(57)【要約】  本発明は、一塩基多型（SNP）rs3815496、または被験者における放射線療法後に有害作用、特に急性および/または亜急性の皮膚炎およびリンパ球のアポトーシスを生じるリスクを評価するためのバイオマーカーとしての前記SNPとの100％連鎖不平衡を有する任意のSNPに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における放射線治療後に有害作用を発症するリスクを評価するためのバイオマーカーとしての、rs1131532、rs3815496およびr2の絶対値が0.85である連鎖不平衡を有する任意のSNPからなる群から選択される一塩基多型（SNP）の使用であって、
前記有害作用は、急性および/または亜急性皮膚炎並びにリンパ球アポトーシスからなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項２】
rs3815496との連鎖不平衡を有する前記SNPは、以下のものからなる群における一つから選択される、請求項1に記載の使用：
a) rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557;
b) rs1131532, rs1131542, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1597086, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259, 及び rs9880475, より好ましくは、以下からなる群からから選択される： rs1131532, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, 及び rs1597086;
c) rs3136600;
d) rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799 及び rs4894557。
【請求項３】
rs1131532との連鎖不平衡を有する前記SNPは、以下のものからなる群における一つから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用：
a) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs3181142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673 及び rs9811639;
b) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086, rs1126161, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259 及び rs9880475, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086 及び rs1126161
c) rs1131542, rs11720451, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs12696330, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs9811639, rs62282578, rs9849142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs9859809 及び rs63562861;
d) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673, 及び rs9811639。
【請求項４】
rs1131532およびrs3815496との連鎖不平衡を有する前記SNPは、rs9811673、rs9811639、rs3815496、rs3181643、rs3136606、rs3136607、rs3819773、rs1126161、rs63562861、rs1131542、rs11720451、rs9859809、rs6807069、rs6783667、rs9869255、rs9811650、rs9811646、rs62282578、rs1992868、rs1992869、rs6414542、rs1597086、rs9880799、rs4894557からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項５】
SNPはrs3815496またはrs1131532である、ことを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項６】
被験者における放射線療法後に有害作用を発症するリスクを評価するための方法であって、前記方法は、rs1131532、rs3815496および、被験者サンプルにおいてr2の絶対値が0.85である連鎖不平衡を有する任意の一塩基多型（SNP）からなる群から選択されるSNPの対立遺伝子を決定する工程を含み、
前記有害作用は、急性および/または亜急性皮膚炎並びにリンパ球アポトーシスからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
rs3815496との連鎖不平衡を有するSNPは、以下のものからなる群における一つから選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法：
a) rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, およびrs4894557, より好ましくは、以下のものからなる群から選択される：rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557;
b) rs1131532, rs1131542, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1597086, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259, 及びrs9880475, より好ましくは、以下のものからなる群から選択される：rs1131532, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, 及び rs1597086;
c) rs3136600;
d) rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799 及び rs4894557。
【請求項８】
rs1131532との連鎖不平衡を有するSNPは、以下のものからなる群における一つから選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法：
a) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs3181142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673 及び rs9811639;
b) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086, rs1126161, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259 及びrs9880475, より好ましくは、以下のものからなる群から選択される： rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086 及び rs1126161;
c) rs1131542, rs11720451, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs12696330, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs9811639, rs62282578, rs9849142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs9859809 及び rs63562861;
d) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673及び rs9811639。
【請求項９】
rs1131532およびrs3815496との連鎖不平衡を有する前記SNPは、rs9811673、rs9811639、rs3815496、rs3181143、rs3136606、rs3136607、rs3819773、rs1126161、rs63562861、rs1131542、rs11720451、rs9859809、rs6807069、rs6783667、rs9869255、rs9811650、rs9811646、rs62282578、rs1992868、rs1992869、rs6414542、rs1597086、rs9880799およびrs4894557からなる群から選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記SNPは、rs3815496またはrs1131532である、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
対立遺伝子を決定する工程は、シークエンシング、選択的ハイブリダイゼーションおよび/或いは選択的増幅、酵素に基づく方法、または分子のコンフォメーション、重量もしくはサイズにおける差異に依存する方法による遺伝子型決定の工程である、ことを特徴とする請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験者サンプルは、唾液、尿、全血、血漿、または血清サンプルであることを特徴とする請求項6〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
被験者に適した放射線量の決定方法であって、
前記方法は、請求項6〜12のいずれかに記載の方法を実施することを含み、前記被験者が放射線療法後の有害作用を発症するリスクの増加に関連するSNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有する場合に、低減された放射線量が選択されるように、かつ、前記被験者が放射線療法後に有害作用を発症するリスクの増加に関連するSNPのいかなる対立遺伝子を示さない場合に、最大放射線量が選択されるように、前記被験者に適した放射線量を選択することを含むことを特徴とする決定方法。
【請求項１４】
被験者における放射線療法後に、急性および/または亜急性皮膚炎、ならびに/あるいはリンパ球アポトーシスである有害作用を発症するリスクを評価するための、あるいは被験者に適切な放射線量を決定するおよび/または放射線療法送達を選択するためのキットの使用であって、
