(57)【要約】本開示は、抗細菌性組成物及び、耐性細菌が原因となる細菌感染の処置方法を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質耐性細菌が原因となる感染の処置に有用な組成物であって、前記耐性が、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものであり、前記組成物が、
ｉ）少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタム、
ｉｉ）少なくとも１種のβラクタマーゼ阻害薬、及び
ｉｉｉ）少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタム
を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記抗生物質耐性細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗生物質耐性細菌が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、及びＳ．ｆｅｌｉｓからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗生物質耐性細菌が、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムが、メロペネム、イミペネム、トモペネム、セフタロリン、及びセフトビプロールからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムが、メロペネム及びイミペネムからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種のβラクタマーゼ阻害薬が、クラブラン酸（クラブラネート）、スルバクタム、タゾバクタム、及びアビバクタムからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種のβラクタマーゼ阻害薬が、タゾバクタム及びクラブラネートからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムが、カルバペネム、アミノペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン、オキサシリン、メチシリン、及び一部のセファロスポリンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記カルバペネムが、メロペネム、イミペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、及びテビペネムからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オキサシリンまたはメチシリンが、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、オキサシリン、メチシリン、及びナフシリンからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記セファロスポリンが、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフタロリン、及びセフトビプロールからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アミノペニシリンが、アモキシシリン、アンピシリン、ピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン、及びエピシリンからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カルボキシペニシリンが、カルベニシリン、カリンダシリン、チカルシリン、及びテモシリンからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ウレイドペニシリンが、アズロシリン、メズロシリン、及びピペラシリンからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムが、メシリナム、セフラジン、及びチエナマイシンではない、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムが、ピペラシリン及びアモキシシリンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記カルバペネムがメロペネムであり、前記βラクタマーゼ阻害薬がタゾバクタムであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合する前記βラクタムがピペラシリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記カルバペネムがイミペネムであり、前記βラクタマーゼ阻害薬がクラブラネートであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合する前記βラクタムがピペラシリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記カルバペネムがメロペネムであり、前記βラクタマーゼ阻害薬がタゾバクタムであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合する前記βラクタムがアモキシシリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の比が１：１：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、前記組成物に対する耐性の進化を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
対象における、抗生物質耐性細菌が原因となる感染を処置する方法であって、前記耐性が、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものであり、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項１から２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）が原因となる感染を処置する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１から２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、ＮＩＧＭＳ、ＮＳＦ、ＮＨＧＲＩ、ＮＩＤＤＫ、ＮＩＡＩＤ、及びＮＩＨにより授与されたＧＭ：００７０６７、ＤＧＥ−１１４３９５４、Ｔ３２ＨＧ００００４５、Ｔ３２ＧＭ００７０６７、ＤＰ２ＤＫ０９８０８９、Ｒ０１ＧＭ０９９５３８、ＡＩ９０８１８、及びＡＩ１０４９８７の下、政府支援によりなされたものである。政府は、本発明にある一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月９日に出願された米国仮出願番号第６２／１９０，５８８号の利益を主張し、その全体が参照により本書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本開示は、抗細菌性組成物及び、耐性細菌が原因となる細菌感染の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
多剤耐性（ＭＤＲ）病原体は、ヒトの健康に対する増大する脅威となっており、実際上、多くの感染性疾患が抗生物質以前の時代に向かって退行している。その典型例として、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の市中感染が劇的に上昇していることが挙げられる。メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、世界中で最も蔓延している多剤耐性病原体の１つであり、このような多剤耐性病原体感染の処置に使用される最新抗生物質による単剤療法に対し、耐性の増加を示している。ＭＲＳＡの出現により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する治療選択肢としてのβラクタムを使用は事実上排除された。最近開発されたβラクタム剤のセフタロリンは、ＭＲＳＡ感染の処置において、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位に結合することにより活性を示し、薬剤による不活性化のために活性部位の開放を誘発する。しかし、セフタロリンに対する耐性や、ＭＲＳＡの処置に使用される他の抗生物質（リネゾリド、バンコマイシン、及びダプトマイシンを含む）に対する耐性が報告されている。したがって、当技術分野では、ＭＤＲ病原体を処置し、かつ既存の抗生物質を再利用するための新しい戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本開示は、抗生物質耐性細菌が原因となる感染の処置に有用な組成物であって、この耐性が、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものである、組成物を提供する。この組成物は、（ｉ）少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムと、（ｉｉ）少なくとも１種のβラクタマーゼ阻害薬と、（ｉｉｉ）ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムと、を含む。ある特定の実施形態では、この抗生物質耐性細菌は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。一実施形態では、カルバペネムはメロペネムであり、βラクタマーゼ阻害薬はタゾバクタムであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムはピペラシリンである。別の実施形態では、カルバペネムはイミペネムであり、βラクタマーゼ阻害薬はクラブラネートであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムはピペラシリンである。なお別の実施形態では、カルバペネムはメロペネムであり、βラクタマーゼ阻害薬はタゾバクタムであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムはアモキシシリンである。具体的には、この組成物は、組成物に対する耐性の進化を抑制する。
【０００６】
別の態様では、本開示は、対象における、抗生物質耐性細菌が原因となる感染を処置する方法であって、この耐性がペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものである、方法を提供する。この方法は、対象に、有効量の本開示における組成物を投与することを含む。
【０００７】
なお別の態様では、本開示は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）が原因となる感染を処置する方法を提供する。この方法は、対象に、有効量の本開示における組成物を投与することを含む。
【０００８】
本出願ファイルには、カラーで制作された図面が少なくとも１点含まれている。カラー図面による本特許出願発行物のコピーは、要請時及び必要料金の支払時に特許商標庁から提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】３Ｄチェッカーボードの相乗作用判定を示す図である。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺの単剤、２剤、または３剤条件下で最小阻害濃度（ＭＩＣ）及びインビトロで増殖させたアイソボールを示している。各パネル内の色の付いた線／アイソボールは、併用した２種の薬剤のＭＩＣを示す。破線は、相加的相互作用の理論濃度を示す。点は、メロペネム（ＭＥ）、ピペラシリン（ＰＩ）、及びタゾバクタム（ＴＺ）の各試験条件における最高阻害未満濃度を示す。赤色の三角は、併用した全３種の薬剤（各２μｇ／ｍｌ）のＭＩＣを示す。
【図２】ＭＲＳＡ  Ｎ３１５が抗細菌剤併用物による攻撃を受けた際の経時的な増殖速度の変化を示すグラフである。１１日間にわたるＭＲＳＡ  Ｎ３１５の増殖速度を、ＭＩＣを下回る１段階３倍希釈で試験した各抗細菌性併用物について計算した。１日目（初期増殖速度）とアッセイの最後の６日間における平均速度（最終増殖速度）との間の増殖速度の差（Δｒ）を計算した。増殖速度Δｒの変化が０．２超の条件にあるＭＲＳＡ  Ｎ３１５を、適応されたものとみなした。適応時間パラメーターｔ−ａｄａｐｔを、増殖速度の変化が最大半量である時間として計算した。この基準を満たす株について、適応速度α＝（Δｒ／２）ｔ−ａｄａｐｔ（１／ｈ２）を計算した。結果は、２回の反復実験によるものである。ＭＥ／ＰＩの速度：α＝８．２３×１０−３ｈ−２；ＭＥ／ＴＺ：α＝８．６８×１０−４ｈ−２；ＰＩ／ＴＺ：α＝４．３２×１０−３ｈ−２。ＭＩＣを下回るある３倍希釈におけるＭＥ／ＰＩ／ＴＺ（各１．２μｇ／ｍｌ）及び薬剤なし対照のみが増殖速度増加を示さず、適応しなかった。
【図３】ＭＲＳＡ  Ｎ３１５の抗細菌性併用物に対する適応を抑制する基礎となる付帯感受性を例示する図である。（図３Ａ）ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ、その単一構成要素及び２重構成要素、ならびに様々なサブクラスの他の１３ラクタム化合物（セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、及び１３ラクタマーゼ阻害薬）の間の付帯感受性及び耐性における、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５の相互作用ネットワークである。ノードの色は、１３ラクタム、１３ラクタマーゼ阻害薬、または併用物のサブクラスを示す。青色の矢印は、付帯感受性を示す。黒色の線は、付帯耐性を示す。例えば、ピペラシリンに対する適応により、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５はメロペネム及びイミペネムに対し感作される。セファロスポリンは、試験を行ったいずれの化合物に対しても付帯感受性を有しなかった。対が試験されなかった場合、または付帯効果が見られなかった場合、接続矢印は示されない。（図３Ｂ）ＭＥ／ＰＩ／ＴＺならびにその単一及び２重の構成要素のみの間の付帯感受性及び耐性における、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５の相互作用ネットワークである。太い青色の矢印は、２つのノード（例えば、ピペラシリン及びメロペネム／タゾバクタム）間の相互的付帯感受性を示す。
【図４】相乗作用及び付帯感受性の機序についてのゲノム的根拠を示すグラフである。（図４Ａ）ＭＲＳＡ  Ｎ３１５のメロペネム／タゾバクタムまたはタゾバクタム単体に対する適応により、プラスミドｐＮ３１５が不安定になる。タゾバクタムを含有する薬剤併用物（ＴＺ）またはタゾバクタムを含有しない薬剤併用物（ｎｏｎ−ＴＺ）に適応させたＭＲＳＡ  Ｎ３１５において、ｐＮ３１５にアライメントするリードカバレッジ（試料当たりの総リードとの対比で）。所与の条件下の適応日数が示されており、例えばＤ−２は、分離菌が適応から２日後にシークエンスされたことを示す。（図４Ｂ、図４Ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲは、ｂｌａ及びｍｅｃオペロンの調節不全をＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるいくつかの付帯感受性の原因機序として裏付けている。野生型ＭＲＳＡ  Ｎ３１５または適応株（ＴＺ  １００μｇ／ｍｌに適応させたＮ３１５及びＰＩ  ３３．３μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌに適応させたＮ３１５）において、ｇｙｒＢと比較して示されるｂｌａＺまたはｍｅｃＡの発現、次にブロス単独またはブロス＋ＭＩＣ未満  ＰＩまたはＴＺ中での増殖。Ｎ．Ｄ．＝測定されず。「−」は、発現なしを示す。ＴＺに適応させたＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるｂｌａＺ発現の喪失は、ｂｌａＺ及びｂｌａオペロンの喪失を裏付けるものであり、かつｍｅｃＡ発現の調節不全にも合致する。データは、３回の反復実験によるものである。誤差バーは、測定値の標準誤差を示す。
【図５】ＭＲＳＡ  Ｎ３１５の好中球減少マウス腹膜炎モデルにおけるＭＥ／ＰＩ／ＴＺ処置の有効性を示すグラフである。マウス（ｎ＝６）における各薬剤処置からの相対的生存が示されている。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ、ＭＥ／ＰＩ、及びリネゾリドによる処置は、ビヒクルに対し有意差がある。（＊ｐ＝０．０２）誤差バーは、試験条件ごとの生存割合の標準誤差を示す。
【図６】細菌プレートの増殖を示す写真であり、ＭＲＳＡ  ＣＯＬアンチセンス（ＡＳ）株についてのＰＢＰキシロース誘導を例示するものである。（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）ｐｂｐ２ａ／ｍｅｃＡアンチセンス（ＡＳ）株。ＰＢＰ２ａの標的化抑制により、キシロース誘導下でメロペネムの増加した感受性が示された。増加した感受性が、ピペラシリンについても観察された。増加した感受性が、全ての併用物について観察された。（図６Ｄ、図６Ｅ）ｐｂｐＡアンチセンス（ＡＳ）株。ＰＢＰ１の標的化抑制により、メロペネム及びピペラシリンに対する増加した感受性が示された。感受性増加が、ＭＥ／ＰＩ、ＭＥ／ＴＺ、及びＭＥ／ＰＩ／ＴＺの併用物について観察された。（図６Ｆ、図６Ｇ）ｐｂｐ２アンチセンス（ＡＳ）株。ＰＢＰ２の標的化抑制により、メロペネム及びピペラシリンに対する感受性増加が示された。感受性増加は、全ての組み合わせについて観察された。（図６Ｈ、図６Ｉ）ｐｂｐ３アンチセンス（ＡＳ）株。ＰＢＰ３の標的化抑制により、単一薬剤のいずれに対しても感受性増加が示されなかった。ＭＥ／ＰＩ併用物についてはわずかな感受性の増加が観察されたが、他の併用物はいずれについても感受性の変化が観察されなかった。
【図７】ＭＲＳＡ  Ｎ３１５のβラクタム併用物に対する適応を抑制する基礎となる、付帯感受性を例示するプロットである。青の陰影は、株を単一薬剤及び２重薬剤併用物に対し事前に適応させた後の、株の単一薬剤及び併用物に対する付帯感受性を示す。赤の陰影は、付帯耐性を示す。薄い陰影＝１段階のＭＩＣ希釈の変化。濃い陰影＝２段階以上のＭＩＣ希釈の変化。例えば、ピペラシリンに対する適応によりメロペネムに対する付帯感受性がもたらされ、逆も同様である。ＭＥ＝メロペネム、ＰＩ＝ピペラシリン、ＴＺ＝タゾバクタム、ＡＸ＝アモキシシリン、ＣＦ＝セフジニル、ＣＰ＝セフェピム、ＣＸ＝セフォキシチン、ＤＣ＝ジクロキサシリン、ＩＭ＝イミペネム。
