(57)【要約】  フィトスフィンゴシンやスフィンガニン等の目的物質の製造法を提供する。LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変された、目的物質を生産する能力を有する酵母を培地で培養し、前記酵母の菌体および／または前記培地から目的物質を回収することにより、目的物質を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質の製造方法であって、
目的物質を生産する能力を有する酵母を培地で培養すること、および
前記酵母の菌体および／または前記培地から目的物質を回収すること、
を含み、
前記酵母が、LCB4遺伝子およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されており、
前記目的物質が、フィトスフィンゴシン（PHS）およびスフィンガニン（DHS）からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記タンパク質の活性が、LCB4遺伝子および／またはCKA2遺伝子の発現を弱化させることにより、またはLCB4遺伝子および／またはCKA2遺伝子を破壊することにより、低下した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質の活性が、LCB4遺伝子およびCKA2遺伝子の欠失により、低下した、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記LCB4遺伝子にコードされるタンパク質が、下記（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、スフィンゴイド塩基キナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、スフィンゴイド塩基キナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
前記CKA2遺伝子にコードされるタンパク質が、下記（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、カゼインキナーゼ２活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、カゼインキナーゼ２活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記酵母が、さらに、LCB5、ELO3、ORM2、およびCHA1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を弱化させることにより、または該タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、低下した、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の欠失により、低下した、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母が、さらに、LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が増大するように改変されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大した、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めることにより、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、増大した、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィトスフィンゴシンが、C16 PHS、C18 PHS、C20 PHS、C18:1 PHS、C20:1 PHS、４−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−６−テトラデカニル−１，３−オキサジナン−５−オール、および４−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−６−ヘキサデカニル−１，３−オキサジナン−５−オールからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が、目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および／または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記添加剤が、シクロデキストリンおよびゼオライトからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵母が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母が、非改変株よりも多い量の前記目的物質を培地中および／または菌体内に生成し蓄積することができる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母を用いたフィトスフィンゴシン（PHS）やスフィンガニン（DHS）等の目的物質の製造法に関する。PHSやDHSは、医薬品や化粧品等の成分として産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
生物工学的手法によりスフィンゴイド塩基やスフィンゴ脂質を製造する試みがなされている。生物工学的手法によりスフィンゴイド塩基やスフィンゴ脂質を製造する方法としては、酵母を用いる方法が報告されている（特開2014-529400）。
【０００３】
LCB4遺伝子は、主要なスフィンゴイド塩基キナーゼをコードする。LCB4遺伝子は、スフィンゴイド塩基からのセラミドの合成に対する主要制御因子であると報告されている（J Biol Chem. 2003 Feb 28;278(9):7325-34.）。CKA2遺伝子は、カゼインキナーゼ２のアルファダッシュサブユニットをコードする。CKA2遺伝子は、セラミドシンターゼの完全な活性化のために要求されると報告されている（Eukaryot Cell. 2003 Apr;2(2):284-94.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、酵母によるフィトスフィンゴシン（PHS）やスフィンガニン（DHS）等の目的物質の生産を向上させる新規な技術を開発し、効率的な目的物質の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように酵母を改変することにより、酵母のフィトスフィンゴシン（PHS）やスフィンガニン（DHS）等の目的物質の生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、例えば、以下の通り例示できる。
［１］
目的物質の製造方法であって、
目的物質を生産する能力を有する酵母を培地で培養すること、および
前記酵母の菌体および／または前記培地から目的物質を回収すること、
を含み、
前記酵母が、LCB4遺伝子およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されており、
前記目的物質が、フィトスフィンゴシン（PHS）およびスフィンガニン（DHS）からなる群より選択される、方法。
［２］
前記タンパク質の活性が、LCB4遺伝子および／またはCKA2遺伝子の発現を弱化させることにより、またはLCB4遺伝子および／またはCKA2遺伝子を破壊することにより、低下した、前記方法。
［３］
前記タンパク質の活性が、LCB4遺伝子およびCKA2遺伝子の欠失により、低下した、前記方法。
［４］
前記LCB4遺伝子にコードされるタンパク質が、下記（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に記
載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、スフィンゴイド塩基キナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、スフィンゴイド塩基キナーゼ活性を有するタンパク質。
［５］
前記CKA2遺伝子にコードされるタンパク質が、下記（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、カゼインキナーゼ２活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、カゼインキナーゼ２活性を有するタンパク質。
［６］
前記酵母が、さらに、LCB5、ELO3、ORM2、およびCHA1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されている、前記方法。
［７］
前記１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を弱化させることにより、または該タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、低下した、前記方法。
［８］
前記１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の欠失により、低下した、前記方法。
［９］
前記酵母が、さらに、LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が増大するように改変されている、前記方法。
［１０］
前記１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大した、前記方法。
［１１］
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めることにより、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、増大した、前記方法。
［１２］
前記フィトスフィンゴシンが、C16 PHS、C18 PHS、C20 PHS、C18:1 PHS、C20:1 PHS、４−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−６−テトラデカニル−１，３−オキサジナン−５−オール、および４−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−６−ヘキサデカニル−１，３−オキサジナン−５−オールからなる群より選択される、前記方法。
［１３］
前記培地が、目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および／または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する、前記方法。
［１４］
前記添加剤が、シクロデキストリンおよびゼオライトからなる群より選択される、前記方法。
［１５］
前記酵母が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する、前記方法。
［１６］
前記酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、前記方法。
［１７］
前記酵母が、非改変株よりも多い量の前記目的物質を培地中および／または菌体内に生成し蓄積することができる、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】小スケール培養におけるPHS生産に関するデータを示す図。PHS：スフィンゴ脂質経路遺伝子LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2
【図２】EVST20240株を用いたバイオリアクタ発酵に関するデータを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明の方法は、目的物質の製造方法であって、目的物質を生産する能力を有する酵母を培地で培養すること、および前記酵母の菌体および／または前記培地から目的物質を回収することを含み、前記酵母が、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されている方法である。本発明の方法に用いられる酵母を、「本発明の酵母」ともいう。
【００１０】
＜１＞本発明の酵母
本発明の酵母は、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変された、目的物質を生産する能力を有する酵母である。「目的物質を生産する能力」を、「目的物質生産能」ともいう。
【００１１】
＜１−１＞目的物質生産能を有する酵母