前記キットは、請求項1〜5のいずれか一項に定義されるSNPと特異的に結合またはハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸プローブ、および/または請求項1〜5のいずれか一項に定義されるSNPを増幅するために適した増幅反応に用いるために適した少なくとも1組のプライマーを含むことを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。特に、本発明は、個体の放射線感受性および有害作用のリスクを評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線感受性の個人差は、放射線の発見以来、広く記録されており、すべての放射線療法患者が経験するさまざまなレベルの毒性と因果関係がある。しかしながら、突然変異したATM遺伝子のホモ接合キャリアなどの非常にまれな一因性疾患を除いて、個々の放射線感受性の遺伝的基礎はあまり特徴付けられていない。それにもかかわらず、細胞放射線感受性と臨床放射線感受性との間に相関関係があることが数多くの研究によって示されている。これは、低CD8+-リンパ球アポトーシスと放射線誘発遅発毒性との関連によって例証されている(Ozsahin et al., 2005, Clin Cancer Res. 11:7426〜7433)。しかし、放射線療法に関連する早期および/または後期の臨床的有害作用の予測に確実に使用できる利用可能な生物学的試験にはコンセンサスが存在しない(Finnon et al., 2012, Radiother Oncol. 105:329〜336; Greve et al., 2011, PLoS ONE. 7:e47185〜e47185)。
【０００３】
放射線量と腫瘍コントロールとの間に直接的関係があるため、少数の患者で観察される副作用による用量制限は、放射線療法の有効性を大きく低下させる。放射線送達の最適化などの技術開発を超えて、放射線療法の結果を改善するには、最終的に個別化放射線療法を可能にする個々の放射線感受性の基礎メカニズムをより良い理解することが要求される(West and Barnett, 2011, Genome Med. 3:52)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ozsahin et al., 2005, Clin Cancer Res. 11:7426〜7433
【非特許文献２】Finnon et al., 2012, Radiother Oncol. 105:329〜336
【非特許文献３】Greve et al., 2011, PLoS ONE. 7:e47185〜e47185
【非特許文献４】West and Barnett, 2011, Genome Med. 3:52
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、放射線感受性を予見することを可能にする方法は、癌治療を最適化するために臨床医にとって有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、リンパ球のアポトーシス感受性に関連する個々の放射線感受性および照射された正常組織における合併症を発症するリスクを評価するための方法を提供する。該方法は、TNFSF10/TRAIL遺伝子における特定の多型を遺伝子型決定することを含む。
【０００７】
本発明は、rs1131532、rs3815496およびr2の絶対値が0.85である連鎖不平衡を有する任意のSNPからなる群から選択される一塩基多型（SNP）の使用であって、被験者における放射線療法後の有害作用を発症するリスクを評価するためのバイオマーカーとしての使用に関する。ここで、前記有害作用は、急性および/または亜急性の皮膚炎、およびリンパ球のアポトーシスからなる群から選択される。
【０００８】
本発明は、被験者における放射線療法後に有害作用を発症するリスクを評価する方法にも関する。この方法は、rs1131532、rs3815496および被験者サンプルにおいてr2の絶対値が0.85である連鎖不平衡を有する任意のSNPからなる群から選択される一塩基多型（SNP）の対立遺伝子を決定することを含む；前記有害作用は急性および/または亜急性皮膚炎、および/またはリンパ球のアポトーシスである。好ましくは、対立遺伝子を決定する工程は、シークエンシング、選択的ハイブリダイゼーションおよび/または選択的増幅、酵素ベースの方法または分子のコンフォメーション、重量或いはサイズの差異に依存する方法による遺伝子型決定の工程である。好ましくは、被験者のサンプルは、唾液、尿、全血、血漿、または血清サンプルである。より好ましくは、被験者はヒトである。
【０００９】
本発明はまた、被験者に適した放射線量を決定するための方法にも関する。この方法は、上記で開示したような被験者における放射線療法後に有害作用を発症するリスクを評価するための方法を実施すること、および被験者に適した放射線量を選択することを含む。それによって、前記被験者に適した放射線量を選択することは、被験者が放射線療法後の有害作用を発症するリスクの増加に関連するSNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有する場合に低減された放射線量が選択されるように、かつ、被験者が放射線療法後に有害作用を発症するリスクの増加に関連するSNPのいかなる対立遺伝子を示さない場合に最大放射線量が選択されるようにすることである。
【００１０】
本発明はさらに、急性および/または亜急性皮膚炎ならびに/あるいはリンパ球アポトーシスである、被験者における放射線療法後の有害作用を発症する危険性を評価するための、または放射線量を決定するためおよび/または被験者に適した放射線療法送達を選択するためのキットの使用に関し、ここで、本発明のSNPを特異的に結合またはハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸プローブ、および/または本発明で定義されるSNPを増幅するために適した増幅反応に使用するために適した少なくとも1組のプライマーを含む。
【００１１】
好ましくは、rs3815496との連鎖不平衡を有するSNPは、以下のものからなる群における一つから選択される：
a) rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557;
b) rs1131532, rs1131542, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1597086, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259, 及び rs9880475, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs1131532, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, 及び rs1597086;
c) rs3136600;
d) rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799 及び rs4894557。
【００１２】
あるいは、rs1131532との連鎖不平衡を有するSNPは、以下のものからなる群における一つから選択される：
a) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs3181142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673 及び rs9811639;
b) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086, rs1126161, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259 及び rs9880475, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086 及び rs1126161
c) rs1131542, rs11720451, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs12696330, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs9811639, rs62282578, rs9849142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs9859809 及び rs63562861;
d) rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673, 及び rs9811639。
【００１３】
好ましい実施形態では、rs1131532およびrs3815496との連鎖不平衡を有するSNPは、rs9811673、rs9811639、rs3815496、rs3181143、rs3136606、rs3136607、rs3819773、rs1126161、rs63562861、rs1131542、rs11720451、rs9859809、rs6807069、rs6783667、 rs981125、rs9811650、rs9811646、rs62282578、rs1992868、rs1992869、rs6414542、rs1597086、rs9880799およびrs4894557からなる群から選択される。
【００１４】
最も好ましい実施形態では、SNPはrs3815496またはrs1131532である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、PBMCサンプルの2Gyでの照射から18時間後、T4EMにおけるアネキシン(annexin)V陽性細胞の定量化につながるゲーティング戦略を示しており、ドットプロットは、T4およびT8 CD62Lリンパ球におけるアネキシンV陽性細胞、およびT4EMリンパ球におけるアネキシンV陽性細胞の不在を示す。
【図２】TRAIL/TNFSF10 mRNAレベルは、T4EM細胞放射線感受性表現型と相関する。（図2A）示された用量での照射から18時間後のT4EMリンパ球のアネキシンV蛍光強度のオーバーレイされたヒストグラム。（図2B）アポトーシスのレベル（灰色の円）によって測定されたT4EMリンパ球の放射線感受性に従う373個体のランキングである。4つの「感受性」および4つの「耐性」の無関係な個体（黒の円）由来のT4EMリンパ球を、マイクロアレイ発現分析のために選択した。qPCRには、15人の「感受性」、「中央値」および「耐性」の無関係な個体からのT4EMリンパ球を用いた。（図2C）15の「耐性」（R）、15の「中央値（M）および15の「耐性」の無関係個体（S）からの選別されたT4EMリンパ球におけるTRAIL/TNFSF10の発現レベルの定量的PCR分析である。結果は、中央値（赤）を有する内部参照遺伝子（RPLP0）に対するdCtのボックスプロット（*** p<10-3）として表示される。（図2D）2Gyでの照射の2,4,6および24時間後、5つの「耐性」（R）および5つの「感受性」（S）の無関係の個体から選別されたT4EMリンパ球におけるTNFSF10/TRAIL（左パネル）、TNFRSF10a/DR4（中パネル）およびTNFRSF10b/DR5（右パネル）の多変量qPCR分析。結果は、照射後の各時点（時間）について、非照射サンプルのdCtとテストサンプルのdCtとの間のdCtの差（ddCt）として表示され、中央線（赤色）を有するボックスプロットとして表示される（***p<10-3）。
