(57)【要約】  本明細書において、ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有する単一特異性ＨＣＡｂ抗体、ならびにＰＤＧＦ‐２及びＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ及びＡＮＧ‐２に対する抗原結合特異性を有する二重特異性抗体を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有する重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＨＣＡｂが、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、または５０のうちの１つの可変重鎖（ＶＨ）領域配列を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項２】
ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＨＣＡｂのＶＨ領域配列が、前記配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、または５０のうちの１つの配列に対し、少なくとも８５％の同一性を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項３】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ‐ＢＢである、請求項１または２のいずれかに記載のＨＣＡｂ。
【請求項４】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号１１〜１３、１５〜１７、１９〜２１、２３〜２５、２７〜２９、３１〜３３、３５〜３７、３９〜４１、４３〜４５、４７〜４９及び５１〜５３から選択される、前記ＨＣＡｂ。
【請求項５】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、１つ以上の前記ＣＤＲが、配列番号１１〜１３、１５〜１７、１９〜２１、２３〜２５、２７〜２９、３１〜３３、３５〜３７、３９〜４１、４３〜４５、４７〜４９及び５１〜５３から選択される前記ＣＤＲ配列に少なくとも８５％の同一性を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項６】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号１１〜１３を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項７】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号１５〜１７を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項８】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号１９〜２１を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項９】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号２３〜２５を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１０】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号２７〜２９を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１１】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号３１〜３３を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１２】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号３５〜３７を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１３】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号３９〜４１を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１４】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号４３〜４５を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１５】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号４７〜４９を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１６】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲが配列番号５１〜５３を有する、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１７】
前記ＶＨ領域の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、付加、または欠失しており、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項１、２、または４〜１６のいずれか一項に記載のＨＣＡｂ。
【請求項１８】
ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲ１がＧＦＴＦＳＳＹＡ＿（配列番号２３）を有し、７位のアミノ酸が任意のアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、前記ＨＣＡｂ。
【請求項１９】
前記７位のアミノ酸が保存的アミノ酸で置換されており、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項１８に記載のＨＣＡｂ。
【請求項２０】
前記７位のアミノ酸が同じクラスのアミノ酸で置換されており、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項１８に記載のＨＣＡｂ。
【請求項２１】
ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲ２がＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号２４）を有し、３位または８位のアミノ酸の１つ以上が任意のアミノ酸で置換されており、前記ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、前記ＨＣＡｂ。
【請求項２２】
前記３位または８位のアミノ酸の１つ以上が保存的アミノ酸で置換されており、前記ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項２１に記載のＨＣＡｂ。
【請求項２３】
前記３位または８位のアミノ酸の１つ以上が同じクラスのアミノ酸で置換されており、前記ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項２１に記載のＨＣＡｂ。
【請求項２４】
ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、前記ＣＤＲ３がＲＮＳＥＩＦＭＶＫＧＶＩＱＹＮＳ（配列番号２５）を有し、３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位のアミノ酸の１つ以上が任意のアミノ酸で置換されており、前記ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、前記ＨＣＡｂ。
【請求項２５】
前記３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位のアミノ酸の１つ以上が保存的アミノ酸で置換されており、前記ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項２４に記載のＨＣＡｂ。
【請求項２６】
前記３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位のアミノ酸の１つ以上が同じクラスのアミノ酸で置換されており、前記ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している、請求項２４に記載のＨＣＡｂ。
【請求項２７】
ＨＣＡｂ  Ｐ３６Ｆ３、Ｐ３６Ｅ１０、Ｐ３６Ｅ８、Ｐ３６Ｃ１２、Ｐ３６Ａ４、Ｐ３６Ａ３、Ｐ３６Ｄ９、Ｐ３６Ｅ４、Ｐ３６Ｅ９、Ｐ３６Ｇ９、及び／またはＰ３６Ｈ４とＰＤＧＦ‐ＢＢとの結合に競合するヒトまたはヒト化抗体。
【請求項２８】
ＰＤＧＦに対する第一の抗原結合特異性、及びＶＥＧＦに対する第二の抗原結合特異性を有する二重特異性抗体。
【請求項２９】
前記第一の抗原結合特異性が、請求項１、２、または４〜２６のいずれか一項に記載のＨＣＡｂによって表される、請求項２８に記載の二重特異性抗体。
【請求項３０】
前記第二の抗原結合特異性が、ベバシズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される、請求項２８に記載の二重特異性抗体。
【請求項３１】
前記第二の抗原結合特異性が、ラニビズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される、請求項２８に記載の二重特異性抗体。
【請求項３２】
ＰＤＧＦに対する第一の抗原結合特異性、及びＡＮＧ‐２に対する第二の抗原結合特異性を有する二重特異性抗体。
【請求項３３】
前記第一の抗原結合特異性が、請求項１、２、または４〜２７のいずれか一項に記載のＨＣＡｂによって表される、請求項３２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
前記第二の抗原結合特異性が、ＨＣＡｂ  Ａ３３Ａ８（配列番号５４）、Ａ１Ｇ２（配列番号５５）、Ａ１Ｆ８（配列番号５６）、Ａ２Ｂ６（配列番号５７）、またはＡ１Ｂ１（配列番号５８）によって表される、請求項３２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３５】
請求項１、２、または４〜２７のいずれか一項に記載のＰＤＧＦ結合型ＨＣＡｂ、または請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌疾患の治療方法。
【請求項３６】
前記癌疾患Ｉが、萎縮型加齢性黄斑変性症、滲出型加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視関連脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、異常な角膜血管新生、結膜翼状片、網膜下浮腫、または網膜内浮腫からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記異常な角膜血管新生が、角膜炎、角膜移植、ケロイド形成または低酸素症の結果である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象における癌疾患の治療用の薬剤の製造における、請求項１、２、または４〜２７のいずれか一項に記載のＶＨ領域を有するＰＤＧＦ結合型ＨＣＡｂ、または請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項３９】
前記癌疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視関連脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、異常な角膜血管新生、結膜翼状片、網膜下浮腫、または網膜内浮腫を含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記異常な角膜血管新生が、角膜炎、角膜移植、ケロイド形成または低酸素症の結果である、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年８月１４日に出願された米国仮出願第６２／２０５，１９１号及び２０１６年５月９日に出願された米国仮出願第６２／３３３，７７２号の利益を主張する。前記出願はいずれもその内容全体を参照として本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
既存の脈管構造からの新規血管形成である血管新生は、未熟児網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫及び加齢性黄斑変性症のような失明を引き起こすいくつかの網膜血管疾患の主要な成分である。眼血管新生は、眼内の異常なまたは過剰な血管の形成である。眼血管新生は、糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性症の両方に関連することが示されている。
【０００３】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高齢者集団における失明の主要な原因であり、萎縮型及び滲出型ＡＭＤ形態として認識されている。萎縮型すなわち非滲出性形態は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮及び肥大の両方の変化を伴う。萎縮型形態は、黄斑ドルーゼを特徴とし、これは死細胞及び代謝産物を含む色素沈着領域であり、網膜を歪ませ、最終的に急性視力喪失を引き起こす。非滲出型ＡＭＤ（萎縮型形態）を有する患者は、滲出型、すなわち滲出性もしくは新生血管性ＡＭＤに進行する可能性があり、その場合、網膜下に病理性の脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）が発生し、体液及び血液が漏出し、最終的に、未処理のまま放置すれば比較的短い時間枠で、中心視力喪失性の円盤状瘢痕を生じる。脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）は、脈絡膜毛細血管網からブルッフ膜／ＲＰＥ界面を経て神経網膜へと成長し、網膜剥離、網膜下及び網膜内浮腫、ならびに瘢痕化をもたらす。
【０００４】
糖尿病は、多くの様式で眼に影響を及ぼし得る。糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、眼の後ろ（網膜）の光感受性組織の血管への損傷から生じる糖尿病の合併症である。糖尿病性網膜症は、初期は、症状をまったく引き起こさないか、または軽度の視力障害のみを引き起こし得る。しかしながら、糖尿病性網膜症は、最終的に失明をもたらし得る。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、黄斑内の血管からの流体の漏出による糖尿病における網膜の腫脹である。
【０００５】
［概要］
本明細書において、ＰＤＧＦに対する特異性を有する単一特異性重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）ならびにＰＤＧＦ及びＡＮＧ‐２またはＶＥＧＦに対する特異性を有する二重特異性抗体を開示する。
【０００６】
したがって、いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有する重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）を開示する。特定の実施形態では、ＨＣＡｂは、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、または５０のうちの１つの可変重鎖（ＶＨ）配列を有する。他の実施形態では、ＨＣＡｂ  ＶＨ領域は、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、または５０のうちの１つの可変領域配列に対し、少なくとも８５％の同一性を有する。
【０００７】
