(57)【要約】  本発明は、天然より入手可能なＮＲＰＳ由来の人工非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）の修飾および／またはオーダーメード設計の新規方法に関する。人工ＮＲＰＳは、所定の長さならびにアミノ酸組成および配列を有する。ある種の方法における明確に定義されたＮＲＰＳ単位（いわゆる「交換単位」）の融合を介し、リンカー部分の特定の配列モチーフを用いて、人工および／または修飾ＮＲＰＳアセンブリラインを構築することができ、所望の構造のペプチドを合成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の交換単位（ＥＵ）のアセンブリを含有するＮＲＰＳを生成する方法であって、Ａドメインに続いてＴおよびＣドメインを含むポリペプチドをコードするＥＵを含む方法。
【請求項２】
アセンブリの第１のＥＵが、第１のＡドメインの前に追加のＣドメインを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アセンブリの最後のＥＵが、Ａ、ＴおよびＴＥドメインのいずれかで構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アセンブリの最後のＥＵがＴＥドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アセンブリの最後のＥＵの前にあるＥＵが、ＡおよびＴドメインで構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣドメインがＣｙまたはＣｔｅｒｍドメインに置き換わることができる、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
修飾ドメインとしてＥ、ＭＴまたはＯｘをＥＵに付加することできる、請求項１から６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＵのアセンブリが、これらに限定されないが、細菌、菌類または植物のような種に由来するＥＵドメインで構成される、請求項１から７に記載の方法。
【請求項９】
特定の種由来のＣドメインおよび別の種由来の次のＥＵのＡドメインの基質特異性が、同一であるまたは関連していなければならない、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＵのアセンブリが、これらに限定されないが、ギブソンクローニングまたは酵母ベースＴＡＲ−クローニングのような分子生物学の方法によって達成され得る、請求項１から９に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＵドメイン間の境界が、Ｃ−Ａリンカー内のコンセンサス配列Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕによって定義される、請求項１から１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＲＰＳがＰＫＳ、またはＮＲＰＳ−ＰＫＳ  ＥＵを含有する、請求項１から１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＲＰＳが２〜１０のＥＵを含有する、請求項１から１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＲＰＳが１１〜１００のＥＵを含有する、請求項１から１２に記載の方法。
【請求項１５】
細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であり、前記菌類が酵母細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
抗菌性、抗真菌性、抗腫瘍薬、または免疫抑制のような活性を有するペプチドの同定および生産のための、請求項１から１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＵのアセンブリを含有するＮＲＰＳをコードする遺伝子を構成するキットであって、
ａ）次のＥＵドメイン：Ａ、Ｔ、Ｃ、または
ｂ）Ｅ、ＭＴもしくはＯｘまたは他のＮＲＰＳドメインのような修飾ドメインを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｃ）第１のＥＵとしてＣを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｄ）最後のＥＵとしてＡ、ＴまたはＴＥを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｅ）Ｃの代わりにＣｙまたはＣｔｅｒｍを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｄ）異なる種由来のＥＵドメインを含有するＥＵドメインのアセンブリであって、異なる種由来の隣接したＣおよびＡドメインが、同一または類似の基質特異性を有していなければならない、ＥＵドメインのアセンブリ、および
