(57)【要約】  本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴを細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することができる細胞標的化分子を提供する。本発明の細胞標的化分子は、事実上あらゆるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞外空間から標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路に送達するのに使用することができ、この標的細胞は、悪性細胞及び／又は非免疫細胞であり得る。標的細胞は、次いで、ＭＨＣ  Ｉ分子と複合体化した送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞表面上に提示し得る。本発明の細胞標的化分子は、脊索動物内を含む細胞型の混合物内での特定の細胞型の標的化された標識及び／又は殺滅、並びに有益な免疫応答の刺激を含む用途を有する。本発明の細胞標的化分子は、例えば、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染を含む様々な疾患、障害、及び状態の治療における用途を有する。
2018524006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）志賀毒素Ａ１断片領域を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
ii）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる異種結合領域と、
iii）志賀毒素Ａ１断片領域に埋め込まれていない異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと
を含む細胞標的化分子であって、
前記細胞標的化分子を細胞に投与することにより、前記細胞による前記細胞標的化分子の内在化、及び前記細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示がもたらされる、前記細胞標的化分子。
【請求項２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は結合領域に融合されている、請求項１に記載の細胞標的化分子。
【請求項３】
結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む一本鎖ポリペプチドを含む、請求項２に記載の細胞標的化分子。
【請求項４】
結合領域が、２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖を含み、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドが、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むポリペプチドと前記２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖のうちの１つとに融合されている、請求項２に記載の細胞標的化分子。
【請求項５】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来領域を含み、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、前記志賀毒素Ａ１断片由来領域の前記カルボキシ末端に対してカルボキシ末端側に位置する、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項６】
結合領域が、単一ドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域３断片、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、Ｆｄ断片、抗原結合断片、アルマジロ反復ポリペプチド、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニプロテイン、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項７】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、
（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１、
（iii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１、及び
（iv）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含むか又はそれから本質的になる、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項８】
志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端が、破壊されたフーリン切断モチーフを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項９】
破壊されたフーリン切断モチーフが、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、前記変異が、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０に天然に位置する領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する、請求項８に記載の細胞標的化分子。
【請求項１０】
破壊されたフーリン切断モチーフが、前記フーリン切断モチーフ中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対するアミノ酸残基の置換を含む、請求項８又は９に記載の細胞標的化分子。
【請求項１１】
フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換が、アルギニン残基から、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基への置換である、請求項１０に記載の細胞標的化分子。
【請求項１２】
結合領域が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイス−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイス−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ４５、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ＩＬ−１Ｒ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ−Ｌ１、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１３】
結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に細胞標的化分子を投与することにより、前記細胞標的化分子が、前記細胞の死を引き起こすことができる、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１４】
メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第１の細胞集団、及びメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第２の細胞集団に細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する前記細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果と比べて少なくとも３倍大きい、請求項１３に記載の細胞標的化分子。
【請求項１５】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、志賀毒素エフェクター領域の酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する変異を含み、前記変異が、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１６】
変異が、毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性を低減又は除去する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される、請求項１５に記載の細胞標的化分子。
【請求項１７】
配列番号１３〜６１及び７３〜１１５のいずれか１つのポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる、請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子、若しくはそれらの相補物、又は前述のもののいずれかの断片をコードすることができるポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のポリヌクレオチド又は発現ベクターのいずれか１つを含む、宿主細胞。
【請求項２２】
細胞を殺滅する方法であって、前記細胞を、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項１８に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項２３】
接触させるステップがインビトロで行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
接触させるステップがインビボで行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
患者における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項１８に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２６】
疾患、障害、又は状態が、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
がんが、骨がん、乳がん、中枢／末梢神経系がん、消化器がん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓から尿道のがん、肝臓がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫障害が、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、心臓発生、クローン病、糖尿病、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、リンパ増殖性障害、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎症、結節性多発性動脈炎、多発関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、脈管炎からなる群から選択される疾患と関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子を含む組成物。
【請求項３０】
がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための医薬品の製造における、請求項１〜２１のいずれかに記載の物質の組成物の使用。
【請求項３１】
脊索動物内の組織の場所を「シーディング」する方法であって、前記脊索動物に、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項１８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３２】
細胞標的化分子のＴ細胞エピトープ−ペプチドが、
ＭＨＣクラスＩ複合体において細胞標的化分子の標的細胞によって天然に提示されないペプチド、標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質中にも天然に存在しないペプチド、標的細胞のトランスクリプトーム又はプロテオーム中に天然に存在しないペプチド、シーディングしようとする部位の細胞外の微環境中に天然に存在しないペプチド、及び標的化しようとする腫瘤又は感染組織部位に天然に存在しないペプチド
からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
組織の場所が、悪性の、罹患した、又は炎症を起こした組織を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
組織の場所が、腫瘤、がん性の増殖、腫瘍、感染した組織、又は異常な細胞塊からなる群から選択される組織を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫療法を使用してがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞標的化分子又は請求項１８に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３６】
請求項１〜２１のいずれかに記載の物質の組成物並びに追加の試薬及び／又は医薬送達デバイスを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれが（１）細胞標的化のための結合領域、（２）細胞内送達のための志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド領域、及び（３）１つ又は２つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、細胞標的化分子であって、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、例えば、悪性細胞などの標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することができる、細胞標的化分子に関する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端に対してカルボキシ末端側の位置で志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドに直接的又は間接的のいずれかで連結された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することができる。本発明の細胞標的化分子は、例えば、細胞外の位置から標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの送達；提示されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープによる標的細胞の細胞表面標識化；特定の細胞型の選択的殺滅；インビボでの有益な免疫応答の刺激；標的細胞に対する細胞毒性Ｔリンパ球細胞応答の惹起；インビボでの有害な免疫応答の抑制；メモリー免疫細胞の生成、並びに様々な疾患、障害、及び状態、例えば、がん、腫瘍、他の増殖異常、免疫障害、及び微生物感染などの診断及び治療のための用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、自己と非自己とを識別することによって、身体を潜在的な有害物質侵入から保護している。両生類、鳥類、魚類、哺乳類、爬虫類、及びサメを含む脊索動物の免疫監視系は、防御免疫応答を開始するために、体内を外来分子に関して探査して、侵入してくる病原体、外来細胞、及び悪性細胞を特定している。有顎脊椎動物（顎口類）の免疫系は、脅威となる分子、病原体、及び／又は細胞を検出しようと、細胞外環境及び細胞内環境の両方を外来性エピトープに関して絶えず探査している。このような脊椎動物では、主要組織適合（ＭＨＣ，major histocompatibility）系が、免疫系のＴリンパ球（Ｔ細胞）による認識のためにペプチドを細胞表面上に提示するように機能する（Elliot T et al., Nature 348: 195-7 (1990)を参照）。ＭＨＣ系は、脊椎動物において、自己と非自己とを区別するための適応免疫系の一部として機能し、この免疫系が、病原体を除去し、外来分子を中和し、感染又は損傷した細胞を殺滅させ、形質転換された細胞を拒絶する免疫系の能力に寄与している（Janeway’s Immunobiology (Murphy K, ed., Garland Science, 8th ed., 2011)）。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩ系は、細胞内抗原のエピトープ提示を提供することによって、免疫系において欠かせない役割を果たしている（Cellular and Molecular Immunology (Abbas A, ed., Saunders, 8th ed., 2014)）。このプロセスは、主として、細胞内病原体、並びに細胞内抗原を発現する悪性細胞、例えば、がん細胞などから保護するために脊索動物において進化した系である適応免疫系の重要な部分であると考えられている。例えば、細胞内病原体が関与するヒト感染症は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスIIの両方の系の作用が合わさることによってのみ克服され得る（例えば、Chiu C, Openshaw P, Nat Immunol 16: 18-26 (2015)を参照）。ＭＨＣクラスＩ系は、細胞内抗原の特定に基づいて悪性細胞を特定し、殺滅させることに寄与している。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩ系は、脊椎動物のあらゆる有核細胞において細胞内（又は内因性）抗原を提示するように機能し、一方でＭＨＣクラスII経路は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ，antigen-presenting cell）において細胞外（又は外因性）抗原を提示するように機能する（Neefjes J et al., Nat Rev Immunol 11: 823-36 (2011)）。ＭＨＣクラスＩ系によって認識される細胞内又は「内因性」エピトープは、典型的には、細胞の小胞体（ＥＲ，endoplasmic reticulum）のサイトゾル又は内腔において遭遇する分子の断片であり、これらの分子は、典型的に、サイトゾルにおいてプロテアソーム及び／又は別のプロテアーゼによってタンパク質分解性プロセシングを受ける。ＥＲに存在する場合、これらの内因性エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子にロードされ、ｐＭＨＣ  Ｉとして細胞の表面上に提示される。対照的に、ＭＨＣクラスII系は、特化した細胞においてのみ、例えば、後期エンドソーム、リソソーム、ファゴソーム、及びファゴリソソームなどの特定のエンドソーム区画においてのみプロセシングされる細胞外遭遇分子に由来する外因性エピトープを認識するように機能し、これには、エンドサイトーシス細胞小器官に存在する細胞内病原体が含まれる。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ系によるペプチド提示には、５つの主要なステップが関与する：１）サイトゾルペプチドの生成、２）ＥＲの内腔へのこれらのペプチドの輸送、３）ある特定のペプチドと結合したＭＨＣクラスＩ分子の安定な複合体の形成、４）細胞表面上でのこれらの安定なｐＭＨＣ  Ｉの提示、及び５）特定のＣＤ８＋免疫細胞によるある特定の提示されたｐＭＨＣ  Ｉの認識。ＣＤ８＋Ｔ細胞による提示されたｐＭＨＣ  Ｉの認識は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、クローン性の拡張、及び特定のｐＭＨＣ  Ｉ提示細胞を破壊の標的とする細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ，cytotoxic T lymphocyte）を含むＣＤ８＋エフェクターＴ細胞への分化をもたらし得る。これにより、一部が身体全体にわたって全身を移動して特定のエピトープ−ＭＨＣクラスＩ複合体提示細胞を探し出して破壊することができる特定のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞集団、並びにメモリーＴ細胞集団の生成がもたらされる。提示されている特定のｐＭＨＣ  Ｉ（例えば、リコール抗原）を認識するＣＴＬがすでに存在している場合、このＣＴＬは、即座に、ｐＭＨＣ  Ｉ提示細胞の殺滅及びサイトカインの放出を行うことができる。
【０００６】
一般的に、ＭＨＣクラスＩ経路は、サイトゾルペプチドで開始する。サイトゾルにおけるペプチドの存在は、複数の様式で生じ得る。一般的に、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドは、細胞内タンパク質のプロテアソーム分解に由来する。ＭＨＣクラスＩ経路は、ＥＲ膜と会合した抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ，transporters associated with antigen processing）で開始し得る。ＴＡＰによりペプチドがサイトゾルからＥＲの内腔へと移行され、そこでは、ペプチドが空のＭＨＣクラスＩ分子と会合することができる。ＴＡＰは、一般的に、８〜１２アミノ酸残基の長さのペプチドを移行させるが、ＴＡＰはまた、６アミノ酸残基程度の長さの小さいペプチド及び４０アミノ酸残基程度の長さの大きなペプチドを輸送することもできる（Koopmann J et al., Eur J Immunol 26: 1720-8 (1996)）。
【０００７】
ＭＨＣクラスＩ経路はまた、プロセシングのためにタンパク質又はペプチドをサイトゾル内へと輸送し、ある特定の分解された断片をＴＡＰ媒介性移行によってＥＲ内へと輸送し戻すことを伴う経路によって、ＥＲの内腔で開始される場合もある。
【０００８】
ＴＡＰによってサイトゾルからＥＲの内腔へと輸送されたペプチドは、次いで、ＭＨＣクラスＩ分子による結合に利用可能となる。ＥＲにおいて、ペプチドをローディングする複雑な分子機構は、安定なペプチド−ＭＨＣクラスＩ分子複合体（ｐＭＨＣ  Ｉ）の構築に役立ち、一部の事例では、トリミングと呼ばれるプロセスにおいて最適なサイズに切断することによって、ペプチドをさらにプロセシングする（Mayerhofer P, Tampe R, J Mol Biol pii S0022-2835 (2014)を参照）。ＥＲにおいて、ＭＨＣクラスＩ分子は、高度に特異的な免疫グロブリン型抗原結合ドメインを使用して、特定のペプチド−エピトープと堅く結合するが、これらのドメインはそれぞれがある特定のペプチド−エピトープに対してのみ強い結合親和性を有する。次いで、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、細胞外環境への提示及びＣＤ８＋免疫細胞による調査のために分泌経路を介して原形質膜へと輸送される。その後、生物を保護するために、特定のＣＤ８＋ＣＴＬが、特定のｐＭＨＣ  Ｉを提示している細胞を殺滅させるように標的化される。
【０００９】
脊索動物における有核細胞によるＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した特定のエピトープ−ペプチドの提示は、細胞内病原体、腫瘍、及びがんに対する免疫応答の刺激及び維持において主要な役割を果たしている。ＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＣＤ８＋Ｔ細胞と特定のエピトープ−ＭＨＣクラスＩ複合体を提示している細胞との細胞間結合により、提示細胞の拒絶、すなわち、１つ又は２つ以上のＣＴＬの細胞毒性活性に起因する提示細胞の死をもたらすことができる、防御免疫応答が開始される。この細胞間結合の特異性は、複数の因子によって決定される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらのＴＣＲによって別の細胞の細胞表面上のｐＭＨＣ  Ｉを認識する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、異なる同種ｐＭＨＣ  Ｉに対しては異なる結合特異性を有する様々なＴ細胞受容体（ＴＣＲ，T-cell receptor）を発現する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異性は、それぞれ個々のＴ細胞の特異的ＴＣＲ、及び提示されたエピトープ−ＭＨＣ複合体に対するそのＴＣＲの結合親和性、並びに提示細胞に対する全体的なＴＣＲ結合占有率に依存する。加えて、ロード及び提示されるペプチドの特異性（すなわち、ｐＭＨＣ  Ｉレパートリー）に影響を及ぼすことによって、並びにエピトープ認識に関与するＴＣＲとｐＭＨＣ  Ｉとの間の接触領域に影響を及ぼすことによっての少なくとも２通りで、細胞間ＣＤ８＋Ｔ細胞認識に影響を及ぼす、ＭＨＣクラスＩ分子の多様なバリアントが存在する。
【００１０】
ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したある特定のエピトープの提示により、提示細胞を、溶解、アポトーシス誘導、及び／又は壊死による標的化された殺滅に対して感受性にすることができる。ＣＴＬによるｐＭＨＣ  Ｉ提示細胞の殺滅は、主として、細胞毒性微粒を介した提示細胞へのパーフォリン及び／又はグランザイムの送達により媒介される細胞溶解活性によって生じる（例えば、Russell J, Ley T, Annu Rev Immunol 20: 323-70 (2002);Cullen S, Martin S, Cell Death Diff 15: 251-62 (2008)を参照）。ＣＴＬに媒介される標的細胞殺滅の他の機構は、ＴＮＦシグナル伝達によって、例えば、ＦａｓＬ／Ｆａｓ及びＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−ＤＲシグナル伝達などによって、提示細胞においてアポトーシスを誘導することを伴う（例えば、Topham D et al., J Immunol 159: 5197-200 (1997)；Ishikawa E et al., J Virol 79: 7658-63 (2005)；Brincks E et al., J Immunol 181: 4918-25 (2008)；Cullen S, Martin S, Cell Death Diff 15: 251-62 (2008)を参照）。さらに、活性化されたＣＴＬは、認識されたｐＭＨＣ  Ｉ提示細胞の近傍にある他の細胞を、他の近傍細胞により提示されているペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体のレパートリーを問わず、無差別に殺滅させ得る（Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 10985-90 (2006)）。加えて、活性化されたＣＴＬは、免疫刺激性サイトカイン、インターロイキン、及び微小環境の免疫活性化に影響を及ぼす他の分子を放出し得る。
【００１１】
このＭＨＣクラスＩ及びＣＴＬによる免疫監視系は、ある特定の治療法によって、ある特定の細胞型を拒絶し、特異的に殺滅させるように対象の適応免疫系を誘導するために利用できることが考えられる。具体的には、ＭＨＣクラスＩ提示経路は、様々な治療用分子によって、特異的に標的化された細胞の殺滅を含む所望される免疫応答を誘導するために、ある特定の標的化細胞に、ある特定のエピトープを細胞表面上に提示させるのに利用することができる。そのような治療用分子は、悪性細胞（例えば、腫瘍細胞又は感染細胞）によってそれ自体の破壊をシグナル伝達するよう提示するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ経路に特異的に送達することができる。しかしながら、このような治療用分子を開発するには、例えば、治療用分子の細胞型標的化；標的細胞の原形質膜を通じた治療用分子の送達；エンドサイトーシス経路を回避することができ、リソソームにおける破壊を回避することができる治療用分子の提供；並びに、一般的に、そのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴを標的細胞による外因性外来分子の離隔、修飾、及び／又は破壊から保護し、同時にそのカーゴを所望される細胞内の位置に送達することができる治療用分子の提供を含む、いくつかの障壁がある（Sahay G et al., J Control Release 145: 182-195 (2010); Fuchs H et al., Antibodies 2: 209-35 (2013)）。
【００１２】
一般的に、細胞への外来分子の外来的（exogenous）投与は、分子の分解をもたらすが、これは離隔及び／又は修飾の後であることが多い。第１に、細胞への外因性ペプチド（例えば、免疫原性エピトープ）又はタンパク質（例えば、抗原性タンパク質）の投与の結果、これらの分子は、原形質膜の物理的障壁に起因して、細胞に入ることはない。加えて、これらの分子は、細胞の表面及び／又は細胞外環境において細胞外酵素活性によって、より小さな分子に（例えば、タンパク質がペプチドに）分解されることが多い。エンドサイトーシスによって細胞外環境から内在化されたタンパク質は、一般的に、初期エンドソーム、後期エンドソーム、及びリソソームが関与するエンドサイトーシス経路の一部として、リソソーム性タンパク質分解によって分解される。ファゴサイトーシスによって細胞外環境から内在化されたタンパク質は、一般的に、最終的にファゴリソソームで終わる類似の経路によって分解される。したがって、外来的に投与されたペプチド及びタンパク質、又はそれらの断片は、一般的に、ＭＨＣクラスＩ経路に入るのに適した細胞内区画、例えば、サイトゾル又はＥＲなどに到達することはない。
【００１３】
外来的に投与されたときに、選択された標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することができる細胞標的化分子を有することが望ましく、ここで、標的細胞は、広範な種類の細胞、例えば、悪性細胞及び／又は感染細胞、特に、樹状細胞のようなプロフェッショナルＡＰＣ以外の細胞などから選択され得る。健常な細胞よりも悪性細胞を優先的に標的とするこのような細胞標的化分子は、例えば、感染細胞、新生物細胞、又はそれ以外の悪性細胞などの標的化細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のためのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのインビボ送達のために、脊索動物に投与され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Elliot T et al., Nature 348: 195-7 (1990)
【非特許文献２】Janeway’s Immunobiology (Murphy K, ed., Garland Science, 8th ed., 2011)
【非特許文献３】Cellular and Molecular Immunology (Abbas A, ed., Saunders, 8th ed., 2014)
【非特許文献４】Chiu C, Openshaw P, Nat Immunol 16: 18-26 (2015)
【非特許文献５】Neefjes J et al., Nat Rev Immunol 11: 823-36 (2011)
【非特許文献６】Koopmann J et al., Eur J Immunol 26: 1720-8 (1996)
【非特許文献７】Mayerhofer P, Tampe R, J Mol Biol pii S0022-2835 (2014)
【非特許文献８】Russell J, Ley T, Annu Rev Immunol 20: 323-70 (2002)
【非特許文献９】Cullen S, Martin S, Cell Death Diff 15: 251-62 (2008)
【非特許文献１０】Topham D et al., J Immunol 159: 5197-200 (1997)
【非特許文献１１】Ishikawa E et al., J Virol 79: 7658-63 (2005)
【非特許文献１２】Brincks E et al., J Immunol 181: 4918-25 (2008)
【非特許文献１３】Cullen S, Martin S, Cell Death Diff 15: 251-62 (2008)
【非特許文献１４】Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 10985-90 (2006)
【非特許文献１５】Sahay G et al., J Control Release 145: 182-195 (2010)
【非特許文献１６】Fuchs H et al., Antibodies 2: 209-35 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、志賀毒素Ａサブユニット由来の細胞標的化分子であって、志賀毒素Ａサブユニットにとって異種のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含み、それぞれの細胞標的化分子が、そのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達する能力を有する、細胞標的化分子を提供する。本発明の細胞標的化分子は、送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがＭＨＣクラスＩ分子と複合体化して標的細胞表面上に提示されるように、脊索動物内の任意の有核標的細胞に様々なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを標的化送達するために使用することができる。標的細胞は、例えば、新生物細胞、感染細胞、細胞内病原体を保有する細胞、及び他の望ましくない細胞など、様々な型のものであり得、標的細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、本発明の細胞標的化分子によって標的化され得る。加えて、本発明は、様々な細胞標的化分子であって、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞内送達が可能であり、同時に、これらの細胞標的化分子の細胞外インビボ忍容性を改善することが可能である、プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む、細胞標的化分子を提供する。本発明のある特定の細胞標的化分子は、所与の投薬量において非特異的毒性をもたらす可能性が低減されているため、治療剤及び／又は診断剤のいずれかとして脊索動物に投与することに関する改善された有用性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の細胞標的化分子は、３つの異なる成分：（ｉ）志賀毒素エフェクターポリペプチドと、（ii）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域と、（iii）ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとを含み、細胞標的化分子を細胞に投与することにより、この細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示がもたらされる。ある特定のさらなる実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に融合されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含む。
【００１７】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）志賀毒素Ａ１断片領域を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドと、（ii）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる細胞標的化部分又は作用物質を含む異種結合領域と、（iii）異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドとを含み、細胞標的化分子を細胞に投与することにより、この細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示がもたらされる。ある特定のさらなる実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、志賀毒素Ａ１断片領域に埋め込まれても挿入されてもいない。ある特定のさらなる実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に融合されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）志賀毒素Ａ１断片領域を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドと、（ii）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる細胞標的化部分又は作用物質を含む異種結合領域と、（iii）異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドとを含み、細胞標的化分子を細胞に投与することにより、この細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示がもたらされるが、ただし、細胞標的化分子が、配列番号７１〜７２を含むものでもそれからなるものでもないことを条件とする。ある特定のさらなる実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、志賀毒素Ａ１断片領域に埋め込まれても挿入されてもいない。ある特定のさらなる実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に融合されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子を細胞に投与することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドが細胞内の位置でＭＨＣクラスＩ分子と複合体化し、その後でこの細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示がもたらされる。
【００２０】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖を含み、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むポリペプチドと結合領域の２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖のうちの１つとに融合されている。
【００２１】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体可変断片（Ｆｖ）、相補性決定領域３断片（ＣＤＲ３）、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）、Ｆｄ断片、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、抗原結合断片（Ｆａｂ）、アルマジロ反復ポリペプチド（ＡｒｍＲＰ）、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン（１０Ｆｎ３）、テネイシンIII型ドメイン（ＴＮｆｎ３）、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ−Ａ）、リポカリン（アンチカリン）、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（アフィチン）、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニプロテイン、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変（engineered）抗体模倣物、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００２２】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１、（iii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１、及び（iv）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１からなる群から選択されるポリペプチド配列を含むか又はそれから本質的になる。
【００２３】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ，prostate-specific membrane antigen）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ，fibroblast activated protein）、ルイス−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１又はＮＴＲＫＲ１）、炭酸脱水酵素IX（ＣＡ９）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ，folate binding protein）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイス−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ，carcinoembryonic antigen）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ，prostate specific antigen）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ，prostate stem cell antigen）、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ，bladder tumor antigen）、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型）、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ＩＬ−１Ｒ（インターロイキン−１受容体，interleukin-1 receptor）、ｍｒｐ−１４、ＮＫＧ２Ｄリガンド、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１，programmed death-ligand 1）、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子（ポリペプチドと複合体化していてもよい）、ＭＨＣクラスII分子（ペプチドと複合体化していてもよい）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態において、カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥＬ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、及びＳＫＥＬからなる群から選択される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化分子内で志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に対してカルボキシ末端側に位置する異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、細胞標的化分子内で志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に対してカルボキシ末端側に位置する２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、細胞標的化分子は、カルボキシ末端の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。
【００２７】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している標的細胞に細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、ＣＤ８＋免疫細胞による標的細胞の細胞間結合を引き起こすことができる。
【００２８】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している標的細胞に細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、標的細胞の死を引き起こすことができる。ある特定のさらなる実施形態に関して、そのメンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。
【００２９】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する変異を含み、この変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、変異は、毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性を低減又は除去する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。
【００３０】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号７１〜１１５のいずれかからなるものでもそれを含むものでもない。
【００３１】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号１３〜６１及び７２〜１１５のいずれかのポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。
【００３２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる細胞標的化部分又は作用物質を含む、結合領域、（ii）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び（iii）細胞標的化分子のタンパク質性成分に連結されている異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含み、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドが、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端に対してカルボキシ末端側にあることにより、また細胞標的化分子を細胞に投与することにより、この細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示がもたらされる（例えば、図１−Ｂを参照）。ある特定のさらなる実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に融合されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、結合領域は、２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖を含み、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むポリペプチドと結合領域の２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖のうちの１つとに融合されている。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ又はＶＨドメイン断片）、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ，immunoglobulin new antigen receptor）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体可変断片（Ｆｖ）、相補性決定領域３断片（ＣＤＲ３）、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）、Ｆｄ断片、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ，small modular immunopharmaceutical）ドメイン、抗原結合断片（Ｆａｂ）、アルマジロ反復ポリペプチド（ＡｒｍＲＰ，Armadillo repeat polypeptide）、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン（１０Ｆｎ３）、テネイシンIII型ドメイン（ＴＮｆｎ３）、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ−Ａ）、リポカリン（アンチカリン）、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド（アフィチン）、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニプロテイン、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣体、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１、（iii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１、及び（iv）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１からなる群から選択されるポリペプチド配列を含むか又はそれから本質的になる。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、配列番号２１〜３９、５２〜５３、５７〜６１、及び１０１〜１１５のいずれかのポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来領域を含み、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端は、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０天然に位置する領域、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物における等価な領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換は、アルギニン残基から、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基への置換である。ある特定のさらなる実施形態において、結合領域は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ルイス−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１又はＮＴＲＫＲ１）、炭酸脱水酵素IX（ＣＡ９）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイス−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型）、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ＩＬ−１Ｒ（インターロイキン−１受容体）、ｍｒｐ−１４、ＮＫＧ２Ｄリガンド、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子（ポリペプチドと複合体化していてもよい）、ＭＨＣクラスII分子（ペプチドと複合体化していてもよい）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ＫＤＥＬファミリーのメンバーのカルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態において、カルボキシ末端の小胞体保持／回収シグナルモチーフは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＦ、ＨＤＥＬ、ＲＤＥＦ、ＲＤＥＬ、ＷＤＥＬ、ＹＤＥＬ、ＨＥＥＦ、ＨＥＥＬ、ＫＥＥＬ、ＲＥＥＬ、ＫＡＥＬ、ＫＣＥＬ、ＫＦＥＬ、ＫＧＥＬ、ＫＨＥＬ、ＫＬＥＬ、ＫＮＥＬ、ＫＱＥＬ、ＫＲＥＬ、ＫＳＥＬ、ＫＶＥＬ、ＫＷＥＬ、ＫＹＥＬ、ＫＥＤＬ、ＫＩＥＬ、ＤＫＥＬ、ＦＤＥＬ、ＫＤＥＦ、ＫＫＥＬ、ＨＡＤＬ、ＨＡＥＬ、ＨＩＥＬ、ＨＮＥＬ、ＨＴＥＬ、ＫＴＥＬ、ＨＶＥＬ、ＮＤＥＬ、ＱＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＮＥＬ、ＲＴＤＬ、ＲＴＥＬ、ＳＤＥＬ、ＴＤＥＬ、及びＳＫＥＬからなる群から選択される。ある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している標的細胞に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、ＣＤ８＋免疫細胞による標的細胞の細胞間結合を引き起こすことができる。ある特定のさらなる実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合���ている標的細胞に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、標的細胞の死を引き起こすことができる。ある特定のさらなる実施形態に関して、そのメンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、配列番号２１〜３９、５２、５７〜６１、及び１０１〜１１５のいずれかのポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。ある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する変異を含み、この変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、変異は、毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性を低減又は除去する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、配列番号５３に示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。ある特定の実施形態において、結合領域は、ＣＤ８＋エピトープ−ペプチドが結合領域に対して自家であるか異種であるかに関係なく、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。
【００３３】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に融合されている。ある特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含む。
【００３４】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端は、破壊されたフーリン切断モチーフを含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフの最小のフーリン切断部位中に、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含む。ある特定のさらなる実施形態において、最小のフーリン切断部位は、コンセンサスアミノ酸配列Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ及び／又はＲ−ｘ−ｘ−Ｒによって表される。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、変異は、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０に天然に位置する領域、又は志賀毒素Ａサブユニット若しくはそれらの派生物における等価な領域で、少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換を含む。
【００３５】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、結合領域に埋め込まれているか又は挿入されている。
【００３６】
ある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子を細胞に投与することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドが細胞内の位置でＭＨＣクラスＩ分子と複合体化し、その後でこの細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示がもたらされる。ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子及び／又はその志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素Ａ１断片又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む参照細胞標的化分子と同程度の細胞内経路決定効率（routing efficiency）を示すことができ、及び／又は細胞のエンドソーム開始位置から小胞体及び／又はサイトゾルへの有意なレベルの細胞内の経路決定活性（routing activity）を示すことができる。
【００３７】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、脊索動物に導入された場合に、その志賀毒素エフェクターポリペプチド成分のすべてがそれぞれ、野生型志賀毒素Ａ１断片及び／又はそのＡ１断片領域のカルボキシ末端の野生型志賀毒素のフーリン切断部位を含むこと以外は第１の細胞標的化分子からなる第２の細胞標的化分子と比較して、インビボ忍容性の改善を示すことができる。これは、第２の細胞標的化分子が、本発明の細胞標的化分子と同じ方式で、本発明の細胞標的化分子と同じ結合領域及び同じ異種ＣＤ８＋エピトープ−ペプチドに連結されている志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含むが、第２の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片領域を含む野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドのＡ１断片領域のカルボキシ末端に野生型フーリン切断部位を含むという点で、第１の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドとは異なることを意味する。
【００３８】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、（ｉ）野生型志賀毒素Ａ１断片若しくは野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同程度の触媒活性レベル、（ii）半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値が１０，０００ピコモル以下のリボソーム阻害活性、及び／又は（iii）有意なレベルの志賀毒素の触媒活性を示すことができる。
【００３９】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、細胞の死滅を引き起こすことが可能である。ある特定のさらなる実施形態において、細胞外標的生体分子の存在又はレベルに関して異なる２種の異なる細胞型の集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、細胞標的化分子は、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合していない細胞型に対するＣＤ５０の少なくとも３倍又はそれ未満のＣＤ５０で、細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞型に細胞死をもたらすことが可能である。ある特定の実施形態に関して、そのメンバーが細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子に物理的に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子にも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定の実施形態に関して、そのメンバーが有意な量の細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子に物理的に結合している第１の細胞集団、及びそのメンバーが有意な量の結合領域のいずれの細胞外標的生体分子にも物理的に結合していない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。ある特定の実施形態に関して、第１の標的生体分子陽性細胞集団、及びそのメンバーが細胞表面において有意な量の細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子を発現しない第２の細胞集団に本発明の細胞標的化分子を投与することにより、第１の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果に比べて少なくとも３倍大きい。
【００４０】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞に導入された場合、半最大阻害濃度（ＣＤ５０）値が３００ｎＭ以下の細胞毒性を示すことができる、及び／又は有意なレベルの志賀毒素の細胞毒性を示すことができる。
【００４１】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、低い細胞毒性効力を表す（すなわちある特定の陽性標的細胞型に導入された場合、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、又は５０ｎＭの細胞標的化分子濃度で細胞集団の１％細胞死より大きい細胞毒性を示すことができない）。
【００４２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、天然に存在する志賀毒素Ｂサブユニットを含まない。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、天然の志賀毒素Ｂサブユニットの機能的な結合ドメインを含むか又はそれから本質的になるいかなるポリペプチドも含まない。それよりもむしろ、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドは、細胞標的化を実現するために異種結合領域と機能的に会合している。
【００４３】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素Ａ１断片領域に埋め込まれていない。ある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドに埋め込まれていない。
【００４４】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素Ａ１断片領域に挿入されていない。ある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドに挿入されていない。
【００４５】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、配列番号１０に示されるポリペプチドを含むこともそれからなることもない。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）の天然の５３位に埋め込まれたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドGILGFVFTL（配列番号１０）を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを含まない。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号１０に示されるポリペプチドを含まない。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、任意の埋め込まれたか又は挿入されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むいかなる志賀毒素エフェクターポリペプチドも含まない。
【００４６】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号７１に示されるリンカーを含まず、リンカーは、直接的又は間接的のいずれかで、結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとの間に融合されており、結合領域は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに対してアミノ末端側に位置する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、配列番号７１に示されるリンカーを含まず、リンカーは、結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとの間に融合されている。
【００４７】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとの間に融合されたいかなる異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まず、結合領域は、志賀毒素エフェクターに対してアミノ末端側に位置する。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとの間に融合されたいかなる異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まない。
【００４８】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、標的細胞は、樹状細胞型などのプロフェッショナル抗原提示細胞ではない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞によって発現されない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子は、有意な量で、プロフェショナル抗原提示細胞と物理的に会合していない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞と物理的に会合していない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の標的生体分子は、治療を受ける脊索動物対象において、有意な量で、いずれのプロフェッショナル抗原提示細胞の細胞表面上にも発現されない。
【００４９】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片由来領域のいずれのアミノ酸残基とも直接的に会合していない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドのいずれの内部アミノ酸残基とも直接的に会合しておらず、これは、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかのアミノ酸残基が、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドに直接的に連結され得ることを意味する。
【００５０】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドに埋め込まれていない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドに挿入されていない。
【００５１】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、アミノ酸残基１９〜１８３に対応するヒトＣＤ４の断片を含まない。本発明の細胞標的化分子ある特定の実施形態において、結合領域は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であるヒトＣＤ４の断片を含まない。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、ヒト免疫細胞表面の補助受容体の断片を含まない。
【００５２】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、細胞のＭＨＣクラスＩ分子による提示が可能なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞に送達する方法であって、細胞を本発明の細胞標的化分子及び／又はそれらの組成物（例えば、本発明の医薬品又は診断用組成物）と接触させるステップを含む、方法が挙げられる。