さらに他の実施形態では、ＨＣＡｂの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１１〜１３、１５〜１７、１９〜２１、２３〜２５、２７〜２９、３１〜３３、３５〜３７、３９〜４１、４３〜４５、４７〜４９、及び５１〜５３から選択される。他の実施形態では、ＨＣＡｂ  ＣＤＲは、配列番号１１〜１３、１５〜１７、１９〜２１、２３〜２５、２７〜２９、３１〜３３、３５〜３７、３９〜４１、４３〜４５、４７〜４９、及び５１〜５３から選択されるＣＤＲ配列に対し、少なくとも８５％の同一性を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号１１〜１３のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号１５〜１７のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号１９〜２１のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号２３〜２５のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号２７〜２９のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号３１〜３３のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号３５〜３７のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号３９〜４１のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号４３〜４５のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号４７〜４９のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂは、配列番号５１〜５３のＣＤＲを有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＨＣＡｂ  ＶＨ領域配列の少なくとも１つのアミノ酸を置換、付加、または欠失させるとともに、ＨＣＡｂはＰＤＧＦに対するその特異性を保持している。
【００１０】
また、本明細書において、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、ＣＤＲ１がＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号２３）を有し、７位のアミノ酸が任意のアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ  ‐ＢＢに対するその特異性を保持しているＨＣＡｂも開示する。他の実施形態では、７位のアミノ酸は保存的アミノ酸で置換され、ＨＣＡｂはＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。さらに他の実施形態では、７位のアミノ酸は同じクラスのアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂはＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。
【００１１】
また、本明細書において、ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、ＣＤＲ２がＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号２４）を有し、３位または８位のアミノ酸の１つ以上が任意のアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持しているＨＣＡｂも開示する。他の実施形態では、３位または８位のアミノ酸の１つ以上が保存的アミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。さらに他の実施形態では、３位または８位のアミノ酸の１つ以上が同じクラスのアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂはＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。
【００１２】
また、本明細書において、ＰＤＧＦに対する抗原結合特異性を有するＨＣＡｂであって、ＣＤＲ３がＲＮＳＥＩＦＭＶＫＧＶＩＱＹＮＳ（配列番号２５）を有し、３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位のアミノ酸の１つ以上が任意のアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。他の実施形態では、位置３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１６位のアミノ酸の１つ以上が保存的アミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。さらに他の実施形態では、３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１６位のアミノ酸の１つ以上が同じクラスのアミノ酸で置換され、ＨＣＡｂがＰＤＧＦ‐ＢＢに対するその特異性を保持している。
【００１３】
本明細書において、ＰＤＧＦ‐ＢＢへの結合に関して、ＨＣＡｂ  Ｐ３６Ｆ３、Ｐ３６Ｅ１０、Ｐ３６Ｅ８、Ｐ３６Ｃ１２、Ｐ３６Ａ４、Ｐ３６Ａ３、Ｐ３６Ｄ９、Ｐ３６Ｅ４、Ｐ３６Ｅ９、Ｐ３６Ｇ９、及び／またはＰ３６Ｈ４と競合するヒトまたはヒト化抗体も開示する。
【００１４】
特定の実施形態では、ＰＤＧＦに対する第一の抗原結合特異性及びＶＥＧＦに対する第二の抗原結合特異性を有する二重特異性抗体を提供する。他の実施形態では、第一の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ  Ｐ３６Ｆ３  Ｐ３６Ｅ１０、Ｐ３６Ｅ８、Ｐ３６Ｃ１２、Ｐ３６Ａ４、Ｐ３６Ａ３、Ｐ３６Ｄ９、Ｐ３６Ｅ４、Ｐ３６Ｅ９、Ｐ３６Ｇ９、及び／またはＰ３６Ｈ４またはそのＶＨドメインによって表される。さらに他の実施形態では、第二の抗原結合特異性は、ベバシズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される。特定の実施形態では、第二の抗原結合特異性は、ラニビズマブ、またはそのＶＨもしくはＶＬ領域によって表される。
【００１５】
また、ＰＤＧＦに対する第一の抗原結合特異性及びＡＮＧ‐２に対する第二の抗原結合特異性を有する二重特異性抗体も開示する。特定の実施形態では、第一の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ  Ｐ３６Ｆ３、Ｐ３６Ｅ１０、Ｐ３６Ｅ８、Ｐ３６Ｃ１２、Ｐ３６Ａ４、Ｐ３６Ａ３、Ｐ３６Ｄ９、Ｐ３６Ｅ４、Ｐ３６Ｅ９、Ｐ３６Ｇ９及び／またはＰ３６Ｈ４またはそのＶＨドメインによって表される。他の実施形態では、第二の抗原結合特異性は、ＨＣＡｂ  Ａ３３Ａ８（配列番号５４）、Ａ１Ｇ２（配列番号５５）、Ａ１Ｆ８（配列番号５６）、Ａ２Ｂ６（配列番号５７）、もしくはＡ１Ｂ１（配列番号５８）、またはその少なくとも１つのＣＤＲを有する抗体によって表される。
【００１６】
また、本明細書において、本明細書中に開示するＶＨ領域を有するＰＤＧＦ結合ＨＣＡｂ、または本明細書中に開示する二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、眼科疾患の治療方法も開示する。
【００１７】
また、本明細書において、本明細書中に開示するＶＨ領域を有するＰＤＧＦ結合性ＨＣＡｂまたはそれを必要とする対象内の眼科疾患を治療するための医薬品の製造における本明細書中に開示する二重特異性抗体の使用も開示する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、眼科疾患は、萎縮型（非滲出性）加齢性黄斑変性症、滲出型（滲出性または新生血管性）加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視関連脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、異常な角膜血管新生、結膜翼状片、網膜下浮腫または網膜内浮腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異常な角膜血管新生は、角膜炎、角膜移植、ケロイド形成または低酸素症の結果である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ＨＣＡｂトランスジェニックマウスにおけるヒト免疫グロブリン遺伝子座（ハーバー抗体）を示す。
【図１Ｂ】ＨＣＡｂマウスによって産生されるＨＣＡｂ抗体構造を示す。
【図２Ａ】単一ドメインＶＨを示す。
【図２Ｂ】二重特異性ＨＣＡｂ抗体を示す。
【図２Ｃ】二重特異性ＨＣＡｂ抗体を示す。
【図２Ｄ】四量体抗体／ＶＨ二重特異性抗体を示す。
【図２Ｅ】二重特異性Ｆａｂ／ＶＨ抗体を含む二重特異性抗体のいくつかの形態を示す。第二の抗原結合ドメインを、卵形で示す。第二の抗原結合ドメインの任意の位置を、アスタリスクによって示す。
【図３】本明細書に開示するヒト化ＨＣＡｂの遺伝子構造を示す。
【図４】Ａ３３Ａ８／Ｐ３６Ｆ３  ＨＣＡｂ二重特異性抗体の結合特性分析を示す（その一例を図２Ｂに示す）。
【図５】ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図６】Ａ３３Ａ８／Ｐ３６Ｆ３  ＨＣＡｂ二重特異性抗体の結合特性分析を示す（その一例を図２Ｂに示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において、ＰＤＧＦに対する特異性を有する単一特異性重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）、ならびにＰＤＧＦ及びＡＮＧ‐２、またはＰＤＧＦ及びＶＥＧＦに対する特異性を有する二重特異性抗体を開示する。
【００２１】
ＰＤＧＦは、既存の血管組織からの血管の成長である血管形成（血管新生）において重要な役割を果たす。ＰＤＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞及びグリア細胞を含む間葉系起源の細胞に対する強力な分裂促進因子である。ＰＤＧＦは、２つのＡ（‐ＡＡ）または２つのＢ（‐ＢＢ）サブユニット、またはこの２種の組合せ（‐ＡＢ）からなる二量体糖タンパク質である。Ａサブユニットは２１１残基のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ０４０８５；  配列番号１  ＭＲＴＬＡＣＬＬＬＬＧＣＧＹＬＡＨＶＬＡＥＥＡＥＩＰＲＥＶＩＥＲＬＡＲＳＱＩＨＳＩＲＤＬＱＲＬＬＥＩＤＳＶＧＳＥＤＳＬＤＴＳＬＲＡＨ  ＧＶＨＡＴＫＨＶＰＥＫＲＰＬＰＩＲＲＫＲＳＩＥＥＡＶＰＡＶＣＫＴＲＴＶＩＹＥＩＰＲＳＱＶＤＰＴＳＡＮＦＬＩＷＰＰＣＶＥＶＫＲＣＴＧ  ＣＣＮＴＳＳＶＫＣＱＰＳＲＶＨＨＲＳＶＫＶＡＫＶＥＹＶＲＫＫＰＫＬＫＥＶＱＶＲＬＥＥＨＬＥＣＡＣＡＴＴＳＬＮＰＤＹＲＥＥＤＴ  ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰＴ）であり、Ｂサブユニットは２４１残基のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ０１１２７、配列番号２  ＭＮＲＣＷＡＬＦＬＳＬＣＣＹＬＲＬＶＳＡＥＧＤＰＩＰＥＥＬＹＥＭＬＳＤＨＳＩＲＳＦＤＤＬＱＲＬ  ＬＨＧＤＰＧＥＥＤＧＡＥＬＤＬＮＭＴＲＳＨＳＧＧＥＬＥＳＬＡＲＧＲＲＳＬＧＳＬＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩ  ＤＲＴＮＡＮＦＬＶＷＰＰＣＶＥＶＱＲＣＳＧＣＣＮＮＲＮＶＱＣＲＰＴＱＶＱＬＲＰＶＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶＴＬＥＤ  ＨＬＡＣＫＣＥＴＶＡＡＡＲＰＶＴＲＳＰＧＧＳＱＥＱＲＡＫＴＰＱＴＲＶＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＨＲＫＦＫＨＴＨＤＫＴＡＬＫＥ  ＴＬＧＡ）である。したがって、様々な実施形態において、ＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、及び／またはＰＤＧＦ‐ＡＢ、またはその断片に対する特異性を有する抗体を開示する。マウス及びヒトの両方において、ＰＤＧＦシグナル伝達ネットワークは、４つのリガンドＰＤＧＦＡ〜Ｄ、ならびに２つの受容体ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ（受容体チロシンキナーゼ）からなる。すべてのＰＤＧＦは、分泌性ジスルフィド結合型ホモ二量体として機能するが、ＰＤＧＦＡとＢのみが機能的ヘテロ二量体を形成することができる。
【００２２】
したがって、特定の実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、またはＰＤＧＦ‐ＡＢである。
【００２３】
したがって、本明細書において、ＰＤＧＦに対する単一特異性及び二重特異性ＨＣＡｂ抗体、ならびに開示する抗体を用いた眼疾患の治療方法を開示する。
【００２４】
疾患を治療するための抗体は当該技術分野において周知である。本明細書中で使用する用語「抗体」とは、抗原結合部位を含む１つ以上のポリペプチド鎖を有する単量体または多量体タンパク質を指す。抗体は抗原に特異的に結合し、また、抗原の生物学的活性を調節可能なものであってもよい。本明細書中で使用する用語「抗体」は、「完全長抗体」及び「抗体断片」を含み得る。本明細書中で使用する用語「結合部位」または「抗原結合部位」とは、リガンドが実際に結合する抗体分子上の領域（複数可）を指す。用語「抗原結合部位」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２５】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば、自然抗体は単一特異性である。本明細書中で使用する用語「単一特異性」抗体とは、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を意味する。本明細書中に開示する一価の単一特異性抗体は、ＰＤＧＦに特異的である。
【００２６】
「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体を指す。本明細書中に開示する二重特異性抗体は、ＰＤＧＦ、及びＶＥＧＦまたはＡＮＧ‐２に特異的である。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「価の」とは、抗体分子中の特定の数の結合部位の存在を示す。したがって、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗体分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを示す。本明細書中に開示する二重特異性抗体は、「二価」である。しかしながら、２つの抗原結合部位が同じ抗原に結合する単一特異性二価抗体は、本開示の範囲に含まれる。単一特異性二価抗体の抗原結合部位は、抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープのいずれかに結合することができる。
【００２８】
本明細書における「全長抗体」とは、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳類において、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、２種類の免疫グロブリン鎖の同一の２つの対からなり、各対はそれぞれ軽鎖及び重鎖を１つ有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメイン  ＶＬ及びＣＬを、ならびに各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を有する。いくつかの哺乳類、例えばラクダ及びラマでは、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖（ＨＣＡｂ）のみからなり、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を有する。
