(57)【要約】対象の２型糖尿病を治療するための組成物及び方法。プロペプチド及びＧＬＰ−１の活性部分をコードする配列を含む核酸分子を含み、発現されると、ＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸がプロペプチドのＣ末端アミノ酸の直後に続くウイルスベクターを提供する。目的とする実施形態では、対象はネコまたはイヌである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロペプチド及びＧＬＰ−１をコードする配列を含む核酸分子を含み、発現されると、ＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸がプロペプチドのＣ末端アミノ酸の直後に続く、選ばれた種での糖尿病治療に有用なウイルスベクター。
【請求項２】
前記プロペプチドが少なくとも約４０アミノ酸である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記プロペプチドが、最終的に前記ベクターの投与を意図するのと同じ種に由来する、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記プロペプチドがネコ科動物の配列である、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記プロペプチドがイヌ科動物、ヒト、ヒト以外の霊長類などの配列である、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記ウイルスベクターがネコ科動物、イヌ科動物、またはヒトから選択される哺乳動物を標的とするように設計されている、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１配列がＧＬＰ−１の活性部分をコードする、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１配列がアミノ酸７−３７をコードする、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１配列が、配列番号１またはそれと少なくとも７５％同一な配列である、請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記ＧＬＰ−１をコードする核酸配列が、配列番号２またはそれと少なくとも６０％同一な配列を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記配列が、ネコ科動物またはイヌ科動物またはヒトの発現に合わせてコドン最適化された、請求項１０に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記核酸配列が、シグナルペプチド（プレペプチド）及びプロペプチドの両方をコードする、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記プロペプチドが、第ＩＸ因子プロペプチドまたはその変異体である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
前記プロペプチドが、ネコ科動物の第ＩＸ因子プロペプチドまたはそれと少なくとも８０％同一な配列である、請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
前記プロペプチド配列が、第ＩＸ因子配列のアミノ酸１−４６をコードする、請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
前記プロペプチド配列が配列番号３である、請求項１５に記載のウイルスベクター。
【請求項１７】
前記プロペプチドをコードする前記核酸配列が配列番号４を含む、請求項１５に記載の
ウイルスベクター。
【請求項１８】
前記プロペプチドがアルブミンプロペプチドである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
前記プロペプチドが、凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、プロテインＣ、及びプロテインＳタンパク質から選択される凝固因子のプロペプチド部分である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
前記プロペプチド配列が、前記選ばれた患者種に合わせてコドン最適化されている、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、前記プロペプチド及びＧＬＰ−１の宿主細胞内での発現を指示する発現制御配列をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２２】
前記発現制御配列がプロモーターを含む、請求項２１に記載のウイルスベクター。
【請求項２３】
前記プロモーターがＣＢ７プロモーターである、請求項２２に記載のウイルスベクター。
【請求項２４】
前記発現制御配列が組織特異的プロモーターを含む、請求項２１に記載のウイルスベクター。
【請求項２５】
前記組織特異的プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、請求項２４に記載のウイルスベクター。
【請求項２６】
前記組織特異的プロモーターが、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターまたはリンパ球特異的タンパク質１（ＬＳＰ１）プロモーターから選択される、請求項２４に記載のウイルスベクター。
【請求項２７】
イントロン、コザック配列、ポリＡ、及び転写後調節因子の各エレメントのうち１つ以上をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２８】
前記ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２９】
前記ベクターが、ＡＡＶ８、ｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ．３７、またはｒｈ１０から選択されるキャプシド及びその変異体を有するｒＡＡＶである、請求項２６に記載の組換えベクター。
【請求項３０】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、組込みベクター、ＤＮＡ及びＲＮＡナノ粒子から選択される、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３１】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜３０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項３２】
糖尿病の治療方法であって、請求項３１に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記組成物が静脈内投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が哺乳動物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がネコ科動物またはイヌ科動物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象がネコ科動物であり、前記プロペプチドがネコ科動物の配列である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、別の療法と組み合わせて投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物がインスリン療法と共に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、約１ｘ１０12ＧＣ／ｋｇの投与量で投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が２回以上投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
対象におけるＧＬＰ−１の血中半減期を延長する方法であって、内因性プロペプチド及びＧＬＰ−１の活性部分を提供することを含み、発現されるとＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸が前記プロペプチドのＣ末端アミノ酸の直後に続く、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形式で提出された資料の相互参照
本出願人は本明細書と共に電子形式で提出された配列表を参照により本明細書に組み込む。ファイルの名称は「１５−７４７１＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」である。
【背景技術】
【０００２】
米国の猫４００匹に１匹、犬５００匹に１匹が、ヒトの２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）に類似した病態を有している。現在の標準治療は、頻繁な獣医師受診を伴う飼主による１日２回のインスリン注射、及び使い捨ての診断薬であり、いずれも動物の飼主にとって高額かつ時間のかかる不便なものである。
【０００３】
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、グルコースホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす内因性ペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１類似体は現在、糖尿病治療の一般的なヒト治療用ホルモンとして使用されている。ＧＬＰ−１は、インスリン放出を増強し、インスリン感受性を高め、β細胞の損失を防止し、胃内容排出を遅延することによって高血糖を制御する能力を有する。しかしながら、血中での半減期が短いため、安定的なベクターを媒介した送達なしに単独の治療薬としてＧＬＰ−１を開発することは困難である。天然ホルモンの半減期の短さを克服するように設計されたＧＬＰ−１類似体が、Ｔ２ＤＭ治療の重要な治療薬として注目されている。しかしながら、こうした薬物は依然として頻繁な皮下注射を必要とする。ＧＬＰ−１の治療レベルを持続させる別の方法は、アデノ随伴ウイルスベクターもしくは他のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって媒介される遺伝子導入を用いて、天然ペプチドを連続的にｉｎ  ｖｉｖｏ産生させるものである。ＧＬＰ−１は短い半減期、広い治療指数、長期間の曝露での安全性を有することから、この送達方法には理想的な候補である。この方法は、Ｔ２ＤＭに罹患したヒト及び他の種いずれにおいても利便かつ効果的なＴ２ＤＭの療法を提供することができる。
【０００４】
前駆体ポリペプチドから活性ペプチドを放出させるには細胞特異的プロテアーゼが必要であるため、ＧＬＰ−１を遺伝子治療ベクターから天然形態で発現させることはできない。単にペプチド単独を発現させシグナルペプチドにより分泌を誘導する試みは失敗しているが、おそらくこれは、小タンパク質の翻訳及び分泌が非効率であること、または活性ＧＬＰ−１を生成するシグナルペプチドの切断が非効率であることに起因する。ベクター媒介性のＧＬＰ−１発現に関する以前の齧歯類試験では、大型の非種特異的プロペプチドの後ろにインフルエンザ赤血球凝集素が続き、ＧＬＰ−１のＮ末端直前に切断部位がある場合にのみ、有効なＧＬＰ−１血中レベルが達成された。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ，ｄｓＡＡＶ８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ｂ−ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｒｅ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９：７９１−９（２０１２）及びＣｈｏｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ，ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＧＬＰ−１  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１５５−６３（２０１１）を参照のこと。しかしながら、これらの外来性プロペプチドは、形質導入された細胞に対する破壊的な免疫応答を誘発する可能性がある。したがって、対象、特にコンパニオンアニマルにおける２型糖尿病の有効な治療に有用な組成物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では新規の遺伝子組換えグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）構築物を提供する。この構築物から発現されるＧＬＰ−１タンパク質は、単独の治療薬として提供されるＧＬＰ−１タンパク質と比較して、血中半減期の延長という好ましい特徴を有し、ｉｎ
ｖｉｖｏでＧＬＰ−１の活性部分を放出するように有効に処理される。この構築物は、それを必要とする対象に複数の経路を介して、具体的には組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどの組換えベクターによって媒介されるｉｎ  ｖｉｖｏ発現により送達することができる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１構築物を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１構築物はプロペプチド及びＧＬＰ−１の活性部分をコードし、発現されると、ＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸がプロペプチドのＣ末端アミノ酸の直後に続く。
【０００７】