本発明において、「目的物質生産能を有する酵母」とは、培地で培養したときに、目的物質を生成し、回収できる程度に培地中および／または菌体内に蓄積することができる酵母をいう。培地は、本発明の方法で用いることができる培地であってよく、特に、目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および／または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有する培地であってよい。目的物質生産能を有する酵母は、非改変株よりも多い量の目的物質を培地中および／または菌体内に蓄積することができる酵母であってよい。「非改変株」とは、目的物質生産能が付与または増強されるように改変されていない対照株であってよく、特に、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されていない対照株であってよい。すなわち、非改変株としては、野生株や親株、例えば、Saccharomyces cerevisiae BY4742株（ATCC 201389; EUROSCARF Y10000）、S288C株（ATCC 26108）、NCYC 3608株が挙げられる。また、目的物質生産能を有する酵母は、好ましくは5 mg/L以上、より好ましくは10 mg/L以上の量の目的物質を培地に蓄積することができる酵母であってもよい。
【００１２】
本発明において、目的物質は、フィトスフィンゴシン（PHS）およびスフィンガニン（DHS）からなる群より選択される。
【００１３】
フィトスフィンゴシン（PHS）およびスフィンガニン（DHS）は、いずれも、長鎖アルキル鎖を有し、該長鎖アルキル鎖が、アミノ基をC2位に有し、さらに複数のヒドロキシル基を有する。目的物質を構成するアルキル鎖の長さや不飽和度は、可変である。アルキル鎖の長さは、例えば、C16、C18、またはC20であってよい。アルキル鎖は、１つまたはそれ以上の不飽和二重結合を有していてよい。すなわち、目的物質としては、フィトスフィンゴシン（PHS）およびスフィンガニン（DHS）の、長さおよび／または不飽和度が異なる上
記のようなバリアント種も挙げられる。「フィトスフィンゴシン（PHS）」とは、PHSの典型種であるC18 PHSを意味してもよく、PHSの上記のようなバリアント種、例えば、飽和C16アルキル鎖を有するC16 PHS、飽和C18アルキル鎖を有するC18 PHS、飽和C20アルキル鎖を有するC20 PHS、不飽和二重結合を１つ含むC18アルキル鎖を有するC18:1 PHS、不飽和二重結合を１つ含むC20アルキル鎖を有するC20:1 PHS、を総称してもよい。「フィトスフィンゴシン（PHS）」には、PHSの付加体、例えば、４−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−６−テトラデカニル−１，３−オキサジナン−５−オール（4-(hydroxymethyl)-2-methyl-6-tetradecanyl-1,3-oxazinan-5-ol）や４−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−６−ヘキサデカニル−１，３−オキサジナン−５−オール（4-(hydroxymethyl)-2-methyl-6-hexadecanyl-1,3-oxazinan-5-ol）（これらはそれぞれC18 PHSおよびC20 PHSとアセトアルデヒドとの反応により生じ得る）、も包含されてよい。同様に、「スフィンガニン（DHS）」とは、DHSの典型種であり飽和C18アルキル鎖を有するC18 DHSを意味してもよく、DHSの上記のようなバリアント種を総称してもよい。
【００１４】
製造される目的物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、本発明において、「目的物質」という用語は、フリー体の目的物質、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩等の無機酸の塩や、乳酸塩、グリコール酸塩等の有機酸の塩が挙げられる（Acta Derm Venereol. 2002;82(3):170-3.）。目的物質の塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を用いてもよい。
【００１５】
酵母は、本発明の方法に用いることができるものであれば特に制限されない。酵母は出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。酵母は、一倍体の酵母であってもよく、二倍体またはそれ以上の倍数性の酵母であってもよい。
【００１６】
酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属、ピチア・シフェリイ（Pichia ciferrii）、ピチア・シドウィオラム（Pichia sydowiorum）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属（ウィッカーハモマイセス（Wickerhamomyces）属ともいう）、キャンディダ・ユティリス（Candida
utilis）等のキャンディダ属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。Pichia属のいくつかの種は、Wickerhamomyces属（Int J Syst Evol Microbiol. 2014 Mar;64(Pt 3):1057-61）に再分類されている。よって、例えば、Pichia ciferriiおよびPichia sydowiorumは、それぞれ、Wickerhamomyces ciferriiおよびWickerhamomyces sydowiorumとも呼ばれる。本発明において、「Pichia」には、かつてPichia属に分類されていた種であって、Wickerhamomyces等の他の属に再分類されたものも包含されるものとする。
【００１７】
Saccharomyces cerevisiaeとして、具体的には、BY4742株（ATCC 201389; EUROSCARF Y10000）、S288C株（ATCC 26108）、Y006株（FERM BP-11299）、NCYC 3608株、およびそれらの派生株が挙げられる。Pichia ciferrii（Wickerhamomyces ciferrii）として、具体的には、NRRL Y-1031株（ATCC 14091）、CS.PCΔPro2株（Schorsch et al., 2009, Curr Genet. 55, 381-9.）、WO95/12683に開示された株、およびそれらの派生株が挙げられる。Pichia sydowiorum（Wickerhamomyces sydowiorum）として、具体的には、NRRL Y-7130株（ATCC 58369）やその派生株が挙げられる。
【００１８】
これらの菌株は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC, Address: 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）、EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional Analysis（EUROSCARF, Address: Institute for Molecular Biosciences, Johann Wo
lfgang Goethe-University Frankfurt, Max-von-Laue Str. 9; Building N250, D-60438 Frankfurt, Germany）、National Collection of Yeast Cultures（NCYC, Address: Institute of Food Research, Norwich Research Park, Norwich, NR4 7UA, UK）、または各寄託株に対応する寄託機関から入手することができる。すなわち、例えば、ATCC株の場合、各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して注文することができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、American Type Culture Collectionのカタログに記載されている。
【００１９】
本発明の酵母は、本来的に目的物質生産能を有するものであってもよく、目的物質生産能を有するように改変されたものであってもよい。目的物質生産能を有する酵母は、上記のような酵母に目的物質生産能を付与することにより、または、上記のような酵母の目的物質生産能を増強することにより、取得できる。
【００２０】
以下、目的物質生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。目的物質生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。本発明の酵母を構築するための改変は、任意の順番で実施されてよい。
【００２１】
目的物質生産能は、目的物質の生産に関与する１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が増大または低下するように酵母を改変することにより、付与または増強することができる。すなわち、本発明の酵母は、目的物質の生産に関与する１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が増大または低下するように改変されていてよい。「タンパク質」には、ポリペプチド等の、いわゆるペプチドも包含される。目的物質の生産に関与するタンパク質としては、目的物質の合成を触媒する酵素（以下、「目的物質の生合成酵素」ともいう）、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素（以下、「副生物の生合成酵素」ともいう）、目的物質の分解を触媒する酵素（以下、「目的物質の分解酵素」ともいう）、およびそのような酵素の活性に影響する（例えば増大または低下させる）タンパク質が挙げられる。
【００２２】
発現および／または活性を増大または低下させるタンパク質は、目的物質の種類や、目的物質の生産に関与するタンパク質および本発明の酵母が本来的に有するタンパク質の種類や活性に応じて適宜選択することができる。例えば、好ましくは、目的物質の生合成酵素から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性を増大させてよい。また、好ましくは、副生物の生合成酵素および目的物質の分解酵素から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性を低下させてよい。
【００２３】
タンパク質の発現および／または活性を増大または低下させる詳しい方法については後述する。タンパク質の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大させることができる。タンパク質の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を弱化させることにより、または同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、低下させることができる。遺伝子の発現を、「タンパク質の発現（すなわち、同遺伝子にコードされるタンパク質の発現）」ともいう。このようなタンパク質の発現および／または活性を増大または低下させる方法は、本技術分野においてよく知られている。
【００２４】
目的物質の生産に関与するタンパク質として、具体的には、LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、およびCHA1遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。これらの遺伝子を総称して「標的遺伝子」ともいい、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質を総称して「標的タンパク質」ともいう。
【００２５】
本発明の酵母は、少なくとも、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されている。「LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、LCB4遺伝子および／またはCKA2遺伝子の発現が弱化することを意味してもよく、LCB4遺伝子および／またはCKA2遺伝子が破壊されることを意味してもよい。LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性の低下により、目的物質生産能が増大する、すなわち、目的物質の生産が増大する。本発明の酵母は、目的物質生産能を有する酵母を、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変することにより取得できる。また、本発明の酵母は、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように酵母を改変した後に、目的物質生産能を付与または増強することによっても取得できる。なお、本発明の酵母は、LCB4およびCKA2遺伝子にコードされるタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されたことにより、目的物質生産能を獲得したものであってもよい。
