(57)【要約】本発明は、生体試料中の、インターロイキン１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量を定量する工程を含み、試料を採取される患者における、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞が前記試料の５％未満であり、治療により奏効が得られる尤度が５０％を突破する、予後診断方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法であって、前記抗体が、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体であり、前記試料中の、インターロイキン１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量のインビトロ定量を含む方法において、腫瘍試料を採取される患者における、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量が、前記試料の細胞の総量の５％未満であり、前記治療用抗体での治療後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が９０％超となる尤度が５０％を突破する、方法。
【請求項２】
血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法であって、前記抗体が、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体であり、前記方法が、前記試料の細胞における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程と、
−  治療前にインターロイキン１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量を定量する工程と
を含む方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位に、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にバリンを有し、
−  ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量が、試料中の全細胞の５％未満であり、前記治療用抗体で治療を施された後に、前記血液疾患の細胞枯渇率が９０％超となる尤度が５０％を突破する、方法。
【請求項３】
前記血液疾患が、ＣＤ２０表面マーカーを発現する細胞における血液病である、請求項１または２に記載の予後診断方法。
【請求項４】
前記血液疾患が、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病（B-cell chronic lymphoid leukemia）（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma）およびＣＤ２０を発現するこれら全ての組織学的変種；濾胞性のリンパ腫（follicular lymphoma）およびマントル細胞リンパ腫；辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、ＭＡＬＴリンパ腫（英名：粘膜関連リンパ組織）、バーキットリンパ腫（Burkitt lymphoma）、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma）、ワルデンストレーム病（Waldenstrom’s disease）、Ｂ細胞前リンパ性白血病（B-cell prolymphocytic leukemia）、ならびに全ての分類不能なＢ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）ＣＤ２０＋からなる群から選択される、ことにより特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予後診断方法。
【請求項５】
ＩＬ−１０の分泌の活性後に、前記試料中５％未満におけるＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量が、フローサイトメトリでの測定、または血清中ＩＬ−１０の循環濃度の測定によって定量される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の予後診断方法。
【請求項６】
ＩＬ−１０の分泌の活性化および前記分泌の不活性化後に、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量をフローサイトメトリで測定する、請求項５に記載の予後診断方法。
【請求項７】
配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程が、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、ＰＣＲ単独使用、またはＰＣＲと逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくはネステッドＰＣＲ（nested PCR）との併用などにより遂行される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の予後診断方法。
【請求項８】
前記抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３、具体的には抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体、具体的にはリツキシマブである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の予後診断方法。
【請求項９】
血液疾患に罹患する、治療用抗体での治療が可能な患者に対するインビトロ予後診断用のキットであって、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸の検出手段と、
−  ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量を定量する手段と、
−  １種以上の対照試料とを含むキット。
【請求項１０】
配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸の検出手段に、配列番号３、配列番号４および配列番号５の配列のオリゴヌクレオチドが包含される、請求項９に記載の予後診断用キット。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の予後診断方法を実施するための適切な媒体上に実装されたコンピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品が、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量の定量を可能にする、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ性血液疾患（特に、リンパ性白血病およびリンパ腫（lymphoma））の予後診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、癌および免疫不全症をはじめとする多くの疾患における治療的な処置に変革をもたらしてきた。リツキシマブ（MabThera（登録商標））は、例えば、リンパ腫（lymphoma）または慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）患者の生存率を高め、且つ免疫性機能不全疾患に罹患する患者のクオリティ・オブ・ライフの向上を可能にしてきた。
【０００３】
リツキシマブは、前リンパ球（pro-lymphocyte）分裂期、プラズマ細胞分裂期のＢリンパ球（B lymphocyte）により発現されるＣＤ２０を認識するキメラ免疫グロブリンＩｇＧ１である。リツキサポートシマブのさまざまな作用機序に関しては、リツキシマブの定常Ｆｃ部分（ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびファゴサイトーシス）に依存する作用機序、ならびにリツキシマブの可変Ｆｖ（アポトーシス）部分に依存する作用機序について、インビトロベースで説明してきた。ＦｃγＲＩＩＩａは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、および依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のエフェクター細胞によって発現される。