いくつかの実施形態では、プロペプチドは内因性配列である。すなわち、プロプチド配列は、最終的に投与を意図するものと同じ対象種に由来する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、プロペプチドは凝固因子由来のリーダー配列である。一実施形態では、プロペプチド配列は、プロテインＳ、第ＩＸ因子、アルブミン、アルブミン、ＩＬ２、トロンビン、及びマンノシダーゼから選択されるリーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチドはフューリン部位を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、ＧＬＰ−１の活性部分に対応するＧＬＰ−１配列をコードする。一実施形態では、ＧＬＰ−１配列はＧＬＰ−１のアミノ酸７−３７をコードする。別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列は配列番号１である。
一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物をコードする核酸配列は配列番号６に記載されたものである。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号５をコードするコドン最適化配列である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に示す組換えベクターは、プロペプチド及びＧＬＰ−１を含んでいる発現カセットを有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、肝細胞においてＧＬＰ−１の発現を特異的に指示するプロモーターを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組換えベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ．３７、またはＡＡＶｒｈ１０から選択されるキャプシドを有する。ある特定の実施形態では、プロペプチド及びＧＬＰ−１の活性部分が含まれる発現カセットを有するｒＡＡＶベクターを提供する。ある特定の実施形態では、プロペプチドは第ＩＸ凝固因子のリーダー配列を含む。別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列はＧＬＰ−１のａａ７−３７をコードする。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、肝細胞におけるＧＬＰ−１構築物の発現を特異的に指示するプロモーターが含まれる発現カセットを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的に許容される担体及び組換えベクターを含む医薬組成物を提供する。発現カセットを有する本明細書に記載の組換えベクターを、それを必要とする対象に投与することによってＴ２ＤＭを治療する方法であって、前記発現カセットが、対象におけるＧＬＰ−１構築物の発現を指示する調節制御配列をさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療される対象はコンパニオンアニマルである。一実施形態では、対象はネコ科動物である。別の実施形態では、対象はイヌ科
動物である。本明細書で使用される場合、用語「患者」及び「対象」は同義に使用され、ヒトまたは獣医学的対象を指す場合がある。
【００１３】
さらに別の実施形態では、内因性プロペプチド及びＧＬＰ−１の活性部分をコードする発現カセットを有し、発現されるとＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸がプロペプチドのＣ末端の直後に続く本明細書に記載の組換えベクターを提供することを含む、対象におけるＧＬＰ−１の血中半減期を延長する方法である。
【００１４】
上記の組換えベクターを、２型糖尿病を治療するためのレジメンに使用することができる。
【００１５】
本発明の他の態様及び利点は、本発明に関する以下の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例２に記載される、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における活性ＧＬＰ−１発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価の結果を示す。左側のバーは、培地のみの対照に対応する。中央のバーは、実施例１に記載される、インターロイキン−２シグナルペプチドの後ろにＧＬＰ−１（７−３７）を含むＧＬＰ−１構築物に対応する。右側のバーは、実施例１に記載される、第ＩＸ因子プロペプチドの後ろにＧＬＰ−１（７−３７）を含むＧＬＰ−１構築物に対応する。値は反復ウェルの平均＋／−ＳＥＭである。
【図２】ＡＡＶ８．ＣＢ．ｆＦＩＸ＿ＧＬＰ１によるＲＡＧ−／−マウスの形質導入を介した、ＧＬＰ−１のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を示す試験の結果を示す。上側３本の線（四角、三角、及び菱形）は、ＡＡＶ８．ＣＢ．ｆＦＩＸ＿ＧＬＰ１で処置した３匹のマウスに対応する。最下部の線は内部対照マウスに対応する。
【図３】糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）をＡＡＶ８．ＣＢ．ｆＦＩＸ＿ＧＬＰ１（Ｄｂ＋ＡＡＶ）で処置した試験の結果を示す。野生型（ＷＴ）の同齢対照を、ベクターでトランスフェクトされていない糖尿病（Ｄｂ）マウスと同様に使用した。血清グルコースレベルを毎週測定した。値は平均＋／−ＳＥＭである。
【図４】実施例２及び３で使用したＧＬＰ−１構築物の構築手法を示すマップである。マップは、ＣＢ７プロモーター、ネコ科動物の第ＩＸ因子プロペプチド、ＧＬＰ−１（７−３７）、及びポリＡ配列を示す。
【図５】トランスフェクトされたＨｕＨ７細胞における活性ＧＬＰ−１発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価の結果を示す。実施例１に記載のＧＬＰ−１配列の上流に以下の配列それぞれを配置した：プロテインＳプロペプチド（Ｐｒｏｔ  Ｓ）、アルブミンプロペプチド（Ａｌｂ）、フューリン部位を有するＩＬ２リーダー（ＩＬ２  Ｆｕｒ）、フューリン部位を有するアルブミンプロペプチド（Ａｌｂ  Ｆｕｒ）、第ＩＸ因子プロペプチド（ＦＩＸ）、フューリン部位を持たないＩＬ２リーダー（ＩＬ２）、及びトランスフェクションされていないＨｕＨ７細胞。使用した配列はすべてネコ科動物配列であった。
【図６】トランスフェクトされた細胞における活性ＧＬＰ−１発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価の結果を示す。実施例１に記載のＧＬＰ−１配列の上流に以下の配列それぞれを配置した：フューリン部位を有するＩＬ２リーダー（ＩＬ２  Ｆｕｒ）、フューリン部位を有するアルブミンプロペプチド（Ａｌｂ  Ｆｕｒ）、第ＩＸ因子プロペプチド（ＦＩＸ）、トロンビンリーダー配列、フューリン部位を有するマンノシダーゼリーダー（ＭａｎＦｕｒ）、及びトランスフェクションされていない細胞（ｔｃ＋）。使用した配列はすべてネコ科動物配列であった。
【図７】実施例５に記載される、野生型マウスにおける３種類のＧＬＰ−１構築物の投与結果を示す。各４匹のマウスコホートに５ｘ１０10の対応するベクターを注射し、活性ＧＬＰ−１発現を評価した。
【図８】実施例７に記載される、健常なネコにおける３種類のＧＬＰ−１構築物の投与結果を示す。指定した時点で血液の活性ＧＬＰ−１発現について評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＧＬＰ−１発現構築物は、コンパニオンアニマル及びヒトを含む対象に使用するために開発され、その中のリーダープロペプチドが患畜またはヒト患者の種に内在するタンパク質に由来するものである。切断及び分泌後、構築物から産生されるすべての産物、すなわち遊離プロペプチド及び活性ＧＬＰ−１が非免疫原性自己ペプチドであることが望ましい。
【００１８】
本明細書中に記載のＧＬＰ−１構築物は、単独治療薬としてのＧＬＰ−１ペプチドの投与と比較して、血中ＧＬＰ−１の半減期の延長をもたらすことを特徴とする。これは、ＧＬＰ−１活性ペプチドのＮ末端の正確なプロセシングと組み合わせた、ベクター内に含まれる発現カセットの持続的発現に起因する。
【００１９】
複数の経路を介した、具体的にはｒＡＡＶベクターなどの組換えベクターによって媒介されるｉｎ  ｖｉｖｏ発現による、この構築物の必要とする対象への送達について記載する。また、それらの構築物を、それを必要とする対象におけるＴ２ＤＭまたはメタボリックシンドロームを治療するためのレジメンに使用し、対象におけるＧＬＰ−１の半減期を延長する方法も提供する。加えて、対象におけるＧＬＰ−１の活性を増強する方法を提供する。また、それを必要とする対象において体重減少を誘導する方法も提供する。
【００２０】
グルカゴン様ペプチド１、すなわちＧＬＰ−１はプログルカゴン遺伝子の転写産物に由来するインクレチンである。ｉｎ  ｖｉｖｏでグルカゴン遺伝子は１８０アミノ酸のプレプロポリペプチドを発現するが、これはタンパク質分解処理されてグルカゴン、すなわちＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２という２つの形態を形成する。最初の配列決定研究では、ＧＬＰ−１は３７個のアミノ酸残基を有することが示された。しかし、それ以後の報告から、このペプチドはプロペプチドであり、付加的な処理によりアミノ末端から６個のアミノ酸が除去され、ＧＬＰ−１の活性型であるＧＬＰ−１（７−３７）の形態をとることが明らかとなった。また３７位のグリシンがｉｎ  ｖｉｖｏでアミドに変換され、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを形成する。ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）アミドは、効力の等しいインスリン分泌性ホルモンである。したがって、本明細書で使用される場合、本明細書で有用なＧＬＰ−１の生物学的に「活性な」形態とは、ＧＬＰ−１−（７−３７）及びＧＬＰ−１−（７−３６）ＮＨ2である。
【００２１】
便宜上、「野生型」ＧＬＰ−１（７−３７）の配列、すなわちヒトＧＬＰ−１の天然配列を配列番号１：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ
Ｇに示す。この野生型アミノ酸配列は以降の例示に利用され、ヒト、ネコ、及びイヌを含む様々な種にわたって保存的である。ただし、本明細書で使用される場合、用語ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１の活性型、例えばＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１（７−３６）アミドのいずれをも指す。さらに、一実施形態では、用語ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１ペプチドの機能的変異体を指す。機能的変異体は、異なる種に由来する相同体を含む。ＧＬＰ−１及びそのファミリーペプチドのＮ末端（活性部分）は、高度の配列同一性を共有する。しかしながら、ＧＬＰ−１タンパク質間には、種間で、特に以下の太字の残基に多少の変異が見られる：
【００２２】
【化１】
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【００２３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１の機能的変異体は、本明細書に記載の、または当技術分野
で既知のＧＬＰ−１核酸またはアミノ酸配列から最大約１０％までの変異を含み得るが、野生型配列の機能を保持している変異体を含む。本明細書で使用される場合、「機能を保持する」とは、発現または活性のレベルが必ずしも同じではないものの、核酸またはアミノ酸が野生型配列と同じように機能することを意味する。例えば、一実施形態では、機能的変異体は、野生型配列と比較して発現または活性が増加している。別の実施形態では、機能的変異体は、野生型配列と比較して発現または活性が低下している。一実施形態では、機能的変異体は、野生型配列と比較して、発現または活性が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増加または減少している。
【００２４】
別の実施形態では、ＧＬＰ−１の機能的変異体は、本明細書に記載の、または当技術分野で既知のＧＬＰ−１核酸またはアミノ酸配列から最大約２０％までの変異を含み得るが、野生型配列の機能を保持している変異体を含む。
【００２５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１の機能的変異体は、本明細書に記載の、または当技術分野で既知のＧＬＰ−１核酸またはアミノ酸配列から最大約３０％までの変異を含み得るが、野生型配列の機能を保持している変異体を含む。
【００２６】