ｅ）ＥＵドメイン間の境界は、Ｃ−Ａリンカー内の配列Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕによって定義されること
を含むキット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットによって生産されるＮＲＰＳ遺伝子ライブラリーであって、ライブラリー内の各ＮＲＰＳ遺伝子の遺伝子バリアントをコードする少なくとも１５のＥＵを含む、ＮＲＰＳ遺伝子ライブラリー。
【請求項１９】
請求項１７に記載のキットによって生産されるＮＲＰＳ遺伝子ライブラリーであって、ライブラリー内の各ＮＲＰＳ遺伝子の遺伝子バリアントをコードする少なくとも２５のＥＵを含む、ＮＲＰＳ遺伝子ライブラリー。
【請求項２０】
請求項１７に記載のキットによって生産されるＮＲＰＳ遺伝子ライブラリーであって、ライブラリー内の各ＮＲＰＳ遺伝子の遺伝子バリアントをコードする少なくとも５０のＥＵを含む、ＮＲＰＳ遺伝子ライブラリー。
【請求項２１】
請求項１７に記載のキットによって生産されるＮＲＰＳ遺伝子ライブラリーであって、ライブラリー内の各ＮＲＰＳ遺伝子の遺伝子バリアントをコードする少なくとも１００のＥＵを含む、ＮＲＰＳ遺伝子ライブラリー。
【請求項２２】
ライブラリー多様性が、ランダム変異導入法によって増加している、請求項１８から２１に記載のＮＲＰＳ遺伝子ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮＲＰＳを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）およびポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）は、モジュール構造を保持する多機能酵素複合体である（Marahiel 1997）。抗菌性（例えばテイクソバクチン）、抗腫瘍性（例えばブレオマイシン）、抗真菌性（フェンギシン）および免疫抑制（シクロスポリン）の活性を含む医薬に関連のある特性のために、これらの酵素クラスによって合成される多くの天然物は、医薬品および／またはバイオテクノロジーの関心が持たれる（Ling et al. 2015、Ishizuka et al. 1967、Loeffler et al. 1986、Emmel et al. 1989）。ＮＲＰＳによって生産されたペプチド化合物は広範囲の生物活性および大きな構造的多様性（例えば非タンパク質を構成するアミノ酸、Ｎ−メチル化、エピマー化、複素環）を示すが、一般的な合成様式、いわゆる「多重キャリアチオテンプレート機構」は共有される。
【０００３】
ＮＲＰＳの構造は、必須のモジュールである（図１）。モジュールは、ある特定の構築ブロック（例えばアミノ酸）を、伸長するペプチド鎖へ取り入れる触媒の単位として定義される（Marahiel 1997）。ＮＲＰＳモジュールは（複数の）ドメインに細分することができ、各ドメインは、ペプチドアセンブリの中である種の反応ステップに関与する。例えば、標準的な伸長モジュールは、３個のドメインで構成される。
基質（通常アミノ酸）をアミノアシルアデニレートとして選択的に決定し活性化する、アデニル化（Ａ）ドメイン。
チオール化ドメイン（Ｔ）とも呼ばれるペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）は、補因子４−ホスホパンテテインを結合し、活性化されたアミノ酸（ＡＡ）がチオエステル形成によって共有結合している。
縮合（Ｃ）ドメインは、下流および上流に位置するアミノアシルまたはペプチジル残基のペプチド結合形成を触媒する。
ＮＲＰＳモジュールの第１の（Ｎ末端）モジュール（開始モジュール）は、多くの場合Ｃドメインを持たず、最後の（Ｃ末端）モジュール（終結モジュール）は、通常チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインを含有する（Marahiel et al. 1997）。ＴＥドメインは、通常、直鎖状（水分子に移動する）、環状または分岐環状ペプチド（アミドまたはエステル結合）の放出に関与する。これらの「標準ドメイン」（Ｃ、Ａ、Ｔ、ＴＥ）に加えて、Ｃドメインの代わりに環化（Ｃｙ）ドメインおよびＴＥドメインの代わりに末端縮合（Ｃｔｅｒｍ）ドメインが存在可能である。さらにエピマー化（Ｅ）ドメイン、Ｎ−メチル化（ＭＴ）ドメインまたは酸化（Ｏｘ）ドメインのような修飾ドメインをモジュール内に含むことができる。
ＮＲＰＳおよびＰＫＳについてのさらなる一般的な情報は、Cane et al. (1998)、Marahiel (1997)、Sieber and Marahiel (2005)およびSmith and Tsai (2007)を参照されたい。
【０００４】
