(57)【要約】  本発明は、骨再生の増強をもたらす骨活性タンパク質（例えばＢＭＰ）と抗異化剤（例えばビスホスホネート）との組合せのための骨移植片及び優れた担体として働く、吸収可能な硫酸カルシウム相と安定したリン酸カルシウム相とを含む二相性セラミック骨代用材を示す。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二相性セラミック骨代用材であって、
ａ．硫酸カルシウム相と、
ｂ．リン酸カルシウム相と、
ｃ．少なくとも１つの骨活性タンパク質と、
ｄ．少なくとも１つの抗異化剤と、
を含む、二相性セラミック骨代用材。
【請求項２】
前記硫酸カルシウムが硫酸カルシウム二水和物である、請求項１に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項３】
前記リン酸カルシウムがα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項４】
前記リン酸カルシウム相がヒドロキシアパタイト、好ましくは結晶性ヒドロキシアパタイト粒子から構成される、請求項３に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項５】
前記骨活性タンパク質が骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、スクレロスチン、細胞工場由来の骨活性タンパク質及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項６】
前記骨活性タンパク質がＢＭＰ−２、好ましくはｒｈＢＭＰ−２、及び／又はＢＭＰ−７、好ましくはｒｈＢＭＰ−７等の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項５に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項７】
前記抗異化剤が骨吸収を阻害する作用物質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項８】
前記抗異化剤がビスホスホン酸、ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、デノスマブ又はスタチンである、請求項７に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項９】
前記抗異化剤がエチドロネート、クロドロネート及びチルドロネートを含む群、又はパミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートを含む群から選択されるビスホスホネートである、請求項８に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項１０】
抗生物質、骨治癒促進剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される少なくとも１つの更なる生物活性剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項１１】
ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、リファンピシン、クリンダマイシンから選択される少なくとも１つの抗生物質を含み、抗真菌薬がナイスタチン、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール及びミコナゾールを含む群から選択される、請求項１０に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項１２】
水溶性非イオン性Ｘ線造影剤及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項１３】
前記水溶性非イオン性Ｘ線造影剤がイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオサルコール、イオシミド、イオツサール、イオキシラン、イオフロタール及びイオデコールから選択される、請求項１２に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項１４】
硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）が５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材。
【請求項１５】
硬化性セラミック骨代用材粉末であって、
ａ．硫酸カルシウム１／２水和物粉末と、
ｂ．リン酸カルシウムがα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムから選択される、リン酸カルシウム粉末と、
ｃ．骨活性剤と、
ｄ．抗異化剤と、
ｅ．任意に、好ましくは硫酸カルシウム二水和物及びＮａＣｌ等の無機塩から選択される水溶液中の硫酸カルシウムの凝結促進剤と、
ｆ．任意に水溶液中のリン酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは粒状リン酸カルシウム及び／又はＮａ２ＨＰＯ４等のリン酸塩と、
を含む、硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項１６】
前記リン酸カルシウムが、好ましくは非晶質及び／又は結晶性ヒドロキシアパタイト粒子で構成されるヒドロキシアパタイト粉末である、請求項１５に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項１７】
前記非晶質及び／又は結晶性リン酸カルシウム（例えばヒドロキシアパタイト）粒子が２００μｍ未満、１００μｍ未満、５０μｍ未満、３５μｍ未満又は２０μｍ未満のサイズを有する、請求項１５又は１６に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項１８】
前記抗異化剤を、前記粉末中で前記リン酸カルシウム粒子と予め混合し、それに結合させる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項１９】
前記リン酸カルシウム粒子が結晶性ヒドロキシアパタイト粒子である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２０】
前記抗異化剤が骨吸収を阻害する作用物質であり、ビスホスホン酸、ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、デノスマブ及びスタチンから選択される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２１】
前記抗異化剤がエチドロネート、クロドロネート及びチルドロネートを含む群、又はパミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートを含む群から選択されるビスホスホネートである、請求項２０に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２２】
前記骨活性剤が骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、スクレロスチン、細胞工場由来のタンパク質及びＥＣＭタンパク質を含む群から選択される骨活性タンパク質である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２３】
前記骨活性タンパク質がＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７から選択される骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項２２に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２４】
抗生物質、骨治癒促進剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される生物活性剤を更に含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２５】
ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、リファンピシン、クリンダマイシンから選択される少なくとも１つの抗生物質を含み、抗真菌薬がナイスタチン、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール及びミコナゾールを含む群から選択される、請求項２４に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２６】
水溶性非イオン性Ｘ線造影剤及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤を更に含む、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２７】
前記水溶性非イオン性Ｘ線造影剤がイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオサルコール、イオシミド、イオツサール、イオキシラン、イオフロタール及びイオデコールから選択される、請求項２６に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２８】
硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）が５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０である、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
【請求項２９】
請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末と水性液体とを含む硬化性セラミック骨代用材ペースト。
【請求項３０】
注射可能である、請求項２９に記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト。
【請求項３１】
硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）が５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０であり、液体と乾燥粉末との比率が０．２〜０．８、好ましくは０．３〜０．６である、請求項２９又は３０に記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト又は請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材を作製するキットであって、以下の構成成分：
ｉ）硫酸カルシウム１／２水和物粉末と、
ｉｉ）請求項３又は４に記載のリン酸カルシウム粉末と、
ｉｉｉ）請求項５又は６に記載の骨活性タンパク質と、
ｉｖ）請求項７〜９のいずれか一項に記載の骨吸収を阻害する抗異化剤と、
ｖ）任意に請求項１０又は１１に記載の少なくとも１つの更なる生物活性剤と、
ｖｉ）任意に請求項１２又は１３に記載のＸ線造影剤と、
ｖｉｉ）任意に硫酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは硫酸カルシウム二水和物又はＮａＣｌ等の無機塩と、
ｖｉｉｉ）任意にリン酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは粒状リン酸カルシウム及び／又はＮａ２ＨＰＯ４等のリン酸カルシウム塩と、
ｉｘ）任意に水等の水性液体と、
を含む、キット。
【請求項３３】
前記構成成分が異なる容器内に存在する、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記構成成分の２つ以上を２つ以上の容器内で予め混合する、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
ａ．混合デバイス及び／又は注射デバイス（複数の場合もある）、及び／又は、
ｂ．使用説明書、
を更に含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
生分解性合成膜又はコラーゲン膜を更に含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
失われた骨組織を生成することによるヒト又は非ヒト被験体における支持組織の障害の治療に使用される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
前記添加剤の１つ以上を、個別に又は任意の組合せ（複数の場合もある）で水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入して提供する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載のセラミック骨代用材粉末、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の二相性セラミック骨代用材ペースト及び請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
骨欠損、例えば特に外傷、感染の根絶、腫瘍病巣の切除、遷延治癒又は偽関節に起因する、また初回人工関節置換術又は人工関節再置換術における骨損失を有する患者を治療する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の１つ以上の二相性セラミック骨代用材（移植片）、又は請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の硬化性二相性セラミック骨代用材ペーストを骨が除去された位置に挿入することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成骨移植片及び骨再生におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、二相性セラミック骨代用材が、骨成長を誘導及び／又は刺激することができる骨活性タンパク質、例えば骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及び抗異化薬、例えばビスホスホネートの両方の担体としてどのように働くことができ、それにより活性骨再生の改善において誘導性かつ有用となるかを示す。
【背景技術】
【０００２】
骨折治癒及び骨再形成（bone remodeling：骨リモデリング）は組織再生の形態で見ることができ、生きている骨は一定の再形成に供され、成人における骨量の完全な代謝回転は４年〜２０年毎に起こる。骨再形成は活性化、吸収、逆転及び形成の４つの相を含むサイクルである。活性化は、おそらくは骨折又は骨悪性腫瘍の周辺の破骨細胞の死又は再構成によって開始し、これにより新たな破骨細胞が動員及び誘導され、死骨の吸収が開始する。しばらくの後、吸収は遅くなり、逆転相において骨芽細胞が動員及び活性化される。死骨の吸収後に活性化骨芽細胞が表面に接着し、新たな骨マトリックス−類骨組織の生成を開始し、続いてマトリックスの石灰化が起こる。種々の骨細胞型並びにそれらの活性化因子及び阻害因子の作用は慎重に均衡が保たれ、通常は時間とともに死骨又は骨折骨の置換がもたらされる。
【０００３】
重症の骨欠損、例えば特に外傷、感染の根絶、腫瘍病巣の切除、偽関節手術に起因する、また初回人工関節置換術又は人工関節再置換術による骨治癒における骨損失の修復は多くの場合、新たな骨形成が例えば骨移植片の使用によって支持及び加速される外科的介入によって支持される。
【０００４】
自家骨移植片は、移植片内の生細胞及びタンパク質が骨形成、すなわち骨のデノボ合成を誘導することが可能であるため、理想的な選択肢である。しかしながら、限られた供給及び新たな骨の採取後のドナー部位罹患（donor site morbidity）のリスクから、代わりに骨同種移植片（例えば、一次関節形成術で切除された大腿骨骨頭からの骨）が使用されている。骨伝導性の足場として機能する骨同種移植片、すなわち同種の被験体に由来する死骨は供給が限られ、更には血液感染性疾患を誘導する潜在的リスクを示し、また一部の民族集団では禁止されている。
【０００５】
海綿骨移植片を用いた幾つかの動物研究では、再形成の速度及び再形成される移植片／代用材の体積が骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）によって増大することが見出されているが、新たに形成された、ＢＭＰによる骨誘導により形成される骨の大半が、形成とほぼ同時に吸収された。新たに形成された骨の吸収の理由は、破骨細胞の動員が増強され、早期異化をもたらすＲａｎｋリガンド系のＢＭＰによる活性化であると考えられる。臨床研究では、早期異化は骨折における固定の喪失、早期同種移植片吸収、並びに人工股関節再置換術における失敗及び緩みを引き起こした（非特許文献１）。
【０００６】
ビスホスホネートは骨吸収を阻害する抗異化薬群であり、特に骨粗鬆症及び骨転移の予防及び治療に臨床的に使用されている。静脈内に又は経口で投与されるビスホスホネートは、骨塩を標的化及び結合するため、このように全身的に適用されたビスホスホネートは活性骨再形成領域に主に蓄積する。破骨細胞性吸収中に、骨塩に結合したビスホスホネートが放出され、破骨細胞内に内在化し、続いてこれらの細胞のアポトーシスが起こる。動物研究では、静脈内又は局所的に適用されたビスホスホネートが、自家移植片、又は同種移植片とＢＭＰとの組合せによって誘導される新たに形成された骨の吸収を阻害し得ることが示されている（非特許文献１）。Toshihiko Nishisho et al.は、骨巨細胞腫の治療における人工骨（ヒドロキシアパタイト又はβ−リン酸三カルシウム）に加えたゾレドロン酸の局所投与を開示している（非特許文献２）。
【０００７】
ここ１０年間、大きな骨欠損は骨伝導性骨代用材として働く生体材料等の人工移植片を用いて治療されている（非特許文献３）。これらの材料はポリマー、セラミック又は複合性のものである（非特許文献４）。
【０００８】
骨組織工学における他の研究が多孔性ポリマー、糖ベースの高粘度担体又はコラーゲンにおける骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）のような骨活性タンパク質及びビスホスホネートのような抗異化薬の組込みを扱っている。特許文献１は、生分解性又は生体適合性ポリマーにおける単独の又はゾレドロン酸（ＺＡ）と組み合わせたＢＭＰの組込みを開示している。ヒドロキシアパタイトはＺＡをドープし、形成時にポリマーに組み込むことができる。特許文献２は糖ベースの高粘度担体、ＢＭＰ、ビスホスホネート及び任意にヒドロキシアパタイトを含む組成物を開示している。非特許文献５は、組み換えＢＭＰ及びビスホスホネートの結合及び同時送達を可能にするコラーゲン−ヒドロキシアパタイト足場を開示している。同種移植片又は多孔性ポリマー等の担体を用いたＢＭＰとビスホスホネートとの組合せに関する研究により、程度の差はあるが、ＢＭＰとビスホスホネートとの間の相乗的な結果が示されている。このポリマーは、患者への挿入前に予め作製される標準製品であり、したがって空間を残さない骨の効率的な再生のための個々の骨間隙の充填への効果的使用に容易には適合せず、感染リスクが増大する。ポリマーはそれ自体が骨伝導性でも骨誘導性でもなく、したがって骨再生には積極的に関与しない。
