(57)【要約】  本発明は、a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及びb. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及びd. 約1.0 nM〜約500 mMの間の、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及びe. 厳密に約0% w/wより大きく、約0.5% w/wまでの間の、i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及びii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンを含む防腐剤溶液を含む、少なくとも1種の生体分子を保存するための組成物に関する。
2018525321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；
c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約1.0 nM〜約500 mMの間の、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 厳密に0% w/wより大きく、約0.5% w/wまでの間の、
i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む、少なくとも1種の生体分子を保存するための組成物。
【請求項２】
a. 約8.0% w/w〜約10.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約1.8% w/w〜約2.2% w/wの間のD-マンニトール；及び
c. 約0.04% w/w〜0.06% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約45 nM〜約55 mMの間の、約5.5〜約6.5の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 厳密に0% w/wより大きく、約0.25% w/wまでの間の、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；
c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約1.0 nM〜約500 mMの、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0.01% w/w〜約0.5% w/wの間の、
i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
a. 約8.0% w/w〜約10.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約1.8% w/w〜約2.2% w/wの間のD-マンニトール；及び
c. 約0.04% w/w〜0.06% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約45 nM〜約55 mMの間の、約5.5〜約6.5の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0.01% w/w〜約0.25% w/wの間の、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
液相中で少なくとも1種の生体分子を保存するための方法であって、連続する以下の：
i. 前記生体分子を含む容器を準備する工程；
ii. 前記生体分子を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物で可溶化させる工程；
iii. 容器に不活性ガスを充填する工程；
iv. 容器に封をする工程
を含む、方法。
【請求項６】
固相中で少なくとも1種の生体分子を保存するための方法であって、連続する以下の：
i. 前記生体分子を含む容器を準備する工程；
ii. 前記生体分子を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物で可溶化させる工程；
iii.少なくとも以下の：
1. 第一の圧力P1での凍結工程；及び
2. 前記第一の圧力P1よりも低い第二の圧力P2での一次乾燥工程
を行うことにより、前記生体分子を凍結乾燥する工程；並びに
iv. 容器に不活性ガスを充填する工程；
v. 容器に封をする工程
を含む、方法。
【請求項７】
液相中で少なくとも1種の生体分子を保存するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を保存するための組成物及び液相中で生体分子を保存するためのその使用に関する。また、本発明は、固相中で生体分子を保存するための方法、及び液相中で生体分子を保存するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子は、活性状態にも不活性状態にもなり得る。生体分子の活性状態は、生体分子の三次元構造を形成し、それにより生体分子の機能状態及び作動状態を確保する、原子間の共有結合的及び非共有結合的相互作用に基づく。対照的に、不適切な条件で保存されると、非共有結合的相互作用の少なくとも一部が変化し、生体分子は不活性状態になる。例えば、活性状態の酵素は、生化学的反応を触媒することができるが、一方で酵素が不活性状態にある場合は、生化学反応を触媒することができない。
【０００３】
生物学的アッセイを行うには、一般的には、供給元により、適切な保存バッファーに入って提供される市販の生体分子が必要となる。この点において、保存バッファーは、生体分子を活性状態に維持することを狙いとしている。基本的に、生体分子は、凍結乾燥を経て固相中に保存されるか、又は液相中に保存される。凍結乾燥は、通常、活性な生体分子の緩衝液に対して行われる、連続的なフリーズ・ドライの工程を含む。代替的に、活性な生体分子は、液体保存のための専用の保存バッファー溶液で希釈される。一般的に、固相保存又は液相保存は、特に生体分子の種類、生体分子の安定性、及び保存の期間に応じて選択される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