【００２６】
本発明の酵母は、さらに、LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が増大するように改変されていてもよく、且つ／又は、LCB5、ELO3、ORM2、およびCHA1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の発現および／または活性が低下するように改変されていてもよい。「LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増大することを意味してよい。「LCB5、ELO3、ORM2、およびCHA1遺伝子にコードされるタンパク質から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、LCB5、ELO3、ORM2、およびCHA1遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子の発現が弱化することを意味してもよく、LCB5、ELO3、ORM2、およびCHA1遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子が破壊されることを意味してもよい。
【００２７】
LCB1およびLCB2遺伝子は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（serine palmitoyltransferase）をコードする。「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ」とは、セリンおよびパルミトイル-CoAからの３−ケトスフィンガニンの合成を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 2.3.1.50）。同活性を、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性」ともいう。LCB1およびLCB2遺伝子にコードされるタンパク質を、それぞれ、「Lcb1p」および「Lcb2p」ともいう。LCB1およびLCB2遺伝子としては、S. cerevisiaeやPichia ciferrii等の酵母のものが挙げられる。S. cerevisiae S288CのLCB1およびLCB2遺伝子の塩基配列を配列番号1および3に、同遺伝子にコードされるLcb1pおよびLcb2pのアミノ酸配列を配列番号2および4に示す。Lcb1pおよびLcb2pは、ヘテロダイマーを形成してセリンパルミトイルトランスフェラーゼとして機能してもよい（Plant Cell. 2006 Dec;18(12):3576-93.）。Lcb1pおよびLcb2pの一方または両方の活性は、増大させてよい。Lcb1pおよびLcb2pの一方または両方の活性の増大は、具体的には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性の増大を意味してよい。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性は、例えば、公知の方法（J Biol Chem. 2000 Mar 17;275(11):7597-603.）により測定することができる。
【００２８】
TSC10遺伝子は、３−デヒドロスフィンガニンレダクターゼ（3-dehydrosphinganine reductase）をコードする。「３−デヒドロスフィンガニンレダクターゼ」とは、NADPH等の電子供与体の存在下で３−ケトスフィンガニンのジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）への変換を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 1.1.1.102）。同活性を、「３−デヒドロスフィンガニンレダクターゼ活性」ともいう。TSC10遺伝子にコードされるタンパク質を、「Tsc10p」ともいう。TSC10遺伝子としては、S. cerevisiaeやPichia cif
errii等の酵母のものが挙げられる。S. cerevisiae S288CのTSC10遺伝子の塩基配列を配列番号5に、同遺伝子にコードされるTsc10pのアミノ酸配列を配列番号6に示す。Tsc10pの活性は、増大させてよい。Tsc10pの活性の増大は、具体的には、３−デヒドロスフィンガニンレダクターゼ活性の増大を意味してよい。３−デヒドロスフィンガニンレダクターゼ活性は、例えば、公知の方法（Biochim Biophys Acta. 2006 Jan;1761(1):52-63.）により測定することができる。
【００２９】
SUR2（SYR2）遺伝子は、スフィンゴシンヒドロキシラーゼ（sphingosine hydroxylase）をコードする。「スフィンゴシンヒドロキシラーゼ」とは、スフィンゴイド塩基のヒドロキシル化またはセラミドのスフィンゴイド塩基部位のヒドロキシル化を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 1.-.-.-）。同活性を、「スフィンゴシンヒドロキシラーゼ活性」ともいう。スフィンゴシンヒドロキシラーゼは、例えば、ジヒドロスフィンゴシン（DHS；スフィンガニン）のヒドロキシル化によるフィトスフィンゴシン（PHS）の形成、DHSを含むセラミド（ジヒドロセラミド）のヒドロキシル化によるPHSを含むセラミド（フィトセラミド）の形成を触媒してよい。SUR2遺伝子にコードされるタンパク質を、「Sur2p」ともいう。SUR2遺伝子としては、S. cerevisiaeやPichia ciferrii等の酵母のものが挙げられる。S. cerevisiae S288CのSUR2遺伝子の塩基配列を配列番号7に、同遺伝子にコードされるSur2pのアミノ酸配列を配列番号8に示す。Pichia ciferriiのSUR2遺伝子の塩基配列を配列番号21に、同遺伝子にコードされるSur2pのアミノ酸配列を配列番号22に示す。Sur2pの活性は、例えば、PHSを製造する場合に増大させてよい。Sur2pの活性の増大は、具体的には、スフィンゴシンヒドロキシラーゼ活性の増大を意味してよい。スフィンゴシンヒドロキシラーゼ活性は、例えば、酵素をDHSまたはジヒドロセラミドとインキュベートし、酵素依存的なPHSまたはフィトセラミドの生成を測定することにより、測定することができる。
【００３０】
LCB4およびLCB5遺伝子は、スフィンゴイド塩基キナーゼ（sphingoid base kinase）をコードする。「スフィンゴイド塩基キナーゼ」とは、スフィンゴイド塩基のリン酸化によるスフィンゴイド塩基リン酸（sphingoid base phosphate）の形成を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 2.7.1.91）。同活性を、「スフィンゴイド塩基キナーゼ活性」ともいう。LCB4およびLCB5遺伝子にコードされるタンパク質を、それぞれ、「Lcb4p」および「Lcb5p」ともいう。S. cerevisiae S288CのLCB4およびLCB5遺伝子の塩基配列を配列番号9および11に、同遺伝子にコードされるLcb4pおよびLcb5pのアミノ酸配列を配列番号10および12に示す。これらのうち、Lcb4pが、S. cerevisiaeにおける主要なスフィンゴイド塩基キナーゼである（J Biol Chem. 2003 Feb 28;278(9):7325-34.）。少なくともLcb4pの活性を低下させる。また、Lcb5pの活性も低下させてよい。Lcb4pおよびLcb5pの一方または両方の活性の低下は、具体的には、スフィンゴイド塩基キナーゼ活性の低下を意味してよい。スフィンゴイド塩基キナーゼ活性は、例えば、公知の方法（Plant Physiol. 2005 Feb;137(2):724-37.）により測定することができる。
【００３１】
ELO3遺伝子は、脂肪酸エロンガーゼIIIをコードする。「脂肪酸エロンガーゼIII」とは、C18-CoAの伸長によるC20-CoA〜C26-CoAの形成を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 2.3.1.199）。同活性を、「脂肪酸エロンガーゼIII活性」ともいう。C26-CoAは、好ましくは、セラミドシンターゼによって触媒されるセラミドの合成に用いられてよい。ELO3遺伝子にコードされるタンパク質を、「Elo3p」ともいう。S. cerevisiae S288CのELO3遺伝子の塩基配列を配列番号13に、同遺伝子にコードされるElo3pのアミノ酸配列を配列番号14に示す。Elo3pの活性は、低下させてよい。Elo3pの活性の低下は、具体的には、脂肪酸エロンガーゼIII活性の低下を意味してよい。脂肪酸エロンガーゼIII活性は、例えば、公知の方法（J Biol Chem. 1997 Jul 11;272(28):17376-84.）により測定することができる。
【００３２】
CKA2遺伝子は、カゼインキナーゼ２のアルファダッシュサブユニットをコードする。「カゼインキナーゼ２」とは、セリン／スレオニン選択的なタンパク質のリン酸化を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 2.7.11.1）。同活性を、「カゼインキナーゼ２活性」ともいう。CKA2遺伝子にコードされるタンパク質を、「Cka2p」ともいう。S. cerevisiae S288CのCKA2遺伝子の塩基配列を配列番号15に、同遺伝子にコードされるCka2pのアミノ酸配列を配列番号16に示す。Cka2pは、CKA1、CKB1、およびCKB2遺伝子産物（すなわち、Cka1p、Ckb1p、およびCkb2p）とヘテロ四量体を形成してカゼインキナーゼ２として機能してもよい。Cka2pは、セラミドシンターゼの完全な活性化のために要求され得る（Eukaryot Cell. 2003 Apr;2(2):284-94.）。Cka2pの活性は、低下させてよい。Cka2pの活性の低下は、具体的には、カゼインキナーゼ２活性の低下を意味してよい。カゼインキナーゼ２活性は、例えば、公知の方法（Gene. 1997 Jun 19;192(2):245-50.）により測定することができる。
【００３３】
ORM2遺伝子は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を調節する膜タンパク質をコードする。ORM2遺伝子にコードされるタンパク質を、「Orm2p」ともいう。S. cerevisiae S288CのORM2遺伝子の塩基配列を配列番号17に、同遺伝子にコードされるOrm2pのアミノ酸配列を配列番号18に示す。Orm2pの活性は、低下させてよい。Orm2pの活性の低下は、具体的には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性の増大を意味してよい。
【００３４】
CHA1遺伝子は、Ｌ−セリン／Ｌ−スレオニンアンモニアリアーゼ（L-serine/L-threonine ammonia-lyase）をコードする。「Ｌ−セリン／Ｌ−スレオニンアンモニアリアーゼ」とは、Ｌ−セリンおよびＬ−スレオニンを分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう（EC 4.3.1.17およびEC 4.3.1.19）。同活性を、「Ｌ−セリン／Ｌ−スレオニンアンモニアリアーゼ活性」ともいう。CHA1遺伝子にコードされるタンパク質を、「Cha1p」ともいう。S. cerevisiae S288CのCHA1遺伝子の塩基配列を配列番号19に、同遺伝子にコードされるCha1pのアミノ酸配列を配列番号20に示す。Cha1pの活性は、低下させてよい。Cha1pの活性の低下は、具体的には、Ｌ−セリン／Ｌ−スレオニンアンモニアリアーゼ活性の低下を意味してよい。Ｌ−セリン／Ｌ−スレオニンアンモニアリアーゼ活性は、例えば、公知の方法（Eur J Biochem. 1982 Apr;123(3):571-6.）により測定することができる。
【００３５】
標的遺伝子および標的タンパク質、すなわち、LCB1、LCB2、TSC10、SUR2、LCB4、LCB5、ELO3、CKA2、ORM2、およびCHA1遺伝子、並びにそれらにコードされるタンパク質は、上記塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。「遺伝子またはタンパク質が塩基またはアミノ酸配列を有する」という表現は、遺伝子またはタンパク質が当該塩基またはアミノ酸配列を含む場合、および遺伝子またはタンパク質が当該塩基またはアミノ酸配列からなる場合を包含する。
