(57)【要約】がん処置の新規な方法として、ヒトＨＬＡ−ＤＲを標的にするＣＡＲ細胞および抗体が記載されている。ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ細胞は患者において安全かつ有効であり、ＨＬＡ−ＤＲを発現するヒト腫瘍を処置するために使用し得ることが提案されている。上記ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み得る。
2018524973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインを含む、抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域および抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域と前記抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域との間に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域が、配列番号１〜６またはその各々の等価物のうちの１つまたは複数を含むＣＤＲ領域を含む、請求項２または３に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号７もしくは配列番号９によってコードされるポリペプチド、（ｉｉ）配列番号８もしくは配列番号１０を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）その各々の等価物のうちの１つまたは複数を含む、請求項２または３に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域が、配列番号１１〜１６、またはその各々の等価物のうちの１つまたは複数を含むＣＤＲ領域である、請求項２または３に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号１７もしくは１９によってコードされるポリペプチド、（ｉｉ）配列番号１８もしくは配列番号２０を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）その各々の等価物のうちの１つまたは複数を含む、ＣＤＲ領域である、請求項２または３に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、リンカー、任意選択で、グリシン−セリンリンカーによって連結されている、請求項２から７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
等価物が、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体に対して高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、請求項２から９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞に結合している、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲを含む複合体。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のＣＡＲまたはその相補体もしくはその各々の等価物をコードする単離された核酸配列。
【請求項１３】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体またはＨＬＡ−ＤＲリガンドの前記抗原結合性ドメインの上流に位置するコザックコンセンサス配列をさらに含む、請求項１２に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２または１３に記載の単離された核酸配列。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項１６】
プラスミドである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
レンチウイルスベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む単離された細胞；および／または請求項１２から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸；および／または請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１９】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２０】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１８から１９のいずれかに記載の単離された細胞。
【請求項２１】
ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞に結合している、請求項１８から２０のいずれかに記載の単離された細胞を含む複合体。
【請求項２２】
担体と、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む単離された細胞；および／または請求項１２から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸；および／または請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクター；および／または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の単離された細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物。
【請求項２３】
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を産生する方法であって、
（ｉ）単離された細胞の集団に、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列を形質導入することに成功した前記単離された細胞の小集団を選択するステップであって、それによってＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を産生するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
前記細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
それを必要とする対象において腫瘍の増殖を阻害する方法であって、前記対象に有効量の請求項１８から２０に記載の単離された細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
前記単離された細胞が、処置される前記対象に対して自己由来または同種異系である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍ががん性である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍が、正常な非がん性の対応細胞と比較してＨＬＡ−ＤＲを過剰発現する、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が哺乳動物である、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記腫瘍がＢ細胞リンパ腫腫瘍または白血病腫瘍である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象にＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法以外の抗腫瘍療法を施すステップをさらに含む、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
それを必要とするがん患者を処置する方法であって、前記対象に有効量の請求項１８から２０に記載の単離された細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
前記単離された細胞が、処置される前記対象に対して自己由来または同種異系であり、任意選択で第１選択、第２選択、第３選択、第４選択または第５選択の療法である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんの細胞が、正常な非がん性の対応細胞と比較してＨＬＡ−ＤＲを発現するか、または過剰発現する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が哺乳動物である、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記がんがＢ細胞リンパ腫または白血病である、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象にＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法以外の抗腫瘍療法を施すステップをさらに含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
対象がＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか否かを決定する方法であって、患者から単離された腫瘍またはがん試料をＨＬＡ−ＤＲに選択的に結合する作用物質と接触させるステップを含み、前記腫瘍またはがん試料に結合した前記作用物質の存在によって、前記対象が前記ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことが示され、前記腫瘍またはがん試料に結合した前記作用物質の非存在によって、前記対象が前記ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が低いことが示される、方法。
【請求項３９】
ＨＬＡ−ＤＲに選択的に結合する前記作用物質が、抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記作用物質または抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体またはその抗原結合性断片が検出可能に標識される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
対象がＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか否かを決定する方法であって、前記対象から単離された腫瘍またはがん試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルを決定するステップを含み、正常な対応試料と比較した前記ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現上昇によって、前記対象が前記ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことが示され、発現の上昇がないことによって、前記対象が前記ＨＬＡ−ＤＲ療法に応答する可能性が低いことが示される、方法。
【請求項４２】
ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの前記発現レベルが、免疫組織化学またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法によって決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を受ける対象においてモニタリングＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法をモニタリングする方法であって、患者から単離された試料を、ＨＬＡ−ＤＲに選択的に結合する作用物質と接触させるステップと、前記試料に結合した任意の作用物質の存在を決定するステップとを含む方法。
【請求項４４】
ＨＬＡ−ＤＲに選択的に結合する前記作用物質が、抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体またはその抗原結合性断片である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記作用物質または抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体またはその抗原結合性断片が、検出可能に標識される、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記がんまたは腫瘍が、癌腫、肉腫または白血病の群から選択される、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
したがって、前記試料が、痰、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、血液、または組織のうちの１つまたは複数を含む、請求項３８から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと判定された患者に有効量のＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を施すステップをさらに含む、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記療法が、第１選択、第２選択、第３選択、第４選択または第５選択の療法である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法および指示書を備えるキット。
【請求項５１】
対象から単離された試料におけるＨＬＡ−ＤＲの存在を検出するための試薬および指示書をさらに備える、請求項５０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１５年６月４日に出願された米国仮出願番号第６２／１７１，００４号に基づく優先権を主張しており、この仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、そしてその全体が参考として本明細書によって援用される。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年６月１日に作成され、０６４１８９−７２０２＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、そしてサイズは５１，８０４バイトである。
【０００３】
（背景）
本開示は概して、ヒト免疫学、特にがん免疫療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
以下の背景の考察は、読者が本開示を理解するのを助けるために示しただけであり、本開示の先行技術を記載または構成するとは認められない。
【０００５】
Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、ヒトＢ細胞、樹状細胞、ならびにＢ細胞由来リンパ腫および白血病の表面上に主に発現されるＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ分子に対するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
新規ながん免疫療法キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する方法および組成物が提供される。本開示の態様は、（ａ）Ｌｙｍ−１および／またはＬｙｍ−２抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；ならびに（ｄ）細胞内ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示のさらなる態様は、（ａ）Ｌｙｍ−１および／またはＬｙｍ−２抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【０００７】
本開示の態様は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２抗体に関する。
【０００８】
本開示のいくつかの態様は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗原に特異的な抗原結合性ドメイン、例えば、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２抗体の抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【０００９】
本開示のさらなる態様は、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ−２  ＣＡＲをコードする単離された核酸配列およびこの単離された核酸配列を含むベクターに関する。
【００１０】
本開示の他の態様は、Ｌｙｍ−１またはＬｙｍ−２指向性ＣＡＲを含む単離された細胞、およびそのような細胞を産生する方法に関する。本開示のさらに他の方法態様は、腫瘍の増殖を阻害し、がん患者を処置するための方法であって、それを必要とする組織または対象に有効量の単離された細胞を投与するステップを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる方法に関する。
【００１１】
本開示のさらなる方法態様は、Ｌｙｍ−１またはＬｙｍ−２抗体および／またはＬｙｍ−１  ＣＡＲまたはＬｙｍ−２  ＣＡＲ細胞のうちの１つまたは複数の使用を通じて、患者がＬｙｍ−１  ＣＡＲまたはＬｙｍ−２  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いかまたはそうでないか否かを判定する方法に関する。
【００１２】
本開示のさらなる態様は、担体と、本明細書に開示される実施形態で記載される生成物のうちの１つまたは複数とを含む組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、（図１Ａ）陰性対照；（図１Ｂ）Ｌｙｍ−１；（図１Ｃ）Ｌｙｍ−１およびＢ１；（図１Ｄ）Ｂ１のみ；（図１Ｅ）Ｌｙｍ−２；および（図１Ｆ）患者の正常な末梢血リンパ球とのＬｙｍ−２およびＢ１染色反応性のフローサイトメトリー分析を示す図である。Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２の両方は、正常なヒト末梢性Ｂ細胞に対する結合の異なるプロファイルを有する。
【００１４】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、Ｂ細胞胚中心において膜の陽性を実証する、正常なヒト扁桃のＬｙｍ−１およびＬｙｍ−２染色を示す図である。染色パターンにおける差は、Ｌｙｍ−１（図２Ａ）とＬｙｍ−２（図２Ｂ）の間で明らかである。散在性の濾胞間の樹状細胞のみが、Ｔ細胞ゾーン（ＩＨＣ、凍結切片、×３２５）中で両方の抗体について陽性である。
【００１５】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２モノクローナル抗体の免疫ペルオキシダーゼ染色であり、中間グレードの悪性Ｂ細胞リンパ腫を示す図である。Ｌｙｍ−１（図３Ａ）およびＬｙｍ−２（図３Ｂ）モノクローナル抗体の免疫ペルオキシダーゼ染色、中間グレードの悪性Ｂ細胞リンパ腫（凍結切片、×７２０）である。切片中の細胞の大多数の顕著な膜染色パターンに留意されたい。
【００１６】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、（図４Ａ）Ｒａｊｉ細胞に対するＬｙｍ−１モノクローナル抗体およびＡＲＨ−７７細胞に対するＬｙｍ−２モノクローナル抗体の結合プロファイル；（図４Ｂ）Ｌｙｍ−１モノクローナル抗体とＲａｊｉ細胞のスキャッチャードプロット分析；（図４Ｃ）Ｌｙｍ−２モノクローナル抗体とＡＲＨ−７７細胞のスキャッチャードプロット分析の結合プロファイルおよびスキャッチャードプロットを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、（図４Ａ）Ｒａｊｉ細胞に対するＬｙｍ−１モノクローナル抗体およびＡＲＨ−７７細胞に対するＬｙｍ−２モノクローナル抗体の結合プロファイル；（図４Ｂ）Ｌｙｍ−１モノクローナル抗体とＲａｊｉ細胞のスキャッチャードプロット分析；（図４Ｃ）Ｌｙｍ−２モノクローナル抗体とＡＲＨ−７７細胞のスキャッチャードプロット分析の結合プロファイルおよびスキャッチャードプロットを示す図である。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、（図４Ａ）Ｒａｊｉ細胞に対するＬｙｍ−１モノクローナル抗体およびＡＲＨ−７７細胞に対するＬｙｍ−２モノクローナル抗体の結合プロファイル；（図４Ｂ）Ｌｙｍ−１モノクローナル抗体とＲａｊｉ細胞のスキャッチャードプロット分析；（図４Ｃ）Ｌｙｍ−２モノクローナル抗体とＡＲＨ−７７細胞のスキャッチャードプロット分析の結合プロファイルおよびスキャッチャードプロットを示す図である。
【００１７】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｌｙｍ−１（図５Ａ）およびＳＣ−２抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（図５Ｂ）による３５Ｓ−メチオニンおよび１４Ｃ−ロイシン−標識Ｒａｊｉタンパク質の免疫沈降を示す図である。
【００１８】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、免疫療法のための、（図６Ａ）Ｌｙｍ−１および（図６Ｂ）Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の構築の概略を示す図である。図６Ａおよび６Ｂは、配列番号５１を開示する。
【００１９】
【図７】図７は、模式的な非限定の例示的なＬｙｍ−１遺伝子移入ベクターおよび導入遺伝子を示す図である。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶベースで、２シストロン性のレンチウイルスベクターｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎであり、ＨＩＶ−１  ５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、ＺｓＧｒｅｅｎ、緑色蛍光タンパク質、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにシミアンウイルス４０オリジン（ＳＶ４０）を含有する。ＣＤ８リーダー配列、Ｌｙｍ−１に特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域および４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子の構成的な発現は、ＥＦ−１αプロモーターの存在によって保証される。検出タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域によって実施される。ベクターの組込みは、蛍光顕微鏡による、細胞中のＺｓＧｒｅｅｎの存在によってアッセイすることができる。
【００２０】
【図８】図８は、初代ヒトＴ細胞におけるＬｙｍ−１  ＣＡＲの発現を示す図である。Ｔ細胞はＬｙｍ−１  ＣＡＲが形質導入され、Ｂｉｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、続いてストレプトアビジン−ＰＥで染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。
【００２１】
【図９】図９は、Ｌｙｍ−１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞毒性は、方法に記載されるとおりＬＤＨ細胞毒性キットを使用して決定された。アッセイ前に、Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２ｍｌの培地に３０ｕｌ）を使用して活性化された。活性化Ｔ細胞はＬｙｍ−１  ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入され、その後にＴ細胞はαＣＤ３／ＣＤ８  ビーズを使用して活性化された。未形質導入の活性化Ｔ細胞は、対照として使用された。１５，０００個のＲａｊｉ細胞を、ウェル当たりプレートした。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ウェルに２０：１、１０：１、５：１および１：１の比で添加した。各データポイントは、三連の測定の平均を表す。
【００２２】
【図１０】図１０は、模式的な非限定の例示的なＬｙｍ−２遺伝子移入ベクターおよび導入遺伝子を示す図である。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶベースで、２シストロン性のレンチウイルスベクターｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎであり、ＨＩＶ−１  ５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、ＺｓＧｒｅｅｎ、緑色蛍光タンパク質、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにシミアンウイルス４０オリジン（ＳＶ４０）を含有する。ＣＤ８リーダー配列、Ｌｙｍ−２に特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域およびＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子の構成的な発現は、ＥＦ−１αプロモーターの存在によって保証される。検出タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域によって実施される。ベクターの組込みは、蛍光顕微鏡による、細胞中のＺｓＧｒｅｅｎの存在によってアッセイすることができる。
【００２３】
【図１１】図１１は、初代ヒトＴ細胞におけるＬｙｍ−２  ＣＡＲの発現を示す図である。Ｔ細胞はＬｙｍ−２  ＣＡＲが形質導入され、Ｂｉｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、続いてストレプトアビジン−ＰＥで染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。
【００２４】
【図１２】図１２は、Ｌｙｍ−２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞毒性は、方法に記載されるとおりＬＤＨ細胞毒性キットを使用して決定された。アッセイ前に、Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２ｍｌの培地に３０ｕｌ）を使用して活性化された。活性化Ｔ細胞はＬｙｍ−２  ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入され、その後にＴ細胞はαＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して活性化された。未形質導入の活性化Ｔ細胞は、対照として使用された。１５，０００個のＲａｊｉ細胞を、ウェル当たりプレートした。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ウェルに２０：１、１０：１、５：１および１：１の比で添加した。各データポイントは、三連の測定の平均を表す。
【００２５】
【図１３】図１３は、Ｌｙｍ−１、Ｌｙｍ−２、およびＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ヒトリンパ腫Ｒａｊｉ細胞に対して高度に細胞傷害性であることを示す図である。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２によって標的されるＨＬＡ−ＤｒとＣＤ１９の両方について陽性であり、ＣＤ１９はＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の陽性対照として作用する。陰性対照は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＺｓｇｒｅｅｎ細胞からなる。
【００２６】
【図１４】図１４は、Ｌｙｍ−１、Ｌｙｍ−２がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＬＡ−Ｄｒ陽性であるが、ＣＤ１９陰性であるＴＬＢＲ−２ヒトＴリンパ腫細胞に対して高度に細胞溶解性であるが、ＣＤ１９  ＣＡＲはそうではないことを示す図である。リンパ腫に関連する乳房移植片に由来するＴＬＢＲ−２ヒトＴリンパ腫細胞は、ＨＬＡ−Ｄｒに関して陽性であるが、ＣＤ１９に関してはそうではない（Lechnerら（２０１２年）Clin.  Cancer  Res.１８巻（１７号）：４５４９〜４５５９頁）。これらの結果は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異性ならびにＨＬＡ−Ｄｒ陽性腫瘍の死滅におけるそれらの作用強度を示す。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  ＴおよびＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ陽性細胞のパーセンテージを、通常の未形質導入初代Ｔ細胞を使用して５０％に調整した。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のパーセンテージは、２４％であった。
【００２７】
【図１５】図１５は、トランスフェクトされたＮＫ細胞のＦＡＣｓ分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（詳細な説明）
