(57)【要約】  改良されたαS1-カゼイン切断及びC/P特性を有するキモシンの変異体。
2018525996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離キモシンポリペプチド変異体であって、以下:
(a) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される、
によって特徴付けられる単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項２】
親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも80%、85%、95%、97%、98%、99%の配列同一性を有する、請求項1に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項３】
該変異体が、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換が、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される: 
Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D 、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L及び/又はV317L、
請求項1又は2に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項４】
該変異体が、以下の置換の組み合わせのうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、各置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される:
Y21S + H76Q + Y307F + V317L、
R61S + L166V + T239S、
V32L + E294Q + R316L + V317L、
S226T + G244D + I263L + G289S、
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F、
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S、
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E、
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T、
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A、
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I、
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D、
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D、
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I、
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D、
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W、
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T、
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y、
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I、
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y、
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D、
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y、
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L、
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L、
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I、
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V、
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I、
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V、
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L、 
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D、
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I、
H76Q + N100Q + N291Q、
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q、
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L、
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I、
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E、
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D又は
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D、
請求項1〜3の何れか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項５】
単離キモシンポリペプチド変異体であって、以下:
(a) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の115%以上の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される、
によって特徴付けられる単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項６】
親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも80%、85%、95%、97%、98%、99%の配列同一性を有する、請求項5に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項７】
該変異体が、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで該置換が、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される: V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321P、
請求項5又は6に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項８】
単離キモシンポリペプチド変異体であって、
該変異体が、以下の置換の組み合わせのうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、各置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される:
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N、
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q、
Y21S + R61S + H146R、
R61S + G163E + M256L + S277N、
D59N + S271P + T284S、
V248I + S226T + E294Q、
S74F + G244D + S271P、
V221K + V248I + S255Y、
V183I + G251W + M256L、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
D98V + G251D + M256L + V259I、
V183I + V248I + G244D + T284S、
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D、
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L、
H146R + D158S + S273Y、
S74F + V259I + Y268F、
G70N + D98V + V136I、
I96L + M142I + R145Q + H146R、
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
S132A + Q188E + F223V、
I200V + G251D + G289S、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
F223V + G251W + S273Y + D279E、
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S、
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L、
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A、
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T、
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P、
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q、
V32L + N100Q + N291Q、
N292H + N100Q + N291Q、
V221K + N100Q + N291Q、
I297A + N100Q + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N、
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H、
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H、
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q、
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q、
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q、
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L、 
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q及び/又は
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231、
請求項5〜7の何れか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
【請求項９】
請求項1〜4の何れか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体を作製する方法であって、
(a): 配列番号2の成熟ポリペプチドをコードするDNA配列において1つ又はそれ以上の位置で改変を作製する段階、ここで、該改変は、少なくとも1つのアミノ酸位置において、置換、欠失又は挿入を含み;
(b): 段階(a)の改変ポリペプチドを生産及び単離する段階、
を含む、単離キモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
【請求項１０】
(a) 該変異体が、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換が、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される: Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、R242E、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、T239S、G251D、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L、
請求項9に記載の単離キモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
【請求項１１】
請求項5〜8の何れか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体を作製する方法であって、
(a): 配列番号2の成熟ポリペプチドをコードするDNA配列において1つ又はそれ以上の位置で改変を作製する段階、ここで、該改変は、少なくとも1つのアミノ酸位置において、置換、欠失又は挿入を含み;
(b): 段階(a)の改変ポリペプチドを生産及び単離する段階、
を含む、単離キモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
【請求項１２】
該変異体が、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換が、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される: V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K、K321P、
請求項11に記載の単離キモシンポリペプチド変異体を作製する方法。
【請求項１３】
食品又は飼料製品の製造方法であって、請求項1〜8の何れか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の有効量を食品又は飼料製品に加えること、及び食品又は飼料製品を得るためにさらなる製造工程を実施することを含む、食品又は飼料製品の製造方法。
【請求項１４】
食品又は飼料製品が、乳製品である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
請求項1〜8の何れか1項に記載のキモシンポリペプチド変異体を含む食品又は飼料製品。
【請求項１６】
チーズを製造する方法における請求項1〜8の何れか1項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【請求項１７】
パスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズを製造する方法における、請求項16に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたαS1-カゼイン及びC/P切断特性を有するキモシンの変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の凝乳酵素であるキモシン（EC3.4.23.4）及びペプシン（EC3.4.23.1）は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
【０００３】
胃粘膜細胞で産生される場合、キモシン及びペプシンは酵素的に不活性なプレプロキモシン及びプレペプシノゲンとしてそれぞれ生じる。キモシンが分泌されると、N末端ペプチドフラグメントであるプレフラグメント（シグナルペプチド）が切断され、プロフラグメントを含むプロキモシンが得られる。プロキモシンは酵素の実質的に不活性な形態であるが、プロフラグメントの自己触媒的除去によって酸性条件下で活性化されると活性キモシンになる。この活性化は、in vivoでは適切なpH条件下の胃管腔において、in vitroでは酸性条件下で起こる。
【０００４】
ウシ、すなわち、Bos taurusのプレプロキモシン、プロキモシン及びキモシンの構造的及び機能的特徴は、広範に研究されている。ウシプレプロキモシン分子のプレ部分は、16aa残基を含み、対応するプロキモシンのプロ部分は42aa残基の長さを有する。活性型ウシキモシンは、323aaを含む。
【０００５】
キモシンは、ウシ、ラクダ、カプリン、バッファロー、ヒツジ、ブタ、ヒト、サル及びラット等の哺乳動物種において天然に産生される。
【０００６】
ウシ及びラクダキモシンは、長年にわたり酪農業界に市販されてきた。
【０００７】
キモシン及びペプシン等の凝乳酵素による乳の酵素的凝固は、チーズの製造において最も重要な工程の1つである。酵素的な凝乳は、二相式プロセスである。すなわち、タンパク質分解酵素であるキモシン又はペプシンが、k-カゼインをアタックし、カゼインミセル構造の準安定状態をもたらす第1相、及び、その後乳が凝固し凝塊を形成する第2相である(参考文献1)。キモシンは、k-カゼインを切断することによって乳の凝固を促進することに加えて、主にPhe23とPhe24との間でアルファS1-カゼイン（αS1-カゼイン）を切断し(Moynihan et al. 2014)、αS1(1-23)ペプチドの形成をもたらす。
【０００８】
αS1(1-23)ペプチドの形成は、チーズのテクスチャーの軟化に寄与すると記載されている(Creamer & Olsen, 1982)。両パラメータの相関は、例えば、Bos taurus及びCamelus dromedarius由来のキモシンを比較することで見出されている。ウシキモシンはラクダキモシンと比較してより速くPhe23とPhe24の間のαS1カゼインを切断するが(Creamer & Olsen, 1982, Bansal et al. 2009)、例えばチェダー(Creamer & Olsen, 1982, Bansal et al. 2009)又はモッツアレラ(Moynihan et al. 2014)等のより高度なテクスチャー破壊を伴うより柔らかいチーズを産する。
【０００９】
αS1（1-23）ペプチド形成の程度が異なる種々のチーズ凝固剤を利用することで、チーズ製造者はチーズマトリックスに違ったレベルの柔軟性を付与することが可能である。したがって、チーズ製造においては、αS1（1-23）ペプチド形成が増加したキモシン変異体も、減少したうキモシン変異体も、工業的に非常に興味深い。微調整されたαS1-カゼインタンパク質分解を伴う凝固剤は、最適なカード硬度を有する様々なチーズ種の製造を容易にし得る。
【００１０】
直下に列挙される参考文献は、本明細書において、キモシンの突然変異体を記載する参考文献としてみなされ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO02/36752A2 (Chr. Hansen) describes recombinant production of camel chymosin.
【特許文献２】WO2013/174840A1 (Chr. Hansen) describes mutants/variants of bovine and camel chy-mosin.
【特許文献３】WO2013/164479A2 (DSM) describes mutants of bovine chymosin.
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71.
【非特許文献２】Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569.
【非特許文献３】van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of bio-technology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
【非特許文献４】Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Trichoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83.
【非特許文献５】M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural anal-ysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997.
【非特許文献６】Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Bio-chemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871.
【非特許文献７】Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139.
【非特許文献８】Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant pro-chymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
【００１３】
以下に記載されるように、上記の先行技術文献の何れも、キモシンの変異体であって、その変異体の元となった親と比較して、改変されたαS1-カゼインの切断頻度及びC/P値の増加を示すキモシン変異体を、直接、かつ一義的に記載していない。
【発明の概要】
【００１４】
本発明によって解決されるべき課題は、親ポリペプチドと比較した際、より低い又はより高いαS1-カゼインの切断頻度と、増加したC/P値とを有するキモシン変異体を提供することである。
【００１５】
献身的な努力と多岐にわたる研究戦略を適用することによって、発明者達は、以下の点を特徴とする単離キモシンポリペプチド変異体の設計を可能にする単一変異並びに複数変異の組み合わせを見出した:
(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200％であるC/P値を有し; 及び
(b) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００１６】
加えて、本発明の発明者達は、以下の点を特徴とする単離キモシンポリペプチド変異体の設計を可能にする単一変異並びに複数変異の組み合わせを見出した:
(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200％であるC/P値を有し; 及び
(b) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の少なくとも115%の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００１７】
さらに、本発明は単離キモシンポリペプチド変異体を作製するための方法を提供し、この方法は、以下の段階を含む方法である:
(a): 配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)をコードするDNA配列の1つ又はそれ以上の位置で改変を行う段階であり、ここで、該改変が、Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L及び/又はV317L、あるいはV32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K、及び/又はK321Pに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含む、
(b): 段階(a)の改変されたポリペプチドを生産及び単離する段階。
【００１８】
関連する態様において、本発明はまた、親ポリペプチドと比較して改変されたαS1-カゼイン切断頻度を有する単離キモシンポリペプチド変異体の作製方法に関し、該方法は、以下の段階を含む方法である:
(a): 親ポリペプチドにおいて1つ又はそれ以上の位置で改変を作製する段階であり、ここで、該改変が、Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L、V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321Pの何れかの位置に対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含む、
(b) 段階(a)の改変されたポリペプチドを生産及び単離する段階、
及び、ここで:
(i) 該親ポリペプチドのアミノ酸位置が、親ペプチドと配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドのアライメントによって決定され;
及び
(ii) 該親ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドに対して少なくとも65%の配列同一性、及び/又は、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドに対して少なくとも65%の配列同一性を有する。
【００１９】
さらに、本発明はまた、本発明の実施形態において概説されている置換の特定の組み合わせにも関する。
【００２０】
本開示はまた、単離キモシンポリペプチド変異体を含む食品又は飼料製品並びにチーズ製造工程における単離キモシンポリペプチド変異体の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
異なる変異体の比較解析に基づき、本発明者達は、同定したアミノ酸位置の1つ又はそれ以上の変異体を作製することにより、より低いか又はより高いかの何れかのαS1-カゼイン切断頻度及び増加したC/P値有する改善されたキモシン変異体を得ることができる重要な多数のアミノ酸位置を本明細書中で同定した。
【００２２】
したがって、前述のとおり、本発明は、以下によって特徴付けられる単離キモシンポリペプチド変異体を提供する:
(a) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満又は少なくとも115%の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００２３】
本発明のより詳細な態様は、以下によって特徴付けられる単離キモシンポリペプチド変異体を提供する:
(a) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び
(b) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００２４】
密接に関連した態様において、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴られる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断する本発明の単離キモシンポリペプチド変異体は、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される: Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L及び/又はV317L。
【００２５】
上記特定の突然変異は、複数の置換を含む変異体又は突然変異体を産生するために突然変異の組合せの一部を形成し得る。特に、関連する態様として、減少したαS1-カゼイン切断頻度を有する単離キモシンポリペプチド変異体は、以下の変異の組み合わせのうち1つ又はそれ以上を含み得、ここで、各置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される:
Y21S + H76Q + Y307F + V317L、
R61S + L166V + T239S、
V32L + E294Q + R316L + V317L、
S226T + G244D + I263L + G289S、
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F、
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S、
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E、
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T、
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A、
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I、
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D、
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D、
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I、
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D、
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W、
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T、
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y、
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I、
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y、
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D、
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y、
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L、
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L、
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I、
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V、
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I、
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V、
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L、
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D、
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I、
H76Q + N100Q + N291Q、
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q、
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L、
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I、
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E、
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H.
