(57)【要約】  生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、（ａ）固体支持体上でランダムに配置された異なる核酸プローブを含む固体支持体を提供する工程であって、異なる核酸プローブはそれぞれ、固体支持体上に他のランダムに配置されたプローブのバーコード配列とは異なるバーコード配列を包含する、工程；（ｂ）固体支持体上で核酸検出反応を実行して、固体支持体上にバーコード配列を配置する工程；（ｃ）生物学的試料を、ランダムに配置されたプローブを有する固体支持体と接触させる工程；（ｄ）ランダムに配置されたプローブを、生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｅ）標的核酸にハイブリダイズしたランダムに配置されたプローブを改変し、それによってバーコード配列と標的特異的な改変とを包含する改変されたプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けする工程を包含する、方法。【選択図】なし
2018510662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、
（ａ）固体支持体に異なる核酸プローブを付着させて、固体支持体上でランダムに配置されたプローブを生産する工程であって、異なる核酸プローブはそれぞれ、バーコード配列を含み、ランダムに配置されたプローブのそれぞれは、固体支持体上に他のランダムに配置されたプローブとは異なるバーコード配列を含む、工程；
（ｂ）固体支持体上で核酸検出反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置されたプローブのバーコード配列を決定する工程；
（ｃ）生物学的試料を、ランダムに配置されたプローブを含む固体支持体と接触させる工程；
（ｄ）ランダムに配置されたプローブを、ランダムに配置されたプローブの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および
（ｅ）ランダムに配置されたプローブを伸長させて、バーコード配列と標的核酸からの配列とを含む伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けする工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、固体支持体上でランダムに配置されたプローブのそれぞれを増幅して、固体支持体上に核酸プローブの複数のアンプリコンを含むクラスターを形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体が、複数のクラスターを含み、複数のクラスターの平均ピッチが、１０μｍ未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体が、複数のクラスターを含み、クラスターの平均面積が、１００μｍ2未満である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
核酸検出反応が、シーケンシング反応を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
核酸検出反応が、デコーダープローブのハイブリダイゼーション反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
固体支持体が、ビーズのアレイを含み、異なる核酸プローブが、アレイ中の異なるビーズに付着される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）が、固体支持体上に異なるビーズをランダムに分配させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固体支持体が、複数の前記ビーズの１個のビーズのみを受け入れる寸法を有するウェルを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
異なるビーズが、異なるバーコード配列に付着されており、異なるバーコード配列の数が、ウェルの数を超える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
固体支持体が、少なくとも１×１０6個の、異なる核酸プローブを含む異なるビーズを含む、請求項７から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ビーズのアレイが、１０μｍ未満の平均ピッチを含む、請求項７から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ビーズが、１０μｍ未満の平均直径を含む、請求項７から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
固体支持体に異なる核酸プローブを付着させることが、異なる核酸プローブの流体混合物を固体支持体と接触させることを含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体が、別個のフィーチャのパターンを含み、異なる核酸プローブが、パターン中の別個のフィーチャにランダムに分配される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
異なるバーコード配列の数が、流体混合物と接触するフィーチャの数を超える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
固体支持体が、少なくとも１×１０6個の異なる核酸プローブを含む、請求項１または請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固体支持体が、ゲルコーティングを含む、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
複数の核酸プライマーが、ゲルコーティングに付着されており、複数のもののうちの核酸プライマーが、複数のもののうちの核酸プライマーに共通のユニバーサルプライマー配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
異なる核酸プローブが、ユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズするユニバーサルプライマー結合性配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）が、核酸プライマーの伸長によって異なる核酸プローブを増幅し、それによって固体支持体上に核酸プローブの複数のアンプリコンを含む核酸クラスターを生産することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の複数の核酸プライマーが、ゲルコーティングに付着されており、第２の複数のもののうちの核酸プライマーが、第２の複数のもののうちの核酸プライマーに共通の第２のユニバーサルプライマー配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異なる核酸プローブが、第２のユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズする第２のユニバーサルプライマー結合性配列を含み、増幅することは、架橋増幅を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
異なる核酸プローブが、生物学的試料からの異なる標的核酸配列にハイブリダイズする異なる標的捕獲配列を含む、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
異なる核酸プローブが、固体支持体上でランダムに配置されたプローブに共通の標的捕獲配列を含む、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
標的捕獲配列が、ポリＴまたはポリＡ配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
固体支持体と接触する生物学的試料の画像を獲得する工程をさらに含む、請求項１から２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ランダムに配置されたプローブで決定されたバーコード配列を、生物学的試料の画像における配置と相関させる工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固体支持体から伸長したプローブを除去する工程をさらに含む、請求項１、２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
伸長したプローブをプールして、固体支持体から除去された伸長したプローブの混合物を形成する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
固体支持体から除去された伸長したプローブの標的核酸からの配列およびバーコード配列を決定する工程をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
固体支持体から除去された伸長したプローブを、第２の固体支持体に付着させる工程をさらに含む、請求項２９、３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
標的核酸からの配列およびバーコード配列が、合成によるシーケンシング技術によって決定される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｂ）の間、固体支持体が、フローセル中またはその上に配置されている、請求項１から３３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｃ）の間、固体支持体が、フローセルから除去される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｃ）の間、フローセルを開放して、固体支持体を露出させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
固体支持体と接触させる生物学的試料が、細胞の混合物である、請求項１から３６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｃ）が、細胞を固体支持体に付着させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｃ）が、細胞を溶解させて、細胞から標的核酸を放出させることをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
固体支持体と接触させる生物学的試料が、組織である、請求項１から３６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｃ）が、組織を固体支持体に付着させることをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｃ）が、組織を透過化して、組織から標的核酸を放出させることをさらに含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
標的核酸が、ｍＲＮＡ、ｇＤＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡからなる群より選択される、請求項１から４２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、
（ａ）固体支持体に付着した複数の核酸プライマーを提供する工程であって、複数のもののうちの核酸プライマーは、複数のもののうちの核酸プライマーに共通のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）核酸プローブの集団を、複数の核酸プライマーに結合させる工程であって、核酸プローブは、ユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズするユニバーサルプライマー結合性配列、標的捕獲配列および集団中の他の核酸プローブのバーコード配列とは異なるバーコード配列を含み、それによって固体支持体上でランダムに配置された位置に異なる核酸プローブを付着させる、工程；
（ｃ）核酸プライマーの伸長によって異なる核酸プローブを増幅し、それによって固体支持体上でランダムに配置された位置で、バーコード配列のコピーと標的捕獲配列とを有する核酸クラスターを生産する工程；
（ｄ）シーケンシング反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置された位置におけるバーコード配列を決定する工程；
（ｅ）生物学的試料を、固体支持体上で核酸クラスターと接触させる工程；
（ｆ）クラスターの標的捕獲配列を、クラスターの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および
（ｇ）標的捕獲配列を伸長させて、標的核酸からの配列とバーコード配列のコピーとを含む伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸をタグ付けする工程
を含む、方法。
【請求項４５】
第２の複数の核酸プライマーが、固体支持体に付着されており、第２の複数のもののうちの核酸プライマーが、第２の複数のもののうちの核酸プライマーに共通の第２のユニバーサルプライマー配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
異なる核酸プローブが、第２のユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズする第２のユニバーサルプライマー結合性配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
異なる核酸プローブを増幅することが、架橋増幅を含み、第１および第２の複数のもののうちの核酸プライマーが、伸長される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
核酸プローブが、標的捕獲配列と第２のユニバーサルプライマー結合性配列との間に切断部位をさらに含む、請求項４５から４７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ｇ）の前に、標的捕獲配列と第２のユニバーサルプライマー結合性配列との間の切断部位を切断する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
異なる核酸プローブが、生物学的試料からの異なる標的核酸配列にハイブリダイズする異なる標的捕獲配列を含む、請求項４４から４９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
異なる核酸プローブが、固体支持体上でランダムに配置されたプローブに共通の標的相補配列を含む、請求項４４から４９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
標的相補配列が、ポリＴまたはポリＡ配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
標的核酸が、工程（ｆ）において標的相補配列にハイブリダイズするポリＡテールを有するｍＲＮＡ分子を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
核酸プローブのそれぞれが、バーコード配列と核酸プローブの固体支持体への付着点との間に配置される切断部位を含む、請求項４４から５３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
バーコード配列と核酸プローブの固体支持体への付着点との間に配置される切断部位で切断することによって、固体支持体から伸長したプローブを除去する工程をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
伸長したプローブをプールして、固体支持体から除去された伸長したプローブの混合物を形成する工程をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
固体支持体から除去された伸長したプローブの標的核酸からの配列およびバーコード配列を決定する工程をさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
固体支持体から除去された伸長したプローブを、第２の固体支持体に付着させる工程をさらに含む、請求項５５、５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
標的核酸からの配列およびバーコード配列が、合成によるシーケンシング技術によって決定される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
異なる核酸プローブが、シーケンシングプライマー結合性部位をさらに含み、合成によるシーケンシング技術が、シーケンシングプライマーをシーケンシングプライマー結合性部位にハイブリダイズすることを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
シーケンシングプライマー結合性部位の配列が、異なる核酸プローブで同じである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
固体支持体が、ゲルコーティングを含む、請求項４４から６１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
核酸プライマーが、ゲルを介して固体支持体に付着されている、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
固体支持体が、複数のクラスターを含み、複数のクラスターの平均ピッチが、１０μｍ未満である、請求項４４から６３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
固体支持体が、複数のクラスターを含み、クラスターの平均直径が、１００μｍ2未満である、請求項４４から６４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｂ）が、異なる核酸プローブの流体混合物を固体支持体と接触させることを含む、請求項４４から６５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
固体支持体が、別個のフィーチャのパターンを含み、異なる核酸プローブが、パターン中の別個のフィーチャにランダムに分配される、請求項４４から６６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
異なるバーコード配列の数が、流体混合物と接触するフィーチャの数を超える、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
固体支持体が、少なくとも１×１０6個の異なる核酸プローブを含む、請求項４４から６８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
固体支持体と接触する生物学的試料の画像を獲得する工程をさらに含む、請求項４４から６６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
ランダムに配置された位置で決定されたバーコード配列を、生物学的試料の画像における配置と相関させる工程をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
工程（ｄ）の間、固体支持体が、フローセル中またはその上に配置されている、請求項４４から７１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
工程（ｅ）の間、固体支持体が、フローセルから除去される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
工程（ｅ）の間、フローセルを開放して、固体支持体を露出させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
固体支持体と接触させる生物学的試料が、細胞の混合物である、請求項４４から７４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
工程（ｅ）が、細胞を固体支持体に付着させることをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
工程（ｅ）が、細胞を溶解させて、細胞から標的核酸を放出させることをさらに含む、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
固体支持体と接触させる生物学的試料が、組織である、請求項４４から７７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
工程（ｅ）が、組織を固体支持体に付着させることをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
工程（ｅ）が、組織を透過化して、組織から標的核酸を放出させることをさらに含む、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
