(57)【要約】  本開示は、ＮＫ細胞殺傷活性を増強する方法および医薬組成物に関する。詳細には本開示は、必要とする対象におけるＮＫ細胞殺傷活性を増強する方法であって、ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物の治療有効量を、該対象へ投与することを含む、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象におけるＮＫ細胞殺傷活性を増強する方法であって、ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物の治療有効量を、前記対象へ投与することを含む、方法。
【請求項２】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、ＣＤ２４５への特異性を有する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）（それぞれ二重特異性または三重特異性の、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体）、ｓｃ−ダイアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ(ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー、Ｔ細胞を誘引するｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性形式）；ＳＩＰ（小免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体）；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性リターゲティング（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）」）、１つまたは複数のＣＤＲを含む小抗体模倣物などからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、ヒト重鎖定常領域配列を含むが、それらが結合するＮＫ細胞を欠失せず、好ましくは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドへ実質的に結合し得るＦｃドメインを含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、Ｆｃドメインを欠如するか、またはＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ２４５への特異性を有する第一の抗原結合部位と、少なくとも１つの第二の抗原結合部位と、を含む多重特異性抗体。
【請求項１１】
前記第二の抗原結合部位が、癌細胞、またはウイルスもしくは細菌により感染された細胞により発現される抗原に結合する、請求項１０に記載の多重特異性抗体。
【請求項１２】
必要とする対象における癌または感染性疾患を処置する方法であって、ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物の治療有効量を、前記対象へ投与することを含む、方法。
【請求項１３】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、ＣＤ１３７への特異性を有する抗体と併用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、化学療法剤、標的癌治療、免疫療法剤、または共刺激分子に特異性のある抗体と併用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、ＡＤＣＣを介して、第二の薬剤が結合する抗原を発現する細胞の死を誘導する前記第二の薬剤と併用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
必要とする対象における抗体のＮＫ細胞抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する方法であって、前記抗体を前記対象へ投与すること、およびＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物を前記対象へ投与すること、を含む、方法。
【請求項１７】
必要とする対象における癌を処置する方法であって、癌細胞抗原に選択性のある第一の抗体を前記対象へ投与すること、およびＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物を前記対象へ投与すること、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ＮＫ細胞殺傷活性を増強するための方法および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、予備刺激なしで腫瘍細胞を自然に殺傷することが可能なリンパ球のサブセットとして４０年間以上前に同定された（１〜４）。ＮＫ細胞は、ほとんどの哺乳動物および鳥類に存在し、抗腫瘍および抗感染免疫（５、６）、ならびに再生（７）において重大な役割を担う。ヒトにおいてＮＫリンパ球は、表現型としては神経細胞接着分子のアイソフォームであるＣＤ５６の発現により、そしてＣＤ３の非存在により特徴づけられる（８）。ＮＫ細胞傷害性は、活性化受容体と阻害性受容体の間のエンゲージメントから生じるシグナルのバランスにより緊密に制御される（６、９）。標的細胞との接触により、ＮＫ細胞表面のインテグリンが、標的細胞上の接着分子に結合して、細胞間相互作用を安定化させる（１０）。標的細胞上での細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）へのインテグリン：リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）の結合が、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）ドメイン含有Ｖａｖ１およびｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性化を通して、ＮＫ細胞内の初期シグナル伝達カスケードを開始する（１１）。これにより、細胞骨格再構成と、ＮＫ免疫シナプス（ＮＫＩＳ）（１３）と称されるＮＫ標的細胞境界の活性化ＮＫ受容体（ＮＫＲ）の凝集が生じる（１２）。活性化ＮＫＲのエンゲージメントが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアダプタータンパク質の動員を導く。ＩＴＡＭ中のこの２つのチロシンが、Ｓｒｃキナーゼファミリーメンバーによってリン酸化され、リン酸化されたＩＴＡＭがチロシンキナーゼのＳｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）ドメインのための結合部位を形成して（１４）、標的細胞の顆粒極性化（ｇｒａｎｕｌｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、脱顆粒、および細胞溶解を担うシグナル伝達カスケードを惹起する。活性化ＮＫＲとしては、自然な細胞傷害性受容体（ＣＤ２４５（１５）、ＮＫｐ４４（１６）、およびＮＫｐ３０（１７）など）のファミリーのメンバー、Ｃ型レクチン受容体のＮＫＧファミリー（ＮＫＧ２Ｄ）（１８）のメンバー、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）（１９、２０）のメンバー、Ｉｇ様シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー（２Ｂ４）（２１）のメンバー、およびＣＤ１６０（２２、２３）などのその他のメンバーが挙げられる。４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、抗体依存性細胞傷害性（２５）の場合と同様に、発現がＮＫ細胞表面でのＦｃ受容体のエンゲージメントにより惹起される、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞上で発現される共刺激受容体である（２４）。ＣＤ１３７の刺激は、異なる癌モデルにおいてセツキシマブ−、リツキシマブ−、およびトラスツズマブ−依存性ＮＫ細胞傷害性を増強する（２６〜２８）。阻害性ＮＫＲが、標的細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合すると、ＮＫ細胞活性化が、主として抑制される（２９）。ヒトにおいて、これらの受容体は、主にＮＫＧ２Ａヘテロ二量体としてＣ型レクチン受容体に（３０）、または受容体のＫＩＲスーパーファミリーに（１９、２０）属する。活性化ＫＩＲと異なり、阻害性ＫＩＲは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）配列を有する長い細胞質テールを含む（３１���。後者は、Ｓｒｃ相同性領域２含有タンパク質チロシンホスファターゼ−１（ＳＨＰ−１）またはＳＨＰ−２のタンデムＳＨ２ドメインのための特異的結合部位を提供する。ＮＫＩＳでのＳＨＰ動員は、細胞溶解を導くシグナンル伝達カスケードにおける重要なステップの多くを遮断することができる（３２）。ＣＤ２４５は、ヒト末梢血リンパ球の表面の独特な表面抗原として過去に記載されており、モノクローナル抗体ＤＹ１２によって認識される（３３）。しかしＣＤ２４５の分子的および機能的特徴は、依然として大部分が未知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の概要
本発明は、ＮＫ細胞殺傷活性を増強する方法および医薬組成物に関する。詳細には本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明者らは、免学的アプローチとプロテオミクス的アプローチを組み合わせて、ＣＤ２４５を、細胞骨格構成およびゴルジ体出芽（Ｇｏｌｇｉ  ｂｕｄｄｉｎｇ）において重大な役割を担う高度に保存されたモーター酵素：非従来型ミオシン１８Ａとして同定した。健常なヒトの血液および肺由来のＮＫ細胞は、ミオシン１８Ａを構成的に発現した。ミオシン１８Ａは、ＮＫ細胞の形質膜および細胞質に局在化し、その膜発現は、活性化誘導性であった。ＮＫ細胞上のミオシン１８Ａの動員は、抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）または抗ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）でコーティングされたＰ８１５標的細胞に対する細胞傷害性と、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染Ｂ細胞に向けられるリンフォカイン活性化キラー活性の両方を大きく増強した。ミオシン１８Ａの刺激は、ＮＫ細胞上のＣＤ１３７表面発現を誘導した。ＣＤ１３７Ｌの遮断は、ＣＤ１３７Ｌ発現Ｂリンパ腫細胞に向けたミオシン１８Ａ誘導性ＮＫ細胞傷害性を排除した。ミオシン１８Ａは、ホスファターゼ活性に関連し、複数のＮＫ受容体のシグナル伝達物質であるＳｒｃ相同性領域２含有タンパク質チロシンホスファターゼ２（ＳＨＰ−２）、ならびにアクチン構成およびＮＫ免疫シナプス形成に関与するｐ２１活性化キナーゼ２ＰＡＫ２に結合することが可能であった。新たに記載されたＮＫ活性化受容体ミオシン１８Ａは、癌免疫療法における有望なターゲットになると思われる。
【０００５】
したがって本発明の一目的は、必要とする対象におけるＮＫ細胞殺傷活性を増強する方法であって、ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物の治療有効量を、該対象へ投与することを含む、方法に関する。
【０００６】
本明細書で用いられる「ＮＫ細胞」は、非従来型免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞の場合のＣＤ５６および／またはＣＤ１６をはじめとする特異的表面抗原の発現、細胞表面でのα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特異的細胞溶解機構の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してそれを殺傷する能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞を殺傷する能力、および免疫反応を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力（「ＮＫ細胞殺傷活性」）など、特定の特徴および生物学的特性のおかげで同定することができる。ＮＫ細胞の任意の亜集団もまた、ＮＫ細胞という用語に包含される。本発明の状況において、「活性」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解する能力を有する、または他の細胞の免疫機能を増強する能力を有するＮＫ細胞をはじめとする、生物学的に活性のＮＫ細胞を示す。例えば「活性」ＮＫ細胞は、ＮＫ受容体を活性化するためのリガンドを発現する細胞、および／またはＮＫ細胞上のＫＩＲによって認識されたＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞を殺傷することが可能である。
【０００７】
本明細書で用いられる用語「ＣＤ２４５」は、非従来型ミオシン１８Ａ、非従来型ミオシン−ＸＶＩＩＩａまたはＭｙｏ１８Ａを示す。模範的なヒト核酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０７８４７１．３およびＮＭ＿２０３３１８．１として参照される。模範的なヒトアミノ酸配列は、ＮＰ＿５１０８８０．２およびＮＰ＿９７６０６３．１として参照される。さらなる模範的アミノ酸配列としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（図１Ｂ）が挙げられる。
【０００８】
本明細書で用いられる表現「ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物」は、ＣＤ２４５にエンゲージ（即ち、結合）してＮＫ細胞殺傷活性を増強することが可能な任意の化合物を指す。ＮＫ細胞殺傷活性を増強する本発明の化合物の能力は、当該技術分野で周知の任意アッセイによって決定され得る。典型的には前記アッセイは、ＮＫ細胞を標的細胞（例えば、ＮＫ細胞によって認識および／または溶解される標的細胞）と接触させるインビトロアッセイである。例えば該化合物は、ＮＫ細胞による特異的溶解を、本発明の化合物によって接触されるＮＫ細胞またはＮＫ細胞株と同じエフェクター：標的細胞比で得られる特異的溶解の約２０％より多く、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、またはより多く増加させる能力のために選択され得る。古典的な細胞傷害性アッセイのためのプロトコルの例は、例えばＰｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ，  １９９８，  １８８  （５）：  ９５３−９６０；  Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １９９９．  ２９：１６５６−１６６６；  Ｂｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，  （２００５）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ７８：３５９−３７１；  Ｅｌ−Ｓｈｅｒｂｉｎｙ  ｅｔ  ａｌ，  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７（１８）：８４４４−９；およびＮｏｌｔｅ−’ｔ  Ｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  （２００７）  Ｂｌｏｏｄ  １０９：６７０−６７３に記載される。典型的にはＮＫ細胞傷害性は、実施例に記載される任意のアッセイにより決定される。ＮＫ細胞傷害性は、細胞傷害性の古典的なインビトロクロム放出テストによって測定され得る。エフェクター細胞は、典型的には健常ドナー由来の新しいＰＢ−ＮＫである。標的細胞は、典型的にはネズミマスト細胞腫Ｐ８１５細胞またはＥＢＶ感染Ｂ細胞株である。したがって、標的細胞（感染細胞、腫瘍細胞、炎症促進性細胞など）に向けられるＮＫ細胞の反応性もしくは細胞傷害性の増加、ＮＫ細胞における活性化、活性化マーカー（例えば、ＣＤ１０７発現）および／もしくはＩＦＮγ産生の増加、ならびに／またはそのような活性化、反応性、細胞傷害性および／もしくは活性化ＮＫ細胞のインビボでの頻度の増加を引き起こす場合に、本発明の化合物が選択される。
【０００９】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、ＣＤ２４５への特異性を有する抗体である。
【００１０】
したがって本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために用いられ、該用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）（それぞれ二重特異性または三重特異性の、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体）、ｓｃ−ダイアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ(ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー、Ｔ細胞を誘引するｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性形式）；ＳＩＰ（小免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体）；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性リターゲティング（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）」）、１つまたは複数のＣＤＲを含む小抗体模倣物などの抗原結合ドメインを含む抗体断片を包含する。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および使用する技術は、当該技術分野で周知である（参照により本明細書に特別に組み入れられるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１参照）。特にダイアボディは、欧州特許第４０４，０９７号およびＷＯ９３／１１１６１号にさらに記載されるが、線状抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）にさらに記載される。抗体は、従来の技術を利用して断片化され得る。例えばＦ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することにより、作製され得る。得られたＦ（ａｂ’）２断片を、ジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂ’断片を生成することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成をもたらすことができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片および他の断片を、組換え技術により合成することもでき、または化学合成することもできる。抗体断片を生成する技術は、当該技術分野で周知であり、記載されている。例えばＢｅｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，  ２００５；  Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｒｅｆｆ  ＆  Ｈｅａｒｄ，  ２００１  ；  Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；およびＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５のそれぞれは、効果的な抗体断片の生成をさらに記載しており、それを可能にする。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「特異性」は、非ＣＤ２４５タンパク質または構造物（ＮＫ細胞上または他の細胞型で提示される他のタンパク質など）との検出可能な反応性が相対的にほとんどないが、ＣＤ２４５などの抗原上で提示されるエピトープに検出可能に結合する抗体の能力を指す。特異性は、本明細書の他の箇所に記載された通り、例えばＢｉａｃｏｒｅ機を利用して、結合または競合的結合アッセイにより相対的に決定され得る。特異性は、特異的抗原への結合と、他の無関係な分子への非特異的結合とで対比させた、例えば約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０，０００：１またはそれを超える親和性／アビディティ比によって呈され得る（この場合、特異性抗原はＣＤ２４５ポリペプチドである）。本明細書で用いられる用語「親和性」は、エピトープに対する抗体の結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、非結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄにより得られる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８），  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９９２，  １９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９２：５８９−６０１  （１９８３）に見出すことができ、それらは、全体が参照により本明細書に組み入れられる。ｍＡｂの親和性を決定するための当該技術分野で周知の１つの好ましい標準法は、Ｂｉａｃｏｒｅ機の使用である。
【００１２】