【０００９】
吸収可能な硫酸カルシウム１／２水和物構成成分と安定したリン酸カルシウム構成成分、例えばヒドロキシアパタイトとを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで硬化して合成移植片として働く能力を有する注射用二相性セラミック骨代用材が、ここ数年で例えばスウェーデン企業のBone Support ABにより開発されている（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８を参照されたい）。これらの文献から、骨代用材が生物活性剤の長いリストから選ばれる添加剤を含有してもよいことが示唆される。このリストには、とりわけ抗生物質、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）のような骨活性タンパク質、及びビスホスホネートが含まれる。しかしながら、これまでは抗生物質しか市販の骨代用材に含まれていなかった。Bone Support ABはＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＢＯＮＥ  ＶＯＩＤ  ＦＩＬＬＥＲ、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＳＰＩＮＥ  ＳＵＰＰＯＲＴ及びＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＧ（ゲンタマイシンを含むＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標））の３つの二相性セラミック製品を市場に出しており、４つ目の製品であるＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＶ（バンコマイシンを含むＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標））が現在ＣＥに認証されており、発売の準備がされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０９４７０８号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０３２０９９号
【特許文献３】欧州特許第１３０１２１９号
【特許文献４】欧州特許第１４６５６７８号
【特許文献５】欧州特許第１６０１３８７号
【特許文献６】欧州特許第１８２９５６５号
【特許文献７】国際公開第２０１１／０９８４３８号
【特許文献８】国際公開第２０１４／１２８２１７号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nicole Y.C. Yu, Aron Schindler, Magnus Tagil, Andrew J. Ruys, David G. Little. Frontiers in Bioscience E4, 2647-2653, June 1, 2012
【非特許文献２】Orthopedics Vol. 38, Issue 1: e25-e30 (2015)
【非特許文献３】Oryan A, Alidadi S, Moshiri A, Maffulli N. Bone regenerative medicine: classic options, novel strategies, and future directions. Journal of orthopaedic surgery and research. 2014; 9:18
【非特許文献４】Habibovic P, de Groot K. Osteoinductive biomaterials-properties and relevance in bone repair. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2007; 1:25-32
【非特許文献５】Murphy CM, Schindeler A, Gleeson JP, Yu NYC, Cantrill LC, Mikulec K, et al. Acta Biomaterialia. 2014; 10:2250-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
程度の差はあるが骨伝導性の骨代用材の使用における多くの有望な結果にもかかわらず、骨再生を迅速化し得る骨誘導性の骨代用材が非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、骨活性タンパク質（複数の場合もある）及び抗異化剤（複数の場合もある）が、初期ミクロ細孔性及び機械的安定性をもたらし、ｉｎ  ｖｉｖｏで吸収される同化剤を含有する少なくとも１つの相と、安定しており、ｉｎ  ｖｉｖｏでゆっくりとしか再形成されず、好ましくは抗異化剤に高い親和性を有する少なくとも１つの他の相とを含む二相性セメント／セラミック材料から構成される骨伝導性担体により骨欠損へと、改善された骨代用材中で共に送達される。
【００１４】
担体材料はそれ自体が主に骨伝導性であるが、ミクロ細孔性の急速に吸収可能な相が添加された様々な治療剤の制御送達をもたらし、材料のマクロ細孔性を増大し、骨成長因子によって誘導される新たな骨細胞の急速な内部成長を可能にする一方で、抗異化剤が密に結合した安定な相が、新たな骨細胞が多孔性材料に入り込むことによって非常にゆっくりと再形成されることで、抗異化剤は時間をかけてゆっくりと放出され、より密で強い新たな骨の形成という利益のための急速な骨成長と新たな骨の吸収との継続した局所的な均衡がもたらされる。
【００１５】
本発明の一実施の形態による二相性セラミック骨代用材、すなわち凝結状態のセラミック材料は、ａ）硫酸カルシウム相と、ｂ）リン酸カルシウム相と、ｃ）少なくとも１つの骨活性タンパク質と、ｄ）少なくとも１つの抗異化剤とを含む。少なくとも１つの骨活性タンパク質は、好ましくは急速に吸収可能な硫酸カルシウム相内に存在し、少なくとも１つの抗異化剤は、好ましくは安定したリン酸カルシウム相内に存在する。抗異化剤は、骨吸収を阻害する作用物質であり、リン酸カルシウムに対して親和性を有するのが好ましい。
【００１６】
硫酸カルシウム相は、石膏としても知られる硫酸カルシウム二水和物（ＣＳＤ）から本質的になるのが好ましい。針状硫酸カルシウム二水和物粒子は、焼石膏としても知られる硫酸カルシウム１／２水和物（ＣＳＨ）が水と反応し、生じるＣＳＤ針状結晶が噛み合い、ミクロ細孔性が約２０％〜４０％の固体ＣＳＤマトリックスが作り出されることで形成される。ＣＳＤは水及び体液に比較的溶解性であり、したがって体内で比較的迅速に溶解し、完全に吸収される（６週間〜１２週間以内）。溶解されるまでに、硫酸カルシウム相は骨支持体に望ましい機械的強度を与え、これはヒドロキシアパタイト粒子が移動しないような患者への移植後の人工移植片の安定性に不可欠な場合が多い。ＣＳＤの溶解及び吸収の過程で、ミクロ細孔が骨代用材内で徐々に拡大してマトリックスを形成することで、幹細胞（例えば間葉系前駆細胞）、活性化骨芽細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質及び他の骨細胞が骨間のライニング、骨髄及び骨代用材から骨代用材の深くへと移動し、そこで新たな骨の形成及び再形成が起こり得る。これにより、硫酸カルシウム相の特性からセラミック骨代用材内での骨細胞の進行性の内部成長が可能となる一方で、新たに形成された骨が機械的安定性を確保するまで機械的安定性が維持される。
【００１７】
本発明の一実施の形態では、固体ＣＳＤは、硫酸カルシウム１／２水和物粉末を水と混合する凝結プロセス中に形成される。多くの場合、プロセスが所望の制御可能な時間内に生じるように促進剤を添加する必要がある。代用材を、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ治療において液体形態で（例えばペーストとして）注射するか又は他の形で適用する場合、好都合な凝結時間は１０分〜３０分である。反応促進剤として、硫酸カルシウム二水和物又は生理食塩水（ＮａＣｌ溶液）を使用することができる。
【００１８】
骨活性タンパク質、また存在する場合に他の生物活性剤（例えば抗生物質）は、好ましくは硫酸カルシウム相内に入れられ、体液との接触時に硫酸カルシウム相から硫酸カルシウム相のミクロ細孔を介して放出される。患者への移植後の活性剤の急速な放出は、骨代用材マトリックス内及び近傍の骨活性タンパク質及び任意に他の骨活性因子の高い初期局所濃度を移植の直後にもたらし、骨細胞の活性化及び成長の強い初期刺激を生じる。
【００１９】
本発明の一実施の形態では、骨活性タンパク質及び任意に他の任意の生物活性剤を、リン酸カルシウム及び液体と混合する前にＣＳＨ粉末と予め混合する。別の実施の形態では、骨活性タンパク質及び任意に他の任意の生物活性剤を、硫酸カルシウム及びリン酸カルシウムと混合する前に液体と予め混合する。更なる実施の形態では、骨活性タンパク質及び任意に他の任意の生物活性剤を、硫酸カルシウム及び液体と混合する前にリン酸カルシウムと予め混合する。また別の実施の形態では、骨活性タンパク質及び任意に他の任意の生物活性剤を、「遅延混合」として知られるプロセスで硫酸カルシウム粉末及びリン酸カルシウム粉末と液体とを混合した直後にペーストと混合する（特許文献７を参照されたい）。後者は、骨活性タンパク質及び任意に他の任意の生物活性剤により凝結又は凝結時間が乱され、例えば凝結時間が患者の外科手術への使用に対して長くなり過ぎる場合に適切であり得る。いずれの混合の際にも、骨活性タンパク質及び任意に他の任意の生物活性剤が、本発明の二相性セラミック骨代用材において最終的に硫酸カルシウム相に含まれるのが好ましい。
【００２０】
本発明の二相性セラミック骨代用材の硫酸カルシウム相は、骨活性タンパク質の独特の担体及び送達マトリックスをもたらし、制御されてはいるが、比較的急速な骨活性タンパク質の放出を可能にし、同時に初期機械的安定性と併せて急速な骨細胞の内部成長に有益な多孔性をもたらす。
【００２１】
リン酸カルシウム相はα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムからなる群から選択されるリン酸カルシウムセラミックから本質的になるのが好ましい（特許文献３（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。種々のリン酸カルシウムセラミックの混合物を所望に応じて適用してもよい。
【００２２】
リン酸カルシウム相は、非晶質及び／又は結晶性リン酸カルシウム粒子からなる。粒子サイズは好ましくは２００μｍ未満、例えば１００μｍ未満、５０μｍ未満、３５μｍ未満、２０μｍ未満又は１０μｍ未満（好ましくは０．１μｍ〜５０μｍ）である。一実施の形態では、リン酸カルシウムはリン酸カルシウム粒子（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト粒子）として提供され、それが硫酸カルシウム粉末及び硫酸カルシウムを凝結させる水と混合され、リン酸カルシウム粒子が凝結後に硫酸カルシウム相中に組み込まれる。別の実施の形態では、リン酸カルシウムは、水との混合時にリン酸カルシウムセメントが形成される凝結反応のために調製される硬化性リン酸カルシウム粉末として提供される（特許文献３（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。リン酸カルシウムの凝結反応は、粒状リン酸カルシウム又はリン酸塩、例えばリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）によって加速することができる。
【００２３】
本発明の特定の一実施の形態では、リン酸カルシウム相はヒドロキシアパタイト粒子から本質的になる。ヒドロキシアパタイト粒子は非晶質又は結晶性状態であり得る。好ましい実施の形態では、リン酸カルシウム相は焼結結晶性ヒドロキシアパタイト粒子から本質的になる。一実施の形態では、焼結結晶性ヒドロキシアパタイト粒子は、特許文献８（引用することにより本明細書の一部をなす）に開示の方法に従って調製されるが、この場合、焼結結晶性ヒドロキシアパタイト粒子を加熱によって不活性化することで、結晶性ヒドロキシアパタイトと硫酸カルシウムとを含む二相性セラミック組成物中の硫酸カルシウム相の凝結特性の改善がもたらされる。これは組成物が抗生物質等の付加的な作用物質を含む場合に好ましい。
【００２４】
本発明の一実施の形態では、本発明の二相性セラミック骨代用材に有用な骨活性タンパク質は、骨形成に活性がある同化因子、すなわち好ましくは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、スクレロスチン（sclerostine）等を含む群から選択される骨成長タンパク質である。骨活性タンパク質は、細胞工場由来の骨活性タンパク質及びＥＣＭタンパク質を含む組成物の形態でも提供することができる（国際公開第２００８／０４１９０９号）。代替的には、骨成長因子としてのストロンチウムを、骨活性タンパク質の代用材に加えて又は代用材として使用してもよい。
【００２５】
好ましい実施の形態では、骨活性タンパク質は、ＢＭＰの長いリストから選択される骨成長タンパク質、最も好ましくはＢＭＰ−２又はＢＭＰ−７又はそれらの組合せであり得る。ＢＭＰはドナー細胞（例えば骨細胞工場）から単離するか、又は組み換え技術によって調製することができる。ヒト患者については、ｒｈＢＭＰ−２又はｒｈＢＭＰ−７等の組み換えヒトＢＭＰを使用するのが好ましい。ｒｈＢＭＰは市販されているか、又は既知の技法によって作製することができる。
【００２６】
骨活性タンパク質をそのまま提供し、粉末、水性液体又はペーストのいずれかに添加することができる。代替的には、骨活性タンパク質を使用前に水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子（dihydrate nidation particles）等に封入することができる。封入された活性添加剤は、使用の相当前に調製することができることに加えて保管及び混合時に保護されるという利点を有する。封入された活性添加剤は、先に又はペースト中で又は硫酸カルシウム相の溶解及び吸収時に放出させることができる。
【００２７】
本発明の別の実施の形態では、本発明の二相性セラミック骨代用材に有用な抗異化剤は、骨吸収を阻害する作用物質である。骨吸収特性を有する阻害剤の例はビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）（例えばラロキシフェン、タモキシフェン、ラソフォキシフェン及びバゼドキシフェン）、デノスマブ（Amgenによって開発されたＲＡＮＫＬに対するモノクローナル抗体）及びスタチンである。ヒドロキシアパタイトに対する活性結合が起こらない場合、作用物質が封入された遅延送達システムが好ましい。
【００２８】
好ましい実施の形態では、抗異化剤はビスホスホネートである。ビスホスホネートは骨塩、すなわちヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウムに対して強い親和性を有し、単純ビスホスホネート（例えばエチドロネート）と窒素含有ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート及びゾレドロネート）とに分けることができる。異なるビスホスホネートの効力を、本発明による二相性セラミック骨代用材に使用されるビスホスホネートの選択時に考慮するものとする。アレンドロネートはゾレドロネートよりも１０倍〜１００倍強力であり、エチドロネートは最大１００００倍エチドロネートよりも強力である。
【００２９】
ビスホスホネートは、それらの分子構造及びカルシウムイオンをキレート化するそれらの能力により骨塩を標的化及び結合する。ビスホスホネートは、骨中の無機質に対するそれらの強い親和性のために活性再形成領域中、また他の細胞型に僅かに蓄積し、骨吸収中に放出され、破骨細胞に内在化するまで実質的に結合したままである。しかしながら、ビスホスホネートが破骨細胞に対して毒性であることから、破骨細胞はアポトーシスへと進み、骨吸収は阻害されるか又は持続する。
【００３０】
本発明の二相性セラミック骨代用材のリン酸カルシウム相は抗異化剤、好ましくはビスホスホネートのための独特の担体及び送達マトリックスをもたらし、特にＢＭＰ活性化の結果として、新たに形成された骨細胞が作り出され、破骨細胞へと分化するのと同じ速度での作用物質の制御された遅延放出を可能にし、同時に非常にゆっくりと吸収されるか（４ヶ月〜１２ヶ月）、又は硫酸カルシウムが吸収された後に新たに形成される骨へと組み込まれる安定したマトリックスを形成する。既知の幾つかのポリマー担体と比較して、リン酸カルシウム相は時間とともに天然無機物として吸収されるか又は組み込まれ、患者内に人工ポリマーは残らない。本発明による二相性セラミック骨代用材中に存在する抗異化剤（例えばビスホスホネート）は、マトリックス中のリン酸カルシウム粒子に結合した抗異化剤が硫酸カルシウム相の溶解及び吸収の結果として露出することから、新たな骨の内部成長に従う速度で二相性骨代用材中の結合した破骨細胞による新たに形成された骨の早期吸収を抑制する。これにより、新たに形成された骨細胞が、骨欠損に挿入された移植片からマトリックスへと新たに形成された骨の完全な石灰化以上に展開する際に抗異化剤と接触する。早期吸収の抑制は動物筋肉モデルで見られるように、新たな骨のより密な形成及び石灰化をもたらし、骨欠損を有する患者の治癒を以前に見られるよりもより良好かつ迅速な時間で助長する。リン酸カルシウムの全部又は一部を、最適な均衡のために、及び即座に開始するが、１２ヶ月〜２４ヶ月とより長期にわたって継続する骨内部成長のためにビスホスホネートで前処理することにより結合させてもよい。
【００３１】
既知のポリマー担体は少量のヒドロキシアパタイトしか含まないが（特許文献１では２％（ｗ／ｖ）及び特許文献２では１％〜５％（ｗ／ｖ））、本発明の二相性セラミック担体は最大で約９５％（ｗ／ｗ）のリン酸カルシウム（例えばヒドロキシアパタイト）（市販のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品中約４０％のヒドロキシアパタイト）を含むことができるため、ビスホスホネートを本発明の担体中にはるかに高密度で分散させることが可能である。より高い密度では、破骨細胞に入り込み、骨芽細胞から離れることによる骨細胞吸収のより効果的な局所阻害が確保される。さらに、一部のポリマーしか機械的支持をもたらさず、いずれのポリマーもそれほど骨伝導性ではないため骨移植片として理想的ではないが、本発明で使用される二相性セラミック骨代用材担体（例えば、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品）はミクロ細孔性、機械的支持性、骨伝導性かつ骨誘導性である。機械的支持をもたらす多孔性ポリマー、例えば乳酸−グリコール酸共重合体（特許文献１を参照されたい）は溶媒及び／又は温度を要し、又は発熱重合プロセスを有するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ重合、ひいては注射による挿入に不適当である。注射用ポリマー、例えば糖ベースの高粘度ポリマー（特許文献２を参照されたい）は多孔性が低く、機械的支持をもたらさない。