【図３】膜結合TRAIL（mTRAIL）は、照射されたT4EMリンパ球におけるアポトーシス促進自己分泌シグナル伝達を媒介する。（図3A）無関係な個体からの4つ「耐性」（S）および4つの「耐性」（R）サンプルからの休止T4EMリンパ球のフローサイトメトリー分析によるmTRAILレベルである。中央線（***p<10-3）を有するボックスプロット表示である。（図3B）照射なしの18時間後の「耐性」（左パネル）または「感受性」（右パネル）サンプルのアネキシンV蛍光強度のオーバーレイヒストグラム（影付き灰色）、およびTRAILブロッキング抗体の非存在下（「耐性」/「感受性」）または存在（黒色）下での2Gy照射18時間後のアネキシンV蛍光強度のオーバーレイヒストグラムである。（図3C）TRAILブロッキング抗体の非存在下（-）または存在下（+）、0, 0.5,1および2Gyでの照射から18時間後、4つの「感受性」（S）および4つの「耐性」（R）サンプルからのアポトーシスT4EMリンパ球の割合である。中央線（赤色）（*p <0.05、***p <10-3）のボックスプロットで表示される。（図3D）105/ml（1X）および106/ml（10X）（**p<<10-2）の細胞濃度で2Gy照射後の無関係の「感受性」個体からの9サンプルの放射線感受性である。（図3E）0.4μg/mlのrh-sTRAIL（黒色）の非存在下（「耐性」/「感受性」）または存在下での2Gy照射の後のアネキシンV蛍光強度のオーバーレイヒストグラム、および照射なしの18時間後の「耐性」（左パネル）または「感受性」（右パネル）サンプルのアネキシンV蛍光強度のオーバーレイヒストグラム（影付き灰色）である。（図3F）rh-sTRAIL（0.4μg/ml）の非存在下（-）または存在下（+）で、0,0.5,1および2Gyでの照射から18時間後、4つの「感受性」（S）および4つの「耐性」（R）サンプルからのアポトーシスT4EMリンパ球の割合である。中央線を有する（*p<0.05、***p<10-3）ボックスプロットである。
【図４】マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤1,10-フェナントロリンは、T4EMリンパ球の放射線感受性と相関するT4EMリンパ球のアポトーシスを誘導する。（図4A）80μg/mlの1,10-フェナントロリンを含まず（黒）および含んでの2時間培養後、T4EMリンパ球に対するフローサイトメトリー分析によるmTRAILレベルである。対応するFMO対照のヒストグラムは影付き灰色で表示される。（図4B）4つの「感受性」（S）および4つの「耐性」（R）サンプル由来のT4EMリンパ球においてmTRAILの発現に対する80μg/mlの1,10-フェナントロリンによる処理の効果。中央線（* p <0.05および*** p <10-3）を有するボックスプロットで表示される。（図4C）2時間後、80μg/ mlの1,10-フェナントロリンを含まず（黒）および含んで、T4EMリンパ球のアネキシンV蛍光強度のオーバーレイドヒストグラムである。（図4D）4μg/ml rh-sTRAILまたは4μg/ml rh-sDR5の非存在下または存在下で、80μg/mlの1,10-フェナントロリンを有しない（黒色）または有して、2時間後の、T4EMリンパ球のアネキシンV蛍光強度のオーバーレイヒストグラムである。（図4E）T4EMリンパ球の放射線感受性（横軸）対1,10-フェナントロリンによるアポトーシス（縦軸）の散布図。4（凍結保存; ■）、5（生鮮;●）、および6（凍結保存; ▲）サンプルを含む3つの独立した実験であり、回帰直線を実験ごとに計算した。
【図５】TRAIL/TNFSF10 SNPｓ、放射線感受性と放射線誘発急性および亜急性皮膚炎との間の関連である。rs3815496の遺伝子型別の126人の無関係個体の中央線（赤色）を有し、65人のAA、55人のGAおよび6人のGGを数えたボックスプロットである。
【００１６】
本発明者らは、被験者の放射線感受性を予測するために使用することができるTRAIL/TNFSF10遺伝子に位置するSNPを同定する。特に、同定されたSNPは、急性および/または亜急性皮膚炎、および/またはリンパ球アポトーシスのより高いリスクまたは可能性と関連している。同定されたSNPは、rs3815496およびrs1131532であり、これらは相互間に連鎖不均衡を示す。
【００１７】
第1態様では、同定されたSNPおよび少なくとも0.85であるr2の絶対値を有する連鎖不平衡を有する任意のSNPを使用して、放射線被曝、特に放射性物質の摂取、吸入または蓄積などによる偶発的な放射線被曝後の被験者の放射線感受性を決定することができる。そして、被験者が放射線感受性を示すと判断された場合、医学的モニタリングの増加の利益を受け、または予防的治療などの適切な治療を受けることができる。
【００１８】
しかしながら、放射線曝露の主な原因は、放射線療法、特に癌治療のための放射線療法である。従って、本発明の主な態様は、被験者における放射線療法後の有害作用を生じるリスクを評価するためのバイオマーカーとして、同定されたSNPおよび少なくとも0.85であるr2の絶対値を有する連鎖不平衡を有する任意のSNPの使用である。特に、有害作用は、急性および/または亜急性皮膚炎、およびリンパ球アポトーシス、特にCD4+エフェクター記憶リンパ球のアポトーシスからなる群から選択される。
【００１９】
「放射線療法」という用語は、当技術分野において一般的に使用され、内部および外部放射線療法、放射線免疫療法、およびX線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、および電離放射線の他の形態を含む様々なタイプの放射線の使用を含む複数のタイプの放射線療法を指す。好ましくは、放射線療法は、X線またはガンマ線の使用に関する。
【００２０】
本明細書で使用される用語「TRAIL/TNFSF10遺伝子」は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーである、メンバー10ポリペプチド（遺伝子ID：8743）をコードするポリヌクレオチドを指す。このタンパク質の例示的な配列は、Genbank Accession Number：NP_003801.1である。前駆体をコードするこのポリヌクレオチド（mRNA）の例示的な配列は、Genbank Accession Number：NM_003810.3である。
【００２１】
本明細書に開示される本発明の方法は、インビボ、エクスビボまたはインビトロの方法であり得る。好ましくはインビトロの方法である。
【００２２】
本発明は、さらに、被験者における放射線療法後の有害作用を発症するリスクを評価するための方法に関する。この方法は、rs1131532、rs3815496、および被験者サンプルの0.85のr2の絶対値を有する連鎖不平衡を有する任意のSNPからなる群から選択される一塩基多型（SNP）の対立遺伝子を決定することを含む。好ましくは、前記有害作用は、急性および/または亜急性皮膚炎、および/またはリンパ球アポトーシスである。
【００２３】
特定の態様では、SNP rs3815496の少なくとも1つの対立遺伝子Aの存在は、放射線療法後の有害作用または放射線療法後の有害作用の素因を生じるリスクを示す。放射線療法後に有害作用を発現するリスクは、対立遺伝子Gのみを有する被験者と比較して、SNP rs3815496の1つまたは2つの対立遺伝子Aを有する被験者においてより高い。対立遺伝子Aのホモ接合キャリアである被験者において、ヘテロ接合体キャリアと比較して、リスクまたは素因が増加する。
【００２４】
別の特定の態様では、SNP rs1131532の少なくとも1つの対立遺伝子Cの存在は、放射線療法後の有害作用または放射線療法後の有害作用の素因を生じるリスクを示す。放射線療法後に有害作用を発現するリスクは、対立遺伝子Gのみを保有する被験者と比較して、SNP rs1131532の1つまたは2つの対立遺伝子Cを有する被験者においてより高い。対立遺伝子Cのホモ接合キャリアである被験者において、ヘテロ接合性のキャリアと比較して、リスクまたは素因が増加する。
【００２５】
本発明は、さらに、上記で詳述した被験者における放射線療法後の有害作用を発現するリスクを評価するための方法を実施することを含む方法であって、被験者に対する治療を最適化する方法に関する。
【００２６】
被験者が、放射線療法後に有害作用を発症するリスクの増加に関連するSNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有する場合、医学的モニタリングの増加の利益を得る、または予防治療などの適切な治療を受けることができる。例えば、予防的治療には、組換えTRAILまたはTRAILアゴニスト抗体を用いる治療が含まれ得る。この治療は、放射線療法の前に被験者に提供され得る。
【００２７】
被験者に対する放射線療法後に有害作用を生じるリスクに応じて、医師は、例えば、最も適切な送達手段を選択することおよび/または放射線量を選択することにより、被験者に対する放射線療法手順を最適化することができる。
【００２８】
特定の実施形態では、この方法は、対象に適した放射線量を決定するために適している。この方法は、上記に詳述した被験者における放射線療法後の有害作用を発症するリスクを評価するための方法の実施と、被験者に適切な放射線量の選択とを含む。それによって、上記被験者に適切な放射線量の選択は、この被験者が放射線療法後の有害作用を発症する危険性が高いことに関連するSNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有する場合に減少した放射線量が選択されるようにすること、および被験者が放射線療法後に有害作用を発症するリスクの増大と関連するSNPの対立遺伝子を示さない場合に、最大放射線量が選択されるようにすることである。この方法はさらに、選択された放射線量を被験者に投与/適用する工程を含むことができる。好ましい実施形態において、選択された放射線量は、コンフォメーション照射によって投与される。実際に、この技術は、正確な位置において被験者に正確な放射線量を送達するために適している。
【００２９】
本発明者らは、2つのSNP、すなわちrs3815496およびrs1131532を同定した。
