(57)【要約】  本発明は概して、生物学的試料中に存在する核酸の定量的PCR（qPCR）分析を、シーケンシング準備済みの核酸ライブラリを上記試料から同時又は逐次のいずれかで調製するのと共に実施することが可能な自動化されたシステムに関する。更なる一態様においては、本発明はまた、生物学的試料中に存在する核酸に対するqPCRを、シーケンシング準備済みの核酸ライブラリを上記試料から同時又は（or）逐次に調製すると共に実施するための方法を提供する。最後に、本発明はまた、本発明による自動化されたシステム及び方法で使用するための着脱可能なカートリッジを提供する。【選択図】図9
2018522588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システム中に受容された核酸源若しくは生物学的試料中に存在する核酸の定量的PCR（qPCR）分析をするのと並行して、前記核酸源からシーケンシング用核酸ライブラリを調製するための、
核酸を増幅し、そのような増幅の間に生成されるシグナルを検出可能にするために適した、qPCRを実施するために必要な試薬を含む熱サイクル用qPCR区画を含む定量的PCR（qPCR）を実施するための手段を含む自動化されたシステムであって、
核酸ライブラリを調製するための試薬を含むライブラリ区画を含む核酸ライブラリを調製するための手段を更に含むことを特徴とする、自動化されたシステム。
【請求項２】
前記システムは、
少なくとも1つの核酸源受容区画及び/又は受容された核酸源から核酸を遊離又は精製するための手段と、
受容された核酸源又は該核酸源から遊離若しくは精製された核酸を、少なくとも熱サイクル用qPCR区画とライブラリ区画とに分割するための手段と、
を更に含む、請求項1に記載の自動化されたシステム。
【請求項３】
前記熱サイクル用qPCR区画及び前記ライブラリ区画若しくは核酸源受容区画並びに受容された核酸源から核酸を遊離するための手段は、前記自動化されたシステムと係合可能なカートリッジ中に含まれる、請求項1又は2に記載の自動化されたシステム。
【請求項４】
前記qPCRを実施するための手段は、以下：
そのqPCRに供される核酸のクオリティーを評価するために適したクオリティーコントロール（QC）qPCR、又は、
そのqPCRに供される核酸中に存在する可能性のあるゲノム改変の存在若しくは量を測定するために適した非クオリティーマルチプレックスqPCR、
のいずれかを実施するように適合されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の自動化されたシステム。
【請求項５】
前記QC qPCRは、マルチプレックスQC qPCRであり、かつ前記自動化されたシステムは、前記マルチプレックスQC PCRから得られたデータからクオリティー測定量の出力を生成するための手段を更に含む、請求項4に記載の自動化されたシステム。
【請求項６】
前記熱サイクル用qPCR区画及び前記ライブラリ区画を同時に又は逐次に作動させることが可能である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の自動化されたシステム。
【請求項７】
前記ライブラリ区画は、該ライブラリ区画中に受容される核酸から核酸断片を生成する手段を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の自動化されたシステム。
【請求項８】
前記核酸断片は、更に「ライブラリPCR」と呼ばれるPCRにおいて生成される、請求項7に記載の自動化されたシステム。
【請求項９】
前記ライブラリ区画は、オリゴヌクレオチドアダプターを、前記核酸断片の少なくとも一方の末端若しくはその両末端に結合させるための手段を含む、請求項7又は8に記載の自動化されたシステム。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドアダプターの核酸断片への結合は、ライブラリPCR中に使用される少なくとも1つのプライマーの配列中にアダプター配列を含めることによって実施される、請求項9に記載の自動化されたシステム。
【請求項１１】
以下：
自動化されたシステム中に受容された核酸源の一部、
自動化されたシステム中に遊離された遊離核酸の一部、
自動化されたシステム中で調製された核酸ライブラリの少なくとも一部、
のいずれかを回収するための回収区画を更に含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の自動化されたシステム。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の自動化されたシステムにおいてqPCRを核酸ライブラリの調製と並行して実施する方法であって、
a）核酸源を、自動化されたシステム中に受容する工程と、
b）前記自動化されたシステムにおいて、前記受容された核酸源の少なくとも一部から核酸を遊離又は精製する工程と、
c）核酸源から遊離又は精製された核酸に対して、前記システム中に含まれ、核酸の増幅のために適した熱サイクル用qPCR区画において前記核酸を熱サイクル処理することを含むqPCRを実施し、そのような増幅の間に生成されたシグナルの検出を可能にする工程と、
d）前記システム中に含まれるライブラリ区画中で核酸ライブラリを調製する工程と、
を含み、ここで、工程c）及び工程d）は、前記自動化されたシステムにおいて、逐次又は同時のいずれかで実施される、方法。
【請求項１３】
工程a）〜工程d）は、前記自動化されたシステムにおいてカートリッジで実施される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
qPCRの実施のために必要な試薬を含む少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画と、
少なくとも1つのライブラリ区画と、
を含み、前記ライブラリ区画が、核酸ライブラリを調製するために必要な試薬を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の自動化されたシステムのためのカートリッジ。
【請求項１５】
前記カートリッジは、
少なくとも1つの核酸源受容区画及び/又は受容された核酸源から核酸を遊離するための手段と、
受容された核酸源又は該核酸源から遊離された核酸を、少なくとも熱サイクル用qPCR区画とライブラリ区画とに分割するための手段と、また、
カートリッジに特異的な識別子と、
を更に含む、請求項14に記載のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、生物学的試料中に存在する核酸の定量的PCR（qPCR）分析を、シーケンシング準備済みの核酸ライブラリを上記試料から同時又は逐次のいずれかで調製するのと共に並行実施することが可能な自動化されたシステムに関する。更なる一態様においては、本発明はまた、生物学的試料中に存在する核酸に対するqPCRを、シーケンシング準備済みの核酸ライブラリを上記試料から同時又は逐次に調製すると共に実施するための自動化された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムPCRとしても知られる定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）は、ターゲット核酸の分析のための強力かつ汎用性の高いツールである。多くのその他のPCRベースの技術と同様に、qPCRは、選ばれた核酸の増幅及び／又は検出のためのターゲット特異的なプライマーを使用する。最近では、qPCRは、診断のための最も優れた技術として認識されており、研究所及び診療所において世界的に広く用いられている。
【０００３】
その他の分野及び用途のなかで、qPCRは、臨床腫瘍学において、野生型の核酸と変異型の核酸とを両者の診断のために識別するためだけでなく、標的療法のために適したアクショナブルなアレルを特定するために広く使用されている。その技術は、迅速であり、ロバスト性であり、かつ限られた数の明確に定義された変異によって駆動されるであろうことが知られるこれらの癌の大部分において、例えば、変異したBRAF及びNRASにて通常疑いが持たれる黒色腫において素晴らしい機能を発揮する。しかしながら、最も可能性のある予想される変異又は変異の集合を検出し損なうと、少なくとも1つの潜在的にアクショナブルなターゲットが特定されるまで、莫大な量の遺伝子を（それぞれ、種々の特異的プライマー組及び／又はプローブ組を用いて）分析することが必要とされることとなるという状況に直面することがある。
【０００４】
そのような事例では、より広範で配列非依存性の遺伝子カバレッジをもたらす技術によって、所定の癌試料の診断的フォローアップを実施することが必要となることがある。この目的のために特に適したアプローチは、第二世代シーケンシング又は次世代シーケンシング（NGS）としても知られる高スループットシーケンシングを含み、それは、格段により遅い古典的なサンガーのストラテジーをベースとするシーケンシングとは対照的である。NGS分析の費用が絶えず減少している（2014年には、1ゲノム当たり1000ドルという記録的な低価格に至った）にもかかわらず、その技術は、依然として比較的高価である。さらに大抵は、核酸の量及びクオリティーの検証のような多数の準備段階に引き続いてシーケンシング準備済みの核酸ライブラリを作製するため、大きな労力を要するとみなされる。また一方で最も重要なことには、NGSは、1実行当たりに多量のデータが生成され、その分析には追加的な計算上の問題を伴い、そしてデータ解釈のために高度な熟練者を必要とする。したがって、可能であれば一層経済的でありかつより迅速なqPCRが、その診断アプローチには好ましい。それにもかかわらず、NGSは、必要なフォローアップの選択肢がない場合には、依然として有効であり、しばしば価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、NGS分析がうまくいくための重要な留意事項は、試料中に備わる核酸が、十分な量で存在するかどうか、及びシーケンシングに十分なライブラリを生成するために十分なクオリティーであるかどうかである。この目的のために使用される従来の核酸検証法は、標準的なアプローチ、例えば吸光度（光学密度）測定、アガロースゲル電気泳動、又は例えば蛍光DNA結合色素を使用する蛍光分析法を含む。最近になって、NGSを目的とする核酸試料をできるだけ節約するために、そのわずか一部をPCRにかけた後、その産物を、必要な量及びクオリティーの評価を実施するために使用するようになっている。この目的のために通常使用されるPCR産物は、例えばAluリピートのような短鎖散在反復配列（SINE）又は長鎖散在反復配列（LINE）を使用して生成される（Buehler et al. 2010を参照）。