本開示は、記載される特定の態様に限定されず、当然のことながら変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００２９】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この技術が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本技術の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイスおよび材料がここに記載される。本明細書で引用した全ての技術文献および特許公報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本技術が先行発明によってそのような開示よりも先行する資格がないという承認と解釈されるものはない。
【００３０】
本技術の実施には、他に示さない限り、当技術分野の技術範囲内の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術が使用される。例えば、SambrookおよびRussell編（２００１年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版；Ausubelら編（２００７年）Current  Protocols  in  Molecular  Biologyのシリーズ；Methods  in  Enzymology（Academic  Press,  Inc.、N.Y.）のシリーズ；MacPhersonら（１９９１年）PCR1:  A  Practical  Approach（IRL  Press、Oxford  University  Press）；MacPhersonら（１９９５年）PCR2:  A  Practical  Approach；HarlowおよびLane編（１９９９年）Antibodies,  A  Laboratory  Manual；Freshney（２００５年）Culture  of  Animal  Cells:A  Manual  of  Basic  technique、第５版；Gait編（１９８４年）Oligonucleotide  Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；HamesおよびHiggins編（１９８４年）Nucleic  Acid  Hybridization；Anderson（１９９９年）Nucleic  Acid  Hybridization；HamesおよびHiggins編（１９８４年）Transcription  and  Translation;  Immobilized  Cells  and  Enzymes（IRL  Press（１９８６年））；Perbal（１９８４年）A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning；MillerおよびCalos編（１９８７年）Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）；Makrides編（２００３年）Gene  Transfer  and  Expression  in  Mammalian  Cells；MayerおよびWalker編（１９８７年）Immunochemical  Methods  in  Cell  and  Molecular  Biology（Academic  Press、London）；ならびにHerzenbergら編（１９９６年）Weir's  Handbook  of  Experimental  Immunologyを参照のこと。
【００３１】
範囲を含む全ての数値指定、例えばｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、適宜、１．０または０．１の増分で（＋）もしくは（−）変化する近似であるか、そうでなければ＋／−１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％の変動である。必ずしも明示的ではないが、全ての数値表示の前に「約」という用語が付されていることを理解されたい。また、必ずしも明示的ではないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であること、およびそのような等価物が当技術分野で公知であることも理解されるべきである。
【００３２】
本技術がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関連する場合、等価物または生物学的に等価物は、本技術の範囲内であることが意図されていることは、明白な記載なしでかつ別段意図しない限り、推測されるべきである。
【００３３】
定義
本明細書および特許請求の範囲において使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物生物をいう。「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両方を含む。
【００３５】
「対象」、「宿主」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書で交換可能に用いる場合、ヒトおよび動物の対象、例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、およびウシを指す。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、例であって、限定するものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組合せ、ならびに、任意の脊椎動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスのような哺乳動物における免疫応答中に産生される同様の分子、ならびに非哺乳動物種における同様の分子、例えば、サメ免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を総称する。特に断りのない限り、「抗体」という用語は、他の分子（例えば、生物学的試料中の他の分子に対する結合定数よりも大きい少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、または少なくとも１０５Ｍ−１の目的の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体断片）に対する結合の実質的な除外に対して、インタクトな免疫グロブリンと、目的の分子（または目的の高度に類似した分子の群）に特異的に結合する「抗体断片」または「抗原結合性断片」を含む。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce  Catalog  and  Handbook（１９９４〜１９９５年）（Pierce  Chemical  Co.、Rockford、Ill）；Kuby,  J.（１９９７年）Immunology、第３版、W.H.  Freeman  &  Co.、New  Yorkも参照のこと。抗体の「抗原結合性断片」とは、抗体の標的抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の一部である。
【００３７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって、産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリッド抗体形成細胞を骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合から作製することにより、当業者に公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体としては、ヒト化モノクローナル抗体およびヒト抗体が挙げられる。
【００３８】
抗体構造に関して、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互連結された重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）を有する。軽鎖にはラムダ（λ）とカッパ（κ）の２種類がある。抗体分子の機能活性を決定する、５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（この領域は「ドメイン」としても公知である）。組み合わせれば、重鎖および軽鎖可変領域は抗原に特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は規定されている（参照により本明細書に援用される、Kabatら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services、１９９１年を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースは、現在オンラインで管理されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、主にβシートコンフォメーションを採用し、ＣＤＲは、βシート構造を連結し、ある場合には、その一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合相互作用によって、ＣＤＲを正しい配向に位置付ける足場を形成するように機能する。
【００３９】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。各鎖のＣＤＲは、代表的には、Ｎ末端から順に番号が付けられてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、代表的にはまた特定のＣＤＲが位置する鎖（ＣＤＨＲと名付けられた重鎖領域およびＣＤＬＲと名付けられた軽鎖領域）によっても特定される。したがって、ＣＤＨＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であり、一方で、ＣＤＬＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。ＴＮＴ抗体は、ＴＮＴ関連抗原に固有の特異的ＶＨ領域およびＶＬ領域配列を有し、したがって特異的ＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体から抗体まで変化するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体のような特異的体液性または細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに複雑な炭水化物（例えば、多糖類）、リン脂質およびタンパク質などの高分子を含む任意の種類の分子であってもよい。抗原の一般的なカテゴリーとしては、限定するものではないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患に関与する抗原、アレルギーおよび移植片拒絶、毒素ならびにその他の雑多な抗原が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用される「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原標的に特異的に結合することができる任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。
【００４２】
本明細書で使用する「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、ある場合には、「キメラ受容体」、「Ｔ体」または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。「抗原に結合することができる細胞外ドメイン」とは、特定の抗原に結合することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」とは、細胞内の生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて、１つまたは複数の同時刺激シグナル伝達ドメインを含んでも、または代わりに本質的にそれからなっても、またはさらに含んでもよい。「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜を貫通することが知られており、細胞外ドメインおよびシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体とは、任意選択で、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして働く「ヒンジドメイン」を含んでもよい。このようなドメインの非限定的な例は、本明細書に提供され、例えば、以下である：
ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジ配列、配列番号４２：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域配列番号４３：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
細胞内ドメイン：４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域、配列番号４４：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
細胞内ドメイン：ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域、配列番号４５：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域、配列番号４６：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡ−ＤＲ」という用語は、この名称に関連するＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体、およびＨＬＡ−ＤＲＡとＨＬＡ−ＤＲＢハプロタイプとの組合せを含むＨＬＡ−ＤＲ血清型ＤＲ１〜ＤＲ７５を含むが、これに限定されない、いくつかの改変体のいずれか１つを含むが、これに限定されない任意のＨＬＡ−ＤＲ改変体と、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＨＬＡ−ＤＲ配列の例は当技術分野で公知であり、その限定されない例は、Rose,  L.M.ら（１９９６年）Cancer  Immunol.  Immunother.  ４３巻：２６〜３０頁において以下が開示される：
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１００１［ＤＲ１０］配列番号３０
GDTRPRFLEEVKFECHFFNGTERVRLLERRVHNQEEYARYDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLERRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPQSGEVYTCQVEHPSVMSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLPPTGFLS;
ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２０１［ＤＲ５２］配列番号３１
GDTRPRFLELLKSECHFFNGTERVRFLERHFHNQEEYARFDSDVGEYRAVFELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGQVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPQVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKAGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETFPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWSARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGFLS;
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１［ＤＲ１７（３）］配列番号３２
GDTRPRFLEYSTSECHFFNGTERVRYLDRYFHNQEENVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGRVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPRGFLS、およびその各々の等価物。
【００４４】
Ｒｏｓｅらはまた、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が結合し得、したがって、追加の抗体、モノクローナル抗体およびその各々の抗原結合性断片の生成のための免疫原として役立ち得る例示的なエピトープを開示している。特定のＨＬＡ−ＤＲサブタイプを含むがこれらに限定されない、ＨＬＡ−ＤＲという名称またはその等価物に対応する列挙された参照番号およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号のそれぞれに関連する配列は、さらなる非限定的な例として参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
「組成物」は、代表的には、活性な作用物質、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞、抗体、化合物と、天然に存在するかまたは天然には存在しない担体、不活性物質（例えば、検出剤、または標識）または活性物質、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどとの組合せを意図しており、これは、薬学的に許容される担体を含む。担体としてはまた、薬学的賦形剤および添加のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、糖類、例としては、単糖類、二糖、三糖、四糖のオリゴ糖類、およびオリゴ糖類；誘導体化糖類、例えば、アルジトール、アルドン酸類、エステル化糖類など；ならびに多糖類または糖重合体）が挙げられ、これは、単独で存在してもよく、または１〜９９．９９重量％もしくは容積％で組み合わされて存在してもよい。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝化能力としても機能し得る、代表的なアミノ酸／抗体成分としてはアラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物賦形剤もまた、この技術の範囲内で意図しており、その例としては、限定するものではないが、単糖類、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；ならびにアルジトール類、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールが挙げられる。
【００４６】
本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、一連の複数の配列をアラインメントさせることによって決定され、多数の配列の対応するそれぞれの位置でのアミノ酸または塩基の優勢な選択を表す理想化された配列を定義する、アミノ酸または核酸配列を指す。一連の複数の配列の配列に依存して、そのシリーズのコンセンサス配列は、０個、１個、少数、またはそれ超の置換によって各配列と異なり得る。また、一連の複数の配列の配列に依存して、複数のコンセンサス配列をそのシリーズについて決定し得る。コンセンサス配列の生成は、集中的な数学的解析の対象となっている。様々なソフトウェアプログラムを用いてコンセンサス配列を決定してもよい。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤ８αヒンジドメイン」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示されるようなＣＤ８αヒンジドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ヒト、マウスおよび他の種についてのＣＤ８αヒンジドメインの例示的な配列は、Pinto,  R.D.ら（２００６年）Vet.  Immunol.  Immunopathol.  １１０巻：１６９〜１７７頁に示される。ＣＤ８αヒンジドメインに関連する配列は、Pinto,  R.D.ら（２００６年）Vet.  Immunol.  Immunopathol.  １１０巻：１６９〜１７７頁に示される。そのようなものの非限定的な例としては：
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン（配列番号３３）；
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン（配列番号３４）；
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン（配列番号３５）；
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY、およびその各々の等価物が挙げられる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示されるようなＣＤ８α膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１８３〜２０３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７５９．３）、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１９７〜２１７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１９０〜２１０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１３７２６．１）に関連する断片配列は、ＣＤ８α膜貫通ドメインのさらなる例の配列を提供する。列挙されたＮＣＢＩの各々に関連する配列は、以下のように提供される：
ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン（配列番号３６）：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT;
マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン（配列番号３７）：IWAPLAGICVALLLSLIITLI;
ラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン（配列番号３８）：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI、およびその各々の等価物。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示される４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域の例示的な配列は、米国特許出願公開第２０１３／０２６６５５１Ａ１号（米国特許出願第１３／８２６，２５８号として出願）に示されている。米国特許出願第１３／８２６，２５８号に開示されている４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域の配列は、以下のように開示されている：
４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域（配列番号３９）：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL、およびその各々の等価物。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示されるＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ２８同時刺激領域は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例示的な配列ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達ドメインは、米国特許第５，６８６，２８１号；Geiger,  T.L.ら（２００１年）Blood  ９８巻:２３６４〜２３７１頁；Hombach,  A.ら（２００１年）J  Immunol.  １６７巻：６１２３〜６１３１頁；Maher,  J.ら（２００２年）Nat  Biotechnol.  ２０巻：７０〜７５頁；Haynes,  N.M.ら（２００２年）J  Immunol.  １６９巻：５７８０〜５７８６頁；Haynes,  N.M.ら（２００２年）Blood  １００巻：３１５５〜３１６３頁に示される。非限定的な例としては、下のＣＤ２８配列（配列番号４０）：MLRLLLALNL  FPSIQVTGNK  ILVKQSPMLV  AYDNAVNLSC  KYSYNLFSRE  FRASLHKGLDSAVEVCVVYG  NYSQQLQVYS  KTGFNCDGKL  GNESVTFYLQ  NLYVNQTDIY  FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG  TIIHVKGKHL  CPSPLFPGPS  KPFWVLVVVG  GVLACYSLLVTVAFIIFWVR  SKRSRLLHSD  YMNMTPRRPG  PTRKHYQPYA  PPRDFAAYRSの残基１１４〜２２０、およびその等価物が挙げられる。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「ＩＣＯＳ同時刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示されるＩＣＯＳ同時刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＩＣＯＳ同時刺激シグナル伝達領域の非限定的な例の配列は、下記に示す例示的なポリヌクレオチド配列である米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提供される。
ＩＣＯＳ同時刺激シグナル伝達領域、配列番号４７：
ACAAAAAAGA  AGTATTCATC  CAGTGTGCAC  GACCCTAACG  GTGAATACAT  GTTCATGAGA  GCAGTGAACA  CAGCCAAAAA  ATCCAGACTC  ACAGATGTGA  CCCTA
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「ＯＸ４０同時刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示されるＯＸ４０同時刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＯＸ４０同時刺激シグナル伝達領域の非限定的な例の配列は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、以下に提供される例示的な配列を含む。
ＯＸ４０同時刺激シグナル伝達領域、配列番号４８：
AGGGACCAG  AGGCTGCCCC  CCGATGCCCA  CAAGCCCCCT  GGGGGAGGCA  GTTTCCGGAC  CCCCATCCAA  GAGGAGCAGG  CCGACGCCCA  CTCCACCCTG  GCCAAGATC
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書に示されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの例示的な配列は、米国出願第１３／８２６，２５８号（米国特許出願公開第２０１３／０２６６５５１号として公開）に示されている。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに関連する配列を以下のとおり列挙する（配列番号４１）：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR、およびその等価物。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺において成熟する種類のリンパ球を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって、Ｂ細胞などの他のリンパ球と識別される。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」という用語は、ナチュラルキラー細胞としても知られており、骨髄に由来し、かつ自然免疫系において重要な役割を果たすリンパ球の一種を指す。ＮＫ細胞は、抗体および主要組織適合性複合体が細胞表面に存在しない場合でも、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞または他のストレス細胞に対して迅速な免疫応答を提供する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指して交換可能に使用される。したがって、この用語には、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖または複数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。
【００５７】