【００３２】
抗異化剤は、粉末若しくは溶液として提供するか、及び／又は水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。封入された活性添加剤は、使用の相当前に調製及び保管することができることに加えて保管及び混合時に保護されるという利点を有する。封入される成分として添加される場合、ビスホスホネートは、例えば封入物が水と接触した際、例えばペーストを調製する際、又はｉｎ  ｖｉｖｏで体液がカプセル化物に接近した際にそれらの封入物から放出され、隣接リン酸カルシウム粒子に結合する。抗異化剤及び骨活性タンパク質は、同じ又は異なる封入物内で提供することができる。
【００３３】
本発明の一実施の形態では、二相性セラミック骨代用材は抗生物質（抗真菌薬を含む）、骨治癒促進剤（bone healing promotors）、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される１つ以上の付加的な生物活性剤を更に含む。好ましい実施の形態では、二相性セラミック骨代用材は１つ以上の抗生物質（例えばゲンタマイシン及び／又はバンコマイシン）を含む。付加的な生物活性剤（複数の場合もある）を硫酸カルシウム粉末、リン酸カルシウム粉末／粒子若しくは液体と混合しても、又は上記のような遅延混合プロセスにおいて硫酸カルシウム粉末、リン酸カルシウム粉末／粒子及び液体を含むペーストと混合してもよい。また、付加的な生物活性剤を水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入してもよい。付加的な生物活性剤（複数の場合もある）は、任意に抗異化剤及び／又は骨活性タンパク質とともに同じ又は異なる封入物内で提供し、先に又はペースト中で又はｉｎ  ｖｉｖｏで体液との接触により放出させることができる。
【００３４】
本発明のまた別の実施の形態では、二相性セラミック骨代用材は、水溶性非イオン性Ｘ線造影剤（例えばイオヘキソール）及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤も含む。Ｘ線造影剤を硫酸カルシウム粉末、リン酸カルシウム粉末、他の添加剤若しくは液体と混合しても、又は上記の遅延混合プロセスにおいて硫酸カルシウム粉末、リン酸カルシウム粉末及び液体を含むペーストと混合してもよい。Ｘ線造影剤も必要に応じて水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。Ｘ線造影剤（複数の場合もある）は、任意に抗異化剤及び／又は骨活性タンパク質及び／又は他の添加剤とともに同じ又は異なる封入物内で提供し、先に又はペースト中で放出させることができる。セラミック粉末と混合可能な状態の、Ｘ線能の増強のためにヨウ素（イオヘキソール）を含む予め混合したＸ線溶液は、BONESUPPORT ABからＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵの商品名で入手可能である。
【００３５】
本発明の特定の実施の形態では、BONESUPPORT AB製の二相性セラミック材料、例えばＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）Ｉ  ＢＯＮＥ  ＶＯＩＤ  ＦＩＬＬＥＲ、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）Ｉ  ＳＰＩＮＥ  ＳＵＰＰＯＲＴ、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＧ及びＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＶが、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）のような骨活性剤（複数の場合もある）及びビスホスホネートのような抗異化剤（複数の場合もある）の担体として働くことができる。表１は、市販のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品の内容物を示す。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品中に存在するヒドロキシアパタイトが、幹細胞に対して骨誘導性に作用することができ、低い免疫原性を有することが本発明で実証されている。
【００３６】
【表１】
2018514248.tif 000003
【００３７】
本書の目的上、「Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品」は、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）Ｉ  ＢＯＮＥ  ＶＯＩＤ  ＦＩＬＬＥＲ、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）Ｉ  ＳＰＩＮＥ  ＳＵＰＰＯＲＴ、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＧ及びＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＶのそれぞれに存在する粉末組成物の１つ以上を意味し、ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＢＶＦ又はＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＢＶＦ又はＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ；ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＳＳ又はＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＳＳ；ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）Ｇ又はＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ；及びＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）Ｖ又はＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｖと表す。液体と混合することによってこれらの粉末組成物から作製されるペースト及び凝結固体骨支持体は、本書全体を通して同じ名称で言及され得る。「Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品」の状態及び含量は文脈から明らかである。
【００３８】
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品からの骨活性タンパク質（例えばＢＭＰ−２）の高い初期放出及びビスホスホネート（例えばＺＡ）の持続放出により、これが優れた担体プラットホームとなることが示されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られる骨活性タンパク質の高い初期放出は、吸収可能な硫酸カルシウム及び初期ミクロ細孔性を有する二相性材料によるものである。誘導性細胞へのかかるタンパク質のアベイラビリティの増大は分化の早期開始につながり、これにより骨成長の加速がもたらされ得る。対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られる担体プラットホームからのビスホスホネートの持続するが低い放出は、リン酸カルシウム（例えばヒドロキシアパタイト）粒子の表面へのビスホスホネートの強い結合によって引き起こされる。新たな骨細胞へのビスホスホネートの持続放出及び曝露は、新たに形成された骨の早期吸収を阻害し、これにより新たな骨細胞の成熟及び石灰化が可能となり、再形成された強い骨の急速な形成がもたらされる。
【００３９】
本発明の一実施の形態では、二相性セラミック骨代用材は、患者への移植前に鋳型（複数の場合もある）内のビーズとして作製し、及び／又は任意の所望の形態に造形する（sculptured）ことができる。材料の凝結時間は、予め凝結した（preset）ビーズ又は造形した調製物にとっては重要ではないと言える。本発明の別の実施の形態では、二相性セラミック骨代用材はｉｎ  ｖｉｖｏ凝結プロセスの結果であり、本発明による二相性セラミック骨代用材ペーストは患者の骨欠損部位に注射されるか、又は他の形で設置される。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ凝結プロセスでは、凝結時間が重要であることが多い。凝結構成成分、添加剤及び促進剤の正しい組合せが、骨代用材の最適な一貫した確実な凝結に不可欠である。ペーストは、乾燥粉末と水溶性添加剤の一部又は全てを含み得る水性液体とを混合することによって使用直前に調製してもよい。添加剤の一部又は全てを、水性液体と混合する前に１つの又は異なる乾燥粉末と予め混合することができる。添加剤の一部又は全てを使用前及び凝結前にペーストに添加し、混合してもよい。添加剤の一部又は全てが、上記のように後の放出のために封入形態であってもよい。
【００４０】
本発明の更なる実施の形態では、粉末及び添加剤は混合可能な状態のキット内で提供することができ、この場合種々の粉末及び添加剤が個別に又は任意の望ましい方法で予め混合して又は異なる容器内の組合せで提供される。キットはペーストの調製のための水性液体を含んでいてもよく、液体は添加剤の１つ以上を含有し得る。
【００４１】
付加的に、キットは、例えば国際公開第２００５／１２２９７１号に開示されるような混合及び使用、及び／又は混合デバイス、及び注射器を含む注射デバイスの取扱説明書を含んでいてもよい。
【００４２】
本発明による二相性セラミック骨代用材は、外科的介入及び空隙の充填が必要とされる及び／又は有益である殆どの骨欠損、例えば特に外傷、感染領域の創面切除、病理学的病変（例えば骨肉腫）の切除、偽関節手術に起因する、また初回人工関節置換術又は人工関節再置換術における骨損失の治療に使用することができる。治療される骨としては、任意の動物又はヒトの脊髄、手、指、腕、足、足指、下腿又は上腿、膝、臀部、足首、肘、手首、肩、頭蓋、顎及び歯の骨が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性分析を示す図である。ＲＡＷ２６４．７細胞をＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ上に播種し、様々な炎症性サイトカインＩＬ−１β（パネルＡ）、ＩＬ−２（パネルＢ）、ＩＬ−６（パネルＣ）及びＴＮＦ−α（パネルＤ）の放出を分析し、免疫原としてのＬＰＳと比較した。
【図２】電子顕微鏡検査による細胞−材料相互作用を示す図である。パネルＡ及びパネルＢは、それぞれＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇを表す。パネルＣ及びパネルＤは、両方の材料（ＢＶＦ／Ｇ）の表面に対するＣ２Ｃ１２細胞の接着を表し、パネルＥ及びパネルＦは、Ｃ２Ｃ１２細胞の核染色（ＤＡＰＩを用いる）を表し、２つの材料（ＢＶＦ／Ｇ）の表面全体にわたる細胞の均一な分布が示される。
【図３】Ｃ２Ｃ１２細胞を用いたＭＴＴ及びＡＬＰ分析によるＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ材料に対する細胞培養研究を示す図である。パネルＡは、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ生体材料上での播種後５週間にわたるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖パターンを表す。細胞増殖を、増殖の対照として２Ｄ−ポリスチレンプレートを用いたＭＴＴアッセイにより評定した。パネルＢは、３５日間にわたって組織培養プレートと比較した、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ上に播種したＣ２Ｃ１２筋芽細胞のＡＬＰ活性のレベルを示すアルカリホスファターゼアッセイを表す。
【図４】Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）上に播種したＣ２Ｃ１２筋芽細胞の免疫細胞化学的及びＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ上に播種したＣ２Ｃ１２細胞を、骨分化を可視化する免疫細胞化学を用いて分析した。細胞を播種の７日後及び２１日後に染色した。細胞は播種の７日目にＲｕｎＸ−２（Ａ〜Ｃ）、２１日後にそれぞれＣｏｌ  Ｉ（Ｄ〜Ｆ）、ＯＣＮ（Ｇ〜Ｉ）及びＯＰＮ（Ｊ〜Ｌ）のような骨形成マーカーに対して陽性に染色された。左パネル（Ａ、Ｄ、Ｇ及びＪ）の画像は、ＤＡＰＩを用いた核染色を示し、中央パネル（Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＫ）の画像は、それぞれの標的タンパク質の抗体に基づく検出を示し、右パネル（Ｃ、Ｆ、Ｉ及びＬ）は、それぞれの重ね合わせ画像を示す。
【図５】骨分化の早期開始が、７日後にＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ上に播種したＣ２Ｃ１２細胞におけるＲｕｎＸ−２遺伝子の存在によって確認されたことを示す図である（パネルＭ）。筋細胞の骨芽細胞成熟（播種の２１日後）は、対照ラダー（パネルＮ、レーン５）を用いてＣｏｌ  Ｉ（パネルＮ、レーン１）、ＯＣＮ（パネルＮ、レーン２）、ＢＳＰ（パネルＮ、レーン３）、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（パネルＮ、レーン４）をコードする骨芽細胞遺伝子の存在によって確認された。
【図６】細胞工場骨活性タンパク質による処理後の骨格筋細胞Ｌ６の形態学的変化及び表現型的変化を示す図である。パネルＡ〜Ｄは、実験群における播種の１２日後のそれぞれＣｏｌ  Ｉ、ＯＣＮ、ＯＰＮ及びＢＳＰの発現を示す。細胞は、最も顕著な骨芽細胞マーカーＣＯＬＩ（パネルＡ）、ＯＣＮ（パネルＢ）、ＯＰＮ（パネルＣ）及びＢＳＰ（パネルＤ）に対して陽性に染色された。パネルＥ及びＦは対照群における筋管形成を示し、細胞工場処理群は単核形態を示す（パネルＧ及びＨ）。パネルＩは両方の群における細胞増殖を示し、パネルＪは両方の群の筋管数を示す。
【図７】Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクからのＢＭＰ−２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを示す図である。
【図８】経時的なＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクからのＺＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを示す図である。
【図９】Ａ５４９腫瘍細胞に対するＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクから放出されたＺＡによって誘導される細胞毒性を示す図である。
【図１０】４週間にわたって腹筋袋（pouch）に移植されたＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクのＸ線写真を示す図である。パネルＡはＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを示し、ＢはＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２を示し、ＣはＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡを示す。
【図１１】４週間にわたって腹筋袋に移植されたＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクのマイクロ−ＣＴ及び組織像を示す図である。パネルＡ〜Ｃは、それぞれＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡの３Ｄマイクロ−ＣＴ再構成を表す。パネルＤ〜Ｆは、それぞれｉｎ  ｖｉｖｏ移植の４週間後のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡの組織像（Ｈ＆Ｅ）を表す。
【図１２】それぞれｉｎ  ｖｉｖｏ移植の４週間後のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡにおける石灰化組織量を示す図である。
【図１３】４週間にわたって腹筋袋に移植されたＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクのマイクロ−ＣＴ及び組織像を示す図である。Ａ〜Ｃのパネル（１列目）は、それぞれＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡの３Ｄマイクロ−ＣＴ再構成を表す。組織像及びＥＭについて撮影された領域を示す。２列目は、骨細胞を含まないＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ（Ｄ）、周辺部にのみ骨を含むＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２（Ｅ）、及び中心部にまたがる骨梁を有するＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡ（Ｆ）のＥＭを示す。３列目（Ｇ〜Ｉ）は、より低倍率で上記２列目と同じものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、移植片が必要とされる骨欠損、特に重症の骨欠損の再生等の支持組織の障害の治療に使用される新たな二相性セラミック骨代用材に関する。セラミック骨代用材の２つの相は、比較的急速に吸収可能な硫酸カルシウム相と非常にゆっくりと吸収可能なリン酸カルシウム相とからなる。二相性セラミック骨代用材は、新たな骨の再生のための骨誘導因子として働く少なくとも１つの骨活性タンパク質と、骨吸収を阻害する少なくとも１つの抗異化剤とを更に含む。骨活性タンパク質、特定の骨吸収の阻害剤、及びミクロ細孔性の比較的急速に吸収可能な相と非常にゆっくりと吸収可能な相とを含む二相性セラミック骨代用材担体の組合せは、驚くほど有益であることが証明されている。
【００４５】
