(57)【要約】T細胞を含む養子治療用の細胞を改変するためのキメラ受容体、および遺伝子改変細胞が提供される。いくつかの局面において、細胞を改変し生産するための方法および組成物、前記細胞を含有する組成物、ならびに対象にそれらを投与するための方法も提供される。いくつかの態様において、前記細胞、例えばT細胞は、抗原に特異的に結合する遺伝子改変抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）であって、TRAF6媒介シグナリングを誘導する能力を有する細胞内シグナリングドメインを含有するものを含有する。いくつかの態様において、前記細胞および方法の特徴は、増加したまたは改良された活性、効力および/または持続性をもたらす。2018532432.tif 000009
2018532432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）リガンド結合ドメイン、
（b）膜貫通ドメイン、および
（c）ヒトCD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【請求項２】
（a）リガンド結合ドメイン、
（b）ヒトCD28由来の膜貫通ドメイン、および
（c）CD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【請求項３】
CD40がヒトCD40である、請求項2記載のキメラ受容体。
【請求項４】
CD40由来のシグナリングドメインが、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む機能的変異体を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項５】
（a）リガンド結合ドメイン、
（b）膜貫通ドメイン、および
（c）SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含む細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【請求項６】
膜貫通ドメインが、TRAF-6誘導性ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む分子に由来する膜貫通ドメインを含む、請求項1または請求項5記載のキメラ受容体。
【請求項７】
膜貫通ドメインがCD40に由来する、請求項1、請求項5または請求項6記載のキメラ受容体。
【請求項８】
膜貫通ドメインが、CD4、CD28、またはCD8由来の膜貫通ドメインであるか、あるいはCD4、CD28、またはCD8由来の膜貫通ドメインを含む、請求項1および5のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項９】
膜貫通ドメインが、CD28由来の膜貫通ドメインであるか、またはCD28由来の膜貫通ドメインを含む、請求項8記載のキメラ受容体。
【請求項１０】
膜貫通ドメインが、ヒトの膜貫通ドメインであるか、またはヒトタンパク質に由来する、請求項1および5〜9のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項１１】
膜貫通ドメインが、
a）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列、または
b）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項2〜4、9および10のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項１２】
細胞内シグナリングドメインが、活性化細胞質シグナリングドメインをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項１３】
活性化細胞質シグナリングドメインが、
T細胞において一次活性化シグナルを誘導する能力を有し、
T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または
免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、
請求項12記載のキメラ受容体。
【請求項１４】
活性化細胞質シグナリングドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体またはシグナリング部分であるか、あるいはCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体またはシグナリング部分を含む、請求項12または請求項13記載のキメラ受容体。
【請求項１５】
細胞内シグナリングドメインが、そのN末端からC末端に向かって順に、CD40由来のシグナリングドメインおよび活性化細胞質シグナリングドメインを含む、請求項12〜14のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項１６】
細胞内シグナリングドメインがCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項１７】
細胞内シグナリングドメインが、CD40由来のシグナリングドメインとは別の共刺激シグナリングドメインをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項１８】
共刺激シグナリングドメインが、CD40に由来するもの以外のT細胞共刺激分子の細胞内シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む、請求項17記載のキメラ受容体。
【請求項１９】
共刺激シグナリングドメインが、CD28、4-1BB、またはICOS由来のシグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む、請求項17または請求項18記載のキメラ受容体。
【請求項２０】
リガンド結合ドメインが、抗原結合ドメインであるか、あるいは抗原結合ドメインを含む、請求項1〜19のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項２１】
抗原結合ドメインが、抗体または抗原結合性抗体フラグメントである、請求項20記載のキメラ受容体。
【請求項２２】
抗原結合ドメインが、一本鎖フラグメントである抗原結合性抗体フラグメントである、請求項21記載のキメラ受容体。
【請求項２３】
抗原結合性抗体フラグメントが、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された複数の抗体可変領域を含む、請求項21または請求項22記載のキメラ受容体。
【請求項２４】
抗原結合ドメインが、一本鎖可変フラグメント（scFv）であるか、あるいは一本鎖可変フラグメント（scFv）を含む、請求項21〜23のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項２５】
リガンド結合ドメインが、
疾患または障害と関連する抗原、および/または
疾患または障害の細胞または組織によって発現される抗原
に特異的に結合する、請求項1〜24のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項２６】
疾患または障害が、感染性疾患もしくは感染状態、自己免疫疾患もしくは自己免疫状態、炎症性疾患もしくは炎症状態、または腫瘍もしくはがんである、請求項25記載のキメラ受容体。
【請求項２７】
がんが固形腫瘍である、請求項16記載のキメラ受容体。
【請求項２８】
リガンド結合ドメインが腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項1〜27のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項２９】
リガンド結合ドメインが、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、または4、erbB二量体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受容体a2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、およびユニバーサルタグと関連する抗原、がん-精巣抗原、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123, c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、および病原体特異抗原からなる群より選択される抗原に特異的に結合する、請求項1〜16のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項３０】
リガンド結合ドメインがCD19に特異的に結合する、請求項1〜17のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項３１】
リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとを接合するスペーサーをさらに含む、請求項1〜30のいずれか一項記載のキメラ受容体。
【請求項３２】
スペーサーがヒトIgGに由来する、請求項31記載のキメラ受容体。
【請求項３３】
スペーサーが、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCP（SEQ ID NO:1）を含む、請求項31または請求項32記載のキメラ受容体。
【請求項３４】
スペーサーが、
任意でヒトCD28である、CD28由来の細胞外部分
を含む、請求項31記載のキメラ受容体。
【請求項３５】
CD28由来の細胞外部分が、1〜50アミノ酸長、1〜40アミノ酸長、1〜30アミノ酸長、1〜20アミノ酸長、または1〜10アミノ酸長を含む、請求項34記載のキメラ受容体。
【請求項３６】
スペーサーと膜貫通ドメインが全体として、
a）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列、または
b）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項34または請求項35記載のキメラ受容体。
【請求項３７】
請求項1〜36のいずれか一項記載のキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項３８】
シグナル配列をさらに含む、請求項37記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが第1ポリヌクレオチドであり、
核酸分子が、第1キメラ受容体以外の、任意で第2キメラ受容体のポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドを含む、
請求項37または請求項38記載の核酸分子。
【請求項４０】
第1ポリヌクレオチドと第2ポリヌクレオチドとが、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって隔てられているか、自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはリボソームスキッピングを引き起こすもしくは促進するペプチド、任意でT2AもしくはP2Aであるものをコードするヌクレオチド配列によって隔てられている、請求項35記載の核酸分子。
【請求項４１】
請求項37〜40のいずれか一項記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４２】
発現ベクターである、請求項41記載のベクター。
【請求項４３】
ウイルスベクターである、請求項41または請求項42記載のベクター。
【請求項４４】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項43記載のベクター。
【請求項４５】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項43または請求項44記載のベクター。
【請求項４６】
ウイルスベクターがガンマレトロウイルスベクターである、請求項43または請求項44記載のベクター。
【請求項４７】
請求項37〜40のいずれか一項記載の核酸または請求項41〜46のいずれか一項記載のベクターを含む、または請求項1〜38のいずれか一項記載のキメラ受容体を含むもしくは発現する、改変細胞。
【請求項４８】
T細胞である、請求項47記載の改変細胞。
【請求項４９】
CD8＋ T細胞である、請求項47または請求項48記載の改変細胞。
【請求項５０】
改変細胞を生産する方法であって、請求項37〜40のいずれか一項記載の核酸分子または請求項41〜46のいずれか一項記載のベクターを細胞に導入し、それによって改変細胞を生産する工程を含む、方法。
【請求項５１】
請求項50記載の方法によって生産される、改変細胞。
【請求項５２】
請求項47〜49および51のいずれか一項記載の改変細胞を含む、組成物。
【請求項５３】
以下を含む、組成物：
請求項49記載の改変細胞、または請求項1〜38のいずれか一項記載のキメラ受容体を発現する改変CD8＋細胞；
前記CD8＋細胞において発現するキメラ受容体とは別の、異なるキメラ受容体であって、前記CD8＋細胞において発現するキメラ受容体と比較して異なる共刺激シグナリングドメインを含む、異なるキメラ受容体、を含む、改変CD4＋細胞。
【請求項５４】
第1改変細胞対第2改変細胞の比が、1:1、1:2、2:1、1:3もしくは3:1または約1:1、1:2、2:1、1:3もしくは3:1である、請求項53記載の組成物。
【請求項５５】
CD8＋細胞と比較して、CD4＋細胞において発現するキメラ受容体における、または該受容体のアミノ酸配列および/もしくはコードしている核酸配列における、唯一の相違または実質的に唯一の相違が、前記異なる共刺激シグナリングドメインである、請求項53または請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
前記異なる共刺激シグナリングドメインが、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力を有するTRAF-6誘導ドメインを含まず、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有するドメインを含まない、請求項53〜55のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５７】
前記異なる共刺激シグナリングドメインが、PI-3キナーゼの活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力もしくはPI3K/Aktシグナリングの誘導を促進する能力を有するPI-3キナーゼ動員ドメインであるか、あるいはPI-3キナーゼの活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力もしくはPI3K/Aktシグナリングの誘導を促進する能力を有するPI-3キナーゼ動員ドメインを含む、請求項53〜56のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５８】
前記異なる共刺激シグナリングドメインが、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインであるか、あるいはCD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、あるいはそのシグナリング部分の機能的変異体である、請求項53〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５９】
インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した増殖能または増大能を呈する、請求項52〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質の存在下で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した数のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットを呈する、請求項52〜59のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６１】
メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD62L＋である、請求項60記載の組成物。
【請求項６２】
メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）である、請求項60または請求項61記載の組成物。
【請求項６３】
メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、
a）CD127＋、および/または
b）CD45RA＋、CD45RO-、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数、t-betlow、IL-7Ra＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数
を含む表現型をさらに含む、請求項61または請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD8＋である、請求項61〜63のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６５】
投与された遺伝子改変細胞に由来するメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数が、参照組成物と比較して、増加したまたはより大きなパーセンテージの、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）を含む、請求項61〜64のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６６】
インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した持続性および/または生存を呈する、請求項52〜65のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６７】
インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、より多くのIL-2を生産する、請求項52〜66のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６８】
前記1種または複数種の刺激性作用物質が、前記キメラ受容体に特異的な抗原、抗CD3/抗CD28抗体を含み、かつ/またはIL-2、IL-15および/もしくはIL-7サイトカインを含む、
請求項52〜67のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６９】
増加が、刺激の開始後、3日、4日、5日、6日、7日、10日または14日以内に観察される、請求項52〜68のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７０】
増加が、3:1より大きい、もしくは約3:1より大きい、もしくは約3:1の、または5:1より大きい、もしくは約5:1より大きい、もしくは約5:1の、または9:1より大きい、もしくは約9:1より大きい、もしくは約9:1のエフェクター対ターゲット比で観察される、請求項52〜69のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７１】
複数ラウンドの抗原特異的刺激に続くインビトロアッセイにおいて、組成物からのT細胞が、
T細胞の集団を含む参照組成物と比較して、
単一ラウンドの刺激と比較して、ならびに/または
単一ラウンドの刺激および/もしくは前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の同じアッセイにおけるレベルと比較して、
持続したまたは増加したレベルの、T細胞の機能、健全性、または活性を示す因子を呈示するか、または呈示することが観察されている、請求項52〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７２】
参照細胞組成物が、
発現したキメラ受容体がCD40由来の細胞内シグナリングドメインを含有しない異なる共刺激分子を含むこと以外は実質的に同じである、遺伝子改変細胞
を含有する、請求項59〜71のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７３】
単一ラウンドの刺激および/または前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の、同じアッセイにおける参照集団または参照レベルと比較して、前記因子のレベルが減少しない、請求項69〜72のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７４】
前記複数ラウンドの刺激が、少なくとも3、4、または5ラウンドを含み、かつ/または少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25日の期間にわたって行われる、請求項69〜73のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７５】
ある疾患または状態を有する対象に請求項47〜49および51のいずれか一項記載の細胞または請求項52〜75のいずれか一項記載の組成物を投与する工程を含む、処置の方法。
【請求項７６】
キメラ受容体が、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
疾患または状態が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である、請求項75または請求項76記載の方法。
【請求項７８】
遺伝子改変T細胞または遺伝子改変T細胞のサブセットが、対象において、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量の参照細胞組成物を投与された対象の場合よりも、増加したまたはより長期の増大および/または持続性を呈する、請求項75〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
遺伝子改変T細胞または遺伝子改変T細胞のサブセットがCD8＋ T細胞である、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
増加または減少が、細胞の投与から1ヶ月以内、2ヶ月以内、6ヶ月以内、または1年以内に観察されるか、または存在する、請求項78または請求項79記載の方法。
【請求項８１】
参照細胞組成物が、
発現したキメラ受容体がCD40由来の細胞内シグナリングドメインを含有しない異なる共刺激分子を含むこと以外は実質的に同じである、遺伝子改変細胞
を含有する、請求項78〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置する際に使用するための、請求項52〜74のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８３】
疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置するための、請求項52〜74のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８４】
疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置するための医薬を製造するための、請求項52〜74のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８５】
リガンド結合受容体が、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する、請求項82記載の使用のための組成物または請求項84もしくは請求項85記載の使用。
【請求項８６】
疾患または状態が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である、請求項82〜85のいずれか一項記載の使用のための組成物または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2015年11月5日に出願された「Chimeric Receptors Containing Traf-Inducing Domains and Related Compositions and Methods」と題する米国仮出願第62/251,590号に基づく優先権を主張し、この米国仮出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
本願は電子形式の配列表と共に出願されている。この配列表は、2016年11月3日に作成されたサイズ37,708バイトの735042002940SeqList.txtという名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、いくつかの局面において、T細胞を含む養子治療用の細胞を改変するためのキメラ受容体、および遺伝子改変細胞に関する。いくつかの局面において、本開示はさらに、細胞を改変し生産するための方法および組成物、前記細胞を含有する組成物、ならびに対象にそれらを投与するための方法に関する。いくつかの態様において、前記細胞、例えばT細胞は、抗原に特異的に結合する遺伝子改変抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）であって、TRAF6媒介シグナリング（TRAF6-mediated signaling）を誘導する細胞内シグナリングドメインを含有するものを含有する。いくつかの態様において、前記細胞および方法の特徴は、増加したまたは改良された活性、効力および/または持続性をもたらす。
【背景技術】
【０００４】
背景
養子治療用の改変細胞を生産し投与するために、さまざまな戦略を利用することができる。例えば、CARなどの遺伝子改変抗原受容体を発現する免疫細胞を工学的に作出し、そのような細胞を含有する組成物を対象に投与するための戦略を、利用することができる。細胞の効力を、例えば対象への投与後の細胞の持続性および/または生存を改良するなどして改良するには、改良された戦略が必要である。そのような必要性を満たす方法、細胞、組成物、キット、および系が、提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本願は、いくつかの局面において、リガンド結合ドメインと、TNF受容体関連因子6（TRAF-6）誘導ドメイン（inducing domain）および活性化細胞質シグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインとを含む、キメラ受容体を提供する。
【０００６】
リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびヒトCD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体も、ここに提供される。リガンド結合ドメイン、ヒトCD28由来の膜貫通ドメイン、およびCD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体も、提供される。いくつかの例において、CD40はヒトCD40である。任意のそのような態様の一部において、CD40由来のシグナリングドメインは、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含有する機能的変異体を含有する。
【０００７】
リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびSEQ ID NO:12に示すCD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体も、提供される。いくつかの例において、膜貫通ドメインはCD40に由来する。
【０００８】
任意のそのような態様の一部において、膜貫通ドメインは、CD4、CD28、もしくはCD8に由来する膜貫通ドメインであるか、またはCD4、CD28、もしくはCD8に由来する膜貫通ドメインを含有する。いくつかの実施例において、膜貫通ドメインは、CD28由来の膜貫通ドメインであるか、CD28由来の膜貫通ドメインを含有する。場合により、膜貫通ドメインはヒトの膜貫通ドメインであるか、またはヒトタンパク質に由来する。
【０００９】
任意のそのような態様の一部において、CD28由来の膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性の有するアミノ酸配列を含有する。
【００１０】
任意のそのような態様の一部において、キメラ受容体は活性化細胞質シグナリングドメインをさらに含有する。場合により、活性化細胞質シグナリングドメインは、T細胞において一次活性化シグナルを誘導する能力を有し、T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）（ITAM）を含む。いくつかの態様において、活性化細胞質シグナリングドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分であるか、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分を含有する。
【００１１】
任意のそのような態様の一部において、細胞内シグナリングドメインは、そのN末端からC末端に向かって順に、CD2由来のシグナリングドメイン、および活性化細胞質シグナリングドメインを含有する。任意のそのような態様の一部において、細胞内シグナリングドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインを含有しない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは追加の共刺激シグナリングドメインをさらに含有する。
【００１２】
任意のそのような態様の一部において、追加の共刺激シグナリングドメインは、CD40に由来するもの以外のT細胞共刺激分子の細胞内シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含有する。いくつかの局面において、追加の共刺激シグナリングドメインは、CD28、4-1BB、またはICOSに由来するシグナリングドメイン、またはそのシグナリング部分を含有する。
【００１３】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは抗原結合ドメインである。いくつかの実施例において、抗原結合ドメインは抗体または抗原結合性抗体フラグメントである。場合により、抗原結合ドメインは、一本鎖フラグメントである抗原結合性抗体フラグメントである。いくつかの例において、抗原結合性抗体フラグメントは、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された抗体可変領域を含有する。場合により、抗原結合ドメインは一本鎖可変フラグメント（scFv）である。
【００１４】
別の一局面では、第1キメラ受容体および第2キメラ受容体を含む多量体型キメラ受容体複合体が提供される。さらなる別の局面では、キメラ受容体または多量体型キメラ受容体複合体をコードする核酸またはベクター、キメラ受容体または多量体型キメラ受容体複合体を発現する細胞、キメラ受容体発現細胞または多量体型キメラ受容体複合体発現細胞を含む組成物、およびそのような細胞の投与を含む処置の方法が提供される。
【００１５】
いくつかの態様では、（a）リガンド結合ドメインと、（b）（i）TRAF-6の活性化もしくは細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、TNF受容体関連因子6（TRAF-6）誘導ドメイン、および（ii）活性化細胞質シグナリングドメインを含む、細胞内シグナリングドメインとを含む、キメラ受容体が提供される。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、TRAF-6結合ドメインを含むか、TRAF-6結合ドメインを含む分子に結合する能力またはTRAF-6結合ドメインを含む分子を動員する分子に結合する能力を有するドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6結合ドメインはPro-Xxa-Glu-Xaa-Xaa-Xaa（SEQ ID NO:26）を含むアミノ酸配列を含み、かつ/またはTRAF-6結合ドメインはTRAF-6以外のTRAF分子には特異的に結合せず、かつ/またはキメラ受容体は、他の任意のTRAF分子、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、および/またはTRAF-5に特異的に結合する分子に特異的に結合する能力および/または他の任意のTRAF分子、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、および/またはTRAF-5に特異的に結合する分子を動員する能力を有する結合ドメインを含まない。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子のTRAF-6誘導ドメインであるか、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子のTRAF-6誘導ドメインを含むか、またはTNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子のTRAF-6誘導ドメインの機能的フラグメントもしくは機能的変異体である。
【００１６】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF誘導ドメインも含まず;前記分子は、前記分子に由来するTRAF-1誘導ドメインを含まず;前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-2誘導ドメインも含まず;前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-3誘導ドメインも含まず;前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-4誘導ドメインも含まず;前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-5誘導ドメインも含まず;前記分子は、他のTRAFの活性化もしくは細胞局在またはTRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、もしくはTRAF-5の活性化もしくは細胞局在を誘導する能力を有する前記分子のドメインを含まず、かつ/または前記分子は、他のTRAFを介したシグナリングおよび/またはTRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、もしくはTRAF-5を介したシグナリングを誘導する能力を有する前記分子のドメインを含まない。
【００１７】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、TRAF-6誘導ドメインは、腫瘍壊死因子（TNF）受容体スーパーファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインであるか、腫瘍壊死因子（TNF）受容体スーパーファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントであり;またはTRAF-6誘導ドメインは、Toll/IL-1ファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインであるか、Toll/IL-1ファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントである。いくつかの態様において、前記分子は、CD40、RANKおよびインターロイキン1受容体タイプ1（IL1R1）のなかから選択される。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、（i）SEQ ID NO:12、14または16に示すアミノ酸の配列;（ii）SEQ ID NO:12、14または16に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む機能的変異体;（iii）SEQ ID NO:12に対して100％未満の配列同一性およびSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を呈する機能的変異体、または（iv）（i）、（ii）もしくは（iii）の機能的フラグメントのなかから選択されるアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様において、機能的変異体または機能的フラグメントは、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力および/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6結合ドメインを含むか、TRAF-6結合ドメインを含む分子に結合する能力またはTRAF-6結合ドメインを含む分子を動員する分子に結合する能力を有するドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導部分は、TRAF-6結合ドメインを含む分子を動員し、動員される分子はIRAKであるかIRAKを含み、かつ/またはTRAF-6誘導部分は、IRAKを動員する能力を有するTIRドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、CD40またはOX40の細胞質シグナリングドメインではないか、CD40またはOX40の細胞質シグナリングドメインを含まず、かつ/またはCD40もしくはOX40の全細胞質ドメインではないか、CD40もしくはOX40の全細胞質ドメインを含まず、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:34に示す配列によってコードされるもの）またはSEQ ID NO:20もしくは32に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:33に示す配列によってコードされるもの）でないか、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:34に示す配列によってコードされるもの）またはSEQ ID NO:20もしくは32に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:33に示す配列によってコードされるもの）を含まず、かつ/またはTRAF-6結合ドメイン以外のOX40またはCD40のTRAF結合ドメインを含まない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、そのN末端からC末端に向かって順に、リガンド結合ドメイン、（TRAF-6）誘導ドメインおよび活性化細胞質シグナリングドメインを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、TRAF-6誘導ドメインは、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体を含み、リガンドが結合したときに、キメラ受容体は、補助シグナリングドメインを含む第2のキメラ受容体との多量体型複合体を形成する能力を有し、前記多量体型複合体は、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する。いくつかの態様において、補助シグナリングドメインは、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインを含むか、第1キメラ受容体との多量体型複合体を形成するのに十分なその機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含む。いくつかの態様において、多量体型複合体は、ヘテロ二量体型複合体である。
【００１９】
いくつかの態様では、（a）リガンド結合ドメイン、および（b）（i）リガンドが結合したときに、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導するように協同する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、TRAF-6誘導ドメインおよび補助シグナリングドメインと、（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む、細胞内シグナリングドメイン、を含むキメラ受容体が提供される。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体であるか、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体を含み、補助シグナリングドメインは、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントであるか、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインと補助シグナリングドメインは、直接的または間接的に、タンデムに連結されている。
【００２０】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、活性化細胞質シグナリングドメインは、T細胞において一次活性化シグナルを誘導する能力を有し、T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む。いくつかの態様において、活性化細胞質シグナリングドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分であるか、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、機能的非TCR抗原受容体またはトランスジェニックTCRである。いくつかの態様において、キメラ受容体は、リガンド結合ドメインが抗原結合ドメインであるキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは抗体または抗体フラグメントである。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、一本鎖フラグメントである抗体フラグメントである。いくつかの態様において、フラグメントは、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された抗体可変領域を含む。いくつかの態様において、フラグメントはscFvを含む。
【００２１】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、リガンド結合ドメインは、疾患または障害と関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、疾患または障害は、感染性疾患もしくは感染状態、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんであり、リガンド結合ドメインは腫瘍抗原に特異的に結合し、かつ/またはリガンド結合ドメインは、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、erbB二量体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリンe受容体（fetal acethycholine e receptor）、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（Preferentially expressed antigen of melanoma）（PRAME）、サバイビン、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受容体a2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、およびユニバーサルタグと関連する抗原、がん-精巣抗原、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、MAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）およびサイクリンA1（CCNA1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、および病原体特異抗原からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。任意のそのような態様の一部において、リガンド結合ドメインはCD19に特異的に結合する。
