一部の実施形態では、他の組換え構造は、非相同もしくは相同ポリヌクレオチド配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするプロテアーゼポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合する（Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：４４１−４５３，１９９３）。そのような精製促進性ドメインには、固定化金属上での精製を可能にする例えばヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド（Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ３：２６３−２８１，１９９２）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメインおよびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム内で利用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）が含まれるがそれらに限定されない。精製ドメインと非相同タンパク質との間の例えばＸＡ因子もしくはエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の包含もまた、精製を促進するために利用される。
【０２０５】
上述のように、本発明は、同一条件下で増殖させられたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によって未改変全長酵素からプロセシングされた場合に同一成熟プロテアーゼのレベルより高いレベルで成熟形を生成するために、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によってプロセシングされている改変全長プロテアーゼをコードする改変全長ポリヌクレオチドを提供する。生成のレベルは、分泌酵素の活性のレベルによって決定される。
【０２０６】
生成の１つの尺度は、改変プロテアーゼからプロセシングされた場合の成熟形の酵素活性値対未改変前駆プロテアーゼからプロセシングされた場合の成熟形酵素活性値の比率の百分率として表示される、相対活性として決定できる。１００％以上の相対活性は、改変前駆体からプロセシングされているプロテアーゼの成熟形が、同一成熟プロテアーゼが生成されるが未改変前駆体からプロセシングされた場合のレベル以上のレベルで生成されることを示している。したがって、一部の実施形態では、改変プロテアーゼからプロセシングされた成熟プロテアーゼの相対活性は、未改変プロテアーゼからプロセシングされたプロテアーゼの成熟形の対応する生成と比較した場合に、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３７５％、少なくとも約４００％、少なくとも約４２５％、少なくとも約４５０％、少なくとも約４７５％、少なくとも約５００％、少なくとも約５２５％、少なくとも約５５０％、少なくとも約５７５％、少なくとも約６００％、少なくとも約６２５％、少なくとも約６５０％、少なくとも約６７５％、少なくとも約７００％、少なくとも約７２５％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８２５％、少なくとも約８５０％、少なくとも約８７５％、少なくとも約８５０％、少なくとも約８７５％、少なくとも約９００％および少なくとも約１０００％以上までである。または、相対活性は、改変前駆体からプロセシングされたプロテアーゼの活性値を未改変前駆体からプロセシングされた場合の同一プロテアーゼの活性値で割ることによって決定される生成率の比として表示される。したがって、一部の実施形態では、改変前駆体からプロセシングされた成熟プロテアーゼの生成比は、少なくとも約１、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約．１８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約２．２５、少なくとも約２．５、少なくとも約２．７５、少なくとも約３、少なくとも約３．２５、少なくとも約３．５、少なくとも約３．７５、少なくとも約、少なくとも約４．２５、少なくとも約４．５、少なくとも約４．７５、少なくとも約５、少なくとも約５．２５、少なくとも約５．５、少なくとも約５．７５、少なくとも約６、少なくとも約６．２５、少なくとも約６．５、少なくとも約６．７５、少なくとも約７、少なくとも約７．２５、少なくとも約７．５、少なくとも約８、少なくとも約８．２５、少なくとも約８．５、少なくとも約８．７５、少なくとも約９および少なくとも約１０までである。
【０２０７】
プロテアーゼの活性を検出および測定するためには、当業者には公知の様々なアッセイがある。特に、プロテアーゼ活性を測定するためには、２８０ｎｍでの吸光度として、またはフォリン法を用いた比色測定により測定される、カゼインもしくはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイを利用することができる（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ’’ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８４を参照されたい）。一部のアッセイは、色素産生基質の可溶化を含んでいる（例えば、Ｗａｒｄ，‘‘Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ’’，ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８３，ｐｐ２５１−３１７を参照されたい）。他の典型的なアッセイには、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が含まれるがそれらに限定されない。当業者には公知の数多くの追加の参考文献が好適な方法を提供する（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１−７９２５，１９８３；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１１９−１２９，１９９４およびＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：２２１−２２７，１９９９を参照されたい）。本発明が任意の特定アッセイ法に限定されることは意図されていない。
【０２０８】
宿主細胞内での成熟プロテアーゼの生成レベルを決定するための他の手段には、タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体いずれかを使用する方法が含まれるが、それらに限定されない。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）が挙げられるがそれらに限定されない。これらやその他のアッセイは、当分野では周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１，１９８３を参照されたい）。
【０２０９】
成熟プロテアーゼを生成する方法
また別の態様では、本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法であって：
ａ）本発明の発現ベクターを提供する工程；
ｂ）前記発現ベクターを用いてバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）宿主細胞を形質転換させる工程；および
ｃ）前記成熟プロテアーゼが前記宿主細胞によって生成されるような好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
【０２１０】
１つの態様では、本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞中で成熟プロテアーゼを生成するための方法であって、
ａ）本発明の前記宿主細胞を提供する工程；
ｂ）前記成熟プロテアーゼが前記宿主細胞によって生成されるような好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
【０２１１】
本方法の一部の実施形態では、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【０２１２】
本方法の一部の実施形態では、前記成熟プロテアーゼは、野生型バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）セリンプロテアーゼ、変異体またはそのホモログである。
【０２１３】