一実施形態では、用語ＧＬＰ−１は、上記で産生される配列（配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換がなされた活性ＧＬＰ−１を指す。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換が、種間で変異が見られる残基（すなわち、上記の太字の残基）において行われる。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換が、種間で保存される残基において行われる。ＧＬＰ−１は種間に共通する高度の同一性を有するが、最終的にベクターの投与を意図する対象の種に基づいてＧＬＰ−１配列を選択することが望ましい場合がある。一例では、対象は哺乳動物である。例えば、一実施形態では、対象がネコ科動物である場合、ＧＬＰ−１配列はネコ科のタンパク質に由来する。別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列はイヌ科のタンパク質に由来する。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列はヒトのタンパク質に由来する。別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列はヒト以外の霊長類のタンパク質に由来する。別の実施形態では、ＧＬＰ−１は、ウシ、ヒツジ、またはブタのタンパク質に由来する。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１は齧歯類に由来する。一実施形態では、ＧＬＰ−１配列はＧＬＰ−１（７−３７）をコードする。別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列は配列番号１である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１配列は配列番号１のａａ１−２９である（これは野生型ＧＬＰ−１のａａ７−３６に対応する）。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「由来する」または「に由来する」とは、配列またはタンパク質が特定の対象種を起源とするか、または特定の対象種を起源とするタンパク質または配列と同じ配列を共有することを意味する。例えば、イヌ科動物に「由来する」プロペプチド配列は、イヌ科動物で発現されるのと同じプロペプチド配列と同じ配列（または本明細書で定義されるその変異体）を共有する。しかしながら、指定された核酸またはアミノ酸が実際にイヌ科動物から供給される必要はない。類似したタンパク質（例えば、相同体）の突然変異誘発、または核酸もしくはアミノ酸配列の人工的作製を含め、目的配列を産生できる様々な技術が当技術分野で既知である。「由来する」核酸またはアミノ酸は、由来する配列の実際の起源を問わず、それが「由来する」種の核酸またはアミノ酸と同じ機能を保持する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ＧＬＰ−１構築物」、「ＧＬＰ−１発現構築物」、及び同義語には、プロペプチド配列と組み合わせた本明細書に記載のＧＬＰ−１配列が含まれる。用語「ＧＬＰ−１構築物」、「ＧＬＰ−１発現構築物」、及び同義語は、プロペプチド及びＧＬＰ−１またはその発現産物をコードする核酸配列を指す際に使用されることがある。
【００２９】
本明細書に記載のＧＬＰ−１構築物はまた、プロペプチド配列を含む。本明細書で使用される場合、用語リーダー配列、プロペプチド、シグナル配列、プレペプチド、及び類似の同義語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで最終的な活性ＧＬＰ−１ペプチドから切断される配列を指す。そのような「プロペプチド」配列は、２つ以上のそのような配列、例えば、シグナル配列とプロペプチド配列を含み得る。内因性ＧＬＰ−１はプロホルモン（プログルカゴン、切断されてＧＬＰ−１の活性型になる）として発現されるが、本明細書に記載の構築物に使用されるプロペプチドは、ＧＬＰ−１に対して非相同であるタンパク質に由来するリーダー配列であることが望ましい。
【００３０】
一実施形態では、プロペプチドは、最終的に投与を意図するのと同じ種に由来する。例えば、一実施形態では、目的の対象がネコ科動物である場合、プロペプチド配列はネコ科のタンパク質に由来する。別の実施形態では、プロペプチド配列はイヌ科のタンパク質に由来する。さらに別の実施形態では、プロペプチド配列はヒトのタンパク質に由来する。別の実施形態では、プロペプチド配列はヒト以外の霊長類のタンパク質に由来する。別の実施形態では、プロペプチドは、ウシ、ヒツジ、またはブタのタンパク質に由来する。さらに別の実施形態では、プロペプチドは齧歯類のタンパク質に由来する。
【００３１】
プロペプチドの長さを変更及び／または選択して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＬＰ−１構築物の発現を増強することができる。したがって、内因性プロペプチドの望ましい長さを選択するか、または目的のプロペプチドを遺伝子操作して、野生型プロペプチドの機能を保持するが、より望ましい配列長であるプロペプチドを得ることができる。
【００３２】
プロペプチドは、ＧＬＰ１の長さに少なくとも約１９個のアミノ酸を付加して、最終プロペプチド−ＧＬＰ−１発現産物を少なくとも約４５〜５０アミノ酸長にすることが望ましい。一実施形態では、プロペプチドが少なくとも約３５アミノ酸長であり、最終プロペプチド−ＧＬＰ−１発現産物を少なくとも約６５アミノ酸長にすることが望ましい。このようなサイズ条件があるため、アルブミン及び凝固因子がプロペプチドの望ましい起源である。本明細書に記載されるこれらのプロペプチドの突然変異体及び変異体もまた、本明細書に記載の組成物及び方法に有用である。具体的には、本明細書に記載のプロペプチドのＮ末端切断断片（すなわち、Ｃ末端部分を保持する）は、プロペプチドが発現産物の活性ＧＬＰ−１への適切なプロセシングに必要とされる切断シグナルを保持する場合に限り有用である。
【００３３】
一実施形態では、目的のプロペプチドの機能的変異体は、本明細書に記載の、または当技術分野で既知のプロペプチドの核酸またはアミノ酸配列から最大約１０％までの変異を含み得るが、野生型配列の機能を保持している変異体を含む。本明細書で使用される場合、「機能を保持する」とは、発現または活性のレベルが必ずしも同じではないものの、核酸またはアミノ酸が野生型配列と同じように機能することを意味する。例えば、一実施形態では、機能的変異体は、野生型配列と比較して発現または活性が増加している。別の実施形態では、機能的変異体は、野生型配列と比較して発現または活性が低下している。一実施形態では、機能的変異体は、野生型配列と比較して、発現または活性が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増加または減少している。
【００３４】
別の実施形態では、目的のプロペプチドの機能的変異体は、本明細書に記載の、または当技術分野で既知のプロペプチドの核酸またはアミノ酸配列から最大約２０％までの変異を含み得るが、野生型配列の機能を保持している変異体を含む。
【００３５】
別の実施形態では、目的のプロペプチドの機能的変異体は、本明細書に記載の、または
当技術分野で既知のプロペプチドの核酸またはアミノ酸配列から最大約３０％までの変異を含み得るが、野生型配列の機能を保持している変異体を含む。
【００３６】
一実施形態では、プロペプチド配列は、Ｎ末端プロセシングの効率を高めるために追加の配列と組み合わされる。一実施形態では、プロペプチド配列は、フューリン切断部位と組み合わされる。一実施形態では、フューリン配列はＲＸ［Ｒ／Ｋ］Ｒコンセンサス配列を含む。別の実施形態では、フューリン配列は配列ＲＫＲＲを含む。フューリン部位を当業者が修飾してもよい。実験的に確認されたフューリン切断部位、基質、種、実験方法、実験の原典、及びフューリン基質を標的とする関連薬物を収録したデータベースであるＦｕｒｉｎＤＢに関する考察については、文献が参照により本明細書に組み込まれるＴｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ，２０１１，１２：１０１０−５を参照のこと。
【００３７】
一実施形態では、プロペプチドは第ＩＸ因子プロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドは第ＩＩ因子プロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドは第ＶＩＩ因子プロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドは第Ｘ因子プロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドはプロテインＣプロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドはプロテインＳプロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドはアルブミンプロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドはマンノシダーゼプロペプチドである。別の実施形態では、プロペプチドは骨の「ｇｌａ」タンパク質に由来する。一実施形態では、プロペプチドは、少なくとも端点を含む約１９〜１００（この間の任意の整数を含む）アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約２５アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約３５アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約４０アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約４０アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約５０アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約５５アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約６０アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約６５アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約７０アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約７５アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチドは約８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長である。一実施形態では、プロペプチドは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９アミノ酸長である。
【００３８】
用語「アミノ酸置換」及びその同義語は、あるアミノ酸を別の置換アミノ酸で置換することによるアミノ酸配列の修飾を包含することを意図する。置換は保存的置換であり得る。置換はまた非保存的置換であり得る。用語「保存的」は、２つのアミノ酸を指す場合、各アミノ酸が当業者によって認識される共通の特性を共有することを意味することを意図する。例えば、疎水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、疎水性酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性非酸性側鎖を有するアミノ酸、親水性酸性側鎖を有するアミノ酸、及び親水性塩基性側鎖を有するアミノ酸である。共通の特性はまた、疎水性側鎖を有するアミノ酸、脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸、芳香族疎水性側鎖を有するアミノ酸、極性中性側鎖を有するアミノ酸、荷電側鎖を有するアミノ酸、荷電酸性側鎖を有する側鎖、及び荷電塩基性側鎖を有するアミノ酸であり得る。天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸はいずれも当技術分野で既知であり、各実施形態において置換アミノ酸として使用することができる。アミノ酸の置換方法は当業者に周知されており、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異を含むが、これに限定されない。本明細書で「１つ以上の」と記述する場合、例えば、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の個々の実施形態を包含することを意図する。
【００３９】
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドまたはプロペプチドは、これらの用語が本明細書に記載される場合、ＧＬＰ−１配列またはプロペプチド配列から最大約１０％までの変異を含み得る変異体を含む。すなわち、ＧＬＰ−１ペプチドまたはプロペプチドは、本明細書で提供される及び／または当技術分野で既知であるＧＬＰ−１またはプロペプチド配列に対して、約９０％の同一性から約９９．９％の同一性、約９５％〜約９９％の同一性、または約９７％〜約９８％の同一性を共有する。
【００４０】
本明細書で提供されるＧＬＰ−１ペプチド及びプロペプチドに加えて、これらのペプチドをコードする核酸配列を提供する。一実施形態では、本明細書に記載のＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸配列を提供する。別の実施形態で、この配列は配列番号１のＧＬＰ−１配列をコードする任意の核酸配列を含む。ＧＬＰ−１（７−３７）の野生型核酸配列は配列番号５６に示されている。ネコ科動物グルカゴンの配列は既知であり、例えばＮＣＢＩ標準配列：ＸＭ＿００６９３５３２０．１として記載されている。イヌ科動物グルカゴンの配列は既知であり、例えばＮＣＢＩ標準配列：ＮＭ＿００１００３０４４．１として記載されている。一実施形態では、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列は、本明細書に記載のＧＬＰ−１ペプチドのいずれかをコードするコドン最適化配列である。一実施形態では、コドン最適化配列は、当技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載のＧＬＰ−１核酸配列と少なくとも約６０％の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化配列は、当技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載のＧＬＰ−１核酸配列と少なくとも約７０％の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化配列は、当技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載のＧＬＰ−１核酸配列と少なくとも約８０％の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化配列は、当技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載のＧＬＰ−１核酸配列と少なくとも約９０％の同一性を共有する。一実施形態では、ＧＬＰ−１配列は、ネコ科動物での発現に合わせて最適化される。一実施形態では、ＧＬＰ−１（７−３７）の核酸配列は配列番号２に示されたものである。別の実施形態では、本明細書に記載のプロペプチド配列のいずれかをコードする核酸配列を提供する。一実施形態では、核酸配列は第ＩＸ因子プロペプチド配列をコードする。別の実施形態では、ネコ科動物の第ＩＸ因子プロペプチド配列をコードする核酸配列は、配列番号４である。