【００３０】
【表Ａ】
2018532420.tif 000002
【００３１】
【表Ｂ】
2018532420.tif 000003
【００３２】
rs3815496およびrs1131532は、ヨーロッパのスーパー集団（European super population）では0.895、アフリカのスーパー集団では1であるr2の絶対値を有する連関不均衡を示している。
【００３３】
本明細書で使用される「多型的部位（polymorphic site）」または「多型部位（polymorphism site）」または「多型」または「一塩基多型部位」（SNP部位）または「一塩基多型」（SNP）は、多様性(divergence)が起こる所与の配列を有する座または位置である。「多型」は、集団中（in a population）の2つ以上の形態の遺伝子または遺伝子内の位置（対立遺伝子）の出現である。多型部位は、それぞれが選択された集団の1％を超える頻度で、10％または20％を超えてもよい頻度で出現する少なくとも2つの対立遺伝子を有する。多型部位は、核酸配列内の既知の位置に存在してもよく、または存在すると判定されてもよい。多型は、遺伝子のコード領域および非コード領域（例えば、プロモーター、イントロンまたは非翻訳領域）の両方で生じ得る。多型は、単一ヌクレオチド部位（SNP）で生じ得るか、または本明細書に記載される挿入または欠失を含み得る。SNPは、NCBIのdbSNPデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）のそれらのrefSNPによって同定される。
【００３４】
本明細書中で使用される「連鎖不均衡」（LD）は、遺伝子座における対立遺伝子頻度から予想される割合よりも大きな割合での、連鎖した対立遺伝子の特定の組み合わせの集団における出現である。従って、第1遺伝子座の遺伝子型が第2遺伝子座（または第3遺伝子座など）を有するLDにある場合、ただ1つの遺伝子座での対立遺伝子の決定は、必然的に他の遺伝子座における対立遺伝子の同一性を提供する。従って、高レベルのLDを有する2つのSNPは、関心対象の対立遺伝子の同一性を決定する際に等しく有用であり得る。従って、あるSNPにおける対立遺伝子の同一性を知ることは、LDにおける別のSNPにおける対立遺伝子同一性を表す。従って、単一の遺伝子座の遺伝子型の決定は、LDにおける任意の遺伝子座の遺伝子型の同一性を提供することができ、2つのSNPが交換可能に使用される可能性が高いほど、連鎖不均衡の程度が高い。LDの座位を評価する際、連鎖不平衡の程度が高い（すなわち、r2の絶対値が0.5である）所与の集団内のそれらの部位は、関心対象の対立遺伝子（すなわち、放射線感受性または有害な影響に関連する）の同一性を予測する上において潜在的に有用である。高度の連鎖不平衡は、r2>0.7の絶対値またはr>0.8の絶対値によって表すことができる。さらに、高度の連鎖不平衡は、r2>0.85の絶対値またはr2>0.9の絶対値またはr2>0.95の絶対値で表すことができる。好ましい実施形態において、高度の連鎖不平衡は、r2の絶対値が1で表される。より具体的には、r2の絶対値が1である場合、2つのSNPは交換可能である。
【００３５】
LDは、遺伝子型-表現型関連研究に有用であり得る。例えば、1つのSNP部位（例えば、「A」）における特定の対立遺伝子が、当時の遺伝的関連研究では、数学的推論によって特定の臨床結果（例えば、この臨床結果「B」と呼ぶ）の原因である場合、最初のSNPと有意なLDにあるいずれのSNP（例えば「C」）は、臨床結果との関連を示す。すなわち、AがB（すなわち、A-B）と関連し（〜）およびC-Aである場合、それはC-Bに従う。
【００３６】
このSNPと別のSNPとの連鎖不均衡を決定するためにツールが利用可能である。特に、そのようなデータはウェブサイトwww.broadinstitute.org/mpg/snap/で入手できる。
【００３７】
場合によって、ヨーロッパのスーパー集団、アフリカのスーパー集団および東アジアのスーパー集団からなる群から選択される集団について、連鎖不平衡（例えば、r2の絶対値）が計算される。
【００３８】
rs3815496と少なくとも0.85であるr2の絶対値を有する連鎖不平衡を有するSNPは、以下の群における一つから選択することができる：
1. rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs3815496, rs3181143, rs3181142, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, 及び rs4894557;
2. rs1131532, rs1131542, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1597086, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259, 及び rs9880475, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs1131532, rs3815496, rs3181143, rs3136600, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, 及び rs1597086;
3. rs3136600;
4. rs1131532, rs9811673, rs9811639, rs3136600, rs3815496, rs3181143, rs3136606, rs3136607, rs3819773, rs1126161, rs63562861, rs1131542, rs11720451, rs9859809, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799 及び rs4894557。
【００３９】
rs1131532と少なくとも0.85であるr2の絶対値を有する連鎖不平衡を有するSNPは、以下の群における一つから選択することができる：
1. rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs1131568, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs3181142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673 及び rs9811639;
2. rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086, rs1126161, rs9811639, rs1992869, rs6414542, rs9880799, rs4894557, rs9859259 及び rs9880475, より好ましくは、以下からなる群から選択される： rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs3136600, rs6807069, rs6783667, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1597086 及び rs1126161
3. rs1131542, rs11720451, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs12696330, rs9811673, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs9811639, rs62282578, rs9849142, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs9859809 及び rs63562861;
4. rs3815496, rs1131542, rs63562861, rs11720451, rs9859809, rs3819773, rs3136607, rs3136606, rs6807069, rs6783667, rs9869255, rs9811650, rs9811646, rs62282578, rs3181143, rs1992868, rs1992869, rs6414542, rs1597086, rs9880799, rs1126161, rs4894557, rs9811673, 及び rs9811639。
【００４０】
より具体的には、項目1はヨーロッパのスーパー集団、項目2はアフリカのスーパー集団、項目3は東アジアのスーパー集団、項目4はヨーロッパとアフリカのスーパー集団の共通のSNPに関する。
【００４１】
好ましい実施形態では、SNPは、rs9811673、rs9811639、rs3815496、rs3181143、rs3136606、rs3136607、rs3819773、rs1126161、rs63562861、rs1131542、rs11720451、rs9859809、rs6807069、rs6783667、rs9869255、rs9811650、rs9811646、rs62282578、rs1992868、rs1992869、rs6414542、rs1597086、rs9880799、rs4894557からなる群から選択することができる。それらは、rs1131532およびrs3815496の両方と少なくとも0.85であるr2の絶対値を有する連鎖不均衡を有し、ヨーロッパとアフリカのスーパー集団の間で共通している。
【００４２】
本発明による方法、使用およびキットは、本明細書中に開示されるような1つのSNPまたはそれらの組み合わせで実施され得る。
【００４３】
好ましい実施形態では、被験者はヒトである。場合によって、被験者は、ヨーロッパのスーパー集団、アフリカのスーパー集団または東アジアのスーパー集団に属することができる。
【００４４】
遺伝子型決定
この方法は、被験者由来のサンプル中の本発明のSNPの対立遺伝子を決定することを含む。これは、被験者からのサンプルを提供する前工程を含むことができる。
【００４５】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、SNPの遺伝子型決定に適した細胞または遺伝物質を含有する目的の被験者から得られた、またはそれに由来する組成物を指す。サンプルの供給源は、新鮮な、凍結したおよび/または保存した器官または組織サンプルまたは生検または吸引物からの固体組織;血液または任意の血液成分; 脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液であってもよい。サンプルはまた、初代または培養細胞であってもよい。場合により、サンプルは、疾患組織/器官、特に癌または腫瘍から得ることができる。組織サンプルは、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、抗生物質などの天然の組織と自然に混ざらない化合物を含有してもよい。好ましい実施形態において、サンプルを、唾液、尿、全血、血漿、または血清サンプルである。サンプルは、従来の技術に従って収集し、本発明の方法で直接使用するか、または使用前に保存することができる。サンプルを使用前に処理することができる。