【図８】ピペラシリン／タゾバクタムに適応させたＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるゲノム複製を例示するヒストグラムである。ヒストグラムは、Ｎ３１５のゲノムにわたる総リードカバレッジを示しており、図８Ａはメロペネム／タゾバクタムに５日間、図８Ｂはタゾバクタム単独に２日間、図８Ｃはピペラシリン／タゾバクタムに６日間、図８Ｄはピペラシリン／タゾバクタムに１１日間、それぞれ適応させたＮ３１５についてのものである。塩基毎のリードカバレッジの全ゲノムにわたる平均及び赤色の四角が示す領域のみにおける塩基リードカバレッジ当たりの平均は、それぞれ、ａ）１１６．６リード／ｂｐ及び１２６．６リード／ｂｐ、ｂ）１２４．５リード／ｂｐ及び１２８．９リード／ｂｐ、ｃ）１５７．８リード／ｂｐ及び３０２．２リード／ｂｐ、ならびにｄ）１２０．１リード／ｂｐ及び２３０．６リード／ｂｐである。図８Ａ及び図８Ｂのクローンを、全ての非ピペラシリン／タゾバクタム適合を代表するものとして選択した。
【図９】ＭＲＳＡに対するメロペネム／ピペラシリン／タゾバクタム（ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ）の相乗作用の機序を提案する図である。発明者らのデータは、発明者らが提案するＭＲＳＡにおける細胞壁合成に対する相乗的作用様式を支持するものであり、この作用様式は以下を伴う：Ｉ）カルバペネムによる、ＰＢＰ１の分裂隔壁におけるペプチド転移の抑制、ＩＩ）ペナム（ペニシリン）による、ＰＢＰ２のペプチド転移の抑制、ＩＩＩ）βラクタマーゼ阻害薬による、ペナムに対するβ−ラクタマーゼ活性の抑制、及びＩＶ）メロペネムまたは他のβラクタムによる阻害を可能にする、メロペネムによる、ＰＢＰ２ａの活性部位のアロステリックな開放。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書では、抗生物質の併用物を含む組成物が開示される。これらの抗生物質は、βラクタム抗生物質の３つのサブクラスからのものであり、いずれも細胞壁合成を標的とする。この療法は、以下のものを使用する：１）同じ細胞系の複数のノードを標的とする抗生物質、２）薬剤の相乗作用の利用により薬剤の効力を増加させるようなこれらの抗生物質の併用物、及び３）耐性の進化を抑制するための、当該併用物における構成要素間の付帯感受性。理論に拘泥されることは望まないが、当該組成物は、ペニシリン結合タンパク質−１（ＰＢＰ１）を阻害し、かつ併用物における抗生物質の別の分子が阻害できるようにするためにＰＢＰ２ａの活性部位をアロステリックに開放するカルバペネムまたは他の好適なβラクタムと、ＰＢＰ２及びＰＢＰ２ａと結合するβラクタムと、βラクタマーゼからβラクタム（複数可）を保護するβラクタマーゼ阻害薬と、を含む。この結果、細胞壁合成機構の複数の構成要素を同時に攪乱することによる相乗的応答がもたらされる。発明者らは、この併用物が相乗的に作用し、ＰＢＰ２ａを含む細菌、具体的にはメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）に対し殺細菌性であることを示した。
【００１１】
Ｉ．組成物
一態様では、抗生物質耐性細菌が原因となる感染の処置に有用な組成物であって、この耐性がペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものである、組成物が、本明細書で提供される。この組成物は、少なくとも１種の、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムと、少なくとも１種のβラクタマーゼ阻害薬と、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムと、を含む。
【００１２】
発明者らは、本開示の組成物が、記載されている抗生物質併用物に曝露した後の耐性細菌の進化を低減または消去することを発見した。本開示の組成物においては、１つの抗生物質がＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合し、別の抗生物質がＰＢＰ２ａの活性部位と結合することが不可欠である。理論に拘泥されることは望まないが、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合する抗生物質は、ＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼ活性部位を開放し、ＰＢＰ２ａの活性部位と結合する抗生物質がＰＢＰ２ａの別の部位にも結合できるようにする。これら抗生物質の両方が結合するには、生命に必要となるＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼ機能を完全に停止する必要がある。ＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼ機能を停止することにより、ＰＢＰ２ａ駆動機序に依存する抗生物質耐性細菌が死滅することになる。このような細菌の一具体例に、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）がある。当該組成物におけるβラクタマーゼ阻害薬は、併用物におけるβラクタム（複数可）を、耐性細菌が産生するβ−ラクタマーゼによる酵素分解から保護することにより、耐性細菌の死滅をさらに促進する。
【００１３】
本開示によれば、当該組成物は、耐性がペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものである抗生物質耐性細菌に対し、有効である。当業者であれば、抗生物質耐性細菌がＰＢＰ２ａ駆動機序による耐性を示すかを判定できるであろう。例えば、このような細菌は、ＰＢＰ２ａをコードするｍｅｃＡを含み得る。概して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種は、現時点ではｍｅｃＡ遺伝子を所持することが知られており、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、及びＳ．ｆｅｌｉｓが挙げられる（Ｐｅｔｉｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｃＡ，ｍｅｃＲ１  ａｎｄ  ｍｅｃＩ  ｇｅｎｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７，２９７−３０４（２００１））、（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｗａｓｔｅ．  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｅｖ．Ｃｔｒｉｅｓ．９，（２０１５））。したがって、一実施形態では、抗生物質耐性細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に由来する。別の実施形態では、抗生物質耐性細菌は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、及びＳ．ｆｅｌｉｓからなる群から選択される。特定の実施形態では、この抗生物質耐性細菌は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。ＰＢＰはペニシリン結合タンパク質であり、これは、細菌におけるペプチドグリカン細胞壁の合成に必要なトランスペプチダーゼ酵素である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓには４種の未変性ＰＢＰが存在し、このうちＰＢＰ２は、細胞の生存能に不可欠なＰＢＰである。メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、ＰＢＰ２の所持に加えて、細胞壁合成のための全ての重要なトランスペプチダーゼ活性を実施することができる補助的ＰＢＰ（ＰＢＰ２ａ）を獲得している。ＰＢＰ２ａは、βラクタム（典型的には、未変性ＰＢＰ２を阻害することによって機能する）が多く存在する場合であっても、トランスペプチダーゼ活性を有する。βラクタム薬剤はＰＢＰを特定的に標的とし、いくつかのサブクラスから構成されている。これらのサブクラスはいずれもβラクタムの「弾頭」を含有し、様々なＰＢＰ親和性を有する。非限定的な例としては、ペニシリン、カルバペネム、セファロスポリン、及びモノバクタムが挙げられる。しかし、ＰＢＰ２ａは、未変性の閉構造において、一部のβラクタムとの親和性が低く、ＰＢＰ２ａを含有する生命体は、この薬剤クラスに対し高い耐性を有することになる。したがって、本開示は、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位に結合する１つのβラクタムを用いて、ＰＢＰ２ａを開放したまま保持しながら、第２のβラクタムが活性部位の開放構造に結合してＰＢＰ２ａの機能を実際上阻害することにより、この弱い結合を克服する。
【００１４】
本開示の組成物は、部分的には、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムを含む。したがって、本開示のカルバペネムまたは他の好適なβラクタムは、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位に結合しなければならない。ＰＢＰ２ａのアロステリック部位に結合するカルバペネムまたは他の好適なβラクタムの非限定的な例としては、メロペネム、イミペネム、トモペネム、セフタロリン、及びセフトビプロールが挙げられる。特定の実施形態では、カルバペネムは、メロペネム及びイミペネムからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、カルバペネムはメロペネムである。なお別の特定の実施形態では、カルバペネムはイミペネムである。
【００１５】
本開示の組成物は、部分的には、βラクタマーゼ阻害薬を含む。好適なβラクタマーゼ阻害薬は、組成物中にも存在するβラクタムを、細菌が産生するβ−ラクタマーゼによる酵素分解から保護する。したがって、βラクタマーゼ阻害薬は、β−ラクタマーゼの活性を阻害する。β−ラクタマーゼは、ペニシリンに類する抗生物質を機能させるβラクタム環を破壊する酵素のファミリーである。βラクタマーゼ阻害薬の非限定的な例としては、クラブラン酸（クラブラネート）、スルバクタム、タゾバクタム、及びアビバクタムが挙げられる。特定の実施形態では、βラクタマーゼ阻害薬は、タゾバクタム及びクラブラネートからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、βラクタマーゼ阻害薬はタゾバクタムである。なお別の特定の実施形態では、βラクタマーゼ阻害薬はクラブラネートである。
【００１６】
本開示の組成物は、部分的には、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムを含む。したがって、本開示のβラクタムは、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造に結合しなければならない。ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造に結合するβラクタムの非限定的な例としては、カルバペネム、アミノペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン、オキサシリン、メチシリン、及び一部のセファロスポリンが挙げられる。カルバペネムの非限定的な例としては、メロペネム、イミペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、及びテビペネムが挙げられる。オキサシリン及びメチシリンの非限定的な例としては、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、オキサシリン、メチシリン、及びナフシリンが挙げられる。ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造に結合するセファロスポリンの非限定的な例としては、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフタロリン、及びセフトビプロールが挙げられる。注目すべきことに、ほとんどのペニシリン型βラクタム（例えば、アミノペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン）は、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造に結合する。アミノペニシリンの非限定的な例としては、アモキシシリン、アンピシリン、ピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン、及びエピシリンが挙げられる。カルボキシペニシリンの非限定的な例としては、カルベニシリン、カリンダシリン、チカルシリン、及びテモシリンが挙げられる。ウレイドペニシリンの非限定的な例としては、アズロシリン、メズロシリン、及びピペラシリンが挙げられる。ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造に結合せず、本開示の組成物においては機能しないβラクタムの非限定的な具体例としては、メシリナム、セフラジン、及びチエナマイシンが挙げられる。特定の実施形態では、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムは、ピペラシリン及びアモキシシリンからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムは、ピペラシリンである。なお別の特定の実施形態では、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムは、アモキシシリンである。
【００１７】
特定の実施形態では、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムはメロペネムであり、βラクタマーゼ阻害薬はタゾバクタムであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムはピペラシリンである。別の特定の実施形態では、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムはイミペネムであり、βラクタマーゼ阻害薬はクラブラネートであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムはピペラシリンである。なお別の実施形態では、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタムはメロペネムであり、βラクタマーゼ阻害薬はタゾバクタムであり、ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムはアモキシシリンである。
【００１８】
併用物における各抗生物質の量の比は、当技術分野で公知の方法を介して実験的に決定することができる。例えば、図１に示すように、３Ｄチェッカーボードグラフを使用して、併用物における各抗生物質の比を決定することができる。このような方法体系を使用して、当業者は抗生物質併用物の最適な比を決定でき得る。発明者らが実証するように、併用物における抗生物質の比は、６４：１：１、１：６４：１、及び１：１：６４〜１：１：１の範囲とすることができる。特定の実施形態では、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位と結合可能なカルバペネムまたは他の好適なβラクタム：β−ラクタマーゼ阻害剤：ＰＢＰ２ａの活性部位の開放構造と結合するβラクタムの比は、１：１：１である。ただし、これらの比は様々なものとすることができ、依然として本開示における有効な併用物となり得ることを理解されたい。
【００１９】
有利なことに、本開示の組成物は、上記組成物に対する耐性の進化を抑制する。特定の抗生物質による処置を受けた患者は、様々な理由によりかかる抗生物質に対する耐性を発達させることが多い。この耐性の発達及び伝播は、抗微生物療法の有効性及び寿命を劇的に減じる恐れがある。驚くべきことに、発明者らは、本開示の併用物が耐性の進化を抑制することを示した。言い換えれば、本開示の併用物に細菌を長時間曝露した後に、上記併用物に耐性を有する細菌は観察されなかった。このことは、単剤及び二剤併用物のいずれとも全く対照的である。
【００２０】
（ａ）医薬組成物
本開示は、医薬組成物も提供する。この医薬組成物は、活性成分としての本開示における１つ以上の抗生物質と、少なくとも１種の医薬的に許容される添加剤とを含む。
【００２１】
医薬的に許容される添加剤は、賦形剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、ｐＨ改変剤、崩壊剤、分散剤、保存料、滑沢剤、食味マスキング剤、香味剤、または着色剤とすることができる。医薬組成物の形成に利用される添加物の量及び型は、薬学における既知の原理に従って選択され得る。
【００２２】
一実施形態では、添加物は賦形剤であり得る。賦形剤は、圧縮性（すなわち、可塑的に変形可能）であっても摩耗的に脆く（ａｂｒａｓｉｖｅｌｙ  ｂｒｉｔｔｌｅ）てもよい。好適な圧縮性賦形剤の非限定的な例としては、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、アセテート及びブチレートの混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トウモロコシデンプン、リン酸化トウモロコシデンプン、アルファ化トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン−乳糖、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ブドウ糖、果糖、乳糖、乳糖一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、及びトレハロースが挙げられる。好適な摩耗的に脆い賦形剤の非限定的な例としては、第二リン酸カルシウム（無水物または二水和物）、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、及び炭酸マグネシウムが挙げられる。
【００２３】
別の実施形態では、添加物は結合剤であり得る。好適な結合剤としては、以下に限定するものではないが、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びこれらの併用物が挙げられる。