【０００６】
先に挙げた準備段階は、NGS分析に進む決断がなされた後にのみ実施される独立型のアッセイとして存在することに留意すべきである。NGSのフォローアップがいつか必要とされるであろう場合に臨床試料から得られた核酸を確保するために、予防的にシーケンシング用ライブラリを調製することは、一般的な方法ではない。この理由は、主として、クオリティーコントロール工程及びライブラリ調製工程が熟練者から追加的な時間を奪い、それにより試料取扱いプロセス全体のコストが高まるからである。事実、試薬のコスト的に、これらの工程は、NGSワークフロー全体のなかでもおそらく最も安い部分である。
【０００７】
臨床試料の初期の標準的なqPCRスクリーニングの段階で既に、シーケンシング準備済みのライブラリが自動的に生成されることによって、時間及び熟練した人材を節約することとなるだけでなく、貴重な量的に限られた臨床試料のより良い管理を保証することにもなる。そのような解決策の更なる利点は、リアルタイム監視qPCR反応からの情報を核酸の量及びクオリティーの指標、ひいてはNGSライブラリ生成のためのその適性として直ちに生成又は使用することができることであろう。更なる利点は、qPCRの結果と、その後に該qPCRと同じ機械を用いてその同じ機械において、同じ時点（すなわち、同時に）又はそのすぐ後（すなわち、逐次に）のいずれかで、かつ重要なことには、同じ処理がなされた核酸の同じプールを使用して並行して生成されたライブラリのNGS分析から得られた結果とを直接比較することができることであろう。さらに、こうしてqPCR分析と、ライブラリの形の遊離核酸の安定化との間の通常の時間的な分離を取り除くことによって、生物学的試料又はそこから単離された遊離核酸の、それらの少なくとも部分的な分解を引き起こし得る長期の貯蔵期間によって起こる、qPCR結果とNGS結果との間のあらゆる潜在的な分析的な分離を更にできるだけ小さくすることができる。
【０００８】
本発明は、高感度なqPCR分析を、同じ生物学的試料からのNGSライブラリ調製と組み合わせて実施する（performing）ための自動化されたシステム及び方法を提供することによって上記利点に取り組んでいる。そうすることによって、本発明は、試料のクオリティーの検証をNGSライブラリの調製と共に可能にするだけでなく、所定の試料中に存在するゲノム改変に対するNGSにより提供されるより広範な洞察に先だって、ドライバー変異を即座に高深度で発見するための手段を更に提供する。本発明の上記利点及びその他の利点を、引き続き示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、添付の独立形式請求項に定義されている。好ましい実施の形態は、従属形式請求項に定義されている。特に本発明は、システム中に受容された核酸源、例えば生物学的試料中に存在する核酸の定量的PCR（qPCR）分析をするのと並行して、上記核酸源からシーケンシング用核酸ライブラリを調製するための、
qPCRを実施するために必要な試薬を含む熱サイクル用区画（さらに、「熱サイクル用qPCR区画」とも呼ばれる）を含む定量的PCR（qPCR）の実施のための手段を含む自動化されたシステムであって、
上記熱サイクル用qPCR区画とは異なるライブラリ区画を含む核酸ライブラリを調製するための手段を更に含み、上記ライブラリ区画が、NGS特異的アダプター配列を含む核酸ライブラリを調製するために必要な試薬を含むことを特徴とする、自動化されたシステムに関する。
【００１０】
好ましくは、本発明の自動化されたシステムは、カートリッジ式のマイクロ流体システムである。このように、更なる態様においては、本発明は、本発明による自動化されたシステムのための着脱可能なカートリッジであって、
qPCRの実施のために必要な試薬を含む少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画と、
上記熱サイクル用qPCR区画とは異なる、少なくとも1つのライブラリ区画と、
を含み、上記ライブラリ区画が、NGS特異的アダプター配列を含む核酸ライブラリを調製するために必要な試薬を含む、着脱可能なカートリッジを提供する。
【００１１】
好ましい実施の形態においては、本発明のカートリッジには、好ましくは、生物学的試料を受容するための手段と、生物学的試料から核酸を遊離するための手段とが更に組み込まれる。
【００１２】
最後に、本発明はまた、本発明による自動化されたシステムにおいてqPCRを核酸ライブラリの調製と並行して実施する方法であって、
a）核酸を含む核酸源を、自動化されたシステム中に受容する工程と、
b）任意に、上記自動化されたシステムにおいて、上記受容された核酸源の少なくとも一部から核酸を遊離する工程と、
c）核酸源において与えられる又は核酸源から遊離された核酸に対して、上記システム中に含まれる熱サイクル用qPCR区画において上記核酸を熱サイクル処理することを含むqPCRを実施する工程と、
d）上記システム中に含まれるライブラリ区画中で核酸ライブラリを調製する工程と、
を含み、ここで、工程c）及び工程d）は、上記自動化されたシステムにおいて、逐次又は同時のいずれかで実施される、方法を提供する。
【００１３】
定義
本明細書においては、用語「定量的PCR」又は単純に「qPCR」には、標的DNA分子を増幅すると同時に、それを検出又は定量化するために使用される、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を基礎とする研究室用技術の定義が与えられる。反応産物がその終わりに、すなわち熱サイクル処理が完了した後に検出される標準的なPCRとは対照的に、qPCRの主な特徴は、DNA産物が、熱サイクル処理の間に反応が進行しながら「リアルタイム」で検出されることであり、したがってqPCRの代替名は、「リアルタイムPCR」である。最近では、多くの種々のタイプのqPCRが存在する。例えば、逆転写（RT）工程から開始する場合に、qPCRは、メッセンジャーRNAの数を定量するために使用することができ、その場合には、逆転写（reversetranscription）qPCR又はRT-qPCRと呼ばれる。本明細書で使用される場合に、用語「定量的PCR」又は単純に「qPCR」は、しばしばRT-PCRとも略記される逆転写PCRとの混同を避けるために、好ましくは用語「リアルタイムPCR」又は「RT-PCR」に関して使用されるものとする。ほとんどのqPCRは、産物増幅をリアルタイムで検出するための2つの最も一般的な方法：（a）非特異的蛍光色素の任意の二本鎖DNAでのインターカレーション、又は（2）プローブとその相補的ターゲット配列とのハイブリダイゼーション後にのみ検出が可能となる蛍光性リポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的DNAプローブのうちの一方を使用する。熱サイクル処理の間に生成される蛍光シグナルは、適切な光学検出システムによって検出され、蛍光シグナルがバックグラウンド閾値を通り過ぎてから反応がプラトーに達するまでの時点から突き止められる。ターゲット配列のコピー数は、相対定量化又は絶対定量化のストラテジーのいずれかを使用して、一般的に、得られた増幅曲線の形状を解析すること（検量線ストラテジー）によって、又はシグナルが幾つかの閾値より高く上昇する時点（しばしば、Ct値と呼ばれるが、Cp値又はCq値と呼ばれることもある（sometimes））を測定することによって推定することができる。相対定量化においては、所定の試料でCt又は検量線解析を使用して推定されたターゲット核酸レベルは、別の参照試料、例えば未処理の対照試料において同じターゲットについて得られた値と相対的に表現される。それに対して、絶対定量化においては、qPCRシグナルは、検量線を使用して投入コピー数に関連付けられるか、又はより最近のデジタルPCR法に従って計算することもできる。当面は、最初のストラテジーが依然としてより優勢であり、得られた値と事前に作成した検量線との比較によりターゲットDNA量を推定することを基礎とする。これらのqPCR定量化ストラテジー及びその他のqPCR定量化ストラテジーは、当該技術分野で広く知られており、それらの計算は、所定のアプリケーション及びqPCRシステムに依存して、多少異なっていてもよい。
【００１４】