標的核酸が、ｍＲＮＡ、ｇＤＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡからなる群より選択される、請求項４４から８０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、
（ａ）固体支持体上にビーズのアレイを提供する工程であって、異なる核酸プローブは、アレイ中の異なるビーズに付着され、異なる核酸プローブはそれぞれ、バーコード配列を含み、各ビーズは、固体支持体上に他のビーズからの異なるバーコード配列を含み、異なる核酸プローブのそれぞれは、標的捕獲配列を含む、工程；
（ｂ）固体支持体上でデコーダープローブのハイブリダイゼーション反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置されたプローブにおけるバーコード配列を決定する工程；
（ｃ）生物学的試料をビーズのアレイと接触させる工程；
（ｄ）異なる核酸プローブを、ビーズの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および
（ｅ）異なる核酸プローブを伸長させて、標的核酸からの配列とバーコード配列とを含む伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸をタグ付けする工程
を含む、方法。
【請求項８３】
工程（ａ）が、固体支持体上に異なるビーズをランダムに分配させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
固体支持体が、複数の前記ビーズの１個のビーズのみを受け入れる寸法を有するウェルを含む、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
異なるバーコード配列の数が、ウェルの数を超える、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ビーズのアレイが、少なくとも１×１０6個の、異なる核酸プローブを含む異なるビーズを含む、請求項８２から８５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
ビーズのアレイが、１０μｍ未満の平均ピッチを含む、請求項８２から８６までのいずれか１項に記載の方法
【請求項８８】
ビーズが、１０μｍ未満の平均直径を含む、請求項８２から８７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
異なる核酸プローブが、生物学的試料からの異なる標的核酸配列にハイブリダイズする異なる標的捕獲配列を含む、請求項８２から８８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
異なる核酸プローブが、ビーズのアレイ中の異なる核酸プローブに共通の標的捕獲配列を含む、請求項８２から８８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
標的捕獲配列が、ポリＴまたはポリＡ配列を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ビーズのアレイと接触する生物学的試料の画像を獲得する工程をさらに含む、請求項８２から９１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
ビーズのバーコード配列を、生物学的試料の画像における配置と相関させる工程をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
ビーズのアレイから伸長したプローブを除去する工程をさらに含む、請求項８２、９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
伸長したプローブをプールして、ビーズのアレイから除去された伸長したプローブの混合物を形成する工程をさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
固体支持体から除去された伸長したプローブの標的核酸からの配列およびバーコード配列を決定する工程をさらに含む、請求項９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
固体支持体から除去された伸長したプローブを、第２の固体支持体に付着させる工程をさらに含む、請求項９４、９５または９６に記載の方法。
【請求項９８】
標的核酸からの配列およびバーコード配列が、合成によるシーケンシング技術によって決定される、請求項８２から９７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
固体支持体と接触させる生物学的試料が、細胞の混合物である、請求項８２から９８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
工程（ｃ）が、細胞を固体支持体に付着させることをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
工程（ｃ）が、細胞を溶解させて、細胞から標的核酸を放出させることをさらに含む、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
固体支持体と接触させる生物学的試料が、組織である、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０３】
工程（ｃ）が、組織を固体支持体に付着させることをさらに含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
工程（ｃ）が、組織を透過化して、組織から標的核酸を放出させることをさらに含む、請求項１０２または１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
標的核酸が、ｍＲＮＡ、ｇＤＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡからなる群より選択される、請求項８２から１０４までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
男性４人のうち１人が、がんで死亡すると予想される。米国がん学会によるさらなる統計によれば、女性５人のうち１人が同じ運命に遭うことが予想される。多くのがんには、利用可能な処置がある。しかしながら、ほとんどにとっての成功は、早期発見に頼っている。
現在、がんはゲノムの疾患と言われている。多くの腫瘍学者およびがん研究者は、ゲノム分析ツールの進歩が早期発見および処置への道を提供することを期待している。しかしながら、これらのツールは、ほとんどの腫瘍学者が容易に入手できるレベルにまだ達していない研究所においてより重要である。改善が必要である。
診断時、全てのがん患者はモザイクであると言われている。がん患者は、少なくとも２つの別個のゲノム、すなわちがん患者が持って生まれたゲノムと、がん患者が不本意ながらがんにより獲得したゲノムとを有するため、モザイクである。さらに、腫瘍が成長するにつれて、別個のがん細胞集団が顕在化する。それにより、腫瘍内でモザイクがより一層複雑になる。このがん細胞の不均質性はしばしば、がん療法に異なって応答する細胞の部分集団を生じる。最終結果は、多くの場合、細胞のある部分集団の初期の陽性応答であり、そのため患者の腫瘍の縮小が観察されるが、その後、結局は腫瘍組織の再成長、一部のケースでは転移に至る。腫瘍の早期発見にもかかわらず、処置に抵抗性を有する細胞の部分集団を同定できなければ、高悪性度のがんを処置するのに要する時間の損失を引き起こす可能性がある。これは、患者にとって感情的にも物理的にも有害事象を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
腫瘍中のがん細胞の部分集団を区別できるゲノムツールへの必要性がある。本発明の開示は、この必要性に取り組み、さらには他の利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の開示は、生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法を提供する。本方法は、（ａ）固体支持体上でランダムに配置された複数の異なる核酸プローブを含む固体支持体を提供する工程であって、異なる核酸プローブはそれぞれ、固体支持体上に他のランダムに配置されたプローブのバーコード配列とは異なるバーコード配列を包含する、工程；（ｂ）固体支持体上で核酸検出反応を実行して、固体支持体上にバーコード配列を配置する工程；（ｃ）生物学的試料を、ランダムに配置されたプローブを有する固体支持体と接触させる工程；（ｄ）ランダムに配置されたプローブを、ランダムに配置されたプローブの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｅ）標的核酸にハイブリダイズしたランダムに配置されたプローブを改変し、それによってバーコード配列と標的特異的な改変とを包含する改変されたプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けする工程を包含し得る。
【０００４】
この開示は、生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、（ａ）固体支持体に異なる核酸プローブを付着させて、固体支持体上でランダムに配置されたプローブを生産する工程であって、異なる核酸プローブはそれぞれ、バーコード配列を包含し、ランダムに配置されたプローブのそれぞれは、固体支持体上に他のランダムに配置されたプローブとは異なるバーコード配列を包含する、工程；（ｂ）固体支持体上で核酸検出反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置されたプローブのバーコード配列を決定する工程；（ｃ）生物学的試料を、ランダムに配置されたプローブを有する固体支持体と接触させる工程；（ｄ）ランダムに配置されたプローブを、ランダムに配置されたプローブの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｅ）ランダムに配置されたプローブを伸長させて、バーコード配列と標的核酸からの配列とを包含する伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けする工程を包含する方法をさらに提供する。
【０００５】
生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、（ａ）固体支持体に付着した複数の核酸プライマーを提供する工程であって、複数のもののうちの核酸プライマーは、複数のもののうちの核酸プライマーに共通のユニバーサルプライマー配列を包含する、工程；（ｂ）核酸プローブの集団を、複数の核酸プライマーに結合させる工程であって、核酸プローブは、ユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズするユニバーサルプライマー結合性配列、標的捕獲配列および集団中の他の核酸プローブのバーコード配列とは異なるバーコード配列を包含し、それによって固体支持体上でランダムに配置された位置に異なる核酸プローブを付着させる、工程；（ｃ）核酸プライマーの伸長によって異なる核酸プローブを増幅し、それによって固体支持体上でランダムに配置された位置で、バーコード配列のコピーと標的捕獲配列とを有する核酸クラスターを生産する工程；（ｄ）シーケンシング反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置された位置におけるバーコード配列を決定する工程；（ｅ）生物学的試料を、固体支持体上で核酸クラスターと接触させる工程；（ｆ）クラスターの標的捕獲配列を、クラスターの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｇ）標的捕獲配列を伸長させて、標的核酸からの配列とバーコード配列のコピーとを包含する伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸をタグ付けする工程を包含する、方法も提供される。
【０００６】
この開示は、生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、（ａ）固体支持体上にビーズのアレイを提供する工程であって、異なる核酸プローブは、アレイ中の異なるビーズに付着され、異なる核酸プローブはそれぞれ、バーコード配列を包含し、各ビーズは、固体支持体上に他のビーズからの異なるバーコード配列を包含し、異なる核酸プローブのそれぞれは、標的捕獲配列を包含する、工程；（ｂ）固体支持体上でデコーダープローブのハイブリダイゼーション反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置されたプローブにおけるバーコード配列を決定する工程；（ｃ）生物学的試料をビーズのアレイと接触させる工程；（ｄ）異なる核酸プローブを、ビーズの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｅ）異なる核酸プローブを伸長させて、標的核酸からの配列とバーコード配列とを包含する伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸をタグ付けする工程を包含する、方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル上でバーコード化されたオリゴｄＴプローブを生成し、ｍＲＮＡ配列を有する伸長したバーコード化プローブを作り出し、フローセルから伸長したプローブを放出させるのに使用できる工程および試薬の図解的な表示を示す図である。
【図２】プローブを架橋増幅し、ＢｓｐＨ１で制限酵素消化して架橋増幅に使用されるプライマー結合性部位の１つを除去した後の、プローブ上のオリゴｄＴ捕獲配列の利用可能性を示すデータを示す図である。
【図３】実施例１で説明され図２に示されるフローセルのシーケンシングの基準（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｒｉｃｓ）を示す図である。
【図４】実施例１で説明され図２に示されるフローセルの２１個のタイルで決定された固有のバーコードの数を示す図である。
【図５】パターン化したフローセル上で捕獲された細胞の画像（パネルＡ）および細胞数データ（パネルＢ）を示す図である。
【図６】異なる条件でフローセルに接着したままの細胞を示す図である。
【図７】ゲルに付着したプローブを作り出すのに使用される工程および試薬の図解的な表示（パネルＡ）、ゲルに付着したプローブを使用して標的核酸を捕獲してプローブを蛍光標識するのに使用される工程および試薬の図解的な表示（パネルＢ）、およびプローブによる捕獲とゲルからの組織の除去後における蛍光標識した標的核酸によって作り出された画像を示す図である。
【図８】ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）に付着したプローブを使用して標的核酸を捕獲してプローブを蛍光標識するのに使用される工程および試薬の図解的な表示（パネルＡ）、およびプローブによる捕獲とＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）からの組織の除去後における蛍光標識した標的核酸によって作り出された画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の開示は、生物学的試料のマルチプレックスな核酸分析を実行するときに空間的な情報を保存するための組成物、装置および方法を提供する。様々なツールが、マルチプレックスな核酸分析、例えば核酸マイクロアレイおよびいわゆる「次世代」シーケンシングプラットフォームなどに利用可能である。このようなツールは、例えば、生物の遺伝物質の全てまたはほぼ全てに相当するＤＮＡ収集物（すなわち「ゲノム」）、生物の発現される遺伝子の相補物の全てまたはほぼ全てに相当するＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）収集物（すなわち「トランスクリプトーム」）などのかなり大規模で複雑な核酸の収集物の並行検出を可能にし、一部のケースでは、収集は、数種の異なる生物からの数種のゲノムおよび／またはトランスクリプトーム（例えば共同体または生態系からのメタボロームまたはバイオーム）を包含する場合もある。これらのツールは、評価される生物学的試料中にどれほどの核酸配列が存在するのかに関する膨大な量の情報を提供するが、いずれかの特定の核酸が生物学的試料中でどこに存在するのかを本来的に区別しない。実際に、マルチプレックスな核酸分析ツールに適用されるサンプルの圧倒的多数が、生物学的試料由来の多くの様々な細胞の混合物から得られたホモジネートである。結果として空間的な情報は失われ、これらのツールから得られた結果は、その試料における平均的なトランスクリプトームまたは平均的なゲノムとみなされ、個々の細胞間の重要な差は失われる。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明の開示は、核酸が得られる生物学的試料の空間的な情報の保存を可能にする、既存のマルチプレックスな核酸分析ツールへの新しい有用な改変を提供する。例えば、通常マルチプレックスな合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＳＢＳ）技術に使用される固体支持体を、生物学的試料から核酸を捕獲して空間的にタグ付けすることに使用するために改変することができる。代替例において、ビーズのアレイ、例えば遺伝子型解析または遺伝子発現分析に使用されるものを、生物学的試料から核酸を捕獲して空間的にタグ付けすることに使用することができる。以下の実施例に記載されるように、ＳＢＳに使用される固体支持体、またはＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により商品化されたＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームは、空間的なタグ付けのために改変することができる。しかしながら、様々な固体支持体のいずれも、本明細書に記載の教示に従って作製し使用できることが理解されると予想される。空間的にタグ付けされた核酸は、固体支持体から除去し、一緒にプールして、例えば、本明細書に記載のシーケンシングプラットフォームまたはマイクロアレイプラットフォームなどの様々なマルチプレックスな核酸分析システムのいずれかでの検出のために第２の固体支持体に付着させることができる。
【００１０】
本明細書に記載の方法、組成物または装置によって提供される空間的な情報としては、例えば、１つまたは複数の遺伝子座（例えば遺伝子型）に特定の対立遺伝子を有する、ゲノム中に特定の構造的なバリエーション（例えば融合、挿入、欠失、再配列など）を有する、特定の後成的な署名（例えばメチル化）を有する、特定の遺伝子を発現する、遺伝子の特定の対立遺伝子を発現する、遺伝子の特定のスプライスバリアントを発現する等の、組織（または他の試料）中の１つまたは複数の細胞の配置を挙げることができる。生物学的試料中のその空間的な配置に従って核酸を同定することに加えて、本発明の開示の方法、組成物または装置は、空間的な配置に従って１つまたは複数の核酸を定量するのに使用することができる。例えば、組織（または他の試料）中の１つまたは複数の細胞に関する空間的な情報としては、ゲノム中の特定の対立遺伝子または染色体領域の量（例えば倍数関係）；遺伝子座の後成的な改変（例えばメチル化）の量；特定の遺伝子、対立遺伝子またはスプライスバリアントの発現レベル等を挙げることができる。量は、混成の、または非空間的にタグ付けされたサンプルで当業界で達成された類似の測定に従って絶対量であってもよく、または相対量であってもよい。
【００１１】
本明細書に記載の方法は、生物学的試料中の核酸の局所的な検出に使用することができる。一部の実施形態において、方法は、生物学的試料のトランスクリプトームまたはゲノムの全てを同定するかまたは特徴付けるのに使用することができる。代替として、方法は、試料のトランスクリプトームまたはゲノムの一部のみを同定するかまたは特徴付けるのに使用することができる。本明細書に記載の方法で評価された転写物または遺伝子のサブセットは、特定の疾患または状態に関する可能性がある。
【００１２】
本明細書に記載の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡにかかわらず、生物学的試料中の核酸の局所的または空間的な検出に使用することができる。したがって、１つまたは複数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、細胞もしくは組織または他の生物学的試料中におけるその自然の位置または配置に関して配置させることができる。例えば、１つまたは複数の核酸は、細胞もしくは隣接する細胞のグループに、または細胞のタイプに、または組織サンプル中のエリアの特定の領域に局所化することができる。個々のＲＮＡまたはＤＮＡ分子の自然の配置または位置は、本発明の開示の方法、装置または組成物を使用して決定することができる。