【００２２】
任意のそのような態様の一部において、キメラ受容体は、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとを接合するスペーサーを、さらに含有する。場合により、スペーサーはヒトIgGに由来する。いくつかの実施例において、スペーサーはアミノ酸配列ESKYGPPCPPCP（SEQ ID NO:1）を含有する。いくつかの例において、スペーサーはCD28の細胞外部分を含有し、このCD28は任意でヒトCD28である。いくつかの局面において、CD28由来の細胞外部分は、1〜50アミノ酸長、1〜40アミノ酸長、1〜30アミノ酸長、1〜20アミノ酸長、または1〜10アミノ酸長を含有する。
【００２３】
任意のそのような態様の一部において、スペーサーおよび膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含有するか、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。
【００２４】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、キメラ受容体は、リガンド結合ドメインと細胞内シグナリングドメインとを連結する膜貫通ドメインを、さらに含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインがTRAF-6誘導性ドメイン（TRAF-6 inducible domain）に連結されることにより、TRAF-6誘導性ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、TRAF-6誘導性ドメインを含む分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体であるか、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインとTRAF-6誘導性ドメインは同じ分子に由来する。いくつかの態様において、前記分子は、CD40、RANKおよびインターロイキン1受容体タイプ1（IL1R1）のなかから選択される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、（i）SEQ ID NO:11、13または15に示すアミノ酸の配列;（ii）SEQ ID NO:11、13または15に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む機能的変異体;（iii）（i）または（ii）の機能的フラグメントのなかから選択されるアミノ酸の配列を含む。
【００２５】
いくつかの態様では、上述したキメラ受容体のいずれかにおいて、細胞内シグナリングドメインは、（iii）共刺激シグナリングドメインをさらに含む。いくつかの態様において、共刺激シグナリングドメインは、T細胞共刺激分子の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分を含む。いくつかの態様において、共刺激シグナリングドメインは、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）誘導ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナリングドメインは、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはそのシグナリング部分の機能的変異体である。いくつかの態様では、共刺激シグナリングドメインが、TRAF-6誘導ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にあるか、またはTRAF-6誘導ドメインが、共刺激シグナリングドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、共刺激分子の膜貫通ドメインを含む。
【００２６】
いくつかの態様では、（1）（a）第1リガンド結合ドメインおよび（b）（i）TRAF-6誘導ドメインと（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む第1細胞内シグナリングドメインを含む第1キメラ受容体、ならびに（2）（c）第1リガンド結合ドメインと同じリガンドに結合する能力を有する第2リガンド結合ドメインおよび（d）（iii）補助シグナリングドメインを含む第2細胞内シグナリングドメインを含む第2キメラ受容体を含み、リガンドが結合したときに、TRAF誘導ドメインおよび補助シグナリングドメインは、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導するように協同する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、多量体型キメラ受容体複合体が提供される。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体を含み、補助シグナリングドメインは、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含む。いくつかの態様において、第1リガンド結合ドメインと第2リガンド結合ドメインは同じであるか、実質的に同じである。
【００２７】
いくつかの態様では、上述した多量体型キメラ受容体複合体のいずれかにおいて、第2キメラ受容体は、第2活性化細胞質シグナリングドメインをさらに含み、この第2活性化細胞質シグナリングドメインは、任意で、第1活性化細胞質ドメインと同じであるか、実質的に同じである。いくつかの態様において、第1活性化細胞質シグナリングドメインおよび/または第2活性化細胞質シグナリングドメインであることができる活性化細胞質シグナリングドメインは、独立して、T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む。いくつかの態様において、第1活性化細胞質シグナリングドメインおよび/または第2活性化細胞質シグナリングドメインであることができる活性化細胞質シグナリングドメインは、独立して、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞質シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む。
【００２８】
いくつかの態様では、上述した多量体型キメラ受容体複合体のいずれかにおいて、第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体は、共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、第1共刺激シグナリングドメインおよび/または第2共刺激シグナリングドメインであることができる共刺激シグナリングドメインは、独立して、T細胞共刺激分子の細胞質シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む。いくつかの態様において、第1共刺激シグナリングドメインおよび/または第2共刺激シグナリングドメインであることができる共刺激シグナリングドメインは、独立して、CD28、4-1BB、またはICOSの細胞質シグナリングドメイン、またはそのシグナリング部分を含む。いくつかの態様において、第1リガンド結合ドメインおよび/または第2リガンド結合ドメインは、機能的非TCR抗原受容体またはトランスジェニックTCRである。
【００２９】
いくつかの態様では、上述した多量体型キメラ受容体複合体のいずれかにおいて、第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体は、第1リガンド結合ドメインおよび/または第2リガンド結合ドメインが抗原結合ドメインであるキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントである。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、一本鎖フラグメントである抗体フラグメントである。いくつかの態様において、前記フラグメントは、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された抗体可変領域を含む。いくつかの態様において、前記フラグメントは、scFvを含む。
【００３０】
いくつかの態様では、上述した多量体型キメラ受容体複合体のいずれかにおいて、第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体は、リガンド結合ドメインと細胞内シグナリングドメインとを連結する膜貫通ドメインを、さらに含む。
【００３１】
いくつかの態様では、上述した態様のいずれかによるキメラ受容体をコードする核酸分子が提供される。任意のそのような態様の一部において、核酸分子はシグナル配列をさらに含有する。いくつかの態様において、核酸分子は、（a）第1リガンド結合ドメインおよび（b）（i）TRAF-6誘導ドメインと（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む第1細胞内シグナリングドメインを含む第1キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列、ならびに/または（c）第1リガンド結合ドメインと同じリガンドに結合する能力を有する第2リガンド結合ドメインおよび（d）（iii）補助シグナリングドメインを含む第2細胞内シグナリングドメインを含む第2キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列を含む。
【００３２】
いくつかの態様において、核酸分子は、第1キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列と第2キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列とを含む単一ポリヌクレオチドであり、任意で、第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターを、さらに含む。いくつかの態様において、第1キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列は第1プロモーターに機能的に連結され、第2キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列は第2プロモーターに機能的に連結されていて、第1プロモーターと第2プロモーターは同じであるかまたは異なることができ、あるいは第1キメラ受容体と第2キメラ受容体は配列内リボソーム進入部位（IRES）によって隔てられていて、第1キメラ受容体と第2キメラ受容体は、同じプロモーターの制御下に発現される。いくつかの態様において、コードされている第1キメラ受容体および/またはコードされている第2キメラ受容体は、上述した態様のいずれかによる多量体型複合体の第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体である。いくつかの態様において、第1ポリヌクレオチドおよび第2ポリヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって隔てられているか、または自己切断性ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードするヌクレオチド配列によって隔てられており、前記ペプチドは任意でT2AまたはP2Aである。
【００３３】
いくつかの態様では、上述した態様のいずれかによる核酸分子を含むベクターが提供される。場合により、ベクターは発現ベクターである。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスベクターであり、このベクターは、任意で、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、修飾カスパーゼ分子も誘導性カスパーゼ分子もコードせず、任意で、前記カスパーゼ分子は修飾カスパーゼ-9または誘導性カスパーゼ9である。
【００３４】
いくつかの態様では、上述した態様のいずれかによる核酸分子またはベクターを含むか、上述した態様のいずれかによるキメラ受容体を発現する、改変細胞が提供される。いくつかの態様において、改変細胞は、（a）第1リガンド結合ドメインおよび（b）（i）TRAF-6誘導ドメインと（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む第1細胞内シグナリングドメインを含む第1キメラ受容体、ならびに/または（c）第1リガンド結合ドメインと同じリガンドに結合する能力を有する第2リガンド結合ドメインおよび（d）（iii）補助シグナリングドメインを含む第2細胞内シグナリングドメインを含む第2キメラ受容体を含む。いくつかの態様において、第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体は、上述した態様のいずれかによる多量体型複合体の第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体である。いくつかの態様において、細胞は、修飾カスパーゼ分子も誘導性カスパーゼ分子も発現せず、任意で、前記カスパーゼ分子は修飾カスパーゼ-9または誘導性カスパーゼ9である。いくつかの態様において、改変細胞はT細胞である。いくつかの態様において、改変T細胞はCD8＋ T細胞である。
【００３５】
改変細胞を生産する方法であって、上述の核酸分子または上述のベクターを細胞に導入し、それによって改変細胞を生産する工程を含む方法も、提供される。上述した方法によって生産される改変細胞も、提供される。
【００３６】
いくつかの態様では、上述した態様のいずれかによる改変細胞と、任意で薬学的に許容される緩衝液とを含む、組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物は、上述した態様のいずれかによるキメラ受容体を発現するか、上述した態様のいずれかによる多量体型複合体の第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体を発現する、改変CD8＋細胞と、CD8＋細胞において発現するキメラ受容体と比較して異なるキメラ受容体であって、異なる共刺激シグナリングドメインを含むキメラ受容体を含む、改変CD4＋細胞と、任意で、薬学的に許容される緩衝液とを含む。いくつかの態様において、第1改変細胞対第2改変細胞の比は、1:1、1:2、2:1または約1:1、1:2、2:1である。
【００３７】
いくつかの態様において、CD8＋細胞と比較して、CD4＋細胞において発現するキメラ受容体の唯一の相違は、異なる共刺激シグナリングドメインである。いくつかの態様において、前記異なる共刺激シグナリングドメインは、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力および/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有するTRAF-6誘導ドメインを含まない。いくつかの態様において、前記異なる共刺激シグナリングドメインは、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）の活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有するPI3K誘導ドメインであるか、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）の活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有するPI3K誘導ドメインを含む。いくつかの態様において、前記異なる共刺激シグナリングドメインは、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインであるか、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはそのシグナリング部分の機能的変異体である。
【００３８】
いくつかの態様では、上述した組成物のいずれかにおいて、インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の改変細胞は、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した増殖能または増大能を呈する。いくつかの態様において、インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質の存在下で刺激された場合に、組成物中の改変細胞は、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した数のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットを呈する。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットはCD62L＋である。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットは、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）である。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットは、a）CD127＋、および/またはb）CD45RA＋、CD45RO-、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数ならびにt-betlow、IL-7Ra＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数を含む表現型を、さらに含む。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットはCD8＋である。いくつかの態様において、投与された改変細胞に由来するメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数は、参照組成物と比較して、増加したまたはより大きなパーセンテージの、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、上述した組成物のいずれかにおいて、インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の改変細胞は、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した持続性および/または生存を呈する。いくつかの態様において、前記1種または複数種の刺激性作用物質は、抗原、抗CD3/抗CD28抗体を含み、かつ/またはIL-2、IL-15および/またはIL-7サイトカインを含む。いくつかの態様において、増加は、刺激の開始後、3日、4日、5日、6日、7日、10日または14日以内に観察される。
【００４０】
いくつかの態様では、ある疾患または状態を有する対象に、上述した態様のいずれかによる改変細胞を投与する工程を含む、処置の方法が提供される。いくつかの態様において、キメラ受容体は、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、疾患または状態は、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である。いくつかの態様において、組成物中の改変細胞は、対象において、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量の参照細胞組成物を投与された対象の場合よりも、増加したまたはより長期の増大および/または持続性を呈する。いくつかの態様では、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来する対象中のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数または持続性と比較して、増加したまたはより多数の、投与された改変細胞に由来する対象中のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセット、および/または増加した、もしくはより長期の、投与された改変細胞に由来する対象中のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの持続性が見られる。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットはCD62L＋である。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットはセントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）である。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットは、a）CD127＋;および/またはb）CD45RA＋、CD45RO-、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数ならびにt-betlow、IL-7Ra＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数を含む表現型を、さらに含む。いくつかの態様において、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットはCD8＋である。
【００４１】
いくつかの態様では、上述した処置の方法のいずれかにおいて、投与された遺伝子改変細胞に由来するメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数は、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来するそのような細胞の数と比較して、増加した、またはより大きなパーセンテージの、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）を含む。いくつかの態様では、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来する対象中の非最終分化細胞の数と比較して、増加したまたはより多数の、投与された遺伝子改変T細胞に由来する対象中の非最終分化T細胞が見られる。いくつかの態様において、投与された改変細胞に由来する対象中の細胞は、1種または複数種の刺激性作用物質の存在下にエクスビボで再刺激したときに、同じ1種または複数種の刺激性作用物質の存在下にエクスビボで再刺激された場合の、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来する対象中の細胞の活性化または増殖と比較して、活性化または増殖の増加を呈する。いくつかの態様において、前記1種または複数種の刺激性作用物質は、抗原、抗CD3/抗CD28抗体を含むか、IL-2、IL-15および/またはIL-7サイトカインを含む。
【００４２】
いくつかの態様において、増加は、刺激の開始後、3日、4日、5日、6日、7日、10日または14日以内に観察される。いくつかの態様において、増加は、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、または5倍である。いくつかの態様では、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量の参照細胞組成物を投与された対象中の細胞における疲弊マーカーの発現と比較して、減少または低減した、投与された改変細胞に由来する対象中の細胞における疲弊マーカーの発現が見られる。いくつかの態様において、疲弊マーカーは、CD244、CD160およびPD-1のなかから選択される。いくつかの態様において、発現は、1.2分の1、1.5分の1、2.0分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1、10分の1またはそれ未満に減少または低減する。いくつかの態様において、増加または減少は、細胞の投与から1ヶ月以内、2ヶ月以内、6ヶ月以内、または1年以内に、観察され、または存在する。いくつかの態様では、上述した組成物のいずれかにおいて、増加は、3:1より大きい、もしくは約3:1より大きい、もしくは約3:1の、または5:1より大きい、もしくは約5:1より大きい、もしくは約5:1の、または9:1より大きい、もしくは約9:1より大きい、もしくは約9:1の、エフェクター対ターゲット比で観察される。いくつかの態様では、上述した組成物のいずれかにおいて、インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞は、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、より多くのIL-2を生産する。いくつかの態様では、上述した組成物または処置の方法のいずれかにおいて、参照細胞組成物は、発現するキメラ受容体が、匹敵するキメラ受容体の異なるまたは別の共刺激分子に由来する細胞内シグナリングドメインを含む点以外は、実質的に同じ改変細胞を含有する。いくつかの態様において、参照細胞組成物は、TRAF-6誘導ドメイン（例えばCD40由来のシグナリングドメイン）を含まず、かつ/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有する共刺激シグナリングドメインに由来するシグナリングドメインを含み、かつ/またはCD28、4-1BB、またはICOSの共刺激ドメイン、例えばヒトCD28、4-1BB、またはICOSの共刺激ドメインを含む、細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体を発現する改変細胞を含有する。いくつかの態様において、参照細胞組成物は、ICOS（例えばヒトICOS）由来の細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体を発現する改変細胞を含有する。場合により、前記異なる共刺激分子は、TRAF-6誘導ドメイン、任意でOX40由来の細胞内シグナリングドメインを含む、別の共刺激分子である。
【００４３】
いくつかの態様において、上述した組成物のいずれかでは、複数ラウンドの抗原特異的刺激に続くインビトロアッセイにおいて、T細胞の集団を含む参照組成物と比較して、単一ラウンドの刺激と比較して、ならびに/または単一ラウンドの刺激および/もしくは前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の同じアッセイにおけるレベルと比較して、組成物からのT細胞は、持続したまたは増加したレベルの、T細胞の機能、健全性、または活性を示す因子を呈示するか、または呈示することが観察されている。
【００４４】
任意のそのような態様の一部において、参照細胞組成物は、発現するキメラ受容体が、CD40由来の細胞内シグナリングドメインを含有しない異なる共刺激分子を含む点以外は、実質的に同じである遺伝子改変細胞を含有する。
【００４５】
いくつかの態様では、上述した組成物のいずれかにおいて、前記複数ラウンドの刺激は、少なくとも3、4、または5ラウンドを包み、かつ/または、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25日の期間にわたって行われる。
【００４６】
任意のそのような態様の一部において、上述した組成物は、疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置する際に使用するための組成物である。任意のそのような態様の一部において、上述した組成物は、疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置するための組成物である。任意のそのような態様の一部において、疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置するための医薬を製造するための、上述した組成物のいずれかの使用も提供される。
【００４７】
リガンド結合受容体が、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する、上述した使用のいずれかのための、上述した組成物のいずれかも提供される。任意のそのような態様の一部において、疾患または状態は、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である。
【００４８】
任意のそのような態様の一部において、リガンド結合ドメインは、CD40Lに特異的に結合せず、かつ/またはCD40に由来しない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】CD3ゼータシグナリングドメイン（「z」）と、1）41BB由来の共刺激シグナリングドメイン（41BBz、べた塗りの四角形）、2）CD28由来の共刺激シグナリングドメイン（CD28z、濃色の三角形）、3）ICOS由来の共刺激シグナリングドメイン（ICOSz、下向きの三角形）、4）CD40由来の共刺激シグナリングドメイン（CD40z、輪郭付きの丸）、または5）OX40由来の共刺激シグナリングドメイン（OX40z、輪郭付きの四角形）のいずれかとを含有する細胞内シグナリングドメインをそれぞれ有する、さまざまなCD19指向性CAR-T細胞による、CD19発現ターゲット細胞（K562-CD19細胞）のターゲット細胞殺滅を描いた図である。殺滅指数（killing index）は、9:1、3:1および1:1のCAR-T細胞::ターゲット細胞比での共培養後のターゲット細胞成長曲線の1/AUCによって算出した。ターゲット細胞のみ（ターゲットのみ、淡色の三角形）または非CAR形質導入T細胞（モック、べた塗りの丸）による対照ウェルの殺滅指数も描かれている。
【図２Ａ】CAR発現細胞と、抗原を発現するK562-CD19ターゲット細胞とを、1:1、3:1および9:1のE:T比でインキュベートした後の、4日目の上清からのサイトカイン放出を示す図である。TNF-α（図2A）。評価したCAR-T細胞は、CD40由来の共刺激シグナリングドメイン、OX40由来の共刺激シグナリングドメイン、ICOS由来の共刺激シグナリングドメイン、4-1BB由来の共刺激シグナリングドメイン、またはCD28由来の共刺激シグナリングドメインを含有した。非CAR形質導入T細胞からのサイトカイン放出（モック、べた塗りの丸）も描かれている。
【図２Ｂ】CAR発現細胞と、抗原を発現するK562-CD19ターゲット細胞とを、1:1、3:1および9:1のE:T比でインキュベートした後の、4日目の上清からのサイトカイン放出を示す図である。GM-CSF（図2B）。評価したCAR-T細胞は、CD40由来の共刺激シグナリングドメイン、OX40由来の共刺激シグナリングドメイン、ICOS由来の共刺激シグナリングドメイン、4-1BB由来の共刺激シグナリングドメイン、またはCD28由来の共刺激シグナリングドメインを含有した。非CAR形質導入T細胞からのサイトカイン放出（モック、べた塗りの丸）も描かれている。
【図２Ｃ】CAR発現細胞と、抗原を発現するK562-CD19ターゲット細胞とを、1:1、3:1および9:1のE:T比でインキュベートした後の、4日目の上清からのサイトカイン放出を示す図である。IFNγ（図2C）。評価したCAR-T細胞は、CD40由来の共刺激シグナリングドメイン、OX40由来の共刺激シグナリングドメイン、ICOS由来の共刺激シグナリングドメイン、4-1BB由来の共刺激シグナリングドメイン、またはCD28由来の共刺激シグナリングドメインを含有した。非CAR形質導入T細胞からのサイトカイン放出（モック、べた塗りの丸）も描かれている。
【図２Ｄ】CAR発現細胞と、抗原を発現するK562-CD19ターゲット細胞とを、1:1、3:1および9:1のE:T比でインキュベートした後の、4日目の上清からのサイトカイン放出を示す図である。IL-2（図2D）。評価したCAR-T細胞は、CD40由来の共刺激シグナリングドメイン、OX40由来の共刺激シグナリングドメイン、ICOS由来の共刺激シグナリングドメイン、4-1BB由来の共刺激シグナリングドメイン、またはCD28由来の共刺激シグナリングドメインを含有した。非CAR形質導入T細胞からのサイトカイン放出（モック、べた塗りの丸）も描かれている。
【図３Ａ】CD40由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD8＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）のどちらかで刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図３Ｂ】OX40由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD8＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）のどちらかで刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図３Ｃ】ICOS由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD8＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）のどちらかで刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図３Ｄ】4-1BB由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD8＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）のどちらかで刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図３Ｅ】CD28由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD8＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）のどちらかで刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図４Ａ】CD40由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD4＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）で刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図４Ｂ】OX40由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD4＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）で刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図４Ｃ】ICOS由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD4＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）で刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図４Ｄ】4-1BB由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD4＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）で刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図４Ｅ】CD28由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCD4＋ T細胞サブセットにおける、CAR改変T細胞をCD19-K562ターゲット細胞（黒色）または対照親細胞（灰白色）で刺激した後の、さまざまなサイトカインの細胞内サイトカイン発現を示す図である。細胞内サイトカイン発現が、TNF-アルファおよびIFN-γ（右下）、IL-17AおよびグランザイムB（右上）、IL-13およびIL-22（左下）、またはIL-10およびIL-2（左上）に関して示されている。
【図５】連続刺激アッセイにおける、CD19発現ターゲット細胞による再刺激の各ラウンド後の、モック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現する抗CD19CAR改変細胞の細胞数の倍加数を示す図である。
【図６Ａ】播種性腫瘍異種移植片マウスモデルにおける、腫瘍のみの試験群およびモック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインのいずれかを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスの腫瘍量を示す図である。腫瘍量は、マウスにおける平均放射輝度（p/s/cm2/sr）を測定することによって評価した。
【図６Ｂ】播種性腫瘍異種移植片マウスモデルにおける、腫瘍のみの試験群およびモック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスの生存率を示す図である。
【図７Ａ】モック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞の投与後28日目におけるマウスからの血液中の腫瘍細胞数を示す図である。
【図７Ｂ】モック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞の投与後28日目におけるマウスからの脾臓中の腫瘍細胞数を示す図である。
【図７Ｃ】モック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞の投与後28日目におけるマウスからの骨髄中の腫瘍細胞数を示す図である。
【図７Ｄ】モック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスの骨髄における、CAR-T細胞移入後28日目の、EGFRt＋ CAR T細胞の絶対量を示す図である。
【図７Ｅ】モック試験群と比較した、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスの骨髄における、CAR-T細胞移入後28日目の、EGFRt＋ CAR T細胞の絶対量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細な説明
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する専門用語、表記ならびに他の技術用語および科学用語または用語法は、クレームに記載する主題が関係する技術分野の通常の技能を有する者に一般に理解されているものと同じ意味を有するものとする。場合によっては、一般に理解されている意味を持つ用語を、明快さのために、かつ/またはいつでも参照できるように、本明細書において定義するが、本明細書にそのような定義を含めることは、必ずしも、当技術分野において一般に理解されているものとの実質的な相違を表すと解釈すべきでない。
【００５１】
本願において言及する刊行物は、特許文書、科学論文およびデータベースを含めてすべて、個々の刊行物が個別に参照により本明細書に組み入れられた場合と同じ程度に、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。本明細書に示す定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、出願公開および他の刊行物において示された定義に反するか、または他の形で一致しない場合は、本明細書に示す定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義に優先する。
【００５２】
本明細書において使用する見出しには構成上の目的しかなく、記載される内容をそれらが限定すると解釈してはならない。
【００５３】
I.概観
TRAF分子の活性化または細胞局在を誘導する能力を有しかつ/またはTRAF媒介シグナリングを誘導する能力を有するTRAF誘導シグナリングドメインを含有する細胞内シグナリングドメインを組み込んだ組換え受容体（キメラ抗原受容体などのキメラ受容体を含む）が、ここに提供される。いくつかの態様において、TRAF誘導シグナリングドメインは、T細胞シグナリング分子などの細胞シグナリング分子の細胞質シグナリングドメイン、例えば共刺激分子またはサイトカイン受容体の細胞質シグナリングドメインに由来する。いくつかの態様において、TRAF誘導シグナリングドメインは、TRAF-6分子の活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有し、かつ/または下流シグナリングの1つまたは複数のメディエーターを、直接的または間接的に活性化する、TRAF-6誘導シグナリングドメインである。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、TRAF-6分子の活性化または細胞局在を誘導する能力を有するか、TRAF-6分子の活性化または細胞局在を誘導し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有し、かつ/または下流シグナリングの1つまたは複数のメディエーターを活性化する、TNF受容体スーパーファミリーメンバーまたはIL-1もしくはTollファミリーメンバーのメンバーの細胞質シグナリングドメインであるか、それに由来する。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインはCD40、RANKまたはIL-1Rであるか、CD40、RANKまたはIL-1Rに由来する。
【００５４】
いくつかの態様において、TRAF誘導ドメインは、所望の抗原（例えば腫瘍抗原）に対する特異性を提供するリガンド結合ドメイン（例えば抗体または抗体フラグメント）および一次活性化シグナルを提供するT細胞活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン部分をも併せ持つ、キメラ抗原受容体などのキメラ受容体の一部として提供される。いくつかの態様において、提供されるキメラ受容体は、遺伝子工学によって免疫細胞に導入した場合に、T細胞の活性を調整することができ、またいくつかの例では、T細胞の分化またはホメオスタシスを調整することができ、それによって、インビボで改良された寿命、生存および/または持続性を持つ、例えば養子細胞治療法において使用するための、遺伝子改変細胞がもたらされる。
【００５５】
養子細胞治療（関心対象の疾患または障害に特異的なキメラ受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）および/または他の組換え抗原受容体を発現する細胞の投与を伴うもの、ならびに他の養子免疫細胞治療および養子T細胞治療を含む）は、がんならびに他の疾患および障害の処置において有効な場合がある。一定の状況では、利用可能な養子細胞治療へのアプローチが、いつでも全く申し分ないというわけではない場合もある。いくつかの状況において、最適な効力は、投与された細胞の、ターゲット（例えばターゲット抗原）を認識しそれに結合する能力、対象、腫瘍、およびその環境内で輸送され、局在化し、適当な部位にうまく進入する能力、活性化状態になって、増大する能力、さまざまなエフェクター機能を発揮する能力（細胞傷害性の殺滅（cytotoxic killing）およびサイトカインなどのさまざまな因子の分泌を含む）、持続（長期間を含む）する能力、一定の表現型状態（エフェクター、長寿命メモリー、低分化度、およびエフェクター状態など）に分化し、移行し、またはそれら一定の表現型状態へのリプログラミングにエンゲージする能力、クリアランスおよびターゲットリガンドまたはターゲット抗原への再曝露に続いて有効でロバストなリコール応答を与え、疲弊、アネルギー、最終分化、および/または抑制状態への分化を回避しまたは低減する能力、に依存しうる。