非リボソームペプチド（ＮＲＰ）およびポリケチド（ＰＫ）は、さまざまな生物において生産される二次代謝産物群である。天然物のこの分類の多くのメンバーは、抗菌性（例えば、バンコマイシンおよびエリスロマイシン）、抗腫瘍性（例えば、ブレオマイシンおよびエポチロン）、抗真菌性（例えば、ソラフェンおよびフェンギシン）、免疫抑制（例えば、シクロフィリンおよびラパマイシン）およびコレステロール低下（例えば、ロバスタチン）の活性を含む医薬に関連のある特性を示す。ＮＲＰおよびＰＫの天然の産物は化学的に多様であるにもかかわらず、これらのタイプの化合物は、それらの同種の生産生物において、非リボソームペプチドシンセターゼおよびポリケチドシンターゼとして知られた多酵素大複合体による類似の方法で生合成される。これらの大きなタンパク質は、単純な化学的モノマー（ＮＲＰＳの場合アミノ酸、およびＰＫＳの場合アシル−ＣｏＡチオエステル）からのアセンブリラインによってＮＲＰおよびＰＫの枠組みを構築する。ＮＲＰおよびＰＫの分類のさらなる情報については、Cane et al. (1998)およびその中の参考文献を参照されたい。潜在的薬物としてのＮＲＰおよびＰＫの能力は、それらの多様で複雑な化学構造にある。一般に、これらの天然物（またはそのバリアント）を合成的に利用可能にすることを困難にしているのは、その複雑さにある。手間のかかる合成経路を開発したいくつかの例が存在するが、ＮＲＰまたはＰＫについてはめったにうまくいかない。さらに、そのような分子のさまざまな部分は、有機合成による修飾で近づき難く、またはそのような技術を用いて低い収量でしか生産することができない。ＮＲＰおよびＰＫ天然物の合成および修飾におけるこの困難さは、合成を促進し、これらの分子のバリアントを開発するための代替の戦略の必要性を強調する。
【０００５】
ＮＲＰＳの明らかなモジュール構造にもかかわらず、本発明より前に、得られるＮＲＰＳが活性であるようにドメインを交換することは実際に困難であった。あるドメインを別のものに置換すると、一般に収量が大きく低下し（例えば、＞１０倍）、望ましくない生合成副産物の生産を高める結果になる。これらの変化は、ドメイン間四次相互作用が破壊された結果である場合があり、したがってドメイン交換は、修飾するタンパク質の特定のＮＲＰＳ四次構造に関する深い知識を必要とする。したがって、新しい種類のＮＲＰおよびＰＫを生産する新しい方法が必要であり、そのようなＮＲＰおよびＰＫの収量を高める方法が必要である。
【０００６】
ＮＲＰＳ内には、以下のドメイン：Ｃ（縮合）、Ｃｙ（複素環化）、Ａ（アデニル化）、Ｔ（チオール化）またはＰＣＰ（ペプチジルキャリアタンパク質）、ＴＥ（チオエステラーゼ）、Ｅ（エピマー化）、ＭＴ（メチルトランスフェラーゼ）、Ｏｘ（オキシダーゼ）、およびＲｅ（レダクターゼ）ドメインが含まれ得る。
非リボソームペプチドシンセターゼは一般に、以下の構造：Ａ−Ｔ−（Ｃ−Ａ−Ｔ）ｎ−ＴＥを有し、ここでＡ−Ｔは開始モジュールであり、Ｃ−Ａ−Ｔは伸長モジュールであり、ＴＥは終結モジュールである（図１）。個々のモジュール内で例えば、以下の変形：ＣがＣｙに置き換わること、およびＥ、ＭＴ、Ｏｘ、またはＲｅが挿入されること、ＴＥがＣまたはＲｅに置き換わることが生じ得る。完全なアセンブリラインは、開始モジュール、終結モジュール、およびおよそ０からｎ−２個の伸長モジュールを有し得、ここでｎはポリマー生成物中の単量体の数である。この規則の例外が存在し得る。例えば、エンテロバクチンシンセターゼは、ＴＥドメインがオリゴメラーゼとして作動するが、２個のモジュールを持つのみであり、これらの二量体生成物の３つを一緒につなぎ、六量体のペプチド生成物を形成する。
【０００７】
ＮＲＰＳコアドメインは、ＡおよびＰＣＰ（またはＴ）ドメインを含む（図２）。この図は、モノマーがモジュールのＴドメインへどのように結合するか（ＡＴＰを用いて）を示す。伸長ステップにおいて、単量体はあるモジュールのＴドメインから次のモジュールのＴドメインへ移される。この移動には伸長モジュールのＣドメインが関与する。ＮＲＰ合成の最終ステップはＴＥドメインによって実行され、加水分解、大環状化、またはオリゴマー化反応を触媒する（図３）。
ＮＲＰＳは一般にモジュール構造であり、一連の触媒ステップは、ＮＲＰＳを構成する各ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へ移動する。例えばチロシジン（ｔｙｐｒｏｃｉｄｉｎe）を生産するＮＲＰＳは、３つのポリペプチドを生産する３つの遺伝子で作られている。ＴｙｃＡは開始モジュールを含有し、ＴｙｃＢは３つの伸長モジュールを含有し、ＴｙｃＣは６つの追加の伸長モジュールと終結モジュールとを含有する。