天然抗体では、２つの重鎖が、ジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖が、ジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）という２つの軽鎖がある。抗体分子ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある。各鎖は、明確な配列ドメインを含む。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）という２つのドメインを含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）と、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、集合的にＣＨと称される）という４つのドメインを含む。軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域が、抗原への結合認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）鎖および重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合など、重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主として超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成される。場合により、非超可変またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、ドメイン構造全体に、そしてそれにより該結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域またはＣＤＲは、ネイティブ免疫グロブリン部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒になって決定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲを有し、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される。それゆえ、抗体結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれから設定されるＣＤＲを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挟み込まれたアミノ酸配列を指す。
【００１３】
用語「Ｆａｂ」は、ＩｇＧをプロテアーゼのパパインで処理することにより得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側のおよそ半分およびＬ鎖全体が、ジスルフィド結合を通して互いに結合する、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を示す。
【００１４】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＩｇＧをプロテアーゼのペプシンで処理することにより得られる断片のうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりもわずかに大きい、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指す。
【００１５】
用語「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指す
【００１６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合により連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であり、通常は、ペプチドコードリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合から発現される。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価および多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成され得るか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２などのペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることにより作製され得る。
【００１７】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、該断片が、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインの間に対合ができないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが強制的に別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を生成する。
【００１８】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５，  １９７５）の方法を利用して作製され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウスまたは他の適当な宿主動物を、適当な抗原性形態（即ち、本発明のポリペプチド）で適切な間隔で（例えば、週２回、週１回、月２回、または月１回）免疫化する。動物は、殺処分後１週間以内に抗原の最終「ブースト」を投与され得る。多くの場合、免疫化の際に免疫アジュバントを使用することが望ましい。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、ＨｕｎｔｅｒのＴｉｔｅｒｍａｘ、サポニンアジュバント、例えば、ＱＳ２１もしくはＱｕｉｌ Ａ、またはＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは、当該分野で周知である。この動物は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻内、または他の経路により免疫化され得る。所与の動物は、複数形態の抗原を用いて複数経路により免疫化され得る。
【００１９】
手短に述べると、本発明の組換えポリペプチドは、組換え細胞株を用いた発現によって提供され得る。ポリペプチドの組換え形態は、任意の過去に記載された方法を利用して提供され得る。免疫化のレジメンに従って、リンパ球が、動物の脾臓、リンパ節または他の臓器から単離され、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマを形成させる。融合後に、標準法を利用して、融合パートナーではなくハイブリドーマが成長可能な培地中に細胞を入れる。ハイブリドーマの培養後に、所望の特異性の抗体、即ち抗原と選択的に結合する抗体の存在について、細胞上清を分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、およびウエスタンブロット分析が挙げられる。他のスクリーニング技術は、当該分野において周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトで自然にフォールディングした抗原への抗体の結合を確認する技術、例えば未変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、および免疫沈降などである。
【００２０】
注目すべきこととして、当該技術分野で周知の通り、抗体分子の小部分、つまりパラトープのみが、エピトープへの抗体の結合に関与する（一般には、Ｃｌａｒｋ，  Ｗ．  Ｒ．  （１９８６）  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｒｏｉｔｔ，  Ｉ．  （１９９１）  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ参照）。例えば、Ｆｃ’領域およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素切断されるか、またはｐＦｃ’領域を有さずに生成された抗体（Ｆ（ａｂ’）２断片と称される）は、インタクト抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素切断されるか、またはＦｃ領域を有さずに生成された抗体（Ｆａｂ断片と称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。さらにＦａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖および抗体重鎖の一部（Ｆｄと呼ばれる）からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄ断片は、抗体特異性を変更することなく、１０個までの異なる軽鎖と会合され得る）、Ｆｄ断片は、単離されてエピトープ結合能力を保持する。
【００２１】
当該技術分野で周知の通り、抗体の抗原結合部分の中に、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般には、Ｃｌａｒｋ，  １９８６；  Ｒｏｉｔｔ，  １９９１参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片および軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲＳ）によりそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特に重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性の大部分を担う。
【００２２】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、本来の抗体のエピトープ特異性を維持しながら、同種特異性または異種特異性抗体の類似の領域と置換され得ることは、現在、当該技術分野で十分に確立されている。このことは、機能的抗体を生成するために非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合で接合された「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明確に示されておいる。
【００２３】
幾つかの実施形態において、該抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で用いられる「ヒト化」は、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の幾つか、ほとんど、または全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を示す。ヒト化の方法としては、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第５，８５９，２０５号に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。先の米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、ならびにＷＯ９０／０７８６１号には、ヒト化抗体を設計する際に用いられ得る４つの可能な基準も提案されている。最初の提案は、アクセプターのために、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと通常は相同性である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを使用することであった。第二の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク内のアミノ酸が通常と異なり、かつその位置のドナーアミノ酸がヒト配列の典型ならば、アクセプターよりもむしろドナーアミノ酸が選択され得る、ということであった。第三の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖の中の３つのＣＤＲに直接隣接する位置では、アクセプターアミノ酸よりもむしろドナーアミノ酸が選択され得る、ということであった。第四の提案は、アミノ酸が抗体の三次元モデルのＣＤＲの３Ａ内に側鎖原子を有すると予測され、そしてＣＤＲと相互作用が可能であると予測されるフレームワーク位置で、ドナーアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｅ）を使用することであった。上記方法は単に、当業者がヒト化抗体を作製するのに用い得る方法の幾つかの例示である。当業者は、抗体のヒト化に関する他の方法に熟知している。
【００２４】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の幾つか、ほとんど、または全ては、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の幾つか、ほとんど、または全てのアミノ酸は、変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換、または修飾は、それらが所定の抗原に結合する抗体の能力を排除しない限り容認され得る。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＭ分子が挙げられよう。「ヒト化」抗体は、本来の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかし、内容が参照により本明細書に組み入れられるＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ／．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９４：１５１，  １９９９に記載される通り、ヒト化の特定の方法を利用して、抗体の結合の親和性および／または特異性が、「指向性進化法」の方法を用いて増強され得る。
【００２５】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座の大部分がトランスジェニックなマウスを免疫化することにより調製され得る。例えば、内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５９８，３６９号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５４５，８０７号、同第６，１５０，５８４号、およびそれらに列挙された参考資料を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生において機能的欠陥が存在するように、遺伝子修飾されている。この動物はさらに、これらの動物の免疫化により該当する抗原への完全ヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むよう修飾される。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化後、モノクローナル抗体が、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製され得る。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それゆえヒトへ投与した場合に、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）反応を誘導しない。ヒト抗体を生成するためのインビトロ方法もまた存在する。これらには、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号）およびヒトＢ細胞のインビトロ刺激（米国特許第５，２２９，２７５号および同第５，５６７，６１０号）がある。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２６】
したがって、当業者に明白な通り、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列または非ヒト配列で置換されたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列または非ヒト配列で置換されたキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同的なヒト配列または非ヒト配列で置換されたキメラＦａｂ断片抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同的なヒト配列または非ヒト配列で置換されたキメラＦｄ断片抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００２７】
様々な抗体分子および断片が、非限定的にＩｇＡ、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭをはじめとする任意の一般に知られている免疫グロブリンクラスに由来し得る。ＩｇＧサブクラスもまた、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、一本鎖抗体である。本明細書で用いられる用語「一本鎖抗体」は、当該技術分野の一般的な意味を有し、軽鎖が自然に欠如するラクダ科哺乳動物において見出され得るタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。そのような単一ドメイン抗体はまた、「ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）」である。（単一）ドメイン抗体の一般的記載については、先に引用された先行技術、および欧州特許第０３６８６８４号、Ｗａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ  １２；  ３４１  （６２４２）：  ５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００３，  ２１（１１）：４８４−４９０；およびＷＯ０６／０３０２２０号、ＷＯ０６／００３３８８号にも記載される。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列および構造は、フレームワーク領域がそれぞれ「ＣＤＲ１」の「相補性決定領域」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と当該技術分野で称される３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」により中断された、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」と、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」と、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」と、そして「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と当該技術分野および本明細書で称される、４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」で構成されると見なされ得る。したがって単一ドメイン抗体は、一般構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３を指す） のアミノ酸配列として定義され得る。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒト重鎖定常領域配列を含むが、それらが結合するＮＫ細胞を欠失せず、好ましくは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない。本明細書で用いられる、ＣＤ２４５発現細胞に関連する用語「欠失する」は、試料または対象に存在するＣＤ２４５発現細胞の数に不の影響を及ぼすように、殺傷、排除、溶解し得る、またはそのような殺傷、排除もしくは溶解を誘導し得る、工程、方法または化合物を意味する。用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」は、例えばヒトガンマ重鎖の約２３０アミノ酸（ａａ）〜約４５０ａａ、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、εおよびμ）のそれに対応する配列、またはその天然由来アロタイプからの、抗体重鎖のＣ末端断片を指す。他に断りがなければ、免疫グロブリンに関して一般に許容されるカバットのアミノ酸番号付けが、本開示全体で用いられている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤを参照）。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤ２４５ポリペプチドを発現するＮＫ細胞の欠失を直接的または間接的に誘導しない（例えば、１０％、２０％、５０％、６０％またはより多くのＣＤ２４５＋ＮＫ細胞数の排除または減少を生じない）。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドへ実質的に結合し得るＦｃドメインを含まない。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを欠如するか（例えば、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを欠如するか）、またはＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体断片、または複数の異なる抗体断片を含む多重特異性抗体からなるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、毒性部分に連結されていない。幾つかの実施形態において、アミノ酸残基から選択された１つまたは複数のアミノ酸を、抗体が改変されたＣ２ｑ結合性および／または減少もしくは消失した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、ｌｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号に更に詳述されている。
【００３０】
幾つかの実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数が改変される、例えば増加または減少するように、該ヒンジ領域が修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号に更に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖とのアッセンブリを促すように、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように、改変される。
【００３１】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾される。様々なアプローチが、可能である。例えば、Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載される通り、１つまたは複数の下記突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入することができる。あるいは、生物学的半減期を延長するために、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載される通り、ＩｇＧのＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変させることができる。
【００３２】
