(57)【要約】  本発明は、全般的に発酵技術、及びそのような発酵に有用な微生物の分野に関する。本発明はまた微生物の発酵特性を変更するために有用な核酸及びタンパク質を含む物質に関し、またそのような核酸及び／又はタンパク質を含めた微生物に関する。特に、本発明は微生物ストレス耐性を与え、改変し、又は低減するための物質に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物によって生成される物質を酸化から保護するための方法であって、
a)発現宿主においてポリペプチドの生成を指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子を含む組換え核酸によって、前記物質を生成することができる微生物を形質転換すること、ここで該ポリペプチドは、
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、若しくは
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
である、
又は
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、若しくは
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
をコードするカタラーゼ遺伝子を異種遺伝子として含む微生物を提供すること、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
発酵産物を生成するための発酵方法であって、
a)発現宿主においてポリペプチドの生成を指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子を含む組換え核酸によって、前記物質を生成することができる微生物を形質転換する工程、ここで該ポリペプチドは、
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、若しくは
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
である、
又は
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、若しくは
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
をコードするカタラーゼ遺伝子を異種遺伝子として含む微生物を提供する工程、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養し、また前記発酵産物の生成をもたらす工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが1つ以上の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記制御配列が誘導性プロモーター、好ましくは過酸化水素誘導性プロモーターであるか又はそれを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が核酸構築物又は発現ベクターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物によって生成される物質又は発酵産物が、タンパク質、好ましくは酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択され、ここで好ましいプロテアーゼはサブチリシンプロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に発酵技術、及びそのような発酵に有用な微生物の分野に関する。本発明はまた微生物の発酵特性を変更するために有用な核酸及びタンパク質を含む物質に関し、またそのような核酸及び／又はタンパク質を含む微生物に関する。特に、本発明は酸化ストレスに対する微生物ストレス耐性を付与し、改変し、又は低減するための物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的物質の生物工学的生産は、工業規模では、一般的に液体培地中で微生物を培養することによって行われ、ここで前記微生物はその培養条件において前記目的物質を生成することができる。そのような液体発酵中には、個々の微生物細胞は、経時的に大きく且つ複雑に変化する条件を経験する。そのような変化する条件に対し、微生物細胞は遺伝子発現を変化させることによって応答し得るが、これは次に目的物質の生成が望ましくなく低くなることにつながり得る。それに応じて、好ましくない発酵条件に対する改善された回復力を微生物に提供し、それによって同等な微生物に比較して増加した目的物質の生成を可能にする必要性がある。
【０００３】
したがって、発酵中のストレス条件に対する微生物の回復力を改善するために、そのようなストレス条件を決定し、微生物の遺伝的構成を改変することがしばしば試みられてきた。残念ながら、個別の微生物細胞が経験する発酵条件及びそのような条件に対する微生物の遺伝的反応の解析は、困難であることで有名である。Wiegand et al. (Fermentation stage-dependent adaptations of Bacillus licheniformis during enzyme production; Microbial Cell Factories 2013, 12:120)は、そのような解析を試みた。しかし、発酵条件の理解は、未だにほとんどが不完全なままである。
【０００４】
Wiegand et al.は、サブチリシンプロテアーゼの液体発酵生産中に、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）において、経時的な増殖期カタラーゼ（KatA）タンパク質の蓄積が全く観察できないことを報告したが、本発明者らは驚くことに、カタラーゼ活性を増大させると、例えばプロテアーゼなどの液体発酵生産中の例えばB.リケニフォルミス（B. licheniformis）などの全体的な発酵特性が改善することを見出した。Wiegand et al.によれば、そのような発酵の基本的にすべての段階を通じて、O2分圧（pO2）が大幅に低下するため、このことはさらにいっそう驚くことであった。したがって、主要ストレス因子としての過酸化水素の生成は予想されないことであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wiegand et al. (Fermentation stage-dependent adaptations of Bacillus licheniformis during enzyme production; Microbial Cell Factories 2013, 12:120)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、発酵を改善するための、発酵中の酸化ストレスを低減するための、培地から過酸化水素を除去するための、微生物の過酸化水素耐性を増加させるための、及び／又は微生物によって生成された物質を酸化から保護するための、物質と方法を提供することが、本発明の目的であった。前述の目的のために、好適なカタラーゼを提供し、そのようなカタラーゼを利用する微生物を提供し、対応する発酵方法を提供することもまた本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はしたがって、発現宿主においてポリペプチドの生成を指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子を含む組換え核酸を提供し、ここで該ポリペプチドは、
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、又は
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
である。
【０００８】
本発明はしたがって、特にそのバリアント及び断片を含むカタラーゼを提供する。したがって、本発明はまた、本発明のカタラーゼを微生物における発現に利用可能にするために、この酵素をコードするカタラーゼ遺伝子を含む核酸、特に組換え核酸を提供する。該核酸は好ましくは構築物又は発現ベクターである。
【０００９】
本発明はまた、1つ以上の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を含む、配列番号1のポリペプチドのバリアントを含む。さらに本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に由来するアミノ酸の位置特異的及び位置非特異的な置換のための指針を提供する。
【００１０】
本発明はまた、
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、又は
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
をコードするカタラーゼ遺伝子を異種遺伝子として含む微生物を提供する。
【００１１】
該遺伝子はしたがって、そのバリアント又は断片を含む本発明のカタラーゼを指す。該遺伝子は好ましくは、場合により、予め規定された限定された条件下で、微生物における本発明のカタラーゼの生成を指令する1個以上の制御配列の制御下にある。この異種遺伝子は、微生物のゲノム中に組み込むことができ、及び／又は非ゲノム性核酸、例えばプラスミド上に存在することができる。
【００１２】
本発明はまた、カタラーゼを生成するための方法であって、
a)本発明の微生物を提供する工程、及び
b)前記遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養する工程
を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
本明細書中に記載されるように、該遺伝子は、好ましくはその遺伝子産物、すなわちカタラーゼ又はその断片の生成を指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結される。また本明細書中に記載されるように、前記遺伝子の過酸化水素誘導性発現をもたらす制御配列が好ましい。したがって、低用量の過酸化水素で微生物を前処理することによって、前記微生物の培養中の所望の時にカタラーゼの生成を選択的に増加させることが可能である。
【００１４】
本発明はまた、培地から過酸化水素を除去するための方法であって、
a)前記培地中に本発明に係る微生物を提供する工程、及び
b)前記遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養する工程
を含む、前記方法を提供する。
【００１５】
したがって、本方法は、本発明のカタラーゼを含む培養物を生成するために好適な条件下で微生物を培養することを想定する。そのカタラーゼ活性によって、前記培養物中に含まれる本発明のカタラーゼは、培地中に含まれるか、又は前記培地中に存在する微生物、おそらく本発明の微生物によって提供される、過酸化水素を低減する。
【００１６】
本発明はまた、微生物の過酸化水素耐性を増大させるための方法であって、
a)本発明に係る組換え核酸で微生物を形質転換すること、及び
b)前記遺伝子の発現を可能にする条件で該微生物を培養すること
を含む前記方法に関する。
【００１７】
該遺伝子が、遺伝子産物、すなわちカタラーゼ又はその断片の生成を過酸化水素依存的に指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結される場合には、培養中の微生物を低用量の過酸化水素に暴露することによって、前記微生物の過酸化水素耐性をさらに増大させることができる。過酸化水素の用量は、好ましくは、前記培養中の微生物の増殖速度を著しく低減することなく該遺伝子の発現を誘導するように調整される。
【００１８】
本発明はまた、微生物によって生成される物質を酸化から保護する方法であって、
a)本発明の組換え核酸によって、前記物質を生成することができる微生物を形質転換すること、又は
本発明に係る微生物を提供すること、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にする条件下で、前記培地中で該微生物を培養すること
を含む前記方法を提供する。
【００１９】
