(57)【要約】  本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法、及びこのような被験体の治療方法に関する。本発明はさらに、癌を有する被験体の予後を予測又は決定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
(i) 前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原の数を決定するステップ；及び/又は
(ii) 前記被験体に由来する2つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップ；及び/又は
(iii) 前記被験体に由来する癌細胞及び/若しくは腫瘍浸潤免疫細胞における免疫チェックポイント分子の発現プロファイル、又は腫瘍タイプを決定するステップ
を含み、
ここでより多数のクローナル新生抗原、及び/又はより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合、及び/又は参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現は、免疫チェックポイント介入に対する応答を示す、前記方法。
【請求項２】
免疫チェックポイント分子の発現プロファイルの決定が、免疫チェックポイント関連遺伝子の差次的発現を同定するためのトランスクリプトームワイドな差次的遺伝子発現解析によって実施される、請求項１(iii)に記載の方法。
【請求項３】
癌を有する被験体の予後を予測又は決定する方法であって、該方法が、以下のステップ：
(i) 前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原の数を決定するステップ；及び/又は
(ii) 前記被験体に由来する2つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップ、
を含み、ここでより多数のクローナル新生抗原及び/又はより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合は、改善された予後を示す、前記方法。
【請求項４】
被験体における癌を治療又は予防する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
i) 請求項１又は２に記載の方法に従って、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定するステップ；及び
ii) 前記被験体を免疫チェックポイント介入により治療するステップ
を含む、前記方法。
【請求項５】
免疫チェックポイント介入により癌を有する被験体を治療するステップを含む、被験体における癌を治療又は予防する方法であって、ここで該被験体は、以下：
(i) より多数のクローナル新生抗原；及び/又は
(ii) より高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合；及び/又は
(iii) 参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現
を有すると決定されている、前記方法。
【請求項６】
被験体における癌の治療又は予防方法において使用するための免疫チェックポイント介入であって、その方法が、以下のステップ：
i) 請求項１又は２に記載の方法に従って、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定するステップ；及び
ii) 前記被験体を免疫チェックポイント介入により治療するステップ
を含む、前記免疫チェックポイント介入。
【請求項７】
被験体における癌の治療又は予防において使用するための免疫チェックポイント介入であって、該被験体が、以下：
(i) より多数のクローナル新生抗原；及び/又は
(ii) より高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合；及び/又は
(iii) 参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現
を有する、前記免疫チェックポイント介入。
【請求項８】
被験体における癌の治療又は予防において使用するための免疫チェックポイント介入の使用であって、該被験体が、以下：
(i) より多数のクローナル新生抗原；及び/又は
(ii) より高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合；及び/又は
(iii) 参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現
を有する、前記使用。
【請求項９】
免疫チェックポイント介入が、CTLA4、PD-1、PD-L1、Lag-3、Tim-3、TIGIT又はBTLAと相互作用する、請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【請求項１０】
免疫チェックポイント介入が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ又はイピリムマブである、請求項９に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【請求項１１】
前記癌が、膀胱癌、胃癌、食道癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌(腎細胞)、肺癌(小細胞、非小細胞及び中皮腫)、脳癌(神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫)、黒色腫、リンパ腫、小腸癌(十二指腸及び空腸)、白血病、膵臓癌、肝胆道腫瘍、生殖細胞癌、前立腺癌、頭部及び頸部癌、甲状腺癌及び肉腫から選択される、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【請求項１２】
癌が肺癌又は黒色腫である、請求項１１に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【請求項１３】
癌が非小細胞肺癌(NSCLC)である、請求項１２に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【請求項１４】
前記被験体が、哺乳動物、好ましくはヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【請求項１５】
前記被験体がヒトである、請求項１４に記載の方法、免疫チェックポイント介入、又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法、及びこのような被験体の治療方法に関する。本発明はさらに、癌を有する被験体の予後を予測又は決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
治療的抗腫瘍免疫の活性化に対するアプローチの中で最も有望なのは、免疫チェックポイントの遮断である。免疫チェックポイントは、二次的組織損傷を最小限にするために末梢組織における自己免疫寛容を維持し且つ生理学的免疫応答の持続時間及び大きさを調節するため極めて重要な、免疫系における抑制経路である。現在、腫瘍は、特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する、免疫耐性の主要な機構として利用していることが明らかになっている。免疫チェックポイントの多くはリガンド受容体相互作用によって開始されるため、これらは、抗体によって容易に遮断したり、組換え型のリガンド又は受容体によってモジュレートしたりすることができる。
【０００３】
癌における免疫チェックポイント調節に対する現在のアプローチは、これらの化合物が利用可能となった順番にほぼ基づく、あるレベルの当て推量及びセレンディピティ(運)を伴う。CTLA4、PD-1及びPDL1は、この順番で発見及び生産され、これらは現在までこの順番で投与されてきた。初期の試験はCTLA-4を用いて実施されたが、これはCTLA-4が最初にFDAにより認可されたためである。これに続いて、PD-1/PDL1治療が認可され利用された。
【０００４】
WO 2015/103037は、癌細胞が、患者の免疫系により非自己として認識され得るネオエピトープを生じる体細胞変異を有し得るという発見に基づき、免疫チェックポイントモジュレーターによる治療に応答する可能性が高い被験体を同定する方法を提供する。癌サンプルにおける1つ以上のネオエピトープの同定は、どの癌患者が免疫チェックポイントモジュレーターによる治療に対して良好に応答する可能性が高いかを決定するのに有用であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2015/103037
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明者らは、より多数のクローナル新生抗原、及び/若しくはより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原又は低いサブクローナル新生抗原割合を有する癌患者は、免疫チェックポイント介入による治療に応答する可能性がより高いという重要且つ驚くべき決定を行った。
【０００７】
本実施例において実証されるとおり、高いクローナル新生抗原負荷及び/又は低いサブクローナル新生抗原負荷を有する腫瘍を有する患者は、チェックポイント遮断による免疫療法(例えば抗PD1療法)に対してより良好な応答を示す。このことは、癌を治療及び予防するための、改善され且つより指向性の治療様式及び予防様式の可能性を開くという点において、当技術分野への重要な寄与を示す。この点で、治療的介入及び予防的介入を、癌の個別の状況及び特定の状況に対して標的化させることができる。
【０００８】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、多数のクローナル新生抗原を有する腫瘍細胞が、免疫チェックポイント分子の類似発現プロファイルを示すこと(すなわち、これらの腫瘍細胞が免疫チェックポイント分子の共通発現プロファイルを示すこと)を見出した。従来は特定のタイプの癌が免疫チェックポイント分子の特定の発現プロファイルを示すことは示されていなかったため、これは当技術分野への重要な寄与である。本発明者らはこのことを最初に示し、この知見は、特定の癌の治療又は予防に対するより指向性のアプローチを容易にする。
【０００９】
また本発明者らは、驚くべきことに、より多数のクローナル変異及びより高い比率のクローナル変異：サブクローナル変異を有する患者が改善された予後を有することを見出した。
【００１０】
従って本発明は、当技術分野における、新たな、代替的な及び/又はより効果的な癌の治療方法及び予防方法のニーズを取り扱う。
【００１１】
従って、本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
(i) 前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原の数を決定するステップ；及び/又は
(ii) 前記被験体に由来する2つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップ；及び/又は
(iii) 前記被験体に由来する癌細胞及び/若しくは腫瘍浸潤免疫細胞における免疫チェックポイント分子の発現プロファイル、又は腫瘍タイプを決定するステップ
を含み、ここでより多数のクローナル新生抗原、及び/又はより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合、及び/又は参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現は、免疫チェックポイント介入に対する応答を示す、上記方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、癌を有する被験体の予後を予測又は決定する方法であって、上記方法が、以下のステップ：
