(57)【要約】  本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に結合する抗体及びその使用方法を提供する。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ヒトＡＮＧＰＴＬ８と高い親和性で結合する。本発明の抗体は、完全ヒト抗体でも良い。本発明の抗体は、血中トリグリセリドレベルの上昇により、部分的に特徴付けられる様々な疾患又は障害の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照抗体としてＡＮＧＰＴＬ８上の同一エピトープに結合し、及び／又はＡＮＧＰＴＬ８と参照抗体との結合について競合する、抗体又はその抗原結合断片であり、ここで参照抗体が配列番号１６４／１６６／１６８／１７２／１７４／１７６又は３１６／３１８／３２０／３２４／３２６／３２８のアミノ酸配列を夫々有するＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３ドメインを含む前記の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
参照抗体が
ａ）配列番号１６４／１６６／１６８／１７２／１７４／１７６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３ドメインを含み、かつ、配列番号３６８により定義されるエピトープに特異的に結合し、又は、
ｂ）配列番号３１６／３１８／３２０／３２４／３２６／３２８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３ドメインを含み、かつ、配列番号３４８により定義されるヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域中の線状エピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
参照抗体が、
ａ）完全ヒトモノクローナル抗体であり、
ｂ）配列番号３３８のヒトＡＮＧＰＴＬ３ペプチドのＮ末端コイルドコイル領域に、又は配列番号３３９のヒトＡＮＧＰＴＬ４ペプチドのＮ末端コイルドコイル領域に結合せず、
ｃ）表面プラズモン共鳴による測定で、２５℃において、ＫＤ約１５０ｐＭ未満でヒトＡＮＧＰＴＬ８に結合し、かつ、２５℃において、ＫＤ約９０ｐＭ未満でサルＡＮＧＰＴＬ３に結合し、
ｄ）約１０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した時、哺乳動物のトリグリセリドレベルを約６８％低下させ、
ｅ）約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で皮下投与した時、哺乳動物のトリグリセリドレベルを約７日〜２１日に亘る期間、低下させ、
ｆ）配列番号１６２又は３１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、
ｇ）配列番号１７０又は３２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、又は
ｈ）表１のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む参照抗体と交差競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、組換え産生したヒト抗体である、請求項１〜３の何れかに記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的に結合し、抗体又はその抗原結合断片をコードする単離した核酸分子であり、ここで、抗体又はその抗原結合断片が（ａ）配列番号１６２又は３１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は（ｂ）配列番号１７０又は３２２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片、及び医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
それを必要とする患者において、ＡＮＧＰＴＬ８の活性を阻害する方法であって、請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の何れか１つ又はそれ以上を、又は請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の何れか１つ又はそれ以上を含む医薬組成物を患者に投与することを含み、ここで、ＡＮＧＰＴＬ８の少なくとも１つの活性が低減又は消滅する方法。
【請求項８】
前記投与により、患者の血中におけるトリグリセリドのレベルの低下をもたらす、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＡＮＧＰＴＬ８活性の上昇したレベルに部分的に関連する疾患又は状態を治療する方法であり、ＡＮＧＰＴＬ８阻害剤／アンタゴニストがＡＮＧＰＴＬ８に特異的な抗体又はその抗原結合断片である、ＡＮＧＰＴＬ８阻害剤／アンタゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
ＡＮＧＰＴＬ８に特異的な抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１６２／１７０又は３１４／３２２に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
高レベルの血中トリグリセリドに関連するか又は部分的に特徴づけられる状態又は疾患、又はその状態又は疾患に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を治療するための方法であって、請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項６に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に、血中のトリグリセリドのレベルが低下するか、又はその状態又は疾患を媒介するように、又はその状態又は疾患に関連する少なくとも１つの症状又は合併症を軽減又は、頻度、重症度が低減するように、投与することを含む方法。
【請求項１２】
状態又は疾患が、高脂血症、高リポタンパク血症、脂質異常症（アテローム発生性異脂肪血症、糖尿病性異脂肪血症、混合脂質異常症）、高トリグリセリド血症、ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬを有する重症の高トリグリセリド血症及び関連する急性膵炎、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、肥満、メタボリック症候群、糖尿病、ＡｐｏＣ２の変化、ＡｐｏＥの欠損、ＡｐｏＢの増加、極く低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増加及び／又は消失の減少のもたらす、若しくは引起こす脂肪異栄養症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に起因する脂肪組織萎縮症、特定の薬物治療（例えば、グルココルチコイド治療誘発性脂質異常症）、及びトリグリセリド又は脂質の上昇をもたらす遺伝的な何れかの素因、食事、又は生活様式からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
状態又は疾患が、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、心筋梗塞及び末梢血管疾患からなる群から選択される心血管疾患又は障害である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
医薬組成物を、第２の治療薬と組合わせて患者に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第２の治療剤を、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ阻害剤、コレステロール摂取及び／又は胆汁酸再吸収の阻害剤、ナイアシン、フィブラート又は両親媒性カルボン酸、ＬＸＲ転写因子（例えば、２２−ヒドロキシコレステロール）の活性化剤、又は、固定組合せ（例えば、エゼチミブ＋シンバスタチン）、胆汁酸（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）を有するスタチン、ナイアシン＋スタチンの固定した組合わせ（例えば、ナイアシンとロバスタチン）、及び他の脂質低下剤（例えば、オメガ−３−脂肪酸エチルエステル）から成る群から選択した請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、及びプラバスタチンから成る群から選択した請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第２の治療薬を、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様タンパク質５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様タンパク質６（ＡＮＧＰＴＬ６）、及びヒトプロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケクシン９型（ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する単離した抗体又はその抗原結合断片からなる群から選択する請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
第２の治療薬を、インスリン、インスリン類似体、ビグアニド（メトホルミン）、スルホニルウレア（例えばグリブリド、グリピジド）、ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）アルファグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ボグリボース）、 グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）アゴニスト（例えば、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）（エクセナチド）、ＴＲＵＬＩＣＩＴＹ（登録商標）（ジュラグルチド）、ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標）（リラグルチド）、ＬＹＸＵＭＩＡ（登録商標）（リキシセナチド、ＴＡＮＺＥＵＭ（登録商標）（アルビグルチド）、又は上記の何れかの類似体、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−４）阻害剤（例えばサクサグリプチン（ＯＮＧＬＹＺＡ（登録商標））、シタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標））及びビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ（登録商標）ナトリウム−グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、ＩＮＶＯＫＡＮＡ（登録商標）（カナグリフロジン）、ＦＯＲＸＩＧＡ（登録商標）（ダパグリフロジン）エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン）、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（プラムリンチド）、グルカゴン受容体アンタゴニスト、非スルホニルウレア分泌促進薬、インスリン類似体（例えば、速効型リスプロ、アスパルト、グルリシン及び長期作用型インスリンデテミル、インスリンデグルデク、グラルジンインスリン）、エキセンディン−４ポリペプチド、β３アドレナリン受容体アゴニスト、コレステロール摂取および／または胆汁酸再吸収の阻害剤、ＬＤＬ−コレステロールアンタゴニスト、コレステリルエステル伝達タンパク質アンタゴニスト（例えば、トルセトラピブ、アナセトラピブ、ダルセトラピブ、またはエバセトラピブ）、エンドセリン受容体アンタゴニスト、成長ホルモンアンタゴニスト、インスリン感作物質、アミリン模倣物またはアゴニスト、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、メラノコルチン、メラニン凝集ホルモン受容体アゴニスト、ＳＮＲＩ、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）模倣物、線維芽細胞増殖因子受容体１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃ）アゴニスト、高度に糖化した最終生成物形成（例えば、アミノグアニジン）の阻害剤、及びタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤からなる群から選択した、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
第２の治療剤が、鎮痛剤又は抗炎症剤である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）８に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片、これらの抗体を含む組成物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＮＧＰＴＬ８（あるいはＴＤ２６、ＲＩＦＬ、リパシン、Ｃ１９ｏｒｆ８０及びＢｅｔａｔｒｏｐｈｉｎと呼ばれる）は、トリグリセリド（ＴＧ）及びグルコース代謝の両方に関与する新たに認識されたＡＮＧＰＴＬファミリーメンバーである。主に肝臓及び脂肪組織で発現する循環タンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４とは異なり、ＡＮＧＰＴＬ８は、Ｃ末端のフィブリノゲン様ドメインを欠除しているが、他のＡＮＧＰＴＬファミリーメンバーと至極同様に、Ｎ末端コイルドコイルドメインを含む。系統発生分析から、ＡＮＧＰＴＬ８はＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４と共通の祖先を共有することが明らかにされた（非特許文献１）。
【０００３】
ＡＮＧＰＴＬ８の肝臓過剰発現は、高トリグリセリド血症に関連するが、Ａｎｇｐｔｌ８の不活性化は、血漿ＴＧレベルの低下を引き起こす（非特許文献２、非特許文献３）。ＡＮＧＰＴＬ８が脂質調節に関与しているという共通の認識が有るにもかかわらず、このプロセスの原因となるメカニズムは依然として議論の的となっている。提案された一つのメカニズムは、ＡＮＧＰＴＬ８がリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性を阻害し、トリグリセリドの加水分解及び排出を減少させるというものである（非特許文献４）。
【０００４】
ＡＮＧＰＴＬ８は又インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１により、インスリン抵抗性が誘発され、マウス内のβ細胞増殖及びベータ細胞塊に対してある役割を果たしていることが報告されている（非特許文献５）。然しながら、その後の研究により、ＡＮＧＰＴＬ８はβ細胞機能、即ちインスリン抵抗性に対するベータ細胞増殖応答には必要とされないことが明らかになった。更に、ＡＮＧＰＴＬ８の過剰発現は、ベータ細胞面積を増加させず、又は血糖コントロールを改善しない（非特許文献６）。
【０００５】
ＡＮＧＰＴＬ８による肝臓過剰発現は高トリグリセリド血症と関連し、しかも、Ａｎｇｐｔｌ８を不活性化すると血漿中のトリグリセリドレベルの低下をもたらすので、ＡＮＧＰＴＬ８の阻害剤若しくはアンタゴニストは、トリグリセリドレベルの上昇により、部分的に特徴付けられる疾患、である高トリグリセリド血症、これに限定する訳ではない、の治療に有効であり得ることが明らかにされた。
【０００６】
Ｚｈａｎｇは、野生型マウスに腹腔内注射した場合、リパシンに対するモノクローナル抗体が血清トリグリセリドレベルを低下させることを報告した（非特許文献７）。然しながら、今日まで、高トリグリセリド血症等の高レベルのトリグリセリドにより特徴付けられる疾患若しくは状態を治療するための臨床的環境において使用し得る、ＡＮＧＰＴＬ８に特異的な完全ヒト抗体については記載はされていない。
【０００７】
従って、高トリグリセリド血症及び上昇したトリグリセリド及び脂質レベルに関連する他の障害又は状態にある患者を治療するために、この分野で、本明細書に記載する抗体等の新規なアンタゴニストであるＡＮＧＰＴＬ８の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｕ、Ｚ．ら、（２０１３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４３０：１１２６−１１３１
【非特許文献２】Ｑｕａｇｌｉａｒｉｎｉ、Ｆ．ら（２０１２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９（４８）：１９７５１−１９７５６
【非特許文献３】Ｗａｎｇ、Ｙ．ら、（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：１６１０９−１６１１４
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ、Ｒ．ら、（２０１２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．４２４：７８６−７９２
【非特許文献５】Ｙｉ、Ｐ．ら（２０１３）、Ｃｅｌｌ  １５３：７４７−７５８
【非特許文献６】Ｇｕｓａｒｏｖａ、Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９：６９１−６９６
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ、Ｒ．（２０１５）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ’ｓ  ９７th  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＯＲ１３−６、Ｍａｒｃｈ  ５−８、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アンジオポエチン様タンパク質８（ＡＮＧＰＴＬ８）に結合する、抗体及びその抗原結合断片を提供する。本発明の１つの態様は、ＡＮＧＰＴＬ８に結合／相互作用するヒト抗体及びその抗原結合断片を提供し、この結合及び／又は相互作用は、哺乳動物におけるトリグリセリドレベルの低下をもたらす。
【００１０】
従って、第１の態様では、本発明は、ＡＮＧＴＰＬ８、特に、ヒトＡＮＧＰＴＬ８の、少なくとも１つの活性に特異的に結合し、中和し、阻害し、遮断し、排除し、低減し、又は妨害する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及びその抗原結合断片を提供する  （ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６１１５７．３のアミノ酸２２−１９８及び配列番号３４０番のアミノ酸１−１７７を参照のこと）。本発明の抗体又はその抗原結合断片により、中和、阻害、遮断、抑止、低減又は妨害し得るＡＮＧＰＴＬ８の活性としては、ＬＰＬ活性の阻害、又はインビボでのトリグリセリドレベルの低下等を挙げられるが、これに限定する訳ではない。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に特異的に結合し、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性を中和し、又は阻害するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供するものであり、ここで、その抗体又はその抗原結合断片の有する１又はそれ以上の特徴を以下に示す。
ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である。
ｂ）配列番号３３７により定義されるヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域の線状エピトープに特異的に結合する。
ｃ）配列番号３３７により定義されるヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域の線状エピトープに結合しない。
ｄ）配列番号３３８のヒトＡＮＧＰＴＬ３ペプチドのＮ末端コイルドコイル領域に、又は配列番号３３９のヒトＡＮＧＰＴＬ４ペプチドのＮ末端コイルドコイル領域に結合しない。
ｅ）表面プラズモン共鳴により測定して、２５°Ｃで約１５０ｐＭ未満のＫDでヒトＡＮＧＰＴＬ８に結合し、２５℃で約９０ｐＭ未満のＫDでサルＡＮＧＰＴＬ８に結合する。
ｆ）約１０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した場合、哺乳動物のトリグリセリドレベルを約６８％（最大）低下させる。
ｇ）用量範囲約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇで皮下投与すると、哺乳動物におけるトリグリセリドレベルを、約７日〜２１日の範囲の期間、低下させる。
ｈ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２６６、２７４、２８２、２９０、２９８、３０６、３１４及び３３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。
ｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０及び３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、又は
ｊ）参照抗体と交差競合し、ここで参照抗体は、表１のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ｈＡＮＧＰＴＬ８の標的化活性（例えば、ＡＮＧＰＴＬ８のＬＰＬ阻害活性）に直接関与するｈＡＮＧＰＴＬ８のエピトープに結合することによりｈＡＮＧＰＴＬ８の活性を中和し、阻害し、遮断し、抑止し、低減し又は妨害出来る。
【００１３】
別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ｈＡＮＧＰＴＬ８の標的化活性（例えば、ＡＮＧＰＴＬ８のＬＰＬ阻害活性）に直接には関与しないｈＡＮＧＰＴＬ８のエピトープに結合することによりｈＡＮＧＰＴＬ８の活性を中和し、阻害し、遮断し、抑止し、低減し又は妨害出来る、然し、そこに結合した抗体又はその断片は、抗体−抗原接触表面とは異なる部位における立体的重複又はアロステリック効果のどちらかによりｈＡＮＧＰＴＬ８の標的化活性を阻害し、遮断し、抑止し、低減し又は妨害出来る。
【００１４】
別の実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、ｈＡＮＧＰＴＬ８（即ち、非遮断抗体）の標的化活性（例えば、ＡＮＧＰＴＬ８のＬＰＬ阻害活性）に直接には関与しないｈＡＮＧＰＴＬ８のエピトープに結合するが、しかし、抗体又はその断片は、抗体又はその断片が存在しない下でのトリグリセリドレベルの低下と比較して、インビボでトリグリセリドレベルの低下をもたらす。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、配列番号３４０（配列番号３３７としても示される）の残基１−３９のＮ末端領域内に位置するエピトープに結合する、単離した抗―ｈＡＮＧＰＴＬ８抗体又はその抗原結合性断片であることを特徴とする。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、配列番号３４０（配列番号３３７として示される）の残基１−３９のヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域内に位置するエピトープに結合するが、然し、ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号３３８）のＮ末端コイルドコイル領域に、若しくは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号３３９）のＮ末端コイルドコイル領域には結合しない単離した抗体又は抗原結合断片を提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、配列番号３４０のアミノ酸残基１−３９（配列番号３３７としても示される）により定義されるヒトＡＮＧＰＴＬ８の領域の外側（即ち配列番号３４０番のアミノ酸残基４０−１７７）に位置するエピトープに結合する単離した抗―ｈＡＮＧＰＴＬ８抗体又はその抗原結合断片を特徴とし、かつ、ｈＡＮＧＰＴＬ８の少なくとも１つの活性を中和し、阻害し、抑止し、低減し、又は妨害する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ８（配列番号３４０のアミノ酸残基１〜１７７、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６１１５７．３のアミノ酸残基２２〜１９８もまた参照のこと）に結合するが、然し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３（配列番号３４２のアミノ酸配列、配列番号３４３に示される核酸配列によりコードされる）、又はヒトＡＮＧＰＴＬ４（配列番号３４４のアミノ酸配列、配列番号３４５に示される核酸配列によりコードされる）などの関連タンパク質と交差反応しない単離した抗―ｈＡＮＧＰＴＬ８抗体又は抗原結合断片であることを特徴とする。
【００１９】
本発明の抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）でも良く、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖ断片）のみを含むこともあり得るし、又は、機能性に影響するように変性し、例えば、宿主における持続性を増加させても良く、又は残留エフェクター機能を排除しても良い（Ｒｅｄｄｙら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。特定の実施形態では、抗体は二重特異性でも良い。