【００４６】
SNPの対立遺伝子は、当業者に公知の任意の方法によって、DNAまたはRNAのレベルで決定され得る。
【００４７】
これらの方法には、直接シークエンシングに基づく方法、ハイブリダイゼーションに基づく方法、プライマー伸長に基づく方法、連結に基づく方法、多型を含む分子のコンフォメーションに基づく方法、または侵襲的切断に基づく方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
特定の実施形態において、SNPの対立遺伝子は、周知の技術、好ましくは次世代シークエンシング技術を用いた直接シークエンシングによって検出される。シークエンシングは、TRAIL/TNFS10遺伝子の完全な配列、またはより好ましくはrs3815496および/またはrs1131532を含むゲノム領域上で行うことができる。
【００４９】
別の実施形態において、SNPの対立遺伝子は、選択的ハイブリダイゼーションによって検出される。ハイブリダイゼーションに基づく遺伝子型決定法には、サザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、特にSNPマイクロアレイ（増幅産物が、固体支持体上に固定化された標的配列へのハイブリダイゼーションによって分析される）上の遺伝子型同定、特異的対立遺伝子にのみハイブリダイズするように設計された分子ビーコンを用いる方法、および動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（DASH）アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
別の実施形態において、SNPの対立遺伝子は、選択的増幅によって検出される。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、タッチダウンPCR（TD-PCR）、液滴デジタルPCR（ddPCR）、定量的PCR（q-PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）および核酸配列に基づく増幅（NASBA）などの当技術分野で公知の様々な技術に従って行うことができる。これらの技術を、市販の試薬およびプロトコールを用いて行うことができる。好ましい技術は、対立遺伝子特異的PCR、テトラプライマーARMS-PCRを用いる(Shu et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29(17): e88)。
【００５１】
SNPの対立遺伝子は、限定するものではないが、制限断片長多型（RFLP）分析、特異的核酸構造を切断するフラップエンドヌクレアーゼの活性を中継する侵入アッセイ、酵素消化、Taq DNAポリメラーゼの5'-ヌクレアーゼ活性に依存するTaqManアッセイまたは5'-ヌクレアーゼプローブアッセイ（例えば、液滴デジタルPCR（ddPCR）または定量PCR（q-PCR）を用いて実施）; オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ライゲーションローリングサークル増幅またはL-RCA(Xiaoquan et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29(22): e116)、または特異的多型対立遺伝子に直接隣接する塩基とのプローブのハイブリダイゼーションに依存するプライマー伸長に基づく方法を含む酵素に基づく方法によっても決定され得る。
【００５２】
SNPの対立遺伝子はまた、PCR-SSCP、MALDI-TOF質量分析法(Griffin and Smith, 2000, Trends in Biotechnology, 18: 77〜84)、変性-HPLCおよび温度勾配ゲル電気泳動（TGCE）などの分子の立体配座、重量或いはサイズの差異に依存する方法を用いて決定することができる。
【００５３】
種々の方法を、均質反応および固体支持体上の反応を含む様々な反応形式で実施することができる。放射性検出、発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、ゲル電気泳動、および質量分析を含むが、これらに限定されない様々な検出方法をSNPの検出に用いることができる。
【００５４】
好ましくは、SNPの対立遺伝子は、特定の対立遺伝子にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸プローブを用いて決定される。
【００５５】
特定の実施形態において、SNP rs1131532の対立遺伝子は、多型部位rs1131532において、C対立遺伝子および/またはT若しくはG対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブに特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて検出される。好ましくは、多型部位rs1131532の対立遺伝子は、C対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブおよび/またはT対立遺伝子若しくはG対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブ、特に本発明のキットの一部として以下に記載される任意のプローブを用いて、5'-ヌクレアーゼプローブアッセイによって決定される。
【００５６】
別の特定の実施形態では、SNP rs3815496の対立遺伝子は、多型部位rs3815496において、A対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブ、および/またはG対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて検出される。好ましくは、多型部位rs3815496の対立遺伝子は、A対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブ、および/またはG対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブ、特に本発明のキットの一部として以下に記載されている任意のプローブを用いて、5'-ヌクレアーゼプローブアッセイによって決定される。
【００５７】
別の態様において、本発明は、以下のものを含むキットにも関する：
【００５８】
i）本明細書中に開示されるSNPに特異的に結合またはハイブリダイズし得る少なくとも1つの核酸プローブ、および/または
【００５９】
（ii）増幅反応における使用に適した少なくとも1組のプライマーのセットであって、ここで開示されるSNPを増幅するプライマーのセット
【００６０】
および場合によって、このようなキットを使用するためのガイドラインを提供するリーフレット。
【００６１】
一組のプライマーは、TRAIL/TNFSF10遺伝子全体または本明細書に開示されるSNPの一つの断片のみを増幅させることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、核酸プローブは、検出可能なシグナルを生成する少なくとも1つのレポーター分子に結合され得る。検出可能なシグナルは、例えば、蛍光シグナル、発光シグナルまたは有色シグナルであり得る。
【００６３】
好ましい実施形態では、核酸プローブはフルオロフォア - クエンチャー対に結合される。これらのプローブは、5'-ヌクレアーゼプローブアッセイにおいて特に有用である。5'-ヌクレアーゼプローブは、FRETを介して相互作用するドナー - アクセプターフルオロフォア対で標識された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブである。プローブは、PCRプライマーと同時に標的DNA鎖にハイブリダイズするように設計されている。Taq DNAポリメラーゼがプライマーを伸長すると、それはプローブに遭遇し、その5'-ヌクレアーゼ活性の結果として、それはプローブを切断する。プローブの切断は、ドナーフルオロフォアおよびクエンチャー分子の分離をもたらし、蛍光シグナルの強度の増加をもたらす。
【００６４】
文献（例えばMarras et al. Methods Mol Biol. 2006;335:3-16を参照する）およびサプライヤーのカタログには、広範囲のフルオロフォア - クエンチャー対が詳述されている。
【００６５】
フルオロフォアの例には、限定されないが、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、テトラクロロフルオレセイン（TET）およびヘキサクロロフルオレセイン（HEX）などのフルオレセイン誘導体、Cy2、Cy3およびCy5などのシアニン色素、テトラメチルローダミン（TMR）、オレゴングリーン染料およびテキサスレッドが含まれる。
【００６６】
クエンチャーの例には、限定されないが、DABCYL（4-（4-（ジメチルアミノ）フェニルアゾ）安息香酸）、QSY（登録商標）クエンチャー(Invitrogen, Carlsbad, CA)、ECLIPSE（登録商標）クエンチャー（Epoch Biosciences, Bothell, WA）およびBHQ（登録商標）（BHQ-1,2,3 (Biosearch Technologies, Inc. Novato CA)）およびDDQ-1または-2が含まれる。
【００６７】
特定の実施形態では、フルオロフォア - クエンチャー対は、HEX-BHQ1および6-FAM-BHQ1から選択される。好ましくは、別個のフルオロフォア - クエンチャー対は、各核酸プローブタイプ、すなわち、第1対立遺伝子に特異的なプローブ、およびそれらのシグナルを区別するために、本明細書に開示される、特定のSNPについて他の対立遺伝子に特異的なプローブに結合される。
【００６８】
特に、本明細書に開示されるSNPの第1対立遺伝子に特異的な核酸プローブは、その5'末端に結合したヘキサクロロフルオレセイン、およびその3'末端に結合したBHQ1クエンチャーを含むことができる。SNPの他の対立遺伝子に特異的な核酸プローブは、その5'末端に結合した6-カルボキシフルオレセイン、およびその3'末端に結合したBHQ1クエンチャーを含むことができる。
【００６９】
キットはまた、本明細書に開示されるSNPを検出するために使用され得る少なくとも1つの分子ビーコンまたはマイクロアレイを含み得る。
【００７０】
キットは、前記少なくとも1つの核酸プローブのハイブリダイゼーションを検出するため、および/または前記遺伝子改変または多型部位を増幅および/または検出するための1つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。特定の実施形態では、キットは、液滴デジタルPCRを実施するために必要な試薬をさらに含む。