(i) 前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原の数を決定するステップ；及び/又は
(ii) 前記被験体に由来する2つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップ
を含み、ここでより多数のクローナル新生抗原及び/又はより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合は、改善された予後を示す、上記方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、被験体における癌を治療又は予防する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
i) 本発明の方法に従って、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定するステップ；及び
ii) 前記被験体を免疫チェックポイント介入により治療するステップ
を含む、上記方法を提供する。
【００１４】
なおさらなる態様において、本発明は、癌を有する被験体を免疫チェックポイント介入により治療するステップを含む、被験体における癌を治療又は予防する方法であって、ここで上記被験体は、以下：
(i) より多数のクローナル新生抗原；及び/又は
(ii) より高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合；及び/又は
(iii) 参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現
を有すると決定されている、上記方法を提供する。
【００１５】
また本発明は、被験体における癌の治療又は予防方法において使用するための免疫チェックポイント介入であって、上記方法が、以下のステップ：
i) 本発明の方法に従って、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定するステップ；及び
ii) 前記被験体を免疫チェックポイント介入により治療するステップ
を含む、上記免疫チェックポイント介入も提供する。
【００１６】
本発明はさらに、被験体における癌の治療又は予防において使用するための免疫チェックポイント介入であって、上記被験体が、以下：
(i) より多数のクローナル新生抗原；及び/又は
(ii) より高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合；及び/又は
(iii) 参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現
を有する、上記免疫チェックポイント介入を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】(A)TCGA LUAD(肺腺癌)腫瘍のコホートにおける総推定新生抗原負荷。クローナル変異(青色)若しくはサブクローナル変異(赤)から生じる新生抗原又はクローン性が決定されていない新生抗原(灰色)の割合が示される。
【図１Ｂ−Ｄ】(B)コホートの上位四分位として定義される高い新生抗原負荷を示す腫瘍を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=86)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.011)。(C)コホートの上位四分位として定義される高いクローナル新生抗原負荷を示す腫瘍を有する患者(n=29)の、残りのコホート(n=87)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.0077)。(D)コホートの上位四分位として定義される高いサブクローナル新生抗原負荷を示す腫瘍を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=86)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.12)。
【図１Ｅ】共発現についてクラスタ化された、高いクローナル新生抗原負荷を有する腫瘍と、コホートの下部四分位として定義される低いクローナル新生抗原負荷を有する腫瘍との間で差次的に発現された遺伝子。本文中で強調されている免疫遺伝子のクラスタが囲みで示されている。
【図２Ａ】A)非サイレント変異の数に比例した幹及び分岐の長さを有する、L011及びL012についての系統樹。
【図２Ｂ−Ｅ】B)L011における全てのミスセンス変異について予測される推定新生抗原。MTFR2D326Y新生抗原(FAFQEYDSF)が強調されている。C)L012における全てのミスセンス変異について予測される推定新生抗原。CHTF18 L769V新生抗原(LLLDIVAPK)及びMYADMR30W新生抗原(SPMIVGSPW)が示される。D、E)L011(D)及びL012(E)の3つの腫瘍領域及び正常組織に由来する、in vitro増殖させたCD8+Tリンパ球のMHC多量体解析。両方のケースで、変異ペプチドに反応性のCD3+CD8+Tリンパ球の頻度が示される。
【図３Ａ】A)患者L011(上パネル)及びL012(下パネル)から得られた腫瘍領域1〜3、隣接正常肺組織及びPBMCに由来する、非増殖CD8+T細胞のMHC多量体解析。CD3+CD8+コンパートメントからのMHC多量体陽性細胞の頻度が示される。
【図３Ｂ】B)患者L011に由来する腫瘍浸潤CD8+T細胞の免疫表現型。同じ腫瘍領域、正常組織及びPBMC中のMTFR2反応性CD8+T細胞(MTFR2+)をMHC多量体陰性CD8+T細胞(MTFR2-)と比較している。示したデータは、全領域の代表として、腫瘍領域3に由来する。CTLA-4、PD-1、LAG-3、Ki-67及びGzmBを発現する細胞のパーセントが示される。
【図３Ｃ−Ｄ】C)MTFR2反応性(MTFR2+)CD8+T細胞及び非反応性(MTFR2-)CD8+T細胞上のPD-1、Ki67及びGzmBの共発現。D)上パネル：L011及びL012由来の原発腫瘍のマルチカラーIHC。CD8(赤)、グランザイムB(青色)及びLAG-3(茶色)が示される。下パネル：隣接正常組織と比較した、L011の領域3におけるPD-L1染色。
【図４Ａ−Ｆ】ディスカバリーコホート(A-C)及びバリデーションコホート(D-F)について、持続的臨床利益(DCB)を有する患者、又は非持続的利益(NDB)を有する患者のクローナル新生抗原数及びサブクローナル新生抗原割合が示される。ディスカバリーコホート(C)及びバリデーションコホート(F)について、より少数の新生抗原又は高いサブクローナル割合を有する腫瘍と比較した、より多数の新生抗原及び低いサブクローナル割合を有する腫瘍における無増悪生存率が示される。
【図４Ｇ−Ｈ】G)配列決定された各腫瘍のクローン構造。無増悪生存期間(PFS)はバープロットの下に報告され、継続中の無増悪生存を示す腫瘍は+で標識される。PD-L1はバープロットの下方に以下のように示される。強い(+)：50％膜染色；弱い(+/-)：1〜49％膜染色；陰性(-)：<1％膜染色；未知(？)。H)より多数の新生抗原及び低いサブクローナル割合を有する腫瘍をより少数の新生抗原又は高いサブクローナル割合を有する腫瘍と比較する、複合腫瘍コホートにおける無増悪生存率。
【図４Ｉ−Ｊ】I)HERC1変異が強調され、サブクローンが示される、CA9903腫瘍サンプルのクローン構造。J)CA9903における全てのミスセンス変異について予測される推定新生抗原。HERC1P3278S新生抗原(ASNASSAAK)が強調されている。
【図５Ａ】LUAD生存率の四分位分割。総新生抗原ロード(A)、クローナル新生抗原ロード(B)、及びサブクローナル新生抗原ロード(C)について患者を比較する全4つの四分位数を示す全生存曲線。各四分位間の関連する対数順位p値は、プロットの右側に示される。
【図５Ｂ】LUAD生存率の四分位分割。総新生抗原ロード(A)、クローナル新生抗原ロード(B)、及びサブクローナル新生抗原ロード(C)について患者を比較する全4つの四分位数を示す全生存曲線。各四分位間の関連する対数順位p値は、プロットの右側に示される。
【図５Ｃ】LUAD生存率の四分位分割。総新生抗原ロード(A)、クローナル新生抗原ロード(B)、及びサブクローナル新生抗原ロード(C)について患者を比較する全4つの四分位数を示す全生存曲線。各四分位間の関連する対数順位p値は、プロットの右側に示される。
【図６】LUADにおける単一ヌクレオチド変異(SNV)の数別の生存率。(B)高いSNV負荷を有する腫瘍を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=86)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.01)。(C)高いクローナルSNV負荷を有する腫瘍を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=86)と比較した、全生存曲線(対数順位P=0.014)。(D)高いサブクローナルSNV負荷を有する腫瘍を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=86)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.14)。
【図７Ａ】LUSC(肺扁平上皮癌)コホートのサマリー。(A)TCGA LUSC患者の全推定新生抗原負荷。カラムを着色し、クローナル変異(青)若しくはサブクローナル変異(赤)から生じるか、又はクローン性が決定されていない変異(灰色)から生じる新生抗原の割合を示した。
【図７Ｂ−Ｇ】(B)LUSC(肺扁平上皮癌)コホートのサマリー。高い新生抗原負荷を有する患者(n=30)の、低い新生抗原負荷を有する患者(n=91)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.84)。(C)高いクローナル新生抗原負荷を有する患者(n=29)の、低いクローナル新生抗原負荷を有する患者(n=92)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.99)。(D)高いサブクローナル新生抗原負荷を有する患者(n=30)の、低いサブクローナル新生抗原負荷を有する患者(n=91)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.32)。(E)高いSNV負荷を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=90)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.52)。(F)高いクローナルSNV負荷を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=91)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.89)。(G)高いサブクローナルSNV負荷を有する患者(n=30)の、残りのコホート(n=92)と比較した全生存曲線(対数順位P=0.28)。
【図８】差次的遺伝子発現解析。共発現についてクラスタ化された、高いクローナル新生抗原負荷を有する患者と残りのコホートとの間で差次的に発現される遺伝子。
【図９Ａ】患者L012に由来する腫瘍浸潤CD8+T細胞の免疫表現型。A)腫瘍(多量体-)、正常組織及びPBMCにおける、MHC多量体陰性CD8+T細胞と比較した、腫瘍浸潤CD8+CHTF18反応性(CHTF18+)及びMYADM反応性(MYADM+)T細胞の活性化及び機能的表現型。CTLA-4、PD-1、LAG-3、Ki-67及びGzmBを発現する細胞のパーセントが示される。ヒストグラムはL012の領域2から作成され、知見は全ての腫瘍領域を代表する。
【図９Ｂ】患者L012に由来する腫瘍浸潤CD8+T細胞の免疫表現型。B)腫瘍浸潤MHC多量体陰性CD8+T細胞(多量体-)と比較した、腫瘍浸潤CD8+CHTF18反応性(CHTF18+)及びMYADM反応性(MYADM+)T細胞上のPD-1、Ki67及びグランザイムBの共発現。