本発明により企図される本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を延長するようにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはその断片は、典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応される。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で用いられる用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されている任意の形態のＰＥＧ、例えば、モノ（ＣＩ−ＣＩＯ）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングルコール−マレイミドを包含するものとする。幾つかの実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野で公知であり、本発明のヒトモノクローナル抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号およびＩｓｈｉｋａｗａらによる同第０４０１３８４号を参照されたい。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書の先に記載された本発明の抗体から得られた第一の抗原結合部位と、少なくとも１つの第二の抗原結合部位と、を含む多重特異性抗体を提供する。したがって第一の抗原結合部位は、殺傷メカニズムを動員するため、即ち、ＮＫ細胞障害性を増大するために用いられる。典型的には第二の抗原結合部位は、癌細胞、またはウイルス、細菌に感染した細胞によって発現された抗原に結合する。幾つかの実施形態において、第二の抗原結合部位は、ヒトＢ細胞上の抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ１３８およびＨＬＡ−ＤＲに結合する。幾つかの実施形態において、第二の抗原結合部位は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である抗原に結合する。模範的なＴＡＡは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、ＲＡＧＥ（腎抗原）、ａ−フェトプロテイン、ＣＡＭＥＬ（黒色腫におけるＣＴＬ認識抗原）、ＣＴ抗原（ＭＡＧＥ−Ｂ５、−Ｂ６、−Ｃ２、−Ｃ３、およびＤ；Ｍａｇｅ−１２；ＣＴ１０；ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ならびにＳＡＧＥ）、ムチン抗原（例えば、ＭＵＣ１、ムチン−ＣＡ１２５など）、ガングリオシド抗原、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｃ−Ｍｅｔ、Ｍａｒｔｉ、ＭｅｌａｎＡ、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＨＬＡ−Ｂ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、または癌関連インテグリン、例えば、α５β３インテグリンを含む。本発明の多重特異性抗体分子についての模範的なフォーマットとしては、（ｉ）化学的なヘテロコンジュゲーションにより架橋した２つの抗体（一方はＣＤ２４５に対する特異性を有し、他方は第二の抗原に対する特異性を有する）；（ｉｉ）２種類の異なる抗原結合領域を含む１つの抗体；（ｉｉｉ）２種類の異なる抗原結合領域を含む一本鎖抗体、例えば追加のペプチドリンカーによりタンデムに連結された２つのｓｃＦｖ；（ｉｖ）各軽鎖および重鎖が２つの可変ドメインを短いペプチド結合を介してタンデムに含有する二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，  Ｉｎ  ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  （２０１０））；（ｖ）化学的に連結した二重特異性（Ｆａｂ’）２断片；（ｖｉ）Ｔａｎａｄａｂ、つまり各ターゲット抗原に対して２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合物；（ｖｉｉ）フレキシボディ、つまり多価分子をもたらすｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせ；（ｖｉｉｉ）Ｆａｂに加えられると、異なるＦａｂ断片に連結した２つの同一のＦａｂ断片からなる三価二重特異性結合タンパク質を生成し得る、プロテインキナーゼＡ中の「二量体化およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック」分子；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂ−アームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子、および（ｘ）ダイアボディが挙げられ���が、これらに限定されない。二重特異性抗体についての別の模範的なフォーマットは、ヘテロ二量体化させるための、相補的なＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。そのような分子は、公知の技術、例えばＴｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、静電的に適合するもの（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ−ｍａｔｃｈｅｄ）（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、およびＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）技術として知られるものを利用して調製し得る。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は、典型的には、ＤｕｏＢｏｄｙ技術を利用して、制御されたＦａｂ−アーム交換により得られる、または得ることができる。制御されたＦａｂ−アーム交換により二重特異性抗体を生成するインビトロ法は、ＷＯ２００８１１９３５３号および同第２０１１１３１７４６号（両方とも、Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）に記載されている。ＷＯ２００８１１９３５３号に記載された１つの模範的な方法において、二重特異性抗体は、還元条件下でのインキュベーションにより、２つの単一特異性抗体（両方ともＩｇＧ４様ＣＨ３領域を含む）間の「Ｆａｂ−アーム」または「半分子」交換（重鎖と付着した軽鎖とのスワッピング）により形成される。得られた生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。ＷＯ２０１１１３１７４６号に記載された別の模範的な方法において、第一および第二の抗体の少なくとも１つが本発明の抗体である、本発明の二重特異性抗体は、下記ステップを含む方法によって調製される：ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第一の抗体を提供するステップであって、前記Ｆｃ領域が第一のＣＨ３領域を含む、ステップ；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第二の抗体を提供するステップであって、前記Ｆｃ領域が第二のＣＨ３領域を含み、前記第一および第二のＣＨ３領域の配列が異なり、前記第一および第二のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第一および第二のＣＨ３領域の各ホモ二量体相互作用よりも強いようする、ステップ、ｃ）前記第一の抗体を前記第二の抗体と共に、還元条件下でインキュベートするステップ、ならびにｄ）前記二重特異性抗体を獲得するステップであって、第一の抗体が本発明の抗体であり、第二の抗体が異なる結合特異性を有するか、またはその逆であるステップ。還元条件は、例えば２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンから選択される、還元剤を添加することにより提供され得る。ステップｄ）は、例えば還元剤の除去により、例えば脱塩により、非還元性にする、または還元性を低下させる条件を回復させることを更に含み得る。好ましくは、第一および第二のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第一および第二のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第一および第二のＣＨ３領域の���ホモ二量体相互作用よりも強力になるように、わずか数個のかなり保存的な非対称の突然変異を含む。これらの相互作用およびそれらをどのようにして実現し得るかについてのより詳細は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１１１３１７４６に提供される。
【００３４】
本発明により企図される抗体の別の修飾は、得られた分子の半減期を延長するための、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンまたはその断片へのコンジュゲートまたはタンパク質融合である。そのようなアプローチは、例えばＢａｌｌａｎｃｅらの欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。
【００３５】
本発明の抗体は、非限定的に単独または組み合わせでの任意の化学的、生物学的、遺伝子学的、または酵素的技術など、当該技術分野で公知の任意技術により生成され得る。例えば、所望の配列のアミノ酸配列を知れば、当業者は、前記抗体を、ポリペプチド生成用の標準的技術により容易に生成することができる。例えば該抗体は、周知の固相法を用いて、好ましくは市販のペプチド合成装置（カリフォルニア州フォスターシティー所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより製造されたものなど）を使用し、製造業者の使用説明書に従って合成され得る。あるいは本発明の抗体は、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術により合成され得る。例えば抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込み、そのようなベクターを所望の抗体を発現する適切な真核生物または原核生物の宿主内に導入した後、ＤＮＡ発現生成物として得ることができ、その後、周知の技術を利用して単離することができる。
【００３６】
幾つかの実施形態において、対象は、癌または感染性疾患に罹患している。したがって本発明のさらなる目的は、必要とする対象における癌または感染性疾患を処置する方法であって、ＮＫ細胞上のＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物の治療有効量を、該対象へ投与することを含む、方法に関する。
【００３７】
本明細書で用いられる「処置」または「処置すること」は、臨床結果を含む有益な、または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益な、または所望の臨床結果としては、以下のものの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない：該疾患から得られた１つもしくは複数の症状を軽減すること、該疾患の程度を低減すること、該疾患を安定化させること（例えば、該疾患の増悪を予防または遅延させること）、疾患の拡大（例えば、転移）を予防もしくは遅延させること、該疾患の再発を予防もしくは遅延させること、該疾患の進行を遅延もしくは緩徐化すること、該疾患の状態を改善すること、該疾患の緩解（部分または完全）を提供すること、該疾患を処置するのに必要となる１つもしくは複数の他の薬品の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を向上させること、および／または生存を延長させること。本発明の方法は、処置のこれらの態様の任意の１つまたは複数を企図する。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「癌」は、当該技術分野の一般的意味を有し、固形腫瘍および血液由来の腫瘍が挙げられる、これらに限定されない。癌という用語は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液および血管の疾患を包含する。用語「癌」はさらに、原発癌および転移癌の両方を包含する。本発明の方法および組成物により処置され得る癌の例としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮由来の癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、具体的には癌は、以下の組織学的な種類の癌であり得るが、これらに限定されない：悪性新生物；カルチノーマ；未分化癌；巨細胞紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；家族性ポリポーシス腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支‐肺胞性腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭腺癌および濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜様癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺；腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；および悪性神経芽細胞腫（ｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）；セルトリ細胞腫；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性パラガングリオーマ；乳房外悪性パラガングリオーマ；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫（ｍａｌｉｇ ｍｅｌａｎｏｍａ）；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル芽細胞線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性グリオーマ；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳性肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リン���腫；びまん性悪性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ならびにヘアリー細胞白血病。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「感染性疾患」は、ウイルス、細菌、原生動物、カビまたは真菌によって引き起こされる任意の感染を包含する。幾つかの実施形態において、ウイルス感染は、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、クロステロウイルス科、コモウイルス科、シストウイルス科、フラビウイルス科、フレキシウイルス科、ヘペウイルス、レビウイルス科、ルテオウイルス科、モノネガウイルス目、モザイクウイルス、ニドウイルス目、ノダウイルス科、オルトミクソウイルス科、ピコビルナウイルス、ピコルナウイルス科、ポティウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、セキウイルス科、テヌイウイルス、トガウイルス科、トンブスウイルス科、トティウイルス科、ティモウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、またはパピローマウイルス科のウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルスによる感染を含む。ＲＮＡウイルスの関連する分類学的ファミリーとしては、アストロウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、カリシウイルス科、クロステロウイルス科、コモウイルス科、シストウイルス科、フラビウイルス科、フレキシウイルス科、ヘペウイルス、レビウイルス科、ルテオウイルス科、モノネガウイルス目、モザイクウイルス、ニドウイルス目、ノダウイルス科、オルトミクソウイルス科、ピコビルナウイルス、ピコルナウイルス科、ポティウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、セキウイルス科、テヌイウイルス、トガウイルス科、トンブスウイルス科、トティウイルス科、およびティモウイルス科のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、該ウイルス感染は、アデノウイルス、ライノウイルス、肝炎ウイルス、免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、西ナイルウイルス、天然痘ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザウイルス（ヒト、トリ、ブタを含む）、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴウイルス、マールブルグウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、プンタトロウイルス、タカリベウイルス、ピキンデウイルス、アデノウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルス（ヒト、トリ、ブタを含む）、フニンウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ピキンデウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、タカリベウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マーレーバレーウイルス、ポワサンウイルス、ロシオウイルス、跳躍病ウイルス、バンジウイルス、イルヘウスウイルス（Ｉｌｈｅｕｓ  ｖｉｒｕｓ）、ココベラウイルス（Ｋｏｋｏｂｅｒａ  ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス、アルフィウイルス（Ａｌｆｕｙ  ｖｉｒｕｓ）、ウシ下痢症ウイルス、およびキァサヌル森林病ウイルスからなる群から選択される１種または複数のウイルスによる感染を含む。本発明により処置され得る細菌感染としては、以下のものによって引き起こされる感染が挙げられるが、これらに限定されない：ブドウ球菌；Ｓ．ピオゲネスを含む連鎖球菌属；腸球菌；炭疽菌および乳酸桿菌属を含むバシラス属；リステリア属；ジフテリア菌；膣ガルドネレラ菌を含むガルドネレラ属；ノカルジア属；ストレプトマイセス属；サーモアクチノミセス・ブルガリス；トレポネーマ；カンピロバクター属、緑膿菌を含むシュードモナス属；レジオネラ属；淋菌およびＮ．メニンギチデスを含むナイセリア属；Ｆ．メニンゴセプチカムおよびＦ．オドラターンを含むフラボバクテリウム属；ブルセラ属；百日咳菌およびボルデテラブロンキセプチカを含むボルデテラ属；大腸菌を含むエシュリヒア属、クレブシエラ属；エンテロバクター属、Ｓ．マルセセンスおよびＳ．リクエファシエンスを含むセラチア属；エドバルシエラ属；Ｐ．ミラビリスおよびＰ．ブルガリスを含むプロテウス属；ストレプトバチルス属；Ｒ．フィケッツフィを含むリケッチア科、Ｃ．プシッタシおよびＣ．トラコルナティスを含むクラミジア属；結核菌、Ｍ．イントラセルラレ、Ｍ．フォルイターン、ライ菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．ボビス、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ． カンサシ、Ｍ．イントラセルラレおよびＭ．レプレルヌリウムを含むマイコバクテリウム属；ならびにノカルジア属。本発明により処置され得る原生動物感染としては、レーシュマニア、コクジディオア属およびトリパノソーマ属により引き起こされる感染が挙げられるが、これに限定されない。感染性疾患の完全な列挙は、アメリカ疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｗｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＣＤＣ）（ワールド・ワイド・ウェブ（ｗｗｗ）アドレスｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｉｄｏｄ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／）の国立感染症センター（ＮＣＩＤ）のウェブサイトに見いだすことができ、この列挙は、参照により本明細書に組み入れられる。前記疾患の全てが、本発明による組成物を用いた処置の候補である。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、所望の治療効果を実現するのに必要となる投与量および期間で効果的な量を指す。本発明の化合物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する本発明の化合物の能力などの因子により変動し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が抗体または抗体部分の任意の毒性または有害作用にまさる場合の量でもある。本発明の化合物の効率的投与量および投与レジメンは、処置される疾患または状態に依存し、当業者によって決定され得る。当該技術分野の通常の技能を有する医師は、必要となる医薬組成物の有効量を即座に決定および処方することができる。例えば医師は、該医薬組成物において用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を実現するのに必要となるレベルよりも低レベルで開始し、所望の効果が実現されるまで投与量を徐々に増加させることができる。一般に本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与レジメンに従って治療効果を生成するのに効果的な最低用量である化合物量であろう。そのような有効量は一般に、先に記載された因子に依存するであろう。例えば、治療的使用のための治療有効量は、疾患の進行を安定化させる能力により測定され得る。典型的には癌を阻害する化合物の能力は、例えばヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価され得る。あるいは組成物のこの特性は、熟練の実施担当者に知られたインビトロアッセイにより細胞傷害性を誘導する該化合物の能力を検査することにより評価され得る。治療化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させ得る、またはさもなければ対象における症状を改善し得る。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができよう。本発明の化合物の治療有効量の非限定的範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇなど、例えば約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇなど、例えば約０．５、約０．３など、約１、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇまたは約８ｍｇ／ｋｇである。本発明の化合物の治療有効量の模範的な非限定的範囲は、約０．０２〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜３０ｍｇ／ｋｇなど、約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜３ｍｇ／ｋｇなど、例えば約０．５〜２ｍｇ／ｋｇである。投与は、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であり得、例えば標的の部位の付近へ投与され得る。上記処置および使用の方法における投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば単一ボーラスが投与され得るか、複数に分割された用量が経時的に投与され得るか、または用量を治療状況の急迫性に示される通り比例して減少もしくは増加させ得る。幾つかの実施形態において、処置の有効性は、治療の間に、例えば所定の時点で、モニタリングされる。幾つかの実施形態において、該有効性は、疾患エリアの視覚化によって、または本明細書にさらに記載される他の診断方法によって、例えば標識された本発明の化合物、本発明の化合物に由来する断片またはミニ抗体を用いて、例えば１回もしくは複数回のＰＥＴ−ＣＴスキャンを実施することにより、モニタリングされ得る。所望なら、医薬組成物の効果的な日用量は、場合により単位投与剤形において、当日を適当な間隔に分けて投与される２、３、４、５、６またはより多いサブ用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅｓ）として投与され得る。幾つかの実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、任意の望まない副作用を最小限に抑えるために、２４時間を超えるような長期間にわたり緩徐な連続輸液により投与される。本発明の化合物の効果的用量はまた、週１回、週２回、または週３回の投与期間を利用して投与され得る。投与期間は、例えば８週間、１２週間に、または臨床的進行が確定されるまでに制限され得る。非限定的な例として、本発明による処置は、処置開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週目のうちの少なくとも１週に、１日あたり０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇなどの約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量で、またはそれらの任意の組合せで、 単回投与または２４、１２、８、６、４もしくは２時間ごとの分割投与を利用して、またはそれらの組み合わせで、本発明の化合物の日用量として提供され得る。