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D又は
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D。
【００２６】
従って、本発明はまた、以下によって特徴付けられる単離キモシンポリペプチド変異体を含む:
(a) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の少なくとも115%の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００２７】
密接に関連した態様において、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の少なくとも115%の頻度でαS1-カゼインを切断する本発明の単離キモシンポリペプチド変異体は、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される: V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321P。
【００２８】
他の関連した態様において、増加したαS1-カゼイン切断頻度を有する単離キモシンポリペプチド変異体は、以下の変異の組み合わせのうち1つ又はそれ以上を含み得、ここで、各置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を基準として特定される:
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N、
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q、
Y21S + R61S + H146R、
R61S + G163E + M256L + S277N、
D59N + S271P + T284S、
V248I + S226T + E294Q、
S74F + G244D + S271P、
V221K + V248I + S255Y、
V183I + G251W + M256L、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
D98V + G251D + M256L + V259I、
V183I + V248I + G244D + T284S、
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D、
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L、
H146R + D158S + S273Y、
S74F + V259I + Y268F、
G70N + D98V + V136I、
I96L + M142I + R145Q + H146R、
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
S132A + Q188E + F223V、
I200V + G251D + G289S、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
F223V + G251W + S273Y + D279E、
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S、
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L、
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A、
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T、
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P、
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q、
V32L + N100Q + N291Q、
N292H + N100Q + N291Q、
V221K + N100Q + N291Q、
I297A + N100Q + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N、
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H、
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H、
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q、
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q、
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q、
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L、 
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q及び/又は
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231N。
【００２９】
本発明は、斯かる単離キモシンポリペプチド変異体を製造する方法、斯かる単離キモシンポリペプチド変異体を用いて食料又は飼料製品を製造する方法、それら変異体を含む食料及び飼料製品、並びに、食料及び飼料製品の製造のための斯かる変異体の使用を、さらに提供する。
【００３０】
加えて、本発明は、例えばパスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズ等のチーズを製造する方法における本発明のキモシンポリペプチド変異体の使用に関連する。
【００３１】
重要なキモシンのアミノ酸位置の決定
【００３２】
変異体を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸番号付けは、成熟ペプチドに基づく。
【００３３】
当該技術分野で知られているように、異なる哺乳動物種（例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラット）から得られる異なる天然の野生型キモシンポリペプチド配列は、比較的高い配列類似性/同一性を有する。本明細書において、天然に得られる野生型キモシン（ウシキモシン又はラクダキモシン等）は、本明細書で親ポリペプチド、すなわち本発明の変異型キモシンポリペプチドを産生するための改変が行われる親ポリペプチドの例であり得る。
【００３４】
本明細書で概説されるように、重要な親キモシンポリペプチド（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ等）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書では、配列番号2の公知のCamelius dromedarius成熟キモシン配列が使用される。本明細書では、代わりに、ラクダキモシンと称することができる。配列番号2の成熟ポリペプチド配列は、本明細書において配列番号4として例示される。
【００３５】
あるいは、他のキモシンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1において開示された成熟ポリペプチドとアライン(align)され得、及びアライメントに基づき、配列番号1に開示される成熟ポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号は、ClustalWアルゴリズムを用いて、又は本明細書の実施例1に記載されるように決定される。
【００３６】
上記の公知のコンピュータープログラムに基づき、重要な本明細書に関連するキモシンポリペプチド（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシ等）のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
【００３７】
凝乳活性の測定
凝乳活性は、国際酪農連盟(International Dairy Federation)（IDF法）によって開発された標準的な方法であるREMCAT法を用いて決定され得る。
【００３８】
この方法において、凝乳活性は、0.5g/リットル（pH≒6.5）の塩化カルシウム溶液を用いた低温、低脂肪粉乳から調製された標準乳基質の目視可能な凝固のために必要な時間から決定される。レンネットサンプルの凝固時間は、既知の凝乳活性を有し、サンプルと同じIDF標準110Bによって同じ酵素組成を有する参照標準の凝固時間と比較される。サンプルおよび参照標準は、同一の化学的及び物理的条件下で測定される。変異体サンプルを、84mM酢酸緩衝液pH5.5を用いて約3IMCU/mlに調整する。その後、水浴中に設置されたガラス試験管(32℃±1℃の一定温度に維持することが可能)中の10mlの予熱された乳(32℃)に200μlの酵素調製物を加える。あるいは、20μlの酵素調製物を、上記のように1mLの予熱された乳に加える。
【００３９】
レンネットの凝乳活性（強度）は、サンプルと同じ酵素組成を有する標準と比較して、1ml当たりの国際凝乳単位（IMCU）を単位として、以下の式に従い計算される:
IMCU/mlにおける強度=標準×T標準×Dサンプル
D標準×Tサンプル
標準: レンネットの国際参照標準の凝乳活性。
T標準: 標準希釈で得られた凝固時間（秒）。
Dサンプル: サンプルの希釈係数。
D標準: 標準の希釈係数。
Tサンプル: 希釈されたレンネット試料について、酵素の添加から凝固の時間までに得られた凝固時間（秒）。
【００４０】
あるいは、REMCAT法の代わりにμIMCU法を用いてもよい。REMCATと比較して、μIMCUアッセイにおけるキモシン変異体の凝固時間は、UV/VISプレートリーダー内で、96ウェルマイクロタイタープレートで800nmでのOD測定によって決定される。既知の凝固強度を有する参照標準の様々な希釈の標準曲線を各プレートに記録する。サンプルを、84mMアセテート緩衝液、0.1％トリトンX-100、pH5.5中で酵素を希釈することによって調製する。32℃での反応を、4％（w/w）の低熱、低脂肪粉乳及び7.5％（w/w）塩化カルシウム（pH≒6.5）を含む250μlの標準乳基質を25uL酵素サンプルに加えることによって開始する。その後、国際凝乳単位(IMCU)/mlにおけるキモシン変異体の凝乳活性を、標準曲線に対するサンプルの凝固時間に基づいて決定する。
【００４１】
総タンパク質含量の決定
好ましくは、総タンパク質含量は、提供者の指示に従い、Thermo ScientificのPierce BCAタンパク質アッセイキットを用いて決定される。
【００４２】
特異的な凝固活性の計算
特異的な凝固活性（IMCU/mg総タンパク質）は、凝固活性（IMCU/ml）を総タンパク質含有量（1mlあたりの総タンパク質mg）で割ることによって決定され得る。
【００４３】
変異体の命名法
本発明の変異体の説明においては、参照を容易とするために、以下に記載する命名法を採用する。許容されるIUPACの1文字又は3文字のアミノ酸略語が使用される。
【００４４】
以下のこの「命名法」のセクションで論じた特定の変異体は、本明細書では本発明の関連する変異体ではない可能性がある。すなわち、この「命名法」のセクションは、本発明との関連で使用される命名法を説明するためのものに過ぎない。上記のように、本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために使用されるアミノ酸の番号は、成熟したキモシンポリペプチド配列中のアミノ酸の位置に基づく。
【００４５】
置換
アミノ酸置換に関し、以下の命名法を用いる: 元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、理論上226位のトレオニンをアラニンに置換した場合は、「Thr226Ala」又は「T226A」と示される。複数の突然変異は、付加記号（「+」）で区切って示す。例えば「Gly205Arg + Ser411Phe」又は「G205R + S411F」は、205位のグリシン（G）をアルギニン(R)で、411位のセリン(S)をフェニルアラニン(F)でそれぞれ置換することを表す。例えば「226A」と称される置換は、226位の親アミノ酸（例えば、T、Q、S又は別の親アミノ酸）をアラニンで置換することを指す。
【００４６】
欠失
アミノ酸欠失に関し、以下の命名法を用いる: 元のアミノ酸、位置、*。従って、195位でのグリシンの欠失は、「Gly195*」又は「G195*」のように示される。複数の欠失は、例えば、「Gly195* + Ser411*」又は「G195* + S411*」のように、付加記号（「+」）で区切って示す。
【００４７】
挿入
アミノ酸挿入に関し、以下の命名法を用いる: 元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸。従って、195位でのグリシンの後にリシンを挿入する場合は、「Gly195GlyLys」又は「G195GK」で示される。複数のアミノ酸の挿入は、［オリジナルアミノ酸、位置、オリジナルアミノ酸、挿入アミノ酸♯1、挿入アミノ酸♯2; 等］で示される。例えば、195位のグリシンの後にリシンを挿入する場合は、「Gly195GlyLysAla」又は「G195GKA」として示される。
【００４８】
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に先行するアミノ酸残基の位置番号へ小文字を付加することで番号付けを行う。上記の例において、配列は次のようになる:
【表１】
2018525996.tif 000003
【００４９】
複数改変
複数の改変を含む変異体は、付加記号（「+」）で区切って示す。例えば、「Arg170Tyr + Gly195Glu」又は「R170Y + G195E」は、170位のチロシンをグリシンで、195位のアルギニンをグルタミン酸で、それぞれ置換することを表す。
【００５０】
異なる置換
一つの位置に複数の異なる置換が導入され得る際、斯かる複数の異なる置換をコンマで区切って示す。例えば、「Arg170Tyr,Glu」又は「R170Y,E」は、170位のアルギニンをチロシン又はグルタミン酸で置換することを示す。従って、「Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala」又は「Y167G,A + R170G,A」は、以下の変異体を示す:
「Tyr167Gly + Arg170Gly」、「Tyr167Gly + Arg170Ala」、「Tyr167Ala + Arg170Gly」及び「Tyr167Ala + Arg170Ala」。
【００５１】
好ましい変異体:
本明細書に概説されるように、本発明の発明者は、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンと比較し、変異体のC/P値を少なくとも2倍に増加させるが、対応する親ポリペプチドとは異なる所望の頻度でαS1-カゼインを切断する多くの好ましいキモシンポリペプチド変異体を作製した。
【００５２】
減少したαS1-カゼイン切断活性を有する好ましい変異体
本発明の好ましいキモシンポリペプチド変異体は、以下によって特徴付けられる変異体を含む。
(a) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有する; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００５３】
好ましい態様において、単離キモシンポリペプチド変異体は、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満、50%未満、40%未満、30%未満又は20%未満の頻度でαS1-カゼインを切断する。本発明の単離キモシンポリペプチド変異体は、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンポリペプチドの少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、少なくとも900%、少なくとも1200%又は少なくとも1400%のC/P値を含む、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンポリペプチドのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有する。
【００５４】
親ポリペプチドは、配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチド又は配列番号1の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも80％、例えば少なくとも80％、85％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有する。
【００５５】
密接に関連した態様において、単離キモシンポリペプチド変異体は、以下によって特徴付けられる。
(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し;
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行され、ここで、該置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関して特定される: Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L及び/又はV317L。
【００５６】
加えて、直前で記述された減少したαS1-カゼイン切断活性を有する単離キモシンポリペプチドは、以下の置換の組み合わせのうち1つ又はそれ以上を含み得、及び各置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関して特定される:
Y21S + H76Q + Y307F + V317L、
R61S + L166V + T239S、
V32L + E294Q + R316L + V317L、
S226T + G244D + I263L + G289S、
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F、
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S、
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E、
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T、
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A、
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I、
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D、
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D、
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I、
