(57)【要約】  本明細書では、水、スクロースおよび１種以上のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応を開示する。これらの反応において使用されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンの生成を可能にする所定のモチーフを含む。
2018518179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここで前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでおらず；
ここで前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する反応溶液。
【請求項２】
前記触媒ドメインは、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の反応溶液。
【請求項３】
（Ａ）配列番号７８と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列する；
（Ｂ）配列番号７９と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列する；および／または
（Ｃ）配列番号８０と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する、請求項２に記載の反応溶液。
【請求項４】
モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含み、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含み、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む、請求項１に記載の反応溶液。
【請求項５】
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合を有するポリα−１，３−グルカンを合成する、請求項１に記載の反応溶液。
【請求項６】
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも４００のＤＰｗを有するポリα−１，３−グルカンを合成する、請求項１に記載の反応溶液。
【請求項７】
不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する方法であって：
（ａ）少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここで前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでおらず；
これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される工程；
および
ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記ポリα−１，３−グルカンを単離する工程を含む方法。
【請求項８】
前記触媒ドメインは、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式中、
（１）配列番号７８と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列する；
（２）配列番号７９と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列する；および／または
（３）配列番号８０と少なくとも９０％同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含み、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含み、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において１００％のα−１，３−グリコシド結合を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において少なくとも４００のＤＰｗを有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定するための方法であって：：
グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の少なくとも１つのモチーフの存在を検出する工程であって、前記少なくとも１つのモチーフは：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフからなる群から選択され、
これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記検出する工程は：
（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
（ｃ）タンパク質シークエンシング工程を含む方法を用いて、および／または
（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出する工程は、前記触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のそれぞれの存在を検出する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／１８０，７７９号明細書（２０１５年６月１７日出願）および同第６２／１８０，７８８号明細書（２０１５年６月１７日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、酵素触媒反応の分野に含まれる。例えば、本開示は、所定のアミノ酸配列モチーフを有するグルコシルトランスフェラーゼを使用して直鎖状ポリα−１，３−グルカンを生成する工程に関する。
【０００３】
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１６年６月１４日作成の２０１６０６１５＿ＣＬ６４５２ＵＳＮＰＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５＿ＥｘｔｒａＬｉｎｅｓＲｅｍｏｖｅｄ．ｔｘｔのファイル名を備え、７０４キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
微生物もしくは植物宿主の酵素合成または遺伝子工学を使用して新規な構造の多糖類を見出したいという欲求に推進されて、研究者らは、生分解性であって、再生可能な起源の供給原料から経済的に製造できる多糖類を発見するに至った。そのような多糖類の１つは、α−１，３−グリコシド結合を有することを特徴とするグルカンポリマーであるポリα−１，３−グルカンである。このポリマーは、スクロースの水溶液とストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）酵素とを接触させることによって単離されてきた（非特許文献１）。
【０００５】
特許文献１は、Ｓ．サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素を使用する多糖類繊維の調製物を開示した。この繊維のポリマー内の少なくとも５０％のヘキソース単位は、α−１，３−グリコシド結合を介して連結された。Ｓ．サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素は、最終生成物としてのポリα−１，３−グルカンおよびフルクトースを生成する重合反応における基質としてスクロースを利用する（Ｓｉｍｐｓｏｎら，１９９５）。開示されたポリマーは、溶媒中または溶媒を含む混合液中に臨界濃度を超えて溶解されると、液晶溶液を形成した。この溶液から、繊維用途において紡糸して使用することができる長く強い綿様繊維が得られた。
【０００６】
紡糸に使用するために好適なα−１，３−グリコシド結合の分子量およびパーセンテージを備えるグルカンを全てのグルコシルトランスフェラーゼ酵素が生成できるわけではない。例えば、大多数のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも５０％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の数平均重合度を有するグルカンを生成しない。このため、スクロースから高パーセンテージのα−１，３−グリコシド結合および高分子量を有するグルカンポリマーへ変換させることができるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７００００００号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｉｍｐｓｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１４５１−１４６０，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書では、所定のアミノ酸モチーフを含有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応が開示される。これらの酵素は、高分子量の直鎖状ポリα−１，３−グルカンポリマーを合成することができる。さらに、そのような酵素を同定するための方法もまた開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの実施形態では、本開示は、水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含まず、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する反応溶液に関する。
【００１１】
また別の実施形態では、触媒ドメインは、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
また別の実施形態では、配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列し、配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列し、および／または配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸の位置は配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する。
【００１３】
また別の実施形態では、モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含み、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含み、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む。
【００１４】
また別の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合を有するポリα−１，３−グルカンを合成する。
【００１５】
また別の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも４００のＤＰｗを有するポリα−１，３−グルカンを合成する。
【００１６】
本開示のまた別の実施形態は、不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する方法に関する。本方法は：（ａ）少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでおらず；これにより少なくとも９５％のα−１，３グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される工程、およびｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたポリα−１，３−グルカンを単離する工程を含む。
【００１７】
また別の実施形態では、触媒ドメインは、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一性を備えるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
また別の実施形態では、配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列し、配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列し、および／または配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する。
【００１９】
また別の実施形態では、モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含み、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含み、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む。
【００２０】
また別の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合を有するポリα−１，３−グルカンを合成する。
【００２１】
また別の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも４００のＤＰｗを有するポリα−１，３−グルカンを合成する。
【００２２】
本開示のまた別の実施形態は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法に関する。本方法は、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の少なくとも１つのモチーフの存在を検出する工程であって、少なくとも１つのモチーフは：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフからなる群から選択され；
これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む。
【００２３】
また別の実施形態では、検出する工程は、（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ（コンピューター）内で、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、（ｃ）タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、および／または（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施される。
【００２４】
また別の実施形態では、検出する工程は、触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のそれぞれの存在を検出する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＴＦ（グレー）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＧＴＦ（黒色）の主鎖三次フォールドの比較を示す図である。Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＴＦの構造には、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）ＧＴＦの構造から切断された第５ドメイン（ドメインＶ）が含まれる。活性部位もまた指示されており、中心ドメイン内の空洞によって形成される（いわゆるＡドメインおよびＢドメイン）；この場所は、αアミラーゼ内の類似のドメインとの空間的類似性に基づく。Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）３ＡＩＥ  ＧＴＦ構造のアミノ酸配列は配列番号６６であり、Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）３ＫＬＫ  ＧＴＦ構造のアミノ酸配列は、配列番号６７である。
【図２−１】２４のＧＴＦ配列とそれらの結晶学構造が公知であるＳ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）（３ＡＩＥ、配列番号６６）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）（３ＫＬＫ、配列番号６７）からのＧＴＦの部分の配列とのアラインメントを示す図である；一文字アミノ酸コードが使用されている。１００％のα−１，３結合および高分子量（試験した初期スクロース濃度下で少なくとも４００のＤＰｗ、表４を参照されたい）を備えるグルカンを生成したＧＴＦアミノ酸配列は、「＋＋」で指示した。１００％のα−１，３結合および少なくとも１００のＤＰｗを備えるグルカンを生成するそれらのＧＴＦは、「＋−」で指示した。混合結合を備えるグルカンを生成する他のＧＴＦは、「−−」で指示した。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図２−５】図２−４の続き。
【図２−６】図２−５の続き。
【図２−７】図２−６の続き。
【図２−８】図２−７の続き。
【図２−９】図２−８の続き。
【図２−１０】図２−９の続き。
【図２−１１】図２−１０の続き。
【図２−１２】図２−１１の続き。
【図２−１３】図２−１２の続き。
【図２−１４】図２−１３の続き。
【図２−１５】図２−１４の続き。
【図２−１６】図２−１５の続き。
【図２−１７】図２−１６の続き。
【図２−１８】図２−１７の続き。
【図２−１９】図２−１８の続き。
【図２−２０】図２−１９の続き。
【図２−２１】図２−２０の続き。
【図２−２２】図２−２１の続き。
【図２−２３】図２−２２の続き。
【図２−２４】図２−２３の続き。
【図２−２５】図２−２４の続き。
【図２−２６】図２−２５の続き。
【図２−２７】図２−２６の続き。
【図２−２８】図２−２７の続き。
【図２−２９】図２−２８の続き。
【図２−３０】図２−２９の続き。
【図３−１】モチーフ１ａおよび１ｂの近くにある試験したＧＴＦ酵素の配列を示す図である。モチーフ１ａおよび１ｂの配列領域は、上流および下流フランキング参照配列モチーフと一緒に囲み領域内に示した。モチーフ１ａおよび１ｂは、「挿入１」と表示した囲み内に位置する。この図におけるアラインメントは、図２におけるアラインメントの一部分を表す。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４】図４ａ−４ｂは、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）（３ＡＩＥ、配列番号６６）（図４ａ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）（３ＫＬＫ、配列番号６７）（図４ｂ）の参照結晶学構造に基づくＧＴＦ７５２７（配列番号６５）のホモロジーモデルの比較を通したモチーフの可視化を示す図である。各画像内のホモロジーモデルの主鎖フォールディングは暗線で示し、参照構造の主鎖フォールディングは明線で示した。参照結晶学構造内で触媒部位を形成する残基は、参照のためにファン・デル・ワールス球として示した。モチーフ１ａ（矢印間）は、ＧＴＦ触媒ドメインの残りに比較してポジショニングする手段を提供するための相同セグメントが存在しない結果として、溶媒中に伸展するオープンループ（黒色）として両方のホモロジーモデル内で提示した。
【図５−１】モチーフ２の近くでの試験したＧＴＦ酵素の配列を示す図である。モチーフ２の配列領域は、上流および下流フランキング参照配列モチーフと一緒に囲み領域内に示した。モチーフ２は、「挿入２」と表示した囲み内に位置する。この図におけるアラインメントは、図２におけるアラインメントの一部分を表す。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】図６ａ−６ｂは、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）（３ＡＩＥ、配列番号６６）（図６ａ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）（３ＫＬＫ、配列番号６７）（図６ｂ）の参照結晶学構造に基づくＧＴＦ７５２７（配列番号６５）のホモロジーモデルの比較を通したモチーフ２の可視化を示す図である。各画像内のホモロジーモデルの主鎖フォールディングは暗線で示し、参照構造の主鎖フォールディングは明線で示した。参照結晶学構造内で触媒部位を形成する残基は、参照のためにファン・デル・ワールス球として示した。モチーフ２（矢印間）は、ＧＴＦ触媒ドメインの残りに比較してポジショニングする手段を提供するための相同セグメントが存在しない結果として、溶媒中に伸展するオープンループ（黒色）として両方のホモロジーモデル内で提示した。
【図７】モチーフ３ａおよび３ｂの近くでの試験ＧＴＦ酵素の配列を示す図である。モチーフ３ａおよび３ｂの配列領域は、上流および下流フランキング参照配列モチーフと一緒に囲み領域内に示した。モチーフ３ａおよび３ｂは、「挿入３」と表示された囲み内に位置する。この図におけるアラインメントは、図２におけるアラインメントの一部分を表す。
