(57)【要約】  本発明はプログラム細胞死リガンド1（PD-L1)遮断薬を持つキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞に関する。本発明は更に、当該免疫エフェクター細胞をベクターとしてPD-L1の遮断薬を分泌発現する方法を提供する。これにより、キメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の抗腫瘍作用が向上する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PD-L1遮断薬を持つキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項２】
前記PD-L1遮断薬は、
可溶性PD-1、
可溶性PD-1とhIgG4e1-FcのCH3ドメインの融合ペプチド、
可溶性PD-1とhIgG4e1-Fcの融合ペプチド、又は
特異的抗PD-L1抗体を含むことを特徴とする請求項1に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項３】
前記可溶性PD-1は、シグナルペプチドとPD-1の細胞外領域を含み、好ましくは、前記シグナルペプチドは配列番号 1に示されるヌクレオチド配列でコードされ、好ましくは、前記PD-1の細胞外領域は配列番号 2に示されるヌクレオチド配列でコードされることを特徴とする請求項2に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項４】
前記hIgG4e1-FcのCH3ドメインは配列番号 2に示されるヌクレオチド配列でコードされる、及び/又は前記hIgG4e1-Fcの配列において288番目のアミノ酸がSerからProに突然変異したことを特徴とする請求項2に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項５】
キメラ抗原受容体は細胞外抗原結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記細胞外抗原結合領域は腫瘍に高発現する抗原に特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項1に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項６】
前記細胞内シグナル領域はCD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、4-1BB、CD134、CD40の細胞内シグナル領域配列又はMyd88、若しくはその組み合わせを含むことを特徴とする請求項5に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項７】
前記膜貫通領域はCD8膜貫通領域、CD28膜貫通領域を含むことを特徴とする請求項6に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項８】
前記腫瘍に高発現する抗原はEGFR、GPC3、HER2、EphA2、クローディン18.1、クローディン18.2、クローディン6、GD2、EpCAM、メソテリン、CD19、CD20、ASGPR1、EGFRvIII、de4 EGFR、CD19、CD33、IL13R、LMP1、PLAC1、NY-ESO-1、MAGE4、MUC1、MUC16、LeY、CEA、CAIX、CD123を含むことを特徴とする請求項5に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項９】
前記免疫エフェクター細胞はTリンパ球、NK細胞又はNKT細胞、Treg細胞を含むことを特徴とする請求項1に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項１０】
免疫エフェクター細胞を修飾するための融合ポリペプチドをコードする核酸構築物であって、前記核酸構築物は、順に連結しているPD-L1遮断薬をコードする配列、細胞外抗原結合領域をコードする配列、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域をコードする配列を含み、前記細胞外抗原結合領域は腫瘍に高発現する抗原に特異的に結合する抗体である核酸構築物。
【請求項１１】
前記PD-L1遮断薬をコードする配列と細胞外抗原結合領域をコードする配列との間はリンカーペプチドをコードする配列で連結される、及び/又は、
前記PD-L1遮断薬をコードする配列と細胞外抗原結合領域をコードする配列との間に、更にリボソームスキップ配列が含まれることを特徴とする請求項10に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
請求項11に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項12に記載の発現ベクターを含むことを特徴とするウイルス。
【請求項１４】
腫瘍にターゲッティングするキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞を製造するための、請求項10の核酸構築物、又は当該核酸構築物を含む発現ベクター又はウイルスの使用。
【請求項１５】
腫瘍抑制医薬組成物を製造するための、請求項1〜9のいずれかに記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の使用。
【請求項１６】
請求項1〜9のいずれかに記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞を含むことを特徴とする腫瘍抑制医薬組成物。
【請求項１７】
免疫エフェクター細胞の抗腫瘍作用を増大させる、キメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の製造のためのPD-L1遮断薬の使用。
【請求項１８】
前記PD-L1遮断薬は、
可溶性PD-1、
可溶性PD-1とhIgG4e1-FcのCH3ドメインの融合ペプチド、
可溶性PD-1とhIgG4e1-Fcの融合ペプチド、又は
特異的抗PD-L1抗体、を含むことを特徴とする請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
腫瘍はPD-L1を発現する腫瘍である、請求項1に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞、請求項11に記載の核酸構築物、請求項14に記載の核酸構築物、又は当該核酸構築物を含む発現ベクター又はウイルスの使用、請求項15に記載の使用又は請求項16に記載の腫瘍抑制医薬組成物。
【請求項２０】
請求項10に記載の核酸構築物を免疫エフェクター細胞に導入することを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫治療分野に関し、特にPD-L1遮断薬を持つキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫エフェクター細胞(例えばTリンパ球)の腫瘍免疫応答における作用は重視されつつある。現在、Tリンパ球による養子免疫治療は一部の腫瘍においてある程度の効果が得られ、且つこのような免疫療法は抗体療法の問題を解消することができるものの、大多数の腫瘍に対する治療効果は未だ満足できるものではない。近年、CTLの標的細胞に対する認識特異性がTリンパ球受容体(T Cell Receptor、TCR)に依存するという発見に基づき、腫瘍細胞関連抗原に対する抗体のscFvをTリンパ球受容体のCD3ζやFcεRIγ等の細胞内シグナル活性化モチーフと融合させてキメラ抗原受容体(Chimeric antigen receptor、CAR)とし、そして、それを例えばレンチウイルス感染等の手段によりTリンパ球表面に遺伝子修飾する。このようなCAR Tリンパ球は主要組織適合複合体(Major Histocompatibility Complex、MHC) 非拘束性の形態でTリンパ球を選択的に腫瘍細胞にターゲッティングし、特異的に腫瘍を殺傷することができる。
