(57)【要約】【解決手段】  単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器が開示される。各ユニットは、（ａ）捕捉部位３２２を有する流入経路３２０と、（ｂ）捕捉部位３２２の後に位置し、捕捉部位３２２から距離ｇだけ離れた受容部位３４２を有する大チャンバー３４０と、（ｃ）捕捉部位３２２と受容部位３４２の間に位置する捕捉経路３３０と、（ｄ）大チャンバー３４０の後に位置し大チャンバー３４０と流体接続するチャンバー経路３５０と、（ｅ）流入経路３２０、大チャンバー３４０及びチャンバー経路３５０の横に位置し、第１の端部３６０ａと第１の端部３６０ａの反対にある第２の端部３６０ｂを有し、第１の端部３６０ａは捕捉部位３２２のすぐ前の流入経路３２０から分岐し、第２の端部３６０ｂはチャンバー経路３５０と接続するバイパス経路３６０とを含む。１つより多くの種類の単一細胞を捕捉する方法も開示される。【選択図】  図３
2018525003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器であって、
前記単一細胞捕捉ユニットのそれぞれは、
（ａ）長さＬ１、幅Ｗ１、高さＨ１を有し、前端及び前記前端の反対側にある後端を有し、前記後端は捕捉部位を有する流入経路と、
（ｂ）直径Ｍ及び深さＤを有し、前記流入経路の前記捕捉部位の後に位置し、前記捕捉部位から距離ｇだけ離れた受容部位を有し、１つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び／又は移動するように形成された内部空間を有する大チャンバーと、
（ｃ）長さＬ２、幅Ｗ２、高さＨ２を有し、前記捕捉部位と前記受容部位の間に位置し、前記流入経路と前記大チャンバーとを流体連結する捕捉経路と、
（ｄ）長さＬ３、幅Ｗ３、高さＨ３を有し、前記大チャンバーの後に位置し、前記大チャンバーと流体接続し、前端及び前記前端の反対側にある後端を有し、前記高さＨ３は前記大チャンバーの深さＤより小さいチャンバー経路と、
（ｅ）長さＬ４、幅Ｗ４、高さＨ４を有し、前記流入経路、前記大チャンバー及び前記チャンバー経路の横に位置し、第１の端部と前記第１の端部の反対側にある第２の端部を有し、前記第１の端部は前記捕捉部位のすぐ前の前記流入経路から分岐し、前記第２の端部は前記チャンバー経路の前記後端で前記チャンバー経路と合流し、前記幅Ｗ４及び前記高さＨ４は前記捕捉経路の前記幅Ｗ２及び前記高さＨ２より大きいバイパス経路と、
を備え、
前記配列の各カラムにおいて、
（ｉ）前記単一細胞捕捉ユニットは流体接続し、
（ｉｉ）各ユニットの前記流入経路は、第１のユニットを除き、すぐ次の上流ユニットの前記チャンバー経路と流体接続し、
（ｉｉｉ）各ユニットの前記バイパス経路は、最後のユニットを除き、すぐ次の下流ユニットの前記流入経路と流体接続する、流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項２】
前記配列の各カラムにおいて、各ユニットの前記チャンバー経路は、最後のユニットを除き、すぐ隣の下流ユニットの前記流入経路と流体接続する、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項３】
前記配列の各カラムにおいて、前記最後のユニットの前記チャンバー経路は流出経路と流体接続する、請求項２に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項４】
前記配列の各カラムにおいて、前記第１のユニットの前記流入経路は入口経路と流体接続され、前記最後のユニットの前記流出経路は出口経路と流体接続する、請求項３に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項５】
（ａ）前記入口経路と流体接続する入口と、
（ｂ）前記出口経路と流体接続する出口と、を更に備える、請求項４に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項６】
前記配列のカラム間の前記単一細胞捕捉ユニットは入口経路及び出口経路を介して流体接続する、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項７】
前記流入経路、前記捕捉経路、前記チャンバー経路及び前記バイパス経路の表面はアルブミンで覆われている、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項８】
前記大チャンバー内に１つ又は複数の種類の分離した単一細胞を更に含む、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項９】
少なくとも２種類の分離した単一細胞を前記大チャンバー内に含む、請求項８に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項１０】
単一細胞懸濁液を更に含み、前記単一細胞のサイズは前記バイパス経路の断面より小さいが、前記捕捉経路の断面より大きい、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項１１】
透明な基板に隣接する、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項１２】
ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ガラス、熱可塑性プラスチック材料及びそれらの組合せから成る群から選択される材料から作製される、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項１３】
前記バイパス経路は前記ユニットの片側に沿って横方向に蛇行する、請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器。