【図８】図８ａ−８ｂは、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）（３ＡＩＥ、配列番号６６）（図８ａ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）（３ＫＬＫ、配列番号６７）（図８ｂ）の参照結晶学構造に基づくＧＴＦ７５２７（配列番号６５）のホモロジーモデルの比較を通したモチーフ３ａの可視化を示す図である。各画像内のホモロジーモデルの主鎖フォールディングは暗線で示し、参照構造の主鎖フォールディングは明線で示した。参照結晶学構造内で触媒部位を形成する残基は、参照のためにファン・デル・ワールス球として示した。モチーフ３ａ（矢印間）は、ＧＴＦ触媒ドメインの残りに比較してポジショニングする手段を提供するための相同セグメントが存在しない結果として、溶媒中に伸展するオープンループ（黒色）として両方のホモロジーモデル内で提示した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
【表１】
2018518179.tif 000003
【００２７】
【表２】
2018518179.tif 000004
【００２８】
【表３】
2018518179.tif 000005
【００２９】
【表４】
2018518179.tif 000006
【００３０】
【表５】
2018518179.tif 000007
【００３１】
【表６】
2018518179.tif 000008
【００３２】
本明細書に引用した全ての特許文献および非特文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００３３】
他に特に開示しない限り、本明細書で使用する用語「１つの」は、参照した特徴の１つ以上（つまり、少なくとも１つ）を含むことが意図されている。
【００３４】
存在する場合、他に特に記載されていない限り、すべての範囲は、包括的および結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が記載された場合、記載された範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈すべきである。
【００３５】
用語「ポリα−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカンポリマー」、「グルカンポリマー」などは、本明細書において互換可能に使用される。ポリα−１，３−グルカンは、グリコシド結合により一緒に結合されるグルコースモノマー単位を含むポリマーであり、ここで少なくとも約５０％のグリコシド結合はα−１，３−グリコシド結合である。所定の実施形態におけるポリα−１，３−グルカンは、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合を含む。
【００３６】
用語「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）」および「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）」などは、本明細書において互換可能に使用され、炭水化物（糖）分子を例えばまた別の炭水化物などの別の基に結合させる共有結合を意味する。本明細書において使用する用語「α−１，３−グリコシド結合」は、α−Ｄ−グルコース分子を、隣接するα−Ｄ−グルコース環上の１位および３位の炭素を介して相互に結合させる共有結合のタイプを指す。本明細書のα−１，３−グルカンのグリコシド結合は、さらに「グルコシド結合」と呼ぶこともできる。本明細書では、「α−Ｄ−グルコース」は、「グルコース」と呼ばれるであろう。
【００３７】
本明細書で使用する用語「固有粘度」は、グルカンポリマーを含む液体（例えば、溶液）の粘度へのグルカンポリマー（例えば、分岐状α−グルカン）の寄与の尺度を意味する。固有粘度は、例えば、下記の実施例に開示した方法、または例えば、Ｗｅａｖｅｒら（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．３５：１６３１−１６３７）およびＣｈｕｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５：７０１−７１１）によって開示されたように測定することができる。
【００３８】
用語「分岐指数」、「分岐比」など（ｇ’と表示することができる）は、本明細書では互換的に使用され、所定のモル質量を備える分岐状ポリマー鎖の流体力学的体積対同一モル質量を備える直鎖状ポリマー鎖の流体力学的体積の比率を意味する。分岐状ポリマーは、液状では同一モル質量を備えるその直鎖状対応物より小さなサイズを有する。したがって、分岐比は、多分散ポリマー内の全分岐頻度の有用な尺度である。分岐指数は、例えば、下記の実施例に開示した方法を使用して、またはＺｄｕｎｅｋら（Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：３５２５−３５３５）およびＨｅｒｇｅｔら（ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：３５）によって開示されたように測定することができる。
【００３９】
本明細書の用語「スクロース」は、α−１，２−グリコシド結合によって連結されたα−Ｄ−グルコース分子およびβ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元型二糖を意味する。スクロースは、一般には砂糖として知られている。
【００４０】
用語「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ＧＴＦ酵素」、「ＧＴＦ」、「グルカンスクラーゼ」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書のＧＴＦ酵素の活性は、生成物であるポリα−１，３−グルカンおよびフルクトースを作成するための基質スクロースの反応を触媒する。ＧＴＦ反応の他の生成物（副生成物）は、グルコース、様々な可溶性グルコーオリゴ糖（ＤＰ２〜ＤＰ７）およびロイクロースを含む可能性がある。ＧＴＦ酵素の野生型形は、一般に（Ｎ末端からＣ末端方向に）シグナルペプチド、可変ドメイン、触媒ドメインおよびグルカン結合ドメインを含有する。本明細書のＧＴＦは、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）によると、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類される。
【００４１】
本明細書の用語「グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素にポリα−１，３−グルカン合成活性を提供するグルコシルトランスフェラーゼ酵素のドメインを意味する。グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、好ましくはこの活性を有する任意の他のドメインの存在を必要としない。
【００４２】
本明細書で使用する「反応溶液」は、一般にスクロース、水、少なくとも１つの活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素および任意選択的に他の成分を含む溶液を意味する。反応溶液は、または本明細書では、例えば「グルカン合成反応」、「グルカン反応」、「ＧＴＦ反応」または「反応組成物」と呼ぶことができる。グルカン合成反応に含まれる可能性がある他の成分には、フルクトース、グルコース、ロイクロースおよび可溶性グルコーオリゴ糖（例えば、ＤＰ２〜ＤＰ７）が含まれる。例えば、少なくとも８もしくは９の重合度（ＤＰ）を備えるポリα−１，３−グルカンなどの所定のグルカン生成物は水不溶性であるので、そこでグルカン合成反応においては溶解されず、むしろ溶液外に存在する可能性があることは理解されるであろう。所定のグルカン生成物は、水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程が実施される反応溶液中にある。本明細書で使用する用語「好適な反応条件下」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を介してスクロースからポリα−１，３−グルカンへの変換を支持する反応条件を意味する。本明細書で要求した反応溶液は、天然型ではないと考えられる。
【００４３】
反応溶液の「乾燥固体率」は、グルカン合成反応中の糖全部に対する重量％を意味する。反応溶液の乾燥固体率は、例えば、反応を調製するために使用されるスクロースの量に基づいて計算することができる。
【００４４】
本明細書の反応溶液によるポリα−１，３−グルカンの「収率」は、反応において変換させられるスクロース基質の重量のパーセンテージとして表示されるポリα−１，３−グルカン生成物の重量を表す。例えば、反応溶液中の１００ｇのスクロースが生成物に変換させられ、１０ｇの生成物がポリα−１，３−グルカンである場合、ポリα−１，３−グルカンの収率は１０％となるであろう。この収率計算は、ポリα−１，３−グルカンに向かう反応の選択性の尺度であると見なすことができる。
【００４５】
本明細書の用語「モチーフ」は、例えばアミノ酸配列内の特徴的な繰り返し構造単位を意味する。「繰り返し」は、例えば、１つのモチーフが複数の関連ポリペプチド内で発生することを意味する。
【００４６】
本明細書で使用する用語「モチーフ（ｉ）」は、配列番号７８と少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列を意味する（モチーフ１ａ、表１）。
【００４７】
本明細書で使用する用語「モチーフ（ｉｉ）」は、配列番号７９と少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列を意味する（モチーフ２、表１）。
【００４８】
本明細書で使用する用語「モチーフ（ｉｉｉ）」は、配列番号８０と少なくとも９０％同一である配列を含むアミノ酸配列を意味する（モチーフ３ａ、表１）。
【００４９】
用語「体積によるパーセント」、「体積パーセント」、「体積％」、「ｖ／ｖ％」などは、本明細書では互換的に使用される。溶液中の溶質の体積によるパーセントは、次式：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％を用いて決定することができる。
【００５０】
用語「重量によるパーセント」、「重量パーセンテージ（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）」などは、本明細書では互換的に使用される。重量によるパーセントは、それが組成物中、混合物中もしくは溶液中に含まれるかのように質量ベースでの物質のパーセンテージを意味する。
【００５１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」などは、本明細書では互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり、任意選択的に合成、非天然もしくは改変ヌクレオチド塩基を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマーであってよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混合物のうちの１つ以上のセグメントから構成されてよい。ヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド）は、以下の一文字略称によって呼ぶことができる：アデニル酸もしくはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対して）について「Ａ」、シチジル酸またはデオキシチジル酸（ＲＮＡまたはＤＮＡそれぞれに対して）について「Ｃ」、グアニル酸またはデオキグアニル酸（ＲＮＡまたはＤＮＡそれぞれに対して）について「Ｇ」、ウリジル酸（ＲＮＡに対して）について「Ｕ」、デオキシチミジル酸（ＤＮＡに対して）について「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）について「Ｙ」、ＧまたはＴについて「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」、ＡまたはＴについて「Ｗ」、そして任意のヌクレオチドについて「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列に言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＴまたはＧであってよく；ＲＮＡ配列に言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＵまたはＧであってよい）。
【００５２】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、コーディング領域からＲＮＡ（ＲＮＡはＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し、そのＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（タンパク質をコードする）または非タンパク質コーディングＲＮＡであってよい。遺伝子は、コーディング領域単独を意味する場合がある、またはコーディング領域への上流および／または下流の調節配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’転写ターミネーター領域）を含む場合がある。またはタンパク質をコードするコーディング領域は、本明細書では「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼ぶことができる。「天然」もしくは「内因性」である遺伝子は、固有の調節配列を備える自然界で見いだされる遺伝子を意味する；そのような遺伝子は、宿主細胞のゲノム内の自然な場所に所在する。「キメラ」遺伝子は、天然遺伝子ではない、自然には一緒に見いだされることのない調節配列およびコーディング配列を含む（すなわち、調節配列およびコーディング配列は相互に異種である）、あらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列を含む可能性がある、または同一起源に由来するが、自然に見いだされるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含む可能性がある。「外来」もしくは「異種」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生体内に導入される遺伝子を意味する。外来／異種遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主の新たな場所に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含む可能性がある。本明細書の所定の実施形態内のポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、遺伝子導入手法（例えば、形質転換）によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する。
【００５３】
本明細書に記載の細胞または生物に含まれる本明細書の「非天然」アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、そのような細胞もしくは生物の天然（自然）対応物中では発生しない。
【００５４】
本明細書で使用する「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）、５’非翻訳領域、イントロンおよび３’非コーディング領域を指し、遺伝子から転写されるＲＮＡの転写、プロセシングもしくは安定性および／または翻訳に影響を及ぼす可能性がある。本明細書の調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造および遺伝子発現の調節に関連する他の要素を含む可能性がある。本明細書の１つ以上の調節要素は、本明細書のコーディング領域に対して異種であってよい。
【００５５】
本明細書中で使用する「プロモーター」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してよい、自然界に見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成されてよい、またはいっそう合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。あらゆる状況下のほとんどの時点で遺伝子が細胞内で発現することを誘発するプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。本明細書における１つ以上のプロモーターは、本明細書のコーディング領域にとって異種であってよい。
【００５６】
本明細書で使用する「強力プロモーター」は、単位時間当たり相当に多数の生産開始を導くことができるプロモーターを指示できるプロモーター、および／または細胞内の遺伝子の平均転写レベルよりも高いレベルの遺伝子転写を駆動するプロモーターである。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「３’非コーディング配列」、「転写ターミネーター」、「ターミネーター」などは、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。
【００５８】
本明細書で使用するように、第１核酸配列は、第１核酸配列の一本鎖形が好適なアニーリング条件（例えば、温度、溶液イオン強度）下で第２核酸配列にアニーリングできる場合は第２核酸配列に「ハイブリダイズする」ことができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、周知であり、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章および表１１．１の中で例証されている。
【００５９】
用語「ＤＮＡ操作技術」は、ＤＮＡポリヌクレオチド配列の配列が改変させられる任意の技術を意味する。改変されているＤＮＡポリヌクレオチド配列は改変のための基質自体として使用できるが、ＤＮＡポリヌクレオチド配列は所定の技術のために物理的に所有されている必要はない（例えば、コンピューター内に保存された配列を操作技術のための基礎として使用することができる）。ＤＮＡ操作技術は、より長い配列内で１つ以上のＤＮＡ配列を欠失および／または突然変異させるために使用することができる。ＤＮＡ操作技術の例としては、組換えＤＮＡ技術（制限およびライゲーション、分子クローニング）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および合成ＤＮＡ法（例えば、オリゴヌクレオチド合成およびライゲーション）が挙げられる。合成ＤＮＡ技術に関して、ＤＮＡ操作技術は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＤＮＡポリヌクレオチドを観察する工程、ＤＮＡポリヌクレオチドの所望の改変（例えば、１つ以上の欠失）を決定する工程、および所望の改変を含有するＤＮＡポリヌクレオチドを合成する工程を必要とする可能性がある。
【００６０】
本明細書の用語「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」は、例えばコンピューターなどの情報記憶および／またはプロセシング装置内および上で；コンピューターソフトウエアもしくはシミュレーションを使用して実施もしくは生成されること、すなわちバーチャルリアリティを意味する。
【００６１】
用語「カセット」、「発現カセット」、「遺伝子カセット」などは、本明細書では互換的に使用される。カセットは、タンパク質コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーターを意味することができる。カセットは、任意選択的に３’非コーディング配列に機能的に連結していてよい。本明細書のカセットの構造は、任意選択的に、「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純表記表によって表すことができる。詳細には、Ｘはプロモーターを表し、Ｙはコーディング配列を表し、Ｚはターミネーター（任意選択的）を表す；Ｘは、Ｙに機能的に連結しており、およびＹはＺに機能的に連結している。
【００６２】
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用する用語「上流」および「下流」は、それぞれ、「５’」および「３’」を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する用語「発現」は、（ｉ）コーディング領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくは非タンパク質コーディングＲＮＡ）の転写、および／または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を意味する。ポリヌクレオチド配列のコーディング領域の発現は、所定の実施形態では、アップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。
【００６４】
本明細書で使用する用語「機能的に連結した」は、一方の機能が他方の機能により影響されるような２つ以上の核酸配列の会合を意味する。例えば、プロモーターがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼせる場合、プロモーターはコーディング配列と機能的に連結している。すなわち、コーディング配列は、プロモーターの転写調節下にある。コーディング配列は、例えば、１つ（例えば、プロモーター）または２つ以上（例えば、プロモーターおよびターミネーター）の調節配列と機能的に連結させることができる。