【００５６】
いくつかの例では、養子治療法は、これらの点のすべてにおいて、完全に満足できるわけではない。例えばいくつかの例において、既存のキメラ受容体（例えばCAR）は、CD28または4-1BBなどの分子の共刺激シグナリングドメインを組み込んだものを含めて、持続性の欠如を伴う場合がある。例えばCD28または4-1BBに由来するそのような共刺激シグナリングドメインを組み込んだキメラ受容体（例えばCAR）で遺伝子改変された細胞は、ターゲット細胞殺滅およびサイトカイン生産を含むロバストなT細胞増殖またはT細胞応答を促進することができるが、その一方でそれらは、最終的にはT細胞疲弊および/または遺伝子改変細胞の持続性の欠如をもたらす過大なシグナルも、もたらしうる。例えば、いくつかの例において、CD28および他の共刺激分子の共刺激シグナリングドメインによって誘導されるPI3K/Akt経路などといった一定の細胞シグナリング経路は、遺伝子改変細胞を対象に投与した場合に、インビボで低減した持続性をもたらしかつ/または低減した持続性につながりうるT細胞の分化状態または活性化状態の変化をもたらしうる。起こりうる分化状態の変化として、いくつかの例では、ナイーブ表現型の喪失、メモリーT細胞表現型の喪失、および/または疲弊もしくはアネルギーの促進による疲弊T細胞表現型を持つエフェクター細胞の生成が挙げられる。T細胞の疲弊は、T細胞機能の漸進的喪失および/または細胞の枯渇につながりうる（Yi et al.（2010）Immunology, 129:474-481）。T細胞疲弊および/またはT細胞持続性の欠如は、養子細胞治療の効力および治療アウトカムにとって障壁であり、抗原受容体（例えばCAR）発現細胞へのより強いおよび/またはより長い曝露と処置アウトカムとの間の相関は、臨床治験によって明らかになっている。
【００５７】
このように、遺伝子改変T細胞において発現するキメラ受容体（例えばCAR）に組み込まれた一定の共刺激シグナリングドメイン（例えばPI-3キナーゼシグナリング共刺激ドメインおよび/またはCD28もしくは4-1BBの細胞質共刺激シグナリングドメイン）の使用は、それらのエフェクター機能を促進することができるものの、それは、長期間曝露および抗腫瘍効力にとって重要となりうる、改変細胞の、メモリーコンパートメントにおいて長期間持続する能力および/またはメモリー細胞サブセットに分化する能力が損なわれることにより、長期的には最適でない場合がありうる。場合により、そのような事象は、遺伝子改変（例えばCAR＋）T細胞が、抗原-抗原受容体結合後に、疲弊表現型を獲得する一因になる場合があり、それは、次いで、機能性の低減につながりうる。場合により、これは、時間が経過するとメモリー表現型またはセントラルメモリー表現型を持つこれらの細胞の数またはパーセンテージを低減して、例えば、セントラルメモリーコンパートメント（例えば長寿命メモリーCD8＋ T細胞および/またはCD8＋ セントラルメモリーT細胞）などの、長寿命メモリーT細胞コンパートメントおよび/またはセントラルメモリーコンパートメントの低減をもたらす場合があり、かつ/またはこれらの細胞の長期間生存能を低減する。
【００５８】
ここに提供されるキメラ受容体およびそのようなキメラ受容体を含有する細胞は、上述した他の既存キメラ受容体で改変された細胞と比較して、他の細胞経路からのシグナリングを誘導する代替的シグナリングドメインの存在による利点を提供しうる。特に、ここに提供されるキメラ受容体は、TRAF-6などのTRAFシグナリングタンパク質ファミリーからのシグナリングモダリティを組み込んでいる。TRAF、すなわち「腫瘍壊死因子受容体関連因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor）」は、細胞内シグナリングを誘導または媒介するように一定の細胞表面分子と協調または共役するシグナリングアダプターである。特に、TRAF-6は、TNF受容体スーパーファミリーおよびIL-1/Toll様受容体ファミリーの受容体からのシグナルを伝達し、それによってそのような受容体を発現させる免疫細胞における細胞内シグナリングを媒介することができるTRAFタンパク質である。いくつかの態様において、そのような受容体へのリガンドの結合は、受容体におけるコンフォメーション変化を誘導する。いくつかの例において、このコンフォメーション変化には、受容体のオリゴマー化が含まれ、それは、TRAF、例えばTRAF-6を動員することによって受容体にシグナリング能を与えることができ、次にそれは、引き続いて細胞内シグナリング経路を活性化することができる。いくつかの態様において、動員または活性化されたTRAF、例えばTRAF-6は、TRAFの二量体または三量体の形成につながることができ、かつ/または細胞膜へのTRAFの局在をもたらす。いくつかの態様において、リガンドが結合したときのTRAF-6の動員および/または活性化は、IκB（IKK）およびMAPキナーゼの活性化をもたらすことができ、いくつかの例では、Aktキナーゼの活性化をもたらすSrcチロシンキナーゼファミリーの活性化をもたらすことができる。下流TRAF-6シグナリングに関与する例示的なメディエーターまたはプレーヤーとしては、MAP3K TAK1、TAB2、IRAK、ECSIT、ペリニオ（Pellinio）を挙げることができる。
【００５９】
いくつかの態様において、TRAF-6媒介シグナリングは、免疫細胞ホメオスタシスおよびT細胞分化と関連し、いくつかの例では、本来であれば最終分化をもたらしうる強い抗原シグナルの負の調節物質として作用することができる。例えば、Traf6-/-マウスには過剰に活性化されたCD4＋ T細胞の存在があり、活性化T細胞ではTRAF6が迅速にアップレギュレートされることが見いだされるので、免疫ホメオスタシスの維持におけるTRAF6の役割が指し示される（King et al.（2006）Nature Medicine, 12:1088）。CD8＋ T細胞におけるTRAF6の欠失は、エフェクターT細胞応答に影響を及ぼすことなく長期記憶T細胞の生成を損なうので、TRAF6が持続性長寿命メモリーT細胞の発生を調節することも観察されている（Pearce et al.（2009）Nature, 40:103-107）。このように、これらの結果は、キメラ受容体へのTRAF-6媒介シグナリングドメインの組み込みが、メモリーリプログラミングにバイアスをかけまたはメモリーリプログラミングを促進するシグナルを明示し、それによって、そのようなキメラ受容体を発現させる長寿命メモリー細胞の生成をもたらすことを立証している。
【００６０】
いくつかの態様において、ここに提供されるTRAF-6誘導キメラ受容体で遺伝子改変された細胞は、長寿命メモリーT細胞コンパートメントおよび/またはセントラルメモリーコンパートメントT細胞集団、例えばセントラルメモリーコンパートメント（例えば長寿命メモリーCD8＋ T細胞および/またはCD8＋セントラルメモリーT細胞）をもたらし、かつ/またはこれらの細胞の長期間生存能を増加させることができる。場合により、経時的なメモリーT細胞（例えば長寿命および/またはセントラルメモリーT細胞）のT細胞寿命、分化および持続性は、キメラ受容体で改変された細胞、例えばCAR改変T細胞の治療効力を強化するのに有利であるだろう。
【００６１】
いくつかの態様において、ここに提供されるキメラ受容体は、対象に投与された場合に参照細胞組成物と比較して改良された1つまたは複数の特性を呈する遺伝子改変T細胞を生産するために、細胞中で発現させることができる。場合により、投与された参照組成物の細胞と比較して改良し、増加させ、または増大させることができる、投与された遺伝子改変細胞の1つまたは複数の特性としては、そのような投与された細胞の、対象における増加したまたはより長期の増大および/または持続性、増加したまたはより多数のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセット（例えばセントラルメモリー、長寿命メモリーまたはTメモリー幹細胞）、増加したまたはより長期の、メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセット（例えばセントラルメモリー、長寿命メモリーまたはTメモリー幹細胞）の持続性、増加したまたはより多数の非最終分化T細胞、抗原で再刺激したときの増加したまたはより大きなリコール応答、あるいは減少または低減した疲弊マーカー発現が挙げられる。いくつかの態様において、増加または減少は、参照細胞組成物を投与したときの同じ特性または特徴と比較した、そのような特性または特徴の、少なくとも1.2倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍の増加または減少であることができる。いくつかの態様において、そのような特性または特徴の1つまたは複数の増加または減少は、遺伝子改変細胞の投与後、1ヶ月以内、2ヶ月以内、3ヶ月以内、4ヶ月以内、5ヶ月以内、6ヶ月以内、または12ヶ月以内に、観察され、または存在することができる。
【００６２】
いくつかの態様において、TRAF-6媒介性シグナリングを誘導する能力を有するTRAF-6誘導キメラ受容体を含む、ここに提供されるキメラ受容体は、それらが発現する免疫細胞において、低分化度表現型または非最終分化表現型へのそのような免疫細胞のバイアシング（biasing）またはリプログラミングをもたらすシグナリングを誘導し、それによって、大きなパーセンテージのまたは多数のメモリーT細胞を生産しまたは生成させることができる。いくつかの態様において、そのようなリプログラミングまたはバイアシングは、遺伝子改変T細胞が抗原による再刺激に応答するように、疲弊マーカーの低減または減少を呈する細胞をもたらす。いくつかの態様において、ここに提供されるキメラ受容体およびそのようなキメラ受容体を含有する遺伝子改変細胞のこれらの特徴は、例えば養子細胞治療において使用するための、遺伝子改変免疫細胞の長期持続性をもたらすことができる。
【００６３】
いくつかの態様において、TRAF-6誘導細胞内ドメイン、例えばCD40由来の細胞内ドメインを含有するここに提供されるキメラ抗原受容体を発現する細胞は、抗原による刺激に応答する。いくつかの態様において、抗原による再刺激に対する応答は、インビトロ連続刺激アッセイにおいて観察することができる。反復刺激に続いてエクスビボで増大する細胞の能力は、いくつかの局面において、CAR-T細胞の（例えば初回活性化後の）持続能力を示すことができ、かつ/またはインビボでの機能を示すものである（Zhao et al.（2015）Cancer Cell, 28:415-28）。いくつかの態様において、TRAF-6誘導細胞内ドメイン、例えばCD40由来の細胞内ドメインを含有するここに提供されるキメラ抗原受容体を発現する細胞は、複数ラウンドの抗原特異的刺激後に、持続的なまたは増加したレベルの、T細胞の機能、健全性または活性を示す因子を呈する。いくつかの態様において、前記増加したまたは持続的なレベルの、T細胞の活性または機能を示す因子は、細胞増大、細胞生存、抗原特異的細胞傷害性、および/またはサイトカイン分泌の程度であるか、それらを含む。いくつかの態様において、そのような増加したまたは持続的なレベルの、T細胞活性を示す因子は、複数ラウンドの抗原特異的刺激後に、例えば少なくとも3、4、または5ラウンド後に、かつ/または複数ラウンドの抗原特異的刺激が、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25日の期間にわたって行われた後に、観察される。いくつかの態様において、T細胞の活性または機能に関する因子のレベルは、参照細胞組成物、例えばここに記載する任意の参照細胞組成物と比較して増加する。いくつかの態様において、T細胞の活性または機能を示す因子は、単一ラウンドの刺激および/または前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の、同じアッセイにおけるレベルと比較して、持続的なまたは増加したレベルである。いくつかの態様において、前記因子のレベルは、単一ラウンドの刺激および/または前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の、同じアッセイにおける参照集団または参照レベルと比較して、減少しない。
【００６４】
参照細胞組成物は、T細胞またはT細胞の集団が、匹敵するキメラ受容体とは別の、かつ/または匹敵する遺伝子改変細胞の別のTRAF-6誘導ドメインを有する細胞内シグナリングドメインを含有する、異なるキメラ受容体を発現する点以外は、同じまたは実質的に同じ条件下で得られ、単離され、作製され、生産され、かつ/またはインキュベートされるT細胞または複数細胞の組成物であることができる。いくつかの態様において、参照細胞組成物は、発現するキメラ受容体が、TRAF-6誘導ドメインを含まない異なる共刺激分子に由来する部分を有する細胞内シグナリングドメインを含み、かつ/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有する共刺激シグナリングドメインを含み、かつ/または例えばヒトのまたはヒト由来の、CD28、4-1BB、またはICOSの共刺激ドメインを含む点以外は、実質的に同じ遺伝子改変細胞を含有する。いくつかの態様において、参照細胞組成物は、OX40、例えばヒトOX40に由来する細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体を含む遺伝子改変細胞を含有する。いくつかの態様において、参照細胞組成物は、ICOS、例えばヒトICOSに由来する細胞内シグナリングドメインを含有するキメラ受容体を含む遺伝子改変細胞を含有する。いくつかのそのような態様において、参照組成物のキメラ受容体における唯一の相違または実質的に唯一の相違は、匹敵する細胞のキメラ受容体と比較して、異なる共刺激シグナリングドメインを含む。
【００６５】
いくつかの局面において、参照細胞組成物は、異なるキメラ受容体の導入を含む点を除いて、細胞の活性または特性に影響を及ぼしうる任意の1つまたは複数の条件が、細胞間で変動しないまたは実質的に変動しないように、そのような細胞またはT細胞は、TRAF-6誘導キメラ受容体が導入されたT細胞または細胞と同一または実質的に同一の処理に付される。例えば、参照細胞組成物の細胞が発現するキメラ受容体は、同じ抗原結合ドメイン（例えばscFv）、同じ活性化細胞質シグナリングドメインを含有するが、代替的または異なる共刺激シグナリングドメインを含有しうる。さらに、対象に投与される参照細胞組成物の投薬量は、匹敵する組成物に入れて投与される細胞の投薬量と比較して、ほぼ同じであるか、同じであるか、関連する量である。
【００６６】
いくつかの態様において、ここに提供されるキメラ受容体（例えばCD40由来の細胞内シグナリングドメインを含有するもの）を発現する細胞、またはそのような細胞のサブセットは、PI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有する共刺激シグナリングドメインを含有するキメラ受容体、例えばCD28または4-1BBに由来する共刺激ドメインを含有するキメラ受容体を発現する細胞の場合と同じまたは実質的に同じ、T細胞の機能、健全性または活性を示す1種または複数種の因子を呈する。場合により、そのような因子は、細胞増大、細胞生存、抗原特異的細胞傷害性、および/またはサイトカイン分泌の程度であるか、それらを含む。いくつかの態様において、遺伝子改変T細胞はCD3＋ T細胞であるか、CD4＋またはCD8＋ T細胞を含む。
【００６７】
いくつかの態様において、ここに提供されるキメラ受容体（例えばCD40由来の細胞内シグナリングドメインを含有するもの）を発現する細胞はCD8＋細胞であり、そのような細胞は、PI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有する共刺激シグナリングドメインを含有するキメラ受容体、例えばCD28または4-1BBに由来する共刺激ドメインを含有するキメラ受容体を発現する類似のCD8＋細胞よりも改良されたまたは強い、T細胞の機能、健全性または活性を示す1種または複数種の因子を呈する。場合により、そのような因子は細胞増大、細胞生存、抗原特異的細胞傷害性、および/またはサイトカイン分泌の程度であるか、それらを含む。
【００６８】
いくつかの態様において、対象に投与された場合に、増加した持続性および/または低減したT細胞疲弊を呈する遺伝子改変T細胞を生産するために、ここに提供されるキメラ受容体を、細胞中で発現させることができる。いくつかの態様において、ここに提供されるキメラ受容体、例えばCD40由来の細胞内シグナリングドメインを含有するものを発現するそのような遺伝子改変細胞はCD8＋ T細胞であるか、CD8＋ T細胞を含む。いくつかの態様において、持続性が増加している、かつ/または疲弊が低減している、そのような遺伝子改変細胞は、それが投与された対象において、より良い力価、または持続的なもしくは耐久性の向上した活性を呈しうる。いくつかの態様において、投与後の対象におけるCAR発現T細胞などの遺伝子改変細胞の持続性は、代替的方法、例えば記載の参照細胞組成物の投与を伴う方法によって達成されるであろうものと比較して、大きい。いくつかの態様において、持続性は、少なくとも、または少なくとも約、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍またはそれ以上、増加する。
【００６９】
いくつかの態様において、投与された細胞の持続性の度合いまたは程度を、対象への投与後に、検出し、定量することができる。例えばいくつかの局面では、対象の血液もしくは血清または器官または組織（例えば患部）における組換え受容体を発現する細胞（例えばCAR発現細胞）の量を評価するために、定量PCR（qPCR）が使用される。いくつかの局面において、持続性は、DNA 1マイクログラムあたりの、受容体（例えばCAR）をコードするDNAまたはプラスミドのコピー数として定量されるか、試料、例えば血液または血清の試料1マイクロリットルあたりの、または試料1マイクロリットルあたりの末梢血単核球（PBMC）もしくは白血球もしくはT細胞の総数あたりの、受容体発現細胞（例えばCAR発現細胞）の数として定量される。いくつかの態様では、受容体を発現する細胞を、一般に、その受容体に特異的な抗体を使って検出する、フローサイトメトリーアッセイも、行うことができる。機能的細胞の数またはパーセンテージを検出するために、例えば当該疾患もしくは状態の細胞または受容体によって認識される抗原を発現する細胞に結合し、かつ/またはそれらの細胞を中和し、かつ/またはそれらの細胞に対する応答、例えば細胞傷害性応答を誘導する能力を有する細胞の数またはパーセンテージを検出するために、細胞ベースのアッセイも使用することができる。そのような態様のいずれにおいても、対象中の投与された細胞と内在性細胞とを識別するために、組換え受容体（例えばCAR発現細胞）と関連する別のマーカーの発現の程度またはレベルを使用することができる。
【００７０】
いくつかの態様において、対象に投与された場合に、減少した1種または複数種の疲弊マーカーの発現を呈する遺伝子改変T細胞を生産するために、細胞中で、ここに提供されるキメラ受容体を発現させることができる。いくつかの態様において、疲弊マーカーはCD244、CD160またはPD-1であることができる。
【００７１】
いくつかの態様において、対象に投与された場合に参照細胞組成物と比較して変化した表面マーカー発現プロファイルを呈する遺伝子改変T細胞を生産するために、細胞中で、ここに提供されるキメラ受容体を発現させることができる。いくつかの態様において、変化した表面マーカー発現プロファイルは、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69、CCR7、CD27、CD28、CD122、t-bet、IL-7Rα、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1、およびKLRG1から選択される1つまたは複数の表面マーカーについて、陽性、陰性または低発現量状態である、T細胞の1つまたは複数のサブセットのパーセンテージの変化による。いくつかの態様では、CD62Lおよび/またはIL-7Rα（CD127）について陽性であり、かつ/またはt-betについて陰性または低発現状態である、投与された遺伝子改変細胞からのT細胞のサブセットの増加が見られる。いくつかの態様では、CD45RAについて陽性であり、かつ/またはCD45ROについて陰性または低発現状態である、投与された遺伝子改変細胞からのT細胞のサブセットの増加が見られる。いくつかの態様では、CCR7、CD45RA、CD62L、CD27、CD28、IL-7Rα（CD127）、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、およびLFA-1のうちの1つまたは複数について陽性であり、かつ/またはCD45ROについて陰性である、投与された遺伝子改変細胞T細胞からのT細胞のサブセットの増加が見られる。いくつかの態様では、CD62L＋であり、かつa）CD45RAlow/＋、CD45ROlow/＋、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数、およびb）t-betlow、IL-7Rα＋（CD127＋）、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数である、投与された遺伝子改変細胞からのT細胞のサブセットの増加が見られる。いくつかの態様において、T細胞サブセットの数およびパーセンテージは、対象への参照組成物の投与によってもたらされるT細胞のサブセットの数またはパーセンテージと比較して、少なくとも約2倍（例えば少なくとも約、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上のいずれか）増加する。いくつかの態様において、増加は、投与後、1ヶ月以内、2ヶ月以内、3ヶ月以内、4ヶ月以内、5ヶ月以内、6ヶ月以内、または12ヶ月以内に観察される。
【００７２】
いくつかの態様において、遺伝子改変細胞を投与したときに対象において増加するT細胞サブセット、例えばCD62L＋ T細胞サブセットは、メモリーT細胞またはその特定サブセット、例えば長寿命メモリーT細胞であるか、それらを含むか、それらと表現型特徴を共有する。いくつかの態様において、そのようなメモリーT細胞は、セントラルメモリーT細胞（TCM）またはTメモリー幹細胞（TSCM）細胞である。いくつかの態様において、メモリーT細胞はTSCM細胞である。TSCM細胞は、他のメモリーT細胞サブセットと比較して、またはナイーブT細胞と比較して、例えば分化度が低いまたはよりナイーブであるなどの、1つまたは複数の表現型の相違または機能的特徴を有すると記述することができる（例えばAhlers and Belyakov（2010）Blood, 115:1678）; Cieri et al.（2015）Blood, 125:2865; Flynn et al.（2014）Clinical & Translational Immunology, 3, e20; Gattinoni et al.（2012）Nat. Med., 17:1290-1297; Gattinoni et al.（2012）Nat. Reviews, 12:671; Li et al.（2013）PLOS ONE, 8:e67401;およびPCT出願公開番号WO2014/039044を参照されたい）。場合により、TSCM細胞は、エフェクターT細胞と3つすべてのメモリーT細胞サブセット（TSCM、TCM、およびTEM）とを生成させることができる唯一のメモリーT細胞であると考えられる。いくつかの局面において、TSCM細胞は、すべてのメモリーT細胞サブセットのなかで、最も高い生存率および抗原刺激またはホメオスタシス刺激に対する増殖応答を有し、コグネイト抗原の不在下での消耗が最も少ない。いくつかの態様において、分化度の低いTSCM細胞は、養子移入に続いて他のメモリーT細胞を上回る、増大、長期生存、およびターゲット細胞破壊を呈することができ、したがって、TCM細胞またはTEM細胞のいずれかで考えうるものより、少ない移入細胞で、より効果的な処置を媒介することができうる。
【００７３】
いくつかの局面において、TSCM細胞について報告されているまたは公知である表現型特徴または機能的特徴の例として、例えば、そのような細胞は、a）CD45RO-、CCR7＋、CD45RA＋、CD62L＋、CD27＋、CD28＋、IL-7Rα＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋、およびLFA-1＋であること、b）CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、およびCD95＋であること、c）CD45RA＋、CD45RO＋、CCR7＋、CD62L＋、CD27＋、CD28＋、CD95＋、およびIL-2Rβ＋であること、d）CD45RO-、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、CD27＋、CD28＋、CD127＋、およびCD95＋であること、e）CD45RA＋、CD44＋/-、CD62L＋、CD127＋、IL-2Rβ＋、CD28＋、CD43-、KLRG1-、ペフォリン（Peforin）-、およびグランザイムB-であること、f）高レベルのCCR7、CD62L、CD27、およびCD28、中レベルのCD95およびIL-2Rβ、低レベルのCD45RAを発現し、かつCD45ROもKLRG-1も発現しないこと、g）高レベルのCD62L、低レベルのCD44およびt-betを発現し、かつSca-1＋であること、および/または中等度のIL-2生産能力、低いIFNγ生産能力、低い細胞傷害性、および高い自己再生能力を有すること、が挙げられる。
【００７４】
T細胞マーカーの発現および/またはレベルを評価するための方法および技法は、当技術分野において公知である。そのようなマーカーを検出するための抗体および試薬は当技術分野において周知であり、すぐに入手できる。そのようなマーカーを検出するためのアッセイおよび方法として、細胞内フローサイトメトリーを含むフローサイトメトリー、ELISA、ELISPOT、サイトメトリックビーズアレイまたは他のマルチプレックス法、ウェスタンブロットおよび他のイムノアフィニティーベースの方法が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、T細胞上のマーカーの表面発現を評価する工程には、投与後の対象において、投与された抗原受容体（例えばCAR）発現細胞を検出する工程が含まれる。対象中の抗原受容体（例えばCAR）発現細胞を検出し、表面マーカーのレベルを評価することは、当業者の水準内である。いくつかの態様において、抗原受容体（例えばCAR）発現細胞、例えば対象の末梢血から得られる細胞は、そのような細胞にユニークなマーカーの発現に関するフローサイトメトリーまたは他のイムノアフィニティーベースの方法によって検出することができ、次にそのような細胞を、1種または複数種の他のT細胞表面マーカーについて共染色することができる。いくつかの態様において、抗原受容体（例えばCAR）を発現するT細胞は、非免疫原性選択エピトープとして切断型EGFR（EGFRt）を発現するように作製することができ（例えば同じコンストラクトから2つのタンパク質を発現させるためにT2Aリボソームスイッチで隔てられたCARとEGFRtとをコードするコンストラクトの導入による）、その場合はそれをそのような細胞を検出するためのマーカーとして使用することができる（例えば米国特許第8,802,374号参照）。
【００７５】
がんの処置での養子治療などにおける、方法および前記細胞の使用も提供される。前記細胞を改変し、調製し、生産するための方法、前記細胞を含有する組成物、ならびに前記細胞を含有する、前記細胞を使用し、生産し、投与するためのキットおよびデバイスも提供される。前記改変細胞を生産するための方法、化合物および組成物も提供される。コンストラクトなどの核酸、例えば遺伝子改変抗原受容体をコードするウイルスベクター、およびそのような核酸を形質導入などによって細胞中に導入するための方法が提供される。前記改変細胞を含有する組成物、ならびに前記細胞および組成物を、例えば養子細胞治療のために、対象に投与するための方法、キットおよびデバイスも提供される。いくつかの局面では、細胞が、対象から単離され、改変され、同じ対象に投与される。別の局面では、細胞が、ある対象から単離され、改変され、別の対象に投与される。
【００７６】
II.組換え受容体、例えばキメラ受容体
改変受容体または組換え受容体およびそのような受容体を発現する細胞が提供される。いくつかの態様において、改変受容体または組換え受容体には、キメラ受容体、例えばリガンド結合ドメインまたはその結合性フラグメントを含有するもの、例えば機能的非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）が包含され、T細胞受容体（TCR）およびその構成成分も包含される。CARなどのキメラ受容体は、一般に、1つまたは複数の細胞内シグナリング構成成分に（いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して）連結された、細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。いくつかの態様において、そのような分子は、典型的には、TRAF-6媒介シグナリングなどのTRAFシグナリングを媒介する共刺激受容体によるシグナルと共同して、天然の抗原受容体によるシグナルを模倣しまたは近似する。
【００７７】
特定の態様において、キメラ受容体などの組換え受容体は、i）シグナリングに関与するTRAFメディエーターの活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF媒介シグナリングを誘導する能力を有する、TRAF誘導ドメイン、ii）膜貫通ドメイン、および任意で、（ii）活性化細胞質シグナリングドメイン、例えばT細胞における一次活性化シグナルを誘導する能力を有する活性化細胞質ドメイン、例えばT細胞受容体（TCR）構成成分の細胞質シグナリングドメイン（例えばCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分）、および/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含むものを含有する。いくつかの態様において、TRAF誘導ドメインは、TRAF誘導ドメインを含有する分子またはTRAF誘導ドメインを含有する分子を動員する分子に結合する能力を有する。
【００７８】
いくつかの態様において、TRAF誘導ドメインは、シグナリングに関与するTRAF-6メディエーターの活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、例えばTRAF-6誘導ドメインを含有する分子および/またはTRAF-6誘導ドメインを含有する分子を動員する分子に結合する能力を有する、TRAF-6誘導ドメインである。いくつかの態様において、組換え受容体（例えばキメラ受容体）中のTRAF-6誘導ドメインは、下流シグナリングの1つまたは複数のメディエーターを直接的または間接的に活性化する能力を有する。
【００７９】
いくつかの態様において、キメラ受容体は、リガンド（例えば抗原）抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを含有する。いくつかの態様において、キメラ受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有するCARである。いくつかの態様において、抗原などのリガンドは、細胞の表面に発現するタンパク質である。いくつかの態様において、CARはTCR様CARであり、抗原は、TCRのように、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子との関連において細胞表面上で認識される、プロセシングされたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原である。
【００８０】
CARおよび組換えTCRを含む例示的組換え受容体、およびそれらの受容体を改変し、細胞中に導入するための方法には、例えば国際特許出願公開番号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開番号US2002131960、US2013287748、US20130149337、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、ならびに欧州特許出願番号EP2537416に記載されているもの、および/またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3（4）:388-398、Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338、Turtle et al., Curr. Opin. Immunol, 2012 October; 24（5）:633-39、Wu et al., Cancer, 2012 March 18（2）:160-75に記載されているものがある。いくつかの態様において、遺伝子改変抗原受容体には、米国特許第7,446,190号に記載のCARおよび国際特許出願公開番号WO/2014055668A1に記載されているものが包含される。いくつかの態様では、構築および免疫細胞への導入または移入のための類似する方法を、ここに提供されるキメラ受容体に使用することができる。
【００８１】
A.リガンド結合ドメイン
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）などの組換え受容体は、抗原（またはリガンド）に結合する（例えば特異的に結合する）リガンド結合ドメインを含む。キメラ受容体が標的とする抗原には、養子細胞治療の標的となる疾患、状態、または細胞タイプとの関連において発現されるものが含まれる。疾患および状態には、増殖性、新生物性、および悪性の疾患および障害、例えばがんおよび腫瘍、例えば血液がん、免疫系のがん、例えばリンパ腫、白血病、および/または骨髄腫、例えばB、T、および骨髄性白血病、リンパ腫、ならびに多発性骨髄腫が含まれる。
【００８２】
いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）はポリペプチドである。いくつかの態様において、それは糖質または他の分子である。いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は、正常細胞もしくは正常組織または非標的細胞もしくは非標的細胞と比較して、疾患または状態の細胞上に、例えば腫瘍細胞上または病原細胞上に、選択的に発現し、または過剰発現する。別の態様では、抗原が正常細胞上に発現し、かつ/または改変細胞上に発現する。
【００８３】
いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は腫瘍抗原またはがんマーカーである。いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、もしくは4、erbB二量体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受容体a2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、およびユニバーサルタグと関連する抗原、がん-精巣抗原、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、および/またはビオチン化分子、および/または病原体特異的抗原、例えばHIV、HCV、HBVまたは他の病原体が発現する分子であるか、それらを含む。
【００８４】
いくつかの態様において、抗原は病原体特異的抗原である。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原（例えばHIV、HCV、HBVなどからのウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。
【００８５】
1.抗原受容体
いくつかの態様において、キメラ受容体はCARを包含する。いくつかの態様では、特定抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば養子治療の標的となるべき特定細胞タイプにおいて発現する抗原、例えばがんマーカー、および/または抑制応答（dampening response）を誘導するための抗原、例えば正常細胞タイプまたは非疾患細胞タイプ上に発現する抗原に対する特異性を持つCARが構築される。したがって、CARは、典型的には、その細胞外部分に、1つまたは複数の抗原結合分子、例えば1つもしくは複数の抗原結合性フラグメント、抗原結合ドメイン、もしくは抗原結合部分、または1つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様において、CARは、1つまたは複数の、ある抗体分子の抗原結合部分、例えばモノクローナル抗体（mAb）の可変重（VH）鎖および可変軽（VL）鎖から誘導される一本鎖抗体フラグメント（scFv）を含む。
【００８６】
用語「抗体」は、本明細書では、最も広義に使用され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含し、インタクト抗体および抗原に特異的に結合する能力を有する機能的（抗原結合性）抗体フラグメント、例えばFab（fragment antigen binding）フラグメント、F（ab'）2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、組換えIgG（rIgG）フラグメント、可変重鎖（VH）領域、一本鎖抗体フラグメント、例えば一本鎖可変フラグメント（scFv）、および単一ドメイン抗体（例えばsdAb、sdFv、ナノボディ）フラグメントを含む。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子改変型および/または他の修飾型、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性（例えば二重特異性）抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデム・ジ-scFv、タンデム・トリ-scFvを包含する。別段の言明がある場合を除き、用語「抗体」は、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語は、インタクト抗体、すなわち完全長抗体も包含し、任意のクラスまたはサブクラスの抗体、例えばIgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、ならびにIgDを含む。
【００８７】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質、抗体およびその抗原結合性フラグメントは、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖は完全長であるか、または抗原結合部分（Fab、F（ab'）2、Fvまたは一本鎖Fvフラグメント（scFv））であることができる。別の態様において、抗体重鎖定常領域は、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選ばれ、具体的には例えばIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4から選ばれ、より具体的には、IgG1（例えばヒトIgG1）である。別の一態様において、抗体軽鎖定常領域は例えばカッパまたはラムダから選ばれ、具体的にはカッパである。
【００８８】
ここに提供される抗体には、抗体フラグメントが含まれる。「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体ではない分子であって、インタクトな抗体のうち、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2;ダイアボディ;線状抗体;可変重鎖（VH）領域、一本鎖抗体分子、例えばscFvおよび単一ドメインVH抗体;ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメント、例えばscFvである。
【００８９】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体重鎖または抗体軽鎖のうち、抗原への抗体の結合に関与するドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つのCDRとを含んでいる（例えばKindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91（2007）を参照されたい）。抗原結合特性を付与するには単一のVHドメインまたはVLドメインで十分でありうる。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのVHドメインまたはVLドメインを使って、それぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより、単離することができる。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887（1993）; Clarkson et al., Nature 352:624-628（1991）を参照されたい。
【００９０】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。一定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、CARは、抗原、例えば腫瘍細胞またはがん細胞などの標的となるべき細胞または疾患のがんマーカーまたは細胞表面抗原、例えば本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のターゲット抗原のいずれかに、特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。
【００９１】
抗体フラグメントは、例えば限定するわけではないが、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化および組換え宿主細胞による生産などといった、さまざまな技法によって製造することができる。いくつかの態様において、抗体は組換え生産されたフラグメント、例えば自然には見いだされない編成を含むフラグメント、例えば2つ以上の抗体領域または抗体鎖が合成リンカー（例えばペプチドリンカー）で連結されているもの、および/または天然のインタクトな抗体の酵素消化では生産され得ないものである。いくつかの態様において、抗体フラグメントはscFvである。
【００９２】
「ヒト化」抗体は、CDRアミノ酸残基のすべてまたは実質上すべてが非ヒトCDRに由来し、FRアミノ酸残基のすべてまたは実質上すべてがヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、典型的には、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティーを保ちつつヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化を受けた、非ヒト抗体の変異体を指す。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基が、例えば抗体の特異性またはアフィニティーを回復または改良するために、非ヒト抗体（例えばCDR残基の由来源である抗体）の対応残基で置換される。
【００９３】
いくつかの態様において、CARは、細胞の表面に発現する抗原、例えばインタクト抗原を、特異的に認識する抗体または抗原結合性フラグメント（例えばscFv）を含有する。
【００９４】
いくつかの態様において、CARは、TCR様の抗体、例えばMHC-ペプチド複合体として細胞表面上に提示される細胞内抗原（例えば腫瘍関連抗原）を特異的に認識する抗体または抗原結合性フラグメント（例えばscFv）を含有する。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の一部として、細胞上に発現させることができる。抗原受容体には、キメラ抗原受容体（CAR）などの機能的非TCR抗原受容体が含まれる。一般に、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様の特異性を呈する抗体または抗原結合性フラグメントを含有するCARを、TCR様CARということもできる。
【００９５】