【０００３】
キメラ抗原受容体は細胞外結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含む。通常、細胞外領域は腫瘍関連抗原を認識できるscFvを含み、膜貫通領域としてはCD8、CD28等の分子の膜貫通領域が用いられ、細胞内シグナル領域としては免疫受容体活性化チロシンモチーフ (ITAM) CD3ζ又はFcεRIγ及び共刺激シグナル分子CD28、CD27、CD137、CD134等の細胞内シグナル領域が用いられる。
【０００４】
細胞内シグナル領域がITAMのみを含むものは、第一世代CAR Tリンパ球であり、そのキメラ抗原受容体の各部分はscFv-TM-ITAMの形態で連結している。このようなCAR Tは抗腫瘍の細胞毒性効果を引き起こすことができるが、サイトカインの分泌が少なく、且つ生体内で長続きする抗腫瘍効果を引き起こすことができない。
【０００５】
その後、開発された第二世代のCAR Tリンパ球にCD28又はCD137(別名4-1BB)の細胞内シグナル領域が加えられ、そのキメラ抗原受容体の各部分はscFv-TM-CD28 -ITAM又はscFv-TM-/CD137-ITAMの形態で連結している。細胞内シグナル領域によるB7/CD28又は4-1BBL/CD137の共刺激作用はTリンパ球の連続的な増殖を引き起こし、Tリンパ球からのIL-2やIFN-γ等のサイトカインの分泌レベルを向上させるとともに、CAR T生体内での生存周期と抗腫瘍效果を向上させることができる。
【０００６】
近年開発された第三世代のCAR Tリンパ球において、キメラ抗原受容体の各部分はscFv-TM-CD28-CD137-ITAM又はscFv-TM-CD28-CD134-ITAMの形態で連結しており、CAR T生体内の生存周期とその抗腫瘍效果は更に向上した。
【０００７】
免疫エフェクター細胞は腫瘍免疫治療において将来性を備えるものの、固形腫瘍における治療効果は未だ顕著ではなく、免疫エフェクター細胞の腫瘍組織内における生存率も低く、活性も高くない。よって、当分野において更なる研究が必要とされており、腫瘍免疫治療に対する免疫エフェクター細胞の治療効果の更なる向上が切望されている。  
【発明の概要】
【０００８】
本発明はPD-L1遮断薬を持つキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞を提供とすることを目的とする。
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一つは、PD-L1 (プログラム細胞死リガンド1) 遮断薬 (Blocker)を持つ又は発現するキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞を提供する。
【００１０】
一つの好ましい例において、前記PD-L1遮断薬は、
可溶性PD-1 (sPD-1)、
可溶性PD-1とhIgG4e1-FcのCH3ドメインの融合ペプチド、
可溶性PD-1とhIgG4e1-Fcの融合ペプチド、又は
特異的抗PD-L1抗体、を含む（但しこれらに限らない）。
【００１１】
もう一つの好ましい例において、前記可溶性PD-1はシグナルペプチドと細胞外領域を含む。好ましくは、前記シグナルペプチドは配列番号 1に示されるヌクレオチド配列でコードされる。好ましくは、前記細胞外領域は配列番号 2に示されるヌクレオチド配列でコードされる。
【００１２】
もう一つの好ましい例において、前記hIgG4e1-FcのCH3ドメインは配列番号 2に示されるヌクレオチド配列でコードされる、及び/又は
前記hIgG4e1-Fcの配列において288番目のアミノ酸がSerからProに突然変異した。
【００１３】
もう一つの好ましい例において、前記キメラ抗原受容体は細胞外抗原結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記細胞外抗原結合領域は腫瘍に高発現する抗原に特異的に結合する抗体である。
【００１４】
もう一つの好ましい例において、前記細胞内シグナル領域はCD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134、CD40の細胞内シグナル領域配列又はMyd88、若しくはその組み合わせを含む（但しこれらに限らない）。
【００１５】
もう一つの好ましい例において、前記膜貫通領域はCD8 (例えばCD8α)膜貫通領域、CD28膜貫通領域を含む（但しこれらに限らない）。
【００１６】
もう一つの好ましい例において、前記細胞外抗原結合領域と膜貫通領域との間に更にヒンジ領域を含む。好ましくは、当該ヒンジ領域はCD8(例えばCD8α)ヒンジ領域を含む。
【００１７】
もう一つの好ましい例において、前記腫瘍に高発現する抗原はEGFR、GPC3、HER2、EphA2、クローディン（Claudin）18.1、クローディン18.2、クローディン6、GD2、EpCAM、メソテリン（mesothelin）、CD19、CD20、ASGPR1、EGFRvIII、de4 EGFR、CD19、CD33、IL13R、LMP1、PLAC1、NY-ESO-1、MAGE4、MUC1、MUC16、LeY、CEA、CAIX、CD123を含む（但しこれらに限らない）。
【００１８】
もう一つの好ましい例において、前記腫瘍に高発現する抗原に特異的に結合する抗体は一本鎖抗体又はドメイン抗体である。
【００１９】
もう一つの好ましい例において、前記免疫エフェクター細胞はTリンパ球、NK細胞又はNKT細胞、Treg細胞を含む。
【００２０】
本発明のもう一つは、免疫エフェクター細胞を修飾するための融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、順に連結しているPD-L1遮断薬をコードする配列、細胞外抗原結合領域をコードする配列、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域をコードする配列を含み、前記細胞外抗原結合領域は腫瘍に高発現する抗原に特異的に結合する抗体である。
【００２１】
一つの好ましい例において、前記PD-L1遮断薬をコードする配列と細胞外抗原結合領域をコードする配列との間はリンカーペプチドをコードする配列で連結される、及び/又は、
前記PD-L1遮断薬をコードする配列と細胞外抗原結合領域をコードする配列との間に、更にリボソームスキップ配列(F2A)が含まれる。
【００２２】
もう一つの好ましい例において、前記リンカーペプチドは(Gly Gly Gly Gly Ser)3である。
【００２３】
本発明のもう一つは、前記核酸構築物を含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
本発明のもう一つは、前記発現ベクターを含むウイルスを提供する。
【００２５】
本発明のもう一つは、腫瘍にターゲッティングするキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞を製造するための、前記核酸構築物、又は当該核酸構築物を含む発現ベクター又はウイルスの使用を提供する。
【００２６】
一つの好ましい例において、前記免疫エフェクター細胞はPD-1を発現する免疫エフェクター細胞である。