【００２４】
別の実施形態では、添加物は充填剤であり得る。好適な充填剤としては、以下に限定するものではないが、炭水化物、無機化合物、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。非限定的な例として、充填剤は、硫酸カルシウム（二塩基性及び三塩基性の両方）、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶性セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、修飾デンプン、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールであり得る。
【００２５】
なお別の実施形態では、添加物は緩衝剤であり得る。好適な緩衝剤の代表例としては、以下に限定するものではないが、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、トリス緩衝液、及び緩衝食塩液塩（例えば、トリス緩衝食塩液またはリン酸緩衝食塩液）が挙げられる。
【００２６】
様々な実施形態では、添加物はｐＨ改変剤であり得る。非限定的な例として、ｐＨ改変剤は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、またはリン酸であり得る。
【００２７】
別の実施形態では、添加物は崩壊剤であり得る。崩壊剤は、非発泡性であっても発泡性であってもよい。非発泡性崩壊剤の好適な例としては、以下に限定するものではないが、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、これらのアルファ化デンプン及び修飾デンプン）、甘味料、ベントナイトなどの粘土、微結晶性セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム（例えば、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペシチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、及びトラガント）が挙げられる。好適な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、重炭酸ナトリウムとクエン酸との組み合わせ及び重炭酸ナトリウムと酒石酸との組み合わせが挙げられる。
【００２８】
さらに別の実施形態では、添加物は分散剤または分散強化剤であり得る。好適な分散剤としては、以下に限定するものではないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａｔｅ）、及び微結晶性セルロースが挙げられ得る。
【００２９】
別の代替実施形態では、添加物は保存料であり得る。好適な保存料の非限定的な例としては、酸化防止剤（例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはパルミチン酸レチニル、クエン酸、クエン酸ナトリウム）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、及び抗微生物剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、またはフェノール）が挙げられる。
【００３０】
さらなる実施形態では、添加物は滑沢剤であり得る。好適な滑沢剤の非限定的な例としては、鉱物（例えば、タルクまたはシリカ）及び脂肪（例えば、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸）が挙げられる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、添加物は食味マスキング剤であり得る。食味マスキング物質としては、セルロースエーテル、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールとのコポリマー、モノグリセリドまたはトリグリセリド、アクリルポリマー、アクリルポリマーとセルロースエーテルとの混合物、酢酸フタル酸セルロース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３２】
代替実施形態では、添加物は香味剤であり得る。香味剤は、合成香味油及び合成香味料ならびに／または天然油、植物、葉、花、果実からの抽出物、ならびにこれらの組み合わせから選択することができる。
【００３３】
なおさらなる別の実施形態では、添加物は着色剤であり得る。好適な着色添加物としては、以下に限定するものではないが、食品、薬剤、及び化粧品着色料（ＦＤ＆Ｃ）、薬剤及び化粧品着色料（Ｄ＆Ｃ）、または外用薬剤及び化粧品着色料（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。
【００３４】
当該組成物における添加剤または添加剤の組み合わせの重量分率は、組成物の総量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下とすることができる。
【００３５】
当該組成物は、様々な剤形に製剤化し、治療有効量の活性成分を送達する複数の異なる手段により投与することができる。このような組成物は、経口的、非経口的、または局所的に、従来の無毒な医薬的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを所望に応じて含有する投与単位製剤において、投与することができる。また、局所投与は、経皮投与（例えば、経皮パッチまたはイオン導入デバイス）の使用も伴う場合がある。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内の注入、または輸液手法を含む。薬剤の製剤は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１８ｔｈ  ｅｄ，１９９５）、及びＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）で論じられている。
【００３６】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル、錠剤、カプレット、丸剤、粉末、ペレット、及び顆粒が挙げられる。そのような固体剤形では、通常、活性成分は１つ以上の医薬的に許容される添加剤と配合する。この添加剤の例は、上に詳述されている。また、経口調製物は、水性懸濁液、エリキシル剤、またはシロップとして投与することもできる。これらに関しては、活性成分は、様々な甘味剤または香味剤、着色剤、ならびに所望の場合は乳化剤及び／または懸濁化剤、さらに賦形剤（例えば、水、エタノール、グリセリン、及びそれらの組み合わせ）と配合することができる。
【００３７】
非経口投与（皮下、皮内、静脈内、筋肉内、及び腹腔内を含む）に関しては、調製物は水性溶液であっても油系溶液であってもよい。水性溶液としては、以下のものを挙げることができる：滅菌賦形剤、例えば、水、食塩液、医薬的に許容されるポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）、抗微生物剤及び／または抗真菌剤、例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなど、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム、キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、ならびに／あるいは張度調整用の薬剤、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖、またはポリアルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）。水溶液のｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。油系の溶液または懸濁液は、ゴマ油、ピーナツ油、オリーブ油、または鉱物油をさらに含んでもよい。
【００３８】
局所（例えば、経皮または経粘膜）投与に関しては、概して、バリアに対する透過に適切な透過剤が調製物に含まれる。経粘膜投与は、点鼻スプレー、エアロゾルスプレー、錠剤、または座薬の使用を通じて遂行することができ、経皮投与は、当技術分野で広く知られている軟膏、膏薬、ゲル、パッチ、またはクリームを介して遂行することができる。
【００３９】
ＩＩ．方法
一態様では、本開示は、対象における、抗生物質耐性細菌が原因となる感染を処置する方法であって、この耐性がペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものである、方法を包含する。この方法は、対象に、有効量の本開示における組成物を投与することを含む。
【００４０】
別の態様では、本開示は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）が原因となる感染を処置する方法を包含する。この方法は、対象に、有効量の本開示における組成物を投与することを含む。
【００４１】
本明細書で使用される「感染」という用語には、対象の表面上または中に存在し、増殖を阻害すれば対象に利益がもたらされるような、細菌を含めた微生物の存在が含まれる。そのため、「感染」という用語は、細菌の存在を指すことに加えて、望ましくない正常細菌叢も指す。「感染」という用語には、細菌が原因となる感染も含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」、または「処置」という用語は、本開示の医薬組成物を予防的目的及び／または治療的目的のために投与することを指す。「予防的処置」という用語は、まだ感染していないが感染しやすい、または感染のリスクがある対象に処置することを指す。「治療的処置」という用語は、既に感染にかかっている対象に処置を投与することを指す。また、本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」、または「処置」という用語は、追加の医薬的に活性または不活性の成分を伴ってまたは伴わずに、以下の目的で本開示の組成物を投与することも指す：（ｉ）細菌感染もしくは細菌感染の１つ以上の症状のいずれかを低減または除去する、または（ｉｉ）細菌感染もしくは細菌感染の１つ以上の症状の進行を遅らせる、または（ｉｉｉ）細菌感染もしくは細菌感染の１つ以上の症状の重症度を低減する、または（ｉｖ）細菌感染の臨床的徴候を抑制する、または（ｖ）細菌感染の有害症状の徴候を抑制する。
【００４３】
本明細書で使用される「制御する」または「制御すること」という用語は、概して、感染の防止、低減、もしくは根絶、またはそのような感染の割合及び程度の阻害、または微生物個体数（例えば、身体または構造、面、液体、対象などの表面上または中に存在する微生物個体数）の低減であって、このような感染または微生物個体数の防止または低減が、未処置の感染または個体数に対して統計的に有意である、低減を指す。概して、そのような制御は、微生物個体数における死亡率の増加によって達成され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療効果を有する量を指し、あるいは対象において治療効果をもたらすのに必要とされる量である。例えば、抗生剤または医薬組成物の治療有効量または医薬的有効量は、臨床試験結果、モデル動物感染研究、及び／または（例えば、寒天またはブロス培地における）インビトロ試験によって判断され得る所望の治療効果をもたらすのに必要とされる、抗生剤または医薬組成物の量である。有効量または医薬的有効量は、いくつかの要因に依存し、この要因には、以下に限定するものではないが、関連する微生物（例えば、細菌）、対象の特徴（例えば、身長、体重、性別、年齢、及び病歴）、感染の重症度、使用する抗生物質の詳細な型が含まれる。予防的処置に関しては、治療有効量または予防的有効量は、微生物（例えば、細菌）感染を防止するのに有効となるであろう量である。注目すべきことに、本明細書で開示される併用物は、活性薬剤の併用物の有効量を、単独の場合の有効量よりも低量とすることができ、その結果、総濃度がより低い抗生物質を対象に投与することができる。
【００４５】
「投与」または「投与すること」という用語には、組成物または１つ以上の医薬的活性成分を対象に送達することが含まれ、例えば、組成物もしくはその活性成分または他の医薬的活性成分を感染部位に送達する働きをする任意の適切な方法により送達することが含まれる。投与方法は、様々な要因、例えば、医薬組成物の構成成分、または医薬的活性成分もしくは非活性成分の型／性質、潜在的または実際的感染部位、関連する微生物、感染の重症度、対象の年齢及び健康状態などに応じて様々なものとなり得る。本開示による組成物または医薬的活性成分を対象に投与する方法のいくつかの非制限的な例としては、経口、静脈内、局所、呼吸器内、腹腔内、筋肉内、非経口、舌下、経皮、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、膣内、遺伝子銃、経皮パッチ、点眼、点耳、または洗口剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、この組成物またはその活性成分は、経口投与される。
【００４６】
本開示による組成物は様々な剤形に製剤化することができ、活性成分は、剤形中で共に（例えば、混合物として）存在しても別々の構成成分として存在してもよい。組成物中の様々な成分が混合物として製剤化される場合、そのような組成物は、そのような混合物を（例えば、タブレット、カプセル、溶液、粉末などの好適な単位剤形の形態で）投与することによって送達させることができる。代替方法として、諸成分は、有益な治療レベルに達し全体として組成物が相乗的効果をもたらす限りにおいて、別々に（同時または順次に）投与することもできる。組成物または剤形において、諸成分が混合物ではなく別々の構成成分としてもたらされる場合、このような組成物／剤形は、いくつかの方法で投与され得る。可能性がある一方法では、諸成分を所望の割合で混合することができ、次にこの混合物を必要に応じて投与する。代替方法として、構成成分を別々に投与することができ、構成成分は、同等の混合物の投与により達成されるであろう治療レベルまたは効果と同じまたは同等の治療レベルまたは効果が達成できるような適切な割合にする。
【００４７】
対象は、ヒト、家畜動物、ペット動物、実験動物、または動物園の動物とすることができる。一実施形態では、この対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどとすることができる。別の実施形態では、この対象は、家畜動物とすることができる。好適な家畜動物の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、及びアルパカを挙げることができる。さらに別の実施形態では、この対象は、ペット動物とすることができる。ペット動物の非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、及び鳥類などのペットを挙げることができる。さらに別の実施形態では、この対象は、動物園の動物とすることができる。本明細書で使用する「動物園の動物」とは、動物園で見いだされ得る動物を指す。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミ、及びクマが含まれ得る。ある特定の実施形態では、この動物は実験動物である。実験動物の非限定的な例としては、げっ歯類、イヌ、ネコ、及び非ヒト霊長類を挙げることができる。ある特定の実施形態では、この動物はげっ歯類である。げっ歯類の非限定的な例としては、マウス、ラット、モルモットなどを挙げることができる。
【００４８】
概して、本明細書で開示される医薬組成物及び方法は、抗生物質耐性細菌が原因となる細菌感染であって、この耐性がペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）駆動機序によるものである、細菌感染の処置または制御に有用である。ＰＢＰ２ａが起因となり耐性を発達させたことが知られているこのような細菌のいくつかの非限定的な例としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、及びＳ．ｆｅｌｉｓが挙げられる（Ｐｅｔｉｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｃＡ，ｍｅｃＲ１  ａｎｄ  ｍｅｃＩ  ｇｅｎｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７，２９７−３０４（２００１））、（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｗａｓｔｅ．  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｅｖ．Ｃｔｒｉｅｓ．９，（２０１５））。特定の実施形態では、この抗生物質耐性細菌は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。本開示の組成物及び／または方法を用いて防止または処置され得る感染の非限定的な例としては、皮膚及び軟部組織の感染、発熱性好中球減少症、尿路感染、腹腔内感染、呼吸器感染、肺炎（院内）、菌血症、髄膜炎、ならびに外科的感染が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
本開示の様々な実施形態を実証するために以下の実施例を含める。当業者は、次の実施例に開示されている手法が、発明者によって発見された、本発明の実施で十分に機能するための手法を表し、したがってこの手法が本発明を実施するための好ましい様式を構成するものとみなされ得ることを、理解するはずである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更がなされ得て、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似のまたは同様の結果が得られ得ることも理解するはずである。
【００５０】
実施例に向けての序論