カタラーゼ遺伝子は、好ましくは、微生物によって生成される物質の生産の前及び／又は間及び／又は後に発現される。工程a)における形質転換の代わりに、そのようにして形質転換された微生物又はその子孫を提供し、工程b)に規定されるように該微生物を培養することによって、本発明の方法を実施することもできる。該微生物は、酸化から保護されるべき、微生物によって生成される物質をも生成する同じ微生物であってもよい。該微生物はまた、酸化から保護されるべき、微生物によって生成される物質を生成する1種類以上の他の微生物に加えられてもよい。
【００２０】
本発明はまた、発酵産物を生成するための発酵方法であって、
a)発現宿主において本発明に係るポリペプチドの生成を指令する1つ以上の制御配列に作動可能に連結される該ポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子を含む組換え核酸によって、前記物質を生成することができる微生物を形質転換する工程、又は本発明に係る微生物を提供する工程、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にする、また前記発酵産物の生成をもたらす条件下で該微生物を培養する工程
を含む前記方法を提供する。
【００２１】
前記発酵産物は、工程a)の前記微生物と共培養される別の微生物によって生成されてもよい。本発明の微生物に発酵産物を生成させることもまた可能である。本明細書に記載されるように、過酸化水素の存在下で遺伝子産物、すなわちカタラーゼ又はその断片の生成を指令する1つ以上の制御配列に該遺伝子が作動可能に連結される場合、該微生物の成長速度を著しく低減することなく、及び／又は前記発酵産物の生成速度を著しく低減することなく、遺伝子発現に十分な低用量の過酸化水素を該微生物に暴露することが好ましい。
【００２２】
本発明のこれらの及び他の態様が以下の記載においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、対数増殖中のB.プミラス（B.pumilus）細胞（Ａ）、及び2mM H2O2で処理した後（Ｂ）の2Dゲル電気泳動におけるKatX2タンパク質スポットを示す図である。タンパク質の蓄積が緑色で示され、BODIPY蛍光染色で染色された可逆的に酸化されたチオール修飾が赤色で示される。
【図２】図２は、異なる酸化ストレス条件下のバシラス（Bacillus）培養物の増殖曲線を示す図である。枯草菌（B.subtilis）168株（正方形）と比較した枯草菌（B.subtilis）katX2変異体（ひし形）の増殖曲線が描かれる。対照条件は塗りつぶしのマークで、ストレス負荷培養は白抜きのマークで示される。H2O2を添加する時点は矢印で示され、使用されるH2O2濃度は50μM（Ａ）、200μM（Ｂ）及び2mM（Ｃ）であった。
【図３】図３は、増殖中の細胞の培地に添加した後のH2O2濃度の減少を示す図である。枯草菌（B.subtilis）の値はひし形で、B.リケニフォルミス（B.licheniformis）の値は三角形で、B.プミラス（B.pumilus）の値は正方形で示される。
【図４】図４は、枯草菌（B.subtilis）168株（ひし形）、B.リケニフォルミス（B.licheniformis）DSM 13（三角形）及びB.プミラス（B.pumilus）SAFR-032（正方形）からの細胞抽出物によるH2O2の分解を示す図である。対数増殖中の細胞からの抽出物は塗りつぶしのマークで、事前にストレスを与えた細胞からの抽出物は白抜きのマークで示される。
【図５】図５は、枯草菌（B.subtilis）168株（ひし形）、枯草菌（B.subtilis）katX2変異体（三角形）及びB.プミラス（B.pumilus）SAFR-032（正方形）からの細胞抽出物によるH2O2の分解を示す図である。対数増殖中の細胞からの抽出物は塗りつぶしのマークで、事前にストレスを与えた細胞からの抽出物は白抜きのマークで示される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は特にカタラーゼに関する。この点について、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を有するカタラーゼ、そのようなカタラーゼのバリアント及びそれらの断片に特に重点を置く。したがって、「本発明のカタラーゼ」は、異なる意味がこの用語に明示的に与えられない限り、配列番号1のアミノ酸配列を含む又はからなるポリペプチド、配列番号1に記載される配列に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるそのようなポリペプチドのバリアント、及びまたそのようなポリペプチドの断片を指す。該バリアント及び断片はカタラーゼ活性を有するものと理解される。
【００２５】
本発明のカタラーゼは特にバシラス・プミラス（Bacillus pumilus）由来であり一般名KatX2として知られる。バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）のカタラーゼKatX2のアミノ酸配列は繰り返し決定されており、2015年10月8日に表示されるところではアクセッション番号B4AFT4_BACPU、A8FBF9_BACP2、A0A063Z4T4_BACPU、A0A0B0QA43_9BACI、M5RKX5_9BACI、K2MHE7_9BACI、W8QL66_BACPU、W6ANB4_BACPU、A0A0B4S5R6_9BACI、A0A059NBL2_9BACI、A0A0C2PYN3_BACPU及びA0A081LAW9_9BACIとしてUniprotデータベースに登録されている。本発明によれば、カタラーゼKatX2は好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなる又はそのアミノ酸配列を含む。しかし、前述のUniprot識別子のもと登録された任意の他のカタラーゼ（配列番号2〜13の配列）も同様に本発明のカタラーゼと考えられる。
【００２６】
したがって、本発明に係るカタラーゼ配列は特に以下から選択される：
2018537108.tif 000002
2018537108.tif 000003
2018537108.tif 000004
2018537108.tif 000005
2018537108.tif 000006
【００２７】
バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）は過酸化水素によって誘発される酸化ストレスに対して高い耐性を有することが記載されていた（Handtke et al., "Bacillus pumilus Reveals a Remarkably High Resistance to Hydrogen Peroxide Provoked Oxidative Stress", PLOS ONE, January 2014, volume 9, pages 1 to 14）。前記刊行物の著者らは、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）は、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）及びバシラス・リケニフォルミス（B.licheniformis）の過酸化水素防御に関わる、それ以外では一般的なカタラーゼKatAを欠いていることを記載する。これらのバシラス（Bacilli）では、カタラーゼKatAの発現が過酸化水素への暴露時に100倍超誘導される。バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）では、過酸化水素への暴露時のKatX2の発現は、たった20倍までしか誘導されない。該著者らはさらに、過酸化水素への暴露時にバシラス・プミラス（Bacillus pumilus）は多数のレギュロンを誘導し、中でもチオール化合物の濃度の増加をもたらすということを指摘する。バチリチオールのようなそのような化合物は、例えば可逆的又は不可逆的システイン酸化を防ぐことによって、細胞内物質を酸化から保護することが知られてきた。該著者らは、これまで機能が知られていない、過酸化水素によって誘導される特有のタンパク質の相当数のセットが同定されたことにも言及した。注目すべきことに、前記刊行物は、そこに記載される実験が再現できないという理由により、その雑誌の編集者らによって懸念表明の対象とされている（PLOS ONE, July 2014, Vol 9 Issue 7）。
【００２８】
別の刊行物（Handtke et al., "Cell physiology of the biotechnological relevant bacterium Bacillus pumilus - an omics-based approach", Journal of Biotechnology 192 (2014), 204-214）では、著者らは、モデル発酵中のバシラス・プミラス（Bacillus pumilus）のタンパク質濃度の変化を解析した。該著者らは、細胞質タンパク質の全セットにおけるKatX2カタラーゼのいかなる有意な存在量も報告しなかった。したがって、KatX2が特に高い触媒活性を有するカタラーゼであるだけではなく、KatX2が他の物質の発酵生成を改善し得ることは驚くべきこととなった。
【００２９】
本発明はしたがって、発現宿主においてポリペプチドの生成を指令する1つ以上の制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子を含む核酸を提供し、ここで該ポリペプチドは、
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、又は
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
である。
【００３０】
本明細書においてより詳細に説明されるように、そのような組換え核酸は、微生物において、カタラーゼポリペプチドの異種遺伝子としての発現を特に促進する。したがって、本発明の組換え核酸は、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）だけではなく他の微生物においても、本発明のカタラーゼの発現の利益を付与することを可能にする。
【００３１】
本発明によれば、カタラーゼ、及びカタラーゼ活性を有するポリペプチドという用語は互換的に使用される。カタラーゼ活性は、これ以降の実施例セクションで説明されるように、カタラーゼ活性が推定されるポリペプチドを生成する微生物のタンパク質抽出物を過酸化水素に曝し、抽出物をインキュベートし、規定された時点で残存過酸化水素濃度を測定することによって決定することができる。
【００３２】
該遺伝子は、配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼをコードする。したがって、本発明はまた、配列番号1のアミノ酸配列の1つ以上の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を含む、配列番号1の成熟ポリペプチドのバリアントを包含し、同様にまた対応する遺伝子等を包含する。上記のように、すべてのそのようなカタラーゼバリアントはカタラーゼ活性を有しなければならない。
【００３３】
KatX2カタラーゼの構造は解明されており、アクセッション番号4QOL（DOI 10.2210/PDB4QOL/PDB）でPDBデータベースに登録されている。配列番号1に記載されるカタラーゼのバリアントは前述のUniprot識別子のもとで公開されており、配列番号2〜13の配列として本明細書において再び記載される。したがって、当業者は、配列番号1のアミノ酸配列と比較した1つ以上のアミノ酸の任意の置換、欠失、及び／又は挿入が、アミノ酸鎖の三次元的な折り畳みに干渉することはなく、またその四量体への凝集にも干渉することはないことに留意しながら、配列番号1に記載されるカタラーゼの新しいバリアントを合理的に構築することができる。
【００３４】
配列番号1のアミノ酸配列に記載されるカタラーゼの新しいバリアントを提供するために、当業者は、配列番号1のアミノ酸配列と別の機能的なカタラーゼのアミノ酸配列とのペアワイズアラインメントを行うことができる。このようにして、当業者は、配列番号1のアミノ酸配列の各位置について、カタラーゼ活性を有することが知られる別のカタラーゼのアミノ酸配列の対応する位置に見出される別のアミノ酸を決定することができる。当業者は次に、各々の所望の位置で、配列番号1に記載される配列中に見られるアミノ酸を、他のカタラーゼの対応する位置に見出される対応するアミノ酸によって置き換えることができる。同じことが配列番号1に記載されるアミノ酸配列と比較した挿入及び欠失にも当てはまる。
