(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのメチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させることを目的とした、チオエーテルアルキル化法の利用に関する。本発明は、エラスチン様ポリペプチドの誘導体と、その調製方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのメチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させることを目的とした、チオエーテルアルキル化法の利用。
【請求項２】
前記エラスチン様ポリペプチドが、以下の式（Ｖ）：
【化１】
2018525439.tif 000034
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む、請求項１に記載の利用。
【請求項３】
以下の式（Ｉ）：
【化２】
2018525439.tif 000035
（ただしＲは、
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキル基；
（このアルキル基は、ＯＨ、ＯＲa、ＮＲbＲc、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒcからなるグループから選択された１つ、またはいくつかの置換基で置換することができる（ここに
Ｒaは、１つ、またはいくつかのヘテロ原子（Ｏ、ＮＨ、Ｓなど）を割り込ませることのできる（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルキン基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルケニル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−Ｘ’基からなるグループから選択され；
Ｘ’は、以下の式：
【化３】
2018525439.tif 000036
を持つ基を表わし；
ＲbとＲcは、互いに独立に、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ10）アルキル基を表わす））
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキレン−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ2〜Ｃ22）アルキン基；
−糖
からなるグループから選択される）を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物。
【請求項４】
以下の式（ＩＩ）：
【化４】
2018525439.tif 000037
（ただし、
−ｎは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項３において定義した通りであり；
−Ａは、Ｈ、アセチル、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択され；
−Ｂは、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＡｃ、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択される）を持つ、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ａが、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｂが、ＯＨであるか、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
以下の式（ＩＩＩ）：
【化５】
2018525439.tif 000038
（ただし、
−ｍは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項３において定義した通りであり；
−Ａ’は、１〜２０個のアミノ酸を含むペプチドである）を持つ、請求項３〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
以下の式（ＩＶ）：
【化６】
2018525439.tif 000039
（ただし、
−ｐは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項３において定義した通りであり；
−Ａ”は、１〜２０個のアミノ酸を含むペプチドである）を持つ、請求項３〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒが、
−（Ｃ1−Ｃ22）アルキル基；と
−（Ｃ1−Ｃ22）アルキレン−フェニル基
からなるグループから選択される、請求項３〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒが、−Ａ1−ＣＨ（ＯＨ）−Ａ2−Ｏ−Ａ3−Ａ4基である（ただし、
−Ａ1は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり；
−Ａ2は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり；
−Ａ3は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基または−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）i−基（ｉは１〜４の整数である）であり；
−Ａ4は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基または（Ｃ2−Ｃ4）アルキン基である）、請求項３〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒが（Ｃ1−Ｃ4）アルキル基またはベンジル基である、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれか１項に記載の化合物を調製することを目的としたチオエーテルアルキル化法であって、以下の式（Ｖ）：
【化７】
2018525439.tif 000040
を持つ反復単位を含むエラスチン様ポリペプチドのチオエーテルアルキル化工程を含んでいて、このチオエーテルアルキル化工程が、アルキル化剤との反応からなる方法。
【請求項１３】
前記アルキル化剤が、式（ＩＩＩ）Ｒ−Ｘの化合物である（ただしＲは請求項３において定義した通りであり、Ｘは、ハロゲン原子であるか、式（ＩＩＩ−１）の化合物：
【化８】
2018525439.tif 000041
（ただしＡ2、Ａ3、Ａ4は、請求項１０において定義した通りである）である）、請求項１２に記載のチオエーテルアルキル化法。
【請求項１４】
エラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させる方法であって、この方法が、以下の式（Ｖ）：
【化９】
2018525439.tif 000042
を持つ少なくとも１つの反復単位を含むエラスチン様ポリペプチドのチオエーテルアルキル化工程を含んでいる方法。
【請求項１５】
前記チオエーテルアルキル化工程が、エラスチン様ポリペプチドを式（ＩＩＩ）Ｒ−Ｘの化合物（ただしＲは請求項３において定義した通りであり、Ｘはハロゲン原子である）と反応させることからなる、請求項１４に記載の下限臨界溶液温度を変化させる方法。
【請求項１６】
以下の式（Ｉ’）：
【化１０】
2018525439.tif 000043
を持つ少なくとも１つの反復単位（ただし、
Ｒは、
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキル基；
（このアルキル基は、ＯＨ、ＯＲa、ＮＲbＲc、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒcからなるグループから選択された１つ、またはいくつかの置換基で置換することができる（ここに
Ｒaは、１つ、またはいくつかのヘテロ原子（Ｏ、ＮＨ、Ｓなど）を割り込ませることのできる（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルキン基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルケニル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−Ｘ’基からなるグループから選択され；
Ｘ’は、以下の式：
【化１１】
2018525439.tif 000044
を持つ基を表わし；
ＲbとＲcは、互いに独立に、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ10）アルキル基を表わす））
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキレン−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ2〜Ｃ22）アルキン基；
−糖
からなるグループから選択される）を含む化合物。
【請求項１７】
以下の式（ＩＩ’）：
【化１２】
2018525439.tif 000045
（ただし、
−Ｘ1は対イオンであり、１価のアニオン性対イオンから選択されることが好ましく；
−ｎは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項１６において定義した通りであり；
−Ａは、Ｈ、アセチル、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択され；