【００２７】
本発明のもう一つは、腫瘍抑制医薬組成物を製造するための前記キメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の使用を提供する。
【００２８】
本発明のもう一つは、前記キメラ受容体修飾免疫エフェクター細胞を含む腫瘍抑制医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明のもう一つは、免疫エフェクター細胞の抗腫瘍作用を増大させる、キメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の製造するための、PD-L1遮断薬の使用を提供する。
【００３０】
一つの好ましい例において、前記PD-L1遮断薬は、
可溶性PD-1、
可溶性PD-1とhIgG4e1-FcのCH3ドメインの融合ペプチド、
可溶性PD-1とhIgG4e1-Fcの融合ペプチド、又は
特異的抗PD-L1抗体、を含む（但しこれらに限らない）。
【００３１】
もう一つの好ましい例において、前記腫瘍はPD-L1を発現 (又は高発現)する腫瘍である。
【００３２】
本発明のもう一つは、前記核酸構築物を免疫エフェクター細胞に導入することを含むキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞の製造方法を提供する。
【００３３】
本発明の他の面は本文の開示内容により、当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図1はヒト由来可溶性PD-1 (sPD-1)、sPD-1-CH3、sPD-1-Fc融合蛋白質の概略図である。
【図２】図2はsPD-1-FcとM27-CARの融合蛋白質の概略図である。VLとVHはそれぞれ一本鎖抗体M27(即ちY022一本鎖抗体であり、これは抗原EGFRvIII及び過剰に発現したEGFRを特異的に認識できる。中国専利出願番号：201510431481.6参照)の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を示す。CAR領域において、4-1BB-CD3ζをBBZと略称し、CD28-CD3ζを28Zと略称し、CD28-4-1BB-CD3ζを28BBZと略称する。
【図３】図3はsPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27 CAR T細胞の陽性率を示した図である。
【図４】図4はsPD-1-CH3/sPD-1-Fcの感染T細胞&上清における発現を示した図である。Lysisは細胞溶解液を表し、supernatantは上清液を表す。
【図５】図5は腫瘍細胞系におけるEGFR287-302エピトープの暴露状況を示した図である。
【図６】図6はPD-L1及びEGFRの各種腫瘍細胞系における発現状況分析を示した図である。
【図７】図7はsPD-1-Fc-F2A-M27 CAR T細胞のU87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27に対する殺傷效果を示した図である。図中、M27-28Z、M27-BBZ、M27-28BBZはM27-28Z、M27-BBZ、M27-28BBZのみ発現したTリンパ球を導入した実験結果を示す。FC-28Z、FC-BBZ、FC-28BBZはsPD-1-Fc-F2A-M27-28Z、sPD-1-Fc-F2A-M27-BBZ、sPD-1-Fc-F2A-M27-28BBZを発現したTリンパ球を導入した実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明者は深く研究した後、免疫エフェクター細胞に発現するプログラム細胞死リガンド-1 (PD-L1) の受容体PD-1と腫瘍細胞に発現するプログラム細胞死リガンド-1の結合を阻害することにより、腫瘍における免疫エフェクター細胞の生存及び機能が向上する方法を開示した。
【００３６】
本発明において使用される用語「腫瘍に高発現する抗原」とはキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞がターゲッティングする抗原を指し、当該抗原は腫瘍又は細胞において高発現する。好ましくは、当該「腫瘍に高発現する抗原」とは腫瘍関連抗原を指し、例えばEGFR、GPC3、HER2、EphA2、クローディン18.1、クローディン18.2、クローディン 6、GD2、EpCAM、メソテリン、CD19、CD20、ASGPR1、EGFRvIII、de4 EGFR、CD19、CD33、IL13R、LMP1、PLAC1、NY-ESO-1、MAGE4、MUC1、MUC16、LeY、CEA、CAIX (炭酸脱水酵素IX)、CD123から選ばれる（但しこれらに限らない）。
【００３７】
本発明において、当分野において既知の複数種の腫瘍はみな本発明に含まれる。当該腫瘍はプログラム細胞死リガンド-1が発現(又は高発現)し、かつ正常組織に低発現する腫瘍関連抗原(腫瘍に高発現する抗原)が発現さえすればよい。例えば前記腫瘍として、肝癌、肺癌、悪性グリオーマ、乳癌、皮膚扁平上皮細胞癌、口腔扁平上皮癌、胃癌、前立腺癌、脳腫瘍、卵巣癌、骨腫瘍、結腸癌、甲状腺腫瘍、縦隔腫瘍、腸腫瘍、腎腫瘍、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、睾丸腫瘍、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、神経系腫瘍、食道癌、胸膜中皮腫、膵臓癌、白血病、頭頚部腫瘍、子宮頸癌、メラノーマ、膣上皮癌、胆嚢癌、悪性線維性組織球腫を含む（但しこれらに限らない）。
【００３８】
用語「キメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞 (又は略称キメラ抗原受容体免疫エフェクター細胞)」とは当分野で公知のものであり、遺伝子組み換え技術により抗原(例えば腫瘍抗原)に特異的なキメラ受容体を発現する免疫エフェクター細胞であり、ターゲッティング的に殺傷作用を発揮できる。前記免疫エフェクター細胞としては例えばT細胞、NK細胞、NKT細胞、制御性T細胞(Regulatory cell、略称Treg )を含む。通常の「キメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞」を調製する方法としては当業者にとって既知であり、例えばCD28 (好ましくはCD28a、CD28bを含む)、CD137、CD27、CD3ζ(好ましくはCD3ζ細胞内ドメイン)、CD8、CD19、CD134、CD20、FcεRIγのうちの一種又は複数種である細胞内共刺激分子の細胞内ドメインを発現させることを含む。これらは対応するリガンドと結合することにより、免疫エフェクター細胞の第二シグナルが活性化され、免疫細胞の増殖能力及びサイトカインの分泌機能が増大され、免疫細胞の生存時間が延長される。
【００３９】
腫瘍組織内における免疫エフェクター細胞の生存率が低く、活性が高くない一つの重要な原因は、おそらく固形腫瘍細胞又は他の細胞にPD-L1が発現することによりキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞(例えばCAR T細胞)の生存に影響することであると考えられる。腫瘍細胞はPD-L1を高発現することにより、免疫エフェクター細胞上の受容体PD-1と結合し、負調節シグナルを伝達し、腫瘍抗原特異的T細胞のアポトーシスと免疫不能を引き起こし、生体の免疫監視と殺傷を逃避する。
【００４０】