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D、
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W、
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T、 
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y、
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I、
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y、
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D、
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y、
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L、
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L、
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I、
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V、
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I、
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V、
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L、
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D、 
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D、
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I、
H76Q + N100Q + N291Q、
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q、
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L、
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I、
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E、
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D又は
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D。
【００５７】
増加したαS1-カゼイン切断活性を有する好ましい変異体
本発明の好ましい単離キモシンポリペプチド変異体は、以下で特徴付けられる変異体を含む。
(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の115%以上の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。
【００５８】
単離キモシンポリペプチド変異体の好ましい態様においては、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼインの頻度の少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも145%又は少なくとも150%の頻度でαS1-カゼインを切断する。増加したαS1-カゼイン切断活性を有する単離キモシンポリペプチド変異体は、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンポリペプチドの少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも500%、少なくとも900%、少なくとも1200%、少なくとも1400%のC/P値であるC/P値を含む、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンポリペプチドの少なくとも200%のC/P値であるC/P値を有する。親ポリペプチドは、少なくとも80％、例えば配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチド又は配列番号1の成熟ポリペプチド（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドの少なくとも80％、85％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有する。
【００５９】
密接に関連した態様において、単離キモシンポリペプチド変異体は、以下によって特徴付けられる。
(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値であるC/P値を有し; 及び
(b) 該単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の115%以上の頻度でαS1-カゼインを切断し、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行され、ここで、該置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関して特定される: V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q、N292H、L295K及び/又はK321P。
【００６０】
加えて、直前で記述された減少したαS1-カゼイン切断活性を有する単離キモシンポリペプチドは、以下の置換の組み合わせのうち1つ又はそれ以上を含み得、及び各置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関して特定される:
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N、
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q、
Y21S + R61S + H146R、
R61S + G163E + M256L + S277N、
D59N + S271P + T284S、
V248I + S226T + E294Q、
S74F + G244D + S271P、
V221K + V248I + S255Y、
V183I + G251W + M256L、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
D98V + G251D + M256L + V259I、
V183I + V248I + G244D + T284S、
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D、
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L、
H146R + D158S + S273Y、
S74F + V259I + Y268F、
G70N + D98V + V136I、
I96L + M142I + R145Q + H146R、
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
S132A + Q188E + F223V、
I200V + G251D + G289S、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
F223V + G251W + S273Y + D279E、
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S、
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L、
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A、
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T、
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P、
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q、
V32L + N100Q + N291Q、
N292H + N100Q + N291Q、
V221K + N100Q + N291Q、
I297A + N100Q + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N、
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H、
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H、
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q、
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q、
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q、
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L、 
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q及び/又は
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231。
【００６１】
本発明の単離キモシンポリペプチド変異体は、天然のキモシンペプチドに対して高い全体的な配列同一性を維持する。例えば、本発明のポリペプチド変異体は、好ましくは、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも85%、95%、97%、98％又は99%の配列同一性を含む、配列番号2の成熟ポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有する。
【００６２】
上記記載のように、例えば本明細書で議論されるコンピューター配列アライメントプログラムに基づき、重要な本明細書に関連するキモシンポリペプチド（例えば、ラクダ、ヒツジ、ウシなど）の本明細書において関連するアミノ酸位置を決定することは当業者にとって日常的な作業である。
【００６３】
例えば、配列番号2の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10改変(例えば、置換)を有するラクダキモシン変異体は、依然として少なくとも65%の配列同一性の配列番号2(ラクダ)の成熟ポリペプチドを有する、親ペプチドであり得る。
【００６４】
言い換えれば、本明細書に関連する単離キモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求される位置以外の位置に改変（例えば、置換）を含み得る。本明細書において当業者によって理解されるように、本明細書において、例えば、配列番号1(ウシキモシン-すなわち配列番号1の59〜381アミノ酸位置)の成熟ポリペプチドを有する成熟ヒツジ、C. bactrianus、ラクダ、ブタ又はラットキモシンに関する配列同一性パーセンテージは、上記配列同一性パーセンテージと比較的類似する。
【００６５】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも92％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも95％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも97％の配列同一性を有する。親ポリペプチドが、配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。
【００６６】
単離ラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して30未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含むことが好ましい場合があり、又は単離ラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して20未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含むことが好ましい場合があり、又は単離ラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して10未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含むことが好ましい場合があり、又は単離ラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して5未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含むことが好ましい場合がある。
【００６７】
本明細書において当業者によって理解されるように、本明細書に記載の単離ラクダキモシン変異体に関する「単離変異体ポリペプチドは、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有する」という用語は、配列番号2の公知成熟野生型ラクダキモシン配列と100%同一であるポリペプチド配列を有さないものとする。
【００６８】
少なくとも1つの改変が置換であること、すなわち、本明細書で関連する好ましい実施形態が、単離キモシンポリペプチド変異体に関連することが好ましいとされ得、ここで、該改変が、本明細書で請求された何れかの位置に対応する少なくとも1つのアミノ酸位置においての改変を含む。
【００６９】
好ましくは、親ポリペプチドは、少なくとも80％、例えば、配列番号1（ウシキモシン）及び/又は配列番号2（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと85％、90％、95％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する。
【００７０】
一例として、例えばウシキモシンAであり得る、本明細書中で適切な関連親ポリペプチドは、当該技術分野で知られているように、ウシキモシンAは、本明細書の配列番号1のウシキモシンBと比較して1つのアミノ酸の違いのみ有し得る。
【００７１】
本明細書の内容において当業者に理解されるように、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、例えば、対応する野生型キモシンの例えば変異体であり得る可能性がある。
【００７２】
例えば、配列番号1の成熟野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10改変(例えば、置換)を有するウシキモシン変異体は、依然として配列番号1の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ポリペプチドであり得る。
【００７３】
言い換え及び一般的に言えば、本明細書に関連する単離キモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求される位置以外の位置に改変（例えば、置換）を含み得る。
【００７４】
本明細書において当業者によって理解されるように、単離キモシン変異体は、上記のもの以外のアミノ酸位置の改変（例えば、置換）を含み得る。
【００７５】
例えば、配列番号1の野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、5〜10改変(例えば、置換)を有するウシキモシン変異体は、依然として配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドを有する少なくとも95%の配列同一性を持つ親ペプチドであり得る。
【００７６】
配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して、30未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含む単離ウシキモシン変異体が好ましい場合があり、又は配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して、20未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含む単離ウシキモシン変異体が好ましい場合があり、又は配列番号1の成熟ポリペプチドと比較して、10未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含む単離ウシキモシン変異体が好ましい場合があり、又は配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して、5未満のアミノ酸改変(例えば、置換)を含む単離ウシキモシン変異体が好ましい場合がある。
【００７７】
言い換えれば、成熟ウシキモシンと少なくとも65％の配列同一性を有する成熟親キモシンポリペプチド（例えばヒツジ又はブタ）は、本明細書に関連するために、例えばウシ又はラクダキモシンと十分に構造的に同一であると考えられ、すなわち、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有する本明細書における成熟親キモシンポリペプチド(例えば、ヒツジ又はラット由来)は、本明細書に記載のアミノ酸位置のいずれかで変異体を作製することによって改善されるようになるために、例えば、ウシ又はラクダキモシンに関連した十分な構造とみなされ得る。
【００７８】
配列番号2のラクダキモシンポリペプチドは、配列番号1のウシポリペプチドと84%の配列同一性(すなわち、プレ及びプロ配列を含む、1〜381位置の配列番号1完全配列)を有する。
【００７９】
単離キモシンポリペプチド変異体の作製方法
本発明はまた、以下によって特徴付けられる単離キモシンの製造方法に関連する。(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び(b) 配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の80%未満の頻度でαS1-カゼインを切断する、製造方法であって、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される、製造方法であり、該方法は、以下の段階を含む:
(a): 配列番号2の成熟ポリペプチドをコードするDNA配列において1つ又はそれ以上の位置で改変を作製する段階、ここで、該改変は、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関連し特定される: Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、R242E、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、T239S、G251D、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L;