本方法の一部の実施形態では、前記成熟プロテアーゼは、同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが第２ポリヌクレオチド領域は第３ポリヌクレオチド領域によってコードされたＢ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの野生型プロペプチド領域をコードする発現ベクターもしくは改変染色体を含む宿主細胞によるより高レベルで発現する。
【０２１４】
本方法の一部の実施形態では、前記第２ポリヌクレオチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域をコードするが、このとき前記成熟プロテアーゼは、同一の第１ポリヌクレオチド領域および第３ポリヌクレオチド領域を含むが第２ポリヌクレオチド領域はバチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来の同一サブチリシンの野生型プロペプチド領域をコードする発現ベクターもしくは改変染色体を含む宿主細胞によるより高レベルで発現する。
【０２１５】
本方法の一部の実施形態では、生成された成熟プロテアーゼは、２個のグルタミンから始まる。一部の実施形態では、生成された成熟領域は、配列番号１１または１２との少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、生成された成熟プロテアーゼは、配列番号１１または１２の配列を含む。
【０２１６】
ポリペプチド
また別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、または本明細書に記載した改変プロテアーゼを含むポリペプチドを提供する。
【０２１７】
一部の実施形態では、本ポリペプチドは、１つの改変プロテアーゼを含み、前記プロテアーゼはバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域を含み、ここで前記プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも４０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、本ポリペプチドは、１つの改変プロテアーゼを含み、前記改変プロテアーゼはバチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼのプロペプチド領域を含み、ここで前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来である。
【０２１９】
一部の実施形態では、本プロペプチド領域は、成熟領域のアミノ末端に連結している。
【０２２０】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来である。
【０２２１】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｈｅｎｓｉｓ）およびバチルス・ノバリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｖａｌｉｓ）からなる群から選択されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。
【０２２２】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）由来である。
【０２２３】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンである。
【０２２４】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの野生型プロペプチド領域である。
【０２２５】
一部の他の実施形態では、前記プロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域である。
【０２２６】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂｐａｎ０１７４４、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０、Ｂｐｓ０２００３、Ｂｏｈｎ００５６９、ＢｓｐＡＫ０１３０５、Ｂｐａｎ０４３８２およびＢｓｐＡＬ０３２７９からなる群から選択される。
【０２２７】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、ＢｓｐＱ０１２１１、Ｂｐｓ０２５９２、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００、ＢｓｐＡＬ０３２４０、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ＿Ｐ４１３６２、Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ＿ＡＦＫ０８９７０およびＢｐａｎ０１７４４からなる群から選択される。
【０２２８】
一部の実施形態では、前記非相同バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ＿Ｐ２９６００である。
【０２２９】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも５０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも７５％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の配列を含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）もしくはその関連種由来のサブチリシンの変異プロペプチド領域であって、配列番号８の６位、３０位もしくは３２位に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異プロペプチド領域である。
【０２３４】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の６位に対応する位置にあり、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６ＹおよびＥ６Ｖからなる群から選択される。
【０２３５】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３０位に対応する位置にあり、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０ＹおよびＥ３０Ｖからなる群から選択される。
【０２３６】
一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号８の３２位に対応する位置にあり、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される。
【０２３７】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、前記プロペプチド領域が配列番号８の６位、３０位および３２位から選択された位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号８に規定した配列を含む。
【０２３８】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の６位で、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｃ、Ｅ６Ｒ、Ｅ６Ｎ、Ｅ６Ｑ、Ｅ６Ｇ、Ｅ６Ｈ、Ｅ６Ｉ、Ｅ６Ｌ、Ｅ６Ｋ、Ｅ６Ｍ、Ｅ６Ｆ、Ｅ６Ｐ、Ｅ６Ｓ、Ｅ６Ｔ、Ｅ６Ｗ、Ｅ６ＹおよびＥ６Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【０２３９】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の３０位で、Ｅ３０Ａ、Ｅ３０Ｒ、Ｅ３０Ｎ、Ｅ３０Ｄ、Ｅ３０Ｃ、Ｅ３０Ｑ、Ｅ３０Ｇ、Ｅ３０Ｈ、Ｅ３０Ｌ、Ｅ３０Ｋ、Ｅ３０Ｍ、Ｅ３０Ｓ、Ｅ３０Ｔ、Ｅ３０Ｗ、Ｅ３０ＹおよびＥ３０Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、前記プロペプチド領域は、配列番号８の３２位で、Ａ３２Ｒ、Ａ３２Ｎ、Ａ３２Ｃ、Ａ３２Ｑ、Ａ３２Ｇ、Ａ３２Ｈ、Ａ３２Ｉ、Ａ３２Ｌ、Ａ３２Ｋ、Ａ３２Ｍ、Ａ３２Ｆ、Ａ３２Ｐ、Ａ３２Ｓ、Ａ３２Ｔ、Ａ３２Ｗ、Ａ３２ＹおよびＡ３２Ｖからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を含む。
【０２４１】