【図９Ｃ−Ｄ】患者L012に由来する腫瘍浸潤CD8+T細胞の免疫表現型。C)In vitro増殖腫瘍浸潤CD8+T細胞を、変異ペプチド又は野生型ペプチドのいずれかをロードしたMHC多量体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。CD3+CD8+ゲートのMHC多量体陽性細胞のパーセントが示される。L011(最上パネル)：腫瘍領域1由来の増殖CD8+T細胞は、変異型MTFR2は認識するが野生型MTFR2は認識しない。L012(中央パネル)：腫瘍領域2に由来する増殖CD8+T細胞は、変異型MTFR2は認識するが野生型CHTF18は認識しない。L012(最下パネル)：腫瘍領域2に由来する増殖CD8+T細胞は、変異型及び野生型MYADMの両方を認識する。MYADMにおける変異はアンカー残基上の変異であり、主にHLA結合に影響を及ぼすが、T細胞認識には影響を及ぼさない。データは、この患者のT細胞は(本発明者らのMHC多量体システム中で安定化させた場合に)変異ペプチドと野生型ペプチドの両方を認識できるが、野生型ペプチドの極めて低い親和性はin vivoにおける十分な提示を妨げることを示している。(D)L011及びL012由来の増殖腫瘍浸潤リンパ球に結合するBV650及びPE-Cy7 MHC多量体のバリデーション。非増殖腫瘍サンプルにおけるMTFR2反応性、MYADM反応性、及びCHTF18反応性T細胞を特性決定するために使用される試薬の品質を確認するため、本発明者らは、同じ試薬を使用して、より多数の増殖TILを染色した。L011(左パネル)、及びL012(右パネル)から得られたデータは、増殖TIL中のMTFR2反応性、MYADM反応性、及びCHTF18反応性T細胞の明確な定義された集団を示す。
【図１０】(A)ディスカバリーコホート腫瘍及び(B)バリデーションコホート腫瘍の変異負荷及びクローン構造。
【図１１】2つの腫瘍群のPD-L1発現。PD-L1は、高いクローナル新生抗原負荷及び低いサブクローナル新生抗原割合を有する腫瘍において、低いクローナル新生抗原負荷又は高いサブクローナル新生抗原割合を有する腫瘍と比較して、有意により強い発現を示す。
【図１２Ａ−Ｆ】A)持続的臨床利益(DCB)を有する患者又は非持続的利益(NDB)を有する患者から得られたディスカバリーコホート腫瘍における予測されるクローナル変異の数。B)DCB又はNDBを有する患者から得られた腫瘍におけるサブクローナル割合。C)より少数のクローナル変異又は高いサブクローナル割合を有する腫瘍と比較した、より多数のクローナル変異及び低いサブクローナル割合を有するディスカバリー腫瘍の無増悪生存率。D)DCBを有する患者又はNDBを有する患者から得られたバリデーションコホート腫瘍における予測されるクローナル変異の数。E)DCB又はNDBを有するバリデーション患者から得られた腫瘍におけるサブクローナル割合。F)より少数のクローナル変異又は高いサブクローナル割合を有する腫瘍と比較した、より多数のクローナル変異及び低いサブクローナル割合を有するバリデーション腫瘍における無増悪生存率。
【図１２Ｇ−Ｈ】G)バープロットで示される、クローナル変異(濃い陰影)及びサブクローナル変異(薄い陰影)を有する配列決定された各腫瘍についてのクローナル変異及びサブクローナル変異の数。臨床利益状態を示すためにバーに陰影がつけられている。DCB(緑)；NDB(赤)。PFSはバープロットの下に報告され、継続中の無増悪生存を示す患者は+で標識される。PD-L1はバープロットの下方に以下のように示される。強(+)：50％膜染色；弱(+/-)：1〜49％膜染色；陰性(-)：1％膜染色；未知(？)：評価不能。H)より多数のクローナル変異及び低いサブクローナル割合を有する腫瘍をより少数のクローナル変異又は高いサブクローナル割合を有する腫瘍と比較した、複合腫瘍コホートにおける無増悪生存率。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
「新生抗原（ネオアンチゲン）」は、癌細胞中の変異の結果として生じる腫瘍特異的抗原である。従って、新生抗原は、被験体中の健常細胞によっては発現されない。
【００１９】
本明細書中に記載される新生抗原は、野生型の健常細胞によって発現される非変異タンパク質と比較して、癌細胞によって発現されるタンパク質を変化させる任意の非サイレント変異によって生じ得る。例えば、変異タンパク質は転座変異であってもよく、融合変異であってもよい。
【００２０】
「変異」は、同じ個体から得られた健常細胞と比較した、腫瘍細胞中のヌクレオチド配列(例えばDNA又はRNA)の差異を指す。ヌクレオチド配列中の差異は、同じ個体から得られた健常細胞によっては発現されないタンパク質の発現をもたらし得る。
【００２１】
例えば、変異は、アミノ酸配列の変化(コーディング変異)をもたらす、単一ヌクレオチド変異(SNV)、多重ヌクレオチド変異、欠失変異、挿入変異、転座、ミスセンス変異又はスプライス部位変異であり得る。
【００２２】
変異は、エクソームシーケンス、RNA-seq、全ゲノム配列決定及び/又は標的化遺伝子パネル配列決定及び又は単一遺伝子の日常的なサンガー配列決定によって同定することができる。好適な方法は当技術分野で公知である。
【００２３】
エクソームシーケンスおよびRNA-seqについての説明は、Boa et al.(Cancer Informatics. 2014；13(Suppl 2)：67-82.)及びAres et al.(Cold Spring Harb Protoc. 2014 Nov 3；2014(11)：1139-48)によってそれぞれ提供される。標的化遺伝子パネル配列決定の説明は、例えば、Kammermeier et al.(J Med Genet. 2014 Nov；51(11)：748-55)及びYap KL et al.(Clin Cancer Res. 2014. 20：6605)に見出され得る。Meyerson et al., Nat. Rev. Genetics, 2010及びMardis, Annu Rev Anal Chem, 2013も参照されたい。標的化遺伝子配列決定パネルは、商業的に入手することも可能である(例えば、Biocompareによりまとめられる(http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targetinc-Tools/)。
【００２４】
腫瘍サンプルから得られたDNA及び/又はRNAにおけるヌクレオチド差異(例えばSNV)を、非腫瘍サンプルから得られたDNA及び/又はRNAと比較して同定するための配列アラインメントは、当技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。例えば、参照サンプルと比較したヌクレオチド差異は、Koboldt et al.により記載される方法(Genome Res. 2012；22：568-576)を用いて実施することができる。参照サンプルは、生殖細胞系列DNA及び/又はRNA配列であり得る。
【００２５】
クローナル新生抗原
本発明者らは、腫瘍内不均一性(ITH)が、ある腫瘍の異なる領域において発現される新生抗原間及びある腫瘍における異なる細胞間で変動を生じ得ることを決定した。特に、本発明者らは、ある腫瘍内で、特定の新生抗原は腫瘍の全領域及び本質的に全ての細胞において発現されるが、他方、他の新生抗原は、一部の腫瘍領域及び細胞においてのみ発現されることを決定した。
【００２６】
従って、「クローナル」新生抗原又は「幹」新生抗原は、腫瘍全体を通して効果的に発現され、本質的に全ての腫瘍細胞においてコードされる新生抗原である。「サブクローナル」新生抗原又は「分岐」新生抗原は、腫瘍中の一部分又は一部の細胞又は領域において発現される新生抗原である。
【００２７】
本明細書における「本質的に全ての」との言及は、被験体における腫瘍細胞の大部分を包含することが意図される。例えば、「本質的に全ての」は、細胞の60〜100％、例えば、被験体における腫瘍細胞の60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％を含み得る。
【００２８】
「腫瘍全体を通して存在する」、「腫瘍全体を通して効果的に発現される」及び「本質的に全ての腫瘍細胞においてコードされる」は、クローナル新生抗原が、サンプルが分析される腫瘍の全領域において発現されることを意味し得る。
【００２９】
変異が「本質的に全ての腫瘍細胞においてコードされる」との決定は統計的計算を指し、従って、統計的解析及び閾値に供されることが理解されるだろう。
【００３０】
同様に、クローナル新生抗原が「腫瘍全体を通して効果的に発現される」との決定は、統計的計算を指し、従って、統計的解析及び閾値に供されることが理解されるであろう。
【００３１】
「本質的に全ての腫瘍細胞又は本質的に全ての腫瘍細胞において効果的に発現される」とは、適切な統計的方法を用いて決定されたとおりに、変異がサンプル中で分析された全ての腫瘍細胞中に存在することを意味し得る。
【００３２】
例として、癌細胞割合(CCF)(変異を有する癌細胞の割合を表す)を使用して、変異がクローナルであるか又は分岐しているかを決定することができる。例えば、癌細胞割合は、Landau et al. (Cell. 2013 Feb 14；152(4)：714-26)により記載されるとおり、変異アレル頻度にコピー数及び純度推定値を統合することによって決定することができる。
【００３３】
手短に言えば、CCF値は、分析されるそれぞれ及び全ての腫瘍領域内で同定される全ての変異について計算される。1つの領域のみ(すなわち単一サンプルのみ)が使用される場合、1セットのCCF値のみが得られるだろう。このCCF値は、どの変異がその腫瘍領域内の全ての腫瘍細胞中に存在するかについての情報を提供し、これにより、変異がクローナルであるか又は分岐しているかについての指標を提供するだろう。腫瘍領域中の全てのサブクローナル変異(すなわちCCF<1)は分岐していると決定されるが、CCF=1を有するクローナル変異はクローナルであると決定される。
【００３４】
上記のとおり、クローナル変異の決定は、統計的解析及び閾値に供される。従って、ある変異は、CCF 95％信頼区間>=0.60(例えば0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00又は>1.00)を有すると決定される場合、クローナルであると同定することができる。逆に、ある変異は、分析される任意のサンプルにおいてCCF 95％信頼区間<=0.60(例えば0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05又は0.01)を有すると決定される場合、分岐していると同定することができる。
【００３５】
クローナル変異を同定する方法の精度は、腫瘍から単離された2つ以上のサンプルについてクローナル変異を同定することによって増加することが理解されるであろう。
【００３６】
腫瘍サンプル
腫瘍からの生検及びサンプルの単離は、当技術分野における一般的な実務であって、任意の好適な方法に従って実施することが可能であり、このような方法は当業者に公知であろう。
【００３７】
この態様の方法は、例えば、腫瘍から単離された1つ以上の腫瘍領域に由来する癌細胞中に存在する変異を決定するステップを含み得る。例えば、腫瘍から単離された単一の生検、あるいは少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個以上の生検中に存在する変異が決定され得る。
【００３８】
個々の腫瘍サンプルは、腫瘍全体に位置する異なる領域(原発部位内若しくは原発部位と転移部位の間、又は転移部位内若しくは転移部位間)から単離することができる。例えば、異なる領域中で形態学的に異なる組織学を示すことがわかっている腫瘍中に存在する変異を決定するステップは、形態学的に異なる領域から単離された多数の個別サンプル中に存在する変異を決定するステップを包含し得る。
【００３９】
サンプルは、血液サンプルであってよい。例えば、血液サンプルは、循環腫瘍DNA、循環腫瘍細胞、又は腫瘍DNAを含むエキソソームを含み得る。
【００４０】