【００５３】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、細胞が、外来的に投与されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをＭＨＣクラスＩ分子と複合体化して提示するように誘導する方法であって、細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む本発明の細胞標的化分子及び／又はその組成物（例えば、そのような本発明の細胞標的化分子を含む本発明の医薬組成物又は診断用組成物）と接触させるステップを含む、方法が挙げられる。
【００５４】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープＭＨＣクラスＩ分子複合体を介して、標的細胞に対する免疫細胞媒介性応答を誘導する方法であって、標的細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む本発明の細胞標的化分子及び／又はその組成物（例えば、そのような本発明の細胞標的化分子を含む本発明の医薬組成物又は診断用組成物）と接触させるステップを含む、方法が挙げられる。ある特定のさらなる実施形態に関して、免疫応答は、ＣＤ８＋免疫細胞によるサイトカインの分泌、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に誘導される標的細胞における増殖の停止、ＣＴＬに誘導される標的細胞の壊死、ＣＴＬに誘導される標的細胞のアポトーシス、免疫細胞に媒介される標的細胞以外の細胞の細胞殺滅からなる群から選択される。
【００５５】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、ＣＤ８＋免疫細胞と標的細胞との細胞間結合を引き起こす方法であって、標的細胞を、ＣＤ８＋免疫細胞の存在下において本発明の細胞標的化分子と接触させるステップ、又は標的細胞を１つ又は２つ以上のＣＤ８＋免疫細胞と接触させる後続のステップを含む、方法が挙げられる。ある特定の実施形態に関して、接触ステップは、インビトロで生じる。ある特定の他の実施形態に関して、接触ステップは、例えば、細胞標的化分子を脊索動物、脊椎動物、及び／又は哺乳動物に投与することなどによって、インビボで生じる。ある特定の実施形態に関して、細胞間結合は、インビトロで生じる。ある特定の実施形態に関して、細胞間結合は、インビボで生じる。
【００５６】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、脊索動物内の組織の場所（locus）に「シーディング（seeding）」するための本発明の細胞標的化分子を含む組成物が挙げられる。
【００５７】
ある特定の実施形態に関して、本発明の方法は、脊索動物内の組織の場所を「シーディング」するためであって、脊索動物に、本発明の細胞標的化分子、本発明の医薬組成物、及び／又は本発明の診断用組成物を投与するステップを含む、方法が挙げられる。ある特定のさらなる実施形態に関して、本方法は、悪性の、罹患した、及び／又は炎症を起こした組織を含む脊索動物内の組織の場所を「シーディング」するための方法である。ある特定のさらなる実施形態に関して、本方法は、罹患した組織（diseased tissue）、腫瘤（tumor mass）、がん性の増殖（cancerous growth）、腫瘍、感染した組織、又は異常な細胞塊からなる群から選択される組織を含む脊索動物内の組織の場所を「シーディング」するための方法である。ある特定の実施形態に関して、脊索動物内の組織の場所を「シーディング」するための方法は、脊索動物に、ＭＨＣクラスＩ複合体において細胞標的化分子の標的細胞によって天然に（natively）提示されないペプチド、標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質中にも天然に存在しないペプチド、標的細胞のトランスクリプトーム及び／又はプロテオーム中に天然に存在しないペプチド、シーディングしようとする部位の細胞外の微小環境中に天然に存在しないペプチド、及び標的化しようとする腫瘤又は感染組織部位に天然に存在しないペプチドからなる群から選択される異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む本発明の細胞標的化分子を投与するステップを含む。
【００５８】
本発明はまた、本発明の細胞標的化分子及び少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物、並びに本明細書にさらに記載される本発明の方法におけるそのような細胞標的化分子又はそれを含む組成物の使用を提供する。本発明のある特定の実施形態は、本発明のいずれかの細胞標的化分子及び少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤又は担体を含む、医薬組成物である。
【００５９】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の細胞標的化分子又はその組成物、並びに細胞型、組織、器官、疾患、障害、状態、及び／又は患者に関する診断上有用な情報などの情報を収集するための検出促進剤を含む、診断用組成物が挙げられる。
【００６０】
本発明の細胞標的化分子及び組成物以外に、本発明の細胞標的化分子又はそのタンパク質成分をコードすることができるポリヌクレオチドが、本発明の範囲内であり、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も同様である。発現ベクターを含む宿主細胞は、例えば、本発明の細胞標的化分子又はそのタンパク質成分若しくは断片を、組換え発現によって産生するための方法で使用され得る。
【００６１】
本発明はまた、固体基板に固定された、いずれかの本発明の物質の組成物（composition of matter）も包含する。本発明の物質の組成物のこのような配設は、例えば、本明細書に記載される分子スクリーニング方法において、利用され得る。
【００６２】
さらに、本発明は、細胞を殺滅する方法であって、細胞を、本発明の細胞標的化分子又は本発明の細胞標的化分子を含む医薬組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態に関して、細胞を接触させるステップは、インビトロで生じる。ある特定の他の実施形態に関して、細胞を接触させるステップは、インビボで生じる。細胞を殺滅する方法のさらなる実施形態に関して、本方法は、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子の細胞外における存在及び／又は発現レベルに関して異なる細胞の混合物を接触させた場合に、他の細胞及び／又は細胞型よりも優先的に細胞及び／又は細胞型を選択的に殺滅することができる。
【００６３】
本発明はさらに、疾患、障害、及び／又は状態の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子を含む組成物又は医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態に関して、本発明のこの方法を使用して治療しようとする疾患、障害、又は状態は、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染から選択される。この方法のある特定の実施形態に関して、治療しようとするがんは、骨がん、乳がん、中枢／末梢神経系がん、消化器がん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓から尿道のがん、肝臓がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される。この方法のある特定の実施形態に関して、治療しようとする免疫障害は、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、結節性多発性動脈炎、多発関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び脈管炎からなる群から選択される疾患に関連する免疫障害である。
【００６４】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染の治療又は予防のための、本発明の細胞標的化分子を含む組成物が挙げられる。本発明のある特定の実施形態のなかでも、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染の治療又は予防のための医薬品の製造における、本発明の物質の組成物の使用が挙げられる。
【００６５】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に１つ又は２つ以上の追加の外因性物質を送達するための、本発明の細胞標的化分子を含む組成物が挙げられる。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、本発明の細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に、１つ又は２つ以上の追加の外因性物質を送達するために使用してもよい。加えて、本発明は、細胞の内部に外因性物質を送達するための方法であって、細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。本発明はさらに、細胞の内部への外因性物質の送達を、それを必要とする患者において行うための方法であって、患者に、本発明の細胞標的化分子を投与するステップを含み、標的細胞が、本発明の細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している、方法を提供する。
【００６６】
疾患、障害、及び／又は状態の診断、予後予測、及び／又は特徴付けのための本発明のいずれかの組成物（例えば、細胞標的化分子、医薬組成物、又は診断用組成物）の使用は、本発明の範囲内である。
【００６７】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の細胞標的化分子及び／又は診断用組成物を使用して細胞を検出する方法であって、細胞を、前記細胞標的化分子及び／又は診断用組成物と接触させるステップ、並びに前記細胞標的化分子及び／又は診断用組成物の存在を検出するステップを含む、方法が挙げられる。ある特定の実施形態に関して、細胞を接触させるステップはインビトロで行われる。ある特定の実施形態に関して、細胞を接触させるステップはインビボで行われる。ある特定の実施形態に関して、細胞を検出するステップはインビトロで行われる。ある特定の実施形態に関して、細胞を検出するステップはインビボで行われる。
【００６８】
例えば、本発明の診断用組成物は、脊索動物対象に、検出促進剤を含む本発明の細胞標的化分子を含む組成物を投与し、次いで、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明の細胞標的化分子及び／又は異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの存在を検出することによって、インビボで細胞を検出するために使用してもよい。
【００６９】
がん、腫瘍、増殖異常、及び／又は免疫障害の治療又は予防のための本発明のいずれかの組成物の使用は、本発明の範囲内である。
【００７０】
本発明のある特定の実施形態は、免疫療法を使用して患者におけるがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法を含む。
【００７１】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の物質の組成物を含み、任意選択で使用説明書、追加の試薬、及び／又は医薬送達デバイスを含むキットが挙げられる。
【００７２】
これら及び他の本発明の特色、態様及び利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付の図面に関してよりよく理解されるようになると予想される。上述した本発明の要素は、以降、組合せ又は除去の目的について全く述べられていなくても、本発明の他の実施形態を作製するために自由に個々に組み合わせたり又は除去したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ−Ｂ】それぞれが細胞標的化結合領域（結合領域）、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド（志賀毒素エフェクタードメイン）、及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド（エピトープ）を含む、本発明の例示的な細胞標的化分子の一般的な配置を示す図である。「Ｎ」及び「Ｃ」の表記は、それぞれ、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシ末端を表す。図１における例示的な分子の図は、本発明の実施形態の限られたセットの構造上の特徴をある特定の一般的な配置で例示するためのものである。これらの例示的な分子は、決して、本発明の分子の任意の構造上の特徴及び／又は構成要素の配置に関して、完全に限定的であることを意図するものでも、そのように見なされるものでもないことを理解されたい。図１の概略図に示される特徴の相対的なサイズ、位置、又は数は、簡略化されている。例えば、細胞標的化分子１つ当たりの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴの総数は、２個超、３個超、４個超、５個超、１０個超、２０個超、又は３０個超であってもよく、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープペプチドが、より大きな抗原性分子内に含まれてもよい。図１の概略図は、本発明の任意の実施形態における分子構造の相対的なサイズに関する任意の情報を正確に表現することを意図するものではない。
【図１Ｂ】プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）を含む本発明の例示的な細胞標的化分子の一般的な配置を示す図であり、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分に対してカルボキシ末端側で細胞標的化分子と会合している。
【図２】志賀毒素Ａサブユニット由来の細胞標的化分子への異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの融合により、標的陽性細胞に対する細胞標的化分子の細胞毒性活性が著しく損なわれることはなかったことを示す図である。細胞の生存率パーセントを、底を１０として、タンパク質濃度の対数でプロットした。図２は、細胞殺滅アッセイの結果を示す図であり、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）が、いずれの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まない親細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号６３）の細胞毒性に類似する細胞毒性を呈した。
【図３】細胞殺滅アッセイの結果を示す図であり、例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）の細胞毒性活性は、ある特定の濃度範囲にわたって標的陽性細胞に対して特異的であった。細胞の生存率パーセントを、底を１０として、タンパク質濃度の対数でプロットした。結合領域ｓｃＦｖ２の標的生体分子の細胞表面発現が陰性の細胞は、標的陽性細胞に対するＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）のＣＤ５０値を正確に測定するために使用した図２に示されている分子濃度範囲にわたって、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）によって殺滅されなかった（ほぼ１００％の細胞生存率）。
【図４】標的陽性がん細胞による、細胞標的化分子によって送達されＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの細胞表面上での提示を、陰性対照と比較して示す図である。図４は、陰性対照、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）、又は細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２（配列番号６４）のいずれかで処置した細胞セットのフローサイトメトリー分析であるTCR-STAR（商標）アッセイの結果のオーバーレイを示す。標的陽性細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ，fluorescence-activated cell sorting）フローサイトメトリーによる細胞数を、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子（ヒトＨＬＡ−Ａ２）により提示されるＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）複合体の存在を表すPE-STAR（商標）多量体試薬からの相対発光単位（ＲＬＵ，relative light unit）の発光シグナルに対してプロットした。本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）で処置した標的陽性細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）をそれらの細胞表面上に提示したが（上部グラフ）、一方で関連する細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２（配列番号６４）で処置した標的陽性細胞は、Ｃ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）を細胞表面上に提示しなかった（下部グラフ）。
【図５】標的陽性がん細胞による、細胞標的化分子によって送達されＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの細胞表面上での提示を、陰性対照と比較して示す図である。図５において、異なる処置を受容した細胞セットに対応するＲＬＵでのPE-STAR（商標）多量体試薬の平均蛍光強度指数（「ｉＭＦＩ」，indexed, mean, fluorescent intensity、陽性集団の蛍光に陽性パーセントを乗じたもの）を、グラフにした。図５は、外因性Ｃ２ペプチド（配列番号６）対照、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ」（配列番号６５）、又は細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）のいずれかで処置した細胞のフローサイトメトリー分析であるTCR-STAR assay（商標）の結果を示す。外来的に投与したＣ２ペプチド（（配列番号６）、上述）を、ペプチドローディング増強剤（「ＰＬＥ」，Peptide Loading Enhancer、Altor Biosicence社、Miramar、FL、U.S.）と組み合わせた。Ｃ２ペプチド（配列番号６）をペプチドローディング増強剤（ＰＬＥ）処置と組み合わせることにより、外来的に投与したＣ２ペプチド（配列番号６）が、細胞内に入ることなく細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子にロードされ得る陽性対照が得られる。本発明の例示的な細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）で処置した標的陽性細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）をそれらの細胞表面上に提示したが、外因性Ｃ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）又は親細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２」（配列番号６５）のみで処置した同じ細胞は、Ｃ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）を細胞表面上に提示しなかった。
【図６】異なるインキュベーション時間（４時間又は１６時間）で、標的陽性がん細胞による、細胞標的化分子によって送達されＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの細胞表面上での提示を、陰性対照と比較して示す図である。図６は、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）又は陰性対照のいずれかで処置した細胞セットのフローサイトメトリー分析であるTCR-STAR（商標）アッセイの結果のオーバーレイを示す。標的陽性細胞のＦＡＣＳ細胞数を、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子（ヒトＨＬＡ−Ａ２）により提示されるＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）複合体の存在を表すPE-STAR（商標）多量体試薬からの相対発光単位（ＲＬＵ）の発光シグナルに対してプロットした。本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）で処置した標的陽性細胞は、４時間（上部グラフ）又は１６時間（下部グラフ）のいずれかのインキュベーション期間の後に、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）をそれらの細胞表面上に提示した。
【図７】標的陽性がん細胞による、細胞標的化分子によって送達されＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの細胞表面上での提示を、陰性対照と比較して示す図である。図７は、陰性対照、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５：：Ｃ２（配列番号５７）、又は細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５（配列番号６６）のいずれかで処置した細胞セットのフローサイトメトリー分析であるTCR-STAR（商標）アッセイの結果のオーバーレイを示す。標的陽性細胞のＦＡＣＳ細胞数を、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子（ヒトＨＬＡ−Ａ２）により提示されるＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）複合体の存在を表すPE-STAR（商標）多量体試薬からの相対発光単位（ＲＬＵ）の発光シグナルに対してプロットした。本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５：：Ｃ２（配列番号５７）で処置した標的陽性細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）をそれらの細胞表面上に提示したが（上部グラフ）、一方で親細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５（配列番号６６）で処置した標的陽性細胞は、Ｃ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）を細胞表面上に提示しなかった（下部グラフ）。
【図８】標的陽性がん細胞による、細胞標的化分子によって送達されＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの細胞表面上での提示を、陰性対照と比較して示す図である。図７は、陰性対照、細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７：：Ｃ２（配列番号６０）、又は細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７（配列番号６９）のいずれかで処置した細胞セットのフローサイトメトリー分析であるTCR-STAR（商標）アッセイの結果のオーバーレイを示す。標的陽性細胞のＦＡＣＳ細胞数を、細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子（ヒトＨＬＡ−Ａ２）により提示されるＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）複合体の存在を表すPE-STAR（商標）多量体試薬からの相対発光単位（ＲＬＵ）の発光シグナルに対してプロットした。本発明の例示的な細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７：：Ｃ２（配列番号６０）で処置した標的陽性細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したＣ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）をそれらの細胞表面上に提示したが（上部グラフ）、一方で親細胞標的化分子ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７（配列番号６９）で処置した標的陽性細胞は、Ｃ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）を細胞表面上に提示しなかった（下部グラフ）。
【図９】試験したそれぞれの条件に関してプロットした、インターフェロンガンマＥＬＩｓｐｏｔアッセイの結果をスポット又は分泌細胞の数で示す図である。それぞれの試料について、標的陽性がん細胞を、細胞標的化分子又は陰性対照で処置し、次いで、ヒトＰＢＭＣとともにインキュベートした後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。本発明の例示的な細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）で処置した標的陽性細胞は、免疫細胞によるサイトカイン分泌の形態で細胞間応答を刺激したが、一方で親細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２」（配列番号６５）で処置した標的陽性細胞による結果は、バックグラウンドレベルでインターフェロン−γの分泌をもたらすＰＢＭＣの細胞間結合を示したと推定され、これは、「緩衝液のみ」の陰性対照処置とほぼ同じであった。
【図１０】試験したそれぞれの条件に関してＲＬＵでプロットした、細胞間Ｔリンパ球（Ｔ細胞）活性化アッセイの結果をルシフェラーゼ活性で示す図である。それぞれの試料について、標的陽性がん細胞を、細胞標的化分子又は陰性対照で処置し、次いで、細胞表面上に提示されたヒトＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ２）Ｆ２エピトープ（配列番号１０）複合体を特異的に認識するヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、ルシフェラーゼ発現を駆動するＮＦＡＴ転写応答要素を含む、ヒトＴ細胞とともにインキュベートした。本発明の例示的な細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６：：Ｆ２」（配列番号５９）で処置した標的陽性細胞は、ＴＣＲ認識及びＮＦＡＴシグナル伝達によるＴ細胞活性化の形態で分子間応答を刺激したが、一方で親細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６」（配列番号６８）で処置した標的陽性細胞の結果は、バックグラウンドレベルでＮＦＡＴによる分子間Ｔ細胞シグナル伝達活性化を示したと推定され、これは、「緩衝液のみ」の陰性対照処置とほぼ同じであった。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、例示的な非限定的な実施形態、及び添付の図面への参照を使用して、下記でより詳細に説明される。しかしながらこの発明は、多くの様々な形態を具体化することができ、以下に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。そうではなく、この開示が十分であり、当業者に本発明の範囲を伝えられるように、これらの実施形態は提供される。本発明をより容易に理解できるように、以下である特定の用語を定義する。追加の定義が本発明の詳細な説明中に見出される場合もある。
【００７５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形及び複数形の指示対象の両方を含む。
【００７６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「及び／又は」は、２つの種、Ａ及びＢを指す場合、Ａ及びＢの少なくとも１つを意味する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「及び／又は」は、２つより多くの種、例えばＡ、Ｂ、及びＣを指す場合、Ａ、Ｂ、若しくはＣの少なくとも１つ、又はＡ、Ｂ、若しくはＣのあらゆる組合せの少なくとも１つを意味する（それぞれの種は単数又は複数の可能性がある）。
【００７７】
本明細書にわたり、言葉「含む（comprise）」又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変化形は、必然的に述べられている整数（又は要素）又は整数（又は要素）の群を含むが、他のあらゆる整数（又は要素）又は整数（又は要素）の群も排除されないことと理解されるものとする。
【００７８】
本明細書にわたり、用語「含む（including）」は、「限定されないが、〜が挙げられる」を意味するのに使用される。「含む（including）」及び「限定されないが、〜が挙げられる」は、同義的に使用される。
【００７９】
用語「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドに取り込まれているアミノ酸への言及を含む。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸又はアミノ酸残基のあらゆるポリマーを含む。用語「ポリペプチド配列」は、物理的にポリペプチドを構成する一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。「タンパク質」は、１つ又は２つ以上のポリペプチド又はポリペプチド「鎖」を含む高分子である。「ペプチド」は、合計およそ１５〜２０アミノ酸残基未満のサイズを有する小さいポリペプチドである。用語「アミノ酸配列」は、長さに応じてペプチド又はポリペプチドを物理的に構成する一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。別段の指定がない限り、本明細書で開示されたポリペプチド及びタンパク質配列は、アミノ末端からカルボキシ末端にそれらの順番を表示するのに、左から右へ記載される。
【００８０】
用語「アミノ酸」、「アミノ酸残基」、「アミノ酸配列」、又はポリペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸（Ｌ及びＤイソステレオマーを含む）を含み、別段の限定がない限り、天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能できる天然アミノ酸の公知のアナログ、例えばセレノシステイン、ピロリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン、ガンマ−カルボキシグルタメート、ヒドロキシプロリンヒプシン、ピログルタミン酸、及びセレノメチオニンも含む（例えば、Nagata K et al., Bioinformatics 30: 1681-9 (2014)を参照）。本明細書で述べられるアミノ酸は、表Ａで示されるような簡略名によって記載される。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
成句「保存的置換」は、ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子のアミノ酸残基に関して、全体的なペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子の機能及び構造を実質的に変更しない、ペプチド、ペプチド領域、ポリペプチド領域、タンパク質、又は分子のアミノ酸組成における変化を指す（Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2nd ed., 1992))を参照）。
【００８３】
本発明の目的に関して、成句「由来の」は、ポリペプチド又はポリペプチド領域を指す場合、ポリペプチド又はポリペプチド領域が、「親の」タンパク質に元々見出されるアミノ酸配列を含み、「親の」分子のある特定の機能及び構造が実質的に保存される限り、現時点で元のポリペプチド又はポリペプチド領域に対するある特定のアミノ酸残基の付加、欠失、短縮化、再配列、又は他の変更含む可能性があることを意味する。熟練した作業者であれば、当業界において公知の技術、例えば、タンパク質配列アライメントソフトウェアを使用してポリペプチド又はポリペプチド領域の由来となる親の分子を同定できると予想される。
【００８４】
特許請求された発明の目的に関して、さらに志賀毒素ポリペプチド配列又は志賀毒素由来のポリペプチドに関して、用語「野生型」は、一般的に、例えば病原菌などの生きた種に見出される天然に存在する志賀毒素タンパク質配列を指し、その志賀毒素タンパク質配列は、最も高頻度で生じるバリアントの１つである。これは、統計学的に有効な数の少なくとも１つの志賀毒素タンパク質バリアントを含む所与の種の天然に存在する個々の生物をサンプリングした場合、天然に存在するもののその種の個々の生物の１パーセント未満で見出されるまれにしか生じない志賀毒素タンパク質配列とは対照的である。その天然環境を除去した天然分離株のクローン性の拡張（分離株が、生物学的な配列情報を含む生物であるか又は分子であるかに関係なく）は、クローン性の拡張が、その種の天然に存在する集団に存在しない新しい配列多様性を導入したり及び／又は配列バリアントの相対的比率を互いに変化させたりしない限り、天然に存在する必要条件を変更しない。
【００８５】
特許請求された発明に関する用語「会合する」、「会合すること」、「連結された」、又は「連結すること」は、２つ又は３つ以上の分子の要素が合体、結合、接続、若しくはそれ以外の方法で結合して単一分子を形成している状況、又は２つの分子間の会合、連結、結合、及び／若しくは他のあらゆる接続を作り出すことによって互いに会合した２つの分子を作製し、単一分子を形成する作用を指す。例えば、用語「連結された」は、単一分子が形成されるように１つ又は２つ以上の原子の相互作用によって会合した２つ又は３つ以上の要素を指す場合もあり、原子の相互作用は、共有結合及び／又は非共有結合によるものであってもよい。２つの要素間の共有結合による会合の非限定的な例としては、ペプチド結合及びシステイン間のジスルフィド結合が挙げられる。２つの分子要素間の非共有結合による会合の非限定的な例としては、イオン結合が挙げられる。
【００８６】
本発明の目的に関して、用語「連結された」は、単一分子が形成されるように１つ又は２つ以上の原子の相互作用によって会合した２つ又は３つ以上の分子の要素を指し、原子の相互作用は、少なくとも１つの共有結合を含む。本発明の目的に関して、用語「連結すること」は、上述したような連結された分子を作り出す作用を指す。
【００８７】
本発明の目的に関して、用語「融合した」は、少なくとも１つの共有結合によって会合した２つ又は３つ以上のタンパク質要素を指し、少なくとも１つの共有結合は、ペプチド結合がカルボキシル酸基の炭素原子の参加を含むか又は例えばα−炭素、β−炭素、γ−炭素、σ−炭素などの別の炭素原子を含むかどうかに関係なくペプチド結合である。一緒に融合した２つのタンパク質要素の非限定的な例としては、例えば、得られた分子が単一の連続的なポリペプチドになるようにペプチド結合を介してポリペプチドに融合したアミノ酸、ペプチド、又はポリペプチドが挙げられる。本発明の目的に関して、用語「融合すること」は、上述したような融合した分子、例えば、翻訳されたときに単一のタンパク質性分子を産生する遺伝学的領域の組換え融合から生成した融合タンパク質などを作り出す作用を指す。
【００８８】
記号「：：」は、その前及びその後のポリペプチド領域が物理的に一緒に連結されて連続的なポリペプチドを形成していることを意味する。
【００８９】
用語「発現される」、「発現すること」、又は「発現する」、及びそれらの文法上の変化形は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド又は核酸のタンパク質への翻訳を指す。発現されたタンパク質は、細胞内に留まって細胞表面の膜の要素になる場合もあるし、又は細胞外空間に分泌される場合もある。
【００９０】
本明細書で使用される場合、少なくとも１つの細胞表面で有意な量の細胞外標的生体分子を発現する細胞は、「標的陽性細胞」又は「標的＋細胞」であり、特定された細胞外標的生体分子に物理的に結合している細胞である。
【００９１】
記号「α」は、本明細書で使用される場合、記号の後に続く生体分子に結合することができる免疫グロブリン型の結合領域の略記である。記号「α」は、記号の後に続く生体分子に結合するその能力に基づく免疫グロブリン型の結合領域の機能的な特徴を指すのに使用され、解離定数（ＫＤ）によって記載される結合親和性は１０−５又はそれ未満である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「重鎖可変（ＶＨ）ドメイン」又は「軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン」はそれぞれ、あらゆる抗体ＶＨ又はＶＬドメイン（例えばヒトＶＨ又はＶＬドメイン）、加えて対応する天然の抗体（例えば天然のマウスＶＨ又はＶＬドメイン由来のヒト化ＶＨ又はＶＬドメイン）の少なくとも定性的な抗原結合能力を保持するあらゆるそれらの派生物を指す。ＶＨ又はＶＬドメインは、３つのＣＤＲ又はＡＢＲを途中に有する「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的結合のためにＣＤＲ又はＡＢＲを並べるのに役立つ。アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＶＨ及びＶＬドメインの両方は、以下のフレームワーク（ＦＲ）及びＣＤＲ領域又はＡＢＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４；又は同様にＦＲ１、ＡＢＲ１、ＦＲ２、ＡＢＲ２、ＦＲ３、ＡＢＲ３、及びＦＲ４を含む。用語「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、又は「ＨＣＤＲ３」は、本明細書で使用される場合、それぞれＶＨドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用され、用語「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、それぞれＶＬドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用される。本明細書で使用される場合、用語「ＨＡＢＲ１」、「ＨＡＢＲ２」、又は「ＨＡＢＲ３」は、それぞれＶＨドメイン中のＡＢＲ１、２、又は３を指すのに使用され、用語「ＬＡＢＲ１」、「ＬＡＢＲ２」、又は「ＬＡＢＲ３」は、それぞれＶＬドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用される。ラクダ科動物のＶＨＨ断片、軟骨魚類のＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ断片、ある特定の単一ドメイン抗体、及びそれらの派生物に関して、同じベースの配列：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む単一の重鎖可変ドメインが存在する。用語「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、又は「ＨＣＤＲ３」は、本明細書で使用される場合、それぞれ単一の重鎖可変ドメイン中のＣＤＲ１、２、又は３を指すのに使用される場合もある。
【００９３】
本発明の目的に関して、用語「エフェクター」は、細胞毒性、生物学的なシグナル伝達、酵素による触媒作用、細胞内経路決定（subcellular routing）、並びに／又はアロステリック作用及び／若しくは１つ又は２つ以上の因子の動員をもたらす分子間結合などの生物活性を提供することを意味する。
【００９４】
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素エフェクターポリペプチド」、「志賀毒素エフェクターポリペプチド領域」、及び「志賀毒素エフェクター領域」は、志賀毒素ファミリーのメンバーの少なくとも１つの志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド又はポリペプチド領域を指し、ポリペプチド又はポリペプチド領域は、少なくとも１つの志賀毒素の機能を表すことができる。
【００９５】
本発明の目的に関して、結合領域を説明する用語「異種」は、結合領域が、天然に存在する志賀毒素とは異なる源に由来することを意味し、例えば、ポリペプチドである異種結合領域は、いかなる天然の志賀毒素の一部としても天然に見出されないポリペプチドである。
【００９６】
本発明の目的に関して、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを説明する用語「異種」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、（１）天然に存在する志賀毒素のＡサブユニットとは異なる源に由来する、例えば、異種ポリペプチドは、天然の志賀毒素のいかなるＡサブユニットの一部としても天然に見出されず、（２）先行技術の志賀毒素エフェクターポリペプチドとは異なる源に由来することを意味する。例えば、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドに関する用語「異種」は、修飾しようとする細胞標的化分子（親分子）中に最初に生じなかったが、本明細書に記載される埋込み、融合、挿入、及び／若しくはアミノ酸置換のプロセスにより付加されたか又は修飾された細胞標的化分子を作製するための任意の他の改変手段によって付加されたかにかかわらず、分子に付加された、ペプチド配列を指す。その結果、元の修飾されていない細胞標的化分子にとって外来であるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む修飾された細胞標的化分子が得られ、すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、修飾されていない細胞標的化分子（親分子）には存在していなかった。
【００９７】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはまた、細胞標的化分子の結合領域成分にとっても異種であり、例えば、異種エピトープは、結合領域の結合活性に必要ではなく、結合領域の結合活性を提供する最小限の結合領域構造体の構造の一部ではないものである。例えば、ある免疫グロブリンに天然に存在しないＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、免疫グロブリン型結合領域の結合活性に必要ではなく、免疫グロブリン型結合領域の結合活性を提供する最小限の結合領域構造体の構造の一部でない場合、その免疫グロブリンに由来する免疫グロブリン型結合領域にとって異種である。
【００９８】
特許請求された発明の目的に関して、ＣＤ８＋免疫細胞による「細胞間結合」という成句は、ＣＤ８＋免疫細胞が、例えば、他の細胞の殺滅、他の免疫細胞の動員及び活性化（例えば、サイトカイン分泌）、ＣＤ８＋免疫細胞の成熟、ＣＤ８＋免疫細胞の活性化などに関与する応答など、ＣＤ８＋免疫細胞による免疫応答の活性化を示す様式で、異なる細胞に応答すること（例えば、１つ又は２つ以上のｐＭＨＣ  Ｉを提示しているその他のものを感作することによって）を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」は、分子の機能的な活性を説明する場合、分子が、細胞内においてＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む分子のタンパク質部分のプロテアソームによる切断を引き起こすのに適した細胞内区画に局在化する生物活性を提供することを意味する。分子の「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」機能は、分子を外部から投与した細胞の細胞表面上において、分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴのＭＨＣ提示を観察することによってアッセイすることができ、又はこのアッセイは、そのエンドソーム区画の１つ又は２つ以上に分子を含有する細胞を用いて開始された。一般的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをプロテアソームに送達する分子の能力は、「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」分子の最初の位置が細胞の初期エンドソーム区画であり、次いで分子がエピトープ−ペプチドを細胞のプロテアソームに送達することが実験的に示される場合に決定することができる。しかしながら、「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」能力はまた、分子の最初の位置が細胞外であり、エピトープを細胞内及び細胞のプロテアソームに送達することが直接的又は間接的のいずれかで実験的に示される場合でも決定することができる。例えば、ある特定の「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」分子は、例えば、細胞へのエンドサイトーシスによる侵入の後などに、その細胞のエンドソーム区画を通過する。代替として、「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」活性は、「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」分子が細胞に入りＴ細胞エピトープ−ペプチドを細胞のプロテアソームに送達するのではなく、分子の最初の位置が細胞外であり、そのため分子が細胞のいずれのエンドソーム区画にも入らない場合にも観察することができ、これはなぜなら「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する」分子が、そのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド成分のプロテアソームによる切断をもたらすのに適した細胞内区画への経路決定にそれ自身を方向付けたためと予想される。
【０１００】
本発明の目的に関して、志賀毒素エフェクター機能は、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド領域によって付与された生物活性である。志賀毒素エフェクター機能の非限定的な例としては、細胞の侵入を促進すること；脂質膜の変形；細胞内在化を促進すること；クラスリン媒介エンドサイトーシスを刺激すること；例えばゴルジ、小胞体、及びサイトゾルなどの様々な細胞内区画への細胞内経路決定を指示すること；カーゴを用いて細胞内経路決定を指示すること；リボソーム機能を阻害すること；触媒活性、例えばＮ−グリコシダーゼ活性、及びリボソームを触媒的に阻害することなど；タンパク質合成を低減すること、カスパーゼ活性化を誘導すること、エフェクターカスパーゼを活性化すること、細胞増殖抑制作用を実現すること、並びに細胞毒性が挙げられる。志賀毒素の触媒活性としては、例えば、リボソーム不活性化、タンパク質合成阻害、Ｎ−グリコシダーゼ活性、ポリヌクレオチド：アデノシングリコシダーゼ活性、ＲＮアーゼ活性、及びＤＮＡアーゼ活性が挙げられる。志賀毒素は、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である。ＲＩＰは、核酸、ポリヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｍＲＮＡ（及びポリＡ）、及びウイルス核酸を脱プリン化することができる（例えば、Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992)；Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994)；Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994)；Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996)；Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996)；Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996)；Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997)；Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999)；Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000)；Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000)；Brigotti M et al., Toxicon 39: 341-8 (2001)；Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002)；Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003)；Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)を参照）。いくつかのＲＩＰは、抗ウイルス活性及びスーパーオキシドジスムターゼ活性を示す（Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993)；Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000)；Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004)；Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)）。志賀毒素の触媒活性は、インビトロとインビボの両方で観察されている。志賀毒素エフェクター活性のためのアッセイの非限定的な例は、例えば、タンパク質合成阻害活性、脱プリン活性、細胞増殖の阻害、細胞毒性、スーパーコイルＤＮＡの緩和活性、及びヌクレアーゼ活性などの様々な活性を測定する。
【０１０１】
志賀毒素エフェクター機能の保持は、本明細書で使用される場合、同じ条件下における野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド対照（例えば志賀毒素Ａ１断片）又は野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば志賀毒素Ａ１断片）を含む細胞標的化分子と同程度の、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のある志賀毒素の機能的な活性のレベルを示すことができることを指す。リボソーム不活性化又はリボソーム阻害の志賀毒素エフェクター機能に関して、保持された志賀毒素エフェクター機能は、例えば熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用することなどによるインビトロの環境で、１０，０００ピコモル（ｐＭ）以下のＩＣ５０を表すことである。標的陽性細胞殺滅アッセイにおける細胞毒性の志賀毒素エフェクター機能に関して、保持された志賀毒素エフェクター機能は、例えば熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用することによって示されるような、適切な細胞外標的生体分子の細胞型及びその発現に応じて、１，０００ナノモル（ｎＭ）以下のＣＤ５０を表すことである。
【０１０２】
特許請求された発明の目的に関して、用語「同等な（equivalent）」は、リボソーム阻害に関して、同じ条件下における参照分子（例えば、第２の細胞標的化分子又は第３の細胞標的化分子）の活性の１０％以内又はそれ未満を再現性よく示す、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のあるリボソーム阻害活性の実験的に測定されたレベルを意味する。
【０１０３】
特許請求された発明の目的に関して、用語「同等な（equivalent）」は、細胞毒性に関して、同じ条件下における参照分子（例えば、第２の細胞標的化分子又は第３の細胞標的化分子）の活性の１０％以内又はそれ未満を再現性よく示す、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のある細胞毒性の実験的に測定されたレベルを意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「弱化した」は、細胞毒性に関して、分子が、同じ条件下において参照分子によって表されるＣＤ５０の１０倍〜１００倍のＣＤ５０を表すか又は表したことを意味する。
【０１０５】
不正確なＩＣ５０及びＣＤ５０値は、志賀毒素エフェクター機能活性のレベルを決定する場合に考慮すべきではない。いくつかの試料について、ＩＣ５０又はＣＤ５０のいずれかの正確な値は、正確な曲線のあてはめに必要なデータポイントを収集することができないために入手が難しい場合がある。例えば、理論上、所与の試料の一連の濃度で５０％より大きいリボソーム阻害又は細胞死がそれぞれ起こらない場合、ＩＣ５０もＣＤ５０も決定することができない。例示的な志賀毒素エフェクター機能アッセイ、例えば以下の実施例で説明されるアッセイなどからのデータの分析で説明されるような正確に曲線をあてはめるには不十分なデータは、実際の志賀毒素エフェクター機能を代表するものとして考慮すべきではない。
【０１０６】
志賀毒素エフェクター機能における活性を検出できないことは、細胞の侵入、細胞内経路決定、及び／又は酵素活性の欠如というより、不適切な発現、ポリペプチドフォールディング、及び／又はタンパク質安定性による可能性がある。志賀毒素エフェクター機能のためのアッセイは、有意な量の志賀毒素エフェクター機能活性を測定するのに本発明のポリペプチドをそれほど多く必要としない場合がある。エフェクター機能が低いか又はない根本的な原因がタンパク質発現又は安定性に関連することが実験的に決定される程度に、当業者は、志賀毒素の機能的なエフェクター活性を回復させ測定が可能になるように、当業界において公知のタンパク質化学及び分子工学技術を使用してこのような要因を相殺することができる。例として、不適切な細胞ベースの発現は、異なる発現制御配列を使用することによって相殺される場合もあるし、不適切なポリペプチドフォールディング及び／又は安定性は、末端配列を安定化すること、又は分子の３次元構造を安定化させる非エフェクター領域中の補償的な変異（compensatory mutation）によって利益を得る場合もある。
【０１０７】
ある特定の志賀毒素エフェクター機能、例えば細胞内経路決定機能は、容易に測定可能ではない。例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドが細胞毒性にならないこと及び／又は異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達できないことが不適切な細胞内経路決定に起因するかどうかを区別する慣例的な定量的アッセイはないが、試験が利用可能である場合に、適切な野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較してあらゆる有意なレベルの細胞内経路決定について志賀毒素エフェクターポリペプチドを分析することができる。しかしながら、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターのポリペプチド成分が、野生型志賀毒素Ａサブユニットコンストラクトと同程度又は同等な細胞毒性を表す場合、細胞内経路決定活性レベルは、それぞれ少なくとも試験された条件下で野生型志賀毒素Ａサブユニットコンストラクトの細胞内経路決定活性レベルと同程度又は同等であると推論される。
【０１０８】
個々の志賀毒素の機能のための新しいアッセイが利用可能になる場合、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子は、それらの志賀毒素エフェクター機能のあらゆるレベルに関して、例えば野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドの活性の１０００倍若しくは１００倍以内又はそれ未満であること、又は機能的にノックアウトされた志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して３倍から３０倍又はそれより大きい活性を示すことに関して分析することができる。
【０１０９】
十分な細胞内経路決定は、細胞毒性アッセイ、例えばＴ細胞エピトープ提示に基づく又はサイトゾル及び／又は小胞体に局在化した標的基質に関与する志賀毒素エフェクター機能に基づく細胞毒性アッセイなどで細胞標的化分子の志賀毒素細胞毒性活性レベルを観察することによって単に推測することができる。
【０１１０】
「有意な」志賀毒素エフェクター機能の保持は、本明細書で使用される場合、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド対照（例えば志賀毒素Ａ１断片）と同程度の、適切な定量的アッセイによって測定された再現性のある志賀毒素の機能的な活性のレベルを指す。インビトロでのリボソーム阻害の場合、有意な志賀毒素エフェクター機能は、アッセイで使用されるリボソーム源（例えば細菌、古細菌、又は真核（藻類、真菌、植物、又は動物）源）に応じて３００ｐＭ以下のＩＣ５０を示すことである。これは、触媒的に破壊されたＳＬＴ−１Ａ１−２５１二重変異体（Ｙ７７Ｓ／Ｅ１６７Ｄ）の１００，０００ｐＭのおよそのＩＣ５０と比較して有意に大きい阻害である。実験細胞培養における標的陽性細胞殺滅アッセイにおける細胞毒性の場合、有意な志賀毒素エフェクター機能は、結合領域及び細胞型の標的生体分子、特に、評価される分子によって標的化された適切な細胞外標的生体分子及び／又は細胞外のエピトープのその細胞型の発現及び／又は細胞表面表示に応じて、１００、５０、３０ｎＭ、又はそれ未満のＣＤ５０を示すことである。これは、細胞株に応じて１００〜１０，０００ｎＭのＣＤ５０を有する細胞標的化結合領域を含まない志賀毒素Ａサブユニット単独（又は野生型志賀毒素Ａ１断片）と比較して有意により大きい適切な標的陽性細胞集団に対する細胞毒性である。
【０１１１】
本発明の目的に関して、さらに本発明の分子の志賀毒素エフェクター機能に関して、用語「適度な活性」は、天然に存在する志賀毒素を含む分子に関して本明細書において定義されるような少なくとも中程度のレベル（例えば１１倍〜１，０００倍以内）の志賀毒素エフェクター活性を示すことを指し、志賀毒素エフェクター活性は、内在化効率、サイトゾルへの細胞内経路決定効率、標的細胞による送達されたエピトープの提示、リボソーム阻害、及び細胞毒性からなる群から選択される。細胞毒性に関して、志賀毒素エフェクター活性の適度なレベルは、野生型志賀毒素コンストラクトの１，０００倍以内であること、例えば、野生型志賀毒素コンストラクト（例えば野生型志賀毒素Ａ１断片を含む細胞標的化分子）が０．５ｎＭのＣＤ５０を表す場合、５００ｎＭ以下のＣＤ５０を示すことを含む。
【０１１２】
本発明の目的に関して、及び本発明の分子の細胞毒性に関して、用語「最適な」は、野生型志賀毒素Ａ１断片（例えば志賀毒素Ａサブユニット又はある特定のそれらの短縮型バリアント）及び／又は天然に存在する志賀毒素を含む分子の細胞毒性の２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍以内の志賀毒素触媒ドメインが媒介する細胞毒性のレベルを指す。
【０１１３】
注目すべきことに、志賀毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性が、野生型志賀毒素Ａサブユニット又はそれらの断片と比較して低減される場合であっても、実際には、生物活性を弱化した志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用する適用は、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを使用するのと等しく又はそれより高く有効であり得るが、これは、最も高い効力のバリアントは望ましくない作用を表す可能性があるが、そのような作用は細胞毒性効力が低減されたバリアントにおいて最小化されるか又は低減されるためである。野生型志賀毒素は非常に強力であり、毒素が与えられた細胞のサイトゾルにわずか１つの毒素分子が到達した後、又は場合により毒素が与えられた細胞にわずか４０個の毒素分子が内在化した後に、毒素が与えられた細胞を殺滅することができる。例えば細胞内経路決定又は細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能が野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して顕著に低減した志賀毒素エフェクターポリペプチドは、それでもなお、例えば標的化された細胞を殺滅すること、異種エピトープ送達、並びに／又は特異的な細胞及びそれらの細胞内区画の検出を含む適用などの実際の適用に十分に強力であり得る。加えて、ある特定の活性が低減した志賀毒素エフェクターポリペプチドは、標的細胞のある特定の細胞内配置又は細胞内区画にカーゴ（cargo）（例えば追加の外因性物質又はＴ細胞エピトープ）を送達するのに特に有用な場合もある。
【０１１４】
用語「選択的な細胞毒性」は、分子の細胞毒性活性に関して、生体分子標的陽性細胞集団（例えば標的化された細胞型）と非標的化バイスタンダー細胞（bystander cell）集団（例えば生体分子標的陰性細胞型）との間の細胞毒性の相対レベルを指し、これは、細胞毒性の選択性の測定基準、又は標的化された細胞と非標的化細胞との殺滅の優先性の指標を提供するための、非標的化細胞型のＣＤ５０に対する標的化された細胞型の半最大細胞毒性濃度（ＣＤ５０）の比率として表すことができる。
【０１１５】
所与の細胞外標的生体分子（又は所与の標的生体分子の細胞外エピトープ）の細胞表面表示及び／又は密度は、本発明のある特定の細胞標的化分子を最も好適に使用することができる適用に影響を与えることができる。所与の標的生体分子の細胞表面表示及び／又は密度における細胞間の差は、本発明の所与の細胞標的化分子の細胞内在化の効率及び／又は細胞毒性効力を、定量的及び定性的の両方で変更することができる。細胞周期又は細胞分化における異なるポイントにおいて、標的生体分子陽性細胞間で、又は同じ細胞においてでも、所与の標的生体分子の細胞表面表示及び／又は密度を大幅に変更することができる。特定の細胞又は細胞集団における所与の標的生体分子及び／又は所与の標的生体分子のある特定の細胞外エピトープの合計の細胞表面表示は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーを含む方法などの熟練した作業者公知の方法を使用して決定することができる。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「破壊された」、「破壊」、又は「破壊すること」、及び文法上のその変化形は、ポリペプチド領域又はポリペプチド内の機構に関して、領域内の又は破壊された機構を構成する少なくとも１つのアミノ酸の変更を指す。アミノ酸の変更は、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を変更する欠失、逆位、挿入、又は置換などの様々な変異を含む。アミノ酸の変更はまた、例えばアミノ酸官能基における１つ又は２つ以上の原子の変更、又はアミノ酸官能基への１つ又は２つ以上の原子の付加などの化学的変化も含む。
【０１１７】
「脱免疫化された」は、本明細書で使用される場合、脊索動物への投与後、例えば野生型ペプチド領域、ポリペプチド領域、又はポリペプチドなどの参照分子と比較して低減した抗原性及び／又は免疫原性の見込みを意味する。これは、参照分子と比較して１つ又は２つ以上のデノボ、抗原性及び／又は免疫原性エピトープが導入されているにもかかわらず、全体的な抗原性及び／又は免疫原性の見込みが低減していることを含む。ある特定の実施形態に関して、「脱免疫化された」は、分子が、哺乳動物への投与後に、例えば野生型志賀毒素Ａ１断片などのその由来となった「親の」分子と比較して低減した抗原性及び／又は免疫原性を表することを意味する。ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、参照分子と比較して相対的な抗原性を示すことが可能であり、例えば定量的ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析のような熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイなどの同じアッセイによって測定された同じ条件下における参照分子の抗原性より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれより大きく低減された抗原性を示すことができる。ある特定の実施形態において、本発明の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、参照分子と比較して相対的な免疫原性を表すことが可能であり、例えば所与のタイムポイントで分子の非経口投与を受けた後の哺乳動物中で産生された抗分子抗体の定量的な測定のような熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイなどの同じアッセイによって測定された同じ条件下における参照分子の免疫原性より、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれより大きく低減された免疫原性を示すことができる。
【０１１８】
例示的な細胞標的化分子の相対的な免疫原性は、長期間にわたる（over periods of many）繰り返しの非経口投与の後にインビボにおける細胞標的化分子に対する抗体応答のためのアッセイを使用して決定された。
【０１１９】
本発明の目的に関して、成句「ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された」は、細胞標的化分子が、生きた脊索動物中の有核の脊索動物細胞の内部に存在する場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原性又は免疫原性に関して、いずれの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まない同じ分子と比較して増加した抗原性及び／又は免疫原性の見込みを有することを意味する。
【０１２０】
用語「埋め込まれた」及び文法上のその変化形は、Ｔ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープ−ポリペプチドのペプチド成分に関して、開始のポリペプチド領域と同じアミノ酸残基総数を共有する新しいポリペプチド配列を生成するための、ポリペプチド領域内における異なるアミノ酸での１つ又は２つ以上のアミノ酸の内部の置き換えを指す。したがって、用語「埋め込まれた」は、いかなる追加のアミノ酸、ペプチド、又はポリペプチド成分の開始のポリペプチドへのいかなる外部からの末端融合も、いかなる追加のアミノ酸残基のいかなる追加の内部挿入も含まないが、既存のアミノ酸の置換のみを含む。内部の置き換えは、単にアミノ酸残基の置換によって、又は一連の置換、欠失、挿入、及び／若しくは逆位によって達成することができる。１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入が使用される場合、埋め込まれたＴ細胞エピトープをもたらすためには、挿入とは別に同数の近位のアミノ酸を欠失させなければならない。これは、本発明のポリペプチド内に含有されるＴ細胞エピトープに関する用語「挿入された」の使用とは対照的であり、この用語は、ポリペプチド内部への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を指し、その結果として開始のポリペプチドと比較してアミノ酸残基数が増加した新しいポリペプチドが生じる。
【０１２１】
用語「挿入された」及び文法上のその変化形は、ポリペプチド内に含有されるＴ細胞エピトープに関して、ポリペプチド内への１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を指し、その結果として開始のポリペプチドと比較してアミノ酸残基数が増加した新しいポリペプチド配列が生じる。
【０１２２】