【０００４】
遺伝子ＦＣＧＲ３Ａの多型によって受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＶＦ）上のアミノ酸１５８が置換されて、リツキシマブに対して良好に反応する（ホモ接合体１５８−Ｖ）患者と、リツキシマブに対して反応しない（ホモ接合体１５８−Ｆおよびヘテロ接合体）患者との判別が可能になることが明らかにされてきた。
【０００５】
特に、特許出願（国際公開第２００３０３５９０４号）により既知のこととなっているように、リンパ腫（lymphoma）をはじめとする悪性腫瘍の罹患患者に対して、被験者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型の判定を用いることができる。この遺伝子型の判定は、最も良好に反応する被験者を選択し、且つ／あるいは低反応プロファイルで反応する被験者に応じて治療条件またはプロトコールを調整するのに適している。
【０００６】
にもかかわらず、インビボ抗ＣＤ２０（anti-CD20）の作用機序は、依然としてあまり解明されておらず、病理（pathology）に応じて異なる場合がある。なおまた、重要な留意すべき点は、陰性表現型を有する患者の６７％は依然としてリツキシマブに適応することから、現在ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８ＶＦの予測効果解析は臨床用途に用いられていないことである。したがって、この作用機序を理解することによって、改善を図るための新たな治療方針を提案するとともに、この種の高額治療が奏効しえない患者をより適正に選択して、他の治療選択肢に転向させることに対する関心が高まってきている。
【０００７】
免疫細胞の中には、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を分泌するＢリンパ球（B lymphocyte）（Ｂ１０細胞）を含み、特に細胞傷害性Ｔ応答を制限するという機能を司る免疫調節性サイトカインが存在する。これらの細胞は、マウスおよびヒトにおいて存在する。Ｂリンパ球腫瘍（Tumor B lymphocyte）は、ＩＬ−１０の分泌というＢ１０の機能を呈しうる。
【０００８】
ネズミのリンパ腫（lymphoma）モデルにおいて明らかにされてきたように、マウスにおいてＢ１０が発生するとネズミ抗ＣＤ２０（anti-CD20）を用いた治療に対する反応が妨げられていた（Horikawaら著「JClinInvest」２０１１年１１月１日発行；第１２１巻（第１１号）、４２６８〜４２８０頁）。しかしながら、本研究はマウスにおいて実施する限りで当てはまるものであって、ヒトにおけるＢ１０細胞の発生は、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体で治療された患者における治療反応には関係しなかった。更になお、さまざまな免疫グロブリンアイソタイプの生物学的活性、および免疫グロブリンＦｃ部分における受容体の発現に関して、ヒトとマウスとでは極めて大きな相違点がある。マウスにおいて得られた結果をヒトに関して推定することは不可能であり、且つ、いかなる場合でもマウスモデルにおいて得られた結果を臨床的に実証すること無しにヒトに適用することはできない。
【０００９】
免疫療法に対する反応が周知となって久しいことから、患者の治療を適応可能とする成分に対するニーズが存在する。
【００１０】
本発明の一目的は、これらの不利益を克服することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、奏効する尤度を考慮に入れ、治療の失敗に付随するコストを抑えることを視野に入れたうえで、所与の病理学的状況に適用される治療プロトコールを簡単且つ迅速に特定することを可能にする、予後診断方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、前記方法を実施するための予後診断パッケージまたはキットを提供することにある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法に関する。前記抗体が、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体であり、前記腫瘍試料中の、インターロイキン１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量のインビトロ定量を含む方法において、腫瘍試料を採取される患者における、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量が、前記試料の細胞の総量の５％未満であり、前記治療用抗体での治療後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が９０％超となる尤度が、５０％を突破するものと見られる。
【００１４】
本発明は、第一に、上記血液疾患は、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の母集団を示し、第二に、患者に治療用抗体で治療を施したときに、これらの細胞の量が患者の予後に影響を及ぼすという、本発明者らによる驚くべき観察に基づくものである。更にまた、治療前には低量であったＩＬ−１０を分泌する細胞の量が増えると治療に対する反応が改善されるため患者の予後診断が良好化されることも、本発明者らによって見出された。
【００１５】
特に、本発明者らは、ＩＬ−１０を分泌する細胞の量は、血液疾患の循環細胞の総数の５％未満であり、治療後の患者の予後診断は、過半数の症例において利益をもたらすことを明らかにすることができた。
【００１６】
本発明との関連において、用語「血液疾患に罹患する患者由来の腫瘍試料」とは、試料もしくは生検の全部ないしは一部に腫瘍細胞が含まれる、血液試料または生検を指す。上述の腫瘍試料は、血液疾患の根絶を図るための治療の開始に先立って患者から採取される。
【００１７】
赤血球および有核細胞は考慮に入れないものとする。
【００１８】
本発明に係る予後診断方法は、治療用抗体、またはより全般的には「抗体」に関する。本明細書では以降、特に具体的詳細を特記しない限り、両方の呼称を使用するものとする。「治療用抗体」とは、個体または患者において判別された標的細胞を排除する機能を有する抗体であると考えられる。標的細胞の例としては、腫瘍細胞のほか、１種以上のウイルスに感染した細胞、アレルギーおよび自動免疫疾患などに関与する病理学的免疫コンピテント細胞（例えば、Ｂリンパ球（B lymphocyte）、Ｔリンパ球（lymphocyte T）もしくは抗原提示細胞など）、または更には正常な細胞（抗血管新生治療方針における内皮細胞の例）が挙げられる。好ましい標的細胞は、腫瘍細胞および感染細胞である。
【００１９】
リツキシマブのような、アイソタイプがＩｇＧ１である治療用抗体によって、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity）（すなわち、ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（antibody-dependent cellular phagocytosis）（すなわち、ＡＤＰＣ）および補体依存性細胞溶解（complement-dependent cell lysis）（すなわち、ＣＤＣ）が媒介される場合もある。
【００２０】
本発明に係る治療用抗体は、ハイブリドーマまたは遺伝子工学によって生成可能で、且つアイソタイプがＩｇＧ１またはＩｇＧ３であるものが好ましい。本発明において好ましい治療用抗体は、腫瘍抗原（腫瘍の表面上に発現するＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３８などの分子）、またはより一般的には造血性腫瘍抗原（hematopoietic tumor antigen）、好ましくはリンパ腫（lymphoid）に対する上記アイソタイプを有する抗体である。
【００２１】
本発明において、「枯渇化（depleting）」抗体とは、標的細胞の枯渇、例えば、標的細胞の減弱または劣化を引き起こす抗体を指す。
【００２２】
本発明の予後診断は、インターロイキン１０（すなわちＩＬ−１０）を分泌する能力を有する腫瘍（tumor）のＢ細胞の量を定量することに基づく。ＩＬ−１０は、インターロイキン２、インターロイキン３、ＴＮＦおよび或るインターフェロンなどの、或るサイトカインの生成を阻害することにより、免疫応答を阻害する効果を有する。また、ＩＬ−１０は、免疫系に関与するさまざまな細胞（マスト細胞、リンパ球（lymphocyte）など）の数を調節することによって免疫に作用する。
