(57)【要約】  配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体である、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、そのｐＧ１−ｘプロモーターは、少なくとも２９３ｂｐの長さを有する配列番号１の少なくとも一部からなるかまたはこれを含み、以下のプロモーター領域：  ａ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのコア調節領域；ならびに  ｂ）前記コア調節領域以外の、ｐＧ１−ｘプロモーター配列内の任意の領域である非コア調節領域、を特徴とし、  ｐＧ１−ｘプロモーターが、プロモーター領域のうちの何れかにおける、少なくとも１つの突然変異と、配列番号２および配列番号３における、少なくとも８０％の配列同一性と、配列番号２または配列番号３以外の任意の領域における、少なくとも５０％の配列同一性とを含み；さらに、  ｐＧ１−ｘプロモーターが、ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは増大させた、プロモーター強度および誘導比を特徴とし、この場合、  ・プロモーター強度が、誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ／または  ・誘導比が、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している、ｐＧ１−ｘプロモーター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体である、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、そのｐＧ１−ｘプロモーターは、少なくとも２９３ｂｐの長さを有する配列番号１の少なくとも一部からなるかまたはこれを含み、以下のプロモーター領域：
ａ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのコア調節領域；ならびに
ｂ）前記コア調節領域以外の、ｐＧ１−ｘプロモーター配列内の任意の領域である非コア調節領域、を特徴とし、
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、前記プロモーター領域のうちの何れかにおける、少なくとも１つの突然変異と、配列番号２および配列番号３における、少なくとも８０％の配列同一性と、配列番号２または配列番号３以外の任意の領域における、少なくとも５０％の配列同一性とを含み；さらに、
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは増大させた、プロモーター強度および誘導比を特徴とし、この場合、
・前記プロモーター強度が、誘導状態において、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ／または
・前記誘導比が、前記ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している、
ｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項２】
配列番号２および／または配列番号３が、１つ以上の転写因子結合性部位（ＴＦＢＳ）を含む、請求項１に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項３】
前記コア調節領域が、配列番号４のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体を含む、請求項１または２に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項４】
前記コア調節領域を、配列番号５、または前記１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体により表される主要調節領域へと組み込んだ、請求項１〜３の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項５】
前記１つ以上のＴＦＢＳが、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳである、請求項１〜４の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項６】
ｐＧ１配列の５’端において、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む前記ｐＧ１プロモーターの機能的変異体であって、好ましくは、前記ｐＧ１配列の３’側領域、または前記３’側領域の機能的変異体のうちの、少なくとも２９３ヌクレオチドを残す、請求項１〜５の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項７】
前記コア調節領域が、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項８】
前記コア調節領域または主要調節領域の、少なくとも２つのコピーを含む、請求項１〜７の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項９】
配列番号１２〜２９のうちの何れかにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフを含む、請求項１〜８の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１０】
Ｔモチーフが、前記コア調節領域の上流に配置され、任意に、主要調節領域の上流に配置される、請求項１〜９の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１１】
Ｔモチーフが、前記コア調節領域の下流に配置され、任意に、主要調節領域の下流に配置される、請求項１〜９の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１２】
翻訳開始部位の少なくとも一部を含む、３’末端のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１３】
２０００ｂｐ以下の長さを有する、請求項１〜１２の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１４】
ａ）配列番号３７〜４４、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れか；
ｂ）配列番号７７〜８０、好ましくは、配列番号８１〜１１２のうちの何れか；
ｃ）配列番号１１３〜１１４、好ましくは、配列番号１１５〜１３０のうちの何れか；
ｄ）配列番号１３１〜１３２、好ましくは、配列番号１３３〜１４８のうちの何れか；
ｅ）配列番号１４９〜１５０、好ましくは、配列番号１５１〜１６６のうちの何れか；
ｆ）配列番号１６７〜１６８、好ましくは、配列番号１６９〜１８４のうちの何れか；
ｇ）配列番号１８５〜１８６、好ましくは、配列番号１８７〜２０２のうちの何れか；
ｈ）配列番号２０３〜２０４、好ましくは、配列番号２０５〜２２０のうちの何れか；
ｉ）配列番号２２１〜２２２、好ましくは、配列番号２２３〜２３８のうちの何れか；
ｊ）配列番号２３９〜２４０、好ましくは、配列番号２４１〜２５６のうちの何れか；および
ｋ）配列番号３２〜３６もしくは配列番号２５７〜２５９；
のうちの何れかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる;
または
ｌ）上記ａ）〜ｋ）のうちの何れかの機能的変異体である、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、
配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体である機能的変異体である、ｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列のうちの何れかの機能的変異体、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れかの機能的変異体であって、以下の特色：
ａ）前記配列が、プロモーター配列の５’端において、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含み、好ましくは、前記プロモーター配列の３’側領域、または前記３’側領域の機能的変異体のうちの、少なくとも２９３ヌクレオチドを残す、上記ａ）〜ｋ）の前記ｐＧ１−ｘプロモーターのうちの何れかのプロモーター配列の機能的変異体であること；
ｂ）前記配列が、１つ以上のＴＦＢＳを含み、好ましくは、前記ＴＦＢＳが、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳであること；
ｃ）コア調節領域が、配列番号４のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体を含むこと；
ｄ）前記コア調節領域を、配列番号５、または前記ＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体により表される主要調節領域へと組み込んでいること；
ｅ）前記コア調節領域が、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含むこと；
ｆ）前記配列が、前記コア調節領域または前記主要調節領域の、少なくとも２つのコピーを含むこと；
ｇ）前記配列が、配列番号１２〜２９のうちの何れかにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフを含み、好ましくは、前記Ｔモチーフが、前記コア調節領域の上流または下流に配置され、任意に、前記主要調節領域の上流または下流に配置されること；
ｈ）前記配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部を含む、３’末端のヌクレオチド配列を含むこと；
ｉ）前記配列を、２０００ｂｐ以下の長さへと伸長させていること
のうちの１つ以上を特徴とする機能的変異体である、請求項１４に記載のｐＧ１−ｘプロモーター。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載のｐＧ１−ｘプロモーターを含む、単離ｐＧ１−ｘプロモーター核酸、または相補的配列を含む核酸。
【請求項１７】
対象のタンパク質（ＰＯＩ：protein of interest）をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結されており、前記ＰＯＩをコードする前記ヌクレオチド配列と、天然では会合しない、請求項１６に記載のｐＧ１−ｘプロモーター核酸。
【請求項１８】
前記ＰＯＩの分泌を可能とするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記ＰＯＩをコードする前記ヌクレオチド配列の５’端に隣接して配置される、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１６〜１８の何れか一項に記載の核酸を含む発現構築物、好ましくは、自己複製ベクターもしくは自己複製プラスミド、または宿主細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる、ベクターもしくはプラスミドである発現構築物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現構築物を含む組換え宿主細胞、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、酵母細胞または糸状真菌細胞、より好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組換え宿主細胞系を培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）により、ＰＯＩを作製する方法であって、
ａ）前記ＰＯＩを発現させる条件下で、前記細胞系を培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）工程と、
ｂ）前記ＰＯＩを回収する工程と
を含む方法。
【請求項２２】
培養が、
ａ）基本炭素供給源を使用することでｐＧ１−ｘプロモーターを抑制する、第１の工程と、これに続く
ｂ）補充炭素供給源を使用しないか、または限定量の補充炭素供給源を使用することで前記ｐＧ１−ｘプロモーターの抑制を解除して、前記ＰＯＩの産生を誘導する第２の工程と
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の工程ｂ）が、増殖制限量の前記補充炭素供給源を供給して、比増殖速度を、０．００１ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは、０．００５ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つ、フィード培地を援用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）前記基本炭素供給源を、グルコース、グリセロール、エタノール、これらの混合物、および複合栄養物材料からなる群から選択し；
ｂ）前記補充炭素供給源が、ヘキソース、たとえば、グルコース、果糖、ガラクトースもしくはマンノース、二糖、たとえば、サッカロース、アルコール、たとえば、グリセロールもしくはエタノール、または前出のうちの何れかの混合物である、
請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養を、バイオリアクター内で、前記第１の工程としての回分期で始め、前記第２の工程としての流加期または連続培養期を後続させて実施する、請求項２２〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記基本炭素供給源を、前記細胞系が消費するまで、前記回分期を実施する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記回分期が、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルの持続的減少を特徴とし、前記回分期の終点が、ｐＯ２の増大を特徴とする、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
回分期中に、前記ｐＯ２を、６５％未満または低飽和へと減少させるのに続き、回分の終点では、６５％を上回る増大または高飽和をもたらす、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記回分期を、約２０〜３６時間にわたり実施する、請求項２５〜２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記回分期を、回分培地１Ｌ中４５ｇのグリセロールを使用して実施し、培養を、２５℃で、約２７〜３０時間にわたり、または３０℃で、約２３〜３６時間にわたり実施する、請求項２５〜２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記流加期中の前記培養を、約１５〜８０時間、約１５〜７０時間、約１５〜６０時間、約１５〜５０時間、約１５〜４５時間、約１５〜４０時間、約１５〜３５時間、約１５〜３０時間、約１５〜３５時間、約１５〜２５時間、または約１５〜２０時間；好ましくは、約２０〜４０時間のうちの何れかにわたり実施する、請求項２５〜３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記流加期中の前記培養を、約８０時間、約７０時間、約６０時間、約５５時間、約５０時間、約４５時間、約４０時間、約３５時間、約３０時間、約２５時間、約２０時間、または約１５時間のうちの何れかにわたり実施する、請求項２５〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の工程ｂ）が、増殖制限量の前記補充炭素供給源を供給して、比増殖速度を、０．０４ｈ-1〜０．２ｈ-1の範囲内に保つフィード培地を流加期において援用する、請求項２５〜３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
約３０ｍｇ（Ｌ  ｈ）-1の空時収量を達成する、請求項２５〜３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記流加期中の前記培養を、約３０時間にわたり実施する、請求項３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
組換え宿主細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属のうちの何れかの酵母、好ましくは、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項２５〜３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、配列番号３７〜４４のうちの何れか、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れかである、請求項２５〜３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｐＧ１−ｘプロモーターが、配列番号３９、好ましくは、配列番号４９により特徴付けられる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＯＩを、前記細胞の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも１５％の転写速度で作製する、請求項２１〜３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＯＩが、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生剤、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカイン、またはＰＯＩの代謝物を含む治療用タンパク質から選択される異種タンパク質である、請求項２１〜３９の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体または誘導体である、単離人工プロモーターであって、ここでは、ｐＧ１−ｘと称するプロモーターであり、特異的なプロモーターエレメントおよび特色を特徴とする単離人工プロモーターを指す。
【背景】
【０００２】
メチロトローフ酵母であるメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属種と同義）は、十分に確立されたタンパク質産生宿主である。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のための多数の株操作法が、多様な産物のための生産性を改善しており、また、産生を目的とするプロモーターにも、努力が傾けられている（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒ，Ｒ．、Ｍ．Ｍａｕｒｅｒ、Ｊ．Ｋｌｅｉｎ、Ｊ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｃ．Ｋｉｚｉａｋ、Ｂ．Ｇａｓｓｅｒ、およびＤ．Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ（２０１３）、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ、１２：５）。遺伝子プロモーターは、対象の遺伝子（ＧＯＩ：gene of interest）を発現させるための鍵となる特色である：下流（３’）のＧＯＩのＲＮＡの転写は、上流（５’）のプロモーター配列により駆動される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）は、真核生物におけるｍＲＮＡの転写の一因となる。ＲＮＡＰＩＩプロモーターは、コアプロモーターと、いくつかのシス活性化ＤＮＡエレメント：近位プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、およびバウンダリー／インシュレーターエレメントとからなる。酵母コアプロモーターは、典型的に、主要転写開始部位の近傍（−７５／＋５０ｂｐ）に配置され、それらは、高頻度で、不適正なＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡコンセンサス配列に対する差違を２塩基以下とする）を含有し、他の生物において典型的に見出されるプロモーターエレメントを欠く。転写の調節は、異なる条件に応答し、シス活性化エレメントおよび対応する調節タンパク質（転写因子（ＴＦ））を介してなされる。
【０００３】
バイオテクノロジーへの適用のためには、構成的または調節的／誘導的遺伝子発現を可能とするプロモーターを使用する。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を活用する産生プロセスは、炭素供給源依存性プロモーター、たとえば、メタノール誘導性ＰAOXを適用すると好都合である。これにより、増殖期を、潜在的に煩瑣なタンパク質産生期から分離することができる。近年、炭素供給源によってもまた制御されるが、誘導のためにメタノールに依拠しない、一連のプロモーターが報告された（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら、２０１３）：これらのプロモーターは、過剰グリセロールによる抑制および制限グルコースによる誘導の特色を共有する。これらのプロモーターのうちで最も強力なｐＧ１（配列番号１）は、１Ｌ当たり０．０５ｇを下回るグルコースで完全に誘導され；天然では、高アフィニティーのグルコース輸送体遺伝子ＧＴＨ１の発現を制御する。グルコース取込みの特徴は、高および低アフィニティーグルコース輸送体の存在に依存する。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内の、１７のヘキソース輸送（ＨＸＴ）遺伝子（ＨＸＴ１〜１７）は、グルコース濃度に応じて発現し、２つのＨＸＴ相同体だけが、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内で見出される（ＰｐＨｘｔ１およびＰｐＨｘｔ２と名付けられる、ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−４＿０５７０およびＰＡＳ＿ｃｈｒ２−１＿００５４）。ＰｐＨｘｔ１は、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内の、主要な低アフィニティー輸送体であることが同定されているが、高アフィニティーのグルコース輸送は、他の２つの遺伝子、すなわち、ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿００２３およびＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿００１１（ｐＧ１により制御される遺伝子であるＧＴＨ１；Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら、２０１３）により容易となる。
【０００４】
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、巨大なグルコース取込み能および（発酵性）グルコース代謝を特色とするのに対し、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、低グルコース取込み速度と、呼吸器によるグルコース代謝とを有する。さらに、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より、はるかに低細胞外濃度で、グルコースを消費することが可能である（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるｍＭ範囲と対比した、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてμＭ範囲である、高アフィニティー輸送体のＫM）。グルコース取込み挙動における根本的な差違はまた、関連遺伝子の転写制御においても表され、また、転写調節因子、たとえば、ＰｐＡｆｔ１およびＰｐＭｘｒ１（ＳｃＡｄｒ１の相同体）の機能の進化においても見ることができる。
【０００５】
メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のプロモーターについての研究、ならびにＰAOX1およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターであるＰGAPのランダム突然変異誘発は、野生型プロモーターと比較して異なる活性、変更された誘導挙動を保有するプロモーター変異体を伴うライブラリーと、ＰAOX1の、いくつかの重要な転写因子結合性部位（ＴＦＢＳ）の同定とを結果としてもたらした（ＷＯ２００６／０８９３２９Ａ２）。
【０００６】
ｐＧ１プロモーターおよびその断片は、ＷＯ２０１３／０５０５５１Ａ１においてさらに記載されている。
【０００７】
ＷＯ２０１４０６７９２６Ａ１は、特異的なリーダー配列を援用する、対象のタンパク質の発現について開示している。リーダーは、多様なプロモーターと共に使用された。例示的なプロモーターとして、ｐＧ１プロモーターが使用された。
【０００８】
Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、１９８２、７８（７）：４４６１〜４４６５）は、酵母ｈｉｓ３プロモーター領域の欠失マッピングについて記載している。Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．は、大半の真核遺伝子に先行するＴ−Ａ−Ｔ−Ａボックス配列が、野生型プロモーターの機能に十分ではないことを結論付け、酵母プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの単純な相互作用部位より複雑であると考えられることを示唆している。
【０００９】
Ｑｕａｎｄｔら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９５、２３（２３）４８７８〜４８８４）は、ヌクレオチド配列データ中のコンセンサスマッチを検出して、配列データ解析に基づき、調節モチーフを同定するためのツールについて記載している。コンセンサスパターンのライブラリーを創出し、ソフトウェアツール（ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ）を使用して、潜在的な配列マッチを検出した。
【発明の概要】
【００１０】
炭素供給源による調節およびプロモーター強度に関して、改善された調節可能なプロモーターを提供することが、本発明の目的である。ＰＯＩの作製を増強し、かつ／または短縮された時間内でＰＯＩを作製するための、このようなプロモーターを提供することが、さらなる目的である。
【００１１】
この目的は、特許請求される主題により達成される。
【００１２】
本発明によれば、配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、炭素供給源により調節可能なｐＧ１プロモーターの機能的変異体である、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターであって、そのｐＧ１−ｘプロモーターは、少なくとも２９３ｂｐの長さを有する配列番号１の少なくとも一部からなるかまたはこれを含み、以下のプロモーター領域：
ａ）配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのコア調節領域；ならびに
ｂ）コア調節領域以外の、ｐＧ１−ｘプロモーター配列内の任意の領域である非コア調節領域
を特徴とし、
ｐＧ１−ｘプロモーターが、プロモーター領域のうちの何れかにおける、少なくとも１つの突然変異と、配列番号２および配列番号３における、少なくとも８０％の配列同一性と、配列番号２または配列番号３以外の任意の領域における、少なくとも５０％の配列同一性とを含み；さらに、
ｐＧ１−ｘプロモーターが、ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは増大させた、プロモーター強度および誘導比を特徴とし、この場合、
・プロモーター強度が、誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ／または
・誘導比が、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している、
ｐＧ１−ｘプロモーターが提供される。
【００１３】
具体的に、配列番号１により特定される、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｐＧ１プロモーターは、配列番号７、８、または９のうちの何れかであり、より具体的に、ここでの例において、基準として使用される、配列番号９である。