本明細書で使用される用語は、別段の規定がない限り関連分野におけるその通常の意味で解釈されるものとする。本明細書で使用される数種の用語およびその意味は、以下に記載の通りである。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「アンプリコン」は、核酸に関して使用される場合、核酸のコピー産物を意味し、ここで産物は、その核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同じであるかまたはそれに相補的なヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、テンプレートとして核酸またはそのアンプリコンを使用する様々な増幅方法、例えば、ポリメラーゼ伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ライゲーション伸長、またはライゲーション連鎖反応のいずれかによって生産することができる。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列の単一のコピー（例えばＰＣＲ産物）またはヌクレオチド配列の複数のコピー（例えばコンカテマー様のＲＣＡ産物）を有する核酸分子であってもよい。標的核酸の第１のアンプリコンは、典型的には相補的コピーである。後続のアンプリコンは、標的核酸から、または第１のアンプリコンからの第１のアンプリコンの生成後に作り出されるコピーである。後続のアンプリコンは、標的核酸に実質的に相補的な配列または標的核酸に実質的に同一な配列を有し得る。
【００１４】
用語「アレイ」は、本明細書で使用される場合、相対的な配置に従って互いに識別することができるフィーチャ（feature）または部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイ中の部位の配置に従って互いに識別することができる。アレイの個々の部位は、特定のタイプの１つまたは複数の分子を包含し得る。例えば、部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を包含する場合もあるし、または部位は、同じ配列（および／またはその相補配列）を有する数種の核酸分子を包含する場合もある。アレイの部位は、同じ基板に配置された異なるフィーチャであってもよい。例示的なフィーチャとしては、これらに限定されないが、基板中のウェル、基板中または基板上のビーズ（または他の粒子）、基板からの突出部、基板上の隆起部または基板中のチャネルが挙げられる。アレイの部位は、それぞれ異なる分子を有する別々の基板であってもよい。別々の基板に付着した異なる分子は、基板が連結される表面上の基板の配置に従って、または液体またはゲル中の基板の配置に従って同定することができる。表面上に別々の基板が配置されている例示的なアレイとしては、これらに限定されないが、ウェル中にビーズを有するものが挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「付着した」は、２つのものが互いに合体した、固定された、接着した、接続された、または結合した状況を指す。例えば、核酸などの分析物は、ゲルまたは固体支持体などの材料に、共有結合または非共有結合によって付着させることができる。共有結合は、原子間の電子対の共有を特徴とする。非共有結合は、電子対の共有がない化学結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を挙げることができる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「バーコード配列」は、核酸、核酸の特徴、または核酸に行われた操作を同定するのに使用できる核酸中の一連のヌクレオチドを意味することが意図される。バーコード配列は、バーコード化された核酸を得た生物中において、天然に存在する配列でもよく、または天然に存在しない配列でもよい。バーコード配列は、集団中の単一の核酸種に固有であってもよく、またはバーコード配列は、集団中の数種の異なる核酸種に共通のものであってもよい。例えば、集団中の各核酸プローブは、集団中の全ての他の核酸プローブとは異なるバーコード配列を包含していてもよい。代替として、集団中の各核酸プローブは、集団中の一部またはほとんどの他の核酸プローブとは異なるバーコード配列を包含していてもよい。例えば、集団中の各プローブは、共通のバーコードを有するプローブがその長さに沿って他の配列領域で互いに異なっていたとしても、集団中の数種の異なるプローブごとに存在するバーコードを有していてもよい。特定の実施形態において、生物学的試料と共に使用される１つまたは複数のバーコード配列は、生物学的試料のゲノム、トランスクリプトームまたは他の核酸中に存在しない。例えば、バーコード配列は、特定の生物学的試料中の核酸配列に８０％、７０％、６０％、５０％または４０％未満の配列同一性を有していてもよい。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「生物学的試料」は、１つまたは複数の細胞、組織、生物またはその部分を意味することが意図される。生物学的試料は、様々な生物のいずれからも得ることができる。例示的な生物としては、これらに限定されないが、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄類、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類（すなわちヒトまたは非ヒト霊長類）などの哺乳動物；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、トウモロコシ、モロコシ、オートムギ、コムギ、米、キャノーラ、またはダイズなどの植物；コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などの藻類；カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）などの線虫；キイロショウジョウバエ、蚊、ミバエ、ミツバチまたはクモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚類；爬虫類；カエルまたはアフリカツメガエルなどの両生類；キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、酵母、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｏｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などの真菌；または熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が挙げられる。また標的核酸は、細菌、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌またはマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの原核生物；古細菌（ａｒｃｈａｅ）；Ｃ型肝炎ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；またはウイロイド由来であってもよい。試料は、上記の生物の均一な培養物または集団由来であってもよく、または代替として例えば共同体または生態系の数種の異なる生物の収集物由来であってもよい。
【００１８】
用語「切断部位」は、本明細書で使用される場合、結合の破断を受けやすい核酸分子における配置を意味することが意図される。この配置は、結合の破断を引き起こす特定の化学的、酵素的または物理的なプロセスに特異的であってもよい。例えば、この配置は、脱塩基したヌクレオチド、または除去されて脱塩基部位を生じやすい塩基を有するヌクレオチドであり得る。除去を受けやすいヌクレオチドの例としては、本明細書の以下においてさらなる詳細で記載されるように、ウラシルおよび８−オキソグアニンが挙げられる。この配置はまた、ニッキング酵素などの制限エンドヌクレアーゼの認識配列にあってもよく、またはその近くにあってもよい。
【００１９】
用語「クラスター」は、本明細書で使用される場合、核酸に関して使用される場合、フィーチャまたは部位を形成するために固体支持体に付着される核酸の集団を指す。核酸は、一般的に単一種のメンバーであり、それによりモノクローナルクラスターが形成される。核酸の「モノクローナル集団」は、特定のヌクレオチド配列に関して均一な集団である。クラスターは、必ずしもモノクローナルでなくてもよい。それよりむしろ、いくつかの用途について、クラスターは、第１の核酸からのアンプリコンに基づき優勢に集団化していてもよく、低レベルの第２の核酸からのアンプリコンの混入があってもよい。例えば、クラスターのアレイが検出用途で使用される場合、混入の許容レベルは、検出技術のシグナル対ノイズまたは分析能に許容できない程の影響を及ぼさないレベルと予想される。したがって、見かけのクローン生成能は、一般的に、本明細書に記載の方法によって作製されたアレイ特定の使用または用途に関連すると予想される。個々のクラスターにおいて許容できる例示的な混入レベルとしては、これらに限定されないが、最大で０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、５  ２５％、または３５％の混入アンプリコンが挙げられる。クラスター中の核酸は、一般的に、例えばその５’末端を介して固体支持体に共有結合で付着されるが、一部のケースにおいて、他の付着手段も可能である。クラスター中の核酸は、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。全てではないがいくつかの実施形態において、クラスターは、架橋増幅として公知の固相増幅方法によって作製される。例示的なクラスターの構成およびそれらを生産するための方法は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，６４１，６５８号；米国特許公開第２００２／００５５１００号；米国特許第７，１１５，４００号；米国特許公開第２００４／００９６８５３号；米国特許公開第２００４／０００２０９０号；米国特許公開第２００７／０１２８６２４号；および米国特許公開第２００８／０００９４２０号に記載されている。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「異なる」は、核酸に関して使用される場合、核酸が互いに同じではないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つ以上の核酸が、その全長にわたり異なるヌクレオチド配列を有していてもよい。代替として、２つ以上の核酸が、その長さの相当部分にわたり異なるヌクレオチド配列を有していてもよい。例えば、２つ以上の核酸が、２つ以上の分子で異なる標的ヌクレオチド配列部分を有し、同時に２つ以上の分子で同じユニバーサル配列部分も有していてもよい。２つのビーズが、異なる核酸に付着されているという理由で互いに異なっていてもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「各」は、ものの収集物に関して使用される場合、収集物中の個々のものを明らかにすることが意図されるが、必ずしも収集物中のものの一つ一つを指すわけではない。明示的な開示または文脈が明らかにそうではないことを規定する場合、例外が発生する場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「伸長する」は、核酸に関して使用される場合、核酸への少なくとも１つのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの付加を意味することが意図される。特定の実施形態において、１つまたは複数のヌクレオチドを、例えばポリメラーゼ触媒作用（例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）を介して核酸の３’末端に付加することができる。１つまたは複数のヌクレオチドを核酸の３’または５’末端に付加するのに、化学的または酵素的方法を使用することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、例えば化学的または酵素的な（例えばリガーゼ触媒作用）方法を介して核酸の３’または５’末端に付加することができる。核酸は、テンプレート指向的な方式で伸長させることができ、それによって伸長産物は、伸長される核酸にハイブリダイズされるテンプレートの核酸に相補的である。
【００２２】
用語「フィーチャ」は、本明細書で使用される場合、特定の分子種に関するアレイ中の配置を意味する。フィーチャは、単一の分子のみを含有していてもよく、または同じ種の数種の分子の集団を含有していてもよい。アレイのフィーチャは、典型的には別個である。別個のフィーチャは、隣接していてもよく、または互いに間隔を開けていてもよい。フィーチャのサイズおよび／またはフィーチャ間の間隔は、アレイが高密度、中密度またはより低い密度になるように変更が可能である。高密度のアレイは、約１５μｍ未満で分離した部位を有することと特徴付けられる。中密度のアレイは、約１５〜３０μｍ分離した部位を有し、一方で低密度のアレイは、３０μｍより大きく分離した部位を有する。本明細書において有用なアレイは、例えば、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、または０．５μｍ未満で分離した部位を有していてもよい。本発明の開示の装置または方法は、上記の密度または密度範囲で部位を区別するのに十分な分析能でアレイを検出するのに使用することができる。
【００２３】
用語「流体混合物」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の異なるものが溶液中に同時に存在することを意味することが意図される。典型的には、２つ以上のものは、溶液中で自由に拡散可能である。２つ以上のものは、異なるタイプのもの（例えば核酸と、異なるタイプの分子であるタンパク質）であってもよく、または異なる種の同じタイプのもの（例えば異なる配列を有する２つの核酸分子）であってもよい。流体混合物中に存在し得る例示的なものとしては、これらに限定されないが、分子、細胞またはビーズが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「フローセル」は、反応を行うことができるチャンバー、チャンバーに試薬を送達するための入口、およびチャンバーから試薬を除去するための出口を有する容器を意味することが意図される。一部の実施形態において、チャンバーは、チャンバーで起こる反応を検出するために設計される。例えば、チャンバーは、チャンバー中の生物学的試料、光学的に標識された分子等の視覚的な検出を可能にする１つまたは複数の透明な表面を包含し得る。例示的なフローセルとしては、これらに限定されないが、核酸シーケンシング装置で使用されるもの、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により商品化されたＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）もしくはＨｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォームのためのフローセル；またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により商品化されたＳＯＬｉＤ（商標）もしくはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）シーケンシングプラットフォームのためのフローセルが挙げられる。例示的なフローセルならびにそれらを製造および使用するための方法はまた、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１４２８４１；米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号および米国特許第８，９５１，７８１号にも記載されている。
【００２５】
用語「ゲル」は、本明細書で使用される場合、液体およびガスに対して透過性の半剛体の材料を意味することが意図される。典型的には、ゲル材料は、液体を吸収すると膨潤することができ、液体が乾燥によって除去されると収縮することができる。例示的なゲルとしては、これらに限定されないが、コロイド構造を有するもの、例えばアガロース；ポリマーメッシュ構造、例えばゼラチン；または架橋ポリマー構造、例えばポリアクリルアミド、ＳＦＡ（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号を参照）またはＰＡＺＡＭ（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／００７９９２３号を参照）が挙げられる。特に有用なゲル材料は、それが存在するウェルまたは他のくぼんだフィーチャの形状に適合するものと予想される。
【００２６】
用語「核酸」および「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、当業界におけるその使用と一致することが意図され、天然に存在する種またはその機能的な類似体を包含する。特に有用な核酸の機能的な類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることが可能であるか、または特定のヌクレオチド配列の複製のためのテンプレートとして使用することが可能である。天然に存在する核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体の構造は、当業界において公知の様々な連結のいずれかを含む、代替の骨格の連結を有することができる。天然に存在する核酸は、一般的に、デオキシリボース糖（例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出される）またはリボース糖（例えばリボ核酸（ＲＮＡ）に見出される）を有する。核酸は、当業界において公知のこれらの糖成分の様々な類似体のいずれかを有するヌクレオチドを含有していてもよい。核酸は、自然または非自然のヌクレオチドを包含していてもよい。これに関して、自然のデオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群より選択される１つまたは複数の塩基を有していてもよく、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシンまたはグアニンからなる群より選択される１つまたは複数の塩基を有していてもよい。核酸またはヌクレオチド中に包含され得る有用な非自然の塩基は、当業界において公知である。用語「プローブ」または「標的」は、核酸または核酸配列に関して使用される場合、本明細書に記載の方法または組成物の文脈において核酸または配列に関する意味論上の識別名であることが意図され、明示的に別段の指示がない限り、必ずしも核酸または配列の構造または機能を限定するものではない。用語「プローブ」および「標的」は同様に、タンパク質、小分子、細胞等の他の分析物にも適用することができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「ピッチ」は、アレイのフィーチャに関して使用される場合、隣接するフィーチャの中心から中心の間隔を指すことが意図される。フィーチャのパターンは、平均ピッチに関して特徴付けることができる。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように並べてもよく、または変動係数が比較的大きくなる可能性があるケースでは、パターンはランダムであってもよい。いずれのケースにおいても、平均ピッチは、例えば、少なくとも約１０ｎｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１００μｍまたはそれより大きくてもよい。代替として、またはそれに加えて、平均ピッチは、例えば、最大で約１００μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍまたはそれ未満であってもよい。当然ながら、フィーチャの特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択される下の値の１つと上の値の１つとの間であってもよい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ポリＴまたはポリＡ」は、核酸配列に関して使用される場合、それぞれ一連の２つ以上のチアミン（Ｔ）またはアデニン（Ａ）塩基を意味することが意図される。ポリＴまたはポリＡは、それぞれ少なくとも約２、５、８、１０、１２、１５、１８、２０個またはそれより多くのＴまたはＡ塩基を包含していてもよい。代替として、またはそれに加えて、ポリＴまたはポリＡは、それぞれ最大で約３０、２０、１８、１５、１２、１０、８、５または２個のＴまたはＡ塩基を包含していてもよい。
【００２９】