PD-1/PD-L1は免疫グロブリンスーパーファミリーの共刺激分子の重要成員として、自身の免疫、移植免疫及び腫瘍免疫等の生体の免疫調節プロセスに参与する。PD-1は主に活化免疫エフェクター細胞(例えばTリンパ球)に発現する抑制性受容体であり、そのリガンドPD-L1と結合し、免疫エフェクター細胞の活性化と増殖を顕著に抑制するとともに、サイトカインの発現と分泌を調節する。PD-L1は複数種の免疫細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞に広く発現し、PD-L1は複数種の腫瘍においてみな過剰に発現される。現在、多くの研究により明らかなのは、複数種のヒトの腫瘍に大量に発現するPD-L1分子は患者の臨床病理特徴と予後に密接に関係しており、腫瘍の検出と予後判断の新しい生物学的指標となっている。
【００４１】
よって、本発明者は、キメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞がPD-L1の可溶性受容体又は抗体又は他の遮断薬を分泌発現することができれば、固形腫瘍内におけるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞の生存及び機能を増大できる可能性があると想定した。そして、この想定に基づき、本発明者は更に検証を行い、免疫エフェクター細胞にPD-L1の可溶性受容体(sPD-1)が発現し、良好な抗腫瘍活性を起こすことができることを証明した。
【００４２】
本発明の好ましい形態として、本発明のキメラ抗原受容体の構造の概略図は図1を参照できる。順に(好ましくはN端からC端まで)、プログラム細胞死リガンド-1遮断薬、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル領域を含む。
【００４３】
前記プログラム細胞死リガンド-1(PD-L1)遮断薬はPD-L1をダウンレギュレーション、阻害、ブロック、抑制できる複数種の物質とすることができ、PD-L1と免疫エフェクター細胞に発現するPD-1の相互作用を阻止又は競争的に干渉できればよい。本発明の好ましい形態として、前記プログラム細胞死リガンド-1遮断薬はsPD-1、sPD-1とhIgG4e1-FcのCH3ドメインの融合ペプチド、sPD-1とhIgG4e1-Fcの融合ペプチド、又は特異的抗PD-L1抗体を含む（但しこれらに限らない）。
【００４４】
本発明の好ましい形態として、前記細胞外抗原結合領域は腫瘍に高発現する抗原を特異的に認識する抗体を含み、好ましくは一本鎖抗体である。より好ましくは、前記キメラ抗原受容体の細胞外抗原結合領域がCD8ヒンジ領域を介してCD8又はCD28の膜貫通領域と互いに連結され、膜貫通領域のすぐ後に細胞内シグナル領域が連結される。
【００４５】
キメラ抗原受容体の膜貫通領域はCD8又はCD28等の蛋白質の膜貫通領域から選ばれるものであってよい。ヒトCD8蛋白質はヘテロ二量体形態であり、αβ又はγ δの二本鎖からなる。本発明の一つの実施形態において、膜貫通領域はCD8α又はCD28の膜貫通領域から選ばれるものである。この他、CD8αヒンジ領域(hinge)はフレキシブル領域であるため、CD8又はCD28の膜貫通領域とヒンジ領域とともに、キメラ抗原受容体CARの細胞外抗原結合領域と細胞内シグナル領域との連結に用いられる。
【００４６】
細胞内シグナル領域はCD3ζ、FcεRIγ、CD28、CD137 (4-1BB)、CD134蛋白質の細胞内シグナル領域及びその組み合わせから選ばれるものであってもよい。CD3分子は五個のサブユニットからなり、そのうちCD3ζサブユニット(別称CD3 zeta、略称Z)は三個のITAMモチーフを含み、当該モチーフはTCR-CD3複合体における重要なシグナル伝達領域である。CD3δZは短く切断されたITAMモチーフを持たないCD3ζ配列であり、本発明の実施において通常、陰性対照の構築に用いられる。FcεRIγは主に肥満細胞と好塩基性細胞の表面に分布し、一つのITAMモチーフを含み、構造、分布及び機能においてCD3ζに類似する。この他、上述のように、CD28、CD137、CD134は共刺激シグナル分子であり、それぞれのリガンドと結合すると、その細胞内シグナル領域に発生した共刺激作用は、免疫エフェクター細胞(主にTリンパ球)の連続増殖を引き起こすとともに、免疫エフェクター細胞からのIL-2やIFN-γ等のサイトカインの分泌レベルを向上させ、同時にCAR免疫エフェクター細胞の生体内の生存周期と抗腫瘍效果を向上させることができる。
【００４７】
本発明にかかるキメラ抗原受容体ポリペプチドは、以下のように順に連結される
細胞外抗原結合領域-CD8膜貫通領域-4-1BB-CD3ζ、
細胞外抗原結合領域-CD28a-CD28b-CD3ζ、
細胞外抗原結合領域-CD28a-CD28b-4-1BB-CD3ζ、
及びその組み合わせの群から選ばれるものであってもよい。但し関連するキメラ抗原受容体蛋白質中のCD28aはCD28分子の膜貫通領域を示し、CD28bはCD28分子の細胞内シグナル領域を示す。
【００４８】
本発明は前記キメラ抗原受容体をコードする核酸も含む。本発明は更に、本発明と同様なアミノ酸配列を有するポリペプチド又はポリペプチドの断片、類似物、誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。
【００４９】
本発明は更に、上記キメラ抗原受容体の核酸を含むベクターを提供する。本発明は更に、上記ベクターを含むウイルスを含む。本発明のウイルスはパッケージング済みの感染力を有するウイルスを含み、感染力を有するウイルスのパッケージングに必要な成分を含有する未パッケージングのウイルスも含む。外来遺伝子を免疫エフェクター細胞に形質導入するための当分野で既知の他のウイルス及びそれに対応するプラスミドベクターも本発明に適用できる。
【００５０】
本発明は更に、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸が形質導入された、又は前記核酸が含まれた組み換えプラスミド、又は当該プラスミドを含むウイルスが形質導入されたキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞を提供する。非ウイルススによる形質導入方法とウイルススによる形質導入方法を含む当分野の通常の核酸形質導入方法のいずれも本発明に適用できる。非ウイルスによる形質導入方法は、エレクトロポレーション法とトランスポゾン法を含む。最近、Amaxa社が研究開発したNucleofector核内トランスフェクターによれば、外来遺伝子を直接細胞核に導入し、目的遺伝子の効率的な形質導入を実現することができる。また、眠れる森の美女トランスポゾンシステム(Sleeping Beauty system)又はPiggyBacトランスポゾン等のトランスポゾンシステムによる形質導入効率は、通常のエレクトロポレーションより大きく向上しており、nucleofectorトランスフェクターと眠れる森の美女トランスポゾンシステムの併用は既に報告されており[Davies JK.、et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res、2010、70(10): OF1-10.]、当該方法は高い形質導入效率を有するだけでなく、目的遺伝子の部位特異的インテグレーションも実現できる。本発明のもう一つの実施形態において、キメラ抗原受容体遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を実現する形質導入方法はレトロウイルスやレンチウイルスのようなウイルスに基づく形質導入方法である。当該方法は、形質導入效率が高く、外来遺伝子が安定的に発現でき、かつ体外で免疫エフェクター細胞を臨床レベル数まで培養する時間を短縮できる等の利点がある。当該遺伝子組み換え免疫エフェクター細胞表面では、形質導入された核酸は転写、翻訳によりその表面に発現する。各種異なる培養腫瘍細胞に対してインビトロ細胞毒性実験を行うことで、本発明のキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞は、高度で特異的な腫瘍細胞殺傷效果(細胞毒性とも言う)を有
