(57)【要約】オートファジーの調節による創傷治癒のための方法および化合物が開示されている。オートファジーを調節するための製剤は、一般構造（Ｉ）を有する化合物から選択される第１の調節化合物（ＦＡＭ）を含んでなり、Ｌは、−Ｃ≡Ｃ−、（トラン）、−ＣＨ＝ＣＨ−（スチルベン、好ましくはトランス）、または−ＣＲａ＝ＣＲｂ−スチルベン誘導体から選択されるリンカーを表し、ここでＲａおよびＲｂは独立して、Ｈまたは−（Ｒ３）ｐまたは−（Ｒ４）ｑで置換されていてもよいフェニルであり、Ｒ１〜Ｒ４は、フェニル環の任意の利用可能な位置の、好ましくは、３，３’、４，４’、および／または５，５’の独立した置換基であり、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、それぞれ独立して、環の置換基の数を表す０、１、２、または３であるが、ｍまたはｎの少なくとも１つは≧１でなければならない。各Ｒ１〜Ｒ２は、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、ハロメチル、およびグリコシドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載の置換基から独立して選択される。当該製剤は、本明細書に記載の補助的オートファジー調節化合物（ＡＡＭ）も含み得る。当該製剤は、これらの化合物自体よって形成されたヒドロゲルを含み得るか、またはそうでなければ塩および/または複合体を含み得る。【化１】2018510902.tif 000027【選択図】なし
2018510902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性創傷または皮膚状態を有する患者における創傷治癒を促進するための方法であって、
構造（Ｉ）を有する第１のオートファジー調節化合物であって、
【化１】
2018510902.tif 000025
式中、Ｌは、−Ｃ＝Ｃ−および−ＣＲａ＝ＣＲｂ−から選択されるリンカーであり、
ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、または−（Ｒ３）ｐもしくは−（Ｒ４）ｑで置換されていてもよいフェニルであり；
Ｒ１〜Ｒ４は、独立して、フェニル環の任意の利用可能な位置の置換基であり、
ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、それぞれ独立して、環の置換基の数を表す０、１、２、または３であり、ｍまたはｎの少なくとも１つは≧１でなければならず、
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、
（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルから選択され、−ＯＨ、−ＳＨ、−ハロ、−ＮＨ２、またはＮＯ２から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−Ｒ５、
ＹがＯ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｒ６がＨまたはＲ５から選択される−ＹＲ６、
Ｚが−Ｎ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である−ＺＲ５、
−ハロ、
−ＮＯ２、
−ＳＯ３Ｎａ、
−アジド、および
−グリコシド
−ならびにこれらの塩、
から選択され、
レスベラトロールまたは４，４’−（エチン−１，２−ジイル）ジフェノール（TOLECINE、４，４’−ジヒドロキシトランとしても知られている）ではない前記第１のオートファジー調節化合物を含んでなる治療有効量の製剤を患者に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記第１のオートファジー調節化合物が、Ｌが−Ｃ≡Ｃ−であるトランである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランが、１〜４個のヒドロキシル置換基を有する、ヒドロキシル化トランである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランが、２，４，４’−トリヒドロキシトラン、４，３’，５’−トリヒドロキシトラン、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシトラン、３，３’，５，５’−テトラヒドロキシトラン、および４−ヒドロキシ−４’−（トリフルオロ）メチルトランから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランが、４，４’−ジヒドロキシ−３−メトキシトラン、２，４，４’−トリヒドロキシトラン−ベータ−Ｄ−グルコシド、および４−ヒドロキシ−４’−メトキシトランから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のオートファジー調節化合物が、Ｌが−ＣＨ＝ＣＨ−であるトランス−スチルベンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記スチルベンが、１〜４個のヒドロキシル置換基を有するヒドロキシル化スチルベンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
補助的オートファジー調節化合物の併用投与をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記補助的オートファジー調節化合物を前記第１のオートファジー調節化合物と同時に投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記補助的オートファジー調節化合物を前記第１のオートファジー調節化合物を投与する前に投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記補助的オートファジー調節化合物が、置換型または非置換型パラベンゾキノン、置換型または非置換型オルトベンゾキノン、および置換型または非置換型アントラキノンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記補助的オートファジー調節化合物が、アミノ酸、酸性単糖、およびビタミンまたはその塩からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンが酸素含有ビタミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビタミンがイソプレノイド含有ビタミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のオートファジー調節化合物が、オートファジー活性をアップレギュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記創傷または皮膚の状態が、老化、炎症を伴う自己免疫疾患、無血管壊死、細菌感染、癌、糖尿病性神経障害、子宮内膜症、真菌感染症、痛風、脱毛、感染性関節炎、炎症、炎症性腸疾患、虚血、ライム病、器官/組織移植、寄生虫感染、乾癬性関節炎、乾癬、偽痛風、関節リウマチ、強皮症、壊血病、敗血症、皮膚疾患、手術瘢痕、外科的癒着、トランスフェクション法、潰瘍性大腸炎、潰瘍、ウイルス感染、疣贅、手術創傷、切開、裂傷、切り傷および擦り傷、皮膚移植による供与部創傷、外傷性創傷、感染性創傷、虚血性創傷、火傷、水疱性創傷、非感染創傷、打撲傷、切創、裂傷、非貫通創、開いた創傷、貫通創、穿孔創、刺創、膿創、皮下創、慢性潰瘍、胃潰瘍、皮膚潰瘍、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、痛風、高血圧性虚血性潰瘍、鬱血性潰瘍、舌下潰瘍、粘膜下潰瘍、症候性潰瘍、栄養性潰瘍、熱帯性潰瘍、および性病性潰瘍から選択される１つ以上である、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１７】
オートファジーの調節の必要性を生じさせる状態、障害、または疾患が、角化症、光老化、乾癬、皮膚発疹、日焼け、および光反応過程などの１つ以上の皮膚病である、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記状態、障害、または疾患が、口腔内のびらんおよび熱傷、抜歯後創傷、特に嚢胞および膿瘍の治療に関連する歯内創傷、細菌性、ウイルス性、または自己免疫性起源の潰瘍および病変、機械的、化学的、熱的、感染性、および苔癬状創傷、ヘルペス潰瘍、アフタ性口内炎、急性壊死性潰瘍性歯肉炎および口腔内灼熱症などの損傷した口腔組織の治癒を保護および促進するために口腔洗浄剤またはスプレーの形態で経口的に使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記状態、障害、または疾患が、角膜潰瘍、放射状角膜切開、角膜移植、エピケラトファキア、および他の手術により誘発された眼内の創傷に起因する創傷などの創傷を治療するために眼科用製剤に使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記状態、障害、または疾患が、掻痒症、直腸炎、肛門裂傷、および痔核などの状態を治療するために肛門直腸クリームおよび座薬に使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記状態、障害、または疾患が、以下の効果：保湿および保護、乾いた割れた肌の治癒、他の疾患による重度の乾燥肌（静脈皮膚炎）の治癒、ＵＶ光損傷からの皮膚の保護、および脂漏性状態の治療のために使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記状態、障害、または疾患が、熱傷、炭疽病、破傷風、ガス壊疽、猩紅熱（ｓｃａｌａｔｉｎａ）、丹毒、ひげ毛瘡、毛嚢炎、伝染性膿痂疹、または水疱性膿痂疹などである、本発明により成功裏に治療され得る創傷またはびらんに関連する状態を治療するために使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記状態、障害、または疾患が、皮膚における老化の徴候の少なくとも１つを治療することであって、前記皮膚の弾力性を向上させること、前記皮膚の堅さを向上させること、および前記皮膚のしわまたはセルライトの出現を減少させることからなる群から選択されること、および／または（ｉｉ）前記皮膚の非座瘡形成性炎症を治療することに使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記状態、障害、または疾患が、例えば、放射線および／または化学療法から生じる口腔および口腔傍潰瘍治療として使用してもよい１つ以上の前記オートファジー調節剤の必要性を生じさせる、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の第１のオートファジー調節化合物をヒドロゲル中に分散して含んでなる製剤。
【請求項２６】
前記ヒドロゲルが、前記第１のオートファジー調節化合物によって部分的に形成された液晶性ヒドロゲルである、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
前記ヒドロゲルがアルギン酸塩である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２８】
約１：１〜約１：１０の第１のオートファジー調節化合物：シクロデキストリンの比でシクロデキストリンと組み合わされた請求項１〜７のいずれか一項に記載の第１のオートファジー調節化合物を含んでなる製剤。
【請求項２９】
アスコルビン酸およびカチオンとの複合体に組み込まれた、請求項１〜７のいずれか１項に記載の第１のオートファジー調節化合物を含んでなる製剤。
【請求項３０】
患者に治療有効量の製剤を投与することを含んでなる、オートファジー調節を必要とする患者におけるオートファジーを調節するための方法であって、前記製剤が、
構造（Ｉ）を有する第１のオートファジー調節化合物を含んでなり、
【化２】
2018510902.tif 000026
式中、Ｌは、−Ｃ≡Ｃ−および−ＣＲａ＝ＣＲｂ−から選択されるリンカーであり、
ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、または−（Ｒ３）ｐもしくは−（Ｒ４）ｑで置換されていてもよいフェニルであり；
Ｒ１〜Ｒ４は、独立して、フェニル環の任意の利用可能な位置の置換基であり、
ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、それぞれ独立して、環の置換基の数を表す０、１、２、または３であり、ｍまたはｎの少なくとも１つは≧１でなければならず、
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、または（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルから選択され、−ＯＨ、−ＳＨ、−ハロ、−ＮＨ２、またはＮＯ２から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−Ｒ５、
ＹがＯ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｒ６がＨまたはＲ５から選択される−ＹＲ６、
Ｚが−Ｎ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である−ＺＲ５、
−ハロ、
−ＮＯ２、
−ＳＯ３Ｎａ、
−アジド、および
−グリコシド、
ならびにこれらの塩、
から選択される、前記方法。
【請求項３１】
前記患者がオートファジーアップレギュレーションを必要とする状態に罹患しており、前記状態が、創傷治癒、毛髪再成長、細菌感染、炎症、ウイルス感染、パーキンソン病、老化、アルツハイマー、神経変性疾患、神経障害、循環器疾患、熱傷、心臓病、アルツハイマー病、アテローマ性動脈硬化症、動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、糖尿病、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、アミロイドーシス、滑液包炎、皮膚炎、血管炎、炎症を伴う自己免疫疾患、血液疾患、再生不良性貧血、子宮内膜症、肝炎、ヘルペス、ＨＩＶ、多発性硬化症、網膜剥離、老化性黄斑変性症、網膜色素変性、およびレーバー先天性黒内障、リソソーム蓄積症、関節炎、乾癬、骨減少症、骨粗鬆症、手術瘢痕、外科的癒着、宇宙旅行（骨密度障害）、腱炎、および潰瘍性大腸炎のうち１つ以上を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者がオートファジーダウンレギュレーションを必要とする状態に罹患しており、前記状態が、老化、癌、多嚢胞腎および肝疾患、腎疾患、肝疾患、喘息、糖尿病性網膜症、線維筋痛症、強直性脊椎炎、セリアック病、グレーブス病、狼瘡、代謝性疾患、腎炎、関節リウマチ、骨溶解、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）障害、臓器および組織移植、強皮症、および敗血症のうち１つ以上を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年４月８日に出願された仮出願シリアル番号６２／１４４，５３９の優先権を主張し、その内容を参照により本明細書に明示的に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、概して細胞生物学の分野に関し、より詳細には、創傷または皮膚に関連する疾患または状態を治療するためにオートファジーを調節するための化合物、製剤、および方法に関する。オートファゴサイトーシスとしても知られる「オートファジー」という名称は、「食べる」と「自己」を意味するギリシャ語に由来する。オートファジーは、一般に自己消化と定義される。