既存の保存バッファーは、一般的には液相保存又は固相保存のいずれかに特異的に設計されている。出願人の知る限りでは、生体分子を固相及び液相中で保存するための多価（万能）保存バッファーは存在しない。
【０００５】
製品の保存を最適化する過程で、出願人は、生体分子を固体状態又は液体状態で保存するための独自の保存バッファーを開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；
c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約1.0 nM〜約500 mMの間の、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0% w/w〜約0.5% w/wの間の、
i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む、少なくとも1種の生体分子を保存するための組成物を提供することにより、これらの目的を充足する。
【０００７】
また、本発明は、液相中で少なくとも1種の生体分子を保存するための方法であって、連続する以下の：
i. 前記生体分子を含む容器を準備する工程；
ii. 前記生体分子を、本発明に係る組成物で可溶化させる工程；
iii. 容器に不活性ガスを充填する工程；
iv. 容器に封をする工程
を含む、方法にも関する。
【０００８】
さらに、本発明は、固相中で少なくとも1種の生体分子を保存するための方法であって、連続する以下の：
i. 前記生体分子を含む容器を準備する工程；
ii. 前記生体分子を、本発明に係る組成物で可溶化させる工程；
iii.少なくとも以下の：
1. 第一の圧力P1での凍結工程；及び
2. 前記第一の圧力P1よりも低い第二の圧力P2での一次乾燥工程
を行うことにより、前記生体分子を凍結乾燥する工程；並びに
iv. 容器に不活性ガスを充填する工程；
v. 容器に封をする工程
を含む、方法にも関する。
【０００９】
最後に、本発明は、液相中で少なくとも1種の生体分子を保存するための、本発明に係る組成物の使用に関する。
【００１０】
したがって、本発明は、固相又は液相のいずれかの中で少なくとも1種の生体分子を保存することができる組成物を提供することにより、課題を解決する。本発明に係る組成物は、異なる保存温度を必要とする生体分子を保存するために使用することができるように、保存温度の柔軟性を提供する。
【００１１】
固体担体に結合された生体分子は、生体分子の前記固体担体との相互作用のために、分解されがちである。しかしながら、本発明に係る組成物は、固体担体に結合された生体分子を、液体状態又は固体状態の両方で保存するのに効果的であることが判明する。したがって、組成物は、微粒子に結合されたタンパク質を保存するために適切であることがわかる。生体分子を保存することに関しては、本発明に係る組成物は、固体保存又は液体保存のいずれについても、既存の保存バッファーより優れており、特に以下の実施例３で、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での42日間にわたる試験において例示するとおり、活性状態にある生体分子の割合は、前記組成物中において、既存の保存バッファーにおける活性状態の生体分子の割合よりも、より高く、より長い期間維持される。したがって、さらに、本発明に係る組成物により、生体分子、より特定すれば捕捉生体分子を、活性状態で、液体状態又は固体状態のいずれにおいても保存することができる。
【００１２】
固体保存、例えばフリーズ・ドライプロセスによる凍結乾燥を経るものは、典型的には異なる圧力及び温度での複数の工程を必要とする。対照的に、液体保存プロセスは、限られた数の工程を含み、大抵の場合は、保存する生体分子を単に液体保存組成物中に希釈し、液体の上部の空気を不活性ガスで置換する。
【００１３】
有利には、本発明に係る組成物は、少なくとも1種の生体分子を液相中で保存するのに特に適合している。特に、本発明に係る組成物により、室温、例えば20℃〜30℃の間で、生体分子を活性状態で保存することができるが、この点は実験室内で生体分子を保存することに関して、非常に興味深い。この点において、本発明に係る組成物中の糖類（サッカライド）誘導体、例えばトレハロース及びマンニトールの存在が、生体分子の活性を保つのに重要な役割を果たしているようである。
【００１４】
本発明は、少なくとも1種の生体分子を保存するための組成物及びその使用の例示的及び説明的実施態様を表す、付属の図面を考慮して説明される、以下の詳細な説明によりさらに例示される。説明には以下の図面が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】図1aは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、MCBSバッファー中の捕捉抗体IL-6を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図１ｂ】図1bは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、MCBSバッファー中の捕捉抗体TNF-アルファを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図１ｃ】図1cは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、MCBSバッファー中のIL-1ベータを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図１ｄ】図1dは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、MCBSバッファー中のIL-2を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図２ａ】図2aは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSバッファー中の捕捉抗体IL-6を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図２ｂ】図2bは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSバッファー中の捕捉抗体TNF-アルファを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図２ｃ】図2cは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSバッファー中のIL-1ベータを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図２ｄ】図2dは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSバッファー中のIL-2を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図３ａ】図3aは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSTNaバッファー中の捕捉抗体IL-6を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図３ｂ】図3bは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSTNaバッファー中の捕捉抗体TNF-アルファを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図３ｃ】図3cは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSTNaバッファー中のIL-1ベータを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図３ｄ】図3dは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、PBSTNaバッファー中のIL-2を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図４ａ】図4aは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、SG02（登録商標）（StabilGuard Choice Microarray Stabilizer）バッファー中の捕捉抗体IL-6を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図４ｂ】図4bは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、SG02（登録商標）（StabilGuard Choice Microarray Stabilizer）バッファー中の捕捉抗体TNF-アルファを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図４ｃ】図4cは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、SG02（登録商標）（StabilGuard Choice Microarray Stabilizer）バッファー中のIL-1ベータを検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【図４ｄ】図4dは、42日間にわたる、-20℃、4℃、24℃、及び37℃での、SG02（登録商標）（StabilGuard Choice Microarray Stabilizer）バッファー中のIL-2を検出することを目的とするイムノアッセイ中の蛍光の発生を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施態様によれば、本発明に係る組成物は、
a. 約8.0% w/w〜約10.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約1.8% w/w〜約2.2% w/wの間のD-マンニトール；及び
c. 約0.04% w/w〜0.06% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約45 nM〜約55 mMの間の、約5.5〜約6.5の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0% w/w〜約0.25% w/wの間の、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００１７】
有利には、この実施態様による組成物は、既存の保存溶液と比較すると、活性状態の生体分子の割合を著しく向上させる。さらに、前記組成物により、生体分子を活性状態で保存することができる。
【００１８】
一実施態様において、組成物は、厳密に0% w/wより多い防腐剤溶液を含む。換言すれば、前記実施態様によれば、防腐剤溶液が無い場合は除かれる、すなわち本発明の組成物は、必然的に前記防腐剤溶液を含む。
【００１９】
前記実施態様によれば、本発明の組成物は、
a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；
c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約1.0 nM〜約500 mMの、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0% w/w、ただしこの割合は厳密に0より大きく、約0.5%までの間の、
i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００２０】
前記実施態様によれば、本発明の組成物は、好ましくは、
a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；