【００４１】
一実施形態では、プロペプチド及びＧＬＰ−１ペプチドは、産物が発現されると、ＧＬＰ−１ペプチドのＮ末端アミノ酸残基が、間にいかなる付加残基も含まずプロペプチドのＣ末端アミノ酸残基の直後に続くように配置される。したがって、望ましくは、プロペプチドとＧＬＰ−１ペプチド両方のコード領域が、プロペプチドとＧＬＰ−１の各コード配列の間にリンカーを含まない単一の核酸配列に組み込まれる。
【００４２】
ＧＬＰ−１ペプチド及び／またはプロペプチドの変異体または断片が望ましい場合、これらのペプチドのコード配列を、野生型核酸配列の部位特異的突然変異誘発を用いて生成することができる。その代わりにまたはそれに加えて、ウェブベースまたは市販のコンピュータープログラム、ならびにサービスベース企業を利用して、アミノ酸配列をＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡの両方を含む核酸コード配列に逆翻訳することができる。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）；Ｇｅｎｅ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（http://ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ−／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照のこと。一実施形態では、ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡコード配列は、本明細書で述べるように、最終的に投与を意図する対象種において最適に発現するように設計される。したがって、一実施形態では、コード配列は、ネコ科動物において最適に発現するように設計される。したがって、別の実施形態では、コード配列は、イヌ科動物において最適に発
現するように設計される。したがって、一実施形態では、コード配列は、ヒトにおいて最適に発現するように設計される。したがって、一実施形態では、コード配列は、霊長類において最適に発現するように設計される。別の実施形態では、コード配列は、ヒツジ、ウシ、またはブタにおいて最適に発現するように設計される。別の実施形態では、コード配列は、齧歯類において最適に発現するように設計される。
【００４３】
コーディング配列は、コドン最適化を用いて、最適に発現するように設計することができる。コドン最適化コード領域は、様々な異なる方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで入手可能な方法、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する企業を利用して行うことができる。コドン最適化方法の一つは、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１５／０１２９２４に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、産物をコードする核酸配列を同義のコドン配列で修飾する。好適には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修飾する。ただし、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみが改変されてもよい。これらの方法のうち１つを用いることにより、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を割り当て、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。
【００４４】
核酸配列に関連して、用語「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一性パーセント」は、アラインメントして対応させた場合に同じである２つの配列中の塩基を指す。配列同一性を比較する長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約１００〜１５０ヌクレオチドもしくは所望の断片にわたってもよい。しかしながら、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドといった小さい断片間の同一性が望まれる場合もある。複数の配列アライメントプログラムもまた、核酸配列に利用可能である。このようなプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、インターネット上のウェブサーバー経由でアクセス可能である。こうしたプログラムの他の供給元は当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、上記のプログラムに搭載されるものを含め、ヌクレオチド配列同一性の測定に使用できる当技術分野で既知のアルゴリズムが複数存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧバージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａ（商標）を使用して比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）では、クエリと検索配列間の最良の重複領域のアライメント及び配列同一性パーセントが得られる。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１で提供されるデフォルトのパラメーター（ワードサイズが６及びスコア行列にはＮＯＰＡＭファクター）を用いたＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。
【００４５】
アミノ酸配列に関連して、用語「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一性パーセント」は、アラインメントして対応させた場合に同じである２つの配列中の残基を指す。タンパク質の全長、ポリペプチド、約７０アミノ酸から約１００アミノ酸、もしくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、または対応する核酸配列のコード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）について、同一性パーセントを容易に決定することができる。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大約１５０アミノ酸までであり得る。一般に、２種類の配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は「アライメントされた」配列に対して決定される。「アライメントされた」配列または「アライメント」とは、標準配列と比較した塩基またはアミノ酸の欠失または付加の補正をしばしば含む、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、公開されたまたは市販されている種々の多重配列アライメントプログラムの
いずれかを使用して実施する。例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムといった配列アライメントプログラムをアミノ酸配列に使用することができる。一般に、こうしたプログラムのいずれもデフォルト設定で使用されるが、当業者は必要に応じてその設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照したアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同一性またはアライメントのレベルが同様である別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照のこと。
【００４６】
本明細書の教示に従ってプロペプチド及びＧＬＰ−１配列を種々に組み合わせることで、望ましいＧＬＰ−１発現構築物を産生することができる。これには、当技術分野で既知のプロペプチド配列と、本明細書に記載のＧＬＰ−１活性ペプチド配列との組み合わせを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、凝固因子プロペプチドの使用が望ましい。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のプロペプチド部分は高度に保存される。Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｏｌｍａｎ，Ｅｄ．，１８２７  ｐｐ．，ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６を参照のこと。
【００４８】
一実施形態では、プロペプチド配列は第ＩＸ因子配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされた第ＩＸ因子配列を含む。以下の例に示されるように、一実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物（ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）の第ＩＸ因子リーダー配列である。一実施形態では、第ＩＸ因子リーダー配列は、シグナル配列及び活性化配列（プロ配列）を含み、約４６アミノ酸長である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物をコードする核酸配列は配列番号６に記載されたものである。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号５をコードするコドン最適化配列である。ネコ科動物の第ＩＸ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ２６３４６．１にて参照できるが、便宜上、配列番号１１に転載する。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物（ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）の第ＩＸ因子リーダー配列である。イヌ科動物の第ＩＸ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＮＰ＿００１００３３２３．１にて参照できるが、便宜上、配列番号１２に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号１２のアミノ酸１−３９である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号１３をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒト第ＩＸ因子リーダー配列である。ヒト第ＩＸ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＡＡＡ９８７２６．１にて参照できるが、便宜上、配列番号１４に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号１４のアミノ酸１−４６である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号１５をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知の第ＩＸ因子の他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００４９】
別の実施形態では、プロペプチド配列は第ＶＩＩ因子配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされた第ＶＩＩ因子配列を含む。一実施形態では、第ＶＩＩ因子リーダー配列は、シグナル配列及び活性化配列（プロ配列）を含み、約３７〜４０アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物（ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）の第ＶＩＩ因子リーダー配列である。ネコ科動物の第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ  ００３９８０５８２．１にて参照できるが、便宜上、配列番号１６に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号１６のアミノ酸１−４０である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号１７をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物の第ＶＩＩ因子リーダー配列である。イヌ科動物の第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＡＢＢ０２５３１．１にて参照できるが、便宜上、配列番号１８に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号１８のアミノ酸１−４０である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号１９をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒト第ＶＩＩ因子リーダー配列である。ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＡＣＢ８７２０３．１にて参照できるが、便宜上、配列番号２０に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号２０のアミノ酸１−６０である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号２１をコードするコドン最適化配列である。３８  ａａのリーダー配列を有するヒト第ＶＩＩ因子の別の形態を変異体２と称する場合がある。この変異体２は変異体１と比較して、５’コード領域のエキソンを欠失するが、リーディングフレームは維持している。コードされたアイソフォーム（ｂ）はアイソフォーム（ａ）よりも短い。ヒト第ＶＩＩ因子、変異体２のアミノ酸配列は既知であり、例えばＮＣＢＩ標準配列：ＮＰ＿０６２５６２．１にて参照できるが、便宜上、配列番号２２に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号２２のアミノ酸１−３８である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号２３をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知の第ＶＩＩ因子の他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５０】
