(57)【要約】本発明は、nが0〜10の間の整数である、式IのGalNAc誘導体、ならびにその塩、その対応する鏡像異性体および/または光学異性体の新しい調製法を含む。式IのGalNAc酸誘導体は、治療的に有用なGalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製のために用いることができる。2018523643.tif 000054
2018523643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式中、nは0〜10の間の整数である、式I 
2018523643.tif 000036
のGalNAc酸誘導体、ならびにその塩、その対応する鏡像異性体および/または光学異性体の調製のための方法であって、
a）式中、R1はエステル保護基であり、かつXは酸のアニオンである、式II
2018523643.tif 000037
のトリアミン塩を、
式中、R2はヒドロキシ保護基であり、かつnは前述のとおりである、式III
2018523643.tif 000038
のテトラヒドロピラン酸と、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせて、
式中、R1およびR2およびnは前述のとおりである、式IV
2018523643.tif 000039
のGalNAcエステルを生成する段階；
b）エステル保護基R1およびヒドロキシ保護基R2を、鉱塩基（mineral base）存在下で除去して、
式中、nは前述のとおりであり、かつMは金属カチオンである、式V
2018523643.tif 000040
のGalNAc酸塩を生成する段階；
ならびに
c）任意で、式VのGalNAc酸塩を式IのGalNAc酸誘導体に変換する段階
を含む、前記方法。
【請求項２】
nが0〜5の間の整数であり、エステル保護基R1がC1-7-アルキルまたはフェニル-C1-7-アルキルであり、ここでフェニル基はハロゲンまたはC1-7-アルキルで置換されていてもよく、ヒドロキシ保護基R2がアセチルであり、かつXがスルホン酸のアニオンから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ペプチドカップリング剤がn-プロピルホスホン酸無水物であり、かつアミン塩基が三級アミンである、請求項1または2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
段階a）のカップリングを極性非プロトン性溶媒である有機溶媒中、20℃〜70℃の反応温度で行う、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
段階b）におけるエステル保護基R1の除去のための鉱塩基がアルカリ水酸化物である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
段階a）およびb）を組み合わせて、式VのGalNAcエステルを単離せずに、1段階で実施する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
式VのGalNAc酸塩の式IのGalNAc酸誘導体への任意の変換を、カチオン交換により、または酸での処理により実施する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
式IのGalNAc酸誘導体が、
式中、nは前述のとおりである、式Ia
2018523643.tif 000041
の鏡像異性体、またはその塩、対応する鏡像異性体および/もしくは光学異性体である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
式IIのトリアミンを生成する方法が、
a1）式中、R3'およびR4は異なり、互いに独立にアミノ保護基である、式X
2018523643.tif 000042
のカルボン酸を、
式中、R1はエステル保護基であり、かつR3'およびR4は前述のとおりである、式XI
2018523643.tif 000043
のエステルに変換する段階；
b1）アミノ保護基R4を除去し、続いて
式中、R1およびR3'は前述のとおりであり、かつX-は酸アニオンである、式XII
2018523643.tif 000044
のアミン塩を生成する段階；
c1）式XIIのアミン塩を、
式中、R3''およびR3'''はアミノ保護基である、式XIII
2018523643.tif 000045
のヘキサン酸誘導体とカップリングさせて、
式中、R3'、R3'、R3'''およびR1は前述のとおりである、式XIV
2018523643.tif 000046
の保護トリアミンを生成する段階；
d1）式XIVの保護トリアミンを酸により式IIのトリアミン塩に変換する段階
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
R3'、R3'およびR3'''が同じで、酸性条件下で切断可能な保護基であり、かつR4が塩基性条件下または水素化分解により切断可能な保護基である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
R3'、R3'およびR3'''がBocであり、かつR4がFMOCである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
段階a1）の変換をベンジルアルコールにより、活性化剤、アミン触媒および非プロトン性有機溶媒の存在下、20℃〜50℃の反応温度で行う、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
アミノ保護基R4がFMOCであり、段階b1）におけるその除去を二級脂肪族アミンにより、極性非プロトン性溶媒中、20℃〜50℃の反応温度で実施する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
段階b1）における続いての式XIIのアミン塩の生成をスルホン酸により行う、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
段階c1）のカップリングを、n-プロピルホスホン酸無水物をカップリング剤として、三級アミンおよび極性非プロトン性溶媒の存在下、20℃〜50℃の反応温度で実施する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
段階d1）において、式IIのトリアミン塩をスルホン酸により、極性非プロトン性溶媒中、20℃〜80℃の反応温度で生成する、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
式IIのトリアミン塩の結晶化を防止する極性非プロトン性溶媒を選択する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成する方法が、
a2）式中、nは前述のとおりである、式XX
2018523643.tif 000047
のジオールを、
式中、nは前述のとおりであり、かつR5はエステル保護基である、式XXI
2018523643.tif 000048
のアルコールエステルに変換する段階；
b2）式XXIのアルコールエステルを、
式中、R2およびR6は互いに独立にヒドロキシ保護基である、式XXII
2018523643.tif 000049
のテトラヒドロピラン誘導体とカップリングさせて、
式中、n、R2およびR5は前述のとおりである、式XXIII
2018523643.tif 000050
のテトラヒドロピランエステルを生成する段階；
c2）エステル基を除去して、式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成する段階
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
ヒドロキシ保護基R2がアセチルであり、エステル保護基R5がベンジルであり、かつヒドロキシ保護基R6がアセチルである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
段階a2）の第一の段階において、式XXのジオールをアルカリ金属アルコラートにより、極性プロトン性または極性非プロトン性の溶媒の存在下、50℃〜120℃の反応温度で脱プロトン化する、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
段階a2）の第二の段階において、ハロゲン酢酸またはその塩により、極性プロトン性または極性非プロトン性の溶媒の存在下、50℃〜120℃の反応温度で、酢酸部分を導入する、請求項18または19記載の方法。
【請求項２２】
段階a2）の第三の段階において、ハロゲン化ベンジルまたはベンジルスルホニルエステルにより、極性非プロトン性溶媒中、20℃〜120℃の反応温度で、R5がベンジルである式XXIのアルコールエステルを生成する、請求項18または19記載の方法。
【請求項２３】
