(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染の治療のための、少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧを含むヌクレオチドであり、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンであり、Ａはデオキシアデノシンであり、Ｔはデオキシチミジンである］を含むデオキシリボ核酸の非コード配列に関する。特に、デオキシリボ核酸の非コード配列は、抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と組み合わせて使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染の治療のための、少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧを含むヌクレオチドであり、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンであり、Ａはデオキシアデノシンであり、Ｔはデオキシチミジンである］を含むデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項２】
組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と組み合わせた、請求項１に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項３】
ウイルス感染が潜伏性である、請求項１または２に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項４】
ＨＩＶ−１の治療のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項５】
潜伏性ＨＩＶ−１感染の治療のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項６】
Ｎ１Ｎ２が、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴおよびＡＡの群から採用される要素であり、Ｎ３Ｎ４が、ＣＴ、ＴＧおよびＴＴの群から採用される要素である、請求項１から５のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項７】
両側における直鎖状開鎖であるか、二本鎖部分の片側における直鎖状開鎖であり二本鎖のそれぞれの他の側に一本鎖のヘアピンを有するか、またはダンベル形で部分的に一本鎖の共有結合的に閉じたデオキシリボ核酸の鎖であるかのいずれかである、請求項１から６のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項８】
前記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を少なくとも３つを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項９】
デオキシリボ核酸の直鎖状開鎖非コード配列が、Ｌ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１０】
デオキシリボ核酸の直鎖状開鎖非コード配列のＤＮＡ一本鎖の５’端および／または３’端に位置する５つの末端ヌクレオチドのうちの１つが、Ｌ−立体配座にある、請求項９に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１１】
ａ．ＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧ  ＡＣＧＴＴＣＴＴＡＧ  ＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣ  ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＧ  ＧＡＧＡＧＡＡＣ（配列番号１）または
ｂ．ＡＣＣＴＴＣＣＴＴＧ  ＴＡＣＴＡＡＣＧＴＴ  ＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡ  ＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴ  ＴＣＡＴＡＡＣＧＴＴ  ＧＣＣＴＡＧＡＴＣＡ（配列番号２）、または
ｃ．ＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴ（配列番号３）、または
ｄ．ＡＧＧＴＧＧＴＡＡＣ  ＣＣＣＴＡＧＧＧＧＴ  ＴＡＣＣＡＣＣＴＴＣ  ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＴ  ＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧ  ＴＣＧＴＴＣＴＴ（配列番号４）
の配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１２】
４０から２００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１３】
