(57)【要約】本開示は、サイトカイン／ケモカインの、例えば、改善された臨床転帰、有意に増大した生存時間および腫瘍もしくはがんの再発までの有意に増大した時間と相関する、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てのレベルを生じる部分的に成熟しかつ活性化された樹状細胞を提供する。これらサイトカインの決定された閾値量は、（ｉ）活性化された樹状細胞に関する免疫療法有効性試験、（ｉｉ）応答者患者を選択する、（ｉｉｉ）非応答者患者を却下する、および（ｉｖ）サイトカイン／ケモカインの閾値量の生成をも誘導し得る樹状細胞活性化または成熟化薬剤をスクリーニングするために使用され得る。
2018537949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定するための方法であって、該方法は、
ｉ）活性化された樹状細胞を調製する工程；
ｉｉ）インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）および／もしくは腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の相対量を決定する工程；
ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの該決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに
ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること；あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定する工程
を包含する方法。
【請求項２】
活性化されたＤＣ集団の免疫療法有効性を増大させるための方法であって、該方法は、
ｉ）活性化された樹状細胞集団を調製する工程；
ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；
ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの該決定された量と閾値量とを比較する工程；
ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回るか否かを決定する工程；ならびに
ｖ）該活性化されたＤＣによるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての生成を誘導して、増大した免疫療法有効性を有する活性化されたＤＣ集団を形成するように、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての量を、該閾値量を上回るようにし得る薬剤の十分な量を添加する工程、
を包含する方法。
【請求項３】
活性化された樹状細胞の投与に応答する患者を、該患者に由来する活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定することによって選択するための方法であって、該方法は、
ｉ）活性化された樹状細胞を調製する工程；
ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；
ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの該決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに
ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること、あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定し、そして該閾値を上回るそれら患者を、応答する患者として選択する工程
を包含する方法。
【請求項４】
活性化された樹状細胞の投与に応答しない患者を、該患者に由来する活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定することによって選択するための方法であって、該方法は、
ｉ）活性化された樹状細胞を調製する工程；
ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；
ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの該決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに
ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること、あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定し、そして該閾値を下回るそれら患者を、応答しない患者として選択する工程
を包含する方法。
【請求項５】
増大した免疫療法有効性を有する活性化された樹状細胞を生成するための樹状細胞成熟化薬剤を選択するための方法であって、該方法は、
ｉ）未成熟樹状細胞と試験樹状細胞成熟化薬剤とを接触させることによって、活性化された樹状細胞を調製する工程；
ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；
ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの該決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに
ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること、あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、該活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定し、そして閾値を上回る活性化された樹状細胞の生成を誘導する該樹状細胞成熟化薬剤を選択する工程
を包含する方法。
【請求項６】
前記活性化された樹状細胞は、約５０〜約２００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６；約５００〜約２０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約３０〜約７０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＴＮＦα；少なくとも約７５〜約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０サブユニット；および約１〜３ｎｇ／１００万個細胞／２４時間の生物学的に活性なＩＬ−１２  ｐ７０を生成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化された樹状細胞は、約７５〜約１５０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６；約７５０〜約１５００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０；少なくとも約１〜３ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ７０；および少なくとも約３０〜７０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＴＮＦαを生成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記活性化された樹状細胞は、約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６、および１０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８、少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０；少なくとも約２ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ７０；ならびに少なくとも約３０ｎｇのＴＮＦαを生成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記活性化された樹状細胞は、以下の工程：
ｉ）末梢血からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む細胞集団を単離する工程；
ｉｉ）ヒトＰＢＭＣを含む該細胞集団を、ヒト単球性樹状細胞前駆体に関して富化する工程；
ｉｉｉ）ヒト単球性樹状細胞前駆体に関して富化された該細胞集団を、有効量の樹状細胞分化薬剤を補充した組織培養培地とともに、該ヒト単球性樹状細胞前駆体を未成熟ヒト樹状細胞へと分化させるために十分な期間にわたって培養する工程；
ｉｖ）未成熟ヒト樹状細胞に関して富化された該細胞集団を、有効量の樹状細胞成熟化薬剤とともに培養する工程であって、該未成熟ヒト樹状細胞を活性化する工程；ならびに
ｖ）該活性化されたヒト樹状細胞を単離および洗浄する工程、
によって調製される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性化された樹状細胞は、以下の工程：
ｉ）ヒト単球性樹状細胞前駆体を含む細胞集団を単離する工程；
ｉｉ）ヒト単球性樹状細胞前駆体に関して富化された該細胞集団を、有効量の樹状細胞分化薬剤を補充した組織培養培地とともに、該ヒト単球性樹状細胞前駆体を未成熟ヒト樹状細胞へと分化させるために十分な期間にわたって培養する工程；
ｉｉｉ）未成熟ヒト樹状細胞に関して富化された該細胞集団を、有効量の樹状細胞成熟化薬剤とともに培養する工程であって、該未成熟ヒト樹状細胞を活性化する工程；ならびに
ｉｖ）該活性化されたヒト樹状細胞を単離および洗浄する工程、
によって調製される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単球性樹状細胞前駆体は、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、臍帯血、または末梢血から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単球性樹状細胞前駆体細胞は、活性化されていない単球性樹状細胞前駆体である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記単球性樹状細胞前駆体は、処置される個々の被験体から得られる、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単球性樹状細胞前駆体は、前記処置される個々の被験体にＨＬＡマッチした健康な個々の被験体から得られる、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記樹状細胞分化薬剤は、いかなる他のサイトカインもなしのＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１３もしくはＩＬ−１５との組み合わせでのＧＭ−ＣＳＦである、請求項９および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹状細胞成熟化薬剤は、不活性化カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、イミダゾキノリン化合物、合成２本鎖ポリリボヌクレオチド、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のアゴニスト、樹状細胞の成熟化を誘導することが公知の非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸の配列、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項９および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記不活性化ＢＣＧは、全ＢＣＧ、ＢＣＧの細胞壁構成要素、ＢＣＧ由来リポアラビノマンナン、またはＢＣＧ成分を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記不活性化ＢＣＧは、熱不活性化ＢＣＧ、ホルマリン処理ＢＣＧ、または熱不活性化かつホルマリン処理ＢＣＧである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記有効量のＢＣＧは、約１０５〜１０７ｃｆｕ／ミリリットル  組織培養培地であり、前記有効量のＩＦＮγは、約１００〜約１，０００ユニット／ミリリットル  組織培養培地である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記イミダゾキノリン化合物は、イミダゾキノリン−４−アミン化合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記イミダゾキノリン−４−アミン化合物は、４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾール［４，５−ｃ］キノリン−ｌ−５  エタノールまたは１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、またはこれらの誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記合成２本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリ［Ｉ］：ポリ［Ｃ（１２）Ｕ］である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年９月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／２１９，０５８号に基づく優先権を主張しており、その全体はすべての目的のために本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
切除不能の局所的に進行した、または転移性の固形腫瘍を有する患者は予後不良であり、治療選択肢は、特に、標準治療に失敗した後には、ほとんどない。Ａｍａｔｏ，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２７：１７７−１８６，  ２０００；  Ｂｒａｍｗｅｌｌら，  Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ．  Ｒｅｖ．  ３：Ｃｄ００３２９３，  ２００３；  Ｋｌｅｌｇｅｒら，  Ａｎｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２５：１２６０−１２７０，  ２０１４）。近年、がん免疫療法（ｉｍｍｕｎｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）におけるいくつかの有望な進歩があった（Ｉｔｏら，  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｉｎｔ．  ２０１５：６０５４７８，  ２０１５；  Ｗｅｓｔ，  ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌ．  １：１１５，  ２０１５）；しかし、がんに対する有効な免疫応答を高めるために、免疫系は、がん細胞を攻撃するためにまず感作されなければならない（Ｍｅｌｅｒｏら，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  １５：４５７−４７２，  ２０１５）。具体的には、腫瘍特異的抗原が、抗原提示細胞によってナイーブＴ細胞に提示されなければならない。このことは、翻って、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へのＴ細胞分化を誘導する（Ｉｔｏら，  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｉｎｔ．  ２０１５：６０５４７８，  ２０１５；  ＭａｃＫｅｏｎら，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：２４３，  ２０１５）。
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原性化合物の取り込みおよびその後の免疫系への提示を通じて、適応免疫応答を開始することに熟達している。ＤＣは、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方を刺激し、共刺激分子（例えば、サイトカイン）を生成して、ＣＴＬ拡大を駆動する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２，  １９９８）。ＤＣが広い免疫応答を誘導する能力を考慮して、ＤＣベースの免疫療法研究は近年急激に増大した。ＤＣベースのがんワクチンの臨床試験が、種々の程度の有望さを示し、いくつかの製品は、現在、後期臨床試験の段階にある（Ａｎｇｕｉｌｌｅら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６７：７３１−７５３，  ２０１５）。血液中で見出される種々のＤＣが、それらの効率的な抗原クロスプレゼンテーションおよび排出リンパ節へと効果的に移動するそれらの能力に関して公知である。しかし、ＤＣは、末梢血単核細胞のうちの１％未満を構成する。このことは、腫瘍特異的免疫を開始および維持するための組成物を生成するには、細胞材料が不十分であることを意味する（ＭａｃＫｅｏｎ，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：２４３，  ２０１５；  Ａｎｇｕｉｌｌｅら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６７：７３１−７５３，  ２０１５）。結果として、例えば、白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって処置されるべき被験体のために集められた単球に由来するＤＣがエキソビボで生成された；しかし、他のＤＣタイプを使用するストラテジーが、現在研究されつつある。ＤＣを生成した後、その細胞は一般に、抗原でパルスされ、その患者へと感染し戻される。抗原の選択および供給源（例えば、精製腫瘍特異的または腫瘍関連抗原）。