用語「ランダム」は、本明細書で使用される場合、表面上の配置の空間的な整列または組成を指すために使用することができる。例えば、本明細書で説明されるアレイには少なくとも２つのタイプの並びがあり、第１の並びは、フィーチャ（「部位」とも称される）の間隔および相対的配置に関し、第２の並びは、特定のフィーチャに存在する特定の分子種の同一性または予め決定された知見に関する。したがって、アレイのフィーチャは、最隣接のフィーチャが互いに様々な間隔を有するようにランダムに間隔を開けられていてもよい。代替として、フィーチャ間の間隔は、例えば直線格子または六角格子などの規則的なパターンが形成されるように並べることができる。別の点では、アレイのフィーチャは、間隔がランダムなパターンまたは規則正しいパターンを生じるかどうかに関係なく、各フィーチャを占有する分析物の種（例えば特定の配列の核酸）の同一性または予め決定された知見に関してランダムであってもよい。本明細書に記載のアレイは、ある点では規則正しく、別の点ではランダムであってもよい。例えば、本明細書に記載の一部の実施形態において、核酸が、その相対的配置に関して規則正しく並べられているが、いずれかの特定の部位に存在する核酸種に関する配列の知見に関して「ランダムに配置された」部位に付着する条件下で、表面を核酸の集団と接触させる。表面上の配置に核酸を「ランダムに分配する」という言及は、どの核酸がどの配置で捕獲されるのか（配置が規則正しいパターンで整列されるか否かに関係なく）に関して知見がないこと、または事前の決定がないことを指すことが意図される。
【００３０】
用語「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、水性の液体に不溶性の硬い基板を指す。基板は、非多孔質であってもよく、または多孔質であってもよい。基板は、任意選択で液体を吸収すること（例えば多孔性により）が可能であるが、典型的には、液体を吸収しても基板が実質的に膨潤せず、液体が乾燥によって除去されても実質的に収縮しない程度に硬いと予想される。非多孔質の固体支持体は、一般的に、液体またはガスに対して不浸透性である。例示的な固体支持体としては、これらに限定されないが、ガラスおよび変性または官能化ガラス、プラスチック（例えば、アクリル系樹脂、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）、環状オレフィン、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック、樹脂、ゼオノア、シリカまたはシリカベースの材料、例えばケイ素および変性ケイ素など、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバー束、ならびにポリマーが挙げられる。一部の実施形態に関して特に有用な固体支持体は、フローセル装置内に配置される。例示的なフローセルは、本明細書でさらに詳細に記載される。
【００３１】
用語「空間的なタグ」は、本明細書で使用される場合、配置を示す配列を有する核酸を意味することが意図される。典型的には、核酸は、核酸と共に使用されると予想される１つまたは複数の生物学的試料に存在しない配列を有する合成分子である。しかしながら、一部の実施形態において、核酸分子は天然由来であってもよく、または核酸の配列が、例えば核酸と共に使用される生物学的試料中に天然に存在していてもよい。空間的なタグによって示された配置は、生物学的試料中もしくはその上に、固体支持体中もしくはその上に、またはそれらの組合せで配置されていてもよい。バーコード配列は、空間的なタグとして機能することができる。
【００３２】
用語「組織」は、本明細書で使用される場合、細胞と任意選択で細胞間物質の集合体を意味することが意図される。典型的には、組織中の細胞は、溶液中で浮動性ではなく、その代わりに互いに付着して多細胞性の構造を形成している。例示的な組織のタイプとしては、筋肉組織、神経組織、表皮組織および結合組織が挙げられる。
【００３３】
用語「ユニバーサル配列」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸分子が互いに異なる配列の領域も有していたとしても、それらの分子に共通する一連のヌクレオチドを指す。分子の収集物の異なるメンバー中に存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的なユニバーサル捕獲核酸の集団を使用して、複数の異なる核酸を捕獲することが可能である。同様に、分子の収集物の異なるメンバー中に存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマーの集団を使用した複数の異なる核酸の複製または増幅を可能にする。したがって、ユニバーサル捕獲核酸またはユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を包含する。標的核酸分子は、例えば異なる標的配列の一方または両方の末端でユニバーサルアダプターに付着するように改変されてもよい。
上記の定義を考慮して、以下に記載された実施形態および特許請求の範囲で列挙された実施形態を理解することができる。
【００３４】
本発明の開示は、生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法を提供する。本方法は、（ａ）固体支持体に異なる核酸プローブを付着させて、固体支持体上でランダムに配置されたプローブを生産する工程であって、異なる核酸プローブはそれぞれ、バーコード配列を包含し、ランダムに配置されたプローブのそれぞれは、固体支持体上に他のランダムに配置されたプローブとは異なるバーコード配列を包含する、工程；（ｂ）固体支持体上で核酸検出反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置されたプローブのバーコード配列を決定する工程；（ｃ）生物学的試料を、ランダムに配置されたプローブを有する固体支持体と接触させる工程；（ｄ）ランダムに配置されたプローブを、ランダムに配置されたプローブの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｅ）ランダムに配置されたプローブを伸長させて、バーコード配列と標的核酸からの配列とを包含する伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けする工程を包含し得る。
【００３５】
本発明の開示の方法、組成物または装置に、様々な固体支持体のいずれを使用してもよい。特に有用な固体支持体は、核酸アレイに使用されるものである。例としては、ガラス、変性ガラス、官能化ガラス、無機ガラス、マイクロスフェア（例えば不活性および／または磁気粒子）、プラスチック、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカ、シリカベースの材料、炭素、金属、光ファイバーまたは光ファイバー束、ポリマーおよびマルチウェル（例えばマイクロタイター）プレートが挙げられる。例示的なプラスチックとしては、アクリル系樹脂、ポリスチレン、スチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタンおよびＴｅｆｌｏｎ（商標）が挙げられる。例示的なシリカベースの材料としては、ケイ素および変性ケイ素の様々な形態が挙げられる。
【００３６】
特定の実施形態において、固体支持体は、例えばウェル、チューブ、チャネル、キュベット、ペトリ皿、ボトル等の容器内にあってもよく、またはその一部であってもよい。特に有用な容器は、フローセルであり、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１４２８４１；米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号および米国特許第８，９５１，７８１号またはBentley et al., Nature 456:53-59 (2008)に記載されるようなものである。例示的なフローセルは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）またはＨｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォームなどのシーケンシングプラットフォームと共に使用するための、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されているフローセルである。別の特に有用な容器は、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレート中のウェルである。
【００３７】
任意選択で、固体支持体は、ゲルコーティングを包含していてもよい。ゲルを介した固体支持体への核酸の付着は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から商業的に入手可能な、またはそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号、２０１４／００７９９２３号、もしくは２０１５／０００５４４７号；またはＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０９３０９８号に記載されているフローセルによって例示される。本明細書に記載の方法および装置で使用できる例示的なゲルとしては、これらに限定されないが、コロイド構造を有するもの、例えばアガロース；ポリマーメッシュ構造、例えばゼラチン；または架橋ポリマー構造、例えばポリアクリルアミド、ＳＦＡ（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号を参照）またはＰＡＺＡＭ（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／００７９９２３号、または２０１５／０００５４４７号を参照）が挙げられる。
【００３８】
一部の実施形態において、固体支持体は、核酸を付着させることができるフィーチャのアレイとして設計することができる。フィーチャは、様々な望ましい様式のいずれかで存在していてもよい。例えば、フィーチャは、ウェル、穴、チャネル、隆起部、高くなった領域、ペグ、ポスト等であり得る。一部の実施形態において、フィーチャは、ビーズを含有していてもよい。しかしながら、特定の実施形態において、フィーチャは、ビーズまたは粒子を含有していなくてもよい。例示的なフィーチャとしては、４５４  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの子会社）またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの子会社）により販売されている市販のシーケンシングプラットフォームに使用されている基板中に存在するウェルが挙げられる。ウェルを有する他の基板としては、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，２６６，４５９号；６，３５５，４３１号；６，７７０，４４１号；６，８５９，５７０号；６，２１０，８９１号；６，２５８，５６８号；６，２７４，３２０号；米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号；２００９／０１２７５８９号；２０１０／０１３７１４３号；２０１０／０２８２６１７号またはＰＣＴ公開ＷＯ００／６３４３７号に記載されている、エッチングされた光ファイバーおよび他の基板が挙げられる。一部の実施形態において、基板のウェルは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号に記載されるようなゲル材料（ビーズ含有または非含有）を包含していてもよい。
【００３９】
固体支持体上のフィーチャは、ガラス、プラスチックまたは上記で例示された他の材料などの非金属表面上の金属フィーチャであってもよい。金属層は、湿式プラズマエッチング、乾式プラズマエッチング、原子層堆積、イオンビームエッチング、化学蒸着法、真空スパッタリング等の当業界において公知の方法を使用して表面上に堆積させることができる。例えば、ＦｌｅｘＡＬ（登録商標）、ＯｐＡＬ（登録商標）、Ｉｏｎｆａｂ  ３００ｐｌｕｓ（登録商標）、またはＯｐｔｏｆａｂ  ３０００（登録商標）システム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）などの様々な市販の機器のいずれかを、必要に応じて使用することができる。金属層はまた、参照により本明細書に組み入れられるThornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7:239-60 (1977)に記載されるような電子ビーム蒸発またはスパッタリングによって堆積させてもよい。上記で例示されたものなどの金属層の堆積技術は、表面上に金属領域またはパッチを作り出すために、フォトリソグラフィー技術と組み合わせることができる。金属層の堆積技術とフォトリソグラフィー技術とを組み合わせるための例示的な方法は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，８９５，２４９号または米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号に提供される。
【００４０】
フィーチャは、固体支持体上にスポットまたはパッチの格子として出現し得る。フィーチャは、繰り返しのパターンで、または不規則な繰り返しではないパターンで配置させることができる。特に有用な繰り返しのパターンは、六角形のパターン、直線のパターン、格子パターン、鏡映対称性を有するパターン、回転対称性を有するパターンなどである。非対称パターンも有用である可能性がある。ピッチは、最隣接のフィーチャの異なる対間で同じであってもよく、またはピッチは、最隣接のフィーチャの異なる対間で変化していてもよい。
高密度のアレイは、約１５μｍ未満の平均ピッチを有することを特徴とする。中密度のアレイは、約１５〜３０μｍの平均ピッチを有し、一方で低密度のアレイは、３０μｍより大きい平均ピッチを有する。本発明において有用なアレイは、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍまたは０．５μｍ未満の平均ピッチを有していてもよい。本明細書の上記または他所に記載の平均ピッチの値および範囲は、規則正しいアレイまたはランダムなアレイに適用可能であることが意図される。
【００４１】
特定の実施形態において、固体支持体上のフィーチャはそれぞれ、約１００ｎｍ2、２５０ｎｍ2、５００ｎｍ2、１μｍ2、２．５μｍ2、５μｍ2、１０μｍ2、１００μｍ2、または５００μｍ2より大きい面積を有していてもよい。代替として、またはそれに加えて、フィーチャはそれぞれ、約１ｍｍ2、５００μｍ2、１００μｍ2、２５μｍ2、１０μｍ2、５μｍ2、１μｍ2、５００ｎｍ2、または１００ｎｍ2より小さい面積を有していてもよい。上記の範囲は、上から可視化または画像化される場合、固体支持体上のビーズまたは他の粒子の見かけの面積を記載する場合がある。
【００４２】
特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズまたは他の粒子の収集物を包含していてもよい。粒子は、溶液中に懸濁されていてもよく、または粒子は、基板の表面上に配置されていてもよい。表面上に配置されたビーズを有するアレイの例としては、ウェル中にビーズが配置されているアレイ、例えばＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、４５４  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの子会社）からのシーケンシングプラットフォームに使用されている基板、またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの子会社）からのシーケンシングプラットフォームに使用されている基板が挙げられる。表面上に配置されたビーズを有する他の固体支持体は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，２６６，４５９号；６，３５５，４３１号；６，７７０，４４１号；６，８５９，５７０号；６，２１０，８９１号；６，２５８，５６８号；または６，２７４，３２０号；米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号；２００９／０１２７５８９号；２０１０／０１３７１４３号；または２０１０／０２８２６１７号もしくはＰＣＴ公開ＷＯ００／６３４３７号に記載されている。上記の参考文献のうちいくつかは、固体支持体中またはその上にビーズをローディングする前にビーズに核酸プローブを付着させるための方法を記載している。そのようなものとして、ビーズの収集物は、それぞれ固有のプローブを付着させた異なるビーズを包含していてもよい。しかしながら、ビーズをユニバーサルプライマーを包含するように作製して、次いでビーズをアレイ上にローディングすることにより、本明細書に記載の方法で使用するためのユニバーサルアレイを形成できることが理解されると予想される。本明細書で前述したように、ビーズアレイに典型的に使用される固体支持体は、ビーズなしで使用することができる。例えば、プローブまたはプライマーなどの核酸は、ウェルまたはウェル中のゲル材料に直接付着させることができる。したがって、上記の参考文献は、本明細書に記載の方法および組成物で使用するために改変することができる材料、組成物または装置の例示である。
【００４３】
したがって、本明細書に記載の方法で使用される固体支持体は、ビーズのアレイを包含していてもよく、ここで異なる核酸プローブは、アレイ中の異なるビーズに付着される。この実施形態において、各ビーズは、異なる核酸プローブに付着されていてもよく、ビーズは、異なる核酸プローブを固体支持体に効果的に付着させるために固体支持体上でランダムに分配されていてもよい。任意選択で、固体支持体は、１個のビーズのみを受け入れる寸法を有するウェルを包含していてもよい。このような構成において、ウェル中のビーズがフィットする結果生じる力によって、ビーズがウェルに付着されていてもよい。ウェル中にビーズを保持するために、付着の化学作用または接着剤を使用することも可能である。
ビーズに付着される核酸プローブは、バーコード配列を包含していてもよい。ビーズの集団は、各ビーズが１つのみのタイプのバーコードに付着されて、集団中にそれぞれ異なるバーコードを有する多くの様々なビーズが存在するように設計されていてもよい。この実施形態において、固体支持体上にビーズをランダムに分配させることは、固体支持体上に核酸プローブ（およびそれらそれぞれのバーコード配列）をランダムに配置することになると予想される。一部のケースにおいて、集団中に冗長性が存在するように、同じバーコード配列を有する複数のビーズが存在していてもよい。ビーズ集団中の固有のバーコードの数より多くのキャパシティーを有する固体支持体上にビーズの冗長な集団をランダムに分配させることは、固体支持体上でバーコードの冗長性をもたらすことになると予想される。代替として、固体支持体上におけるバーコードの集団に関して冗長ではないアレイを生産するために、ビーズの集団中の異なるバーコードの数は、固体支持体のキャパシティーを超えていてもよい。固体支持体のキャパシティーは、一部の実施形態において、ビーズを付着させるかまたはそれ以外の方法でビーズを受け入れるフィーチャ（例えば単一のビーズを占有するウェル）の数によって決定されると予想される。
【００４４】
固体支持体は、複数の異なる核酸プローブを包含していてもよく、または複数の異なる核酸プローブを付着させるための本明細書に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、固体支持体は、少なくとも１０、１００、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9個またはそれより多くの異なるプローブを包含していてもよい。代替として、またはそれに加えて、固体支持体は、最大で１×１０9、１×１０8、１×１０7、１×１０6、１×１０5、１×１０4、１×１０3、１００個、またはそれより少ない異なるプローブを包含していてもよい。例えばプローブが増幅されてクラスターを形成する場合、異なるプローブのそれぞれが数々のコピー中に存在し得ることが理解されると予想される。したがって、上記の範囲は、固体支持体上の異なる核酸クラスターの数を記載する場合がある。上記の範囲は、特定の核酸プローブに固有であると本明細書に記載される異なるバーコード、標的捕獲配列、または他の配列エレメントの数を記載する場合があることも理解されると予想される。代替として、またはそれに加えて、範囲は、本明細書に記載の方法を使用して固体支持体上に作り出された伸長したプローブまたは改変されたプローブの数を記載する場合がある。
【００４５】
フィーチャは、固体支持体を核酸プローブと接触させる前に固体支持体上に存在していてもよい。例えば、プローブがプライマーへのハイブリダイゼーションを介して支持体に付着される実施形態において、プライマーはフィーチャに付着することができるが、それに対してフィーチャの外側における隙間のエリアは実質的に全てのプライマーを欠いている。それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，８９５，２４９号、米国特許第８，７７８，８４９号、または米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号に記載の方法を使用して、核酸プローブを固体支持体上の予め形成されたフィーチャで捕獲して、任意選択で固体支持体上で増幅することができる。代替として、固体支持体は、プライマーのローン（ｌａｗｎ）を有していてもよく、またはそうでなければフィーチャを欠いていてもよい。このケースでは、固体支持体上に核酸プローブが付着しているために、フィーチャを形成することができる。任意選択で、捕獲された核酸プローブは、結果得られたクラスターがフィーチャになるように固体支持体上で増幅させることができる。付着は、上記でプライマーとプローブの相補的部分との捕獲として例示されているが、プライマー以外の捕獲成分が、予備形成されたフィーチャに、またはローンとして存在していてもよいことが理解されると予想される。他の例示的な捕獲成分としては、これらに限定されないが、核酸プローブと反応して共有結合を作り出すことが可能な化学成分、または非共有結合によって核酸プローブ上のリガンドと結合することが可能な受容体が挙げられる。