【００２０】
本発明の代表的な抗―ＡＮＧＰＴＬ８抗体を、本明細書の表１及び２に列挙する。表１に、代表的な抗―ＡＮＧＰＴＬ８抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２には、例示的な抗―ＡＮＧＰＴＬ８抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
【００２１】
本発明は、表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列を有し、又はその配列の少なくとも９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有するＨＣＶＲを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２２】
本発明は、又、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列を有し、又はその配列の少なくとも９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有するＬＣＶＲを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２３】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかと対を形成する表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列の何れかを含むＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体若しくはその抗原結合断片を提供する。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に特異的に結合するか、及び／又は阻害する単離した抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、配列番号が２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２５０、２６６／２５０、２７４／２５０、２８２／２５０、２９０／２５０、３０６／２５０、３１４／３２２及び３３０／３２２から成る群から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に特異的に結合するか、及び／又は阻害する単離した抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで抗体又は抗原結合断片は、配列番号が６６／７４、１６２／１７０、１９４／２０２及び３１４／３２２からなる群から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に特異的に結合するか、及び／又は阻害する単離した抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、配列番号が１６２／１７０であるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に結合するか、及び／又は阻害する単離した抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）表１に示す重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列の何れか１つに含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び、（ｂ）表１に示す軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列の何れか１つに含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に特異的に結合するか、及び／又は阻害する単離した抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２６８、２７６、２８４、２９２、３００、３０８、３１６及び３３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７０、２７８、２８６、２９４、３０２、３１０、３１８、及び３３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０及び３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２及び３２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、及び３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６及び３２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
【００２９】
本発明は又、表１に列挙したＨＣＤＲ１アミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３０】
本発明は又、表１に列挙したＨＣＤＲ２アミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも、９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有する、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３１】
本発明は又、表１に列挙したＨＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも、９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有する、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３２】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ１アミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも、９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有する、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３３】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ２アミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも、９０％少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有する、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３４】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかから選択するアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも、９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％が同一である実質的に同類の配列を有する、軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３５】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかと対を形成する表１に列挙したＨＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかを有する、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、本発明は、表１に列挙した代表的な抗―ＡＮＧＰＴＬ８抗体の何れかに含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号７２／８０（例えば、Ｈ４Ｈ１５３２１Ｐ）、１６８／１７６（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ）、２００／２０８（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４５Ｐ）及び３２０／３２８（例えば、Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２）から成る群から選択される。一実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号１６８／１７６（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ）である。
【００３６】
本発明は又、表１に列挙した代表的な抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の何れかに含まれる６つのＣＤＲのセット（即ち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態において、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号６８−７０−７２−７６−７８−８０（例えば、Ｈ４Ｈ１５３２１Ｐ）、１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ）、１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４５Ｐ）、３１６−３１８−３２０−３２４−３２６−３２８（例えば、Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２）からなる群から選択される。一実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ）である。
【００３７】
関連する実施形態では、本発明は、表１に列挙した代表的な抗ーＡＮＧＰＴＬ８抗体の何れかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含まれる６つのＣＤＲのセット（即ち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号６６／７４（例えば、Ｈ４Ｈ１５３２１Ｐ）、１６２／１７０（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ）、１９４／２０２（例えば、Ｈ４Ｈ１５３４５Ｐ）、３１４／３２２（例えば、Ｈ４１５３６７Ｐ２）から成る群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含まれるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体またはその抗原結合断片を含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は、当技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用しても良い。ＣＤＲの境界を同定するために使用し得る代表的な規約には、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、及びＡｂＭの定義を含む。一般論としては、Ｋａｂａｔの定義は配列の可変性を基準とし、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的なループ領域の位置を基準とし、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの考え方の間のである。Ｋａｂａｔ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）、及びＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照。公開データベースも又、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
【００３８】
本発明は、変性したグリコシル化パターンを有する抗―ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去する変性が有用であり得る、即ち、例えば抗体がオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を除去して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させる（Ｓｈｉｅｌｄら、（２００２）ＪＢＣ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の応用では、ガラクトシル化の変性により、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を変性させても良い。
【００３９】
本発明は又、ＨＣＶＲのＣＤＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体又はその抗原結合断片とＡＮＧＰＴＬ８への特異的結合を競合する抗体及びその抗原結合断片を提供し、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは各々、表１に列挙したＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８への結合について、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２５０、２６６／２５０、２７４／２５０、２８２／２５０、２９０／２５０、３０６／２５０、３１４／３２２、及び３３０／３２２からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と、競合する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４１】
本発明は又、ＨＣＶＲのＣＤＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体又はその抗原結合断片としてＡＮＧＰＴＬ８上の同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片を提供し、ここで、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、各々表１に列挙したＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８上の同じエピトープに、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２５０、２６６／２５０、２７４／２５０、２８２／２５０、２９０／２５０、３０６／２５０、３１４／３２２、及び３３０／３２２からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体として結合する単離したモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４３】
一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に対し、特異的に結合するか、及び／又は阻害する、単離した抗体は、組換え産生したヒトモノクローナル抗体である。
【００４４】
一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に対し、特異的に結合するか、及び／又は阻害する、単離した抗体が、組換え産生したヒトモノクローナル抗体であり、表１にあるアミノ酸配列から選択されたＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲ配列を有する。
【００４５】
一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に対し、特異的に結合するか、及び／又は阻害する、単離した抗体が、組換え産生したヒトモノクローナル抗体であり、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２５０、２６６／２５０、２７４／２５０、２８２／２５０、２９０／２５０、３０６／２５０、３１４／３２２、及び３３０／３２２から成る群から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を有する。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８活性を中和する完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供し、ここで、その抗体またはその断片は、以下の特徴の１つ以上を示す。（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２６６、２７４、２８２、２９０、２９８、３０６、３１４および３３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、および３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。（ｉｉｉ）配列番号が８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列、を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号が１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６および３２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列、を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む、（ｉｖ）配列番号が４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２６８、２７６、２８４、２９２、３００、３０８、３１６および３３２、から成る群から選択されるアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、配列番号が６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７０、２７８、２８６、２９４、３０２、３１０、３１８、および３３４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、配列番号が１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２及び３２４から成る群から選択されるアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、及び配列番号が１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、及び３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含む。（ｖ）配列番号３３７によって定義されるヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域に特異的に結合する。（ｖｉ）配列番号３３７によって定義されるヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域に特異的に結合しない。（ｖｉｉ）配列番号３３８のヒトＡＮＧＰＴＬ３ペプチドのＮ末端コイルドコイル領域に、又は配列番号３３９のヒトＡＮＧＰＴＬ４ペプチドのＮ末端コイルドコイル領域に結合しない。（ｖｉｉｉ）表面プラズモン共鳴により測定したとき、ヒトＡＮＧＰＴＬ８に、２５℃で約１５０ｐＭ未満のＫＤで結合し、サルＡＮＧＰＴＬ８に、２５℃で約９０ｐＭ未満のＫＤで結合する。（ｉｘ）約１０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した場合、哺乳動物のトリグリセリドレベルを約６８％（最大）低下させる。（ｘ）約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で皮下投与した場合、約７日〜２１日の範囲の期間、哺乳動物のトリグリセリドレベルを低下させる。（ｘｉ）参照抗体と交差競合し、ここで参照抗体は表１のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかから成る群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む。
【００４７】
第２の態様において、本発明は、又、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体又はその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＶＲ核酸配列の何れか、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＶＲ核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００４９】
本発明は又、表１に列挙したＨＣＤＲ１アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＤＲ１核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００５０】
本発明は又、表１に列挙したＨＣＤＲ２アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＤＲ２核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００５１】
本発明は又、表１に列挙したＨＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＤＲ３核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００５２】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ１アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子も提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＤＲ１核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００５３】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ２アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子も提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＤＲ２核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００５４】
本発明は又、表１に列挙したＬＣＤＲ３アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分子も提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＬＣＤＲ３核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。
【００５５】
本発明は又、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここで、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（即ち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙した代表的な抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の何れかにより定義される。
【００５６】
本発明は又、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここで、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（即ち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙した代表的な抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の何れかにより定義される。
【００５７】
本発明は又、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ここで、ＨＣＶＲは、表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列の何れかのアミノ酸配列を含み、かつＬＣＶＲは、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙したＨＣＶＲ核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含み、及び、表２に列挙したＬＣＶＲ核酸配列の何れかから選択されるポリヌクレオチド配列、又はその配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一性を有する実質的に同類の配列を含む。本発明のこの態様による特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここで、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、両方共に表１に列挙した同一抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体に由来する。