(b): 段階(a)の改変ポリペプチドを生産及び単離する段階。
【００８０】
関連した態様において、本発明はまた、以下によって特徴づけられる単離キモシンポリペプチド変異体の製造方法に関連する。(a) 単離キモシンポリペプチド変異体が、配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのC/P値の少なくとも200%のC/P値を有し; 及び(b) 配列番号2の成熟ポリペプチドによって特徴付けられる単離ラクダキモシンのαS1-カゼイン切断の頻度の115%以上の頻度でαS1-カゼインを切断する、製造方法であって、ここで、αS1-カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られるαS1-カゼインペプチドを定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される、製造方法であり、該方法は、以下の段階を含む:
(a): 配列番号2の成熟ポリペプチドをコードするDNA配列において1つ又はそれ以上の位置で改変を作製する段階、ここで、該改変は、以下の置換のうち1つ又はそれ以上を含み、ここで、該置換は、配列番号2の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に関連し特定される: V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321P;
(b): 段階(a)の改変ポリペプチドを生産及び単離する段階。
【００８１】
上記のように、当業者は、共通の一般的な知識に基づいてキモシン及びキモシン変異体を日常的に産生及び生成し得る。言い換えれば、当業者が、重要なキモシン活性を有する本明細書に関連する親ペプチド(例えば、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラット由来)及び本明細書で開示された教示を所持していれば、当業者にとって重要な親キモシン等の変異体を作製することは日常的な作業である。
【００８２】
キモシン（変異体又は親）を生成及び単離するための適切な方法の例は、例えば、WO02/36752A2 (Chr. Hansen)に記載される技術に基づく、例えば真菌の組換発現/生産等のよく知られているものであり得る。
【００８３】
当業者が、キモシン活性を有する親ポリペプチドにおいて、1つ又はそれ以上の位置で改変を行うことはまた、日常的な作業であり、ここで、改変は、本明細書中に開示されるような少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含む。当業者に知られるように、これは、例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発及び組換え発現/産生に基づく技術によって行われ得る。
【００８４】
本明細書に関連する親ポリペプチド（例えば、ラクダ又はウシ野生型キモシン）及び/又は本明細書に関連する変異体がキモシン活性を有するか否かを決定することはまた、当業者にとって日常的な作業である。
【００８５】
当該技術分野で知られているように、キモシン特異性は、特異的な凝固活性（C）をタンパク質分解活性（P）で割ることによって決定される、いわゆるC/P値によって決定され得る。当該技術分野で知られているように、より高いC/P値は、一般に、例えば、チーズ製造中の非特異的なタンパク質分解に起因するタンパク質の損失が低減することを意味し、すなわち、チーズの収率が改善される。
【００８６】
当該技術分野で知られているように、αS1-カゼイン切断及びαS1-カゼイン（αS1（1-23）を含む）形成は、当業者に利用可能な標準的方法を用いて決定することができる。
【００８７】
追加の方法が、実施例において提供される。
【００８８】
乳製品の製造方法
【００８９】
上記のように、本明細書に記載の単離キモシンポリペプチド変異体は、例えば、重要な乳製品(例えばチーズ製品等)を製造するため、当該技術分野に従い使用され得る。
【００９０】
上記のように、本発明の一態様は、本明細書中に記載された単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を食品又は飼料成分に加えること、及び食品又は飼料製品を得るために、さらなる製造工程を実施することを含む、食品又は飼料製品の製造方法に関する。
【００９１】
好ましくは、食品又は飼料製品は、乳製品であり、及び該方法は、本明細書に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の有効量を乳に加えること及び乳製品を得るためにさらなる製造段階を実行することを含む。
【００９２】
例えば、本発明のキモシンポリペプチド変異体は、乳の発酵後に乳製品に加えられ得る。一態様において、本発明のキモシンポリペプチド変異体は、チーズを製造する方法の一部として、発酵乳製品の凝固のために加えられる。
【００９３】
該乳は、例えば、ダイズ乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳であり得る。
【００９４】
該乳製品は、例えば、クワルク(quark)又はチーズ等の発行乳製品であり得る。
【００９５】
食品又は飼料製品
本発明はまた、本発明のキモシンポリペチド変異体又は本発明の方法に従って得られるキモシンポリペプチド変異体を含む食品及び飼料製品を提供する。食品及び飼料製品は、好ましくは、チーズ及びクワルクを含む発酵乳製品等の発酵食品である。
【００９６】
代替的ではあるが、関連する態様において、本発明は以下に列挙された項目に関連する：
項目1.
親ポリペプチドと比較して改変されたαS1-カゼイン切断頻度を有する単離キモシンポリペプチド変異体を作製するための方法であって、該方法は、以下の段階、
(a): 親ポリペプチドにおいて1つ又はそれ以上の位置で改変を作製する段階、ここで、該改変は、対応する以下の何れかの位置で少なくとも1つのアミノ酸において置換、欠失又は挿入を含み: Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L、V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321P、
(b): 段階(a)の改変ポリペプチドを生産及び単離する段階、
を含む方法であり、
及び、ここで
(i) 該親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと親ポリペプチドとのアライメントによって決定され;
及び
(ii) 該親ポリペプチドが、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドの少なくとも65%の配列同一性及び/又は配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドの少なくとも65%を有する。
【００９７】
項目2.
項目1に記載の方法であって、ここで、単離キモシンポリペプチド変異体が以下:
-配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのαS1-カゼイン切断頻度と比較してより低いαS1-カゼイン切断頻度を示すキモシン活性及び/又は
-配列番号2の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのαS1-カゼイン切断頻度と比較してより低いαS1-カゼイン切断頻度を示すキモシン活性、
を有する方法。
【００９８】
項目3.
項目2の単離キモシンポリペプチド変異体の製造方法であって、ここで該改変は、以下の置換: Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、 S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L及び/又はV317L、のうち1つ又はそれ以上である製造方法。
【００９９】
項目4.
項目2及び3の何れかに記載の方法であって、ここで、該単離キモシンポリペプチド変異体が、以下に対応する位置を含む1つ又はそれ以上の位置の組み合わせの改変:
Y21S + H76Q + Y307F + V317L、 
R61S + L166V + T239S、
V32L + E294Q + R316L + V317L、
S226T + G244D + I263L + G289S、
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F、
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S、
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E、
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T、
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A、
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I、
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D、
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D、
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I、
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D、
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W、
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T、
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y、
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I、
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y、
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D、
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y、
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L、
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L、
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I、
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V、
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I、
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V、
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L、
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D、
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I、
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q、
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L、
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I、
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E、
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H、
H76Q + N100Q + N291Q、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D又は
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D、
を含む方法。
【０１００】
項目5.
項目1に記載の方法であって、該単離キモシンポリペプチド変異体が、
-キモシン活性が、配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのαS1-カゼイン切断頻度と比較して、より高いαS1-カゼイン切断頻度を示す、及び/又は
-キモシン活性が、配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのαS1-カゼイン切断頻度と比較して、より高いαS1-カゼイン切断頻度を示す、
を有する方法。
【０１０１】
項目6.
項目5の単離キモシンポリペプチド変異体の製造方法であって、該改変が、以下の置換のうち1つ又はそれ以上である: 
V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321P、
である製造方法。
【０１０２】
項目7.
項目5及び6の何れかに記載の方法であって、該単離キモシンポリペプチド変異体が、以下に対応する位置を含む1つ又はそれ以上の位置の組み合わせの改変:
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N、
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q、
Y21S + R61S + H146R、
R61S + G163E + M256L + S277N、
D59N + S271P + T284S、
V248I + S226T + E294Q、
S74F + G244D + S271P、
V221K + V248I + S255Y、
V183I + G251W + M256L、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
D98V + G251D + M256L + V259I、
V183I + V248I + G244D + T284S、
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D、
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L、
H146R + D158S + S273Y、
S74F + V259I + Y268F、
G70N + D98V + V136I、
I96L + M142I + R145Q + H146R、
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
S132A + Q188E + F223V、
I200V + G251D + G289S、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
F223V + G251W + S273Y + D279E、
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S、
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L、
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A、
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T、
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P、
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q、
V32L + N100Q + N291Q、
N292H + N100Q + N291Q、
V221K + N100Q + N291Q、
I297A + N100Q + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N、
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H、
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H、
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q、
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q、
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q、
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L、
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q及び/又は
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231、
を含む方法。
【０１０３】
項目8.
項目1〜7の何れか1項目に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の製造方法であって、親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する製造方法。
【０１０４】
項目9.
キモシン活性を有する親ポリペプチドと比較して、1つ又はそれ以上の位置で改変を含む単離キモシンポリペプチド変異体であって、該改変が、以下に対応する何れかの位置で少なくとも1つのアミノ酸位置の置換:
Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D 、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L及び/又はV317L、
を含む単離キモシンポリペプチド変異体であり、ここで
(i): 親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと親ポリペプチドのアライメントによって決定され、及び
(ii): 親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有し;
ここで、該単離キモシンポリペプチド変異体が、対応する親ポリペプチドより低い頻度でαS1-カゼインを切断する、単離キモシンポリペプチド変異体。
【０１０５】
項目10.
項目9に記載の単離キモシンポリペプチド変異体であって、該親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば80%、85%、95%、97%、98%、99%の配列同一性を有する、単離キモシンポリペプチド変異体。
【０１０６】
項目11.