本明細書で使用される場合に、用語「定量的PCRを実施するための手段」は、qPCRを実施するための試薬及びエレメントの必要最低限の取り合わせと解釈されるものとする。それらの手段は通常、核酸源から受容された核酸鋳型のリアルタイムPCRの熱サイクル処理において検出可能にするあらゆる試薬を含むものとする。そのような試薬は、限定されるものではないが、qPCRのタイプに応じて、PCRグレードのポリメラーゼ、少なくとも1つのプライマー組、検出可能な色素又はプローブ、dNTP、PCRバッファー等を含む。さらにまた、「定量的PCRを実施するための手段」は通常、以下の（1）リアルタイムで検出可能な熱サイクル処理を行うことができる適切な区画（さらに、「熱サイクル用qPCR区画」とも呼称される）を通常含むが、それに限定されるものではない当該技術分野で既知の任意の標準的な部材の最小限の集成物も含むものとする。そのような区画は、例えば、核酸を増幅するのに適したチャンバ、すなわち十分な内部温度制御をもたらす適切な材料からできており、更にそのような増幅の間に生成されるシグナルのリアルタイム検出を可能にする少なくとも1つの壁部、例えば透光性の壁部を含むチャンバによって形成され得る。さらに、このような手段は、（2）様々な既存の熱サイクル用装置から広範に知られるこのチャンバ又はその他の区画中の温度を変更するための手段を含む。さらに、このような手段は、（3）qPCR熱サイクル処理の間に生成されるシグナルを検出するための手段、例えばコンピュータに接続された光学検出器を含む。要するに、そのような最小限の集成物は、通常は、熱サイクル用qPCR区画中での熱サイクル反応を開始及び維持し、その中の安定な熱サイクル条件を保証するために温度を調節及び制御することが可能な当該技術分野で既知の任意の1つ以上のシステム等を含むものとし、さらに、該集成物はまた、任意の適切な1つ以上の検出デバイス、データ処理のための手段（例えば、コンピュータ、或いはデータベースに接続されたコンピュータ）、及びqPCR反応の熱サイクル処理をリアルタイムに読み取り、監視することを可能にする出力システム（通常は、適切なグラフィックユーザインターフェースに反応の進捗を表示するコンピュータスクリーン）、並びに機構を操作する、及び／又は得られた結果の解釈を表示し、また場合によってはその解釈を補助するために適切な任意のソフトウェアパッケージを含むものとする。
【００１５】
さらに、本明細書で使用される場合に、用語「シーケンシング用ライブラリ」又は「シーケンシング用核酸ライブラリ」とは、特に近年知られる次世代シーケンシング（NGS）ストラテジーのいずれかを使用した配列解析準備済みの一式のポリヌクレオチド、最も多くは、一式のDNAタイプを指す。こうして、本発明の現時点で好ましい実施の形態においては、シーケンシング用ライブラリは、最も好ましくは選択される所定のNGSストラテジーと適合可能なアダプター分子（又はアダプター配列）と融合された、複数のPCR増幅されたDNA分子から構成される。シーケンシング用ライブラリのタイプ及びその調製方法の包括的概要は、van Dijk et al. Exp Cell Res. 2014のレビューに見ることができる。
【００１６】
同様に、本明細書で使用される場合に、用語「核酸ライブラリを調製するための手段」は、NGSに適した核酸ライブラリを調製するための必要最低限のエレメントと解釈されるものとし、これには、核酸源から受容された核酸を核酸ライブラリ調製に供することができる少なくとも1つの区画、ライブラリ調製のための必要最低限の試薬（例えば、適切な酵素又は酵素混合物、NGSストラテジーに特異的なアダプター配列又はアダプター、バッファー等）、並びに、更には例えばライブラリ調製手法を開始及び／又は指示するために適した標準的な当該技術分野で既知の機構及びソフトウェアが含まれる。本明細書で使用される場合に、「核酸ライブラリを調製するために必要な試薬」は、NGSのために使用することができる核酸ライブラリを調製するために十分な当該技術分野で既知の試薬の任意の混合物と解釈されるべきである。好ましくは、用語「核酸ライブラリを調製するために必要な試薬」は、NGSのために直接的に使用することができる、すなわち選択される所定のNGSストラテジーと適合可能なNGS特異的アダプター配列を含む核酸ライブラリを調製するために十分な当該技術分野で既知の試薬の任意の混合物と解釈され得る。そのような試薬は、NGS特異的アダプター配列がプライマーの配列中に含まれるプライマー配列を含んでよく、試薬の混合物は、酵素、基質及びそのようなプライマーによってライブラリPCRを実施することを可能にする緩衝条件を含む。代替的には、そのようなNGS特異的なアダプター配列は、ライゲーションのために適切であってよく、かつ酵素リガーゼも含む試薬混合物中に供給され得る。
【００１７】
さらに、用語「生物学的試料から核酸を遊離又は精製するための手段」は、生物学的試料中の細胞又はその他の構造物から核酸を遊離するために、そして精製の場合には、上記核酸を不所望な試料デブリから許容可能な純度の形へと（用語「許容可能な」は、そのような精製された核酸の更なる目的に依存する）通常は水溶液中で十分に分離するために使用することが知られる、当該技術分野で既知の任意の複数の（of）化学的試薬及び／又は物理的エレメントと解釈されるべきである。そのような目的のために適した化学的試薬は、組織又は細胞を破壊及び／又は液状化し、こうしてそこに含まれる核酸を溶液中に放出させるにあたり使用される任意の当該技術分野で既知の界面活性剤及び／又は界面活性剤、カオトロピック剤、ヌクレアーゼ阻害剤等を含むバッファーを含む。同様に、核酸の遊離／精製の目的のための様々な試料処理方法で使用されるべき当該技術分野で既知の物理的エレメントは、例えばシリカ固体担体、例えばスピンカラム中の樹脂、シリカ膜、ビーズ等、更なる機械的破壊装置又は破壊エネルギーを発生する機械、例えば超音波発生装置等を含む。
【００１８】
次いで、本明細書で使用される場合に、用語「核酸」及び同等の「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドサブユニットの間にホスホジエステル結合を含むリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシドの重合体を指す。核酸としては、限定されるものではないが、例えばゲノムDNA、ミトコンドリアDNA又はmeDNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、microRNA、lncRNA及びそれらの様々な改変物を含むDNA及びRNAが挙げられる。核酸は、最も一般的には、様々な種類の生物から得られる生物学的試料のような天然源から得ることができる。他方で、核酸は、既知のヒトにより編み出された方法（例えば、PCRのような核酸増幅法）のいずれかにおいて合成、組換え、又はさもなくば産生することもできる。
【００１９】
本明細書で使用される場合に、用語「核酸源」は、核酸を含む又は核酸を含むと予想される液体又は固体のどちらかの任意の物質と理解される。核酸源は、例えば、合成核酸又は組換え核酸を含む人工的に作製した溶液、例えばなかでもライゲーション産物、電気泳動マーカー（いわゆる「ラダー」）、プライマーストック等を含有する溶液であってよい。しかしながら最も一般的には、核酸源は、生物又はそれを形成する細胞若しくはそれに由来する細胞、好ましくは患者から得られた臨床試料であるものとする。
【００２０】
本明細書で使用される場合に、用語「生物学的試料」又は単純に「試料」は、核酸及び／又は細胞材料を含有する様々な生物学的源を含むと解釈され、これには例えば哺乳動物細胞のような細胞の培養物が含まれるが、他にも真核性微生物の培養物、体液、体液沈殿物、洗浄液検体、細針吸引物、生検試料、組織試料、癌細胞、患者から得られたその他の種類の細胞、組織由来の細胞、若しくは疾患若しくは感染症について試験及び／又は処置される個体からのin vitro培養細胞、又は法医学的試料が含まれる。体液試料の例としては、限定されるものではないが、全血、骨髄、脳脊髄液（CSF）、腹膜液、胸膜液、リンパ液、血清、血漿、尿、乳糜、大便、射出精液、痰、乳頭吸引液、唾液、スワブ検体、洗液若しくは洗浄液及び／又はブラシ検体が挙げられる。
【００２１】
生物学的試料が上記システム中に供給されると、又は本発明の方法を実施する間に、その試料は、通常、核酸が放出される溶解物を得るための組成物と接触されることとなる。本明細書で使用される場合に、「接触」とは、試料と該組成物とを一緒にすること、曝露すること、インキュベートすること、又は混合することを意味する。「放出する」とは、遊離すること、獲得すること、及び／又は架橋を逆行させることを指す。試料から核酸を遊離するためには、プロテアーゼ活性及びpH緩衝が、該組成物から必要とされ得る。放出は、該組成物から、調査される試料中に存在する核酸以外の成分を沈殿させ、固定剤を除去／溶解する潜在的な活性を必要とし得る。放出は、加熱又は高密度焦点式超音波（HIFU）等の条件を必要とし得る。本発明の趣旨による一実施の形態においては、生物学的試料は、様々な溶液との接触及び核酸の放出を含む試料処理工程が行われる診断分析器等の自動化されたシステムと適合可能なカートリッジ中に導入される。
【００２２】
さらに、用語「カートリッジ」は、そのようなカートリッジを受け入れる又はそれと接続するために適切なより大きな機器の内側又は外側に嵌まるものとして移送又は移動することができる単独の物体として形成されるチャンバ及び／又はチャネルの自己充足型の集成物と理解される。カートリッジ中に含まれる幾つかの部材は、固く連結されていてよいが、その他はフレキシブルに連結されていてよく、カートリッジのその他のコンポーネントに対して可動であってよい。同様に、本明細書で使用される場合に、用語「流体カートリッジ」は、流体、好ましくは液体を処置、処理、排出、又は分析するために適切な少なくとも1つのチャンバ又はチャネルを含むカートリッジと理解される。そのようなカートリッジの一例は、国際公開第2007004103号に示されている。有益には、流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジであってよい。流体カートリッジに関しては、用語「下流」及び「上流」は、流体がそのようなカートリッジ中を流れる方向に対するものとして定義され得る。すなわち、流体が同じカートリッジ中の第二のセクションに向かって流れるカートリッジ中の流体路のセクションは、その第二のセクションの上流に位置しているものと解釈されるべきである。同様に、流体がその後に到達するセクションは、上記流体がその前に通過したセクションに対して下流に位置している。
【００２３】
概して、本明細書で使用される場合に、用語「流体」又は時々「マイクロ流体」とは、小さいスケール、通常少なくとも1つの次元又は2つの次元（例えば、幅及び高さ又はチャネル）においてミリメートル未満のスケールに幾何学的に制約される流体の挙動、制御及び操作を扱うシステム及び装置に対するものである。そのような小さい容量の流体は、小さいサイズ及び低いエネルギー消費しか必要としないマイクロスケールで移動、混合、分離又はさもなくば処理される。マイクロ流体システムは、マイクロニューマティックシステム等の構造物（圧力源、液体ポンプ、マイクロバルブ等）及びマイクロリットル、ナノリットル及びピコリットルの容量を取り扱うためのマイクロ流体構造物（マイクロ流体チャネル等）を含む。例示的なマイクロ流体システムは、欧州特許第1896180号、欧州特許第1904234号及び欧州特許第2419705号に記載されており、したがって、本明細書に示される発明の或る特定の実施の形態に導入し適用することができる。