【０００３】
オートファジーは、本来、老化したタンパク質およびオルガネラを分解し、新しい分子合成およびＡＴＰ産生のためにヌクレオチド、アミノ酸、および遊離脂肪酸を再吸収することによって恒常性機能を発揮するために細胞に共通に使用されるリソソームの再利用またはリサイクル経路である。オートファジーは、細胞レベルの自己保存機構として、飢餓、成長因子欠乏、ＥＲストレス、および病原体感染などの細胞外または細胞内ストレスおよびシグナルに応答してアップレギュレーションされ得る。いくつかの病的状態では、オートファジー過程を刺激することが望ましいが、創傷治癒などの他の病的状態では、オートファジー過程を抑制または遅延させて細胞の破壊を減少させることが望ましい。したがって、オートファジーの調節は、細胞増殖および細胞死過程の促進/刺激または抑制/減速のいずれかを引き起こし得る。
【０００４】
オートファジーの最も一般的な形態は、（１）延長する単離膜の形成を伴い、終端は、最終的に（２）オートファゴソームとして知られる二重膜小胞内の細胞内容物を包含するように融合する。次に、オートファゴソームは、（３）酵素を提供するリソソームと融合し、（４）オートファゴソームの内容物を消化し、そして、その内容物は、再び原材料または構成要素の栄養素として細胞に利用可能になる。オートファジーは、ユビキチンタグタンパク質の平行プロテアソーム分解といくつかの類似点を示すが、オートファゴソームはタンパク質だけでなく、細胞質、ミトコンドリア、オルガネラ、および他の細胞構造も含む点が異なる。この意味では、バルク分解システムとして知られている。
【０００５】
オートファジーの過程は、外的要因および条件に応じて細胞にとって有益でも有害でもあり得るので、過程は厳密に制御されなければならない。酵母および哺乳類系の両方が研究されており、最大で３６のタンパク質を利用している。図１は、哺乳類における過程を示す。
【０００６】
酵母オートファジー関連遺伝子産物（Ａｔｇ８）は、３つの哺乳類ホモログを有する：（１）ＬＣ３、（２）ＧＡＢＡＡ受容体関連タンパク質（ＧＡＢＡＲＡＰ）、および（３）ゴルジ関連ＡＴＰアーゼエンハンサー（ＧＡＴＥ−１６）。これらの中で、ＬＣ３は最も盛んに研究されており、哺乳類のオートファジーマーカーとして頻繁に使用されている。翻訳直後（ｐｒｏＬＣ３）、ＬＣ３はＣ末端でＡｔｇ４ＡまたはＡｔｇ４ＢによりＬＣ３−Ｉにプロセシングされる。オートファジーの誘導または増強に際して、ＬＣ３−Ｉは、Ｅ１（酵母Ａｔｇ７）およびＥ２（酵母Ａｔｇ３）を介して基質ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）にコンジュゲートされる。ＰＥ−ＬＣ３−Ｉコンジュゲートは、ＬＣ３−ＩＩと呼ばれる。このコンジュゲーションは、当該過程でオートファゴソーム形成時に起こり、可溶性ＬＣ３−Ｉのオートファジー小胞結合ＬＣ３−ＩＩへの変換をもたらす。この脂質コンジュゲーションは、ＬＣ３−ＩＩがオートファジー活性のマーカーとして使用されることを可能にする。
【０００７】
創傷の進行は、局所組織低灌流、炎症の長期化、フリーラジカル損傷、アポトーシス、および壊死を含む多くのメカニズムによって引き起こされる。これらは、典型的には、（ｉ）炎症段階、（ｉｉ）細胞増殖段階、および（ｉｉｉ）リモデリング段階を含む損傷後の３つの段階に分けられる。これらの段階のそれぞれは、生物学的および組織学的に特有なフィンガープリントと関連があり、オートファジーは各段階で特別な役割を果たす。例えば、炎症段階の間、オートファジーは、創傷縁部の細胞が死ぬことを防ぐように働くという点で、最初は組織を保護するものである。創傷を閉じるために複数の細胞型の細胞の増殖および遊走を伴う増殖段階では、オートファジーは、β１インテグリンおよび他の細胞遊走タンパク質を制御して、創傷の前縁において制御された細胞の列を形成するのに役立つ。リモデリングにおいて、これらの遊走する細胞の方向は、しばしば、プロコラーゲンとしてこれらの形質転換された線維芽細胞によって分泌されるコラーゲンの方向性および沈着によって制御される。コラーゲンは、フィブロネクチンおよびラミンなどの他の成分とともに、増殖および遊走段階の間に基底膜を再生するのに役立つ。
【０００８】
創傷治癒過程の間、コラーゲン原線維は、適切な細胞遊走を可能にする構造トポロジー、剛性、および構成を与える。慢性創傷および火傷では、この環境は、様々な要因に付され、様々な要因には、ｐＨ変化、慢性炎症、およびしばしば、創傷細胞（例えば、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋線維芽細胞）を移動させて、侵入してくる微生物および環境要因（例えば温度調節）から身体を守るために、創傷を満たし、無傷の皮膚の層を回復させることによって使用される必須のコラーゲン管を含む基底膜の喪失が含まれる。自然治癒過程の間に、皮膚細胞は、より高次の構造を酵素的に形成すること、またはエントロピー駆動自己組織化過程を受けることができるプロコラーゲンとして知られる可溶性形態のコラーゲンを分泌する（Prockop, D. and D. Hulmes (1994)）。プロコラーゲンは、三重らせんとして細胞から分泌され、その液晶性質のために原繊維に自己組織化することができる。この過程は、ｐＨ、イオン強度、温度、および濃度に大きく依存する。次いで、原繊維は個々のコラーゲン繊維に形成され、より高次の３次元ネットワークおよび構造にランダムに組織化される。
【０００９】
米国特許第６，５９９，９４５号および第７，０９４，８０９号は、数種のヒドロキシトラン化合物と、感染性ヘルペスウイルス粒子の形成の阻害におけるそれらの使用、またはナイセリア・ゴノレエによって引き起こされる淋病を治療するためのそれらの使用とを開示する。国際公開第２００９／１２６７００号は、類似の化合物の紫外線などスキンケア用、および美容用途の使用を開示する。そして、米国特許第８，７１６，３５５号（国際公開第２０１１／０１３０４６８号）および第８，６８０，１４２号（国際公開第２０１１／０１６０３０１号）は、抗腫瘍剤としての使用のための類似のヒドロキシトランを開示している。しかしながら、これらの、またはその他のヒドロキシトランのオートファジー調節化合物としての潜在的な有用性は、本発明がなされるまで知られていなかった。米国特許第６，００８，２６０号、第６，１９７，８３４号、および第６，３５５，６９２号は、特定のヒドロキシル化スチルベン、具体的にはレスベラトロールを開示している。これらの文献のいずれも、オートファジー調節剤としてのそのような修飾トランまたはスチルベン化合物の使用を開示していない。
【００１０】
オートファジーの過程が調節され、いくつかの条件では刺激されまたは増強され、他の条件では減速または抑制され得るならば有利であろう。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、オートファジーを調節するための、特に慢性創傷または皮膚状態を有する患者における創傷治癒を促進する適用または目的のための化合物、製剤、および方法に関する。一態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの第１のオートファジー調節（ＦＡＭ）化合物を投与することを含んでなる、創傷治癒を促進する方法を含んでなる。創傷治癒の促進のためのほとんどの実施形態において、オートファジー調節は、方向的にオートファジー活性のアップレギュレーションである。特定の実施形態では、ＦＡＭは、補助的オートファジー調節（ＡＡＭ）化合物と共に投与される。ＦＡＭおよびＡＡＭは、同時投与されてもよく、または一方が他方よりも前に投与されてもよい。同時投与される場合、それらは同じ剤形で、または２つの異なる投薬量または製剤として調製され得る。ＡＡＭは、多くは密閉型化合物（hermetic compound）であるため、その効果を刺激または増加させることによって、またはその効果を抑制または阻害することによって、ＦＡＭの効果を調節し得る。
【００１２】
これらのオートファジー調節剤は、本質的に液晶性であり、特定の組み合わせで作用して、創傷または皮膚に関連する疾患もしくは状態を治療する。本発明はさらに、これらの液晶を用いて、創傷または皮膚に関連する状態における治癒を促進するために生物活性膜としても機能し得るヒドロゲルおよびアルギン酸塩などの生物活性製剤を作製することを記載する。したがって、いくつかの態様において、本発明は、ＦＡＭおよびＡＡＭを含有する製剤を含んでなる。製剤は、ヒドロゲル、例えばアルギン酸塩であり得る。製剤は、ＦＡＭのカチオン性塩、またはＦＡＭおよびＡＡＭとカチオンとの複合体を含み得る。他の製剤では、ＦＡＭおよび／またはＡＡＭを、シクロデキストリンと配合し得る。
【００１３】
特定のＦＡＭは、トランまたはスチルベン（シスおよびトランススチルベンを含む）であり得、本明細書に記載の様々な置換基のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、置換基は、分子の溶解性および極性を増加させるヒドロキシル基またはアルコキシル基である。任意のＦＡＭを、任意のＡＡＭとともに投与し得る。例えば、ＦＡＭはトランであり得、ＡＡＭはビタミン、酸性糖、アミノ酸、またはキノロンであり得る。同様に、ＦＡＭはスチルベンであり得、ＡＡＭはビタミン、酸性糖、アミノ酸、またはキノロンであり得る。
【００１４】
いくつかの態様において、方法は、特定の徴候における創傷治癒を促進し、創傷または皮膚の状態は、老化、炎症を伴う自己免疫疾患、無血管壊死、細菌感染、癌、糖尿病性神経障害、子宮内膜症、真菌感染症、痛風、脱毛、感染性関節炎、炎症、炎症性腸疾患、虚血、ライム病、器官/組織移植、寄生虫感染、乾癬性関節炎、乾癬、偽痛風、関節リウマチ、強皮症、壊血病、敗血症、皮膚疾患、手術瘢痕、外科的癒着、トランスフェクション法、潰瘍性大腸炎、潰瘍、ウイルス感染、疣贅、手術創傷、切開、裂傷、切り傷および擦り傷、皮膚移植による供与部創傷、外傷性創傷、感染性創傷、虚血性創傷、火傷、水疱性創傷、非感染創傷、打撲傷、切創、裂傷、非貫通創、開いた創傷、貫通創、穿孔創、刺創、膿創、皮下創、慢性潰瘍、胃潰瘍、皮膚潰瘍、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、痛風、高血圧性虚血性潰瘍、鬱血性潰瘍、舌下潰瘍、粘膜下潰瘍、症候性潰瘍、栄養性潰瘍、熱帯性潰瘍、および性病性潰瘍から選択される１つ以上である。
【００１５】
いくつかの方法では、治癒すべき創傷は、性質上皮膚の創傷、例えば切り傷、擦過傷、多くのタイプおよび程度の潰瘍、老化、皮膚の非弾力性などである。他の方法では、創傷は、眼または耳の創傷であり得、他の方法では、創傷は、性質上口の創傷、例えば癌びらん、ヘルペスウイルス感染症、抜歯創傷、歯肉炎などであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付の図面は、そのいくつかの態様において本発明を例示し、明細書と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。図面において、線、層、および領域の厚さは、明瞭化のために誇張されている場合がある。
【００１７】
【図１】オートファジーにおけるＬＣ３の役割を示す略図である。
【００１８】
【図２】オートファジー関連ヒト疾患を示す略図である。
【００１９】
【図３】実施例５に記載のＬＣ３−ＩＩ蛍光染色の棒グラフである。
【００２０】
【図４】実施例６に記載のＬＣ３−ＩＩウェスタンブロットの棒グラフである。
【００２１】
【図５】実施例６に記載のＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比の棒グラフである。
【００２２】
【図６】実施例８に記載のＡＫＴシグナリングのグラフである。
【００２３】
【図７】実施例9に記載の線維芽細胞成長因子のグラフである。
【００２４】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付の図面は、そのいくつかの態様において本発明を例示し、明細書と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。図面において、線、層、および領域の厚さは、明瞭化のために誇張されている場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
例えば、角度、成分の量、ポリマー分子量、反応条件（ｐＨ、温度、電荷レベルなど）、物理的寸法など、本発明を特徴付けるために使用される数値範囲、測定値、およびパラメーターは、必然的に近似値であり、できるだけ正確に報告されているものの、それぞれの測定値に由来する不正確さを本質的に含む。したがって、明細書および特許請求の範囲で使用される大きさの範囲を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。全ての数値範囲は、その範囲の外側境界内の全ての可能な漸増の部分範囲を含むと理解される。したがって、３０〜９０単位の範囲は、例えば、３５〜５０単位、４５〜８５単位、および４０〜８０単位などを開示する。他に定義されない限り、パーセンテージは、重量／重量（ｗｔ／ｗｔ）であり、処方は、概して、重量／容量（ｗ／ｖ）、１００ｍＬあたりのグラム数（密度１．０の水溶液ではｗｔ／ｗｔに相当）であり、創傷面積は、面積／面積（ａ／ａ）としてｃｍ２で表されている。
【００２６】
本明細書に引用される全ての特許、公開特許出願、および非特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明は、第１のオートファジー調節（ＦＡＭ）化合物および任意の補助的オートファジー調節（ＡＡＭ）化合物の投与を含んでなる、オートファジーを調節する方法を含んでなる。ＦＡＭおよびＡＡＭ化合物を、以下のセクションでより詳細に記載する。ＦＡＭおよびＡＡＭ化合物を、連続して、または同時に与えてもよい。連続して与える場合、順序は最初にＦＡＭ、次にＡＭＭとしてもよく、または最初にＡＭＭ、次にＦＡＭとしてもよい。同時に投与する場合、別々の個々の製剤で与えてもよく、または成分の配合として単一の製剤で与えてもよい。化合物は、製剤の賦形剤に応じて、１日１回から最大で１日当り約６回投与し得る。投与経路には、局所、経皮、経口、経鼻、眼、耳、ＩＶ、ＩＭ、皮下、直腸、および膣が含まれる。
【００２８】