−Ｂは、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＡｃ、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択される）を持つ、請求項１６に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスチン様ポリペプチドの誘導体と、その調製方法に関する。本発明は、そのような誘導体の利用にも関する。
【０００２】
タンパク質操作技術は、生物学の基礎研究のほか、バイオテクノロジーと医薬の産業で一般に利用されて組み換えタンパク質や組み換え治療薬を生み出す一方で、ポリマー科学の分野を急速に進展させていて、一次構造、すなわちモノマー配列と、分子量を精巧に制御した精密なタンパク質様ポリマーへの道を開いている。絹に基づくタンパク質が主にティッシュエンジニアリングとドラッグデリバリー（薬送達）のために開発されてきたことに加え、組み換えエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）が、生体医学とバイオテクノロジーの特定の用途のため、刺激応答性自己集合特性を有する精密ポリマーの独自のクラスとして出現しつつある。
【０００３】
ＥＬＰは、［−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−］というペンタペプチド（その中のゲスト残基Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）の反復配列であり、元々はトロポエラスチンの疎水性ドメインから着想された。ＥＬＰは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＭ）などの合成ポリマーと同様、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）（逆温度転移（Ｔｔ）とも呼ばれる）を示す。ＥＬＰ鎖は、ＬＣＳＴより低温では水に完全に溶けるのに対し、ＬＣＳＴよりも高温では不溶状態に切り換わる。凝集は完全に可逆的であり、ＥＬＰ反復に含まれるＸａａゲスト残基の性質、ＥＬＰの全分子量とモル濃度、溶液のイオン強度などのさまざまなパラメータの影響を受ける（Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，Ａ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２００４年、第５巻、８４６〜８５１ページ；ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｒ．；Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｄ．Ｃ．；Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，Ａ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１３年、第１４巻（８）、２８６６〜２８７２ページ）。溶解性のこの切り換わりは、細菌ライセートから組み換えＥＬＰを精製する際や、個別のＥＬＰブロックの自己集合化を制御する際に１つの大きな利点であることが証明されている。
【０００４】
これまでに報告されているＥＬＰの重合化後修飾には、たいてい鎖の端部が関与している。さまざまなＥＬＰ配列が小さな有機分子、オリゴヌクレオチド、薬、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共役されてきた。ＥＬＰドメイン内のアミノ酸側鎖の位置での修飾に関する報告ははるかに少ない。これら配列内のすべての反復官能基を大きな収率でうまく修飾しようとすると、そのような修飾に高効率の反応を利用する必要がある。こうした修飾では、アミノ酸骨格、Ｃ末端、Ｎ末端、他の残基の側鎖基に影響を与えることなく残基特異的側鎖を化学選択的に修飾するのに生体直交型連結戦略を利用することも必要とされる。
【０００５】
本発明の目的は、化学的修飾を利用して、修飾された組み換えエラスチン様ポリペプチドを提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、Ｘａａゲスト残基上に修飾されたエラスチン様ポリペプチドを調製するための化学的選択法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、エラスチン様ポリペプチドの誘導体として、その下限臨界溶液温度が、出発時のエラスチン様ポリペプチドと比べて変化している誘導体を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、バイオテクノロジーからのいかなる支援もなしにエラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させる容易な方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2018525439.tif 000002
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物に関する。ただしＲは、
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキル基
（このアルキル基は、ＯＨ、ＯＲa、ＮＲbＲc、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒcからなるグループから選択された１つ、またはいくつかの置換基で置換することができる（ただし、
Ｒaは、１つ、またはいくつかのヘテロ原子（Ｏ、ＮＨ、Ｓなど）を割り込ませることのできる（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルキン基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルケニル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−Ｘ’基からなるグループから選択され；
Ｘ’は、以下の式：
【化２】
2018525439.tif 000003
を持つ基を表わし；
ＲbとＲcは、互いに独立に、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ10）アルキル基を表わす））；
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキレン−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ2〜Ｃ22）アルキン基；
−糖
からなるグループから選択される。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物は、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）の誘導体である。これらの化合物は、少なくとも１つのメチオニン残基がチオアルキル化された、修飾されたＥＬＰに対応する。言い換えると、式（Ｉ）の化合物は、メチオニン残基のイオウ原子がアルキル化された（上に規定したＲ基が存在する）、修飾されたＥＬＰである。
【００１１】
本発明は、以下の式（Ｉ’）：
【化３】
2018525439.tif 000004
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物にも関する。ただし、
−Ｒは、式（Ｉ）において上に定義した通りであり、
−Ｘ1は対イオンであり、１価のアニオン性対イオンから選択されることが好ましい。
【００１２】
Ｘ1は、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＰＦ6-、ＮＴｆ2-、
【化４】
2018525439.tif 000005
から選択されることが好ましい。
【００１３】
本発明によれば、「Ｃt〜Ｃz」という表現は、炭素を基礎としていてｔ〜ｚ個の炭素原子を有することのできる鎖を意味する。例えばＣ1〜Ｃ3は、炭素を基礎としていて１〜３個の炭素原子を有することのできる鎖を意味する。
【００１４】
本発明によれば、「ハロゲン原子」という用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素のいずれかを意味する。
【００１５】
本発明によれば、「アルキル基」という用語は、特に断わらない限り、１〜２２個、好ましくは１〜１０個の炭素原子を含む、直線状の、または分岐した、飽和または不飽和の炭化水素を基礎とした脂肪族基を意味する。例示すると、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基が挙げられる。好ましい一実施態様によれば、アルキル基は、１〜６個の炭素原子、特に１〜４個の炭素原子を含んでいる。
【００１６】
本発明によれば、アルキル基は、１個または数個の不飽和も含むことができる。
【００１７】
本発明によれば、「アリール基」という用語は、６〜３０個の炭素原子、好ましくは６〜１０個の炭素原子を含む環式芳香族を意味する。アリール基を例示すると、フェニル基またはナフチル基が挙げられる。
【００１８】
アルキル基がアリール基で置換されているとき、「アリールアルキル」基または「アラルキル」基という用語を用いる。「アリールアルキル」基または「アラルキル」基は、アリール−アルキル基であり、アリール基とアルキル基は上に定義した通りである。アリールアルキル基のうちでは、特にベンジル基またはフェネチル基を挙げることができる。
【００１９】