多剤耐性（ＭＤＲ）病原体は、ヒトの健康に対する増加している脅威となっており、実際上、多くの感染性疾患が抗生物質以前の時代に向かって退行している１〜３。その典型例として、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の市中感染が劇的に増加していることが挙げられる。１９４０年代、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染は、主として第１世代βラクタム（ペニシリン）により処置されたが、これは、細胞壁の合成に重要なトランスペプチダーゼであるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）、標的とするものである４。Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいては、４種のＰＢＰ（ＰＢＰ１〜ＰＢＰ４）がこれらの機能を果たしている４。βラクタマーゼ産生株の出現により、βラクタマーゼ耐性第２世代ペニシリンの開発につながった。メチシリンがこれに含まれる。１９５９年にメチシリンが導入されてから間もなく、最初のＭＲＳＡ株が報告された５。これらの株は、βラクタム抗生物質に対する誘導耐性を産生する非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ供与源から、高度に調節された複数の遺伝子を獲得した４。これらの遺伝子の１つであるｍｅｃＡは、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）をコードする。ＰＢＰ２ａは、細胞壁を架橋するという重要なトランスペプチダーゼ反応を行い、βラクタム抗生物質による攻撃下、他のＰＢＰが阻害されている場合であってもこれを行う６〜８。この結果をもたらす機構的基盤は複雑であり、活性部位のための閉構造に関連があり、その機能はアロステリック性により調節されている９、１０。ＭＲＳＡの出現により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する治療選択肢としてのβラクタムを使用は事実上排除された。最近開発されたβラクタム剤のセフタロリンは、ＭＲＳＡ感染の処置において、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位に結合することにより活性を示し、薬剤による不活性化のために活性部位の開放を誘発する１０、１１。しかし、セフタロリンに対する耐性１２や、ＭＲＳＡの処置に使用される他の抗生物質（リネゾリド、バンコマイシン、及びダプトマイシンを含む）に対する耐性が報告されている１３〜１５。
【００５１】
直交的な細胞プロセスを標的とする多剤併用療法の使用は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、及び他の感染の処置で奏効している１６、１７。しかし、これらの療法に対しても耐性が増加している１８〜２０。発明者らは、ＭＲＳＡに対し可能性が見込まれる新たな療法を特定した。この療法は、３つの別個の世代及びβラクタム抗生物質サブクラスからの、臨床的に承認された薬剤の併用物からなり、いずれも細胞壁合成を標的とする。これらの薬剤は、すなわち、メロペネム、ピペラシリン、及びタゾバクタム（ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ）である。この療法は、以下の３つの戦略からの構成要素を使用する：１）同じ細胞系の複数のノードを標的とする半合成抗生物質誘導体の使用１２、２１、２）薬剤の相乗作用の利用により薬剤の効力を増加させるようなこれらの抗生物質の併用物の使用２２、２３、及び３）耐性の進化を抑制するための、当該併用物における構成要素間の付帯感受性の使用２４，２５。これらの方法のそれぞれは、主なＭＤＲグラム陰性及びグラム陽性のヒト病原体に対し用いられ、成功している２６、２７。しかし、これらの戦略を個別に使用すると、しばしばＭＤＲ病原体の新たな耐性進化による妨害を受け、これらの感染の処置に対する選択肢の減少につながった５、１４、２１、２８、２９。
【００５２】
発明者らは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺが以下を通じて機能するものと仮定している：メロペネムによるＰＢＰ１阻害、ピペラシリンによるＰＢＰ２の標的化、タゾバクタムによるＰＣ１クラスＡ  βラクタマーゼからのピペラシリンの保護６、３０〜３４、及び当該併用物における抗生物質の別の分子が阻害を行うための、メロペネムによるＰＢＰ２ａの活性部位のアロステリックな開放１１。この結果、ＭＲＳＡにおける細胞壁合成機構の複数の構成要素を同時に攪乱することによる相乗的応答がもたらされる。発明者らは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺの構成成分をＭＲＳＡ  Ｎ３１５に曝露することにより、この相乗作用の高い３重併用物内で、耐性進化を抑制する相互的付帯感受性が示されることを見いだしている。これは、逆に耐性進化を加速させてしまう一部の相乗的併用療法２３、３５とは対照的である。この効果は、付帯感受性がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの非病原性実験室株における耐性進化を遅らせることを示す最近の研究２４、３６に合致している。発明者らによる結果は、付帯感受性構成成分の相乗的併用物で使用する場合に、旧型βラクタム抗生物質をＭＲＳＡに対し再び臨床的に使用することを支持し、ヒト用に承認済の既存の薬剤を用いた新たな処置パラダイムを開くものである。
【００５３】
実施例１  インビトロのＭＲＳＡ株におけるメロペネム、ピペラシリン、及びタゾバクタム間の相乗作用
２３種の様々な抗生物質（表１）に対する高い耐性レベルを有することに基づき、全ゲノムが配列決定されているＭＲＳＡのＭＤＲ株の群からＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  Ｎ３１５３７を本試験用に選択した。ＭＲＳＡ  Ｎ３１５は、ブドウ球菌染色体カセットのｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）ＩＩ型を含有し、これはｍｅｃメチシリン耐性オペロン３８をコードし、さらにｂｌａ  βラクタマーゼオペロン３９を含有するペニシリナーゼプラスミドｐＮ３１５をコードする。あらゆる主な薬剤クラスからの代表的薬剤が含まれるこれら２３種の抗生物質化合物に対する集中的な組み合わせスクリーニングから（表１）、発明者らは、インビトロでＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対し高度に相乗的な殺細菌活性を示すＭＥ／ＰＩ／ＴＺの組み合わせを特定した。分画阻害濃度指数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）（ＦＩＣＩ）の測定基準を使用すると、ＦＩＣＩ＝０．１１だった４０、４１（表２Ａ）。任意の数の薬剤併用について、１未満のＦＩＣＩは相乗作用を示し、１に等しいＦＩＣＩは相加性を示し、１を越えるＦＩＣＩは無関連または拮抗作用を示す。注目すべきことには、これらの３種の薬剤全てが、βラクタム薬剤の異なるサブクラスに属し、典型的にはＭＲＳＡ株はほとんどのβラクタムに対し高耐性である８にもかかわらず、これらの薬剤は細胞壁合成における重要なトランスペプチダーゼ酵素を標的とする。個々のβラクタムに対する全般的な耐性は、これらの薬剤がＰＢＰ２ａのトランスペプチダーゼ活性部位を阻害できないことに起因し、これによりＳ．ａｕｒｅｕｓにおける他のトランスペプチダーゼのβラクタム阻害が相殺される８。
【００５４】
ＭＥ／ＰＩ／ＴＺは、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対し、臨床的に意義のある濃度で、この３種構成要素のうちの２重併用物であるメロペネム／ピペラシリン（ＭＥ／ＰＩ）、メロペネム／タゾバクタム（ＭＥ／ＴＺ）、及びピペラシリン／タゾバクタム（ＰＩ／ＴＺ）と比較して、増加した相乗作用を示す（図１、表２Ｂ〜Ｃ）。３種全てのβラクタム化合物の最終ＭＩＣ及びＦＩＣＩを、３Ｄチェッカーボードを用いて、各化合物につき１２８〜２μｇ／ｍｌの２倍希釈系列及び薬剤なしで試験した。これらの希釈系列により、構成成分の比を最大６４倍の差にして最大相乗作用を探ることが可能になり、さらに、それぞれの単一化合物、全構成要素の２重併用物及び３重併用物について単独の結果を得ることができた。発明者らは、３Ｄチェッカーボードを使用して、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対する最小薬剤投入及び最大相乗作用のためのＭＥ／ＰＩ／ＴＺの最適比を１：１：１と判定した。併用物における３種の構成成分のＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）（それぞれ２μｇ／ｍｌ）は、これらの薬剤のそれぞれが単独の場合のメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する臨床的感受性ブレイクポイント（４〜８μｇ／ｍｌ）４２を下回る。構成要素の２重併用物であるＭＥ／ＰＩ及びＰＩ／ＴＺも、それぞれＦＩＣＩ＝０．４４及び０．２２でＮ３１５に対し相乗的であるが、一方ＭＥ／ＴＺは０．６７と相乗性が低い。Ｌｏｅｗｅによる相乗の相加モデルに基づけば、薬剤は自らに対し相乗的になることができない３６。βラクタムは全て細胞壁経路を標的とするが、発明者らによるＦＩＣＩ法（Ｌｏｅｗｅ相加性）の使用は、これらの相互作用の非相加的性質を裏付けるものである。ＭＲＳＡ  Ｎ３１５においてＭＥ／ＰＩ／ＴＺの高い相乗作用が見られるのに対し、当該併用物は、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）参照株ＡＴＣＣ２９２１３４２、４３では相加活性をわずかに下回り（ＦＩＣＩ＝１．１２）（表２Ｂ〜Ｃ）、発明者らは、相乗作用が生じるにはＰＢＰ２ａが必要であると仮定する。
【００５５】
発明者らは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺについて観察される相乗作用の機序が、セフタロリンに関する報告１０、１１と同様に、その構成要素によるＰＢＰ２ａのアロステリックなトリガーに起因することを提唱する。実際に、発明者らは、メロペネムがＰＢＰ２ａのアロステリック部位に２７０±８０μＭ（１０４±３１μｇ／ｍｌに相当）の解離定数（Ｋｄ）で結合すると判定した。健康なヒトの場合、メロペネムを１ｇの推奨用量でボーラス静脈内注入した後の平均ピーク血漿濃度は１１２μｇ／ｍｌである４４。臨床的に達成されるメロペネムの濃度はＫｄを上回るため、これらの濃度において、ＰＢＰ２ａのアロステリック部位に結合するメロペネムはＰＢＰ２ａの活性部位を開放するトリガーとなり、それにより、メロペネムの別の分子または当該併用物における他のβラクタムがアシル化／非活性化のためにそのトランスペプチダーゼ活性部位にアクセスすることが可能になると考えられる８、１０、４５。
【００５６】
ＭＥ／ＰＩ／ＴＺのＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対する高度に相乗的な活性を、複数のＳＣＣｍｅｃの型を表す７２種の臨床的ＭＲＳＡ分離菌のパネルの全てに対して再現させた（表３Ａ〜Ｂ）。臨床的分離菌に対する当該併用物のＭＩＣは、各構成要素につき０．４〜３３．３μｇ／ｍｌの範囲であり、平均が９．７μｇ／ｍｌ、ＭＩＣ５０及びＭＩＣ９０がそれぞれ３．７μｇ／ｍｌ及び３３．３μｇ／ｍｌであった（表４Ａ）。
【００５７】
実施例２  ＭＲＳＡに対し代替的カルバペネム、ペニシリン、及びβラクタマーゼ阻害薬を用いた相乗作用における機構的頑健性
発明者らは、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５及び代表的な臨床的ＭＲＳＡ分離菌を他のカルバペネム／ペニシリン／βラクタマーゼ阻害薬併用物に対し試験することによって、観察された相乗作用がアッセイ対象の抗生物質に限定されるのではなく、これらのそれぞれのβラクタムクラスに対し一般化可能であると判定した。発明者らは、イミペネム／ピペラシリン／クラブラネート（ＩＭ／ＰＩ／ＣＶ）によるＭＲＳＡ  Ｎ３１５の処置が、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺと同じまたはそれより高い相乗作用を示すことを見いだした。メロペネム／アモキシシリン／タゾバクタム（ＭＥ／ＡＸ／ＴＺ）は、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５のみにおいて高い相乗作用（ＦＩＣＩ＝０．０４）を維持し、臨床的ＭＲＳＡ分離菌では低い相乗作用（ＦＩＣＩ＝０．５５）が示された（表２Ｂ）。これらの代用３剤の構成成分についてのＭＩＣは全て、インビボにおけるこれらの平均ピークヒト血漿濃度４６、４７を下回っている。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺと同様、ＩＭ／ＰＩ／ＣＶもＭＳＳＡ  ＡＣＴＴ  ２９２１３に対し相加未満の活性（ＦＩＣＩ＝１．１４）を示している（表２Ｂ〜Ｃ）。これらの結果は、相乗作用のためには、ｍｅｃＡ遺伝子産物であるＰＢＰ２ａがそのアロステリズムと共に存在する必要があることをさらに支持するものである。その理由は、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの場合には、カルバペネム／ペニシリン／βラクタマーゼ阻害薬の併用物の相乗性が欠如するためである。
【００５８】
また、当該併用物におけるカルバペネム構成成分を、２種の他の後世代βラクタム誘導体であるモノバクタム系またはセファロスポリン系のいずれかと置き換えた場合の影響についても試験した。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺとは対照的に、アズトレオナム／ピペラシリン／タゾバクタム（ＡＺ／ＰＩ／ＴＺ）及びセフェピム／ピペラシリン／タゾバクタム（ＣＰ／ＰＩ／ＴＺ）の３重併用物における相乗作用レベル（共にＦＩＣＩ＝０．３３）は、ＰＩ／ＴＺのみの場合（ＦＩＣＩ＝０．２２）よりも低かった（表２Ｂ）。考えられる理由としては、アズトレオナム（モノバクタム系）がグラム陰性ＰＢＰ活性を有する４８のに対し、セフェピム（セファロスポリン系）はＰＢＰ１よりもＰＢＰ２を優先的に標的とすることが挙げられる。
【００５９】
ＭＲＳＡ  ＣＯＬ株バックグラウンドにおいてキシロース誘導型アンチセンスＲＮＡ戦略を用いてＰＢＰ１、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２ａ、またはＰＢＰ３の発現を低減することにより、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺの構成要素の標的を確認した。ＰＢＰ２ａの発現レベルを減弱すると、株は、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓとしてふるまい、全ての試験βラクタムに対し感作された（図６Ａ〜Ｃ）。メロペネム、ピペラシリン、及びタゾバクタムをｐｂｐＡアンチセンス株に対し試験したところ、メロペネムのみがキシロース誘導下で広い阻害ゾーンを示した。これは、ＰＢＰ１がメロペネムの標的であることを確認するものである（図６Ｄ〜Ｅ）。ｐｂｐ２アンチセンス株に関しては、メロペネム及びピペラシリンの療法がキシロース誘導下で有効性の増加を示した。これは、メロペネム及びピペラシリンがそれぞれＰＢＰ２に対する一定の活性を有することを実証するものである（図６Ｆ〜Ｇ）。ｐｂｐ３アンチセンス株についてはいかなる影響も観察されなかった。これは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ活性がＰＢＰ１、ＰＢＰ２、及びＰＢＰ２ａの攪乱に集中的に向けられているという発明者らの仮説に合致した（図６Ｈ〜Ｉ）。ｐｂｐ３株を除く全ての場合におけるアンチセンス株は、当該３重併用物に対する感作を示し、観察された相乗作用を強調するものだった。
【００６０】
実施例３  ＭＲＳＡ  Ｎ３１５における１０日超にわたるメロペネム／ピペラシリン／タゾバクタムに対する適応欠如
耐性の発達及び伝播は、抗微生物療法の有効性及び寿命を劇的に減じる恐れがある。発明者らは、阻害未満抗生物質濃度の当該３重併用物及びその構成要素のそれぞれにおいて連続継代を行うことで、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺがＭＲＳＡにおける耐性進化を抑制することを実証した。インビボ及びインビトロの臨床的処置をより正確にモデル化するため、発明者らは、これらの薬剤を、経時的に用量を増加させて適用するのではなく、臨床的処置で生じるのと同様に、長期間にわたって固定した用量で適用した。１１日の実験の間、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５のＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対する耐性進化は観察されなかった。これに対し、全ての２重併用物及び単一構成要素に対する耐性進化は１〜８日以内に観察され、これは先行研究２３、５０に合致する結果であった（図２）。２重併用物及び単一構成要素については、最初に決定したＭＩＣを上回る全条件で生細胞が観察されたが、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺについては、初期ＭＩＣまたはそれを上回る条件で生細胞が観察されなかった。全ての２重併用物及び単一構成要素において経時的な増殖速度の増加が注目されたが、一方ＭＩＣ未満のＭＥ／ＰＩ／ＴＺにおいては、Ｎ３１５の増殖速度は実験全体を通して変化せず、薬剤なし対照と同等であった（図２）２３。また、ＭＥ／ＰＩの２重併用物に曝露したＮ３１５は、１日目の後に３倍のＭＩＣ増加を示したが、これは１日目の後に生細胞が存在していたが、さらなる継代及び適応が行われるまで増殖しなかったことを示すものである。最小殺細菌濃度（ＭＢＣ）の決定により、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺの３重併用物がＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対し殺細菌性であることが裏付けられた（表４Ｂ）。同時に、これらの結果は、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５のＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対する新たな耐性出現の抑制を実証するものである。
【００６１】
実施例４  これらの併用物の構成成分における相互的付帯感受性が適応抑制の基礎となる