【請求項１４】
分離した単一細胞を捕捉する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップと、
（ｂ）単一種類の分離した細胞を含む培地を、一列に並んだ前記配列における第１の単一細胞捕捉ユニットの前記流入経路に装填するステップと、
（ｃ）前記単一種類の分離した細胞を前記捕捉部位で捕捉するステップと、
（ｄ）捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
（ｅ）経路に培地を逆流させ、捕捉された前記単一種類の分離した細胞を放出し、放出された細胞を前記大チャンバーに逆流させるステップと、
を含む分離した単一細胞を捕捉する方法。
【請求項１５】
１つより多くの種類の分離した単一細胞を捕捉する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップと、
（ｂ）特定の種類の分離した単一細胞を含む培地を一列に並んだ前記配列における第１の単一細胞捕捉ユニットの前記流入経路に装填するステップと、
（ｃ）前記特定の種類の分離した単一細胞を前記捕捉部位で捕捉するステップと、
（ｄ）捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
（ｅ）前記チャンバー経路を逆流させ、前記特定の種類の捕捉された単一細胞を放出し、前記特定の種類の放出された細胞を前記大チャンバーに逆流させるステップと、
（ｆ）それぞれの繰り返しのステップにおいて、前記分離した単一細胞が異なる種類であることを条件として、前記ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を１回以上繰り返すステップと、
を含む分離した単一細胞を捕捉する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に生物学的マイクロ流体チップに関し、より具体的には、複数の単一細胞を捕捉し培養するための流体力学シャトリングチップ機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、単一細胞を正確に操作する技量に基づき、単一細胞の捕捉、単一細胞のペアリング及び長期間の培養のために微細加工装置が設計されてきた。それらはハイスループットであり、低コストであり、試薬の消費を減らすという理由で有利である。ヤマグチら（非特許文献１）は単一細胞の捕捉及び培養を可能にする高さ３０μｍで幅１００μｍの経路を有する簡略な機器を報告した。この機器の捕捉効率は７３％である。
しかし、この機器は空間が限られているため、捕捉した細胞を２４時間までしか成長させられない。リーら（非特許文献２）は細胞同士の相互作用の研究のための単一細胞共培養プラットフォームを設計する同様の概念を使用した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Yamaguchi et al., Sens Actuators B Chem. 2009. 136(2):555-61
【非特許文献２】Lee et al., Integr Biol (Camb). 2012. 4(4):374-80
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この概念の機器の単一細胞のペアリングの効率は５０％であったが、まだ細胞を増殖させる十分な空間が足りていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一つの態様において、本発明は単一細胞捕捉ユニットの配列を備える流体力学シャトリングチップ機器であって、単一細胞捕捉ユニットのそれぞれは、
（ａ）長さＬ１、幅Ｗ１、高さＨ１を有し、前端及び前端の反対側にある後端を有し、後端は捕捉部位を有する流入経路と、
（ｂ）直径Ｍ及び深さＤを有し、流入経路の捕捉部位の後に位置し、捕捉部位から距離ｇだけ離れた受容部位を有し、１つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び／又は移動するように形成された内部空間を有する大チャンバーと、
（ｃ）長さＬ２、幅Ｗ２、高さＨ２を有し、捕捉部位と受容部位の間に位置し、流入経路と大チャンバーと流体接続する捕捉経路と、
（ｄ）長さＬ３、幅Ｗ３、高さＨ３を有し、大チャンバーの後に位置し、大チャンバーと流体接続し、前端及び前端と反対の後端を有し、高さＨ３は大チャンバーの深さＤより小さい、チャンバー経路と、
（ｅ）長さＬ４、幅Ｗ４、高さＨ４を有し、流入経路、大チャンバー及びチャンバー経路の横に位置し、第１の端部と第１の端部と反対の第２の端部を有し、第１の端部は捕捉部位のすぐ前の流入経路から分岐し、第２の端部はチャンバー経路の後端でチャンバー経路と合流し、幅Ｗ４及び高さＨ４は捕捉経路の幅Ｗ２及び高さＨ２より大きい、バイパス経路と、
を備える。
【０００６】
配列の各カラムにおいて、
（ｉ）単一細胞捕捉ユニットは流体接続し、
（ｉｉ）各ユニットの流入経路は、第１のユニットを除き、すぐ次の上流ユニットのチャンバー経路と流体接続し、
（ｉｉｉ）各ユニットのバイパス経路は、最後のユニットを除き、すぐ次の下流ユニットの流入経路と流体接続する。
【０００７】
一つの実施形態において、配列の各カラムにおいて、各ユニットのチャンバー経路は、最後のユニットを除き、すぐ隣の下流ユニットの流入経路と流体接続する。
【０００８】
他の実施形態において、配列の各カラムにおいて、最後のユニットのチャンバー経路は流出経路と流体接続する。
【０００９】
他の実施形態において、配列の各カラムにおいて、第１のユニットの流入経路は入口経路と流体接続され、最後のユニットの流出経路は出口経路と流体接続する。
【００１０】