二相性セラミック骨代用材の硫酸カルシウム相は、硫酸カルシウム１／２水和物を水と反応させることで、硫酸カルシウム二水和物結晶が時間をかけて形成され、互いに噛み合い、ミクロ細孔性マトリックスとなる凝結プロセス中に形成される硫酸カルシウム二水和物から本質的になる。凝結反応は０．１重量％〜１０重量％、例えば０．２重量％〜５重量％の硫酸カルシウム二水和物又は好適な塩を、例えば溶液、例えば生理食塩水（ＮａＣｌ溶液）の形態で添加することによって加速することができる。凝結プロセスにおいて、リン酸カルシウム相中のリン酸カルシウム粒子（例えばヒドロキシアパタイト粒子）が、ミクロ細孔性硫酸カルシウム二水和物マトリックス（硫酸カルシウム相）の空隙中に組み込まれる。硫酸カルシウム相は、機械的に堅固な初期特性を骨代用材に与える。硫酸カルシウム相のミクロ細孔性及び体内での比較的急速な吸収により、硫酸カルシウム相中に存在する添加剤が高い初期速度で遊離し、人工材料が硫酸カルシウムの吸収とともに非常に多孔性の骨格へと変換され、リン酸カルシウム相中のリン酸カルシウム粒子への体液及び細胞の接近の増大がもたらされる。このことは（急速な）骨細胞内部成長において極めて有益であると示されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、ＢＭＰ−２が固体Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）骨支持体から７日間にわたって一定速度で放出され、７日後にＢＭＰ−２の９０％近くが放出されることが示されている。
【００４６】
二相性セラミック骨代用材のリン酸カルシウム相はα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムからなる群から選択されるリン酸カルシウム粒子から本質的になる。リン酸カルシウム構成成分は予め凝結した粒子として添加しても、又は水の添加時に二相性材料における凝結プロセスの硬化性前駆体（粉末）として添加してもよい。かかる凝結プロセスの促進剤、例えば粒状リン酸カルシウム粒子及びリン酸塩は当該技術分野で既知であり、プロセス中に添加することができる。リン酸カルシウム粒子は非晶質又は結晶性の構造であり得る。所望の構造は、例えば当該技術分野で既知の熱処理、再結晶化及び／又は溶解プロセスによって得ることができる。特許文献３、特許文献４及び特許文献５はリン酸カルシウム、それらの調製及びセラミック骨代用材におけるそれらの使用を開示している。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、リン酸カルシウム相はヒドロキシアパタイト、特に結晶性ヒドロキシアパタイト粒子から本質的に構成される。ビスホスホネート等の抗異化剤は、市販のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品中でリン酸カルシウム相を構成するヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウムに対して強い親和性を有する。
【００４８】
特許文献８は、不動態化結晶性ヒドロキシアパタイト粒子及びセラミック骨代用材におけるそれらの使用を開示している。結晶性ヒドロキシアパタイト粉末は焼結し、粉砕又は摩砕した後に加熱されるが、これは驚くべきことに、そうでなければ特に骨代用材粉末が抗生剤等の添加剤を含む場合に、硫酸カルシウム相の凝結プロセスを妨げる可能性がある、結晶性ヒドロキシアパタイト粒子の不動態化（不活性化）をもたらす。不動態化結晶性ヒドロキシアパタイト粒子は、本発明において有利に使用することができる。
【００４９】
骨活性タンパク質
二相性セラミック骨代用材中に添加剤として含まれる骨活性タンパク質は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、スクレロスチン等を含む群のような骨成長タンパク質から選択されるのが好ましい。代替的には、１つ以上の骨活性タンパク質を、細胞工場由来の骨活性タンパク質及び／又は細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）の組成物として提供することができる。より代替的には、ストロンチウムを骨活性タンパク質に加えて使用するか、又は骨活性タンパク質に代用することができる。一実施形態では、骨活性タンパク質を硫酸カルシウム１／２水和物粉末と混合した後、硫酸カルシウム１／２水和物及びリン酸カルシウム粉末を混合する。代替的には、骨活性タンパク質を混合した硫酸カルシウム１／２水和物及びリン酸カルシウム粉末若しくは水性液体と混合するか、又はペーストに添加する。骨活性タンパク質は、水溶性及び／又は生分解性ポリマー（複数の場合もある）に封入して提供することができる。
【００５０】
一実施形態では、骨活性タンパク質は骨成長タンパク質、好ましくは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である。ＢＭＰはＢＭＰ−２又はＢＭＰ−７であるのが好ましい。特定の実施形態では、ＢＭＰは組み換えＢＭＰ、好ましくは組み換えヒトＢＭＰ、例えばｒｈＢＭＰ−２又はｒｈＢＭＰ−７である。ＢＭＰは乾燥粉末１ｇ当たり０．２μｇ〜５００μｇ、より好ましくは乾燥粉末１ｇ当たり１．０μｇ〜２５０μｇ、又は２μｇ〜２００μｇ、又は５μｇ〜１５００μｇ、又は１０μｇ〜１２０μｇのＢＭＰの濃度で使用される。他の骨活性タンパク質は同様の若しくは対応する濃度、又は所望の効果を得るために必要とされる濃度で使用することができる。
【００５１】
骨活性タンパク質は、骨代用材粉末又は水性液体のいずれかに添加し、混合することによって骨代用材に組み込まれる。代替的には、骨活性タンパク質を注型の前にペーストに添加することができる。好ましい実施形態では、骨活性タンパク質をリン酸カルシウム粉末と混合する前に硫酸カルシウム粉末と予め混合する。
【００５２】
骨活性タンパク質はそのまま提供し、粉末、水性液体又はペーストのいずれかに添加することができる。代替的には、骨活性タンパク質を使用前に水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。
【００５３】
抗異化剤
本発明の二相性セラミック骨代用材に含まれる１つ以上の抗異化剤は、ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）（例えばラロキシフェン、タモキシフェン、ラソフォキシフェン又はバゼドキシフェン）、デノスマブ（Amgenによって開発されたＲＡＮＫＬに対するモノクローナル抗体）、若しくはスタチン、又はこれらの抗異化剤の２つ以上の任意の組合せのいずれかから選択されるのが好ましい。抗異化剤は１つ以上のビスホスホネートであるのが好ましい。
【００５４】
ビスホスホネートは、無窒素（又は単純）ビスホスホネートとＮ含有ビスホスホネートとに分けられる。Ｎ含有ビスホスホネートは、単純ビスホスホネートよりも強力である。
【００５５】
単純ビスホスホネートは、細胞内でＡＴＰの末端ピロリン酸部分と置き換わり、細胞エネルギー代謝においてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と競合する非機能性分子を形成する化合物へと代謝される。破骨細胞がアポトーシスを開始し、死ぬことで、骨の破壊の全体的な減少がもたらされる。単純ビスホスホネートの例はエチドロネート、クロドロネート及びチルドロネートである。クロドロネート及びチルドロネートは、エチドロネートよりも１０倍強力である。
【００５６】
窒素性ビスホスホネートは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路（メバロン酸経路としても知られる）における酵素ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）と結合し、阻害することによって骨代謝に作用する。Ｎ含有ビスホスホネートの例（エチドロネートと比べた効力を括弧内に与える）は、パミドロネート（１００）、ネリドロネート（１００）、オルパドロネート（５００）、アレンドロネート（５００）、イバンドロネート（１０００）、リセドロネート（２０００）及びゾレドロネート（１００００）である。
【００５７】
ビスホスホネートは、硫酸カルシウム粉末と混合する前に溶液中でリン酸カルシウム粒子／粉末（例えばヒドロキシアパタイト）に添加することができ、そこでリン酸カルシウムに強く結合する。所望の効果を得るために必要とされるビスホスホネートの量／濃度は、特に選択されるビスホスホネートの効力によって異なる。「ドープされた」リン酸カルシウム粒子中のビスホスホネートの濃度は、溶液中のビスホスホネート濃度及び／又は粒子がビスホスホネート溶液中に入れられる時間を選択することによって制御することができる。代替的には、粉末及びペースト中のビスホスホネートの量／濃度は、所望の比率での既知の（高い）量／濃度のビスホスホネートがドープされたリン酸カルシウム粒子（例えばヒドロキシアパタイト）と、ドープされていないリン酸カルシウム粒子との混合物を用いて制御することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、選択されるビスホスホネートはゾレドロネート／ゾレドロン酸（ＺＡ）である。
【００５９】
ＺＡは、０．２μｇ／ｇ〜５００μｇ／ｇ（乾燥粉末）、より好ましくは１μｇ／ｇ〜３００μｇ／ｇ、又は１０μｇ／ｇ〜２００μｇ／ｇ、又は１０μｇ／ｇ〜１２０μｇ／ｇの濃度で使用される。他のビスホスホネートは同様の若しくは対応する濃度、又は所望の効果を得るために必要とされる濃度で使用することができる。本発明に従う局所適用に使用されるＢＭＰの投与量は、全身注入に必要とされる投与量の２０％と低くするか、又は更に低くすることができる。過度に高いビスホスホネート（例えばＺＡ）の投与量は毒性であり、単独で炎症反応を引き起こし、破骨細胞を殺すだけでなく、骨芽細胞を損傷する。加えて、ＢＭＰ単独の高い投与量は強い反応及び過度に広範な骨形成を引き起こす可能性がある。
【００６０】
骨活性タンパク質は粉末又は溶液として提供し、粉末、水性液体又はペーストのいずれかに添加することができる。代替的には、骨活性タンパク質を使用前に水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＺＡ放出アッセイに使用されるディスクは、ＺＡをセラミック粉末（Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ）、液体と混合し、鋳型に流し込むことによって作製した。生理食塩水をディスクに添加し、種々の時点で培地のサンプルを採取し、分析した。各々のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクからのＺＡの放出は、採取した上清中で、ＺＡがアポトーシスを誘導することが知られる肺癌細胞（細胞株Ａ５４９）を添加することによって算出することができる。７日後に、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦから放出されるＺＡの量は、装填した全ＺＡの約１０％であった。
【００６２】
選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばラロキシフェン、タモキシフェン、ラソフォキシフェン及びバゼドキシフェンは、閉経後骨粗鬆症に対して効果を有することが証明されており、したがって本発明に使用される抗異化剤として選択することができる。
【００６３】
デノスマブは、骨除去の一次シグナルとして作用するタンパク質であるＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫリガンド）を阻害するように設計された完全ヒトモノクローナル抗体である。多くの骨量減少病態では、ＲＡＮＫＬは骨破壊に対する身体の自然防御を圧倒する。デノスマブはバイオテクノロジー企業Amgenによって開発され、骨粗鬆症、治療誘導性の骨量減少、骨転移、多発性骨髄腫及び骨巨細胞腫の治療に使用されている。
【００６４】
スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路を阻害する別の薬物群である。ビスホスホネートとは異なり、スタチンは高親和性によって骨表面と結合せず、ひいては骨に特異的でない。それにもかかわらず、幾つかの研究から、スタチン使用者における骨折率（骨粗鬆症の指標）の減少及び／又は骨塩密度の増大が報告されている。
【００６５】
付加的な生物活性剤
本発明による二相性セラミック骨代用材は、少なくとも１つの更なる生物活性剤を含んでいてもよい。このような生物活性剤は、抗生物質（抗真菌薬を含む）、骨治癒促進剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される。
【００６６】
抗生剤はゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、リファンピシン、クリンダマイシンから選択されるのが好ましく、抗真菌薬はナイスタチン、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール及びミコナゾールを含む群から選択されるのが好ましい。骨置換への使用のために販売されているセラミック粉末製品ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＧは、ゲンタマイシンを含む。骨置換に使用される新たなセラミック粉末製品であるＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＶは、バンコマイシンを含む。
【００６７】
付加的な生物活性剤の濃度は、作用物質及び所望の効果によって異なる。抗生物質ゲンタマイシン及びバンコマイシンについては、セラミック粉末の０．５重量％〜１０重量％、好ましくは１重量％〜６重量％の量で使用される。
【００６８】
更なる生物活性剤を骨代用材に（骨活性タンパク質及び抗異化剤に加えて）含めることが所望される場合、これらは粉末又は水性液体中に添加し、含めることができる。代替的には、付加的な生物活性剤の１つ以上を凝結前にペーストに添加することができる。
【００６９】
付加的な生物活性剤はそのまま提供し、粉末、水性液体又はペーストのいずれかに添加することができる。代替的には、生物活性剤を使用前に水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。
【００７０】
Ｘ線造影剤
移植状況では、多くの場合、外科医が外科手術中及び外科手術後に患者における二相性セラミック骨代用材の配置を追跡可能であることが重要である。新たな骨又は補修する必要がある破損部の内部成長を追跡可能であることも有用であり得る。本発明の一実施形態では、水溶性非イオン性Ｘ線造影剤及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤を、骨代用材に組み込むことができる。特許文献４及び特許文献８は、セラミック骨支持体へのＸ線造影剤の組込みを開示している。Ｘ線造影剤は、全粉末成分の１重量％〜２５重量％、好ましくは１０重量％〜２５重量％を占めるように添加することができる。
【００７１】
好ましい実施形態では、水溶性非イオン性Ｘ線造影剤がイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド（metrizamid）、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド（ioglucamide）、イオグルニド、イオグラミド（iogulamide）、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオサルコール、イオシミド、イオツサール（iotusal）、イオキシラン（ioxilane）、イオフロタール（iofrotal）及びイオデコール（iodecol）から選択される。別の実施形態では、付加的な細孔をもたらし得る生分解性Ｘ線造影剤を使用することができる。
【００７２】
Ｘ線造影剤はそのまま提供し、粉末、水性液体又はペーストのいずれかに添加することができる。代替的には、Ｘ線造影剤は使用前に水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。
【００７３】
セラミック骨代用材粉末
更なる実施形態では、本発明は、硬化性セラミック骨代用材粉末であって、
ａ．硫酸カルシウム１／２水和物粉末と、
ｂ．リン酸カルシウムがα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムからなる群の１つ以上から選択される、リン酸カルシウム粉末と、
ｃ．骨活性タンパク質と、
ｄ．抗異化剤と、
ｅ．任意に、好ましくは硫酸カルシウム二水和物及び塩（例えばＮａＣｌ）から選択される硫酸カルシウムの凝結促進剤と、
ｆ．任意にリン酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは粒状リン酸カルシウム及び／又はリン酸塩（例えばＮａ２ＨＰＯ４）と、
を含む、硬化性セラミック骨代用材粉末に関する。
【００７４】
「硬化性セラミック骨代用材粉末」は、硫酸カルシウム１／２水和物粉末及び任意にリン酸カルシウム粉末が、液体との接触後に固体材料として凝結するものを意味する。
【００７５】
本発明による二相性セラミック骨代用材粉末（添加剤を含む又は含まない基礎粉末）は、５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０の硫酸カルシウム１／２水和物とリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）を有する。市場に出ているＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）は、５９．６重量％の硫酸カルシウム１／２水和物と４０重量％のヒドロキシアパタイトとを含む。
【００７６】
好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粉末は、好ましくは非晶質及び／又は結晶性ヒドロキシアパタイト粒子で構成される予め凝結したヒドロキシアパタイト粉末である。
【００７７】
予め凝結したリン酸カルシウム粉末として使用されるリン酸カルシウム粒子（例えば結晶性ヒドロキシアパタイト）は、２００μｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、より好ましくは５０μｍ未満、例えば３５μｍ未満の粒子サイズＤ（ｖ，０．９９）を有する。粉末の比表面積は、既知の重量の粉末サンプルの表面上に吸着する気体（通常はＮ２）の体積の測定によってサンプルの質量当たりの面積（ｍ２／ｇ）単位で表される粉末の全表面積を決定する方法であるＢＥＴ（ブルナウアー、エメット及びテラー）法に従って測定した場合に、好ましくは２０ｍ２／ｇ未満、より好ましくは１０ｍ２／ｇ未満とする。表面積を決定する他の方法を代替的に適用してもよい。
【００７８】