【００６５】
本明細書で例えばプラスミド、ベクターまたは構築物などのＤＮＡ配列を特徴付けるために本明細書で使用する場合の用語「組み換え」は、例えば化学合成により、および／または遺伝子工学技術による核酸の分離セグメントの操作によって、２つのさもなければ分離した配列のセグメントの人工的組合せを意味する。本明細書の組換え構築物／ベクターを調製するための方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）によって記載された標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術にしたがうことができる。
【００６６】
本明細書で使用する用語「形質転換」は、任意の方法によって核酸分子を宿主生物または宿主細胞に移すことを指す。生物／細胞に形質転換されている核酸分子は、生物／細胞中で自律的に複製する分子、生物／細胞のゲノムに組み込まれる分子または複製もしくは組み込みされずに細胞内に一時的に存在する分子であってよい。例えばプラスミドおよび直鎖状ＤＮＡ分子などの、形質転換のために好適な核酸分子の非限定的な例は、本明細書に開示されている。形質転換核酸配列を含有する本明細書に記載の宿主生物／細胞は、例えば、「トランスジェニック」、「組み換え」、「形質転換（された）」、「遺伝子組換え（された）」、「形質転換体」、および／または「外因性遺伝子発現のために改変（された）」と称することができる。
【００６７】
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列に関して本明細書で使用する用語「配列同一性」もしくは「同一性」は、特定の比較窓にわたって最高一致について整列させた場合に同一である、２つの配列内の核酸塩基もしくはアミノ酸残基に関する。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」もしくは「同一性率（％）」は、比較窓にわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定される数値を意味するが、このとき比較窓内のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適整列のための参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較して付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含む可能性がある。パーセンテージは、マッチ位置数を生じさせるために両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、マッチ位置数を比較窓内の位置の総数で割り、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果に１００を掛けることによって計算される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列同一性を計算した場合に、ＤＮＡ配列のＴ残基がＲＮＡ配列のＵ残基と一致すれば「同一」と見なせると理解されるであろう。第１および第２ポリヌクレオチドの「相補率」を決定するためには、例えば、（ｉ）第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドの相補配列（またはその逆）との同一性率、および／または（ｉｉ）正準ワトソン＆クリック塩基対を作り出すであろう第１および第２ポリヌクレオチド間の塩基のパーセンテージを決定することによってこれを得ることができる。
【００６８】
オンラインにより全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用できるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のアルゴリズムを使用すると、例えば、本明細書で開示する、２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間の同一性率を測定することができる。または、配列間の同一性率は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶもしくはＣｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ）を使用して実施することができる。Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法を使用するマルチプルアラインメントについては、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する可能性がある。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列のパーセント相同性計算のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。核酸については、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であってよい。またはさらに、配列間の同一性率は、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用して、例えば、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝フォールス、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５などのパラメーターを用いるＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えば、ニードル）を使用して実施することができる。
【００６９】
本明細書では、様々なポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、所定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書に開示した配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％または９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変異体を使用する、または参照することができる。または、変異アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示した配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有することができる。変異アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能／活性または開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、典型的には、アミノ酸配列のＮ末端で少なくとも１つの開始メチオニンをさらに含む可能性がある。
【００７０】
本明細書に開示したタンパク質の各アミノ酸位置の全てのアミノ酸残基は、例である。
所定のアミノ酸が相互に類似の構造的特徴および／または荷電特徴を共有する（すなわち、保存されている）ことを前提にすると、本明細書のタンパク質の各位置でのアミノ酸は、本明細書に開示した配列で提供されるようなアミノ酸であってよい、または以下のように、保存アミノ酸残基で置換されていてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．次の小さな脂肪族の非極性もしくは弱極性の残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．次の極性の負荷電残基およびそれらのアミドは、相互に置換することができる：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．次の極性の正荷電残基は、相互に置換することができる：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．次の脂肪族の非極性残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；および
５．次の大きな芳香族残基は、相互に置換することができる：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００７１】
本明細書で使用する用語「単離（された）」は、その天然源から完全に、または部分的に精製されているポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子を意味する。一部の例では、単離ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子は、より大きな組成物、バッファー系または試薬ミックスの一部である。例えば、分離されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチド分子は、細胞または生物の内部に異種的方法で含まれる可能性がある。本明細書の「単離（された）」は、さらに合成／人工である実施形態、および／または天然型ではない特性を有する実施形態を特徴付けることができる。
【００７２】
本明細書で使用する用語「増加（した）」は、それに対して増加した量または活性が比較される量もしくは活性より少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％または２００％以上である量もしくは活性を意味することができる。用語「増加（した）」、「上昇（した）」、「増強（された）」、「より多い」、「改善（された）」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００７３】
高分子量の直鎖状α−１，３−グルカンポリマーを合成できるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、需要が多い。したがって、本明細書に開示した一部の実施形態は：水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、２０、２８、３０、６５、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０、配列番号２０の５５〜９６０を含んでいない反応溶液に関する。重要にも、そのような反応溶液中のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する。大部分もしくは完全に直鎖状であるそのようなグルカンは、紡糸および他の産業用途において使用するために好適である。
【００７４】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素により生成されたポリα−１，３−グルカンの分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）もしくはＤＰｎ（数平均重合度）として測定することができる。または、本明細書のポリα−１，３−グルカンの分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）もしくは重量平均分子量（Ｍｗ）として測定することができる。またはさらに、分子量は、ダルトンもしくはグラム／モルによって測定できる。
【００７５】
所定の実施形態におけるポリα−１，３−グルカンは、少なくとも約１００のＤＰｗもしくはＤＰｎでの分子量を有する可能性がある。例えば、分子量は、少なくとも約４００ＤＰｗもしくはＤＰｎであってよい。さらにまた別の実施形態におけるＤＰｗもしくはＤＰｎは、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１，０００（または１００〜１，０００の間の任意の整数）であってよい。
【００７６】
ポリα−１，３−グルカンの分子量は、当分野において公知の数種の手段のいずれかを使用して測定できる。例えば、グルカンポリマー分子量は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して測定できる。
【００７７】
所定の実施形態におけるポリα−１，３−グルカンは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のα−１，３−グリコシド結合を有する。したがって、一部の実施形態では、ポリα−１，３−グルカンは、約５％、４％、３％、２％、１％もしくは０％未満のα−１，３ではないグリコシド結合を有する。ポリα−１，３−グルカン内に存在するα−１，３−グリコシド結合のパーセンテージが高いほど、ポリマー内で分岐点を形成する所定のグリコシド結合の発生率がより低くなるので、ポリα−１，３−グルカンが直鎖状である確率が高くなることを理解すべきである。したがって、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備えるポリα−１，３−グルカンは、完全に直鎖状である。所定の実施形態では、ポリα−１，３−グルカンは、分岐点を有していない、またはポリマー内のグリコシド結合のパーセントとして約５％、４％、３％、２％または１％未満の分岐点を有する。分岐点の例としては、α−１，６分岐点が挙げられる。
【００７８】
本明細書のポリα−１，３−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３ＣＮＭＲまたは１ＨＮＭＲ）を使用する方法を用いて決定することができる。使用できるこれらや他の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＦｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されている。
【００７９】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素によって生成されたポリα−１，３−グルカンは、典型的にはほとんどの水性系中で不溶性である。一般に、水性系中のグルカンポリマーの溶解度は、その結合タイプ、分子量および／または分岐度に関連する。ポリα−１，３−グルカンは、一般に２０℃の水性（もしくは大部分が水性の）液体中で８以上のＤＰｗで不溶性である。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、本明細書に開示したポリα−１，３−グルカンを生成することができる。
【００８０】
所定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であり、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに含む。または、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、例えば、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％（しかし１００％ではない）同一であるアミノ酸配列を含むことができ、およびグルコシルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
【００８１】
配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）、３０（ＧＴＦ２６７８）、４（ＧＴＦ６８５５）、２８（ＧＴＦ２９１９）および２０（ＧＴＦ２７６５）は、それぞれの野生型対応物と比較して、シグナルペプチドドメインならびに可変ドメインの全部分もしくは実質的部分が欠如するグルコシルトランスフェラーゼを表す。したがって、これらのグルコシルトランスフェラーゼ酵素のそれぞれは、後にグルカン結合ドメインが続く触媒ドメインを有する。これらの酵素内の触媒ドメイン配列の近似場所は、次の通りである：７５２７（配列番号６５の残基５４〜９５７）、２６７８（配列番号３０の残基５５〜９６０）、６８５５（配列番号４の残基５５〜９６０）、２９１９（配列番号２８の残基５５〜９６０）、２７６５（配列番号２０の残基５５〜９６０）。ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９および２７６５の触媒ドメインのアミノ酸配列は、７５２７の触媒ドメイン配列（すなわち、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７）とのそれぞれ約９４．９％、９９．０％、９５．５％および９６．４％の同一性を有する（表４）。これらの特定のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも４００のＤＰｗを備えるポリα−１，３−グルカンを生成することができる（表４）。したがって、所定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９もしくは２７６５の触媒ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％もしくは９９．５％（しかし１００％ではない）同一であるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む、またはそれらのグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインからなる。一部の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン配列は、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでいない。
【００８２】
配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位は、ＧＩ番号４７５２７（配列番号６０）を付してＧＥＮＢＡＮＫにおいて同定されたグルコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン配列を近似的に表す。配列番号６５は、一般に配列番号６０の触媒ドメインおよびグルカン結合ドメインを表す；シグナルペプチドおよび可変ドメインは、配列番号６５から欠如している。実施例１４に示したように、配列番号６５の触媒ドメイン配列（残基５４〜９５７）は、ポリα−１，３−グルカンの生成を触媒することができた。実施例１４は、さらに配列番号１４の触媒ドメイン配列（配列番号１４の残基５７〜９０６［ＧＴＦ５９２６］）は、ポリα−１，３−グルカンの生成を触媒することができた。これらの触媒ドメイン配列それぞれによって生成されたポリα−１，３−グルカンの分子量は、概して、触媒ドメインおよびグルカン結合ドメインの両方を含有するそれらの酵素対応物によって生成された生成物の分子量と一致した（表４における配列番号６５および１４の活性、ＤＰｗ１５０を意味する）。したがって、本明細書の触媒ドメイン配列は、ポリα−１，３−グルカンを生成することができるグルコシルトランスフェラーゼ酵素にとっての重要な構造的成分であると考えられる。
【００８３】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は例えば配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位（または配列番号３０の５５〜９６０位、配列番号４の５５〜９６０位、配列番号２８の５５〜９６０位もしくは配列番号２０の５５〜９６０位）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む配列などの触媒ドメイン配列だけを有する必要があると考えられているが、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、より大きなアミノ酸配列内に含めることができる。例えば、触媒ドメインはそのＣ末端でグルカン結合ドメインに連結させることができる、および／またはそのＮ末端で可変ドメインおよび／またはシグナルペプチドに連結させることができる。
【００８４】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素のさらにまた別の例は、本明細書に開示した、およびＮ末端および／またはＣ末端上の１〜３００（または、その間の任意の整数［例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０］）個の残基を含むいずれかであってよい。そのような追加の残基は、それにグルコシルトランスフェラーゼ酵素が由来する対応する野生型配列由来であってよい、または例えば、（Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかでの）エピトープタグもしくは（Ｎ末端での）異種シグナルペプチドなどの異種配列であってよい。