他の実施形態において、機器は、（ａ）入口経路と流体接続する入口と、（ｂ）出口経路と流体接続する出口と、を更に備える。
【００１１】
他の実施形態において、配列のカラム間の単一細胞捕捉ユニットは入口経路及び出口経路を介して流体接続する。
【００１２】
流入経路、捕捉経路、チャンバー経路及びバイパス経路の表面は覆われているか、又は覆われていない。
【００１３】
一つの実施形態において、流入経路、捕捉経路、チャンバー経路及びバイパス経路の表面はアルブミン、例えばウシ血清アルブミンで覆われている。他の種類の表面コーティングは機器の適用目的に応じて使用され得る。
【００１４】
他の実施形態において、大チャンバーは１つの分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、大チャンバーは異なる種類の２つの分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、大チャンバーは異なる種類の複数の分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、大チャンバーは同じ種類の複数の分離した単一細胞を含む。
【００１５】
他の実施形態において、機器は大チャンバーに１つ又は１つより多くの種類の分離した単一細胞を含む。
他の実施形態において、機器は大チャンバーに２つ以上の種類の分離した単一細胞を含む。
【００１６】
他の実施形態において、機器は単一細胞懸濁液を更に含み、単一細胞のサイズはバイパス経路の断面より小さいが、捕捉経路の断面より大きい。
【００１７】
他の実施形態において、機器は透明な基板に隣接する。基板は一片のガラスでも良い。
【００１８】
他の実施形態において、機器はポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ガラス、プラスチック及びそれらの組合せから成る群から選択される材料から作製される。
【００１９】
他の実施形態において、バイパス経路はユニットの片側に沿って横方向に蛇行する。
【００２０】
他の態様において、本発明は分離した単一細胞を捕捉する方法に関する。その方法は、
（ａ）本発明の流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップと、
（ｂ）単一種類の分離した細胞を含む培地を一列に並んだ配列における第１の単一細胞捕捉ユニットの流入経路に装填するステップと、
（ｃ）単一種類の分離した細胞を捕捉部位で捕捉するステップと、
（ｄ）捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
（ｅ）経路に培地を逆流させ、捕捉された単一種類の分離された細胞を放出し、放出された細胞を大チャンバーに逆流させるステップと、
を含む。
【００２１】
他の態様において、本発明は１つより多くの種類の分離した単一細胞を捕捉する方法に関する。その方法は、
（ａ）本発明に記載の流体力学シャトリングチップ機器を提供するステップと、
（ｂ）特定の種類の分離した単一細胞を含む培地を一列に並んだ配列における第１の単一細胞捕捉ユニットの流入経路に装填するステップと、
（ｃ）特定の種類の分離した単一細胞を捕捉部位で捕捉するステップと、
（ｄ）捕捉されていない、余分な細胞を未使用培地で洗い流すステップと、
（ｅ）チャンバー経路を逆流させ、特定の種類の捕捉された単一細胞を放出し、特定の種類の放出された細胞を大チャンバーに逆流させるステップと、
（ｆ）それぞれの繰り返しのステップにおいて分離した単一細胞が異なる種類であることを条件として、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を１回以上繰り返すステップと、
を含む。
【００２２】
他の実施形態において、前記捕捉するステップは１つの捕捉部位につき１つの分離した単一細胞を捕捉する。
【００２３】
他の実施形態において、逆流ステップにおける体積流量は洗い流しステップにおける体積流量より大きい。
【００２４】
他の実施形態において、逆流ステップにおける体積流量は細胞装填ステップにおける体積流量に劣らない。
【００２５】
これらの及び他の態様は以下の図面と併せて採用される以下の好ましい実施形態の説明から明らかになると思われるが、それらにおける変化及び修正は開示の新規な概念の精神及び範囲から逸脱しない範囲で変化させても良い。
【００２６】
添付の図面は本発明の１つ又は複数の実施形態を示し、記載された説明により、本発明の原理を説明する役割を果たす。出来る限り図面を通して同じ参照番号を使用し、実施形態の同様の又は類似の要素に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａから１ＨはＨＳＣチップのマスクデザインのパターンを示す概略図であり、縮尺は５ｍｍである。図１Ａはデザイン１における第１の層（層１）のフォトマスクの上面図を示す。
【図１Ｂ】デザイン１における第２の層（層２）のフォトマスクの上面図を示す。
【図１Ｃ】デザイン１における第３の層（層３）のフォトマスクの上面図を示す。
【図１Ｄ】デザイン１における３つの層（層１、２、３）の重なりの上面図を示す。
【図１Ｅ】デザイン２における第１の層（層１）のフォトマスクの上面図を示す。
【図１Ｆ】デザイン２における第２の層（層２）のフォトマスクの上面図を示す。
【図１Ｇ】デザイン２における第３の層（層３）のフォトマスクの上面図を示す。
【図１Ｈ】デザイン２における３つの層（層１、２、３）の重なりの上面図を示す。