本発明の目的に関して、成句「アミノ末端の近位」は、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の位置を参照した場合、細胞標的化分子が本明細書で言及される適切なレベルの志賀毒素エフェクター機能活性（例えば、ある特定のレベルの細胞毒性効力）を示すことができる限り、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の少なくとも１つのアミノ酸残基が、細胞標的化分子のアミノ末端の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれより多くのアミノ酸残基以内、例えば１８〜２０アミノ酸残基までである距離を指す。したがって本発明のある特定の実施形態に関して、アミノ末端を志賀毒素エフェクターポリペプチドに融合させたいずれのアミノ酸残基も、志賀毒素エフェクターポリペプチドの機能的な活性が本明細書で必要な適切な活性レベルより低く低減されるようにいずれの志賀毒素エフェクター機能を低減させないと予想される（例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ末端の近くで構造に立体的に干渉することによって）。
【０１２３】
本発明の目的に関して、成句「アミノ末端のより近位」は、本発明の細胞標的化分子内の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の配置を別の成分（例えば、細胞を標的化する、結合領域、分子部分、及び／又は追加の外因性物質）と比較して参照した場合、志賀毒素エフェクターポリペプチドのアミノ末端の少なくとも１つのアミノ酸残基が、他の参照された成分と比較して、本発明の細胞標的化分子の直鎖状のポリペプチド成分のアミノ末端により近い配置を指す。
【０１２４】
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素ファミリーのメンバーの１つのＡサブユニット由来の活性な酵素ドメイン」は、触媒性のリボソーム不活性化メカニズムを介してタンパク質合成を阻害する能力を有することを指す。天然に存在する志賀毒素の酵素活性は、例えば生きた細胞の非存在下におけるＲＮＡ翻訳を含むインビトロでのアッセイ、又は生きた細胞におけるＲＮＡ翻訳を含むインビボでのアッセイなどの熟練した作業者公知のアッセイを使用して、タンパク質の翻訳を阻害する能力と定義される場合がある。熟練した作業者公知の及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して、志賀毒素の酵素活性の効力は、例えばリボソームニッキングアッセイなどによりリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対するＮ−グリコシダーゼ活性を観察することによって直接的にアセスメントしてもよいし、及び／又はリボソーム機能及び／又はタンパク質合成の阻害を観察することによって間接的にアセスメントしてもよい。
【０１２５】
本発明の目的に関して、用語「志賀毒素Ａ１断片領域」は、志賀毒素Ａ１断片から本質的になるか及び／又は志賀毒素の志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド領域を指す。
【０１２６】
本発明の目的に関して、用語「末端」、「アミノ末端」、又は「カルボキシ末端」は、細胞標的化分子に関して、細胞標的化分子のポリペプチド鎖（例えば、単一の連続的なポリペプチド鎖）の最後のアミノ酸残基を一般的に指す。細胞標的化分子は１つより多くのポリペプチド又はタンパク質を含む可能性があることから、本発明の細胞標的化分子は、複数のアミノ末端及びカルボキシ末端を含む可能性がある。例えば、細胞標的化分子の「アミノ末端」は、ポリペプチドのアミノ末端の終わりの部分を示すポリペプチド鎖の第１のアミノ酸残基と定義される場合があり、これは、一般的に、開始のアミノ酸残基がいずれのアミノ酸残基とのペプチド結合も有さず、開始のアミノ酸残基の主鎖のアミノ基を含むか、又はＮ−アルキル化されたアルファアミノ酸残基のクラスのメンバーである開始のアミノ酸残基にとって等価な窒素を含むことを特徴とする。同様に、細胞標的化分子の「カルボキシ末端」は、ポリペプチドのカルボキシル末端の終わりの部分を示すポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基と定義される場合があり、これは、一般的に、最後のアミノ酸残基が、その主鎖のカルボキシル基のアルファ−炭素にペプチド結合によって連結されたいずれのアミノ酸残基も有さないことを特徴とする。
【０１２７】
本発明の目的に関して、用語「末端」、「アミノ末端」、又は「カルボキシ末端」は、ポリペプチド領域に関して、その領域の外側に追加のアミノ酸残基がペプチド結合によって連結されているかどうかに関係なく、その領域の局所的な境界を指す。言い換えれば、ポリペプチド領域の末端は、その領域が他のペプチド又はポリペプチドに融合されているかどうかを問わない。例えば、２つのタンパク質領域、例えばペプチド又はポリペプチドを含む結合領域及び志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む融合タンパク質は、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のアミノ酸残基２５１で終わるカルボキシ末端を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を有していてもよいが、別のタンパク質領域、例えば結合領域の始まりを示す２５２位のアミノ酸残基へのペプチド結合が残基２５１を含む。この例において、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端は、融合タンパク質の末端ではなく内部領域の境界を示す残基２５１を指す。したがって、ポリペプチド領域の場合、用語「末端」、「アミノ末端」、及び「カルボキシ末端」は、境界が物理的な末端であるか、又はより大きいポリペプチド鎖内に埋め込まれた内部位置であるかにかかわらず、ポリペプチド領域の境界を指すのに使用される。
【０１２８】
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素Ａ１断片由来領域」は、志賀毒素エフェクターポリペプチドのすべて又は一部を指し、この領域は、天然に存在する志賀毒素Ａ１断片又はその短縮形に相同なポリペプチド、例えば、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）のアミノ酸７５〜２３９、ＳｔｘＡ（配列番号２）のアミノ酸７５〜２３９、若しくは（配列番号３）のアミノ酸７７〜２３８、又は志賀毒素ファミリーのメンバーの別のＡサブユニットにおける等価な領域からなるか又はそれを含むポリペプチドなどからなる。「志賀毒素Ａ１断片由来領域」のカルボキシ末端は、天然に存在する志賀毒素Ａ１断片と比べて、（１）天然に存在する志賀毒素Ａ１断片との相同性を共有するカルボキシ末端のアミノ酸残基で終わるものとして、（２）Ａ１断片及びＡ２断片のジャンクションで終わるものとして、（３）フーリン切断部位若しくは破壊されたフーリン切断部位で終わるものとして、並びに／又は（４）志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端短縮形、すなわち、天然に存在する志賀毒素Ａ１断片との相同性を共有するカルボキシ末端のアミノ酸残基で終わるものとして、定義される。
【０１２９】
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端領域」は、天然に存在する志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド領域を指し、この領域は、疎水性残基（例えば、ＳｔｘＡ−Ａ１及びＳＬＴ−１Ａ１のＶ２３６、並びにＳＬＴ−２Ａ１のＶ２３５）で始まり、それに続いて疎水性残基があり、さらにこの領域は、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチド間で保存されたフーリン切断部位で終わり、天然の志賀毒素ＡサブユニットにおけるＡ１断片とＡ２断片との間のジャンクションで終わる。本発明の目的に関して、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端領域は、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチドのカルボキシ末端由来のペプチド領域、例えば、志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端を含むか又はそれから本質的になるペプチド領域などを含む。志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端由来のペプチド領域の非限定的な例としては、Ｓｔｘ１Ａ（配列番号２）又はＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）における、２３６位から、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、又は２５１位まで；及びＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における、２３５位から、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、又は２５０位までの天然に位置するアミノ酸残基配列が挙げられる。
【０１３０】
本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片ポリペプチドのカルボキシ末端の近位」は、連結された分子部分及び／又は結合領域に関して、志賀毒素Ａ１断片ポリペプチドの最後の残基を定義するアミノ酸残基から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２アミノ酸残基以内であることを指す。
【０１３１】
本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」は、Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端中のアミノ酸残基、例えば、Ｓｔｘ１Ａ（配列番号２）若しくはＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）における２３６〜２５１位又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）における２３５〜２５０位のいずれか１つにおける天然に位置するアミノ酸残基由来のアミノ酸残基などに連結及び／又は融合した、サイズが４．５ｋＤａであるか又はそれより大きいあらゆる分子部分（例えば、免疫グロブリン型の結合領域）を含む。本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」はまた、Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端中のアミノ酸残基、例えば、Ａ１断片由来の領域の最後のアミノ酸及び／又は志賀毒素エフェクターポリペプチドに対するカルボキシ末端のアミノ酸残基などに連結及び／又は融合した、サイズが４．５ｋＤａであるか又はそれより大きいあらゆる分子部分（例えば、免疫グロブリン型の結合領域）も含む。本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」はまた、Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端の細胞による認識、例えば真核細胞のＥＲＡＤ機構による認識などを物理的に防ぐ、サイズが４．５ｋＤａであるか又はそれより大きいあらゆる分子部分（例えば、免疫グロブリン型の結合領域）も含む。
【０１３２】
本発明の目的に関して、結合領域、例えば、少なくとも４０アミノ酸を含むポリペプチドを含む、及びＡ１断片由来の領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端に連結されている（例えば、融合されている）免疫グロブリン型の結合領域などは、「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を立体的にカバーする」分子部分である。
【０１３３】
本発明の目的に関して、結合領域、例えば、少なくとも４０アミノ酸を含むポリペプチドを含む、及びＡ１断片由来の領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチド領域のカルボキシ末端に連結されている（例えば、融合されている）免疫グロブリン型の結合領域などは、「Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端を妨害する」分子部分である。
【０１３４】
本発明の目的に関して、用語「志賀毒素ファミリーのメンバーのＡ１断片」は、志賀毒素Ａサブユニット間で保存されており、野生型志賀毒素Ａサブユニット中でＡ１断片とＡ２断片との間に配置されたフーリン切断部位でフーリンによりタンパク質分解された後の志賀毒素Ａサブユニットの残存したアミノ末端断片を指す。
【０１３５】
特許請求された発明の目的に関して、成句「Ａ１断片領域のカルボキシ末端におけるフーリン切断モチーフ」は、志賀毒素Ａサブユニット間で保存されており、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニット中のＡ１断片とＡ２断片との間でジャンクションを架橋する特異的なフーリン切断モチーフを指す。
【０１３６】
本発明の目的に関して、成句「Ａ１断片領域のカルボキシ末端の近位におけるフーリン切断部位」は、Ａ１断片領域又はＡ１断片由来の領域中の最後のアミノ酸残基を定義するアミノ酸残基から、１、２、３、４、５、６、７未満の、又はそれより多くのアミノ酸残基の距離内のアミノ酸残基を有するあらゆる同定可能なフーリン切断部位を指し、例えば、Ａ１断片領域又はＡ１断片由来の領域のカルボキシ末端に配置されている、例えば、例えば本発明の細胞標的化分子の分子部分などの分子の別の成分へのＡ１断片由来の領域の連結部の近位に配置されているフーリン切断モチーフを含む。
【０１３７】
本発明の目的に関して、成句「破壊されたフーリン切断モチーフ」は、（ｉ）本明細書で説明される特定のフーリン切断モチーフ、及び（ii）参照分子と比較してフーリン切断が低減した分子、例えば、同じ条件下における同じアッセイで観察された参照分子のフーリン切断より３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はそれ未満（切断なしの場合の１００％を含む）の、再現性よく観察されるフーリン切断の低減を示す分子を付与することができる、変異及び／又は短縮化を含む、フーリン切断モチーフを指す。参照分子と比較したフーリン切断のパーセンテージは、参照分子の切断された材料：切断されていない材料で割った所望の分子の切断された材料：切断されていない材料の比率として表すことができる（下記の実施例を参照）。好適な参照分子の非限定的な例としては、野生型志賀毒素フーリン切断モチーフ並びに／又は本明細書のＩ−Ｂ章、IV−Ｂ章及び／若しくは実施例で説明されるフーリン切断部位を含むある特定の分子、並びに／又は以下の実施例で参照分子として使用される分子が挙げられる。
【０１３８】
本発明の目的に関して、成句「フーリン切断耐性」は、分子又はそれらの特定のポリペプチド領域が、本明細書に記載される方法を使用することなどによる熟練した作業者にとって利用可能ないずれかの手段によってアッセイした場合、（ｉ）野生型志賀毒素Ａサブユニットにおける志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端、又は（ii）Ａ１断片とＡ２断片との間のジャンクションに天然に位置する、天然に存在するフーリン切断部位が破壊されていないコンストラクトの志賀毒素Ａ１断片由来の領域のカルボキシ末端より少ないフーリン切断を再現性よく示すことを意味する。
【０１３９】
本発明の目的に関して、成句「志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニット由来の活性な酵素ドメイン」は、志賀毒素の酵素活性に基づき触媒によるリボソームの不活性化を介してタンパク質合成を阻害する能力を有するポリペプチド構造を指す。タンパク質合成の阻害活性及び／又は触媒によるリボソームの不活性化を示す分子構造の能力は、様々な熟練した作業者公知のアッセイ、例えば、生きた細胞の非存在下におけるＲＮＡ翻訳アッセイを含むインビトロでのアッセイ、又はインビボでの生きた細胞のリボソームを含むアッセイを使用して観察することができる。例えば、熟練した作業者公知のアッセイを使用して、志賀毒素の酵素活性に基づく分子の酵素活性は、例えばリボソームニッキングアッセイなどのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対するＮ−グリコシダーゼ活性を観察することによって直接的に、並びに／又はリボソーム機能、ＲＮＡ翻訳、及び／若しくはタンパク質合成の阻害を観察することによって間接的にアセスメントすることができる。
【０１４０】
「組合せ」は、本明細書で志賀毒素エフェクターポリペプチドに関して使用される場合、各部分領域が（１）内因性エピトープ又はエピトープ領域における破壊及び（２）志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフの少なくとも１つを含む、２つ又は３つ以上の部分領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドを説明する。
【０１４１】
本発明は、例示的な非限定的な実施形態、及び添付の図面への参照を使用して、下記でより詳細に説明される。しかしながらこの発明は、多くの様々な形態を具体化することができ、以下に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。そうではなく、この開示が十分であり、当業者に本発明の範囲を伝えられるように、これらの実施形態は提供される。
【０１４２】
導入
本発明は、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に送達し、送達されたエピトープの細胞表面上での提示をもたらすことができる、様々な例示的な志賀毒素Ａサブユニット由来のコンストラクトを提供する。志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドは、特定の細胞標的化結合領域にそれらを連結することによって、細胞標的化の特異性を有するように改変することができる。本発明は、高度に免疫原性のＣＤ８＋Ｔ細胞抗原、例えば、ペプチド−エピトープなどを、脊索動物細胞のＭＨＣクラスＩ提示系に送達するために、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドがそれ自体の細胞内経路決定を行う能力を利用する。志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、細胞内在化を誘導し、サイトゾルへの細胞内経路決定を指示し、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴを細胞の表面上での提示のためにＭＨＣクラスＩ経路に送達することができる。ＭＨＣクラスＩ分子との複合体で細胞表面上に提示されたある特定のペプチド−エピトープは、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞に、提示細胞を殺滅するように、並びに局所領域において他の免疫応答を刺激するように、シグナルを伝達することができる。したがって、本発明は、特定の標的細胞を、例えば、ＭＨＣクラスＩ経路によるある特定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示を介して、殺滅させる、志賀毒素Ａサブユニット由来の細胞標的化分子を提供する。本発明の細胞標的化分子は、例えば、細胞殺滅分子、細胞毒性治療薬、治療用送達剤、及び診断用分子として利用することができる。
【０１４３】
Ｉ．本発明の細胞標的化分子の一般的な構造
本発明の細胞標的化分子は、それぞれ、１）細胞標的化結合領域、２）志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、並びに３）分子の志賀毒素Ａサブユニット及び結合領域にとって異種であるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。この系は、任意の数の多様なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、本発明の細胞標的化分子の標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達するためのカーゴとして使用することができるという点で、モジュール式である。
【０１４４】
Ａ．志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーの志賀毒素Ａサブユニットに由来するポリペプチドであり、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの志賀毒素機能を呈することができる。志賀毒素機能としては、例えば、細胞に入るのを促進すること、脂質膜を変形させること、クラスリン媒介エンドサイトーシスを刺激すること、逆行性輸送を指示すること、細胞内経路決定を指示すること、細胞内分解を回避すること、触媒作用によりリボソームを不活性化すること、細胞毒性を実現すること、及び細胞増殖抑制作用を実現することが挙げられる。
【０１４５】
本発明における使用に適しているか又は当技術分野で公知の技術を使用して修飾して本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドにするための親ポリペプチドとして使用するのに適している、熟練した作業者に公知の多数の志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する（例えば、Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)；国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット；同第２０１５／１１３００５号パンフレット；同第２０１５／１１３００７号パンフレット；同第２０１５／１３８４５２号パンフレット；同第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。
【０１４６】
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、その天然の志賀毒素Ｂサブユニットのいずれの形態からも解離された志賀毒素Ａサブユニットに由来するポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ｂサブユニットの細胞標的化ドメインを含まない。原型的な志賀毒素は、天然には、志賀毒素Ｂサブユニットを介してヒト細胞表面受容体であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、Ｇｂ３Ｃｅｒ、又はＣＤ７７）及びグロボテトラオシルセラミド（Ｇｂ４又はＧｂ４Ｃｅｒ）を標的とするが、これにより、標的化する細胞型が限定されること、並びに血管内皮細胞、ある特定の腎臓上皮細胞、及び／又は呼吸器上皮細胞を不要に標的化する可能性があることにより、潜在的な用途が著しく制限される（Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993)；Ling H et al., Biochemistry 37: 1777-88 (1998)；Bast D et al., Mol Microbiol 32: 953-60 (1999)；Rutjes N et al., Kidney Int 62: 832-45 (2002)；Shimizu T et al., Microb Pathog 43: 88-95 (2007)；Pina D et al., Biochim Biophys Acta 1768: 628-36 (2007)；Shin I et al., BMB Rep 42: 310-4 (2009)；Zumbrun S et al., Infect Immun 4488-99 (2010)；Engedal N et al., Microb Biotechnol 4: 32-46 (2011)；Gallegos K et al., PLoS ONE 7: e30368 (2012)；Stahl A et al., PLoS Pathog 11: e1004619 (2015)）。Ｇｂ３及びＧｂ４は、様々な血管床由来の多形核白血球及びヒト内皮細胞など様々な健常な細胞型の細胞膜の細胞外側の膜に存在する一般的な中性のスフィンゴ脂質である。本発明の細胞標的化分子は、天然の志賀毒素Ｂサブユニットの機能的な結合ドメインを含むか又はそれから本質的になるいかなるポリペプチドも含まない。むしろ、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、細胞標的化を実現するために、異種結合領域と機能的に会合され得る。
【０１４７】
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、完全長志賀毒素Ａサブユニット（例えば、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３））を含むか又はそれから本質的になり得るが、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットが、それらのアミノ末端に、除去されると成熟志賀毒素Ａサブユニットを生じ、熟練した作業者に認識可能な約２２個のアミノ酸のシグナル配列を含有する前駆体形態を含み得ることに留意されたい。他の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、完全長志賀毒素Ａサブユニットよりも短い短縮型志賀毒素Ａサブユニット、例えば、当技術分野で公知の短縮形を含むか又はそれから本質的になる（例えば、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット；同第２０１５／１１３００５号パンフレット；同第２０１５／１１３００７パンフレット；同第２０１５／１３８４５２パンフレット；同第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。
【０１４８】
熟練した作業者に公知のいずれの志賀毒素エフェクターポリペプチドも、本発明の細胞標的化分子の成分としての使用に好適であり得るが、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットに記載されているいずれかの志賀毒素エフェクターポリペプチドが、送達された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と複合体化して細胞表面上に検出可能に提示されるのを誘導するために、志賀毒素エフェクターポリペプチドに挿入も埋込みもされていない異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への十分な細胞内送達を提供することができるかどうかは、未知である。さらに、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットに記載されているいずれかの志賀毒素エフェクターポリペプチドが、送達された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と複合体化して細胞表面上に検出可能に提示されるのを誘導するために、結果として得られる組合せの分子が、安定しており、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への十分な細胞内送達を提供することができるように、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに発明として記載されている志賀毒素エフェクターポリペプチドのいずれかの構造的特徴と組合せ可能であるかどうかは、未知であり、予測不可能である。
【０１４９】
Ｂ．送達のための異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴ
本発明の細胞標的化分子は、それぞれが、それぞれの志賀毒素エフェクターポリペプチド及び結合領域にとって異種である１つ又は２つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１つの個体の免疫系によって認識可能な分子構造、すなわち、抗原性ペプチドである。本発明の細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、実質的にいずれのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープから選択してもよい。
【０１５０】
特許請求された発明の目的に関して、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩエピトープ又はＭＨＣクラスＩペプチドとしても知られる）は、抗原性ペプチドで構成される分子構造体であり、直鎖状のアミノ酸配列によって表すことができる。一般的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、８〜１１アミノ酸残基のサイズを有するペプチドである（Townsend A, Bodmer H, Annu Rev Immunol 7：601-24 (1989)）。しかしながら、ある特定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸長さが８よりより小さいか又は１１より大きい長さを有する（例えば Livingstone A, Fathman C, Annu Rev Immunol 5：477-501 (1987)；Green K et al., Eur J Immunol 34：2510-9 (2004)を参照）。
【０１５１】
特許請求された発明の目的に関して、用語「異種」は、（１）天然に存在する志賀毒素のＡサブユニット及び（２）異種成分を含む細胞標的化分子の結合領域とは異なる源のものを意味する。本発明の細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、野生型志賀毒素Ａ１断片；天然に存在する志賀毒素Ａ１断片；及び／又は細胞標的化分子の成分として使用される先行技術の志賀毒素エフェクターポリペプチドにすでに存在しているものではないＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドである。
【０１５２】
本発明のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、少なくとも７アミノ酸残基の長さである。本発明のある特定の実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、Stone J et al., Immunology 126: 165-76 (2009)に記載の式を使用して計算した場合、１０ミリモル（ｍＭ）未満（例えば、１〜１００μＭ）のＫＤを特徴とする結合親和性でＴＣＲと結合する。しかしながら、注目すべきことに、ＭＨＣ−エピトープとＴＣＲとの間の所与の範囲内の結合親和性は、例えばＭＨＣ  Ｉ−ペプチド−ＴＣＲ複合体安定性、ＭＨＣ  Ｉ−ペプチド密度、及びＣＤ８などのＴＣＲ補因子のＭＨＣ非依存性の機能のような要因による抗原性及び／又は免疫原性（例えばAl-Ramadi B et al., J Immunol 155：662-73 (1995)を参照）と関係ない場合がある（Baker B et al., Immunity 13：475-84 (2000)；Hornell T et al., J Immunol 170：4506-14 (2003)；Woolridge L et al., J Immunol 171：6650-60 (2003)）。
【０１５３】
Ｔ細胞エピトープは、本発明で使用するための多数の源の分子から選択されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、様々な天然に存在するタンパク質から作り出されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、哺乳動物にとって外来の様々な天然に存在するタンパク質、例えば微生物のタンパク質などから作り出されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、変異したヒトタンパク質及び／又は悪性ヒト細胞によって異常に発現されるヒトタンパク質から作り出されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。Ｔ細胞エピトープは、合成的に作り出されてもよいし、又は合成分子に由来していてもよい（例えば、Carbone F et al., J Exp Med 167：1767-9 (1988)；Del Val M et al., J Virol 65：3641-6 (1991)；Appella E et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1：177-84 (1995)；Perez S et al., Cancer 116：2071-80 (2010)を参照）。
【０１５４】
本発明の細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、例えば、ヒト病原体、典型的には、最も一般的な病原性ウイルス及び細菌に由来する十分に特徴付けられた免疫原性エピトープなど、様々な公知の抗原から選択され得る。
【０１５５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、例えば、遺伝学的アプローチ、ライブラリースクリーニング、及びＭＨＣクラスＩ分子を提示する細胞をペプチドから溶出し、それらを質量分析法によって配列決定することなど、熟練した作業者に公知の逆免疫法（reverse immunology method）によって同定することができる（例えば、Van Der Bruggen P et al., Immunol Rev 188: 51-64 (2002)を参照）。
【０１５６】
追加として、既知の対照と比較した、所定のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子についての三元ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化させるペプチドの能力の測定に基づいた他のＭＨＣ  Ｉ−ペプチド結合アッセイが、開発されている（例えば、ProImmune社、Sarasota, FL, U.S.のＭＨＣ  Ｉ−ペプチド結合アッセイ）。このようなアプローチは、推定上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの有効性を予測すること又は既知のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに関する経験上の根拠を裏付けるのに役立ち得る。
【０１５７】
どのようなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープも、本発明の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとして使用されるものとして予期されるが、所望の特性に基づきある特定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選択することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞で過免疫された細胞標的化分子を作り出すことが１つの目的であり、これは、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドが、細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ分子と複合体化したことが提示されたときにインビボでロバストな（robust）免疫応答を惹起することができるため、高度に免疫原性であることを意味する。
【０１５８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、脊椎動物の免疫応答を惹起できることがすでに公知の多数の源の分子に由来していてもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、脊椎動物にとって外来の様々な天然に存在するタンパク質、例えば病原微生物のタンパク質及び非自己がん抗原などに由来していてもよい。特定には、感染性微生物は、公知の抗原性及び／又は免疫原性特性を有する多数のタンパク質を含有し得る。さらに、感染性微生物は、公知の抗原性及び／若しくは免疫原性の部分領域又はエピトープを有する多数のタンパク質を含有し得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、例えば、がん細胞によって発現される変異型タンパク質など、変異型ヒトタンパク質及び／又は悪性ヒト細胞によって異常に発現されるヒトタンパク質に由来し得る（例えば、Sjoblom T et al., Science 314: 268-74 (2006)；Wood L et al., Science 318: 1108-13 (2007)；Jones S et al., Science 321: 1801-6 (2008)；Parsons D et al., Science 321: 1807-12 (2008)；Wei X et al., Nat Genet 43: 442-6 (2011)；Govindan R et al., Cell 150: 1121-34 (2012)；Vogelstein B et al., Science 339: 1546-58 (2013)を参照）。
【０１５９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ペプチド、タンパク質のペプチド成分、及びタンパク質に由来するペプチドを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起できることがすでに公知の多数の源の分子から選択されてもよいし、又はそれらに由来していてもよい。例えば、哺乳類宿主を伴う細胞内病原体のタンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの源である。よく研究された抗原性のタンパク質又はペプチドを有する、多数の細胞内病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、及び単細胞真核生物などがある。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ヒトウイルス又は他の細胞内病原体、例えばマイコバクテリウム属（mycobacterium）のような細菌、トキソプラズマ属（toxoplasmae）のような真菌、及びトリパノソーマ属（trypanosomes）のような原生生物などから選択又は同定することができる。
【０１６０】
例えば、ヒトに感染するウイルス由来の公知のウイルスタンパク質の免疫原性ウイルスペプチド成分が、多数存在する。多数のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、Ａ型インフルエンザウイルス由来のタンパク質中のペプチド、例えばタンパク質ＨＡ糖タンパク質ＦＥ１７、Ｓ１３９／１、ＣＨ６５、Ｃ０５、ヘマグルチニン１（ＨＡ１）、血球凝着素２（ＨＡ２）、非構造タンパク質１及び２（ＮＳ１及びＮＳ２）、マトリックスタンパク質１及び２（Ｍ１及びＭ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ））中のペプチドなどにマッピングされており、これらのペプチドの多くが、例えばエクスビボのアッセイを使用することによって、ヒト免疫応答を惹起することが示されている（例えば、Assarsson E et al, J Virol 82: 12241-51 (2008); Alexander J et al., Hum Immunol 71: 468-74 (2010); Wang M et al., PLoS One 5: e10533 (2010); Wu J et al., Clin Infect Dis 51: 1184-91 (2010); Tan P et al., Human Vaccin 7: 402-9 (2011); Grant E et al., Immunol Cell Biol 91: 184-94 (2013); Terajima M et al., Virol J 10: 244 (2013)を参照）。同様に、多数のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来のタンパク質のペプチド成分、例えばタンパク質ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ＵＬ１２８〜１３１、前初期１（ＩＥ−１；ＵＬ１２３）、糖タンパク質Ｂ、外被タンパク質中のペプチドなどにマッピングされており、これらのペプチドの多くが、例えばエクスビボのアッセイを使用することによって、ヒト免疫応答を惹起することが示されている（例えば、Schoppel K et al., J Infect Dis 175: 533-44 (1997); Elkington R et al, J Virol 77: 5226-40 (2003); Gibson L et al., J Immunol 172: 2256-64 (2004); Ryckman B et al., J Virol 82: 60-70 (2008); Sacre K et al., J Virol 82: 10143-52 (2008)を参照）。
【０１６１】
別の例として、ヒトにおける多くの免疫原性がん抗原がある。がんのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ及び／又は腫瘍細胞抗原は、熟練した作業者により、例えば差次的なゲノミクス、差次的なプロテオミクス、イムノプロテオミクス、予測とそれに次ぐ検証、及び逆の遺伝学的トランスフェクションのような遺伝学的アプローチなどの当業界において公知の技術を使用して同定することができる（例えば、Admon A et al., Mol Cell Proteomics 2：388-98 (2003)；Purcell A, Gorman J, Mol Cell Proteomics 3：193-208 (2004)；Comber J, Philip R, Ther Adv Vaccines 2：77-89 (2014)を参照）。ヒトがん及び／又は腫瘍細胞において生じることがすでに同定又は予測された多くの抗原性及び／又は免疫原性のＴ細胞エピトープがある。例えば、Ｔ細胞エピトープは、一般的に変異されるか又は新生細胞中で過剰発現されるヒトタンパク質、例えばＡＬＫ、ＣＥＡ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ−Ｖ）、ＨＣＡ５８７、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、及びＴＲＡＧ−３などにおいて予測されている（van der Bruggen P et al., Science 254：1643-7 (1991)；Kawakami Y et al., J Exp Med 180：347-52 (1994)；Fisk B et al., J Exp Med 181：2109-17 (1995)；Guilloux Y et al., J Exp Med 183：1173 (1996)；Skipper J et al., J Exp Med 183：527 (1996)；Brossart P et al., 93：4309-17 (1999)；Kawashima I et al., Cancer Res 59：431-5 (1999)；Papadopoulos K et al., Clin Cancer Res 5：2089-93 (1999)；Zhu B et al., Clin Cancer Res 9：1850-7 (2003)；Li B et al., Clin Exp Immunol 140：310-9 (2005)；Ait-Tahar K et al., Int J Cancer 118：688-95 (2006)；Akiyama Y et al., Cancer Immunol Immunother 61：2311-9 (2012)を参照）。加えて、ヒトがん細胞由来のＴ細胞エピトープの合成バリアントが作り出されている（例えば、Lazoura E, Apostolopoulos V, Curr Med Chem 12：629-39 (2005)；Douat-Casassus C et al., J Med Chem 50：1598-609 (2007)を参照）。
【０１６２】
あらゆる異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを本発明の組成物及び方法において使用することができるが、ある特定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、それらの公知の及び／又は実験的に決定された特徴に基づいて好ましい場合がある。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起する免疫原性ペプチド−エピトープは、熟練した作業者に公知の技術を使用して説明されている及び／又は同定することができる（例えば、Kalish R, J Invest Dermatol 94: 108S-111S (1990)；Altman J et al., Science 274: 94-6 (1996)；Callan M et al., J Exp Med 187: 1395-402 (1998)；Dunbar P et al., Curr Biol 8: 413-6 (1998)；Sourdive D et al., J Exp Med 188: 71-82 (1998)；Collins E et al., J Immunol 162: 331-7 (1999)；Yee C et al., J Immunol 162: 2227-34 (1999)；Burrows S et al., J Immunol 165: 6229-34 (2000)；Cheuk E et al., J Immunol 169: 5571-80 (2002)；Elkington R et al, J Virol 77: 5226-40 (2003)；Oh S et al., Cancer Res 64: 2610-8 (2004)；Hopkins L et al., Hum Immunol 66: 874-83 (2005)；Assarsson E et al, J Virol 12241-51 (2008)；Semeniuk C et al., AIDS 23: 771-7 (2009)；Wang X et al., J Vis Exp 61: 3657 (2012)；Song H et al., Virology 447: 181-6 (2013)；Chen L et al., J Virol 88: 11760-73 (2014)を参照）。
【０１６３】
多くの種において、ＭＨＣ遺伝子は、複数のＭＨＣ−Ｉ分子バリアントをコードする。ＭＨＣクラスＩタンパク質多型は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原−ＭＨＣクラスＩ複合体の認識に影響を与える可能性があることから、ある特定のＭＨＣクラスＩ多型、及び／又は異なる遺伝子型のＴ細胞によって認識される、ある特定の抗原−ＭＨＣクラスＩ複合体の能力に関する知見に基づき、異種Ｔ細胞エピトープを選択することができる。
【０１６４】
免疫原性ＭＨＣクラスＩにより制限される及び／又は特異的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ，human leukocyte antigen）バリアントと適合することが公知の明確に定義されたペプチド−エピトープがある。ヒトにおける適用又はヒト標的細胞の関与のために、熟練した作業者により、当業界において公知の標準的な技術を使用して、ＨＬＡクラスＩ制限エピトープを選択又は同定することができる。ペプチドのヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力は、推定上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの免疫原性の見込みを予測するのに使用することができる。ペプチドのヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力は、ソフトウェアツールを使用してスコア付けすることができる。ある特定のヒト集団においてより優勢な対立遺伝子によってコードされたＨＬＡバリアントのペプチド選択性に基づいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、本発明のＣＤ８＋異種のＴ細胞エピトープ成分として使用するために選択されてもよい。例えば、ヒト集団は、ＭＨＣクラスＩ分子のアルファ鎖に関して多形性であり、可変の対立遺伝子は、ＨＬＡ遺伝子によってコードされる。ある特定のＴ細胞エピトープは、特異的なＨＬＡ分子、例えばＨＬＡ−Ａ対立遺伝子グループのＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ３によってコードされた一般的に存在するＨＬＡバリアントなどによってより効率的に提示される可能性がある。
【０１６５】
本発明の細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド成分として使用するためにＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを選ぶ場合、標的化しようとする細胞型又は細胞集団中に存在するＭＨＣクラスＩ分子に最もよく適合するＣＤ８＋エピトープが選択され得る。異なるＭＨＣクラスＩ分子は、特定のペプチド配列への優先的な結合を示し、特定のペプチド−ＭＨＣクラスＩバリアント複合体は、エフェクターＴ細胞のＴＣＲによって特異的に認識される。熟練した作業者は、本発明で使用される異種Ｔ細胞エピトープの選択を最適化するために、ＭＨＣクラスＩ分子の特異性及びＴＣＲ特異性に関する知見を使用することができる。
【０１６６】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、異種ポリペプチド、例えば、抗原又は抗原性タンパク質などに含まれる。ある特定のさらなる実施形態において、異種ポリペプチドは、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、又は３０ｋＤａを上回らない。
【０１６７】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、２つ又は３つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。ある特定のさらなる実施形態において、すべての異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを合わせたサイズは、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、又は３０ｋＤａを上回らない。
【０１６８】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、標準型プロテアソームと比較して、免疫プロテアソーム（immunoproteasome）、中間プロテアソーム（intermediate proteasome）、及び／又は胸腺プロテアソーム（thymoproteasome）を多く有する細胞においてより良好にプロセシングされるが、しかしながら、他の実施形態では逆の場合もある。
【０１６９】
本発明の細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド成分として使用するためのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを選択する場合、例えば、標的細胞中の以下の因子：プロテアソーム、ＥＲＡＡＰ／ＥＲＡＰ１、タパシン、及びＴＡＰのエピトープ特異性など、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの生成及び受け入れ可能なＭＨＣクラスＩ分子への輸送に影響を与える可能性のある、ＭＨＣクラスＩ提示系における複数の要因が考慮され得る（例えば、Akram A, Inman R, Clin Immunol 143: 99-115 (2012)を参照）。
【０１７０】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、中間プロテアソームによってインタクトな形態でタンパク質分解によりプロセシングされるだけである（例えば、Guillaume B et al., Proc Natl Acad Sci USA 107: 18599-604 (2010)；Guillaume B et al., J Immunol 189: 3538-47 (2012)を参照）。
【０１７１】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、標準型プロテアソーム、免疫プロテアソーム、中間プロテアソーム、及び／又は胸腺プロテアソームによって破壊されず、これは、細胞型、サイトカイン環境、組織の場所などにも依存し得る（例えば、Morel S et al., Immunity 12: 107-17 (2000)；Chapiro J et al., J Immunol 176: 1053-61 (2006)；Guillaume B et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107: 18599-604 (2010)；Dalet A et al., Eur J Immunol 41: 39-46 (2011)；Basler M et al., J Immunol 189: 1868-77 (2012)；Guillaume B et al., J Immunol 189: 3538-47 (2012)を参照）。
【０１７２】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、例えば、インビボでは所与の対象又は遺伝子型群又は前述のものに由来する細胞においてＣＤ８＋ＣＴＬ応答を惹起するのが「弱い」など、「弱い」エピトープであると考えられる（例えば、Cao W et al., J Immunol 157: 505-11 (1996)を参照）。
【０１７３】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、腫瘍細胞エピトープ、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７−１６５Ａなどである（例えば、Jager E et al. J Exp Med 187: 265-70 (1998)を参照）。
【０１７４】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、ユビキチン化を増加させるために、そのアミノ末端に嵩高な又は荷電した残基を有するように修飾されている（例えば、Grant E et al., J Immunol 155: 3750-8 (1995)；Townsend A et al., J Exp Med 168: 1211-24 (1998)；Kwon Y et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95: 7898-903 (1998)を参照）。
【０１７５】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、タンパク質分解による切断の可能性を増加させるために、そのカルボキシ末端に疎水性アミノ酸残基を有するように修飾されている（例えば、Driscoll J et al., Nature 365: 262-4 (1993)；Gaczynska M et al., Nature 365: 264-7 (1993)を参照）。
【０１７６】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、Ｔレジトープ（Tregitope）である。Ｔレジトープは、免疫抑制結果を誘導することができるエピトープ−ペプチドとして機能的に定義される。天然に存在するＴレジトープの例としては、ヒト免疫グロブリンＧ重鎖定常領域の部分領域（Ｆｃ）及びＦａｂが挙げられる（例えば、Sumida T et al., Arthritis Rheum 40: 2271-3 (1997)；Bluestone J, Abbas A, Nat Rev Immunol 3: 253-7 (2003)；Hahn B et al., J Immunol 175: 7728-37 (2005)；Durinovic-Bello I et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 11683-8 (2006)；Sharabi A et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 8810-5 (2006)；De Groot A et al., Blood 112: 3303-11 (2008)；Sharabi A et al., J Clin Immunol 30: 34-4 (2010)；Mozes E, Sharabi A, Autoimmun Rev 10: 22-6 (2010)を参照）。
【０１７７】
本発明の細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの位置は、一般的に、制限されない。本発明のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素Ａ１断片由来領域に対してカルボキシ末端側の位置で、細胞標的化分子に連結されている。
【０１７８】
Ｃ．細胞標的化結合領域
本発明の細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる細胞標的化結合領域を含む。
【０１７９】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分（例えば細胞外標的生体分子）に高親和性で特異的に結合することができる、ドメイン、分子部分、又は薬剤などの細胞標的化成分である。熟練した作業者に公知の、又は熟練した作業者により当業界において公知の技術を使用して発見され得る多数のタイプの結合領域がある。例えば、本明細書に記載される必要な結合特徴を示すあらゆる細胞標的化成分が、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態における結合領域として使用することができる。
【０１８０】
標的生体分子の細胞外部分は、分子が細胞と物理的に結合している場合、例えば標的生体分子が細胞によって細胞表面に発現されている場合に細胞外環境に露出したその構造の一部を指す。この状況において、細胞外環境に露出したとは、標的生体分子の一部が、例えば、抗体又は抗体より小さい少なくとも結合部分、例えば単一ドメイン抗体ドメイン、ナノボディ、ラクダ科動物又は軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン、一本鎖可変断片、又は多数の免疫グロブリンへの改変された代替足場などによって利用可能であることを意味する（以下を参照）。細胞に物理的に結合している標的生体分子の一部の細胞外環境への露出又はその利用しやすさは、熟練した作業者により、当業界において周知の方法を使用して実験的に決定することができる。
【０１８１】
本発明の細胞標的化分子の結合領域は、例えばリガンド、ペプチド、免疫グロブリン型の結合領域、モノクローナル抗体、改変された抗体派生物、又は抗体の改変された代替物であり得る。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分に高親和性で特異的に結合することができるタンパク質性の部分である。本発明の細胞標的化分子の結合領域は、１つ又は２つ以上の様々なペプチド性部分又はポリペプチド部分、例えば無作為に生成したペプチド配列、天然に存在するリガンド又はそれらの派生物、免疫グロブリン由来のドメイン、免疫グロブリンドメインの代替物として合成的に改変された足場などを含んでいてもよい（例えば、国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット；国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット；Cheung M et al., Mol Cancer 9：28 (2010)；米国特許出願公開第２０１３／０１９６９２８号明細書；国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット；国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子を選択的及び特異的に結合することができる１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む結合領域を含む。
【０１８３】
特異的な細胞型に、それらの結合特徴、例えばある特定のリガンド、モノクローナル抗体、改変された抗体派生物、及び改変された抗体代替物などを介して分子を標的化するのに有用な、当業界において公知の多数の結合領域がある。
【０１８４】
１つの特異的な、ただし非限定的な態様によれば、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、細胞外標的生体分子、一般的には細胞表面受容体への結合機能を保持する天然に存在するリガンド又はそれらの派生物を含む。例えば、当業界において公知の様々なサイトカイン、増殖因子、及びホルモンを使用して、同起源のサイトカイン受容体、増殖因子受容体、又はホルモン受容体を発現する特異的な細胞型の細胞表面に、本発明の細胞標的化分子を標的化することができる。リガンドのある特定の非限定的な例（括弧内に代替の名称を示す）としては、アンギオゲニン、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ，B-cell activating factor，ＡＰＲＩＬ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ，colony stimulating factor）、上皮増殖因子（ＥＧＦ，epidermal growth factor）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ，fibroblast growth factor）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ，vascular endothelial growth factor）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ，insulin-like growth factor）、インターフェロン、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ−２３）、神経増殖因子（ＮＧＦ，nerve growth factor）、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ，transforming growth factor）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，tumor necrosis factor）が挙げられる。
【０１８５】
本発明の細胞標的化分子のある特定の他の実施形態によれば、結合領域は、細胞外標的生体分子と結合することができる合成リガンドを含む（例えばLiang S et al., J Mol Med 84：764-73 (2006)；Ahmed S et al., Anal Chem 82：7533-41 (2010)；Kaur K et al., Methods Mol Biol 1248：239-47 (2015)を参照）。
【０１８６】
ある特定の実施形態において、結合領域は、ペプチドミメティクス、例えばＡＡペプチド、ガンマ−ＡＡペプチド、及び／又はスルホノ−γ−ＡＡペプチドなどを含む（例えば、Pilsl L、Reiser O、Amino Acids 41：709-18 (2011)；Akram O et al., Mol Cancer Res 12：967-78 (2014)；Wu H et al., Chemistry 21：2501-7 (2015)；Teng P et al., Chemistry 2016 Mar 4を参照）。
【０１８７】
１つの具体的な、ただし非限定的な態様によれば、結合領域は、免疫グロブリン型の結合領域を含んでいてもよい。用語「免疫グロブリン型の結合領域」は、本明細書で使用される場合、例えば抗原又はエピトープなどの１つ又は２つ以上の標的生体分子と結合することが可能なポリペプチド領域を指す。結合領域は、標的分子に結合するそれらの能力によって機能的に定義される場合がある。免疫グロブリン型の結合領域は、一般的に抗体又は抗体様構造に由来するが、他の源由来の代替足場もこれらの用語の範囲内であると予期される。
【０１８８】
免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質は、Ｉｇドメインとして公知の構造ドメインを有する。Ｉｇドメインは、長さが約７０〜１１０アミノ酸残基の範囲であり、２つのベータシートに典型的に７〜９個の逆平行ベータ鎖が配列されてサンドイッチ様構造を形成する特徴的なＩｇ−フォールドを有する。Ｉｇフォールドは、サンドイッチの内部表面と鎖中のシステイン残基間の高度に保存されたジスルフィド結合とにおける疎水性アミノ酸相互作用によって安定化されている。Ｉｇドメインは、可変（ＩｇＶ又はＶ−セット）、定常（ＩｇＣ又はＣ−セット）又は中間（ＩｇＩ又はＩ−セット）であり得る。いくつかのＩｇドメインは、それらのエピトープに結合する抗体の特異性にとって重要な、「相補性決定領域（complementary determining region）」とも称される相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determining region）と会合していてもよい。Ｉｇ様ドメインはまた、非免疫グロブリンタンパク質にも見出され、それに基づきタンパク質のＩｇスーパーファミリーのメンバーとして分類される。ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＧＮＣ，HUGO Gene Nomenclature Committee）は、Ｉｇ様ドメインを含有するファミリーのメンバーのリストを提供している。
【０１８９】
免疫グロブリン型の結合領域は、抗体又はそれらの抗原結合断片のポリペプチド配列であってもよく、そのアミノ酸配列は、例えば分子工学又はライブラリースクリーニングによる選択によって天然の抗体又は非免疫グロブリンタンパク質のＩｇ様ドメインのアミノ酸配列から変更されている。免疫グロブリン型の結合領域の生成における組換えＤＮＡ技術及びインビトロのライブラリースクリーニングの適切性のために、抗体を再設計して、例えばより小さいサイズ、細胞の侵入、又はインビボの用途及び／若しくは治療用途に関する他の改善などの所望の特徴を得ることができる。多くの可能なバリエーションがあり、たった１つのアミノ酸の変化から例えば可変領域の完全なデザイン変化まで多岐にわたっていてもよい。典型的には、抗原結合特徴を改善する、可変領域の安定性を改善する、又は免疫原性応答の可能性を低減するためには、可変領域における変化がなされると予想される。
【０１９０】
本発明の成分として予期される多数の免疫グロブリン型の結合領域がある。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン型の結合領域は、免疫グロブリンの結合領域、例えば細胞外標的生体分子と結合することが可能な抗体パラトープなどに由来する。ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン型の結合領域は、いずれの免疫グロブリンドメインにも由来しないが、細胞外標的生体分子への高親和性結合を提供することによって免疫グロブリンの結合領域のように機能する改変されたポリペプチドを含む。この改変されたポリペプチドは、本明細書に記載される免疫グロブリン由来の相補性決定領域を含むか又はそれから本質的になるポリペプチド足場を含む場合がある。
【０１９１】