【００２４】
本発明の本質のより完全な理解のためには、添付の図面と関連づけて考えて以下の詳細な説明に参照がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】液状化されたFFPE試料で実施された5プレックスqPCRの5つの産物に相当する電気泳動ゲル上の5つのDNAバンドを示す図である。
【図２】図1に示される5プレックスqPCRの5つの産物についてのqPCR増幅曲線を示す図である。
【図３】5プレックスqPCR産物のそれぞれの少なくとも4つの複製物についてのコピー数に対するCqの棒グラフを示す図である。
【図４】5プレックスqPCR産物のそれぞれについてのR二乗値の測定を示す図である。
【図５】5プレックスqPCRの、様々な程度の核酸断片化を区別する能力を示す図である。パネルAは、比較的インタクトなDNAを有する3つのFFPE試料から得られた結果を示している。パネルBは、より高い水準の断片化を有するもう一つの組の3つのFFPE試料からの結果を示している。最後に、パネルCは、かなり断片化されたDNAを含む6つの異なるFFPE試料からの結果を示している。
【図６】wt BRAF、V600M変異型BRAF又はV600K及びT1794C二重変異型BRAFのいずれかをコードする配列を含むプラスミドでそれぞれスパイクされた3つのFFPE試料で実施した、wt BRAFとV600K/R/M変異型のBRAFとを識別可能なBRAF特異的qPCRの結果を示す図である。
【図７】NGS特異的アダプターを含むプライマーを用いるライブラリPCRを使用する1つのタイプのNGS準備済みのライブラリの調製の原理を示す図である。野生型の配列（配列番号1）、V600Mの配列（配列番号2）及びV600K＋T1794Cの配列（配列番号3）が表されている。
【図８】wt BRAF、V600M変異型BRAF又はV600K及びT1794C二重変異型BRAFのいずれかをコードする配列を含むプラスミドでそれぞれスパイクされた3つのFFPE試料で実施したNGSの結果を示す図である。
【図９】本発明による最適化された試料採取から結果取得までのワークフロー（sample-to-result workflow）の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は概して、核酸試料の評価のためのqPCRベースのシステム及び方法と、NGSライブラリの調製のためのシステム及び方法とを統合したものである。そのような統合により、より迅速でより効率的な診断ワークフローがもたらされ、qPCRの実行から推論される核酸クオリティーについての情報を使用して、上記核酸がNGSデータ解析を続行するために十分に適しているかどうかを直接的に決定するために特に有益である。
【００２７】
こうして、qPCR及びライブラリ調製の両方のために、同一処理された全く同じ核酸が使用されるので、本発明はまた、qPCRによってスクリーニングされた主要なターゲット変異に対する診断情報と、NGSデータから得られるより広範な遺伝的背景とを直接的に比較するための独自の手段を提供する。
【００２８】
特に、本発明は、システム中に受容された核酸源（例えば生物学的試料）中に存在する核酸の定量的PCR（qPCR）分析をするのと並行して、上記核酸源からシーケンシング用核酸ライブラリを調製するための、
核酸を増幅し、そのような増幅の間に生成されるシグナルを検出可能にするために適した、qPCRを実施するために必要な試薬を含む熱サイクル用qPCR区画を含む定量的PCR（qPCR）を実施するための手段を含む自動化されたシステムであって、
核酸ライブラリを調製するための試薬を含む、熱サイクル用qPCR区画とは異なるライブラリ区画を含む核酸ライブラリを調製するための手段を更に含むことを特徴とする、自動化されたシステムを提供する。
【００２９】
好ましくは、熱サイクル用qPCR区画で実施されるqPCRは、マルチプレックスqPCR、すなわち単独反応において複数の配列を同時に増幅及び検出するqPCRである。マルチプレックスqPCRは、単独のqPCR混合物中で複数のプライマー組を使用するため、1つのチューブ、チャンバ又はその他のタイプのqPCR熱サイクル用区画において複数の産物を生成する。2種のプライマー組（通常は対）を使用するマルチプレックスqPCRは、デュプレックスと呼ばれ、しばしば2プレックスと示される。同様に、3種のプライマー組を用いるマルチプレックスqPCRは、トリプレックス又は3プレックスである。本発明において好ましいマルチプレックスqPCRの取り合わせは、2プレックス、3プレックス、4プレックス、5プレックス、6プレックス、7プレックス又はそれ以上を含む。
【００３０】
したがって、好ましい実施形態においては、qPCRを実施するために必要な試薬は、それぞれ異なるアンプリコンに対する、好ましくは2、3、4、5、6、7又はそれ以上である複数のプライマー組を含む。
【００３１】
ロバスト性のマルチプレックスqPCRを設計することが容易でないことは、当該技術分野では良く知られている。それというのも、そのアッセイは、多数の個々のプライマー組（通常は、プライマー対）が、1つの反応チューブにおいて、したがって一式の単独の反応条件の下で、それらの固有のアンプリコンを特異的にターゲティングすることが必要とされるからである。プライマー設計は、典型的には、プライマー純度（17塩基長〜30塩基長）を考慮に入れ、G/Cリッチドメイン及びA/Tリッチドメインのバランスを取り（20%〜70%のG+C）、55℃〜80℃の間の融解温度に設定し、相補的3’末端塩基対が生成されることを避け、プライマーの自己相補を避け、そして、特に真核性ゲノムDNAのような複雑な試料でマルチプレックスが実施されるべき場合にはプライマーの3’末端で1つ以上のC又はGを避ける。PCRプライマーの設計を補助する幾つかのウェブベースのプライマー設計ソフトウェアツールが利用可能である（例えば、Primer3Plus）。その他の要因、例えばプライマーの相対濃度、PCRバッファー成分の正確な濃度、塩化マグネシウム濃度とデオキシヌクレオチド濃度との間のバランス、サイクル温度及び熱サイクル用DNAポリメラーゼ等はまた、しばしば、マルチプレックスqPCRがうまくいくようにするために微調整する必要がある。とりわけ、アニーリング温度及びバッファー濃度の最適な組み合わせを見出すことは、マルチプレックスPCRにおいて、高度に特異的な増幅産物を得るためには必須である。塩化マグネシウム濃度は、dNTPの量と比例している必要があるが、一方で、それぞれのターゲットのためのプライマー濃度は、比較的ロバスト性であるべきである。適切なポリメラーゼの選択は、反応の成果に影響を及ぼすこともある。理論上、マルチプレックスPCRは、標準的なPCRポリメラーゼを用いて実施することができるが、実際には、高度にプロセッシブ型で高感度のDNAポリメラーゼ、例えばGoTaq又はAmpliTaqを使用することが好ましい。特に高感度な用途のためには、マルチプレックスqPCRの更なる変更、例えばDNAザイム又はMNAザイムを用いるマルチプレックスqPCRは、本発明における用途に有益であることがある。本明細書で述べられる要因の一覧及びマルチプレックス最適化のストラテジーは、決して外延的なものと解釈されるべきではなく、当業者によって直ちに理解されるものである。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明のシステム及び方法におけるqPCRの定量化は、検量線法に基づくものであるが、その他の定量化ストラテジーを使用することもできることは、当業者によって直ちに理解されるものである。
【００３３】
同様に、多くの種々の一般的なタイプの蛍光色素又は検出プローブを、本発明のシステム及び方法において使用することができる。好ましい実施形態においては、配列特異的プローブ、例えばエキソヌクレアーゼプローブ、ハイブリダイゼーションプローブ又は分子ビーコンから選択されるプローブが使用されることとなる。そのようなプローブは、アッセイに特異性を与えるだけでなく、マルチプレックス用途を可能にするのに重要である。実施例に示されるように、本発明の方法は、Taqmanプローブを使用することで効果的に適用されたが、その他のプローブも同様に適切であろう。
【００３４】
本発明の更なる一態様においては、核酸クオリティーの評価のために特に適切なマルチプレックスqPCRが、様々なサイズのアンプリコンを生成するマルチプレックスqPCRであることが述べられている。アンプリコンのサイズ範囲は、より小さいサイズのAxからより大きいサイズのAy（ここで、x<y）までにおよび、典型的には50 bp〜600 bpのサイズ範囲である。好ましくは、より小さいAxのサイズは、50 bpから110 bpまでの範囲であり、その範囲の間のどの長さであってもよい。好ましくは、Axは、60 bp±10 bpの間である。本明細書で実施例において更に示されるように、Axは、63 bp又は105 bpである。好ましくは、より大きいAyのサイズは、300 bpから550 bpまでの範囲であり、その範囲の間のどの長さであってもよい。実施例に更に示されるように、Ayは、504 bp（例えば、TRFC遺伝子について）、或いは318 bp（例えば、β−アクチン遺伝子について）である。RNAシーケンシングの場合に、特にmicroRNA（例えば、15 bp〜35 bpのサイズ範囲）に焦点を絞った用途において、より小さいAxサイズ範囲を、相応して小さくする必要があることがある。当業者に理解されるように、本発明の目的のためのマルチプレックスqPCR設計の間に、好ましいアンプリコンサイズは、有益には、アンプリコンの長さによるNGSカバレッジについての最も適切な推定を提供するために、選択されたNGS用途に応じて選択され得る。