上記の「アルキル」基、「アルキレン」基、「アリール」基は、１個以上の置換基で置換することができる。そうした置換基のうちで挙げることができるのは、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、アリールオキシ、アリールアルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボキシ、カルボキシアルキルである。アルキル置換基は、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノからなるグループから選択されることが好ましく、最も好ましいのはヒドロキシルまたはアルコキシである。
【００２０】
本明細書では、「アルキレン」（または「アルキリデン」）という用語は、１〜２２個、好ましくは１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含む２価の基を意味する。この基が直線状であるときには、式（ＣＨ2）kで表わすことができる。ただしｋは１〜２２の整数であり、１〜６が好ましい。アルキレン基の例として、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンを挙げることができる。
【００２１】
本発明によれば、「アルキン基」という用語は、少なくとも１つの三重結合を含む炭化水素基を意味する。アルキン基は、−Ｃ≡ＣＨ基であることが好ましい。
【００２２】
本発明によれば、「アルケニル基」という用語は、少なくとも１つの二重結合を含む炭化水素基を意味する。アルケニル基は、−ＣＨ＝ＣＨ2基であることが好ましい。
【００２３】
本発明によれば、「（Ｃ1−Ｃ22）アルキレン（Ｃ2−Ｃ22）アルキン基」という表現は、アルキン基によって置換されたアルキレン基を意味する。
【００２４】
本発明によれば、「（Ｃ1−Ｃ22）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール基」という表現は、アリール基によって置換されたアルキレン基、特にフェニル基によって置換されたアルキレン基を意味する。
【００２５】
本発明によれば、「糖」という用語は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖のいずれかを意味する。
【００２６】
本発明は、以下の式（ＩＩ）：
【化５】
2018525439.tif 000006
を持つ化合物にも関する。ただし、
−ｎは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、式（Ｉ）において上に定義した通りであり；
−Ａは、Ｈ、アセチル、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択され；
−Ｂは、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＡｃ、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択される。
【００２７】
本発明は、以下の式（ＩＩ’）：
【化６】
2018525439.tif 000007
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物にも関する。ただし、
−Ａ、Ｂ、ｎ、Ｒは、式（ＩＩ）において上に定義した通りであり；
−Ｘ1は対イオンであり、１価のアニオン性対イオンから選択されることが好ましい。
【００２８】
本発明によれば、「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。
【００２９】
本明細書では、「アミノ酸」という用語は、天然の２０種類のアミノ酸、すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンと；生体内に見いだされる翻訳後修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン、ホスホトレオニンと；他の一般的ではないアミノ酸（非限定的な例には、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシン、オルニチンが含まれる）を含むと理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の両方を含んでいる。
【００３０】
本発明の文脈では、「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、区別なしに用いられ、元のペプチド（タンパク質分解生成物または合成されたペプチド）のほか、ペプチド模倣体（例えばペプチド類似体であるペプトイドやセミペプトイドであり、例えばペプチドを体内でより安定にしたり、いくらか免疫原性にしたりする修飾を持つことができる）を意味する。そのような修飾の非限定的な例には、環化、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（その非限定的な例には、ＣＨ2−ＮＨ、ＣＨ2−Ｓ、ＣＨ2−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ2−Ｏ、ＣＨ2−ＣＨ2、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＦ＝ＣＨが含まれる）、骨格修飾、残基修飾が含まれる。ペプチド模倣化合物を調製する方法は本分野では周知であり、『ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ』、ＣＡ．Ｒａｍｓｄｅｎ編、第１７．２章、Ｆ．ＣｈｏｐｌｉｎＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ社（１９９２年）に具体的に記載されている。
【００３１】
本発明によれば、ペプチドは、５０個未満のアミノ酸、好ましくは４０個未満のアミノ酸、より好ましくは３０個未満のアミノ酸、さらに好ましくは２０個未満のアミノ酸からなる。
【００３２】
本発明によれば、「合成ポリマー」という用語は、反応性モノマーが関与する重合法（例えばアニオン重合、カチオン重合、ラジカル重合、開環重合）によって得られる任意のポリマーを意味する。最も一般的なポリマーは、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミドである。
【００３３】
好ましい一実施態様によれば、Ａは、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択される。
【００３４】
一実施態様によれば、Ａは、いくつかのアミノ酸の連なりを表わし、その中には特に、１つ、またはいくつかの反復配列−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−を含めることができる。ただしＸａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。
【００３５】
Ａは、特に、１つ、またはいくつかの反復配列−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−を含むことができる。
【００３６】
好ましい一実施態様によれば、Ｂは、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＡｃ（Ａｃはアセチル基を表わす）のいずれかであるか、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択される。最も好ましいのは、ＢがＯＨであるか、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択されることである。
【００３７】
一実施態様によれば、Ｂは、いくつかのアミノ酸の連なりを表わし、その中には特に、１つ、またはいくつかの反復配列−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−を含めることができる。ただしＸａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。
【００３８】
Ｂは、特に、１つ、またはいくつかの反復配列−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−を含むことができる。
【００３９】
本発明による好ましい１つの化合物は、以下の式（ＩＩＩ）：
【化７】
2018525439.tif 000008
を持つ。ただし、
−ｍは、１〜２００の整数であり、２０〜２００が好ましく；
−Ｒは、式（Ｉ）において上に定義した通りであり；
−Ａ’は、１〜２０個のアミノ酸を含むペプチドである。
【００４０】
本発明は、以下の式（ＩＩＩ’）：
【化８】
2018525439.tif 000009
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物にも関する。ただし、
−Ａ’、Ｂ、ｎ、Ｒは、式（ＩＩＩ）において上に定義した通りであり；
−Ｘ1は対イオンであり、１価のアニオン性対イオンから選択されることが好ましい。
【００４１】
本発明による別の好ましい化合物は、以下の式（ＩＶ）：
【化９】
2018525439.tif 000010
を持つ。ただし、
−ｐは、１〜２００の整数であり、５〜２００が好ましく；
−Ｒは、式（Ｉ）において上に定義した通りであり；
−Ａ’’は、１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜８個のアミノ酸を含むペプチドである。
【００４２】
本発明は、以下の式（ＩＶ’）：
【化１０】
2018525439.tif 000011