【図２】デザイン１におけるＳＵ−８型（Ａ−Ｃ）及び流体力学シャトリングチップ（ＨＳＣ）機器のガラス上のＰＤＭＳ機器（Ｄ−Ｆ）の上面図写真である。（Ａ）３．８μｍの長さ、５．０μｍの幅及び４．３μｍの高さの捕捉経路（層１）の写真である。（Ｂ）２５．０μｍの幅、２３．０μｍの高さのバイパス経路（層１、２、３が重なった）を示す写真である。（Ｃ）５００．６μｍの直径、５７．８μｍの高さ（深さ）を有する大チャンバーを示す写真である。（Ｄ）流体力学構造（矢印ａ、ｂは異なる流れ抵抗を示し、矢印ｃは細胞捕捉場所を示す）を示す顕微鏡画像である。（Ｅ）単一細胞捕捉ユニットを示す拡大図である。（Ｆ）ＰＤＭＳを使用して作製されたＨＳＣ機器の外観を示す写真である。体積流量はＱと規定される。経路Ａの体積流量はＱ１と示され、経路Ｂの体積流量はＱ２と示される。縮尺は１００μｍである。
【図３】ＨＳＣ機器の操作手順を示す概略図である。（Ａ）流れ方向を示す細胞装填ステップである。（Ｂ）細胞が捕捉位置で捕捉されると、大チャンバーへの流体経路の流れ抵抗の増加を引き起こし、後に続く細胞は蛇行したバイパス経路に向かって流れる。（Ｃ）マイクロチャネルにある余分な細胞を洗うために細胞培地が使用される。（Ｄ）捕捉された細胞は捕捉位置から解放され、大チャンバーへ流れる。
【図４】大チャンバーにおけるＭＣＦ−７単一細胞捕捉の連続した画像を示す。コラム（Ａ）の上の図は下流ユニットの流入経路に入る上流ユニットのバイパス経路からの２つの単一細胞を示す。２番目の図は下流ユニットの捕捉位置に向かって流れる２つの単一細胞を示す。３番目の図は前方の細胞（第１の細胞）が下流ユニットの流入経路の捕捉位置で捕捉されることを示す。下の図は後に続く単一細胞（第２の細胞）が捕捉位置を迂回することを示す。コラム（Ｂ）の上の図は捕捉位置で捕捉された第１の細胞を示す。２番目の図は捕捉位置から解放された第１の細胞を示す。３番目の図はチャンバーへの経路を流れる第１の細胞を示す。下の図は大チャンバーに入る第１の細胞を示す。縮尺は１００μｍである。
【図５】ＣＯＭＳＯＬによる流速シミュレーションを示す。広い場所及び流線形部分の流速の結果である。捕捉経路での流速はバイパス経路及び大チャンバーの流速より速い。
【図６】デザイン１のＨＳＣ機器のＭＣＦ−７細胞捕捉効率を示す。（Ａ）捕捉位置における（実線の円で印をつけた）捕捉された単一細胞の写真である。（Ｂ）大チャンバーにおける（点線の円で印をつけた）捕捉された単一細胞の写真である。（Ｃ）捕捉位置での単一細胞捕捉と大チャンバーでの単一細胞捕捉の効率を示す。細胞は緑のカルセイン−ＡＭ蛍光染料で染色された。縮尺は１００μｍである。
【図７】デザイン２のＨＳＣ機器の大チャンバーのＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７の単一細胞のペアリング結果を示す写真である。ＭＣＦ−７細胞は緑のカルセイン−ＡＭ蛍光染料（実線の円で印をつけた）で染色され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は赤のＤｉｌ蛍光染料（点線の円で印をつけた）で染色された。用語「１Ａ＋１Ｂ」は「１つの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。用語「＞１Ａ＋１Ｂ」は「１つより多くの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。縮尺は１ｍｍである。
【図８】大チャンバーにおける単一の及び複数の単一細胞の捕捉効率を示す。用語「１Ａ」は「１つの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞」を指す。用語「１Ｂ」は「１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。用語「１Ａ＋１Ｂ」は「１つの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。用語「＞１Ａ＋１Ｂ」は「１つより多くの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（用語の定義）
本明細書で使用される用語は一般に本発明の文脈内、及びそれぞれの用語が使用される特定の文脈において業界の通常の意味を有する。
本発明の記載に関し熟練者に追加のガイダンスを提供するため、発明を記載するために使用される特定の用語が以下に、又は明細書の他の場所で議論される。便宜上、特定の用語は例えばイタリック体及び／又は引用符を使用して強調され得る。強調の使用は用語の範囲及び意味に影響せず、その用語が強調されているかに拘わらず、同じ文脈において用語の範囲及び意味は同じである。同じことが複数の方法で言えることが理解される。従って、本明細書で議論される１つ又は複数の用語に対し代替の言語及び類義語が使用でき、用語が詳しく述べられるか又は本明細書で議論されるかどうかに応じて特別な重要性も置かれない。特定の用語の類義語が提供される。１つ又は複数の類義語の記載は他の類義語の使用を排除しない。
【００２９】
本明細書で議論される用語の例を含む本明細書のどこかの例の使用は例示的のみであり、本発明又は例示された用語の範囲及び意味を少しも制限しない。同様に、発明は本明細書で与えられる様々な実施形態に制限されない。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は本発明が関連する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本文献における用語法に準拠するものとする。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「ほぼ」、「約」又は「およそ」は一般的に所与の値又は範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。
本明細書で与えられる数量は概算であり、「ほぼ」、「約」又は「およそ」の用語は、明確に述べられていなければ上の記載に従って推論され得る。
【００３１】
本明細書で使用されるように、数又は範囲が記載される時、当業者はそれが本発明に関する特定の分野の適切で合理的な範囲を包含することを意図すると理解する。