【００３５】
他のカタラーゼにおけるアミノ酸の出現を考慮しないでアミノ酸を置換するには、以下が適用され、ここで、括弧内の数字は置換の優先度を示す（数字が大きいほど、優先度が高いことを示す）。AはS(1)、C(0)、G(0)、T(0)又はV(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。CはA(0)によって置換されてもよい。DはE(2)、N(1)、Q(0)又はS(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。EはD(2)、Q(2)、K(1)、H(0)、N(0)、R(0)又はS(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。FはY(3)、W(1)、I(0)、L(0)又はM(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。GはA(0)、N(0)又はS(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。HはY(2)、N(1)、E(0)、Q(0)又はR(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。IはV(3)、L(2)、M(1)又はF(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。KはR(2)、E(1)、Q(1)、N(0)又はS(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。LはI(2)、M(2)、V(1)又はF(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。MはL(2)、I(1)、V(1)、F(0)又はQ(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。NはD(1)、H(1)、S(1)、E(0)、G(0)、K(0)、Q(0)、R(0)又はT(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。QはE(2)、K(1)、R(1)、D(0)、H(0)、M(0)、N(0)又はS(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。RはK(2)、Q(1)、E(0)、H(0)又はN(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。SはA(1)、N(1)、T(1)、D(0)、E(0)、G(0)、K(0)又はQ(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。TはS(1)、A(0)、N(0)又はV(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。VはI(3)、L(1)、M(1)、A(0)又はT(0)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。WはY(2)又はF(1)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。YはF(3)、H(2)又はW(2)から選択される任意のアミノ酸によって置換されてもよい。
【００３６】
好ましくは、配列番号1のポリペプチドのバリアントは、バシラス・リケニフォルミス及び／又は枯草菌のKatA及び／又はKatXカタラーゼのアミノ酸配列に対するよりも、配列番号1に対してより高い配列同一性を有する。
【００３７】
このように、配列番号1に記載されるカタラーゼのバリアントを提供する際には、当業者は、配列番号1に記載されるカタラーゼに比べて、バリアントカタラーゼの触媒活性が減少するように配列番号1に記載されるアミノ酸配列を改変することを、避けることができる。
【００３８】
本発明のカタラーゼは好ましくは配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有する。さらにより好ましくは、該カタラーゼは、配列番号1に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは配列番号1に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは配列番号1に対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは配列番号1に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する。配列番号1に対する配列同一性が増加するとともに、バリアントポリペプチドが大きく減少したカタラーゼ活性を有する確率は減少する。これに対応して、該カタラーゼは好ましくは、個々のアミノ酸の15個以下の置換、欠失及び／又は挿入、個々のアミノ酸のさらにより好ましくは最大で14個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で13個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で12個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で11個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で10個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で9個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で8個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で7個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で6個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で5個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で4個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で3個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で2個の置換、欠失及び／又は挿入、より好ましくは最大で1個の置換、欠失及び／又は挿入によって配列番号1と異なるアミノ酸配列からなる。
【００３９】
本発明に係るバリアントでは、配列番号1に記載の位置279及び／又は359におけるシステイン部分を欠失又は置換しないことが好ましい。本明細書に記載されるように、配列番号1に記載されるカタラーゼを過酸化水素に暴露すると、システイン461のチオール基だけが、その位置でスルホン酸の形成によって修飾されることが認められる。しかし、位置279及び359におけるシステイン部分は影響を受けないままであるようであり、したがって置換又は欠失を必要としないかもしれない。
【００４０】
本発明によれば、該カタラーゼポリペプチドは、上述のアミノ酸配列、又は要求されるアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントからなることが可能である。しかし、本発明はまたそのようなカタラーゼポリペプチドの断片であって、カタラーゼ活性を有する断片を提供する。そのような断片は、アミノ酸鎖のいずれかの末端における1つ以上のアミノ酸の欠失によって、前述のアミノ酸配列及びそのバリアントと相違し得る。そのカタラーゼ活性を保つためにカタラーゼの三次元構造を維持する必要性から、本発明に係る断片は、アミノ酸鎖のいずれかの末端における好ましくは5個以下のアミノ酸欠失によって、又はアミノ酸鎖のいずれかの末端における、より好ましくは最大4個の欠失によって、さらにより好ましくは最大3個の欠失によって、さらにより好ましくは最大2個の欠失によって、さらにより好ましくは最大1個の欠失によって、前述のアミノ酸配列又はそのバリアントと相違する。本発明に係る断片は、カタラーゼ活性を有するポリペプチドの生成を可能にする一方で、そのようなカタラーゼを生成するための資源の量を減少させる。これは過酸化水素への暴露、又は微生物による過酸化水素の内部産生のような酸化ストレス条件下で特に有利であり、これは、これらの条件下の微生物は前記酸化ストレスに対する防御のためにその資源のすべてを必要とするためである。
【００４１】
本発明に係る組換え核酸は、発現宿主において該ポリペプチドの生成を指令する1個以上の制御配列を含む。該制御配列は好ましくは、誘導性プロモーター、最も好ましくは過酸化水素誘導性プロモーターを含む又はそのプロモーターである。過酸化水素誘導は、H2O2の存在下又は非存在下で前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子のmRNAの存在又は濃度をノーザン解析又は定量PCRによって比較することにより、決定することができる。好ましくは、過酸化水素誘導性プロモーターは、少なくとも4倍、さらにより好ましくは少なくとも8倍、さらにより好ましくは少なくとも10倍、さらにより好ましくは少なくとも30倍、さらにより好ましくは少なくとも90倍の前記mRNA濃度の増加をもたらす。そのようなプロモーターは、カタラーゼ活性が実際に必要である条件下で遺伝子の転写をもたらし、それによってその微生物の資源の効率的な利用をもたらす。このように、本発明に係る組換え核酸は、本明細書に記載されるように目的物質の安定した実体生成に使用することができる資源不必要に流用することなく、発酵をさらに促進する。好ましいプロモーターはEMBLアクセッション番号のもとに登録されている。好ましいプロモーターは、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）KatAプロモーター及びバシラス・プミラス（Bacillus pumilus）KatX2プロモーターであり、その詳細は例えばhttp://bsubcyc.org/gene?orgid=BSUB&id=BSU08820、及びGenbank識別子NC_000964.3及びNC_009848.1でそれぞれ見出すことができる。
【００４２】
好ましくは、当該1つ以上の制御配列は、遺伝子の低い基礎発現を可能にする。このように、本発明の組換え核酸は、発現宿主が、発酵中に起きるように、過酸化水素濃度の遅い変化に対してすぐに反応することを可能にする。
【００４３】
本発明に係る組換え核酸は好ましくは核酸構築物又は発現ベクターである。このように、該組換え核酸は、本発明のカタラーゼ（これは上述のようにバリアント又は断片であってもよい）を好ましくは上述のように必要に応じて発現させるために、微生物を発現宿主へと効率的に形質転換することを可能にする。
【００４４】
本発明はまた、
i)配列番号1に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するカタラーゼ、又は
ii)カタラーゼ活性を有する、i)に記載のカタラーゼの断片
をコードするカタラーゼ遺伝子を異種遺伝子として含む微生物を提供する。
【００４５】
本発明の微生物はしたがって組換え微生物である。該微生物は、本明細書において説明されるように、野生型微生物を本発明の組換え核酸で形質転換することによって取得することができる。したがって、本発明に係る微生物は、前記ポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子で形質転換された微生物と呼ぶこともできる。この定義は、形質転換が成功しなかった細胞、又は形質転換イベント後に該遺伝子を失った細胞を除外する。
【００４６】
該微生物は、該カタラーゼ遺伝子をそのゲノム中又はプラスミド上に含んでもよい。該遺伝子のゲノムへの組み込みは、当業者に公知である任意の好適な手段によって達成することができ、各々の微生物を考慮して選択してもよい。ゲノムへの組み込みを行うための指南は、例えばWach, A. (1996) PCR-synthesis of marker cassettes with long flanking homology regions for gene disruptions in S. cerevisiae. Yeast 12, 259-265において見出すことができ、その内容の全体が本明細書に組み込まれる。ゲノムへの組み込みは、本発明に係るカタラーゼをコードする遺伝子が選択圧、例えば抗生物質圧の非存在下でさえも培養及び発酵中において維持されることが可能であるという利点を有する。また、ゲノムへの組み込みは、該微生物の天然カタラーゼ遺伝子を本発明のカタラーゼ遺伝子によって置換することを可能にする。