【００５８】
本発明は又、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の重鎖又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現する能力を有する組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記の核酸分子の何れかを含む組換え発現ベクター、即ち表１に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲ配列の何れかをコードする核酸分子を含む。又、本発明の範囲には、そのようなベクターが導入された宿主細胞、並びに抗体又は抗体断片の産生が可能となる条件下で宿主細胞を培養し、次いで、そのように産生した抗体及び抗体断片を回収する方法が含まれる。
【００５９】
一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性に特異的に結合する、及び／又は、阻害する単離した抗体は、組換えにより産生され、表２に示す核酸配列から選択された核酸配列によりコードされたＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲを有するヒトモノクローナル抗体である。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的に結合する抗体又はその断片をコードする単離した核酸分子を提供し、ここで、抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）表１に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び、（ｂ）表１に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする単離した核酸分子を提供し、ここで抗体又は抗原結合断片は、表１に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるＨＣＶＲ、及び、表１に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるＬＣＶＲを含む。
【００６２】
第３の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に特異的に結合する組換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、表１に示す抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の何れかの抗体又はその抗原結合断片から選択されたヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的な少なくとも１つの抗体、及び医薬的に許容し得る担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００６４】
関連する局面において、本発明は、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と第２の治療剤との組合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療薬は、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と有利に組合わせる何れかの薬剤である。
【００６５】
一実施形態では、第２の治療剤は、高トリグリセリド血症などの高トリグリセリドレベルを特徴とする疾患又は状態に罹患している患者において、トリグリセリドを低下させるか、又は少なくとも１つの症状を軽減できる薬剤でも良い。
【００６６】
特定の実施形態では、第２の治療剤は、抗体又は本発明の抗体の抗原結合断片に関連し得る副作用、万一そのような副作用が起こると仮定すれば、を中和又は軽減するのに役立つ薬剤でも良い。
【００６７】
第２の治療剤は、小分子薬剤、タンパク質／ポリペプチド、抗体、アンチセンス分子などの核酸分子、又はｓｉＲＮＡでも良い。第２の治療薬は、合成でも、天然由来でも良い。
【００６８】
本発明の抗体及び医薬的に許容し得る組成物は、他の併用療法で使用出来る、即ち、抗体及び医薬的に許容し得る組成物を、１つ又はそれ以上の他の所望の治療又は医療処置と同時に、前に、又は後に投与しても良いことは理解されよう。併用レジメンで使用する特定の治療法（治療法又は手順）の組合わせでは、所望の治療法及び／又は手順の適合性及び達成されるべき所望の治療効果を考慮にいれる。使用される療法は、同じ障害（例えば、抗体は同じ障害を治療するために使用される別の薬剤と同時に投与され得る）に対して所望の効果を達成し得ること、又はそれらが異なる効果（例えば、悪影響の何れをも抑制する）を達成することも理解し得よう。本明細書で治療される疾患又は状態に使用される追加治療薬は、特定の疾患又は状態を治療又は予防するために通常投与されるもので、適合している。
【００６９】
関連する実施形態では、本発明は、本発明の特徴は抗体又はその抗原結合断片と、第２の治療剤とを組合せた組成物であり、第２の治療剤としては（１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン等、（２）コレステロール摂取及び／又は胆汁酸の再吸収阻害剤、（３）リポタンパクの異化を増加させるナイアシン、（４）ＴＧレベル、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを低下させ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルを改善するフィブラート又は両親媒性カルボン酸、及び（５）２２−ヒドロキシコレステロール、又はエゼチミブ＋シンバスタチンのような固定された組合わせ等の、コレステロール排除において役割を果たすＬＸＲ転写因子の活性化剤、胆汁レジン（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）を有するスタチン、ナイアシン＋スタチン（例えば、ナイアシンとロバスタチン）の固定された組合わせ、又はオメガ−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール）のような他の脂質低下剤と組合わせを挙げられる。
【００７０】
更に、第２の治療剤はＡＮＧＰＴＬ８の１種又はそれ以上の他の阻害剤、同様に、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン型９（ＰＣＳＫ９）のような他の分子の阻害剤でも良く、これは、脂質代謝、特にコレステロール及び／又はトリグリセリドの恒常性に関連している。これらの分子の阻害剤には、小分子、アンチセンス分子、及びこれらの分子に特異的に結合し、その活性を遮断する抗体が含まれる。
【００７１】
一実施形態では、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を糖尿病（例えば、２型糖尿病）等の疾患の治療に使用する場合、これらの抗体は、現在利用可能な以下の糖尿病のための治療の１つ又はそれ以上と組合わせて使用しても良い。それを以下に挙げると、インスリン、インスリン類似体（下記参照）、ビグアナイド（メトホルミン）、スルホニルウレア（例えばグリブリド、グリピジド）、ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えばピオグリタゾン、ロシグリタゾン）、アルファグルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース、ボグリボース）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）アゴニスト（例えば、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）（エクセナチド）、ＴＲＵＬＩＣＩＴＹ（登録商標）（ジュラグルチド）、ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標）（リラグルチド）、Ｌｙｘｕｍｉａ（登録商標）（リキシセナチド）、Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標）（アルビグルチド））、ジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤（例えば、サキサグリプチン（ＯＮＧＬＹＺＡ（登録商標））、シタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標））、及びビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ（登録商標））、ナトリウムグルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、ＩＮＶＯＫＡＮＡ（登録商標）（カナグリフロジン）、ＦＯＲＸＩＧＡ（登録商標）ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン）、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（プラムリンチド）、（例えば、米国特許第８５４５８４７号に記載されているような）グルカゴン受容体アンタゴニスト、およびグルカゴンアンタゴニストである。
【００７２】
ある関連する実施形態では、組成物は、第２の薬剤を含んでも良く、それらは、非スルホニルウレア分泌促進物質、速効型（例えば、リスプロ、アスパルト、グルリスシン）及び遅効型（例えば、デテミ−ルインスリン、デグルデックインスリン、又はグラルギンインスリン）を含むインスリン類似体、エキセンディン−４ポリペプチド、ベータ３アドレナリン受容体アゴニスト、コレステロール摂取及び／又は胆汁酸再吸収の阻害剤、ＬＤＬコレステロールアンタゴニスト、コレステリルエステル移動タンパク質アンタゴニスト（例えばトルセトラピブ、アナセトラピブ、ダルセトラピブ又はエバセトラピブ）エンドセリン受容体アンタゴニスト、成長ホルモンアンタゴニスト、インスリン感作物質、アミリン模倣物またはアゴニスト、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、メラノコルチン、メラニン凝集ホルモン受容体アゴニスト、ＳＮＲＩ、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）模倣物（例えば、米国特許公開第２０１１０００２８４５号及び米国特許公開第２００８０２６１２３６号を参照）、線維芽細胞増殖因子受容体１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃ）アゴニスト（例えば、米国特許公開第２０１１０１５０９０１号を参照）、アミノグアニジンなどの高度糖化最終生成物の阻害剤、及びタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤等であるが、これに限定する訳ではない。
【００７３】
関連する実施形態において、第２の治療剤は、鎮痛剤、Ｃｏｘ−２阻害剤などの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）を含む抗炎症剤、等の１種又はそれ以上の他の治療剤でも良く、必要であれば、根底にある状態に付随する症状を寛解及び／又は軽減するように投与する。
【００７４】
第４の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性を、それを必要とする患者において中和し、阻害し、遮断し、抑止し、低減又は妨害する方法を提供するものであり、表１に示す本発明の抗体の何れかの１種又はそれ以上を、又は、これらの抗体の何れかの１種又はそれ以上を含む医薬組成物を、これらを必要とする患者に投与する方法を含み、ここでＡＮＧＰＴＬ８に関連する少なくとも１つの活性を低減するか消失させる。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、治療を必要とする被験者に、本発明の１種又はそれ以上の抗−ｈＡＮＧＰＴＬ８抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量及び、場合により、１種又はそれ以上の上記の追加的治療剤、を投与することを含む治療方法を提供する。
【００７６】
第５の態様において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８の上昇した発現及び／又は活性に部分的に関連する疾患又は状態を治療する方法を提供するものであり、その方法とはＡＮＧＰＴＬ８阻害剤／アンタゴニストを投与することを含み、ここでＡＮＧＰＴＬ８阻害剤／アンタゴニストは、ＡＮＧＰＴＬ８に特異的である抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ８に特異的な抗体又はその抗原結合断片は、表１のアミノ酸配列からなる群から選択されるＨＣＶＲ、及び表１のアミノ酸配列からなる群から選択されるＬＣＶＲを含む。
【００７７】
一実施形態では、本発明の方法によって治療可能な疾患または障害は、抗ーｈＡＮＧＰＴＬ８抗体治療（例えば、ＡＮＧＰＴＬ８で媒介する疾患または障害）を伴わない場合と比較して、ＡＮＧＰＴＬ８活性を除去し、阻害し、低減し、またはそうでなければ妨害することにより、改善され、寛解され、阻害され、若しくは予防されるか、又は疾患に関連する少なくとも１つの症状発症の重症度、又は頻度が減少する疾患または障害の何れかである。本発明の方法により治療可能な疾患又は障害の例としては、これに限定する訳ではないが、脂質代謝を伴うもの、例えば、高脂血症、高リポ蛋白血症および異常脂質血症、例えば、アテローム発生性異脂肪血症、糖尿病性異脂肪血症等、ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬの重症高トリグリセリド血症およびこれに伴う急性膵炎を含む、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合異脂肪血症（肥満、メタボリック症候群、糖尿病など）脂肪異栄養症、脂肪組織萎縮症、等が挙げられ、これらは、例えば、ＬＰＬ活性および／またはＬＰＬ欠損の減少、ＡｐｏＣ２の変化、ＡｐｏＥの欠損、ＡｐｏＢの増加、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増加および／または消失の減少、特定の薬物による治療（例えば、グルココルチコイド治療誘発性異常脂質血症）、遺伝的素因、食事、生活様式などの何れかを挙げられる。
【００７８】
本発明の方法は又、トリグリセリド血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高リポタンパク血症及び／又は、これらに限定する訳ではないが、心血管疾患または障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患などを含む異常脂質血症、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病などの血糖障害、肥満などに関連するか、又はそれらに起因する疾患又は障害を予防又は治療することも出来る。
【００７９】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片は、メタボリック症候群に関連する異常脂質血症、肥満を治療するため、又は体重増加を予防するため、又は正常な体重を維持するために使用しても良い。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、血中トリグリセリドレベルを低下させる方法、又は高血中トリグリセリドレベルに関連するか、若しくはその一部を特徴とする状態若しくは疾患、又はその状態若しくは疾患に関連する少なくとも１つの症状若しくは合併症を治療する方法を提供するものであり、その方法とは、表１のヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的な１種又はそれ以上の抗体を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に、血中トリグリセリドレベルを低下させる、又はその状態若しくは疾患を媒介させるか、又は少なくとも１つの症状、又は状態若しくは疾患に関連する合併症の、重症度を寛解又は軽減させるように投与することを含む。
【００８１】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片は、単独で、又は第２若しくは第３の治療剤と組合わせて、高トリグリセリド血症又は高トリグリセリド血症に関連する少なくとも１つの症状を治療するために、又は、高トリグリセリド血症を発症する危険性のある患者、例えば、高トリグリセリド血症を発症する遺伝的素因を有する患者、例として、家族性高トリグリセリド血症若しくは家族性異常βリポタンパク血症、を治療するために使用しても良い。
【００８２】
他の状態では、患者が高レベルのトリグリセリドになりやすくする可能性がある。例えば、ベータ遮断薬、避妊薬、利尿薬、ステロイド、又はタモキシフェンの使用など、特定の薬物は、トリグリセリドのレベルの上昇をもたらし、その結果、患者は、高レベルのトリグリセリドに関連する状態または合併症例えば、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心臓発作、及び他の心臓病を発症する可能性が高まる可能性がある。
【００８３】
更に、ある種の他の状態は、肥満、制御不能な糖尿病、甲状腺機能低下症、腎臓疾患又はアルコール摂取を含む、高レベルのトリグリセリドを誘引し得る。
【００８４】
一実施形態において、抗体は、上昇した血中トリグリセリドレベルにより部分的には特徴付けられる疾患若しくは障害の発症を予防するため、又はそのような疾患若しくは障害を発症する可能性を防止するため、又は疾患若しくは障害の重篤度、又は、その疾患若しくは障害に関連する少なくとも１つの症状を緩和するために使用しても良い。本発明の抗体は、単独で、又は、他の薬剤若しくは、上昇した血中トリグリセリドレベルにより部分的に特徴付けられる、それに限定する訳ではないが、高トリグリセライド血症等の疾患又は状態を患っている患者を治療するための標準治療として知られる方法との補助療法として使用し得ることを想定している。このような標準的な療法は、流体投与、又は血液中性脂肪又は脂質の低下に、又は体重減量のために有用な他の何れかの薬剤の投与を含み得る。
【００８５】
一実施形態では、本明細書に記載の抗体の使用は、正常なレベルのトリグリセリドを達成するのに有効な手段であり、それにより、高トリグリセリドにより特徴付けられる疾患に関連する１つ以上の症状又は長期の合併症を寛解又は予防し得る。
【００８６】
一実施形態では、本発明の抗体は上昇したレベルのトリグリセリドにより、部分的に特徴付けられる疾患又は障害の何れかを治療する際に使用するための医薬の調製に使用しても良い。
【００８７】
本発明の抗体は、急性診療における短期療法として使用しても良く、又は慢性治療としての長期に亘る使用を想定しても良い。
【００８８】
他の実施形態は、以下に示す詳細な説明の概要で明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐを単回皮下投与したヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおける血清トリグリセリド及び総コレステロール濃度の平均＋／−標準誤差を示す。投与用量は、試験の０日目に１、５、１０又は２５ｍｇ／ｋｇであった。統計的比較は、対照Ａｂとの差の２元分散分析（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１により行った
【図２】図２は、１、５、１０又は２５ｍｇ／ｋｇの用量でのＨ４Ｈ１５３４１Ｐの単回の皮下投与の投与の後の循環抗ヒト抗体のレベルを示す。
【図３】図３は、対照抗体と比較した、ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおける血清リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝リパーゼに及ぼすＨ４Ｈ１５３４１Ｐ  ｍＡｂの効果を示す。統計は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ−検定により行った。＊＊ｐ＜０．０１
【図４】図４は、ＡＮＧＰＴＬ８マウス中の脂質耐性試験におけるｍＡｂ  Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐの効果を示す。  Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ  ｍＡｂを投与して、対照抗体と比較した、急性脂肪負荷後のトリグリセリドレベルの低下について評価した。ボンフェローニ事後検定を用いた２元ＡＮＯＶＡにより統計を行った。  ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明を記載する前に、本発明は、記載した特定の方法及び実験条件に限定する訳ではないので、その方法及び条件は変動し得ることは理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、かつ、限定することを意図している訳ではないことも理解されたい、なぜなら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきであるからである。
【００９１】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者により通常に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で「約」という用語使用する場合、特定の列挙した数値に関して使用する時のその値は列挙した値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用する表現「約１００」は、９９及び１０１並びにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００９２】
本明細書に記載した方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料の何れも、本発明の実施又は試験において使用することができるが、ここに記載するのは好ましい方法及び材料である。本明細書で言及した全ての特許、出願、非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
〔定義〕
「アンジオポエチン様タンパク質８」又は「ＡＮＧＰＴＬ８」は、タンパク質のアンジオポエチンファミリーの一種であり、たまに、ＴＤ２６、ＲＩＦＬ、リパシン、Ｃ１９ｏｒｆ８０及びベータトロフィンと呼ばれることがある。本明細書中で使用される場合、「ＡＮＧＰＴＬ８」は、配列番号３４０のアミノ酸残基１〜１７７に示されるアミノ酸配列を含むヒトＡＮＧＰＴＬ８を指す。シグナル配列を含む完全長ヒトＡＮＧＰＴＬ８アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０６１１５７．３にも見出され、一方、ヒトＡＮＧＰＴＬ８をコードする完全長核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０１８６８７．６に見出し得る。ヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端コイルドコイルドメインは、配列番号３４０のアミノ酸残基１〜３９に及んでおり、又、配列番号３３７として示されている。本明細書のタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種に由来するものとして明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド又はタンパク質断片のヒトバージョンである。従って、表現「ＡＮＧＰＴＬ８」は、非ヒト種、例えば「マウスＡＮＧＰＴＬ８」、「サルＡＮＧＰＴＬ８」などからの由来であると特定されない限り、ヒトＡＮＧＰＴＬ８を意味する。
【００９４】
本明細書で使用される「ヒトアンジオポエチン様タンパク質３」又は「ｈＡＮＧＰＴＬ３」という用語は、配列番号３４３に示される核酸配列及び配列番号３４２のアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を有するＡＮＧＰＴＬ３を指す。ヒトＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメインは、配列番号３３８として示される。
【００９５】
本明細書で使用する「ヒトアンジオポエチン様タンパク質４」又は「ｈＡＮＧＰＴＬ４」という用語は、配列番号３４５に示される核酸配列、及び配列番号３４４のアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な断片を有するＡＮＧＰＴＬ４を指す。ヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイルドメインは、配列番号３３９として示される。
【００９６】
本発明の特定の実施形態、抗体又は抗体断片は、第２のＡＮＧＰＴＬ８アンタゴニストなどの治療的部分（「免疫複合体」）、又は、上昇したトリグリセリドレベルにより部分的に引起こされる疾患又は状態を治療するのに有用な他の何れかの治療部分と複合し得る。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、「抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体」という表現は、単一特異性を有する一価抗体、並びにＡＮＧＰＴＬ８に結合する第一アーム及び第二（標的）抗原に結合する第二アームを含む二重特異性抗体の両方を含み、抗−ＡＮＧＰＴＬ８アームは、本明細書の表１に示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列の何れかを含む。