抗凝固因子ＩＩはまたプロトロンビンとも呼ばれる。本明細書で使用される場合、第ＩＩ因子は、プロトロンビン及びトロンビンと同義に使用される。一実施形態では、プロペプチド配列は第ＩＩ因子リーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされた第ＩＩ因子（トロンビン）配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは約４１〜４３アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物の第ＩＩ因子リーダー配列である。ネコ科動物の第ＩＩ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００３９９３２６７．１にて参照できるが、便宜上、配列番号２４に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号２４のアミノ酸１−４３である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号２５をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物の第ＩＩ因子リーダー配列である。イヌ科動物の第ＩＩ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＸＰ＿００３６３
９７４２．１にて参照できるが、便宜上、配列番号２６に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号２６のアミノ酸１−４１である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号２７をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒト第ＩＩ因子リーダー配列である。ヒト第ＩＩ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＮＰ＿０００４９７．１にて参照できるが、便宜上、配列番号２８に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号２８のアミノ酸１−４３である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号２９をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知の第ＩＩ因子の他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５１】
別の実施形態では、プロペプチド配列は第ＩＸ因子リーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされた第ＩＸ因子配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは約３９〜４６アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物の第ＩＸ因子リーダー配列である。ネコ科動物の第ＩＸ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００９３７７．１にて参照できるが、便宜上、配列番号３０に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号３０のアミノ酸１−４６である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３１をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物の第ＩＸ因子リーダー配列である。イヌ科動物の第ＩＸ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＮＰ＿００１００３３２３．１にて参照できるが、便宜上、配列番号３２に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号３２のアミノ酸１−３９である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３３をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒト第ＩＸ因子リーダー配列である。ヒト第ＩＸ因子のアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＮＰ＿０００１２４．１にて参照できるが、便宜上、配列番号３４に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号３４のアミノ酸１−４６である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３５をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知の第ＩＸ因子の他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５２】
別の実施形態では、プロペプチド配列はプロテインＳ（ビタミンＫ依存性プロテインＳとも称する）リーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされたプロテインＳ配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは約３６〜５７アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物のプロテインＳリーダー配列である。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号７のアミノ酸１−５７である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号７をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号８またはそのコドン最適化配列によってコードされる。ネコ科動物のプロテインＳのアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿０１１２８４２８９にて参照できるが、便宜上、配列番号３６に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号３６アミノ酸１−３６であ
る。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３７をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物のプロテインＳリーダー配列である。イヌ科動物のプロテインＳのアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＸＰ＿００５６３９５００．１にて参照できるが、便宜上、配列番号３８に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号３８のアミノ酸１−４１である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号３９をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒトプロテインＳリーダー配列である。ヒトプロテインＳのアミノ酸配列は既知であり、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０７２２５．１にて参照できるが、便宜上、配列番号４０に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号４０のアミノ酸１−４１である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号４１をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知のプロテインＳの他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５３】
別の実施形態では、プロペプチド配列はプロテインＺ（ビタミンＫ依存性プロテインＺとも称する）リーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされたプロテインＺ配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは約６２アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物のプロテインＺリーダー配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号１に示すＧＬＰ−１（７−３７）と組み合わされたイヌ科動物のプロテインＺリーダー配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒトプロテインＺリーダー配列である。ヒトプロテインＺのアミノ酸配列は既知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３６５０１．１にて参照できるが、便宜上、配列番号４２に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号４２のアミノ酸１−６２である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号４３に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号４３をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知のプロテインＺの他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５４】
別の実施形態では、プロペプチド配列はプロテインＣ（ビタミンＫ依存性プロテインＣとも称する）リーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされたプロテインＣ配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは約４２アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号１に示すＧＬＰ−１（７−３７）と組み合わされたネコ科動物のプロテインＣリーダー配列である。ネコ科動物のプロテインＣのアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＸＰ＿０１１２８３５０８．１にて参照できるが、便宜上、配列番号４４に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号４４のアミノ酸１−４２である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号４５をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物のプロテインＣリーダー配列である。イヌ科動物のプロテインＣのアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ０５１２６．１にて参照できるが、便宜上、配列番号４６に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号４６のアミノ酸１−４２である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構
築物は、配列番号４７をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号１に示すＧＬＰ−１（７−３７）と組み合わされたヒトプロテインＣリーダー配列である。ヒトプロテインＣのアミノ酸配列は既知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０１６６．１にて参照できるが、便宜上、配列番号４８に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号４８のアミノ酸１−４２である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号４９をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知のプロテインＣの他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５５】