製剤の調製における医薬賦形剤の使用は、一般に医薬品の論文、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990)、およびその後続版であるRemingtons: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (2012)などからよく理解されている。局所製剤を、とりわけ、溶媒、乳化剤、皮膚軟化剤、溶媒などと組み合わせて、溶液、懸濁液、クリーム、軟膏、およびヒドロゲルを作製し得る。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、ＦＡＭ化合物およびＡＡＭ化合物を含有する製剤に関する。モル比として表される製剤中のＦＡＭ対ＡＡＭの相対量は、約５００：１〜約１：５００（ＦＡＭ：ＡＡＭ）におよび得、または特定の実施形態では、約２００：１〜１：２００におよび得る。液体製剤において、ＦＡＭは、約０．０１％〜約４０％（ｗ／ｖ）の製剤を含んでなり得、ＡＭＭは、約０．０１％〜約９９．９％（ｗ／ｖ）の製剤を含んでなり得る。特定の実施形態において、ＦＡＭは、約０．１％〜約４０％（ｗ／ｖ）の製剤を含んでなり得、ＡＭＭは、約０．１％〜約６０％（ｗ／ｖ）の製剤を含んでなり得る。ＦＡＭの製剤濃度は、０．５〜１５％（ｗ／ｖ）であることが最適である。
化学的および生物学的定義
【００３０】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または均等な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。書籍、雑誌の記事、公開された米国または外国の特許出願、発行された米国または外国の特許、およびそのほかの参考文献を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、それぞれ、引用文献に示された全てのデータ、表、図、およびテキストを含むそれぞれの全体が参照により組み込まれる。
【００３１】
本出願を通じて使用される以下の用語は、下記の意味を有する。
【００３２】
「第１のオートファジー調節剤」または「ＦＡＭ化合物」または「ＦＡＭ」は、式Ｉの化合物を意味し、
【００３３】
【化１】
2018510902.tif 000003
【００３４】
式中、Ｌは、−Ｃ＝Ｃ−および−ＣＲａ＝ＣＲｂ−から選択されるリンカーであり、
ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、または−（Ｒ３）ｐもしくは−（Ｒ４）ｑで置換されていてもよいフェニルであり、
Ｒ１〜Ｒ４は、独立して、フェニル環の任意の利用可能な位置の置換基であり、
ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは、それぞれ独立して、環の置換基の数を表す０、１、２、または３であり、ｍまたはｎの少なくとも１つは≧１でなければならず、
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、または（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルから選択され、−ＯＨ、−ＳＨ、−ハロ、−ＮＨ２、またはＮＯ２から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−Ｒ５、
ＹがＯ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｒ６がＨまたはＲ５から選択される−ＹＲ６、
Ｚが−Ｎ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である−ＺＲ５、
−ハロ、
−ＮＯ２、
−ＳＯ３Ｎａ、
−アジド、および
−グリコシド
−ならびにこれらの塩、
から選択され、
但し、ＦＡＭはレスベラトロールまたは４，４’−（エチン−１，２−ジイル）ジフェノール（ＴＯＬＣＩＮＥ）ではない。
【００３５】
「補助的オートファジー調節剤」または「ＡＡＭ化合物」または「ＡＡＭ」は、オートファジー調節効果も有する本明細書に記載の化合物を意味する。その効果は、化合物に応じて刺激性であっても阻害性であってもよい。いかなる特定の理論にも拘束されるつもりはないが、ＡＡＭ化合物は、細胞取り込み機構などの律速段階で競合することによって阻害作用を有し得る。より具体的なＡＡＭ化合物については、後のセクションで説明する。
【００３６】
オートファジー調節は、細胞におけるオートファジーの過程のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを指す。特定の病状または状態に応じて、後述するように、オートファジーの調節の一方の方向または他方の方向を達成することが望ましい。そして、ホルメシスの考察を参照すると、任意の特定のＦＡＭまたはＡＡＭ化合物または配合または複合体の用量は、アップレギュレーションもしくはダウンレギュレーション、またはその両方を達成し得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖および分岐非環式飽和炭化水素を指す。代表的な直鎖−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基には、メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、および−ｎ−ヘキシルが含まれる。代表的な分岐鎖−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基には、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピルおよび１，２−ジメチルプロピル、メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチルなどが含まれる。より一般的には、下付き数字は鎖中の炭素原子の数を指す。したがって、用語「−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖および分岐非環式飽和炭化水素を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル」は、２〜６個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含む直鎖および分岐非環式炭化水素を指す。代表的な直鎖および分岐−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基には、−ビニル、アリル、１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニルなどが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル」は、２〜６個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素−炭素三重結合を含む直鎖および分岐非環式炭化水素を指す。代表的な直鎖および分岐−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基には、−アセチレニル、−プロピニル、−１ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、−４−ペンチニルなどが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ」は、１つ以上のエーテル基および１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐非環式炭化水素を意味する。代表的な直鎖および分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシには、−メトキシ、−エトキシ、−プロポキシ、−ブチルオキシ、−ペンチルオキシ、−ヘキシルオキシ、−ヘプチルオキシ、−メトキシメチル、−２−メトキシエチル、−５−メトキシペンチル、−３−エトキシブチルなどが含まれる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ」は、１つ以上のエーテル基および１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐非環式炭化水素を意味する。代表的な直鎖および分岐（Ｃ１〜Ｃ５）アルコキシには、−メトキシ、−エトキシ、−プロポキシ、−ブチルオキシ、−ペンチルオキシ、−ヘキシルオキシ、−メトキシメチル、−２−メトキシエチル、−５−メトキシペンチル、−３−エトキシブチルなどが含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「−（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素原子を有する環式飽和炭化水素を指す。代表的な（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルおよびシクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシルなどが含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「−（Ｃ４〜Ｃ１２）シクロアルケニル」は、４〜１２個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含む環式炭化水素を指す。代表的な−（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルケニルには、−シクロブテニル、−シクロペンテニル、−シクロペンタジエニル、−シクロヘキセニル、−シクロヘキサジエニル、−シクロヘプテニル、−シクロヘプタジエニル、−シクロヘプタトリエニル、−シクロオクテニル、−シクロオクタジエニル、−シクロシクロオクタトリエニル、−シクロオクタテトラエニル、−シクロノネニル、−シクロノナジエニル、−シクロデセニル、−シクロデカジエニル、−ノルボルネニルなどが含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「−（７〜１２員）二環式アリール」は、７〜１２個の炭素原子を含む二環式芳香族炭素環式環を意味する。代表的な−（７〜１２員）二環式アリール基には、−インデニル、−ナフチルなどが含まれる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」は、１つ以上のヒドロキシ基で置換された上記のＣ１〜６アルキル基のいずれかを意味する。代表的なヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基には、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、およびヒドロキシブチル基、特に、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシ−１−メチルプロピル、および１，３−ジヒドロキシプロパ−２−イルが含まれる。
【００４６】
上記で定義した基のいずれかは、置換されていてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「置換されていてもよい」は、非置換型または置換型である基を指す。任意の置換基が存在していて、他に示されない限りは、任意の置換基には、−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ＯＨ、ハロ、−Ｃ（ハロ）３、−ＣＨ（ハロ）２、−ＣＨ２（ハロ）、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＣＮ、ＳＨ、フェニル、ベンジル、（＝Ｏ）、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−からなる群からそれぞれ独立に選択される１、２、または３つの基が含まれる。したがって、特定の置換された実施形態には、下記のものが含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ジヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」は、２つのヒドロキシ基で置換された上記のＣ１〜６アルキル基のいずれかを意味する。代表的なジヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基には、ジヒドロキシエチル基、ジヒドロキシプロピル基、およびジヒドロキシブチル基、特に１，２−ジヒドロキシエチル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシブチル、１，４−ジヒドロキシブチル、および１，３−ジヒドロキシプロパ−２−イルが含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「−ＣＨ２（ハロ）」は、メチル基の水素の１つがハロゲンで置き換えられたメチル基を意味する。代表的な−ＣＨ２（ハロ）基には、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、および−ＣＨ２Ｉが含まれる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「−ＣＨ（ハロ）２」は、メチル基の水素の２つがハロゲンで置き換えられたメチル基を意味する。代表的な−ＣＨ（ハロ）２基には、−ＣＨＦ２、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨＢｒ２、−ＣＨＢｒＣｌ、−ＣＨＣｌＩ、および−ＣＨＩ２が含まれる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「−Ｃ（ハロ）３」は、メチル基の水素の各々がハロゲンで置き換えられたメチル基を意味する。代表的な−Ｃ（ハロ）３基には、−ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、および−ＣＩ３が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「（ハロ）ｐ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−」は、ｐ個の位置がハロで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル鎖を意味し、ｐは１、２、または３である。ハロ置換基は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル中の同じまたは異なる炭素上で置換されていてもよい。代表的な「（ハロ）ｐ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−」基には、例えば、−ＣＨ２ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨＢｒ２、−ＣＨＢｒＣｌ、−ＣＨＣｌＩ、−ＣＨ２ＣＨＩ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＣｌＣＨ２Ｂｒなどが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「アジド」は、式−Ｎ＝Ｎ＝Ｎの置換基を意味する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「グリコシド」は、式Ｉの化合物に結合した５または６員の環式糖を意味する。結合は、一般に、糖のアノマー炭素からのグリコシド結合であり、（１）酸素原子を介して形成され得、したがって「Ｏ−グリコシド」が形成され得る、（２）窒素原子を介して形成され得、したがって「Ｎ−グリコシド」が形成され得る、または（３）硫黄原子を介して形成され得、したがって「Ｓ−グリコシド」が形成され得る。グリコシドは、１つまたは２つの環構造を有する単糖類または二糖類であり得る。６員の糖グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、およびアルトロシドから形成される代表的なグリコシドおよび５員の糖から形成されるグリコシドには、リボシド、アラビノシド、キシロシド、およびリキソシドが含まれる。糖は、任意の置換基を含んでいてもよいが、多くの実施形態は、それぞれの糖を定義する天然の−Ｈおよび−ＯＨ置換基のみを含む。