核酸配列に適用される「コードする」という用語は、その天然の状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合にポリペプチドを「コードする」と言われ、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生するために転写および／または翻訳され得るポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補鎖であり、コード配列はそこから推定され得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、シグナルペプチドまたはシグナルポリペプチドという用語は、新たに合成された分泌または膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸配列を意図する。それは、ポリペプチドを、細胞膜を横切ってまたは細胞膜の中に向けるように作用し、その後、除去される。そのような例は、当該技術分野において周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号および第５，９５８，７３６号に記載されているものである。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどを含むがこれらに限定されない、異なる宿主間の移動のために設計された核酸構築物を指す。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、市販のベクターから調製してもよい。他の実施形態では、ウイルスベクターは、当技術分野で公知の技術に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから産生され得る。一実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞をいう。この用語には、原核細胞および真核細胞が含まれる。
【００６１】
「免疫細胞」としては、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および骨髄由来の細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマデルタＴ細胞を含むＣＤ３を発現する全ての種類の免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球（細胞は細胞傷害性応答を媒介し得る）を含む。
【００６２】
キメラ抗原受容体細胞の産生に適用される「形質導入する」または「形質導入」という用語は、外来ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、この形質導入はベクターを介して行われる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、細胞に関して「自己」という用語は、単離され、同じ対象（レシピエントまたは宿主）に注入して戻された細胞を指す。「同種異系」とは、非自己細胞を指す。
【００６４】
「有効量」または「有効な量」とは、哺乳動物または他の対象の処置のために投与された場合、疾患のそのような治療を行うのに十分である作用物質（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ細胞）の量または２つまたはそれ超の作用物質の組み合わせ量を指す。「有効量」とは、作用物質、疾患およびその重症度および処置される対象の年齢、体重などに依存して変化し得る。
【００６５】
「固形腫瘍」とは、通常は嚢胞または液体領域を含有しない異常な塊の組織である。固形腫瘍は、良性であっても、または悪性であり得る。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する種類の細胞に命名される。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫、およびリンパ腫が挙げられる。
【００６６】
「Ｂ細胞リンパ腫または白血病」という用語は、リンパ系または骨髄に関して形成される種類のがんを指し、悪性形質転換を受けて、がん内の細胞を、宿主生物に対して身体の他の部分に侵入または伝播する能力で異常にする。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するものとする。組成物および方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」とは、意図された使用のために、任意の本質的に重要な意味の他の要素を組合せに含まないことを意味するものとする。例えば、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、微量汚染物質を単離および精製方法ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水、防腐剤などを除外しない。「からなる」とは、他の成分の微量元素より多くを排除すること、および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内にある。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「検出可能なマーカー」という用語は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に産生することができる少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的な列挙としては、検出可能なシグナルを、例えば比色、蛍光、発光、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、発色団、例えば蛍光性、発光性色素、電子顕微鏡によって検出される電子密度を有する基によって、またはそれらの電気的特性、例えば、伝導度、電流測定、電圧測定、インピーダンス、検出可能な基、例えばその分子が物理的および／または化学的性質における検出可能な修飾を誘導するのに十分な大きさであるような基によって、生じる酵素が挙げられ、このような検出は、光学的方法、例えば、回折、表面プラズモン共鳴、表面変動、接触角変化、あるいは物理的方法、例えば、原子力分光法、トンネル効果または３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性分子によって達成され得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「精製マーカー」という用語は、精製または識別に有用な少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストとしては、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ−ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、チェリー（ｃｈｅｒｒｙ）、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、またはＳタンパク質が挙げられる。適切な直接的または間接的な蛍光マーカーは、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、チェリー、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、タムラ、テキサスレッド、ローダミン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣまたは任意の他の蛍光色素またはハプテンを含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定され得る。一態様では、１つの試料由来の遺伝子の発現レベルは、対照または参照試料由来のその遺伝子の発現レベルと直接比較してもよい。別の態様では、ある試料からの遺伝子の発現レベルを、化合物の投与後の同じ試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較してもよい。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「相同性」または「同一」、パーセント「同一性」または「類似性」とは、２つまたはそれ超の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、２つまたはそれ超の配列または小配列であって、同一であるか、あるいは、特定の領域（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列）に対して、同じ、例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する、２つまたはそれ超の配列または小配列を指す。相同性は、比較のためにアラインメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されるならば、その分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致または相同位置の数の関数である。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、１９８７年）補遺３０巻、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているものなどの、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトパラメータを、アラインメントのために使用する。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。具体的には、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列（５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；並べ替え（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見ることができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。「相同性」または「同一」、パーセント「同一性」または「類似性」という用語はまた、試験配列の相補性を指すか、またはそれに対して適用され得る。この用語はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列を含む。本明細書に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を説明し得る。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域か、またはより好ましくは長さが少なくとも５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在する。「無関係」または「非相同」配列は、本明細書中に開示される配列のうちの１つと４０％未満の���一性または２５％未満の同一性を共有する。
【００７２】
「第１選択」または「第２選択」または「第３選択」という語句は、患者が受けた処置の順序を指す。第１選択療法のレジメンとは、第１に与えられる処置であるが、第２または第３選択療法は、それぞれ、第１選択療法後または第２選択療法後に与えられる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、第１選択療法を「疾患または状態の第１の処置」と定義している。がん患者では、一次処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの療法の組合せであってもよい。第１選択療法はまた、当業者には「一次療法および一次処置」と呼ばれる。２００８年５月１日に最後に訪れたＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照のこと。代表的には、患者には、その患者が第１選択療法に対して陽性の臨床的応答示さなかったか、または無症状応答であるか、または第１選択療法を停止したので、引き続く化学療法レジメンを与えられる。
【００７３】
一態様では、抗体の「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、ＥＬＩＳＡまたは他の適切な方法によって測定されるように、そのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合する抗体の能力を意味する。生物学的に等価な抗体としては、限定するものではないが、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、ペプチド、抗体断片、抗体改変体、抗体誘導体および抗体模倣物が挙げられる。
【００７４】
本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、抗体またはその断片に関連する場合、そのような等価物または生物学的に等価なものは、本開示の範囲内であるものとすることは、明白な記載がなく、他に意図されない限り推測されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体またはその断片、ポリペプチドまたは核酸を指す場合、「その等価物」と同義であることを意図しており、依然として所望の構造または機能性を維持している最小の相同性を有するものを意図する。本明細書に具体的に列挙されていない限り、上記のいずれもその等価物も含むことが考慮される。例えば、等価物とは、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％あるいは少なくとも９８％の相同性または同一性を意図しており、参照のタンパク質、ポリペプチド、抗体またはその断片または核酸と実質的に等価な生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物とは、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。あるいは、ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で、参照ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド由来の発現ポリペプチドまたはタンパク質である。
【００７５】
別の配列に対する特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）とは、塩基（またはアミノ酸）の割合は、アラインメントされた場合、２つの配列を比較する際に同じであることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、１９８７年）補遺３０巻、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されるプログラムを用いて決定され得る。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメータを使用する。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。具体的には、好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータを使用する：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；並べ替え＝ハイスコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見ることができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００７６】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。その複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖複合体を形成する３本またはそれ超の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広範なプロセスにおける一段階を構成し得る。
【００７７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分から２４時間、１、２またはそれ超の洗浄ステップであり、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用するＳＳＣの等価物を使用してもよいことが理解される。
【００７８】
「腫瘍組織型に対応する正常細胞」とは、腫瘍組織と同じ組織型由来の正常細胞をいう。非限定的な例は、肺腫瘍を有する患者由来の正常肺細胞、または結腸腫瘍を有する患者由来の正常結腸細胞である。
【００７９】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の物質を実質的に含まない分子または生物学的物質または細胞物質を指す。一態様では、「単離された」という用語は、天然の供給源に存在する、それぞれ、他のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞オルガネラ、または組織もしくは器官から分離された、核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を意味する。「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって生成された時の細胞材料、ウイルス材料、または培養培地も、または化学的に合成されたときの化学的前駆体もしくは他の化学物質も実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在しない核酸断片を含み、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指し、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。「単離された」という用語はまた、本明細書では、他の細胞または組織から単離されている細胞または組織を指し、培養および操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、例えばハイブリッド抗体形成細胞を骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合から作製することにより、当業者に公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００８１】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ超のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣体の化合物を指して、交換可能に、そしてそれらの最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。
【００８２】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前に付与されても、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに修飾されてもよい。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。特に明記されるか、または必要でない限り、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される二つの相補的一本鎖形態の両方を包含する。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、絶対純度を必要としない；そうではなく、それは相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性化合物は、タンパク質または他の汚染物質から全体的または部分的に単離されたものである。一般に、本開示内で使用するための実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性化合物は、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性化合物と、薬学的担体、賦形剤、緩衝液、吸収促進剤、安定剤、防腐剤、アジュバントまたは他の補助成分との混合または製剤化の前に調製物中に存在する全ての高分子種の８０％超を、治療的投与のための完全な医薬製剤中に含む。より代表的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性化合物は、他の製剤成分と混合する前に、精製調製物中に存在する全ての高分子種の９０％超、しばしば９５％超に相当するように精製される。他の場合には、精製された調製物は本質的に均一であってもよく、他の高分子種は従来の技術によって検出可能ではない。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性を有する抗体と抗原との間の接触を意味する。特定の態様において、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチドであって、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが、適切な発現ベクターに挿入され、これらが次に用いられて、異種タンパク質を産生するために宿主細胞を形質転換する、ポリペプチドを指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、対象における疾患の「処置する」または「処置」という用語は、（１）疾患の素因があるか、またはその疾患の症状がまだ示されていない対象において、その症状または疾患を予防すること；（２）疾患を阻害するか、もしくはその発症を阻止すること；または（３）疾患または疾患の症状を緩和するかまたは退行させることを指す。当技術分野で理解されているように、「処置」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の技術の目的のために、有益なまたは所望の結果としては、限定するものではないが、検出可能であっても検出不能であっても、１つまたは複数の症状の軽減または緩和、状態（疾患を含む）の程度の低減、ある状態（疾患を含む）の安定化された（すなわち、悪化していない）状態、状態（疾患を含む）の遅延または緩徐化、状態（疾患を含む）の進行、緩和または寛解、状態および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）の１つまたは複数を含み得る。疾患ががんである場合、以下の臨床エンドポイントは、処置の非限定的な例である：腫瘍負荷の減少、腫瘍成長の遅延、全生存期間の延長、腫瘍進行までのより長い時間、転移の阻害または腫瘍の転移の減少。
【００８７】
本明細書で使用される場合、細胞、組織、または器官に関する「過剰発現」という用語は、対照細胞、対照の組織または器官において産生される量よりも多い量のタンパク質を発現する。過剰発現されるタンパク質は、宿主細胞に対して内在性であっても宿主細胞に対して外因性であってもよい。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「リンカー配列」という用語は、１〜１０個、あるいは８個のアミノ酸、あるいは６個のアミノ酸、あるいは５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列であって、これが、１〜１０回、あるいは約８回、あるいは約６回、あるいは約５回、または４回、あるいは３回、または代わりに２回反復され得るアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは３回繰り返すペンタペプチドからなる１５個までのアミノ酸残基を含んでもよい。リンカー配列の非限定的な例は、当技術分野で公知であり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（およびその等価物）（配列番号４９）；トリペプチドＥＦＭ；またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（配列番号５０）およびその各々の等価物である。一態様では、リンカー配列は、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ（配列番号５２）の３つのコピーおよびその等価物を含む（グリシン４セリン）３可撓性ポリペプチドリンカー（配列番号５１）である。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という本明細書に用いられる用語は、発現される核酸配列に関連して核酸配列の位置および配向に関係なく核酸配列の転写を増強、改善または改良する配列エレメントを示す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写を増強しても、または同時に複数のプロモーターからの転写を増強してもよい。転写を改善するこの機能性が保持されるか、または実質的に保持されている限り（例えば、野生型活性の、すなわち全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）、野生型エンハンサー配列の任意の短縮型、突然変異型、または他の改変された改変体もまた、上記の定義内にある。
【００９０】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子などのコード配列の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的であっても、誘導性であっても、抑制性であっても、または組織特異的であってもよい。「プロモーター」とは、開始および転写速度が制御される、ポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。それは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝的エレメントを含有してもよい。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「ＷＰＲＥ」または「ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント」という用語は、この名称、および本明細書に示されるＷＰＲＥ配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物学的機能を有する任意の他の分子に関連する特定のヌクレオチド断片を指す。例えば、ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４５１４）に存在するヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）と類似の領域であって、このゲノム配列の１０９３位から１６８４位までの５９２個のヌクレオチドが転写後調節領域に対応する領域を指す（Donello,  J.E.ら（１９９８年）Journal  of  Virology  ７２巻：５０８５〜５０９２頁）。レトロウイルスベクターを用いた分析によって、目的の遺伝子の３’末端非翻訳領域に挿入されたＷＰＲＥが、産生されるタンパク質の量を５〜８倍増大させることが明らかになった。ＷＰＲＥの導入はｍＲＮＡ分解を抑制することも報告されている（Zufferey,  R.ら（１９９９年）Journal  of  Virology  ７３巻：２８８６〜２８９２頁）。広義には、ｍＲＮＡを安定化することによってアミノ酸翻訳の効率を高めるＷＰＲＥのようなエレメントもエンハンサーであると考えられる。
略語の列挙
ＣＡＲ：キメラ抗原受容体
ＨＬＡ：組織適合性リンパ球抗原
Ｉｐ：腹腔内
ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位
ＭＦＩ：平均蛍光強度
ＭＯＩ：感染多重度
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片
ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント
【００９２】
開示を実施するための形態
遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による自己治療を用いるＢ細胞リンパ腫および白血病において最近、前例のない結果が得られたことから（Maude,  S.L.ら（２０１４年）New  Engl.  J.  Med.  ３７１巻：１５０７〜１５１７頁；Porter,  D.L.ら（２０１１年）New  Engl.  J.  Med.  ３６５巻：７２５〜７３３頁）、多くの研究所が、卵巣がん、前立腺がんおよび膵臓腫瘍を含む固形腫瘍にこのアプローチを適用し始めている。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、モノクローナル抗体のＨＬＡ非依存性標的特異性と、活性化Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖およびホーミング特性とを組み合わせるが、チェックポイント抑制に応答しない。抗原を発現する標的を直接殺すそれらの能力のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、任意の抗原陽性細胞または組織に対して極めて毒性であり、そのため高度に腫瘍特異的抗体を有するＣＡＲを構築することが必要となる。今日まで、α−葉酸受容体、メソテリン、およびＭＵＣ−ＣＤ、ＰＳＭＡおよび他の標的に対して、ヒト固形腫瘍に対するＣＡＲ修飾Ｔ細胞が構築されてきたが、ほとんどの場合、正常組織において抗原のある程度のオフターゲット発現がある。これらの構築物は、固形腫瘍に対して使用され得るＣＡＲ  Ｔ細胞構築の新しい標的および方法を識別するためのさらなる研究の必要性が強調される患者では、同じ例外的結果は示さなかった。
【００９３】