【００４７】
該微生物は、1つ以上のプラスミド上に該遺伝子を含むこともできる。そのようなプラスミドは、本発明に係る発現ベクターであるべきであり、それによって、1個以上の制御配列により、適切な条件下で、本発明のカタラーゼをコードする遺伝子の発現がもたらされる。一般的には、プラスミドによる微生物の形質転換の方が、カタラーゼ遺伝子のゲノムへの組み込みよりも達成するのが容易である。そのような1つ以上のプラスミドを含む微生物は、したがって、本発明のバリアントカタラーゼを生成してそのカタラーゼ活性を試験するために特に好ましい。
【００４８】
本発明に係る該微生物は、遺伝子産物、すなわちカタラーゼ又はその断片の生成を指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結された前記遺伝子を含むことが理解される。これによって、制御配列に関する上述の利益を実現することが可能になる。
【００４９】
該微生物は、1つ以上の異種制御配列の制御下に該異種遺伝子を含むことができる。例えば、カタラーゼプロモーターは、本発明の微生物（標的微生物）に密接に関連した微生物（供給源微生物）から取得される制御配列として使用することができる。供給源微生物は好ましくは標的微生物と同じ綱のもの、さらにより好ましくは標的微生物と同じ科のもの、さらにより好ましくは標的微生物と同じ属のもの、最も好ましくは標的微生物と同じ種のものである。供給源微生物及び標的微生物が系統学的に互いに密接に関連しているほど、供給源微生物から取得された制御配列が、供給源微生物と同じ条件下において、標的微生物（発現宿主）において対応するカタラーゼポリペプチドの生成を指令する可能性が高い。
【００５０】
該微生物は原核生物又は真核生物であってもよい。好ましくは、該微生物は細菌、古細菌、真菌細胞、酵母細胞又は真核細胞である。好ましくは、本発明の微生物は好ましくはファーミキューテス門（Firmicutes）又はプロテオバクテリア門（Proteobacteria）に属する。好ましくは、該微生物はバシラス綱（Bacilli）に、バシラス目（Bacillales）又はラクトバシラス目（Lactobacillales）に、クロストリジウム綱（Clostridia）に、クロストリジウム目（Clostridiales）、ハロアナエロビウム目（Halanaerobiales）、ナトラナエロビウス目（Natranaerobiales）、サーモアナエロバクター目（Thermoanaerobacterales）に、エリシペロトリクス綱（Erysipelotrichia）に、エリシペロスリックス目（Erysipelotrichales）に、リムノコーディウム綱（Limnochordia）に、リムノコーディウム目（Limnochordales）に、ネガティウィクテス綱（Negativicutes）に、セレノモナス目（Selenomonadales）に、テルモリトバクター綱（Thermolithobacteria）に、テルモリトバクター目（Thermolithobacterales）に、アルファプロテオバクテリア綱（Alphaproteobacteria）に、カウロバクター目（Caulobacterales）、キロニエラ目（Kiloniellales）、コプリイモナス目（Kopriimonadales）、コルディイモナス目（Kordiimonadales）、マグネトコッカス目（Magnetococcales）、パルヴルアーキュラ目（Parvularculales）、ペラギバクター目（Pelagibacterales）、リゾビウム目（Rhizobiales）（根圏細菌）、ロドバクター目（Rhodobacterales）、ロドスピリルム目（Rhodospirillales）、ロドサラシア目（Rhodothalassiales）、リケッチア目（Rickettsiales）（リケッチア）、スネアチエラ目（Sneathiellales）、スフィンゴモナス目（Sphingomonadales）に、ベータプロテオバクテリア綱（Betaproteobacteria）に、バークホルデリア目（Burkholderiales）、フェリトロフィカス目（Ferritrophicales）、フェロバス目（Ferrovales）、ガリオネラス目（Gallionellales）、ヒドロゲノフィルス目（Hydrogenophilales）、メチロフィルス目（Methylophilales）、ナイセリア目（Neisseriales）、ニトロソモナス目（Nitrosomonadales）、プロカバクター目（Procabacteriales）、ロドシクルス目（Rhodocyclales）、サルフリセラス目（Sulfuricellales）に、デルタプロテオバクテリア綱（Deltaproteobacteria）に、イプシロンプロテオバクテリア綱(Epsilonproteobacteria）に、ガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteobacteria）に、アシディフェロバクター目（Acidiferrobacterales）、アシディチオバシラス目（Acidithiobacillales）、エアロモナス目（Aeromonadales）、アルテロモナス目（Alteromonadales）、アレニセラス目（Arenicellales）、カルディオバクテリウム目（Cardiobacteriales）、セルビブリオ目（Cellvibrionales）、クロマチウム目（Chromatiales）、エンテロバクター目（Enterobacteriales）、レジオネラ目（Legionellales）、メチロコッカス目（Methylococcales）、オケアノスピリルム目（Oceanospirillales）、オルバス目（Orbales）、パスツレラ目（Pasteurellales）、シュードモナス目（Pseudomonadales）、サリニスファエラ目（Salinisphaerales）、チオスリックス目（Thiotrichales）、ビブリオ目（Vibrionales）、キサントモナス目（Xanthomonadales）に、オリゴフレキシア綱（Oligoflexia）に、オリゴフレキシア目（Oligoflexales）に、ゼータプロテオバクテリア綱（Zetaproteobacteria）又はマリプロフンドゥス目（Mariprofundales）に属する。
【００５１】
バシラス目（Bacillales）の中では、該微生物は好ましくはアリサイクロバシラス科（Alicyclobacillaceae）、バシラス科（Bacillaceae）、リステリア科（Listeriaceae）、パエニバシラス科（Paenibacillaceae）、プラノコッカス科（Planococcaceae）、スポロラクトバシラス科（Sporolactobacillaceae）又はサーモアクチノマイセタジー科（Thermoactinomycetaceae）のものである。アリサイクロバシラス科（Alicyclobacillaceae）の中では、該微生物は好ましくは、アリサイクロバシラス属（Alicyclobacillus）、エフシバシラス属（Effusibacillus）、キロピディア属（Kyrpidia）又はチューメバシラス属（Tumebacillus）のいずれかのものである。バシラス科（Bacillaceae）の中では、該微生物は好ましくは、エアリバシラス属（Aeribacillus）、アルカリバシラス属（Alkalibacillus）、アロバシラス属（Allobacillus）、アルテリバシラス属（Alteribacillus）、アンフィバシラス属（Amphibacillus）、アミロバシラス属（Amylobacillus）、アナエロバシラス属（Anaerobacillus）、アノキシバシラス属（Anoxybacillus）、アクイバシラス属（Aquibacillus）、アクイサリバシラス属（Aquisalibacillus）、バシラス属（Bacillus）、カルダルカリバシラス属（Caldalkalibacillus）、カルディバシラス属（Caldibacillus）、カルディテリコラ属（Calditerricola）、セラシバシラス属（Cerasibacillus）、ドミバシラス属（Domibacillus）、ファルシバシラス属（Falsibacillus）、フィクティバシラス属（Fictibacillus）、フィロバシラス属（Filobacillus）、ジオバシラス属（Geobacillus）、グラシリバシラス属（Gracilibacillus）、ハロアルカリバシラス属（Halalkalibacillus）、ハロバシラス属（Halobacillus）、ハロラクティバシラス属（Halolactibacillus）、ヒドロゲニバシラス属（Hydrogenibacillus）、レンチバシラス属（Lentibacillus）、リシニバシラス属（Lysinibacillus）、マリノコッカス属（Marinococcus）、ミクロエアロバクター属（Microaerobacter）、ナトリバシラス属（Natribacillus）、ナトロノバシラス属（Natronobacillus）、オセアノバシラス属（Oceanobacillus）、オルニチニバシラス属（Ornithinibacillus）、パラリオバシラス属（Paraliobacillus）、パウシサリバシラス属（Paucisalibacillus）、ピシバシラス属（Piscibacillus）、ポンチバシラス属（Pontibacillus）、シュードグラシリバシラス属（Pseudogracilibacillus）、サイクロバシラス属（Psychrobacillus）、サッカロコッカス属（Saccharococcus）、サリミクロビウム属（Salimicrobium）、サリニバシラス属（Salinibacillus）、サリラブダス属（Salirhabdus）、サリセディミニバクテリウム属（Salisediminibacterium）、サリテリバシラス属（Saliterribacillus）、サルシューギニバシラス属（Salsuginibacillus）、セディミニバシラス属（Sediminibacillus）、シニバシラス属（Sinibacillus）、ストレプトハロバシラス属（Streptohalobacillus）、テニューイバシラス属（Tenuibacillus）、テピディバシラス属（Tepidibacillus）、テルリバシラス属（Terribacillus）、テクスココニバシラス属（Texcoconibacillus）、タラソバシラス属（Thalassobacillus）、サーモロンギバシラス属（Thermolongibacillus）、バージバシラス属（Virgibacillus）又はブルカニバシラス属（Vulcanibacillus）のいずれかのものである。リステリア科（Listeriaceae）の中では、該微生物は好ましくは、ブロコトリックス属（Brochothrix）又はリステリア属（Listeria）のいずれかのものである。パエニバシラス科（Paenibacillaceae）の中では、該微生物は好ましくは、アン��ニイバシラス属（Ammoniibacillus）、アニューリニバシラス属（Aneurinibacillus）、（群）、ブレビバシラス属（Brevibacillus）、コーネラ属（Cohnella）、フォンティバシラス属（Fontibacillus）、ゴリリバクテリウム属（Gorillibacterium）、パエニバシラス属（Paenibacillus）、サッカリバシラス属（Saccharibacillus）又はサーモバシラス属（Thermobacillus）のいずれかのものである。パスツリア科（Pasteuriaceae）の中では、該微生物は好ましくはパスツリア属（Pasteuria）のものである。