「主要組織適合遺伝子複合体」（MHC）とは、多形のペプチド結合部位またはペプチド結合溝であって、いくつかの例では、細胞機構によってプロセシングされたペプチド抗原などといったポリペプチドのペプチド抗原と複合体を形成することができるものを含有するタンパク質、一般的には糖タンパク質を指す。場合により、MHC分子は、T細胞上の抗原受容体、例えばTCRまたはTCR様抗体によって認識されうるコンフォメーションで抗原を提示するために、例えばペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体として、細胞表面上に提示され、または発現されうる。一般に、MHCクラスI分子は、膜を貫通するα鎖、場合によっては3つのαドメインと、非共有結合的に会合したβ2ミクログロブリンとを有するヘテロ二量体である。一般に、MHCクラスII分子は、典型的にはどちらも膜を貫通している、2つの膜貫通糖タンパク質αおよびβとから構成される。MHC分子は、ペプチドを結合するための1つまたは複数の抗原結合部位と、適当な抗原受容体による認識に必要な配列とを含有する、MHCの有効部分を含みうる。いくつかの態様において、MHCクラスI分子は、サイトゾル中で生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでMHC-ペプチド複合体はT細胞によって、例えば一般的にはCD8＋ T細胞によって、ただし場合によってはCD4＋ T細胞によって、認識される。いくつかの態様において、MHCクラスII分子は、小胞系中で生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでそれらは、典型的にはCD4＋ T細胞によって認識される。一般に、MHC分子は、一群の連鎖した遺伝子座によってコードされており、それらはマウスではH-2、ヒトではヒト白血球抗原（HLA）と、総称されている。したがって、通例、ヒトMHCをヒト白血球抗原（HLA）と呼ぶこともできる。
【００９６】
用語「MHC-ペプチド複合体」または「ペプチド-MHC複合体」またはそれらの変形は、ペプチド抗原とMHC分子との複合体または会合物、例えば一般的には、MHC分子の結合溝または結合クレフトにおけるペプチドの非共有結合的相互作用によるものを指す。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面に存在し、または提示される。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、TCR、TCR様CARまたはそれらの抗原結合部分などの抗原受容体によって、特異的に認識されうる。
【００９７】
いくつかの態様において、ポリペプチドのペプチド、例えばペプチド抗原またはペプチドエピトープは、例えば抗原受容体による認識のために、MHC分子と会合することができる。一般にペプチドは、より長い生物学的分子、例えばポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントに由来しまたは基づく。いくつかの態様において、ペプチドは典型的には約8〜約24アミノ酸長である。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のために、9〜22アミノ酸または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のために、8〜13アミノ酸または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、MHC分子との関連においてペプチドが認識されると、例えばMHC-ペプチド複合体が認識されると、TCRまたはTCR様CARなどの抗原受容体は、T細胞応答、例えばT細胞増殖、サイトカイン生産、細胞傷害性T細胞応答または他の応答を誘導する、T細胞への活性化シグナルを生成し、またはトリガーする。
【００９８】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特異的MHC-ペプチド複合体を含有する免疫原の有効量で宿主を免疫することによって生産することができる。場合により、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、MHCに結合する能力を有する抗原、例えば腫瘍抗原、例えばユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原または後述する他の抗原のエピトープである。いくつかの態様では、次に、免疫応答を引き出すために有効量の免疫原が宿主に投与され、ここでは、免疫原が、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元的提示に対する免疫応答を引き出すのに十分な期間にわたって、その三次元形状を保つ。次に、宿主から収集された血清をアッセイして、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元的提示を認識する所望の抗体が生産されているかどうかを決定する。いくつかの態様において、抗体が、MHC-ペプチド複合体を、MHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと無関係なペプチドとの複合体と、区別できることを確認するために、生産された抗体を評価することができる。次に、所望の抗体を単離することができる。
【００９９】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、ファージ抗体ライブラリーなどの抗体ライブラリーディスプレイ法を使って生産することができる。いくつかの態様では、例えばライブラリーのメンバーが、1つまたは複数のCDRの1つまたは複数の残基において、突然変異を起こしている、突然変異型のFab、scFVまたは他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーを作製することができる。そのような方法の典型例は、当技術分野において公知である（例えば米国特許出願公開番号US20020150914、US2014/0294841、およびCohen CJ. et al.（2003）J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい）。
【０１００】
2.TCR
いくつかの態様において、組換え受容体は、組換えT細胞受容体（TCR）および/または天然T細胞からクローニングされたTCRを含む。
【０１０１】
いくつかの態様において、T細胞受容体（TCR）は、可変α鎖および可変β鎖（それぞれTCRαおよびTCRβとも呼ばれている）もしくは可変γ鎖および可変δ鎖（それぞれTCRγおよびTCRδとも呼ばれている）またはそれらの機能的フラグメントを含有していて、分子が、MHC受容体に結合している抗原ペプチドに特異的に結合する能力を有するようになっている。いくつかの態様において、TCRはαβ型である。典型的には、αβ形およびγδ型で存在するTCRは、一般に構造上は類似しているが、それらを発現するT細胞は、別々の解剖学的位置または機能を有しうる。TCRは、細胞の表面に見いだされるか、または可溶型で見いだされうる。一般にTCRは、T細胞（すなわちTリンパ球）の表面上に見いだされ、そこで、一般的には、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識を担っている。いくつかの態様において、TCRは、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または短い細胞質テールも含有しうる（例えばJaneway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p.4:33, 1997参照）。例えば、いくつかの態様において、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端の短い細胞質テールを有しうる。いくつかの態様において、TCRは、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体の不変（invariant）タンパク質と会合する。
【０１０２】
別段の言明がある場合を除き、用語「TCR」は、その機能的TCRフラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語は、インタクトTCR、すなわち完全長TCRも包含し、αβ型のTCRまたはγδ型のTCRを含む。したがって本明細書において、TCRへの言及は、任意のTCRまたは機能的フラグメント、例えばMHC分子中に結合している特異的抗原ペプチド（すなわちMHC-ペプチド複合体）に結合するTCRの抗原結合部分を包含する。TCRの「抗原結合部分」または「抗原結合性フラグメント」は、相互可換的に使用することができ、TCRの構造ドメインの一部分を含有するが、完全なTCRが結合する抗原（例えばMHC-ペプチド複合体）に結合する分子を指す。場合により、抗原結合部分は、特異的MHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分な、例えば一般に各鎖が3つの相補性決定領域を含有する、TCRの可変ドメイン、例えばTCRの可変α鎖および可変β鎖を含有する。
【０１０３】
いくつかの態様において、TCR鎖の可変ドメインは会合して、ループ、または免疫グロブリンに似た相補性決定領域（CDR）を形成し、それが抗原認識を付与し、TCR分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性を決定し、ペプチド特異性を決定する。通例、CDRは、免疫グロブリンのように、フレームワーク領域（FR）によって隔てられている（例えばJores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990、Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照されたい。また、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照されたい）。いくつかの態様では、CDR3が、プロセシングされた抗原の認識を担う主要CDRであるが、アルファ鎖のCDR1も抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することが示されており、一方、ベータ鎖のCDR1はペプチドのC末端と相互作用する。CDR2はMHC分子を認識すると考えられる。いくつかの態様において、β鎖の可変領域はさらなる超可変（HV4）領域を含有しうる。
【０１０４】
いくつかの態様において、TCR鎖は定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンのように、TCR鎖（例えばα鎖、β鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリンドメイン、すなわちN末端の可変ドメイン（例えばVαまたはVβ、Kabatナンバリング（Kabat et al.,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」米国保険福祉省公衆衛生局国立衛生研究所、1991、第5版）に基づいて、典型的にはアミノ酸1〜116）と、細胞膜に隣接する1つの定常ドメイン（例えばα鎖定常ドメイン、すなわちCα、Kabatに基づいて典型的にはアミノ酸117〜259、β鎖定常ドメイン、すなわちCβ、Kabatに基づいて典型的にはアミノ酸117〜295）とを、含有しうる。例えばいくつかの例において、これら2つの鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインと、CDRを含有する2つの膜遠位可変ドメインとを含有する。TCRドメインの定常ドメインは短い接続配列を含有し、そこではシステイン残基がジスルフィド結合を形成することで、2つの鎖を連結している。いくつかの態様では、TCRが定常ドメイン中に2つのジスルフィド結合を含有するように、TCRはα鎖およびβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有しうる。
【０１０５】
いくつかの態様において、TCR鎖は膜貫通ドメインを含有することができる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは正に荷電している。場合により、TCR鎖は細胞質テールを含有する。場合により、この構造は、TCRがCD3のような他の分子と会合することを可能にする。例えば、定常ドメインを膜貫通領域と共に含有するTCRは、そのタンパク質を細胞膜に固定して、CD3シグナリング装置またはCD3複合体の不変（invariant）サブユニットと会合することができる。
【０１０６】
一般に、CD3は、哺乳動物では3つの別々の鎖（γ、δおよびε）ならびにζ鎖を有しうる多タンパク質複合体である。例えば哺乳動物では、この複合体は、CD3γ鎖、CD3δ鎖、2つのCD3ε鎖、およびCD3ζ鎖のホモ二量体を含有することができる。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの近縁細胞表面タンパク質である。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、それが、これらの鎖が正に荷電したT細胞受容体鎖と会合することを可能にしている特徴である。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖の細胞内テールは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちITAMとして公知である保存されたモチーフを、それぞれ1つずつ含有しており、一方、各CD3ζ鎖はそれを3つ持っている。一般に、ITAMは、TCR複合体のシグナリング能力に関与する。これらの補助分子は、負に荷電した膜貫通領域を有し、TCRから細胞内へのシグナルの伝播において役割を果たす。CD3鎖およびζ鎖は、TCRと共に全体として、T細胞受容体複合体として知られているものを形成する。
【０１０７】
いくつかの態様において、TCRは、2つの鎖αおよびβ（または任意でγおよびδ）のヘテロ二量体であるか、一本鎖TCRコンストラクトであることができる。いくつかの態様において、TCRは、1つまたは複数のジスルフィド結合などによって連結された、2本の別個の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。
【０１０８】
いくつかの態様では、ターゲット抗原（例えばがん抗原）に対するTCRが同定され、細胞中に導入される。いくつかの態様において、TCRをコードする核酸は、さまざまな供給源から、例えば公に利用できるTCR DNA配列のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅などによって、得ることができる。いくつかの態様では、TCRが、生物学的供給源から、例えば細胞から、例えばT細胞（例えば細胞傷害性T細胞）、T細胞ハイブリドーマ、または他の公に利用できる供給源などから得られる。いくつかの態様において、T細胞はインビボ単離細胞から得ることができる。いくつかの態様では、高アフィニティーT細胞クローンなどのT細胞クローンを患者から単離し、TCRを単離することができる。いくつかの態様において、T細胞は、培養T細胞ハイブリドーマまたは培養T細胞クローンであることができる。いくつかの態様では、ターゲット抗原に対するTCRクローンが、ヒト免疫系遺伝子（例えばヒト白血球抗原系、すなわちHLA）で改変されたトランスジェニックマウス中で作製されている。例えば腫瘍抗原（例えばParkhurst et al.（2009）Clin Cancer Res. 15:169-180およびCohen et al.（2005）J Immunol. 175:5799-5808を参照されたい）を参照されたい。いくつかの態様では、ターゲット抗原に対するTCRを単離するためにファージディスプレイが使用される（例えばVarela-Rohena et al.（2008）Nat Med. 14:1390-1395およびLi（2005）Nat Biotechnol. 23:349-354を参照されたい）。いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分を、TCRの配列に関する知識から、合成的に作製することができる。
【０１０９】
いくつかの態様では、T細胞クローンを得た後に、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖を単離し、遺伝子発現ベクター中にクローニングする。いくつかの態様では、TCRアルファ遺伝子およびTCRベータ遺伝子を、両鎖が共発現するように、ピコルナウイルス2Aリボソームスキップペプチドを介して連結する。いくつかの態様では、TCRの遺伝子移入が、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターによって、またはトランスポゾンによって達成される（例えばBaum et al.（2006）Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063、Frecha et al.（2010）Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757、Hackett et al.（2010）Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683を参照されたい）。
【０１１０】
B.細胞内シグナリングドメイン
いくつかの態様において、抗原特異的結合構成成分または抗原特異的認識構成成分などのリガンド結合ドメインは、1つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナリングドメインに連結される。したがっていくつかの態様において、抗原認識ドメインなどのリガンド結合ドメインは、1つまたは複数の細胞シグナリングモジュールに連結される。抗原認識ドメインなどのリガンド結合ドメインは、一般に、1つまたは複数の細胞内シグナリング構成成分を含む細胞内ドメインに、例えばTRAF-6シグナリングを誘導しかつ/またはTRAF-6を結合もしくは動員する能力を有する（すなわちTRAF-6誘導ドメインであるか、TRAF-6誘導ドメインを含有する）シグナリング構成成分と、TCR複合体などの抗原受容体複合体による活性化および/または他の細胞表面受容体を介したシグナルを行う能力を有する、またはそのようなシグナルを模倣することができる、活性化シグナリングドメインとを含む細胞内ドメインに、連結される。場合により、TRAF-6誘導ドメインは、TRAF-6結合コンセンサス配列（例えばSEQ ID NO:26に示すもの）を含有しかつ/または抗原（例えばリガンド）結合時または抗原（例えばリガンド）結合後にTRAF-6を他の形で動員および/もしくは活性化することができる共刺激分子に由来する、細胞質シグナリングドメインであることができる。
【０１１１】
T細胞活性化は、いくつかの局面において、2種類の細胞質シグナリング配列、すなわち、TCRによる抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナリング配列）と、抗原非依存的に二次シグナルまたは共刺激シグナルを与えるように作用するもの（二次細胞質シグナリング配列）とによって媒介されると記述されている。いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）は、そのようなシグナリング構成成分の一方または両方を含み、キメラ受容体（例えばCAR）にTRAF-6および他の関連シグナリング分子に結合しかつ/またはそれらを動員する能力を有するTRAF-6誘導ドメインを含めることによって、二次シグナルの少なくとも一部が、TRAF-6媒介経路によって媒介される。いくつかの態様では、キメラ受容体のシグナリング構成成分の一部として、さらなる共刺激シグナルも含めることができ、これには、いくつかの例では、PI3K/Aktシグナリング経路などの異なるシグナリング経路からのシグナリングを誘導する共刺激シグナルを含めることができる。
【０１１２】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインの活性化シグナリングドメインには、天然の抗原受容体によるシグナル、共刺激受容体と組み合わされたそのような受容体によるシグナル、および/または共刺激受容体単独によるシグナルを、模倣しまたは近似するものが含まれる。いくつかの態様において、受容体は、TCR複合体の細胞内構成成分、例えばT細胞の活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、例えばCD3ゼータ鎖を含む。いくつかの態様において、活性化シグナリングドメインは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナリングドメイン、および/または他のCDの膜貫通ドメインであるか、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナリングドメイン、および/または他のCDの膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えばCARは、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16などといった、1つまたは複数の追加分子の一部分をさらに含む。例えば、いくつかの態様において、CARは、CD3-ゼータ（CD3-ζ）またはFc受容体γとCD8、CD4、CD25またはCD16との間のキメラ分子を含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）のライゲーションが起こると、キメラ受容体（例えばCAR）の細胞質ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞、例えばキメラ受容体（例えばCAR）を発現するように改変されたT細胞の、正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、いくつかの状況において、CARは、細胞溶解活性またはTヘルパー活性などのT細胞の機能、例えばサイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様において、1つまたは複数の細胞内シグナリングドメインは、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列を含み、いくつかの局面では、自然の状況下で、抗原受容体エンゲージメントに続いて、そのような受容体と協調してシグナル伝達を開始するように作用する補助受容体および/またはそのような分子の任意の誘導体もしくは変異体の細胞質配列、および/または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。
【０１１４】
いくつかの態様において、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナリング配列を含む。刺激的に作用する一次細胞質シグナリング配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちITAMとして公知の、シグナリングモチーフを含有しうる。ITAM含有一次細胞質シグナリング配列の例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD8、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが挙げられる。いくつかの態様において、CAR中の細胞質シグナリング分子は、CD3ゼータに由来する細胞質シグナリングドメイン、その一部分、または配列を含有する。
【０１１５】
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の細胞内ドメインは、ヒトCD3ゼータ活性化シグナリングドメインまたはその機能的変異体、例えばヒトCD3ζ（アクセッション番号P20963.2）のアイソフォーム3の112AA細胞質ドメイン、または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載のCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、細胞内ドメインは、SEQ ID NO:21〜23（SEQ ID NO:41に示す配列によってコードされるもの）のいずれかに示すアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:21〜23のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む、活性化シグナリングドメインを含む。
【０１１６】
天然TCRの場合、完全な活性化は、一般に、TCRによるシグナリングだけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの態様では、完全な活性化を促進するために、CARなどのキメラ受容体には、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するためのTRAF-6誘導シグナリングドメインも含める。別の態様において、活性化シグナリングドメインを含有するCARなどのキメラ受容体は、共刺激シグナルを生成させるための構成成分を含まず、その場合は、TRAF-6誘導シグナリングドメインを、例えば同じ細胞中で発現させる追加CARなどといった、第2のキメラ受容体上に用意することができる。
【０１１７】
いくつかの態様において、CARなどのキメラ受容体は、共刺激TRAF-6誘導シグナリング分子に由来するシグナリングドメインまたはその機能的部分もしくは機能的変異体を含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーまたはIL-1/Tollスーパーファミリーのメンバーであることができる。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子は、CD40、RANK、IL1R-1、BAFF-R、BCMA、TACI、OX40、Troy、XEDAR、またはFn14の細胞質配列の全部または一部に由来するか、CD40、RANK、IL1R-1、BAFF-R、BCMA、TACI、OX40、Troy、XEDAR、またはFn14の細胞質配列の全部または一部を含有することができる。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子は、CD40、RANKまたはIL1R-1由来の細胞質ドメインであるか、CD40、RANKまたはIL1R-1由来の細胞質ドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子は、TRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有するが、CD40またはOX40の全細胞質配列を含有するわけではなく、例えば他のTRAFを介したシグナリングを誘導する能力を有する細胞質配列を含有せず、かつ/またはTRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、またはTRAF-5を介したシグナリングを誘導する能力を有する1つまたは複数のドメインを含有しない。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、CD40またはOX40の細胞質ドメインではなく、またはCD40もしくはOX40の細胞質ドメインを含有しない。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインはCD40由来の細胞質ドメインであるか、CD40由来の細胞質ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激TRAF-6誘導シグナリング分子はアポトーシス促進性でない。
【０１１８】
任意のそのような態様の一部において、TRAF-6誘導シグナリングドメインはヒトのTRAF-6誘導シグナリングドメインであるか、ヒトCD40、RANK、IL1R-1、BAFF-R、BCMA、TACI、OX40、Troy、XEDAR、またはFn14などのヒトタンパク質の細胞質配列に由来する。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリングドメインは、ヒトCD40細胞質シグナリングドメインに由来する。
【０１１９】
いくつかの態様において、例示的キメラ受容体（例えばCAR）のリガンド結合ドメイン、リガンド結合ドメインは、CD40、RANK、IL1R-1、BAFF-R、BCMA、TACI、OX40、Troy、XEDAR、またはFn14に由来しない。
【０１２０】
いくつかの態様において、組換え受容体（例えばCAR）の細胞内ドメインは、ヒトCD40の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分を含む。例えば細胞内ドメインは、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:34に示す配列によってコードされるもの）またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む細胞質シグナリングドメインを含むことができる。
【０１２１】
いくつかの態様において、組換え受容体（例えばCAR）の細胞内ドメインは、ヒトRANKの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分を含む。例えば細胞内ドメインは、SEQ ID NO:14に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:14に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む細胞質シグナリングドメインを含むことができる。
【０１２２】
いくつかの態様において、組換え受容体（例えばCAR）の細胞内ドメインは、ヒトIL1R-1の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分を含む。例えば細胞内ドメインは、SEQ ID NO:16に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:16に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む細胞質シグナリングドメインを含むことができる。
【０１２３】
いくつかの態様において、CARなどのキメラ受容体は、補助シグナリングドメインをさらに含有し、かつ/または補助シグナリングドメインを含有する第2キメラ受容体との複合体として協働する。いくつかの態様において、補助シグナリングドメインの存在は、例えばTRAF-6媒介シグナリングを容易にするためにTRAF-6結合ドメインを含有する複合体への1つまたは複数の分子の動員を容易にすることによって、TRAF-6誘導ドメインのTRAF-6誘導活性を増加させることができる。例えば、いくつかの例では、受容体にリガンドが結合したときに、IL1R-1は、IL1R補助タンパク質（IL-1RAcP）との複合体を形成することで、その複合体へのIL-1受容体関連タンパク質（IRAK）の動員を容易にし、IRAKは、TRAF-6に結合して複合体からのシグナリングを媒介するためのTRAF-6結合ドメインを含有する。
【０１２４】
いくつかの態様において、IL1R-1の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分であるか、IL1R-1の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分を含む、TRAF-6誘導ドメインを含有するキメラ受容体は、補助シグナリングドメインも、例えばタンデムに、含有することができる。場合によっては、第1キメラ受容体が、IL1R-1の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分であるTRAF-6誘導ドメイン、あるいはIL1R-1の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分を含むTRAF-6誘導ドメインを含有し、第2キメラ受容体が、補助シグナリングドメインを含有する、第1キメラ受容体と第2キメラ受容体とを、本明細書に記載するように提供することができる。場合によっては、第1キメラ受容体および第2キメラ受容体を同じ細胞中で発現させる。これは、抗原による刺激を受けるか天然の抗原受容体によるシグナルを模倣しまたは近似する刺激を受けたときにTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、多量体型複合体の生成をもたらす。いくつかの態様において、補助シグナリングドメインは、キメラ受容体（例えばCAR）の細胞内ドメインの構成成分である。いくつかの態様において、補助シグナリングドメインは、ヒトIL1R-1AcPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分であるか、ヒトIL1R-1AcPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分を含む。例えば細胞内ドメインは、SEQ ID NO:18に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:18に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む細胞質シグナリングドメインを含むことができる。
【０１２５】
いくつかの態様では、同じCARが、活性化構成成分と共刺激構成成分の両方を含有する細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの態様では、活性化ドメイン（例えばCD3ゼータ）が1つのCAR内に含まれ、一方、共刺激構成成分（例えばCD40、RANK、IL1R-1、またはIL1R-1AcP）は、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。いくつかの態様において、CARは、活性化CARまたは刺激CARと共刺激CARとを含み、それらはどちらも同じ細胞上に発現される（WO2014/055668参照）。
【０１２６】
いくつかの態様において、CARなどのキメラ受容体は、別のさらなる共刺激分子の細胞質シグナリングドメインを、さらに含む。いくつかの態様において、細胞質シグナリングドメインは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、ICOS、またはCD27の細胞質シグナリングドメインであるか、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、ICOS、またはCD27の細胞質シグナリングドメインに由来する。いくつかの態様において、前記さらなる共刺激分子はPI3K/Aktシグナリングを媒介する能力を有する。例えば、いくつかの態様において、前記さらなる細胞質共刺激ドメインは、CD28、4-1BB、またはICOSであるか、CD28、4-1BB、またはICOSに由来する。
【０１２７】
いくつかの態様において、CARなどのキメラ受容体は、CD3（例えば、CD3-ゼータ）活性化シグナリングドメインに連結された、TRAF-6-シグナリングを媒介する共刺激分子の細胞質ドメインに由来するTRAF-6誘導ドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子は、CD40、RANK、IL1R-1、および/またはIL1R-1AcPの細胞質シグナリングドメインに由来する。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子はアポトーシス促進性でない。一定の態様において、CARなどのキメラ受容体は、さらなる共刺激シグナリングドメイン、例えばCD28、4-1BB、OX40、DAP10、ICOS、またはCD27の細胞質シグナリングドメインに由来するものを、さらに含む。
【０１２８】
いくつかの態様において、キメラ受容体、例えばCARは、1つまたは複数の、例えば2つ以上の、共刺激ドメインと、活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインとを、細胞質部分に包含する。例示的CARは、CD3-ゼータ、TRAF-6誘導シグナリング分子（例えばCD40、RANK、IL1R-1、および/またはIL1R-1AcPの細胞質シグナリングドメインに由来するもの）、および任意でCD28、ICOS、または4-1BBに由来する、細胞内構成成分を含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子はアポトーシス促進性でない。
【０１２９】
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の細胞内ドメインは、ヒトCD28の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分、例えばネイティブCD28タンパク質の186〜187番目にLL→GG置換を持つドメインなどを、さらに含む。例えば細胞内ドメインは、SEQ ID NO:8もしくは9に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:8もしくは9に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む細胞質シグナリングドメインを、さらに含むことができる。
【０１３０】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、ICOSの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分、例えばSEQ ID NO:35に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:36に示す配列によってコードされるもの）またはSEQ ID NO:35に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む。
【０１３１】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、4-1BB（例えばアクセッション番号Q07011.1）の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的部分、例えばSEQ ID NO:10に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:10に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を、さらに含む。
【０１３２】
いくつかの態様において、細胞は、阻害性CAR（iCAR、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5（215）（December, 2013）参照）、例えばターゲット抗原以外の抗原を認識するCARを、さらに含む。これにより、ターゲット抗原結合性CARによって送達される活性化シグナルは、例えばオフターゲット効果を低減するために、阻害性CARがそのリガンドに結合することによって、減少または阻害される。
【０１３３】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメイン（例えば抗体）は、1つまたは複数の膜貫通ドメインを介して、細胞内シグナリングドメインに連結される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは細胞外ドメインに融合される。一態様では、受容体（例えばCAR）中のドメインの一つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合が回避されるように選択され、またはアミノ酸置換によって修飾される。
【０１３４】
いくつかの態様では、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば2〜10アミノ酸長のリンカー、例えばグリシンとセリン（例えばグリシン-セリンダブレット）を含有するものが、キメラ受容体の膜貫通ドメインと細胞内シグナリングドメインとの間に存在して、連結を形成している。
【０１３５】
いくつかの態様における膜貫通ドメインは、天然供給源に由来するか、合成供給源に由来する。供給源が天然である場合、前記ドメインは、いくつかの局面において、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来する。膜貫通領域としては、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、RANK、インターロイキン1受容体タイプ1（IL1R-1）、インターロイキン1受容体タイプ1補助タンパク質（IL1R-1AcP）に由来するもの（すなわち、少なくともその膜貫通領域を含むもの）、および/またはそれらの機能的変異体を含有する膜貫通領域、例えば構造的（例えば膜貫通）特性の実質的部分を保っているものが挙げられる。いくつかの態様において、いくつかの態様における膜貫通ドメインは合成物である。いくつかの態様において、合成膜貫通ドメインは、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見いだされるであろう。いくつかの態様において、連結はリンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメインによる。
【０１３６】
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、TRAF-6誘導シグナリング分子由来の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD40、RANK、IL1R-1、またはIL1R-1AcP由来の膜貫通ドメイン、またはその機能的変異体である。
【０１３７】
例えば、いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の膜貫通ドメインは、ヒトCD40（例えばアクセッション番号P25942）の膜貫通ドメインまたはその変異体、例えばSEQ ID NO:11に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:11に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、それを含む。
【０１３８】
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の膜貫通ドメインは、ヒトRANK（例えばアクセッション番号Q9Y6Q6）の膜貫通ドメインまたはその変異体、例えばSEQ ID NO:13に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:13に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、それを含む。
【０１３９】
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の膜貫通ドメインは、ヒトIL1R-1（例えばアクセッション番号P14778）の膜貫通ドメインまたはその変異体、例えばSEQ ID NO:15に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:15に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、それを含む。
【０１４０】
いくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の膜貫通ドメインは、ヒトIL1R-1AcP（例えばアクセッション番号Q9NPH3）の膜貫通ドメインまたはその変異体、例えばSEQ ID NO:17に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:17に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、それを含む。
【０１４１】
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、別の共刺激分子に由来する膜貫通ドメイン、または膜タンパク質としてT細胞の表面に発現することが公知である別の分子に由来する膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD4、CD28、またはCD8、例えばCD8アルファに由来する膜貫通ドメイン、またはその機能的変異体である。