請求項１０のｃ）の配列が、配列ＣＣＴＡＧＧＧＧＴＴ  ＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡ  ＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧ  ＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴＣＴＴＡＧＧ  ＴＧＧＴＡＡＣＣ  ＣＣＴＡＧＧＧＧＴＴ  ＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡ  ＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧ  ＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴＣＴＴＡＧＧ  ＴＧＧＴＡＡＣＣ（配列番号５）の部分である、請求項１１または１２に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１４】
４８から１１６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１５】
前記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４が、一本鎖領域の部分である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１６】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列を、組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と同時に、交互にまたは連続して提供するステップを含む方法。
【請求項１７】
デオキシリボ核酸の非コード配列が、組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の前に提供される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
医薬品として使用するための、請求項２から１６のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列。
【請求項１９】
デオキシリボ核酸の非コード配列を含む医薬組成物の製造のための、請求項２から１６のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列の使用。
【請求項２０】
医薬がワクチンである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２１】
ＨＩＶ−１の治療のための治療用または予防用のワクチン接種におけるアジュバントとしての、請求項１から１６のいずれか一項に記載のデオキシリボ核酸の非コード配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染のような疾患の治療のための組合せおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を刺激すること、誘導すること、促進することまたは抑制することによる疾患の治療を定義する。免疫療法の戦略は、免疫系を活性化することによって、癌、感染症、アレルギーおよび喘息などの、疾患と闘うことである。
【０００３】
ウイルス感染は、個々の細胞の可逆的な非生産的な感染の状態を特徴とする、ウイルス潜伏と呼ばれる状態をもたらしうる。ウイルス潜伏は、免疫認識からのウイルスの残存および回避に重要な機序を可能にする（ＰｅｒｎｇおよびＪｏｎｅｓ、Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２０１０、Ｐ２６２４１５）。
【０００４】
ヘルペスウイルスは、例えば、最も低いウイルス遺伝子の発現でそれらのウイルスゲノムの残存を可能にする遺伝的プログラムを使用することが知られている。レトロウイルスでは、逆転写されたウイルスｃＤＮＡが宿主細胞ゲノム内に安定に組み込まれることは、感染細胞の生存期間中のウイルスゲノムの残存に向けての重要なステップである。潜伏性の感染の状態を確立するレトロウイルスがある。潜伏という用語は、最初は、ＨＩＶ−１について、初期の感染とＡＩＤＳの発症との間の長い無症状の期間を記載するための臨床的な意味で使用されていた。しかし、ＨＩＶ−１は、感染の進行の全体を通して、無症状の期間中も、活発に複製することが明らかになった。ＨＩＶ−１が免疫応答から回避する主要な機序のうちの１つは、抗体および細胞溶解性Ｔリンパ球を中和することによって認識を抑止する回避変異の急速な進化を通したものである（Ｂａｉｌｅｙら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６、４７０〜４７６ページ、２００４）。それにもかかわらず、ＨＩＶ−１が、個々のＴ細胞のレベルにおいて潜伏性の感染の状態を確立できることが明らかになってきている。したがって、潜伏リザーバーを除去することはＨＩＶの療法の改良における主要な因子となりうる。
【０００５】
抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）は、ＨＩＶ感染のようなレトロウイルス感染の治療のための薬物療法を指す。これらの薬物は、患者が治療後にウイルスなしになるようにウイルスを無効にするわけではない。しかし、薬物−またはその選択が組合せで与えられるときに、それらは、ウイルスの増殖を防ぎうる。ウイルスが減速するときに、ＨＩＶ疾患も減速する。抗レトロウイルス薬は、ＡＲＶと呼ばれる。組合せＡＲＶ療法（ｃＡＲＴ）は、高活性ＡＲＴ（ＨＡＡＲＴ）と呼ばれる。
【０００６】
ＡＲＶ薬は、異なるやり方でＨＩＶを攻撃し、それらは、いわゆるクラスに分けられる。開発された第１のクラスの抗ＨＩＶ薬は、「ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤」である（ＮＲＴＩまたは「ヌーク」と呼ばれる。）これらの薬物は、ＲＮＡからＤＮＡを生成するためのＨＩＶの遺伝物質の使用を遮断する。ＡＺＴは、このクラスの最も優れたメンバーである。
【０００７】
もう１つのクラスは、「非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤」であり、非ヌークまたはＮＮＲＴＩとも呼ばれ、これも、ＤＮＡへのＲＮＡの転写を遮断する。
【０００８】
「プロテアーゼ阻害剤」のクラスに属しているメンバーは、新しいＨＩＶウイルスのための原料を特定の断片に切るステップを遮断する。最後に、ＨＩＶが細胞に入るのを防ぐ「侵入阻害剤」のクラス、および宿主ゲノム内へのＨＩＶ遺伝物質の組み込みを防ぐ「ＨＩＶ組み込み阻害剤」のクラスがある。本開示の意味の範囲内で、ｃＡＲＴとは、これらのクラスのＡＲＶのうちの少なくとも２つのメンバーの組合せの使用を指す。
【０００９】
最近、ＨＩＶ−１潜伏の状態は、患者において潜伏解除剤（ＬＲＡ）、特に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）による組合せ抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）で安全に崩壊できることが示された（Ａｒｃｈｉｎら、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  ４８７（７４０８）：４８２〜４８５；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１３、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ９（５））。しかし、潜在的に感染した細胞単独の再活性化は、ＨＩＶ−１リザーバーを減少させないことが大多数の患者において明らかになった。これは、再活性化された細胞の不十分な免疫媒介性死滅に関連するようである。しかし、自然免疫および適応免疫の活性化は、ＨＩＶ感染細胞を活性化して疾患を進行させることになるリスクを有する。したがって、免疫系の活性化がＨＩＶ患者の助けになるかどうかは疑問である。
【００１０】
免疫療法によって支持されるＨＩＶ治療の概念は、ｃＡＲＴ治療した非ウイルス血症ＨＩＶ患者からのＣＤ８＋  Ｔ細胞には、再活性化された感染した自己のＣＤ４＋  Ｔ細胞を死滅させる能力があるが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が共培養の前に抗原刺激されているときのみであることを示している最近のｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験によって支持されている（Ｓｈａｎら、２０１２、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６（３）：４９１〜５０１）。
【００１１】
したがって、ＨＩＶ感染細胞の潜伏性リザーバーを、それらの活性化および、薬理学的介入を通した免疫媒介性死滅のための、再活性化された細胞のターゲティングを通して曝露することになる化合物の必要性がある。
【００１２】
この現況技術に基づき、本開示の目的は、潜伏性ＨＩＶ感染細胞の再活性化ならびに免疫系によるそれらの認識および破壊のための免疫賦活性化合物を提供すること、ならびに医薬品としてのそれらの使用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来技術に関して、ウイルス感染の治療のための少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧを含むヌクレオチドであり、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンであり、Ａはデオキシアデノシンであり、Ｔはデオキシチミジンである］を含むデオキシリボ核酸の非コード配列を提供することは本開示の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ウイルス感染において本発明のデオキシリボ核酸の非コード配列を組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と組み合わせて使用することが意図され、ここで、ウイルス感染は潜伏性であってもよい。
【００１５】
本開示のデオキシリボ核酸の非コード配列は、ＨＩＶ−１の治療のために、特に、潜伏性ＨＩＶ−１感染の治療のために、提供されることが意図される。