プラノコッカス科（Planococcaceae）の中では、該微生物は好ましくはバルガバエア属（Bhargavaea）、カリオファノン属（Caryophanon）、クリセオミクロビウム属（Chryseomicrobium）、クロシノバクテリウム属（Crocinobacterium）、フィリバクター属（Filibacter）、ヨトガリバシラス属（Jeotgalibacillus）、クルチア属（Kurthia）、パエニスポロサルシナ属（Paenisporosarcina）、プラノコッカス属（Planococcus）、プラノミクロビウム属（Planomicrobium）、ルメリイバシラス属（Rummeliibacillus）、サバギア属（Savagea）、ソリバシラス属（Solibacillus）、スポロサルシナ属（Sporosarcina）、ウレイバシラス属（Ureibacillus）又はビリディバシラス属（Viridibacillus）のいずれかのものである。スポロラクトバシラス科（Sporolactobacillaceae）の中では、該微生物は好ましくはプルラニバシラス属（Pullulanibacillus）、スコプリバシラス属（Scopulibacillus）、シノバカ属（Sinobaca）、スポロラクトバシラス属（Sporolactobacillus）又はテュベリバシラス属（Tuberibacillus）のいずれかのものである。スタフィロコッカス科（Staphylococcaceae）の中では、該微生物は好ましくはアリイコッカス属（Aliicoccus）、ジェオトガリコッカス属（Jeotgalicoccus）、マクロコッカス属（Macrococcus）、ノソコミイコッカス属（Nosocomiicoccus）、サリニコッカス属（Salinicoccus）又はスタフィロコッカス属（Staphylococcus）のいずれかのものである。サーモアクチノマイセタジー科（Thermoactinomycetaceae）の中では、該微生物は好ましくはデスモスポラ属（Desmospora）、ジオサーモミクロビウム属（Geothermomicrobium）、ハゼネラ属（Hazenella）、クロッペンステドティア属（Kroppenstedtia）、ラセイェラ属（Laceyella）、リフアクスエラ属（Lihuaxuella）、マリニネマ属（Marininema）、マリニサーモフィラム属（Marinithermofilum）、マカラカリマイセス属（Mechercharimyces）、メルギリマイセス属（Melghirimyces）、ノビバシラス属（Novibacillus）、プラニフィラム属（Planifilum）、ポリクラドマイセス属（Polycladomyces）、サリニトリクス属（Salinithrix）、セイノネラ属（Seinonella）、シマズエラ属（Shimazuella）、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）又はサーモフラビミクロビウム属（Thermoflavimicrobium）のいずれかのものである。エンテロバクター目（Enterobacteriaceae）の中では、該微生物は好ましくはエンテロバクター科（Enterobacteriaceae）のものであり、さらにより好ましくはアラニコラ属（Aranicola）、アーセノフォナス属（Arsenophonus）、アベリエラ属（Averyella）、ビオストラチコラ属（Biostraticola）、ブレネリア属（Brenneria）、ブクネラ属（Buchnera）、バドビシア属（Budvicia）、バティアクセラ属（Buttiauxella）、セデセア属（Cedecea）、シトロバクター属（Citrobacter）、コセンゾエア属（Cosenzaea）、クロノバクター属（Cronobacter）、ディケヤー（Dickeya）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エスケリキア属（Escherichia）、エウィンゲラ属（Ewingella）、フランコニバクター属（Franconibacter）、ギッブシエラ属（Gibbsiella）、グリモンテラ属（Grimontella）、グハインゲラ属（Guhaiyinggella）、ハフニア属（Hafnia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、クライベラ属（Kluyvera）、コサコニア属（Kosakonia）、レクレルシア属（Leclercia）、レリオッティア属（Lelliottia）、レミノレラ属（Leminorella）、ロンスダリア属（Lonsdalea）、マングロビバクター属（Mangrovibacter）、マルガレフィア属（Margalefia）、モエラーレラ属（Moellerella）、モーガネラ属（Morganella）、オベサムバクテリウム属（Obesumbacterium）、パントエア属（Pantoea）、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）、ファセオリバクター属（Phaseolibacter）、フォトラブダス属（Photorhabdus）、フィトバクター属（Phytobacter）、プレジオモナス属（Plesiomonas）、プルラリバクター属（Pluralibacter）、プラジア属（Pragia）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、シュードシトロバクター属（Pseudocitrobacter）、ラーネラ属（Rahnella）、ラオウルテラ属（Raoultella）、ローゼンベルギエラ属（Rosenbergiella）、ロウシエラ属（Rouxiella）、サルモネラ属（Salmonella）、サムソニア属（Samsonia）、セラチア属（Serratia）、シゲラ属（Shigella）、シムウェリア属（Shimwellia）、シッキバクター属（Siccibacter）、ソダリス属（Sodalis）、テイタメラ属（Tatumella）、ソルセリア属（Thorsellia）、ティエドジェイア属（Tiedjeia）、トラブルシエラ属（Trabulsiella）、ウィグレスウォルシア属（Wigglesworthia）、ゼノラブダス属（Xenorhabdus）、エルシニア属（Yersinia）及びヨケネラ属（Yokenella）のいずれかのものである。シュードモナス目の中では、該微生物は好ましくはモラクセラ科（Moraxellaceae）のものであり、これらの中では好ましくはアシネトバクター属（Acinetobacter）、アルカニンディゲス属（Alkanindiges）、エンハイドロバクター属（Enhydrobacter）、ファウシコラ属（Faucicola）、モラクセラ属（Moraxella）、パラペルシジバカ属（Paraperlucidibaca）、ペルルシジバカ属（Perlucidibaca）及びサイクロバクター属（Psychrobacter）のいずれかのものであり、又は、同等に好ましくは、該微生物はシュードモナス科（Pseudomonadaceae）のものであり、これらの中で好ましくはアゾトバクター属（Azotobacter）（群）、メソフィロバクター属（Mesophilobacter）、ペルミアニバクター属（Permianibacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ルガモナス属（Rugamonas）、セルペンス属（Serpens）及びチオシュードモナス属（Thiopseudomonas）のいずれかのものである。
【００５２】
ラクトバシラス目（Lactobacillales）の中では、該微生物は好ましくはアエロコッカス科（Aerococcaceae）、カルノバクテリウム科（Carnobacteriaceae）、エンテロコッカス科（Enterococcaceae）、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、ロイコノストック科（Leuconostocaceae）及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）のいずれかに属する。アエロコッカス科（Aerococcaceae）の中では、該微生物は好ましくはアビトロフィア属（Abiotrophia）、アエロコッカス属（Aerococcus）、ドロシコッカス属（Dolosicoccus）、エレモコッカス属（Eremococcus）、ファクラミア属（Facklamia）、グロビカテラ属（Globicatella）又はイグナビグラナム属（Ignavigranum）のいずれかに属する。カルノバクテリウム科（Carnobacteriaceae）の中では、該微生物は好ましくはアギトコッカス属（Agitococcus）、アルカリバクテリウム属（Alkalibacterium）、アロフスティス属（Allofustis）、アロイオコッカス属（Alloiococcus）、アトポバクター属（Atopobacter）、アトポコッカス属（Atopococcus）、アトポスティペス属（Atopostipes）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、デセムジア属（Desemzia）、ドロシグラヌルム属（Dolosigranulum）、グラニュリカテラ属（Granulicatella）、イソバキュラム属（Isobaculum）、ヨトガリバカ属（Jeotgalibaca）、ラクティシゲニウム属（Lacticigenium）、マリニラクティバシラス属（Marinilactibacillus）、ピシグロバス属（Pisciglobus）又はトリココッカス属（Trichococcus）のいずれかに属する。エンテロコッカス科（Enterococcaceae）の中では、該微生物は好ましくはババリコッカス属（Bavariicoccus）、カテリコッカス属（Catellicoccus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、メリッソコッカス属（Melissococcus）、ピリバクター属（Pilibacter）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）又はバゴコッカス属（Vagococcus）のいずれかに属する。ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）の中では、該微生物は好ましくはラクトバシラス科（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）又はシャーペア属（Sharpea）のいずれかに属する。ロイコノストック科（Leuconostocaceae）の中では、該微生物は好ましくはコンビビナ属（Convivina）、フルクトバシラス属（Fructobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、オエノコッカス属（Oenococcus）又はワイセラ属（Weissella）のいずれかに属する。レンサ球菌科（Streptococcaceae）の中では、該微生物は好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）（ラクティック・ストレプトコッシ(lactic streptococci)）、ラクトブム属（Lactovum）、オカダエラ属（Okadaella）又はレンサ球菌属（Streptococcus）のいずれかに属する。
【００５３】
好ましくは、該微生物はバシラス（Bacillus）細胞、例えば、バシラス・アルカロフィウス（Bacillus alkalophius）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サークランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・ファーマス（Bacillus firmus）、バシラス・ジョータス（Bacillus Jautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）及びバシラス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）である。最も好ましくは、該真核生物はバシラス（Bacillus）細胞、好ましくは、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）又はバシラス・レンタス（Bacillus lentus）、最も好ましくは、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のバシラス（Bacillus）細胞である。
【００５４】
本発明はまたカタラーゼを生成する方法であって、
a)本発明に係る微生物を提供する工程、及び