付帯感受性がＭＥ／ＰＩ／ＴＺの適応抑制における因子であるかどうかを判定するため、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５を様々なβラクタムに事前に曝露することが他の構成成分に対する感受性に及ぼす影響について解析した（図３及び図７）。メロペネムとピペラシリンとの間、及びピペラシリンとＭＥ／ＴＺとの間には強力な相互的付帯感受性の存在が観察され、一方ＰＩ／ＴＺはＭＲＳＡ  Ｎ３１５をメロペネムに対し感作させたが相互的ではなかった。ピペラシリンに対する付帯感受性もタゾバクタムに対する事前曝露により付与されたが、逆のことは生じなかった。興味深いことに、タゾバクタムに対しては、いずれの単一または２重の化合物に曝露した後も付帯感受性は見いだされなかった。アモキシシリン及びピペラシリンの付帯感受性及び耐性プロファイルはほぼ同一であり、メロペネムに対する適応により、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５はアモキシシリンに対し感作される（図３及び図７）。また、ピペラシリンは、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対するなおいっそう強力なカルバペネムであるイミペネムに対する付帯感受性も示した。しかし、カルバペネム／ペニシリン／βラクタマーゼ阻害薬の併用物または構成要素により付帯感受性を試験したいずれのセファロスポリンについても感受性を示す結果は得られず、むしろ耐性の増加または無関連が注目された。これらの結果は、観察された付帯感受性による耐性抑制がＭＥ／ＰＩ／ＴＺの構成要素薬剤クラスに特有であることを裏付けるものである。
【００６２】
実施例５  適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５は大規模なゲノム改変を経る
発明者らは、全ゲノム配列決定を使用して、感受性のゲノム基盤ならびに野生型ＭＲＳＡ  Ｎ３１５及び適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５株の耐性表現型について調べた。いずれの適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５分離菌内にもＰＢＰまたはβ−ラクタマーゼ遺伝子の変異は見いだされなかった。しかし、リードカバレッジの不在により、タゾバクタム単独（１００μｇ／ｍｌ）及びＭＥ／ＴＺ（各１１．１μｇ／ｍｌ）に適応させた分離菌において、ペニシリナーゼプラスミドｐＮ３１５が喪失していることが特定された（図４Ａ）。このプラスミド喪失は、過去に報告されたＭＲＳＡからプラスミドを除去する手法（例えば、高熱及びＳＤＳ処置）５１による場合よりもはるかに急速に生じた。ＰＩ／ＴＺ適応分離菌においては、約４００ｋｂのＭＲＳＡ  Ｎ３１５染色体（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＢＡ００００１８．３）がリードカバレッジ深度の解析後に、適切なゲノム位置２，１００，０００から２，５５０，０００ｂｐに複製されることが観察された。興味深いことに、この間隔は、ｄｄｌＡ  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼを含めた、細胞壁合成に関わるいくつかの推定遺伝子及び確認済遺伝子を含有する（図８）。
【００６３】
ＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるｐＮ３１５の喪失は、ピペラシリン及びアモキシシリンに対する感受性の増加と相関する。これらはいずれも、当該プラスミド上でコードされるｂｌａＺ（ＰＣ１）クラスＡ  β−ラクタマーゼに感受性であるはずのペニシリンである。しかし、ｐＮ３１５の喪失は、タゾバクタム単独及びＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対する耐性の増加ももたらす（図３、図７、表５Ａ）。ｐＮ３１５の存在とＭＥ／ＰＩ／ＴＺ活性との間に考えられる結びつきの１つは、既知の、ＭｅｃＩ及びＢｌａＩリプレッサーとこれらの共有ｍｅｃオペロン標的との間で行われる調節性クロストークである５２〜５４。ｐＮ３１５の喪失が、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ活性に重要であると知られている遺伝子の発現に及ぼす影響を試験するため、適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５株及び野生型ＭＲＳＡ  Ｎ３１５株のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した（図４Ｂ）。発明者らは、野生型ＭＲＳＡ  Ｎ３１５内のｐＮ３１５プラスミドにおけるｂｌａＺ  β−ラクタマーゼの発現が常在的であると判定したが、タゾバクタムに適合させたクローンではｂｌａＺの発現が観測されず、これらのクローンにおけるｐＮ３１５の喪失に合致した。また、発明者らは、１００μｇ／ｍｌのタゾバクタムに適合させたｂｌａＺ欠損ＭＲＳＡ  Ｎ３１５分離菌におけるｍｅｃＡの発現が常在的であることも見いだした。これはｐＮ３１５及びｂｌａオペロンの喪失を介してのｍｅｃオペロンの調節不全に合致した。最終的に、発明者らは、タゾバクタムが、ｂｌａｚ欠損条件下で見られたｍｅｃＡの常在的発現と同様のレベルで、野生型ＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるｍｅｃＡの強力な誘導物質であることを見いだした。
【００６４】
実施例６  ＭＲＳＡ  Ｎ３１５が構成要素に対する耐性を進化させた場合におけるＭＥ／ＰＩ／ＴＺの相乗作用
次に、発明者らは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺの構成成分に対する耐性がＭＲＳＡに対する有効性について有する役割について調べた（表５Ａ）。ＭＲＳＡ  Ｎ３１５を事前に３３．３μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌいずれかのピペラシリンに曝露することにより、次にＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対する株の感作が示され、各構成成分につき３．７μｇ／ｍｌから１．２μｇ／ｍｌに減少した。しかし、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５を事前にＭＥ／ＴＺ（各１１．１μｇ／ｍｌ）またはメロペネム単独（３３．３μｇ／ｍｌ）に曝露することでは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対する耐性レベルにおいて９倍の増加が示された（各構成部分につき３．７μｇ／ｍｌから３３．３μｇ／ｍｌに増加）。タゾバクタム単独に曝露すると、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対する耐性は、７日目までは中程度の耐性がもたらされ（各１１．１μｇ／ｍｌ）、１１日目にはより高い耐性がもたらされた（各３３．３μｇ／ｍｌ）。ＭＥ／ＰＩまたはＰＩ／ＴＺに対する事前曝露は、１１日にわたりＭＩＣの３倍の増加（３．７μｇ／ｍｌ〜１１．１μｇ／ｍｌ）をもたらすにとどまった。
【００６５】
構成成分薬剤に適応させた分離菌においてＭＥ／ＰＩ／ＴＺに対するＭＩＣの上昇があったものの、この３剤併用物は依然として、全ての適応分離菌において相乗作用を維持した（表５Ｂ）。このことは、単剤ＭＩＣとの比較で、７２種の臨床的ＭＲＳＡ分離菌において観察されたＭＥ／ＰＩ／ＴＺのＭＩＣの範囲内における相乗的薬剤活性（表４）に合致する。これらの結果は、サブ構成成分耐性を有効にするゲノム的変化が選択され得る場合であっても、３剤併用物による全体的な相乗的活性は維持されるということを示している。発明者らは、非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株についての最近の研究３６とは対照的に、任意の構成成分薬剤に対する耐性の増加を伴っても、相乗作用に関するＭＥ／ＰＩ／ＴＺの全体的な薬剤相互作用プロファイルにおける変化を観察しなかった。
【００６６】
実施例７  ＭＥ／ＰＩ／ＴＺはリネゾリドと同程度にインビボでＭＲＳＡに対し有効である
次に発明者らは、腹膜炎の好中球減少マウスモデルを用いて、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺまたはその構成要素が、インビボのＭＲＳＡ感染の処置において有効であり得るかについての試験を行った。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ、ＭＥ／ＰＩ（各６７ｍｇ／ｋｇ）、またはリネゾリド（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスから感染１１時間後に血液を採取したところ、蒔かれたコロニーが０で液体培養中の増殖はないという、感染の排除を示す結果となった（図５、表７）。これらの処置のそれぞれを受けた全マウス（ｎ＝６／群）が感染後６日間（マウス研究の総期間）生存した。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ及びＭＥ／ＰＩの有効性は、ビヒクルと比較しての全ての処置マウスにおけるＭＲＳＡ感染の排除及び生存（ｐ＝０．０２、フィッシャーの正確確率検定）に基づいて、リネゾリド単剤療法に類似するものであった。
【００６７】
ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ、ＭＥ／ＰＩ、またはリネゾリドにより感染マウスが完全に救助されたこととは対照的に、ＭＥ／ＴＺ、ＰＩ／ＴＺ、またはメロペネム単体で処置した一部のマウス、及びピペラシリンまたはタゾバクタムのみで処置した全てのマウスは、（ほとんどが４８時間以内に）感染によって死んだ（図５、表７）。これらの他の薬剤レジメンによる処置は、ビヒクルによる処置と有意差はなく（ｐ＞０．０５、フィッシャーの正確確率検定）（表６Ａ）、ビヒクル処置の全てのマウスも４８時間以内に感染で死んだ。
【００６８】
発明者らは、メロペネム、ピペラシリン、またはビヒクルで処置したマウスから採取した血液からのＭＲＳＡ  Ｎ３１５培養物を、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ及びその構成要素単剤に対するインビトロＭＩＣについて試験し、インビボの継代中に適応が生じるかどうかを判定した。全ての４つの試験対象ＭＲＳＡ  Ｎ３１５分離菌は、３重ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ及び全ての構成成分薬剤に対して同一のＭＩＣを有し、そのため同一の相乗作用を有した（表６Ｂ）。これらのデータは、インビボ継代１１時間以内では、これらの株内で試験対象の３重ＭＥ／ＰＩ／ＴＺを克服するための適応が生じなかったことを示唆する。
【００６９】
実施例に対する考察
カルバペネム、ペニシリン、及びβラクタマーゼ阻害薬を含有する抗細菌性３剤併用物が、同じ細胞系における複数のノード（細胞壁合成）を標的とし、また、インビトロの様々なＭＲＳＡ株に対し、臨床的に達成可能な濃度で高度に相乗的かつ殺細菌性であることを示した。これは、付帯感受性及び相乗作用が、非病原性の実験室株のみで、直交的な細胞標的に対し機能する薬剤クラスの併用物から生じると示している細菌の研究２５、３６とは対照的である。高濃度のカルバペネム及び他の薬剤は毒性効果を有する可能性が考えられるため、相乗作用を介して薬剤当たりの用量を低減することによって、潜在的な毒性が緩和される５５。発明者らによる３Ｄチェッカーボード試験は、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対するＭＥ／ＰＩ／ＴＺの最適投入濃度が１：１：１の比（各２μｇ／ｍｌ）で与えられることを裏付けたが、この濃度は、これら化合物のメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感受性ブレイクポイントを下回り、この高耐性ＭＲＳＡ株に対し以前は不活性だったこれらの薬剤の投入濃度は、８〜６４倍の低減となる。発明者らの機構的解析は、発明者らの仮説、すなわちメロペネムによるＰＢＰ１の標的化、ピペラシリンによるＰＢＰ２の標的化、タゾバクタムによるβ−ラクタマーゼ切断からのピペラシリン保護、及び併用物中の抗生物質の別の分子が阻害するようにするための、メロペネムによるＰＢＰ２ａの活性部位のアロステリックな開放が、ＭＲＳＡの細胞壁合成システムの複数の構成成分を同時に攪乱することにより相乗効果をもたらす、という仮説を支持するものである（図９）。
【００７０】
また発明者らは、予備的に、この併用物がインビボモデルで、高致死性の好中球減少性ＭＲＳＡにおける活性を有することも示した。これは、この臨床的に承認されたβラクタムの３重併用物が、リネゾリドのような大幅に高額の単剤療法と同様に感染を排除する可能性があることを実証するものである。マウスで観察されたメロペネムの血漿レベルは、健康なヒトにおける薬剤の血漿レベルと十分な相関があり５６、メロペネムはこれらの臨床的に達成可能な濃度で、ＰＢＰ２ａの活性部位を開放するアロステリック性のトリガーとなるＫｄを獲得し、当該併用物におけるメロペネム及び他のβラクタムが阻害のためにアクセスできるようになる。
【００７１】
注目すべきことに、ＭＥ／ＰＩの２重併用物は、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ及びリネゾリドと同様に、インビボのＭＲＳＡ  Ｎ３１５感染を１１時間以内に排除した。インビトロでは、この併用物について、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺで見られたのと同様に、高い相乗性スコア及び相互的付帯感受性が観察された。ただし、ＭＥ／ＰＩは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺと同じ程度には耐性進化を抑制しなかった。この特性は、今回の攻撃的感染モデルには関連性がなかった可能性があるが、ヒトのＭＲＳＡ感染で見られる、より長い処置時間にとっては重要であり得る。また、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺは、その高い相乗作用のため、ＭＥ／ＰＩより低い総濃度でも有効である可能性がある。Ｎ３１５株をインビボでＭＥ／ＰＩ／ＴＺのタゾバクタム構成成分に対し長く曝露させても、付帯感受性及び適応の抑制についてのインビトロの結果と一致して、ペニシリン構成成分に対する同時感作によるｐＮ３１５プラスミドの放出が促進される可能性がある。実際、より適切にこの問題に対処するには、潜在的な長期間のインビボ耐性進化の試験を、薬剤の致死未満濃度下で重要なマウスの追跡実験において行う必要があるであろう。
【００７２】
発明者らによる、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ活性についてのロバスト機構のインビトロ結果及び予備的なインビボ結果から、この併用物が臨床で即時に使用可能であり得ることが示唆される。それは、この併用物には、ＭＲＳＡに対する単剤療法としては数十年前に陳腐化したものの現時点でＦＤＡ承認されている薬剤が含まれているためである。しかし、インビトロで示された当該併用物のさらなる機構的特徴（相乗作用、長期間の投与にわたる耐性抑制、付帯感受性など）は、発明者らによる高度に攻撃的な好中球減少マウスモデルで観察された、有望ではあるが予備的な活性を支持するためには、相当に多くのインビボ試験を必要とするであろう。
【００７３】
発明者らは、メロペネムまたはタゾバクタムに対する高耐性により、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺの有効性が相乗作用を維持しながらもわずかに低減することに注目する。発明者らによる耐性進化の解析では、メロペネム、ピペラシリン、及びタゾバクタムの間の関係を破壊する可能性が考えられる、水平方向に獲得された耐性遺伝子を説明することができない。このような注意点があるものの、発明者らは、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ併用物が即時に実行可能な抗ＭＲＳＡ治療法であり、かつ、この併用物により、相乗的であると同時に付帯感受性を有する構成要素によってコードされる高次の抗生物質併用物について想定される優れた有効性をさらに機構的に探ることが保証されるものと考えている。ＭＲＳＡに対しリネゾリドと同様の活性を有するＭＥ／ＰＩ／ＴＺの潜在的有効性により、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉに対するβラクタムの臨床使用の広範な見通しが再び開かれる。また、この系統の、慎重に設計された相乗的併用物で既存の抗生物質を別の目的に再利用するという研究は、このような薬剤が既にヒト用に承認されていることから、即時的な臨床需要に対処するであろうことも示唆される。いずれかの抗生物質またはいずれかの抗生物質併用物に対し耐性が出現することは避けられない。それでも、発明者らの研究で証明されたように、主要な薬物間相互作用の特徴から構成される併用物は、薬理学設備内で使用可能な既存薬剤の有用さを保つことにより、抗生物質耐性の出現を軽減する上でのツールとなり得る。
【００７４】
実施例のための方法
微生物学的試験：ＭＲＳＡ  Ｎ３１５は、Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅｎ  Ｇｉｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡから寄贈された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得した。Ｂａｒｎｅｓ−Ｊｅｗｉｓｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡの臨床的分離菌株バンクから、匿名化された臨床的ＭＲＳＡ分離菌をランダムに選択した。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＳＬＩ）の勧告４３に基づき、増殖阻害のための最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイを実施した。簡潔に述べると、２３種の抗細菌性化合物（補足表１）を、全ての主な薬剤クラスの範囲に基づき選択した。この中には、ヒト用の抗生物質としては分類されないが既知の抗細菌特性を有する３種の化合物が含まれる。化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５０ｍｇ／ｍｌのストック濃度にした。例外：スルホメツロンはＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍｌ、トブラマイシン、Ｄ−シクロセリン、及びコリスチンはＨ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍｌ、２μｍにて濾過。２３種の化合物を、固定の比でかつ溶媒中１００倍濃度で、考えられる２５３種の固有の対での併用物になるよう製剤化した。考えられる相乗的または拮抗的薬剤相互作用を検査する濃度範囲を広げるため（２，０００倍超）、薬剤ストックを３倍希釈系列にし、ＢｉｏＭｅｋ  Ｆｘ自動分注機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて、９６ウェルのＣｏｓｔａｒマスター薬剤プレートに８列で配列した。次に、薬剤を１：１００で混合し、２００μｌ／ウェルのカチオン調整Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＣＡＭＨＢ）を含有する９６ウェルプレートに入れた。全ての薬剤感受性アッセイウェルに、約１μｌの中間対数期の細菌培養物を０．５マクファーランド標準（約２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ）で接種し、３７℃で２４時間増殖させた。３７℃で２４時間後のエンドポイント増殖を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１リーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｉｎｃ．）を用いて６００ｎｍ≧０．１の光学濃度により決定した。