【００５５】
用語「創傷」、「潰瘍」、および「びらん」の使用の間で文献に重複が存在し、さらにこれらの用語はしばしばランダムに使用される。従って、本文脈において、用語「創傷」は、用語「潰瘍」、「病変」、「びらん」、および「梗塞」を包含し、これらの用語は、別段の定めがない限り互換的に使用される。創傷は、サイズまたは面積（大または小）、障害の深さまたは層、原因、治癒の困難さなどを含む多くの基準によって分類されている。ｉ）外科切開、軽い擦傷、および軽い咬傷に起因する小さな組織喪失、またはｉｉ）虚血性潰瘍、褥瘡、瘻孔、裂傷、重度の咬傷、熱傷、およびドナー部位の創傷（軟組織および硬組織における）、および梗塞などの重度の組織喪失によって創傷を分類することがある。創傷の全ての種類および分類は、本発明に包含される。
【００５６】
用語「皮膚」は、外皮の表皮層を包含し、皮膚表面が多かれ少なかれ損傷している場合、下にある真皮層も包含する非常に広い意味で使用される。角質層は別として、皮膚の表皮層は外側（上皮）層であり、皮膚のより深い結合組織層は、感覚の神経および終末器官を含む「真皮」と呼ばれる。
【００５７】
「創傷の治癒を促進する」方法は、治療の結果として、治療の非存在下での同様の創傷の治癒よりも迅速な創傷治癒をもたらす。また、「創傷治癒の促進」は、当該方法がとりわけケラチノサイトの増殖および/または成長を調節すること、または、創傷が、より少ない瘢痕、より少ない創傷収縮、より少ないコラーゲン沈着、およびより表面積の大きい表面で治癒することを意味し得る。特定の例では、「創傷治癒の促進」は、本発明の方法と共に使用される場合、創傷治癒の特定の方法が向上した成功率（例えば、皮膚移植片の取り込み率）を有することを意味することもできる。
【００５８】
ホルメシスの現象は、一般に、用量依存的な様式で生物学的に反対の効果を誘発する化合物と関連しており、文献、例えば、Calabrese EJ, Bachmann KA, Bailer AJ, Bolger PM, Borak J, et al.(2007), Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hermetic dose-response framework.Toxicol Appl Pharmacol.222: 122-128; Penniston KL, Tanumihardjo SA.The acute and chronic toxic effects of vitamin A. Am J Clin Nutr.2006;83: 191-201; and Cook R, Calabrese EJ.The importance of hormesis to public health.Cien saude Colet.2007;12:955-963に充分に記載されている。一般に、低用量では刺激性効果または有益な効果があり、高用量では阻害性効果または毒性効果がある。また、ホルメシスは、とりわけ、自己保護、適応応答、およびプレコンディショニングとしても特徴付けられており、β−カーブ、二相性、ベル形、Ｕ字形または逆Ｕ字形、二峰性、機能的拮抗、および二重応答などを特に含む、その用量反応曲線の形状により、特徴付けられている。公知のホルメシス物質（または「ホルメチン（hormetin）」）には、ビタミンＡ、フェルラ酸、カルコン、ラパマイシン、エピガロカテキン−３−ガラート、および他の多くのものが含まれる。
【００５９】
ホルメシスはまた、重度のストレス要因に直面したときに適応性のある抵抗性を生物に与えるために適度なストレスが加えられる適応応答を表すことができる。酸化代謝および熱ストレスなどの環境ストレスは、特定の応答または適応変化を誘発するために使用されるホルメチン（hormetin）として役立つ（Mattson MP. Hormesis defined, Ageing Res Rev. 2008;7: 1-7）。ホルメチン（hormetin）は、熱ショックタンパク質、抗酸化剤、タンパク質シャペロン、代謝、カルシウムホメオスタシス、および成長因子を含む様々なストレスおよび解毒経路を活性化することが示されている（Mattson MP, Cheng A. Neurohormetic phytochemicals: Low-dose toxins that induce adaptive neuronal stress responses.Trends Neurosc.2006;29:632-639; および上述のMattson, 2008）。これらの用量応答効果は、一酸化窒素、アデノシン、オピオイド、アドレナリン作動薬、プロスタグランジン、エストロゲン、アンドロゲン、５−ヒドロキシトリプタミン、およびドーパミンを含む広範囲の天然のシグナル伝達分子について分析されている（Calabrese EJ, Bachmann KA, Bailer AJ, Bolger PM, Borak J, et al.(2007), Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.Toxicol Appl Pharmacol.222: 122-128 and Hayes DP.Nutritional hormesis.Eur J Clin Nutr.2007;61: 147-159）。これらのホルメシス物質の多くは、捕食性の種から自己を守るために、細菌、真菌、ウイルス、および植物によって濃縮される。しかしながら、これらの物質の多くがより低い濃度で利用される場合、これらは有益な効果を有し得る。
【００６０】
ヒドロゲルは、水と、かなりの量の水を吸収し保持して三次元網目構造を形成することができるポリマープラスチックまたは多糖などのゲル化剤とを含んでなる希薄架橋水性系である。ヒドロゲル構造は、水和時にポリマーネットワークに存在する親水性基またはドメインと水との相互作用によって生成する。ヒドロゲルは、定常状態での流動挙動に依存して、弱または強に主に分類される。
【００６１】
ポリマー濃度が増加するとゲル化が起こり、ポリマーの分散により、分岐および架橋形成が始まる。臨界濃度に達すると、ゾルはゲルになり、ゾル−ゲル転移が起こる。ゲルは、化学的に結合しているか、または物理的に結合していると考えられ得る。物理的ゲルは、結合の性質に応じて、強または弱にサブカテゴライズすることができ、強く物理的に接近している化学的ゲルは、結合が永続性である。強い物理的結合には、層状微結晶、ガラス状小結節、または二重および三重らせんが含まれ、一方、弱い物理的ゲルには、水素結合、ブロック共重合体、ミセル、およびイオン会合を含まれる。
【００６２】
ヒドロゲルは、その相当な含水量に起因して、天然組織と同様の程度の柔軟性を有し、粘弾性または純粋な弾性挙動、および粘着性を示すことがある。ヒドロゲルの特性は、極性、表面特性、機械的特性、および膨潤挙動を制御することによって改変され得る。ゲルは、ｐＨ、イオン強度、温度、電場、および光における小さな変化に応答して有意な体積変化を示すことがある。不安定な結合を含む生分解性ヒドロゲルは、組織工学、創傷治癒、および薬物送達などの応用において有利である。これらの不安定な結合は、ポリマー骨格中またはヒドロゲルを調製するために使用される架橋剤中に存在することができる。不安定な結合は、生理的条件下で、酵素的または化学的に、ほとんどの場合加水分解により、壊すことができる（ Bajpai, A.K., Shukla, S.K., Bhanu, S. & Kankane, S. (2008）.Responsive polymers in controlled drug delivery.Progress in Polymer Science.33: 1088- 1118）。
【００６３】
生理的ｐＨで負に帯電した基を有するイオン性ポリマーを、多価カチオンの添加によって架橋することができ、一価カチオン（例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋など）であっても、負に帯電した基（例えばＳＯ−３）の反発を遮蔽して安定なゲルを形成し得る。例として、Ｎａ＋アルギン酸−、キトサン−ポリリジン、キトサン−グリセロールリン酸塩（Syed K. H. Gulrez1 and Saphwan Al-Assaf.Progress in molecular and environmental bioengineering from analysis and modeling to technology applications Chapter 5: Hydrogels: Methods of preparation, characterization and applications.Publisher InTech.August, 01, 2011(34)) and chitosan-dextran hydrogels (Hennink, W.E.& Nostrum, C.F.(2002).Novel crosslinking methods to design hydrogels.Advanced drug delivery reviews.54: 13）が挙げられる。
【００６４】
アルギン酸塩は、通常褐海藻から得られる天然に存在するアニオン性多糖類であり、その生体適合性、低毒性、比較的低コストであること、およびＣａ２＋などの２価カチオンの添加によりヒドロゲルを形成する能力のために、多くの生物医学用途で広く研究され使用されている。アルギン酸ヒドロゲルは、創傷治癒および薬物送達を含む様々な用途で使用されてきた。アルギン酸塩創傷被覆材は、湿った創傷環境を維持し、創傷部位での細菌感染を最小限にし、創傷治癒を促進する。薬剤分子は、使用される架橋剤および架橋方法に依存して、制御された様式でアルギン酸ゲルから放出され得る。さらに、アルギン酸ゲルは、経口投与または注射することができ、そのため、製薬分野において広範囲で有用である。
【００６５】
アルギン酸塩は、可変量のβ−Ｄ−マンヌロン酸および１〜４個のグリコシド結合によって連結されたそのＣ５−エピマーであるα−Ｌ−グルロン酸によって構成された多糖である。アルギン酸塩がゾル−ゲル中で粘性を与える能力は、その分子量（ＭＭ）に依存する。藻類のアルギン酸塩の分子量（ＭＭ）は、４８〜１８６ｋＤａに亘ることが分かっており（３８）、アゾトバクター・ビネランジー（A. vinelandii）から単離されたいくつかのアルギン酸塩は、８０〜４，０００ｋＤａの範囲のＭＭを示す（Galindo, E.; Pena, C. ; Nunez, C. ; Segura, D. & Espin, G. (2007). Molecular and bioengineering strategies to improve alginate and polyhydroxyalkanoate production by Azotobacter vinelandii. Microbial Cell Factories, 6, 1-1）。サッカリド単量体は、源である種に応じて、連続したマンヌロン酸残基（Ｍ）、グルロン酸残基（Ｇ）、または交互残基（ＭＧ）のブロックに分布する（Smidsrod, O. & Draget, K. (1996). Chemistry and physical properties of alginates. Carbohydrates European, 14, 6-12）。アルギン酸塩のＧブロックは、２価のカチオン（例えば、Ｃａ２＋）との分子間架橋に関与してヒドロゲルを形成する。組成（すなわちＭ／Ｇ比）、配列、Ｇブロック長、および分子量は、アルギン酸塩およびアルギン酸ヒドロゲルの物理的性質を変える重要な因子である（例えば、Ｇ−ブロック長の増加はイオン結合およびゲルの機械的剛性を増加させる）。これらの同じ特性は、薬剤を含有するアルギン酸塩の放出速度と共に、ゲルの安定性を制御する。低いＭ／Ｇ比を有するアルギン酸塩は、強くて脆いゲルを形成し、一方、高いＭ／Ｇ比を有するアルギン酸塩は、弱く柔らかいがより弾性のあるゲルを形成する。最後に、細菌性アルギン酸塩は、マンヌロン酸残基のＯ−２および／またはＯ−３の位置でアセチル化され、その程度は変わり得る（Skjak-Braek, G.; Grasdalen, H. & Larsen, B. (1986). Monomer sequence and acetylation pattern in some bacterial alginates. Carbohydrates Research, 154, 239-250）。分子量、モノマーブロック構造、およびアセチル化の変動性は全て、ゲルポリマーの物理化学的およびレオロジー的特性に影響を及ぼす。
【００６６】
アルギン酸塩の大部分は、２価カチオンであるカルシウムまたはＮａ＋またはＫ＋などの１価イオンを使用し、一方、Ｍｇ２＋などの他のイオンが提案されているが、ゲル化過程を起こすために必要なマグネシウムイオンの濃度は、カルシウムの濃度よりも５〜１０倍高い（Topuz, F., Henke, A., Richtering, W. & Groll, J. (2012). Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8:4877-4881）。アルギン酸塩は、イオンがイオン化から保護されて不溶性のアルギン酸塩を生じるアルギン酸またはアルギン酸カルシウムのように水溶性が低下していてもよい。水溶性アルギン酸塩は、Ｎａ＋またはＫ＋などの１価アニオンまたは一般に水溶性であるＮＨ４などの非極性基を使用して塩を生じさせることによって簡単に作製することができる。
第１のオートファジー調節剤（ＦＡＭ）
【００６７】
上記のように、第１のオートファジー調節剤は、リンカーＬによって結合された２つのフェニル環を含み、フェニル環に結合した１つ以上のＲ１またはＲ２を有する式Ｉの化合物である。いくつかの実施形態では、Ｌは−Ｃ≡Ｃ−であり、これらのＦＡＭ化合物は、一般にフェニル環からフェニル環が直線状である「トラン」として知られている。他の実施形態では、Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−であり、これらのＦＡＭ化合物は、二重結合についてシス型およびトランス型の異性体である「スチルベン」として知られている。いくつかの実施形態では、ＦＡＭ化合物はトランススチルベンである。さらなる他の実施形態では、Ｌは−ＣＲａ＝ＣＲｂ−であり、ここでＲａおよび／またはＲｂはフェニル環またはＨであってもよい。これらは、スチルベンでもあり、この場合「フェニルスチルベン誘導体」であり、トランススチルベンまたはシススチルベンでもあり得る。