【０００４】
前臨床研究において、活性化されたＤＣ（ａＤＣ；ＤＣＶａｘ（登録商標）−Ｄｉｒｅｃｔ）は、腫瘍内注射の際に、マウスから腫瘍を除去するにあたって、未成熟ＤＣよりすぐれていることが示された。
【０００５】
樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を活性化し得ると考えられる、免疫系の専門抗原提示細胞である。樹状細胞は、免疫療法、特に、がんの免疫療法において使用するために、ますますエキソビボで調製されている。最適な免疫刺激特性を有する樹状細胞の調製は、これら細胞のエキソビボ培養に関する生物学の理解および活用を必要とする。これら細胞を培養するための種々のプロトコルは、各プロトコルに帰する種々の利点とともに、記載されてきた。
【０００６】
樹状細胞の活性化は、未成熟ＤＣ（これは、皮膚ランゲルハンス細胞に表現型が類似している）を、リンパ節へと移動し得る成熟した抗原提示細胞へと転換するプロセスを開始する。このプロセスは、未成熟樹状細胞を特徴付ける強力な抗原取り込み能の漸進的かつ連続的な喪失を、ならびに共刺激細胞表面分子および種々のサイトカインの発現のアップレギュレーションを生じる。種々の刺激が、ＤＣの成熟化を開始し得る。このプロセスは複雑であり、少なくとも、樹状細胞、特に、単球性樹状細胞のインビトロでの完全成熟化は、使用される樹状細胞成熟化薬剤に依存して、完了するまでに４８時間までかかり得る。成熟化の１つの他の転帰は、細胞のインビボ移動特性の変化である。例えば、未成熟樹状細胞成熟化の誘導は、いくつかのケモカインレセプター（ＣＣＲ７が挙げられ、これは、成熟ＤＣがクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子の状況において、ＤＣ表面に提示された抗原に対してＴ細胞を活性化する場所である排出リンパ節のＴ細胞領域へと細胞を指向する）を誘導する。用語「活性化」および「成熟化」および「活性化された」および「成熟（した）」とは、未成熟ＤＣ（抗原を取り込む能力によって部分的に特徴付けられる）から成熟ＤＣ（新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）Ｔ細胞応答を有効に刺激し得る能力によって部分的に特徴付けられる）への移行を誘導しかつ完了させるプロセスを説明する。この用語は、代表的には、当該分野で交換可能に使用される。
【０００７】
公知の成熟化プロトコルは、抗原への曝露の間または後にＤＣが遭遇すると考えられるインビボ環境に基づく。このアプローチの初期の例は、細胞培養培地としての単球馴化培地（ＭＣＭ）の使用である。ＭＣＭは、単球を培養することによってインビトロで生成され、成熟化因子の供給源として使用される（例えば、ＵＳ  ２００２／０１６０４３０（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。成熟化を担うＭＣＭ中の主要成分は、炎症（促進）性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−ｌβ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であると報告されている。他の樹状細胞成熟化薬剤としては、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２））の混合物中の例えば、Ｔｏｌｌ様レセプターアゴニストが挙げられる。
【０００８】
ＤＣの成熟化は、従って、多くのシグナル伝達経路を介して作用する多数の異なる因子によって引き金を引かれ得るかまたは開始され得る。結果として、単一の成熟化経路または転帰というものは存在しないが、成熟ＤＣステージの領域（ｕｎｉｖｅｒｓｅ）というものは実際に存在し、各々、それら自体の別個の機能的特徴がある。概念として、これは意味のあることである。なぜなら免疫系が応答しなければならない身体への種々の脅威は、異なる攻撃ストラテジーを要求して、多種多様であるからである。例として、細菌感染は、特定の抗体が補充された活性化マクロファージによって最もよく一掃される一方で、ウイルス感染は、ウイルス感染細胞を有効に死滅させる細胞傷害性Ｔ細胞を介して最もよく攻撃される。がん細胞の死滅は、代表的には、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および抗体の組み合わせを要する。
【０００９】
ＤＣのインビトロ成熟化は、従って、免疫応答の１タイプを別のタイプより好都合である免疫系を誘導するように、すなわち、免疫応答を極性化するように設計され得る。ＤＣの指向的成熟化（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）は、成熟化プロセスの転帰が、成熟したＤＣでの処置から生じる結果として起こる免疫応答を確実にするタイプを必然的に決定するという概念を説明する。その最も単純な形態では、指向的成熟化は、Ｔｈ１タイプまたはＴｈ２タイプの免疫応答のいずれかに極性化されたＴ細胞応答を指向するサイトカインを生成するＤＣ集団を生じる。インターフェロンγ、インターフェロンα、およびポリイノシン：ポリシチジン酸を使用して、ＩＬ−１２を分泌する成熟タイプ１極性化ＤＣを生成するために、樹状細胞成熟化薬剤を補充した。成熟ＤＣは、ナチュラルキラー細胞を誘起するＴ−ヘルパー細胞１（ＴＨ１）タイププロフィールおよびＣＴＬ活性化を増大させる（ｃｒｅａｓｅ）（Ｍａｉｌｌａｒｄら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：５９３４−５９３７，  ２００４；  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｂｌｏｏｄ  ８４：４００８−４０２７，  １９９４）。ＣＴＬ活性化は、炎症促進状態の引き金を引き、これらの細胞が腫瘍細胞を直接的に死滅させるように刺激する（Ｃｏｕｌｉｅら，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  １４：１３５−１４６，  ２０１４）。
【００１０】
ＤＣは、９種までの異なるＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ９）を発現し、それらの各々は、成熟化の引き金を引くために使用され得る。驚くべきことではないものの、細菌生成物とＴＬＲ２およびＴＬＲ４との相互作用は、ＤＣの指向的成熟化を生じ、細菌感染を扱うのに最も適した極性化した応答を生じる。結論として、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９を介して引き金を引かれた成熟化は、抗ウイルスタイプ応答をより生じるようである。さらなる例として、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を大部分の成熟化プロトコルに付加すると、成熟ＤＣによるインターロイキン１２の生成が生じ、これは、Ｔｈ１タイプ免疫応答を必然的に決定する。逆に、プロスタグランジンＥ２を含めると、反対の効果がある。
【００１１】
完全に成熟した樹状細胞は、未成熟ＤＣとは定性的にかつ定量的に異なる。一旦完全に成熟した後は、ＤＣは、より高レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原、ならびにより高レベルのＴ細胞共刺激分子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）を発現する。これらの変化は、樹状細胞がＴ細胞を活性化する能力を増大させる。なぜならそれら樹状細胞は、細胞表面上の抗原密度を、ならびにＴ細胞上の共刺激分子（例えば、ＣＤ２８など）の対応物を介して、Ｔ細胞活性化シグナルの大きさを増大させるからである。さらに、成熟ＤＣは、多量のサイトカインを生成し、これは、Ｔ細胞応答を刺激しかつ極性化する。これらサイトカインとしては、Ｔｈ１タイプ免疫応答と関連するインターロイキン１２、ならびにＴｈ２タイプ免疫応答と関連するインターロイキン−１０およびインターロイキン−４が挙げられる。
【００１２】
一般に、エキソビボでＤＣを生成するための方法は、被験体に由来するＤＣ前駆体細胞に関して富化された細胞集団を得る工程、およびその後、そのＤＣ前駆体細胞を、その被験体に導入して戻す前に、インビトロで完全に成熟したＤＣへと分化させる工程を包含する。代表的には、このプロセスの間に、成熟しつつあるＤＣは、ＤＣが成熟していくときに、取り込みおよびプロセシングのために抗原と接触する。ＤＣは、最終的に分化されなければならないか、またはそれらが脱分化して単球／マクロファージへと戻り、それらの免疫強化能力のうちの大部分を失うと考える者もいる。単球から生成されるＤＣのエキソビボでの成熟化は、当該分野で周知の方法および薬剤で成功裡に達成されてきた。
【００１３】
樹状細胞（ＤＣ）は、がんの積極的な免疫療法に関する選りすぐりのビヒクルとして認識されている。動物実験によって、マウスを腫瘍形成から防御することおよび確立された腫瘍を排除することの両方においてＤＣベースの免疫療法の潜在的可能性が示された。これらの成功は、小規模臨床試験においてヒトで少なくとも部分的に再現された。小規模な安全性または概念実証治験から、活性または効力が示され得るより大規模な治験への移行は、上記に記載されるとおりのＤＣ調製の骨の折れるかつ扱いにくい性質によって妨げられてきた。結論として、このような製品の大きな潜在的治療価値にも拘わらず、僅かな会社しか、ＤＣベースのがんワクチンの開発に興味を示してこなかった。
【００１４】
成熟化に加えて、その投与法は、転帰に顕著な影響を有する。投与経路は、ＤＣがＴ細胞分化を誘導し得るように、リンパ節に到達することを可能にしなければならない。いくつかの方法（静脈内注射、皮内注射、およびリンパ節内注射（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を含む）は、以前から研究されてきた（Ａｎｇｕｉｌｌｅら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６７：７３１−７５３，  ２０１５）。ＤＣの腫瘍内（ＩＴ）注射は、ＤＣベースの免疫療法の特別な形態である。注射の際に、ナイーブＤＣは、例えば、アポトーシス細胞もしくは死滅しつつある（壊死）腫瘍細胞および腫瘍環境からインビボで抗原を取り込み、プロセシングし、そしてリンパ節への移動後にその抗原をＴ細胞に提示する。実際に、動物モデルにおけるこのような処置の効力は、腫瘍におけるアポトーシスの程度と相関することが見出された（Ｃａｎｄｉｄｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：２２８−２３６，  ２００１）。これは、このアプローチが、ＤＣの注射の前に化学療法剤または放射線での腫瘍の処置と完全に適合性であることを示唆する。さらに、いくつかのグループが、このような併用療法が確立された腫瘍に対して特に有効であることを示した（Ｎｉｋｉｔｉｎａら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９４：８２５−８３３，  ２００１；  Ｔａｎａｋａら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １０１：２６５−２６９，  ２００２；  Ｔｏｎｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：７５３０−７５３５，  ２００１）。
【００１５】
インビボでの腫瘍細胞は、抗原の供給源であるので、腫瘍内注射は、腫瘍抗原の選択および製造の両方の必要性なしで済ませられる。なぜならＩＴ注射は、大部分のインビトロでのＤＣベースの治療アプローチにおいて現在使用されているからである。腫瘍抗原の選択は、しばしば、会社が独占的な位置をもつ必要性によって活発になり、今日までに同定された数個の腫瘍抗原がなお、顕著な臨床上の利益を提供することを立証されなければならない。さらに、このような腫瘍抗原の使用はしばしば、一価の免疫原性組成物またはワクチンを生じ、これは、腫瘍細胞が免疫において使用される抗原の発現をダウンレギュレートする場合にその有効性を失い得る。さらに、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ＧＭＰ）の下で必要とされる条件下で腫瘍抗原を製造する必要性が、古典的なＤＣベースの免疫法にさらなるコストを加算する。
【００１６】
ＤＣのＩＴ注射は、樹状細胞を免疫抑制性の腫瘍環境に置き得る。腫瘍は、ＤＣを不活性化するかまたはＴ細胞応答をあまり有効でないＴｈ２タイプ免疫応答に向かって曲げていく能力を有するサイトカインを生成することが公知である。いくつかのグループは、ＤＣの遺伝的改変を使用して、これらの抑制効果を、特にサイトカインであるインターロイキン１２の生成（ＩＬ−１２；  Ｎｉｓｈｉｏｋａら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：４０３５−４０４１，  １９９９；  Ｍｅｌｅｒｏら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：  １７７９−１７８４，  １９９９）またはＣＤ４０リガンドの発現（Ｋｉｋｕｃｈｉら，  Ｂｌｏｏｄ  ９６：９１−９９，２０００）を通じて克服しようと試みた。これらのグループによって説明された有望な結果は、治療アプローチとしてのＤＣのＩＴ注射の実現性をさらに示す。
【００１７】
Ｔｒｉｏｚｚｉら（Ｃａｎｃｅｒ  ８９：２６４７−２６５４，  ２０００）は、転移性黒色腫または乳がんを有する患者におけるＤＣのＩＴ注射を記載する。彼らは、黒色腫を有する４名の患者および乳がんを有する２名の患者において腫瘍退縮を得た。退縮しつつある病変の生検は、浸潤しているＴ細胞を示した。これは、ＤＣが腫瘍細胞に対する免疫応答を実際に活性化したことを示唆する。全体としてこれらのデータは、ＤＣのＩＴ注射がヒトにおいて実現可能であり、顕著な臨床上の利益を提供し得ることを示した。しかし、注射されるＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ抗原のおよびＢ７−２（ＣＤ８６）共刺激分子の顕著なダウンレギュレーションが、観察された。これら重要な分子のダウンレギュレーションは、ＤＣの免疫刺激可能性を低減すると予測される。
【００１８】
このダウンレギュレーションを克服するための１つの方法は、ＷＯ２００４／０５３０７２（本明細書に参考として援用される）において開示されている。そこでは、ダウンレギュレーションが、投与する前にＤＣの部分的成熟化を通じ介して回避され得ることが見出された。この方法では、樹状細胞前駆体（赤血球溶解後の骨髄細胞または単球性樹状細胞前駆体）を、先ずインビトロで誘導して未成熟樹状細胞へと分化させ、その後、その未成熟樹状細胞を誘導して、その細胞を、樹状細胞成熟化薬剤（例えば、ＢＣＧおよびＩＦＮγ）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、イミダゾキノリン化合物、合成２本鎖ポリリボヌクレオチド、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のアゴニスト、ＤＣの成熟化を誘導することが公知の非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸の配列、サイトカインの組み合わせ（例えば、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）と組み合わせられる、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα））、またはこれらの任意の組み合わせとともに培養することによって、成熟化を開始した。その未成熟樹状細胞を、未成熟樹状細胞が完全に成熟することが以前に決定されたものより短い期間にわたって成熟化を継続することを可能にした。樹状細胞をインビトロで完全に成熟させた場合には、その細胞は、患者への投与後に、抗原を取り込みかつプロセシングすることは不可能であった。本明細書で開示される方法は、本明細書で示されるとおりのＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの有意なレベルが、部分的に成熟した樹状細胞の単離および免疫刺激の必要性のある患者または個体への投与のための製剤化の前に生成されるように、樹状細胞を活性化に十分な期間にわたって成熟させることを可能にされるはずであることを示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１６０４３０号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４／０５３０７２号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ａｍａｔｏ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：１７７−１８６，２０００
【非特許文献２】Ｂｒａｍｗｅｌｌら、Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．３：Ｃｄ００３２９３，２００３
【非特許文献３】Ｋｌｅｌｇｅｒら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１２６０−１２７０，２０１４
【非特許文献４】Ｉｔｏら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１５：６０５４７８，２０１５
【非特許文献５】Ｗｅｓｔ，ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌ．１：１１５，２０１５
【非特許文献６】Ｍｅｌｅｒｏら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １５：４５７−４７２，２０１５
【非特許文献７】Ｉｔｏら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１５：６０５４７８，２０１５