以下のドメイン、ＫＳ（ケトシンターゼ）、ＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）、Ｔ（チオール化）、ＫＲ（ケトレダクターゼ）、ＤＨ（デヒドラターゼ）、ＥＲ（エノイルレダクターゼ）、ＴＥ（チオエステラーゼ）がＰＫＳ内に含まれ得る。ＰＫＳは一般に以下の構造、ＡＴ−Ｔ−（ＫＳ−ＡＴ−Ｔ）n−ＴＥを持つ。ＡＴ−Ｔは開始モジュールであり、ＫＳ−ＡＴ−Ｔは伸長モジュールであり、ＴＥは終結モジュールである。ＰＫＳの構造はＮＲＰＳの構造と非常に類似している。両タイプのアセンブリラインをつなぎ合わせてまとまりのある単位を形成する、ハイブリッドのＰＫＳ−ＮＲＰＳシステムの多くの例（例えば、エルシニアバクチン、エポチロン、ブレオマイシン）がある。各ＰＫＳモジュール内に、ＫＲ、ＫＲおよびＤＨ、ＫＲおよびＤＨおよびＥＲ、または追加のドメインがない、のいずれかが見られる。モジュール内のこれらの追加のドメインは、β炭素の化学的機能性（例えば、カルボニル、ヒドロキシル、オレフィン、または飽和炭素）を決定する。
【０００８】
先行技術
Ｍａｒａｈｉｅｌら（ＷＯ２０００５２１５２）がアデニル化−チオール化ジドメインを交換することによってＮＲＰＳを再結合させることが可能であることを示すことができた１９９５年以来、ＮＲＰＳ研究に注目が集まった（Ｍａｒａｈｉｅｌら  １９９５）。この２０年の間に、ＮＲＰＳを再プログラム化する多数の試みがなされた。フェニルアラニン活性化ドメインＰｈｅＡ（ＰＤＢ−ＩＤ：１ＡＭＵ）の結晶構造に基づいて、Stachelhaus et al.は触媒中心の特異性を付与するＡＡを解明することができた（Conti et al. 1997、Stachelhaus et al. 1999）。Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ−コードと示されるこの特異性を付与するコードによって、生体外におけるＡドメインの基質特異性を予測し変えることができる（Khurana et al. 2010、Rausch et al. 2005、Rottig et al. 2011、Kries et al. 2014）。この試みの最大の明らかに不都合な点は、それが生体内に適用できないことである。この欠点の１つの主要な原因は、基質不適合になる選択性をＣドメインも持つことである（Belshaw et al. 1999）。
【０００９】
既知のＮＲＰＳ生合成クラスターを変えるさらなる試み（ＷＯ２００１３０９８５、Ｍａｒａｈｉｅｌら）は、単一ドメイン、ジドメイン、またはモジュール全体の交換および個々のドメインの間の厳密に定義された境界（リンカー）の知識に基づいている。本発明により、追加のモジュールを導入または削除することによって、わずかのＮＲＰＳをうまく変更することができた。しかし、人工のＮＲＰＳを、モジュールの人工のデノボの組合せから、全体的に生産することは決してできなかった。このことは、新しいペプチドをも生産する新規のＮＲＰＳが天然には存在しない結果となるはずである。そのような交換または組合せの問題は常に、モジュールおよび／またはドメインの互いの間の適合性に関する不確実性であった。上記の問題に対する解決策を欠いていることから生じる欠点は、この方法によって設計された人工ペプチドはほとんどないという事実によって示される。
【００１０】
既知のＮＲＰＳ生合成クラスターを変える別の試み（ＷＯ２００７０１４０７６、Ｗａｌｓｈら）は、シンターゼの別の言い方であるいわゆる「アセンブリライン」の突然変異誘発法に基づいている。ＮＲＰＳ遺伝子の突然変異誘発法は本発明の主題ではないが、本発明の方法は、生成されたＮＲＰＳを改変し、改変されたペプチド合成を引き起こす突然変異誘発法と組み合わせることができる。本突然変異誘発法はＮＲＰＳライブラリーの多様性およびライブラリー内のＮＲＰＳクローン数を増加させるために有用であることがあり得る。
【発明の概要】
【００１１】
ＮＲＰＳのモジュール構成にもかかわらず、本発明より前に、デノボに完全なＮＲＰＳを構築することは言うまでもなく、活性なＮＲＰＳになるようにドメインおよび／またはモジュールを交換することは非常に困難であった。
ＮＲＰＳおよびＰＫＳは、以下のカテゴリーの小分子、（ｉ）非リボソームペプチド、（ｉｉ）ポリケチド、および（ｉｉｉ）非リボソームペプチド−ポリケチドハイブリッドの１つまたは複数を合成する多モジュール酵素を形成する１つのポリペプチドまたは複数の相互作用ポリペプチドを意味する。ＮＲＰＳは、開始モジュールおよび終結モジュールを含む。ＮＲＰＳは、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の伸長モジュールをさらに含み得る。ＮＲＰＳラインは、シンターゼ、シンセターゼ、またはそれらの組合せであり得る。
「アセンブリ」とは、ドメインの組を意味する。複数のアセンブリはＮＲＰＳを含む。１つまたは複数のポリペプチドは、モジュールを含み得る。モジュールの組合せは、より大きな分子を形成するための一連の反応を触媒することができる。一例では、モジュールはＣ（縮合）ドメイン、Ａ（アデニル化）ドメイン、およびペプチジルキャリアタンパク質ドメインを含み得る。Ａドメイン、ジドメイン、ドメイン−ドメイン境界および完全なモジュールについてのより構造的な情報は、Conti et al. (1997)、Sundlov et al. (2013)、Tanovic et al. (2008)、Mitchell et al. (2012)およびTan et al. (2015)を参照されたい。