し、かつ腫瘍組織において有效生存することが証明された。よって、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸、当該核酸を含むプラスミド、当該プラスミドを含むウイルス、前記核酸、プラスミド又はウイルスが形質導入された遺伝子組み換え免疫エフェクター細胞は、腫瘍の免疫治療に有効適用できる。
【００５１】
本発明にかかるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞は更に、外来のサイトカインのコード配列を持つことができる。前記サイトカインはIL-12、IL-15又はIL-21等を含むが、これらに限らない。これらサイトカインは免疫調節又は抗腫瘍の活性を有し、エフェクターT細胞及び活性化されたNK細胞の機能をエンハンスメントでき、又は抗腫瘍作用を直接発揮できる。よって、当業者であれば、これらサイトカインの運用は前記免疫細胞に対してより良好な作用を発揮すると理解できる。
【００５２】
本発明にかかるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞は更に、上記キメラ受容体以外の別のキメラ受容体を発現でき、当該受容体はCD3ζを含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメイン、又はこの両者の組み合わせを含む。
【００５３】
本発明にかかるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞は更に、ケモカイン受容体を発現できる。前記ケモカイン受容体はCCR2を含むが、これに限らない。当業者であれば、前記CCR2ケモカイン受容体は体内のCCR2がこれと競争的に結合し、腫瘍の転移を阻害するのに有益であることを理解できる。
【００５４】
本発明にかかるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞は更に、PD-1の発現を低減できるsiRNA又はPD-L1を阻害する蛋白質を発現することができる。当業者であれば、PD-L1とその受容体PD-1の相互作用を競争的に阻害することは、抗腫瘍T細胞の反応を回復し、腫瘍の成長を抑制するのに有益であることを理解できる。
【００５５】
本発明にかかるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞は更に、安全スイッチを発現できる。好ましくは、前記安全スイッチはiCaspase-9、短縮型（truncated） EGFR又はRQR8を含む。
【００５６】
本発明のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞は医薬組成物又は診断キットを調製するために使用できる。前記組成物は有效量の前記免疫細胞を含む他、さらに薬学的に許容し得るベクターを含む。用語「薬学的に許容し得る」とは分子本体と組成物が動物やヒトに適切に投与されるとき、不具合、過敏、又はその他の不良な反応を起こさないことを指す。
【００５７】
薬学的に許容し得るベクター又はその成分の幾つかの物質の具体例としては、乳糖、ブドウ糖、蔗糖等の糖類；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉等の澱粉；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース及びその誘導体；トラガカントゴム粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等の固体潤滑材；硫酸カルシウム；落花生油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、カカオ脂等の植物油；プロパンジオール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール等のポリオール；アルギン酸；Tween等の乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤；着色剤；調味料；ペレタイザー、安定剤；抗酸化剤；防腐剤；脱パイロゲン水；等張液及びリン酸緩衝液等とすることができる。
【００５８】
本発明の組成物は必要に応じて各種剤型に調製できるとともに、医師が患者のタイプ、年齢、体重、大体の病状、投与法等の要素に基づき病人に対して有効な量を決めて用いることができる。投与法は注射又はその他の療法とすることができる。
【００５９】
本発明のキメラ抗原受容体修飾免疫エフェクター細胞は腫瘍内におけるキメラ抗原修飾免疫エフェクター細胞の生存及び機能を効果的に増大することができる。
【００６０】
以下、具体的な実施例と合わせて更に本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常の条件、例えばジョゼフ・サムブルック等の著作「分子クローニング実験指南、第三版、科学出版社、2002」に記載の条件、又はメーカーで薦めている条件に従って行う。
【実施例】
【００６１】
実施例1、可溶性sPD-1-Fc結合キメラ抗原(EGFR VIII)受容体の組み換えレンチウイルスベクターPRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1- Fc-F2A-M27-CARの構築
【００６２】
1. ヒト由来sPD-1、sPD-1-CH3及sPD-1-Fc配列デザイン
(1) ヒト由来sPD-1等配列デザイン
図1に示されるように、ヒト由来sPD-1蛋白質はPD-1のシグナルペプチド及び細胞外ドメインを含む。ヒト由来sPD-1-CH3蛋白質はPD-1のシグナルペプチド、細胞外ドメインを含むとともに、リンカー（linker）を介してhIgG4e1-FcのCH3ドメインを結合する。ヒト由来sPD-1-Fc融合蛋白質はPD-1のシグナルペプチド及び細胞外ドメインを保留するとともに、リンカーを介してhIgG4e1-Fcドメインを融合することで、その安定性を増大させる。hIgG4e1-FcはS288P突然変異を有するため、hIgG4e1-Fcが人体内で引き起こす補体依存の細胞毒性(CDC)及び抗体依存性細胞仲介の細胞毒性(ADCC)を低減させることができる。hIgG4e1-Fc配列はInvivogen社のpFUSE-hIgG4e1-Fc1プラスミド(http://www.invivogen.com/pfuse-higg4e1-fc)を参照できる。
【００６３】
PD-1 DNA配列はPubmed Nucleotideデータベースを参照し、PD-1と対応する番号はNM_005018.2であり、PD-1のシグナルペプチド(1-20アミノ酸)及び細胞外セグメント(21-170アミノ酸)はUniprotデータベースを参照できる。
【００６４】
PD-1シグナルペプチド配列：
【表１】
2018537088.tif 000002
PD-1細胞外セグメント配列：
【表２】
2018537088.tif 000003
【００６５】
(2) ヒト由来sPD-1-CH3配列デザイン
sPD-1はリンカーを介してhIgG4e1-Fc中のCH3ドメインと連結し、リンカー配列はTATGGTである。CH3ドメイン配列はpFUSE-hIgG4e1-Fc1プラスミドを参照できる。
【００６６】
CH3ドメインのDNA配列：
【表３】
2018537088.tif 000004
【００６７】