【００８５】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素には、典型的にはＮ末端シグナルペプチドが欠如する。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を生成するための発現系は、所望であれば、細胞外分泌を指示するＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む、酵素コーディングポリヌクレオチドを使用することができる。そのような実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌工程中に酵素から切断される。シグナルペプチドは、グルコシルトランスフェラーゼに対して天然および異種のいずれであってもよい。本明細書において有用なシグナルペプチドの例は、細菌種（例えば、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）または真菌種由来のシグナルペプチドである。細菌シグナルペプチドの例は、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来などのａｐｒＥシグナルペプチドである（例えば、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＶｏｇｔｅｎｔａｎｚら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５５：４０−５２を参照されたい）。
【００８６】
図２は、ＧＴＦ７５２７の触媒ドメイン配列（配列番号６５の残基５４〜９５７）が数種の他のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン配列と整列することを示しており、数個の領域は配列全体にわたり完全な保存（暗色の背景を備える残基）を示している。図２における暗色の背景残基は、各配列の触媒ドメインを視覚的にマッピングしており、これはそれらの長さが約８５０〜９００アミノ酸残基長であることを示している。したがって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメインは、例えば、約８００〜９５０（または８００〜９５０の間の任意の整数）アミノ酸残基長であってよい。
【００８７】
図２における所定の保存領域には、配列番号６８、６９、７０および７１の触媒活性部位モチーフが含まれる（実施例３を参照されたい）。したがって、一部の態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン配列は、それぞれ配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７内に存在するような配列番号６８、６９、７０および７１とアラインメントしている配列番号６８、６９、７０および７１のうちの１つ以上を含有することができる。図２における他の保存領域には、配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７が含まれる（実施例４を参照されたい）。したがって、一部の態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン配列は、それぞれ配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７内に存在するような配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７とアラインメントしている配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７のうちの１つ以上を含有することができる。
【００８８】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメインは、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類されるグルコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインによって示されるような活性を有することができる。そのようなＧＨ７０グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）の中に見いだすことができる。
【００８９】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む可能性がある。
モチーフ（ｉ）は、「モチーフ１ａ」と一致する（図３）。モチーフ（ｉｉ）は、「モチーフ２」と一致する（図５）。モチーフ（ｉｉｉ）は、「モチーフ３ａ」と一致する（図７）。
【００９０】
モチーフ（ｉ）は、配列番号７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。モチーフ（ｉｉ）は、配列番号７９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。モチーフ（ｉｉｉ）は、配列番号８０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。したがって、所定の実施形態では、モチーフ（ｉ）が配列番号７８を含む可能性があり、モチーフ（ｉｉ）が配列番号７９を含む可能性があり、およびモチーフ（ｉｉｉ）が配列番号８０を含む可能性があることは明らかである。
【００９１】
所定の実施形態におけるモチーフ（ｉ）に関して、配列番号７８（Ｄ／Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｉ／Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｓ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｈ）の第１残基はアスパラギン酸（Ｄ）であってよく、第４残基はイソロイシン（Ｉ）であってよい。または、第１残基はアスパラギン酸（Ｄ）であってよく、第４残基はバリン（Ｖ）であってよい、または第１残基はアスパラギン（Ｎ）であってよく、第４残基はイソロイシン（Ｉ）であってよい、または第１残基はアスパラギン（Ｎ）であってよく、第４残基はバリン（Ｖ）であってよい。
【００９２】
所定の実施形態におけるモチーフ（ｉｉ）に関して、配列番号７９（Ｎ−Ｋ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｋ／Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ｖ／Ａ−Ｋ−Ｑ／Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｇ−Ｋ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｓ）の第６残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１４残基はバリン（Ｖ）であってよく、および１６残基はグルタミン（Ｑ）であってよい。または、第６残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１４残基はアラニン（Ａ）であってよく、第１６残基はグルタミン（Ｑ）であってよい；または第６残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１４残基はバリン（Ｖ）であってよく、および第１６残基はリシン（Ｋ）であってよい。追加の例には、第６残基がトレオニン（Ｔ）であってよい場合が含まれる。
【００９３】
所定の実施形態におけるモチーフ（ｉｉｉ）に関して、配列番号８０（Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｎ／Ｋ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｔ−Ｎ／Ｓ−Ｅ）の第９残基は、アスパラギン（Ｎ）であってよく、第１８残基はアスパラギン（Ｎ）であってよい。または、第９残基はアスパラギン（Ｎ）であってよく、第１８残基はセリン（Ｓ）であってよい、または第９残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１８残基はアスパラギン（Ｎ）であってよい、または第９残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１８残基はセリン（Ｓ）であってよい。
【００９４】
モチーフ（ｉ）（配列番号７８）、モチーフ（ｉｉ）（配列番号７９）およびモチーフ（ｉｉｉ）（配列番号８０）の相対位置は、図２に示したＧＴＦ７５２７配列（配列番号６５）の残基２３１〜２４３、３９６〜４２５および５４９〜５６７とそれぞれ整列する。本明細書の所定の実施形態では、
（Ａ）グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列する；
（Ｂ）グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列する；および／または
（Ｃ）グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する。
【００９５】
用語「〜と整列する」は、「〜と対応する」、「〜と一致する」などと互換的に使用できる。したがってグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の相対位置は、上記の配列番号６５のアミノ酸位置を参照して決定することができる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインの配列は、例えば、上述したアラインメントアルゴリズムもしくはソフトウエア（例えば、ＢＬＡＳＴＰ，ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＣｌｕｓｔａｌＶ，ＥＭＢＯＳＳ）を使用するなど、当分野において公知の任意の手段を使用して配列番号６５と整列させることができる。
【００９６】
グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の相対位置は、所望であれば、所定の保存配列、つまり配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７を参照して決定することができる。
【００９７】
モチーフ１ａ（配列番号７８）は、図３に示したように上流および下流保存配列に隣接される。先行するモチーフ１ａは配列ＳｘｘＲｘｘＮ（配列番号７２）であり、このモチーフに続くのは配列ＧＧｘｘｘＬＬｘＮＤｘＤｘＳＮＰｘＶＱＡＥｘＬＮ（配列番号７３）である。したがって、モチーフ（ｉ）の位置は、配列番号７２と７３との間に位置決めすることができる。配列番号７２は、モチーフ（ｉ）の（上流）またはモチーフ（ｉ）の上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５（または１〜１５）個のアミノ酸残基に直接隣接する可能性がある。配列番号７３は、モチーフ（ｉ）の（下流）またはモチーフ（ｉ）の下流１、２、３、４もしくは５（または１〜５）個のアミノ酸残基に直接隣接する可能性がある。
【００９８】
モチーフ２（配列番号７９）は、図５に示したように上流および下流保存配列に隣接される。詳細には、先行するモチーフ２は配列ＷｘｘｘＤｘｘＹ（配列番号７４）であり、およびこのモチーフに続くのは配列ＹｘＦｘＲＡＨＤ（配列番号７５）である。したがって、モチーフ（ｉｉ）の位置は、配列番号７４と７５との間に位置決めすることができる。配列番号７４は、モチーフ（ｉｉ）の（上流）またはモチーフ（ｉｉ）の上流１〜６５（または１〜６５の間の任意の整数）個のアミノ酸残基に直接隣接する可能性がある。配列番号７５は、モチーフ（ｉｉ）の（下流）またはモチーフ（ｉｉ）の下流１、２、３、４もしくは５（または１〜５）個のアミノ酸残基に直接隣接する可能性がある。
【００９９】
モチーフ３ａ（配列番号８０）は、図７に示したように上流および下流保存配列に隣接される。詳細には、先行するモチーフ３ａは配列ＹｘｘＧＧＱ（配列番号７６）であり、およびこのモチーフに続くのは配列ＶＲｘＧ（配列番号７７）である。したがって、モチーフ（ｉｉｉ）の位置は、配列番号７６と７７との間に位置決めすることができる。配列番号７６は、モチーフ（ｉｉｉ）の（上流）またはモチーフ（ｉｉｉ）の上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１（または１〜１１）個のアミノ酸残基に直接隣接する可能性がある。配列番号７７は、モチーフ（ｉｉｉ）の（下流）またはモチーフ（ｉｉｉ）の下流１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９（または１〜９）個のアミノ酸残基に直接隣接する可能性がある。
【０１００】
上流／下流保存配列である配列番号７２〜７７における所定のアミノ酸位置は、任意のアミノ酸（表１における各配列においては「Ｘ」によって示した）であってよい。配列番号７２および７３の例は、配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）の２１４〜２２０位および２４５〜２６８位とそれぞれ整列する各ＧＴＦ配列のアミノ酸で図２および３におけるＧＴＦ配列のいずれかに示したとおりである。配列番号７４および７５の例は、配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）の３３４〜３４１位および４２８〜４３５位とそれぞれ整列する各ＧＴＦ配列のアミノ酸で図２および５におけるＧＴＦ配列のいずれかに示したとおりである。配列番号７６および７７の例は、配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）の５３７〜５４２位および５７２〜５７５位とそれぞれ整列する各ＧＴＦ配列のアミノ酸で図２および７におけるＧＴＦ配列のいずれかに示したとおりである。
【０１０１】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば細菌もしくは真菌などの任意の微生物起源由来であってよい。細菌グルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種もしくはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来する酵素である。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｓ．サルバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリナス（ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンチロウセッティ（ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティクス（ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびＳ．サングイニス（ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種の例としてはＬ．メセンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンチナム（ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カルノスム（ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）およびＬ．フルクトサム（ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｌ．アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブリュキイ（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．フェルメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
【０１０２】
一部の態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０または配列番号６５を含んでいない。所定の実施形態では、本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４の残基２〜１３４１、配列番号２０の残基２〜１３４０、配列番号２８の残基２〜１３４０、配列番号３０の残基２〜１３４１または配列番号６５の残基２〜１３４１を含んでいない。
【０１０３】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、上記の開示にあるような、本明細書で開示したポリα−１，３−グルカンを生成することができる。
【０１０４】
所定の態様では、１つ以上の異なるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が使用されてよい。所定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、デキストランスクラーゼ、ロイテランスクラーゼ、オルタナンスクラーゼ活性またはムタンスクラーゼ活性を有していない、または極めてわずかに（１％未満）しか有していない。本明細書の反応溶液は、例えば、１種、２種またはそれ以上のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含有していてよい。
【０１０５】
本明細書のグルカン合成反応のためのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、当分野において公知の任意の手段によって生成できる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、微生物異種発現系などの異種発現系内で組換え技術により生成することができる。異種発現系の例としては、細菌（例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）、例えばＴＯＰ１０もしくはＭＧ１６５５；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）および真核生物（例えば、酵母、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種）の発現系が挙げられる。
【０１０６】
所定の実施形態では、異種遺伝子発現系は、タンパク質分泌のために設計される遺伝子発現系であってよい。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、典型的にはそのような実施形態においてシグナルペプチド（シグナル配列）を含む。シグナルペプチドは、天然シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドのいずれであってもよい。
【０１０７】
本明細書に記載したグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、任意の精製状態（例えば、純粋または非純粋）で使用することができる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その使用前に精製および／または単離されてよい。非純粋であるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例としては、細胞溶解物の形態にあるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が挙げられる。細胞溶解物または抽出物は、酵素を異種発現させるために使用される細菌（例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ））から調製することができる。例えば、細菌は、フレンチプレッシャーセルを使用して破砕させられてよい。また別の実施形態では、細菌は、ホモジナイザー（例えば、ＡＰＶ、Ｒａｎｎｉｅ、Ｇａｕｌｉｎ）を用いてホモジナイズされてよい。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、典型的には、これらのタイプの調製物に可溶性である。本明細書の細菌細胞溶解物、抽出物もしくはホモジネートは、スクロースからポリα−１，３−グルカンを生成するための反応溶液中で、例えば、約０．１５〜０．３（ｖ／ｖ）％で使用することができる。
【０１０８】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、当分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性は、スクロース（約５０ｇ／Ｌ）、デキストランＴ１０（約１ｍｇ／ｍＬ）およびリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）を含有する反応物中で、還元糖（フルクトースおよびグルコース）の生成を測定することによって決定することができるが、このとき溶液は約２２〜２５℃で約２４〜３０時間保持する。還元糖は、１ＮのＮａＯＨおよび０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウムを含有する混合物に０．０１ｍＬの反応溶液を加え、次に５分間にわたってＯＤ４８０ｎｍでの吸光度の増加を監視することによって測定することができる。
【０１０９】
本明細書の「反応溶液」は、少なくともスクロース、水および活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素ならびに任意選択的に他の成分を含む溶液を意味する。グルカン合成反応に含めることのできる他の成分には、フルクトース、グルコース、ロイクロースおよび可溶性オリゴ糖（例えば、ＤＰ２〜ＤＰ７）が含まれる。例えば、少なくとも８もしくは９の重合度（ＤＰ）を備えるポリα−１，３−グルカンなどの所定のグルカン生成物は水不溶性である可能性があり、したがってグルカン合成反応においては溶解されず、むしろ溶液外に存在する可能性があることは理解されるであろう。本明細書の反応溶液は、不溶性グルカン生成物を生成することに加えて、例えばロイクロースおよび／または可溶性オリゴ糖などの副生成物を生成する反応溶液であってよい。
