(57)【要約】  融合タンパク質を開示する。本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリンＧのＦｃフラグメント及び生物活性分子を有し、該Ｆｃは単鎖Ｆｃである。Ｆｃのヒンジにおけるアミノ酸は、Ｆｃのヒンジがジスルフィド結合を形成することができないように、変異、置換、又は欠失される。本発明の融合タンパク質の製造方法および使用方法も提供される。
2018518533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ分子のＦｃフラグメント及び生物活性分子を有する融合タンパク質であって、前記Ｆｃフラグメントが単鎖Ｆｃ（ｓＦｃ）である、上記融合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｆｃフラグメントは、ヒンジ領域を有する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ヒンジ領域は、変異され、ジスルフィド結合を形成しない請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ヒンジ領域は、配列番号１〜６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ヒンジ領域は、配列番号２３又は配列番号２７のアミノ酸配列を有する請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記生物活性分子は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、又はその機能的部分である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記生物活性分子は、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、ＩＦＮα、ＧＣＳＦ、及びΙＦΝβである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記生物活性分子は、変異ヒンジ領域を介して前記Ｆｃフラグメントに連結されている請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６６、６８、７０、７２、及び７４からなる群から選択される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載の融合タンパク質および医薬上許容可能な担体又は賦形剤を有する医薬組成物。
【請求項１１】
融合タンパク質を製造する方法であって、
ａ）生物活性分子およびヒンジ領域を含むＦｃフラグメントを用意する工程、
ｂ）アミノ酸置換および／または欠失により前記ヒンジ領域を変異させ、変異Ｆｃを形成する工程、及び
ｃ）前記生物活性分子および前記変異Ｆｃを結合させる工程
を有する、上記方法。
【請求項１２】
前記ヒンジ領域は、システイン残基の置換及び／又は欠失により変異される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物活性分子は、ヒンジ領域を介して変異Ｆｃと結合される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物活性分子は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、又はその機能的部分である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物活性分子は、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、ＩＦＮα、ＧＣＳＦ、及びΙＦΝβである請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願番号62/175,186（出願日：2015年6月12日）の利益を主張する米国出願番号15/002,396（出願日：2016年1月20日）の継続出願である米国出願番号15/177,605（出願日：2016年6月9日）の利益および優先権を主張する国際ＰＣＴ出願である（これら全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００２】
本発明は、免疫グロブリンＧのＦｃフラグメント及び生物活性分子を有する治療用融合タンパク質であって、該Ｆｃフラグメントが単鎖である治療用融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリンは、４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重鎖および２本の軽鎖を有し、これらが鎖間ジスルフィド結合を介して結合したものである。各軽鎖は、２つのドメイン、すなわち軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有し、各重鎖は、２つの領域、すなわち重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を有する。重鎖定常領域（ＣＨ）は番号で指定される複数の重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３など）から構成される（例えば、US 6,086,875 (Blumberg R. S. et al.)、US 5,624,821 (Winter G. P. et al.)およびUS 5,116,964 (Capon D. J. and Lasky L. A.)を参照されたい）。免疫グロブリンは、その生物学的特性、すなわち生物における存在位置（location in an organism）や、異なる抗原（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に対処する能力に基づいて異なるアイソタイプに分類される。免疫グロブリンのアイソタイプに依存して、重鎖定常領域（ＣＨ）は３つまたは４つのＣＨドメインを有することができる。また、いくつかのアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ）では、重鎖は分子に柔軟性を付与するヒンジ領域を含む（Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.）。
【０００４】
ヒトには４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３及び４）があり、これらの血清中における量の順で命名されている（ＩｇＧ１が最も量が多い）。ＩｇＧアイソタイプは、２本の軽鎖および２本の重鎖からなり、各重鎖は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む。ＩｇＧの２本の重鎖は、互いに、かつ、各軽鎖とジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）によって連結されている。ＩｇＧの抗原結合部位は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含む、抗原結合断片領域（Ｆａｂ領域）に位置している。ＩｇＧの結晶化可能断片領域（Ｆｃ領域）は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖の一部であり、特定の細胞の表面に見られるＦｃ受容体（例えば、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））に結合する。また、ＩｇＧの重鎖は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に、Ｆｃ領域からＦａｂ領域を分離し、かつ、ジスルフィド結合を介した２本の重鎖の連結に関与する、ヒンジ領域（ヒンジ）を有する。ヒンジ領域の構造は、４つのＩｇＧサブクラスそれぞれの固有な生物学的特性に寄与する。
【０００５】
ＩｇＧは、自身を組織へ容易に灌流させ得る小サイズのモノマーとして分泌される。ヒト胎盤の通過を容易にし、子宮内で胎児を保護する受容体（新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））を有するのはこのアイソタイプのみである。胎盤を通過して吸収されたＩｇＧは、新生児自身の免疫系が発達する前に新生児に体液性免疫を付与する。
【０００６】
ＩｇＧの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合部位はこの抗体のＦｃ領域に位置している。ＦｃＲｎは、通常、ヒト胎盤および上皮細胞で発現され、ＩｇＧの分解を防止するエンドサイトーシスサルベージ経路に関与している。このサルベージ経路は、酸性ｐＨにおけるＩｇＧのｐＨ高度依存的なＦｃＲｎに対する結合親和性によって媒介される。酸性ｐＨにおけるＩｇＧのＦｃＲｎに対する高い親和性は、酸性エンドソームへ取り込まれた後の内在化されたＩｇＧのＦｃＲｎへの結合をもたらすと考えられる（Goebl NA, et al, 2008; Junghans RP, et al, 1996）。ほとんどの可溶性タンパク質は、内在化された後、リソソームに輸送されるが、内在化されＦｃＲｎに結合したＩｇＧは細胞膜に戻り、既定の分解経路から効果的に救出される。細胞外空間の中性ｐＨに曝されると、ＩｇＧはＦｃＲｎから解離し、再び循環に付される。このように、血清中半減期が延びるというＩｇＧの特性はＦｃフラグメントに保持されている。
【０００７】
上記のサルベージ経路は、非修飾タンパク質医薬品に比べて血液循環における半減期が延長された次世代タンパク質医薬品を開発するための一つのメカニズムを提供する。とりわけ、非修飾タンパク質医薬品は循環半減期が短く、必要とされる延長された治療期間に亘って頻繁に投与される。タンパク質医薬品の半減期を延長するためにＰＥＧ化融合タンパク質技術（U.S. Food and Drug Administration; Osborn BL, et al, 2002）など多くの手段による広範な取り組みがなされているが、これらの取り組みの成果は未だ理想的なものではない。
【０００８】
目的タンパク質またはそのフラグメントを連結したＩｇＧ定常領域を有する融合タンパク質の作製について説明する。例えば、目的タンパク質「Ｘ」をＩｇＧの「Ｆｃ」ドメインと連結させて「Ｆｃ−Ｘ」または「Ｘ−Ｆｃ」融合タンパク質（免疫融合）を作製する。免疫融合タンパク質は、概して、他のタイプの融合タンパク質に比べて多量に調製および精製することができる。これは、融合タンパク質のＦｃ部分が細胞によって効率的に分泌されるよう設計されているためである。免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質は、当該融合タンパク質においてＦｃ領域を含まないものと比べて、タンパク質の安定性の向上および血清半減期の延長（Capon et al. 1989, Nature 337:525を参照）、並びに新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体に結合する能力（例えば、US 6,086,875 (Blumberg R. S. et al.)、US 6,485,726 (Blumberg R. S. et al.)、US 6,030,613、WO 03/077834 (Blumberg R. S. et al.)、及びUS 2003-0235536A1 (Blumberg R. S. et al.を参照）などの、改善された特性を有することが示されている。以下の特許文献は更なる例を説明する。
【０００９】
US 5,116,964 (Capon D. J. and Lasky L. A.)には、リンパ球細胞表面糖タンパク質（ＬＨＲ）および免疫グロブリン鎖を有するリガンド結合パートナータンパク質であって、当該リガンド結合パートナータンパク質および免疫グロブリンがＮ末端アミノ基またはＣ末端カルボキシル基のいずれかを介して融合されてなるものが開示されている。
【００１０】
WO 94/04689 (Pastan I. H. et al.)には、リガンド結合ドメイン（ＣＤ４受容体）およびシュードモナス外毒素Ａを含み、延長された半減期を有する毒素を提供するための、免疫グロブリンのＦｃの使用が開示されている。ＩｇＧのＦｃはＣＤ４受容体およびシュードモナス外毒素Ａと連結する。
【００１１】
US 6,797,493 (Sun L-H. et al.)には、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）、約２０個以下のアミノ酸からなる適応性のあるペプチドリンカー（Ｌ）、およびヒトＩｇＧのＦｃ改変体を有するｈＧ−ＣＳＦ−Ｌ−ｖＦｃ融合タンパク質が開示されている。Ｆｃ改変体は非溶解性の性質を有し、最小限の望ましくないＦｃ仲介性の副作用を示す。
【００１２】
US 8,557,232 (Gillies S. D. et al.)には、可溶性および生物学的活性を有するＦｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質およびその改変体（Ｆｃ−ＩＦＮ−βｓｏｌ）を発現するための方法および組成物が開示されている。Ｆｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域のカルボキシ末端に連結したＩＦＮ−βタンパク質を含む。
【００１３】
上記文献には、互いに近接する２つの生物活性分子を有する、２本鎖Ｆｃ融合タンパク質デザインを有する融合タンパク質が記載されている。これら従来の融合タンパク質の生物活性分子は、標的分子または細胞との相互作用が一般的に抑制され又は立体的に妨げられている。したがって、生物活性分子の生物活性を妨げることなく、生物活性分子のインビボでの半減期を増やすことができる、ＩｇＧの改変されたＦｃ領域に連結された生物活性分子を有する融合タンパク質を開発する必要がある。このような改変された融合タンパク質は、関連するアフィニティー精製法による精製を容易にするための付加的な利点を提供するであろう。
【００１４】
参考文献；
１．Blumberg R. S. et al., “Receptor specific transepithelialus transport of therapeutics” US Patent Nos. 6,030,613 (2000), 6,086,875 (2000), and 6,485,726 (2002).
２．Blumberg R. S. et al., “Central airway administration for systemic delivery of therapeutics” WO 03/077834 (2002) and US Patent Application 2003-0235536A1 (2003)．
３．Capon D. J., et al., “Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy” Nature 337:525 (1989).
４．Capon D. J. and Lasky L. A., “Hybrid immunoglobulins” US Patent 5,116,964 (1992).
５．Gillies S. D. et al., “Stabilization of Fc-interferon-beta fusion proteins” US Patent 8,557,232 (2013).
６．Goebl N.A., et al, “Neonatal Fc Receptor Mediates Internalization of Fc in Transfected Human Endothelial Cells” Mol. Biol. Cell, 19(12): 5490-5505 (2008).
７．Janeway et al., Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y (2001).
８．Junghans R.P., et al., “The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor” Proc Natl Acad Sci USA.93(11): 5512-5516 (1996).
９．Ober R. J. et al, Exocytosis of IgG as mediated by the receptor, FcRn: an analysis at the single-molecule level. Proc Natl Acad Sci USA.101(30):11076-81 (2004).
１０．Ober R. J. et al., Visualizing the site and dynamics of IgG salvage by the MHC class I-related receptor, FcRn. J Immunol. 172(4):2021-9 (2004).
１１．Osborn B. L. et al., “Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys.” J Pharmacol Exp Ther.303(2):540-8 (2002).
１２．Pastan I.H., et al, “Recombinant toxin with increased half-life” WO 94/04689 (1993).
１３．Peters R. T. et al., Prolonged activity of factor IX as a monomeric Fc fusion protein. Blood. 115(10):2057-64 (2010).
１４．Sun L-H. et al., “Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities” US Patent 6,797,493 (2004).
１５．Winter G. P. et al., “Antibodies with altered effector functions” US Patent 5,624,821 (1997).
１６．Vaccaro C, et al., Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol.23(10):1283-8 (2005).