(3) ヒト由来sPD-1-Fc配列デザイン
sPD-1はリンカーを介してhIgG4e1-Fcドメインと連結し、リンカー配列はTATGGTである。hIgG4e1-Fcドメイン配列はpFUSE-hIgG4e1-Fc1 v01プラスミドを参照できる。
【００６８】
hIgG4e1-FcドメインのDNA配列(下線部はS288P突然変異を構成する部位である)：
【表４】
2018537088.tif 000005
【００６９】
2、sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-FcとM27-CARの連結
sPD-1、sPD-1-CH3又はsPD-1-FcをM27-CARと連結する。具体的には以下のとおり：
(1) sPD-1-Fc配列を含むプラスミドT-sPD-1-Fcプラスミド (上海捷鋭生物工程有限公司から購入) を鋳型とし、
【表５】
2018537088.tif 000006
によりPCR増幅し、sPD-1配列1を得る。但し二重線はF2A重複配列である。
【００７０】
(2) T-sPD-1-Fcプラスミドを鋳型とし、
【表６】
2018537088.tif 000007
によりPCR増幅し、sPD-1配列2(紫色はリンカー、青色はCH重複配列である)を得る。
【表７】
2018537088.tif 000008
【００７１】
によりPCR増幅し、CH3断片3を得る。但し二重線はF2A重複配列である。      
【００７２】
(3) T-sPD-1-Fcプラスミドを鋳型とし、
【表８】
2018537088.tif 000009
により増幅し、sPD-1-Fc断片4を得る。但し二重線はF2A重複配列である。
【００７３】
(4) pWPT-mcherry-F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZの三種類のプラスミド (上海鋭勁生物技術有限公司より購入、プラスミドの名称における「/」は前後ペプチド断片の間が“又は”の関係であることを示す。以下同様。但し28Z/BBZ/28BBZ略称CAR)をそれぞれ鋳型とし、上流プライマー5’-GTGAAACAGACTTTGAATTTT-3’ (配列番号 13)、下流プライマー5’-CTATGTTGCTCCTTTTACGCTA-3’ (配列番号 14)によりPCR増幅し、F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZ断片(5/6/7)を得る。
【００７４】
(5) 等モル量の各断片1+5/6/7、2+3+5/6/7、4+5/6/7をそれぞれライゲーションし、
【表９】
2018537088.tif 000010
により増幅し、sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27- 28Z/BBZ/28BBZ断片を得る。但しsPD-1-FcとM27-CARの融合蛋白質の概略図は図2を参照できる。
【００７５】
PCR増幅条件：初期変性：94℃、4分間。変性：94℃、20s。アニーリング：58℃、30s。伸長：68℃、1000bp/分間 (kod-plus)。25 サイクル実施し、最終伸長68℃、10分間。
【００７６】
核酸断片のライゲーション：未ライゲーション断片を等モル量で加え、ライゲーションを行う。ライゲーション条件：初期変性：94℃、4分間。変性：94℃、30s。アニーリング：58℃、30s。伸長：68℃、1000bp/分間。6〜8サイクル実施し、最終伸長68℃、10分間。それから等体積の上流プライマーと下流プライマーを含むPCRミックスを追加して、PCRを実施。PCR条件：初期変性：94℃、4分間。変性：94℃、30s。アニーリング：58℃、30s。伸長：68℃、1000bp/分間。25サイクル実施し、最終伸長68℃、10分間。
【００７７】
3.組み換えレンチウイルスベクターPRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD-1 /sPD-1-CH3/sPD-1- Fc-F2A-M27-CARの構築
【００７８】
上文中のsPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZ断片5’端にMlu I酵素切断部位を有し、3’端にSal I酵素切断部位を有する。MluIとSalIの二重酵素切断により、同様に二重酵素切断された pRRLSIN-cPPT.EF-1αベクター(addgeneから購入、中国専利出願番号201510481235.1参照)に連結し、sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc蛋白質及び各キメラ抗原受容体を成功的に発現するレンチウイルスベクターを構築する。
【００７９】
以上をまとめ、リボソームスキップ配列F2Aにより、EGFR287-302にターゲッティングするM27-CARをそれぞれsPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fcと連結し、バイシストロン遺伝子を得る。制限酵素切断部位MluIとSalIにより、バイシストロン目的遺伝子を含む断片を同様にMluIとSalI二重酵素切断されたpRRLSIN-cPPT.EF-1αベクターに連結し、組み換え目的発現ベクターを成功的に構築し、成功的に構築した組み換えレンチウイルスベクターはシークエンシングにより鑑定される。正確に鑑定した後、レンチウイルスのパッケージングを行う。
【００８０】
実施例2.レンチウイルスの調製及びTリンパ球キメラ抗原受容体の発現
【００８１】
1.レンチウイルス調製、濃縮、滴定
【００８２】
1)   1.2×107の密度で第6〜10世代まで培養した293T細胞を15cm培養ディッシュに接種し、37℃、5% CO2で一晩培養し、トランスフェクションのために用意する。培地は10%牛胎児血清(Gibco)含有DMEMである。
【００８３】
2)    目的遺伝子プラスミドPRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP(Mock)10.8μg又はPRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-CAR 10.8μgをそれぞれパッケージング済みプラスミドpRsv-REV 12.4μg、RRE-PMDLg 12.4μg、Vsvg 4.8 μgと、 800μL のブランクDMEM培養液に溶解し、均一に混合する。
【００８４】
3)    60μg のPEI (1μg/μl)を800μlの無血清DMEM培養液に溶解し、軽く均一に混合(又は1000rpmで5秒ボルテックス)し、室温で5分間インキュベートした。
【００８５】
4)   トランスフェクション複合体の形成：プラスミド混合液をPEI混合液に入れ、添加後直ちにボルテックス混合又は軽く均一に混合し、室温で20分間インキュベートする。
【００８６】
5)    トランスフェクション複合体1.6ml を11ml DMEM培地を含む10cm培養ディッシュに滴下する(培地交換不要)。
【００８７】
6)   4-5時間後、10 %FBSのDMEM培地でトランスフェクションされた293T細胞に培地交換する。
【００８８】
7)   37℃で72時間インキュベートし、ウイルス液の上清を収集する。
【００８９】
8)   5X PEG8000 NaClの調製： NaCl 8.766 g、PEG8000 50g を取り、200ml Milli-Q純水に溶解し、121℃ 30分間加圧蒸気殺菌し、4℃で保存する。
【００９０】
9)   0.45μm フィルターでレンチウイルスの上清液を濾過する。
【００９１】