項目9〜10の何れか1項目に記載の単離キモシンポリペプチド変異体であって、該単離キモシンポリペプチド変異体が、以下:
Y21S + H76Q + Y307F + V317L、
R61S + L166V + T239S、
V32L + E294Q + R316L + V317L、
S226T + G244D + I263L + G289S、
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F、
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S、
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E、
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T、
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A、
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I、
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D、
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D、
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I、
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D、
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W、
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T、
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y、
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I、
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I、
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I、
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y、
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I、
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y、
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y、
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y、
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D、
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y、
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I、
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y、
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y、
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D、 
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L、
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L、 
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I、
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V、
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L、
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I、
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L、
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D、
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y、
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V、
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V、
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L、 
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I、
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D、
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D、
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D、
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I、
H76Q + N100Q + N291Q、
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q、
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L、
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I、
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E、
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I、
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E、
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D、
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I、
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D又は
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D、
に対応する位置を含む1つ又はそれ以上の位置の組み合わせを含む、単離キモシンポリペプチド変異体。
【０１０７】
項目12.
キモシン活性を有する親ポリペプチドと比較して、1つ又はそれ以上の位置での改変を含む単離キモシンポリペプチド変異体であって、該改変が、以下:
V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K及び/又はK321P、
に対応する何れかの位置の少なくとも1つのアミノ酸位置において置換を含む、単離キモシンポリペプチド変異体であり、ここで
(i): 該親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと親ポリペプチドのアライメントによって決定され、及び
(ii): 該親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドの少なくとも65%の配列同一性を有し;
ここで、該単離キモシンポリペプチド変異体が、対応する親ポリペプチドより高い頻度でαS1-カゼインを切断する、単離キモシンポリペプチド変異体。
【０１０８】
項目13.
項目12に記載の単離キモシンポリペプチド変異体であって、該親ポリペプチドが、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドの少なくとも80%、例えば少なくとも80%、85%、95%、97%、98%、99%の配列同一性を有する、単離キモシンポリペプチド変異体。
【０１０９】
項目14.
項目12〜13の何れか1項目に記載の単離キモシンポリペプチド変異体であって、該単離キモシンポリペプチド変異体が、以下:
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N、
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q、
Y21S + R61S + H146R、
R61S + G163E + M256L + S277N、
D59N + S271P + T284S、
V248I + S226T + E294Q、
S74F + G244D + S271P、
V221K + V248I + S255Y、
V183I + G251W + M256L、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
D98V + G251D + M256L + V259I、
V183I + V248I + G244D + T284S、
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D、
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L、
H146R + D158S + S273Y、
S74F + V259I + Y268F、
G70N + D98V + V136I、
I96L + M142I + R145Q + H146R、
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K、
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F、
S132A + Q188E + F223V、
I200V + G251D + G289S、
N50K + D158S + V203A + E294Q、
F223V + G251W + S273Y + D279E、
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S、
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L、
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A、
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T、
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P、
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q、
V32L + N100Q + N291Q、
N292H + N100Q + N291Q、
V221K + N100Q + N291Q、
I297A + N100Q + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N、
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H、
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H、
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q、
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q、
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q、
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L、 
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q、
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q及び/又は
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231、
に対応する位置を含む1つ又はそれ以上の位置の組み合わせの改変を含む、単離キモシンポリペプチド変異体。
【０１１０】
項目15.
食品又は飼料製品の製造方法であって、項目9〜14の何れか1項目に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の有効量を食品又は飼料製品に加えること、及び食品又は飼料製品を得るためにさらなる製造工程を実施することを含む、食品又は飼料製品の製造方法。
【０１１１】
項目16.
請求項15に記載の方法であって、食品又は飼料製品が乳製品である、方法。
【０１１２】
項目17.
チーズを製造する方法における項目9〜12の何れか1項目に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【０１１３】
項目18.
パスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ製造工程における項目9〜14の何れか1項目に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【０１１４】
項目19.
ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズ製造工程における項目9〜14の何れか1項目に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【０１１５】
本発明のさらに関連した態様は、単離キモシンポリペプチド変異体の有効量を食品又は飼料製品に加えること、及び食品又は飼料製品、特に食品又は飼料製品が乳製品である、を得るためにさらなる製造工程を実施することを含む食品又は飼料製品の製造方法に関係する。
【０１１６】
本明細書に記載されたキモシンポリペプチド変異体の、チーズを製造する方法における使用も、本発明に含まれる。より詳細には、パスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズの製造方法における、その対応する親ペプチドより低いαS1-カゼイン切断頻度を有するキモシンポリペプチド変異体の使用、及び/又は、ソフトチーズ、ホワイトブラインチーズ及び長期熟成ゴーダチーズの製造方法における、その対応する親ペプチドより高いαS1-カゼイン切断頻度を有するキモシンポリペプチド変異体の使用、である。
【０１１７】
定義
本明細書に関連する用語の全ての定義は、本明細書に関連する技術的内容に関連して当業者によって理解され得るものに従う。
【０１１８】
用語「αS1-切断」又は「αS1-カゼインの切断」は、αS1-カゼインの任意の酵素的切断を意味する。例えば、αS1-(1-23)ペプチドの形成において得られる、例えばPhe23とPhe24の間の切断等である。
【０１１９】