【００７１】
また、本発明は、被験者における放射線療法後の有害作用を発症するリスクを評価するためのこのキットの使用に関し、前記有害作用は、急性および/または亜急性皮膚炎、および/またはリンパ球アポトーシスであり、または被験者に適した放射線量を決定するための方法を提供する。
【００７２】
本発明の方法について上記開示された全ての実施形態もこの態様において意図される。
【００７３】
本発明は、TRAIL変調の利点も有する。
【００７４】
本発明のさらなる態様および利点は、以下の実施例で説明されるが、これは例示的なものであり限定的ではないと見なされるべきである。
【００７５】
実施例
結果
TRAIL/TNFSF10発現はT4EMにおける放射線感受性と相関する
電離放射線誘発アポトーシスに対するヒトTリンパ球の亜集団の感受性を、免疫表現型検査およびアネキシンV標識に基づいて以前に定義された放射線感受性アッセイを用いて、健常献血者のPBMCサンプルの照射（0-2Gy）の18時間後に定量した。CD62L陽性Tリンパ球亜集団はアポトーシスを起こさなかったが（図1）、CD62L陰性T4EMリンパ球では用量依存的にアポトーシスが増加していた（図2A）。線量-生存曲線の指数回帰係数を用いて、それらのT4EMリンパ球亜集団の放射線感受性に従ってヒトPBMCサンプルを分類し、「感受性」および「耐性」サンプルをT4EM放射線感受性表現型分布の2つの末端で定義した。示差的に発現される遺伝子を同定するために、4つの「感受性」および4つの「耐性」日新鮮サンプルのフローソートされたT4EMリンパ球のアレイベースの発現プロファイリングを行った（図2B;黒丸）。バックグラウンドに対して少なくとも3倍およびp <0.01の発現レベルを2以上（または0.5未満）の「感受性」対「耐性」比を用いて、本発明者らは、「感受性」サンプルにおいてより高いレベル（平均DF2.40; 2.01〜4.42）で発現する31の遺伝子、より低いレベル（平均DF -2.67; -2.01〜-7.48）で発現される33個の遺伝子を同定した。オントロジー分析は、サイトカイン - サイトカイン受容体相互作用（hsa04060）、免疫応答（GO：0006955）、および死亡（GO：0016265）の3つの重要な経路を同定した。「感受性」サンプルでアップレギュレートされた遺伝子のうち、TRAIL/TNFSF10は、2.34倍高い発現レベルを示し、さらに試験された。「感受性」、「中央値」及び「耐性」サンプル（それぞれ、図2Bの放射線感受性表現型の分布における「赤色」、「緑色」および「青色」ドットによって示される）のフローソートされたT4EMリンパ球におけるTRAIL/TNFSF10 mRNA発現レベルは、TRAIL/TNFSF10 mRNAレベルが「耐性」と比較して「感受性」において5.7倍高く、一方、「中央値」放射線感受性を有するサンプルのTRAIL/TNFSF10 mRNAレベルが中間であることを示した（図2C）。試験した45のサンプルのうち1つだけが、不一致のT4EMリンパ球放射線感受性およびTRAIL/TNF10の発現レベルを示した。
【００７６】
本発明者らは、2Gy照射の2,4,6および24時間後に、「感受性」および「耐性」サンプルからの独立した三つの種類のT4EMリンパ球上のそれらのmRNAレベルの多重化測定を行った。デコイ受容体TNFRSF10d/DcR2の発現は、T4EMリンパ球で検出限界未満であった（データ示さず）。TRAIL/TNFSF10、デコイ受容体TNFRSF10d/DcR2（図示せず）およびプロアポトーシス受容体TNFRSF10a/DR4 mRNAレベルに対する照射の有意な効果は、「感受性」または「耐性」サンプルで見られなかった（図2D、左および中央パネル）。対照的に、「耐性」サンプルおよび「感受性」サンプルの両方において、プロアポトーシスレセプターTNFRSF10b / DR5のmRNAレベルは、照射後4時間で増加し始め、照射後4,6および24時間で高値を維持した（2D、右パネル）。TNFRSF10b / DR5発現レベルのこの増加は、マウスおよび他の細胞型における放射線誘発アポトーシスにおけるこのプロアポトーシス受容体の重要性を示した以前の研究と一致する(Coureuil et al., 2010, PLoS ONE. 5:e12134; Luce et al., 2009, Carcinogenesis. 30:432〜439; Finnberg et al., 2005, Mol. Cell. Biol. 25:2000〜2013)。現在の結果は、休止T4EMリンパ球におけるTRAILが、放射線誘発プロアポトーシスDR5受容体に結合することによってアポトーシスを媒介することを示唆している。
【００７７】
T4EMの放射線感受性はmTRAIL発現に依存する
TRAILは可溶性（sTRAIL）または膜結合型（mTRAIL）であり得る(Schneider et al., 1998, J. Exp. Med. 187:1205〜1213; Wajant et al., 2001, Oncogene. 20:4101〜4106)。T4EMリンパ球の放射線誘発アポトーシスに使用された実験条件下で、培地中のsTRAILのレベルは、サンドイッチELISA検出レベル（<20pg / ml;データ示さず）未満であった。 本発明者らは、mTRAILに関する試験に焦点を当てた。CD253を含むモノクローナル抗体パネルを用いて、それらはフローサイトメトリーによる細胞表面mTRAIL発現のレベルを測定した。mTRAILの4倍高い発現が、「耐性」サンプルと比較して「感受性」サンプルのT4EMリンパ球で見出された（図3A）。T4EMリンパ球における放射線誘発アポトーシスにおけるmTRAILの役割を特徴づけるために、「感受性」および「耐性」サンプルを、ヒトTRAIL（CD253;クローンRIK-2）に対する可溶性ブロッキング抗体の存在下で照射した。「耐性」サンプル中のT4EMリンパ球のアポトーシスは、ブロッキング抗体の存在によって影響を受けなかったが、TRAILのブロッキングは、「感受性」サンプル中のT4EMリンパ球における放射線誘発アポトーシスの強い阻害をもたらし、2.0Gyの照射後でさえ、「耐性」サンプルで観察されたレベルと同様になるアポトーシスのレベルを有する（図3Bおよび3C）。
【００７８】
細胞濃度の10倍の増加は、サンプル感度分類にかかわらず、アポトーシス誘導を増加させなかった。9つの「感受性」サンプルのセットにおいて、10倍高い細胞濃度は、T4EMリンパ球において1.5倍低いアポトーシス誘導をもたらした（図3D）。これらの結果は、組換えヒト可溶性TRAIL（rh-sTRAIL）の添加によって消滅させることができる作用モードである、mTRAILの自己分泌モードの作用を示した（図3Eおよび3F）。
【００７９】
メタロプロテアーゼはT4EMリンパ球におけるmTRAILレベルを調節する
mTRAILの放出は、メタロプロテアーゼ活性に依存する。本発明者らは、広範囲のメタロプロテアーゼ阻害剤である1,10-フェナントロリンの効果を試験した(Yan et al., 2011, CORD Conference Proceedings.108〜111)。1,10-フェナントロリンの添加の2時間後、「耐性」サンプルおよび「感受性」サンプルにおいてT4EMリンパ球においてmTRAIL発現の増加が観察された（図4Aおよび4B）。しかし、1,10-フェナントロリン処理した「耐性」サンプル中のT4EMリンパ球におけるmTRAILのレベルは、未処理の「感受性」サンプル（図4B）におけるそれよりも低いままであり、mTRAIL提示における制限因子は、TRAIL/TNFSF10遺伝子発現であることを示唆している。
【００８０】
プロアポトーシスTRAIL-受容体DR5（データ示さず）の発現の増加に関連するmTRAIL発現の増加は、rh-sTRAILまたは組換えヒト可溶性DR5受容体（rh-sDR5）によって阻害され得る（図4D）アポトーシスの急速な誘導と関連していた（図4C）。興味深いことに、1,10フェナントロリン誘発アポトーシスに対するT4EMリンパ球の感受性とそれらの放射線感受性との間の有意な相関が観察された（図4E）。従って、T4EMリンパ球における放射線誘発アポトーシスは、mTRAIL細胞表面発現に依存し、これは、メタロプロテアーゼ活性によって調節されている。
【００８１】
TRAIL/TNFSF10遺伝子座とT4EMリンパ球の放射線感受性との間の遺伝的関連
TRAIL/TNFSF10遺伝子座とT4EMリンパ球の放射線感受性との間の遺伝的関連性を調べるために、eQTLに関連するかまたはeQTLとして作用する可能なSNPを含む、TRAIL/TNFSF10遺伝子のコード領域およびフランキング領域の選択された領域が、遺伝子型決定された。以前にT4EMリンパ球の放射線感受性について特徴付けられた373人の個体由来のTRAIL/TNFSF10遺伝子を包含し、遺伝性および分離分析に供された4.2kb領域(Schmitz et al., 2007, Int J Radiat Oncol Biol Phys. 68:1169〜1177)をシークエンシングした。表1は、調査された集団におけるそれらの頻度および位置とともに、同定された36の多型マーカーの結果をまとめたものである。Family-Based Association Testing（FBAT）による15の同定された頻繁な変異体（MAF> 5％）およびT4EMリンパ球放射線感受性の間の単一マーカー関連分析は、3つのSNPについて有意な関連を示した；rs3815496（p = 0.03;イントロン3、MAF = 0.28）、rs1131532（p = 0.04;エクソン5、MAF = 0.28）、rs1131535（p = 0.05; 3'UTRエクソン5、MAF = 0.38）である。SNP rs1131532およびrs3815496は強い連鎖不平衡にあり、rs1131535と部分的に連鎖していた（r2が0.5未満、具体的にはそれぞれ0.49および0.47である）。シークエンシングされた領域のいくつかの他のSNPは、わずかながらも有意に関連していることが見出された（表2）。TNFSF10/TRAIL遺伝子の15の最も頻度の高いSNPとT4EMリンパ球の放射線感受性との間のマルチマーカー関連試験は、Family based MM association test（FBAT-MM）（p = 0.02）およびFisher製品（p = 0.04）によって有意に示され（P = 0.04）、TRAIL/TNFSF10遺伝子の中または近くのT4EMリンパ球の放射線感受性への遺伝的寄与を実証する。rs3815496の遺伝子型によるT4EMリンパ球放射線感受性中央値を用いて126人の無関係な個体の選択の分析は、T4EMリンパ球における放射線誘発アポトーシスの高レベルのリスク対立遺伝子としてAを同定した（図5）。
【００８２】