【００９８】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＡＮＧＰＴＬ８）に特異的に結合するか又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合分子又は分子複合体を意味する。用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略記する）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣH１、ＣH２及びＣH３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣL１）．を含む。ＶH及びＶL領域は、より保存され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。各ＶH及びＶLは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。本発明の異なる実施形態において、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一でも良く、又は天然又は人工的に変性していても良い。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００９９】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書中で使用される抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等は、天然に存在し酵素的に入手可能な、合成した、又は遺伝子操作したポリペプチド又は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、タンパク質可変消化、又は可変、場合により定常ドメインの抗体をコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子工学技術等の適切な標準技術の何れかを用いて例えば、完全抗体分子から誘導し得る。このようなＤＮＡは公知であり、及び／又は例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、又は合成しても良い。ＤＮＡは、化学的に又は分子生物学技術を用いて配列決定及び操作してもよく良く、例えば、１つ又はそれ以上の可変及び／又は定常ドメインを適切な配置で並べ、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を変性し、追加し又は削除しても良い。
【０１００】
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離した相補性決定領域（ＣＤＲ））又は拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位を挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインも又、本明細書で使用される「抗原結合断片」という表現に包含される。
【０１０１】
抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの可変ドメインを含むのが通常である。可変ドメインは、どのような、サイズ又は、アミノ酸組成物でも良く、一般に、１つ又はそれ以上のフレームワーク配列を有するフレームに隣接して、又はフレーム内にある少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶLドメインと会合したＶHドメインを有する抗原結合断片において、ＶHドメイン及びＶLドメインは、適切ならば相互に如何なる位置でも配置しても良い。例えば、可変領域は二量体でも、ＶH−ＶH、ＶH−ＶL又は、ＶL−ＶL二量体を含んでも良い。或いは、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶH又はＶLドメインを含んでも良い。
【０１０２】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変ドメイン及び定常ドメインの代表的な配置としては、これに限定する訳ではなく、以下のｉ）ＶH−ＣH１、（ｉｉ）ＶH−ＣH２、（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３、（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２、（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３、（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３、（ｖｉｉ）ＶH−ＣL、（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１、（ｉｘ）ＶL−ＣH２、（ｘ）ＶL−ＣH３、（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２、（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３、（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３、及び（ｘｉｖ）ＶL−ＣL．が含まれる。上記に列挙した代表的な構成の何れかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインの何れかの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、又は完全又は部分ヒンジ又はリンカー領域により連結していても良い。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメインの間で可撓性又は半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸から成っていても良い。更に、本発明の抗体の抗原結合断片は、互に非共有結合的に会合して、及び／又は一種又はそれ以上の単量体ＶH又はＶLドメインと（例えば、ジスルフィド結合により）会合して、上記に列挙した可変及び定常ドメイン配置の何れかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含んでいても良い。
【０１０３】
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、通常少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原に、又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書中に開示した代表的な二重特異性抗体フォーマットを含む多重特異性抗体フォーマットの何れも、当該分野で利用可能な日常的な技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片の文脈において使用するために適合させても良い。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、天然に存在しないヒト抗体を含むことを意図する。この用語は、非ヒト哺乳動物、又は非ヒト哺乳動物の細胞において組換え産生した抗体を含む。この用語は、ヒト被験体から単離した、又はヒト被験体において生成した抗体を含むことを意図していない。
【０１０５】
本発明の抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体でも良い。用語「組換えヒト抗体」とは、本明細書中で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、作製または単離する全てのヒト抗体を含むことを意図しており、その抗体とは、宿主細胞内にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現した抗体（以下に更に記載する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下に更に記載する）から単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子で遺伝子組換えした動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照）又は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列へスプライシングしたもの含む他の何れかの手段により調製し、発現し、作製し又は単離した抗体等である。特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列の遺伝子組換え動物を使用する場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に付し、従って、組換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶH及びＶL配列に関連はしながら、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【０１０６】
ヒト抗体は、ヒンジ異質性に関連する２つの形態で存在し得る。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物を含み、ここで二量体は鎖間重鎖ジスルフィド結合により共に保持されている。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されず、軽鎖及び重鎖（半抗体）が共有結合した構成で、約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、アフィニティ精製後でさえ、分離することが極めて困難であった。
【０１０７】
様々な無処置のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的差異に起因するが、これに限定する訳ではない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換をすると、第２の形態（Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）の出現は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて通常観察されるレベルまで顕著に低下させ得る。本発明は、ヒンジ、ＣH２又はＣH３領域内に１箇所又はそれ以上の変異を有する抗体を包含し、生産上望ましく、例えば、所望の形態の抗体の収率を改善し得る。
【０１０８】
本発明の抗体は、単離した抗体でも良い。本明細書で使用する「単離した抗体」とは、同定されたものであり、その自然環境の少なくとも１つの成分から、分離され及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生命体の少なくとも１つの成分から、又は抗体が天然に存在するか又は天然に産生される組織又は細胞から分離又は除去された抗体は、本発明の目的のための「単離した抗体」である。単離した抗体は又、組換え細胞内のその場で抗体を含む。単離した抗体は、少なくとも１つの精製又は単離工程に供された抗体である。特定の実施形態によれば、単離した抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないものとなり得る。
【０１０９】
本明細書に開示する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば公的抗体配列データベースから入手可能な配列と比較することにより容易に確認することができる。１つ又はそれ以上の突然変異を含む抗体及び抗原結合断片を一度得たならば、結合特異性の向上、結合親和性の増加、アンタゴニスト又はアゴニスト生物学的特性（場合により）の向上又は増強、免疫原性の低減など、の１つ又はそれ以上の所望する特性について、容易に試験することが出来る。この一般的方法で得られる抗体及び抗原結合断片は、本発明に包含される。
【０１１０】
本発明は又、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列の何れかの変異体を有する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含む。例えば、本発明は、例として、本明細書の表１に記載したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列の何れかに関連する１０個又はそれ未満、８個又はそれ未満、６個又は又はそれ未満、４個又はそれ未満、等の保存的アミノ酸置換を備えたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含む。
【０１１１】
本明細書で使用する「遮断抗体」又は「中和抗体」（又は「ＡＮＧＰＴＬ８活性を中和する抗体」）とは、その抗体とＡＮＧＰＴＬ８との結合及び／又は相互作用が、ＡＮＧＰＴＬ８の少なくとも１つの生物活性の阻害をもたらすという意味を意図している。例えば、本発明の抗体は、ＡＮＧＰＴＬ８のリポタンパク質リパーゼ阻害活性を阻害し得るか、又はＡＮＧＰＴＬ８のＬＰＬ阻害活性の阻害を通じて行なう以外の機構により血漿トリグリセリドを低下させ得る。ＡＮＧＰＴＬ８の生物活性のこの阻害は、当技術分野で公知の数種の標準的なインビトロ又はインビボ試験の１種又はそれ以上によるＡＮＧＰＴＬ８の生物活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することにより評価しても良い。活性が替わるのは、本発明の抗体に関連してトリグリセリドの活性を低下させるのである。
【０１１２】
本明細書で使用する「表面プラズモン共鳴」又は「ＳＰＲ」という用語は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、生体分子相互作用の分析をリアルタイムで可能にする光学現象を意味し、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）又はＭＡＳＳ−１システム（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ及びＧｒｅｅｎｖｉｌｌｅ、ＲＩ）を使用する。
【０１１３】
本明細書で使用する「ＫD」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味することを意図している。
【０１１４】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を意味する。単一の抗原は１個より多いエピトープを有し得る。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、高次構造であるか又は線状のどちらでも良い。高次構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸を空間的に並置することにより産生する。線状エピトープは、ポリペプチド鎖の中の隣接するアミノ酸残基により産生するエピトープである。特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基又はスルホニル基の部分を含み得る。
【０１１５】
用語「実質的同一性」又は「実質的に同一の」は、核酸又はその断片に言及する場合、別の核酸（又はその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失とを最適に整列する場合、例えば、以下で記述するが、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰ等の配列同一性についての周知のアルゴリズムの何れかによって測定されるように、ヌクレオチドを基準に少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照とする核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、ある場合には、参照核酸分子によりコードされたポリペプチドとして、同一又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【０１１６】
「実質的類似性」又は「実質的に類似」という用語は、ポリペプチドに適用する場合、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重量を用いるＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムにより最適に整列された場合、少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により、異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないものである。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性のパーセント又は類似性の程度を上方に調整して、置換の保存的性質を補正しても良い。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。これは参考として本明細書に取り込む。類似した化学的性質を備える側鎖を有するアミノ酸の群の例として、（１）脂肪族側鎖であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖であるセリン及びスレオニン、（３）アミド含有側鎖であるアスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖であるフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖であるリジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖であるアスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、及び（７）硫黄含有側鎖としてはシステイン及びメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度（ゆうど）行列において正の値を有する任意の変化であり、Ｇｏｎｎｅｔら．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３−１４４５、に開示されており、参考として本明細書に取り込む。「適度に保存的」な置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有する任意の変化である。
【０１１７】
ポリペプチドの配列類似性は、通常、配列分析ソフトを用いて測定する。タンパク質分析ソフトは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の変性に割り当てられた類似性の尺度を用いて類似の配列を比べる。例えば、ＧＣＧソフトは、デフォルトパラメーターと共に使用出来るＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含み、異なる種の生物からの相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性又は配列同一性を決定する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列も又、ＦＡＳＴＡを使用して、デフォルト又は推奨のパラメーターと比較することができる。ＧＣＧバージョン６．１プログラムであるＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上掲）との間の最良重複領域の配列比較及びパーセント配列同一性を提供する。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、４１０及び（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９  ４０２を参照のこと、その各々は参照として本明細書に取り込まれる。
【０１１８】
語句「治療有効量」とは、それを投与するものに関して所望の効果を産み出す量を意味する。正確な量は、治療の目的に依存し、既知の技術（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照）を用いて当業者により確認し得るであろう。
【０１１９】
本明細書で使用する「治療する」又は「治療」という用語は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法を意味する。本発明の一実施形態では、有益な又は所望の臨床結果としては、血中トリグリセリドレベルの改善、又は、高トリグリセリド血症等を含む、上昇したトリグリセリドレベルに関連するか、又はそれに起因する１つ又はそれ以上の状態、疾患又は症状の何れかの改善が含まれるが、これに限定される訳ではない。
【０１２０】
ｐＨ依存性結合
本発明は、ｐＨ依存性の結合特性を有する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含む。例えば、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、中性のｐＨと比較したとき、酸性のｐＨではＡＮＧＰＴＬ８への結合の低下を示し得る。或いは、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、中性のｐＨと比較して酸性のｐＨでのＡＮＧＰＴＬ８への結合の増強を示し得る。「酸性のｐＨ」という表現は、約６．２未満のｐＨ値、例えば、約６．０、５．９５、５、９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、又はそれ未満である。本明細書中で使用される表現「中性のｐＨ」は、約７．０から約７．４のｐＨを意味する。「中性のｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
【０１２１】
ある特定の例においては、「中性のｐＨと比較して酸性のｐＨでのＡＮＧＰＴＬ８への結合の低減」とは、酸性のｐＨでＡＮＧＰＴＬ８に結合する抗体のＫＤ値と、中性のｐＨでＡＮＧＰＴＬ８に結合する抗体のＫＤ値の比率の面から表現する（又はその逆）。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片の酸性／中性のＫD比が約３．０又はそれ以上であるならば、本発明の目的のために「中性のｐＨと比較して酸性のｐＨではＡＮＧＰＴＬ８への結合が低減している」と見なし得る。特定の代表的な実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性断片の酸性／中性のＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、  １３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０又はそれ以上である。
【０１２２】
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性のｐＨと比較して酸性のｐＨでの特定の抗原への結合を減少（又は増強）する抗体の集団をスクリーニングすることにより得ることができる。更に、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの変性は、ｐＨ依存性特性を有する抗体を生じ得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ内）の１つ又はそれ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性のｐＨに対して酸性のｐＨで抗原結合が低減する抗体を得ることができる。
【０１２３】
Ｆｃ変異体を含む抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体
本発明の特定の実施形態によれば、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を、例えば中性のｐＨと比較して酸性のｐＨで増強又は低減する１つ又はそれ以上の突然変異を有するＦｃドメインを含む抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を提供する。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣH２又はＣH３領域に変異を有する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含み、ここで変異は、酸性環境（例、ｐＨは約５．５〜約６．０の範囲にあるエンドソーム中）においてＦｃドメインのＦｃＲｎへの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与した場合、抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ変性の例としては、それに限定する訳ではないが、例えば、位置２５０での変性（例、Ｅ又はＱ）、２５０及び４２８（例、Ｌ又はＦ）、２５２（例、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４（例、Ｓ又はＴ）、及び２５６（例、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ又はＴ）、位置４２８及び／又は４３３での変性（例、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）及び／又は４３４（例Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ又はＹ（Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ又はＮ４３４Ｙ））、又は位置２５０及び／又は４２８での変性、又は位置３０７及び／又は３０８（例、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）及び４３４位での変性を含む。一実施形態において、変性は、４２８Ｌ（例、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例、Ｎ４３４Ｓ）変性、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例、Ｖ２５９Ｉ）及び３０８Ｆ（例、Ｖ３０８Ｆ）変性、４３３Ｋ（例、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例、４３４Ｙ）変性、２５２、２５４、及び２５６（例、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の変性、２５０Ｑ及び４２８Ｌ変性（例、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、及び３０７及び／又は３０８の変性（例、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。更に別の実施形態では、変性は、２６５Ａ（例、Ｄ２６５Ａ）及び／又は２９７Ａ（例、Ｎ２９７Ａ）変性を含む。