【００１６】
本開示のデオキシリボ核酸の非コード配列に関して、Ｎ１Ｎ２は、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴおよびＡＡの群から採用される要素であってもよく、Ｎ３Ｎ４は、ＣＴ、ＴＧおよびＴＴの群から採用される要素であってもよい。
【００１７】
デオキシリボ核酸の非コード配列は、両側における直鎖状開鎖であるか、二本鎖部分の片側における直鎖状開鎖であり二本鎖のそれぞれの他の側に一本鎖のヘアピンを有するか、またはダンベル形で部分的に一本鎖の共有結合的に閉じたデオキシリボ核酸の鎖であるかのいずれかであってもよい。
【００１８】
デオキシリボ核酸の非コード配列は、前記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４のうちの少なくとも３つを含んでいてもよい。
【００１９】
デオキシリボ核酸の非コード配列は、さらに、Ｌ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸の直鎖状開鎖非コード配列であってもよい。
【００２０】
デオキシリボ核酸の直鎖状開鎖非コード配列のＤＮＡ一本鎖の５’端および／または３’端に位置する５つの末端ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｌ−立体配座にある。末端に対するこの制限が、ｌ−立体配座にある５’端および／または３’端のいずれかのヌクレオチドにおける末端の５つのヌクレオチドの範囲内のみを含有することを意味することは当業者には明らかである。
【００２１】
デオキシリボ核酸の非コード配列には、
ａ．ＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧ  ＡＣＧＴＴＣＴＴＡＧ  ＧＡＡＣＧＴＴＣＴＣ  ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＧ  ＧＡＧＡＧＡＡＣ（配列番号１）または
ｂ．ＡＣＣＴＴＣＣＴＴＧ  ＴＡＣＴＡＡＣＧＴＴ  ＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡ  ＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴ  ＴＣＡＴＡＡＣＧＴＴ  ＧＣＣＴＡＧＡＴＣＡ（配列番号２）、または
ｃ．ＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴ（配列番号３）、または
ｄ．ＡＧＧＴＧＧＴＡＡＣ  ＣＣＣＴＡＧＧＧＧＴ  ＴＡＣＣＡＣＣＴＴＣ  ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＴ  ＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧ  ＴＣＧＴＴＣＴＴ（配列番号４）
の配列のうちの少なくとも１つが含まれていてもよいことが意図される。
【００２２】
本開示のデオキシリボ核酸の非コード配列は、４０から２００ヌクレオチドまたはより詳細には４８から１１６ヌクレオチドの長さを有していてもよい。
【００２３】
上記に示されているＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴの配列は、配列ＣＣＴＡＧＧＧＧＴＴ  ＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡ  ＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧ  ＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴＣＴＴＡＧＧ  ＴＧＧＴＡＡＣＣ  ＣＣＴＡＧＧＧＧＴＴ  ＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡ  ＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧ  ＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ  ＣＧＴＴＣＴＴＡＧＧ  ＴＧＧＴＡＡＣＣ（配列番号５）の部分であってもよい。
【００２４】
配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４は、デオキシリボ核酸の非コード配列の一本鎖領域の部分であってもよいことが意図される。
【００２５】
本開示の別の目的は、本開示のデオキシリボ核酸の非コード配列を、組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と同時に、交互にまたは連続して提供するステップを含む方法である。
【００２６】
デオキシリボ核酸の非コード配列は、組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の前に提供されてもよい。代替的に、デオキシリボ核酸の非コード配列は、組合せ抗レトロウイルス療法および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と交互に提供されてもよいことが意図される。