b)前記遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養する工程
を含む、前記方法を提供する。
【００５５】
上記のように、本発明の微生物は、本発明のカタラーゼポリペプチドをコードするカタラーゼ遺伝子を含む。前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にするために、該遺伝子は好ましくは、遺伝子産物、すなわち該カタラーゼ又はその断片の生成を指令する1個以上の制御配列に作動可能に連結される。そのバリアント及び断片を含む好ましいカタラーゼ並びに対応する遺伝子は上で説明された。好ましい制御配列もまた上で説明されている。したがって、本発明の微生物を使用することによって、高いカタラーゼ活性を有する本発明のカタラーゼを生成することが可能である。さらに、対応する制御配列（単数又は複数）に合わせて当業者によって具体的に選択される条件下でそのようなカタラーゼを生成することが可能である。
【００５６】
該カタラーゼは細胞内タンパク質として生成されることが可能であり、又は該微生物から分泌されることが可能である。第1の場合には、カタラーゼ活性は、生成する微生物それ自体の中で大部分が現れる。したがってそのような微生物は、本発明のカタラーゼを生成していない微生物に比べて、過酸化水素に対する耐性が増大しているという利点を有する。
【００５７】
本発明はそれに対応して微生物の過酸化水素耐性を増大させるための方法であって、
a)本発明に係る微生物を前記培地中に提供すること、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養すること
を含む、前記方法を提供する。
【００５８】
上記のように、該微生物を低用量の過酸化水素に暴露することによって前記微生物の過酸化水素耐性をさらに増大させることが可能であり、ここでその用量は、過酸化水素誘導性制御配列の制御下にある本発明のカタラーゼ遺伝子の発現を誘導するように選択される。さらに当業者は、微生物の酸化ストレスが、該微生物が該カタラーゼを生成し続けることを可能にするのに十分低く保たれるように、過酸化水素の用量を選択する。過酸化水素の好ましい用量は5〜10μMである。
【００５９】
本発明はまた、培地から過酸化水素を除去するための方法であって、
a)本発明の組換え核酸によって微生物を形質転換する工程、又は本発明の微生物を提供する工程、及び
b)前記遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養する工程
を含む前記方法を提供する。
【００６０】
本発明のカタラーゼを含む培養物を生成するために好適な条件下での培養によって、本発明のカタラーゼの活性に固有の利点を実現することが可能になり、したがって該微生物が前記カタラーゼを生成している前記培地から過酸化水素を除去することが可能になる。該微生物は培地から過酸化水素を取り込み、前記微生物によって生成される本発明のカタラーゼによってそれを減少させる。この方法はしたがって培地、好ましくは発酵培地の過酸化水素濃度を効果的に減少する。
【００６１】
培地中で該微生物を培養する代わりに、本発明はまた、培地から過酸化水素を除去するための方法であって、
a)前記カタラーゼの発現を可能にする条件下、第1の培地中で本発明の微生物を培養する工程、及び
b)過酸化水素が除去されるべき培地（第2の培地）を、工程a)において増殖させた前記微生物の無細胞抽出物と混合する工程
を含む、前記方法を想定する。
【００６２】
この無細胞抽出物は本発明のカタラーゼを適切に含む。このように、本発明の微生物に前記第2の培地の構成物質を消費させることなく、第2の培地から過酸化水素を除去することが可能である。第2の培地が発酵培地である場合、前記第2の培地が目的物質を生成するための生産微生物を含むことが特に好ましい。このように、該生産微生物は、本発明の該微生物と共培養する必要なく、また本発明のカタラーゼをそれ自身で生成する必要なく、本発明のカタラーゼの作用から利益を受けることができる。
【００６３】
本発明はまた、微生物によって生成された物質を酸化から保護する方法であって、
a)本発明に係る組換え核酸によって、前記物質を生成することができる微生物を形質転換すること、又は本発明の微生物を提供すること、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にする条件下で該微生物を培養すること
を含む、前記方法を提供する。
【００６４】
上記のように、本発明の前記カタラーゼ遺伝子の発現によって、該微生物の中の及び／又は周囲の培地中の過酸化水素濃度が効果的に減少する。したがって、前記微生物によって生成される物質は、本質的に該カタラーゼの作用から利益を受け、それによって少なくとも部分的には酸化から保護される。タンパク質酸化は、質量分析法を使用することによりシステインのチオール基の酸化とその後のジスルフィド結合形成を示すチオール修飾アッセイによって測定することができる（Schroeter R, Voigt B, Juergen B, Methling K, Poether DC, Schaefer H, Albrecht D, Mostertz J, Maeder U, Evers S, Maurer KH, Lalk M, Mascher T, Hecker M, Schweder T. The peroxide stress response of Bacillus licheniformis. Proteomics. 2011 Jul;11(14):2851-66. doi: 10.1002/pmic.201000461）。その上、システインの酸化はiodoTMT試薬（Thermo Scientific）を使用して特異的に決定することができる。十分量の物質が生成されたら該カタラーゼ遺伝子を誘導すること。そのような誘導によって、該物質を生成するために使用することができる栄養を不必要に犠牲にすることなく、該物質を酸化から保護することが可能になる。
【００６５】
本発明はしたがってまた発酵産物を生成するための発酵方法であって、
a)本発明に係る微生物を提供する工程、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にし、また前記発酵産物の生成をもたらす条件下で該微生物を培養する工程
を含む、前記方法を提供する。
【００６６】
上記のように、本発明の前記カタラーゼ遺伝子の発現によって、微生物によって生成された物質を酸化から保護し、したがって発酵産物を効果的に保護することが可能になる。発酵産物が本発明に係る活性カタラーゼと接触している又は混合されている限り、保護が与えられる。したがって、本発明の発酵方法は、発酵中の、また下流の処理の間の、発酵産物のための保護を提供する。下流の処理は、細胞溶解及び均質化のような細胞破壊工程を含む。
【００６７】
上記のように、発酵産物を生成する微生物（生産株）と本発明のカタラーゼを生成する微生物とを共培養することによって、発酵を行ってもよい。このように、前記発酵産物を生成する生産株を改変する必要なく、発酵培地の過酸化水素濃度を減少させることが可能である。
【００６８】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、
a)本発明に係るカタラーゼ遺伝子を含む第1の微生物を提供する工程、
b)好ましくは発酵産物をコードする遺伝子を含むことによって、発酵産物を生成することができる第2の微生物を提供する工程、並びに
c)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にし、また前記発酵産物の生成をもたらす条件下で第1及び第2の微生物を一緒に培養する工程
を含む、発酵産物を生成するための発酵方法に向けられる。
【００６９】
この実施形態では、該カタラーゼ遺伝子を含む第1の微生物、及び発酵産物を生成する第2の微生物は同じ又は異なる種のものであってもよい。好ましくは、第1及び第2の微生物は同じ種のものである。
【００７０】
しかし、より好ましくは、発酵産物を生成するための生産株はまた本発明のカタラーゼを発現する。そのような場合には生産株は本発明の微生物である。このように該カタラーゼは非常に近くで、すなわち所望の発酵産物をも生成している同一の微生物の中で、生成される。したがって、発酵産物は1つの区画の中（すなわち同一の微生物又はその区画の中）で本発明のカタラーゼと完全に混ざることができ、したがって該カタラーゼが発酵産物に向けて輸送される必要なしにカタラーゼ活性から利益を受けられる。
【００７１】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は発酵産物を生成するための発酵方法であって、
a)本発明に係るカタラーゼ遺伝子を含み、また発酵産物を生成することが、好ましくは発酵産物をコードする遺伝子を含むことによって可能である微生物を提供する工程、及び
b)前記カタラーゼ遺伝子の発現を可能にし、また前記発酵産物の生成をもたらす条件下で該微生物を培養する工程
を含む、前記方法に向けられている。
【００７２】
発酵産物を生成することができる微生物は、発酵産物をコードする遺伝子、又は発酵産物の生成に関わる1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子をそのゲノム中又はプラスミド上に含んでもよい。該微生物はまた前記遺伝子を1つ以上のプラスミド上に含むことができる。発酵産物をコードする遺伝子、又は発酵産物の生成に関わる1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子は、異種又は同種遺伝子、好ましく異種遺伝子であってもよい。
【００７３】
好ましくは、発酵産物を生成できる微生物は、遺伝子産物の生成を指令する1つ以上の制御配列に作動可能に連結された、発酵産物をコードする前記遺伝子、又は発酵産物の生成に関わる1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を含む。該微生物は、1つ以上の異種又は同種制御配列、好ましくは異種制御配列の制御下に該遺伝子を含むことができる。
【００７４】
発酵産物を生成する微生物は、カタラーゼ発現微生物について上述したように、原核生物又は真核生物であってよく、好ましくは細菌、古細菌、真菌細胞、酵母細胞、又は真核細胞であってもよい。有用な原核生物は、グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞である。好ましい有用なグラム陽性細菌は、以下に限定されないが、バシラス（Bacillus）細胞、例えばバシラス・アルカロフィウス（Bacillus alkalophius）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サークランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・ファーマス（Bacillus firmus）、バシラス・ジョータス（Bacillus Jautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）及びバシラス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）を含む。最も好ましくは、該原核生物はバシラス（Bacillus）細胞であり、好ましくは枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）又はバシラス・レンタス（Bacillus lentus）、最も好ましくはバシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のバシラス（Bacillus）細胞である。
【００７５】
本発明のカタラーゼをコードするカタラーゼ遺伝子が、その遺伝子の誘導性発現をもたらす1つ以上の制御配列の制御下にある場合、低用量の誘導因子（おそらく過酸化水素）で該微生物を処理することによって、発酵中の所望の時間にカタラーゼ生成を選択的に増加させ、それによって所望の発酵産物を過酸化水素による酸化から追加的に保護することを提供することができる。
【００７６】