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物にも関する。ただし、
−Ａ’’、ｐ、Ｒは、式（ＩＶ）において上に定義した通りであり；
−Ｘ1は対イオンであり、１価のアニオン性対イオンから選択されることが好ましい。
【００４３】
一実施態様によれば、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩ）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ）、（ＩＶ’）において、Ｒは、
−（Ｃ1−Ｃ22）アルキル基；
−（Ｃ1−Ｃ22）アルキレン−フェニル基
からなるグループから選択される。
【００４４】
Ｒは、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル基またはベンジル基であることが好ましく、Ｒは、−ＣＨ3、−（ＣＨ2）3−ＣＨ3、−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5のいずれかであることがより好ましい。
【００４５】
一実施態様によれば、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（ＩＩ）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ）、（ＩＶ’）において、Ｒは、基−Ａ1−ＣＨ（ＯＨ）−Ａ2−Ｏ−Ａ3−Ａ4である。ただし、
−Ａ1は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり；
−Ａ2は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり；
−Ａ3は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基または−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）i−基（ｉは１〜４の整数である）であり；
−Ａ4は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基または（Ｃ2−Ｃ4）アルキン基である。
【００４６】
Ａ3が−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）i−基であるとき、Ａ3とＡ4の間の結合は、最後の反復単位−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−の酸素原子とＡ4の最初の炭素原子の間の結合に対応する。
【００４７】
一実施態様によれば、Ａ1とＡ2は−ＣＨ2−である。
【００４８】
一実施態様によれば、Ａ3は（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり、Ａ4は（Ｃ2−Ｃ4）アルキン基である。より好ましいのは、Ａ3が−ＣＨ2−であり、Ａ4が−Ｃ≡ＣＨであることである。
【００４９】
一実施態様によれば、Ａ3は−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）i−基であり、Ａ4は（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基である。Ａ3は、−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）2−基または−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）3−基であることが好ましい。Ａ3は、−ＣＨ3または−ＣＨ2−ＣＨ3であることが好ましい。
【００５０】
本発明による好ましいＲ基は、
【化１１】
2018525439.tif 000012
である。ただし
【化１２】
2018525439.tif 000013
という記号は、式（Ｉ）の中のイオウ原子との結合を示す。
【００５１】
本発明は、本発明の化合物を調製するためのチオエーテルアルキル化法にも関するものであり、この方法は、以下の式（Ｖ）：
【化１３】
2018525439.tif 000014
を持つ少なくとも１つの反復単位を含むエラスチン様ポリペプチドのチオエーテルアルキル化工程を含んでいて、このチオエーテルアルキル化工程は、アルキル化剤との反応からなる。
【００５２】
一実施態様によれば、そのチオエーテルアルキル化工程は、式（ＩＩＩ）の化合物Ｒ−Ｘとの反応からなる。ただしＲは上に定義した通りであり、Ｘはハロゲン原子である。
【００５３】
一実施態様によれば、そのチオエーテルアルキル化工程は、式（ＩＩＩ−１）の化合物：
【化１４】
2018525439.tif 000015
との反応からなる。ただしＡ2、Ａ3、Ａ4は、上に定義した通りである。
【００５４】
このような実施態様は、Ｒが−Ａ1−ＣＨ（ＯＨ）−Ａ2−Ｏ−Ａ3−Ａ4である本発明の化合物の調製に対応する。
【００５５】
アルキル化剤は、式（ＩＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ−１）の化合物であることが好ましい。
【００５６】
一実施態様によれば、上記のアルキル化工程は、少なくとも１つの溶媒中で実施される。
【００５７】
本発明による好ましい溶媒は、塩化メチレン、ギ酸、ＤＭＳＯ、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）からなるグループから選択される。
【００５８】
上記のアルキル化工程は、２０℃〜５０℃の温度で実施されることが好ましい。
【００５９】
一実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、周囲温度で調製される。
【００６０】
したがって本発明は、チオエーテルアルキル化法を利用して、Ｘａａの位置に少なくとも１つのメチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチドを修飾することに関する。
【００６１】
本発明は、チオエーテルアルキル化法を利用して、少なくとも１つのメチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させることにも関する。
【００６２】
本発明で用いるＥＬＰは、上に定義した式（Ｖ）を持つ反復単位を少なくとも１つ含むことが好ましい。
【００６３】
本発明は、エラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させるための方法にも関するものであり、この方法は、上に定義した式（Ｖ）を持つ反復単位を少なくとも１つ含むエラスチン様ポリペプチドのチオエーテルアルキル化工程を含んでいる。
【００６４】
本発明によれば、「下限臨界溶液温度」（ＬＣＳＴ）または「逆温度転移」（Ｔｔ）という用語は、ＥＬＰが可溶形態から不溶形態へと転移する温度を意味する。ＥＬＰは、ＬＣＳＴより低温では水に完全に溶けるのに対し、ＬＣＳＴより高温では不溶状態へと切り換わる。特に、ＥＬＰの水溶液を加熱することにより、このＥＬＰは水に溶けなくなる。
【００６５】
本発明によれば、「変化させる」という用語に、「増加させる」と「減少させる」が含まれる。
【００６６】
実際、驚くべきことに、チオエーテルアルキル化法を利用すると、ＥＬＰのＬＣＳＴを変化させることができる。
【００６７】
現在まで、ＥＬＰのＬＣＳＴを変化させるには、ＥＬＰのポリペプチド鎖をバイオテクノロジー法によって変化させていた。これは非常に複雑で時間がかかる方法であり、分子生物学とバイオプロダクション最適化工程を必要とする。言い換えると、ＬＣＳＴを変化させるのにＸａａ残基が関与する化学的方法はこれまで用いられてこなかった。しかし本発明の修飾法は、実施が非常に容易で、しかも精密かつ選択的でもある化学的な方法である。
【００６８】
下限臨界溶液温度を変化させる方法の一実施態様によれば、チオエーテルアルキル化工程は、エラスチン様ポリペプチドをアルキル化剤と反応させることからなる。
【００６９】
一実施態様によれば、チオエーテルアルキル化工程は、エラスチン様ポリペプチドを式（ＩＩＩ）の化合物Ｒ−Ｘ（Ｒは式（Ｉ）において上に定義した通りであり、Ｘはハロゲン原子である）と反応させることからなる。
【００７０】
下限臨界溶液温度を変化させる方法の一実施態様によれば、チオエーテルアルキル化工程は、エラスチン様ポリペプチドを上に定義した式（ＩＩＩ−１）の化合物と反応させることからなる。
【００７１】
本発明は、本発明の修飾されたＥＬＰ（例えば式（ＩＩ）のＥＬＰ）を薬担体として利用することにも関する。
【００７２】
本発明は、本発明の修飾されたＥＬＰ（例えば式（ＩＩ）のＥＬＰ）を利用して本発明の化合物と薬の間の共役体を調製することにも関する。
【００７３】
本発明は、本発明の修飾されたＥＬＰ（例えば式（ＩＩ）のＥＬＰ）を利用してタンパク質を精製することにも関する。
【００７４】
本発明は、本発明の修飾されたＥＬＰ（例えば式（ＩＩ）のＥＬＰ）を利用して汚染された媒体から重金属を除去することにも関する。
【実施例】
【００７５】
材料と方法
材料