別の実施形態では、プロペプチド配列はアルブミンリーダー配列である。別の実施形態では、プロペプチド配列には、フューリン部位と組み合わされたアルブミンリーダー配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは約２４アミノ酸長である。別の実施形態では、プロペプチド配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたネコ科動物のアルブミンリーダー配列である。ネコ科動物のアルブミンのアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ５９２７９．１にて参照できるが、便宜上、配列番号５０に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号５０のアミノ酸１−２４である。一実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号９をコードするコドン最適化配列である。一実施形態では、ネコ科動物アルブミンプロペプチド−ＧＬＰ−１構築物をコードする核酸配列は配列番号１０である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたイヌ科動物のアルブミンリーダー配列である。イヌ科動物のアルブミンのアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＣＡＢ６４８６７．１にて参照できるが、便宜上、配列番号５１に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号５１のアミノ酸１−２４である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号５２をコードするコドン最適化配列である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、ＧＬＰ−１（７−３７）野生型配列と組み合わされたヒトアルブミンリーダー配列である。ヒトアルブミンのアミノ酸配列は既知であり、ＮＣＢＩ標準配列：ＡＡＡ９８７９７．１にて参照できるが、便宜上、配列番号５３に転載する。一実施形態では、プロペプチド配列は、配列番号５３のアミノ酸１−２４である。別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物配列は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列をコードする。さらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１構築物は、配列番号５４をコードするコドン最適化配列である。当技術分野で既知のアルブミンの他のアイソフォームを用いて類似した構築物を作製することができる。
【００５６】
一実施形態では、例えば、宿主細胞内にパッケージングされるＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスベクターを有するナノ粒子を作製するため、及び／または対象の宿主細胞に送達するために、本明細書に記載のＧＬＰ−１構築物をコードする核酸配列を、任意の好適な遺伝子エレメント、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、エピソームなどに組み込み、それに保持されるｈＬＤＬＲ配列を宿主細胞に移入する。一実施形態では、遺伝子エレメントはプラスミドである。選択した遺伝子エレメントを、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染、及び原形質融合を含む任意の好適な方法で送達することができる。このような構築物の作製に使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、これには遺伝子工学技術、組換え工学技術、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照のこと。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、ＧＬＰ−１構築物のコード配列（例えば、プロペプチド及びＧＬＰ−１活性ペプチドのコード配列）、プロモーターを含み、場合によってそれらに対する他の調節配列を含み得る核酸分子を指し、カセットは遺伝子エレメントに組み込むこと、及び／またはウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のキャプシドにパッケージングすることができる。通常は、ウイルスベクターを生成するためのこのような発現カセットは、本明細書に記載のものなどのウイルスゲノム及び他の発現制御配列のパッケージングシグナルと隣接して、本明細書に記載のＧＬＰ−１構築物配列を含有する。本明細書に記載されるように、いずれの発現制御配列も、例えばコドン最適化を含む当技術分野で既知の技術を使用して、特定の種に合わせて最適化することができる。
【００５８】
発現カセットは通常、発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含む。一実施形態では、肝臓特異的プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が使用される。本明細書に記載のプラスミド及びベクターでは、ＣＢ７プロモーターが使用される。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβアクチンプロモーターである。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターを使用してもよい［例えば、Ｔｈｅ
Ｌｉｖｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，http://rulai.schl.edu/LSPD，アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：５１２４  ３２（１９９７），ｈｕｍＡｌｂ；及び肝炎Ｂウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２  ９（１９９６）を参照のこと］。ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、アルファ−アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンレスｓｃＡＡＶが必要）。あまり望ましくないが、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーターなどの他のプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照］、または生理的な合図に応答するプロモーターを、本明細書に記載のベクターに利用してもよい。
【００５９】
プロモーターに加えて、発現カセット及び／またはベクターには、他の適切な転写開始配列、終止配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどのＲＮＡプロセシング効率化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに必要に応じて、コード産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、及びＴＫポリＡが挙げられる。好適なエンハンサーの例としては特に、例えばアルファフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファ１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が挙げられる。
【００６０】
これらの制御配列は、ＧＬＰ−１構築物配列に機能的に連結される。本明細書で使用される場合、用語「機能的に連結される」とは、目的遺伝子と隣接する発現制御配列と、目的遺伝子を制御するためにトランスでまたは一定の距離で作用する発現制御配列の両方を指す。
【００６１】
発現カセットは、ウイルスベクターの産生に使用されるプラスミドに組み込むことができる。ＡＡＶウイルス粒子への発現カセットのパッケージングに必要な最小配列はＡＡＶの５’及び３’のＩＴＲであり、これはキャプシドと同じＡＡＶ起源であっても、（偽型ＡＡＶを産生するために）異なるＡＡＶ起源であってもよい。一実施形態では、便宜上及び規制認可の迅速化のため、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列、またはその欠失型（ΔＩＴＲ）を使
用する。ただし、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ起源由来である場合、得られたベクターを偽型と称する場合がある。通常、ＡＡＶベクター用の発現カセットには、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、プロペプチド−ＧＬＰ−１活性ペプチドのコード配列及び任意の調節配列、ならびにＡＡＶの３’ＩＴＲが含まれる。ただし、これらのエレメントの他の構成が適している場合もある。Ｄ配列と末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ：ｔｒｓ）が欠失している５’ＩＴＲの短縮型（ΔＩＴＲと称される）が記載されている。その他の実施形態では、全長のＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。例示的なプラスミドを配列表に示す。
【００６２】
配列番号５７は、ｐｎ１０４４．ＣＢ７．ＧＬＰ１ｆｅｐｒｏｔＳと称した、ネコ科動物のプロテインＳプロペプチド−ＧＬＰ１構築物をコードする例示的なプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号５７のプラスミドに組み込まれる。配列番号５８は、ｐｎ１０４４．ＣＢ７．ＧＬＰ１ｆｅＩＬ２ｆｕｒと称した、ネコ科動物のＩＬ２プロペプチド（フューリン部位を含む）−ＧＬＰ１構築物をコードするプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号５８のプラスミドに組み込まれる。配列番号５９は、ｐｎ１０４４．ＣＢ７．ＧＬＰ１ｆｅＴｈｒｏｍｂｉｎと称した、ネコ科動物のトロンビンプロペプチド−ＧＬＰ１構築物をコードするプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号５９のプラスミドに組み込まれる。配列番号６０は、ｐ１０４４．ＣＢ７．ＧＬＰ１ｆｅＭａｎＦｕｒと称した、ネコ科動物のマンノシダーゼ（フューリン部位を有する）プロペプチド−ＧＬＰ１構築物をコードするプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号６０のプラスミドに組み込まれる。配列番号６１は、ｐ１０４４ＧＬＰ１ｆｅａｌｂと称した、ネコ科動物のアルブミンプロペプチド−ＧＬＰ１構築物をコードするプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号６１のプラスミドに組み込まれる。配列番号６２は、ｐ１０４４ＧＬＰ１ｆｅａｌｂｆｕｒと称した、ネコ科動物のアルブミン（フューリン部位を有する）プロペプチド−ＧＬＰ１構築物をコードするプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号６２のプラスミドに組み込まれる。配列番号６３は、ｐ１０４４ＧＬＰ１ｆｅａｌｂｆｕｒと称した、ネコ科動物のトロンビン（フューリン部位を有する）プロペプチド−ＧＬＰ１構築物をコードするプラスミドの配列を示している。一実施形態では、発現カセットが配列番号６２のプラスミドに組み込まれる。
【００６３】
略語「ｓｃ」は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列が保持するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染時に、第２の鎖の細胞媒介性の合成を待機するのではなく、ｓｃＡＡＶの２つに分かれた相補的な部分が会合して、即座に複製及び転写できるように準備された１本の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ１６，Ｐａｇｅｓ１２４８−１２５４を参照のこと。自己相補性ＡＡＶについては、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号：及び同７，４５６，６８３号に記載されており、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶ  ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中に標的細胞に送達される核酸配列がパッケージングされている。ＡＡＶキャプシドは、６０のキャプシド（ｃａｐ）タンパク質
サブユニットから構成され、選択されたＡＡＶに応じてＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が約１：１：１０〜１：１：２０の比率で二十面体対称に配置される。ＡＡＶウイルスベクター（ＤＮａｓｅ耐性ウイルス粒子）のキャプシドの起源として、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ１０、及び既知のもしくは言及されているＡＡＶまたは未発見のＡＡＶのいずれかの変異体を含む、ＡＡＶ血清型を選択することができる。例えば、米国公開特許出願第２００７−００３６７６０−Ａ１号；米国公開特許出願第２００９−０１９７３３８−Ａ１号；ＥＰ１３１０５７１を参照のこと。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のシミアンＡＡＶ）、米国特許７７９０４４９及び米国特許７２８２１９９（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、及びＷＯ２００６／１１０６８９、及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）を参照のこと。あるいは、引用元のＡＡＶのいずれかに基づいた組換えＡＡＶを、ＡＡＶキャプシドの起源として使用することができる。これらの文献にはまた、ＡＡＶを産生する際に選択できる他のＡＡＶについて記載されており、これは参照により組み込まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターに使用されるＡＡＶ  ｃａｐは、上述のＡＡＶ  Ｃａｐまたはそれをコードする核酸いずれか１つの突然変異誘発により（すなわち、挿入、欠失、または置換により）産生することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、上記ＡＡＶキャプシドタンパク質の２つまたは３つまたは４つ以上からのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶからのＶｐ１、ＶＰ２、及びＶｐ３単量体のモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は複数の上記Ｃａｐを含む。