【００２３】
本発明者らは、血液疾患においてＩＬ−１０を分泌するＢリンパ球（B lymphocyte）の数を定量化することによって、治療前のこれらの細胞の５%未満において腫瘍（tumor）が、治療用抗体での治療に対する反応性を高め、結果として、患者の予後診断の良好化につながることを見出した。したがって、この治療用抗体を単独で用いる療法、または他のプロトコール（化学療法、放射線療法など）と併用する療法を、当該の患者に合わせて構想することが可能である。ＩＬ−１０を分泌するＢリンパ球（B lymphocyte）の数が５％の閾値を超え、治療用抗体１種類だけを用いた治療を施された患者の予後診断がおそらくあまり良好ではない場合、別のより好適なレジメンを検討することが推奨される。
【００２４】
したがって、本発明の予後診断は、コストを合理化し、全然ではないにしろ奏効が良好でない患者に対して高額な過剰治療を施すのを回避しながら、治療用抗体での治療が奏効する機会を特定し、患者に提供するのに最善の療法を判別することを可能にするものである。
【００２５】
好都合にも、本発明は、上述の予測方法に関し、配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸を定量する工程を更に含む。そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位に、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にバリンを有し、
−  治療前に、試料中ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量は、試料の細胞の総量の５％未満であった。前記治療用抗体で治療を施された後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が９０％超となる尤度が、５０％を突破するものと見られる。
【００２６】
言い換えれば、本発明は、血液疾患に罹患する患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対するインビトロ予後診断方法であって、前記抗体を、前記血液疾患の細胞を枯渇させる抗体とした、方法に関する。本方法は、前記試料の細胞における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸のインビトロ定量を行う工程と、
−  治療前にインターロイキン１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量を定量する工程と、
を含み、そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位に、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にバリンを有し、
−  ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量は試料中の全細胞の５％未満であった。前記治療用抗体で治療を施された後には、前記血液疾患の細胞枯渇率が９０％超となる尤度が、５０％を突破するものと見られる。
【００２７】
本発明者らによって、第２の驚くべき観察が為された。それは、ＩＬ−１０を分泌するＢリンパ球（B lymphocyte）の量を定量することと、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の特定の多型を判別することとを組み合わせることによって、患者の予後診断が有意に良好化されることである。
【００２８】
下掲の例に示すように、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の多型を判別しただけでは、治療用抗体で治療される患者の適正な反応を予測するための十分な情報を得ることが可能にならないのが、実情である。
【００２９】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の多型に関しては、先行技術において、特に、国際特許出願（国際公開第２００３０３５９０４号）において既に論述されている。タンパク質の１７６位にある、または成熟タンパク質の１５８位にある、変異を経たアミノ酸が、フェニルアラニン（Ｆ）もしくはバリン（Ｖ）のどちらであるかに応じて、治療用抗体に対する治療反応が異なってくる。
【００３０】
本発明において、配列番号１の配列からなるタンパク質はＦｃγＲＩＩＩａタンパク質に対応していて、配列番号２の配列からなるタンパク質は成熟タンパク質ＦｃγＲＩＩＩａに対応している。
【００３１】
ヒトは二倍体であるため、この多型が取りうる遺伝子型には、１７６Ｖ／Ｖ（または１５８Ｖ／Ｖ）、１７６Ｖ／Ｆ（または１５８Ｖ／Ｆ）、および１７６Ｆ／Ｆ（または１５８Ｆ／Ｆ）の３とおりがある。
【００３２】
上述の方法との関連において、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の両方の対立遺伝子上の１７６位または１５８位にバリンを有する個体または患者は、ホモ接合体Ｖ／Ｖを有する患者であると見なされる。それゆえ、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１７６（１５８）位がホモ接合体Ｖ／Ｖである患者において、治療を施される前にはＩＬ−１０を分泌するＢリンパ球（B lymphocyte）の濃度が全腫瘍細胞を基準にして５％未満であり、治療後には、治療用抗体での治療が奏効する尤度は５０％を突破し、且つ腫瘍細胞の枯渇率も９０％を突破するものと見られる。
【００３３】
ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の比率は、腫瘍細胞の総量の５％未満であれば有利である。つまり、ＩＬ−１０を分泌する細胞の比率が４．９％、４．８％、４．７％、４．６％、４．５％、４．４％、４．３％、４．２％、４．１％、４％、３．９％、３．８％、３．７％、３．６％、３．５％、３．４％、３．３％、３．２％、３．１％、３％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．３％、２．２％、２．１％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％であれば、特に有利である。
【００３４】
好都合にも、本発明は、該血液疾患がＣＤ２０表面マーカーを発現する細胞における血液疾患である（つまり、ＣＤ２０表面マーカーを発現する腫瘍細胞における血液疾患である）、上述の予後診断方法に関する。
【００３５】
ＣＤ２０は、ヒトＢリンパ球（B lymphocyte）の第１の分化抗原であり、モノクローナル抗体を使用して同定されてきた。Ｂ細胞の特異的マーカーは、細胞発育過程である前駆Ｂ（pre-B）ステージから成熟Ｂリンパ球（B lymphocyte）ステージまでの間にわたって存在するが、血漿（plasma）細胞の表面には存在しない。コード遺伝子は染色体１１に位置する。ＣＤ２０が属する分子系統（family）は、ＣＤ２０と、高親和性ＩｇＥ受容体のβ鎖と、リンパ性および骨髄性造血細胞の表面上に存在し且つ未知の機能を有するＨＴｍ４分子とを含んで構成される。
【００３６】
有利な一実施形態において、本発明は、血液疾患が、ＣＤ２０を発現する慢性Ｂ細胞リンパ性白血病（B-cell chronic lymphoid leukemia）（ＣＬＬ）、リンパ腫（lymphoma）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma）およびその全ての組織学的変種；濾胞性のリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫；辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、ＭＡＬＴリンパ腫（英名：粘膜関連リンパ組織）、バーキットリンパ腫（Burkitt lymphoma）、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma）、ワルデンストレーム病（Waldenstrom’s disease）、Ｂ細胞前リンパ性白血病（B-cell prolymphocytic leukemia）、ならびに全ての分類不能なＢ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）ＣＤ２０＋からなる群から選択される、上述の予後診断方法に関する。
【００３７】