【０１１０】
本明細書の反応溶液の温度は、所望であれば、制御することができる。所定の実施形態では、反応の温度は、約５℃〜約５０℃である。所定の他の実施形態における温度は、約２０℃〜約４０℃または約２０℃〜約３０℃（例えば、約２５℃）である。
【０１１１】
本明細書の反応溶液中のスクロースの初期濃度は、例えば、約２０ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌであってよい。または、スクロースの初期濃度は、約７５ｇ／Ｌ〜約１７５ｇ／Ｌまたは約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌであってよい。またはさらに、スクロースの初期濃度は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０もしくは１６０ｇ／Ｌ（または４０〜１６０ｇ／Ｌの間の任意の整数）であってよい。「スクロースの初期濃度」は、全ての反応溶液成分（例えば、少なくとも、水、スクロース、ＧＴＦ酵素）が加えられた直後のＧＴＦ反応溶液中のスクロース濃度を意味する。
【０１１２】
本明細書のグルカン合成反応に使用されたスクロースは、高度に純粋（≧９９．５％）または任意の他の純度もしくはグレードのスクロースであってよい。例えば、スクロースは、少なくとも９９．０％の純度を有する可能性がある、または試薬グレードのスクロースであってよい。また別の例として、精製が不完全なスクロースを使用することができる。本明細書の精製が不完全なスクロースは、精白糖まで加工されていないスクロースを意味する。したがって、精製が不完全なスクロースは、完全に未精製であってよい、または部分精製されていてよい。未精製スクロースの例は、「粗スクロース」（「粗糖」）およびそれらの溶液である。部分精製スクロースの例は、１回、２回、３回またはそれ以上の結晶化工程を受けていない。本明細書の不完全精製スクロースのＩＣＵＭＳＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（国際砂糖分析法統一委員会））値は、例えば、１５０より大きい可能性がある。本明細書のスクロースは、例えば、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、サトウモロコシもしくはトウモロコシなどの任意の再生可能な砂糖源由来であってよい。本明細書で有用なスクロースの好適な形態は、例えば、結晶形または非結晶形（例えば、シロップ、サトウキビ汁、ビート汁）である。
【０１１３】
スクロースについてのＩＣＵＭＳＡ値を決定する方法は当分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＩＣＵＭＳＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＣＵＭＳＡ）（Ｅｄ．Ｈ．Ｃ．Ｓ．ｄｅ  Ｗｈａｌｌｅｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９６４）において国際砂糖分析法統一委員会によって開示されている。ＩＣＵＭＳＡは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲ．Ｊ．ＭｃＣｏｗａｇｅ，Ｒ．Ｍ．Ｕｒｑｕｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｂｕｒｇｅ（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｌｏｕｒ  ｏｆ  Ｒａｗ  Ｓｕｇａｒｓ，Ｂｒｏｗｎ  Ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｕｒｅｄ  Ｓｙｒｕｐｓ  ａｔ  ｐＨ  ７．０−Ｏｆｆｉｃｉａｌ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｄｒ  Ａｌｂｅｒｔ  Ｂａｒｔｅｎｓ，２０１１  ｒｅｖｉｓｉｏｎ）によって記載されたＩＣＵＭＳＡ法ＧＳ１／３−７によって測定できる。
【０１１４】
所定の実施形態におけるグルカン合成反応のｐＨは、約４．０〜約８．０の間であってよい。または、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５もしくは８．０であってよい。ｐＨは、リン酸塩、ｔｒｉｓ、クエン酸塩もしくはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない好適なバッファーの添加もしくは組み込みによって調整または制御することができる。グルカン合成反応中のバッファー濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約１０、２０もしくは５０ｍＭであってよい。
【０１１５】
本明細書の反応溶液を実施するために好適な他の条件および成分の例は、それらの全部が本明細書に参照により組み込まれる米国特許第７００００００号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８８号明細書、同第２０１３／０２４４２８７号明細書、同第２０１３／０１９６３８４号明細書、同第２０１３／０１５７３１６号明細書および同第２０１４／００８７４３１号明細書に開示されている。
【０１１６】
本開示はさらに、不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成するための方法であって：
（ａ）少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、２０、２８、３０、６５、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでおらず、
これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される工程；および
ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたポリα−１，３−グルカンを単離する工程を含む方法。重要にも、そのような方法で生成されたポリα−１，３−グルカンは、大部分もしくは完全に直鎖状である。したがってこの方法は、任意選択的に直鎖状（または大部分が直鎖状）ポリα−１，３−グルカンを生成する方法として特徴できることができる。
【０１１７】
本明細書に開示したグルカン合成法は、少なくとも水、スクロースおよび本明細書に記載したグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程を含む。これらや任意選択的に他の試薬を一緒に加えることができる、または下記で考察するように任意の順序で加えることができる。この工程は、水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液を提供する工程を含む可能性がある。グルコシルトランスフェラーゼ酵素がポリα−１，３−グルカンを合成するにつれて、反応溶液は、不溶性ポリα−１，３−グルカンが反応の混濁化によって指示されるように溶液から抽出されることを前提に、反応混合物になることは理解されるであろう。本明細書に開示した方法の接触させる工程は、任意の数の方法で実施できる。例えば、所望の量のスクロースを最初に水に溶解させ（任意選択的に、他の成分、例えばバッファー成分もまたこの調製段階で加えることもできる）、その後にグルコシルトランスフェラーゼ酵素を添加することができる。溶液は、静止状態に維持できる、または例えば撹拌する工程もしくは軌道振動によってかき混ぜることができる。典型的には、グルカン合成反応は、無細胞であってよい。
【０１１８】
所定の実施形態における反応の完了は、例えば、視覚的に（不溶性ポリα−１，３−グルカンの蓄積がもはや存在しない）、および／または液中に残されたスクロース（残留スクロース）の量を測定することによって決定できるが、このとき約９０％を超えるスクロース消費率は反応完了を指示する可能性がある。典型的には、本明細書に開示した方法の反応は、反応に使用されたスクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素の量などの所定のパラメーターに依存して、完了するためには約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４もしくは９６時間を要するであろう。
【０１１９】
所定の実施形態における反応のスクロース消費率は、水およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素と最初に接触したスクロースの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である。または、スクロース消費率は、＞９０％または＞９５％であってよい。
【０１２０】
本明細書のグルカン合成反応の一部の態様において生成されたポリα−１，３−グルカンの収率は、反応において転換されたスクロースの重量に基づいて、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％であってよい。
【０１２１】
本明細書に開示した方法で生成されたポリα−１，３−グルカンは、任意選択的に単離されてよい。例えば、不溶性ポリα−１，３−グルカンは、遠心分離または濾過によって分離されてよい。そのようにする際に、ポリα−１，３−グルカンは、水、フルクトースおよび所定の副生成物（例えば、ロイクロース、可溶性オリゴ糖ＤＰ２〜ＤＰ７）を含んでいる可能性がある反応溶液の大部分から分離される。この溶液は、さらに残留スクロースおよびグルコースモノマーも含んでいてよい。単離は、任意選択的にさらにポリα−１，３−グルカンを水または他の水性液体で１、２または３回以上洗浄する工程、および／またはポリα−１，３−グルカンを乾燥させる工程を含むことができる。
【０１２２】
本明細書のグルカン合成法の所定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であり、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに含む可能性がある。または、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、例えば、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％（しかし１００％ではない）同一であるアミノ酸配列を含むことができ、およびグルコシルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
【０１２３】
ポリα−１，３−グルカン合成法の上記の実施形態は、例である。したがって、本明細書に開示した任意の他の特徴は、グルカン合成法にも当てはまる可能性がある。例えば、本明細書に開示したポリα−１，３−グルカン生成物、グルコシルトランスフェラーゼ酵素（例えば、触媒ドメインおよびそのモチーフｉ、ｉｉおよびｉｉｉ）および反応溶液条件の特徴のいずれも、適切に適用することができる。
【０１２４】
本開示は、さらにグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法に関する。本方法は、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の少なくとも１つのモチーフの存在を検出する工程であって、少なくとも１つのモチーフは：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフからなる群から選択され、
これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む。本方法において生成されたポリα−１，３−グルカンは大部分もしくは完全に直鎖状であるので、本方法は、任意選択的に直鎖状ポリα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法であると特徴付けることができる。
【０１２５】
上記の方法はグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内でモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれか１つを検出する工程を含むが、方法がこれらのモチーフ全３つを有するグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを検出することを生じさせることは企図されている。そこで、本明細書のＧＴＦ同定法は、任意選択的にグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）のうちの１つ、２つまたは全３つを検出する工程を含むことができる。
【０１２６】
本明細書のＧＴＦ同定法における検出工程は、モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）を有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素の単離アミノ酸配列を検出する工程を含むことができる。検出する工程は、さらにモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）を有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド配列を検出する工程によって実施することもできる。そのような実施形態において単離ポリヌクレオチド配列を調製するために使用されるコドンは、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を異種発現させるために使用できる種（例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）またはＳ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のために好ましいコドンである。
【０１２７】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つの存在は、当分野において公知の任意の手段および／または本明細書に記載した任意の手法にしたがって検出することができる。例えば、検出は、（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、（ｃ）タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、および／または（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施することができる。
【０１２８】
モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ検出法によって同定できる（例えば、下記の実施例４を参照されたい）。したがって、コンピューター内もしくはデータベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、ＲＥＦＳＥＱ、ＧＥＮＥＰＥＰＴ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＰＤＢなどの公衆データベース）内に保存されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（および／またはそのようなグルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列）は、例えば、触媒ドメイン内にモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定するためにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで精査することができる。そのような精査は、例えば、上述したようなアラインメントアルゴリズムもしくはソフトウエア（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、ＥＭＢＯＳＳ）などの当分野において公知の任意の手段を使用することを含むことができよう。精査されるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインの配列は、モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の存在もしくは非存在を検出するために、モチーフ１ａ（配列番号７８）、２（配列番号７９）および３ａ（配列番号８０）を含む配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）の触媒ドメイン配列と整列させることができた。または精査されるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインの配列は、モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の存在もしくは非存在を検出するために、それらの全部がモチーフ１ａ（配列番号７８）、２（配列番号７９）および３ａ（配列番号８０）を含む配列番号３０（ＧＴＦ２６７８）、配列番号４（ＧＴＦ６８５５）、配列番号２８（ＧＴＦ２９１９）および／または配列番号２０（ＧＴＦ２７６５）の触媒ドメイン配列と整列させることができた。
【０１２９】
グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン配列内でモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）を検出するためのまた別のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ手段は、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン配列の予測三次元構造（三次構造）を参照構造と比較する工程を含む可能性がある。精査される触媒ドメインおよび参照両方の構造は、例えばアミノ酸配列入力に基づく構造を提供するコンピュータープログラム（例えば、ソフトウエアパッケージＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いるなどの当分野において公知の任意の手段を使用して視覚的に比較することができる。例えば、参照構造にモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）が欠如する場合、比較は、精査される構造内のドメインが参照構造内に対応するドメインを有していないことを示すことによって、モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の存在を検出することができる。このタイプの比較の例は、図４ａ、４ｂ、６ａ、６ｂ、８ａおよび８ｂに示した。
【０１３０】
または、その触媒ドメイン内にモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を検出する工程は、核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を使用することによってでよい。そのような方法は、ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロット、ドットブロット）、ＲＮＡハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット）または例えば核酸ハイブリダイゼーション工程（例えば、全部が１つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含んでいてよいＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）を有する任意の他の方法の使用を含むことができる。１つの例として、モチーフ１ａ（配列番号７８）、２（配列番号７９）または３ａ（配列番号８０）をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう１つのオリゴヌクレオチドを使用すると、精査されるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド配列内の存在もしくは非存在を検出することができた。ハイブリダイゼーション法を実施するための条件およびパラメーターは、一般に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｓｉｌｈａｖｙ  ＴＪ，Ｂｅｎｎａｎ  ＭＬ  ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ  ＬＷ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）；およびＩｎｎｉｓ  ＭＡ，Ｇｅｌｆａｎｄ  ＤＨ，Ｓｎｉｎｓｋｙ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ＴＪ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に開示されている。
【０１３１】
また別の態様では、その触媒ドメイン内にモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、タンパク質シークエンシング工程を含む方法を使用して検出することができる。そのようなタンパク質シークエンシング工程は、例えば、Ｎ末端アミノ酸分析、Ｃ末端アミノ酸分析、Ｅｄｍａｎ分解法または質量分析法などのうちの１つ以上の手法を含むことができる。