段階b2）において、式XXIのアルコールエステルを式XXIIのテトラヒドロピラン誘導体と、ハロゲン化スルホン酸存在下、極性非プロトン性溶媒存在下で、0℃〜140℃の反応温度でカップリングさせる、請求項18または19記載の方法。
【請求項２４】
段階c2）において、ベンジルエステル基を、水素化触媒存在下、水素での接触水素化により除去する、請求項18または19記載の方法。
【請求項２５】
式XXIのアルコールエステルの生成が、
a3）式中、R5は前述のとおりであり、かつXはハロゲン原子である、式XXV
2018523643.tif 000051
の2-アミノ酢酸エステルを亜硝酸塩でジアゾ化して、
式中、R5は前述のとおりである、式XXVI
2018523643.tif 000052
の2-ジアゾ化合物を生成する段階；および
b3）式XXVIの2-ジアゾ化合物を式XXのジオールにより変換する段階
を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
段階a3）のジアゾ化を、亜硝酸アルカリにより、水および非極性非プロトン性溶媒の溶媒混合物存在下、-10℃〜10℃の反応温度で実施する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
段階b3）における2-ジアゾ化合物の式XXのジオールによる変換を、ルイス酸および非極性非プロトン性溶媒の存在下、-10℃〜10℃の反応温度で実施する、請求項25または26記載の方法。
【請求項２８】
式中、R1およびR3'はアミン保護基であり、かつX-は酸のアニオンである、式XII
2018523643.tif 000053
のアミン塩。
【請求項２９】
R1がベンジルであり、R3'がBocであり、かつXがメタンスルホン酸のアニオンである、請求項28記載のアミン塩。
【請求項３０】
GalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製法における、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項３１】
GalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製法であって、
a3）請求項1〜27のいずれか一項に従って、式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を調製する段階、および
b3）式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を、ペプチドカップリング条件下でオリゴヌクレオチドと結合する段階
を含む、前記方法。
【請求項３２】
式VのGalNAc酸塩を用いる、請求項31記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式IのGalNAc誘導体、ならびにその塩、その対応する鏡像異性体および/または光学異性体の新しい調製法に関する。
2018523643.tif 000003
式中、nは0〜10の間の整数である。
【背景技術】
【０００２】
式IのGalNAc誘導体は、通常は、GalNAc部分および一定のオリゴヌクレオチドを含む結合体の標的指向部分である。GalNAc部分は、肝細胞上に位置するアシアロ糖タンパク質受容体へのその親和性により、オリゴヌクレオチド結合体の肝細胞への機能的送達を可能にする。そのようなGalNAcクラスターアンチセンス結合体は、薬物動態調節剤として作用する可能性を有し、例えば、PCT公報WO 2012/083046（特許文献1）またはUS特許出願公報US 2011/0207799（特許文献2）に記載されている。これらの公報もGalNAc誘導体の調製法を開示しているが、これらの方法は技術的規模の合成の基準を満たさないことが判明した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 2012/083046
【特許文献２】US 2011/0207799
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、工業規模の方法の要求を満たす、式IのGalNAc誘導体の改良された調製法を提供することである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、治療的に有用なGalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製のための式IのGalNAc酸誘導体の使用およびそのような結合体の調製法の使用である。
【０００６】
本目的は、以下の段階を含む、本発明の方法によって達成することができる。
a）式II
2018523643.tif 000004
［式中、R1はエステル保護基であり、かつXは酸のアニオンである］
のトリアミン塩を、式III
2018523643.tif 000005
［式中、nは前述のとおりであり、かつR2はヒドロキシ保護基である］
のテトラヒドロピラン酸と、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせて、式IV
2018523643.tif 000006
［式中、n、R1およびR2は前述のとおりである］
のGalNAcエステルを生成する段階；
b）エステル保護基R1およびヒドロキシ保護基R2を、鉱塩基（mineral base）存在下で除去して、式V
2018523643.tif 000007
［式中、nは前述のとおりであり、かつMは金属カチオンである］
のGalNAc酸塩を生成する段階；
および
c）任意で、式VのGalNAc酸塩を式IのGalNAc酸誘導体に変換する段階。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下の定義は、本明細書において本発明を記載するために用いられる様々な用語の意味および範囲を例示し、定義するために示す。
【０００８】
化学構造中にキラル炭素が存在する場合はいつも、そのキラル炭素に関連するすべての立体異性体は、純粋な立体異性体ならびにその混合物として構造に包含されることが意図される。
【０００９】
「C1-7アルキル」なる用語は、1〜7炭素原子、特定の態様においては1〜4炭素原子の一価直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、またはtert-ブチルが含まれる。
【００１０】
フェニル-C1-7-アルキルなる用語は、前述の定義のC1-7アルキル基に連結されているフェニル基を意味する。特定の例はベンジル基である。
【００１１】
フェニル基は、塩素、臭素もしくはヨウ素などのハロゲン、または前述の定義のC1-7アルキル基で置換されていてもよい。
【００１２】
「アミノ保護基」なる用語は、アミノ基を保護することが意図される基を意味し、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、カルボベンジルオキシ（CBZまたはZ）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル（BOC）、およびトリフルオロアセチルが含まれる。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7；E. Haslam, ''Protective Groups in Organic Chemistry'', J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', John Wiley and Sons, New York, NY, 1981において見出される。好ましいアミノ保護基はFMOCおよびBOCである。
【００１３】
「ヒドロキシ保護基」なる用語および「エステル保護基」なる用語は、ヒドロキシ基を保護することが意図される基を意味し、エステルおよびエーテル形成基、特にテトラヒドロピラニル、ベンゾイル、アセチル、カルバモイル、ベンジルおよびシリルエーテル（例えば、TBS、TBDPS）基が含まれる。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3；E. Haslam, ''Protective Groups in Organic Chemistry'', J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, ''Protective Groups in Organic  Synthesis'', John Wiley and Sons, New York, NY, 1981において見出される。
【００１４】
好ましい態様において、GalNAc誘導体は、nが前述のとおりである、式Iaを有する。
2018523643.tif 000008
【００１５】
式Iaと同様に、中間体II、III、IV、X、XI、XII、XIII、XIV、XX、XXIおよびXXIIはそのキラル中心で同じ立体化学を有する。
【００１６】
式IIのトリアミン塩（構築ブロックA）の合成：
方法は以下の段階を含む。
a1）式X
2018523643.tif 000009