【００３２】
「４０μｍから１００μｍまで」という記述により、その範囲内の全ての整数単位の量が特に本発明の一部として開示されることが意味される。よって、この場合、４０、４１、４２・・・９７、９８、９９及び１００μｍの整数単位量が本発明の実施形態として含まれる。
「３００μｍから４０００μｍまで」という記述により、その範囲内の全ての整数単位の量が特に本発明の一部として開示されることが意味される。よって、３００、３０１、３０２・・・３９９７、３９９８、３９９９及び４０００μｍの整数単位量が本発明の実施形態として含まれる。
「５００μｍから２０００μｍまで」という記述により、その範囲内の全ての整数単位の量が特に本発明の一部として開示されることが意味される。よって、５００、５０１、５０２・・・１９９７、１９９８、１９９９及び２０００μｍの整数単位量が本発明の実施形態として含まれる。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「単一細胞捕捉ユニット」は「ユニット」と呼ばれ得る。
本明細書で使用されるように、「大チャンバー」は一般的に細胞の拡散、増殖及び／又は移動のために２４時間以上細胞の培養をする広々とした空間を有する空間を意味する。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「入口経路」は一般に、配列のカラムにおける第１の単一細胞捕捉ユニットの流入経路をＨＳＣ機器の入口穴に接続するマイクロチャネルを意味する。配列の各カラムはＨＳＣ機器の入口に接続された１つの入口経路を有する。入口経路はＨＳＣ機器の入口に接続される前に１つのマイクロチャネルに合流する。カラム間の入口経路は流体接続である。
本明細書で使用されるように、「出口経路」は一般に配列のカラムの最後の単一細胞捕捉ユニットの流出経路をＨＳＣ機器の出口穴に連結するマイクロチャネルを意味する。配列の各カラムはＨＳＣ機器の出口に連結された１つの出口経路を有する。出口経路はＨＳＣ機器の出口に接続される前に１つのマイクロチャネルに合流する。カラム間の出口経路は流体接続である。
【００３５】
「１つの単一細胞」及び「１つの分離した単一細胞」の用語は互換性がある。
「２つの単一細胞」及び「２つの分離した単一細胞」の用語は互換性がある。
「熱可塑性プラスチック材料」の用語は一般に特定の温度以上で柔軟、又は成形可能になり、冷却すると凝固するプラスチック材料又はポリマーを意味する。
（略語）「ＨＳＣ」は流体力学シャトリングチップを意味する。。
【００３６】
（実施例）
本発明の範囲を制限する意図無しに、本発明の実施形態による例としての機器、装置、方法及びそれらに関連する結果が以下に示される。なお、読み手の便宜のため、例において題名又は副題が使用されるが、本発明の範囲を決して制限しない。さらに、特定の理論が本明細書において提案及び開示されるが、それらが正しかろうと正しくなかろうと、発明が特別な理論又は行動の計画を使用せずに本発明により実行される限り、本発明の範囲を決して制限しない。
【００３７】
（方法）
（機器デザイン及び製造）
マイクロ流体ＨＳＣ機器は、前述の通り、ソフトリソグラフィー技術を使用してポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使って製造された。
まず、５μｍのネガ型のフォトレジストの厚い層（米国、マサチューセッツ州、ニュートン、マイクロケム製のＳＵ−８）を、シリコンウエハー上でスピンコートし、５μｍ幅の捕捉経路を有するフォトマスクの下で紫外線に曝した。
第２に、２５μｍのネガ型のフォトレジストの厚い層を、同じシリコンウエハー上でスピンコートし、２５μｍ幅のバイパス経路を有する別のフォトマスクの下で紫外線に曝した。
【００３８】
第３に、デザイン１（図１から１Ｄ）に対しては５０μｍのネガ型のフォトレジストの厚い層を同じシリコンウエハー上でスピンコートし、５００μｍの直径の大チャンバーを有する他のフォトマスクの下で紫外線に曝した。デザイン２については（図１Ｅから１Ｈ）、５０μｍのネガ型のフォトレジストの厚い層を同じシリコンウエハー上でスピンコートし、２０００μｍの直径の大チャンバーを有する他のフォトマスクの下で紫外線に曝した。原盤は型として使用され、シルガード１８４（米国ダウコーニング製）ＰＤＭＳプレポリマーに１０対１の割合で架橋剤を混合したものが注入され、従来型オーブンを使用して６５℃で一晩硬化された。硬化したＰＤＭＳの複製は型から剥がされた。
内径が０．７５ｍｍのパンチャー（ハリスユニコア（商標）、米国テッドペラ製）を使用して１つの入口穴及び１つの出口穴を穴開けし、流体をＰＤＭＳ機器の流体経路へ導いた。短い酸素プラズマ処理の後、ＰＤＭＳの複製とガラススライドの両方を接触し、オーブン内に６５℃で２４時間載置し、永久結合を実現した。
【００３９】
（複数の単一細胞捕捉のためのＨＳＣ機器の準備）
細胞の実験の前に、ＨＳＣ機器は脱イオン水で満たされ、デシケーター内の脱イオン水で満たされた容器内に浸され、マイクロチャネル内の気泡が除去された。その後、脱ガスしたＨＳＣ機器は紫外線に曝され、３０分間滅菌された。直後に細胞がＰＤＭＳ表面に接着するのを防ぐため、１×ＰＢＳ内の５％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ベーシングテクノロジー、台湾）がマイクロ流体経路に注入され、３７℃で３０分間培養された。
【００４０】
（細胞培養及び保持）
人間の乳がんＭＤＡ−ＭＤ−２３１及びＭＣＦ−７細胞株が研究において細胞モデルとして使用された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７細胞は１０％のウシ胎仔血清（ハイクローンサーモ、米国）及び１％の抗生物質（グルタミン−ペニシリン−ストレプトミシン、バイオウエスト、フランス）を加えたＤＭＥＭ培地（ギブコ、米国）内で、加湿した培養器内で３７℃、５％の二酸化炭素で培養された。細胞の培養は７０から８０％の合流を有する製造者の標準プロトコルに従いトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％のＰＢＳ、バイオウエスト、米国）を使用して移動された。