したがって、本開示は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗体、ならびにその使用および産生に関連する方法および組成物を提供する。加えて、本開示は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として提供され、いくつかの態様では、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２抗体の抗原結合性ドメイン、ならびにその使用および産生に関連する方法および組成物である。
【００９４】
抗体およびその使用
Ｉ．組成物
抗体の一般的な構造は当技術分野で公知であり、ここでは簡単に要約する。免疫グロブリンモノマーは、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は、ジスルフィド結合を介して直接結合している軽鎖の１つと対になっている。各重鎖は、定常領域（抗体のアイソタイプに依存して変化する）および可変領域を含む。可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と称され、かつフレームワーク領域内で支持される３つの超可変領域（または相補性決定領域）を含む。各軽鎖は、定常領域および可変領域を含み、可変領域は、重鎖の可変領域と類似の様式でフレームワーク領域によって支持された３つの超可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と称される）を含む。
【００９５】
重鎖および軽鎖の各対の超可変領域は互いに協働して、標的抗原に結合することができる抗原結合部位を提供する。重鎖および軽鎖の対の結合特異性は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列によって定義される。したがって、特定の結合特異性を生じる一組のＣＤＲ配列（すなわち、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列）が一旦決定されれば、ＣＤＲ配列のセットは、原則として、同一の抗原結合特異性を有する異なる抗体を提供するために、任意の抗体定常領域と連結された任意の他の抗体フレームワーク領域内の適切な位置に挿入され得る。
【００９６】
一態様では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離抗体を提供し、ここで重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ヒトＨＬＡ−ＤＲのエピトープに結合する抗原結合部位を形成する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列（ｉ）ＧＦＳＬＴＳＹＧ（配列番号１）、（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＮＹＷ（配列番号２）、またはその各々の等価物のいずれか１つで開始し、カルボキシ末端の追加の５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４個または３個、または２個または１個のアミノ酸が続くアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列（ｉ）ＩＷＳＤＧＳＴ（配列番号３）、（ｉｉ）ＩＲＦＫＳＨＮＹＡＴ（配列番号４）、またはその各々の等価物のいずれか１つで開始し、カルボキシ末端の追加の５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４個または３個、または２個または１個のアミノ酸が続くアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列（ｉ）ＡＳＨＹＧＳＴＬＡＦＡＳ（配列番号５）、（ｉｉ）ＴＲＲＩＧＮＳＤＹＤＷＷＹＦＤＶ（配列番号６）、またはその各々の等価物のいずれか１つで開始し、カルボキシ末端の追加の５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４個または３個、または２個または１個のアミノ酸が続くアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、以下に記載のポリヌクレオチド配列：
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCATCTCAGGGTTCTCATTAACCAGCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTAGTGATATGGAGTGATGGAAGCACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGTCACTACGGTAGTACCCTTGCCTTTGCTTCCTGGGGCCACGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA（配列番号７）によってコードされるポリペプチドまたはその抗原結合断片またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
QLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCASHYGSTLAFASWGHGTLVTVSA（配列番号８）、またはその抗原結合性断片、またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、以下に記載のポリヌクレオチド配列：
GAAGTGCAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGCTCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTTAAATCTCATAATTATGCAACACATTTTGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGAGGATAGGAAACTCTGATTACGACTGGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC（配列番号９）によってコードされるポリペプチド、またはその抗原結合性断片またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
EVQLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRFKSHNYATHFAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRIGNSDYDWWYFDVWGAGTSVTVSSAS（配列番号１０）、またはその抗原結合性断片、またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の配列（ｉ）ＶＮＩＹＳＹ（配列番号１１）、（ｉｉ）ＱＮＶＧＮＮ（配列番号１２）、またはその各々の等価物のいずれか１つで開始し、カルボキシ末端の追加の５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４個または３個、または２個または１個のアミノ酸が続くアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、（ｉ）ＮＡＫ（配列番号１３）、（ｉｉ）ＳＡＳ（配列番号１４）、またはその各々の等価物で開始し、カルボキシ末端の追加の５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４個または３個、または２個または１個のアミノ酸が続くアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
【０１０６】
他の実施形態では、軽鎖可変領域は、（ｉ）ＱＨＨＹＧＴＦＴ（配列番号１５）、（ｉｉ）ＱＱＹＮＴＹＰＦＴ（配列番号１６）、またはその各々の等価物を開始し、カルボキシ末端の追加の５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４個または３個、または２個または１個のアミノ酸が続くアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCATATGTCGAGCAAGTGTGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCCAAAATCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA（配列番号１７）によってコードされるポリペプチド、またはその抗原結合性断片、またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIQMTQSPASLSASVGETVTIICRASVNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTFTFGSGTKLEIK（配列番号１８）、またはその抗原結合性断片またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTAATAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA（配列番号１９）によってコードされるポリペプチド、またはその抗原結合性断片、またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれらからなる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGNNVAWYQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNTYPFTFGSGTKLEIK（配列番号２０）、またはその抗原結合性断片またはその各々の等価物を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１１１】
本発明の技術の別の態様において、単離された抗体は、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、開示される軽鎖配列のいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、開示された重鎖配列のいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、開示された軽鎖配列のいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、開示された軽鎖配列のいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である；および
（ｅ）抗体は、開示された配列のいずれかによって結合されたエピトープと重複するエピトープに結合する
のうちの１つまたは複数を含む。
【０１１２】
開示されたＣＤＲ配列および重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む例示的な抗体は、それぞれ表１および表２に開示される。
【表１】
2018524973.tif 000003
【表２】
2018524973.tif 000004
【０１１３】
一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２からなる群より選択される抗体と少なくとも８５％同一である単離抗体を提供する。
【０１１４】
一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−１のＣＤＲを含む単離された抗体を提供する。一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−１と少なくとも８５％同一である単離された抗体を提供する。
【０１１５】
一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−２のＣＤＲを含む単離された抗体を提供する。一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−２と少なくとも８５％同一である単離された抗体を提供する。
【０１１６】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−１の可変ドメイン配列を含むか、それから本質的になるか、またはさらにそれからなり、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−１の可変ドメイン配列を含むか、それから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１１７】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−２の可変ドメイン配列を含むか、それから本質的になるか、またはさらにそれからなり、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−２の可変ドメイン配列を含むか、それから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１１８】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＨＬＡ−ＤＲに結合する。本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗原結合部位は、ヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する。
【０１１９】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体は可溶性Ｆａｂである。
【０１２０】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。
【０１２１】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体は全長抗体である。
【０１２２】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１２３】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体は、キメラまたはヒト化されている。
【０１２４】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群より選択される。
【０１２５】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体はＦｃドメインを含む。本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体はウサギ抗体である。本明細書で提供される抗体のいくつかの態様では、抗体はヒトもしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。
【０１２６】
本明細書に提供される抗体のいくつかの態様において、抗体はヒト抗体フレームワーク領域を含む。
【０１２７】
他の態様では、本明細書で提供される抗体のＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換される。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味において、「保存的」であり得る。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けられ、それらのファミリー内で保存的置換が起こる。
【０１２８】
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン。
【０１２９】
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸
【０１３０】
３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン。
【０１３１】
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
【０１３２】
別の態様では、１つまたは複数のアミノ酸残基が、抗体の１つまたは複数のＣＤＲに付加されているかまたは欠失されている。そのような付加または欠失は、ＣＤＲのＮ末端もしくはＣ末端またはＣＤＲ内の位置で生じる。
【０１３３】
抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をアミノ酸の付加、欠失または置換によって変化させるステップにより、標的抗原に対する結合親和性の増加などの様々な効果を得てもよい。
【０１３４】
このような変化したＣＤＲ配列を含む本開示の抗体は、開示された抗体と類似の特異性および感度プロフィールでＨＬＡ−ＤＲになお結合することが理解されるべきである。これは、当業者に公知であり、本明細書に簡単に記載されている結合アッセイによって試験してもよい。
【０１３５】
抗体の定常領域も変化されてもよい。例えば、抗体には、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）またはＩｇＭのいずれかのアイソタイプのＦｃ領域が提供される。定常領域配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
【０１３６】
ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０（配列番号２１）
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK、およびその等価物。
【０１３７】
ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７（配列番号２２）
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK、およびその等価物。
【０１３８】
ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９（配列番号２３）
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK、およびその等価物。
【０１３９】
ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０（配列番号２４）
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK、およびその等価物。
【０１４０】
ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１（配列番号２５）
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY、およびその等価物。
【０１４１】
ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１（配列番号２６）
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK、およびその等価物。
【０１４２】
ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６（配列番号２７）
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY、およびその等価物。
【０１４３】
ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７（配列番号２８）
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY、およびその等価物。
【０１４４】
ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４（配列番号２９）
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC、およびその等価物。
【０１４５】
いくつかの態様では、抗体は、配列番号７〜１０のいずれか１つと少なくとも８０％同一である重鎖定常領域を含む。
【０１４６】
いくつかの態様では、抗体は、配列番号１７〜２０のいずれか１つと少なくとも８０％同一である軽鎖定常領域を含む。
【０１４７】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、抗体は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１４８】
本明細書で提供される抗体のいくつかの態様において、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体は、ヒトＨＬＡ−ＤＲとＬｙｍ−１およびＬｙｍ−２との結合について競合する。
【０１４９】
本明細書に提供される抗体のいくつかの態様では、抗体は、急速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進するための構造改変を含有する。いくつかの態様において、ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進するために、抗体のＣＨ２定常重鎖領域に欠失を含有する。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進するためにＦａｂ断片が使用される。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進するためにＦ（ａｂ）’２断片が使用される。
【０１５０】
抗体、断片、およびその等価物は、担体、例えば、薬学的に許容される担体または他の作用物質と組み合わせて、使用および／または保存のための製剤を提供してもよい。
【０１５１】
ＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体を生成するのに有用な、ＨＬＡ−ＤＲまたはその断片のアミノ酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる単離されたポリペプチドがさらに提供され、それらをコードする単離されたポリヌクレオチドも同様に提供される。一態様では、単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、標識および／または連続ポリペプチド配列（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）キャリアタンパク質）またはポリヌクレオチドの場合、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに作動可能に結合された配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、種々の担体、例えばリン酸緩衝化生理食塩水と組み合わされてもよい。単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、酵母、哺乳類（ラット、サル、ハムスターまたはヒト）がさらに提供される。宿主細胞は担体と組み合わされてもよい。
【０１５２】
ＩＩ．組成物を調製するためのプロセス
抗体、その製造および使用は周知であり、例えばHarlow,  E.およびLane,  D.（１９９９年）Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.に開示される。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて生成され得る。抗体の例としては（限定するものではないが）、抗体のモノクローナル、一本鎖、および機能的断片が含まれる。そのような抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知である；例えば、Collariniら（２００９年）J.  Immunol.  １８３巻（１０号）:６３３８〜６３４５頁を参照のこと。
【０１５３】
抗体は、様々な宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、および他のものにおいて産生され得る。それらは、ＨＬＡ−ＤＲのＣ末端断片または単離されたポリペプチドのような、免疫原性特性を有する標的抗原またはその断片もしくはオリゴペプチドを注射することによって免疫され得る。宿主種に依存して、様々なアジュバントを加えて、これを用いて、免疫学的応答を増大させてもよい。そのようなアジュバントとしては、限定するものではないが、フロイント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、および界面活性剤、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられる。ヒトで使用されるアジュバントの中で、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが特に有用である。この本開示はまた、単離されたポリペプチドおよびアジュバントを提供する。
【０１５４】
特定の態様において、本開示の抗体は、ポリクローナル、すなわち、異なるアミノ酸配列を有する複数の種類の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の混合物である。一態様では、ポリクローナル抗体は、異なるＣＤＲを有する複数の種類の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の混合物を含む。このように、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、得られた培養物から精製された抗体を用いてもよい（国際公開第ＷＯ２００４／０６１１０４号を参照のこと）。
【０１５５】
モノクローナル抗体産生。ＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製してもよい。そのような技術としては、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler,  G.ら（１９７５年）Nature  ２５６巻：４９５〜４９７頁を参照のこと）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor,  D.ら（１９８３年）Immunol.  Today  ４巻：７２頁を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Coleら（１９８５年）、Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy、Alan  R.  Liss,  Inc.、７７〜９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実施に利用されてもよく、ヒトハイブリドーマ（例えば、Cote,  R.J.ら（１９８３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ８０巻：２０２６〜２０３０頁を参照のこと）によって、またはヒトＢ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓで形質転換することによって（例えば、Coleら（１９８５年）、Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy、Alan  R.Liss,  Inc.、７７〜９６頁を参照のこと）産生され得る。例えば、抗体の領域をコードする核酸集団を単離してもよい。抗体の保存領域をコードする配列から誘導されたプライマーを利用するＰＣＲを用いて、集団から抗体の一部をコードする配列を増幅し、次いで、増幅された配列から抗体またはその断片、例えば可変ドメインをコードするＤＮＡを再構築する。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌上での融合ポリペプチドの発現および提示のために、他のタンパク質（例えばバクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡに融合してもよい。次いで、例えば、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチド上に存在する抗原またはエピトープに対する発現された抗体またはその断片の親和性に基づいて、増幅された配列を発現させ、さらに選択または単離してもよい。あるいは、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、例えば、ＨＬＡ−ＤＲのアミノ酸配列またはその断片を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる、単離されたポリペプチドを用いて対象を免疫すること、次いで慣用的な方法を用いてこの対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製され得る。例えば、Galfre,  G.ら（１９８１年）Methods  Enzymol.  ７３巻：３〜４６頁を参照のこと。標準的な方法を用いてハイブリドーマをスクリーニングすることは、種々の特異性（すなわち、異なるエピトープに関して）および親和性のモノクローナル抗体を生成する。所望の特性、例えばＨＬＡ−ＤＲ結合を有する選択されたモノクローナル抗体は、（ｉ）ハイブリドーマによって発現されるように使用されてもよく、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような分子に結合してその性質を変えてもよく、または（ｉｉｉ）モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを単離し、配列決定し、種々の方法で操作してもよい。一態様では、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニッ��マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。ハイブリドーマ技術には、当技術分野で公知であり、Harlowら（１９８８年）Antibodies:  A  Laboratory  Manual  Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Cold  Spring  Harbor、N.Y.  ３４９巻；Hammerlingら（１９８１年）Monoclonal  Antibodies  And  T-Cell  Hybridomas、５６３〜６８１頁に教示される。