【００３６】
標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した各遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、標的タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した各タンパク質のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「LCB1」、「LCB2」、「TSC10」、「SUR2」、「LCB4」、「LCB5」、「ELO3」、「CKA2」、「ORM2」、および「CHA1」遺伝子という用語は、それぞれ、上記例示した各遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含する。同様に、「Lcb1p」、「Lcb2p」、「Tsc10p」、「Sur2p」、「Lcb4p」、「Lcb5p」、「Elo3p」、「Cka2p」、「Orm2p」、および「Cha1p」という用語は、それぞれ、上記例示した各タンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。すなわち、例えば、「LCB1遺伝子」という用語は、上記例示したLCB1遺伝子（例えばS. cerevisiaeのLCB1遺伝子）を包含し、さらに、それらのバリアントも包含する。同様に、例えば、「Lcb1タンパク質」という用語は、上記例示したLcb1タンパク質（例えばS. cerevisiae
のLCB1遺伝子にコードされるタンパク質）を包含し、さらに、それらのバリアントも包含する。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した標的遺伝子および標的タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。遺伝子やタンパク質のバリアントを生成する方法は本技術分野においてよく知られている。
【００３７】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば活性や性質）に対応する機能（例えば活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、対応する機能（例えば上記例示した活性や性質）を有することをいう。すなわち、標的タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、Lcb1pおよびLcb2pについてセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性；Tsc10pについて３−デヒドロスフィンガニンレダクターゼ活性；Sur2pについてスフィンゴシンヒドロキシラーゼ活性； Lcb4pおよびLcb5pについてスフィンゴイド塩基キナーゼ活性；Elo3pについて脂肪酸エロンガーゼIII活性；Cka2pについてカゼインキナーゼ２活性；Orm2pについてセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を調節する性質；Cha1pについてＬ−セリン／Ｌ−スレオニンアンモニアリアーゼ活性を有することであってよい。また、Cka2pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、その活性の低下によりセラミドシンターゼ活性が低下するという性質を有することであってもよい。また、Orm2pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、その活性の低下によりセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性が増大するという性質を有することであってもよい。標的タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、標的タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、他の適切なサブユニットとの組み合わせで対応する機能（例えば上記例示した活性や性質）を発揮することであってもよい。すなわち、例えば、Lcb1pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、適切なLcb2pとの組み合わせでセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有することであってもよく、Lcb2pについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、適切なLcb1pとの組み合わせでセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有することであってもよい。
【００３８】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００３９】
上記例示した遺伝子のホモログまたは上記例示したタンパク質のホモログは、例えば、上記例示した遺伝子の塩基配列または上記例示したタンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記例示した遺伝子のホモログは、例えば、酵母等の生物の染色体を鋳型にして、上記例示した遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００４０】
標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または削減されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパ
ク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４２】
また、標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００４３】
また、標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００４４】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとしては、例えば、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００４５】
また、標的遺伝子は、上記塩基配列において任意のコドンをそれと等価のコドンに置換した塩基配列を有するものであってもよい。例えば、標的遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００４６】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:48
2の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００４７】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００４８】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００４９】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００５０】
＜１−２＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【００５１】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して増大することを意味する。「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味してよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２
倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、適切な種類の標的タンパク質を導入してもよい。
【００５２】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００５３】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００５４】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ARS）や、染色体上に約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。WO95/32289には、相同組み換えを利用して酵母の形質転換を行った例が開示されている。また、染色体への遺伝子の導入は、例えば、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ転移させることによっても実施することができる。
【００５５】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００５６】
また、標的遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、シングルコピーベクターであってもよく、マルチコピーベクターであってもよい。また、ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを含むことが好ましい。マーカーとしては、KanMX、NatMX（nat1）、HygMX（hph）遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子や、LEU2、HIS3、URA3遺伝子等の栄養要求性を相補する遺伝子が挙げられる。酵母において自律複製可能なベクターとしては、CEN4の複製開始点を有するプラスミドや
2μm DNAの複製開始点を有するプラスミドが挙げられる。酵母において自律複製可能なベクターとして、具体的には、pAUR123（タカラバイオ）やpYES2（インビトロジェン）が挙げられる。
【００５７】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の酵母に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の酵母において機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００５８】
遺伝子の下流には、ターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の酵母において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。本発明の酵母において機能するターミネーターとしては、CYC1、ADH1、ADH2、ENO2、PGI1、TDH1ターミネーターが挙げられる。
【００５９】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００６０】
また、２種またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の酵母に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。あるいは、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。なお、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
【００６１】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミドを鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
【００６２】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。
【００６３】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。酵母で利用できるより強力なプロモーターとしては、PGK1、PGK2、PDC1、TDH3、TEF1、TEF2、TPI1、HXT7、ADH1、GPD1、KEX2プロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモータ
ーの高活性型のものを取得してもよい。
【００６４】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子を異種発現する場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されていてよい。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl.
Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【００６５】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【００６６】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００６７】
また、酵素の活性が増大するような改変は、例えば、酵素の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強された酵素は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の酵素に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００６８】
形質転換の方法は特に限定されず、酵母の形質転換に従来用いられている方法を用いることができる。そのような方法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H. Ito et al., J. Bacteriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）が挙げられる。また、酵母の胞子形成や１倍体酵母の分離等の操作の方法については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社；等に記載されている。
【００６９】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００７０】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【００７１】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Sambrook, J., et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００７２】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００７３】
＜１−３＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００７４】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味してよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味する。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７５】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現が野生株や親株等の非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７６】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、プロモーター等の、遺伝子の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００７７】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能する
タンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（例えば活性や性質）が低下又は完全に消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
【００７８】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００７９】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００８０】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００８１】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、組換えＤＮＡを用いて実施できる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、任意の配列（例えば、欠失型遺伝子や任意の挿入配列）を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端に染色体上の相同組換え対象部位の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、対象部位を当該任意の配列に置換することができる。染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、具体的には、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子としては、遺伝子の全領域あるいは一部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子が挙げられる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。
【００８２】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理等の通常の変異処理が挙げられる。
【００８３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００８４】
遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００８５】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８６】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８７】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００８８】
＜２＞本発明の目的物質の製造方法
本発明の方法は、目的物質の製造方法であって、本発明の酵母を培地で培養すること、および前記酵母の菌体および／または前記培地から目的物質を回収することを含む方法である。本発明においては、１種の目的物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上の目的物質が製造されてもよい。
【００８９】
使用する培地は、本発明の酵母が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、酵母の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。そのような培地としては、SD培地、SG培地、SDTE培地、YPD培地が挙げられる。培地は、例えば、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、およびその他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有していてよい。培地成分の種類や濃度は、使用する酵母の種類や製造する目的物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【００９０】
培地は、目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および／または目的物質の捕捉が可能な添加剤を含有していてもよい。添加剤の使用により、目的物質の生産が増大し得る。すなわち、本発明の酵母による目的物質の生産量は、添加物の非存在下と比較して、添加物の存在下で増大し得る。添加剤の使用により、具体的には、培地中での目的物質の生産が増大してよい。培地中での目的物質の生産を、「目的物質の排出」ともいう。「目的物質との会合、目的物質との結合、目的物質の可溶化、および／または目的物質の捕捉」とは、具体的には、目的物質の培地への溶解度を増大させることを意味してよい。添加剤としては、シクロデキストリンやゼオライトが挙げられる。シクロデキストリンを構成するグルコース残基の数は、特に制限されない。シクロデキストリンを構成するグルコース残基の数は、例えば、５、６、７、または８であってよい。すなわち、シクロデキストリンとしては、５個のグルコース残基からなるシクロデキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびそれらの誘導体が挙げられる。シクロデキストリン誘導体としては、１つまたはそれ以上の官能基が導入されたシクロデキストリンが挙げられる。官能基の種類、数、および量、並びに官能基を導入する位置は、誘導体が目的物質と会合、目的物質と結合、目的物質を可溶化、および／または目的物質を捕捉できる限り、特に制限されない。官能基は、例えば、C2位
の水酸基、C3位の水酸基、C6位の水酸基、またはそれらの組み合わせに導入されてよく、これによりシクロデキストリン自体の溶解度が増大し得る。官能基としては、アルキル基やヒドロキシアルキル基が挙げられる。アルキル基およびヒドロキシアルキル基は、いずれも、直鎖アルキル鎖を有していてもよく、分岐アルキル鎖を有していてもよい。アルキル基およびヒドロキシアルキル基は、いずれも、炭素数が、例えば、１、２、３、４、または５であってよい。アルキル基として、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、イソプロピル基、イソブチル基が挙げられる。ヒドロキシアルキル基として、具体的には、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基、ヒドロキシイソプロピル基、ヒドロキシイソブチル基が挙げられる。シクロデキストリン誘導体として、具体的には、メチル−α−シクロデキストリン；メチル−β−シクロデキストリン；２−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン等のヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。ゼオライトの種類は特に制限されない。添加剤としては、１種の添加剤を用いてもよく、２種またはそれ以上の添加剤を組み合わせて用いてもよい。
【００９１】
添加剤は、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間にのみ培地に含有されていてもよい。例えば、添加剤は、培養開始時から培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。添加剤が培養開始時に培地に含有されていない場合は、培養開始後に培地に添加剤を供給する。供給のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、本発明の酵母が十分に生育してから培地に添加剤を供給してもよい。また、いずれの場合にも、適宜、培地に添加剤を追加的に供給してよい。添加剤を培地に供給する手段は特に制限されない。例えば、添加剤を含有する流加培地を培地に流加することにより、添加剤を培地に供給することができる。培地中の添加剤濃度は、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地中の添加剤濃度は、例えば、０．１ｇ／Ｌ以上、１ｇ／Ｌ以上、２ｇ／Ｌ以上、５ｇ／Ｌ以上、または１０ｇ／Ｌ以上であってもよく、２００ｇ／Ｌ以下、１００ｇ／Ｌ以下、５０ｇ／Ｌ以下、または２０ｇ／Ｌ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。培地中の添加剤濃度は、例えば、０．１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、または５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌであってもよい。添加剤は、培養の全期間において上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。添加剤は、例えば、培養開始時に上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、培養開始後に上記例示した濃度となるように培地に供給されてもよい。