【００１４】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１（配列番号２６４）と名付けられた、先行技術によるプロモーターのうちの何れかでも、ＷＯ２０１３０５０５５１Ａ１において記載されている、ｐＧ１ａ（配列番号２６５）、ｐＧ１ｂ（配列番号２６６）、ｐＧ１ｃ（配列番号２６７）、ｐＧ１ｄ（配列番号２６８）、ｐＧ１ｅ（配列番号２６９）、またはｐＧ１ｆ（配列番号２７０）のうちの何れでもない。
【００１５】
具体的な態様によれば、本発明に従うｐＧ１−ｘプロモーターは、
・誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍、もしくは少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．３倍、もしくは少なくとも１．４倍、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも１．６倍、もしくは少なくとも１．７倍、もしくは少なくとも１．８倍、もしくは少なくとも１．９倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも２．１倍、もしくは少なくとも２．２倍、もしくは少なくとも２．３倍、もしくは少なくとも２．４倍、もしくは少なくとも２．５倍、もしくは少なくとも２．６倍、もしくは少なくとも２．７倍、もしくは少なくとも２．８倍増大しているプロモーター強度、または少なくとも２．９倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも３．３倍、もしくは少なくとも３．５倍、もしくは少なくとも３．８倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも４．５倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも５．５倍、もしくは少なくとも６倍増大しているプロモーター強度と、
・炭素供給源により調節される能力であって、ｐＧ１プロモーターにより達成される誘導比と比較して、同じであるかまたは大きな誘導比により決定される能力と
を特徴とする、炭素供給源により調節可能なプロモーターである。
【００１６】
さらなる具体的な態様によれば、本発明に従うｐＧ１−ｘプロモーターは、
・誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは大きなプロモーター強度と
・炭素供給源により調節される能力であって、ｐＧ１プロモーターにより達成される誘導比と比較して、少なくとも１．１倍、もしくは少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．３倍、もしくは少なくとも１．４倍、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも１．６倍、もしくは少なくとも１．７倍、もしくは少なくとも１．８倍、もしくは少なくとも１．９倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも２．１倍、もしくは少なくとも２．２倍、もしくは少なくとも２．３倍、もしくは少なくとも２．４倍、もしくは少なくとも２．５倍、もしくは少なくとも２．６倍、もしくは少なくとも２．７倍、もしくは少なくとも２．８倍増大している誘導比、または少なくとも２．９倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも３．３倍、もしくは少なくとも３．５倍、もしくは少なくとも３．８倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも４．５倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも５．５倍、もしくは少なくとも６倍増大している誘導比により決定される能力と
を特徴とする、炭素供給源により調節可能なプロモーターである。
【００１７】
さらなる具体的な態様によれば、本発明に従うｐＧ１−ｘプロモーターは、
・誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍、もしくは少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．３倍、もしくは少なくとも１．４倍、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも１．６倍、もしくは少なくとも１．７倍、もしくは少なくとも１．８倍、もしくは少なくとも１．９倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも２．１倍、もしくは少なくとも２．２倍、もしくは少なくとも２．３倍、もしくは少なくとも２．４倍、もしくは少なくとも２．５倍、もしくは少なくとも２．６倍、もしくは少なくとも２．７倍、もしくは少なくとも２．８倍増大しているプロモーター強度、または少なくとも２．９倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも３．３倍、もしくは少なくとも３．５倍、もしくは少なくとも３．８倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも４．５倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも５．５倍、もしくは少なくとも６倍増大しているプロモーター強度と、
・炭素供給源により調節される能力であって、ｐＧ１プロモーターにより達成される誘導比と比較して、少なくとも１．１倍、もしくは少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．３倍、もしくは少なくとも１．４倍、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも１．６倍、もしくは少なくとも１．７倍、もしくは少なくとも１．８倍、もしくは少なくとも１．９倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも２．１倍、もしくは少なくとも２．２倍、もしくは少なくとも２．３倍、もしくは少なくとも２．４倍、もしくは少なくとも２．５倍、もしくは少なくとも２．６倍、もしくは少なくとも２．７倍、もしくは少なくとも２．８倍増大している誘導比、または少なくとも２．９倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも３．３倍、もしくは少なくとも３．５倍、もしくは少なくとも３．８倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも４．５倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも５．５倍、もしくは少なくとも６倍増大している誘導比により決定される能力と
を特徴とする、炭素供給源により調節可能なプロモーターである。
【００１８】
具体的に、プロモーター強度を、ｐＧ１プロモーターと比較した、対象のタンパク質（ＰＯＩ：protein of interest）、たとえば、モデルタンパク質（たとえば、たとえば、増強型ＧＦＰであるｅＧＦＰ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受託番号：Ｕ５７６０７を含む、緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰ）の発現レベルおよび／または転写速度により決定する。ｐＧ１−ｘのプロモーター強度は、具体的に、たとえば、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．２倍、もしくは少なくとも１．３倍、もしくは少なくとも１．４倍、もしくは１．５倍、もしくは少なくとも１．６倍、もしくは少なくとも１．７倍、もしくは少なくとも１．８倍、もしくは少なくとも１．９倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも２．１倍、もしくは少なくとも２．２倍、もしくは少なくとも２．３倍、もしくは少なくとも２．４倍、もしくは少なくとも２．５倍、もしくは少なくとも２．６倍、もしくは少なくとも２．７倍、もしくは少なくとも２．８倍増大している、または少なくとも２．９倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも３．５倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも４．５倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも５．５倍、もしくは少なくとも６倍、もしくは少なくとも６．５倍、もしくは少なくとも７倍、もしくは少なくとも７．５倍、もしくは少なくとも８倍、もしくは少なくとも８．５倍、もしくは少なくとも９倍、もしくは少なくとも９．５倍、もしくは少なくとも１０倍増大している。
【００１９】
ここでは、ｐＧ１プロモーターは、プロモーター機能の改善を決定する基準または対照として用いてもよい。このような対照ｐＧ１プロモーターは、同じ宿主細胞および発現系を使用する並行対照実験において使用してもよく、同じ宿主細胞培養物中の内部対照として使用してもよい。プロモーター機能を、ｐＧ１プロモーターと比較して適格とするこのような対照実験は、好ましくは、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞培養物中、特に、モデルタンパク質、たとえば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰを発現させる、組換えメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において実行される。
【００２０】
ｐＧ１−ｘプロモーターによる誘導は、さらなる翻訳および前記ＰＯＩの任意の発現を具体的に含む、転写の誘導を具体的に指す。
【００２１】
前記転写速度は、プロモーター強度の尺度として決定され、具体的に、前記プロモーターを完全に誘導したときに得られる、転写物の量を指す。
【００２２】
前記転写速度は、たとえば、制限グルコースによるケモスタット培養条件下で得られる、完全誘導状態における転写強度により決定し、ｐＧ１プロモーターの転写速度と比べて表してもよい。
【００２３】
好ましくは、転写解析は、定量的または半定量的であり、好ましくは、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡシーケンシング、およびトランスクリプトーム解析を援用する。
【００２４】
ｐＧ１プロモーター強度と比較したプロモーター強度は、以下の標準的なアッセイにより決定することができる：被験プロモーターの制御下で、ｅＧＦＰを発現させるメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、ウェル１つ当たりの培養物を２ｍＬとして、２８０ｒｐｍで振とうしながら、深型２４ウェルプレート内、２５℃でスクリーニングする。グルコースフィードビーズ（６ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）を使用して、グルコース制限増殖条件を作出する。細胞を、誘導状態（ＹＰ＋１つのフィードビーズ、２０〜２８時間にわたる）における、ｅＧＦＰの発現について解析する。
【００２５】
培養条件が、たとえば、１Ｌ当たり０．４ｇ未満、好ましくは、１Ｌ当たり０．０４ｇ未満、具体的に、１Ｌ当たり０．０２ｇ未満のグルコース濃度で、ほぼ最大の誘導をもたらす場合、前記プロモーターは、抑制解除され、完全に誘導されていると考えられる。完全に誘導されたプロモーターは、好ましくは、天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の転写速度を示し、少なくとも１００％、なおまたはこれより大きい、少なくとも１５０％もしくは少なくとも２００％の転写速度を示す。転写速度は、たとえば、たとえば、下記の実施例節で記載される通り、液体培養物中でクローンを培養したときの、レポーター遺伝子、たとえば、ｅＧＦＰの転写物の量により決定してもよい。あるいは、転写速度は、マイクロアレイ上の転写強度により決定してもよく、この場合、マイクロアレイデータは、抑制状態と抑制解除状態との発現レベルの差違と、完全誘導状態における、対照と比較して大きなシグナル強度とを示す。
【００２６】
具体的には前記天然ｐＧＡＰプロモーターは、ＰＯＩの発現を決定するのに宿主細胞として使用されうる真核細胞に内因性または相同であるプロモーターであり、比較を目的として、標準または基準プロモーターとして用いられる。
【００２７】
たとえば、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の天然ｐＧＡＰプロモーターは、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内でＧＡＰＤＨの発現を制御するのに使用される通り、たとえば、図７に示される配列：メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＧＳ１１５）の天然ｐＧＡＰプロモーター配列（配列番号２６０）を有する、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内の、改変されていない内因性のプロモーター配列である。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を、本発明に従うＰＯＩを作製するための宿主として使用する場合、本発明に従うｐＧ１−ｘプロモーターの転写強度または速度を、このようなメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較し、かつ／または天然ｐＧ１プロモーターと比較する。
【００２８】
別の例としては、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然ｐＧＡＰプロモーターは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内でＧＡＰＤＨの発現を制御するのに使用される通り、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内の、改変されていない内因性のプロモーター配列である。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、ＰＯＩを作製するための宿主として使用する場合、ｐＧ１−ｘプロモーターの転写強度または速度を、このような出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較する。
【００２９】
したがって、本発明に従うプロモーターの相対転写強度または速度は通例、ＰＯＩを作製するための宿主として使用される、同じ種または株の細胞の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較される。
【００３０】
誘導比は、本ｐＧ１−ｘプロモーターの調節を決定するのに、鍵となるパラメータであり、誘導状態におけるプロモーター活性または強度を、抑制状態におけるプロモーター活性または強度と比べる。たとえば、抑制状態におけるモデルタンパク質（たとえば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）の発現レベルおよび／または転写速度は、過剰グリセロールによる抑制時に、決定され、モデルタンパク質の発現レベルおよび／または転写速度は、グルコースフィーディングの制限による誘導時の、誘導状態において決定される。
【００３１】
具体的に、誘導比を、抑制状態と対比した誘導状態における、発現レベル（たとえば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）の比により決定する。ｐＧ１−ｘプロモーターの誘導比は具体的に、ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは大きい。具体的な場合において、誘導比は、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大している。
【００３２】
ｐＧ１プロモーター強度と比較した誘導比は、以下の標準的なアッセイにより決定することができる：被験プロモーターの制御下で、ｅＧＦＰを発現させるメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、ウェル１つ当たりの培養物を２ｍＬとして、２８０ｒｐｍで振とうしながら、深型２４ウェルプレート内、２５℃でスクリーニングする。グルコースフィードビーズ（６ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）を使用して、グルコース制限増殖条件を作出する。細胞を、抑制（ＹＰ＋１％グリセロール、指数関数的増殖期）および誘導（ＹＰ＋１つのフィードビーズ、２０〜２８時間にわたる）時における、ｅＧＦＰの発現について解析する。
【００３３】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、抑制解除（誘導）状態において、抑制状態の少なくとも２．５倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍のプロモーター活性または強度（たとえば、転写活性または転写強度）を有する。
【００３４】
具体的に、コア調節領域が、配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を組み込む場合、配列番号２および３の配列を、ｐＧ１−ｘプロモーター配列内に、任意の順序で、好ましくは、互いと近接して、たとえば、配列番号２の配列と配列番号３の配列との間を、１０、２０、５０、または１００ｂｐ以下として含むことを意味する。
【００３５】
具体的に、配列番号２および／または配列番号３は、１つ以上の転写因子結合性部位（ＴＦＢＳ）を含有する。
【００３６】
具体的に、配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列は、それらの各々または両方の配列が併せて、それぞれの転写因子により認識されて機能的であると考えられる、ＴＦＢＳまたは少なくともその一部を表す。このような配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列（またはその機能的変異体）は、不可欠であると考えられ、ｐＧ１−ｘプロモーター内に、改変されていない形態で、あるいは少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、１００％以下の配列同一性を伴うその機能的変異体として組み込まれる。
【００３７】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、配列番号２および配列番号３以外のヌクレオチド配列であって、ｐＧ１プロモーター内の対応する領域に対する、少なくとも５０％の配列同一性、具体的に、コア調節領域または非コア調節領域における、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。具体的に、配列番号２および配列番号３以外の任意のヌクレオチド配列である、コア調節領域内のヌクレオチド配列は、ｐＧ１プロモーター内の対応する領域に対する、少なくとも少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する。具体的に、非コア調節領域内のヌクレオチド配列は、ｐＧ１プロモーター内の対応する領域に対する、９０％未満、または８０％未満、または７０％未満、または６０％未満の配列同一性を有しうる。
【００３８】
具体的に、コア調節領域は、配列番号４のヌクレオチド配列、またはＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性を伴う機能的変異体を含むかまたはこれからなる。
【００３９】
具体的に、コア調節領域を、配列番号５、またはＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性を伴う機能的変異体により表される主要調節領域へと組み込む。
【００４０】
具体的に、１つ以上のＴＦＢＳは、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳである。
【００４１】
具体的に、ＴＦＢＳは、転写因子であるＲｇｔ１および／またはＣａｔ８−１および／またはＣａｔ８−２により認識される。同じ因子対して変動しうるＴＦＢＳは、ある特定のコンセンサス配列を特徴とする。具体的な転写因子は、以下の通りに特定される。
【００４２】
Ｒｇｔ１は、グルコース応答性の転写活性化因子および抑制因子であり、いくつかのグルコース輸送体（ＨＸＴ）遺伝子の発現を調節する。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＲｇｔ１は、配列番号２６１のアミノ酸配列を特徴とする（図７）。
【００４３】
Ｃａｔ８−１およびＣａｔ８−２は、非発酵性増殖条件下で、様々な遺伝子の抑制解除に必要な、炭素供給源応答エレメントに結合する、亜鉛クラスター転写活性化因子である。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＣａｔ８−１およびＣａｔ８−２は、それぞれ、配列番号２６２および２６３のアミノ酸配列を特徴とする（図７）。
【００４４】
具体的に、コア調節領域は、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む。欠失は、１つ以上の点突然変異であってもよく、配列番号２と配列番号３との間に配置される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ全てのヌクレオチドを指す。
【００４５】
具体的に、コア調節領域は、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む。挿入は、１つ以上の点突然変異であってもよく、配列番号２と配列番号３との間に配置される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを指す。
【００４６】
具体的に、コア調節領域は、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。置換は、１つ以上の点突然変異であってもよく、配列番号２と配列番号３との間に配置される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ全てのヌクレオチドを指す。
【００４７】
ｐＧ１−ｘプロモーターを得るのに、特異的な欠失、挿入、または置換の何れを組み合わせてもよい。
【００４８】
具体的な側面によれば、ｐＧ１−ｘプロモーターは、少なくとも１つの突然変異を含む、元のコア調節領域または機能的変異体である、コア調節領域または主要調節領域の、少なくとも２つのコピーを含む。具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、コア調節領域の、少なくとも２つ、３つ、もしくは４つのコピー、および／または主要調節領域の、少なくとも２つ、３つ、もしくは４つのコピーを含んでもよい。
【００４９】
別の具体的な側面によれば、ｐＧ１−ｘプロモーターは、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される、１つ以上のＴＦＢＳの、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのコピーを含む。
【００５０】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、好ましくは、ｐＧ１配列の３’側領域、または３’側領域の機能的変異体のうちの、少なくとも２８０ヌクレオチドを残して、ｐＧ１配列の５’端における、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む、改善されたｐＧ１プロモーターの機能的変異体である。
【００５１】
具体的な態様によれば、ｐＧ１−ｘプロモーターは、配列番号１２〜２９のうちの何れかにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフを含む。Ｔモチーフは具体的に、
ａ）連続Ｔ（チミン）の配列であって、ここで、Ｔnもしくは（Ｔ）n［配列中、好ましくは、ｎ＝１３〜２０であり、好ましくは、Ｔモチーフは、Ｔ１４、Ｔ１５、もしくはＴ１６である］と称する配列；
ｂ）第１の位置におけるＡ（アデニン）に続く、連続Ｔ（チミン）の配列を特徴とする配列であって、ここで、ＡＴｎもしくはＡ（Ｔ）n［配列中、好ましくは、ｎ＝１３〜２０、場合によって、好ましくは、ｎ＝１３〜２２］と称する配列；
ｃ）第１の位置におけるＴ（チミン）および第２の位置におけるＡ（アデニン）に続く、連続Ｔ（チミン）の配列を特徴とする配列であって、ここで、ＴＡＴｎもしくはＴＡ（Ｔ）n［配列中、好ましくは、ｎ＝１３〜２０］と称する配列；
ｄ）連続Ｔ（チミン）の配列および最後の位置におけるＡ（アデニン）を特徴とする配列であって、ここで、ＴｎＡもしくは（Ｔ）nＡ［配列中、好ましくは、ｎ＝１３〜２０］と称する配列；
ｅ）連続Ｔ（チミン）の配列に続く、最後から２番目の位置におけるＡ（アデニン）、および最後の位置におけるＴ（チミン）を特徴とする配列であって、ここで、ＴｎＡＴもしくは（Ｔ）nＡＴ［配列中、好ましくは、ｎ＝１３〜２０］と称する配列；または
ｆ）Ａ（アデニン）を、Ｔ（チミン）で置換した、ｃ）もしくはｅ）の配列であって、ここで、ＴＴＴｎもしくはＴｎＴＴもしくはＴ（Ａ／Ｔ）ＴｎもしくはＴ（Ａ／Ｔ）（Ｔ）n、もしくはＴｎ（Ａ／Ｔ）Ｔもしくは（Ｔ）n（Ａ／Ｔ）Ｔ［配列中、好ましくは、ｎ＝１３〜２０］と称する配列、たとえば、（Ｔ）n［配列中、ｎ＝１５〜２２］の配列からなるＴモチーフを結果としてもたらす配列
のうちの何れかからなる。
【００５２】
たとえば、プロモーター配列が、ＴＡ（Ｔ）nモチーフ［配列中、ｎ＝１３〜２０］である１つのＴモチーフと、（Ｔ）nモチーフ［配列中、ｎ＝１３〜２２］である別のＴモチーフとを含むように、上記のａ）〜ｆ）下で指定したＴモチーフのうちの何れを、１つのプロモーター配列内に組み合わせてもよい。
【００５３】
Ｔモチーフは任意に、それが、Ｔモチーフの３’端および／または５’端における、１つ以上の「Ａ」（たとえば、１つ、２つ、または３つのアデニン）と、任意に、さらに「Ｔ」（たとえば、１つ、２つ、または３つのチミン）とによる延長であるような延長を含み、この延長を、ここではまた、延長型Ｔモチーフとも称する。
【００５４】
ここでは、「Ｔモチーフ」という用語は、延長されているかまたは延長されていないＴモチーフを必ず含むものとし、したがって、用語は、具体的に、延長を含まないＴモチーフと延長型Ｔモチーフの両方を含む。
【００５５】
具体的に、Ｔモチーフは、配列番号１２〜２９のうちの何れかであるヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなる。Ｔモチーフのうちの任意の１つ、２つ以上は、モチーフの延長を伴って、ｐＧ１−ｘプロモーターへと組み込んでもよく、モチーフの延長を伴わずに、ｐＧ１−ｘプロモーターへと組み込んでもよい。
【００５６】
具体的な一側面によれば、Ｔモチーフの延長は、その５’端における、「ＴＡ」配列の伸長であって、「ＴＡＴ」５’端を得るための伸長である。
【００５７】
別の具体的な側面によれば、Ｔモチーフの延長は、その５’端における、「ＴＡＡ」配列の伸長であって、「ＴＡＡＴ」５’端を得るための伸長である。
【００５８】
別の具体的な側面によれば、Ｔモチーフの延長は、その３’端における、「ＡＴ」配列の伸長であって、「ＴＡＴ」３’端を得るための伸長である。
【００５９】
別の具体的な側面によれば、Ｔモチーフの延長は、その３’端における、「ＡＡＴ」配列の伸長であって、「ＴＡＡＴ」３’端を得るための伸長である。
【００６０】
具体的な側面によれば、Ｔモチーフは、コア調節領域の上流に配置され、任意に、主要調節領域の上流に配置される。
【００６１】
別の具体的な側面によれば、Ｔモチーフは、コア調節領域の下流に配置され、任意に、主要調節領域の下流に配置される。
【００６２】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、翻訳開始部位の少なくとも一部を組み込む、３’末端のヌクレオチド配列を含む。翻訳開始部位は、具体的に、真核生物におけるＫｏｚａｋコンセンサス配列として公知であり、遺伝子の発現を支援するのに適する配列である。
【００６３】
具体的に、翻訳開始部位は、
ａ）ｐＧ１プロモーターに由来し、配列番号６のヌクレオチド配列、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を伴うその機能的変異体からなるかもしくはこれを含むか；または
ｂ）メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の他の任意のプロモーター、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を伴うその機能的変異体に由来する。
【００６４】
ｐＧ１プロモーターの３’末端領域の代わりに使用される場合もあり、配列番号６のヌクレオチド配列の代わりに使用される場合もある、例示的な代替な３’末端プロモーター領域は、たとえば、以下のプロモーター：ｐＡＯＸ１、ｐＡＯＸ２、ｐＤＡＳ１、ｐＤＡＳ２、ｐＦＬＤ、ｐＧＡＰ、またはｐＴＥＦ２のうちの何れかから導出される。