【０１３２】
さらにまた別の態様では、その触媒ドメイン内にモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、タンパク質結合工程を含む方法を使用して検出することができる。そのようなタンパク質結合工程は、例えば、これらのモチーフの１つに特異的に結合する１つの抗体を使用して実施することができよう。モチーフ（ｉ）の存在もしくは非存在を同定するための抗体は、配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列に対して特異的である可能性がある。モチーフ（ｉｉ）の存在もしくは非存在を同定するための抗体は、配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列に対して特異的である可能性がある。モチーフ（ｉｉｉ）の存在もしくは非存在を同定するための抗体は、配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列に対して特異的である可能性がある。
【０１３３】
モチーフ（ｉ）は、配列番号７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。モチーフ（ｉｉ）は、配列番号７９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。モチーフ（ｉｉｉ）は、配列番号８０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である。したがって、本明細書の検出方法の所定の実施形態では、モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含む可能性があり、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含む可能性があり、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む可能性があることは明らかである。
【０１３４】
所定の実施形態におけるモチーフ（ｉ）に関して、配列番号７８（Ｄ／Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｉ／Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｓ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｈ）の第１残基はアスパラギン酸（Ｄ）であってよく、第４残基はイソロイシン（Ｉ）であってよい。または、第１残基はアスパラギン酸（Ｄ）であってよく、第４残基はバリン（Ｖ）であってよい、または第１残基はアスパラギン（Ｎ）であってよく、第４残基はイソロイシン（Ｉ）であってよい、または第１残基はアスパラギン（Ｎ）であってよく、第４残基はバリン（Ｖ）であってよい。
【０１３５】
所定の実施形態におけるモチーフ（ｉｉ）に関して、配列番号７９（Ｎ−Ｋ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｋ／Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ｖ／Ａ−Ｋ−Ｑ／Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｇ−Ｋ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｓ）の第６残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１４残基はバリン（Ｖ）であってよく、および１６残基はグルタミン（Ｑ）であってよい。または、第６残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１４残基はアラニン（Ａ）であってよく、第１６残基はグルタミン（Ｑ）であってよい；または第６残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１４残基はバリン（Ｖ）であってよく、および第１６残基はリシン（Ｋ）であってよい。追加の例には、第６残基がトレオニン（Ｔ）であってよい場合が含まれる。
【０１３６】
所定の実施形態におけるモチーフ（ｉｉｉ）に関して、配列番号８０（Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｎ／Ｋ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｔ−Ｎ／Ｓ−Ｅ）の第９残基は、アスパラギン（Ｎ）であってよく、第１８残基はアスパラギン（Ｎ）であってよい。または、第９残基はアスパラギン（Ｎ）であってよく、第１８残基はセリン（Ｓ）であってよい、または第９残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１８残基はアスパラギン（Ｎ）であってよい、または第９残基はリシン（Ｋ）であってよく、第１８残基はセリン（Ｓ）であってよい。
【０１３７】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン配列内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の位置決めに関する上記の特徴はいずれも、適切に使用するとこれらのモチーフの１つ以上を検出することができる。モチーフ（ｉ）（配列番号７８）、（ｉｉ）（配列番号７９）および（ｉｉｉ）（配列番号８０）の相対位置は、図２に示したＧＴＦ７５２７配列（配列番号６５）の残基２３１〜２４３、３９６〜４２５および５４９〜５６７とそれぞれ整列する。本明細書の所定の実施形態では、
（Ａ）グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列する；
（Ｂ）グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列する；および／または
（Ｃ）グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する。
【０１３８】
したがってグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内で検出されたアミノ酸配列の相対位置は、配列番号６５の上記のアミノ酸位置を参照して決定することができる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインの配列は、当分野において公知のおよび／または配列番号上述の任意の手段を使用して配列番号６５と整列させることができる。
【０１３９】
または、モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）は、所定の保存配列の近くで、つまり上述のように配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７に基づいて検出することができる。
【０１４０】
一部の態様における同定方法は、さらに本明細書に開示したグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを検出する工程をさらに含む可能性がある。例えば、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位、配列番号３０の５５〜９６０位、配列番号４の５５〜９６０位、配列番号２８の５５〜９６０位および／または配列番号２０の５５〜９６０位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを検出することができる。または、上記の配列のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％（しかし１００％ではない）同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを検出することができる。一部の実施形態では、同定方法は、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン配列を検出しない。
【０１４１】
図２における所定の保存領域には、配列番号６８、６９、７０および７１の触媒活性部位モチーフが含まれる（実施例３を参照されたい）。したがって、一部の態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン配列は、それぞれ配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７内に存在するような配列番号６８、６９、７０および７１とアラインメントしている配列番号６８、６９、７０および７１のうちの１つ以上を含有することに基づいて同定することができる。図２における他の保存領域には、配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７が含まれる（実施例４を参照されたい）。したがって、一部の態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメイン配列は、それぞれ配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７内に存在するような配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７とアラインメントしている配列番号７２、７３、７４、７５、７６および７７のうちの１つ以上を有することに基づいて同定することができる。
【０１４２】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は例えば配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位（または配列番号３０の５５〜９６０位、配列番号４の５５〜９６０位、配列番号２８の５５〜９６０位もしくは配列番号２０の５５〜９６０位）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む配列のような触媒ドメイン配列だけを有する必要があると考えられているが、本明細書の方法で同定されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、典型的にはより大きなアミノ酸配列内に含まれる。例えば、触媒ドメインはそのＣ末端でグルカン結合ドメインに連結させることができる、および／またはそのＮ末端で可変ドメインおよび／またはシグナルペプチドに連結させることができる。
【０１４３】
本明細書で同定したグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメインは、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類されるグルコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインによって示される活性を有することができる。そのようなＧＨ７０グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）の中に見いだすことができる。
【０１４４】
本明細書で同定したグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００のＤＰｗを有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを合成することができる。所定の実施形態では、同定されたＧＴＦ酵素は、構成グリコシド結合の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％がα−１，３−結合であるポリα−１，３−グルカンを合成することができる。したがって、そのような実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その中ではα−１，３ではない約５％、４％、３％、２％、１％もしくは０％未満のグリコシド結合が存在するポリα−１，３−グルカンを合成する。
【０１４５】
また別の態様では、本明細書で同定したグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、分岐点を有していない、またはポリマー内のグリコシド結合のパーセントとして約５％、４％、３％、２％または１％未満の分岐点を有するポリα−１，３−グルカンを合成することができる。分岐点の例としては、α−１，６分岐点が挙げられる。
【０１４６】
さらにまた別の態様では、本明細書で同定したグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約１００のＤＰｗもしくはＤＰｎでの分子量を有するポリα−１，３−グルカンを合成することができる。または、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約４００のＤＰｗもしくはＤＰｎでの分子量を有するポリα−１，３−グルカンを合成することができる。またはさらに、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１，０００（または１００〜１，０００の間の任意の整数）のＤＰｎもしくはＤＰｗでの分子量を有するポリα−１，３−グルカンを合成することができる。
【０１４７】
本明細書で同定したグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、所望であれば、さらに分析することができる。例えば、１つ以上のモチーフｉ、ｉｉおよび／またはｉｉｉが、同定されたグルコシルトランスフェラーゼ（親ＧＴＦ）から（１つ以上のモチーフがもはや配列番号７８、７９もしくは８０それぞれと少なくとも９０％同一ではないように）欠失している、および／または突然変異している場合は、改変グルコシルトランスフェラーゼ（子ＧＴＦ）は分岐状α−グルカンポリマーを生成すると予想することができる。本明細書の子ＧＴＦによって生成された分岐状α−グルカンポリマーは、例えば、対応する親ＧＴＦによって合成されたポリα−１，３−グルカンの固有粘度および／または分岐指数と比較して、少なくとも３０％減少している固有粘度および／または分岐指数を有する可能性がある。α−グルカンポリマーの固有粘度および／または分岐指数は、当分野において公知の、または下記の実施例において提供するような任意の手段によって測定できる。
【０１４８】
本明細書に開示した方法において同定されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、任意選択的に生成することができる。そのような生成は、当分野において公知の任意の手段によってでよい。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば微生物異種発現系（例えば、米国特許第７０００００００号明細書）などの異種発現系内で組換え技術により生成することができる。異種発現系の例としては、細菌（例えば、ＴＯＰ１０などのＥ．コリ（ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）および真核生物（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種などの酵母）の発現系が挙げられる。
【０１４９】
本明細書に開示した組成物および方法の非限定的例としては、以下が挙げられる：
１．水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、２０、２８、３０、６５、または配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０もしくは配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでおらず；およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する反応溶液。
【０１５０】
２．実施形態１の反応溶液であって、触媒ドメインは、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む反応溶液。
【０１５１】
３．実施形態１または２の反応溶液であって：
（Ａ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列する；
（Ｂ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列する；および／または
（Ｃ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する反応溶液。
【０１５２】
４．実施形態１、２または３の反応溶液であって、モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含み、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含み、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む反応溶液。
【０１５３】
５．実施形態１、２、３または４の反応溶液であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合を有するポリα−１，３−グルカンを合成する反応溶液。
【０１５４】
６．実施形態１、２、３、４または５の反応溶液であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも４００のＤＰｗを有するポリα−１，３−グルカンを合成する反応溶液。
【０１５５】
７．不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の３つのモチーフ：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、２０、２８、３０、６５、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０を含んでおらず、これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される工程；および
ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたポリα−１，３−グルカンを単離する工程を含む方法。
【０１５６】
８．実施形態７の方法であって、触媒ドメインは、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む方法。
【０１５７】
９．実施形態７または８の方法であって：
（１）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸２３１〜２４３位と整列する；
（２）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸３９６〜４２５位と整列する；および／または
（３）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号６５のアミノ酸５４９〜５６７位と整列する方法。
【０１５８】
１０．実施形態７、８または９の方法であって、モチーフ（ｉ）は配列番号７８を含み、モチーフ（ｉｉ）は配列番号７９を含み、およびモチーフ（ｉｉｉ）は配列番号８０を含む方法。
【０１５９】
１１．実施形態７、８、９または１０の方法であって、工程（ａ）において１００％のα−１，３−グリコシド結合を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される方法。
【０１６０】
１２．実施形態７、８、９、１０または１１の方法であって、工程（ａ）において少なくとも４００のＤＰｗを有する不溶性ポリα−１，３−グルカンが生成される方法。
【０１６１】
１３．グルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定するための方法であって：
グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の少なくとも１つのモチーフの存在を検出する工程であって、少なくとも１つのモチーフは：
（ｉ）配列番号７８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、
（ｉｉ）配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む１つのモチーフからなる群から選択され、
これにより少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合および少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む方法。
【０１６２】
１４．実施形態１３の方法であって、前記検出する工程は：
（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
（ｃ）タンパク質シークエンシング工程を含む方法を用いて、および／または
（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施される方法。
【０１６３】
１５．実施形態１３または１４の方法であって、検出する工程は、触媒ドメイン内のモチーフ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のそれぞれの存在を検出する工程を含む方法。
【実施例】
【０１６４】
