(57)【要約】本開示は、迅速かつ効率的な植物形質転換のための方法および組成物に関する。本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。この要約は、特定の分野を検索するためのスキャニングツールであって、本開示を限定することを意図するものではない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で前記（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項２】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）それらの組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；または前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされ；
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；または前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。
【請求項３】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＷＵＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＯＤＰ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）それらの組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記ＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含むか；または前記ＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされ；
前記ＯＤＰ２ポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列を含むか；または前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７および２１のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。
【請求項４】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で前記（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項５】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で前記（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項６】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で前記（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項７】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で前記（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；
（ｃ）前記（ｂ）の再生可能な植物構造体を発芽させて、約１４日〜約６０日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項８】
トランスジェニック植物の生産方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；
（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されず、かつ前記再生可能な植物構造体は前記細胞の形質転換から約０〜７日以内または約０〜１４日以内に形成される）工程と；
（ｃ）前記（ｂ）の再生可能な植物構造体を発芽させて、前記細胞の形質転換から約１４日〜約６０日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項９】
前記発現コンストラクトは、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む請求項１〜３および６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現コンストラクトは、前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む請求項１〜４および６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現コンストラクトは、前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む請求項１〜３および５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または前記２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項１〜４、６〜１０および１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項１〜３、５〜９および１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである請求項１７〜１９および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記リプレッサーはＴＥＴＲであり、前記テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リプレッサーはＥＳＲであり、前記スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである請求項１７〜１９および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む請求項１７〜１９、２１および２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む請求項１７〜１９、２１、２８および３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである請求項１７〜１９、２１および２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである請求項１７〜１９、２１、２８および３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロモーターは、脱抑制プロモーターである請求項１７〜１９、２１および３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである請求項１７〜１９、２１、２５〜２７、３３および３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される請求項１７〜１９および２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する請求項２２または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記単子葉植物はトウモロコシである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する請求項２２または３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む請求項２２または３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれかいずれか１つを含む請求項２２、３９および４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む請求項５６または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項５６または５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む請求項６２または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項６３または６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む請求項６８または７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項６８または７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである請求項１〜４、６〜８、９〜１０、１２〜１８および２０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む請求項７４〜７５および７