(57)【要約】  本発明は、組換えブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）ワクチン又は組成物を包含する。特に、本発明は、PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5及び/又はE抗原、タンパク質、エピトープ又は免疫原をコードし発現する組換えアデノウイルスベクターを包含する。そのようなワクチン又は組成物は動物をPRRSVから防御するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、安全かつ有効な免疫学的又はワクチン組成物：
a．1つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む1つ以上の組換えウイルスベクターであって、前記ポリヌクレオチドが1つ以上のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又はその変種をコードする前記組換えウイルスベクター；及び
b．医薬的に又は獣医的に許容できる担体。
【請求項２】
1つ以上のベクターが、組換えアデノウイルス5 PRRSV（Ad5-PRRSV）ベクター、組換えバキュロウイルスPRRSVベクター、組換えブタサイトメガロウイルスPRRSVベクター、又は組換えポックスウイルスPRRSVベクターを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
1つ以上のベクターが以下のどちらかを含む、請求項2に記載の組成物：
a．PRRSV E抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又はその変種をコードするヌクレオチド配列；又は
b．改変PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5若しくはM抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又はその変種をコードするヌクレオチド配列であって、対応する野生型のPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5若しくはM抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又はその変種の既存の細胞内局在化配列が異種遺伝子に由来する細胞表面発現決定基配列で入れ替えられている前記配列。
【請求項４】
1つ以上のベクターが2つのベクターの混合物を含み、第一のベクターが再標的化誘導したPRRSV微量タンパク質を発現し、第二のベクターが再標的化誘導したPRRSV主要タンパク質を発現する、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
組換えベクターが以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項3に記載の組成物：
a：配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリペプチド；又は
b．配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリペプチド。
【請求項６】
組換えPRRSVベクターが以下のポリヌクレオチドを含むAd5-PRRSVベクターである、請求項４に記載の組成物：
a：配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリヌクレオチド；又は
b．配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78の部分配列に示される配列によってコードされるエクトドメインと少なくとも90%配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
組成物又はワクチンが1つ又は2つの組換えAd5-PRRSVベクターを含む、請求項1又は6に記載の組成物。
【請求項８】
組換えAd5-PRRSVベクターが、1つ以上のPRRSV抗原、ポリペプチド、エクトドメイン又はその変種の以下の単一体又は組合せを発現する、請求項7に記載の組成物：
a．gp2及びE；
b．gp2、gp4及びE；
c．gp2、gp3、gp4及びE；
d．rtg-gp2、rtg-gp3及びrtg-gp4；
e．rtg-gp2及びE；
f．rtg-gp2、rtg-gp4及びE；
g．rtg-gp3及びE；
h．rtg-gp4及びE；
i．rtg-gp5及びrtg-M；
j．rtg-E；
k．E；
l．rtg-gp5；並びに
m．rtg-M。
【請求項９】
a．組換えAd5-PRRSVベクターが、抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
i．配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
ii．配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139の部分配列に示されるエクトドメイン配列をコードする配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
又は
b．組換えAd5-PRRSVベクターがポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、
i．配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
ii．配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78の部分配列に示されるエクトドメイン配列をコードする配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項7に記載の組成物。
【請求項１０】
1つ以上のPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE抗原、ポリペプチド、エクトドメイン又はその変種、又は前記の組み合わせをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１１】
1つ以上のポリヌクレオチドが1つ以上の抗原、ポリペプチド又はエクトドメインをコードし、前記抗原、ポリペプチド又はエクトドメインが、
a：配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１２】
1つ以上のポリヌクレオチドが、
a：配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76、78に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10又は11に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１３】
Ad5-PRRSVベクターが、PRRSV gp2抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号: 1、14、34−39、又は80−89の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10又は11に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１４】
Ad5-PRRSVベクターが、PRRSV E抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号: 7、20、52−58、又は130−139の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10又は11に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１５】
Ad5-PRRSVベクターが、PRRSV gp3抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）のいずれか1つに示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:5、18、40−45、90−99の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10又は11に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１６】
Ad5-PRRSVベクターが、PRRSV gp2及びE抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ及び配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つ及び配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10又は11に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１７】
Ad5-PRRSVベクターが、PRRSV gp2、E及びgp3抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ、配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）に示される配列の1つ、及び配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つ、配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つ、及び配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項10又は11に記載の組換えAd5-PRRSVベクター。
【請求項１８】
PRRSVに対抗する防御応答をその必要がある動物で誘引する方法であって、少なくとも1つのPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又は前記の変種を発現する組換えAd5-PRRSVベクター並びに医薬的又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを当該動物に投与する工程を含み；及び/又は
当該投与が、口鼻、噴霧、飲水、筋肉内又は皮下投与、皮内、経皮により；及び/又は
当該投与がプライム-ブーストであり；及び/又は
初回ワクチン接種が2つのAd5ベクターの混合物であり、第一のAd5ベクターが再標的化誘導したPRRSV微量タンパク質を発現しかつ第二のAd5ベクターがPRRSV主要タンパク質を発現し、さらに当該ブーストが、初回ワクチン接種の両方のベクター又はどちらか一方のベクター単独を含むか又は本質的に前記から成り；及び/又は
当該動物がブタである、前記応答を誘引する方法。
【請求項１９】
Ad5-PRRSVベクターが、2つのPRRSV抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ及び配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つ及び配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
Ad5-PRRSVベクターが、3つのPRRSV抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記抗原、ポリペプチド、又はエクトドメインが、
a：配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ、配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）に示される配列の1つ、及び配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか；又は
b．配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つ、配列番号:7、20、52−58、又は130−139（Eタンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つ、及び配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有する、
請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は仮特許出願USSN62/183,410（2015年6月23日出願）の優先権を主張する（前記出願は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
（参照による取り込み）一切の先行する出願及びそれら出願に又はそれら出願の審査中に引用された全ての文献（“出願引用文献”）、並びに当該出願引用文献で引用又は参照された全ての文献、並びに本明細書で引用又は参照される全ての文献（“本明細書引用文献”）、並びに本明細書引用文献で引用又は参照された全ての文献は、本明細書に又は本明細書に参照により取り込まれている任意の文献で言及されるいずれかの製品についてのいずれかの製造業者の指示、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートとともに参照により本明細書に含まれ、本発明の実施で利用することができる。本出願でそのような文献を引用又は認定したとしても、そのような文献が本発明に先行する技術として利用できることを容認するものではなく、そのような引用特許文献の有効性、特許性及び/又は法的強制力を何ら反映するものではない。GenBankアクセッション番号によって本明細書に参照する全ての配列は参照によりその全体が本明細書に含まれ、それらの配列は本出願の出願日現在GenBankで示されている通りである。
（技術分野）
本発明は、組換えアデノウイルスベクターPRRSVワクチン、組成物及び使用方法を包含する。
【発明の概要】
【０００２】
PRRSVは経済的に極めて重要なブタの壊滅的ウイルス性感染媒体である（Derald J.Holtkamp, 2013）。種々の単離株の抗原性特徴には大きな変動性があり、感染を防止する有効な手段は限られている。PRRSに対して利用可能なワクチンには2つの主要なグループが存在する（弱毒改変生ウイルス（MLV）ワクチン又は死滅ウイルスワクチンである）。MLVワクチンは、ホモローグチャレンジで有効であるが多くの流布変種ではより幅広い防御を提供できず、野生型復帰して劇症感染をもたらす潜在性を有する。そのうえ、MLVワクチンでワクチン免疫された動物はウイルスを放出し続け、このワクチンを使用する農場はPRRSVフリーになり得ない。他方、死滅ウイルスワクチンははるかに安全であるが、MLVワクチンよりも有効性は低い。したがって、感染防止に利用可能な従来の選択肢は安全でも有効でもない（Charerntantanakul, 2012）（Tjeerd G.Kimman, 2009）。過去20年間もの間、従来ワクチンのこの主要な欠点に主眼を置くことができる組換えワクチンが一丸となって鋭意開発されてきた（Zhang, 2012）。しかしながら、多大な努力にもかかわらず、PRRSV感染の予防のために認可された単一の組換えワクチンは市場に存在しない。過去に査定された大半の組換えワクチンは、中和抗体応答の標的と考えられているウイルスエンベロープタンパク質の1つ又は組合せを基礎とした。しかしながら、エンベロープタンパク質間の又は標的細胞の受容体との機能的な相互作用が完全には理解されていないために、効果的な組換えワクチンの合理的設計が阻まれた。
【０００３】
PRRSVのウイルスエンベロープは、ビリオン内のタンパク質の多さを基準にして概ね主要タンパク質及び微量タンパク質に分類される（Dokland, 2010）（Dea S, 2000）。主要ウイルスエンベロープタンパク質はgp5（ORF5）及びM（ORF6）であり、ダイマーを形成する。微量エンベロープタンパク質はgp2（ORF2）、gp3（ORF3）、gp4（ORF4）及びE（ORF2b）、並びにおそらく新たに特定されたウイルスタンパク質gp5a（ORF5a）である。微量エンベロープタンパク質はマルチマーとして存在すると考えられ、それらは、受容体CD163との直接的相互作用に関与し、ウイルスの侵入を媒介する（Phani B.Das, 2010）。
以前の組換えワクチン開発の試みの大半は、主要タンパク質のg5、M又は組合せに狙いを付けていた（Dea, 1998）。これはおそらく、主要タンパク質に対する抗体がPRRSV感染動物で容易に検出され、それらが免疫系に中和標的を提供すると仮定したという事実のためである。そのうえ、gp5には高度な配列変動性が存在し、これらのタンパク質は免疫選択圧力を受けることを示している。しかしながら中和血清のgp5特異抗体枯渇は、これらの抗体がほとんど当該血清の非中和分画に属することを示した（Juan Li, 2012）。したがって、これらの事柄は、主要タンパク質以外のウイルスエンベロープタンパク質上に（おそらくは微量タンパク質上に）第一位の中和標的が存在することを提示した。組換えワクチンの抗原として主要タンパク質を発展させようとする多大な努力にもかかわらず、精製組換えタンパク質から多様なベクタープラットフォームを用いてデリバリーされるワクチン（Jazmina L.G.Cruza, 2010）に至るまで、いずれも強力な防御を提供できないが故に市場に送り出されることはなかった。
【０００４】
最近、組換えPRRSワクチンの開発の焦点は微量タンパク質にシフトした（Jing-Qiang Ren, 2014）（Sakthivel Subramaniam, 2014）（Z.S.WANG, 2011）。このシフトは主として3つの最近の発見によってもたらされた。第一に、微量タンパク質の2つ、gp2及びgp4はCD163受容体に直接結合することが示された。第二に、EAV（ウマ動脈炎ウイルス）（同じくアルテリウイルスである）との微量タンパク質（主要タンパク質ではない）の交換は当該ウイルスの向性を変化させ、受容体との相互作用及び標的細胞へのウイルスの誘導における微量タンパク質の重要性を提示した（Lu Z1, 2012）（Tian D, 2012）。最後に、CD163（微量タンパク質の第一位受容体である）のノックアウト変異体はウイルス感染を防ぎ、一方、CD169（主要タンパク質のための受容体）の同様なノックアウトはウイルスの進入に影響を与えなかった（Randall S.Prather, 2013）。ウイルス進入及び中和抗体応答のための関連標的としての微量タンパク質の役割における情報が増えたにもかかわらず、これまでのところ微量タンパク質をベースにして開発された組換えワクチンのいずれもワクチン接種動物にPRRS感染防御をもたらさなかった。
我々は、本明細書において、この微量タンパク質の組合せに別の微量タンパク質Eを加えることによって劇的に相違する防御応答がもたらされることを示す。驚くべきことに、gp2、gp3及びgp4とともにEタンパク質が存在することによって、激しい免疫応答及びPRRSチャレンジによる肺病巣の減少が誘発された。Eタンパク質が防御免疫応答を誘発できるタンパク質複合体の重要な成分として示されたのは、これが最初である。これは、微量タンパク質複合体の本質的な成分としてEタンパク質を特定するだけでなく、タンパク質複合体の形成を促進する単一ベクタープラットフォームから4つのタンパク質全てを発現させることによって達成された。この新規な発見は、ウイルスタンパク質と細胞受容体との重要な相互作用の更なる理解に役立つだけでなく、生PRRSVを実際に含まない万能性組換えPRRSVワクチンの達成への道を開くであろう。
【０００５】
我々の手法では、gp2、gp3及びgp4を発現するプールプラスミドによる動物のワクチン免疫は、激しい免疫応答を発生させることはできなかった（未発表観察）。この動物試験の結論は、これらのタンパク質はマルチマーとして存在すると推定され、したがってマルチマー化を促進するために単一細胞内でこれらすべてのタンパク質を同時に発現させることが、免疫系に中和エピトープを提示する正確な立体構造を形成するために要求されるということであった。その後の生化学的アッセイもまたこのことを示し、同時発現を可能とするため全てのタンパク質を単一ベクター内に配置した。驚くべきことに、ここに報告する動物試験で、これもまた防御免疫応答の誘発に十分でないことを我々は見出した。むしろ、これらの抗原による防御免疫応答の誘発のために重要な要件は、細胞内区画から細胞の表面へ当該タンパク質を再標的化誘導する（re-target）ために導入される改変であった。改変タンパク質と非改変タンパク質との間のそのような劇的な違いは完全に予想に反し、多様なウイルス標的による同様なチャレンジに対処する新規な道を開くであろう。PRRSVエンベロープの微量タンパク質の免疫原性が、単一ベクターから微量タンパク質の全てを発現させ、かつ細胞表面発現を強化する改変を導入することによって、PRRSチャレンジによる肺病巣の防御とともに血清のウイルス血症レベルの低下をもたらすことができるほどに強化されたのは、我々の知る限りではこれもまた最初である
【０００６】
参考文献
Changhee Lee, D.Y.(2006).The small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus possesses ion channel protein-like properties.Virology , 30-43.
Charerntantanakul, W.(2012).Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects.World Journal of Virology, 23-30.
Dea S, G.C.(2000).Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates.Archives of Virology, 659-688.
Dea, B.P.(1998).Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Journal of General Virology, 989-999.
Derald J.Holtkamp, J.K.(2013).Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on united States Pork producers.Journal of Swine Health and production, 72-84.
Dokland, T.(2010).The structural biology of PRRSV.Virus Reserach, 86-97.
F.A.Osorio, J.A.(2002).Passive Transfer of Virus-Specific Antibodies Confers Protection against Reproductive Failure Induced by a Virulent Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus and Establishes Sterilizing Immunity.Virology, 9-20.