【００２９】
天然の抗体構造ユニットは、通常、四量体を有する。各四量体は、通常、各対が１つの「軽」鎖（一般的に約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（一般的に約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する２つの同一のポリペプチド鎖の対からなる。軽鎖及び重鎖の各々は、可変領域及び定常領域と呼ばれる２つの異なる領域から構成される。免疫グロブリンのＩｇＧクラスに関して、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、重鎖定常ドメイン３と呼ばれるＶＨ‐ＣＨ１‐ＣＨ２‐ＣＨ３の順に連結した４つの免疫グロブリンドメインからなる（ＶＨ‐Ｃγ１‐Ｃγ２‐Ｃγ３とも呼ばれ、それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメインγ１、重鎖定常ドメインγ２及び重鎖定常ドメインγ３を表す）。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、それぞれ、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを表すＶＬ‐ＣＬの順序で連結した２つの免疫グロブリンドメインからなる。定常領域は、より少ない配列多様性を示し、多数の天然タンパク質に結合して重要な生化学的事象を誘発する役割を担う。
【００３０】
抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがってその標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域がそのように命名されるのは、同じクラス内の他の抗体に比べて、配列が最も異なっているからである。可変領域では、重鎖及び軽鎖のＶドメインのそれぞれに対して３つのループが集まって抗原結合部位を形成する。各ループは、アミノ酸配列の変異が最も顕著な相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」と称する）と呼ばれる。重鎖と軽鎖に対してそれぞれ３つずつ、合計６つのＣＤＲが存在し、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３と呼ばれる。ＣＤＲの外側の可変領域は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。ＣＤＲほど多様ではないが、異なる抗体間のＦＲ領域において配列の可変性が生じる。全体的に、抗体のこの特徴的な構造は、安定した骨格（ＦＲ領域）を提供し、骨格上で免疫系によって実質的な抗原結合多様性（ＣＤＲ）を探索し、広範な抗原配列に対する特異性を得ることができる。
【００３１】
免疫グロブリン遺伝子座をコードする遺伝子は、「Ｄ」及び「Ｊ」と名付けられた短いヌクレオチド配列とともに複数のＶ領域配列を含み、Ｖ、Ｄ及びＪヌクレオチド配列の組合せにより、ＶＨ多様性が生じる。
【００３２】
抗体は、定常領域によって遺伝的に決定されるように、アイソタイプとも呼ばれるクラスに分類される。ヒト定常軽鎖は、κ（Ｃκ）及びλ（Ｃλ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、またはイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に使用される。ヒトでは、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。したがって、本明細書中で使用する場合、「アイソタイプ」とは、その定常領域の化学的及び抗原的特性によって定義される免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスのいずれかを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。開示するＨＣＡｂ抗体及び二重特異性抗体は、上記のアイソタイプのすべてまたは一部を含む定常領域を有し得る。
【００３３】
同様に、本開示の特許請求の範囲に含まれるものとして、限定するものではないが、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（ｉｖ）単一の可変領域を有するｄＡｂフラグメント、（ｖ）単離したＣＤＲ領域、（ｖｉ）連結した２つのＦａｂフラグメントを有する二価断片であるＦ（ａｂ′）2フラグメント、及び（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）が挙げられ、そこにおいて、ＶＨドメインとＶＬドメインは、２つのドメインを会合させるペプチドリンカーによって連結し、抗原結合部位を形成している。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ技術によって抗体を産生する。さらなる実施形態では、天然に存在する抗体の酵素的または化学的切断によって抗体を産生する。
【００３４】
本明細書中で使用する「ヒト化」抗体とは、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）、及び非ヒト（通常マウスまたはラット）抗体由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体を「ドナー」と呼び、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンを「アクセプター」と呼ぶ。特定の実施形態において、ヒト化は、主に、ドナーＣＤＲをアクセプター（ヒト）ＶＬ及びＶＨフレームワークへグラフトすることによってなされる。この戦略は、「ＣＤＲグラフティング」と呼ばれる。選択したアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナー残基へ「逆突然変異」させることは、しばしば、最初にグラフトした構築物において失われた親和性を取り戻すために必要とされる。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンの一部を含み、したがって通常はヒトＦｃ領域を含む。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させるヒト化または他の方法は、リサーフェイシング法を含み得る。一実施形態では、選択ベースの方法を用いて、ヒト化し、及び／または親和性成熟抗体の可変領域、すなわちその標的抗原に対する可変領域の親和性を高めてもよい。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみをグラフトすることを含む場合があり、限定するものではないが、米国特許第６，７９７，４９２号に記載されている方法が挙げられ、前記文献は、ＣＤＲグラフティングに関するその開示のすべてについて、参照として本明細書に援用する。例えば、米国特許第７，１１７，０９６号に記載されるようなヒト化及び親和性成熟に関して、構造ベースの方法を用いてもよく、前記文献は、ヒト化及び親和性成熟に関するその開示のすべてについて、参照として本明細書に援用する。
【００３５】
本明細書の様々な実施形態では、抗体は重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である。ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマ）は、正常な重鎖及び軽鎖抗体（１つの抗体に２つの軽鎖と２つの重鎖）に加えて、一本鎖抗体（重鎖のみを含む）を保有する（図１Ｂ参照）。これらは、ＶＨＨ遺伝子と呼ばれる異なるＶＨセグメントのセットによってコードされる。ＶＨ及びＶＨＨは、ゲノム中に散在している（すなわち、それらは互いの間に混在しているように見える）。ＶＨとＶＨＨ  ｃＤＮＡ中に同一のＤセグメントが同定されることから、ＤセグメントがＶＨとＶＨＨに共通して使用されていることが示唆される。天然のＶＨＨ含有抗体は、重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン全体を欠損している。ＣＨ１ドメインをコードするエキソンは、ゲノム中に存在するが、ＣＨ１エキソンの５′側の機能的スプライスアクセプター配列を欠失しているため、スプライスアウトされる。その結果、ＶＤＪ領域はＣＨ２エキソン上にスプライシングされる。このような定常領域（ＣＨ２、ＣＨ３）上にＶＨＨが組み換えられると、一本鎖抗体として作用する抗体（すなわち、軽鎖と相互作用することがない２本の重鎖の抗体）が産生される。抗原の結合は、従来の抗体で認められる結合とは異なるが、同じ方法で、すなわち可変領域の高頻度変異と、そのような高親和性抗体を発現する細胞の選択によって、高い親和性が達成される。
【００３６】
例示的な実施形態では、内在性マウス抗体の発現を排除し、ヒトトランスジーンを導入したトランスジェニックマウスを免疫することによって、本開示のＨＣＡｂを産生する（図１Ａ参照）。ＨＣＡｂマウスは、米国特許第８，８８３，１５０号、米国特許第８，９２１，５２４号、米国特許第８，９２１，５２２号、米国特許第８，５０７，７４８号、米国特許第８，５０２，０１４号、ＵＳ２０１４／０３５６９０８、ＵＳ２０１４／００３３３３５、ＵＳ２０１４／００３７６１６、ＵＳ２０１４／０３５６９０８、ＵＳ２０１３／０３４４０５７、ＵＳ２０１３／０３２３２３５、ＵＳ２０１１／０１１８４４４、及びＵＳ２００９／０３０７７８７に開示されており、これらすべての文献は、重鎖のみ抗体及びトランスジェニックマウスにおけるそれらの産生に関してそれらが開示するすべてについて、参照として本明細書に援用する。ＨＣＡｂマウスを免疫し、得られる抗原刺激脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させる。次いで、得られるＨＣＡｂを、マウスＣＨ２及びＣＨ３領域からヒト配列へ置換することにより、完全にヒト化することができる。
【００３７】
本明細書において、２つの抗原結合ドメインが結合して単一の二重特異性分子となっている二重特異性抗体も開示する。二重特異性抗体は、（ｉ）二重特異性Ｆｖフラグメント（図２Ａ）；（ｉｉ）第二の特異性を有する第二のＶＨドメインと会合している第一の特異性のＨＣＡｂ（図２Ｂ及び２Ｃ）；（ｉｉｉ）第二の特異性を有する第二のＶＨドメインと会合している第一の特異性を有する四量体モノクローナル抗体であって、第二のＶＨドメインが第一のＶＨドメインと会合している抗体（図２Ｄ）；及び（ｉｖ）第二の特異性を有する第二のＶＨドメインと会合している第一の特異性のＦａｂフラグメント（ＶＨ‐ＣＨ１／ＶＬ／ＣＬ）（図２Ｅ〜２Ｆ）を含む、多くの形態をとり得る。例示的なＦａｂフラグメントを図２に示し、図中、第二の特異性を有する第二のＶＨ配列は、第一のＶＨドメインのＣ末端もしくはＮ末端、または第一のＣＨ１もしくは第一のＣＬドメインのＣ末端もしくはＮ末端と会合している。別の実施形態では、図２Ｅにも示すように、第二及び／または第三の特異性を有するＶＨ配列は、第一のＶＨドメインのＣ末端もしくはＮ末端、または第一のＣＨ１もしくは第一のＣＬドメインのＣ末端もしくはＮ末端と会合することができる。
【００３８】
二重特異性抗体は、Ｐ３６Ｆ３、Ｐ３６Ｅ１０、Ｐ３６Ｅ８、Ｐ３６Ｃ１２、Ｐ３６Ａ４、Ｐ３６Ａ３、Ｐ３６Ｄ９、Ｐ３６Ｅ４、Ｐ３６Ｅ９、Ｐ３６Ｇ９、またはＰ３６Ｈ４などのＰＤＧＦ結合抗体の配列を第二の特異性を有するＶＨ領域に連結するリンカー配列を有する場合があり、これにより配列の適切なフォールディングを可能にして、所望の三次元構造及び抗原結合特性を生成する。適切なリンカーとして、限定するものではないが、ＥＰＫＳＣＤ（配列番号３）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号４）、及び（ＧＧＧＧＳ）n（配列番号５）が挙げられ、配列中のｎは０〜８の整数である。一実施形態では、ｎは１である。
【００３９】
本明細書において開示する二重特異性抗体は、二価性であり、ＰＤＧＦに対する第一の特異性、ならびに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びアンジオポエチン２（ＡＮＧ‐２）に対する特異性を含み得るがこれらに限定されない第二の特異性を有する。第一の特異性及び第二の特異性が、独立して、ＡＮＧ‐２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦに対するものであって、唯一の制限として第一及び第二の特異性が同じであり得ない二重特異性抗体は、本開示の範囲に含まれる。
【００４０】
哺乳類のＶＥＧＦファミリーは：ＶＥＦＧ‐Ａ、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ‐Ｂ、ＶＥＧＦ‐Ｃ、及びＶＥＧＦ‐Ｄの５つのメンバーからなる。部位、時間、及び程度は異なるものの、ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーは、細胞表面上のチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、それらを二量体化し、トランスリン酸化によって活性化することにより、細胞応答を刺激する。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外部分、単一の膜貫通領域、及びスプリットチロシンキナーゼドメインを含む細胞内部分を有する。ＶＥＧＦ‐Ａは、ＶＥＧＦＲ‐１（Ｆｌｔ‐１）及びＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ‐１）に結合する。ＶＥＧＦＲ‐２は、ＶＥＧＦに対する公知の細胞応答のほとんどすべてを媒介するようである。ＶＥＧＦＲ‐１の機能は、ＶＥＧＦＲ‐２シグナル伝達を調節すると考えられるが、あまり明確ではない。ＶＥＧＦＲ‐１の別の機能は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ‐２に結合しないように隔離するダミー／デコイ受容体として作用することである可能性がある（これは、胚における脈管形成中に特に重要なようである）。ＶＥＧＦ‐Ａを除くＶＥＧＦ‐ＣとＶＥＧＦ‐Ｄは、リンパ管形成を媒介する第三の受容体（ＶＥＧＦＲ‐３／Ｆｌｔ４）のリガンドである。受容体（ＶＥＧＦＲ‐３）は、標的細胞上のリガンドの永続的作用及び機能を媒介する主リガンド（ＶＥＧＦ‐Ｃ及びＶＥＧＦ‐Ｄ）の結合部位である。ＶＥＧＦ‐Ｃは、リンパ管新生（ＶＥＧＦＲ‐３を介した）及びＶＥＧＦＲ‐２を介した血管新生を刺激する。ＶＥＧＦ‐Ａは２３２残基のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ１５６９２）である。
【００４１】
ヒトアンジオポエチン１及び２（ＡＮＧ‐１及びＡＮＧ‐２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｏ１５１２３；あるいはＡＮＧＰＴ２またはＡＮＧ２と略記））は、血管内皮において選択的に発現するチロシンキナーゼファミリーであるＴｉｅのリガンドとして発見された。アンジオポエチンファミリーの確定したメンバーが４種類存在する。アンジオポエチン３及び４（ＡＮＧ‐３及びＡＮＧ‐４）は、マウス及びヒトにおいて同じ遺伝子座の広範に分岐した対応物を表し得る。ＡＮＧ‐１及びＡＮＧ‐２は、組織培養実験において、当初、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして同定された。公知のアンジオポエチンはすべて、主にＴｉｅ‐２に結合する。ＡＮＧ‐１は内皮細胞（ＥＣ）の生存をサポートし、内皮の完全性を促進するが、ＡＮＧ‐２は生存因子ＶＥＧＦまたは塩基性線維芽細胞増殖因子の非存在下では反対の作用を有し、血管の不安定化及び退縮を促進する。しかしながら、ＡＮＧ‐２機能の多くの研究は、より複雑な状況を示唆している。ＡＮＧ‐２は、血管発芽及び血管退縮の両方において役割を果たす血管リモデリングの複雑な調節因子であり得る。ＡＮＧ‐２のこのような役割を支持するものとして、発現分析は、血管新生発芽の成体環境下ではＡＮＧ‐２がＶＥＧＦとともに迅速に誘導されるのに対し、血管退縮の環境下ではＡＮＧ‐２がＶＥＧＦの非存在下で誘導されることを明らかにする。状況に応じて異なる役割に矛盾することなく、ＡＮＧ‐２は、ＡＮＧ‐１によって活性化される同じ内皮特異的受容体Ｔｉｅ‐２に特異的に結合するが、状況に応じて、その活性化に対して異なる影響を及ぼす。