【００６５】
具体的な態様によれば、プロモーターは、２０００ｂｐ以下の長さを有する。具体的なｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１プロモーターより短い長さを有し、たとえば、少なくとも２９３ｂｐもしくは３００ｂｐの長さ、または少なくとも３２８ｂｐ、もしくは少なくとも３５０ｂｐ、もしくは少なくとも４００ｂｐ、もしくは少なくとも５００ｂｐの長さを伴う。
【００６６】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１プロモーターの断片に由来する配列を含んでもよい。具体的な側面によれば、ｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１の親断片の変異体または誘導体であって、配列番号１の、少なくとも３’側領域であり、ｐＧ１配列の、少なくとも５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または少なくとも９０％に及ぶ領域を含む変異体または誘導体である。
【００６７】
具体的に、ｐＧ１−ｘのヌクレオチド配列は、５’末端領域の欠失または５’末端領域内の欠失、たとえば、５’端におけるヌクレオチド配列の切断を含んで、３’端〜変動する５’端の範囲を伴う具体的な長さ、たとえば、少なくとも２９３ｂｐもしくは３００ｂｐの長さ、または少なくとも３２８ｂｐ、もしくは少なくとも３５０ｂｐ、もしくは少なくとも４００ｂｐ、もしくは少なくとも５００ｂｐの長さ〜少なくとも１、または少なくとも１０、または少なくとも１００ｂｐの欠失を含むｐＧ１プロモーター断片の長さのヌクレオチド配列の長さを得る、ｐＧ１プロモーターのヌクレオチド配列から導出される。
【００６８】
しかし、プロモーターの長さはまた、たとえば、ｐＧ１プロモーターの長さより長い長さ、具体的に、１５００ｂｐ以下、または２０００ｂｐ以下の長さを得るように増大させることもできる。具体的に、長さは、範囲：２９３ｂｐ〜１５００ｂｐ、２９３ｂｐ〜２０００ｂｐ、３２８ｂｐ〜１５００ｂｐ、または３２８〜２０００ｂｐののうちの何れかのうちの長さであってもよい。
【００６９】
具体的な側面によれば、本発明は、単離および／または人工ｐＧ１−ｘプロモーターを提供し、それは、
ａ）配列番号３７〜４４、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れか；
ｂ）配列番号７７〜８０、好ましくは、配列番号８１〜１１２のうちの何れか；
ｃ）配列番号１１３〜１１４、好ましくは、配列番号１１５〜１３０のうちの何れか；
ｄ）配列番号１３１〜１３２、好ましくは、配列番号１３３〜１４８のうちの何れか；
ｅ）配列番号１４９〜１５０、好ましくは、配列番号１５１〜１６６のうちの何れか；
ｆ）配列番号１６７〜１６８、好ましくは、配列番号１６９〜１８４のうちの何れか；
ｇ）配列番号１８５〜１８６、好ましくは、配列番号１８７〜２０２のうちの何れか；
ｈ）配列番号２０３〜２０４、好ましくは、配列番号２０５〜２２０のうちの何れか；
ｉ）配列番号２２１〜２２２、好ましくは、配列番号２２３〜２３８のうちの何れか；
ｊ）配列番号２３９〜２４０、好ましくは、配列番号２４１〜２５６のうちの何れか；および
ｋ）配列番号３２〜３６もしくは配列番号２５７〜２５９；
のうちの何れかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなる;
または
ｌ）上記ａ）〜ｋ）のうちの何れかの機能的変異体である、ｐＧ１−ｘプロモーターであって、好ましくは、ｐＧ１−ｘプロモーターが、ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは増大させた、プロモーター強度および誘導比を特徴とし、この場合、
・プロモーター強度が、誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ／または
・誘導比が、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している。
【００７０】
このような、上記ａ）〜ｋ）のｐＧ１−ｘプロモーターの機能的変異体は、好ましくは、ここで記載されるｐＧ１プロモーターの機能的変異体について記載される具体的な特色のうちの何れかを特徴とする。
【００７１】
具体的に、上記ａ）〜ｋ）のｐＧ１−ｘプロモーターのうちの何れかの機能的変異体、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れかの機能的変異体は、以下の特色：
ａ）配列が、プロモーター配列の５’端において、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含み、好ましくは、プロモーター配列の３’側領域、または３’側領域の機能的変異体のうちの、少なくとも２８０ヌクレオチドを残す、上記ａ）〜ｋ）のｐＧ１−ｘプロモーターのうちの何れかのプロモーター配列の機能的変異体であって、好ましくは、プロモーター配列の、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００ヌクレオチドの５’欠失であり、主要調節領域の下流または３’側における任意の配列と併せた、前記主要調節領域までであるがこれを含まない５’欠失を含む機能的変異体であり、主要調節領域が１つより多い場合、プロモーター配列の５’端欠失が、第１または最も５’側の主要調節領域までであるがこれを含まないこと；
ｂ）配列が、１つ以上のＴＦＢＳを含み、好ましくは、ＴＦＢＳが、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２からなる群から選択される転写因子のうちの何れかに対するＴＦＢＳであること；
ｃ）コア調節領域が、配列番号４のヌクレオチド配列、または１つ以上のＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体を含むこと；
ｄ）コア調節領域を、配列番号５、またはＴＦＢＳを含む、その機能的変異体、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性を伴う機能的変異体により表される主要調節領域へと組み込んでいること；
ｅ）コア調節領域が、配列番号２のヌクレオチド配列と配列番号３のヌクレオチド配列との間に、１つ以上のヌクレオチドの欠失を含むこと；
ｆ）配列が、コア調節領域または主要調節領域の、少なくとも２つのコピーを含むこと；
ｇ）配列が、配列番号１２〜２９のうちの何れかにより特定される、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＴモチーフをさらに含み、好ましくは、Ｔモチーフが、コア調節領域の上流または下流に配置され、任意に、主要調節領域の上流または下流に配置されること；
ｈ）配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部を含む、３’末端のヌクレオチド配列を含むこと；
ｉ）配列を、２０００ｂｐ以下の長さへと伸長させていること
のうちの１つ以上を特徴とする。
【００７２】
本発明はさらに、単離形態のｐＧ１−ｘプロモーターも提供する。
【００７３】
具体的に、ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーター、または相補的配列を含む核酸を含む、単離ｐＧ１−ｘプロモーター核酸が提供される。具体的に、相補的配列は、厳密な条件下で、ｐＧ１−ｘプロモーターとハイブリダイズする配列である。
【００７４】
具体的に、核酸は、対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結されており、この核酸は、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と、天然では会合しない。ＰＯＩは、具体的に、異種のポリペプチドまたはタンパク質である。
【００７５】
具体的に、ヌクレオチド配列は、ＰＯＩの分泌を可能とするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の５’端に隣接して配置される。
【００７６】
具体的に、シグナルペプチドは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ−接合因子プレプロペプチドに由来するシグナル配列、ならびにメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）および細胞外タンパク質Ｘ（ＥＰＸ１）に由来するシグナルペプチドからなる群から選択される（Ｈｅｉｓｓ，Ｓ．、Ｖ．Ｐｕｘｂａｕｍ、Ｃ．Ｇｒｕｂｅｒ、Ｆ．Ａｌｔｍａｎｎ、Ｄ．Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ、およびＢ．Ｇａｓｓｅｒ（２０１５）、Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｌｅａｄｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｐｘ１  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００７７】
具体的に、ＰＯＩは、真核生物タンパク質、好ましくは、哺乳動物タンパク質である。
【００７８】
具体的な場合において、ＰＯＩは、多量体タンパク質、具体的に、二量体または四量体である。
【００７９】
具体的な態様によれば、ＰＯＩは、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生剤、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素（process enzyme）、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカイン、またはＰＯＩの代謝物を含む、具体的に、本発明のプロモーターの転写制御下で対象の遺伝子を発現させる組換え細胞培養物の細胞代謝物を含む、治療用タンパク質から選択される異種タンパク質である。
【００８０】
具体的なＰＯＩは、抗原結合性分子、たとえば、抗体またはその断片である。具体的なＰＯＩには、抗体、たとえば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ：immunoglobulin）または免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ：immunoglobulin class G）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）、あるいはこれらの断片、たとえば、抗原結合性（Ｆａｂ：fragment-antigen binding）、Ｆｄ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、あるいは操作されたその変異体、たとえば、Ｆｖ二量体（ダイアボディー）、Ｆｖ三量体（トリアボディー）、Ｆｖ四量体、またはミニボディー、および単一ドメイン抗体、たとえば、ＶＨまたはＶＨＨもしくはＶ−ＮＡＲがある。さらなる抗原結合性分子は、（代替的な）足場タンパク質、たとえば、操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン、アドネクチン、アフィボディー、アンチカリン、およびＤＡＲＰｉｎから選択してもよい。「足場」という用語は、抗原結合性分子を作出するための出発点として用いられる、コンパクトかつ安定的にフォールディングされた、多面型のタンパク質基（サイズ、構造、および由来が異なる）について記載する。抗体（免疫グロブリン）の構造−機能関係から着想された、このような代替的なタンパク質足場は、所与の（生体）分子標的の緊密かつ具体的な認識のために作り変えられうる相互作用部位を支持する、頑健で保存的な構造フレームワークをもたらす。
【００８１】
具体的な態様によれば、発酵産物は、ＰＯＩ、代謝物、またはこれらの誘導体を使用して製造される。
【００８２】
本発明はさらに、ここで記載される核酸を含む発現構築物、好ましくは、自己複製ベクターもしくは自己複製プラスミド、または宿主細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる、ベクターもしくはプラスミドである発現構築物も提供する。
【００８３】
具体的に、発現構築物は、ｐＧ１−ｘプロモーターの転写制御下で、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した前記プロモーターであって、ＰＯＩのコード配列と天然では会合しないプロモーターを含む。具体的に、発現構築物は、ベクターである。
【００８４】
本発明はさらに、ここで記載される発現構築物を含む組換え宿主細胞、好ましくは、真核細胞、たとえば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、糸状真菌細胞、または植物細胞、好ましくは、酵母細胞または糸状真菌細胞、より好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母細胞である、組換え宿主細胞も提供する。
【００８５】
具体的に、酵母は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、好ましくは、メチロトローフ酵母からなる群から選択される。
【００８６】
具体的に好ましい酵母は、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）、またはＫ．シュードパストリス（Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）、たとえば、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である、ＣＢＳ７０４、ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ７４３５、ＣＢＳ９１７３−９１８９、ＤＳＭＺ７０８７７、Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、およびＳＭＤ１１６８のうちの何れかである。
【００８７】
具体的な側面によれば、組換え宿主細胞は、核酸配列の複数コピー、および／または発現構築物の複数コピーを含む。たとえば、組換え細胞は、２コピー、３コピー、４コピー以上（遺伝子コピー数：ＧＣＮ（gene copy number））を含む。
【００８８】
本発明はさらに、ここで記載される組換え宿主細胞の安定培養物も提供する。
【００８９】
具体的な態様によれば、剰余炭素供給源の存在下で、制限炭素供給源条件と比べて大きな比増殖速度を有する細胞を援用する。
【００９０】
本発明はさらに、ここで記載される組換え宿主細胞系を培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）により、ＰＯＩを作製する方法であって、
ａ）前記ＰＯＩを発現させる条件下で、細胞系を培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）工程と、
ｂ）ＰＯＩを回収する工程と
を含む方法も提供する。
【００９１】
具体的に、前記方法を、炭素供給源により調節可能なｐＧ１−ｘプロモーターによる転写制御下で実行するが、この場合、前記ｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１プロモーターと比較して、改善されたプロモーター強度および調節可能な特色のうちの少なくとも１つを有する。
【００９２】
具体的な態様によれば、細胞系を、回分、流加、もしくは連続培養条件下で、かつ／または制限炭素基質を含有する培地中で培養する。
【００９３】
具体的に、培養を、バイオリアクター内で、第１の工程としての回分期で始め、第２の工程としての流加期または連続培養期を後続させて実施する。
【００９４】
具体的に、宿主細胞は、高増殖速度期（たとえば、少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大増殖速度まで）において、炭素供給源に富む培地中で増殖させ、ＰＯＩは、低増殖速度期（たとえば、最大増殖速度の９０％未満、好ましくは８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、または４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、または０．２％未満）において、好ましくは、限定最小培地フィーディングにより、たとえば、炭素供給源を制限しながら、作製する。
【００９５】
具体的に、ＰＯＩは、たとえば、細胞系を、最大増殖速度未満の増殖速度、典型的に、細胞の最大増殖速度の９０％未満、好ましくは、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、または０．２％未満で培養することにより、増殖制限条件下で発現させる。典型的に、最大増殖速度は、具体的な宿主細胞について、個別に決定される。
【００９６】
具体的に、培養法は、
ａ）基本炭素供給源を使用することでｐＧ１−ｘプロモーターを抑制する、第１の工程と、これに続く
ｂ）補充炭素供給源を使用しないか、または限定量の補充炭素供給源を使用することでｐＧ１−ｘプロモーターを抑制解除または誘導して、ＰＯＩの産生を誘導する第２の工程と
を含む。
【００９７】
具体的に、細胞培養物へと最初に添加された基本炭素供給源を、細胞系が消費するまで、回分期を実施する。溶存酸素（ＤＯ）スパイク法を使用して、回分期における基本炭素供給源消費を決定することができる。
【００９８】
具体的な態様によれば、回分期は、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルの持続的減少を特徴とし、回分期の終点は、ｐＯ２の増大を特徴とする。典型的に、回分期において、基本炭素供給源を消費しながら、回分期に典型的である通りに、さらなる炭素供給源を添加しない場合、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルは、たとえば、６５％を下回る、たとえば、３０％まで、連続的に減少するであろう。基本炭素供給源を消費したら、ｐＯ２は、たとえば、３０％を上回る、たとえば、６５％以上を上回るまで増大しうることから、フィード培地を使用する流加系へと切り替えて、炭素供給源限定条件下で、さらなる炭素供給源を添加するのに適切な時点が指し示される。
【００９９】
具体的に、回分期中に、ｐＯ２を、６５％未満または低飽和へと減少させるのに続き、回分の終点では、６５％を上回る増大または高飽和をもたらす。具体的に、回分期を、酸素分圧（ｐＯ２）シグナルの増大が、６５％を上回る飽和、具体的に、７０％、７５％、８０％、または８５％の何れかを上回る飽和となるまで実施する。
【０１００】
具体的に、回分期を、約２０〜３６時間にわたり実施する。
【０１０１】
培養時間に関する「約」という用語は、±５％または±１０％を意味するものとする。
【０１０２】
たとえば、約２０〜３６時間の具体的な回分実施時間とは、１８〜３９．６時間、具体的に、１９〜３７．８時間の持続時間を意味する。
【０１０３】
具体的な態様によれば、回分期を、回分培地中、１Ｌ当たり４０〜５０ｇのグリセロール、具体的に、１Ｌ当たり４５ｇのグリセロールを、基本炭素供給源として使用して実施し、培養を、２５℃で、約２７〜３０時間にわたり、もしくは３０℃で、約２３〜３６時間にわたり、または２３〜３６時間の培養時間中、２５℃〜３０℃の間の任意の温度で実施する。回分培地中のグリセロール濃度を低下させると、回分期の長さが短くなるのに対し、回分培地中のグリセロールを増大させると、回分期はさらに長くなるであろう。グリセロールに対する代替物として、グルコースを、たとえば、ほぼ同じ量で使用することもできる。
【０１０４】
細胞培養およびＰＯＩ発現の典型的な系であって、回分期に流加期を後続させる系では、具体的に、流加期中の培養を、約１５〜８０時間、約１５〜７０時間、約１５〜６０時間、約１５〜５０時間、約１５〜４５時間、約１５〜４０時間、約１５〜３５時間、約１５〜３０時間、約１５〜３５時間、約１５〜２５時間、または約１５〜２０時間；好ましくは、約２０〜４０時間のうちの何れかにわたり実施する。具体的に、流加期中の培養を、約８０時間、約７０時間、約６０時間、約５５時間、約５０時間、約４５時間、約４０時間、約３５時間、約３３時間、約３０時間、約２５時間、約２０時間、または約１５時間のうちの何れかにわたり実施する。
【０１０５】
１２０時間未満または１００時間未満または８０時間以下の、任意のこのような流加培養であって、ＰＯＩ産生の成功を結果としてもたらし、これにより、高収量を得る流加培養を、ここでは、「高速発酵」と称する。具体的に、容量特異的な産物形成速度（ｒＰ）とは、単位容量（Ｌ）および単位時間（ｈ）当たりに形成される産物の量（ｍｇ）（ｍｇ（Ｌ  ｈ）-1）である。容量特異的な産物形成速度はまた、空時収量（ＳＴＹ）または容量生産性とも呼ばれる。
【０１０６】
具体的に、流加培養を、約３０ｍｇ（Ｌ  ｈ）-1（３０ｍｇ（Ｌ  ｈ）-1±５％または±１０％を意味する）の空時収量を達成するように実施する。具体的に、約３０ｍｇ（Ｌ  ｈ）-1の空時収量を、約３０時間の流加内に達成し、具体的に、少なくとも２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３ｍｇ（Ｌ  ｈ）-1のうちの何れかを、３３時間、３２時間、３１時間、３０時間、２９時間、２８時間、２７時間、２６時間、または２５時間のうちの何れか未満の流加時間内に達成することができる。
【０１０７】
具体的に、回分期を、第１の工程ａ）として実施し、流加期を、第２の工程ｂ）として実施する。
【０１０８】
具体的に、第２の工程ｂ）は、増殖制限量の補充炭素供給源を供給して、比増殖速度を、０．０４ｈ-1〜０．２ｈ-1の範囲内、好ましくは、０．２、０．１５、０．１ｈ-1、または０．１５ｈ-1のうちの何れか未満に保つフィード培地を流加期において援用する。
【０１０９】
具体的に、回分培養および流加培養の方法は、酵母宿主細胞、たとえば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属もしくはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属もしくはコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属のうちの何れかの酵母、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属以外の属に由来する酵母、たとえば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｚ．ルーキシー（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）、Ｐ．スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、もしくはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来する酵母、好ましくは、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を援用する。具体的に、酵母を、高速発酵において使用する。
【０１１０】
具体的に、回分培養および流加培養の方法は、配列番号３７〜４４のうちの何れか、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れかであるｐＧ１−ｘプロモーターを援用する。特に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、配列番号３９、好ましくは、配列番号４９により特徴付けられる。
【０１１１】
具体的に、ＰＯＩを、細胞の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも１５％の転写速度で作製する。
【０１１２】
具体的な態様によれば、基本炭素供給源は、補充炭素供給源と異なる、たとえば、定量的に、かつ／または定性的に異なる。定量的差違は、プロモーター活性を抑制するかまたはその抑制を解除するのに、異なる条件をもたらしてもよい。
【０１１３】
さらなる具体的な態様によれば、基本炭素供給源と、補充炭素供給源とは、同じ種類の分子または炭水化物を、好ましくは、異なる濃度で含む。さらなる具体的な態様によれば、炭素供給源は、２つ以上の異なる炭素供給源の混合物である。
【０１１４】
真核細胞培養物のために使用するのに適切である任意の種類の有機炭素を使用してもよい。具体的な態様によれば、炭素供給源は、ヘキソース、たとえば、グルコース、果糖、ガラクトースもしくはマンノース、二糖、たとえば、サッカロース、アルコール、たとえば、グリセロールもしくはエタノール、またはこれらの混合物である。
【０１１５】
具体的に好ましい態様によれば、基本炭素供給源は、グルコース、グリセロール、エタノール、またはこれらの混合物、および複合栄養物材料からなる群から選択される。好ましい態様によれば、基本炭素供給源は、グリセロールである。
【０１１６】
さらなる具体的な態様によれば、補充炭素供給源は、ヘキソース、たとえば、グルコース、果糖、ガラクトースおよびマンノース、二糖、たとえば、サッカロース、アルコール、たとえば、グリセロールもしくはエタノール、またはこれらの混合物である。好ましい態様によれば、補充炭素供給源は、グルコースである。
【０１１７】
具体的に、
ａ）基本炭素供給源は、グルコース、グリセロール、エタノール、これらの混合物、および複合栄養物材料からなる群から選択され；
ｂ）補充炭素供給源は、ヘキソース、たとえば、グルコース、果糖、ガラクトースもしくはマンノース、二糖、たとえば、サッカロース、アルコール、たとえば、グリセロールもしくはエタノール、または前出のうちの何れかの混合物である。
【０１１８】
前記培養工程は、具体的に、前記炭素供給源の存在下で、したがって、前記炭素供給源を含む培養培地中で細胞系を培養すること、またはまた、工程ｂ）の、補充炭素供給源の非存在下でも細胞系を培養することを含む。
【０１１９】
抑制解除（または誘導）条件は、特異的な手段により、適切に達成してもよい。第２の工程ｂ）は、任意に、補充炭素供給源を供給しないか、または制限量の補充炭素供給源を供給する、フィード培地を援用する。
【０１２０】
具体的に、フィード培地は、化学的に規定され、メタノールを含有しない培地である。
【０１２１】
フィード培地は、液体形態で、あるいは他の代替的形態、たとえば、固体、たとえば、錠剤もしくは他の持続的放出手段として、または気体、たとえば、二酸化炭素により、培養培地に添加してもよい。しかし、好ましい態様によれば、細胞培養培地に添加される補充炭素供給源の制限量はなお、ゼロでもよい。好ましくは、制限炭素基質の条件下で、培養培地中の補充炭素供給源の濃度は、０〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．６ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ未満、好ましくは１〜５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ、具体的に好ましくは１ｍｇ／Ｌであるか、なおまたはこれを下回り、たとえば、適切な標準的なアッセイにおいて測定される、たとえば、増殖しつつある細胞培養物による消費時に、培養培地中の残留濃度として決定される検出限界を下回る。
【０１２２】
好ましい方法では、制限量の補充的供給源がもたらす細胞培養物中の残留量は、産生期の終点における発酵培養液中、または、好ましくは、発酵産物の採取時に発酵プロセスのアウトプット中で決定される検出限界を下回る。
【０１２３】
具体的に、第２の工程ｂ）は、増殖制限量の補充炭素供給源を供給して、比増殖速度を、０．００１ｈ-1〜０．２ｈ-1、好ましくは、０．００５ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つ、フィード培地を援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用する、ｐＧ１の、炭素供給源と関連するＴＦＢＳについての配列解析。ｐＧ１（また、ＰGTH1とも称する）をまず増幅し、−９６５〜−１位（９６５ｂｐの長さであり、配列を、図６に提示する（配列番号１、特に、配列番号９を使用した））からクローニングした。番号は、ＴＦＢＳを指し示し、ＴＦＢＳを欠失のために選択した（表２に列挙する）。関連するマトリックスファミリーは、Ｆ＄ＣＳＲＥ（炭素供給源応答エレメント、斜線付きボックス）、Ｆ＄ＡＤＲ（酵母代謝調節因子、点描付きボックス）、Ｆ＄ＭＧＣＭ（単量体Ｇａｌ４クラスモチーフ、黒色ボックス）およびＦ＄ＹＭＩＧ（酵母ＧＣボックスタンパク質、白色ボックス）である。他のＴＦＢＳも、欠失の影響を受ける可能性がある（マトリックスマッチについては詳細情報を、表１に示す）。黒色の破線ボックスは、短縮型ｐＧ１変異体をスクリーニングすることにより同定された、ｐＧ１の主要調節領域を指し示す。星印は、欠失および突然変異のためにもまた選択される、顕著なＴＡＴ（−３９０〜−３７４位）モチーフの位置を指し示す。短縮型ｐＧ１プロモーター変異体の、代替的な５’側始点を、矢印および対応する変異体の長さで表す。