【００４１】
本発明はまた、本発明の化合物が例えば癌を処置するために、少なくとも１種のさらなる治療薬と併用される、治療適用を提供する。そのような投与は、同時、分割、または連続であり得る。同時投与では、該薬剤は、適宜、１つの組成物として、または別の組成物として投与され得る。さらなる治療薬は、典型的には処置される障害に関連する。模範的な治療薬としては、他の抗癌性抗体、細胞傷害剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗癌性免疫原、細胞周期制御／アポトーシス調節剤、ホルモン調節剤および以下に記載される他の薬剤が挙げられる。
【００４２】
幾つかの実施形態において、該第二の薬剤は、ＮＫ細胞活性化の天然リガンド、またはＣＤ２４５以外のＮＫ細胞活性化受容体に結合してそれを活性化する抗体である。幾つかの実施形態において、該薬剤は、標的細胞（例えば、感染細胞または腫瘍細胞）の表面のＮＫ細胞活性化受容体の天然リガンドの存在を増加させる薬剤である。ＮＫ細胞活性化受容体としては、例えばＮＫＧ２Ｄまたは活性化ＫＩＲ受容体（ＫＩＲ２ＤＳ受容体、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４）が挙げられる。本明細書で用いられる用語「活性化ＮＫ受容体」は、刺激されると、ＮＫ活性に関連して当該技術分野で公知の任意特性または活性、例えばサイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）産生、細胞内遊離カルシウムレベルの上昇、例えば本明細書の他の箇所に、記載された通りリダイレクトキリングアッセイ（ｒｅｄｉｒｅｄｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）おいて細胞を標的とする能力、またはＮＫ細胞増殖を刺激する能力の測定可能な増大を引き起こす、ＮＫ細胞表面の任意の分子を指す。用語「活性化ＮＫ受容体」は、活性化形態またはＫＩＲタンパク質（例えば、ＫＩＲ２ＤＳタンパク質）、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８ＲおよびＩＬ−２１Ｒを包含するが、これらに限定されない。活性化受容体でアゴニストとして作用するリガンドの例としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１ポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態において、該第二の抗体は、ＣＤ１３７に特異性がある。本明細書で用いられる用語「ＣＤ１３７」は、当該技術分野の一般的意味を有し、Ｌｙ６３、ＩＬＡまたは４−１ＢＢとも称され得る。ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。この受容体ファミリーのメンバーおよびそれらの構造的に関連するリガンドは、非常に様々な生理学的工程の重要な調節因子であり、免疫反応の調節において重要な役割を担う。ＣＤ１３７は、活性化されたＮＫ細胞、ＴおよびＢリンパ球、ならびに単球／マクロファージによって発現される。該遺伝子は、細胞外ドメイン（この受容体ファミリーの特徴）、膜貫通領域、および潜在的リン酸化部位を含む短いＮ末端細胞質部分の中に３つの高システインモチーフを有する２５５アミノ酸タンパク質をコードする。初代細胞における発現は、厳密には活性化依存性である。該受容体のリガンドは、ＴＮＦＳＦ９である。ヒトＣＤ１３７は、そのリガンドのみに結合することが報告されている。アゴニストとしては、ネイティブリガンド（ＴＮＦＳＦ９）、アプタマー（ＭｃＮａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １  １８：  ３７６−３８６）、および抗体が挙げられる。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、化学療法剤と併用される。用語「化学療法剤」は、腫瘍の成長を阻害するのに効果的な化学薬品を指す。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンアミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールアミンなどのエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体のＫＷ２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン；イホスファミド、メクロルエタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビシン；フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニンヌスチン；抗生物質、例えばエネジイン系抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシン（１１およびカリケアミシン２Ｉ１、例えばＡｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：１８３−１８６（１９９４）参照；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連するクロモプロテイン・エンジイン・アンチバイオティック・クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラルマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン（ｃａｎｎｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリン−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、マイクフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベンメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メソトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似��、例えば、デノプテリン、メソトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシナビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シナラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎抗体、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイズ、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；ジゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン（２，２’，２’’−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｅ）；トリコテシン（特に、Ｔ−２トキシン、ヴェルラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロムトール（ｍｉｔｏｂｒｏｍｔｏｌ）；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ニュージャージー州プリンストン所在）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、フランス  アントニー所在）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メソトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノール酸；カペシタビン；および上記のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸または誘導体が挙げられる。同じくこの定義に含まれるのは、腫瘍上でホルモン（ｈｏｎｎｏｎｅ）作用を調節または阻害する働きがある抗ホルモン剤、例えばタモシキフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０���８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；ならびに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸または誘導体である。
【００４４】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、標的癌治療と併用される。標的癌治療は、癌の成長、進行、および拡大に関与する特異的分子（「分子ターゲット」）と干渉することにより癌の成長および拡大を遮断する薬物または他の物質である。標的癌治療は、「分子標的薬」、「分子標的治療」、「プレシジョン・メディシン」、または類似の名称で呼ばれることがある。幾つかの実施形態において、標的治療は、対象にチロシンキナーゼ阻害剤を投与することからなる。用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターおよび／または非レセプターチロシンキナーゼの選択的または非選択的阻害剤として作用する種々の治療薬または薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤および関連化合物は、当該技術分野において周知であり、全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号に記載されている。当業者であれば、チロシンキナーゼ阻害剤に関連する化合物が、チロシンキナーゼ阻害剤の効果を再現するであろうこと、例えば該関連化合物が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果を生じるであろうことを理解するであろう。本発明の実施態様における方法に使用するのに適したチロシンキナーゼ阻害剤および関連化合物の例としては、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ ４３−９００６）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ；ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸）、それらの誘導体、それらの類似物、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に適した更なるチロシンキナーゼ阻害剤および関連化合物は、例えば米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、同第５，６３９，７５７号、同第５，７２８，８６８号、同第５，８０４，３９６号、同第６，１００，２５４号、同第６，１２７，３７４号、同第６，２４５，７５９号、同第６，３０６，８７４号、同第６，３１３，１３８号、同第６，３１６，４４４号、同第６，３２９，３８０号、同第６，３４４，４５９号、同第６，４２０，３８２号、同第６，４７９，５１２号、同第６，４９８，１６５号、同第６，５４４，９８８号、同第６，５６２，８１８号、同第６，５８６，４２３号、同第６，５８６，４２４号、同第６，７４０，６６５号、同第６，７９４，３９３号、同第６，８７５，７６７号、同第６，９２７，２９３号、および同第６，９５８，３４０号に記載されており、これらの全てが、全体として参照により本明���書に組み入れられる。幾つかの実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、小分子キナーゼ阻害剤で、経口投与されており、少なくとも１つの第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１つの第ＩＩ相臨床試験、更により好ましくは少なくとも１つの第ＩＩＩ相臨床試験の対象であり、最も好ましくは血液学的または腫瘍学的症状に関してＦＤＡにより認可されている。そのような阻害剤の例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ダンヅチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モタセニブ、ＯＳＩ−９３０、セディラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−Ｉ（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１、およびＰＤ−０３２５９０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
幾つかの実施態様において、本発明の化合物は、免疫療法剤と併用される。本明細書で用いられる用語「免疫療法剤」は、癌細胞に対する身体の免疫反応を間接的もしくは直接的に増強する、刺激するもしくは増加させる、そして／または他の抗癌療法の副作用を減少させる化合物、組成物または処置を指す。したがって、免疫療法は、癌細胞に対する免疫系の反応を直接的もしくは間接的に刺激もしくは増強する、そして／または他の抗癌剤によって引き起こされ得る副作用を低下させる治療である。免疫療法はまた、当該技術分野において、免疫学的療法、生物学的療法、生物反応修飾物質療法およびバイオセラピーと称される。当該技術分野で公知の一般的な免疫療法剤の例としては、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体および非サイトカインアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは免疫療法処置は、対象者にある量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞）を投与することからなり得る。免疫療法剤は、非特異的であり得る、即ち一般にヒトの身体が癌細胞の成長および／または拡大に対抗するのにより効果的になるように免疫系を高めることができ、またはこれらは特異的であり得る、即ち癌細胞自体に標的化させることができ、免疫療法レジメンは、非特異的免疫療法剤と特異的免疫療法剤の使用を組み合わせることができる。非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激する、または間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法剤は、癌の処置のために主治療として単独で、そして非特異的免疫療法剤が他の治療（例えば、癌ワクチン）の有効性を増強する補助剤として機能する場合には主治療に加えて、使用されてきた。非特異的免疫療法剤はまた、この後者の状況においても、他の治療の副作用、例えば特定の化学療法剤によって誘発される骨髄抑制を低下させるように機能することができる。非特異的免疫療法剤は、重要な免疫系細胞上で作用し、サイトカインおよび免疫グロブリンの産生増加などの二次反応を引き起こすことができる。あるいは該薬剤は、それ自体サイトカインを含み得る。非特異的免疫療法剤は一般に、サイトカインまたは非サイトカインアジュバントとして分類される。多数のサイトカインが、免疫系を高めるように設計された一般的な非特異的免疫療法、または他の治療と共に提供されるアジュバントのいずれかとして、癌の処置における適用例を見出した。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキンおよびコロニー刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって企図されるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、一般的なタイプのＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）およびＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えば、癌細胞の成長を緩徐にすること、より正常な挙動を示す細胞への発達を促進すること、および／または癌細胞の抗原産生を増加させ、これにより免疫系が癌細胞を認識および破壊するのをより容易にすることによって、癌細胞に直接作用することができる。ＩＦＮはまた、例えば血管新生を緩徐にすること、免疫系を高めること、ならびに／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞およびマクロファージを刺激することによって、癌細胞に間接的に作用することができる。組換えＩＦＮ−アルファは、Ｒｏｆｅｒｏｎ（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＩｎｔｒｏｎ  Ａ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）として市販されている。本発明によって企図されるインターロイキンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１およびＩＬ−１２が挙げられる。市販の組換えインターロイキンの例としては、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（ＩＬ−２；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＮｅｕｍｅｇａ（登録商標）（ＩＬ−１２；  Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（ワシントン州シアトル）は現在、組換え形態のＩＬ−２１を試験しており、これもまた本発明の組み合わせにおける使用に企図される。本発明によって企図されるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはフィルグラスチム）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦまたはサルグラモスチム）およびエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）が挙げられる。１種または複数の増殖因子での処置は、従来の化学療法を受けている対象における新規血液細胞の生成の刺激を支援すし得る。したがって、ＣＳＦでの処置は、化学療法と関連する副作用を減少させる上で役に立つことができ、かつより高用量の化学療法剤の使用を可能にする。様々な組換えコロニー刺激因子、例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ；Ａｍｇｅｎ）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム（ｐｅｌｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）；Ａｍｇｅｎ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｂｅｒｌｅｘ）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（エリスロポエチン；Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｅｐｏｇｅｎ（エリスロポエチン；Ａｍｇｅｎ）、Ａｒｎｅｓｐ（エリスロポエチン（ｅｒｙｔｒｏｐｏｉｅｔｉｎ））が市販されている。 本発明の組み合わせ組成物および併用投与法はまた、「全細胞」および「養子」免疫治療法を伴い得る。例えば、そのような方法は、免疫系細胞(例えば、ＣＣ２＋および／もしくはＣＤ８＋  Ｔ細胞などの、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ)(例えば、腫瘍特異的抗原および／もしくは遺伝子増強で増大されたＴ細胞)、抗体発現Ｂ細胞またはその他の抗体−産生もしくは−提示細胞、樹状細胞(例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよび／もしくはＦｌｔ３−ＬなどのＤＣ増大薬と共に培養された樹状細胞、ならびに／または腫瘍関連抗原を取り込んだ樹状細胞)、抗腫瘍ＮＫ細胞、いわゆるハイブリッド細胞、またはその組み合わせの注入または再注入を含み得る。細胞溶解物もまた、そのような方法および組成物において有用になり得る。そのような態様で有用になり得る臨床試験における細胞「ワクチン」としては、Ｃａｎｖａｘｉｎ(商標)、ＡＰＣ−８０１５（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）、ＨＳＰＰＣ−９６（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、およびＭｅｌａｃｉｎｅ（登録商標)細胞溶解物が挙げられる。また、場合によりミョウバンなどのアジュバントと混和された、癌細胞から放出された抗原、およびその混合物(例えばＢｙｓｔｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ���  ７，  １８８２−１８８７，  Ｊｕｌｙ  ２００１参照)が、そのような方法および組み合わせ組成物における成分であり得る。 