また、ポリペプチドをそれらの高親和性結合特徴を介して特異的な細胞型に標的化するのに有用な、従来技術における多数の結合領域もある。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片）、ラクダ科動物ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片由来の重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、ナノボディ、重鎖及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、並べ替えられたＦｖ（ｐＦｖ）、一本鎖Ｆｖ−ＣＨ３ミニボディ、二量体ＣＨ２ドメイン断片（ＣＨ２Ｄ）、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ）、単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）断片、拘束フレームワーク領域３、ＣＤＲ３、フレームワーク領域４（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）ポリペプチド、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）ドメイン、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、多量体ｓｃＦｖ断片（二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、ジスルフィド安定化抗体の可変（Ｆｖ）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるジスルフィド安定化抗原結合（Ｆａｂ）断片、二価ナノボディ、二価ミニボディ、二価Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆａｂ二量体）、二重特異性タンデムＶＨＨ断片、二重特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二重特異性ナノボディ、二重特異性ミニボディ、並びにその結合機能性を保持する前述のもののあらゆる遺伝子操作された対応物を含む群から選択される免疫グロブリンドメインを含む（Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001)；Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002)；Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004)；Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005)；Hey T et al., Trends Biotechnol 23 :514-522 (2005)；Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005)；Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006)；Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)；Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010)；Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011)；Alfarano P et al., Protein Sci 21: 1298-314 (2012)；Madhurantakam C et al., Protein Sci 21: 1015-28 (2012)；Varadamsetty G et al., J Mol Biol 424: 68-87 (2012)；Reichen C et al., J Struct Biol 185: 147-62 (2014)）。
【０１９２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、自律的なＶＨドメイン、単一ドメイン抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）、ラクダ科動物由来の重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片）、ラクダ科動物ＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片由来の重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類由来の重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、ナノボディ、重鎖及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、一本鎖Ｆｖ−ＣＨ３ミニボディ、二量体ＣＨ２ドメイン断片（ＣＨ２Ｄ）、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ）、単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）断片、拘束フレームワーク領域３、ＣＤＲ３、フレームワーク領域４（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）ポリペプチド、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ，small modular immunopharmaceutical）ドメイン、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、多量体ｓｃＦｖ断片（二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、ジスルフィド安定化抗体の可変（Ｆｖ）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるジスルフィド安定化抗原結合（Ｆａｂ）断片、２価ナノボディ、２価ミニボディ、２価Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｆａｂ二量体）、二重特異性タンデムＶＨＨ断片、二重特異性タンデムｓｃＦｖ断片、二重特異性のナノボディ、二重特異性のミニボディ、並びにそのパラトープ及び結合機能を保持する前述のもののあらゆる遺伝子操作された対応物を含む群から選択される（Ward E et al., Nature 341：544-6 (1989)；Davies J, Riechmann L, Biotechnology (NY) 13：475-9 (1995)；Reiter Y et al., Mol Biol 290：685-98 (1999)；Riechmann L, Muyldermans S, J Immunol Methods 231：25-38 (1999)；Tanha J et al., J Immunol Methods 263：97-109 (2002)；Vranken W et al., Biochemistry 41：8570-9 (2002)；Jespers L et al., J Mol Biol 337：893-903 (2004)；Jespers L et al., Nat Biotechnol 22：1161-5 (2004)；To R et al., J Biol Chem 280：41395-403 (2005)；Saerens D et al., Curr Opin Pharmacol 8：600-8 (2008)；Dimitrov D, MAbs 1：26-8 (2009)；Weiner L, Cell 148：1081-4 (2012)；Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012：980250 (2012)を参照）。
【０１９３】
免疫グロブリンの定常領域由来のポリペプチド、例えば、改変された二量体Ｆｃドメイン、単量体Ｆｃ（ｍＦｃ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＶＨＨ−Ｆｃ、ＣＨ２ドメイン、単量体ＣＨ３ｓドメイン（ｍＣＨ３）、合成的にリプログラミングされた免疫グロブリンドメイン、及び／又は免疫グロブリンドメインとリガンドとのハイブリッド融合体などを含む様々な結合領域がある（Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 105：12451-6 (2008)；Xiao J et al., J Am Chem Soc 131：13616-13618 (2009)；Xiao X et al., Biochem Biophys Res Commun 387：387-92 (2009)；Wozniak-Knopp G et al., Protein Eng Des Sel 23 289-97 (2010)；Gong R et al., PLoS ONE 7：e42288 (2012)；Wozniak-Knopp G et al., PLoS ONE 7：e30083 (2012)；Ying T et al., J Biol Chem 287：19399-408 (2012)；Ying T et al., J Biol Chem 288：25154-64 (2013)；Chiang M et al., J Am Chem Soc 136：3370-3 (2014)；Rader C, Trends Biotechnol 32：186-97 (2014)；Ying T et al., Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82 (2014)）。
【０１９４】
ある特定の他の実施形態によれば、結合領域は、免疫グロブリンドメインへの改変された代替足場を含む。例えば標的生体分子の高親和性の及び特異的な結合などの免疫グロブリン由来の構造に対して類似の機能的な特徴を示す改変された代替足場が当業界において公知であり、ある特定の免疫グロブリンドメインに、例えばより大きい安定性又は低減した免疫原性などの改善された特徴を提供することができる。一般的に、免疫グロブリンへの代替足場は、２０キロダルトン（ｋＤａ）未満であり、単一のポリペプチド鎖からなり、システイン残基を欠失しており、相対的に高い熱力学的な安定性を示す。
【０１９５】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、免疫グロブリン型結合領域は、改変されたアルマジロ反復ポリペプチド（ＡｒｍＲＰ）；改変されたフィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型（１０Ｆｎ３）ドメイン（モノボディ、AdNectin（商標）、又はAdNexin（商標））；改変されたテネイシン由来テネイシンIII型ドメイン（Centryn（商標））；改変されたアンキリン反復モチーフ含有ポリペプチド（DARPin（商標））；改変された低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ−Ａ）（Avimer（商標））；リポカイン（アンチカリン）；改変されたプロテアーゼ阻害因子由来クニッツドメイン；改変されたプロテインＡ由来Ｚドメイン（Affibody（商標））；改変されたガンマ−Ｂクリスタリン由来の足場又は改変されたユビキチン由来の足場（Ａｆｆｉｌｉｎ）；Ｓａｃ７ｄ由来のポリペプチド（Nanoffitin（登録商標）又はアフィチン）；改変されたＦｙｎ由来ＳＨ２ドメイン（Fynomer（登録商標））；及び改変された抗体模倣体、並びにその結合機能性を保持する前述のもののあらゆる遺伝子操作された対応物を含む群から選択される（Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001)；Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002)；Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004)；Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005)；Hey T et al., Trends Biotechnol 23 :514-522 (2005)；Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005)；Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006)；Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)；Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010)；Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011)；Alfarano P et al., Protein Sci 21: 1298-314 (2012)；Madhurantakam C et al., Protein Sci 21: 1015-28 (2012)；Varadamsetty G et al., J Mol Biol 424: 68-87 (2012)）。
【０１９６】
例えば、ＣＤ２０を発現する細胞に対して高親和性結合を呈する改変されたＦｎ３（ＣＤ２０）結合領域足場が存在する（Natarajan A et al., Clin Cancer Res 19: 6820-9 (2013)）。
【０１９７】
例えば、細胞外受容体ＨＥＲ２に結合する多数の代替足場が同定されている（例えば、Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17：455-62 (2004)；Orlova A et al. Cancer Res 66：4339-8 (2006)；Ahlgren S et al., Bioconjug Chem 19：235-43 (2008)；Feldwisch J et al., J Mol Biol 398：232-47 (2010)；米国特許第５，５７８，４８２号明細書；５，８５６，１１０号明細書；５，８６９，４４５号明細書；５，９８５，５５３号明細書；６，３３３，１６９号明細書；６，９８７，０８８号明細書；７，０１９，０１７号明細書；７，２８２，３６５号明細書；７，３０６，８０１号明細書；７，４３５，７９７号明細書；７，４４６，１８５号明細書；７，４４９，４８０号明細書；７，５６０，１１１号明細書；７，６７４，４６０号明細書；７，８１５，９０６号明細書；７，８７９，３２５号明細書；７，８８４，１９４号明細書；７，９９３，６５０号明細書；８，２４１，６３０号明細書；８，３４９，５８５号明細書；８，３８９，２２７号明細書；８，５０１，９０９号明細書；８，５１２，９６７号明細書；８，６５２，４７４号明細書；及び米国特許出願公開第２０１１／００５９０９０号明細書を参照）。代替の抗体様式に加えて、抗体様の結合能力は、非タンパク質性化合物、例えばオリゴマー、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、炭水化物、及びグリコカリックスカリックスアレーン（例えばSansone F, Casnati A, Chem Soc Rev 42：4623-39 (2013)を参照）又は部分的にタンパク質性の化合物、例えばペプチドと結合したフェノール−ホルムアルデヒド環状オリゴマー及びカリックスアレーン−ペプチド組成物など（例えば米国特許第５，７７０，３８０号明細書を参照）によって付与することができる。
【０１９８】
上記した結合領域構造はいずれも、結合領域成分が細胞外標的生体分子に対して１０−５〜１０−１２モル／リットル、好ましくは２００ナノモル濃度（ｎＭ）未満の解離定数を有する限り、本発明の細胞標的化分子の成分として使用してもよい。
【０１９９】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、標的生体分子の細胞外部分又は細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域に連結及び／又は融合した、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。細胞外標的生体分子は、例えば本明細書に記載される基準などの多数の基準に基づき選択してもよい。
【０２００】
結合領域によって結合した細胞外標的生体分子
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、標的生体分子の細胞外部分又は細胞外標的生体分子に特異的に結合することができ、好ましくは所望の細胞型、例えばがん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を内包する宿主細胞などの表面と物理的に結合しているタンパク質領域を含む。好ましくは、標的化される細胞型は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現するであろう。本発明の細胞標的化分子の結合領域によって結合した標的生体分子としては、がん細胞、免疫細胞、及び／又は例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、若しくは原生動物などの細胞内病原体に感染した細胞に過剰な比率で又は独占的に存在するバイオマーカーを挙げることができる。
【０２０１】
用語「標的生体分子」は、本発明の細胞標的化分子の結合領域と結合して、その結果として特異的な細胞、細胞型、及び／又は多細胞生物内の位置への細胞標的化分子の標的化が生じる生体分子、一般的には、例えば糖付加などの翻訳後修飾によって改変されたタンパク質性分子又はタンパク質を指す。
【０２０２】
本発明の目的に関して、用語「細胞外」は、標的生体分子に関して、その構造の少なくとも一部が細胞外環境に露出した生体分子を指す。細胞外環境への露出又は標的生体分子の細胞に結合した部分への利用しやすさは、熟練した作業者により当業界において周知の方法を使用して実験的に決定することができる。細胞外標的生体分子の非限定的な例としては、細胞膜成分、膜貫通タンパク質、細胞膜に固定された生体分子、細胞表面に結合した生体分子、及び分泌された生体分子が挙げられる。
【０２０３】
本発明に関して、成句「物理的に結合している」は、標的生体分子を説明するのに使用される場合、共有結合及び／又は非共有結合による分子間相互作用により標的生体分子又はそれらの一部を細胞の外側に結合させることを意味し、例えば、単一の相互作用それぞれのエネルギーが概して少なくとも約１〜５キロカロリーの、標的生体分子と細胞との間の複数の非共有結合による相互作用（例えば、静電結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性力など）である。全ての内在性膜タンパク質が、細胞膜に物理的に結合していることを見出すことができ、表在性膜タンパク質も同様である。例えば、細胞外標的生体分子は、膜貫通領域、脂質アンカー、グリコリピドアンカーを含む場合もあるし、及び／又は前述のもののいずれか１つを含む因子と非共有結合によって（例えば非特異的な疎水性相互作用及び／又は脂質結合相互作用を介して）会合している場合もある。
【０２０４】
標的生体分子の細胞外部分としては、改変されていないポリペプチド、生化学的な官能基及びグリコリピドの付加によって改変されたポリペプチドを含む、様々なエピトープを挙げることができる（例えば米国特許第５，０９１，１７８号明細書；欧州特許第２４３１７４３号明細書を参照）。
【０２０５】
本発明の細胞標的化分子の結合領域は、例えばそれらの標的生体分子の細胞型特異的な発現、それらの標的生体分子の特異的な細胞型に関する物理的な局在化、及び／又はそれらの標的生体分子の特性などの多数の基準に基づき設計又は選択することができる。例えば、本発明のある特定の細胞標的化分子は、１つの種の１つのみの細胞型又は多細胞生物中の１つのみの細胞型によって細胞表面で独占的に発現される細胞表面の標的生体分子と結合することが可能な結合領域を含む。細胞外標的生体分子は、本質的に内在化されているか又は本発明の細胞標的化分子と相互作用したときに容易に内在化されることが望ましいが、必須ではない。
【０２０６】
熟練した作業者であれば、志賀毒素エフェクターポリペプチドと会合及び／又は結合させて、本発明の細胞標的化分子を産生するのに好適な結合領域を設計又は選択するのに、あらゆる所望の標的生体分子を使用できることを認識しているものと予想される。
【０２０７】
本発明の細胞標的化分子の一般構造は、様々な多様な細胞標的化結合領域を、多様な標的細胞型のＭＨＣクラスＩ系への様々なエピトープの多様な標的化及び送達を提供するために、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチド及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドとともに使用することができるという点で、モジュール式である。本発明の細胞標的化分子（例えば、タンパク質）は、細胞標的化分子のタンパク質性成分のカルボキシ末端に、カルボキシ末端小胞体保持／回収シグナルモチーフ、例えば、アミノ酸ＫＤＥＬなどをさらに含んでもよい（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／１９６８４号明細書を参照）。
【０２０８】
Ｄ．本発明の細胞標的化分子の成分を接続する連結
個々の細胞標的化結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、及び／又は本発明の細胞標的化分子の他の成分は、好適には、当業界において周知の及び／又は本明細書に記載される１つ又は２つ以上のリンカーを介して互いに連結されていてもよい（例えば、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット；国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット；国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット；国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。結合領域の個々のポリペプチド下位成分、例えば重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ＣＤＲ、及び／又はＡＢＲ領域が、好適には、当業界において周知の及び／又は本明細書に記載される１つ又は２つ以上のリンカーを介して互いに連結されていてもよい。本発明のタンパク質性成分、例えば多連鎖の結合領域は、好適には、当業界において周知の１つ又は２つ以上のリンカーを介して、互いに又は本発明の他のポリペプチド成分に連結されていてもよい。本発明のペプチド成分、例えば、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、好適には、１つ又は２つ以上のリンカー、例えば当業界において周知のタンパク質性リンカーなどを介して、本発明の別の成分に連結されていてもよい。
【０２０９】
好適なリンカーは、一般的に、本発明の各ポリペプチド成分を、いかなるリンカー又はそれと会合した別の成分も用いずに個別に産生されたポリペプチド成分に非常に類似した３次元構造にフォールディングさせることができるリンカーである。好適なリンカーとしては、単一のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び上述のもののいずれも含まないリンカー、例えば様々な非タンパク質性炭素鎖などが挙げられ、分岐状か又は環状かは問わない。
【０２１０】
好適なリンカーは、タンパク質性であってもよく、１つ又は２つ以上のアミノ酸、ペプチド、及び／又はポリペプチドを含んでいてもよい。タンパク質性のリンカーは、組換え融合タンパク質及び化学的に連結されたコンジュゲートの両方にとって好適である。タンパク質性のリンカーは、典型的には約２〜約５０アミノ酸残基、例えば約５〜約３０又は約６〜約２５アミノ酸残基を有する。選択されるリンカーの長さは、例えばリンカーが選択される理由となる所望の１つ又は複数の特性などの様々な要因に依存すると予想される。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質性であり、本発明のタンパク質成分の末端の近くに、典型的には末端から約２０アミノ酸以内に連結されている。
【０２１１】
好適なリンカーは、例えば化学的リンカーなどの非タンパク質性であり得る。
【０２１２】
本発明の細胞標的化分子の成分の連結に好適な方法は、その結合が、細胞標的化結合領域の結合能力、及び／又は適切な場合は所望の志賀毒素エフェクター機能を実質的に妨害しない限り、本明細書に記載されるアッセイを含む適切なアッセイによって測定された場合にそのような連結を達成するための目下当業界において公知のあらゆる方法によってなされ得る。例えば、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合を使用して、本発明の細胞標的化分子の２つ又は３つ以上のタンパク質性成分を連結してもよい。
【０２１３】
本発明の細胞標的化分子の目的に関して、具体的な順番又は方向は、成分について、明記されていない限り固定されない。志賀毒素エフェクターポリペプチド、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、結合領域、及びあらゆる任意選択のリンカーの配列は、具体的に述べられていない限り、互いに関連して、又は細胞標的化分子全体で、固定されない（例えば、図１を参照）。一般的に、本発明の細胞標的化分子の成分は、結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの所望の活性が除去されないのであれば、どのような順番で配列されてもよい。
【０２１４】
II．本発明の細胞標的化分子の具体的な構造バリエーションの例
本発明の細胞標的化分子は、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、細胞標的化結合領域、及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達する能力を有する細胞標的化分子は、原理的には、結果として得られる細胞標的化分子が、少なくとも志賀毒素エフェクター、細胞標的化部分、又はそれらの構造上の組合せによって提供される細胞内在化能力（例えば、エンドサイトーシスによるものなど）を有する限り、及び志賀毒素エフェクターポリペプチド成分又は全体としての細胞標的化分子構造が、標的細胞内に入ると、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達するのに適した細胞内区画、例えば、サイトゾル又は小胞体（ＥＲ）などへの十分な細胞内経路決定を提供する限り、任意の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、細胞標的化結合領域及び志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドの任意の組合せに連結させることによって作り出すことができる。
【０２１５】
本発明の細胞標的化分子は、それぞれ、志賀毒素ファミリーのメンバーの少なくとも１つのＡサブユニットに由来する少なくとも１つの志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、短縮型志賀毒素Ａサブユニットを含むか又はそれから本質的になる。志賀毒素Ａサブユニットの短縮化は、例えば、触媒活性及び細胞毒性などの志賀毒素エフェクター機能に影響することなく、エピトープ全体及び／若しくはエピトープ領域、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、並びに／又はフーリン切断部位の欠失を生じ得る。完全な酵素活性を示すことが示された最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、Ｓｌｔ１Ａの残基１〜２３９で構成されるポリペプチドであった（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005））。有意な酵素活性を示すことが示された最小の志賀毒素Ａサブユニット断片は、ＳｔｘＡの残基７５〜２４７で構成されるポリペプチドであった（Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)）。
【０２１６】
本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、一般的に、完全長志賀毒素Ａサブユニットより小さくあり得るが、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）又はＳｔｘＡ（配列番号２）の）アミノ酸位置７７〜２３９のポリペプチド領域、又は志賀毒素ファミリーのメンバーの他のＡサブユニットにおけるその等価物（例えば、（配列番号３）の７７〜２３８）を維持する必要があり得る。例えば、本発明の分子のある特定の実施形態において、ＳＬＴ−１Ａに由来する本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７５〜２５１、配列番号１の１〜２４１、配列番号１の１〜２５１、又は配列番号１のアミノ酸１〜２６１を含むか又はそれから本質的になり得る。同様に、ＳｔｘＡに由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７５〜２５１、配列番号２の１〜２４１、配列番号２の１〜２５１、又は配列番号２のアミノ酸１〜２６１を含むか又はそれから本質的になり得る。追加として、ＳＬＴ−２に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、配列番号３の１〜２４１、配列番号３の１〜２５１、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１を含むか又はそれから本質的になり得る。
【０２１７】
野生型志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドに由来するとはいえ、本発明の分子のある特定の実施形態に関して、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットとは、最大で１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、又は４１個以上のアミノ酸残基（ただし、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を保持するアミノ酸残基の数よりは多くないアミノ酸残基）が異なる。
【０２１８】
本発明は、本発明の細胞標的化分子のバリアントであって、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットと、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、又は４１個以上のアミノ酸残基だけ、又は最高それまでのアミノ酸残基（ただし、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を保持するバリアントにおける異なるアミノ酸残基の数より多くないアミノ酸残基）が異なる、バリアントをさらに提供する。したがって、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する、本発明の分子は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性が、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対して維持される限り、最初の配列からの付加、欠失、短縮化、又は他の変更を含み得、例えば、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフがある。
【０２１９】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明の分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）などの天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットに対する少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．７％の全配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になり、例えば、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端において、破壊されたフーリン切断モチーフがある。
【０２２０】
本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドの完全長又は短縮型のいずれも、その志賀毒素由来ポリペプチドが、天然に存在する志賀毒素Ａサブユニットと比較して、１つ又は２つ以上の変異（例えば、置換、欠失、挿入、又は反転）を含む。志賀毒素エフェクターポリペプチドが、宿主細胞形質転換、トランスフェクション、感染、若しくは導入の周知の方法によるか、又は志賀毒素エフェクターポリペプチドと連結した細胞標的化結合領域により媒介される内在化によるかのいずれかにより、細胞への侵入後に細胞毒性を保持するのに十分な、野生型志賀毒素Ａサブユニットとの配列同一性を有することが、本発明のある特定の実施形態において好ましい。志賀毒素Ａサブユニットにおける酵素活性及び／又は細胞毒性にとって最も重要な残基は、とりわけ、以下の残基位置にマッピングされている：アスパラギン−７５、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、及びアルギニン−１７６（Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)）。本発明の実施形態のいずれか１つにおいて、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、ＳｔｘＡ、ＳＬＴ−１Ａにおける位置７７、１６７、１７０、及び１７６、又は典型的には強力な細胞毒性活性に必要とされる志賀毒素ファミリーの他のメンバーにおける等価の保存された位置に見出されるものなどの位置に、１つ又は２つ以上の保存されたアミノ酸を維持することが、必ずしもではないが、好ましくあり得る。細胞死を引き起こす本発明の細胞毒性細胞標的化分子の能力、例えば、それの細動毒性は、当技術分野においてよく知られたいくつかのアッセイのいずれか１つ又は２つ以上を使用して測定され得る。
【０２２１】
単一のｐＭＨＣ  Ｉ複合体の提示ですら、細胞溶解のためのＣＴＬによる提示細胞の細胞間結合に十分であるため、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較して細胞内経路決定の志賀毒素エフェクター機能が相当に低減されている志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む本発明の細胞標的化分子でも、依然として、それらの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド成分を標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に、例えば、ＣＤ８＋免疫細胞の細胞間結合を伴う免疫応答の誘導及び／又は特定の細胞型のある特定の細胞内区画の検出に十分な量などで、送達することが可能な場合がある（Sykulev Y et al., Immunity 4: 565-71 (1996)）。
【０２２２】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド、及び（２）志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチドのカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含む。志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチドのカルボキシ末端は、熟練した作業者により、当技術分野において公知の技術を使用することによって同定することができ、例えば、タンパク質配列アライメントソフトウェアなどを使用することによって、（ｉ）天然に存在する志賀毒素とともに保存されたフーリン切断モチーフ、（ii）天然に存在する志賀毒素とともに保存された表面に露出した伸長したループ、及び／又は（iii）ＥＲＡＤシステムによって認識することが可能な主として疎水性のアミノ酸残基のストレッチ（すなわち疎水性「パッチ」）を同定することができる。
【０２２３】
本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端においてすべてのフーリン切断モチーフが完全に欠失していてもよいし、並びに／又は（２）その志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端及び／若しくは志賀毒素Ａ１断片のカルボキシ末端由来の領域に、破壊されたフーリン切断モチーフを含んでいてもよい。フーリン切断モチーフの破壊としては、フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基への様々な変更、例えば、翻訳後修飾、アミノ酸官能基中の１つ若しくは２つ以上の原子の変更、アミノ酸官能基への１つ若しくは２つ以上の原子の付加、非タンパク質性部分への会合、及び／又は例えば結果として分岐したタンパク質性構造が生じるアミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチドへの連結などが挙げられる。例えば、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端との連結は、連結しているエピトープ−ペプチドがない参照分子と比較して志賀毒素エフェクターポリペプチドのフーリン切断の低減をもたらし得る。
【０２２４】
プロテアーゼ切断耐性志賀毒素エフェクターポリペプチドは、本明細書に記載される方法、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットで説明された方法、及び／又は熟練した作業者に公知の方法を使用して、天然に存在するか又はしないかにかかわらず、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は志賀毒素Ａサブユニットポリペプチドから作り出すことができ、得られた分子は、それでもなお１つ又は２つ以上の志賀毒素Ａサブユニット機能を保持する。
【０２２５】
フーリン切断部位又はフーリン切断モチーフに関する本発明の目的に関して、用語「破壊」又は「破壊された」は、天然に存在するフーリン切断部位及び／又はフーリン切断モチーフからの変更、例えば、野生型志賀毒素Ａサブユニット又は野生型ポリペプチド配列のみを含む野生型志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドのフーリン切断と比較して、志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端、又はそれらに由来する同定可能な領域の近傍におけるフーリン切断の低減を引き起こす変異などを指す。フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基への変更としては、例えばフーリン切断モチーフの欠失、挿入、逆位、置換、及び／又はカルボキシ末端短縮化などのフーリン切断モチーフ中の変異、並びに、例えば、アミノ酸残基の官能基に分子をコンジュゲート又は連結することを含むグリコシル化、アルブミン化などの結果としての翻訳後修飾が挙げられる。フーリン切断モチーフは理論上約２０アミノ酸残基で構成されることから、これらの２０個の位置のいずれか１つの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基に関与する変更、改変、変異、欠失、挿入、及び／又は短縮化が、フーリン切断の感受性の低減を引き起こす可能性がある（Tian S et al., Sci Rep 2：261 (2012)）。
【０２２６】
本発明の目的に関して、「破壊されたフーリン切断モチーフ」は、天然の志賀毒素Ａサブユニットにおいて志賀毒素Ａ１断片とＡ２断片領域との間のジャンクションに見出される保存されたフーリン切断モチーフを表す志賀毒素Ａサブユニットのフーリン切断によりＡ１断片及びＡ２断片の産生が生じるように配置された２０アミノ酸残基の領域に由来する１つ又は２つ以上のアミノ酸残基への変更を含むフーリン切断モチーフであり、破壊されたフーリン切断モチーフは、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載される適切なアッセイを使用してフーリン切断をモニターできる程度に十分に大きいサイズを有するカルボキシ末端のポリペプチドに融合した野生型志賀毒素Ａ１断片領域を含む参照分子と比較して、実験的に再現可能な方式で低減されたフーリン切断を呈する。
【０２２７】
フーリン切断部位及びフーリン切断モチーフを破壊させることができる変異のタイプの例は、アミノ酸残基の欠失、挿入、短縮化、逆位、並びに／又は、非標準アミノ酸及び／若しくは非天然アミノ酸との置換を含む、置換である。加えて、フーリン切断部位及びフーリン切断モチーフは、例えば、ペグ化、低分子アジュバントの結合、及び／又は部位特異的なアルブミン化などの結果として部位又はモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸をマスクする共有結合で連結された構造の付加によるアミノ酸の修飾を含む変異によって、破壊することができる。
【０２２８】
フーリン切断モチーフが、変異及び／又は非天然アミノ酸残基の存在によって破壊されている場合、ある特定の破壊されたフーリン切断モチーフは、いずれかのフーリン切断モチーフに関連していると容易に認識できない可能性がある。しかしながら、志賀毒素Ａ１断片由来領域のカルボキシ末端は、認識可能であると予想され、破壊されていなければそのフーリン切断モチーフがどこに配置されるかを定義すると予想される。例えば、破壊されたフーリン切断モチーフは、志賀毒素Ａサブユニット及び／又は志賀毒素Ａ１断片と比較して、カルボキシ末端の短縮化により、２０個未満のフーリン切断モチーフのアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【０２２９】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、（１）カルボキシ末端を有する志賀毒素Ａ１断片由来のポリペプチド、及び（２）志賀毒素Ａ１断片ポリペプチド領域のカルボキシ末端における破壊されたフーリン切断モチーフを含み、細胞標的化分子は、例えば、野生型の志賀毒素ポリペプチド成分のみ又はＡ１断片とＡ２断片との間に保存されたフーリン切断モチーフを有する志賀毒素エフェクターポリペプチド成分のみを含む関連分子などの参照分子と比較して、よりフーリン切断耐性である。例えば、参照分子と比較した１つの分子のフーリン切断の低減は、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットに記載されているインビトロのフーリン切断アッセイを使用し、同じ条件を使用して実行し、次いで切断の結果生じるあらゆる断片のバンド密度の定量を実行してフーリン切断の変化を定量的に測定することにより決定することができる。
【０２３０】
一般的に、本発明の細胞標的化分子のプロテアーゼ切断感受性は、それを、志賀毒素Ａ１断片を含む野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド成分でそのフーリン切断耐性の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分が置き換えられている同じ分子と比較することによって、試験される。ある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフを含む本発明の分子は、そのカルボキシ末端においてペプチド又はポリペプチドに融合した野生型志賀毒素Ａ１断片を含む参照分子と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又はそれ以上のインビトロにおけるフーリン切断の低減を示す。
【０２３１】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素Ａサブユニットの保存された高度に利用可能なプロテアーゼ切断感受性ループ由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸における破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、志賀毒素Ａサブユニット間で保存された表面に露出したプロテアーゼ感受性ループにおいて変異を含む破壊されたフーリン切断モチーフを含む志賀毒素エフェクターポリペプチド。ある特定のさらなる実施形態において、変異は、フーリン切断感受性が低減されるように、ループ内のある特定のアミノ酸残基の表面における利用しやすさを低減する。
【０２３２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチドの破壊されたフーリン切断モチーフは、例えば、最小のフーリン切断モチーフＲ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒの１位及び４位におけるアミノ酸残基など、コンセンサスアミノ酸残基Ｐ１及びＰ４の一方又は両方の存在、位置、又は官能基に関する破壊を含む。例えば、最小のフーリンコンセンサス部位Ｒ−ｘ−ｘ−Ｒにおける２個のアルギニン残基の一方又は両方をアラニンに変異させることは、その部位でのフーリン切断を低減又は停止させることによってフーリン切断モチーフを破壊させると予想される。例えば、一方又は両方のアルギニン残基をヒスチジンに変異させることによって、フーリン切断の低減が生じると予想される。同様に、最小のフーリン切断モチーフＲ−ｘ−ｘ−Ｒにおけるアルギニン残基の一方又は両方のアミノ酸残基を熟練した作業者公知のいずれかの非保存的アミノ酸残基に置換することは、モチーフのフーリン切断感受性を低減させると予想される。特に、アルギニンから、例えばＡ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、及びＹなどの正電荷を有さないいずれかの非塩基性アミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換により、破壊されたフーリン切断モチーフが生じると予想される。
【０２３３】
ある特定の実施形態において、本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチドの破壊されたフーリン切断モチーフは、コンセンサスアミノ酸残基Ｐ４からＰ１の間隔において、２以外の介在するアミノ酸残基の数に関する破壊を含み、それにより、Ｐ４及び／又はＰ１のいずれかが異なる位置に変化し、Ｐ４及び／又はＰ１の記号が除去される。例えば、最小のフーリン切断部位のフーリン切断モチーフ又はコアのフーリン切断モチーフ内の欠失は、フーリン切断モチーフのフーリン切断感受性を低減すると予想される。
【０２３４】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ中に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５１；並びにＳＬＴ−２Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチドの場合、いずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はいずれかの正電荷を有さないアミノ酸残基で置換されたＲ２５０などを含む。
【０２３５】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、破壊されていない最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒを含むが、その代わりに破壊されたフランキング領域を含み、例えば、例として２４１〜２４７及び／又は２５２〜２５９に天然に位置するフーリン切断モチーフのフランキング領域における１つ又は２つ以上のアミノ酸残基におけるアミノ酸残基置換などを含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフのＰ１〜Ｐ６領域に位置するアミノ酸残基の１つ又は２つ以上の置換；Ｐ１’を、例えばＲ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、及びＨなどの嵩高なアミノ酸に変異させること；並びにＰ２’を、極性及び親水性アミノ酸残基に変異させること；並びにフーリン切断モチーフのＰ１’〜Ｐ６’領域に配置されたアミノ酸残基の１つ又は２つ以上を、１つ又は２つ以上の嵩高な及び疎水性アミノ酸残基で置換することを含む。
【０２３６】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、フーリン切断モチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、逆位、及び／又は置換を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４９〜２５１、又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０に天然に位置するか、又は保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／若しくは非天然の志賀毒素エフェクターポリペプチド配列における等価な位置に、アミノ酸配列の破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、例えば、非標準アミノ酸又は化学修飾された側鎖を有するアミノ酸へのアミノ酸置換などの変異を含む、破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフ内の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む、破壊を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断モチーフ内のカルボキシ末端のアミノ酸残基の９個、１０個、１１個、又は１２個以上の欠失を含む。これらの実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、フーリン切断部位又は最小のフーリン切断モチーフを含まないと予想される。言い換えれば、ある特定の実施形態は、Ａ１断片領域のカルボキシ末端においてフーリン切断部位が欠失している。
【０２３７】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の欠失及びアミノ酸残基の置換、並びにカルボキシ末端の短縮化を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ内に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失及び置換を含む。
【０２３８】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ内のアミノ酸置換とカルボキシ末端の短縮化の両方、例えば、ＳｔｘＡ及びＳＬＴ−１Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸位置２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２以上で終わる短縮化、並びに、適切な場合には、任意の正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された、天然に位置するアミノ酸残基Ｒ２４８及び／又はＲ２５１を含むこと；ＳＬＴ−２Ａ由来志賀毒素エフェクターポリペプチドについて、天然でのアミノ酸位置２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、又は２９２以上で終わる短縮化、並びに、適切な場合には、任意の正電荷を有さないアミノ酸残基で置換された、天然に位置するアミノ酸残基Ｙ２４７及び／又はＲ２５０を含むことを含む。
【０２３９】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の欠失及びアミノ酸残基の置換の両方を含む。ある特定のさらなる実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、最小のフーリン切断部位Ｒ／Ｙ−ｘ−ｘ−Ｒ内に１つ又は２つ以上のアミノ酸残基の欠失及び置換を含む。
【０２４０】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、破壊されたフーリン切断モチーフは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比較して、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の置換、及び／又はカルボキシ末端の短縮化を含む。
【０２４１】
本発明の細胞標的化分子は、それぞれ、１つ又は２つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、ヒトにおいて抗原性及び／又は免疫原性のエピトープである。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド成分は、例えば、ヒトに感染するウイルスに由来する抗原など、ヒトに感染する微生物病原体の分子に由来する８〜１１アミノ酸長のペプチドを含むか又はそれから本質的になる。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド成分は、配列番号４〜１２に示されるペプチドのいずれか１つを含むか又はそれから本質的になる。
【０２４２】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、ジスルフィド結合を介して細胞標的化分子に連結されている。ある特定のさらなる実施形態において、ジスルフィド結合は、システインとシステインのジスルフィド結合である。
【０２４３】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、例えば、ＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のＣ２４１又はＳｔｘＡ（配列番号２）若しくはＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）の２４２など、細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分のシステイン残基の官能基が関与するジスルフィド結合を介して、細胞標的化分子に連結されている。ある特定のさらなる実施形態において、システイン残基は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端のカルボキシ末端側に位置している（例えば、ＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のＣ２６０又はＳｔｘＡ（配列番号２）若しくはＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）のＣ２６１のシステイン残基）。
【０２４４】
本発明の細胞標的化分子は、少なくとも１つの細胞標的化結合領域を含む。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態のなかでも、結合領域は、がん細胞又は腫瘍細胞の細胞表面上における表面抗原への特異的で高親和性の結合に関して選択される免疫グロブリン型ポリペプチドに由来し、この場合、抗原は、発現ががん細胞又は腫瘍細胞に制限される（Glokler J et al., Molecules 15：2478-90 (2010)；Liu Y et al., Lab Chip 9： 1033-6 (2009)を参照）。他の実施形態によれば、結合領域は、がん細胞の細胞表面上における表面抗原への特異的で高親和性の結合に関して選択され、この場合、抗原は、非がん細胞と比較して、がん細胞によって過剰発現されるか又は優先的に発現される。いくつかの代表的な標的生体分子としては、これらに限定されないが、以下に列挙した、がん及び／又は特定の免疫細胞型に関連する標的が挙げられる。
【０２４５】
がん細胞に関連する細胞外エピトープに高親和性で結合する多くの免疫グロブリン型の結合領域が熟練した作業者に公知であり、例えば、以下の標的生体分子：アネキシンＡＩ、Ｂ３黒色腫抗原、Ｂ４黒色腫抗原、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原タンパク質ＣＤ２０）、ＣＤ２２、ＣＤ２５（インターロイキン−２受容体ＩＬ２Ｒ）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３７、ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４０、ＣＤ４４（ヒアルロナン受容体）、ＩＴＧＡＶ（ＣＤ５１）、ＣＤ５６、ＣＤ６６、ＣＤ７０、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＣＤ７３、ＣＤ７４（ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連の不変鎖）、ＣＤ７９、ＣＤ９８、エンドグリン（ＥＮＤ、ＣＤ１０５）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１３８、ケモカイン受容体タイプ４（ＣＤＣＲ−４、フーシン、ＣＤ１８４）、ＣＤ２００、インスリン様増殖因子１受容体（ＣＤ２２１）、ムチン１（ＭＵＣ１、ＣＤ２２７、ＣＡ６、ＣａｎＡｇ）、基底細胞接着分子（Ｂ−ＣＡＭ、ＣＤ２３９）、ＣＤ２４８（エンドシアリン、ＴＥＭ１）、腫瘍壊死因子受容体１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤ２６２）、腫瘍壊死因子受容体１３Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＡＣＩ、ＣＤ２７６）、血管内皮増殖因子受容体２（ＫＤＲ、ＣＤ３０９）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＣＤ３４０）、がん抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）、ＣＡ２４２、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（例えばＣＥＡＣＡＭ３（ＣＤ６６ｄ）及びＣＥＡＣＡＭ５）、癌胎児性抗原タンパク質（ＣＥＡ）、コリン輸送体様タンパク質４（ＳＬＣ４４Ａ４）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰ４、ＭＣＳＰ、ＮＧ２）、ＣＴＬＡ４、デルタ様タンパク質（例えばＤＬＬ３、ＤＬＬ４）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼタンパク質（例えばＥＮＰＰ３）、エンドセリン受容体（ＥＴＢＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、葉酸受容体（ＦＯＬＲ、例えばＦＲα）、Ｇ−２８、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ＨＬＡ−Ｄｒ１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ、ヒト上皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、エフリンタイプＢ受容体２（ＥｐｈＢ２）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ／セプラーゼ）、グアニリルシクラーゼｃ（ＧＣＣ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、インテグリンアルファ−Ｖベータ−３（αＶβ３）、インテグリンアルファ−Ｖベータ−５（αｖβ５）、インテグリンアルファ−５ベータ−１（α５β１）、Ｌ６、亜鉛輸送体（ＬＩＶ−１）、ＭＰＧ、黒色腫関連抗原１タンパク質（ＭＡＧＥ−１）、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ−３）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、メタロレダクターゼＳＴＥＡＰ１、ＭＰＧ、ＭＳ４Ａ、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン（例えばネクチン−４）、ｐ２１、ｐ９７、ポリオウイルス受容体様４（ＰＶＲＬ４）、プロ���アーゼ活性化受容体（例えばＰＡＲ１）、前立腺特異的膜抗原タンパク質（ＰＳＭＡ）、ＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様タンパク質（例えばＳＬＩＴＲＫ６）、トーマス−フリーデンライヒ（Thomas-Friedenreich）抗原、膜貫通糖タンパク質（ＧＰＮＭＢ）、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＧＢ、５Ｔ４、ＷＡＩＦ１）、及び腫瘍関連のカルシウムシグナルトランスデューサー（ＴＡＣＳＴＤ、例えばＴｒｏｐ−２、ＥＧＰ−１など）のいずれか１つと結合する結合領域などがある（例えばLui B et al., Cancer Res 64：704-10 (2004)；Novellino L et al., Cancer Immunol Immunother 54：187-207 (2005)；Bagley R et al., Int J Oncol 34：619-27 (2009)；Gerber H et al., mAbs 1：247-53 (2009)；Beck A et al., Nat Rev Immunol 10：345-52 (2010)；Andersen J et al., J Biol Chem 287：22927-37 (2012)；Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7：e50920 (2012)；Rust S et al., Mol Cancer 12：11 (2013)を参照）。この標的生体分子のリストは、非限定的であることが意図される。熟練した作業者であれば、本発明の細胞標的化分子の成分として使用するのに好適であり得る結合領域を設計又は選択するために、がん細胞又は他の所望の細胞型と関連するあらゆる所望の標的生体分子を使用できることを認識していよう。
【０２４６】
がん細胞と強く関連し、公知の免疫グロブリン型の結合領域によって高親和性で結合される他の標的生体分子の例としては、ＢＡＧＥタンパク質（Ｂ黒色腫抗原）、基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ又はルセラン式血液型糖タンパク質）、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、がん精巣抗原ＬＡＧＥタンパク質、ＣＤ１９（Ｂリンパ球抗原タンパク質ＣＤ１９）、ＣＤ２１（補体受容体−２又は補体３ｄ受容体）、ＣＤ２６（ジペプチジルペプチダーゼ−４、ＤＰＰ４、又はアデノシンデアミナーゼ複合タンパク質２）、ＣＤ３３（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン−３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原）、ＣＤ５６、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリー７番又はＳＬＡＭＦ７）、細胞表面Ａ３３抗原タンパク質（ｇｐＡ３３）、エプスタイン−バーウイルス抗原タンパク質、ＧＡＧＥ／ＰＡＧＥタンパク質（黒色腫関連がん／精巣抗原）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ）、ＭＡＧＥタンパク質、Ｔ細胞１タンパク質によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＡＲＴＩ）、ムチン、優先的に発現される黒色腫抗原（ＰＲＡＭＥ）タンパク質、前立腺特異的抗原タンパク質（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原タンパク質（ＰＳＣＡ）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、及びウィルムス腫瘍抗原が挙げられる。
【０２４７】
がん細胞と強く関連する他の標的生体分子の例は、炭酸脱水酵素IX（ＣＡ９／ＣＡＩIＸ）、クローディンタンパク質（ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４）、エフリンタイプＡ受容体３（ＥｐｈＡ３）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ガングリオシドＧＭ２、インスリン様増殖因子受容体、インテグリン（例えばＣＤ１１ａ−ｃ）、核因子カッパＢの受容体活性剤（ＲＡＮＫ）、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒＢ−３、腫瘍壊死因子受容体１０Ａ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＤＲ４）、腫瘍壊死因子受容体１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、テネイシンＣ、及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）である（Hough C et al., Cancer Res 60：6281-7 (2000)；Thepen T et al., Nat Biotechnol 18：48-51 (2000)；Pastan I et al., Nat Rev Cancer 6：559-65 (2006)；Pastan, Annu Rev Med 58：221-37 (2007)；Fitzgerald D et al., Cancer Res 71：6300-9 (2011)；Scott A et al., Cancer Immun 12： 14-22 (2012)を参照）。この標的生体分子のリストは、非限定的であることが意図される。
【０２４８】
加えて、予期される標的生体分子の多数の他の例があり、例えば、標的生体分子に関して、ＡＤＡＭメタロプロテイナーゼ（例えばＡＤＡＭ−９、ＡＤＡＭ−１０、ＡＤＡＭ−１２、ＡＤＡＭ−１５、ＡＤＡＭ−１７）、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＴ１、ＡＲＴ４）、抗原Ｆ４／８０、骨髄間質抗原（ＢＳＴ１、ＢＳＴ２）、ブレイクポイントクラスター領域−ｃ−ａｂｌ腫瘍遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ）タンパク質、Ｃ３ａＲ（補体成分３ａ受容体）、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５（ルイスＸ又はステージ特異的胎児抗原１）、ＣＤ２３（ＦＣイプシロンＲII）、ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型）、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５３、ＣＤ５４（細胞間接着分子１）、ＣＤ６３（テトラスパニン）、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８８（補体成分５ａ受容体１）、ＣＤ１１５（コロニー刺激因子１受容体）、ＩＬ−１Ｒ（インターロイキン−１受容体）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１２９（インターロイキン９受容体）、ＣＤ１８３（ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９５（ケモカイン受容体ＣＣＲ５）、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２２５（インターフェロン誘導膜貫通タンパク質１）、ＣＤ２４４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、ＣＤ２８２（Ｔｏｌｌ様受容体２）、ＣＤ２８４（Ｔｏｌｌ様受容体４）、ＣＤ２９４（ＧＰＲ４４）、ＣＤ３０５（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、アルファ−フェトプロテイン抗原１７−Ａ１タンパク質、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）、免疫グロブリン様転写ＩＬＴ−３、リゾホスファチジルグリセロール（lysophosphatidlglycerol）アシルトランスフェラーゼ１（ＬＰＧＡＴ１／ＩＡＡ０２０５）、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ、例えばＣＤ１０７）、メラニン細胞タンパク質ＰＭＥＬ（ｇｐ１００）、骨髄関連タンパク質−１４（ｍｒｐ−１４）、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬ−１６結合タンパク質、Ｈ−６０、Ｒａｅ−１、及びそれらのホモログ）、受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂＢ−３、ＳＡＲＴタンパク質、スカベンジャー受容体（例えばＣＤ６４及びＣＤ６８）、シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）、シンデカン（例えばＳＤＣ１又はＣＤ１３８）、チロシナーゼ、チロシナーゼ（tyrosinease）関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）、チロシナーゼ関連抗原（ＴＡＡ）、ＡＰＯ−３、ＢＣＭＡ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９、ＣＤ９０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ケモカイン受容体、補体タンパク質、サイトカイン受容体、組織適合性タンパク質、ＩＣＯＳ、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、ｃ−ｍｙｃ、オステオプロテゲリン、ＰＤ−１、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２）、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４などであり（Scott A et al., Cancer Immunity 12： 14 (2012)；Cheever M et al., Clin Cancer Res 15：5323-37 (2009)を参照）、ここに記載した標的生体分子は非限定的な例であることに留意されたい。