［式中、R3'およびR4は異なり、互いに独立にアミノ保護基である］
のカルボン酸を、式XI
2018523643.tif 000010
［式中、R1はエステル保護基であり、かつR3'およびR4は前述のとおりである］
のエステルに変換する段階；
b1）アミノ保護基R4を除去し、続いて式XII
2018523643.tif 000011
［式中、R1およびR3'は前述のとおりであり、かつX-は酸アニオンである］
のアミン塩を生成する段階；
c1）式XIIのアミン塩を、式XIII
2018523643.tif 000012
［式中、R3''およびR3'''はアミノ保護基である］
のヘキサン酸誘導体とカップリングさせて、式XIV
2018523643.tif 000013
［式中、R3'、R3''、R3'''およびR1は前述のとおりである］
の保護トリアミンを生成する段階；
d1）式XIVの保護トリアミンを酸により式IIのトリアミン塩に変換する段階。
【００１７】
段階a1）は、式Xのカルボン酸をアルコールR1OHにより、活性化剤、アミン触媒および有機溶媒の存在下で、式XIのそれぞれのエステルに変換する段階を含む。
【００１８】
エステル保護基は、塩基性条件下で切断可能であるべきであるため、適切なアルコールR1OHは、R1がC1-7アルキルまたはフェニル-C1-7アルキルであるものであり、ここでフェニル基はハロゲンまたはC1-7アルキルで置換されていてもよい。特に適しているのは、メタノールもしくはエタノールなどのC1-4脂肪族アルコールまたはベンジルアルコールである。好ましいアルコールはベンジルアルコールである。
【００１９】
アミノ保護基R3'、R3''およびR3'''は、それらの除去のための条件に関して、R4と異なっていることが重要である。適切には、好ましいBoc基などの酸性条件下で切断可能なアミノ保護基を、R3'、R3''およびR3'''のために選択する。
【００２０】
R4のために、FMOC（塩基性条件）またはZ（水素化分解）などの塩基性条件下または水素化分解により切断可能なアミノ保護基を好ましくは選択する。FMOCがR4のために好ましいアミノ保護基である。
【００２１】
適切な活性化剤は、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）または1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）などの、当業者には公知の古典的カルボジイミドから選択することができるが、好ましくはDCCを用いる。
【００２２】
アミン触媒、好ましくは4-(ジメチルアミノ)ピリジンの存在が、エステル化には有利である。
【００２３】
エステル化は、一般に、ジクロロメタンのようなハロゲン化炭化水素などの非プロトン性有機溶媒中、20℃〜50℃の温度で実施する。
【００２４】
第一の段階の段階b1）は、アミノ保護基R4、好ましくはFmocを、脂肪族アミンにより、有機溶媒存在下で除去する段階を含む。
【００２５】
便宜上、脂肪族アミンはジメチルアミン、ジエチルアミン、モルホリンまたはピペラジンなどの、二級脂肪族アミンである。好ましくは、ジエチルアミンを適用する。
【００２６】
反応は、一般に、テトラヒドロフランのような極性非プロトン性溶媒などの適切な有機溶媒中、20℃〜50℃の間の反応温度で実施する。
【００２７】
過剰のアミンを、例えば、アセトニトリルなどの適切な溶媒との、共沸蒸留により、適切に除去することができる。
【００２８】
段階b1）の第二の段階において、遊離アミンを適切な酸で式XIIのアミン塩に変換する。
【００２９】
適切な酸は、塩酸もしくはリン酸のような鉱酸またはスルホン酸である。好ましくは、メタンスルホン酸またはp-トルエンスルホン酸などのスルホン酸、より好ましくはメタンスルホン酸を用いることができる。
【００３０】
したがって、Xは適用した酸のアニオンを表す。
【００３１】
遊離アミンは、一般に、単離しないため、反応は、段階b1）で用いたアセトニトリル中、通常は室温で行うことができる。
【００３２】
生成した式XIIのアミン塩は、一般に、ろ過により単離することができる。
【００３３】
式XII
2018523643.tif 000014
［式中、R1およびR3'はアミン保護基であり、かつX-は酸のアニオンである］
のアミン塩は、当技術分野において公知ではない化合物であり、したがって、本発明のさらなる態様を構成する。
【００３４】
さらなる好ましい態様において、式XIIのアミン塩中、R1はベンジルであり、R3'はBocであり、かつXはメタンスルホン酸のアニオンである。
【００３５】
段階c1）は、R1、R3'およびXが前述のとおりであるが、好ましくはR1がベンジルであり、R3'がBocであり、かつXがメタンスルホン酸のアニオンである、式XIIのアミン塩を、R3''およびR3'''が前述のとおりであるが、好ましくはBocである、式XIIIのヘキサン酸誘導体と、カップリング剤により、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせ、式XIVの保護トリアミンを生成する段階を含む。
【００３６】
カップリングは、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）、EDC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド）またはEDC・HCl（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミドカップリング剤ならびにHOBt（1-ヒドロキシベンズトリアゾール）、HOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）、TBTU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）またはHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールおよびTBTU/HOBtまたはHBTU/HOAtなどのその一般的組み合わせのような添加剤を用いて、当業者には公知の古典的方法に従うことができる。
【００３７】
好ましい態様において、n-プロピルホスホン酸無水物（T3P）を、トリエチルアミンまたはN-エチルジイソプロピルアミンのような三級アミン塩基と共に、好ましくはN-エチルジイソプロピルアミンと共に、カップリング剤として選択する。
【００３８】
式XIIIのヘキサン酸誘導体、特にBoc保護誘導体は、市販の化合物である。
【００３９】
カップリング反応は、通常は、アセトニトリルもしくはテトラヒドロフランまたはその混合物のような極性非プロトン性溶媒中、0℃〜50℃の範囲の反応温度で行う。
【００４０】
式XIVの粗製保護トリアミンの単離は、溶媒を除去することにより行うことができる。続いて、例えば、アセトニトリルにより結晶化して、高純度の生成物を得、これは次の段階d1）のために容易に用いることができる。
【００４１】
好ましい態様において、式XIVの保護トリアミン中、R1はベンジルであり、かつR3'、R3''およびR3'''はBocである。
【００４２】
段階d1）は、R1、R3'、R3''およびR3'''が前述のとおりで、好ましくはR1がベンジルであり、かつR3'、R3''およびR3'''がBocである、式XIVの保護トリアミンを酸により、有機溶媒存在下で式IIのトリアミン塩に変換する段階を含む。
【００４３】
適切な酸は、塩酸もしくはリン酸のような鉱酸、トリフルオロ酢酸またはスルホン酸である。好ましくは、メタンスルホン酸またはp-トルエンスルホン酸などのスルホン酸、より好ましくはメタンスルホン酸を用いることができる。
【００４４】
好ましくは、4当量〜10当量過剰のそれぞれの酸を用いる。
【００４５】
反応は、通常は、適切な極性非プロトン性溶媒中、20℃〜80℃の反応温度で実施する。
【００４６】
本発明の好ましい態様において、変換は、得られる式IIのトリアミン塩が結晶化するのを防ぐ、極性非プロトン性溶媒中で実施する。特に好ましい溶媒はアセトニトリルで、これは得られる式IIのトリアミン塩を乳濁液の形態のままとし、これは段階a）におけるその後の式IIのテトラヒドロピラン酸とのカップリングのために容易に用いることができる。
【００４７】
式IIIのテトラヒドロピラン酸（構築ブロックB）の合成：
式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成する方法は以下の段階を含む。
a2）式XX
2018523643.tif 000015
［式中、nは0〜10の間の整数である］
のジオールを、式XXI
2018523643.tif 000016
［式中、nは前述のとおりであり、かつR5はエステル保護基である］
のアルコールエステルに変換する段階；
b2）式XXIのアルコールエステルを式XXII
2018523643.tif 000017
［式中、R2およびR6は互いに独立にヒドロキシ保護基である］
のテトラヒドロピラン誘導体とカップリングさせて、式XXIII
2018523643.tif 000018
［式中、R2およびR5は前述のとおりである］