【００６８】
構造中に示され、少なくとも１つが存在しなければならない（すなわち、ｍまたはｎの少なくとも１つが≧１である）置換基Ｒ１およびＲ２を含有する２つの「１次」フェニル環が存在する。必要に応じて、任意のＲａおよびＲｂ内に２個以下の「２次」フェニル環もある。各フェニル環（最大４個まで可能、２つの１次および２つの２次）上に、０〜５個の各置換基Ｒ１〜４が存在し得る。特定の実施形態では、１次フェニル環上に１〜３個のＲ１および／または１〜３個のＲ２置換基が存在する。いくつかの実施形態では、１次フェニル環上のＲ１および／またはＲ２の位置は、大部分がパラ位およびメタ位、すなわち一方のフェニル環上の３、４、または５位であり、他方のフェニル環上の３’、４’および５’位にあるが、オルト位（２、２’、６、および６’）に置換基を有することも可能である。第１のフェニル環上に１個、２個、または３個のＲ１置換基が存在し、それに対応して第２のフェニル環上に０〜３個のＲ２置換基が存在してもよい。逆に、第２のフェニル環上に１個、２個、または３個のＲ２置換基が存在し、それに対応して第１のフェニル環上に０〜３個のＲ１置換基が存在してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、２次フェニル環は、１〜３個の置換基Ｒ３およびＲ４を含み得る。これらの中の全ての順列が可能であり、例えば、１つのＲ１および１つのＲ２、２つのＲ１および２つのＲ２、３つのＲ１および３つのＲ２、１つのＲ１および２つのＲ２、１つのＲ１および３つのＲ２、２つのＲ１および１つのＲ２、２つのＲ１および２つのＲ２、２つのＲ１および３つのＲ２、３つのＲ１および１つのＲ２、または３つのＲ１および２つのＲ２が可能である。Ｒ３およびＲ４でも同様である。各Ｒ１〜４は、独立して選択され、２つ以上存在する場合、それらは同じでも異なっていてもよい。いくつかの特定の第１のオートファジー調節剤の例は、表Ａに与えられており、トランはスチルベンの類似体であるので、詳細な構造は各個々の化合物について必要ではない。
【００６９】
【表１−１】
2018510902.tif 000004
【００７０】
【表１−２】
2018510902.tif 000005
【００７１】
【表１−３】
2018510902.tif 000006
【００７２】
【表１−４】
2018510902.tif 000007
【００７３】
【表１−５】
2018510902.tif 000008
【００７４】
【表１−６】
2018510902.tif 000009
【００７５】
【表１−７】
2018510902.tif 000010
【００７６】
【表１−８】
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【００７７】
【表１−９】
2018510902.tif 000012
【００７８】
【表１−１０】
2018510902.tif 000013
【００７９】
スチルベン化合物の多くは、よく研究されている、天然に存在する分子であり、いくつかは市場において容易に入手可能である。他のものは、Ali, M.A., Kondo, K. and Tsuda, Y. (1992).Synthesis and Nematocidal activity of Hydroxy stilbenes.Chem.Pharm.Bull.40(5): 1130- 1136;およびThakkar, K., Geahlen, R.L. and Cushman, M. (1993).Synthesis and Protein-tyrosine kinase inhibitory activity of polyhydroxylated stilbene analogues ofpiceatannol.J. Med.Chem.36: 2950-2955)に記載されている方法などの常法により合成され得る。フェニルスチルベン誘導体、すなわち、少なくとも１つのＲａまたはＲｂがフェニル環であるフェニルスチルベン誘導体、および多くの他のスチルベンは、Zhenlin Bai, Substituted Stilbenes and 1 ,2-Diaryl-l ,2-diazidoethanes as Potential Anticancer Agents: Syntheses and Estrogenic/Antiestrogenic Properties in MCF-7-2a Cells, im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universitat Berlin (2006)の学位論文に示される方法に従って合成され得る。グルコシド誘導体は、国際公開第２００７／０２０６７３Ａ１号に記載されている手順に従って得られ得る。トランは、Docherty & Tsaiの米国特許第６，５９９，９４５Ｂ２号に記載されている一般的な手順を用いて合成され得る。
【００８０】
上記のＦＡＭ化合物は通常極性であり、それぞれの末端に特定の電気陰性置換基（例えば、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＮＯ２、−ハロ、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒなど）を有することに留意することができる。これは必須ではないと考えられるが、分子が溶液状態でリオトロピックな、または部分的に規則的な構造をとる液晶様挙動を与えることが望ましい場合がある。
【００８１】
ＦＡＭ化合物は、上記で同定した化合物の塩も含む。ＦＡＭ化合物、特にそれらのモノまたはポリヒドロキシル化化合物は、ｐＨに依存して１つ以上のプロトンを容易に放出してアニオンを形成する。このようなアニオンは、１価、２価、および３価のカチオンなどのカチオンと結合して塩を形成し得る。１価のカチオン（Ｍ＋）では、単一のＦＡＭが結合してＭ＋ＦＡＭ−塩を形成する。同様に、２価カチオン（Ｍ２＋）では、２つのＦＡＭ分子が結合して、Ｍ２＋（ＦＡＭ−）２塩を形成し、３価カチオン（Ｍ３＋）では、３つのＦＡＭ分子が結合してＭ＋３（ＦＡＭ−）３塩を形成する。塩はしばしば水性媒質に容易に溶解でき、このことにより、製剤化が容易になり得る。限定されないが例示的なＦＡＭ塩形成のためのカチオンには、Ｎａ＋またはＫ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋Ｆｅ２＋、およびＦｅ３＋が含まれる。
補助的オートファジー調節剤（ＡＡＭ）および製剤
【００８２】
特定の実施形態では、ＦＡＭは、補助的オートファジー調節剤（ＡＡＭ）との併用で使用される。ＡＭＭは、使用する場合、本明細書に記載したいくつかの形態のいずれかをとり、以下の分類：ビタミン、アミノ酸、酸性糖、およびキニーネ誘導体のいずれかに入り得る。
ビタミン
【００８３】
ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＫは、全てＡＡＭとして有用であり得る。慣習により、用語「ビタミン」は、（ビタミンよりも多くの量が必要とされる）栄養素のミネラル、必須脂肪酸、または必須アミノ酸などの他の必須栄養素も、健康を促進する他の多数の栄養素も含まない。現在、１３種のビタミンが広く認知されている。ビタミンは、それらの生物学的および化学的活性によって分類され、その構造によっては分類されない。したがって、各「ビタミン」は、全てが特定のビタミンに関連する生物学的活性を示すいくつかの「ビタマー」化合物を指す。このような化学物質のセットは、下記のような複数の化合物を含む「ビタミンＡ」などのアルファベット順のビタミンの「包括的記述語」名称の下にグループ分けされている。ビタマーは、定義上、体内のビタミンの活性型に変換可能であり、時には相互転換可能でもある。特定の実施形態では、一般に長鎖脂肪族側鎖を有しないビタミンの塩形態は、優れたＡＡＭである。特定の実施形態において、酸素含有ビタミンは、好適なＡＡＭである。
【００８４】
また、ほとんどのビタミンは、ＡＡＭの範囲内でもある塩を形成する。例えば、ビタミンは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、または鉄などのカチオン性元素と結合して塩を形成し得る。さらに、ビタミンは、ジエタノールアミン塩、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール塩、トリエタノールアミン塩、モルホリン塩、ピペラジン塩、ピペリジン塩、アルギニン塩、リシン塩、およびヒスチジン塩を形成することができる。いくつかのビタミンは、酢酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩などを形成する。
【００８５】
ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、カロテノイド、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、キサントフィル、クリプトキサンチン、１３−シスレチノイン酸、１３−トランスレチノイン酸、トレチノイン、ＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）、ルチン、１１−シス−レチナール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチナール、レシチン、レチニルエステル、９−シス−β−カロテン、パルミチン酸レチニル、アシトレチン、ビタミンＡ２（３，４−デヒドロレチノール）、Ａ３（３−ヒドロキシレチノール）、およびそれらの塩を含むがこれらに限定はされない脂質可溶性不飽和イソプレノイド化合物の一群を指す。これらのイソプレノイドの全ての異性体および立体化学的形態が本発明に包含される。
【００８６】
ビタミンＢには、以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない：チアミン（Ｂ１）；リボフラビン（Ｂ２）；ナイアシンまたはナイアシンアミド（Ｂ３の形態）；パントテン酸、パンテノール、パントテノール、およびパントテン酸カルシウム（Ｂ５の形態）；ピリドキシン、ピリドキシン５’−ホスフェート、ピリドキサール、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール５’−ホスフェート、ピリドキサミン、ピリドキサミン５’−ホスフェート、４−ピリドキシン酸（Ｂ６の形態）；ビオチン、ビタミンＨ、または補酵素Ｒ（Ｂ７の形態）；葉酸、葉酸塩、ビタミンＭ、ビタミンＢｃ、プテロイル−Ｌ−グルタミン酸、およびプテロイル−Ｌ−グルタミン酸塩（Ｂ９の形態）；ならびにコバラミン、シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン、アデノキシルコバラミン（Ｂ１２の形態）; ならびにそれらの塩。
【００８７】
ビタミンＣは、アスコルビン酸、そのアスコルビン酸アニオン、およびアスコルビン酸塩、ならびにアスコルビルパルミテートおよびそれらの塩（例えば、アスコルビルパルミテート、マグネシウムアスコルビルパルミテート、マンガンアスコルビルパルミテート、カルシウムアスコルビルパルミテート、亜鉛アスコルビルパルミテート、鉄アスコルビルパルミテート）、ベンジルアスコルベート、および２−アスコルビルホスフェートを指す。
【００８８】
ビタミンＤは、脂溶性セコステロイド分子の一群を指し、カルシジオール、カルシフェロール（ＩＮＮ）、エルゴカルシフェロールおよびルミステロール（Ｄ１の形態）；エルゴカルシフェロール、ｆｒｏｍｅｒｇｅｒｇｏｌ、および２５−ヒドロキシビタミンＤ２（Ｄ２の形態）；コレカルシフェロール、７−デヒドロコレステロール、および２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（または２５−ヒドロキシビタミンＤ３、略して２５（ＯＨ）Ｄ３、（Ｄ３の形態）；２２−ジヒドロエルゴカルシフェロール（Ｄ４）；シトカルシフェロール（Sitocalciferol）、７−デヒドロシトステロール（Ｄ５）；２５−Ｄ−グルクロン酸、２５−Ｄ−ヘキスロン酸、２５−ヒドロキシビタミンＤ２−２５−β−Ｄ−グルクロニド、およびそれらの塩を含むが、これらに限定はされない。
【００８９】
ビタミンＥは、トコフェロールまたはトコトリエノールのいずれかである脂溶性化合物の一群を指し、その中で最も活性なものはα−トコフェロールである。他のトコフェロールには、ベータ、ガンマ、デルタが含まれる。同様に、トコトリエノールも、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタの形態で存在する。これらのトコフェロールおよびトコトリエノールおよびそれらの塩の全ての異性体および立体化学形態が本発明に包含される。例えば、合成ビタミンＥは、８種の異性体の混合物であり、通常は「オールラック（all-rac）」または「ｄｌ」と表示される。トコフェロールおよびトコトリエノール誘導体には、トコフェロールの全てのＲおよび全てのＳ立体異性体（ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＳＲ、ＳＲＲ、ＲＳＳ、ＳＲＳ、およびＳＳＳ）ならびにトコトリエノールの２つの立体異性体（例えばＲまたはＳ−α−トコトリエノール）が含まれる。他の例には、以下が含まれる：コンジュゲートされたビタミンＥ分子；ビタミンＥまたはトコフェロールまたはトコトリエノールエステル；アルファ−トコフェリルアセテート；ビタミンＥ分子をカルボン酸でエステル化することによって形成される化合物の一群を含むビタミンＥエステル（例えば、アルファ−トコフェリルスクシネート）；多くの場合、他のトコフェロール（β、γ、δ、ε、ζ、η）の２種以上のエナンチオマーの混合物であるか、またはトコトリエノール、ｎ−プロピオネート、またはリノレエート、例えばビタミンＥアセテートまたはアルファ−トコフェリルアセテートとして存在するｄ−α−トコフェロール。ビタミンＥの水溶性形態には、以下が含まれる：Ｒ−（＋）−アルファリポ酸マグネシウム、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−トラメチルクロマン−２−カルボン酸（トロロクス）、またはビタミンＥの塩。
【００９０】
ビタミンＫは、２−メチル−１，４ナフトキノンコアおよび３位に側鎖を有する化合物の一群を指す。ビタマーＫ１（フィロキノン、フィトメナジオン、またはフィトナジオン）およびＫ２（メナキノン）は天然に存在する。実際、Ｋ２は１つではなく、様々な長さのイソプレノイド側鎖を有する一連の化合物であり、メナキノンファミリーは、ＭＫ−ｎと呼ばれることもあり、ｎはイソプレノイド基の数であり、ｎ＝４が最も一般的である。さらに、側鎖を持たないＫ３（メナジオン）、Ｋ４、Ｋ５（２−メチル−４−アミノ−１−ナフトール塩酸塩）、ビタミンＫ６（２−メチル−１，４−ナフタレンジアミン）、およびＫ７を含むいくつかの合成ビタミンＫ類似体が作製されている。多くのビタミンＫ化合物は塩を形成し、２価塩はＡＡＭとして最も有用である。例えば、カチオンの塩は、以下の形態をとり得る：Ｍが２価カチオンであるＭ（Ｋｉ）２、またはＭが３価カチオンであるＭ（Ｋｉ）３。特定の実施形態では、有用なＡＡＭには、ビタミンＫの二量体およびＣａまたはＭｇなどの二価カチオンの塩を含む。
【００９１】