【０２４９】
ある特定の実施形態において、結合領域は、免疫系の細胞型の細胞表面に特異的に高親和性で結合することが可能な免疫グロブリン型の結合領域を含むか又はそれから本質的になる。例えば、免疫細胞表面の因子に結合する免疫グロブリン型の結合ドメインが公知であり、例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ６６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ２３５、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、核因子カッパＢの受容体活性剤（ＲＡＮＫＬ）、ＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）、及びＴＮＦＳＦ１８（腫瘍壊死因子リガンド１８又はＧＩＴＲＬ）などである。
【０２５０】
本発明の分子における使用に想定される標的生体分子及び結合領域のさらなる例については、国際公開第２００５／０９２９１７号パンフレット、国際公開第２００７／０３３４９７号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０１５６４１７号明細書、日本国特許第４３３９５１１号明細書、欧州特許第１７２７８２７号明細書、独国特許第６０２００４０２７１６８号明細書、欧州特許第１９４５６６０号明細書、日本国特許第４９３４７６１号明細書、欧州特許第２２２８３８３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１９６９２８号明細書、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、米国特許第２０１５０２５９４２８号明細書、６２／１６８，７５８号明細書、６２／１６８，７５９号明細書、６２／１６８，７６０号明細書、６２／１６８，７６１号明細書、６２／１６８，７６２号明細書、６２／１６８，７６３号明細書、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６５８０号明細書を参照されたい。
【０２５１】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、細胞毒性の細胞標的化融合タンパク質である。ある特定のさらなる実施形態は、配列番号１３〜４０、４２、４４〜５０、５２、５４〜５８、６０〜６１、及び７２〜１１５に示されるポリペプチドのうちの１つを含むか又はそれから本質的になる細胞標的化分子である。
【０２５２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、例えば、免疫毒素及びリガンド−毒素融合体などの融合タンパク質である。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、細胞毒性が低減されているか又は非細胞毒性の細胞標的化融合タンパク質である。ある特定のさらなる実施形態は、配列番号４１、４３、５１、５３、及び５９に示されるポリペプチドのうちの１つを含むか又はそれから本質的になる細胞標的化分子である。他のさらなる実施形態は、配列番号１３〜４０、４２、４４〜５０、５２、５４〜５８、６０〜６１、及び７２〜１１５に示されるポリペプチドを含むか又はそれから本質的になり、さらに、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分に、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３のＡ２３１Ｅ、Ｒ７５Ａ、Ｙ７７Ｓ、Ｙ１１４Ｓ、Ｅ１６７Ｄ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７６Ｋ、及び／若しくはＷ２０３Ａからなる群から選択される天然に位置する残基又は志賀毒素Ａサブユニットにおける等価なアミノ酸残基を変更する１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む、細胞標的化分子である。
【０２５３】
本発明の細胞標的化分子は、それぞれ、細胞の表面上に発現される標的生体分子など、細胞と物理的に会合している少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる、細胞標的化結合領域を含む。この一般的な構造は、任意の数の多様な細胞標的化部分を、本発明の細胞標的化分子の結合領域として使用することができるという点で、モジュール式である。標的生体分子の任意の細胞外部分に対する機能性結合部位を含有し、さらにより好ましくは、高親和性で（例えば、１０−９モル／リットル未満のＫＤによって示される）標的生体分子に結合することができる、本発明の細胞標的化分子の断片、バリアント、及び／又は派生物を使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本発明は、ヒトタンパク質に結合することができるポリペプチド配列を提供するが、１０−５〜１０−１２モル／リットル、好ましくは２００ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、標的生体分子の細胞外部分に結合する任意の結合領域が、本発明の細胞標的化分子の作製及び本発明の方法での使用において代用され得る。
【０２５４】
III．本発明の細胞標的化分子の一般的な機能
本発明は、（１）少なくとも１つの志賀毒素機能を呈することができる志賀毒素Ａサブユニット由来の毒素エフェクターポリペプチド、及び（２）志賀毒素Ａサブユニットとは無関係のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを含む、細胞標的化分子であって、細胞標的化分子を細胞に投与することにより、細胞標的化分子が細胞内に入り、その異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路に送達することをもたらし得る、細胞標的化分子を提供する。この系は、任意の数の多様な結合領域を、多様な細胞型を標的化するのに使用することができるという点、及び任意の数の多様なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、標的細胞に送達することができるという点で、モジュール式である。本発明の細胞標的化分子は、治療用分子、細胞毒性分子、細胞標識分子、及び診断用分子として使用することができる。
【０２５５】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、脊索動物へ投与後に、以下のうちの１つ又は２つ以上を提供する：１）標的化された細胞、例えば、感染細胞及び／又は新生物細胞の強力かつ選択的な殺滅、２）細胞標的化分子が細胞外空間に存在する間の細胞標的化結合領域と志賀毒素エフェクターポリペプチドとの間の連結安定性（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）、３）低レベルのオフターゲット細胞死及び／又は望まれない組織損傷（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）、並びに４）例えば、組織の場所、例えば、腫瘤におけるＣＤ８＋ＣＴＬの動員及び免疫刺激性サイトカインの局所的放出などの望ましい免疫応答を刺激するために標的細胞によって提示するための異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞標的化送達。さらに、標的細胞による送達された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示は、これらの提示細胞にｐＭＨＣ  Ｉで印をつけ、これは、例えば、診断情報などの情報を収集する目的で検出することができる。
【０２５６】
本発明の細胞標的化分子は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−カーゴの標的化送達、免疫応答刺激、標的化された細胞殺滅、標的化された細胞増殖の阻害、生物学的情報の収集、及び／又は健康状態の改善を含む、多様な用途において有用である。本発明の細胞標的化分子は、例えば、がん、免疫障害、及び微生物感染を含む、様々な疾患の診断又は治療のために特定の細胞型をインビボで標的化することを伴う用途において、治療用分子及び／又は診断用分子として、例えば、細胞標的化非毒性送達媒体；細胞標的化細胞毒性治療用分子；及び／又は細胞標的化診断用分子などとして、有用である。本発明のある特定の細胞標的化分子は、腫瘍又はがんを罹患した脊索動物を、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性機構が関与するその脊索動物の抗腫瘍免疫の有効性を増強することによって治療するために使用することができる（例えば、Ostrand-Rosenberg S, Curr Opin Immunol 6: 722-7 (1994)；Pietersz G et al., Cell Mol Life Sci 57: 290-310 (2000)；Lazoura E et al., Immunology 119: 306-16 (2006)を参照）。
【０２５７】
実施形態に応じて、本発明の細胞標的化分子は、以下の特徴又は機能性のうちの１つ又は２つ以上を提供する：（１）インビボでのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の刺激、（２）脱免疫化（例えば、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレットを参照）、（３）プロテアーゼ切断耐性（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）、（４）ある特定の濃度での強力な細胞毒性、（５）選択的な細胞毒性、（６）ある特定の用量若しくは投薬量での多細胞生物における低いオフターゲット毒性（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）、及び／又は（７）さらなる材料（例えば、核酸又は検出促進剤）からなるカーゴの細胞内送達。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、その分子が、本明細書に記載される特性又は機能性の２つ又は３つ以上を有するため、多機能性である。本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態は、単一分子において、前述の特性及び機能性の全部を提供する。
【０２５８】
本発明の治療用細胞標的化分子の作用機序としては、志賀毒素エフェクター機能による直接的な標的細胞の殺滅、細胞間免疫細胞媒介性プロセスによる間接的な細胞殺滅、及び／又はレシピエントの免疫系を「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープシーディング」の結果として、ある特定の細胞及び組織の場所、例えば、腫瘤を拒絶するように訓練することが挙げられる。
【０２５９】
Ａ．標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路への異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの送達
本発明の細胞標的化分子の主要な機能の１つは、脊索動物細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のための１つ又は２つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの細胞標的化送達である。本発明の細胞標的化分子は、実質的にあらゆる脊索動物標的細胞への実質的にあらゆるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの一般的な送達媒体として使用するためのモジュール足場である。標的化送達は、細胞標的化分子がある特定の標的細胞に特異的に結合し、標的細胞に入り、インタクトな異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドをＭＨＣクラスＩ提示経路に入るのに適した細胞内区画に送達することを要する。本発明の細胞標的化分子を使用した標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの送達は、標的細胞が、細胞表面上にＭＨＣクラスＩ分子と会合したエピトープ−ペプチドを提示するように誘導するのに使用することができる。
【０２６０】
免疫原性ＭＨＣクラスＩエピトープ、例えば、公知のウイルス抗原に由来するものを、本発明の細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴとして使用することにより、脊索動物の免疫細胞の有益な機能を例えばインビトロで、及び／又は脊索動物の免疫系をインビボで、刺激するための、免疫刺激性抗原の標的化送達及び提示を達成することができる。
【０２６１】
脊索動物において、ＭＨＣクラスＩ複合体による免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示により、提示細胞をＣＴＬ媒介性細胞溶解による殺滅の標的とし、免疫細胞が微小環境を変更するように促進し、脊索動物内の標的細胞部位にさらに多くの免疫細胞を動員するためのシグナル伝達を行うことができる。本発明のある特定の細胞標的化分子は、生理学的条件下において、送達されたＴ細胞エピトープがＭＨＣクラスＩ分子と複合体化して提示されるように、その異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的脊索動物細胞のＭＨＣクラスＩ経路に送達することができる。これは、細胞標的化分子を細胞外空間、例えば、血管の内腔などに外来的に投与し、次いで、細胞標的化分子が標的細胞を発見し、その細胞に入り、細胞内にそのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴを送達するのを可能にすることによって、達成され得る。脊索動物内の標的細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示は、脊索動物内の標的細胞に直接的な応答及び／又は標的細胞の組織の場所における全般的な応答を含む、免疫応答をもたらし得る。
【０２６２】
本発明の細胞標的化分子のこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＭＨＣクラスＩ提示の機能の用途は、広範である。例えば、脊索動物において、細胞へのＣＤ８＋エピトープの送達及びその細胞による送達されたエピトープのＭＨＣクラスＩ提示は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞間結合を引き起こすことができ、ＣＴＬによる標的細胞の殺滅及び／又は免疫刺激性サイトカインの分泌をもたらし得る。
【０２６３】
本発明の細胞標的化分子は、外来的に投与したときに、脊索動物の有核細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のために、１つ又は２つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達することができる。ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、特定の細胞型の細胞表面に会合した細胞外標的生体分子を結合し、かつそれらの細胞に侵入する能力がある。標的化された細胞型に内在化されると、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分（触媒的に活性であるか、細胞毒性が低減されているか、又は非毒性であるかに関係なく）の経路を標的細胞のサイトゾルに決定することができる。
【０２６４】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞外空間から、１つ又は２つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを標的細胞のプロテアソームに送達することができる。その後、送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、タンパク質分解性プロセシングを受け、標的細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ経路によって提示され得る。ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、細胞標的化分子と会合している異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、細胞の表面上でのＭＨＣクラスＩ分子によるエピトープ−ペプチドの提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ分子に送達することができる。ある特定の実施形態に関して、細胞を本発明の細胞標的化分子と接触させることにより、細胞標的化分子は、細胞標的化分子と会合している異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、細胞の表面上でのＭＨＣクラスＩ分子によるエピトープ−ペプチドの提示のために、細胞のＭＨＣクラスＩ分子に送達することができる。
【０２６５】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、脊索動物対象に投与することにより、対象における特定の標的細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のために、１つ又は２つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを標的化送達することができる。
【０２６６】
原理的には、いずれのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも、本発明の細胞標的化分子における使用に選択することができる。したがって、本発明の細胞標的化分子は、標的細胞の表面を、選択したエピトープ−ペプチドと複合体化したＭＨＣクラスＩ分子で標識するのに有用である。
【０２６７】
哺乳類生物におけるあらゆる有核細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープペプチドをＭＨＣクラスＩ経路によりそれらの細胞外表面上に提示する能力を有し得る。加えて、Ｔ細胞エピトープ認識の感受性は、非常に鋭いため、免疫応答をもたらすために提示されるＭＨＣ−Ｉペプチド複合体はごく少数しか必要とされず、例えば、単一の複合体の提示だけでも、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞間結合にとって十分であり得る（Sykulev Y et al., Immunity 4: 565-71 (1996)）。本発明の細胞標的化分子の標的細胞は、実質的にあらゆる有核の脊索動物細胞型であり得、必ずしも免疫細胞及び／又はプロフェッショナル抗原提示細胞である必要はない。プロフェッショナル抗原提示細胞の例としては、樹状細胞、マクロファージ、及び機能的ＭＨＣクラスII系を有する特化した上皮細胞が挙げられる。実際、本発明の細胞標的化分子の好ましい実施形態は、プロフェッショナル抗原提示細胞を標的としない。１つの理由としては、本発明の細胞標的化分子の投与の結果として生じる望ましくない免疫応答が、例えば、細胞標的化分子内のエピトープを認識する抗細胞標的化分子抗体など、細胞標的化分子自体を対象とする体液性応答となることである。したがって、プロフェッショナル抗原提示細胞及びある特定の免疫細胞型は、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態によって標的化されることがなく、これは、これらの細胞による本発明の細胞標的化分子の取り込みが、細胞標的化分子に存在する、特に、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分及び／又は抗原性カーゴに存在するが結合領域にも含まれる、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの認識をもたらし得るためである。
【０２６８】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態によるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達する能力は、様々な条件下において、及び非標的化傍観者細胞の存在下、例えば、エキソビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又は多細胞生物内のようなインビボ設定における標的細胞などの存在下において、達成され得る。
【０２６９】
本発明の細胞標的化分子が、設計された通りに機能するためには、細胞標的化分子は、１）標的細胞に入り、２）そのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを、ＭＨＣクラスＩ経路に入るのに適した細胞内の場所に局在化させる必要がある。一般的に、本発明の細胞標的化分子は、エンドサイトーシスによって標的細胞内への内在化を達成する。本発明の細胞標的化分子が内在化されると、この分子は、典型的に、初期エンドソーム区画、例えば、エンドサイトーシス小胞などに存在し、リソソーム又は後期エンドソームにおける破壊が運命づけられるであろう。細胞標的化分子は、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを含む細胞標的化分子の少なくとも一部分が、別の細胞内区画へと脱出するように、完全な離隔及び分解を回避しなければならない。さらに、標的細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現するか、又はＭＨＣクラスＩ分子を発現するよう誘導できるかのいずれかでなければならない。
【０２７０】
ＭＨＣクラスＩ分子の発現は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド（本発明の細胞標的化分子によって送達される）の細胞表面提示のために、天然である必要はない。本発明のある特定の実施形態に関して、標的細胞は、熟練した作業者に公知の方法を使用して、例えば、ＩＦＮ−γでの処置などによって、ＭＨＣクラスＩ分子を発現するように誘導することができる。
【０２７１】
一般的に、本発明の細胞標的化分子は、それらのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のサイトゾル区画のプロテアソームに局在化することによって、ＭＨＣクラスＩ経路送達を達成する。しかしながら、ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、異種ＣＤ８＋エピトープ−ペプチドを、エピトープ−ペプチドがサイトゾル区画に一度も入らず及び／又はエピトープ−ペプチドがプロテアソームによるタンパク質分解性プロセシングを受けることなく、ＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することができる。
【０２７２】
本発明のある特定の実施形態に関して、標的細胞は、例えば、ＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αでの処置など、熟練した作業者に公知の方法を使用して、異なるプロテアソームサブユニット及び／又はプロテアソームサブタイプを発現するように誘導することができる。これは、プロテアソーム及びプロテアソームサブタイプのペプチダーゼ活性の相対レベルを変更することなどによって、細胞に送達されたＣＤ８＋エピトープペプチドのタンパク質分解性プロセシングの位置及び／又は相対効率を変更し得る。
【０２７３】
本発明の細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達機能は、当技術分野において熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書に記載される様々な標準方法により検出し、かつモニターすることができる。例えば、本発明の細胞標的化分子の、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを送達し、かつ標的細胞のＭＨＣクラスＩ系によるペプチドの提示を駆動させる能力は、様々なインビトロ及びインビボのアッセイを使用して調べることができ、そのアッセイには、例えば、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体（ｐＭＨＣ  Ｉ）の直接的検出／可視化、Ｔ細胞ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子に対する結合親和性の測定、及び／又は、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ，cytotoxic T-lymphocyte）応答をモニターすることによる標的細胞上のｐＭＨＣ  Ｉ提示の機能的影響の測定が挙げられる（例えば、下記の実施例参照）。
【０２７４】
本発明の細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達機能をモニターし、定量するためのある特定のアッセイは、インビトロ又はエキソビボでの特定のｐＭＨＣ  Ｉの直接的な検出を伴う。ｐＭＨＣ  Ｉの直接的可視化及び定量化のための一般的な方法は、熟練した作業者に公知の様々な免疫検出試薬を含む。例えば、特異的なモノクローナル抗体は、特定のｐＭＨＣ  Ｉを認識するように発生させることができる。同様に、TCR-STAR試薬（Altor Bioscience Corp.社, Miramar, FL, U.S.）などの可溶性多量体Ｔ細胞受容体は、特異的なｐＭＨＣ  Ｉを直接的に可視化し、又は定量化するために使用することができる（Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006)；例えば、下記の実施例を参照）。これらの特異的ｍＡｂ又は可溶性多量体Ｔ細胞受容体は、例えば、免疫組織化学法、フローサイトメトリー、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）を含む、様々な検出方法と共に使用され得る。
【０２７５】
ｐＭＨＣの直接的同定及び定量化のための代替方法は、マススペクトル法分析、例えば、ProPresent Antigen Presentation Assay（ProImmune, Inc.社, Sarasota, FL, U.S.）（そのアッセイにおいて、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体が細胞の表面から抽出され、その後、そのペプチドが、精製され、シーケンシングマススペクトル法により同定される）を含む（Falk K et al., Nature 351: 290-6 (1991)）。
【０２７６】
本発明の細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＭＨＣクラスＩ提示機能をモニターするためのある特定のアッセイは、ＭＨＣクラスＩとペプチドの結合及び安定性をモニターするためのコンピュータ的及び／又は実験的方法を含む。ペプチドのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対する結合応答を予測するために熟練した作業者が用いるのに、いくつかのソフトウェアプログラムが利用可能であり、例えば、The Immune Epitope Database and Analysis Resource（ＩＥＤＢ）分析リソースＭＨＣ−Ｉ結合予測コンセンサスツール（Analysis Resource MHC-I binding prediction Consensus tool）（Kim Y et al., Nucleic Acid Res 40: W525-30 (2012)）である。いくつかの実験的アッセイが日常的に適用されており、例えば、結合動態を定量化及び／又は比較する細胞表面結合アッセイ及び／又は表面プラズモン共鳴アッセイである（Miles K et al., Mol Immunol 48: 728-32 (2011)）。
【０２７７】
或いは、細胞表面上でのｐＭＨＣ  Ｉ提示の結果の測定は、その特異的な複合体に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答をモニターすることにより実施することができる。これらの測定は、ＣＴＬのＭＨＣクラスＩ四量体又は五量体試薬での直接的標識を含む。四量体又は五量体は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ，Major Histocompatibility Complex）対立遺伝子とペプチドの複合体によって決定される特定の特異性のＴ細胞受容体と直接的に結合する。追加として、インターフェロンガンマ又はインターロイキンなどの放出されたサイトカインのＥＬＩＳＡ又は酵素結合免疫スポット（ELIspot，enzyme-linked immunospot）による定量化は、一般的に、特異的ＣＴＬ応答を同定するためにアッセイされる。ＣＴＬの細胞傷害性能力は、いくつかのアッセイを使用して測定することができ、そのアッセイには、古典的５１クロム（Ｃｒ）遊離アッセイ又は代替の非放射性細胞傷害性アッセイ（例えば、Promega Corp社., Madison, WI, U.S.から入手可能なCytoTox96（登録商標）非放射性キット及びCellTox（商標）CellTiter-GLO（登録商標）キット）、Granzyme B ELISpot、カスパーゼ活性アッセイ、又はＬＡＭＰ−１転位置フローサイトメトリーアッセイが挙げられる。標的細胞の殺滅を特異的にモニターするために、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ，carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）を用いて、インビトロ又はインビボ調査のために所望の細胞集団を容易かつ迅速に標識し、エピトープ特異的ＣＳＦＥ標識標的細胞の殺滅をモニターすることができる（Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)）。
【０２７８】
ＭＨＣクラスＩ提示に対するインビボ応答は、ＭＨＣクラスＩ／抗原促進物質（例えば、ペプチド、タンパク質、又は不活性化／弱毒化ウイルスワクチン）を投与し、続いて、活性物質（例えば、ウイルス）での誘発、及びその物質に対する応答を、典型的にはワクチン接種をしていない対照と比較して、モニターすることにより追跡することができる。エクスビボでの試料は、前に記載された方法（例えば、ＣＴＬ細胞傷害性アッセイ及びサイトカイン放出の定量化）と類似した方法でＣＴＬ活性をモニターすることができる。
【０２７９】
生物におけるＭＨＣクラスＩ提示に続いて、逆免疫法を行ってもよい。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子複合体が、抗原Ｘを含む本発明の細胞標的化分子で中毒化した細胞から、溶解後に、免疫親和性を使用して単離され（例えば、抗ＭＨＣ  Ｉ抗体「プルダウン」精製）、会合したペプチド（すなわち、単離したｐＭＨＣ  Iによって結合されたペプチド）が、精製された複合体から回収される。回収されたペプチドは、シーケンシングマススペクトル法により分析される。マススペクトル法データは、外因性（非自己）ペプチド（抗原Ｘ）の配列及び（「自己」又は非免疫原性ペプチドを表す）ヒトについてのinternational protein indexからなるタンパク質データベースライブラリーに対して比較される。そのペプチドは、確率データベースによる有意性によりランク付けされる。検出された抗原性（非自己）ペプチド配列が列挙される。データは、誤ったヒットを減らすためにスクランブル化デコイデータベースに対して検索することにより検証される（例えば、Ma B, Johnson R, Mol Cell Proteomics 11: O111.014902 (2012)参照）。結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原Ｘ由来のどのペプチドが、細胞標的化分子で中毒化された標的細胞の表面上にＭＨＣ  Ｉ複合体で提示されているかを示し得る。
【０２８０】
Ｂ．細胞殺滅：直接的に標的化された志賀毒素細胞毒性及び／又はＣＴＬの動員を介して間接的に標的化された細胞媒介性細胞毒性
本発明の細胞標的化分子は、１）提示及びＣＴＬの細胞間結合のための、ＭＨＣクラスＩ提示経路へのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞型特異的送達、並びに２）サイトゾルへの強力な志賀毒素細胞毒性の細胞型特異的送達を提供し得る。これらの複数の細胞毒性機構は、直接的な（例えば、志賀毒素の触媒作用に媒介される）標的細胞殺滅及び間接的な（例えば、ＣＴＬに媒介される）標的細胞殺滅の両方を提供することなどによって、相互補完的であり得る。
【０２８１】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子は、ある特定の濃度において細胞毒性である。本発明の細胞標的化分子は、間接的な細胞殺滅機構（例えば、ＣＤ８＋免疫細胞の細胞間結合による）及び／又は直接的な細胞殺滅機構（例えば、細胞内毒素エフェクター活性による）が関与する用途において使用することができる。志賀毒素は、真核生物細胞を殺滅するように適合されているため、志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチドを使用して設計された細胞毒性の細胞標的化分子は、強力な細胞殺滅活性を示し得る。活性な酵素ドメインを含む志賀毒素Ａサブユニット及びその派生物は、細胞のサイトゾルに入ると、真核生物細胞を殺滅させることができる。細胞標的化結合領域及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドと、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドとの融合は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性及び細胞毒性活性を著しく低減させることなく達成することができる（以下の実施例を参照）。したがって、本発明のある特定の細胞標的化分子は、（１）本発明の細胞標的化分子による異種ＣＤ８＋エピトープカーゴの送達の結果としての間接的な免疫細胞媒介性殺滅、及び（２）本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の機能的活性を介した直接的な殺滅という少なくとも２つの冗長な標的細胞殺滅機構を提供し得る。
【０２８２】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している標的細胞を接触させることにより、細胞標的化分子は、標的細胞の死を引き起こすことができる。細胞殺滅の機構は、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性による直接的なもの、又は免疫細胞媒介性機構、例えば、ＣＴＬに媒介される標的細胞の細胞溶解による間接的なものであり得、エキソビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又はインビボの標的細胞など、標的細胞の様々な条件下におけるものであり得る。
【０２８３】
標的生体分子の発現は、本発明の細胞標的化分子による標的化された細胞殺滅のために、天然である必要はない。標的生体分子の細胞表面発現は、感染の結果、病原体の存在、及び／又は細胞内微生物病原体の存在であり得る。標的生体分子の発現は、例えば、ウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス系、アデノ随伴ウイルス系、及びレトロウイルス系参照）での感染後の強制又は誘導された発現によるなど、人工的であり得る。標的生体分子の誘導された発現の例は、オールトランスレチノイン酸及び様々な合成レチノイド、又は任意のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ，retinoic acid receptor）アゴニストのようなレチノイドへ曝された細胞のＣＤ３８発現の上方制御である（Drach J et al., Cancer Res 54: 1746-52 (1994)；Uruno A et al., J Leukoc Biol 90: 235-47 (2011)）。別の例において、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ発現は、細胞を電離放射線に曝すことにより、誘導され得る（Wattenberg M et al., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)）。
【０２８４】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子は、分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴの送達の結果、標的細胞による送達されたエピトープのＭＨＣクラスＩ提示、及び免疫細胞に媒介される標的細胞の殺滅がもたらされるため、細胞毒性である。
【０２８５】
本発明のある特定の細胞標的化分子は、例えば、ＣＤ８＋免疫細胞に媒介される標的細胞殺滅の刺激など、間接的な細胞殺滅機構が関与する用途において使用され得る。免疫刺激性非自己抗原、例えば、高い免疫原性を有する既知のウイルスエピトープ−ペプチドなどの標的細胞による提示は、標的細胞を破壊し、より多くの免疫細胞を生物内の標的細胞部位へ動員するように、他の免疫細胞へシグナルを伝達することができる。ある特定の条件下において、ＭＨＣクラスＩ複合体標的による免疫原性ＣＤ８＋エピトープ−ペプチドの細胞表面提示は、ＣＤ８＋ＣＴＬ媒介性細胞溶解による殺滅のために、提示細胞を殺滅するように免疫系を刺激する。
【０２８６】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を接触させることにより、細胞標的化分子は、例えば、標的細胞による１つ又は２つ以上のＴ細胞エピトープの提示及びその後のＣＴＬの動員などにより、細胞の死を間接的に引き起こすことができる。
【０２８７】
加えて、脊索動物内では、標的細胞による本発明の細胞標的化分子によって送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示は、局所領域に対する免疫刺激並びに／又は局所領域及び／若しくはその脊索動物の全身にわたるある特定の悪性細胞の免疫寛容の破壊という追加の機能性を提供し得る。
【０２８８】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を接触させることにより、本発明の細胞標的化分子は、例えば、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は本明細書に記載される細胞毒性剤の酵素活性などにより、細胞の死を直接的に引き起こすことができる。本発明の細胞標的化分子のある特定のさらなる実施形態に関して、細胞標的化分子は、細胞標的化分子によるＭＨＣクラスＩ提示経路へのいずれの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの送達のいずれの機能的結果にも関係なく、触媒的に活性な志賀毒素エフェクターポリペプチド成分を含むため、細胞毒性である。
【０２８９】
加えて、志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性に基づいた細胞毒性を示す本発明の細胞毒性細胞標的化分子は、志賀毒素エフェクターに基づいた細胞毒性を低減又は除去するために、熟練した作業者により、慣例的な方法を使用して、酵素不活性なバリアントへ改変され得る。結果として得られる「不活性化」細胞標的化分子は、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に送達する能力及びそれに続くＭＨＣクラスＩ分子による標的細胞の表面上での送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの提示により、なお細胞毒性である場合もそうでない場合もある。
【０２９０】
Ｃ．細胞型の間での選択的細胞毒性
本発明のある特定の細胞標的化分子は、非標的化傍観者細胞の存在下での特定の標的細胞の選択的殺滅に使用される。免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの送達の標的を標的細胞のＭＨＣクラスＩ経路に向けることにより、その後の送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示及びエピトープを提示している標的細胞のＣＴＬ媒介性細胞溶解のＴＣＲ特異的制御は、非標的化細胞の存在下において、選択された細胞型を優先的に殺滅することに限定され得る。加えて、様々な志賀毒素エフェクターポリペプチドの強力な細胞毒性活性による標的細胞の殺滅は、免疫原性Ｔ細胞エピトープ及び細胞毒性毒素エフェクターポリペプチドの同時送達により、標的細胞を優先的に殺滅することに限定され得る。
【０２９１】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子を細胞型の混合物へ投与することにより、細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子と物理的に結合していない細胞型と比較して、細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を選択的に殺滅することができる。
【０２９２】
ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子を細胞型の混合物へ投与することにより、細胞毒性細胞標的化分子は、細胞外標的生体分子と物理的に結合していない細胞型と比較して、細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を選択的に殺滅することができる。ある特定の実施形態に関して、本発明の細胞毒性細胞標的化分子は、２つ又は３つ以上の異なる細胞型の混合物内で特定の細胞型の死を選択的又は優先的に引き起こすことができる。これは、標的生体分子を発現しない「傍観者」細胞型と比べて３倍大きい細胞毒性効果など、高い優先性で細胞毒性活性の標的を特定の細胞型へ向けることを可能にする。或いは、結合領域の標的生体分子の発現は、標的生体分子が、十分低い量で発現される、及び／又は標的にされることになっていない細胞型と低量で物理的に結合している場合には、１つの細胞型に排他的なものでない場合がある。これは、有意な量の標的生体分子を発現しないか又は有意な量の標的生体分子と物理的に結合していない「傍観者」細胞型と比べて３倍大きい細胞毒性効果など、高い優先性で特定の細胞型の標的化細胞殺滅を可能にする。
【０２９３】
ある特定のさらなる実施形態に関して、細胞毒性細胞標的化分子を２つの異なる細胞型集団へ投与することにより、細胞毒性細胞標的化分子は、最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）により定義されるような細胞死を、メンバーが細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子を発現する標的細胞集団に、メンバーが細胞毒性細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子を発現しない細胞集団への同じ細胞毒性細胞標的化分子のＣＤ５０用量の少なくとも３分の１の用量で、引き起こすことができる。
【０２９４】
ある特定の実施形態に関して、細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞型集団に対する本発明の細胞標的化分子の細胞毒性活性は、結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない細胞型集団に対する細胞毒性活性よりも少なくとも３倍高い。本発明によれば、選択的細胞毒性は、（ａ）結合領域の標的生体分子と物理的に結合している特定の細胞型の細胞集団への細胞毒性の、（ｂ）結合領域の標的生体分子と物理的に結合していない細胞型の細胞集団への細胞毒性に対する比率（ａ／ｂ）によって定量化され得る。ある特定の実施形態に関して、細胞毒性比率は、結合領域の標的生体分子と物理的に結合している細胞又は細胞型の集団について、結合領域の標的生体分子と物理的に結合していない細胞又は細胞型の集団と比較して、少なくとも３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、又は１０００倍高い選択的細胞毒性を示す。
【０２９５】
特定の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子の優先的細胞殺滅機能又は選択的細胞毒性は、本発明の細胞標的化分子に存在する追加の外因性材料（例えば、細胞毒性材料）及び／又は異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープによるものであり、必ずしも、細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の触媒活性の結果とは限らない。
【０２９６】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態に関して、細胞標的化分子を脊索動物に投与することにより、細胞標的化分子は、標的細胞の近傍にある非標的化細胞及び／又は共通の悪性条件を共有することで標的細胞と関連している非標的化細胞の死を引き起こし得ることに留意することが重要である。脊索動物内での標的細胞によるある特定のＴ細胞エピトープの提示は、ＣＴＬに媒介される標的細胞の殺滅、並びに送達されたエピトープを提示していないが、エピトープ提示細胞の近傍にある他の細胞の殺滅をもたらし得る。さらに、脊索動物における標的化腫瘍細胞によるある特定のＴ細胞エピトープの提示は、分子間でのエピトープ拡散、腫瘍微小環境の刺激性状態への再プログラミング、アネルギー又は標的細胞若しくはそれらを含む損傷した組織に対する脱感作の除去による既存の免疫細胞の放出、並びに非自己腫瘍抗原に対する対象の免疫系の寛容に関する生理学的状態の克服をもたらし得る（以下のＸ．細胞標的化分子の使用方法の節を参照）。
【０２９７】
Ｄ．追加の外因性材料の標的細胞の内部への送達
細胞殺滅を指向することに加えて、本発明の細胞標的化分子は、追加の外因性材料を標的細胞の内部に送達するために使用してもよい。追加の外因性材料の送達は、例えば、細胞毒性、細胞分裂阻害性、及び免疫系刺激、免疫細胞標的化、情報収集、及び／又は診断機能のために使用してもよい。本発明の細胞毒性細胞標的化分子の非細胞毒性バリアント、又は任意で毒性バリアントは、細胞標的化分子の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞の内部へ追加の外因性材料を送達するため及び／又はその細胞の内部を標識するために使用され得る。標的生体分子を少なくとも１つの細胞表面に発現する様々な型の細胞及び／又は細胞集団は、外因性材料を受けるために、本発明の細胞標的化分子によって標的にされ得る。
【０２９８】
本発明の細胞標的化分子は、その非毒性形態を含め、その結合領域によって認識される細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に入ることができるため、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、追加の外因性材料を標的細胞型の内部へ送達するために使用することができる。ある意味では、本発明の細胞標的化分子全体が、細胞に入ると予想される外因性物質であることから、「追加の」外因性物質は、コアの細胞標的化分子そのもの以外の連結されている外因性物質である。ある特定の状況においてＣＴＬ媒介性細胞殺滅を刺激しない異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む、本発明の非毒性細胞標的化分子は、それでもなお、ＭＨＣクラスＩ提示による細胞殺滅をもたらすのではなく、例えば、個体における免疫系機能、ＭＨＣクラスＩバリアントの発現、及びある特定の細胞におけるＭＨＣクラスＩ系の操作性に関するものなど、情報収集を可能にする、「無害の」ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを送達するのに有用であり得る。
【０２９９】
「追加の外因性物質」は、本明細書で使用される場合、一般的に天然の標的細胞内には存在しないことが多い１つ又は２つ以上の分子を指し、本発明のタンパク質は、細胞の内部にこのような物質を特異的に輸送するのに使用することができる。追加の外因性物質の非限定的な例は、細胞毒性剤、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、検出促進剤、及び小分子化学療法剤である。
【０３００】
追加の外因性物質の送達のための本発明のタンパク質のある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、例えば、小分子化学療法剤、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、及び／又はチューブリン阻害剤などの細胞毒性剤である。細胞毒性剤の非限定的な例としては、アジリジン、シスプラチン、テトラジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ビンカアルカロイド、タキサン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、アクラルビシン、アントラサイクリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ドラスタチン、マイタンシン、ドセタキセル、アドリアマイシン、カリケアマイシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、マイトマイシンＣ、パクリタキセル、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、リファンピシン、シスプラチン、メトトレキサート、及びゲムシタビンが挙げられる。
【０３０１】
ある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、酵素を含むタンパク質又はポリペプチドを含む。ある特定の他の実施形態において、追加の外因性物質は、例えば低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small inhibiting RNA）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として機能するリボ核酸などの核酸である。ある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、がんにおいて変異したタンパク質、がんにおいて異常に発現されるタンパク質、又はＴ細胞相補性決定領域に由来する抗原などの抗原である。例えば、外因性物質としては、細菌に感染した抗原提示細胞に特徴的な抗原などの抗原、及び外因性抗原として機能することができるＴ細胞相補性決定領域が挙げられる。外因性物質のさらなる例としては、酵素など、抗原性ペプチドよりも大きなポリペプチド及びタンパク質が挙げられる。
【０３０２】
ある特定の実施形態において、追加の外因性物質は、アポトーシス促進性ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、例えば、ＢＣＬ−２、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３若しくはカスパーゼ−６の断片）、シトクロム、グランザイムＢ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ，apoptosis-inducing factor）、ＢＡＸ、ｔＢｉｄ（短縮型Ｂｉｄ）、及びそれらのアポトーシス促進性断片又は派生物などを含む(例えば、Ellerby H et al., Nat Med 5: 1032-8 (1999)；Mai J et al., Cancer Res 61: 7709-12 (2001)；Jia L et al., Cancer Res 63: 3257-62 (2003)；Liu Y et al., Mol Cancer Ther 2: 1341-50 (2003)；Perea S et al., Cancer Res 64: 7127-9 (2004)；Xu Y et al., J Immunol 173: 61-7 (2004)；Dalken B et al., Cell Death Differ 13: 576-85 (2006)；Wang T et al., Cancer Res 67: 11830-9 (2007)；Kwon M et al., Mol Cancer Ther 7: 1514-22 (2008)；Shan L et al., Cancer Biol Ther 11: 1717-22 (2008)；Qiu X et al., Mol Cancer Ther 7: 1890-9 (2008)；Wang F et al., Clin Cancer Res 16: 2284-94 (2010)；Kim J et al., J Virol 85: 1507-16 (2011)を参照）。
【０３０３】
Ｅ．診断機能のための情報収集
本発明の細胞標的化分子は、情報収集機能に使用してもよい。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、細胞表面上でＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド（本発明の細胞標的化分子によって送達される）を認識するｐＭＨＣ  Ｉに特異的な抗体を使用した特定のｐＭＨＣ  Ｉ提示細胞のイメージングに使用され得る。加えて、本発明のある特定の細胞標的化分子は、特定の細胞、細胞型、及び／又は細胞集団のインビトロ及び／又はインビボでの検出に使用される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される細胞標的化分子は、診断及び治療の両方、又は診断のみに使用される。
【０３０４】
当技術分野において公知の検出促進剤を本発明の様々な細胞標的化分子にコンジュゲートする能力は、がん、腫瘍、増殖異常、免疫、及び感染細胞の検出に有用な組成物を提供する。本発明の細胞標的化分子のこれらの診断用実施形態は、当技術分野において公知の様々なイメージング技術及びアッセイによる情報収集に使用され得る。例えば、本発明の細胞標的化分子の診断用実施形態は、患者又は生検試料における個々のがん細胞、免疫細胞、又は感染細胞の細胞内小器官（例えば、エンドサイトーシス、ゴルジ、小胞体、及びサイトゾルの区画）のイメージングによる情報収集に使用され得る。
【０３０５】
様々な種類の情報が、診断用か他の用途かにかかわらず、本発明の細胞標的化分子の診断用実施形態を使用して収集され得る。この情報は、例えば、新生物細胞のサブタイプを診断すること、特定の細胞型におけるＭＨＣクラスＩ経路及び／若しくはＴＡＰ系の機能性を決定すること、特定の細胞型におけるＭＨＣクラスＩ経路及び／若しくはＴＡＰ系の機能性の経時的な変化を決定すること、患者の疾患の治療感受性を決定すること、抗新生物治療の進行を経時的にアッセイすること、免疫調節治療の進行を経時的にアッセイすること、抗菌治療の進行を経時的にアッセイすること、移植材料において感染細胞の存在を評価すること、移植材料において望ましくない細胞型の存在を評価すること、並びに／又は腫瘤の外科的切除後の残存腫瘍細胞の存在を評価することにおいて有用であり得る。
【０３０６】
例えば、本発明の細胞標的化分子の診断用バリアントを使用して収集された情報を使用して患者の亜集団を確認することができ、その後、個々の患者を、それらの診断用実施形態を使用して明らかにされたそれらの固有の特性に基づいて亜集団へ分類することができる。例えば、特定の医薬又は治療の有効性は、患者の亜集団を定義するために使用される基準の１つの種類となり得る。例えば、本発明の特定の細胞毒性細胞標的化分子の非毒性診断用バリアントは、どの患者が、同じ本発明の細胞標的化分子の細胞毒性バリアントに対して陽性に応答すると予測される患者のクラス又は亜集団に入るかを識別するために使用され得る。したがって、本発明の細胞毒性細胞標的化分子の非毒性バリアントを含め、本発明の細胞標的化分子を使用した患者の同定、患者の層別化、及び診断のための関連方法は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０３０７】
IV．本発明の細胞標的化分子のタンパク質成分のポリペプチド配列におけるバリエーション
熟練した作業者であれば、例えば、標的細胞に外来的に投与した後に異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することに関する細胞標的化分子の全体的な構造及び機能を維持することによって、上述の本発明の細胞標的化分子、及び前述のもののいずれかをコードするポリヌクレオチドに、それらの生物活性を減弱させることなくバリエーションをもたせることができることを認識するであろう。例えば、いくつかの修飾により、発現を促進する、精製を容易にする、薬物動態特性を改善する、及び／又は免疫原性を改善することができる。そのような修飾は、熟練した作業者には周知であり、例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、都合良く配置された制限部位又は終止コドンを作製するためにいずれかの末端に配置される追加のアミノ酸、並びに便宜的な検出及び／又は精製を提供するためにいずれか末端に融合された生化学的親和性タグが挙げられる。ポリペプチドの免疫原性を改善するための一般的な修飾は、ポリペプチドの産生後に、細菌宿主系において産生中にホルミル化され得る開始メチオニン残基を取り除くことであり、これは、例えば、Ｎ−ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ，N-formylmethionine）の存在が脊索動物において望ましくない免疫応答を誘導する可能性があるためである。
【０３０８】
本発明の細胞標的化分子の実施形態のある特定のバリエーションにおいて、結合領域のある特定の細胞標的化機能性は、標的生体分子の結合の特異性及び選択性が有意に保存されるように、維持されなければならない。本発明の細胞標的化分子の実施形態のある特定のバリエーションにおいて、志賀毒素エフェクターポリペプチドのある特定の生物活性、例えば、細胞内在化の誘導、ある特定の細胞内区画（ＭＨＣクラスＩ経路に入るのに適した区画など）への細胞内経路決定、及び／又は外因性物質を標的細胞のある特定の細胞内区画へ送達する能力は、保存される必要があり得る。
【０３０９】
生化学的タグ又は他の部分の配列など、追加のアミノ酸残基をアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に含むこともまた、本明細書において企図される。追加のアミノ酸残基は、例えば、クローニング、発現、翻訳後修飾、合成、精製、検出、及び／又は投与の促進を含む、様々な目的のために使用され得る。生化学的タグ及び部分の非限定的な例は、キチン結合タンパク質ドメイン、エンテロペプチダーゼ切断部位、第Ｘａ因子切断部位、ＦＩＡｓＨタグ、ＦＬＡＧタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，green fluorescent protein）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ部分、ＨＡタグ、マルトース結合タンパク質ドメイン、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、ＲｅＡｓＨタグ、ｓｔｒｅｐ−タグ、ｓｔｒｅｐ−タグII、ＴＥＶプロテアーゼ部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びＶ５エピトープタグである。
【０３１０】
上述の実施形態のある特定のものにおいて、本発明の細胞標的化分子のタンパク質配列又はそのポリペプチド成分は、タンパク質又はポリペプチド成分への１つ又は２つ以上の保存的アミノ酸置換の導入により、多様であるが、これは、送達及び／又は送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞表面ＭＨＣクラスＩ提示が、熟練した作業者に公知及び／又は本明細書に記載されるアッセイを使用して検出されるように、細胞標的化分子が、標的細胞に外来的に投与した後にその異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示系に送達する能力を保持する限りにおいてである。
【０３１１】
本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」は、１つ又は２つ以上のアミノ酸が、別の生物学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えられることを意味する。例としては、アミノ酸残基を、類似した特性を有するアミノ酸残基、例えば、小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸と置換することが挙げられる（例えば、以下の表Ｂを参照）。内因性哺乳類ペプチド及びタンパク質に通常は見出されない残基での保存的置換の例は、アルギニン又はリジン残基から、例えば、オルニチン、カナバニン、アミノエチルシステイン、又は別の塩基性アミノ酸への保存的置換である。ペプチド及びタンパク質における表現型的にサイレントな置換に関するさらなる情報については、例えば、Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)を参照されたい。
【０３１２】
【表２】
2018524006.tif 000004
【０３１３】
上記の表Ｂにおける保存的置換スキームにおいて、アミノ酸の例示的な保存的置換は、物理化学的性質により以下のようにグループ化される：Ｉ：中性、親水性；II：酸及びアミド；III：塩基性；IV：疎水性；Ｖ：芳香族、嵩高のアミノ酸、VI親水性非荷電、VII脂肪族非荷電、VIII無極性非荷電、IXシクロアルケニル結合型、Ｘ疎水性、XI極性、XII小型、XIII回転可能、及びXIV可動性。例えば、保存的アミノ酸置換には以下が挙げられる：１）ＳがＣの代わりに用いられ得る；２）Ｍ又はＬがＦの代わりに用いられ得る；３）ＹがＭの代わりに用いられ得る；４）Ｑ又はＥがＫの代わりに用いられ得る；５）Ｎ又はＱがＨの代わりに用いられ得る；及び６）ＨがＮの代わりに用いられ得る。
【０３１４】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子（例えば、細胞標的化融合タンパク質）は、本明細書に列挙されるポリペプチド配列と比較して、多くとも２０個、１５個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸残基置換を有する、本発明のポリペプチド領域の機能的断片又はバリアントを含み得るが、これは、それを含む細胞標的化分子が、その異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することができる限りにおいてである。本発明の細胞標的化分子のバリアントは、変化した細胞毒性、変化した細胞分裂停止効果、変化した免疫原性、及び／又は変化した血清半減期など、所望される特性を達成するために、結合領域又は志賀毒素エフェクターポリペプチド領域内などにおいて１つ若しくは２つ以上のアミノ酸を変更すること又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸を欠失若しくは挿入することによって、本発明の細胞標的化タンパク質のポリペプチド成分を変化させた結果として、本発明の範囲内である。本発明の細胞標的化分子又はそのポリペプチド成分は、シグナル配列をさらに伴ってもよく、又は伴わなくてもよい。
【０３１５】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の結合領域は、当技術分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアライメントが行われたアライメント配列と比較した場合に、本明細書に列挙されるか又はそれ以外のすでに公知の結合領域に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．７％の全体的な配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるが、これは、結合領域が、例えば、標的生体分子に対して１０−５〜１０−１２モル／リットルのＫＤを呈するなど、細胞標的化分子の成分として、妥当な量の細胞外標的生体分子結合特異性及び親和性を呈する限りにおいてである。
【０３１６】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、当技術分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアライメントが行われたアライメント配列と比較して、天然に存在する毒素、例えば、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）などの志賀毒素Ａサブユニットなどに対して、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．７％の全体的な配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれから本質的になるが、これは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、細胞標的化分子の成分として、必要とされるレベルの、細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを少なくとも１つの標的細胞型のＭＨＣクラスＩ提示経路に細胞内送達することと関連する志賀毒素エフェクター機能を呈する限りにおいてである。
【０３１７】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分は、志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性及び／又は細胞毒性が変更又は変化していてもよいが、これは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、細胞標的化分子の成分として、必要とされるレベルの、細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを少なくとも１つの標的細胞型のＭＨＣクラスＩ提示経路に細胞内送達することと関連する志賀毒素エフェクター機能を呈する限りにおいてである。この変化は、志賀毒素エフェクターポリペプチド又は変更された志賀毒素エフェクターポリペプチドが成分である細胞標的化分子の細胞毒性の変化をもたらす場合ももたらさない場合もある。志賀毒素の酵素活性及び細胞毒性の両方が、変異又は短縮化によって変更、低減、又は除去され得る。可能性のある変更としては、短縮化、欠失、逆位、挿入、再配列、及び置換からなる群から選択される、志賀毒素エフェクターポリペプチドに対する変異が挙げられるが、これは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが、細胞標的化分子の成分として、必要とされるレベルの、細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを少なくとも１つの標的細胞型のＭＨＣクラスＩ提示経路に細胞内送達することと関連する志賀毒素エフェクター機能を保持する限りにおいてである。
【０３１８】
志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットの細胞毒性は、変異又は短縮化によって、変更、低減、又は除去され得る。本発明の細胞標的化分子は、それぞれが、志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性に関係なく、細胞標的化分子の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを少なくとも１つの標的細胞型のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達する能力をそれぞれの細胞標的化分子に提供する、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド領域を含む。以下の実施例に示されるように、志賀毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性及び細胞毒性は、融合型異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを標的細胞型のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達する能力を本発明の細胞標的化分子に提供するのに必要とされる他の志賀毒素エフェクター機能とは無関係であり得る。したがって、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチド成分は、例えば、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、酵素活性に関与する１つ又は２つ以上の重要な残基におけるアミノ酸残基の変異の存在によってなど、減弱又は無効となった志賀毒素細胞毒性を呈するように改変されている。これにより、志賀毒素の細胞毒性機能によって直接的に標的細胞を殺滅させることのない本発明の細胞標的化分子が得られる。細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を欠いているこのような本発明の細胞標的化分子は、１）標的細胞によるＭＨＣクラスＩ提示のための異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの送達による細胞殺滅、２）異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを標的細胞のＭＨＣクラスＩ系に送達した結果としての、標的細胞に対する望ましい細胞間免疫細胞応答の刺激、及び／又は３）標的細胞には必要とされる機序が欠損していない場合に標的細胞を特定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子複合体で標識することを実行するのに有用である。