のテトラヒドロピランエステルを生成する段階；
c2）エステル基R5を除去して、式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成する段階。
【００４８】
段階a2）は、式XXのジオールの式XXIのアルコールエステルへの変換を必要とする。
【００４９】
式XXのジオールはn回繰り返す-(CH2-)-O-単位によって特徴付けられる。整数nは、一般に、0〜10の間で選択するが、好ましくは0〜5の間、より好ましくは0〜2の間で選択する。好ましいジオールは市販の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノール（n＝1）である。
【００５０】
段階a2）の第一の段階において、式XXのジオールをアルカリ金属アルコラートにより脱プロトン化する。
【００５１】
適切なアルカリ金属アルコラートは、ナトリウムもしくはカリウムt-ブチラートまたはナトリウムもしくはカリウムアミラートなどの、ナトリウムまたはカリウム三級アルコラートである。
【００５２】
脱プロトン化のために、N,N-ジメチルホルムアミドまたはt-ブタノールもしくは2-メチル-2-ブタノールのような三級アルコールなどの極性プロトン性または極性非プロトン性溶媒が存在してもよく、反応は50℃〜120℃で行うことができる。
【００５３】
段階a2）の第二の段階において、ハロゲン酢酸またはその適切な塩により、酢酸部分を導入する。
【００５４】
適切なハロゲン酢酸はブロモもしくはクロロ酢酸またはそのアルカリ金属塩である。好ましい態様において、ハロゲン酢酸の塩を用い、より好ましくはクロロ酢酸ナトリウムを用いる。
【００５５】
反応は、極性プロトン性または極性非プロトン性の溶媒中、通常は前段階と同じ溶媒中で行うことができる。
【００５６】
反応温度は溶媒に依存するが、一般に、50℃〜120℃の間で選択する。
【００５７】
段階a2）の第三の段階において、中間のエステル塩は単離することなく式XXIのアルコールエステルに変換する。
【００５８】
アルコールエステルの生成はエステル保護基R5の導入を意味する。
【００５９】
エステルを保護するための多くの可能性が当技術分野において公知であるが、ベンジル基が最も適切であることが判明した。その導入は、ハロゲン化ベンジルまたはベンジルスルホニルエステルにより行い得るが、好ましくは臭化ベンジルにより行うことができる。
【００６０】
エステル化は、極性非プロトン性溶媒中、通常は前段階と同じ溶媒中、20℃〜120℃の反応温度で行うことができる。
【００６１】
反応混合物からのアルコールエステルの単離は、メチルt-ブチルエーテルなどの適切な溶媒での抽出および溶媒の除去により行うことができる。段階b2）は、式XXIのアルコールエステルを式XXIIのテトラヒドロピラン誘導体と、酸および有機溶媒の存在下で反応させて、式XXIIIのテトラヒドロピランエステルを生成することを必要とする。
【００６２】
多くのヒドロキシ保護基が当技術分野において公知であるが、R2およびR6は好ましくはアセチルである。
【００６３】
式XXIIのテトラヒドロピラン誘導体、特にアセチル誘導体は、市販の化合物である。
【００６４】
適切な酸は、好ましいトリフルオロメタンスルホン酸などのハロゲン化スルホン酸である。
【００６５】
反応は、通常は、ジクロロメタンのような極性非プロトン性溶媒中、0℃〜40℃の反応温度で実施する。
【００６６】
好ましい態様において、生成した酢酸を反応経過中に持続的に留去する。
【００６７】
反応混合物の中和後、溶媒を除去することにより、式XXIIIのテトラヒドロピランエステルを単離することができる。粗生成物をシリカクロマトグラフィで、移動層としてN-ヘプタン/アセトンまたは好ましくはtert-ブチルメチルエーテル/アセトンにより精製することができる。
【００６８】
好ましい態様において、式XXIIIのテトラヒドロピランエステル中、R2はアセチルであり、かつR6はベンジルである。
【００６９】
段階c2）は、エステル基R6の除去を意味する。
【００７０】
エステル基の除去は、原理的には、当業者には公知で、文献中に詳細に記載されている。
【００７１】
好ましい態様として、段階c2）は、水素化触媒存在下で水素により接触水素化してベンジル基を除去し、式IIIのテトラヒドロピラン酸を生成することを含む。
【００７２】
ベンジル基を除去するための典型的な水素化触媒は、パラジウム担持炭素（Pd/C）である。
【００７３】
反応は通常は、テトラヒドロフランのような極性非プロトン性溶媒存在下、10℃〜30℃の間の反応温度および1bar〜5barの水素圧で実施する。
【００７４】
式IIIのテトラヒドロピラン酸は、触媒をろ去した後、本発明の方法の段階a）におけるその後のカップリングのために、溶液中で直接用いることができる。
【００７５】
式IIIの好ましいテトラヒドロピラン酸中、R2はアセチルである。
【００７６】
もう1つの態様において、式XXIのアルコールエステルは以下の段階を含む方法により調製することができる。
a3）式XXV
2018523643.tif 000019
［式中、R5は前述のとおりであり、かつXはハロゲン原子である］
の2-アミノ酢酸エステルを亜硝酸塩でジアゾ化して、式XXVI
2018523643.tif 000020
［式中、R5は前述のとおりである］
の2-ジアゾ化合物を生成する段階；および
b3）式XXVIの2-ジアゾ化合物を式XXのジオールにより、式XXIの所望のアルコールエステルに変換する段階。
【００７７】
段階a3）は、式XXVの2-アミノ酢酸エステルのアミノをジアゾ化して、式XXVIの2-ジアゾ化合物を生成することを必要とする。
【００７８】
式XXVのアミノ酢酸エステルは市販の化合物で、これは塩酸塩（X＝Cl）として適切に適用される。
【００７９】
ジアゾ化は、一般に、亜硝酸アルカリ、好ましくは亜硝酸ナトリウムにより、水と非極性非プロトン性溶媒との溶媒混合物の存在下、-10℃〜10℃、好ましくは0℃〜5℃の反応温度で実施する。
【００８０】
適切な非極性非プロトン性溶媒は、メチルtert-ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジクロロメタンおよびトルエンから選択することができる。好ましくは、トルエンを水との体積比1：1の混合物で用いる。
【００８１】
得られる式XXVIの2-ジアゾ化合物は、段階b3）におけるその後の変換のために、有機相に溶解したままにする。
【００８２】
段階b3）は、式XXVIの2-ジアゾ化合物の、式XXのジオールによる変換を必要とする。
【００８３】
上で概要を述べたとおり、式XXのジオールは、n回繰り返す-(CH2-)-O-単位によって特徴付けられる。整数nは、一般に、0〜10の間で選択するが、好ましくは0〜5の間、より好ましくは0〜2の間で選択する。好ましいジオールは市販の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノール（n＝1）である。
【００８４】
反応は、ルイス酸および非極性非プロトン性溶媒の存在下、-10℃〜10℃、好ましくは0℃〜5℃で実施することができる。
【００８５】
非極性非プロトン性溶媒は、一般に、段階a3）で用いるものと同じである。
【００８６】
典型的なルイス酸は、三フッ化ホウ素および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートのようなその市販の付加物などの三ハロゲン化ホウ素、または酢酸ロジウム(II)もしくはトリフルオロメタンスルホン酸銅(II)から選択することができる。好ましくは、ジエチルエーテラートの形の三フッ化ホウ素を適用する。
【００８７】
式XXIのアルコールエステルは、有機層を分離し、溶媒を蒸発により除去し、かつ任意に粗生成物をクロマトグラフィでさらに精製することを含む、一般的な後処理手順によって、反応混合物から単離することができる。
【００８８】
式XXIのアルコールエステルは、次いで、その後の段階b2）のために容易に用いることができる。
【００８９】
構築ブロックAおよびBの組み立て
段階a）は、式IIのトリアミン塩を式IIIのテトラヒドロピラン酸と、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下でカップリングさせて、式IVのGalNAcエステルを生成することを必要とする。
【００９０】
前述のとおり、式IIのトリアミン塩および式IIIのテトラヒドロピラン酸はいずれも、好ましくは、それらの合成から得られる反応混合物から単離せずに用いることができる。
【００９１】
上で概要を述べたとおり、式IIIの好ましいテトラヒドロピラン酸中、R2はアセチルであり、かつ式IIの好ましいトリアミン塩中、R1はベンジルであり、かつXはメタンスルホン酸のアニオンである。
【００９２】