【００４２】
ＡＮＧ‐１及びＡＮＧ‐２は、角膜血管新生アッセイにおいて同様の効果を有し、ＶＥＧＦと相乗的に作用して新しい血管の成長を促進する。高濃度において、ＡＮＧ‐２は、血清欠乏アポトーシス中に、ＰＩ‐３キナーゼ及びＡｋｔ経路を介したＴｉｅ‐２の活性化を介した内皮細胞のアポトーシス生存因子として作用する。
【００４３】
ＡＮＧ‐１の役割は、成体では保存されていると考えられており、広範かつ構成的に発現している。対照的に、ＡＮＧ‐２の発現は、ＡＮＧ‐１の構成的安定化または成熟機能をブロックすると考えられる血管リモデリングの部位に主に限定され、血管を、発芽シグナルに対してより応答性が高い可能性がある塑性状態に戻し、及び留まらせることができる。
【００４４】
ＡＮＧ‐２は、血管リモデリングが生じている部位での発生中に発現する。成体では、ＡＮＧ‐２の発現は、血管リモデリングの部位、ならびに高度に血管新生した腫瘍内に限定される。ＡＮＧ‐２は出生後の血管新生に必要である。ＡＮＧ‐２ノックアウトマウスでは眼の硝子体の脈管構造の発生上のプログラム化された退縮が起こらず、その網膜の血管は網膜中心動脈から出芽できない。ＡＮＧ‐２の欠損は、リンパ脈管構造のパターン形成及び機能に深刻な欠陥をもたらす。ＡＮＧ‐１による遺伝的レスキューは、リンパを矯正するが、血管新生の欠陥を矯正するものではない。
【００４５】
したがって、本明細書において、ＰＤＧＦに特異的なＨＣＡｂ、及びＡＮＧ‐２とＰＤＧＦの両方に特異的な、またはＰＤＧＦとＶＥＧＦの両方に特異的な二重特異性抗体を開示する。他の実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、本明細書において開示するヒト抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂ抗体であるＰ３６Ｆ３、ならびに任意のヒトまたはヒト化ＶＥＧＦ特異的抗体のＶＨ及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。ＶＥＧＦ特異的抗体として、米国特許第７，２９７，３３４号、米国特許第６，８８４，８７９号、米国特許第８，９４５，５５２号、ＷＯ１９９８０４５３３１、ＵＳ２０１５０１７５６８９、及びＵＳ２００９０１４２３４３に記載されている抗体が挙げられるが、これらに限定するものではない。例示的なヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシツマブ及びラニビズマブである。
【００４６】
特定の実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、本明細書において開示するヒト抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂ抗体Ｐ３６Ｆ３ならびにベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。ベバシズマブのアミノ酸配列は、米国特許第７，２９７，３３４号に開示されており、前記文献は、抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列に関するその開示のすべてについて、参照として本明細書に援用する。特定の実施形態では、ベバシズマブのＶＨ配列はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）であり、ベバシズマブのＶＬ配列はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号７）である。
【００４７】
特定の実施形態では、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、本明細書において開示するヒト抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂ抗体Ｐ３６Ｆ３及びラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のＶＨ及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。ラニビズマブのアミノ酸配列は、  米国特許第６，８８４，８７９号に開示されており、前記文献は、抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列に関するその開示のすべてについて、参照として本明細書に援用する。特定の実施形態では、ラニビズマブのＶＨ配列はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦ  ＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴ  ＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）であり、ラニビズマブのＶＬ配列はＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬ  ＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号９）である。
【００４８】
他の実施形態では、ＰＤＧＦ／ＡＮＧ‐２二重特異性抗体は、本明細書に開示するヒト抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂ抗体Ｐ３６Ｆ３及び任意のヒトまたはヒト化ＡＮＧ‐２特異的抗体のＶＨ及び／またはＶＬ領域から形成される二重特異性抗体である。例示的なヒト化抗ＡＮＧ‐２抗体は、例えば、ＵＳ２０１０／０１５９５８７及びＵＳ２０１３０２５９８６８に開示されており、前記文献は、抗ＡＮＧ‐２抗体に関するその開示のすべてについて、参照として本明細書に援用する。例示的なＡＮＧ‐２結合抗体はまた、代理人整理番号１９８６４ＮＴＢを有する２０１６年７月２９日出願の同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４８３８に開示されており、前記文献は、ＡＮＧ‐２結合抗体に関するその開示のすべてについて、参照として援用する。
【００４９】
また、抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変異を導入することによって、またはペプチド合成によって調製するヒト抗ＰＤＧＦ単一特異性または二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体も、本開示の範囲に含まれる。そのような変異体は、例えば、本明細書の実施例の抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／または挿入及び／または置換を有する。欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせて導入し、最終構築物に到達させ、最終構築物が所望の特性を有するようにする。アミノ酸変異はまた、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、ヒト化抗体または変異型抗体の翻訳後プロセスを変化させる可能性がある。
【００５０】
好ましい変異誘発位置となるような抗体の特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。標的残基の残基または官能基を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置換し、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位に向けて、さらなる変異体または他の変異体を導入することによって精細化する。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位を予め決定しておく一方で、突然変異そのものの性質は予め決定しておく必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で行い、発現する抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００５１】
アミノ酸配列挿入には、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端への１残基〜１００残基以上の長さの範囲のポリペプチドの融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗ＰＤＧＦ抗体またはエピトープタグに融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体として、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドに対する抗体の、ＮまたはＣ末端への融合体が挙げられる。
【００５２】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されている。置換型突然変異誘発にとって最も関心対象となる部位として、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も想定される。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と命名するか、または以下にアミノ酸クラスを示してさらに記載する置換的変異を導入し、産物をスクリーニングしてもよい。
表１
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【００５３】
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、例えばシートもしくはヘリックス構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することに対して、改変が及ぼす効果が有意に異なる変異を選択することによって達成される。天然起源の残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００５４】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
【００５５】
単一特異性または二重特異性の抗ＰＤＧＦ抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般的にセリンに置換し、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を予防してもよい。逆に、システイン結合（複数可）を抗体に追加して、その安定性を向上させてもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体断片である場合）。
【００５６】
別のタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域の残基を置換することを含む。通常、さらに開発するために選択して得られる変異体（複数可）は、それらの生成元の親抗体に比べて向上した生物学的特性を有する。そのような置換変異体を作製するための簡便な方法は、ファージディスプレイ法を用いた親和性成熟である。要約すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位にすべての可能なアミノ置換を生成する。このようにして生成した抗体変異体を、各粒子内にパッケージングしたＭ１３遺伝子ＩＩＩＩ産物への融合体として、繊維状ファージ粒子から一価様式で提示させる。次いで、ファージディスプレイした変異体を、本明細書に開示するようなその生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変領域部位を同定するために、抗原結合に有意に寄与する同定した超可変領域残基に対してアラニンスキャニング突然変異誘発を行うことができる。あるいは、または加えて、抗原‐抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＰＤＧＦとの接触点を同定することが有効である場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述する技術による置換の候補である。そのような変異体をいったん生成した後、変異体のパネルを、本明細書に記載するようなスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択してもよい。
【００５７】
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体では、抗体が元々備えているグリコシル化パターンを改変する。改変とは、抗体に認められる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、及び／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【００５８】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン‐Ｘ‐セリン及びアスパラギン‐Ｘ‐スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに糖Ｎ‐アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つを結合させることを意味するが、５‐ヒドロキシプロリンまたは５‐ヒドロキシリジンもまた、使用してもよい。
【００５９】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記トリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成される。改変はまた、元の抗体の配列（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）への１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によって行ってもよい。
【００６０】
当該技術分野で公知の様々な方法によって、単一特異性または二重特異性抗ＰＤＧＦ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を調製する。これらの方法として、天然供給源からの単離（天然起源のアミノ酸配列変異体の場合）、または初期に調製した変異体もしくは抗ＰＤＧＦ抗体の非変異体の、オリゴヌクレオチドを介した（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００６１】
単一特異性または二重特異性の抗ＰＤＧＦ抗体の他の改変も企図される。例えば、エフェクター機能に関して抗体を修飾し、それによって、例えば、疾患の治療における抗体の有効性を高めることが望ましい場合がある。例えば、Ｆｃ領域にシステイン残基（複数可）を導入し、それによってこの領域で鎖間ジスルフィド結合を形成できるようにしてもよい。そのようにして生成したホモ二量体抗体は、内部移行能力が向上し、及び／または補体を介した細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増大し得る。また、ヘテロ二官能性クロスリンカーを用いて、抗腫瘍活性を高めたホモ二量体抗体を調製してもよい。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それにより増強した補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体をエンジニアリングすることができる。
【００６２】
本明細書に開示する抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂの配列に対し、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９８％の同一性を有する抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂもまた、本開示の範囲に含まれる。