Jazmina L.G.Cruza, S.Z.(2010).Vectored vaccines to protect against PRRSV.Virus Research , 150-160.
Jing-Qiang Ren, W.-C.S.-J.-B.-L.-X.-P.-W.-Y.(2014).Construction and immunogenicity of a DNA vaccine coexpressing GP3 and GP5 of genotype-I porcine reproductive and respiratory syndrome virus.BMC Veterinary Research, 1-11.
Juan Li, M.P.(2012).Dissociation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralization from antibodies specific to major envelope protein surface epitopes.Virology, 367-376.
Lu Z1, Z.J.(2012).Chimeric viruses containing the N-terminal ectodomains of GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus do not change the cellular tropism of equine arteritis virus.Virology, 99-109.
Maorong Yua, X.L.(2010).Subcellular localization and topology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus E protein.Virus Reserach, 104-114.
Meng, X.(2000).Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development.Veterinary Microbiology 74 (2000) 309±329, 309-329.
O.J.Lopez, M.F.(2007).Protection against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Infection through Passive Transfer of PRRSV-Neutralizing Antibodies Is Dose Dependent.linical and Vaccine Immunology, 269-275.
Phani B.Das, P.D.(2010).The Minor Envelope Glycoproteins GP2a and GP4 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Interact with the Receptor CD163.Journal of Virology, 1731-1740.
Randall S.Prather, R.R.(2013).An Intact Sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) Is Not Required for Attachment/Internalization of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.Journal of Virology, 9538-9546.
Sakthivel Subramaniam, P.P.(2014).In vivo targeting of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigen through porcine DC-SIGN to dendritic cells elicits antigen-specific CD4T cell immunity in pigs.Vaccine, 6768-6775.
Tian D, W.Z.-D.(2012).Arterivirus minor envelope proteins are a major determinant of viral tropism in cell culture.Journal of Virology, 3701-3712.
Tjeerd G.Kimman, L.A.-Z.(2009).Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccinology.Vaccine, 3704-3718.
Yijun Du, F.A.(2010).Myristoylation of the small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus is non-essential for virus infectivity but promotes its growth.Virus Research, 294-299.
Z.S.WANG, X.X.(2011).Immunogenicity of the envelope GP3 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus displayed on baculovirus.Acta Virologica, 139-146.
Zhang, J.H.(2012).Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Vaccines: Current Status and Strategies to a Universal Vaccine.Transboundary and Emerging Diseases, 109-120.
【０００７】
本開示は、新規なPRRSVワクチン組成物並びにその作製及び使用方法を提供する。
本開示は、部分的には、別のPRRSV微量タンパク質（E）を他の微量タンパク質の組合せに加えることは劇的に相違する防御応答をもたらすという驚くべきかつ予想に反する発見に基づく。いくつかの実施態様では、Eタンパク質の十分な部分（例えばそのトランスメンブレン（TM）、アミノ末端（NT）又はそのカルボキシ末端（CT）ドメイン）を用いて前記防御応答を引きだすことができる。
驚くべきことに、Eタンパク質がgp2、gp3及びgp4と一緒に存在することによって、激しい免疫応答及びPRRSチャレンジによる肺病巣の減少が誘発された。これは、防御免疫応答を誘発できるタンパク質複合体の重要な成分としてEタンパク質が示された最初である。
したがって、本開示のワクチンは、単にEタンパク質を微量タンパク質複合体の本質的成分として特定することによって達成されたわけではなく、さらにタンパク質複合体の形成を促進する単一ベクタープラットフォームから4つのタンパク質全てを発現することによって達成された。
別の特徴では、本開示は、PRRSV微量タンパク質のキメラバージョンを発現する組換えウイルスベクターを提供し、このベクターは、それらの対応する野生型遺伝子と比較して異なる細胞内局在決定基を含む。特に、VSV糖タンパク質（G）の一部及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）が付加されて、得られたキメラ遺伝子生成物を細胞表面に局在させる。これらの組換えベクターは、PRRSVに対して安全で有効な免疫応答を宿主動物で誘引する。したがって、PRRSV微量タンパク質の表面発現を達成するために当該微量タンパク質に導入された改変は、Eタンパク質をgp2、gp3及びgp4と一緒に共発現させた場合と同様な効果をもたらした。
【０００８】
したがって、本開示は、生ウイルスが100%存在しない普遍的組換えPRRSワクチンを達成するためのロードマップを提供する。
より具体的には、本開示はアデノウイルスベクターPRRSVワクチン又は組成物に関し、これらは、ある種のPRRSV抗原を保持しこれを発現する1つ以上の操作された組換えアデノウイルスベクター、及び場合によって医薬的に又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを含む。PRRSVは任意の株でよい。なぜならば、本明細書で開示する新規で刷新的な組成物及び方法は、以下でより完全に考察する理由のために、全ての公知のPRRSV株及び今後発見される株にも普遍的に適用できるからである。
当該PRRSV抗原はPRRSV微量タンパク質（例えばgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE）を任意の組合せで含み、さらに場合によって追加のPRRSV微量タンパク質（例えばgp5又はM）を含む。他の微量タンパク質と同様に、gp5aは比較的良好に保存され、出願人は本開示の安全で有効な組換えウイルスベクターの有効な付加物又は代用物であると考える。
【０００９】
PRRSV組換えベクターは、少なくとも以下の遺伝子又は成分の組合せを含み、動物宿主でそれらを発現することができる（組合せは任意の順序であり、任意のプロモーターエレメント（PE）（提示されているものを含み、例えばIRES及び2A-ペプチドが含まれる）によって駆動される）（rtg＝再標的化誘導（re-targeted）；CMV＝サイトメガロウイルスプロモーター；SV40＝シミアンウイルス40プロモーター；IRES＝配列内リボソーム進入部位、自己切断2Aペプチドは口蹄疫（FMD）ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、ソセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス又はブタテッショウウイルス-1に由来する）：1）(PE)gp2、(PE)gp3、(PE)gp4、(PE)E；2）(PE)rtg gp2、(PE)gp3及び(PE)gp4；3）(PE)rtg gp2、(PE)rtg gp3及び(PE)rtg gp4；4）(PE)rtg gp2、(PE)rtg gp3、(PE)rtg gp4及び(PE)E；5）(PE)rtg gp2、(PE)rtg gp3、(PE)rtg gp4及び(PE)rtg E；6) (PE)rtg gp2、(PE)rtg gp4及び(PE)rtg E；7）(PE)rtg gp2及び(PE)rtg gp4；8）(M-(SV40)-(CMV)-gp5-(IRES)-gp5a；9)gp2-(SV40)-(CMV)-E；10）rtg gp2-(SV40)-(CMV)-E；11）rtg gp2-(SV40)-(CMV)-rtg E；12）(CMV)-E；11）E-(p2A)-gp2-(SV40)-(CMV)-gp4；12）rtg E-(p2A)-rtg gp2-(SV40)-(CMV)-rtg gp4；13）(PE)gp2-(PE)gp4-(PE)E；14）(PE)gp2-(PE)E；15）(PE)gp2；16）(PE)gp2-(PE)gp3；16）(PE)gp2-(PE)gp4；17）(PE)gp2-(PE)gp5a；18）(PE)E；19）(PE)E-(PE)gp3；20）(PE)E-(PE)gp4；19）(PE)E-(PE)gp5a；20)。有利な実施態様では、ベクターは、最小限(PE)gp2、(PE)gp4及び(PE)E（野生型又はその“rtg”バージョン）を含み、前記を発現する。有利にはベクターはまたgp2プラスPRRSVポリペプチドをコードする任意の他の遺伝子を含むことができる。
【００１０】
再標的化誘導は、既存のgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEタンパク質のトランスメンブレン（TM）ドメイン及び細胞質テール（TC）ドメインをそれぞれVSVのTMドメイン及びCTドメインに入れ替えることによって達成できる。ある実施態様では、gp5及びMタンパク質もまた再標的化誘導手順に付すことができる。自然のままのPRRSVタンパク質配列もまた或いはまた別に、tPAシグナル配列並びにVSVのTM及びCTの一方又は両方（又は他の適切な表面発現ポリペプチドに由来するそれらの同じエレメント）に入れ替えられる。また別には、再標的化誘導は、既存のgp2、gp3、gp4、gp5a、E、gp5又はMタンパク質CTドメインをVSVのCTドメインに入れ替えることによっても達成できる（すなわち既存TMドメインは交換しない）。Eの再標的化誘導もまた、その細胞内局在化シグナルをII型膜タンパク質に由来するものに、又はVSV-G、又は前記の組み合わせに、或いは他の表面糖タンパク質のTM/CTドメインに入れ替えることによって達成できる。
出願人はさらに、PRRSV抗原を宿主動物の免疫系に提示する多くの代替手段を想定する。例えば、抗原はウイルス様粒子（VLP）の表面にディスプレーすることが可能である。他の実施態様では、抗原の可溶バージョンを宿主動物に投与することが可能であり、この場合、当該タンパク質を互に或いはVSV-Gの成分又は他のウイルスタンパク質を加えてオリゴマー化（トリマー化を含む）するか、又は任意のオリゴマー化（トリマー化モチーフ（例えば細菌のGCN4由来モチーフなど）を含む）が実施される。さらにまた、I型ウイルス表面糖タンパク質のTM/CTドメインが同じ目的の達成のために想定され、したがって、VSV-Gの対応するドメインと相互に交換することができる。
したがって、今や本発明が開示されたので、PRRSV微量タンパク質（E、Gp2、gp3、gp4、gp5aを含む）、主要タンパク質（gp5及びMを含む）又は微量及び/又は主要タンパク質の組合せの宿主動物の免疫系への実質的に同じ提示を達成するために、多くの代替方法及び機能的に等価な方法が存在することは当業者には理解されるであろう。
【００１１】
本発明はまた、1つ以上のワクチン又は組成物の有効量を動物に投与する工程を含む、動物をワクチン免疫する方法に関し、前記1つ以上のワクチン又は組成物は、有効量のアデノウイルスベクターPRRSVワクチン及び場合によって医薬的又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを含むことができる。投与は、皮下、鼻内、筋肉内、経皮、皮内、粘膜投与であることができ、経口又は任意の他の投与が含まれる。
本発明はさらに、プライム-ブーストプロトコルを用いるワクチン又は組成物の投与に関する。本発明はさらに、免疫応答を誘引又は誘発する方法を実施するためのキットを包含し、前記キットは、組換えAd5免疫学的組成物若しくはワクチン、又は不活化免疫学的組成物若しくはワクチン及び当該方法を実施するための指示の任意の1つを含むことができる。
したがって、以前に公知の一切の製品、当該製品を作製する方法、又は当該製品を使用する方法を本発明内に包含しないことは本発明の目的であり、出願人は権利を留保し、以前に公知の一切の製品、プロセス又は方法を除外することを明記する。USPTO（35 U.S.C.§112、第1節）又はEPO（EPCの条項83）の記載及び実施可能性要件に適合しないいずれの製品、当該製品の作製プロセス又は当該製品の使用方法も本発明の範囲内に包含することを意図しないことを更に特記し、本出願人は権利を留保し、以前に記載の一切の製品、当該製品の作製プロセス、又は当該製品の使用方法を除外することを明記する。
これらの実施態様及び他の実施態様は、下記の「発明を実施するための形態」の項に開示され又は当該項で明瞭でありかつ当該項に含まれている。
以下の詳細な説明（例示として提供され、記載する具体的な実施態様にだけ本発明を限定しようとするものではない）は、添付の図面と一緒にして最良の理解を提供するであろう。当該図面は下記の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）の微量ウイルスエンベロープタンパク質を発現する、4つの異なる組換えウイルスベクターの作製に用いた挿入物のマップを示す。vAF3042は、コドン最適化PRRSV gp2、gp3及びgp4を発現しEは存在しない（A）；vAD3038は、コドン最適化、再標的化誘導（re-targeted）（“rtg”）rtg-gp2、rtg-gp3及びrtg-gp4を発現しEは存在しない（B）；vAD3041は、コドン最適化gp2、gp3、gp4をEとともに発現する（C）；vAD3067は、コドン最適化rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4をEとともに発現する（D）；vAD3046は、コドン最適化ブタインフルエンザウイルスヘマグルチニンSIV-HA）を発現する（E）；vAD3069は、コドン最適化核タンパク質（Np又はN）、M、gp5及びgp5aを発現する（F）；vAD3064は、コドン最適化rtg-M、rtg-gp5及びrtg-gp5aを発現する（G）。
【図２】ウイルス膜表面のPRRSV“主要”タンパク質及び“微量”タンパク質の編成を示す模式図である。
【図３】PRRSV“微量”タンパク質は宿主細胞表面の受容体（例えばCD163）と相互作用すると考えられるこれまでの事象及び開示の事象の示唆にしたがって、PRRSV微量タンパク質の配置及び相互作用を示す模式図である。
【図４】vAD3041パッサージ3（A）及びvAD3042パッサージ3（B）に挿入されたPRRSV微量タンパク質の領域のPCRアンプリコンを示すゲル画像である。
【図５Ａ】PRRSVエンベロープタンパク質を細胞表面に再標的化誘導するために用いられる案を示す。
【図５Ｂ−５Ｄ】rtg-gp2、rtg-gp3及びrtg-gp4タンパク質のマップを示す。マップでは、内因性TM及びCTドメインが水疱性口内炎ウイルス-G（VSV-G）のトランスメンブレン（TM）及び細胞質テール（CT）ドメインに入れ替えられ、シグナル配列が入れ替えられ、エピトープタグが付加され、さらにリンカー配列が挿入されている。
【図６】エピトープタグ付加rtg-gp2、rtg-gp3及びrtg-gp4タンパク質をトランスフェクトされた固定HEK293T細胞の免疫蛍光アッセイ（IFA）画像を示す。
【図７】個々の再標的化誘導エンベロープタンパク質をそれぞれコードするプラスミドをトランスフェクトされたHEK293T細胞の共免疫沈澱（co-IP）溶解物の抗VSVGウェスタンブロット（WB）を示す。
【図８】個々の再標的化誘導エンベロープタンパク質又はブタCD16をそれぞれコードするプラスミドをトランスフェクトされたHEK293T細胞のco-IP溶解物のいくつかのWBを示す。IP：α-VSV、Wb：α-VSV-HRP（A）；IP：α-VSV、Wb：α-CD163（B）；IP：α-CD163、Wb：α-CD163-ビオチン（C）。
【図９Ａ−９Ｃ】vAD3038（コドン最適化rtg-gp234を含む）を感染させ、表示のタンパク質に特異的な2つの抗体及び異なる蛍光体タグで同時染色したHEK293T細胞の二重免疫蛍光アッセイ（IFA）画像を示す。画像は、各蛍光体に固有のフィルターを用いて同一光学視野から採取された。対応する画像は矢印で示されている。
【図１０】本試験を通して収集したサンプル及び収集時期を詳述するチャートである。
【図１１】種々のグループ間の肺病巣スコアの分布を示すグラフである。vAD3042（コドン最適化野生型gp2、野生型gp3及び野生型gp4を発現するAd5）；vAD3041（コドン最適化野生型gp2、野生型gp3、野生型gp4及び野生Eを発現するAd5）；vAD3038（コドン最適化rtg-gp2、rtg-gp3及びrtg-gp4を発現するAd5）；vAD3033（ブタインフルエンザウイルス（SIV）のコドン最適化ヘマグルチニン（HA）遺伝子を発現するAd5、陰性コントロール）。中央値（横棒線）及び平均（＋）及び枠は第一及び第三の四分位数範囲を表す。灰色の輪は、各グループの各動物個体の実際の肺スコアを示す。
【図１２】配列表に存在する配列を列挙し詳述する。
【図１３】配列番号:34−39に示されるgp2ポリペプチド配列のClustal Wアラインメントである。
【図１４】配列番号:40−45に示されるgp3ポリペプチド配列のClustal Wアラインメントである。
【図１５】配列番号:46−51に示されるgp4ポリペプチド配列のClustal Wアラインメントである。
【図１６】配列番号:52−58に示されるEポリペプチド配列のClustal Wアラインメントである。
【図１７】配列番号:62−65に示されるgp5aポリペプチド配列のClustal Wアラインメントである。