【００４６】
固体支持体に核酸プローブを付着させる工程は、異なる核酸プローブの混合物を含有する流体を提供し、この流体混合物を固体支持体と接触させることによって行うことができる。接触によって、流体混合物からの多くの様々な核酸プローブが付着すると予想される表面と、流体混合物が接触した状態にすることができる。したがって、プローブは、表面へのランダムアクセスを有する（表面が、プローブを付着させるように設計された予備形成されたフィーチャを有するか、または付着のために設計された均質な表面を有するかにかかわらず）。したがって、プローブは、固体支持体上でランダムに配置されていてもよい。
【００４７】
最終的に表面に付着させる異なるプローブの総数と多様性は、特定の用途または使用に応じて選択することができる。例えば、支持体にプローブを付着させる目的で異なる核酸プローブの流体混合物を固体支持体と接触させる実施形態において、異なるプローブ種の数は、プローブに対する固体支持体の占有率を超えてもよい。したがって、固体支持体に付着する異なるプローブの数と多様性は、固体支持体のプローブの占有率と同等であってもよい。代替として、固体支持体上の異なるプローブ種の数と多様性は、占有率より少なくてもよい（すなわち、固体支持体が同じプローブ種を有する複数のフィーチャを含有し得るようにプローブ種の冗長性が生じるようになる）。このような冗長性は、例えば、固体支持体を、固体支持体のプローブ占有率より実質的に低いプローブ種の数と多様性を含有する流体混合物と接触させることによって達成することができる。
【００４８】
核酸プローブの付着は、固体支持体に付着した相補的プライマーへの核酸プローブのハイブリダイゼーション、核酸プローブ上の反応性成分と固体支持体との間の化学結合の形成（その例は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，８９５，２４９号、米国特許第８，７７８，８４９号、または米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号に記載される）、核酸プローブ上の成分と固体支持体に結合した成分との親和性相互作用（例えば、公知の受容体−リガンド対、例えばストレプトアビジンとビオチン、抗体−エピトープ、レクチン−炭水化物等の間）、核酸プローブと固体支持体との物理的な相互作用（例えば水素結合、イオン力、ファンデルワールス力等）、または核酸を表面に付着させるための当業界において公知の他の相互作用によって媒介されてもよい。
【００４９】
一部の実施形態において、核酸プローブの付着は、固体支持体に付着されているかまたは付着されると予想される核酸プローブと他の核酸プローブとの間のあらゆる配列差に関して非特異的である。例えば、異なるプローブは、表面に付着したプライマーを補完するユニバーサル配列を有していてもよく、または異なるプローブは、表面への付着を媒介する共通の成分を有していてもよい。代替として、異なるプローブのそれぞれ（または異なるプローブの部分集団）は、固体支持体上で固有のプライマーを補完する固有の配列を有していてもよく、またはそれらは、固体支持体上で１つまたは複数の異なる反応性成分と相互作用する固有の成分を有していてもよい。このようなケースにおいて、固有のプライマーまたは固有の成分は、任意選択で、特定のプローブ、または特定のタイプのプローブをそれぞれ所定の配置で選択的に捕獲するために、所定の配置に付着させることができる。
【００５０】
固体支持体上の１つまたは複数のフィーチャはそれぞれ、特定のプローブの単一分子を包含していてもよい。フィーチャは、一部の実施形態において、１個の核酸プローブ分子のみを受け入れるように設計されていてもよい。しかしながら、フィーチャが１個より多くの核酸プローブ分子を受け入れられるかどうかにかかわらず、フィーチャは、それでもなお１個の核酸プローブ分子のみを包含していてもよい。代替として、個々のフィーチャは、複数の核酸プローブ分子、例えば互いに同じ配列を有する核酸プローブ分子の集合体を包含していてもよい。特定の実施形態において、集合体は、例えば表面に付着したクラスターとしてアンプリコンを生産するために単一の核酸プローブテンプレートから増幅させることによって、生産することができる。
本明細書に記載の方法は、様々な増幅技術のいずれも使用することができる。使用できる例示的な技術としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライム増幅（ＲＰＡ）が挙げられる。一部の実施形態において、例えば、アレイのフィーチャが、所望のキャパシティーを有する体積でアンプリコンを含有することが可能な場合、増幅は溶液中で行うことができる。好ましくは、本発明の開示の方法で使用される増幅技術は、固相上で行われると予想される。例えば、１つまたは複数のプライマー種（例えば、核酸プローブ中に存在する１つまたは複数のユニバーサルプライマー結合性部位のためのユニバーサルプライマー）が、固体支持体に付着されていてもよい。ＰＣＲの実施形態において、増幅に使用されるプライマーの一方または両方が、固体支持体に付着されていてもよい（例えばゲルを介して）。固体支持体に付着した２種のプライマーを利用する様式はしばしば、二本鎖アンプリコンが、コピーされたテンプレート配列を端部に有する２つの表面に付着したプライマー間で架橋様の構造を形成するため、架橋増幅と称される。架橋増幅に使用することができる例示的な試薬および条件は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，６４１，６５８号、７，１１５，４００号、もしくは８，８９５，２４９号；または米国特許公開第２００２／００５５１００号、２００４／００９６８５３号、２００４／０００２０９０号、２００７／０１２８６２４号または２００８／０００９４２０号に記載されている。固相ＰＣＲ増幅はまた、固体支持体に付着した増幅プライマーの１つおよび溶液中の第２のプライマーを用いても行うことができる。表面に付着したプライマーと可溶性プライマーとの組合せを使用する例示的な様式は、エマルジョンＰＣＲに使用される様式であり、これらは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるDressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003)、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号または２００５／００６４４６０号に記載されている。エマルジョンＰＣＲは、この様式の例示であり、本明細書に記載の方法の目的で、エマルジョンの使用は任意選択であり、数々の実施形態にとって実際には、エマルジョンは使用されないことが理解されると予想される。
【００５１】
ＲＣＡ技術は、本発明の開示の方法で使用するために改変してもよい。ＲＣＡ反応で使用できる例示的な要素およびＲＣＡがアンプリコンを生産する原理は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるLizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)および米国特許出願公開第２００７／００９９２０８号に記載されている。ＲＣＡに使用されるプライマーは、溶液中であってもよく、または固体支持体に付着されていてもよい。プライマーは、本明細書で説明されるユニバーサルプライマーの１つまたは複数であってもよい。
【００５２】
ＭＤＡ技術は、本発明の開示の方法で使用するために改変してもよい。ＭＤＡに関する一部の基礎原理および有用な条件は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるDean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)；Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)；Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995；Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)；ＵＳ５，４５５，１６６；ＵＳ５，１３０，２３８；およびＵＳ６，２１４，５８７に記載されている。ＭＤＡに使用されるプライマーは、溶液中であってもよく、または増幅部位で固体支持体に付着されていてもよい。ここでもプライマーは、本明細書で説明されるユニバーサルプライマーの１つまたは複数であってもよい。
【００５３】
特定の実施形態において、上記で例示された増幅技術の組合せを使用することもできる。例えば、ＲＣＡとＭＤＡとを組み合わせて使用することができ、ここでＲＣＡは、溶液中で（例えば液相プライマーを使用して）コンカテマー様のアンプリコンを生成するのに使用される。次いでアンプリコンを、固体支持体に付着したプライマー（例えばユニバーサルプライマー）を使用するＭＤＡのためのテンプレートとして使用することができる。この実施例において、組み合わされたＲＣＡおよびＭＤＡ工程の後に生産されたアンプリコンは、固体支持体に付着されると予想される。
【００５４】
本明細書に記載の方法で使用される、または本発明の開示の装置もしくは組成物中に存在する核酸プローブは、バーコード配列を包含していてもよく、複数の異なる核酸プローブを包含する実施形態の場合、プローブのそれぞれは、複数のもののうちの他のプローブからの異なるバーコード配列を包含していてもよい。バーコード配列は、様々な長さのいずれを有していてもよい。配列が長いほど、一般的に、集団１つにつきより大きい数と多様性を有するバーコードを受け入れることができる。一般的に、複数のもののうち全てのプローブは、同じ長さのバーコード（配列は異なるが）を有すると予想されるが、異なるプローブに対して異なる長さのバーコードを使用することも可能である。バーコード配列の長さは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、２０またはそれより多くのヌクレオチドであってもよい。代替として、またはそれに加えて、バーコード配列の長さは、最大で２０、１５、１２、１０、８、６、４またはそれより少ないヌクレオチドであってもよい。使用できるバーコード配列の例は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０３４２９２１号および米国特許第８，４６０，８６５号に記載されている。
【００５５】
本発明の開示の方法は、固体支持体上で核酸検出反応を実行して、固体支持体上に配置された核酸プローブのバーコード配列を決定する工程を包含していてもよい。多くの実施形態において、プローブは、固体支持体上でランダムに配置されており、核酸検出反応は、異なるプローブのそれぞれを配置するための情報を提供する。例示的な核酸検出方法としては、これらに限定されないが、プローブの核酸シーケンシング、核酸のプローブへのハイブリダイゼーション、プローブにハイブリダイズされる核酸のライゲーション、プローブにハイブリダイズされる核酸の伸長、プローブにハイブリダイズされる第１の核酸の伸長、それに続くプローブにハイブリダイズされる第２の核酸への伸長した核酸のライゲーション、または当業界において公知の他の方法、例えばそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，２８８，１０３号もしくは８，４８６，６２５号に記載の方法が挙げられる。
【００５６】
シーケンシング技術、例えば合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）技術は、バーコード配列を決定するのに特に有用な方法である。ＳＢＳは、以下のように行うことができる。第１のＳＢＳサイクルを開始させるために、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＢＳプライマーなどを、固体支持体上の１つまたは複数のフィーチャ（例えば核酸プローブを固体支持体に付着させるフィーチャ）と接触させることができる。ＳＢＳプライマーの伸長が標識されたヌクレオチドの取り込みを引き起こすフィーチャを検出することができる。任意選択で、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがＳＢＳプライマーに付加されたらさらなるプライマー伸長を終結させる可逆的な終結成分を包含していてもよい。例えば、脱ブロッキング剤が送達されて成分を除去するまで後続の伸長を起こすことができないように、可逆的なターミネーター成分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加することができる。したがって、可逆的な終結を使用する実施形態の場合、固体支持体に脱ブロッキング試薬を送達してもよい（検出が行われる前またはその後に）。洗浄は、様々な送達工程間に行うことができる。次いでサイクルをｎ回繰り返し、プライマーをｎ個のヌクレオチド分伸長させることによって、長さｎの配列を検出することができる。本発明の開示の組成物、装置または方法との併用のために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体工学システムおよび検出プラットフォームは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるBentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６７８号、ＷＯ０４／０１８４９７号またはＷＯ０７／１２３７４４号；米国特許第７，０５７，０２６号、７，３２９，４９２号、７，２１１，４１４号、７，３１５，０１９号または７，４０５，２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されている。
【００５７】
サイクル反応を使用する他のシーケンシング手順、例えばパイロシーケンシングも使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生の核酸鎖に取り入れられたときの無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出を検出する（それぞれが参照により本明細書に組み入れられるRonaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996)；Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001)；Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998)；または米国特許第６，２１０，８９１号、６，２５８，５６８号または６，２７４，３２０号）。パイロシーケンシングにおいて、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼにより即座にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換されることによって検出することができ、生成したＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼによって生産されたフォトンを介して検出することができる。したがって、シーケンシング反応は、発光検出システムを介してモニターすることができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、必ずしもパイロシーケンシング手順に必要ではない。パイロシーケンシングを本発明の開示の装置、組成物または方法に適用するのに使用できる有用な流体工学システム、検出器および手順は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１２／０５８０９６号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８号、または米国特許第７，５９５，８８３号もしくは７，２４４，５５９号に記載されている。
【００５８】
また、ライゲーション反応によるシーケンシング、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるShendure et al. Science 309:1728-1732 (2005)；または米国特許第５，５９９，６７５号もしくは５，７５０，３４１号で説明されるものなども有用である。一部の実施形態は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるBains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988)；Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998)；Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995)；またはＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ１９８９／１０９７７号で説明されるようなハイブリダイゼーション手順によるシーケンシングを包含していてもよい。ライゲーションによるシーケンシングおよびハイブリダイゼーション手順によるシーケンシングの両方において、アレイの部位に存在する標的核酸（またはそのアンプリコン）は、オリゴヌクレオチドの送達および検出の繰り返しのサイクルに供される。本明細書または本明細書で引用された参考文献に記載の組成物、装置または方法は、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーション手順によるシーケンシングに容易に適合させることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドを蛍光標識して、本明細書または本明細書で引用された参考文献に記載のＳＢＳ手順に関して説明されたものに類似した蛍光検出器を使用して検出することができる。
【００５９】
一部のシーケンシングの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性をリアルタイムでモニターすることを含む方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォアが結合しているポリメラーゼとγ−リン酸で標識されたヌクレオチドとの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の相互作用を介して、またはゼロモード導波管（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースのシーケンシングのための技術および試薬は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるLevene et al. Science 299, 682-686 (2003)；Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)；Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)に記載されている。
一部のシーケンシングの実施形態は、伸長産物にヌクレオチドが取り込まれたときに放出されたプロトンの検出を包含する。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒの子会社）から市販されている電気的検出器および関連する技術、またはそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号；２００９／０１２７５８９号；２０１０／０１３７１４３号；もしくはＵＳ２０１０／０２８２６１７号に記載されているシーケンシング方法およびシステムを使用することができる。
【００６０】
核酸ハイブリダイゼーション技術は、バーコード配列を決定することにとっても有用な方法である。一部のケースにおいて、マルチプレックスビーズアレイのデコードに使用されるものなどのコンビナトリアルハイブリダイゼーション方法を使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，４６０，８６５号を参照）。このような方法は、バーコード配列の少なくとも一部に相補的な標識された核酸デコーダープローブを利用する。ハイブリダイゼーション反応は、標識が最終的に固体支持体上に存在する配置によって、核酸プローブが核酸相補性のルールに従って同定されるように、公知の標識を有するデコーダープローブを使用して行うことができる。一部のケースにおいて、区別可能な標識を有する多くの様々なプローブのプールが使用され、それによってマルチプレックスなデコード操作が可能になる。デコード操作で決定された異なるバーコードの数は、デコード操作に使用される標識の数を超えてもよい。例えば、デコードは数段階で行うことができ、その場合、各段階は、デコーダープローブの異なるプールとのハイブリダイゼーションを構成する。異なるプール中に同じデコーダープローブが存在していてもよいが、各デコーダープローブ上に存在する標識は、プール間で異なっていてもよい（すなわち各デコーダープローブは、異なるプール中に存在する場合、異なる「状況」で存在する）。これらの状況および段階の様々な組合せを使用して、デコードに利用可能な別個の標識の数をはるかに超えて、デコードされ得るバーコードの数を拡張することができる。このようなコンビナトリアル方法は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，４６０，８６５号またはGunderson et al., Genome Research 14:870-877 (2004)でさらに詳細に記載されている。