【００２７】
本開示のさらなる目的は、医薬品としての使用のための上記に開示の特徴を有するデオキシリボ核酸の非コード配列である。
【００２８】
デオキシリボ核酸の非コード配列ならびにおそらくさらにＡＲＶおよび／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む医薬組成物の製造のための本開示のデオキシリボ核酸の非コード配列の使用は、本開示の別の目的である。
【００２９】
医薬組成物は、ワクチンであってもよく、それは、ＨＩＶ−１の治療のための治療用または予防用のワクチン接種におけるアジュバントとして上記に開示のような特徴を有するデオキシリボ核酸の非コード配列を使用することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本開示は、開示の実施形態に限定されることなく、例および図面によってさらに例示されることになる。本発明のデオキシリボ核酸の非コード配列は、図１〜３において「ＭＧＮ１７０３」、かつ図４において「ｄＳＬＩＭ」として、ラベル付けされている。
【図１Ａ】ＭＧＮ１７０３が、末梢血免疫エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞）において、細胞活性化のマーカー、ＣＤ６９の発現を上方制御することを示した図である。
【図１Ｂ】ＭＧＮ１７０３が、末梢血免疫エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞）において、細胞活性化のマーカー、ＣＤ６９の発現を上方制御することを示した図である。
【図２】ＭＧＮ１７０３刺激されたＮＫ細胞がＨＩＶの拡散を阻害することを示した図である。
【図３】本発明の非コードＤＮＡコンストラクトが、炎症促進性サイトカインＩＬ−６およびＴＮＦαにおいて無視できる変化を引き起こすことを示した図である。
【図４Ａ】ＤＮＡの非コード免疫賦活性配列でのＮＫ細胞の刺激の効果の活性化を示した図である。
【図４Ｂ】ＤＮＡの非コード免疫賦活性配列でのＮＫ細胞の刺激の効果の活性化を示した図である。
【図５Ａ】非コードＤＮＡコンストラクトでのＮＫ細胞の処理を示した図である。非コードＤＮＡコンストラクトは、ＨＩＶ−１産生自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性死滅を促進する。
【図５Ｂ】非コードＤＮＡコンストラクトでのＮＫ細胞の処理を示した図である。非コードＤＮＡコンストラクトは、ＨＩＶ−１産生自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性死滅を促進する。
【図５Ｃ】非コードＤＮＡコンストラクトでのＮＫ細胞の処理を示した図である。非コードＤＮＡコンストラクトは、ＨＩＶ−１産生自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性死滅を促進する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、ウイルス感染の治療のための化合物および方法を提供する。特に、本発明は、レトロウイルス感染およびウイルス潜伏の治療に関する。提供されるデオキシリボヌクレオチドの非コード配列は、ＨＩＶ発現細胞の死滅促進を導く、ＮＫ細胞活性およびＨＩＶ特異的ＣＤ８＋細胞傷害活性を実質的に増強する。
【００３２】
本開示の意味の範囲内で、直鎖状開鎖ＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドと呼ばれ、ＯＤＮと略記される。前記ＤＮＡ配列は、一本鎖であってもよく、または部分的にもしくは完全に二本鎖であってもよい。オリゴ、オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドという用語は、同義的に使用され、該当するＤＮＡ配列の長さの制限を示すものではない。オリゴヌクレオチドの単一成分は、ヌクレオチドである。
【００３３】
オリゴは、合成的に製造されてもよく、または部分的にもしくは完全に生物由来のものであってもよく、ここで、生物由来には、遺伝子に基づくＤＮＡ配列製造方法が含まれる。
【００３４】
Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−立体配座にあるヌクレオチドとは、天然に存在するＤ−デオキシリボースの代わりに糖残基としてＬ−デオキシリボースを含む、ヌクレオチドを指す。Ｌ−デオキシリボースは、Ｄ−デオキシリボースのエナンチオマー（鏡像）である。Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドから部分的にまたは完全になるオリゴヌクレオチドは、部分的にまたは完全に一本鎖または二本鎖であってもよい；しかし、Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドは、Ｄ−立体配座にあるヌクレオチドにハイブリダイズすることができない（Ｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００６  ３４：５１０１〜１１）。Ｌ−ＤＮＡは、Ｄ−ＤＮＡと同程度に可溶性かつ選択的である。さらに、Ｌ−ＤＮＡは、天然に存在する酵素、特に、エキソヌクレアーゼの酵素的エキソ活性に対して耐性であり、そのため、Ｌ−ＤＮＡは、細胞内分解に対して保護されている（Ｕｒａｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  ２０：３３２５〜３２）。したがって、Ｌ−ＤＮＡは、きわめて広く適用可能である。