【０１２４】
例えば、本発明は、２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ（例、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉ及び３１１Ｉ（例、Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉ及び４３４Ｈ（例、Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖ及び４３４Ｈ（例、Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａ及び４３４Ａ（例、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａ）、及び４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つ又はそれ以上の対又は突然変異群を備えたＦｃドメインを有する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含む。前述のＦｃドメイン突然変異、及び本明細書に開示した抗体可変ドメイン内の他の突然変異の可能な組合わせは全て、本発明の範囲内であると企図している。
【０１２５】
本発明は又、キメラ重鎖定常（ＣH）領域を有する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含み、キメラＣH領域は、１つより大きい免疫グロブリンアイソタイプのＣH領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣH２ドメインの一部又は全部を含むキメラＣＨ領域を含み、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４分子由来のＣH３ドメインの一部又は全部と組合わされている。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣH領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵナンバリングに従って２２８位〜２３６位のアミノ酸残基）と組合せた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングに従って２１６〜２２７位のアミノ酸残基）を含むことができる。特定の実施形態によれば、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基、及びヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のキメラＣH領域を含む抗体は、抗体の治療的又は薬物動態学的特性に悪影響を及ぼすことなく、変性されたＦｃエフェクター機能を表すことが出来る。（例えば、２０１３年２月１日出願の米国仮特許出願第６１／７５９、５７８号を参照のこと、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２６】
抗体の生物学的特性
本発明は、高い親和性でＡＮＧＰＴＬ８に結合する抗体及びその抗原結合断片を含む。例えば、本発明は、２５℃又は３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による測定で約１５０ｎＭ未満のＫDでヒト又はサルのＡＮＧＰＴＬ８に結合する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含み、例えば、本明細書中の実施例３及び４に定義されている測定形式、又は実質的に類似の測定法を用いて、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  Ｃ末端融合と共に組換えＡＮＧＰＴＬ８タンパク質を使用する。特定の実施形態によれば、ヒト又はサルのＡＮＧＰＴＬ８に結合する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を提供し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による測定により、例えば、本明細書中の実施例３及び４に定義されている測定形式、又は実質的に類似の測定形式で、そのＫDは２５℃又は３７℃で約９０ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、又は約９０ｐＭ未満を有する。
【０１２７】
本発明は又、ヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域に由来する配列番号３３７のペプチドに結合する抗体及びその抗原結合断片も含み、本明細書の実施例３で定義された測定形式又は実質的に同様の測定法を使用して、２５℃又は３７℃で表面プラズモン共鳴により測定したとき、約１００分を超える解離半減期（ｔ１／２）を有する。特定の実施形態によれば、ヒトＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域に由来するペプチドと結合する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を提供し、本明細書の実施例３で定義された測定形式又は実質的に同様の測定法を使用して、２５℃で表面プラズモン共鳴により測定したとき、そのｔ１／２は約１１０分と等しいか又はそれ以上、約１２０分超、約１３０分超、約２００分超、約３００分超、約４００分超、約５００分超、又はそれ以上を有する。
【０１２８】
本発明は又、哺乳動物のトリグリセリドを低減する抗体及びその抗原結合断片を含み、皮下的に約０．１ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約１００ｍｇ／ｋｇ、用量を投与したとき、その低減は、約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％又はそれ以上となる。本発明の抗体が血漿トリグリセリドの低減に及ぼす効果は、投与後少なくとも７日から投与後約３週間若しくは４週間、又はそれ以上持続し得る。
【０１２９】
本発明の抗体は、配列番号が２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２６６、２７４、２８２、２９０、２９８、３０６、３１４及び３３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、及び、
配列番号が１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、及び、３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、又は参照抗体と交差競合しても良く、ここで、参照抗体は表１のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列の何れかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む。
【０１３０】
本発明の抗体は、配列番号
２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２５０、２６６／２５０、２７４／２５０、２８２／２５０、２９０／２５０、３０６／２５０、３１４／３２２、及び３３０／３２２からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含み得る。
【０１３１】
本発明の抗体は、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２６８、２７６、２８４、２９２、３００、３０８、３１６及び３３２、からなる群から選択されるアミノ酸配を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７０、２７８、２８６、２９４、３０２、３１０、３１８、及び３３４からなる群から選択されるアミノ酸配を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０及び３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン。
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２及び３２４、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、及び３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、及び
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６及び３２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【０１３２】
本発明の抗体は、前述の生物学的特性の１つ又はそれ以上、又はその組合わせの何れかを有し得る。本発明の抗体の生物学的特性の前述のリストは網羅的なものを意図してはいない。本発明の抗体の他の生物学的性は、本明細書の実施例を含む本開示の総説から当業者に明らかになるであろう。
【０１３３】
エピトープマッピング及び関連技術
本発明の抗体が結合するエピトープは、ＡＮＧＰＴＬ８タンパク質の単一の連続する３個又はそれ以上（例、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸配列を含む。或いは、エピトープは、ＡＮＧＰＴＬ８の複数の非連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなり得る。
【０１３４】
当業者に公知の様々な技術を用いて、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する」か否かを決定することができる。代表的な技術としては、例えば抗体を記載する日常の交差遮断分析、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ＮＹ）、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド開裂分析が挙げられる。更に、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出及び化学変性などの方法を用いても良い（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析により検出する水素／重水素交換である。一般的に言えば、水素／重水素交換法は注目するタンパク質を重水素で標識し、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移動し、抗体により保護された残基（重水素標識されたままである）を除くすべての残基で水素−重水素交換が起こるようにする。抗体が解離した後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析にかけ、それにより抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９、Ｅｎｇｅｎ及びＳｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。
【０１３５】
本発明は更に、本明細書に記載した特定の代表的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載のアミノ酸配列の何れかを含む抗体）の何れかと同一のエピトープに結合する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含む。同様に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ８との結合について、本明細書に記載した特定の代表的抗体（例えば、本明細書の表１に記載したアミノ酸配列の何れかを含む抗体）の何れかと競合する抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体も含む。
【０１３６】
当技術分野で公知であり本明細書に例示されている日常的な方法を使用することにより、抗体が参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれとの結合に競合するか否かを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と同一のエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体をＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に結合させる。次に、試験抗体がＡＮＧＰＴＬ８分子に結合する能力を評価する。もし、試験抗体が、参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と飽和結合した後にＡＮＧＰＴＬ８に結合することが出来るならば、試験抗体は参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けても良い。他方で、試験抗体が、参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と飽和結合した後にＡＮＧＰＴＬ８分子に結合することが出来ないならば、試験抗体は、本発明の参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体により結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。更なる日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合の分析）を、その後実施しても良く、試験抗体で観察された結合の欠如は、実際は、参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するのか、又は立体的遮断（または別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認する。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能な他の何れかの定量的若しくは定性的抗体結合測定を用いて行うことができる。本発明の特定の実施形態によれば、もし、例えば、１つの抗体が１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰で、競合的結合分析で測定したとき、他方の結合を少なくとも５０％、然し好ましくは、７５％、９０％又は更に９９％阻害するならば、２つの抗体は、同一の（または重複する）エピトープに結合している（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。或いは、もし、片方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少又は排除するならば、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。１つの抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を減少又は排除するならば、２つの抗体は「重複エピトープ」を有するとみなされる。
【０１３７】
抗体が参照抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体との結合について競合する（又は結合について交差競合する）かどうかを決定するために、上記の結合方法論を２方向で実施する。第１の方向において、参照抗体を飽和条件下でＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に結合し、続いて試験抗体のＡＮＧＰＴＬ８分子への結合の評価を行う。第２の方向において、試験抗体を飽和条件下でＡＮＧＰＴＬ８分子に結合し、続いて参照抗体のＡＮＧＰＴＬ８分子への結合の評価を行なう。両方向のうち、もし、第１（飽和）抗体のみがＡＮＧＰＴＬ８分子に結合する能力があるならば、試験抗体及び参照抗体はＡＮＧＰＴＬ８への結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解されるように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合する必要はないが、重複する若しくは近接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【０１３８】
ヒト抗体の調製
本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、完全ヒト（非天然起源）抗体でも良い。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である。このような公知の方法の何れかを本発明の文脈中で使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的に結合するヒト抗体を作製しても良い。
【０１３９】
モノクローナル抗体を生成するための、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６、５９６、５４１号、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照）または他の公知の何れかの方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するアレルゲンに対して高親和性のキメラ抗体を最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、抗原性刺激に応答したマウスが、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を産生するように、内因性マウス定常領域に作動可能に連結されたヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子導入マウスの作製に関わる。次いで、完全ヒト抗体を発現可能な細胞中でＤＮＡを発現させる。
【０１４０】
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを注目する抗原に暴露し、抗体を発現したマウスからリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を回収する。リンパ細胞をミエローマ細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製しても良く、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択し、注目する抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖及び軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域に連結しても良い。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞内で産生しても良い。或いは、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離しても良い。
【０１４１】
以下の実験の項に記載するように、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性のキメラ抗体を単離し、特性を決定し、親和性、選択性、エピトープ等の望ましい特性について選択する。次いで、マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型、即ち変性ＩｇＧ１又はＩｇＧ４を生成させる。選択される定常領域は特定の用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合及び標的特異特性は可変領域に存在する。
【０１４２】
一般に、本発明の抗体は、固体相上に又は溶液相内の何れかの抗原に固定化される結合により測定するとき、非常に高い親和性を有し、通常、約１０-12から約１０-9ＭのＫDを有する。
【０１４３】
生物学的同等性
本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体および抗体断片は、アミノ酸配列を有するタンパク質を包含し、記述された抗体のものとは異なるが、ヒトＡＮＧＰＴＬ８に結合する能力を保持している。このような変異体抗体及び抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の１個又はそれ以上の付加、欠失又は置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等の生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較してヌクレオチドの１個又はそれ以上の付加、欠失又は置換を含むが、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体又は抗体断片をコードする配列を包含し、それは、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に同等である。そのような変異体アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は上記で議論した。
【０１４４】
２種の抗原結合タンパク質又は抗体は、例えば、類似した実験条件下で同じモル用量で、単回用量か多数回用量のどちらかを、投与したとき、その吸収速度及び程度が顕著な差を示さず、医薬的等価物又は医薬的代替物であるならば、生物学的同等であると見做す。いくつかの抗体は、たとえ、吸収の程度は同等であるが、吸収速度は同等ではなくても、同等又は医薬的に代替的であると見做し、及び、その吸収速度の差異は意図的であり、標識に反映されていて、例えば慢性的な使用に対して、有効な身体薬物濃度の達成に必須ではなく、かつ、研究している特定の医薬製品について医学的に重要ではないとみなされるため、生物学的に同等であるとみなしても良い。
【０１４５】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度、及び効力において臨床的に有意な差異がない場合、生物学的に同等である。
【０１４６】
一実施形態において、患者が、切替えをしない継続的な治療と比較して、臨床的に顕著な免疫原性の変化又は有効性の低下等、予想される悪影響のリスクが増加することなく、参照生成物と生物学的生成物とを１回又はそれ以上の回数切替えることが出来るならば、２つの抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
【０１４７】
一実施形態では、もし、２つの抗原結合タンパク質の両方が、条件又は使用条件のために、共通のメカニズムまたは作用メカニズムによって、そのメカニズムで知られている程度迄、作用する場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である
【０１４８】
生物学的同等性は、インビボ及びインビトロの方法により実証しても良い。生物学的同等性の測定には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度を血液、血漿、血清または他の生物学的液体中で時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験（ｂ）ヒトインビボでの生物学的利用能のデータと相関し、かつ、合理的に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生物学的利用能または生物学的同等性を確立する、十分に制御された臨床試験などを含む。
【０１４９】
本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の生物学的同等変異体は、例えば、残基又は配列の種々の置換を作製することにより、又は生物学的活性に不必要な末端又は内部残基もしくは配列を欠失させることにより構築しても良い。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基を、欠失させ、又は他のアミノ酸で置き換えて、再生の際に不必要若しくは不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止しても良い。他の状況において、生物学的同等抗体は、抗体のグリコシル化特性を変性するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除又は除去する変異を含む抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体変異体を含んでも良い。
【０１５０】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は一つより多い標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は１つより多い標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９、Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照。本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に連結するか、又はそれらと同時発現させることができる。例えば、抗体又はその断片は、別の抗体又は抗体断片などの１つ又はそれより多い他の分子実体に機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方法により）結合されて、第二の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を産生する。