本開示を以下の実施例において詳細に説明する。これらの実施例は、本明細書の所定の好ましい態様を示しているが、単に説明の目的でのみ記されていると理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、本明細書に開示した実施形態を様々な使用および条件に適合させるために様々な変更および修飾を加えることができる。
【０１６５】
略語
本明細書で使用する略語の一部の意味は、次のとおりである：「ｇ」はグラムを指し、「ｈ」は時間を指し、「ｍＬ」はミリリットルを指し、「ｐｓｉ」は毎平方インチ当たりポンドを指し、「ｗｔ％」は重量％（パーセント）を指し、「μｍ」はマイクロメートルを指し、「℃」は摂氏温度を指し、「ｍｇ」はミリグラムを指し、「ｍｍ」はミリメートルを指し、「μＬ」はマイクロリットルを指し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを指し、「ｍｉｎ」は分間を指し、「ｍｏｌ％」はモル％を指し、「Ｍ」はモルを指し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を指し、「ＭＰａ」はメガパスカルを指し、「ＩＶ」は固有粘度を指し、「ｇ’」は分岐比を指す。
【０１６６】
一般的方法
グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）酵素の粗抽出物の調製
ＧＴＦ酵素は、次のように調製した。Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（登録商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、特定のＧＴＦコーディングＤＮＡ配列を含有するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）をベースとする構築物により形質転換させた。各配列は、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内でＧＴＦ酵素を発現させるためにコドン最適化された。特定のＧＴＦ酵素を発現する個々のＥ．コリ（ｃｏｌｉ）菌株は、振とうしながら３７℃でアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を用いてＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中でＯＤ６００＝０．４〜０．５となるまで増殖させ、その時点にＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、製品番号Ｉ６７５８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最終濃度が０．５ｍＭとなるまで加えた。この培養をＩＰＴＧ誘導後に３７℃で２〜４時間にわたりインキュベートした。細胞は１５分間にわたる５，０００×ｇでの遠心分離によって採取し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、１．０ｍＭ）が補給された５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中に再懸濁させた（２０（ｗ／ｖ）％）。再懸濁細胞は、＞９５％の細胞溶解を保証するために、Ｆｒｅｎｃｈプレッシャーセル（ＳＬＭ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を２回通過させた。溶解細胞は、４℃、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。結果として生じた上清は、ＧＴＦ酵素の発現を確証するためにＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、上清を−２０℃で保管した。
【０１６７】
ＧＴＦ酵素活性の決定
ＧＴＦ酵素活性は、ＧＴＦ反応溶液中で還元糖（フルクトースおよびグルコース）の生成を測定することによって確証した。反応溶液は、ＧＴＦ抽出物（上記のように調製した）を、スクロース（５０もしくは１５０ｇ／Ｌ）、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）および任意選択的にデキストラン（１ｍｇ／ｍＬ、デキストランＴ１０、製品番号Ｄ９２６０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する混合物に加えることによって調製した；ＧＴＦ抽出物は２．５体積％〜５体積％まで加えた。次に反応溶液を２２〜２５℃で２４〜３０時間にわたりインキュベートし、その後に反応溶液を遠心分離した。１ＮのＮａＯＨおよび０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する混合物に上清（０．０１ｍＬ）を加えた。この混合物を５分間インキュベートし、その後に還元糖であるフルクトースおよびグルコースの存在を測定するためにＵＬＴＲＯＳＰＥＣ分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用してＯＤ４８０を決定した。
【０１６８】
グリコシド結合の決定
ＧＴＦ酵素によって合成されたグルカン生成物中のグリコシド結合は、１３ＣＮＭＲ（核磁気共鳴）によって決定した。乾燥グルカンポリマー（２５〜３０ｍｇ）は、５０℃で攪拌しながら３重量％のＬｉＣｌを含有する１ｍＬの重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。ガラスピペットを使用して、０．８ｍＬの溶液を５ｍｍのＮＭＲチューブ内に移した。２６，０４１．７Ｈｚのスペクトル窓を使用して、スペクトル周波数１２５．７６ＭＨｚにあるＣＰＤＵＬクライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００−ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して定量的な１３ＣＮＭＲスペクトルを入手した。ｗａｌｔｚデカップリングを使用する逆ゲーテッドデカップリングパルスシーケンスを、０．６２９秒間のデータ取得時間、５秒間のパルス間遅延時間および６，０００パルスで使用した。時間ドメインのデータは２．０Ｈｚの指数関数的乗算を使用して変換した。
【０１６９】
数平均重合度（ＤＰｎ）の決定
ＧＴＦ酵素により合成されたグルカン生成物のＤＰｎは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。乾燥グルカンポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミド（ＤＭＡｃ）および５％のＬｉＣｌ中に５ｍｇ／ｍＬで溶解させ、１００℃で一晩振とうした。使用したＳＥＣシステムは、３基のオンライン検出器：Ｗａｔｅｒｓ製の示差屈折計２４１０、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）製のマルチアングル光散乱測光計Ｈｅｌｅｏｓ（商標）８＋およびＷｙａｔｔ製の示差毛細管式粘度計ＶｉｓｃｏＳｔａｒ（商標）と結合したＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）製のＡｌｌｉａｎｃｅ（商標）２６９５分離モジュールであった。ＳＥＣのために使用したカラムは、Ｓｈｏｄｅｘ（日本）製の４本のスチレン−ジビニルベンゼンカラムと、ポリマー分散の低分子量領域での解像度を改良するための２本のＫＤ−８０６Ｍ、ＫＤ−８０２およびＫＤ−８０１リニアカラムであった。移動相は０．１１％のＬｉＣｌを含むＤＭＡｃであった。使用したクロマトグラフィーの条件は、カラムおよび検出器区画で５０℃、試料および注入器区画で４０℃、流量０．５ｍＬ／ｍｉｎおよび注入量１００μＬであった。データ整理のために使用したソフトウエアパッケージは、Ｗａｔｅｒｓ製のＥｍｐｏｗｅｒ（商標）バージョン３（広域グルカンポリマー標準物質を用いて較正）およびＷｙａｔｔ製のＡｓｔｒａ（登録商標）バージョン６（カラム較正を用いる三重検出法）であった。
【０１７０】
固有粘度の決定
マルチ検出器サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、光散乱（ＬＳ）光度計および示差屈折計（ＤＲ）の組み合わせを使用したモル質量分布（ＭＭＤ）の測定を許容した。ポリマー分布全体に及ぶ分離分画のモル質量（Ｍ）は、２つの検出基応答の比率：
Ｍ〜ＬＳ／ＤＲ（任意のカラム較正を伴わない）
として測定した。
類似の方法で、インライン示差粘度計（ＤＶ）は、分離分画の固有粘度（ＩＶ）：
ＩＶ〜ＤＶ／ＤＲ
の測定を可能にした。
対数−対数スケール内のＭの関数としてＩＶをプロットすることによって、試験したサンプルについていわゆるマーク・ハウィンクプロットを入手した。
【０１７１】
分岐比の決定
マーク・ハウィンク（ＭＨ）プロットは、モル質量の関数としてそれらのサイズを測定することを通してポリマー内の分岐度を推定するために有用であった。したがって、希釈液中の高分子の流体力学的サイズ（Ｈ）はＨ＝ＩＶ×Ｍであると決定されたので、ＭＨプロットを使用すると、ポリマー鎖のサイズがそのモル質量に伴ってどのように変化をするのかを見ることができよう。分岐状ポリマーは溶液中で同一モル質量を備えるその直鎖状対応物より小さいサイズを有し、ＭＨプロットの位置は、ポリマーの分岐度を示す。
【０１７２】
分岐度を定量するために、分岐比（もしくは分岐指数）ｇ’をモル質量の関数としてプロットした。この指数は、所定のモル質量Ｍを備える分岐状ポリマー鎖の流体力学的体積Ｈｂｒ対同一質量を備える直鎖の類似の体積Ｈｌｉｎの比率；すなわち、ｇ’（Ｍ）＝Ｈｂｒ／Ｈｌｉｎであると定義されている。ＨはＩＶとＭの積であると定義されており、Ｍは分子および分母のどちらにおいても同一であるので、ｇ’は、モル質量Ｍを備える各分離分画に対してｇ’＝ＩＶｂｒ／ＩＶｌｉｎとして対応するＭＨプロットから直接的に決定することができた。これらのプロットは、分岐度がポリマー質量に伴ってどのように変化するのかを示している。各ポリマーに対する重量平均分岐指数（すなわち、ｇ’＝ＩＶｂｒ，ｗ／ＩＶｌｉｎ，ｗ）は、多分散ポリマー内の全分岐頻度の有用な推定値である。１のｇ’値は、この分析によると、ポリマーが直鎖状（非分岐）であることを示すが、他方＜１のｇ’値は、ポリマーが分岐状であることを示す。
【０１７３】
実施例１
ＧＴＦ酵素の生成
本実施例では、本試験で使用されるグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）酵素の末端短縮バージョンの調製について記載する。
【０１７４】
ＧＴＦ酵素のＮ末端短縮バージョンをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内でのタンパク質発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。ＧＴＦ発現プラスミド（表２、プラスミドＩＤ）を生成するために、ＧＴＦ酵素（表２、ＡＡ配列番号）をコードする核酸生成物（表２、ｎｔ配列番号）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓｓ４０４（登録商標）（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）内にサブクローニングした。ＧＴＦ発現菌株（表２、菌株ＩＤ）を生成するために、ＧＴＦ発現プラスミドを使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換させた。細菌発現によるＧＴＦ酵素の生成および酵素活性の決定は、一般的方法に記載したように実施した。
【０１７５】
【表７】
2018518179.tif 000009
【０１７６】
実施例２
ＧＴＦ酵素を使用したグルカンポリマーの生成
本実施例では、グルカンポリマーを合成するために実施例１で調製されたＧＴＦ酵素を使用する工程について記載する。
【０１７７】
重合反応は、実施例１で調製したＧＴＦ酵素のそれぞれを用いて実施した。スクロース（５０ｇ／Ｌ）、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５、２０ｍＭ）およびＧＴＦ酵素（２．５体積％の抽出物）を含む反応溶液を調製した。２２〜２５℃で２４〜３０時間後、不溶性グルカンポリマー生成物は、遠心分離により採取し、水を用いて３回洗浄し、エタノールを用いて１回洗浄し、２４〜３０時間にわたり５０℃で乾燥させた。
【０１７８】
各不溶性グルカンポリマー生成物中でのグリコシド結合は１３ＣＮＭＲによって決定し、各不溶性ポリマー生成物についてのＤＰｎは、一般的方法において記載したようにＳＥＣによって決定した。これらの測定は、下記の表３に提供した。
【０１７９】
【表８】
2018518179.tif 000010
【０１８０】
下記のＧＴＦ酵素：６８５５（配列番号４）、７５２７（配列番号８）、１７２４（配列番号１０）、０５４４（配列番号１２）、５９２６（配列番号１４）、２７６５（配列番号２０）、０４２７（配列番号２６）、２９１９（配列番号２８）、２６７８（配列番号３０）および３９２９（配列番号３４）（表３を参照されたい）は、少なくとも５０％のα−１，３−グリコシド結合を含み、少なくとも１００のＤＰｎを有するグルカンポリマーを生成した。下記のＧＴＦ酵素：６８５５（配列番号４）、７５２７（配列番号８）、１７２４（配列番号１０）、５９２６（配列番号１４）、２７６５（配列番号２０）、０４２７（配列番号２６）、２９１９（配列番号２８）、２６７８（配列番号３０）および３９２９（配列番号３４）は、１００％のα−１，３−グリコシド結合を含み、直鎖状ポリマーを示すグルカンポリマーを生成した。これらの結果は、ＧＴＦ酵素全部が直鎖状ポリα−１，３−グルカンポリマーを生成できるわけではないことを明確に示している。
【０１８１】
実施例３
ＧＴＦ配列において観察された構造／機能の関係
本実施例では、数種のＧＴＦ酵素のアミノ酸配列が任意の構造を共有するかどうかを決定するためにアラインメントする工程について記載する。
【０１８２】
実施例２では、ＧＴＦ酵素がグルカンポリマーを生成する能力について、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備えるグルカンを生成するそれらの酵素に焦点を当てて評価した。これらの酵素のうちの数種の配列は、所定のＳ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＴＦ配列（それぞれ、３ＡＩＥ［配列番号６６］および３ＫＬＫ［配列番号６７］）によって形成される三次元構造とアラインメントされた；Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＴＦ配列は、ソフトウエアパッケージＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用して共通三次構造を重ね合わせるためにアラインメントされた。このアラインメントに使用したＧＴＦ酵素のそれぞれについての配列は、各酵素の触媒およびグルカン結合ドメインをそれぞれ含有する（すなわち、このアラインメントには各ＧＴＦのＮ末端シグナルペプチドおよび可変ドメインは含まれていない）。図２は、このアラインメントを示している。結晶構造が公知であるＳ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＴＦの配列はこのアラインメントに含まれた；図２では、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）ＧＴＦは「３ＡＩＥ」（配列番号６６）と略記され、Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＴＦは「３ＫＬＫ」（配列番号６７）と略記されている。
【０１８３】
図２におけるアラインメントは、整列したＧＴＦ配列全部が極めて多数の不変領域（暗い背景で示されている）を維持していることを示している。これらの不変配列は、（実験的に決定された構造とは対照的にホモロジーモデルに基づくと）各ＧＴＦの触媒ドメインの全体に所在する。整列したＧＴＦにおける触媒ドメインは、約９００〜９５０アミノ酸残基長であり、図２に示した配列のそれぞれにおいて１位（人工的開始メチオニン）の後から始まる。各ＧＴＦにおける触媒ドメインに続く配列は、グルカン結合ドメインを表す。整列したＧＴＦ配列は、公知のＧＴＦ構造（Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）３ＡＩＥおよびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）３ＫＬＫ）の配列と４０％という低い配列同一性しか共有していない。しかし図２におけるこれらの配列のアラインメントは、保存配列モチーフの分散パターンおよび全ての整列した配列）内に保存されている特定残基（図２における暗い背景を伴う残基のパターンを示している。これらの保存配列モチーフは、例えば下記で説明する触媒部位などの重要な構造的特徴に関連付けることができ、特定の性能利点と関連付けることができる固有もしくは特徴的な機能を同定するための基準点として機能することができる。
【０１８４】
触媒部位残基は、全ての整列した配列内で繰り返される配列モチーフ内で見いだすことができる（図２）。詳細には、図２におけるＧＴＦ７５２７（配列番号６５）由来の配列を参照すると、Ａｒｇ２９２およびＡｓｐ２９４はＳ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）３ＡＩＥ  ＧＴＦのＡｒｇ４７５およびＡｓｐ４７７ならびにＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）３ＫＬＫ  ＧＴＦのＡｒｇ１０２３およびＡｓｐ１０２５に対応するモチーフＦＤｘｘＲｘＤＡｘＤＮＶ（配列番号６８）内で見いだされる；Ｇｌｕ３３２は、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）３ＡＩＥ  ＧＴＦ内のＧｌｕ５１５およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）３ＫＬＫ  ＧＴＦ内のＧｌｕ１０６３に対応する配列モチーフＥｘＷｘｘｘＤｘｘＹ（配列番号６９）内で見いだされる；Ｈｉｓ４３４およびＡｓｐ４３５は、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）３ＡＩＥ  ＧＴＦ内のＨｉｓ５８７およびＡｓｐ５８８ならびにＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）３ＫＬＫ  ＧＴＦ内のＨｉｓ１１３５およびＡｓｐ１１３６に対応する配列モチーフＦｘＲＡＨＤ（配列番号７０）内で見いだされる；およびＴｙｒ（Ｙ）７８３は、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）３ＡＩＥ  ＧＴＦの残基Ｔｙｒ９１６およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）３ＫＬＫ  ＧＴＦのＴｙｒ１４６５に対応する配列モチーフＩｘＮＧＹＡＦ（配列番号７１）内で見いだされる。
【０１８５】
したがって、試験したＧＴＦ酵素は、複数の高度に保存された領域を含む触媒ドメインを有する。
【０１８６】
実施例４
高分子量α−１，３−グルカンを合成するＧＴＦ酵素内の配列モチーフ
図２においてそれらの配列が整列させられたＧＴＦ酵素がグルカンポリマーを生成する能力について、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備えるグルカンを生成するそれらの酵素に焦点を当てて詳細に評価した（表４）。
【０１８７】
【表９】
2018518179.tif 000011
【０１８８】
整列したＧＴＦ酵素中９種は、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備えるグルカンを生成し、これらの酵素９種中５種は高分子量ポリマーを生成した（ＤＰｗ＞４００、表４）。詳細には、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備える高分子量グルカンを生成する特性を示した５種のＧＴＦ酵素は、７５２８（配列番号６５）、２６７８（配列番号３０）、６８５５（配列全部４）、２９１９（配列番号２８）および２７６５（配列番号２０）である。これらのＧＴＦのそれぞれの配列は、図２において「＋＋」を付して示した。
【０１８９】
これらの配列モチーフは、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備える高分子量グルカンを生成する全５種のＧＴＦ酵素のアミノ酸配列内で見いだされ、公知のＧＴＦ構造の触媒ドメインの周囲に位置する３つの異なる「挿入」として出現する。手短には、これらの配列モチーフは、下記として指定した。
モチーフ１ａ（配列番号７８）：
Ｄ／Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｉ／Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｓ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｈ
モチーフ２（配列番号７９）：
Ｎ−Ｋ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｋ／Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ｖ／Ａ−Ｋ−Ｑ／Ｋ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｇ−Ｋ−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｓ
モチーフ３ａ（配列番号８０）：
Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｄ−Ｇ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｎ／Ｋ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｔ−Ｎ／Ｓ−Ｅ
【０１９０】
モチーフ１ａ、２および３ａの相対位置は、図２における７５２７ＧＴＦ配列（配列番号６５）の残基２３１〜２４３、３９６〜４２５および５４９〜５６７とそれぞれ整列する。これらのモチーフは、高分子量α−１，３−グルカンを合成するＧＴＦ酵素中で保存されていると思われる。
【０１９１】
図２に示したアラインメントでは、モチーフ１ａは、図３に示したように上流および下流配列に隣接されている。詳細には、モチーフ１ａに先行するのは配列ＳｘｘＲｘｘＮ（配列番号７２）であり、モチーフ１ａに続くのは配列ＧＧｘｘｘＬＬｘＮＤｘＤｘＳＮＰｘＶＱＡＥｘＬＮ（配列番号７３）である。これらの配列はどちらも全ての整列したＧＴＦ配列内で見いだされ、他のＧＴＦ配列においてモチーフ１ａを同定するための基準点として機能することができる。図２に示したアラインメントでは、モチーフ２は、図５に示したように上流および下流配列に隣接されている。詳細には、約５０個のアミノ酸によってモチーフ２に先行するのは配列ＷｘｘｘＤｘｘＹ（配列番号７４）であり、およびモチーフ２に続くのは配列ＹｘＦｘＲＡＨＤ（配列番号７５）である。下流配列（配列番号７５）には、活性部位残基中の２つである（Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）ＧＴＦ構造、３ＡＩＥを参照してナンバリングされた）Ｈｉｓ５８７およびＡｓｐ５８８が含まれる。これらの配列はどちらも全ての整列したＧＴＦ配列内で見いだされ、他のＧＴＦ配列においてモチーフ２を同定するための基準点として機能することができる。図２に示したアラインメントでは、モチーフ３ａは、図７に示したように上流および下流配列に隣接されている。詳細には、モチーフ３ａに先行するのは配列ＹｘｘＧＧＱ（配列番号７６）であり、およびモチーフ３ａに続くのは配列ＶＲｘＧ（配列番号７７）である。これらの配列はどちらも全ての整列したＧＴＦ配列内で見いだされ、他のＧＴＦ配列においてモチーフ２を同定するための基準点として機能することができる。
【０１９２】
１００％のα−１，３−グリコシド結合を有する高分子量グルカンを合成するＧＴＦ酵素の触媒ドメイン内のモチーフ１ａ（配列番号７８）、２（配列番号７９）および３ａ（配列番号８０）の同定は、これらのモチーフのそれぞれが類似の活性を備える他のＧＴＦを同定するために有用な可能性があることを示している。
【０１９３】
実施例５
低分子量α−１，３−グルカンを合成するＧＴＦ酵素内の配列モチーフ
４種のＧＴＦ酵素は、１００％のα−１，３−グリコシド結合を有する低分子量グルカンを生成した（表４）。詳細には、これらの酵素は、５９２６（配列番号１４）、０４２７（配列番号２６）、０８７４（配列番号２）および１７２４（配列番号１０）であった。これらの酵素のそれぞれの配列は、図２において「＋−」を付して示した。２つの配列モチーフは、これらのＧＴＦ酵素のアミノ酸配列内で見いだされ、公知のＧＴＦ構造の触媒ドメインの周囲に位置する２つの異なる「挿入」として出現する。手短には、これらの配列モチーフは、下記と指定した：
モチーフ１ｂ（配列番号８１）：Ｄ−Ｓ／Ｐ−Ｒ−Ｆ−Ｔ−Ｙ／Ｆ−Ｎ−Ａ／Ｑ／Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｐモチーフ３ｂ（配列番号８２）：Ｉ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｅ
【０１９４】
モチーフ１ｂおよび３ｂの相対位置は、図２における７５２７ＧＴＦ配列（配列番号６５）の残基２３１〜２４３および５４９〜５５３とそれぞれ整列する。１００％のα−１，３−グリコシド結合を有する低分子量グルカンを合成するＧＴＦ酵素の触媒ドメイン内のモチーフ１ｂ（配列番号８１）および３ｂ（配列番号８２）の同定は、これらの固有のモチーフのそれぞれが類似の活性を備える他のＧＴＦを同定するために有用な可能性があることを示している。
【０１９５】
実施例６
配列モチーフ１ａが欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ１ａ（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０１であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ（配列番号８５）をコードする核酸生成物（配列番号８４）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０１であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０１を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列は、配列番号８５のアミノ酸５４〜９４１位（近く）に所在することが認められる。
【０１９６】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ酵素（配列番号８５）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０１９７】
実施例７
配列モチーフ２が欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ２（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０２であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ２（配列番号８７）をコードする核酸生成物（配列番号８６）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０２であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０２を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列が配列番号８７のアミノ酸５４〜９２７位（近くに）に所在することが認められる。
【０１９８】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ２（配列番号８７）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０１９９】
実施例８
配列モチーフ３ａが欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ３ａ（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０３であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ３ａ（配列番号８９）をコードする核酸生成物（配列番号８８）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０３であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０３を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列が配列番号８９のアミノ酸５４〜９３５位（近く）に所在すると認められる。
【０２００】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ３ａ（配列番号８９）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０２０１】
実施例９
配列モチーフ１ａおよび２が欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ１ａおよび２（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０４であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ、２（配列番号９１）をコードする核酸生成物（配列番号９０）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０４であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０４を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列は、配列番号９１のアミノ酸５４〜９１１位（近く）に所在することが認められる。
【０２０２】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ，２（配列番号９１）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０２０３】
実施例１０
配列モチーフ１ａおよび３ａが欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ１ａおよび３ａ（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０５であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ，３ａ（配列番号９３）をコードする核酸生成物（配列番号９２）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０５であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０５を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列は、配列番号９３のアミノ酸５４〜９１９位（近く）に所在することが認められる。
【０２０４】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ、３ａ（配列番号９３）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０２０５】
実施例１１
配列モチーフ２および３ａが欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ２および３ａ（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０６であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ２，３ａ（配列番号９５）をコードする核酸生成物（配列番号９４）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０６であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０６を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列は、配列番号９５のアミノ酸５４〜９０５位（近く）に所在することが認められる。
【０２０６】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ２，３ａ（配列番号９５）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０２０７】
実施例１２
配列モチーフ１ａ、２および３ａが欠如するＧＴＦ酵素の生成
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）内で発現させるために最適化されたコドン（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を使用して、配列番号６５の７５２７ＧＴＦに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ１ａ、２および３ａ（実施例４）の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。ｐＭＰ１０７であると同定されたプラスミドを生成するために、ＧＴＦタンパク質７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ，２，３ａ（配列番号９７）をコードする核酸生成物（配列番号９６）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）内にサブクローニングした。ＴＯＰ１０／ｐＭＰ１０７であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドｐＭＰ１０７を使用してＥ．コリ（ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換させた。ＧＴＦ触媒ドメイン配列は、配列番号９７のアミノ酸５４〜８８９位（近く）に所在することが認められる。
【０２０８】
Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）を用いた７５２７−ＮＴ−ｄｌＳ１ａ、２、３ａ（配列番号９７）の生成およびこの酵素を使用したグルカンポリマーの生成は、上述したように実施した（一般的方法）。グルカン生成物は不溶性であり、α−グリコシド結合しか含まない可能性が高い。グルカン生成物の固有粘度および分岐（一般的方法において記載したように分析した）は、下記の表５に列挙した。
【０２０９】
実施例１３
ＧＴＦ酵素によって合成されたグルカン生成物の固有粘度および分岐の分析
本実施例では、実施例６〜１２において調製した欠失含有ＧＴＦ酵素のそれぞれによって合成されたグルカンポリマーの固有粘度（ＩＶ）および分岐（ｇ’）を測定する工程について説明する。これらの測定値を、モチーフ１ａ、２および／または３ａの任意の内部欠失を有していない配列番号６５の７５２７ＧＴＦによって生成されたグルカンポリマーを用いて得られた測定値と比較した。
【０２１０】
７５２７ＧＴＦであるポリα−１，３−グルカンによって合成されたグルカンポリマーは、１００％のα−１，３−グリコシド結合を有し、したがって直鎖状である（例えば、表４を参照されたい）。
【０２１１】
７５２７ＧＴＦの欠失含有バージョンによって生成されたグルカンポリマーサンプルの固有粘度および分岐は、一般的方法に記載したように分析し、下記の表５に示した。非欠失７５２７ＧＴＦは、表５に「７５２７−ＮＴ」として列挙した。表５に「７５２７−ＮＴ」として列挙した非欠失７５２７ＧＴＦ（コントロール）によって合成されたグルカンポリマーについても分析した。
【０２１２】
【表１０】
2018518179.tif 000012
【０２１３】
表５に示したように、モチーフ１ａ（モチーフｉ）、２（モチーフｉｉ）または３ａ（モチーフｉｉｉ）のうちの少なくとも１つが欠如する各ＧＴＦ酵素によって生成されたグルカンは、これらのモチーフのそれぞれを有する対応するコントロールＧＴＦ（７５２７−ＮＴ）によって生成されたグルカンと比較して、減少した固有粘度（ＩＶ）および分岐指数（ｇ’）を有した。ＩＶおよび／またはｇ’のいずれかにおける減少はポリマー分岐の増加を示すので、これらの結果は、直鎖状ポリα−１，３−グルカンポリマーを生成するために、モチーフ１ａ、２および３ａのそれぞれが所定のＧＴＦ酵素−これらのモチーフのそれぞれを自然に含有するＧＴＦ酵素−にとって不可欠である可能性がある。
【０２１４】
この観察所見は、直鎖状生成物を生成する一部のＧＴＦ酵素がモチーフ１ａ、２または３ａのいずれも含有していないことを前提にすると、予想されなかった。例えば、ＧＴＦ５９２６、０４２７、０８７４および１７２４のそれぞれは、これらのモチーフのいずれも有していないにも関わらず、１００％のα−１，３−グリコシド結合を備えるポリα−１，３−グルカン（直鎖状である）を生成する。実際に、モチーフ１ａ、２および３ａの存在とグルカン生成物の分子量の増加との間には相関関係があると思われたので（実施例４を参照されたい）、モチーフ１ａ、２および／または３ａの除去が（分岐へ影響を及ぼす代わりに）グルカン生成物の分子量を減少させたと予想する方が妥当であろう。
【０２１５】
したがって、ＧＴＦアミノ酸モチーフ１ａ、２および３ａは、これらのモチーフを含有するそれらのＧＴＦ酵素による直鎖状ポリα−１，３−グルカンの生成において重要な役割を果たす。
【０２１６】
実施例１４
ＧＴＦ触媒ドメイン活性
本実施例では、不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成する能力について所定のＧＴＦの触媒ドメイン配列を試験する方法について記載する。詳細には、ＧＴＦ７５２７（配列番号６５）および５９２６（配列番号１４）の触媒ドメイン配列を活性について試験した。
【０２１７】
配列番号６５のアミノ酸残基５４〜９５７を有するＧＴＦの触媒ドメイン配列は、上述した異種発現技術を使用して調製した。手短には、第１アミノ酸位置にあるメチオニンに続く配列番号６５のアミノ酸残基５４〜９５７をコードするＤＮＡ配列（Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）における発現のために最適化されたコドン）を調製して、この触媒ドメイン配列を発現させるために使用した。このタンパク質は、ＧＩ番号４７５２７（配列番号６０）を付してＧＥＮＢＡＮＫにおいて同定されたアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端で２３０個のアミノ酸およびＣ末端で３８４個のアミノ酸が短縮している。
【０２１８】
配列番号１４のアミノ酸残基５７〜９０６を有するＧＴＦ触媒ドメイン配列は、上述した異種発現技術を使用して調製した。手短には、第１アミノ酸位置にあるメチオニンに続く配列番号１４のアミノ酸残基５７〜９０６をコードするＤＮＡ配列（Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）における発現のために最適化されたコドン）を調製して、この触媒ドメイン配列を発現させるために使用した。このタンパク質は、ＧＩ番号１６７７３５９２６（配列番号８３）を付してＧＥＮＢＡＮＫにおいて同定されたアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端で１９９個のアミノ酸およびＣ末端で４１７個のアミノ酸が短縮している。
【０２１９】
これらのＧＴＦの触媒ドメイン配列のいずれかを含有する反応溶液を調製するために、上記の手法にしたがった。この反応を２５℃で実施し、各反応において生成されたα−１，３−グルカンをＤＰｗについて分析した。結果は表６に要約した。
【０２２０】
【表１１】
2018518179.tif 000013
【０２２１】
表６に示したように、ＧＴＦ７５２７（配列番号６５の残基５４〜９５７）およびＧＴＦ５９２６（配列番号１４の残基５７〜９０６）は、ポリα−１，３−グルカンの生成を触媒することができた。これらの触媒ドメイン配列それぞれによって生成されたポリα−１，３−グルカンの分子量は、概して、触媒ドメインおよびグルカン結合ドメインの両方を含有するそれらの対応物によって生成された生成物の分子量と一致した（表４における配列番号６５および１４の活性、ＤＰｗ１５０を意味する）。
【０２２２】
したがって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメインを使用すると、反応溶液中で不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成することができる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
2018518179.tif 000022
【図２−９】
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【図２−１０】
2018518179.tif 000024
【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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【図２−２３】
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【図２−２４】
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【図２−２５】
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【図２−２６】
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【図２−２７】
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【図２−２８】
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【図２−２９】
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【図２−３０】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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