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項７４〜７５および７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである請求項１〜３、５〜９、１１〜１７および１９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである請求項１〜３、５〜９、１１〜１７、１９〜４８および８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記単子葉植物はトウモロコシである請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである請求項１〜３、５〜９、１１〜１７、１９〜４８および８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸を含む請求項１〜３、５〜９、１１〜１７および１９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項１〜３、５〜９、１１〜１７および１９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである請求項１〜３、５〜９、１１〜１７および１９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＯＤＰ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項１００】
前記２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである請求項１〜３、５〜９、１１〜１７および１９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記単子葉植物はトウモロコシである請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または前記細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に前記再生可能な植物構造体が形成され、前記細胞の形質転換から約１４日〜前記細胞の形質転換から約６０日で前記トランスジェニック植物が形成される請求項１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
発根培地なしで行われる請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
発根培地の存在下で行われる請求項１〜１１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記外植体は未熟胚である請求項１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概ね、植物の遺伝子操作などの植物分子生物学に関する。より具体的には、本開示は、サイトカイニンの非存在下、カルスを形成することなく、形質転換された植物を迅速かつ効率良く作製する方法および組成物に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８５７８号の優先権を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
テキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１６年８月１７日作成の２０１６０８２６＿６７５２ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔのファイル名を備え、１０００ＫＢのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
この数年間に植物形質転換は大きな進歩を遂げてきた。様々な農学的に重要な植物、例えば、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、コムギ、インディカイネおよびソルガム、ならびに近交系の形質転換は、依然として困難であり、かつ時間を要している。様々な農学的に重要な植物、例えば、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、コムギ、インディカイネおよびソルガム、ならびに近交系の形質転換は、依然として困難であり、かつ時間を要している。従来、培養反応を生じさせる唯一の方法は、培地成分、ならびに／または外植体材料および外植体源の最適化によるものであった。いくつかの遺伝子型では、この方法により成功したが、選良の近交系または変種を含む多くの重要な作物は、好ましい培養反応を起こさない。モデル遺伝子型の形質転換は効率が良いが、トランス遺伝子の生産近交系への移入プロセスは、困難で、費用を要し、時間もかかる。もし遺伝子をより速く、より効率的に導入し評価することができれば、かなりの時間と費用の節約になるであろう。
【０００５】
いくらか制約はあるものの、コーン、イネおよびコムギなどの単子葉植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（多くの場合、選択外植体として未熟胚などの分裂組織を使用して行われる）は、依然として広く用いられている実験手法である（例えば、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。イネでは、吸水種子の形質転換もまた報告されている（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）．細胞をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌と接触させる方法としてこれまで最も汎用されてきた方法は、未熟胚などの外植体組織を培養し（「共培養」）（場合により、「遅延」または「静止」（非選択的）工程を含む）、続いて、細胞を脱分化させるオーキシンを含有する選択培地で培養してカルスを形成することを含む。このカルス形成期に、適切な選択剤の存在下、選択培地上で、形質転換耐性カルス組織が選択される。この後、カルスの分化、およびカルスの植物体への再生を促進する条件下、再生および発根培地上で、細胞を増殖させる。さらに生育するための土壌に移し得る植物体の作製のためには、このプロセスは、通常、少なくとも１０〜１２週を要する。このプロセスはまた、形質転換プロセス全体を通して、数回の手作業による移行操作を必要とし、かつ数種の異なるタイプの培地を使用する。
【０００６】
したがって、形質転換および再生の標準的なプロトコルの使用は、時間がかかり非効率的であり、初期の研究によって得られた結果に基づいて、大規模な現地作業での使用に、どの遺伝子コンストラクトを優先するか決定する「優先開発窓（ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｗｉｎｄｏｗ）」に季節的な制約があることを考慮すると、トランスジェニック製品の開発スケジュールに負の影響を及ぼす。形質転換および再生に利用可能な標準的方法には、トランスジェニック植物を生産しスクリーニングする速さおよび効率を制限する多くの欠点がある。例えば、形質転換および再生の多くの標準的方法は、オーキシンまたはサイトカイニンを高濃度で使用する必要があり、また、肺活性カルス形成または器官形成を含み、形質転換後に設ける温室で成育するための植物体を作製する前に何週間もかかる手順を生じさせる工程を必要とする。そのような方法では、２，４−Ｄを供給してトウモロコシの体細胞胚の形成を促進する工程（最大８週を要する）、一時体細胞胚から胚発生カルスを作製する工程（さらに最大８週を要する）、シュートを形成する工程（さらに最大３週を要する）、そして、最後に根付かせる工程（さらに１〜３週を要する）を含め、植物体の作製に１２〜２３週を要し得ることが報告されている（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔａ  １８７：４９０−４９７）。あるいは、Ｚｈｏｎｇらは、直接形態形成を促進するためにオーキシンと共にサイトカイニンを即座に供給して、８〜２８週でシュートおよび直接植物形成を行っている（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔａ  １８７：４９０−４９７）。
植物分子生物学、とりわけ植物形質転換および再生が進歩しているにもかかわらず、トランスジェニック植物を迅速かつ効率良く作製し、研究および製品の開発決定により多くの時間と自由度を与える高スループットシステムが依然として求められている。そのような形質転換の高スループットシステムは、材料および労働のコストを下げつつ、遺伝子実験および／または製品開発のための多数のトランスジェニック植物の生産を促進する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔａ  １８７：４９０−４９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  Ｐ���Ｏ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロサイテトラクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを
含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【０００９】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされ；２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる方法を提供する。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリ
ペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１０】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＯＤＰ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされ；ＯＤＰ２ポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７および２１のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる方法を提供する。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペ
プチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１１】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１２】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１３】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ���ＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭ
Ｎ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１４】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）（ｂ）の再生可能な植物構造体を発芽させて、約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つ
のＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１５】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されず、かつ再生可能な植物構造体は細胞の形質転換から約０〜７日以内または約０〜１４日以内に形成される）工程と；（ｃ）（ｂ）の再生可能な植物構造体を発芽させて、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。一態様では、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。一態様では、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列、および／またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。一態様では、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。一態様では、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。一態様では、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。一態様では、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。一態様では、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一態様では、誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。一態様では、誘導性プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。一態様では、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。一態様では、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯから選択される。一態様では、誘導性プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。一態様では、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。一態様では、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。一態様では、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３から選択される。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、単子葉植物に由来する。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、双子葉植物に由来する。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２またはＰＬＴＰ３プロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドから選択される。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。一態様では、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一態様で
は、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ＯＤＰ２は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
【００１６】
本開示は、植物、例えばトウモロコシなどの単子葉植物を迅速かつ効率良く形質転換するための方法および組成物を含む。各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が作製される。一態様では、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。一態様では、発現コンストラクトはさらに、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、（ｃ）発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または構成的プロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択され；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択され；かつＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。ある態様では、外植体は、単子葉植物または双子葉植物に由来する。一態様では、本方法によって生産された植物の種子。
【００１７】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれかのアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされ；あるいは２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれかのアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされる方法を提供する。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が作製される。一態様では、一態様では、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。一態様では、発現コンストラクトはさらに、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、（ｃ）発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または構成的プロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３��バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択され；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択され；かつＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。ある態様では、外植体は、単子葉植物または双子葉植物に由来する。一態様では、本方法によって生産された植物の種子。