【発明の概要】
【００１５】
本開示は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の一部を有する新規な融合タンパク質、その組成物、並びに開示された融合タンパク質の作製方法および使用方法に関する。開示された融合タンパク質は、生物において、生物活性分子の血清中半減期を延長するために有用である。
【００１６】
本開示の一つの面は、融合タンパク質、並びにそのハイブリッド、コンジュゲートおよび組成物に関する。本開示の融合タンパク質は、一般に、（ａ）生物活性分子および（ｂ）Ｉｇ分子に由来する重鎖定常領域（ＣＨ）の一部（Ｉｇフラグメント）を有する。Ｉｇフラグメントは、一つ又はそれ以上の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、Ｆｃ領域、および／またはこれらの組み合わせなどの重鎖定常領域の任意の部分を含むことができる。当該技術分野で開示されているように、融合タンパク質の（ａ）生物活性分子および（Ｂ）Ｉｇフラグメントのアミノ酸配列は、各フラグメントの野生型配列に由来する。由来する配列としては、野生型配列だけでなく、ホモログ、アナログ、フラグメント、および野生型配列の他の改変体が挙げられる。
【００１７】
特定の態様において、融合タンパク質のＩｇフラグメントは、単鎖Ｆｃ（ｓＦｃ又はｓｃＦｃ）、ダイマーを形成することのないモノマーを有する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリンのヒンジ領域に対応する配列を有する。種々の態様において、ヒンジ領域は、融合タンパク質が別の融合タンパク質または別の免疫グロブリン分子とジスルフィド結合を形成するのを妨げる改変を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、変異および／または１つ又はそれ以上のシステインアミノ酸を欠失させ、ジスルフィド結合の形成を阻害することにより改変される。いくつかの態様において、生物活性分子はヒンジ領域を介してｓｃＦｃに連結される。特定の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に、変異ヒンジ領域を介してｓｃＦｃに連結される生物活性分子を有する。ある態様において、本発明は融合タンパク質および医薬上許容可能な担体または賦形剤を有する医薬組成物などの組成物に関する。
【００１８】
本発明の別の面は、融合タンパク質およびその組成物の作製方法および使用方法に関する。いくつかの態様において、融合タンパク質を作製する方法は、（ｉ）生物活性分子、Ｆｃフラグメント、およびヒンジ領域を用意する工程、（ｉｉ）ヒンジ領域を改変し、それによりジスルフィド結合の形成を阻害する工程、及び（ｉｉｉ）ヒンジ領域を介して生物活性分子をＦｃフラグメントに連結させて、融合タンパク質、そのハイブリッド、コンジュゲート、もしくは組成物を形成する工程、を有する。本開示はまた、（ｉ）融合タンパク質を用意する工程、及び（ｉｉ）プロテインＡまたはプロテインＧ系クロマトグラフィーメディアにより融合タンパク質を精製する工程、を有する、融合タンパク質の精製方法を提供する。
【００１９】
本発明を、添付の図面を参照しつつ以下の態様において詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、本開示の種々の態様による単鎖融合タンパク質デザインを示す。図１Ａは、Ｎ末端にヒンジ領域と共有結合で連結した生物学的に活性な分子及びヒトＩｇＧのＦｃフラグメント（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を有する融合タンパク質を示す。図１Ｂは、Ｎ末端にリンカーを介してヒンジ領域と共有結合で連結した生物学的に活性な分子及びヒトＩｇＧのＦｃフラグメント（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を有する融合タンパク質を示す。図１Ｃは、Ｃ末端にヒンジ領域と共有結合で連結した生物学的に活性な分子及びヒトＩｇＧのＦｃフラグメント（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を有する融合タンパク質を示す。図１Ｄは、Ｃ末端にリンカーを介してヒンジ領域と共有結合で連結した生物学的に活性な分子及びヒトＩｇＧのＦｃフラグメント（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を有する融合タンパク質を示す。
【図２】図２は、ｐＺＤ／ＥＰＯ−ｓＦｃプラスミドのマップを示す。ｐＺＤ／ＥＰＯ−ｓＦｃプラスミドは、本発明の態様によるＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。
【図３】図３は、ｐＺＤ／ＦＩＸ−ｓＦｃプラスミドのマップを示す。ｐＺＤ／ＦＩＸ−ｓＦｃプラスミドは、本発明の態様による第ＩＸ因子−ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。
【図４】図４は、本明細書に開示される方法によって製造されるエリスロポエチン単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＥＰＯ−ｓＦｃ）のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。レーンＭは分子量マーカーである（マーカーは２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、および２５０ｋＤａのサイズの組換えタンパク質を含む）。レーン１は細胞培養培地中のＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質である。レーン２はプロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＨｉＴｒａｐカラム）により精製したＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の溶出液である。レーン３はＤＥＡＥカラムにより精製したＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の溶出液である。ＥＰＯ−ｓＦｃ（レーン１〜３）の分子量は、グリコシル化の含有量が高く、５０〜７０ｋＤａである。
【図５】図５は、本明細書に開示される方法によって製造される第ＩＸ因子単鎖Ｆｃ融合タンパク質（第ＩＸ因子−ｓＦｃ）のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。レーンＭは分子量マーカーである（マーカーは５０、７５、１００、および１５０ｋＤａのサイズの組換えタンパク質を含む）。レーン１はオリジナルの組換えヒト第ＩＸ因子（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））である。レーン２はプロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＨｉＴｒａｐカラム）により精製した第ＩＸ因子−ｓＦｃ融合タンパク質の溶出液である。第ＩＸ因子−ｓＦｃ（レーン２）のＭＷは、グリコシル化の含有量の高い１００〜１１０ｋＤａである。
【図６】図６は、ラットにおける、エリスロポエチン単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＥＰＯ−ｓＦｃ）（黒丸）、およびオリジナルの組換えヒトＥＰＯ（ＥＰＲＥＸ（登録商標））（白丸）の単回用量皮下（Ｓ．Ｃ．）投与の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すグラフである。ＥＰＯ−ｓＦｃのＳ．Ｃ．投与の単回用量が１６．８μｇ／ｋｇのとき、ＥＰＯ−ｓＦｃの半減期は約２２時間であり、ＥＰＲＥＸ（登録商標）よりも３倍長い。
【図７】図７は、ラットにおける、第ＩＸ因子単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＦＩＸ−ｓＦｃ）（四角）、およびオリジナルの組換えヒトヒト第ＩＸ因子（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））（三角形）の単回用量静脈内（Ｉ.Ｖ.）投与の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すグラフである。Ｉ.Ｖ.投与したＦＩＸ−ｓＦｃの半減期は約５６時間であり、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（Ｔ１／２＝１１．９１時間）よりも５倍長い。
【図８】図８は、ｐＺＤ／ＩＦＮα−ｓＦｃのプラスミドマップを示す。ｐＺＤ／ＩＦＮα−ｓＦｃプラスミドは、本発明の態様によるＩＦＮα−ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。
【図９】図９は、本明細書に開示される方法によって製造されたインターフェロンα単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−ｓＦｃ）のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。レーンＭは分子量マーカーである（マーカーは２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、および２５０ｋＤａのサイズの組換えタンパク質を含む）。レーン１および２はそれぞれ０．２〜０．４Ｍスクロースを含むＩＦＮα−ｓＦｃ融合タンパク質の溶出液である。レーン３および４はそれぞれ１．０〜２．０Ｍ尿素を含むＩＦＮα−ｓＦｃ融合タンパク質の溶出液である。
【図１０】図１０は、ラットにおける、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）（丸）、インターフェロンα単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−ｓＦｃ）（長方形）、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）（三角形）、およびＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）（逆三角形）の単回用量皮下（Ｓ．Ｃ．）投与の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すグラフである。ＩＦＮα−ｓＦｃの半減期は約５０．２時間であり、他のインターフェロン製品よりも長い。
【図１１】図１１は、ラットにおける、インターフェロンα単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−ｓＦｃ）（丸）、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）（三角形）、およびインターフェロンαＦｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−Ｆｃ）（逆三角形）の抗ウイルス活性を示すグラフである。ＩＦＮα−ｓＦｃの抗ウイルス活性（ＩＣ５０）は約０．００６１ｎＭであり、ＩＦＮα−ＦＣ（ＩＣ５０＝０．０３１３ｎＭ）およびＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）（ＩＣ５０＝０．０８９４）よりも遥かに良好である。
【図１２ａ】図１２ａは、インターフェロンα受容体１（ＩＦＮＡＲ１）とＩＦＮα−ｓＦｃとの関連プロファイル（図１２ａ）を示す。
【図１２ｂ】図１２ｂは、ＩＦＮＡＲ１とＩＦＮα−Ｆｃとの関連プロファイル（図１２ｂ）を示す。
【図１３】図１３は、ｐＺＤ−ＧＣＳＦ−ｓＦｃのプラスミドマップを示す。ｐＺＤ／ＧＣＳＦ−ｓＦｃプラスミドは、本発明の態様によるＩＦＮａ８−ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。
【図１４】図１４は、本明細書に開示される方法によって製造されるＧＣＳＦ単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）のクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。レーンＭは分子量マーカーである（マーカーは２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、および２５０ｋＤａのサイズの組換えタンパク質を含む）。レーン１はＧＣＳＦ−ｓＦｃの溶出液である。
【図１５】図１５は、ラットにおける、ＧＣＳＦ単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）（丸）、レノグラスチム（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））（三角）、およびペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））（長方形）の単回用量皮下（Ｓ．Ｃ．）投与の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すグラフである。ＧＣＳＦ−ｓＦｃの半減期は約１７．１６時間であり、レノグラスチム（４．１時間）、およびペグフィルグラスチム（１２．０時間）の半減期よりも長い。
【図１６】図１６は、レノグラスチムの単回用量（Ｂ１群およびＢ２群）または４回用量（Ｂ３群）皮下（Ｓ．Ｃ．）投与、およびＧＣＳＦ単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）（Ｃ１群およびＣ２群）の単回用量皮下（Ｓ．Ｃ．）投与の生物活性を示すグラフである。ＧＣＳＦ−ｓＦｃはマウスにおいてレノグラスチムより高い活性を有し、好中球の分化と増殖を促進する。
【図１７】図１７は、ｐＺＤ−ＩＦＮβ−ｓＦｃのプラスミドマップである。ｐＺＤ−ＩＦＮβ−ｓＦｃプラスミドは、本発明の態様によるＩＦＮβ−ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。
【図１８】図１８は、ラットにおける、インターフェロンβ単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮβ−ｓＦｃ）（長方形）およびＲｅｂｉｆ（登録商標）（ひし形）の単回用量皮下（Ｓ．Ｃ．）投与の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すグラフである。ＩＦＮβ−ｓＦｃの半減期は約３１．８９〜３７．７時間であり、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）の半減期（１８．９２〜２３．５７時間）よりも長い。
【図１９】図１９は、ＩＦＮβ−ｓＦｃ融合タンパク質およびＲｅｂｉｆ（登録商標）によるオステオポンチン（ＯＰＮ）の阻害を示すグラフである。ＩＦＮβ−ｓＦｃ融合タンパク質は、１．５ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬでそれぞれ７３．４±０．８％および７９．５±３．６％という著しい阻害効果を示した。ＩＦＮβ−ｓＦｃの生物学的活性はＲｅｂｉｆ（登録商標）と同等であった。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本開示は、生物活性分子および免疫グロブリン分子の部分を有する新規な融合タンパク質に関する。本開示の種々の面は、融合タンパク質、その組成物、および開示された融合タンパク質の作製方法および使用方法に関する。開示された融合タンパク質は、生物において、生物活性分子の血清半減期を延長するために有用である。
【００２２】
以下は本発明の実施に際し当業者を助力するために提供される詳細な説明である。当業者は、本明細書に明示的に記載された態様の改良や変形が、本明細書に含まれる情報の思想または範囲から逸脱するものではなく、本開示に包含されることを理解する。本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。以下、セクションの見出しは構成上の目的のためだけに使用するものであり、開示された主題を限定するものとして解釈されるべきものではない。
【００２３】
本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、図面、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に完全に記載又は引用されるように組み込まれる。
【００２４】
１．融合タンパク質
本明細書において、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、自然界で通常見られない形で互いに連結された少なくとも２つのタンパク質またはペプチドを有するハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。
【００２５】
本開示の一つの面は、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃフラグメントおよび生物活性分子を有する融合タンパク質に関する。開示された融合タンパク質に組み込まれた生物活性分子は、非融合の、又は、従来技術に開示された融合タンパク質（例えば、２本鎖Ｆｃ領域を含む融合タンパク質）に組み込まれた、同一の生物活性分子に比べて改善された生物学的特性を有する。例えば、開示された融合タンパク質に組み込まれた生物活性分子は、非融合の生物活性分子に比べて長い血清中半減期を有する。また、開示された融合タンパク質は、生物活性分子の機能を何ら低下させることなく完全な生物活性を維持する。これは、２本鎖Ｆｃ領域に由来する立体障害により活性が低下する従来技術の融合タンパク質に対する改善である。
【００２６】
本開示の融合タンパク質は、非融合の生物活性分子および先行技術に記載の融合タンパク質に組み込まれた生物活性分子に比べて、生物活性分子に著しい生物学的利点を提供する。
【００２７】
開示された融合タンパク質は、下記式のいずれか（図１Ａ〜１Ｄにも示す）を有することができる。
（Ｂ）−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）          （式１）（図１Ａ）
（ＣＨ３−ＣＨ２）−（ヒンジ）−（Ｂ）                    （式２）（図１Ｂ）
（Ｂ）−（Ｌ）ｍ−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）；または    （式３）（図１Ｃ）
（ＣＨ３−ＣＨ２）−（ヒンジ）−（Ｌ）ｍ−（Ｂ）           （式４）（図１Ｄ）。
式中、「Ｂ」は、生物活性分子であり、
「ヒンジ」は、ＩｇＧ分子のヒンジ領域であり、
「ＣＨ２−ＣＨ３」は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２およびＣＨ３定常領域ドメインであり、
「Ｌ」は、任意のリンカーであり、
「Ｍ」は、任意の整数または０であってもよい。
融合タンパク質の種々の部分／フラグメントについて以下にさらに述べる。
【００２８】
ａ．Ｆｃ領域とＦｃフラグメント
本開示の融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子由来のＦｃフラグメントを含む。
【００２９】
以下で使用されるように、「Ｆｃ領域」は、重鎖定常領域のＣ末端に位置する免疫グロブリンの一部分を言う。Ｆｃ領域は、免疫系の活性化を助けるために細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）および補体系の他のタンパク質と相互作用する、免疫グロブリンの一部分である。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は２つの重鎖ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含む。ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２〜ＣＨ４ドメイン）を含む。Ｆｃ部分の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むものと定義され、その番号付けはＥＵインデックスに従う。