一部の実施形態では、本ポリペプチドは１つの改変プロテアーゼを含み、前記改変プロテアーゼは、第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの成熟領域に機能的に連結している第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの変異プロペプチド領域を含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、前記第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼもしくは前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、セリンプロテアーゼもしくはサブチリシンである。
【０２４３】
一部の実施形態では、前記第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、同一バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。
【０２４４】
一部の実施形態では、前記第１バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼおよび前記第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼは、異なるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来である。
【０２４５】
一部の実施形態では、前記変異プロペプチド領域は、配列番号７との少なくとも６０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、前記変異プロペプチド領域は、配列番号７との少なくとも９０％の同一性を備える１つのアミノ酸配列を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、前記変異プロペプチド領域は、前記プロペプチド領域が配列番号７の３４位で１つのアミノ酸置換を含むことを前提に、配列番号７に規定したプロペプチド領域を含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、前記アミノ酸置換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞による第２バチルス・ギブソニイ・クレード（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）プロテアーゼの前記成熟領域の生成を強化する。
【０２４９】
一部の実施形態では、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞である。
【０２５０】
一部の実施形態では、配列番号７の３４位での前記アミノ酸置換は、Ｅ３４Ｄ、Ｅ３４Ｃ、Ｅ３４Ｇ、Ｅ３４Ｈ、Ｅ３４ＳおよびＥ３４Ｖからなる群から選択される。
【０２５１】
一部の実施形態では、前記非相同もしくは変異プロペプチド領域は、配列番号４４に規定した１つのアミノ酸配列を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、前記非相同もしくは変異プロペプチド領域は、配列番号６９に規定した１つのアミノ酸配列を含む。
【０２５３】
ポリペプチドの一部の実施形態では、改変プロテアーゼの成熟領域は本明細書に記載されている。
【０２５４】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、さらに本明細書に記載した１つのシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種においてタンパク質を分泌させるために好適である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてタンパク質を分泌させるために好適である。
【０２５５】
本明細書に言及した全刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明に記載した方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者には明白であろう。本発明は、特定の実施形態に結び付けて記述してきたが、本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施するための本明細書に記載した様式の様々な修飾は、当業者には明白であり、本発明の特許請求の範囲の範囲内に含まれることは企図されている。
【０２５６】
実験
下記に記載する実験の開示においては、次の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モルの）；ｍＭ（ミリモルの）；μＭ（マイクロモルの）；ｎＭ（ナノモルの）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；μｌおよびμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒間）；ｍｉｎ（ｓ）（分／分間）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時間）；℃（摂氏温度）；ＱＳ（十分量）；ＱＣ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）、ＮＤ（実施していない）；ＮＡ（適用不可）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｗ／ｖ（重量対容積）；ｖ／ｖ（容積対容積）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロベース対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−アラニル−パラ−ニトロアニリド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ｃＤＮＡ（コピーもしくは相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７．２］）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＳＯＣ（２％のバクトトリプトン、０．５％のバクト酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣｌ）；Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ；１２ｇ／ｌのバクト・トリプトン、２４ｇ／ｌのグリセロール、２．３１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４および１２．５４ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学密度）；ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）；Ａ４０５（４０５ｎｍでの吸光度）；Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の最大初期速度）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩酸塩）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＴＡＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラアセチレンジアミン）。
【０２５７】
以下の実施例は、本発明の特定の実施例および態様を例示し、さらに詳しく説明するために提供するものであり、その範囲を限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０２５８】
実施例１
方法
プロテアーゼ活性のＡＡＰＦアッセイ
下記に記載するように入手したＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養をプロテアーゼ発現の１つの指標として活性サブチリシンプロテアーゼの生成についてアッセイした。生成された酵素を合成基質であるスクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ＡＡＰＦ）に対する活性についてアッセイした。このアッセイは、活性プロテアーゼの生成をｐ−ニトロアナリンの加水分解および放出の結果として生じた経時的な４０５ｎｍでの吸光度の増加として測定する（Ｅｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：６５１８−６５２１，１９８５）。Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養上清は、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０、ｐＨ８．６を含有するＴｒｉｓ緩衝剤中に適切に希釈した。反応は、希釈した培養上清を２５μＬのＡＡＰＦ基質（上述したＴｒｉｓ緩衝液中の１ｍｇ／ｍｌのＡＡＰＦ）中に加えることによって調製した。動態アッセイは、２分間にわたり９６ウエルプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）上でランしたが、これは線形反応を生じさせた。