【００４１】
複数の単一細胞捕捉、分離及び培養  各細胞捕捉実験の前に、細胞は、ＨＳＣ機器内の細胞を認識しやすくするため、４ｍＭ膜色素ＤｉｌＣ１２（３）（ＢＤバイオサイエンス、米国）又は４ｍＭ膜透過性生細胞標識染色カルセイン−ＡＭ（インビトロジェン、ライフテクノロジー、米国）で予め３０分染色された。
【００４２】
デザイン１のＨＳＣ機器における各単一細胞捕捉実験に対し、１．０×１０6細胞／ｍＬ濃度（合計で１×１０3細胞）の１μＬのＭＣＦ−７細胞が、注射器ポンプ（ハーバード機器、ハーバードバイオサイエンス、米国）及びテフロン（登録商標）管（内径０．５１ｍｍ、外径０．８２ｍｍ、エバーシャープテクノロジー社、台湾）を使用して１０μＬ／分の流速でマイクロ流体経路に装填された。その後、５μＬのＤＭＥＭ培地が０．３μＬ／分の流速でマイクロ流体経路に装填された。その後に、１０μＬ／分の流速の０．６μＬのＤＭＥＭの逆流が、細胞を放出して大チャンバーに移動させるために使用された。
【００４３】
デザイン２のＨＳＣ機器に対し、１．０×１０6細胞／ｍＬ濃度（合計で５×１０2細胞）の１μＬのＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＭＣＦ−７細胞が、注射器ポンプ（ハーバード機器、ハーバードバイオサイエンス、米国）及びテフロン（登録商標）管（内径０．５１ｍｍ、外径０．８２ｍｍ、エバーシャープテクノロジー社、台湾）を使用して０．３μＬ／分の流速でマイクロ流体経路に装填された。その後、５μＬのＤＭＥＭ培地が０．３μＬ／分の流速でマイクロ流体経路に装填された。その後に、２００μＬ／分の流速の１０μＬのＤＭＥＭの逆流が、細胞を放出して大チャンバーに移動させるために使用された。
【００４４】
「複数の単一細胞捕捉」という用語は、ＨＳＣ機器が大チャンバー内の１つの細胞を一度に、及び複数の分離された単一細胞が大チャンバーで捕捉される処理を繰り返すことにより捕捉可能であることを意味する。「分離する」は細胞がそれぞれ大チャンバーで捕捉される時、それらが物理的に分離されることを意味する（マイクロチャネルは大チャンバーと流体接続するが）。この特徴は１つの単一細胞が操作される間の、他の細胞への外乱を最小にする。
【００４５】
（細胞の撮像）
全ての細胞の画像が付属の電荷結合素子（レチガ−４０００ＤＣ、Ｑイメージング、カナダ）及び制御ソフトウエア（ＮＩＳ−エレメンツ  Ａｒ、ニコン、日本）を有する倒立顕微鏡（ニコンＴｉ−Ｅ倒立蛍光顕微鏡、日本）を使用して得られた。
【００４６】
（結果）
機器デザイン及び操作  マイクロチャネル機器はＰＤＭＳから作られ、ガラス基板に隣接する。ＰＤＭＳ部分を作るため、３層のＳＵ−８の原盤型がフォトリソグラフィーを使用して微細加工された。私どもは２つのＨＳＣデザインを作成した。図１Ａから１Ｄはデザイン１における、第１の層のフォトマスク、第２の層のフォトマスク、第３の層のフォトマスク、及び３つの層のフォトマスクの重なりのそれぞれの上面図を示す。図１Ｅから１Ｈはデザイン２における第１の層のフォトマスク、第２の層のフォトマスク、第３の層のフォトマスク、及び３つの層のフォトマスクの重なりのそれぞれの上面図を示す。
【００４７】
図２はデザイン１のＳＵ−８型（Ａ−Ｃ）及び完成したガラス上のＰＤＭＳのＨＳＣ機器（Ｄ−Ｆ）の写真の上面図である。図２ＡはＳＵ−８構造の捕捉経路３３０（それぞれが長さ３．８μｍ、幅５．０μｍ及び高さ４．３μｍ）を有する第１の層を示す。第２の層は、バイパス経路３６０（それぞれが幅２５．０μｍ及び高さ２３．０μｍ）及び捕捉経路３３０を介してバイパス経路３６０に連結された大チャンバー３４０（それぞれが直径５００μｍ及び高さ２３．０μｍ）を生成する（図２Ｂ）。第３の層（高さ５７．８）は第２の層の上部に建設され大チャンバーの高さ及びそれらの容積を生成及び増加させた（図２Ｃ）。よって、デザイン１の機器の大チャンバーの最終的な高さは５７．８μｍである。デザイン２に対し、捕捉経路のそれぞれは長さ５．１μｍ、幅６．５μｍ及び高さ４．９μｍである。バイパス経路は幅２５μｍ、高さ２３．３であるが、大チャンバーのそれぞれは直径２５００μｍで高さ８２．０μｍである。
【００４８】
図２Ｄを参照する。各細胞捕捉部位が１つの単一細胞のみを確実に捕捉するようにするため、体積流量Ｑ１及びＱ２（Ｑ１及びＱ２は経路Ａ及び経路Ｂのそれぞれを通過する体積流量である）が第１の流入細胞が、経路Ｂ（即ち、バイパス経路３６０に向かって移動する、矢印ｂによりマークされた方向）ではなく経路Ａ（即ち、捕捉経路３３０へ向かって移動する、矢印ａによりマークされた方向）を通る方法でデザインされ、その結果細胞は捕捉部位で捕捉される（矢印ｃでマークされる）。
【００４９】
細胞を捕捉部位で捕捉した後、経路Ａの流れ抵抗が増加し、その結果Ｑ１とＱ２の比率が小さくなり、結果として次の流入細胞は経路Ａではなく経路Ｂを通過する。マイクロチャネルの抵抗を計算するのにダルシー・ワイスバッハの式が使用される（数式１）。数式１で、Ｐは流体の駆動圧力、Ｃ（α）はマイクロチャネルのアスペクト比（０＜α＜１）の定数、μは流体粘度、Ｌは経路の長さ、Ｑは体積流量、Ｒは外周、Ａはマイクロチャネルの断面積である。
【００５０】
【数１】
2018525003.tif 000003
【００５１】
設計された捕捉経路３３０を層流システムにおいて任意の流速で確実に機能させるため、細胞の中心は経路Ａの流線の内側に位置する必要がある。細胞の中心と流入経路の壁との距離をＸとし、流入経路の幅をＹと規定する。Ｑ１／Ｑ２の比が（Ｙ−Ｘ）／Ｘの値より大きい場合、細胞は層流領域において任意の流速で捕捉部位において捕捉される（数式２）。