【００４６】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、放射線療法と併用される。放射線療法は、放射線、または患者への放射性医薬の関連投与を含み得る。放射線源は、処置される患者の体外または体内のいずれかであり得る（放射線処置は、例えば外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）、または小線源治療（ＢＴ）の形態であり得る)。そのような方法を実施する際に使用され得る放射性元素としては、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、およびインジウム−１１１が挙げられる。
【００４７】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、共刺激分子に特異性のある抗体と併用される。共刺激分子に特異性のある抗体の例としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、または抗Ｂ７Ｈ６抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
幾つかの実施形態において、該第二の薬剤は、ＡＤＣＣを介して該第二の薬剤が結合する抗原を発現する細胞の死を誘導する薬剤である。幾つかの実施形態において、該薬剤は、抗体が結合する細胞に向けたＡＤＣＣの誘導を作用機序が含む抗体（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの）である。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣを誘導することにおいて重要な役割を有し、ＮＫ細胞の反応性増大は、そのような第二の薬剤の使用を通して標的細胞に向けられ得る。幾つかの実施形態において、該第二の薬剤は、細胞表面抗原、例えば膜抗原に特異性のある抗体である。幾つかの実施形態において、該第二の抗体は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＫＤＲ、αＶβ３などの先に記載された腫瘍抗原（例えば、腫瘍細胞によって特異的に発現される分子）、特にリンパ腫抗原（例えば、ＣＤ２０）に特異性がある。したがって本発明はまた、腫瘍抗原（複数可）に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を増強する方法を提供する。本発明の方法において、ＡＤＣＣ機能は、特異的に増大され、その一方で１つまたは複数の腫瘍抗原に対する抗体および本発明の化合物の連続投与によって標的細胞殺傷を増進する。
【００４９】
したがってさらなる目的は、必要とする対象における抗体のＮＫ細胞抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する方法であって、該抗体を該対象へ投与すること、およびＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物を該対象へ投与すること、を含む、方法に関する。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、必要とする対象における癌を処置する方法であって、癌細胞抗原に選択性のある第一の抗体を該対象へ投与すること、およびＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物を該対象へ投与すること、を含む、方法に関する。
【００５１】
複数の抗体が現在、癌の処置のために臨床使用されており、その他は、臨床開発の様々な段階にある。本発明の方法のための該当する抗体は、ＡＤＣＣを通して作用し、典型的には腫瘍細胞に選択性があるが、一部の臨床的に有用な抗体が非腫瘍細胞、例えばＣＤ２０に作用することを、当業者は認識しているであろう。Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための複数の抗原および対応するモノクローナル抗体が存在する。評判の良い標的抗原の１つが、Ｂ細胞悪性腫瘍上で見出されるＣＤ２０である。リツキシマブは、ＣＤ２０抗原に対するキメラ非コンジュゲート化モノクローナル抗体である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の活性化、増殖および分化において重要な機能的役割を有する。ＣＤ５２抗原は、慢性リンパ球性白血病の処置に適用されるモノクローナル抗体アレムツズマブによって標的化される。ＣＤ２２は、複数の抗体によって標的化され、近年になり化学療法耐性ヘアリー細胞白血病における毒性を組み合わせた有効性が実証されている。ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体としては、トシツモマブおよびイブリツモマブも挙げられる。固形腫瘍で用いられてきた、本発明の方法において有用なモノクローナル抗体としては、エドレコロマブおよびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。エドレコロマブは、結腸および直腸癌で認められる１７−１Ａ抗原を標的化し、これらの適応症に対して欧州で使用が認可された。その抗腫瘍効果は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および抗イディオタイプネットワークの誘導を通して媒介される。トラスツズマブは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的化する。この抗原は、乳癌の２５％〜３５％に認められる。トラスツズマブは、種々の方法、つまりＨＥＲ−２受容体発現のダウンレギュレーション、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖阻害、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞に対する免疫動員およびＡＤＣＣの増進、ならびに血管新生因子のダウンレギュレーションにおいて働くと考えられる。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）は、慢性リンパ球性白血病；結腸癌および肺癌の処置に用いられ、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）は急性骨髄性白血病の処置に用途を見出し；イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）は、非ホジキンリンパ腫の処置に用途を見出し；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）は、結腸癌の処置に用途を見出している。セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）もまた、本発明の方法における使用に該当する。該抗体は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、結腸癌ならびに頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）をはじめとする固形腫瘍の処置に用いられてきた。
【００５２】
典型的には本発明の化合物は、医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物の形態で該対象へ投与される。これらの組成物中で用いられ得る医薬的に許容し得る担体としては、イオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝性物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびラノリンが挙げられるが、これらに限定されない。 患者への投与における使用の場合、該組成物は、患者へ投与されるように配合される。本発明の組成物は、経口投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、局所投与、直腸投与、鼻腔投与、口腔投与、経膣投与または埋め込まれたリザーバによる投与であり得る。本明細書で利用されるものとしては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、クモ膜下、肝臓内、病変内および頭蓋内注射または輸液技術が挙げられる。本発明の組成物の滅菌注射可能形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、当該技術分野で公知の技術に従い、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて配合され得る。滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。中でも用いることが可能な許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー液および等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌不揮発油が、溶媒または懸濁媒体として従来から用いられる。この目的では、合成のモノ−またはジ−グリセリドをはじめとする任意の刺激のない不揮発油が使用され得る。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、天然の医薬的に許容し得る油、例えばオリーブ油またはヒマシ油と同様に、注射可能物の調製において、特にこれらのポリオキシエチル化物において有用である。 これらのオイル溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤、例えばエマルジョンおよび懸濁液をはじめとする医薬的に許容し得る投与剤形の配合で一般に用いられるカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などを含有し得る。Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤などの他の一般に用いられる界面活性剤、または医薬的に許容し得る固体、液体もしくは他の投与剤形の製造で一般に用いられる生物学的利用性増進剤もまた、配合の目的で用いられ得る。本発明の組成物は、非限定的にカプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液をはじめとする任意の経口的に許容し得る投与剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に用いられる担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた、典型的には添加される。カプセル形態での経口投与���は、有用な希釈剤としては、例えばラクトースが挙げられる。水性懸濁液が、経口使用で求められる場合、有効成分が、乳化剤および懸濁剤と混和される。所望なら、特定の甘味剤、香味剤または着色剤もまた添加され得る。 あるいは本発明の組成物は、直腸投与のために坐剤の形態で投与され得る。これらは、該薬剤を、室温で固体であるが直腸温で液体になる適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得、それゆえ直腸内で融解して薬物を放出する。そのような材料として、ココアバター、ビーズワックスおよびポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の組成物はまた、特に、目、皮膚または下部腸管の疾患をはじめとする、処置ターゲットが局所適用によって即座に接近可能な領域または臓器を含む場合に、局所投与され得る。適切な局所配合剤は、これらの各領域または臓器用に即座に調製される。局所適用の場合、該組成物は、１種または複数の担体に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切な軟膏に配合され得る。本発明の化合物の局所適用の担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは該組成物は、１種または複数の医薬的に許容し得る担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する、適切なローションまたはクリームに配合され得る。 適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。下部腸管のための局所適用は、直腸用坐剤配合剤（上記参照）または適切な浣腸配合剤中で実行され得る。貼付薬もまた、用いられ得る。本発明の組成物はまた、鼻腔エアロゾルまたは吸入により投与され得る。そのような組成物は、医薬配合剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、生物学的利用性を向上させる吸入促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。例えば本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）のいずれかの単回使用バイアルに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。該生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および注射用滅菌水中で、ＩＶ投与用に配合される。該ｐＨは、６．５に調整される。本発明の医薬組成物中の抗体についての模範的で適切な投与量範囲は、約１ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２であり得る。しかし、これらの計画が模範であり、最適な計画およびレジメンが医薬組成物中の特定の抗体の親和性および耐容性を考慮して適合させることができ、臨床試験で決定されるべきであることは、理解されよう。注射用（例えば、筋肉内、Ｉ．Ｖ．）の本発明の医薬組成物は、滅菌緩衝水（例えば、筋肉内なら１ｍｌ）および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５ｎｇ〜約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの��発明の抗ＣＤ２４５抗体を含有するように調製することができる。
【００５３】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに示される。しかしこれらの実施例および図は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒトＮＫ細胞はミオシン１８Ａの長い（α）アイソフォームおよび短い（β）アイソフォームを発現する  Ａ．ＤＹ１２は、ＹＴ２Ｃ２  ＮＫ細胞の細胞表面にある特有の２２０〜２４０ｋＤａタンパク質を認識する。ビオチン化ＹＴ２Ｃ２白血球細胞株を、ＤＹ１２  ｍＡｂまたは対照ＩｇＧ１（Ｄ６２１２）抗体で免疫沈降させた。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ストレプトアビジンに暴露した後、免疫沈降物が特有の２２０〜２４０ｋＤａ細胞表面タンパク質であることが見出された。  Ｂ．ＹＴ２Ｃ２  ＮＫ細胞の細胞表面にあるＤＹ１２によって認識されたタンパク質の配列は、ミオシン１８Ａの配列に対応する。免疫沈降物のアミノ酸配列は、質量分析（ＭＳ）法によって決定した。下線は、ミオシン１８Ａの配列に共通する配列である。トリプシンペプチドの質量２３９のリストのうち、５９は、ミオシン１８Ａの質量に対応し、対応する理論的質量からの差が３６ｐｐｍ未満である。  Ｃ．ＤＹ１２によって認識されたタンパク質は、抗ミオシン１８Ａ抗体の標的である。ＹＴ２Ｃ２細胞溶解物を、ＤＹ１２  ｍＡｂまたはＩｇＧ１対照アイソタイプを用いて免疫沈降させて、免疫沈降物を、ポリクローナル抗ミオシン１８Ａ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。ＤＹ１２は、ミオシン１８Ａの２３０ｋＤａ（ミオシン１８Ａα、Ｌ−Ｍｙｏ１８Ａ）および１９０ｋＤａ（ミオシン１８Ａβ、Ｓ−Ｍｙｏ１８Ａ）アイソフォームを認識することが示された。  Ｄ．ＤＹ１２は、ヒト末梢血リンパ球の細胞表面のミオシン１８Ａの短いアイソフォームを認識する。健常対象由来の新しい末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を溶解し、ＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体で免疫沈降させて、抗ミオシン１８Ａポリクローナル抗体と、その後、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体を用いて免疫ブロッティングした。全ＰＢＭＣ溶解物を、陽性対照として用いた。健常対象由来のＰＢＭＣ中のＤＹ１２によって免疫沈降されたタンパク質は、ミオシン１８Ａの短いアイソフォーム（Ｓ−Ｍｙｏ１８Ａ）であった。  Ｅ．新しいヒト肺溶解物でのミオシン１８Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームを認識する  ヒト対象の新しく健常な肺組織を溶解し、ＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体で免疫沈降させて、抗ミオシン１８Ａポリクローナル抗体と、その後、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体を用いて免疫ブロッティングした。全ＰＢＭＣ溶解物を、陽性対照として用いた。ＤＹ１２によって免疫沈降されたタンパク質は、ミオシン１８Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム（Ｓ−Ｍｙｏ１８Ａ）であった。
【図２】ミオシン１８Ａの動員はＮＫ細胞傷害性を増強する  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ．Ｐ８１５マスト細胞腫細胞株に対するミオシン１８Ａ誘導性逆細胞傷害性。細胞傷害性アッセイを、標準の５１Ｃｒ放出法に従って実施した。エフェクター細胞は、新たに単離された（Ａ、Ｃ、Ｅ）、またはＩＬ−２で活性化された健常ドナー由来の（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＰＢ−ＮＫであった。標的細胞は、ネズミマスト細胞腫Ｐ８１５細胞であった。Ｐ８１５を、ＤＹ１２または対照ｍＡｂ、および１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）または抗ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）と共にプレインキュベートした。１０３個の標的細胞を用いた様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比でのアッセイを、三重測定で実施した。  Ｇ．ミオシン１８Ａの動員は、ヒトＮＫ細胞のリンフォカイン活性化キラー活性を増強する。細胞傷害性アッセイを、標準の５１Ｃｒ放出法に従って実施した。エフェクター細胞は、新たにＩＬ−２で活性化された健常ドナー由来のＰＢ−ＮＫであった。標的細胞は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染Ｂ細胞株であった。標的細胞を、１０μｇ／ｍｌのＤＹ１２対照Ｆ（ａｂ’）２または対照Ｆ（ａｂ’）２  Ａｂと共にプレインキュベートした。  Ｈ．ミオシン１８Ａの動員は、標的腫瘍細胞の存在下でＮＫ細胞の脱顆粒を増加させる。  エフェクター細胞は、１０μｇ／ｍｌの濃度のＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体と共に１時間インキュベートさせた後、ウサギ抗マウスＩｇＧ  １０μｇ／ｍｌと架橋させた、健常ドナーから新たに単離されたＰＢ−ＮＫであった。標的細胞を、その後、様々なエフェクター：標的比で１００μｌ／ウェルの最終容量で添加した。ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下、３７℃で４時間培養した後に、細胞を洗浄して、ＣＤ１０７ａ発現を生存するＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞でフローサイトメトリーにより測定した。
【図３】ミオシン１８Ａ誘導性ＮＫ細胞傷害性は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）依存性である  ヒトＣＤ１３７Ｌポリクローナル抗体とのＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用を遮断することで、ＲＡＪＩ細胞の存在下でＣＤ２４５誘導性ＮＫ細胞脱顆粒を完全が排除される。エフェクター細胞は、１０μｇ／ｍｌの濃度のＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体と共に１時間インキュベートさせた後、ウサギ抗マウスＩｇＧ  １０μｇ／ｍｌと架橋させた、健常ドナーから新たに単離されたＰＢ−ＮＫであった。標的細胞を、その後、ヒトＣＤ１３７Ｌポリクローナル抗体１０μｇ／ｍｌの存在下または非存在下、様々なエフェクター：標的比で１００μｌ／ウェルの最終容量で添加した。ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下、３７℃で４時間培養した後に、細胞を洗浄して、ＣＤ１０７ａ発現を生存するＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞でフローサイトメトリーにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
実施例
方法
細胞