【図１８】vAd3038（Gp234-Rtrg＋死滅ワクチン）又はvAd3046（SIV-HA）のどちらかを投与されたブタの肺病巣スコアを示す図表である。
【図１９】vAd3038（Gp234-Rtrg＋死滅ワクチン）又はvAd3046（SIV-HA）のどちらかを投与されたブタの血清ウイルス量を示す図表である。
【図２０】チャレンジ前及びチャレンジ後のグループ1、2、4及び5の免疫応答の比較である。Eタンパク質レベル（上段左）の可視化に抗V5を用い、gp3（右）の検出に抗Flagを用い、gp4タンパク質レベル（下段左）の可視化に抗HAを用いてウェスタンブロットをプローブした。
【図２１】vAD3067（IM/IM）続いて死滅ワクチン、vAD3067（IN/IM）続いて死滅ワクチン、vAD3067＋vAD3064（IN/IM）続いて死滅ワクチン、又はvAD3046続いてプラセボを投与されたブタの肺病巣スコアを示す図表である。全ての死滅ワクチンは1回IMで投与された。
【図２２】vAD3067（IM/IM）続いて死滅ワクチン、vAD3067（IN/IM）続いて死滅ワクチン、vAD3067＋vAD3064（IN/IM）続いて死滅ワクチン、又はvAD3046及びプラセボを投与されたブタの血清ウイルス量を示す図表である。全ての死滅ワクチンは1回IMで投与された。
【図２３】Eと再標的化誘導したgp4との間の可能な相互作用を精査するために設計された免疫沈澱試験の結果を示す（相互作用は観察されなかった）。構築では、Flagタグがgp3に結合され、V5タグがEに結合され、HAタグがgp4に結合され、Mycタグがgp2に結合される。WB（ウェスタンブロット）、IP（免疫沈澱）、S（可溶性gp）及びV（VSVタグ付加gp）。
【図２４】Eと再標的化誘導したgp3との間の可能な相互作用を精査するために設計されたIP試験の結果を示す（相互作用は観察されなかった）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示、特に特許請求の範囲及び/又はパラグラフでは、例えば“comprises(含む)”、“comprised”、“comprising”などという用語は、米国特許法で前記に帰せられた意味を有し、例えば、それら用語は、“includes（含む）”、“included”、“including”などを意味することができ、例えば“consisting essentially of（本質的に〜から成る）”及び“consists essentially of”という用語は、米国特許法でそれらに割り当てられた意味を有し、例えば、それらは明確に列挙されていない要素を許容するが、先行技術で見出されている要素又は当該発明の基本的な又は新規な特徴に影響を及ぼす要素を排除することが特記される。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数用語“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示さないかぎり複数の指示対象を含む。同様に、 “or（又は）”という語は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり“and（及び）”を含む。
本明細書で用いられる用語“about（約）”は、およそ、〜の範囲で、おおざっぱに、〜辺りを意味する。“約”という用語が数域と一緒に用いられるとき、前記用語は、表示の数値より上方及び下方に境界を広げることによって当該範囲を修正する。一般的には、“約”という用語は、10%の差異で表示の値より上方及び下方に数値を修正するために用いられる。ある特徴では、“約”という用語は、用いられる数字の20%の数値がプラス又はマイナスされることを意味する。したがって、約50%は45%−55%の範囲にあることを意味する。本明細書に末端から列挙される数域は当該範囲内に包含される全ての数字及び分数を含む（例えば1から5は、1、1.5、2、2.75、3、3.90、4及び5を含む）。全ての数字及びその分数が、“約”という用語によって修正できると推定されることは理解されよう。
【００１４】
本発明では、アデノウイルス5（Ad5）又は別の適切なベクターを用いて、選択したPRRSVエンベロープタンパク質をin vivoで動物宿主にデリバリーし発現させ、病毒性のPRRSVによる実験的又は天然のチャレンジに対して安全で有効な免疫応答を誘引する。
本開示ではAd5をPRRSVタンパク質のデリバリーに用いるが、他のいずれの適切なベクターも用いることができよう。例えば、バキュロウイルス、ポックスウイルス（家禽ポックスウイルス、カナリアポックスウイルスを含む）を用いて、本明細書に開示する新規で刷新的な遺伝子組合せをデリバリーすることができる。別の実施態様では、ブタサイトメガロウイルス（PCMV）をベクターとして用いてもよい（PCMVは、体中の組織（炎症（鼻炎）を引き起こす場合は新生期仔豚の鼻を含む）に見いだされるヘルペスウイルスである）。
本発明はしたがって、有効量の1つ以上の操作されたAd5ベクター又は他の適切なベクター、及び場合によって医薬的又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを含むことができる、ワクチン又は免疫学的組成物に関する。
したがって、本発明は、PRRSVエンベロープタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を発現する、操作されたAd5ベクター（又は他の適切なベクター）を包含し、このベクターは動物で免疫原性応答を誘引する。PRRSVタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a及びEから選択される、少なくとも1つのPRRSV微量タンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を含む。
本明細書で用いられる、“PRRSV微量ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原”という用語は、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスの任意の微量ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を指す。これまでのところ、微量ポリペプチド又はその成分にはgp2、gp3、gp4、gp5a及びEタンパク質が含まれるが、これまでに公知の微量タンパク質に随伴する他のタンパク質も存在し、これらもまた本開示発明の実施で有効に用いることができよう。一般的に及び本明細書で用いられる、“エクトドメイン”という用語は、細胞外空間に伸長する膜タンパク質のドメインを指す。したがって、あるタンパク質のエクトドメインとのパーセント同一性といえば、前記タンパク質の非エクトドメイン（トランスメンブレンドメイン（TMD）及び細胞質ドメイン（CTD）を含む）との比較を含むことは意図されない。
【００１５】
“動物”という用語によって哺乳動物、ヒト、鳥類などが意図される。動物は以下から成る群から選択され得る：ウマ科の動物（例えばウマ）、イヌ科の動物（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ科の動物（例えばライオン、トラ、家ネコ、野生ネコ、他の大型のネコ、及び他のネコ科の動物（チーター及びオオヤマネコを含む））、ヒツジ科の動物（例えばヒツジ）、ウシ科の動物（畜牛、乳牛、バッファロー）、ブタ科の動物（ブタ）、鳥類（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー及びヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）及び魚類。“動物”という用語はまた個々の動物の全発育期（胚性期及び胎児期を含む）を含む。
本発明では、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスに対するブタの免疫学的防御が最重要である。しかしながら、本明細書で開示する概念は、（本発明の場合のように）中心的な“細胞進入媒介”表面タンパク質の相対的低発現又は限定的発現がワクチン開発を特に困難にしている他のウイルスにも同様に具合よく適用されるであろう。したがって、本明細書に開示するように、そのような“微量エンベロープタンパク質”の細胞表面への再標的化誘導及び/又はシャペロニングは、すべてのエンベロープウイルスに広範囲にわたって適用される。
ある実施態様では、Ad5免疫学的組成物又はワクチンは、1つ以上の操作されたAd5ベクター、及び場合によって医薬的又は獣医的に許容できる賦形剤、アジュバント、担体又はビヒクルを含む。操作されたAd5ベクターは、PRRSV微量タンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。PRRSVタンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、gp2、gp3、gp4、gp5a、E又は前記の任意のフラグメントであり得る。
【００１６】
本明細書で用いられる、“抗原”又は“免疫原”という用語は、宿主動物で特異的な免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、全生物（死滅、弱毒又は生）；生物のサブユニット又は部分；エピトープ、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、又は免疫原性特性を有する前記のフラグメントを発現する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物への提示に際して免疫応答を誘発することができる核酸の断片又はフラグメント；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。また別には、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。
本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質又はペプチド”にはまた、いったん宿主に投与されたら、当該タンパク質に対して液性及び/又は細胞性免疫応答を惹起できるという意味で免疫学的に活性なペプチド及びポリペプチドが含まれる。好ましくは、タンパク質フラグメントは、完全、インタクトな天然のままのタンパク質と同じ免疫学的活性を実質的に有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープ又は抗原性決定基を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。エピトープという用語（抗原性決定基としても知られている）は、免疫系によって認識され、液性タイプ（B細胞）及び/又は細胞性タイプ（T細胞）の免疫反応を誘発できる巨大分子の部分である。
【００１７】
“免疫原性タンパク質又はペプチド”という用語はさらに、当該配列に対する欠失、付加及び置換を意図するが、ただし当該ポリペプチドが機能して本明細書に定義する免疫学的応答をもたらすことを条件とする。前記に関しては、特に好ましい置換は一般的には事実上保存的な置換、すなわち1つのアミノ酸ファミリー内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸は一般的に4つのファミリーに分割される：（1）酸性---アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性---リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性---アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性---グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはときに芳香族アミノ酸として分類される。ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる入れ替え又はその逆；アスパラギン酸のグルタミン酸による入れ替え又はその逆；スレオニンのセリンによる入れ替え又はその逆；又はあるアミノ酸の構造的に関係を有するアミノ酸による同様な保存的入れ替えは、それぞれ生物学的活性に対して大きな影響を示さないであろうということは合理的に予想できる。タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を有するが実質的には参照分子と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの定義内である。
【００１８】
“エピトープ”という用語は、免疫系によって認識され、液性タイプ（B細胞）及び/又は細胞性タイプ（T細胞）の免疫応答を誘発できる巨大分子の部分を指す。当該用語はまた、“抗原性決定基”又は“抗原性決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体が別の抗体と標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイによって特定することができる。
組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”は、当該宿主における対象組成物又はワクチンに対する細胞性及び/又は抗体媒介性免疫応答の発達である。通例、“免疫学的応答”には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：対象組成物又はワクチンに含まれる1つ又は複数の抗原に特異的に向けられる抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は治療的な又は防御的な免疫学的応答のどちらかを示し、それにより新たな感染に対する耐性が強化され、及び/又は当該疾患の臨床的重篤性が低下するであろう。そのような防御は、感染宿主によって通常示される徴候の緩和又は欠如、より迅速な回復期間、及び/又は感染宿主におけるウイルス力価の低下によって提示されるであろう。
本明細書で用いられる“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドはまた、上記のように免疫学的応答を誘引するアミノ酸配列を指す。本明細書で用いられる、“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、当該タンパク質の完全長配列、そのアナローグ、又はその免疫原性フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”は、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記の免疫学的応答を誘引するタンパク質のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、いくつものエピトープマッピング技術を用いて特定することができる。前記技術は当業界で周知であり、例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66（Glenn E.Morris, Ed., 1996）。
【００１９】
例えば、線状エピトープは、例えば多数のペプチド（タンパク質分子の複数の部分に一致する）を固相うえで同時に合成し、ペプチドが固相に結合している間に抗体と反応させることによって決定できる。そのような技術は当業界では公知であり、例えば以下に記載されている：U.S.Pat.No.4,708,871；Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986。同様に立体的エピトープは、アミノ酸の空間配座を例えばx-線結晶学及び二次元核磁気共鳴で決定することによって容易に特定される（例えば上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい）。
合成抗原（例えばポリペプチド、フランキングエピトープ、及び他の組換え体又は合成により誘導される抗原）もまた当該定義内に含まれる。本発明の目的のためには、免疫原性フラグメントは、通常少なくとも約3つのアミノ酸、約5つのアミノ酸、約10−15のアミノ酸、約15−25のアミノ酸、又はそれより大きいアミノ酸の分子を含むであろう。当該フラグメントには決定的な上限は存在せず、フラグメントは、ほぼ完全長のタンパク質配列又は当該タンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質すら含み得よう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小限の構造は、それが、PRRSVタンパク質又はポリペプチドのエピトープ又は抗原性決定基をコードするヌクレオチドを含むか、本質的に前記ヌクレオチドから成るか、又は前記ヌクレオチドから成るということである。全タンパク質又はポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該全タンパク質又はポリペプチドをコードする配列の最小限15ヌクレオチド、有利には約30−45ヌクレオチド、好ましくは約45−75、少なくとも57、87、又は150の切れ目なく続くか又は連続するヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。エピトープ決定手順、例えばオーバーラップペプチドライブラリーの作製（Hemmer et al., 1998）、ペプスキャン（Pepscan）（Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1985；Van der Zee R.et al., 1989；Geysen, 1990；Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron）及びアルゴリズム（De Groot et al., 1999）を、過度な実験を実施することなく本発明の実施で用いることができる。
ポリヌクレオチドは任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び任意の組合せのアナローグを含む。ポリヌクレオチドは三次元構造を有することができ、任意の機能（公知又は未知）を発揮することができる。“ポリヌクレオチド”という用語には、二本鎖、一本鎖、及び三本鎖へリックス分子が含まれる。特段の指定又は要請がなければ、本明細書に記載する、ポリヌクレオチドのいずれの実施態様も二本鎖形及び2つの相補鎖形の各々の両方を包含し、後者の相補鎖形はDNA、RNA又はハイブリッド分子の二本鎖形を構成することが判明しているか又は予測されるものである。
【００２０】
“コドン最適化”という用語は、タンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ、ドメイン又はフラグメントをコードする核酸配列を選択宿主での発現/翻訳のために最適に構成するプロセスを指す。一般的には、遺伝子発現レベルは多くの要件（例えばプロモーター配列及び調節エレメント）に左右される。最も重要な要件は、転写遺伝子のコドン使用頻度を宿主の典型的なコドン使用頻度に適応させることである（Lithwich, G.and Margalit, H., Genome Res.13, 2665-2673, 2003）。したがって、翻訳選別下にある原核細胞ゲノムの高度に発現される遺伝子は、強いコドン使用頻度の偏りを有する。これは、それらがもっとも豊富なRNA種によって認識される小さなコドンサブセットを利用することによる（Ikemura, T., J.Mol.Biol.151, 389-409, 1981）。このコドン適応を調整する力は翻訳選別と呼ばれ、その強さは急速に増殖する細菌で重要である（Rocha, E.P., Genome Res.14, 2279-2286, 2004；Sharp, P.M.et al., Nucleic Acids Res.33, 1141-1153）。宿主が稀に利用するコドンを遺伝子が含む場合、その発現レベルは最大ではないであろう。これは異種タンパク質発現の限界の1つであり（Gustafsson, C.et al., Trends Biotechnol.22, 346-353, 2004）、DNAワクチン開発の限界の1つであり得る（Ivory, C.and Chadee, K., Genet.Vaccines Ther.2, 17, 2004）。発現レベルを高めるために、多数の合成遺伝子が再設計された。合成遺伝子データベース（SGDB）（Wu, G.et al., Nucleic Acids Res.35, D76-D79, 2007）は、合成遺伝子に関する200を超える公表実験の情報を含んでいる。ある種のタンパク質を最適量で発現させるために新たな宿主に挿入される核酸配列の設計プロセスで、コドン使用頻度の最適化は通常最初の工程の1つである（Gustafsson, C., Trends Biotechnol.22, 346-353, 2004）。コドン使用頻度最適化は、基本的には標的遺伝子の稀なコドンを変更して、それにより、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく当該コドン使用頻度がより緊密に宿主のコドン使用頻度を反映することができる（Gustafsson, C., Trends Biotechnol.22, 346-353, 2004）。最適化プロセスに通常用いられる情報は、したがって最適化されるべきDNA及びタンパク質配列並びに宿主のコドン使用頻度表（参照セット）である。