【００３５】
原則的に、そのようなクオリティーコントロールマルチプレックスqPCRを実施するために、ターゲットは、任意の遺伝子又はゲノム領域から選択することができる。しかしながら、癌のような遺伝的に不安定な状態の診断のためには、それらの変異した配列又はコピー数の変化を有する可能性のある疾患感受性領域を避けることがより好ましい。したがって、好ましい一実施形態においては、クオリティーコントロールマルチプレックスqPCRのターゲットは、単一コピー遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子のエキソン内配列から選択される。上記解決策の更なる利点は、エキソン内領域に対する同じターゲット配列が、DNAクオリティー及びRNAクオリティー両方のライブラリ材料としての評価において使用することができるということである。このため、1つの試料からのゲノム及びトランスクリプトームの両方をシーケンシングするには、DNAベース及びRNAベースの両方の構築が必要とされ、したがってその両方についてのクオリティー検証も必要とされる場合、本発明のクオリティーコントロールマルチプレックスqPCRの設計が特に有用である。このように、好ましい一実施形態においては、本発明のシステム及び方法で使用されるべきクオリティーコントロールマルチプレックスqPCRは、単一コピー遺伝子における少なくとも1つのエキソン内配列をターゲットとする。場合によっては、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ又はそれ以上の単一コピー遺伝子における1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ又はそれ以上のエキソン内配列がターゲットとされる。ハウスキーピング遺伝子の代わりに、DNAライブラリ構築において、反復配列（例えば、LINE又はSINE、例えばAluエレメント）が対象となるターゲットであってよい。実施例部に示される限定されない例としては、本発明の方法は、RNアーゼP遺伝子、HPRT1遺伝子、β−アクチン遺伝子、TRFC遺伝子及びABCB1遺伝子のエキソン内配列で効果的に実施される。
【００３６】
好ましい実施形態においては、本発明による自動化されたシステムは、熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画に対して上流に位置する少なくとも1つの核酸源受容区画を更に含み、利用者は、その区画中に核酸含有源（nucleicacid-containing source）、例えばスクリーニングすることが望まれる生物学的試料を容易に供給（例えば、挿入又は注入）することができる。
【００３７】
好ましい実施形態においては、核酸源は、生物学的試料である。好ましくは、試料は、採取したての試料、採取したての凍結試料、細針吸引物、保存のために処置され、固定化処置のため反応性部位の架橋を含み得る試料、ワックス接触試料若しくはワックス包埋試料、FFPE切片の形のFFPE試料、液体試料、例えば尿試料、血液試料、血清試料又は任意のその他の臨床試料である。
【００３８】
上記実施形態と適合性の高いもう一つの実施形態においては、本発明の自動化されたシステムはまた、受容された核酸源から核酸を遊離又は精製するための手段も含み、上記手段は、熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画に対して上流で、かつ核酸源受容区画に対して下流に位置し、核酸源受容区画と流体連通しているか、或いは上記核酸源受容区画中に含まれている。そのような手段は、受容された試料の残りの成分からの核酸の分離及び／又は精製に導く機能を発揮するエレメントの任意の複雑又は単純な取り合わせを含み得る。
【００３９】
本発明のシステム及び方法に導入されると、生物学的試料は、通常、核酸の放出をもたらす組成物と接触させることによって処理されることとなる。好ましい実施形態においては、該組成物は、マイクロ流体分析器で使用するように最適化されており、好ましくは、有機溶剤ではなくサーファクタントを含有する。上記組成物との混合は、通常は、そのような処理された試料のマイクロ流体システムを通じた輸送も容易にする。試料がFFPE試料である実施形態においては、上記組成物中に含まれるサーファクタントは、好ましくは非イオン性である。FFPE試料から得られる核酸は、一般的に、ヌクレオチドとヌクレオチドとの架橋及びヌクレオチドとタンパク質との架橋、塩基修飾並びに核酸の完全性に影響を及ぼすその他の化学的修飾を含む。本発明の好ましい方法は、非イオン性サーファクタントを導入し、その他の有機溶剤を使用せずに、包埋されたワックスの自動化された除去及び成分の遊離を可能にする。このことが特に有益であるのは、そのサーファクタントが、遊離された核酸を、PCRを介した核酸増幅のような酵素活性を必要とする小規模用途と適合する条件及び環境に置くからである。一実施形態においては、試料から放出される溶解物及び／又は成分は、診断分析器においてマイクロ流体システムを使用して更に処理されることとなる。
【００４０】
任意に、遊離された核酸は、本発明の自動化されたシステムでのqPCR及び核酸ライブラリ構築のための鋳型として直接的に使用するために十分に純粋な形で提供される。好ましい実施形態においては、核酸遊離手段は、流体装置又はマイクロ流体装置においてその機能を発揮する。そのような事例において、そのような核酸遊離手段を形成するエレメントは、一連の連続した、又はさもなくば流体連通したチャンバ又はチャネルのような区画を含んでよく、その少なくとも幾つかには、溶解バッファー、酵素溶液、抽出バッファー、結合バッファー、及び／又は洗浄バッファーのような試薬が供給されているか、又はその少なくとも幾つかは、任意に、機械的な試料洗浄又は核酸の結合、洗浄及び放出のような処理を容易にする、当該技術分野で既知の物理障壁、例えばフィルタ又は高親和性樹脂のいずれかを含む。核酸遊離のためのそのような手段及び代替的な手段は、当該技術分野で良く知られており、したがって本明細書においては、あまり詳細には論じないこととする。
【００４１】
もう一つの有益な実施形態において、自動化されたシステムは、受容された核酸源又は該核酸源から遊離若しくは精製された核酸を、少なくとも熱サイクル用qPCR区画とライブラリ区画とに分割するための手段を更に含む。そのような手段は、例えば、核酸源受容区画又は上記核酸源から遊離された核酸が核酸遊離過程の最終工程で堆積される区画から、熱サイクル用qPCR区画中及びライブラリ区画中のそれぞれに延びる2つの別々のチャネルを含むことができる。選択された区画の間に核酸を能動的に輸送するために、本発明の自動化されたシステムは、所望の量の流体を規定された方向へと押す又は引くことが可能な圧力勾配を提供することができる。ポンプ、吸引装置、マニホールド等によるそのような圧力勾配の生成は、現在のマイクロ流体システムで広く使用されており、したがって、当該技術分野で良く知られている。
【００４２】
もう一つの好ましい実施形態においては、本発明の自動化されたシステムは、それぞれライブラリ区画から物理的に離れた2つ以上の熱サイクル用qPCR区画を含み、ここで、熱サイクル用qPCR区画のそれぞれは、qPCRを実施するために必要な試薬を含み、核酸の増幅のために適切であり、かつそのような増幅の間に生成されるシグナルの検出を可能にする。そのような実施形態においては、第二の後続の熱サイクル用qPCR区画は、好ましくは、選択された特異的マーカーをスクリーニングするために使用され得る。
【００４３】
本発明は、好ましくは、カートリッジ式のシステムを提供する。したがって、別の態様において、1つ以上の熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画、好ましくはまた核酸源受容区画並びに受容された核酸源から核酸を遊離するための手段は、上記自動化されたシステムと係合可能な1つのカートリッジ中に含まれる、好ましくは流体又はマイクロ流体カートリッジである、自動化されたシステムが提供される。
【００４４】
本発明の目的のために適切なマイクロ流体カートリッジは、当該技術分野で既知である。好ましくは、そのようなカートリッジは、熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画を含む少なくとも2つの反応チャンバと1つ以上の流体チャンバとを含み得る。流体チャンバの幾つかは、試料から溶解物を生成するために使用される流体を保持し得る。その他のチャンバは、洗浄流体及び増幅溶液等の流体を保持し得る。熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画としては、別々の反応チャンバが使用される。熱サイクル用qPCR区画として機能するように構成されるチャンバは、その他の増幅試薬及びqPCRの実施のために必要な酵素と一緒に、多くのプライマー組を含む。ライブラリ区画として機能するように構成されるその他のチャンバは、選択されたNGS用途のための核酸ライブラリを構築する工程を実施するように適合される。試料の一部は、反応チャンバへ移送されることとなり、そのような移送を可能にするために、チャンバは、1つ以上の流体チャネルに連結される。これらの流体チャネルの少なくとも1つであるが、好ましくはそれぞれにおいて、バルブ手段が設けられていてよく、そのバルブ手段は、好ましくは通常、流体チャネルを閉じるが、該バルブ手段が動作したときに流体チャネルを開放し、それによりそれぞれ2つのチャンバが流体連通される。バルブ手段は、一方向弁として設計され得る。
【００４５】
別の有益な実施形態において、本発明はまた、qPCRを実施するための手段は、以下：
そのqPCRに供される核酸のクオリティーを評価するために適したクオリティーコントロール（QC）qPCR、又は、
そのqPCRに供される核酸中に存在する可能性のあるゲノム改変の存在若しくは量を測定するために適した非クオリティーマルチプレックスqPCR、