治療に適した被験体
本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法は、前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原数を決定するステップを含み、ここで多数のクローナル新生抗原は、免疫チェックポイント介入に対する応答を示す、上記方法を提供する。
【００４１】
本明細書中で使用される「治療に適した」という用語は、免疫チェックポイント介入による治療に応答する可能性がより高い被験体、又は免疫チェックポイント介入による治療の候補である被験体を指し得る。治療に適した被験体は、本発明を用いて好適ではないと決定される被検体よりも、前記治療に応答する可能性がより高い場合がある。本発明による治療に適していると決定される被験体は、免疫チェックポイント介入による治療に応答して、少なくとも6ヶ月間持続する部分的な応答又は安定な疾患として定義され得る持続的臨床利益(DCB)を示し得る。
【００４２】
被験体から得られた癌細胞において同定又は予測されるクローナル新生抗原数を、1つ以上の所定の閾値と比較することができる。このような閾値を用いて、被験体を、治療に対する応答の程度を示すカテゴリーに階層化することができる。
【００４３】
閾値は、癌患者の参照コホートに対して決定することができる。コホートは、10、25、50、75、100、150、200、250、500人以上の癌患者を含み得る。コホートは、任意の癌コホートであってよい。あるいは、患者は全て、当該被験体の関連の癌タイプ又は特定の癌タイプを有し得る。
【００４４】
一実施形態において、「多」数のクローナル新生抗原は、癌患者の参照コホートにおいて予測されるクローナル新生抗原のメジアン数(例えば参照コホートの上位四分位に存在すると予測されるクローナル新生抗原の最小数)より多い数を意味する。
【００４５】
別の実施形態において、「多」数のクローナル新生抗原は、10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190又は200以上のクローナル新生抗原と定義することができる。
【００４６】
当業者であれば、「多」数又は「より多」数のクローナル新生抗原との言及は文脈特異的である可能性があり、これに応じて適切な解析を実施し得ることを理解するだろう。
【００４７】
本発明はさらに、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法が、2人以上の癌細胞被験体におけるクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップを含み、ここで高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原又はより低い/低いサブクローナル新生抗原割合は、免疫チェックポイント介入に対する応答を示す、上記方法を提供する。
【００４８】
上記のとおり、クローナル：サブクローナル比率は、任意の癌を有する被験体のコホート又は関連癌/特定癌を有する被験体のコホートのいずれかの文脈の範囲内に入り得る。従って、クローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原比率は、上記の方法を参照コホートに適用することによって決定することができる。「高い」又は「より高い」クローナル：サブクローナル比率は、従って、癌患者の参照コホートにおいて予測されるメジアンのクローナル：サブクローナル比率(例えば参照コホートの上位四分位において予測される最小クローナル：サブクローナル比)より高い数に相当し得る。
【００４９】
別の実施形態において、「高い」又は「より高い」クローナル：サブクローナル比率は、3：1〜100：1の範囲内の比率、例えば、少なくとも3：1、5：1、10：1、15：1、20：1、25：1、50：1、75：1又は100：1の比率を意味する。当業者であれば、上記の値が、当該コホートに応じて決定され得ることを理解するであろう。
【００５０】
またサブクローナル新生抗原割合は、上記のとおり、参照コホートに対して定義することもできる。例えば、「より低い」又は「低い」サブクローナル新生抗原割合は、癌患者の参照コホートにおいて予測されるメジアンのサブクローナル新生抗原割合(例えば、コホートの下部四分位に存在すると予測される最大数)より小さな割合に相当し得る。
【００５１】
あるいは、当業者であれば、サブクローナル新生抗原割合は、サブクローナル新生抗原数(例えば、前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞において予測されるサブクローナル新生抗原数)を、総新生抗原の数(例えば、前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞において予測される総新生抗原の数)で割ることにより、(例えば各患者について)決定し得ることを理解するであろう。
【００５２】
一実施形態において、「より低い」又は「低い」サブクローナル新生抗原割合は、25％以下の割合、例えば、20、15、10、5、3、2又は1％以下の割合を意味し得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、本方法は、クローナル新生抗原数とクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率の両方、又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップを含み得る。実施例に示されるとおり、新生抗原負荷と新生抗原サブクローナル割合の両方の測定値を組み合わせることにより、ペムブロリズマブに対する感受性を、いずれかの測定値のみより良好に予測することが可能となり(図4C参照)、またほぼ全ての症例において転帰を予測することができた(図4G〜H)。
【００５４】
従って本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
(i) 前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原の数を決定するステップ；及び
(ii) 前記被験体に由来する2つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原の比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップ；
を含み、ここでより多数のクローナル新生抗原及びより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原、又はより低い(若しくは低い)サブクローナル新生抗原割合は、免疫チェックポイント介入に対する応答を示す、上記方法を提供する。
【００５５】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、多数のクローナル新生抗原を有する腫瘍細胞が、免疫チェックポイント分子の類似の発現プロファイルを示すこと(すなわち、これらの腫瘍細胞が免疫チェックポイント分子の共通発現プロファイルを示すこと)を見出した。従って、非癌細胞に対して発現が増加又は低下した特定の免疫チェックポイント分子を同定するためのアプローチは、チェックポイント遮断療法に応答する可能性が高い患者を同定するために使用することもできる。
【００５６】
従って、一態様において、本発明は、免疫チェックポイント介入に応答する可能性がより高い癌を有する被験体を同定する方法であって、前記被験体に由来する癌細胞における免疫チェックポイント分子の発現プロファイル、又は腫瘍タイプを決定するステップを含む、上記方法を提供する。
【００５７】
一態様において、本方法は、例えば、差次的に発現された遺伝子を(例えば好適な参照サンプルに対して)同定することによる、腫瘍における免疫チェックポイント分子の発現プロファイルを決定するステップを含む。差次的な免疫チェックポイント分子の発現に関する参照サンプルは、非癌性の細胞若しくは腫瘍(例えば低いクローナル新生抗原負荷を有する)又は末梢血リンパ球であり得る。
【００５８】
例えば、免疫チェックポイント分子の発現プロファイルは、
(i) 腫瘍から単離されたサンプルのRNA配列を決定するステップ；及び/又は
(ii) 免疫チェックポイント関連遺伝子の差次的発現を同定するための(例えばp<0.05に調整された)トランスクリプトームワイドな差次的遺伝子発現解析を実施するステップ
によって決定することができる。例えば同じ患者又は標準参照に由来する非癌細胞データを比較として使用し得る。
【００５９】
本発明はさらに、特定の癌タイプにおける免疫チェックポイント分子の発現プロファイルを決定する方法であって、以下のステップ：
(i) 目的の癌を有する患者のコホートのポータルとなるCancer Genome Atlas (TCGA)データからRNA配列決定データを得るステップ；
(ii) 各患者からLevel_3遺伝子レベルデータを得るステップ；
(iii) 解析のために生リードカウントをパッケージDESeq2に入力するステップ；及び
(iv) 有意に差次的に発現された(p<0.05に調整された)免疫チェックポイント関連遺伝子を同定するためのトランスクリプトームワイドな差次的遺伝子発現解析を実施するステップ
を含む、上記方法を提供する。
【００６０】
従って本発明は、免疫チェックポイント介入に応答する可能性がより高い癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法を用いて前記被験体に由来する癌細胞における免疫チェックポイント分子の発現プロファイル、又は腫瘍タイプを決定するステップを含む、上記方法を提供する。
【００６１】
好ましい態様において、高いクローナル新生抗原負荷を有する腫瘍と低いクローナル新生抗原負荷を有する腫瘍との間で差次的に発現される遺伝子が同定される(例えば図1Eを参照)。従って、クローナル新生抗原数に関する情報は有益であって、2つのアプローチ、すなわち多数のクローナル新生抗原を有する被験体/腫瘍を同定及び標的化するアプローチと、高レベルのクローナル新生抗原を有する被験体/腫瘍における免疫チェックポイント分子の遺伝子発現をさらに調査するアプローチとの組み合わせを容易にする。これは、「二方面からの」治療攻撃を容易にする。
【００６２】
一態様において、前記差次的免疫発現は、阻害性受容体又は共刺激性受容体である免疫チェックポイント分子の、好適な参照サンプルと比較したアップレギュレーション又は高発現であり、ここでこのようなアップレギュレーション又は高発現は、アップレギュレートされた又は高発現を示した免疫チェックポイント分子を標的とする免疫チェックポイント介入に対する応答を示す。
【００６３】
遺伝子発現プロファイルは、例えば、本実施例1において記載される方法によって決定することができる。
【００６４】
好ましい実施形態において、免疫チェックポイント分子は、PD-1及び/又はLAG-3である。特に好ましい実施形態において、被験体は、肺癌、好ましくは、非小細胞肺癌を有する。
【００６５】
代替的実施形態において、免疫チェックポイント分子はCTLA4である。
【００６６】
好ましい実施形態において、癌は、肺癌又は黒色腫であり、好ましくは非小細胞肺癌又は黒色腫である。
【００６７】
またこの方法は、以前に記載された、免疫チェックポイント介入による治療に応答する可能性が高い癌を有する被験体を同定する方法と組み合わせて使用することもできる。
【００６８】
従って本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
(i) 前記被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原の数を決定するステップ；及び
(ii) 前記被験体に由来する癌細胞及び/若しくは腫瘍浸潤免疫細胞における免疫チェックポイント分子の発現プロファイル、又は腫瘍タイプを決定するステップ
を含み、ここでより多数のクローナル新生抗原及び参照サンプルと比較して差次的な免疫チェックポイント分子発現は、免疫チェックポイント介入に対する応答を示す、上記方法を提供する。
【００６９】
予後の方法