カップリングは、DCCのようなカルボジイミドカップリング剤ならびにHOBt（1-ヒドロキシベンズトリアゾール）、HOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）、TBTU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）またはHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールおよびTBTU/HOBtまたはHBTU/HOAtなどのその一般的組み合わせのような添加剤を用いて、当業者には公知の古典的方法に従うことができる。
【００９３】
好ましい態様において、n-プロピルホスホン酸無水物（T3P）を、トリエチルアミンまたはN-エチルジイソプロピルアミンのような三級アミン塩基と共に、好ましくはN-エチルジイソプロピルアミンと共に、カップリング剤として選択する。
【００９４】
カップリング反応は、通常は、アセトニトリルもしくはテトラヒドロフランまたはその混合物のような極性非プロトン性溶媒中、20℃〜70℃の範囲の反応温度で行う。
【００９５】
生成したメタンスルホン酸ならびに過剰のアミン塩基およびカップリング剤は、カップリング反応の完了後に、2-プロパノールなどの適切な有機溶媒中で、粗生成物を沈澱させることにより除去することができる。
【００９６】
代替の好ましい態様において、段階a）およびb）を組み合わせて、式IVのGalNAcエステルを単離せずに、一段階で実施することができる。したがって、段階a）からの反応混合物を、以下の段階b）において概要を述べるとおり、鉱塩基で直接処理することができる。
【００９７】
式IVの好ましいGalNAcエステル中、R1はベンジルであり、かつR2はアセチルである。
【００９８】
段階b）は、エステル保護基R1およびヒドロキシ保護基R2を鉱塩基存在下で除去して、式VのGalNAc酸塩を生成することを必要とする。
【００９９】
一般に、式IVのGalNAcエステルを極性有機溶媒、特にメタノールのようなアルコールに溶解する。
【０１００】
Mは金属カチオン、通常はリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリまたは土類金属カチオンであるが、好ましくはナトリウム、カリウムまたはカルシウム、より好ましくはナトリウムを表す。
【０１０１】
したがって、適切な鉱塩基は、典型的には水溶液の形で適用される、水酸化ナトリウム、カリウムまたはカルシウムから選択されるアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物である。好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液を、11当量〜25当量過剰で用いる。
【０１０２】
反応は0℃〜40℃の温度で実施することができる。
【０１０３】
粗生成物を、溶媒の蒸発により単離することができる。生成物のさらなる精製は、極性固定相および極性移動相を用いて、分取逆相クロマトグラフィにより達成することができる。
【０１０４】
好ましい極性移動相は、炭酸水素ナトリウム水溶液およびアセトニトリルの混合物であることが判明し、これらを勾配を変えながら適用した。
【０１０５】
クロマトグラフィから選択した分画の濃縮により、純粋な式VのGalNAc酸塩が得られる。
【０１０６】
式Vの好ましいGalNAc酸塩中、R1はベンジルであり、R2はアセチルであり、かつMはナトリウムである。
【０１０７】
式VのGalNAc塩を、式VのGalNAc酸塩の式IのGalNAc酸誘導体への変換を含む、任意の段階c）にかける場合、濃縮は必要ない。
【０１０８】
変換は、適切なカチオン交換体を用いてのイオン交換により、または適切な酸、例えば、リン酸またはメタンスルホン酸のようなスルホン酸での中和により実施することができる。
【０１０９】
所望の式IのGalNAc酸誘導体を単離する場合、変換は、好ましくは、メタノール溶液中で行うことができる。溶媒の除去により、高純度および高収率で所望の生成物を得る。
【０１１０】
または、式IのGalNAc酸誘導体をオリゴヌクレオチドとの結合に直接供する場合、変換はN,N'-ジメチルホルムアミドのような極性非プロトン性溶媒中で適切に実施する。
【０１１１】
さらなる代替法として、上で概要を述べたとおり、式IのGalNAc酸誘導体を式VのGalNAc塩に、適切な鉱塩基存在下で再度変換することができる。この代替法は、原理的には、金属カチオンの交換を可能にする。
【０１１２】
したがって、式IのGalNAc酸誘導体の文脈における「塩」なる用語は、カチオンがリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、カルシウムまたはマグネシウムから選択されるが、好ましくはナトリウム、カリウムまたはカルシウム、より好ましくはナトリウムである、アルカリまたはアルカリ土類金属塩を意味する。
【０１１３】
オリゴヌクレオチドへの結合
治療的に有用なGalNAcオリゴヌクレオチド結合体の調製のために、最初に記載したとおり、式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を用いることができる。
【０１１４】
本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドなる用語は、複数の共有結合されたヌクレオシドを含む分子として、当業者によりそれが一般に理解されるとおりに定義される。治療的に有用なオリゴヌクレオチドとしての使用のためには、オリゴヌクレオチドは典型的には7〜30ヌクレオチドの長さで合成される。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、修飾RNAもしくはLNAヌクレオシドモノマー、またはその組み合わせからなってもよい。LNAヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間にリンカー基（ビラジカル（biradicle）または架橋と呼ぶ）を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献中で架橋核酸または二環式核酸（BNA）とも呼ばれる。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドは、例えば、C-6-アミノリンカーなど、オリゴヌクレオチドの5'末端にアミノリンカーを含んでもよい。
【０１１７】
GalNAcポリヌクレオチド結合体の調製は、以下の段階を含む。
a3）本発明の式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を前述のとおりに調製する段階、および
b3）式IのGalNAc酸誘導体または式VのGalNAc酸塩を、ペプチドカップリング条件下でポリヌクレオチドと結合させる段階。
【０１１８】
式VのGalNAc酸塩との結合が好ましい。
【０１１９】
ペプチドカップリング条件は、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）、EDC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド）またはEDC・HCl（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミドカップリング剤ならびにHOBt（1-ヒドロキシベンズトリアゾール）、HOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）、TBTU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸塩、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）またはHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールおよびTBTU/HOBtまたはHBTU/HOAtなどのその一般的組み合わせのような添加剤を用い、当業者には公知の古典的方法である。
【０１２０】
GalNAc誘導体のオリゴヌクレオチドへの結合の参考に、例として、US特許出願公報第2011/0207799号を引用することができる。
【実施例】
【０１２１】
略語：
AcOH  酢酸
DMAP  4-(ジメチルアミノ)-ピリジン
DMF  N,N'-ジメチルホルムアミド
EtOH  エタノール
MeOH  メタノール
rt  室温
THF  テトラヒドロフラン
TBME  tert-ブチルメチルエーテル
【０１２２】
構築ブロックA：
実施例1
(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル
2018523643.tif 000021