当業者によるある種のコドン最適化を可能にする、いくつかの公開ウェブサービス及び単独機能性ソフトが存在する。‘GeneDesign’（Richardson, S.M.et al., Genome Res.16, 550-556, 2006）、‘Synthetic Gene Designer’（Wu, G.et al., Protein Expr.Purif.47, 441-445, 2006）、及び‘Gene Designer’（Villalobos, A.et al., BMC Bioinformatics 7, 285, 2006）は、コドン最適化工程を含む合成遺伝子設計のためのプラットフォームを提供するパッケージである。各サーバー又はプラグラムで利用可能なコドン使用頻度最適化のための方法に関して、最初に開発されたプログラムは単に‘一アミノ酸-一コドン’を利用した。最近のプログラム及びサーバーはさらに、ある程度のコドン使用頻度可変性を作出する方法を含むようになった。この可変性は、天然の高度発現遺伝子のコドン使用頻度可変性を反映し、最適化プロセスで導入されるべき追加基準（例えば制限部位の回避）を可能にする。本明細書に記載する大半のソフト及びウェブサーバーは以下の3つの方法を提供する：全てのコドンの完全な最適化、モンテカルロ（Monte Carlo）アプローチを用いる参照セットの相対的コドン使用頻度を基準にする最適化、及びクェリー配列と最適化配列との間の変化を最少にし最適化を最大にするために設計された新規なアプローチ。
【００２１】
ある実施態様では、組換えPRRSV微量タンパク質、抗原、ペプチド、ポリペプチド、フラグメント、ドメイン又はエピトープをコードする核酸配列は、動物での発現のためにコドン最適化される。別の実施態様では、コドン最適化配列は、ブタのPRRSV微量エンベロープタンパク質、抗原、ペプチド、ポリペプチド、フラグメント、ドメイン又はエピトープを動物での発現のためにコードする。さらに別の実施態様では、コドン最適化配列は、PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEタンパク質、抗原、ペプチド、ポリペプチド、フラグメント、ドメイン又はエピトープを動物での発現のためにコードする。
以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは改変ヌクレオチドを含むことができ、それらは例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナローグ、ウラシル、他の糖及び連結基、例えばフルオロリボース及びチオレート、並びにヌクレオチド分枝である。ヌクレオチドの配列はさらに重合の後で、例えば標識成分との結合によって改変することができる。この定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナローグによる置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド又は固相に結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成によって入手するか、又は微生物から誘導できる。
【００２２】
“遺伝子”という用語は広範囲に用いられ、生物学的機能を伴うポリヌクレオチドの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子には、ゲノム配列のイントロン及びエクソン、cDNAのコード配列そのもの、及び/又はそれらの発現に必要な調節配列が含まれる。例えば、遺伝子はまた、mRNA若しくは機能的RNAを発現するか、又は固有のタンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、前記には調節配列が含まれる。
本発明はさらに、PRRSV微量エンベロープタンパク質、抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドに対する相補鎖を含む。相補鎖はポリマーであり任意の長さを有することができ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナローグを任意の組合せで含むことができる。
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”及び“ポリペプチドフラグメント”という用語は本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。当該ポリマーは直鎖状でも分枝状でもよく、改変アミノ酸又はアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分によって中断されていてもよい。当該用語はまた天然に又は介入により改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。そのような改変は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば標識成分若しくは生物活性成分との結合である。
“単離”ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの天然の環境においてそれらに随伴する物質を“実質的に含まない”ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。“実質的に含まない”とは、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、それらの物質の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%を含まないということを意味する。“単離”ポリヌクレオチド又はポリペプチドが“ほぼ完全に夾雑物を含まない”と明示される場合、当該単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドはこれらの物質の少なくとも98%を含まないことを意味する。
【００２３】
本発明はさらに、PRRSVポリペプチドの機能的に等価の変種及び誘導体並びにその機能的に等価のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを包含し、前記ポリヌクレオチドは、それらによってコードされるポリペプチドの本来の特性を強化することがあり、低下させることがあり、或いは有意な影響を与えないことがある。これらの機能的に等価の変種、誘導体及びフラグメントは活性を保持する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列に変化を与えないDNA配列の変化は、アミノ酸残基の保存的置換、1つ若しくはいくつかのアミノ酸の欠失又は付加、及びアミノ酸アナローグによるアミノ酸残基の置換をもたらすDNA配列の変化と同様に、当該コードされるポリペプチドの特性に有意には影響を及ぼさない変化である。ある実施態様では、変種は、PRRSVポリヌクレオチド又は対象のポリペプチドと少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の相同性若しくは同一性を有する。
ある特徴では、本発明は、PRRSVポリペプチド、特にPRRSV微量エンベロープポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示される配列を有するポリペプチド又はその変種若しくはフラグメントを提供する。
【００２４】
別の特徴では、本発明は、本発明のPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチド、特に配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に特定するPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチド（配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者は容易に調製することができる。変種は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−13に示される配列を有するPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5若しくはEポリペプチド又はその変種の連続する少なくとも8、10、15又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチドのフラグメントは、完全長のPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチドで見いだされる特異的な抗原性エピトープを含む。
【００２５】
別の特徴では、本発明は、PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−13に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−13に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又は、これらのポリペプチドの１つ又はこれらのポリペプチドの組合せの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化することができる。
別の特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78に示される配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリヌクレオチド、又はその変種を提供する。
【００２６】
ある特徴では、本発明はPRRSVポリペプチド、とくにPRRSV Eポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:7、20、52−58又は130−139に示される配列を有するポリペプチド、およびその変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のPRRSV Eポリペプチド、特に配列番号:7、20、52−58又は130−139に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に特定されるPRRSV Eポリペプチド（配列番号:7、20、52−58又は130−139）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者は容易に調製することができる。
変種は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:7、20、52−58又は130−139に示されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
PRRSV Eポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:7、20、52−58又は130−139に示される配列を有するPRRSV Eポリペプチド又はその変種の連続する少なくとも8、10、15又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、PRRSV Eポリペプチドのフラグメントは、完全長のPRRSV Eポリペプチドで見いだされる特異的な抗原性エピトープを含む。
別の特徴では、本発明は、PRRSV Eポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:7、20、52−58又は130−139に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:7、20、52−58又は130−139に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又は、これらのポリペプチドの１つ又はこれらのポリペプチドの組合せの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。PRRSV Eポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化することができる。
【００２７】
別の特徴では、本発明はPRRSVポリペプチド、とくにPRRSV gp2ポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:1、14、34−39又は80−89に示される配列を有するポリペプチド、及びその変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のPRRSV gp2ポリペプチド、特に配列番号:1、14、34−39又は80−89に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に特定されるPRRSV gp2ポリペプチド（配列番号:1、14、34−39又は80−89）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者は容易に調製することができる。
変種は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:1、14、34−39又は80−89に示されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
PRRSV gp2ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:1、14、34−39又は80−89に示される配列を有するPRRSV gp2ポリペプチド又はその変種の連続する少なくとも8、10、15又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、PRRSV gp2ポリペプチドのフラグメントは、完全長のPRRSV gp2ポリペプチドで見いだされる特異的な抗原性エピトープを含む。
別の特徴では、本発明は、PRRSV gp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:1、14、34−39又は80−89に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:1、14、34−39又は80−89に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又は、これらのポリペプチドの１つ又はこれらのポリペプチドの組合せの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。PRRSV gp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化することができる。
【００２８】
別の特徴では、本発明はPRRSVポリペプチド、とくにPRRSV gp3ポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:3、16、又は40-45に示される配列を有するポリペプチド、及びその変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のPRRSV gp3ポリペプチド、特に配列番号:3、16、又は40−45に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に特定されるPRRSV gp3ポリペプチド（配列番号:3、16、又は40−45）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者は容易に調製することができる。
変種は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:3、16又は40−45に示されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
PRRSV gp3ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:3、16、又は40−45に示される配列を有するPRRSV gp3ポリペプチド又はその変種の連続する少なくとも8、10、15又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、PRRSV gp3ポリペプチドのフラグメントは、完全長のPRRSV gp3ポリペプチドで見いだされる特異的な抗原性エピトープを含む。
別の特徴では、本発明は、PRRSV gp3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:3、16、又は40−45に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:3、16、又は40−45に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又は、これらのポリペプチドの１つ又はこれらのポリペプチドの組合せの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。PRRSV gp3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化することができる。
【００２９】
別の特徴では、本発明はPRRSVポリペプチド、特にPRRSV gp4ポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:5、18、又は46−51に示される配列を有するポリペプチド、及びその変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のPRRSV gp4ポリペプチド、特に配列番号:5、18、又は46−51に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に特定されるPRRSV gp4ポリペプチド（配列番号:5、18、46−51）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者は容易に調製することができる。
変種は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:5、18、又は46−51に示されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
PRRSV gp4ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:5、18、又は46−51に示される配列を有するPRRSV gp4ポリペプチド又はその変種の連続する少なくとも8、10、15又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、PRRSV gp4ポリペプチドのフラグメントは、完全長のPRRSV gp4ポリペプチドで見いだされる特異的な抗原性エピトープを含む。