【０１５６】
ファージディスプレイ技術。上記のように、本開示の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用によって産生され得る。例えば、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて調製してもよい。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原で直接選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法で使用されるファージは、代表的にはｆｄを含む繊維状ファージであり、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するＭ１３は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合される。さらに、方法は、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチド、例えば、ポリペプチドまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ効果的な識別を可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築に適合されてもよい（例えば、Huse,  W.D.ら（１９８９年）Science  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁を参照のこと）。本開示の単離された抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の他の例としては、Huston,  J.S.ら（１９８８年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ８５巻:５８７９〜５８８３頁；Chaudhary,  V.K.ら（１９９０年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、８７巻:１０６６〜１０７０頁；Brinkmanら、J.  Immunol.  Methods  １８２巻:４１〜５０頁（１９９５年）；Ames,  R.S.ら（１９９５年）J.Immunol.Methods  １８４巻:１７７〜１８６頁；Kettleboroughら、Eur.J.Immunol.２４巻:９５２〜９５８頁（１９９４年）；Persic,  L.ら（１９９７年）Gene  １８７巻:９〜１８頁；Burton,  D.R.ら（１９９４年）Advances  in  Immunology  ５７巻：１９１〜２８０頁；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際特許出願公開番号ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ＷＯ９６／０６２１３；ＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）；ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）；ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号に開示されるものが挙げられる。
【０１５７】
ポリペプチドを、ジスルフィド結合を介して付着させることによってバクテリオファージ粒子の表面にポリペプチドを提示するために有用な方法は、Ｌｏｈｎｉｎｇの米国特許第６，７５３，１３６号に記載されている。上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体または任意の他の所望の抗原結合性断片を含む全抗体を生成するために使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主中で発現する。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９２／２２３２４号；Mullinax,  R.L.ら（１９９２年）BioTechniques  １２巻：８６４〜８６９頁；Sawai,  H.ら（１９９５年）AJRI  ３４巻：２６〜３４頁；ならびにBetter,  M.ら（１９８８年）Science  ２４０巻：１０４１〜１０４３頁に開示されているような当技術分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に産生する技術を使用してもよい。
【０１５８】
一般に、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面に存在するので、ディスプレイベクターにクローニングされるハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、良好な結合活性を維持する改変体を識別するために、適切な抗原に対して選択され得る。例えば、Barbas  IIIら、Phage  Display,  A  Laboratory  Manual（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、２００１年）を参照のこと。しかし、選択および／またはスクリーニングのために抗体断片ライブラリーを溶菌ファージベクター（改変Ｔ７またはラムダザップシステム）にクローニングするなど、このプロセスには他のベクターフォーマットを使用してもよい。
【０１５９】
抗体産生の代替方法。抗体はまた、リンパ球集団におけるｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導することにより、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生され得る（Orlandi,  R.ら（１９８９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻:３８３３〜３８３７頁；Winter,  G.ら（１９９１年）Nature  ３４９巻：２９３〜２９９頁）。
【０１６０】
あるいは、単鎖抗体の産生のための技術を使用してもよい。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（代表的には約５〜２５アミノ酸長）に連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ｓｃＦｖにおいて、重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体に由来しても、または異なる抗体に由来してもよい。ｓｃＦｖは、組換え技術を用いて、例えばＥ．ｃｏｌｉのような宿主生物におけるｓｃＦｖをコードするベクターの発現によって合成してもよい。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、上記抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ、およびその軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡから選択されるＤＮＡの全部または所望のアミノ酸配列をコードする部分ＤＮＡを、鋳型として用いて増幅を行うことにより、それらの両方の末端を規定するプライマー対を用いるＰＣＲにより、ならびにさらに、ポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡとその両端を規定するプライマー対とを組み合わせた増幅を行うことによって得て、それによってリンカーの両端をそれぞれ重鎖および軽鎖に連結してもよい。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターおよび発現ベクターによって形質転換された宿主は、当技術分野で公知の従来の方法に従って得てもよい。
【０１６１】
抗原結合性断片、例えば、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ断片も生成され得る。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に識別してもよい（Huse,  W.D.ら（１９８９年）Science  ２５６巻：１２７５〜１２８１頁）。
【０１６２】
抗体修飾。本開示の抗体は、抗原に対する親和性を増大させるために多量体化されてもよい。多量体化されるべき抗体は、同じ抗原の複数のエピトープを認識する抗体の１種であってもまたは複数の抗体であってもよい。抗体の多量体化の方法としては、２つのｓｃＦｖ分子へのＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの結合、ストレプトアビジンへの結合、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフの導入などが挙げられ得る。
【０１６３】
本明細書中に開示される抗体組成物は、これらの抗体のいずれかと別の作用物質（免疫複合体）との間で形成されるコンジュゲートの形態であってもよい。一態様において、本明細書に開示される抗体は、放射性物質にコンジュゲートされる。別の態様では、本明細書中に開示される抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な種類の分子に結合され得る。
【０１６４】
抗体スクリーニング。種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を識別するスクリーニングに使用してもよい。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合結合または免疫放射線測定アッセイのための多数のプロトコールが当技術分野で周知である。このようなイムノアッセイは、代表的には、ＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の断片もしくはオリゴペプチドとその特異的抗体との間の複合体形成の測定を含む。２つの非干渉性ＨＬＡ−ＤＲエピトープに特異的なモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイを使用してもよいが、競合的結合アッセイも使用してもよい（Maddox,  D.E.ら（１９８３年）J.  Exp.  Med.  １５８巻：１２１１〜１２１６頁）。
【０１６５】
抗体精製。本明細書に開示される抗体は、均一性まで精製され得る。抗体の分離および精製は、従来のタンパク質分離および精製法を使用して行ってもよい。
【０１６６】
ごく一例として、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などの使用を適切に選択し組み合わせることにより、抗体を分離して精製してもよい。Strategies  for  Protein  Purification  and  Characterization:  A  Laboratory  Course  Manual、Marshak,  D.R.ら編、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（１９９６年）；Antibodies:  A  Laboratory  Manual.  Ed  HarlowおよびDavid  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory（１９８８年）。
【０１６７】
クロマトグラフィーの例としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが挙げられる。一態様において、クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーを使用することによって実施してもよい。
【０１６８】
一態様では、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを、アフィニティークロマトグラフィーに使用してもよい。他の例示的なカラムとしては、プロテインＡカラム、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などが挙げられる。
【０１６９】
使用方法
一般。本明細書中に開示される抗体は、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの局在化および／または定量に関する（例えば、適切な生理学的試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルの測定に使用するための、診断方法における使用のため、ポリペプチドの画像化に使用するためなど）当技術分野で公知の方法において有用である。本明細書中に開示される抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的技術によってＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを単離する際に有用である。本明細書中に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体は、生物学的試料、例えば哺乳類の血清または細胞、ならびに宿主系において発現される組換え産生ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドからの天然のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの精製を促進し得る。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して、ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチド（例えば、血漿、細胞溶解物または細胞上清中）を検出してもよい。本明細書中に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体は、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組織におけるＨＬＡ−ＤＲレベルをモニタリングするために診断的に使用してもよい。検出は、本明細書に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによって促進され得る。
【０１７０】
別の態様では、例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合する、本明細書に開示される抗体または抗原結合性断片を含む組成物が、本明細書で提供される。一態様では、ペプチドは細胞と会合している。例えば、組成物は、本明細書に開示される抗体または抗体断片で標識された脱凝集細胞試料を含んでもよく、この組成物は、例えば細胞を単離するためのアフィニティークロマトグラフィー法またはフローサイトメトリーに基づく細胞分析もしくは細胞選別に有用である。別の例として、例えば、免疫組織化学または細胞学分析において組成物が有用である、本明細書に開示される抗体または抗体断片で標識された固定組織試料または細胞スミアを含んでもよい。別の態様では、抗体または抗体断片は、固体支持体に結合され、これは例えば以下において有用である：ＥＬＩＳＡ；ＨＬＡ−ＤＲタンパク質またはその断片、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞、またはＨＬＡ−ＤＲおよび他の細胞成分を含有する複合体を単離するためのアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法。別の態様において、ペプチドは固体支持体に結合される。例えば、ペプチドは、ペプチドに特異的な二次抗体を介して固体支持体に結合されてもよく、これは、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて有用である。別の例として、ペプチドはクロマトグラフィーカラムに結合されてもよく、これは、本技術による抗体の例えば、単離または精製に有用である。別の態様では、ペプチドは、分画された細胞の細胞下画分を含有する溶解溶液または溶液などの溶液中に入れられ、ここで、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質もしくはその断片、またはＨＬＡ−ＤＲおよび他の細胞成分を含有する複合体を単離する、例えば、ＥＬＩＳＡおよびアフィニティークロマトグラフィー、または免疫沈降法に有用である。別の態様では、ペプチドは、例えばゲル電気泳動ゲルまたはウェスタンブロッティングに一般的に使用されるマトリックス（ニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリドからなる膜など）などのマトリックスと会合され、この組成物は、電気泳動および／またはウェスタンブロッティングなどのイムノブロッティング技術に有用である。
【０１７１】
ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの検出。生物学的試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルを検出するための例示的な方法は、対象から生物学的試料を取得するステップと、その生物学的試料をＨＬＡ−ＤＲ結合作用物質、例えば本明細書中に開示されるか、または当技術分野で公知であり、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出することができる抗体と接触させるステップとを含む。
【０１７２】
一態様において、ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｌｙｍ−１もしくはＬｙｍ−２、またはその断片は、検出可能に標識される。抗体に関して「標識された」という用語は、抗体に検出可能な物質をカップリング（すなわち、物理的に連結）させるステップによる、抗体の直接標識、ならびに直接標識されている別の化合物との反応性による抗体の間接的な標識を包含するものとする。間接的標識の非限定的な例としては、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようなビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。
【０１７３】
本開示の検出方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルを検出するために使用してもよい。ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、および免疫蛍光（例えば、ＩＨＣ）が挙げられる。さらに、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの検出のためのｉｎ  ｖｉｖｏ技術には、対象に標識抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を導入することを含む。単なる一例であるが、抗体は、検出可能なマーカー、例えば、対象におけるその存在および位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーを用いて標識され得る。一態様では、生物学的試料は、対象由来のポリペプチド分子を含有する。
【０１７４】
イムノアッセイおよび画像化。本明細書に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体は、抗体ベースの技術を用いて生物学的試料（例えば、ヒト血漿）中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織におけるタンパク質発現は、古典的な免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法で研究してもよい。Jalkanen,  M.ら（１９８５年）J.  Cell.  Biol.  １０１巻：９７６〜９８５頁；Jalkanen,  M.ら（１９８７年）J.  Cell.  Biol.  １０５巻：３０８７〜３０９６頁。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセイが挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ならびに放射性同位体、または他の放射性剤、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、ならびに蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンが挙げられる。
【０１７５】
生体試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルをアッセイすることに加えて、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルはまた、画像化によってｉｎ  ｖｉｖｏで検出してもよい。ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルのｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のために抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体に組み込み得る標識としては、Ｘ線撮影、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影では、適切な標識としては、バリウムやセシウムなどの放射性同位体であって、検出可能な放射線を放出するが、対象にはあまり有害ではない放射性同位体が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲに適したマーカーとしては、関連ｓｃＦｖクローンの栄養素を標識することによってＨＬＡ−ＤＲ抗体に組み込むことができる重水素などの検出可能な特徴的なスピンを有するマーカーが挙げられる。
【０１７６】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射性不透明物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質などの適切な検出可能な画像化部分で標識されたＨＬＡ−ＤＲ抗体が、対象に導入される（例えば、非経口、皮下、または腹腔内で）。対象のサイズおよび使用される画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定するであろうことは、当技術分野において理解され得る。放射性同位体部分の場合、ヒト対象に関しては、注入される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識されたＨＬＡ−ＤＲ抗体は、特異的標的ポリペプチドを含有する細胞の位置に優先的に蓄積する。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍画像化は、Burchiel,  S.W.ら（１９８２年）Tumor  Imaging:  The  Radiochemical  Detection  of  Cancer  １３巻に記載される。
【０１７７】
いくつかの態様において、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進する構造改変を含有するＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化検出方法において有用である。いくつかの態様において、ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進するために、抗体のＣＨ２定常重鎖領域に欠失を含有する。いくつかの態様では、Ｆａｂ断片を使用して迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進する。いくつかの態様では、Ｆ（ａｂ）’２断片を使用して、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または徐放を促進する。
【０１７８】
ＨＬＡ−ＤＲ抗体の診断的使用。本明細書に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体組成物は、診断および予後予測の方法において有用である。このように、本開示は、対象におけるＨＬＡ−ＤＲ関連医学的状態の診断において本明細書に開示される抗体を使用するための方法を提供する。本明細書に開示される抗体は、それらがＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに対する高レベルのエピトープ結合特異性および高い結合親和性を有するように選択され得る。一般に、抗体の結合親和性が高いほど、標的ポリペプチドを除去することなく非特異的に結合した物質を除去するためにはイムノアッセイにおいてよりストリンジェントな洗浄条件を実施し得る。したがって、診断アッセイに有用な本技術のＨＬＡ−ＤＲ抗体は、通常、少なくとも１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１または１０−１２Ｍの結合親和性を有する。ある態様では、診断試薬として使用されるＨＬＡ−ＤＲ抗体は、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分間、標準条件下で平衡に達するのに十分な動力学オンレートを有する。
【０１７９】
本技術のいくつかの方法は、診断試薬として抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体およびポリクローナル抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体組成物のポリクローナル調製物を使用し、他の方法はモノクローナル単離物を用いる。上述の方法に従って調製されたポリクローナルヒト抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いる方法では、調製には、代表的には、ＨＬＡ−ＤＲ抗体、例えば、標的ポリペプチドに対して異なるエピトープ特異性を有する抗体の仕分けを含有する。本開示のモノクローナル抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、密接に関連する抗原の存在または潜在的存在における単一の抗原の検出に有用である。
【０１８０】
本開示のＨＬＡ−ＤＲ抗体は、任意の種類の生物学的試料の診断試薬として使用してもよい。一態様では、本明細書に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ヒト生物学的試料の診断試薬として有用である。ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して、様々な標準アッセイ形式でＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出してもよい。そのようなフォーマットには、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー、ＩＨＣおよびイムノメトリックアッセイが挙げられる。HarlowおよびLane、Antibodies、A  Laboratory  Manual（Cold  Spring  Harbor  Publications、New  York、１９８８年）；米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８７９，２６２号；同第４，０３４，０７４号、同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号および同第４，０９８，８７６号を参照のこと。生物学的試料は、対象の任意の組織（生検を含む）、細胞または体液から得てもよい。
【０１８１】
別の態様では、本開示は、対象が本明細書に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞組成物で効果的に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。この方法は、任意の適切な方法、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ抗体またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる免疫組織化学を使用して、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質またはポリペプチド発現について患者から単離されたがんまたは腫瘍の試料をアッセイするステップを含む。一態様では、対象から得られた生物学的試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルを決定し、対象または疾患のない患者の集団から得られた生物学的試料中に見出されるＨＬＡ−ＤＲ発現レベルと比較する。疾患のない患者由来の患者試料中のポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルと比較して、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現の増大は、その患者が本開示のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞に対して応答性である可能性が高いことを示し、発現の上昇がないことは、その患者がＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞療法に応答する可能性が低いことを示す。試料の非限定的な例としては、例えば、痰、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含むがこれらに限定されない任意の体液および体組織の生検試料が挙げられる。試料はまた、腫瘍細胞でもある。上記の方法で使用される試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびアッセイされるべき試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化する。さらなる態様では、有効量のＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法が対象または患者に施される。