【００１８】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）（ｂ）の再生可能な植物構造体を約１４〜約６０日間発芽させて小植物体を形成する工程と；（ｄ）（ｃ）の小植物体を植物へ成長させる工程とを含む方法を提供する。一態様では、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が作製される。一態様では、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。一態様では、発現コンストラクトはさらに、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。一態様では、（ｃ）発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または構成的プロモーターに作動可能に連結している。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択され；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１、ＤＲ５、ＸＶＥ、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８Ａ、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択され；かつＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４Ａ、またはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。ある態様では、外植体は、単子葉植物または双子葉植物に由来する。一態様では、本方法によって生産された植物の種子。
【００１９】
各種態様において、本開示はさらに、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、本開示はさらに、本開示の方法により作製された再生可能な植物構造体から得られた小植物体を生産する方法を提供する。一態様では、本開示はさらに、再生可能な植物構造体から得られた植物体を生産する方法を提供する。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。一態様では、本開示はさらに、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成するための説明書とを含むキットを提供する。
【００２０】
本開示は、植物、例えばトウモロコシなどの単子葉植物を迅速かつ効率良く形質転換するための方法および組成物を含む。各種態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜７日以内、または約０〜１４日以内に再生可能な植物構造体が作製される。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８ＡまたはＸＶＥである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択され；誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＡＸＩＧ１ＤＲ５、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８ＡまたはＸＶＥから選択され；発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４ＡまたはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。各種態様において、外植体は、単子葉植物または双子葉植物に由来する。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２１】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされ；２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる方法を提供する。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜７日以内、または約０〜１４日以内に再生可能な植物構造体が作製される。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８ＡまたはＸＶＥである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択され；誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＡＸＩＧ１ＤＲ５、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８ＡまたはＸＶＥから選択され；発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４ＡまたはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。各種態様において、外植体は、単子葉植物または双子葉植物に由来する。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２２】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）（ｂ）の再生可能な植物構造体を小植物体へと約１４〜約６０日間成長させる工程と；（ｄ）（ｃ）の小植物体を植物へ成長させる工程とを含む方法を提供する。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜７日以内、または約０〜１４日以内に再生可能な植物構造体が作製される。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３から選択される部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８ＡまたはＸＶＥである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、および構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョン、またはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）から選択され；誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＡＸＩＧ１ＤＲ５、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ１８ＡまたはＸＶＥから選択され；発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４ＡまたはＬＥＡ−Ｄ３４から選択される。各種態様において、外植体は、単子葉植物または双子葉植物に由来する。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２３】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各
種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、各種態様において、一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ＯＤＰ２は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２４】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされ；２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる方法を提供する。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号４である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号３によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号６である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号５によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号８である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号７によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号１４である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号１３によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号２０である。