のいずれかを実施するように適合されている、すなわち実施するのに必要な成分を全て含む、自動化されたシステムを提供する。
【００４６】
また、QCqPCRは、マルチプレックスQC qPCRであり、かつ自動化されたシステムは、上記マルチプレックスQC PCRから得られたデータからクオリティー測定量の出力を生成するための手段を更に含む、自動化されたシステムが提供される。そのようなクオリティー測定量の出力は、ライブラリの作製に使用されるべき核酸又は既にライブラリ区画中で作製された後のライブラリ自体からの核酸のどちらも特徴付けることができる。したがって、可能な実施形態においては、本発明の自動化されたシステムは、ライブラリ区画中で作製されたライブラリから核酸の一部を移送するための手段を更に含み得る。
【００４７】
特に好ましい実施形態において、本発明の自動化されたシステムは、熱サイクル用qPCR区画及びライブラリ区画を同時に又は逐次に作動させることが可能である。つまり、3つの作業モードを想定することができる：（i）両方の区画は、核酸が区画に供給されたら作動し、こうしてライブラリ調製は、qPCRとは独立であり、qPCRと並行して進行する；（ii）まずqPCRが行われ、次いでライブラリが作製され、このように、qPCRの結果が分かったらシーケンシングのためのライブラリを調製する決断がなされ、その決断はこれらの結果に依存し得る；（iii）まずライブラリが作製され、次いでqPCRは、ライブラリクオリティーの検証のために、そのライブラリに対して行われる。
【００４８】
上記選択肢（i）は、核酸試料の一部からのNGSのためのライブラリの調製を、同じ核酸試料の別の部分に対するqPCRアッセイと同時に実行し、両者を、好ましくはカートリッジ式のマイクロ流体システム中で並行して行う同時の作業を記載している。本明細書で使用される場合に、用語「同時に」又は「並行して」とは、同じ時点で起こる又は同じ時点で行うことを指す。そのような取り合わせにおいては、qPCRは、核酸試料からの一部に対して行われるのと同時に、NGS用途のための核酸ライブラリが、同じ核酸試料からの別の部分から構築される。すなわち、同時の作業の間に、qPCRを介した試料の分析及びライブラリ構築の両方が、本発明の自動化されたシステムによって同時に実行される。
【００４９】
それに対して、上記選択肢（ii）及び（iii）は、両方とも「逐次に」作動されるものとして記載され得る。逐次の作業の可能な一実施形態においては、少なくとも2つの熱サイクル用qPCR区画が、本発明の自動化されたシステムにおいて作動する。例えば、第一のqPCRは、対象となるマーカーの発現を読み取り、そして該システム中に供給される核酸源のクオリティーを検証するために行われ得る。この第一のqPCRの後に（逐次）、又は時間を節約するために、上記第一のqPCRと並行して（同時に）、ライブラリが構築される。次いで、第二のqPCR又はコントロールqPCRを、このようにして構築されたライブラリに対して、そのクオリティーが該ライブラリを更なる用途、例えばシーケンシングにかけるために十分であるかどうかを検証するために実施することができる。
【００５０】
シーケンシング用ライブラリの調製又は構築に関しては、最近では、シーケンシング準備済みのライブラリを生成する多くの様々な方式が存在し、それらの選択は、通常は、どのNGSストラテジーを実施することを意図しているかに依存する。一般に、NGSライブラリ生成は、所定のNGSと適合可能な核酸断片の生成を含む。したがって、好ましい実施形態において、ライブラリ区画は、該ライブラリ区画中に受容される核酸から核酸断片を生成する手段を含む、自動化されたシステムが提供される。
【００５１】
ほとんどの商業的に利用可能なNGSプラットフォームに関して、核酸断片の増幅は、シーケンシング用鋳型の十分なコピーを生成するのに必要である。このように、好ましくは、核酸断片は、更に「ライブラリPCR」と呼ばれるPCRにおいて生成される。適切なライブラリPCRは、当該技術分野で既知であり、ブリッジ増幅又はエマルジョンPCR等の方法を含む。
【００５２】
最も多くは、シーケンシング準備済みのライブラリを形成する核酸断片は、NGSプラットフォームに特異的なオリゴヌクレオチドアダプターを含む。そのようなアダプターは、ライゲーション又はPCRを介して核酸断片中に導入され得る。上記による特定の実施形態において、ライブラリ区画は、オリゴヌクレオチドアダプターを、核酸断片の少なくとも一方の末端、好ましくはその両末端に結合させるための手段を含む。有益には、核酸断片はライブラリPCRにおいて生成され、オリゴヌクレオチドアダプターの上記核酸断片への結合は、上記ライブラリPCR中に使用される少なくとも1つのプライマーの配列中にアダプター配列を含めることによって実施される。
【００５３】
核酸断片を含むNGSライブラリは、対象となる核酸源、例えばゲノムDNA、二本鎖cDNA及びPCRアンプリコンから得ることができる。アダプター配列の存在は、ライブラリ分子の選択的なクローナル増幅を可能にする。
【００５４】
既に上述したように、核酸ライブラリの構築は、DNAシーケンシング、RNAシーケンシング、及びその他の用途、例えばシーケンシングベースのメチル化解析のために必要とされる。RNAシーケンシング（RNA-seq）は、生物のトランスクリプトームを、ディープシーケンシング技術を使用して調査する方法である。トータルRNAは、一般的に、非常に小さい割合にすぎないコーディングRNA又は機能的RNA、リボソームRNA（rRNA：トータルRNAの80%〜90%まで）、そしてより少ない程度のトランスファーRNA（tRNA）を含み、それらが試料中のRNAの大部分を構成する。しばしば、反復rRNA配列に対するそのシーケンシング能力の80%〜90%を使用しないために、rRNAを、シーケンシング前に試料から除去することができる。rRNAの除去後のRNAが、ライブラリにされる。これは、RNA（又は断片化されたRNA）からの逆転写による二本鎖cDNAの作製を含む。次いで、この二本鎖cDNAは、それを適切なNGSストラテジーに特異的なアダプターと結合させることを含む残りのライブラリ構築過程全体を通じて、通常のゲノムDNAとして取り扱うことができる。
【００５５】
別の態様において、以下：
自動化されたシステム中に受容された核酸源の一部、
自動化されたシステム中に遊離された遊離核酸の一部、
自動化されたシステム中で調製された核酸ライブラリの少なくとも一部、
のいずれかを回収するための回収区画を更に含む、自動化されたシステムが提供される。
【００５６】
そのような回収区画は、本発明のシステムの作動の間に反応が行われない別のチャンバを含んでもよく、又は単純に該チャンバでできていてよい。そのような回収は、好ましくは、本発明の自動化されたシステム又は自動化されたシステムのカートリッジの外側から容易にアクセス可能であるものとする。例えば、上記回収区画は、シリンジの針又はピペットによって穴を空けることができ、こうしてその内容物を吸引することが可能となる穴を空けることができる材料（例えば、フォイル又はフィルム）でできた壁部を含み得る。代替的には、回収区画を、上記のいずれかと選択的に流体連通させて、そしてポンプ動作によって、本発明の自動化されたシステムのインターフェースを通じて利用者により示される指示に従ってそれを充填することができる。
【００５７】
可能な実施形態においては、そのような回収区画は、本発明の自動化されたシステムと係合可能又は連結可能な外部容器、例えばプラスチックチューブ又はバイアルであってよい。そのような事例においては、以下のような区画：
自動化されたシステム中に受容される核酸源の少なくとも一部又は該核酸源から遊離された核酸の少なくとも一部を収容する区画、
ライブラリ区画、
熱サイクル用qPCR区画、
のいずれかは、それらの区画と回収区画とを、上記の列挙された区画のいずれか1つに含まれる内容物の少なくとも一部を回収区画中に移送することが可能な任意の手段によって流体連通させることが可能な構造（例えば、チャネル又はチャネルを形成するエレメントと係合可能な区域のような延長部）を含み得る。
【００５８】
有益な実施形態においては、ライブラリ区画は、その区画をNGSが行われる区画と直接的に流体連通させることができる構造を含んでよく、場合によって上記区画は、別のシステム、つまり自動シーケンサ等のシステム中に含まれている。
【００５９】
更なる態様においては、本発明はまた、qPCR分析と並行してライブラリ調製を実施する有益な方法を提供する。従来のアプローチにおいては、核酸試料は、最初にクオリティーコントロール工程に供され、これらの工程の結果が分かった後にのみ、上記試料は、次いでシーケンシング用ライブラリの生成のために使用される。そのような連続処理においては、核酸は、結果が分かるまで或る特定の時間量にわたって貯蔵され、その間、核酸は分解され得る。こうして、より早期のクオリティーコントロールアッセイにおいてライブラリ調製のために適していると特徴付けられているにもかかわらず、核酸試料は、ライブラリ構築のために使用されるまで、例えば、多すぎる融解凍結サイクル又はその他の貯蔵の間の誤りにより、既にクオリティーが低下され得る。幾つかの、特にRNAに適用可能な場合においては、これは、NGSの失敗さえももたらし得る。また、連続的アプローチは、労力を要し、時間を浪費し、かつ異なる試料からのデータが混合する危険を伴う。本発明は、上述の課題を、クオリティーコントロールqPCRを実行する工程を、同じ自動化されたシステムで同じ核酸試料を使用してNGSに適したライブラリを構築する工程と並行して含む方法を提供することによって解決する。好ましくは、これらの工程の両方は、カートリッジ式のマイクロ流体システム中に嵌まる1つのカートリッジで実施される。
【００６０】
したがって、本発明は、qPCRを、核酸ライブラリの調製と並行して、少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画と、該少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画とは異なるライブラリ区画とを含む本発明による自動化されたシステムにおいて実施するための方法であって、