【０１４２】
例えばいくつかの態様において、キメラ受容体（例えばCAR）の膜貫通ドメインは、ヒトCD28（例えばアクセッション番号P10747.1）の膜貫通ドメインまたはその変異体、例えばSEQ ID NO:6に示すアミノ酸の配列またはSEQ ID NO:6に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、それを含み、いくつかの態様において、組換え受容体の膜貫通ドメイン部分は、SEQ ID NO:7に示すアミノ酸の配列またはそれに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくは少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０１４３】
いくつかの態様において、CARなどのキメラ受容体、例えばその抗体部分は、スペーサーをさらに含み、このスペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはその変異体もしくは修飾型の少なくとも一部分、例えばヒンジ領域、例えばIgG4ヒンジ領域、ならびに/またはCH1/CLおよび/もしくはFc領域であるか、それを含むことができる。いくつかの態様において、定常領域の一部分は、抗原認識構成成分などのリガンド結合ドメイン、例えばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として役立つ。スペーサーは、スペーサーが存在しない場合と比較して、抗原結合に続く細胞の応答性を増加させる長さであることができる。いくつかの実施例において、スペーサーは12アミノ酸長または約12アミノ酸長であるか、12アミノ酸長を超えない。例示的スペーサーとして、少なくとも約10〜229アミノ酸、約10〜200アミノ酸、約10〜175アミノ酸、約10〜150アミノ酸、約10〜125アミノ酸、約10〜100アミノ酸、約10〜75アミノ酸、約10〜50アミノ酸、約10〜40アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約10〜20アミノ酸、または約10〜15アミノ酸を有するもの（列挙した範囲のいずれかの端点間の任意の整数を含む）が挙げられる。いくつかの態様において、スペーサー領域は、約12アミノ酸以下、約119アミノ酸以下、または約229アミノ酸以下を有する。例示的スペーサーとして、IgG4ヒンジのみ、CH2ドメインおよびCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジが挙げられる。例示的スペーサーとして、Hudecek et al.（2013）Clin. Cancer Res., 19:3153、国際特許出願公開番号WO2014031687、米国特許第8,822,647号または出願公開番号US2014/0271635に記載されているものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４４】
いくつかの態様において、定常領域または定常部分はヒトIgG、例えばIgG4またはIgG1のものである。いくつかの態様において、スペーサーは配列ESKYGPPCPPCP（SEQ ID NO:1に示す）を有し、SEQ ID NO:2に示す配列によってコードされる。いくつかの態様において、スペーサーはSEQ ID NO:3に示す配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーはSEQ ID NO:4に示す配列を有する。いくつかの態様において、定常領域または定常部分はIgDのものである。いくつかの態様において、スペーサーはSEQ ID NO:5に示す配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:1〜5のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を有する。
【０１４５】
いくつかの態様において、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えばSEQ ID NO:1に示すヒンジのみのスペーサーを含有する。別の態様において、スペーサーは、任意でCH2および/またはCH3ドメインに連結された、Igヒンジ、例えばIgG4由来のヒンジであるか、またはそれを含有する。いくつかの態様において、スペーサーは、CH2ドメインおよびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジ、例えばSEQ ID NO:4に示すものなどである。いくつかの態様において、スペーサーは、CH3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジ、例えばSEQ ID NO:3に示すものである。いくつかの態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または他の柔軟なリンカー、例えば公知の柔軟なリンカーであるか、それを含む。
【０１４６】
いくつかの態様において、CARまたは他の抗原受容体などのキメラ受容体を含むコンストラクトは、受容体を発現させるための細胞の形質導入または改変を確認するために使用することができる細胞表面マーカーなどのマーカー、例えば細胞表面受容体の切断型、例えば切断型EGFR（tEGFR）を、さらに含む。いくつかの態様において、マーカーは、CD34、NGFR、もしくは上皮成長因子受容体（例えばtEGFR）またはそれらの機能的変異体の全部または一部（例えば切断型）を含む。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば切断可能なリンカー配列、例えばT2Aをコードするポリヌクレオチドに、機能的に連結される。例えばマーカー、および任意でリンカー配列は、特許出願公開番号WO2014031687に開示されているもののいずれであることもできる。例えばマーカーは、任意でT2A切断可能リンカー配列などのリンカー配列に連結された、切断型EGFR（tEGFR）であることができる。切断型EGFR（例えばtEGFR）の例示的なポリペプチドは、SEQ ID NO:25もしくは31に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:30に示す配列によってコードされるもの）またはSEQ ID NO:25もしくは31に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む。例示的T2Aリンカー配列は、SEQ ID NO:24もしくは29に示すアミノ酸の配列（SEQ ID NO:40に示す配列によってコードされているもの）またはSEQ ID NO:24もしくは29に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む。
【０１４７】
いくつかの態様において、マーカーは、T細胞上に天然には見いだされない分子、またはT細胞の表面上に天然には見いだされない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその一部分である。
【０１４８】
いくつかの態様において、分子は非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」と認識されないものである。
【０１４９】
いくつかの態様において、マーカーは、治療的機能を果たさず、かつ/またはうまく改変された細胞を選択することなどを目的とする遺伝子工学用のマーカーとして使用される以外の効果を生じない。別の態様において、マーカーは、他の形で何らかの望ましい効果を発揮する1種または複数種の治療分子、例えばインビボで遭遇する細胞にとってのリガンド、例えば養子移入されてリガンドと出会ったときに、細胞の応答を強化しかつ/または弱めるための共刺激分子または免疫チェックポイント分子であってもよい。
【０１５０】
場合によっては、遺伝子改変受容体および/または表面マーカーをコードするヌクレオチドの配列が、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。いくつかの局面において、シグナル配列は、ネイティブ細胞表面分子由来のシグナルペプチドをコードしうる。他の局面において、シグナル配列は、異種シグナルペプチドまたは非ネイティブシグナルペプチド、例えばSEQ ID NO:38または39に示すヌクレオチド配列によってコードされるSEQ ID NO:37に示すGMCSFRアルファ鎖の例示的シグナルペプチドなどをコードしうる。場合により、キメラ抗原受容体（CAR）および/または細胞表面マーカーをコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。限定するわけではないが、シグナルペプチドの典型例として、例えばSEQ ID NO:37に示すGMCSFRアルファ 鎖シグナルペプチドが挙げられる。
【０１５１】
場合によっては、キメラ受容体、例えばCARを、第1、第2、および/または第3世代CARという。いくつかの局面において、第1世代CARは、抗原が結合したときにCD3鎖誘導シグナルを提供するものである。いくつかの局面において、第2世代CARは、そのようなシグナルと共刺激シグナルとを提供するもの、例えばTRAF-6媒介性シグナリングを誘導する能力を有するTRAF-6誘導ドメインである細胞内シグナリングドメイン、例えばCD40、RANK、IL1R-1、またはIL1R-1AcPなどの共刺激受容体からの細胞内シグナリングドメインを含むものである。いくつかの局面において、第3世代CARは、いくつかの局面において、異なる共刺激受容体の共刺激ドメインを複数含むものである。
【０１５２】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載する抗体またはフラグメントを含有する細胞外部分を含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載する抗体またはフラグメントを含有する細胞外部分と、細胞内シグナリングドメインとを含む。いくつかの態様において、抗体またはフラグメントはscFvを含み、細胞内ドメインはITAMを含有する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖のシグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナリングドメインとを連結する膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはTRAF-6誘導シグナリング分子の膜貫通部分を含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD40、RANK、IL1R-1、またはIL1R-1AcPの膜貫通部分を含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ヒトCD4、ヒトCD28またはヒトCD8などのCD4、CD28またはCD8に由来する膜貫通部分を含有する。細胞外ドメインと膜貫通ドメインは直接的または間接的に連結することができる。いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインはスペーサー（例えば本明細書に記載する任意のスペーサー）によって連結される。いくつかの態様において、キメラ受容体は、TRAF-6誘導シグナリング分子に由来する共刺激シグナリングドメインまたはその機能的変異体を含む細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様において、TRAF-6誘導シグナリング分子は、CD40、RANK、IL1R-1、またはIL1R-1AcPの細胞質ドメインに由来する。いくつかの態様において、細胞内ドメインは上述の追加共刺激シグナリングドメインをさらに含有する。
【０１５３】
いくつかの態様において、キメラ受容体、例えばCARは、本明細書に記載のリガンド結合ドメイン、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部分を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン、例えばTRAF-6誘導シグナリング分子の、またはCD4、CD28もしくはCD8由来の、膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメイン由来のTRAF-6誘導シグナリング分子、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナリングドメインは膜貫通ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。
【０１５４】
いくつかの態様において、キメラ受容体、例えばCARは、本明細書に記載のリガンド結合ドメイン、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン（例えばCD40由来の膜貫通ドメイン、またはCD4、CD28もしくはCD8に由来するもの）、CD40由来の細胞質シグナリングドメインであるTRAF-6誘導ドメイン、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。
【０１５５】
キメラ受容体（例えばCAR）の典型例は、本明細書に記載の抗原のいずれかに特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えばscFv）、例えば抗CD19結合ドメイン; Ig由来のスペーサー（例えばSEQ ID NO:1に示すもの、例えばSEQ ID NO:2に示す配列によってコードされるもの）、ヒトCD28由来の膜貫通ドメイン（例えばSEQ ID NO:6に示すもの、例えばSEQ ID NO:46に示す配列によってコードされるもの）; CD40由来の細胞内シグナリングドメイン、例えばヒトCD40由来のもの（例えばSEQ ID NO:12に示すもの、例えばSEQ IN NO:34に示す配列によってコードされるもの）;およびヒトCD3-ゼータ由来のシグナリングドメイン（SEQ ID NO:21、例えばSEQ ID NO:41に示す配列によってコードされるもの）を含むものである。いくつかの態様において、キメラ受容体は、N末端からC末端に向かって順に上述の構成成分を含有する。いくつかの態様において、例示的キメラ受容体（例えばCAR）のリガンド結合ドメイン、リガンド結合ドメインはCD40Lに特異的に結合せず、かつ/またはCD40に由来しない。
【０１５６】
いくつかの態様において、CARは、本明細書に記載のリガンド結合ドメイン、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部分を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン（例えばRANK由来の膜貫通ドメイン、またはCD4、CD28もしくはCD8に由来するもの）、RANK由来の細胞質シグナリングドメインであるTRAF-6誘導ドメイン、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。
【０１５７】
いくつかの態様において、キメラ受容体、例えばCARは、本明細書に記載のリガンド結合ドメイン、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部分を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン（例えばIL1R-1由来の膜貫通ドメイン、またはCD4、CD28もしくはCD8に由来するもの）、IL1R-1由来の細胞質シグナリングドメインであるTRAF-6誘導ドメイン、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、TRAF-6誘導ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。場合により、そのようなキメラ受容体は、IL1R-1Acp補助シグナリングドメインを含有する第2キメラ受容体との複合体を形成することができる第1キメラ受容体である。
【０１５８】
いくつかの態様において、キメラ受容体、例えばCARは、IL1R-1AcP由来の細胞質ドメインである補助シグナリングドメインをさらに含む。いくつかの態様では、IL1R-1Acp由来の細胞質ドメインである補助シグナリングドメインを含有する第2キメラ受容体が提供される。いくつかの態様において、第2キメラ受容体は、本明細書に記載のリガンド結合ドメイン（これは、任意で、第1リガンド結合ドメインと同じであることができる）、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部分を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン（例えばIL1R-1AcP由来の膜貫通ドメイン、またはCD4、CD28もしくはCD8に由来するもの）、IL1R-1AcP由来の細胞質シグナリングドメインである補助シグナリングドメイン、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む。
【０１５９】
いくつかの態様において、本明細書に記載する態様のいずれかによる2つのキメラ受容体、例えばCARは、会合して、機能的ヘテロ二量体などの多量体型複合体を形成することができる。一定の局面において、第1TRAF-6誘導シグナリング分子は、一方のキメラ受容体（例えばCAR）内に含まれ、かつTRAF-6-補助シグナリング分子は、他方のキメラ受容体（例えばCAR）内に含まれ、第1キメラ受容体および第2キメラ受容体はどちらも同じ細胞上に発現して、相互作用することにより、TRAF-6シグナリングを媒介する。いくつかの態様において、TRAF-6依存的シグナリング分子はアポトーシス促進性でない。例えば、いくつかの態様では、会合して、a）本明細書に記載のリガンド結合ドメイン、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部分を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン、IL1R-1由来の細胞質シグナリングドメイン、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む第1キメラ受容体（例えばCAR）と、b）本明細書に記載のリガンド結合ドメイン、例えば抗原認識ドメイン、スペーサー、例えば免疫グロブリン分子の一部分を含有するスペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域、例えばIg-ヒンジ含有スペーサー、膜貫通ドメイン、IL1R-1AcP由来の補助シグナリングドメイン、およびCD3ゼータ活性化シグナリングドメインを含む第2キメラ受容体（例えばCAR）とを含む、機能的ヘテロ二量体を形成する、2つのキメラ受容体（例えばCAR）が提供される。
【０１６０】
いくつかの態様において、キメラ受容体、CARは、追加の共刺激シグナリングドメイン、例えばPI3K誘導シグナリング分子に由来するもの、および/またはCD28、4-1BBもしくはICOS共刺激シグナリング分子に由来するものを、さらに含む。いくつかの態様において、さらなる共刺激シグナリングドメインは、TRAF-6誘導シグナリング分子由来の共刺激シグナリングドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある。
【０１６１】
いくつかの局面において、核酸分子は、本明細書に記載のコンストラクトにおいて使用するために修飾することができる。場合によっては、ベクターにクローニングするための末端制限部位配列を含有するように、配列を設計することができる。場合によっては、コドン最適化によって配列を修飾することができる。コドン最適化は、選択されたコドンのパーセンテージを、過剰になることも律速になることもないように、公表されたヒト転移RNAの存在比と均衡させることを伴う。ほとんどのアミノ酸は2種類以上のコドンでコードされ、コドン使用頻度は生物ごとに異なるので、場合によっては、これが必要になりうる。トランスフェクトされた遺伝子と宿主細胞との間でのコドン使用頻度の相違は、核酸コンストラクトのタンパク質発現および免疫原性に対する影響を有しうる。一般に、コドン最適化のためには、ヒト使用頻度と均衡したコドンが選択されるように、コドンが選ばれる。典型的には、アミノ酸に対するコドンの冗長性は、異なるコドンが1種類のアミノ酸をコードするようなものである。いくつかの態様において、置き換えのためのコドンを選択する際には、コドン変化がアミノ酸配列に影響を及ぼさないように、結果として生じる突然変異がサイレント突然変異であることが望ましいであろう。一般に、コドンの最後のヌクレオチドはアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、不変のままであることができる。
【０１６２】
III.核酸、ベクターおよび改変細胞
遺伝子改変細胞を生産するための方法、核酸、組成物、およびキットが提供される。遺伝子工学は一般に、培養細胞を含有する組成物への、例えばレトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換による、キメラ受容体をコードする核酸の導入を伴う。
【０１６３】
いくつかの態様において、核酸分子は、組換え受容体、例えばキメラ受容体、例えば上述したもののいずれかをコードする。そのような核酸分子を含有するベクターまたはコンストラクトも提供される。いくつかの態様において、ベクターまたはコンストラクトは、受容体をコードするヌクレオチドの発現を駆動するために、受容体をコードするヌクレオチドに機能的に連結された1つまたは複数のプロモーターを含有する。いくつかの態様において、プロモーターは、1つまたは2つ以上の核酸分子に機能的に連結される。
【０１６４】
キメラ受容体によるシグナリングが、ホモ二量体またはヘテロ二量体などといった、別のキメラ受容体との複合体への会合によって促進される一定の例では、各キメラ受容体は同じ核酸分子によってコードされるか、別々の核酸分子によってコードされうる。いくつかの態様において、第1キメラ受容体および第2キメラ受容体は、別々の核酸分子によってコードされ、細胞中で両方のキメラ受容体を発現させるために、それぞれを細胞中に個別に移入または導入することができる。いくつかの態様において、核酸分子は単一ポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、第1キメラ受容体および第2キメラ受容体はどちらも単一ポリヌクレオチド上にコードされる。いくつかの態様において、各キメラ受容体のコーディング配列は、プロモーターに機能的に連結させることができ、そのプロモーターは同じであるか、異なることができる。
【０１６５】
いくつかの態様において、ベクターまたはコンストラクトは、1つまたは複数の核酸分子の発現を駆動する単一のプロモーターを含有することができる。いくつかの態様において、そのようなプロモーターは、多シストロン性（二シストロン性、三シストロン性、例えば米国特許第6,060,273号参照）であることができる。例えばいくつかの態様では、単一のプロモーターからのメッセージによる遺伝子産物（例えば第1キメラ受容体および第2キメラ受容体をコードするもの）の同時発現を可能にするIRES（配列内リボソーム進入部位）を含有する二シストロン性単位として、転写単位を改変することができる。あるいはいくつかの例では、自己切断性ペプチド（例えばT2A）またはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた2つまたは3つの遺伝子（例えば第1キメラ受容体および第2キメラ受容体をコードするもの）を単一のオープンリーディングフレーム（ORF）中に含有するRNAの発現を、単一のプロモーターが指示しうる。したがって前記ORFは単一のポリプロテインをコードし、そのポリプロテインは、翻訳中（T2Aの場合）または翻訳後に、個々のタンパク質に切断される。場合により、T2Aなどのペプチドは、リボソームが、2A要素のC末端において、ペプチド結合の合成をスキップ（リボソームスキッピング）する原因となり、2A配列の最後とその下流にある次のペプチドとの分離をもたらしうる。2A切断ペプチドの例は、リボソームスキッピングを誘導しうるものを含めて、T2A、P2A、E2AおよびF2Aである。2A要素の例示的な配列として、米国特許出願公開第20070116690号に記載の口蹄疫ウイルス（F2A、例えばSEQ ID NO:45）、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A、例えばSEQ ID NO:44）、トーセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（T2A、例えばSEQ ID NO:24または29）、およびブタテッショウウイルス1（P2A、例えばSEQ ID NO:42または43）からの2A配列が挙げられる。
【０１６６】
細胞、例えば本明細書に記載したような、例えば工学的に改変されたキメラ受容体を含有する細胞も提供される。そのような細胞の集団、そのような細胞を含有しかつ/またはそのような細胞が濃縮された組成物、例えばキメラ受容体を発現する細胞が、組成物中の全細胞またはT細胞もしくはCD8＋もしくはCD4＋細胞などの一定タイプの細胞の少なくとも50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセントまたはそれ以上を占めるものも提供される。本組成物には、例えば養子細胞療法のための、薬学的組成物および投与のための製剤が含まれる。また、対象、例えば患者に細胞および組成物を投与するための治療方法も提供される。
【０１６７】
したがって、キメラ受容体を発現する遺伝子改変細胞、例えばCARを含有する細胞も提供する。細胞は一般に、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、典型的にはヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は血液、骨髄、リンパ、またはリンパ器官に由来し、免疫系の細胞、例えば自然免疫または適応免疫の細胞、例えばリンパ球を含む骨髄系細胞またはリンパ系細胞、典型的にはT細胞および/またはNK細胞である。他の例示的細胞として、幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞s（iPSC）を含む複能性幹細胞および多能性幹細胞が挙げられる。細胞は典型的には初代細胞、例えば対象から直接単離されたものおよび/または対象から単離され凍結されたものである。いくつかの態様において、細胞は、T細胞または他の細胞タイプの1つまたは複数のサブセット、例えば全T細胞集団、CD4＋ 細胞、CD8＋ 細胞、およびそれらの亜集団、例えば活性化状態、成熟度、分化能、増殖能、再循環能、局在能、および/または存続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定器官または特定コンパートメントにおける存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイル、および/または分化度によって規定されるものを含む。処置しようとする対象に関して、細胞は同種異系および/または自家である。本方法には既製（off-the-shelf）の方法が含まれる。いくつかの局面において、例えば既製技術に関して、細胞は多能性および/または複能性であり、例えば幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞（iPSC）である。いくつかの態様において、本方法は、対象から細胞を単離し、調製し、処理し、培養し、かつ/または本明細書に記載するようにそれらを工学的に改変し、それらを凍結保存せずに、または凍結保存後に、患者に再導入する工程を含む。
【０１６８】
T細胞ならびに/またはCD4＋および/もしくはCD8＋ T細胞のサブタイプおよび亜集団には、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーT（TSCM）、中枢メモリーT（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）、または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連不変T（MAIT）細胞、天然および適応制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞、およびデルタ/ガンマT細胞がある。
【０１６９】
いくつかの態様において、細胞はナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの態様において、細胞は単球または顆粒球、例えば骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、および/または好塩基球である。
【０１７０】
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子改変によって導入される1つまたは複数の核酸を含み、その結果、そのような核酸の組換え産物または遺伝子改変産物を発現する。いくつかの態様において、核酸は異種、すなわち細胞中または細胞から得られる試料中に通常は存在しないもの、例えば別の生物または細胞から得られるものであって、例えば工学的に改変される細胞および/またはそのような細胞の由来源である生物には通常見いだされないものである。いくつかの態様において、核酸は天然ではなく、例えば自然界には見いだされない核酸、例えば複数の異なる細胞タイプからのさまざまなドメインをコードする核酸のキメラ組み合わせを含むものである。
【０１７１】
A. 工学的改変用の細胞の調製
いくつかの態様において、工学的に改変された細胞の調製は、1つまたは複数の培養および/または調製工程を含む。キメラ受容体、例えばCARを導入するための細胞は、生物学的試料などの試料、例えば対象から得られるものまたは対象に由来するものから単離しうる。いくつかの態様において、細胞の単離源となる対象は、疾患または状態を有する者、または細胞療法の必要がある者、または細胞療法が施行される予定である者である。対象は、いくつかの態様において、特定の治療的介入を必要とするヒト、例えばその治療のために細胞が単離され、処理され、かつ/または工学的に改変されている養子細胞療法を必要とするヒトである。
【０１７２】
したがって細胞は、いくつかの態様において、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料としては、対象から直接採取された組織、体液、および他の試料、ならびに例えば分離、遠心分離、遺伝子改変（例えばウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、および/またはインキュベーションなどといった1つまたは複数の処理工程の結果として得られる試料が挙げられる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接的に得られる試料であるか、処理された試料であることができる。生物学的試料としては、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液試料、組織試料および器官試料（それらに由来する処理済み試料を含む）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１７３】
いくつかの局面において、細胞の由来源または単離源となる試料は、血液または血液由来の試料であるか、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であるか、またはそれに由来する。例示的試料として、全血、末梢血単核球（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、大腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃、もしくは他の器官、および/またはそれらに由来する細胞が挙げられる。細胞療法、例えば養子細胞療法との関連において、試料には、自家供給源および同種異系供給源からの試料が包含される。
【０１７４】
いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。細胞は、いくつかの態様において、異種供給源、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類、またはブタから得られる。
【０１７５】
いくつかの態様において、細胞の単離は、1つまたは複数の調製工程および/または非アフィニティー系細胞分離工程を含む。いくつかの例では、例えば不要な構成成分を除去し、所望の構成成分を濃縮し、特定の試薬に対して感受性である細胞を溶解または除去するために、1つまたは複数の試薬の存在下で、細胞を洗浄し、遠心分離し、かつ/またはインキュベートする。いくつかの例では、細胞が、1つまたは複数の性質、例えば密度、付着性、サイズ、特定の構成成分に対する感受性および/または耐性に基づいて単離される。
【０１７６】
いくつかの例では、対象の循環血からの細胞が、例えばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面において、リンパ球、例えばT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および/または血小板を含有し、いくつかの局面において、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。
【０１７７】
いくつかの態様では、例えば血漿画分を除去したり、後続の処理工程に適した緩衝液または培地に細胞を入れたりするために、対象から収集した血球を洗浄する。いくつかの態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。いくつかの態様では、洗浄溶液がカルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多くのもしくはすべての二価カチオンを欠く。いくつかの局面では、洗浄工程が半自動「フロースルー」遠心分離機（例えばCobe2991細胞処理装置、Baxter）により、製造者の指示に従って達成される。いくつかの局面では、洗浄工程がタンジェンシャルフロー濾過（TFF）により、製造者の指示に従って達成される。いくつかの態様では、洗浄後に、例えばCa＋＋/Mg＋＋非含有PBSなどのさまざまな生物適合性緩衝液に、細胞を再懸濁する。一定の態様では、血球試料の構成成分を取り出し、細胞を培養培地に直接再懸濁する。
【０１７８】
いくつかの態様において、本方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば赤血球の溶解およびPercollまたはFicoll勾配での遠心分離による末梢血からの白血球の調製を含む。
【０１７９】
いくつかの態様において、単離方法は、細胞における1つまたは複数の特異的分子、例えば表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸の発現または存在に基づく、異なる細胞タイプの分離を含む。いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づいて分離するための任意の公知方法を使用しうる。いくつかの態様では、分離がアフィニティーまたはイムノアフィニティーに基づく分離である。例えば単離は、いくつかの局面において、例えば細胞をそのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーと共にインキュベートし、続いて一般に洗浄工程を行い、抗体または結合パートナーに結合した細胞を抗体または結合パートナーに結合しなかった細胞から分離することなどによる、1つまたは複数のマーカー（典型的には細胞表面マーカー）の細胞発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離を含む。
【０１８０】
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞をその後の使用のためにとっておく陽性選択および/または抗体もしくは結合パートナーに結合しなかった細胞をとっておく陰性選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方のフラクションをその後の使用のためにとっておく。いくつかの局面において、不均一な集団中の一細胞タイプを特異的に同定する抗体を利用できず、所望の集団以外の細胞が発現するマーカーに基づいて分離を実行することが最善である場合に、陰性選択は特に役立ちうる。
【０１８１】
分離が、特定マーカーを発現する特定の細胞集団または細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、ある特定タイプの細胞（例えばあるマーカーを発現するもの）の陽性選択または濃縮とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指し、当該マーカーを発現しない細胞が全く存在しない状態をもたらす必要はない。同様に、特定タイプの細胞（例えばあるマーカーを発現するもの）の陰性選択、除去、または枯渇とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指し、すべてのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
【０１８２】
いくつかの例では、分離工程を複数回実行し、1つの工程で陽性選択または陰性選択されたフラクションを別の分離工程（例えば後続の陽性選択または陰性選択）に供する。いくつかの例では、例えば陰性選択のための標的となるマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることなどにより、単一の分離工程で、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、さまざまな細胞タイプ上での発現物と複数の抗体または結合パートナーを共に細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時に陽性選択することもできる。
【０１８３】
例えば、いくつかの局面では、T細胞の特定亜集団、例えば1つまたは複数の表面マーカーが陽性であるか高レベルに発現する細胞、例えばCD28＋、CD62L＋、CCR7＋、CD27＋、CD127＋、CD4＋、CD8＋、CD45RA＋、および/またはCD45RO＋ T細胞が、陽性選択技法または陰性選択技法によって単離される。
【０１８４】
例えば、CD3＋、CD28＋ T細胞は、CD3/CD28コンジュゲート磁気ビーズ（例えばDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を使って、陽性選択することができる。
【０１８５】
いくつかの態様では、陽性選択で特定細胞集団を濃縮することによって、または陰性選択で特定細胞集団を枯渇させることによって、単離が実行される。いくつかの態様において、陽性選択または陰性選択は、それぞれ陽性選択または陰性選択される細胞上に発現しているか（マーカー＋）、比較的高レベルに発現している（マーカーhigh）、1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合作用物質と共に、細胞をインキュベートすることによって達成される。
【０１８６】
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞上に発現するマーカー（例えばCD14）の陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4＋ヘルパーT細胞とCD8+細胞傷害性T細胞とを分離するために、CD4＋またはCD8＋選択工程が使用される。そのようなCD4＋集団およびCD8＋集団はさらに、1つまたは複数のナイーブT細胞亜集団、メモリーT細胞亜集団、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現しているマーカーまたは比較的高度に発現しているマーカーに関する陽性選択または陰性選択によって亜集団に選別することができる。
【０１８７】
いくつかの態様では、CD8＋細胞を、ナイーブ細胞、中枢メモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、および/または中枢メモリー幹細胞について、例えば各亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択などによって、さらに濃縮するか、または枯渇させる。いくつかの態様では、効力を増加させるために、例えば投与後の長期生存、増殖および/または定着を改良するために、中枢メモリーT（TCM）細胞の濃縮が実行される（いくつかの局面において、前記の性質はそのような亜集団では特にロバストである）。Terakuraら（2012）Blood.1:72-82; Wang et al.（2012）J Immunother. 35（9）:689-701参照。いくつかの態様では、TCM濃縮CD8＋ T細胞およびCD4＋ T細胞を組み合わせることによって、効力がさらに強化される。
【０１８８】
諸態様において、メモリーT細胞は、CD8＋末梢血リンパ球のCD62L＋サブセットとCD62L-サブセットの両方に存在する。抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用するなどして、PBMCを、CD62L-CD8＋フラクションおよび/またはCD62L＋CD8＋フラクションについて、濃縮し、または枯渇させることができる。
【０１８９】
中枢メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、いくつかの態様では、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性発現または高表面発現に基づき、いくつかの局面では、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現または高度に発現する細胞の陰性選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞が濃縮されたCD8＋集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって実行される。一局面において、中枢メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択される細胞の陰性フラクションから出発して実行され、それが、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択およびCD62Lに基づく陽性選択に付される。そのような選択は、いくつかの局面では同時に実行され、別の局面では逐次的に、いずれかの順序で実行される。いくつかの局面では、CD8+細胞集団または亜集団の調製に使用したものと同じCD4発現に基づく選択工程を、CD4＋細胞集団または亜集団を作製するためにも使用することで、CD4に基づく分離からの陽性フラクションおよび陰性フラクションの両方をとっておき、任意で1つまたは複数のさらなる陽性選択工程または陰性選択工程後に、本方法の後続の工程において使用する。
【０１９０】
特定の一例では、PBMCの試料または他の白血球試料をCD4＋細胞の選択に付し、陰性フラクションと陽性フラクションの両方をとっておく。次に、陰性フラクションを、CD14およびCD45RAまたはROR1の発現に基づく陰性選択およびCD62LまたはCCR7などの中枢メモリーT細胞に特有のマーカーに基づく陽性選択に供する。この場合、前記陽性選択と陰性選択はいずれかの順序で行われる。
【０１９１】
細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、CD4＋ Tヘルパー細胞を、ナイーブ細胞、中枢メモリー細胞、およびエフェクター細胞に選別する。CD4＋リンパ球は標準的方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4＋ Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA＋、CD62L＋、CD4＋ T細胞である。いくつかの態様において、中枢メモリーCD4＋細胞はCD62L＋かつCD45RO＋である。いくつかの態様において、エフェクターCD4＋細胞はCD62L-かつCD45RO-である。