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離媒体（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ、フランス  ヴェリジー＝ヴィラクブレー所在）での密度勾配遠心分離により、健常ドナーから得られたヘパリン添加静脈血から単離した。末梢血（ＰＢ−ＮＫ）細胞由来の新しいＮＫ細胞を、ＮＫ細胞単離キットを用い、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ  ベルギッシュ・グラッドバッハ所在）の推奨に従って、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により単離した。ＰＢ−ＮＫ細胞の純度は、フローサイトメトリーによる評定で９０％を超えることが示された。ＹＴ２Ｃ２  ＮＫ細胞株（米国マナサス所在のＡＴＣＣから購入）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染Ｂ細胞株（現場で生成（３４））およびＲＡＪＩ細胞（バーキットリンパ腫Ｂ細胞株、ＡＴＣＣ）を、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、および１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ヴィルボン＝シュル＝イヴェット所在）を補充されたロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地で培養した。
【００５６】
ＰＢＭＣによるＣＤ２４５発現のフローサイトメトリー分析
この試験におけるフローサイトメトリーアッセイで用いられたヒト抗原へのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、以下の通りであった：抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ２７９（プログラム細胞死（ＰＤ）−１）、抗ＣＤ１９７（Ｃ−Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７））、抗γδＴ−細胞受容体ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｉｙ）、および抗ＣＤ２４５  ｍＡｂ（ＤＹ１２、現場で生成されたマウスＩｇＧ１ｋ）。無関係なアイソタイプ適合Ａｂを、陰性対照として用いた。フルオレセインイセチオシアナート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−またはＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）−コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国ブレア所在）を、二次試薬として用いた。細胞を、間接的イムノフルオレセインにより表現型分類した。手短に述べると、細胞を特異的ｍＡｂと共に４℃で３０分間インキュベートして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カールスバッド所在）で２回洗浄して、適当なＦＩＴＣ−またはＲＰＥ−標識二次Ａｂと共にさらにインキュベートした。細胞を洗浄して、ＦＣ５００分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）でのフローサイトメトリーによって分析した。幾つかの実験において、全ＰＢＭＣを組換えヒトＩＬ−２  １００ＩＵ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス  ヌイイ・シュル・セーヌ所在）で７２時間刺激した後、フローサイトメトリー分析のために細胞を標識した。
【００５７】
免疫組織化学的測定
健常対象の、ホルマリン固定されてパラフィン包埋された肺生検および末梢血由来ＰＢ−ＮＫを、標準のペルオキシダーゼ法を用いてＣＤ２４５発現について分析した。ＰＢ−ＮＫを、組換えヒトＩＬ−１５  １０ｎｇ／ｍｌと共に、またはそれを伴わずに一晩プレインキュベートした。マウス抗ヒトＣＤ２４５抗体（現場で生成されたＤＹ１２）、またはモノクローナルマウス抗ヒトグランザイムＢ（クローンＧｒＢ−７、ＤＡＫＯ）を、一次抗体として用いた後、アビジン・ストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ（ＬＳＡＢキット、Ｄａｋｏ、フランス  レ・ジュリス所在）で明らかとされたペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス抗体を用いた。その後、ペルオキシダーゼ反応により、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質を用いて５〜８分間発色させた。
【００５８】
細胞表面ビオチン化
細胞を、スルホスクシンイミドビオチン（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ、米国ロックフォード所在）手順によりビオチン化した。手短に述べると、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎと共にＰＢＳで１０×１０６／ｍｌに懸濁させた。４℃で３０分間のインキュベートした後、細胞を完全培地で３回洗浄した。
【００５９】
免疫沈降およびウエスタンブロット
ＹＴ２Ｃ２ビオチン化細胞を溶解して、ＤＹ１２またはＤ６２１２対照ＩｇＧ１  Ａｂ、その後、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズと共にインキュベートした。沈降したタンパク質を洗浄し、ＳＤＳ−８％ＰＡＧＥにより分離して、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国ベッドフォード所在）にブロットした。膜をＰＢＳ中の５％粉乳＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と共に１時間ブロックして、タンパク質バンドを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ストレプトアビジンおよび化学発光（ＥＣＬ）試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ）で発色させた。
【００６０】
免疫ブロッティング
ＤＹ１２またはＤ６２１２対照Ａｂを用いた免疫沈降を、先に記載された通り、ＹＴ２Ｃ２細胞溶解物、新たに単離されたヒトＮＫ細胞、または新しいヒト肺で実施した。免疫沈降物を、８％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分解し、ニトロセルロース膜にブロットして、ウサギポリクローナル抗ミオシン１８Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、英国マンチェスター所在）、抗ＳＨＰ２または抗ＰＡＫ２ポリクローナルＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ビバリー所在）を用いた免疫ブロット分析に供した。ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ウエストグローブ所在）を二次Ａｂとして用い、免疫反応性タンパク質を、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて視覚化した。全ＹＴ２Ｃ２細胞溶解物を、陽性対照として用いた。
【００６１】
質量分析（ＭＳ）
ＤＹ１２ｍＡｂでの免疫沈降の後、ニトロセルロースからバンドを外科用メスで切り出した。その後、ブロットの切片を、過去に記載された化学的処理を行わずにＭＳ分析用に加工した（３５、３６）。バンドをトリプシンで消化して、ＭＳ分析を、ＭＡＬＩＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＡＢＩ４８００（（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国フォスターシティー所在）を用いて実施した。ＭＳ−ＭＡＬＩＤＩにより得られた質量分析物を、Ｅｘｐａｓｙデータベースおよびソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ］およびローカルＶｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＶＢＡ）ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、米国レドモンド所在）を用いて解析した。
【００６２】
細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイを、標準の５１Ｃｒ放出法に従って実施した。エフェクター細胞は、健常ドナー由来の新しいＰＢ−ＮＫであった。標的細胞は、ネズミマスト細胞腫Ｐ８１５細胞またはＥＢＶ感染Ｂ細胞株であった。標的細胞を、１００μＣｉ  Ｎａ５１ＣｒＯ４により３７℃で９０分間標識し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。その後、標的細胞を９６ウェルＶ底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ、フランス  クルタブフ所在）に播種した。
【００６３】
Ｐ８１５細胞株に対するリダイレクトキリングアッセイにおいて、ＰＢ−ＮＫ細胞を、組換えヒトＩＬ−２（１００国際単位（ＩＵ）／ｍｌ）の存在下で７２時間予備活性化した、またはしなかった。Ｐ８１５をその後、ＤＹ１２または対照ｍＡｂ、および抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）または抗ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）１０μｇ／ｍｌと共にプレインキュベートした。１０３個標的細胞を用いた様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比でのアッセイを、三重測定で実施した。
【００６４】
ＥＢＶ感染Ｂ細胞株に対するリンフォカイン活性化キラーアッセイにおいて、ＰＢ−ＮＫを、組換えヒトＩＬ−１５  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で２４時間予備活性化した、またはしなかった。エフェクター細胞をその後、ＤＹ１２  ｍＡｂまたは対照ＩｇＧ１抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、１５０μｌ／ウェルの最終容量で添加した。
【００６５】
３７℃で４時間培養した後、プレートを遠沈して、細胞上清１００μｌを各ウェルから採取した。５１Ｃｒ放出を、γカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国メリデン所在）を用いて定量した。特異的溶解の割合％を、以下の通り計算した：％特異的溶解＝［（試料ｃｐｍ−自然な溶解対照ｃｐｍ）／最大溶解対照ｃｐｍ−自然な溶解対照ｃｐｍ）］×１００。この溶解は、最大細胞溶解の１０％を超えていれば、有意と見なした。
【００６６】
ＮＫ細胞活性化受容体発現のフローサイトメトリー分析
新たに精製されたＮＫ細胞株上でのＮＫ細胞活性化受容体の発現を、Ｍｙｏ１８Ａを１０μｇ／ｍｌ濃度のＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体で１時間インビトロ刺激し、洗浄して１０μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で架橋した後に評定した。その後、細胞を洗浄して、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｉｎ  ４５０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国フランクリンレークス所在）およびヒト細胞表面抗原に対する以下の抗体で標識した：ＡＰＣコンジュゲート化抗ＣＤ１３７、ＰＥコンジュゲート化抗ＮＫＧ２Ｄ、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＤＮＡＸ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  （ＤＮＡＭ−１、ＣＤ２２６）、ＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ１６０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＰＥコンジュゲート化抗ＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）、抗ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）、および抗ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞を洗浄して、Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【００６７】
標的Ｂ細胞株によるＣＤ１３７Ｌ発現
ＲＡＪＩおよびＥＢＶ感染Ｂ細胞株（３４）を、先に記載された通り培養し、洗浄して、フローサイトメトリー分析のためにＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｉｎ  ４５０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ１３７Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。
【００６８】
ＲＡＪＩ、ＥＢＶへの細胞傷害性およびＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用の遮断
新たに単離されたＰＢ−ＮＫ細胞を、組換えヒトＩＬ−１５  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で１２時間予備活性化し、またはせずに、洗浄して、１０μｇ／ｍｌ濃度のＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体と共に１時間インキュベートし、再度洗浄して１０μｇ／ｍｌウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で架橋させた。標的細胞をその後、様々なエフェクター／標的比で最終容量１００μｌ／ウェルになるように添加した。ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ１０７ａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の存在下、３７℃で４時間培養した後、細胞を洗浄して、フローサイトメトリー分析に向けて調製した。幾つかの実施形態において、ヒト４−１ＢＢ  Ｌｉｇａｎｄ／ＴＮＦＳＦ９  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｂ（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネアポリス所在）を、最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように培養物に添加して、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用を遮断した。
【００６９】
分析
フローサイトメトリー分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて実施した。全ての値が、平均で表されている。値をそれらの平均および標準偏差でプロットして、Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｇｒａｐｆ  Ｐａｄ）で両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定による群間比較を行い、２つの試料群における連続変数を比較する。ｐ≦０．０５を、統計学的に有意であると見なした。
【００７０】
結果
ヒトＮＫ細胞はミオシン１８Ａの長い（α）アイソフォームおよび短い（β）アイソフォームを発現する
本発明者らは、過去にＣＤ２４５を、モノクローナル抗体ＤＹ１２によって認識されたヒト造血細胞により発現された表面抗原として記載した（３３）。ＣＤ２４５の分子特性を決定するために、本発明者らは、ＤＹ１２  ｍＡｂまたは対照ＩｇＧ１抗体と共にビオチン化ＹＴ２Ｃ２白血病細胞株で免疫沈降させた。図１Ａに示される通り、ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンに暴露した後、免疫沈降物が特有の２２０〜２４０ｋＤａ細胞表面タンパク質であることが見出された。この細胞表面タンパク質をさらに特徴づけるために、過去に記載されたように、ニトロセルロースからバンドを外科用メスで切り出し、トリプシンで消化し、その後、ＭＳ分析用に加工した（３６）。トリプシンペプチド質量２３９のリストのうち、５９は、ミオシン１８Ａの質量に対応し、対応する理論的質量からの差は３６ｐｐｍ未満である（図１Ｂ）。ＹＴ２Ｃ２細胞株の細胞表面で発現されたＣＤ２４５が、非従来型ミオシン１８Ａであることを確認するために、ＹＴ２Ｃ２細胞溶解物を、ＤＹ１２  ｍＡｂまたはＩｇＧ１対照アイソタイプを用いて免疫沈降させて、免疫沈降物を、ポリクローナル抗ミオシン１８Ａ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。ＤＹ１２は、ミオシン１８Ａの２３０ｋＤａ（ミオシン１８Ａα）および１９０ｋＤａ（ミオシン１８Ａβ）アイソフォームを認識することが示された（図１Ｃ）。したがってヒトＹＴ２Ｃ２ＮＫ細胞株の細胞表面で発現されたＣＤ２４５は、正真正銘のミオシン１８Ａである。ヒト造血細胞においてインビボで発現されたＣＤ２４５が、ミオシン１８Ａか否かをさらに検査するために、健常対象由来の新しいＰＢＭＣを溶解し、ＤＹ１２または対照ＩｇＧ１抗体で免疫沈降させて、抗ミオシン１８Ａポリクローナル抗体と、その後、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体を用いて免疫ブロッティングした。全ＰＢＭＣ溶解物を、陽性対照として用いた。健常対象由来のＰＢＭＣ中のＤＹ１２によって免疫沈降されたタンパク質は、ミオシン１８Ａの短いアイソフォームであった（図１Ｄ）。結論として、これらの結果から、ヒト造血細胞で発現されたＣＤ２４５が非従来型ミオシン１８Ａであることが確認される。ＮＫ細胞は、ｐ１９０およびｐ２３０アイソフォームを発現した。ｐ２３０は、ＹＴ２Ｃ２細胞株のＮＫ細胞表面で発現された主なアイソフォームであることが示された。これとは対照的に、Ｐ１９０はＰ２３０と異なり、全ヒトＰＢＭＣ溶解物中で見出された。これらのデータは、ミオシン１８Ａα（ｐ２３０）およびβ（ｐ１９０）が異なる細胞内局在化を有し、前者が小胞体およびゴルジ構造と共局在化することを示したマウスでの過去の試験と一致している（３７）。本発明者らは、新しいヒト肺溶解物でこれらの結果を確認し、ＤＹ１２がヒト肺内ミオシン１８Ａの２つのアイソフォームを認識することを示した（図１Ｅ）。
【００７１】
末梢血リンパ球の細胞表面でのミオシン１８Ａ／ＣＤ２４５発現が構成的であり、活性化により増加する
インビボでの末梢血リンパ球の様々なサブセットでのＭｙｏ１８Ａ／ＣＤ２４５の発現を検査するために、健常対象由来の生存するＰＢＭＣを単離して、フルオロクロムコンジュゲート化ＤＹ１２ｍＡｂおよび抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ５６、γδＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）ｍＡｂを用いたフローサイトメトリー分析に供した。全ての末梢血リンパ球サブセットは、Ｍｙｏ１８Ａ／ＣＤ２４５を様々な度合いで発現した。ほとんどのＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６＋（即ち、ＮＫ細胞と、それに加えてわずかな数のγδＴおよびＮＫＴ末梢血リンパ球サブセット）、およびＣＤ２０＋Ｂ細胞の半数が、Ｍｙｏ１８Ａ／ＣＤ２４５を発現した。ＣＤ２４５発現は、リンパ節ホーミング（３９）に関与するＴ、Ｂ細胞およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞（３８）中で発現されるケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現と、より小さい度合いではあるが関連した。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞は、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞よりも高レベルでＣＤ２４５を発現した。全ＰＢＭＣのＩＬ−２活性化の後、ほぼ全てのリンパ球が、ＣＤ２４５を発現した。ＣＤ２４５の平均蛍光強度は、ＩＬ−２の後に３〜８倍増加した。これとは対照的に、ミオシン１８Ａを検出するために過去に示された（４０）サーファクタントプロテインＡ受容体（ＳＰ−Ｒ）−２１０に対するポリクローナル抗体を用いて、Ｓａｍｔｅｎらは、ミオシン１８Ａが末梢血ＣＤ３＋リンパ球の非常に小さな画分によって発現されることを見出した。ミオシン１８Ａを発現するＣＤ３＋細胞の割合％は、４８時間の結核菌刺激ＰＢＭＣにおいて５〜１０倍上昇した（４１）。
【００７２】
末梢血ＮＫ細胞上でのミオシン１８Ａの動員はマスト細胞腫株に対するＮＫ細胞逆細胞傷害性を増加させる
末梢血由来のヒトＮＫ細胞によるＣＤ２４５の発現を確認するために、健常ドナーから新たに単離されたＰＢ−ＮＫを、ＤＹ１２ｍＡｂを用いた免疫組織化学的検査によりＣＤ２４５発現について評定した。抗グランザイムＢ抗体を、陽性対照として用いた。ＰＢ−ＮＫは、定常状態の細胞膜上および細胞質内でミオシン１８Ａを発現した。
【００７３】
Ｍｙｏ１８ＡのリガンドであるＳＰ−Ａは、インビボでの抗腫瘍免疫性をＮＫ細胞依存性に刺激することが過去に示されている（４２）。本発明者らは、Ｍｙｏ１８Ａの刺激が腫瘍細胞に対するＮＫ細胞傷害性を調整し得るか否かを検査した。図２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆに示される通り、ＤＹ１２単独で刺激されたＮＫ細胞は、わずかの細胞傷害活性を示した。これとは対照的に、ＤＹ１２刺激は、Ｐ８１５ネズミマスト細胞腫細胞株に対するＮＫｐ４６−およびＮＫｐ３０誘導性細胞傷害性を強く増強した。平均では、ＤＹ１２での刺激は、新しく単離されたＮＫ細胞においてそれぞれＮＫｐ４６−およびＮＫｐ３０誘導性細胞傷害性を６９％および２８３％増強し、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞において７５％および３９％増強した。これらのデータからＣＤ２４５は、天然の細胞傷害性受容体により惹起されたＮＫ細胞抗腫瘍活性の強い活性物質として同定される。
【００７４】
Ｍｙｏ１８Ａ動員はエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染Ｂ細胞に対するＩＬ−２活性化ＮＫ細胞傷害性を増強する
（ｉ）ＮＫ細胞は、抗ウイルス性免疫防御において重大で第一線的な役割を担い（５）、（ｉｉ）ヒトＮＫ細胞は、高レベルのミオシン１８Ａを発現し、（ｉｉｉ）ミオシン１８Ａ細胞表面発現は、ＮＫ細胞内のＩＬ−２により誘導され、（ｉｖ）ミオシン１８Ａは、ヒト肺におけるウイルスクリアランスに関与する（４３）ＳＰ−Ａの受容体である（４０）ため、本発明者らは、ＮＫ細胞表面のＭｙｏ１８Ａのエンゲージメントがウイルス感染細胞に対するＩＬ−２活性化キラー活性を調節し得るか否かを探求した。健常対象由来のＩＬ−２活性化ＰＢ−ＮＫの表面でのＭｙｏ１８Ａのエンゲージメントは、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株に対する細胞傷害活性を平均で１１０％（８３〜１５８％）上昇させた（図２Ｇ）。Ｍｙｏ１８Ａの動員は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞とＮＫ細胞とのコンジュゲートの形成を有意に増加しなかったが（データを示さない）、ＲＡＪＩ細胞の存在下でのＰＢ−ＮＫ細胞脱顆粒を５０／１比で２５％増加させた（図２Ｈ）。これらのデータから、Ｍｙｏ１８ＡがヒトＮＫ細胞のリンフォカイン活性化キラー細胞活性および抗ウイルス機能において役割を担うことが示唆される。