別の特徴では、本発明は、PRRSV gp4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:5、18、又は46−51に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:5、18、又は46−51に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又は、これらのポリペプチドの１つ又はこれらのポリペプチドの組合せの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。PRRSV gp4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化することができる。
【００３０】
別の特徴では、本発明はPRRSVポリペプチド、特にPRRSV gp5aポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:31又は62−65に示される配列を有するポリペプチド、及びその変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のPRRSV gp5aポリペプチド、特に配列番号:31又は62−65に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に特定されるPRRSV gp5aポリペプチド（配列番号:31又は62−65）のフラグメント及び変種を提供し、これらは周知の分子生物学的技術を用いて当業者は容易に調製することができる。
変種は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:31又は62−65に示されるアミノ酸配列と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
PRRSV gp5aポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:31又は62−65に示される配列を有するPRRSV gp5aポリペプチド又はその変種の連続する少なくとも8、10、15又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、PRRSV gp5aポリペプチドのフラグメントは、完全長のPRRSV gp5aポリペプチドで見いだされる特異的な抗原性エピトープを含む。
別の特徴では、本発明は、PRRSV gp5aポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:31又は62−65に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:31又は62−65に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又は、これらのポリペプチドの１つ又はこれらのポリペプチドの組合せの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは少なくとも10アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。PRRSV gp5aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の動物種での発現のためにコドン最適化することができる。
【００３１】
別の特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又はその変種を提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78に示される配列を有するポリヌクレオチドの1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリヌクレオチド、又はその変種を提供する。
いくつかの実施態様では、本発明は、1つ以上の組換えウイルスベクター及び医薬的又は獣医的に許容できる担体を含む、安全かつ有効な免疫学的又はワクチン組成物を提供し、前記ウイルスベクターは、1つ以上のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又はその変種をコードする1つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。“その変種”は、抗原、ポリペプチド及びエクトドメインの免疫学的等価バージョン（例えば本明細書に開示するタンパク質の再標的化誘導変種を含む）を包含することが意図される。“免疫学的に等価”は、“その変種”が、元々の比較物抗原、ポリペプチド又はエクトドメインと比較して実質的に同様な免疫応答（防御免疫応答を含む）を誘引できることを意味する。
当該組成物のいくつかの実施態様では、1つ以上のベクターは、組換えアデノウイルス5 PRRSV（Ad5-PRRSV）ベクター、組換えバキュロウイルスPRRSVベクター、組換えブタサイトメガロウイルスPRRSVベクター又は組換えポックスウイルスPRRSVベクターを含む。
いくつかの実施態様では、1つ以上のベクターは、PRRSV E抗原、ポリペプチド、エクトドメイン又はその変種をコードするヌクレオチド配列、又は改変PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はM抗原、ポリペプチド、エクトドメイン又はその変種をコードするヌクレオチド配列のどちらかを含み、ここで、gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はMの既存の細胞内局在化配列は、異種遺伝子の細胞表面発現決定基配列で入れ替えられている。いくつかの実施態様では、1つ以上のベクターは2つのベクターの混合物を含み、第一のベクターは再標的化誘導PRRSV微量タンパク質を発現し、第二のベクターは再標的化誘導PRRSV主要タンパク質を発現する。
【００３２】
いくつかの実施態様では、本発明は、配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139のいずれか1つ以上と少なくとも90%配列同一性を有するか、又は配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する抗原、ポリペプチド又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様では、組換えAd5-PRRSVベクターは、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78と少なくとも90%配列同一性を有するか、又は配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78の部分配列によってコードされるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様では、当該組成物又はワクチンは1つ又は2つのAd5-PRRSVベクターを含む。いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSVは、gp2及びE；gp2、gp4及びE；gp2、gp3、gp4及びE；rtg-gp2、rtg-gp3及びrtg-gp4；rtg-gp2及びE；rtg-gp2、rtg-gp4及びE；rtg-gp3及びE；rtg-gp4及びE；E単独；rtg-E単独；rtg-gp5, rtg-Mを発現することができる。
いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSV組換えベクターは、配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139と少なくとも90%配列同一性を有する抗原、ポリペプチド又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139の部分配列に示されるエクトドメインと少なくとも90%配列同一性を有するエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様では、組換えAd5-PRRSVベクターは、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78と少なくとも90%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、又は配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78の部分配列によってコードされるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様では、組換えAd5-PRRSVベクターは、1つ以上のPRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE抗原、ポリペプチド、エクトドメイン、又はその変種、又はその組合せをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【００３３】
いくつかの実施態様では、組換えAd5-PRRSVベクターは、1つ以上の抗原、ポリペプチド又はエクトドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、当該抗原、ポリペプチド又はエクトドメインは、（a）配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示される配列と少なくとも90%配列同一性、又は（b）配列番号:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34−39、40−45、46−51、52−58、59−61、62−66、68、71、73、75、77又は79−139に示される配列によって包含されるエクトドメインと少なくとも90%配列同一性を有する。“〜によって包含されるエクトドメイン”とは、提示の配列番号の細胞外部分のみが（すなわちトランスメンブレン又は細胞質部分ではない）パーセント配列同一性制限を受けることが意図される。例えば、200アミノ酸から成るポリペプチドがアミノ酸20番から100番に至るエクトドメインを有する場合、比較物ポリペプチドは、アミノ酸20番から100番を通して90%同一であることを要するだけである（すなわち90%配列同一性という場合）。本発明の開示が今や完了したので、当業者は、多種多様なTMD及びCTDから日常的に選び出して、防御性PRRSVポリペプチドの開示の単体及び組合せ物のエクトドメインと組み合わせることができると本出願人らは考える。
いくつかの実施態様では、1つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか、又は当該ポリヌクレオチドは、配列番号:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21−24、30、67、69、70、72、74、76又は78の部分配列に示される配列によってコードされるエクトドメインの全長にわたって少なくとも90%配列同一性を有する。日常的技術を用いて、当業者はどのポリヌクレオチド配列がエクトドメインをコードするかを理解又は確認することができる。
【００３４】
いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSVベクターはPRRSV gp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、（a）配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）配列番号:1、14、34−39、又は80−89の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSVベクターはPRRSV Eポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、（a）配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）配列番号:7、20、52−58、又は130-139の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSVベクターはPRRSV gp3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、（a）配列番号:5、18、40-45、又は90−99（gp3タンパク質）に示される配列と少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）配列番号:5、18、40−45、又は90−99の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSVベクターはPRRSV gp2及びEポリペプチドをコードする2つのポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、（a）配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ及び配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列及び配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）の部分配列に示されるエクトドメイン配列と少なくとも90%配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、Ad5-PRRSVベクターはPRRSV gp2、E及びgp4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、（a）配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ、配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）に示される配列の1つ、及び配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される部分配列の1つによって包含されるエクトドメイン、配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）に示される部分配列の1つによって包含されるエクトドメイン、及び配列番号:5、18、40−45、又は90−99（gp3タンパク質）に示される部分配列の1つによって包含されるエクトドメインと少なくとも90%配列同一性を有する。
【００３５】
別の特徴では、本開示は、その必要がある動物でPRRSVに対抗する防御免疫応答を誘引する方法を提供し、前記方法は、gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE PRRSV抗原の少なくとも1つを発現する組換えAd5-PRRSVベクター及び医薬的に又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを当該動物に投与する工程を含む。
当該方法のいくつかの実施態様では、当該Ad5-PRRSVベクターは1つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、（a）配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）及び配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）前述の配列番号に一致するものによって包含されるgp2タンパク質又はEタンパク質のエクトドメインと少なくとも90%配列同一性を有する。
請求項24に記載の方法では、当該Ad5-PRRSVベクターは1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含み、当該ポリペプチドは、配列番号:1、14、34−39、又は80−89（gp2タンパク質）に示される配列の1つ、配列番号:7、20、52−58、又は130-139（Eタンパク質）に示される配列の1つ、又は配列番号:5、18、40−45、90−99（gp3タンパク質）に示される配列の1つと少なくとも90%配列同一性を有するか、又は（b）前述の配列番号に一致するものによって包含されるgp2、E及びgp3タンパク質のエクトドメインと少なくとも90%配列同一性を有する。
いくつかの実施態様では、投与は、口鼻経由投与、噴霧、飲水、筋肉内、又は皮下投与、皮内投与、経皮投与による。いくつかの実施態様では、投与はプライム-ブーストである。いくつかの実施態様では、1回目のワクチン接種は2つのAd5ベクターの混合物であり、当該第一のベクターは再標的化誘導PRRSV微量タンパク質を発現し、第二のベクターはPRRSV主要タンパク質を発現し、さらにブーストは、1回目のワクチン接種の両方のベクター又はどちらかのベクター単独を含むか、又は本質的に前記から成る。いくつかの実施態様では、防御の必要がある動物はブタである。
【００３６】
一般的には、アミノ酸配列の比較は、公知構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列を未知構造のポリペプチドのアミノ酸配列とアラインメントすることによって達成される。続いて配列内のアミノ酸を比較し、相同なアミノ酸グループでグループを作る。この方法はポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸挿入及び欠失の判断の根拠を与える。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを用いることによって決定できる（上記の相同性に関する記載もまた参照されたい）。本明細書にまた別に記載したものの他に、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）が提供する、プログラム、BLAST、ギャップ付加BLAST、BLASTN、BLASTP及びPSI-BLASTも言及しておく。これらのプログラムは前記の目的のために当業界で広く用いられ、2つのアミノ酸の相同な領域をアラインメントすることができる。
また別に或いは追加として、ヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して例えば“相同性”又は“同一性”という用語は、2つの配列間の相同性の定量手段を提示することができる。パーセント配列同一性は(Nref−Ndif)*100/Nrefとして算出することができる。式中、Ndifはアラインメントしたときの2つの配列間における非同一残基の総数であり、Nrefは一方の配列の残基総数である。したがって、DNA配列のAGTCAGTCは、配列AATCAATCと75%の配列同一性を有するであろう（Nref＝8、Ndif＝2）。
また別に或いは追加として、配列に関して“相同性”又は“同一性”は、同一ヌクレオチド又はアミノ酸の位置の数を、2つの配列の短い方の配列のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割ったものを指すことができ、2つの配列のアラインメントはWilburとLipmanのアルゴリズム（Wilbur et al., 1983）にしたがって決定され、例えばウィンドウサイズ20ヌクレオチド、ワード長4ヌクレオチド、及びギャップペナルティ4を用いることができる。さらに、アラインメントを含む配列データのコンピュータアシスト分析及び解釈は、便利には市販のプログラム、例えばベクターNTIソフト（Vector NTI SoftwareTM, Invitrogen Inc.CA, USA）を用いて実施できる。RNA配列がDNA配列と類似している、又はある度合いの配列同一性若しくは相同性を有するというとき、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等価とみなされる。DNA配列中のチミジン（T）がRNA配列中のウラシル（U）と等価とみすることによってRNA配列はDNA配列から導き出すことができ、したがって、RNA配列は本発明の範囲内にある。さらに、煩瑣な実験を行うことなく、当業者は多くの他のプログラム及び参考文献をパーセント相同性の決定のために利用することができる。
【００３７】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現分子に含まれてプロモーターエレメントに作動できるように連結され、場合によってエンハンサーに連結されるPRRSVポリヌクレオチドを包含する。