【００６５】
発現カセットをビリオンにパッケージングする場合、遺伝子と同じ構築物にシスで必要とされるＡＡＶ成分はＩＴＲのみである。一実施形態では、複製物（ｒｅｐ）及び／またはキャプシド（ｃａｐ）のコード配列をＡＡＶゲノムから取り出し、トランスでまたはパッケージング細胞株によって供給し、ＡＡＶベクターを生成する。例えば、上述したように、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドの起源とは異なる起源からのＩＴＲを含み得る。それに加えてまたはその代わりに、キメラＡＡＶキャプシドを利用してもよい。さらに、それ以外のＡＡＶ成分を選択してもよい。そのようなＡＡＶ配列の起源は本明細書に記載されており、学術、商用、または公共の起源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離するかまたは得ることもできる。あるいは、ＡＡＶ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などの文献またはデータベースで入手できるような公開された配列を参照することにより、合成手段によってまたは他の好適な手段によって得ることができる。
【００６６】
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許７７９０４４９；米国特許７２８２１９９；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及びＵＳ７５８８７７２  Ｂ２を参照のこと。ある系では、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物、ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）でプロデューサー細胞株を一過性トランスフェクトする。第２の系では、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物で、ｒｅｐ及びｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株を一過性トランスフェクトする。これらの各系で、ＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶを混入ウイルスから分離するのに必要とされるヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスによる感染に応答して産生される。近年、ＡＡＶの回収にヘルパーウイルスによる感染を必要としない系が開発されており、この系では、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もトランスで供給される。これら
の新しい系では、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性トランスフェクトすることによりヘルパー機能を供給することも、あるいはヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含むように細胞を操作することもでき、発現を転写レベルまたは転写後レベルで制御可能である。さらに別の系では、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルスを用いたベクターへの感染によって昆虫細胞に導入する。この産生系の概説については、一般に、例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９を参照のこと。それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの系及び他のＡＡＶ産生系の作製及び使用方法は、以下の米国特許にも記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”  Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３；及び以下に引用される文献を参照のこと。それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明のいずれの実施形態の構築に使用される方法も核酸操作の当業者に既知であり、これには遺伝子工学技術、組換え工学技術、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照のこと。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は周知であり、好適な方法の選択によって本発明が限定されるものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照のこと。
【００６７】
場合に応じて、本明細書に記載のＧＬＰ−１構築物は、ｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを介して送達されてもよい。そのような他のウイルスベクターには、遺伝子治療に使用できる、適した任意のウイルスを含み得るが、これには限定されないもののアデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルスなどが挙げられる。このような他のベクターのいずれかを生成する場合、複製欠損性ウイルスベクターとして産生することが好ましい。
【００６８】
「複製欠損性ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含む発現カセットがウイルスキャプシドまたはエンベロープにパッケージングされ、そのウイルスキャプシドまたはエンベロープ内に同様にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列が複製欠損性である、すなわち子孫ビリオンを生成できないが、標的細胞に感染する能力を保持している合成または人工ウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムを「ｇｕｔｌｅｓｓ」となるように操作することができる。すなわち人工ゲノムの増幅とパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的導入遺伝子のみを含む）が、産生時にこれらの遺伝子が供給されてもよい。したがって、複製に必要なウイルス酵素が存在する場合を除いて、子孫ビリオンによる複製及び感染が発生し得ないため、遺伝子治療に使用する際に安全である
と考えられる。
【００６９】
本明細書に記載のウイルスベクター構築物を含む組成物もまた提供する。本明細書に記載の医薬組成物は、それを必要とする対象に、任意の好適な経路によってまたは異なる経路の組み合わせによって送達するように設計される。肝臓への直接送達（場合に応じて静脈内経由、肝動脈経由、または埋め込みによる）、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路。本明細書に記載のウイルスベクターは、単一の組成物または複数の組成物として送達することができる。場合に応じて、２種類以上のＡＡＶ、すなわち複数のウイスルを送達することができる［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照のこと］。別の実施形態では、複数のウイルスに、異なる複製欠損性ウイルス（例えば、ＡＡＶとアデノウイルス）を含み得る。
【００７０】
複製欠損性ウイルスは、遺伝子導入及び遺伝子治療の用途に使用される生理学的に許容される担体と共に製剤化することができる。ＡＡＶウイルスベクターの場合、製剤に含有される用量の指標としてゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化を用いることができる。当技術分野で既知である任意の方法を使用して、本発明の複製欠損性ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶのＧＣ数の滴定を実施するための一方法は、以下の通りである：精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮａｓｅで処理して、産生工程からの非キャプシド化ＡＡＶゲノムＤＮＡまたは混入プラスミドＤＮＡを除去する。次いでＤＮａｓｅ耐性粒子に熱処理を施し、キャプシドからゲノムを放出させる。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域（通常ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって定量する。
【００７１】
また、複製欠損性ウイルス組成物は、約１．０ｘ１０9ＧＣ〜約１．０ｘ１０15ＧＣの範囲内の量の複製欠損性ウイルスを含有する投与量単位で製剤化することができる。別の実施形態では、この量のウイルスゲノムを分割用量で送達してもよい。一実施形態では、投与量は、約５ｋｇの平均的なネコ科動物または小型イヌ科対象の場合で約１．０ｘ１０11ＧＣ〜約１．０ｘ１０12ＧＣである。一実施形態では、投与量は、約２０ｋｇの平均的な中型イヌ科対象の場合で約１．０ｘ１０12ＧＣ〜約１．０ｘ１０13ＧＣである。平均的なイヌ科動物の体重は約５〜約５０ｋｇの範囲である。一実施形態では、投与量は、約７０ｋｇの平均的なヒト対象の場合で約１．０ｘ１０12ＧＣ〜約１．０ｘ１０13ＧＣである。平均的なヒト対象の体重は約５５〜約８０ｋｇの範囲である。一実施形態では、投与量は、ある対象に対して約１．０ｘ１０11ＧＣ〜約１．０ｘ１０13ＧＣである。別の実施形態では、用量は３ｘ１０12ＧＣである。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１ｘ１０11ＧＣ、約５ｘ１０11ＧＣ、約１ｘ１０12ＧＣ、約５ｘ１０12ＧＣ、または約１ｘ１０13ＧＣであり得る。別の例では、構築物は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｍＬの量で送達され得る。一実施形態では、構築物は、獣医学的対象に対して約１μＬ〜約１００ｍＬの容積で送達され得る。例えば、種々の獣医学対象の動物への物質の投与に適した実施方法に関する考察については、Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５−２３（２００１）を参照のこと。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、用語「投与量」は、治療の過程で対象に送達される総投与量、または（複数回のうちの）単回投与で送達される量を指すことがある。
【００７２】
上記の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達することができる。ｒＡＡＶ、好ましくは生理学的に適合性のある担体中に懸濁されたものを、ネコ、イヌ、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物対象を含むがこれに限定されない目的の対象に投与することができる。好適な担体は、移入ウイルスが標的とする適応症を考慮して、当業者が容
易に選択することができる。例えば、ある好適な担体として生理食塩水が挙げられ、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と処方することができる。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択によって本発明が限定されるものではない。
【００７３】
場合に応じて、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び／または変異体ならびに担体（複数可）に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有してもよい。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【００７４】
一実施形態では、それぞれが本明細書に記載の１つ以上のＧＬＰ−１構築物を含む１つ以上のウイルスベクターを含む組成物を提供する。例えば、一実施形態では、組成物は、プロペプチド−ＧＬＰ−１−（７−３７）構築物をコードするＡＡＶベクターを含む。同じ組成物には、プロペプチド及びＧＬＰ−１−（７−３６）ＮＨ2構築物をコードするＡＡＶベクターも含まれる。ＡＡＶベクターキャプシドの起源は、組成物に含まれる各構築物において同じであっても異なっていてもよい。
【００７５】
本明細書に記載のウイルスベクター及び他の構築物は、ＧＬＰ−１構築物を、それを必要とする対象に送達し、半減期が延長されたＧＬＰ−１を対象に供給するため、及び／または対象における２型糖尿病またはメタボリックシンドロームを治療するための医薬品の調製に使用することができる。したがって、別の態様では、糖尿病の治療方法を提供する。この方法には、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載のプロペプチド−ＧＬＰ−１発現カセットを含むウイルスベクターを含む。一実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象はネコ科動物またはイヌ科動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。