【０１９２】
一例では、CD4＋細胞を陰性選択によって濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルが、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様では、陽性選択および/または陰性選択のための細胞の分離に備えて、抗体または結合パートナーを磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固形支持体またはマトリックスに結合させる。例えば、いくつかの態様では、免疫磁気（またはアフィニティー磁気）分離技法を使って、細胞および細胞集団が分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S.A. Brooks and U. Schumacher（c）Humana Press Inc., Totowa, NJに概説されている）。
【０１９３】
いくつかの局面では、分離しようとする細胞の試料または組成物を、小さな磁化可能材料または磁気応答材料、常磁性ビーズなどの磁気応答粒子または微粒子（例えばDynalビーズまたはMACSビーズなど）と共にインキュベートする。磁気応答材料、例えば粒子は、一般に、分離することが望まれる（例えば陰性選択または陽性選択することが望まれる）1つまたは複数の細胞または細胞の集団上に存在する分子（例えば表面マーカー）に特異的に結合する結合パートナー（例えば抗体）に、直接的または間接的に取り付けられる。
【０１９４】
いくつかの態様において、磁気粒子または磁気ビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合構成要素に結合した磁気応答材料を含む。磁気分離法において使用される周知の磁気応答材料は数多くある。適切な磁気粒子には、Moldayの米国特許第4,452,773号および欧州特許明細書EP452342Bに記載されているものがあり、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。他の例には、コロイドサイズの粒子、例えばOwenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものがある。
【０１９５】
インキュベーションは一般に、抗体もしくは結合パートナー、またはそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば二次抗体または他の試薬であって、磁気粒子または磁気ビーズに取り付けられているものが、細胞表面分子に（それがもし試料内の細胞上に存在するのであれば）特異的に結合するような条件下で実行される。
【０１９６】
いくつかの局面において、試料を磁場に入れると、磁気応答粒子または磁化可能粒子が取り付けられている細胞は磁石に引きつけられ、非標識細胞から分離されるであろう。陽性選択の場合は、磁石に引きつけられた細胞をとっておき、陰性選択の場合は、磁石に引きつけられなかった細胞（非標識細胞）をとっておく。いくつかの局面では、同じ選択工程中に陽性選択と陰性選択との組み合わせを実施して、陽性フラクションと陰性フラクションとをとっておいて、さらに処理するか、さらなる分離工程に供する。
【０１９７】
一定の態様において、磁気応答粒子は、一次抗体もしくは他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンで被覆される。一定の態様において、磁気粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に取り付けられる。一定の態様では、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーで標識してから、細胞タイプ特異的二次抗体被覆磁気ビーズまたは他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）被覆磁気ビーズを加える。一定の態様では、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズをビオチン化一次または二次抗体と共に使用する。
【０１９８】
いくつかの態様では、磁気応答粒子を細胞に取り付けたままにしておき、その細胞を引き続いてインキュベートし、培養し、かつ/または工学的に改変する。また、いくつかの局面では、患者に投与するために粒子を細胞に取り付けたままにしておく。いくつかの態様では、磁化可能粒子または磁気応答粒子を細胞から取り除く。磁化可能粒子を細胞から取り除くための方法は公知であり、例えば競合非標識抗体の使用、切断可能なリンカーにコンジュゲートされた磁化可能粒子または抗体などがある。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。
【０１９９】
いくつかの態様において、アフィニティーに基づく選択は、磁気活性化細胞選別法（magnetic-activated cell sorting: MACS）（Miltenyi Biotech、カリフォルニア州オーバン）による。磁気活性化細胞選別（MACS）システムでは、磁気粒子が取り付けられている細胞の高純度選択が可能である。一定の態様において、MACSは、外部磁場の適用後に非ターゲット種とターゲット種とが逐次的に溶出するモードで作動する。すなわち、磁化粒子に取り付けられた細胞はその場に保持され、一方、取り付けられていない種は溶出する。次に、この第1溶出工程が完了した後に、磁場に捕らわれて溶出が妨げられていた種が、溶出して回収されうるような何らかの方法で解放される。一定の態様では、非ターゲット細胞を標識して、不均一な細胞集団から枯渇させる。
【０２００】
一定の態様では、単離または分離が、本方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、および/または製剤工程のうちの1つまたは複数を実行するシステム、デバイス、または装置を使って実行される。いくつかの局面では、例えばエラー、ユーザー操作および/または汚染を最小限に抑えるために、システムを使って、閉鎖環境または無菌環境においてこれらの工程のそれぞれを実行する。一例において、システムは、国際特許出願公開番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載のシステムである。
【０２０１】
いくつかの態様では、システムまたは装置が、単離、処理、工学的改変、および製剤化工程のうちの1つまたは複数、例えば全てを、統合型システムまたは自己完結型システムにおいて、かつ/または自動化されたもしくはプログラム可能な形で実行する。いくつかの局面において、システムまたは装置は、システムまたは装置と通信するコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムであって、ユーザーが処理工程、単離工程、工学的改変工程、および製剤化工程のさまざまな局面をプログラムし、制御し、その成果を評価し、かつ/または調節することを可能にするものを含む。
【０２０２】
いくつかの局面において、分離工程および/または他の工程は、例えば閉鎖された無菌系における臨床スケールレベルでの細胞の自動分離のために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotic）を使って実行される。構成部品には、組み込みマイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、およびさまざまなピンチ弁が含まれうる。組み込みコンピュータは、いくつかの局面において、計器のすべての構成部品を制御し、標準化されたシーケンスで反復手順を行うようにシステムに指示する。磁気分離ユニットは、いくつかの局面において、可動永久磁石および選択カラム用の保持具を含む。蠕動ポンプは管系セット全体の流速を制御し、ピンチ弁と共に、システムを通る緩衝液の制御された流れと細胞の絶え間ない懸濁とを保証する。
【０２０３】
CliniMACSシステムは、いくつかの局面において、無菌非発熱性溶液に入れて供給される抗体カップリング磁化可能粒子を使用する。いくつかの態様では、磁気粒子による細胞の標識化後に、細胞を洗浄して過剰の粒子を除去する。次に、細胞調製バッグを管系セットに接続し、そしてその管系セットを緩衝液を含有するバッグおよび細胞収集バッグに接続する。管系セットは組み立て済みの無菌管系（プレカラムおよび分離カラムを含む）からなり、1回限りの使い捨て用である。分離プログラムの開始後に、システムは自動で細胞試料を分離カラムに適用する。標識細胞はカラム内に保持され、一方、非標識細胞は一連の洗浄工程によって除去される。いくつかの態様では、本明細書に記載する方法で使用するための細胞集団が標識されておらず、カラム中に保持されない。いくつかの態様では、本明細書に記載する方法で使用するための細胞集団が標識されており、カラム中に保持される。いくつかの態様では、磁場の除去後に、本明細書に記載する方法で使用するための細胞集団をカラムから溶出させて、細胞収集バッグ内に収集する。
【０２０４】
一定の態様では、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を使って、分離および/または他の工程が実行される。CliniMACS Prodigyシステムは、いくつかの局面において、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニット（cell processing unity）を装備している。CliniMACS Prodigyシステムは、ソース細胞産物（source cell product）の肉眼的層を識別することによって最適な細胞分画終点を決定する内蔵カメラおよび画像認識ソフトウェアも含むことができる。例えば末梢血は、赤血球、白血球および血漿層へと自動的に分離され得る。CliniMACS Prodigyシステムは、例えば細胞の分化および増殖、抗原負荷、および長期細胞培養などの細胞培養プロトコールを遂行する組み込み細胞培養チャンバーも含むことができる。投入口は、培地の無菌的取り出しおよび補充を可能にすることができ、組み込み顕微鏡を使って細胞を監視することができる。例えばKlebanoff et al.（2012）J Immunother. 35（9）:651-660、Terakura et al.（2012）Blood.1:72-82、およびWang et al.（2012）J Immunother. 35（9）:689-701を参照されたい。
【０２０５】
いくつかの態様では、複数種の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流にのせて運ばれるフローサイトメトリーによって本明細書に記載する細胞集団が収集され、濃縮（または枯渇）される。いくつかの態様では、調製用（FACS）選別法によって、本明細書に記載する細胞集団が収集され、濃縮（または枯渇）される。一定の態様では、微小電気機械システム（MEMS）チップをFACSベースの検出システムと併用することによって、本明細書に記載する細胞集団が収集され、濃縮（または枯渇）される（例えばWO 2010/033140、Cho et al.（2010）Lab Chip 10, 1567-1573、およびGodin et al.（2008）J Biophoton. 1（5）:355-376を参照されたい）。どちらの場合も、細胞を複数種のマーカーで標識して、高純度の明確なT細胞サブセットの単離を可能にすることができる。
【０２０６】
いくつかの態様では、陽性選択および/または陰性選択のための分離が容易になるように、抗体または結合パートナーが、1つまたは複数の検出可能マーカーで標識される。例えば分離は蛍光標識抗体への結合に基づきうる。いくつかの例では、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離が、流体流中で、例えば蛍光活性化細胞選別法（FACS）（例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせされた分取用（FACS）および/または微小電気機械システム（MEMS）チップを含む）によって行われる。そのような方法により、複数種のマーカーに基づく陽性選択および陰性選択が同時に可能になる。
【０２０７】
いくつかの態様において、調製方法は、単離、インキュベーション、および/または工学的改変の前または後に、細胞を凍結するための方法、例えば冷凍保存するための方法を含む。いくつかの態様では、凍結とそれに続く融解の工程によって、細胞集団中の顆粒球が除去され、ある程度は単球も除去される。いくつかの態様では、例えば血漿および血小板を除去するための洗浄工程後に、細胞が凍結溶液に懸濁される。さまざまな公知の凍結溶液およびパラメータはどれでも、いくつかの局面において使用しうる。一例では、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBSまたは他の適切な細胞凍結培地が使用される。次に、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるように、これを培地で1:1希釈する。次に細胞を、毎分1°の速度で-80℃まで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存する。
【０２０８】
いくつかの態様において、ここに提供する方法は、培養（cultivation）、インキュベーション、培養（culture）、および/または遺伝子改変工程を含む。例えば、いくつかの態様では、枯渇処理した細胞集団および培養開始組成物をインキュベートしかつ/または工学的に改変する方法が提供される。
【０２０９】
したがって、いくつかの態様では、細胞集団を培養開始組成物中でインキュベートする。インキュベーションおよび/または工学的改変は、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、管系セット、バルブ、バイアル、培養ディッシュ、バッグ、または他の培養物用もしくは細胞培養用容器などの培養槽中で実行しうる。
【０２１０】
いくつかの態様では、遺伝子改変の前に、または遺伝子改変との関連において、細胞をインキュベートし、かつ/または培養する。インキュベーション工程は、培養（culture）、培養（cultivation）、刺激、活性化、および/または増殖を含むことができる。いくつかの態様では、組成物または細胞を、刺激条件または刺激作用物質の存在下でインキュベートする。そのような条件には、集団中の細胞の増殖（proliferation）、増殖（expansion）、活性化、および/または生存を誘発し、抗原ばく露を模倣し、かつ/または遺伝子改変のために（例えば組換え抗原受容体を導入するために）細胞をプライミングするように意図されたものが含まれる。
【０２１１】
条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化することを意図した他の任意の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【０２１２】
いくつかの態様において、刺激条件または刺激作用物質は、TCR複合体の細胞内シグナリングドメインを活性化する能力を有する1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドを含む。いくつかの局面では、作用物質が、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナリングカスケードを作動させる、すなわち開始させる。そのような作用物質は、抗体、例えばTCR構成成分および/または共刺激受容体に特異的なもの、例えば抗CD3、抗CD28（例えばビーズなどの固形支持体に結合したもの）、および/または1つまたは複数のサイトカインを含みうる。任意で、増殖方法は、抗CD3および/または抗CD28抗体を培養培地に（例えば少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）加える工程をさらに含みうる。いくつかの態様において、刺激作用物質は、IL-2および/またはIL-15、例えば少なくとも約10単位/mLの濃度のIL-2を含む。
【０２１３】
いくつかの局面では、インキュベーションが、Riddellらの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al.（2012）J Immunother. 35（9）:651-660、Terakuraら（2012）Blood.1:72-82、および/またはWang et al.（2012）J Immunother. 35（9）:689-701に記載されている技法などの技法に従って実行される。
【０２１４】
いくつかの態様では、培養開始組成物に非分裂末梢血単核球（PBMC）などのフィーダー細胞を（例えば結果として生じる細胞の集団が、増殖される開始集団中の各Tリンパ球につき少なくとも約5、10、20、もしくは40またはそれ以上のPBMCフィーダー細胞を含有するように）加え、その培養物を（例えばT細胞の数を増加させるのに十分な時間にわたって）インキュベートすることによって、T細胞を増殖させる。いくつかの局面において、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ照射PBMCフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの態様では、細胞分裂を防止するために、約3000〜3600ラドの範囲のガンマ線をPBMCに照射する。いくつかの局面では、T細胞の集団を加える前に、フィーダー細胞を培養培地に加える。
【０２１５】
いくつかの態様において、刺激条件には、ヒトTリンパ球の成長に適した温度、例えば少なくとも摂氏約25度、一般的には少なくとも約30度、一般的には摂氏37度または約37度が含まれる。任意で、インキュベーションは、非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダー細胞として加えることをさらに含みうる。LCLは、約6000〜10,000ラドの範囲のガンマ線で照射することができる。LCLフィーダー細胞は、いくつかの局面において、少なくとも約10:1のLCLフィーダー細胞対初期Tリンパ球の比など、任意の適切な量で与えることができる。
【０２１６】
諸態様では、ナイーブTリンパ球または抗原特異的Tリンパ球を抗原で刺激することによって、抗原特異的CD4＋および/またはCD8＋ T細胞などの抗原特異的T細胞を得る。例えば、サイトメガロウイルス抗原に対しては、感染対象からT細胞を単離し、インビトロでその細胞を同じ抗原で刺激することによって、抗原特異的T細胞株または抗原特異的T細胞クローンを作製することができる。
【０２１７】
B. ベクターおよび遺伝子改変の方法
遺伝子改変された構成成分、例えば抗原受容体、例えばCARまたはTCRを導入するためのさまざまな方法が周知であり、ここに提供される方法および組成物と共に使用することができる。例示的方法として、受容体をコードする核酸を移入するための方法、例えばウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはトランスポゾン、例えばスリーピング・ビューティ（Sleeping Beauty）トランスポゾンシステムを介した方法が挙げられる。遺伝子移入の方法としては、形質導入、エレクトロポレーションまたは細胞への遺伝子移入をもたらす他の方法を挙げることができる。
【０２１８】
いくつかの態様において、遺伝子導入は、細胞を、例えばサイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定される増殖、生存、および/または活性化などの応答を誘発する刺激と混合することなどによって、まず細胞を刺激してから、活性化された細胞の形質導入、臨床応用に十分な数への増大培養を行うことによって達成される。
【０２１９】
状況によっては、刺激因子（例えばリンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現は対象にとって毒性でありうる。したがって状況によっては、工学的に改変された細胞は、例えば養子免疫療法において投与された時に、細胞がインビボで陰性選択を受けうるようにする遺伝子セグメントを含む。例えば、いくつかの局面において、細胞は、それらが投与された患者のインビボ条件の変化の結果として排除されうるように、工学的に改変される。陰性選択可能表現型は、投与される作用物質、例えば化合物への感受性を付与する遺伝子の挿入に起因しうる。陰性選択可能遺伝子には、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wigler et al., Cell II :223, 1977）;細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ（Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33（1992））などがある。
【０２２０】
いくつかの態様において、組換え核酸は、例えばシミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）由来のベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使って細胞に導入される。いくつかの態様において、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ-レトロウイルスベクターを使って、T細胞に導入される（例えばKoste et al.（2014）Gene Therapy 2014 Apr 3. doi:10.1038/gt.2014.25; Carlens et al.（2000）Exp Hematol 28（10）:1137-46; Alonso-Camino et al.（2013）Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29（11）:550-557を参照されたい）。
【０２２１】
いくつかの態様において、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）由来のレトロウイルスベクターなど、レトロウイルスベクターは、長末端反復配列（LTR）を有する。大半のレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスには、任意の鳥類細胞または哺乳動物細胞供給源に由来するものが包含される。レトロウイルスは典型的にはアンホトロピックである。つまり、それらは、ヒトを含む複数種の宿主細胞に感染する能力を有する。一態様では、発現させようとする遺伝子でレトロウイルスgag、polおよび/またはenv配列を置き換える。実例となるレトロウイルス系がいくつか記述されている（例えば米国特許第5,219,740号;同第6,207,453号;同第5,219,740号;Miller and Rosman（1989）BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D.（1990）Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al.（1991）Virology 180:849-852; Burns et al.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin（1993）Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109）。
【０２２２】
レンチウイルス形質導入の方法は公知である。例示的方法は、例えばWang et al.（2012）J. Immunother. 35（9）:689-701; Cooper et al.（2003）Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al.（2009）Methods Mol Biol. 506:97-114;およびCavalieri et al.（2003）Blood. 102（2）:497-505に記載されている。
【０２２３】
いくつかの態様において、組換え核酸は、エレクトロポレーションによってT細胞に導入される（例えばChicaybam et al,（2013）PLoS ONE 8（3）:e60298およびVan Tedeloo et al.（2000）Gene Therapy 7（16）:1431-1437）。いくつかの態様において、組換え核酸は、転移（transposition）によってT細胞に導入される（例えばManuri et al.（2010）Hum Gene Ther 21（4）: 427-437; Sharma et al.（2013）Molec Ther Nucl Acids 2, e74; and Huang et al.（2009）Methods Mol Biol 506: 115-126を参照されたい）。免疫細胞における遺伝物質の導入および発現の方法には、他にも、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されているもの）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソームによるトランスフェクション、タングステン粒子によるマイクロパーティクルボンバードメント（Johnston, Nature, 346: 776-777（1990））、およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034（1987））などがある。
【０２２４】
組換え産物をコードする核酸を導入するための他のアプローチおよびベクターは、例えば国際特許出願公開番号WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
【０２２５】
いくつかの態様において、細胞、例えばT細胞には、増大中または増大後に、例えばT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をトランスフェクトすることができる。所望の受容体の遺伝子を導入するためのこのトランスフェクションは、例えば任意の適切なレトロウイルスベクターで実行することができる。次に、その遺伝子修飾細胞集団を、は、初期刺激（例えばCD3/CD28刺激）から解放し、次に第2タイプの刺激（例えば新たに導入された受容体を介した刺激）で刺激することができる。この第2タイプの刺激は、ペプチド/MHC分子の形態にある抗原刺激、遺伝子導入受容体のコグネイト（架橋）リガンド（例えばCARの天然リガンド）または新しい受容体のフレームワーク内に（例えば受容体の定常領域を認識することによって）直接結合する任意のリガンド（抗体など）を含みうる。例えばCheadle et al,「Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy」Methods Mol Biol, 2012; 907:645-66、またはBarrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65:333-347（2014）を参照されたい。
【０２２６】
追加の核酸、例えば導入用遺伝子には、治療の効力を、例えば移植された細胞の生存性および/または機能を促進することなどによって改良するもの、細胞の選択用および/または評価用の遺伝子マーカーを提供するための（例えばインビボでの生存または局在化を評価するための）遺伝子、例えばLupton S.D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6（1991）およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338（1992）に記載されているように細胞をインビボでの陰性選択を受けうるようにすることなどによって、安全性を改良するための遺伝子が含まれる。また、優性陽性選択可能マーカーを陰性選択可能マーカーと融合することによって得られる二官能性選択可能融合遺伝子の使用を記載しているLuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公開公報も参照されたい。例えばRiddellらの米国特許第6,040,177号の第14〜17欄を参照されたい。
【０２２７】
VI.組成物、製剤、および投与方法
また、例えばCD40由来シグナルドメインを含むCARのようなキメラ受容体を含む組成物、および工学的に改変された細胞を含む組成物（薬学的組成物および薬学的製剤を含む）も提供する。抗原が発現する疾患、状態、および障害の処置などにおける、前記組成物の使用方法、または検出、診断、および予後方法も提供する。
【０２２８】
A.組成物/製剤
「薬学的製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態にあって、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほどに毒性な追加の構成成分を含有しない調製物を指す。
【０２２９】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３０】
いくつかの局面において、担体の選択は、一つには、その特定の細胞によって、かつ/または投与の方法によって決まる。したがって適切な製剤はさまざまである。例えば、薬学的組成物は保存剤を含むことができる。適切な保存剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。いくつかの局面では、2つ以上の保存剤の混合物が使用される。保存剤またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約0.0001重量％〜約2重量％の量で存在する。担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.（1980）によって記載されている。薬学的に許容される担体は使用する投薬量および濃度において一般に受容者にとって非毒性であり、これには例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール;メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体（例えばZn-タンパク質複合体）;および/またはポリエチレングリコール（PEG）などのノニオン界面活性剤があるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３１】
いくつかの局面では、緩衝作用物質が組成物に含まれる。適切な緩衝作用物質には、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および他のさまざまな酸および塩がある。いくつかの局面では、2種以上の緩衝作用物質の混合物を使用する。緩衝作用物質またはその混合物は、典型的には組成物全体の約0.001重量％〜約4重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的方法は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.（May 1, 2005）に詳述されている。
【０２３２】
製剤または組成物は、当該細胞で処置されるその特定適応症、疾患、または状態に有用な2種以上の他の活性成分、好ましくは当該細胞に対して相補的な活性を持ち、それぞれの活性が互いに有害な影響を及ぼさないものも含有しうる。そのような活性成分は意図した目的に有効な量で組み合わせされて適切に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な作用物質または薬物、例えば化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどを、さらに含む。
【０２３３】
薬学的組成物は、いくつかの態様において、疾患または状態を処置または防止するのに有効な量で、例えば治療有効量で、または予防有効量で、細胞を含有する。治療効力または予防効力は、いくつかの態様において、処置された対象の周期的評価によって監視される。状態に依存して数日またはそれ以上にわたる繰り返し投与の場合、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで、処置を繰り返す。しかし、他の用量用法が役立つ場合もあり、他の用量用法を決定することができる。望ましい投薬量は、組成物の単回ボーラス投与によって、または組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の持続注入投与によって送達することができる。
【０２３４】
細胞は、標準的な投与技法、製剤、および/またはデバイスを使って投与しうる。組成物の貯蔵および投与のために、シリンジおよびバイアルなどの製剤およびデバイスが提供される。細胞の投与は、自家投与であるか、異種投与であることができる。例えば免疫応答細胞または前駆細胞を対象から得て、それを同じ対象または異なる適合対象に投与することができる。末梢血由来免疫応答細胞またはそれらの子孫（例えばインビボ、エクスビボまたはインビトロ派生物）は、限局的注射（カテーテル投与を含む）、全身注射、限局的注射、静脈内注射、または非経口投与によって投与することができる。治療用組成物（例えば遺伝子修飾免疫応答細胞を含有する薬学的組成物）を投与する場合、治療組成物は一般に注射可能な単位剤形（溶液、懸濁液、エマルション）に製剤化されるであろう。
【０２３５】
製剤には、経口投与用、静脈内投与用、腹腔内投与用、皮下投与用、肺投与用、経皮投与用、筋肉内投与用、鼻腔内投与用、口腔粘膜投与用、舌下投与用、または坐剤投与用のものが含まれる。いくつかの態様において、細胞集団は非経口投与される。本明細書において使用する「非経口」という用語は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、腟投与、および腹腔内投与を包含する。いくつかの態様では、細胞集団が、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射による末梢全身送達を使って対象に投与される。
【０２３６】
組成物は、いくつかの態様において、無菌液状調製物として、例えば等張性水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供され、それらは、いくつかの局面において、選択されたpHに緩衝化されている。液状調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固形組成物よりも調製が容易である。加えて、液状組成物は、投与（特に注射によって投与）するのに多少便利である。一方、粘性組成物は、特定組織との接触期間が長くなるように、適当な粘度範囲内で製剤化することができる。液状組成物または粘性組成物は担体を含むことができ、それらは、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（polyoi）（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物などを含有する溶媒または分散媒であることができる。
【０２３７】
無菌注射可能溶液は、細胞を溶媒に組み入れることによって、例えば無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤と混合して調製することができる。組成物は凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路および所望の調製物に依存して、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えばメチルセルロース）、pH緩衝作用物質、ゲル化または増粘性添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。いくつかの局面では、標準的な教本を参照することで、適切な調製物を調製することができる。
【０２３８】
抗微生物保存剤、酸化防止剤、キレート剤、および緩衝剤など、組成物の安定性および無菌性を強化するさまざまな添加剤を加えることができる。微生物作用の防止は、さまざまな抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保することができる。注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって引き起こすことができる。
【０２３９】
インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌である。無菌性は例えば無菌濾過膜による濾過などによって容易に達成されうる。
【０２４０】
B.投与の方法
細胞、集団、および組成物を投与する方法、ならびにがんを含む疾患、状態、および障害を処置しまたは防止するためのそのような細胞、集団、および組成物の使用が提供される。いくつかの態様において、細胞、集団、および組成物は、例えば養子T細胞治療などの養子細胞治療によって処置されるべき特定の疾患または状態を有する対象または患者に投与される。いくつかの態様において、ここに提供される細胞および組成物は、疾患または状態を有するかそのリスクがある対象に投与される。いくつかの局面において、本方法は、それにより、疾患または状態の1つまたは複数の症状を、例えば改変T細胞によって認識される抗原を発現するがんの腫瘍量を減らすことなどによって、処置、例えば改善する。
【０２４１】
養子細胞療法のために細胞を投与する方法は公知であり、ここに提供する方法および組成物との関連において使用しうる。例えば養子T細胞療法は、Gruenberg et alの米国特許出願公開番号2003/0170238号;Rosenbergの米国特許第4,690,915号; Rosenberg（2011）Nat Rev Clin Oncol. 8（10）:577-85などに記載されている。例えばThemeli et al.（2013）Nat Biotechnol. 31（10）:928-933; Tsukahara et al.（2013）Biochem Biophys Res Commun 438（1）:84-9; Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338を参照されたい。
【０２４２】
本明細書にいう「対象」は哺乳動物、例えばヒトまたは他の動物であり、典型的にはヒトである。いくつかの態様において、細胞、細胞集団、または組成物の投与を受ける対象、例えば患者は、哺乳動物、典型的にはヒトなどの霊長類である。いくつかの態様において、霊長類はサルまたは類人猿である。対象は男性または女性であることができ、幼児対象、若年対象、青年対象、成人対象、および老齢対象を含む任意の適切な年齢であることができる。いくつかの態様において、対象は、齧歯類などの非霊長類哺乳動物である。
【０２４３】
本明細書にいう「処置」（およびその文法上の変形、例えば「処置する」または「処置すること」）は、疾患もしくは状態もしくは障害、またはそれに伴う症状、有害作用もしくはアウトカム、もしくは表現型の完全なまたは部分的な改善または低減を指す。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的結果の減縮、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善または緩和、ならびに寛解または予後の改良などがあるが、それらに限定されるわけではない。これらの用語は、疾患の完全な治癒も、何らかの症状またはすべての症状もしくはアウトカムに対する何らかの効果の完全な排除も含意しない。
【０２４４】
本明細書において「疾患の発達を遅延させる」とは、疾患（例えばがん）の発達を延期し、妨げ、減速し、遅延させ、安定化し、抑制し、かつ/または先延ばしにすることを意味する。この遅延は、処置される疾患および/または個体の履歴に依存して、さまざまな長さの期間であることができる。当業者には明白であるように、十分な遅延または著しい遅延は、その個体では疾患が発達しないという点で、実際上、防止を包含することができる。例えば末期がん（転移の発達など）を遅延させうる。
【０２４５】
本明細書にいう「防止する」には、ある疾患に対する素因を有しうるがまだその疾患とは診断されていない対象における当該疾患の発生または再発に関して、予防が含まれる。いくつかの態様において、ここに提供する細胞および組成物は、疾患の発達を遅延させるためまたは疾患の発達を遅くするために使用される。
【０２４６】
本明細書において使用する場合、機能または活性を「抑制する」とは、関心対象の条件またはパラメータを除く他の点では同じ条件と比較して、あるいは別の条件と比較して、その機能または活性を低減することである。例えば、腫瘍成長を抑制する細胞は、その細胞が存在しない場合の腫瘍の成長速度と比較して、腫瘍の成長速度を低減する。
【０２４７】
投与との関連において、作用物質、例えば薬学的製剤、細胞、または組成物の「有効量」とは、所望の結果、例えば治療結果または予防結果を達成するのに、必要な投薬量/量および期間において、有効な量を指す。
【０２４８】
作用物質、例えば薬学的製剤、または細胞の「治療有効量」とは、例えば疾患、状態または障害の処置に関して所望の治療結果、および/または処置の薬物動態的もしくは薬力学的効果を達成するのに、必要な投薬量および期間において、有効な量を指す。治療有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに投与される細胞集団などの因子に応じて変動しうる。いくつかの態様において、ここに提供する方法は、細胞、および/または組成物を有効量で、例えば治療有効量で投与することを伴う。
【０２４９】
「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに、必要な投薬量および期間において、有効な量を指す。予防用量は疾患に先だってまたは疾患の初期段階において対象に使用されるので、典型的には、予防有効量は治療有効量より少ないであろうが、必ずしもそうとは限らない。
【０２５０】
処置される疾患または状態は、抗原の発現が、疾患状態または障害と関連しかつ/またはその病因に関与する、例えばそのような疾患、状態、または障害を引き起こし、悪化させ、またはそのような疾患、状態、もしくは障害に他の形で関与する、任意の疾患または状態であることができる。例示的な疾患および状態としては、細胞の悪性病変または形質転換と関連する疾患または状態（例えばがん）、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または感染性疾患、例えば細菌、ウイルスまたは他の病原体が引き起こすものを挙げることができる。処置することができるさまざまな疾患および状態と関連する抗原を含む例示的抗原については上述した。特定の態様では、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックTCRが、疾患または状態と関連する抗原に特異的に結合する。
【０２５１】
いくつかの態様において、疾患または状態は、腫瘍、例えば固形腫瘍、リンパ腫、白血病、血液腫瘍、転移性腫瘍、または他のがんもしくは腫瘍タイプである。
【０２５２】
いくつかの態様において、疾患または状態は、限定するわけではないがウイルス感染、レトロウイルス感染、細菌感染、および原虫感染、免疫不全、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バー・ウイルス（EBV）、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスなどの、感染性疾患または感染状態である。いくつかの態様において、疾患または状態は、自己免疫性または炎症性の疾患または状態、例えば関節炎、例えば関節リウマチ（RA）、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Grave's disease）、クローン病、多発性硬化症、喘息、および/または移植と関連する疾患もしくは状態である。
【０２５３】
いくつかの態様において、疾患または障害と関連する抗原は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、または4、erbB二量体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受容体a2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、およびユニバーサルタグと関連する抗原、がん-精巣抗原、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、および/またはビオチン化分子、および/または病原体特異的抗原、例えばHIV、HCV、HBVまたは他の病原体が発現する分子からなる群より選択される。