【００５２】
【数２】
2018525003.tif 000004
【００５３】
デザイン１のＨＳＣに対し、製造された機器はＱ１／Ｑ２の値が３．５６３であり、これは閾値の２．１２５（表１）より大きく、第１の流入細胞が経路Ｂではなく経路Ａを通過し捕捉部位で捕捉されることを確実にする。図２ＥはＨＳＣ機器における捕捉部位３２２及び大チャンバー３４０の拡大図を示し、図２Ｆは３８４個の大チャンバー及び１つの入口穴及び１つの出口穴を含む全体のＨＳＣ機器２００を示す。デザイン２のＨＳＣ機器のＱ１／Ｑ２の値の３．３９１も閾値の２．１２５（表１）より大きい。表１はマイクロチャネル抵抗比を示す。
【００５４】
【表１】
2018525003.tif 000005
【００５５】
ＨＳＣに適用可能な細胞のサイズは捕捉経路及びバイパス経路の直径に依存する。細胞のサイズは細胞がバイパス経路を詰まらせるのを避けるためバイパス経路の断面より小さくする必要があり、同時に細胞が捕捉部位で捕捉されずに捕捉経路を通過しないように捕捉経路の断面より大きくする必要がある。
【００５６】
図２Ｄから２Ｆと図３を参照する。ＨＳＣ機器２００は単一細胞捕捉ユニットの配列を備え、単一細胞捕捉ユニットのそれぞれは、以下の（ａ）〜（ｅ）を備える。
（ａ）長さＬ１、幅Ｗ１、高さＨ１を有し、前端３２０ａ及び前端と反対の後端３２０ｂを有し、後端は捕捉部位３２２を有する流入経路３２０。
（ｂ）直径Ｍと深さＤを有し、流入経路３２０の捕捉部位３２２の後に位置し、捕捉部位３２２から距離ｇだけ離れた受容部位３４２を有し、１つより多くの単一細胞が付着、成長、増殖及び／又は移動に適した内部空間を有する大チャンバー３４０。
（ｃ）長さＬ２、幅Ｗ２及び高さＨ２を有し、捕捉部位３２２と受容部位３４２との間に位置し、流入経路３２０と大チャンバー３４０と流体接続する捕捉経路３３０。
（ｄ）長さＬ３、幅Ｗ３及び高さＨ３を有し、大チャンバー３４０の後に位置し大チャンバー３４０と流体接続し、前端３５０ａと前端３５０ａと反対の後端３５０ｂを有し、高さＨ３は大チャンバー３４０の深さＤより小さい、チャンバー経路３５０。
（ｅ）長さＬ４、幅Ｗ４及び高さＨ４を有し、流入経路３２０、大チャンバー３４０及びチャンバー経路３５０の横に位置し、第１の端部３６０ａと第１の端部３６０ａの反対にある第２の端部３６０ｂを有し、第１の端部３６０ａは捕捉部位３２２のすぐ前の流入経路３２０から分岐し、第２の端部３６０ｂはその後端３５０ｂでチャンバー経路と結合し、幅Ｗ４及び高さＨ４は捕捉経路の幅Ｗ２及び高さＨ２より大きい、バイパス経路３６０。
【００５７】
ＨＳＣ機器の操作手順は以下のステップを含む。
図３Ａを参照する。細胞懸濁液がユニット３００の入口経路３１０に装填される。個々の細胞はカラムの配列内の第１のユニット３００の流入経路３２０に入る。第１の単一細胞３７０が第１のユニット３００の流入経路３２０の捕捉部位３２２で捕捉される。カラムの配列内のユニット３００、…３０６、３０７は流体接続される。各カラムの配列の最後のユニット３０７は出口経路３９２に連結される流出経路３９０を有する。
図３Ｂを参照する。、個々の細胞３７０がユニット３０６の流入経路３２０の捕捉部位３２２で捕捉されると、結果として大チャンバー３４０への流体経路の流れ抵抗が増加し、後に続く細胞３８０がユニット３０６の蛇行するバイパス経路３６０へ向かって流れ、すぐ隣の下流ユニット３０７の流入経路３２０に入り、その捕捉部位３２２で捕捉される。
【００５８】
図３Ｃを参照する。細胞培地がマイクロチャネル内の余分な細胞を洗うために使用される。
図３Ｄを参照する。培地がユニット３０７の出口経路３９２及び流出経路３９０を通ってマイクロチャネルを逆流させるのに使用される。ユニット３０７内の捕捉された細胞３８０はユニット３０７の流入経路３２０の捕捉部位３２２から放出され、ユニット３０６のチャンバー経路３５０を通ってすぐ隣の上流ユニット３０６の大チャンバー３４０へ流れる。
【００５９】
デザイン１に対し、以下のステップが実施される。
１）１μＬの細胞懸濁液が注射器ポンプを使用することにより１０μＬ／分の流速で入口経路に装填される。個々の単一細胞は単一のカラムの第１のユニットの流入経路に流入し、第１の細胞は捕捉部位で捕捉される（図３Ａ）。細胞が捕捉部位で捕捉されると、結果として大チャンバーへの流体経路の流れ抵抗が増加し、後に続く細胞は蛇行するバイパス経路（図３Ｂ）に向かって流れ、すぐ次の下流ユニットの流入経路に入る（図３Ｂ）。
２）５マイクロリットルの未使用培地が注射器ポンプを使用することにより０．３μＬ／分の流速で経路に装填され（図３Ｃ）、マイクロチャネルから余分な細胞を洗い流す。
３）最後に、０．６μＬの未使用培地の１０μＬ／分での逆流がマイクロチャネルに導入され、捕捉部位から捕捉された細胞を放出し、これらの細胞を大チャンバーに移動した（図３Ｄ）。
大チャンバーへの流れ抵抗はバイパス経路を経由するより小さいため、放出された細胞はバイパス経路ではなく大チャンバーに流入する。更に、大チャンバーの拡大された断面積のため、大チャンバーの中で流速は大幅に減少し、それは大チャンバー内の装填された細胞が流れによって運び去られ、受容部位と捕捉経路の交点で捕捉されることを防止する。ＭＣＦ−７細胞の実演のため、全体の手順は２０分で実行される。
上記のステップを繰り返すことにより他の細胞種類の個々の細胞が大チャンバーに装填され得る。
【００６０】
デザイン２に対し、以下の３つの操作手順がある。
１）５マイクロリットルの細胞懸濁液が注射器ポンプを使用することにより０．３μＬ／分の流速で経路に装填される。このステップにおいて個々の単一細胞は捕捉部位で捕捉される。
２）５マイクロリットルの未使用培地が注射器ポンプを使用することにより０．３μＬ／分の流速で経路に装填され、マイクロチャネルから余分な細胞を洗う。