【００３０】
特定の態様において、融合タンパク質は、循環に繰り返しリサイクルされ得るＦｃＲｎ結合フラグメントであるＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。このドメインを有する融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの融合タンパク質の半減期の増加を示す。
【００３１】
本明細書において、「Ｆｃフラグメント」とは、任意のアイソタイプ由来の免疫グロブリン分子のＦｃ領域に相当する融合タンパク質の一部分を言う。いくつかの態様において、ＦｃフラグメントはＩｇＧのＦｃ領域を有する。特定の態様において、ＦｃフラグメントはＩｇＧ１のＦｃ領域の全長領域を有する。いくつかの態様において、当技術分野で特徴づけられ又は説明されているように、Ｆｃフラグメントとは免疫グロブリン分子の全長Ｆｃ領域を言う。他の態様において、Ｆｃフラグメントは、全長Ｆｃ領域の一部分またはフラグメント、例えば、重鎖ドメインの一部（例えば、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインなど）および／またはＦｃ領域に通常見られるヒンジ領域を含む。例えば、Ｆｃフラグメントは、ＣＨ２ドメインの全部又は一部、および／または、ＣＨ３ドメインの全部又は一部を有することができる。いくつかの態様において、Ｆｃフラグメントは、全長Ｆｃ領域またはその一部分の機能的アナログを含む。
【００３２】
本明細書において、「機能的アナログ」とは、オリジナル配列と実質的に同一の機能的特性（結合識別性、結合親和性など）を保持するアミノ酸配列または核酸配列の改変体を言う。機能的アナログの例には、オリジナル配列と類似しているが、アミノ酸の位置における保存的置換；総電荷の変化；別の部分への共有結合；または僅かな付加、挿入、欠失もしくは保存的置換；および／またはこれらの任意の組み合わせを含む配列が挙げられる。Ｆｃフラグメントの機能的アナログは当技術分野で公知の任意の方法によって合成的に作製することができる。例えば、機能的アナログは、部位特異的変異によるアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって既知のアミノ酸配列を改変することによって作製することができる。いくつかの態様において、機能的アナログは、所定の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する。２つの配列間の同一性の割合は、２つの配列がアラインメントアルゴリズムに従った最良のアラインメント状態にある場合に、ＣｌｕｓｔａｌＸなど標準的なアラインメントアルゴリズムによって決定される。
【００３３】
免疫グロブリン分子は、任意の動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモット）から得るか又は導くことができる。また、免疫グロブリンのＦｃフラグメントは、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）、またはアイソタイプの範囲内のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）から得るか又は導くことができる。いくつかの態様において、ＦｃフラグメントはＩｇＧから得るか又は導くことができ、特定の態様において、Ｆｃフラグメントはヒト化ＩｇＧなどのヒトＩｇＧから得るか又は導くことができる。
【００３４】
Ｆｃフラグメントは当技術分野で公知の任意の方法によって得るか又は作製することができる。例えば、Ｆｃフラグメントは動物から単離および精製し、組換え的に発現させ、または合成的に作製することができる。いくつかの態様において、Ｆｃフラグメントは核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の中にコード化され、細胞、生殖細胞、ｃＤＮＡライブラリー、またはファージライブラリーから単離される。
【００３５】
Ｆｃ領域および／またはＦｃフラグメントは、いくつかの免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ）に見られるヒンジ領域を含むことができる。特定の態様において、Ｆｃフラグメントは、Ｃｙｓを含まないように、且つ、ジスルフィド結合を形成できないように、ヒンジ領域を変異させることによって改変される。ヒンジ領域についてはさらに後述する。
【００３６】
開示された融合タンパク質のＦｃフラグメントは、好ましくは、単鎖Ｆｃである。本明細書において、「単鎖Ｆｃ」（または、「ｓＦｃ」）とは、Ｆｃフラグメントがダイマーを形成しないような方法で（例えば、アミノ酸の化学的修飾ｆまたは変異、付加、欠失、もしくは置換によって）改変されていることを意味する。
【００３７】
特定の態様において、融合タンパク質のＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１に由来し、野生型ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列またはその改変体を含むことができる。いくつかの態様において、融合タンパク質のＦｃフラグメントは、ネイティブヒトＩｇＧ１分子のアミノ酸位置２９７でＮ−グリコシル化部位として機能するアミノ酸Ａｓｎ（Ｆｃフラグメント（配列番号６１）の残基６７に対応する）を含む（USP7,501,494に説明されている、ＩｇＧ１の欧州ナンバリングシステムに基づく）。他の態様において、ＦｃフラグメントにおけるＮグリコシル化部位は、Ａｓｎ（Ｎ）残基を、Ｈｉｓ（Ｈ）（配列番号６２）またはＡｌａ（Ａ）（配列番号６３）に変異させることによって除去される。Ｎ−グリコシル化部位に可変位置を含むＦｃフラグメントを配列番号６４として配列表に示す。
【００３８】
いくつかの態様において、ＦｃフラグメントのＣＨ３−ＣＨ２ドメインは、野生型配列に対応するアミノ酸配列（配列番号６１に開示される）を有する。特定の態様において、ＦｃフラグメントのＣＨ３−ＣＨ２ドメインは配列番号６２のアミノ酸配列を有し、Ｎ−グリコシル化部位はＡｓｎ（Ｎ）残基をＨｉｓ（Ｈ）に変異させることによって除去されている。特定の態様において、ＦｃフラグメントのＣＨ３−ＣＨ２ドメインは配列番号６３のアミノ酸配列を有し、Ｎ−グリコシル化部位はＡｓｎ（Ｎ）残基をＡｌａで（Ａ）に変異させることによって除去されている。
【００３９】
ｂ．ヒンジ領域
本開示の融合タンパク質は、いくつかの免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ）に見られるヒンジ領域を含むことができる。ヒンジ領域は、Ｆａｂ領域からＦｃ領域を分離し、分子に柔軟性を付与し、ジスルフィド結合を介して２本の重鎖を連結させることができる。インタクトなＦｃ領域によって提供される機能には２つのＣＨ２−ＣＨ３ドメインを有するダイマーの形成が必要とされる。野生型ヒンジ領域におけるシステイン間の鎖間ジスルフィド結合は二本鎖のＦｃ分子が互いにホールディングするのを助け、機能的ユニットを生じさせる。
【００４０】
特定の態様において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１に由来する。ヒンジ領域は全長または改変された（トランケーションされた）ヒンジ領域であってもよい。
【００４１】
特定の態様において、ヒンジ領域は、融合タンパク質が別の融合タンパク質または免疫グロブリン分子とジスルフィド結合を形成するのを妨げる改変を含む。特定の態様において、ヒンジ領域は、１つ又はそれ以上のシステインアミノ酸を変異および／または欠失させることにより改変され、その結果ジスルフィド結合の形成が阻害される。全長ヒンジ領域のＮ末端またはＣ末端を欠失させて、トランケーションされたヒンジ領域を形成してもよい。ジスルフィド結合の形成を回避するために、ヒンジ領域中のシステイン（Ｃｙｓ）を、非システインアミノ酸で置換または欠失させることができる。特定の態様において、ヒンジ領域のＣｙｓを、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＶａｌで置換してもよい。ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４由来の野生型および変異型ヒンジ領域の例として、表１に示すアミノ酸配列（配列番号１〜２２）が挙げられる。変異配列を含む２つのヒンジ領域の間にジスルフィド結合が形成されることはない。ＩｇＧ１ヒンジ領域を改変し、表２に示す配列（配列番号２３〜６０）を有する種々の変異ヒンジ領域に適合させた。
【００４２】
ｃ．リンカー
融合タンパク質は、ＦｃフラグメントのＮ末端に連結された生物活性分子を有していてもよい。また、融合タンパク質は、ＦｃフラグメントのＣ末端に連結された生物活性分子を有していてもよい。連結は、共有結合、好ましくはペプチド結合である。
【００４３】
本発明において、１つ又はそれ以上の生物活性分子はＦｃフラグメントのＣ末端またはＮ末端に直接連結されていてもよい。好ましくは、生物活性分子（単数または複数）はＦｃフラグメントのヒンジに直接連結させることができる。
【００４４】
さらに、融合タンパク質は、場合により、少なくとも１つのリンカーを有してもよい。つまり、生物活性分子がＦｃフラグメントに直接連結されていなくてもよい。リンカーは生物活性分子とＦｃフラグメントとの間に介在していてもよい。リンカーはＦｃフラグメントのＮ−末端またはＦｃフラグメントのＣ末端に連結することができる。
【００４５】
一つの態様において、リンカーはアミノ酸を含む。リンカーは１〜５個のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００４６】
ｄ．生物活性分子
本明細書において、「生物学的に活性な分子」という用語は、タンパク質、糖タンパク質、およびこれらの組合せを言う。生物学的に活性な物質の例として、抗血管新生因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、これらの受容体、およびこれらのフラグメントが挙げられる
【００４７】
生物学的に活性なサイトカインの例として、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８）；マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ΜΙΡ１α、ΜΙΡ１β）；マクロファージコロニー刺激因子；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、リンホカイン阻害因子；血小板由来成長因子；幹細胞因子；腫瘍成長因子β；リンホトキシン；Ｆａｓ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；白血病抑制因子；オンコスタチン−Ｍ；毛様体神経栄養因子；プロラクチン；ＣＤ４０−リガンド；ＣＤ２７−リガンド；およびＣＤ３０−リガンド；顆粒球および／またはマクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１）などのコロニー刺激因子および成長因子；および血小板由来成長因子、表皮成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子および線維芽細胞成長因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。生物学的に活性なサイトカインはまた、これらの受容体および／またはフラグメントを含む。生物学的に活性なサイトカインはまた、例えば、既に記載のサイトカインを含む（USP6,086,875および6,485,726を参照）。
【００４８】
成長因子、タンパク質ホルモン、およびＦｃＲｎ結合パートナーを介して送達されてもよいこれらの受容体の例として、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンジオゲニン、肝細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、神経成長因子、腫瘍成長因子α、トロンボポエチン、甲状腺刺激因子、甲状腺放出ホルモン、ニューロトロフィン、上皮成長因子、ＶＥＧＦ、毛様体神経栄養因子、ＬＤＬ、ソマトメジン、インスリン成長因子、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩが挙げられるが、これらに限定されるものではない。生物学的に活性な成長因子はまた、例えば、既に記載の成長因子を含む（USP6,086,875および6,485,726を参照）。
【００４９】
特定の態様において、本発明によって考慮される生物学的に活性な分子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）を含む。
【００５０】
ある態様において、生物学的に活性な分子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。分子量約３４，０００ダルトンの酸性糖タンパク質であるエリスロポエチンは、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。エリスロポエチンは血液循環において赤血球レベルを制御する際に不可欠である。天然に存在するエリスロポエチンは、胎生期に肝臓により、および成体の腎臓により産生され、血液中を循環し、骨髄における赤血球の産生を刺激する。欧州薬局方のエリスロポエチン濃縮溶液を参照されたい。特定の態様において、ＥＰＯタンパク質は配列番号６５のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
別の態様において、生物学的に活性な分子は第ＩＸ因子（ＦＩＸ）である。分子量約７０，０００ダルトンの球状タンパク質であるＦＩＸは、血液凝固に関与するビタミンＫ依存性タンパク質である。ＦＩＸはチモーゲンの形態で合成され、血液中に分泌される前に、３種類の翻訳後修飾を受ける。男性では、肝臓がＦＩＸ合成の部位である。このタンパク質は血液凝固サイクルに関与し、血友病Ｂ患者の治療のために使用される。現在、ＦＩＸの唯一の市販供給源はヒト血漿である。欧州薬局方のヒト凝固第ＩＸ因子を参照されたい。特定の態様において、ＦＩＸタンパク質は配列番号６７のアミノ酸配列を有する。
【００５２】
他の態様において、生物学的に活性な分子はインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）である。インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウイルス作用、免疫調節作用および抗増殖作用を有する糖タンパク質（１９〜２０ＫＤａ）であり、その構造的相同性およびそれが結合する特定の受容体により３つのクラス（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）に分けられる。Ｉ型ＩＦＮファミリーは、多数のＩＦＮアルファ改変体、単一ＩＦＮベータメンバー、並びにあまり知られていないＩＦＮイプシロン、カッパ、オメガおよびデルタを含む。しかし、すべてのＩ型ＩＦＮはＩＦＮアルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）にのみ結合する。ＩＦＮアルファは異なる刺激に応答して白血球によって産生され、これに対し、ＩＦＮベータは白血球を除くほとんどの細胞種によって産生される。ＩＦＮベータはＩＦＮアルファと３０％のアミノ酸相同性を有するが、ＩＦＮアルファと比較した場合、より高いＩＦＮＡＲとの結合親和性を有する。ＩＦＮアルファおよびベータは種々のヒト癌およびウイルス起源の疾患の治療に使用される。特定の態様において、ＩＦＮαタンパク質は、配列番号６９のアミノ酸配列を有するＩＦＮａ８である。特定の態様において、ＩＦＮβタンパク質は配列番号７３のアミノ酸配列を有する。
【００５３】
別の態様において、生物学的に活性な分子は顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）である。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、１７４または１７７アミノ酸の単一ポリペプチド鎖を有する２０ＫＤａの糖タンパク質である。短いフォームは、長いアイソフォームに比べより大きな活性および安定性を有し、商用医薬ＧＣＳＦ製品の基礎である。ＧＣＳＦは好中球減少症前駆細胞の増殖および顆粒球への分化を刺激し、成熟した好中球を活性化させる。ＧＣＳＦは化学療法誘発性好中球減少症の治療に非常に頻繁に使用されている。特定の態様において、ＧＣＳＦタンパク質は配列番号７１のアミノ酸配列を有する。
【００５４】
２．組成物
特定の態様において、本発明は、融合タンパク質及び医薬上許容可能な担体または賦形剤を有する医薬組成物などの組成物に関する。
【００５５】
医薬組成物は、融合タンパク質と任意の医薬上許容可能な担体とを混合することによって調製することができる。医薬上許容可能な担体として、溶媒、分散媒、等張剤等が挙げられる。担体の例として、水、生理食塩水もしくは他のバッファー（例えば、リン酸塩、クエン酸塩バッファー）、油、アルコール、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン）、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、もしくはデキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物）、ゲル、脂質、リポソーム、安定剤、防腐剤、アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの対イオンを形成する塩、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５６】
医薬組成物は１つ以上の活性化合物を含むことができる。例えば、製剤は１つ又はそれ以上の融合タンパク質および／または１つ又はそれ以上の付加的な有益化合物（単数または複数）を含むことができる。活性成分は、任意の簡便および実用的な方法で、例えば、混合物、溶液、懸濁液、乳化、カプセル化、吸収等により、担体と組み合わせることができ、また、粉末（例えば、凍結乾燥粉末）や、注射、点滴などに適した懸濁液のように製剤化することができる。徐放性調製物を調製することもできる。
【００５７】
特定の態様において、医薬組成物はヒトに使用するための融合タンパク質を含む。医薬組成物は、クエン酸塩、リン酸塩、トリス、ビス−トリス等の非限定的な適切なバッファー中、適切なｐＨで調製することができ、また、糖（５０ｍＭ〜５００ｍＭのスクロース、トレハロース、マンニトール、またはこれらの混合物）、界面活性剤（例えば、０．０２５％〜０．５％のＴｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０）、および／または他の試薬などの賦形剤を含むことができる。製剤は様々な量の融合タンパク質を含むように調製することができる。一般に、被検体へ投与するための製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬで含む。特定の態様において、製剤は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質を含むことができる。特定の態様において、製剤は約１．０ｍｇ／ｍＬ、約５．０ｍｇ／ｍＬ、約１０．０ｍｇ／ｍＬ、または約２５．０ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質を含む。
【００５８】
３．方法
本発明の別の面は、融合タンパク質およびその組成物の作製方法および使用方法に関する。
【００５９】
ａ．融合タンパク質の製造