【００６３】
例示的な変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、もしくは５０のうちの１つ以上の配列、または配列番号１１〜１３、１５〜１７、１９〜２１、２３〜２５、２７〜２９、３１〜３３、３５〜３７、３９〜４１、４３〜４５、４７〜４９及び５１〜５３から選択される１つ以上のＣＤＲを有し、そこにおいて１つ以上のアミノ酸は、表１のアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、置換配列が未置換配列の結合特異性を保持するか、またはより高い結合特異性を有することを条件として、最大１、最大２、最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０、最大１２、最大１４、最大１６、最大１８、または最大２０残基のアミノ酸を、付加、置換、または欠失させる。他の実施形態では、置換配列が、未置換配列の全長に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９８％の同一性を有することを条件として、最大１、最大２、最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０、最大１２、最大１４、最大１６、最大１８、または最大２０残基のアミノ酸を、付加、置換、または欠失させる。
【００６４】
特定の実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、可変領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、１つ以上の相補性決定領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、１つ以上のフレームワーク領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。さらに別の実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、１つ以上の定常領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、ＣＤＲ１に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、ＣＤＲ２に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、ＣＤＲ３に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。
【００６６】
特定の実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、フレームワーク１領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、フレームワーク２領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、フレームワーク３領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、フレームワーク４領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体、すなわち変異型抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂは、ヒンジ領域に１つ以上の付加、置換、または欠失を含む。
【００６７】
本明細書において、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはその断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性複合体）などの細胞傷害剤に複合体化した本明細書に記載の抗体を含む免疫複合体もまた、開示する。
【００６８】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を記載する。使用可能な酵素的に活性な毒素及びその断片として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合型活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、ボツリヌス毒素、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α‐サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ‐Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシンが挙げられるが、これらに限定するものではない。放射性複合体化単一特異性または二重特異性抗ＰＤＧＦ抗体の産生に対し、様々な放射性核種が利用可能である。例として、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、及び186Ｒｅが挙げられる。
【００６９】
Ｎ‐スクシンイミジル‐３‐（２‐ピリジルジチオール）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ‐アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス‐ジアゾニウム誘導体（ビス‐（ｐ‐ジアゾニウムベンゾイル）‐エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸（トリレン２，６‐ジイソシアネートなど）、及びビス活性のフッ素化合物（１，５‐ジフルオロ‐２，４‐ジニトロベンゼンなど）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、抗体と細胞傷害剤との複合体を作製する。炭素１４標識１‐イソチオシアナトベンジル‐３‐メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ‐ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合体化させるための例示的なキレート剤である。
【００７０】
別の実施形態では、抗体‐受容体複合体を患者に投与し、続いてクリアリング剤を使用して循環系から未結合複合体を除去するプレターゲティングに利用するために、抗体を「受容体」（ストレプトアビジンなど）に複合体化し、その後、細胞傷害剤（例えば、放射性核種）に複合体化した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与してもよい。
【００７１】
本明細書中に開示する単一特異性または二重特異性の抗ＰＤＧＦ抗体もまた、リポソーム中に製剤化してもよい。抗体を含有するリポソームは、例えば、米国特許第４，４８５，０４５号、米国特許第４，５４４，５４５号、米国特許第５，０１３，５５６号に記載されている当該分野で公知の方法によって調製する。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ‐ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。規定の細孔サイズのフィルターを通してリポソームを押し出し、所望の直径を有するリポソームを得る。抗体のＦａｂ′フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに複合体化することができる。
【００７２】
単一特異性または二重特異性抗ＰＤＧＦ抗体の共有結合修飾も、本開示の範囲に含まれる。適用可能な場合、化学合成または抗体の酵素的もしくは化学的切断によってそれらを作製してもよい。抗体の標的化アミノ酸残基を、選択した側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることによって、抗体の他のタイプの共有結合修飾を分子に導入する。ポリペプチドの例示的な共有結合修飾が、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されており、ポリペプチドの共有結合的修飾に関するその開示のすべてについて、参照として本明細書に具体的に援用する。抗体の共有結合修飾の例示的なタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、または米国特許第４，１７９，３３７号に記載されている方法で、抗体を様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つに連結することを含む。
【００７３】
本明細書に開示する単一特異性及び二重特異性抗体は、組換え手段によって産生してもよい。したがって、本明細書において、抗体をコードする核酸、抗体をコードする核酸を有する発現ベクター、及び抗体をコードする核酸を保有する細胞を開示する。組換え産生のための方法は当該技術分野で公知であり、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現、続いて抗体の単離、ならびに通常、薬学的に許容可能な純度への精製を含む。宿主細胞中での上記のような抗体発現のために、抗体配列をコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞で発現させ、抗体を細胞（上清または溶解後の細胞）から回収する。
【００７４】
したがって、本明細書に開示する特定の実施形態は、ａ）抗体をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；ｂ）抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養し；及びｃ）培養物から前記抗体分子を回収する工程を含む。
【００７５】
抗体は、例えば、プロテインＡ‐セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離する。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は同じ意味で使用し、そのような指定のすべてに子孫が含まれる。したがって、用語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、移入数に関係なく、初代対象細胞及びそれから誘導される培養物を含む。意図的または偶然の突然変異が生じるため、すべての子孫のＤＮＡ内容が正確に同一ではないことも理解されたい。本用語には、最初に形質転換した細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型の子孫が含まれる。異なる名称を示す場合、それは文脈から明らかであろう。
【００７７】
本明細書中で使用する用語「形質転換」とは、ベクター／核酸の宿主細胞への移入プロセスを指す。手強い細胞障壁を有さない細胞を宿主細胞として用いる場合、例えば、リン酸カルシウム沈殿法によって形質移入を行うことができる。しかしながら、核内注入法またはプロトプラスト融合法などの、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法もまた、使用してもよい。原核細胞または実質的な細胞壁構築物を有する細胞を用いる場合、例えば、形質移入の１つの方法は、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡ（転写産物ともいう）がその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物及びコードされたポリペプチドは、集合的に遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞内での発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００７９】
「ベクター」とは、核酸分子、特に自己複製する核酸分子であり、ベクターに挿入された核酸分子を宿主細胞内へ、及び／または宿主細胞間で移動させる。本用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への挿入（例えば、染色体組込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能する複製ベクター、及びＤＮＡまたはＲＮＡの転写及び／または翻訳のために機能する発現ベクターを指す。また、記載するような機能を複数提供するベクターも含まれる。
【００８０】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入した場合に、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、通常、所望の発現産物を生じるように機能し得る発現ベクターからなる適切な宿主細胞を指す。
【００８１】
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」とは、本明細書に開示する抗体を生成するように改変可能な任意の種類の細胞系を意味する。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する。
【００８２】
原核生物に適した調節配列として、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００８３】
核酸は、これを別の核酸配列と機能的関係に配置する場合、「作動可能に連結する」。例えば、プレ配列または分泌リーダーＤＮＡは、それをポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現させる場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結し；リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置する場合、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結する」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には隣接するとともに、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、利便性の高い制限酵素部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の方法に従って用いる。
【００８４】
本明細書において、単一特異性または二重特異性のヒト抗ＰＤＧＦ抗体をコードする単離された核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、ならびに抗体産生のための組換え技術も開示する。
【００８５】
抗体の組換え産生のために、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第５，２０４，２４４号に記載されているように、相同組換えによって抗体を産生してもよく、前記文献は、抗体産生に関するその開示のすべてについて本明細書に具体的に援用する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素として、例えば、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されているように、一般的に：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終止配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定するものではなく、前記文献は、タンパク質発現に関するその開示のすべてについて本明細書に具体的に援用する。
【００８６】