【００７６】
別の実施形態では、ネコ科動物においてＴ２ＤＭを治療するための方法を提供する。この方法には、ネコ科動物の第ＩＸ因子プロペプチド及びＧＬＰ−１の活性部分をコードする配列を含む核酸分子を含み、発現されると、ＧＬＰ−１のＮ末端アミノ酸がプロペプチドのＣ末端アミノ酸の直後に続くウイルスベクターを投与することを含む。
【００７７】
別の態様では、メタボリックシンドロームの治療方法を提供する。この方法には、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載のプロペプチド−ＧＬＰ−１発現カセットを含むウイルスベクターを含む。一実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象はネコ科動物またはイヌ科動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。
【００７８】
別の態様では、対象の体重を減少させる方法を提供する。この方法には、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載のプロペプチド−ＧＬＰ−１発現カセットを含むウイルスベクターを含む。一実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象はネコ科動物またはイヌ科動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。
【００７９】
治療の過程には、場合に応じて、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ８とＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を伴う場合がある。さらに、本明細書に記載のウイルスベクターを用いたそれ以外の組み合わせ
を選択することができる。場合に応じて、本明細書に記載の組成物を、他の糖尿病薬またはタンパク質による療法（例えば、ＧＬＰ−１類似体、インスリン、経口抗高血糖薬（スルホニル尿素、ビグアニド、チアゾリジンジオン、及びアルファ−グルコシダーゼ阻害剤）を含む）に関わるレジメンに組み込んでもよい。場合に応じて、本明細書に記載の組成物を、食餌計画及び運動計画を含む生活様式の変化に関わるレジメンに組み込んでもよい。
【００８０】
用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を指すものと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書で同義に使用される。
【００８１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語及びその変化形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態が、「含む」という語を用いて示されるが、他の状況下では、関連する実施形態が、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語を用いて解釈及び記載されることも意図される。
【００８２】
明細書で使用される場合、用語「約」は特に明記しない限り、所与の基準からの１０％の変動を意味する。
【００８３】
用語「調節」またはその変化形は、本明細書で使用される場合、組成物が生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する能力を指す。
【００８４】
「対象」は哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、またはサル、チンパンジー、ヒヒもしくはゴリラなどのヒト以外の霊長類である。本明細書で使用される場合、用語「対象」は「患者」と同義に使用される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「病態」は、対象の異常な状態を示す際に同義に使用される。
【００８６】
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本出願で使用される多数の用語に関する一般的な解説を当業者に示す公的テキストの参照事項によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００８７】
以下の実施例は単に例示的なものであり、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８８】
実施例１−ＧＬＰ−１ベクターの構築
既知の切断部位を有するプロペプチドを含む複数の分泌タンパク質を選択した。これには、凝固因子（第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ）及び肝臓によって産生される他のタンパク質（アルブミン）が含まれる。プロペプチド配列をＧＬＰ−１（７−３７）アミノ酸配列の上流に配置した。ＧＬＰ−１（７−３７）の前にインターロイキン−２シグナルペプチドのみを含む対照配列も設計した。得られたタンパク質配列を逆翻訳し、コドンを最適化した後、コザックコンセンサス配列、終止コドン、及びクローニング部位を付加した。この配列をＧｅｎｅＡｒｔによって産生させ、ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリ−βアクチンプロモーターを含有する発現ベクター（ｐ１０４４）にクローニングした。発現構築物は、ＡＡＶ２  ＩＴＲに隣接している。ネコ科動物のＦＩＸ＿ＧＬＰ１アミノ酸配列を配列番号５に示す。ネコ科動物の
ＰｒｏｔＳ＿ＧＬＰ１アミノ酸配列を配列番号７に示す。ネコ科動物のＡｌｂ＿ＧＬＰ１アミノ酸配列を配列番号９に示す。ネコ科動物のＦＶＩＩ＿ＧＬＰ１アミノ酸配列を配列番号１７に示す。ネコ科動物のＦＩＩ＿ＧＬＰ１アミノ酸配列を配列番号２５に示す。ネコ科動物のＰｒｏｔＣ＿ＧＬＰ１アミノ酸配列を配列番号４５に示す。
【００８９】
実施例２−ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＧＬＰ−１配列の上流にＩＬ−２シグナルペプチドまたはネコ科動物の第ＩＸ因子プロペプチドのみを含む構築物の精製プラスミドを、製造業者の指示に従って、リポフェクタミン２０００を用いて９０％コンフルエントなＨＥＫ２９３細胞の６ウェルプレートのウェルに３連でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に上清を採取し、高感度のＮ末端ＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて活性ＧＬＰ−１を測定した。２つの構築物の発現を図１に示す。図１は、ＩＬ−２対照におけるＧＬＰ−１の発現が本質的にゼロであったが、第ＩＸ因子構築物の発現は約６０ｐＭであることを示す。
【００９０】
実施例３−ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＬＰ−１の発現
ネコ科動物の第ＩＸ因子プロペプチドを含む構築物を、上述したように、３連のトランスフェクション及びイオジキサノール勾配精製によりＡＡＶ血清型８ベクターにパッケージングした。ＲＡＧ−／−マウス（ｎ＝４）マウスを、５０マイクロリットルＰＢＳ中のベクター（１０12ＧＣ／ｋｇ）の静脈内注射により処置した。内部対照の役割を果たす１匹の動物（マウスＤ）では、静脈路確保を達成できなかった。５マイクロリットルのＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を入れた血清分離管中で全血を分離することにより血清を連続的に採取し、上記の活性ＧＬＰ−１についてアッセイした。血清の活性ＧＬＰ−１濃度を図２に示す。図２は、対照マウスにおける活性ＧＬＰ−１のレベルが２ｐＭ未満であることを示す。対照的に、ＡＡＶ８．ＣＢ．ｆＦＩＸ＿ＧＬＰ１を注射した３匹のマウスでは、開始時に１ｐＭ未満であったＧＬＰ−１濃度が１４日目にスパイクし（マウスＣでは約１０ｐＭまで）、２１日目に減少した後、４２日目に上昇に転じた。ＧＬＰ−１は人工構築物中で送達されるが、プロペプチドの切断後、図２に示すようにペプチドは活性である。肝臓（図２）に加えて、筋肉におけるプロペプチドのプロセシングを特性決定した（データは示さず）。過剰発現した場合でもプロセシングは有効である。
【００９１】
実施例４−ＧＬＰ−１構築物による糖尿病のｉｎ  ｖｉｖｏ治療
６〜７週齢の糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスを、５０マイクロリットルＰＢＳ中の第ＩＸ因子プロペプチドベクター（３ｘ１０12ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝５）の静脈内注射により処置した。同齢の未処置ｄｂ／ｄｂマウス（ｎ＝５）及び未処置ｄｂ＋／−マウス（ｎ＝５）（ＷＴ）を対照として用いた。血清グルコースを、プレートによるグルコースアッセイ（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて毎週測定した。血清グルコースデータを図３に示す。図３は、ＡＡＶ８．ＣＢ．ｆＦＩＸ＿ＧＬＰ１で処置した糖尿病マウスの血清グルコースレベルが、治療後、未処置の同齢の糖尿病（Ｄｂ）マウスよりも一貫して低いことを示している。
【００９２】
実施例５−種々の構築物のｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＬＰ−１発現
この試験は、ＡＡＶ媒介性ＧＬＰ−１発現の可能性のある臨床候補を分析するために考案された。我々は以前に第ＩＸ因子フューリンプロペプチドがマウスにおいてＮ末端切断ｇｌｐ１（活性ｇｌｐ−１）を発現できることを見出した。さらに我々は、改善が見込まれる構築物を評価するために、Ｂｌａｃｋ  ６野生型マウスにおいて様々な他の構築物を試みた。コホートは、合計５ｘ１０10の対応するベクターをＩＶ投与した、それぞれ４匹のマウスであった。別の凝固因子であるトロンビンフューリンプロペチドは、Ｂｌａｃｋ
６において第ＩＸ因子及びマンノシダーゼフューリン構築物よりも活性なＧＬＰ−１を産生した。図７。
【００９３】
実施例６−ネコのｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＬＰ−１治療
単回投与の非盲検パイロット試験を６匹の受診者所有の動物で行う。組み入れ基準は以下の通りである。
【００９４】
１．少なくとも２回の連続測定で血糖値が２００ｍｇ／ｄＬを超える
【００９５】
２．フルクトサミンが実験室基準範囲を超える
【００９６】
３．対象がインスリン治療候補ではない（所有者が治療を提供できないため、または他の禁忌による）
【００９７】
４．所有者が試験プロトコールの遵守に協力的である
【００９８】
除外基準は以下の通りである。
【００９９】
１．高血糖が、投薬、先端巨大症などに付随するものであると考えられる
【０１００】
２．現在、インスリンまたは経口血糖降下剤を使用している
【０１０１】
３．拘束及び静脈穿刺を適用できない
【０１０２】
４．研究者の判断で、対象にさらなるリスクを呈するか、治験薬の評価を妨げると思われる何らかの条件
【０１０３】
０日目に１０13ＧＣのＡＡＶ８．ＣＢ７．ｔｈｒＧＬＰ１を対象動物に投与する。ＣＢＣ／ｃｈｅｍ、フルクトサミン、グルコース曲線、及び血清ＧＬＰ−１を、０、１４、２８、４２、６０、９０、１２０、１５０、１８０日目にスクリーニングする。
【０１０４】
実施例７−健常なネコにおけるキャプシド及び用量の比較
健常なネコに、以下に記載のベクター発現ＧＬＰ１を与え、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｃｔｉｖｅ  ＧＬＰ１アッセイによってｄ９０まで週単位で評価した。アッセイ分析のための血液を、ＧＬＰ１保存用のＤＰＰＩＶ阻害剤入り血漿チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐ７００血漿チューブ）に回収した。ＣＢＣ及び生化学検査を、０日目、１４日目、２８日目、４２日目、６０日目、及び９０日目に行った。９０日後、動物を犠牲死させた。
【０１０５】
最初のコホートのネコに、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄｐｃｒ）で測定した７ｘ１０12ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ８．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＬＰ１ｔｈｒｏｍｂｉｎ．ｒＢＧを与えた。１匹のネコに、７ｘ１０12ｇｃ／ｋｇ（ｄｄｐｃｒ）のＡＡＶ３ｂ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＬＰ１ｔｈｒｏｍｂｉｎ．ｒＢＧを与えた。２匹のネコに、２ｘ１０12ｇｃ／ｋｇ（ｄｄｐｃｒ）のＡＡＶ８．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＬＰ１ｔｈｒｏｍｂｉｎ．ｒＢＧを与えた。ｇｌｐ１活性の差を図８に示す。
【０１０６】
本明細書に引用されたすべての刊行物ならびに米国仮特許出願第６２／２０１，８０３号及び同第６２／３５６，２８９号は、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、本明細書に参照され、添付の配列表に表示される配列番号は、参照により組み込まれる。本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく変更を行い得ることが理解されるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【図１】
2018523477.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2018523477000001.app
【国際調査報告】
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