一実施形態では、抗異化剤は、硫酸カルシウム粉末との混合前にリン酸カルシウム粒子と予め混合された（それに結合した）ビスホスホネートである。更なる実施形態では、リン酸カルシウム粒子は結晶性ヒドロキシアパタイト粒子である。代替的には、抗異化剤を、予め混合された硫酸カルシウム／リン酸カルシウム粉末（基礎粉末、例えばＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品）に添加し、混合する。
【００７９】
他の一実施形態では、粉末中に存在する骨活性タンパク質は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ストロンチウム、スクレロスチン、細胞工場由来のタンパク質及びＥＣＭタンパク質を含む群から選択される。骨活性タンパク質は硫酸カルシウム１／２水和物粉末、リン酸カルシウム粉末又は基礎粉末と予め混合することができる。
【００８０】
硫酸カルシウム粉末、リン酸カルシウム粉末又は基礎粉末は、抗生物質（抗真菌薬を含む）、骨治癒促進剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される１つ以上の生物活性剤を含んでいてもよい。少なくとも１つの抗生剤はゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、リファンピシン、クリンダマイシンから選択することができ、抗真菌薬がナイスタチン、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール及びミコナゾールを含む群から選択される。
【００８１】
硫酸カルシウム粉末、リン酸カルシウム粉末又は基礎粉末は、水溶性非イオン性Ｘ線造影剤及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤を更に含んでいてもよい。水溶性非イオン性Ｘ線造影剤はイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオサルコール、イオシミド、イオツサール、イオキシラン、イオフロタール及びイオデコールから選択することができる。
【００８２】
付加的な生物活性剤／Ｘ線造影剤のいずれかは、粉末又は溶液として提供し、粉末のいずれかに任意に添加することができる。代替的には、付加的な生物活性剤／Ｘ線造影剤を、粉末のいずれかと混合する前に合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入することができる。
【００８３】
硬化性セラミック骨代用材ペースト
本発明は、上記に規定される硬化性セラミック骨代用材粉末と水性液体とを含む硬化性セラミック骨代用材ペーストに更に関する。水性液体は、上記で論考される骨活性タンパク質及び／又は抗異化剤（例えばビスホスホネート）を含む添加剤のいずれかを含んでいてもよい。Ｘ線造影剤及び抗生物質等の生物活性剤は、セラミック骨代用材粉末と混合する前に水性液体に溶解するのが好ましい。代替的には、骨活性タンパク質及び／又は抗異化剤（例えばビスホスホネート）を含む添加剤を、上記で開示される遅延混合によってペーストに添加し、混合することができる。添加剤の１つ以上が硬化性ペーストの凝結を妨げる場合、かかる添加剤を遅延混合によってペーストに有利に添加することができる。
【００８４】
ペーストの調製における液体と乾燥粉末との比率（Ｌ／Ｐ）は、０．２ｍｌ／ｇ〜０．８ｍｌ／ｇ、例えば０．３ｍｌ／ｇ〜０．６ｍｌ／ｇ、好ましくは０．４ｍｌ／ｇ〜０．５ｍｌ／ｇの範囲である。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態では、硬化性セラミック骨代用材ペーストは、粉末（複数の場合もある）、添加剤及び液体を好適なボウル又は特別に設計された混合デバイス（例えば、BONESUPPORT AB（Sweden）から入手可能な混合及び注射デバイス（ＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣＭＩ）、又は真空を用いて若しくは用いずに使用されるBiomet（US）によるＯｐｔｉｐａｃ（商標）等の他の混合デバイス）内で混合することによって調製され、注射器（例えば、BONESUPPORT AB（Sweden）から入手可能な特定の注射デバイス）による注射が可能な状態とされる。添加剤は粉末（複数の場合もある）若しくは液体の一部であっても、又は自蔵であっても、粉末（複数の場合もある）及び液体とともに添加してもよい。特定の実施形態では、１つ以上の添加剤を、「遅延混合」プロセスにおける粉末（複数の場合もある）及び液体の初期混合の後にペーストに添加する。添加剤（複数の場合もある）の添加及び混合を、任意の凝結反応が開始する前に行うのが重要である。ペーストへの添加剤（複数の場合もある）の添加は、初期混合後２分〜４分以内に行うのが好ましい。
【００８６】
キット
本発明は、本発明による二相性セラミック骨代用材に使用される成分の全て又は一部を送達するキットにも関する。かかるキットは、
ｉ）硫酸カルシウム１／２水和物粉末と、
ｉｉ）請求項３又は４に規定されるリン酸カルシウム粉末と、
ｉｉｉ）請求項５〜７のいずれか一項に規定される骨活性タンパク質と、
ｉｖ）請求項９〜１１のいずれか一項に規定される骨吸収を阻害する抗異化剤と、
任意に以下の１つ以上：
ｖ）上記に規定される少なくとも１つの更なる生物活性剤、
ｖｉ）上記に規定されるＸ線造影剤、
ｖｉｉ）硫酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは硫酸カルシウム二水和物又はＮａＣｌ等の塩、
ｖｉｉｉ）リン酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは粒状リン酸カルシウム粒子及び／又はリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）等のリン酸塩、
ｉｘ）任意に水性液体、
とを含む。
【００８７】
水性液体は、任意に塩及び／又は緩衝液を含む蒸留水であり得る。
【００８８】
一実施形態では、キットは、リン酸カルシウム粉末（ｉｉ）と予め混合された硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）を含む基礎粉末（ｘ）を含む。
【００８９】
キットの別の実施形態では、抗異化剤（ｉｖ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）の少なくとも一部、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）の少なくとも一部、基礎粉末（ｘ）又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する。
【００９０】
キットのまた別の実施形態では、骨活性タンパク質（ｉｉｉ）を硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）の少なくとも一部、リン酸カルシウム粉末（ｉｉ）の少なくとも一部、基礎粉末（ｘ）又は水性液体ｉｉ）と予め混合する。
【００９１】
キットの更なる実施形態では、上記に規定される少なくとも１つの更なる生物活性剤（ｖ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する。
【００９２】
キットのまた更なる実施形態では、上記に規定されるＸ線造影剤（ｖｉ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する。
【００９３】
キットの別の実施形態では、上記に規定される硫酸カルシウムの凝結促進剤（ｖｉｉ）を硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する。
【００９４】
キットのまた別の実施形態では、上記に規定されるリン酸カルシウムの凝結促進剤（ｖｉｉｉ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する。
【００９５】
付加的な生物活性剤／Ｘ線造影剤はいずれも、そのまま又は粉末若しくは液体中のいずれかで提供することができる。代替的には、付加的な生物活性剤／Ｘ線造影剤を、個別に又は任意の好適な組合せで水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子及び／又は二水和物着床粒子等に封入し、粉末又は液体のいずれかと任意に混合することができる。
【００９６】
本発明によると、キットは混合デバイス、及び任意に注射用の注射器を含む注射デバイスを更に含んでいてもよい。キットは使用説明書を含んでいてもよい。
【００９７】
本発明の更なる実施形態では、キットは、合成移植片を取り囲む又は移植片を外部に対して閉じるライニング膜、例えば生分解性合成膜又はコラーゲン膜、例えば国際公開第２０１３１８５１７３号に開示されるものを更に含む。合成移植片を特にスプレーとして適用され得る溶液中のタンパク質で密閉し、それにより表面治癒を支持することもできる。被覆タンパク質は、表面の細菌付着及びバイオフィルム生成の防止において付加的な利益をもたらし得る。
【００９８】
別の態様では、本発明は、特に外傷、感染の根絶、腫瘍病巣の切除、遷延治癒又は偽関節に起因する、また初回人工関節置換術又は人工関節再置換術における骨損失等の骨欠損を有する患者を治療する方法にも関する。一実施形態では、該方法は、本発明による１つ以上の二相性セラミック骨代用材（移植片）を治療すべき骨病変に挿入することを含む。別の実施形態では、該方法は、本発明による硬化性二相性セラミック骨代用材のペーストを治療すべき骨病変である脊髄、手、指、腕、足、足指、下腿又は上腿、膝、臀部、足首、肘、手首、肩、頭蓋、顎及び歯の骨を含む動物又はヒト身体内の全ての骨に適用することを含む。例えば硬化性ペーストの形態での二相性セラミック骨代用材の挿入を、骨の除去、例えば折れた骨、骨腫瘍又は感染骨組織の除去に続いて行うことができる。代用材が移植片の周辺の組織に含まれる、又は周辺への漏れを防止する、又は開放創を被覆する必要がある場合、人工の、例えばポリマー膜を適用することが有益であるか、又は必要であり得る。かかる膜は、体液及び細胞を多孔性移植片から流入及び流出させ、及び／又は外部に対して部分的若しくは完全に密閉することを可能にする多孔性とすることができる。挿入後に、二相性セラミック骨代用材又はペーストを硬化させ、筋組織及び皮膚を整復するか、又は人工骨代用材の上に移植することができる。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品自体が免疫原性であるか否かを確認するために、免疫原性物質と接触した場合に多量のサイトカインを活性化し、分泌することが知られるＲＡＷ２６４．７マクロファージを用いる試験を選択した。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品から作製したセラミックディスクに、ネズミマクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を播種し、インターロイキン（ΙＬ）−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αのような炎症性サイトカインの分泌を７日間にわたってＥＬＩＳＡを用いて評定した。全てのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）の分泌は陰性対照と同程度（comparative）であり、ＬＰＳ（リポ多糖）治療陽性対照よりも顕著に低い。このため、患者におけるＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）の適用は、たとえあったとしても非常に低い免疫学的活性をもたらすようである。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨誘導効果
幾つかの臨床例では、ヒドロキシアパタイト／スルフェート注射用混合物であるＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＢＶＦで処理した、外科的に作り出した骨欠損を被覆する、表面を覆う（overlaying）筋肉において広範な骨形成が観察された。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを、筋肉と骨代用材との間の界面での骨誘導能を調査するために設計した。骨格筋細胞を、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇから作製したディスク上に播種した。ＳＥＭを用いたＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）の生理化学的特性化の際に、多孔性構造を検証した（図２Ａ及び図２Ｂ）。多孔性Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）足場は細胞接着に十分な表面積、更には栄養素、気体及び他のシグナル伝達分子の交換に効率的な環境をもたらす。ＳＥＭ及びＤＡＰＩ分析により観察されるように、細胞は足場の表面全体にわたって均等に分布した（図２Ｃ〜図２Ｆ）。どちらの材料上でも、骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２は骨芽細胞様細胞へと分化し、ｒｕｎｔ関連転写因子−２（ＲＵＮＸ−２）、１型コラーゲン（ＣＯＬＩ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）及び骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のような骨マーカーを発現した。細胞増殖はゲンタマイシンを含む及び含まない両方の足場で同様であり、本モデルにおいて足場へのゲンタマイシンの添加が細胞に対していかなる悪影響も生じないことが示された（図３Ａ）。足場は組織培養プレートと比較して漸進的であるが、抑制されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖を示した。しかしながら、このＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）及び２Ｄ組織培養プレート上での細胞の増殖挙動における差異は、筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞系列への分化によるものであり得る。ＡＬＰは重要な骨形成マーカーであり、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）上に播種した細胞におけるＡＬＰ活性の８倍の増大（図３Ｂ）から、ゲンタマイシンを添加するか否かにかかわらず材料の骨誘導挙動が明らかに実証された。これは骨芽細胞へと分化し、成熟相に入り始めるＣ２Ｃ１２細胞に起因するものであった。ＡＬＰが骨形成原細胞形成の予測因子として作用し得ることが知られている。ＲＵＮＸ２が骨芽細胞に特異的な転写因子及び骨芽細胞の分化の調節因子であることが知られている。ＣＯＬＩ、ＯＰＮ及びＯＣＮのような成熟骨芽細胞の他のマーカーの存在が、細胞播種の２１日目までに検出された。
【０１０２】
人工移植片からの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質及び成長因子の漏れを有する手術条件を模倣するために、骨細胞ＲＯＳ１７／２．８をバイオリアクター内で培養し、分泌された成長因子及びＥＣＭタンパク質を採取した。採取した細胞培養物により産生される骨活性タンパク質を、ＥＬＩＳＡを用いて測定し、骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２、８．４±０．８ｎｇ／ｍｇ）及びＢＭＰ−７（５０．６±２．２ｎｇ／ｍｇ）が見出された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで採取した骨活性タンパク質により、骨格筋細胞Ｌ６の骨形成原系列への分化が誘導され、これは骨マーカーに対して陽性に染色された。
【０１０３】
上記の結果に基づいて、二相性セラミック骨代用材からのまたその内部に存在する、骨芽細胞の分化を誘導することができる成長因子及び／又はＥＣＭタンパク質の放出により、骨形成が相乗的に増強し得ることが見出された。
【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＰ−２放出
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ−ｒｈＢＭＰ−２ペーストを混合によって調製し、注射器に移し、固体ディスクを鋳型内で作製した。２μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有する各ディスクを１ｍＬの生理食塩水に浸漬し、３７℃のインキュベーター内に設置した。７日間にわたる種々の時点で、上清から５０μｌの生理食塩水を回収して分析し、タンパク質濃度を算出した。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦからのＢＭＰ−２の一定放出が７日間にわたって観察され、ｒｈＢＭＰ−２の９０％近くが７日後に放出された。
【０１０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＺＡ放出
二相性セラミック骨代用材からのビスホスホネート（ゾレドロン酸（ＺＡ）を一例として使用した）の放出を、ゲンタマイシンを含む及び含まないＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）において調査した。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ−ＺＡペースト及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ−ＺＡペーストを、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）粉末の各々をＺＡ及び液体と混合することによって調製した。注射器を用いてペーストを鋳型に移すことによってディスクを作製し、固体ディスクを凝結させた。生理食塩水をディスクに添加し、生理的条件でインキュベートした。７日間にわたる種々の時点で、培地のサンプルを回収し、分析した。種々の時点で各Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）＋ＺＡディスクからのＺＡの放出を評定するために、回収した上清をＡ５４９細胞に添加し、４８時間のインキュベーション後にＭＴＴアッセイを用いて細胞生存性を算出した。ＺＡの濃度を標準曲線から算出した。
【０１０６】
７日後に固体Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクから放出されるＺＡの量は、装填した全ＺＡの１０％近くであった。ゲンタマイシンを含むＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）と含まないＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）とでＺＡ放出の差異は見られなかった。Ａ５４９細胞に対するＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇディスクから放出されるＺＡの細胞障害効果は、より多くの時点で細胞生存性の減少を示した。