【０１８２】
特定の態様において、本開示は、患者がＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか、否かを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、この方法は、患者から単離した腫瘍試料を有効量のＨＬＡ−ＤＲ結合作用物質、例えばＨＬＡ−ＤＲ抗体と接触させるステップと、腫瘍試料に結合した任意の作用物質または抗体の存在を検出するステップとを含む。さらなる実施形態では、腫瘍試料に結合した作用物質または抗体の存在は、その患者がＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを示し、腫瘍試料に結合した抗体が存在しないことは、その患者がＨＬＡ−ＤＲ療法に応答する可能性が低いことを示す。試料の非限定的な例としては、例えば、痰、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含むがこれらに限定されない任意の体液が挙げられ、および体の組織の生検試料を含む。試料はまた、腫瘍細胞でもある。上記の方法で使用される試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびアッセイされるべき試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと判定された患者に有効量のＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を施すという追加のステップを含む。いくつかの実施形態において、患者は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍および／またはがんを有する。
【０１８３】
ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの上昇した発現レベルが、疾患を有する対象が特定の種類の療法または処置に応答する可能性が高いか否かを示すことが知られている多くの疾患状態がある。このような疾患状態の非限定的な例としては、がん、例えば、癌腫、肉腫または白血病が挙げられる。したがって、生物学的試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出する方法は、例えば、対象が療法または治療に応答する可能性を評価するための予後予測の方法として使用してもよい。対象由来の適切な組織または体液試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルを決定し、適切な対照、例えば、同じ疾患を有するが処置に好都合に応答した対象におけるレベルと比較する。試料の非限定的な例としては、例えば、痰、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含むがこれらに限定されない任意の体液が挙げられ、および体の組織の生検試料が含まれる。試料はまた、腫瘍細胞でもある。上記の方法で使用される試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびアッセイされるべき試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化する。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法は、当技術分野で公知であり、利用される系と適合する試料を得るために容易に適合され得る。
【０１８４】
一態様では、本開示は、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現に対する作用物質（例えば、本開示のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞組成物、薬物、化合物、または低分子）の影響をモニタリングする方法を提供する。そのようなアッセイは、基本的な薬物スクリーニングおよび臨床試験に適用することができる。例えば、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルを低下させる作用物質の有効性は、ＨＬＡ−ＤＲの発現の上昇を示す対象、例えばがんと診断された患者の臨床試験においてモニターしてもよい。ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現に影響を及ぼす作用物質は、その作用物質を投与し、応答を観察することによって識別し得る。このようにして、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現パターンは、その作用物質に対する対象の生理学的反応を示すマーカーとしての役割を果たすことができる。したがって、この応答状態は、その作用物質による対象の処置の前、およびその間の様々な時点で決定されてもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法の有効量を追加の療法を必要とすると判定された患者に投与するという追加のステップをさらに含む。
【０１８５】
本開示のさらなる方法態様は、患者がＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか否かを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、この方法は、患者から単離した腫瘍試料を有効量のＨＬＡ−ＤＲ抗体と接触させるステップと、腫瘍試料に結合した任意の抗体の存在を検出するステップとを含む。さらなる実施形態では、腫瘍試料に結合した抗体の存在によって、患者がＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことが示され、腫瘍試料に結合した抗体がないことは、患者がＨＬＡ−ＤＲ療法に応答する可能性が低いことを示す。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと判定された患者に有効量のＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を投与する追加のステップを含む。いくつかの実施形態において、患者は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍および／またはがんを有する。
【０１８６】
ＩＩＩ．キット
本明細書に記載されるように、本開示は、ＨＬＡ−ＤＲの発現レベルを決定するための診断方法を提供する。１つの特定の態様において、本開示は、これらの方法を実施するためのキット、ならびに組織の収集および／またはスクリーニングの実施および／または結果の分析のような本開示の方法を実施するための指示書を提供する。
【０１８７】
キットは、本明細書中に開示されるＨＬＡ−ＤＲ抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体）および指示書を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。このキットは、生物学的試料、例えば、任意の体液、例としては、限定するものではないが、例えば、痰、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水（acitic  fluid）または血液、そして体組織の生検サンプルを含む生物学的試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの存在を検出するのに有用である。試験試料は、腫瘍細胞、腫瘍に隣接する正常細胞、腫瘍組織型に対応する正常細胞、血液細胞、末梢血リンパ球、またはそれらの組合せであってもよい。上記の方法で使用される試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびアッセイされるべき試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化する。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法は、当技術分野で公知であり、利用される系と適合する試料を得るために容易に適合され得る。
【０１８８】
いくつかの態様では、キットは；生物学的試料（例えば、抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｌｙｍ−１またはＬｙｍ−２の同じ抗原結合特異性を有するもの）中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに結合可能であり、結合する１つまたは複数のＨＬＡ−ＤＲ抗体と；この試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの量を測定するための手段と；この試料中のＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの量を標準と比較する手段とを備えてもよい。１つまたは複数のＨＬＡ−ＤＲ抗体を標識してもよい。キットの構成要素（例えば、試薬）は、適切な容器にパッケージングされてもよい。キットは、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出するためのキットの指示書をさらに備えてもよい。特定の態様では、キットは、ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに結合する、例えば固体支持体に結合した第１の抗体；任意選択で；２）ＨＬＡ−ＤＲポリペプチドまたは第１抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされている第２の異なる抗体を備える。
【０１８９】
キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤を含んでもよい。キットは、検出可能な標識、例えば、酵素または基質を検出するために必要な構成要素をさらに備えてもよい。このキットはまた、対照試料または一連の対照試料を備えてもよく、これをアッセイして試験試料と比較してもよい。キットの各構成要素は、個々の容器内に封入してもよく、様々な容器のすべてを、キットを用いて実施したアッセイの結果を解釈するための指示とともに、単一のパッケージ内に入れてもよい。本開示のキットは、キット容器上またはキット容器内に書類を備えてもよい。この書類によって、キットに含まれている試薬の使用方法が記載されている。
【０１９０】
受け入れやすいように、これらの示唆されたキット構成要素は、当業者が使用するために慣習的な様式でパッケージングされてもよい。例えば、これらの示唆されたキットの構成要素は、溶液中または液体分散物などとして提供されてもよい。
【０１９１】
ＩＶ．担体
抗体はまた、多くの異なる担体に結合されてもよい。したがって、本開示はまた、抗体および活性または不活性の別の物質を含有する組成物も提供する。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本開示の目的のために可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、抗体に結合するための他の適切な担体を承知しているか、または慣用的な実験を用いてそのようなものを確認し得る。
【０１９２】
キメラ抗原受容体およびその使用
Ｉ．組成物
本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む細胞活性化部分を含むか、またはそれから本質的になるＨＬＡ−ＤＲに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。細胞外ドメインは、抗原結合性ドメインとも呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。別様に細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、同時刺激シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。ＣＡＲは任意選択で、３００アミノ酸まで、好ましくは１０〜１００アミノ酸、より好ましくは２５〜５０アミノ酸のスペーサードメインをさらに含んでもよい。
【０１９３】
抗原結合性ドメイン。特定の態様では、本開示は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗原結合性ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。さらなる実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、抗体の重鎖可変領域は、配列番号７〜１０またはその各々の等価物を含むか、もしくはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる、および／または配列番号１〜６またはその各々の等価物を含む１つまたは複数のＣＤＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１７〜２０またはその等価物を含むか、もしくはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる、および／または配列番号１１〜１６を含む１つまたは複数のＣＤＲ領域またはその等価物を含む。
【０１９５】
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成供給源のいずれから誘導されてもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示において特に使用される膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲ由来であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見出され得る。任意選択で、短いオリゴ−またはポリペプチドリンカー、好ましくは２〜１０アミノ酸の長さが、膜貫通ドメインとＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン−セリンのダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。
【０１９６】
細胞質ドメイン。ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された免疫細胞の伝統的なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞にその特異的機能を行わせるタンパク質の一部を指す。短縮された部分がエフェクター機能シグナルを伝達するのに十分である限り、シグナル伝達ドメイン全体を使用しても、またはその短縮された部分を使用してもよい。ＴＣＲおよび共働受容体ならびにそれらの誘導体または改変体の細胞質配列は、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能し得る。本開示における特定の用途の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄに由来し得る。ＴＣＲを通じて生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化のために単独では不十分であるため、二次的または同時刺激性のシグナルもまた必要とされ得る。したがって、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない同時刺激シグナル伝達分子の細胞内領域もまた、ＣＡＲの細胞質ドメインに含まれてもよい。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４−１ＢＢタンパク質、およびＣＤ３−ゼータタンパク質からなる群より選択される、１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインである。
【０１９８】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、同時刺激シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。さらなる実施形態では、同時刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域のいずれかまたは両方を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含み得る。
【０２００】
さらなる態様において、本開示は、その標的細胞に結合したＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ細胞を含む複合体を提供する。さらなる態様において、この複合体は検出可能に標識される。検出可能な標識は、当技術分野で公知であり、本明細書中で簡単に説明される。
【０２０１】
ＩＩ．ＣＡＲを調製するプロセス
本開示の態様は、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞、およびそのような細胞を産生する方法に関する。細胞は、原核細胞または真核細胞である。一態様では、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種、例えば、動物細胞、ヒト、ネコまたはイヌ細胞などの哺乳動物細胞由来であってもよい。
【０２０２】
特定の実施形態では、単離された細胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる外因性ＣＡＲを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。特定の実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、例えば動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞である。特定の実施形態において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞である。
【０２０３】
特定の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を産生する方法が開示されており、この方法は、（ｉ）単離された細胞の集団に、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の上記核酸配列を形質導入することに成功した細胞の小集団を選択するステップを含むか、または代わりにそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞であり、それによってＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が産生される。特定の実施形態において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞であり、それによりＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  ＮＫ細胞が産生される。
【０２０４】
単離された細胞の供給源。本明細書に開示される細胞の増殖および遺伝子改変に先立って、細胞は、対象から（例えば、自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）療法を含む実施形態において）得てもよいし、または市販の培養物から得てもよい。
【０２０５】
細胞は、対象における多数の供給源から得られてもよく、この供給源としては、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍が挙げられる。
【０２０６】
関連細胞を単離する方法は、当技術分野で周知であり、本出願に容易に適合させられ得る；例示的な方法は、以下の実施例に記載する。本開示に関連して用いるための単離方法としては、限定するものではないが、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム；ＳＴＥＭｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット、ならびに他の市販の細胞分離および単離キットが挙げられる。免疫細胞の特定の小集団は、固有の細胞表面マーカーに特異的なそのようなキットにおいて利用可能なビーズまたは他の結合剤の使用によって、単離され得る。例えば、ＭＡＣＳ（商標）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために使用され得る。
【０２０７】
あるいは、Ｔ細胞に関しては、限定するものではないが、市販の細胞培養物、株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））；ＮＫ細胞に関しては、株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））を通じて得てもよい。
【０２０８】
ベクター。ＣＡＲは、ベクターを用いて調製してもよい。本開示の態様は、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離された核酸配列、ならびにＣＡＲおよびその相補体およびその各々の等価物をコードする単離された核酸配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなるベクターに関する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、単離された核酸配列は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代わりに本質的にそれから本質的になるか、またはさらにそれらからなるＣＡＲをコードする。特定の実施形態では、単離された核酸配列は、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインに続いて（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメインに続いて（ｄ）ＣＤ２８同時刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ同時刺激シグナル伝達領域に続いて（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、単離された核酸配列は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインをコードする配列の上流にコザックコンセンサス配列を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、単離された核酸配列はベクターに含まれる。特定の実施形態では、ベクターはプラスミドである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【０２１２】
例示的ベクターの調製および上記ベクターを用いたＣＡＲ発現細胞の生成は、以下の実施例において詳細に考察される。要約すると、ＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、代表的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。このベクターは、複製および組込み真核生物に適切であり得る。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら（２００１年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  Yorkを参照のこと）。
【０２１３】
一態様において、「ベクター」という用語は、非分裂細胞および／またはゆっくりと分裂する細胞に感染および形質導入し、標的細胞のゲノムに組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様において、ベクターは、野生型ウイルスに由来するか、または野生型ウイルスに基づく。さらなる態様において、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するか、または野生型レンチウイルスに基づく。このような例としては、限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。あるいは、他のレトロウイルスが、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのベクター骨格の基礎として使用され得ることが企図される。本開示によるウイルスベクターは、特定のウイルスの構成要素に限定される必要はないことは明らかである。ウイルスベクターは、２つまたはそれ超の異なるウイルスに由来する構成要素を含んでもよく、合成の構成要素を含んでもよい。ベクター成分は、標的細胞特異性のような所望の特性を得るために操作してもよい。
【０２１４】
本開示の組換えベクターは、霊長類および非霊長類に由来する。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、さらに最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。先行技術の組換えレンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，０７，９９３号；同第７，４１９，８２９号および同第７，４４２，５５１号を参照されたい。
【０２１５】
米国特許第６，９２４，１２３号は、特定のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの組込みを促進することを開示している。この特許は、各レトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含むことを教示している。これらの遺伝子には、両端に、長い末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの組込みおよび転写を担う。それらは、エンハンサー−プロモーター配列としても機能する。換言すれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御し得る。レトロウイルスＲＮＡのカプセル化は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。ＬＴＲ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり異なる場合がある。ウイルスゲノムの場合、ポリ（Ａ）付加（停止）の部位は、右側のＬＴＲのＲとＵ５との境界にある。Ｕ３は、プロウイルスの転写制御エレメントの大部分を含有し、これには、細胞の、ある場合にはウイルス転写アクチベータータンパク質に応答するプロモーターおよび複数のエンハンサー配列が含まれる。
【０２１６】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ自体に関して、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）およびＮＣ（ヌクレオカプシド）へ、タンパク質分解によりプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介する、ＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。
【０２１７】
ウイルスベクター粒子の産生のために、ベクターＲＮＡゲノムは、それをコードするＤＮＡ構築物から、宿主細胞中で発現される。ベクターゲノムによってコードされていない粒子の構成要素は、宿主細胞中で発現される追加の核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のいずれかまたは両方を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の産生に必要とされる一連の配列は、一過性トランスフェクションによって宿主細胞に導入されてもよいし、またはそれらは宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよいし、またはそれらは複数の混合方法で提供されてもよい。関与する技術は、当業者に公知である。
【０２１８】
本開示における使用のためのレトロウイルスベクターとしては、限定するものではないが、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬｅｎｔｉシリーズのバージョン４、６および６．２「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」システム（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．が製造）；ｐＨＩＶ−７−ＧＦＰ（実験室生成およびＣｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが使用）；「Ｌｅｎｔｉ−Ｘ」レンチウイルスベクター、ｐＬＶＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈが製造）；ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製造）；ｐＬｅｍｉＲ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製造）；ならびにｐＬＶ（実験室生成およびＣｈａｒｉｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （ＣＢＦ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙが使用）が挙げられる。