【非特許文献８】ＭａｃＫｅｏｎら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４３，２０１５）．
【非特許文献９】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２，１９９８
【非特許文献１０】Ａｎｇｕｉｌｌｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６７：７３１−７５３，２０１５
【非特許文献１１】ＭａｃＫｅｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４３，２０１５
【非特許文献１２】Ａｎｇｕｉｌｌｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６７：７３１−７５３，２０１５
【非特許文献１３】Ｍａｉｌｌａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：５９３４−５９３７，２００４
【非特許文献１４】Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｂｌｏｏｄ  ８４：４００８−４０２７，１９９４
【非特許文献１５】Ｃｏｕｌｉｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １４：１３５−１４６，２０１４
【非特許文献１６】Ａｎｇｕｉｌｌｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６７：７３１−７５３，２０１５
【非特許文献１７】Ｃａｎｄｉｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２２８−２３６，２００１
【非特許文献１８】Ｎｉｋｉｔｉｎａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４：８２５−８３３，２００１
【非特許文献１９】Ｔａｎａｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０１：２６５−２６９，２００２
【非特許文献２０】Ｔｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７５３０−７５３５，２００１
【非特許文献２１】Ｎｉｓｈｉｏｋａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４０３５−４０４１，１９９９
【非特許文献２２】Ｍｅｌｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１７７９−１７８４，１９９９
【非特許文献２３】Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９６：９１−９９，２０００
【非特許文献２４】Ｔｒｉｏｚｚｉら、Ｃａｎｃｅｒ  ８９：２６４７−２６５４，２０００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
予測外なことに、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのある特定の量、または閾値量を生成する活性化された樹状細胞は、増大された生存時間および／またはがん再発までの増大した時間のような特徴によって測定される、改善された臨床転帰と相関する免疫療法有効性のレベルを有することが、決定された。よって、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの閾値量を上回って生成する活性化された樹状細胞は、被験体への投与において使用するための改善された組成物を提供し、その組成物は、プラス方向の臨床転帰を生じる増大した能力を示す。
【００２２】
要旨
この要旨は、以下の詳細な説明においてさらに記載される単純化された形態で概念の選択を導入するために提供される。この要旨は、特許請求された主題の鍵となる特徴を同定することが意図されるのでもなければ、特許請求された主題の範囲を決定する一助として使用されることが意図されるのでもない。
【００２３】
図面の説明
前述の局面および本発明の付随する利点のうちの多くは、添付の図面とともに理解される場合に、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるように、より容易に理解されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、活性化ＤＣ処置後のＴ細胞浸潤を示す。免疫化学染色は、ＣＤ３＋活性化Ｔ細胞を含む腫瘍浸潤リンパ球を示す。免疫組織化学染色は、ＣＤ３＋活性化Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、およびＣＤ８＋キラー細胞を含む腫瘍浸潤リンパ球が、２７名の生検実施患者のうちの１５名においてベースラインから増大したことを示す。代表画像は、６００万個の活性化されたＤＣ／注射で処置した明瞭な細胞肉腫の腫瘍（ａ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ  ｔｕｍｏｒ）のものである。生検時には２回の注射を投与していた。倍率は、２０×であり、スケールバーは、２００μｍを表す。図１Ｂおよび図１Ｃは、活性化Ｔ細胞によるサイトカイン生成を示す。組織切片を、以下に関してプローブした：図１Ｂ  ＩＦＮγ、そして図１Ｃは、ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用するＴＮＦα発現（濃い点）および免疫組織化学を使用するＣＤ３発現（より薄い点）の共染色を示す。黒矢印は、それらそれぞれのサイトカインを発現するＣＤ３＋活性化Ｔ細胞を表す。白矢印は、ＣＤ３−サイトカイン生成細胞（おそらくマクロファージ）を表す。代表画像は、６００万個の活性化されたＤＣ／注射で処置した明瞭な細胞肉腫の腫瘍のものである。生検時には２回の注射を投与していた。倍率は、２０×であり、スケールバーは、１００μｍを表す。
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２Ｆは、活性化されたＤＣの特徴付けを示す。図２Ａは、ＩＬ−８生成（ｎｇ／１０６  ＤＣ／日）と全生存との間の相関を示す。ＩＬ−８生成および生存のカプラン−マイヤー曲線。破線は、＜９８５ｎｇ／１０６  ＤＣ／日（メジアンＩＬ−８濃度）を生成するａＤＣを注射した患者における生存を示す；実線は、≧９８５ｎｇ／１０６  ＤＣ／日を生成する細胞を注射したものを示す。図２Ｂは、ＩＬ−１２ｐ４０生成（ｎｇ／１０６  ＤＣ／日）と全生存との間の相関を示す。ＩＬ−１２ｐ４０生成および生存のカプラン−マイヤー曲線。破線は、＜３３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日（メジアンＩＬ−１２ｐ４０濃度）を生成する活性化されたＤＣを注射した患者における生存を示す；実線は、≧３３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日を生成する細胞を注射したものを表す。図２Ｃは、８週目での安定な疾患（ＳＤ）および生存を有する患者数を示す。８週目でＳＤを有する患者のカプラン−マイヤー曲線を、８週目で進行性疾患（ＰＤ）を有する患者のものと比較した。破線は、８週目でＰＤを有する患者における生存を示す；実線は、８週目でＳＤを有する患者のものを表す。全生存は、２群間で有意差があった（ｐ＝０．０４）。図２Ｄは、活性化されたＤＣによるＴＮＦα生成および８週目での疾患状態を示す。８週目でＳＤを有する患者数は、黒棒で示され、ＰＤを有する患者数は、白棒で示される。ＴＮＦαレベルが＞１３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日である患者の中で、８週目でＰＤを有する患者は存在しなかった。多変量解析において、ＴＮＦα生成は、生存と相関する（ｐ＝０．０１６）。図２Ａ〜図２Ｄに関して、ｎ＝３９。患者生存と細胞表面マーカーの発現レベルとの関連性。図２Ｅは、ＭＨＣ−ＩＩに関する染色を測定し、図２Ｆは、ＣＤ８６に関する染色を示す（両方の図においてｎ＝２５）。図２Ｅの実線は、ＭＨＣ−ＩＩに関して染色した場合に、＞１２，０００平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を伴う患者を示す；破線は、６，２００〜１２，０００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を示す；そして点線は、＜６，２００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を表す。図２Ｆの実線は、ＣＤ８６に関して染色した場合に、＞３，４００平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を伴う患者を示す；破線は、２，０００〜３，４００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を示す；そして点線は、＜２，０００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を表す。ログランク分析を、図２Ａ〜図２Ｃおよび図２Ｅ〜図２Ｆに関して使用した。χ２乗分析を、図２Ｄに関して使用した。
【図２ＣＤ】図２Ａ〜２Ｆは、活性化されたＤＣの特徴付けを示す。図２Ａは、ＩＬ−８生成（ｎｇ／１０６  ＤＣ／日）と全生存との間の相関を示す。ＩＬ−８生成および生存のカプラン−マイヤー曲線。破線は、＜９８５ｎｇ／１０６  ＤＣ／日（メジアンＩＬ−８濃度）を生成するａＤＣを注射した患者における生存を示す；実線は、≧９８５ｎｇ／１０６  ＤＣ／日を生成する細胞を注射したものを示す。図２Ｂは、ＩＬ−１２ｐ４０生成（ｎｇ／１０６  ＤＣ／日）と全生存との間の相関を示す。ＩＬ−１２ｐ４０生成および生存のカプラン−マイヤー曲線。破線は、＜３３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日（メジアンＩＬ−１２ｐ４０濃度）を生成する活性化されたＤＣを注射した患者における生存を示す；実線は、≧３３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日を生成する細胞を注射したものを表す。図２Ｃは、８週目での安定な疾患（ＳＤ）および生存を有する患者数を示す。８週目でＳＤを有する患者のカプラン−マイヤー曲線を、８週目で進行性疾患（ＰＤ）を有する患者のものと比較した。破線は、８週目でＰＤを有する患者における生存を示す；実線は、８週目でＳＤを有する患者のものを表す。全生存は、２群間で有意差があった（ｐ＝０．０４）。図２Ｄは、活性化されたＤＣによるＴＮＦα生成および８週目での疾患状態を示す。８週目でＳＤを有する患者数は、黒棒で示され、ＰＤを有する患者数は、白棒で示される。ＴＮＦαレベルが＞１３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日である患者の中で、８週目でＰＤを有する患者は存在しなかった。多変量解析において、ＴＮＦα生成は、生存と相関する（ｐ＝０．０１６）。図２Ａ〜図２Ｄに関して、ｎ＝３９。患者生存と細胞表面マーカーの発現レベルとの関連性。図２Ｅは、ＭＨＣ−ＩＩに関する染色を測定し、図２Ｆは、ＣＤ８６に関する染色を示す（両方の図においてｎ＝２５）。図２Ｅの実線は、ＭＨＣ−ＩＩに関して染色した場合に、＞１２，０００平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を伴う患者を示す；破線は、６，２００〜１２，０００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を示す；そして点線は、＜６，２００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を表す。図２Ｆの実線は、ＣＤ８６に関して染色した場合に、＞３，４００平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を伴う患者を示す；破線は、２，０００〜３，４００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を示す；そして点線は、＜２，０００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を表す。ログランク分析を、図２Ａ〜図２Ｃおよび図２Ｅ〜図２Ｆに関して使用した。χ２乗分析を、図２Ｄに関して使用した。
【図２ＥＦ】図２Ａ〜２Ｆは、活性化されたＤＣの特徴付けを示す。図２Ａは、ＩＬ−８生成（ｎｇ／１０６  ＤＣ／日）と全生存との間の相関を示す。ＩＬ−８生成および生存のカプラン−マイヤー曲線。破線は、＜９８５ｎｇ／１０６  ＤＣ／日（メジアンＩＬ−８濃度）を生成するａＤＣを注射した患者における生存を示す；実線は、≧９８５ｎｇ／１０６  ＤＣ／日を生成する細胞を注射したものを示す。図２Ｂは、ＩＬ−１２ｐ４０生成（ｎｇ／１０６  ＤＣ／日）と全生存との間の相関を示す。ＩＬ−１２ｐ４０生成および生存のカプラン−マイヤー曲線。破線は、＜３３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日（メジアンＩＬ−１２ｐ４０濃度）を生成する活性化されたＤＣを注射した患者における生存を示す；実線は、≧３３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日を生成する細胞を注射したものを表す。図２Ｃは、８週目での安定な疾患（ＳＤ）および生存を有する患者数を示す。８週目でＳＤを有する患者のカプラン−マイヤー曲線を、８週目で進行性疾患（ＰＤ）を有する患者のものと比較した。破線は、８週目でＰＤを有する患者における生存を示す；実線は、８週目でＳＤを有する患者のものを表す。全生存は、２群間で有意差があった（ｐ＝０．０４）。図２Ｄは、活性化されたＤＣによるＴＮＦα生成および８週目での疾患状態を示す。８週目でＳＤを有する患者数は、黒棒で示され、ＰＤを有する患者数は、白棒で示される。ＴＮＦαレベルが＞１３０ｎｇ／１０６  ＤＣ／日である患者の中で、８週目でＰＤを有する患者は存在しなかった。多変量解析において、ＴＮＦα生成は、生存と相関する（ｐ＝０．０１６）。図２Ａ〜図２Ｄに関して、ｎ＝３９。患者生存と細胞表面マーカーの発現レベルとの関連性。図２Ｅは、ＭＨＣ−ＩＩに関する染色を測定し、図２Ｆは、ＣＤ８６に関する染色を示す（両方の図においてｎ＝２５）。図２Ｅの実線は、ＭＨＣ−ＩＩに関して染色した場合に、＞１２，０００平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を伴う患者を示す；破線は、６，２００〜１２，０００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を示す；そして点線は、＜６，２００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を表す。図２Ｆの実線は、ＣＤ８６に関して染色した場合に、＞３，４００平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有する細胞を伴う患者を示す；破線は、２，０００〜３，４００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を示す；そして点線は、＜２，０００  ＭＦＩを有する細胞を伴う患者を表す。ログランク分析を、図２Ａ〜図２Ｃおよび図２Ｅ〜図２Ｆに関して使用した。χ２乗分析を、図２Ｄに関して使用した。
【図３】図３は、活性化された樹状細胞の表現型を示す。種々の樹状細胞活性化マーカーの代表的なフローサイトメトリーヒストグラムが示される。濃い灰色のヒストグラムは、白血球アフェレーシスの間に採取された単球集団のものである。薄い灰色のヒストグラムは、活性化されたＤＣのものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本開示は、活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）活性化された樹状細胞を調製する工程；（ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；（ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの上記決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに（ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること；あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定する工程を包含する。
【００２６】
活性化されたＤＣ集団の免疫療法有効性を増大するための方法もまた提供され、上記方法は、（ｉ）活性化された樹状細胞集団を調製する工程；（ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；（ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの上記決定された量と閾値量とを比較する工程；（ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの任意の１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てのいずれかが閾値を下回るか否かを決定する工程；ならびに（ｖ）上記活性化されたＤＣによるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの任意の１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての生成を誘導して、増大した免疫療法有効性を有する活性化されたＤＣ集団を形成するように、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの量を、閾値量を上回るようにし得る薬剤の十分な量を添加する工程を包含する。
【００２７】