“ベクター”は、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバリーされる異種ポリヌクレオチドを含む組換えDNA又はRNAプラスミド、バクテリオファージ又はウイルスを指す。異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的のため又は治療のために問題の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形であり得る。本明細書で用いられるベクターは、最終標的細胞又は対象動物で複製能力を有する必要はない。“ベクター”という用語はウイルスベクターとともにクローニングベクターを含む。
“操作された”又は“組換え体”という用語は、天然には存在しないか、又は天然では見出されない編成で別のポリヌクレオチドに連結されている、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
“異種”は、比較されている実体の残りの部分と遺伝的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドを遺伝子操作技術によって異なる供給源に由来するプラスミド又はベクターに取り込むことができ、この場合、前記ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。プロモーターがその自然のままのコード配列から取り出され、本来の配列以外のコード配列に作動できるように連結された場合、そのプロモーターは異種プロモーターである。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは追加の配列を含むことができる。例えば、同じ転写ユニット内の追加のコード配列、制御配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロモーターの制御下にある追加の転写ユニット、クローニング、発現、相同性組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列、並びに本発明を具体化するために所望される任意の構築物である。
PRRSVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の発現のためのエレメントが有利には本発明のベクターに存在する。最低限の態様では、これは、開始コドン（ATG）、終止コドン及びプロモーター、さらにまた場合によってはある種のベクター（例えばプラスミド及びある種のウイルスベクター）のためにポリアデニル化配列を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。ポリヌクレオチドがポリペプチドフラグメント（例えばPRRSVペプチド）をコードするときは、有利にはベクターにATGはリーディングフレームの5’に配置され、終止コドンは3’に配置される。発現制御のための他のエレメントも存在することができ、例えばエンハンサー配列、安定化配列（例えばイントロン及び/又は非翻訳5’又は3’配列）、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列である。
【００３９】
本発明の遺伝子生成物のin vivo又はin vitro発現のためのベクター又は組換え体又はプラスミドの製造及び/又は投与の方法は任意の所望の方法を用いることができ、前記方法は、例えば、以下に引用される文献に開示された方法によるか又は類似する方法である：米国特許4,603,112号、4,769,330号、4,394,448号、4,722,848号、4,745,051号、4,769,331号、4,945,050号、5,494,807号、5,514,375号、5,744,140号、5,744,141号、5,756,103号、5,762,938号、5,766,599号、5,990,091号、5,174,993号、5,505,941号、5,338,683号、5,494,807号、5,591,639号、5,589,466号、5,677,178号、5,591,439号、5,552,143号、5,580,859号、6,130,066号、6,004,777号、6,130,066号、6,497,883号、6,464,984号、6,451,770号、6,391,314号、6,387,376号、6,376,473号、6,368,603号、6,348,196号、6,306,400号、6,228,846号、6,221,362号、6,217,883号、6,207,166号、6,207,165号、6,159,477号、6,153,199号、6,090,393号、6,074,649号、6,045,803号、6,033,670号、6,485,729号、6,103,526号、6,224,882号、6,312,682号、6,348,450号、6,312,683号、及び6,596,279号、米国特許出願12/753,597、WO 90/01543、W091/11525、WO 94/16716、WO 96/39491、WO 98/33510、EP 265785、EP 0 370 573。
【００４０】
本発明はまた、ベクター（例えば発現ベクター）を含む組成物又はワクチンに関する。当該組成物又はワクチンは、1つ以上のベクター（例えば発現ベクター、例えばin vivo発現ベクター）を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成ることができ、前記ベクターは、1つ以上のPRRSVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る（或いは前記を発現する）。ベクターは、PRRSV抗原、エピトープ又は免疫原をコードする（又は発現する）ポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成るポリヌクレオチドを、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクル中に含み前記を発現する。
別の実施態様にしたがえば、組成物又はワクチン中のベクター（1つ又は複数）は、1つ以上のタンパク質又はそのフラグメント（PRRSVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原）をコードするポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。本発明の組成物又はワクチンは1つ以上のベクターを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成り、前記ベクターは、異なるPRRSV単離株のポリヌクレオチド（同じタンパク質及び/又は異なるタンパク質をコードする）を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成り、さらに有利には前記をin vivoの相応しい条件下若しくは適切な条件下で、又は適切な宿主細胞で発現する。
プラスミドという用語は、本発明のポリヌクレオチド及び所望の宿主又は標的の1つ又は複数の細胞でそのin vivo発現に必要とされるエレメントを含む一切のDNA転写ユニットをカバーする。これに関しては、スーパーコイルプラスミド及びその全てのトポ異性体、開環プラスミドとともに線状プラスミドが本発明の範囲内に存在することを特記しておく。
【００４１】
組換えタンパク質、抗原、エピトープ又は免疫原をコードする異種ポリヌクレオチドに加えて、各プラスミドは、異種ペプチド配列、変種、アナローグ又はフラグメントをコードする場合によって融合されたポリヌクレオチドを含むか、又は前記を収容するか、又は本質的に前記から成り、前記ポリヌクレオチドは、作動できるようにプロモーターに連結されるか、又はプロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに依存する。真核細胞で機能を有する強力なプロモーターを用いるのが有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒト又はげっ歯類起原（又は場合によって別の起原、例えばラット又はモルモット起原）の前初期サイトメガロウイルスプロモーター（CMV-IE）である。CMV-IEプロモーターは事実上のプロモーターセグメントを含むことができ、エンハンサーセグメントに結合していても結合してなくてもよい。以下を参照することができる：EP-A-260 148、EP-A-323 597、米国特許5,168,062号、5,385,839号及び4,968,615号、並びにPCT出願WO87/03905。CMV-IEプロモーターは、有利にはヒトCMV-IE（Boshart et al., 1985）又はげっ歯類CMV-IEである。
より一般的な用語では、プロモーターはウイルス起源又は細胞起源のどちらかである。本発明の実施で有効に利用できるCMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施で有効に利用できる強力な細胞性プロモーターは、細胞骨格遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa et al., 2000）、又はアクチンプロモーター（Miyazaki et al., 1989）である。
【００４２】
これらプロモーターの機能的なサブフラグメント（すなわち適切なプロモーター活性を維持するこれらプロモーターの一部分）は本発明の範囲内に含まれ、例えば末端短縮CMV-IEである（PCT出願WO98/00166又は米国特許6,156,567号）。したがって、本発明で用いられるプロモーターには、適切なプロモーター活性を維持する（したがってプロモーターとして機能する）完全長プロモーターの誘導体及びサブフラグメントが含まれる。好ましくは、前記プロモーター活性は、当該誘導体又はサブフラグメントが誘導される事実上の又は完全長のプロモーターの活性と実質的に類似し、例えば、完全長CMV-IEプロモーターに対する米国特許6,156,567号の末端短縮CMV-IEプロモーターの活性と同様である。したがって、本発明で用いられるCMV-IEプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーター部分及び/又は完全長プロモーターのエンハンサー部分とともにその誘導体及びサブフラグメントを含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成ることができる。
好ましくは、プラスミドは他の発現制御エレメントを含むか又は本質的に前記から成る。安定化配列、例えばイントロン配列（好ましくはhCMV-IEの最初のイントロン（PCT出願WO89/01036）、ウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., 1979））を取り込むことは特に有益である。
プラスミド及びウイルスベクター（ポックスウイルスを除く）についてポリアデニル化シグナル（ポリA）に関しては、ウシ成長ホルモン（bGH）遺伝子のポリ(A)シグナル（米国特許5,122,458号参照）又はウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナル又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルを使用することができる。
【００４３】
本発明の別の実施態様にしたがえば、発現ベクターは、適切な細胞系でタンパク質をin vitro発現させるために用いられる発現ベクターである。発現されたタンパク質を分泌後に培養上清で又は培養上清から採集し（或いは分泌後でなくてもよい（分泌されない場合には典型的には細胞溶解が生じるか又は細胞溶解が実施される））、場合によって濃縮方法（例えば限外ろ過）によって濃縮するか、及び/又は精製手段（例えば親和性交換、イオン交換又はゲルろ過型クロマトグラフィー方法）によって精製することができる。
“宿主細胞”は、既に遺伝的に改変されているか、又は外因性ポリヌクレオチド（例えば組換えプラスミド又はベクター）を投与することによって遺伝的に改変できる原核細胞又は真核細胞を指す。遺伝的に改変された細胞というとき、当該用語は最初に改変された細胞及びその子孫の両方を指す。宿主細胞には、ベビーハムスター腎（BHK）細胞、結腸癌（Caco-2）細胞、COS7細胞、HEK293細胞、MCF-7細胞、MCF-10細胞、Madin-Darbyイヌ腎（MDCK）株、ミンク肺（Mv1Lu）細胞、MRC-5細胞、U937細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サルVero細胞（アフリカミドリザルの腎を起源とする細胞株）、ウズラ（ウズラ筋肉細胞株QM7）、ニワトリ細胞株DF1、及びVERO細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なクローニングベクター又は発現ベクターに挿入し、このベクターを複製及び増幅のために適切な宿主に順次導入することができる。ポリヌクレオチドは、当業界で公知の任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。問題のポリヌクレオチドを含むベクターは、以下を含む多数の適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入できる：直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、f-メーティング、エレクトロポレーション、トランスフェクションであって塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン又は他の物質を利用するもの、微粒子ボンバードメント、リポフェクチン、及び感染（この場合ベクターは感染性で、例えばレトロウイルスベクターである）。ベクター又はポリヌクレオチド導入の選択はしばしば宿主の特性に左右されるであろう。
【００４４】
本発明のある実施態様では、ベクターは、US 2010/0255029（参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載のAd5ベクターである。
Ad5ベクターをベースとするPRRSVワクチンの利点には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：（1）液性、細胞性及び粘膜応答を含む広範囲の免疫を誘発する；（2）全てのPRRSVタンパク質を発現するわけではないのでDIVA（感染動物をワクチン接種動物から識別する）戦略に適う；（3）免疫の迅速な開始を誘発する；及び（4）事故により漏出されたとき、製造によってもたらされる環境リスクは不活化ワクチンより低い。
本発明のある特徴は、PRRSV抗原を発現する操作された又は組換え体のAd5ベクターに関する。当該抗原は、PRRSV微量エンベロープタンパク質、例えば前述のgp2、gp3、gp4、gp5a又はEタンパク質である。操作されたAd5ベクターは、1つ以上のPRRSV抗原をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。別の特徴では、操作されたAd5ベクターは、PRRSV gp2抗原又はその変種、PRRSV E抗原又はその変種、PRRSV gp3抗原又はその変種、PRRSV gp4抗原又はその変種、又は前記の組み合わせをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
ある実施態様では、本発明は、標的細胞でタンパク質、抗原、エピトープ又は免疫原をデリバリー又は発現するために治療的に有効な量の処方物の投与を提供する。予防的又は治療的に有効な量の決定は当業者にとっては日常的な試験である。別の実施態様では、当該処方物は、PRRSV微量エンベロープ抗原、エピトープ又は免疫原を発現するポリヌクレオチド及び医薬的又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤を含む発現ベクターを含む。別の実施態様では、当該医薬的又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル、アジュバント又は賦形剤はトランスフェクションを促進し及び/又はベクター又はタンパク質の保存を改善する。
医薬的又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形剤は、滅菌水、0.9% NaCl溶液（例えば食塩水）又はリン酸緩衝液であり得る。本発明の方法に用いることができる他の医薬的又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形剤には、ポリ-(L-グルタメート)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。医薬的又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形は、ベクター（又はin vitroで本発明のベクターから発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せであり得る。有利には、当該担体又はビヒクル又はアジュバント又は賦形剤はトランスフェクションを促進し及び/又はベクター（又はタンパク質）の保存を改善する。用量及び用量体積は本明細書で一般的に考察されており、また本開示を読みさらに当業界の知識と併せれば全く煩瑣な試験を行うことなく当業者によって決定され得る。
【００４５】
第四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質（プラスミドにとって適切であるがただし排他的に適切というわけではない）は、下記の式を有するものである：
【００４６】
【化１】
2018523993.tif 000002
【００４７】
式中、R1は12から18の炭素原子を有する飽和又は不飽和直鎖脂肪族基であり、R2は2から3の炭素原子を含む別の脂肪族基であり、Xはアミン又はヒドロキシル基（例えばDMRIE）である。別の実施態様では、陽イオン性脂質は中性脂質（例えばDOPE）と会合することができる。
これらの陽イオン性脂質の中で、DMRIE (N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム；WO96/34109）が好ましく、これは、有利には中性脂質と会合し、有利にはDOPE (ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン（Behr, 1994））と会合してDMRIE-DOPEを形成する。
プラスミドとアジュバントの混合物は、即時調製されるか、及び/又は調製物の投与と同時に或いは調製物の投与の少し前に、例えば投与の少し前又は投与に先立って作製される。プラスミド-アジュバント混合物は、有利には混合物が複合体を形成するために十分な時間を投与前に与えるように、例えば投与の約10分から約60分前、例えば投与のほぼ30分前に作製される。
DOPEが存在するとき、DMRIE：DOPEモル比は、約95：約5から約5：約95、又質量比は、約50：約1から約1：約10、例えば約10：約1から約1：約5、有利には約1：約1から約1：約2、例えば1：1から1：2である。
【００４８】
別の実施態様では、医薬的又は獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はビヒクルは油中水型乳剤であり得る。適切な油中水型乳剤の例には油を基剤とする油中水ワクチン乳剤が含まれ、これらは4℃で安定かつ液体であり、以下を含む：6から50v/v %の抗原含有水相、好ましくは12から25 v/v %、50から94 v/v %の油相（全体で又は部分的に非代謝性油（例えば鉱物油、例えばパラフィン油）及び/又は代謝性油（例えば植物油又は脂肪酸、ポリオール又はアルコールエステル）を含む）、0.2から20 p/v %の界面活性剤（好ましくは3から8 p/v %）。後者は、全体で又は部分的に或いは混合物中でポリグリセロールエステル（前記ポリグリセロールエステルは好ましくはポリグリセロール(ポリ)リシンオレエートである）又はポリオキシエチレンリシン油若しくは他の水素添加ポリオキシエチレンリシン油である。油中水乳剤で用いることができる界面活性剤の例には、エトキシル化ソルビタンエステル（例えばポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート（TWEEN 80(商標)、アプリケム社(AppliChem, Inc., Cheshire, CT)から入手できる）及びソルビタンエステル（例えばソルビタンモノオレエート（SPAN 80(商標)、シグマアルドチッチ社（Sigma Aldrich, St.Louis, MO）から入手できる）が含まれる。この他に、油中水乳剤に関しては、米国特許6,919,084号もまた参照されたい。いくつかの実施態様では、抗原含有水相は、1つ以上の緩衝剤を含む食塩水溶液を含む。適切な緩衝溶液の例はリン酸緩衝食塩水である。ある実施態様では、油中水乳剤は水/油/水（W/O/W）三重乳剤であり得る（例えば米国特許6,358,500号を参照されたい）。他の適切な乳剤の例は米国特許7,371,395号に記載されている。