【０３１９】
志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットの触媒活性及び／又は細胞毒性活性は、変異又は短縮化によって、減弱又は除去され得る。志賀毒素Ａサブユニットにおいて酵素活性及び／又は細胞毒性にとって最も重要な残基は、とりわけ、以下の残基位置にマッピングされている：アスパラギン−７５、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、アルギニン−１７６、及びトリプトファン−２０３（Di R et al., Toxicon 57:525-39 (2011)）。特に、グルタミン酸−Ｅ１６７からリジンへの変異及びアルギニン−１７６からリジンへの変異を含有するＳｔｘ２Ａの二重変異体コンストラクトは、完全に不活性化されたが、一方で、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２における多くの単一変異は、細胞毒性の１０分の１への低減を示した。標識された位置、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、チロシン−１１４、及びトリプトファン−２０３は、Ｓｔｘ、Ｓｔｘ１、及びＳｔｘ２の触媒活性にとって重要であることが示されている（Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988)；Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992)；Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993)；Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993)；Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994)；Suhan M, Hovde C,, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。グルタミン酸−１６７及びアルギニン−１７０の両方を変異させることにより、無細胞リボソーム不活性化アッセイにおいて、Ｓｌｔ−Ｉ  Ａ１の酵素活性が除去された（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体におけるＳｌｔ−Ｉ  Ａ１のデノボ発現を使用する別のアプローチにおいて、グルタミン酸−１６７及びアルギニン−１７０の両方を変異させることにより、その発現レベルでのＳｌｔ−Ｉ  Ａ１断片の細胞毒性が除去された（LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
【０３２０】
さらに、Ｓｔｘ１Ａの１〜２３９又は１〜２４０への短縮化により、その細胞毒性が低減され、同様に、Ｓｔｘ２Ａの保存的疎水性残基への短縮化により、その細胞毒性が低減された。志賀毒素Ａサブユニットにおいて、真核生物リボソームとの結合及び／又は真核生物リボソーム阻害にとって最も重要な残基は、とりわけ、以下の残基位置にマッピングされている：アルギニン−１７２、アルギニン−１７６、アルギニン−１７９、アルギニン−１８８、チロシン−１８９、バリン−１９１、及びロイシン−２３３（McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012））。
【０３２１】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）又はＳｔｘＡ（配列番号２）に由来する成分に由来するか又はそれを含む志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドは、野生型志賀毒素ポリペプチド配列からの変更、例えば、以下のアミノ酸残基置換のうちの１つ又は２つ以上などを含む：７５位のアスパラギン、７７位のチロシン、１１４位のチロシン、１６７位のグルタミン酸、１７０位のアルギニン、１７６位のアルギニン、及び／又は２０３位のトリプトファンの置換。そのような置換の例は、先行技術に基づいて熟練した作業者に公知であり、例えば、７５位におけるアスパラギンからアラニンへの置換、７７位におけるチロシンからセリンへの置換、１１４位におけるチロシンからアラニンへの置換、１６７位におけるグルタミン酸からアスパラギン酸への置換、１７０位におけるアルギニンからアラニンへの置換、１７６位におけるアルギニンからリジンへの置換、及び／又は２０３位におけるトリプトファンからアラニンへの置換である。志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドの酵素活性及び／又は細胞毒性を増強するか又は低減するかのいずれかである他の変異は、本発明の範囲内であり、周知の技術及び本明細書に開示されるアッセイを使用して決定され得る。
【０３２２】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又はそのタンパク質性成分は、例えば、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、アミド化、ヒドロキシル化、及び／又はメチル化など、１つ又は２つ以上の翻訳後修飾を含む（例えば、Nagata K et al., Bioinformatics 30: 1681-9 (2014)を参照）。
【０３２３】
本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の酵素活性を増加させるために、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が、変異、挿入、又は欠失され得るが、これは、細胞標的化分子が、その異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドカーゴを標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に送達することができる限りにおいてである。例えば、Ｓｔｘ１Ａにおける残基位置アラニン−２３１をグルタミン酸へ変異させることにより、インビトロにおけるその酵素活性が増加した（Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。
【０３２４】
本発明の細胞標的化分子は、１つ又は２つ以上の追加の作用物質とコンジュゲートさせてもよく、作用物質としては、本明細書に記載される作用物質を含む、当技術分野で公知の治療剤及び／又は診断剤を挙げることができる。
【０３２５】
Ｖ．本発明の細胞標的化分子の産生、製造、及び精製
本発明の細胞標的化分子は、当業者に周知の生化学的改変技術を使用して、産生することができる。例えば、本発明の細胞標的化分子及び／又はそのタンパク質成分は、標準的な合成方法によって、組換え発現系の使用によって、又は他のあらゆる好適な方法によって製造することができる。したがって、本発明のある特定の細胞標的化分子及びそのタンパク質成分は、例えば、（１）標準的な固相又は液相手法を使用して、段階的に又は断片のアセンブリのいずれかによって、タンパク質のポリペプチド又はポリペプチド成分を合成し、最終的なポリペプチド又はタンパク質化合物産物を単離及び精製すること；（２）宿主細胞中で本発明の細胞標的化分子のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを発現させ、宿主細胞又は宿主細胞培養物から発現産物を回収すること；又は（３）本発明の細胞標的化分子のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを無細胞で、インビトロで発現させ、発現産物を回収することを含む方法によって、又は（１）、（２）若しくは（３）の方法のあらゆる組合せを含む、多数の方法によって合成し、ペプチド成分の断片を得て、それに続き断片を合体させて（例えばライゲートして）ペプチド成分を得て、ペプチド成分を回収することができる。例えば、ポリペプチド及び／又はペプチドの成分は、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシカルボジイミド及びＮ−エチル−５−フェニル−イソオキサゾリウム−３’−スルホネート（ウッドワード試薬Ｋ）などのカップリング試薬を使用して、一緒にライゲーションすることができる。
【０３２６】
本発明の細胞標的化分子又は細胞標的化分子のタンパク質性成分を、固相又は液相ペプチド合成を用いて合成することが好ましい場合もある。本発明の細胞標的化分子及びその成分は、標準的な合成方法によって好適に製造することができる。したがって、ペプチドは、例えば、標準的な固相又は液相手法によって、段階的に又は断片のアセンブリのいずれかによってペプチドを合成すること、及び最終的なペプチド産物を単離及び精製することを含む方法によって合成することができる。この文脈において、国際公開第１９９８／１１１２５号パンフレット、又はとりわけ、Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis（Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002）及びそこに記載された合成例を参照することができる。
【０３２７】
融合タンパク質である本発明の細胞標的化分子は、当技術分野で周知の組換え技術を使用して調製（産生及び精製）することができる。一般的に、コード化されたポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養して、細胞培養物からタンパク質を回収することによってタンパク質を調製するための方法は、例えば、Sambrook J et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989)； Dieffenbach C et al., PCR Primer： A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)に記載されている。任意の好適な宿主細胞を、本発明の細胞標的化タンパク質又は本発明の細胞標的化分子のタンパク質性成分の産生に使用することができる。宿主細胞は、本発明の細胞標的化分子及び／又はそのタンパク質成分の発現を駆動させる、１つ又は２つ以上の発現ベクターが安定に若しくは一過的にトランスフェクトされた、形質形質転換された、導入された、又はそれに感染した細胞であり得る。加えて、本発明の細胞標的化分子は、例えば変化した細胞毒性、変化した細胞増殖抑制作用、及び／又は変化した血清中半減期などの所望の特性を達成するために、１つ若しくは２つ以上のアミノ酸の変更又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸の欠失又は挿入を引き起こす本発明の細胞標的化タンパク質又は本発明の細胞標的化分子のタンパク質性成分をコードするポリヌクレオチドの改変によって産生することもできる。
【０３２８】
本発明の細胞標的化分子を産生するように選択することができる多種多様の発現系がある。例えば、本発明の細胞標的化タンパク質の発現のための宿主生物としては、原核生物、例えば大腸菌及び枯草菌（B. subtilis）、真核細胞、例えば酵母及び糸状菌（filamentous fungi）（Ｓ．セレビジエ（S. cerevisiae）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、及びＫ．ラクティス（K. lactis）など）、藻類（コナミドリムシ（C. reinhardtii）など）、昆虫細胞株、哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）、植物細胞株、及び真核生物、例えばトランスジェニック植物（シロイヌナズナ（A. thaliana）及びベンサミアナタバコ（N. benthamiana）など）が挙げられる。
【０３２９】
したがって、本発明はさらに、上記で列挙された方法に従って、また（ｉ）本発明の分子若しくは本発明の細胞標的化分子のポリペプチド成分の一部若しくはすべてをコードするポリヌクレオチド、（ii）好適な宿主細胞若しくは無細胞発現系に導入される場合、本発明の分子若しくはそのポリペプチド成分の一部若しくはすべてをコードすることができる本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又は（iii）本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を使用して、本発明の細胞標的化分子を産生するための方法も提供する。
【０３３０】
組換え技術を使用して宿主細胞又は無細胞系中でタンパク質が発現される場合、高い純度を有するか又は実質的に均一な調製物を得るために、例えば宿主細胞成分などの他の成分から所望のタンパク質を分離すること（又は精製すること）が有利である。精製は、例えば遠心分離技術、抽出技術、クロマトグラフ及び分画技術（例えばゲルろ過によるサイズ分離、汚染物質を除去するための、イオン交換カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカ又は例えばＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及びプロテインＡセファロースクロマトグラフィーによる電荷分離）、及び沈殿技術（例えばエタノール沈殿又は硫酸アンモニウム沈殿）などの当業界において周知の方法によって達成することができる。本発明の細胞標的化分子の純度を増加させるために、多数の生化学精製技術を使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、ホモ多量体形態（例えば、２つ又は３つ以上の同一な本発明の細胞標的化分子の安定な複合体）又はヘテロ二量体形態（例えば、２つ又は３つ以上の同一でない本発明の細胞標的化分子の安定な複合体）で精製されてもよい。
【０３３１】
以下の実施例は、本発明の細胞標的化分子又はそのポリペプチド成分を産生するための方法の非限定的な例、並びに本発明の例示的な細胞標的化分子の産生の具体的ではあるが非限定的な態様の説明である。
【０３３２】
VI．本発明の細胞標的化分子を含む医薬品及び診断用組成物
本発明は、以下のさらなる詳細で説明される状態、疾患、障害、又は症状（例えばがん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染）を治療又は予防するための、単独で、又は医薬組成物中で１つ若しくは２つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するための、細胞標的化分子を提供する。本発明はさらに、本発明の細胞標的化分子、又は薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を、本発明に従って、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又はビヒクルと一緒字含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞標的化分子のホモ多量体及び／又はヘテロ多量体の形態を含んでいてもよい。医薬組成物は、以下のさらなる詳細で説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療する、緩和する、又は予防する方法において有用であろう。このような疾患、状態、障害、又は症状のそれぞれは、本発明に係る医薬組成物の使用に関して別個の実施形態であることが想定される。本発明はさらに、以下でより詳細に説明される本発明に係る少なくとも１つの治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。
【０３３３】
用語「患者」及び「対象」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、少なくとも１つの疾患、障害、又は状態の症状、徴候、及び／又は兆しを呈する、あらゆる生物、一般的には脊椎動物、例えばヒト及び動物などを指す。これらの用語は、哺乳動物、例えば非限定的な例として霊長類、家畜動物（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、コンパニオンアニマル（例えばネコ、イヌなど）及び実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラットなど）を含む。
【０３３４】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」及びその文法上の変化形は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチを指す。この用語は、状態、障害若しくは疾患の発症若しくは進行速度を遅延させること、それに関連する症状を低減若しくは軽減すること、状態の完全若しくは部分寛解をもたらすこと、又は上記したもののいずれかのいくつかの組合せを指す場合もある。本発明の目的に関して、有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、症状の低減又は軽減、疾患の程度の減縮、疾患の状態の安定化（例えば悪化させないこと）、疾患の進行の遅延又は減速、病状の緩和又は一時的緩和、及び緩解（部分的か又は総合的かにかかわらず）が挙げられる。「治療する」、「治療すること」、又は「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存期間に対して生存を延長することを意味する場合もある。したがって治療が必要な対象（例えばヒト）は、すでに問題の疾患又は障害に罹患している対象であってもよい。用語「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、治療がなされない場合と比較した、病理学的な状態又は症状の重症度の増加の阻害又は低減を含み、関連する疾患、障害、又は状態の完全な停止を伴うことを必ずしも意味しない。腫瘍及び／又はがんに関して、治療は、全体的な腫瘍負荷量及び／又は個々の腫瘍サイズの低減を含む。
【０３３５】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」及びその文法上の変化形は、状態、疾患、障害の発症を予防するための、又は状態、疾患、若しくは障害の病状を変更するためのアプローチを指す。したがって、「予防」は、防止措置又は予防措置を指す場合もある。本発明の目的に関して、有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、疾患の症状、進行又は発症の予防又は減速が挙げられる。したがって予防が必要な対象（例えばヒト）は、まだ問題の疾患又は障害に罹患していない対象であってもよい。用語「予防」は、治療がなされない場合と比較して疾患の発症を減速することを含み、関連する疾患、障害又は状態の永続的な予防を伴うことを必ずしも意味しない。したがって状態を「予防すること」又はその「予防」は、ある特定の文脈において、その状態を発症するリスクを低減すること、又はその状態に関連する症状の発症を予防すること若しくは遅延させることを指す場合がある。
【０３３６】
「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、対象において少なくとも１つの所望の治療作用、例えば標的とする状態の予防若しくは治療、又は有利には状態に関連する症状の軽減をもたらす組成物（例えば治療用組成物、又は薬剤）の量又は用量である。最も望ましい治療有効量は、それらを必要とする所与の対象ごとの、当業者によって選択される特定の治療の望ましい効能をもたらすと予想される量である。この量は、熟練した作業者によって理解される様々な要因に応じて様々であると予想され、このような要因としては、これらに限定されないが、治療用化合物（活性、薬物動態学、薬力学、及び生物学的利用率など）の特徴、対象の生理学的な状態（年齢、性別、疾患のタイプ、疾患の段階、全身の状態、与えられた投薬量に対する応答性、及び薬物療法のタイプなど）、調合物中の薬学的に許容される１つ又は複数の担体の性質、及び投与経路が挙げられる。臨床及び薬理学分野における熟練者は、慣例的な実験を介して、すなわち化合物の投与に対する対象の応答をモニターすること、及びそれに応じて投薬量を調整することによって、治療有効量を決定することができよう（例えばRemington：The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)を参照）。
【０３３７】
本発明の診断用組成物は、本発明の細胞標的化分子及び１つ又は２つ以上の検出促進剤を含む。同位体、色素、比色剤、コントラスト増強剤、蛍光剤、生物発光剤、及び磁気性の物質などの様々な検出促進剤が、当技術分野で公知である。これらの薬剤は、任意の位置で、本発明の細胞標的化分子に取り込まれていてもよい。薬剤の取り込みは、タンパク質のアミノ酸残基を介して、又はリンカー及び／若しくはキレート化剤を介するものを含め、当技術分野で公知のいくつかの種類の連結を介して、なされてもよい。薬剤の取り込みは、スクリーニング、アッセイ、診断手順、及び／又はイメージング技術で診断用組成物の存在を検出できるような方法でなされる。
【０３３８】
本発明の診断用組成物を生産又は製造する場合、本発明の細胞標的化分子は、直接的又は間接的に１つ又は２つ以上の検出促進剤に連結されていてもよい。情報収集方法のための、例えば生物の疾患、障害、又は状態に対する診断及び／又は予後予測用途などのための、本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子に機能するように連結できる、熟練した作業者公知の多数の検出促進剤がある（例えばCai W et al., J Nucl Med 48：304-10 (2007)；Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20：825-41 (2009)；Paudyal P et al., Oncol Rep 22：115-9 (2009)；Qiao J et al., PLoS ONE 6：e18103 (2011)；Sano K et al., Breast Cancer Res 14：R61 (2012)を参照）。例えば、検出促進剤としては、蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ６８０、インドシアニングリーン、及びＣｙ５．５）などのイメージ増強コントラスト剤、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７３Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、及び２２３Ｒなどの同位体及び放射性核種；クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジウム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、又はエルビウム（III）などの常磁性イオン；ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、及びビスマス（III）などの金属；リポソームなどの超音波コントラスト増強剤；バリウム、ガリウム、及びタリウム化合物などの放射線不透過性物質が挙げられる。検出促進剤は、中間官能基、例えば、２−ベンジルＤＴＰＡ、ＰＡＭＡＭ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、それらのアナログなどのキレート化剤、及び前述のもののいずれかの機能的等価物を使用して、直接的又は間接的に取り込まれ得る（Leyton J et al., Clin Cancer Res 14: 7488-96 (2008)を参照）。
【０３３９】
様々な検出促進剤を、タンパク質、特に免疫グロブリン及び免疫グロブリン由来のドメインに取り込む、付加する、及び／又はコンジュゲートするための、熟練した作業者に公知の多数の標準的な技術がある（Wu A, Methods 65: 139-47 (2014)）。同様に、熟練した作業者公知の多数のイメージングアプローチ、例えば、医療の場で一般的に使用される非侵襲的なインビボのイメージング技術、例えばコンピュータ断層撮影イメージング（ＣＴスキャニング）、光学的イメージング（直接、蛍光、及び生物発光イメージングを含む）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ，magnetic resonance imaging）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ，positron emission tomography）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ，single-photon emission computed tomography）、超音波、及びＸ線コンピュータ断層撮影イメージングなどがある（総論に関して、Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012)を参照）。
【０３４０】
VII．本発明の細胞標的化分子を含む医薬品及び／又は診断用組成物の産生又は製造
本発明の細胞標的化分子のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物は、同様に本発明の範囲内である。
【０３４１】
用語「溶媒和物」は、本発明の文脈において、溶質（この場合、本発明に係る細胞標的化分子又はそれらの薬学的に許容される塩）と溶媒とで形成される規定の化学量論の複合体を指す。この文脈において溶媒は、例えば、水、エタノール、又は別の薬学的に許容される、典型的には低分子の有機化学種、例えば、これらに限定されないが、酢酸又は乳酸であってもよい。問題の溶媒が水である場合、このような溶媒和物は通常、水和物と称される。
【０３４２】
本発明の細胞標的化分子、又はそれらの塩は、貯蔵又は投与のために調製された医薬組成物として製剤化してもよく、医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中に本発明の化合物又はそれらの塩の治療有効量を含む。用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な製剤用担体のいずれかを含む。治療的用途のための薬学的に許容される担体は薬学分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985))で説明されている。「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、ありとあらゆる生理学的に許容できる、すなわち適合性の、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体又は希釈剤としては、経口、直腸、経鼻又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、及び経皮を含む）投与に好適な調合物で使用されるものが挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が挙げられる。本発明の医薬組成物で採用される可能性がある好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液のケースでは必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。ある特定の実施形態において、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に好適である。選択される投与経路に応じて、低いｐＨや特定の投与経路で患者に投与した場合に活性なタンパク質が遭遇する可能性がある他の自然の不活性化条件の作用から化合物を保護することを意図した材料で、タンパク質又は他の医薬品成分をコーティングしてもよい。
【０３４３】
本発明の医薬組成物の調合物は、都合のよい形態として単位剤形で提供してもよいし、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製してもよい。このような形態において、組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に分割される。単位剤形は、パッケージ化された調製物であってもよく、パッケージは、個別の量の調製物、例えば、バイアル又はアンプル中に個包装された錠剤、カプセル剤、及び粉末剤を含有する。単位剤形はまた、カプセル剤、カシェ剤、又は錠剤それ自身であってもよいし、又は適切な数のこれらのパッケージ化された形態のいずれかであってもよい。単位剤形は、単回用量の注射可能な形態で、例えばペンの形態で提供されてもよい。組成物は、あらゆる好適な投与の経路及び手段のために製剤化されていてもよい。本明細書に記載される医薬組成物及び治療用分子にとっては、皮下又は経皮の投与様式が特に好適であり得る。
【０３４４】
本発明の医薬組成物はまた、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有していてもよい。微生物の存在の予防は、滅菌手順と、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方によって確実にすることができる。また、組成物への例えば糖、塩化ナトリウムなどなどの等張剤も望ましい場合がある。加えて、注射用医薬形態の持続吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらされる可能性がある。
【０３４５】
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでいてもよい。例示的な薬学的に許容される抗酸化剤は、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ，butylated hydroxyanisole）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ，butylated hydroxytoluene）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；及び金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，ethylenediamine tetraacetic acid）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などである。
【０３４６】
別の態様において、本発明は、本発明の異なる細胞標的化分子、又は前述の物質のいずれかのエステル、塩若しくはアミドの１つ又は組合せ、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０３４７】
治療用組成物は、典型的には滅菌されており、製造及び貯蔵条件下で安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の秩序だった構造として製剤化されてもよい。担体は、例えば、水、アルコール、例えばエタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、又はあらゆる好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、当業界において周知の製剤化学に従い、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液のケースでは必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。ある特定の実施形態において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、又は塩化ナトリウムが組成物において望ましい場合がある。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に包含させることによってもたらされる可能性がある。
【０３４８】
皮内又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、典型的には、滅菌希釈剤、例えば注射用水、塩類溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒など；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩など；及び張度調節剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの１つ又は２つ以上を含む。ｐＨは、例えば塩酸若しくは水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基、又はクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩などを含む緩衝剤で調整することができる。このような調製物は、ガラス又はプラスチックで作製された、アンプル、使い捨てのシリンジ又は複数回投与用のバイアル中に封入されていてもよい。
【０３４９】
滅菌注射用溶液は、上述した成分の１つ又は組合せを含む適切な溶媒中に本発明の細胞標的化分子を必要な量で取り込むこと、必要に応じて、それに続き滅菌精密ろ過することによって調製することができる。分散液は、分散媒及び例えば上述したものなどの他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことによって調製することができる。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末のケースにおいて、調製方法は、それらの滅菌ろ過した溶液からあらゆる追加の所望の成分に加えて活性成分の粉末を生じさせる真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０３５０】
本発明の細胞標的化分子の治療有効量を、例えば静脈内、皮膚又は皮下注射によって投与されるように設計する場合、結合剤は、パイロジェンフリーの非経口的に許容できる水溶液の形態であろう。適切なｐＨ、等張性、安定性などを考慮した、非経口的に許容できるタンパク質溶液を調製するための方法は、当業界における能力の範囲内である。静脈内、皮膚、又は皮下注射にとって好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、等張ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロース及び塩化ナトリウム注射、乳酸リンゲル注射用のビヒクル、又は当業界で公知の別のビヒクルを含有するであろう。本発明の医薬組成物はまた、当業者周知の安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、又は他の添加剤を含有していてもよい。
【０３５１】
本明細書の他所で説明されるように、本発明の細胞標的化分子又は組成物（例えば、医薬組成物又は診断用組成物）は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化した送達系を含む、制御放出製剤など、急速な放出から細胞標的化分子を保護する担体を用いて調製され得る。生分解性生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などが使用されてもよい。このような調合物を調製するための多くの方法は、特許化されているか又は一般的に当業者公知である（例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)を参照）。
【０３５２】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物（例えば医薬又は診断用組成物）は、インビボにおける所望の分配を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門は、多くの大きい及び／又は親水性化合物を排除する。特定のインビボにおける位置に本発明の治療的細胞標的化分子又は組成物を標的化するために、それは、例えば、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送される１つ又は２つ以上の部分を含み得るリポソーム中に製剤化されてもよく、そのようにして標的化された薬物送達が強化される。例示的な標的部分としては、葉酸塩又はビオチン；マンノシド；抗体；サーファクタントプロテインＡ受容体；ｐ１２０カテニンなどが挙げられる。
【０３５３】
医薬組成物は、インプラント又は微粒子系として使用されるように設計された非経口調合物を含む。インプラントの例は、例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、及び可溶性塩溶液などの高分子又は疎水性成分で構成されるデポ製剤である。微粒子系の例は、マイクロスフェア、微粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、及びナノ粒子である（例えばHonda M et al., Int J Nanomedicine 8：495-503 (2013)；Sharma A et al., Biomed Res Int 2013：960821 (2013)；Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3：1429-45 (2012)を参照）。放出制御製剤は、イオンに感受性を有するポリマー、例えばリポソーム、ポロキサマー（polaxamer）４０７、及びヒドロキシアパタイトなどを使用して調製されてもよい。
【０３５４】
VIII．本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞
本発明の細胞標的化分子及びそれらのポリペプチド成分の他にも、本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子、又はそれらの機能的部分をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に包含される。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と同等であり、これらのそれぞれは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマー、リボ核酸（ＲＮＡ）のポリマー、ヌクレオチドアナログを使用して生成されたこれらのＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、並びにそれらの派生物、断片及びホモログの１つ又は２つ以上を含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であり得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡコドンの３番目の位置で許容されることがわかっているゆらぎを考慮に入れた、それでもなお異なるＲＮＡコドンと同じアミノ酸をコードする例示的なタンパク質をコードすることができる全てのポリヌクレオチドを含むことが具体的に開示されている（Stothard P, Biotechniques 28：1102-4 (2000)を参照）。
【０３５５】
一態様において、本発明は、本発明の細胞標的化分子（例えば、融合タンパク質）、又はそのポリペプチド断片若しくは派生物をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列のうちの１つを含むポリペプチドに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上の同一性のポリペプチドをコードする核酸配列を挙げることができる。本発明はまた、本発明の細胞標的化分子、又はそれらのポリペプチド断片若しくは派生物、又はあらゆるこのような配列のアンチセンス若しくは相補物をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。
【０３５６】
本発明の細胞標的化分子の派生物又はアナログとしては、とりわけ、例えば、同じサイズのポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列に対して、又はアライメントが当技術分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによって行われたアライメント配列と比較した場合に、少なくとも約４５％、５０％、７０％、８０％、９５％、９８％、又はさらには９９％の同一性（好ましい同一性は８０〜９９％）で、本発明のポリヌクレオチド、細胞標的化分子、又は細胞標的化分子のポリペプチド成分に実質的に相同な領域を有するポリヌクレオチド（又はポリペプチド）分子が挙げられる。例示的なプログラムは、Smith T, Waterman M, Adv Appl Math 2：482-9 (1981)のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を使用した、ＧＡＰプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package、UNIX用バージョン８、Genetics Computer Group、University Research Park、Madison、WI、U.S.）である。また、本発明の細胞標的化分子をコードする配列の相補物を、ストリンジェントな条件下（例えばAusubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)を参照）及びそれより低い条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも包含される。ストリンジェントな条件は当業者公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989)）で見出すことができる。
【０３５７】
本発明はさらに、本発明の範囲内のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本発明の細胞標的化分子、又はそのポリペプチド成分をコードすることができるポリヌクレオチドは、発現ベクターを産生するための当業界において周知の材料及び方法を使用して、細菌プラスミド、ウイルスベクター及びファージベクターを含む公知のベクターに挿入されてもよい。このような発現ベクターは、あらゆる最適な宿主細胞又は無細胞発現系（例えばｐＴｘｂ１及びｐＩＶＥＸ２．３）中で予期される本発明の細胞標的化分子の産生を維持するのに必要なポリヌクレオチドを含むであろう。具体的なタイプの宿主細胞又は無細胞発現系と共に使用するための発現ベクターを含む具体的なポリヌクレオチドは、当業者周知であり、慣例的な実験を使用して決定してもよいし、又は購入してもよい。
【０３５８】
用語「発現ベクター」は、本明細書で使用される場合、直鎖状又は環状の、１つ又は２つ以上の発現単位を含むポリヌクレオチドを指す。用語「発現単位」は、所望のポリペプチドをコードし、宿主細胞における核酸セグメントの発現をもたらすことができるポリヌクレオチドセグメントを示す。発現単位は、典型的には、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを全て機能するような立体位置で含む。発現ベクターは、１つ又は２つ以上の発現単位を含有する。したがって、本発明の文脈において、本発明の細胞標的化分子（例えば、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドに融合した志賀毒素エフェクターポリペプチドを用いて遺伝子組換えしたｓｃＦｖ）をコードする発現ベクターは、単一のポリペプチド鎖につき少なくとも１つの発現単位を含むが、一方で、例えば、２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（例えば、１つの鎖がＶＬドメインを含み、第２の鎖が毒素エフェクター領域に連結されたＶＨドメインを含む）は、少なくとも２つの発現単位を含み、すなわちタンパク質の２つのポリペプチド鎖のそれぞれにつき１つの発現単位を含む。本発明の多連鎖の細胞標的化タンパク質の発現のために、各ポリペプチド鎖の発現単位は、異なる発現ベクターに別々に含有されていてもよい（例えば発現は、各ポリペプチド鎖の発現ベクターが導入された単一の宿主細胞で達成することができる）。
【０３５９】
ポリペプチド及びタンパク質の一過性の又は安定な発現を指示することが可能な発現ベクターは当業界において周知である。発現ベクターとしては、一般的に、これらに限定されないが、異種シグナル配列又はペプチド、複製起点、１つ又は２つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列の１つ又は２つ以上が挙げられ、これらのそれぞれは当業界において周知である。採用可能な任意選択の調節制御配列、統合配列、及び有用なマーカーが当業界において公知である。
【０３６０】
用語「宿主細胞」は、発現ベクターの複製又は発現を維持することができる細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌又は真核細胞（例えば酵母、昆虫、両生類、鳥類、又は哺乳動物細胞）であり得る。本発明のポリヌクレオチドを含む、又は本発明の細胞標的化分子、又はそのポリペプチド成分を産生することが可能な宿主細胞株の生成及び単離は、当業界において公知の標準的な技術を使用して達成することができる。
【０３６１】
本発明の範囲内の細胞標的化分子は、本明細書に記載されるポリペプチド及びタンパク質のバリアント又は派生物であってもよく、これらは、例えば宿主細胞によるより最適な発現などの所望の特性を達成するのにそれをより好適にすることができる１つ又は２つ以上のアミノ酸の変更、又は１つ又は２つ以上のアミノ酸の欠失若しくは挿入によって、ポリペプチド及び／又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを改変することによって産生される。
【０３６２】
IX．送達デバイス及びキット
ある特定の実施形態において、本発明は、それらを必要とする対象に送達するための、例えば医薬組成物などの１つ又は２つ以上の本発明の物質の組成物を含むデバイスに関する。したがって、本発明の１つ又は２つ以上の化合物を含む送達デバイスは、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射；経口投与；経皮投与；経肺又は経粘膜投与；インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ又はマイクロポンプによる投与を含む様々な送達方法によって、又は当業者によって認識されている他の手段によって、本発明の物質の組成物を患者に投与するのに使用することができる。
【０３６３】
また、少なくとも１つの本発明の物質の組成物、並びに任意選択でパッケージ及び使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、薬物投与及び／又は診断情報収集に有用であり得る。本発明のキットは、少なくとも１つの追加の試薬（例えば、標準、マーカーなど）を含んでいてもよい。キットは、典型的には、キット内容物の意図される使用を示すラベルを含む。キットは、試料又は対象中で細胞型（例えば腫瘍細胞）を検出するための、又は患者が、本発明の細胞標的化分子、又はその組成物、又は本明細書に記載される本発明の関連する方法を利用する治療戦略に応答するグループに属するかどうかを診断するための試薬及び他のツールをさらに含んでいてもよい。
【０３６４】
X．本発明の細胞標的化分子並びにそれらの医薬組成物及び／若しくは診断用組成物を使用するための方法
一般的に、本発明の目的は、例えばある特定のがん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は本明細書で述べられるさらなる病態などの疾患、障害、及び状態の予防及び／又は治療に使用することができる、薬理活性薬剤、加えてそれを含む組成物を提供することである。したがって、本発明は、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの送達、特定の細胞の標的化殺滅、特定のｐＭＨＣ  Ｉでの標的細胞の細胞表面の標識及び／又は標的細胞の特定の内部区画の標識、診断情報の収集、並びに本明細書に記載される疾患、障害、及び状態の治療に、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び診断用組成物を使用する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、がん、がんの発生、腫瘍の発生、転移、及び／又はがん疾患の再発を予防又は治療するための免疫療法として使用することができる。
【０３６５】
特定には、本発明の目的は、現在のところ当業界において公知の薬剤、組成物、及び／又は方法と比較して一定の利点を有する、このような薬理学的に活性な薬剤、組成物、及び／又は方法を提供することである。したがって、本発明は、特定されたタンパク質配列により特徴付けた細胞標的化分子並びにそれらの医薬組成物を使用する方法を提供する。例えば、配列番号１〜６２及び７１〜１１５に記載のポリペプチド配列のいずれかは、以下の方法又は熟練した作業者公知の細胞標的化分子を使用するためのあらゆる方法で、例えば国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４６９３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１３８４５２号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレット、国際公開第２０１５／１１３００７号パンフレット、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２８号明細書、及び米国特許出願公開第２０１４／９６５８８２号明細書で説明される様々な方法などで使用される細胞標的化分子の成分としてとりわけ利用される場合がある。
【０３６６】
本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを細胞に送達する方法であって、細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、接触ステップの後に、インビトロ細胞培養物において又は生きた脊索動物内でインビボにおいてのいずれかで、この細胞の、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／又はＣＴＬなどによる細胞間結合を引き起こす。生物体内における標的細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示は、生物体内における標的細胞及び／又はその全般的な場所へのロバストな免疫応答の活性化をもたらし得る。したがって、提示のためのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの標的化送達は、治療レジメ及び／又はワクチン接種戦略中にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化するための機構として利用され得る。
【０３６７】
本発明は、脊索動物細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを送達する方法であって、細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。ある特定のさらなる実施形態において、本発明の細胞標的化分子は、接触ステップの後に、インビトロ細胞培養物において又は脊索動物内でインビボにおいてのいずれかで、この細胞の、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／又はＣＴＬなどによる細胞間結合を引き起こす。
【０３６８】
本発明の細胞標的化分子を使用した標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路へのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの送達は、標的細胞が、細胞表面上にＭＨＣクラスＩ分子と会合したエピトープ−ペプチドを提示するように誘導するのに使用することができる。脊索動物において、ＭＨＣクラスＩ複合体による免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示により、提示細胞をＣＴＬ媒介性細胞溶解による殺滅に感受性にし、免疫細胞が微小環境を変更するように誘導し、脊索動物内の標的細胞部位にさらに多くの免疫細胞を動員するためのシグナル伝達を行うことができる。したがって、本発明の細胞標的化分子及びその組成物は、細胞を本発明の細胞標的化分子と接触させることにより、特定の細胞型を殺滅するのに使用することができる、及び／又は脊索動物において免疫応答を刺激するのに使用することができる。
【０３６９】
ＭＨＣクラスＩエピトープ、例えば、公知のウイルス抗原に由来するものを改変して細胞標的化分子にすることにより、例えばインビトロで脊索動物の免疫細胞の有益な機能及び／又はインビボで脊索動物の免疫系の有益な機能を利用及び指示するために、免疫刺激性抗原の標的化送達及び提示を使用することができる。これは、細胞標的化分子を細胞外空間、例えば、血管の内腔などに外来的に投与し、次いで、細胞標的化分子が標的細胞を発見し、その細胞に入り、細胞内にそのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴを送達するのを可能にすることによって、達成され得る。本発明の細胞標的化分子のこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＭＨＣクラスＩ提示の機能の用途は、広範である。例えば、脊索動物において、細胞へのＣＤ８＋エピトープの送達及びその細胞による送達されたエピトープのＭＨＣクラスＩ提示は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞間結合を引き起こすことができ、ＣＴＬによる標的細胞の殺滅及び／又は免疫刺激性サイトカインの分泌をもたらし得る。
【０３７０】
本発明のある特定の実施形態は、免疫治療方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法である。ある特定のさらなる実施形態において、免疫治療方法は、患者において有益な免疫応答を刺激することによって、疾患、障害、及び／又は状態（例えば、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び／又は微生物感染）を治療する方法である。
【０３７１】
本発明のある特定の実施形態は、がんを治療する免疫治療方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法である。
【０３７２】
本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを脊索動物における標的細胞に送達し、免疫応答を引き起こすことを伴う免疫治療方法であって、脊索動物に、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定のさらなる実施形態に関して、免疫応答は、ＣＤ８＋免疫細胞によるサイトカインの分泌、標的細胞におけるＣＴＬ誘導性増殖停止、標的細胞のＣＴＬ誘導性壊死、標的細胞のＣＴＬ誘導性アポトーシス、組織の場所における非特異的な細胞死、分子間エピトープ拡散、悪性細胞型に対する免疫寛容の破壊、及び悪性細胞型に対する脊索動物の持続的な免疫の獲得からなる群から選択される細胞間免疫細胞応答である（例えば、Matsushita H et al., Cancer Immunol Res 3: 26-36 (2015)を参照）。これらの免疫応答は、熟練した作業者に公知の技術を使用して検出及び／又は定量化することができる。例えば、ＣＤ８＋免疫細胞は、免疫刺激性サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα，tumor necrosis factor alpha）、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β，macrophage inflammatory protein-1 beta）、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２などのインターロイキンなどを放出し得る（例えば、以下の実施例；Seder R et al., Nat Rev Immunol 8: 247-58 (2008)を参照）。ＩＦＮ−γは、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を増加させ、新生物細胞をＣＴＬ媒介性の細胞殺滅に対して感受性にすることができる（Vlkova V et al., Oncotarget 5: 6923-35 (2014)）。炎症性サイトカインは、サイトカイン放出細胞に対して無関係のＴＣＲ特異性を有する傍観者Ｔ細胞を刺激することができる（例えば、Tough D et al., Science 272: 1947-50 (1996)を参照）。活性化されたＣＴＬは、エピトープ−ＭＨＣクラスＩ複合体を提示する細胞の近傍にある細胞を、近傍の細胞がペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体レパートリーを提示するかどうかに関係なく、無差別に殺滅させ得る（Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 10985-90 (2006)）。したがって、ある特定のさらなる実施形態に関して、免疫応答は、近傍細胞が本発明の細胞標的化分子によって送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを全く提示していない場合、及び殺滅される近傍細胞に物理的に結合している細胞標的化分子の結合領域のいずれの細胞外標的化生体分子の存在にも関係のない、免疫細胞によって媒介される近傍細胞の殺滅からなる群から選択される、細胞間免疫細胞応答である。
【０３７３】
標的細胞であるか単に標的細胞の近傍にある細胞かにかかわらず、ＣＴＬによる溶解を受けた細胞における非自己エピトープの存在は、細胞間エピトープ拡散の機構による標的細胞における非自己エピトープの認識を含め、免疫系によって外来物として認識及び標的化され得る（McCluskey J et al., Immunol Rev 164: 209-29 (1998)；Vanderlugt C et al., Immunol Rev 164: 63-72 (1998)；Vanderlugt C, Miller S, Nat Rev Immunol 2: 85-95 (2002)を参照）。近傍細胞としては、例えば、がん関連の線維芽細胞、間葉幹細胞、腫瘍関連内皮細胞、及び未成熟骨髄由来抑制細胞など、非新生物細胞を挙げることができる。例えば、がん細胞は、コーディング配列中に平均で２５〜５００個の非同義変異を有し得る（例えば、Fritsch E et al., Cancer Immunol Res 2: 522-9 (2014)を参照）。がんドライバー変異及び非ドライバー変異のいずれも、がん細胞の変異状況の一部であり、これは、細胞１個当たり多数の非自己エピトープを提供し得、平均の腫瘍は、１０又は１１以上の非自己エピトープを有し得る（例えば、Segal N et al., Cancer Res 68: 889-92 (2008)を参照）。例えば、腫瘍タンパク質ｐ５３の変異体形態は、非自己エピトープを含有し得る（例えば、Vigneron N et al., Cancer Immun 13: 15 (2013)を参照）。加えて、変異型自己タンパク質などの非自己エピトープの存在は、これらの新しいエピトープに特異的なメモリー細胞の産生をもたらし得る。本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態は、標的化された組織の場所においてサンプリングされる樹状細胞を増加させ得るため、細胞内抗原による免疫系の交差抗原刺激の可能性が、増加し得る（例えば、Chiang C et al., Expert Opin Biol Ther 15: 569-82 (2015)を参照）。したがって、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの細胞標的化分子の送達及びそのエピトープのＭＨＣクラスＩ提示の結果として、本発明の細胞標的化分子によって送達されたエピトープ以外の非自己エピトープによるものを含め、非自己抗原を含有する標的細胞及び他の近傍細胞は、免疫系によって拒絶され得る。このような機構により、例えば、細胞標的化分子の結合領域の細胞外標的生体分子を発現しない腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫が誘導され得る。
【０３７４】
サイトカイン分泌及び／又はＴ細胞活性化を伴う免疫応答は、脊索動物内のある場所の免疫微小環境の調節をもたらし得る。本発明の方法は、例えば、腫瘍関連マクロファージ、Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、抗原提示細胞、及びナチュラルキラー細胞などの免疫細胞に対する制御性恒常性を変化させるために、脊索動物内の組織の場所の微小環境を変更するのに使用され得る。
【０３７５】
ある特定の実施形態に関して、本発明の方法は、例えば、メモリーＴ細胞の発達及び／又は腫瘍微小環境に対する変更などによって、脊索動物対象における抗腫瘍細胞免疫の増強及び／又は脊索動物における持続的な抗腫瘍免疫を作り出すのに使用することができる。
【０３７６】
本発明の細胞標的化分子又はその医薬組成物のある特定の実施形態は、脊索動物内のある場所に、免疫系を刺激して、その場所をより強力に規制するため及び／又は免疫阻害性シグナル、例えば、アネルギー誘導シグナルを緩和するために、非自己ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド提示細胞を「シーディング」するのに使用することができる。この本発明の「シーディング」方法のある特定のさらなる実施形態において、場所は、腫瘤又は感染した組織部位である。本発明のこの「シーディング」方法のある特定の実施形態において、非自己ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、細胞標的化分子の標的細胞によってまだ提示されていないペプチド、標的細胞によって発現されるあらゆるタンパク質中に存在しないペプチド、標的細胞のプロテオーム又はトランスクリプトーム中に存在しないペプチド、シーディングしようとする部位の細胞外の微環境中に存在しないペプチド、及び標的化しようとする腫瘤又は感染した組織部位中に存在しないペプチドからなる群から選択される。
【０３７７】
この「シーディング」方法は、免疫細胞による細胞間認識及び下流の免疫応答の活性化のために、１つ又は２つ以上のＭＨＣクラスＩ提示されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ｐＭＨＣ  Ｉ）で脊索動物内の１つ又は２つ以上の標的細胞を標識するように機能する。本発明の細胞標的化分子の細胞内在化、細胞内経路決定、及び／又はＭＨＣクラスＩエピトープ送達の機能を利用することにより、送達されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを提示する標的細胞は、脊索動物の免疫細胞の免疫監視機構によって認識され、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、ＣＴＬなどによる、提示標的細胞の細胞間結合をもたらすことができる。本発明の細胞標的化分子を使用するこの「シーディング」方法は、細胞標的化分子によって送達されたＴ細胞エピトープを提示しているかどうかにかかわらず、例えば、細胞間エピトープ拡散及び／又は人工的に送達されたエピトープとは対照的な内因性抗原の提示に基づく標的細胞の免疫寛容の破壊などの結果として、免疫細胞に媒介される標的細胞殺滅を刺激することができる。本発明の細胞標的化分子を使用したこの「シーディング」方法は、ナイーブＴ細胞によって外来物として認識される及び／又はメモリーＴ細胞によって非自己としてすでに認識可能である（すなわち、リコール抗原）のいずれかであるエピトープの検出に基づいて、シーディングされた微小環境内、例えば、腫瘤又は感染組織部位などにおいて細胞に対する適応免疫応答を誘導することによって、ワクチン接種効果（新しいエピトープの曝露）及び／又はワクチン接種追加免疫効果（エピトープ再曝露）を提供し得る。この「シーディング」方法はまた、脊索動物内において、末梢的又は全身的のいずれかで、標的細胞集団、腫瘤、罹患組織部位、及び／又は感染組織部位に対する免疫寛容の破壊も誘導し得る。
【０３７８】
１つ又は２つ以上の抗原性及び／又は免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープで脊索動物内の場所をシーディングするステップを含む本発明のある特定の方法は、局所的に又は全身に投与されるかどうかにかかわらず、ある特定の抗原に対する免疫応答を刺激するために免疫学的なアジュバントの投与と組み合わせてもよく、例えば本発明の組成物と、サイトカイン、細菌産物、又は植物のサポニンのような１つ又は２つ以上の免疫学的なアジュバントとの共投与などである。本発明の方法で使用するのに適している可能性がある免疫学的なアジュバントの他の例としては、アルミニウム塩及び油、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、鉱油、スクアレン、パラフィン油、落花生油、及びチメロサールなどが挙げられる。
【０３７９】
本発明のある特定の方法は、脊索動物におけるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫原性交差提示及び／又は交差抗原刺激の促進を伴う。本発明のある特定の方法に関して、交差抗原刺激は、本発明の細胞標的化分子によって引き起こされる標的細胞の死及び／又は死の手段の結果として、免疫監視機構に対して死ぬ標的細胞又は死んだ標的細胞における細胞内抗原の曝露が促進されるようになることで生じる。
【０３８０】
単一の本発明の細胞標的化分子によって複数の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが送達され得るため、本発明の細胞標的化分子の単一の実施形態が、例えば、異なるＨＬＡ対立遺伝子を有するヒトにおいてなど、異なるＭＨＣクラスＩ分子バリアントを有する同じ種の異なる個々の脊索動物において、治療的に有効であり得る。本発明のある特定の実施形態のこの能力により、単一の細胞標的化分子において、ＭＨＣクラスＩ分子の多様性及び多型性に基づいて、異なる対象の亜集団において異なる治療有効性を有する異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを組み合わせることが可能となり得る。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ分子、ＨＬＡタンパク質は、遺伝学的祖先、例えば、アフリカ人（サハラ以南）、アメリカンインディアン、コーカソイド、モンゴロイド、ニューギニア及びオーストラリア人、又は太平洋諸島系住民に基づいて、ヒトの間で異なる。
【０３８１】
ヒト集団の大部分が、ＣＭＶ抗原に反応するように抗原刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のセットを有し、生涯にわたり無症状を維持するように慢性的なＣＭＶ感染を絶えず抑制しているため、ＣＭＶ抗原由来の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む本発明の細胞標的化分子が、特に有用であり得る。加えて、高齢のヒトは、例えば、ＣＭＶに対してより焦点の定まっている可能性のある免疫監視、並びにより高齢のヒトにおけるＴ細胞抗原受容体レパートリー及び相対ＣＴＬレベルの組成によって示されるような、ＣＭＶに関する適応免疫系における加齢関連の変化により、ＣＭＶ  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープにさらにより迅速かつ強力に反応し得る（例えば、Koch S et al., Ann N Y Acad Sci 1114: 23-35 (2007)；Vescovini R et al., J Immunol 184: 3242-9 (2010)；Cicin-Sain L et al., J Immunol 187: 1722-32 (2011)；Fulop T et al., Front Immunol 4: 271 (2013)；Pawelec G, Exp Gerontol 54: 1-5 (2014)を参照）。
【０３８２】