一態様において、αS1-切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンとインキュベートすることによって得られるαS1-切断ペプチド1-23を定量することによって決定され、ここで、定量化は、ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCによって実行される。αS1-カゼイン切断を決定する好ましい方法の詳細は、実施例に記載されている。
【０１２０】
用語「キモシン」は、EC 3.4.23.4クラスの酵素に関連する。キモシンは、高い特異性を有し、主にカゼインのκ-鎖中の単一の104-Ser-Phe-|-Met-Ala-107の切断により乳を凝固させる。副活性として、キモシンはまた、主にPhe23とPhe24との間でα-カゼインを切断する(参考文献2、3)。得られたペプチドαS1(1-23)は、熟成チーズに加えられた微生物由来のプロテアーゼによってさらに分解され得る(参考文献4)。当該分野で使用されるキモシンの別の名称はレンニン（rennin）である。
【０１２１】
用語「キモシン活性」は、本明細書において当業者によって理解されるキモシン酵素のキモシン活性に関する。当業者は、本明細書において関連するキモシン活性を決定する方法を熟知している。
【０１２２】
用語「特異的凝固活性」は、キモシンポリペプチドの凝乳活性を表し、当該技術分野で周知のアッセイに従って決定され得る。タンパク質のIMCU/mgの観点から特定の凝固活性を決定するために好ましい方法は、段階を含む国際酪農連盟(IDF法)によって開発された標準的な方法であり、ここで、凝乳活性は、乳基質の目に見える凝固に必要な時間から決定され、サンプルの凝固時間は、既知の凝乳活性を有する参照標準のものと比較され、サンプルと同じIDF標準110Bによる同じ酵素組成と比較される。サンプル及び参照標準は、同一の科学的及び物理的条件下で測定される。IDF方法の詳細は、実施例に記載される。
【０１２３】
当該技術分野で知られているように、本明細書で関連する、いわゆるC/P値は、特異的な凝固活性(C)をタンパク質分解活性(P)で割ることによって決定される。当該技術分野で知られているように、より高いC/P値は、一般に、例えば、チーズ製造中の非特異的なタンパク質分解に起因するタンパク質の損失が低減することを意味し、すなわち、チーズの収率が改善される。C/P値の差異はパーセンテージで定義され得る。例として、20のC/P値は、40のC/P値の50％に対応し得る。
【０１２４】
用語「単離変異体」は、ヒトの行為によって改変された変異体を意味する。一態様において、変異体は、SDS PAGEにより決定される少なくとも1％の純度、例えば少なくとも5%の純度、少なくとも10%の純度、少なくとも20%の純度、少なくとも40%の純度、少なくとも60%の純度、少なくとも80%の純度及び少なくとも90%の純度、である。
【０１２５】
本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドの番号付けで行われる。本出願で提供される配列表において：
配列番号1は、ウシプレ-プロキモシンの完全ポリペプチド配列を表し;
配列番号2は、ラクダプレ-プロキモシンの完全ポリペプチド配列を表し;
配列番号3は、成熟ウシキモシンのポリペプチド配列を表し;
配列番号4は、成熟ラクダキモシンのポリペプチド配列を表す。
【０１２６】
言い換えると、配列番号3及び4は、配列番号1及び2の59〜381アミノ酸にそれぞれ対応する。本明細書において同定された特定の置換の全ては、成熟キモシン配列の位置に関連して、すなわち、配列番号3又は4のアミノ酸番号付けに関連して同定される。位置が、配列番号1又は2のアミノ酸番号付けを基準として特定される限り、配列番号1又は2の位置を同定するために、58残基を付加しなければならない。
【０１２７】
用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳及び任意の翻訳後修飾（例えば、N末端プロセッシング、C末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化等）を経た後の最終形態のペプチドを意味する。本明細書において、本発明に関連し得る成熟キモシンポリペプチドは、活性化キモシンポリペプチド配列、すなわち、プレ部分及び/又はプロ部分配列を含まない配列と理解してもよい。本明細書中で、成熟ポリペプチドに関連する例は、例えば、配列番号1の59アミノ酸位置〜381アミノ酸位置由来である配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチド、配列番号2の59アミノ酸位置〜381アミノ酸位置由来である配列番号2(ラクダキモシン)である。
【０１２８】
用語「親」又は「キモシン活性を有する親ポリペプチド」は、本発明の酵素変異体を生産するために改変がなされたポリペプチドを意味する。該親は、その自然発生する(野生型)ポリペプチド又は変異体であり得る。
【０１２９】
用語「配列同一性」は、2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間の関連性に関する。本発明の目的のために、EMBOSSパッケージのNeedleプログラムで実装されているように(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降で、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を用いて決定され得る。使用されるオプションのパラメータは、ギャップオープンペナルティー10、ギャップエクステンションペナルティー0.5、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされた針の出力（nobriefオプションを使用して取得）は、パーセント同一性として使用され、次のように計算される:
(同一の残基×100)/(アライメントの長さ−アライメントにおけるギャップの総数)
【０１３０】
本発明の目的のために、EMBOSSパッケージのNeedleプログラムで実装されているように(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)、好ましくはバージョン3.0.0又はそれ以降で、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, supra)を用いて決定され得る。使用されるオプションのパラメータは、ギャップオープンペナルティー10、ギャップエクステンションペナルティー0.5、及びEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされた針の出力（nobriefオプションを使用して取得）は、パーセント同一性として使用され、次のように計算される:
(同一のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アライメントの長さ−アライメントにおけるギャップの総数)
【０１３１】
用語「変異体」は、1つ又はそれ以上の（いくつかの）位置に改変、すなわち置換、挿入及び/又は欠失を含む、キモシン活性を有するペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味し、欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し、挿入は、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して1〜3個のアミノ酸を付加することを意味する。
【０１３２】
該アミノ酸は天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。例えば、D-アラニンの特にD-異性体(又はD-体)による置換が、理論的に可能であり得る。
【０１３３】
用語「野生型」ペプチドは、天然に存在するヌクレオチド配列又はペプチド配列、すなわちヒトの行為によって標的突然変異を受けていないヌクレオチド配列又はペプチド配列を指す。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】αS1-カゼイン結合モデルを用いたラクダキモシン(PDB: 4AA9)の３D構造を青色で示す。αS1-カゼインは、残基23と24との間の切断しやすい結合を有するキモシン基質結合間隙に設置される。ラクダキモシン残基R266、V51、E83、I263、L253、L105、I96及びL180を緑でハイライトした。
【図２】αS1-カゼイン結合モデルを用いたラクダキモシン(PDB: 4AA9)の３D構造を青色で示す。αS1-カゼインは、残基23と24との間の切断しやすい結合を有するキモシン基質結合間隙に設置される。ラクダキモシン残基V32、H76、F119、L130、S132、Y190、V221、R242、S273、G289、N292、L295及びI297を緑でハイライトした。
【図３】ラクダキモシン(詳細、PDB: 4AA9)の３D構造。N末端タンパク質の残基Y11、L12及びD13並びに潜在的なY11相互作用パートナーD290を紫色でハイライトした。
【実施例】
【０１３５】
実施例1: キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアライメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、EBI(EBI, tools, multiple sequence alignment, CLUSTALW”, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)によって提供され、「Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948.」に記述されたClustalWアルゴリズムを用いてアラインした。
【０１３６】
マルチプル配列アライメントのためのClustalW2セッティングは、タンパク質重量マトリックス = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION= 0,05, GAP DISTANC-ES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ、である。
【０１３７】
参照配列としてウシキモシンBプレプロキモシンを使用し(Genbank accession number P00794 - 本明細書中で配列番号1として記載される)、ここで、N末端メチオニンは、番号1(MRCL……)を有し、C末端のイソロイシン(タンパク質配列において、…LAKAI)は、番号381を有する。
【０１３８】
実施例2: キモシン変異体の設計
キモシン変異体を異なる戦略を用い設計した。
【０１３９】
ラクダキモシンと呼ばれる場合、本明細書の配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンを指す。配列番号2のラクダキモシンは、そのラクダキモシン変異体を作製するために使用されるキモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドとしてみなされ得る。
【０１４０】
ウシキモシンと呼ばれる場合、本明細書の配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンを指す。配列番号1のウシキモシンは、そのウシキモシン変異体を作製するために使用されるキモシン活性を有する本明細書に関連する親ポリペプチドとしてみなされ得る。
【０１４１】
ラクダキモシンの変異体1〜269及び367〜461は、ウシキモシンBと比較して25％以上の同一性を有する公知のアスパラギン酸プロテアーゼ配列のラージセットのアライメント(alignment of a large set )に基づいて設計した。
【０１４２】
変異は、一般に種間のアミノ酸変異のレベルが高い領域に導入されたが、保存領域は変更されなかった。アルファカゼイン切断に有益な効果を示す可能性が高い変異を同定するために、系統学的、構造的及び実験的情報に基づいてアミノ酸置換を選択した。種々の置換の間の共変動の影響を最小限に抑えるために、各変異体構築物に複数の変異体を導入して、各単一の変異体が複数の変異体構築物に存在することを確実にした。実験データの機械学習及び統計解析を用いて、キモシン変異体の測定された凝固剤性能に対するアミノ酸置換の相対的寄与を決定した（参考文献14、15）。
【０１４３】
変異体270〜366を、ウシキモシン（PDBコード：4AA8）及びラクダキモシン（PDBコード：4AA9）の詳細構造解析に基づいて設計した。変異を、それぞれのアミノ酸側鎖の化学的性質、及びカゼイン基質結合又は一般的酵素特性のいずれかに対する予想される影響に基づいて選択した。変異体270〜346のアミノ酸置換の大部分は、基質結合間隙の内部若しくは近くに、又は結合したカゼイン基質と接触する二次構造要素に近接してのどちらかの配列位置に作られた。さらに、これらの領域（参考文献5）の電荷プロフィールを変えるタンパク質表面上の位置に変異が生じ、したがって酵素性能に影響を及ぼすことが期待される。変異体347〜366は、ウシ及びラクダのキモシンにおけるN末端配列の異なる構造的コンフォメーションに基づいて作製された。アミノ酸置換は、ラクダキモシン中のN末端と相互作用する基質結合間隙内の位置でなされた。
【０１４４】
実施例3: キモシン変異体酵素材料の調製
全てのキモシン変異体は、合成遺伝子として合成され、真菌発現ベクター、例えば、pGAMpR-C (WO02/36752A2に記載)等にクローニングされた。
【０１４５】
ベクターを大腸菌に形質転換し、プラスミドDNAを、当業者に公知の標準的な分子生物学プロトコールを用いて精製した。改変体プラスミドを個々にAspergillus niger又はAspergillus nidulans菌株に形質転換し、本質的にWO02/36752A2に記載されているようにタンパク質を生成し、標準的なクロマトグラフィー技術を用いて精製した。
【０１４６】
当該技術分野で知られているように、当業者は、共通の一般知識に基づき、本明細書に記載のウシ及びラクダキモシン変異体等のキモシン及びキモシン変異体を産生及び精製することができる。
【０１４７】
実施例4: 特定のキモシン活性の決定
4.1  凝乳活性の決定
凝乳活性を、国際酪農連盟（IDF法）によって開発された標準的方法であるREMCAT法を用いて決定した。凝乳活性は、0.5g/リットル（pH≒6.5）の塩化カルシウム溶液を用いて低温低脂肪粉乳から調製した標準乳基質の目に見える凝固のために必要な時間から決定される。レンネットサンプルの凝固時間を、既知の乳凝固活性を有し、サンプルと同じIDF標準110Bによって同じ酵素組成を有する参照標準の凝固時間と比較する。サンプル及び参照標準は、同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体サンプルを、84mM酢酸緩衝液pH5.5を用いて約3IMCU/mlに調整した。その後、水浴中に置かれたガラス試験管中の予熱した乳（32℃）10mlに200μlの酵素調製物を添加し、一定の攪拌下で32℃±1℃の一定温度を維持し得た。あるいは、20μLの酵素調製物を上記のように1mLの予熱した乳に加えた。
【０１４８】
レンネットの全凝乳活性（強度）を、国際凝乳単位（IMCU）において、式に従って試料と同じ酵素組成を有する標準と比較して1mlあたりで計算した。
IMCU/ml中の強度 = 標準 × T標準 × Dサンプル
D標準 × Tサンプル
標準：レンネットの国際基準標準の凝乳活性。
T標準：標準希釈で得られた凝固時間（秒）。
Dサンプル：サンプルの希釈係数
D標準：標準の希釈係数
Tサンプル：希釈したレンネットサンプルの酵素の添加から凝固時間までに得られた凝固時間（秒）
【０１４９】