【００４９】
本発明の免疫学的組成物及びワクチンは、1つ以上のアジュバントを含むか又は本質的に前記から成る。本発明の実施に用いられる適切なアジュバントは、（1）アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（2）免疫刺激性配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., 1996; WO98/16247）、（3）水中油型乳剤、例えばSPT乳剤（“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”（p147）, M.Powell, M.Newman, Plenum Press 1995）及び乳剤MF59（同書、183ページ）、（4）四級アンモニウム塩（例えばDDA）を含む陽イオン脂質、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、（7）サポニン又は（8）本出願に引用され及び参照により含まれるいずれかの文献で考察されている他のアジュバント、並びに前記の任意の組合せ又は混合物である。
（3）の水中油型乳剤（ウイルスベクターのために特に適切である）は、以下を基剤とすることができる：軽質流動パラフィン油（欧州局方型）、イソプレノイド油（例えばスクアラン、スクアレン）、アルケンのオリゴマー化から得られる油（例えばイソブテン又はデセン）、直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル（例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ(カプリレート/カプレート)、ジオレイン酸プロピレングリコール）、又は分枝脂肪アルコール又は酸のエステル（特にイソステアリン酸エステル）。
乳剤を形成するために、油を乳化剤と組み合わせて用いることができる。乳化剤は非イオン性界面活性剤であり得る。それらは例えば以下である：エステルであって、一方ではソルビタン、マンニド（例えば無水オレイン酸マンニトール）、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールのエステル、及び他方ではオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（前記エステルは場合によってエトキシル化される）、又はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック（例えばプルロニック（Pluronic）、例えばL121。
【００５０】
（1）のタイプのアジュバントポリマーでは、架橋アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたポリマーが好ましい。これらの化合物はカルボマーの名称で知られ（Pharmeuropa, vol.8, no.2, June 1996）、当業者はまた米国特許2,909,462号を参照できる。前記特許は、ポリヒドロキシル化合物によって架橋されたアクリル酸ポリマーを提供する。前記ヒドロキシル化合物は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくはそのような基は8つを超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子は、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって入れ替えられる。好ましい置換基は、2から4の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル、及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和基はまた、他の置換基（例えばメチル）を含むことができる。カルボポール（Carbopol）（BF Goodrich, Ohio, USA）という名で販売される製品が特に適切である。それらはアリルサッカロース又はアリルペンタエリトリトールによって架橋される。それらの中ではとりわけ、カルボポール974P、934P及び971Pが挙げられる。
無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、EMA（Monsanto）が好ましい。これは直鎖又は架橋されたエチレン-無水マレイン酸コポリマーであり、それらは、例えばジビニルエーテルによって架橋される。以下の文献もまた参照されたい：J.Fields et al., 1960。
【００５１】
構造に関しては、アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー及びEMAは、好ましくは下記式を有する基本ユニットによって形成される：
【００５２】
【化２】
2018523993.tif 000003
【００５３】
式中、
R1及びR2（これらは同じでも異なっていてもよい）は、H又はCH3を表し、
ｘ＝0又は1、好ましくはｘ＝1であり、
ｙ＝1又は2で、ｘ＋ｙ＝2である。
EMAについては、ｘ＝0でｙ＝２であり、カルボマーについてはｘ＝ｙ＝1である。
これらのポリマーは水又は生理学的塩類溶液（20g/LのNaCl）中で可溶性であり、pHは7.3から7.4に例えばソーダ（NaOH）によって調整して、発現ベクターを取り込むことができるアジュバント溶液を提供することができる。最終的な免疫学的又はワクチン組成物におけるポリマー濃度は、0.01から1.5% w/v、0.05から1% w/v、又は0.1から0.4% w/vの範囲であり得る。
【００５４】
（5）のサイトカイン（1つ又は複数）は免疫学的又はワクチン組成物中でタンパク質形として存在するか、又は、免疫原（1つ又は複数）又はそのエピトープとともに宿主で共同発現させることができる。免疫原（1つ又は複数）又はそのエピトープを発現する同じベクターによって又は別々のベクターによって、サイトカイン（1つ又は複数）を共発現させることが好ましい。
本発明は、例えば複数の活性成分を、有利には一緒にかつアジュバント、担体、サイトカイン、及び/又は希釈剤とともに混合することによるそのような組合せ組成物の調製を包含する。
本発明に用いることができるサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFNα）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-11（IL-11）、インターロイキン-12（IL-12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、腫瘍壊死因子β（TNFβ）、及び形質転換増殖因子β（TGFβ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本発明の免疫学的又はワクチン組成物と同時投与されるか、及び/又は連続的に投与され得ることは理解されるであろう。したがって、例えば、本発明のワクチンはまた、in vivoで適切なサイトカイン（例えばワクチンを接種される又は免疫学的応答が誘引される宿主に適合するサイトカイン（例えばネコに投与する調製物にはネコサイトカイン））を発現する外因性核酸分子を含むことができる。
別の実施態様では、本発明の組成物は、Staufferら（Stauffer et al., Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 1, 291-296, 2006）が記載する化学的又は物理的方法を用いて調製され得る。不活化技術のいくつかは下記の表に要約される。
【００５５】
表1：不活化技術
2018523993.tif 000004
本発明の免疫学的組成物及び/又はワクチンは、本明細書で考察する1つ以上の発現ベクター及び/又はポリペプチドの防御応答又は治療応答を誘引するために有効な量を含むか、又は本質的に前記有効量から成るか、又は前記有効量から成る。有効な量は、本開示（本明細書に取り込まれた文献を含む）及び当業界の知識から煩瑣な実験を行うことなく決定され得る。
本発明の組成物又はワクチンは、飲水、口鼻経由、噴霧、エーロゾル、鼻内点滴、経皮、皮下又は筋肉内注射により動物に投与できる。有利には、ワクチンは、経皮、口鼻、皮下、筋肉内、噴霧を介して又は飲水によって投与される。
本発明は、本発明にしたがって作製した治療組成物の有効量を動物に少なくとも1回投与することを意図する。本発明の治療組成物は、無針装置（例えばピッグジェット（Pigjet）、デルモジェット（Dermojet）、バイオジェクター（Biojector）、ベトジェット（Vetjet）又はビタジェット（Vitajet）装置（Bioject, Oregon, USA）を用いる）によって投与できる。
本発明のある実施態様では、プライム-ブーストレジメンを利用できる。前記レジメンは、少なくとも1回のプライム（一次）投与及び少なくとも1回のブースター投与から構成され、少なくとも1つの共通タンパク質、ポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原が用いられる。プライム投与に用いられる免疫学的組成物又はワクチンは、ブーストとして用いられるものと性質が異なる。しかしながら、同じ組成物を一次投与及びブースト投与として用い得ることを特記しておく。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。
【００５６】
本発明のプライム-ブーストプロトコルの別の特徴では、操作されたAd5 PRRSVワクチン又は組成物を含む組成物が投与され、続いて以下が投与される：PRRSV抗原を含みin vivoで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチン若しくは組成物、又はPRRSV抗原を含む不活化ウイルスワクチン若しくは組成物、又はPRRSVサブユニット（タンパク質）を含むワクチン若しくは組成物、又はPRRSV抗原を含むか若しくは発現するDNAプラスミドワクチン若しくは組成物。同様に、プライム-ブーストプロトコルは、PRRSV抗原を含みin vivoで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチン若しくは組成物、又はPRRSV抗原を含む不活化ウイルスワクチン若しくは組成物、又はPRRSVサブユニット（タンパク質）を含むワクチン若しくは組成物、又はPRRSV抗原を含むか若しくは発現するDNAプラスミドワクチン若しくは組成物の投与に続いて、操作されたAd5 PRRSVワクチン又は組成物を含む組成物が投与される。一次及び二次投与の両方が、操作されたAd5 PRRSVワクチン又は組成物を含む組成物を含み得ることを特記しておく。さらにまた、一次及び二次投与の両方が、本発明の操作されたベクターを含む1つ以上の組成物を含み得ることを特記しておく。
プライム-ブーストプロトコルは、少なくとも1回のプライム投与及び少なくとも1回のブースト投与を含み、少なくとも1つの共通抗原を用いる。プライム投与に用いられるワクチン又は組成物は、後のブースターワクチン又は組成物として用いられるものと性質が異なっていてもよい。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は1回以上の投与を含むことができる。
様々な投与が、好ましくは約1から約6週間離して、又は約2から約4週間離して実施される。2から6週間毎に繰り返されるブースター又は年に1回のブースターもまた意図される。動物は、最初の投与時には好ましくは少なくとも1日齢である。
免疫学的組成物及び/又はワクチンは、1用量当たり約104から約1011、有利には約105から約1010、より有利には約106から約109の組換えアデノウイルス粒子を含み、前記ウイルス粒子はPRRSV抗原、エピトープ又は免疫原を発現する。ポックスウイルスに基づく免疫学的組成物及び/又はワクチンの場合には、用量は約102pfuから約109pfuであり得る。免疫学的組成物及び/又はワクチンは、1用量当たり約102から約107、有利には約103から約105のポックスウイルス又はヘルペスウイルス組換え体を含み、それら組換え体はPRRSV抗原、エピトープ又は免疫原を発現する。
【００５７】
ウイルスベクターは弱毒アビポックス発現ベクターであり得る。ある実施態様では、アビポックス発現ベクターは鶏痘ベクター、例えばTROVAC(商標)であり得る。別の実施態様では、アビポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター、例えばALVAC(商標)であり得る。さらに別の実施態様では、バキュロウイルス発現プラットフォームを用いることができる。例えば、抗原は宿主として昆虫細胞培養を用いてバキュロウイルス発現系で生成でき、得られた組換えポリペプチドを動物に投与できる。また別には、組換えバキュロウイルス全体をワクチンとして投与できる。一般的には、PRRSV抗原、エピトープ又は免疫原は、PRRSV微量エンベロープタンパク質、例えばgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5又はE抗原であり得る。本発明の方法で用いることができる他のウイルスには、ワクシニアウイルス(例えば弱毒ワクシニアウイルス、例えばNYVAC)、アデノウイルス及びヘルペスウイルス（ブタCMVを含む）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ワクチンの有効性は、PRRSVの病毒株を用いて動物をチャレンジすることによって、最後の免疫から約2から4週間後に試験することができる。同種株及び異種株の両方をチャレンジに用いて、ワクチンの有効性を試験することができる。動物は、噴霧、鼻内、IM、気管内、及び/又は経口によりチャレンジできる。ウイルスチャレンジは、投与ルートに応じた体積中の1用量当たり約103から約109ビリオン又は感染単位であり得る。例えば投与が噴霧による場合、ウイルス懸濁物をエーロゾル化して1から200μmの小滴を生成する。投与が鼻内、気管内又は経口である場合、チャレンジウイルスの体積は約0.05から約5mLである。チャレンジに続いて毎日、動物を臨床徴候及び死亡率について14日間観察することができる。加えて、動物グループを安楽死させて、病理学的所見を評価することができる。ウイルス検出のために、チャレンジ後の全動物から口腔咽頭、気管、又は総排泄腔スワブを収集することができる。組織中のウイルス抗原の有無は、免疫組織化学、ウイルス単離若しくは力価測定、又は核酸検出（例えば逆転写ポリメラーゼ（RT-PCR））によって判定できる。チャレンジ後に血液サンプルを収集して、抗PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、Eウイルス特異抗体の存在について分析することができる。また別には、操作されたベクターがエピトープタグを含むときは、タグ特異抗体を用いて組換えワクチンポリペプチドの存在及び場所を検出することができる。
本明細書の開示は例示として提供され、本発明はそれらに限定されないことは当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当業界における知識から、当業者は、投与回数、投与経路、及び用いられるべき用量を各免疫プロトコルについて煩瑣な試験を全く実施することなく決定できる。
【００５８】
本発明の別の実施態様は、PRRSVに対抗する免疫学的応答又は防御応答を動物で誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、組換えAd5免疫学的組成物若しくはワクチン又は不活化PRRSV免疫学的組成物若しくはワクチン、及び動物で免疫応答を誘引するために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
特段の指示がなければ、核酸挿入物、プラスミド及び組換えウイルスベクターの構築は、当業界で公知の標準的分子生物学技術を用いて実施された。前記技術は、例えば以下に記載されている：J.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989。
特に主題適格性に関して、本明細書に開示されるベクターは、PRRSVタンパク質の天然に存在するレベルでの発現をワクチン接種動物でもたらさない。各遺伝子の発現は、非天然異種プロモーターエレメントによって駆動され、したがって発現される同系の各タンパク質の最終的な量はPRRSV自然感染時に生成される量と同等ではないであろう。さらにまた、本開示発現系の1つの重要な目的は、安全かつ防御的な免疫応答を動物で誘引するために、相対的に高レベルの（自然のままの、改変された又は操作された）PRRSV微量エンベロープタンパク質を生成すること、及び宿主動物の免疫系に当該微量タンパク質を適切に提示することである。PRRSV自然感染に典型的なPRRSV微量エンベロープタンパク質のレベル及び提示は、PRRSV微量タンパク質に対する安全かつ有効な免疫応答を誘引することができない。したがって、本開示ワクチンの組成及びワクチン接種動物内のそれらの最終的配置は両方とも、それらの最も近縁な天然に存在する対応物と比較したとき、構造及び機能において顕著に相違する。
本発明をさらに下記の非限定的実施例によって詳述する。
【実施例１】
【００５９】
PRRSV遺伝子を発現するプラスミドの構築及び試験
免疫系にとっての見えやすさを高めるために、多数の変化を導入しつつ細胞外ドメイン（推定的抗体結合部位）を維持することによって、PRRSVエンベロープタンパク質を細胞内区画から細胞表面へ再標的化誘導した。エンベロープ遺伝子の再標的化誘導は、まず初めに自然のままのタンパク質の細胞質ドメイン及びトランスメンブレンドメイン（おそらく保持シグナルのための部位である）を除去し、それらを水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（VSV-G）（細胞表面発現のための公知の別のウイルスタンパク質）に入れ替えることによって試みられた。自然のままのエンベロープ遺伝子のシグナル配列もまた組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）（特徴がよく知られた分泌タンパク質）由来のシグナル配列で入れ替えられ、改変タンパク質の分泌経路への侵入及び最終的には細胞表面での発現を容易にした。特異的なエピトープタグもまた各再標的化誘導タンパク質に挿入され、細胞内のタンパク質の発現及び移動が追跡された。リンカー配列にフランキングするエピトープタグMyc、Flag及びHAがgp2、gp3及びgp4にそれぞれ挿入された（図5A−5D）。
再標的化誘導したタンパク質の表面発現：再標的化誘導遺伝子の各々の全体を合成し、CMVプロモーターと共に発現プラスミドにクローニングした。このプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトし、発現を免疫蛍光アッセイ（IFA）によって検出した（図6）。細胞表面及び全体のタンパク質発現は、gp3-Flag-VSV及びgp4-HA-VSVの両方をトランスフェクトした細胞で容易に検出された。しかしながら、gp2-Myc-VSVトランスフェクト細胞での発現は、細胞を透過性にした後でのみ検出され、gp2に導入された改変は細胞表面にこのタンパク質を再標的化誘導するためには十分ではないことを示した。さらにまた、透過性達成後におけるgp2-Myc-VSVの染色はgp3及びgp4改変（再標的化誘導）タンパク質の染色とは完全に異なっていた。gp2-Myc-VSVの場合には、染色はより局所的であり強いが、gp3-Flag-VSV及びgp4-HA-VSVでは染色は細胞全体に拡散していた。これは、gp2-Myc-VSVタンパク質は発現されたが、不適切に折り畳まれいずれかの細胞局在区画に閉じ込められた可能性があることを示した。改変gp2を適切に折り畳むことができないことについていくつかの理由が存在し得る。第一に、これらは、適切な折畳みのためにタンパク質の他の部分（例えば表面発現のための改変プロセスで除去されたシグナル配列、トランスメンブレン又は細胞質テール）の要求であり得る。第二に、その理由はまた、gp2のまだ保持シグナルを含んでいるドメインの不完全な除去によるものであり得る。第三に、不正確な折畳みはmycタグの存在により導入されたかもしれない（mycタグは改変gp3又はgp4のどちらにも存在しない）。第四に、微量タンパク質の1つが発現されないと全ての微量タンパク質のビリオンへの取り込みが停止することが示され、したがってgp2は、適切な折畳みの達成のためにgp3及びgp4の存在を必要とする可能性がある。