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１９によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２５】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＯＤＰ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされ；ＯＤＰ２ポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７および２１のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる方法を提供する。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２６】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１Ｚ��  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２７】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。各種態様において、２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ＯＤＰ２は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２８】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または１４日未満で起こる。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において，脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において，双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において，ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む
。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ＯＤＰ２は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００２９】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）（ｂ）の再生可能な植物構造体を発芽させて、約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、
単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ＯＤＰ２は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約０〜約７日以内、または細胞の形質転換から約０〜約１４日以内に再生可能な植物構造体が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００３０】
さらなる態様において、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されず、かつ再生可能な植物構造体は細胞の形質転換から約０〜７日以内または約０〜１４日以内に形成される）工程と；（ｃ）（ｂ）の再生可能な植物構造体を発芽させて、約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を提供する。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または約１４日未満で起こる。各種態様において、発芽工程は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。各種態様において、発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。各種態様において、不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｌ１７Ｇ）〜ＣＲＥである。各種態様において、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、誘導性プロモーターは、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、ＬＴＰ２、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａである。各種態様において、誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。各種態様において、化学誘導性プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。各種態様において、リプレッサーはＴＥＴＲであり、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。各種態様において、リプレッサーはＥＳＲであり、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、構成的プロモーターは、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓの−１３５バージョンまたはＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）である。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または構成的プロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。各種態様において、発生調節プロモーターは、ＰＬＴＰプロモーターである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。各種態様において、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１および２のいずれか１つを含む。各種態様において、誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１である。各種態様において、ＡＸＩＧ１プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。各種態様において、プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む。各種態様において、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５エンハンサーモチーフを含む。各種態様において、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。各種態様において、プロモーター中の１つ以上のオペレーター配列は、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している。各種態様において、プロモーターは、ＮＯＳ、ＡＸＩＧ１、ＺＭ−ＧＯＳ２、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯまたはＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯである。各種態様において、プロモーターは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含むＤＲ５プロモーターである。各種態様において、プロモーターは、脱抑制プロモーターである。各種態様において、脱抑制プロモーターは、ＴＥＴＲ、ＥＳＲまたはＣＲである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物のヌクレオチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列をコードする。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つを含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５ポリペプチドである。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＷＯＸ５ポリペプチドは、配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉ
ａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ＯＤＰ２は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。各種態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタである。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、１〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、３．５〜５ｍｍの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約７日後、または細胞の形質転換の約１４日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、（ａ）のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
【００３１】
一態様では、本開示はさらに、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書とを含むキットを提供する。各種態様において、キットは、約１４日〜約６０日以内に形質転換植物を得るための説明書を提供する。各種態様において、キットは、キットを使用して形質転換された外植体から植物を得るための説明書を提供する。
【００３２】
一態様では、本開示はさらに、（ａ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書とを含むキットを提供する。各種態様において、キットは、約１４日〜約６０日以内に形質転換植物を得るための説明書を提供する。各種態様において、キットは、キットを使用して形質転換された外植体から植物を得るための説明書を提供する。
【００３３】
一態様では、本開示はさらに、（ａ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書とを含むキットを提供する。各種態様において、キットは、約１４日〜約６０日以内に形質転換植物を得るための説明書を提供する。各種態様において、キットは、キットを使用して形質転換された外植体から植物を得るための説明書を提供する。
【００３４】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示した方法から生産される植物の種子を提供する。
【００３５】
本特許または本出願書類は、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を有する本特許または本特許出願公開物の写しは、請求があり、必要な料金が支払われれば、特許庁から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本開示の方法により処理された未熟胚の代表的な像を示す（実施例５を参照）。矢印は、処理後、表面に新しく形成された代表的な胚を示す。
【図２】図２は、本開示の方法により処理された未熟胚の代表的な像を示す（実施例５を参照）。この像は、処理後の表面上の蛍光を発する胚を示している。
【図３】図３は、１３日間、成熟培地で成長させた後の、本開示の方法（実施例７を参照）により得られた元の単一の接合未熟胚由来の複数の成熟体細胞胚の代表的な像を示す。
【図４】図４は、本開示の方法（実施例７を参照）により最初に形質転換された４５個の接合未熟胚から得られた植物体の代表的な像を示す。
【図５】図５は、Ｐｉｏｎｅｅｒ  ｅｌｉｔｅ  Ｓｐｒｉｎｇｗｈｅａｔの変種ＨＣ０４５６Ｄの未熟胚にアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を感染させた後、２週間で迅速に形成された体細胞胚から生じた早期発芽シュートを示す。
【図６】図６は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌によるトランスフェクションから２日後の未熟接合胚からの胚盤表面における早期垂層分裂（矢印）の代表的な像を示す。
【図７】図７は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌によるトランスフェクションから２日後のトランスフェクト未熟接合胚からの胚盤表面における小さい球状の体細胞胚形成の代表的な像を示す。
【図８】図８は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌によるトランスフェクションから２日後のトランスフェクト未熟接合胚からの胚盤表面における大きい球状の体細胞胚形成の代表的な像を示す。
【図９】図９は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌によるトランスフェクションから４日後のトランスフェクト未熟接合胚からの胚盤表面に形成された移行段階の体細胞胚を示す代表的な像であり、体細胞胚の表面が平滑であり、また下部の接合胚との維管束連結が欠損していることを示している。
【図１０】図１０は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌によるトランスフェクションから４日後のトランスフェクト未熟接合胚からの胚盤表面に形成された複数の移行段階の体細胞胚を示す代表的な像であり、近接して存在する体細胞胚が、下部の接合胚表面から発生し、二次の体細胞胚形成を介して発生していないことを示している。
【図１１】図１１は、（矢印で示す）視野内の複数の細胞中に観察される中期および後期構造に示されるように、成長する体細胞胚内の高分裂指数を示す、高い倍率で拡大して示す代表的な像である。
【図１２】図１２は、ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＢＢＭと共にＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２を含むＴ−ＤＮＡによる形質転換から１０日後のトウモロコシの未熟胚を示す。多数の体細胞胚（これらのうちのいくつかは、成熟するにつれ、融合している）および初期成長葉が胚盤表面から成長しているのが観察される。オイルレッドＯで２０分間染色し、７０％イソプロパノールで２回洗浄した後、体細胞胚発生期間の間に蓄積した脂質が赤色に染色される（黒色の矢印）一方、成長している葉（白色の矢印で標識）および最初に形質転換された接合胚盤（白色の矢印で標識）はほとんど染色されず、これらの組織では脂質の沈着が通常低いレベルであることを示している。
【図１３】図１３は、胚をスライドとカバーガラス間に挟み、オイルレッドＯで染色した後の、体細胞胚細胞の光学マイクロ写真を示す。細胞内に散在する、赤色に染色された脂質の小滴（黒色の矢印で例示）が観察された
【図１４】図１４は、代表的な、試料の植物組織全体にわたって構成的に発現したダイズＥＦ１Ａ遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａ転写産物定量を示す。
【図１５】図１５は、胚／種子特異的遺伝子ＬＴＰ３のＩｌｌｕｍｉｎａ転写産物定量を示し、各転写レベルは、種々の植物器官および種々の発達段階におけるプロモーターの活性を示している。
【図１６】図１６は、５種のプロモーター、すなわち、Ｇｍ−フィトクロムＰ４５０プロモーター（Ｐ４５０  ＰＲＯ）；Ｇｍ−グリコシルヒドロラーゼプロモーター（ＧＨ  ＰＲＯ）；Ｇｍ−ホメオドメイン／Ｓｔａｒｔドメインタンパク質プロモーター（ＨＳＤ  ＰＲＯ）；Ｇｍ−ＬＴＰ３プロモーター（ＬＴＰ３  ＰＲＯ）；Ｇｍ−ストリクトシジンシンターゼ様１プロモーター（ＳＳＬ１  ＰＲＯ）；ＷＵＳを発現しないネガティブコントロール（ＮＥＧ  ＣＯＮ）の中の１つの後にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳ遺伝子を有する発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを導入するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換が行われた後に体細胞胚を形成した、処理後未熟子葉の頻度によって測定された形質転換反応を示す。各プロモーターでは、ボックスの上端および下端は、データの上方および下方４分の１を示し、ボックス内の線はメジアン値を示す。Ｐ４５０  ＰＲＯでは、２つの複製体のみが、この分析に含まれたため、メジアン値は算出されなかった。
【図１７】図１７Ａは、成熟培地に移し、胚の発生を完了させた体細胞胚の光学マイクロ写真を示し、図１７Ｂはその対応する落射蛍光像を示す（下部の未熟子葉を、Ｇｍ−ＬＴＰ３  ＰＲＯ：：Ａｔ−ＷＵＳを含むＴ−ＤＮＡで形質転換させてから３５日後の成熟培地上を示す）。矢印は、赤色の蛍光を発する体細胞子葉の１つを示し、スケールバーは、長さ２ｍｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下に、添付の図面を参照しながら本明細書中の開示をより詳しく説明するが、図面は可能な態様のいくつかを示すものであって全部ではない。実際、開示は、多くの異なる形態で具体化可能であり、本明細書中に記載した態様に限られると解釈すべきではなく、むしろ、これらの態様は、本開示が適用法的要件を満たすために提供される。
【００３８】