【０２５４】
したがって、ここに提供される方法および使用には、養子細胞治療のための方法および使用が包含される。いくつかの態様において、本方法は、対象、組織、または細胞への、例えば疾患、状態または障害を有するか、そのリスクがあるか、それを有すると疑われるものへの、細胞または細胞を含有する組成物の投与を含む。いくつかの態様では、細胞、集団、および組成物が、例えば養子T細胞治療などの養子細胞治療によって処置されるべき特定の疾患または状態を有する対象に投与される。いくつかの態様において、細胞または組成物は、対象、例えば疾患または状態を有する対象またはそのリスクがある対象に投与され、疾患または状態の1つまたは複数の症状を改善する。
【０２５５】
いくつかの態様において、細胞治療、例えば養子T細胞治療は、細胞が、細胞治療を受ける予定の対象から、またはそのような対象に由来する試料から、単離されかつ/または他の形で調製される、自家移入によって実行される。したがって、いくつかの局面において、細胞は処置を必要とする対象、例えば患者に由来し、細胞は、単離および加工後に、同じ対象に投与される。
【０２５６】
いくつかの態様において、細胞治療、例えば養子T細胞治療は、細胞が、細胞治療を受ける予定の対象または最終的に細胞治療を受ける対象、例えば第1対象ではない対象から、単離されかつ/または他の形で調製される、同種異系移入によって実行される。そのような態様では、次に細胞が、同じ種の異なる対象、例えば第2対象に投与される。いくつかの態様において、第1対象および第2対象は遺伝子的に同一である。いくつかの態様において、第1対象および第2対象は遺伝子的に類似している。いくつかの態様において、第2対象は、第1対象と同じHLAクラスまたはHLAスーパータイプを発現する。細胞は任意の適切な手段によって投与することができる。投薬および投与は、一つには、投与が短期間であるか長期間であるかに依存する。さまざまな投薬スケジュールとして、単回投与またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０２５７】
一定の態様において、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、約100万〜約1000億細胞の範囲で、かつ/または体重1キログラムにつき、その細胞量で、例えば100万〜約500億細胞（例えば約500万細胞、約2500万細胞、約5億細胞、約10億細胞、約50億細胞、約200億細胞、約300億細胞、約400億細胞、または前記の値のいずれか2つによって画定される範囲）、例えば約1000万〜約1000億細胞（例えば約2000万細胞、約3000万細胞、約4000万細胞、約6000万細胞、約7000万細胞、約8000万細胞、約9000万細胞、約100億細胞、約250億細胞、約500億細胞、約750億細胞、約900億細胞、または前記の値のいずれか2つによって画定される範囲）、および場合によっては約1億細胞〜約500億細胞（例えば約1億2000万細胞、約2億5000万細胞、約3億5000万細胞、約4億5000万細胞、約6億5000万細胞、約8億細胞、約9億細胞、約30億細胞、約300億細胞、約450億細胞）、またはこれらの範囲内の任意の値で、かつ/または体重1キログラムにつきその量で、対象に投与される。ここでも、投薬量は、疾患もしくは障害および/または患者に特有の属性、および/または他の処置に依存して変動しうる。いくつかの態様において、細胞は、併用処置の一部として、例えば別の治療的介入、例えば抗体または改変細胞または改変受容体または作用物質、例えば細胞毒性剤または治療剤と、同時に、または任意の順序で逐次的に、投与される。細胞は、いくつかの態様では、1つまたは複数の追加治療剤と、または別の治療的介入と共に、同時に、または任意の順序で逐次的に、共投与される。いくつかの状況下において、細胞は、細胞集団が1つまたは複数の追加治療剤の効果を強化するように、またはその逆になるように、十分に近い時間間隔で、別の治療法と共投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加治療剤に先だって投与される。いくつかの態様において、細胞は、前記1つまたは複数の追加治療剤の後に投与される。いくつかの態様において、前記1つまたは複数の追加剤は、例えば持続性を強化するためのサイトカイン、例えばIL-2を含む。いくつかの態様において、本方法は、化学治療剤の投与を含む。
【０２５８】
細胞を哺乳動物に投与したら、いくつかの態様では、工学的に改変された細胞の集団の生物学的活性を、例えば、いくつかある公知の方法のいずれかによって測定する。評価するパラメータには、例えばイメージングによるインビボでの、または例えばELISAもしくはフローサイトメトリーによるエクスビボでの、抗原に対する工学的に改変されたT細胞もしくは天然T細胞または他の免疫細胞の特異的結合が含まれる。一定の態様では、例えばKochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32（7）:689-702（2009）およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285（1）:25-40（2004）などに記載の細胞傷害性アッセイなど、当技術分野において公知である任意の適切な方法を使って、ターゲット細胞を破壊する工学的に改変された細胞の能力を測定することができる。一定の態様において、細胞の生物学的活性は、CD107a、IFNγ、IL-2、およびTNFなどといった1種または複数種のサイトカインの発現および/または分泌をアッセイすることによって測定する。いくつかの局面において、生物学的活性は、腫瘍量または腫瘍負荷量の低減などといった臨床アウトカムを評価することによって測定される。
【０２５９】
一定の態様では、工学的に改変された細胞を、それらの治療的または予防的効力が増加するように、いくつかの方法でさらに修飾する。例えば、その集団によって発現される工学的に改変されたCARまたはTCRは、ターゲティング部分に直接的に、またはリンカーを介して間接的に、コンジュゲートされ得る。化合物（例えばCARまたはTCR）をターゲティング部分にコンジュゲートする手法は当技術分野において公知である。例えばWadwa et al., J.Drug Targeting 3:111（1995）および米国特許第5,087,616号を参照されたい。
【０２６０】
V.定義
本明細書において使用する単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明確である場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば「1つの（a）」または「1つの（an）」は、「少なくとも1つの」または「1つまたは複数の」を意味する。本明細書に記載する局面および変形は、局面および変形「からなる」ならびに/または局面および変形「から本質的になる」を包含すると理解される。
【０２６１】
この開示の全体を通して、特許請求の範囲に記載する内容のさまざまな局面は、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、特許請求の範囲に記載する内容に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解すべきである。したがって範囲の記載は、可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値をすべて具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、値の範囲が与えられた場合、その範囲の上限および下限と、他の任意の明示された値またはその明示された範囲内の中間値との間にある中間値は、特許請求の範囲の内容に包含される。これら小範囲の上端および下端は独立してその小範囲に含まれてよく、それらもまた、特許請求の範囲の内容に包含される。ただし、明示されたその範囲内にあって特に除外された端点はいずれも除く。明示された範囲が端点の一方または両方を含む場合、それら含まれた端点の一方または両方を除外した範囲も特許請求の範囲の内容に含まれる。これは範囲の幅とは無関係に適用される。
【０２６２】
本明細書において使用する「約」という用語は、当業者にとっては明白な、各値に関する通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」がつく値またはパラメータは、その値またはパラメータそのものに向けられた態様を包含する（そしてそのような態様を記載している）。例えば「約X」という記載は「X」の記載を包含する。
【０２６３】
本明細書にいう組成物とは、2種類以上の製品、物質、または化合物（細胞を含む）の任意の混合物を指す。これは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせでありうる。
【０２６４】
本明細書にいう「濃縮する」は、1つまたは複数の特定細胞タイプまたは細胞集団に関していう場合、例えば組成物中の細胞の総数または組成物の体積と比較して、または他の細胞タイプとの比較において、当該細胞タイプまたは細胞集団の数またはパーセンテージを、例えば当該集団または細胞が発現するマーカーに基づく正の選択によって、または枯渇させるべき細胞集団もしくは細胞上に存在しないマーカーに基づく負の選択によって、増加させることを指す。この用語は、組成物からの他の細胞、細胞タイプ、または集団の完全な除去を必要とせず、そうして濃縮された細胞が、濃縮組成物中に100％存在することを必要とせず、100％近く存在することさえ必要とはしない。
【０２６５】
本明細書において、ある細胞または細胞の集団がある特定マーカーに関して「陽性」であるとは、その細胞上またはその細胞中における特定マーカー（典型的には表面マーカー）の検出可能な存在を指す。表面マーカーに関する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって（例えばマーカーに特異的に結合する抗体で染色し、該抗体を検出することによって）検出される表面発現の存在を指し、この場合、前記染色は、アイソタイプ対応対照を他の点では同一な条件下で使って同じ手順を実行することで検出される染色を実質的に上回るレベル、および/またはそのマーカーに関して陽性であることがわかっている細胞でのレベルと類似するレベルで、および/またはそのマーカーに関して陰性であることがわかっている細胞でのレベルより実質的に高いレベルで、フローサイトメトリーによって検出されうる。
【０２６６】
本明細書において、ある細胞または細胞の集団が特定マーカーに関して「陰性」であるとは、その細胞上またはその細胞中における特定マーカー（典型的には表面マーカー）の検出可能な実質的存在がないことを指す。表面マーカーに関する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって（例えばマーカーに特異的に結合する抗体で染色し、該抗体を検出することによって）検出される表面発現の非存在を指し、この場合、前記染色は、アイソタイプ対応対照を他の点では同一な条件下で使って同じ手順を実行することで検出される染色を実質的に上回るレベル、および/またはそのマーカーに関して陽性であることがわかっている細胞でのレベルより実質的に低いレベル、および/またはそのマーカーに関して陰性であることがわかっている細胞でのレベルと比較して実質的に類似するレベルでは、フローサイトメトリーによって検出されない。
【０２６７】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子などの核酸分子のコーディング配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスを指す。このプロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組合せを含みうる。
【０２６８】
本明細書にいう対象は、任意の生きている生物、例えばヒトおよび他の哺乳動物を包含する。哺乳動物には、ヒトおよびヒト以外の動物、例えば農用動物、競技用動物、齧歯類およびペットが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２６９】
本明細書において対照とは、それが被験パラメータで処理されない点、または血漿試料である場合には、それが関心対象の状態に陥っていない正常ボランティアからの試料でありうる点を除けば、被験試料と実質的に同一である試料を指す。対照は、内部対照であることもできる。
【０２７０】
本明細書にいう「機能的に連結される」（operably linkedまたはoperatively linked）とは、DNA配列（例えば異種核酸）と調節配列などといった構成成分の、適当な分子（例えば転写活性化因子タンパク質）が調節配列に結合すれば遺伝子発現が可能になるような形での連係を指す。したがってこれは、記載の構成成分が、それらが意図した形で機能することを可能にする関係にあることを意味する。
【０２７１】
本明細書にいう「配列同一性パーセント（％）」および「同一性パーセント」は、それがヌクレオチド配列（参照ヌクレオチド配列）またはアミノ酸配列（参照アミノ酸配列）に関して使用される場合には、最大の配列同一性パーセントが得られるように配列をアライメントし、必要であればギャップを導入した後に、参照配列中の残基と同一である候補配列中のそれぞれヌクレオチド残基またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野における技量内のさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アライメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列をアライメントするための適当なパラメータを決定することができる。
【０２７２】
本明細書において使用する用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターも包含する。一定のベクターは、それらが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」という。ベクターには、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが含まれる。
【０２７３】
VI.例示的態様
ここに提供される態様には、以下に挙げるものがある:
1.（a）リガンド結合ドメイン、および
（b）（i）TNF受容体関連因子6（TRAF-6）の活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、TRAF-6誘導ドメインと、（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む、細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【０２７４】
2. TRAF-6誘導ドメインが、TRAF-6結合ドメインを含むか、TRAF-6結合ドメインを含む分子に結合する能力またはTRAF-6結合ドメインを含む分子を動員する分子に結合する能力を有するドメインを含む、態様1のキメラ受容体。
【０２７５】
3. TRAF-6結合ドメインが、Pro-Xxa-Glu-Xaa-Xaa-Xaa（SEQ ID NO:26）を含むアミノ酸配列を含み、かつ/または
TRAF-6結合ドメインがTRAF-6以外のTRAF分子に特異的に結合せず、かつ/または
キメラ受容体が、他のいずれかのTRAF分子、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、および/またはTRAF-5に特異的に結合する分子に特異的に結合する能力および/または他のいずれかのTRAF分子、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、および/またはTRAF-5に特異的に結合する分子を動員する能力を有する結合ドメインを含まない、
態様1のキメラ受容体。
【０２７６】
4. TRAF-6誘導ドメインが、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子のTRAF-6誘導ドメインであるか、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子のTRAF-6誘導ドメインを含むか、またはTNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子のTRAF-6誘導ドメインの機能的フラグメントまたは機能的変異体である、態様1〜3のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２７７】
5.前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF誘導ドメインも含まず、
前記分子は、前記分子に由来するTRAF-1誘導ドメインを含まず、
前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-2誘導ドメインも含まず、
前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-3誘導ドメインも含まず、
前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-4誘導ドメインも含まず、
前記分子は、前記分子に由来する他のいかなるTRAF-5誘導ドメインも含まず、
前記分子は、別のTRAFの、またはTRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、もしくはTRAF-5の、活性化または細胞局在を誘導する能力を有する、前記分子のドメインを含まず、かつ/または
前記分子は、別のTRAFによる、またはTRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、もしくはTRAF-5の、シグナリングを誘導する能力を有する、前記分子のドメインを含まない、
態様4のキメラ受容体。
【０２７８】
6. TRAF-6誘導ドメインは、腫瘍壊死因子（TNF）受容体スーパーファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインであるか、腫瘍壊死因子（TNF）受容体スーパーファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、その機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含み、または
TRAF-6誘導ドメインは、Toll/IL-1ファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインであるか、Toll/IL-1ファミリーの分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、その機能的変異体もしくは機能的フラグメントである、
態様1〜5のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２７９】
7.前記分子が、CD40、RANKおよびインターロイキン1受容体タイプ1（IL1R1）のなかから選択される、態様4〜6のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２８０】
8. TRAF-6誘導ドメインが、
（i）SEQ ID NO:12、14または16に示すアミノ酸の配列、
（ii）SEQ ID NO:12、14または16に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む機能的変異体、
（iii）SEQ ID NO:12に対して100％未満の配列同一性を呈し、かつSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を呈する、アミノ酸の配列を含む機能的変異体、または
（iv）（i）、（ii）または（iii）の機能的フラグメント
のなかから選択されるアミノ酸の配列を含む、態様1〜7のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２８１】
9.機能的変異体または機能的フラグメントが、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6結合ドメインを含むか、TRAF-6結合ドメインを含む分子に結合する能力またはTRAF-6結合ドメインを含む分子を動員する分子に結合する能力を有するドメインを含む、態様6〜8のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２８２】
10. TRAF-6誘導部分がTRAF-6結合ドメインを含む分子を動員し、動員される分子がIRAKであるかIRAKを含み、かつ/またはTRAF-6誘導部分がIRAKを動員する能力を有するTIRドメインを含む、態様2または態様9のキメラ受容体。
【０２８３】
11. TRAF-6誘導ドメインが、CD40またはOX40の細胞質シグナリングドメインでないか、CD40またはOX40の細胞質シグナリングドメインを含まず、かつ/またはCD40もしくはOX40の全細胞質ドメインでないか、CD40またはOX40の全細胞質ドメインを含まず、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:20に示すアミノ酸の配列でないか、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:20に示すアミノ酸の配列を含まず、かつ/またはTRAF-6結合ドメイン以外のOX40またはCD40のTRAF結合ドメインを含まない、態様1〜10のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２８４】
12.細胞内シグナリングドメインが、そのN末端からC末端に向かって順に、リガンド結合ドメイン、（TRAF-6）誘導ドメインおよび活性化細胞質シグナリングドメインを含む、態様1〜11のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２８５】
13. TRAF-6誘導ドメインがIL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体を含み、リガンドが結合したときに、キメラ受容体は、補助シグナリングドメインを含む第2のキメラ受容体との多量体型複合体を形成する能力を有し、前記多量体型複合体は、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、態様1〜12のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２８６】
14.補助シグナリングドメインが、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインを含むか、第1キメラ受容体との多量体型複合体を形成するのに十分なその機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含む、態様13のキメラ受容体。
【０２８７】
15.多量体型複合体がヘテロ二量体型複合体である、態様13または態様14のキメラ受容体。
【０２８８】
16.（a）リガンド結合ドメイン、および
（b）（i）リガンドが結合したときに、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導するように協同する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、TRAF-6誘導ドメインおよび補助シグナリングドメインと
（ii）活性化細胞質シグナリングドメインと
を含む、細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ受容体。
【０２８９】
17. TRAF-6誘導ドメインが、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体であるか、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体を含み、
補助シグナリングドメインが、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントであるか、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含む、
態様16のキメラ受容体。
【０２９０】
18. TRAF-6誘導ドメインと補助シグナリングドメインが、直接的または間接的に、タンデムに連結されている、態様16または態様17のキメラ受容体。
【０２９１】
19.活性化細胞質シグナリングドメインが、T細胞において一次活性化シグナルを誘導する能力を有し、T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、態様1〜18のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２９２】
20.活性化細胞質シグナリングドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分であるか、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分を含む、態様1〜19のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２９３】
21.リガンド結合ドメインが、機能的非TCR抗原受容体またはトランスジェニックTCRである、態様1〜20のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２９４】
22.リガンド結合ドメインが抗原結合ドメインである、キメラ抗原受容体（CAR）である、態様1〜21のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２９５】
23.抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントである、態様22のキメラ受容体。
【０２９６】
24.抗原結合ドメインが、一本鎖フラグメントである抗体フラグメントである、態様23のキメラ受容体。
【０２９７】
25.フラグメントが、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された抗体可変領域を含む、態様23または態様24のキメラ受容体。
【０２９８】
26.フラグメントがscFvを含む、態様23〜25のいずれか一つのキメラ受容体。
【０２９９】
27.リガンド結合ドメインが、疾患または障害と関連する抗原に特異的に結合する、態様1〜26のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３００】
28.疾患または障害が、感染性疾患もしくは感染状態、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんであり、
リガンド結合ドメインが腫瘍抗原に特異的に結合し、かつ/または
リガンド結合ドメインが、ROR1、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児性抗原、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、MAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）およびサイクリンA1（CCNA1）
からなる群より選択される抗原に特異的に結合する、
態様25のキメラ受容体。
【０３０１】
29.リガンド結合ドメインと細胞内シグナリングドメインとを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、態様1〜28のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３０２】
30.膜貫通ドメインが、TRAF-6誘導性ドメインに連結されることにより、TRAF-6誘導性ドメインは、膜貫通ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある、態様29のキメラ受容体。
【０３０３】
31.膜貫通ドメインが、TRAF-6誘導性ドメインを含む分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、態様29または態様30のキメラ受容体。
【０３０４】
32.膜貫通ドメインが、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体であるか、TNF-Rファミリーメンバー、サイトカイン受容体、およびToll様受容体（TLR）からなる群より選択される分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、態様31のキメラ受容体。
【０３０５】
33.膜貫通ドメインとTRAF-6誘導性ドメインとが同じ分子に由来する、態様29〜32のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３０６】
34.前記分子が、CD40、RANKおよびインターロイキン1受容体タイプ1（IL1R1）のなかから選択される、態様32または態様33のキメラ受容体。
【０３０７】
35.膜貫通ドメインが、
（i）SEQ ID NO:11、13または15に示すアミノ酸の配列、
（ii）SEQ ID NO:11、13または15に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む機能的変異体、
（iii）（i）または（ii）の機能的フラグメント
のなかから選択されるアミノ酸の配列を含む、態様32〜34のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３０８】
36.細胞内シグナリングドメインが（iii）共刺激シグナリングドメインをさらに含む、態様1〜35のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３０９】
37.共刺激シグナリングドメインが、T細胞共刺激分子の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分を含む、態様36のキメラ受容体。
【０３１０】
38.共刺激シグナリングドメインがPI-3キナーゼ誘導ドメインを含む、態様36または態様37のキメラ受容体。
【０３１１】
39.共刺激シグナリングドメインが、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはそのシグナリング部分の機能的変異体である、態様36〜38のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３１２】
40.共刺激シグナリングドメインが、TRAF-6誘導ドメインと活性化シグナリングドメインとの間にあるか、または
TRAF-6誘導ドメインが、共刺激シグナリングドメインと活性化シグナリングドメインとの間にある、
態様36〜39のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３１３】
41.膜貫通ドメインが共刺激分子の膜貫通ドメインを含む、態様29、30および36〜40のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３１４】
42.（1）（a）第1リガンド結合ドメインおよび（b）（i）TRAF-6誘導ドメインと（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む第1細胞内シグナリングドメインを含む、第1キメラ受容体、ならびに
（2）（c）第1リガンド結合ドメインと同じリガンドに結合する能力を有する第2リガンド結合ドメインおよび（d）（iii）補助シグナリングドメインを含む第2細胞内シグナリングドメインを含む、第2キメラ受容体
を含み、
リガンドが結合したときに、TRAF誘導ドメインおよび補助シグナリングドメインは、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導するように協同する能力を有し、かつ/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有する、多量体型キメラ受容体複合体。
【０３１５】
43. TRAF-6誘導ドメインが、IL1R1の細胞質シグナリングドメインまたはそのフラグメントの機能的変異体を含み、
補助シグナリングドメインが、IL1RAPの細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントを含む、
態様41の多量体型複合体。
【０３１６】
44.第1リガンド結合ドメインと第2リガンド結合ドメインが同じであるか、実質的に同じである、態様42または態様43の多量体型複合体。
【０３１７】
45.第2キメラ受容体が第2活性化細胞質シグナリングドメインをさらに含み、この第2活性化細胞質シグナリングドメインは、任意で、第1活性化細胞質ドメインと同じであるか、実質的に同じである、態様42〜44のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３１８】
46.第1活性化細胞質シグナリングドメインおよび/または第2活性化細胞質シグナリングドメインであることができる活性化細胞質シグナリングドメインは、独立して、T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、態様42〜45のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３１９】
47.第1活性化細胞質シグナリングドメインおよび/または第2活性化細胞質シグナリングドメインであることができる活性化細胞質シグナリングドメインは、独立して、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む、態様42〜46のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２０】
48.第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体が、共刺激シグナリングドメインを含む、態様42〜47のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２１】
49.第1共刺激シグナリングドメインおよび/または第2共刺激シグナリングドメインであることができる共刺激シグナリングドメインは、独立して、T細胞共刺激分子の細胞質シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む、態様48の多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２２】
50.第1共刺激シグナリングドメインおよび/または第2共刺激シグナリングドメインであることができる共刺激シグナリングドメインは、独立して、CD28、4-1BB、またはICOSの細胞質シグナリングドメイン、またはそのシグナリング部分を含む、態様48または態様49の多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２３】
51.第1リガンド結合ドメインおよび/または第2リガンド結合ドメインが、機能的非TCR抗原受容体またはトランスジェニックTCRである、態様42〜50のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２４】
52.第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体は、第1リガンド結合ドメインおよび/または第2リガンド結合ドメインが抗原結合ドメインであるキメラ抗原受容体（CAR）である、態様42〜51のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２５】
53.抗原結合ドメインが抗体または抗体フラグメントである、態様52の多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２６】
54.抗原結合ドメインが、一本鎖フラグメントである抗体フラグメントである、態様53の多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２７】
55.前記フラグメントが、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された抗体可変領域を含む、態様53または態様54の多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２８】
56.前記フラグメントがscFvを含む、態様53〜55のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３２９】
57.第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体が、リガンド結合ドメインと細胞内シグナリングドメインとを連結する膜貫通ドメインを、さらに含む、態様42〜56のいずれか一つの多量体型キメラ受容体複合体。
【０３３０】
58.態様1〜41のいずれか一つのキメラ受容体をコードする核酸分子。
【０３３１】
59.（a）第1リガンド結合ドメインおよび（b）（i）TRAF-6誘導ドメインと（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む第1細胞内シグナリングドメインを含む第1キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列、ならびに/または
（c）第1リガンド結合ドメインと同じリガンドに結合する能力を有する第2リガンド結合ドメインおよび（d）（iii）補助シグナリングドメインを含む第2細胞内シグナリングドメインを含む第2キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列
を含む、核酸分子。
【０３３２】
60.第1キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列と第2キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列とを含む単一ポリヌクレオチドであり、任意で、第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターを、さらに含む、態様59の核酸分子。
【０３３３】
61.第1キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列は第1プロモーターに機能的に連結され、第2キメラ受容体をコードするヌクレオチドの配列は第2プロモーターに機能的に連結されており、第1プロモーターと第2プロモーターは同じであるか、異なることができ、または
第1キメラ受容体と第2キメラ受容体は、配列内リボソーム進入部位（IRES）、自己切断性ペプチド、もしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、任意でT2Aポリペプチド、によって隔てられていて、第1キメラ受容体と第2キメラ受容体は、同じプロモーターの制御下に発現される、
態様60の核酸分子。
【０３３４】
62.コードされている第1キメラ受容体および/またはコードされている第2キメラ受容体が、態様42〜57のいずれか一つの多量体型複合体の第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体である、態様59〜61のいずれか一つの核酸分子。
【０３３５】
63.態様58〜62のいずれか一つの核酸分子を含むベクター。
【０３３６】
64.ウイルスベクターである態様63のベクター。
【０３３７】
65.任意で、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、レトロウイルスベクターである、態様63または態様64のベクター。
【０３３８】
66.態様58〜62のいずれか一つの核酸または態様63〜65のいずれか一つのベクターを含むか、態様1〜42のいずれか一つのキメラ受容体を発現する、改変細胞。
【０３３９】
67.（a）第1リガンド結合ドメインおよび（b）（i）TRAF-6誘導ドメインと（ii）活性化細胞質シグナリングドメインとを含む第1細胞内シグナリングドメインを含む、第1キメラ受容体、ならびに/または
（c）第1リガンド結合ドメインと同じリガンドに結合する能力を有する第2リガンド結合ドメインおよび（d）（iii）補助シグナリングドメインを含む第2細胞内シグナリングドメインを含む、第2キメラ受容体
を含む、改変細胞。
【０３４０】
68.第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体が、態様42〜57のいずれか一つの多量体型複合体の第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体である、態様67の改変細胞。
【０３４１】
69.細胞が、修飾カスパーゼ分子も誘導性カスパーゼ分子も発現せず、任意で、前記カスパーゼ分子は修飾カスパーゼ-9または誘導性カスパーゼ9である、態様63〜65のいずれか一つのベクター、または態様66〜68のいずれか一つの改変細胞。
【０３４２】
70. T細胞である、態様66〜69のいずれか一つの改変細胞。
【０３４３】
71. CD8＋ T細胞である、態様66〜70のいずれか一つの改変細胞。
【０３４４】
72.態様66〜71のいずれか一つの改変細胞と、任意で薬学的に許容される緩衝液とを含む、組成物。
【０３４５】
73.態様1〜42のいずれか一つのキメラ受容体を発現するか、態様42〜57のいずれか一つの多量体型複合体の第1キメラ受容体および/または第2キメラ受容体を発現する、改変CD8＋細胞と、
CD8＋細胞において発現するキメラ受容体と比較して異なるキメラ受容体であって、異なる共刺激シグナリングドメインを含むものを含む、改変CD4＋細胞と、
任意で、薬学的に許容される緩衝液と
を含む組成物。
【０３４６】
74. CD8＋細胞と比較して、CD4＋細胞において発現するキメラ受容体の唯一の相違は、異なる共刺激シグナリングドメインである、態様73の組成物。
【０３４７】
75.前記異なる共刺激シグナリングドメインが、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力および/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有するTRAF-6誘導ドメインを含まない、態様73または態様74の組成物。
【０３４８】
76.前記異なる共刺激シグナリングドメインが、PI-3キナーゼの活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3キナーゼ/Aktシグナリングを誘導する能力を有するPI3キナーゼ誘導ドメインであるか、PI-3キナーゼの活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3キナーゼ/Aktシグナリングを誘導する能力を有するPI3キナーゼ誘導ドメインを含む、態様73〜75のいずれか一つの組成物。
【０３４９】
77.前記異なる共刺激シグナリングドメインが、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインであるか、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはそのシグナリング部分の機能的変異体である、態様73〜76のいずれか一つの組成物。
【０３５０】
78.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した増殖能または増大能を呈する、態様73〜77のいずれか一つの組成物。
【０３５１】
79.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質の存在下で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した数のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットを呈する、態様73〜78のいずれか一つの組成物。
【０３５２】
80.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD62L＋である、態様79の組成物。
【０３５３】
81.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）である、態様79または態様80の組成物。