TRAIL/TNFSF10 SNP rs1131532、rs3815496、およびrs1131535と、CD8+リンパ球アポトーシスと乳癌放射線療法誘発皮膚毒性との遺伝的関連
Co-Ho-RT試験(Azria et al. 2010, The Lancet Oncology, 11(3), 258〜265)に含まれている、113の遺伝子型同定された乳癌患者のセットにおいて、同定されたTRAIL/TNFSF10 SNPとCD8+リンパ球アポトーシスとの関連性および臨床放射線感受性エンドポイントについて試験した。これらの患者からの血液サンプルは、Ozsahinら(Clin Cancer Res. 11:7426〜7433,2005)によると、放射線誘導性のCD8+  Tリンパ球アポトーシスを特徴とする。遺伝的関連研究では、rs3815496（MAF = 0.28、P = 0.06）、rs1131532（MAF = 0.28、P = 0.06）、およびrs1131535（MAF = 0.44、P = 0.09）である3個のSNPと放射線誘導されたCD8+ Tリンパ球のアポトーシスとの関連への傾向を示した。最後に、これら3種のTRAIL/TNFSF10 SNPとの関連について、急性および亜急性皮膚炎（10例）、急性紅斑（44例）、急性色素沈着（7例）、後期線維症（28例）および後期毛細血管拡張症（3例）を評価した。これらの3つのSNPのいずれも、後期線維症、急性紅斑、または急性色素沈着と関連していなかった（表3）。後期毛細血管拡張に関連が示されたが（表3）、症例数が不十分であるため、この結果は考慮されない。興味深いことに、急性および亜急性皮膚炎では、rs3815496（p = 0.047、効果対立遺伝子= A、OR：3.88,95％ci：0.87-17.22）およびrs1131532（p = 0.045、効果対立遺伝子= C、OR 3.90,95％ci：0.88-17.30）とは強い関連が同定されたが、rs1131535とはそうではなかった。
【００８３】
放射線療法の進歩は、個々の放射線感受性を予測するために使用することができる検証された検査および遺伝マーカーの欠如に苦しんでいる。ヒトT4EMリンパ球照射誘発アポトーシスは、休止T4EMリンパ球におけるTRAIL/TNFSF10の発現が、インビトロでこれらのリンパ球の電離放射線に対する高いアポトーシス応答を有する個体を同定することを示す。このT4EMリンパ球の感受性を、抗TRAIL/CD253ならびに外因性sTRAILによって調節することができ、TRAILシグナル伝達を伴うT4EMリンパ球アポトーシスは、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害によってインビトロで誘導することができた。最後に、本発明者らは、TRAIL/TNFSF10遺伝子内の3つのSNPとT4EMリンパ球放射線感受性との関連性を同定し、それは、以前に有意な遺伝性を示し、その分離がメンデルモードの転送（a Mendelian mode of transmission）との適合性を示したことが示された定量的形質である。放射線に対する臨床応答における、およびその生理病理学におけるTRAILの役割は、これらの3つのTRAIL/TNFSF10 SNPのうちの2つの高アポトーシスに関連する対立遺伝子と、乳癌患者のコホートにおける放射線療法誘導性皮膚反応（RISR）のサブセットである急性および亜急性皮膚炎との間の関連によって示唆される。同定されたSNPの中で、rs1131532は、全身性炎症性バイオマーカーP-セレクチンの濃度と関連することを以前に記載されていた(Schnabel et al. 2009, Circulation: Cardiovascular Genetics, 2(3), 229〜237)。本発明者らは、TRAIL/TNFSF10 SNPと急性紅斑、または急性過色素沈着との関連を同定しなかった。
【００８４】
Ozsahinによれば、TRAIL/TNFSF10 SNPとCD8+ Tリンパ球アポトーシス表現型との間に傾向が存在するが、本発明者らは、リストされたTRAIL/TNFSF10 SNPと後期線維症との間の関連を検出しなかった。後期線維症は、以前はアポトーシスに対するリンパ球耐性に関連していた放射線療法の重篤な合併症である。CD8リンパ球の低アポトーシスと後期線維症との間の関連性は、Ozsahinら(Ozsahin et al., 2005, Clin Cancer Res. 11:7426〜7433)、いくつかの独立した研究で再現された。本研究で用いた放射線感受性表現型戦略は、L-セレクチン/ CD62L陰性CD4陽性リンパ球のみに依存し、特にアポトーシス耐性L-セレクチン陽性リンパ球を除外している点で著しく異なる。リンパ球アポトーシス、放射線感受性、および遅発毒性の間の関連性をさらに調査するために、放射線に続くL-セレクチン放出/ダウンレギュレーションにおける個体間差異を研究することが適切であり得る。全体として、本研究は、TRAIL/TNFSF10 SNPに関連するリンパ球放射線誘発アポトーシスにおけるTRAILの機能を強調している。GWASの力を提供する国際コンソーシアム研究は、同定されたTRAIL/TNFSF10 SNPの放射線療法毒性への相対的貢献を評価することを可能にする(Kerns et al., 2013, Radiother Oncol. 107:372〜376)。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】
方法
健康な献血者
すべてのサンプルは、健常な正常なボランティアから採取した静脈血から、午前9時から午前11時まで調製した。健康なボランティアの参加に先立って医学的インタビューが行われ、Fondation Jean Dausset-CEPHまたはパリのEtablissement Francais du Sang, Hopital Saint Louisの地方倫理ガイドラインに従って、すべてのドナーから書面による同意が得られた。
【００８９】
サンプル
末梢血単核細胞（PBMC）を、標準化手順により、新鮮な（6時間以内、平均180分以内）抗凝固処理した血液サンプルから調製した。簡潔には、2倍に希釈した血液30mlを10mlのHistopaque（登録商標）-1077（Sigma-Aldrich）で下層にし、2000gで20分間遠心分離した。収集した中間層をRPMI1640/15％ウシ胎仔血清（FCS）40mlで2回洗浄し、さらに記載されているように使用し、または凍結保存のためにFCS/10％DMSOに回収した。4mlの血液に対応する各1mlの画分を、制御された温度低下を用いて直ちに凍結させ、液体窒素中に保存した。クライオチューブの56℃水浴（45秒）への急速移送、1mlのFCSの添加、および12mlのRPMI/15％FCSへの内容物の移送によって、細胞の解凍を行った。解凍した細胞を2回洗浄し、最終的に適切な容量の培地（RPMI1640/15％FCS）に再懸濁させた。
【００９０】
古典的なフェノール/クロロホルム法によりPBMCからDNA抽出を行った。収率および純度は、260および280nmで分光光度的に評価した（Thermo Scientific NanoDrop（商標）1000）。家族関係は口頭インタビューから記録され、HLA-Aシークエンシングを用いて、家族ベースの関連分析から発表された家族性の相互関係との不適合を示すサンプルを除外した。
【００９１】
モノクローナル抗体およびタンパク質
すべての蛍光色素結合モノクローナル抗体を、滴定によって決定される飽和状態で使用した。抗ヒトCD抗体は、Becton Dickinson ImmunoCytometry Systems（CD62L-PE、CD62L-PECy5.1、CD14-PECy5.1、CD-235a- PECy5.1、CD27-PECy5.1、CD4-PECy7、CD19-PECy7、 CD45RA-APC、CD8-APCH7）、Beckman Coulter（CD3-PETxR）、Biolegend（CD253/TRAIL-PE、CD62L-BV421、CD3-BV605）から、またはR＆D Systems（CD262 / DR5-APC）から入手することができる。組換えヒト可溶性TRAIL（rh-sTRAIL）および組換えヒト可溶性DR5（rh-s-TRAILはR＆D Systems、Becton DickinsonのアネキシンV-FITCおよびSigma-Aldrichの1,10-フェナントロリンであった。
【００９２】
アポトーシス誘導
RPMI1640/15％FCS中の約5×105細胞/ml（または結果セクションで特定された細胞密度）の細胞懸濁液を137Cs源(IBL637; Cis-Bio international/Scherring, Saclay, France)で約0.5Gy/分の線量速度で照射し、組換えヒト可溶性TRAIL（rh-sTRAIL）、組換えヒト可溶性DR5（rh-sDR5）、抗TRAIL細胞毒性ブロッキング抗体（CD253;クローンRIK-2）または1,10-フェナントロリン（DMSO中の200mMのストック溶液）の示された濃度の存在下でインキュベートした。記載された全ての実験は、我々の実験手順との適合性について事前に試験された熱不活性化FCSの同じバッチで行った。 結果セクションで指定されているように18時間以下のインキュベーションは、37℃および5％CO2であった。
【００９３】
リンパ球サブセット同定およびアポトーシス定量のための細胞標識
処理した細胞を集め、アネキシンV緩衝液（140mM NaCl、5mM CaCl2、10mM HEPES; ph7.4）で洗浄し、100μl中の蛍光色素標識CDマーカーとの組み合わせで2.5μlのアネキシンV-FITCで30分間染色した。遺伝子発現分析用の細胞選別のために、アネキシンV陽性細胞を除外し、CD3標識を省略してTCR媒介活性化シグナル伝達を回避した。さらに、CD14およびCD235aは、選別ゲートの汚染の影響を受けやすい単球および網状赤血球を排除するために含まれた。CD27は、サンプル操作手順により一過性にCD62Lを失った中心記憶リンパ球による選別ゲートの汚染を避けるために、凍結保存されたサンプルの種類に含まれていた。CD253（mTRAIL）の定量のために、アネキシンV、CD253、CD3、CD4およびCD62Lを含む補償の必要性を制限するように設計されたコンパクトなパネルを使用した。
【００９４】
フローサイトメトリー