【００７５】
ミオシン１８Ａの動員により誘導されたＮＫ細胞傷害性は４−１ＢＢ依存性である
ＣＤ２４５の動員が腫瘍細胞株に対するＮＫ細胞傷害性を増強するメカニズムをさらに理解するために、本発明者らは、ＤＹ１２ｍＡｂまたは対照アイソタイプによるＣＤ２４５のエンゲージメント後の活性化ＮＫ細胞受容体の発現を研究した。ＣＤ２４５動員は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄの発現において任意の有意な変化を誘導しなかった。そして、ＤＮＡＭ１またはＣＤ１６０の発現に及ぼす有意な影響を有さなかった（データを示さない）。これとは対照的に、ＣＤ２４５刺激は、ＣＤ１３７（４．１ＢＢ）の発現を平均で９４％（５６〜１５６％）増加させた。先に示された通り、ＣＤ２４５刺激は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株（図２Ｇ）およびＲＡＪＩ  Ｂ細胞（図２Ｈ）に対するＮＫ細胞傷害性を増強した。Ｂ細胞リンパ腫細胞は、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）を発現することが過去に示されている（４４）。本発明者らは、標的細胞、ＥＢＶ感染Ｂ細胞およびＲＡＪＩ細胞がＣＤ１３７Ｌを発現することを確認した。ヒト４−１ＢＢリガンドポリクローナルＡｂでのＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ相互作用の遮断は、ＲＡＪＩ細胞の存在下でＣＤ２４５誘導性ＮＫ細胞脱顆粒を完全に排除した（図３）。これとは対照的に、ＮＫ細胞脱顆粒の有意な増加は、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢ）を発現しないセザリー細胞の存在下ではＤＹ１２によって誘導されなかった（データを示さない）。総括すると、これらのデータから、ミオシン１８Ａの動員により誘導されたＮＫ細胞傷害性が４−１ＢＢ依存性であることが示唆される。
【００７６】
ミオシン１８ＡはＮＫ細胞活性化および脱顆粒の２つの重要なシグナンル伝達物質：ＰＡＫ−２およびＳＨＰ−２と相互作用する
過去に示された通り、Ｍｙｏ１８Ａの動員は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞株に対するＮＫ細胞傷害性を増強した。ＮＫ細胞傷害性は、最初にＮＫ免疫シナプスを作製し（１３）、その後、細胞溶解性顆粒の極性化およびエキソサイトーシスを可能にするための（４５、４６）細胞骨格再構成に依存する。Ｍｙｏ１８Ａは、細胞骨格構成において役割を担い、上皮細胞株においてＰＡＫ−２と相互作用することが示された（４７）。ＣＤ２４５刺激がＮＫ細胞脱顆粒および標的細胞の溶解を増加させるメカニズムをさらに解明するために、本発明者らは、ＹＴ２Ｃ２細胞株をＤＹ１２または対照ＩｇＧ１アイソタイプで免疫沈降させて、免疫沈降物を、抗ＰＫＡ２抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。全ＹＴ２Ｃ２を、陽性対照として用いた。ＰＡＫ２は、ＹＴ２Ｃ２細胞内でＭｙｏ１８Ａにより免疫沈降した。これらのデータから、Ｍｙｏ１８ＡがＮＫ細胞内でＰＡＫ２と相互作用し、ＰＡＫ２キナーゼをＭｙｏ１８Ａ誘導性ＮＫ細胞傷害性の潜在的シグナル伝達物質として同定することが、初めて示される。
【００７７】
過去に実証された通り（３３）、ＣＤ２４５は、ＮＫ  ＹＴ２Ｃ２細胞株内で自然なホスファターゼ活性を呈することが示された。中でも、ＮＫ受容体からのシグナル伝達に関与する主なホスファターゼは、それらのＳＨドメインを通して、他のタンパク質上のリン酸化チロシン残基と相互作用するＳｒｃ相同性ドメイン含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）である（３２、４８〜５０）。特にＳＨＰ−２は、ＮＫ細胞の機能を調節する（５０）。したがって本発明者らは、Ｍｙｏ１８ＡがＳＨＰ−２を動員し得るか否かを検査した。ＤＹ１２抗体でのＹＴ２Ｃ２細胞溶解物の免疫沈降、そしてさらに抗ＳＨＰ−２Ａｂを用いた免疫ブロッティングが、Ｍｙｏ１８ＡとホスファターゼＳＨＰ−２との関連性を明らかにした。したがってＳＨＰ−２は、Ｍｙｏ１８Ａ活性化受容体からのシグナル伝達に関与する可能性がある。
【００７８】
考察
本発明の研究において、本発明者らは、末梢血リンパ球上で発現されたヒト細胞表面抗原ＣＤ２４５を、細胞骨格構成およびゴルジ体出芽に関与する高度に保存されたモーター酵素：非従来型ミオシン１８Ａ（Ｍｙｏ１８Ａ）として同定した（５１〜５４）。本発明者らは、Ｍｙｏ１８Ａ／ＣＤ２４５を、細胞表面発現がＩＬ−２によって誘導される、決定的なヒトＮＫ細胞活性化受容体として同定した。Ｍｙｏ１８Ａ刺激は、ウイルス感染Ｂ細胞および腫瘍Ｂ細胞に向けられるＮＫ細胞脱顆粒および細胞傷害性を増強することができた。本発明者らは、Ｍｙｏ１８Ａ刺激がＮＫ細胞表面でＣＤ１３７発現を誘導し得ること、およびＭｙｏ１８Ａ誘導性ＮＫ細胞傷害性がＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用に依存することを見出した。最後にＭｙｏ１８Ａは、ＮＫ細胞受容体のシグナル伝達において重要な役割を有するホスファターゼ：ＳＦＰ−２（５０）、および細胞骨格構成を制御するセリン／トレオニンキナーゼ：ＰＡＫ−２と相互作用することができた。新たに記載されたＮＫ細胞活性化受容体に関するこれらの全体的に新規な分子および機能データは、広範囲の潜在的適用例を有する。
【００７９】
非従来型ミオシン１８Ａ（Ｍｙｏ１８Ａ）は、モーター酵素のミオシンスーパーファミリーのメンバーである。ミオシンは一般に、保存的触媒ヘッドを含有するが、該触媒ヘッドはＡＴＰ加水分解を触媒し、Ｆ−アクチンに結合し、それにより運動性を促進する。最初のミオシンＭ２は、筋肉抽出物中で発見され、従来型ミオシンと称されるが、クラス１８などの他のクラスでは、非従来型ミオシンと呼ばれる（５５）。ミオシン２Ａは、ヒトＮＫ細胞内で細胞溶解性顆粒エキソサイトーシスに必要とされる（５６）。クラス１８ミオシンは、上皮細胞遊走（４７）、間質細胞分化（５７）および腫瘍抑制（５８〜６０）をはじめとする、哺乳動物の基本的組織内プロセスに関与した。ヒトおよびマウスにおいて、ミオシン１８Ａは、α（２３０ｋＤａ）およびβ（１９０ｋＤａ）と称される２つのスプライスバリアントとして、造血細胞内で発現される。ミオシン１８Ａαは、一番端のＮ末端の高リシンおよびグルタミン酸（高ＫＥ）配列と、その後のＰＤＺドメインを含有する（３７、５７）。ミオシン１８Ａβは、高ＫＥ配列およびＰＤＺドメインを欠如し、代わりにモーターの上流に短いリーディング配列を有する（３７）。両方のアイソフォームは、予測された正準のＩＱカルモジュリン結合モチーフと、その後の、ミオシン−２のテールと類似のコイルドコイルテールを有する。Ｍｙｏ１８Ａの第三のアイソフォームであるｐ１１０ミオシンが、マクロファージ内で同定されており、それは、マクロファージ・コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）処置によるマクロファージ分化の誘導後にチロシン残基のリン酸化を介してＭｙｏ１８Ａαまたはβの翻訳後プロセシングを通して生じ得る（６１）。細胞レベルでは、ミオシン１８Ａが、細胞骨格構成（５１）、ゴルジ体出芽（５２、５３）、ならびに上皮細胞内のＦ−アクチンおよびゴルジホスホプロテイン３（ＧＯＬＰＨ３）との会合によるＤＮＡ損傷誘導性ゴルジ分散（ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｏｌｇｉ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）（５４）に参画するが、ＮＫ細胞におけるその特異的役割は、まだ示されていない。
【００８０】
ミオシン１８Ａは、ヒト肺（６２）、血液（６３）、腸管（６４）および皮膚（６５）の中に存在し、病原の排出に参画する（４３）コレクチン：サーファクタントプロテインＡ（ＳＰ−Ａ）（４０）のための受容体として報告された。ＳＰ−Ａは、異種移植片マウスモデルにおいて抗腫瘍免疫を強く刺激することも示されている（４２）。ＳＰ−Ａが形質導入された腫瘍細胞は、ベクター単独で形質導入されたものよりも緩やかに成長した。ＳＰ−Ａのこの抗腫瘍効果は、インビボでは全体としてＮＫ細胞に依存するが（４２）、その厳密なメカニズムは、依然として未知であった。本発明者らのデータは、インビボでのＳＰ−Ａのこの主要な抗腫瘍効果がＮＫ細胞上でのＭｙｏ１８Ａとの相互作用によって媒介される、という仮説を裏づけている。
【００８１】
ＮＫ細胞の抗腫瘍機能を調整するモノクローナル抗体の使用は、急速に成長する研究分野である。一方では、癌細胞、およびＮＫ細胞上に存在するＦｃγＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６活性化受容体の両方を標的とすることにより抗体依存性細胞傷害性を誘導することが可能なモノクローナル抗体は、リンパ腫（６６〜６９）およびヒト癌（７０、７１）のマネージメントを改革した。他方では、全ての悪性腫瘍が、同定された新薬の開発につながるターゲットを有するわけではなく、同定されたターゲットを有する一部の癌は、治療抗体を免れる。この設定では、モノクローナル抗体の有効性を増大することを目指した戦略が有望である。ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１３７（４−１ＢＢ）受容体の刺激が、ヒト癌のインビトロおよびインビボモデルの両方でセツキシマブ（２６）、トラスツズマブ（２７）およびリツキシマブ（２８）の有効性を増大し得ることが示されている。本発明の研究で示されたＤＹ１２などのＮＫ細胞表面でのＣＤ１３７の発現を調整するモノクローナル抗体の使用は、この設定において興味を引く可能性がある。結論として、ＮＫ細胞活性化受容体Ｍｙｏ１８Ａは、ヒト癌および造血系悪性腫瘍の免疫療法の分野で非常に有望なターゲットになると思われる。
【００８２】
参考資料
本出願全体で、様々な参考資料が、本発明が属する技術分野の最先端を記載している。これらの参考資料の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
1.        Rosenberg EB, Herberman RB, Levine PH, Halterman RH, McCoy JL, Wunderlich JR. Lymphocyte cytotoxicity reactions to leukemia-associated antigens in identical twins. Int J Cancer J Int Cancer. 15 mai 1972;9(3):648‐58. 
2.        Kiessling R, Klein E, Wigzell H. ＜Natural＞killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. fevr 1975;5(2):112‐7. 
3.        Kiessling R, Klein E, Pross H, Wigzell H. ＜Natural＞ killer cells in the mouse. II. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Characteristics of the killer cell. Eur J Immunol. fevr 1975;5(2):117‐21. 
4.        Takasugi M, Mickey MR, Terasaki PI. Reactivity of lymphocytes from normal persons on cultured tumor cells. Cancer Res. nov 1973;33(11):2898‐902. 
5.        Cerwenka A, Lanier LL. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. oct 2001;1(1):41‐9. 
6.        Caligiuri MA. Human natural killer cells. Blood. 1 aout 2008;112(3):461‐9. 
7.        Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat Rev Immunol. sept 2002;2(9):656‐63. 
8.        Hercend T, Griffin JD, Bensussan A, Schmidt RE, Edson MA, Brennan A, et al. Generation of monoclonal antibodies to a human natural killer clone. Characterization of two natural killer-associated antigens, NKH1A and NKH2, expressed on subsets of large granular lymphocytes. J Clin Invest. mars 1985;75(3):932‐43. 
9.        Lanier LL. Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol. mai 2008;9(5):495‐502. 
10.       Melder RJ, Koenig GC, Witwer BP, Safabakhsh N, Munn LL, Jain RK. During angiogenesis, vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor regulate natural killer cell adhesion to tumor endothelium. Nat Med. sept 1996;2(9):992‐7. 
11.       Riteau B, Barber DF, Long EO. Vav1 phosphorylation is induced by beta2 integrin engagement on natural killer cells upstream of actin cytoskeleton and lipid raft reorganization. J Exp Med. 4 aout 2003;198(3):469‐74. 
12.       Watzl C, Long EO. Natural killer cell inhibitory receptors block actin cytoskeleton-dependent recruitment of 2B4 (CD244) to lipid rafts. J Exp Med. 6 janv 2003;197(1):77‐85. 
13.       Davis DM, Chiu I, Fassett M, Cohen GB, Mandelboim O, Strominger JL. The human natural killer cell immune synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 21 dec 1999;96(26):15062‐7. 
14.       Futterer K, Wong J, Grucza RA, Chan AC, Waksman G. Structural basis for Syk tyrosine kinase ubiquity in signal transduction pathways revealed by the crystal structure of its regulatory SH2 domains bound to a dually phosphorylated ITAM peptide. J Mol Biol. 21 aout 1998;281(3):523‐37. 
15.       Mandelboim O, Lieberman N, Lev M, Paul L, Arnon TI, Bushkin Y, et al. Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 22 fevr 2001;409(6823):1055‐60. 
16.       Vitale M, Bottino C, Sivori S, Sanseverino L, Castriconi R, Marcenaro E, et al. NKp44, a novel triggering surface molecule specifically expressed by activated natural killer cells, is involved in non-major histocompatibility complex-restricted tumor cell lysis. J Exp Med. 15 juin 1998;187(12):2065‐72. 
17.       Pende D, Parolini S, Pessino A, Sivori S, Augugliaro R, Morelli L, et al. Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp Med. 15 nov 1999;190(10):1505‐16. 
18.       Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, et al. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science. 30 juill 1999;285(5428):727‐9. 
19.       Moretta A, Tambussi G, Bottino C, Tripodi G, Merli A, Ciccone E, et al. A novel surface antigen expressed by a subset of human CD3- CD16+ natural killer cells. Role in cell activation and regulation of cytolytic function. J Exp Med. 1 mars 1990;171(3):695‐714. 
20.       Moretta A, Bottino C, Pende D, Tripodi G, Tambussi G, Viale O, et al. Identification of four subsets of human CD3-CD16+ natural killer (NK) cells by the expression of clonally distributed functional surface molecules: correlation between subset assignment of NK clones and ability to mediate specific alloantigen recognition. J Exp Med. 1 dec 1990;172(6):1589‐98. 
21.       Brown MH, Boles K, van der Merwe PA, Kumar V, Mathew PA, Barclay AN. 2B4, the natural killer and T cell immunoglobulin superfamily surface protein, is a ligand for CD48. J Exp Med. 7 dec 1998;188(11):2083‐90. 
22.       Le Bouteiller P, Barakonyi A, Giustiniani J, Lenfant F, Marie-Cardine A, Aguerre-Girr M, et al. Engagement of CD160 receptor by HLA-C is a triggering mechanism used by circulating natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 24 dec 2002;99(26):16963‐8. 
23.       Bensussan A, Gluckman E, el Marsafy S, Schiavon V, Mansur IG, Dausset J, et al. BY55 monoclonal antibody delineates within human cord blood and bone marrow lymphocytes distinct cell subsets mediating cytotoxic activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 13 sept 1994;91(19):9136‐40. 
24.       Melero I, Johnston JV, Shufford WW, Mittler RS, Chen L. NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. Cell Immunol. 15 dec 1998;190(2):167‐72. 
25.       Lin W, Voskens CJ, Zhang X, Schindler DG, Wood A, Burch E, et al. Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into ＜ agonistic ＞ effects of anti-CD137 monoclonal antibodies. Blood. 1 aout 2008;112(3):699‐707. 
26.       Kohrt HE, Colevas AD, Houot R, Weiskopf K, Goldstein MJ, Lund P, et al. Targeting CD137 enhances the efficacy of cetuximab. J Clin Invest. 2 juin 2014;124(6):2668‐82. 
27.       Kohrt HE, Houot R, Weiskopf K, Goldstein MJ, Scheeren F, Czerwinski D, et al. Stimulation of natural killer cells with a CD137-specific antibody enhances trastuzumab efficacy in xenotransplant models of breast cancer. J Clin Invest. 1 mars 2012;122(3):1066‐75. 