【００６１】
本発明の開示の方法は、生物学的試料を、核酸プローブを付着させた固体支持体と接触させる工程を包含し得る。一部の実施形態において、核酸プローブは、固体支持体上でランダムに配置されている。核酸プローブの同一性および配置は、生物学的試料を固体支持体と接触させる前にデコードされていてもよい。代替として、核酸プローブの同一性および配置は、固体支持体を生物学的試料と接触させた後に決定することができる。
【００６２】
一部の実施形態において、生物学的試料は、１つまたは複数の細胞である。細胞は、固体支持体との接触がなされる時に、個別になっており、いかなる組織または多細胞性の構造も含まないものでもよい。例えば、細胞は、流体中に存在していてもよく（例えば、複数の異なる細胞が存在する場合、流体は、異なる細胞の流体混合物であり得る）、流体は、異なるプローブが付着された固体支持体と接触させてもよい。例えば原核生物、古細菌または真核生物由来の細胞などの様々な細胞のいずれも使用することができる。本発明の開示の方法、組成物または装置で使用される１つまたは複数の細胞は、単細胞生物であってもよく、または多細胞生物由来であってもよい。１つまたは複数の細胞を得ることができる例示的な生物としては、これらに限定されないが、哺乳動物、植物、藻類、線虫、昆虫、魚類、爬虫類、両生類、真菌または熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。例示的な種は、本明細書において前述されているか、または当業界において公知である。
【００６３】
本発明の開示の実施形態は、生物学的試料として１つまたは複数の細胞内要素も使用することができる。例えば、流体混合物は、１つまたは複数の核、ゴルジ装置、ミトコンドリア、葉緑体、膜画分、小胞、小胞体、または当業界において公知の他の要素を包含していてもよい。他の有用なタイプの生物学的試料は、１つまたは複数のウイルスまたはウイロイドである。
生物学的試料は、上記の細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドの均一な培養物または集団であり得ることが理解されると予想される。代替として、生物学的試料は、細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドの同質ではない収集物、例えば共同体または生態系の数種の異なる生物由来の収集物であり得る。例示的な共同体は、哺乳動物などの多細胞生物の消化器系、肺または他の器官中に存在する細菌の収集物である。
【００６４】
本明細書に記載の方法で固体支持体と接触させる１つまたは複数の細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドは、固体支持体に付着されていてもよい。付着は、固体支持体への核酸の付着に関して本明細書で例示された方法などの当業界において公知の方法を使用して達成することができる。一部の実施形態において、付着は、特定のタイプの細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドに関して選択的である。例えば、固体支持体は、流体混合物中に存在する異なる細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドの１つまたはサブセット上に存在するエピトープまたはリガンドに関して選択的な抗体または他の受容体を包含していてもよい。他の実施形態において、細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドの付着は、広範な反応性を有する化学成分などの非選択的な成分によって媒介されてもよい。
【００６５】
特定の実施形態において、固体支持体と接触させた１つまたは複数の細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドを溶解させて、標的核酸を放出させることができる。溶解は、化学的処理、酵素処理、エレクトロポレーション、熱、低張性処理、超音波破砕等の１つまたは複数を採用する方法などの、当業界において公知の方法を使用して行うことができる。例示的な溶解技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)およびAnsubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999)に記載されている。
【００６６】
一部の実施形態において、生物学的試料は、組織切片である。組織は、上記で細胞に関して例示されたものなどの多細胞生物由来であってもよい。組織切片は、例えば、固体支持体の表面上に組織を置くことによって、固体支持体と接触させることができる。組織は、生物から新たに切り出すこともできるし、または組織は、例えば凍結、パラフィンなどの材料中への包埋（例えばホルマリン固定されたパラフィン包埋サンプル）、ホルマリン固定、浸透、脱水等によって事前に保存されていてもよい。任意選択で、例えば核酸、細胞、ウイルス、ビーズ等を固体支持体に付着させることに関して本明細書で例示された技術および組成物を使用して、組織切片を固体支持体に付着させることができる。さらなる選択肢として、組織を透過化して、組織が固体支持体と接触したときに組織の細胞を溶解させてもよい。上記で細胞の溶解に関して記載されたものなどの様々な処理のいずれも使用することができる。透過化した組織から放出された標的核酸は、表面上の核酸プローブによって捕獲することができる。
【００６７】
本明細書における方法、組成物または装置において、組織は、その使用にとってあらゆる便利なまたは所望の方法で調製することができる。新鮮な、凍結した、固定した、または固定されていない組織を使用することができる。組織は、本明細書に記載の方法または当業界において公知の方法を使用して固定または包埋することができる。
本明細書における使用のための組織サンプルは、組織構造の完全性を維持または保存するのに好適な温度で、例えば−２０℃未満で急速冷凍することによって固定することができる。別の例において、組織は、当業界において公知のホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）方法を使用して調製することができる。要求に応じて他の固定剤および／または包埋材料を使用することができる。固定または包埋した組織サンプルは、公知の方法を使用して、切片化する、すなわち薄くスライスすることができる。例えば、組織サンプルは、組織サンプルの構造的な完全性とサンプル中の核酸の化学特性の両方を維持するのに好適な温度に設定した冷却したマイクロトームまたはクライオスタットを使用して切片化することができる。
【００６８】
一部の実施形態において、組織サンプルは、核酸の放出、捕獲または改変の前に、サンプルから包埋材料を除去する（例えばパラフィンまたはホルマリンを除去する）ように処理されると予想される。これは、サンプルを適切な溶媒（例えばキシレンおよびエタノール洗浄液）と接触させることによって達成することができる。処理は、組織サンプルを本明細書に記載の固体支持体と接触させる前に行ってもよく、または処理は、組織サンプルが固体支持体上にある状態で行ってもよい。核酸が付着される固体支持体と共に使用するための組織の操作に関する例示的な方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／００６６３１８号に記載されている。
【００６９】
本明細書に記載の方法、組成物または装置において固体支持体と接触させる組織サンプルまたは他の生物学的試料の厚さは、所望のあらゆる好適な厚さであってもよい。代表的な実施形態において、厚さは、少なくとも０．１μｍ、０．２５μｍ、０．５μｍ、０．７５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍであるかまたはそれより厚いと予想される。代替として、またはそれに加えて、固体支持体と接触させる生物学的試料の厚さは、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２５μｍ、０．１μｍ以下またはそれより薄いと予想される。
生物学的試料に関して特に関連性のある源は、ヒトである。試料は、器官に由来するものであってもよく、例えば、筋骨格系の器官、例えば筋肉、骨、腱または靱帯；消化器系の器官、例えば唾液腺、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、胆嚢または膵臓；呼吸器系の器官、例えば喉頭、気管、気管支、肺または横隔膜；泌尿器系の器官、例えば腎臓、尿管、膀胱または尿道；生殖器、例えば卵巣、ファロピウス管、子宮、膣、胎盤、睾丸、精巣上体、精管、精嚢、前立腺、陰茎または陰嚢；内分泌系の器官、例えば下垂体、松果腺、甲状腺、副甲状腺、または副腎；循環系の器官、例えば心臓、動脈、静脈または毛細血管；リンパ系の器官、例えばリンパ管、リンパ節、骨髄、胸腺または脾臓；中枢神経系の器官、例えば脳、脳幹、小脳、脊髄、脳神経、または脊髄神経；感覚器官、例えば目、耳、鼻、または舌；または外皮の器官、例えば皮膚、皮下組織または乳腺などに由来するものであってもよい。一部の実施形態において、生物学的試料は、体液または排泄物、例えば血液、リンパ液、涙、汗、唾液、精液、膣分泌液、耳垢、排泄物または尿から得られる。
【００７０】
ヒトからの試料が使用される場合、それは、健康または罹患したとみなすことができる（またはその疑いがあるとすることができる）。一部のケースにおいて、２つの試料を使用することができ、第１の試料は、罹患したとみなされ、第２の試料は、健康とみなされる（例えば健康な対照として使用するために）。様々な状態のいずれか、これらに限定されないが、自己免疫疾患、がん、嚢胞性線維症、異数性、病原性の感染、心理的な状態、肝炎、糖尿病、性感染症、心疾患、卒中、心臓血管疾患、多発性硬化症または筋ジストロフィーなどを評価することができる。特に関連性のある状態は、遺伝学的状態または同定可能な遺伝子署名を有する病原体に関連する状態である。
【００７１】
上記の通り、フローセルは、本明細書に記載の方法で使用するための便利な装置を提供する。例えば、フローセルは、一部の核酸シーケンシングプロトコールまたは一部の核酸ハイブリダイゼーションプロトコールに使用される繰り返しの流体送達などの複数の流体試薬で処理されると予想される固体支持体を収容するのに便利な装置である。一部の実施形態において、例えば、細胞、細胞内要素、ウイルスまたはウイロイドの流体混合物が固体支持体に送達されたときに、生物学的試料がフローセル中の固体支持体に送達され得る。一部の実施形態において、生物学的試料を固体支持体にうまく送達するために、フローセルを開放して固体支持体の内部を露出させるか、またはフローセルから固体支持体を除去することがより好ましい場合がある。例えば、フローセルの開放または固体支持体の除去は、使用者またはロボット利用のデバイスが、組織切片を固体支持体上に置くことを可能にする。フローセルの開放またはフローセルからの固体支持体の除去は、一時的であってもよい。したがって、フローセルは、その後閉じてもよく、または固体支持体をフローセルに戻して、本明細書に記載の方法の１つまたは複数の後続工程を再開してもよい。
【００７２】
一部の実施形態において、フローセルは、フローセルを開放したりまたは分解したりできる構造を有していてもよい。例えばフローセルは、例えばバーコードをデコードするためにシーケンシング反応を実行している間、閉じた状況であってもよい。次いで、フローセル表面上に組織を設置できるように、フローセルを分解することができる。フローセルは、１つまたは複数の表面を除去してそれを開放できるように、接着剤によって一緒に保持されていてもよい。例えば、フローセルは、上部または底部に接着面を有するスペーサー（片面または両面の粘着テープのようなもの）を有していてもよく、このスペーサーは、２つの固体支持体間に存在していてもよい。固体支持体の一方または両方は、本明細書に記載の通りに核酸を付着させ、生物学的試料を支持するように設計されていてもよい。スペーサーは、２つの固体支持体とスペーサーとに隣接する流体のチャネルを作り出す開放した領域（例えばスペーサー材料のレーザーによる切断によって作り出された）を有していてもよい。したがって、固体支持体の一方または両方を非永続的にスペーサーに接着させて、それらの一方または両方を、その上に組織または他の試料を置いたときに表面にアクセスできるように除去することができる。
【００７３】
本明細書に記載の組成物、装置または方法で使用される核酸プローブは、標的捕獲成分を包含していてもよい。特定の実施形態において、標的捕獲成分は、標的捕獲配列である。標的捕獲配列は、一般的に、プローブ−標的のハイブリッド複合体の形成によって標的の捕獲が起こるように、標的配列に相補的である。標的捕獲配列は、例えば上記のバーコード配列の文脈で例示された長さなどの様々な長さのいずれであってもよい。
マルチプレックスの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、生物学的試料からの異なる標的核酸配列にハイブリダイズする異なる標的捕獲配列を包含していてもよい。異なる標的捕獲配列は、生物学的試料からの１つまたは複数の所望の標的核酸に選択的に結合させるのに使用することができる。一部のケースにおいて、異なる核酸プローブは、固体支持体上のプローブの全てまたはサブセットに共通の標的捕獲配列を包含していてもよい。例えば、固体支持体上の核酸プローブは、ポリＡまたはポリＴ配列を有していてもよい。このようなプローブまたはそのアンプリコンは、ポリＡまたはポリＴテールを有するｍＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができる。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ種は異なる標的配列を有すると予想されるが、捕獲は、共通のポリＡまたはポリＴ配列領域によって媒介されると予想される。
【００７４】
これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの様々な標的核酸のいずれも、本明細書に記載の方法で捕獲して分析することができる。特定の標的配列は、データベース、および当業界において公知の技術およびデータベースを使用して設計された適切な捕獲配列から選択することができる。
有用な他の標的捕獲成分としては、例えば、固体支持体に核酸プローブを付着させるのに有用なものとして本明細書に記載された成分が挙げられる。
【００７５】
本明細書に記載の方法は、固体支持体上の核酸プローブを、生物学的試料のプローブの近位にある部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程を包含していてもよい。一般的に、標的核酸は、生物学的試料の領域から、その試料の領域に近接する固体支持体のエリアに拡散すると予想される。ここで標的核酸は、標的核酸が放出された試料の領域の近位にある核酸プローブと相互作用すると予想される。標的核酸が核酸プローブ上で相補的標的捕獲配列と遭遇するところで、標的−プローブのハイブリッド複合体が形成され得る。標的−プローブのハイブリッド複合体の配置は、一般的に、標的核酸が生じた生物学的試料の領域と相関すると予想される。マルチプレックスの実施形態において、固体支持体は複数の核酸プローブを包含し、生物学的試料は複数の標的核酸を放出して、固体支持体上で複数の標的−プローブのハイブリッドが形成されると予想される。標的核酸の配列およびその支持体上における配置は、生物学的試料の核酸内容物に関する空間的な情報を提供すると予想される。上記の例は、生物学的試料から放出される標的核酸という文脈で説明されているが、必ずしも標的核酸が放出されなくてもよいことが理解されると予想される。それよりむしろ、例えば、標的核酸が固体支持体上の適切な核酸プローブにも結合できるような方式で標的核酸が生物学的試料の露出した表面に付着される場合、標的核酸は、生物学的試料と接触したままであってもよい。
【００７６】
本発明の開示の方法は、標的核酸がハイブリダイズされる固体支持体に付着したプローブを伸長させる工程を包含していてもよい。プローブがバーコード配列を包含する実施形態において、結果得られた伸長したプローブは、バーコード配列および標的核酸からの配列（ただし相補的な形態である）を包含すると予想される。したがって伸長したプローブは、生物学的試料からの標的核酸の空間的にタグ付けされたバージョンである。伸長したプローブの配列は、どの核酸が生物学的試料中にあるか、および生物学的試料中のどこに標的核酸が配置されているかを同定する。伸長したプローブ中に、核酸プローブ中に存在する他の配列エレメントも包含されていてもよいことが理解されると予想される。このようなエレメントとしては、例えば、プライマー結合性部位、切断部位、他のタグ配列（例えばサンプル同定タグ）、捕獲配列、核酸が結合するタンパク質または核酸酵素のための認識部位等が挙げられる。
【００７７】
プローブの伸長は、本明細書で例示された、またはそれ以外の核酸の増幅もしくは核酸のシーケンシングに関する技術分野において公知の方法を使用して行うことができる。特定の実施形態において、１つまたは複数のヌクレオチドを、例えば、ポリメラーゼ触媒作用（例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）を介して核酸の３’末端付加することができる。１つまたは複数のヌクレオチドを核酸の３’または５’末端に付加するのに、化学的または酵素的な方法を使用することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、例えば化学的または酵素的な（例えばリガーゼ触媒作用）方法を介して核酸の３’または５’末端に付加することができる。核酸は、テンプレート指向的な方式で伸長させることができ、それによって伸長産物は、伸長される核酸にハイブリダイズされるテンプレートの核酸に相補的である。一部の実施形態において、ＤＮＡプライマーは、ＲＮＡテンプレートを使用して逆転写酵素により伸長され、それによってｃＤＮＡが生産される。したがって、本明細書に記載の方法で作製される伸長したプローブは、逆転写されたＤＮＡ分子であってもよい。核酸を伸長させるための例示的な方法は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開２００５／００３７３９３号または米国特許第８，２８８，１０３号または８，４８６，６２５号に記載されている。
【００７８】
核酸プローブにハイブリダイズされる標的核酸の全てまたは一部は、伸長によってコピーすることができる。例えば、伸長したプローブは、少なくとも、１、２、５，１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれより多くの、標的核酸からコピーされるヌクレオチドを包含していてもよい。伸長産物の長さは、例えば、伸長反応において可逆的に終結したヌクレオチドを使用して、限られた数の伸長サイクルを行うことによって制御することができる。サイクルは、ＳＢＳ技術に関して例示されたように行うことができ、標識されたヌクレオチドの使用は、必ずしも必要ではない。したがって、本明細書に記載の方法で生産された伸長したプローブは、１０００、５００、２００、１００、５０、２５、１０、５、２または１以下の、標的核酸からコピーされるヌクレオチドを包含していてもよい。当然ながら、伸長したプローブは、上記に記載の範囲内またはその外側のあらゆる長さであり得る。
【００７９】
本発明の開示の方法は、標的核酸にハイブリダイズされるプローブが伸長されて標的核酸の少なくとも一部がコピーされる実施形態によって例示されているが、プローブは、代替の方法で改変してもよいことが理解されると予想される。標的核酸にハイブリダイズされるプローブは、プローブの標的の特異的な改変を生じる反応に供することができる。標的特異的な改変は、例えばハイブリダイゼーションに基づく相補性を介して、プローブが標的核酸と相互作用するときだけ起こると予想される。多くの実施形態において、標的特異的な改変は、プローブと相互作用する特定の標的核酸の配列に特異的であると予想される。有用な標的特異的な改変の例としては、これらに限定されないが、ライゲーションまたは転位による配列の挿入または付加（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号を参照）、検出可能なタグ成分のソラレンによる架橋または付加などの化学修飾、核酸酵素による改変、ヘアピンリンカーのライゲーション、またはそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００３７３９３号もしくは米国特許第８，２８８，１０３号または８，４８６，６２５号の核酸アッセイに記載の他の改変が挙げられる。
【００８０】