マルチ置換ライブラリー1、3、4及び6並びに変異体270〜366の凝固活性の決定のために、REMCAT法の代わりにμIMCU法を用いた。REMCATと比較して、μIMCUアッセイにおけるキモシン変異体の凝固時間を、UV/VISプレートリーダーで、800nmの96ウェルマイクロタイタープレートでのOD測定によって決定した。既知の凝固強度を有する参照標準の種々の希釈の標準曲線を、各プレートに記録した。サンプルを、84mM酢酸緩衝液、0.1％トリトンX-100、pH5.5中で酵素を希釈することによって調製した。32℃の反応を、4％（w/w）の低温、低脂肪粉乳及び7.5％（w/w）塩化カルシウム（pH≒6.5）を含有する標準乳基質250μLを25μL酵素サンプルに加えることによって開始した。ml当たりの国際凝乳単位（IMCU）におけるキモシン変異体の凝乳活性を、標準曲線に対するサンプル凝固時間に基づいて決定した。
【０１５０】
4.2  総タンパク質含量の決定
サーモサイエンティフィック社のPierce BCA Protein Assay Kitを使用して、製造元の指示に従って総タンパク質含量を決定した。
【０１５１】
4.3  特定の凝固活性の計算
凝固活性（IMCU/ml）を、全タンパク質含有量（mg総タンパク質/ml）で割ることにより、特定の凝固活性（IMCU/mg総タンパク質）を決定した。
【０１５２】
実施例5  αS1-カゼイン切断の決定
αS1-カゼイン加水分解活性の決定
乳タンパク質のキモシン媒介タンパク質分解を、pH4.6で抽出された水溶性ペプチドのプロファイルを決定することによって特徴付けた。96ウェルプレートで作製した無培養チーズモデルを研究に使用した。手短に言えば、デンマークOllingegardのスキムミルク750μlにグルコノデルタラクトン（GDL）を添加し、塩化カルシウムを96ディープウェルプレートのウェルに等分した。乳にGDLを添加してから10分後、キモシンの変異体をプレートの個々のウェルに0.05μMU/ mlの最終活性まで加えた。形成された凝塊を、凝塊をピペットチップで完全に撹拌することによってレンネットを添加してから30分後に切断した; 各ウェルに新しいチップを使用した。続いて、プレートを更に60分間静置した後、カード及びホエイを、2500gで10分間遠心分離することにより分離した。乳はレンネッティング、切断及び脱水の間、30℃に保たれた。最後に、ホエイをプレートからデカントし、プレートに残ったレンネットカードのペレットを室温で4日間保存した。各ウェルに500μlの0.5Mクエン酸三ナトリウムを添加し、プレートを37℃で24時間穏やかに振盪することによって、ペプチドを抽出した。次に完全に溶解したレンネットカードを、塩酸を加えることによって最終pH4.4-4.5にして沈殿させた。プレートを、遠心分離機でスピンダウンし、上清を回収しpH4.5の可溶性ペプチドをさらに解析した。
【０１５３】
ESI-Q-TOF質量分析計に連結されたRP-HPLCを使用して、pH4.5の可溶性ペプチドのプロファイルを決定した。解析を、質量分析計(G6540A Q-TOF, Agilent Technologies A/S, Santa Clara, California, USA)に連結された液体クロマトグラフィー(Agilent 1290 infinity, Agilent Technologies A/S, Santa Clara, California, USA)を用いて行った。LCシステムのカラムは、Ascentis Express Peptide ES-C18m、2.7μm、100x2.1mm(Supelco, Sigma-Aldrich, St. Lou-is, USA)であった。移動相は、溶離剤A（水中0.1％ギ酸）及び溶離剤B（Ace-ニトリル：水中0.1％ギ酸、9：1）からなる。2％Bでカラムを平衡化した後、10μLのサンプル容量を注入した。溶離液Bを15カラム容量で2％から50％まで増加させることによって生成された勾配溶出によって、ペプチドを分離した。流速は0.44mL/分であった。214nmでのUV吸光度を連続的に測定することにより、ペプチドを検出した。100から2000m/zのMSスキャンを実行することにより、質量スペクトルを回収した。MS/MS分析を、各スキャンからの2つの最も強いイオンについて実施した。解析された全てのサンプルの等量からなる混合サンプルを調製し、このサンプルを各12サンプルについて解析した。MSデータを、Agilent .dフォーマットからMSConvert ver. 3.0.6618を使用して.mzmlファイルに変換した。それ以降のデータ解析はすべてR 3.1.3を使用して行った。Rパッケージ「MSGFplus」バージョン1.05を用いて、MS/MSスペクトルからペプチドを同定した。ペプチド同定のための検索データベースは、ウシ乳タンパク質に限定されていた： αS1-カゼイン、αS1-カゼイン、β-カゼイン、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトグロブリン、ラクトペルオキシダーゼ及びラクトフェリン。セリンのリン酸化及びメチオニンの酸化は、様々な修飾として含まれていた。Rパッケージ「xcms」v.1.42.0を、「Smith et al. (2006)」に従い、サンプルセット中のサンプルにわたるピークの検出及びグループ化に使用した。Massifquant法をピーク検出に用い、ピークのグループ化を密度法に基づいて行った。同一性は、αS1-カゼイン(1-23)を含むヤク200の同定されたペプチドの定量表で得られたグループ化されたピークに割り当てられる。
【０１５４】
αS1-カゼイン切断に対する位置及び変異効果の統計解析
統計的機械学習アプローチ及びPCAに基づく解析を使用して、アミノ酸Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に対するマルチ置換ライブラリー1〜3、4、5、6、及び7の変異体に存在する全ての単一変異の影響を決定した。
【０１５５】
結果
マルチ置換ライブラリー1
野生型と比較してマルチ置換を各自有するラクダキモシンの変異体を、上記のように作製し解析した。全ての変異体は、ラクダキモシン（配列番号2）と同一のアミノ酸配列を有し、表に記載されている変形例は除外されている。ウシとラクダの両方のキモシンを参考として含む。
【０１５６】
凝固活性を、μIMCU方法を用いて決定した。
【０１５７】
表1: ラクダキモシン変異体1-95によるアミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値を、野生型ラクダキモシンの％切断で示す（CHY-MAX M）。
【表２−１】
2018525996.tif 000004
【表２−２】
2018525996.tif 000005
【表２−３】
2018525996.tif 000006
【０１５８】
表1は、ラクダキモシン変異体とPhe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に関するデータを表す。実験において0.05 IMCU/mLの標準化された濃度で全ての酵素変異体が使用されたため、減少したαS1-カゼイン切断は、減少した一般的な酵素活性より、Phe23とPhe24との間のαS1カゼインの切断に対するPhe105とMet106との間のαS1-カゼインの切断に対する各変異体の特異性の増加を示す。逆に、αS1-カゼイン切断の増加は、増加した一般的な酵素活性よりも、Phe23とPhe24の間のαS1カゼインの切断に対するPhe105とMet106との間のαS1-カゼインの切断に対する各変異体の特異性の増加を示す。
【０１５９】
マルチ置換ライブラリー2
野生型と比較して複数の置換を各自有するもう1組のラクダキモシン変異体を作製し、記載の通りに解析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシとラクダの両方のキモシンを参照した。REMCAT法を用いて凝固活性を決定した。
【０１６０】
表2: ラクダキモシン変異体96-143による、アミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値を、野生型ラクダキモシンの％切断で示す（CHY-MAX M）。
【表３−１】
2018525996.tif 000007
【表３−２】
2018525996.tif 000008
【０１６１】
表2に、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に関するデータとラクダキモシン変異体を示す。実験では全ての酵素変異体を0.05 IMCU/mLの標準化濃度で使用したため、減少したαS1-カゼイン切断は、減少した一般的な酵素活性よりもむしろPhe23とPhe24との間のαS1カゼインの切断に対するPhe105とMet106との間のαS1-カゼインの切断に対する各変異体の特異性の増加を示す。逆にαS1-カゼイン切断の増加は、増加した一般的酵素活性ではなく、Phe23とPhe24間のαS1-カゼインの切断に対するPhe105とMet106との間のαS1-カゼインの切断に対する各変異体の特異性の低下を示す。
【０１６２】
マルチ置換ライブラリー3
野生型と比較してそれぞれ複数の置換を有する第3の組のラクダキモシン変異体を作製し、記述したように解析した。全ての変異体は、表に記載された変異体を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシとラクダの両方のキモシンを参照した。凝固活性を、μIMCU法を用いて決定した。
【０１６３】
表3: ラクダキモシン変異体144-179による、アミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値は、野生型ラクダキモシンの％切断で示される（CHY-MAX M）。
【表４】
2018525996.tif 000009
【０１６４】
表3には、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に関するデータとラクダキモシン変異体を示す。実験では全ての酵素変異体を0.05 IMCU/mLの標準化濃度で使用したため、減少したαS1-カゼイン切断は、減少した一般的な酵素活性よりもむしろPhe23とPhe24との間のαS1カゼインの切断に対するPhe105とMet106との間のαS1-カゼインの切断に対する各変異体の特異性の増加を示す。逆にαS1-カゼイン切断の増加は、増加した一般的酵素活性ではなく、Phe23とPhe24間のαS1-カゼインの切断に対するPhe105とMet106との間のαS1-カゼインの切断に対する各変異体の特異性の低下を示す。
【０１６５】
マルチ置換ライブラリー1〜3の突然変異解析
ライブラリー1〜3のタンパク質分解データに基づき、αS1-カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計解析を行った。減少したαS1-カゼイン切断の最も有益な突然変異を表4に示す。
【０１６６】
表4: 統計解析に基づいたαS1カゼイン切断の減少及び標準偏差（sd）に対する突然変異の貢献（平均）。
【表５】
2018525996.tif 000010
【０１６７】
得られた結果に基づき、表4に示される突然変異が、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に対する阻害効果を示すことを結論付けた。表4に示す突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のための、キモシン変異体における好ましい突然変異を表す。産業的に関連性のある例には、最適化されたスライス及び細断工程のためにカードの硬度が改善されたパスタフィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズを含む。
【０１６８】
Phe23とPhe24間のαS1-カゼイン切断に最も強い阻害作用を有する8つの突然変異（R266V、V51L、E83S、I263L、L253I、L105E、I96L、L180I）は、ラクダキモシンの基質結合間隙から離れている(図1)。したがって、αS1-カゼイン切断に対するこれら変異の間接的な影響を結論付けることができる。
【０１６９】
増加したαS1-カゼイン切断の最も有益な突然変異を表5に示す。
【０１７０】
表5: 統計解析に基づく、増加したαS1-カゼイン切断及び標準偏差(sd)に対する突然変異の貢献(平均)。
【表６】
2018525996.tif 000011
【０１７１】
得られた結果に基づき、表5に示される突然変異は、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインのより高い切断を引き起こすと結論づけられる。表5に示される突然変異は、αS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のため、キモシン変異体における好ましい変異を表す。工業的に関連する例には、ソフトチーズ及びホワイトブラインチーズを含む。
【０１７２】
Phe23とPhe24の間のαS1カゼイン切断の増加に最も大きな影響を与える5つの突然変異のうち4つは、ラクダのキモシン（V221K、F223V、V32L、L295K; 図2）の結合間隙に位置し、したがって、チーズ熟成中のαS1-カゼイン結合に直接的な影響を有し得る。これら3つの突然変異(V221K、F223V、V32L)は、それぞれの位置にウシキモシン(CHY-MAX)のアミノ酸を導入し、それはラクダキモシン(CHY-MAX M; 表1〜3)と比較して、Phe23とPhe24との間の増加したαS1-カゼインの切断を示す。
【０１７３】
マルチ置換ライブラリー4
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するもう1組のラクダキモシン変異体を作製し、上記のように解析した。全ての変異体は、表に記載した変異体を除き、ラクダキモシン(配列番号2)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY-MAX M)は、参照として含まれる。
【０１７４】
凝固活性を、μIMCU法を用いて決定した。
【０１７５】
表6: ラクダキモシン変異体179〜222によるアミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N-末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値を、野生型ラクダキモシンの切断%で示す（CHY-MAX M）。
【表７】
2018525996.tif 000012
【０１７６】
表6に、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に関するデータとラクダキモシン変異体を示す。全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して11％〜65％の低下したタンパク質分解活性を示す。
【０１７７】
マルチ置換ライブラリー4の突然変異解析
ライブラリー4変異体のタンパク質分解データに基づき、αS1-カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計解析を行った。αS1-カゼイン切断の増加又は減少に対する最も有益な突然変異を表7に示す。
【０１７８】
表7: 統計解析に基づく改変αS1-カゼイン切断及び標準偏差（sd）に対する突然変異の貢献（平均）。正の平均値は、減少したαS1-カゼイン切断を表す。負の平均値は、αS1-カゼイン切断の増加を表す。
【表８】
2018525996.tif 000013
【０１７９】
表7に示す結果に基づき、突然変異K19T、H76Q、I96L、S164G、L166V、L222I及びR242Eは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を減少させることを結論付けた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のため、キモシン変異体の好ましい突然変異を表す。突然変異Y21S、D59N及びS132Aは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を増加させる。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のためのキモシン変異体において好ましい変異変異を表す。