【０２５９】
プロテアーゼサンプルを単離するためのＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養
コントロールプラスミドまたは１つの改変プロテアーゼをコードするプラスミドを有する細菌コロニーを使用して、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）のウエル内に５ｐｐｍのクロラムフェニコール（ＣＭＰ）を含有するＬｕｒｉａブロス１５０μＬを接種した。次にＭＴＰを２５０ｒｐｍで回転させながら３７℃で４時間にわたりインキュベートした。各１０μｌの培養は、下記に記載するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養培地１６０μｌを含有する新規なＭＴＰにｐＨ７．６で移し、これらの培養を３１℃の２７０ｒｐｍで６８時間にわたり振とうインキュベーター内で増殖させた。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養培地は、主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを含み、堅固な細胞増殖のために１％のＳｏｙｔｏｎｅが補給されたＭＯＰ緩衝剤をベースとする濃縮半合成培地であった。インキュベーション時間後、ＭＴＰを遠心し、上述したＡＡＰＦアッセイを使用して、培養それぞれの上清をプロテアーゼ活性についてアッセイした。
【０２６０】
実施例２
天然Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド配列もしくはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン由来の非相同プロペプチド配列のいずれかを使用したバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６成熟サブチリシンの発現
Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号２）、Ｂｇｉ０２４４６プロ配列（配列番号３）、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６成熟配列（配列番号４）およびＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）終結因子（配列番号３９）を含むＤＮＡカセットは、ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって合成された。図２は、Ｂｇｉ０２４４６天然プロペプチド配列を用いたＢｇｉ０２４４６サブチリシン発現のために使用された遺伝子カセットを示している。
【０２６１】
プロ配列予測は、例えば、ＢＰＮ’（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１１：７９１１−７９２５，１９８３）およびＰＢ９２プロテアーゼ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５７：９０１−９０９，１９９１）などの相同性セリンプロテアーゼ内のプロ−成熟接合に関する知識に基づいた。ＡｐｒＢＧとしても公知のバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６の発現は、以前に（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｈａｌｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ．’’Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１９７−２０８，２０１４）およびさらにＰＣＴ国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットの中でＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．によって報告されている）。Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンは、ＤＳＭ８７２２菌株によってコードされ、さらにＡｐｒＢＧ（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）としても公知である。このサブチリシンは、菌株ＤＳＭ９７２８、ＤＳＭ９７２９、ＤＳＭ９７３０およびＤＳＭ９７３１によってコードされる相同性酵素と一緒に、全部がサブチリシン系統樹の同一領域内の重要な配列同一性およびクラスターを共有している。それらは、サブチリシンのＢ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）の基礎を形成する（ＰＣＴ国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレット）。
【０２６２】
Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号２）、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンプロペプチド配列（配列番号５）、Ｂｇｉ０２４４６サブチリシン成熟配列（配列番号４）およびＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）終結因子（配列番号３９）を含むＤＮＡカセットが合成された（ＧｅｎｅＡｒｔ）。図３は、この場合にはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンプロペプチド配列を用いたＢｇｉ０２４４６サブチリシン発現のために使用された遺伝子カセットを示している。
【０２６３】
どちらの発現カセットも、標準分子生物学プロトコルを使用して制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｄＩＩＩによって消化された。
【０２６４】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（配列番号６）由来のクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子発現カセットもまた合成された（ＤＮＡ２．０  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）。このカセットの図は、図４に示した。この発現カセットは、標準分子生物学プロトコルを使用して制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｄＩＩＩによって消化された。
【０２６５】
バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンを発現する２つの遺伝子カセットをそれぞれ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＣＡＴ遺伝子カセットにライゲートさせ、次にキットの製造業者の取扱説明書にしたがってローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を実施した（製品番号２５６４００１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。ローリングサークル増幅反応を使用して、好適なＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の２００μｌのコンピテント細胞を形質転換させた。形質転換細胞は、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間にわたりインキュベートした。形質転換混合物由来の細胞は、クロラムフェニコール選択下で１．６％の脱脂乳を含有する寒天プレート上でプレーティングした。単一コロニーを選択して６００ｎｍで１．３の光学密度までＬｕｒｉａブロス内で増殖させた。次に各菌株サンプルは、２０％のグリセロールを用いて−８０℃で凍結させた。配列番号２によってコードされたＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＡｐｒＥシグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４０に規定した。