【００９２】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【００９３】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【００９４】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【００９５】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【００９６】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００９７】
また、生育にアミノ酸や核酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００９８】
培養条件は、本発明の酵母が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、酵母の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する酵母の種類や製造する目的物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【００９９】
培養は、液体培地を用いて、好気条件、微好気条件、または嫌気条件で行うことができる。培養は、好ましくは、好気条件で行うことができる。「好気条件」とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、0.33 ppm以上、好ましくは1.5 ppm以上である条件であってよい。好気条件の場合、酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度に対して、5〜50％、好ましくは10〜20％程度に制御されてもよい。好気培養は、具体的には、通気または振盪により行うことができる。「微好気条件」とは、培養系に酸素が供給されているが、液体培地中の溶存酸素濃度が0.33ppm未満である条件であってよい。「嫌気条件」とは、培養系に酸素が供給されない条件であってよい。培養温度は、例えば、25〜35℃、好ましくは27℃〜33℃、より好ましくは28℃〜32℃であってよい。培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4〜8であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。pHの調整には、無機または有機の酸性またはアルカリ性の物質、例えばアンモニアガス等、を用いることができる。培養期間は、例えば、10時間〜200時間、または15時間〜120時間であってよい。培養条件は、培養の全期間において一定であってもよく、培養中に変化させてもよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。培養は、種培養と本培養の２段階で行ってもよい。そのような場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、なくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。あるいは、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０１００】
このような条件下で本発明の酵母を培養することにより、培地中および／または菌体内に目的物質が蓄積する。
【０１０１】
目的物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【０１０２】
生成した目的物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うこと
ができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、晶析法が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕することができ、次いで、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から目的物質を回収することができる。回収される目的物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。
【０１０３】
また、目的物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により目的物質を回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０１０４】
尚、回収される目的物質は、目的物質以外に、酵母菌体、培地成分、水分、及び酵母の代謝副産物を含んでいてもよい。回収される目的物質の純度は、例えば、50％（w/w）以上、好ましくは85％（w/w）以上、特に好ましくは95%（w/w）以上であってよい。
【０１０５】
フィトスフィンゴシン（PHS）やスフィンガニン（DHS）等の目的物質は、同スフィンゴイド塩基（PHS／DHS）と脂肪酸との混合物の化学反応により、フィトセラミド（PHC）やジヒドロセラミド（DHC）等の対応するスフィンゴ脂質に変換してもよい（J. Biol. Chem. July 2002 277 (29): 25847-5）。
【実施例】
【０１０６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、いかなる意味においても、これにより制限されるものではない。
【０１０７】
実施例１：菌株の構築
S. cerevisiae EVST20240株は、最も開発の進んだPHS生産株であり、the National Collection of Yeast CulturesのNCYC 3608株に由来する。NCYC 3608株（遺伝子型：MATalpha gal2 ho::HygMX ura3::KanMX）は、S288CのMatα派生株である。EVST20240株は、以下の改変を含む：すなわち、his3Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0の欠損 Δcha1::LoxP Δcka2::LoxP Δlcb4::LoxP Δlcb5::LoxP Δorm2::LoxP CAT5-91Met gal2 ho YNRCΔ9::ScLCB1/ScSUR2
YPRCΔ15::ScLCB2/ScTSC10 [ARS/CEN/URA/ScTSC10/ScSUR2] [ARS/CEN/HIS/ScLCB1/ScLCB2] [ARS/CEN/LEU]。EVST20240株は、通常の遺伝子工学的手法により操作することができ、また、通常の二倍体または一倍体の酵母株として使用することができる。EVST20240株の構築の詳細を以下に示す。
【０１０８】
S. cerevisiae EYS4769株を、NCYC 3608株より構築した。第１段階は、HO遺伝子の欠失の際に残存したHygMX選択マーカーの除去である。このために、プラスミドpEVE3195を構築した。このプラスミドは、HygMXの開始コドンの直上流のHygMXプロモーターに相同な領域と、それに続くloxP部位で挟まれたKluyveromyces lactisのURA3遺伝子、およびHygMXの終始コドンの直下流のHygMXターミネーターに相同な領域とからなるモジュールを含む。このモジュールは２つのAscI制限サイトで挟まれており、AscI消化により切り出され、次いで、切り出した断片を用いてS288C株を形質転換した。この結果、HygMXマーカーが、K. lactisのURA3選択マーカーを含む上記モジュールで置換された。最後に、URA3マーカーが、loxP配列間で自然に組み換えが起こることにより除去された。URA3を有さないクローンを、まずSC液体培地で選抜し、次いで1 g/L ５’−フルオロオロチン酸（5-FOA）培地（1.926 g/L SC mixture (SC-mix) without uracil, 30 mg/L uracil, 6.7 g/L yeast nitrogen base, 20 g/L glucose, pH 5.8）（完全SC mixについては表１５を参照）を含むプレート上で選抜した。5-FOAは、活性なURA3遺伝子を有する酵母により毒性化合物に変化する。
【０１０９】
KanMX選択マーカーの除去、HygMXマーカーの除去の際に残存したloxP跡の除去、並びにLEU2およびHIS3遺伝子の欠失は、以下のようにPCRを介したシームレスな遺伝子欠失ストラテジーにより達成した。
【０１１０】
KanMX選択マーカーの除去のために、プラスミドpEVE3622を構築した。このプラスミドは、KanMXの開始コドンの直上流のKanMXプロモーターに相同な領域、KanMXの終始コドンの直下流のKanMXターミネーターに相同な領域、およびそれに続くloxP部位で挟まれたKluyveromyces lactisのURA3遺伝子からなるモジュールを含む。第１段階では、DNA断片ＡをAscI制限サイトでベクターpEVE1915に導入することにより、プラスミドpEVE3191を構築した。DNA断片Ａは、オーバーラップＰＣＲにより調製した。すなわち、NCYC 3608株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーペアEV3964/EV3965およびEV3966/EV3967を用いたＰＣＲにより、２種のＤＮＡ断片を増幅した。次いで、プライマーペアEV3964/EV3967を用いたＰＣＲによりこれら２種のＤＮＡ断片をつなぎ合わせ、DNA断片Ａを得た。次の段階では、プライマーペアEVPR11045/EVPR11046を用いてpEVE3195からKluyveromyces lactisのURA3遺伝子をＰＣＲ増幅し、EcoRVで線状化したプラスミドpEVE3191にIn-Fusionクローニングによってクローニングし、プラスミドpEVE3622を構築した。下流の相同領域のNdeI制限サイトを利用してプラスミドを消化し、ゲノムに組み込んでuracilを含有しないSC培地（1.926 g/L SC-mix without uracil, 6.7 g/L yeast nitrogen base, 20 g/L glucose, pH 5.8）（完全SC mixについては表１５を参照）で選抜した。次いで、1 g/L ５’−フルオロオロチン酸（5-FOA）寒天プレートを含むプレート上でURA3マーカーを有さないクローンを選抜した。遺伝子型が野生型のクローンと所望の欠損を有するクローンとが混在する集団が得られ、PCRにより欠損株を同定した。
【０１１１】
loxP跡の除去、並びにLEU2およびHIS3遺伝子の欠失は、同一の方法で実施した。プライマーペアEV3970/EV3971、EV3972/EV3973、およびEV3970/EV3973を用いて、HIS3遺伝子のオープンリーディングフレームの欠失用の標的断片を生成した。プライマーペアEV3976/EV3977、EV3978/EV3979、およびEV3976/EV3979を用いて、LEU2遺伝子のオープンリーディングフレームの欠失用の標的断片を生成した。loxP跡を標的とするプラスミドpEVE3621は、下流の組み込みタグ内のPmlIを利用して線状化した。LEU2マーカーを標的とするプラスミドpEVE3624は、下流の組み込みタグ内のBseRIを利用して線状化した。HIS3マーカーを標的とするプラスミドpEVE3623については、単一のHindIII制限サイトを上流の組み込みタグに部位特異的変異法により導入してpEVE3763を構築し、HindIIIで消化した。ゲノムへの組み込みおよびuracilを含有しないSC培地での選抜の後、1 g/L 5-FOAを含有する寒天プレート上でURA3マーカーを有さないクローンを選抜した。遺伝子型が野生型のクローンと所望の欠損を有するクローンとが混在する集団が得られ、PCRにより欠損株を同定した。