本発明は、細胞を殺滅する方法であって、細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物は、細胞を、特許請求された物質の組成物の１つと接触させることにより、特定の細胞型を殺滅するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、異なる細胞型の混合物、例えばがん細胞、感染細胞、及び／又は血液系細胞を含む混合物などにおいて、特定の細胞型を殺滅するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、異なる細胞型の混合物において、がん細胞を殺滅するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、移植前組織など、異なる細胞型の混合物において、特定の細胞型を殺滅するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、治療目的の投与前の組織材料など、細胞型の混合物において、特定の細胞型を殺滅するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、ウイルス又は微生物に感染した細胞を選択的に殺滅するか、又はそれ以外の方法で、細胞表面生体分子などの特定の細胞外標的生体分子を発現する細胞を選択的に殺滅するのに使用することができる。本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物は、様々な用途を有し、このような用途としては、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで組織から不要な細胞型を枯渇させることにおける使用、抗ウイルス剤としての使用、抗寄生虫剤としての使用、及び移植組織から不要な細胞型を取り除くことにおける使用が挙げられる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物は、治療目的の投与前の組織材料、例えば、移植前の組織など、異なる細胞型の混合物において、特定の細胞型を殺滅するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、ウイルス又は微生物に感染した細胞を選択的に殺滅するか、又はそれ以外の方法で、細胞表面生体分子などの特定の細胞外標的生体分子を発現する細胞を選択的に殺滅するのに使用することができる。
【０３８３】
本発明は、細胞の殺滅を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、少なくとも１つの本発明の細胞標的化分子又はそれらの医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。本発明の志賀毒素エフェクターポリペプチド、又は細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物のある特定の実施形態は、感染細胞と物理的に結合していることが見出された細胞外生体分子を標的化することによって、患者において感染細胞を殺滅するのに使用することができる。
【０３８４】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又はその医薬組成物は、がん細胞又は腫瘍細胞と物理的に結合していることが見出された細胞外生体分子を標的化することによって、患者においてがん細胞を殺滅するのに使用することができる。用語「がん細胞」又は「がん性細胞」は、異常に促進された及び／又は無秩序な様式で増殖及び分裂する様々な新生物細胞を指し、これは、当業者には明らかであろう。用語「腫瘍細胞」は、悪性細胞及び非悪性細胞の両方を含む。一般的に、がん及び／又は腫瘍は、治療及び／又は予防を受ける余地のある疾患、障害、又は状態と定義することができる。本発明の方法及び組成物によって利益を得る可能性があるがん細胞及び／又は腫瘍細胞で構成されるがん及び腫瘍（悪性又は良性のいずれか）は、当業者には明らかであろう。新生物細胞は、無秩序な増殖、分化の欠如、局所的な組織浸潤、血管新生、及び転移の１つ又は２つ以上に関連することが多い。ある特定のがん細胞及び／又は腫瘍細胞を標的化する本発明の方法及び組成物によって利益を得る可能性があるがん及び／又は腫瘍（悪性又は良性のいずれか）の結果生じる疾患、障害、及び状態は、当業者には明らかであろう。
【０３８５】
本発明の細胞標的化分子及び組成物のある特定の実施形態は、一般的に分裂が遅く、化学療法及び放射線のようながん療法に対する耐性を有する、がん幹細胞、腫瘍幹細胞、前がん状態の発がん性細胞、及び腫瘍始原細胞を殺滅するのに使用することができる。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ，acute myeloid leukemia）は、本発明を用いて、ＡＭＬ幹細胞及び／又は休眠中のＡＭＬ前駆細胞を殺滅することにより治療することができる（例えばShlush L et al., Blood 120：603-12 (2012)を参照）。がん幹細胞はしばしば、細胞表面の標的、例えば、本発明の細胞標的化分子のある特定の実施形態のある特定の結合領域の標的となり得るＣＤ４４、ＣＤ２００、及び他の本明細書で列挙したものなどを過剰発現する（例えばKawasaki B et al., Biochem Biophys Res Commun 364：778-82 (2007)；Reim F et al., Cancer Res 69：8058-66 (2009)を参照）。
【０３８６】
志賀毒素Ａサブユニットベースの作用機序のために、本発明の物質の組成物は、例えば、化学療法、免疫療法、放射線、幹細胞移植、及び免疫チェックポイント阻害剤などの他の療法とそれらとの組合せを含む方法で、又は他の療法との補足的な様式で、並びに／又は化学療法抵抗性／放射線抵抗性及び／若しくは静止腫瘍細胞／腫瘍始原細胞／幹細胞に対して有効な方法で、より効果的に使用することができる。同様に、本発明の物質の組成物は、他の細胞標的化療法と組み合わせて、同じ疾患、障害、又は状態のための同じエピトープ以外のオーバーラップしない又は異なる標的を標的とすることを含む方法でより効果的に使用することができる。
【０３８７】
本発明の細胞標的化分子又はそれらの医薬組成物のある特定の実施形態は、免疫細胞と物理的に結合していることが見出された細胞外生体分子を標的化することによって、患者において免疫細胞（健常であるか又は悪性であるかにかかわらず）を殺滅するのに使用することができる。
【０３８８】
本発明の細胞標的化分子又はその医薬組成物を、細胞集団（例えば、骨髄）から悪性細胞及び／又は新生物細胞を取り除き、次いで、標的細胞を枯渇させた材料を、それを必要とする患者に再注入する目的で利用することは、本発明の範囲内である。
【０３８９】
加えて、本発明は、患者における疾患、障害、又は状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物の少なくとも１つの治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。この方法を使用して治療され得る予期される疾患、障害、及び状態としては、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染が挙げられる。「治療上有効な投薬量」の本発明の組成物の投与は、疾患の症状の重症度における減少、疾患の無症状期間の頻度及び持続時間における増加、又は疾患の苦痛による欠陥又は能力障害の予防をもたらすことができる。
【０３９０】
本発明の組成物の治療有効量は、投与経路、治療する対象のタイプ、及び検討中の具体的な患者の身体的特徴に依存すると予想される。この量を決定するためのこれらの要因及びそれらの関係は、医療分野における熟練した技術者に周知である。この量及び投与方法は、最適な効能を達成するために調整することができ、体重、食事、並行する薬物療法のような要因、及び医療分野における当業者に周知の他の要因に依存する可能性がある。ヒトでの使用に最も適切な投薬の程度及び用量レジメンは、本発明により得られた結果によって導かれてもよいし、適切に設計された臨床試験で確認されてもよい。有効な投薬量及び治療プロトコールは、実験動物で低い用量から開始して、次いで作用をモニターしながら投薬量を増加させ、同様に投薬レジメンを系統的に変化させる従来の手段によって決定することができる。所与の対象にとって最適な投薬量を決定するときに、臨床医は多数の要因を考慮に入れることができる。このような考慮は、当業者公知である。
【０３９１】
許容できる投与経路は、これらに限定されないが、エアロゾル、経腸、経鼻、経眼、経口、非経口、直腸、経膣、又は経皮（例えばクリーム剤、ゲル剤若しくは軟膏剤の局所投与、又は経皮パッチ剤による）を含む、当業界において公知のあらゆる投与経路を指す場合もある。「非経口投与」は、典型的には意図される作用部位への、又はそれと連通する部位への注射に関連し、眼窩下、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹膜内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、又は経気管投与が挙げられる。
【０３９２】
本発明の医薬組成物を投与するために、投薬量範囲は、一般的に、対象の体重１キログラム当たり約０．００１〜１０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）及びそれより多く、通常は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇである。例示的な投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０７ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．０９ｍｇ若しくは体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的な治療計画は、１日１回若しくは２回の投与、又は週１回若しくは２回の投与、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、月１回、２若しくは３ヶ月ごとに１回、又は３〜６ヶ月ごとに１回である。特定の患者ごとに治療上の利益を最大化するために、必要に応じて、投薬量は、熟練した健康管理の専門家により選択され再調整されてもよい。
【０３９３】
本発明の医薬組成物は、典型的には同じ患者に複数回投与されると予想される。単回投薬間のインターバルは、例えば２〜５日おき、１週間おき、１ヶ月おき、２若しくは３ヶ月おき、６ヶ月おき、又は１年おきであってもよい。また投与間のインターバルは、対象又は患者中の血中レベル又は他のマーカーの調節に基づき不規則であってもよい。本発明の組成物のための投薬レジメンは、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり３ｍｇの静脈内投与で、２〜４週間ごとに６回の投薬で組成物を投与すること、次いで３ヶ月ごとに体重１ｋｇ当たり３ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり１ｍｇ投与することを含む。
【０３９４】
本発明の医薬組成物は、１つ又は２つ以上の投与経路を介して、当業界において公知の様々な方法の１つ又は２つ以上を使用して投与してもよい。熟練した作業者であれば理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて様々であろう。本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び診断用組成物のための投与経路としては、例えば静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路が挙げられ、例えば注射又は注入による投与経路である。他の実施形態に関して、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び診断用組成物は、非経口以外の経路によって投与されてもよく、例えば、局所、表皮、又は粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸内、舌下、又は局所などによって投与されてもよい。
【０３９５】
本発明の治療用細胞標的化分子又はその医薬組成物は、当技術分野において公知の様々な医療用デバイスの１つ又は２つ以上を用いて投与されてもよい。例えば、一実施形態において、本発明の医薬組成物は、無針の皮下注射デバイスを用いて投与されてもよい。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、当業界において、例えば、制御された速度での送達のための移植可能なマイクロ注入ポンプ；経皮投与するためのデバイス；正確な注入速度で送達するための注入ポンプ；連続的な薬物送達のための可変流量の移植可能な注入デバイス；及び浸透性薬物送達システムなどが挙げられる。これらの及び他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールは、当業者公知である。
【０３９６】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物は、単独で、又は他の化合物若しくは医薬組成物と組み合わせて、治療を必要とする患者などの対象において、インビトロ又はインビボで細胞集団に投与した場合に強力な細胞殺滅活性を示すことができる。特定の細胞型に対する高親和性結合領域を使用して、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴと会合した志賀毒素エフェクターポリペプチドの送達を標的化することによって、志賀毒素エフェクター及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ提示に媒介される細胞殺滅活性を、生物内のある特定の細胞型、例えば、ある特定のがん細胞、新生物細胞、悪性細胞、非悪性腫瘍細胞、又は感染細胞などを特異的及び選択的に殺滅するように限定することができる。
【０３９７】
本発明の細胞標的化分子、又はその医薬組成物は、単独で、又は１つ又は２つ以上の他の治療剤又は診断剤と組み合わせて投与されてもよい。併用療法は、治療しようとする特定の患者、疾患又は状態に基づき選択される少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせた、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物を含んでいてもよい。他のこのような薬剤の例としては、とりわけ、細胞毒性剤、抗がん剤又は化学療法剤、抗炎症剤又は増殖抑制剤、抗微生物剤又は抗ウイルス剤、増殖因子、サイトカイン、鎮痛薬、治療活性を有する小分子又はポリペプチド、一本鎖抗体、古典的な抗体又はそれらの断片、又は１つ又は２つ以上のシグナル伝達経路をモジュレートする核酸分子、及び治療的又は防止的処置レジメンを補うか又はそれ以外の方法で有益な可能性がある類似のモジュレートする治療的分子が挙げられる。
【０３９８】
本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物での患者の治療は、好ましくは、標的化された細胞の細胞死及び／又は標的化された細胞の増殖の阻害を引き起こす。そのようなものとして、本発明の細胞標的化分子、及びそれらを含む医薬組成物は、とりわけ、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び感染細胞などの、標的細胞を殺滅すること又は枯渇させることが有益であり得る様々な病理学的障害を治療するための方法において有用であろう。本発明は、ある特定の細胞型の新形成及び／又は望ましくない増殖を含む、細胞増殖の抑制及び細胞障害の治療のための方法を提供する。
【０３９９】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物を使用して、がん、腫瘍（悪性及び良性）、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染を治療又は予防することができる。さらなる態様において、上記したエクスビボの方法を上記したインビボの方法と組み合わせて、骨髄移植レシピエントにおける拒絶を治療又は予防する、及び免疫寛容を達成するための方法を提供することができる。
【０４００】
本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物は、一般的には抗新生物剤であり、それらが、増殖を阻害すること及び／又はがん若しくは腫瘍細胞の死滅を引き起こすことによって新生物又は悪性細胞の発症、成熟、又は蔓延を治療及び／又は予防することができることを意味する。ある特定の実施形態において、本発明は、例えばヒトなどの哺乳動物対象における悪性腫瘍又は新生物及び他の血液細胞関連のがんを治療するための方法であって、それらを必要とする対象に、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０４０１】
別の態様において、本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物のある特定の実施形態は、抗微生物剤であり、それらが、微生物学的な病原性感染、例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は原生動物によって引き起こされる感染などの獲得、発症、又は結果を治療及び／又は予防することができることを意味する。
【０４０２】
本発明の細胞標的化分子及び／又は医薬組成物は、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物の治療有効量をそれらを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法に利用することができる。本発明の方法のある特定の実施形態において、治療されるがんは、骨がん（例えば多発性骨髄腫又はユーイング肉腫）、乳がん、中枢／末梢神経系がん（例えば脳腫瘍、神経線維腫症、又は膠芽腫）、消化器がん（例えば胃がん又は結腸直腸がん）、生殖細胞がん（例えば卵巣がん及び睾丸がん）、腺がん（例えば膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん）、頭頸部がん（例えば鼻咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん）、血液がん（例えば白血病、リンパ腫、又は骨髄腫）、腎臓から尿道のがん（例えば腎臓がん及び膀胱がん）、肝臓がん、肺／胸膜がん（例えば中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌）、前立腺がん、肉腫（例えば血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫）、皮膚がん（例えば基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫）、及び子宮がんからなる群から選択される。
【０４０３】
本発明の細胞標的化分子及び医薬組成物は、本発明の細胞標的化分子又は医薬組成物の治療有効量を、それらを必要とする患者に投与することを含む、免疫障害を治療する方法に利用することができる。本発明の方法のある特定の実施形態において、免疫障害は、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、心臓発生（cardiogenesis）、クローン病、糖尿病、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、リンパ増殖性障害、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎症、結節性多発性動脈炎、多発関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、脈管炎からなる群から選択される疾患と関連する炎症と関連している。
【０４０４】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の細胞標的化分子を、がん、腫瘍、他の増殖異常、免疫障害、及び／又は微生物感染を治療又は予防するための医薬組成物又は医薬品の成分として使用することが挙げられる。例えば、患者の皮膚上に現れる免疫障害は、炎症を低減させるために、このような医薬品で治療されてもよい。別の例において、皮膚腫瘍は、腫瘍サイズを低減する又は腫瘍を完全に除去するために、このような医薬品で治療されてもよい。
【０４０５】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を、疾患、状態、及び／又は障害に関する情報収集の目的で、使用する方法が挙げられる。例えば、本発明の細胞標的化分子は、ある特定のｐＭＨＣ  Ｉに特異的な抗体を使用して、腫瘍細胞によるｐＭＨＣ  Ｉ提示をイメージングするために使用してもよい。本発明の細胞標的化分子で処置した後にこのような標識された標的細胞を検出することにより、抗原プロセシング及びＭＨＣクラスＩ提示に対する標的化細胞型の適格性に関する読取り値、並びに本発明の細胞標的化分子の診断用バリアントからの読取り値と組み合わせた場合には標的細胞集団中のこのような適格性の標的細胞の割合を得ることができる。
【０４０６】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、疾患、状態及び／又は障害に関する情報収集の目的で細胞型の存在を検出するために、本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を使用する方法が挙げられる。本方法は、アッセイ又は診断技術によって分子を検出するために、細胞を、診断上十分な量の本発明の細胞標的化分子と接触させることを含む。成句「診断上十分な量」は、利用される特定のアッセイ又は診断技術による情報収集目的にとって十分な検出及び正確な測定をもたらす量を指す。一般的に、生物全体のインビボの診断的使用にとって診断上十分な量は、対象ごとに対象１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇの検出促進剤が連結された本発明の細胞標的化分子の非累積な用量であろう。典型的には、これらの情報収集方法で使用される本発明の細胞標的化分子の量は、それでもなお診断上十分な量であるという条件で、できる限り低いであろう。例えば、インビボにおける生物中での検出の場合、対象に投与される本発明の細胞標的化分子又は診断用組成物の量は、実現可能な限り低いであろう。
【０４０７】
検出促進剤と組み合わせた本発明の細胞標的化分子の細胞型特異的な標的化は、本発明の分子の結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞を検出及びイメージングする方法を提供する。或いは、細胞標的化分子により送達された異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示は、本発明の細胞標的化分子を内在化した細胞を検出及びイメージングする手段を提供し得る。本発明の細胞標的化分子及び診断用組成物を使用して細胞をイメージングすることは、当技術分野において公知のあらゆる好適な技術によって、インビトロ又はインビボで実行することができる。診断情報は、生物の全身イメージングを含む当業界において公知の様々な方法を使用して、又は生物から採取したエクスビボの試料を使用して収集することができる。本明細書において使用される用語「試料」は、これらに限定されないが、例えば血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門分泌物、膣分泌物、及び精液などの流体、並びに生検手順により得られた組織などの多数の物を指す。例えば、様々な検出促進剤は、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学的方法（例えば直接、蛍光、及び生物発光イメージング）、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、超音波、Ｘ線コンピュータ断層撮影、及び上述のものの組合せなどの技術による、非侵襲的なインビボでの腫瘍イメージングに利用することができる（総論に関して、Kaur S et al., Cancer Lett 315：97-111 (2012)を参照）。
【０４０８】
本発明のある特定の実施形態のなかでも、新生物細胞及び／又は免疫細胞型の内部を標識又は検出するために本発明の細胞標的化分子、医薬組成物、及び／又は診断用組成物を使用する方法が挙げられる（例えば、Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13: 2936-45 (2007)；Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72 (2009)；Yang L et al., Small 5: 235-43 (2009)を参照）。これは、特定の細胞型の内部区画が検出のために標識されるように、本発明のある特定の細胞標的化分子が、特定の細胞型に入り、逆行性細胞内輸送を介して、細胞内での経路を特定の細胞内区画に決定する能力に基づき得る。これは、インサイチュで患者の細胞に実行してもよいし、又は生物から取り出された細胞及び組織、例えば生検材料にインビトロで実行してもよい。
【０４０９】
本発明の診断用組成物を使用して、本発明の関連する医薬組成物によって治療できる可能性があるとして疾患、障害、又は状態を特徴付けることができる。本発明のある特定の物質の組成物を使用して、患者が、本明細書に記載される本発明の細胞標的化分子、又はその組成物、又は本発明の関連する方法を利用する治療戦略に応答するグループに属するかどうか、又は本発明の送達デバイスを使用するのによく適しているかどうかを決定することができる。
【０４１０】
本発明の診断用組成物は、疾患、例えばがんをよりよく特徴付けるために、例えば遠隔転移、不均質性、及びがん進行のステージをモニターするために、それが検出された後に使用してもよい。疾患、障害又は感染の表現型の評価は、治療の意思決定中の予後及び予測を助けることができる。疾患再発において、ある特定の本発明の方法を使用して、それが局所か又は全身の問題かを決定することができる。
【０４１１】
本発明の診断用組成物は、例えば低分子薬物、生物学的な薬物、又は細胞ベースの療法などの治療のタイプを問わず、治療に対する応答をアセスメントするのに使用することができる。例えば、本発明の診断用組成物のある特定の実施形態は、腫瘍サイズの変化、抗原陽性細胞集団の数及び分布などの変化を測定すること、又はすでに患者に施された療法によって標的化された抗原とは異なるマーカーをモニターすることに使用することができる（Smith-Jones P et al., Nat. Biotechnol 22：701-6 (2004)；Evans M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108：9578-82 (2011)を参照）。
【０４１２】
本発明の診断用組成物は、標的細胞型においてＭＨＣクラスＩ系の機能性を評価するために使用してもよい。例えば、感染細胞、腫瘍細胞、又はがん細胞などのある特定の悪性細胞は、それらのＭＨＣクラスＩ提示経路に変更、欠損、及び混乱を呈し得る。これは、インビトロ又はインビボで研究することができる。本発明の診断用組成物は、生物内の標的細胞集団における個々の細胞間でのＭＨＣクラスＩ提示における変化をモニターするのに使用することができるか、又は生物、腫瘍生検などにおけるＭＨＣクラスＩ提示が欠損した標的細胞の割合を計数若しくは判定するのに使用することができる。
【０４１３】
細胞型の存在を検出するのに使用される方法のある特定の実施形態は、例えば、骨がん（例えば多発性骨髄腫又はユーイング肉腫）、乳がん、中枢／末梢神経系がん（例えば脳腫瘍、神経線維腫症、又は膠芽腫）、消化器がん（例えば胃がん又は結腸直腸がん）、生殖細胞がん（例えば卵巣がん及び睾丸がん、腺がん（例えば膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん）、頭頸部がん（例えば鼻咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん）、血液がん（例えば白血病、リンパ腫、又は骨髄腫）、腎臓から尿道のがん（例えば腎臓がん及び膀胱がん）、肝臓がん、肺／胸膜がん（例えば中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌）、前立腺がん、肉腫（例えば血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫）、皮膚がん（例えば基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫）、子宮がん、ＡＩＤＳ、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、心臓発生、クローン病、糖尿病、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、リンパ増殖性障害、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎症、結節性多発性動脈炎、多発関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、脈管炎、細胞増殖、炎症、白血球活性化、白血球接着、白血球走化性、白血球成熟、白血球遊走、ニューロンの分化、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ，acute lymphoblastic leukemia）、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病／リンパ腫（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ，acute myeloid leukemia）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ，B-cell chronic lymphocytic leukemia）、Ｂ細胞性前リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫（ＢＬ，Burkitt's lymphoma）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ，chronic lymphocytic leukemia）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ−ＢＰ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ，chronic myeloid leukemia）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ，hairy cell leukemia）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ，Hodgkin's Lymphoma）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ形質細胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ，multiple myeloma）、ナチュラルキラー細胞白血病、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ，Non-Hodgkin's lymphoma）、プラズマ細胞性白血病、形質細胞腫、原発性滲出液リンパ腫、前リンパ球性白血病、前骨髄球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ，T-cell lymphoma）、重鎖病、単クローン性免疫グロブリン血症、単クローン性免疫グロブリン沈着症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ，myelodusplastic syndromes）、くすぶり型多発性骨髄腫、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症などの疾患、障害、及び状態に関する情報を収集するのに使用することができる。
【０４１４】
ある特定の実施形態において、本発明の細胞標的化分子、又はそれらの医薬組成物は、診断及び治療の両方に、又は診断単独に使用される。いくつかの状況において、治療で使用するための本発明の細胞標的化分子を選択する前に、対象及び／又は例えば治療が必要な患者などの対象からの罹患した組織で発現されるＨＬＡバリアント及び／又はＨＬＡ対立遺伝子を決定又は検証することが望ましい。一部の状況において、個々の対象に関して、どの細胞標的化分子又はその組成物を本発明の方法において使用するかを選択する前に、ある特定のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの免疫原性を判定することが望ましいであろう。
【０４１５】
本発明は、前述の構造及び機能、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの送達を特定の細胞に細胞外標的化する機能、及びそれに続く細胞表面上での提示のためのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩ経路への細胞内送達の機能を含む、細胞標的化分子の非限定的な例によってさらに例証される。
［実施例］
【０４１６】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示す。しかしながら、これらの実施例は、例示目的のものに過ぎず、本発明の条件及び範囲に関して完全に決定的であることを意図するものでもそのように見なすものでもないことを理解されたい。以下の実施例における実験は、詳細に別途記載されている場合を除き、当業者にとって周知であり、慣例的である、標準的な技法を使用して実行した。
【０４１７】
細胞標的化志賀毒素エフェクターポリペプチドは、標的細胞による提示のために、免疫原性エピトープ−ペプチドを送達するように改変することができる。これらの細胞標的化ポリペプチドは、エピトープの標的化送達を提供し、脊索動物において細胞型に特異的な免疫刺激性エピトープの提示を伴う用途で使用することができる。脊索動物におけるＭＨＣクラスＩ系によるＴ細胞免疫原性エピトープの提示は、ＣＤ８＋ＣＴＬ媒介性溶解による殺滅の標的をエピトープ提示細胞とし、その近傍において他の免疫応答も刺激することができる。
【０４１８】
実施例において、Ｔ細胞抗原を、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチドを含む細胞標的化分子に融合させた。これらの融合ポリペプチドはすべて、開始ポリペプチド足場への少なくとも１つのペプチドの付加を伴い、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の内部にいずれかの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを埋め込むことも挿入することも必要としない。したがって、本発明のある特定の例示的な細胞標的化分子において、志賀毒素エフェクターポリペプチド領域は、完全に野生型の志賀毒素ポリペプチドからなる。
【０４１９】
以下の実施例では、それぞれが免疫グロブリン型結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び融合型異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む、本発明の例示的な細胞標的化タンパク質について説明する。本発明の例示的な細胞標的化分子は、標的化された細胞型によって発現される標的生体分子に結合し、標的化された細胞に入った。内在化された本発明の例示的な細胞標的化タンパク質は、それらの志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の経路をサイトゾルへと効率的に決定し、標的細胞を殺滅させた。例示的な細胞標的化タンパク質は、標的細胞内で、その融合型Ｔ細胞エピトープ−ペプチドをＭＨＣクラスＩ経路に送達し、標的細胞の表面上でのＴ細胞エピトープ−ペプチドの提示をもたらした。標的による送達されたＴ細胞エピトープの提示は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞に、エピトープを提示している標的細胞を殺滅するように、並びにエピトープ提示標的細胞の近傍において他の免疫応答を刺激するように、シグナルを伝達し得る。
【実施例１】
【０４２０】
志賀毒素Ａサブユニット由来のポリペプチド領域及び融合型Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む細胞標的化分子
細胞標的化分子を作製し、試験した。細胞標的化分子は、それぞれ、１）細胞標的化結合領域、２）志賀毒素エフェクターポリペプチド領域、及び３）Ｔ細胞エピトープ−ペプチド領域を含む。これまでにも、志賀毒素Ａサブユニット由来の細胞標的化分子が構築されており、細胞内在化を促進し、サイトゾルへの細胞内経路決定を指示することが示されている（例えば、国際公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、同第２０１４／１６４６９３号パンフレット、同第２０１５／１３８４３５号パンフレット、同第２０１５／１３８４５２号パンフレット、同第２０１５／１１３００５号パンフレット、同第２０１５／１１３００７号パンフレット、及び同第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）。新規な細胞標的化分子を作製するために、これらの志賀毒素Ａサブユニット由来の細胞標的化分子のモジュールポリペプチド成分に、Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを融合させた。
【０４２１】
この実施例において以下に示されるように、本発明のいくつかの細胞標的化タンパク質は、外来的に投与した場合に、標的化されたヒトがん細胞による提示のために異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドをＭＨＣクラスＩ経路に送達することが可能であった。本発明のある特定の細胞標的化タンパク質は、それらの志賀毒素エフェクターポリペプチド領域により、標的化されたヒトがん細胞を特異的に殺滅することが可能であったこともまた、この実施例において以下に示されている。この実施例の本発明の例示的な細胞標的化タンパク質の細胞標的化結合領域は、それぞれ、特定の細胞型の表面に物理的に結合している細胞外標的生体分子に対する高親和性結合を呈することが可能であった。この実施例の本発明の例示的な細胞標的化タンパク質は、それらの細胞標的化結合領域の標的生体分子を発現する細胞を選択的に標的化し、これらの標的細胞に内在化することが可能である。
【０４２２】
Ｉ．細胞標的化分子のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ成分
この実施例では、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に対して免疫原性であることが公知のエピトープ−ペプチドを、志賀毒素由来の細胞標的化タンパク質への融合に選択した。具体的には、免疫原性エピトープ−ペプチドを、ヒトに感染するウイルスのウイルスタンパク質から選択し、これらのＴ細胞エピトープ−ペプチドを、小胞体を介してサイトゾルに細胞内経路決定する本質的な能力を有する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化タンパク質に融合させた。
【０４２３】
この実施例のウイルス免疫原性Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、それらの、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合し、それによってヒトＣＴＬ媒介性免疫応答を誘起する能力に基づいて選択した。ヒトインフルエンザＡ型ウイルス及びヒトＣＭＶウイルスなどのヒトウイルスに由来する公知の免疫原性ウイルスタンパク質及びウイルスタンパク質のペプチド成分が、多数存在する。免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ，Immune Epitope Database）分析リソースＭＨＣ−Ｉ結合予測コンセンサスツール及び推奨されるパラメーター（Kim Y et al., Nucleic Acids Res 40: W252-30 (2012)）を使用して、ヒト集団により多く見られる対立遺伝子によりコードされる共通のヒトＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ，human leukocyte antigen）バリアントへの結合の能力に関して、７種類のウイルスエピトープ−ペプチド（配列番号４〜１２）をスコア付けした。ＩＥＤＢ  ＭＨＣ−Ｉ結合予測分析コンセンサスツールにより「ＡＮＮ親和性」が予測され、これは、入力されたペプチドと選択されたヒトＨＬＡバリアントとの間の推定される結合親和性であり、５０ナノモル（ｎＭ）未満のＩＣ５０値が高親和性とみなされ、５０〜５００ｎＭのＩＣ５０値が中等度の親和性とみなされ、５００〜５０００ｎＭのＩＣ５０値が低親和性とみなされる。ＩＥＤＢ  ＭＨＣ−Ｉ結合予測分析は、親和性が高い結合物質ほど、パーセンタイル順位が低いことを示した。表１は、コンピュータで試験した、ある特定のヒトＨＬＡバリアントに結合する７種類のＴ細胞エピトープ−ペプチド（配列番号４〜１２）の、ＩＥＤＢ  ＭＨＣ−Ｉ結合予測分析のパーセンタイル順位及び予測された結合親和性を示す。
【０４２４】
【表３】
2018524006.tif 000005
【０４２５】
ＩＥＤＢ  ＭＨＣ−Ｉ結合予測分析の結果は、一部のペプチドは少なくとも１つのヒトＭＨＣクラスＩ分子に対して高親和性で結合することが予測された一方で、他のペプチドは分析したヒトＭＨＣクラスＩ分子に対してより軽度の親和性で結合することが予測されたことを示す。
【０４２６】
II．志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド領域及び融合型Ｔ細胞エピトープ−ペプチド領域を含む細胞標的化融合タンパク質の作製
この実施例の例示的な細胞標的化融合タンパク質は、それぞれ、細胞標的化結合領域ポリペプチド、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、タンパク質性リンカー、及び表１のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含んでいた。
【０４２７】
当技術分野で公知の技術を使用して、タンパク質性リンカーによって分離される１）志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及び２）細胞標的化結合領域ポリペプチドを含む親細胞標的化タンパク質のポリペプチド成分のアミノ末端（Ｎ末端）又はカルボキシ末端（Ｃ末端）に、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを遺伝子融合することによって、例示的な細胞標的化融合タンパク質を作製した。融合したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、一般的にヒトに感染するウイルスを起源とするいくつかのＴ細胞エピトープ−ペプチドの中から選択した（表１を参照）。この実施例の結果として得られた細胞標的化融合タンパク質は、それぞれが、細胞標的化結合領域ポリペプチド、志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、及び融合型異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む単一の連続するポリペプチドを含むように構築した。
【０４２８】
この実施例において産生し、試験した本発明の細胞標的化分子には、次のものが含まれた：Ｃ２：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２（配列番号５０）、「不活性Ｃ２：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２」（配列番号５１）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２（配列番号５２）、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）、Ｆ２：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２（配列番号５４）、ｓｃＦｖ３：：Ｆ２：：ＳＬＴ−１Ａ（配列番号５５）、ｓｃＦｖ４：：Ｆ２：：ＳＬＴ−１Ａ（配列番号５６）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５：：Ｃ２（配列番号５７）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６：：Ｆ２（配列番号５８）、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６：：Ｆ２」（配列番号５９）、及びＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７：：Ｃ２（配列番号６０）。この実施例において試験した他の本発明の細胞標的化分子には、次のものが含まれた：Ｃ１：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号１３に類似）、Ｃ１−２：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号１４に類似）、Ｃ３：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号１５に類似）、Ｃ２４：：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号１６に類似）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ１（配列番号２１に類似）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２４−２（配列番号２３に類似）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｅ２（配列番号２４に類似）、及びＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｆ３（配列番号２５に類似）。本発明のこれらの例示的な細胞標的化分子は、それぞれ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む細胞標的化結合領域、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド、及び結合領域又は志賀毒素エフェクターポリペプチドのいずれかに融合されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含んでいた。
【０４２９】
この実施例の細胞標的化分子の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域はすべて、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）のアミノ酸１〜２５１からなるか又はそれに由来しており、そのうちいくつかは、野生型志賀毒素Ａサブユニットと比べて、例えば、触媒ドメイン不活性化置換Ｅ１６７Ｄ、Ｃ２４２Ｓ、及び／又はフーリン切断耐性をもたらす置換Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａ（例えば、国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレットを参照）など、２つ又は３つ以上のアミノ酸残基置換を含有していた。この実施例で使用される場合、細胞標的化分子の命名「不活性」は、Ｅ１６７Ｄ置換を有する志賀毒素エフェクターポリペプチド成分のみを含む分子を指す。
【０４３０】
免疫グロブリン型結合領域ｓｃＦｖ１、ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ５、ｓｃＦｖ６、及びｓｃＦｖ７は、それぞれ、ある特定のヒトがん細胞の表面に物理的に結合している、ある特定の細胞表面の標的生体分子に高親和性で結合した一本鎖可変断片である。ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２の両方は、同じ細胞外標的生体分子に高い親和性及び特異性で結合する。
【０４３１】
この実施例の実験において試験した細胞標的化分子は、参照細胞標的化分子（例えば、配列番号６３〜７０）を含め、すべて、細菌系において産生され、熟練した作業者に公知の技術を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製された。
【０４３２】
III．結合領域及びＴ細胞エピトープ−ペプチドの融合後の志賀毒素機能の保持に関する、細胞標的化分子の志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド成分の試験
例示的な細胞標的化タンパク質を、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドの融合後に、志賀毒素Ａサブユニットエフェクター機能の保持に関して試験した。分析した志賀毒素Ａサブユニットエフェクター機能は、触媒作用による真核生物リボソームの不活性化、細胞毒性、及び推論としてサイトゾルへの細胞内経路決定の自己指示であった。少なくとも７種類の本発明の例示的な細胞標的化タンパク質が、いずれの異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチド又は追加のポリペプチド部分にも融合されていない野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと同程度の触媒活性を呈した。
【０４３３】
Ａ．本発明の例示的な細胞標的化分子のリボソーム阻害能力の試験
本発明の細胞標的化分子の志賀毒素Ａサブユニット由来の志賀毒素エフェクターポリペプチド領域の触媒活性を、リボソーム阻害アッセイを使用して試験した。
【０４３４】
TNT（登録商標）Quick Coupled Transcription/Translation Kit（L1170 Promega社、Madison、WI、U.S.）を使用して、無細胞インビトロタンパク質翻訳アッセイを使用して、この実施例の例示的な細胞標的化タンパク質のリボソーム不活性化能力を判定した。このキットは、Luciferase T7 Control DNA（L4821 Promega社、Madison、WI、U.S.）及びTNT（登録商標）Quick Master Mixを含む。リボソーム活性反応物を、製造業者の指示書に従って調製した。試験する志賀毒素由来の細胞標的化タンパク質の１０倍希釈系列を、適切な緩衝液中に調製し、各希釈物に対して、同一のTNT反応混合成分系列を作製した。希釈系列中の各試料を、Luciferase T7 Control DNAとともにTNT反応混合物のそれぞれと合わせた。被験試料を、摂氏３０度（℃）で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、Luciferase Assay Reagent（E1483 Promega、Madison、WI、U.S.）をすべての被験試料に添加し、ルシフェラーゼタンパク質翻訳量を、製造業者の指示書に従って発光により測定した。
【０４３５】
翻訳阻害レベルを、相対発光単位に対する総タンパク質の対数変換した濃度の非線形回帰分析によって判定した。統計ソフトウェア（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.）を使用して、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値を、用量応答阻害の項目でPrismソフトウェアのｌｏｇ（阻害剤）対応答（３パラメーター）の関数［Ｙ＝最低値＋（（最高値−最低値）／（１＋１０＾（Ｘ−Ｌｏｇ  ＩＣ５０）））］を使用して、各試料に関して計算した。１回又は２回以上の実験によりそれぞれの志賀毒素由来の細胞標的化タンパク質のＩＣ５０値を計算したが、これを、ピコモル（ｐＭ）単位で表２に示す。野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ（配列番号６２））を含む陽性対照分子の１０倍以内のＩＣ５０を呈した本発明の例示的な細胞標的化分子は、本明細書において、野生型と同程度のリボソーム阻害活性を呈すると見なす。
【０４３６】
【表４】
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【０４３７】
表２に示されるように、例示的な細胞標的化タンパク質は、陽性対照：１）野生型志賀毒素Ａサブユニットポリペプチド配列のみを含む「ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴのみ」ポリペプチド（配列番号６２）、及び２）ｓｃＦｖ結合領域に融合されているが、いずれの融合型異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まないＳＬＴ−１Ａ由来の志賀毒素エフェクターポリペプチド、例えば、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号６３）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２（配列番号６４）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５（配列番号６６）、又はＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６（配列番号６７）を含む細胞標的化タンパク質と同程度の強力なリボソーム阻害を呈した。
【０４３８】
Ｂ．本発明の例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性の試験
本発明の例示的な細胞標的化分子の細胞毒性活性を、組織培養細胞ベースの毒性アッセイを使用して測定した。同種細胞集団において細胞の半数を殺滅する、外来的に投与される細胞標的化分子の濃度（最大半量細胞毒性濃度）を、本発明のある特定の細胞標的化分子に関して判定した。それぞれの細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子に関して、標的生体分子陽性細胞又は標的生体分子陰性細胞のいずれかを含む細胞殺滅アッセイを使用して、例示的な細胞標的化分子の細胞毒性を試験した。
【０４３９】
細胞殺滅アッセイは、次のように行った。ヒト腫瘍細胞株の細胞を、３８４ウェルプレートにおいて、２０μＬの細胞培養培地中に播種した（典型的には、付着細胞については１ウェル当たり２×１０３個の細胞で、タンパク質添加の前日に播種し、又は懸濁細胞については1ウェル当たり７．５×１０３個の細胞で、タンパク質添加と同日に播種した）。試験しようとするタンパク質の１０倍希釈系列を、適切な緩衝液中に調製し、５μＬの希釈物又は陰性対照としては緩衝液のみを、細胞に添加した。細胞培養培地のみを含む対照ウェルを、ベースライン補正として使用した。細胞試料を、タンパク質又は緩衝液のみとともに、３７℃で３又は５日間、５％二酸化炭素（ＣＯ２）雰囲気下においてインキュベートした。全細胞生存又は生存率パーセントを、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（G7573、Promega社、Madison、WI、U.S.）を製造業者の使用説明書に従って使用し、相対発光単位（ＲＬＵ）で測定される発光読取り値を使用して判定した。
【０４４０】
実験ウェルの生存率パーセントを、以下の等式を使用して計算した：（試験ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）／（平均細胞ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）×１００。生存率パーセントに対するタンパク質濃度の対数を、Prism（GraphPad Prism、San Diego、CA、U.S.）においてプロットし、ｌｏｇ（阻害剤）対応答（３パラメーター）の分析を使用して、試験したタンパク質の最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）値を判定した。可能な場合は、試験したそれぞれの例示的な細胞標的化タンパク質についてＣＤ５０値を計算した。
【０４４１】
細胞標的化分子の結合領域の標的生体分子を有意な量で発現する細胞（標的陽性細胞）に対する細胞殺滅活性を、任意の細胞表面に物理的に結合されている細胞標的化分子の結合領域のいかなる標的生体分子のいかなる有意な量でも示さない細胞（標的陰性細胞）に対する細胞殺滅活性と比較することによって、所与の細胞標的化分子の細胞毒性活性の特異性を判定した。これは、分析されている細胞標的化分子の標的生体分子の細胞表面発現が陽性であった細胞集団に対する本発明の所与の細胞標的化分子の最大半量細胞毒性濃度を判定し、次いで、同じ細胞標的化分子の濃度範囲を使用して、細胞標的化分子の標的生体分子の細胞表面発現が陰性であった細胞集団に対する最大半量細胞毒性濃度の判定を試みることによって、達成した。一部の実験において、最大量の志賀毒素を含有する分子で処置した標的陰性細胞は、「緩衝液のみ」の陰性対照と比較して、生存率にいかなる変化も示さなかった。
【０４４２】
上述の細胞殺滅アッセイを使用して試験した様々な分子の細胞毒性活性レベルを、表３に報告する。表３に報告されるように、このアッセイにおいて試験した本発明の例示的な細胞標的化タンパク質は、強力な細胞毒性を呈した。異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを志賀毒素由来の細胞標的化タンパク質に融合することにより、細胞毒性に変化が生じることはない可能性があるが、一部の例示的な細胞標的化タンパク質は、いずれの融合型異種エピトープ−ペプチドも含まない、由来元である親タンパク質と比較して、低減された細胞毒性を呈した（表３）。実施例において報告されるように、参照分子の測定されたＣＤ５０値の１０倍以内のＣＤ５０値を呈する分子は、その参照分子のものと同程度の細胞毒性活性を呈するとみなす。具体的には、標的陽性細胞集団に対して、同じ結合領域及び野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド（例えば、ＳＬＴ−１Ａ−ＷＴ（配列番号６２））を含むがいずれの融合型異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まない参照細胞標的化分子の同じ細胞型に対するＣＤ５０値の１０倍以内のＣＤ５０値を呈する本発明のいずれの例示的な細胞標的化分子も、本明細書において、「野生型と同程度である」と称される。標的陽性細胞集団に対して、同じ結合領域及び同じ志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むが、いずれの融合型異種Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含まない参照分子の１０倍から１００倍以内のＣＤ５０値を呈した細胞標的化分子は、本明細書において、活性であるが「減弱化された」と称される。
【０４４３】
【表５】
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2018524006.tif 000009
【０４４４】
試験した例示的な細胞標的化タンパク質はすべて、標的陽性細胞を強力に殺滅させたが（表３）、同じ投薬量において、標的陰性細胞を同程度の割合で殺滅させることはなかった（例えば、図２及び３を参照）。図２及び３は、例示的な細胞標的化タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）の特異的細胞毒性が、標的を発現する細胞に対してのみ特異的であり（図２）、標的陰性細胞に対しては試験した濃度範囲全体で特異的ではなかった（図３）ことを示す図である。標的陰性細胞に対する細胞標的化タンパク質のＣＤ５０値は、試験した細胞標的化タンパク質の濃度範囲からは計算できなかったが、これは、試験した最も高い濃度において、細胞生存率に相当な減少が存在しない場合には正確な曲線が生成できないためであった（例えば、図３を参照）。
【０４４５】
IV．エピトープ−ペプチドの送達及び標的細胞表面での送達されたエピトープ−ペプチドの提示の試験
Ｔ細胞エピトープの送達の成功は、特定の細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子／エピトープ複合体（ｐＭＨＣ  Ｉ）を検出することによって判定することができる。細胞標的化タンパク質が、標的細胞のＭＨＣクラスＩ提示経路に融合型Ｔ細胞エピトープを送達することができるかどうかを試験するために、特定のエピトープと複合体化したヒトＭＨＣクラスＩ分子を検出するアッセイを利用した。フローサイトメトリー法を使用して、Ｔ細胞エピトープ（志賀毒素Ａサブユニット由来の細胞標的化分子に融合している）の送達及び標的細胞の表面上におけるＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した送達されたＴ細胞エピトープ−ペプチドの細胞外提示を実証した。このフローサイトメトリー法は、それぞれが異なるエピトープ−ヒトＨＬＡ複合体に高親和性で結合する可溶性ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ、T-cell receptor）多量体試薬（Soluble T-Cell Antigen Receptor STAR（商標）Multimer、Altor Bioscience社、Miramar、FL、U.S.）を利用する。
【０４４６】
それぞれのSTAR（商標）ＴＣＲ多量体試薬は、特定のＴ細胞受容体に由来し、選択されたＴＣＲが特定のＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される特定のペプチドを認識する能力に基づいた特定のペプチド−ＭＨＣ複合体の検出を可能にする。これらのＴＣＲ多量体は、ビオチニル化されており、ストレプトアビジンと多量体化している、組換えヒトＴＣＲから構成されている。ＴＣＲ多量体は、フィコエリトリン（ＰＥ、phycoerythrin）で標識する。これらのＴＣＲ多量体試薬は、ヒト細胞の表面上に提示される特定のペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の検出を可能にするが、これは、それぞれの可溶性ＴＣＲ多量体型が、様々な条件下において特定のペプチド−ＭＨＣ複合体を認識し、安定に結合するためである（Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006)）。これらのＴＣＲ多量体試薬は、細胞の表面上に提示されるペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体のフローサイトメトリーによる特定及び定量化を可能にする。
【０４４７】
TCR CMV-pp65-PE STAR（商標）多量体試薬（Altor Bioscience社、Miramar、FL、U.S.）を、この実施例で使用した。ＨＬＡ−Ａ２を発現するヒト細胞によるヒトＣＭＶ  Ｃ２ペプチド（NLVPMVATV（配列番号６））のＭＨＣクラスＩ経路提示は、ヒトＨＬＡ−Ａ２と複合体化したＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープ−ペプチド（残基４９５〜５０３、NLVPMVATV）の高親和性認識を示し、ＰＥで標識されている、TCR CMV-pp65-PE STAR（商標）多量体試薬を用いて検出することができる。
【０４４８】
この実施例において使用した標的細胞（標的陽性細胞株Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨ）は、ATCC（Manassas VA、U.S.）又はDSMZ（The Leibniz Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture）（Braunschweig、DE））から入手可能な不死化ヒトがん細胞であった。当技術分野で公知の標準的なフローサイトメトリー法を使用して、標的細胞が、それらの細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２  ＭＨＣクラスＩ分子及びこの実施例で使用した細胞標的化タンパク質の細胞外標的生体分子の両方を発現することを確認した。一部の実験では、ヒトＨＬＡ−Ａ２の発現を増強するように、ヒトがん細胞をヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）で事前処置した。
【０４４９】
標的細胞のセットを、カルボキシ末端の融合型ウイルス性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子：ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５：：Ｃ２（配列番号５７）、及びＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７：：Ｃ２（配列番号６０）の外来的な投与によって処置したか、又はいずれの融合型異種ウイルス性エピトープ−ペプチドも含まない陰性対照の細胞標的化融合タンパク質（ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１（配列番号６３）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２（配列番号６５）、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２」（配列番号６４）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５（配列番号６６）、若しくはＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７（配列番号６９））の外来的な投与によって処置した。これらの実験において使用した細胞標的化分子及び参照分子には、触媒的に活性な細胞毒性の細胞標的化分子、並びに志賀毒素エフェクターポリペプチド成分はすべてが、志賀毒素Ａサブユニット及び志賀毒素の触媒活性を大幅に低減させる変異Ｅ１６７Ｄを含んでいたことを意味する「不活性化」細胞標的化分子の両方が含まれる。これらの処置は、志賀毒素に対する細胞型特異的感受性を考慮して他者により使用されたものと類似の細胞標的化分子濃度で行った（例えば、国際公開第２０１５／１１３００５号パンフレットを参照）。処置した細胞を、次いで、３７℃及び５％二酸化炭素の雰囲気を含む標準的な条件下において４〜１６時間インキュベートして、志賀毒素エフェクターポリペプチドによって媒介される中毒を起こさせた。次いで、細胞を洗浄し、TCR CMV-pp65-PE STAR（商標）多量体試薬とともにインキュベートして、Ｃ２ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体提示細胞を「染色」した。
【０４５０】
対照として、標的細胞のセットを、３つの条件で処置した：１）いずれの処置も行わない（「未処置」）、すなわち、細胞には緩衝液のみを添加し、いずれの外因性分子の添加も行わない、２）ＣＭＶ  Ｃ２ペプチド（ＣＭＶ−ｐｐ６５、アミノ酸４９５〜５０３：配列NLVPMVATV、BioSynthesis社、Lewisville、TX、U.S.により合成）（配列番号６）の外来的投与、及び／又は３）ペプチドローディング増強剤（「ＰＬＥ」、Altor Biosicence社、Miramar、FL、U.S.）と組み合わせたＣＭＶ  Ｃ２ペプチド（上述の（配列番号６））の外来的投与。Ｃ２ペプチド（配列番号６）とＰＬＥとの組合せ処置は、外来的ペプチドローディングを可能にし、陽性対照として機能した。適切なＭＨＣクラスＩハプロタイプを呈する細胞は、細胞外空間から（すなわち、適用されたペプチドの細胞内在化の非存在下で）又はＢ２−ミクログロブリン及び他の成分の混合物であるＰＬＥの存在下において、適切な外来的に適用されるペプチドを強制的にロードすることができる。
【０４５１】
処置後に、すべての細胞セットを洗浄し、TCR CMV-pp65-PE STAR（商標）多量体試薬とともに氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、試料の蛍光を、Accuri（商標）Ｃ６フローサイトメーター（BD Biosciences社、San Jose、CA、U.S.）を使用してフローサイトメトリーによって測定して、集団中の細胞に結合した任意のTCR CMV-pp65-PE STAR（商標）多量体の存在（本明細書において「染色」と称される場合がある）を検出し、相対発光単位（ＲＬＵ）で定量化した。
【０４５２】
表４及び図４〜８は、細胞表面のＣ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２  ＭＨＣクラスＩ分子の複合体を検出するTCR STAR（商標）アッセイを使用した実験による結果を示す。それぞれの実験に関して、未処置対照試料を使用して、未処置対照の細胞から「陽性」ゲートに入る細胞が１％未満であるゲートを用いて陽性細胞集団及び陰性細胞集団を特定した（バックグラウンドシグナルを表す）。同じゲートを、他の試料に適用して、各試料の陽性集団を特徴付けた。このアッセイにおける陽性細胞は、TCR-CMV-pp65-PE STAR（商標）試薬によって結合され、上述の陽性ゲートに数えられた細胞であった。図４及び図６〜８において、フローサイトメトリーのヒストグラムを、Ｙ軸における計数（細胞の数）、及びＸ軸におけるTCR CMV-pp65 STAR（商標）多量体PE染色シグナルを表す相対蛍光単位（ＲＦＵ，relative fluorescent unit）とともに示す（対数目盛）。黒色の線は、未処置細胞のみの試料の結果を示し、灰色の線は、陰性対照（いずれのウイルス性エピトープ−ペプチドも含まない親細胞標的化タンパク質のみでの処置）又は本発明の特定の例示的な細胞標的化タンパク質での処置の結果を示す。図４、７、及び８において、上部パネルは、未処置細胞試料の結果を黒色の線を使用して示し、細胞標的化分子処置試料の結果を灰色の線を使用して示す。図４、７、及び８において、下部パネルは、未処置細胞試料の結果を黒色の線を用いて示し、いずれの融合型エピトープ−ペプチドも含まない対照タンパク質の結果を灰色の線を使用して示す。図６において、上部パネルは、４時間のインキュベーションの結果を示し、下部パネルは１６時間のインキュベーションの結果を示す。表４において、Ｃ２エピトープ−ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２  ＭＨＣクラスＩ分子複合体の染色が陽性であった、処置セット中の細胞の割合を示す。表４はまた、各処置セットについて、対応する平均蛍光強度指数（「ｉＭＦＩ」、陽性集団の蛍光に陽性パーセントを乗じたもの）をＲＦＵで示す。