本明細書に開示する多くの変更および他の態様は、本発明の組成物および方法が関連する分野の当業者であって、以下の説明や添付の図面に提示された教示を利用できる者であれば、思い付くであろう。したがって、開示が、本明細書に開示した特定の態様に限定されるべきではなく、また、変更やその他の態様が添付の請求項の範囲に含まれることを意図していることは理解されるべきである。本明細書中には特定の用語が使用されるが、それらは、一般的かつ記述的意味でのみ使用されものであって、限定を目的として使用されるものではない。
【００３９】
また、本明細書に使用される専門用語は、単に特定の態様を説明するためのものであって、限定を目的とするものではないことも理解されるべきである。本明細書および特許請求の範囲で使用する用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」態様が含まれ得る。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の組成物および方法が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。この後に続く本明細書および特許請求の範囲においては、本明細書で定義する多くの用語について言及するであろう。
【００４０】
Ｉ．トランスジェニック植物を作製するための方法および組成物
本開示は、トランスジェニック植物を作製するための方法および組成物であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトを有する外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法および組成物を含む。再生可能な植物構造体は、約０〜７日または約０〜１４日以内に作製される。一態様では、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、再生可能な植物構造体の形成を促進することができる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、再生可能な植物構造体の形成を促進することができる。
【００４１】
一態様では、本方法の形質転換された各細胞中での（ａ）のポリペプチドの発現は制御される。制御された発現が特定の期間、間欠的に起こる。（ａ）のポリペプチドの発現の制御は、以下の本明細書中に開示する様々な方法によって行うことができる。
【００４２】
本開示の方法により、再生可能な植物構造体の形成開始前に、単一細胞由来の細胞または組織の増殖を介することなく、形質転換された外植体上または外植体内の単一の細胞から直接生じる単一の再生可能な植物構造体が作製されると理解されるべきである。対照的に、前述した当該技術分野で知られる形質転換および再生方法は、カルス、未分化カルス、胚発生カルスおよび器官形成カルスと称する種々の成長パターンを含む、単一細胞由来の細胞または組織の増殖の介在を伴う。各種態様において、用語「カルス」は，成長が制御されていない状態にある未分化の細胞塊を指す。カルスは、植物組織の分化した細胞を、オーキシン（例えば、２，４−Ｄ）またはサイトカイニンなどの植物成長調節剤物質を含む培地中で培養することにより得ることができる（ここで、サイトカイニンを含む培地は、脱分化培地と呼ばれる）。胚発生を促すために組織培養培地に添加することができるオーキシンの例としては、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）および２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）などのオーキシンに加えて、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、クロロインドール−３−酢酸（ＣＬ−ＩＡＡ）、２−フェニル酢酸（ＰＡＡ）、インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）およびインドール−３−酪酸（ＩＢＡ）などの天然に存在するオーキシンが挙げられる。形態形成（特に、分裂組織およびシュート発達を促すために組織培養培地に添加することができるサイトカイニンの例としては、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、キネチン、チジアズロン（ＴＤＺ）、メタ−トポリンおよびメトキシトポリンが挙げられる。組織培養培地に添加することができるオーキシンおよびサイトカイニンは、外因性である。前述した当該技術分野で知られる形質転換および再生方法がまた、新たな分裂組織の形成（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４：３５３９−３５４８）、多数のシュート形成（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔａ  １８７：４８３−４８９）および緑色組織培養の（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １３８：２２９−２４４；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２２：４８３−４８９）、（全て、培地中にサイトカイニンが必要である（例えば、米国特許第８３９５０２０Ｂ２号明細書、米国特許第８５８１０３５Ｂ２号明細書））を包含する、分裂組織増殖と称する種々の成長パターンを含む、単一細胞由来の、または組織の増殖の介在を伴うこともまた理解されるべきである。
【００４３】
開示した方法では、未熟胚、１〜５ｍｍの接合胚、３〜５ｍｍの胚、ならびに、成熟した雌穂由来の種子、葉脚、十分に成長した植物体の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟雌穂、および毛（ｓｉｌｋ）に由来する胚などの様々な外植体を使用することができる。各種態様において、形質転換に使用される植物由来の外植体としては、未熟胚、１〜５ｍｍの接合胚、３．５〜５ｍｍの胚が挙げられる。一態様では、開示した方法で使用される胚は、成熟した雌穂由来の種子、葉脚、十分に成長した植物体の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟雌穂、および毛（ｓｉｌｋ）由来のものであり得る。
【００４４】
再生可能な植物構造体は、限定はされないが、体細胞胚、胚発生カルス、体細胞分裂組織および／または器官形成カルスなどの、完全に機能する稔性植物を形成することができる多細胞構造体と定義される。
【００４５】
体細胞胚は、球形の移行期にある胚の形成、胚軸および胚盤の形成、ならびに脂質およびデンプンの蓄積を含む、接合胚の発達に類似した発達段階を経て成長する多細胞構造体と定義される。接合胚から生じる単一の体細胞胚は発芽して、本来単細胞から生じ得る非キメラ植物体を作製する
【００４６】
胚発生カルスは、成熟稔性植物に再生することができる増殖性の一次および二次体細胞胚を包んでいる未分化の、または部分的に未分化の細胞の脆い、または脆くない混合物と定義される。
【００４７】
体細胞分裂組織は、葉原基によって隣接され、維管束始原細胞によって包まれた、地上生育植物を生じさせる未分化の頂端ドームを有するとされる、未分化軸種子由来の胚の一部である頂端分裂組織に類似した多細胞構造体と定義される。そのような体細胞分裂組織は、単一の分裂組織、または融合した分裂組織の集まりを形成することができる。
【００４８】
器官形成カルスは、限定はされないが、頂端分裂組織、根分裂組織、葉および根などの分化した成長する植物構造体のコンパクトな混合物と定義される。
【００４９】
発芽とは、小植物体を形成する再生可能な構造体の成長をいい、小植物体は成長を続けて植物を作る。
【００５０】
トランスジェニック植物は、導入遺伝子を含む成熟した稔性植物と定義される。
【００５１】
本開示の方法に使用される外植体は、限定はされないが、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバ（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）またはコムギなどの単子葉植物由来であり得る。あるいは、本開示の方法に使用される外植体は、限定はされないが、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、エンドウ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタなどの双子葉植物由来であり得る。
【００５２】
さらなる態様において、本開示の方法に使用される外植体は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属する植物由来であり得る。外植体が由来し得る好適な植物の非限定的な例としては、限定はされないが、オオムギ、トウモロコシ（トウモロコシ）、カラスムギ、イネ、ライムギ、ソルガム、コムギ、キビ、ライコムギなどの穀類；限定はされないが、タケ、マーラム、タチイチゴツナギ、アシ、ライグラス、サトウキビなどの葉茎作物；シバ（ｌａｗｎ  ｇｒａｓｓ）、パンパスグラス、ならびに、スイッチグラスおよびシバ（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）などのその他の草が挙げられる。