さらに、本開示は、活性化された樹状細胞の投与に応答する患者を、上記患者に由来する活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定することによって選択するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）活性化された樹状細胞を調製する工程；（ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；（ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの上記決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに（ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること、あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定し、そして上記閾値を上回るそれら患者を応答する患者として選択する工程を包含する。
【００２８】
さらになお、本開示は、活性化された樹状細胞の投与に応答しない患者を、上記患者に由来する活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定することによって選択するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）活性化された樹状細胞を調製する工程；（ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；（ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの上記決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに（ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること、あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定し、そして上記閾値を下回るそれら患者を、応答しない患者として選択する工程を包含する。
【００２９】
本開示は、増大した免疫療法有効性を有する活性化された樹状細胞を生成するための樹状細胞成熟化薬剤を選択するための方法をさらに提供し、上記方法は、（ｉ）未成熟樹状細胞と試験樹状細胞成熟化薬剤とを接触させることによって、活性化された樹状細胞を調製する工程；（ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を決定する工程；（ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの上記決定された量と閾値量とを比較する工程；ならびに（ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること、あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定し、そして閾値を上回る活性化された樹状細胞の生成を誘導する上記樹状細胞成熟化薬剤を選択する工程を包含する。上記樹状細胞成熟化薬剤が一旦決定されると、それは、本明細書で記載されるとおりの部分的に成熟しかつ活性化された樹状細胞の生成を誘導するために使用され得る。
【００３０】
上記の方法のうちのいずれか１つの代表的実施形態において、上記活性化された樹状細胞は、約５０〜約２００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６；約５００〜約２０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約３０〜約７０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＴＮＦα；少なくとも約７５〜約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０サブユニット；および約１〜３ｎｇ／１００万個細胞／２４時間の生物学的に活性なＩＬ−１２  ｐ７０の閾値量を生成する。上記活性化された樹状細胞はまた、約７５〜約１５０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６；７５０〜約１５００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０；少なくとも約１〜３ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ７０；および少なくとも約３０〜７０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＴＮＦα、または約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６、および１０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８、少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０；少なくとも約２ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ７０；および少なくとも約３０ｎｇのＴＮＦαを生成し得る。
【００３１】
上記実施形態のうちのいずれか１つにおいて使用される活性化された樹状細胞は、以下の工程によって調製され得る：（ｉ）末梢血からヒトＰＢＭＣを含む細胞集団を単離する工程；（ｉｉ）ヒトＰＢＭＣを含む上記細胞集団を、ヒト単球性樹状細胞前駆体に関して富化する工程；（ｉｉｉ）ヒト単球性樹状細胞前駆体に関して富化された上記細胞集団を、有効量の樹状細胞分化薬剤を補充した組織培養培地とともに、上記ヒト単球性樹状細胞前駆体を未成熟ヒト樹状細胞へと分化させるために十分な期間にわたって培養する工程；（ｉｖ）未成熟ヒト樹状細胞に関して富化された上記細胞集団を、有効量の樹状細胞成熟化薬剤とともに培養する工程であって、上記未成熟ヒト樹状細胞を活性化する工程；ならびに（ｖ）上記活性化されたヒト樹状細胞を単離および洗浄する工程。
【００３２】
別の実施形態において、上記活性化された樹状細胞は、以下の工程によって調製される：（ｉ）ヒト単球性樹状細胞前駆体を含む細胞集団を単離する工程；（ｉｉ）ヒト単球性樹状細胞前駆体に関して富化された上記細胞集団を、有効量の樹状細胞分化薬剤を補充した組織培養培地とともに、上記ヒト単球性樹状細胞前駆体を未成熟ヒト樹状細胞へと分化させるために十分な期間にわたって培養する工程；（ｉｉｉ）未成熟ヒト樹状細胞に関して富化された上記細胞集団を、有効量の樹状細胞成熟化薬剤とともに培養する工程であって、上記未成熟ヒト樹状細胞を活性化する工程；ならびに（ｉｖ）上記活性化されたヒト樹状細胞を単離および洗浄する工程。上記樹状細胞分化薬剤は、いかなる他のサイトカインもなしのＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１３もしくはＩＬ−１５との組み合わせでのＧＭ−ＣＳＦであり得る。
【００３３】
上記単球性樹状細胞前駆体は、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、臍帯血、または末梢血から得られ得る。ある特定の実施形態において、上記単球性樹状細胞前駆体細胞は、活性化されていない単球性樹状細胞前駆体である。さらに、上記単球性樹状細胞前駆体は、処置される個々の被験体から得られ得るか、またはその個体が応答性の単球性樹状細胞前駆体の十分数を有しない場合、上記単球性樹状細胞前駆体は、処置される個々の被験体にＨＬＡマッチした健康な個々の被験体から得られ得る。
【００３４】
部分的に成熟した活性化された樹状細胞を生成するための方法において有用である樹状細胞成熟化薬剤は、不活性化カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、イミダゾキノリン化合物、合成２本鎖ポリリボヌクレオチド、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のアゴニスト、樹状細胞の成熟化を誘導することが公知の非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸の配列、またはこれらの任意の組み合わせとの組み合わせでのＢＣＧであり得る。上記不活性化ＢＣＧは、全ＢＣＧ、ＢＣＧの細胞壁構成要素、ＢＣＧ由来リポアラビノマンナン（ｌｉｐｏａｒａｂｉｄｏｍａｎｎａｎ）、またはＢＣＧ成分を含み得、上記ＢＣＧは、熱不活性化、ホルマリン処理、またはこれらの組み合わせを使用して不活性化されたＢＣＧであり得る。代表的には、ＢＣＧの有効量は、約１０５〜１０７ｃｆｕ／ミリリットル  組織培養培地であり、ＩＦＮγの有効量は、約１００〜約１，０００ユニット／ミリリットル  組織培養培地である。さらに、上記イミダゾキノリン化合物は、イミダゾキノリン−４−アミン化合物であり得、代表的には、４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾール［４，５−ｃ］キノリン−ｌ−５  エタノールまたは１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、またはこれらの誘導体である。代表的には、上記合成２本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリ［Ｉ］：ポリ［Ｃ（１２）Ｕ］である。
【００３５】
実施形態の説明
樹状細胞は、種々のリンパ性組織および非リンパ性組織で見出される抗原提示細胞の多様な集団である（Ｌｉｕ，  Ｃｅｌｌ  １０６：２５９−２６２，２００１；  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：２７１−２９６，１９９１を参照のこと）。樹状細胞としては、脾臓のリンパ性樹状細胞、表皮のランゲルハンス細胞、および血液循環中のベール細胞が挙げられる。まとめると、樹状細胞は、それらの形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、単球、およびナチュラルキラー細胞上で発現されるある特定の他の表面マーカーの非存在に基づく群として分類される。特に、単球由来樹状細胞（単球性樹状細胞ともいわれる）は、通常、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を発現し、ＨＬＡ−ＤＲ＋であるが、ＣＤ１４−である。
【００３６】
対照的に、単球性樹状細胞前駆体（代表的には、単球）は、通常は、ＣＤ１４＋である。単球性樹状細胞前駆体は、それらが存在する場所である任意の組織、特に、リンパ性組織（例えば、脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺）から得られ得る。単球性樹状細胞前駆体はまた、循環系から単離され得る。
【００３７】
末梢血は、単球性樹状細胞前駆体の容易にアクセス可能な供給源である。臍帯血は、単球性樹状細胞前駆体の他の供給源である。単球性樹状細胞前駆体は、免疫応答が誘起され得る種々の生物から単離され得る。このような生物としては、動物（例えば、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、霊長類、哺乳動物（イヌ、ネコ、マウス、およびラットが挙げられる））、鳥類（ニワトリが挙げられる）、ならびにこれらのトランスジェニックの種が挙げられる）が挙げられる。
【００３８】
ある特定の実施形態において、単球性樹状細胞前駆体および／または未成熟樹状細胞は、健康な被験体から、または免疫刺激の必要性のある被験体（例えば、がん患者または細胞性の免疫刺激が有益であり得るかもしくは望ましいことであり得る他の被験体（すなわち、細菌感染もしくはウイルス感染、または過形成状態を有する被験体など）のような）から単離され得る。樹状細胞前駆体および／または未成熟樹状細胞はまた、部分的活性化および免疫刺激の必要性のあるＨＬＡマッチした被験体への投与のために、ＨＬＡマッチした健康な個体から単離され得る。被験体から単離された樹状細胞前駆体および／または未成熟樹状細胞が、適切なレベルの免疫刺激効力因子を生成する活性化された樹状細胞組成物を形成しない特定の実施形態において、ＨＬＡマッチした正常ドナーに由来する樹状細胞前駆体または未成熟樹状細胞が、使用され得る。
【００３９】
樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞
樹状細胞前駆体（例えば、活性化されていない樹状細胞前駆体、および種々の供給源（血液および骨髄が挙げられる）に由来する未成熟樹状細胞）に関して富化された細胞集団を単離するための方法は、当該分野で公知である。例えば、樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞は、ヘパリン添加血液を集めることによって、アフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって、バフィーコートの調製、ロゼット形成、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標）、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）（透析不能ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で被覆されたコロイド性シリカ粒子（１５〜３０ｎｍ直径））、スクロースなどを使用）、細胞の差次的溶解、濾過などによって、単離され得る。ある特定の実施形態において、白血球集団は、例えば、被験体から血液を集め、線維素除去して、血小板を除去し、赤血球を溶解することによって、調製され得る。樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞は、必要に応じて、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介する遠心分離、抗体パニングなどによって、単球性樹状細胞前駆体に関して富化され得る。
【００４０】
樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞は必要に応じて、閉鎖無菌系の中で調製され得る。本明細書で使用される場合、用語「閉鎖無菌系」または「閉鎖系」とは、非滅菌の、周囲の、もしくは循環する空気または他の非滅菌条件への曝露が最小限にされるかまたは排除される系をいう。樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞を単離するための閉鎖系は、一般に、オープントップチューブ中での密度勾配遠心分離、細胞のオープンエアー移動、組織培養プレートもしくはシールされていないフラスコ中での細胞の培養などを排除する。代表的実施形態において、閉鎖系は、樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞を最初の収集容器からシール可能な組織培養容器への無菌的移動を、非滅菌空気への曝露なしに可能にする。
【００４１】
樹状細胞前駆体を単離するための別の報告された方法は、商業的に処理されたプラスチック基材（例えば、ビーズもしくは磁性ビーズ）を使用して、接着性の単球および他の「非樹状細胞前駆体」を選択的に除去することである（例えば、米国特許第５，９９４，１２６号および同第５，８５１，７５６号を参照のこと）。接着性の単球および非樹状細胞前駆体は、その非接着性細胞がエキソビボ培養および成熟化のために保持される間に捨てられる。別の方法では、アフェレーシス細胞は、プラスチック培養バッグ（これに、プラスチック（すなわち、ポリスチレンもしくはスチレン）のマイクロキャリアビーズがバッグの表面積を増大させるために添加された）中で培養された。
【００４２】
細胞は、ある特定の細胞がビーズに接着する十分な期間にわたって培養される。その接着していない細胞は、バッグから洗い流した（Ｍａｆｆｅｉ，ら，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０：１４１９−１４２０，  ２０００；  ＷＯ  ０２／４４３３８（本明細書に参考として援用される））。ある特定の他の実施形態において、単球性樹状細胞前駆体は、ＷＯ  ０３／０１０２９２（その開示は、本明細書に参考として援用される）に開示されるように、単球結合基材への接着によって単離される。例えば、白血球の集団（例えば、白血球アフェレーシスによって単離される）は、単球性樹状細胞前駆体接着基材と接触させられ得る。白血球の集団がその基材と接触される場合、その白血球集団中の単球性樹状細胞前駆体は、上記基材に優先的に接着する。他の白血球（他の潜在的樹状細胞前駆体を含む）は、上記基材への低下した結合親和性を示し、それによって、上記単球性樹状細胞前駆体が上記基材の表面上で優先的に富化されることを可能にする。
【００４３】
適切な基材としては、例えば、大きな表面積  対  容積比を有するものが挙げられる。その基材は、例えば、粒状または線維性の基材であり得る。適切な粒状基材としては、例えば、ガラス粒子、プラスチック粒子、ガラス被覆プラスチック粒子、ガラス被覆ポリスチレン粒子、およびタンパク質吸着に適した他のビーズが挙げられる。本発明における使用に適した線維性基材としては、マイクロキャピラリーチューブおよび微絨毛膜などが挙げられる。粒状または線維性の基材は、代表的には、その接着した単球性樹状細胞前駆体の生存性を実質的に低減することなく、その接着した細胞が溶離されることを可能にする。粒状または線維性の基材は、単球性樹状細胞前駆体または樹状細胞の基材からの溶離を促進するために実質的に非多孔性であり得る。「実質的に非多孔性」の基材は、少なくとも、その基材に存在する孔のうちの大部分が、その基材中に細胞が捕捉されるのを最小限にするために、その細胞より小さい基材である。
【００４４】