【００７５】
抗生物質併用物の相乗作用を分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）法５７、５８を用いて決定した。この方法により、併用での抗生化合物のＭＩＣを化合物単体のＭＩＣで除算し、この併用物における各薬剤構成成分の分画寄与を得た。併用物における商を全て加算し、薬剤相互作用を以下の式を用いてスコア化する：ＦＩＣＩ＝（ＭＩＣ  ＡＡ、Ｂ、Ｃ併用物）／ＭＩＣ薬剤Ａ＋（ＭＩＣ  ＢＡ、Ｂ、Ｃ併用物）／ＭＩＣ薬剤Ｂ＋（ＭＩＣ  ＣＡ Ｂ Ｃ併用物）／ＭＩＣ薬剤Ｃ。次に、選択したＭＲＳＡに対する対の併用物を残りの２１種の単一薬剤のそれぞれと組み合わせて３重併用物を作製し、製剤化し、２重併用物と同一の方法で試験した。ＭＩＣでの薬物条件の３重反復測定を介して、併用物の相乗作用を確認した。スパースなスクリーニングでのＭＲＳＡ  Ｎ３１５に対する高い相乗作用に基づき、ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ及びその構成要素をさらなる特性解析のために選択した。ＭＥ／ＰＩ／ＴＺ及びその構成要素に対する最終的な感受性試験を、各構成成分につき１２８〜２μｇ／ｍｌの２倍希釈を用いて実施した。
【００７６】
重複ウェルのＣＡＭＨＢ媒体中指示濃度のＭＥ／ＰＩ／ＴＺを約５Ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌの中間対数期にあるＭＲＳＡ  Ｎ３１５に接種し、３７℃で２４時間インキュベートすることにより、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるＭＥ／ＰＩ／ＴＺの最小殺細菌濃度（ＭＢＣ）を決定した。重複ＭＥ／ＰＩ／ＴＺウェルから採取した５０μｌを１：１００希釈したものの１００μｌを、ミューラー・ヒントン寒天培地（ＭＨＡ）プレートに播種し、終夜２４時間インキュベートした。ＣＬＳＩにより定義されるように５９、ＭＩＣ、またはＭＩＣを２段階上回る希釈においてコロニー増殖のないことが殺細菌活性を確認した。メロペネム（ＣＡＳ  ９６０３６−０３−２）及びクラブラネート（ＣＡＳ  ６１１７７−４５−５）はＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。ピペラシリン（ＣＡＳ  ５９７０３−８４−３）、タゾバクタム（ＣＡＳ  ８９７８６−０４−９）、イミペネム（ＣＡＳ  ７４４３１−２３−５）、及びアモキシシリン（ＣＡＳ  ２６７８７−７８−０）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。
【００７７】
適応及び交差耐性アッセイ：４１４ＭＲＳＡ  Ｎ３１５を１５０μｌ／ウェルのＣＡＭＨＢ中、３７℃で絶え間なく振とうして増殖させ、継代を１１日にわたりＭＥ／ＰＩ／ＴＺ、ＭＥ／ＰＩ、ＭＥ／ＴＺ、ＰＩ／ＴＺ、ＭＥ、ＰＩ、及びＴＺの反復３倍希釈液を含有する同一の９６ウェルプレート中で行った。薬剤併用物の最高濃度は各構成成分につき３３．３μｇ／ｍｌであり、単一薬剤の最高濃度は１００μｇ／ｍｌであった。細胞生存能を試験するため、１１日目のアッセイ終了時、プレートの全ウェルを滅菌済９６ピンレプリケーターでピン差しし、ＣＡＭＨＢ単独に移した。継代後、プレートに１：１の３０％ＣＡＭＨＢ／グリセロールを満たし、後の解析のために−８０℃で冷凍した。
【００７８】
各条件下の継代にわたる分離菌の増殖速度を、対数変換した指数増殖期の線形適合により決定した。Ｈｅｇｒｅｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ２３に従い、薬物条件下で１日目と最後の６日間の増殖の平均との間で増殖速度が０．２ｈ−１超であった細胞を含有するウェルを、顕著に条件に適応しているとみなし、適応速度αを生成した。ＭＩＣまたは増殖速度の増加を示すウェル中の各併用物または単一化合物から、適応分離菌を遡及的に選択し、冷凍した分離菌を寒天プレート上に縞状に並べて単一のコロニーを取得し、当初の増殖時と同一のブロス条件下で分離菌を再増殖させ、次に、１１日間実施した当初の４３１プレートと同一の滅菌済９６ウェルプレートに再接種した。
【００７９】
ｑＲＴ−ＰＣＲによる発現プロファイリング：野生型及び適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５分離菌を、１００ｍｌのフラスコにおいて３重反復で、ＣＡＭＨＢ＋／−１１．１μｇ／ｍｌのピペラシリンまたは３３．３μｇ／ｍｌのタゾバクタム中で中間対数期まで増殖させた。中間対数期で細胞を採取するため、各培養フラスコを２ｘ５０ｍｌのスクリューキャップ管に分割し、４℃で、１０分間３５００ｒｐｍで遠心沈降させ、上清を除去し、沈渣を２ｍｌの血清学的ピペットで慎重に合わせた。１ｍｌのＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を沈渣に添加してＲＮＡを安定化させ、軽くボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。インキュベート後、管を再び４℃で、１０分間３５００ｒｐｍで遠心沈降させ、上清を除去し、沈渣を−８０℃で保管した。以下のプロトコールにより全ＲＮＡを抽出した。
（１）細胞沈渣を５００μｌの緩衝液Ｂ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させる。
（２）２１０μｌの２０％ＳＤＳを添加する。
（３）約２５０μｌの体積の酸洗浄滅菌済ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）を添加する。
（４）５００μｌのフェノール：クロロホルム：ＩＡＡを添加する。
（５）ビーズビーティングを「高（ｈｉｇｈ）」で５分間行う。
（６）４℃で、３分間８０００ｒｐｍで遠心する（相分離させるため）。
（７）上面の水相を除去し、新たな管に移す。
（８）７００μｌのイソプロパノールを添加する。
（９）７０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃを添加し、反転により十分に混合する。
（１０）４℃、最大ｒｐｍで１０分間遠心する。
（１１）上清を吸引する。
（１２）７５０μｌの氷冷７０％ＥｔＯＨを添加し、最大ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する。
（１３）上清を吸引し、ＥｔＯＨを乾燥させ、ＲＮアーゼのない場所で管を開けたままにする。
（１４）１００μｌの無ヌクレアーゼ水を各管に添加し、再懸濁させる（５０℃ヒートブロックに管を入れ、定期的にボルテックスする）。
（１５）１２μｌのＴＵＲＢＯ−ＤＮアーゼ懸濁液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）及び１０μｌの無ＲＮアーゼＴＵＲＢＯ−ＤＮアーゼを各試料に添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。
（１６）製造業者のプロトコールによりＭＥＧＡＣｌｅａｒカラム及びキットを用いて試料を精製する。
（１７）製造業者のプロトコールに従って、Ｂａｓｅｌｉｎｅ−ＺＥＲＯ  ＤＮアーゼ懸濁液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｃ．）及び１０μｌのＢａｓｅｌｉｎｅ−ＺＥＲＯ  ＤＮアーゼを用いて試料を再精製する。
（１８）最終ＲＮＡ試料を３０μｌのＴＥ懸濁液、ｐＨ７．０で溶出させる。
【００８０】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて第１ストランドｃＤＮＡを合成した。ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）上のＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＣＦＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＭＲＳＡ  Ｎ３１５におけるｐｂｐ２、ｍｅｃＡ、及びｂｌａＺのｑＲＴ−ＰＣＲをｇｙｒＢに対して実施した。使用したプライマー配列（各０．３μＭ）：
ｐｂｐ２＿Ｆ：  ＣＧＴＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＧＣ、配列番号１
ｐｂｐ２＿Ｒ：  ＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣ、配列番号２
ｍｅｃＡ＿Ｆ：  ＴＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＣ、配列番号３
ｍｅｃＡ＿Ｒ：  ＣＡＧＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣ、配列番号４
ｂｌａＺ＿Ｆ：  ＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＴＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣ、配列番号５
ｂｌａＺ＿Ｒ：  ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣ、配列番号６
ｇｙｒＢ＿Ｆ：  ＣＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡＴＡＴＴＡＧ、配列番号７
ｇｙｒＢ＿Ｒ：  ＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＡＣ、配列番号８
ＣＦＸプロトコール：５０℃で２分、９５℃で２分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）ｘ４０サイクル。正規化定量６０のΔΔＣｔ法を用いて遺伝子発現を決定した。ここで、Ｃｔは指数増殖期が閾値の蛍光シグナルを上回って増加したときのサイクル数を示す。
【００８１】
配列決定ライブラリーの調製：下記のようにして、リソスタフィン消化及びフェノール：クロロホルム：ＩＡＡ抽出を用いて、野生型及び適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。
（１）終夜振とうした５ｍｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ株培養物から１ｍｌのアリコートを採取し、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心沈降させ、培地を捨て、追加の１ｍｌの培養物を添加し、これを繰り返す。
（２）５００μｌの２Ｘ緩衝液Ａ（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ、トリス２００ｍＭ、ＥＤＴＡ２０ｍＭ）を４℃でペレット状の細胞に添加し、軽くボルテックスして細胞を再懸濁させる。
（３）２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ（２００ｘ）リソスタフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）を管に添加する。
（４）管を叩いて混合し遠心沈降させ、３７℃のドライバスに１時間入れる。
（５）高速冷却マイクロ遠心処理で４℃にする。
（６）約２５０μｌの０．１ｍｍジルコニウムビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号１１０７９１０）を添加する。
（７）２１０μｌの２０％ＳＤＳを添加する。
（８）５００μｌのフェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（２５：２４：１、ｐＨ７．９）を添加し、試料を氷上で冷やす。
（９）ビードビーティングを「均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）」設定で４分間行う（ビーティング２分、氷冷２分、ビーティング２分）。
（１０）６８００ｒｃｆ（４℃）で３分間遠心する。
（１１）待機の間、ＰＬＧカラム（５Ｐｒｉｍｅ，ｃａｔ＃２３０２８２０）を最大速度（２０，８００ｒｃｆ）、室温で３０秒間、遠心沈降させる。
（１２）水相（約５００μｌ）を、事前遠心したフェーズロックゲル管に移す。
（１３）等量（５００μｌ）のフェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（２５：２４：１、ｐＨ７．９）を管に添加し、反転により（ボルテックスはしないこと）混合する。
（１４）管を最大速度（２０，８００ｒｃｆ）（室温）で５分間遠心する。
（１５）水相（約５００μｌ）を、新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移す。
（１６）５００μｌの−２０℃イソプロパノールを添加する。
（１７）５０μｌ（１／１０の体積）の３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ９７４０）を添加し、反転により十分に混合する。
（１８）−２０℃で少なくとも１時間（終夜が好ましいが必須ではない）保管する。
（１９）最大速度、４℃で２０分間遠心する。
（２０）沈渣を５００μｌの１００％  ＥｔＯＨ（室温）で洗浄し、４℃で３分間遠心沈降させる。
（２１）ＥｔＯＨからピペットで慎重に取り、１５分超風乾する。
（２２）３０μｌのＴＥ（Ａｍｂｉｏｎ，ＡＭ９８６１）を添加し、５０℃で５分間インキュベートする。
（２３）ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムを通じて以下の変更を伴ってＤＮＡを実行する：カラムクリーンアップ開始時のＲＮアーゼ処理。使用する全てのＰＢ緩衝液３００μｌごとに４μｌのＱｕｉａｇｅｎＲＮアーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、ＰＢ緩衝液／ＮＲアーゼ中室温で１５分間インキュベートする。
（２４）ＰＥ洗浄緩衝液を室温で２分間カラム内に静置させ、５５℃に事前加熱した３５μｌのＥＢ緩衝液でｇＤＮＡを溶出させ、最終スピンの前に１分間静置させる。
【００８２】
発明者らは、各ゲノムからの５００ｎｇの全長ＤＮＡを、１０分での切断を９ラウンドそれぞれＢｉｏＲｕｐｔｏｒ  ＸＬで行い、約３００ｂｐの断片に切断した。各ラウンドにおいてパワー設定は「Ｈ」であり、試料を３０秒処理し３０秒休ませた。各試料をＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて製造業者のプロトコールにより濃縮した。２．５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液を１０ｍＭ  ＡＴＰ（ＮＥＢ，Ｂ０２０２Ｓ）、１μｌの１ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）、０．５μｌのＴ４ポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｍ０２０３Ｓ）、０．５μｌのＴ４  ＰＮＫ（ＮＥＢ  Ｍ０２０１Ｓ）、及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｍ０２６７Ｓ）と共に添加することで、切断ＤＮＡ断片の末端修復を開始した。この混合物を２５℃で３０分間、次に７５℃で２０分間インキュベートした。次にこの溶液に、バーコード付きアダプターを０．８μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，Ｍ０２０２Ｍ）と共に添加した。これはアダプターをＤＮＡ断片に連結させることが目的である。次に、この溶液を１６℃で４０分間、次に６５℃で１０分間インキュベートした。次に、このアダプター連結ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて製造業者のプロトコールにより精製した。
【００８３】
次に、Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＧｅｌＧｒｅｅｎ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で染色した１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液中２％アガロースゲル上でＤＮＡ断片をサイズ選択した。ゲルにロードする前に、ＤＮＡ断片を２．５μｌの６ｘＯｒａｎｇｅ  ｌｏａｄｉｎｇ色素と合わせた。ＱＩＡＧＥＮ  ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて製造業者のプロトコールにより、アダプター連結ＤＮＡを２５０〜３００ｂｐのＤＮＡに相当するゲルスライスから抽出した。精製したＤＮＡの濃縮を、ＰＣＲにより２５μｌ反応液中１２．５μｌの２ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及び１μｌの１０μＭ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを用いて、１μｌの精製したＤＮＡをテンプレートとして用いて行った。ＤＮＡの増幅を、９８℃で３０秒、次に９８℃で１０秒を１８サイクル、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒、そして最後の伸長を７２℃で５分行った。次に、Ｑｕｂｉｔフルオロメーターを用いてＤＮＡ濃度を測定し、１０ｎｍｏｌの各試料（シークエンシングのレーン当たり最大１０６試料）をプールした。次に、試料をＧＴＡＣ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にあるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ−２５００  Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ（ＰＥ）の１０１ｂｐ配列決定のために提出した。