【０２６６】
実施例３
天然Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド配列もしくはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン由来の非相同プロペプチド配列を使用した場合のＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６野生型成熟サブチリシンの発現レベル
実施例２に記載した構築物から入手したＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養を使用して、菌株それぞれ由来のサンプル上の相対サブチリシン活性を測定した。ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質上のプロテアーゼ活性を使用して、本実施例および下記の実施例において評価した様々な構築物によって発現したサブチリシン酵素の相対量を検出した。天然Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド対非相同Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドが発現に及ぼす作用の比較の結果は、表３に示した。バチルス．ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンの発現は、異なるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種サブチリシン、今回の場合にはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン由来のプロペプチドを天然型配列に代えて使用した場合に有意に強化される。これらの２つのプロペプチドのアミノ酸配列は、下記の実施例１３上の配列アラインメントから明らかなように、有意に相違する。
【０２６７】
【表４】
2018518185.tif 000012
【０２６８】
Ｂｇｉ０２４４６プロ配列によってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に規定し、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンプロ配列によってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８に規定した。
【０２６９】
実施例４
天然Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド配列もしくはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン由来のプロペプチド配列のいずれかを使用した成熟サブチリシンのバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１の発現
Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号２）、バチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６（配列番号３）もしくはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）（配列番号５）いずれか由来のプロ配列およびＢＳＰ−００８０１（配列番号９）と呼ばれるバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６の変異体に対する遺伝子に対応する配列を含むＤＮＡカセットは、表４に列挙したプライマーを使用する増幅によって合成した。当分野において公知の技術を使用して、最終発現カセットを作成するためにＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＳＧＩ  ＤＮＡ、製品番号ＧＡ１１００−１０）を使用してＰＣＲ断片を組み立てた。ローリングサークル増幅反応は、製造業者の取扱説明書にしたがって実施した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品番号２５６４００１０）。ローリングサークル増幅反応を使用して、好適なＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の２００μｌのコンピテント細胞を形質転換させた。形質転換細胞は、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間にわたりインキュベートした。形質転換混合物由来の細胞は、クロラムフェニコール選択下で１．６％の脱脂乳を含有する寒天プレート上でプレーティングした。単一コロニーを選択して６００ｎｍで１．３の光学密度までＬｕｒｉａブロス内で増殖させた。次に各菌株サンプルは、２０％のグリセロールを用いて−８０℃で凍結させた。
【０２７０】
【表５】
2018518185.tif 000013
【０２７１】
実施例５
天然Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド配列もしくはＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン由来の非相同プロペプチド配列を使用した場合のＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１成熟サブチリシンの発現レベル
実施例４に記載した構築物から入手したＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養を使用して、菌株それぞれ由来のサンプル上の相対サブチリシン活性を測定した。ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質上のプロテアーゼ活性を使用して、本実施例および下記の実施例において評価した様々な構築物によって発現したＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１サブチリシン酵素の相対量を検出した。天然Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド対非相同Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの比較の結果は、表３に示した。本発明者らは、ＢＳＰ−００８０１成熟遺伝子（配列番号９）を備える発現カセット中のＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンプロペプチド配列（配列番号３）を使用すると、ＢＳＰ−００８０１タンパク質の生産性の強化が与えられることを観察した。Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドを使用してＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１が発現した場合に観察される強化された発現は、野生型Ｂｇｉ０２４４６Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）プロペプチド配列について観察されたものと大きさが類似する（表５を参照されたい）。
【０２７２】
【表６】
2018518185.tif 000014
【０２７３】
実施例６
成熟プロテアーゼ配列の確認
タンパク質を沈降させるために、トリクロロ酢酸を用いてサンプルを処理した。タンパク質ペレットを８Ｍの尿素に溶解させ、ジチオトレイトールを用いて還元させ、ヨードアセトアミドを用いてアルキル化し、トリプシン、α−キモトリプシンおよびエンドプロテイナーゼＧｌｕＣの混合物を用いて消化した。高分解能ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用してこれらのサンプルを分析した。サンプルをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣ上のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｅｒｉｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＸＢ−Ｃ１８カラム、Ｗａｔｅｒｓ）および０．１％のギ酸を用いる２〜８５％のアセトニトリル勾配にかけた。システムは、連続的に高分解能タンデム質量分光計（ＯｒｂｉＴｒａｐ  ＸＬ，Ｔｈｅｒｍｏ）に接続した。ポリペプチドは、プロテオミクスデータベース検索ソフトウエアであるＰｒｏｔｅｍｅ  Ｄｉｓｃｏｂｖｅｒｅｒ  １．４上で同定された。
【０２７４】