基材への単球性樹状細胞前駆体の接着は、結合媒体の添加によって必要に応じて増強され得る。適切な結合媒体としては、個々にまたは任意の組み合わせで、例えば、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、もしくはインターロイキン１３（ＩＬ−１３）との組み合わせでのＧＭ−ＣＳＦ）、血漿、血清（例えば、ヒト血清（例えば、自己血清もしくは同種異系血清））、精製タンパク質（例えば、血清アルブミン）、二価カチオン（例えば、カルシウムおよび／またはマグネシウムイオン）ならびに基材への単球性樹状細胞前駆体の特異的接着を補助するかもしくは基材への非単球性樹状細胞前駆体の接着を妨げる他の分子を補充した、例えば、単球性樹状細胞前駆体培養培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、ＸＶＩＶＯ  １５（登録商標）など）が挙げられる。ある特定の実施形態において、血漿もしくは血清は、熱不活性化され得る。熱不活性化血漿は、その白血球に対して自己または異種であり得る。
【００４５】
基材への単球性樹状細胞前駆体の接着の後に、接着していない白血球は、単球性樹状細胞前駆体／基材複合体から分離される。任意の適切な手段は、その接着していない細胞を複合体から分離するために使用され得る。例えば、接着していない白血球および複合体の混合物は、沈殿させられ得、その接着していない白血球および培地は、捨てられるかまたは排出され得る。あるいは、その混合物は遠心分離され得、その接着していない白血球を含む上清は、ペレット化した複合体から捨てられるかまたは排出され得る。
【００４６】
別の方法において、活性化されていない単球性樹状細胞前駆体は、国際特許出願公開番号ＷＯ  ２００４／０００４４４（２００３年６月１９日出願、現在は米国特許第７，６９５，６２７号（ともに本明細書に参考として援用される））に記載されるものなどの接線流濾過デバイスの使用によって調製される白血球が富化された細胞集団から単離され得る。単球性樹状細胞前駆体が富化された細胞集団の単離に有用な接線流濾過デバイスは、クロスフローチャンバ、濾液チャンバおよびその間に配置された濾材を有する除去ユニットを含み得る。その濾材は、一側の保持表面でそのクロスフローチャンバと、および他側の濾液表面でその濾液チャンバと流体連絡した状態にある。そのクロスフローチャンバは、白血球を含む血液構成要素のサンプルを、そのクロスフローチャンバへと、およびその濾材の保持表面に対して平行に導入するように適合された入り口を有する。出口は、その濾材の保持表面の反対側のチャンバの一部において中心に配置されたクロスフローチャンバの中に提供される。接線流濾過デバイスにおける使用に適した濾材は、代表的には、約１〜約１０ミクロンの範囲に及ぶ平均孔サイズを有する。その濾材は、平均孔サイズ約３〜約７ミクロンを有し得る。クロスフローチャンバの入り口への所定のサンプル投入速度を提供するための手段およびその濾材を通って濾液チャンバへの濾液の濾過速度を制御するための手段がまた、含まれ得る。その濾過速度制御手段は、その濾材に関する妨害のない（ｕｎｏｐｐｏｓｅｄ）濾過速度未満へと濾過速度を制限する。血液構成要素を含むサンプルは、供給源デバイス（例えば、白血球アフェレーシスデバイスまたは白血球アフェレーシスデバイスから収集したサンプルを含む容器）によって提供され得る。
【００４７】
単球性樹状細胞前駆体およびこの前駆体に関して富化された細胞集団は、分化、ならびに部分的成熟化および／または拡大のためにエキソビボでまたはインビトロで培養され得る。本明細書で使用される場合、単離された未成熟樹状細胞、樹状細胞前駆体、および他の細胞とは、人の手によって、それらの天然の環境から離れて存在する、および従って、天然生成物ではない細胞をいう。単離された細胞は、精製された形態で、半精製された形態で、または非天然の環境で存在し得る。簡潔には、インビトロおよび／またはエキソビボでの樹状細胞分化は、代表的には、単球性樹状細胞前駆体、または樹状細胞前駆体を有する細胞集団を、１もしくはこれより多くの樹状細胞分化薬剤の存在下で培養する工程を要する。適切な分化薬剤としては、例えば、細胞増殖因子（例えば、（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなサイトカイン、またはＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン４（ｌＬ−４）、インターロイキン１３（ｌＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、またはインターロイキン７（ＩＬ−７）の組み合わせ））が挙げられ得る。ある特定の実施形態において、単球性樹状細胞前駆体は、単球由来未成熟樹状細胞を形成するために分化される。
【００４８】
樹状細胞前駆体は、適切なインビトロ培養条件において培養および分化され得る。適切な樹状細胞組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。組織培養培地には、細胞の分化を促進するために、血清、血漿、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５）、二価カチオンなどが補充され得る。ある特定の実施形態において、樹状細胞前駆体は、無血清培地中で培養され得る。培養条件は、いかなる動物由来生成物をも必要に応じて排除し得る。樹状細胞培養培地とともに使用される代表的なサイトカイン組み合わせは、約５００ユニット／ｍＬの、ＧＭ−ＣＳＦと、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−１３との各々を含む。活性化されていない樹状細胞前駆体が使用される代表的実施形態において、代表的な樹状細胞組織培養培地には、ＧＭ−ＣＳＦが、いかなる他のサイトカインもなしに補充され得る。ＧＭ−ＣＳＦが単独で使用される場合、その組織培養培地にはまた、組織培養基材への活性化されていない単球性樹状細胞前駆体の接着を妨げるために、高濃度のヒトもしくは動物タンパク質が代表的には補充され、それによって、樹状細胞前駆体の成熟化が活性化される。代表的には、ヒトまたは動物タンパク質は、１％より高い濃度で添加され、代表的には、１０％もしくはこれ未満の濃度で使用される。そのヒトまたは動物タンパク質は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、血清、血漿、ゼラチン、ポリアミノ酸などであり得る。
【００４９】
樹状細胞前駆体は、未成熟樹状細胞を形成するために分化される場合、皮膚ランゲルハンス細胞に表現型が類似である。未成熟樹状細胞は、代表的には、ＣＤ１４−およびＣＤ１１ｃ＋であり、低レベルのＣＤ８６およびＣＤ８３を発現し、特化したエンドサイトーシスを介して可溶性抗原を捕捉し得る。
【００５０】
樹状細胞成熟化薬剤としては、例えば、ＢＣＧ、ＬＰＳ、ＴＮＦα、ＴＮＦαのインターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の組み合わせ、イミダゾキノリン化合物、例えば、イミダゾキノリン−４−アミン化合物（例えば、４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾール［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（Ｒ８４８と称される）もしくは１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、およびこれらの誘導体（例えば、ＷＯ２０００／４７７１９（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）、合成２本鎖ポリリボヌクレオチド、例えば、ポリ［Ｉ］：ポリ［Ｃ（１２）Ｕ］など、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のアゴニスト（例えば、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７および／もしくはＴＬＲ−９）、ＤＣの成熟化を誘導することが公知の非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸の配列など、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、インターフェロンγは、上記の樹状細胞成熟化薬剤のうちの１種もしくはこれより多くと組み合わされて、未成熟樹状細胞の成熟化を、Ｔｈ１タイプ応答を誘導し得る表現型に向かって偏らせ得る。ＢＣＧの有効量は、代表的には、不活性化前に、約１０５〜１０７ｃｆｕ／ミリリットル  組織培養培地に等価な範囲に及ぶ。ＩＦＮγの有効量は、代表的には、約１００〜約１０００Ｕ／ミリリットル  組織培養培地の範囲に及ぶ。
【００５１】
カルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓの無毒性（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）株である。本明細書で使用される場合、ＢＣＧとは、全ＢＣＧならびに細胞壁構成要素、ＢＣＧ由来リポアラビノマンナン、および他のＢＣＧ成分をいう。ＢＣＧは、必要に応じて不活性化される（例えば、熱不活性化ＢＣＧ、ホルマリン処理ＢＣＧ、または熱および他の不活性化方法の組み合わせによるものなど）。有効量のイミダゾキノリン化合物、例えば、イミダゾキノリン−４−アミン化合物（例えば、４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾール［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（Ｒ８４８と称される））は、約１〜約５０μｇ／ｍｌ  培養培地であり得、より代表的には、５〜約１０μｇ／ｍｌ  培養培地が使用される。イミダゾキノリン化合物は、単独で使用され得るか、あるいは例えば、ＢＣＧおよび／またはＩＦＮγ、またはさらなるＴＬＲアゴニストと併用され得る。
【００５２】
未成熟ＤＣは、代表的には、有効量の樹状細胞成熟化薬剤（例えば、ＢＣＧおよびＩＦＮγ）と、成熟化を誘導し、そして樹状細胞を活性化するが、完全には活性化しないように十分な時間にわたって接触される。代表的には、ＢＣＧおよびＩＦＮγが樹状細胞を成熟させるために使用される場合に、少なくとも２４時間のインキュベーション期間が完全な成熟化に必要とされ、使用される樹状細胞成熟化薬剤に依存して、約４８〜約７２時間の代表的インキュベーション期間が、完全な成熟化に必要とされる。使用される樹状細胞成熟化薬剤に依存するある特定の実施形態において、その期間は、約５時間〜約１９時間、またはこれより長い時間であり得る。ＢＣＧおよびＩＦＮγが使用されるより代表的な実施形態において、樹状細胞の部分的成熟化および最適な活性化のための期間は、約８〜約１９時間、またはこれより長い時間であり得る。未成熟樹状細胞は、培養され得、そして適切な成熟化培養条件において部分的に成熟化および活性化され得る。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。上記組織培養培地には、上記細胞の成熟化の誘導を促進するために、アミノ酸；ビタミン；サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦのみ（例えば、米国特許第８，３８９，２７８号（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）、またはＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、もしくはＩＬ−１５との組み合わせでのＧＭ−ＣＳＦ）；二価カチオン；などが補充され得る。代表的なサイトカインは、高濃度のヒトもしくは動物タンパク質とともにＧＭ−ＣＳＦ単独であり得るか、またはＧＭ−ＣＳＦは、組み合わせで使用される場合、約５００ユニット／ｍｌ〜約１０００ユニット／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの濃度で使用され、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＩＬ−１３、もしくはＩＬ−１５が使用される。
【００５３】
未成熟樹状細胞の部分的成熟化および活性化は、樹状細胞に関して当該分野で公知の方法によってモニターされ得る。細胞表面マーカーは、当該分野でよく知られたアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学など）で検出され得る。その細胞はまた、サイトカイン生成に関して（例えば、ＥＬＩＳＡ、別の免疫アッセイによって、またはオリゴヌクレオチドアッセイの使用によって）モニターされ得る。樹状細胞成熟化薬剤（例えば、ＢＣＧおよびＩＦＮγが挙げられるが、これらに限定されない）の存在下で本発明に従って培養され、および部分的に成熟し、かつ最適に活性化されたＤＣでは、未成熟樹状細胞と比較した場合に増大したレベルのリン酸化ＪＡＫ２（ｊａｎｕｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ２）が、当該分野で周知の方法によって成熟化の開始を示すために測定され得る。細胞表面マーカーおよびサイトカインの発現の誘導、ならびにシグナル伝達分子（例えば、ｊａｋ２）のリン酸化はまた、樹状細胞が一旦個体に投与された後に、樹状細胞がインビボでの抗原の取り込みおよび免疫応答の誘導に関して調節される指標として公知である。
【００５４】
上記未成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞の成熟化を開始する、および樹状細胞を部分的に成熟させそして活性化するために必要な期間にわたってのみ、成熟化を受ける。代表的には、有効量のＢＣＧおよび有効量のＩＦＮγとともに約５時間、または８時間、または１０〜１９時間というインキュベーションが、被験体に投与するために、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた場合に組成物として使用するための樹状細胞を部分的に成熟させ、活性化することが見出された。完全に成熟したＤＣは、抗原を取り込み、共刺激細胞表面分子および種々のサイトカインのアップレギュレートされた発現を示す能力を失う。具体的には、成熟したＤＣは、未成熟樹状細胞より高いレベルのＭＨＣクラスＩおよびＩＩの抗原を発現し、そして成熟した樹状細胞は、一般に、ＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、およびＣＤ１４−であると同定される。より高いＭＨＣ発現は、ＤＣ表面上での抗原密度の増大をもたらす一方で、共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションは、共刺激分子の対応物（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ２８）を介してＴ細胞活性化シグナルを強化する。本開示において使用されるとおりの部分的に成熟し、かつ活性化された樹状細胞は、代表的には、樹状細胞成熟化薬剤へと一旦曝露された後、未成熟樹状細胞と比較した場合に、細胞表面上の共刺激分子の発現においてアップレギュレーションを示すような樹状細胞を含む。これらの共刺激分子としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６および／またはＣＤ５４が挙げられるが、これらに限定されない。上記細胞は、ＣＤ８３を発現してもよいし発現しなくてもよいが、上記細胞は、抗原を効率的に取り込んでプロセシングする能力を維持する。さらに、上記部分的におよび最適に成熟した樹状細胞は、未成熟樹状細胞によって顕著な量では代表的には生成されない、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０および／もしくはＩＬ−１２のうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てを生成し得る。
【００５５】
ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てのある特定の量を生成する活性化された樹状細胞は、今や改善された臨床転帰と相関した。改善された臨床転帰は、処置されない個体または標準的な承認された処置プロトコルで処置された個体と比較した場合に、例えば、増大した生存時間および／または腫瘍再発までの増大した時間によって、測定され得る。本説明の中で、約５０〜約２００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６、約５００〜約２０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約３０〜約７０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＴＮＦα；ならびに／または少なくとも約７５〜約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットおよび約１〜３ｎｇ／１００万個細胞／２４時間の生物学的に活性なＩＬ−１２  ｐ７０を生成する活性化された樹状細胞が、改善された臨床転帰と相関する免疫学的有効性を有することが見出された。これらサイトカイン／ケモカインはまた、約７５〜約１５０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間の間、および好ましくは、約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６；約７５０〜約１５００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間、および好ましくは、約１０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０、および好ましくは少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ７０の範囲に及び得、改善された臨床転帰と相関する免疫学的有効性を生じる。先に開示されるように、改善された臨床転帰は、処置されていないかまたは現在確立されている標準ケアを使用して処置されたかのいずれかである同じがんまたは腫瘍を有する個体と比較して、有意に増大した生存時間または腫瘍もしくはがんの再発までの有意に増大した時間によって特徴付けられる。
【００５６】