したがって、好都合にも、本発明は、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）患者から採取された腫瘍試料中の治療用抗体によって媒介される治療反応に対する上記インビトロ（in vitro）予後診断方法を提供する。
【００３８】
有利な一実施形態において、本発明は、上記に定義されている予後診断方法に関するものであり、本方法は、ＩＬ−１０の分泌が活性化された後にフローサイトメトリで、あるいは血清中ＩＬ−１０の循環濃度を測定することによって、試料中のＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量を定量する。
【００３９】
腫瘍試料中のＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量を定量するにはいくつかの方法があるが、本発明の方法は、フローサイトメトリによる検出からなることが好ましい。
【００４０】
この目的に合うように、患者から単離された有核細胞を、培養液中に入れてＩＬ−１０の分泌を促す化合物で処理する。その後で、培養培地内に分泌されたＩＬ−１０の量を定量することもできるし（ただし、この定量的情報は刺激が人為的なものである限りにおいては精度が良くない）、あるいは分泌阻止工程を遂行し、生成されたＩＬ−１０が分泌元のＢ細胞内に接収されるようにもできる。続いて、細胞を抗ＩＬ−１０抗体で標識し、フローサイトメトリで定量化してもよい。実験の詳細については、後述の実施例に示す。
【００４１】
また、本発明者らによって明らかにされてきたように、上記に定義されている血液疾患に罹患する患者における腫瘍（tumor）中のＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量と、前記患者の血漿（plasma）中を循環するＩＬ−１０の量との間には相関がある（下掲の例を参照のこと）。また、血清中ＩＬ−１０の単回投与によって、確かにより大雑把ではあるが、患者におけるＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の比率を定量することが可能である。
【００４２】
別の有利な実施形態において、本発明は、配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸のインビトロ定量を、常法および特異的オリゴヌクレオチド（プライマー）を使用して、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、ＰＣＲ単独使用、またはＰＣＲと逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくはネステッドＰＣＲ（nested PCR）との併用などによって遂行する、上述の予後診断方法に関する。
【００４３】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体をコードする遺伝子の遺伝子型判定は、核酸またはタンパク質の解析をはじめとするさまざまな技法により達成できる。制限酵素での特異的消化、ハイブリダイゼーション、または有利には、増幅／分離／配列決定によって、解析（analyses）を実行できる。ＲＮＡからの多型を判別し同定することを、検討することさえできる。その技法としては、国際公開第２００３０３５９０４号の出願に記載されているものが準用される。
【００４４】
ＰＣＲ技法などの増幅反応を用いた状況において、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、５０個のヌクレオチド、好ましくは約３０個のヌクレオチド、好ましくは１７〜２５個のヌクレオチドを含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、少なくとも５個、または更には少なくとも８個のヌクレオチド、厳密には、増幅の対象となる標的配列に相補的なヌクレオチド、特に、前記オリゴヌクレオチドの３’位にヌクレオチドを有することが好ましい。有利なオリゴヌクレオチドを特定するために、当業者は、データベースで（具体的にはGenBankデータベースで）ＡＬ５９０３８５という番号でアクセスできるヒトＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の配列を使用することもできるし、あるいはGenBankデータベースでＮＭ＿０００５６９という番号で指定できる相補的ＤＮＡ配列を使用することもできる。
【００４５】
本発明に係る予後診断を特定するうえで特に有利なオリゴヌクレオチドは、配列番号３、配列番号４および配列番号５の配列で表されるオリゴヌクレオチドである。
【００４６】
当然ながら、本発明はこれらの特異的オリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、当業者であれば、より特異的なオリゴヌクレオチドを想到できる。
【００４７】
更に別の有利な実施形態において、本発明は、前記治療用抗体を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３免疫グロブリン、特に抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体、具体的にはリツキシマブとする、上述の方法に関する。
【００４８】
ゆえに、本発明の方法との関連において使用される治療用抗体は、有利には、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体、具体的にはリツキシマブである。本構成において、本発明の方法は、好都合にも、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病（B-cell chronic lymphoid leukemia）またはＢ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）に対する本抗体で治療される患者に対して奏効する予後診断を提案しようとするものである。
【００４９】
リツキシマブは、ＣＤ２０表面分子に対するキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブのＦａｂ可変部分は、Ｂリンパ球（B lymphocyte）のＣＤ２０抗原に結合する。これらのリンパ球（lymphocytes）の溶解を引き起こす免疫エフェクター機能はリツキシマブの定常Ｆｃ部分によって生起されうる。エフェクターによって誘発される可能性のある細胞溶解の機序としては、Ｃ１ｑフラグメントの結合を伴う補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity）（ＣＤＣ）；顆粒球、マクロファージおよびＮＫ細胞の表面上の１つ以上のＦｃγ受容体を介した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ならびに顆粒球およびマクロファージの表面上のＦｃγ受容体との相互作用を同様に介したファゴサイトーシス（すなわち、ＡＤＰＣ）が挙げられる。また、リツキシマブが、Ｂリンパ球（B lymphocyte）のＣＤ２０抗原に結合することによって、アポトーシスによる細胞死を誘発することも実証されてきた。
【００５０】
ゆえに、この好ましい態様において、本発明は、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）またはＢ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）の罹患患者から採取された腫瘍試料中の、アイソタイプがＩｇＧ１またはＩｇＧ３である抗ＣＤ２０（anti-CD20）治療用抗体によって媒介される治療応答のインビトロ予後診断方法に関するものであり、本方法は、前記試料の細胞における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸を、インビトロ定量する工程と、
−  インターロイキン１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量を定量する工程と、
を含み、そのような方法において、腫瘍試料を採取される患者における、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位に、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にバリンを有し、
−  ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量は試料中の全細胞の５％未満であり、前記抗ＣＤ２０（anti-CD20）治療用抗体での治療後に、前記白血病またはリンパ腫（lymphoma）の細胞枯渇率が９０％超となる尤度が、５０％を突破するものと見られる。