いくつかの態様において、融合タンパク質を作製するための方法は、（ｉ）生物活性分子およびヒンジ領域を有するＦｃフラグメントを用意する工程、（ｉｉ）ヒンジ領域を改変し、それがジスルフィド結合を形成しないようにする工程、および（ｉｉｉ）変異ヒンジ領域を介して、生物活性分子をｓｃＦｃに直接的または間接的に連結させ、融合タンパク質、またはそのハイブリッド、コンジュゲートもしくは組成物を形成する工程、を有する。本開示はまた、（Ｉ）融合タンパク質を用意する工程、および（ｉｉ）プロテインＡまたはプロテインＧ系クロマトグラフィーメディアにより融合タンパク質を精製する工程を有する、融合タンパク質の精製方法を提供する。
【００６０】
融合タンパク質はまた、周知の分子生物学技術によって発現させてもよい。分子クローニング技術に関する任意の標準的マニュアルは、組換えＤＮＡおよびＲＮＡの発現による本発明の融合タンパク質を製造するための詳細なプロトコルを提供する。本発明の融合タンパク質を発現する遺伝子を構築するために、好ましくは遺伝子が発現される生物のために最適化されたコドンを用いて、アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳する。次に、一般に、融合タンパク質および必要な調節エレメントをコードするオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを合成することによって、ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を作製する。合成遺伝子をアセンブルし、所望の発現ベクターに挿入する。本発明に包含される合成核酸配列として、本発明の融合タンパク質をコードする配列、およびコードする分子の生物学的活性を変えない非コード配列における変化を特徴とする核酸構築物が挙げられる。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、組換え体を得ることを特徴とする。融合タンパク質は選択された発現系および宿主に適した条件下で発現される。融合タンパク質はプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティーカラム（例えば、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）、ＡｃｒｏＳｅｐ（登録商標）、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（登録商標）、またはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））により精製される。
【００６１】
本発明の融合タンパク質は、哺乳類細胞、下等真核生物または原核生物において製造することができる。哺乳類細胞の例として、サルＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。
【００６２】
本発明はまた、ＩｇＧのＦｃのヒンジ領域におけるＣｙｓの変異、置換または欠失を有する、免疫グロブリンＧの単鎖Ｆｃ（ｓＦｃ）領域を製造する方法を提供する。一つの態様において、ＣｙｓはＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔで置換されている。別の態様において、Ｃｙｓは欠失されている。さらなる態様において、ヒンジのフラグメントは欠失されている。
【００６３】
本発明はさらに、（ａ）生物活性分子およびヒンジ領域を有するＩｇＧのＦｃフラグメントを用意する工程、（ｂ）アミノ酸置換および／または欠失によりヒンジ領域を変異させ、ジスルフィド結合を形成しない変異Ｆｃを形成する工程、および（ｃ）生物活性分子と変異Ｆｃを組み合わせる工程、を有する融合タンパク質の製造方法を提供する。
【００６４】
ｂ．融合タンパク質の使用
本発明の融合タンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、または任意の粘膜表面を介して、例えば、経口的に、舌下で、頬側に、経鼻的に、直腸に、経膣的に、または肺経路を介して、投与することができる。
【００６５】
本発明の融合タンパク質の投与量は、被検体および個別の投与形態に依存して変わる。必要な投与量は、融合タンパク質、被検体の種、被検体の大きさなどこれらに限定されない当業者に知られている多くの要因によって変わる。投与量は０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ体重で変動してもよい。融合タンパク質は、２４時間の期間を通じて単回、複数回、または持続注入で、投与することができる。融合タンパク質は持続的に又は特定のスケジュールで投与することができる。有効用量は動物モデルから得られる用量応答曲線から推定することができる。
【００６６】
４．特定の態様
本発明の特定の態様として下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない：
（１）ＩｇＧ分子のＦｃフラグメントおよび生物活性分子を有する融合タンパク質であって、Ｆｃフラグメントが単鎖Ｆｃ（ｓＦｃ）である、融合タンパク質。
（２）Ｆｃフラグメントがヒンジ領域を有する（１）に記載の融合タンパク質。
（３）ヒンジ領域が変異され、ジスルフィド結合を形成しない（２）に記載の融合タンパク質。
（４）ヒンジ領域が配列番号１〜６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する（２）に記載の融合タンパク質。
（５）ヒンジ領域が配列番号２３又は配列番号２７のアミノ酸配列を有する（２）に記載の融合タンパク質。
（６）生物活性分子がサイトカイン、成長因子、ホルモン、又はその機能的部分である（１）に記載の融合タンパク質。
（７）生物活性分子がエリスロポエチン、第ＩＸ因子、ＩＦＮα、ＧＣＳＦ、及びΙＦΝβである（１）に記載の融合タンパク質。
（８）生物活性分子が変異ヒンジ領域を介してＦｃフラグメントに連結されている（１）に記載の融合タンパク質。
（９）融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６６、６８、７０、７２、及び７４からなる群から選択される（１）に記載の融合タンパク質。
（１０）  （１）〜（９）のいずれか一つに記載の融合タンパク質および医薬上許容可能な担体又は賦形剤を有する医薬組成物。
（１１）融合タンパク質を製造する方法であって、
ａ）生物活性分子およびヒンジ領域を有するＦｃフラグメントを用意する工程、
ｂ）アミノ酸置換および／または欠失によりヒンジ領域を変異させ、変異Ｆｃを形成する工程、及び
ｃ）生物活性分子および変異Ｆｃを結合させる工程
を有する上記方法。
（１２）ヒンジ領域がシステイン残基の置換及び／又は欠失により変異される（１１）に記載の方法。
（１３）生物活性分子がヒンジ領域を介して変異Ｆｃと結合される（１１）に記載の方法。
（１４）生物活性分子がサイトカイン、成長因子、ホルモン、又はその機能的部分である（１１）に記載の方法。
（１５）生物活性分子がエリスロポエチン、第ＩＸ因子、ＩＦＮα、ＧＣＳＦ、及びΙＦΝβである（１１）に記載の方法。
【００６７】
本発明のさらなる具体的な態様として以下の実施例が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例１
エリスロポエチン単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＥＰＯ−ｓＦｃ）
１．融合タンパク質
この例では、上記式１の構造を有する融合タンパク質を調製した。
（Ｂ）−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）
式中、生物活性分子（Ｂ）は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）タンパク質（配列番号６５）であり；
ヒンジ領域（ヒンジ）は、変異ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２７）であり；
（ＣＨ２−ＣＨ３）は、ＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３（配列番号６２）である。
【００６９】
ＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を配列番号６６として配列表に示す。
【００７０】
２．発現ベクター
ＥＰＯ−ｓＦｃはＤＮＡ発現ベクターを用いて製造した。エリスロポエチン単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＥＰＯ−ｓＦｃ）のＤＮＡフラグメントを、アセンブリポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法により、オーバーラップしたプライマーを使用してアセンブルした。次いで、アセンブルしたＥＰＯ−ｓＦｃフラグメントをｐＺＤベクター（ｄｈｆｒ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１Ｎｅｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、カタログｎｏ．Ｖ７９０−２０）のＰａｃＩおよびＥｃｏＲＶサイトに連結し、図２に示すｐＺＤ／ＥＰＯ−ｓＦｃを得た後、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。発現ベクター構築物は選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を含んでいた。
【００７１】
実施例２
ＥＰＯ−ｓＦｃを産生する安定な組換え細胞株の確立
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞をトリプシン処理し、３×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＰ−Ｔバッファー（Ｃｙｔｏ  ｐｌｕｓｅ  カタログ  ＣＰ−Ｔ）に再懸濁した。エレクトロポレーション（ＰＡ４０００  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、１０μｇのプラスミドｐＺＤ／ＥＰＯ−ｓＦｃを０．２ｍＬの細胞懸濁液（６×ｌ０５細胞）にトランスフェクトした。非選択培地において４８時間増殖させた後、トランスフェクタントをＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  カタログ１４８６４０６）および５ｎＭのＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ社  カタログＢＣＬ５７０７Ｖ）を含む選択完全培地でインキュベートし、高収率クローンｚＥ９３を得た。培養培地中の分泌融合タンパク質の発現をＱ−ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）Ｅｐｏ  ＥＬＩＳＡキット）により検出し、定量した。
【００７２】
オリジナルｚＥ９３細胞を、１０％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＩＭＤＭ含有１０ｃｍディッシュで培養した。細胞を、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２に加湿したインキュベーター（モデル３３２６、Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で維持した。無血清培地中で細胞を順応させるため、培地をＩＭＤＭから５％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＪＲＨ無血清培地に変更した。細胞が安定したら、トリプシン処理により１０ｃｍディッシュから細胞を剥離し、その後同じ割合のＦＢＳで補充したＪＲＨ無血清培地５０ｍＬを含むスピナーフラスコに移した。３〜５日で９０％コンフルエントに達したら、細胞を低い割合のＦＢＳで補充したＪＲＨ無血清培地を含むスピナーフラスコで継代培養した。スピナーフラスコ中のＦＢＳの割合を１０％から０％まで段階的に減少させることで、細胞をより低い血清状態に順応させた。
【００７３】
血清サンプル中のＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の濃度をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）Ｅｐｏ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＮ：ＤＥＰ００）によって定量した。血清の希釈倍率を最適化し、融合タンパク質を使用して正式なアッセイを行う前に、標準、コントロール、および検体用のプレートレイアウトを決定した。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。
【００７４】
選択、限定的希釈、および段階的なＭＴＸ投与（challenge）により高収率クローンを上手く得て、最終的に単鎖Ｆｃに連結した組換えＥＰＯ（つまり、ＥＰＯ−ｓＦｃ）を有する融合タンパク質を製造した。得られた融合タンパク質を、更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的活性アッセイおよび薬物動態研究のために精製した。
【００７５】
実施例３
ＥＰＯ−ｓＦｃのクロマトグラフィー精製
プロテインＡ系樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標））およびＤＥＡＥ樹脂（ＤＥＡＥ  ＦＦ（ファストフロー）アニオン交換カラム）の双方を使用して、ＥＰＯ−ｓＦｃを精製した。精製後、対応する回収率を定量的ＥＬＩＳＡにより、各純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。ＥＰＯ−ｓＦｃの精製方法を以下に詳述する。
【００７６】
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）精製
高収率ＥＰＯ−ｓＦｃ産生細胞株由来の培養培地を、１ｍＬの樹脂に対し約４．８ｍｇの充填比率で、プロテインＡ系ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ社；カタログ番号：１１−００３４−９３）に添加した。２回の洗浄工程の後、融合タンパク質をｐＨ３．０の溶出バッファーで溶出させ、その後、溶出液をｐＨ８．８に中和した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット）で分析し、量および回収率を測定した。回収率は６５．８％であり、これはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムによりデザインされたＥＰＯ−ｓＦｃの効率的な結合および精製を示す（表３）。
【００７７】
２．ＤＥＡＥ  ＦＦ精製
ＤＥＡＥ  ＦＦ  １ｍＬ  ＨｉＴｒａｐカラムに充填する前、バッファーをＤＥＡＥ  ＦＦ平衡バッファーに交換した。その後、実施例２に記載の、高収率細胞株から調製されたＥＰＯ−ｓＦｃ含有細胞培地を、１ｍＬの樹脂に対し約５．９２ｍｇの充填比率で、ＤＥＡＥ  ＦＦ  １ｍＬ  ＨｉＴｒａｐカラムに充填した。酸性洗浄工程の後、メインピークを１３０ｍＭのＮａＣｌを含む４０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ８．０）により溶出した。その後、ＤＥＡＥ  ＦＦ溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット）により分析した。全体の回収率は１５．４８％であった（表３）。
【００７８】
３．結果
表３は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）およびＤＥＡＥ  ＦＦそれぞれで精製したＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質に関する情報を示す。この表は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）により単一の精製工程で効率的に高純度ＥＰＯ−ｓＦｃが得られることを示している。
【００７９】
図４は、上述の方法を用いて製造したＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる主要バンドを有していたことを示す（レーン１、２および３）。ＥＰＯ−ｓＦｃの分子量（ＭＷ）は、グリコシル化の含有量が高く、５０〜７０ＫＤａであり、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色法によって写し取られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに示された。
【００８０】
シアル酸はＥＰＯ−ｓＦｃにとって体内循環におけるその半減期に影響を与える重要な要素の一つであった。ＥＰＯ−ｓＦｃの分子量は、グリコシル化の含有量が高く、５０〜７０ＫＤａであった。表３によれば、ＥＰＯ−ｓＦｃは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）およびＤＥＡＥ  ＦＦをそれぞれ含む異なるクロマトグラフィーによって精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）により、単一の精製工程で効率的に高純度ＥＰＯ−ｓＦｃが得られた。ＤＥＡＥ  ＦＦアニオン交換樹脂は、精製におけるさらなる洗練性を提供し、ＥＰＯ−ｓＦｃの半減期に影響を与える可能性のある、ＥＰＯ−ｓＦｃの低シアル酸アイソフォームを取り除くであろう。
【００８１】
実施例４
ＥＰＯ−ｓＦｃの薬物動態試験
１０匹のラット（体重２７６〜３００ｇのラット）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ株式会社から購入した。全てのラットを検疫し、薬物動態（ＰＫ）試験の開始前に４日間順応させた。ＰＫ試験のために、ラットを３つの試験群：（１）ＤＥＡＥにより精製したＥＰＯ−ｓＦｃ；（２）プロテインＡにより精製したＥＰＯ−ｓＦｃ；および（３）オリジナル組換えヒトＥＰＯ（ＥＰＲＥＸ（登録商標））に分けた。（１）群および（２）群のラットに１６．８μｇ／ｋｇで投薬し、（３）群のラットに３．５μｇ／ｋｇで投薬した。タンパク質は皮下（Ｓ．Ｃ．）投与により投薬した。ラットをグループ化し、毛皮用染料で標識した。対照タンパク質（ＥＰＲＥＸ（登録商標）、３．５μｇ／ｍＬ）並びに試験融合タンパク質ＥＰＯ−ｓＦｃ（ＤＥＡＥ樹脂）およびＥＰＯ−ｓＦｃ−（プロテインＡ樹脂）（１６．８μｇ／ｍＬ）の双方を、注射用に、生理食塩水中の新たなサンプル希釈剤（０．２５％ウシ血清アルブミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＣＮ：Ａ０８５０、０２５０））を用いて調製した。すべての注射液を背側頚部のサイトを介してＳ．Ｃ．経路でラットに投与した。
【００８２】
血液サンプルを、注射後０．５時間、１時間、２時間、５時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、および１４４時間で回収し、次いで、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を−７０℃で保存した。
【００８３】
血清サンプル中のＥＰＯ濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＮ：ＤＥＰ００）により定量した。アッセイを行う前、血清希釈倍率を最適化し、プレートを、標準、コントロール、および検体用にレイアウトした。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。血清中のＥＰＯ濃度から、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ値、および消失相半減期（Ｔ１／２）を、ＰＫソリューションズ２．０（商標）ソフトウェアにより計測した。
【００８４】