本発明者らは、より多数のクローナル新生抗原及び/若しくはより高い比率のクローナル新生抗原：サブクローナル新生抗原又は低いサブクローナル新生抗原割合を有する癌患者は改善された予後を有するという重要且つ驚くべき決定を行った。
【００７０】
当業者であれば、本発明の文脈において、多数の又はより多数のクローナル新生抗原を有する被験体が、例えば被験体の1コホート内で、又は多数の異なる被験体又はコホートを用いて同定される範囲内で、より少数のクローナル新生抗原を有する被験体と比較して改善された生存率を有し得ることを理解するであろう。
【００７１】
クローナル新生抗原数についての参照値は、以下の方法を用いて決定することが可能であり、「多数」又は「より多数」はその参照値を上回る全ての数である。
【００７２】
前記方法は、癌被験体のコホートにおいて予測されるクローナル新生抗原数を決定するステップ、及び以下のステップのいずれか：
(i) そのコホートにおいて予測されるクローナル新生抗原のメジアン数(ここでメジアン数は参照値である)を決定するステップ；又は
(ii) そのコホートの上位四分位において存在すると予測されるクローナル新生抗原の最小数(ここで最小数は参照値である)を決定するステップ(例えば、本実施例中のTCGAデータ解析を参照)
を包含し得る。
【００７３】
このような「メジアン数」又は「上位四分位において存在する最小数」は、任意の癌コホート自体において、あるいは関連癌/特定癌タイプにおいて決定され得る。
【００７４】
あるいは、「多」数又は「より多」数のクローナル新生抗原は、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190又は200個以上のクローナル新生抗原として定義することができる。
【００７５】
当業者であれば、「多」数又は「より多」数のクローナル新生抗原との言及が文脈特異的であり、これに応じて適切な解析を実施し得ることを理解するであろう。
【００７６】
従って本発明はまた、癌を有する被験体の予後を予測又は決定する方法であって、被験体に由来する1つ以上の癌細胞におけるクローナル新生抗原数を決定するステップを含む、上記方法も提供し、ここで、例えば上記のコホートと比較してより多数のクローナル新生抗原は、改善された予後を示す。好ましい実施形態において、癌は、肺癌又は黒色腫、好ましくは非小細胞肺癌又は黒色腫である。
【００７７】
代替的実施形態において、本発明は、癌を有する被験体の予後を予測又は決定する方法であって、上記方法は、前記被験体に由来する2つ以上の癌細胞におけるクローナル：サブクローナル比率及び/又はサブクローナル新生抗原割合を決定するステップを含み、ここで、例えば上記のコホートと比較してより高いクローナル：サブクローナル比率及び/又はより低い/低いサブクローナル新生抗原割合は改善された予後を示す、上記方法を含む。好ましい実施形態において、癌は、黒色腫又は肺癌、好ましくは黒色腫又は非小細胞肺癌である。
【００７８】
癌の治療
また本発明は、被験体における癌を治療又は予防する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
i) 本発明の方法に従って、免疫チェックポイント介入による治療に適した癌を有する被験体を同定するステップ；及び
ii) 前記被験体を免疫チェックポイント介入により治療するステップ
を含む、上記方法も提供する。
【００７９】
本明細書中で定義される「治療」は、治療される疾患、障害又は感染の1つ以上の症状の、治療前の症状と比較した低下、軽減又は除去を指す。
【００８０】
「予防(prevention)(又は予防(prophylaxis)」は、疾患、障害又は感染の症状の発症を遅らせるか又は防止することを指す。予防は、絶対的な(疾患が発生しないような)予防であってもよく、又は一部の個体においてのみ、若しくは限定された時間量に対してのみ有効であってもよい。
【００８１】
「免疫チェックポイント介入」という用語は、本明細書中で、免疫チェックポイント分子と相互作用するか、又は免疫チェックポイント分子を調節する任意の治療法を指すために使用される。例えば、免疫チェックポイント介入を、本明細書中で「チェックポイント遮断療法」、「チェックポイントモジュレーター」又は「チェックポイント阻害剤」と呼ぶこともできる。
【００８２】
「阻害剤」という用語は、これらの経路によるT細胞活性の阻害を予防するための任意の手段を意味する。これは、受容体-リガンド相互作用を遮断する抗体又は分子、細胞内シグナル伝達経路の阻害剤、及びT細胞表面上の免疫チェックポイント分子の発現を妨げる化合物によって達成され得る。
【００８３】
チェックポイント阻害剤としては、限定するものではないが、例えばCTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、Lag-3阻害剤、Tim-3阻害剤、TIGIT阻害剤及びBTLA阻害剤が挙げられる。免疫調節受容体を通して陽性シグナルを送達する共刺激抗体としては、限定するものではないが、ICOS、CD137、CD27 OX-40及びGITRが挙げられる。
【００８４】
好適な免疫チェックポイント介入の例としては、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ及びイピリムマブが挙げられる。
【００８５】
実施例1に示されるとおり(図5及び7を参照)、多数のクローナル新生抗原を有する肺腫瘍は、高レベルのPD-1及びLag-3を発現し、これに合わせて肺癌被験体におけるクローナル新生抗原に反応性のT細胞も高レベルのPD-1及びLAG-3を発現する。低いクローナル負荷を有する腫瘍と比較した、高いクローナル新生抗原負荷を有する腫瘍におけるPD-1とLag-3の共発現は、両経路の同時標的化が最大の利益を生じ得ることを示唆している。
【００８６】
従って、一態様において、本発明は、例えば肺癌における、各経路を標的とする阻害剤の共投与による、又は両経路を標的とする単一試薬の投与によるPD-1経路及びLag-3経路の共標的化に関する。後者の例として、二特異性抗体は、PD-1及びLag-3、又はPD-L1及びLag-3に結合することができる。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態において、被験体は、哺乳動物、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットであるが、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【００８８】
一態様において、本発明による癌の治療又は予防方法は、前記治療又は療法を必要とする患者を同定するステップを含む。
【００８９】
癌は、例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌(腎細胞)、肺癌(小細胞、非小細胞及び中皮腫)、脳癌(例えば神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫)、黒色腫、リンパ腫、小腸癌(十二指腸及び空腸)、白血病、膵臓癌、肝胆道腫瘍、生殖細胞癌、前立腺癌、頭部及び頸部癌、甲状腺癌及び肉腫から選択することができる。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態において、癌は肺癌である。特に好ましい実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌である。
【００９１】
本発明の一実施形態において、癌は黒色腫である。
【００９２】
本発明の一態様において、被験体は前浸潤性の疾患を有するか、又は、それらの原発疾患が切除された被験体、例えば本発明により提供されるアジュバント療法を必要とし得るか若しくはアジュバント療法から恩恵を受け得る被験体である。
【００９３】
また本発明の方法を用いる治療は、循環腫瘍細胞及び/又はこの腫瘍に由来する転移を標的化するステップも包含し得る。
【００９４】
本発明による癌を治療する方法及び使用は、追加的な癌療法と組み合わせて実施することができる。特に、本発明による免疫チェックポイント介入は、共刺激抗体、化学療法及び/又は放射線療法、標的化療法又はモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与することができる。
【００９５】
ここで本発明は実施例によりさらに説明されるが、この実施例は、当技術分野において通常の技能を有する者が本発明を実施することを支援する役割を果たすことが意図され、本発明の範囲を限定することは全く意図されない。
【実施例】
【００９６】
実施例1
非小細胞肺癌の腫瘍内不均一性(NSCLC ITH)の文脈での新生抗原と免疫調節との臨床的関連性、及び新生抗原反応性腫瘍浸潤T細胞の特性(identity)を調べた。
【００９７】
材料及び方法
患者コホートの説明
配列決定用のサンプル(L011及びL012)を、非小細胞肺癌(NSCLC)との診断を受けた患者であって、任意の形態のアジュバント療法(例えば化学療法又は放射線療法)を受ける前に根治的な外科的切除を受けた上記患者から得た。ゲノム配列決定を許可するインフォームドコンセントは得られていた。両サンプルをロンドン大学病院(University College London Hospital)(ロンドン)(UCLHRTB 10/H1306/42)から回収し、病理検査に供して組織学的サブタイプを確立した：1つの腫瘍はCK7+/TTF1+腺癌(L011)に分類され、1つの腫瘍(L012)は扁平上皮癌組織に分類された。詳細な臨床的特徴は、表S1に示される。
【００９８】
(1)から得られたサンプルは、ステージIV NSCLCの患者コホートを示し、この患者コホートの詳細な説明(腫瘍処理を含む)は、(1)の補足資料において見出すことができる。このコホートの詳細な臨床的特徴は表S3に示される。
【００９９】
臨床的有効性分析
臨床的有効性分析を(1)に記載のとおりに実施した。手短に言えば、ペムブロリズマブに対する客観的応答を放射線科研究医による研究者評価の免疫関連応答判定基準(irRC)によって評価した。プロトコルに概略が示されるとおり、CTスキャンを9週間毎に実施した。部分的応答及び完全応答が、応答の初期同定から最小4週間後に行われた反復画像診断により確認された。応答未確認は、2回目のCTスキャンの結果に応じて、安定な疾患又は進行性の疾患と判断された。「持続的臨床利益(DCB)」は、6ヶ月間より長く持続する安定な疾患又は部分的応答(第27週、第3のプロトコルによりスケジュールされた応答評価時)として定義された。持続的利益なし(NDB)は、治療の開始から6ヶ月間以下での疾患の進行として定義された。研究治療に対して継続中の応答を示す患者について、直近の画像診断評価の日に無増悪生存期間を打ち切り(censor)とした。生存患者については、最後に連絡をとったことがわかっている日に全生存期間を打ち切りとした。各患者についての応答に関する詳細は、表S2に見出すことができる。
【０１００】
TCGAエクソームデータセット
肺腺癌のコホート(LUAD、n=124)及び肺扁平上皮癌のコホート(LUSC、n=124)について、以下に記載される変異コール及びHLAタイプを有する腫瘍サンプルをCancer Genome Atlas (TCGA)から得た。LUAD TCGAコホート及びLUSC TCGAコホートについて、SNVデータをTumourPortal(2)から得た(http://www.tumourportal.org/tumour_types?ttype=LUAD | LUSC)。1人のLUAD患者、TCGA-05-4396は、7000個超の、主にC[C>G]Gコンテキストでコールされる低品質変異を有していたため除外された。LUSC患者、TCGA-18-3409は、LUSC腫瘍に特徴的でない強いUVシグネチャーを有していたため除外された。
【０１０１】
腫瘍処理