ＬＢ培地、バクト−トリプトン、酵母エキスは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ル・ポン−ドゥ−クレ、フランス国）から購入した。アンピリシンは、Ｅｕｒｏｂｉｏ社（クルタブフ、フランス国）から取得した。グルコースとポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（リヨン、フランス国）から購入した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、ＱＢｉｏｇｅｎｅ社（イルキルシュ、フランス国）から取得した。完全ミニ無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤は、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（マンハイム、ドイツ国）から購入した。脱イオン水（１８ＭΩ−ｃｍ）は、自家製の脱イオン水を、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｉ−ＱＢｉｏｃｅｌＡ１０精製ユニットを通過させることによって得た。ＴＨＦは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ウォルサム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）から購入した。ヨウ化メチル、臭化ベンジル、ギ酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）から購入した。
【００７６】
実施例１：ＥＬＰ２０の調製
ＥＬＰ２０は、上に定義した式（Ｖ）の反復単位を２０個含むＥＬＰである。
【００７７】
大腸菌において翻訳を適切に開始させるための開始メチオニンと、検出を目的としたトリプトファンと、その細菌宿主におけるＥＬＰ２０の最適な産生のための追加残基を提供するため、リーダーと名づけたアミノ酸１３個の長さを持つ配列をＥＬＰドメインのＮ末端に導入した。
【００７８】
配列ＩＤ番号１はオリゴヌクレオチド配列に対応し、配列ＩＤ番号２は、ＥＬＰ２０合成遺伝子のタンパク質配列とポリペプチドに対応する。
【００７９】
組み換えＥＬＰ２０のバイオプロダクション
１つの細菌コロニーを選択し、回転式振盪機上で２００ｒｐｍにて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのリッチなＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、１％酵母エキス）の中で３７℃にて一晩培養した。この種培養物を、グルコース（１ｇ／ｌ）とアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補足した０．９５ｌのリッチなＬＢ培地に接種し、細菌をマルチ−バイオリアクターシステムの中で３つの独立な１ｌ容器プロセス制御（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｑｐｌｕｓ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍＢｉｏｔｅｃｈ社、ドイツ国）を用いて３７℃で培養した。１Ｍリン酸と１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７に維持した。撹拌速度（１５０〜６００ｒｐｍ）と空気流（１〜１．５ｌ／分）を調節することにより、溶けた酸素の圧力ｐＯ2を１５％超に維持した。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）が１．２という値に達したとき、ＩＰＴＧを添加して最終濃度を０．５ｍＭにし、培養の温度を２５℃まで低下させた。その後、サンプルを１時間ごとに回収してＯＤ600を測定した。
【００８０】
組み換えＥＬＰ２０の単離と精製
ＩＰＴＧで誘導してから５時間後、培養物を４℃にて７，５００ｇで１５分間遠心分離することによって回収した。細胞ペレットを、１錠剤／１０ｍｌの完全ミニ無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤を補足した１０ｍｌ／ｇ（湿潤重量）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ；ＮａＣｌ１３７ｍＭ、ＫＣｌ２．７ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4８ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4２ｍＭ、ｐＨ７．４）を用いて再懸濁させた。この混合物を−８０℃で一晩インキュベートした後、４℃でのインキュベーションによりゆっくりと解凍した。１２５Ｗの４秒間パルスを９秒間の休止期間を挟んで合計１５分間にわたって続けるという超音波処理を１５℃で実施することによって細胞溶解を完了させた。次にＰＥＩを最終濃度０．４４％（ｖ／ｖ）で添加して細菌ＤＮＡを沈殿させた。溶けなかった残骸を４℃にて１６，０００ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。残骸を除去されたライセートに対してその後逆転移サイクリング（ＩＴＣ）を３回続けて実施した。簡単に述べると、ＥＬＰ２０ポリペプチドを２５℃でＮａＣｌを用いて沈殿させ、２５℃にて１６，０００ｇで３０分間遠心分離すること（「暖スピン」）によって回収した。上清に含まれる可溶性タンパク質を除去した後、ＥＬＰ２０含有ペレットを冷たいＰＢＳに再懸濁させた。ペレットに含まれる、大腸菌からの熱変性した不溶性タンパク質を、４℃にて１６，０００ｇで１５分間遠心分離すること（「冷スピン」）によって除去する一方で、ＥＬＰ２０を含む上清に対して追加のＩＴＣを実施した。各「暖スピン」の前に使用したＮａＣｌの最終濃度は、１回目、２回目、３回目のＩＴＣでそれぞれ１．５Ｍ、０．７Ｍ、０．５Ｍであった。次に、可溶性ＥＬＰ２０を、１ｋＤａのＭＷＣＯ透析管（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ７）を用いて４℃の超純水に対して徹底的に透析した後、凍結乾燥させた。ＥＬＰ２０の純度と平均ＭＷは、コロイダルブルーＧ２５０で染色した１５％トリス−グリシンゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【００８１】
ＥＬＰ２０の質量分析
ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦＰｒｅｍｉｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ社、マンチェスター、イギリス国）で質量分析を実施した。使用した溶媒はすべてＨＰＬＣグレードであった。凍結乾燥させたＥＬＰ２０をＤＭＳＯに再懸濁させた後、Ｈ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１：１ｖ／ｖ）の中で希釈した。この溶液をメタノール／０．１％ギ酸水溶液（１：１ｖ／ｖ）の中で希釈して最終濃度を約１０ピコモル／μｌにし、エレクトロスプレーイオン化源に流速１０μｌ／分で注入した。質量分析器をプラスモードで操作し、アセトニトリル／０．１％ギ酸水溶液（１：１ｖ／ｖ）の中に標準タンパク質アポミオグロビンが１ピコモル／μｌの濃度で含まれる溶液を用いて外部較正を実施した。ＥＬＰ２０スペクトルの解析を、Ｗａｔｅｒｓ社のソフトウエアＭａｘＥｎｔにより、最大エントロピーに基づく方法を利用して行なった。ＥＬＰ２０の平均分子量の理論値は１０，３８１．６４Ｄａである。実験値［Ｍ＋Ｈ］+＝１０，３８２．０。
【００８２】
ＥＬＰ２０のＮＭＲ質量分析
位相感受性（ｐｈａｓｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＨＳＱＣ実験を利用して２Ｄスペクトルを取得すると、1Ｈ−13Ｃ結合に加えてＤＥＰＴタイプの情報が得られた。この実験は、ＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅＩＩＩＨＤＮＭＲを４００．３ＭＨｚ（炭素に関しては１００．７ＭＨｚ）で作動させて２９８Ｋで実施した。使用した1ＪＣＨは１４５Ｈｚであった。リサイクルの遅延を２秒にして１２８回のスキャンを行なった。ＣＯＳＹ実験を同じ質量分析器で２９８Ｋにて実施した。リサイクルの遅延を２秒にして２５６回のスキャンを記録した。ＤＭＳＯ信号を参照信号として使用した（δ＝２．５０ｐｐｍ）。Ｔｏｐｓｐｉｎソフトウエアを用いてデータ処理を実施した。アミノ酸の化学シフトは文献で周知である。位相感受性ＨＳＱＣでは、ＣＨnスピンのベクトルは、何個の水素がその炭素原子に結合しているかに応じ、９０°パルスの後に異なる変化をする。ＣＨベクトルとＣＨ3ベクトルは、ＣＨ2とは位相が逆である。われわれは、バリンのＣＨ3が０．８５〜０．９０ｐｐｍ（13Ｃに関しては１８．９〜１９．５ｐｐｍ）であることを突き止め、それを、積分を較正するための基準として使用した。ＣＯＳＹスペクトルを調べた後、各アミノ酸の共鳴を求めた。ＥＬＰ２０の特定は、ＣＯＳＹとＨＳＱＣの助けを借りて実施した。
【００８３】
実施例２：ＥＬＰ２０のメチオニンアルキル化
ＥＬＰ２０サンプルをアルキル化剤と反応させた。その目的は、このバイオ接合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）反応がこれらタンパク質基質に及ぼす効果を評価することと、鎖の特性（ＬＣＳＴとコンホメーション）に対して得られる効果を測定することの両方であった。
【００８４】
一般的な手続き
ＥＬＰ２０を０．２Ｍのギ酸水溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かした。ハロゲン化アルキル（メチオニン残基１つにつき１５当量）をＴＨＦ中の溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）として添加した。反応物を密封し、ホイルで覆い、室温で５日間撹拌した。次に、（反応体積のほぼ半分に等しい）ジエチルエーテルを反応物に添加し、過剰なハロゲン化アルキルを抽出した。この二相反応物を軽くボルテックスした後、放置して有機相と水相に分離させた。エーテル層をピペットで回収して廃棄した。次にこの反応混合物を２，０００ＭＷＣＯ透析管に移し、０．１ＭＮａＣｌに対して２４時間透析してすべての対イオンを塩化物と交換した後、超純水に対し、水を頻繁に交換しながら４８時間透析した。生成物を凍結乾燥させて乾燥状態にすると、白色の粉末が約８５％の収率で得られた。