c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約1.0 nM〜約500 mMの、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 厳密に0% w/wより大きく、約0.5% w/wまでの間の、
i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン.
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００２１】
より好ましくは、この実施態様によれば、本発明の組成物は、
a. 約0.2% w/w〜約20.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約0.1% w/w〜約10.0% w/wの間のD-マンニトール；
c. 約0.01% w/w〜0.3% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約1.0 nM〜約500 mMの、約4.0〜約8.0の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0.01% w/w〜約0.5% w/wの間の、
i. 約1.0% w/w〜約5.0% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/w〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００２２】
さらにより好ましくは、この実施態様において、防腐剤溶液は、本発明の組成物の約0.05% w/w〜約0.5% w/wの間、より好ましくは0.05% w/w〜約0.5% w/wの間、さらにより好ましくは0.1% w/w〜約0.5% w/wの間を占め、前記防腐剤溶液は、
i. 約1.0% w/〜約5.0% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.1% w/〜約3.0% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む。
【００２３】
有利には、一実施態様によれば、本発明の組成物は、
a. 約8.0% w/w〜約10.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約1.8% w/w〜約2.2% w/wの間のD-マンニトール；及び
c. 約0.04% w/w〜0.06% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約45 nM〜約55 mMの間の、約5.5〜約6.5の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0% w/w、ただしこの割合は厳密に0より大きく、約0.25%までの間の、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００２４】
有利には、同実施態様によれば、本発明の組成物は、好ましくは、
a. 約8.0% w/w〜約10.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約1.8% w/w〜約2.2% w/wの間のD-マンニトール；及び
c. 約0.04% w/w〜0.06% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約45 nM〜約55 mMの間の、約5.5〜約6.5の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 厳密に0% w/wより大きく、約0.25% w/wまでの間の、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００２５】
より有利には、同実施態様によれば、本発明の組成物は、
a. 約8.0% w/w〜約10.0% w/wの間のD-(+)-トレハロース二水和物；及び
b. 約1.8% w/w〜約2.2% w/wの間のD-マンニトール；及び
c. 約0.04% w/w〜0.06% w/wの間のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；及び
d. 約45 nM〜約55 mMの間の、約5.5〜約6.5の間のpHのクエン酸ナトリウム；及び
e. 約0.01% w/w〜約0.25% w/wの間の、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む防腐剤溶液
を含む。
【００２６】
有利には、この実施態様において、防腐剤溶液は、本発明の組成物の約0.05% w/w〜約0.25% w/wの間、より好ましくは0.05% w/w〜約0.25% w/wの間、さらにより好ましくは0.1% w/w〜約0.25% w/wの間を占め、前記防腐剤溶液は、
i. 約2.1% w/w〜約2.5% w/wの間の5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン；及び
ii. 約0.6% w/w〜約0.8% w/wの間の2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン
を含む。
【００２７】
一実施態様において、少なくとも1種の生体分子は、固体担体上に結合されている。有利には、本発明に係る組成物は、少なくとも1つの固体担体上に結合されている生体分子を保存するのに適している。例えば、本発明は、少なくとも1つの微粒子に結合されている抗体を保存するのに特に適合している。
【００２８】
一実施態様において、少なくとも1種の生体分子を液体及び/又は固体保存中で保存するための保存バッファーは、本発明に係る組成物から成る。
【００２９】
一実施態様において、生体分子は、タンパク質、好ましくは抗体である。
【００３０】
一実施態様において、不活性ガスは、窒素若しくはアルゴン又はこれらの混合物から選択される。
【００３１】
本発明によれば、用語「少なくとも1種の生体分子を保存する」は、その製造後の、適切な媒体中での生体分子の保存を指し、前記媒体は、生体分子の変性を制限するのに適している。