L011及びL012の両方について、単一の腫瘍塊から1cm間隔で分離された4つの原発腫瘍領域及び隣接正常組織が病理学者により選択され、写真により文書化され、急速凍結された。L011における脳転移については、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色により決定された4つの腫瘍領域が、病理学者によりホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織ブロックの形態で選択された。全患者から手術の時に末梢血を集め、急速凍結させた。約5x5x5mmの急速凍結させた腫瘍組織及び500μlの血液を、製造者のプロトコルに従ってDNeasyキット(Qiagen)を用いるゲノムDNA抽出に使用した。FFPE組織について、マニュアルブレード顕微解剖を用いて10〜40μmの未染色スライドから組織の腫瘍リッチ領域を取り出し、この腫瘍リッチ領域からDNeasy血液及び組織キット(Qiagen)を用いてDNAを抽出し、Qubit(Invitrogen)によりDNAを定量し、アガロースゲル電気泳動によりDNAの完全性を調べた。バリデーションコホート及びディスカバリーコホートの処理に関する詳細は、(1)の補足資料中に見出すことができる。
【０１０２】
多領域全エクソームシーケンス及び変異コーリング
L012
患者L012に由来する各腫瘍領域及び及び対応する生殖細胞系列について、Illumina Nexterキットを製造者のプロトコル(Illumina)に従って使用し、1〜2μgのDNAに対してエクソームキャプチャーを実施した。以前に記載されたとおり(3、4)、サンプルは、LRIの先端配列決定施設(Advanced Sequencing Facility)にあるIllumina HiSeq 2500でペアエンドマルチプレックスシーケンスを行った。キャプチャーされた各ライブラリをIlluminaプラットフォーム上にロードし、所望の平均シーケンス深度までペアエンドシーケンスを行った(平均エクソーム幅=392.75)。Illuminaパイプラインにより生成されたFastQフォーマットの生ペアエンドリード(100bp)を、bwa mem(bwa-0.7.7)(6)を使用し、GATKバンドル2.8(5)から得られた全hg19ゲノムアセンブリ(未知のコンティグを含む)に対してアラインメントした。Picardツール v1.107を使用して、同一の患者領域に由来するファイルをクリーンにし、ソートし及びマージし、重複リードを除去した(http://broadinstitute.github.io/picard)。picardツール(1.107)、GATK(2.8.1)及びFastQC(0.10.1)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)の組み合わせを用いて、品質管理尺度を得た。
【０１０３】
SAMtools mpileup(0.1.16)(7)を使用して、腫瘍サンプル及び生殖細胞系列サンプル中の非参照位置を特定した。<20のphredスコアを有する塩基又は<20のマッピングクオリティを有するリードはスキップした。BAQ計算は無効になり、マッピング品質をダウングレードするための係数を50に設定した。腫瘍と、対応する生殖細胞系列との間の体細胞変異を、SAMtools mpileupからの出力を利用するVarScan2 somatic(v2.3.6)(8)を用いて決定した。生殖細胞系列サンプルの最小カバレッジを10に設定し、最小変異頻度を0.01に変更し、腫瘍純度を0.5に設定した以外は、デフォルトパラメーターを使用した。VarScan2 process Somaticを使用して体細胞変異を抽出した。結果として得られたSNVコールを、VarScan2の付属fpfilter.plスクリプトを用いて偽陽性についてフィルタリングし、bam-readcount(0.5.1)によりそのデータを最初に走らせた。VarScan2 process Somaticにより「高信頼度」に分類されるINDELコールのみをさらなる分析のために維持した。
【０１０４】
Integrated Genomics Viewers (IGV)(9)を用いて全変異を手動で再調査し、Illumina特異的なエラープロファイル(10)を示す変異を除去した。残りの変異を、Ion Torrent PGMシーケンサー(Life Technologies)上で1513のメジアン深度まで配列決定した。このため、オンラインデザイナー(www.ampliseq.com)を使用してIon AmpliSeqTMカスタムパネル(Life Technologies)を設計した。各領域に由来するDNAに対し、製造者のプロトコルに従ってマルチプレックスPCRを実施した。バーコード化されたシーケンシングライブラリをTM構築し、これを、Ion Torrent PGMシーケンサー(Life Technologies)で、200bpリード長で配列決定した。IonTorrent TorrentSuiteTMソフトウェアを用いて、hg19ゲノム由来の標的領域に対する配列アラインメントを実施した。少なくとも1つの領域でカバレッジが50であった変異が選択された。ある変異は、変異頻度がSNVについて≧0.01、INDELSについて≧0.02であった場合に領域中に存在するとされた。同様に、IGVにおける手動再調査を実施し、このステージをパスした変異を後続の解析に使用した。全変異はANNOVARを用いてアノテーションされ(11)、潜在的なドライバー変異が(12)に記載されるとおりに定義された。
【０１０５】
L011
生殖細胞系列及び原発腫瘍領域のシーケンス及び解析は、(13)において以前に記載されている。転移領域のシーケンスは、BGI Techにより、(13)に記載されるプロトコルに従って実施された。転移領域の演算処理を、L012について上述される方法を用いて、複数サンプルにまたがる平均メジアン深度93.7で実施した。L012と同様に、IGVを用いて非サイレント変異を手動で再調査した。
【０１０６】
Rizviデータからの変異コーリング
(i) ディスカバリーコホートを示す16個のサンプル及びバリデーションコホートを示す18個のサンプル(Rizviデータ)から、生殖細胞系列と腫瘍領域の両方を示すBAMファイルを得て、picardツール(1.107) SamToFastqアラインメントを用いてFASTQフォーマットに変換し、L012について上記のように変異コーリングを実施した。
【０１０７】
クローナル解析
TCGAサンプルについて、以前に記載されるとおり(14)、各変異のクローン状態を、野生型アレルカウント及び変異型アレルカウント、メジャーコピー絶対数及びマイナーコピー絶対数、並びに腫瘍純度推定値を統合することによって推定した。L011及びL012について、多領域配列決定解析に基づいて各変異のクローン状態を推定した。手短に言えば、各変異は、腫瘍内の配列決定される各腫瘍領域及び全ての腫瘍領域において同定され且つ存在する場合、クローナルであると分類された。逆に、全ての腫瘍領域において普遍的に存在しない変異はサブクローナルであると分類された。
【０１０８】
(1)から得られたデータを含むディスカバリーコホート腫瘍及びバリデーションコホート腫瘍について、各変異の癌細胞割合を、局所的コピー数(ASCATから入手、以下参照)、腫瘍純度(同様にASCATから入手)、及び変異アレル頻度を統合することによって推定した。手短に言えば、所与の変異について、本発明者らは、まず、観測された変異コピー数「nmut」(所与の変異を有する腫瘍細胞の割合にその遺伝子座における染色体コピーの数を乗じた結果を表す)を、以下の式：
【数１】
2018527935.tif 000002
(式中、VAFは変異塩基における変異アレル頻度に相当し、p、CNt、CNnは、それぞれ腫瘍純度、腫瘍遺伝子座特異的コピー数及び正常遺伝子座特異的コピー数である)を用いて計算した。次いで、本発明者らは、VAFを使用し、最大尤度を用いてある変異を可能性のあるコピー数の1つに割り当て、予測変異コピー数「nchr」を計算した。また本発明者らは、適用可能な場合、変異コピー数をサブクローナルコピー数によってより良く説明し得るか否かについても評価した。最終的には、これにより、本発明者らは、コピー数及び腫瘍純度の両方が補正された、全ての変異についての修正変異カウント及び参照カウントを得ることができた。次いで、PyClone Dirichletプロセスクラスタリング(15)を用いて全変異をクラスタ化した。コピー数及び純度が予め補正されていることを考慮して、本発明者らは整数コピー数を1、純度を1に設定し；それによりクローナル変異群とサブクローナル変異群に単純にクラスタ化することを可能とした。本発明者らは、PyCloneを、10,000反復及びバーンイン1000、並びにデフォルトパラメータで実行した。注目すべきは、変異のクローン状態を評価するため、最初に変異をさらにフィルタリングして信頼性の高いクラスタリングを確保したことである。手短に言えば、生殖細胞系列及び腫瘍の両方において、少なくとも10のリード深度を有する変異のみを使用した(VarScan2 体細胞性 p値閾値0.01)。各変異について最小で5つの代替リード、並びに1％の最小腫瘍変異アレル頻度が必要とされた。また変異は、最大2つの生殖細胞系列リード、及び2％の生殖細胞系列変異アレル頻度を可能とするようにフィルタリングもされた。
【０１０９】
2つの腫瘍ZA6965及びGR0134については、信頼性の高いコピー数、変異及び純度推定値を抽出することはできず、クローン構造解析は困難となったことから、これらの腫瘍を解析から除外した。
【０１１０】
コピー数分析
(1)の処理サンプルから得られたデータについて、VarScan2(v2.3.6)を用いて腫瘍-正常ペアに由来するエクソームSNP及びコピー数データを作成した。最小カバレッジ(21221095)及びデータ比以外はデフォルトパラメーターを用いて、Varscan2コピー数を実行した。(22300766)に記載されるとおり、サンプル毎の基準でデータ比を計算した。ASCAT v2.3(20837533)を用いてVarscanからの出力を処理し、全サンプルについて、エクソーム配列データに基づき、セグメント化されたコピー数データ並びに細胞充実度(cellularity)推定値及び倍数性推定値を与えた。以下の設定をそのデフォルト値から変更した：ACFを1に設定する閾値を0.2から0.15に調整し、ガンマ設定1でパッケージを実行した。TCGAサンプルについては、McGranahan(2015)に記載されるとおり、SNP6.0データを処理してコピー数情報を得た。
【０１１１】
系統樹構築
(12)に記載のように、腫瘍内の変異の領域的分布から構築された二成分存在/不存在マトリクスを用いて、系統樹を構築した。腫瘍L011について、L012及びL011の転移領域について記載される方法を用いて原発腫瘍データを再分析し、原発領域と転移領域の両方を扱う複合系統樹を可能とした。
【０１１２】
患者サンプルのHLAタイピング
全てのTCGA患者について、POLYSOLVER(POLYmorphic loci reSOLVER)(16)を用いて4桁のHLAタイプを決定した。患者L011及びL012は、Optitype(17)を用いて血清型が同定され且つ同時に遺伝子型が同定され、一致した結果が得られた。
【０１１３】
推定新生抗原の同定
同定された非サイレント変異を使用して、変異アミノ酸を可能な各位置に示した9〜11アミノ酸長のペプチドの包括的リストを生成した。全ての変異ペプチド及びその対応する野生型ペプチドの、患者の生殖細胞系列HLAアレルに対する結合親和性を、netMHCpan-2.8(18、19)を用いて予測した。候補新生抗原は、<500nmの予測結合強度を有する新生抗原として同定された。
【０１１４】
TCGA生存率分析
TCGAデータポータルを通じてTCGA患者の臨床データにアクセスし、
https://tcgadata.nci.nih.gov/tcgafiles/ftp_auth/distro_ftpusers/anonymous/tumour/CANCER.TYPE/bCR/biotab/clin/からダウンロードした。生存率パッケージを用いて、Rにおいて生存率分析を実施した。
【０１１５】
差次的遺伝子発現解析
TCGAデータポータルからRNA配列決定データをダウンロードした。各LUAD患者について、全ての入手可能な「Level_3」遺伝子レベルデータを得た。生リードカウントを、分析のためのRパッケージDESeq2への入力として使用した。トランスクリプトームワイドな差次的遺伝子発現解析を実施して、有意に差次的に発現された(p<0.05に調整された)免疫関連遺伝子(表S1にリストされる)を同定した。これらの遺伝子は、尺度1-r2を用いてそれらの共発現についてクラスタ化された。