【００６０】
再標的化誘導したタンパク質は相互作用してオリゴマーを形成する：
微量タンパク質間の相互作用は機能的アッセイによって示唆され、直接的には生化学アッセイによって示された。再標的化誘導したタンパク質の各々をコードするプラスミドをHEK293細胞に共同トランスフェクトし、微量タンパク質間の相互作用を共同免疫沈澱（co-IP）によって試験した。図7に示すように、抗HA抗体はgp4-HA-VSVを特異的に沈殿させるが（レーン3）、gp3-Flag-VSV（レーン2）又はgp2-Myc-VSV（レーン1）は沈殿させない。しかしながら、全ての改変タンパク質を共同トランスフェクトしたときは同じ抗HA抗体が、gp4-HA-VSV以外の追加のタンパク質バンドを生じ（レーン4、赤色ドット）、当該追加のタンパク質はgp4-HA-VSVとの直接相互作用を有するが、抗HA抗体とは直接相互作用をもたないことを示した。このバンドのサイズは、gp2-Myc-VSV（レーン6）又はgp3-Flag-VSV（レーン7）と同様であり、gp4と相互作用するこのタンパク質はgp2、gp3又はその両方であり得ることを示している。co-IPの追加のバンド（レーン4）を抗Flag又は抗Myc抗体で続いてプローブし両方が陽性であることが判明し（データは示されていない）、このバンドはgp2及びgp3タンパク質を含むことが示された。したがって、前記及び追加の実験の結論は、これらgpの表面発現のために導入された改変はそれらの四次構造に変化をもたらさなかったということである。
再標的化誘導したタンパク質は改変後にCD163受容体との相互作用を維持する：再標的化誘導したタンパク質の適切な折畳みを確認する次の工程は、それらがなお受容体（ブタCD163）と相互作用する能力を維持していることを示すことであった。再標的化誘導したタンパク質を発現するプラスミドの各々をCD163（ドメイン4−9）発現プラスミドとともに共トランスフェクトした（前記CD163が標的細胞へのウイルスの進入を媒介するために十分であることは以前に示されている）。細胞溶解物の一部を抗VSV抗体（エンベロープタンパク質に特異的）とともに免疫沈澱させ、他の部分を抗CD163抗体と免疫沈澱させた。抗CD163抗体と沈殿させた溶解物をビオチン結合抗CD163抗体でプローブし、各co-IP反応へのインプットCD163を管理した（図8C）。抗VSVで免疫沈澱させた溶解物を二重に泳動し、一方の膜を抗VSV-HRPでプローブして（図8A）改変gpの量を測定し、他方の膜を抗CD163でプローブして（図8B）改変エンベロープ糖タンパク質で共同免疫沈澱したCD163の量を測定した。
全ての改変微量エンベロープ糖タンパク質が確かにCD163と相互作用したが、改変gp5（陰性コントロールとして用いた主要タンパク質）は、CD163とはるかに弱い（又は検出不能の）相互作用を示した。
【実施例２】
【００６１】
プールされたPRRSVエンベロープ遺伝子発現プラスミドによる動物のワクチン免疫
32匹の3週齢ブタを、それぞれを8匹とする4つのグループに分けた（表2）。
表2：実験の詳細
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【００６２】
野生型グループは標的誘導されていないgpを発現する3プラスミドのプールを投与され、組換え型グループは再標的化誘導gpを発現する3プラスミドのプールを投与され（すなわち図5B及び5D）、擬似グループは狂犬病糖タンパク質をコードするプラスミドを投与されたが、非ワクチン接種グループはTris-EDTA緩衝液のみを投与された。各プラスミドは濃度が約1μg/μLであり、それぞれ約400μgのプラスミドが、各耳当たり200μL投与された。4回の免疫後に、各グループをさらに分けて、TS6アジュバント中の死滅ワクチン又は5回目のDNA免疫でブーストした（TS6アジュバントについては以下を参照されたい：US 7,371,395B2（Merial）、これは参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
どちらかのプラスミドプールでワクチン接種された動物では、肺病巣に対する防御の増加傾向が認められるようであるが、狂犬病G又は非ワクチン接種グループと比較したとき、全グループ間の平均は統計的に有意ではなかった。さらにまた標的誘導プラスミド投与グループと再標的化誘導プラスミド投与グループ間で有意な相違はなかった。
したがって、出願人は次に単一ベクター内に全遺伝子を置いて単一細胞内での同時発現を可能にして、PRRSVエンベロープタンパク質の相互作用/オリゴマー化を促進した。
【実施例３】
【００６３】
PRRSV遺伝子を発現するウイルスベクターの構築及び試験
細胞と培地：HEK293細胞（ATCC）は10%ウシ胎児血清（Moregate Batch #81827101）を含むMEM（Gibco #11095）で、5%CO2下に37℃で維持された。これらの細胞は、組換えアデノウイルス（vAD3041、vAD3042、vAD3038、vAD3033及びvAD3067）のレスキュー及びウイルスストックの作製に用いられた。
ウイルスベクターの構築及び免疫原：PRRSVの微量エンベロープタンパク質はgp2（ORF2）、gp3（ORF3）、gp4（ORF4）及びE（ORF2b）を含む。これらタンパク質の各々のDNA配列はGenBankアクセッション番号U87392（VR2332、PRRSV II型）から得た。VR2332（北アメリカ株）はPRRSVの2つの公知の主要血清型の1つである（Done et al., 1996）。他方（プロトタイプLelystad）は、西部ヨーロッパで単離された少なくとも大半の株の代表である。各タンパク質のコドン最適化配列は、適切なプロモーターとともに構築されたとき、単一ウイルスベクターから全てのタンパク質を発現する（図1）。各事例で、SV40（サルウイルス40）及びCMV（サイトメガロウイルス）プロモーターが、矢印に示すように反対の向きでそれぞれgp2及びgp4の発現を駆動する。これらのプロモーターは、SV40がgp4の発現を駆動できるように、かつ、CMVがgp2の発現を駆動できるように交換することが可能であることは想定される。そのような変動は当業者には明白であろう。重要なことに、安全な防御性免疫応答の誘引でPRRSV微量タンパク質が果たす本明細書に開示の重大な役割ゆえに、本出願人らは、以下のアプローチが全てのPRRSB株に等しく良好に適用できることを十分に期待する。したがって、Lelystad微量タンパク質のコドン最適化バージョンを日常的な方法で調製し、得られた配列を本開示の組換えベクターでクローニングすることができる。
全てのAd5 PRRSV構築物で、微量エンベロープタンパク質gp3の発現は、配列内リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site（IRES））によって促進される。vAD3041及びvAD3067の微量エンベロープ糖タンパク質Eの発現（図1C及び1D）は、自己切断ペプチド（p2A）の存在によって達成される（Ad5構築物では、p2Aはgp2コード領域の直後に位置する）。
さらにまた、SV40及びCMVプロモーターによる転写物の半減期はSV40のポリAテール（pA）及びチミジンキナーゼ（TK）の添加によって増大する。attL1及びattL2（図1で示される各挿入物のはるか左方及び右方）を用いて、合成フラグメント全体をアデノウイルスゲノムにLR組換え（ゲートウェイ技術（Gateway technology）（Invitrogenn））によって挿入する（それによってvAD3042、vAD3038、vAD3041及びvAD3067を作製する）。図1の挿入物を発現クローンのクローニングのための適切な制限部位を含むように化学的に合成し（Genscript）、組換えAd5を作製した（Gateway Technology, Invitrogen）。繰り返せば、個々のPRRSV遺伝子の発現をどのエレメントで促進させるかについての変動は意図され、本開示から当業者は容易に着想することができる。
したがって、微量タンパク質の多数の組合せを組換えのために集合させて以下のようにAd5ベクターを形成できる：1つは微量タンパク質の3つのみを含みEを含まない（vAD3042）（図1A；配列番号:2）；1つはrtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4タンパク質を含みEを含まない（vAD3038）（図1B；配列番号:3）；1つは4つ全てのコドン最適化微量タンパク質gp2、gp3、gp4及びEを含む（vAD3041）（図1C；配列番号:3）；さらに1つは4つ全てのコドン最適化微量タンパク質rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4及びEを含む（vAD3067）（図1D；配列番号:4）。
【００６４】
表3：造作の構築物内の配置
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【００６５】
ウイルスの生成：発現クローンは、ゲートウェイ技術（Invitrogen）を用いエントリーベクターとデスティネーションベクターとのLR組換えによって作製された。組換えアデノウイルスvAD3041、vAD3042及びvAD3038は、トランスフェクション試薬を用いて線状化した発現クローンをHEK293細胞にトランスフェクトすることによって生成された。レスキュー後、凍結融解サイクル及び遠心分離による細胞屑の除去によって各ウイルスを採集した。継代のためには、各ウイルスを単層HEK293細胞に接種し、感染後約3−4日でウイルスを凍結融解サイクル及び遠心分離による清澄化によって採集した。3回の継代を実施してウイルスストックを作製し、-80℃で保存した。陰性コントロールとして、ブタインフルエンザウイルス（SIV）のコドン最適化ヘマグルチニン（HA）遺伝子を同様にアッセンブリングしてAd5ウイルスベクター（vAD3033）を作製した。
ウイルス力価：HEK293細胞を3枚の96ウェルプレートにプレート当たり7ｘ105細胞の密度でプレートした。2%のFBS（Moregate Batch #81827101）、非必須アミノ酸（Gibco #11140）、抗生物質-抗真菌剤（Gibco #15240）を含むMEM（Gibco #11095）を用いた。感染の日に、プレート当たり100μLの10-3から10-10に希釈したウイルスで各プレートを感染させた。感染後10日でウイルス力価を判定し、3プレートの平均を力価の計算に用いた。3継代のvAD3041のストック力価（vAD3041 P.3）は109.03 TCID50/mLで、vAD3042 P.3のストック力価は108.90 TCID50/mLであった。vAD3038 P.3のストック力価は109.93 TCID50/mLで、vAD3042 P.3の別のバッチのストック力価は109.97 TCID50/mLであった。
ウイルスDNAを各ウイルスストックから抽出し、pAdフォワードプライマー（5’-GAC TTT GAC CGT TTA CGT GGA GAC-3’）（配列番号:26）、及びpAdリバースプライマー（5’-CCT TAA GCC ACG CCC ACA CAT TTC-3’）（配列番号:27）を用い、指示にしたがってプラチナPCRスーパーミックスハイフェデリティー（Invitrogen #12532）により増幅させた。PCRアンプリコンは予想と同じサイズ、例えばvAD3041については4709bp、vAD3042については4408bpであった（図4）。各組換えアデノウイルスのPCRアンプリコンのヌクレオチド配列はエントリーベクター中に構築されたもの（図1に記載）と同一であり、トランスジーンカセットのヌクレオチド配列（PRRSV遺伝子及びプロモーター及びポリAテール）に変化はなかった。
組換えアデノウイルスの再標的化誘導微量エンベロープ糖タンパク質の発現：組換えアデノウイルスの各改変エンベロープタンパク質の単一細胞内での同時発現は、二重免疫蛍光アッセイを用いて確認された。組換えvAD3038でコンフルエントなHEK293細胞を高MOIで感染させ、48時間後に細胞を固定し、組換え抗原の発現についてIFAで可視化した。全てのタンパク質が細胞表面上を含めて良好に発現するのが示された（図9A及び9B）。
重要なことに、gp2は単独で発現されたときには欠陥があり、初期に強い局所的細胞内発現として示され、表面発現は検出不能であったが、gp2の発現は改善され、細胞内発現は拡散し明瞭な細胞表面発現を示した（図9C）。このことは、改変gp2の適切な折畳み及び輸送はgp3及び/又はgp4の発現に依存し得ることを示した。この結果は、中和エピトープの形成は、微量タンパク質間の相互作用による高次構造の形成を必要とすることを主張する。
【実施例４】
【００６６】
Ad5 PRRSVワクチンの安全性及び有効性の臨床試験
60匹のブタを無作為に4グループ（各々15匹を含む）に分けた（表3）。グループ1はvAD3038（gp2、gp3及びgp3のみを発現）を投与され、グループ2はvAD3041（さらにEを発現）を投与され、グループ3はvAD3042（標的誘導化gp2、gp3及びgp4を発現）を投与され、グループ4はvAD3033を投与された（後者はSIV HAを発現し、陰性コントロールである）。アデノウイルスワクチンを投与されたグループには、各鼻孔に約108-9 TCID50/mLの濃度の1mLの調製物（合計2mL）を投与することによって免疫を開始した。これらのグループには21日後に同じ調製物の筋肉内投与によって追加免疫（ブースト）した。実験開始から42日後に、全ての動物をPRRSV NADC20株で鼻内チャレンジした。チャレンジから2週間後に全ての動物を犠牲にし、図9に示すように、肺病巣を調査し、さらに組織及び血清のウイルス力価の分析のためにサンプルを取集した。
【００６７】
表3：ワクチン接種試験計画
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一般的に、データは、微量エンベロープタンパク質gp2、gp3及びgp4をコードする単一ベクター（vAD3042）によるワクチン免疫は陰性コントロールと比較して有意な利点を提供しないが、E微量タンパク質の付加（vAD3041）はPRRSVチャレンジによる肺病巣に対する防御で顕著な相違を生じることを示している。さらにまた、微量タンパク質の再標的化誘導（vAD3038）もまた顕著な相違をもたらす（図11）。
したがって、本明細書に開示するデータ及び結果は広範囲に適用可能なモデルを支持し、このモデルでは、PRRSVチャレンジに対する防御は、表面タンパク質の1つ（例えばgp2）又は表面のオリゴマー構造（複数のタンパク質の三次/四次構造/編成によって形成及び提示される）に対して誘導される抗体によって提供される。
【００６８】
本開示の前には、Eタンパク質と微量タンパク質の残り又はビリオン中の他のタンパク質との相互作用が防御免疫の必要条件であることは知られてなかった。本ワクチン免疫試験はしたがって、微量タンパク質E（単独又はgp2、gp3及びgp4の1つ以上との組合せ）の、病毒性PPRRSVチャレンジに対する有意に高いブタの防御の誘引における驚くべきかつ予想に反する役割を明らかにした。
本出願人らは、例えば、中和エピトープを例えばEタンパク質上に直に配置するか、又はEタンパク質の存在下で微量タンパク質の任意の1つ又は組合せによって中和エピトープを誘導し得ることを想定する。従来技術から観れば、この発見は完全に予想に反し驚くべきことである。したがって、この予期せぬ発見は、PRRSV防御抗原組成物（生PRRSVを含まないワクチン開発の基礎として役立つ）を特定しただけではなく、タンパク質-タンパク質/ウイルス-細胞受容体相互作用を明らかにするためにPRRSV研究の新領域を開く。
これらのデータ及び結果から、E＋微量タンパク質の他の組合せ（例えばE＋gp2；E＋gp2＋gp3；E＋gp2＋gp4など）も同様に、動物の免疫系への“中和エピトープ”の提示に関する問題を解決するであろう。中和エピトープは、本明細書では動物で防御応答（ウイルス中和抗体の生成を含む）を誘引できるエピトープと定義される。さらにまた、これらの結果は、PRRSV微量タンパク質の再標的化誘導は、同様に驚くべき安全な防御免疫を誘引することを示した。
本出願人らはしたがって、別々に発現されたgp2、gp3及びgp4は、宿主動物の免疫系にウイルス中和エピトープを提示できず、病毒性PRRSVチャレンジに対する防御免疫応答を誘引できない点を克服する2つの主要でなお互に関連を有するアプローチを明らかにした。
さらにまた、本出願は、PRRSVエンベロープ微量タンパク質は防御免疫応答を誘引するために十分に強化され得ることを初めて明らかにした。これらの刷新的なアプローチは、他のウイルス（特にそのようなウイルスでは、細胞内局在はウイルス中和エピトープの宿主免疫系への提示の妨害で役割を有する）に対して広い応用性を有すると考えられる。
【実施例５】
【００６９】
Ad5 PRRSVワクチンの安全性及び有効性の臨床試験
実施例３に開示した方法を用いて別の実験を実施し、表4は概括を提供する。当該アデノウイルスベクターは以下のような挿入物を有する：vAD3038（Gp234-Rtrg）；vAD3067（Gp234-Rtrg+E-opt）；vAD3064（M-gp5-gp5a-Rtrg）；vAD3041（Gp234E）；vAD3069（Np-M-gp5-gp5a）；vAD3046（SIV-HA）。
表4：ワクチン接種試験計画（IM＝筋肉内；IN＝鼻内）
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要約：データは、死滅ワクチンで追加免疫したベクター発現の再標的化誘導PRRSV微量エンベロープタンパク質は血清ウイルス量を低下させ、加えて肺病巣の有意な防御を誘引することを示した（図18及び19）。これらのデータは、本実験前には、たとえ実施例3に提示したデータを見ても予想できなかった。この実験を実施した今では、本出願人らは、肺病巣のこの驚くべき防御及び血清ウイルス量の低下は再標的化誘導微量エンベロープタンパク質のプライミング効果によると考える（図20）。実施例3に示した反対の結果とは対照的に、再標的化誘導した微量エンベロープタンパク質へのEの付加は肺病巣の有意な防御を示す（図21及び22）という発見もまた予想に反した（すなわち、E+Wt微量エンベロープタンパク質を含むアデノ構築物は肺病巣を有意に低下させた）。図23及び24に示す相互作用のデータから、本出願人らは、肺病巣防御の低下は、再標的化誘導微量エンベロープタンパク質に対し負の相互作用を有する野生型Eによって引き起こされた可能性があると考える（すなわち再標的化誘導タンパク質に存在する変化したTM及びCTドメインに起因する）。
【００７０】
本発明の好ましい実施態様を詳細に記載したが、それらの多くの明瞭な変型が本発明の要旨を逸脱することなく可能であるので、上記で明らかにした本発明は、上記に示す個々の記載に限定されるべきでないことは理解されよう。
本出願引用文献で引用又は参照された全ての文献、及び本明細書で引用又は参照された全ての文献（“本明細書引用文献”）、及び本明細書引用文献で引用又は参照された全ての文献は、一切の製造業者の指示、説明書、製品明細書、及び本明細書又は本明細書に取り込まれた一切の文献に記載の製品についてのプロダクトシートと併せて、参照により本明細書に含まれ、さらに本発明の実施で用いることができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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