天然Ｂｇｉ０２４４６プロペプチドを使用して発現系から単離されたＢｇｉ０２４４６成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０に規定した。Ｎ末端で１つのグルタミン（Ｑ）を備える２６８アミノ酸ポリペプチドは、以前に観察されたＢｇｉ０２４４６成熟タンパク質と一致する（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４およびＰＣＴ国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットの中で配列番号７としてＤａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．によって報告された）。例えばＢＰＮ’（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１１：７９１１−７９２５，１９８３）およびＰＢ９２プロテアーゼ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５７：９０１−９０９，１９９１）などの相同セリンプロテアーゼ内でのプロ−成熟接合に関する知識に基づくプロ配列予測は、Ｎ末端で２つのグルタミン（ＱＱ）を有する２６９アミノ酸成熟Ｂｇｉ０２４４６タンパク質を予測したが、その代わりに１つのグルタミン（Ｑ）しか観察されなかった。
【０２７５】
非相同Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドを使用して発現系から単離されたＢｇｉ０２４４６成熟タンパク質の２６９アミノ酸配列は、配列番号１１に規定した。非相同Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドを使用した場合に得られる成熟Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンのこの配列が天然／相同Ｂｇｉ０２４４６プロペプチドを使用した場合に得られる配列とは異なることが見いだされることは、興味深い。非相同発現カセットの場合は、２６９アミノ酸Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンは予測Ｎ末端を有するが、それ以上プロセシングされない。
【０２７６】
Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１サブチリシンのサンプルは、さらに上述したＬＣ／ＭＳによっても分析した。Ｂｇｉ０２４４６成熟タンパク質と同様に、ＢＳＰ−００８０１サブチリシン変異体もまた、発現カセット内で使用されたプロペプチドに依存して異なるＮ末端を有していた。Ｂｇｉ０２４４６と同様に、ＢＳＰ−００８０１サブチリシン変異体は、非相同Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド（配列番号１２）を使用して発現させた場合はＮ末端で２つのグルタミン（ＱＱ）を示したが、親Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド（配列番号１３）を使用して発現させた場合はＮ末端で１つのグルタミン（Ｑ）を示した。
【０２７７】
実施例７
Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンを発現させるためのＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド位置評価ライブラリーの構築
Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンの発現への大きな影響を評価するために、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンプロペプチドの複数のアミノ酸位置での位置評価ライブラリー（ＳＥＬ）を生成した。これらのＳＥＬは、標準分子生物学プロトコルを使用して生成した。Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号５）およびＢｇｉ０２４４６成熟遺伝子（配列番号４）を含むＤＮＡカセットを含有する鋳型プラスミドを構築し、ｐＫＢ７２３−Ｂｇｉ０２４４６と称した（図５）。位置飽和ライブラリー内の各アミノ酸位置に対するフォワードおよびリバースＮＮＳオリゴマー（表６に列挙した）および外部プライマー（表７に列挙した）を使用して、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）から入手した発現カセットの始まりおよび終わりにハイブリダイズさせた。
【０２７８】
適切なプライマー対および鋳型プラスミドを用いたポリメラーゼ連鎖反応は、ＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して実施した。ＰＣＲは、４０μＬのＨ２Ｏ、５μＬのＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  １０×バッファー、１μｌのｄＮＴＰミックス（Ｒｏｃｈｅ）、１μｌの各プライマー（濃度５μＭ）および１μｌのＤＮＡ鋳型を使用して実施した。ＰＣＲは、下記の条件：９５℃で２分間を１回、その後に９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で３０秒間を３０サイクル、次に７２℃で３分間を１サイクルを使用してサーモサイクラー内でインキュベートした。ＰＣＲ断片は、１．５μＬの各ＰＣＲ反応液＋８μｌの２×のＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ＋５μＬのＨ２Ｏからなる反応液中のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＳＧＩ  ＤＮＡ製品番号ＧＡ１１００−１０）を使用して集合させ、５０℃のサーモサイクラー内で８０分間インキュベートし、その後６５℃で１０分間インキュベートして、４℃に冷却した。
【０２７９】
好適なＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コンピテント細胞は、集合ＤＮＡを用いて形質転換させた。形質転換細胞は、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間にわたりインキュベートした。形質転換混合物由来の細胞は、クロラムフェニコール選択下で１．６％の脱脂乳を含有する寒天プレート上でプレーティングした。単一コロニーを選択して６００ｎｍで１．３の光学密度までＬｕｒｉａブロス内で増殖させた。次に各菌株サンプルを２０％のグリセロールを用いて−８０℃で凍結させた。
【０２８０】
各変異体は、ＤＮＡ配列分析によって確証した。分析のためのＢｇｉ０２４４６サブチリシンプロテアーゼサンプルを生成するために、変異体の選択的増殖は、各３１℃で６８時間にわたり、９６ウエルＭＴＰ中のウエル内の培養培地（主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを含み、堅固な細胞増殖のために１％のＳｏｙｔｏｎｅが補給されたＭＯＰバッファーをベースとする濃縮半合成培地）中で実施した。インキュベーションの終了時に、以下に記載するＡＡＰＦアッセイを使用して培養のそれぞれをプロテアーゼ活性についてアッセイした。
【０２８１】
【表７】
2018518185.tif 000015
【０２８２】
【表８】
2018518185.tif 000016
【０２８３】
実施例８
Ｂｇｉ０２４４６野生型サブチリシンの発現にＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの６位、３０位および３２位での突然変異が及ぼす作用
Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドＳＥＬおよびＢｇｉ０２４４６成熟サブチリシンの発現に由来する培養上清のアリコートを実施例１において上述したようにＡＡＰＦ活性についてアッセイした。活性（成熟）Ｂｇｉ０２４４６サブチリシンの相対発現は、参照物質としての野生型Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドを使用して、各発現プラスミドについて計算した。突然変異した位置は、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド直鎖配列（配列番号８）の６位、３０位および３２位に対応する。表８は、野生型配列に比して発現の増加を示しているＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの６位での変異体の結果を列挙しており、表９は、野生型配列に比して発現の増加を示しているＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの３０位での変異体の結果を列挙しており、表１０は、野生型配列に比して発現の増加を示しているＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの３２位での変異体の結果を列挙している。