本明細書におけるベクター中のＤＮＡをクローニングし、または発現させることに適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物として、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物などの真性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａを含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属、例えばＳ．ｍａｒｃｅｓｃａｎｓなどのＳｅｒｒａｔｉａ属、及びＳｈｉｇｅｌｌａ属、ならびに例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  などのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉクローニング宿主の一例は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の株は好適である。これらの例は、限定するものではなく、むしろ例示的なものである。
【００８７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、単一特異性または二重特異性のヒト抗ＰＤＧＦ抗体をコードするベクターのための適切なクローニングまたは発現用宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、本明細書において、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の宿主；  Ｙａｒｒｏｗｉａ属（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属；及び、例えばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍなどのｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒ  などのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主のような多くの他の属、種、及び株が一般に利用可能であり、有用である。
【００８８】
グリコシル化単一特異性または二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体の発現に適した宿主細胞は、植物及び昆虫細胞などの無脊椎動物細胞を含む多細胞生物に由来する。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの多くのバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ‐１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ‐５株が公に入手可能であり、そのようなウイルスを本発明のウイルスとして、特にＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入用に使用してもよい。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【００８９】
しかしながら、脊椎動物細胞での関心が最も高く、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は日常的な手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ‐７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングした２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／‐ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ‐７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；  マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００９０】
単一特異性または二重特異性抗ＰＤＧＦ抗体産生のための上記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変した従来の栄養培地で培養する。
【００９１】
単一特異性または二重特異性のヒト抗ＰＤＧＦ抗体を産生するために使用する宿主細胞は、様々な培地中で培養してもよい。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ‐１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適している。さらに、米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；もしくは米国特許第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；またはＵＳ  Ｒｅ．３０，９８５を宿主細胞用の培地として用いてもよい。これらの培地のいずれかには、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が含まれる。任意の他の必要なサプリメントもまた、当業者に公知と思われる適切な濃度で含有させてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞で従前から用いているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９２】
組換え技術を用いる場合、抗体は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生可能であるか、または培地中に直接分泌可能である。抗体を細胞内で産生する場合、第一の工程として、例えば遠心分離または限外濾過によって、宿主細胞または溶解した断片のいずれかである微粒子デブリを除去する。
【００９３】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスは、最も多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速及びより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを有する場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂は精製に有用である。回収する抗体に応じて、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた利用可能である。
【００９４】
任意の予備精製工程（複数可）の後、対象の抗体及び夾雑物を含む混合物を、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、溶出緩衝液を約２．５〜４．５のｐＨで用い、好ましくは低塩濃度で（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）実行する。
【００９５】
本明細書において、眼疾患の治療のための単一特異性及び二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体の使用方法も開示する。眼疾患の例として、萎縮型（非滲出性）加齢性黄斑変性症、滲出型（滲出性または新生血管性）加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、近視関連脈絡膜新生血管、血管線条、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞に起因する黄斑浮腫、及び、例えば、角膜炎、角膜移植、または角膜形成術後の角膜血管新生、低酸素（過度のコンタクトレンズ装着）による角膜血管新生のような眼の前部における血管新生、翼状結膜炎、網膜下浮腫及び網膜内浮腫が挙げられるが、これらに限定するものではない。加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の例として、萎縮型すなわち非滲出性ＡＭＤ、または滲出型すなわち滲出性もしくは新生血管性ＡＭＤが挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００９６】
加齢性黄斑変性症とも呼ばれる黄斑変性症は、米国における５０歳以上の視力喪失の最も一般的な原因であり、その罹患率は年齢とともに増加する。ＡＭＤは、滲出型（新生血管）または萎縮型（非新生血管）のいずれかに分類される。この疾患の萎縮型形態が最も一般的である。これは、網膜色素上皮の萎縮及び黄斑光受容体の喪失に関連するプロセスである、網膜中心の歪み、色素沈着、または最も一般的には薄くなったときに起こる。結果は、中心部の地図状萎縮である。この疾患の滲出型形態は、最も重篤な視力喪失の原因となる。滲出型形態は通常老化に関連するが、滲出性黄斑変性症を引き起こす可能性がある他の疾患には、重度の近視、及びヒストプラスマ症などのいくつかの眼内感染が含まれ、これはＡＩＤＳ患者において悪化する可能性がある。滲出型形態は、網膜色素上皮を通って成長する異常な血管を特徴とし、出血、滲出、瘢痕、または網膜剥離をもたらす。
【００９７】
本明細書において、眼疾患の治療のための単一特異性及び二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体の徐放性製剤を開示する。したがって、徐放性薬物送達システムから、単一特異性及び二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体を、硝子体内に、３〜６か月の期間にわたって放出して、萎縮型ＡＭＤなどの慢性眼疾患の長期治療を提供することができる。
【００９８】
ヒドロゲルは、水または他の水性媒体中の分散液として形成されるコロイド状ゲルである。したがって、ヒドロゲルは、分散相（ポリマー）が連続相（すなわち水）と結合して粘性のゼリー状生成物を生成するコロイドの形成時に形成されるものであって；例えば、凝固したケイ酸である。ヒドロゲルは、化学的または物理的結合のいずれかによって架橋される親水性ポリマー鎖の三次元網状構造である。ポリマー鎖が親水性の性質を有するため、ヒドロゲルは水を吸収して膨潤する（既に最大量の水を吸収していない限り）。膨潤プロセスは、非架橋親水性ポリマーの溶解と同じである。定義上、水はヒドロゲルの総重量（または体積）の少なくとも１０％を構成する。
【００９９】
ヒドロゲルの例として、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、及び化学的または物理的に架橋したポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリエチレンオキシド、ならびに加水分解ポリアクリロニトリルなどの合成ポリマーが挙げられる。有機ポリマーであるヒドロゲルの例として、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸の多価金属塩などの共有結合またはイオン架橋型多糖類ベースのヒドロゲル、ならびに、キチン、キトサン、プルラン、ジェラン及びキサンタン由来のヒドロゲルが挙げられる。発明者らの実験に用いた特定のヒドロゲルは、セルロース化合物（すなわち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース［ＨＰＭＣ］）及び高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）であった。
【０１００】
いくつかの実施形態では、高分子ヒアルロン酸及び本明細書に開示する単一特異性及び／または二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体を用いた硝子体内注射のためのヒドロゲル製剤を開示する。この薬物送達システムは、単一特異性及び二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体の徐放を低い一日量で、３〜６か月の間、提供し、萎縮型から滲出型ＡＭＤへの変換を防止することができる。薬物送達システムはまた、ヒドロゲル中の単一特異性及び二重特異性ヒト抗ＰＤＧＦ抗体のミクロスフェアカプセル化を含むことができる。徐放性薬物送達システムは、必要な抗ＰＤＧＦ遮断を眼に提供し、萎縮型から新生血管性ＡＭＤへの進行の機会を低減することができる。加えて、長期間にわたって低用量で眼内へ放出するため、薬剤を全身毒性レベルで提供することはない。
【０１０１】
徐放性薬物送達システムを用いて、血管新生のリスクがある網膜中心静脈閉塞症を有する患者において、及び血管新生疾患のリスクを有する重篤な非増殖性糖尿病性網膜症を有する患者において、徐放性抗ＰＤＧＦ遮断を提供することもできる。
【０１０２】
あるいは、薬物送達システムは、ＰＬＧＡインプラント、任意に架橋ヒアルロン酸に封入したリポソーム封入抗体であり得る。さらに、ミクロスフェア、マイクロカプセル（０．００１〜１００μｍの範囲）及び放出を改変するためにヒドロゲルポリマーと相互作用するための修飾表面を有するリポソームであってもよい。
【０１０３】
特定の薬物送達システム製剤及び眼疾患を治療するためのこれらの薬物送達システムの投与方法も本明細書に包含される。眼内投与は、眼の硝子体腔（後眼房）への移植または注射によって行うことができる。本開示の範囲内の薬物送達システムは、生分解性インプラント及び／またはミクロスフェアであり得る。薬物送達システムは、モノリシック、すなわち活性薬剤が生分解性ポリマー全体に均一に分布または分散されている状態であり得る。約２時間〜１２か月またはそれ以上の期間、本発明に従って作製した薬物送達システムから治療剤を放出させることができる。薬物送達システムの重要な特徴は、薬物送達システムが、それを投与する眼内の位置に固定するための手段（例えば、キャップ、突起または縫合タブなど）を含まないことである。
【０１０４】
本開示の範囲内の薬物送達システムの重要な特徴は、眼内位置（前テノン嚢下、結膜下、硝子体内または脈絡膜上の位置など）に移植または注入し、眼内移植または注射の部位及びそれに隣接する部位で、有意な免疫原性の発生または持続を伴わずに、治療薬の徐放を提供することができることである。
【０１０５】
ポリラクチド（ＰＬＡ）ポリマーは、ポリ（Ｌ‐ラクチド）及びポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド）の２つの化学的形態で存在する。純粋なポリ（Ｌ‐ラクチド）はレジオ規則性であり、したがってまた高度に結晶性であり、したがってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて非常に遅い速度で分解する。ポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド）はレジオランダムであり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより迅速な分解をもたらす。したがって、主成分がポリ（Ｌ‐ラクチド）ポリマーであり、残りがポリ（Ｄ‐ラクチド）ポリマーである混合物のＰＬＡポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ポリ（Ｄ‐ラクチド）ポリマーを主成分とするＰＬＡポリマーに比べて遅い速度で分解する。ＰＬＧＡは、ポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド）とポリ（グリコリド）とを様々な可能な比率で混合したコポリマーである。ＰＬＧＡ中のグリコリド含量が高いほど、ポリマー分解が速くなる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、眼内投与用（すなわち、硝子体内移植または注入による）の薬物送達システムは、少なくとも７５重量％のＰＬＡ及び約２５重量％以下のポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）ポリマーを含むか、それらから構成されるか、それらからなるか、実質的にそれらからなる。
【０１０７】
また、注射針を介して眼内の位置に投与することができるヒドロゲル（高分子ヒアルロン酸など）中に懸濁したミクロスフェア（抗血管新生剤を含有する）の懸濁液も本発明の範囲に含まれる。そのような懸濁液を投与するには、２５℃におけるミクロスフェア懸濁液の粘度が約３００，０００ｃＰ未満であることが必要である。２５℃における水の粘度は約１．０ｃＰ（ｃＰまたはｃｐｓはセンチポアズ、すなわち粘度の尺度である）である。２５℃において、オリーブ油の粘度は８４ｃＰであり、ひまし油では９８６ｃＰ、及びグリセロールでは１４９０ｃＰである。
【０１０８】