微生物によって生成される物質（「発酵産物」とも呼ばれる）は好ましくはタンパク質である。該タンパク質は生産微生物に関して同種性又は異種性であってもよい。好ましくはその物質は酵素である。酵素は好ましくはプロテアーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、クチナーゼ、ぺクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群より選択され、好ましくはプロテアーゼである。好ましいプロテアーゼはサブチリシンプロテアーゼである。好ましいサブチリシンプロテアーゼは、サブチリシン168、サブチリシンBPN'、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンDY、サブチリシン147、サブチリシン309及びそれらのバリアントからなる群より選択される。
【００７７】
本発明の方法から生じる発酵ブロスは当技術分野で公知の方法によってさらに処理されてもよい。例えば、発酵産物は、当技術分野で公知の1つ以上の下流の方法、例えば、結晶化、沈殿、微量濾過、遠心分離、限外濾過、抽出、脱色、クロマトグラフィー、脱臭、噴霧乾燥又は蒸発によって精製又は部分精製することができる。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及び態様を示し、さらに説明するために提供され、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００７９】
材料と方法
バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）SAFR-032（Gioia J, Yerrapragada S, Qin X, Jiang H, Igboeli OC, et al. (2007) Paradoxical DNA repair and peroxide resistance gene conservation in Bacillus pumilus SAFR-032. PLoS One 2: e928）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）DSM13（Waschkau B, Waldeck J, Wieland S, Eichstadt R, Meinhardt F (2008) Generation of readily transformable Bacillus licheniformis mutants. Appl Microbiol Biotechnol 78: 181-188）、及び枯草菌（Bacillus subtilis）168（Burkholder PR, Giles NH, Jr. (1947) Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am J Bot 34: 345-348）が本研究で使用された。細胞は、1.8 mM KH2PO4、2mM CaCl2、1μM FeSO4 x 7H2O、10μM MnSO4 x 4H2O、4.5mMグルタミン酸、62.4μMトリプトファン、0.2％w/vグルコース及び0.04μMビオチンを添加した15mM (NH4)2SO4、8mM MgSO4 x 7H2O、27mM KCl、7mM Na-クエン酸 x 2H2O、50mM Tris-HCl (pH7.5)を含有する合成培地(chemically defined medium)中で37℃、180rpmで好気的に増殖させた。
【００８０】
変異株の構築
B.プミラス（B.pumilus）katX2遺伝子、スペクチノマイシン耐性マーカー、及び枯草菌（B.subtilis）の相同隣接配列を有する直鎖状DNA断片を、連結する上流／下流断片に相同な数個のヌクレオチドによって伸長されたプライマーを使用して構築した。枯草菌（B.subtilis）katAの調節構造を含む600kb上流断片をB.プミラス（B.pumilus）katX2遺伝子と結合し、ATG開始コドンで始まり終止コドンで終わるようにした。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、枯草菌（B.subtilis）katA終止コドンの直後に始まる600kb下流断片と融合した。第2の工程では、両方の融合産物を結合した。
【００８１】
PCR産物の精製、融合及び形質転換はReder et al.に従って行った。変異体は、200μg/mＬスペクチノマイシン含有LB寒天プレート上で選択した。ノックアウト及びノックイン変異体の確認のために、染色体DNAを増幅し、最終的にはEurofins（http://www.eurofinsgenomics.eu/de/home.aspx）によって配列決定した。
【００８２】
試料調製
細胞は、0.6のOD500で、様々な濃度のH2O2を用いて回収し、又はストレスを与えられた。2D-PAGE分析、蛍光チオール修飾アッセイ及びカタラーゼタンパク質蓄積の定量のために使用される試料は50μM（枯草菌（B.subtilis）、枯草菌（B.subtilis）katA::katX2、B.リケニフォルミス（B.licheniformis））及び2mM（B.プミラス（B.pumilus））のH2O2でそれぞれストレスを与えられた。カタラーゼ活性アッセイに使用される試料は、これらの濃度の10分の1を使用してストレスを与えられた。
【００８３】
細胞は、遠心分離（20000 x g、4℃、10分）、続いて100mM Tris-HCl緩衝液、pH7.5を用いた2回の洗浄工程によって回収した。細胞破壊は、1.4mM PMSFを含有するTE緩衝液（10mM Tris、pH7.5、10mM EDTA）に再懸濁した後に超音波処理によって行われた。絶対タンパク質定量には、PMSFを含まないTE緩衝液を用いたタンパク質の溶液内消化を使用した。タンパク質濃度はRotiNanoquant（Roth）で決定した。
【００８４】
2D-PAGE、ゲル撮像、相対定量及びタンパク質同定
200μgのタンパク質を2Mチオ尿素／8M尿素で306μLに調整し、34μL CHAPS溶液（20mM DTT、1％ w/v CHAPS、0.5% v/v Pharmalyte、pH4〜7又は3〜10）と混合し、4〜7のpH範囲の市販のIPGストリップ（SERVA Electrophoresis）にロードした。IEFをBuettner et al.（Buettner K, Bernhardt J, Scharf C, Schmid R, Maeder U, et al. (2001) A comprehensive two-dimensional map of cytosolic proteins of Bacillus subtilis. Electrophoresis 22: 2908-2935）に従って行った。フォーカスしたタンパク質を含有するストリップの平衡化を、Goerg et al.（Goerg A, Boguth G, Obermaier C, Posch A, Weiss W (1995) Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG-Dalt): the state of the art and the controversy of vertical versus horizontal systems. Electrophoresis 16: 1079-1086）に説明されるように、DTTとヨードアセトアミドをそれぞれ含有する溶液中で行った。12.5％アクリルアミド及び2.6％ビスアクリルアミドのゲルを第2の次元における分離に使用した。ゲルはFlamingo Fluorescent Gel Stain（Bio-Rad Laboratories）を用いて製造業者の指示にしたがって染色した。
【００８５】
ゲル画像及びスポット定量の解析は、Delta2Dソフトウェアversion 4.4（Decodon）を使用して、Wolf et al.に説明されるように行った（Wolf C, Hochgraefe F, Kusch H, Albrecht D, Hecker M, et al. (2008) Proteomic analysis of antioxidant strategies of Staphylococcus aureus: diverse responses to different oxidants. Proteomics 8: 3139-3153）。タンパク質スポットはゲルから切り出して（Ettan Spot Picker, GE Healthcare）、消化してMALDI標的（Ettan Spot Handling Workstation, GE Healthcare）上にスポットした。標的のMS分析はProteome Analyzer 4800（Applied Biosystems）を使用してMALDI-TOF-MS/MSによって行い、ピークリストは、Wolf et al.（Wolf C, Hochgraefe F, Kusch H, Albrecht D, Hecker M, et al. (2008) Proteomic analysis of antioxidant strategies of Staphylococcus aureus: diverse responses to different oxidants. Proteomics 8: 3139-3153）によって説明されるように、MASCOTサーチエンジンversion 2.1.0.4（Matrix Science）と探索パラメーターを用いて探索した。
【００８６】
無標識定量（LC-IMSE）
トリプシンを用いたタンパク質抽出物の溶液内消化は、以前に記載された方法（Muntel J, Fromion V, Goelzer A, Maabeta S, Maeder U, et al. (2014) Comprehensive absolute quantification of the cytosolic proteome of Bacillus subtilis by data independent, parallel fragmentation in liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS(E)). Mol Cell Proteomics 13: 1008-1019）に従って行われた。ステージチップを使用する質量分析の解析の前のペプチドの脱塩は、標準的プロトコル（Rappsilber J, Mann M, Ishihama Y (2007) Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc 2: 1896-1906）を使用して達成した。絶対定量には、ペプチド混合物に、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（Waters）のトリプシン消化物を終濃度50fmol/μLで添加した。
【００８７】
ペプチド混合物を分離して試料を質量分析機に導入するために、nanoACQUITY（商標）UPLC（商標）システム（Waters）を使用した。ペプチド混合物は分析カラム（nanoACQUITY（商標）UPLC（商標）カラム、BEH300 C18、1.7mm、75mm_200mm、Waters）に直接ロードした。IMSE（イオン移動度分離を用いたMSE）のためのペプチドの分離は、5％緩衝液Bから40％緩衝液Bへの90分の勾配を用いて行った。すべてのMSE解析は、以前に記載されたように（Muntel J, Fromion V, Goelzer A, Maabeta S, Maeder U, et al. (2014) Comprehensive absolute quantification of the cytosolic proteome of Bacillus subtilis by data independent, parallel fragmentation in liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS(E)). Mol Cell Proteomics 13: 1008-1019）行った。唯一の改変は、プリカーサーイオントレースにおける4eVと、フラグメントイオントレースのための25-45eVランプとの間で衝突エネルギーを交互に入れ替えたことだった。波の速度は1,000-400m/sから傾斜させ、波の高さは40Vに設定した。
【００８８】