【００１２】
「開始モジュール」とは、モノマーを第２のモジュール（例えば、伸長または終結モジュール）に供給することができるモジュールを意味する。ＮＲＰＳの場合、開始モジュールは例えば、Ａ（アデニル化）ドメインおよびＰＣＰ（ペプチジルキャリアタンパク質）またはＴ（チオール化）ドメインを含む。開始モジュールはＥ（エピマー化）ドメインを含有し得る。ＰＫＳの場合、開始モジュールは、ＡＴ（アセチルトランスフェラーゼ）ドメインおよびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインを含む。開始モジュールは、好ましくはアセンブリラインの第１のモジュールのポリペプチドのアミノ末端にあり、各アセンブリラインは、好ましくは１つの開始モジュールを含有する。
「伸長モジュール」とは、モノマーを別のモノマーまたはポリマーに加えるモジュールを意味する。伸長モジュールは、Ｃ（縮合）、Ｃｙ（複素環化）、Ｅ、ＭＴ（メチルトランスフェラーゼ）、Ｏｘ（オキシダーゼ）、またはＲｅ（レダクターゼ）ドメイン、Ａドメイン、またはＴドメインを含み得る。伸長ドメインは、追加のＥ、Ｒｅ、ＤＨ（脱水）、ＭＴ、ＮＭｅｔ（Ｎ−メチル化）、ＡＭＴ（アミノトランスフェラーゼ）、またはＣｙドメインをさらに含み得る。
【００１３】
「終結モジュール」とは、分子（例えば、ＮＲＰ、ＰＫ、またはそれらの組合せ）をアセンブリラインから放出するモジュールを意味する。分子は、例えば、加水分解または環化によって放出され得る。終結モジュールは、ＴＥ（チオエステラーゼ）、Ｃ、またはＲｅドメインを含み得る。終結モジュールは、好ましくはＮＲＰＳまたはＰＫＳのポリペプチドのカルボキシ末端にある。終結モジュールは、追加の酵素的活性（例えば、オリゴメラーゼ活性）をさらに含み得る。
【００１４】
「ドメイン」とは、単一の酵素活性を持つポリペプチド配列、またはより大きなポリペプチド配列の断片を意味する。したがって、単一のポリペプチドは多重ドメインを含み得る。多重ドメインは、モジュールを形成し得る。ドメインの例は、Ｃ（縮合）、Ｃｙ（複素環化）、Ａ（アデニル化）、Ｔ（チオール化）、ＴＥ（チオエステラーゼ）、Ｅ（エピマー化）、ＭＴ（メチルトランスフェラーゼ）、Ｏｘ（オキシダーゼ）、Ｒｅ（レダクターゼ）、ＫＳ（ケトシンターゼ）、ＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）、ＫＲ（ケトレダクターゼ）、ＤＨ（デヒドラターゼ）、およびＥＲ（エノイルレダクターゼ）を含む。「非リボソーム的に合成されたペプチド」、「非リボソームペプチド」、または「ＮＲＰ」とは、リボソームによって生産されない任意のポリペプチドを意味する。ＮＲＰは、直鎖状、環化または分岐であり、タンパク新生の、天然の、または非天然のアミノ酸、またはそれらの任意の組合せを含有し得る。ＮＲＰはアセンブリラインによって生産されるペプチドを含む。
「ポリケチド」とは、多重ケチル単位を含む化合物を意味する。
「非リボソームペプチドシンセターゼ」とは、非リボソームペプチドを生産するポリペプチドまたは一連の相互作用ポリペプチドを意味する。
「ポリケチドシンターゼ」（ＰＫＳ）とは、ポリケチドを生産するポリペプチドまたは一連のポリペプチドを意味する。「量を改変する」とは、増加または減少のいずれかによって量を変化させることを意味する。増加または減少は、３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上であり得る。
「構造を改変する」とは、参照構造と比較して、化学的（例えば、共有結合的または非共有結合的）結合における任意の変化を意味する。
「突然変異」とは、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が、天然に存在する配列から少なくとも１つのアミノ酸改変を持つような核酸配列における改変を意味する。突然変異は、制限なく、挿入、欠失、フレームシフト突然変異、またはミスセンス突然変異であり得る。この用語は、突然変異体核酸配列にコードされるタンパク質も記載する。
「異種」とは、参照配列に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を持つポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。配列同一性は、一般的に配列解析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．  ５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、さまざまな置換、欠失、および／または他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列にマッチする。