【０２１９】
宿主細胞に外因性核酸を導入するか、そうでなければ本開示の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイ実施してもよい。このようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）によって、または本開示の範囲内にある作用物質を識別するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの有無を検出することが挙げられる。
【０２２０】
細胞の活性化および増殖。所望のＣＡＲを発現するための細胞の遺伝子改変の前後にかかわらず、細胞は、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号および同第６，８６７，０４１号に記載されているような一般的に公知の方法を用いて活性化され、増殖され得る。ＨＬＡ−ＤＲ抗原でのｅｘ  ｖｉｖｏの刺激は、選択されたＣＡＲ発現細胞小集団を活性化し、かつ増殖し得る。あるいは、その細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原との相互作用によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化され得る。
【０２２１】
関連する細胞を活性化する方法は、当技術分野で周知であり、本出願に容易に適合され得る；例示的な方法を以下の実施例に記載する。この開示に関連して使用される単離方法としては、限定するものではないが、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システムの活性化および増殖キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ（商標）活性化／増殖キット、ならびに関連する細胞の活性化部分に特有の他の市販の細胞キットが挙げられる。免疫細胞の特定の小集団は、そのようなキットで利用可能なビーズまたは他の作用物質の使用によって活性化または増殖され得る。例えば、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は、単離されたＴ細胞の集団を活性化および増殖するために使用され得る。
【０２２２】
ＩＩＩ．使用方法
治療的適用。本開示の方法態様は、それを必要とする対象において腫瘍の増殖を阻害する方法、および／またはそれを必要とするがん患者を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、腫瘍／がんは、Ｂ細胞リンパ腫または白血病腫瘍／がんである。いくつかの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍、例えば、癌腫である。いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんは、ＨＬＡ−ＤＲを発現する。特定の実施形態では、これらの方法は、対象または患者に有効量の単離された細胞を投与するステップを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる。さらなる実施形態では、この単離された細胞はＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む。さらなる実施形態では、単離された細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、処置される対象または患者に対して自己由来である。さらなる態様において、腫瘍は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現し、対象は、本明細書に記載のものなどの診断によって療法のために選択されている。療法は、第１選択療法であっても、第２選択療法であっても、第３選択療法であっても、もしくは第４選択療法であっても、または処置する医師によって決定される任意のさらなる療法であってもよい。それらは、他の療法と組み合わされて、順次投与されても、または同時に投与されてもよい。
【０２２３】
本明細書に開示されるＣＡＲ細胞は、単独で投与されてもよく、あるいは希釈剤、ＣＡＲ細胞以外の他の抗がん治療剤、および／または免疫刺激性であるサイトカインもしくは他の細胞集団などの他の成分と組み合わせて投与されてもよい。
【０２２４】
本明細書中に開示される医薬組成物は、治療または予防される疾患に適切な様式で投与されてもよい。投与の量および頻度は、臨床試験によって適切な用量を決定することができるが、患者の状態ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定される。
【０２２５】
ＩＶ．担体
本開示のさらなる態様は、担体と、本明細書に開示される実施形態に記載される生成物、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離された細胞、単離された核酸、ベクター、任意の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の単離された細胞またはＣＡＲ細胞、抗ＨＬＡ−ＤＲのうちの１つまたは複数とを含む組成物に関する。
【０２２６】
簡潔には、特許請求の範囲に記載の組成物のいずれか１つを含むが、これに限定されない本明細書に開示される医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される標的細胞集団を含んでもよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含んでもよい。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸および／または非経口投与のために製剤化されてもよい。特定の実施形態において、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【実施例】
【０２２７】
以下の実施例は、開示を実際に実施する様々な例において使用することができる手順の例示である。
（実施例１）
マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体の生成
抗原
【０２２８】
Ｒａｊｉアフリカバーキットリンパ腫細胞核を、Ｌｙｍ−１抗体を産生させるための抗原として使用した。ＣＬＬバイオプシー細胞核を、Ｌｙｍ−２抗体を産生させるための抗原として使用した。
免疫手順
【０２２９】
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した４週齡雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント（第１および第２の免疫）または不完全フロイントアジュバント（第３および第４の免疫）で乳化した１０７個の核で２週間ごと４回免疫した。マウスを、免疫当たりマウスの背中に３つの分離したスポットに分けて合計１０７個の核／アジュバントを皮内に注射した。最終免疫の１０日後、血液試料を得て、抗原被覆プレートでＥＬＩＳＡ手順によって力価を調べた。次に、最高の力価を示すマウスを、アジュバントなしで静脈内に５回目の追加免疫を行って、１０６個の核を無菌リン酸緩衝生理食塩水の１００μｌ溶液において側尾静脈を介して注射した。
ハイブリドーマの生成
【０２３０】
４日後、これらのマウスを屠殺し、脾臓をハイブリドーマ手順のため除去した。Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の溶液中に脾細胞を分散させた後、ＰＥＧ（Ｈｙｂｒｉ  ＭＡＸ、分子量１４５０、カタログ番号：ｐ７１８１、Ｓｉｇｍａ）を使用して脾細胞をマウスＮＳＯ細胞と融合した。次に、ＨＡＴ選択を使用して、融合させた細胞のみが成長することを可能にした。次に、成長しているハイブリドーマ細胞を有するウェルからの上清を、最初に抗原被覆プレートに対するＥＬＩＳＡおよび二番目にＨＬＡ−ＤＲ陽性（Ｒａｊｉ）および陰性ヒト腫瘍細胞株（ＣＥＭ  Ｔ細胞白血病）におけるフローサイトメトリーによってスクリーニングした。陽性かつ高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示すハイブリドーマを、限界希釈法によってサブクローニングのため選択した。次に、サブクローンをフローサイトメトリーによって再試験し、液体窒素中で凍結し、２Ｌ容器中に拡大増殖させ、抗体をタンドン（tandon）プロテインＡまたはＧおよびイオン交換クロマトグラフィー法によって精製した。次に、精製された抗体をバイアルに入れ、使用するまで−２０℃で貯蔵した。
フローサイトメトリー手順およびデータ
【０２３１】
フローサイトメトリーを使用するスクリーニング方法を、抗原被覆プレートに対するＥＬＩＳＡによって陽性であることが見出されたハイブリドーマからの上清を使用してＨＬＡ−ＤＲ陽性（Ｒａｊｉ）および陰性（ＣＥＭ）細胞株で行った。次に、高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、ＨＬＡ−ＤＲに対する選択的な陽性に関して再スクリーニングした。以下の図１Ａ〜１Ｆに示されるとおり、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、Ｂ１抗体とは異なるプロファイルでＨＬＡ−ＤＲ発現Ｒａｊｉ細胞株に対して高いＭＦＩを産生した。これらのデータから、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２を選択して、以下に記載されるとおりＣＡＲ−Ｔ細胞を生成した。
選択した抗体での免疫組織化学
【０２３２】
抗体Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、図２Ａ〜２Ｂに記載されるとおり、標準的な免疫組織化学手順および抗原回復法を使用してヒト扁桃組織の胚中心においてＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を染色することが見出された。胸腺、脾臓および骨髄における染色性は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現するＢ細胞または樹状細胞に限定されていた（表３）。
【表３】
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【０２３３】
図３Ａ〜３Ｂに示されるとおり、ＨＬＡ−ＤＲ陽性は、抗原陽性腫瘍、例えば、中間グレードＢ細胞リンパ腫の細胞膜に見られた。最終的に、正常な組織および器官からの組織切片は、皮膚のリンパ様Ｂ細胞およびマクロファージに対する限定的な反応性を示した（表４）。免疫組織化学を使用してＨＬＡ−ＤＲに対するコンパニオン診断抗体の利用可能性により、来たるべき臨床試験におけるＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法から利益が得られそうな患者の識別が可能となる。
【表４】
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生細胞ラジオイムノアッセイ
【０２３４】
Ｌｙｍ−１またはＬｙｍ−２を使用して、一連のヒトリンパ腫および固形腫瘍細胞株を、生細胞ラジオイムノアッセイ手順を使用して、結合性に関してスクリーニングした。このアッセイのために、懸濁液培養およびＥＤＴＡ−トリプシンでフラスコから取り外した固形腫瘍細胞株を、ＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）、および０．０２％アジ化ナトリウムからなる冷緩衝液中で２回洗浄した。１００μｌの洗浄緩衝液中に再懸濁された細胞（５×１０５）を、ＰＢＳ中のＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で一晩前処理してウェルへの抗体結合を防止した、マイクロウェルにピペットで移した。次に、Ｌｙｍ−１またはＬｙｍ−２上清を、室温で９６ウェルプレートのためのマイクロシェーカー装置を使用して連続的に振盪して、３０分間のインキュベーション期間添加した。４回洗浄後、次に１００，０００ｃｐｍのＩ−１２５ヤギ抗マウスＩｇＧを１００μｌ中に添加し、追加の３０分間インキュベーションを連続的に振盪して細胞とインキュベートした。４回の最終的な洗浄後、ウェルを、ガンマカウンター中でカウントして、各細胞調製物への抗体結合を決定した。これらの研究の結果は、より大規模な一連のヒトリンパ腫および白血病バイオプシーに関して、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２の反応性が、Ｂ細胞の腫瘍に限定的であるが、Ｔ細胞起源には限定的ではないことを示した（表５）。
【表５】
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【０２３５】
これらの結果と一致して、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、表６に示されているとおり、選択された数のヒトリンパ腫および白血病細胞株と結合することが見出された。
【表６Ａ−１】
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【表６Ａ−２】
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【０２３６】
対照的に、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、上記の生細胞ラジオイムノアッセイ手順を使用して、３５種のヒト固形腫瘍細胞株に結合することは見出されなかった（表７）。
【表７−１】
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【表７−２】
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Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２抗体の結合プロファイルならびにＬｙｍ−１抗原の識別
【０２３７】
Ｒａｊｉ細胞と結合するＬｙｍ−１の結合プロファイルおよびスキャッチャードプロット分析が、図４Ａに示される。同様に、ＡＲＨ−７７骨髄腫細胞株と結合するＬｙｍ−２のスキャッチャードプロット分析が、図４Ｂに示される。これらのデータは、両方の抗体が、抗原陽性腫瘍細胞株に対して１０８Ｍ−１の結合親和性を有することを示す。表８に示されているとおり、正常な末梢血Ｂ細胞と比較する場合、腫瘍細胞で見られたものと比較して、結合親和性において２〜４倍の減少があった。加えて、Ｒａｊｉ細胞の３５Ｓ−メチオニンおよび１４Ｃ−ロイシンでの代謝性標識化は、ＨＬＡ−ＤＲに関して見られた特徴的なバンド形成パターンを示した（図５Ａ〜５Ｂ）。対照として、ＳＣ−１抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を並行して使用して、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によって同一のタンパク質分子量で同じバンド形成パターンを得た。
【表６Ｂ】
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（実施例２）
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成
単鎖ＨＬＡ−ＤＲ抗体遺伝子の構築および合成
【０２３８】
研究室において生成された２つの高い結合抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２）についてのＤＮＡ配列が、ＭＣＬＡＢ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得られた。両方の抗体を試験して、どちらが以下に記載されるアッセイにおいて最も有効にＣＡＲを産生するかを決定した。以下に示されているとおり、第２または第３（図６）世代ＣＡＲベクターが、以下のタンデム遺伝子からなるよう構築した：コザックコンセンサス配列；ＣＤ８シグナルペプチド；抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域；（グリシン４セリン）３可動性ポリペプチドリンカー（配列番号５１）；それぞれの抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域；ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζ細胞内同時刺激性シグナル伝達ドメイン。ヒンジ、膜貫通、およびシグナル伝達ドメインＤＮＡ配列は、Ｃａｒｌ  Ｊｕｎｅによる特許（米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８Ａ１号を参照されたい）から確認された。抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ遺伝子は、ベクター宿主にアンピシリン耐性を付与する、ｂｌａ遺伝子を含有するｐＵＣ５７ベクター骨格内にＧｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によって合成された。
レンチウイルスプラスミドへのＣＡＲ遺伝子のサブクローニング
【０２３９】
ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲプラスミドｃＤＮＡで形質転換された。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の成長後、ＣＡＲプラスミドは、精製され、適切な制限酵素で消化されて、ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有する、ＨＩＶ−１ベースレンチウイルスベクター中に、一晩のＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；  Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して挿入された。次に、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、生じた抗ＨＬＡ−ＤＲ含有レンチウイルスプラスミドで形質転換された。
レンチウイルス粒子の産生
【０２４０】
トランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０ｍＬ完全−Ｔｅｔ−ＤＭＥＭ中の４．０×１０６細胞／１００ｍｍ組織−培養−処理プレートに播種し、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中に３７℃で一晩インキュベートされた。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＡＲ−遺伝子レンチウイルスプラスミドおよびレンチウイルスエンベロープ＆カプシド成分を形成するため必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド、加えて、独自の反応緩衝液およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を促進するためのポリマーで同時トランスフェクトされた。
【０２４１】
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養を４時間、３７℃でインキュベート後、トランスフェクション培地は、１０ｍＬの新鮮な完全Ｔｅｔ  ＤＭＥＭで置きかえられた。次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は追加の４８時間インキュベートされ、その後に細胞上清は収穫され、主なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対してサンドイッチＥＬＩＳＡでレンチウイルス粒子について試験された。レンチウイルス含有上清はアリコートにされ、標的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の形質導入のための使用まで−８０℃で貯蔵された。
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および富化
【０２４２】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で密度勾配遠心分離によって富化され、回収され、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳと共に遠心分離によって洗浄された。ＭＡＣＳ  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）キットが使用されて、これらのヒトＴ細胞サブセットは単離され、磁力活性化されたＬＳカラムを使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に関して陽性選択された。次に、磁力で結合されたＴ細胞は、磁気ＭＡＣＳセパレーターから除去され、ＬＳカラムからフラッシュされ、新鮮な完全培地中で洗浄された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーによって評価され、必要な場合、ＵＳＣのフローサイトメトリーコア施設で行った蛍光活性化セルソーティングによって富化された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、適切な細胞培養容器中で１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２で補充した完全培地中に１．０×１０６個細胞／ｍＬの密度に維持され、そこにα−ＣＤ３／α−ＣＤ２８ヒトＴ細胞Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）を添加して、培養されたＴ細胞が活性化された。Ｔ細胞は、ＣＡＲ−レンチウイルス粒子で形質導入する前に２日間、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートされた。
ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
【０２４３】
活性化Ｔ細胞が収集され、死細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  密度勾配遠心分離またはＭＡＣＳ  死細胞除去  キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用によって除去された。６−ウェルプレートにおいて、活性化Ｔ細胞は、１．０×１０６個細胞／ｍＬ完全培地の濃度でプレートされた。ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ含有レンチウイルス粒子は、様々なウェルに、１、５、１０、および５０などの感染多重度（ＭＯＩ）で細胞懸濁物に添加された。レンチウイルス粒子と標的細胞表面の間の相互作用を促進することによって形質導入を助ける陽イオン性ポリマーであるポリブレンは、４μｇ／ｍＬの最終濃度で添加された。プレートは、８００×ｇで１時間、３２℃で遠心分離された。遠心分離後、レンチウイルス含有培地は吸引され、細胞ペレットは１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を有する新鮮な完全培地中で再懸濁された。細胞は、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中に３７℃で一晩置かれた。形質導入３日後に、細胞はペレットにされ、ＩＬ−２および４００μｇ／ｍＬジェネテシン（Ｇ４１８硫酸塩）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有する新鮮な完全培地中に再懸濁された。ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、形質導入手順の成功を実証するため、フローサイトメトリーおよびサザンブロット分析によって評価された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ前に、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＦＡＣＳによって富化され、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために１：１に混合された。
カルセイン放出細胞毒性アッセイによるＣＡＲ有効性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
【０２４４】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原陽性および陰性のヒト細胞株は、収集され、洗浄され、１．０×１０６個細胞／ｍＬの濃度で完全培地中に再懸濁された。カルセイン−アセトキシメチル（ＡＭ）は、１５μＭで標的細胞試料に添加され、次にこれは３７℃で５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３０分間インキュベートされた。染色された陽性および陰性の標的細胞は、２回洗浄され、遠心分離によって完全培地中に再懸濁され、９６−ウェルプレートに１．０×１０４個細胞／ウェルで添加された。ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、完全培地においてプレートにエフェクター対標的細胞比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｒａｔｉｏ）５０：１、５：１、および１：１で添加された。完全培地および２％トリトンＸ−１００を有する完全培地中に懸濁された染色された標的細胞は、それぞれ自発性および最大放出対照として貢献する。プレートは３６５ｘｇおよび２０℃で２分間で遠心分離され、その後にインキュベーターに３時間戻された。次に、プレートは１０分間遠心分離され、細胞上清が黒色ポリスチレン９６−ウェルプレート上のそれぞれのウェルにアリコートとされ、励起および発光をそれぞれ４８５／２０ｎｍおよび５２８／２０ｎｍで、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴマイクロプレートリーダーにおいて蛍光に関して評価された。
Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｂｉｏａｓｓａｙによるヒトサイトカインの定量
【０２４５】
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ修飾Ｔ細胞およびＨＬＡ−ＤＲ陽性および陰性の腫瘍細胞株の上清は、研究室においてルーチンで行われる標準手順を使用してＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の尺度としてサイトカイン分泌について測定された。データを、培地単独とおよび非活性化ヒトＴ細胞を使用する培養物と比較して、バックグラウンド放射能を識別した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、および他の妥当なサイトカインの濃度は、インキュベーションプロセスの間に経時的に測定された。
２種の異種移植片ＨＬＡ−ＤＲ陽性がんモデルにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
【０２４６】
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２種の異なるヒト腫瘍細胞株異種移植片腫瘍モデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでさらに評価付けられた。両方について、固形腫瘍は、５×１０６個のＨＬＡ−ＤＲ陽性またはＨＬＡ−ＤＲ陰性固形腫瘍細胞株の注射によって６〜８週齡雌性ヌードマウスにおいて皮下で確立された。腫瘍が直径０．５ｃｍに達すると、マウス（ｎ＝５）の群は、１もしくは３×１０７個の陰性対照としてのヒトＴ細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究結果に基づき最も活性なＨＬＡ−ＤＲ抗体から構築されたＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で静脈内に処置された。次に、腫瘍体積は週当たり３回キャリパーによって測定され、体積成長曲線は、対照に対する実験処置の有効性を実証するため生成された。
【０２４７】
ＨＬＡ−ＤＲは、ＣＡＲ  Ｔ細胞開発についての優れた標的であることが見出された。
（実施例３）
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
【０２４８】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲベクターは、ＣＤ８リーダー配列、続いて細胞外抗原結合部分またはｓｃＦＶ（これは特異的にＬｙｍ−１抗原に結合する）を含有する。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して細胞質シグナル伝達ドメインに連結し、これはＣＤ８膜貫通領域、ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ζからのシグナル伝達ドメインを含む（図７）。シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ配列を、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービス（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成的に合成した。プラスミドは、精製され、適切な制限酵素で消化されて、ＨＩＶ−１  ５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）ならびにシミアンウイルス４０オリジン（ＳＶ４０）を含有するＨＩＶ−１ベースレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）中に、一晩Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；  Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、続いて制限酵素消化を使用するＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎの欠失およびＴ４  ＤＮＡリガーゼでのライゲーションを介して挿入された。次に、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、生じたＣＡＲ含有レンチウイルスプラスミドで形質転換された。