ビタミンＰ（幾分古い用語ではあるが）は、２つのフェニル環（ＡおよびＢ）ならびに複素環（Ｃ）からなる１５炭素骨格の一般構造を有するフラボノイドの一群を指す。この炭素構造はＣ６−Ｃ３−Ｃ６と略記することができる。置換基の性質および骨格上の位置に基づいて、フラボノイドは以下の３つの化学分類の１つに入る：１）フラボンコア（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）をベースとするフラボノイドまたはバイオフラボノイド；（２）３−フェニルクロメン−４−オン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）コア構造をベースとするイソフラボノイド；および（３）４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）コア構造をベースとするネオフラボノイド。
アミノ酸
【００９２】
特定のアミノ酸およびその誘導体もＡＡＭとして有用である。よく知られているように、アミノ酸は一般式
【００９３】
【化２】
2018510902.tif 000014
【００９４】
を有し、ここで、Ｒは、いくつかのよく認知されている側鎖のいずれかである。汎用コードでコード化された２０種のアミノ酸があり、ヒトは、これらのうちの１１種を合成し、そのため、他の９種は「必須」アミノ酸となっており、食事で摂取しなければならない。２０種とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。これらのアミノ酸およびこれらのアミノ酸の塩の全ての異性体および立体化学形態が本発明に包含される。特定の実施形態では、有用なアミノ酸には、チロシン、フェニルアラニン、システイン、セリン、スレオニン、およびトリプトファンが含まれるが、これらに限定されない。さらに、特定のアミノ酸誘導体、例えばリコピンおよびＮ−アシルシステイン（ＮＡＣ）が有用である。
酸性糖
【００９５】
酸性糖には、４〜６員アルドースおよびケトースから形成された単糖類および二糖類が含まれる。それらは、プロトンが多くのヒドロキシル基から放出されやすいため、通常酸性である。有用な単糖には、エリトロース、エリスロース（erythulose）、トレオース、リボース、リブロース、アラビノース、キシロース、キシルロース、グルコース、デキストロース（またはＤ−グルコース）、マンノース、グラクトース、フルクトース、およびソルボースが含まれるが、これらに限定されない。有用な二糖類には、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、およびトレハロースが含まれるが、これらに限定されない。これらの糖類の全ての異性体および立体化学的形態が本発明に包含される。
キノン誘導体
【００９６】
キノン誘導体には、１、２、または３個の環を有するものが含まれ、したがって、
【００９７】
【化３】
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【００９８】
をベースとする１，４−ベンゾキノン、
【００９９】
【化４】
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【０１００】
をベースとする１，４−ナフトキノン、
【０１０１】
【化５】
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【０１０２】
をベースとする９，１０−アントラキノン、
【０１０３】
【化６】
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【０１０４】
およびをベースとする１，３インダンジオンが含まれる。これらのキノン誘導体は、ケトン以外の任意の位置に置換基を含んでいてもよく、その置換基は一般にヒドロキシル、メトキシ、メチル、エチル、ハロ、およびアミノから選択される。１〜４のヒドロキシル置換基が特に有用である。例えば、ヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン誘導体の他の例には、２−ヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、２，３−ジヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、２，３，５−トリヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、および２，３，５，６−テトラヒドロキシ−１，４−ベンゾキノンが含まれる。他の１，４−ベンゾキノン誘導体には、以下が含まれる：２，６−ジメトキシ−１，４−ベンゾキノン、２，３，５，６−テトラメチル−１，４−ベンゾキノン、１，４−ベンゾキノンテトラカルボン酸、ブラテラキノン、２，５−ジクロロ−３，６−ジヒドロキシベンゾキノン（クロラニル酸）、および２−イソプロピル−５−メチルベンゾ−１，４−キノン（チモキノン）。
【０１０５】
モノ−、ジ−、およびテトラ−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノンの例としては、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（ラウソン）、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン）、６−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，３−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，６−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，７−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、５，６−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、５，７−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（ナフタザリン）、６，７−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、および２，３，５，７−テトラヒドロキシナフトキノン（スピノクロムＢ）が挙げられる。他の１，４−ナフトキノン誘導体には、メナジオン（ビタミンＫ３または２−メチル−１，４−ナフトキノンと呼ばれることもある）が含まれる。
【０１０６】
９，１０アントラキノロンの例としては、ジヒドロキシ誘導体１，２−ジヒドロキシアントラキノン（アリザリン）、１，３−ジヒドロキシアントラキノン（プルプロキサンチン、キサントプルプリン）、１，４−ジヒドロキシアントラキノン（キニザリン）、１，５−ジヒドロキシアントラキノン（アントラルフィン）、１，６−ジヒドロキシアントラキノン、１，７−ジヒドロキシアントラキノン、１，８−ジヒドロキシアントラキノン（ダントロン、クリサジン）、２，３−ジヒドロキシアントラキノン、２，６−ジヒドロキシアントラキノン、および２，７−ジヒドロキシアントラキノン；トリヒドロキシ誘導体１，２，３−トリヒドロキシアントラキノン（アントラガロール）、１，２，４−トリヒドロキシアントラキノン（プルプリン）、１，２，５−トリヒドロキシアントラキノン（オキシアントラルフィン）、１，２，６−トリヒドロキシアントラキノン（フラボプルプリン）、１，２，７−トリヒドロキシアントラキノン（イソプルプリン、アントラプルプリン）、１，２，８−トリヒドロキシアントラキノン（オキシクリサジン）、１，３，５−トリヒドロキシアントラキノン、１，３，６−トリヒドロキシアントラキノン、１，３，７−トリヒドロキシアントラキノン、１，３，８−トリヒドロキシアントラキノン、１，４，５−トリヒドロキシアントラキノン、１，４，６−トリヒドロキシアントラキノン、１，６，７−トリヒドロキシアントラキノン、および２，３，６−トリヒドロキシアントラキノンが挙げられる。
【０１０７】
塩複合体は、すでに記載したように、ＦＡＭおよび／またはＡＡＭ化合物から形成されていてもよい。さらに、複合体は、ＦＡＭ化合物と特定のＡＡＭ化合物との間に形成されてもよい。このようなＦＡＭ＋ＡＡＭ複合体には、ビタミンを含むもの、例えばアスコルビン酸塩およびアスコルビルパルミテート；アミノ酸を含むもの、例えばアルギン酸塩、リシン塩（lysinate）、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；ならびに酸性糖を含むもの、例えばグルコシド、リボシド、ガラクトシド、マンノシドなどが少なくとも含まれる。実施例４は、ＦＡＭおよびＡＡＭ化合物の塩および複合体の両方のいくつかの具体例を与える。
【０１０８】
液晶としてのＦＡＭ化合物の性質は、創傷治癒におけるそれらの役割を促進および/または媒介し得る。液晶の極性の性質は、それらが自己組織化してポリマー様構造になることを可能にし、したがって、それらは、（ｉ）独自のヒドロゲルを生じさせること、および／または（ｉｉ）これらの分子を従来のヒドロゲルに添加することによって、ゾル−ゲル転移状態を強化して独特な一組の液晶ヒドロゲルを作製することができる。これらのゲルは、強い化学結合から弱い化学結合といった任意の様々な前述のゲルの種類を作り出すように、または生分解性ゲルを作り出すように改変されていてもよい。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これらのＦＡＭ分子は創傷治癒への応用に有用であると考えられるが、その一つの理由は、分子自体が高次構造を組み立てるコラーゲン原線維のように振る舞い、創傷治癒中の足場および細胞遊走に役立つことができることにある。さらに、これらの液晶ヒドロゲルの添加は、創傷治癒過程の間の瘢痕またはケロイド形成のリスクを低減する適切なコラーゲンの整列および配向を促進し得る。
【０１０９】
ヒドロゲル製剤に加えて、ＦＡＭ化合物の別の有用な製剤はシクロデキストリンを含むものである。一般的なシクロデキストリン配合物は、約１：１、１．５：１、１．５：２、１．５：３、１：３、１．５：４、１：４、１．５：５、１：５、１．５：６、１：６、１．５：７、１：７、１．５：８、１：８、１．５：９、１：９、１．５：１０、または１：１０のＦＡＭ：シクロデキストリンの比を有するＦＡＭからなる。これらの比は、シクロデキストリン中のＦＡＭの充分な溶解を可能にする。加えられるＡＡＭは、約０．１％〜約９９％（ｗ／ｖ）、例えば、０．１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、５０〜６０％、６０〜７０％、および８０〜９０％（ｗ／ｖ）またはそれ以上であり得る。
オートファジー調節におけるＦＡＭおよびＡＡＭの有用性
【０１１０】
近年、科学者は、様々な重篤な疾患を治療する方法として、オートファジー経路の調節の効果を研究してきた。実際、オートファジーの調節不全は、心臓病、癌、および糖尿病を含む主要な疾患に関連している（Klionsky D.J. (2010).The Autophagy Connection.Developmental Cell.Jul 20; 19(1): 11-2.からの図２を参照されたい。）この論文は、オートファジー経路と主要なヒト疾患との間の関連性を記載する。個々の「ミオパシー」を命名するのではないが、この経路を調節する能力は、疾患の転帰の調節と主要な関連性がある。病状に応じて、オートファジーの細胞のレベルをアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることが有益であり得る。
【０１１１】
いくつかの病状では、病理的原因は、抑制されたオートファジー活性またはオートファジーの活性化に関連しており、その関連するシグナル伝達経路は、炎症の抑制をもたらす。したがって、オートファジーをアップレギュレートすることが有益であり得る疾患または状態には、創傷治癒、毛髪再成長の促進、細菌感染、炎症、ウイルス感染、パーキンソン病、老化、アルツハイマー、神経変性疾患、神経障害、循環器疾患、熱傷、心臓病、アルツハイマー病、アテローマ性動脈硬化症、動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、糖尿病、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、アミロイドーシス、滑液包炎、皮膚炎、血管炎、炎症を伴う自己免疫疾患、血液疾患、再生不良性貧血、子宮内膜症、肝炎、ヘルペス、ＨＩＶ、多発性硬化症、網膜剥離、老化性黄斑変性症、網膜色素変性、およびレーバー先天性黒内障、リソソーム蓄積症、関節炎、乾癬、骨減少症、骨粗鬆症、手術瘢痕、外科的癒着、宇宙旅行（骨密度障害）、腱炎、および潰瘍性大腸炎が含まれる。
【０１１２】
他の病状では、病理的原因は、オートファジー活性の過剰発現、ならびにオートファジーおよびその関連シグナル伝達経路の活性化に関連する。したがって、オートファジーをダウンレギュレートすることが有益である疾患または状態には、老化、癌、多嚢胞腎および肝疾患、腎疾患、肝疾患、喘息、糖尿病性網膜症、線維筋痛症、強直性脊椎炎、セリアック病、グレーブス病、狼瘡、代謝性疾患、腎炎、関節リウマチ、骨溶解、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）障害、臓器および組織移植、強皮症、および敗血症が含まれる。
【０１１３】
創傷治癒において、オートファジーレベルの上昇は、組織の保護に役立ち、炎症を減少させ、プロコラーゲン、ヒアルロナン、およびエラスチンの合成を促進する。本明細書に示されているように、ＦＡＭおよびＡＡＭ化合物は、ＵＶ照射暴露による損傷後の創傷治癒、毛髪成長、および皮膚修復を促進するために単独または組み合わせて使用されている。
【０１１４】