【００３２】
本発明によれば、用語「防腐剤溶液」は、組成物と混合される場合に、前記組成物中の細菌、並びに/又は真菌及び/若しくは酵母の成長を制限することができる溶液を指す。
【００３３】
一実施態様によれば、用語「液体状態」は、本質的に液体状態にある、好ましくは液体状態にある組成物を指す。
【００３４】
本発明によれば、用語「液相中で少なくとも1種の生体分子を保存する」は、本質的に液体状態にある、好ましくは液体状態にある組成物において保存される、少なくとも1種の生体分子を指す。
【００３５】
一実施態様によれば、用語「固体状態」は、本質的に固体状態にある、好ましくは固体状にある組成物を指す。固体状態は、複数のプロセスにより得ることができる。例えば、前記プロセスは、凍結、フリーズ・ドライ、又は凍結乾燥から選択される。
【００３６】
本発明によれば、用語「固相中で少なくとも1種の生体分子を保存する」は、本質的に固体状態にある、好ましくは固体状態にある組成物において保存される、少なくとも1種の生体分子を指す。
【００３７】
本発明によれば、用語「タンパク質の活性」は、前記タンパク質の活性状態と不活性状態との相対的割合を指す。
【００３８】
活性状態では、タンパク質は機能的であり、その機能を果たすように作動する。例えば、タンパク質が酵素である場合、活性状態では、前記酵素は生化学的反応を触媒することができるが、一方で酵素が不活性状態にある場合は、生化学反応を触媒することができない。
【実施例】
【００３９】
「実施例１：保存バッファーの調製」
本発明に係る組成物を含む保存バッファーは、以下の工程により調製される：
1.i. 5.25 gのクエン酸一水和物（CAS番号5949-29-1）
ii. 500 mlの水（CAS番号7732-18-5）
を含む溶液１を調製する工程；
2.i. 29.41 gのクエン酸ナトリウム二水和物（CAS番号6131-04-3）
ii. 2000 mlの水（CAS番号7732-18-5）
を含む溶液２を調製する工程；
3. 230 mlの溶液１と1770 mlの溶液２とを混合して溶液３を得る工程；
4. 溶液３に溶液１及び/又は溶液２を加えることにより、溶液３をpH 6に調整する工程；
5. 溶液３を、
i. 1.0 gのtween 80（CAS番号9005-65-6）
ii. 180 gのD-(+)-トレハロース二水和物（CAS番号6138-23-4）
iii. 40 gのD-マンニトール（CAS番号69-65-8）
と混合することにより、溶液４を調製する工程
6. 溶液４を0.2マイクロメートルのフィルター膜に通すことにより、溶液４を濾過する工程；
7. 工程６由来の溶液４を2 mlのProClin（登録商標） 300（Sigma-Aldrichにより市販されており、5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、CAS番号26172-55-4；及び2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、CAS番号2682-20-4を含む、ProClin（登録商標） 300）と混合することにより、溶液５を調製する工程。
【００４０】
本実施例で調製された保存バッファーは、少なくとも1種の生体分子を液相中及び固相中で、好ましくは液相中で保存するのに適している。
【００４１】
「実施例２：微粒子に結合された生体分子を凍結乾燥するための凍結乾燥プロセス」
凍結乾燥プロセスは、以下の工程を含む：
1. 生体分子又は微粒子にグラフトされた生体分子を含む容器を準備する工程。例えば、容器は試験管又はカートリッジであってもよい。本実施例の場合には、容器は、約20 000の微粒子を含む試験管である；
2. 前記微粒子を、適切な液量の、上記実施例１に従って調製した本発明に係る組成物と接触させる工程。本実施例では、3.3マイクロリットルの組成物を試験管に分注し、前記溶液は、
3% (w/v)のトレハロース、2% (w/v)のマンニトール、0.05%のTween 80、10 mMのpH 6のクエン酸ナトリウムバッファー
を含む；
3. ・凍結工程：室温（約20℃）から-50℃まで、3時間50分間にわたり、大気圧（約1バール）で；続いて
・一次フリーズ・ドライ工程：-50℃から30℃まで、22にわたり、40マイクロバールで
を含むフリーズ・ドライプロセスを行うことにより、組成物中に含まれる微粒子を凍結乾燥する工程；
4. 容器中に含まれる、生じた凍結乾燥された微粒子を、窒素と接触させて、窒素雰囲気下で保存する工程；
5. 容器に封をする工程。
【００４２】
「実施例３：4種の候補保存バッファー中の4種のタンパク質の活性の比較」
本実施例は、4種類の候補保存バッファー中の、微粒子上に結合されたタンパク質の活性を試験することを目的とする。
【００４３】
本試験について、候補保存バッファーは：
・MCBS：上述の実施例１に従って調製された、MyCartis Biomolecule Storageバッファー；
・PBSベースのバッファー（PBSはリン酸緩衝液生理食塩水（Phosphate Buffered Saline）を意味する）：
i. PBSベースのバッファーは、10 mM PBS、0.1% BSA（CAS番号9048-46-8）、0.02% Tween20（CAS番号9005-64-5）、0.05%アジ化ナトリウム（CAS番号26628-22-8）を含む；
ii. pHは、7.2〜7.4に調整され、前記PBSベースのバッファーは、0.2マイクロメートルのフィルター膜で濾過される；
・PBSTNaバッファー：
i. PBSNaバッファーは、10 mM PBS、0.3% Tween 20（CAS番号9005-64-5）、0.05%アジ化ナトリウム（CAS番号26628-22-8）を含む；
ii. pHは、7.2〜7.4に調整され、前記PBSNaバッファーは、0.2マイクロメートルのフィルター膜で濾過される。
・SG02（登録商標）：StabilGuard Choice Microarray Stabilizer（SurModics、エデン・プレイリー、ミネソタ、米国により市販されるSG02（登録商標））
である。
【００４４】