レンチウイルス粒子の産生
【０２４９】
トランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％透析ＦＣＳで補充した２０ｍＬ  ＤＭＥＭ中で１５０ｃｍ２組織培養処理フラスコ中で４．０×１０６個細胞で播種され、一晩３７℃で加湿５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートされた。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン（streptamycin）なしで１％透析ＦＣＳで補充した２０ｍｌ  ＤＭＥＭ中で、２時間３７℃で加湿５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＡＲプラスミドおよびレンチウイルスエンベロープ＆カプシド成分を形成するため必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドで同時トランスフェクトされた。独自の反応緩衝液およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を促進するためのポリマーも、添加された。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養を２４時間、３７℃でインキュベート後、トランスフェクション培地は、２０ｍＬの新鮮な完全ＤＭＥＭで置きかえられた。レンチウイルス上清は２４時間毎に３日間収集され、上清は１，２５０ｒｐｍで５分４℃で遠心分離され、続いてフィルター滅菌および２０，０００ｇで２時間４℃で遠心分離された。濃縮されたレンチウイルスは、７％トレハロースおよび１％ＢＳＡを含有するＰＢＡ中に再懸濁された。次に、レンチウイルスは、アリコートにされ、標的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の形質導入のための使用まで−８０℃で貯蔵された。２４時間後に収穫された細胞上清は、主なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対してサンドイッチＥＬＩＳＡでレンチウイルス粒子について試験された。トランスフェクション効率は、ビオチン標識タンパク質Ｌ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での染色、その後ＰＥにコンジュゲートされたストレプトアビジンでインキュベーションされるＦＡＣＳ分析によって２０％〜５０％の間と推定され検出された。
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および富化
【０２５０】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で密度勾配遠心分離によって富化され、回収され、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳと共に遠心分離によって洗浄された。Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が使用されて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に関する陰性選択を使用してこれらのヒトＴ細胞サブセットが磁力的に単離された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーによって評価され、蛍光活性化セルソーティングによって富化された。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、適切な細胞培養容器中で１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２で補充した完全５０％クリック培地／５０％ＲＰＭＩ−１６４０培地中に１．０×１０６個細胞／ｍＬの密度に維持され、そこにα−ＣＤ３／α−ＣＤ２８ヒトＴ細胞アクチベータビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養されたＴ細胞が活性化された。次に、Ｔ細胞は、ＣＡＲレンチウイルス粒子を形質導入する前に２日間、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートされた。
ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
【０２５１】
活性化Ｔ細胞が収集され、死細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離またはＭＡＣＳ死細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用によって除去された。６−ウェルプレートにおいて、活性化Ｔ細胞は、完全培地中に１．０×１０６個細胞／ｍＬの濃度でプレートされる。細胞は、細胞に対するトランスフェクション援助剤（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であるＬｅｎｔｉｂｌａｓｔで補充したレンチウイルス粒子で形質導入される。形質導入した細胞を、２４時間３７℃で加湿５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞は、スピンダウンされ、培地は交換され、続いてＴ細胞アクチベータビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が追加された。
フローサイトメトリーによるＬｙｍ−１  ＣＡＲ発現の検出
【０２５２】
レンチウイルス形質導入の７日後、初代Ｔ細胞は、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の４％ＢＳＡ）を使用して３回洗浄された。細胞は、Ｂｉｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ（２ｕｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で４℃で４５分インキュベートされた。再び、細胞は、洗浄緩衝液で３回洗浄され、続いて２ｕｌのストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で４℃で４５分インキュベートされた。細胞は、３回洗浄され、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して分析された。
細胞毒性アッセイ
【０２５３】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定された。活性化Ｔ細胞は収集され、１×１０６個細胞は、上記のとおりＬｙｍ−１  ＣＡＲレンチウイルス構築物で形質導入された。細胞は、細胞毒性アッセイ前２日間Ｔ細胞アクチベータビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して活性化された。標的細胞の至適な数は、製造者のプロトコールのように決定された。アッセイに関して、適切な標的細胞は、９６ウェルプレートで２４時間３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中で三通りにプレートされ、続いて活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を２０：１、１０：１、５：１  および１：１の比で追加し、２４時間３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートされた。細胞は、３７℃で４５分溶解され、１，２５０ｒｐｍで５分間スピンダウンされた。上清は、新しい９６ウェルプレートに移され、続いて反応混合物が３０分間追加された。反応は、停止液を使用して停止され、プレートは４５０ｎｍで読み取られ６５０ｎｍで吸光度補正された。
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
【０２５４】
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスは、Ｌｙｍ−１抗原を発現する、不死化Ｂリンパ腫細胞株Ｒａｊｉを注射された。２００ｕｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個Ｒａｊｉ細胞と共に１×１０６個ヒト繊維芽細胞が、循環ＮＫ細胞の数が低下され、高頻度で異種移植の移植を可能にする、前照射マウス（４００ｒａｄｓ）の左脇腹に注射された。Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ２８アクチベータ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で２日間活性化された。次に、活性化Ｔ細胞は、Ｌｙｍ−１  ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入され、続いてαＣＤ３／ＣＤ２８アクチベータ複合体で追加の２日間活性化された。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ（２．５×１０６）を発現する活性化Ｔ細胞は、腫瘍接種の７日後に側尾静脈を介してマウスの静脈内に注射された。腫瘍サイズがノギスを使用して週当たり３回評価され、腫瘍体積が計算された。
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ発現の検出
【０２５５】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲの発現についてＬｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の分析は、Ｌｙｍ−１について陽性の６２．５％の形質導入Ｔ細胞を示した（図８中央パネル）。対照的に、対照として使用される未形質導入Ｔ細胞の僅か１％が、ＣＡＲ発現に関して陽性であった（図８左パネル）。ＣＤ１９形質導入Ｔ細胞は、陽性対照として使用され、ＣＤ１９  ＣＡＲの５２％発現が示された（図８右パネル）。
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞毒性
【０２５６】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株であるＲａｊｉを使用して検査した。Ｒａｊｉは、ＦＡＣＳ分析によって決定されたとおり、Ｌｙｍ−１抗原（ＨＬＡ−Ｄｒ１０）を発現する。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１および１：１のエフェクター対標的細胞比でＲａｊｉ細胞に添加した。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、５：１、１０：１および２０：１の比で２２％の溶解比で標的Ｒａｊｉ細胞の溶解の増加を示した。それに対し、未形質導入Ｔ細胞は、試験されたいずれの比でもＲａｊｉ細胞を溶解しなかった。
（実施例４）
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
【０２５７】
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲベクターは、ＣＤ８リーダー配列、続いて細胞外抗原結合部分またはｓｃＦＶ（これは特異的にＬｙｍ−２抗原（ＨＬＡ−Ｄｒ）に結合する）を含有する。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して細胞質シグナル伝達ドメインに連結し、これはＣＤ８膜貫通領域、ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ζからのシグナル伝達ドメインを含む。シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ配列を、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービス（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成的に合成した。プラスミドは、精製され、適切な制限酵素で消化されて、ＨＩＶ−１  ５’および３’長末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）ならびにシミアンウイルス４０オリジン（ＳＶ４０）を含有するＨＩＶ−１ベースレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）中に、一晩Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；  Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、続いて制限酵素消化を使用するＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎの欠失およびＴ４  ＤＮＡリガーゼでのライゲーションを介して挿入された。次に、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、生じたＣＡＲ含有レンチウイルスプラスミドで形質転換される。
レンチウイルス粒子の産生
【０２５８】
トランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％透析ＦＣＳで補充した２０ｍＬ  ＤＭＥＭ中で１５０ｃｍ２  組織培養処理フラスコ中で４．０×１０６個細胞で播種され、一晩３７℃で加湿５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートされた。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンなしで１％透析ＦＣＳで補充した２０ｍｌ  ＤＭＥＭ中で、２時間３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＡＲプラスミドおよびレンチウイルスエンベロープ＆カプシド成分を形成するため必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドで同時トランスフェクトされた。独自の反応緩衝液およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を促進するためのポリマーも、添加された。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養を２４時間、３７℃でインキュベート後、トランスフェクション培地は、２０ｍＬの新鮮な完全ＤＭＥＭで置きかえられた。レンチウイルス上清は２４時間毎に３日間収集され、上清は１，２５０ｒｐｍで５分４℃で遠心分離され、続いてフィルター滅菌および２０，０００ｇで２時間４℃で遠心分離された。濃縮されたレンチウイルスは、７％トレハロースおよび１％ＢＳＡを含有するＰＢＡ中に再懸濁された。レンチウイルスは、アリコートにされ、標的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の形質導入のための使用まで−８０℃で貯蔵された。２４時間後に収穫された細胞上清は、主なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対してサンドイッチＥＬＩＳＡでレンチウイルス粒子について試験された。トランスフェクション効率は、ビオチン標識タンパク質Ｌ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での染色、続いてＰＥにコンジュゲートされたストレプトアビジンでインキュベーションされ、ＦＡＣＳ分析によって検出されて２０％〜５０％の間と推定された。
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および富化
【０２５９】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で密度勾配遠心分離によって富化され、回収され、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳと共に遠心分離によって洗浄された。Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が使用されて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に関する陰性選択を使用してこれらのヒトＴ細胞サブセットが磁力的に単離された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーによって評価され、蛍光活性化セルソーティングによって富化される。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、適切な細胞培養容器中で１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２で補充した完全５０％クリック培地／５０％ＲＰＭＩ−１６４０培地中に１．０×１０６個細胞／ｍＬの密度に維持され、そこにα−ＣＤ３／α−ＣＤ２８ヒトＴ細胞アクチベータビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養されたＴ細胞が活性化された。次に、Ｔ細胞は、ＣＡＲレンチウイルス粒子を形質導入する前に２日間、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートされた。
ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
【０２６０】
活性化Ｔ細胞が収集され、死細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離またはＭＡＣＳ死細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用によって除去された。６−ウェルプレートにおいて、活性化Ｔ細胞は、完全培地中に１．０×１０６個細胞／ｍＬの濃度でプレートされた。細胞は、細胞に対するトランスフェクション援助剤（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であるＬｅｎｔｉｂｌａｓｔで補充したレンチウイルス粒子で形質導入された。形質導入した細胞は、２４時間３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートされた。細胞は、スピンダウンされ、培地は交換され、続いてＴ細胞アクチベータビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が追加された。
細胞毒性アッセイ
【０２６１】
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定された。活性化Ｔ細胞は収集され、１×１０６個細胞は、上記のとおりＬｙｍ−２  ＣＡＲレンチウイルス構築物で形質導入された。細胞は、細胞毒性アッセイ前２日間Ｔ細胞アクチベータビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して活性化された。標的細胞の至適な数は、製造者のプロトコールのように決定される。アッセイに関して、適切な標的細胞が、９６ウェルプレートで２４時間３７℃で３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で三通りにプレートされ、続いて活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を２０：１、１０：１、５：１および１：１の比で追加し、上記のとおり２４時間インキュベートされる。細胞は３７℃で４５分溶解され、１，２５０ｒｐｍで５分間遠心分離される。上清は、新しい９６ウェルプレートに移され、続いて反応混合物が３０分間追加された。反応は、停止液を使用して停止され、プレートは４５０ｎｍで読み取られ６５０ｎｍで吸光度補正された。
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
【０２６２】
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスは、Ｌｙｍ−２抗原を発現する、不死化Ｂリンパ腫細胞株Ｒａｊｉを注射された。２００ｕｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個Ｒａｊｉ細胞と共に１×１０６個ヒト繊維芽細胞が、高摂取比（ｈｉｇｈ  ｔａｋｅ  ｒａｔｅ）の腫瘍を保証して、前照射（４００ｒａｄｓ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの左脇腹に注射された。Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ２８アクチベータ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で２日間活性化された。次に、活性化Ｔ細胞は、Ｌｙｍ−２  ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入され、続いてαＣＤ３／ＣＤ２８アクチベータ複合体で追加の２日間活性化された。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ（２．５×１０６）を発現する活性化Ｔ細胞は、腫瘍接種の７日後にマウスの静脈内に注射された。腫瘍サイズがノギスを使用して週当たり３回評価され、腫瘍体積が計算された。
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ発現の検出
【０２６３】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲの発現についてＬｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の分析は、Ｌｙｍ−２について陽性の２８％の形質導入されたＴ細胞を示した（図１１中央パネル）。対照的に、対照として使用される未形質導入Ｔ細胞の僅か１％が、ＣＡＲ発現に関して陽性であった（図１１左パネル）。ＣＤ１９形質導入Ｔ細胞は、陽性対照として使用され、ＣＤ１９  ＣＡＲの５２％発現が示された（図１１右パネル）。
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞毒性
【０２６４】
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株であるＲａｊｉを使用して決定した。Ｒａｊｉは、ＦＡＣＳ分析によって決定されたとおり、Ｌｙｍ−２抗原を発現する。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１および１：１のエフェクター対標的細胞比でＲａｊｉ細胞に添加した。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、５：１および１０：１の比で２２％の溶解比で標的Ｒａｊｉ細胞の溶解の増加を示す。それに対し、未形質導入Ｔ細胞は、試験されたいずれの比でもＲａｊｉ細胞を溶解しなかった。
（実施例５）
ＮＫ細胞形質導入
ＮＫ−９２ＭＩ形質導入
【０２６５】
ＮＫ−９２Ｍｉ細胞株を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２４０８）から購入し、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ−１６４０中に維持した。形質導入前に、非組織処理２４−ウェルを、３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で室温で２時間、１０μｇのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔ１００Ａ）とインキュベートした。１００万個のＮＫ−９２Ｍｉ細胞およびレンチウイルス（ＭＯＩ＝５）を、混合し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ被覆プレートに添加した。次に、プレートを、２８℃、８００ｇで９０分遠心分離した。遠心分離後、細胞を、細胞培養インキュベーター中に一晩維持した。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、次に翌朝、形質導入ＮＫ−９２Ｍｉ細胞を、拡大増殖のために２４ウェルＧ−Ｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）プレートに移した。レンチウイルス形質導入７日後、細胞を、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中４％ＢＳＡ）中で３回洗浄し、Ｂｉｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ（１ｕｇ／１００万個細胞、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）で４℃で４５分染色し、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２ｕｌストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃で４５分添加した。洗浄緩衝液中での最終的な３洗浄後、細胞をＦＡＣｓ（Ａｔｔｕｎｅ）によって分析した（図１５）。
均等物
【０２６６】
他で定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本技術が属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０２６７】
本明細書中に例示的に記載される本技術は、本明細書中に特定的に開示されない、何らかの要素、制限の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、開放的に（ｅｘｐａｎｓｉｖｅｌｙ）かつ限定されることなく、読み取られるものとする。追加的に、本明細書中に用いられる用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定することはない、示されかつ記載される特性またはその一部の任意の均等物を除外する用語および表現の使用に意図はないが、様々な改変が、請求される本技術の範囲内で可能であることが認識される。
【０２６８】
したがって、本明細書中に提供される材料、方法、および例は、好ましい態様の代表であり、例示的であり、本技術の範囲における限定として意図されないことが理解されるべきである。
【０２６９】
本技術は、広範かつ総称的に本明細書中に記載される。属の開示内のより狭い種および亜属の分類の各々も本技術の一部を構成する。これは本技術の属の説明を含み、取り除かれるものが本明細書中に具体的に列記されるか否かに関わらず、属からの何らかの主題を除く条件または負の限定を伴う。
【０２７０】
加えて、本技術の特性または態様が、マーカッシュ群の条件で記載される場合に、当業者は、本技術も、それにより、マーカッシュ群のメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループの条件で記載されることを認識する。
【０２７１】
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願および特許、ならびに他の参照は、個々の参照によって各々が組み込まれたのと同程度まで、その全体を参照によって明示的に組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先する。
【０２７２】
他の態様は、以下の特許請求の範囲内に記載される。
【図１Ａ】
2018524973.tif 000013
【図１Ｂ】
2018524973.tif 000014
【図１Ｃ】
2018524973.tif 000015
【図１Ｄ】
2018524973.tif 000016
【図１Ｅ】
2018524973.tif 000017
【図１Ｆ】
2018524973.tif 000018
【図２Ａ】
2018524973.tif 000019
【図２Ｂ】
2018524973.tif 000020
【図３Ａ】
2018524973.tif 000021
【図３Ｂ】
2018524973.tif 000022
【図４Ａ】
2018524973.tif 000023
【図４Ｂ】
2018524973.tif 000024
【図４Ｃ】
2018524973.tif 000025
【図５Ａ】
2018524973.tif 000026
【図５Ｂ】
2018524973.tif 000027
【図６】
2018524973.tif 000028
【図７】
2018524973.tif 000029
【図８】
2018524973.tif 000030
【図９】
2018524973.tif 000031
【図１０】
2018524973.tif 000032
【図１１】
2018524973.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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