234.0g（500.0mmol）の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸を500mlのジクロロメタンに懸濁し、62.0ml（600mmol、1.2当量）のベンジルアルコールおよび3.05gのDMAP（25.0mmol、0.05当量）を加えた。溶液を40分間のうちに0〜5℃に冷却し、500mlのジクロロメタン中の108.0g（525.0mmol、1.05当量）のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を滴加した。白色懸濁液を0〜5℃で1時間と、次いで室温で15時間撹拌した。懸濁液をG3ガラスフィルターでろ過し、白色ろ過ケークを合計250mlのジクロロメタンで少しずつ洗浄した。ろ液を650〜10mbar/1時間で蒸発させて、黄色油状物を得、これを2.0Lの酢酸エチルに溶解し、2.0Lの0.5M塩酸、2.0Lの1M NaHCO3および1.0Lの食塩水で抽出し、有機層を40℃/150〜10mbar/5時間で蒸発乾固させて、291.1gの粗製(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルを白色固体として、収率104％および純度96.4％（HPLC面積％；約5％のベンジルアルコールを含む）で得た。この材料をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 459.22735 (M-boc+H)+。
【０１２３】
実施例2
(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩
2018523643.tif 000022
291.1g（500.0mmol）の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度；95.8％；約5％のベンジルアルコールを含む）を1.4LのTHFに室温で溶解した。10分以内に、1.04Lのジエチルアミン（10.0mol、20当量）を加え、淡黄色溶液を室温で2時間撹拌し、次いで40℃/200〜10mbarで蒸発させ、200mlのアセトニトリルを加え、ジエチルアミンを効率的に除去するために40℃/100〜10mbar/1時間で再度蒸発させた。最後に、268.1gの黄色油状物を得、これを2.5Lのアセトニトリルに溶解し、室温で10分間撹拌した。不溶性粒子をガラスファイバーフィルターでろ過し、500mlのアセトニトリルで洗浄した。ろ液を10分間のうちに20℃〜25℃で34.0mlのメタンスルホン酸を滴加して処理した。生成した白色懸濁液を室温で17時間撹拌し、G3ガラスフィルターでろ過した。ろ過ケークを500mlのアセトニトリルで少しずつ洗浄した。白色結晶を40℃/15mbar/4時間で乾燥し、195.8gの(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩を白色結晶として、収率91％（2段階）および純度99.3％（HPLC面積％）で得た。MS: m/z = 337.2149 (M+H)+。
【０１２４】
実施例3
(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル
2018523643.tif 000023
190.0g（439.0mmol）の(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩を1.9LのTHFに室温で懸濁した。335ml（1.98mol、4.5当量）のN-エチルジイソプロピルアミンを加え、それにより温度は15℃までわずかに低下した。次に、213g（615mmol、1.4当量）の(S)-2,6-ビス((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸を加え、白色懸濁液を室温で20分間撹拌した。390mlのn-プロピルホスホン酸無水物（環式三量体としてのT3P、酢酸エチル中50％、659mmol、1.5当量）を20分のうちに20〜25℃（冷水浴中で冷却）で滴加した。得られた淡黄色混濁溶液を室温で1.5時間撹拌し、分液漏斗に移し、1.9L TBMEで希釈し、1.9Lの水、1.9Lの0.5M塩酸、1.9Lの0.5M NaOH、1.9Lの水および1.9Lの食塩水で抽出した。分離した、まだ混濁した有機層をガラスファイバーフィルターでろ過し、フィルターを100mlのTBMEで洗浄し、合わせたろ液を40℃/100mbar/1時間で蒸発させ、1.0LのTBME（水を共沸除去するため）を再度加え、40℃/250〜10mbar/1時間で蒸発させて、粗生成物296.4gを白色固体残渣で得た。
【０１２５】
粗製固体を500mlのアセトニトリルで処理し、混濁溶液を60〜65℃で10分間加熱した。混合物を20〜25℃に冷却し、10分間撹拌し、ガラスファイバーフィルターでろ過し、50mlのアセトニトリルで洗浄した。淡黄色溶液を40℃/100〜10mbar/4時間で蒸発させて、295gの(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルをオフホワイト固体として、収率101％（HPLC純度：100％、ジアステレオマー純度（SS）98.6％）で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 565.3741 (M-boc+H)+。
【０１２６】
実施例4
(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩
2018523643.tif 000024
124.0g（187mmol）の(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルを1.25Lのアセトニトリルに懸濁した。61.0ml（935.0mmol、5.0当量）のメタンスルホン酸を20〜25℃で、10分のうちに加えた（ガス放出）。得られた橙色懸濁液を40分以内に55〜60℃まで加熱し、55〜60℃でさらに1時間撹拌した。橙赤色乳濁液を室温まで冷却し（脱boc化を1H-NMRにより制御した）、それ以上精製せずにA+B組み立て段階、実施例8で用いた。MS: m/z = 365.2558 (M+H)+。
【０１２７】
構築ブロックB:
実施例5a
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
2018523643.tif 000025
30.0g（200.0mmol）の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを50mlのDMFに20〜25℃で溶解し、次いで、46.0mlのメタノール中25％ナトリウムメトキシド（200.0mmol、1.0当量）を加えた。生成した溶液を40℃/50mbar/0.5時間で蒸発させ（40mlの溶媒の除去）、50mlのDMFを再度加え、40℃/20mbar/0.5時間で蒸発させた（15mlの溶媒の除去）、わずかにゼリー様の懸濁液に、50ml DMF中の13.9gのブロモ酢酸（100mmol、0.5当量）の溶液を20〜25℃で加え、混合物を6時間撹拌した。11.9mlの臭化ベンジル（100mmol、0.5当量）を加え、混合物を20〜25℃でさらに16時間撹拌した。次いで、反応混合物を200mlの食塩水で処理し、200mlのTBMEで抽出した。分離したTBME層を200mlの食塩水で抽出し、次いで、分離したTBME層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、40℃/300〜10mbar/1時間で蒸発させて、23.9gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。
【０１２８】
クロマトグラフィ（600gのシリカ60（0.063〜0.2mm）、移動相：酢酸エチル）後、合計7.85gの2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを無色油状物として、収率13％および純度99.0％（HPLC面積％）で単離した。MS: m/z = 299.1517 (M+H)+。
【０１２９】
実施例5b
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
2018523643.tif 000026
11.2gのtert-酪酸カリウム（100.0mmol、0.5当量）を70mlの2-メチル-2-ブタノールに懸濁し（軽度の発熱35℃）、次いで30.0g（200.0mmol）の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを5分のうちに滴加し、滴下漏斗を10mlの2-メチル-2-ブタノールで洗浄し（温度は45℃に上昇）、溶液を60〜65℃まで加熱し、11.6g（100mmol、0.5当量）のクロロ酢酸ナトリウムを加え、60〜65℃で16時間撹拌し、次いで11.9mlの臭化ベンジル（100mmol、0.5当量）を加え、混合物を60〜65℃でさらに16時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで50mlの水で処理し、80mlのTBMEおよび40mlのTBMEで抽出した。合わせたTBME層を50mlの半飽和食塩水で洗浄し、有機層を40℃/300〜10mbar/1時間で蒸発させて、27.0gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。
【０１３０】