３）最後に、１０μＬの未使用培地の２００μＬ／分の逆流がマイクロチャネルに導入され、捕捉部位から捕捉された細胞を放出し、これらの細胞を大チャンバーに移動する。全体の手順は４０分で実行され得る。
【００６１】
図４は大チャンバーにおけるＭＣＦ−７単一細胞捕捉の連続した画像を示す。コラム（Ａ）を参照する。上の図はバイパス経路と流入経路との交点の近くの２つの単一細胞を示し、第１の細胞は下流ユニットの流入経路にあり、第２の細胞は上流ユニットのバイパス経路にある。２番目の図は下流ユニットのチャンバーの捕捉部位に向かって流れる第１の細胞と、下流ユニットの流入経路に流入した第２の細胞を示す。３番目の図は下流ユニットの捕捉部位で捕捉された第１の細胞と、第１の細胞の後に続く第２の細胞を示す。下の図は捕捉部位を迂回し、下流ユニットのバイパス経路に流入する第２の細胞を示す。
【００６２】
図４のコラム（Ｂ）を参照する。上の図は下流ユニットの捕捉部位で捕捉された個々の細胞（第１の細胞）を示す。２番目の図は下流ユニットの捕捉部位から放出された第１の細胞を示す。３番目の図は上流ユニットのすぐ隣の大チャンバーへ向かって流れるチャンバー経路内の第１の細胞を示す。下の図は下流ユニットのすぐ隣の大チャンバー内の第１の細胞を示す。
【００６３】
ＣＯＭＳＯＬシミュレーション  ＣＯＭＳＯＬの層流モジュールを使用して、操作手順の下で流速をシミュレートした。捕捉経路を通した流速はバイパス経路のものよりもずっと速く、これは注入された細胞が捕捉経路に向かって流れることを示す（図５）。シミュレーション結果は、チャンバーの大きな断面積は大チャンバーの流線形の流速を大幅に遅くすることも示す。
【００６４】
図６はデザイン１のＨＳＣ機器のＭＣＦ−７細胞捕捉効率を示す。細胞は観察のため緑のカルセイン−ＡＭ蛍光染料で染色された。図６Ａは捕捉部位で捕捉された単一細胞を示し（実線の円で印をつけた）、図６Ｂは大チャンバー内の捕捉された単一細胞を示す（点線の円で印をつけた）。図６Ｃは捕捉部位の単一細胞捕捉と大チャンバーでの単一細胞の捕捉効率を示す。
【００６５】
図７はデザイン２のＨＳＣ機器のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７単一細胞のペアリング結果を示す。大チャンバーでの対になった単一細胞の上面の写真である。ＭＣＦ−７細胞（実線の円で印をつけた）は緑のカルセイン−ＡＭ蛍光染料で染色され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（点線の円で印をつけた）は赤のＤｉｌ蛍光染料で染色された。縮尺は１ｍｍである。
用語「１Ａ」は「１つの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞」を指す。
用語「１Ｂ」は「１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。
用語「１Ａ＋１Ｂ」は「１つの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。
用語「＞１Ａ＋１Ｂ」は「１つより多くの単一ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び１つの単一ＭＣＦ−７細胞」を指す。
【００６６】
図８は図７に示す大チャンバー内の単一の及び複数の単一細胞の捕捉効率を示す。
【００６７】
本発明の例としての実施形態の上記の説明は例示及び説明の目的のみで提示され、開示された正確な形式に対して発明を消耗させる又は制限することを意図しない。多くの修正及び変化が上記の教示を考慮して実行可能である。実施形態及び実施例は本発明の原理及びそれらの実用的な応用を説明する目的で選択及び記載され、業界の他者が本発明及び様々な実施形態を、期待された特定の使用に適したものとしての様々な修正と共に利用可能とする。代替の実施形態が、本発明の精神及び範囲を逸脱せずに本発明が関連する当業者に明らかとなるであろう。従って、本発明の範囲は、上述の説明及び本明細書に記載された例としての実施形態よりも請求の範囲により規定される。
【符号の説明】
【００６８】
３００、３０６、３０７・・ユニット
３１０・・・・・・・・・・入口経路
３２０・・・・・・・・・・流入経路
３２０ａ、３５０ａ・・・・前端
３２０ｂ、３５０ｂ・・・・後端
３２２・・・・・・・・・・捕捉部位
３３０・・・・・・・・・・捕捉経路
３４０・・・・・・・・・・大チャンバー
３４２・・・・・・・・・・受容部位
３５０・・・・・・・・・・チャンバー経路
３６０・・・・・・・・・・バイパス経路
３６０ａ・・・・・・・・・第１の端部
３６０ｂ・・・・・・・・・第２の端部
３７０、３８０・・・・・・単一細胞
３９０・・・・・・・・・・流出経路
３９２・・・・・・・・・・出口経路
Ｑ１、Ｑ２・・・・・・・・体積流量
【図１Ａ】
2018525003.tif 000006
【図１Ｂ】
2018525003.tif 000007
【図１Ｃ】
2018525003.tif 000008
【図１Ｄ】
2018525003.tif 000009
【図１Ｅ】
2018525003.tif 000010
【図１Ｆ】
2018525003.tif 000011
【図１Ｇ】
2018525003.tif 000012
【図１Ｈ】
2018525003.tif 000013
【図２】
2018525003.tif 000014
【図３】
2018525003.tif 000015
【図４】
2018525003.tif 000016
【図５】
2018525003.tif 000017
【図６】
2018525003.tif 000018
【図７】
2018525003.tif 000019
【図８】
2018525003.tif 000020
【国際調査報告】
2018525003.tif 000021