【００５１】
別の態様において、本発明は、治療用抗体で治療することの可能な血液疾患に罹患する患者のインビトロ予後診断用のキットに関し、具体的には、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）またはＢ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）の予後診断用のキットに関するものであり、本予後診断キットは、
−  配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸を検出する手段と、
−  ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞リンパ球（B-cell lymphocyte）の量を定量する手段と、
−  １種以上の対照試料とを含む。
【００５２】
本発明に係る予後診断パッケージまたはキットは、上記方法に必須の２つのパラメータ：受容体多型およびＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量、を測定する手段を提供するものである。予後診断を標準化するため、本キットまたは本パッケージには、対照試料もまた付属している。これらの対照試料は、健常者から採取された試料（陰性対照）、ならびに／または病人（陽性対照）および／もしくは予後診断（陽性対照）が不良であると診断された個体の予後不良に対応している。
【００５３】
本対照試料（１種以上）は、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量を定量するフローサイトメーターの較正を可能にする指示データ（indications）、または物理媒体上のコンピュータデータとすることができる。
【００５４】
上述したように、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量を定量する手段は、細胞のフローサイトメトリで評価される対象の抗体としてもよいし、あるいはＩＬ−１０の生成を刺激し且つ／または阻害するための薬物としてもよい。また、血漿（plasma）中に循環しているＩＬ−１０の量を定量するための抗体とすることもできる。
【００５５】
好都合にも、本発明は、上記に定義されている予後診断用のキットに関する。配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にあるアミノ酸を検出する手段には、配列番号３、配列番号４および配列番号５の配列のオリゴヌクレオチドが包含される。
【００５６】
もちろん、当業者は、多型に対応している領域のＰＣＲ増幅用に他のオリゴヌクレオチドを供給することによって、試験対象の患者が保有する対立遺伝子を判別することができる。
【００５７】
別の態様において、本発明は、血液疾患に罹患する患者由来の試料中のＩＬ−１０を分泌するＢ細胞のインビトロ検出用の適切な媒体上に実装されたコンピュータプログラム製品に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の検出をフローサイトメトリで実行するように設計され、且つ／あるいは（特に、フローサイトメーターに接続された）コンピュータ上で前記プログラムが実行されたときに、前記検出を実行する部分／手段／指示プログラムコードを備える、ソフトウェア製品またはコンピュータプログラム製品に関する。好都合にも、前記プログラムは、コンピュータ可読データ記録媒体内に収録されている。そのようなサポートは、ＣＤ−ＲＯＭなどの携帯型記録媒体だけに限定されず、コンピュータの内部メモリー（例えば、ＲＡＭおよび／もしくはＲＯＭ）、またはハードドライブもしくはＵＳＢメモリスティック（USB key）などの外部メモリーデバイスを備えるデバイス、または近傍サーバーもしくは遠隔サーバーも共有できる。
【００５９】
したがって、本発明は、上記に定義されているような予後診断方法の実施用の適切な媒体上に実装されたコンピュータプログラム製品であって、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量の定量を可能にする前記コンピュータプログラム製品に関する。
【００６０】
本コンピュータプログラムは、特に、自動調整および標準化の実行によって、ユーザーが単に情報をサイトメーター内にローディングして再現的に取得される腫瘍細胞を渡すだけで、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞の量の定量を可能にするものである。
【００６１】
別の態様において、本発明は、治療用抗体により血液疾患の改善を図る方法において、リンパ球（lymphocyte）によるＩＬ−１０の分泌または活性に対する少なくとも１つの阻害剤の使用を含む方法に関する。
【００６２】
特に、本発明は、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体、具体的にはリツキシマブにより血液疾患の治療の改善を図る方法において、リンパ球（lymphocyte）によるＩＬ−１０の分泌または活性に対する少なくとも１つの阻害剤の使用を含む方法に関する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、ＩＬ−１０を分泌するリンパ球（lymphocytes）に対する少なくとも１つの阻害剤の使用を含む、治療用抗体により血液疾患の改善を図る方法に関する。
【００６４】
特に、本発明は、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞に対する少なくとも１つの阻害剤の使用を含む、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体、具体的にはリツキシマブによる血液疾患の治療の改善を図る方法に関する。
【００６５】
本発明において、ＩＬ−１０を分泌するＢ細胞に対する阻害剤、またはＩＬ−１０を分泌するリンパ球（lymphocyte）に対する阻害剤は、それらの増殖を阻害することによりＩＬ−１０を分泌する能力を阻害するか、あるいはアポトーシス等の死を誘発するかのいずれかによって、Ｂ１０リンパ球（lymphocyte）の活性を妨げる能力を有する化合物もしくは分子、またはこれらの混合物であると定義される。
【００６６】
Ｂ１０細胞がリツキシマブの有効性に及ぼす影響、およびＩＬ−１０の分泌との相関が、本発明者らによって同定されたことから、
−  Ｂリンパ球（B lymphocyte）によるＩＬ−１０の生成を、例えば、合成または分泌を抑制することによって阻害すること、
−  またはＩＬ−１０の生物学的活性を阻害すること、
のいずれかを正しく実現する方法が提案されれば有利である。
【００６７】
分泌阻害剤としてブレフェルディンＡを使用してもよい。
【００６８】
また、ＩＬ−１０抗体などのＩＬ−１０阻害剤を使用することもできるし、あるいは標的インターロイキンを飽和させるペプチド模倣薬を使用して、天然タンパク質の活性を阻害しても差し支えない。
【００６９】
一般知識を有する当業者であれば、ＩＬ−１０を阻害する分子、またはＩＬ−１０の分泌を阻害する分子を、スクリーニングするための方法を、容易に提供することができる。
【００７０】
本発明はまた、治療用抗体（特に、抗ＣＤ２０（anti-CD20）またはリツキシマブ）による血液疾患の処置の促進を図る薬剤の調製を目的とした、ＩＬ−１０の活性または分泌に対する阻害剤の使用に関する。
【００７１】
本発明は、少なくとも１つの治療用抗体（特に、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体またはリツキシマブ）を用いた血液疾患の治療という状況において用いるための、ＩＬ−１０の活性または分泌に対する阻害剤に関する。
【００７２】
好都合にも、本発明は、ＩＬ−１０の活性または分泌に対する少なくとも１つの阻害剤と、少なくとも１つの治療用抗体（特に、血液疾患治療用の抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体またはリツキシマブであって、その腫瘍細胞が、配列番号１の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１７６位にある、または配列番号２の配列で表されるＦｃγＲＩＩＩａ受容体の配列の１５８位にある、バリンを有するもの）とを含む組成物に関する。
【００７３】