クロマトグラフィ（270gのシリカ60（0.063〜0.2mm）、移動相：酢酸エチル/n-ヘプタン1/1で開始し、純粋な生成物が見えれば、移動相を100％酢酸エチルに変更）後、合計11.4gの2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを無色に近い油状物として、収率19％（クロロ酢酸ナトリウムから38％）および純度99.0％（HPLC面積％）で単離した。
【０１３１】
実施例5c
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
2018523643.tif 000027
40.3g（200.0mmol）の2-アミノ酢酸ベンジル塩酸塩を、0〜5℃に冷却した340mlの水および340mlのトルエンに、60分のうちに溶解し、50mlの水中の16.5g（240mmol、1.2当量）の亜硝酸ナトリウムの溶液を0〜5℃で、激しく撹拌しながら滴加した。反応混合物を0〜5℃で3時間撹拌した。黄色のトルエン層を分離し、340mlの1M NaHCO3および340mlの食塩水で洗浄し、分離したトルエン層を60gの硫酸ナトリウムで処理し、20〜25℃で1時間撹拌した。黄色懸濁液をろ過し、50mlのトルエンで洗浄した。澄明黄色トルエン溶液は最大200.0mmolの2-ジアゾ酢酸ベンジル（トルエン中約8.5％）を含む。この溶液を60分のうちに、0〜5℃に冷却し、よく撹拌した、170mlのトルエン中、60.0g（400mmol）のトリエチレングリコールおよび465μl（3.67mmol、0.02当量）の三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートの混合物に、窒素ガス発生下で滴加した。黄色反応混合物を20〜25℃で90分間撹拌し、ここで無色溶液が生成した。溶液を250mlの食塩水で抽出し、分離した有機層を60gの硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、100mlのトルエンで洗浄し、40℃/40〜10mbar/1時間で蒸発させて、49.9gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。クロマトグラフィをTeledyne Isco CombiFlash（330gのシリカ60（0.035〜0.070mm Teledyne Isco Cat.No. 69-2203-330）、移動相：15％アセトン85％n-ヘプタンから45分で30％および70％への勾配、分画サイズ20mlで実施した。合わせた分画から33.88gの2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを無色油状物として、全収率57％および純度99.0％（HPLC面積％）で得た。
【０１３２】
実施例6
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
2018523643.tif 000028
268.0gの2-(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)酢酸ベンジル（900mol）を2.4Lのジクロロメタンに溶解した。385.0gの(2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2,4,5-トリイル三酢酸塩（990mmol、1.1当量）および12.0mlのトリフルオロメタンスルホン酸（135mmol、0.15当量）を加えた。懸濁液をディーンスターク分離器（50ml、AcOHを除去するため）を用いて加熱還流した。1時間後、4.50mlのトリフルオロメタンスルホン酸（50.7mmol、0.05当量）および50mlのジクロロメタンを橙色懸濁液に加え、ディーンスターク分離器からの溶媒（50ml）を排出した。半時間ごとにこの手順を合計6回（3時間）繰り返した。合計4.5時間後、赤色溶液を10〜15℃まで冷却し、30分以内に20〜25℃で1.8Lの1M炭酸水素ナトリウム（1.8mol、2.0当量）の溶液に加えた（CO2放出、pH7〜8）。黄色有機層を分離し、40℃/600〜10mbar/3時間で蒸発させて、585.4gの粗製2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを黄色油状物として得た（HPLC純度：87％）。粗生成物を700mlのアセトンに溶解し、あらかじめ充填されたシリカカラム（3.0kgのシリカ60；0.063〜0.2mm）にチャージした。クロマトグラフィを、n-ヘプタン/アセトンを移動相として用いて（5：1〜1：2の勾配）実施した。合わせた回収分画を40℃/600〜10mbarで蒸発させ、20〜25℃/0.3mbar/3時間で乾燥して、465.0gの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-ピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを黄色油状物として、収率83％および純度100％（HPLC面積％）で得た。MS: m/z = 628.2627 (M+H)+。
【０１３３】
実施例7
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸
2018523643.tif 000029
アルゴン雰囲気下、456.0gの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-ピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル（727mmol）を1.4LのTHFに溶解した。4.56gのPd/C 10％を加え、アルゴン雰囲気を水素（1bar）で置き換えた。黒色懸濁液を20〜25℃で2時間水素化した。水素雰囲気をアルゴンで置き換え、黒色懸濁液をろ過し、ろ過ケークを合計400mlのTHFで少しずつ洗浄した。無色ろ液（HPLC純度：71％および27％トルエン）をいかなる精製もせずにA+B組み立て段階、実施例8で用いた。MS: m/z = 538.2191 (M+H)+。
【０１３４】
構築ブロックAおよびBの組み立て
実施例8a
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル
2018523643.tif 000030
実施例4からの(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩（180.0mmol）の赤橙色溶液（約1.4L）を3.60Lのアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、365.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン（2.16mol、12.0当量）を5分以内に加えた。生成した粘稠スラリーに、実施例7からの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸（720mmol、4.0当量）の溶液（約2.25L）を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、425mlのn-プロピルホスホン酸無水物（T3P、三量体、酢酸エチル中50％、720mmol、4.0当量）の溶液を10分以内に加えた。反応溶液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、40℃/10mbar/6時間で蒸発させて、1.06kgの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度：24.1％）を得た。粗生成物を3回に分けて沈澱させ、メタンスルホン酸N-エチルジイソプロピルアミンおよび残存T3Pを除去した。353gの粗生成物を7.0Lの2-プロパノールに溶解し、1時間で-25℃まで冷却し、-25℃で1時間撹拌し、あらかじめ冷却した（-25℃）G3-ガラスフィルターでろ過し（洗浄なし）、沈澱生成物からの一部が反応器からガラス壁上に沈着した。すべての沈澱をフィルターおよびガラス壁から合計1.0LのTHFで少しずつ溶解した。合わせた溶液を40℃/20mbar/6時間で蒸発させて、390.0gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度：71.9％）を得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 1923.8438 (M+H)+
【０１３５】
実施例8b
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウム
2018523643.tif 000031