【０１１６】
L011及びL012についての腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の単離
腫瘍を手術室から直接病理部に送り、そこでサンプルを領域に分割した。その後サンプルを滅菌条件下で刻み、続いて37℃で30分間にわたり酵素消化した(リベラーゼTLリサーチグレード(Roche)及びDNAse I(Roche)を添加したRPMI-1640(Sigma))後、gentleMACS(Miltenyi Biotech)を用いて機械的に解離させた。結果として得られた単一細胞懸濁液を、Ficoll-paque(GE Healthcare)勾配を通過させることによって白血球について富化させた。生細胞を計数し、-80℃にて10％ジメチルスルホキシドを添加したヒトAB血清(Sigma)中で凍結させた後、液体窒素に移した。
【０１１７】
L011及びL012の腫瘍浸潤リンパ球のin vitro増殖
TILを、急速増殖プロトコル(REP)を用いて、10％ヒトAB血清(Sigma)、可溶性抗CD3(OKT3、BioXCell)、6000IU/mL組換えヒトrhIL-2(PeproTech)、及び3人の同種異系の健常ドナーからプールした2x107放射線照射PBMC(30Gy)を加えたEX-VIVO培地(Lonza)を含むT25フラスコ中で増殖させた。rhIL-2を3000IU/mLで含む新鮮培地を必要に応じて3日毎に添加した。2週間の増殖後、TILを計数し、フローサイトメトリーにより表現型決定し、ヒトAB血清(Sigma)中で-80℃で凍結させた後、関連のアッセイにおいて使用するか、又は液体窒素中で長期保存した。
【０１１８】
MHC多量体生成及びコンビナトリアルコーディング-フローサイトメトリー解析
予測ネオエピトープを保持するMHC多量体を、自家生成した(デンマーク工科大学SRH研究室)。Pepscan Presto (オランダ)において合成ペプチドを購入した。L011のHLA発現と一致するHLA分子(HLA-A1101、A2402、及びB3501)並びにL012のHLA発現と一致するHLA分子(HLA-A1101、A2402、及びB0702)をUV感受性ペプチドでリフォールディングさせ、UV曝露後に目的のペプチドに交換した(20-23)。手短に言えば、UV感受性ペプチドをロードしたHLA複合体を、4℃にて1時間、384ウェルプレート中で候補新生抗原ペプチドの存在下に、366nm UV光(CAMAG)に曝した。ペプチド-MHC多量体を、合計9つの異なる蛍光ストレプトアビジン(SA)コンジュゲート：PE、APC、PE-Cy7、PE-CF594、ブリリアントバイオレット(BV)421、BV510、BV605、BV650、ブリリアントウルトラバイオレット(BUV)395(BioLegend)を用いて生成した。各抗原応答性T細胞のコンビナトリアルコーディングを可能とするために各ペプチド特異性について2つの異なるストレプトアビジン-コンジュゲートを用いてMHC多量体が生成され、それにより36個までの異なるペプチドに対する反応性についての並行した解析が可能になった(24、25)。
【０１１９】
新生抗原反応性CD8+T細胞の同定
領域特異的肺癌サンプル及び隣接正常肺組織から単離された、in vitro増殖させたCD8+Tリンパ球に対しMHC多量体解析を実施した。290個及び355個の候補変異ペプチド(<500nmの予測HLA結合親和性を有し、同じミスセンス変異に由来する複数の可能なペプチドバリエーションを含む)を合成し、それを使用して、増殖させたL011及びL012 TILをそれぞれスクリーニングした。増殖CD8+Tリンパ球の染色のため、サンプルを解凍し、DNAseで10分間処理し、洗浄し、37℃にて15分間MHC多量体パネルで染色した。その後、細胞を、633nm又は635nm励起用のLIVE/DEAD(登録商標)固定可能近赤外線死細胞染色キット(Invitrogen、Life Technologies)、CD8-PerCP(Invitrogenha Life Technologies)、及びCD4、CD14、CD16、CD19(全てBD Pharmingenより)及びCD40(AbD Serotec)の一群に対するFITC結合抗体を用いて、4℃にてさらに20分間染色した。データ取得は、LSR IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)で、FACSDiva 6ソフトウェアを用いて実施した。陽性応答の定義のためのカットオフ値は、全CD8+細胞の0.005％以上及び10以上のイベントであった。
【０１２０】
患者L011について、HLA-B3501 MTFR2由来多量体は、変異配列FAFQEYDSFには結合するが(正味MHC結合スコア：22)、野生型配列FAFQEDDSFには結合しない(正味MHC結合スコア：10)ことが見出された(図11B及びD、図9C)。重複ペプチドAFQEYDSFEK及びKFAFQEYDSFに対する応答は見られなかった。患者L012について、HLA-A1101 CHTF18由来多量体は、変異配列LLLDIVAPKには結合したが(正味MHC結合スコア：37)、野生型配列：LLLDILAPK(正味MHC結合スコア：41)には結合しなかった(図11C及びE、図9C)。重複ペプチドCLLLDIVAPK及びIVAPKLRPVに対する応答は見られなかった。最後に、HLA-B0702 MYADM由来多量体は、変異配列SPMIVGSPWに結合し(正味MHC結合スコア：15)、さらに野生型配列SPMIVGSPRにも結合した(正味MHC結合スコア：1329)。重複ペプチドSPMIVGSPWA、SPMIVGSPWAL、SPWALTQPLGL及びSPWALTQPLに対する応答は見られなかった。
【０１２１】
L011及びL012についての、ベースラインの非増殖腫瘍サンプルのMHC多量体分析及び多重パラメトリックフローサイトメトリー表現型決定
腫瘍サンプルを解凍し、洗浄し、暗所で37℃で10〜15分間、カスタムメイドのMHC多量体でまず染色した。その後、細胞を濡れた氷上に移し、表面抗体の一群(CD8-V500、SK1クローン(BD Biosciences)、PD-1-BV605、EH12.2H7クローン(Biolegend)、CD3-BV785、OKT3クローン(Biolegend)、LAG-3-PE、3DS223Hクローン(eBioscience))を製造者の推奨希釈で用いて、暗所で30分間染色した。細胞を、細胞内固定及びeBioscience製の透過化バッファーセットを使用して20分間透過化した。細胞内染色パネルは氷上、暗所で30分間適用され、製造者の推奨希釈で使用される以下の抗体で構成されていた：グランザイムB-V450、GB11クローン(BD Biosciences)、FoxP3-PerCP-Cy5.5、PCH101クローン(eBioscience)、Ki67-FITC、クローンB56(BD Biosciences)及びCTLA-4-APC、L3D10クローン(Biolegend)。データ取得は、BD FACSAria IIIフローサイトメーター(BD Biosciences)で実施され、Flowjoバージョン10.0.8(Tree Star Inc.)で解析された。
【０１２２】
L011及びL012の免疫組織化学
患者L011及びL012由来のサンプル並びに反応性ヒト扁桃腺を、緩衝ホルマリン中で固定し、従来の組織学的プロトコルに従ってパラフィン包埋した。パラフィンブロックから2〜5マイクロメートルの組織片を切り出し、電気的に荷電したスライドに移し、免疫組織化学に供した。一次使用抗体の詳細は以下の表に列挙されている。最適染色条件(すなわち、抗体希釈及びインキュベーション時間、抗原回収プロトコル、好適な色原体)を確立するため、各抗体を試験し、自動化プラットフォームBenchMark Ultra(Ventana/Roche)及びBond-III Autostainer(Leica Microsystems)を他の文献(26、27)に記載されるプロトコルに従って用いる従来の単一免疫組織化学によってヒト反応性扁桃腺の切片に対し最適化した。
【０１２３】
入手可能な場合、同じタンパク質に対して産生される少なくとも2つの異なる抗体を扁桃腺中で解析し、その染色パターンの特異性を確認した。多重染色について、以前に記載されたプロトコルを実施した(28)。細胞質又は細胞膜におけるタンパク質共発現の評価のため、色原体の単色の変化が記載される(すなわち、青色と赤色は紫色を生じ、茶色と青色はほぼ黒色の標識を生じさせる)。TMにより免疫組織化学及びタンパク質反応性パターンを評価した。多重免疫染色のスコアリングをAFで実施した。この研究についての承認は、国立研究倫理局(National Research Ethics Service)、研究倫理委員会4から得た(REC参照番号09/H0715/64)。
【０１２４】
【表１】
2018527935.tif 000003
【０１２５】
結果
大きな腫瘍新生抗原負荷は、T細胞による腫瘍認識を増加させ、免疫回避の可能性を低下させ得る(12)。腫瘍新生抗原の臨床的関連性(7)の裏付けとして、高い新生抗原ロード(コホートにおいて予測される新生抗原の数の上位四分位として定義される)が、対応する臨床データを有するLUADサンプル(n=117)において、残りの四分位の腫瘍と比較した場合により長い全生存時間に関連していたことが見出された(図1B、対数順位p=0.011；図5A)。
【０１２６】
新生抗原のクローン状態(一部の腫瘍細胞(サブクローナル)と比較した、全腫瘍における新生抗原の存在(クローナル))が生存転帰との関係に影響を与え得るか否かを決定するため、癌細胞割合(各変異を有する癌細胞の比率)を計算し、推定上の各新生抗原を、クローナル又サブクローナルのいずれかとして分類した(13)。多数の予測クローナル新生抗原を有する腫瘍(コホートの上位四分位として定義される)は、コホート中の他の全ての腫瘍と比較してより長い全生存率に関連していた(図1C、対数順位p=0.0077；図5B)。逆に、予測サブクローナル新生抗原数は、全生存率と有意に関連していなかった(図1D、対数順位p=0.12；図5C)。新生抗原負荷は変異負荷に関連していたが、本発明者らは、変異の数と比較して、新生抗原の数と全生存率の間のより強い関係を観察した(図6)。これらのデータは、LUADにおける多数のクローナル新生抗原の存在が、効果的な免疫監視に有利であり得ることを示唆する。LUSCコホートはより狭い範囲の推定新生抗原を有しており(図7A)(メジアン絶対偏差が50、及び四分位範囲が71)、このコホートにおいては、全生存率と新生抗原ロードとの間に統計的に有意な関連は観察されなかった(図7B〜G)。このことは、単一サンプルから腫瘍のクローン構造を分析することの困難性を反映しているかもしれない(14)。
【０１２７】
遺伝子発現解析は、低クローナル新生抗原コホート(コホートにおいて予測されるクローナル新生抗原の数の下位四分位として定義される)と高クローナル新生抗原コホートとの間で差次的に発現される27個の免疫関連遺伝子を明らかにした(表S1)。CD8A(p=0.005)、並びに抗原提示に関連する遺伝子(TAP-1 p=0.003、STAT-1 p<0.001)、T細胞浸潤に関連する遺伝子(CXCL-10 p=0.005、CXCL-9 p=p<0.001)及びエフェクターT細胞機能に関連する遺伝子(IFN-γ p<0.001、グランザイムB p<0.001及びH p=0.008)が、高クローナル新生抗原コホートにおいてアップレギュレートされ、共にクラスタ化された(図1E)。PD-1(p=0.02)及びリンパ球活性化遺伝子3(LAG-3、p<0.001)、T細胞機能の陰性レギュレーター(15)も、このクラスタ中で同定された。PD-L1も高クローナルコホートにおいて有意にアップレギュレートされ(p<0.001)、PD-L2と共にクラスタ化していた。本発明者らが、コホートにおける高クローナル新生抗原腫瘍を他の全ての腫瘍と比較した場合、PD-L1は、最も顕著に差次的に発現された免疫遺伝子として同定された(図8、p<0.001)。