a）核酸を含む核酸源を、自動化されたシステム中に受容する工程と、
b）上記自動化されたシステムにおいて、上記受容された核酸源の少なくとも一部から核酸を遊離又は精製する工程と、
c）核酸源から遊離又は精製された核酸に対して、上記システム中に含まれ、核酸の増幅のために適した熱サイクル用qPCR区画において上記核酸を熱サイクル処理することを含むqPCRを実施し、そのような増幅の間に生成されたシグナルを検出可能にする工程と、
d）上記システム中に含まれるライブラリ区画中で核酸ライブラリを調製する工程と、
を含み、ここで、工程c）及び工程d）は、上記自動化されたシステムにおいて、逐次又は同時のいずれかで実施される、方法を提供する。
【００６１】
好ましくは、工程c）及び工程d）が、上記自動化されたシステムにおいて着脱可能なカートリッジで実施される方法が提供される。最も好ましくは、工程a）〜工程d）が、上記自動化されたシステムにおいてカートリッジで実施される方法が提供される。
【００６２】
本発明の方法の好ましい実施形態においては、工程d）は、更に「ライブラリPCR」と呼ばれるPCRを実施する工程を含む。
【００６３】
先に説明したように、本発明の態様の一つは、コントロールqPCRを、NGSのためのライブラリの調製と並行して実行することを含み、ここで、該手順の両方とも、同じ核酸源（試料）からの核酸、好ましくは臨床試料から遊離された核酸を使用する。好ましい実施形態においては、該手順の両方とも、1つのカートリッジ中で、好ましくは分析器型の装置と係合可能なマイクロ流体カートリッジである1つのカートリッジ中で実施されるので、そのカートリッジは、本発明による方法の工程を実施するための自己充足型の使い捨てプラットフォームである。そのような有益な実施形態においては、本発明の方法を実施するために必要とされる試薬の全ては、好ましくは乾燥形又は凍結乾燥形における貯蔵を考慮して、そのようなカートリッジ内に事前配置される。
【００６４】
したがって、別の好ましい実施形態において、本発明はまた、
qPCRの実施のために必要な試薬を含む少なくとも1つの熱サイクル用qPCR区画と、
熱サイクル用qPCR区画とは異なる少なくとも1つのライブラリ区画と、
を含み、上記ライブラリ区画が、核酸ライブラリを調製するために必要な試薬を含む、本発明による自動化されたシステムのためのカートリッジを提供する。
【００６５】
好ましい実施形態において、このようなカートリッジはまた、
少なくとも1つの核酸源受容区画及び、好ましくはまた、受容された核酸源から核酸を遊離するための手段と、
受容された核酸源又は該核酸源から遊離された核酸を、少なくとも熱サイクル用qPCR区画とライブラリ区画とに分割するための手段と、好ましくはまた、
自動化されたカートリッジ又は患者識別のためのカートリッジに特異的な識別子と、
を更に含む。
【００６６】
好ましくは、そのようなカートリッジは、「試料を取り入れ、クオリティーが確認された核酸ライブラリを出力する」統合されたアプローチを特徴とするより高いスループットの自動化プラットフォームに組み込み可能である。このように、熱サイクル用qPCR区画内で測定される核酸クオリティー測定量は、NGSで使用するために核酸ライブラリと一緒に送達されることとなる。クオリティー測定量の出力に基づき、核酸ライブラリは、NGS用途に更に供するために、本発明の自動化されたシステムにおいて選択又は除外され得る。
【００６７】
本発明は、試料を取り入れるところから測定量を出力するまでに種々の工程を有するワークフローの効果的な自動化をもたらす。本明細書に表されるアプローチは、最小の所用時間、より低い費用、そして改善されたNGS成功率をもたらすための大きな可能性を有する。これにより、本発明の自動化されたシステム、方法及びカートリッジは、FFPE試料等の難しい試料で使用するために特に適したものとなる。これは、本発明のアプローチが、長期の貯蔵期間後に同じ試料で実施された連続的実行の間に見られる変動性を最小限にし、こうしてNGSライブラリ構築の前の核酸条件をより正確に評価する（assess）ことを可能にすることに、少なくとも部分的に由来している。
【００６８】
上記の一般的な記載及び詳細な説明は両者とも例示的かつ説明的なものであるにすぎず、特許請求の範囲に記載の発明を何ら制限するものではないと理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、特に記載がない限り複数を含む。本出願において、「又は」の使用は、特に記載がない限り「及び／又は」を意味する。用語「含む、挙げられる（"including", "includes" or "included"）」の使用は、非限定的である。
【実施例】
【００６９】
実施例1：核酸の試料採取から出力までの自動化された評価のためのQC qPCRの開発
最初に、試料中に存在する核酸の量及びクオリティーを完全に自動的に評価する目的のために、クオリティーコントロール（QC）qPCRアッセイを開発した。それぞれ異なる単コピーのヒト遺伝子から得られる様々な長さのアンプリコンの存在についての当該QC qPCRは、NGS用途のための核酸の適性を評価するために役立つ。アンプリコン及びそれらの長さは、以下の通りである：（1）ヒトRNアーゼP遺伝子由来の63 bp断片、（2）HPRT由来の105 bp断片、（3）TFRC由来の149 bp断片、（4）ABCB由来の213 bp断片、及び（5）β−アクチン由来の318 bp断片。1度のPCR反応での複数の断片の増幅（5プレックス）を、最初に液状化されたFFPE試料（Horizon FFPE試料）に対してGoTaqポリメラーゼ及びTaqmanプローブ（供給元によって特定された組成）を用いて行われたqPCRを使用して検証した。qPCRプログラムは、95℃で5分間保持し、引き続き95℃で5秒間、64℃で44秒間を50サイクルであった。図1は、TBE中での電気泳動後のSYBRグリーン染色された10%ポリアクリルアミドゲル上の得られた断片（左のレーン）とその隣のDNAラダー（右のレーン）とを示している。同じ試料の相応のqPCRプロファイルは、図2に示されている（アンプリコンのサイズは、相応の曲線の隣に示される）。Biorad社製CFX Manager 3.1に内蔵される回帰アルゴリズムで決定されたCq値は、（1）63 bp断片（RNアーゼP）に関して26.1であり、（2）105 bp断片（HPRT）に関して25.6であり、（3）149 bp断片（TFRC）に関して26.0であり、（4）213 bp断片（ABCB）に関して26.2であり、かつ（5）318 bp断片（β−アクチン）に関して27.4である。
【００７０】
次に、断片化されていないヒトゲノムDNAに対する5プレックス性能を評価することで、検量線と一緒に5つのアンプリコンのそれぞれについてのR二乗値を得た。そのために、173 μg/mlの断片化されていないヒトゲノムDNA（Promega）を基質として使用し、そして3.3 pg／半数体のゲノムを前提として用いてコピー数を推定した。1つのPCR当たりに24000コピーで4複製物が、6000コピーで4複製物が、1500コピーで8複製物が、375コピーで8複製物が、94コピーで12複製物が、23コピーで16複製物が、5.9コピーで20複製物が、そして1つのPCR当たりに1.5コピーで24複製物が増幅され、上記のようにCqが決定された。Cqの中央値を、非増幅（いわゆる、フラットライナー）を省いて決定した。この実験を表す棒グラフは、図3に示されている。検量線は、それぞれのアンプリコンについて対数回帰を使用して推定し、R二乗値は、図4で例示されるように、完全なデータセット並びに1つのPCR当たりそれぞれ5.9コピー及び1.5コピーの両方からのCq値を含まないデータセットについて測定した。予想されるように、R二乗値は、2桁のコピー数におけるデータ点だけでは、より良好に1に近づく。34未満のCq値に関しては、最も高いR二乗値を有する等式を使用した。とりわけ、34を上回るCq値については、その定量化は、確率的影響のためあまり正確でないことが分かる。こうして上記等式に従って計算された5種のアンプリコンのそれぞれのコピー数は、所定の試料における有用なDNA含量及び核酸断片化の程度の両方の測定を可能にする。log2（投入コピー数）とCqとの間の線形回帰の方向係数の分析は、アンプリコンのそれぞれの5プレックスqPCRにおける増幅の効率の更なる指標を提供する。当該技術分野で既知のように、完璧なqPCRは、1サイクル当たりアンプリコンの量（したがってまた、正味のTaqman蛍光）を二倍にすると推定され、絶対方向係数1から離れることとなる。こうして、図4に示されるように、318 bpの最大のアンプリコンを除く全てのアンプリコンについての絶対方向係数は、0.9又はそれより高く、そのことは、1PCRサイクル当たりTaqmanプローブ分解の倍に近いロバスト性の増幅を指摘している。最も大きいアンプリコンサイズは、0.8より高い絶対方向係数を示し、そのことは、最も大きい断片が、より遅く増幅すること、そしてこのタイプのTaqmanプローブベースのアッセイについてより長いアンプリコンを用いてPCR  QC試験を設計することにほとんど意味がないことを指摘している。
【００７１】
実施例2．自動化されたFFPE試料処理、核酸クオリティー評価、アクショナブルなターゲットマーカーのスクリーニング及びライブラリ構築