薬物送達システムに存在する抗体は、薬物送達システムの生分解性ポリマー中に均一に分散することができる。使用する生分解性ポリマーの選択は、所望の放出速度、患者の忍容性、治療する疾患の性質などによって様々に異なり得る。考慮すべきポリマー特性として、移植部位における生体適合性及び生分解性、対象の活性薬剤との適合性、及び処理温度が挙げられるが、これらに限定するものではない。生分解性ポリマーマトリックスは、通常、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０重量％のインプラントを含む。１つのバリエーションにおいて、生分解性ポリマーマトリックスは、約４０重量％〜５０重量％の薬物送達システムを含む。
【０１０９】
使用可能な生分解性ポリマーとしては、有機エステルまたはエーテルなどのモノマーから作製したポリマーが挙げられるが、これらに限定するものではない。無水物、アミド、オルトエステルなどを単独でまたは他のモノマーと組み合わせて使用してもよい。ポリマーは一般的に縮合ポリマーである。ポリマーは、架橋型または非架橋型であり得る。
【０１１０】
大部分において、ポリマーは、炭素及び水素に加えて、酸素及び窒素、特に酸素を含む。酸素は、オキシ、例えばヒドロキシまたはエーテルなど、カルボニル、例えばカルボン酸エステルなどの非オキソカルボニルなどとして存在してもよい。窒素は、アミド、シアノ、及びアミノとして存在し得る。使用可能な生分解性ポリマーの例示的なリストは、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎ：“ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｖｏｌ．１．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８７）に記載されている。
【０１１１】
特に興味深いのは、ヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、ホモポリマーまたはコポリマー、及び多糖類である。対象のポリエステルには、Ｄ‐乳酸、Ｌ‐乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、及びそれらの組合せのホモまたはコポリマーが含まれる。グリコール酸と乳酸のコポリマーが特に興味深く、生分解速度はグリコール酸と乳酸との比によって制御される。ポリ（乳‐グリコール）酸（ＰＬＧＡ）コポリマー中の各モノマーの割合は、０〜１００％、約１５〜８５％、約２５〜７５％、または約３５〜６５％であってもよい。特定の変形例では、２５／７５  ＰＬＧＡ及び／または５０／５０  ＰＬＧＡコポリマーを使用する。他の変形例では、ＰＬＧＡコポリマーをポリラクチドポリマーと共に使用する。
【０１１２】
様々な目的のために、他の薬剤を薬物送達システム製剤に使用してもよい。例えば、緩衝剤及び防腐剤を使用してもよい。使用してもよい防腐剤として、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール及びフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定するものではない。使用してもよい緩衝剤の例として、所望の投与経路についてＦＤＡによって承認された、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。コロイド中の粒子を安定化するために使用可能な界面活性剤及び／または塩化ナトリウム及び塩化カリウムのような電解質も、製剤に含めることができる。薬物送達システムはまた、微小環境ならびに界面（拡散停滞層）においてｐＨを調節するための酸性及び塩基性賦形剤を含むことができる。
【０１１３】
生分解性薬物送達システムはまた、活性薬剤の放出を加速または遅延させる追加の親水性または疎水性化合物を含み得る。さらに、例えば米国特許第５，８６９，０７９号に記載されているような放出調節剤をインプラントに含めることができる。使用する放出調節剤の量は、所望の放出特性、調節剤の活性、及び調節剤の非存在下でのグルココルチコイドの放出特性に依存する。緩衝剤または放出促進剤または調節剤が親水性である場合、それは放出加速剤としても作用する場合がある。親水性添加剤は、薬物粒子の周囲の物質がより速く溶解することにより放出速度を増加させるように作用し、これにより薬物の露出表面積が増加し、それにより薬物拡散速度が増加する。同様に、疎水性緩衝剤または促進剤または調節剤は、より緩やかに溶解し、薬物粒子の露出を遅らせ、それによって薬物拡散速度を遅くすることができる。
【０１１４】
本開示の範囲に含まれる薬物送達システムは、生分解性ポリマー内に分散させた活性薬剤抗体の粒子で製剤化することができる。理論に拘泥するものではないが、活性薬剤の放出は、生分解性ポリマーマトリックスの浸食によって、ならびに眼球液、例えば硝子体への微粒子剤の拡散とその後のポリマーマトリックスの溶解及び活性薬剤の放出によって達成することができると考えられる。インプラントからの活性薬剤の放出速度に影響を与える因子として、インプラントのサイズ及び形状、活性薬剤粒子のサイズ、活性薬剤の溶解度、活性薬剤とポリマー（複数可）との比率、製造方法、露出表面積、インプラントの密度ならびにポリマー（複数可）の浸食速度などの特性が挙げられ得る。
【０１１５】
活性薬剤の放出速度は、生分解性ポリマーマトリックスを構成するポリマー骨格成分または複数の骨格成分の分解速度に少なくとも部分的に依存し得る。例えば、縮合ポリマーは加水分解（他のメカニズムの中でも）によって分解される可能性があり、したがって、インプラントによる水吸収を高めるようなインプラントの組成の変化は加水分解速度を増加させ、それによってポリマーの分解及び侵食の速度を増加させ、したがって活性薬剤の放出速度を増加させる見込みが高い。活性薬剤の放出速度はまた、活性薬剤の結晶化度、インプラント中のｐＨ及び界面におけるｐＨによっても影響を受け得る。
【０１１６】
本発明の薬物送達システムの放出速度は、薬物送達システムの表面積に部分的に依存し得る。より大きな表面積によって、より多くのポリマー及び活性薬剤が眼球液に露出し、ポリマーのより速い侵食及び液体中の活性薬剤粒子の溶解が生じる。
【０１１７】
本明細書において、単一特異性ヒト抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂ及び／または特異性の一方がＰＤＧＦである二重特異性抗体を含有する医薬組成物も開示する。医薬組成物を製造するための本明細書に記載の抗体の使用もまた開示する。開示する抗体及び眼疾患の治療のための抗体を含有する医薬組成物の使用方法もまた開示する。
【０１１８】
本明細書中で使用する場合、「医薬担体」には、生理学的に適合性の任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、眼内、硝子体内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。
【０１１９】
本明細書において開示する組成物は、当該分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者であれば理解するように、所望する結果に応じて、投与の経路及び／または様式は様々に異なる。開示する抗体を特定の投与経路で投与するためには、抗体の不活性化を防止する物質と抗体を会合させるか、または抗体とその物質を同時投与することが必要な場合がある。例えば、抗体を、適切な担体、例えばリポソームまたは希釈剤中で、対象に投与してもよい。薬学的に許容可能な希釈剤として、生理食塩水及び水性緩衝液が挙げられる。医薬担体としては、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。
【０１２０】
本明細書中で使用する語句「非経口投与」及び「非経口的に投与する」は、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によって、さらに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、眼内、硝子体内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、ならびに胸骨内への注射及び注入が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【０１２１】
これらの組成物に、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも、含有させてもよい。上記の滅菌手順と、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含ませることの両方によって、微生物の介在を確実に予防してもよい。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤を含めることによって、注射用医薬形態の長期吸収をもたらしてもよい。
【０１２２】
選択した投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用し得る本開示の抗体及び／またはその抗体を含有する医薬組成物を、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容可能な剤形に製剤化する。
【０１２３】
医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成、及び投与様式に対して所望の治療応答を、患者に毒性を与えずに達成するのに有効な量の活性成分を得るために、様々に異なる場合がある。選択する投与量レベルは、使用する本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、治療期間、使用する特定の化合物と組み合わせて使用する他の薬剤、化合物及び／または物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態及び以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含む、様々な薬物動態学的な要因に依存する。
【０１２４】
硝子体内に送達する場合、本明細書に開示する医薬組成物の適切な用量は、眼１つあたり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲である。さらなる適切な用量として、約０．２ｍｇ〜約４０ｍｇ／眼、約０．３ｍｇ〜約３０ｍｇ／眼、約０．４ｍｇ〜約２０ｍｇ／眼、約０．５ｍｇ〜約１５ｍｇ／眼、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ／眼、約０．５ｍｇ／眼、約０．７５ｍｇ／眼、約１ｍｇ／眼、約１．５ｍｇ／眼、約２ｍｇ／眼、約２．５ｍｇ／眼、約３ｍｇ／眼、約３．５ｍｇ／眼、約４ｍｇ／眼、約４．５ｍｇ／眼、約５ｍｇ／眼、約５．５ｍｇ／眼、約６ｍｇ／眼、約６．５ｍｇ／眼、約７ｍｇ／眼、約７．５ｍｇ／眼、約８ｍｇ／眼、約８．５ｍｇ／眼、約９ｍｇ／眼、約９．５ｍｇ／眼、約１０ｍｇ／眼、約１１ｍｇ／眼、約１２ｍｇ／眼、約１３ｍｇ／眼、約１４ｍｇ／眼、約１５ｍｇ／眼、約１５ｍｇ／眼、約１７ｍｇ／眼、約１８ｍｇ／眼、約１９ｍｇ／眼、または約２０ｍｇ／眼が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【０１２５】
組成物がシリンジによって送達可能である限り、組成物は無菌かつ流体でなければならない。水であることに加えて、担体は、好ましくは等張性の緩衝生理食塩水である。
【０１２６】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１２７】
単一特異性及び／または二重特異性のヒト抗ＰＤＧＦ抗体を含む医薬組成物及び薬物送達システムを、シリンジによって眼内位置に注射することができ、または、強膜に切開を施した後に、鉗子、トロカール、または他のタイプのアプリケータによる配置を含む様々な方法によって眼内に挿入（移植）することができる。いくつかの例では、トロカールまたはアプリケータは、切開部を形成せずに使用してもよい。好ましい変形形態では、手持ち式アプリケータを使用して、１つ以上の生分解性インプラントを眼に挿入する。手持ち式アプリケータは、通常、１８〜３０ＧＡのステンレス鋼針、レバー、アクチュエータ、及びプランジャを備える。単一または複数のインプラントを後眼領域または部位に挿入するのに適した装置として、米国特許第７，０９０，６８１号に開示されている装置が挙げられる。
【０１２８】
投与方法は、通常、まず、針、トロカールまたは移植用装置を用いて眼領域内の標的領域にアクセスすることを含む。いったん標的領域、例えば硝子体空洞内に入ると、手持ち式装置上のレバーを押し下げてアクチュエータに働きかけ、プランジャを前方に駆動することができる。プランジャが前進するにつれて、単一または複数のインプラントを標的領域（すなわち、硝子体）に押し込むことができる。
【０１２９】
インプラントを作製するために、本開示の範囲内で様々な技術を用いてもよい。有用な技術として、相分離法、界面法、押出法、圧縮法、成形法、射出成形法、熱プレス法などが挙げられる。
【０１３０】
用語「眼内注射」とは、患者の眼球に入ることによって投与する注射を指す。用語「眼周囲注射」とは、眼の後部ではあるが眼球外壁の外側に投与する注射を指す。用語「経毛様小体」とは、毛様体と目のレンズとを接続する一連の繊維である毛様体小帯を介して投与する注射を指す。用語「硝子体内」とは、患者の眼を介して、眼の内腔に直接投与する注射を指す。
【０１３１】
本明細書に記載の医薬製剤は、経毛様小体か、または所望により非経毛様小体であり得る眼内硝子体内注射によって送達することができる。この製剤の眼内硝子体内注射は、経毛様小体によるか、または直接、毛様体扁平部を介した（経強膜）注射によるかに関わらず、複数の個別の薬剤を至急配合すること、または眼球への複数の個別の注射を行うことを必要とせずに、強力な広域抗生物質を、直接、化膿性の組織に送達する。
【０１３２】
一般的には、上記の医薬組成物は、治療を必要とする哺乳類対象（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、他のペット、飼育動物、野生動物または家畜）に眼内投与する。組成物は、眼科分野の当業者に周知の方法及び技術を用いて、硝子体内へ、及び経毛様小体で注射する。
【０１３３】
通常、一般的な２７ゲージカニューレによる送達は、１ｍＬのＴＢシリンジを利用して行うことができ、その際、瞬間的なフリックを用いて製剤を再懸濁させ、注射直前に振盪することに注意する。この製剤に必要とされる医薬容量（すなわち、投薬量）は、眼疾患のタイプ及び閉じた眼内空間に注射を注入するための利用可能な容積に関する解剖学的考察に応じて様々に異なる。
【０１３４】
さらに、腔内（すなわち、前房）注射は、本開示の範囲に含まれる。
【０１３５】
別の実施形態では、所望または必要であれば、点眼薬またはアイスプレーの形態で、ならびに結膜下注射、眼内の腔内注射、テノン嚢下注射、関節内注射または病巣内注射を介して、特に、限定するものではないが、患者の要求を是認する場合であって追加の薬剤を送達する必要があるいくつかの場合において、製剤を送達してもよい。
【０１３６】
以下の実施例、配列表及び図は、本発明の理解を補助するために提供するものであって、その真の請求範囲は添付の特許請求の範囲に示す。本発明の精神から逸脱することなく、記載する手順において改変を行い得ることは理解されたい。
【実施例】
【０１３７】
実施例１．マウス定常領域を有する抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂ
すべての動物の処置は、動物実験委員会によって定められたガイドラインに従って実施した。Ｈａｒｂｏｕｒ抗体（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のＨＣＡｂマウスを用いて、抗ＰＤＧＦ抗体を作製した。
【０１３８】