【図２】短縮型ｐＧ１プロモーター変異体についてのスクリーニングデータ  抑制的および誘導的な増殖条件において、ｐＧ１（クローン＃８、検証されたＧＣＮを１とする）または短縮型ｐＧ１変異体（２つずつのクローンを、三連で培養し、プレスクリーニングで選択した）の制御下にあるｅＧＦＰを発現させるクローンについて、集団の比ｅＧＦＰ蛍光（細胞容量と関連する蛍光）の幾何平均値を示す。非発現野生型のメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を、陰性対照として使用した。試料は、抑制的前培養時、ならびにフィードビーズによる２４および４８時間にわたる誘導の後に採取した。
【図３】ＴＦＢＳ欠失変異体およびＴＦＢＳ−ＴＡＴ突然変異体についてのスクリーニングデータ  抑制的および誘導的な増殖条件において、ｐＧ１（クローン＃８、検証されたＧＣＮを１とする）またはｐＧ１変異体（９つ以下のクローンを、３つのウェル内でプール培養した）の制御下にあるｅＧＦＰを発現させるクローンについて、集団の比ｅＧＦＰ蛍光（細胞容量と関連する蛍光）の幾何平均値を示す。野生型のメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を、陰性対照として使用した。
【図４】ｐＧ１重複変異体についてのスクリーニングデータ  抑制的および誘導的な増殖条件において、ｐＧ１（クローン＃８、検証されたＧＣＮを１とする）またはｐＧ１変異体（９つ以下のクローンを、３つのウェル内でプール培養し、プレスクリーニングで選択した）の制御下にあるｅＧＦＰを発現させるクローンについて、集団の比ｅＧＦＰ蛍光（細胞容量と関連する蛍光）の幾何平均値を示す。野生型のメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を、陰性対照として使用した。
【図５】ｅＧＦＰを発現させるｐＧ１およびｐＧ１変異体の流加培養  相対ｅＧＦＰ蛍光を、プレートリーダーを使用して、バイオリアクター試料（同様のバイオマス密度まで希釈された）から測定し、回分培養（Ａ）および流加培養（Ｂ）におけるフィード時間（回分の終点を０とする）にわたり示す。ｐＧ１（＃８）の制御下においてｅＧＦＰを発現させるクローンを、ｐＧ１欠失変異体（ｐＧ１−Δ２、配列番号２１１）、ＴＡＴ突然変異（ｐＧ１−Ｔ１６、配列番号２５７）、および重複（ｐＧ１−Ｄ１２４０）変異体（配列番号４９）の制御下において発現させるクローンと比較した。
【図６】ｐＧ１およびｐＧ１−ｘプロモーター配列
【図６ａ】基準配列
【図６ｂ】ｐＧ１−ｘプロモーターの配列
【０１２５】
【化１−１】
2018522565.tif 000002
【０１２６】
【化１−２】
2018522565.tif 000003
【図７−１】
【０１２７】
【化２】
2018522565.tif 000004
【図７−２】（続き）転写因子配列  Ｒｇｔ１（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿０２３３）（配列番号２６１）  Ｃａｔ８−２（ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５４０）（配列番号２６２）  Ｃａｔ８−１（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿０７５７）（配列番号２６３）
【図８】先行技術による配列  ＷＯ２０１３０５０５５１Ａ１において記載されている、ｐＧ１（配列番号２６４）、ｐＧ１ａ（配列番号２６５）、ｐＧ１ｂ（配列番号２６６）、ｐＧ１ｃ（配列番号２６７）、ｐＧ１ｄ（配列番号２６８）、ｐＧ１ｅ（配列番号２６９）、またはｐＧ１ｆ（配列番号２７０）
【図９】Ｍａｕｒｅｒら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、２００６、５：３７）を出典として、（Ａ）標準流加プロトコール、（Ｂ）空時収量を最適化した流加プロトコール（「高速発酵」）を使用する、配列番号３９の、選択されたｐＧ１−３態様（ｐＧ１−Ｄ１２４０（配列番号４９））であって、代替的な足場タンパク質を、モデルタンパク質として発現させるｐＧ１−３態様の流加培養。
【発明の詳細な説明】
【０１２８】
本明細書を通して使用される特殊な用語は、以下の意味を有する。
【０１２９】
ここで使用される「炭素供給源」という用語であって、「炭素基質」ともまた称する用語は、発酵可能な炭素基質、典型的に、微生物のためのエネルギー供給源として適する炭水化物の供給源、たとえば、宿主生物または産生細胞系による代謝が可能な供給源、特に、単糖、オリゴ糖、多糖、グリセロールを含むアルコールからなる群から選択される供給源であって、精製形態における供給源、最小培地中の供給源、または原料、たとえば、複合栄養物材料により供給される供給源を意味するものとする。炭素供給源は、本発明に従い、単一の炭素供給源として使用してもよく、異なる炭素供給源の混合物として使用してもよい。
【０１３０】
「基本炭素供給源」、たとえば、本発明に従い使用される「基本炭素供給源」とは、典型的に、細胞の増殖に適する炭素供給源、たとえば、真核細胞のための栄養物である。基本炭素供給源は、培地、たとえば、基本培地または複合培地により供給してもよいが、また、精製された炭素供給源を含有する、化学的規定培地により供給してもよい。基本炭素供給源は、典型的に、特に、培養プロセスの増殖期において、細胞の増殖をもたらす量、たとえば、１Ｌ当たりの細胞乾燥質量少なくとも５ｇ、好ましくは１Ｌ当たりの細胞乾燥質量少なくとも１０ｇ、または１Ｌ当たりの細胞乾燥質量少なくとも１５ｇの細胞密度を得る量、たとえば、標準的な継代培養ステップにおいて、９０％より大きい生存可能性、好ましくは９５％より大きい生存可能性を呈示する量で供給される。
【０１３１】
本発明によれば、基本炭素供給源は、典型的に、たとえば、大きな比増殖速度による細胞系の培養時において、たとえば、回分または流加培養プロセス中の細胞系の増殖期において、バイオマスを増大させるエネルギーをもたらす過剰として理解される、過剰または剰余量で使用する。この剰余量は特に、補充炭素供給源（増殖制限条件下で使用される）の制限量を超えて、発酵培養液中の残留濃度であって、測定可能であり、典型的に、制限量の補充炭素供給源をフィードするときの、少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍である残留濃度を達成する。
【０１３２】
「補充炭素供給源」、たとえば、本発明に従い使用される「補充炭素供給源」とは、典型的に、特に、培養プロセスの産生期において、産生細胞系による発酵産物の産生を容易とする、補充基質である。産生期は具体的に、たとえば、回分、流加、および連続培養プロセスにおいて、増殖期に後続する。補充炭素供給源は具体的に、流加プロセスのフィード中に含有させてもよい。補充炭素供給源は、典型的に、炭素基質制限条件下の細胞培養物中、すなわち、制限量の炭素供給源を使用する細胞培養物中で援用する。
【０１３３】
「制限量」の炭素供給源または「制限炭素供給源」とは、ここでは、特に、最大増殖速度未満の、制御された増殖速度による培養プロセスにおいて、産生細胞系による発酵産物の産生を容易とする、炭素基質の種類および量を具体的に指すと理解される。産生期は具体的に、たとえば、回分、流加、および連続培養プロセスにおいて、増殖期に後続する。細胞培養プロセスは、回分培養物、連続培養物、および流加培養物を援用してもよい。回分培養とは、少量の種培養溶液を、培地に添加し、培養時において、さらなる培地を添加したり、培養溶液を排出したりせずに、細胞を増殖させる培養プロセスである。連続培養とは、培養時において、培地を連続的に添加および排出する培養プロセスである。連続培養はまた、潅流培養も含む。回分培養と連続培養の中間であり、また、半回分培養とも称する流加培養はとは、培養時において、培地を連続的または逐次的に添加するが、連続培養と異なり、培養溶液を連続的には排出しない培養プロセスである。
【０１３４】
具体的に、増殖制限栄養物基質の、培養物へのフィーディングに基づく、流加プロセスが好ましい。単回流加または反復流加発酵を含む流加戦略は典型的に、バイオインダストリープロセスにおいて、バイオリアクター内の高細胞密度に到達するように使用する。炭素基質の制御された添加は、培養物の増殖速度に直接影響を及ぼし、オーバーフロー代謝または望ましくない代謝副産物の形成を回避する一助となる。炭素供給源制限条件下では、炭素供給源は具体的に、流加プロセスのフィード中に含有されていてもよい。これにより、炭素基質を、制限量で供給する。
【０１３５】
ここで記載されるケモスタットまたは連続培養ではまた、増殖速度も、緊密に制御することができる。
【０１３６】
炭素供給源の制限量とは、ここでは特に、産生細胞系を、増殖制限条件下、たとえば、産生期または産生方式に保つのに必要な炭素供給源の量として理解される。このような制限量を、炭素供給源がフィード培地中に含有され、持続的なエネルギー送達のための小さなフィード速度で培養物に供給される、流加プロセスにおいて援用して、たとえば、バイオマスを、小さな比増殖速度に保ちながら、ＰＯＩを作製してもよい。フィード培地は典型的に、細胞培養物の産生期において、発酵培養液に添加する。
【０１３７】
炭素供給源の制限量は、たとえば、所定の閾値を下回るか、なおまたは標準的な（炭水化物）アッセイにおいて測定される検出限界を下回る、細胞培養液内の炭素供給源の残留量により決定してもよい。残留量は典型的に、発酵産物を回収するときに、発酵培養液中で決定されるであろう。
【０１３８】
炭素供給源の制限量はまた、炭素供給源の、発酵槽への、培養時間当たりの平均フィード速度であって、たとえば、時間当たりで計算される平均量を決定するように、全培養プロセス、たとえば、流加期にわたり添加される量により決定される、平均フィード速度を規定することにより決定してもよい。この平均フィード速度は、細胞培養物による補充炭素供給源の完全な使用を確認するように、小さく、たとえば、０．６ｇ  Ｌ-1  ｈ-1（時間１ｈ当たりに初期発酵容量１Ｌ当たりの炭素供給源ｇ）〜２５ｇ  Ｌ-1  ｈ-1、好ましくは１．６ｇ  Ｌ-1  ｈ-1〜２０ｇ  Ｌ-1  ｈ-1に保つ。
【０１３９】
炭素供給源の制限量はまた、比増殖速度を測定することにより決定してもよく、この比増殖速度は、産生期において、小さく、たとえば、最大比増殖速度より小さく、たとえば、所定の範囲内、たとえば、０．００１ｈ-1〜０．２０ｈ-1、または０．００５ｈ-1〜０．２０ｈ-1、好ましくは０．０１ｈ-1〜０．１５ｈ-1の範囲内に保つ。
【０１４０】
具体的に、化学的に規定され、メタノールを含有しない、フィード培地を使用する。
【０１４１】
細胞培養培地、たとえば、最小培地または流加プロセスにおけるフィード培地に関する「化学的に規定された」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける産生細胞系の細胞培養に適する培養培地であって、化学的成分および（ポリ）ペプチドの全てが公知の培養培地を意味するものとする。典型的に、化学的規定培地は、動物に由来する成分を全く含まず、純粋で一貫した細胞培養環境を表す。
【０１４２】
ここで使用される「細胞系」という用語は、長期にわたり増殖する能力を獲得した、特定の細胞型の確立されたクローンを指す。「宿主細胞系」という用語は、内因性もしくは組換え遺伝子または代謝経路の産物を発現させて、ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドにより媒介される細胞代謝物を作製するために使用される細胞系を指す。「産生宿主細胞系」または「産生細胞系」とは、産生過程の産物、たとえば、ＰＯＩを得るバイオリアクター内の培養のために使用しやすい細胞系であると一般に理解される。「真核生物宿主」または「真核細胞系」という用語は、ＰＯＩまたは宿主細胞代謝物を作製するのに培養してもよい、任意の真核細胞または生物を意味するものとする。用語はヒトを含まないことがよく理解される。
【０１４３】
宿主細胞系に関して、「発酵」ともまた称する、「細胞培養物」または「培養」という用語は、人工的な、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境における、活動または休眠状態にある細胞の増殖、分化、または生存力の持続に好適な条件下における、具体的に、業界で公知の方法に従う制御されたバイオリアクター内の細胞の維持を意味する。
【０１４４】
本発明の培養培地を使用して、細胞培養物を培養する場合は、細胞培養物を、細胞培養物の培養を支援するのに適する条件下で、培養槽内の培地または基質と接触させる。ある種の態様では、ここで記載される培養培地を、当技術分野で周知の標準的な細胞培養法に従い、細胞を培養するのに使用する。本発明の多様な側面では、真核細胞、具体的に、酵母または糸状菌を増殖させるために使用されうる培養培地が提供される。
【０１４５】
細胞培養培地は、細胞を維持し、制御された人工的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境で増殖させるのに必要な栄養物を供給する。細胞培養培地の特徴および組成は、特定の細胞要件に応じて変化する。重要なパラメータは、浸透圧、ｐＨ、および栄養物処方を含む。栄養物のフィーディングは、当技術分野で公知の方法に従い、連続方式で施してもよく、非連続方式で施してもよい。本発明に従い使用される培養培地は、組換えタンパク質を作製するのに特に有用である。
【０１４６】
回分プロセスが、発酵時においてさらなる栄養物のさらなる供給を伴わずに、細胞を培養するために必要な全ての栄養物が、初期培養培地中に含有された培養方式であるのに対し、回分期の後の流加プロセスでは、フィーディングにより、１つ以上の栄養物を培養物に供給するフィーディング期が施される。栄養物フィーディングの目的は、バイオマスの量を増大させて、組換えタンパク質の量もまた増大させることである。大半の培養プロセスでは、フィーディングの方式は、肝要かつ重要であるが、本発明のプロモーターを援用する本発明は、何らかの培養方式に関して制約を受けない。
【０１４７】
ある種の態様では、本発明の方法は、流加プロセスである。具体的に、所望の組換えＰＯＩをコードする核酸構築物で形質転換された宿主細胞を、増殖期培地中で培養し、産生期培地に移して、所望の組換えＰＯＩを作製する。
【０１４８】
別の態様では、本発明の宿主細胞を、連続方式で、たとえば、ケモスタットにより培養する。連続発酵プロセスは、新鮮な培養培地の、バイオリアクターへの、規定の一定で連続的なフィーディング速度により特徴づけられ、同じ規定の一定で連続的な除去速度で、培養液を、バイオリアクターから同時に除去する。培養培地、フィーディング速度、および除去速度を、同じ一定のレベルで保つことにより、バイオリアクター内の培養パラメータおよび条件は、一定を維持する。
【０１４９】
ここで記載される安定的細胞培養物とは、遺伝特性を維持する、具体的に、ＰＯＩ産生レベルを高く、たとえば、約２０世代、好ましくは、少なくとも３０世代、より好ましくは、少なくとも４０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代にわたる培養の後でもなお、少なくともμｇレベルに保つ細胞培養物を指すと具体的に理解される。具体的に、産業スケールの作製のために使用される場合に大きな利点と考えられる、安定的組換え宿主細胞系が提供される。
【０１５０】
本発明の細胞培養物は、たとえば、栄養物のフィーディング、特に、流加もしくは回分プロセス、または連続もしくは半連続プロセス（たとえば、ケモスタット）に基づく培養方式と組み合わせた、容量と技法システムの両方に関して、産業的生産スケールでの方法に特に有利である。
【０１５１】
「発現」または「発現系」または「発現カセット」という用語は、これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主が、コードされるタンパク質または宿主細胞代謝物を産生することが可能であるように、所望のコード配列および制御配列を、作動的連結内に含有する核酸分子を指す。形質転換を実行するために、発現系をベクター内に組み入れてもよいが、また、関与性のＤＮＡを、宿主染色体に組み込んでもよい。発現は、ポリペプチドまたは代謝物を含む、分泌発現産物を指してもよく、非分泌発現産物を指してもよい。
【０１５２】
ここで使用される「発現構築物」または「ベクター」または「プラスミド」は、適切な宿主生物における、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち、組換え遺伝子の転写、およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に要請されるＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターまたはプラスミドは通例、宿主細胞内の自律的複製のための起点、選択マーカー（たとえば、アミノ酸合成遺伝子または抗生剤、たとえば、ゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８、もしくはハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列、および転写ターミネーターを含み、これらの成分は、併せて作動可能に連結される。ここで使用される「プラスミド」および「ベクター」という用語は、自己複製型ヌクレオチド配列のほか、ゲノム組込み型ヌクレオチド配列も含む。
【０１５３】
本発明の発現構築物は、本発明のプロモーターであって、前記プロモーターの転写制御下で、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを具体的に含み、このプロモーターは、ＰＯＩのコード配列と天然では会合しない。
【０１５４】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列またはタンパク質に関してここで使用される「異種」という用語は、所与の宿主細胞に対して外来である、すなわち、「外因性」である、たとえば、天然で見出されない化合物、または所与の宿主細胞内に天然で見出される、たとえば、「内因性」であるが、異種構築物の文脈において、たとえば、異種核酸を援用する化合物の何れかを指す。内因的に見出される異種ヌクレオチド配列はまた、非天然の、たとえば、細胞内で予測される量より大きい量、または細胞内に天然で見出される量より大きい量で作製してもよい。異種ヌクレオチド配列または異種ヌクレオチド配列を含む核酸はおそらく、内因性ヌクレオチド配列と配列が異なるが、内因的に見出される同じタンパク質をコードする。具体的に、異種ヌクレオチド配列とは、天然で宿主細胞と同じ関係では見出されないヌクレオチド配列である。任意の組換えまたは人工ヌクレオチド配列は、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチドの例は、本発明に従うプロモーターと天然では会合しないヌクレオチド配列、たとえば、ここで記載される通り、ハイブリッド体のプロモーターを得るヌクレオチド配列、またはコード配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列である。結果として、ハイブリッド体またはキメラ体のポリヌクレオチドを得てもよい。異種化合物のさらなる例は、内因性で自然発生のＰＯＩコード配列が通常は、作動可能に連結されない、転写制御エレメント、たとえば、本発明のプロモーターに作動可能に連結された、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドである。
【０１５５】
本発明の文脈においてここで使用される「変異体」という用語は、同等な親配列に対する、特異的な配列同一性または相同性を伴う、任意の配列を指すものとする。変異体とは、具体的に、親配列から、たとえば、サイズの変化、たとえば、（末端または非末端の、たとえば、「中間の（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｏｎａｌ）」、すなわち、ヌクレオチド配列内の欠失または挿入を伴う）伸長または断片化、突然変異、ハイブリダイゼーション（配列の組合せを含む）を介して導出された、任意の配列である。
【０１５６】
ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターは、具体的に、天然（野生型）ｐＧ１プロモーターの人工変異体である。天然構造に対するある程度の配列同一性は認められるが、たとえば、具体的に、単離された核酸配列、アミノ酸配列、発現構築物、形質転換された宿主細胞、および組換えタンパク質を指す、本発明の材料、方法、および使用は、「人造」または合成であり、したがって、「自然法則」の結果としては考えられないことが十分に理解される。
【０１５７】
ここで「ｐＧ１−ｘプロモーター」と称するプロモーターは、ｐＧ１プロモーターの変異体であり、そのヌクレオチド配列は、変異体を作製するための「親」配列として使用される、ｐＧ１プロモーターの突然変異誘発により作製することができる。ｐＧ１−ｘプロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の、２つ、３つ、４つ以上のコピーを含むプロモーターを含む。
【０１５８】
一連のｐＧ１−ｘプロモーターは、たとえば、図６ｂで例示される配列のうちの何れか、特に、以下の配列：
ａ）配列番号３７〜４４、好ましくは、配列番号４５〜７６のうちの何れか；
ｂ）配列番号７７〜８０、好ましくは、配列番号８１〜１１２のうちの何れか；
ｃ）配列番号１１３〜１１４、好ましくは、配列番号１１５〜１３０のうちの何れか；
ｄ）配列番号１３１〜１３２、好ましくは、配列番号１３３〜１４８のうちの何れか；
ｅ）配列番号１４９〜１５０、好ましくは、配列番号１５１〜１６６のうちの何れか；
ｆ）配列番号１６７〜１６８、好ましくは、配列番号１６９〜１８４のうちの何れか；
ｇ）配列番号１８５〜１８６、好ましくは、配列番号１８７〜２０２のうちの何れか；
ｈ）配列番号２０３〜２０４、好ましくは、配列番号２０５〜２２０のうちの何れか；
ｉ）配列番号２２１〜２２２、好ましくは、配列番号２２３〜２３８のうちの何れか；
ｊ）配列番号２３９〜２４０、好ましくは、配列番号２４１〜２５６のうちの何れか；および
ｋ）配列番号３２〜３６または配列番号２５７〜２５９
のうちの何れかを含むかまたはこれらからなるプロモーターにより例示される。
【０１５９】
ｐＧ１−ｘプロモーターはまた、配列番号３７〜配列番号２０２のうちの何れか１つの３’断片であって、５’末端〜最初または５’側の主要調節領域の一部または全部を欠失させた３’断片；好ましくは、配列番号３７〜配列番号２０２のうちの何れか１つの５’末端の、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２０、または３２５以下のヌクレオチドを欠失させた３’断片も含む。
【０１６０】
ｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１プロモーターと比較して、同じであるかまたは増大させた、プロモーター強度および誘導比であって、
・プロモーター強度が、誘導状態において、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大しており、かつ／または
・誘導比が、ｐＧ１プロモーターと比較して、少なくとも１．１倍増大している
プロモーター強度および誘導比を有することを特徴とする。
【０１６１】
特に、プロモーターの不可欠なエレメントおよび機能を維持するか、なおまたは改善するように、たとえば、図６ｂの、例示されるｐＧ１−ｘプロモーター、またはサイズ変異体、特に、その伸長変異体または断片を、ある特定の領域の突然変異誘発により変異体を作製するための「親」配列として使用して、さらなるｐＧ１−ｘ変異体も作製可能である。ｐＧ１−ｘプロモーター変異体は、たとえば、組換え細胞系内のプロモーターとしての使用に適する配列を作製するための突然変異誘発により、例示されるｐＧ１−ｘプロモーター配列のうちの何れかから導出してもよい。このような変異体プロモーターは、規定の特性を伴うライブラリーメンバーを選択することにより、突然変異体配列のライブラリーから得てもよい。変異体プロモーターは、同じ特性を有してもよく、なおまたは改善された特性、たとえば、抑制および抑制解除条件下における示差的効果（特に、誘導比）を増大させて、プロモーター強度、ＰＯＩ産生の誘導が改善された特性を有してもよい。変異体プロモーターはまた、類似の配列に由来するヌクレオチド配列、たとえば、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）以外の真核生物種、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属以外の属、たとえば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｚ．ルーキシー（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）、Ｐ．スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）に由来するヌクレオチド配列も含んでよい。
【０１６２】
たとえば、ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターもしくはｐＧ１−ｘプロモーターの変異体、またはｐＧ１プロモーターの変異体である、プロモーターの変異体に関してここで使用される「機能的に活性な」という用語は、突然変異誘発、具体的に、配列内または配列の遠位端の一方もしくは両方における、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換による親配列の改変であって、この配列の活性に影響を及ぼさない（特に、これを損なわない）改変の結果として得られる変異体配列を意味する。ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターに関して、機能および活性は、具体的に、プロモーターの活性および強度のほか、誘導比によっても特徴づけられる。
【０１６３】
ここで記載される、機能的に活性なプロモーター変異体は、具体的に、ｐＧ１プロモーターと実質的に同じ（±１０％、または±５％）であるか、なおまたはこれより大きいプロモーター活性を呈示することを特徴とする。
【０１６４】
ここで記載される、機能的に活性なプロモーター変異体は、具体的に、ｐＧ１プロモーターとたとえば、実質的に同じ誘導比（±１０％、または±５％）、なおまたはこれより大きい誘導比により測定される、実質的に同じ調節特性を呈示することを特徴とする。
【０１６５】
ここで使用される「プロモーター」という用語は、コード配列または機能的なＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーター活性は、その転写効率により評価してもよい。これは、プロモーターによるｍＲＮＡの転写量を、たとえば、ノーザンブロット法を介して測定することにより直接的に決定してもよく、プロモーターにより発現した遺伝子産物の量を測定することにより間接的に決定してもよい。
【０１６６】
ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターは具体的に、コードＤＮＡの発現を誘発するか、調節するか、または他の方法で媒介もしくは制御する。プロモーターＤＮＡとコードＤＮＡは、同じ遺伝子に由来してもよく、異なる遺伝子に由来してもよく、同じ生物に由来してもよく、異なる生物に由来してもよい。
【０１６７】
ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターは、具体的に、調節可能なプロモーター、特に、炭素供給源により調節可能なプロモーターであって、抑制および誘導状態でプロモーター強度が異なる、調節可能なプロモーターとして理解される。
【０１６８】
本発明のプロモーターの強度は、そのプロモーターにおいて高頻度または低頻度で生じる転写誘発の効率により表される、その転写強度に具体的に関する。転写強度が大きいほど、そのプロモーターにおいて生じる転写頻度は大きくなる。プロモーター強度は、それにより、どのくらいの頻度で所与のｍＲＮＡ配列が転写されるのかが決定され、いくつかの遺伝子に対して、他の遺伝子を上回る大きな転写の優先性が効果的に与えられ、大きな転写物濃度がもたらされるために重要である。大量に要請されるタンパク質をコードする遺伝子は、たとえば、典型的に、比較的強力なプロモーターを有する。ＲＮＡポリメラーゼに実施しうる転写タスクは、一度に１つだけなので、その仕事が効率的となるように優先されなければならない。プロモーター強度の差違は、この優先を可能とするように選択される。
【０１６９】
本発明によれば、調節可能なプロモーターは、活性をほぼ最大とする状態として典型的に理解される完全誘導状態において、比較的強力である。
【０１７０】
相対強度は一般に、同等なプロモーター、たとえば、ｐＧ１プロモーター、または標準的なプロモーター、たとえば、宿主細胞として使用される細胞の、それぞれのｐＧＡＰプロモーターに関して決定される。転写頻度は一般に、たとえば、適切なアッセイ、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット法における転写物の量により決定される転写速度として理解される。たとえば、本発明に従うプロモーターの転写強度は、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である宿主細胞内で決定され、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較される。
【０１７１】