４つの図面および以下の実施例に照らし合わせれば、本発明に関する理解が深まるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＩＬ−１０コンピテント白血病（ＣＬＬ）Ｂ細胞の発生が、第０日目（Ｄ０）（すなわち、治療前）の血漿（plasma）中ＩＬ−１０濃度に相関することを示すグラフである（ｐ＝０．０１６６、Ｒ＝３９６９）。ｘ軸に血漿（plasma）中ＩＬ−１０の量（ｐｇ／ｍＬ）を示し、ｙ軸にＢ１０細胞の発現率（%）を表す。
【図２】第０日目（Ｄ０）にＩＬ−１０コンピテントＣＬＬ  Ｂ細胞が発生した結果として、第２２日目 (D22) のリツキシマブ単剤療法以後にリンパ球枯渇率 に対する統計的な影響が観察されたことを示すグラフである（ｐ＝０．００４）。ｘ軸にリンパ球枯渇率（％）を表し、ｙ軸にＢ１０細胞の発現率（％）を表してある。
【図３】ＦｃγＲＩＩＩａの対立遺伝子１５８Ｖを保有する患者にとって、リンパ球枯渇率 が統計的に有意であることを示すグラフである。
【図４】ＩＬ−１０コンピテントＣＬＬ  Ｂ細胞のパーセンテージのみ（Ａ）（ＡＵＣ＝０．７６３）、ＦＣＧＲ３Ａの多型に対する対立遺伝子ＶおよびＦ／Ｆの保有者（Ｂ）（ＡＵＣ＝０．６７５）、ならびにＩＬ−１０コンピテントＣＬＬ  Ｂ細胞のパーセンテージとＦＣＧＲ３Ａの多型に対する対立遺伝子ＶおよびＦ／Ｆの保有者との組み合わせ（Ｃ）（ＡＵＣ＝０．８５５）に対するロジスティック回帰によって作成された、ＲＯＣ曲線（英名：受信者動作特性曲線）を示す。
【図５】（ｘ軸に、サイトメトリによって示す）制御性Ｂ細胞の数と、（ｙ軸に、迅速法による）ＩＬ−１０の分泌の定量値とを、比較して示したグラフである。一点鎖線で描いた長方形は、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体では至適奏効が得られない（suboptimal）低リスクの個体に対応している。実線で描いた長方形は、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体では至適奏効が得られない高リスクの個体に対応している。２つの方法で得られた結果の間には、良好な相関が見られる（Ｒ＝０．７９）。
【実施例】
【００７５】
実施例１
（MabThera（登録商標）、Rituxan（登録商標）として市場投入されている）リツキシマブの作用機序は、依然として解明されていないが、Ｂ細胞性リンパ増殖性疾患の亜型に応じて異なる場合がある。リツキシマブは、インビトロ・アポトーシス、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity）（ＣＤＣ）、細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰＣ）を誘発することで知られており、一部の結果は、傾向的に見れば、これらインビボ機序との関連性を有する。
【００７６】
最近になって、リツキシマブに対する反応に影響するいくつかの要因が発見された。
【００７７】
本発明者らは以前から、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の多型Ｖ／Ｆが、リツキシマブ治療に対する臨床反応に影響することを観察してきた。（ＮＫ細胞およびマクロファージの表面上に発現される）ＦｃγＲＩＩＩａ受容体のＩｇＧ１の定常領域の親和性が、多型によって改変されることから、リツキシマブで治療される濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）に対する治療との関連においてＡＤＣＣの機序を重要視すべきであろうという仮説が本発明者によって想定された。
【００７８】
最近、ヒトおよびマウスにおいてＩＬ−１０を分泌する能力を有する細胞タイプとして同定されているのが、制御性Ｂ細胞である。また、これらのＢ細胞はＢ１０細胞（B10 cell）またはＢ１０とも呼ばれ、ＩＬ−１０を生成することを基礎にして、炎症の抑制、自己免疫、および先天性もしくは適応性免疫応答を可能にするという特徴を備える。ネズミモデルにおいて、Ｂ１０細胞は、免疫グロブリンの定常部分（Ｆｃ部分）によって媒介される単球機能に対して作用することにより、抗ＣＤ２０（anti-CD20）抗体によって誘発されたリンパ腫（lymphoma）を死滅させる細胞を阻害できる。
【００７９】
より最近では、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）（ＣＬＬ）クローナル由来の細胞が、免疫抑制特性およびＩＬ−１０コンピテンスを呈することが明らかにされてきた。
【００８０】
その後、本発明者らによって見出されたように、ＩＬ−１０コンピテント慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞は、この種の白血病患者の治療におけるリツキシマブの有効性に対して影響を及ぼす可能性がある。
【００８１】
患者および治療
患者
２０１２年６月〜２０１３年１月の期間にわたって、フランスにおいて患者１４０例を収容する５９施設で、前向き無作為化第ＩＩ相研究が実施された。本治験では、以前に治療を受けたことがなく（１８〜６５歳）、且つ免疫表現型の分類基準に基づいて確かに慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）であると診断された患者を、ＩＷＣＬＬ２００８（ビネーステージＣにある患者、またはビネーステージＡもしくはＢにあって且つ活動性疾患を伴う患者）として登録した。１７ｐの欠失の無いことを追加的な組み入れ基準として考慮に入れ、ＦＩＳＨにより評価した（＜１０％陽性核）。患者全員が、治験に組み入れられる前に、書面によるインフォームド・コンセントを提出した。
【００８２】
無作為化
ＦＩＳＨ（１１ｑの欠失）解析後、ＩｇＶＨの変異状態に従って患者らを層別化し、ＦＣＲ（フルダラビン、シクロフォスファミドおよびリツキシマブ）化学療法で標準用量を投与されるＡ群、あるいは標準ＦＣＲ治療に先立って、濃縮ＦＣＲと初期相（pre-phase）リツキシマブとを併用投与されるＢ群のいずれかに、１：１の比率で無作為的に割り当てた。
【００８３】
治療
標準ＦＣＲ治療は６周術期からなり、２８日単位で区切られた各周術期には、リツキシマブ（第１周術期の第１日目に３７５ｍｇ／ｍ２、以降の周術期では５００ｍｇ／ｍ２）、フルダラビン（第２日目〜第４日目に４０ｍｇ／ｍ２／日）、およびシクロフォスファミド（第２日目〜第４日目に２５０ｍｇ／ｍ２／日）が投与される。この実験群においては、ＦＣＲ治療に先立つ初期相にて、リツキシマブを４回連続的に（第０日目に５００ｍｇ、第１日目、第８日目および第１５日目に２０００ｍｇのように配分して）投与する。患者においては、第２２日目に第１周術期が始まり、以降の周術期は２８日単位で区切られている。
【００８４】
ＩＬ−１０コンピテントＣＬＬ細胞の同定、ＩＬ−１０の治験およびＦＣＧＲ３Ａの遺伝子型判定
精製ポリクローナルの刺激後に、フローサイトメトリで、単核血液細胞からＩＬ−１０コンピテントＣＬＬ細胞を同定した。
【００８５】
本研究のＢ群におけるＣＬＬの罹患患者から採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll-Hypaque密度勾配（フランス共和国クルタブフに本拠を置くEurobio）を使用して精製した。
【００８６】
このＰＢＭＣを、１０%ウシ胎仔血清（フランス共和国クルタブフに本拠を置くEurobio）と、２ｍＭのＬ−グルタミン（フランス共和国クルタブフのEurobio）と、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと、２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンと（抗生物質はいずれも、フランス共和国イヴリーヌ県のTebu-bioから入手されたもの）を含有する培養物（ドイツ連邦共和国アイデンバッハのBiotech GmbH製RPMI 1640）中に（９×１０６細胞／ｍｌにて）再懸濁させた。
【００８７】