10)   30ml 毎に濾過した後のウイルス初始液に5X PEG-8000 NaCl 貯蔵液7.5mlを入れる。
【００９２】
11)    20〜30分毎に一回混合し、合計3-5回行う。
【００９３】
12)   4℃で一晩放置する。
【００９４】
13)  4℃、4000 g、20分間遠心する。
【００９５】
14)  上清を吸い捨て、チューブに1〜2分静置し、残りの液体を吸い除く。
【００９６】
15)   適量のレンチウイルス溶解液を加えて、レンチウイルスの沈殿を溶解させる。
【００９７】
16)  集めた後のウイルス懸濁液を各部 200 μlに分け、完成品チューブに保存する。-80 ℃で貯蔵する。
【００９８】
17)  有限希釈法で293T 細胞を感染して、組み換えベクターをパッケージしたレンチウイルスの力価を測定する。
【００９９】
18)  2×105細胞数で1ml/ウェルで、293T細胞を6ウェル細胞プレートに接種し、0.6μl/mlで初期濃度10ug/μlのpolybrene溶液を入れ、最終濃度6ug/ml；37℃、5% CO2で1時間培養し、培養液は10%牛胎児血清を含むDMEMである。
【０１００】
19)  10μL/ウェルのウイルス濃縮液を入れて5 倍に3段階希釈し、37℃、5% CO2 で培養する。
【０１０１】
20)   72時間感染後、トリプシンで293T細胞を消化し(30s)、1ml DMEM(10%FBS)を加え消化を終了し、細胞懸濁液を2ml遠心チューブ(二等分)に移し、5000rpm、5分間遠心し、上清を捨て去り、PBSで2回洗浄した。
【０１０２】
21)   一群+PE-SA(対照)。PE-SA 1:50で希釈し、各遠心チューブ内に50μl希釈後のPE-SAを入れ、ピペットで分散し、氷上で45分間インキュベートし、PBS(1% NBS)で2回洗浄した後、400μl PBS(1% NBS)を加え、フローサイトメトリーチューブに移し、PE-SAは全称が臭化エチジウムで標識されたストレプトマイシン(Ethidium bromide labeled streptomycin)であり、ビオチン標識された組み換えEGFR-VIII蛋白質の結合に用いる。
【０１０３】
22)   一群+EGFRvIII-biotin(25μg/ml)。各チューブ内に50μl EGFRvIII-biotin(25μg/ml、上海鋭勁生物技術有限公司から購入)を加え、氷上で45分間インキュベートし、PBS(1% NBS)で2回洗浄した後、1:50で希釈されたPE-SA溶液を加え、氷上で45分間インキュベートし、PBS(1% NBS)で2回洗浄した後、400μl PBS(1% NBS)を加え、フローサイトメトリーチューブに移す。フローサイトメーターによりPEチャネルで測定し、陽性率 5〜20%の細胞数が望ましく、力価(U/mL)= 細胞数×陽性率/ウイルス体積により計算する。EGFRvIII-biotinはアビジン標識された組み換えEGFR-vIII蛋白質(biotinylated recombinant EGFRvIII proteins)であり、キメラ抗原受容体レンチウイルス感染後のT細胞表面のM27 scFVの結合に用いる。
【０１０４】
2.レンチウイルス形質導入Tリンパ球――CAR陽性のTリンパ球の調製
【０１０５】
1)   Tリンパ球活化：約1×106/mLの密度でリンパ球培地液に加えて培養し、磁気ビーズ:細胞の比率が1:1になるように抗CD3及びCD28抗体で共にコーティングされた磁気ビーズ(Invitrogen)と最終濃度300U/mL の組み換えヒトIL-2(上海華新生物高技術有限公司)とを加え、48時間刺激培養した。
【０１０６】
2)    Retronectinを24ウェルプレートにコーティングする：各ウェルに380μl 5μg/mlのRetronectin溶液(PBS)を加え、4℃で一晩インキュベートした。
【０１０７】
3)    24ウェルプレート中のRetronectin溶液(PBS)を除去し、1ml PBSで2回洗浄した。
【０１０８】
4)    感染1時間前に最終濃度が10μg/mLであるpolybreneを追加して感染效率を高め、細胞をRetronectinがコーティングされた24ウェルプレート内に接種し、各ウェル細胞数3×105、培養液体積600μlであった。
【０１０９】
5)    MOI=10 で、PBMCs細胞に濃縮後のレンチウイルスを加え、32℃、1800rpm、 40分間遠心した後、細胞培養箱に移す。
【０１１０】
6)    増幅培養：感染後の細胞を一日おきに 5×105/mLの密度で継代するとともに、リンパ球培養液に最終濃度 300U/mL の組み換えヒトIL-2を追加した。
【０１１１】
3.Tリンパ球キメラ抗原受容体の発現
【０１１２】
ヒトTリンパ球をαCD3/αCD28 磁気ビーズで48時間刺激した後、高力価レンチウイルスを用いてMOI=10で遠心感染した。感染後7日目EGFRvIII-biotin + PE-SAにてフローサイトメトリーによりレンチウイルス感染Tリンパ球陽性率を測定した。
【０１１３】
1)   レンチウイルス感染したTリンパ球を培養して7日目、1×106のT細胞を取り、2ml 遠心チューブ内に二等分した。
【０１１４】
2)   4℃、5000rpm、 5分間遠心し、上清を捨て去り、PBSで2回洗浄した。
【０１１５】
3)   一群+PE-SA(対照)。PE-SA 1:50で希釈し、各遠心チューブ内に50μl希釈後のPE-SAを入れ、ピペットで分散し、氷上で45分間インキュベートし、PBS(1% NBS)で2回洗浄した後、400μl PBS(1% NBS)を加え、フローサイトメトリーチューブに移す。
【０１１６】
4)   一群+EGFRvIII-biotin(25μg/ml)。各チューブ内に50μl EGFRvIII-biotin(25μg/ml)を加え、氷上で45分間インキュベートし、PBS(1% NBS)で2回洗浄した後、1:50で希釈されたPE-SA溶液を加え、氷上で45minインキュベートし、PBS(1% NBS)で2回洗浄した後、400μl PBS(1% NBS)を加え、フローサイトメトリーチューブに移す。フローサイトメーターによりPE(FL2)チャネルで測定する。
【０１１７】
5)   FlowJoソフトウエアにより、異なるキメラ抗原受容体を形質導入したCAR陽性のT細胞の陽性率を確定する。
sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27 CAR T細胞の陽性率の結果は図3を参照できる。sPD-1-CH3-M27-28Zを発現するCAR T(T-CH3-28Z)細胞陽性率は66.8%、sPD-1-CH3-M27-BBZ(T-CH3-BBZ)は66.3%、sPD-1-CH3-M27-28BBZ (T-CH3-28BBZ)は64.1%、sPD-1-Fc-M27-28Z(T-Fc-28Z)は71.7%、sPD-1-Fc-M27-BBZ(T-Fc-BBZ)は70.6%、sPD-1-Fc-M27-28BBZは81.9%、対照Mockを発現したT細胞(T-Mock)陽性率は88.4%であった。
【０１１８】
4.感染T細胞&上清におけるsPD-1-CH3/sPD-1-Fcの発現
【０１１９】
前文のレンチウイルスでT細胞を感染した後の細胞及び上清を収集し、上清における蛋白質をprotein A/Gにより免疫沈澱を行い、蛋白質変性後、免疫ブロット法により感染T細胞上清におけるsPD-1-CH3/sPD-1-Fcの発現を測定した。
【０１２０】
感染後のT細胞&上清におけるsPD-1-CH3/sPD-1-Fcの発現結果は図4を参照できる。sPD-1-CH3/sPD-1-Fcはいずれも感染後のT細胞上清及び細胞において検出された。
【０１２１】
実施例3.腫瘍細胞系におけるEGFR287-302抗原エピトープの暴露状況