ラットにおいて、単回用量で投与した後のＤＥＡＥ  ＦＦおよびＥＰＲＥＸ（登録商標）から精製されたＥＰＯ−ｓＦｃの皮下（Ｓ．Ｃ．）薬物動態プロファイルを図６に示し、平均薬物動態特性を表５に示す。ＥＰＯ−ｓＦｃ−ＤＥＡＥの半減期は２２．３±０．３８（時間）であった。これに対し、ＥＰＲＥＸ（登録商標）の半減期はわずか６．１８２±０．６７５（時間）であった。ＥＰＯ−ｓＦｃ（ＤＥＡＥ）およびＥＰＲＥＸ（登録商標）のＡＵＣはそれぞれ、３２７．４±１５．１３（ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ）および１６１．５±２３．６４（ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ）であった。ＥＰＯ−ｓＦｃ（ＤＥＡＥ）およびＥＰＲＥＸ（登録商標）のＴｍａｘはそれぞれ、１８±０．００（時間）および９．３３±２．３１（時間）であった。
【００８５】
ＥＰＯ−ｓＦｃの半減期は、オリジナルＥＰＯ（ＥＰＲＥＸ（登録商標））製品と比較した場合、最大で３倍延長されることが示された。従って、本発明のＥＰＯ−ｓＦｃは、慢性腎臓病（ＣＫＤ）または癌の患者に注射回数を減らすために使用することが可能であり、患者の生活の質を向上させる。
【００８６】
実施例５
ＥＰＯ−ｓＦｃの生物学的活性アッセイ
８匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）を、ＥＰＯの生物学的活性を決定するために２つのグループに分けた。１つのグループには対照薬（ＥＰＲＥＸ、登録商標）を投与し、他のグループには本開示のＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質（ＥＰＯ−ｓＦｃ）を投与した。対照薬（ＥＰＲＥＸ（登録商標）、Johnson and Johnson社）を購入し、３３６μｇ／ｍＬ（４０ＩＵ／ｍＬに等しい）の濃度で新たに調製した。実施例３に従って製造されたＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質を、０．３３６ｎｇ／ｍＬ（ＥＰＲＥＸ（登録商標）４０ＩＵ／ｍＬと等モル）の濃度で新たに調製した。各マウスに、１日目にＥＰＲＥＸ（登録商標）またはＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質を０．５ｍｌ皮下投与し、次いで、４〜９日目、１１日目、および１３日目に血液採取を行った。
【００８７】
網状赤血球の数はエリスロポエチンの生物学的活性の望ましい指標である。それは、最新の産生量を表し、網状赤血球の数およびエリスロポエチンの効力を決定することが可能となるからである。網状赤血球の数はＦＡＣＳにより決定した。ＰＢＳ  １．０ｍＬおよび全血５．０μＬを未染色サンプル用ポリスチレンチューブに加えた。チアゾールオレンジ（ＢＤ  Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）、ＣＮ：３４９２０４）１．０ｍＬおよび全血５．０μＬを染色サンプル用ポリスチレンチューブに加えた。双方のチューブを３０分間、室温で、暗所にてインキュベートし、次いで、インキュベーション後３．５時間以内に分析した。分析の直前に、サンプルを穏やかに混合した。網状赤血球はフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標））により測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ（商標）ソフトウェアにより分析した。各サンプルの網状赤血球の割合を計測し、ＰＫソリューションズ２．０ソフトウェア（Ｓｕｍｍｉｔ、Ｍｏｎｔｒｏｓｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）により有効性曲線下面積（ＡＵＣ）および網状赤血球の最大割合（ＲＥＴｍａｘ）を評価した。
【００８８】
網状赤血球数を用いて、ＡＵＥＣおよびＲＥＴｍａｘを測定することにより、対照薬およびＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の活性を比較した（表７）。ＥＰＲＥＸ（登録商標）およびＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の０〜１３時間のＡＵＥＣは、それぞれ８８．６９ｎｇ・ｈｒ／ｍｌおよび９１．０３ｎｇ・ｈｒ／ｍｌであった。また、ＥＰＲＥＸ（登録商標）およびＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質のＲＥＴｍａｘは、それぞれ１１．１２％および１０．４８％であった。ＡＵＥＣおよびＲＥＴｍａｘの結果から、この例ではＥＰＯ−ｓＦｃの生物学的活性がＥＰＲＥＸ（登録商標）と同等であったので、ＥＰＯ−ｓＦｃ融合タンパク質の単鎖Ｆｃ部分はＥＰＯ部分の機能をそれほど阻害しないことが示唆される。
【００８９】
実施例６
第ＩＸ因子単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＦＩＸ−ｓＦｃ）
１．融合タンパク質  
この例では、上記式１の構造を有する融合タンパク質を調製した。
（Ｂ）−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）
式中、生物活性分子（Ｂ）は、第ＩＸ因子タンパク質（ＦＩＸ）（配列番号６７）であり；
ヒンジ領域（ヒンジ）は、変異ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２３）であり；
（ＣＨ２−ＣＨ３）は、ＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３（配列番号６１）である。
【００９０】
ＦＩＸ−ｓＦｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を配列番号６８として配列表に示す。
【００９１】
２．発現ベクター
ＤＮＡ発現ベクターを用いてＦＩＸ−ｓＦｃを製造した。第ＩＸ因子のＤＮＡフラグメントを、アセンブリＰＣＲの方法によりオーバーラップしたプライマーを使用してアセンブルした。第ＩＸ因子単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＦＩＸ−ｓＦｃ）の全長遺伝子を反応混合物から増幅させ、ｐＺＤベクター（ｄｈｆｒ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１Ｎｅｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、カタログｎｏ．Ｖ７９０−２０）のＰａｃＩおよびＡｐａＩサイトに連結し、図３に示すｐＺＤ／ＦＩＸ−ｓＦｃを得た後、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。発現ベクター構築物は選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を含んでいた。
【００９２】
実施例７
ＦＩＸ−ｓＦｃを産生する安定な組換え細胞株の確立
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞をトリプシン処理し、３×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＰ−Ｔバッファー（Ｃｙｔｏ  ｐｌｕｓｅ  カタログ  ＣＰ−Ｔ）に再懸濁した。次いで、ｒｈＦＩＸ−ｓＦｃを発現させるためのエレクトロポレーション（ＰＡ４０００  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、プラスミドｐＺＤ／ＦＩＸ−ｓＦｃ  １５μｇを細胞懸濁液（６×ｌ０５細胞）０．２ｍＬにトランスフェクトした。非選択培地において４８時間増殖させた後、トランスフェクタントをＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清、ジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  カタログ１０１３１−０２７）および５ｎＭのＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ社  カタログｍ−８４０７）を含む選択完全培地でインキュベートし、高収率クローンＮ１８を得た。９６ウェルプレートで細胞がコンフルエントに達した後、ｒｈＦＩＸ−ｓＦｃのレベルをＱ−ＥＬＩＳＡにより評価し、高い発現率を有するクローンを６ウェルプレートに移した。これらのクローンを、１×１０５細胞／ウェルで継代培養し、７日間増殖させて、Ｑ−ＥＬＩＳＡによりＦＩＸ−ｓＦｃを含む培地の力価を測定した。
【００９３】
炭酸塩／重炭酸塩コーティングバッファー中、１：１０００（１μｇ／ｍＬ）の捕捉抗体（マウス第ＩＸ因子モノクローナル抗体、Ｂｉｏｐｏｒｔｏ、デンマーク、カタログ  ＨＹＢ１３３−０９）を調製した。希釈捕捉抗体１００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。検出抗体（ウサギ第ＩＸ因子ポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、（Ｕ．Ｋ．）、カタログ  Ａｂ２３３３５）をＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中、１：１０００で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＨＲＰコンジュゲート抗体（ペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−ウサギ抗体、ジャクソンイムノリサーチ、（ＵＳＡ）、カタログ１１１−０３５−１４４）及びＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、カタログ５３−００−０３）を使用し、色を出した。最後に、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを加えて反応を停止させた。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。ＦＩＸ−ｓＦｃの濃度を、式（Ｘ＝［ａ／（Ｙ−Ｙ０）−１］（１／ｂ）×Ｘ０）により決定し、Ｃの初期値、ＡＵＣ値および消失相半減期（Ｔ１／２）を、ＰＫソリューション２．０（商標）ソフトウェアを使用してＦＩＸ−ｓＦｃの濃度を用いて算出した。
【００９４】
オリジナルＮ１８クローンを、５％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．０１μΜ  ＭＴＸで補充したＩＭＤＭ含有１０ｃｍディッシュで培養した。細胞を、３７℃、９５％空気／８％ＣＯ２に加湿したインキュベーター（モデル３３２６、Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で維持した。無血清培地中で細胞を順応させるため、培地をＩＭＤＭから２％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．０２μΜ  ＭＴＸで補充したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地に変更した。細胞が安定したら、トリプシン処理により１０ｃｍディッシュから細胞を剥離し、その後同じ割合のＦＢＳで補充した５０ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地を含むスピナーフラスコに移した。３〜５日で細胞が９０％コンフルエントに達したら、細胞を低い割合のＦＢＳで補充したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地を含むスピナーフラスコで継代培養した。スピナー中のＦＢＳの割合を２％から０％まで段階的に減少させることで、細胞をより低い血清状態に順応させた。ｒｈＦＩＸ−ｓＦｃの生産性および活性をさらに高めるために、クローンに再びｐＺＤ／ＦＩＸ−ｓＦｃをトランスフェクトした。その後、高収率クローンであるＮ１８−ｒｅＺＢ由来細胞をＦＡＣＳによりソートし、その中で高収率細胞群を分離し、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地で増殖させた。クローンＮ１８−ｒｅＺＢ由来細胞を異なるＭＴＸ条件により試験し、高収率でｒｈＦＩＸ−ｓＦｃを産生する細胞を選択した。
【００９５】
選択工程の後、Ｑ−ＥＬＩＳＡ  ＭＴＸ投与により、高収率クローンの１つ、Ｎ１８−ｒｅＺＢ−ｓｐ４−ｓｐ５をさらに選択した。その後、ソーティングおよびＭＴＸ投与により、無血清クローンにｐＺＤ／ＦＩＸ−ｓＦｃを再びトランスフェクトし、高収率クローンにつながる機能選択に付した。このような方法でＮ１８−ｒｅＺＢ−ｓｐ４−ｓｐ５を得た。Ｎ１８−ｒｅＺＢ−ｓｐ４−ｓｐ５のバッチ培養における累積力価を、Ｑ−ＥＬＩＳＡにより測定し、約５３．４μｇ／ｍＬであった。
【００９６】
実施例８
ＦＩＸ−ｓＦｃのクロマトグラフィー精製
プロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標））およびＩＸ  Ｓｅｌｅｃｔ樹脂双方を使用して、ＦＩＸ−ｓＦｃを精製した。精製後、対応する回収率を定量的ＥＬＩＳＡにより、各純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。ＦＩＸ−ｓＦｃの精製方法を以下に詳述する。
【００９７】
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）精製
ＦＩＸ−ｓＦｃ産生細胞株培養培地を、１ｍＬの樹脂に対し約１．８４ｍｇの充填比率で、プロテインＡ系ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラムに添加した。２回の洗浄工程の後、融合タンパク質をｐＨ３．０のバッファーでカラムから溶出させた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡで分析し、量および回収率を測定した。ＦＩＸ−ｓＦｃはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）によって効率的に捕捉され、図５のレーン２に示すように、単一工程の精製で既に高度に精製された調製物を得た。
【００９８】
２．ＩＸ  Ｓｅｌｅｃｔ精製
ＩＸＳｅｌｅｃｔ親和性（ＧＥ；Ｎｏ．：１７−５５０５−０１）樹脂を１ｍＬのカラムに充填した。樹脂をＦＩＸに対し直接作用するモノクローナル抗体と連結させた。充填ｐＨの範囲は６．５〜８．０であった。バッファー交換せずに、ＦＩＸ−ｓＦｃ培地をＩＸＳｅｌｅｃｔカラムに充填した。充填比率は１ｍＬの樹脂に対し約１．６９ｍｇであった。未結合物質を除去するための洗浄工程の後、メインピークを２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．４）により溶出した。その後、ＩＸＳｅｌｅｃｔ溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡにより分析した。
【００９９】
３．結果
表４は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）およびＩＸ  Ｓｅｌｅｃｔ親和性樹脂それぞれで精製したＦＩＸ−ｓＦｃ融合タンパク質に関する情報を示す。この表は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）およびＩＸ  Ｓｅｌｅｃｔにより単一の精製工程で効率的に高純度ＦＩＸ−ｓＦｃが得られることを示す。
【０１００】
図５は、上述の方法を用いて製造したＦＩＸ−ｓＦｃ融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる主要バンドを有していたことを示す（レーン１および２）。第ＩＸ因子−ｓＦｃの分子量（ＭＷ）は、グリコシル化の含有量が高い、１００〜１１０ｋＤａであり、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色法によって写し取られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに示された。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）およびＩＸＳｅｌｅｃｔの回収率はそれぞれ８８．３４％および２０．０５％であった（表４）。プロテインＡ系ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラムクロマトグラフィーは、デザインされた融合タンパク質ＦＩＸ−ｓＦｃに由来するｓＦｃの予期せぬプロテインＡ／Ｇ結合性により、単一の工程で、図５に示すような高い収率および純度でＦＩＸ−ｓＦｃを効率的に精製した。
【０１０１】
実施例９
ＦＩＸ−ｓＦｃの薬物動態試験
８匹のＳＤラット（体重３１５〜３７５ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ株式会社から購入した。薬物動態（ＰＫ）試験のために、ラットを無作為に２つの群：（１）対照薬としての組換えＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））；および（２）本開示のＦＩＸ−ｓＦｃに分けた。（１）群および（２）群のラットに、０日目、尾静脈経由で、１ｍｇ／ｋｇで投薬した。試験スケジュールに従って、注射後０時間、０．２５時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間にラットを採血した。凝固剤を含まない血液サンプルを、３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して単離した血清とともに、少なくとも３０分間室温に置いた。血清サンプルを少量取り、−７０℃で保存し、その後分析した。
【０１０２】
炭酸塩／重炭酸塩コーティングバッファーを用いて、１：１０００（１μｇ／ｍＬ）に希釈した捕捉抗体（マウス第ＩＸ因子モノクローナル抗体、Ｂｉｏｐｏｒｔｏ、デンマーク、カタログＨＹＢ  １３３−０９）を調製した。バッファーカプセル（シグマ、カタログ番号Ｃ−３０４１）をｄｄＨ２Ｏ  １００ｍＬに溶解し、０．０５Ｍ  バッファー、ｐＨ９．６を得て、０．２μｍフィルターで濾過し、４℃で保存した。希釈捕捉抗体１００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキングバッファー（２．０％のＢＳＡ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．２）２００μｌを用いてプレートをブロッキングし、ＰＢＳ（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）２００μｌで３回洗浄した。１００μlのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）（１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、３．１２５ｎｇ／ｍＬ、および１．５６２５ｎｇ／ｍＬ）およびＦＩＸ−ｓＦｃ（対応する濃度）をそれぞれ、各ＥＬＩＳＡウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。検出抗体（ウサギ第ＩＸ因子ポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、（ＵＫ）、カタログ  Ａｂ２３３３５）をＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中、１：１０００で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート抗体（ペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−ウサギ抗体、ジャクソンイムノリサーチ、（ＵＳＡ）、カタログ１１１−０３５−１４４）およびＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、カタログ５３−００−０３）をプレートに添加し、色を出した。最後に、１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。希釈血清の波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍでの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。ＦＩＸ−ｓＦｃの濃度を、式（Ｘ＝［ａ／（Ｙ−Ｙ０）−１］（１／ｂ）×Ｘ０）により決定した。Ｃの初期値、ＡＵＣ値および消失相半減期（Ｔ１／２）を、ＰＫソリューション２．０（商標）ソフトウェアを使用してＦＩＸ−ｓＦｃの濃度を用いて算出した。