【０１０７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験（異所性（筋肉）骨モデル）
ディスクを、組み換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰ−２単独又はＺＡと合わせたｒｈＢＭＰ−２と混合したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）製品から作製し、７週齢ラットに移植した。修正異所性骨モデルにおいて、腹筋の単回鈍的切開を行うことによって移植片を腹筋に挿入した。修正異所性骨モデルは無負荷腹筋を使用する点で独特であり、これにより以前の研究と比較して破骨細胞による骨細胞の吸収の増大がもたらされる。ここで、移植片は背側の股関節内の既存の骨の隣に設置されるため、下層の骨からの局所放出及び刺激による影響を受ける可能性が高く、骨が構築されるレベル並びに試験するビスホスホネート等の抗異化剤及び成長ホルモンに影響を及ぼす（特許文献１）。或る群では、試験動物に１動物当たりＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦのみの２つのディスクを腹部正中線の左側に施し、正中線の右側は１動物当たりＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２の２つのディスクの移植に用いた。別の群では、動物にＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦのみの２つのディスク及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡの２つのディスクを同様に施した。ディスクから時間をかけて現れる足場を動物内に４週間残した。骨形成の分析をＸ線、続いてマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロ−ＣＴ）及び電子顕微鏡検査を用いる石灰化組織量の三次元分析を用いて行った。足場内の細胞の種類を、組織像（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ））を用いて分析した。
【０１０８】
４週間後に屠殺した動物の検査から、ｒｈＢＭＰ−２及びＺＡを装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場が、ｒｈＢＭＰ−２のみを装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場よりも密であることが示された。マイクロ−ＣＴ結果から、石灰化組織量がｒｈＢＭＰ−２とＺＡとの組合せを装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスク群において、ｒｈＢＭＰ−２を装填した群及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスク群よりも顕著に高かったことが示される。ｒｈＢＭＰ−２とＺＡとの組合せを装填した群は、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２群よりも顕著に高い骨塩量を有していた。組織学的には、ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡを装填したサンプルは、足場周辺に足場内で既に目に見える骨梁島を有する皮質殻を生じ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２群は目に見える脂肪髄を有する破骨細胞性吸収の兆候を示した。これは電子顕微鏡検査によって明らかに可視化される。
【実施例】
【０１０９】
実施例に使用するＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）組成物の内容物を表１に示す。
【０１１０】
全ての実施例で、「生理食塩水」は特に明記しない限り、水１ｍＬ当たり９ｍｇのＮａＣｌを含有するＮａＣｌ溶液を意味する。
【０１１１】
実施例１
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストを製造業者の取扱説明書に従って調製し、ディスク（直径：８ｍｍ；高さ：２ｍｍ）の作製に使用し、これは２０分より前に凝結した（sat）。ディスクに合計１×１０５のネズミマクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を播種し、インターロイキン（ΙＬ）−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αのような炎症性サイトカインの分泌を７日間にわたってＥＬＩＳＡを用いて評定した。陽性対照として、ＲＡＷ２６４．７細胞を免疫原性リポ多糖（ＬＰＳ）で処理した。
【０１１２】
全てのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）の分泌は陰性対照（２Ｄ−ＴＣＰ）と同程度であり、ＬＰＳで処理した陽性対照（２Ｄ−ＴＣＰ＋ＬＰＳ）よりも有意に低く、全ての場合でｐ値＜０．０００１であった（図１Ａ〜図１Ｄ）。
【０１１３】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨誘導
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の材料調製
２種類の骨代用材製品であるＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＢＶＦ及びＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＧを、供給業者のガイドライン（Bone Support AB（Lund，Sweden））に従って混合し、均一なペーストを形成した。ペーストを直径８ｍｍ、高さ２ｍｍのディスク形の鋳型に流し込み、３０分間凝結させた。
【０１１４】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、Ｓｉｇｍａｆａｓｔ  ｐＮＰＰ、ダルベッコ変法イーグル培地−高グルコース（ＤＭＥＭ−ＨＧ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、抗生物質カクテル、Ｔｒｉｚｏｌ試薬、及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用のプライマーは、Sigma Aldrich（MA，USA）から購入した。マウスＣＯＬＩ、ＯＣＮ、ＲＵＮＸ−２、ＯＰＮは、Santa Cruz Biotechnology, Inc.（CA，USA）及びSigma Chemical company（MA，USA）から購入した。ラットＣＯＬＩ、ＯＣＮ、ＯＰＮ及び骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）抗体、ＤＲＡＱ５、ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ４８８（ＡＦ−４８８）はAbcam（Cambridge，U.K）から入手した。ＲＴ−ＰＣＲ試薬はThermo scientific（USA）から購入した。ラットＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７  ＥＬＩＳＡキットは、Abnova Inc.（Taiwan）及びQayee Bio（中国）からそれぞれ購入した。他の高純度の全ての試薬は公認供給業者から購入した。
【０１１５】
細胞培養
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を、９５％空気及び５％ＣＯ２を有するインキュベーター内で維持した。増殖及び機能性実験については、１×１０５細胞をＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスク上に播種し、免疫蛍光染色及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）については、１×１０６細胞をＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスク上に播種した。ラット骨格筋の筋芽細胞株Ｌ６を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、及びペニシリン−ストレプトマイシンからなる１％（ｖ／ｖ）抗生物質カクテルを含む高グルコースのＤＭＥＭ中で培養した。細胞を８０％コンフルエンスで継代し、２継代で回復後に使用した。実験前の細胞生存性を、トリパンブルー排除法を用いて評価した。
【０１１６】
筋組織において骨形成をもたらすｉｎ  ｖｉｖｏ条件を模倣するために、骨芽細胞の細胞工場由来のタンパク質をＲＯＳ  １７／２．８骨芽細胞の増加細胞培養物から採取した。細胞を完全培地及び５％（ｖ／ｖ）血清を添加した培養フラスコ内で３日間にわたって増殖させた。培地中の分泌された骨活性タンパク質を回収する一方で細胞を再度継代して、手順を繰り返した。
【０１１７】
筋細胞の骨芽細胞様細胞への分化転換を確実にするために、ラット筋細胞株Ｌ６を使用した。細胞を８０％コンフルエンスまで成長させた後、低血清（５％（ｖ／ｖ））完全培地、又は等しい容量比での完全培地（低血清）と採取した骨芽細胞の細胞工場の培地との混合物のいずれかを供給した。細胞を１０日間又は１２日間にわたって成長させ、種々の技法を用いて分析し、それらの表現型のシフトを確認した。
【０１１８】
統計分析
ＭＴＴ及びＡＬＰアッセイによるデータを、対応のないｔ検定を用いて分析した。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。ＭＴＴアッセイのデータ及び細胞工場実験の筋管数を、ノンパラメトリック多重ｔ検定を用いて分析し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。データは平均及び標準偏差により三連で表す。
【０１１９】
顕微分析
材料の表面形態及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクの表面へのＣ２Ｃ１２細胞の接着を、走査電子顕微鏡法を用いて分析した。材料を勾配エタノール処理によって脱水した。さらに、サンプルを一晩真空乾燥させた。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）表面への細胞接着の分析のために、細胞を両方の材料、すなわちゲンタマイシンを含む材料及びゲンタマイシンを含まない材料に播種した。細胞を３日間成長させた。その後、グルタルアルデヒド（２．５％）を使用して表面上の全細胞を固定した。固定後の工程は、表面形態分析のサンプル調製に用いたものと同じにした。さらに、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクへの細胞の接着を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を用いて分析した。
【０１２０】
ゲンタマイシンを含む及び含まない両方のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクの表面形態は、材料表面の細孔のサイズが１μｍ〜１０μｍの範囲の多孔性構造を示した（図２Ａ及び図２Ｂ）。細胞は、播種の３日後にＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクの表面上に存在していた（図２Ｃ及び図２Ｄ）。細胞はゲンタマイシンを含む及び含まない両方のディスクに付着し、均一に分布していた（図２Ｅ及び図２Ｆ）。これをＤＡＰＩによる細胞の染色によって更に確認することで、同様の種類の分布パターンが明らかとなり、播種した細胞は材料表面に接着し、均等に分布していた。
【０１２１】
細胞増殖アッセイ
両方の材料上の細胞増殖を、ＭＴＴアッセイを用いて一定時間間隔で評価した。簡潔に述べると、ウェル内のＤＭＥＭ培地を除去し、細胞を播種した無機ディスクを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。その後、ＦＢＳを含まず、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地をウェルに添加し、５時間のインキュベーションを行った。さらに、この溶液を除去し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。サンプルを３７℃で２０分間インキュベートした。形成される着色溶液を回収し、吸光度を分光光度法により５７０ｎｍで測定した。Ｌ６細胞を用いた細胞工場実験における細胞増殖分析を同様に行い、５×１０４細胞／ウェルの細胞密度を用いた。筋管の増殖を顕微鏡法によって分析し、多核の伸長細胞を筋管であるとみなした。
【０１２２】
同様の結果が、ゲンタマイシンを含む及び含まない両方のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）材料で観察された（図３Ａ）。７日目までの細胞集団の初期増大の後、細胞増殖は抑制され、その後の時点で細胞集団の減少が観察された。一方、対照とされる二次元ポリスチレン組織培養プレートの場合、１４日目までに細胞増殖の増大が観察され、その後増殖は低下し始める。両方の材料上に播種した細胞が同様の細胞増殖のプロファイルを示した。細胞増殖の統計的に有意な差異は報告されなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、より良好な細胞増殖が、ポリスチレン組織培養プレートにおいてＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクと比較して報告された。
【０１２３】
アルカリホスファターゼアッセイ
Ｓｉｇｍａ  ｆａｓｔ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）錠剤を使用し、製造業者により提供されるプロトコルを用いてｐＮＰＰ基質溶液を調製した。培地をウェルから取り出し、ＰＢＳ緩衝液を用いてサンプルを洗浄した。次いで、サンプルをｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）基質溶液とともに２時間、３７℃のＣＯ２インキュベーター内でインキュベートし、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１２４】
ゲンタマイシンを含む及び含まない材料は、細胞播種の１４日目までにＡＬＰ量の増大を示した（図３Ｂ）。その後、ＡＬＰの値は時間とともに減少し始める。１４日間の期間内に、両方のＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）材料上に播種した細胞が、ポリスチレン対照と比較してＡＬＰレベルの８倍の増大を示した（ｐ＜０．０５）。両方の材料によって示されるＡＬＰレベルに統計的に有意な差異は見られなかった（ｐ＞０．０５）。一方、ポリスチレンプレート上に播種した細胞によるＡＬＰのレベルは、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）材料上に播種した細胞のＡＬＰレベルと比較して低かった。
【０１２５】
骨形成マーカーの免疫蛍光染色
材料の分化能を、免疫蛍光染色を用いて観察した。細胞を染色し、ｒｕｎｘ２、オステオポンチン、オステオカルシン及びＩ型コラーゲン（ＣＯＬＩ）のような種々のマーカーの存在を２１日間にわたって検出した。
【０１２６】
免疫蛍光染色から、細胞播種の７日目までにＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスク上でＲｕｎｘ２の存在が示された（図４Ａ〜図４Ｃ）。ＣＯＬＩ（図４Ｄ〜図４Ｆ）、ＯＣＮ（図４Ｇ〜図４Ｉ）及びＯＰＮ（図４Ｊ〜図４Ｌ）のような成熟骨芽細胞の他のマーカーの存在が、細胞播種の２１日目までに検出された。
【０１２７】
Ｌ６筋細胞の骨芽細胞様細胞への分化転換を確認するために、両方の群の細胞をＩ型コラーゲン（ＣＯＬＩ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）及び骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のような様々な骨芽細胞マーカーについて免疫染色した。細胞を培養フラスコ内で１０日間にわたって、骨芽細胞から採取した骨活性タンパク質又は低血清を含む完全培地中で成長させた。細胞をトリプシン処理し、４ウェルチャンバースライド上に播種し、同じ培地を用いて更に４８時間増殖させた。染色日に、４％ホルムアルデヒドを用いて細胞を１０分間固定し、続いて０．１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた５分間の膜透過化を行った。その後、５％ヤギ血清を用いて細胞を１時間ブロッキングし、それぞれの一次抗体とともに室温で２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて二次抗体（ＡＦ−４８８標識）中でのインキュベーションを１時間行った。スライドを、ＤＲＡＱ５を用いて５分間対比染色し、各々５分間で２回洗浄した。スライドを最後に透明処理し、マウントし、分析前に一晩乾燥させた。細胞をZeissの共焦点顕微鏡で種々の倍率により分析した。
【０１２８】
図６に、骨芽細胞様細胞へと変換した免疫陽性の分化転換した筋細胞を示す。処理群中の細胞はＣＯＬＩ、ＯＣＮ、ＯＰＮ及びＢＳＰのような骨形成原タンパク質を１２日目に発現した（図６Ａ〜図６Ｄ）。互いに融合して筋管を形成する対照群中の細胞は、骨形成原タンパク質を発現しなかった。
【０１２９】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
ゲンタマイシンを含む及び含まないＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）のディスクに、Ｃ２Ｃ１２細胞を１×１０６細胞／ディスクの濃度で播種した。細胞を播種したディスクの７日間及び２１日間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出した。細胞を播種したディスクを、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬を添加した後にマルチウェルプレートからマイクロチューブへと移した。その後、製造業者により供給されるプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、単離ＲＮＡ（２０μｌ）を１μｌのｏｌｉｇｏｄＴとともに７５℃で５分間インキュベートし、続いて氷上で５分間のインキュベーションを行うことにより合成した。これに、４μｌのｂｕｆｆ  ＲＴ、１μｌのＲＴａｓｅ、０．５μｌのＲＩ（ＲＮａｓｅ阻害剤）及び２μｌのｄＮＴＰミックスを含むｃＤＮＡミックスを添加した。ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＵＮＸ２、ＣＯＬＩ、ＢＳＰ及びＯＣＮ等の骨形成原系列の様々な遺伝子の発現を評価した。遺伝子のプライマー配列を以前の研究から得て、表２に挙げる。内因性対照として、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を求めた。連続熱サイクルをＤＮＡ増幅に用いた。ＲＴ−ＰＣＲの産物を、臭化エチジウムを用いて染色した２．０％アガロースゲル上で分解した。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