シトシン−リン酸−グアニン（CpG）（ODN 2006、１０μｇ／ｍＬ；米国サンディエゴに本拠を置くInvivoGen）と、ＣＤ４０Ｌ（５０ｎｇ／ｍＬ；米国ミネソタ州ミネアポリスに本拠を置くR & D Systems）と、抗ポリヒスチジン（５００ｎｇ／ｍＬ；米国ミネソタ州ミネアポリスに本拠を置くR & D Systems）とを用い、ＣＯ２５％ と空気９５％との混合物を含有する加湿雰囲気中、３７℃で４８時間にわたって、Ｂリンパ球（B lymphocyte）のクローン活性化を行った。ＩＬ−１０の生成を促すため、酢酸塩およびミリスチン酸フォルボール（ＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍＬ；米国ミズーリ州セントルイスに本拠を置くSigma-Aldrich）、ならびにイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ；米国ミズーリ州セントルイスに本拠を置くSigma-Aldrich）を加えた。４時間後に、ＣＯ２５％と空気９５％との混合物を含有する加湿雰囲気中、ＩＬ−１０の分泌を阻止するため３７℃にてブレフェルディンＡ（１×溶液／ｍｌ；米国カリフォルニア州サンディエゴに本拠を置くBioLegend）を加えて、Ｂ１０細胞を同定した。細胞を、以下の抗体：BioLegend（米国カリフォルニア州サンディエゴ）製の抗ＣＤ１９ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）、抗ＣＤ６９ＰＥ／Ｃｙ７（ＦＮ５０）、抗ＣＤ３８ＡＰＣ（ＨＩＴ２）、抗ＩＬ−１０ＰＥ（ＪＥＳ３−９Ｄ７）および抗ＣＤ４５ＫＯ（Ｊ．３３）、ならびにBeckmanCoulter（米国カリフォルニア州ブレア）製の抗ＣＤ５ＦＩＴＣ（ＢＬ１ａ）で標識した。クローナルＣＬＬ細胞を、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ２０ｉｎｔリンパ球（lymphocyte）として同定した。フローサイトメーターCyAnTM ADP（米国カリフォルニア州ブレアに本拠を置くBeckma Coulter）を使用して、解析を実行した。
【００８８】
メーカー（米国ミネアポリスに本拠を置くR & D Systems）の推奨事項に従い、レーザー二重読み取りシステムを介して、磁気ビーズベースのLuminexテクノロジー（登録商標）を利用して、血漿（plasma）中ＩＬ−１０濃度を測定した。６８例の患者由来の血漿（plasma）を、抗ＩＬ−１０抗体を塗布した超常磁性ビーズとともに室温下で２時間インキュベートすることによって１／２に希釈した。検出対象となった２種類の抗体：ＩＬ−１０ビオチニル化抗体およびストレプトアビジン抗体（フィコエリトリンに接合されたもの）を組み合わせて使用して、血漿（plasma）中ＩＬ−１０を定量化した。
【００８９】
ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８ＶＦを、ネステッドＰＣＲによって判別した。概略説明すると、単一工程において対立遺伝子に特異的な多重ＰＣＲ検定を、DallOzzoらの特許 （DallOzzoら著「J Immunol Methods」２００３年発行；第２７７巻（第１−２号）：１８５〜１９２頁）に記載されている方法に若干の修正を加えて遂行した。ゲノムＤＮＡ、４００ｎＭのフォワードプライマー（5’-TCCAAA AGCCACACTCAAAGTC-3’（配列番号３））、Ｖ対立遺伝子（5’-AGACACATTTTTACTCCCATC -3’（配列番号４））に特異的な４００ｎＭのリバースプライマー、およびＦ対立遺伝子（5 -GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCGGTGATGTTCACAGTCTCTGATCACACA TTTTTACTCCCATA-3’（配列番号５））に特異的な２００ｎＭのリバースプライマー、４００μΜの各ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、２ｍＭのＭｇＣｌ２ならびに０．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、その緩衝液（米国マディソンに本拠を置くPromega）中に溶解させたものが、２５μＬの反応混合物中に含有されている。このＰＣＲ条件では、９５℃で３．５分間、続いて、９５℃で２０秒間、５６℃で２０秒間および７２℃で３０秒間を１サイクルとして、３５サイクル分繰り返す。増幅後、ＰＣＲ産物（Ｆ対立遺伝子では１３７ｂｐ、Ｖ対立遺伝子では８１ｂｐ）を８％アクリルアミドゲル（米国カールスバッドに本拠を置くInvitrogen）で分離し、臭化エチジウムで標識して明視化する。
【００９０】
統計解析
データの分布を、シャピロ−ウィルク（Shapiro-Wilk）検定を使用して試験した。範疇別のデータには、カイ二乗（χ2）検定およびフィッシャー検定を用いた。
【００９１】
中央値の比較を、スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【００９２】
単変量解析においてｐ値＜０．１０である全ての変数を、中間モデルに含める。スチューデントのｔ検定（有意モデルとしてｐ＜０．０５）を使用して、フェーズダウン/フェーズアウトの手法により、最終的なモデルにおける変数を求めた。
【００９３】
３．０．２．１０バージョンのＲソフトウェアを使用して、α水準０．０５にて両側検定（bilateral test）を行い、全ての統計解析を実行した。
【００９４】
結果および考察
第２２日目（Ｄ２２）にリツキシマブ単剤療法が評価された後のリンパ球枯渇の結果および考察を基に、ＩＬ−１０コンピテント白血病細胞（Ｂ１０）が、本研究の実験群に含まれる６８例の患者においてインビボのリツキシマブの有効性に及ぼす影響を調査した。
【００９５】
リンパ性白血病（lymphocytic leukemia）細胞数の中央値は、リツキシマブ４回投与以前の第０日目に９１．１３Ｇ／Ｌ（範囲：３．７４〜４９７．４０）であったのが、初期相終了時から第２２日目のリツキシマブ単剤療法までの間では２．６０Ｇ／Ｌ（範囲：０．１４〜１８９．４０）になった。ゆえに、初期相治療でのリツキシマブ単剤療法（第２２日目）以後、リンパ球枯渇率の中央値は９５．１％（範囲７７．０〜９９．９％）に達し、そのうちの６６％はリンパ球枯渇率が９０％超であった。
【００９６】
下掲の表１に、リンパ球枯渇率９０％の場合を基準として患者背景および分布を示す。
【００９７】
リンパ球枯渇率が９０％であることと、臨床パラメータ（年齢、性別、ビネー段階、ＩＧＨＶ変異、細胞遺伝学的異常またはβ２ミクログロブリン）との間には、有意な相関が全く見られなかった。
【００９８】
試験対象となった全ての患者において、Ｂ１０細胞の亜群が同定された（ｎ＝４７、中央値：ＣＬＬ細胞の３．０６％、範囲：０．１２〜２９．５５）。白血病細胞中でのＢ１０細胞の発生は、血漿（plasma）中ＩＬ−１０の量に相関する（図１中、Ｒ＝０．３９、ｐ＝０．０２）。対照的に、血漿（plasma）中ＩＬ−１０の濃度は、非Ｂ１０（non-B10）白血病細胞には相関しない（不図示）。Ｂ１０細胞の発生は、患者の特性に応じて差を生じることもなく、且つＩｇＶＨ変異有りまたは無しＣＬＬ患者において有意な差を生じることもない（中央値６．２９％、範囲：０．１２〜１５．８３と、中央値：１．８５%範囲：０．２３〜２０．８１とをそれぞれ比較対照）。加えて、そのようなＢ１０細胞の発生は、細胞遺伝学的な変化とは相関しなかった（ｄｅｌ１１ｑ、ｄｅｌ１３ｑ、三染色体性１２）。
【００９９】
単変量解析から明らかであるように、初期相におけるリツキシマブ治療（第２２日目）以降にはじめて、リンパ球枯渇率が、Ｂ１０細胞の発生の影響を受け、９０％を突破するようになる（図２中、ｐ＝０．００４）。また、Ｂ１０細胞の発生に基づいて、フルダラビンおよびシクロフォスファミドおよびリツキシマブで治療後３か月目には臨床反応（完全寛解）が予測され、この標準治療が慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）患者に適応しているものと見なされた（ｐ＝０．０４）。
【０１００】
これらの結果から明らかであるように、全てのＣＬＬ患者がＢ１０細胞の副母集団を有しており、この副母集団は、白血病Ｂ細胞の可変比率を呈するとともに、リツキシマブの臨床的に意義のある活性に対してインビボでの阻害効果を及ぼす。
【０１０１】
ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖ／Ｆは、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）におけるインビボでリツキシマブの有効性に相関するため、本発明者らはコホート内のさまざまな患者における多型を判別した。
【０１０２】
第２２日目に、ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖ／Ｆは、リンパ球（lymphocyte）数が正常なこと（＜５Ｇ／Ｌ）（ｐ＝０．０３）、およびリンパ球枯渇率が９０％であること（ｐ＝０．０３）に有意に関連している。このことはまた、ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖの保有者にも当てはまる（ｐ＝０．０１）（図３）。
【０１０３】