【０１０３】
ラットにおいて、単回用量で投与した後のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）から精製したＦＩＸ−ｓＦｃおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の静脈内（Ｉ．Ｖ．）薬物動態プロファイルを図７に示し、平均薬物動態特性を表６に示す。ＦＩＸ−ｓＦｃおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の半減期は、それぞれ５６．０±１３．１（時間）および１１．９１±２．５４（時間）であった。ＦＩＸ−ｓＦｃおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）のＡＵＣは、それぞれ１９０８０．３±２６０６．４（ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ）および４６５９４．４０±３６３４．０８（ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ）であった。ＦＩＸ−ｓＦｃおよびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の初期Ｃは、それぞれ４６６８．０±４４７．５（ｎｇ／ｍＬ）および１１７９０．９８±４８９８．８５（ｎｇ／ｍＬ）であった。
【０１０４】
Ｉ．Ｖ．投与したラットにおける本発明のＦＩＸ−ｓＦｃの半減期は約５６時間であり、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の半減期（１１．９１±２．５４時間）よりも５倍長かった。従って、ＦＩＸ−ｓＦｃは、血友病患者にとって注射回数を減らせる持効型の薬物であり、患者の生活の質を向上させる。薬物動態データにより、本発明のＦＩＸ−ｓＦｃは、Ｆｃ受容体に結合して、Ｃの初期濃度およびＡＵＣを低下させ得ること、また、ゆっくりと放出されて、血流中に戻り、半減期がより長くなり得ることが示される。
【０１０５】
実施例１０
ＦＩＸ−ｓＦｃの生物学的活性アッセイ
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）テストを使用して、ＦＩＸ−ｓＦｃの生物学的活性を測定した。簡潔には、対照薬（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）およびＦＩＸ−ｓＦｃを新たに調製し、第ＩＸ因子欠乏血漿（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で、１０、５、２．５μｇ／ｍｌの濃度（最終容量＝５００μＬ）に希釈した。次いで、サンプル（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはＦＩＸ−ｓＦｃ）を同容量のアクチン（登録商標）（Ｄａｄｅ社（登録商標））ＦＳＬ試薬（シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス・プロダクツ社）と混合し、３７℃で３分間インキュベートした。最後に、ＣａＣｌ２を加えて凝固反応を停止させ、血栓形成を観察した。凝固時間および比活性を記録し、平行線法（ＰＬＡ分析）により算出した。
【０１０６】
表８に示すように、凝固時間はＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはＦＩＸ−ｓＦｃの濃度に依存した。ＦＩＸ−ｓＦｃの平均ＡＰＴＴの結果は、２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌおよび１０．０μｇ／ｍｌの各濃度で、３０．１秒、２６．２秒および２５．５秒であった。表８に示すように、ＦＩＸ−ｓＦｃはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と比べて同様の相対的効能および比活性を有した。ＦＩＸ−ｓＦｃはＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と同等の生物学的活性を維持し、これにより、単鎖Ｆｃが融合タンパク質においてＦＩＸの機能を阻害しないことが示唆される。
【０１０７】
実施例１１
インターフェロンα単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−ｓＦｃ）
１．融合タンパク質
この例では、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）を有する融合タンパク質を調製し、続いて、後述する実施例で使用した。ＩＦＮαはＩＦＮα分子の大ファミリーの代表例である。
【０１０８】
具体的には、上記式１の構造を有するＩＦＮα単鎖融合タンパク質（ＩＦＮα−ｓＦｃ）を調製した。
（Ｂ）−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）
式中、生物活性分子（Ｂ）は、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）タンパク質（配列番号６９）であり；
ヒンジ領域（ヒンジ）は、変異ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２３）であり；
（ＣＨ２−ＣＨ３）は、ＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３（配列番号６２）である。
【０１０９】
ＩＦＮα−ｓＦｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を配列番号７０として配列表に示す。
【０１１０】
２．発現ベクター
ＩＦＮα−ｓＦｃはＤＮＡ発現ベクターを用いて製造した。ＩＦＮα−ｓＦｃのＤＮＡフラグメントを、アセンブリポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法により、オーバーラップしたプライマーを使用してアセンブルした。次いで、アセンブルしたＩＦＮα−ｓＦｃフラグメントをｐＺＤベクター（ｄｈｆｒ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１Ｎｅｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、カタログｎｏ．Ｖ７９０−２０）のＰａｃＩおよびＥｃｏＲＶサイトに連結し、図８に示すｐＺＤ／ＩＦＮα−ｓＦｃを得た後、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。発現ベクター構築物は選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を含んでいた。
【０１１１】
実施例１２
ＩＦＮα−ｓＦｃを産生する安定な組換え細胞株の確立
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞をトリプシン処理し、３×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＰ−Ｔバッファー（Ｃｙｔｏ  ｐｌｕｓｅ  カタログＣＰ−Ｔ）に再懸濁した。エレクトロポレーション（ＰＡ４０００  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、プラスミドｐＺＤ／ＩＦＮα−ｓＦｃ  １０μｇを細胞懸濁液（６×ｌ０５細胞）０．２ｍＬにトランスフェクトした。非選択培地において４８時間増殖させた後、トランスフェクタントを、ＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ１４８６４０６）および５ｎＭのＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ社  カタログＢＣＬ５７０７Ｖ）を含む選択完全培地でインキュベートし、高収率クローン２２−１２３−３２７−１１７−Ｒｅ１１７を得た。培養培地中の分泌融合タンパク質の発現をＱ−ＥＬＩＳＡによって検出し、定量した。
【０１１２】
オリジナル２２−１２３−３２７−１１７−Ｒｅ１１７細胞を、１０％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＩＭＤＭ含有１０ｃｍディッシュで培養した。細胞を、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２に加湿したインキュベーター（モデル３３２６、Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で維持した。無血清培地中で細胞を順応させるため、培地をＩＭＤＭから５％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＪＲＨ無血清培地に変更した。細胞が安定したら、トリプシン処理により１０ｃｍディッシュから細胞を剥離し、その後同じ割合のＦＢＳで補充した５０ｍＬのＪＲＨ無血清培地を含むスピナーフラスコに移した。３〜５日で細胞が９０％コンフルエントに達したら、細胞を低い割合のＦＢＳで補充したＪＲＨ無血清培地を含むスピナーフラスコで継代培養した。スピナーフラスコ中のＦＢＳの割合を１０％から０％まで段階的に減少させることで、細胞をより低い血清状態に順応させた。
【０１１３】
血清サンプル中のＩＦＮα−ｓＦｃ融合タンパク質の濃度を自社のＩＦＮα−ｓＦｃ  ＥＬＩＳＡキットにより定量した。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍでの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。選択、限定的希釈、および段階的なＭＴＸ投与により高収率クローンを上手く得て、最終的に単鎖Ｆｃに連結した組換えＩＦＮα８を含む融合タンパク質（つまり、ＩＦＮα−ｓＦｃ）を作製した。得られた融合タンパク質を、更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的活性アッセイおよび薬物動態試験のために精製した。
【０１１４】
実施例１３
ＩＦＮα−ｓＦｃのクロマトグラフィー精製
プロテインＡ系樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標））を使用して、ＩＦＮα−ｓＦｃを精製した。精製後、対応する回収率を定量的ＥＬＩＳＡにより、各純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。ＩＦＮα−ｓＦｃ融合タンパク質の精製方法を以下に詳述する。
【０１１５】
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）精製
高収率ＩＦＮα−ｓＦｃ産生細胞株由来の培養培地を、１ｍＬの樹脂に対し約４．６ｍｇの充填比率で、プロテインＡ系ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ社；カタログ番号：１１−００３４−９３）に添加した。２回の洗浄工程の後、０．１Ｍグリシン溶出バッファー（ｐＨ３．０）で融合タンパク質を溶出した。メインピークを溶出バッファーで溶出させる。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡにより分析し、量および回収率を決定した。
【０１１６】
２．結果
異なるバッファー条件を使用してＩＦＮα−ｓＦｃをＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）により精製した。その結果、０．１Ｍグリシン溶出バッファー（ｐＨ３．０）によりＩＦＮα−ｓＦｃを効率的に、さらなる物理化学的特性の測定にふさわしい高い純度で、精製可能であることがわかった。図９に示すように、精製したＩＦＮα−ｓＦｃサンプルの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図９では、評価した全てのバッファーにおいて精製したＩＦＮα−ｓＦｃが主要バンドとして示された。析出を防止するために、安定化添加剤（スクロースまたは尿素）を溶出バッファー中で使用した。バッファー中の添加剤として尿素を用いた場合、いくつか低分子量の不純物が生じた。スクロース添加剤を有するグリシン溶出バッファー中のＩＦＮα−ｓＦｃの純度は９５％を超えていることが分かった。
【０１１７】
実施例１４
ＩＦＮα−ｓＦｃの薬物動態試験
８匹のラット（体重２７６〜３００ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ株式会社から購入した。すべてのラットを検疫し、薬物動態（ＰＫ）試験の開始前に４日間順応させた。ＰＫ試験のために、ラットを４つの試験群：（１）Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）（ペグ化ＩＦＮα）、（２）本開示のＩＦＮα−ｓＦｃ、（３）Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）（ペグ化ＩＦＮα）、および（４）Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）（組換えＩＦＮα）に分けた。ラットに、３１０ｐｍｏｌ／ｋｇで、ここではＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）１８．６μｇ／ｋｇ、ＩＦＮα−ｓＦｃ  １３．９５μｇ／ｋｇ、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）９．７μｇ／ｋｇ、およびＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）５．８９μｇ／ｋｇに等価変換して投薬した。全ての試験薬は、新しいサンプル希釈剤、つまりリン酸緩衝生理食塩水中の０．２％ウシ血清アルブミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＣＮ：Ａ０８５０、０２５０）を用いて調製した。ラットをグループ化し、毛皮用染料で標識した。すべての注射液を背側頚部のサイトを介して皮下（Ｓ．Ｃ．）経路でラットに投与した。
【０１１８】
血液サンプルを、注射後０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１９２時間、２４０時間、２８８時間および３３６時間の後に回収し、次いで、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を−７０℃で保存した。追加の血液サンプルを採取し、注射後０．０８時間、０．２５時間、および８時間の時点でＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）を投与したラット用に保存した。
【０１１９】
血清サンプル中のインターフェロン濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した。アッセイを行う前に、血清希釈倍率を最適化し、プレートを、標準、コントロール、および検体用にレイアウトした。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。血清中のＩＦＮ濃度から、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、およびＡＵＣ値、並びに消失相半減期（Ｔ１／２）をＰＫソリューションズ２．０（商標）ソフトウェアにより計測した。
【０１２０】
単回用量で投与した後の異なる治療群の皮下（Ｓ．Ｃ．）薬物動態プロファイルを図１０に示すとともに、これらの平均薬物動態特性を表９に示す。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、ＩＦＮα−ｓＦｃ、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、およびＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）の半減期は、それぞれ２３．２時間、５０．２時間、２０．８時間、および０．７３時間であった。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、ＩＦＮα−ｓＦｃ、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、およびＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）のＡＵＣは、それぞれ６４６９４．５ｐＭ／ｈ、６０６２１．９ｐＭ／ｈ、５３０７．６ｐＭ／ｈ、および４８９．２ｐＭ／ｈであった。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、ＩＦＮα−ｓＦｃ、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、およびＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）のＴｍａｘは、それぞれ３２．０時間、３２．０時間、６．０時間、および０．６７時間であった。
【０１２１】
Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）は、第一世代の組換えＩＦＮα製品である。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）およびＰｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）は双方共に、ネイティブなＩＦＮαに結合したＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を有する、ＩＦＮαの第二世代の製品である。ＰＥＧの封入は、従来、非ＰＥＧ化形態に比べてＩＦＮαの半減期を著しく延長することが示されてきた。ＰＥＧによる半減期の増加は、表９および図１０に記載の薬物動態データによって示されるように、本実施例でも観察された（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）のデータと、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）およびＰｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）のデータを対比されたい。）
【０１２２】
表９および図１０はまた、ＩＦＮαが本開示の単鎖Ｆｃ融合タンパク質中に存在する場合、ＩＦＮαの半減期がＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、およびＲｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）に比べてよりさらに延長されることを示す。具体的には、ＩＦＮα−ｓＦｃの半減期は、２つのＰＥＧ化インターフェロン（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）およびＰｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））に比べて２倍以上長く、組換えＩＦＮα（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標））に比べて６８倍以上長い。
【０１２３】
実施例１５
ＩＦＮα−ｓＦｃの生物学的活性アッセイ