完全に成熟した樹状細胞は、本発明に関しては好ましくない。なぜならそれらが一旦完全に成熟した後は、その細胞はもはや効率的に抗原を取り込みかつプロセシングしないからである。さらに、先行技術の方法で使用されるとおりの未成熟樹状細胞は、望ましくない。なぜなら腫瘍内で、または腫瘍を取り囲む組織中で代表的には見出される免疫抑制環境は、未成熟樹状細胞による抗原のプロセシングを妨げることが公知のサイトカインの実質的な濃度を含むからである。本開示において、未成熟樹状細胞の部分的成熟化および最適な活性化は、細胞の表面上のサイトカインレセプターをダウンレギュレートして、腫瘍内空間、または取り囲む組織に存在するサイトカインの任意の免疫抑制効果に対してあまり感受性または応答性でないようにし、そして腫瘍内空間もしくは取り囲む組織内に存在する抗原を効率的に取り込みかつプロセシングし得る細胞を提供する。その樹状細胞は、腫瘍内空間内でもしくは取り囲む組織中で見出されるアポトーシス細胞および死滅しつつある腫瘍細胞に由来する実質的な量の腫瘍抗原を取り込み、プロセシングする。その投与した部分的に成熟し、かつ最適に活性化された樹状細胞が一旦、例えば、ケモカインレセプターＣＣＲ７の発現によって測定されるように腫瘍内空間内で有効に成熟された後、その樹状細胞は、抗原をいま提示している樹状細胞がＴ細胞と接触して、当該樹状細胞によって提示される任意の腫瘍抗原に対する免疫応答をアップレギュレートする場所であるリンパ節へと移動する。
【００５７】
本発明のさらに別の局面によれば、本開示の種々のＤＣは、例えば、単球性樹状細胞前駆体、成熟化の前の未成熟樹状細胞として低温保存によって、または薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせにおいてまたはそのキャリアなしのいずれかで部分的成熟化後に、保存され得る。使用され得る低温保存薬剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、Ｄ−ラクトース、コリンクロリド、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、および無機酸が挙げられるが、これらに限定されない。コントロールされ、ゆっくりとした冷却速度が、重要であり得る。種々の低温保護剤および種々の細胞タイプは、代表的には、種々の最適な冷却速度を有する。
【００５８】
水が氷へと変化する融合相の熱は、代表的には、最小であるべきである。冷却手順は、例えば、プログラム可能な冷凍デバイスまたはメタノールバス手順の使用によって行われ得る。プログラム可能な凍結装置は、最適な冷却速度の決定を可能にし、標準的な再現可能な冷却を容易にする。プログラム可能な、制御された速度の冷凍庫（例えば、Ｃｒｙｏｍｅｄ（登録商標）またはＰｌａｎａｒ（登録商標））は、凍結レジメンを所望の冷却速度曲線に調節することを可能にする。
【００５９】
完全な凍結の後に、薬学的に受容可能なキャリアありまたはなしのいずれかでの単球性前駆体細胞、未成熟ＤＣおよび／または部分的に成熟したＤＣは、長期低温貯蔵容器へと迅速に移され得る。代表的実施形態において、サンプルは、液体窒素（−１９６℃）またはその蒸気（−１６５℃）中で低温貯蔵され得る。造血幹細胞（特に、骨髄または末梢血に由来）の操作、低温貯蔵、および長期貯蔵に関する考慮事項および手順は、本発明の細胞にたいてい適用可能である。このような考察は、例えば、以下の参考文献（本明細書に参考として援用される）に見出され得る：  Ｔａｙｌｏｒら，  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：２６９−７８  （１９９０）；  Ｇｏｒｉｎ，  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １５：１９−４８  （１９８６）；  Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  Ｐａｎｅｌ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｊｕｌ．  ２２２６，  １９６８，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ，  Ｖｉｅｎｎａ，  ｐｐ．  １０７−１８６。
【００６０】
凍結した細胞は、好ましくは、迅速に融解され（例えば、３７℃〜４１℃で維持したウォーターバス中で）、融解したら直ぐに冷却される。融解した際に細胞凝集化を妨げるために細胞を処理することは、望ましいことであり得る。凝集化を妨げるために、種々の手順が使用され得る（ＤＮａｓｅ（Ｓｐｉｔｚｅｒら，  Ｃａｎｃｅｒ  ４５：  ３０７５−８５  （１９８０）、低分子量デキストランおよびシトレート、ヒドロキシエチルデンプン（Ｓｔｉｆｆら，  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：  １７−２４  （１９８３））などの凍結の前および／または後の添加が挙げられるが、これらに限定されない）。低温保護剤は、ヒトにおいて毒性である場合には、その融解した部分的に成熟したＤＣの治療的使用の前に除去されるべきである。低温保護剤を除去する一方法は、微々たる濃度へと希釈することによる。凍結された単球性樹状細胞前駆体、未成熟樹状細胞、および／または部分的に成熟したＤＣが、一旦融解および回復された後、それらは、次いで、部分的に成熟した活性化された樹状細胞の生成を継続するかまたは製剤化された薬学的生成物を生成するかのいずれかのためのさらなる方法において使用され得る。その製剤化された部分的に成熟し、かつ最適に活性化された樹状細胞は、凍結されていない部分的に成熟し、かつ最適に活性化されたＤＣに関して本明細書で記載されるように投与され得る。
【００６１】
部分的に成熟しかつ活性化された樹状細胞の免疫療法有効性の決定
種々の炎症性サイトカインおよびケモカインの量は、当該分野で周知の方法によって測定され得る。本件では、活性化された樹状細胞によって生成されるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの組み合わせ、および／または全ての量は、改善された臨床転帰と関連し得る。改善された臨床転帰は、処置されていない個体または標準的な承認された処置プロトコルで処置された個体と比較して、例えば、有意に増大した生存時間および／または腫瘍再発までの有意に増大した時間によって測定され得る。予測外なことには、約５０〜約２００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６、約５００〜約２０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約３０〜約７０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＴＮＦα；ならびに／または少なくとも約７５〜約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットおよび約１〜３ｎｇ／１００万個細胞／２４時間の生物学的に活性なＩＬ−１２  ｐ７０を生成する活性化された樹状細胞は、改善された臨床転帰と相関する免疫学的有効性を有することが見出された。これらのサイトカイン／ケモカインはまた、約７５〜約１５０ｎｇ／１００万個細胞／２４時間の間、および好ましくは約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−６；約７５０〜約１５００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間、および好ましくは、約１０００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−８；少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ４０、および好ましくは、少なくとも約１００ｎｇ／１００万個細胞／２４時間のＩＬ−１２  ｐ７０の範囲に及び得る。
【００６２】
これら活性化された樹状細胞は、個体に投与し戻された場合に活性化された樹状細胞組成物が改善された臨床転帰を生じる可能性がありそうか否かを決定するために、免疫療法有効性試験のために使用され得る。さらに、上記免疫療法有効性試験は、有意な免疫応答をおそらく発生させる患者を選択するか、個体に投与し戻された場合に有意な免疫応答を生じると予測されない樹状細胞組成物のロットを却下するために使用され得るか；またはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての望ましいレベルを生成し得る樹状細胞活性化薬剤をスクリーニングするために使用され得る。個体から単離された末梢血が、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての望ましいレベルを生成し得る活性化された樹状細胞を生じない場合、その患者は、ＨＬＡマッチした正常ドナーから単離された活性化された樹状細胞で処置される必要があり得る。
【００６３】
活性化された樹状細胞組成物の免疫療法有効性を決定するための方法は、ｉ）上記で示される方法のうちのいずれかを使用して活性化された樹状細胞を調製する工程；ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を、当該分野で周知のいずれかの方法を使用して決定する工程；ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての上記決定された量と閾値量とを比較する工程；ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が低い免疫療法有効性の組成物であること；あるいはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を上回る場合には、上記活性化された樹状細胞組成物が高い免疫療法有効性の組成物であることを決定する工程を包含し得る。ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦαの閾値量は、上記で示される。上記活性化された樹状細胞が高い免疫療法有効性を示す場合、その活性化された樹状細胞は、薬学的に受容可能なキャリアとともに投与するために製剤化され得る。
【００６４】
別の実施形態において、活性化されたＤＣ集団の免疫療法有効性を増大させるための方法が提供される。上記方法は、ｉ）活性化された樹状細胞集団を調製する工程；ｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの相対量を、当該分野で周知の方法によって決定する工程；ｉｉｉ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての上記決定された量と閾値量とを比較する工程；ｉｖ）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全てが閾値を下回るか否かを決定する工程；ｖ）上記活性化されたＤＣによるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαのうちの１種もしくはこれらの任意の組み合わせ、および／または全ての生成を誘導して、増大した免疫療法有効性を有する活性化されたＤＣ集団を形成するように、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２および／もしくはＴＮＦαの量を、上記閾値量を上回るようにし得る薬剤の十分な量を添加する工程を包含する。
【００６５】
部分的に成熟した樹状細胞のインビボ投与
部分的に成熟しかつ活性化された樹状細胞、またはこのような細胞が富化されかつこのような細胞を含む細胞集団を、例えば、がんまたは腫瘍を有する被験体に投与するための方法および組成物が、提供される。ある特定の実施形態において、このような方法は、樹状細胞前駆体もしくは未成熟樹状細胞を得る工程、樹状細胞成熟化薬剤（例えば、ＢＣＧおよびＩＦＮγ）もしくは任意の他の樹状細胞成熟化薬剤（例えば、上記で列挙されるもの）の存在下でそれら細胞を分化させ、かつ部分的に成熟化させる工程によって行われる。上記部分的に成熟しかつ活性化された樹状細胞は、低温状態で医師に提供され得る。投与する前に、その凍結された細胞は迅速に融解され、冷却され、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、緩衝液および／または希釈剤とともに、当業者に周知の方法および組成物を使用して製剤化され得る。その部分的に成熟しかつ活性化された樹状細胞は、免疫刺激の必要性のある被験体へと直接投与され得る。代表的には、約１０２〜約１０１０  細胞が、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）中に懸濁される。その細胞は、腫瘍へと直接、あるいは、腫瘍もしくは腫瘍床の近傍の領域、腫瘍もしくは腫瘍床と隣接する領域、または腫瘍もしくは腫瘍床との接触にある循環血管もしくはリンパ管へのいずれかに注射され、その細胞ががんもしくは腫瘍抗原へのアクセスを有することが担保される。
【００６６】
例えば、限定ではなく、その細胞は、腫瘍へと直接、その腫瘍の外科的除去または切除後に腫瘍床へと、腫瘍周囲空間へと、その腫瘍と直接接触した状態にある排出リンパ節へと、腫瘍もしくはその腫瘍に罹患した器官へと繋がるまたはその腫瘍もしくは器官に供給する血管またはリンパ管（例えば、門脈または肺静脈もしくは肺動脈など）へと、投与され得る。本発明の部分的にかつ最適に成熟した樹状細胞の投与は、腫瘍に対する他の処置（例えば、化学療法または放射線療法）と同時またはその後のいずれかであり得る。さらに、本発明の部分的に成熟した樹状細胞は、別の薬剤と共投与され得、その薬剤は、樹状細胞の成熟化および／あるいは腫瘍内またはその腫瘍近傍もしくは隣接した領域の抗原のプロセシングの補助的手段として作用し得る。さらに、その樹状細胞はまた、腫瘍もしくは腫瘍床の中またはその周りの領域へと埋め込むための徐放性マトリクスへと製剤化または配合され得、その結果、その細胞が、腫瘍抗原との接触のために、腫瘍または腫瘍床へとゆっくりと放出される。
【００６７】
本開示で使用される場合、腫瘍としては、固形腫瘍（例示であって限定ではないが、肉腫；膵臓腫瘍；結腸直腸腫瘍；黒色腫；肺腫瘍；乳房腫瘍；卵巣腫瘍；頭頚部腫瘍；胃の腫瘍；前立腺腫瘍；食道腫瘍；子宮頸部もしくは膣の腫瘍；脳腫瘍（例えば、膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、または髄芽腫）などが挙げられる。さらなる固形腫瘍もまた、本明細書で開示される組成物または方法を使用する処置の対象である。
【００６８】
本開示の部分的に成熟し、かつ活性化された樹状細胞は、製剤および投与様式に対して適切な任意の手段によって投与され得る。例えば、細胞は、薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得、シリンジ、カテーテル、カニューレなどで投与され得る。上記のように、その細胞は、徐放性マトリクスの中で製剤化され得る。この様式で投与される場合、その製剤は、使用されるマトリクスに適した手段によって投与され得る。本発明に適用可能な他の方法および投与様式は、当業者に周知である。
【００６９】
本発明の組成物は、個体の処置において単独で使用され得る。さらに、その組成物は、がんまたは腫瘍を処置するために任意の他の方法と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の方法は、腫瘍の外科的切除、化学療法（細胞傷害性薬物、アポトーシス性薬剤、抗体など）、放射線療法、凍結療法、小線源療法、免疫療法（抗原特異的成熟活性化樹状細胞、ＮＫ細胞、がん細胞または腫瘍抗原に特異的な抗体の投与など）などと組み合わせて使用され得る。これらの方法のうちのいずれかおよび全ては、任意の組み合わせでも使用され得る。併用処置は、同時または逐次的であり得、処置する臨床医によって決定されるとおりの任意の順序で投与され得る。
【００７０】
別の実施形態において、樹状細胞およびレシピエント被験体は、同じＭＨＣ（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する。被験体のＨＬＡハプロタイプを決定するための方法は、当該分野で公知である。関連実施形態において、部分的に成熟した樹状細胞は、レシピエント被験体に対して同種異系である。その同種異系細胞は、代表的には、少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子（例えば、少なくとも１つを共有するが、全てのＭＨＣ対立遺伝子を共有するわけではない）に関して適合される。それほど代表的ではない実施形態では、その樹状細胞およびレシピエント被験体は、互いに対して全て同種異系であるが、全てが少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子を共通して有する。
【００７１】
抗腫瘍免疫応答は、任意の１つもしくはこれより多くの周知の方法によって測定され得る。例えば、抗腫瘍応答は、腫瘍のサイズの縮小、腫瘍細胞死もしくは腫瘍細胞壊死の誘導、腫瘍細胞増殖の低減によって、または腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（ＴＩＬ）の浸潤などによって測定され得る。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は、本説明の種々の局面の例証として提供されるに過ぎず、本明細書で開示される方法および組成物を限定するとは如何様にも解釈されるべきではない。その方法の好ましい実施形態および／または方法は、例証されかつ記載されてきたが、種々の変更が本説明の趣旨および範囲から逸脱することなくそこで行われ得ることは認識される。
【００７３】
この実施例では、活性化された樹状細胞は、種々の固形腫瘍における用量漸増研究において試験される。
【００７４】
方法