【０１５１】
本発明は、免疫グロブリンの片方のアームがヒトＡＮＧＰＴＬ８に結合し、かつ、免疫グロブリンの他方のアームが第２の抗原に特異的である二重特異性抗体を含む。ＡＮＧＰＴＬ８結合アームは、本明細書の表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲアミノ酸配列の何れかを含んでも良い。
【０１５２】
本発明の文脈で使用出来る代表的な二重特異性抗体形式は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇＣ３ドメインの使用を含み、ここで第１及び第２のＩｇＣ３ドメインは互いに少なくとも１つのアミノ酸が異なり、かつ少なくとも１つのアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠いた二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のタンパク質Ａへの結合を低下させる。一実施形態では、第１のＩｇＣH３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣH３ドメインはＨ９５Ｒ変性（エクソンナンバリングＩＭＧＴ、ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を低減又は消滅する変異を含む。第２のＣH３は、更にＹ９６Ｆ変性（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含み得る。更に、第２のＩｇＣH３ドメイン内で見出される変性としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、ａｎｄＶ４２２Ｉ  ｂｙＥＵ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる  Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＥＵによるＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＥＵによるＶ４２２Ｉ）を含む。上記の二重特異性抗体形式についての変形は、本発明の範囲内であると企図している。
【０１５３】
本発明の文脈において使用出来る他の代表的な二重特異的形式としては、これに限定する訳ではないが、例えば、ｓｃＦｖベース又はダイアボディ二重特異性形式、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、四倍体（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブと穴（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例、ノブと穴等を有する共通の軽鎖等）ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及び、Ｍａｂ2二重特異的形式（例えば、Ｋｌｅｉｎら、２０１２、ｍＡｂｓ  ４：６、１−１１、および、前述の形式の総説のための引用文献を参照）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸複合体を用いて構築することも出来、ここで、例えば直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を用いて、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチド複合体を生成し、ついで、それを自己組織化して、所定の組成、価数及び幾何学的構造を有する多量体複合体とする。（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４、２０１２］参照）
【０１５４】
治療上の製剤及び投与
本発明は、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、及び移送、送達、耐用性などを改善して付与する他の薬剤と共に製剤する。適切な製剤の多くは、すべての医薬品化学者に知られている処方集、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、の中に見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルション、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及びカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１。も参照のこと。
【０１５５】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及び体格、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変動し得る。好ましい用量は、通常、体重又は体表面積に従って計算される。成人患者では、本発明の抗体を、通常、単回用量で静脈内に、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重を投与することが有利であり得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調節しても良い。抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を投与するための有効な投薬量及びスケジュールは経験的に決定して良く、例えば、患者の進行を定期的な評価により監視し、それに応じて用量を調整しても良い。更に、用量の種間スケールは、当該分野で周知の方法を用いて行っても良い（例、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【０１５６】
様々な送達系が知られており、例えば、リポソームの中にカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、突然変異ウイルスを発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照のこと）。導入方法としては、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられるが、これらに限定する訳ではない。組成物は、好都合な何れかの経路、例えば、注入又は大量投与、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）による吸収により投与することが出来、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することが出来る。投与は全身又は局所でも良い。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、標準針及び注射器を用いて皮下又は静脈内に送達することができる。更に、皮下送達に関して、ペン型送達装置は、本発明の医薬組成物の送達に容易に適用できる。このようなペン型送達装置は、再使用可能又は使い捨て可能である。再使用可能なペン型送達装置は、一般に、医薬組成物を含んだ交換可能なカートリッジを使用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てを一端、投与し、カートリッジが空になると、空のカートリッジの廃棄は容易であり、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換する。次いで、ペン型送達装置を再使用することができる。使い捨てペン型搬送装置には、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバに保持された医薬組成物が予め充填されて届く。リザーバの医薬組成物が空になると、装置全体を廃棄する。
【０１５８】
多数の再使用可能なペン及び自己注入送達装置が、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（登録商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（登録商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（登録商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（登録商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）、ＢＤ（登録商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＰＥＮＰＲＯ（登録商標）、ＯＰＴＩＰＥＮＳＴＡＲＬＥＴ（登録商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）等を挙げられるが、これらほんの少数の名称に限定する訳ではない。本発明の医薬組成物を皮下に送達するために適用する使い捨てペン型送達装置の例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（登録商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（登録商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（登録商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、ＬＰ）及びＨＵＭＩＲＡ（登録商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）等を挙げられるが、これらほんの少数の名称に限定する訳ではない。
【０１５９】
ある状況では、医薬組成物は制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用しても良い（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用しても良く、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ．を参照のこと。更に別の実施形態では、制御放出系を組成物が標的とする近傍に配置することができるので、全身投与量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ｐｐ．１１５−１３８参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３の総説で議論されている。
【０１６０】
注射可能な製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射用、点滴剤等の剤形を含み得る。これらの注射用製剤は、公知の方法により調製し得る。例えば、注射用製剤は、上記記載の抗体又はその塩を、注射用に従来使用している滅菌水性媒体又は油性媒体に溶解し、懸濁し又は乳化することにより、調製し得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張化剤、その他の補助剤等が挙げられ、適当な可溶化剤、例えばアルコール（例、エタノール）、多価アルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）非イオン性表面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水添ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）等が挙げられる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油等を用い、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と組合わせて使用しても良い。このようにして調製した注射剤は、適切なアンプルに充填するのが好ましい。
【０１６１】
有利には、上記記載の経口又は非経口に使用するための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。単位用量の剤形としては錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。前記抗体の含有量は、単位用量中で剤形当たり、通常約５〜約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、上記の抗体は、約５〜約１００ｍｇ及び他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇ含まれることが好ましい。
【０１６２】
免疫接合体
本発明は、血中トリグリセリドレベル又は脂質を低下させる能力を有する薬剤等の治療部分に接合したヒト抗−ＡＮＧＰＴＬ８モノクローナル抗体（「免疫接合体」）を包含する。抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体に接合し得る治療部分の型は、治療される状態及び達成するべき所望の治療効果を考慮する。例えば、高トリグリセリド血症、又はそれにより血中トリグリセリドを低下させること及び／又は正常な血中トリグリセリドレベルを維持することが望ましい他の何れかの状態を治療するために、薬剤をＡＮＧＰＴＬ８抗体に接合させても良い。或いは、所望する治療効果が、高トリグリセリド血症に関連する続発症若しくは病徴の治療、又は血中トリグリセリドレベルが高いか若しくは制御出来なくなっていることに起因する他の何れかの状態を治療することにある場合、状態の続発症又は病徴を治療するのに適する薬剤を接合させるのは有利であり得る。免疫接合体を形成するのに適した薬剤の例は、当該分野で公知であり、例えば、国際特許公開第０５／１０３０８１号を参照されたい。
【０１６３】
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、例えば、高トリグリセリド血症を患う患者において、またＡＮＧＰＴＬ８の活性を阻害することが有益である状態及び障害の広範囲な治療のために、血中トリグリセリドレベルを低下させるのに有用である。従って、抗体は、例えば、内分泌系、中枢神経系、末梢神経系、心血管系、肺系、及び消化器管系の疾患又は状態又は付随する病徴若しくは後遺症を予防、治療、又は緩和するための使用を、現在の治療に伴う望ましくない副作用の１つ又はそれ以上を低減及び／又は排除しながら、見出し得る。
【０１６４】
本発明の抗体を、疾患の治療又は予防に使用しても良く、例えば、これに限定する訳ではないが、脂質代謝を伴うもの、例えば、高脂血症、高リポ蛋白血症および異常脂質血症、例えば、アテローム発生性異脂肪血症、糖尿病性異脂肪血症等、ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬの重症高トリグリセリド血症およびこれに伴う急性膵炎を含む、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合異脂肪血症（肥満、メタボリック症候群、糖尿病など）脂肪異栄養症、脂肪組織萎縮症、等が挙げられ、これらは、例えば、ＬＰＬ活性および／またはＬＰＬ欠損の減少、ＡｐｏＣ２の変化、ＡｐｏＥの欠損、ＡｐｏＢの増加、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増加および／または消失の減少、特定の薬物による治療（例えば、グルココルチコイド治療誘発性異常脂質血症）、遺伝的素因、食事、生活様式などの何れかを挙げられる。
【０１６５】
本発明の方法では又、トリグリセリド血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高リポタンパク血症及び／又は異常脂質血症に関連するか又はそれに起因する、動脈瘤、高血圧、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患等の治療、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）のような血糖障害、肥満などを含む、疾患又は障害を予防又は治療することができが、それに限定する訳ではない。
【０１６６】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片は、メタボリック症候群に関連する異常脂質血症、肥満を治療するために、又は体重増加を予防するために、又は正常な体重を維持するために使用し得る。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、血中トリグリセリドレベルを低下させるための、又は高血中トリグリセリドレベルに関連するか、又はその一部を特徴とする状態又は疾患、又はその状態又は疾患に関連する少なくとも１つの症状若しくは合併症を治療するための方法を提供し、その方法とは、表１のヒトＡＮＧＰＴＬ８に特異的な１つ又はそれ以上の抗体を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与して、血中トリグリセリドレベルを低下させるか、又はその状態又は疾患が媒介させるか、又は、少なくとも１つの症状又は、状態若しくは疾患に関連する合併症の重症度が緩和又は軽減させることを含む。
【０１６８】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片は、単独で、又は第２若しくは第３の治療剤と組合わせて、高トリグリセリド血症又は高トリグリセリド血症に関連する少なくとも１つの症状を治療するために、又は、高トリグリセリド血症を発症する危険性のある患者、例えば、高トリグリセリド血症を発症する遺伝的素因を有する患者、例として、家族性高トリグリセリド血症若しくは家族性異常βリポタンパク血症、を治療するために使用し得る。
【０１６９】
他の状態では、患者を高レベルのトリグリセリドにかかりやすくする可能性がある。例えば、ベータ遮断薬、避妊薬、利尿薬、ステロイド、又はタモキシフェンの使用など、特定の薬物は、トリグリセリドのレベルの上昇をもたらし、その結果、患者は、高レベルのトリグリセリドに関連する状態または合併症例えば、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心臓発作、及び他の心臓病を発症する可能性が高まる可能性がある。
【０１７０】
更に、ある種の他の状態は、肥満、制御不能な糖尿病、甲状腺機能低下症、腎臓疾患又はアルコール摂取を含む、高レベルのトリグリセリドを誘引し得る。
【０１７１】
一実施形態において、抗体は、上昇した血中トリグリセリドレベルにより部分的に特徴付けられる疾患若しくは障害の発症を予防するため、又はそのような疾患若しくは障害を発症する可能性を防止するため、又は疾患若しくは障害の重篤度、又は、その疾患若しくは障害に関連する少なくとも１つの症状を緩和するために使用し得る。本発明の抗体は、単独で、又は、他の薬剤若しくは方法との補助療法として使用し得ることを想定しており、それに限定する訳ではないが、それは、上昇した血中トリグリセリドレベルにより部分的に特徴付けられる、高トリグリセライド血症等の疾患又は状態を患っている患者を治療するための標準治療として知られている。このような標準的な療法は、流体投与、又は血液中性脂肪又は脂質の低下に、又は体重減量のために有用な他の何れかの薬剤の投与を含み得る。
【０１７２】
一実施形態では、本明細書に記載の抗体の使用は、正常なレベルのトリグリセリドを達成するために効果的な手段であり、それにより高トリグリセリドにより特徴付けられる疾患に関連する１つ以上の症状又は長期の合併症を寛解又は予防し得る。
【０１７３】
本発明の抗体は、急性診療（短期使用のため）又は長期（慢性）使用に使用され得ることが想定される。
【０１７４】
併用療法
併用療法は、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と、本発明の抗体と共に、又は本発明の抗体の生物学的に活性な断片と共に、組合わせて有利になり得る何れかの追加的添加治療剤とを含んでも良い。
【０１７５】
例えば、本発明の抗体が、高トリグリセリド血症のような上昇したトリグリセリドレベルにより部分的に特徴付けられる疾患又は状態を治療する際に使用することを企図する場合、第２の治療薬を用いて、トリグリセリドレベルのさらなる低下を補助し、又は高血中トリグリセリドレベルにより特徴付けられる疾患又は状態に罹患している患者における少なくとも１つの症状を軽減しても良い。このような第２の薬剤は、例えば、別のＡＮＧＰＴＬ８アンタゴニスト（例、別の異なる抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体又はＡＮＧＰＴＬ８の小分子阻害剤）から選択しても良いし、又は、トリグリセリド血症、又は上昇した血中トリグリセリドレベルに関連するか、若しくはそれに起因する他の疾患または状態の治療に有用な、他の治療部分、又は、上昇した及び／又は制御されていない血中トリグリセリドレベルに関連する長期の合併症の何れかの治療に有用な薬剤を含んでも良い。
【０１７６】
関連する実施形態では、本発明は、本発明の特徴は抗体又はその抗原結合断片と、第２の治療剤とを組合せた組成物であり、第２の治療剤としては
（１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えば、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン等、
（２）コレステロール摂取及び／又は胆汁酸の再吸収阻害剤、
（３）リポタンパクの異化を増加させるナイアシン、
（４）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを低下させ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びＴＧレベルを改善し、非致死性心臓発作の回数を低減するフィブラート又は両親媒性カルボン酸、及び
（５）２２−ヒドロキシコレステロール又は固定された組合わせ、例えば、エゼチミブとシンバスタチン、スタチンと胆汁レジン（例、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、ナイアシンとスタチン（例えば、ナイアシンとロバスタチン）の固定された組合わせ、又はオメガ−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール）のような他の脂質低下剤と組合わせ等のコレステロール排除において、役割を果たすＬＸＲ転写因子の活性化剤を挙げられる。
【０１７７】
更に、第２の治療剤は、グルカゴンの１つ又はそれ以上の他の阻害剤／アンタゴニスト、又はグルカゴン受容体の阻害剤／アンタゴニスト、並びにＡＮＧＰＴＬ８の他の阻害剤のような他の分子の阻害剤、並びにＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３とも称され、例えば米国特許第８５３０４３９号、米国特許第７７５０１４１号、米国特許第７５９８２２７号に記載されたＡＰＯＣ３の阻害剤及びボラネソーセン、又、ＩＳＩＳ−ＡＰＯＣＩＩＩＲｘとも称す）のような他の分子の阻害剤及び、脂質代謝、特にコレステロール及び／又はトリグリセリドの恒常性に関与するプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）であっても良い。これらの分子の阻害剤には、小分子、アンチセンス分子、及びこれらの分子に特異的に結合し、その活性を遮断する抗体を含む。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の抗―ＡＮＧＰＴＬ３抗体を糖尿病（例えば、２型糖尿病）のような疾患の治療に使用する場合、これらの抗体は、現在入手可能な以下の糖尿病治療の１つ又はそれ以上と組合わせて使用しても良い。それを以下に挙げると、インスリン、インスリン類似体（下記参照）、ビグアニド（メトホルミン）、スルホニルウレア（例えばグリブリド、グリピジド）、ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）アルファグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ボグリボース）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト（例えば、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）（エクセナチド）、ＴＲＵＬＩＣＩＴＹ（登録商標）（ジュラグルチド）、ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標）（リラグルチド）、ＬＹＸＵＭＩＡ（登録商標）（リキシセナチド、ＴＡＮＺＥＵＭ（登録商標）（アルビグルチド）、又は前記の何れかの類似体、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−４）阻害剤（例えばサクサグリプチン（ＯＮＧＬＹＺＡ（登録商標））、シタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標））及びビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ（登録商標））、ナトリウム−グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、ＩＮＶＯＫＡＮＡ（登録商標）（カナグリフロジン）、ＦＯＲＸＩＧＡ（登録商標）（ダパグリフロジン）エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン）、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（プラムリンチド）、グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えば、米国特許第８５４５８４７号に記載のような）、及びグルカゴンアンタゴニスト、である。
【０１７９】