対象の遺伝子を発現させるプロモーターの強度は一般に、発現強度または高発現レベル／速度を支援する能力として理解される。たとえば、本発明のプロモーターの発現および／または転写強度は、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である宿主細胞内で決定され、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較される。
【０１７２】
ｐＧＡＰプロモーターを、基準物質（標準物質）として援用する比較転写強度は、標準的手段、たとえば、転写物の数量を測定すること、たとえば、細胞培養物中で、マイクロアレイ、または他の手段を援用すること、たとえば、組換え細胞内のそれぞれの遺伝子発現産物の数量を測定することにより決定してもよい。例示的な試験については、実施例節において例示する。
【０１７３】
特に、転写速度は、マイクロアレイ上の転写強度により決定してもよく、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で決定してもよく、この場合、マイクロアレイまたはｑＲＴ−ＰＣＲデータにより、増殖速度の大きな条件と増殖速度の小さな条件の間、または異なる培地組成を援用する条件の間の発現レベルの差違、および天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して大きなシグナル強度が示される。
【０１７４】
発現速度は、たとえば、レポーター遺伝子、たとえば、ｅＧＦＰの発現量により決定してもよい。
【０１７５】
ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターは、宿主細胞内の、場合によって、「相同なｐＧＡＰプロモーター」と呼ばれる天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも１５％の転写速度または転写強度により反映される、比較的大きな転写強度をもたらす。好ましくは、転写速度または強度は、たとえば、ＰＯＩを作製するための宿主細胞として選択された真核細胞内で決定された天然ｐＧＡＰプロモーターと比較して、少なくとも２０％、具体的に好ましい場合には、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも１００％、なおまたはこれより大きい、たとえば、少なくとも１５０％または少なくとも２００％である。
【０１７６】
天然ｐＧＡＰプロモーターは、典型的に、大半の生物中に存在する構成的プロモーターである、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードする、ｇａｐ遺伝子の発現を誘発する。解糖および糖新生の鍵となる酵素である、ＧＡＰＤＨ（ＥＣ  １＼２＼１＼１２）は、異化および同化による炭水化物代謝において、死活的な役割を果たす。
【０１７７】
天然ｐＧＡＰプロモーターは具体的に、組換え真核細胞においても、同じ種または株の天然真核細胞（修飾されていない（非組換え）または組換え真核細胞を含む）の中と同じ態様で活性である。このような天然ｐＧＡＰプロモーターは一般に、内因性プロモーターであり、したがって、真核細胞と同種であると理解されており、比較を目的とする基準（standardまたはreference）プロモーターとして用いられている。
【０１７８】
たとえば、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の天然ｐＧＡＰプロモーターは、たとえば、図１３に示される配列：メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＧＳ１１５）の天然ｐＧＡＰプロモーター配列（配列番号２６０）を有する、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内でＧＡＰＤＨの発現を制御するのに使用される、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内の改変されていない内因性のプロモーター配列である。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を、本発明に従いＰＯＩを作製するための宿主として使用する場合、本発明に従うプロモーターの転写強度または速度を、このようなメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較する。
【０１７９】
別の例として、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然ｐＧＡＰプロモーターは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内でＧＡＰＤＨの発現を制御するのに使用される通り、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内の、改変されていない内因性のプロモーター配列である。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、本発明に従いＰＯＩを作製するための宿主として使用する場合、本発明に従うプロモーターの転写強度または速度を、このような出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然ｐＧＡＰプロモーターと比較する。
【０１８０】
したがって、本発明に従うプロモーターの相対発現または転写強度は通例、ＰＯＩを作製するための宿主として使用される同じ種または株の細胞の、天然ｐＧＡＰプロモーターと比較する。
【０１８１】
ｐＧ１−ｘプロモーターまたはｐＧ１プロモーターに関してここで使用される「調節可能な」という用語は、回分培養の増殖期に、過剰量の炭素供給源（栄養物または基本基質）の存在下で、真核細胞内で抑制され、産生細胞系の産生期の、たとえば、炭素量の低減時、たとえば、流加戦略に従い、増殖制限炭素供給源（栄養物または補充基質）を、培養物へとフィードするときに、強いプロモーター活性をもたらすように抑制解除されるプロモーターを指すものとする。この点で、「調節可能な」という用語は、炭素の消費、低減、欠如もしくは枯渇、または細胞によりたやすく消費されるように制限された炭素供給源の添加による、プロモーターの抑制解除を指す、「炭素供給源制限により調節可能な」または「グルコース制限により調節可能な」として理解される。
【０１８２】
ここで記載される、機能的に活性なｐＧ１−ｘプロモーターは、比較的強力な、調節可能なプロモーターであって、細胞増殖条件下（増殖期）で、サイレンシングまたは抑制され、産生条件下（産生期）で、活性化または抑制解除され、したがって、制限炭素供給源により、産生細胞系内のＰＯＩ産生を誘導するのに適するプロモーターである。
【０１８３】
具体的に、ここで記載されるプロモーターは、炭素供給源により調節可能であり、グルコースの存在下およびグルコース制限下でその強度を比較する試験において決定される、示差的なプロモーター強度を伴い、比較的大きなグルコース濃度、好ましくは、少なくとも１Ｌ当たり１０ｇ、好ましくは、少なくとも１Ｌ当たり２０ｇの濃度で、やはり抑制されることを示す。具体的に、本発明に従うプロモーターは、プロモーターを完全に誘導する、制限グルコース濃度およびグルコース閾値濃度で完全に誘導され、この閾値は、１Ｌ当たり２０ｇ未満、好ましくは、１Ｌ当たり１０ｇ未満、１Ｌ当たり１ｇ未満、さらに、１Ｌ当たり０．１ｇ未満、または１Ｌ当たり５０ｍｇ未満であり、好ましくは、完全転写強度が、たとえば、１Ｌ当たり４０ｍｇ未満のグルコース濃度で、天然の相同ｐＧＡＰプロモーターの少なくとも５０％である。
【０１８４】
好ましくは、誘導比とは、規定の炭素供給源閾値を下回る誘導条件へと切り替えたときの、ＰＯＩ産生の開始により決定され、抑制状態での強度と比較される、示差的なプロモーター強度として理解される。転写強度とは一般に、完全誘導状態での強度、すなわち、抑制解除条件下における最大に近い活性を示す強度として理解される。示差的なプロモーター強度は、たとえば、抑制解除条件下における組換え宿主細胞系内のＰＯＩ産生の、抑制条件と比較した効率または収量に従い、または、そうでなければ、転写物の量により決定される。本発明に従う調節可能なプロモーターは、好ましくは、抑制解除状態で、抑制状態と比較して、少なくとも２倍、より好ましくは、少なくとも５倍、なおより好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０、４０、５０、または１００倍である、示差的なプロモーター強度を有し、また、誘導倍数としても理解される。
【０１８５】
変異体の、親配列と比較した「配列同一性」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列が、対応する位置において、ある程度、最大で１００％に近い程度同じであるかまたは保存的な塩基対を有するという意味における、同一性（または相同性）の程度を指し示す。相同な配列は、典型的に、少なくとも約５０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは、少なくとも約６０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を有する。
【０１８６】
たとえば、プロモーターまたは遺伝子のヌクレオチド配列に関する「同一性パーセント（％）」とは、配列決定し、必要な場合、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成し、任意の保存的置換は配列同一性の部分と考えずにおいた後で、ＤＮＡ配列内のヌクレオチドと同一である、候補ＤＮＡ配列内のヌクレオチドの百分率と定義される。ヌクレオチド配列同一性パーセントの決定を目的とするアライメントは、当技術分野の範囲内にある多様な態様で、たとえば、市販のコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するのに適するパラメータを決定することができる。本発明の目的では、ｂｌａｓｔｎを以下の例示的なパラメータ：Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ：１１；Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ：１０；Ｇａｐ  ｃｏｓｔ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝５、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝２；Ｆｉｌｔｅｒ＝ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ；Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅ：２，−３；Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇ：Ｌ；ｍに設定した、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．２．２９（２０１４年１月６日）を使用して、２つのヌクレオチド配列の間の配列同一性を決定する。
【０１８７】
本発明の文脈において使用される「突然変異誘発」という用語は、たとえば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換により、ヌクレオチド配列の突然変異体をもたらして、非コードまたはコード領域内に少なくとも１か所の変化を伴う、その変異体を得る方法を指すものとする。突然変異誘発は、ランダム突然変異、半ランダム突然変異、または部位指向突然変異を介してもよい。具体的なｐＧ１−ｘプロモーター変異体は、ｐＧ１ヌクレオチド配列を親配列として使用する突然変異誘発法により、ｐＧ１プロモーター配列から導出される。このような突然変異誘発法は、核酸を操作する方法、またはｐＧ１プロモーターの配列情報を鋳型として使用して、ヌクレオチド配列をデノボで合成する方法を包含する。具体的な突然変異誘発法は、合理的なプロモーター操作を適用する。
【０１８８】
ｐＧ１−ｘプロモーターは、ｐＧ１プロモーターの突然変異誘発により作製してもよく、標準的な技法を援用して、ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターの変異体であって、機能的に活性な変異体を含む変異体も、さらに作製してもよい。プロモーターは、たとえば、発現レベルおよび調節可能な特性を変更したプロモーター変異体を作出するように改変してもよい。たとえば、プロモーターライブラリーは、選択されたプロモーター配列の突然変異誘発により調製してもよく、これを親分子として使用して、たとえば、異なる発酵戦略下におけるそれらの発現について変異体を解析し、適切な変異体を選択することにより、真核細胞内の遺伝子発現を微調整してもよい。変異体の合成ライブラリーを使用して、たとえば、選択されたＰＯＩを作製するための要件に合致するプロモーターを選択してもよい。このような変異体は、真核宿主細胞内の発現効率を増大させ、炭素供給源に富む条件下およびこれを制限する条件下で示差的な発現を示しうる。典型的に、大型のランダム化遺伝子ライブラリーであって、遺伝子の多様性が大きく、具体的に、所望の遺伝子型または表現型に従い選択されうる遺伝子ライブラリーを作製する。
【０１８９】
ここで記載される好ましいｐＧ１−ｘプロモーターのうちの一部は、ｐＧ１プロモーターのサイズ変異体であり、プロモーターのある特定のエレメントもしくは領域の、１つより多いコピーを含むか、またはｐＧ１プロモーターの１つ以上の（同じまたは異なる）断片を含む。
【０１９０】
具体的な突然変異誘発法は、配列内の、１つ以上のヌクレオチドの点突然変異、特に、タンデム点突然変異であって、たとえば、プロモーターのヌクレオチド配列内の、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、なおこれ以上の連続ヌクレオチドを変化させる点突然変異をもたらす。このような突然変異は、典型的に、１つ以上のヌクレオチドのうちの、少なくとも１つの欠失、挿入、および／または置換である。プロモーター配列は、遠位端、特に、５’側領域内で突然変異させてもよいが、これは、ヌクレオチド配列のうちの５０％以下に当たり、プロモーター活性を実質的に失わない限りにおいて、高度に可変性であってもよい。プロモーター配列は、具体的に、主要調節領域内で突然変異させうるが、ｐＧ１の親主要調節領域に対する配列同一性が大きく、特に、親コア調節領域に対する配列同一性が大きく、たとえば、少なくとも８０％であることが好ましい。主要調節領域内であるが、コア調節領域外では、配列の可変性は、８０％未満の配列同一性を得る程度に大きくてもよい。
【０１９１】
コア調節領域は、具体的に、転写因子結合性部位（ＴＦＢＳ）を表す、配列番号２および配列番号３と、配列番号２と、配列番号３との中間の領域とを組み込む。
【０１９２】
配列番号２として特定されるヌクレオチド配列は、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２により認識されるＴＦＢＳの少なくとも一部を含む。
【０１９３】
配列番号３として特定されるヌクレオチド配列は、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、およびＣａｔ８−２により認識されるＴＦＢＳの少なくとも一部を含む。
【０１９４】
具体的に、配列番号２と配列番号３との間のヌクレオチド配列（中間の配列）は、非相同配列（たとえば、配列同一性を５０％未満とする）へと突然変異させてもよく、なおまたは欠失させてもよい。
【０１９５】
配列番号２および配列番号３内の任意の突然変異は、具体的に、保存的である、すなわち、たとえば、それぞれの転写因子による認識を維持する（または改善する）ように保存的である。このような保存的な突然変異体を操作するとき、配列番号２および／または配列番号３のヌクレオチド配列内の配列同一性は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％である。
【０１９６】
主要調節領域は、配列番号５により特定されるヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなる。このような領域は、コア調節領域と、ｐＧ１プロモーターの必須エレメントを含み、ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターを作製するのに、ある程度突然変異させてもよい、さらなる非コア調節領域とを含む。
【０１９７】
部位指向突然変異誘発の具体的領域は、たとえば、ｐＧ１またはｐＧ１−ｘプロモーターの非コア調節領域（主要調節領域の内部または外部）である。しかし、具体的な突然変異体はまた、プロモーター機能を維持するように、ある程度の配列同一性を保つ限りにおいて、プロモーターのコア調節領域を指向する突然変異誘発法により調製してもよい。さらに具体的な領域は、主要調節領域の外部または内部である。具体的に、プロモーターは、たとえば、ｐＧ１プロモーターのコア調節領域および１つ以上の領域、または代替的な（天然または人工）プロモーター、たとえば、ｐＧ１プロモーター以外の任意のプロモーターであって、ｐＧ１プロモーターの翻訳開始部位を置換するのに使用しうるプロモーターである、プロモーターの３’側領域（具体的に、末端の少なくとも１０ヌクレオチドまたは末端の少なくとも１５ヌクレオチドを含む３’端）における翻訳開始部位を含む、ハイブリッド体のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１９８】
具体的な突然変異は、ｐＧ１プロモーターの、選択された領域（またはモチーフ）、たとえば、Ｔモチーフまたは延長型Ｔモチーフの重複を指す。このような選択されたモチーフは、モチーフの一方もしくは両方の遠位端、またはモチーフ内において、さらなるヌクレオチドにより伸長させてもよく、短縮してもよい。天然ｐＧ１配列は、ヌクレオチド「Ｔ」に続く、「Ａ」に続く、Ｔ１５からなる、ＴＡＴモチーフ（配列番号１４）を含む。このようなＴＡＴモチーフである、５’−ＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２２）は、プロモーター強度に対して、正の効果を及ぼすことが分かっており、これは、ＴＡＴモチーフを重複させることによりなお増大させてもよく、同じＴＡＴモチーフ、または代替的なＴモチーフである、少なくともＴ１３モチーフ（配列番号１２）を含む、延長型Ｔモチーフ（たとえば、ＴＡＴモチーフ）を使用して、ＴＡＴモチーフの、少なくとも２つ、または３つ、または４つのコピーを挿入することによりなお増大させてもよい。
【０１９９】
本発明はさらに、厳密な条件下で、ｐＧ１−ｘプロモーターとハイブリダイズするヌクレオチド配列も包含する。
【０２００】
本発明で使用される「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」という用語は、２つの核酸配列が、適切な条件下で、互いと、安定的で特異的な水素結合でアニールして、二本鎖を形成するプロセスを意味することを意図する。２つの相補的な配列または十分に相補的な配列の間のハイブリダイゼーションは、使用される操作条件に依存し、特に、厳密性に依存する。厳密性は、相同性の程度を描示すると理解してもよく、厳密性が高度であるほど、配列の間の相同性パーセントも大きくなる。厳密性は特に、２つの核酸配列の塩基組成により定義してもよく、かつ／またはこれらの２つの核酸配列の間のミスマッチングの程度により定義してもよい。条件、たとえば、塩濃度および温度を変化させることにより、所与の核酸配列を、その正確な相補体だけとハイブリダイズさせてもよく（高度な厳密性）、任意の何らかの類縁配列とハイブリダイズさせてもよい（低度な厳密性）。温度の上昇または塩濃度の低下は、ハイブリダイゼーション反応の選択性を増大させる傾向がありうる。
【０２０１】
本発明で使用される「厳密なハイブリダイズ条件下でハイブリダイズすること」という語句は、好ましくは、ある種の厳密性の条件下でハイブリダイズすることを指すと理解される。好ましい態様では、「厳密なハイブリダイズ条件」とは、２つの核酸配列の相同性が、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％である条件、すなわち、このハイブリダイゼーションにおいて得られる二本鎖が、好ましくは、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％のＡ−Ｔ結合およびＣ−Ｇ結合を含む場合に限り、ハイブリダイゼーションが可能となる条件である。
【０２０２】
厳密性は、反応パラメータ、たとえば、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン性分子種の濃度および種類、変性剤の性質および濃度、ならびに／またはハイブリダイゼーション温度に依存してよい。当業者は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）において記載されている通りに、適切な条件を決定することができる。
【０２０３】
核酸、ＰＯＩ、または他の化合物に関してここで使用される「単離された」または「単離」という用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、天然で会合する環境から十分に分離された化合物を指すものとする。「単離された」とは、他の化合物もしくは材料との人工もしくは合成の混合物、または根本的な活性に干渉しない不純物、たとえば、不完全な精製に起因して存在しうる不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離核酸分子はまた、化学合成された核酸分子を含むことも意味し、特に、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）または他の任意の生物において自然発生しない核酸分子であって、ここで「人工」と称する核酸分子を含むことも意味する。本発明の核酸に関しては、場合によって、「単離核酸」または「単離核酸配列」という用語を使用する。ＤＮＡに適用される場合のこの用語は、それが由来する生物の自然発生のゲノム内でじかに隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。たとえば、「単離核酸」は、ベクター、たとえば、プラスミドまたはウイルスベクターに挿入されたＤＮＡ分子、あるいは原核もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでもよい。「単離核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡの何れか）はさらに、生物学的または合成手段により直接作製され、その作製時において存在する他の成分から分離された分子を表してもよい。
【０２０４】
ここで使用される「作動可能に連結された」という用語は、単一の核酸分子、たとえば、ベクター上における、ヌクレオチド配列の、１つ以上のヌクレオチド配列の機能が、前記核酸分子上に存在する、少なくとも１つの他のヌクレオチド配列の影響を受けるような態様での会合を指す。たとえば、プロモーターは、そのコード配列の発現を実行することが可能な場合、組換え遺伝子のコード配列と作動可能に連結されている。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、それが、タンパク質、たとえば、成熟タンパク質の前駆形態または成熟タンパク質を、分泌形態で発現させることが可能な場合、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。具体的に、互いに作動可能に連結されるこのような核酸は、じかに、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列の間にさらなるエレメントまたは核酸配列を伴わずに連結してもよい。
【０２０５】
プロモーターが、コード配列の転写を制御する場合、プロモーター配列は、典型的に、コード配列に作動可能に連結されていると理解される。プロモーター配列が、コード配列と天然では会合しない場合、その転写は、天然（野生型）細胞内では、プロモーターにより制御されないか、または配列が、異なる連続する配列で組み換えられている。
【０２０６】
ここで使用される「対象のタンパク質（ＰＯＩ：protein of interest）」という用語は、宿主細胞内の組換え技術により作製される、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
より具体的に、タンパク質は、宿主細胞内で自然発生でないポリペプチド、すなわち、異種タンパク質であってもよく、あるいは、宿主細胞にとって天然のポリペプチド、すなわち、宿主細胞と同種のタンパク質であってもよいが、たとえば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含有する自己複製型ベクターによる形質転換により、または組込み時における、ＰＯＩをコードする核酸配列の１コピー以上の、宿主細胞のゲノムへの組換え法により、またはＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列、たとえば、プロモーター配列の組換えによる改変により作製される。場合によって、ここで使用されるＰＯＩという用語はまた、組換え発現タンパク質により媒介される、宿主細胞による任意の代謝の産物にも関する。
【０２０７】
ＰＯＩは具体的に、精製形態における、たとえば、実質的に純粋な、細胞培養物から回収してもよい。
【０２０８】
ここで使用される「実質的に純粋な」または「精製された」という用語は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の化合物、たとえば、核酸分子またはＰＯＩを含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適する方法（たとえば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ解析など）により測定する。
【０２０９】
ここで使用される「組換え」という用語は、「遺伝子操作により調製されることまたはこの結果」を意味するものとする。したがって、「組換え微生物」は、少なくとも１つの「組換え核酸」を含む。組換え微生物は具体的に、発現ベクターもしくはクローニングベクターを含むか、または組換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。「組換えタンパク質」は、それぞれの組換え核酸を、宿主において発現させることにより作製する。「組換えプロモーター」とは、ここで記載される、機能的に活性なプロモーターとしてのその使用に適する、遺伝子操作された非コードヌクレオチド配列である。
【０２１０】
一般に、ここで言及される組換え核酸または生物は、当業者に周知の組換え法により作製してもよい。本発明によれば、当技術分野の範囲内にある、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの技法を援用してもよい。このような技法は、文献において十分に説明されている。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）を参照されたい。
【０２１１】
本発明の好ましい態様によれば、プロモーターおよび関与性の遺伝子を、ベクターまたは発現構築物にライゲーションすることにより、組換え構築物を得る。これらの遺伝子は、このようなベクターまたは発現構築物を使用して、宿主細胞を形質転換することにより、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込むことができる。
【０２１２】
発現ベクターは、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、および、具体的に、デザインされたプラスミドを含んでもよいがこれらに限定されない。本発明で使用される好ましい発現ベクターは、宿主細胞内の組換え遺伝子の発現に適する任意の発現ベクターであってもよく、宿主生物に応じて選択される。組換え発現ベクターは、宿主ベクターともまた呼ばれる、宿主生物のゲノム内で複製するかまたはこれに組み込むことが可能な任意のベクターであってもよい。
【０２１３】
適切な発現ベクターは典型的に、真核宿主細胞内で、ＰＯＩをコードするＤＮＡを発現させるのに適するさらなる調節配列を含む。調節配列の例は、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合性部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する配列を含む。調節配列は、ＤＮＡ配列に作動可能に連結して、発現させてもよい。
【０２１４】
宿主細胞内の組換えヌクレオチド配列の発現を可能とするために、発現ベクターは、本発明に従うプロモーターを、コード配列の５’端に隣接して、たとえば、対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはＰＯＩの分泌を可能とするシグナルペプチド遺伝子の上流にもたらしてもよい。こうして、転写は、このプロモーター配列により、調節され、開始される。
【０２１５】