４０名の被験体を、この用量漸増研究に登録して、固形腫瘍において、最適に活性化された樹状細胞を含む活性化されたＤＣ（ａＤＣ）の腫瘍内注射の安全性および実現性を、試験した。少なくとも１種の抗腫瘍処置レジメンをスクリーニングの１２週間以内に受けたことがある、局所的に進行したまたは転移性の疾患を有する１８〜７５歳齢の被験体は、研究に適格であった。他の適格性の基準は、米国東海岸癌臨床試験グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステイタス０または１を有すること、１ｃｍ直径より大きくかつ大血管構造から離れて位置する少なくとも１個の注射可能な腫瘍塊または腫脹しにくい領域（例えば、上気道腫瘍）を有すること、完全な用量コースを製造するために十分数の単球を生成すること、６ヶ月より長い平均余命を有すること、および十分な骨髄および腎機能を有することを包含した。自己免疫疾患もしくは臓器移植の病歴を有する被験体を、この研究から排除した。他の排除基準は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＨＴＬＶ−ＩもしくはＨＴＬＶ−ＩＩの陽性状態を有すること；最初の注射の前４週間以内に、ひどく骨髄抑制性もしくは骨髄毒性の化学療法を受けたこと；２年以内にがん免疫療法を受けていること；処置されていない脳への転移を有すること；ステロイドもしくは抗凝固治療を継続する必要があること；または急性もしくは制御されない感染症を有することを包含した。被験体の特性を、表１にまとめる。
【表１】
2018537949.tif 000003
【００７５】
研究設計
これは、活性化されたＤＣの安全性および効力の評価であった。この研究の用量漸増部分は、「３＋３」設計を使用した。３種の用量レベルを、この研究に含めた：注射１回あたり、２００万個、６００万個、および１５００万個の活性化されたＤＣ。
【００７６】
各被験体に、白血球アフェレーシスを受けさせて、単球、ＤＣ前駆体細胞を集めた。その活性化されたＤＣ（ａＤＣ；商品名ＤＣＶａｘ（登録商標）−Ｄｉｒｅｃｔ）を、以下に記載されるとおりに調製した。最初のａＤＣ注射を、白血球アフェレーシスのおよそ３週間後に行い、その後の注射を、最初の注射の１週間後、２週間後、８週間後、１６週間後、および３２週間後に投与した。全ての注射を、腫瘍の内部にガイド針を配置し、次いで、より細い針で腫瘍組織へと直接生成物を送達するために、画像ガイダンス（超音波法もしくはコンピューター断層撮影法（ＣＴ）のいずれか）を使用して投与した。各免疫のために、３〜４個の針経路を使用して、細胞をその腫瘍境界の中に投与し、単一ボーラスを腫瘍塊の壊死中心部に送達するのを回避すると同時に、死滅腫瘍細胞および死滅しつつある腫瘍細胞へのａＤＣ曝露を増強した。注射後に、その被験体を、バイタルサイン（心拍数、体温および血圧）を３０分ごとにとって、２時間にわたって観察した。
【００７７】
用量制限毒性（ＤＬＴ）および最大耐量（ＭＴＤ）
ＤＬＴを、以下のうちのいずれかとして定義した：≧グレード３の注射部位反応、自己免疫疾患の臨床徴候および症状の発生、≧グレード２のアレルギー反応、３日間もしくはこれより長い日数にわたって持続するかまたは薬物介入を要する、≧グレード２の免疫学的反応、≧グレード３の米国立癌研究所共通毒性規準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（ＮＣＩ  ＣＴＣ）  ｖ．４毒性、または悪性腫瘍進行に関連しないグレード４もしくは生命を脅かす事象。その最大耐量（ＭＴＤ）を、被験体のうちの１／３以下が用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験する最高用量レベルとして定義した。
【００７８】
効力の評価
処置効力を、固形腫瘍の効果判定基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）ｖ．１．１（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４：２２８−２４７，  ２００９）または免疫応答関連基準（Ｈｏｏｓら，  Ｊ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  １０２：１３８８−１３９７，  ２０１０）に従って、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴（ＭＲ）法による画像化研究によって評価した。簡潔には、進行性疾患（ＰＤ）を、研究の間に観察された最小の合計と比較して、標的病変の直径の合計の≧２０％増大として定義した。そしてその絶対合計は、≧５ｍｍ増大でなければならない。安定な疾患（ＳＤ）は、部分応答（≧３０％標的病変直径減少）とみなすには不十分な腫瘍縮小を有すると同時に、ＰＤとみなすには不十分な腫瘍増殖を有すると定義した。
【００７９】
活性化されたＤＣの調製
単球を、タンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して、白血球アフェレーシス生成物から精製した。その細胞を、Ｔｅｆｌｏｎ組織培養バッグ（Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＰＡ）の中に入れ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ＋２％  ヒト血清アルブミン）の存在下で未成熟ＤＣへと５日間にわたって分化させた。細胞を、５日間培養し、次いで、ＢＣＧマイコバクテリアを死滅させ、ＩＦＮγを添加して、約１０〜１９時間の期間にわたってＤＣ活性化を誘導した。活性化後に、活性化された樹状細胞を、少量のＲＰＭＩ−１６４０、４０％  ヒト血清アルブミンおよび１０％  ＤＭＳＯ中に再懸濁し、その細胞を、１用量アリコートで低温貯蔵した。フローサイトメトリーを、樹状細胞活性化マーカーを探す細胞に対して行った（図３）。
【００８０】
サイトカインレベル決定
ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２ｐ４０のためのカスタムマルチプレックス磁性ビーズセット（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）およびＩＬ−１２ｐ７０のためのシングルプレックスセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＤＣＶａｘ−Ｄｉｒｅｃｔ生成物培養からの清澄化上清中のサイトカインの濃度を決定した。データを、１００万個の生きているＤＣあたりで正規化した二連の決定の平均値として報告する。
【００８１】
腫瘍生検の評価
生検で採取した腫瘍を、標準法を使用して、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した。全ての免疫組織化学を、ＱｕａｌＴｅｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，  ＣＡ）によって行った。
【００８２】
ＦＦＰＥ標本におけるＩＦＮγおよびＴＮＦα転写物のインサイチュ検出を、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイと、プローブＨｓ−ＩＦＮγおよびＨｓ−ＴＮＦα（それぞれ、カタログ番号３１０５０１および３１０４２１、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ），  ＵＳＡ）、ならびに陽性コントロールプローブＰＰＩＢ（カタログ番号３１３９０１）、およびＲＮＡｓｃｏｐｅ  ２．０  ＨＤ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｂｒｏｗｎ）（カタログ番号３１００３５，  ＡＣＤ，  ＵＳＡ）とを使用して、製造業者が推奨する手順に従って行った。ＩＦＮγおよびＴＮＦα  ＲＮＡｓｃｏｐｅ特異性を検証するために、３名の健康なドナーに由来するＰＢＭＣを、Ｔ細胞刺激の前後に試験した。Ｔ細胞を刺激するために、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して単離し、１０％  ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で再懸濁し、５０ｎｇ／ｍＬ  ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）および１μｇ／ｍＬ  イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で５時間、３７℃および５％  ＣＯ２において処理した。細胞を、Ｈｉｓｔｏｇｅｌ（登録商標）中の１０％  中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、加工処理し、ＦＦＰＥブロックの中に包埋した。次いで、切片（５μｍ）を、上記で示されるようにＲＮＡｓｃｏｐｅを使用して試験した。その刺激されたＴ細胞は、非処理細胞と比較して、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの両方において強い増大を示した。染色したスライドのデジタル画像を、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴデジタルスライドスキャナーで獲得した。
【００８３】
統計分析
統計分析を行って、サイトカインレベルが転帰と関連するか否かを決定した。さらに、ベースライン特性もしくは処置因子が、サイトカインレベルもしくは転帰の予測となるか否かを評価した。応答を、２つの変数に基づいて測定した：二バイナリ尺度（ｂｉｎａｒｙ  ｍｅａｓｕｒｅ）としての８週目でのＳＤおよび生存期間。多重度を検定するための調節は行わなかった。ｐ値０．０５を、統計的有意と見做した。
【００８４】
第１に、記述尺度（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）を、有効性尺度間の相関を含め、サイトカインレベルに関して生成した。次に、ベースライン特性または処置因子とサイトカインレベルとの間の関連を、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ（ウィルコクソン）法を使用して評価した。測定値の散布図を、サイトカインレベルの対の全てに関して検討した。比例ハザードモデルを使用して、個々のサイトカインレベルの関数としての生存をフィットさせ、後方回帰（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を使用して、特別な尺度が、ジョイントモデルにおいてより予測的であるか否かを決定した。ロジスティックモデルを使用して、８週間でのＳＤを、個々のサイトカインレベルの関数としてフィットさせ、後方回帰を使用して、特別な尺度が、ジョイントモデルにおいてより予測的であるか否かを決定した。比例ハザードモデル、ロジスティックモデル、傾向検定、または尤度比χ二乗検定（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ−ｒａｔｉｏ  χ２  ｔｅｓｔｓ）を使用して、ベースライン特性または処置因子と、尺度およびエンドポイントに適切であるとして、生存および８週間でのＳＤとの関連を評価した。サイトカインレベルに基づく生存のカプラン−マイヤープロットに関しては、メジアン値を、２群間のカットオフとして各サイトカインに関して使用した。
【００８５】
その分析および散布図の検討に基づくと、観察の群は、潜在的なアウトライアーまたはおそらく被験体の特有のセットであるようであった（結果でさらに記載される）。これら被験体の記録を削除した上で分析を繰り返した。ＳＡＳバージョン９．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を使用して分析を完了させた。
【００８６】
結果
被験体
全体として、４０名の被験体を研究に登録した。これらのうち、１名の被験体を、ａＤＣの不正確な製剤化に起因して評価できないとみなした。被験体の人口統計および臨床上の特性を、表１に示す。中間の被験体年齢は、５３歳齢であった（範囲３０〜７３歳）。研究は、２１名の女性（５３．８％）を含んだ。腫瘍タイプのうちの多数が研究の中に含められ、最も一般的なものは、肉腫（ｎ＝８）、結腸直腸癌（ｎ＝７）、および黒色腫（ｎ＝６）であった。被験体は、３個の病変というメジアンを有した（範囲＝１〜５個の病変）。以前の処置のメジアン数は、２であった（平均＝３；範囲＝１〜９）。全ての手順を、放射線科医によって意識下鎮静法によって促進される画像ガイダンス（コンピューター断層撮影法または超音波）の下で、外来患者ベースで行った。２００万個のａＤＣ用量では、１６名の被験体に、４回の注射というメジアンで投与した（範囲＝１〜６回の注射）。６００万個のａＤＣ用量では、２０名の被験体に、３回の注射というメジアンで投与した（範囲＝２〜６回の注射）。１５００万個のａＤＣ用量では、３名の被験体に、４回の注射というメジアンで投与した（範囲＝３〜４回の注射）。被験体あたり１個の腫瘍のみに注射した。
【００８７】
ａＤＣを、画像ガイダンスの下で、１回の注射あたり、２００万個、６００万個、または１５００万個の生きている、活性化された自己ＤＣの用量において腫瘍内に投与した。各注射通院時（０日目、７日目、１４日目、次いで、８週目、１６週目、および３２週目）に、１個の病変に注射した。腫瘍内注射のためのａＤＣを調製するために、それらを、ＢＣＧおよびＩＦＮγへの曝露を介して活性化した。活性化されたＤＣの上清を集めて、サイトカイン生成を測定した。腫瘍生検を、腫瘍壊死および浸潤リンパ球に関して評価した。腫瘍サイズを、標準的画像化手順を通じてモニターし、免疫をモニターするために血液を収集した。
【００８８】
安全性および生存
画像ガイダンスの下での腫瘍内注射は、一般には、十分に許容されかつ実現可能であった。合計で、２００万個の用量レベルで１６名の被験体に、６００万個の用量レベルで２０名の被験体に、および１５００万個の用量レベルで３名の被験体に、ｉ．ｔ．注射を行った。用量漸増の間に用量制限毒性（ＤＬＴ）は観察されなかった。従って、最大耐量（ＭＴＤ）は決定されなかった。最大試験用量（１５００万個のａＤＣ）は、十分に許容された。研究処置に関する有害事象を、表２に報告する。
【表２−１】
2018537949.tif 000004
【表２−２】
2018537949.tif 000005
略語：ａＤＣ、活性化された樹状細胞；Ｇ、グレード（米国立癌研究所共通用語規準バージョン４に準拠）。
ａ有害事象が異なるグレードで複数日に観察された場合、観察された最高グレードを列挙した。
ｂ全患者のうちのパーセント、Ｎ＝３９。
【００８９】
処置関連有害事象は、３２名の被験体（８２．１％）において観察されたが、これらのうちのほぼ全てが、グレード１または２であり、大部分は、研究期間の最後までには消散した。最も一般的な有害事象は、発熱（ｎ＝３１、７９．５％）、悪寒（ｎ＝１６、４１．０％）、疲労（ｎ＝１２、２３．１％）、注射部位疼痛または不快感（ｎ＝１１、２８．２％）、寝汗（ｎ＝１０、２５．６％）、食欲減退（ｎ＝９、２３．１％）、および筋肉痛（ｎ＝７、１７．９％）であった。
【００９０】
４件のグレード３（１０．３％）および１件のグレード４（２．６％）の処置関連有害事象があり、全件が、６００万個のａＤＣ／注射用量においてであった。
【００９１】
組織学
連続する生検データを、２８名の被験体から集めた。合計で、１０４個の生検材料を採取した。新たなもしくは増大した壊死を、１４名の生検実施被験体（５７％）において観察した。新たなもしくは増大した数の間質リンパ球を、１４名の生検実施被験体（５０．０％）において観察した；新たなもしくは増大した数の浸潤リンパ球を、１５名の生検実施被験体（５４％）において観察した；そして８名の生検実施被験体（２９％）では、浸潤リンパ球および間質リンパ球の両方を観察した。生検材料を、３週目および８週目に集め、腫瘍周辺もしくは腫瘍内のＴ細胞を、一般に、８週間の処置後開始で検出した。従って、免疫応答は、その時間枠内のどこかで開始された。いくらかの被験体において、そのＴ細胞蓄積は、最初の注射の２週間後もしくは３週間後に検出された。これらＴ細胞は、活性化されたＤＣ注射後の腫瘍へと集まる既存の抗腫瘍免疫応答を表し得る。
【００９２】
デノボもしくは有意に増強されたＰＤ−Ｌ１発現を、２５個の評価した腫瘍生検材料のうちの１９個で観察した。リンパ球およびＰＤ−Ｌ１の両方に関して染色した生検材料の中で、新たな、もしくは増大したＰＤ−Ｌ１発現を、新たな、もしくは増大した浸潤Ｔ細胞を有する１２名の被験体のうちの９名で、および新たな、もしくは増大した間質リンパ球を有する１２名の被験体のうちの１１名で観察した。新たな、もしくは増大したＰＤ−Ｌ１発現を有する全１９名の被験体の中で、１４名は、腫瘍周辺リンパ球もしくは浸潤リンパ球のいずれかを有した。
【００９３】
浸潤Ｔ細胞が観察された場合、それらは、主に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の混合物であった；しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかが専ら観察された場合も数例あった。場合によっては、そのＴ細胞は、生検切片中の全細胞のうちの３０％超を構成した（図１Ａもまた参照のこと）。
【００９４】
腫瘍関連および腫瘍浸潤Ｔ細胞機能性を評価するために、ＲＮＡｓｃｏｐｅ分析を、選択された組織上でのＩＦＮγおよびＴＮＦα発現に関して行った。試験したサンプルにおけるＴ細胞の大部分は、両方のサイトカインに関して陽性であった（図１Ｂおよび１Ｃ）。このことは、十分に機能的なＴ細胞が、腫瘍へと動員されたことを示唆する。ＴＮＦαを発現する組織マクロファージもまた、検出された。
【００９５】
サイトカインレベル、生存および安定な疾患（ＳＤ）
ａＤＣのサイトカインレベルを、被験体での注射の前に評価した。ａＤＣの各バッチは、被験体自身の単球に由来しているので、サイトカインレベルで観察された被験体間変動性の程度は大きかった。従って、サイトカインレベル間の内部相関およびサイトカインレベルとベースライン特性、処置因子、生存、およびＳＤとの間の関連性を８週間で評価した。
【００９６】
統計分析の間に、３名の被験体が、高レベルのＩＬ−８およびＩＬ−６を有するが、低いＴＮＦαレベルを有する活性化されたＤＣを有した。これらの被験体は、統計上のアウトライアーとして一貫して出現した。第１のアウトライアー被験体は、６００万個のａＤＣ処置群の５１歳齢の男性黒色腫被験体であった。彼には５個の病変があり、以前に一ラウンドの処置を受けていた。彼は、３回の注射を受け、８週目でＳＤを有し、最初の注射のおよそ９ヶ月後に死亡した。第２のアウトライアー被験体は、６００万個のａＤＣ処置群の５９歳齢の女性乳がん被験体であった。彼女には３個の病変があり、以前に８ラウンドの処置を受けていた。彼女は、３回の注射を受け、最初の注射のおよそ１ヶ月後に死亡した。第３のアウトライアー被験体は、１５００万個のａＤＣ処置群の５２歳齢の男性肺がん被験体であった。彼には３個の病変があり、以前に５ラウンドの処置を受けていた。彼は３回の注射を受け、８週目でＰＤ（進行性疾患）を有し、最初の注射のおよそ３．５ヶ月後に死亡した。全３名の被験体は、重度の疾患負荷を有し、極めて予後不良であった。その３名の被験体には、彼らを研究の被験体の残りから区別する他の既知の目立った特徴はなかった。その被験体のうちの１名に由来するａＤＣの探索的分析は、その精製された単球がａＤＣへと完全に変わり損ねた可能性があることを示唆する。その後の分析では、上記アウトライアー被験体データを排除した。