LC-IMSEデータはPLGS v3.0.1を使用して処理した。処理パラメータは以下のように設定した：クロマトグラフィーピーク幅及びMS TOF解像度は自動に設定し、基準物質窓（lock mass window）を0.25Da、低エネルギー閾値を200.0カウント、上昇エネルギー閾値を20.0カウント、強度閾値を750カウントとして、基準物質電荷2（lock mass charge 2）を785.8426Da/eに設定した。B.プミラス（B.pumilus）SAFR032 KatXタンパク質のアミノ酸配列、実験室混入物及び酵母ADH1配列（8,438エントリー）を加えたランダム化枯草菌168データベース（NCBI、version 2014年8月）に対してデータを探索した。陽性タンパク質の同定には、以下の基準を満たす必要があった：ペプチド当たり1フラグメントイオンの一致、タンパク質当たり5フラグメントイオンの一致、タンパク質当たり1ペプチドの一致；2欠落切断が許容され、主要消化試薬はトリプシンであり、固定修飾はカルバミドメチル化C（+57.0215）であり、可変修飾は脱アミド化N、Q（+0.9840）、酸化M（+15.9949）、ピロリドンカルボン酸N-Term（-27.9949）である。タンパク質偽発見率（FDR）は5％に設定された。最終的な解析には2ペプチド同定だけが考慮された。時点当たり3回の技術的繰り返しのうち少なくとも2回でタンパク質が同定されなければならず、これによりタンパク質レベルのFDRが3%未満になった。各時点につき、3回の生物学的レプリケートを解析した。
【００８９】
IMSEモードによって生じたデータは、PLGSソフトウェアによって各試料について作成されたイオン説明出力ファイルに基づく補正係数を実行することによって、検出器飽和効果について補正された。補正係数（cf）は以下の式を使用して計算された。
ΣIペプチド／ΣI産物* 1/m=cf
ここで、ΣIペプチド及びΣI産物は、一致ペプチド／産物強度合計であり、mは試料中で定量されたすべてのタンパク質について計算されたΣIペプチド／ΣI産物比率の中央値である。
【００９０】
カタラーゼ活性アッセイ
細胞は0D500nmが0.6になるまで増殖させた。アッセイ開始直前、25μg/mLラクトペルオキシダーゼ及び0.5Mジカルボキシジンジヒドロクロリド（共にSigma-Aldrich）の作業溶液を調製した。細胞培養物に終濃度2mMの過酸化水素を加えた。ある時点での培養物中の残存H2O2濃度を測定するために、25μLの培養物を500μL作業溶液に混合し、450nmでの吸光度を記載されているようにして測定した（Ma Q, Wood TK (2011) Protein acetylation in prokaryotes increases stress resistance. Biochem Biophys Res Commun 410: 846-851）。
【００９１】
細胞質タンパク質抽出物によるH2O2分解を決定するために同じプロトコルを使用した。5μgのタンパク質抽出物をカタラーゼアッセイ緩衝液（Catalase Assay Kit, BioVision）で200μLまでフィルアップした。H2O2を加えて終濃度2mMとし、抽出物を30℃でインキュベートした。残存H2O2濃度を規定の時点で上述のように測定した。
【００９２】
蛍光チオール修飾アッセイとタンパク質修飾の解析
可逆的に酸化されたシステインを有するタンパク質はHochgraefe et al.（Hochgraefe F, Mostertz J, Albrecht D, Hecker M (2005) Fluorescence thiol modification assay: oxidatively modified proteins in Bacillus subtilis. Mol Microbiol 58: 409-425）によって記述されたプロトコルを使用して可視化した。タンパク質抽出物は、記載されているようにして精製し事前染色し、4〜7のpH範囲のIPGストリップ（SERVA Electrophoresis）にロードした。2D-PAGEを暗所で上述の通り行った。可逆的に酸化されたタンパク質の蛍光スキャンに続いて、ゲルをFlamingo Fluorescent Gel Stain（Bio-Rad Laboratories）で染色した。スポット定量とMS解析を上述の通り行った。
【００９３】
可能性のある修飾の解析のために、タンパク質スポットを上述の通りゲルから切り出し、脱染し（0.2M NH4HCO3、30％アセトニトリル）、トリプシン及びキモトリプシン（共にPromega）で二重消化した。ペプチド抽出は、ゲル片を超純水（Sartorius Stedimユニットで調製）で覆い、超音波水槽中で15分インキュベーションすることによって行った。ペプチドはOrbitrap Elite（Thermo Fisher Scientific）を使用してLC-MS/MSによって検出した。データベース探索は、枯草菌（B.subtilis）168及びB.プミラス（B.pumilus）SAFR-032データベースに対してSEQUESTソフトウェアv28(rev.12、Thermo Fisher Scientific)を用いて行った。データはScaffoldプロテオームビューアーversion 4.0.5を使用して解析した。
【００９４】
〔実施例１〕
対照条件下では、枯草菌（B.subtilis）katA::KatX2変異体の増殖挙動には、野生型株と比べて差はなかった。野生型株と枯草菌（B.substilis）katA::katX2変異体を50μM H2O2で処理した後も、両株の増殖に対して小さな影響のみを検出できるだけだった（図２Ａ）。対照的に、細胞を200μM H2O2で処理したときは、野生型に比べて変異株は、増殖速度に対する有意に小さな影響を示した（図２Ｂ）。変異体細胞は光学密度が約1になるまで増殖し続けたのに対して、野生型は約0.75で最終ODに達した。B.プミラス（B.pumilus）が耐えられる濃度である2mMまで過酸化水素濃度を増加させると、両方の枯草菌（B.subtilis）株でほぼ完全な増殖停止がもたらされた（図２Ｃ）。
【００９５】
枯草菌（B.subtilis）168株及びkatA:katX2変異体の生存を500μM H2O2を使用して分析した。過酸化水素処理後3分では野生型細胞の23％が生き残った。同じ時点でkatA::katX2変異体細胞の約50％が依然として生存していた。H2O2を加えた15分後ではkatX2発現細胞のうち32％が生存していた一方で、野生型細胞の18％だけがこの時点で生き残っていた。これらのデータは、この酸化ストレス条件下では、katX2発現細胞の生存性が1.5〜2倍高いことを示す。
〔実施例２〕
【００９６】
対照条件下では、試験されたすべての抽出物中で、休止期カタラーゼKatAとKatX2の相対スポット容量はそれぞれ約0.4〜0.5％だった。KatX2スポット容量は、H2O2処理の20分後にB.プミラス（B.pumilus）細胞で約1.4倍増加しただけだった。枯草菌（B.subtilis）細胞では、本発明者らはH2O2処理後にKatA量が0.39％から1.23％へ3倍増加することを検出し、そのことはB.プミラス（B.pumilus）細胞に比べて多い量の酵素が存在したことを示した。H2O2を加えた後に同様に約3倍増加することが、枯草菌（B.subtilis）katA::katX2変異体のKatX2スポットについても観察された。
【００９７】
細胞質中のカタラーゼの絶対濃度について情報を得るために、ゲル無し及び無標識の定量方法LC-IMSEを行った。この実験の結果により、対数増殖中の枯草菌（B.subtilis）細胞でKatAの濃度が0.0165fmol/ngタンパク質抽出物であったことが明らかになった。KatAの蓄積は、過酸化水素ストレス細胞でタンパク質抽出物ng当たり0.11fmolまで増加した。B.プミラス（B.pumilus）では、本発明者らは、タンパク質抽出物ng当たり0.0385fmolのKatX2量を測定した。B.プミラス（B.pumilus）細胞では、H2O2を加えて20分後、カタラーゼの蓄積はタンパク質抽出物ng当たり約0.1fmolまで増加した。基礎蓄積量が低いことから、H2O2処理後の誘導率は枯草菌（B.subtilis）細胞で有意に高かった。
【００９８】
対数増殖中の枯草菌（B.subtilis）katA::katX2変異体細胞は、タンパク質抽出物ng当たり0.026fmol KatX2カタラーゼを含有した。過酸化水素処理に続いて、KatX2の蓄積はタンパク質抽出物ng当たり約0.14fmolまで増加し、したがって、これはH2O2ストレス負荷B.プミラス（B.pumilus）細胞におけるKatX2蓄積よりも高かった。
【００９９】
〔実施例３〕
どのように細胞が過酸化水素に対処するのかを分析するために、OD500が0.6の増殖中の細胞に2mM H2O2を加えた。B.プミラス（B.pumilus）培養物中では、枯草菌（B.subtilis）又はB.リケニフォルミス（B.licheniformis）培養物中よりも、過酸化水素濃度が有意に速く減少することが観察された（図３）。2分後、加えたH2O2の10％未満が培養物中に残った。添加3分後、H2O2はほぼ完全に消失した。同時に、枯草菌（B.subtilis）及びB.リケニフォルミス（B.licheniformis）培養物中で最初のH2O2濃度の約3分の1が残った。
【０１００】
第2のアプローチでは、カタラーゼによるH2O2の分解を分析するために、等量のタンパク質を含有する細胞抽出物を使用した。このために、対数増殖中の細胞から、並びに少量のH2O2（枯草菌（B.subtilis）及びB.リケニフォルミス（B.licheniformis）には5μM、B.プミラス（B.pumilus）には200μM）によって事前にストレスを与えられた細胞から、抽出物を調製した（図４）。図４に示されるように、添加したH2O2濃度は事前にストレスを与えた抽出物中でより速く減少した。両方の場合で、B.プミラス（B.pumilus）細胞抽出物は、他の2つの生物に由来する抽出物よりも速く過酸化水素を分解した。枯草菌（B.subtilis）及びB.リケニフォルミス（B.licheniformis）タンパク質抽出物は10分以内に添加されたH2O2の約50％だけを分解した一方、B.プミラス（B.pumilus）抽出物によってその80〜90％が分解された。
【０１０１】
対数増殖中のストレスを与えられていない枯草菌（B.subtilis）katA::KatX2変異体細胞に由来する抽出物の分解速度は野生型によって示されるものと同等であった。事前にストレスを与えられた変異体細胞の抽出物は、他の株や生物に由来する対応する抽出物よりもはるかに速く、事前にストレスを与えられたB.プミラス（B.pumilus）細胞抽出物よりもさらに速く、添加されたH2O2を分解した（図５）。ストレスを与えられたB.プミラス（B.pumilus）において観察される誘導速度に比べて、過酸化水素処理後の枯草菌（B.subtilis）中の組換えカタラーゼKatX2のより高い誘導速度は、細胞中でより多い量のカタラーゼをもたらした。
【０１０２】
〔実施例４〕
B.プミラス（B.pumilus）KatX2タンパク質における可逆的チオール修飾を上述の通り分析した。この方法は、1つはタンパク質蓄積に向け、1つは可逆的チオール酸化に向けた、2つの異なる染色方法を使用する。タンパク質の定量は相対的スポット容量（2D-ゲル上に見えるすべてのスポットの容量に比較されるスポットの容量）を使用して行われる。チオール修飾染色及びタンパク質蓄積染色におけるタンパク質スポットのスポット容量間の比率は、タンパク質中のシステイン残基の可逆的酸化の量の指標である。対数増殖中の細胞では、KatX2システイン残基はほぼ完全に還元される。過酸化水素処理によって可逆的システイン酸化の有意な増加が引き起こされた。チオール修飾のタンパク質蓄積に対する比率は約0.5から1.36に増加した。
【０１０３】
さらに、2D-ゲルから切り出した異なるカタラーゼスポットにおいてシステイン残基の不可逆的酸化を示すために、LC-MS/MS解析を行った。この不可逆的酸化は蛍光チオール修飾アッセイによっては調べることができない。+32及び+48の質量シフトが、枯草菌（B.subtilis）katA::katX2変異体によって発現されるKatX2において検出され、これはスルフィン酸（+32）及びスルホン酸（+48）形成を表している。B.プミラス（B.pumilus）では、KatX2システイン461におけるスルホン酸の形成のみが検出された。
【図１】
2018537108.tif 000007
【図２】
2018537108.tif 000008
【図３】
2018537108.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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