28.       Kohrt HE, Houot R, Goldstein MJ, Weiskopf K, Alizadeh AA, Brody J, et al. CD137 stimulation enhances the antilymphoma activity of anti-CD20 antibodies. Blood. 24 fevr 2011;117(8):2423‐32. 
29.       Benson DM, Caligiuri MA. Killer immunoglobulin-like receptors and tumor immunity. Cancer Immunol Res. fevr 2014;2(2):99‐104. 
30.       Braud VM, Allan DS, O’Callaghan CA, Soderstrom K, D’Andrea A, Ogg GS, et al. HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A, B and C. Nature. 19 fevr 1998;391(6669):795‐9. 
31.       Colonna M, Samaridis J. Cloning of immunoglobulin-superfamily members associated with HLA-C and HLA-B recognition by human natural killer cells. Science. 21 avr 1995;268(5209):405‐8. 
32.       Burshtyn DN, Scharenberg AM, Wagtmann N, Rajagopalan S, Berrada K, Yi T, et al. Recruitment of tyrosine phosphatase HCP by the killer cell inhibitor receptor. Immunity. janv 1996;4(1):77‐85. 
33.       Mason T, Andre P, Bensussan A. Leukocyte Typing VII. White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press. 2002. 692‐693 p. 
34.       Giustiniani J, Marie-Cardine A, Bensussan A. A Soluble Form of the MHC Class I-Specific CD160 Receptor Is Released from Human Activated NK Lymphocytes and Inhibits Cell-Mediated Cytotoxicity. J Immunol. 2 janv 2007;178(3):1293‐300. 
35.       Dufresne-Martin G, Lemay J-F, Lavigne P, Klarskov K. Peptide mass fingerprinting by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of proteins detected by immunostaining on nitrocellulose. Proteomics. janv 2005;5(1):55‐66. 
36.       Mansur I-G, Schiavon V, Giustiniani J, Bagot M, Bensussan A, Marie-Cardine A. Engagement of IL-1 receptor accessory protein (IL-1RAcP) with the monoclonal antibody AY19 provides co-activating signals and prolongs the CD2-induced proliferation of peripheral blood lymphocytes. Immunol Lett. 30 sept 2011;139(1-2):52‐7. 
37.       Mori K, Furusawa T, Okubo T, Inoue T, Ikawa S, Yanai N, et al. Genome structure and differential expression of two isoforms of a novel PDZ-containing myosin (MysPDZ) (Myo18A). J Biochem (Tokyo). avr 2003;133(4):405‐13. 
38.       Yu J, Mao HC, Wei M, Hughes T, Zhang J, Park I, et al. CD94 surface density identifies a functional intermediary between the CD56bright and CD56dim human NK-cell subsets. Blood. 14 janv 2010;115(2):274‐81. 
39.       Saeki H, Moore AM, Brown MJ, Hwang ST. Cutting Edge: Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine (SLC) and CC Chemokine Receptor 7 (CCR7) Participate in the Emigration Pathway of Mature Dendritic Cells from the Skin to Regional Lymph Nodes. J Immunol. 3 janv 1999;162(5):2472‐5. 
40.       Yang C-H, Szeliga J, Jordan J, Faske S, Sever-Chroneos Z, Dorsett B, et al. Identification of the surfactant protein A receptor 210 as the unconventional myosin 18A. J Biol Chem. 14 oct 2005;280(41):34447‐57. 
41.       Samten B, Townsend JC, Sever-Chroneos Z, Pasquinelli V, Barnes PF, Chroneos ZC. An antibody against the surfactant protein A (SP-A)-binding domain of the SP-A receptor inhibits T cell-mediated immune responses to Mycobacterium tuberculosis. J Leukoc Biol. juill 2008;84(1):115‐23. 
42.       Mitsuhashi A, Goto H, Kuramoto T, Tabata S, Yukishige S, Abe S, et al. Surfactant protein A suppresses lung cancer progression by regulating the polarization of tumor-associated macrophages. Am J Pathol. mai 2013;182(5):1843‐53. 
43.       McNeely TB, Coonrod JD. Aggregation and opsonization of type A but not type B Hemophilus influenzae by surfactant protein A. Am J Respir Cell Mol Biol. juill 1994;11(1):114‐22. 
44.       Zhao S, Zhang H, Xing Y, Natkunam Y. CD137 ligand is expressed in primary and secondary lymphoid follicles and in B-cell lymphomas: diagnostic and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. fevr 2013;37(2):250‐8. 
45.       Rak GD, Mace EM, Banerjee PP, Svitkina T, Orange JS. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. sept 2011;9(9):e1001151. 
46.       Brown ACN, Oddos S, Dobbie IM, Alakoskela J‐M, Parton RM, Eissmann P, et al. Remodelling of cortical actin where lytic granules dock at natural killer cell immune synapses revealed by super‐resolution microscopy. PLoS Biol. sept 2011;9(9):e1001152. 
47.       Hsu R‐M, Tsai M‐H, Hsieh Y‐J, Lyu P‐C, Yu J‐S. Identification of MYO18A as a novel interacting partner of the PAK2/betaPIX/GIT1 complex and its potential function in modulating epithelial cell migration. Mol Biol Cell. 15 janv 2010;21(2):287‐301. 
48.       Stebbins CC, Watzl C, Billadeau DD, Leibson PJ, Burshtyn DN, Long EO. Vav1 dephosphorylation by the tyrosine phosphatase SHP‐1 as a mechanism for inhibition of cellular cytotoxicity. Mol Cell Biol. sept 2003;23(17):6291‐9. 
49.       Mahmood S, Kanwar N, Tran J, Zhang M-L, Kung SKP. SHP‐1 phosphatase is a critical regulator in preventing natural killer cell self-killing. PloS One. 2012;7(8):e44244. 
50.       Purdy AK, Campbell KS. SHP‐2 expression negatively regulates NK cell function. J Immunol Baltim Md 1950. 1 dec 2009;183(11):7234‐43. 
51.       Taft MH, Behrmann E, Munske-Weidemann L-C, Thiel C, Raunser S, Manstein DJ. Functional characterization of human myosin-18A and its interaction with F-actin and GOLPH3. J Biol Chem. 18 oct 2013;288(42):30029‐41. 
52.       Dippold HC, Ng MM, Farber‐Katz SE, Lee S‐K, Kerr ML, Peterman MC, et al. GOLPH3 bridges phosphatidylinositol‐4‐ phosphate and actomyosin to stretch and shape the Golgi to promote budding. Cell. 16 oct 2009;139(2):337‐51. 
53.       Ng MM, Dippold HC, Buschman MD, Noakes CJ, Field SJ. GOLPH3L antagonizes GOLPH3 to determine Golgi morphology. Mol Biol Cell. mars 2013;24(6):796‐808. 
54.       Farber‐Katz SE, Dippold HC, Buschman MD, Peterman MC, Xing M, Noakes CJ, et al. DNA damage triggers Golgi dispersal via DNA-PK and GOLPH3. Cell. 30 janv 2014;156(3):413‐27. 
55.       Hartman MA, Spudich JA. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 1 avr 2012;125(Pt 7):1627‐32. 
56.       Andzelm MM, Chen X, Krzewski K, Orange JS, Strominger JL. Myosin IIA is required for cytolytic granule exocytosis in human NK cells. J Exp Med. 1 oct 2007;204(10):2285‐91. 
57.       Furusawa T, Ikawa S, Yanai N, Obinata M. Isolation of a novel PDZ‐containing myosin from hematopoietic supportive bone marrow stromal cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2 avr 2000;270(1):67‐75. 
58.       Nakano T, Tani M, Nishioka M, Kohno T, Otsuka A, Ohwada S, et al. Genetic and epigenetic alterations of the candidate tumor-suppressor gene MYO18B, on chromosome arm 22q, in colorectal cancer. Genes Chromosomes Cancer. juin 2005;43(2):162‐71. 
59.       Nishioka M, Kohno T, Tani M, Yanaihara N, Tomizawa Y, Otsuka A, et al. MYO18B, a candidate tumor suppressor gene at chromosome 22q12.1, deleted, mutated, and methylated in human lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 17 sept 2002;99(19):12269‐74. 
60.       Yanaihara N, Nishioka M, Kohno T, Otsuka A, Okamoto A, Ochiai K, et al. Reduced expression of MYO18B, a candidate tumor-suppressor gene on chromosome arm 22q, in ovarian cancer. Int J Cancer J Int Cancer. 20 oct 2004;112(1):150‐4. 
61.       Cross M, Csar XF, Wilson NJ, Manes G, Addona TA, Marks DC, et al. A novel 110 kDa form of myosin XVIIIA (MysPDZ) is tyrosine-phosphorylated after colony-stimulating factor‐1 receptor signalling. Biochem J. 15 mai 2004;380(Pt 1):243‐53. 
62.       Haagsman HP, Hawgood S, Sargeant T, Buckley D, White RT, Drickamer K, et al. The major lung surfactant protein, SP 28-36, is a calcium-dependent, carbohydrate-binding protein. J Biol Chem. 15 oct 1987;262(29):13877‐80. 
63.       Kuroki Y, Tsutahara S, Shijubo N, Takahashi H, Shiratori M, Hattori A, et al. Elevated levels of lung surfactant protein A in sera from patients with idiopathic pulmonary fibrosis and pulmonary alveolar proteinosis. Am Rev Respir Dis. mars 1993;147(3):723‐9. 
64.       Rubio S, Lacaze-Masmonteil T, Chailley-Heu B, Kahn A, Bourbon JR, Ducroc R. Pulmonary surfactant protein A (SP-A) is expressed by epithelial cells of small and large intestine. J Biol Chem. 19 mai 1995;270(20):12162‐9. 
65.       Aiad HAS, El‐Farargy SM, Soliman MM, El-Wahed Gaber MA, El‐Aziz Othman SA. Immunohistochemical staining of surfactant proteins A and B in skin of psoriatic patients before and after narrow-band UVB phototherapy. Am J Clin Dermatol. 1 oct 2012;13(5):341‐8. 
66.       Coiffier B, Lepage E, Briere J, Herbrecht R, Tilly H, Bouabdallah R, et al. CHOP Chemotherapy plus Rituximab Compared with CHOP Alone in Elderly Patients with Diffuse Large‐B‐Cell Lymphoma. N Engl J Med. 24 janv 2002;346(4):235‐42. 
67.       Bouaziz J-D, Ortonne N, Giustiniani J, Schiavon V, Huet D, Bagot M, et al. Circulating natural killer lymphocytes are potential cytotoxic effectors against autologous malignant cells in sezary syndrome patients. J Invest Dermatol. dec 2005;125(6):1273‐8. 
68.       De Masson A, Guitera P, Brice P, Moulonguet I, Mouly F, Bouaziz J-D, et al. Long-term efficacy and safety of alemtuzumab in advanced primary cutaneous T-cell lymphomas. Br J Dermatol. mars 2014;170(3):720‐4. 
69.       Marie-Cardine A, Viaud N, Thonnart N, Joly R, Chanteux S, Gauthier L, et al. IPH4102, a humanized KIR3DL2 antibody with potent activity against cutaneous T‐cell lymphoma. Cancer Res. 1 nov 2014;74(21):6060‐70. 
70.       Cunningham D, Humblet Y, Siena S, Khayat D, Bleiberg H, Santoro A, et al. Cetuximab Monotherapy and Cetuximab plus Irinotecan in Irinotecan-Refractory Metastatic Colorectal Cancer. N Engl J Med. 22 juill 2004;351(4):337‐45. 
71.       Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer CE, Davidson NE, et al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. N Engl J Med. 20 oct 2005;353(16):1673‐84.
【図１Ａ】
2018524404.tif 000002
【図１Ｂ】
2018524404.tif 000003
【図１Ｃ】
2018524404.tif 000004
【図１Ｄ】
2018524404.tif 000005
【図１Ｅ】
2018524404.tif 000006
【図２Ａ】
2018524404.tif 000007
【図２Ｂ】
2018524404.tif 000008
【図２Ｃ】
2018524404.tif 000009
【図２Ｄ】
2018524404.tif 000010
【図２Ｅ】
2018524404.tif 000011
【図２Ｆ】
2018524404.tif 000012
【図２Ｇ】
2018524404.tif 000013
【図２Ｈ】
2018524404.tif 000014
【図３】
2018524404.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月15日(2018.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象におけるＮＫ細胞殺傷活性を増強する方法であって、ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物の治療有効量を、前記対象へ投与することを含み、前記化合物がＣＤ２４５への特異性を有するキメラ、ヒト化またはヒト抗体である、方法。
【請求項２】
前記抗体が、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）（それぞれ二重特異性または三重特異性の、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体）、ｓｃ−ダイアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ(ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー、Ｔ細胞を誘引するｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性形式）；ＳＩＰ（小免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体）；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性リターゲティング（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）」）、１つまたは複数のＣＤＲを含む小抗体模倣物などからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ヒト重鎖定常領域配列を含むが、それらが結合するＮＫ細胞を欠失せず、好ましくは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドへ実質的に結合し得るＦｃドメインを含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、Ｆｃドメインを欠如するか、またはＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ２４５への特異性を有する第一の抗原結合部位と、少なくとも１つの第二の抗原結合部位と、を含む多重特異性抗体。
【請求項９】
前記第二の抗原結合部位が、癌細胞、またはウイルスもしくは細菌により感染された細胞により発現される抗原に結合する、請求項８に記載の多重特異性抗体。
【請求項１０】
必要とする対象における癌または感染性疾患を処置する際に使用するための、ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物であって、ＣＤ２４５への特異性を有するキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である、化合物。
【請求項１１】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、ＣＤ１３７への特異性を有する抗体と併用される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、化学療法剤、標的癌治療、免疫療法剤、または共刺激分子に特異性のある抗体と併用される、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な前記化合物が、ＡＤＣＣを介して、第二の薬剤が結合する抗原を発現する細胞の死を誘導する前記第二の薬剤と併用される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
必要とする対象における抗体のＮＫ細胞抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する方法であって、前記抗体を前記対象へ投与すること、およびＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物を前記対象へ投与すること、を含み、前記化合物がＣＤ２４５への特異性を有するキメラ、ヒト化またはヒト抗体である、方法。
【請求項１５】
必要とする対象における癌を処置する方法であって、癌細胞抗原に選択性のある第一の抗体を前記対象へ投与すること、およびＮＫ細胞上でＣＤ２４５を刺激することが可能な化合物を前記対象へ投与すること、を含み、前記化合物がＣＤ２４５への特異性を有するキメラ、ヒト化またはヒト抗体である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018524404000001.app
【国際調査報告】
2018524404.tif 000016
2018524404.tif 000017
2018524404.tif 000018