結果から、細胞播種の７日目までにＲＵＮＸ２の存在（図５のＭ）、２１日目までにＣＯＬＩ、ＢＳＰ及びＯＣＮ等の他の骨芽細胞マーカーの存在が示された（図５のＮ）。
【０１３２】
光学顕微鏡法並びにヘマトキシリン及びエオシン染色を用いた形態学的変化
骨芽細胞から採取した骨活性タンパク質を添加した筋細胞の分化転換を、数日間にわたって分析した。形態学的分析を、光学顕微鏡法及びＨ＆Ｅ染色の両方を用いて行った。培養フラスコを、光学顕微鏡を種々の倍率で用いて直接モニタリングした。Ｈ＆Ｅ染色を行うために、細胞を４ウェルチャンバースライド内で成長させ、４％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞を漸減エタノール勾配で水和させ、ヘマトキシリンで５分間染色した。流水を用いて過剰な染色剤を洗い流し、続いてエオシンによる２分間の対比染色を行った。スライドをキシレン中で５分間透明処理し、マウントし、画像化前に一晩乾燥させた。
【０１３３】
経時的な形態学的差異を、骨活性タンパク質で処理した細胞及び対照群において観察した。対照群中の細胞は、処理群中の細胞（図示せず）と比較した場合に、早ければ１日目から実験の終了時まで伸長して見られる（図６Ｅ及び図６Ｆ）。ヘマトキシリン及びエオシン染色により、成長因子で処理した細胞と、処理しない細胞との間の構造差が明らかに示される（図６Ｆ及び図６Ｈ）。対照の場合、筋細胞は多数の核を有する融合した筋管へと分化するが、成長因子で処理した群の細胞は実験全体にわたって単核のままである（図６Ｆ及び図６Ｈ）。さらに、細胞のサイズははるかに小さく、処理細胞の場合に骨芽細胞様形態を有する。
【０１３４】
細胞生存性及び筋管数
細胞の増殖プロファイルの顕著な差異は観察されなかった（図６Ｉ）。それどころか、対照群の細胞は融合して、多数の核を有する筋管を形成した。７日間にわたって観察され得る筋管の数も分析した。対照群における筋管の数は時間とともに増大し続けたが（ｐ＜０．０５）、処理群では１日目に筋管が殆ど観察されず、その数は３日後にゼロに達し、筋管形成の完全な抑制が示された（図６Ｊ）。
【０１３５】
骨芽細胞の細胞工場組成物
ＲＯＳ  １７／２．８細胞工場における様々な前骨芽細胞タンパク質を検出する試みにより、採取した細胞工場タンパク質を４８時間にわたり、８ｋＤａ透析膜を用いて超純水に対して透析した。透析後に、タンパク質を４８時間にわたる凍結乾燥を用いて濃縮した。そのようにして得られた乾燥タンパク質画分を、その後２つの重要な骨活性分子ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７の検出及び測定のためにＥＬＩＳＡを用いて分析した。
【０１３６】
様々な間葉細胞の骨芽細胞系列への骨分化に関与する、２つの最も一般的な骨誘導タンパク質であるＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７の存在が確認された。ＥＬＩＳＡを用いた骨形成原タンパク質の検出を行い、細胞工場中のＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のそれぞれの濃度は、採取したタンパク質画分１ｍｇ当たり８．４±０．８ｎｇ及び５０．６±２．２ｎｇであった。
【０１３７】
実施例３
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＰ−２放出
１ｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを、０．４０６ｍｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵと混合した。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストを３０秒間徹底的に混合し、続いて３０秒間待ち、これを２．５分の時点まで継続した。４０μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有するｒｈＢＭＰ−２（Medtronic）のストック溶液を、ｒｈＢＭＰ−２を４０μＬの生理食塩水（１ｍＬ当たり９ｍｇのＮａＣｌ）に溶解することによって調製した。２．５分の時点で、２４μｌのこのｒｈＢＭＰ／生理食塩水ストック溶液を、予め混合したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストに徹底的に混合した。ｒｈＢＭＰ−２溶液をＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストに完全に混合した後、ｒｈＢＭＰ／Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストを注射器に移し、１２個のディスクを作製した（直径：５±０．１ｍｍ；高さ：１．５±０．０５ｍｍ）。全てのディスクが２０分より前に凝結した。ディスクの重量は４６±３．２ｍｇであり、各ディスクは２μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有していた。
【０１３８】
各ディスクを１ｍＬの生理食塩水に浸漬し、３７℃のインキュベーター内に設置した。各時点（１日目、３日目、５日目及び７日目）で、５０μｌの上清を分析のために回収し、５０μｌの新たな生理食塩水を添加した。ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質濃度を７日間にわたって算出した。図７に、固体Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦからのＢＭＰ−２の一定放出が７日間にわたって観察され、ｒｈＢＭＰ−２の９０％近くが７日後に放出されたことが示される。
【０１３９】
実施例４
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＺＡ放出
ｉｎ  ｖｉｔｒｏゾレドロン酸（ＺＡ）放出試験のために、合計１２個のディスクを作製した。６個のディスクはＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ粉末から作製し、６個のディスクはＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ粉末から作製した。
【０１４０】
５００ｍｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを、１４８．６４μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵと混合した。サンプルを３０秒間徹底的に混合し、続いて３０秒間待ち、これを２．５分の時点まで継続した。２．５分の時点で、６７．５μｌのゾレドロン酸溶液（５４μｇのＺＡ、Ｚｏｍｅｔａ（４ｍｇ／５ｍｌ）、Novartis）を、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストに添加した。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＺＡペーストを更に３０秒間混合し、６個のディスクを作製した（直径：５±０．１ｍｍ；高さ：１．５±０．０５ｍｍ；９μｇのＺＡ）。全てのディスクが２０分より前に凝結した。
【０１４１】
５００ｍｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ粉末を、６．６ｍｇのゲンタマイシンを含有する１４８．６４μｌの生理食塩水と混合した。サンプルを３０秒間徹底的に混合し、続いて３０秒間待ち、これを３．５分の時点まで継続した。３．５分の時点で、６７．５μｌのゾレドロン酸溶液（５４μｇのＺＡ、Ｚｏｍｅｔａ、Novartis）を、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇペーストに添加した。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇ＋ＺＡペーストを更に３０秒間混合し、６個のディスクを作製した（直径：５±０．１ｍｍ；高さ：１．５±０．０５ｍｍ；９μｇのＺＡ）。全てのディスクが２０分より前に凝結した。
【０１４２】
生理食塩水をディスクに添加し、生理的条件でインキュベートした。各時点で、培地のサンプルを回収し、更なる分析のために保管した。各Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ／Ｇ＋ＺＡディスクからのＺＡの放出を種々の時点で評定するために、回収した上清をＡ５４９細胞に添加し、細胞生存性を４８時間のインキュベーション後にＭＴＴアッセイを用いて算出した。次いで、ＺＡの濃度を得られた標準曲線から算出した。
【０１４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ統計分析を、多重ｔ検定（Ｐｒｉｓｍ  ６）を用いて行い、データを平均及び標準偏差により三連で表した。
【０１４４】
７日後にＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇディスクから放出されるＺＡの量は、装填した全ＺＡの１０％近くであった（図８；ＢＶＦ及びＧ群をまとめたが、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクとＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇディスクとの間に差異は見られなかった）。Ａ５４９細胞に対するＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ディスクから放出されるＺＡの細胞障害効果は、より多くの時点で細胞生存性の減少を示す（図９；ＢＶＦ及びＧ群をまとめたが、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクとＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）Ｇディスクとの間に差異は見られなかった）。
【０１４５】
実施例５
ｉｎ  ｖｉｖｏ筋肉袋モデル
本研究は実験動物の使用について地方自治体により承認された（承認番号Ｍ１２４−１４）。Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈＢＭＰ−２及びＺＡのディスクを以下のように作製した。
【０１４６】
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスク：
１ｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを、１６２μｌの生理食塩水及び２６８μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵを含む０．４３ｍＬのイオヘキソール溶液と混合し、３０秒間徹底的に混合し、続いて３０秒間待ち、これを２．５分の時点まで継続した。使用する全液体は、１ｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）粉末について４３０μｌとし、これは０．４３ｍｌ／ｇの液体／粉末比を有する４８０μｌのペーストをもたらす。ペーストを使用して、滅菌鋳型（４０μｌのペースト／円筒）内で１２個の円筒形ディスク（直径：５ｍｍ；高さ：２ｍｍ；重量：４７．６±３ｍｇ）を作製した。各ディスクは８３．３３ｍｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、２２．３３μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵ及び１３．５μｌの生理食塩水を含有し、２０分より前に凝結した。
【０１４７】
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰディスク：
「Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰ」群では、ＢＭＰのストック溶液を、１２０μｇのｒｈＢＭＰ−２（Medtronic）を１６２μｌの生理食塩水に溶解することによって初めに調製した。１ｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを２６８μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵと混合し、３０秒間徹底的に混合し、続いて３０秒間待ち、２．５分まで混合及び休止を繰り返し、ペーストを得た。２．５分の時点で、１６２μｌのＢＭＰ／食塩水（１２０μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有する）をペーストに添加し、更に３０秒間徹底的に混合した。使用した全液体は１ｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ粉末について４３０μｌとし、０．４３ｍｌ／ｇの液体／粉末比をもたらす。１２０μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有する最終容量が４８０μｌのペーストが得られ、各々が４０μｌのＢＭＰ／Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦペーストの容量を有する上記の同じサイズの１２個のディスクを作製するために使用した。各ディスクは８３．３３ｍｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、２２．３３μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵ、１３．５μｌの生理食塩水及び１０μｇのｒｈＢＭＰ−２を含有していた。ディスクは２０分より前に凝結した。
【０１４８】
Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰ＋ＺＡディスク：
ｒｈＢＭＰ−２の溶液を、１２０μｇのｒｈＢＭＰ−２（Medtronic）を１２μｌの生理食塩水に溶解することによって調製した。１５０μｌのＺＡ−溶液（１２０μｇのＺＡ、Novartis）を添加し、ｒｈＢＭＰ−２溶液と混合した。生理食塩水中１６２μｌのＺＡ（１２０μｇ）及びｒｈＢＭＰ−２（１２０μｇ）の全容量が達成された。１ｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを２６８μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵと混合し、ペーストを３０秒間徹底的に混合し、続いて３０秒間待ち、２．５分まで混合及び休止を繰り返し、ペーストを調製した。２．５分の時点で、１６２μｌのＺＡ＋ｒｈＢＭＰ−２溶液をペーストに添加し、更に３０秒間混合し、内容物を均質化した。４８０μｌの最終容量が得られ、各々が４０μｌのＺＡ／ＢＭＰ／Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ペーストの容量を有する上記の１２個のディスクを作製するために使用した。各ディスクは８３．３３ｍｇのＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、２２．３３μｌのＣＥＲＡＭＥＮＴ（商標）ＩＣ−ＴＲＵ、１３．５μｌの生理食塩水、１０μｇのｒｈＢＭＰ−２及び１０μｇのＺＡを含有していた。ディスクは２０分より前に凝結した。
【０１４９】
上記のように作製したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈ−ＢＭＰ−２及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ｒｈ−ＢＭＰ−２＋ＺＡを含むディスクを、７週齢Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに移植した。腹筋の単回鈍的切開を行うことによって移植片を腹筋に挿入した。１群では、５匹の動物に１動物当たりＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦのみを含有する２つのディスクを腹部正中線の左側に施し、正中線の右側は１動物当たりＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰ−２を含有する２つのディスクの移植に用いた。第２の群では、５匹の動物にＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦを含有する２つのディスク及びＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰ−２＋ＺＡを含有する２つのディスクを同様に施した。ディスクから時間をかけて現れる足場を動物内に４週間残した。骨形成の分析をＸ線、続いてマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロ−ＣＴ）を用いる石灰化組織量の三次元分析を用いて行った。足場内の細胞の種類を、組織像（Ｈ＆Ｅ）を用いて分析した。
【０１５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ統計分析を、ｎ＝５のスチューデントｔ検定（平均及びＳＤ）を用いて行った。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
【０１５１】
図１０に見られるように、４週間後の動物の放射線透過試験から、ｒｈＢＭＰ−２及びＺＡを装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場が、ｒｈＢＭＰ−２のみを装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場よりも密であることが示される。ｒｈＢＭＰ−２を装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場は、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクによる足場よりも密である。マイクロ−ＣＴ結果から、ｒｈＢＭＰ−２とＺＡとの組合せを装填したＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスク群及びｒｈＢＭＰ−２を装填した群において、石灰化組織量がＣｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦディスクのみの群と比較して有意に高かったことが示される（ｐ＜０．０１）（図１１〜図１３）。ｒｈＢＭＰ−２とＺＡとの組合せを装填した群は、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰ−２群よりも有意に高い骨塩量を有していた（ｐ＜０．０１）。組織学的には、ｒｈＢＭＰ−２＋ＺＡを装填したサンプルは、足場周辺に足場内で既に目に見える架橋骨梁島を有する皮質殻を生じ、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（商標）ＢＶＦ＋ＢＭＰ−２群は目に見える脂肪髄を有する破骨細胞性吸収の兆候を示した（図１１）。