【０２８４】
【表９】
2018518185.tif 000017
【０２８５】
【表１０】
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【０２８６】
【表１１】
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【０２８７】
実施例９
Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＢＳＰ−００８０１変異サブチリシンを発現させるためのＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド位置評価ライブラリーの構築
突然変異は、表１１に列挙したプライマーならびに標準ＰＣＲおよびアセンブリーＰＣＲ技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を使用してＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＢＳＰ−００８０１変異発現構築物（例えば、図５を参照されたい）のＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド直鎖配列（配列番号８）のアミノ酸６位、３０位および３２位で導入された。生じたＰＣＲ断片は、ライゲーションによって環状化し、好適なバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株内に形質転換させた。個々の突然変異は、引き続きＤＮＡシークエンシングによって同定した。様々なＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド突然変異（置換）を有する菌株は、染色体上での発現構築物の増幅を推進するために、クロラムフェニコールの濃度を増加させながら液体培地中で増殖させた。
【０２８８】
増幅手法に続いて、これらの菌株は、５ｍＭのＣａＣｌ２および５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養培地（実施例１において記載した）中の３１℃で６８時間にわたり増殖させた。培養上清を採取し、ＢＳＰ−００８０１プロテアーゼの量は、実施例１に記載したＡＡＰＦ活性アッセイを使用して決定した。
【０２８９】
【表１２】
2018518185.tif 000020
【０２９０】
配列番号１４（下記に規定した）は、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドおよびＢＳＰ−００８０１サブチリシン変異体オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む発現カセットのヌクレオチド配列を含む。ａｐｒＥシグナル配列には下線を引き、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド配列はイタリック体で記載し、成熟ＢＳＰ−００８０１サブチリシンのヌクレオチド配列は大文字で記載した。
【化７】
2018518185.tif 000021
【０２９１】
実施例１０
Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドのアミノ酸６位、３０位および３２位での突然変異がＢＳＰ−００８０１変異体サブチリシンの発現に及ぼす作用
Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドＳＥＬおよびＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１成熟サブチリシンの発現に由来する培養上清のアリコートを実施例１において上述したようにＡＡＰＦ活性についてアッセイした。活性（成熟）ＢＳＰ−００８０１サブチリシンの相対発現は、参照物質としての野生型Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドを使用して、各発現プラスミドについて計算した。突然変異（置換）した位置は、Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチド直鎖配列（配列番号８）の６位、３０位および３２位に対応する。表１２は、野生型配列に比して発現の増加を示しているＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの６位での変異体についての結果を列挙しており、表１３は、野生型配列に比して発現の増加を示しているＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの３０位での変異体についての結果を列挙しており、表１４は、野生型配列に比して発現の増加を示しているＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）プロペプチドの３２位での変異体についての結果を列挙している。
【０２９２】
【表１３】
2018518185.tif 000022
【０２９３】
【表１４】
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【０２９４】
【表１５】
2018518185.tif 000024
【０２９５】
実施例１１
Ｂｇｉ０２４４６成熟サブチリシンを発現させるためのＢｇｉ０２４４６プロ配列の３４位での部位飽和突然変異誘発
アミノ酸３４位でのＢｇｉ０２４４６プロペプチド（配列番号７）の部位飽和突然変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ＱＣ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示にしたがって使用して実施した。Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号２）、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６プロ配列（配列番号３）およびＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６成熟遺伝子（配列番号４）を含むＤＮＡカセットをｐＪＨ１０１ベクター（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１５１３−１５１５、１９８３）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位内にクローニングしてｐＪＨ−Ｂｇｉ０２４４６プラスミドを生成した（図７）。
【０２９６】
相補的オーバーラッププライマーは、ＮＮＳコドンに隣接している約１８塩基を備える３４位を突然変異させるための設計され、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡから注文された。３４位のアミノ酸を突然変異させるために使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーのポリヌクレオチド配列は、表１５に示した。
【０２９７】
【表１６】
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【０２９８】
ｐＪＨ−Ｂｇｉ０２４４６  ＤＮＡは、下記のようにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ＱＣ）突然変異誘発反応における鋳型として使用された。２μＬのｐＪＨ−Ｐ９ミニプレップＤＮＡ（５０ｎｇ）を３９μＬの無菌蒸留Ｈ２Ｏ、１μＬのＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ、５μｌの１０×ＰＦＵバッファー、１μＬのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、５μＬのフォワードプライマー（５μＭ）および５μｌのリバースプライマー（５μＭ）に計５０μＬとなるように加えた。ＤＮＡ増幅反応（ＰＣＲ）は、次のサイクル条件：９５℃で１分間を１回、次に９５℃で１分間、５５℃で１分間および６８℃で１２分間のサイクルを１９〜２０サイクルで実施した。５μＬのＰＣＲ反応は、１．２％のＥ−ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して電気泳動法によって分析した。
【０２９９】