ＩＦＮの抗ウイルス活性を細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害アッセイにより測定した。簡潔には、９６ウェルプレートのウェルに１．０×１０４Ａ５４９細胞をシードし、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃、２４時間インキュベートした。細胞増殖がコンフルエントな単層を形成したら、細胞を種々の濃度および形態のＩＦＮαで処理した。１７８ｎｇ／ｍＬの濃度で出発して、ＩＦＮの５倍段階希釈物を調製した。ウェルに加えたＩＦＮの最終容量は１００μｌであった。２４時間後、培地を除去し、細胞を６×１０４ＰＦＵ／ｍＬの力価でマウス脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に感染させ、２４時間インキュベートした。インターフェロンを含まないウイルス対照ウェルにおいて細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された。ＭＴＳ溶液２０μｌを各ウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃、３時間インキュベートした。染色された細胞を、自動プレートリーダーを用い分光光度法によりＯＤ４９０ｎｍで分析した。全てのアッセイを３回実施し、全体平均を算出した。
【０１２４】
各濃度のＩＦＮにおけるウイルスＣＰＥ阻害率は下記式を用いて計算した。
「阻害（％）＝（ＯＤ（試験ウェル）−ＯＤ（ウイルスコントロール））／（ＯＤ（細胞コントロール）−ＯＤ（ウイルスコントロール））」
【０１２５】
４パラメータロジスティック曲線および５０％ウイルス複製阻害用量はいずれもＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅにより計算した。
【０１２６】
ＩＦＮα−ｓＦｃ（単鎖）の抗ウイルス活性をＩＦＮα−ＦＣ（ダイマー）のものと比較し、その結果を図１１および表１０に示す。ＩＦＮ−α−ｓＦｃの抗ウイルス活性（ＩＣ５０＝０．００６１ｎＭ）は、ＩＦＮ−α−ＦＣ（ＩＣ５０＝０．０３１３ｎＭ）よりも５．１倍高く、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）（ＩＣ５０＝０．０８９４）よりも１４．７倍高かった。
【０１２７】
総括
実施例１４および１５で得られた結果から、本開示のＩＦＮα単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−ｓＦｃ）は、他のＩＦＮα製品と比べて、生物学的な特性や利点：例えば（１）プロテインＡクロマトグラフィーを用いた精製収率の増大による製造コストの低減、（２）抗ウイルス活性の向上、（３）投薬回数の減少に繋がる、より長い血清半減期、および（４）腎クリアランスの低下、が改善されたことが実証される。従来の二量体化Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮα−Ｆｃ）およびＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）の半減期は、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）と比べて延長されたが、これらの生物学的活性はＩＦＮα−ｓＦｃよりも低かった。ＩＦＮα−ＦｃおよびＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）に見られたより低い生物学的活性は、少なくとも一つには、より大きな融合分子（つまり、ＩＦＮα−Ｆｃ中のＦｃダイマーや、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）中の４０ｋＤａの分岐ＰＥＧ鎖）と結合する受容体の立体障害によって引き起こされると考えられる。
【０１２８】
図１０〜１１および第９〜１０表が示す結果から、本開示の単鎖Ｆｃ改変は、他の形態のＩＦＮαに比べて、延長された半減期および高い生物学的活性を有するＩＦＮαを産生することが実証される。これらの結果から、本発明の改変は、非常に強力かつ効率的な、ペプチドおよびタンパク質に基づく治療を含む医薬組成物を製造するために使用できることが示唆される。
【０１２９】
実施例１６
インターフェロンα受容体１（ＩＦＮＡＲ１）およびインターフェロンα受容体２（ＩＦＮＡＲ２）に対する、ＩＦＮα−ｓＦｃ（単鎖）およびＩＦＮα−ＦＣ（ダイマー）それぞれの結合親和性の対比
インターフェロン融合タンパク質の結合親和性を動態／親和性アッセイにより測定した。
【０１３０】
簡潔には、固定化バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０）中、５μｇ／ｍＬのｒｈＩＦＮα受容体２（ＩＦＮＡＲ２）（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＮ：１０３５９−Ｈ０８Ｈ）を調製した。ｒｈＩＦＮＡＲ２（ＲＬ＝８００ＲＵ）を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置（ＧＥ、モデル：Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００）に搭載されたＣＭ５センサーチップ（ＧＥ、ＣＮ：ＢＲ−１００３−９９）に、従来のアミンカップリングにより固定化した。１２．５〜２００ｎＭのＩＦＮα−ｓＦｃまたはＩＦＮα−Ｆｃを含むサンプル溶液を、ランニングバッファー（０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２倍系列希釈して調製した。この工程で調製した溶液をランニングバッファーで２倍系列希釈し、６．２５〜１００ｎＭ  ＩＦＮα−ｓＦｃまたはＩＦＮα−Ｆｃ単回注射溶液を調製した。その後、２００ｎＭ  ＩＦＮ−α受容体１（ＩＦＮＡＲｌ）（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＮ：１３２２２−Ｈ０８Ｈ）溶液と、前工程で調製した同量のＩＦＮ単回注射溶液とを混合し、ＩＦＮ−ＩＦＮＡＲ１混合液を調製した。ＩＦＮＡＲｌの濃度は１００ｎＭであったのに対し、ＩＦＮα−ｓＦｃまたはＩＦＮα−Ｆｃの濃度は６．２５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲であった。ＩＦＮα−ｓＦｃまたはＩＦＮα−Ｆｃの平衡会合定数（Ｋａ）値および平衡解離定数（Ｋｄ）値をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析し、ＫｄおよびＫａから結合定数（ＫＤ）値を算出した。
【０１３１】
図１２ａ〜１２ｂに示すように、ＩＦＮα−ｓＦｃ−−ＩＦＮＡＲｌおよびＩＦＮα−Ｆｃ−−ＩＦＮＡＲｌは同様の結合プロファイルを有していた。具体的に、これらＩＦＮの結合関連性（binding association）はそれぞれ、Ｋａが１．４Ｅ＋０６（１／Ｍｓ）であるＩＦＮα−ｓＦｃとＫａが３．３Ｅ＋０６（１／Ｍｓ）であるＩＦＮα−Ｆｃとで相対的に類似していたことを表１１は示す。しかし、解離段階では、ＩＦＮα−ｓＦｃ−−ＩＦＮＡＲｌはＩＦＮα−Ｆｃ−−ＩＦＮＡＲｌよりも遅い解離プロファイル（Ｋｄ）を有していた。表１１に示すように、ＩＦＮα−ｓＦｃおよびＩＦＮα−ＦｃのＩＦＮＡＲｌからの解離（Ｋｄ）は、それぞれ５．６Ｅ−０３および５．６Ｅ−０２（１／ｓ）であった。ＩＦＮα−ｓＦｃおよびＩＦＮα−ＦｃのＩＦＮＡＲに対する相互作用の親和性（ＫＤ）は、観察された会合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）プロファイルに基づいて、それぞれ４．０Ｅ−０９および１．７Ｅ−０８ｎＭであると決定された。したがって、三重複合体を形成するためのＩＦＮα−ｓＦｃの親和性はＩＦＮα−Ｆｃのよりも４．２５倍高かった。
【０１３２】
本実施例で観察された結合親和性の結果により、ＩＦＮα−ｓＦｃがＩＦＮα−Ｆｃに比べて高い生物学的活性を有するのは、単鎖ＦｃがＦｃダイマーに比べて受容体との結合における立体障害が少ないことによる可能性が高い、との前実施例で説明した理論がさらに支持される。
【０１３３】
実施例１７
顆粒球コロニー刺激因子単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）
１．融合タンパク質  
この例では、上記式１の構造を有する融合タンパク質を調製した。
（Ｂ）−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）
式中、生物活性分子（Ｂ）は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質（配列番号７１）であり；
ヒンジ領域（ヒンジ）は、変異ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２３）であり；
（ＣＨ２−ＣＨ３）は、ＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３（配列番号７２）である。
ＧＣＳＦ−ｓＦｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を配列番号７２として配列表に示す。
【０１３４】
２．発現ベクター
ＤＮＡ発現ベクターを用いてＧＣＳＦ−ｓＦｃを製造した。顆粒球コロニー刺激因子単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）のＤＮＡフラグメントを、アセンブリポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法により、オーバーラップしたプライマーを使用してアセンブルした。次いで、アセンブルしたＧＣＳＦ−ｓＦｃフラグメントをｐＺＤベクター（ｄｈｆｒ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１Ｎｅｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、カタログｎｏ．Ｖ７９０−２０）のＰａｃＩおよびＥｃｏＲＶサイトに連結し、図１３に示すｐＺＤ−ＧＣＳＦ−ｓＦｃを得た後、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。発現ベクター構築物は選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を含んでいた。
【０１３５】
実施例１８
ＧＣＳＦ−ｓＦｃを産生する安定な組換え細胞株の確立
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞をトリプシン処理し、３×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＰ−Ｔバッファー（Ｃｙｔｏ  ｐｌｕｓｅ  カタログＣＰ−Ｔ）に再懸濁した。エレクトロポレーション（ＰＡ４０００  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、プラスミドｐＺＤ−ＧＣＳＦ−ｓＦｃ  １０μｇを細胞懸濁液（６×ｌ０５細胞）０．２ｍＬにトランスフェクトした。非選択培地において４８時間増殖させた後、トランスフェクタントをＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  カタログ１４８６４０６）および５ｎＭのＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ社  カタログＢＣＬ５７０７Ｖ）を含む選択完全培地でインキュベートし、高収率クローンｚＧ３−１７−４１を得た。培養培地中の分泌融合タンパク質の発現をＱ−ＥＬＩＳＡにより検出し、定量した。
【０１３６】
オリジナルｚＧ３−１７−４１細胞を、１０％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＩＭＤＭを含む１０ｃｍディッシュで培養した。細胞を、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２に加湿したインキュベーター（モデル３３２６、Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で維持した。無血清培地中で細胞を順応させるため、培地をＩＭＤＭから５％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＪＲＨ無血清培地に変更した。細胞が安定したら、トリプシン処理により１０ｃｍディッシュから細胞を剥離し、その後同じ割合のＦＢＳで補充したＪＲＨ無血清培地５０ｍＬを含むスピナーフラスコに移した。スピナーフラスコ中のＦＢＳの割合を１０％から０％まで段階的に減少させることで、細胞をより低い血清状態に順応させた。
【０１３７】
血清サンプル中のＧＣＳＦ−ｓＦｃ融合タンパク質の濃度をＧＣＳＦ−ｓＦｃ  ＥＬＩＳＡ分析によって定量した。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。選択、限定的希釈、および段階的なＭＴＸ投与（ｃｈｅｌｌｅｎｇｅｓ）により高収率クローンを上手く得て、最終的に単鎖Ｆｃに連結した組換えＧＣＳＦ（つまり、ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）を有する融合タンパク質を製造した。得られた融合タンパク質を、更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的活性アッセイおよび薬物動態研究のために精製した。
【０１３８】
実施例１９
ＧＣＳＦ−ｓＦｃのクロマトグラフィー精製
プロテインＡ系樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標））を使用して、ＧＣＳＦ−ｓＦｃを精製した。精製後、対応する回収率を定量的ＥＬＩＳＡにより、各純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。ＧＣＳＦ−ｓＦｃの精製方法を以下に詳述する。
【０１３９】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）精製
高収率ＧＣＳＦ−ｓＦｃ産生細胞株由来の培養培地を、１ｍＬの樹脂に対し約３．４ｍｇの充填比率で、プロテインＡ系ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ社；カタログ番号：１１−００３４−９３）に添加した。２回の洗浄工程の後、融合タンパク質を０．１Ｍグリシン溶出バッファー（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出されたメインピークを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分析した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡでも分析し、量および回収率を測定した。精製されたＧＣＳＦ−ｓＦｃサンプルの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥでも分析した。図１４は、ＧＣＳＦ−ｓＦｃ融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要バンドとして示されたことを示す。つまり、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）によりＧＣＳＦ−ｓＦｃを効率的に捕捉することができた。
【０１４０】
実施例２０
ＧＣＳＦ−ｓＦｃの薬物動態試験
９匹のラット（体重１８０〜２００ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ株式会社から購入した。全てのラットを検疫し、薬物動態（ＰＫ）試験の開始前に４日間順応させた。ＰＫ試験のために、ラットを３つの試験群：（１）ＧＣＳＦ−ｓＦｃ、（２）組換えＧＣＳＦであるレノグラスチム（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））、および（３）組換えヒトＧＣＳＦのペグ化形態であるペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））に分けた。ラットに、ＧＣＳＦ−ｓＦｃ  ２２１．４３μｇ／ｋｇ、１００μｇ／Ｋｇモル当量のレノグラスチムおよびペグフィルグラスチムを投薬した。すべてのＧＣＳＦ製品は、リン酸緩衝生理食塩水中の０．２％ウシ血清アルブミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＣＮ：Ａ０８５０、０２５０）であるサンプル希釈剤を用いて新たに調製した。ラットをグループ化し、毛皮用染料で標識した。すべての注射剤を背側頚部のサイトを介して皮下（Ｓ．Ｃ．）経路でラットに投与した。
【０１４１】
血液サンプルを、注射後５分、０．５時間、１時間、２時間、３時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間および１６８時間の後に回収し、次いで、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を−７０℃で保存した。
【０１４２】
血清サンプル中のＧＣＳＦ濃度を、ペア抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＮ：ＭＡＢ２１４およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＮ：ＢＡＦ２１４）を用いたＥＬＩＳＡ法により定量し、ＧＣＳＦを結合させ、検出した。アッセイを行う前に、血清希釈倍率を最適化し、プレートを標準、コントロール、および検体用にレイアウトした。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。血清中のＧＣＳＦ濃度から、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、およびＡＵＣ値並びに消失相半減期（Ｔ１／２）をＰＫソリューションズ２．０（商標）ソフトウェアにより算出した。
【０１４３】
単回用量で投与した後のラットでの各ＧＣＳＦの皮下（Ｓ．Ｃ．）薬物動態プロファイルを表１２に示すとともに、これらの平均薬物動態特性を図１５に示す。ＧＣＳＦ−ｓＦｃ、レノグラスチムおよびペグフィルグラスチムの半減期は、それぞれ１７．１６、４．１および１２．０時間であった。ＧＣＳＦ−ｓＦｃ、レノグラスチムおよびペグフィルグラスチムのＣｍａｘは、それぞれ９０６．９ｎｇ／ｍＬ、１５６．４ｎｇ／ｍＬおよび４８０．８ｎｇ／ｍＬであった。ＧＣＳＦ−ｓＦｃ、レノグラスチムおよびペグフィルグラスチムのＴｍａｘは、それぞれ４８時間、０．５時間および１０．３時間であった。ＧＣＳＦ−ｓＦｃ、レノグラスチムおよびペグフィルグラスチムのＡＵＣは、それぞれ５０６２４ｎｇ・ｈ／ｍＬ、７９０〜１２９２ｎｇ・ｈ／ｍＬ、および２３２０２±２９２１ｎｇ・ｈ／ｍＬであった。
【０１４４】
レノグラスチムは第一世代の組換えＧＣＳＦ製品である。ペグフィルグラスチムはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）と結合したＧＣＳＦの第二世代の製品である。ＰＥＧの封入により、第１世代の製品（レノグラスチム）と比べてＧＣＳＦの半減期が延長されることは既に示したとおりである。表１２および図１５に示す薬物動態データに示されるように（レノグラスチムのデータとペグフィルグラスチムのデータを対比されたい）、ＰＥＧによるＧＣＳＦ半減期の増加が本実施例においても観察された。
【０１４５】
表１２および図１５はまた、ＧＣＳＦが本開示の単鎖Ｆｃ融合タンパク質中に存在する場合、ＧＣＳＦの半減期がレノグラスチムおよびペグフィルグラスチムと比べてよりさらに延長されることを示す。具体的には、ＧＣＳＦ−ｓＦｃの半減期は、ＰＥＧ化ＧＣＳＦ（ペグフィルグラスチム）よりもほぼ１．５倍長く、組換えＧＣＳＦ（レノグラスチム）よりも４倍以上長い。
【０１４６】
実施例２１
ＧＣＳＦ−ｓＦｃの生物学的活性アッセイ