ここで使用される「シグナルペプチド」という用語は、具体的に、天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、または天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドのハイブリッド体を指すものとし、具体的に、ＰＯＩを産生する宿主生物と異種であってもよく、同種であってもよい。シグナルペプチドの機能は、ＰＯＩが分泌されて、小胞体に入ることを可能とすることである。シグナルペプチドは通例、タンパク質の、細胞膜の外への輸送を方向付け、これにより、異種タンパク質を分離および精製することを容易とする、短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖である。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後で、シグナルペプチダーゼにより、タンパク質から切断される。
【０２１６】
例示的なシグナルペプチドは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ−接合因子プレプロペプチドに由来するシグナル配列、ならびにメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）および細胞外タンパク質Ｘ（ＥＰＸ１）に由来するシグナルペプチドである（Ｈｅｉｓｓら、２０１５；ＷＯ２０１４０６７９２６Ａ１）。
【０２１７】
たとえば、関与性の配列の機能を実証するため、調節エレメント（たとえば、ｐＧ１−ｘプロモーター、および、任意に、シグナル配列）のうちの１つ以上を含む発現ベクターを構築して、ＰＯＩの発現を駆動してもよく、発現収率を、従来の調節エレメントを有する構築物と比較する。多様な異なるＰＯＩを高レベルで作製するために、同定されたヌクレオチド配列は、特異的なヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより増幅し、発現ベクターにクローニングし、たとえば、酵母ベクターおよびメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株を使用して、真核細胞系に形質転換してもよい。ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーターの、このようにして作製される組換えＰＯＩの量に対する効果を推定するために、真核細胞系を、それぞれの細胞内に、従来のｐＧ１プロモーターまたはｐＧＡＰプロモーターを含む株と比較して、振とうフラスコ実験および流加またはケモスタット発酵により培養してもよい。特に、プロモーターの選択は、組換えタンパク質の産生に対して大きな影響を及ぼす。
【０２１８】
ＰＯＩは、形質転換体を培養することにより、組換え宿主細胞系を使用して作製し、これにより、発現させた産物または代謝物を培養物から単離し、任意に、適切な方法により精製して、適切な培地中で得ることができる。
【０２１９】
本発明に従う形質転換体は、このようなベクターＤＮＡ、たとえば、プラスミドＤＮＡを、宿主に導入し、ＰＯＩまたは宿主細胞代謝物を高収率で発現させる形質転換体を選択することにより得ることができる。宿主細胞を処理して、真核細胞を形質転換するために従来使用された方法、たとえば、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびこれらの変法により、それらが、外来ＤＮＡを組み込むことを可能とする。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、好ましくは、電気穿孔により形質転換する。微生物による組換えＤＮＡ断片の取込みのための好ましい形質転換法は、化学的形質転換、電気穿孔、またはプロトプラスト化による形質転換を含む。本発明に従う形質転換体は、このようなベクターＤＮＡ、たとえば、プラスミドＤＮＡを、宿主に導入し、関与性のタンパク質または宿主細胞代謝物を高収率で発現させる形質転換体を選択することにより得ることができる。
【０２２０】
本発明の方法に従う、ＰＯＩを作製するための複数の異なる手法が好ましい。物質は、真核宿主細胞を、関与性のタンパク質および上記で記載した調節エレメントのうちの少なくとも１つをコードする組換えＤＮＡを保有する発現ベクターで形質転換し、形質転換された細胞の培養物を調製し、培養物を増殖させ、転写およびＰＯＩの産生を誘導し、発酵プロセスの産物を回収することにより、発現させ、加工し、任意に、分泌させてもよい。
【０２２１】
本発明に従う宿主細胞は、好ましくは、その発現能または収率について、以下の試験：ＥＬＩＳＡ、活性アッセイ、ＨＰＬＣ、または他の適切な試験により調べる。
【０２２２】
本発明は、具体的に、パイロットまたは産業スケールの発酵プロセスを可能とする。産業プロセススケールであれば、好ましくは、少なくとも１０Ｌ、具体的に、少なくとも５０Ｌ、好ましくは、少なくとも１ｍ3、好ましくは、少なくとも１０ｍ3、最も好ましくは、少なくとも１００ｍ3の容量を援用するであろう。
【０２２３】
たとえば、数日間の典型的なプロセス時間を援用する、１００Ｌ〜１０ｍ3以上のリアクター容量による流加培養、または約５０〜１０００Ｌ以上の発酵槽容量中で、約０．０２〜０．１５ｈ-1の希釈速度を伴う連続プロセスを指す、産業スケールでの作製条件が好ましい。
【０２２４】
適切な培養法は、回分期で始め、大きな比増殖速度における短い指数的流加期を後続させ、小さな比増殖速度における流加期をさらに後続させた、バイオリアクター内の培養を包含してもよい。別の適切な培養法は、回分期に続いて、小さな希釈速度における連続培養相を包含してもよい。
【０２２５】
好ましい態様は、バイオマスをもたらす回分培養に後続させて、高収率のＰＯＩ産生のための流加培養を含む。
【０２２６】
ここで記載される宿主細胞系を、増殖条件下のバイオリアクター内で培養して、１Ｌ当たり少なくとも１ｇの細胞乾燥重量、より好ましくは、１Ｌ当たり少なくとも１０ｇの細胞乾燥重量、好ましくは、１Ｌ当たり少なくとも２０ｇの細胞乾燥重量の細胞密度を得ることが好ましい。バイオマス作製のこのような収率を、パイロットまたは産業スケールでもたらすと有利である。
【０２２７】
バイオマスの蓄積を可能とする増殖培地、具体的に、基本増殖培地は、典型的に、炭素供給源、窒素供給源、硫黄のための供給源、およびリン酸のための供給源を含む。典型的に、このような培地はさらに、微量元素およびビタミンを含み、アミノ酸、ペプトン、または酵母抽出物をさらに含んでもよい。
【０２２８】
好ましい窒素供給源は、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、またはＮＨ3もしくは（ＮＨ４）2ＳＯ4を含む。
【０２２９】
好ましい硫黄供給源は、ＭｇＳＯ4、または（ＮＨ４）2ＳＯ4もしくはＫ2ＳＯ4を含む。
【０２３０】
好ましいリン酸供給源は、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、またはＨ3ＰＯ4もしくはＮａＨ2ＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4もしくはＫ2ＨＰＯ4を含む。
【０２３１】
さらなる典型的な培地成分は、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、および微量元素、たとえば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｉ、Ｂを含む。
【０２３２】
好ましくは、培地に、ビタミンＢ7を補充する。
【０２３３】
メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のための典型的な増殖培地は、グリセロール、ソルビトール、またはグルコース、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ビオチン、および微量元素を含む。
【０２３４】
産生期において、産生培地は具体的に、制限量の補充炭素供給源だけを伴って使用する。
【０２３５】
好ましくは、宿主細胞系を、適切な炭素供給源を伴う無機培地中で培養し、これにより、単離プロセスをさらに著明に単純化する。好ましい無機培地の例は、活用可能な炭素供給源（たとえば、グルコース、グリセロール、ソルビトール、またはメタノール）、多量元素を含有する塩（カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸、リン酸）、および微量元素を含有する塩（銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン酸、コバルト、亜鉛、および鉄塩、およびホウ酸）、ならびに、任意に、たとえば、栄養要求性を補完するビタミンまたはアミノ酸を含有する無機培地である。
【０２３６】
具体的に、細胞は、発現系および発現させるタンパク質の性質、たとえば、タンパク質をシグナルペプチドに融合させているのかどうか、およびタンパク質が可溶性であるのか、膜結合型であるのかに応じて、細胞または培養培地から精製されうる所望のＰＯＩの発現を実行するのに適する条件下で培養する。当業者により理解される通り、培養条件は、宿主細胞の種類および援用される特定の発現ベクターを含む因子に従い変化するであろう。
【０２３７】
典型的な産生培地は、補充炭素供給源、ならびにさらなるＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ビオチン、および微量元素を含む。
【０２３８】
たとえば、発酵物に添加される補充炭素供給源のフィードは、最大で５０重量％の活用可能な糖を伴う炭素供給源を含んでもよい。補充培地のフィード速度が小さければ、産物または副産物による、細胞の増殖に対する阻害効果が制限され、したがって、基質の供給に基づく高産物収率が可能となるであろう。
【０２３９】
発酵は、好ましくは、３〜７．５の範囲のｐＨで実行する。
【０２４０】
典型的な発酵時間は、温度を２０℃〜３５℃、好ましくは２２〜３０℃の範囲内として、約２４〜１２０時間である。
【０２４１】
ＰＯＩは、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、好ましくは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは、少なくとも１ｇ／Ｌの収率をもたらす条件を援用して発現させる。
【０２４２】
ここで開示される方法は、ＰＯＩの発現を、好ましくは、分泌形態で、あるいは、細胞内産物として可能とする条件下で、前記組換え宿主細胞を培養することをさらに含んでもよいことが理解される。次いで、組換えにより作製されたＰＯＩまたは宿主細胞代謝物は、細胞培養培地から単離し、当業者に周知の技法によりさらに精製することができる。
【０２４３】
本発明に従い作製されたＰＯＩは、典型的に、所望のＰＯＩの濃度の上昇および／または少なくとも１つの不純物の濃度の低下を含む、最新の技法を使用して単離および精製することができる。
【０２４４】
ＰＯＩが、細胞から分泌される場合、ＰＯＩは、最新の技法を使用して、培養培地から単離および精製することができる。組換え発現産物の、宿主細胞からの分泌は一般に、産物を、酵母細胞を破壊して、細胞内タンパク質を放出させる結果として生じるタンパク質の複雑な混合物からではなく、培養物上清から回収するので、精製プロセスを容易とすることを含む理由で有利である。
【０２４５】
所望のＰＯＩを含有する細胞抽出物であって、ＰＯＩがそこから単離および精製される細胞抽出物を得るのにはまた、培養された形質転換細胞を、超音波により破断させてもよく、機械的、酵素的、または化学的に破断させてもよい。
【０２４６】
組換えポリペプチドまたはタンパク質産物を得るための単離および精製法として、方法、たとえば、可溶性の差違を活用する方法、たとえば、塩析および溶媒沈殿、分子量の差違を活用する方法、たとえば、限外濾過およびゲル電気泳動、電荷の差違を活用する方法、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、特異的アフィニティーを活用する方法、たとえば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性の差違を活用する方法、たとえば、逆相高速液体クロマトグラフィー、ならびに等電点の差違を活用する方法、たとえば、等電点電気泳動を使用してもよい。
【０２４７】
高度に精製された産物は、夾雑タンパク質を本質的に含まず、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、なおまたは、少なくとも９８％、最大で１００％の純度を有する。精製産物は、細胞培養物上清の精製により得てもよく、あるいは、細胞破砕物から得てもよい。
【０２４８】
単離および精製法としては、以下の標準的な方法：細胞破壊（ＰＯＩが細胞内で得られる場合）、精密濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）または遠心分離による細胞（破砕物）の分離および洗浄、沈殿または加熱処理によるＰＯＩの精製、酵素的消化によるＰＯＩの活性化、クロマトグラフィーによるＰＯＩの精製、たとえば、イオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ除外（ＳＥＣ）またはＨＰＬＣクロマトグラフィー、限外濾過プロセスを介する濃縮および洗浄によるＰＯＩの沈殿が好ましい。
【０２４９】
単離および精製されたＰＯＩは、従来の方法、たとえば、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、活性アッセイ、またはＥＬＩＳＡにより同定することができる。
【０２５０】
ＰＯＩは、任意の真核生物、原核生物、または合成ポリペプチドでありうる。ＰＯＩは、分泌タンパク質の場合もあり、細胞内タンパク質の場合もある。本発明はまた、自然発生のタンパク質の機能的な相同体、機能的な同等変異体、誘導体、および生物学的に活性な断片の組換えによる作製も提供する。機能的な相同体は、好ましくは、配列の機能的な特徴と同一であるか、またはこれに対応し、これを有する。
【０２５１】
ここで言及されるＰＯＩは、好ましくは、治療的、予防的、診断的、解析的、または産業的使用のための、真核宿主細胞と同種の産物であってもよく、異種の産物であってもよい。
【０２５２】
ＰＯＩは、好ましくは、真核細胞、好ましくは、酵母細胞内で、好ましくは、分泌タンパク質として産生される、異種組換えポリペプチドまたはタンパク質である。好ましく作製されたタンパク質の例は、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、アプロチニン、組織因子経路阻害剤、もしくは他のプロテアーゼ阻害剤、およびインスリンもしくはインスリン前駆体、インスリン類似体、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換増殖因子ａもしくはｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＸＩＩＩ、血小板由来増殖因子１、血清アルブミン、酵素、たとえば、リパーゼもしくはプロテアーゼ、または天然タンパク質と同様の機能を有する、機能的な相同体、機能的な同等変異体、誘導体、および生物学的に活性な断片である。ＰＯＩは、天然タンパク質と構造的に同様であってもよく、天然タンパク質のＣおよびＮ末端の一方もしくは両方または側鎖への、１つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列内の１つもしくは多数の異なる部位における、１つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の一端もしくは両端、またはアミノ酸配列内の１つもしくは複数の部位における、１つ以上のアミノ酸の欠失、あるいは天然アミノ酸配列内の１つ以上の部位における、１つ以上のアミノ酸の挿入により、天然タンパク質から導出してもよい。このような改変は、上述されたタンパク質のうちの複数について周知である。
【０２５３】
ＰＯＩはまた、宿主細胞内の生化学反応をもたらす、基質、酵素、阻害剤、または共因子からも選択することができ、これは、前記生化学反応または複数の反応のカスケードの生成物を得ること、たとえば、宿主細胞の代謝物を得ることを目的とする。例示的な生成物は、本発明に従う組換えタンパク質またはＰＯＩの発現の後で、収率を増大させて得ることができる、ビタミン、たとえば、リボフラビン、有機酸、およびアルコールでありうる。
【０２５４】
一般に、組換え産物を発現させる宿主細胞は、組換えによるＰＯＩの発現に適する、任意の真核細胞でありうる。
【０２５５】
好ましい哺乳動物細胞の例は、ＢＨＫ、ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ−Ｓ）、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、およびＶＥＲＯ細胞である。
【０２５６】
本発明に従い宿主細胞として使用される、好ましい酵母細胞の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（たとえば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（たとえば、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはＰ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属（Ｋ．パストリス（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋ．シュードパストリス（Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはＫ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ））、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Schefferomyces stipitis））、またはクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）を含むがこれらに限定されない。
【０２５７】
最近の文献では、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）、およびコマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）に分け、命名し直している。ここでは、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）、およびコマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）の全てについて、同義に使用する。
【０２５８】
好ましい酵母宿主細胞は、メチロトロープ酵母、たとえば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、たとえば、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、もしくはＫ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）、もしくはＫ．シュードパストリス（Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）から導出される。宿主の例は、酵母、たとえば、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の例は、ＣＢＳ  ７０４（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１６０３＝ＤＳＭＺ  ７０３８２）、ＣＢＳ  ２６１２（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−７５５６）、ＣＢＳ  ７４３５（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０）、ＣＢＳ  ９１７３〜９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、およびＤＳＭＺ  ７０８７７（Ｇｅｒｍａｎ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を含むが、また、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の株、たとえば、Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、およびＳＭＤ１１６８も含む。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の例は、Ｗ３０３、ＣＥＮ．ＰＫ、およびＢＹシリーズ（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を含む。上記で記載した株の全ては、使用されて、形質転換体を作製し、異種遺伝子を発現させることに成功している。
【０２５９】
本発明に従う、好ましい酵母宿主細胞、たとえば、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）または出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による宿主細胞は、産生宿主と異なるメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）または出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株から導出してもよい、異種または組換えプロモーター配列を含有する。別の具体的な態様では、本発明に従う宿主細胞は、宿主細胞としての同じ属、種、または株に由来するプロモーターを含む、本発明に従う組換え発現構築物を含む。
【０２６０】
本発明によれば、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ここで記載されるｐＧ１−ｘプロモーター配列を含む、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）による宿主細胞系をもたらすことが好ましい。
【０２６１】
ＰＯＩが、宿主細胞と同種のタンパク質、すなわち、宿主細胞内で自然発生のタンパク質である場合、宿主細胞内のＰＯＩの発現は、その天然プロモーター配列の、本発明に従うプロモーター配列との交換によりモジュレートしてもよい。
【０２６２】
この目的は、たとえば、宿主細胞を、部位特異的組換えを可能とする標的遺伝子の相同な配列、プロモーター配列、および宿主細胞に適する選択マーカーを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換することにより達成してもよい。部位特異的組換えは、プロモーター配列を、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結するために施すものとする。これは、天然プロモーター配列の代わりに、本発明に従うプロモーター配列によるＰＯＩの発現を結果としてもたらす。
【０２６３】
具体的に、ｐＧ１−ｘプロモーターは、プロモーター活性を、ＰＯＩの天然プロモーター配列に照らして増大させていることが好ましい。
【０２６４】
具体的な態様によれば、ＰＯＩ産生法では、ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列であって、宿主細胞のゲノムへの組込みに適するプラスミドにおいて、細胞１個当たり単一コピーまたは複数コピーでもたらされる組換えヌクレオチド配列を援用する。ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列はまた、自己複製型プラスミドによっても、細胞１個当たり単一コピーまたは複数コピーでもたらされる。
【０２６５】
ここで記載される好ましい方法は、真核生物発現ベクター、好ましくは、酵母発現ベクターであるプラスミドを援用する。発現ベクターは、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、および、具体的に、デザインされたプラスミドを含んでもよいがこれらに限定されない。本発明で使用される好ましい発現ベクターは、宿主細胞内の組換え遺伝子の発現に適する任意の発現ベクターであってもよく、宿主生物に応じて選択される。組換え発現ベクターは、宿主ベクターともまた呼ばれる、宿主生物のゲノム内で複製するかまたはこれに組み込むことが可能な任意のベクター、たとえば、本発明に従うＤＮＡ構築物を保有する酵母ベクターであってもよい。好ましい酵母発現ベクターは、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属により代表されるメチロトロープ酵母からなる群から選択される酵母内の発現のための発現ベクターである。
【０２６６】
本発明では、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺアルファ、ｐＧＡＰＺアルファ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＧＡＰＨｉｓ、またはｐＰＵＺＺＬＥから導出されたプラスミドを、ベクターとして使用することが好ましい。
【０２６７】
本発明の好ましい態様によれば、関与性の遺伝子を、ベクターにライゲーションすることにより、組換え構築物を得る。このようなベクターを使用して、宿主細胞を形質転換することにより、これらの遺伝子を、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込むことができる。遺伝子によりコードされるポリペプチドは、形質転換体を培養することにより、組換え宿主細胞系を使用して作製し、これにより、発現させたＰＯＩを培養物から単離し、発現させた産物に適する方法、特に、ＰＯＩを夾雑タンパク質から分離する方法により精製して、適切な培地中で得ることができる。
【０２６８】
発現ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、たとえば、抗生剤耐性を付与するか、または独立栄養要件を課するタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。酵母ベクターは一般に、酵母プラスミドに由来する複製起点、自己複製型配列（ＡＲＳ）、あるいは、宿主ゲノムへの組込みのために使用される配列、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択マーカーを含有する。
【０２６９】
ＤＮＡ配列および調節エレメント、たとえば、ｐＧ１−ｘプロモーター、ならびにＰＯＩをコードする遺伝子、プロモーター、およびターミネーターのそれぞれをライゲーションし、それらを、組込みまたは宿主の複製に必要な情報を含有する適切なベクターに挿入するのに使用される手順は、当業者に周知であり、たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）により記載されている。
【０２７０】
本発明に従う調節エレメント、および／またはＰＯＩを、組込み標的として使用するベクターは、調節エレメントおよび／またはＰＯＩをコードするＤＮＡ配列の全体を含有するＤＮＡ構築物をまず調製し、次いで、この断片を、適切な発現ベクターに挿入することにより構築してもよく、個々のエレメントについての遺伝子情報を含有するＤＮＡ断片を逐次的に挿入した後でライゲーションすることにより構築してもよいことが理解されるであろう。
【０２７１】
また、マルチクローニング部位を有するベクターであり、所望の異種遺伝子を、マルチクローニング部位に組み込んで、発現ベクターをもたらしうる、マルチクローニングベクターも、本発明に従い使用することができる。発現ベクター内で、プロモーターは、ＰＯＩの遺伝子の上流に配置され、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターの場合、ＰＯＩの遺伝子を、マルチクローニング部位に導入するため、プロモーターは、マルチクローニング部位の上流に配置される。
【０２７２】
本発明に従う組換え宿主細胞を得るために準備されるＤＮＡ構築物は、確立された標準的な方法、たとえば、ホスホルアミダイト法を介して、合成により調製してもよい。ＤＮＡ構築物はまた、たとえば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）に従い、合成のオリゴヌクレオチドプローブを使用する、ハイブリダイゼーションにより、本発明のポリペプチドの全部または一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより得られた、ゲノム由来のＤＮＡ構築物であってもよく、ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ構築物であってもよい。最後に、ＤＮＡ構築物は、必要に応じて、合成由来の断片、ゲノム由来の断片、またはｃＤＮＡ由来の断片であって、ＤＮＡ構築物の全体の多様な部分に対応する断片を、標準的な技法に従いアニールすることにより調製された、合成由来のＤＮＡ構築物とゲノム由来のＤＮＡ構築物を混合したＤＮＡ構築物であってもよく、合成由来のＤＮＡ構築物とｃＤＮＡ由来のＤＮＡ構築物を混合したＤＮＡ構築物であってもよく、ゲノム由来のＤＮＡ構築物とｃＤＮＡ由来のＤＮＡ構築物を混合したＤＮＡ構築物であってもよい。
【０２７３】
別の好ましい態様では、酵母発現ベクターは、たとえば、相同組換えにより、酵母ゲノム内に安定的に組み込むことが可能である。
【０２７４】
細胞を、本発明に従う調節エレメントおよび／またはＰＯＩ遺伝子で形質転換することにより得られる、本発明に従う形質転換宿主細胞は、好ましくは、まず、多数の細胞を効率的に増殖させる条件で培養してもよい。ＰＯＩを発現させるために細胞系を調製する場合は、培養法を、発現産物を作製するように選択する。