【００８４】
ＤＮＡ配列解析：アライメント及びバリアント呼び出し。野生型及び適応ＭＲＳＡ  Ｎ３１５について、各ゲノムの全ての配列決定リードをバーコードにより逆多重化して別々のゲノムビンにした。リードをクオリティトリミングして、品質スコアが１９を下回るいずれの末端のアダプター配列及び塩基も除去した。クオリティトリミング後に３１ｂｐより短いリードは、いずれもさらなる解析に使用しなかった。全てのリードをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５染色体（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＢＡ００００１８．３）及びｐＮ３１５プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＰ００３１３９）にマッピングした（コマンド：ｏｗｔｉｅ２  −ｘ  ＜ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｉｎｄｅｘ＿ｎａｍｅ＞  −１  ＜ｆｏｒｗａｒｄ＿ｒｅａｄ＿ｆｉｌｅ＞  −２  ＜ｒｅｖｅｒｓｅ＿ｒｅａｄ＿ｆｉｌｅ＞  −ｑ  −−ｐｈｒｅｄ３３  −−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｌｏｃａｌ  −Ｉ  ２００  −Ｘ  １０００  −Ｓ  ＜ｓａｍ＿ｏｕｔｐｕｔ＞）。参照からのバリアントをｓａｍｔｏｏｌｓ６１を用いて呼び出した（コマンド：ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｖｉｅｗ  −ｂｕＳ  ＜ｓａｍ＿ｆｉｌｅ＞  ｜  ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｓｏｒｔ  −ｍ  ４０００００００００  −  ＜ｓａｍｐｌｅ＿ｐｒｅｆｉｘ＞  ＃＃＃  ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｉｎｄｅｘ  ＜ｂａｍ＿ｆｉｌｅ＞  ＃＃＃  ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐ  −ｕＤ  −ｆ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｇｅｎｏｍｅ＞  ＜ｂａｍ＿ｆｉｌｅ＞  ｜  ｂｃｆｔｏｏｌｓ  ｖｉｅｗ  −ｂｃｖ  −  ＞  ＜ｂｃｆ＿ｆｉｌｅ＞  ＃＃＃  ｂｃｆｔｏｏｌｓ  ｖｉｅｗ  ＜ｂｃｆ＿ｆｉｌｅ＞）。次にバリアントコールフォーマット（ＶＣＦ）ファイルをフィルタリングして、品質スコアが７０より低い、またはカバレッジが塩基当たり予想される平均カバレッジの２倍より大きいＳＮＰを除去した。リードカバレッジの不在または過剰なリードカバレッジは、それぞれプラスミドの喪失または大きな重複を示した。野生型のアライメントから見いだされた任意のバリアント位置は、アライメントエラーの結果であるか、またはＮ３１５におけるラボ固有のドリフトに由来するものと判定し、全ての他のＶＣＦファイルから除去した。次に各バリアント位置を既知のＮ３１５のＯＲＦロケーションと比較して原因バリアントを探索した。
【００８５】
ＭＲＳＡ感染のインビボマウスモデル：動物。非近交系のＩＣＲ雌マウス（６〜８週齢、体重１７〜２５ｇ；Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を使用した。マウスにＴｅｋｌａｄ  ２０１９  Ｅｘｔｒｕｄｅｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）及び水を自由に与えた。マウスを、コーンコブ（Ｔｈｅ  Ａｎｄｅｒｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＵＳＡ）及びアルファドライ（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐａｐｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）の床敷を収容するポリカーボネート製の靴箱サイズのケージ内で、明周期１２時間／暗周期１２時間、２２±１℃で維持した。動物に関わる全ての手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を受けた。
【００８６】
ＭＲＳＡ感染の好中球減少マウス腹膜炎モデル。シクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇに相当する０．９％食塩液中１００μｌの５０ｍｇ／ｍｌ；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）の用量を感染の４日及び１日前に腹腔内（ＩＰ）投与した。Ｓ．株Ｎ３１５をブレイン−ハートインフュージョン（ＢＨＩ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）寒天培地に縞状に並べ、３６℃で終夜増殖させた。ＭＲＳＡ  Ｎ３１５細菌接種物を約１ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ（ＯＤ５４０＝０．５に相当）に調整し、次に希釈して２ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌを得た。１０％ブタムチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）懸濁液を調製し、ｐＨ７に調整した。感染直前に、細菌接種物を１０％ムチンと１：１希釈して、最終濃度を５％ムチン中１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌにした。次に、０．５ｍｌのこの接種物を用いてマウスにＩＰ感染させた。マウスにおけるインビボ化合物投与を、研究されているβラクタムの平均または範囲ピークヒト血漿濃度４４、４６、４７、６２、６３と比較した。
【００８７】
抗生物質の調製。メロペネムはＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．  （Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手し、ピペラシリン及びタゾバクタムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。リネゾリド（ＣＡＳ  １６５８００−０３−３）はＡｍｐｌａＣｈｅｍ（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ，ＵＳＡ）から入手した。抗生物質を１６．６７ｍｇ／ｍｌの濃度で３０％ＤＭＳＯ／３０％プロピレングリコール／４０％水に溶解した。リネゾリドを陽性対照として使用し、７．５ｍｇ／ｍｌで調製した。ビヒクル（３０％ＤＭＳＯ／３０％プロピレングリコール／４０％水）を陰性対照として含めた。投与製剤を注入前に０．２μｍフィルターに通すことにより滅菌した。
【００８８】
血液からの細菌分離。血液試料の細菌増殖を播種及び液体培養により調べた。全血（１００μｌ、群当たり３試料）をブレイン−ハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天培地プレートに広げ、３６℃で終夜インキュベートした。コロニーを計数し、３つのコロニーを選択し、液体ＢＨＩ中で３６℃で終夜増殖させ、次に３０％のＬＢ−グリコールと１：１混合し、−８０℃で保管した。残りの各群の３つの血液試料（５０μｌ）を５ｍｌのＢＨＩブロスに添加し、３６℃で終夜インキュベートした。増殖が認められたら、培養物を３０％のＬＢ−グリコールと１：１混合し、−８０℃で保管した。
【００８９】
統計的解析：最小阻害濃度（ＭＩＣ）のデータは３重反復による測定値から得る。適応データは、各薬剤併用条件について２回の反復実験から得る。ｑＲＴ−ＰＣＲ発現プロファイリングのデータは、それぞれ３回の生物学的反復から得られた３回の反復実験から得、測定値の標準誤差が算出される。マウスを６匹からなる群で処置し、細菌の増殖判定は、３回反復においてプレート及びブロスを介し決定した。ボンフェローニ補正を伴うフィッシャーの正確確率検定を８回の独立した試験に使用した（各処置を６１０ビヒクルと比較）。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００９０】
実施例の参考文献
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７．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ＳＣＣｍｅｃ−ｍｅｃＣ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｉｕｒｉ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１−８，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊａｃ／ｄｋｔ４５２（２０１３）．
８．Ｆｕｄａ，Ｃ．，Ｓｕｖｏｒｏｖ，Ｍ．，Ｖａｋｕｌｅｎｋｏ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｍｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．Ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｂｙ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９，４０８０２−４０８０６，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４０３５８９２００（２００４）．
９．Ｆｕｄａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂｙ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２７，２０５６−２０５７（２００５）．
１０．Ｏｔｅｒｏ，Ｌ．Ｈ．，Ｒｏｊａｓ−Ａｌｔｕｖｅ，Ａ．，Ｌｌａｒｒｕｌｌ，Ｌ．Ｉ．，Ｃａｒｒａｓｃｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．＆  Ｋｕｍａｒａｓｉｒｉ，Ｍ．Ｈｏｗ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１０，１６８０８−１６８１３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３００１１８１１０／  ／ＤＣＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ．ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３００１１８１１０（２０１３）．
１１．Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｅｓｔｒａｄａ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｍ．，Ｈｅｓｅｋ，Ｄ．，Ｖａｋｕｌｅｎｋｏ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｍｏｂａｓｈｅｒｙ，Ｓ．Ｃｏ−ｏｐｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  ｉｎ  Ｆｉｇｈｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＢＰ  ２ａ  ｂｙ  Ｔｗｏ  Ａｎｔｉ−ＭＲＳＡ  β−Ｌａｃｔａｍ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０，９２１２−９２１３（２００８）．
１２．Ｌｏｎｇ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＰＢＰ２ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  Ｃｅｆｔａｒｏｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５８，６６６８−６６７４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．０３６２２−１４（２０１４）．
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１４．  ｖａｎ  Ｈａｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．＆  Ｇｏｓｂｅｌｌ，Ｉ．Ｂ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ  ｉｎ  ａ  ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｎａｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１００９６−０１０−１１２８−３（２０１０）．
１５．Ａｒｉａｓ，Ｃ．Ａ．＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｂ．Ｅ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂｕｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ  −  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｕｐｅｒ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６０，４３９−４４３，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｐ０８０４６５１（２００９）．
１６．Ｂｈｕｓａｌ，Ｙ．，Ｓｈｉｏｈｉｒａ，Ｃ．Ｍ．＆  Ｙａｍａｎｅ，Ｎ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｗｈｅｎ  ｔｈｒｅｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ２６，２９２−２９７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｊａｎｔｉｍｉｃａｇ．２００５．０５．００５（２００５）．
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２１．Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｍ．Ａ．＆  Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）  ３２５，１０８９−１０９３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７６６６７（２００９）．
２２．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｌｅｈａｒ，Ｊ．＆  Ｋｅｉｔｈ，Ｃ．Ｔ．Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ｗｈｅｎ  ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ  ｉｓ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｓ．Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏｄａｙ  １２，３４−４２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｒｕｄｉｓ．２００６．１１．００８（２００７）．
２３．Ｈｅｇｒｅｎｅｓｓ，Ｍ．，Ｓｈｏｒｅｓｈ，Ｎ．，Ｄａｍｉａｎ，Ｄ．，Ｈａｒｔｌ，Ｄ．Ｌ．＆  Ｋｉｓｈｏｎｙ，Ｒ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５，１３９７７−１３９８１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０５９６５１０５（２００８）．
２４．Ｌａｚａｒ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１３．５７（２０１３）．
２５．Ｉｍａｍｏｖｉｃ，Ｌ．＆  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｍ．Ｏ．Ａ．Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｔｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｒｕｇ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｔｈａｔ  Ａｖｏｉｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，２０４ｒａ１３２−２０４ｒａ１３２，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００６６０９（２０１３）．
２６．Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｂａｄ  ｂｕｇｓ，ｎｏ  ｄｒｕｇｓ：ｎｏ  ＥＳＫＡＰＥ！  Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ４８，１−１２，ｄｏｉ：１０．１０８６／５９５０１１（２００９）．
２７．Ｒｉｃｅ，Ｌ．Ｂ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ３４，Ｓ１１−１９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  Ｓ６４−７３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｉｃ．２００６．０５．２２０（２００６）．