【００８５】
ＥＬＰ２０の化学選択的メチオニンアルキル化反応
【化１５】
2018525439.tif 000016
【００８６】
ヨウ化メチルを用いてＥＬＰ２０のメチオニン残基を最初にメチル化し、チオエーテル基から正に帯電したスルホニウムへの変化がＬＣＳＴに及ぼす効果を測定した。メチオニン１つにつき１５当量のＭｅＩを用いてメチル化を定量し、反応を酸性条件（水中の０．２Ｍギ酸）下で実施して、メチオニンの位置での反応を促進させた。過剰なヨウ化メチルは、ジエチルエーテルを用いた液体−液体抽出によって容易に除去された。合成ポリペプチドに含まれるメチオニン残基のアルキル化は、アルキル化剤が化学量論的量に近いと迅速に進行するが、ＥＬＰ２０は反応がより遅いことが見いだされたため、過剰なアルキル化剤を用いてすべてのメチオニン残基を完全に修飾した。
【００８７】
ＥＬＰ２０（Ｍｅ）とＥＬＰ２０（Ｂｎ）の合成と特徴づけ
上に記載した一般的な手続きを利用し、ＥＬＰ２０（Ｍｅ）とＥＬＰ２０（Ｂｎ）を、１０．３ｍｇのＥＬＰ２０と、ヨウ化メチルまたは臭化ベンジルからそれぞれ調製した。
【００８８】
1ＨＮＭＲによってＥＬＰ２０（Ｍｅ）とＥＬＰ２０（Ｂｎ）の特徴を明らかにした。1ＨＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ社の質量分析器で５００ＭＨｚにて周囲温度で記録し、４．７８ｐｐｍの位置にあるＤ2Ｏ溶媒信号に対して較正した。積分値を、０．９ｐｐｍの位置にあるバリンのメチルの６個のプロトンに対して較正した。
【００８９】
上に記載したのと同様にして、１５当量の臭化ベンジルを用い、よりかさばるベンジル基をＥＬＰ２０の各メチオニン側鎖の位置に導入した。Ｅｔ2Ｏで抽出した後、ＥＬＰ２０（Ｂｎ）を過剰なＢｎＢｒから分離し、透析と凍結乾燥を実施した。ベンジル化の程度をやはり1ＨＮＭＲ分析を利用して評価した。上記のようにしてバリンのメチル基に対して積分を較正すると、δ＝７．４７ｐｐｍと７．５４ｐｐｍの位置に共鳴が出現することが観察され、それを積分すると５個のプロトンになったため、それらの共鳴はスルホニウムのフェニル基であると特定した。δ＝４．６６ｐｐｍの位置の共鳴を積分すると２個のプロトンになったため、その共鳴はベンジル基のメチレンであると特定した。メチオニンのメチル基の共鳴は、ＥＬＰ２０でのδ＝２．０９ｐｐｍから、ＥＬＰ２０（Ｂｎ）でのδ＝２．８１ｐｐｍへとシフトした。
【００９０】
ＥＬＰ２０（Ｂｕ）の合成と特徴づけ
【化１６】
2018525439.tif 000017
Ｒは−（ＣＨ2）3−ＣＨ3（Ｂｕ）である。
【００９１】
ブチルトリフラート（ＣＨ3−（ＣＨ2）3−ＯＴｆ；ＢｕＯＴｆ）の合成：
ピリジン（１．０６当量）を不活性雰囲気（Ｎ2）下で無水ジクロロメタン（ＤＣＭ、１５ｍｌ）に添加し、この溶液を、メタノール／液体窒素浴（−２０℃）を用いて２分間冷却した。無水トリフルオロ酢酸（１．０１当量）を一滴ずつ添加し、この混合物を５分間撹拌した。ブタノール（１当量）を一滴ずつ添加した。添加後、この反応混合物を−２０℃で数分間撹拌し、次いで冷浴から取り出し、放置してゆっくりと室温に戻した。この反応混合物を同体積のヘキサンで希釈し、ＤＣＭ／ヘキサン溶媒系（５０：５０）を用いて５０ｍｌのシリカプラグに押しつけて通過させた。生成物の分画を回収し、室温にて減圧下で蒸発させると、無色の液体が得られた。
【００９２】
ＥＬＰ２０（Ｂｕ）の合成
Ａ−［ＶＰＧＭＧ］20を無水ＤＣＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）に懸濁させると白っぽい分散液が得られた。ＢｕＯＴｆ（メチオニン残基１つにつき１５当量）を添加し、この反応混合物を室温にて不活性雰囲気（Ｎ2）下で４８時間撹拌した。この反応混合物をエーテル中で沈殿させ、過剰なブチルトリフラートを除去し、真空下で室温にて蒸発させると生成物が白色の固形物として得られた。この粉末を水とアセトニトリルの混合物（１：１）に分散させた後、２，０００ＭＷＣＯ透析管に移し、０．１ＭＮａＣｌに対して２４時間透析し、脱イオン水に対し、水を頻繁に交換しながら４８時間透析した。次のこの溶液を凍結乾燥させると、ＥＬＰ２０（Ｂｕ）が白色の固形物として得られた。ＥＬＰ２０（Ｂｕ）であることは、1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ、２５℃）によって同定された（主ピーク、１つの（ＶＰＧＭＧ）反復単位）：δ３．４５〜３．２９（ｂｒｍ，４Ｈ，ＳＣＨ2）、２．９２（ｂｒｓ，３Ｈ，ＳＣＨ3）、１．８７〜１．７７（ｂｒｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ｂｕ鎖）、１．５４〜１．４７（ｂｒｍ，２Ｈ，ＣＨ2Ｂｕ鎖）、１．０４〜０．９２（ｂｒｍ，９Ｈ，ＣＨ3Ｖａｌ＋ＣＨ3Ｂｕ鎖）。
【００９３】
実施例３：アルキル化された他のＥＬＰの調製
以下に示す修飾されたＥＬＰ（化合物４〜８）を調製して特徴を明らかにした。
【化１７】
2018525439.tif 000018
【００９４】
【表１】
2018525439.tif 000019
【００９５】
【化１８】
2018525439.tif 000020
【００９６】
【表２】
2018525439.tif 000021
【００９７】
実験の手続き
エポキシドａの合成
【化１９】
2018525439.tif 000022
【００９８】
氷の上でジエチレングリコールモノエチルエーテル（１当量）と水（１ｍｌ）を混合して撹拌した後、ＮａＯＨ（２．９５当量）と０．４Ｍ水酸化テトラブチルアンモニウム（水溶液）（０．０５当量）を添加した。この混合物を０℃に戻し、エピクロロヒドリン（２．９５当量）を何回かに分けて３分間かけて添加した。この混合物を室温で１６時間撹拌した。Ｈ2Ｏ（１５ｍｌ）を添加し、この混合物をＥｔＯＡｃ（４×３０ｍｌ）で抽出した。まとめた抽出液をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させた。この抽出液を減圧下で濃縮した。残留物を真空下で蒸留すると、ａが無色の液体として得られた。沸点は１１０〜１１７℃（０．１ｍｍＨｇ）である。
【００９９】
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５℃）：δ３．８５〜３．４０（ｂｒｍ，１２Ｈ，ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2ＣＨ2）、３．２２〜３．１７（ｂｒｍ，１Ｈ，ＣＨb）、２．８４〜２．８１（ｔ，１Ｈ，ＣＨa）、２．６６〜２．６３（ｍ，１Ｈ，ＣＨa’）、１．２７〜１．２２（ｔ，３Ｈ，ＣＨ3）。
【０１００】
エポキシドｂの合成
【化２０】
2018525439.tif 000023
【０１０１】
氷の上でトリエチレングリコールモノメチルエーテル（１当量）と水（１ｍｌ）を混合して撹拌した後、ＮａＯＨ（２．９５当量）と０．４Ｍ水酸化テトラブチルアンモニウム（水溶液）（０．０５当量）を添加した。この混合物を０℃に戻し、エピクロロヒドリン（２．９５当量）を何回かに分けて３分間かけて添加した。この混合物を室温で１６時間撹拌した。Ｈ2Ｏ（１５ｍｌ）を添加し、この混合物をＥｔＯＡｃ（４×３０ｍｌ）で抽出した。まとめた抽出液をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させた。この抽出液を減圧下で濃縮した。残留物を真空下で蒸留すると、ｂが無色の液体として得られた。沸点は１１０〜１１７℃（０．１ｍｍＨｇ）である。
【０１０２】
1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５℃）：δ３．８０〜３．４４（ｂｒｍ，１４Ｈ，ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3）、３．３７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）、３．１５（ｍ，１Ｈ，ＣＨb）、２．７９（ｄｄ，Ｊ＝６．６，５．６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨa）、２．６１（ｄｄ，Ｊ＝６．７，３．６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨa’）。
【０１０３】
エポキシドｃ
【化２１】
2018525439.tif 000024
【０１０４】
エポキシドｃは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
４、５、６、７、８の合成の一般的な手続き
Ａ−［（ＶＰＧＶＧ）（ＶＰＧＭＧ）（ＶＰＧＶＧ）2］n（ｎ＝５または１０）を不活性雰囲気（Ｎ2）下で氷酢酸（２６ｍｇ／ｍｌ）に溶かした。エポキシドａ（化合物４）、エポキシドｂ（化合物５と７）、エポキシドｃ（化合物６と８）のいずれかを添加し（メチオニン残基１つにつき１５当量）、この混合物を室温で３日間撹拌した。この反応混合物を１，０００ＭＷＣＯ透析管に移し、０．１ＭＮａＣｌに対して２４時間透析し、次いで脱イオン水に対し、水を頻繁に交換しながら４８時間透析した。次に、透析バッグの内容物を凍結乾燥させると、アルキル化されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【０１０５】
化合物５：1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ，２５℃）（主ピーク）：δ３．４０（ｓ，１８Ｈ，ＯＣＨ3）、３．０４〜３．０１（ｄｄ，１８Ｈ，ＳＣＨ3）、１．００〜０．７５（ｂｒｍ，２１０Ｈ，ＣＨ3Ｖａｌ）。