【０２７５】
前出の記載は、以下の例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかし、このような例は、本発明の１つ以上の態様を実施する方法を表すだけのものであり、本発明の範囲を限定するものとして読まれるべきではない。
【０２７６】
［実施例］
例１
ｐＧ１の５’側の短縮は、ｐＧ１の主要調節領域を明らかにする
天然（野生型）のｐＧ１プロモーターは、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）（コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））ＣＢＳ２６１２株（ＣＢＳ株：ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から単離した。サンガーシーケンシングおよび後続のＢＬＡＳＴ解析により決定される通り、ＣＢＳ２６１２のｐＧ１プロモーター配列は、ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿００１１の上流）株およびＣＢＳ７４３５（Ｐ７４３５＿Ｃｈｒ１−０００７の上流）株、またはＫ．パストリス（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＳＭＺ７０３８２株（ＤＳＭＺ株：Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＰＩＰＡ００３７２の上流）のゲノム配列内のそれぞれの領域に対する、９５％より大きい配列同一性を有した。ｐＧ１のゲノム領域についての解析時に、そのＧＴＨ１遺伝子は、始点について、ＣＢＳ７４３５（Ｐ７４３５＿Ｃｈｒ１−０００７）株およびＤＳＭＺ７０３８２（ＰＩＰＡ００３７２）株においてＧＳ１１５（ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿００１１）株の場合と異なる注釈を施されていることが分かった。ＧＳ１１５およびＣＢＳ２６１２とは対照的に、他の２つの株のゲノム配列では、コード配列は、３６ｂｐさらに下流で始まるように注釈されている。
【０２７７】
ｐＧ１の関与性の調節領域を同定するために、代替的な５’側位置である、−８５８、−６６３、−４９２、−３７１、−３２８、−２８３、−２１１、および−６６位から始めて、−１位へと、８つの短縮型ｐＧ１変異体を、ＣＢＳ２６１２からクローニングした（図１を参照されたい；番号付けは、ＧＴＨ１遺伝子の始点である、遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿００１１に基づく）。これらの短縮型プロモーター変異体を、例８において記載されている通りに、深型ウェルプレート内で、ｅＧＦＰ発現についてスクリーニングして、ｐＧ１の元の９６５ｂｐ形と比較した、抑制特性（グリセロールフィードビーズ）および誘導特性（グルコースフィードビーズ）について調べた（図２）。抑制条件において、全ての長さの変異体について、ｅＧＦＰシグナルの差違が見出されなかったことから、短縮型変異体のうちの何れにおいても、プロモーターの抑制は制限されなかったことが示される。４８時間の誘導後、発現能は、３２８ｂｐまでの長さのプロモーター変異体について、完全な機能性を維持した。２８３ｂｐの変異体は、元のｐＧ１プロモーターと比較して、約３分の２の強度にとどまった。最も短い長さの２つの変異体（２１１および６６ｂｐ）は、ほぼ非機能性であると考えられた。これらの結果は、−４００位〜−２００位の間の領域が、重要な調節性の特色を含有することを示唆する。
【０２７８】
例２
炭素供給源と関連することが予測される高密度のＴＦＢＳは、ｐＧ１プロモーターの主要調節領域をマーキングする
Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ製のＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して、ｐＧ１プロモーター配列（遺伝子ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−３＿００１１の１０００ｂｐ上流）を、マトリックスの「真菌」群および「一般コアプロモーターエレメント」群に属するマトリックスファミリーについて検索した。４６の異なるマトリックスファミリーに属する、１１１の推定ＴＦＢＳを見出した（表１）。解析される配列内で最も一般的なマトリックスファミリーは、単量体のＧａｌ４クラスモチーフ（Ｆ＄ＭＧＣＭ、１２の結合性部位）、ホメオドメイン含有転写調節因子（Ｆ＄ＨＯＭＤ、６つの結合性部位）、真菌塩基性ロイシンジッパーファミリー（Ｆ＄ＢＺＩＰ、５つの結合性部位）、および酵母ＧＣボックスタンパク質（Ｆ＄ＹＭＩＧ、５つの結合性部位）であった。極めて高密度のＴＦＢＳ結合性部位が、−４００〜−２００位の間で感知され、言及されたＴＦＢＳ（最も一般的なマトリックスファミリー）のうちの約３分の２（２８中１８）は、これらの位置にあった。一般コアプロモーターエレメントに関しては、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒにより、酵母関連モチーフも、真菌関連モチーフも、同定されなかったが、ＴＡＴＡボックスは、−２６位から見出すことができる。
【０２７９】
たとえば、−３９０〜−３７５位における顕著なモチーフであって、その配列５’−ＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２１）のために、ＴＡＴ１４と称されるか、またはその配列５’−ＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２２）のために、ＴＡＴ１５と称されるモチーフが同定された。プロモーター領域内のこのようなポリ（Ａ：Ｔ）トラクトは、ヌクレオソームの結合に負の影響を及ぼし、酵母内の近傍の部位におけるＴＦの結合を刺激することが公知である。
【０２８０】
例３
炭素供給源と関連する転写因子である、Ｍｘｒ１、Ｒｇｔ１、Ｃａｔ８−１、Ｃａｔ８−２、およびＭｉｇ１は、ｐＧ１の調節特性に重要であることを明らかにした
グルコース依存性または炭素供給源依存性が予測される転写因子結合性部位を、さらなる解析のために選択した（図１および表２を参照されたい）。オーバーラップ−エクステンションＰＣＲを使用して、それぞれの領域を欠失させたｐＧ１変異体を作出した。表３は、選択された全てのＴＦＢＳについて列挙し、欠失の影響を受ける（部分的に）、全てのＴＦＢＳ（表２中の詳細なリスト）を指し示す。一部の欠失（たとえば、Δ９およびΔ１０）では、近傍のＴＦＢＳを機能性に保ち、それらの影響について別個に検討するために、それぞれのＴＦＢＳのうちの一部のヌクレオチドを欠失させずに残した。
【０２８１】
全てのＴＦＢＳ欠失変異体およびＴＡＴ突然変異体を、ｅＧＦＰの発現について、例８に記載されている通り、抑制条件（グリセロールフィードビーズ）下および誘導条件（グルコースフィードビーズ）下でスクリーニングした（図３）。個々のＴＦ／ＴＦＢＳが通例、プロモーターの調節を果たすのに十分ではないことに考慮することは重要である。ＴＦＢＳの欠失はまた、プロモーター配列が、新たに形成された配列の接合、ＴＦＢＳの間の距離の変更、または高次の特性の変化（クロマチンの組織化）の影響を受けうることも含意する。また、他の隣接するＴＦＢＳのために、プロモーターの異なる位置における、同じＴＦＢＳが、異なる機能を果たす場合もある。近傍のＴＦＢＳにおいて、ＴＦは、相乗的に作用する場合もあり、立体障害のために、他のＴＦの結合を制限する場合もあるであろう。
【０２８２】
４つの異なる、炭素供給源と関連するＴＦファミリー：酵母代謝調節因子（Ｆ＄ＡＤＲ；マトリックス：Ｆ＄ＡＤＲ１．０１）、単量体Ｇａｌ４クラスモチーフ（Ｆ＄ＭＧＣＭ；マトリックス：Ｆ＄ＲＧＴ１．０１、Ｆ＄ＲＧＴ１．０２）、炭素供給源応答性エレメント（Ｆ＄ＣＳＲＥ、マトリックス：Ｆ＄ＣＳＲＥ．０１、Ｆ＄ＳＩＰ４．０１）、および酵母ＧＣボックスタンパク質（Ｆ＄ＹＭＩＧ；マトリックス：Ｆ＄ＭＩＧ１．０１およびＦ＄ＭＩＧ１．０２）を、ｐＧ１プロモーター変異体内で欠失させた（表２および表３を参照されたい）。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内の対応する転写因子は、それぞれ、Ａｄｒ１、Ｒｇｔ１、Ｓｉｐ４／Ｃａｔ８、およびＭｉｇ１である。
【０２８３】
炭素供給源依存性プロモーターは、グルコース抑制、および／または炭水化物もしくは他の糖以外の炭素供給源を介する誘導により制御される。グルコース抑制は主に、タンパク質キナーゼ複合体であるＳｎｆ１、転写抑制因子であるＭｉｇ１、およびタンパク質ホスファターゼ１によりなされる。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、下流の因子は、たとえば、呼吸器遺伝子（Ｈａｐ４）、糖新生遺伝子（Ｃａｔ８、Ｓｉｐ４）、およびグルコース輸送体（Ｒｇｔ１）を調節する。
【０２８４】
メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、Ｍｉｇ１−１およびＭｉｇ１−２と呼ばれる、２つのＭｉｇ１相同体を有し、これらのうちの後者はおそらく、炭素異化物の抑制因子として作用する。グルコースが利用可能である場合、Ｍｉｇ１は抑制因子として作用するのに対し、Ｒｇｔ１は、転写活性化因子として作用する。抑制機能を果たすために、Ｍｉｇ１は、脱リン酸化され、核へと移入されて、そこで、共抑制因子である、Ｓｓｎ６およびＴｕｐ１を動員する。
【０２８５】
制限グルコース下では、Ｒｇｔ１が脱リン酸化され、転写抑制因子として作用する。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、Ｒｇｔ１の機能は、そのリン酸化状態（Ｒｇｔ１は、４つのリン酸化部位を有する）により制御され、調節されるプロモーターの誘導は、転写抑制因子について典型的に見られる通り、Ｒｇｔ１の解離を要請しない。
【０２８６】
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、炭素供給源応答性亜鉛フィンガー転写因子であるＡｄｒ１は、グルコース抑制性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）遺伝子の転写活性化に要請される。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＡｄｒ１の相同体は、メタノール代謝の鍵となる調節因子である、Ｍｘｒ１（ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０４８７）であり、メタノールに対する、強力なＰAOXの誘導に不可欠な、正の活性化転写因子であることが報告された。Ｍｘｒ１について報告されたＴＦＢＳコアモチーフである、５’ＣＹＣＣ３’は、ｐＧ１プロモーター配列内で見出される、何れのＦ＄ＡＤＲ１．０１部位とも合致する。
【０２８７】
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、炭素供給源応答エレメント（ＣＳＲＥ）に、転写活性化因子であるＳｉｐ４およびＣａｔ８が結合し、糖新生遺伝子の発現を誘導するように機能する。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）では、ＳｃＣａｔ８の２つの相同体：Ｃａｔ８−１（ＰＡＳ＿ｃｈｒ２−１＿０７５７）およびＣａｔ８−２（ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５４０）を見出すことができ、これらの両方は、ＳｃＳｉｐ４についてもまた、最良のｂｌａｓｔｐヒットである。Ｃａｔ８−２の、ＳｃＣａｔ８との類似性は小さいが、抑制解除条件下で、潜在的に重要な役割を果たす。
【０２８８】
例４
ｐＧ１プロモーターの欠失変異体は、その抑制および誘導の一因となるＴＦＢＳを明らかにする
かつて同定された、ｐＧ１の主要調節領域の上流（５’側）に存在する、５つの欠失変異体（図１および表２における破線ボックスを参照されたい）のうち、変異体ｐＧ１−Δ１、ｐＧ１−Δ２、およびｐＧ１−Δ４は、プロモーター強度に対して、有益な効果を及ぼすと考えられるが、欠失変異体ｐＧ１−Δ３およびｐＧ１−Δ５は、ＧＦＰの発現に対して、元のｐＧ１プロモーター（配列番号９）と比較して、効果を及ぼさなかった。この結果は、プロモーターの、５’側における短縮が、ｐＧ１の操作に有益でありうることを示唆する。ｐＧ１の主要調節領域内のＴＦＢＳの欠失（ｐＧ１−Δ６〜ｐＧ１−Δ１２；図１および表２を参照されたい）は、ｅＧＦＰ発現に対して、異なる影響を及ぼしたが、何れも、抑制特性を失わずには、誘導の増大を示さなかった。したがって、その緊密な調節を保持するためには、ｐＧ１の主要調節領域を、操作ｐＧ１プロモーター変異体内で維持する必要があると仮定される。したがって、例１では、この領域を伴わない場合、制限グルコース下において、はるかに低度の誘導が観察された（ｐＧ１−３２８およびｐＧ１−２８３；図２）。
【０２８９】
Ｍｉｇ１結合性部位を、ｐＧ１−Δ３、ｐＧ１−Δ４、ｐＧ１−Δ１０、およびｐＧ１−Δ１１において欠失させた（Δ３では、Ｆ＄ＭＩＧ１．０２を欠失させ、Δ４、Δ１０、およびΔ１１では、Ｆ＄ＭＩＧ１．０１を欠失させた）が、ここで、ｐＧ１−Δ１０およびｐＧ１−Δ１１はまた、それぞれ、Ｆ＄ＡＤＲ１．０１およびＦ＄ＲＧＴ１．０２の欠失も含む。Δ３について、わずかな抑制の強化が見出される一方、Δ４では、抑制の変化は見られなかったが、誘導の後において、ｅＧＦＰレベルが増強された。
【０２９０】
Δ１０について見られた抑制の緩和ならびにΔ１０およびΔ１１によるプロモーター誘導の低下もまた、この領域内のＦ＄ＲＧＴ１結合性部位（Δ９およびΔ１１において欠失させたＦ＄ＲＧＴ１．０１およびＦ＄ＲＧＴ１．０２）と関連したものである可能性がある。Ｍｉｇ１はまた、ｐＧ１の調節において、二機能性の役割を果たした可能性がある：メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）では、２つのＭＩＧ１遺伝子が見出されており（ＭＩＧ１−１、ＭＩＧ１−２）、グルコースのアベイラビリティーに対して、逆向きに調節されることが示された。
【０２９１】
変異体ｐＧ１−Δ１では、Ｆ＄ＡＤＲ１．０１の欠失は、ｅＧＦＰレベルを上昇させたが、Ｍｘｒ１（Ｐｐにおける、メタノール代謝の正の調節因子であり、ＳｃＡＤＲ１の相同体である）結合性部位の欠失は逆に、プロモーターを弱めることが予測されよう。ｐＧ１−Δ１０における、Ｆ＄ＡＤＲ１．０１の欠失の、Ｆ＄ＭＩＧ１．０１の欠失との組合せは、グリセロールによるプロモーターの抑制を緩和し、その誘導を弱めたが、これが、Ｍｉｇ１  ＴＦＢＳの欠失に対する最終的な応答である。
【０２９２】
変異体ｐＧ１−Δ６（２つの部位）、ｐＧ１−Δ７、ｐＧ１−Δ８、ｐＧ１−Δ１１、およびｐＧ１−Δ１２では、主要調節領域内の結合性部位Ｆ＄ＲＧＴ１．０２を欠失させ、Δ９では、Ｆ＄ＲＧＴ１．０１を欠失させた。対合させたＦ＄ＲＧＴ１．０２部位（Δ６；逆鎖上の結合性部位は、７ｂｐのシフトを伴う）の欠失を宿す変異体は、抑制のわずかな緩和および誘導の低減を示した。変異体Δ７およびΔ８は、極めて近接したＦ＄ＲＧＴ１．０２部位を含有し、ここで、前者のＦ＄ＲＧＴ１．０２部位は、マイナス鎖上にあり、後者のＦ＄ＲＧＴ１．０２部位は、プラス鎖上にあるが、Δ８はまた、Ｆ＄ＳＩＰ４．０１部位の欠失も含有する。前者（Δ７）が、抑制のわずかな緩和および誘導の増大を示したのに対し、後者（Δ８）による誘導は、はるかに弱かった（が、プロモーターの抑制は変化させなかった）。これは、ｐＧ１の誘導にとっての、転写活性化因子であるＣａｔ８−１および／またはＣａｔ８−２（ＳｃＳｉｐ４の最も強力な相同体）の強力な役割を指し示す。変異体Δ９を、近接して配置されるＦ＄ＲＧＴ１．０１およびＦ＄ＣＳＲＥ．０１のＴＦＢＳ（逆鎖上の結合性部位）を欠失させるように創出したが、抑制の大幅な喪失は、これらのＴＦＢＳには、おそらくＲｇｔ１、Ｃａｔ８−１、および／またはＣａｔ８−２の結合を介して、ｐＧ１を緊密に制御する強力な役割があることを指し示す。変異体ｐＧ１−Δ１２内の、Ｆ＄ＲＧＴ１．０２の欠失は、ｅＧＦＰ発現性能に影響を及ぼさなかった。興味深いことに、ＣＡＴ８−２の転写は、制限グルコース下では、グルコース剰余下と比較して強力に上方調節されるが、被験条件下では、ＲＧＴ１およびＣＡＴ８−２の転写調節がなされなかった。
【０２９３】
例５
ｐＧ１プロモーター強度は、ポリ（Ａ：Ｔ）トラクトであるＴＡＴ１４に依存する
ＴＡＴモチーフは、ｐＧ１の主要調節領域の、約８０ｂｐ上流（５’、たとえば、−３９０〜−３７４位）に配置される。メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、ＣＢＳ２６１２、ＣＢＳ７４３５、またはＧＳ１１５における、ＧＴＨ１の５’側領域のシーケンシングの反復は、ＴＡＴモチーフ内の、１５±１のＴの検出を結果としてもたらした。プロモーター性能に対するその影響について解明するため、ＴＡＴ１４モチーフを、欠失（ｐＧ１−ΔＴＡＴ１４）および突然変異（Ｔ１６、Ｔ１８、およびＴ２０；ｐＧ１−Ｔ１６、ｐＧ１−Ｔ１８、ｐＧ１−Ｔ２０への）について選択した。プライマー（表４のプライマー＃３７〜４２を参照されたい）は、当初、Ｔ１８、Ｔ２０、およびＴ２２を得るようにデザインしたが、長さが異なる変異体（それぞれ、Ｔ１６、Ｔ２０、およびＴ１８）を得、使用した。ＴＡＴ１４モチーフの欠失が、ＧＦＰシグナルの低下を結果としてもたらしたのに対し、その伸長は、ｐＧ１の発現強度を増大させた。これは、伸長型ＴＡＴ１４モチーフの使用が、ｐＧ１の操作に有益であることを指し示す。
【０２９４】
例６
ｐＧ１の主要調節領域の部分的な配列の重複は、その発現強度を著明に改善する
２つの配列断片（−４７２〜−１８８および−４７２〜−１）のＰＣＲによる増幅、ならびに制限部位ＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩを使用する挿入（５０９〜５１４および５２５〜５３０位）により、ｐＧ１プロモーターの２つの重複変異体（ｐＧ１−Ｄ１２４０（配列番号４９）およびｐＧ１−Ｄ１４２７（配列番号８５）；番号は、それぞれのプロモーター変異体の長さを表す）を作出した。重複区間は、第１の変異体（ｐＧ１−Ｄ１２４０）では、ｐＧ１−Δ５で欠失させたＴＦＢＳの上流で始まり、ｐＧ１の主要調節領域の後方で終わる一方、第２の重複配列（ｐＧ１−Ｄ１４２７）は、ｐＧ１プロモーターの３’端に達する。これらの変異体を、ＴＦＢＳ欠失変異体およびＴＡＴ１４突然変異体について記載したのと同じ方式で、ｅＧＦＰの発現についてスクリーニングした（例８を参照されたい）。何れの重複変異体も、過剰グリセロール下における抑制の強化と、制限グルコースにおける誘導の強化とを示した（図４）。
【０２９５】
選択圧を伴わずに、約２０世代と同等である、３回連続の回分培養を実施することにより、重複変異体クローンであるｐＧ１−Ｄ１２４０  ＃３の、形質転換後における安定性について調べた。ｅＧＦＰの発現は、全培養時間にわたり安定であった（データは示さない）。これと比較して、典型的なメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）によるバイオリアクタープロセスは、回分期に、ＯＤ600＝１（１Ｌ当たり約０．２〜０．４ｇのＹＤＭ）で始まり、流加期後に、１Ｌ当たり約１００ｇのＹＤＭで終わり、これにより、約１０世代にわたる。
【０２９６】
例７
流加バイオリアクター培養における、ｐＧ１プロモーター変異体の性能の検証
バイオプロセス条件下で作出されたプロモーター変異体の性能を検証するために、一部の変異体を、それらのｅＧＦＰの発現性能の変更に基づき、流加培養のために選択した：ｐＧ１−Δ２（配列番号２１１）は、主要調節領域の上流における、増強が最高度の変異体であり、ｐＧ１−Ｔ１６（配列番号２５７）およびｐＧ１−Ｄ１２４０（配列番号４９）は、グリセロール条件下におけるプロモーターの抑制を失わずに、制限グルコース下で、高度なｅＧＦＰの発現レベルを示した。グリセロール回分期で始め、空時収量を最適化させた流加を後続させる、バイオリアクターによる培養（Ｐｒｉｅｌｈｏｆｅｒら、２０１３）を、クローン１つずつについて実施し、ｅＧＦＰの発現について、対照のｐＧ１株＃８と比較した（図５および表５を参照されたい）。
【０２９７】
流加発酵は、最終作業容量を０．７Ｌとして、ＤＡＳＧＩＰリアクター内で実施した。
【０２９８】
以下の培地を使用した。
【０２９９】
ＰＴＭ1微量元素塩原液は、１リットル当たり、
６．０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０８ｇのＮａＩ、３．３６ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．２ｇのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇのＨ3ＢＯ3、０．８２ｇのＣｏＣｌ2、２０．０ｇのＺｎＣｌ2、６５．０ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇのビオチン、および５．０ｍｌのＨ2ＳＯ4（９５％〜９８％）
を含有した。
【０３００】
グリセロール回分培地は、１リットル当たり、
２ｇのクエン酸一水和物（Ｃ6Ｈ8Ｏ7・Ｈ2Ｏ）、３９．２ｇのグリセロール、１２．６ｇのＮＨ4Ｈ2ＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．９ｇのＫＣｌ、０．０２２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．４ｍｇのビオチン、および４．６ｍｌのＰＴＭ１微量元素塩原液
を含有した。ＨＣｌを添加して、ｐＨを５とした。
【０３０１】
グルコース流加培地は、１リットル当たり、
４６４ｇのグルコース一水和物、５．２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．４ｇのＫＣｌ、０．２８ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．３４ｍｇのビオチン、および１０．１ｍＬのＰＴＭ１微量元素塩原液
を含有した。
【０３０２】
溶存酸素は、攪拌器速度を４００〜１２００ｒｐｍとして、ＤＯ＝２０％に制御した。
曝気速度は、空気２４Ｌ  ｈ-1とし、温度は、２５℃に制御し、ｐＨ設定点である５は、ＮＨ4ＯＨ（２５％）を添加することにより制御した。
【０３０３】
発酵を開始するために、４００ｍＬの回分培地を、発酵槽へと滅菌濾過し、それぞれのメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンの選択的前培養物から、出発光学濃度（ＯＤ６００）を１として接種した。約２５時間の回分期（約２０ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度に到達する）の後、７時間にわたる指数的フィードで始め、１５ｇ／Ｌの一定のフィード速度で１３時間にわたる、グルコース制限流加を施し、最終的な約１００ｇ／Ｌの乾燥バイオマス濃度をもたらした。試料は、回分および流加期において採取し、プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００、Ｔｅｃａｎ、ＣＨ）を使用して、ｅＧＦＰの発現について解析した。そこで、試料を光学濃度（ＯＤ６００）５まで希釈した。結果を、バイオリアクター１つ当たりの相対蛍光（ＦＬ／ｒ）として、図５に示す。
【０３０４】
リアルタイムＰＣＲを使用して、これらの３つのクローンの遺伝子コピー数を解析し、それらの全てについて、１であるＧＣＮを結果としてもたらした（データは示さない）。全てのｐＧ１変異体は、回分期における良好な抑制と、誘導状態における強力な発現とを提示した（表５）。バイオリアクター条件下で、重複変異体ｐＧ１−Ｄ１２４０の強力な改善を検証することができ、クローンｐＧ１−Ｄ１２４０  ＃３は、流加の終点において、ＧＦＰ蛍光の、ｐＧ１と比較して、５０％の増大を示した。回分の終点において、シグナルは、既に増大していたが、誘導比は、元のｐＧ１よりやや大きかった。スクリーニング以外では、クローンｐＧ１−Δ２  ＃３は、回分の終点において、シグナルをわずかに増大させたが、流加の終点において、シグナルを約１０％弱めた。ＴＡＴ１４突然変異体クローンであるｐＧ１−Ｔ１６  ＃３は、回分の終点では、最も強いシグナルを示したが、流加の終点では、重複変異体に劣り、対照のｐＧ１  ＃８を約２０％上回る改善に達し、スクリーニング結果と同様であった。回分期における、クローンの異なる誘導挙動は、回分期を通して、グリセロール濃度を低下させることに起因する、抑制解除により説明される（図５Ａを参照されたい）。全体として、流加培養は、小スケールのスクリーニングで得られた結果をほとんど確認することができた。
【０３０５】
到達点および結論
炭素供給源依存性調節を伴う遺伝子プロモーターは、産生期が、増殖から分離されているため、バイオプロセスへの適用に好適である。潜在的なプロモーターベースのタンパク質作製の改善は、最適な増殖条件（たとえば、増殖速度、フィーディング戦略）を見出すことにより達することもでき、プロモーター配列（たとえば、突然変異、欠失）を直接操作することにより達することもできる。
【０３０６】
長さを短縮し、ＴＦＢＳの欠失、ＴＡＴモチーフの突然変異、および断片の重複を伴う、いくつかのｐＧ１プロモーター変異体を構築した。これにより、その重要なＴＦＢＳを含む、ｐＧ１の主要調節領域を同定した。逆鎖上の同じ位置で結合する、Ｆ＄ＲＧＴ１およびＦ＄ＣＳＲＥからなる、２つのモチーフを欠失させた、ＴＦＢＳの欠失についての解析は、転写因子であるＲｇｔ１ならびにＣａｔ８−１および／またはＣａｔ８−２が、ｐＧ１の抑制および誘導に不可欠な役割を果たすことを指し示す。第１の部分（ｐＧ１−Δ８：−２９３〜−２８５位；ＲＧＴ１：（＋）−３１０〜−２９９、ＣＳＲＥ：（−）−２９９〜−２８５）の欠失が、プロモーターの誘導を弱める一方、第２の部分（ｐＧ１−Δ９：−２７５〜−２６１位；ＲＧＴ１：（−）−２７５〜−２５９、ＣＳＲＥ：（＋）−２７６〜−２６０）の欠失は、プロモーターの抑制を低下させた。これにより、ｐＧ１の調節に不可欠で特徴的な、調節モチーフを同定した。
【０３０７】
他の条件下、たとえば、過剰グルコース条件下またはメタノール誘導条件下では、転写調節因子であるＭｉｇ１（Ｆ＄ＭＩＧ１）およびＭｘｒ１（Ｆ＄ＡＤＲ１）の役割は、より重要でありうるであろう。この領域内またはこの領域の近傍で結合する他の転写因子もまた、ｐＧ１の調節に寄与しうるであろう。
【０３０８】
ポリ（Ａ：Ｔ）トラクトは、プロモーター配列内で役割を果たすことが公知であるが、ｐＧ１内のＴＡＴモチーフであって、主要調節因子領域の上流（たとえば、−３９０〜−３７５位）に配置されるＴＡＴモチーフは、ｐＧ１の強度に不可欠であることを示すことができた。このモチーフの、Ｔ１６、Ｔ１８、およびＴ２０への伸長は、プロモーターの性能に対して、正の効果を及ぼした。
【０３０９】
ｐＧ１の欠失変異体は、５’側の短縮も、プロモーターの操作に同様に有益でありうることを明らかにした。Ｍｘｒ１、Ｍｉｇ１、Ｒｇｔ１、およびＣａｔ８のＴＦＢＳを、ｐＧ１の主要調節領域の上流において欠失させたところ、ｅＧＦＰの発現が改善されたが、５’短縮型プロモーター変異体については、この効果が見られなかった。
【０３１０】
部分的な配列の重複を伴う２つの変異体は、野生型ｐＧ１と比較した、発現能の大幅な増強に達した。
【０３１１】
妥当なプロモーター操作のための堅固な基盤である、ｐＧ１の良好な発現性能の顕著に異なる特色：５’側の短縮、ＴＡＴモチーフの使用、および任意の突然変異／伸長、および断片の重複を割り当てることができた。小スケールのスクリーニングにおけるｐＧ１変異体の性能は、流加培養における検証に成功しえた。
【０３１２】
略号：
ＣＳＲＥ：炭素供給源応答エレメント、Ｆ＄：真菌特異的ＴＦマトリックス、ＧＣＮ：遺伝子コピー数、ＧＯＩ：対象の遺伝子、Ｐｐ：メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓｃ：出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＴＦ：転写因子、ＴＦＢＳ：転写因子結合性部位、ＹＤＭ：酵母乾燥質量
例８
抑制、誘導、ｐＧ１−ｘの発現レベル（ｐＧ１と比較した発現レベル）、誘導比の決定