【０１１２】
S. cerevisiae EYS4789株を、前述のEYS4769株より、LCB4遺伝子の欠失により構築した。これは、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失（start-to-stop-codon deletion）を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。LCB4遺伝子は、欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたNourseothricin耐性遺伝子NatMX（nat1）と、プライマーEV4024およびEV4025（表９）を用いたPCRによって付加されたLCB4遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L nourseothricinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。
【０１１３】
S. cerevisiae EYS4839株、EYS4840株、およびEYS4845株を、前述のEYS4789株より、まず、以前に挿入されたNatMX選択マーカーを以下のようにして除去することにより構築した。EYS4789株を、Creリコンビナーゼ酵素の発現カセットを含むURA3選択プラスミドpEVE0078で形質転換した。Creリコンビナーゼは、NatMXマーカーを挟む2つのloxP部位間での
部位特異的組み換えを触媒し、同時にNatMXマーカーが除去される。Creリコンビナーゼを発現するクローンを、uracilを含有しないSC寒天培地で選抜した。いくつかのクローンを選抜し、各選択プレートに播種することにより選択マーカーの喪失を試験した。Creリコンビナーゼ保有プラスミドは、５’−フルオロオロチン酸（これはURA3遺伝子にコードされる酵素の活性により毒性化合物に変化する）の存在下で各株を生育させることにより除去した。このプラスミドを失ったクローンのみが、5-FOA含有培地上で増殖することができた。陽性クローンの１つをEYS4964株とした。
【０１１４】
S. cerevisiae EYS4964株をORM2、LCB5、およびELO3遺伝子の欠失に供し、EYS4839株、EYS4840株、およびEYS4845株を構築した。EYS4839はORM2遺伝子を欠損し、EYS4840株はLCB5遺伝子を欠損し、EYS4845株はELO3遺伝子を欠損する。これは、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失（start-to-stop-codon deletion）を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。ORM2、LCB5、およびELO3遺伝子は、各欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたNourseothricin耐性遺伝子NatMX（nat1）と、プライマーペアEV4215/EV4216、EV4030/EV4031、およびEV5103/EV5104をそれぞれ用いたPCRによって付加されたORM2、LCB5、およびELO3遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L nourseothricinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。
【０１１５】
S. cerevisiae EYS5009株を、前述のEYS4789株より、CKA2遺伝子の欠失により誘導した。これは、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失（start-to-stop-codon deletion）を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。CKA2遺伝子は、欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたhygromycin耐性遺伝子HygMX（hph）と、プライマーEV4740およびEV4741（表９）を用いたPCRによって付加されたCKA2遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、300 mg/L hygromycinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。第２段階として、以前に挿入された選択マーカーを、Creリコンビナーゼ酵素の発現カセットを含むURA3選択プラスミドpEVE0078を用いた形質転換により除去した。Creリコンビナーゼは、HygMX（hph）マーカーを挟む2つのloxP部位間での部位特異的組み換えを触媒し、同時にHygMX（hph）マーカーが除去される。Creリコンビナーゼを発現するクローンを、uracilを含有しないSC寒天培地で選抜した。いくつかのクローンを選抜し、各選択プレートに播種することにより選択マーカーの喪失を試験した。Creリコンビナーゼ保有プラスミドpEVE0078は、５’−フルオロオロチン酸（これはURA3遺伝子にコードされる酵素の活性により毒性化合物に変化する）の存在下で各株を生育させることにより除去した。このプラスミドを失ったクローンのみが、5-FOA含有SC培地上で増殖することができた。
【０１１６】
S. cerevisiae EYS5066株を、前述のEYS5009株より、LCB5遺伝子の欠失により誘導した。これは、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失（start-to-stop-codon deletion）を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。LCB5遺伝子は、欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたNourseothricin耐性遺伝子NatMX（nat1）と、プライマーEV4030およびEV4031（表９）を用いたPCRによって付加されたLCB5遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/ml nourseothricinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。
【０１１７】
S. cerevisiae EYS5175株を、前述のEYS5066株より、ORM2遺伝子の欠失により誘導した。これは、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失（start-to-stop-codon deletion）を生じるPCRベースの欠失ストラテジーにより実施した。ORM
2遺伝子は、欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたhygromycin耐性遺伝子HygMX（hph）と、プライマーEV4215およびEV4216（表９）を用いたPCRによって付加されたORM2遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L hygromycinを含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。
【０１１８】
S. cerevisiae EVST20057株を、前述のEYS5175株より、オープンリーディングフレームの開始コドンから終始コドンまでの欠失（start-to-stop-codon deletion）を生じるPCRベースの欠失ストラテジーによるCHA1遺伝子の欠失により構築した。CHA1遺伝子は、欠失構築物に置換された。同構築物は、loxP部位で挟まれたアミノグリコシド系抗生物質G418に対する耐性を与えるKanMX遺伝子と、プライマーEV3782およびEV3783（表９）を用いたPCRによって付加されたCHA1遺伝子の在来のプロモーターおよびターミネーターに相同な配列を含む。形質転換体は、100 mg/L G418を含有するSC寒天プレートで選抜した。クローンについて、欠失構築物が適切に挿入されているかをPCR試験により確認した。さらに、LCB5、ORM2、およびCHA1遺伝子の欠失にそれぞれ用いたNatMX、HygMX（hph）、およびKanMX耐性マーカーを、Creリコンビナーゼの発現カセットを含むURA3選択プラスミドpEVE0078を用いた形質転換によりEYS5175から除去した。Creリコンビナーゼは、上記マーカーを挟む2つのloxP部位間での部位特異的組み換えを触媒し、同時に上記マーカーが除去される。Creリコンビナーゼを発現するクローンを、uracilを含有しないSC寒天培地で選抜した。いくつかのクローンを選抜し、各選択プレートに播種することにより選択マーカーの喪失を試験した。Creリコンビナーゼ保有プラスミドpEVE0078は、５’−フルオロオロチン酸（これはURA3遺伝子にコードされる酵素の活性により毒性化合物に変化する）の存在下で各株を生育させることにより除去した。このプラスミドを失ったクローンのみが、uracil含有培地上で増殖することができた。
【０１１９】
S. cerevisiae EVST20160株を、前述のEVST20057株より、S. cerevisiaeの２つの在来遺伝子LCB1およびSUR2と選択マーカーNatMXからなる発現モジュールをゲノム上のTy1 long terminal repeat YNRCΔ9（Chromosome XIV 727363-727661）に組み込むことにより構築した。LCB1およびSUR2遺伝子は、それぞれ、S. cerevisiaeの在来のGPD1およびTEF2プロモーター（表１３）から発現し、S. cerevisiaeの在来のCYC1およびPGI1ターミネーター（表１４）を伴っている。さらに、S. cerevisiaeの２つの在来遺伝子LCB2およびTSC10と選択マーカーHygMX（hph）を発現する第２の組み込みモジュールをゲノム上のTy1 long-terminal repeat YPRCΔ15（Chromosome XVI 776667..776796）に組み込んだ。LCB2およびTSC10遺伝子は、それぞれ、S. cerevisiaeの在来のPGK1およびTPI1プロモーター（表１３）から発現し、S. cerevisiaeの在来のADH2およびTDH1ターミネーター（表１４）を伴っている。
【０１２０】
S. cerevisiae EVST20240株を、前述のEVST20160株より、３つのプラスミドで形質転換することにより構築した。プラスミド１（pEVE4932）は、S. cerevisiaeの在来のTEF1プロモーターとS. cerevisiaeの在来のADH1ターミネーターに挟まれたS. cerevisiaeのLCB1遺伝子のオープンリーディングフレームと、S. cerevisiaeの在来のPGK1プロモーターとS. cerevisiaeの在来のCYC1ターミネーターに挟まれたS. cerevisiaeのLCB2遺伝子のオープンリーディングフレームを備えた二重発現カセットを含む。プラスミド２（pEV22325）は、S. cerevisiaeの在来のTEF1プロモーターとS. cerevisiaeの在来のADH1ターミネーターに挟まれたS. cerevisiaeのTSC10遺伝子のオープンリーディングフレームと、S. cerevisiaeの在来のPGK1プロモーター（表１３）とS. cerevisiaeの在来のCYC1ターミネーター（表１４）に挟まれたS. cerevisiaeのSUR2遺伝子のオープンリーディングフレームを備えた二重発現カセットを含む。プラスミド３（pEVE2159）は、オープンリーディングフレームを欠くS. cerevisiaeの在来のPGK2プロモーターとS. cerevisiaeの在来のADH2ターミネーターのみを備えた空の発現カセットを含む。このプラスミドは、単に、菌株をロイシ