好中球減少症マウスを用いて、ネイティブなＧＣＳＦ、つまりレノグラスチム（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））と比べてＧＣＳＦの効能を分析した。この試験では、３０匹の６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＮａｒｌマウスを６つのグループ（すなわち、グループ当たり５匹のマウス）に分けた。すべてのマウスを０日目にＣＰＡ（シクロホスファミド一水和物；シグマ、ＣＮ：Ｃ７３９７）（１００ｍｇ／ｋｇ）で処理した。対照群としてのＡ群にのみ１日目に０．９％ＮａＣｌ／０．１％ＢＳＡ溶液を加えた。３つの対照群に、それぞれ５１．０２、１１６．０７および１２．７５μΜ／ｋｇの用量を含むレノグラスチム（中外製薬、ＣＮ：Ｎ３Ｌ２１２）を、シングルショット（Ｂ１群およびＢ２群）または４ショット（Ｂ３群）で加えた。２つの試験群に、５１．０２μΜ／ｋｇ（Ｃ１群）および１１６．０７μΜ／ｋｇ（Ｃ２群）の用量を含むＧＣＳＦ−ｓＦｃをシングルショットで加えた。シングルショットで加えた群（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、およびＣ２群）は１日目に注射し、４ショットで加えた群（Ｂ３群）は１、２、３および４日目に注射した。すべてのショットは皮下注射の経路を介して投与した。血液サンプルを投与後毎日採取し、試験終了までヘマトアナライザー（Hematoanalyzer）（ＨＥＭＡＶＥＴ  ９５０  ＬＶ）で分析した。対照用血液サンプルはＣＰＡ処理の前３日かけた（−３日）。本試験で用いた実験デザインを表１３にまとめた。
【０１４７】
図１６は、ＣＰＡでマウスを前処理することが好中球減少症を引き起こすこと、すなわち、処理したマウスの血液中の好中球数を減少させる（すべてのサンプルにおいて１日目と−３日目および０日目を比較されたい）ことを示す。しかし、好中球減少症は一時的なものであることが判明し、対照群において好中球のレベルは約８日後にＣＰＡ処理前のレベルまでゆっくりと戻った（Ａ群の結果を参照）。５１．０２μΜ／Ｋｇの中用量（Ｂ１群）または１１６．０７μΜ／Ｋｇの高用量（Ｂ２群）のいずれかでレノグラスチムを１日目に１ショットした場合、観察期間中、好中球レベルを、ＣＰＡ対照群において観察された好中球レベルを超えて増加させる格別な効果は示さなかった（Ａ群とＢ１群およびＢ２群とを比較）。ＣＰＡ処理に続きレノグラスチムを複数回投与（４ショット）した場合（Ｂ３群）、Ａ群、Ｂ１群およびＢ２群に比べて、好中球レベルを増加させる効果を示した（Ｂ３群、３〜５日目を参照）。しかし、観察された効果は最小限であり、短命であった。これは、好中球レベルが、標準の範囲を超えて上昇することがほとんどなく、複数回投与期間後（Ｂ３群、５日目以降を参照）に標準レベルに低下したためであった。
【０１４８】
これに対し、ＣＰＡ処理に続き中用量（５１．０２μΜ／Ｋｇ）または高用量（１１６．０７μΜ／Ｋｇ）のＧＣＳＦ−ｓＦｃを単回投与した場合、対照群およびレノグラスチムで処理した全ての群を超えて好中球レベルを効果的にかつ顕著に上昇させた（Ａ、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３群と、Ｃ１およびＣ２群とを対比）。
【０１４９】
したがって、本開示のＧＣＳＦ単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＧＣＳＦ−ｓＦｃ）は、ネイティブおよびペグ化形態のＧＣＳＦに比べて、より長い半減期を有し、好中球減少症動物疾患モデルでの好中球の分化および増殖を高める点においてより強力かつ効率的である。
【０１５０】
実施例２２
インターフェロンβ単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮβ−ｓＦｃ）
１．融合タンパク質
この例では、上記式１の構造を有する融合タンパク質を調製した。
（Ｂ）−（ヒンジ）−（ＣＨ２−ＣＨ３）
式中、生物活性分子（Ｂ）は、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）タンパク質（配列番号７３）であり；
ヒンジ領域（ヒンジ）は、変異ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号２３）であり；
（ＣＨ２−ＣＨ３）は、ＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３（配列番号６３）である。
ＩＦＮβ−ｓＦｃ融合タンパク質の全長アミノ酸配列を配列番号７４として配列表に示す。
【０１５１】
２．発現ベクター
ＤＮＡ発現ベクターを用いてＩＦＮβ−ｓＦｃを製造した。ＩＦＮβ−ｓＦｃのＤＮＡフラグメントを、アセンブリポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法により、オーバーラップしたプライマーを使用してアセンブルした。次いで、アセンブルしたＩＦＮβ−ｓＦｃフラグメントをｐＺＤベクター（ｄｈｆｒ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１Ｎｅｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、カタログｎｏ．Ｖ７９０−２０）のＰａｃＩおよびＥｃｏＲＶサイトに連結し、図１７に示すｐＺＤ／ＩＦＮｂ−ｓＦｃを得た後、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。発現ベクター構築物は選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を含んでいた。
【０１５２】
実施例２３
ＩＦＮβ−ｓＦｃを産生する安定な組換え細胞株の確立
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞をトリプシン処理し、３×１０６細胞／ｍＬの濃度でＣＰ−Ｔバッファー（Ｃｙｔｏ  ｐｌｕｓｅ  カタログＣＰ−Ｔ）に再懸濁した。エレクトロポレーション（ＰＡ４０００  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、プラスミドｐＺＤ／ＩＦＮβ−ｓＦｃ  １０μｇを細胞懸濁液（６×ｌ０５細胞）０．２ｍＬにトランスフェクトした。非選択培地において４８時間増殖させた後、トランスフェクタントを、ＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  カタログ１４８６４０６）および５ｎＭのＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ社  カタログＢＣＬ５７０７Ｖ）を含む選択完全培地でインキュベートし、高収率クローンｚＧ３−１７−４１を得た。培養培地中の分泌融合タンパク質の発現をＱ−ＥＬＩＳＡによって検出し、定量した。
【０１５３】
オリジナルＺ−ＢｓＦｃ細胞を、１０％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＩＭＤＭ含有１０ｃｍディッシュで培養した。細胞を、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２に加湿したインキュベーター（モデル３３２６、Ｆｏｒｍａ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で維持した。無血清培地中で細胞を順応させるため、培地をＩＭＤＭから５％ＦＢＳ、ゼオシン、および０．１μΜ  ＭＴＸで補充したＪＲＨ無血清培地に変更した。細胞が安定したら、トリプシン処理により１０ｃｍディッシュから細胞を剥離し、その後同じ割合のＦＢＳで補充したＪＲＨ無血清培地５０ｍＬを含むスピナーフラスコに移した。３〜５日で細胞が９０％コンフルエントに達したら、細胞を低い割合のＦＢＳで補充したＪＲＨ無血清培地を含むスピナーフラスコで継代培養した。スピナーフラスコ中のＦＢＳの割合を１０％から０％まで段階的に減少させることで、細胞をより低い血清状態に順応させた。
【０１５４】
血清サンプル中のＩＦＮβ−ｓＦｃ融合タンパク質の濃度を自社のＩＦＮβ−ｓＦｃ  ＥＬＩＳＡキットにより定量した。融合タンパク質を用いて正式なアッセイを行う前に、血清希釈倍率を最適化し、標準、コントロール、および検体用プレートレイアウトを決定した。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍでの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。選択、限定的希釈、および段階的なＭＴＸ投与により高収率クローンを上手く得て、最終的に単鎖Ｆｃに連結した組換えＩＦＮβを有する融合タンパク質（つまり、ＩＦＮβ−ｓＦｃ）を製造した。得られた融合タンパク質を、更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的活性アッセイおよび薬物動態試験のために精製した。
【０１５５】
実施例２４
ＩＦＮβ−ｓＦｃのクロマトグラフィー精製
プロテインＡ系樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標））を使用して、ＩＦＮβ−ｓＦｃを精製した。精製後、対応する回収率を定量的ＥＬＩＳＡにより、各純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した。ＩＦＮβ−ｓＦｃ融合タンパク質の精製方法を以下に詳述する。
【０１５６】
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）精製
高収率ＩＦＮβ−ｓＦｃ産生細胞株由来の培養培地を、１ｍＬの樹脂に対し約１．５８ｍｇの充填比率で、プロテインＡ系ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ社；カタログ番号：１１−００３４−９３）に添加した。２回の洗浄工程の後、０．１Ｍグリシン溶出バッファー（ｐＨ３．０）で融合タンパク質を溶出した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラムからメインピークで溶出されたタンパク質を分析し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって観察された鋭いピークおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られた鋭いバンド（データは示さず）に基づき、相対的に純粋であることが分かった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）溶出液をＱ−ＥＬＩＳＡで分析し、表１４に示すとおり、量および回収率を決定した。
【０１５７】
実施例２５
ＩＦＮβ−ｓＦｃの薬物動態試験
８匹のＬｅｗｉｓラット（体重２００〜２３０ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ株式会社から購入した。すべてのラットを検疫し、薬物動態（ＰＫ）試験の開始前に４日間順応させた。ＰＫ試験のために、ラットを２つの試験群：（１）ヒトＩＦＮβ−１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））由来の天然繊維芽細胞および（２）ＩＦＮβ−ｓＦｃに分けた。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびＩＦＮβ−ｓＦｃを３７μｇ／Ｋｇの用量でラットに投与した。全ての試験薬は、新しいサンプル希釈剤、つまりリン酸緩衝生理食塩水中の０．２％ウシ血清アルブミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＣＮ：Ａ０８５０、０２５０）を用いて調製した。ラットをグループ化し、毛皮用染料で標識した。すべての注射液を背側頚部のサイトを介して皮下（Ｓ．Ｃ．）経路でラットに投与した。
【０１５８】
血液サンプルを、注射後５分、０．５時間、１時間、４時間、７時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、および１６８時間の後に回収し、次いで、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を−７０℃で保存した。
【０１５９】
血清サンプル中のインターフェロン濃度を、ＩＦＮβに対して、ＶｅｒｉＫｉｎｅ（商標）ヒトＩＦＮβ  ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  ａｓｓａｙ  ｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＮ：４１４１０）により定量した。波長４５０ｎｍおよび６００ｎｍの吸光度をＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５ソフトウェアにより得た。血清中のインターフェロン濃度から、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ値、および消失相半減期（Ｔ１／２）を、ＰＫソリューションズ２．０（商標）ソフトウェアにより計測した。
【０１６０】
ラットにおいて、単回用量で投与した後のＩＦＮβの皮下（Ｓ．Ｃ．）薬物動態プロファイルを図１８に示し、平均薬物動態特性を表１５に示す。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびＩＦＮβ−ｓＦｃの半減期は、それぞれ１８．９２〜２３．５７時間および３１．８９〜３７．７時間であった。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびＩＦＮβ−ｓＦｃのＣｍａｘは、それぞれ３．２±０．７１ｎｇ／ｍＬおよび６．５５±０．７８ｎｇ／ｍＬであった。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびＩＦＮβ−ｓＦｃのＴｍａｘは、それぞれ１２±０時間および９．５５±３．６１時間であった。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびＩＦＮβ−ｓＦｃのＡＵＣは、それぞれ１１５±１８．３８ｎｇ・ｈｒ／ｍＬおよび２７３±２．８３ｎｇ・ｈｒ／ｍＬであった。
【０１６１】
本発明のＩＦＮβ−ｓＦｃは、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）（ＩＦＮのネイティブ形態）の半減期と比較した場合、図１８および表１５に示すように、半減期の延長において向上した。
【０１６２】
実施例２６
ＩＦＮβ−ｓＦｃの生物学的活性アッセイ
ＩＦＮβは抗炎症性サイトカインであり、多発性硬化症（ＭＳ）治療用の主要な薬剤の一つとして機能する。ＭＳは中枢神経系の中で最も一般的な炎症性疾患である。免疫細胞は血液脳関門を渡り、ミエリンを攻撃する。これはＭＳ患者の神経系におけるシグナルの非効率的な伝達の原因となる。週に数回ＩＦＮβ薬剤を注射することはＭＳの再発を制御するために必要である。ＭＳにおけるＩＦＮβの抗炎症メカニズムは、ミエリン鞘の成分に対するＴ細胞応答におけるＴｈ１からＴｈ２へのサイトカインバランスのシフトを伴うことが報告されている。Ｔｈ１およびＴｈ２グループに加えて、オステオポンチン（ＯＰＮ）を含む他の２つの重要な炎症誘発性サイトカインが、ＭＳの病因のうちＣＮＳ（中枢神経系）炎症において重要な役割を果たすことが分かっている。
【０１６３】
本試験では、ＩＦＮβ−ｓＦｃの生物学的活性をオステオポンチン阻害アッセイにおいて評価し、その活性を非改変ＩＦＮβ−１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））と対比した。簡潔には、オステオポンチン阻害アッセイは次のように行った。
【０１６４】
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を全血から単離した。ＰＢＭＣを刺激するため、９６ウェル平底組織培養プレートに、ウェル当たり１μｇ／ｍＬの濃度で抗ＣＤ３抗体１００μｌのプレコートし、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルをＲＰＭＩ  １６４０（ＦＢＳを含む）２００μｌで洗浄し、５×１０４細胞をシードした。各ウェルを、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体、ＩＦＮβ−ｓＦｃ（１．５または１０ｎｇ／ｍＬ）、またはＲｅｂｉｆ（登録商標）（１．５または１０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで処理し、プレートを５％ＣＯ２加湿インキュベーター中、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルからの上清を回収し、−７０℃のフリーザーで保存した。ヒトオステオポンチン（ＯＰＮ）の量をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ＣＮ：ＤＯＳＴ００）により測定した。
【０１６５】
各サンプルにおけるＯＰＮ濃度を以下のとおり算出した：ｘ軸上にＯＰＮ、ｙ軸上に吸光度（ＯＤ４５０〜ＯＤ５７０）を有する別個の標準曲線をプロットし、４パラメーターロジスティック方程式を用いて適合線を描いた。ＯＰＮ濃度は、Chen M. et al. ”Regulatory effects of IFN-β on production of osteopontin and IL-17 by CD4+ T Cells in MS” Eur. J. Immunol. 39, 2525-2536 (2009)に記載されている次の式：Ｘ＝Ｘ０×｛［ａ／（Ｙ−Ｙ０）−１］Λ（１／ｂ）｝を用いて計算した。
【０１６６】
図１９に示すように、本開示の単鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＩＦＮβ−ｓＦｃ）は、１．５ｎｇ／ｍＬ（７３．４±０．８％）および１０ｎｇ／ｍＬ（７９．５±３．６％）の試験薬で治療した細胞において、ＯＰＮの生成を著しく阻害した。対照薬（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））で治療した細胞は、１．５ｎｇ／ｍＬ（８８．４±２．７％）および１０ｎｇ／ｍＬ（８１．３±１３．３％）で、同様のＯＰＮ阻害を示した。これらの結果から、ＩＦＮβ−ｓＦｃは未改変ＩＦＮβと同等な生物学的活性を有しているため、単鎖Ｆｃの封入によって、融合タンパク質のＩＦＮβ部分がその受容体に結合する能力は著しく阻害されないことが示唆される。
【０１６７】
【表１】
2018518533.tif 000003
【０１６８】
【表２】
2018518533.tif 000004
【０１６９】
【表３】
2018518533.tif 000005
【０１７０】
【表４】
2018518533.tif 000006
【０１７１】
【表５】
2018518533.tif 000007
【０１７２】
【表６】
2018518533.tif 000008
【０１７３】
【表７】
2018518533.tif 000009
【０１７４】
【表８】
2018518533.tif 000010
【０１７５】
【表９】
2018518533.tif 000011
【０１７６】
【表１０】
2018518533.tif 000012
【０１７７】
【表１１】
2018518533.tif 000013
【０１７８】
【表１２】
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【０１７９】
【表１３】
2018518533.tif 000015
【０１８０】
【表１４】
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【０１８１】
【表１５】
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【０１８２】
【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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