【００９７】
サイトカインレベルの間の内部相関
活性化の質およびａＤＣによって生成されるサイトカインの効果を評価するために、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、およびＩＬ−１２ｐ７０のレベルを決定した。評価した種々のサイトカインの間には、高いレベルの内部相関があった。それらの値は、単変量分析において転帰（安定な疾患（ＳＤ）もしくは生存）と相関した。別個に、後方回帰モデルを使用して、その尺度の相対的予測強度を評価し、そして因子の全てで出発して、ジョイントモデルに基づいて変数組み合わせを同定した。相関したサイトカインを、３群にソートした。第１の群には、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびより低い程度のＴＮＦαを含めた。ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０に関するピアソンのｒ値は、０．６４（ｐ＝０．００４）であった。ＩＬ−６およびＴＮＦαに関するｒ値は、０．８８（ｐ＝＜０．００１）であった。ＩＬ−８およびＩＬ−１２ｐ４０に関するｒ値は、０．６４１（ｐ＜０．００１）であった。第２の群は、ＩＬ−１０およびＩＬ−８であった。ＩＬ−１８およびＩＬ−１０に関するｒ値は、０．６３（ｐ＜０．００１）であった。第３の群は、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ７０であった。これらに関するｒ値は、０．５５（ｐ＜０．００１）であった。ａＤＣを生成するために使用される短い活性化時間が、ＩＬ−１２ｐ７０生成の完全な補完を検出するには最適でなかったことに注意すべきである。
【００９８】
サイトカインレベルとベースライン特性および処置因子との間の関連性
次に、サイトカインレベルとベースライン特性および処置因子（適応症、病変の数、以前の処置、用量、注射の回数、年齢、合計腫瘍直径もしくは最長腫瘍直径（ＳＬＤ）、およびスクリーニング時の絶対リンパ球数（ＡＬＣ）を含む）との間の関連性を、回帰分析を使用して決定した。ＳＬＤは、ＩＬ−８（Ｒ２＝０．２０；ｐ＝０．００６）、ＩＬ−１２ｐ４０（Ｒ２＝０．１４；ｐ＝０．０２６）およびＩＬ−１２ｐ７０（Ｒ２＝０．１１；ｐ＝０．０５１）のレベルと負の関連があり、ＩＬ−１０レベル（Ｒ２＝０．０２３）と正の関連があった。ＡＬＣは、ＩＬ−１２ｐ４０（Ｒ２＝０．２６；ｐ＝０．００２）と正の関連があった。ＳＬＤもＡＬＣも、生存と独立して関連しなかった。
【００９９】
サイトカインレベルと生存との間の関連性
サイトカインレベルを、比例ハザードモデルにおいて個々にフィットさせて、それらが生存を予測となり得るか否かを決定した。単変量分析は、ＩＬ−６（ｐ＝０．０４８）、ＩＬ−８（ｐ＝０．０１４）、およびＩＬ−１２ｐ４０（ｐ＝０．０１６）が生存と関連することを示した。具体的には、９８５ｎｇ／１０６  細胞／日より高いＩＬ−８レベルおよび３３０  ／１０６  細胞／日より高いＩＬ−１２ｐ４０レベルは、有意に高い全生存（それぞれ、ｐ＝０．００２２およびｐ＝０．００７７；図２Ａおよび２Ｂ）を示した。
【０１００】
探索的分析を行って、抜き出されたサイトカイン対のジョイントモデルを評価し、そして潜在的因子相互作用を評価した。ＩＬ−８およびＩＬ−１２ｐ４０の組み合わせは、潜在的に有意な相互作用項（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）と関連した（ｐ＝０．０２０）。そのジョイント相互作用モデルは、ＩＬ−８およびＩＬ−１２ｐ４０の両方の高い値を有する被験体が、全般的によりよく応答し得ることを示す。この結果は、ＤＣ有効性尺度と臨床転帰との間により複雑な関係性が存在し得ることを示唆する。
【０１０１】
サイトカインレベルと８週目での安定な疾患との間の関連性
カプラン−マイヤー分析は、生存が８週目でのＳＤと有意に関連する（ｐ＝０．００４、図２Ｃ）ことが示された；従って、ＳＤと関連するサイトカインマーカーが存在するか否かを決定した。サイトカインレベルを、ロジスティックモデルへと個々にフィットさせて、それらが８週目でのＳＤの予測となるか否かを決定した。単変量分析から、８週目でのＳＤとＴＮＦαとの間には正の関連性（ｐ＝０．０１５、図２Ｄ）が明らかにされ、この関連性は、多変量後方回帰モデルにおいて確認された（ｐ＝０．０１４）。
【０１０２】
ＤＣの質の他の尺度
２５名の被験体に由来する注射されたａＤＣを、表面マーカー発現に関して分析した。生存とＭＨＣクラスＩ抗原（傾向に関するログランクｐ＝０．０７）およびＣＤ８６共刺激分子（傾向に関するログランクｐ＝０．１）の発現レベル（三分位値へと分けた平均蛍光強度）との間の弱い相関は、ＤＣの質が腫瘍内に送達された場合に被験体の転帰に関する主な原動力であるという仮説のさらなる裏付けを与える（図２Ｅおよび図２Ｆ）。
【０１０３】
疾患の安定化は、高レベルのＴＮＦを生成するａＤＣで処置したより多くの被験体において観察された（ｐ＜０．０１）。生存は、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８の高い生成レベルと同様に関連した。
【０１０４】
この研究において、活性化された自己樹状細胞（ａＤＣ）の安全性および効力を試験した。ａＤＣを、切除不能の、局所的に進行した、または転移性の固形腫瘍を有する被験体の処置として、腫瘍内に注射した。被験体を、０週目、１週目、２週目、８週目、１６週目および３２週目で、または投与するべき自己ａＤＣがなくなるまで、注射１回あたり２００万個、６００万個、または１５００万個のａＤＣで処置した。ＤＬＴは観察されなかったので、ＭＴＤは存在しなかった。この観察は、ＤＬＴもＭＴＤも同定されなかった他のＤＣワクチン研究（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４：４５４，  ２０１３，  Ｄｒａｕｂｅら，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ１８８０１，  ２０１１）と一致する。ＤＣワクチンが自己細胞を使用することを考慮すると、制限された毒性しかないことは、驚くべきことではなかった。ＤＣワクチン用量が、白血球アフェレーシスの間に抽出され得、処置の間に転換され得る細胞数（これは、実現可能な最大用量といわれる）によってのみ制限されることは、以前に示されている（Ａｎｇｕｉｌｌｅら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６７：７３１−７５３，  ２０１５）。
【０１０５】
本明細書で投与される最大用量は、１５００万個のａＤＣ／注射であり、この用量は、十分に許容された；しかし、この大用量は、有効なＴ細胞応答を生じるために必要というわけではない可能性がある。腎臓がんおよび前立腺がんのＤＣワクチン治験の１つの大規模メタ分析は、用量と転帰との間の正の相関を突き止めた（Ｄｒａｕｂｅら，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ１８８０１，  ２０１１）。しかし、いくつかの他の研究は、より少ない細胞でも、ＤＣが排出リンパに有効に達する限りにおいて、比較的少ないＤＣで同等の免疫応答を達成し得ることを示した（Ｔｅｌら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７３：１０６３−１０７５，  ２０１３；  Ａａｒｎｔｚｅｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９：１５２５−１５３３，  ２０１３，  Ｖｅｒｄｉｊｋら，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ８７：８６５−８７４，  ２００８），  Ｃｅｌｌｉら，  Ｂｌｏｏｄ  １２０：３９４５−３９４８，  ２０１２）。比較的少ない低グレードの処置関連有害事象が、この研究のａＤＣ処置で認められた。これらの有害事象は、免疫系の活性化（例えば、発熱）と主に関連していた。これらの結果は、ＭＴＤの欠如と合わせると、ａＤＣが固形腫瘍の安全な処置であることを示す。
【０１０６】
ａＤＣの効力に関連して、注射した腫瘍の生検から、増大した壊死、ならびにＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋キラー細胞を含むリンパ球の浸潤が示された。個々の症例では、免疫反応性は、患者生検においてＴ細胞の迅速なおよび遅延した浸潤ならびに広範囲な壊死の両方とともに観察された。これらの観察は、腫瘍サイズの明白な縮小の前に起こった（データは示さず）。研究から、腫瘍における、ある特定のタイプのＴ細胞（例えば、間質リンパ球およびＣＴＬ）の増大した浸潤および蓄積はいくつかの固形腫瘍において改善された転帰と強く相関することが示された（Ｔｏｓｏｌｉｎｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７１：１２６３−１２７１，  ２０１１；  Ｓｍｙｔｈら，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９０：１−５０，  ２００６；  Ｃｌｅｍｅｎｔｅら，  Ｃａｎｃｅｒ  ７７：１３０３−１３１０，  １９９６）。さらに、ＰＤ−Ｌ１は、試験した２５個の腫瘍のうちの１９個においてアップレギュレートされ、このアップレギュレーションは、免疫活性化に対する腫瘍応答を恐らく反映する。特に、Ｔ細胞に関して陽性の試験した腫瘍生検材料は、増大したＰＤ−Ｌ１発現を有する可能性がより高かいことがその理由であった。ＰＤ−Ｌ１は、リンパ球浸潤の間に誘起される、Ｔ細胞活性をダウンレギュレートして、過剰な免疫反応を制御する共刺激分子である。そして腫瘍は、それを使用して、免疫応答から逃れる（Ｉｔｏら，  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｉｎｔ．  ２０１５：６０５４７８，  ２０１５，  Ａｎｇｕｉｌｌｅら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６７：７３１−７５３，  ２０１５）。上記のＰＤ−Ｌ１データが、生検で採取した腫瘍に由来することを考慮すると、ＰＤ−Ｌ１発現の出現は、免疫応答のダウンレギュレーションを示すというよりむしろ、成功裡の抗腫瘍免疫応答誘導のマーカーとして役立ち得る。全体として、これらの結果は、ａＤＣが固形腫瘍における有効なＴ細胞応答を刺激するという証拠を提供する。
【０１０７】
ａＤＣ処置が有効であることから、患者の転帰もまた改善されるはずである。ａＤＣによって分泌されるサイトカインによって測定される場合に、生存機構がＤＣ有効性に関連したという仮説を本明細書中で立てる。従って、ａＤＣのサイトカインレベルを、腫瘍へとａＤＣを注射する前に評価した。ＩＬ−１２ｐ４０が生存と有意に関連していることが観察された。ＩＬ−１２ｐ４０は、ＩＬ−１２ｐ７０ともいわれるヘテロダイマーＩＬ−１２複合体のうちの１つのサブユニットである。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞および成熟Ｔ細胞を刺激することが公知である。それは、抗腫瘍活性を有するＴＨ１細胞へとＴＨ２細胞を変換する一助となることもまた公知である（Ｄｅｌ  Ｖｅｃｃｈｉｏら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：４６７７−４６８５，  ２００７）。従って、ＩＬ−１２ｐ４０生成ａＤＣは、有効なＤＣワクチンにとって理想的である。さらに、ＩＬ−８分泌は、生存と関連した。具体的には、高いＩＬ−８分泌は、有意により高い全生存を示した。ＩＬ−８は、がんと負に関連すると主に考えられている。ＩＬ−８は、血管形成、細胞増殖、および細胞生存を促進する；しかし、それはまた、腫瘍微小環境への免疫細胞の浸潤を促進する（Ｗａｕｇｈ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：６７３５−６７４１，  ２００８）。ＢＣＧ免疫療法の場合、ＩＬ−８は、抗腫瘍免疫応答の発生と関連した（ｄｅ  Ｂｏｅｒら，  Ｕｒｏｌ．  Ｒｅｓ．  ２５：３１−３４，  １９９７）。ＩＬ−８生成ａＤＣの局所適用が、腫瘍への免疫細胞の浸潤を刺激した可能性がありそうである。さらに、回帰モデルは、その２種の組み合わせが、生存と正に関連することを示した。この観察は、ＩＬ−８およびＩＬ−１２ｐ４０（およびおそらく他のサイトカイン）の組み合わせが、個々のサイトカインよりむしろ、改善された生存の鍵であり得ることを示す。現在では、生存と相関することが示されたその分泌されたサイトカインが直接的な機能的重要性を有するか否か、またはそれらが全体的なＤＣの有効性の感度の高い尺度として働いているか否かは、不明である。患者のベースラインパラメーターと、サイトカイン生成によって測定される場合のＤＣの有効性との間で観察された関連性は、ＳＬＤおよびＡＬＣのような因子が、患者をＤＣベースの療法からより大きな利益を得やすくし得ることを示唆するが、Ｒ２値は、これらのベースラインパラメーターが、サイトカインレベルにおける変動のうちの２５％までを説明するに過ぎないことを示唆する。この可能性は、より均質な患者集団を用いたその後の研究においてさらなる注目される価値があり、さらなる調査の対象になる。
【０１０８】
ａＤＣ処置患者のさらなる生存分析は、８週目でのＳＤが生存と有意に相関することを示した。これらのデータは、腫瘍がａＤＣによって安定化され得る場合、進行なしの生存のオッズが有意に増大することを示す。従って、どのサイトカインが、８週目でのＳＤと関連するかを調査した。サイトカインレベルの分析は、ＴＮＦαが８週目でのＳＤと正に関連することを示した。ＴＮＦαは、ＤＣ成熟化ならびにＴ細胞感作、増殖、および動員を含む免疫応答をアップレギュレートすることと広範囲に関連する十分に特徴付けられたサイトカインである（Ｃａｌｚａｓｃｉａら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７：３８３３−３８４５，  ２００７；  ｖａｎ  Ｈｏｒｓｓｅｎら，  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １１：３９７−４０８，  ２００６）。ヒト研究は、ＴＮＦαの患肢灌流が局所的に進行した軟組織肉腫を処置するために使用され得ることを示した（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔら，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ４：４２９−４３７，  ２００６）。さらに、ＴＮＦαは、マウスにおいて抗腫瘍免疫応答にとって極めて重要であることが示された（Ｃａｌｚａｓｃｉａら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７：３８３３−３８４５，  ２００７）。ＴＮＦαとの間での本明細書で観察された正の関連性は、これらの結果と一致する。有意な内部相関がまた、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１２ｐ４０との間で観察された；しかし、明らかな有意性は、生物学的に関連するものよりむしろ、ＩＬ−８とＩＬ−１２ｐ４０との間の内部相関の結果であり得る。あるいは、上記で考察されるように、それは、全体的なＤＣ有効性の反映であり得る。この仮説は、生存とａＤＣの表面でのＭＨＣ−ＩＩおよびＣＤ８６（重要なＤＣ成熟化のマーカー）の発現との間の相関的傾向によって裏付けられる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ａｎｄ  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４９：４１９−４２６，  ２００７）。
【０１０９】
活性化されたＤＣ（ａＤＣ）が、固形腫瘍を有する患者にとっての安全で、実現可能な処置選択肢であることは、本明細書で示されてきた。特定のサイトカインが、１もしくはこれより多くがａＤＣによって分泌される場合に、疾患の安定化をもたらし、長期間の生存を生じることが同定された。上記のデータを考慮すると、ａＤＣが、切除できない、局所的に進行したまたは転移性の固形腫瘍を有する患者の生存を、複数の固形腫瘍における顕著な毒性なしで延ばすための有望な処置であり、局所的および全身的な免疫応答を誘起し得ることは、明らかである。臨床転帰（例えば、疾患の安定化および生存）は、インビトロでのサイトカイン生成のようなＤＣ有効性尺度と有意に関連する。
【０１１０】
本明細書での結果に基づいて、（ｉ）活性化された樹状細胞の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射が安全でありかつ十分に許容される；（ｉｉ）活性化されたＤＣのｉ．ｔ．注射後の臨床転帰が、サイトカイン生成によって測定されるＤＣ有効性と相関する；（ｉｉｉ）個々のサイトカインが、臨床転帰パラメーターとの異なる関連性を示す、ということが見出された。これは、ＤＣ機能と、考えられる治療上の利益との間の複雑な相関を示唆する。
【０１１１】
例証的な実施形態が例証されかつ記載されてきた一方で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の変更がそこで行われ得ることは認識される。
独占的所有権または独占権が請求される本発明の実施形態は、以下のとおりに定義される。
【図１】
2018537949.tif 000006
【図２ＡＢ】
2018537949.tif 000007
【図２ＣＤ】
2018537949.tif 000008
【図２ＥＦ】
2018537949.tif 000009
【図３】
2018537949.tif 000010
【国際調査報告】
2018537949.tif 000011
2018537949.tif 000012