ンについて原要求性とするために用いた。３つ全てのプラスミドを有する形質転換体は、プラスミド１、２、および３にそれぞれ存在する選択マーカーHIS3、URA3、およびLEU2を利用して、アミノ酸であるヒスチジンおよびロイシン、並びにピリミジン塩基であるウラシルを欠く寒天プレート上で選抜した。
【０１２１】
実施例２：菌株の小スケール回分培養およびPHS生産解析
酵母株（図１）を、ロイシン、ヒスチジン、およびウラシルを欠く選択SC寒天プレートにパッチ状に画線した。一晩生育させた後、ロイシン、ヒスチジン、およびウラシルを欠くSC培地（1.546 g/L SC-mix without leucine, histidine, uracil, 6.7 g/L yeast nitrogen base, 20 g/L glucose, pH 5.8）（完全SC mixについては表１５を参照）へ植菌し、14 ml容の丸底チューブに1 mlの前培養液をセットアップした。前培養液を30℃で24時間振盪培養し、次いで、96穴ディープウェルプレートのロイシン、ヒスチジン、およびウラシルを欠き、20 g/Lグルコースおよび10 g/L α−シクロデキストリンを含有するSC培地でのOD600が0.1となるように本培養液の植菌に用いた。30℃で48時間の振盪培養後、培養物を遠心（5 min, 4000 rpm）で回収し、上清の一部をスフィンゴ脂質の分析に供した。サンプルは、分析物の濃度が検量線の範囲に入るようにメタノールで希釈した。ストック溶液は、表１にまとめたように調製した。
【０１２２】
【表１】
2018525018.tif 000002
【０１２３】
ストック溶液から一連の検量線溶液（4 mg/L, 2 mg/L, 1 mg/L, 0.5 mg/L, 0.25 mg/L,
0.125 mg/L, 62.5 μg/L, 31.25 μg/L；メタノール中）を調製し、UPLC-TOFにインジェクションした。LC-MS/MS法は以下の通りに実施した。
移動相Ａ：2 mM ammonium formate in water + 0.2% formic acid;
移動相Ｂ：1 mM ammonium formate in acetonitrile/methanol 1:1 + 0.2% formic acid;
カラム：Acquity BEH UPLC C8, 2.1 x 100 mm, 1,7 μm
溶離グラジエントを表２に、LC-MS/MS条件を表３に示す。表４は、質量分析計のソースおよび検出器のパラメーターを示す。標準物質の質量および保持時間は表５にある。３−ケトスフィンガニン、C18-フィトスフィンゴシン、およびスフィンガニンの濃度は、それぞれの検量線に基づいて算出した。一方、C20-フィトスフィンゴシン、C18:1-フィトスフィンゴシン、およびC20:1-フィトスフィンゴシンの濃度は、C18-フィトスフィンゴシンの検量線に基づいて推定した。また、C18-フィトスフィンゴシン付加体およびC20-フィトスフィンゴシン付加体の濃度は、C18-フィトスフィンゴシンの検量線に基づいて相関係数0.59を適用して算出した。
【０１２４】
【表２】
2018525018.tif 000003
【０１２５】
【表３】
2018525018.tif 000004
【０１２６】
【表４】
2018525018.tif 000005
【０１２７】
【表５】
2018525018.tif 000006
【０１２８】
二重欠損株であるEYS4839、EYS4840、EYS4845、およびEYS5009について、小スケール酵母培養物の上清におけるフィトスフィンゴシンおよびスフィンガニンの生産を測定した。表６に示すように、フィトスフィンゴシンおよびスフィンガニンの生産は、全ての二重欠損株で増大し、LCB4/ELO3遺伝子欠損またはLCB4/CKA2遺伝子欠損を有する株で顕著に高かった。
【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
さらなる遺伝子改変により、フィトスフィンゴシン生産のさらなる改善が認められた（図１）。LCB4/CKA2二重欠損を背景に、さらにLCB5およびORM2遺伝子の組み合わせを欠損させること、またはLCB5、ORM2、およびCHA1遺伝子の組み合わせを欠損させることにより、20〜30%の増加が認められた。フィトスフィンゴシン生産は、スフィンゴ脂質経路遺伝子LCB1、LCB2、TSC10、およびSUR2を酵母ゲノムへ組み込んで過剰発現することより（EVST20160株）、元株であるEVST20057に対して、約2.5倍に向上した。フィトスフィンゴシン生産は、スフィンゴ脂質経路遺伝子の追加のコピーをプラスミドから過剰発現することにより、さらに30%以上増大した（EVST20240株）。
【０１３１】
実施例３：バイオリアクタにおけるEVST20240の培養
流加（fed-batch）発酵は、以下のパラメーターで実施した：温度は30℃とし、pHを5.85に制御（0.5 M HClおよび5 M NH4OHで調整）し、撹拌および通気の段階的な増大によりpO2を最大酸素溶解度に対し20％超に維持した。用いた培地は、それぞれ、回分段階では選択SC培地、流加段階では30倍濃縮した選択SC培地（46.38 g/L SC-mix without leucine, histidine, uracil, 201 g/L yeast nitrogen base, 600 g/L glucose, pH 5.8）（完全SC mixについては表１５を参照）である。両培地には、50 g/L メチル−α−シクロデキストリンを添加した。回分段階を11時間実施し、その後、対数流加プロファイル（表７）に従って流加を開始した。約100時間にわたり、サンプルを採取し、バイオマス生産およびフィトスフィンゴシン生産の両方について分析した。フィトスフィンゴシンは、LC-MSにより定量した。
【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
結果を図２および表８に示す。フィトスフィンゴシンに加えて、いくつかのフィトスフィンゴシン誘導体が発酵液中に同定された（図２、表８）。炭素鎖の長さが１８のフィトスフィンゴシン（PHS18）が主要な種であり、炭素鎖の長さが２０のフィトスフィンゴシン（PHS20）および炭素鎖の長さが１６のフィトスフィンゴシン（PHS16）と続いた。さらに不飽和を１つ有するPHS18およびPHS20も著量存在していた。驚くべきことに、２つのさ
らなるフィトスフィンゴシン誘導体、すなわち、4-(hydroxymethyl)-2-methyl-6-tetradecanyl-1,3-oxazinan-5-olおよび4-(hydroxymethyl)-2-methyl-6-hexadecanyl-1,3-oxazinan-5-olが存在していた。おそらくは、両化合物は、PHS18またはPHS20とアセトアルデヒドとの反応物である。下記構造（１）に示した4-(hydroxymethyl)-2-methyl-6-tetradecanyl-1,3-oxazinan-5-olの構造は、NMR分析により確認した。
【０１３４】
【表８】
2018525018.tif 000009
【０１３５】
【化１】
2018525018.tif 000010
【０１３６】
＜材料＞
実施例に用いた材料を表９〜１５に示す。
【０１３７】
【表９】
2018525018.tif 000011
【０１３８】
【表１０】
2018525018.tif 000012
【０１３９】
【表１１】
2018525018.tif 000013
【０１４０】
【表１２】
2018525018.tif 000014
【０１４１】
【表１３】
2018525018.tif 000015
【０１４２】
【表１４】
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【０１４３】
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明によれば、酵母のフィトスフィンゴシン（PHS）やスフィンガニン（DHS）等の目的物質の生産能を向上させることができ、目的物質を効率よく製造することができる。
【０１４５】
＜配列表の説明＞
配列番号１：Saccharomyces cerevisiaeのLCB1遺伝子の塩基配列
配列番号２：Saccharomyces cerevisiaeのLcb1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：Saccharomyces cerevisiaeのLCB2遺伝子の塩基配列
配列番号４：Saccharomyces cerevisiaeのLcb2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：Saccharomyces cerevisiaeのTSC10遺伝子の塩基配列
配列番号６：Saccharomyces cerevisiaeのTsc10タンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：Saccharomyces cerevisiaeのSUR2遺伝子の塩基配列
配列番号８：Saccharomyces cerevisiaeのSur2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：Saccharomyces cerevisiaeのLCB4遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Saccharomyces cerevisiaeのLcb4タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：Saccharomyces cerevisiaeのLCB5遺伝子の塩基配列
配列番号１２：Saccharomyces cerevisiaeのLcb5タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：Saccharomyces cerevisiaeのELO3遺伝子の塩基配列
配列番号１４：Saccharomyces cerevisiaeのElo3タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：Saccharomyces cerevisiaeのCKA2遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Saccharomyces cerevisiaeのCka2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：Saccharomyces cerevisiaeのORM2遺伝子の塩基配列
配列番号１８：Saccharomyces cerevisiaeのOrm2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：Saccharomyces cerevisiaeのCHA1遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Saccharomyces cerevisiaeのCha1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：Pichia ciferriiのSUR2遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Pichia ciferriiのSur2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３〜４８：プライマー
配列番号４９〜５５：プラスミド
配列番号５６〜６１：遺伝子欠失構築物
配列番号６２〜６４：プラスミド
配列番号６５〜６９：プロモーター
配列番号７０〜７４：ターミネーター
【図１】
2018525018.tif 000018
【図２】
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【国際調査報告】
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