【０１０６】
ＭＳ−ＥＳＩ：ＭＷの理論値＝１００１２；実験値（Ｍ＋Ｈ）7+ｍ／ｚ＝１４３０．５６
【０１０７】
化合物７：1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ，２５℃）（主ピーク）：δ３．３８（ｓ，３３Ｈ，ＯＣＨ3）、３．０１〜２．９８（ｄｄ，３３Ｈ，ＳＣＨ3）、１．０３〜０．７９（ｂｒｍ，４２０Ｈ，ＣＨ3Ｖａｌ）。
【０１０８】
化合物８：1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ，２５℃）：（主ピーク）：δ３．０３〜３．００（ｄｄ，３３Ｈ，ＳＣＨ3）、１．０１〜０．９３（ｂｒｍ，４２０Ｈ，ＣＨ3Ｖａｌ）。
【０１０９】
ＭＳ−ＥＳＩ：ＭＷの理論値＝１８２７８、実験値（Ｍ）11+ｍ／ｚ＝１６６１．７２
【０１１０】
実施例４：転移温度の測定
ＰＢＳ中の３通りの濃度（５０、１００、２００μＭ）のＥＬＰ２０、ＥＬＰ２０（Ｍｅ）、ＥＬＰ２０（Ｂｎ）に関し、スキャン速度を１℃／分にして２０℃と８０℃の間で濁度を３５０ｎｍで測定することによって転移温度（ＬＣＳＴ）を求めた。Ｖａｒｉａｎ社（パロ・アルト、カリフォルニア州）からのマルチセル熱電温度制御装置を取り付けたＣａｒｙ１００ＢｉｏＵＶ−可視光分光測光器でデータを回収した。Ｔｔは、濁度を温度に対してプロットした曲線の一次微分の最大値に対応する温度として定義される。
【０１１１】
ＥＬＰ骨格のメチル化とベンジル化がＬＣＳＴに対して及ぼす効果を調べるため、異なる濃度のリン酸緩衝液の中で濁度アッセイを実施した。
【０１１２】
ＥＬＰ２０のＬＣＳＴは、濃度（５０〜２００μＭ）に応じて２７℃〜３３℃の範囲であった。メチル化後、得られたＥＬＰ２０（Ｍｅ）は、調べた温度範囲ではＬＣＳＴを示さなかった。実際、このＬＣＳＴは高すぎて測定できない。それは、スルホニウムの正電荷が存在していることによりポリペプチド全体の親水性が増大することに起因する可能性が大きい。ベンジル化により、ＬＣＳＴの挙動を保持したポリペプチドが得られたが、ＬＣＳＴはより大きな値へとシフトした。これは、ベンジル基の疎水性が、正電荷の親水性効果を一部相殺するほど十分に大きいことを示している。ＥＬＰ２０がアルキル化されると二次構造も変化するかどうかを調べるため、どのＬＣＳＴよりも低い２０℃で、ＥＬＰ２０、ＥＬＰ２０（Ｍｅ）、ＥＬＰ２０（Ｂｎ）の円二色性（ＣＤ）スペクトルをＰＢＳの中で測定した。
【０１１３】
これらポリペプチドで通常観察されるように、ＥＬＰ２０は、約１９７ｎｍと約２２５ｎｍに位置する２つの最小値をそれぞれ特徴とするランダムコイル構造とタイプＩＩのβターン二次構造の両方を示した。アルキル化（メチル化とベンジル化）によってランダムコイル構造が全体的に増加し、タイプＩＩのβターンが減少したため、ＥＬＰの親水性が増大して秩序が低下したことが確認される。
【０１１４】
実施例５：アルキル化された他のＥＬＰの調製
修飾されたＥＬＰの化学構造
【化２２】
2018525439.tif 000025
【０１１５】
【表３−１】
2018525439.tif 000026
【表３−２】
2018525439.tif 000027
【０１１６】
一般的な合成手続き：
手続きＡ
ＭＷ−［（ＶＰＧＶＧ）（ＶＰＧＭＧ）（ＶＰＧＶＧ）2］5（ＥＬＰ−Ｍ−２０）を氷酢酸（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、この溶液にＮ2を１時間吹き込み、次いでＮ2下で撹拌することによって脱ガスした。このエポキシド（メチオニン残基１つにつき１０当量）を添加し、この混合物をＮ2下で室温にて４８時間撹拌した。この反応混合物を３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管に移し、４０ｍｌのＤＩ水で精製した。その後、カートリッジの内容物を凍結乾燥させると、修飾されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【０１１７】
手続きＢ
【０１１８】
ＭＷ−［（ＶＰＧＶＧ）（ＶＰＧＭＧ）（ＶＰＧＶＧ）2］10（ＥＬＰ−Ｍ−４０）をＡｃＯＨ／ＨＦＩＰ混合物（９／１、ｖ／ｖ）（２０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、この溶液にＮ2を１時間吹き込み、次いでＮ2下で撹拌することによって脱ガスした。このエポキシド（メチオニン残基１つにつき１０当量）を添加し、この混合物をＮ2下で室温にて４８時間撹拌した。この反応混合物を３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管に移し、４０ｍｌのＤＩ水で精製した。その後、カートリッジの内容物を凍結乾燥させると、修飾されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【０１１９】
実施例６：「クリック化学」によるアルキン担持ＥＬＰとアジド機能化糖のバイオ接合
この実施例は、以下の反復単位（「クリックされた」メチオニン残基）を有するＥＬＰの調製に関する。
【０１２０】
【化２３】
2018525439.tif 000028
【０１２１】
アルキン担持メチオニン残基の化学構造：
【化２４】
2018525439.tif 000029
【０１２２】
【表４−１】
2018525439.tif 000030
【表４−２】
2018525439.tif 000031
【０１２３】
一般的な合成手続き：
手続きＡ
アルキン担持ＥＬＰ−Ｍ−ｎを水に溶かし（５ｍｇ／ｍｌ）、望むアジド糖（１．５当量／アルキン）を添加した。この溶液にＮ2を２時間吹き込み、次いでＮ2下で撹拌することによって脱ガスした。それとは別に、アスコルビン酸ナトリウム（０．６５当量／アルキン）をＣｕ（ＩＩ）ＳＯ4（０．１３当量／アルキン）とペンタメチルジエチレントリアミン（０．１３当量／アルキン）の脱ガス溶液に添加することによってＣｕ（Ｉ）の溶液を調製した。このＣｕ（Ｉ）溶液を注射器で反応混合物に移した。この反応物を室温で７２時間撹拌した。この溶液を３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管に移し、ＥＤＴＡ溶液を用いて精製した後、４０ｍｌのＤＩ水を用いて精製した。その後、カートリッジの内容物を凍結乾燥させると、グリコシル化されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【０１２４】
手続きＢ
【０１２５】
アルキン担持ＥＬＰ−Ｍ−４０を以前に真空中で脱ガスした水に溶かし（５ｍｇ／ｍｌ）、α−Ｄ−マンノピラノシルアジド（１．５当量／アルキン）を添加し、この混合物をＮ2下で撹拌した。それとは別に、アスコルビン酸ナトリウム（０．６５当量／アルキン）をＣｕ（ＩＩ）ＳＯ4（０．１３当量／アルキン）とペンタメチルジエチレントリアミン（０．１３当量／アルキン）の脱ガス溶液に添加することによってＣｕ（Ｉ）の溶液を調製した。この溶液は濃い青色になった。このＣｕ（Ｉ）溶液を注射器で反応混合物に移した。この反応物を室温で７２時間撹拌した。この溶液を３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管に移し、ＥＤＴＡ溶液を用いて精製した後、４０ｍｌのＤＩ水を用いて精製した。その後、カートリッジの内容物を凍結乾燥させると、グリコシル化されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【０１２６】
実施例７：対イオンの交換と転移温度（Ｔｔ）のチューニング
ＥＬＰの化学構造：
【化２５】
2018525439.tif 000032
【０１２７】
【表５】
2018525439.tif 000033
【０１２８】
イオン交換のための一般的な合成手続き
【０１２９】
ＭＷ−［（ＶＰＧＶＧ）（ＶＰＧＭＧ）（ＶＰＧＶＧ）2］10（ＥＬＰ−Ｍ−４０）を０．２Ｍギ酸水溶液に溶かした（２０ｍｇ／ｍｌ）。ヨードメタン（メチオニン１つにつき１５当量）を溶液としてＴＨＦに添加した（５０ｍｇ／ｍｌ）。この反応物を密封し、ホイルで覆い、室温で４日間撹拌した。（反応物の体積のほぼ半分に等しい）ジエチルエーテルをこの反応物に添加して過剰なハロゲン化アルキルを抽出した。この二相反応物を軽くボルテックスした後、相が分離するまで放置した。エーテル層をピペットで回収して廃棄した。次にこの反応混合物を３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管に移し、４０ｍｌのＤＩ水を用いて精製した。その後、カートリッジの内容物を凍結乾燥させると、修飾されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【０１３０】
以前に合成したメチル化されたＥＬＰ−Ｍ−４０を水に懸濁させ、望む塩（ＮａＸまたはＬｉＸ、スルホニウム１つにつき５当量）の溶液に一滴ずつ添加した。この混合物を室温で、または大半の疎水性対イオンに関しては１０℃で、一晩撹拌した。この溶液を３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管に移し、ＤＩ水で２回精製して過剰な塩を除去した。次にカートリッジの内容物を塩（スルホニウム１つにつき５当量）の新たな溶液に一滴ずつ添加して一晩撹拌した。３，０００ＭＷＣＯ超遠心分離フィルタ管を用い、この溶液を４０ｍｌのＤＩ水で精製した。その後、カートリッジの内容物を凍結乾燥させると、修飾されたＥＬＰが白色の固形物として得られた。
【配列表】