いくつかの関連する実施形態では、組成物は、非スルホニルウレア分泌促進薬、インスリン類似体（例えば、速効型リスプロ、アスパルト、グルリシン及び長時間作用型インスリンデテミル、インスリンデグルデク、グラルジンインスリン）、エキセンディン−４ポリペプチド、β３アドレナリン受容体アゴニスト、コレステロール摂取および／または胆汁酸再吸収の阻害剤、ＬＤＬ−コレステロールアンタゴニスト、コレステリルエステル伝達タンパク質アンタゴニスト（例えば、トルセトラピブ、アナセトラピブ、ダルセトラピブ、またはエバセトラピブ）、エンドセリン受容体アンタゴニスト、成長ホルモンアンタゴニスト、インスリン感作物質、アミリン模倣物またはアゴニスト、カンナビノイド受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、メラノコルチン、メラニン凝集ホルモン受容体アゴニスト、ＳＮＲＩ、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）模倣物、（例えば、米国特許公開第２０１１０００２８４５号及び米国特許公開第２００８０２６１２３６号を参照）線維芽細胞増殖因子受容体１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃ）アゴニスト（例えば、米国特許公開第２０１１０１５０９０１号参照）、高度に糖化した最終生成物形成、限定する訳ではないが、例えば、アミノグアニジンの阻害剤、及びタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、からなる群から選択した、第２の薬剤を含んでも良い。
【０１８０】
関連する実施形態では、第２の治療剤は、鎮痛剤、Ｃｏｘ−２阻害剤のような非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）を含む抗炎症剤等、１つ又はそれ以上の他の治療剤で、必要に応じて、根底にある状態に随伴する症状を寛解及び／又は軽減しても良い。
【０１８１】
追加の治療活性成分は、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与しても良い。本開示の目的にとり、そのような投与レジメンは、第２の治療有効成分と「組合わせた」抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の投与と見なす。
【０１８２】
投与レジメン
本発明の特定の実施形態によれば、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体（又は抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と本明細書中に記載する追加的治療活性剤の何れかの組合わせを含む医薬組成物）の多数回用量では、規定の時間経過を超えて被験者に投与しても良い。本発明のこの態様による方法は、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を多数回用量で被験体に経時的に投与することを含む。本明細書中で使用する「順次に投与する」とは、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の各々の用量を、異なる時点、例えば、異なる別の日に所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間又は数ヶ月）で被験体に投与することを意味する。本発明は、患者に、順次に投与をする方法を含み、その方法とは抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を初回に単回投与し、続いて、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を１回又はそれ以上、二次投与し、次いで場合により、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を１回又はそれ以上、３次投与することを含む。
【０１８３】
用語「初回用量」、「二次用量」及び「三次用量」とは、本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の投与の時系列的な順序を指す。従って「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与する用量（「基準用量」とも称す）であり、「二次用量」は、初期用量後に投与される用量であり、次に「三次用量」は、二次用量後に投与される用量である。初期用量、二次用量及び三次用量は全て、同一量の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体を含んでも良いが、一般的に、投与頻度という点では互いに異なっていても良い。然しながら、特定の実施形態では、一連の治療の間に初回、二次及び三次用量に含まれる抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の量は、互いに変動する（例えば、適切に上下に調整する）。特定の実施形態では、２回又はそれ以上の（例えば、２、３、４又は５回）用量を「負荷用量」として治療レジメンの開始時に投与し、次いで、より少ない頻度で（例えば、維持用量」として）順次に投与を行なう。
【０１８４】
本発明の特定の代表的な実施形態では、二次及び／又は三次用量の各々は、直前の投与後、１〜２６（例えば、１、１1/2、２、２1/2、３、３1/2、４、４1/2、５、５1/2、６、６1/2、７、７1/2、８、８1/2、９、９1/2、１０、１０1/2、１１、１１1/2、１２、１２1/2、１３、１３1/2、１４、１４1/2、１５、１５1/2、１６、１６1/2、１７、１７1/2、１８、１８1/2、１９、１９1/2、２０、２０1/2、２１、２１1/2、２２、２２1/2、２３、２３1/2、２４、２４1/2、２５、２５1/2、２６、２６1/2、又はそれ以上）週に投与する。本明細書中で使用する語句「直前の用量」とは、多数回投与の順序において、直後の投与の前の順序に何も介在することなく抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の用量を患者に投与することを意味する。
【０１８５】
本発明のこの態様による方法には、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の二次及び／又は三次用量を任意の回数で患者に投与することを含み得る。例えば、特定の実施形態では、患者に単一回の二次用量のみを投与する。他の実施形態では、２回又はそれ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の）二次用量を患者に投与する。同様に、特定の実施形態では、患者に単一回の三次用量のみを投与する。他の実施形態では、２回又はそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上）の三次用量を患者に投与する。投与レジメンは、特定の被験体の生涯に亘り無期限に、又はそのような治療がもはや治療的に不必要になるか不利益になるまで、実施しても良い。
【０１８６】
多数回の二次用量を含む実施形態において、二次用量の各々は、他の二次用量と同じ頻度で投与しても良い。例えば、二次用量の各々は、直前の投与の１〜２週間又は１〜２ヶ月後に患者に投与しても良い。同様に、多数回の三次用量を含む実施形態において、三次用量の各々は、他の三次用量と同じ頻度で投与しても良い。例えば、三次用量の各々は、直前の投与の２〜１２週間後に患者に投与しても良い。本発明の特定の実施形態では、二次及び／又は三次用量を患者に投与する頻度は、一連の治療レジメンの間に変動しても良い。投与頻度も又、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師による一連の治療過程の間に調整しても良い。
【０１８７】
診断用抗体
本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は又、例えば診断目的のために、試料中のＡＮＧＰＴＬ８を検出及び／又は測定するために使用しても良い。例えば、抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体又はその断片を使用して、ＡＮＧＰＴＬ８の異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）を特徴とする状態又は疾患を診断しても良い。ＡＮＧＰＴＬ８の代表的な診断検査は、例えば、患者から得た試料を本発明の抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体と接触させることを含み、ここで抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は検出可能な標識若しくはレポーター分子で標識するか、又は捕獲リガンドとして使用し、患者の試料からＡＮＧＰＴＬ８タンパク質を選択的に単離する。又、標識していない抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、それ自体が検出可能に標識された第２の抗体と組合わせて診断用に使用しても良い。検出可能な標識又はレポーター分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、又は125Ｉなどの放射性同位体、蛍光又は、フルオレセインイソチオシアネート又はローダミンなどの化学発光部分、又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はルシフェラーゼのような酵素でも良い。
【０１８８】
試料中のＡＮＧＰＴＬ８を検出又は測定するために用いることができる特定の代表的な検査法としては、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫検定（ＲＩＡ）、及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１８９】
本発明によるＡＮＧＰＴＬ８診断検査で使用できる試料としては、正常又は病的条件下で患者から得られる、検出可能な量のＡＮＧＰＴＬ８タンパク質又はその断片を含む、組織又は体液試料の何れかが挙げられる。一般に、健常な患者（例、異常なＡＮＧＰＴＬ８レベル又は活性に関連する疾患又は状態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＡＮＧＰＴＬ８のレベルを測定して、ＡＮＧＰＴＬ８の基準ライン又は標準レベルを最初に確立する。そこで、ＡＮＧＰＴＬ８のこの基準ラインレベルを、ＡＮＧＰＴＬ８に関連する疾患若しくは状態、又はそのような疾患若しくは状態に関連する症状、を有すると疑われる個体から得た試料中で測定したＡＮＧＰＴＬ８のレベルに対して比較することが出来る。
【０１９０】
実施例
本方法を記載する前に、本発明の方法及び条件は変動し得るため、記載してある特定の方法及び実験条件に限定される訳ではないことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい、というのは本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定するからである。使用した数値（例、量、温度など）に関して正確さを確実にするために努力はしたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮するべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はその近傍である。
【０１９１】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で使用する場合、「約」という用語は、特定の列挙した数値に関して使用する場合、その値は列挙した値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用する表現「約１００」は、９９及び１０１並びにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【０１９２】
本明細書に記載した方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料の何れも、本発明の実施又は試験において使用することができるが、ここに記載するのは好ましい方法及び材料である。本明細書で言及した全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
実施例１．  抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の産生
抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（即ち、ヒト免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む改変マウス）を、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａタグで発現した組換えヒトＡＮＧＰＴＬ８を含む免疫原で免疫化することにより得た（配列番号３４０参照）。抗体の免疫応答を、ＡＮＧＰＴＬ８特異的免疫測定法により監視した。所望する免疫応答が達成されたとき、数個の完全ヒト抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体が、抗原陽性Ｂ細胞から産生したことが米国特許公開第２００７／０２８０９４５号に記載され、その全体は参照により本明細書に組込まれる。
【０１９４】
この実施例の方法に従って産生した代表的な抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体の特定の生物学的特性を下記の実施例に詳細に記載する。
【０１９５】
実施例２．重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸及び核酸配列
表１は、重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列識別子並びに本発明の選択された抗−ＡＮＧＰＴＬ８抗体のＣＤＲを示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
【０１９６】
【表１】
2018525383.tif 000002
【０１９７】
【表２】
2018525383.tif 000003
【０１９８】
抗体は、通常、以下の命名法に従って参照する。Ｆｃの接頭辞（例、「Ｈ１Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」、「Ｈ４Ｈ」等）、続いて数値的識別子（例「１５３２１」、「１５３４１」、「１５３５０」等）続いて、表１及び２に示すように、接尾辞「Ｐ」又は「Ｎ」が後に続く。従って、この命名法によれば、ある抗体は、本明細書では「Ｈ４Ｈ１５３２１Ｐ」等として参照し得る。本明細書で使用する抗体名称上の接頭辞Ｈ４Ｈは、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４Ｆｃを有し、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２Ｆｃを有する（すべての可変領域は、抗体名称中では、第一番目の「Ｈ」で表示される完全ヒトである）。当業者には理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することが出来るが、（例、マウスＩｇＧ１Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換出来る、等）いずれの場合でも、表１及び表２に挙げた数値識別子により示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、結合特性は同一であるか、又はＦｃドメインの性質に依らず実質的に類似していると予想される。
【０１９９】
実施例３：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によるＡＮＧＰＴＬ８、ＡＮＧＰＴＬ３、及びＡＮＧＰＴＬ４ペプチドに結合するＡＮＧＰＴＬ８抗体の解離速度定数（ｋｄ）
ＡＮＧＰＴＬ３（国際特許公開第２０１２／１７４１７８号、Ｌｅｅら、（２００９）ＪＢＣ、２８４：１３７３５−１３７４５）及びＡＮＧＰＴＬ４（Ｄｅｓａｉら、（２００７）ＰＮＡＳ、１０４：１１７６６−１１７７１）のＮ末端コイルドコイル領域に結合する抗体がＡＮＧＰＴＬタンパク質のＬＰＬ阻害活性を遮断したことが、以前に実証されている。この実験は、ＡＮＧＰＴＬ８に対する抗体を、ＡＮＧＰＴＬ８のＮ末端領域からのペプチドへの結合について試験したものである。
【０２００】
ヒトＡＮＧＰＴＬ８ペプチド（ｈＡＮＧＰＴＬ８ペプチド、配列番号３３７）に結合するＡＮＧＰＴＬ８抗体の解離速度定数を、リアルタイム表面プラズモン共鳴に基づくＭＡＳＳ−１バイオセンサープラットフォームを使用して決定した。分析は、ＡＮＧＰＴＬ８抗体がセンサー表面上に捕捉され、ペプチドが抗体表面上に注入される形式を利用した。ヒトＡＮＧＰＴＬ３（ｈＡＮＧＰＴＬ３ペプチド、配列番号３３８）及びヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチド、配列番号３３９）のＮ末端コイルドコイル領域由来のペプチドも対照として含めた。又、ＡＮＧＰＴＬ４ペプチド及び陰性アイソタイプ対照抗体に結合する対照抗体（米国特許公開第２０１１／０１５９０１５号からのＨ４Ｈ２６８Ｐ）も含めた。結合の研究のすべてを、２５℃でＨＥＰＥＳ１０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ３ｍＭ、及び界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＨＢＳ−ＥＴランニングバッファ）０．０５％ｖ／ｖ中で行った。ＨＣＡセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ−１００８−３９）へのアミンカップリングにより誘導体化し、この表面に約１０００ＲＵの各ＡＮＧＰＴＬ８抗体又は対照抗体を捕捉した。ペプチド原液をＨＢＳ−ＥＴランニングバッファで５００ｎＭに希釈し、抗体捕捉表面上に流速３０μＬ／分で４分間注入し、続いてＨＢＳ−ＥＴランニングバッファ中で結合ペプチドを１０分間解離した。
【０２０１】
捕捉されたＡＮＧＰＴＬ８抗体に結合するペプチドの会合相は、１：１結合モデルに適合出来ず、従って、解離速度定数（ｋｄ）値のみを、スクラバー２．０ｃ回帰分析ソフトを使用するリアルタイム結合センサーグラムを適合することにより計算した。解離半減期（ｔ１／２）は、ｋｄから以下のように計算した。
【数１】
2018525383.tif 000004
【０２０２】
捕捉されたＡＮＧＰＴＬ８抗体、対照ＡＮＧＰＴＬ４抗体、及びアイソタイプ対照抗体に結合するＡＮＧＰＴＬ８、ＡＮＧＰＴＬ３、及びＡＮＧＰＴＬ４  Ｎ末端領域ペプチドの結合パラメーターを表３〜５に示した。
【０２０３】
結果
これらの実験条件下で、５００ｎＭのｈＡＮＧＰＴＬ８、ｈＡＮＧＰＴＬ３、又はｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドがブランク抗ｈＦｃ表面に示す最大の非特異的結合シグナルは３ＲＵであった。従って非特異的バックグラウンドである３ＲＵの３倍を超える（即ち、９ＲＵ以上）シグナルを有する結合相互作用を、特異的結合相互作用と見做した。この基準に基づいて、９ＲＵ未満の抗体−ペプチド結合シグナルは非結合性であると見做した（表１のＮＢ）。
【０２０４】
この結合研究から、ＡＮＧＰＴＬ８抗体Ｈ４Ｈ１５３２１Ｐ、Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２、及びＨ４Ｈ１５３４５Ｐが、Ｎ末端領域ＡＮＧＰＴＬ８ペプチド（配列番号３３７）に特異的に結合することを示した。ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号３３８）又はｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号３３９）Ｎ末端領域ペプチドに結合したＡＮＧＰＴＬ８は全く無かった。
【０２０５】
【表３】
2018525383.tif 000005
【０２０６】
【表４】
2018525383.tif 000006
【０２０７】
【表５】
2018525383.tif 000007
【０２０８】
実施例４  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による完全長ヒト及びサルＡＮＧＰＴＬ８タンパク質へのＨ４Ｈ１５３４１Ｐ結合についての動力学的結合パラメータの決定。
完全長ヒト及びカニクイザルＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に結合するＡＮＧＰＴＬ８抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐの平衡解離定数（ＫＤ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴に基づくＭＡＳＳ−１バイオセンサープラットフォームを使用して決定した。分析のために、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐを、ヒト又はサルのＡＮＧＰＴＬ８タンパク質が固定化されたセンサー表面上に注入した。すべての結合研究は、２５℃でＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ  ｐＨ７．４、  ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ３ｍＭ、及び界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％ｖ／ｖ（ＨＢＳ−ＥＴランニングバッファ）中で行った。ＨＣＡセンサー表面を、アミンカップリングヤギ抗マウスＩｇＧ２ａポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃１０８０−０１）で最初に誘導体化し、次いで、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ（ｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ；配列番号３４０）で発現したヒトＡＮＧＰＴＬ８、又はＣ末端マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ（ＭｆＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ、配列番号３４１）で発現したサルＡＮＧＰＴＬ８、の約３０ＲＵ（結合単位）を捕捉した。異なる濃度のＡＮＧＰＴＬ８  ｍＡｂを先ずＨＢＳ−ＥＴランニングバッファ（３００ｎＭ〜１．２３ｎＭ、３倍連続希釈）中で調製し、次にＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ捕捉表面上に４分間３０μＬ／分の流速で注入した後、ＨＢＳ−ＥＴランニングバッファ中で結合したｍＡｂを１０分間の解離する。
【０２０９】
スクリーバー２．０ｃ回帰分析ソフトを使用して、マストランスポートリミテーションを有する１：１結合モデルにリアルタイム結合センサーグラムを適合させることにより、動力学的会合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、速度定数から以下のように計算した：
【数２】
2018525383.tif 000008
【０２１０】
２５℃におけるｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ及びＭｆＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃに結合する抗−ＡＮＧＰＴＬ８  ｍＡｂの動力学的結合パラメーターを表６に示す。
【０２１１】
結果
抗体Ｈ４Ｈ１５３４１は、センサー表面に固定化されたヒト及びサルＡＮＧＰＴＬ８タンパク質の両方に結合し、かつ、解離相を記録している間に、測定可能な解離を示さなかった。結合親和性の推定値を得るために、解離速度定数ｋｄを、実験条件下における検出上限値を１．０Ｅ−０５１／ｓに固定した。ｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ及びＭｆＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃに結合するＨ４Ｈ１５３４１Ｐの平衡解離定数（ＫＤ）値を、それぞれ１１７ｐＭ及び８６ｐＭ以下であると推定した。
【０２１２】
【表６】
2018525383.tif 000009
【０２１３】
実施例５  バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によるヒト及びサルＡＮＧＰＴＬ８結合特異性の決定
ヒト及びサルＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に対するＡＮＧＰＴＬ８抗体の結合を、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＡ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を備えたバイオレイヤー干渉法を用いて調査した。すべての実験は、反応マルチウェルプレートを１０００ｒｐｍで撹拌しながら、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％ｖ／ｖ及びＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌ中、２５℃で実施した。Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ（ｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ、配列番号３４０）で産生したヒトＡＮＧＰＴＬ８、又はＣ末端マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグ（ＭｆＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ、配列番号３４１）を用いて産生したカニクイザルＡＮＧＰＴＬ８  約１．６ｎｍを、各タンパク質１０μｇ／ｍＬを含むウェル内にセンサーを４分間浸漬することにより、抗ｍＦｃ（ＡＭＣ）オクテットバイオセンサー上に捕捉した。同一条件下で、同一のｍＦｃタグ（ｈＬＤＬＲ−ｍＦｃ）を有する陰性対照タンパク質もＡＭＣセンサーに結合させた。次いで、全部で４つのセンサー、タンパク質を結合させた３つとブランク一つ、を異なるＡＮＧＰＴＬ８モノクローナル抗体１００ｎＭ又は対照のアイソタイプを含むウェルに、４分間浸漬した。４分の結合工程後に観察される結合シグナルを表７に作表した。