ｐＧ１プロモーターと比較したプロモーター強度および誘導比は、以下の標準的なアッセイにより決定することができる：メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、ウェル１つ当たりの培養物を２ｍＬとして、２８０ｒｐｍで振とうしながら、深型２４ウェルプレート内、２５℃でスクリーニングする。グルコースフィードビーズ（６ｍｍ、Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）を使用して、グルコース制限増殖条件を作出する。フローサイトメトリーを使用して、細胞を、抑制（ＹＰ＋１％グリセロール、指数関数的増殖期）および誘導（ＹＰ＋１つのフィードビーズ、２０〜２８時間にわたる）時における、ｅＧＦＰの発現について解析する。フローサイトメトリーデータの、少なくとも３０００データ点について、比ｅＧＦＰ蛍光を、蛍光強度および前方散乱から計算する。前方散乱は、細胞容量についての相対的尺度である。比ＧＦＰ蛍光は、蛍光強度（ＦＩ）を、前方散乱（ＦＳＣ）で除して、１．５乗したもの、すなわち、ＦＩ／ＦＳＣ1.5に等しい（Ｈｏｈｅｎｂｌｕｍ，Ｈ．、Ｎ．Ｂｏｒｔｈ、およびＤ．Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ（２００３）、Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１０２：２８１〜２９０）。このデータから、集団の比蛍光の幾何平均値を使用し、野生型の非産生性メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞のバックグラウンドシグナルを減じることにより標準化する。グリセロール条件下の比ｅＧＦＰ蛍光を、「抑制」と称し、制限グルコース条件（グルコースフィードビーズ）下の比ｅＧＦＰ蛍光を、「誘導」と称する。したがって、同じスクリーニングの抑制および誘導値ならびにフローサイトメトリーの測定値だけを比較し、計算のために使用することができる。相対ｐＧ１−ｘプロモーター強度を決定するために、ｐＧ１−ｘプロモーターを含む株の誘導値を、元のｐＧ１プロモーターを含む株の誘導値で除することにより、誘導状態における、ｐＧ１−ｘプロモーターのｅＧＦＰ発現レベルを、元のｐＧ１プロモーターと比較した。誘導比は、同じ株／プロモーターの誘導値を、抑制値で除することにより計算する。いくつかのプロモーター変異体についての、抑制、誘導、相対ｐＧ１−ｘプロモーター強度、および誘導比を、表６に示す。
【０３１３】
さらなる例は、配列番号４９のヌクレオチド配列を含むかまたはこれらからなるｐＧ１−ｘプロモーターを使用することにより、モデルタンパク質（ＰＯＩ）が、メタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、非改変ｐＧ１プロモーター（基準；配列番号７）と比較して、はるかに高収量（３．５倍より大きい増大倍率；流加実験）で作製されたことを実証している。
【０３１４】
例９
「高速発酵」と、標準的発酵との比較
概要：標準的な流加レジメを使用する代わりに、空時収量を最適化した流加プロトコールを援用することにより、配列番号３９のｐＧ１−３態様（ｐＧ１−Ｄ１２４０（配列番号４９））によるプロモーターの制御下で、モデルタンパク質としての代替的な足場タンパク質の発現について、発酵時間の著明な低減を得ることができた。
【０３１５】
ｐＧ１−Ｄ１２４０（配列番号４９）の制御下で、モデルタンパク質を発現させるクローンを、流加培養のために選択した。流加培養は、最終作業容量を０．５Ｌとして、ＤＡＳＧＩＰリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で実施した。培地および微量元素溶液は、グリセロール回分培地中のグリセロール濃度を１Ｌ当たり４５ｇとしたことを除き、例７で既に記載した通りに調製した。培養時の溶存酸素レベルは、攪拌器の速度（４００〜１２００ｒｐｍ）により、ＤＯ＝３０％に制御した。通気速度は、空気１ｖｖｍとし、温度は、２５℃に制御し、５．０のｐＨ設定点は、ＮＨ4ＯＨ（２５％）の添加により制御した。バイオリアクターによる培養を開始するために、２５０ｍＬの回分培地に、それぞれのメタノール資化酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンの前培養物から、出発光学濃度（ＯＤ６００）を１．０として接種した。グリセロールによる回分期は、約３０時間にわたり、１Ｌ当たり２５〜２９ｇの乾燥バイオマス濃度に達した。グリセロール回分期に続き、制限グルコース流加を行った。２つの異なる流加培養方式：（Ａ）一定のフィード速度を使用する、標準流加プロトコール、（Ｂ）空時収量を最適化した流加プロトコール（「高速発酵」）であって、グルコースフィード速度を、発酵の容量生産性を最大化するように最適化した流加プロトコールを比較した。
【０３１６】
標準培養には、一定のグルコースフィード速度１．２５ｍＬ  ｈ-1を選択した。流加培養を１００時間（総培養時間を１２６時間とする）にわたり維持する結果として、約９０ｇ  Ｌ-1の最終乾燥バイオマス濃度をもたらした。「高速発酵」には、モデルベースの最適化アルゴリズム（Ｍａｕｒｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、２００６、５：３７）を採用したが、ここで、容量を最適化したグルコースフィード速度Ｆ（ｔ）は、線形増加関数：Ｆ（ｔ）［ｍＬ  ｈ-1］＝０．３２３４ｍＬ  ｈ-2×ｔ＋３．３９２１ｍＬ  ｈ-1で近似した。流加期をｔ＝３３時間（総培養時間を６０時間とする）にわたり維持する結果として、約１４０ｇ  Ｌ-1の最終乾燥バイオマス濃度をもたらした。
【０３１７】
試料は、回分の終点および流加期において採取した。産物力価は、ＨＴ  ｌｏｗ  ＭＷ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓ試薬キットおよびＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して、清明化させた上清により解析した。絶対定量化のための基準となる標準物質として、代替的な足場タンパク質の精製標準物質を使用した。
【０３１８】
図９は、標準培養（Ａ）および「高速発酵」（Ｂ）について、産物および総培養時間にわたるバイオマスの生成を示す。比較すると、「高速発酵」および標準発酵のそれぞれについて、６０時間後および１２６時間後に、６．４ｇ  Ｌ-1および４．３ｇ  Ｌ-1の最終産物力価に達しえた。言い換えると、記載される標準的なフィードレジメを使用する代わりに、「高速発酵」について記載される通り、ｐＧ１−Ｄ１２４０（配列番号４９）プロモーターの下における発現時に、グルコースフィードを補充したところ、著明に短い発酵時間（−６６時間）で、１．４倍の力価（１．２倍の培養液力価に対応する）を見出すことができた。
【０３１９】
表
表１：ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して、ｐＧ１プロモーター配列内で同定されたＴＦＢＳ。標的である、ｐＧ１欠失変異体の、炭素供給源と関連するＴＦＢＳを、太字体で示す。
【０３２０】
【表１−１】
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【０３２１】
【表１−２】
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【０３２２】
【表１−３】
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【０３２３】
【表１−４】
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【０３２４】
【表１−５】
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【０３２５】
【表１−６】
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【０３２６】
【表１−７】
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【０３２７】
【表１−８】
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【０３２８】
【表１−９】
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【０３２９】
【表１−１０】
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【０３３０】
【表１−１１】
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【０３３１】
【表１−１２】
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【０３３２】
【表１−１３】
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【０３３３】
表２：欠失突然変異体であるｐＧ１−Δ１〜Δ１２において影響を受けた、ｐＧ１プロモーター配列のＴＦＢＳ。Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ製のＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して、配列解析を行った。欠失のために選択された、グルコースおよび炭素に関連するＴＦＢＳを、太字体で示し、対応するＩＤ（１〜１２）および欠失させた位置を、欄１および２に明記する。
【０３３４】
【表２−１】
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【０３３５】
【表２−２】
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【０３３６】
【表２−３】
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【０３３７】
【表２−４】
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【０３３８】
表３：ｐＧ１  ＴＦＢＳ欠失変異体の位置およびＴＦＢＳの欠失
ｐＧ１  ＴＦＢＳの欠失変異体（ｐＧ１−Δ１〜Δ１２）における、標的であるＴＦＢＳおよび影響を受けたＴＦＢＳを列挙する。標的である、炭素供給源と関連するＴＦＢＳを、太字体で示す。全てのＴＦＢＳおよび欠失ＴＦＢＳについての詳細な情報を、それぞれ、表１および表２に提示する。
【０３３９】
【表３】
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【０３４０】
表４：プライマー配列
【０３４１】
【表４−１】
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【０３４２】
【表４−２】
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【０３４３】
【表４−３】
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【０３４４】
表５：ｅＧＦＰを発現させるｐＧ１（ここでは、ｐＧ１  ＃８と称する）およびｐＧ１−ｘ変異体（ここではまた、ｐＧ１変異体とも称する）の流加培養
回分の終点および流加の終点について、相対ｅＧＦＰ蛍光を示す。回分の終点において、時点を０に設定した。ｐＧ１（＃８）の制御下でｅＧＦＰを発現させるクローンを、ｐＧ１欠失変異体（ｐＧ１−Δ２）、ＴＡＴ１４突然変異体（ｐＧ１−Ｔ１６）、および重複変異体（ｐＧ１−Ｄ１２４０）の制御下でｅＧＦＰを発現させるクローンと比較した。回分および流加におけるバイオマス濃度（ＹＤＭ）は、予測した通りであった。
【０３４５】
【表５】
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【０３４６】
表６：深型ウェル比較スクリーニングによる、ｐＧ１と比較したプロモーター強度およびｐＧ１変異体のプロモーター誘導比。ｐＧ１−ｘ変異体（誘導された）の発現強度は、元のｐＧ１プロモーターについて得られるｅＧＦＰの発現レベルと関連する。誘導比は、誘導および抑制状態におけるＧＦＰレベルから計算する。
【０３４７】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６ａ−１】
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【図６ａ−２】
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【図６ａ−３】
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【図６ａ−４】
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【図６ａ−５】
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【図６ａ−６】
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【図６ａ−７】
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【図６ｂ−１】
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【図６ｂ−２】
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【図６ｂ−３】
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【図６ｂ−４】
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【図６ｂ−５】
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【図６ｂ−６】
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【図６ｂ−７】
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【図６ｂ−８】
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【図６ｂ−９】
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【図６ｂ−１０】
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【図６ｂ−１１】
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【図６ｂ−１２】
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【図６ｂ−１３】
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【図６ｂ−１４】
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【図６ｂ−１５】
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【図６ｂ−１６】
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【図６ｂ−１７】
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【図６ｂ−１８】
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【図６ｂ−１９】
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【図６ｂ−２０】
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【図６ｂ−２１】
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【図６ｂ−２２】
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【図６ｂ−２３】
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【図６ｂ−２４】
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【図６ｂ−２５】
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【図６ｂ−２６】
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【図６ｂ−２７】
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【図６ｂ−２８】
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【図６ｂ−２９】
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【図６ｂ−３０】
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【図６ｂ−３１】
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【図６ｂ−３２】
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【図６ｂ−３３】
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【図６ｂ−３４】
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【図６ｂ−３５】
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【図６ｂ−３６】
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【図６ｂ−３７】
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【図６ｂ−３８】
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【図６ｂ−３９】
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【図６ｂ−４０】
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【図６ｂ−４１】
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【図６ｂ−４２】
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【図６ｂ−４３】
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【図６ｂ−４４】
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【図６ｂ−４５】
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【図６ｂ−４６】
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【図６ｂ−４７】
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【図６ｂ−４８】
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【図６ｂ−４９】
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【図６ｂ−５０】
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【図６ｂ−５１】
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【図６ｂ−５２】
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【図６ｂ−５３】
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【図６ｂ−５４】
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【図６ｂ−５５】
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【図６ｂ−５６】
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【図６ｂ−５７】
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【図６ｂ−５８】
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【図６ｂ−５９】
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【図６ｂ−６０】
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【図６ｂ−６１】
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【図６ｂ−６２】
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【図６ｂ−６３】
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【図６ｂ−６４】
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【図６ｂ−６５】
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【図６ｂ−６６】
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【図６ｂ−６７】
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【図６ｂ−６８】
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【図６ｂ−６９】
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【図６ｂ−７０】
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【図６ｂ−７１】
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【図６ｂ−７２】
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【図６ｂ−７３】
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【図６ｂ−７４】
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【図６ｂ−７５】
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【図６ｂ−７６】
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【図６ｂ−７７】
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【図６ｂ−７８】
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【図６ｂ−７９】
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【図６ｂ−８０】
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【図６ｂ−８１】
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【図６ｂ−８２】
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【図６ｂ−８３】
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【図６ｂ−８４】
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【図６ｂ−８５】
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【図６ｂ−８６】
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【図６ｂ−８７】
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【図６ｂ−８８】
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【図６ｂ−８９】
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【図６ｂ−９０】
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【図６ｂ−９１】
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【図６ｂ−９２】
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【図６ｂ−９３】
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【図６ｂ−９４】
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【図６ｂ−９５】
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【図６ｂ−９６】
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【図６ｂ−９７】
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【図６ｂ−９８】
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【図６ｂ−９９】
2018522565.tif 000139
【図６ｂ−１００】
2018522565.tif 000140
【図６ｂ−１０１】
2018522565.tif 000141
【図６ｂ−１０２】
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【図６ｂ−１０３】
2018522565.tif 000143
【図６ｂ−１０４】
2018522565.tif 000144
【図６ｂ−１０５】
2018522565.tif 000145
【図６ｂ−１０６】
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【図６ｂ−１０７】
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【図６ｂ−１０８】
2018522565.tif 000148
【図６ｂ−１０９】
2018522565.tif 000149
【図６ｂ−１１０】
2018522565.tif 000150
【図６ｂ−１１１】
2018522565.tif 000151
【図６ｂ−１１２】
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【図６ｂ−１１３】
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【図６ｂ−１１４】
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【図６ｂ−１１５】
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【図６ｂ−１１６】
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【図６ｂ−１１７】
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【図６ｂ−１１８】
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【図６ｂ−１１９】
2018522565.tif 000159
【図６ｂ−１２０】
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【図６ｂ−１２１】
2018522565.tif 000161
【図６ｂ−１２２】
2018522565.tif 000162
【図６ｂ−１２３】
2018522565.tif 000163
【図６ｂ−１２４】
2018522565.tif 000164
【図６ｂ−１２５】
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【図６ｂ−１２６】
2018522565.tif 000166
【図６ｂ−１２７】
2018522565.tif 000167
【図６ｂ−１２８】
2018522565.tif 000168
【図６ｂ−１２９】
2018522565.tif 000169
【図６ｂ−１３０】
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【図７−１】
2018522565.tif 000171
【図７−２】
2018522565.tif 000172
【図８−１】
2018522565.tif 000173
【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
2018522565000001.app
【国際調査報告】
2018522565.tif 000176
2018522565.tif 000177
2018522565.tif 000178
2018522565.tif 000179