引き続いて、１μＬのＤｐｎｌを使用して３７℃で２時間にわたり、変異増幅ＤＮＡを２回消化した。陰性コントロールは、類似の条件下で、しかしプライマーの非存在下で生成した。１μＬの各ＤｐｎＩ消化反応生成物を使用して、１回分の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５０μＬを製造業者のプロトコルにしたがって形質転換させた。形質転換細胞は、３７℃で１時間にわたり振とうしながらＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）内で増殖させ、次に５０ｐｐｍのカルベニシリンを含有するＬｕｒｉａ寒天（ＬＡ）プレート上に線条接種し、３７℃で一晩増殖させた。一晩のインキュベーション後、個別コロニーを取り上げ、５０ｐｐｍのカルベニシリンを含有する１５０μＬのＬＢを接種するために使用し、９６ウエルＭＴＰ内で３７℃で一晩増殖させた。ＤＮＡ突然変異を確証するために、ＤＮＡ配列分析を実施した。
【０３００】
突然変異プロ配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養のアリコートを使用して、５ｍｌのＬＢ＋５０ｐｐｍのカルベニシリンを接種した。Ｑｉａｇｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを準備し、各プラスミドＤＮＡの一部分を使用してＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞を形質転換させた。１０μＬのプラスミドＤＮＡ（ｐＪＨ−Ｂｇｉ０２４４６）を使用して１００μｌの好適なＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コンピテント細胞を形質転換させた。野生型Ｂｇｉ０２４４６プロ配列（配列番号３）を含む構築物を含有するｐＪＨ−Ｂｇｉ０２４４６コントロールプラスミドもまた、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の同一の好適な菌株に形質転換させた。形質転換細胞は、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間にわたりインキュベートした。形質転換混合物由来の細胞は、クロラムフェニコール選択下で１．６％の脱脂乳を含有する寒天プレート上でプレーティングした。単一コロニーを選択してクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａブロス内で増殖させた。プロテアーゼサンプル生成のためには、細胞をバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養培地（主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを含み、堅固な細胞増殖のために１％のＳｏｙｔｏｎｅが補給されたＭＯＰ緩衝剤をベースとする濃縮半合成培地）上で増殖させた。浄化培養上清を実施例１において上述したようにＡＡＰＦアッセイを使用してプロテアーゼ活性についてアッセイした。
【０３０１】
実施例１２
Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）プロペプチドの３４位での突然変異がＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）ＢＳＰ−００８０１変異サブチリシンの発現に及ぼす作用
実施例１において上述したように、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２２４６プロペプチドＳＥＬおよびＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）変異ＢＳＰ−００８０１成熟サブチリシンの発現に由来する培養上清のアリコートをＡＡＰＦ活性についてアッセイした。活性（成熟）ＢＳＰ−００８０１サブチリシンの相対発現は、参照物質としての野生型Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）プロペプチドを使用して、各発現プラスミドについて計算した。表１６は、野生型配列に比較して発現の増加を示している、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２２４６プロペプチド（配列番号７）の３４位での突然変異についての結果を列挙している。
【０３０２】
【表１７】
2018518185.tif 000026
【０３０３】
実施例１３
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）サブチリシンプロペプチド領域間の配列比較
本試験において評価したバチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）およびバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）のサブチリシンプロペプチド配列を比較した。図８は、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）Ｂｇｉ０２４４６プロペプチド＋Ｂｇｉ０２４４６の成熟領域のＮ末端の４個のアミノ酸（配列番号５９、配列番号７の８４残基を含む）とＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００プロペプチド＋Ｐ２９６００の成熟領域のＮ末端の４個のアミノ酸（配列番号６０、配列番号８の８７残基を含む）のアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを示している。これら２つのプロペプチド領域は、このプロ領域のアミノ酸レベルで４０％未満の配列同一性を共有し、中心領域ならびにプロセシングが発生する接合部における有意な相違を含んでいる（図８）。図９に提示したように、Ｂ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）（配列番号３）とＢ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）（配列番号５）サブチリシンのプロペプチド領域をコードする核酸配列の配列アラインメントは、同一性率が５３．７％であることを示している。
【０３０４】
Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）およびＢ．ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）の両方を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー由来のサブチリシンプロペプチド配列のより大規模なコレクションは、図１０に示した。成熟領域の同一性率が７５％を超えるサブチリシンに対応するこの群のプロペプチドポリペプチド全体に、有意な相違点が観察される。しかし下記に規定した表１７から明らかなように、これらのサブチリシンプロペプチド領域は、３５％〜１００％の配列同一性を共有している。
【０３０５】
Ｂ．レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）に程度の差はあるが関連する少数の代表的な種由来のプロペプチド配列を図１０においてアラインメントした（配列番号７、８、４２、４３、４８、４９、５０、５１、５４および５６を含む）。これらの配列の一部は、Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，Ｉｎｃ．が発行したＰＣＴ国際公開第２０１５／０８９４４７号パンフレットおよびどちらも２０１４年１０月２７日に出願された米国特許出願公開第６２／０６９，１８８号明細書および同第６２／０６９，１８４号明細書において最初に報告された。
【０３０６】
図１０の配列アラインメントおよびその他の方法を使用して、図１１に示したＢ．ギブソニイ・クレード（ｇｉｂｓｏｎｉｉ−ｃｌａｄｅ）セリンプロテアーゼの成熟配列を発現させるために使用できる非相同もしくは変異プロペプチド配列のためにモチーフ配列を生成し、そのモチーフ配列は配列番号４４に規定した。図１１における「Ｘ’ｓ」の定義は次のとおりである：各「Ｘ」は任意のアミノ酸であってよく、１位、２２〜５１位および９１位の「Ｘ’ｓ」は個別もしくは集合的に非存在であってよく、２２〜５１位には少なくとも約２３個のアミノ酸が存在する必要がある。所定の位置では、スラッシュ（／）は、列挙したアミノ酸のいずれかが存在することを示している。
【０３０７】
【表１８】
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【図１】
2018518185.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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