【０１２８】
これらのデータは、高いクローナル新生抗原負荷が、特定の免疫チェックポイントタンパク質(PD-1、LAG-3、PD-L1/2)の発現によって調節される可能性がある活性化エフェクターT細胞の存在と関連していることを示す。
【０１２９】
次に、クローナル新生抗原に反応性のCD8+T細胞が、原発NSCLC腫瘍中で同定されるか否かを調べた。2つの早期段階腫瘍であるL011及びL012を多領域エクソームシーケンスに供し(13)、各原発腫瘍領域内の新生抗原の系統学的解析及び予測を可能とした(図2A)。L011は脳転移を含んでおり、一次手術の14ヶ月後に切除して多領域シーケンスに供した。両方の腫瘍が女性喫煙者(>40パックイヤー)に由来するが、それらの変異負荷及び不均一性の程度は異なっていた(図2A)。L011(腺癌)は、均一な原発腫瘍及び、腫瘍領域R3から生じた可能性が高い脳への転移性播種(M1〜M4)を示した(図2A)。原発腫瘍内で合計313個の新生抗原が予測され、このうち88％がクローナルであり、原発腫瘍の全領域において同定された(図2B)。逆に、L012(扁平上皮癌)は、低い変異負荷及び広範な不均一性を示し、予測新生抗原の75％がサブクローナルであった(図2A、C)。
【０１３０】
予測新生抗原をロードしたMHC多量体を使用して、異なる腫瘍領域及び隣接正常肺組織から増殖させたCD8+T細胞をスクリーニングした(13)。L011においては、クローナル変異である変異型MTFR2D326Y(FAFQEYDSF)(野生型形態(10nM)及び変異型形態(22nM)で高い予測HLA結合を有する(図2B))に対して反応性のCD8+T細胞が全ての腫瘍領域において同定され(2.8〜4.4％)、またより低い頻度で正常領域において同定された(0.1％)(図2D)。L012では、変異型CHTF18L769V(LLDIVAPK)及びMYADMR30W(SPMIVGSPW)に対して反応性のCD8+T細胞が全ての腫瘍領域において同定され、またより低い頻度で正常組織において同定された(図2E)。その両方ともクローナル変異であり、CHTF18は変異型形態及び野生型形態で高い予測HLA結合を有し(<50nM)、MYADMは、変異型形態(<50nM)と比較してより低い予測結合(>1000nM)を野生型形態で有していた(図2C)。
【０１３１】
L011において、MTFR2反応性CD8+T細胞は、全原発腫瘍領域に由来する非増殖TIL(腫瘍浸潤リンパ球)(図3A)中でも検出することが可能であり(0.79〜1.35％)、またより低い頻度で、正常組織(0.16％)及び末梢血単核細胞(PBMC)(0.02％)中でも検出することができた。同様に、CHTF18反応性CD8+T細胞及びMYADM反応性CD8+T細胞は、L012における全腫瘍領域に由来する非増殖サンプル中で同定され(CHTF18 0.16〜0.58％、MYADM 2.25〜2.31％)、またより低い頻度で、正常肺組織(CHTF18 0.02％、MYADM 0.17％)及びPBMC(CHTF18 0.02％、MYADM 0.01％)中で同定された(図3A)。
【０１３２】
非増殖サンプルにおける新生抗原反応性T細胞のさらなる特性決定を、フローサイトメトリーにより実施した。CTLA-4発現は、低レベルでは、L011及びL012のいずれについても腫瘍浸潤CD8+T細胞に限定され、一方でMTFR2反応性、CHTF18反応性、及びMYADM反応性T細胞上において最高レベルで同定された(図3B、図9A)。高レベルのPD-1が、>99％のMTFR2、CHTF18及びMYADM反応性腫瘍浸潤CD8+T細胞によって発現され(図3B、図9A)、一方でより低いレベルのPD-1が、腫瘍、正常組織及びPBMC中のCD8+MHC多量体陰性T細胞上で観察された。L011においては、LAG-3発現は、全ての腫瘍浸潤CD8+T細胞(MTFR2反応性細胞を含む)上で、正常組織及びPBMCと比較してより高かった(図3B)。LAG-3発現は、より低いレベルではあったが、L012においても観察された(図9A)。IHC研究は、L011原発腫瘍及びL012原発腫瘍の両方においてLAG-3を共発現するCD8+T細胞を同定するこれらの知見をさらに裏付けた(図3D)。Ki67は、腫瘍浸潤CD8+T細胞上で、正常組織又はPBMC中のレベルより高いレベルで発現されたが(図3B、図9A)、新生抗原反応性細胞及びMHC多量体陰性細胞の両方について、増殖細胞の割合は低かった(<25％)。対照的に、グランザイムB(GzmB)は、全ての研究されたCD8+T細胞サブセット上で高レベルで発現された。重要なことに、腫瘍中の高い割合の新生抗原反応性T細胞が高度に活性化されてGzmBを発現しているように見える一方、これらの細胞の大部分はPD-1を共発現し(>60％)、Ki67レベルに基づいて増殖抑制下にあると考えられた(図3C、図9B)。
【０１３３】
クローナル新生抗原に反応性のT細胞上のLAG-3及びPD-1の発現は、腫瘍PD-L1発現と共に(図3D)、高いクローナル肺腫瘍において同定される免疫シグネチャーを強く裏付ける(図1E)。これらのデータは、クローナル新生抗原を認識するT細胞の活性を抑制する上でのこれらの特異的なチェックポイントの潜在的な役割、及び高いクローナル新生抗原負荷を有するNSCLCにおけるこれらのチェックポイントを標的とする未来の研究を裏付ける。
【０１３４】
次に、推定新生抗原のクローン状態がNSCLCにおけるPD-1遮断に対する変化した感受性と関連し得るか否かを調べた。2つの独立したNSCLCコホートをペムブロリズマブで治療した最近の研究に由来するエクソームシーケンスデータを得て(2)(表S2)、各変異の癌細胞割合を推定することにより各腫瘍のクローン構造を分析した(13)(図10)。以前に報告されたとおり(2)、新生抗原負荷は、ディスカバリーコホート及びバリデーションコホートにおけるペムブロリズマブの臨床的有効性に関連しており、高い新生抗原レパートリーは改善された転帰と関連していた(データ示さず)。
【０１３５】
この関係はまた、各腫瘍のクローン構造に依存していた(図4A〜H)。ディスカバリーコホートにおいて、持続的臨床利益(DCB、(2)と同様に、6ヶ月を超えて持続する部分的応答又は安定な疾患として定義される)を示す全ての腫瘍は、高いクローナル新生抗原負荷(ディスカバリーコホートにおけるクローナル新生抗原のメジアン数(91)と同じ又はそれより高い場合として定義される)及び5％未満の新生抗原サブクローナル割合を有していた(図4A〜B)。逆に、非持続的利益(NDB)を示す全ての腫瘍は、低いクローナル新生抗原レパートリー(<91)又は高い新生抗原サブクローナル割合(>5％)のいずれかを有していた。このように、ディスカバリーコホートにおいて、新生抗原レパートリーと新生抗原不均一性(すなわち、クローナル：サブクローナル新生抗原／変異の比率)の両方を組み合わせることにより、ペムブロリズマブに対する感受性を、測定単独よりも良好に予測することが可能となった(図4C)。
【０１３６】
同様に、バリデーションコホートにおいて、高いクローナル新生抗原負荷(バリデーションコホートのメジアン(69)と同じ又はそれより高い場合として定義される)及び低いサブクローナル新生抗原割合(<5％)を有する6個の腫瘍のうち、5個がDCBと関連していた(図4D〜F)。逆に、低いクローナル新生抗原負荷又は高い新生抗原不均一性を有する10個の腫瘍のうち、8個がNDBと関連していた。例えば、大きな新生抗原負荷にもかかわらず、ZA6505は、非持続的臨床応答を示し、2ヶ月後に再発した。ZA6505はコホート内で最も不均一な腫瘍の1つであり、変異の80％超がサブクローナルとして分類される。
【０１３７】
要約すると、新生抗原不均一性の程度とクローナル新生抗原負荷の程度を併せて考慮した場合、ほぼ全症例において転帰を予測することができた(図4G〜H)。
【０１３８】
さらに、TCGA解析と一致して(図1E)、本発明者らはまた、高いクローナル新生抗原負荷及び低い新生抗原不均一性を有する腫瘍において、低い新生抗原負荷又は高い新生抗原不均一性を有する腫瘍と比較して、より高いPD-L1発現も観察した(P=0.0017、χ2検定、図11)。これらの結果は、クラスI拘束性推定新生抗原ではなく全変異を考慮した場合に依然として一貫しており(図12)、このことは、未同定のMHCクラスII拘束性新生抗原も、抗PD-1療法に応答する免疫反応性(6)及び新生抗原予測アルゴリズムの改良の必要性(16)において重要な役割を果たし得るという見解を裏付けている。CA9903(ペムブロリズマブに対する異例の応答を有する腫瘍)に由来する末梢血リンパ球(PBL)についての以前の分析は、HERC1P3278S変異(ASNASSAAK)から生じる予測新生抗原を認識する自家PBL中のCD8+T細胞集団を同定した(2)。クローナル新生抗原の関連性と一致して、この変異は、配列決定された腫瘍内の癌細胞の100％におそらく存在した(図4I〜J)。
【０１３９】
【表２】
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2018527935.tif 000005
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【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
参考文献
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【０１４２】
本明細書中で言及される全ての文献は、それらが言及される主題について特に注意を払いつつ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法及びシステムの様々な改変及び変動は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求される発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、分子生物学、細胞免疫学又は関連の分野における当業者には明らかな、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変が、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１Ａ】
2018527935.tif 000008
【図１Ｂ−Ｄ】
2018527935.tif 000009
【図１Ｅ】
2018527935.tif 000010
【図２Ａ】
2018527935.tif 000011
【図２Ｂ−Ｅ】
2018527935.tif 000012
【図３Ａ】
2018527935.tif 000013
【図３Ｂ】
2018527935.tif 000014
【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｆ】
2018527935.tif 000016
【図４Ｇ−Ｈ】
2018527935.tif 000017
【図４Ｉ−Ｊ】
2018527935.tif 000018
【図５Ａ】
2018527935.tif 000019
【図５Ｂ】
2018527935.tif 000020
【図５Ｃ】
2018527935.tif 000021
【図６】
2018527935.tif 000022
【図７Ａ】
2018527935.tif 000023
【図７Ｂ−Ｇ】
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【図８】
2018527935.tif 000025
【図９Ａ】
2018527935.tif 000026
【図９Ｂ】
2018527935.tif 000027
【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｆ】
2018527935.tif 000031
【図１２Ｇ−Ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018527935.tif 000034
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