対照的に、ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖ／Ｆは、免疫化学療法後３か月目の臨床反応とは相関しない。また、これらの結果が示唆するように、ＦｃγＲＩＩＩａによって媒介された免疫機能は、リツキシマブの活性に決定的に重要な役目を果たすが、ＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖ／Ｆの関与は、高水準の免疫化学療法、あるいは化学療法での免疫エフェクター細胞の直接阻害のどちらかによってマスキングされうる。
【０１０４】
ロジスティック回帰解析から判るように、初期相治療中の第２２日目のリツキシマブ単剤療法以後にはじめて、９０％であったリンパ球枯渇率に対して、Ｂ１０細胞の発生およびＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖ／Ｆが関連性を持つようになる（近相対危険度（ＯＲ）＝０，８３；信頼区間（ＣＩ）＝０．７２〜０．３；ｐ＝０．００２とＯＲ＝４．９５；９５％ＣＩ＝１．０７〜２７．４８；ｐ＝０．０４とをそれぞれ比較対照）。
【０１０５】
Ｂ１０細胞の発生およびＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８Ｖ／Ｆを使用して作成された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から判るように、曲線下面積（ＡＵＣ）が極めて有意（ＡＵＣ＝０．８５５；９５％ＣＩ＝０．７３２〜０．９７８）であり、リンパ球枯渇率が９０％を突破した患者とリンパ球枯渇率が９０％に満たない患者とが判別し易い（図４）。
【０１０６】
ＲＯＣ曲線（図４）から、以下のデータを抽出できる。
１−  ＦｃγＲＩＩＩａ、単一の受容体の遺伝子型判定によって得られたデータ。
多変量解析（ｎ＝４４）では、母集団ベースとして、曲線下面積（ＡＵＣ＝０．６６９）、９５％ＣＩ＝０．５１４〜０．８２４が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
【０１０７】
【表１】
2018518198.tif 000002
【０１０８】
同定された偽陽性が（約３３％と）極めて多いことが判る。
２−  Ｂ１０細胞の数のみから得られたデータ。
ａ．閾値を４．３４％とした場合
【０１０９】
多変量解析（ｎ＝４４）では、母集団ベースとしてＡＵＣ＝０．７７９、９５％ＣＩ＝０．６５２〜０．９０５が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
【０１１０】
【表２】
2018518198.tif 000003
【０１１１】
ｂ．閾値を３％とした場合
【０１１２】
多変量解析（ｎ＝４４）では、母集団ベースとしてＡＵＣ＝０．７２９、９５％ＣＩ＝０．５９８〜０．５８９であり、結果は次のとおりである。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
ｃ．閾値を５％とした場合
【０１１５】
多変量解析（ｎ＝４４）では、母集団ベースとしてＡＵＣ＝０．７２６、９５％ＣＩ＝０．５８６〜０．８６６が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
Ｂ１０細胞の閾値を５％未満とした場合、偽陽性率が約５％にまで低下することが明らかである。Ｂ１０の検出による予後診断の改善度は、多型の検出による場合と比較して有意である。
３−  ＦｃγＲＩＩＩａ受容体およびＢ１０の遺伝子型判定によって得られたデータ。
多変量解析（ｎ＝４４）では、母集団ベースとして（曲線下面積（ＡＵＣ＝０．０８５５）９５％ＣＩ＝０．７３２〜０．９７８が用いられた。これらに基づいて得られた結果は下表のとおりである。
【０１１８】
【表５】
2018518198.tif 000006
【０１１９】
上掲の表２〜表６において、病態が存在するときに、その病態を検定で同定することの可能な程度を測る尺度を、感受性（Sensitivity）と言う。この感受性は、Ｓｅ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）、つまり、病態を有するものとして検定で検出される真陽性（True positive）（ＴＰ）が占める比率である。偽陰性（False negative）とは、「病態」を有するにもかかわらず、検定では検出されない患者のことを言う。病態無しの患者を切り離すことの方が容易であるという理由から、スクリーニングにおいては感受性の高いことが好ましい。
【０１２０】
病態が存在しないときに、その病態を検定で排除しても差し支えのないことを、特異性と言う。この特異性は、Ｓｐ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）、つまり、病態を有さないものとして検定で検出される真陰性（True negative）（ＴＮ）が占める比率である。偽陽性（False positive）とは、「病態」を有さないにもかかわらず、試験では陽性として検出されてしまう患者のことを言う。
【０１２１】
多型およびＢ１０細胞数の検出を組み合わせることによって、予後診断に改善が見られる。特に、偽陰性と見なされた患者の数の低減がかなり有意である。更に、この二重検出によって、閾値がＢ１０の５％未満の場合には感受性が良好（およそ８６％）となる。
【０１２２】
このようにして、本発明者らにより、慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）に罹患しリツキシマブを投与されている患者において母集団Ｂ１０が判別されたと同時に、これらの患者のＦｃγＲＩＩＩａの表現型１５８ＶＦも判別された。
【０１２３】
Ｂ１０細胞の発生およびＦｃγＲＩＩＩａの多型１５８ＶＦが慢性リンパ性白血病（chronic lymphoid leukemia）患者におけるリツキシマブに対する反応に影響を及ぼすことを、本発明者らは証明することができた。
【０１２４】
これらの２つの要因の解析によって、予後応答の予測に対する感受性および特異性が高まる。
【０１２５】
【表６−１】
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【０１２６】
【表６−２】
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【０１２７】
実施例２
また、制御性Ｂ細胞の発生率を解析するための、単純且つ迅速な方法が、本発明者らによって提案された。この方法を、フローサイトメトリによるＩＬ−１０の合成の細胞質内検出に基づく基準の方法と比較した。
【０１２８】
本方法は、末梢血試料からの陰性選択によって、通常は白血球中にごく少量しか存在しないＢリンパ球（lymphocyte B）の母集団の第１富化工程からなる。血液を、相分離管（タイプBDバキュテイナCPT）中に採取する。代わりに、相分離管内に抗凝血剤が含有されている一次管から、血液を移すこともできる。
【０１２９】
白血球相（leukocyte phase）をＢリンパ球（B lymphocyte）で富化するため、血液試料にRosetteSepStemCellタイプの枯渇カクテルを加える。インキュベーションと、遠心分離と、２回の遠心による細胞洗浄とを含めた本工程の終了時に、Ｂリンパ球（B lymphocyte）含有率が９０％超の母集団が得られる。
【０１３０】
細胞を顕微鏡下で目視計数するかまたはサイトメトリで計数して、６×１０６細胞／ｍｌの濃度に調製し、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清を含有する培養物中に入れた。細胞を、ＣＰＧモチーフとＣＤ４０＋ファシジング−ヒスチジン抗体との混合物としてのカクテルポリクローナル活性化因子のカクテルで刺激する。これと並行的に、未だ刺激を受けていない窪み（well）が出来る。培養物を、１８時間〜４８時間にわたって介入無しで３７℃に維持した。
【０１３１】
このインキュベーション終了時に、細胞培養を遠心し、培養物の上清を集めて−２０℃で貯臓するか、または分泌されたＩＬ−１０の濃度を判別する酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で直ちに検定した。
【０１３２】
サイトメトリにおいて参照法（reference method）と比較して得られたデータから判るように、ＩＬ−１０分泌アッセイＥＩＡを用いた方法によって、２つの方法の間でかなり相関性のある結果が得られる。このようにして、制御性Ｂ細胞の含有率が５％超である細胞試料が、正しく同定される（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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