細菌感染では、様々な種類の細菌が、細菌の細胞取り込みを防止して、最終的に細菌のオートファゴリソソーム分解をもたらすオートファジー経路を妨害しようとする。２つの臨床的に重要な皮膚病原菌、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌は、オートファジー経路を妨害する（I. Nakagawa, et al, Autophagy defends cells against invading group A Streptococcus, Science 306, 1037-1040 (2004);および Schnaith, et al, Staphylococcus aureus subvert autophagy for induction of caspase-independent host cell death, J BiolChem 282, 2695-2706 (2007)を参照されたい）。Ａ群連鎖球菌による侵襲性皮膚感染は、カプセル化による細菌の細胞取り込みの防止によって特徴付けられ、細菌がケラチノサイトに取り込まれると、大部分の連鎖球菌は数時間以内に死滅する（H. M. Schrager, J. G. Rheinwald and M. R. Wessels: Hyaluronic acid capsule and the role of streptococcal entry into keratinocytes in invasive skin infection, J Clin Invest 98, 1954-1958 (1996)）。Nakagawaら（上記で引用）は、オートファジーが殺活性に関与していることを示した。いくつかの細菌は生存するが、細胞外連鎖球菌の数の減少は部分的な保護効果を有する可能性がある。ケラチノサイトではＡ群連鎖球菌に対するオートファジーの作用の機構的研究は行われていないため、皮膚におけるこの推定上の抗菌戦略の妥当性および効率を理解するためにはさらなる研究が必要であろう。黄色ブドウ球菌は、そのアルファ毒素を介してオートファジーを誘発する（Schnaith et al, above, and M. B. Mestre, C. M. Fader, C. Sola and M. I. Colombo: Alpha-hemolysin is required for the activation of the autophagic pathway in Staphylococcus aureus-infected cells, Autophagy 6, 110-125 (2010)）。孔形成毒素は、細胞ホメオスタシスを再確立するためのレスキュー機構としてオートファジーを誘発する栄養素およびエネルギーレベルの低下を引き起こす（N. Kloft, et al: Pro-autophagic signal induction by bacterial pore-forming toxins, Med Microbiollmmunol 199, 299-309 (2010)）。オートファジーがインビボでの皮膚への黄色ブドウ球菌の感染を抑制するか、または増強するかは、決定されていない。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：本発明の特定のＦＡＭの合成：以下の化合物を調製し、表Ｂに示す識別番号を与えた。
【０１１６】
【表２−１】
2018510902.tif 000019
【０１１７】
【表２−２】
2018510902.tif 000020
【０１１８】
スチルベン化合物（ＢＭ２ｘｘｘシリーズ）は、上記のAli, M et al 1992およびThakkar, K. et al 1993に記載の手順に従って合成／入手した。トラン化合物（ＢＭ３ｘｘｘシリーズ）は、Docherty & Tsaiの米国特許第６，５９９，９４５Ｂ２号に記載の手順に従って合成した。
【０１１９】
実施例２：４−ヒドロキシ−４’メトキシトランの簡略化した合成手順
【０１２０】
【化７】
2018510902.tif 000021
【０１２１】
４−ヒドロキシ−４’−メトキシトラン（４−（（４’−メトキシフェニル）エチニル）フェノール）の合成手順は、(Pavia, M. R. ; Cohen, M. P. ; Dilley, G. J. ; Dubuc, G.R. ; Durgin, T. L. ; Forman, F. W. ; Hediger, M. E. ; Milot, G. ; Powers, T. S. ; Sucholeiki, I. ; Zhou, S. ; Hangauer, D. G. The design and synthesis of substituted biphenyl libraries. Bioorg. Med. Chem. 1996,4, 659-666. , Jeffery, T. Heck-type reactions in water. Tetrahedron Lett, 1994,35, 3051-3054, Jeffery, T. ; Galland, J. C.Tetraalkylammonium salts in heck-type reactions using an alkali metal hydrogen carbonate or an alkali metal acetate as the base. Tetrahedron Lett, 1994, 35, 4103-4106, and Schmidt-Radde, R. H.; Vollhardt, K.; Peter C. The total synthesis of angular [4]- and [5]phenylene J Am Chem Soc, 1992, 114, 9713-9715)から改変されたヘック型反応であった。得られた生成物は黄色がかった粉末であり、1HNMR (CDCl3, 300MHz): 5ppm:7.44(d, 4H, J=8.7, Ar-H), 6.89(d, 2H, J=8.7, Ar-H), 6.82(d, 2H, J=8.7, Ar-H), 4.89(s, 1H, OH), 3.85(s, 3H, CH3O)を用いて確認した。得られた生成物は純度９８．２％であり、以後の全ての試験に使用した。
【０１２２】
実施例３：２，４，４’−トリメトキシトランの合成手順概要：合成は、実施例２の合成と類似のヘック型反応であった。
【０１２３】
【化８】
2018510902.tif 000022
【０１２４】
得られた生成物はオフホワイトの粉末であり、1HNMR (CDCl3, 400MHz): 5ppm: 7.47(d, 2H, J=6.4, Ar-H), 7.40(s, 1H, Ar-H), 6.85(d, 2H, J=6.8, Ar-H), 6.47(dd, 2H, J=2.4, Ar-H), 3.89(s, 3H, CH3O), 3.82(s, 6H, 2CH3O)を用いて確認し、純度９９．３％であることが分かった。
【０１２５】
実施例４：ＦＡＭ塩ならびにＦＡＭおよびＡＡＭ塩複合体の融点：全ての塩は、水酸化マグネシウム、酸化亜鉛、アスコルビン酸、またはアスコルビルパルミテートと充分な量の各スチルベン、トレン、または組み合わせを配合して、塩溶液を作製することによって製造した。次いで、各溶液を２０ｍＬのシンチレーションバイアル中で４０℃に設定したロータリーエバポレーター（Centrifan、Harvard Biosciences）を使用して乾燥させ、エタノールと氷の混合物で蒸発させてよりゆっくりと蒸発させた。蒸発させて完全に乾燥させたら、塩を微粉末に粉砕し、塩の形成を確認するためにその融点を使用した。解点（以下の表Ｃ）は、デジタル読み出しを与える温度プローブおよび熱電対を装備したMeltemp II装置を用いて測定した。装置を較正し、既知の融点を有する化合物を試験して未知化合物の分析前に較正を確認した。
【０１２６】
【表３】
2018510902.tif 000023
【０１２７】
実施例５：ヒト真皮線維芽細胞におけるＬＣ３−ＩＩ（微小管関連タンパク質１軽鎖３）染色：染色方法は、Furuta, S, (2000) Ras is involved in the negative control of autophagy through the class I PI3 -kinase, Oncogene.23: 3898-3904; Ge, J.N. et al, (2008) Effect of starvation-induced autophagy on cell cycle of tumor cells, Chinese Journal of Cancer27:8 102-108; and Settembre, C. et al (2011) TFEB Links autophagy to lysosomal biogenesis, Science 332: 17 1429-1433に記載の手順から改変したものである。ＨＤＦｎ（ヒト真皮線維芽細胞新生児、ThermoFisher）細胞を、５，０００細胞／ウェルで黒色ウェルの透明な底板（Coning，Corning，NY）に播種した。次いで細胞を培地のみ、ＦＡＭ、ＡＡＭ、またはそれらの組み合わせで８時間処理した。処理時間後、細胞を室温で１５分間４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定した。次いで、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１時間ブロックした。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＬＣ３−ＩＩＢ（ウサギモノクローナル抗体、Thermo-Fisher）の一次抗体で３時間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳですすぎ、二次蛍光抗体（Alexafluor 488ウサギ抗ヤギ、Thermo-Fisher）を３０分間加えた。次いで、プレートを、SpecraMax i3X（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して画像化し、SoftMax Pro 6.5.1ソフトウェアを使用してＬＣ３−ＩＩ陽性細胞の数を測定した。結果を図３に示す。
【０１２８】
実施例６：オートファジー調節およびホルメシス：ＬＣ３−ＩＩウェスタンブロット：ヒト真皮線維芽細胞を、Ｔ２５組織培養処理フラスコ当り１×１０６細胞の密度で播種した。次いで細胞をＦＡＭ、ＡＡＭ、または組み合わせで８時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、１×ＰＢＳで洗浄し、氷上でＲＩＰＡ緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤で溶解した。細胞を超音波処理し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce Scientific）を実行してタンパク質濃度を測定した。次いで、濃度をサンプル当り１００μｇに標準化し、ローディングダイおよび適切な分子量マーカーを含む１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に流した（全ての試薬はNational Diagnosticsから購入した）。次いで、ゲルを移し、ブロックし、ＭＡＰＬＣ３−２（Thermo-Fisher）に対する一次モノクローナル抗体を膜に加え、一晩インキュベートさせた。適切な洗浄後、Ｅｕ標識二次抗体（Molecular Devices）を加え、Scan Laterモジュールを備えた Spectramax i3xを用いてメンブレンを画像化した。その後、ゲルを剥がし、アクチンについて再プローブして、適切な負荷を確認した。SoftMax Pro 6.5.1ソフトウェアを使用して平均バンド強度の変化を測定した。結果を図４および５に示す。
【０１２９】
実施例７：オートファジー、創傷治癒、および皮膚：非常に低いレベルのオートファジーが皮膚に存在し、タンパク質凝集体、損傷したオルガネラを分解し、メラノソーム中のＦＧＦ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＭＴＯＲシグナル伝達経路を介して皮膚の色を変えるように機能する（Belleudi, et al.The receptor tyrosine kinase FGFR2WKGFR controls early differentiation of human keratinocytes, PLoS One 2011; 6:e24194; PMID:21957444; http://dx.doi. org/10.1371/journal.pone.0024194; and Belleudi, et al, Expression and signaling of the tyrosine kinase FGFR2b/KGFR regulates phagocytosis and melanosome uptake in human keratinocytes.FASEB J 2011; 25: 170-81; PMID:20844240; http://dx.doi.org/10.1096/fj.10-162156.）。ヒトのケラチノサイトのオートファジーの誘発はｐ６２を負に調節し、過剰な炎症および（マクロファージおよびＰＭＮのリソソームに見られる）カテリシジンの誘発を防止する（Lee, et al Autophagy Negatively Regulates Keratinocyte Inflammatory Responses via Scaffolding Protein p62/SQSTMl .J Immunol, published online 15 December 2010）。深部創傷２度熱傷モデルでは、オートファジー誘発因子ラパマイシンは、自食性小胞形成を促進し、創傷再上皮化時間を改善し、ＩＬ−８レベル、メタンジカルボン酸アルデヒドレベル（ＭＤＡ  酸化ストレスの指標）、およびミエロペルオキシダーゼレベル（次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、および塩素アニオン（Ｃｌ−）の産生の指標）を減少させることが示された（Xiao et al, (2013) Rapamycin reduces burn wound progression by enhancing autophagy in deep second-degree burn in rats.Wound Rep.Reg. 21: 852-859）。このことは、皮膚におけるオートファジーの誘発が抗炎症効果をもたらすことを示している。ラパマイシンは、用量依存的に使用される場合、様々な疾患を予防または治療することができる公知のホルメシス化学物質である。
【０１３０】
この特許に記載されている製剤は、以下に示すように、創傷閉鎖および再上皮化の増加を含む様々な疾患および病状の治療のために、用量依存的な様式でオートファジーを誘発することが示されたホルメシス物質である。
【０１３１】
実施例８：プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）：ＨＤＦｎ細胞をＴ−２５フラスコに、フラスコ当り１×１０６細胞の密度で播種し、一晩付着させて拡散させた。次いで、細胞を対照培地、ＦＡＭ、ＡＡＭ、または組み合わせで８時間処理した。トリプシン、続いてトリプシン中和剤を用いて細胞を除去し、遠心沈殿して細胞ペレットを回収した。細胞を氷冷１×ＰＢＳで洗浄し、次いで氷上でＲＩＰＡ緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤で溶解した。サンプルを遠心沈殿し、アリコートに分け、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイすることができるまで凍結させた。細胞を超音波処理し、キット説明書で推奨されるように１：５に希釈した。次いで、サンプルをＡＫＴ  ＥＬＩＳＡ（Thermo-Fisher）を用いてアッセイし、濃度をＡＫＴ標準曲線を用いて測定した。結果を図６に示す。
【０１３２】
実施例９：線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）：ＨＤＦｎ細胞を６ウェル組織培養処理プレートに播種し、７０〜８０％（細胞／面積）のコンフルエンシーに到達させた。次いで、細胞スクレイパーを用いて、細胞単層への損傷をシミュレートするためにプレートの中央に「傷」を作った。次いで、皿を培養液で洗浄して細胞残屑を除去した。次いで、細胞を対照培地、ＦＡＭ、ＡＡＭ、または組み合わせで処理し、次いで３、８、および２４時間にサンプルをとった。サンプルを遠心沈殿し、アリコートに分け、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイすることができるまで凍結させた。ＥＧＦストレプトアビジン−ＨＲＰ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、既知の標準曲線と比較した各サンプル中のＥＧＦの濃度を測定した。結果を図７に示す。