2018525439000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月12日(2018.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのメチオニン残基を含むエラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させることを目的とした、チオエーテルアルキル化法の利用。
【請求項２】
前記エラスチン様ポリペプチドが、以下の式（Ｖ）：
【化１】
2018525439.tif 000046
を持つ少なくとも１つの反復単位を含む、請求項１に記載の利用。
【請求項３】
以下の式（Ｉ）：
【化２】
2018525439.tif 000047
（ただしＲは、
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキル基；
（このアルキル基は、ＯＨ、ＯＲa、ＮＲbＲc、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒcからなるグループから選択された１つ、またはいくつかの置換基で置換することができる（ここに
Ｒaは、１つ、またはいくつかのヘテロ原子を割り込ませることのできる（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルキン基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルケニル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−Ｘ’基からなるグループから選択され；
Ｘ’は、以下の式：
【化３】
2018525439.tif 000048
を持つ基を表わし；
ＲbとＲcは、互いに独立に、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ10）アルキル基を表わす））
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキレン−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ2〜Ｃ22）アルキン基；
−糖
からなるグループから選択される）を持つ少なくとも１つの反復単位を含む化合物。
【請求項４】
以下の式（ＩＩ）：
【化４】
2018525439.tif 000049
（ただし、
−ｎは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項３において定義した通りであり；
−Ａは、Ｈ、アセチル、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択され；
−Ｂは、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＡｃ、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択される）を持つ、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ａが、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｂが、ＯＨであるか、ペプチド、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸からなるグループから選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
以下の式（ＩＩＩ）：
【化５】
2018525439.tif 000050
（ただし、
−ｍは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項３において定義した通りであり；
−Ａ’は、１〜２０個のアミノ酸を含むペプチドである）を持つ、請求項３〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
以下の式（ＩＶ）：
【化６】
2018525439.tif 000051
（ただし、
−ｐは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項３において定義した通りであり；
−Ａ”は、１〜２０個のアミノ酸を含むペプチドである）を持つ、請求項３〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒが、
−（Ｃ1−Ｃ22）アルキル基；と
−（Ｃ1−Ｃ22）アルキレン−フェニル基
からなるグループから選択される、請求項３〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒが、−Ａ1−ＣＨ（ＯＨ）−Ａ2−Ｏ−Ａ3−Ａ4基である（ただし、
−Ａ1は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり；
−Ａ2は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基であり；
−Ａ3は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基または−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）i−基（ｉは１〜４の整数である）であり；
−Ａ4は、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン基または（Ｃ2−Ｃ4）アルキン基である）、請求項３〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒが（Ｃ1−Ｃ4）アルキル基またはベンジル基である、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれか１項に記載の化合物を調製することを目的としたチオエーテルアルキル化法であって、以下の式（Ｖ）：
【化７】
2018525439.tif 000052
を持つ反復単位を含むエラスチン様ポリペプチドのチオエーテルアルキル化工程を含んでいて、このチオエーテルアルキル化工程が、アルキル化剤との反応からなる方法。
【請求項１３】
前記アルキル化剤が、式（ＩＩＩ）Ｒ−Ｘの化合物である（ただしＲは請求項３において定義した通りであり、Ｘは、ハロゲン原子であるか、式（ＩＩＩ−１）の化合物：
【化８】
2018525439.tif 000053
（ただしＡ2、Ａ3、Ａ4は、請求項１０において定義した通りである）である）、請求項１２に記載のチオエーテルアルキル化法。
【請求項１４】
エラスチン様ポリペプチドの下限臨界溶液温度を変化させる方法であって、この方法が、以下の式（Ｖ）：
【化９】
2018525439.tif 000054
を持つ少なくとも１つの反復単位を含むエラスチン様ポリペプチドのチオエーテルアルキル化工程を含んでいる方法。
【請求項１５】
前記チオエーテルアルキル化工程が、エラスチン様ポリペプチドを式（ＩＩＩ）Ｒ−Ｘの化合物（ただしＲは請求項３において定義した通りであり、Ｘはハロゲン原子である）と反応させることからなる、請求項１４に記載の下限臨界溶液温度を変化させる方法。
【請求項１６】
以下の式（Ｉ’）：
【化１０】
2018525439.tif 000055
を持つ少なくとも１つの反復単位（ただし、
Ｘ１は対イオンであり；
Ｒは、
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキル基；
（このアルキル基は、ＯＨ、ＯＲa、ＮＲbＲc、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒcからなるグループから選択された１つ、またはいくつかの置換基で置換することができる（ここに
Ｒaは、１つ、またはいくつかのヘテロ原子（Ｏ、ＮＨ、Ｓなど）を割り込ませることのできる（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルキン基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−（Ｃ2〜Ｃ10）アルケニル基、（Ｃ1〜Ｃ10）アルキレン−Ｘ’基からなるグループから選択され；
Ｘ’は、以下の式：
【化１１】
2018525439.tif 000056
を持つ基を表わし；
ＲbとＲcは、互いに独立に、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ10）アルキル基を表わす））
−（Ｃ1〜Ｃ22）アルキレン−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ6〜Ｃ30）アリール基；
−（Ｃ2〜Ｃ22）アルキン基；
−糖
からなるグループから選択される）を含む化合物。
【請求項１７】
以下の式（ＩＩ’）：
【化１２】
2018525439.tif 000057
（ただし、
−Ｘ1は対イオンであり；
−ｎは１〜２００の整数であり；
−Ｒは、請求項１６において定義した通りであり；
−Ａは、Ｈ、アセチル、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択され；
−Ｂは、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＡｃ、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、合成ポリマーからなるグループから選択される）を持つ、請求項１６に記載の化合物。
【国際調査報告】
2018525439.tif 000058
2018525439.tif 000059
2018525439.tif 000060
2018525439.tif 000061