本発明の実現可能性を実証する目的のために、それぞれのカートリッジが、別々のPCRチャンバ中に、（i）上記の5プレックスQC qPCRを実施するための試薬と、（ii）wt及びV600M／R変異型のBRAFを検出するためのターゲットqPCRを実施するための試薬と、（iii）Illumina社製MiSeqシーケンサと適合可能なDNAライブラリを構築するための試薬とを含む一式のBiocartis社製Idyllaカートリッジを準備した。次いで、上記カートリッジで分析されるべき一式のFFPE試料を、ヒトBRAFをコードするプラスミドでスパイクした。臨床的な現実をシミュレートするために、野生型（wt）BRAF配列を含む断片、V600M変異をコードする断片、並びに2つの変異V600K及びT1794Cをコードする断片を含む種々のBRAF配列を使用した。2つの変異した断片を、FFPE試料中に存在する野生型コピーの量に対して種々の量でスパイクすることで、それぞれ10%及び5%の相対濃度を得た。種々のBRAFでスパイクされたFFPE試料のそれぞれを、個別のカートリッジ中に導入し、Biocartis社製Idylla機器で完全に自動的に処理した。要するに、その処理は、試料液状化（例えば、国際公開第2014128129号中に記載される）に引き続き、カートリッジ中に設けられるシリカ膜での核酸精製を行い、次いで並行して実施される3つの独立した個別に制御されたPCR反応を行うことを含み、それらのPCR反応は、（i）上記のクオリティーコントロール5プレックスQC qPCRによる精製された核酸のクオリティーの検証と、（ii）選択されたBRAFターゲットのリアルタイム検出（アクショナブルなターゲット変異に関するqPCR）と、（iii）Illumina社製のMiSeqシーケンサと適合可能なリンカーを含むBRAF特異的又は標準的なランダムプライムするプライマーを使用したDNAライブラリの構築とを含んでいた。このライブラリ構築PCRは、Q5高忠実度ホットスタートポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用して実施し、以下のプログラム：95℃で5分間及び60℃で90秒間、94℃で5秒間の50サイクルに従ってサイクル処理した。
【００７２】
図5は、種々のFFPE試料に対する5プレックスQC qPCRの結果を示しており、それらは、上記試料中に存在するDNAの完全性に関する情報を提供する。パネルAは、比較的インタクトなDNAを含むFFPE組織試料の3つの例を示す。パネルBは、わずかにより高い程度のDNA断片化を有するその他の3つの例を示す。最後に、パネルCは、かなり断片化されたDNAを含むFFPE組織試料の6つの例を示す。パネルCは、そのような試料をNGSによる更なる分析に供するための反対指示である。
【００７３】
その5プレックスQC qPCRの結果に基づいて、比較的インタクトなDNAを有し、3種の異なる形のスパイクされたBRAF（wt、V600M変異体、又はV600K＋T1794C二重変異体）を含む3つの試料を、更なる調査に選択した。最初に、wt BRAF及びV600M BRAF変異体を検出可能なアッセイqPCRから得られた結果を検討することで、正確なBRAF形の存在を確認した。結果を図6に示す。それらの結果は、スクリーニングされた3つのFFPE試料の全てにおいて、wt BRAFシグナルを検出することができることを裏付けている（図6、左欄、用語「ターゲット」とは、wt BRAF配列を指す）。種々のBRAFプラスミドでスパイクする前の全てのFFPE試料が、wtゲノムBRAF配列を含むことは分かっているので、この結果は予測された。V600M変異体の検出に関して（図6、右欄、用語「ターゲット」とは、V600M／K BRAF配列を指す）、予想されるように、wt BRAFをコードするプラスミドでのみスパイクされた試料においては、V600M変異体は検出することができなかった（図6、右の上部、ターゲットに関しては平坦なシグナル線）。しかしながら、V600M変異体又はV600K＋T1794C二重変異体のいずれかでスパイクされたFFPE試料においては、変異V600Mは、予想される量で正しく検出された（図6、右欄、下部と中央部）。本明細書で使用されるBRAF特異的なqPCRは、T1794C変異について特異的なプローブを含まなかったので、その変異は、二重変異体BRAFでスパイクされた試料において検出することはできなかった。
【００７４】
実施例3．選択されたNGSライブラリのシーケンシング
BRAF特異的なqPCRの結果を確認するとともに、未検出のT1794C変異の存在を検出するためにも、同じ3つの選択されたFFPE試料のプラスミド（wt、V600M、又はV600K及びT1794C）から構築されたNGSライブラリを、次いで、Illumina社製MiSeqシーケンシングにかけた。これらのライブラリを構築するために使用したライブラリPCRは、図7に概略的に示される。該ライブラリPCRは、上述のように5プレックス（5plex）QC PCR及びBRAF特異的アッセイqPCRと同じカートリッジで、それと並行して実施した。そのライブラリPCRは50サイクルを含み、単純化されたBRAF特異的融合プライマー（テイルドプライマーとしても知られる）を使用した。融合プライマー（図7の中央部に示される）は、ターゲット（BRAF）特異的配列以外にも、シーケンシング用プライマー配列及びフローセル結合のためのタグ（P5及びP7）を含んでいた。さらに、リバースプライマーはまた、シーケンシング実行の間に、種々の起源から得られた試料を識別することを可能にするバーコード（及び／又はインデックス）を含んでいた。そのようなバーコードを導入する理由は、一般的に、種々の試料又は患者から構築されたライブラリは、同じNGS機器でプールされ、シーケンシングされるからである。こうして、3つの異なるFFPE試料から得られたライブラリを区別するために、それぞれのカートリッジは、ユニークなバーコード配列を有する僅かに異なるリバースプライマーを含んでいた。
【００７５】
シーケンシング前に、3つのNGSライブラリを、それぞれのカートリッジから針付きシリンジを使用して回収し、その後に試料をプールし、ベンチで更に精製することで、あらゆる未反応のプライマー及びプライマーダイマーを除去した。この精製工程は、自動的に実施することもできることに留意すべきである。最後に、精製されたNGSライブラリを、Illumina社製MiSeq機器のフローセル中にロードし、シーケンシングした。
【００７６】
シーケンシング実行の結果は、図8に示されている。BRAF特異的qPCRの上記結果と一緒に、wt BRAFのみを含む第一の試料においては、変異は検出されなかった。その他の2つの試料については、全ての予想されたBRAF遺伝子変異は、BRAF特異的qPCRで捕捉することができなくても、シーケンシングの間に正しく同定された。特に、NGSは、ターゲット特異的qPCRで見逃されたT1794C BRAF変異を検出しただけでなく、変異体及び二重変異体でスパイクされたFFPE試料のそれぞれにおいてV600M変異とV600K変異とを識別することを可能にし、こうして、既に検出された変異のより一層正確な同定が提供される。当該結果は、本発明の前例のないロバスト性を裏付け、ここで、所望の結果が、迅速かつ効率的に提供されるだけでなく、より深い洞察が望ましい場合に、自由自在に効果的にフォローアップすることができる。
【００７７】
本発明のより完全な理解のために、上記のワークフローが、図9に図示されている。FFPE試料をカートリッジ中に供給することから始まり、その後に後続工程は、最終qPCRの結果（QC qPCR及びアクショナブルなターゲットマーカーqPCR、ここではBRAF）及び使用準備済みのライブラリが得られるまで、完全に自動的にかつ迅速に実施される（リアルタイムの枠組みが提供される）。全てのこれらの結果及びライブラリは、同一処理された同じ試料から得られ、それは、異なるアッセイからのデータの高い比較性を保証することに留意すべきである。とりわけ、並行したNGSライブラリ構築及び上記ライブラリのクオリティーに関する情報を提供することによって、本発明のアプローチは、所定の試料をNGSの臨床的フォローアップに迅速に供することを可能にするだけでなく、そのようなかなり費用のかかるフォローアップが、その試料のクオリティーを考慮して可能かどうかを決定することもできる。上記の点で、本発明は、現在の診断業務における新たな可能性を開く。
【符号の説明】
【００７８】
図面訳
図1
b-actin  b-アクチン
図2
Amplification  増幅
Cycles  サイクル数
図3
unfragmented human DNA  断片化されていないヒトDNA
図4
Linear  線形
copy number  コピー数
図5
little fragmentation  ほとんど断片化されていない
slightly more fragmented  わずかにより断片化されている
heavily fragmented  かなり断片化されている
Cq regression no normalization  Cqの正規化なしの回帰
amplicon length, in bp  アンプリコンの長さ（bp）
図6
Sample  試料
exon  エキソン
wild type  野生型
Positive control  ポジティブコントロール
Target  ターゲット
Arbitrary fluorescence units  任意の蛍光単位
Cycle  サイクル数
図7
wild type  野生型
F. Seq primer  フォワードシーケンシングプライマー
R. Seq primer  リバースシーケンシングプライマー
F. primer  フォワードプライマー
R. primer  リバースプライマー
index  インデックス
F. Seq  フォワードシーケンシング
R. Seq  リバースシーケンシング
図8
Sample  試料
exon  エキソン
wild type  野生型
Color by  色は以下の通り
A percentage  Aのパーセンテージ
C percentage  Cのパーセンテージ
G percentage  Gのパーセンテージ
T percentage  Tのパーセンテージ
Gap percentage  ギャップのパーセンテージ
Frequency  頻度
図9
plasmid  プラスミド
Liquefied sample  液状化された試料
library  ライブラリ
automated  自動的
Purified library  精製されたライブラリ
MiSeq run  MiSeqの実行
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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