【０２１４】
結果：
本研究で試験した２５種のＡＮＧＰＴＬ８  ｍＡｂのうち、２４種の抗体が、無関係の対照センサーチップ上の最大結合シグナルより高い結合シグナルを示した（０．０３ｎｍ、この値はバックグラウンドを超える倍数として結合シグナルを計算するために使用した）。２４種のヒトＡＮＧＰＴＬ８結合体の中で、２０種がサルＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に陽性結合を示した。サルＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に結合しなかった４種の抗体も又、ヒトＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に対して低い結合シグナル、バックグラウンド結合シグナルの１〜２倍の値、を示した。ヒトＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に結合する２４種の抗体について、４種の抗体（Ｈ４Ｈ１５３６２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１５３２１Ｐ、Ｈ４Ｈ１５３３０Ｐ、Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２）は、バックグラウンドの１０倍超の結合シグナルを示した。別の群の１２種の抗体は、上記バックグラウンドより５〜１０倍高い結合シグナルを示した。残りの抗体は、バックグラウンドレベルより１〜５倍高い結合シグナルでヒトＡＮＧＰＴＬ８タンパク質に結合した。
【０２１５】
【表７】
2018525383.tif 000010
【０２１６】
実施例６  ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおける循環トリグリセリドレベルに及ぼすＩｇＧ４抗−ｈＡＮＧＰＴＬ８抗体のインビボ効果
血清トリグリセリド（ＴＧ）レベルに及ぼす抗ｈＡＮＧＰＴＬ８抗体の効果を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおいて測定した。実験の７日前にマウスを事前採血し、各抗体について試験するため各々５匹のマウスのグループに分けた。試験の０日目に、抗体１０ｍｇ／ｋｇ用量（抗ｈＡＮＧＰＴＬ８及び無関係の特異性を有するアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）対照）を皮下注射により投与した。抗体注射の後、毎日連続して、マウスから採血（非絶食）し、血清中のＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００ＳｅｒｕｍＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ社）．により測定した。試験した全抗体の各時点について平均値を計算した。血清ＴＧ濃度の（平均値±標準誤差）として表した結果を表８〜１３に示した。循環抗―ｈＡＮＧＰＴＬ８（血清Ａｂ）のレベルも又、標準的なＥＬＩＳＡ分析法を用いて測定した。簡潔に述べると、プレートをヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆して、血清Ａｂを捕捉した。次に血清をプレートに添加し、捕捉した抗体を西洋ワサビダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて化学発光により検出した。結果を（平均±標準誤差）として表１４〜１９に示す。
対照：アイソタイプが一致した対照Ａｂを接受したマウス
【０２１７】
循環ＴＧレベルに及ぼす２５種のｍＡｂのｈＡＮＧＰＴＬ８に対する効果を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおいて試験した。抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐは、投与後（対照ｍＡｂと比較して）、循環ＴＧの有意な低下（平均６８％まで）をもたらした。
【０２１８】
【表８】
2018525383.tif 000011
【０２１９】
【表９】
2018525383.tif 000012
【０２２０】
【表１０】
2018525383.tif 000013
【０２２１】
【表１１】
2018525383.tif 000014
【０２２２】
【表１２】
2018525383.tif 000015
【０２２３】
【表１３】
2018525383.tif 000016
【０２２４】
【表１４】
2018525383.tif 000017
【０２２５】
【表１５】
2018525383.tif 000018
【０２２６】
【表１６】
2018525383.tif 000019
【０２２７】
【表１７】
2018525383.tif 000020
【０２２８】
【表１８】
2018525383.tif 000021
【０２２９】
【表１９】
2018525383.tif 000022
【０２３０】
実施例７：ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおけるｈＡＮＧＰＴＬ８抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐの用量応答
血清トリグリセリド（ＴＧ）に及ぼす異なる用量のｈＡＮＧＰＴＬ８  ｍＡｂ、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐの効果を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスで評価した。実験の７日前にマウスを事前採血し、試験する各用量について、各５匹のマウスのグループに分けた。Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐを１、５、１０及び２５ｍｇ／ｋｇで投与し、無関係の特異性を有するものとして、アイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）対照を１０ｍｇ／ｋｇで、試験の０日目に単回皮下注射により投与した。抗体注入後２、７、１４及び２１日目にマウスより採血し（非絶食）、血清中のＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で測定した。各時点について平均値を計算した。血清ＴＧ濃度の（平均±標準誤差）として表した結果を図１に示す。
【０２３１】
循環抗−ヒト抗体（血清Ａｂ）のレベルを、標準的なＥＬＩＳＡ分析法を用いて測定した。簡潔に述べると、プレートをヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆して、血清Ａｂを捕捉した。次に血清をプレートに添加し、捕捉した抗体を西洋ワサビダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて化学発光により検出した。結果を（平均±標準誤差）として図２に示す。
対照Ａｂは、アイソタイプ適合対照Ａｂを接受したマウスを指す。
【０２３２】
結果：
循環ＴＧ及びコレステロールレベルに及ぼす異なる４つの用量のＨ４Ｈ１５３４１Ｐ（抗ｈＡＮＧＰＴＬ８）の効果を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスで試験した。Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐは、用量依存的に血清ＴＧが顕著に持続的な減少をもたらし（対照ｍＡｂと比較して平均６６％まで）５ｍｇ／ｋｇが最も低量で有効な用量である。総コレステロールレベルについては何の効果も観察されなかった。
【０２３３】
実施例８  ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおけるｈＡＮＧＰＴＬ８  ｍＡｂ治療後のリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性の評価
ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスで、ＬＰＬ活性に及ぼすｈＡＮＧＰＴＬ８ｍＡｂ（Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ）投与の効果を評価した。実験の７日前にマウスを事前採血し、試験する各用量について、各５匹のマウスのグループに分けた。Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ及び対照Ａｂを、試験の０日目に単回皮下注射により１０ｍｇ／ｋｇで投与した。試験の４日目に、尾静脈を介した静脈内注射によりヘパリン２５０Ｕ／ｋｇをマウスに投与し、血管内皮表面からＬＰＬを放出させた。５分後、マウスの眼窩後洞から採血し、ヘパリン後血漿を収集し、分画して、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーを用いて肝性リパーゼからＬＰＬを分離した。ヘパリン後血漿を、ＧＥ  Ａｋｔａ  Ｐｒｉｍｅにより制御したヘパリン−セファロースＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１．０ｍｌ上に充填し、ＮａＣｌ  ０．２５Ｍ、グリセロール２０％、ＢＳＡ１％、リン酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ６．５で平衡化した。カラムを平衡化緩衝液１０ｍｌで洗浄し、ＮａＣｌ  ３０ｍｌの勾配（グリセロール２０％、ＢＳＡ１％、リン酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ６．５中０．２５〜１．５Ｍ）で溶離した。得られた画分を肝性リパーゼ及びＬＰＬピークによりプールし、リパーゼ活性をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅｎｚｃｈｅｋ  Ｌｉｐａｓｅ基質（カタログ番号Ｅ３３９５５）を用いて分析した。動力学的反応を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３プレートリーダーにより励起４８２ｎｍ／発光５１８ｎｍで読み取った。相対蛍光単位（ＲＦＵ）（平均値±標準誤差）として表した結果を図３に示した。対照Ａｂは、アイソタイプが一致する陰性対照Ａｂを接受したマウスを指す。
【０２３４】
結果
結果は、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスへのＨ４Ｈ１５３４１Ｐ（抗ｈＡＮＧＰＴＬ８）の投与がＬＰＬ活性の有意な増加をもたらし、肝臓リパーゼ活性に影響を及ぼさないことを示した。
【０２３５】
実施例９．ｈＡＮＧＰＴＬ８  ｍＡｂ  Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐで治療したヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスにおける脂質耐性試験
トリグリセリド排出能に対するｍＡｂ  Ｈ４Ｈ１５３４１ＰによるＡＮＧＰＴＬ８阻害の効果を、急性脂肪負荷により評価した。  ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスを実験の８日前に予め採血し、試験した各ｍＡｂについて６匹のマウスのグループに分けた。Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ及びアイソタイプ適合対照Ａｂを、試験の第０日に単回皮下注射により１０ｍｇ／ｋｇで投与した。試験の４日目に、体重１ｇあたり２．５μｌの２０％イントラリピッド（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＩＬ）の静脈内投与後、マウスを４時間絶食させた。その後の時点で尾静脈から採取した血液中のＴＧレベルを評価した。ＴＧ濃度の（平均±標準誤差）として表した結果を図４に示す。対照Ａｂは、アイソタイプが一致した陰性対照Ａｂを受けたマウスを指す。
【０２３６】
結果
ヒト化ＡＮＧＰＴＬ８マウスへのＨ４Ｈ１５３４１Ｐ（抗ｈＡＮＧＰＴＬ８）の投与は、対照抗体と比較して急性脂肪負荷後のＴＧレベルの有意な低下をもたらす。これらのデータは、Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐが、ＡＮＧＰＴＬ８を遮断することにより、循環からのＴＧの排出能を促進することを示唆している。
【０２３７】
実施例１０．アンジオポエチン様タンパク質８のＨｉＳｅｎｓｅ線形エピトープマッピング
ＨｉＳｅｎｓｅ線状ペプチドを用いたペプスキャン分析を用いて、抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ及びＨ４Ｈ１５３６７Ｐ２の線状エピトープを確立した。この試験はＰｅｐｓｃａｎ
Ｐｒｅｓｔｏ  ＢＶ（Ｚｕｉｄｅｒｓｌｕｉｓｗｅｇ  ２、８２４３ＲＣ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。すべてのＰｅｐｓｃａｎデータは、社内で開発したＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬストレージバックエンドで構築された独自のデータベースアプリケーションであるＰｅｐｌａｂTMソフトウェアパッケージに格納されている。
【０２３８】
ペプチドの合成
標的分子のエピトープを再構築するために、ペプチドのライブラリーを合成した。アミノ官能化ポリプロピレン支持体は、独自の親水性ポリマー配合物をグラフト化し、続いてＮヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を有するジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いてｔ−ブチルオキシカルボニル−ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基を切断する。  標準的なＦｍｏｃペプチド合成を使用して、カスタム変性したＪＡＮＵＳ液体処理ステーション（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によりアミノ官能化固体支持体上のペプチドを合成した。
【０２３９】
アレイ上へのアンジオポエチン様タンパク質８の結合
標的タンパク質を、陽性対照としてミニカード上に結合させた。アンジオポエチン様タンパク質８（ｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ）をアレイに結合させるために、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）及びグルタルアルデヒド（ＧＤＡ）の２種類の架橋剤を使用した。ＭＢＳについては、ｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃ４０μｌをＭＢＳ（２ｍｇ／ｍｌ）１μｌと混合し、室温で４５分間インキュベートし、次いでリンカーモチーフＣＧＧＣＧＧ（配列番号３４６）を含む位置でアレイ上に適用した。ＧＤＡ連結のために、リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の０．０５％ＧＤＡをアレイ上に適用し、室温で４時間インキュベートし、次にリン酸緩衝液ｐＨ８．０中濃度５又は２０μｇ／ｍｌのｈＡＮＧＰＴＬ８−ｍＦｃをＧｌｙのみを含むアレイ上の位置に添加し遊離Ｎ末端へのカップリングを可能にする。
【０２４０】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
合成ペプチドの各々への抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液（４℃で一晩）と共にインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０１０−０５）の１／１０００希釈液とともに２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２、２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）２０μｌ／ｍｌとなるように３％Ｈ2Ｏ2を添加した。１時間後、発色を測定した。発色は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムで定量化した。
【０２４１】
スクリーニングの詳細
抗体結合は、抗体の濃度、及びＥＬＩＳＡ緩衝液中の競合タンパク質の量及び性質を含む因子の組み合わせに依存する。又、プレコート条件（実験サンプルによるインキュベーション前のペプチドアレイの特異的処理）は結合に影響を与える。これらの詳細を以下に要約する。
【表２０】
2018525383.tif 000023
Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  及び  Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＳＱ）に関する数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組み合わせ）の相対量を示す。
【０２４２】
情報処理
ＣＣＤカメラから得られた値は、標準９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に０〜３０００ｍＡＵの範囲である。結果は定量化され、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保存した。場合により、ウェルに気泡が含まれているため、偽陽性の値があり、カードを手動で検査し、気泡に起因する値は何れも０として記録される。
【０２４３】
合成の品質管理
合成されたペプチドの品質を確認するために、陽性対照ペプチド及び陰性対照ペプチドを別々のセットとして並行して合成した。これらを抗体５７．９でスクリーニングした（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓ、ら．１９９０  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４：３３０４−３３０９）。
【０２４４】
結果
ペプチドの設計
以下のペプチドセットを標的配列上で合成した：
ヒトＡＮＧＰＴＬ８、成熟配列、ＮＰ＿０６１１５７．３由来のアミノ酸２２−１９８
１  ＡＰＭＧＧＰＥＬＡＱ  ＨＥＥＬＴＬＬＦＨＧ  ＴＬＱＬＧＱＡＬＮＧ  ＶＹＲＴＴＥＧＲＬＴ  ＫＡＲＮＳＬＧＬＹＧ  ５０
５１  ＲＴＩＥＬＬＧＱＥＶ  ＳＲＧＲＤＡＡＱＥＬ  ＲＡＳＬＬＥＴＱＭＥ  ＥＤＩＬＱＬＱＡＥＡ  ＴＡＥＶＬＧＥＶＡＱ  １００
１０１  ＡＱＫＶＬＲＤＳＶＱ  ＲＬＥＶＱＬＲＳＡＷ  ＬＧＰＡＹＲＥＦＥＶ  ＬＫＡＨＡＤＫＱＳＨ  ＩＬＷＡＬＴＧＨＶＱ  １５０
１５１  ＲＱＲＲＥＭＶＡＱＱ  ＨＲＬＲＱＩＱＥＲＬ  ＨＴＡＡＬＰＡ  １７７（配列番号３４７）
【０２４５】
抗体を、ＡＮＧＰＴＬ８の全配列をカバーする一連の１５−ｍｅｒペプチドへの結合について試験し、各ペプチドは次のアミノ酸から１アミノ酸分オフセットした。より精密なエピトープ分析のために一連の試験用ペプチド内の二重アラニン（「ＡＡ」）置換も含めた。
セット  １  模倣体：線形          タイプ：ＬＩＮ
説明    １残基のオフセットを有するアンジオポエチン様タンパク質８の標的配列に由来する長さ１５のペプチド。
配列  （最初の１０個）
ＡＰＭＧＧＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴ（配列番号３４８）
ＰＭＧＧＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴＬ（配列番号３４９）
ＭＧＧＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴＬＬ（配列番号３５０）
ＧＧＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴＬＬＦ（配列番号３５１）
ＧＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴＬＬＦＨ（配列番号３５２）
ＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴＬＬＦＨＧ（配列番号３５３）
ＥＬＡＱＨＥＥＬＴＬＬＦＨＧＴ（配列番号３５４）
ＬＡＱＨＥＥＬＴＬＬＦＨＧＴＬ（配列番号３５５）
ＡＱＨＥＥＬＴＬＬＦＨＧＴＬＱ（配列番号３５６）
ＱＨＥＥＬＴＬＬＦＨＧＴＬＱＬ（配列番号３５７）
セット  ２    模倣体：線形    タイプ：ＬＩＮ．ＡＡ
説明    セット１のペプチドであるが、１０位及び１１位の残基がＡｌａで置換されている。未変性のＡｌａが何れかの位置に存在する場合、それはＧｌｙに置き換えられる。このセットのペプチドの順序は無作為である。アレイ上の実際の順序を表示した。
配列（最初の１０個）
ＴＡＥＶＬＧＥＶＡＡＧＱＫＶＬ（配列番号３５８）
ＶＹＲＴＴＥＧＲＬＡＡＡＲＮＳ（配列番号３５９）
ＧＶＹＲＴＴＥＧＲＡＡＫＡＲＮ（配列番号３６０）
ＶＱＲＬＥＶＱＬＲＡＧＷＬＧＰ（配列番号３６１）
ＬＴＧＨＶＱＲＱＲＡＡＭＶＡＱ（配列番号３６２）
ＶＬＫＡＨＡＤＫＱＡＡＩＬＷＡ（配列番号３６３）
ＬＲＤＳＶＱＲＬＥＡＡＬＲＳＡ（配列番号３６４）
ＲＲＥＭＶＡＱＱＨＡＡＲＱＩＱ（配列番号３６５）
ＶＳＲＧＲＤＡＡＱＡＡＲＡＳＬ（配列番号３６６）
ＡＹＲＥＦＥＶＬＫＧＡＡＤＫＱ（配列番号３６７）
【０２４６】
スクリーニングしたＥＬＩＳＡの結果を未処理でプロットに供し、（ボックスプロット、データは非表示）各データセットを描示し、各データセット内の平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布及び異常値を示した。  実験条件（抗体の量、遮断強度等）に依存して、ＥＬＩＳＡデータの異なる分布を得た。
【０２４７】
抗体Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２
高ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２は、配列１ＡＰＭＧＧＰＥＬＡＱＨＥＥＬＴ１５（配列番号３４８）からなる１つの線状ペプチドのみに貪欲に結合した。このサンプルを同じ条件下で２回試験し、同じ結果を繰り返し得た。抗体Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２は又、陽性対照としてアレイに結合したアンジオポエチン様タンパク質８に強く結合した。興味深いことに、ＧＤＡ結合と比較した場合、ＭＢＳを用いて結合した標的タンパク質では幾分弱い結合が得られた。
【０２４８】
抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ
高ストリンジェンシー条件下で試験すると、抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐは、共通配列
150ＱＲＱＲＲＥＭＶＡＱ159（配列番号３６８）を含む一連の線状ペプチドに貪欲に結合した。  セット１（未変性線状エピトープ模倣体）及びセット２（二重Ａｌａ変異体）に記録された強度特性を比較すると、残基Ｒ１５４、Ｅ１５５及びＱ１５９が抗体結合に必須であることを示した。抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐは又、固定化にかかわらず、陽性対照としてアレイに結合したアンジオポエチン様タンパク質８に強く結合した。
【０２４９】
陰性アイソタイプ対照
陰性アイソタイプ対照は、アレイ上に存在するいずれのペプチドにも結合しなかった。
更に、陽性対照としてアレイに結合したアンジオポエチン様タンパク質８に関する記録には、検出可能な結合は全くなかった。陰性アイソタイプ対照を、Ｐｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡ中で使用し、ヤギ抗ヒト二次コンジュゲートで更に試験した。この二次コンジュゲートにより抗体を認識出来た。
【０２５０】
結論
この試験のために供した３種の抗体をＨｉＳｅｎｓｅペプチドアレイ上で試験した。
２種の抗体については暫定的線状エピトープを確立することが可能であった。インキュベーションを繰り返したにもかかわらず、抗体陰性アイソタイプ対照はアレイに結合しなかった。この試験で同定されたコア暫定エピトープを以下に列挙した。
【表２１】
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【０２５１】
従って、抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐ及びＨ４Ｈ１５３６７Ｐ２は、それぞれＣ末端及びＮ末端内の明確な線状配列を認識する。ＭＢＳとカップリングした抗体Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２について得られたシグナルが、ＧＤＡとのカップリングよりも、少ないという事実は、それがＮ末端上に極端に偏在することと共に、Ｎ末端アミン自体がエピトープの一部であり得ることを示した。更に、抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐについては、二重アラニン変異体が、結合に重要な残基（上記、明灰色の陰影を付けた残基）を特定するのに役立っていた。
【０２５２】
抗体Ｈ４Ｈ１５３４１Ｐはアンジオポエチン様タンパク質８のＣ末端領域を標的とするが、Ｈ４Ｈ１５３６７Ｐ２はまさしくＮ末端を標的とする。抗体陰性アイソタイプ対照はアレイに結合しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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