(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩（12.2mmol）の赤橙色溶液（約95ml）を240mlのアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、30.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン（2.16mol、14.5当量）を5分以内に加えた。生成した粘稠スラリーに、2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸（48.8mmol、4.0当量）の溶液（約150ml）を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、28.8mlのn-プロピルホスホン酸無水物（T3P、三量体、酢酸エチル中50％、48.8mmol、4.0当量）の溶液を10分以内に加えた。反応溶液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、40℃/10mbar/6時間で蒸発させて、73.6gの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度：32面積％）。
【０１３６】
粗生成物68.0g（11.0mmol）を340mlのメタノールに溶解し、20.0ml（220mmol、20当量）の10.8M NaOHを淡黄色溶液に加え、温度が32℃まで上昇し、反応混合物を室温で2.5時間撹拌し、それにより懸濁液が生成した（pH12.0）。懸濁液をろ過し、ろ過ケークを100.0mlのメタノールで洗浄し、ろ液を40℃/250〜10mbar/2時間で蒸発させて、41.5gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウムを得、次いでこれを分取逆相クロマトグラフィで精製した。条件は実験9を参照されたい。
【０１３７】
実施例9
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウム
2018523643.tif 000032
378.0g（197.0mmol、粗製）の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジルを1.9Lのメタノールに溶解した。10分以内に、200.0mLの10.8M水酸化ナトリウム溶液（2.16mol、11.0当量）を20〜25℃で加えた。それにより温度が31℃まで上昇した。淡黄色溶液を20〜25℃で2時間撹拌し（pH13.4）、次いで80.0mLの5M塩化アンモニウム溶液を加えた（pH10.7）。次いで、淡黄色溶液を20〜25℃/100〜20mbar/5時間で蒸発させ、20〜0.5mbar/1時間で乾燥して、543gの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウム（HPLC純度：40.1％）を得、次いでこれを分取逆相クロマトグラフィで精製した。
カラム：Triart C18-120 26×15cm；10um
移動相：A：2mM NaHCO3/B：アセトニトリル
勾配：
2018523643.tif 000033
温度安定化：室温
検出：220nm
溶液：543gを4500mlの2mM NaHCO3に溶解し、ろ過した（GF5）（＝5000ml（109mg/ml）
試料溶液/注入：1回ごとに試料200ml＝21.8g（25回）
濃縮：合わせた分画（46L）を110Lの水で希釈し、この溶液を3分割してRP C18カラムにポンプで送り、水/MeOH 98/2で洗浄し、次いでMeOHで溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、1.18kgのメタノール溶液を得た。分取HPLC精製段階の1.18kgのメタノール溶液の4分の1、すなわち295gを40℃/20mbar/1時間で蒸発させ、次いで20〜25℃/0.35mbar/14時間で乾固させて、43.5gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ナトリウムを非結晶白色粉末、99.88％HPLC純度で得た。前述の溶液の残りの4分の3（885g）を次の段階で用いた。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
【０１３８】
実施例10
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸
2018523643.tif 000034
実施例9からのメタノール溶液（885g）を、20〜25℃で47.9gのDowex（50×8カチオン交換体；H3O+濃度2.57mmol/g）により1時間撹拌して処理し（pH3.1）、ろ過し、200mLのメタノールで洗浄した。ろ液を20〜25℃/15〜50mbarで蒸発させ、20〜25℃/0.01mbar/2時間で乾燥して、128.0gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸を白色非結晶粉末、99.77％HPLC純度で得た。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
【０１３９】
実施例11
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸カルシウム
2018523643.tif 000035
0.10g（0.068mmol）の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸を3.0mlのメタノールおよび0.30mlの水に溶解し、2.60mg（0.034mmol、0.5当量）の水酸化カルシウムを加え、混合物を室温で1時間撹拌した。淡い混濁溶液を40℃/200〜10mbar/1時間で蒸発させて、0.11gを白色固体で得た。99.60％HPLC純度。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドへの結合
実施例11（US特許出願公報第2011/0207799号の実施例15に従って）
（20mg、0.014mmol）の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸（GalNAc酸）をピリジンおよびジクロロメタンと共に同時蒸発させた。残渣を無水DMF（0.9ml）に溶解し、DMF中のN-ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）の溶液（1.6mg、0.014mmol）を、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら加えた。0℃で、DMF中のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の溶液（3.2mg、0.016mmol）をゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。生成したGalNAc N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、それ以上精製せずに、RNAへの結合のために用いた。
【０１４１】
用いたRNAは配列：5'-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3'（SEQ ID 1）を有するアミノ修飾RNAであり、ここでuおよびcは対応する塩基それぞれの2'-O-メチルヌクレオチドであり、sはホスホロチオエートを意味する。
【０１４２】
5'末端にC-6アミノリンカーを備えたRNA（2.54μmol）を凍結乾燥し、250μLのホウ酸ナトリウム緩衝液（0.1mol/Lホウ酸ナトリウム、pH8.5、0.1mol/L KCl）および1.1mLのDMSOに溶解した。8μLのN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の添加後、DMF中のGalNAc N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（理論的には0.014mmol）の溶液をRNA溶液に、持続的に撹拌しながらゆっくり加えた。反応混合物を35℃で終夜撹拌した。反応をRP-HPLC（リソースRPC 3ml、緩衝液：A：水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム（TEAA、2.0M、pH7.0）、B：95％アセトニトリル中100mM TEAA、勾配：20CVで5％B〜22％B）を用いてモニターした。-20℃でEtOH中の酢酸ナトリウム（3M）を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、所望の結合体を酢酸ナトリウム/EtOHを用いて沈澱させて、純粋なRNA結合体を得た。結合体を収率59％（1.50μmol）で単離した。結合体の純度をアニオン交換HPLCで分析し（純度：85.5％）、同一性をESI-MSで確認した（[M+H]1+計算値：8374.4；[M+H]1+測定値：8376.0）。
【国際調査報告】
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