本試験では、2種の捕捉抗体、IL-6（クローンMQ2-13A5）及びTNF（BD Biosciences（登録商標）により市販されている、クローンMAb1）、並びに2種のサイトカイン（IL-1ベータ及びIL-2）を、微粒子に結合させた。試験の前に、出願人は、4種のタンパク質を有意な交差反応性/非特異的シグナルを生じることなくマルチプレックスアッセイ形式で試験することができることを検証した。
【００４５】
候補保存バッファーの各々の中での対象の各タンパク質の活性状態の割合を決定するために、以下の7工程の手順を行った：
1. 1種類の対象のタンパク質（本実施例において、捕捉抗体IL-6又はTNF並びにサイトカインIL-1ベータ及びIL-2から選択される）を、1セットの微粒子上に結合させる工程であり、ここで各セットの微粒子には、そこに結合させたタンパク質を同定するための特定のコードがコードされている；
2. 各セットの微粒子を4等分に分割し、1部をMCBP中に、1部をPBSベースのバッファー中に、1部をPBSTNa中に、及び1部をSG02（登録商標）中に混合する工程；
6. 各試験日に、マルチプレックス機能アッセイにおいて、各セットの微粒子の蛍光を測定することにより、活性なタンパク質の割合を決定する工程；本試験において、測定される蛍光は、微粒子に結合された対象のタンパク質を認識するように設計された標識二次抗体により放出される。
7. 各試験日の蛍光を、保存期間及び温度の関数でプロットし、蛍光を、-80℃で各候補保存バッファー中に保存した参照アリコートに対し正規化する。
【００４６】
本実施例において、2種の捕捉抗体（IL-6及びTNF）並びに2種のサイトカイン（IL-1ベータ及びIL-2）を、候補バッファー中で異なる温度で保存し、1、7、14、28、及び42日目に、マルチプレックスアッセイで試験した。
【００４７】
各保存温度は、特定の目的を有している：-80℃で保存したサンプルは、分解が起こらないという想定の下、参照として用いられ、アッセイ間の変動に相当する；-80℃の結果は、各試験日の蛍光正規化参照として用いられる；20℃及び4℃は、好都合な保存温度であり、リアルタイムの活性状態の割合を評価するために用いられる；24℃及び37℃は、加速老化の目的を担い、バッファー候補の早期評価を可能にする。
【００４８】
本実施例において、蛍光を-80℃、-20℃、4℃、24℃、及び37℃で測定した。イムノアッセイ中、微粒子に結合されたタンパク質が活性状態である場合、前記タンパク質を検出することができ、蛍光シグナルが放出される。対照的に、前記タンパク質が不活性状態にある場合、タンパク質は検出されず、シグナルは放出されない。したがって、測定された蛍光により、活性状態及び不活性状態の生体分子の相対的割合を推定することができる。
【００４９】
捕捉抗体IL-6及びTNF-アルファが極限の状態、すなわち37℃で42日間保存される場合、40〜90%の活性状態の喪失が観察されるが、MCPSバッファー中で保存された場合は例外であり、この場合活性状態の喪失は-20%に制限される。したがって、MCPSは捕捉抗体IL-6及びTHFアルファの活性を妨げない。MCPSは、他の候補バッファーとは対照的に、試験した2種の抗体の活性状態を完全に維持する。24℃で42日間保存される場合、捕捉抗体IL-6及びTNFアルファの両方の活性状態の喪失は、MCBS中では非常に制限されるが、他の候補保存バッファーではそうではない。さらに、4℃又は-20℃でのデータは、42日後のMCBP中の捕捉抗体に関して、有意な活性状態の喪失を示さなかった。
【００５０】
-20℃、4℃、又は24℃のいずれにおいても、MCBP中の捕捉抗体に関して活性状態の喪失は観察されないが、他の保存バッファーではそうではない。したがって、他の候補保存バッファーとは対照的に、MCBPにより、液体状態又は固体状態のいずれにおいても、捕捉抗体を活性状態で保存することが可能になる。これらの知見は、液相中の4℃、24℃、及び37℃での捕捉抗体の保存、並びに固体状態での-80℃及び-20℃での保存についての本試験において実証される。
【００５１】
サイトカインに関しては、IL-2の活性状態の喪失は、MCBP中では50%に制限されるが、他の保存候補バッファー中ではそうではない。また、データは、37℃及び24℃では、活性状態のIL1-ベータの割合は、MCBSにおいて、他の候補保存バッファー中の活性状態のIL1-ベータの割合と比較して、より重大であることも示している。結合されたサイトカインが4℃以下で、MCPSバッファー中で保存される場合、他の候補バッファーとは対照的に、42日後、両方のサイトカインについて、有意な活性状態の喪失は観察されない。
【００５２】
本願に開示される明細書及び本発明の実施を考慮すれば、当業者には、本発明の他の実施態様が明らかである。明細書及び実施例は、例示的なものとしてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は以下の特許請求の範囲により示される。
【図１ａ】
2018525321.tif 000003
【図１ｂ】
2018525321.tif 000004
【図１ｃ】
2018525321.tif 000005
【図１ｄ】
2018525321.tif 000006
【図２ａ】
2018525321.tif 000007
【図２ｂ】
2018525321.tif 000008
【図２ｃ】
2018525321.tif 000009
【図２ｄ】
2018525321.tif 000010
【図３ａ】
2018525321.tif 000011
【図３ｂ】
2018525321.tif 000012
【図３ｃ】
2018525321.tif 000013
【図３ｄ】
2018525321.tif 000014
【図４ａ】
2018525321.tif 000015
【図４ｂ】
2018525321.tif 000016
【図４ｃ】
2018525321.tif 000017
【図４ｄ】
2018525321.tif 000018
【国際調査報告】
2018525321.tif 000019
2018525321.tif 000020
2018525321.tif 000021
2018525321.tif 000022
2018525321.tif 000023