保存的置換は、一般的に以下の群：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、およびフェニルアラニン、チロシン内での置換を含む。同一性の程度を定量する例となる方法では、ＢＬＡＳＴプログラムが、密接に関連する配列を示すｅ-3からｅ-100の間の確率スコアを用いて使用され得る（Altschul et al., 1990）。
本発明の他の特徴および長所は、以下の詳細な記載、図面、および請求項から明らかである。
図面の説明
【００１５】
本発明は、すべての所望の天然のまたは人工ペプチドを合成する能力を持つ人工ＮＲＰＳを生成する方法を提供する。本発明によって構成されるこれらの人工ＮＲＰＳは、抗マラリア、免疫抑制、抗腫瘍、抗コレステロール、抗菌性（例えば、抗菌）、および抗真菌性の活性を含むがこれに限定されない活性を有する新規のペプチドを生産するために有用である。
【００１６】
現在入手可能な先行技術の方法の問題は、常にモジュールおよび／またはドメインの互いの間の適合性に関する不確実性であった。この欠点の原因は、不適合につながる場合がある選択性をＣドメインも持つことである（Belshaw et al. 1999）。
本発明は、「交換単位」の概念を導入することによって、初めて入手可能な、機能性の天然、修飾または人工ＮＲＰＳを生成する信頼性のある方法を提供する。この概念は、所望のＡＡ組成、構造および長さの非リボソームペプチド（ＮＲＰ）の設計、クローニングおよび生産のための、順守する簡単な規則を提供する。
【００１７】
本発明者らは、「交換単位」（ＥＵ）と呼ばれる、リンカーをコードする領域における、正確に定義されたＡＡの定義された連続的配置において、明確に定義されたドメイン単位を融合することによって、前記ドメインの活性を損なうまたは失うことなく機能性ＮＲＰＳを構築することができることを示すことができた（図４）。
【００１８】
一般的な構造
標準ＥＵは、Ａドメインに続いてＴおよびＣドメインの組成物と定義される。第１のＥＵ（開始ＥＵ）は、時々第１のＮＲＰＳのＡドメインの前に追加のＣドメインを有し、最後（終結ＥＵ）は、Ａ、ＴおよびＴＥドメインのいずれか、または単にＴＥドメインで構成される。後者の場合、最後のＥＵの次にあるＥＵは、ＡおよびＴドメインで構成される。さらに、「標準ドメイン」（Ｃ、Ａ、Ｔ、ＴＥ）には、Ｃドメインの代わりにＣｙドメイン、およびＴＥドメインの代わりにＣｔｅｒｍドメインが存在し得る。さらにＥ、ＭＴドメインまたはＯｘドメインのような修飾ドメインをＥＵ内に含めることができる。
【００１９】
ＥＵの境界
標準ＥＵの境界は、Ｃ−Ａリンカー内のコンセンサスモチーフＷＮＡＴＥ（アミノ酸コード）によって定義される。ＮＲＰＳドメインの間のリンカーは、Ｍａｒａｈｉｅｌらによって以前に記載された（ＷＯ２００１１３０９８５）。すべての標準ＥＵは、コンセンサスモチーフＷＮＡＴＥ、続いてＡ、Ｔ、Ｃドメインで始まり、次のＣ−ＡリンカーコンセンサスモチーフのＮ末端ＡＡ（Ｗ）の前のＡＡで終わる。終結ＥＵは、コンセンサスモチーフＷＮＡＴＥ、続いてＡ、ＴおよびＴＥまたはＣｔｅｒｍドメインで始まる。アセンブリラインの設計に使用される終結ＥＵがＴＥまたはＣｔｅｒｍのみからなる場合、これに隣接するＥＵ（Ａ−Ｔ）はＴドメインの最後のＡＡで終わることが好ましい。
ＥＵの融合
ＥＵは、起源（細菌、真菌、植物）にかかわらず、ＥＵの連結による以下の規則が満たされている限り、分子構築キットのようなＥＵの定義に従って構築ブロックとして使用することができる。ＥＵ間の不適合性に関するいかなる問題をも防ぐために、Ｃドメインの基質特異性を厳密に守らなければならない。これは、下流のＥＵのＡドメインの特異性が常に、上流のＣドメインの基質特異性に適合しなければならないことを意味する。ＥＵのアセンブリは、ギブソンクローニング、酵母ベースのＴＡＲ−クローニングなどのような分子生物学の方法によって達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＮＲＰＳの略図である。ドメインを、アデニル化（Ａ、黒色）、チオール化（Ｔ、薄灰色）、縮合（Ｃ、灰色）、修飾（Ｍ、濃灰色）、チオエステラーゼ（ＴＥ、濃灰色）に着色した。縮合ドメインのドナー（Ｄ）およびアクセプタ（Ａ）部位。
【図２】ＮＲＰＳアデニル化およびペプチジルキャリアタンパク質の略図である。
【図３】チオエステラーゼドメイン（ＴＥ）による終結を示す略図である。
【図４】選択された交換単位の略図である。ドメインを強調し、アデニル化（Ａ、黒色）、チオール化（Ｔ、薄灰色）、縮合（Ｃ、灰色）、二重縮合（Ｃ／Ｅ、灰色）、修飾（Ｍ、濃灰色）に標識した。
【図５】ジドメインおよび交換単位スワッピングの図である。シクロ（ｓＱＩＬｆＫ）ペプチドを生産するための機能性ＮＲＰＳの構築。Ａ：ゲームＸペプチド（ＧａｍｅＸＰｅｐｔｉｄｅ）、Ｂ：アンバクチン、Ｃ：現状の方法（生産なし）、Ｄ：交換単位（生産）。