【０３５４】
82.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、
a）CD127＋、および/または
b）CD45RA＋、CD45RO-、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数、ならびにt-betlow、IL-7Ra＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数、
を含む表現型を、さらに含む、態様80または態様81の組成物。
【０３５５】
83.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD8＋である、態様79〜82のいずれか一つの組成物。
【０３５６】
84.投与された遺伝子改変細胞に由来するメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数が、参照組成物と比較して、増加したまたはより大きなパーセンテージの、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）を含む、態様79〜83のいずれか一つの組成物。
【０３５７】
85.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した持続性および/または生存を呈する、
態様73〜84のいずれか一つの組成物。
【０３５８】
86.前記1種または複数種の刺激性作用物質が、抗原、抗CD3/抗CD28抗体を含み、かつ/またはIL-2、IL-15および/またはIL-7サイトカインを含む、態様78〜85のいずれか一つの組成物。
【０３５９】
87.増加が、刺激の開始後、3日、4日、5日、6日、7日、10日または14日以内に観察される態様78〜86のいずれか一つの組成物。
【０３６０】
88.ある疾患または状態を有する対象に、態様66〜71のいずれか一つの細胞または態様72〜87のいずれか一つの組成物を投与する工程を含む、処置の方法。
【０３６１】
89.キメラ受容体が、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する、態様88の方法。
【０３６２】
90.疾患または状態が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である、態様88または態様89の方法。
【０３６３】
91.組成物中の遺伝子改変T細胞が、対象において、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量の参照細胞組成物を投与された対象と比較して、増加したまたはより長期の増大および/または持続性を呈する、態様88〜90のいずれか一つの方法。
【０３６４】
92.同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来する対象中のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数および持続性と比較して、増加したまたはより多数の、投与された遺伝子改変T細胞に由来する対象中のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセット、および/または増加した、もしくはより長期の、投与された遺伝子改変T細胞に由来する対象中のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの持続性が見られる、態様88〜91のいずれか一つの方法。
【０３６５】
93.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD62L＋である、態様92の方法。
【０３６６】
94.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）である、態様92または態様93の方法。
【０３６７】
95.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、
a）CD127＋、および/または
b）CD45RA＋、CD45RO-、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数、ならびにt-betlow、IL-7Ra＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数
を含む表現型を、さらに含む、態様93または態様94の方法。
【０３６８】
96.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD8＋である、態様88〜95のいずれか一つの方法。
【０３６９】
97.投与された遺伝子改変細胞に由来するメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数が、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来するそのような細胞の数と比較して、増加した、またはより大きなパーセンテージの、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）を含む、態様88〜96のいずれか一つの方法。
【０３７０】
98.同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来する対象中の非最終分化細胞の数と比較して、増加したまたはより多数の、投与された遺伝子改変T細胞に由来する対象中の非最終分化T細胞が見られる、態様88〜97のいずれか一つの方法。
【０３７１】
99.投与された遺伝子改変細胞に由来する対象中の遺伝子改変細胞は、1種または複数種の刺激性作用物質の存在下にエクスビボで再刺激したときに、同じ1種または複数種の刺激性作用物質の存在下にエクスビボで再刺激された場合の、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量で投与された参照細胞組成物に由来する対象中の遺伝子改変細胞の活性化または増殖と比較して、活性化または増殖の増加を呈する、態様88〜98のいずれか一つの方法。
【０３７２】
100.前記1種または複数種の刺激性作用物質が、抗原、抗CD3/抗CD28抗体を含むか、IL-2、IL-15および/またはIL-7サイトカインを含む、態様99の方法。
【０３７３】
101.増加が、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、または5倍である、態様91〜100のいずれか一つの方法。
【０３７４】
102.同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量の参照細胞組成物を投与された対象中の遺伝子改変細胞における疲弊マーカーの発現と比較して、減少または低減した、投与された遺伝子改変T細胞に由来する対象中の遺伝子改変細胞における疲弊マーカーの発現が見られる、態様88〜101のいずれか一つの方法。
【０３７５】
103.疲弊マーカーが、CD244、CD160およびPD-1のなかから選択される、態様102の方法。
【０３７６】
104.発現が、1.2分の1、1.5分の1、2.0分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1、10分の1またはそれ未満に減少または低減する、態様102または態様103の方法。
【０３７７】
105.増加または減少が、細胞の投与から1ヶ月以内、2ヶ月以内、6ヶ月以内、または1年以内に、観察され、または存在する、態様88〜104のいずれか一つの方法。
【０３７８】
106.参照細胞組成物は、発現するキメラ受容体が、TRAF-6誘導ドメインを含まず、かつ/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有する共刺激シグナリングドメインを含み、かつ/またはCD28、4-1BB、もしくはICOSの共刺激ドメインを含む点以外は、実質的に同じ遺伝子改変細胞を含有する、態様78〜87のいずれか一つの組成物または態様91〜105のいずれか一つの方法。
【０３７９】
107.（a）リガンド結合ドメイン、
（b）膜貫通ドメイン、および
（c）ヒトCD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【０３８０】
108.（a）リガンド結合ドメイン、
（b）ヒトCD28由来の膜貫通ドメイン、および
（c）CD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【０３８１】
109. CD40がヒトCD40である、態様108のキメラ受容体。
【０３８２】
110.CD40由来のシグナリングドメインが、SEQ ID NO:12に示すアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を呈するアミノ酸の配列を含む機能的変異体を含む、態様107〜109のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３８３】
111.（a）リガンド結合ドメイン、
（b）膜貫通ドメイン、および
（c）SEQ ID NO:12に示すCD40由来のシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む、キメラ受容体。
【０３８４】
112.膜貫通ドメインが、TRAF-6誘導性ドメインを含む分子の膜貫通ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、態様107または態様111のキメラ受容体。
【０３８５】
113.膜貫通ドメインがCD40に由来する、態様107、態様111または態様112のキメラ受容体。
【０３８６】
114.膜貫通ドメインが、CD4、CD28、またはCD8由来の膜貫通ドメインであるか、CD4、CD28、またはCD8由来の膜貫通ドメインを含む、態様107および111〜113のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３８７】
115.膜貫通ドメインがCD28由来の膜貫通ドメインであるか、CD28由来の膜貫通ドメインを含む、態様114のキメラ受容体。
【０３８８】
116.膜貫通ドメインがヒトの膜貫通ドメインであるか、またはヒトタンパク質に由来する、態様107および111〜115のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３８９】
117. CD28由来の膜貫通ドメインが、
a）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列、または
b）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、態様108〜110、115および116のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３９０】
118.活性化細胞質シグナリングドメインをさらに含む、態様107〜117のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３９１】
119.活性化細胞質シグナリングドメインが、T細胞において一次活性化シグナルを誘導する能力を有し、T細胞受容体（TCR）構成成分であり、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、態様118のキメラ受容体。
【０３９２】
120.活性化細胞質シグナリングドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分であるか、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナリングドメインまたはその機能的変異体もしくはシグナリング部分を含む、態様118または態様119のキメラ受容体。
【０３９３】
121.細胞内シグナリングドメインが、そのN末端からC末端に向かって順に、CD40由来のシグナリングドメインおよび活性化細胞質シグナリングドメインを含む、態様118〜120のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３９４】
122.細胞内シグナリングドメインが、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインを含まない、態様107〜117のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３９５】
123.細胞内シグナリングドメインが追加の共刺激シグナリングドメインをさらに含む、態様107〜122のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３９６】
124.追加の共刺激シグナリングドメインが、CD40に由来するもの以外のT細胞共刺激分子の細胞内シグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む、態様123のキメラ受容体。
【０３９７】
125.追加の共刺激シグナリングドメインが、CD28、4-1BB、またはICOS由来のシグナリングドメインまたはそのシグナリング部分を含む、態様123または態様124のキメラ受容体。
【０３９８】
126.リガンド結合ドメインが抗原結合ドメインである、態様107〜125のいずれか一つのキメラ受容体。
【０３９９】
127.抗原結合ドメインが抗体または抗原結合性抗体フラグメントである、態様126のキメラ受容体。
【０４００】
128.抗原結合ドメインが、一本鎖フラグメントである抗原結合性抗体フラグメントである、態様127のキメラ受容体。
【０４０１】
129.抗原結合性抗体フラグメントが、柔軟な免疫グロブリンリンカーによって接合された抗体可変領域を含む、態様127または態様128のキメラ受容体。
【０４０２】
130.抗原結合ドメインが一本鎖可変フラグメント（scFv）である、態様127〜129のいずれか一つのキメラ受容体。
【０４０３】
131.リガンド結合ドメインが疾患または障害と関連する抗原に特異的に結合する、態様107〜130のいずれか一つのキメラ受容体。
【０４０４】
132.疾患または障害が、感染性疾患または感染状態、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、態様131のキメラ受容体。
【０４０５】
133.がんが固形腫瘍がんである、態様122のキメラ受容体。
【０４０６】
134.リガンド結合ドメインが腫瘍抗原に特異的に結合する、態様107〜133のいずれか一つのキメラ受容体。
【０４０７】
135.リガンド結合ドメインが、ROR1、B細胞成熟抗原（BCMA）、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、または4、erbB二量体、EGFR vIII、FBP、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、サバイビン、EGP2、EGP40、TAG72、B7-H6、IL-13受容体a2（IL-13Ra2）、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、葉酸受容体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、およびユニバーサルタグと関連する抗原、がん-精巣抗原、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、腫瘍胎児性抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c-Met、GD-2、O-アセチル化GD2（OGD2）、CE7、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、サイクリン、サイクリンA2、CCL-1、CD138、および病原体特異抗原からなる群より選択される抗原に特異的に結合する、態様107〜122のいずれか一つのキメラ受容体。
【０４０８】
136.リガンド結合ドメインがCD19に特異的に結合する、態様107〜123のいずれか一つのキメラ受容体。
【０４０９】
137.リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとを接合するスペーサーをさらに含む、態様107〜136のいずれか一つのキメラ受容体。
【０４１０】
138.スペーサーがヒトIgGに由来する、態様137のキメラ受容体。
【０４１１】
139.スペーサーがアミノ酸配列ESKYGPPCPPCP（SEQ ID NO:1）を含む、態様137または態様138のキメラ受容体。
【０４１２】
140.スペーサーがCD28の細胞外部分を含み、そのCD28は任意でヒトCD28である、態様137のキメラ受容体。
【０４１３】
141. CD28由来の細胞外部分が、1〜50アミノ酸長、1〜40アミノ酸長、1〜30アミノ酸長、1〜20アミノ酸長、または1〜10アミノ酸長を含む、態様140のキメラ受容体。
【０４１４】
142.スペーサーおよび膜貫通ドメインが、
a）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列、または
b）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、態様140または態様141のキメラ受容体。
【０４１５】
143.態様107〜142のいずれか一つのキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子。
【０４１６】
144.シグナル配列をさらに含む、態様143の核酸分子。
【０４１７】
145.前記ポリヌクレオチドが第1ポリヌクレオチドであり、核酸分子が、第2キメラ受容体をコードする第2ポリヌクレオチドを含む、態様143または態様144の核酸分子。
【０４１８】
146.第1ポリヌクレオチドおよび第2ポリヌクレオチドが、配列内リボソーム進入部位（IRES）によって隔てられているか、または自己切断性ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチドをコードするヌクレオチド配列によって隔てられており、前記ペプチドは任意でT2AまたはP2Aである、態様141の核酸分子。
【０４１９】
147.態様143〜146のいずれか一つの核酸を含むベクター。
【０４２０】
148.発現ベクターである、態様147のベクター。
【０４２１】
149.ウイルスベクターである、態様147または態様148のベクター。
【０４２２】
150.ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様149のベクター。
【０４２３】
151.ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、態様149または態様150のベクター。
【０４２４】
152.ウイルスベクターがガンマレトロウイルスベクターである、態様149または態様150のベクター。
【０４２５】
153.態様143〜146のいずれか一つの核酸または態様147〜152のいずれか一つのベクターを含むか、態様107〜144のいずれか一つのキメラ受容体を発現する、改変細胞。
【０４２６】
154. T細胞である、態様153の改変細胞。
【０４２７】
155. CD8＋ T細胞である、態様153または態様154の改変細胞。
【０４２８】
156.改変細胞を生産する方法であって、態様143〜146のいずれか一つの核酸分子または態様147〜152のいずれか一つのベクターを細胞に導入し、それによって改変細胞を生産する工程を含む方法。
【０４２９】
157.態様156の方法によって生産される改変細胞。
【０４３０】
158.態様153〜155および157のいずれか一つの改変細胞を含む組成物。
【０４３１】
159.態様155の改変細胞、または態様107〜144のいずれか一つのキメラ受容体を発現する改変CD8＋細胞、
CD8＋細胞において発現するキメラ受容体と比較して異なるキメラ受容体であって、異なる共刺激シグナリングドメインを含むものを含む、改変CD4＋細胞、
を含む、組成物。
【０４３２】
160.第1改変細胞対第2改変細胞の比が、1:1〜2:1または約1:1〜2:1であり、任意で1:1、1:2、2:1または約1:1、1:2、2:1である、態様159の組成物。
【０４３３】
161. CD8＋細胞と比較して、CD4＋細胞において発現するキメラ受容体における唯一の相違が、前記異なる共刺激シグナリングドメインである、態様159または態様160の組成物。
【０４３４】
162.前記異なる共刺激シグナリングドメインが、TRAF-6の活性化または細胞局在を誘導する能力および/またはTRAF-6媒介シグナリングを誘導する能力を有するTRAF-6誘導ドメインを含まない、態様159〜161のいずれか一つの組成物。
【０４３５】
163.前記異なる共刺激シグナリングドメインが、PI-3-キナーゼの活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有するPI-3キナーゼ誘導ドメインであるか、PI-3-キナーゼの活性化もしくは細胞局在を誘導する能力および/またはPI3K/Aktシグナリングを誘導する能力を有するPI-3キナーゼ誘導ドメインを含む、態様159〜162のいずれか一つの組成物。
【０４３６】
164.前記異なる共刺激シグナリングドメインが、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインであるか、CD28、4-1BB、またはICOS分子の細胞質シグナリングドメインを含むか、またはそのシグナリング部分の機能的変異体である、態様159〜163のいずれか一つの組成物。
【０４３７】
165.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した増殖能または増大能を呈する、態様158〜164のいずれか一つの組成物。
【０４３８】
166.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質の存在下で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した数のメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットを呈する、態様158〜165のいずれか一つの組成物。
【０４３９】
167.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD62L＋である、態様166の組成物。
【０４４０】
168.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）である、態様166または態様167の組成物。
【０４４１】
169.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットが、
a）CD127＋、および/または
b）CD45RA＋、CD45RO-、CCR7＋およびCD27＋のうちの任意の1つまたは複数、ならびにt-betlow、IL-7Ra＋、CD95＋、IL-2Rβ＋、CXCR3＋およびLFA-1＋のうちの任意の1つまたは複数
を含む表現型を、さらに含む、態様167または態様168の組成物。
【０４４２】
170.メモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットがCD8＋である、態様167〜169のいずれか一つの組成物。
【０４４３】
171.投与された遺伝子改変細胞に由来するメモリーT細胞またはメモリーT細胞サブセットの数が、参照組成物と比較して、増加したまたはより大きなパーセンテージの、セントラルメモリーT細胞（TCM）、長寿命メモリーT細胞またはTメモリー幹細胞（TSCM）を含む、態様167〜170のいずれか一つの組成物。
【０４４４】
172.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、増加した持続性および/または生存を呈する、態様158〜171のいずれか一つの組成物。
【０４４５】
173.インビトロで1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合に、組成物中の遺伝子改変細胞が、同じ1種または複数種の刺激性作用物質で刺激された場合の対応する参照細胞組成物と比較して、より多くのIL-2を生産する、態様158〜172のいずれか一つの組成物。
【０４４６】
174.前記1種または複数種の刺激性作用物質が、キメラ受容体への結合に関して特異的な抗原、抗CD3/抗CD28抗体を含み、かつ/またはIL-2、IL-15および/またはIL-7サイトカインを含む、態様158〜173のいずれか一つの組成物。
【０４４７】
175.増加が、刺激の開始後、3日、4日、5日、6日、7日、10日または14日以内に観察される、態様158〜174のいずれか一つの組成物。
【０４４８】
176.増加が、3:1より大きい、もしくは約3:1より大きい、もしくは約3:1の、または5:1より大きい、もしくは約5:1より大きい、もしくは約5:1の、または9:1より大きい、もしくは約9:1より大きい、もしくは約9:1の、エフェクター対ターゲット比で観察される、態様158〜175のいずれか一つの組成物。
【０４４９】
177.複数ラウンドの抗原特異的刺激に続くインビトロアッセイにおいて、組成物からのT細胞は、T細胞の集団を含む参照組成物と比較して、単一ラウンドの刺激と比較して、ならびに/または単一ラウンドの刺激および/もしくは前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の同じアッセイにおけるレベルと比較して、持続したまたは増加したレベルの、T細胞の機能、健全性、または活性を示す因子を呈示するか、または呈示することが観察されている、態様158〜176のいずれか一つの組成物。
【０４５０】
178.参照細胞組成物は、発現するキメラ受容体が、CD40由来の細胞内シグナリングドメインを含まない異なる共刺激分子に由来する細胞内シグナリングドメインを含む点以外は、実質的に同じである遺伝子改変細胞を含有するか、または
遺伝子改変細胞はCD8＋ T細胞を含み、参照細胞組成物は、同じキメラ受容体を含む遺伝子改変T細胞を含むが、CD8＋ T細胞を含まないか、CD8＋ T細胞を同じ比では含まない、態様73〜87および165〜177のいずれか一つの組成物。
【０４５１】
179.参照細胞組成物は、異なる共刺激分子に由来する細胞内シグナリングを含む遺伝子改変T細胞を含み、
前記異なる共刺激分子は、TRAF-6誘導ドメイン、任意でOX40由来細胞内シグナリングドメインを含む、別の共刺激分子であるか、または
前記異なる共刺激分子は、ICOS由来の細胞内シグナリングドメインである、
態様178の組成物。
【０４５２】
180.因子のレベルが、単一ラウンドの刺激および/または前記複数ラウンドより少ないラウンド数の刺激に続いて評価した場合の同じアッセイにおける参照集団または参照レベルと比較して、減少しない、態様175〜179のいずれか一つの組成物。
【０４５３】
181.前記複数ラウンドの刺激が少なくとも3、4、または5ラウンドを含み、かつ/または少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25日の期間にわたって行われる、態様175〜180のいずれか一つの組成物。
【０４５４】
182.ある疾患または状態を有する対象に、態様153〜155および157のいずれか一つの細胞または態様158〜181のいずれか一つの組成物を投与する工程を含む、処置の方法。
【０４５５】
183.キメラ受容体が、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する、態様182の方法。
【０４５６】
184.疾患または状態が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である、態様182または態様183の方法。
【０４５７】
185.遺伝子改変T細胞または遺伝子改変T細胞のサブセットが、対象において、同じ投薬量またはほぼ同じ投薬量の参照細胞組成物を投与された対象の場合よりも、増加したまたはより長期の増大および/または持続性を呈する、態様182〜184のいずれか一つの方法。
【０４５８】
186.遺伝子改変T細胞または遺伝子改変T細胞のサブセットがCD8＋ T細胞である、態様185の方法。
【０４５９】
187.増加または減少が、細胞の投与から1ヶ月以内、2ヶ月以内、6ヶ月以内、または1年以内に観察され、または存在する、態様185または態様186の方法。
【０４６０】
188.参照細胞組成物は、発現するキメラ受容体が、CD40由来の細胞内シグナリングドメインを含まない異なる共刺激分子を含む点以外は実質的に同じ遺伝子改変細胞を含有する、態様185〜187のいずれか一つの方法。
【０４６１】
189.前記異なる共刺激分子が、TRAF-6誘導ドメイン、任意で、OX40由来の細胞内シグナリングドメインを含む別の共刺激分子である、態様188の組成物。
【０４６２】
190.疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置する際に使用するための態様158〜181のいずれか一つの組成物。
【０４６３】
191.疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置するための態様158〜181のいずれか一つの組成物の使用。
【０４６４】
192.疾患または状態を有する対象における疾患または状態を処置するための医薬を製造するための、態様158〜181のいずれか一つの組成物の使用。
【０４６５】
193.リガンド結合受容体が、前記疾患または状態と関連するリガンドまたは抗原に特異的に結合する、態様190の使用のための組成物または態様191もしくは態様192の使用。
【０４６６】
194.疾患または状態が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、または感染性疾患である、態様190〜193のいずれか一つの使用のための組成物または使用。
【実施例】
【０４６７】
VII.実施例
以下の実施例は、単に例示を目的として含めるのであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０４６８】
実施例1:TRAF-6シグナリングエンドドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）の作製
CD3ゼータ細胞内シグナリングドメインに加えて、ヒトCD40（SEQ ID NO:12、SEQ IN NO:34に示す配列によってコードされるもの）、ヒトOX40（SEQ ID NO:32、SEQ IN NO:33に示す配列によってコードされるもの）またはヒトICOS（SEQ ID NO:35、SEQ IN NO:36に示す配列によってコードされるもの）のいずれかの細胞内シグナリングドメインに由来する共刺激受容体構成成分を保持するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸分子を作製した。具体的に述べると、作製された各核酸コンストラクトによってコードされるCARは、順に、抗CD19 scFv（SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28に示す配列によってコードされるもの）; Ig由来のスペーサー（SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2に示す配列によってコードされるもの）、ヒトCD28由来の膜貫通ドメイン（SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:46に示す配列によってコードされるもの）、上に示した指定のCD40、OX40またはICOS由来の細胞内シグナリングドメイン;およびヒトCD3-ゼータ由来のシグナリングドメイン（SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:41に示す配列によってコードされるもの）を含有した。
【０４６９】
CARをコードする核酸配列は、GMCSFRシグナルペプチド（SEQ ID NO:37）をコードするシグナル配列も含有した。核酸分子は、自己切断性T2A配列（SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:40に示す配列によってコードされるもの）によってCAR配列から隔てられた、形質導入マーカーとして使用するための切断型EGFR（tEGFR）配列（SEQ ID NO:31、SEQ IN NO:30に示す配列によってコードされるもの）も含んだ。
【０４７０】
比較のために、抗CD19 scFv、Ig由来のスペーサー、ヒトCD28由来の膜貫通ドメイン、ヒトCD28由来の共刺激シグナリングドメインまたはヒト4-1BB由来の共刺激シグナリングドメインのどちらか一方、およびヒトCD3-ゼータ由来のシグナリングドメインを含有する追加CARを作製した。
【０４７１】
この核酸分子をレンチウイルスベクターにクローニングし、それを使って、ヒトドナーからイムノアフィニティーベースの濃縮によって単離された初代T細胞に形質導入した。
【０４７２】
実施例2:TRAF-6シグナリングエンドドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）によるインビトロ機能アッセイ
上述のように生産されたさまざまなCARを発現する遺伝子改変細胞を、CD19発現細胞との共培養に続くさまざまな応答について評価した。ターゲット細胞殺滅およびサイトカイン生産を評価するためのインビトロアッセイを、CD19形質導入K562細胞を使って行った。
【０４７３】
2A.細胞溶解活性
CD19発現ターゲット細胞（CD19を発現するように形質導入されたK562細胞、K562-CD19）を、上述したさまざまな改変T細胞と共に、9:1、3:1または1:1のさまざまなエフェクター対ターゲット細胞（E:T）比で、インキュベートした。ターゲット細胞だけが存在するインキュベーション（ターゲットのみ）またはターゲット細胞とCARを発現しないT細胞とのインキュベーション（モック）を対照として使用した。共培養4日目に、アポトーシス細胞を検出するためにIncuCyte（商標）蛍光カスパーゼ3/7試薬を共培養物に添加することにより、0〜約110時間の時間経過にわたって、細胞溶解をリアルタイムにモニタリングした。経時的な自動画像解析によってターゲット細胞死を定量した。各濃度について、経時的な蛍光シグナルの曲線下面積（AUC）を決定した。式:1/AUCを使って殺滅指数を決定した。
【０４７４】
図1は各試験条件についての殺滅指数を示している。図1に示すように、CD40由来、ICOS由来、またはOX40由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現する改変T細胞は、CD19発現ターゲット細胞を殺した。試験したCARの一部については、殺滅のレベルが、4-1BBまたはCD28に由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するT細胞に匹敵するレベルであったが、より高いエフェクター:ターゲット細胞比では、一定のCAR発現について、より多くの殺滅が観察された。
【０４７５】
2B.サイトカイン放出
CAR発現細胞を抗原発現K562-CD19ターゲット細胞と共に1:1、3:1および9:1のE:T比でインキュベートした後のサイトカイン放出を、上述の殺滅アッセイで得た4日目の上清から評価した。具体的に述べると、培養上清中のTNF-α、IFNγ、GM-CSFおよびIL-2の存在を、Luminex（登録商標）ビーズベースマルチプレックスアッセイを使って評価した。図2A〜Dの結果は、ターゲット細胞を、CD40由来、OX40由来またはICOS由来の細胞内シグナリングドメインを含有するCAR発現T細胞のそれぞれと共にインキュベートした後に得られた上清には、CD28由来または41BB由来の細胞内シグナリングドメインを含有するCARで改変された細胞と比較して、すべてのE:T比において、匹敵するレベルのTNF-α、IFNγおよびGM-CSFサイトカインが存在することを示した。図2Dに示すように、OX40またはICOS共刺激シグナリングドメインを保持するCAR発現T細胞と共にインキュベートした共培養物から得られた上清中のIL-2のレベルには、特に最も高い9:1のE:T比において、多少の相違が観察された。
【０４７６】
照射K562-CD19ターゲット細胞またはCD19抗原を発現しない親K562細胞と、1:1のE:T比で、ゴルジ阻害剤の存在下、4時間にわたって共培養した改変T細胞中の細胞内サイトカインレベルをモニタリングすることによって、追加の研究を行った。次に、刺激後の細胞を固定し、透過処理し、TNF、IFN-γ、IL-17A、グランザイムB、IL-13、IL-22、IL-10、またはIL-2について染色した。CD8＋サブセットとCD4＋サブセットを表示の細胞内サイトカインについて別々に評価する前に、まず、CD3＋細胞についてゲーティングし、次にCAR＋細胞（抗CAR抗体を使って同定するか、代用EGFRtマーカーを検出するために抗EGFR抗体を使って同定した）についてゲーティングすることによって同定された、CD4＋/CAR＋細胞およびCD8＋/CAR＋生細胞において、細胞内サイトカインの存在を、フローサイトメトリーによって評価した。
【０４７７】
CD8＋細胞におけるサイトカイン発現を、図3A、CD40;図3B、OX40;図3C、ICOS;図3D、4-1BB;図3E、CD28に示し、CD4＋については、図4A、CD40;図4B、OX40;図4C、ICOS;図4D、4-1BB;図4E、CD28に示す。黒色で示されているのは、K562-CD19ターゲット細胞で刺激されたCAR改変T細胞中の細胞内サイトカインであり、灰色で示されているのは、K562親細胞で刺激されたCAR改変体中の細胞内サイトカインである。各象限の数字は、K562-CD19ターゲット細胞で刺激されたCAR改変細胞を指し、表示した1つまたは複数のサイトカインについて陽性であるそれぞれのCD8＋サブセットまたはCD4＋サブセットについて、そのようなCAR＋細胞のパーセンテージを、当該サブセットの全CAR＋細胞のパーセンテージとして表している。
【０４７８】
実施例3:連続再刺激後の増大の評価
反復刺激に続いてエクスビボで増大する細胞の能力は、いくつかの局面において、CAR-T細胞の（例えば初期活性化に続く）持続能力を示すことができ、かつ/またはインビボでの機能を示す（Zhao et al.（2015）Cancer Cell, 28:415-28）。上述のように作製したCAR-T細胞を、照射ターゲット細胞（K562-CD19）と共に、1:1のエフェクター対ターゲット比で培養した。細胞を刺激し、3〜4日ごとに回収してカウントし、細胞数をラウンドごとに最初の播種密度に再設定してから、同じ培養条件を使って新しいターゲット細胞で再刺激した。14日間の培養期間中に合計4ラウンドの刺激を実行した。各刺激ラウンドについて、倍加数を決定した。
【０４７９】
図5に示すように、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現する抗CD19CAR改変細胞の、同等な初期成長が、集団倍加数に観察された。刺激11日目までは、CD40、CD28、または4-1BB由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現する抗CD19CAR改変細胞の継続的な細胞増大が観察された。
【０４８０】
実施例4:TRAF-6シグナリングエンドドメインを保持するCAR改変T細胞のインビボでの抗腫瘍効力および増大
NOD/Scid/gc-/-（NSG）マウスにCD19＋ Nalm-6播種性腫瘍株の細胞を注射することによって、播種性腫瘍異種移植片マウスモデルを作製した。
【０４８１】
ゼロ（0）日目に、ホタルルシフェラーゼを発現する5×105個のNalm-6細胞をNSGマウスに静脈内注射した。4日目に、マウスを、各群8匹の5つの試験群にグループ分けし、実施例1で述べたように作製した1×106個のCAR改変T細胞を、次のように注射した:1）第1群-CD40由来の細胞内シグナリングドメインを保持するCARを発現するCAR-T細胞;2）第2群-OX40由来の細胞内シグナリングドメインを保持するCARを発現するCAR-T細胞;3）第3群-ICOS由来の細胞内シグナリングドメインを保持するCARを発現するCAR-T細胞;4）第4群-4-1BB由来の細胞内シグナリングドメインを保持するCARを発現するCAR-T細胞;または5）第5群-CD28由来の細胞内シグナリングドメインを保持するCARを発現するCAR-T細胞。対照として、さらに2つの試験群、具体的には、細胞を何も注射しなかったマウス5匹の試験群（腫瘍のみの試験群）およびCARを発現しない1×106個のT細胞を注射したマウス8匹の試験群（モック試験群）を、追加した。
【０４８２】
4A.腫瘍成長および生存
上述の処置に続いて、経時的な腫瘍成長を生物発光イメージングによって測定し、ホタルルシフェラーゼを発現するCD19＋ Nalm-6細胞の注射の28日後まで、平均放射輝度（p/s/cm2/sr）を測定した。図6Aに示すように、CD40、OX40、CD28、ICOS、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインのいずれかを発現するCAR改変細胞を注射したマウスの5つの試験群は、腫瘍のみの試験群およびモック試験群の両者と比較して、試験したどの時点でも平均放射輝度の量に同等な低減を示した。これは、この研究におけるCAR改変細胞の同等な抗腫瘍効力を示している。
【０４８３】
各試験群のマウスを、生存についても、ホタルルシフェラーゼを発現するCD19＋ Nalm-6細胞の注射の40日後まで評価した。図6Bは、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BB由来の共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスの生存パーセントを描いている。腫瘍注射のそれぞれ23日後および24日後までしか生き残らなかった腫瘍のみの試験群およびモック試験群と比較して、各被験群のマウスは、腫瘍注射の約35日後まで生きた。
【０４８４】
4B.インビボ増大
CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスからの血液、脾臓、および骨髄を、7日目または28日目に、EGFRt＋ CAR T細胞および/または腫瘍細胞の存在について分析した。例示的な結果を、28日目の血液、脾臓または骨髄における腫瘍細胞の量について図7A〜Cに示し、28日目の骨髄における循環CD4＋またはCD8＋ CAR-T細胞の量についてそれぞれ図7Dおよび図7Eに示す。
【０４８５】
図7A〜Cに示すように、CD40、OX40、ICOS、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞が投与されたマウスの血液、脾臓または骨髄に検出される腫瘍細胞は、モック試験群と比較して少なかった。図7D〜Eに示すように、CD40、CD28、または4-1BBに由来する共刺激シグナリングドメインを含有するCARを発現するCAR改変細胞は、他のCAR発現細胞と比較して、骨髄中に、より多数の循環CD4＋および/またはCD8＋ CAR-T細胞を呈した。
【０４８６】
本発明は、例えば本発明のさまざまな局面を例示するために提供される開示した特定の態様に、その範囲を限定されるものではない。記載した組成物および方法へのさまざまな修飾は、本明細書の記載および教示内容から明白になるであろう。そのような変形態様は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内に含まれるものとする。
【０４８７】
配列
2018532432.tif 000003
2018532432.tif 000004
2018532432.tif 000005
2018532432.tif 000006
2018532432.tif 000007
2018532432.tif 000008
【図１】
2018532432.tif 000010
【図２Ａ】
2018532432.tif 000011
【図２Ｂ】
2018532432.tif 000012
【図２Ｃ】
2018532432.tif 000013
【図２Ｄ】
2018532432.tif 000014
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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