５匹のメスのＨＣＡｂマウスに対し、０日目に、１０μｇの精製ヒトＰＤＧＦ‐ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）及び完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）で、最初に腹腔内免疫した。マウスに対し、１５、３０及び４５日目に、１０μｇの精製ヒトＰＤＧＦ‐ＢＢ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）で、腹腔内に追加免疫した。免疫スケジュールの６０日目に、ＰＤＧＦ‐ＢＢに対する血清抗体力価を測定した。脾臓を採取する３日前に、マウスに対し、ヒトＰＤＧＦ‐ＢＢ（１０μｇ／マウス）で静脈内に追加免疫した。ＳＰ２０融合パートナーを用いて、標準的なハイブリドーマ技術の方法に従って、融合を実施した。ハイブリドーマ上清を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングし、抗ヒトＰＤＧＦ‐ＢＢを検出した。陽性培養物を増殖させ、限界希釈によって２回サブクローニングした。プロテインＡ精製抗体調製物をすべての試験で使用した。
【０１３９】
実施例２．ヒト定常領域を有する抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂ
所望のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。各ハイブリドーマから単離したＶＨ領域（図３）を、ＬｇＧ１ヒンジ領域及びＣＨ２／ＣＨ３領域に融合させ、ＧＳ  ＳＹＳＴＥＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）発現プラスミド中にＨＣＡｂ配列を形成した。発現プラスミドをＣＨＯ細胞株に形質移入して完全ヒト組換えＨＣＡｂを産生した。
【０１４０】
本発明のヒト抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂの例は以下の通りである：
表２．抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂの配列
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2018523673.tif 000004
2018523673.tif 000005
【０１４１】
実施例３．抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂの特徴決定
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）による２５℃でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて、選択した精製抗ヒトＰＤＧＦ‐βモノクローナル抗体への抗原結合の結合親和性及び速度定数を測定した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を、標準的なカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ‐１００８‐３９）を使用し、メーカーの説明書に従って、ＣＭ５バイオセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接固定した。精製した抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂ分子をランニングバッファーＨＢＳ‐ＥＰＢ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ‐１００６‐６９）で希釈して０．５〜１．０μｇ／ｍｌとし、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ表面に結合させて捕捉した。ヒトＰＤＧＦ‐ＢＢ（Ｒ＆Ｄシステム、２２０‐ＢＢ）の０．６２５〜１０ｎＭの範囲の２倍系列希釈物を、３０μｌ／ｍｉｎの流速で抗ＰＤＧＦ‐ＢＢ  ＨＣＡｂ捕捉表面上に注入した。会合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに基づいて計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比によって決定した。異なる抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂの速度論的結合パラメータを表３に示す。
表３．ヒトＰＤＧＦ  ＢＢへの抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂの結合特性
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*検出限界未満
【０１４２】
実施例４．ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ  ＢＢの結合をブロックする抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂ
９６ウェルマイクロタイタープレート上で２μｇ／ｍＬ／ウェルのＰＤＧＦＲβ‐Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩コーティングした。別のプレートにおいて、抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂの系列希釈物を、２ｎＭのヒトビオチン化ＰＤＧＦ‐ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で１時間、インキュベートした。ＰＤＧＦＲβ‐Ｆｃをコーティングしたマイクロタイタープレートに、１００μＬの抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂ‐ＰＤＧＦ‐ＢＢ混合物を１時間、アプライした。次いで、検出抗体（抗ビオチンＨＲＰ）を１時間、添加し、化学発光ＨＲＰ基質を用いてＥＬＩＳＡを実施し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂは、ＰＤＧＦ‐ＢＢの、その受容体ＰＤＧＦＲβへの結合をブロックしたが、そのＰＤＧＦＲβへのブロックに関する抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂのＩＣ50を表４にまとめる。
表４．ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ  ＢＢの結合に対する抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂのブロッキング
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【０１４３】
実施例５．抗ＰＤＧＦ  ＨＣＡｂの特徴決定
改変した場合に抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂ  Ｐ３６Ｃ１２の結合親和性を変化させるようなＣＤＲ配列中のアミノ酸位置を、アラニンスキャニング法を用いて同定した。
【０１４４】
本開示の抗ＰＤＧＦ  ＢＢ  ＨＣＡｂ  Ｐ３６Ｃ１２において使用するための特定のＣＤＲを、表５に提示する：下線を付したアミノ酸は、アラニンへの置換により結合が実質的に低下するアミノ酸である。
表５
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【０１４５】
したがって、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲの特定の残基に置換を有する抗ＨＣＡｂ抗体は、本開示の範囲に含まれる。一実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号２３）の位置７のアミノ酸を任意のアミノ酸で置換した配列を有する。他の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＳＳＹＡの７位のアミノ酸を本明細書に開示するような保存的アミノ酸で置換した配列を有する。別の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＳＳＹＡの７位のアミノ酸を本明細書で定義するものと同じクラスのアミノ酸で置換した配列を有する。
【０１４６】
一実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ２は、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号２４）の３位または８位のアミノ酸の１つ以上を任意のアミノ酸で置換した配列を有する。他の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ２は、ＩＳＧＳＧＧＳＴの３位または８位のアミノ酸の１つ以上を本明細書に開示するような保存的アミノ酸で置換した配列を有する。他の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２ＣＤＲ２はＩＳＧＳＧＧＳＴの３位または８位のアミノ酸の１つ以上を本明細書で定義するものと同じクラスのアミノ酸で置換した配列を有する。
【０１４７】
別の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ３は、ＲＮＳＥＩＦＭＶＫＧＶＩＱＹＮＳ（配列番号２５）の３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位の１つ以上のアミノ酸を任意の  アミノ酸で置換した配列を有する。他の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ３は、ＲＮＳＥＩＦＭＶＫＧＶＩＱＹＮＳの３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位の１つ以上のアミノ酸を本明細書に開示するような保存的アミノ酸で置換した配列を有する。他の実施形態では、Ｐ３６Ｃ１２  ＣＤＲ３は、ＲＮＳＥＩＦＭＶＫＧＶＩＱＹＮＳの３、４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１６位の１つ以上のアミノ酸を本明細書で定義するものと同じクラスのアミノ酸で置換した配列を有する。
【０１４８】
他に特段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分の量、分子量、反応条件などの特性を表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されるものとして理解すべきである。「約」及び「およそ」という用語は、１０〜１５％、好ましくは５〜１０％の範囲内にあることを意味する。したがって、相反する文言が示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて様々に異なり得る近似値である。最低限、及び特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告する有効数字の桁数を考慮するとともに、通常の概数技術を適用して解釈すべきである。本発明の広い範囲を示す数値域及びパラメータは近似値ではあるが、特定の実施例に示す数値を可能な限り正確に報告する。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に認められる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。
【０１４９】
本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）使用する用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象は、他に特段の指示がない限り、または文脈上、明らかに矛盾がない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に収まる各個別の値を個々に参照することへの略式の方法として作用することを単に意図するものである。本明細書中で他に特段の指示のない限り、個々の値は、それが個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載するすべての方法は、本明細書中で他に特段の指示のない限り、または文脈上、明らかに矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書中で提供する任意の及びすべての実施例、または例示的な用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図したものであって、他の請求しようとする本発明の範囲を限定することを提起するものではない。本明細書中のいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の請求していない要素を示すものとして解釈すべきではない。
【０１５０】
本明細書において開示する本発明の代替の要素または実施形態のグループ分けは、限定するものとして解釈すべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループ内の他のメンバーもしくは本明細書に認められる他の要素と任意に組み合わせて、参照し、請求する場合がある。利便性及び／または特許性の理由から、１つ以上のグループのメンバーを、グループに含めるか、またはグループから削除することが予想される。そのような包含または削除が生じる場合、本発明は修正したグループを含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用するすべてのマーカッシュグループの記述を満たすものとみなされる。
【０１５１】
本発明を実施するために、本発明者らに周知の最良の形態を含む本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。当然のことながら、これらの記載する実施形態の変形例は、上記の説明を通読することによって当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形例を適切に用いることを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載する方法以外の方法で実施されることを想定している。したがって、本発明は、適用法令によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載する本発明のすべての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書中で他に特段の指示のない限り、あるいは文脈上、明らかに矛盾がない限り、本発明は、それらのすべての可能な変形例における上記の要素の任意の組合せを包含する。
【０１５２】
本明細書において開示する特定の実施形態は、用語の「からなる」、または「本質的に〜からなる」を用いる特許請求の範囲において、さらに限定される場合がある。特許請求の範囲において使用する場合、移行句「からなる」は、特許請求の範囲に記載しているか否かに関わらず、特許請求の範囲に記載していない要素、工程、または成分を排除する。移行句「本質的に〜からなる」は、特定の物質または工程、ならびに基礎的及び新規な特性（複数可）に重大な影響を及ぼすことがないそれらのものに請求の範囲を限定する。そのように請求する本発明の実施形態を、本質的にまたは明示的に本明細書に記載するとともに、使用できるようにする。
【０１５３】
さらに、本明細書を通して、特許文献及び刊行物に対し、多数の参照がなされている。上記に引用する各参考文献及び刊行物は、個々に参照としてその全体を本明細書に援用する。
【０１５４】
最後に、本明細書において開示する本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることを理解されたい。用い得る他の改変も本発明の範囲に含まれる。したがって、例示として、しかし限定するものではなく、本発明の代替の構成を本明細書の開示に従って利用してもよい。したがって、本発明は、図示し、記載するものに厳密に限定するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
2018523673.tif 000016
【図４】
2018523673.tif 000017
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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