本明細書に記載の方法、組成物または装置で使用されるプローブは、必ずしも核酸でなくてもよいことが理解されると予想される。タンパク質、炭水化物、小分子、粒子等の他の分子を使用することができる。プローブは、核酸要素（例えばバーコード、プライマー結合性部位、切断部位および／または本明細書に記載の他の配列エレメントを有する）および別の成分（例えば標的核酸を捕獲または改変する成分）の組合せであってもよい。
本明細書に記載の方法は、固体支持体と接触する生物学的試料の画像を獲得する工程をさらに包含していてもよい。固体支持体は、本明細書に記載の様々な状況のいずれにおけるものでもよい。例えば、固体支持体は、付着された核酸プローブまたは付着された核酸プローブ由来のクラスターを包含していてもよい。代替として、固体支持体は、核酸プローブを包含していなくてもよく、その代わりに核酸プローブが付着する前の状況または固体支持体から核酸プローブを除去した後の状況であってもよい。したがって、本明細書に記載の方法における様々なポイントのいずれかで、画像を得ることができる。
【００８１】
画像は、当業界において公知の検出デバイスを使用して得ることができる。例としては、光学、明視野、暗視野、位相コントラスト、蛍光、反射、干渉、または共焦点イメージング用に設計された顕微鏡が挙げられる。異なる領域または細胞間にコントラストを提供するために、画像化の前に生物学的試料を染色してもよい。一部の実施形態において、試料の異なる態様（例えば組織の異なる領域、異なる細胞、特異的な細胞内要素等）を画像化するために、１種より多くの染料を使用することができる。他の実施形態において、染色せずに生物学的試料を画像化してもよい。
【００８２】
特定の実施形態において、蛍光顕微鏡（例えば共焦点蛍光顕微鏡）を使用して、例えば蛍光標識によって蛍光性の生物学的試料を検出することができる。蛍光性の試料はまた、蛍光検出のための光学機器を有する核酸シーケンシングデバイス、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により商品化されたＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）もしくはＨｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォームデバイス；またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により商品化されたＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシングプラットフォームなどを使用して画像化することもできる。使用できる他の画像化光学機器としては、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるBentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６７８号、ＷＯ０４／０１８４９７号またはＷＯ０７／１２３７４４号；米国特許第７，０５７，０２６号、７，３２９，４９２号、７，２１１，４１４号、７，３１５，０１９号または７，４０５，２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されている検出デバイスに見出されるものが挙げられる。
【００８３】
生物学的試料の画像は、例えば組織、細胞または細胞内要素を区別するために、所望の解像度で得ることができる。したがって、解像度は、少なくとも０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、５００μｍ、１ｍｍまたはそれより大きく分離した生物学的試料の要素を区別するのに十分な解像度である。代替として、またはそれに加えて、解像度は、少なくとも１ｍｍ、５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍまたはそれ未満で分離した生物学的試料の要素を区別するように設定することができる。
【００８４】
本明細書に記載の方法は、生物学的試料の画像における配置を、生物学的試料が接触している、接触していた、または接触すると予想される表面に付着した核酸プローブのバーコード配列と相関させる工程を包含していてもよい。したがって、画像において同定可能な生物学的試料の特徴は、その近くに存在することが見出されている核酸と相関させることができる。このような相関において、例えば、細胞の形状、細胞のサイズ、組織の形状、染色パターン、特定のタンパク質の存在（例えば免疫組織化学的染色によって検出されるような）、または病理学もしくは調査用途において慣例的に評価される他の特徴などの様々な形態学的特徴のいずれも使用することができる。したがって、目視での観察によって決定されるような組織またはその要素の生物学的な状況は、空間分解の核酸分析によって決定されるような分子生物学的特徴と相関させることができる。
【００８５】
その上の生物学的試料が画像化される固体支持体は、固体支持体に付着されるプローブに対する試料またはその画像の方向の決定を容易にするための基準マーカーを包含していてもよい。例示的な基準としては、これらに限定されないが、ビーズ（蛍光成分または標識されたプローブが結合できる核酸などの成分を含有するまたは含有しない）、公知のまたは決定可能なフィーチャに付着した蛍光分子、または形態学的な形状を蛍光成分と組み合わせた構造が挙げられる。例示的な基準は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００２／０１５０９０９号または米国特許出願第１４／５３０，２９９号に記載されている。１つまたは複数の基準は、好ましくは、生物学的試料の画像を得る間、可視性の基準である。好ましくは、固体支持体は、少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００個またはそれより多くの基準マーカーを包含する。基準は、所定のパターンで、例えば、固体支持体の外縁または生物学的試料が存在する配置の外周に沿って提供してもよい。好ましい実施形態において、１つまたは複数の基準は、生物学的試料を可視化するのに使用されるのと同じ画像化条件を使用して検出される。しかしながら、必要に応じて、別々の画像を得てもよく（例えば生物学的試料の１つの画像および基準の別の画像）、画像を互いに並べてもよい。
【００８６】
任意選択で、画像を得た後、および固体支持体上の核酸プローブによって標的核酸が捕獲された後に、生物学的試料を固体支持体から除去することができる。したがって、本発明の開示の方法は、固体支持体を洗浄して、細胞、組織または生物学的試料からの他の材料を除去する工程を包含していてもよい。試料の除去は、あらゆる好適な技術を使用して実行することができ、組織サンプルに依存すると予想される。一部のケースにおいて、固体支持体は、水で洗浄することができる。水は、試料の除去を容易にするために、様々な添加剤、例えば界面活性剤（例えば洗浄剤）、酵素（例えばプロテアーゼおよびコラゲナーゼ）、切断試薬等を含有していてもよい。一部の実施形態において、固体支持体は、プロテイナーゼ酵素を含む溶液で処理される。代替として、またはそれに加えて、溶液は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕａｓｅ）またはキチナーゼ酵素（例えば植物または真菌源から組織サンプルを除去することが求められる場合）を包含していてもよい。一部のケースにおいて、洗浄溶液の温度は、少なくとも３０℃、３５℃、５０℃、６０℃または９０℃と予想される。標的核酸と固体支持体に付着した核酸プローブとの間に形成されたハイブリッド複合体を変性させることなく生物学的試料を除去するための条件が選択されてもよい。
【００８７】
本発明の開示の方法は、固体支持体から１つまたは複数の伸長したプローブを除去する工程をさらに包含していてもよい。特定の実施形態において、プローブは、プローブ伸長の産物も切断部位を包含するように切断部位をすでに包含している。代替として、改変工程の間、プローブに切断部位を導入することができる。例えば、伸長工程の間、伸長したプローブに切断部位を導入することができる。
【００８８】
例示的な切断部位としては、これらに限定されないが、結合の破断を引き起こす化学的、酵素的または物理的なプロセスを受けやすい成分が挙げられる。例えば、配置は、エンドヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列であってもよい。好適なエンドヌクレアーゼおよびその認識配列は当業界において周知であり、多くの場合において市販もされている（例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ  ＭＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡまたはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから）。特に有用なエンドヌクレアーゼは、核酸中のその結合性部位に対して３’方向の遠隔にある部位における核酸鎖中の結合を破断すると予想され、その例としては、タイプＩＩ型またはタイプＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、二重鎖核酸中の１つの鎖のみを切断すると予想される（例えばニッキング酵素）。１つの鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼの例としては、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩおよびＮｔ．ＡｌｗＩが挙げられる。
【００８９】
一部の実施形態において、切断部位は、脱塩基部位であるか、または除去されて脱塩基部位を作り出しやすい塩基を有するヌクレオチドである。除去されて脱塩基部位を形成しやすいヌクレオチドの例としては、ウラシルおよび８−オキソグアニンが挙げられる。脱塩基部位は、化学的または酵素的な試薬を使用するヌクレオチド残基の加水分解によって作り出すことができる。脱塩基部位が形成されたら、それを切断して（例えば、エンドヌクレアーゼまたは他の一本鎖を切断する酵素での処理、熱またはアルカリへの曝露によって）、核酸の部位特異的な切断のための手段を提供することができる。脱塩基部位は、核酸の１つの鎖におけるウラシルヌクレオチドに作り出すことができる。酵素のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を使用して、ウラシル塩基を除去し、鎖上に脱塩基部位を生成することができる。次いで核酸の脱塩基部位を有する鎖は、エンドヌクレアーゼ（例えばＥｎｄｏＩＶエンドヌクレアーゼ、ＡＰリアーゼ、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ、ＥｎｄｏＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ）、熱またはアルカリでの処理によって、脱塩基部位で切断してもよい。特定の実施形態において、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより入手可能なＵＳＥＲ（商標）試薬が、核酸中のウラシル塩基に単一のヌクレオチドギャップを作り出すのに使用される。
【００９０】
また脱塩基部位を、ウラシル以外の非天然の／改変されたデオキシリボヌクレオチドに生成して、エンドヌクレアーゼ、熱またはアルカリでの処理による類似の方法で切断してもよい。例えば、８−オキソグアニンは、ＦＰＧグリコシラーゼへの曝露によって脱塩基部位に変換することができる。デオキシイノシンは、ＡｌｋＡグリコシラーゼへの曝露によって脱塩基部位に変換することができる。次いで、このようにして生成した脱塩基部位は、典型的には好適なエンドヌクレアーゼ（例えばＥｎｄｏＩＶまたはＡＰリアーゼ）での処理によって切断してもよい。
核酸を切断するのに使用できる切断部位および方法の他の例は、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，９６０，１２０号に記載されている。
固体支持体から放出される改変された核酸プローブ（例えば伸長した核酸プローブ）をプールして、流体混合物を形成することができる。混合物は、例えば、少なくとも１０、１００、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9個またはそれより多くの異なる改変されたプローブを包含していてもよい。代替として、またはそれに加えて、流体混合物は、最大で１×１０9、１×１０8、１×１０7、１×１０6、１×１０5、１×１０4、１×１０3、１００、１０個またはそれより少ない異なる改変されたプローブを包含していてもよい。流体混合物は、改変された核酸プローブの検出が可能なように操作されていてもよい。例えば、改変された核酸プローブは、第２の固体支持体（すなわち生物学的試料と接触させて改変された後に核酸プローブが放出された固体支持体とは異なる）上で空間的に分離されていてもよく、またはプローブは、流体ストリーム中で一時的に分離されていてもよい。
【００９１】
改変された核酸プローブ（例えば伸長した核酸プローブ）は、本明細書の上記で明示されたものなどのマイクロアレイベースの技術または核酸シーケンシング技術に一般的に採用される捕獲または検出方法において、固体支持体上で分離されていてもよい。例えば、改変されたプローブは、相補核酸へのハイブリダイゼーションによってマイクロアレイに付着させることができる。改変されたプローブは、ビーズまたはフローセル表面に付着させることができ、任意選択で多くの核酸シーケンシングプラットフォームで行われるように増幅させてもよい。改変されたプローブは、マイクロ流体デバイス、液滴操作デバイス、またはフローサイトメーターを使用して、流体ストリーム中で分離されていてもよい。典型的には、検出はこれらの分離デバイスで行われるが、検出は、必ずしも全ての実施形態で必要ではない。
【００９２】
特に有用な液滴操作デバイスは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，６３７，２４２号、２００５年６月２８日に発行された「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」という名称の米国特許第６，９１１，１３２号；２００６年８月３１日に公開された「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」という名称の、Pamulaら、米国特許公開第２００６０１９４３３１号；２００７年１０月２５日に公開された「Droplet-Based Biochemistry」という名称の、Pollackら、国際特許公開ＷＯ／２００７／１２０２４１号；２００４年８月１０日に発行された「Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same」という名称の、Shenderov、米国特許第６，７７３，５６６号；２００３年５月２０日に発行された「Actuators for Microfluidics Without Moving Parts」という名称の、Shenderov、米国特許第２５  ６，５６５，７２７号；２００３年１１月６日に公開された「Electrowettingdriven Micropumping」という名称の、Kimら、米国特許公開第２００３０２０５６３２号；２００６年７月２７日に公開された「Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle」という名称の、Kimら、米国特許公開第２００６０１６４４９０号；２００７年２月１日に公開された「Small Object Moving on Printed Circuit Board」という名称の、Kimら、米国特許公開第２００７００２３２９２号；２００９年１１月１９日に公開された「Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics」という名称の、Shahら、米国特許公開第２００９０２８３４０７号；２０１０年４月２２日に公開された「Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip」という名称の、Kimら、米国特許公開第２０１０００９６２６６号；２００９年６月１６日に発行された「Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface」という名称の、Velev、米国特許第７，５４７，３８０号；２００７年１月１６日に発行された「Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like」という名称の、Sterlingら、米国特許第７，１６３，６１２号；２０１０年１月５日に発行された「Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing」という名称の、Beckerら、米国特許第７，６４１，７７９号；２００５年１２月２０日に発行された「Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing」という名称の、Beckerら、米国特許第６，９７７，０３３号；２００８年２月１２日に発行された「System for Manipulation of a Body of Fluid」という名称の、Decreら、米国特許第７，３２８，９７９号；２００６年２月２３日に公開された「Chemical Analysis Apparatus」という名称の、Yamakawaら、米国特許公開第１５  ２００６００３９８２３号；２０１１年３月３日に公開された「Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes」という名称の、Wu、米国特許公開第２０１１００４８９５１号；２００９年７月３０日に公開された「Electrode Addressing Method」という名称の、Fouilletら、米国特許公開第２００９０１９２０４４号；２００６年５月３０日に発行された「Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces」という名称の、Fouilletら、米国特許第７，０５２，２４４号；２００８年５月２９日に公開された「Droplet Microreactor」という名称の、Marchandら、米国特許公開第２００８０１２４２５２号；２００９年１２月３１日に公開された「Liquid Transfer Device」という名称の、Adachiら、米国特許公開第２００９０３２１２６２号；２００５年８月１８日に公開された「Device for Controlling the Displacement of a Drop Between Two or Several Solid Substrates」という名称の、Rouxら、米国特許公開第２００５０１７９７４６号；およびDhindsa et al.,「Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality」Lab Chip,10:832-836 (2010)に記載されているような液滴アクチュエーターである。
【００９３】
改変されたプローブ（例えば伸長した核酸プローブ）は、例えば流体混合物からの分離の後に、上記に記載のまたは当業界において公知の方法を使用して検出することができる。特定の実施形態において、第２の固体支持体（すなわちプローブと生物学的試料との間での接触がなされた第１の固体支持体とは異なる固体支持体）上で分離される改変されたプローブは、本明細書において前述されたものなどのマイクロアレイベースの技術または核酸シーケンシング技術を使用して検出することができる。流体ストリーム中で分離されるプローブは、公知のマイクロ流体デバイス、液滴操作デバイス、またはフローサイトメーターに装備されている光学、電気的または他の検出器を使用して検出することができる。検出方法を使用して、伸長したプローブの標的核酸配列、バーコード配列または他の配列領域を決定することができる。
【００９４】
プローブが生産された固体支持体から改変されたプローブを除去することに関して、数々の実施形態を例示した。しかしながら、固体支持体上のプローブは、試料からの標的核酸の存在下で固体支持体上で改変された生物学的試料と接触させることができ、次いで改変されたプローブは、固体支持体上で検出することができることが理解されると予想される。このような実施形態において、生物学的試料は、検出工程の前に、固体支持体から除去することができる。
【００９５】
特定の実施形態において、本発明の開示は、生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、（ａ）固体支持体に付着した複数の核酸プライマーを提供する工程であって、複数のもののうちの核酸プライマーは、複数のもののうちの核酸プライマーに共通のユニバーサルプライマー配列を包含する、工程；（ｂ）核酸プローブの集団を、複数の核酸プライマーに結合させる工程であって、核酸プローブは、ユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズするユニバーサルプライマー結合性配列、標的捕獲配列および集団中の他の核酸プローブのバーコード配列とは異なるバーコード配列を包含し、それによって固体支持体上でランダムに配置された位置に異なる核酸プローブを付着させる、工程；（ｃ）核酸プライマーの伸長によって異なる核酸プローブを増幅し、それによって固体支持体上でランダムに配置された位置で、バーコード配列のコピーと標的捕獲配列とを有する核酸クラスターを生産する工程；（ｄ）シーケンシング反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置された位置におけるバーコード配列を決定する工程；（ｅ）生物学的試料を、固体支持体上で核酸クラスターと接触させる工程；（ｆ）クラスターの標的捕獲配列を、クラスターの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｇ）標的捕獲配列を伸長させて、標的核酸からの配列とバーコード配列のコピーとを包含する伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸をタグ付けする工程を包含する、方法を提供する。