【００３５】
本開示による「基部」とは、同じオリゴヌクレオチド内（これは、したがって部分的に自己相補的である）または異なるオリゴヌクレオチド内（これは、部分的にまたは完全に相補的である）でのいずれかの塩基対形成によって形成されたＤＮＡ二本鎖として理解される。分子内塩基対形成は同じオリゴヌクレオチド内での塩基対形成を意味し、異なるオリゴヌクレオチド間の塩基対形成は分子間塩基対形成と呼ばれる。
【００３６】
本開示の意味の範囲内での「ループ」とは、基部構造の中または末端のいずれかの、不対の一本鎖領域として理解される。「ヘアピン」は、基部およびループの異なる組合せであり、これは、同じオリゴヌクレオチドの２つの自己相補領域がハイブリダイズして１つの末端に不対のループを有する基部を形成するときに生じる。
【００３７】
ヌクレオチドが共有結合的にまたは非共有結合的に付加される「固相」とは、カラム、マトリックス、ビーズ、改変または官能化されたガラスなどのガラス、シリカまたは、シリコンおよび改変されたシリコンなどのシリカに基づく物質、プラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、およびスチレンと他の物質のコポリマー、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタンなどを含む）、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、多糖類、炭素、ならびに無機ガラスおよびプラスチックを指すが、これらに限定されない。したがって、マイクロタイタープレートも本開示による固相の範囲内である。
【００３８】
本開示による免疫調節とは、免疫刺激および免疫抑制を指す。免疫刺激とは、免疫系のエフェクター細胞を増殖、移動、分化または任意の他の形態で活性化させるために刺激することを優先的に意味する。Ｂ細胞増殖は、例えば、免疫賦活性オリゴヌクレオチドによって補助刺激シグナルなしで誘導することができ、これは、通常は、ヘルパー胸腺細胞からの補助刺激シグナルを必要とする。
【００３９】
一方、免疫抑制は、免疫系の活性化または効力を低下させることとして理解される。免疫抑制は、例えば、移植臓器の拒絶反応を防ぐために、骨髄移植後に移植片対宿主病を治療するために、または、例えば、関節リウマチもしくはクローン病のような、自己免疫疾患の治療のために、一般的には計画的に誘導される。
【００４０】
本開示の意味の範囲内での、かつその一般定義による、アゴニストとは、受容体またはリガンドのように、別の分子に結合し、したがって、その分子を活性化する、化学物質または分子を表す。活性化するアゴニストとは対照的に、アンタゴニストは、アンタゴニストが結合する分子の、それぞれのアゴニストとの相互作用を遮断する化学物質または分子として理解される。アンタゴニストは、別のアンタゴニストの、例えば、受容体との相互作用を遮断するので、文脈に依存して、本発明の理解におけるアンタゴニストは、プロセスの活性化ももたらしうる。
【００４１】
「薬学的に適用可能なまたは許容される塩」という用語には、本明細書中で使用される場合、本発明の化合物上に見出される特定の置換基に依存して、相対的に無毒性の（すなわち、薬学的に許容される）酸または塩基で調製された、組合せの化合物の塩が含まれる。例えば、本発明の化合物が酸官能性を含有する場合、塩基付加塩は、中性形態のこうした化合物を、無希釈または好適な不活性溶媒中のいずれかの、十分な量の望ましい塩基と接触させることによって得られてもよい。薬学的に許容される塩基付加塩の非限定的な例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩、または同様の塩が含まれる。本発明の化合物が塩基官能性を含有する場合、酸付加塩は、中性形態のこうした化合物を、無希釈または好適な不活性溶媒中のいずれかの、十分な量の望ましい酸と接触させることによって得られてもよい。薬学的に許容される酸付加塩の非限定的な例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、リン酸、部分的に中和したリン酸、硫酸、部分的に中和した硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸由来のもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような相対的に無毒性の有機酸由来の塩が含まれる。さらに含まれるのは、アルギニン酸塩などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）などのような有機酸の塩である。本発明のある特定の化合物は、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換されるのを可能にする塩基官能性および酸官能性の両方を含有していてもよい。