細胞をアネキシンV緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーの直前に、0.2μg/ mLのHoechst 33258(Molecular Probes, Eugene,OR)を含む50μLのアネキシンV緩衝液を死細胞排除のために添加した。サンプルを、3レーザーCyAn LXシステム(DakoCytomation, Fort Collins, CO)または5レーザーSORP LSRII（Becton Dickinson）を用いて分析した。細胞選別は、特注の5レーザーInFluxシステム（Becton Dickinson）を用いて行った。全てのフィルターはChroma Technologies Inc., Brattleboro, Vermontからであった。すべての蛍光シグナルを対数増幅し、リストモードで保存した。CompBeads（Becton Dickinson）を使用して、個々の実験におけるスピルオーバーの決定を補助した（アネキシンV-FITCの代わりにCD3-FITCが使用された）。特に、mTRAILの定量化(SortWare; Becton Dickinson or Flowjo version 9.6.4 ; Treestar, Ashland, OR)のために、必要に応じてFluorescent Minus One（FMO）コントロールを使用した。すべての種類は、1.5滴の拡張一致マスクを用いて、1滴の計量モードで実施される。二重排除は、トリガーパラメータ（FSC）対飛行時間をゲーティングすることによって実施した。
【００９５】
データ分析
FlowJoを用いてデータを分析した。リストモードファイル分析は、アポトーシスリンパ球（より低いFSC、より高いSSC）を含むように形作られた大きな散乱ゲートを使用することによって、非リンパ球事象、主に単球の除外によって進行した。続いて、死んだ細胞をHO33258蛍光に基づいて除外した。Tリンパ球は、陽性PETxR（CD3）蛍光に基づいて同定された。PECy7（CD4）対APCH7（CD8）ヒストグラムは、CD4陽性Tリンパ球（T4）およびCD8陽性Tリンパ球（T8）の同定を可能にした。APC（CD45RA）対PE（CD62L）ヒストグラムは、ナイーブ（CD62L + CD45RA +）、中央メモリー（CM; CD62L + CD45RA-）、エフェクターメモリー（EM; CD62L-CD45RA-）、および末端エフェクター（TE; CD62L- CD45RA +）の間で弁別した。アポトーシス細胞の割合は、同定された亜集団の全てに対してFSC対FITC蛍光（アネキシンV）の二変量プロット上に同一ゲートを適用することによって決定した。用量効果曲線は、少なくとも4回の用量を使用して生成され、以前に記載されたように1,10-フェナントロリン感受性および放射線感受性の定量的評価に使用された(Schmitz et al., 2003, Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57:769〜778)。
【００９６】
マイクロアレイcDNAハイブリダイゼーション解析
選別直後に遠心分離によって回収した目的細胞をRL/T緩衝液（Qiagen）で溶解し、RNA抽出まで凍結保存した。総RNAは、RNeasy Plus Micro Kit（Qiagen）を用いて最小300,000個の細胞から抽出した。RNAサンプルをRNaseフリー水に再懸濁し、-80℃で保存した。RNA収量および純度を、260および280nmで分光光度的に(Thermo Scientific NanoDrop(TM) 1000)評価した。Bioanalyzer 2100（Agilent）を用いてRNA完全性を評価した。マイクロアレイ実験およびデータ解析の一部は、Affymetrix推奨手順に従ってPartnerChip (S. B., Evry, France)によって実施した。4つの感受性個体および4つの耐性個体から標的を調製した。等しい割合で個々の品質管理の後、標的をプールし、Affymetrix 2サイクル技術プロトコールに従ってHU133 2.0 plusアレイ（54645プローブセット）にハイブリダイズさせた。GeneChip Scanner 3000（Affymetrix）で蛍光画像を検出した。GCOSソフトウェア（Affymetrix）を用いて、発現データおよび生の発現データ（CELファイル）を生成した。品質管理は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびβ-アクチン対照プローブセットの3'/5'比に基づいて評価した。
【００９７】
リアルタイム定量PCR遺伝子発現解析
三種類のqPCR遺伝子発現試験を、15μlの1工程RT-qPCR混合物を含む、MicrAmp光学管（Applied Biosystems）に細胞を直接沈着させることによって行った。RT-qPCR前増幅混合物は、Platinum TaqポリメラーゼおよびSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen）、目的の転写物（表4; Applied Biosystems）に特異的なTaqmanプライマー-プローブの混合物（0.2X濃度で）、CellsDirect One-Shot qRT-PCRバッファー（Invitrogen）、およびSuperaseIn RNase阻害剤を含有する。細胞選別の直後に、サンプルを完全に混合し、逆転写（55℃で10分間、50℃で50分間）し、前増幅した（95℃で15秒間および62℃で45秒間の14サイクルのPCR）。予備増幅後、サンプルをHT7900（Applied Biosystems）上で遺伝子特異的定量PCR（95℃/ 15秒、62℃/ 45秒の35サイクル）のために10倍に希釈した。すべてのプライマーは標準的なTaqmanアッセイ（Applied Biosystems）であり、反応条件は製造業者の指示に従った。結果は、内部増幅された参照遺伝子（VIC標識RPLP0、ACTB、またはGAPDH）のCtとFAM標識された試験遺伝子との間の差として表され、3つの種類にわたって平均され、dCTと名付けられた。凍結保存されたリンパ球に対するアッセイ性能制御は、同じ血液サンプルからの異なる低温保存バイアル上の平均dCt、同じ個体からの独立した血液サンプルからの平均dCtを含んだ。参照個体からのサンプルを各実験に含めた。発現の放射線誘導は、照射後の各時点について、用量2.0GyにおけるdCTと用量0GyにおけるdCtとの間の差として表され、ddCTと名付けられた。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
DNA遺伝子型決定
エキソン含有DNA断片およびプロモーターをPCRにより増幅するために、プライマーを確立した。PCRは、25ngのDNA（表5および6のプライマーのリスト）を含む15μLの反応混合物中で行った。シークエンシング反応は、ABI PRISM（登録商標）3730x1 DNA分析器(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて、色素ターミネーター法に従って行った。実験結果の整列、SNP発見および遺伝子型決定は、ソフトウェアGenalysを用いて行った。アライメントに用いられるゲノム配列は、TRAIL/TNFSF10（NC_000003.11）である。rs3136597およびrs2241063の遺伝子型は、それぞれTaqman技術、アッセイC__27464917_20およびC___3260973_20（Applied Biosystems）によって得られた。
【０１００】
【表５】
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【０１０１】
【表６】
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【０１０２】
頻繁な変異体（FBAT）のファミリーベース関連性試験
ファミリー構造（コマンドfbat -o）を考慮しながら、頻繁なSNPと定量的形質との間の単一マーカー分析を行うために、FBAT法およびソフトウェア(Laird et al., 2000, Genet Epidemiol. 19 Suppl 1:S36〜42; Rabinowitz and Laird, 2000, Hum Hered. 50:211〜223)を使用した。TNFSF10と形質との全体的な関連性についてp値を得るために2つの方法が使用されている：
a）一点結合分析から得られたp値のフィッシャー製品(Fisher, 1925, Statistical Methods for Research Workers.)を採取し、その有意性を10,000個の順列を用いて評価し、
b）FBATマルチマーカー統計(Rakovski et al., 2007, Genet Epidemiol. 31:9〜17; Chen et al., 2013, Genet Epidemiol. 37:196〜204)を計算し、その有意性を10,000の順列を用いて評価する。
【０１０３】
TRAIL/TNFSF10 SNP（SNPTEST）による放射線療法誘導皮膚反応関連試験
CO-HO-RT試験(Azria et al. 2010, The Lancet Oncology, 11(3), 258〜265)においてCTCAE v3グレーディングシステムを用いて、急性および亜急性皮膚炎、急性紅斑、急性色素沈着および後期線維症を予測的に評価した。毒性は、バイナリの結果として扱われ、かつ急性毒性について射線治療の6週間後までの間に、後期毒性について放射線療法の3ヶ月後からの経過観察まで（最短2年間、最大8年間）に放射線治療中に最も高いCTCAE等級の出現を取ることによって、決定された。各毒性エンドポイントについて、患者は、CTCAEグレードが2以上である場合に、考慮されたケースであり、CTCAEグレードが1以下である場合に、対照である。放射線誘発アポトーシスを受けるCD8+リンパ球のパーセンテージは連続的な結果として扱われた。
【０１０４】
ゲノムDNAは、血液から単離され、市販のゲノムワイドSNPアレイ(Affymetrix SNP6.0, Affymetrix, San Diego, CA)を使用して遺伝子型決定された。rs1131532およびrs3815496はアレイ上で直接遺伝子型決定されていなかったため、IMPUTE2ソフトウェア[PMID：19543373]を使用して、染色体3の周辺領域（位置100,000,001〜200,000,000、hg構築19）を1000ゲノム参照データに帰属した。帰属後、関心のあるSNPはHardy-Weinberg均衡（p値>10-6）にあることが確認され、良好な帰属品質（情報スコア>0.3）を示した。SNPTESTソフトウェア[PMID：17572673]を用いて、頻度論のテストおよび予想される方法とのSNP表現型の関連性を解析した。これは、帰属から得られる予想される遺伝子型カウント（すなわち遺伝子型用量）を使用する。相加的遺伝相遺伝モデルをすべての解析で仮定した。
【０１０５】
統計分析
統計分析およびデータ提示は、Stata(Stata Corp.,College Station, TX)で行った。ボックスプロット結果では、ボックスは25番目から75番目までのパーセンタイルから延長し、ウィスカは上下の隣接値（四分位範囲の1.5倍）を示す。各ボックスは、少なくとも3つの独立した実験を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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