【０１２２】
フローサイトメトリーによりU87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、CAL27、A431、MDA-MB-468細胞系における腫瘍に特異的なエピトープであるEGFR287-302エピトープの暴露状況を測定した。フローサイトメトリーアッセイに用いられるCH12抗体(中国専利ZL200810038848.8参照)はEGFR287-302エピトープに対して特異的である。
【０１２３】
1)   6cmの平皿を用いて腫瘍細胞：U87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27、MDA-MB-468を培養した。
【０１２４】
2)   10 mMのEDTAを用いて細胞を消化処理し、2Ml EPチューブに細胞をピペットで分散し、3000〜4000rpm 5分間遠心した。1%NPBS で細胞を再懸濁させ、2×106/チューブで分注し、アイソタイプコントロールと検出サンプルとし、2mL 1%NPBS、3000〜4000 rpm 5min遠心した。
【０１２５】
3)   一次抗体であるCH12抗体20μg/mLを加え、同型対照抗体は正常なヒトIgG1抗体であり、20μg/mL 100μL/サンプル。ボルテックスを充分に行い(45s)、45分間氷浴した。
【０１２６】
4)   遊離の一次抗体を除去する：2mL 1%NPBS、3000〜4000rpm 5分間遠心し、ボルテックスを充分に行い、一度繰り返す。
【０１２７】
5)   二次抗体を加える：ヒツジ抗ヒトIgG-FITC:1:50、100μL/EP。45分間氷浴した。
【０１２８】
6)   遊離の二次抗体を除去する：1%NPBS、3000-4000rpm 5分間遠心、ボルテックスを充分に行い、一回繰り返す。
【０１２９】
7)   200〜500μL 1%NPBSを加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移し、検出した。
【０１３０】
フローサイトメトリー結果は図5を参照できる。検出結果から明らかなように、U87細胞は正常レベルのEGFRを発現し、抗体CH12は当該細胞と結合しなかった。しかしEGFR、EGFR-VIIIが過剰に発現するときCH12は細胞と結合できる。図5のCAL27、A431、MDA-MB-468はEGFRを高発現する腫瘍細胞であり、その細胞表面にもEGFR287-302エピトープの暴露が検出された。
【０１３１】
実施例4.腫瘍細胞系におけるPD-L1の発現レベル
【０１３２】
悪性グリオーマ細胞U87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、皮膚扁平上皮細胞癌A431、口腔扁平上皮癌細胞CAL27、乳がん細胞MDA-MB-468、ヒト表皮角化細胞HACATを60cmの培養ディッシュに接種し、細胞溶解液で細胞を溶解して細胞の総蛋白質を抽出し、免疫ブロット法により各腫瘍細胞におけるPD-L1の発現状況を測定した。
【０１３３】
測定結果は図6を参照できる。各種異なる腫瘍においてPD-L1は全て発現が見られた。
【０１３４】
実施例5.体外毒性実験
【０１３５】
それぞれET比（Effector/Target、エフェクター細胞対標的細胞比）3:1、1:1、1:3でsPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28Z、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-BBZ、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28BBZを発現するTリンパ球及び空ベクターMockを感染したTリンパ球のU87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27に対する体外殺傷效果を測定した。合計18時間培養した。具体的には以下のとおり：
【０１３６】
1)   標的細胞：それぞれ50μL 2×105/mLのU87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27、MDA-MB-468を96/ウェルプレートに接種した。
【０１３７】
2)   エフェクター細胞：ET比3:1、1:1又は1:3で、T-Mock、M27-CAR T細胞(それぞれM27-28Z CAR T細胞、M27-BBZ CAR T細胞又はM27-28BBZ CAR T細胞)、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27 CAR T細胞(それぞれsPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28Z CAR T細胞、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-BBZ CAR T細胞又はsPD-1- CH3/Fc-F2A-M27- 28BBZ CAR T細胞)を加えた。
【０１３８】
3)   各組いずれも重複ウェルを4つにし、4つの重複ウェルの平均値を取った。検出時点は18時間目であった。
但し各実験群及び各対照群は以下のとおりである：
各実験群：各標的細胞+異なるキメラ抗原受容体を発現するCTL、
対照群1：標的細胞最大放出LDH；
対照群2：標的細胞自発放出LDH；
対照群3：エフェクター細胞自発放出LDH；
【０１３９】
4)   検出方法：CytoTox 96非放射性細胞毒性検出キット(Promega社)を用いて行った。当該方法は比色法に基づき検出方法であり、51Cr 放出法の代わりに用いられる。CytoTox 96(登録商標)検出は乳酸脱水素酵素(LDH)を定量的に測定する。LDHは安定的細胞質酵素であり、細胞が溶解する時に放出され、その放出形態は放射性解析における51Cr の放出形態とほぼ同様である。培地上清中に放出されたLDHは、30分間カップリングする酵素反応によって検出することができ、酵素反応において、LDHは一種のテトラゾリド(INT)を赤色のホルマザン(Formazan)に変換させることができる。生成される赤色の産物の量は溶解した細胞の数に比例する。具体的には、 CytoTox 96 非放射性細胞毒性検出キットの取扱説明書を参照できる。
【０１４０】
5)   細胞毒性の計算式：
【数１】
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【０１４１】
U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27に対するsPD-1-Fc-F2A-M27 CAR T細胞の殺傷效果は図7を参照できる。その結果、U87-VIII、U87-ER及びA431細胞に対してCH3を発現するM27-28Z T細胞の殺傷作用は明らかにM27-28Z T細胞よりも優れる。U87-ER細胞に対するsPD-1-Fcを発現するM27-28Z/BBZ T細胞の殺傷能力はsPD-1-Fcを発現しないM27-28Z/BBZ T細胞よりも顕著に優れる。
【０１４２】
本発明で言及された全ての文献は本出願において参考として引用され、各文献が参考として単独で引用されているのと同様である。また、本発明の上記内容を閲読した後、当業者は本発明の各種変更や修正を行うことができ、これらの等価の様態も本出願の請求の範囲で限定される範囲に含まれると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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