塩を塩基と接触させることにより、本発明の化合物または酸の中性形態を再生してもよく、従来の様式で親化合物を分離する。化合物の親形態は、極性溶媒中での溶解性のような、特定の物理的特性において多様な塩形態と異なるが、それ以外では、塩は、本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。本発明の化合物は、キラル炭素原子もしくは不斉炭素原子（光学的中心）および／または二重結合を有していてもよい。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の光学異性体は、本発明によって包含される。本発明の化合物は、非溶媒和形態ならびに、水和形態を含む、溶媒和形態で存在していてもよい。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、これも本発明によって包含される。本発明の化合物は、さらに、複数の結晶質または非晶質の形態で存在していてもよい。
【００４２】
塩基配列Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４［式中、Ｎ１Ｎ２は、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴまたはＡＡの群からの要素であり、Ｎ３Ｎ４は、ＣＴまたはＴＴの群からの要素であり、かつＣ  デオキシシトシン、Ｇ  デオキシグアノシン、Ａ  デオキシアデノシンおよびＴ  デオキシチミジン］の１つまたは複数の配列を含有する、部分的に一本鎖の、ダンベル形の、デオキシリボヌクレオシド残基の共有結合的に閉じた鎖からなるデオキシリボ核酸分子は、抗レトロウイルス薬および／またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と組み合わせて使用される。
【００４３】
本開示に関連しているデオキシリボ核酸分子は、最長２００ヌクレオチドの長さを有していてもよい。特に、４８および１１６ヌクレオチドの間の長さを有する配列が意図される。
【００４４】
デオキシリボ核酸分子のダンベル形の非コード配列は、その一本鎖領域内に塩基配列Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を含んでいてもよい。
【００４５】
免疫刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生じうる。
【００４６】
本開示は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフおよびＬ−立体配座にある少なくとも１つのヌクレオチドを含む直鎖状開鎖ＤＮＡ配列も提供する。部分的／完全なＬ−立体配座のため、該ＤＮＡ配列は、部分的にまたは完全にエキソヌクレアーゼに耐性である。コンストラクトが二本鎖の一端に一本鎖ループを有する場合には、その端は分解に対しても保護されている。それにより、ＯＤＮは、有毒であることが示されている、ホスホロチオエート主鎖を使用する必要性を有することなく、全体で細胞分解に対して保護されている。さらに、最少の数のヌクレオチドのみからなるＯＤＮは、それらを小さくし、かつそれによって細胞内にトランスフェクトするのを容易にする。
【００４７】
少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を含むデオキシリボ核酸の非コード配列は、一本鎖であってもよく、または部分的にもしくは完全に二本鎖であってもよい。これは、同じ分子内（分子内）もしくは異なる分子内（分子間）またはこれらの任意の組合せの塩基対形成を含む。コンストラクトが少なくとも１つの不対の一本鎖領域を含むことも可能である。さらなる実施形態として、ヘアピン構造が含まれる。Ｌ−立体配座にあるヌクレオチドは分解されないので、部分的なまたは完全なＬ−立体配座のため、コンストラクトのより長い半減期が確保される。
【００４８】
一本鎖であるか、または部分的にもしくは完全に二本鎖である、少なくとも２つの分子を互いにライゲーションして多量体コンストラクトを形成することができることも本開示の範囲内である。したがって、これらの多量体コンストラクトは、１つの分子内に密接に詰め込まれた、かつしたがって、Ｔ細胞レギュレーターとの組合せの部分として、考慮すべき免疫応答も引き出すことが予想される、ライゲーションパートナーと少なくとも同じ数のＣｐＧモチーフを組み込む。得られた一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖の多量体コンストラクトは、分子内にＬ−立体配座にあるヌクレオチドを含む共有結合的に閉じた多量体コンストラクト、または細胞分解に対する保護のために５’端および／もしくは３’端にＬ−立体配座にあるヌクレオチドを含む開いた多量体コンストラクトのいずれかであってもよい。
【００４９】
本開示は、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基を含む群から選択される官能基を有する少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を含むデオキシリボ核酸の非コード配列内の少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾をさらに含む。これは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子または、例えば、吸着、共有結合性もしくはイオン性の結合による、固相を含む群から選択される化合物にＤＮＡコンストラクトをカップリングすることを可能にする。