【図６】ＮＲＰＳを生産する機能性シクロ（ｖＬｆｌＬ）ペプチドのデノボ構築の図である。人工ＮＲＰＳは、４つの異なるＮＲＰＳ由来の５つのＥＵの組合せである。
【図７】ＮＲＰＳを生産する機能性シクロ（ｖＬｖＶ）ペプチドの構築の図である。再結合させたＮＲＰＳは、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＴＴ０１およびＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ  ＡＴＣＣ１９０６１由来の５つのＥＵの組合せである。
【図８】ＮＲＰＳを生産する機能性シクロ（ｖＬｔＶ）ペプチドのデノボ構築の図である。再結合させたＮＲＰＳは、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＴＴ０１、Ｘ．ｂｏｖｉｅｎｉｉ  ＳＳ−２００４およびＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ  ＡＴＣＣ１９０６１由来の５つのＥＵの組合せである。
【図９】ＮＲＰＳを生産する機能性シクロ（ｖＬｆｌＬ）ペプチドの構築の図である。再結合させたＮＲＰＳは、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＴＴ０１（グラム陰性、黒色）およびＢ．ｂｒｅｖｉｓ  ＡＴＣＣ９９９（グラム陽性、灰色）由来の６つのＥＵの組合せである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の好ましい実施形態は、２つ以上の交換単位（ＥＵ）のアセンブリを含有するＮＲＰＳを生成する方法であって、Ａドメインに続いてＴおよびＣドメインを含むポリペプチドをコードするＥＵを含む方法である。
さらに、本発明の好ましい実施態様は、アセンブリの第１のＥＵは、第１のＡドメインの前に追加のＣドメインを有する、および／またはアセンブリの最後のＥＵは、Ａ、ＴおよびＴＥドメインのいずれかで構成される、および／またはアセンブリの最後のＥＵは、ＴＥまたはＣｔｅｒｍドメインである、および／またはアセンブリの最後のＥＵの前にあるＥＵは、ＡおよびＴドメインで構成される、および／またはＣドメインはＣｙドメインに置き換わることができる、上記の方法である。
さらに、本発明の好ましい実施態様は、修飾ドメインとしてＥ、ＭＴまたはＯｘをＥＵに付加することできる、上記の方法である。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＥＵのアセンブリは、これらに限定されないが、細菌、菌類または植物のような種に由来するＥＵで構成され、特定の種由来のＣドメインおよび別の種由来の隣接した次のＥＵのＡドメインの基質特異性は同一であるまたは類似していなければならず、前記細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、粘液細菌（mixobacteria）、シアノバクテリア(cyanobacteria)または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であり、前記菌類はアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）またはフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）である、方法である。
ＥＵのアセンブリは、これらに限定されないが、ギブソンクローニングまたは酵母ベースＴＡＲ−クローニングのような分子生物学の方法によって達成され得る。
【００２３】
上記のすべての方法の好ましい必要条件は、Ｃ−Ａリンカー内のＥＵの境界の間に定義されるコンセンサス配列Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ（ＷＮＡＴＥ）である。
設計されたペプチドはまた、本発明の実施形態でもあるハイブリッド酵素（例えば、ＮＲＰＳ−ＰＫＳハイブリッド）の構築を必要とするポリケチド、脂肪酸またはテルペンとのハイブリッドの一部であり得る。ＮＲＰＳはＰＫＳである可能性もある。
【００２４】
ＥＵアセンブリ内のＥＵの数は、２〜１０のＥＵまたは１１〜１００のＥＵの間で変化し得る。
別の好ましい実施形態は、ペプチドの同定および生産方法である。上記のペプチドの活性は、抗菌性、抗真菌性、抗腫瘍薬、または免疫抑制である可能性があるが、これに限定されない。
本発明によれば、構築されたペプチドは、コンピューターを使った分子設計または類似の方法によって設計された既知のペプチド、それらの誘導体、および非天然ペプチドであり得る。
【００２５】
また、ＥＵのアセンブリを含有するＮＲＰＳをコードする遺伝子を構成するキットであって、
ａ）次のＥＵドメイン：Ａ、Ｔ、Ｃ、または