【０１８０】
マルチ置換ライブラリー5
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するもう1組のラクダキモシン変異体を作製し、上記のように解析した。全ての変異体は、表に記載した変異体を除き、ラクダキモシン(配列番号2)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY-MAX M)は、参照として含まれる。
【０１８１】
凝固活性を、REMCAT法を用いて決定した。
【０１８２】
表8：ラクダキモシン変異体223-269による、アミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N-末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値を、野生型ラクダキモシンの切断%で示す（CHY-MAX M）。
【表９】
2018525996.tif 000014
【０１８３】
表8に、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に関するデータとラクダキモシン変異体を示す。47のライブラリー変異体のうち、野生型ラクダキモシンと比較して、44が11％〜60％のタンパク質分解活性を示した。
【０１８４】
マルチ置換ライブラリー5の突然変異解析
ライブラリー5変異体のタンパク質分解データに基づき、αS1-カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計解析を行った。αS1-カゼイン切断の増加又は減少に対する最も有益な突然変異を表9に示す。
【０１８５】
表9: 統計解析に基づく改変αS1-カゼイン切断及び標準偏差（sd）に対する突然変異の貢献（平均）。正の平均値は、減少したαS1-カゼイン切断を表す。負の平均値は、αS1-カゼイン切断の増加を表す。
【表１０】
2018525996.tif 000015
【０１８６】
表9に示す結果に基づき、突然変異Y11I、Y11V、K19S、H76Q、I96L、S164G、S164N、L166V、L222I、L222V、R242E、I263L及びS273Yは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を減少させる。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、
熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。突然変異L253V及びG251Dは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を増加させる。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のためのキモシン変異体における好ましい変異を表す。
【０１８７】
ラクダキモシンにおける構造に基づく変異
ラクダキモシンの変異体（配列番号2）を、タンパク質構造解析（表10）によって決定された位置におけるアミノ酸変化を用いて作製した。突然変異N100Q及びN291Qをこれらの変異体のN-グリコシル化部位及び参照ラクダキモシン（CamUGly）の両方に導入して非グリコシル化、均質のタンパク質サンプルを得た。
【０１８８】
凝固活性を、μIMCU法を用いて決定した。
【０１８９】
表10: ラクダキモシン変異体270-308によるアミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値を、野生型ラクダキモシン（CamUGly）の切断％で示す。
【表１１】
2018525996.tif 000016
【０１９０】
表10に示した結果に基づき、突然変異K19T、H76Q、F119Y、Y190A、R242E、R242Q、S273Y、及びG289Sは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を10％以上減少させると結論付けた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のための、キモシン変異体における好ましい突然変異を表す。V32L、L130I、S132A、V221K、N292H、L295K及びI297Aは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を少なくとも10％増加させた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のため、キモシン変異体における好ましい変異を表す。減少及び増加したαS1-カゼイン切断それぞれに対する突然変異H76Q、S273Y、R242E及びV32L、S132A、V221K、L295Kの類似の効果を、マルチ置換ライブラリー1〜6の突然変異解析によって決定した（表5、7、9）。
【０１９１】
基質結合間隙の内部又は構造的に近接(図2)して突然変異(H76Q、F119Y、Y190A、R242E、R242Q、S273Y、G289S、V32L、L130I、S132A、V221K、N292H、L295K、I297A)を有するPhe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を10%以上の減少又は増加を示す、表10の15の変異体のうち14は、β-カゼイン結合に対するこれらの突然変異の直接的な影響を示唆している。
【０１９２】
ウシキモシンの構造に基づく変異
ウシキモシンの変異体（配列番号1）を、タンパク質構造解析（表11）によって決定された位置におけるアミノ酸変化を用い作製した。突然変異N252Q及びN291Qを、これらの変異体のN-グリコシル化部位及び参照ウシキモシン（BovUGly）の両方に導入して、非グリコシル化、均質なタンパク質サンプルを得た。
【０１９３】
凝固活性を、μIMCU法を用いて決定した。
【０１９４】
表11: ウシキモシン変異体326-346によるアミノ酸Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断（N末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値は、野生型ウシキモシン（BovUGly）の切断％で示される。
【表１２】
2018525996.tif 000017
【０１９５】
突然変異K71E、V113F及びA117は、表11に示すように、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を10％以上減少させた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のため、キモシン変異体の好ましい突然変異を表す。突然変異Q83T及びE133Sは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を、少なくとも10％増加させた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のため、キモシン変異体における好ましい変異を表す。
【０１９６】
ラクダキモシンN末端の変異
基質結合間隙内のN-末端配列Y11-D13の分子相互作用のタンパク質構造解析により決定された位置におけるアミノ酸変化を用いて、ラクダキモシンの変異体（配列番号2）を作製した（表12）。突然変異N100Q及びN291Qをこれらの変異体のN-グリコシル化部位及び参照ラクダキモシン（CamUGly）の両方に導入して非グリコシル化、均質なタンパク質サンプルを得た。
【０１９７】
凝固活性を、μIMCU法を用いて決定した。
【０１９８】
表12: ラクダキモシン変異体347-366によるアミノ酸Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断（N末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値は、野生型ラクダキモシン（CamUGly）の切断％で示される。
【表１３】
2018525996.tif 000018
【０１９９】
ラクダキモシン構造の解析は、Y11の潜在的相互作用パートナーであるD290並びにN末端配列Y11-D13の変異をガイドした（図3）。カゼイン基質は結合間隙内で結合するためにN末端キモシン配列と競合するため、結合間隙とモチーフY11-D13との間の相互作用を変化させるアミノ酸置換は、様々なカゼイン基質、したがってαS1-カゼイン切断に対する酵素活性に影響を与えることが予想される。突然変異Y11I及びY11V並びにY11R及びD290Eの組合せは、表12に示すように、Phe23とPhe24間とのαS1-カゼインの切断を10％以上減少させた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のための、キモシン変異体における好ましい突然変異を表す。Y11R（変異体349、表12）もD290E（変異体272、表10）もαS1-カゼイン単独の切断に有意な影響を示さないため、変異体351の改変されたタンパク質分解活性は、両突然変異の相乗効果によって引き起こされる可能性が最も高い。
【０２００】
突然変異L12M、D13N、D13S、D13T及びD13Vは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を少なくとも10％増加させた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のため、キモシン変異体における好ましい変異を表す。
【０２０１】
マルチ置換ライブラリー6
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するもう1組のラクダキモシン変異体を作製し、上記のように解析した。全ての変異体は、表に記載した変異体を除き、ラクダキモシン(配列番号2)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY-MAX M)は、参照として含まれる。
【０２０２】
凝固活性を、μIMCU法を用いて決定した。
【０２０３】
表13：ラクダキモシン変異体367-416による、アミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N-末端ペプチドαS1Nを生じる）。数値を、野生型ラクダキモシンの切断%で示す（CHY-MAX M）。
【表１４−１】
2018525996.tif 000019
【表１４−２】
2018525996.tif 000020
【０２０４】
表13に、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に関するデータとラクダキモシン変異体を示す。50のライブラリー変異体のうち、10は野生型ラクダキモシンと比較して12％〜48％のタンパク質分解活性の低下を示す。他の18の変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して11％〜48％のタンパク質分解活性の増加を示す。
【０２０５】
マルチ置換ライブラリー6の突然変異解析
ライブラリー6変異体のタンパク質分解データに基づき、αS1-カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計解析を行った。増加又は減少したαS1-カゼイン切断の最も有益な突然変異を表14に示す。
【０２０６】
表14: 統計解析に基づく改変αS1-カゼイン切断及び標準偏差（sd）に対する突然変異の貢献（平均）。正の平均値は、減少したαS1-カゼイン切断を表す。負の平均値は、αS1-カゼイン切断の増加を表す。
【表１５】
2018525996.tif 000021
【０２０７】
表14に示した結果に基づき、突然変異Y11V、R242E、G70D、R67Q、及びL222Iは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの開裂切断を減少させることが結論付けられる。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のためのキモシン変異体の好ましい突然変異を表す。突然変異N100Q、N291Q、V32L、L130I、V136I、K231N、V248I、及びM256Lは、Phe23とPhe24との間のαS1カゼインの切断を増加させる。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を増加させるため、熟成中のチーズカードのより軟化を必要とするチーズ製造工程のため、キモシン変異体における好ましい変異を表す。
【０２０８】
マルチ置換ライブラリー7
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するもう1組のラクダキモシン変異体を作製し、上記のように解析した。全ての変異体は、表に記載した変異体を除き、ラクダキモシン(配列番号2)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY-MAX M)は、参照として含まれる。
【０２０９】
凝固活性を、REMCAT法を用いて決定した。
【０２１０】
表15：ラクダキモシン変異体417-461による、アミノ酸Phe23とPhe24の間のαS1-カゼインの切断（N-末端ペプチドαS1Nを生じる）、並びに特定の凝固活性(C)、一般的タンパク質分解活性(P)及びC/P値。数値を、野生型ラクダキモシンの切断%で示す（CHY-MAX M）。
【表１６】
2018525996.tif 000022
【０２１１】
表15に、アミノ酸Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断に対するラクダキモシン変異体のデータ、並びに特定の凝固活性(C)、一般的タンパク質分解活性(P)及びC/P値を示す。全ての変異体は、33%〜82%の間の減少したαS1-カゼイン切断を示す。
【０２１２】
マルチ置換ライブラリー7の突然変異解析
αS1-カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計解析を、ライブラリー7変異体のタンパク質分解データに基づき、実行した。減少したαS1-カゼイン切断の最も有益な突然変異を、表16に示す。
【０２１３】
表16: 統計解析に基づく改変αS1-カゼイン切断及び標準偏差（sd）に対する突然変異の貢献（平均）。正の平均値は、減少したαS1-カゼイン切断を表す。負の平均値は、αS1-カゼイン切断の増加を表す。
【表１７】
2018525996.tif 000023
【０２１４】
表16に示した結果に基づき、突然変異I96L、L166V、R242E、Y11I、L222I、L222V、S164G、L166I、L253I、及びY11Vは、Phe23とPhe24との間のαS1-カゼインの切断を減少させることを結論付けた。これらの突然変異はαS1（1-23）の生成を減少させるため、熟成中のチーズカードの軟化をより少なくする必要があるチーズ製造工程のため、キモシン変異体の好ましい突然変異を表す。
【０２１５】
参考文献
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【図１】
2018525996.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018525996.tif 000028
2018525996.tif 000029
2018525996.tif 000030
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