【００５０】
それぞれの目的のために改変を特異的に選択することができる。コンストラクトは、したがって、例えば、組み込まれたＣｐＧモチーフに応答する特定の細胞に他の分子を往復輸送するために、使用することができる。さらに、こうした改変によってコンストラクトをマイクロプロジェクタイルにカップリングさせることが可能であり、これを使用して細胞内にコンストラクトを移入することができる。コンストラクトは、固相、例えば、マイクロタイタープレートとカップリングされてもよい。
【００５１】
図１は、ＭＧＮ１７０３が、末梢血免疫エフェクター細胞において、細胞活性化のマーカー、ＣＤ６９の発現を上方制御することを示している。全ＰＢＭＣ（ｎ＝５  別々のドナー）をＭＧＮ１７０３またはＬＰＳで刺激した。刺激後、細胞をフローサイトメトリーを介して解析し、ＮＫ細胞（左）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞（右）におけるＣＤ６９発現を特徴付けした。培地対照を超えた平均倍率を示している。
【００５２】
図２は、ＭＧＮ１７０３刺激されたＮＫ細胞がＨＩＶの拡散を阻害することを示している。ＣＤ４を枯渇させたＰＢＭＣ（示されているＳＤを有する１名の代表的なドナー）をＭＧＮ１７０３またはＬＰＳで刺激した。刺激後、細胞を自己のＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞と共にインキュベートした。ＨＩＶカプシドタンパク質（Ｇａｇｐ２４）を培養液上清においてウイルス拡散の測定値として経時的に定量化した。
【００５３】
図３は、非コードＤＮＡコンストラクトが、炎症促進性サイトカインＩＬ−６（図３Ａ）およびＴＮＦα（図３Ｂ）に対する効果をほとんど有していないことを示している。「ＵＴ」は、未処理の対照を表し、「ＭＧＮ１７０３」は、左から右に０．７５μＭ、１．５μＭ、および３μＭの濃度で適用された非コードＤＮＡコンストラクトを表す。したがって、デオキシリボヌクレオチドの非コード免疫賦活性配列の使用により、サイトカインに基づく意図しない炎症を惹起することなく、ウイルス感染細胞が活性化された。
【００５４】
デオキシリボヌクレオチドの非コード免疫賦活性配列でＮＫ細胞を刺激する活性化効果を確認するために、ＮＫ細胞の活性化受容体または阻害性受容体に対する効果を調査した。図４Ａおよび４Ｂは、活性化受容体の発現のみが非コードＤＮＡ配列によって上昇することを示している。
【００５５】
図５は、図２に示したウイルス阻害がＨＩＶ特異的な死滅の結果であって非特異的なＣＤ４  Ｔ細胞死ではないことを確認するために行った実験の結果を示している。ＨＩＶ感染細胞を６日目に収集し、細胞内Ｐ２４抗原について染色した。図５Ａは、単独で培養したＣＤ４  Ｔ細胞を示し、図５Ｂは、未処理のＮＫ細胞と共に培養したＣＤ４  Ｔ細胞を示し、かつ図５Ｃは、ｄＳＬＩＭ処理したＮＫ細胞と共に培養したＣＤ４  Ｔ細胞を示している。各図面内の四角は、ＨＩＶ感染細胞の集団をゲートにかけるものである。全集団におけるそれらの百分率を四角の上に示している。
【００５６】
図５にある結果は、本開示による非コードＤＮＡコンストラクトでのＮＫ細胞の治療が、ＨＩＶ感染細胞の数を著しく減少させるのに好適であることを確認するものである。
【００５７】
本質的には、本開示は、潜伏の原因となるウイルス感染の治療が、本開示による非コードＤＮＡコンストラクトでの治療によって支持されうることを実証する。感染細胞は、活性化または「脱潜伏」されることになり、それによって、免疫系がそれらを死滅させることができるようになる。したがって、ＨＩＶ感染の、ｃＡＲＴとの組合せ治療は、例えば、免疫賦活性非コードＤＮＡを適用することによって支持される。
【００５８】
ｃＡＲＴとＨＤＡＣｉが組み合わされた従来技術として記載される結果を参照すれば、ＨＩＶ治療のそれらの２つの成分と免疫賦活性非コードＤＮＡコンストラクトとの組合せ治療はＨＩＶ治療に有益になりうるようである。こうした有益な効果を証明することを目的とする対応する実験が現在行われている。
【００５９】
本開示の非コード免疫賦活性ＤＮＡコンストラクトが炎症促進性サイトカイン刺激を避けるという利点を有することに注目しなければならない。対照的に、化学修飾によるヌクレアーゼ分解に対して安定である非コードＤＮＡコンストラクトは、炎症促進性サイトカイン放出を引き起こすことが知られている。
【００６０】
潜伏性レトロウイルス感染細胞の刺激が、ＨＩＶ感染のＡＩＤＳへの進行を促進する結果にならなかったのは驚くべきことであった。上記の開示によるコンストラクトでの刺激が、ｃＡＲＴおよび／またはＨＤＡＣｉでのＨＩＣ治療の成功率を高めることは予測不能であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際調査報告】
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