ｂ）Ｅ、ＭＴもしくはＯｘのような修飾ドメインを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｃ）最初のＥＵとしてドメインＣ、Ａ、Ｔ、Ｃドメインを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｄ）最後のＥＵとしてドメインＡ、ＴまたはＴＥを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｅ）Ｃの代わりにＣｙまたはＣｔｅｒｍを含有するＥＵのアセンブリ、または
ｄ）異なる種由来のＥＵを含有するＥＵのアセンブリであって、異なる種由来の隣接したＣおよびＡドメインが、同一または類似の基質特異性を有していなければならない、ＥＵのアセンブリ、および
ｅ）ＥＵ間の境界は、Ｃ−Ａリンカー内の配列Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕによって定義されること
を含むキットは、上記方法を実行するために、本発明の別の好ましい実施形態である。
【００２６】
別の好ましい実施形態は、上記のキットによって生産されたＮＲＰＳ遺伝子ライブラリーである。前記ライブラリーはライブラリー内の各ＮＲＰＳ遺伝子の遺伝子バリアントをコードする少なくとも１５、または２５または５０または１００または１０００のＥＵを含む。
ＮＲＰＳのライブラリーは、当技術分野の標準的な分子生物学的方法を使用して生成され得る。ＮＲＰＳの他のライブラリーは、当技術分野の標準的な分子生物学的方法に続いて突然変異誘発法を使用して生成され得る。アセンブリラインの１つまたは複数のドメインのランダム変異導入法は、本明細書に記載のエラープローンＰＣＲのような既知の方法を使用して実行され得る。突然変異ドメイン突然変異誘発法は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ＜（登録商標）＞ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ）を含むさまざまな手段によって達成され得る。エラープローンＰＣＲは、Beaudry and Joyce (Science 257:635 (1992)）ならびにBartel and Szostak (Science 261 : 1411 (1993)）に記載された当技術分野の標準的な方法である。この技術を使用して、タンパク質をコードする遺伝子へ無作為の突然変異を導入し得る。ＰＣＲによってランダム変異導入法を実行するキット、例えば、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（商標）  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ）は市販されている。核酸配列を修飾するための化学的突然変異、放射線、および当技術分野で既知の任意の他の技術が、本発明における使用に適切である。
【実施例１】
【００２７】
本発明（ＥＵの概念）およびドイツ特許出願第１９９９１５１１９６号の比較
本発明を現状方法と比較するために、以下の実験を行った。本実験において、新しいアンバクチン誘導体を生産するために、アンバクチン生産ＮＲＰＳＡｍｂＳにおいていくつかのドメイン（黄色）を交換することを試みた（図５）。一方では図５ＤのＥＵの概念に従い、および他方では、Ｍａｒａｈｉｅｌら（ＷＯ２００１３０９８５）によって示唆された図５Ｃの当技術分野の方法の状態に従った。本発明のみ所望の環状ペプチドへ導いた。図５Ｃの他の組換えＮＲＰＳは、いかなる新しい誘導体の生産も示さなかった。
【実施例２】
【００２８】
ゲームＸペプチド合成に関与するＮＲＰＳ生合成クラスターＰｌｕ３２６３（ＧｘｐＳ）のデノボアセンブリ
本発明の精度を支持するために、既知のＮＲＰＳ構築ブロックからゲームＸペプチド生産ＮＲＰＳを再アセンブリした。予測したように、本人工ＮＲＰＳは、所望のペプチドを生産することができる（図６）。
【実施例３】
【００２９】
キセノテトラペプチド合成およびトレオニン含有誘導体の生産に関与するＮＲＰＳ生合成クラスターＸｔｐＳのデノボアセンブリ
新規かつ人工のＮＲＰＳを生産する新規ペプチドを構築するために、本発明およびその出願の精度を支持するため（図７、ＸｔｐＳのデノボ構築、図８、人工ＮＲＰＳ）。
【実施例４】
【００３０】
グラム陽性およびグラム陰性起源のＥＵの組換え
本発明者らは、本発明および導入された規則が普遍的に適用可能であることを示すために、グラム陰性（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＴＴ０１）およびグラム陽性（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ  ＡTＣＣ９９９）細菌由来のＥＵを組み換えた。期待されたように、この人工ＮＲＰＳも所望のペプチドを生産することができる（図９）。
【００３１】
文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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