【０１５２】
本発明の具体的な実施形態：
１．  二相性セラミック骨代用材であって、
ａ．硫酸カルシウム相と、
ｂ．リン酸カルシウム相と、
ｃ．少なくとも１つの骨活性タンパク質と、
ｄ．少なくとも１つの抗異化剤と、
を含む、二相性セラミック骨代用材。
２．  硫酸カルシウムが硫酸カルシウム二水和物である、１に記載の二相性セラミック骨代用材。
３．  リン酸カルシウムがα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムからなる群から選択される、１又は２に記載の二相性セラミック骨代用材。
４．  リン酸カルシウム相がヒドロキシアパタイト、好ましくは結晶性ヒドロキシアパタイト粒子から構成される、３に記載の二相性セラミック骨代用材。
５．  骨活性タンパク質が骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、スクレロスチン、細胞工場由来の骨活性タンパク質及びＥＣＭタンパク質を含む群から選択されるか、又はストロンチウムである、１〜４のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材。
６．  骨活性タンパク質が骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、５に記載の二相性セラミック骨代用材。
７．  骨成長タンパク質がＢＭＰ−２、好ましくはｒｈＢＭＰ−２、及び／又はＢＭＰ−７、好ましくはｒｈＢＭＰ−７である、６に記載の二相性セラミック骨代用材。
８．  抗異化剤が骨吸収を阻害する作用物質である、１〜７のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材。
９．  抗異化剤がビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、デノスマブ又はスタチンである、８に記載の二相性セラミック骨代用材。
１０．  抗異化剤がエチドロネート、クロドロネート及びチルドロネートを含む群、又はパミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートを含む群から選択されるビスホスホネートである、９に記載の二相性セラミック骨代用材。
１１．  ビスホスホネートがゾレドロネート（ゾレドロン酸）である、１０に記載の二相性セラミック骨代用材。
１２．  抗生物質（抗真菌薬を含む）、骨治癒促進剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される少なくとも１つの更なる生物活性剤を含む、１〜１１のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材。
１３．  ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、リファンピシン、クリンダマイシンから選択される少なくとも１つの抗生物質を含み、抗真菌薬がナイスタチン、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール及びミコナゾールを含む群から選択される、１２に記載の二相性セラミック骨代用材。
１４．  水溶性非イオン性Ｘ線造影剤及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤を更に含む、１〜１３のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材。
１５．  水溶性非イオン性Ｘ線造影剤がイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオサルコール、イオシミド、イオツサール、イオキシラン、イオフロタール及びイオデコールから選択される、１４に記載の二相性セラミック骨代用材。
１６．  硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）が５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０である、１３〜１５のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材。
１７．  硬化性セラミック骨代用材粉末であって、
ａ．硫酸カルシウム１／２水和物粉末と、
ｂ．リン酸カルシウムがα−リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム及びβ−リン酸三カルシウムからなる群の１つ以上から選択される、リン酸カルシウム粉末と、
ｃ．任意に骨活性タンパク質と、
ｄ．抗異化剤と、
ｅ．任意に、好ましくは硫酸カルシウム二水和物及び塩（例えばＮａＣｌ）から選択される硫酸カルシウムの凝結促進剤と、
ｆ．任意にリン酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは粒状リン酸カルシウム及び／又はリン酸塩（例えばＮａ２ＨＰＯ４）と、
を含む、硬化性セラミック骨代用材粉末。
１８．  リン酸カルシウムが、好ましくは非晶質及び／又は結晶性ヒドロキシアパタイト粒子で構成されるヒドロキシアパタイト粉末である、１７に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
１９．  非晶質及び／又は結晶性リン酸カルシウム（例えばヒドロキシアパタイト）粒子が２００μｍ未満、１００μｍ未満、５０μｍ未満、３５μｍ未満又は２０μｍ未満のサイズを有する、１７又は１８に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２０．  抗異化剤を、粉末中でリン酸カルシウム粒子と予め混合（し、任意にそれに結合）する、１７〜１９のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２１．  リン酸カルシウム粒子が結晶性ヒドロキシアパタイト粒子である、２０に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２２．  抗異化剤が骨吸収を阻害する作用物質から選択される、１７〜２１のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２３．  抗異化剤がビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、デノスマブ又はスタチンである、２２に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２４．  抗異化剤がエチドロネート、クロドロネート及びチルドロネートを含む群、又はパミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートを含む群から選択されるビスホスホネートである、２３に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２５．  ビスホスホネートがゾレドロネート（ゾレドロン酸）である、２４に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２６．  骨活性タンパク質を含む、１７〜２５のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２７．  骨活性タンパク質が骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、スクレロスチン、細胞工場由来のタンパク質及びＥＣＭタンパク質を含む群から選択される骨成長タンパク質であるか、又はストロンチウムである、２６に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２８．  骨活性タンパク質がＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７から選択される骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、２７に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
２９．  骨活性タンパク質を硫酸カルシウム１／２水和物粉末と予め混合する、２６〜２８のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
３０．  抗生物質（抗真菌薬を含む）、骨治癒促進剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、ビタミン、ホルモン、骨髄穿刺液、多血小板血漿及び脱灰骨から選択される生物活性剤を更に含む、１７〜２９のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
３１．  ゲンタマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、リファンピシン、クリンダマイシンから選択される少なくとも１つの抗生物質を含み、抗真菌薬がナイスタチン、グリセオフルビン、アムホテリシンＢ、ケトコナゾール及びミコナゾールを含む群から選択される、３０に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
３２．  水溶性非イオン性Ｘ線造影剤及び／又は生分解性Ｘ線造影剤から選択されるＸ線造影剤を更に含む、１７〜３１のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
３３．  水溶性非イオン性Ｘ線造影剤がイオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオサルコール、イオシミド、イオツサール、イオキシラン、イオフロタール及びイオデコールから選択される、３２に記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
３４．  硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）が５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０である、１７〜３３のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末。
３５．  １６〜３４のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材粉末と水性液体とを含む硬化性セラミック骨代用材ペースト。
３６．  注射可能である、３５に記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト。
３７．  失われた骨組織を生成することによってヒト又は非ヒト被験体における支持組織の障害の治療に使用される、３５又は３６に記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト。
３８．  硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比率（ｗ／ｗ）が５：９５〜９５：５、１０：９０〜９０：１０、２０：８０〜８０：２０、３０：７０〜７０：３０又は４０：６０〜６０：４０である、３５〜３７のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト。
３９．  ３５〜３８のいずれか１つに記載の硬化性セラミック骨代用材ペースト又は１〜１６のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材を作製するキットであって、以下の構成成分：
ｉ）硫酸カルシウム１／２水和物粉末と、
ｉｉ）３又は４に記載のリン酸カルシウム粉末と、
ｉｉｉ）５〜７のいずれか１つに記載の骨活性タンパク質と、
ｉｖ）９〜１１のいずれか１つに記載の骨吸収を阻害する抗異化剤と、
ｖ）任意に１２又は１３に記載の少なくとも１つの更なる生物活性剤と、
ｖｉ）任意に１４又は１５に記載のＸ線造影剤と、
ｖｉｉ）任意に硫酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは硫酸カルシウム二水和物又はＮａＣｌ等の塩と、
ｖｉｉｉ）任意にリン酸カルシウムの凝結促進剤、好ましくは粒状リン酸カルシウム及び／又はリン酸カルシウム塩（例えばＮａ２ＨＰＯ４）と、
ｉｘ）任意に水等の水性液体と、
を含む、キット。
４０．  硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）と予め混合して、基礎粉末（ｘ）を形成する、３９に記載のキット。
４１．  抗異化剤（ｉｖ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）の少なくとも一部、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）の少なくとも一部、基礎粉末（ｘ）、活性添加剤（ｉｉｉ）及び（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）の１つ以上、又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する、４０に記載のキット。
４２．  骨活性タンパク質（ｉｉｉ）を硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）の少なくとも一部、リン酸カルシウム粉末（ｉｉ）の少なくとも一部、基礎粉末（ｘ）、活性添加剤（ｉｖ）〜（ｖｉｉｉ）の１つ以上、又は水性液体（ｉｉ）と予め混合する、３９〜４１のいずれか１つに記載のキット。
４３．  少なくとも１つの更なる生物活性剤（ｖ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）、２）硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）、活性添加剤（ｉｖ）及び（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）の１つ以上、又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する、３９〜４２のいずれか１つに記載のキット。
４４．  Ｘ線造影剤（ｖｉ）をリン酸カルシウム粉末（ｉｉ）、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）、活性添加剤（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）の１つ以上、又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する、３９〜４３のいずれか１つに記載のキット。
４５．  硫酸カルシウムの凝結促進剤（ｖｉｉ）を硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）、活性添加剤（ｉｖ）〜（ｖｉ）及び（ｖｉｉｉ）の１つ以上、又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する、３９〜４４のいずれか１つに記載のキット。
４６．  リン酸カルシウムの凝結促進剤（ｖｉｉｉ）を、リン酸カルシウム粉末（ｉｉ）、硫酸カルシウム１／２水和物粉末（ｉ）、基礎粉末（ｘ）、活性添加剤（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）の１つ以上、又は水性液体（ｉｘ）と予め混合する、３９〜４５のいずれか１つに記載のキット。
４７．  ａ．混合デバイス及び／又は注射デバイス、及び／又は、
ｂ．使用説明書、
を更に含む、３９〜４６のいずれか１つに記載のキット。
４８．  生分解性合成膜又はコラーゲン膜を更に含む、３９〜４７いずれか１つに記載のキット。
４９．  失われた骨組織を生成することによるヒト又は非ヒト被験体における支持組織の障害の治療に使用される、３９〜４８のいずれか１つに記載のキット。
５０．  添加剤の１つ以上を、個別に又は任意の組合せ（複数の場合もある）で水溶性及び／又は生分解性合成ポリマーマイクロカプセル、ウシコラーゲン粒子、デンプン粒子、二水和物着床粒子等に封入して提供する、１〜１６のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材、１７〜３４のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材粉末、３５〜３８のいずれか１つに記載の二相性セラミック骨代用材ペースト及び３９〜４９のいずれか１つに記載のキット。
５１．  骨欠損、例えば特に外傷、感染の根絶、腫瘍病巣の切除、遷延治癒又は偽関節に起因する、また初回人工関節置換術又は人工関節再置換術における骨損失を有する患者を治療する方法であって、１〜１６のいずれか１つに記載の１つ以上の二相性セラミック骨代用材（移植片）、又は３５〜３８のいずれか１つに記載の硬化性二相性セラミック骨代用材ペーストを骨が除去された位置に挿入することを含む、方法。
５２．  骨が脊髄、手、指、腕、足、足指、下腿又は上腿、膝、臀部、足首、肘、手首、肩、頭蓋、顎及び歯の骨を含む動物又はヒト身体の骨から選択される、５１に記載の方法。
５３．  二相性セラミック骨代用材（例えばペースト）の挿入を骨の除去、例えば折れた骨、骨腫瘍又は感染骨組織の除去の後に行う、５１又は５２に記載の方法。
５４．  二相性セラミック骨代用材又はペースト（ｉｎ  ｖｉｖｏで硬化した）の挿入に続いて、筋肉及び／又は皮膚組織の整復又は移植を行う、５１〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．  二相性セラミック骨代用材（例えばペースト）の挿入が、人工の多孔性又は半多孔性ポリマー膜の使用によって開放創において隣接組織及び／又は身体外の周辺に画定される、５１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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2018514248.tif 000019
2018514248.tif 000020