【００９６】
本明細書の上記で例示されたように、複数の核酸プライマーは、固体支持体に付着されていてもよく、複数のもののうちの核酸プライマーは、複数のもののうちの核酸プライマーに共通のユニバーサルプライマー配列を包含する。この実施形態において、第２の複数の核酸プライマーは、固体支持体に付着されていてもよく、第２の複数のもののうちの核酸プライマーは、第２の複数のもののうちの核酸プライマーに共通の第２のユニバーサルプライマー配列を有していてもよい。この実施形態において、支持体と接触させる複数の異なる核酸プローブは、上記の通り、固体支持体上でユニバーサルプライマーにハイブリダイズするユニバーサルプライマー結合性配列を包含していてもよく、異なる核酸プローブはまた、第２のユニバーサルプライマー配列にハイブリダイズする第２のユニバーサルプライマー結合性配列を包含していてもよい。このユニバーサルプライマーおよびユニバーサルプライマー結合性部位の構成は、架橋増幅を介して異なる核酸プローブを増幅することにとって特に有用であり得、その場合、第１および第２の複数のもののうちの核酸プライマーが伸長される。
【００９７】
典型的には、核酸プローブが第１および第２のユニバーサルプライマー結合性部位を含有する場合、それらは、プローブの末端に配置されると予想される。一部の実施形態において、核酸プローブから、またはプローブから生産されたアンプリコンからプライマー結合性部位の少なくとも１つを除去することが望ましい可能性がある。したがって、核酸プローブは、任意選択で、標的捕獲配列とユニバーサルプライマー結合性配列の１つとの間に切断部位を包含していてもよい。このケースにおいて、切断反応を実行して、標的捕獲配列からユニバーサルプライマー結合性部位を分離することができる。一般的に、標的捕獲配列を含有するプローブ（またはそのアンプリコン）の一部が固体支持体に付着されると、結果として固体支持体からのプライマー結合性部位の除去および標的捕獲配列の保持が起こると予想される。したがって、切断されたプローブは、標的核酸をハイブリダイズすることに使用することができ、切断されたプローブは、本明細書において前述された方法を使用して伸長させることができる。
【００９８】
一部の実施形態において、核酸プローブは、２つの異なる切断部位を包含すると予想される。第１の切断部位は、第１のプライマー結合性部位とプローブの１つまたは複数の他の配列エレメントとの間に配置されると予想される。第２の切断部位は、第２のプライマー結合性部位とプローブの１つまたは複数の他の配列エレメントとの間に配置されてもよい。切断部位は、他方をやむを得ず切断することなくそれぞれ個々を選択的に切断することができるように、異なる切断反応に対して反応性を有していてもよい。したがって、第１の切断部位を、プローブを改変する前に（例えば、伸長したプローブを生産する前に）切断することができ、それによって固体支持体に付着したままの１つまたは複数の他の配列エレメントから第１のプライマー結合性部位が分離される。第２の切断部位を、プローブを改変した後に（例えば、伸長したプローブを生産した後に）切断することができ、それによって後続の検出のために改変されたプローブが放出される。
【００９９】
代替として、核酸プローブは、第１の切断部位を包含していてもよく、核酸プローブを捕獲または増幅するのに使用されるプライマーは、第２の切断部位を包含していてもよい。この構成において、切断によって固体支持体に付着したままのプローブの１つまたは複数の他の配列エレメントから第１のプライマー結合性部位が分離されるように、第１の切断部位は、第１のプライマー結合性部位とプローブの１つまたは複数の他の配列エレメントとの間に配置することができる。ここでも、この第１の切断工程は、典型的にはプローブを改変する前に（例えば、伸長したプローブを生産する前に）行われると予想される。第２の切断工程を行って、プローブを改変した後に（例えば、伸長したプローブを生産する後に）第２の切断部位を切断することができ、それによって後続の検出のために改変されたプローブが放出される。
【０１００】
上記の２つの実施形態は、核酸プローブ（または改変された核酸プローブ）の付着点と、空間的なバーコードまたは標的配列などの情報を含有するプローブ（または改変されたプローブ）の１つまたは複数の配列との間に配置される切断部位を例示する。したがって、この切断部位は、改変されたプローブ（例えば伸長したプローブ）の放出に関して、配列情報を検出して、どの配列が生物学的試料中に存在するか、および試料中のどこに配列が存在するかを決定するのに有用である。
【０１０１】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法で固体支持体と接触させる１つまたは複数のプローブは、シーケンシングプライマー結合性部位を包含していてもよい。したがって、改変されたプローブ（例えば伸長したプローブ）は、シーケンシングプライマーをシーケンシングプライマー結合性部位にハイブリダイズさせる工程を包含するシーケンシング技術で検出することができる。プローブの改変されたバージョン（例えば伸長したプローブ）の切断によってシーケンシングプライマー結合性部位を包含する放出されたプローブが生じるように、シーケンシングプライマー結合性部位はプローブ中に配置させることができる。複数の異なるプローブ（例えば異なるバーコードおよび／または標的配列を有する）が同じシーケンシングプライマー結合性部位を有するように、シーケンシングプライマー結合性部位は、ユニバーサルシーケンシングプライマー結合性部位であってもよい。
【０１０２】
この開示は、生物学的試料の核酸を空間的にタグ付けするための方法であって、（ａ）固体支持体上にビーズのアレイを提供する工程であって、異なる核酸プローブは、アレイ中の異なるビーズに付着され、異なる核酸プローブはそれぞれ、バーコード配列を包含し、各ビーズは、固体支持体上に他のビーズからの異なるバーコード配列を包含し、異なる核酸プローブのそれぞれは、標的捕獲配列を包含する、工程；（ｂ）固体支持体上でデコーダープローブのハイブリダイゼーション反応を実行して、固体支持体上でランダムに配置されたプローブにおけるバーコード配列を決定する工程；（ｃ）生物学的試料をビーズのアレイと接触させる工程；（ｄ）異なる核酸プローブを、ビーズの近位にある生物学的試料の部分からの標的核酸にハイブリダイズさせる工程；および（ｅ）異なる核酸プローブを伸長させて、標的核酸からの配列とバーコード配列とを包含する伸長したプローブを生産し、それによって生物学的試料の核酸をタグ付けする工程を包含する、方法をさらに提供する。
【０１０３】
固体支持体または固体支持体に付着した核酸の操作は、固体支持体としてビーズを使用して行うことができることが理解されると予想される。ビーズは、このような操作が行われる前またはその後に、表面（例えばＩｌｌｕｍｉｎａからのＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）における場合のように、ウェルのアレイ）に付着されていてもよい。例えば、アレイ上にビーズを分配させる前またはその後に、核酸プローブをビーズ上で捕獲してもよく、アレイなどの上にビーズを分配させる前またはその後に、核酸プローブを増幅させて、ビーズ上にアンプリコンを作り出すことができる。
【実施例】
【０１０４】
例Ｉ
Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルを使用して組織サンプルからのｍＲＮＡの空間的タグ付け
図１に、バーコード化されたオリゴ−ｄＴを含有するクラスターを生成し、次いでバーコード化されたオリゴ−ｄＴを制限酵素消化によって露出させ、続いてシーケンシングするための方法を説明する。一本鎖のバーコード化されたオリゴ−ｄＡ、Ｐ５’、Ｐ７、ＳＢＳ３シーケンシングプライマー結合性部位およびＢｓｐＨＩ制限酵素部位（図１の上のパネルに示される）を含有するフラグメントのライブラリーを、オリゴ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって調製した。バーコードは２７ｍｅｒであり、合成中にランダムに生成された。シーケンシングによるバーコードのデコードのために、ＳＢＳ３シーケンシングプライマーのための結合性部位を包含させた。クラスター形成および線状化のときにオリゴｄＴ部位が生成するように、オリゴ−ｄＡストレッチを包含させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡフローセルでの標準的なクラスター化学（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｖ３  ｃＢｏｔ  Ｐ／Ｎ：１５０３７９３１）に従って、製造元の推奨されたプロトコールを使用して、架橋増幅およびクラスター形成を実行した。
【０１０５】
架橋増幅およびクラスター形成の後、ＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ中に供給されたホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）酵素を使用したＰ７プライマー中の８−オキソＧの切断によってクラスターを線状化した。それに続いて２００ユニット／ｍＬのＢｓｐＨ１（ＮＥＢカタログ番号Ｒ０５１７Ｌ）によって３７℃で１５分間、制限酵素消化し、クラスターのＰ５アダプターが固定された鎖からＰ７’を除去して、ｍＲＮＡの存在下での後続の伸長のためにオリゴ−ｄＴストレッチを露出させた。１００〜４００Ｕ／ｍＬの範囲の酵素濃度を１５または３０分試験した。ＳＢＳ３シーケンシングプライマーによってバーコードのデコードを開始した。
【０１０６】
図１の下のパネルで示されるように、クラスター中のオリゴ−ｄＴ配列を使用して、バーコードのデコードの後にポリＡ＋ＲＮＡを捕獲した。製造元の推奨する条件に従ってＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ／Ｎ：１５０１２９９７）およびＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｐ／Ｎ：ＭＭ０７０１５０）を使用したクラスターのオリゴ−ｄＴ鎖の伸長によって、バーコード化されたｃＤＮＡを生成した。捕獲されたＲＮＡをテンプレートとして使用した。ＩｌｌｕｍｉｎａのＵｒａｃｉｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ試薬（ＵＳＥＲ）（ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ  ＰＥクラスターキット）を使用してフローセルのＰ５配列からバーコード化されたｃＤＮＡを放出し、第２のＩｌｌｕｍｉｎａフローセルでのシーケンシングのために使用されるバーコード化されたｃＤＮＡライブラリーを遊離させた。
【０１０７】
図２のパネルＡで図解されるように、ＢｓｐＨ１での制限酵素消化後のオリゴｄＴ捕獲配列の利用可能性を、線状化したクラスターをＣｙ５で標識されたポリＡ（２４ｍｅｒ）とハイブリダイズさせることによって確認した。簡単に述べると、制限酵素消化の後、クラスターを０．１ＮのＮａＯＨで処理し、ＨＴ２低塩緩衝液で洗浄して、フローセル上の第２の鎖を除去した。次いで、５００ｎＭのＣｙ５オリゴ−ｄＡ（２４ｍｅｒ）を線状化し変性させたクラスターの上に３０μｌ／分の速度で流し、４０℃で５分インキュベートし、次いで画像化した。オリゴｄＴを含有するＢＯＤＴ−１ライブラリーが存在するＧＡフローセルのレーン２〜７で、Ｃｙ５で標識されたポリＡのオリゴｄＴへのハイブリダイゼーションが検出された（図２の画像、パネルＢに示されるフローセルを参照）。フローセルの画像（パネルＢ）、および棒グラフ（パネルＣ）から明白なように、対照ＰｈｉＸライブラリー（フローセルのレーン１および８）は、Ｃｙ５シグナルにおいて極めて低い蛍光を有することを示した。これらの結果から、線状化時にＣｙ５ポリＡ（２４ｍｅｒ）に特異的に結合することができるクラスター中に、オリゴ−ｄＴ部位を作り出すことができることが実証された。
【０１０８】
図３に示される表に、３．２ｐＭｏｆＢＯＤＴ−１ライブラリーと共に上述のフローセルのシーケンシングの基準を示す。ＧＡシーケンシングから２１個のタイルにおいて数百万のリードが検出された。シーケンシング後、図４にプロットしたように固有のバーコードの数を決定した。これは、全てのパッシングフィルター（ＰＦ）リードがバーコードであると仮定し、各レーン中の固有のリード（バーコード）の数を決定することによってなされた。ＰｈｉＸ対照ライブラリーと比較して、タイルをシーケンシングした後、５〜１１００万個の固有のバーコード化されたクラスターが検出された。これらの結果から、バーコード化されたオリゴ−ｄＴ配列のライブラリーの配列のデコードは実現可能であり、数百万の固有のバーコードを生成することが実証された。
【０１０９】
例ＩＩ
Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル上への細胞接着
単一の細胞を、パターン化したフローセル上で捕獲した（ＨｉＳｅｑ  Ｘ１０フローセル、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）。全ての試薬のフロー工程を、蠕動ポンプまたはｃＢＯＴクラスター生成機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して実行した。簡単に述べると、パターン化したフローセルの全てのレーン上に、ヌクレアーゼ非含有水、続いて３０〜７０ＫのポリＤリシン溶液（１００μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／分の流速で８分流した。加熱不活性化したウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１００８２−１３９）も接着剤として試験した。接着剤をフローセルのレーン上で１時間インキュベートし、続いて１×ＰＢＳ＋０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号２４０４０−０３２）洗浄液をインキュベートした。次に、１００μｌ／分の速度で細胞５〜５０個／μｌまたはおよそ細胞１００〜１０００個／レーンで流動させ、続いて細胞を結合させるために６０分インキュベーション工程を行うことによって、コーティングしたフローセルに細胞を接着させた。７５μｌ／分の速度で１×ＰＢＳ／０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃを用いてフローセルを洗浄した。フローセル上に細胞が固定された場合、上述したように細胞を流動させた後にフローセル上に１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を流し、１５分インキュベートし、続いて１×ＰＢＳ／０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃの工程を行った。フローセルを除去し、顕微鏡を使用してレーン当たりの細胞の数を数えた。
【０１１０】
図５のパネルＡは、パターン化したフローセル上に捕獲された細胞の画像を示す。図５のパネルＢに示される細胞数データから、ＢＳＡでコーティングしたまたは接着剤で処理されなかった対照と比較して、ポリＤリシンでコーティングしたフローセルは細胞接着を助けたことが確認された。図６で示されるように、接着した細胞は、１％ＰＦＡでうまく固定することができる。
【０１１１】
例ＩＩＩ
ゲルに付着したプローブ表面による標的ｍＲＮＡの空間的に局所的な捕獲
この例は、ゲルコーティングしたスライド上のポリＴプローブのローンの作出、ポリＴプローブのローン上部への組織切片の設置、組織切片からのＲＮＡの放出、ポリＴプローブによる放出されたｍＲＮＡの捕獲、ポリＴプローブをＣｙ３標識するための逆転写、組織の除去、およびスライドの画像化を説明する。
図７のパネルＡは、ゲルに付着したプローブを作り出すのに使用される工程および試薬の図解的な表示を示す。簡単に述べると、顕微鏡のスライドをシラン非含有アクリルアミド（ＳＦＡ）でコーティングし、Ｐ５およびＰ７プライマーを付着させ（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号を参照）、ポリＡ配列およびＰ５またはＰ７相補配列のいずれかを有するプローブを、それぞれＰ５およびＰ７プライマーにハイブリダイズさせ、Ｐ５およびＰ７プライマーを伸長させて、ポリＴ配列伸長を生産した。Ｃｙ５で標識されたポリＡオリゴヌクレオチドを伸長したプライマーにハイブリダイズさせて、Ａｘｏｎイメージャーを使用して表面を画像化することによって、品質管理工程を実行した。
【０１１２】
図７のパネルＢで示されるように、組織切片を、ポリＴ伸長プライマーを有するゲルに設置した。組織を処理してｍＲＮＡを放出させ、放出されたｍＲＮＡのポリＡテールを、伸長したプライマーのポリＴ配列にハイブリダイズさせた。テンプレートとして捕獲されたｍＲＮＡを使用してポリＴ配列を伸長させ、伸長したプライマーをＣｙ３で選択的に標識した。ゲルから組織を除去し、表面を画像化して、Ｃｙ３蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）を検出した。
図７の画像で示されるように、ｍＲＮＡ種を放出した組織のエリアの近位のゲルのエリアは蛍光で表され、ｍＲＮＡを放出しなかったエリアは画像中で暗部として表される。したがって、捕獲されたｍＲＮＡは、組織のフィンガープリント様の画像を作り出した。
【０１１３】
例ＩＶ
ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）表面に付着したプローブによる標的ｍＲＮＡの空間的に局所的な捕獲
この例は、ポリＴプローブを有するＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）の上部への組織切片の設置、組織切片からのＲＮＡの放出、ポリＴプローブによる放出されたｍＲＮＡの捕獲、ポリＴプローブをＣｙ５標識するための逆転写、組織の除去、およびＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）の画像化を説明する。
図８のパネルＡで示されるように、マウス嗅覚組織切片を、ポリＴプローブを有するＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）に設置した。組織を処理して、ｍＲＮＡを放出させ、放出されたｍＲＮＡのポリＡテールを、プローブのポリＴ配列にハイブリダイズさせた。テンプレートとして捕獲されたｍＲＮＡを使用してポリＴ配列を伸長させ、伸長したプライマーをＣｙ５で選択的に標識した。ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）から組織を除去し、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）を画像化して、Ｃｙ５蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）を検出した。
【０１１４】
図７のパネルＢで示されるように、ｍＲＮＡ種を放出した組織のエリアの近位のＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）のエリアは蛍光で表され、ｍＲＮＡを放出しなかったエリアは画像中で暗部として表される。したがって、捕獲されたｍＲＮＡは、組織のフィンガープリント様の画像を作り出した。
本出願にわたり、様々な刊行物、特許または特許出願が参照されている。本出願において、これらの刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
用語「含む」は、本明細書において、列挙された要素だけでなくあらゆる追加の要素をさらに包含するオープンエンドであることが意図される。
数々の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な改変がなされ得ることが理解されると予想される。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2018510662.tif 000003
【図２】
2018510662.tif 000004
【図３】
2018510662.tif 000005
【図４】
2018510662.tif 000006
【図５】
2018510662.tif 000007
【図６】
2018510662.tif 000008
【図７】
2018510662.tif 000009
【図８】
2018510662.tif 000010
【国際調査報告】
2018510662.tif 000011
2018510662.tif 000012