２８．Ａｌｅｋｓｈｕｎ，Ｍ．Ｎ．＆  Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃｅｌｌ  １２８，１０３７−１０５０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．０３．００４（２００７）．
２９．Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｉｎｄｉａ，Ｐａｋｉｓｔａｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ＵＫ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０９９，１−６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ１４７３−３０９９（１０）７０１４３−２（２０１０）．
３０．Ｓｐｒａｔｔ，Ｂ．Ｇ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ＦＥＢＳ  ７２，３４１−３５２（１９７７）．
３１．Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆  Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２，８２５−８６９，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉ．５２．０７０１８３．００４１４１（１９８３）．
３２．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ＭＲＳＡ  ｔｏ  β−ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，１３７９−１３８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１１．０８．０１５（２０１１）．
３３．Ｋｏｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｍｏｐｅｎｅｍ（ＣＳ−０２３）  ｆｏｒ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５３，１２３８−１２４１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ａａｃ．０１４３３−０８（２００９）．
３４．Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｂｈａｃｈｅｃｈ，Ｎ．＆  Ｂｕｓｈ，Ｋ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ  ａｎｄ  ｂｉａｐｅｎｅｍ：  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３５，７５−８４（１９９５）．
３５．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｅ．Ｍ．＆  Ｃｈａｏ，Ｌ．Ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｒａｄｅｏｆｆｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｄｒｕｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，ｅ８６９７１−ｅ８６９７１，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８６９７１（２０１４）．
３６．Ｍｕｎｃｋ，Ｃ．，Ｇｕｍｐｅｒｔ，Ｈ．Ｋ．，Ｗａｌｌｉｎ，Ａ．Ｉ．Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｈ．＆  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｍ．Ｏ．Ａ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｒｕｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｄｒｕｇｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，２６２ｒａ１５６−２６２ｒａ１５６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９９４０（２０１４）．
３７．Ｋｕｒｏｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ３５７，１２２５−１２４０（２００１）．
３８．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  β−ｌａｃｔａｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒａｉｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５１，２５１４−２５２２，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．０００４０−０７（２００７）．
３９．Ａｒｅｄｅ，Ｐ．，Ｍｉｎｉｓｔｒｏ，Ｊ．＆  Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｄ．Ｃ．Ｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  β−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：β−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｄｉｓｒｕｐｔ  ｔｈｅ  ＭｅｃＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｍｅｃＡ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｍｅｃＡ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５７，３０３７−３０４５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．０２６２１−１２（２０１３）．
４０．Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｃ．Ｗｈａｔ  ｉｓ  Ｓｙｎｅｒｇｙ？  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９８９（１９８９）．
４１．Ｓａｉｍａｎ，Ｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：’ｔｈｅ  ｍｏｔｉｏｎ  ｆｏｒ’．Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８，２４９−２５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｒｒｖ．２００７．０４．００６（２００７）．
４２．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｉ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ；Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．ＣＬＳＩ  ２９（２００９）．
４３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  −  Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＣＬＳＩ  ２９（２００９）．
４４．ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌ．Ｐ．Ｍｅｒｒｅｍ  ＩＶ（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｕｓｅ  ｏｎｌｙ  ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．１−７（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，２０１３）．
４５．Ｆｉｓｈｏｖｉｔｚ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓ  ａｎ  Ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６，９８１４−９８１７（２０１４）．
４６．Ｓｏｍａｎｉ，Ｐ．，Ｆｒｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｈ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．Ｌ．＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｍｉｐｅｎｅｍ−Ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｎａｌ  Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３２，４−９，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．３２．４．５３０．Ｕｐｄａｔｅｄ（１９８８）．
４７．Ｋｉｎｚｉｇ，Ｍ．，Ｂｒｉｓｍａｒ，Ｂ．＆  Ｎｏｒｄ，Ｃ．Ｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｚｏｂａｃｔａｍ  ａｎｄ  Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３６，１９９７−２００４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．３６．９．１９９７．Ｕｐｄａｔｅｄ（１９９７）．
４８．Ｓｔｕｔｍａｎ，Ｈ．Ｒ．，Ｗｅｌｃｈ，Ｄ．Ｆ．，Ｓｃｒｉｂｎｅｒ，Ｒ．Ｋ．＆  Ｍａｒｋｓ，Ｍ．Ｉ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｚｔｒｅｏｎａｍ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２５，２１２−２１５（１９８４）．
４９．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ＭＲＳＡ  ｔｏ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１８，１３７９−１３８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１１．０８．０１５（２０１１）．
５０．Ａｎｋｏｍａｈ，Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｔ．＆  Ｌｅｖｉｎ，Ｂ．Ｒ．Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏ  −，ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ａｎｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ９，ｅ１００３３００−ｅ１００３３００，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００３３００（２０１３）．
５１．Ｓｏｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ａ．＆  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｎ．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １０９，２６２−２６５（１９７２）．
５２．Ｈａｃｋｂａｒｔｈ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．ｂｌａＩ  ａｎｄ  ｂｌａＲ１  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ａｎｄ  ＰＢＰ  ２ａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３７，１１４４−１１４９（１９９３）．
５３．Ｌｏｗｙ，Ｆ．Ｄ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｔｈｅ  ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１１，１２６５−１２７３，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００３１８５３５．Ｉｎ（２００３）．
５４．Ｂｌａｚｑｕｅｚ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  β  −  Ｌａｃｔａｍ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，１５４８−１５５０（２０１４）．
５５．Ｃｒａｉｇ，Ｗ．Ａ．Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ，ａ  ｎｅｗ  ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２４  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ２６６−２７５（１９９７）．
５６．ＤｅＲｙｋｅ，Ｃ．Ａ．，Ｂａｎｅｖｉｃｉｕｓ，Ｍ．Ａ．，Ｆａｎ，Ｈ．Ｗ．＆  Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ  ａｎｄ  ｅｒｔａｐｅｎｅｍ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｉｎ  ａ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｔｈｉｇｈ  ｍｏｄｅｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５１，１４８１−１４８６，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００７５２−０６（２００７）．
５７．Ｃａｉ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｐｅｉ，Ｆ．＆  Ｌｉａｎｇ，Ｂ．−ｂ．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｌｉｃｉｎ  Ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．Ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ６０，３３５−３３８（２００７）．
５８．Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｃ．Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｗｉｔｈ  ａｎｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｇｅｎｔｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １３７，１２２−１３０（１９７８）．
５９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．ＣＬＳＩ  １９（１９９９）．
６０．Ｌｉｆｅ＿Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＣＦＸ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．１−３４（２０１２）．
６１．Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，２０７８−２０７９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ３５２（２００９）．
６２．Ｐｆｉｚｅｒ．Ｚｏｓｙｎ（Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔａｚｏｂａｃｔａｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＰ）  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｕｓｅ  ｏｎｌｙ  ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．１−２６（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０１２）．
６３．Ｍｅｒｃｋ．ＰＲＩＭＡＸＩＮ  Ｉ．Ｖ．（ＩＭＩＰＥＮＥＭ  ＡＮＤ  ＣＩＬＡＳＴＡＴＩＮ  ＦＯＲ  ＩＮＪＥＣＴＩＯＮ）．１−１７（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，２０１４）．
６４．Ｋｕｍａｒ，Ｋ．Ｍ．，Ａｎｂａｒａｓｕ，Ａ．＆  Ｒａｍａｉａｈ，Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  β−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．１０，８９１−９００（２０１４）．
６５．Ｐｅｔｉｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｃＡ，ｍｅｃＲ１  ａｎｄ  ｍｅｃＩ  ｇｅｎｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７，２９７−３０４（２００１）
６６．Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｗａｓｔｅ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｅｖ．Ｃｔｒｉｅｓ．９，（２０１５）
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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