【０４５３】
【表６】
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【０４５４】
表４及び図４〜８において見られるように、本発明の例示的な細胞標的化タンパク質で処置した細胞試料は、インキュベーション期間に応じて、処置した細胞の大半の表面上に、Ｃ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２  ＭＨＣクラスＩ分子複合体の発現を呈した。外因性細胞標的化タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）又は「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５：：Ｃ２（配列番号５７）、及びＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７：：Ｃ２（配列番号６０）で処置した細胞は、分析した試料における細胞の３３〜９５％において、細胞表面Ｃ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２複合体に関する陽性シグナルを示した（表４）。対照的に、陰性対照としていずれの融合型Ｔ細胞エピトープ−ペプチドも含有しない親細胞標的化タンパク質で処置した細胞は、処置した細胞集団において細胞の５パーセント又はそれ以下の陽性細胞染色を示した（表４、図４〜８）。
【０４５５】
本発明の例示的な細胞標的化タンパク質で処置した細胞は大半が細胞表面上にＣ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示したが、「未処置」細胞集団内の細胞は５パーセント又はそれ以下が、Ｃ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２複合体のTCR STAR（商標）染色を示した（表４、図４、図６）。陽性対照処置は、ペプチドローディング増強剤の存在下において、外因性Ｃ２エピトープ−ペプチド（配列番号６）のみをローディングするということのみに起因して、集団内の細胞の９９％の強力な染色を示した（図５）。測定したわけではないが、プロセシング効率及び動態に起因して、「細胞標的化タンパク質」処置試料において単一の時点で検出される提示されたＣ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２複合体の割合は、本発明の所与の例示的な細胞標的化タンパク質による送達後のＣ２エピトープ／ＨＬＡ−Ａ２提示の見込まれる最大数を正確に反映しない場合もあり得る。
【０４５６】
細胞標的化分子で処置した標的細胞の細胞表面上におけるヒトＭＨＣクラスＩ分子（Ｃ２エピトープ−ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２）と複合体化したＴ細胞エピトープＣ２（配列番号６）の検出は、この融合型エピトープ−ペプチド（Ｃ２（配列番号６））を含む例示的な細胞標的化タンパク質（ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ１：：Ｃ２（配列番号６１）、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）、ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ５：：Ｃ２（配列番号５７）、及びＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ７：：Ｃ２（配列番号６０））が、標的細胞に入り、十分な細胞内経路決定を行い、標的細胞表面による表面提示のために十分なＣ２（配列番号６）エピトープをＭＨＣクラスＩ経路に送達することが可能であったことを示した。
【０４５７】
Ｖ．本発明の細胞標的化分子によって送達されたＴ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩ提示によって引き起こされる、細胞毒性Ｔ細胞に媒介される中毒化された標的細胞の細胞溶解及び他の免疫応答の試験
この実施例において、当技術分野で公知の標準的なアッセイを使用して、本発明の例示的な細胞標的化分子によって送達されたＴ細胞エピトープの標的細胞によるＭＨＣクラスＩ提示の機能的結果を調査する。調査する機能的結果には、ＣＴＬ活性化（例えば、シグナル伝達カスケード誘導）、ＣＴＬに媒介される標的細胞殺滅、及びＣＴＬによるＣＴＬサイトカイン放出が含まれる。
【０４５８】
ＣＴＬに基づく細胞毒性アッセイを使用して、エピトープ提示の結果を評価する。このアッセイは、組織培養した標的細胞及びＴ細胞を含む。標的細胞を、IV．エピトープ−ペプチドの送達及び標的細胞表面での提示の節などで上述のように本発明の例示的な細胞標的化分子で中毒化する。簡単に述べると、標的陽性細胞を、標準条件下において、本発明の細胞標的化分子を含む、異なる外来的に投与した分子とともに、２０時間インキュベートする。次に、処置した標的細胞にＣＴＬを添加し、インキュベートして、ＣＴＬが、エピトープ−ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体（ｐＭＨＣ  Ｉ）を提示する任意の標的細胞を認識し、それに結合できるようにする。次いで、標的細胞へのＣＴＬの結合、ＣＴＬに媒介される細胞溶解によるエピトープ提示標的細胞の殺滅、及びＩＦＮ−γ又はインターロイキンなどのサイトカインの放出を含む、ｐＭＨＣ  Ｉ認識に関するある特定の機能的結果を、ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴによって、熟練した作業者に公知の標準的な方法を使用して調査する。
【０４５９】
本発明の例示的な細胞標的化分子によって送達されたエピトープを提示する標的化がん細胞による細胞表面エピトープ提示に応答したＴ細胞の細胞間結合の機能的結果を評価するために、アッセイを行った。
【０４６０】
図９及び表５は、製造業者の使用説明書に従って使用したインターフェロンガンマＥＬＩｓｐｏｔアッセイ（Mabtech社、Cincinnati、OH、U.S.）の結果を示す。このＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、各スポットがＩＦＮ−γ分泌細胞を示すとして、ＩＦＮ−γ分泌を定量化するのに使用することができる。簡単に述べると、標的陽性細胞株Ｇの細胞試料を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）緩衝液のみ（「緩衝液のみ」）、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）、又は参照分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２」（配列番号６５）のいずれかとともに、２０時間インキュベートした。試料をＰＢＳで洗浄し、Cellular Technology Limited社（Shaker Heights、OH、U.S.）から入手したヒトＰＢＭＣ（ＨＬＡ−Ａ２血清型）を前もってローディングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに添加した。プレートをさらに２４時間インキュベートした後、MabTech社のインターフェロンガンマＥＬＩｓｐｏｔアッセイキットの説明書に従ってスポットを検出し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（Zellnet Consulting社、Fort Lee、NJ、U.S.）を使用して定量化した。
【０４６１】
【表７】
2018524006.tif 000011
【０４６２】
表５及び図９の結果は、細胞株Ｇの細胞を本発明の例示的な細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２：：Ｃ２」（配列番号５３）とともにインキュベートすることにより、緩衝液のみで処置した細胞試料を使用して決定されたバックグラウンドシグナル又は参照分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ２」（配列番号６５）で処置した試料細胞からのルシフェラーゼシグナルよりも高いＰＢＭＣルシフェラーゼ活性シグナルが得られたことを示す。このインビトロでの細胞間免疫細胞結合アッセイからの結果は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに媒介される標的陽性がん細胞への融合型エピトープ−ペプチドの送達及びそれに続く標的化がん細胞によるエピトープの細胞表面提示が、機能的結果、特に、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ分泌を伴う免疫細胞の細胞間結合をもたらし得ることを示した。
【０４６３】
エフェクターＴ細胞が特定のエピトープ−ＭＨＣ−Ｉ複合体を認識すると、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ，nuclear factor of activated T-cell）転写因子のサイトゾルから核内への移行を駆動する細胞内シグナル伝達カスケードを開始し得、ＮＦＡＴ応答要素（ＲＥ，response element）を含む遺伝子の発現の刺激をもたらし得る（例えば、Macian F, Nat Rev Immunol 5: 472-84 (2005)を参照）。Ｆ２ペプチド／ヒトＨＬＡ  Ａ２  ＭＨＣクラスＩ分子複合体を特異的に認識するヒトＴ細胞受容体を発現するように改変されたＪ７６  Ｔ細胞株（Berdien B et al., Hum Vaccin Immunother 9: 1205-16 (2013)）に、ＮＦＡＴ−ＲＥによって制御されるルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］、カタログ番号Ｅ８４８１、Promega社、Madison、WI、U.S.）をトランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしたＪ７６  ＴＣＲ特異的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２／Ｆ２エピトープ−ペプチド（配列番号１０）複合体を提示する細胞を認識し、次いで、発現ベクターのＮＦＡＴ−ＲＥに結合するＮＦＡＴ転写因子によって、ルシフェラーゼの発現が刺激され得る。トランスフェクトしたＪ７６細胞におけるルシフェラーゼ活性レベルは、標準的なルシフェラーゼ基質を添加し、続いて光検出器を使用して発光レベルを読み取ることによって、定量化することができる。
【０４６４】
本発明の例示的な細胞標的化分子によって送達されたエピトープを提示する標的化がん細胞による細胞表面エピトープ提示の認識後の細胞間Ｔ細胞活性化を評価するために、アッセイを行った。簡単に述べると、細胞株Ｆの細胞試料を、「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６：：Ｆ２」（配列番号５９）、参照分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６」（配列番号６８）、又は緩衝液単独とともに６時間インキュベートし、次いで、洗浄した。続いて、ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしたＪ７６  Ｔ細胞を、それぞれの試料と混合し、細胞の混合物を１８時間インキュベートした。次に、One-Glo（商標）Luciferase Assay System試薬（Promega社、Madison、WI、U.S.）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１０及び表６は、この細胞間Ｔ細胞結合アッセイの結果を示す。
【０４６５】
【表８】
2018524006.tif 000012
【０４６６】
表６及び図１０の結果は、本発明の例示的細胞標的化分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６：：Ｆ２」（配列番号５９）とともにインキュベートすることにより、「緩衝液のみ」で処置した細胞を使用して決定されたバックグラウンドルシフェラーゼ活性シグナル又は陰性対照分子「不活性ＳＬＴ−１Ａ：：ｓｃＦｖ６」（配列番号６８）で処置した細胞試料からのルシフェラーゼ活性よりも高いルシフェラーゼ活性レベルが得られたことを示す。このインビトロでのＴ細胞結合アッセイは、志賀毒素エフェクターポリペプチドに媒介される標的陽性がん細胞への融合型エピトープ−ペプチドの送達及びそれに続く標的化がん細胞によるエピトープの細胞表面提示が、Ｔ細胞の細胞間結合及びＴ細胞活性化の細胞内細胞シグナル伝達特徴をもたらし得ることを示した。
【０４６７】
加えて、エピトープ−ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体（ｐＭＨＣ  Ｉ）を提示する標的細胞によるＣＴＬの活性化は、市販入手可能なＣＴＬ応答アッセイ、例えば、CytoTox96（登録商標）非放射性アッセイ（Promega、Madison、WI、U.S.）、グランザイムB ELISpotアッセイ（Mabtech社、Cincinnati、OH、U.S.）、カスパーゼ活性アッセイ、及びLAMP-1転移フローサイトメトリーアッセイを使用して、定量化する。標的細胞のＣＴＬ媒介性殺滅を特に監視するために、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、carboxyfluorescein succinimidyl ester）を、当該技術分野で説明されているように、インビトロ及びインビボでの調査で標的細胞に使用する（例えば、Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)を参照されたい）。
【０４６８】
要約すると、それぞれが１）細胞標的化結合領域、２）志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び３）融合型異種ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴを含む複数の細胞標的化分子は、サイトゾルへの志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の十分なレベルの細胞内経路決定を示すレベルの細胞毒性を呈した（表７）。合わせると、これらの結果は、志賀毒素エフェクター機能、特に、細胞内経路決定が、融合型エピトープ−ペプチドが存在するにもかかわらず、また分子内でのエピトープカーゴの位置に関係なく、高いレベルで保持され得ることを示す（表７）。さらに、いくつかの細胞標的化分子は、あるレベルのエピトープ−ＭＨＣクラスＩ提示をもたらし、Ｔ細胞とエピトープ−カーゴ提示細胞との細胞間結合を刺激するのに十分なレベルのエピトープカーゴの送達を示した。
【０４６９】
【表９】
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【実施例２】
【０４７０】
志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む、ＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化分子
この実施例では、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、上述のように、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換、例えば、Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａなどを有していてもよい志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する（国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、ＭＨＣ  Ｉ分子結合予測、ＨＬＡ型、既に特徴付けられている免疫原性、及び上述のような容易に入手可能な試薬、例えば、Ｃ１−２エピトープ−ペプチドGLDRNSGNY（配列番号５）に基づいて選択する。タンパク質性の結合領域は、ヒトインターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）のリガンド（サイトカインインターロイキン２又はＩＬ−２）に由来し、これは、ヒトＩＬ−２Ｒの細胞外部分に特異的に結合することができる。ＩＬ−２Ｒは、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞などの様々な免疫細胞型によって発現される細胞表面受容体である。
【０４７１】
ＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化融合タンパク質の構築及び産生
リガンド型結合領域αＩＬ−２Ｒ、志賀毒素エフェクターポリペプチド、及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、一緒に融合して、単一の連続的なポリペプチド、「Ｃ１−２：：ＳＬＴ−１Ａ：：ＩＬ−２」又は「ＩＬ−２：：Ｃ１−２：：ＳＬＴ−１Ａ」を形成し、得られたポリペプチドのカルボキシ末端に、ＫＤＥＬを付加してもよい。
【０４７２】
ＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化分子のインビトロ特徴の判定
ＩＬ−２Ｒ陽性細胞及びＩＬ−２Ｒ陰性細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。陽性細胞に対する、この実施例のＩＬ−２Ｒを標的とするある特定の細胞標的化融合タンパク質のＢｍａｘを測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは、０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＩＬ−２Ｒ陰性細胞に対する有意な結合は存在しない。
【０４７３】
この実施例のＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化融合タンパク質のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞インビトロタンパク質翻訳において判定する。無細胞タンパク質合成に対するこの実施例の細胞標的化分子の阻害効果は、有意である。ＩＬ−２Ｒを標的とするある特定の細胞標的化融合タンパク質に関して、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＩＣ５０は、およそ０．１〜１００ｐＭである。
【０４７４】
細胞殺滅アッセイを使用したＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化分子の細胞毒性の判定
この実施例のＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化融合タンパク質の細胞毒性特徴を、前述の実施例に記載のように、ＩＬ−２Ｒ陽性細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、この実施例のＩＬ−２Ｒを標的とする同じ細胞標的化融合タンパク質の選択的細胞毒性の特徴を、ＩＬ−２Ｒ陰性細胞を使用して、ＩＬ−２Ｒ陽性細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。この実施例の細胞標的化分子のＣＤ５０値は、細胞株に応じて、ＩＬ−２Ｒ陽性細胞ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。この実施例のＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化融合タンパク質のＣＤ５０値は、細胞表面上にＩＬ−２Ｒを発現する細胞と比較して、細胞表面上にＩＬ−２Ｒを発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣ１−２提示標的細胞との分子間結合及びこの実施例のＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化融合タンパク質の細胞毒性の誘導を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性に関して調査する。
【０４７５】
動物モデルを使用したＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化分子のインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対するこの実施例のＩＬ−２Ｒを標的とするある特定の細胞標的化融合タンパク質のインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、マウスにおけるＩＬ−２Ｒ陽性細胞に対する、この実施例のＩＬ−２Ｒを標的とする細胞標的化融合タンパク質の静脈内投与の効果を試験する。細胞殺滅効果を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。この実施例の細胞標的化分子の「不活性」バリアント（例えば、Ｅ１６７Ｄ）を使用して、細胞標的化分子のあらゆる志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の触媒活性の不在下におけるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達による間接的な細胞毒性を調査してもよい。
【実施例３】
【０４７６】
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、ＣＥＡを標的とする細胞標的化分子
成人したヒトにおける癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の発現は、がん細胞、例えば、乳房、結腸、肺、膵臓、及び胃の腺癌などと関連している。この実施例において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素のＡサブユニット（ＳｔｘＡ）に由来しており、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａを有していてもよい（国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ分子結合予測、ＨＬＡ型、すでに特徴付けられている免疫原性、及び上述のような容易に入手可能な試薬に基づいて選択され、例えば、実施例１及び表１に記載のＦ３−エピトープILRGSVAHK（配列番号１１）である。ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ、carcinoembryonic antigen）上の細胞外抗原に特異的かつ高親和性で結合する、免疫グロブリン型結合領域αＣＥＡ、例えば、Pirie C et al., J Biol Chem 286: 4165-72 (2011)に記載されるような第１０ヒトフィブロネクチンIII型ドメインに由来する結合領域Ｃ７４３。
【０４７７】
ＣＥＡを標的とする細胞標的化分子の構築、産生、及び精製
志賀毒素エフェクターポリペプチド、αＣＥＡ結合領域ポリペプチド、及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、熟練した作業者に公知の標準的な方法を使用して、作動可能に一緒に連結させて、本発明の細胞標的化分子を形成する。例えば、ＳｔｘＡ：：αＣＥＡ：：Ｆ３、ＳｔｘＡ：：Ｆ３：：αＣＥＡ、αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ：：Ｆ３、Ｆ３：：αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ、αＣＥＡ：：Ｆ３：：ＳｔｘＡ、及びＦ３：：ＳｔｘＡ：：αＣＥＡのうちの１つ又は２つ以上をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって、融合タンパク質を産生させるが、これらは、それぞれ、融合型タンパク質性成分の間に本明細書に記載される１つ又は２つ以上のタンパク質性リンカーを有していてもよい。ＣＥＡを標的とするこれらの例示的な融合タンパク質の発現は、前述の実施形態に記載のように、細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
【０４７８】
ＣＥＡを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質のインビトロでの特徴の判定
ＣＥＡ陽性細胞及びＣＥＡ陰性細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。ＣＥＡ陽性細胞に対するＳｔｘＡ：：αＣＥＡ：：Ｆ３、ＳｔｘＡ：：Ｆ３：：αＣＥＡ、αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ：：Ｆ３、Ｆ３：：αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ、αＣＥＡ：：Ｆ３：：ＳｔｘＡ、及びＦ３：：ＳｔｘＡ：：αＣＥＡのＢｍａｘを、それぞれ測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは、０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＣＥＡ陰性細胞に対する有意な結合は存在しない。
【０４７９】
この実施例の融合タンパク質のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞インビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞毒性融合タンパク質の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。ＳｔｘＡ：：αＣＥＡ：：Ｆ３、ＳｔｘＡ：：Ｆ３：：αＣＥＡ、αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ：：Ｆ３、Ｆ３：：αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ、αＣＥＡ：：Ｆ３：：ＳｔｘＡ、及びＦ３：：ＳｔｘＡ：：αＣＥＡに関して測定した、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＩＣ５０値は、それぞれ、およそ０．１〜１００ｐＭである。
【０４８０】
細胞殺滅アッセイを使用したＣＥＡを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質の細胞毒性の判定
この実施例の細胞標的化分子の細胞毒性特徴を、前述の実施例に記載のように、ＣＥＡ陽性細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、ＣＥＡを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質の選択的細胞毒性特徴を、ＣＥＡ陰性細胞を使用して、ＣＥＡ抗原陽性細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。ＳｔｘＡ：：αＣＥＡ：：Ｆ３、ＳｔｘＡ：：Ｆ３：：αＣＥＡ、αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ：：Ｆ３、Ｆ３：：αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ、αＣＥＡ：：Ｆ３：：ＳｔｘＡ、及びＦ３：：ＳｔｘＡ：：αＣＥＡに関して測定したＣＤ５０値は、細胞株に応じて、ＣＥＡ陽性株ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。この実施例のＣＥＡを標的とする細胞標的化融合タンパク質のＣＤ５０値は、細胞表面上にＣＥＡを発現する細胞と比較して、細胞表面上にＣＥＡを発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＦ３提示標的細胞との分子間結合、並びにＳｔｘＡ：：αＣＥＡ：：Ｆ３、ＳｔｘＡ：：Ｆ３：：αＣＥＡ、αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ：：Ｆ３、Ｆ３：：αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ、αＣＥＡ：：Ｆ３：：ＳｔｘＡ、及びＦ３：：ＳｔｘＡ：：αＣＥＡの細胞毒性の誘導を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性に関して調査する。
【０４８１】
動物モデルを使用したＣＥＡを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質のインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対するＣＥＡを標的とする例示的な融合タンパク質のインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、ＣＥＡを細胞表面に発現するヒト新生物細胞を注入したマウスに静脈内投与した後の細胞標的化融合タンパク質ＳｔｘＡ：：αＣＥＡ：：Ｆ３、ＳｔｘＡ：：Ｆ３：：αＣＥＡ、αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ：：Ｆ３、Ｆ３：：αＣＥＡ：：ＳｔｘＡ、αＣＥＡ：：Ｆ３：：ＳｔｘＡ、及びＦ３：：ＳｔｘＡ：：αＣＥＡの異種移植片腫瘍に対する効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。この実施例の細胞標的化分子の「不活性」バリアント（例えば、Ｅ１６７Ｄ）を使用して、細胞標的化分子のあらゆる志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の触媒活性の不在下におけるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達によって引き起こされる間接的な細胞毒性を調査してもよい。
【実施例４】
【０４８２】
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、ＨＥＲ２を標的とする細胞標的化分子
ＨＥＲ２の過剰発現は、乳房、結腸直腸、子宮内膜、食道、胃、頭頸部、肺、卵巣、前立腺、膵臓、及び精巣生殖細胞の腫瘍細胞において観察されている。この実施例において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素のＡサブユニット（ＳｔｘＡ）に由来しており、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａを有していてもよい（国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ分子結合予測、ＨＬＡ型、すでに特徴付けられている免疫原性、及び上述のような容易に入手可能な試薬に基づいて選択され、例えば、実施例１及び表１に記載のＣ３−エピトープGVMTRGRLK（配列番号７）である。ヒトＨＥＲ２の細胞外部分に結合する結合領域αＨＥＲ２は、熟練した作業者に公知の入手可能な免疫グロブリン型ポリペプチドからスクリーニング又は選択することによって、生成される（例えば、ＨＥＲ２の細胞外エピトープに高親和性で結合するアニリン（anyrin）反復DARPin（商標）Ｇ３（Goldstein R et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 42: 288-301(2015)）を参照）。
【０４８３】
ＨＥＲ２を標的とする細胞標的化分子の構築、産生、及び精製
志賀毒素エフェクターポリペプチド、αＨＥＲ２結合領域ポリペプチド、及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、熟練した作業者に公知の標準的な方法を使用して、作動可能に一緒に連結させて、本発明の細胞標的化分子を形成する。例えば、ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２：：Ｃ３、ＳｔｘＡ：：Ｃ３：：αＨＥＲ２、αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ：：Ｃ３、Ｃ３：：αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ、αＨＥＲ２：：Ｃ３：：ＳｔｘＡ、及びＣ３：：ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２のうちの１つ又は２つ以上をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって、融合タンパク質を産生させるが、これらは、それぞれ、本明細書に記載される１つ又は２つ以上のタンパク質性リンカーを融合型タンパク質性成分の間に有していてもよい。ＨＥＲ２を標的とするこれらの例示的な融合タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
【０４８４】
ＨＥＲ２を標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質のインビトロでの特徴の判定
ＨＥＲ２陽性細胞及びＨＥＲ２陰性細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。ＨＥＲ２陽性細胞に対するＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２：：Ｃ３、ＳｔｘＡ：：Ｃ３：：αＨＥＲ２、αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ：：Ｃ３、Ｃ３：：αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ、αＨＥＲ２：：Ｃ３：：ＳｔｘＡ、及びＣ３：：ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２のＢｍａｘを、それぞれ測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは、０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＨＥＲ２陰性細胞に対する有意な結合は存在しない。
【０４８５】
この実施例の融合タンパク質のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞インビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞毒性融合タンパク質の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２：：Ｃ３、ＳｔｘＡ：：Ｃ３：：αＨＥＲ２、αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ：：Ｃ３、Ｃ３：：αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ、αＨＥＲ２：：Ｃ３：：ＳｔｘＡ、及びＣ３：：ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２に関して測定した、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＩＣ５０値は、それぞれ、およそ０．１〜１００ｐＭである。
【０４８６】
細胞殺滅アッセイを使用したＨＥＲ２を標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質の細胞毒性の判定
この実施例の細胞標的化分子の細胞毒性特徴を、前述の実施例に記載のように、ＨＥＲ２陽性細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、ＨＥＲ２を標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質の選択的細胞毒性特徴を、ＨＥＲ２陰性細胞を使用して、ＨＥＲ２抗原陽性細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２：：Ｃ３、ＳｔｘＡ：：Ｃ３：：αＨＥＲ２、αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ：：Ｃ３、Ｃ３：：αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ、αＨＥＲ２：：Ｃ３：：ＳｔｘＡ、及びＣ３：：ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２に関して測定したＣＤ５０値は、細胞株に応じて、ＨＥＲ２陽性細胞ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。この実施例のＨＥＲ２を標的とする細胞標的化融合タンパク質のＣＤ５０値は、細胞表面上にＨＥＲ２を発現する細胞と比較して、細胞表面上にＨＥＲ２を発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣ３提示標的細胞との分子間結合、並びにＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２：：Ｃ３、ＳｔｘＡ：：Ｃ３：：αＨＥＲ２、αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ：：Ｃ３、Ｃ３：：αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ、αＨＥＲ２：：Ｃ３：：ＳｔｘＡ、及びＣ３：：ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２の細胞毒性の誘導を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性に関して調査する。
【０４８７】
動物モデルを使用したＨＥＲ２を標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質のインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対するＨＥＲ２を標的とする例示的な融合タンパク質のインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、ＨＥＲ２を細胞表面に発現するヒト新生物細胞を注入したマウスに静脈内投与した後の細胞標的化融合タンパク質ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２：：Ｃ３、ＳｔｘＡ：：Ｃ３：：αＨＥＲ２、αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ：：Ｃ３、Ｃ３：：αＨＥＲ２：：ＳｔｘＡ、αＨＥＲ２：：Ｃ３：：ＳｔｘＡ、及びＣ３：：ＳｔｘＡ：：αＨＥＲ２の異種移植片腫瘍に対する効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。この実施例の細胞標的化分子の「不活性」バリアント（例えば、Ｅ１６７Ｄ）を使用して、細胞標的化分子のあらゆる志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の触媒活性の不在下におけるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達によって引き起こされる間接的な細胞毒性を調査してもよい。
【実施例５】
【０４８８】
志賀毒素エフェクターポリペプチド及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、ＥＧＦＲを標的とする細胞標的化分子
上皮成長因子受容体の発現は、ヒトがん細胞、例えば、肺がん細胞、乳がん細胞、及び結腸直腸がん細胞などと関連している。この実施例において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素のＡサブユニット（ＳｔｘＡ）に由来しており、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換Ｒ２４８Ａ／Ｒ２５１Ａを有していてもよい（国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ分子結合予測、ＨＬＡ型、すでに特徴付けられている免疫原性、及び上述のような容易に入手可能な試薬に基づいて選択され、例えば、実施例１及び表１に記載のＣ１−エピトープVTEHDTLLY（配列番号４）である。結合領域αＥＧＦＲは、AdNectin（商標）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：３ＱＷＱ＿Ｂ）、Affibody（商標）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：２ＫＺＩ＿Ａ、米国特許第８，５９８，１１３号明細書）、又は抗体に由来し、これらはすべて、１つ又は２つ以上のヒト上皮成長因子受容体の細胞外部分に結合する。
【０４８９】
ＥＧＦＲを標的とする細胞標的化分子の構築、産生、及び精製
志賀毒素エフェクターポリペプチド、αＥＧＦＲ結合領域ポリペプチド、及び異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを、熟練した作業者に公知の標準的な方法を使用して、作動可能に一緒に連結させて、本発明の細胞標的化分子を形成する。例えば、ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲ：：Ｃ１、ＳｔｘＡ：：Ｃ１：：αＥＧＦＲ、αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ：：Ｃ１、Ｃ１：：αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ、αＥＧＦＲ：：Ｃ１：：ＳｔｘＡ、及びＣ１：：ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲのうちの１つ又は２つ以上をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって、融合タンパク質を産生させるが、これらは、それぞれ、本明細書に記載される１つ又は２つ以上のタンパク質性リンカーを融合型タンパク質性成分の間に有していてもよい。ＥＧＦＲを標的とするこれらの例示的な融合タンパク質の発現は、前述の実施例に記載のように、細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系のいずれかを使用して達成する。
【０４９０】
ＥＧＦＲを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質のインビトロでの特徴の判定
ＥＧＦＲ＋細胞及びＥＧＦＲ−細胞に対するこの実施例の細胞標的化分子の結合特徴を、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって判定する。ＥＧＦＲ陽性細胞に対するＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲ：：Ｃ１、ＳｔｘＡ：：Ｃ１：：αＥＧＦＲ、αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ：：Ｃ１、Ｃ１：：αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ、αＥＧＦＲ：：Ｃ１：：ＳｔｘＡ、及びＣ１：：ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲのＢｍａｘを、それぞれ測定すると、およそ５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは、０．０１〜１００ｎＭの範囲内であるが、このアッセイにおいてＥＧＦＲ陰性細胞に対する有意な結合は存在しない。
【０４９１】
この実施例の融合タンパク質のリボソーム不活性化能力を、前述の実施例に記載のように、無細胞インビトロタンパク質翻訳において判定する。この実施例の細胞毒性融合タンパク質の、無細胞タンパク質合成に対する阻害効果は、有意である。ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲ：：Ｃ１、ＳｔｘＡ：：Ｃ１：：αＥＧＦＲ、αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ：：Ｃ１、Ｃ１：：αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ、αＥＧＦＲ：：Ｃ１：：ＳｔｘＡ、及びＣ１：：ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲに関して測定した、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＩＣ５０値は、それぞれ、およそ０．１〜１００ｐＭである。
【０４９２】
細胞殺滅アッセイを使用したＥＧＦＲを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質の細胞毒性の判定
この実施例の細胞標的化分子の細胞毒性特徴を、前述の実施例に記載のように、ＥＧＦＲ＋細胞を使用して、一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。加えて、ＥＧＦＲを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質の選択的細胞毒性特徴を、ＥＧＦＲ−細胞を使用して、ＥＧＦＲ抗原陽性細胞との比較として、同じ一般的な細胞殺滅アッセイによって判定する。ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲ：：Ｃ１、ＳｔｘＡ：：Ｃ１：：αＥＧＦＲ、αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ：：Ｃ１、Ｃ１：：αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ、αＥＧＦＲ：：Ｃ１：：ＳｔｘＡ、及びＣ１：：ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲに関して測定したＣＤ５０値は、細胞株に応じて、ＥＧＦＲ陽性株ではおよそ０．０１〜１００ｎＭである。この実施例のＥＧＦＲを標的とする細胞標的化融合タンパク質のＣＤ５０値は、細胞表面上にＥＧＦＲを発現する細胞と比較して、細胞表面上にＥＧＦＲを発現しない細胞では、およそ１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣ１提示標的細胞との分子間結合、並びにＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲ：：Ｃ１、ＳｔｘＡ：：Ｃ１：：αＥＧＦＲ、αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ：：Ｃ１、Ｃ１：：αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ、αＥＧＦＲ：：Ｃ１：：ＳｔｘＡ、及びＣ１：：ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲの細胞毒性の誘導を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性に関して調査する。
【０４９３】
動物モデルを使用したＥＧＦＲを標的とする例示的な細胞標的化融合タンパク質のインビボでの効果の判定
動物モデルを使用して、新生物細胞に対するＥＧＦＲを標的とする例示的な融合タンパク質のインビボでの効果を判定する。様々なマウス株を使用して、ＥＧＦＲを細胞表面に発現するヒト新生物細胞を注入したマウスに静脈内投与した後の細胞標的化融合タンパク質ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲ：：Ｃ１、ＳｔｘＡ：：Ｃ１：：αＥＧＦＲ、αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ：：Ｃ１、Ｃ１：：αＥＧＦＲ：：ＳｔｘＡ、αＥＧＦＲ：：Ｃ１：：ＳｔｘＡ、及びＣ１：：ＳｔｘＡ：：αＥＧＦＲの異種移植片腫瘍に対する効果を試験する。細胞殺滅を、熟練した作業者に公知の及び／又は本明細書で説明されるアッセイを使用して、直接的な細胞毒性、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープカーゴ送達及びＣＴＬ媒介性細胞毒性をもたらす提示による間接的な細胞毒性の両方に関して調査する。この実施例の細胞標的化分子の「不活性」バリアント（例えば、Ｅ１６７Ｄ）を使用して、細胞標的化分子のあらゆる志賀毒素エフェクターポリペプチド成分の触媒活性の不在下におけるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ送達によって引き起こされる間接的な細胞毒性を調査してもよい。
【実施例６】
【０４９４】
それぞれが志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド及び志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド成分のカルボキシ末端側に位置する１つ又は２つ以上の異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含む、様々な細胞型を標的とする細胞標的化分子
この実施例において、３つのタンパク質性構造体を互いに会合させて、本発明の例示的な細胞標的化分子を形成する。志賀毒素Ａ１断片領域を有する志賀毒素Ａサブユニットエフェクターポリペプチド成分は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）、志賀毒素のＡサブユニット（ＳｔｘＡ）、及び／又は志賀様毒素２のＡサブユニット（ＳＬＴ−２Ａ）に由来しており、フーリン切断耐性を付与するアミノ酸残基置換を有していてもよい（国際公開第２０１５／１９１７６４号パンフレット）。１つ又は２つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、例えば、ＭＨＣ  Ｉ分子結合予測、ＨＬＡ型、すでに特徴付けられている免疫原性、及び本明細書で説明される容易に入手可能な試薬などに基づいて、選択される。結合領域成分は、表８の列１から選択される分子に由来する免疫グロブリン型ドメインに由来し、これは、表８の列２に示される細胞外標的生体分子に結合する。
【０４９５】
当技術分野で公知の試薬及び技術を使用して、次の３つの成分：１）免疫グロブリン由来の結合領域、２）志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び３）ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチド又は少なくとも１つの異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドを含むより大きなポリペプチドを、互いに会合させて、本発明の細胞標的化分子を形成し、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ−ペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドの志賀毒素Ａ１断片領域のカルボキシ末端のカルボキシ末端側に位置している。この実施例の例示的な細胞標的化分子を、前述の実施例に記載のように、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を使用して試験する。この実施例の例示的な細胞標的化分子は、例えば、表８の列３に示される疾患、状態、及び／又は障害を診断及び治療するために使用され得る。
【０４９６】
【表１０】
2018524006.tif 000014
2018524006.tif 000015
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【０４９７】
本発明の一部の実施形態を、例示の目的で記載しているが、本発明が、本発明の趣旨から逸脱すること又は特許請求の範囲を逸脱することなく、多数の修正、変更、及び適合を伴って、並びに当業者の技能の範囲内である多数の等価物又は代替的な解決策の使用を伴って、実施され得ることは明らかであろう。
【０４９８】
すべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、又は特許出願が具体的かつ個別に参照によりその全体が組み込まれると示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国仮特許出願第６１／７７７，１３０号、同第６１／９３２，０００号、同第６１／９５１，１１０号、同第６１／９５１，１２１号、同第６２／０１０，９１８号、及び同第６２／０４９，３２５号の開示は、それぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。国際特許出願公開第２０１４／１６４６８０号パンフレット、同第２０１４／１６４６９３号パンフレット、同第２０１５／１３８４３５号パンフレット、同第２０１５／１３８４５２号パンフレット、同第２０１５／１１３００５号パンフレット、同第２０１５／１１３００７号パンフレット、及び同第２０１５／１９１７６４号パンフレットは、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２９８４３４Ａ１号明細書、同第２００９／０１５６４１７Ａ１号明細書、同第２０１３／０１９６９２８Ａ１号明細書、及び同第２０１６／０１７７２８４Ａ１号明細書の開示は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６５８０号の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されるGenBank（National Center for Biotechnology Information、U.S.）より電子的に利用可能なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列のすべての生物学的配列情報の完全な開示は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４９９】
【表１１】
2018524006.tif 000021
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【図１−Ａ】
2018524006.tif 000053
【図１−Ｂ】
2018524006.tif 000054
【図２】
2018524006.tif 000055
【図３】
2018524006.tif 000056
【図４】
2018524006.tif 000057
【図５】
2018524006.tif 000058
【図６】
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【図７】
2018524006.tif 000060
【図８】
2018524006.tif 000061
【図９】
2018524006.tif 000062
【図１０】
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【配列表】
2018524006000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月29日(2018.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）志賀毒素Ａ１断片領域を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドと、
ii）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる異種結合領域と、
iii）志賀毒素Ａ１断片領域に対してカルボキシ末端側に位置する異種ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと
を含む細胞標的化分子であって、
前記細胞標的化分子を前記結合領域の前記細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に投与することにより、前記細胞による前記細胞標的化分子の内在化、及び前記細胞による細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの提示がもたらされる、前記細胞標的化分子。
【請求項２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、直接的又は間接的のいずれかで、志賀毒素エフェクターポリペプチド及び／又は結合領域に融合されている、請求項１に記載の細胞標的化分子。
【請求項３】
結合領域、志賀毒素エフェクターポリペプチド及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む一本鎖ポリペプチドを含む、請求項２に記載の細胞標的化分子。
【請求項４】
結合領域が、２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、志賀毒素エフェクターポリペプチドを含むポリペプチドと前記２つ又は３つ以上のポリペプチド鎖のうちの１つとに融合されている、請求項２に記載の細胞標的化分子。
【請求項５】
結合領域が、単一ドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域３断片、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、Ｆｄ断片、抗原結合断片、アルマジロ反復ポリペプチド、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニプロテイン、Ｃ型レクチン様ドメイン足場、改変抗体模倣物、及び結合機能を保持する前述のもののいずれかのあらゆる遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項６】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、
（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１、
（iii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１、及び
（iv）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含むか又はそれから本質的になる、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項７】
志賀毒素Ａ１断片領域が、破壊されたフーリン切断モチーフを含むカルボキシ末端領域を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項８】
破壊されたフーリン切断モチーフが、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対する１つ又は２つ以上の変異を含み、前記変異が、志賀様毒素１のＡサブユニット（配列番号１）若しくは志賀毒素のＡサブユニット（配列番号２）の２４８〜２５１、又は志賀様毒素２のＡサブユニット（配列番号３）の２４７〜２５０に天然に位置する領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更する、請求項７に記載の細胞標的化分子。
【請求項９】
破壊されたフーリン切断モチーフが、前記フーリン切断モチーフ中の、野生型志賀毒素Ａサブユニットに対するアミノ酸残基の置換を含む、請求項７又は８に記載の細胞標的化分子。
【請求項１０】
フーリン切断モチーフ中のアミノ酸残基の置換が、アルギニン残基から、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択される正電荷を有さないアミノ酸残基への置換である、請求項９に記載の細胞標的化分子。
【請求項１１】
結合領域が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤＣＰ１、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、ルイス−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドルイス−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫ、ＦＡＰ、テネイシン、ＣＤ６４、メソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ４５、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ＩＬ−１Ｒ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ−Ｌ１、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、ＣＤ２８４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２、ＣＤ１１ｃ、及び前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合することができる、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１２】
結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している細胞に細胞標的化分子を投与することにより、前記細胞標的化分子が、前記細胞の死を引き起こすことができる、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１３】
メンバーが結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合している第１の細胞集団、及びメンバーが結合領域のいずれの細胞外標的生体分子とも物理的に結合していない第２の細胞集団に細胞標的化分子を投与することにより、前記第１の細胞集団のメンバーに対する前記細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第２の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果と比べて少なくとも３倍大きい、請求項１２に記載の細胞標的化分子。
【請求項１４】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、志賀毒素エフェクター領域の酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する変異を含み、前記変異が、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１５】
変異が、毒素エフェクターポリペプチドの細胞毒性を低減又は除去する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換から選択される、請求項１４に記載の細胞標的化分子。
【請求項１６】
配列番号２１〜３９、５２〜５３及び５７〜６１のいずれか１つのポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる、請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、又はその相補物をコードすることができるポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のポリヌクレオチド又は発現ベクターのいずれか１つを含む宿主細胞。
【請求項２１】
細胞をインビトロで殺滅する方法であって、前記細胞を、請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項１７に記載の医薬組成物とインビトロで接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項１７に記載の医薬組成物の治療有効量を含む、疾患、障害、又は状態の治療剤。
【請求項２３】
疾患、障害、又は状態が、がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、及び微生物感染からなる群から選択される、請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
がんが、骨がん、乳がん、中枢／末梢神経系がん、消化器がん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓から尿道のがん、肝臓がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２５】
免疫障害が、アミロイド症、強直性脊椎炎、喘息、自閉症、心臓発生、クローン病、糖尿病、エリテマトーデス、胃炎、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、溶血尿毒症症候群、ＨＩＶ関連の疾患、紅斑性狼瘡、リンパ増殖性障害、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎症、結節性多発性動脈炎、多発関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、及び脈管炎からなる群から選択される疾患と関連する、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２６】
がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子を含む組成物。
【請求項２７】
がん、腫瘍、増殖異常、免疫障害、又は微生物感染を治療又は予防するための医薬品の製造における、請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項１７に記載の医薬組成物、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載の発現ベクター、又は請求項２０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は請求項１７に記載の医薬組成物を含む、脊索動物内の組織の場所をＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープで「シーディング」するための剤であって、投与することにより、前記細胞標的化分子が、結合領域の細胞外標的生体分子を発現する前記組織の場所において細胞内に内在化し、前記細胞標的化分子の前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを細胞表面においてＭＨＣクラスＩ分子との複合体で提示することができ、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、前記脊索動物にとって非自己のエピトープである、前記剤。
【請求項２９】
細胞標的化分子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、
ＭＨＣクラスＩ複合体において細胞標的化分子の標的細胞によって天然に提示されないペプチド、標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質中にも天然に存在しないペプチド、標的細胞のトランスクリプトーム又はプロテオーム中に天然に存在しないペプチド、シーディングしようとする組織の場所の細胞外の微環境中に天然に存在しないペプチド、及び前記組織の場所の腫瘤又は感染組織に天然に存在しないペプチド
からなる群から選択される、請求項２８に記載の剤。
【請求項３０】
組織の場所が、悪性の、罹患した、又は炎症を起こした組織を含む、請求項２８又は２９に記載の剤であって、組織の場所が、腫瘤、がん性の増殖、腫瘍、感染した組織、及び異常な細胞塊からなる群から選択される組織を含んでもよい、前記剤。
【請求項３１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項１７に記載の医薬組成物、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載の発現ベクター、又は請求項２０に記載の宿主細胞と、追加の試薬及び／又は医薬送達デバイスとを含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４３】
【表５】
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【国際調査報告】
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