【０１３３】
実施例１０：創傷治癒についてのＬＣＢのインビボ評価：２０の５〜６週齢のBalbc/J（ストック番号０００６５１）オスマウスを、カリフォルニア州サクラメントのインビボ研究室のJackson Labsに移した。マウスは、識別のために耳切りをし、ＨＥＰＡ濾過空気を用いて個々にかつ確実に換気されたポリカーボネートケージに収容した。Bed-o-cobというトウモロコシ穂軸の寝床を使用し、ケージを２週間毎に交換した。動物室は、制御された１２時間の明／暗サイクルを有する人工蛍光灯で全体に照明を施す。動物室の常温および相対湿度の範囲は、それぞれ２２±４℃および５０±１５％である。動物室は１時間に１５回の空気交換が行われるように設定されていた。濾過した水道水をｐＨ２．８〜３．１に酸性化し、げっ歯類の固形飼料を自由給餌した。５〜７日の順化後、マウスを体重により１０匹ずつの２コホートにランダム化した。研究０日目では、マウスを麻酔し、マウスの背側（背中）に２つの全層切除創傷（約６ｍｍ）を作った。創傷の１つを半密封ポリウレタン包帯（Tegaderm（商標））を用いて覆った。包帯は、創傷の日（ｄ０）から連続５（５）日間にわたって創傷を覆った。４−ヒドロキシ−４’−メトキシトランの用量は、これまでのヘルペスウイルス研究でマウスの病変治癒を促進した用量をベースとした。５、７、９、および１１日目に創傷の測定を行った。各マウスの創傷のデジタル画像を撮影した。試験薬剤は粘性のペーストであり、収縮による交差汚染および創傷閉鎖を排除するために、創傷を糊付けしたサドルで適所で囲んだ。したがって、創傷面積の変化は再上皮化によるものである。５日間、全ての創傷をグリセリン（対照）またはグリセリンおよび試験薬剤で覆う。５日目に、試験薬剤を除去し、創傷部位における化合物の持続性を評価するために、創傷面積の変化を（面積／面積％として）測定した。５日目までに、グリセリンは２６．１％の創傷閉鎖を生じ、一方、４−ヒドロキシ−４’−メトキシトラン（２．５％）は閉鎖９２．８％創傷閉鎖を生じ、５％４−ヒドロキシ−４’−メトキシトランは９１．４％の創傷閉鎖を生じた。統計的分析の前に、正規性の検定を行い、Ｚスコアを計算して、群全体にわたる全てのマウスについて１日目に各創傷の正規分布領域をｒ２＝０．９８９で確認した。統計量は、５日目の創傷面積の変化を比較する１元配置分散分析に基づいて計算する。全てのマウスは治療に耐えられ、週１回の臨床観察全ては、明るい、敏感な、反応性の高い、水和した（hydrated）マウスを報告する。
【０１３４】
【表４】
2018510902.tif 000024
【０１３５】
実施例１１：対照または５％（ｗ／ｖ）４−ヒドロキシ−４’−メトキシトランで処理した切除皮膚サンプル対照で処理した細胞のＨ＆Ｅ染色では、筋繊維芽細胞の緩やかに組織化された層の上に１〜２細胞の厚さのケラチノサイト層が見られ、結合組織は形成し始めた数少ない深い皮脂腺を有していた。４−ヒドロキシ−４’−メトキシトランで処理した皮膚では、７〜８細胞の厚さの細胞層を有する広範囲のケラチノサイトの増殖が見られた。真皮は、規則的および増殖性の筋線維芽細胞、ならびに表面に伸びて毛包を再構築する高度に増殖性で蔓状の皮脂腺を取り囲む結合組織を示した。
【０１３６】
実施例１２：皮膚付属器におけるオートファジーおよび髪の再成長（脱毛）：オートファゴソーム様構造は、毛髪および皮脂腺の電子顕微鏡により検出されている。皮膚付属器におけるオートファジーの生理的関連性は現在よく理解されていないが、現在の既存のデータは、オートファジーの誘発が、損傷細胞が細胞死を起こし、毛幹細胞が刺激されて毛髪成長を生じるＷｎｔ１依存性細胞若返り過程を介して、脱毛を防止し得ることを示唆する（Castilho R.M., et al.(2009) mTOR mediates Wnt-induced epidermal stem cell exhaustion and aging, Cell Stem Cell 5, 279-289; and Vishnyakova, et al.(2013) Possible Role of Autophagy Activation in Stimulation of Regeneration, Molecular Biology.47(5): 692-700）。
【０１３７】
実施例１３：ＵＶ照射損傷とアンチエイジング皮膚は人体の中で最大の器官であり、環境と接触している。このように、皮膚は、そのバランスを脅かし、その外観を変える外部と内部の両方からのダメージを絶えず受けている。このダメージは、しばしば慢性の低レベルの炎症として顕在化する。例えば、ＵＶへの過度の暴露は、光線性紅斑、日光弾力線維症などの様々な皮膚症状、皮膚老化の影響の時期尚早な出現、皮膚がたるみ、深くしわになり、荒くなり、乾燥し、脱色性または色素沈着した斑点が点在するようになり、血管が拡張するようになるということに反映されることが知られている。皮膚組織に深刻な構造変化を反映するこれらのＵＶ曝露の顕在化は、見苦しくて醜いものであり、多くの人々はそれらを取り除きたいと思う傾向がある。様々な年齢の女性からの培養真皮線維芽細胞のＴＥＭおよびＩＦ顕微鏡分析は、自食性の体液の病的流出の障害を明らかにした。若い真皮線維芽細胞をリソソームプロテアーゼインヒビターで処理して老化した真皮線維芽細胞の状態を模倣すると、オートファジー活性が低下し、Ｉ型プロコラーゲン、ヒアルロナン、およびエラスチンの線維芽細胞含量が変化し、コラーゲン原線維の崩壊を引き起こした。これらの発見はともに、オートファジー誘発の障害が真皮の完全性および皮膚の脆弱性の悪化をもたらすことを示唆している（Tashiro K, et al.(2014) Age-related disruption of autophagy in dermal fibroblasts modulates extracellular matrix components, Biochem Biophys Res Commun.443(1): 167-172）。
【０１３８】
オートファジーは、損傷した細胞オルガネラおよびタンパク質凝集体が適切に分解され、蓄積して細胞機能不全を引き起こすことがないことを確実にする。また、平均余命を延ばすことが示されているカロリー制限（ＣＲ）に応答して、オートファジー活性の強化が見られる。
【０１３９】
実施例１４：ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの４０％（ｗ／ｖ）溶液：滅菌された目盛付きビーカーに４０．０ｇのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを７０ｍＬの水に加え、充分に混合することによって溶液を調製する。溶液が透明になったら適量（QS）を１００ｍＬにする。１．０ｇの液晶化合物（ＦＡＭ）を秤量し、滅菌ガラス瓶に移す。１．５ｍＬのエタノールを瓶に加え、完全に溶解する。薬剤が溶液中に確実に残るように、撹拌しながらゆっくりと１ｍＬのシクロデキストリンを加える。薬剤が溶液中に確実に残るように、撹拌しながら５ｍＬの水を加える。必要に応じて超音波処理する。製剤は透明な溶液であるべきである。０．２μｍフィルターを使用して濾過する。懸濁液を−４０℃以下で凍結し、凍結乾燥する。凍結乾燥ケークは、使用前に滅菌水で再構成してもよい。
【０１４０】
実施例１５：注射用液晶製剤であるＦＡＭシクロデキストリン製剤の調製：１００ｍｇの４，４’−ジヒドロキシトラン化合物を秤量し、５ｍｌのシンチレーション管に入れる。１．５ｍｌの無水エタノールを管に加え、４，４’−ジヒドロキシトランが完全に溶解するまで振とうする。５グラムの発熱物質を含まないヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Sigma）を分析用秤で秤量し、メスシリンダーに入れる。体積が９０ｍｌに達するまで振とうしながら水を加える。上記のＦＡＭのエタノール溶液を、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含有する水溶液に攪拌しながら加える。透明な溶液に水を加えて全容量を１００ｍｌにする。この溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通して滅菌濾過する。懸濁液を−４０℃以下で凍結し、凍結乾燥する。凍結乾燥ケークは、使用前に注射用に滅菌水で再構成してもよい。
【０１４１】
実施例１６：点滴溶液の調製：溶液は、以下の成分から調合される；ＦＡＭ−シクロデキストリン０．６２５部；サッカリンナトリウム０．３部；ソルビン酸０．１部；エタノール３０．０部；香味剤１．０部；蒸留水  ｑ．ｓ．  ａｄ  １００．０部。ＦＡＭ−シクロデキストリン複合体および香味剤をエタノールに溶解し、ソルビン酸およびサッカリンを蒸留水に溶解する。２つの溶液を互いに均一に混合し、混合溶液を懸濁物がなくなるまで濾過する。１ｍｌの濾液はＦＡＭを含み、効果的な治療作用を有する経口投薬単位組成物である。
【０１４２】
実施例１７：微粉化薬剤および薬剤懸濁液の調製：１６グラムの微粉化ＦＡＭを、４インチのミルサイズおよび粉砕ガスとして圧縮窒素ガス／圧縮空気（露点＞４０℃）を用いて粉砕する。材料を手動でホッパーに供給し、供給段の上部に置く。材料は、加圧された粉砕ガスによって密閉円形チャンバに引き込まれる。粉末は粉砕チャンバで高速流に懸濁される。粒度分布を、粒度分析器で測定する。次に、粉砕条件を調整して、許容可能なミクロンサイズの材料を得る。
【０１４３】
実施例１８：ＦＡＭまたはＡＡＭ調節剤−シクロデキストリン複合体ゲル：１００ｍｇのＦＡＭを秤量し、滅菌試験管に入れる。ＦＡＭを２〜３ｍｌの精製無水エタノールに溶解する。５０ｍｌのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの１０〜５０％（ｗ／ｖ）溶液（α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、および特定の修飾を受けたβ−シクロデキストリンなど、吸水の必要性に基づいて、他のシクロデキストリンも使用し得る）を１５０ｍｌの滅菌ビーカー中で調製し、溶液をホットプレート上で攪拌しながら７０〜８０℃に加熱する。ＦＡＭのエタノール溶液を攪拌しながらビーカーにゆっくりと加える。この段階で、ＡＡＭを１〜２５％（ｗ／ｖ）で加え得る。ＦＡＭの添加はゲル−ゾル転移を開始させ、必要に応じて脱イオン水に溶解したペクチン酸ナトリウムなどのゲル化分子を加えてゲル化をさらに促進することができる。他のゲルエンハンサーには、ゲル形成を促進するためにイオン架橋を形成する１価または２価カチオンＦＡＭまたはＡＡＭ塩が含まれる。
【０１４４】
カチオンの使用は、水への溶解度を増加または減少させたいという要望に基づいて選択することができる。ゲル化過程を促進するために、混合中にＦＡＭまたはそのマグネシウム二量体をアルギン酸塩コポリマーに加え、Ｍ／Ｇ比を調整して、安定なＦＡＭ：Ｍｇ２＋：アルギン酸塩生分解性シートを作製する。ＦＡＭカチオンは、Ｇ型アルギン酸塩コポリマーによって形成されたポケットと水素結合を介して相互作用する（図１５参照）。全ての比は、ＦＡＭ濃度および重合を最適化するように調整することができる。Ｍｇ２＋に加えて必要に応じて、Ｃａ２＋、Ｋ＋、またはＺｎ２＋などの他のイオンを加えて、ゲル化プロセスをさらに促進し得る。
【０１４５】
アルギン酸塩Ｇ、Ｍ、またはＧ／Ｍコポリマーは、カルシウムなどの２価カチオンの添加により、アルギン酸カルシウムシートを形成する。これらのシートは、無菌環境で作製することができ、非刺激性、非感作性、および生分解性である。これにより、液晶ＦＡＭ分子は、アルギン酸塩のゲル化、重合、制御コポリマーブロック構造を促進し、アセチル化を変化させて、ポリマーの物理化学的およびレオロジー的特性に影響を及ぼす理想的な分子となる。個々のアルギン酸塩モノマーの分子量を調節することに加えて、選択されたＦＡＭ’ｓは、ゲル粘度も変え得る。
【０１４６】
様々なポリマー糖分子が、本出願に記載されている液晶ＦＡＭおよびＡＡＭ分子と組み合わされたときに、新規な創傷ケア製品を作製する際に使用できる特有なヒドロゲル、アルギン酸塩、および薬剤送達系を作り出すことができる。例えば、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、ヘパリン、アルギン酸塩、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｄ＆Ｅ、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、およびそれらのポリマー、およびポリホスファゼンが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１４７】
場合によっては、溶解性を改善し、ｐＨを調整し、カチオンまたはアニオン濃度のバランスをとり、皮膚への付着性を改善し、水への溶解度を増加または減少させ、濃度勾配を作り出し、ゲル−ゾル転移を改善し、電気伝導度を増加または減少させ、キャパシタンスを増加または減少させ、全体的な抵抗またはインピーダンスを調整するように、追加のＦＡＭまたはＡＡＭを上記の製剤のいずれかに加えてもよい。
【０１４８】
この特許に記載されている製剤は、創傷閉鎖および再上皮化の増加を含む様々な疾患および病状の治療のために、用量依存的な様式でオートファジーを誘発することが示された液晶ホルメシス物質である。
【０１４９】
実施例１９：ＦＡＭまたはＡＡＭ調節剤−アルギン酸塩複合体：１グラムのアルギン酸ナトリウムを５００ｍＬのビーカー中の脱イオン水に溶解し、必要に応じて、選択したＡＡＭ（１〜２５％ｗ／ｖ）を混合しながら加える。この溶液に、予めエタノールに所望の濃度１〜５０％（ｗ／ｖ）に溶解した治療有効量のＦＡＭを添加し、必要に応じて、１価または２価のカチオン塩の添加物を、ゲルが所望のコンシステンシーに到達するまで加える。ＦＡＭ’ｓの塩については、前の工程は必要ではない。ＦＡＭ分子の液晶性質により、水素結合、静電結合、およびイオン結合を介して会合する特有な共ブロック（co-block）ポリマーが生成する。次に、この溶液を用いて、綿織物または他の繊維をコーティングしてアルギン酸包帯を作製することができる。この同じ溶液を用いて、生分解性シート、フィルム、ビーズ、またはゲルを作製することもできる。
【０１５０】
本発明の様々な態様および実施形態の前述の説明は、例示および説明のために提示されたものである。全ての実施形態を網羅すること、または本発明を開示された特定の態様に限定することを意図するものではない。上述の教示に照らして明らかな変更または変形が可能であり、このような変更および変形は、公正に、合法的に、かつ公平に権利が与えられている範囲に従って解釈されるとき、添付の特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲内に含まれ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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