【００５３】
さらなる態様において、本開示の方法に使用される外植体は、高等植物、例えば、被子植物綱（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）および裸子植物綱（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅなどを含む任意の植物由来であり得る。双子葉植物亜綱および単子葉植物亜綱の植物が好適である。好適な種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）およびブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。
【００５４】
本開示の方法で使用される外植体が由来し得る好適な種としては、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）に属するものが挙げられる。
【００５５】
さらなる態様において、本開示の方法に使用される外植体は、農業、園芸、液体燃料分子および他の化学物質の製造するためのバイオマス、ならびに／または林業にとって重要な、または興味深い植物由来であり得る。非限定的な例として、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ワタ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）（トウジンビエ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）種、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）種、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ヒロハノウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）、タケ、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（レタス）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャ）、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ココア）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ）（トウガラシ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（タマネギ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（メロン）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）（カボチャ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（カボチャ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチゴ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）、キナノキ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、ベラトラム・カリフォルニカ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ）（＝トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、インドジャボク属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、アカネグサ（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ナツシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ゴム）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）、アルストロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）種（ペチュニア）、ポインセチア（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ルピン）、ウニオラ・パニクラータ（Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（アスペン）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（カエデ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（バーリー）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクミギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）（ティモシー）、および球果植物が挙げられる。興味深いのは、エネルギー生成のために生育する植物、いわゆるエネルギー作物であり、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（トールフェスク）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）およびタケ（Ｂａｍｂｏｏ）などのセルロース系エネルギー作物、ならびにトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）およびキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）などのデンプン系エネルギー作物、ならびにサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、およびテンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）などの糖系エネルギー作物、ならびにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）などのバイオディーゼル生成エネルギー作物である。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「バイオマス再生可能エネルギー源植物」は、電気エネルギーに変換し得る貯蔵太陽エネルギーを含む（生、もしくは処理されている）材料、液体燃料および他の有用な化学物質を有するか、または生成することを意味する。一般的には、そのような植物は、専用エネルギー作物、ならびに農作植物および木本植物を含む。バイオマス再生可能エネルギー源植物の例としては、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ヒロハノウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）、タケ（Ｂａｍｂｏｏ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）が挙げられる。
【００５７】
一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または１４日未満の間に起こる。
【００５８】
一態様では、発現コンストラクトは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または１４日未満の間に起こる。
【００５９】
一態様では、発現コンストラクトは、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。各種態様において、２つのＡＰ２結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、１日未満、２日未満、５日未満、７日未満、または１４日未満の間に起こる。
【００６０】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列は、部位特異的リコンビナーゼによる切除の標的とされ得る。したがって、形質転換後、所望の時間で切除することにより、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列の発現を制御することができる。発現コンストラクト中のＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列の発現を制御するために、部位特異的リコンビナーゼが使用される場合、発現コンストラクトは、切除するポリヌクレオチド配列に隣接して、適切な部位特異的切除部位を、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼが使用されるなら、Ｃｒｅ  ｌｏｘ部位を含むことは理解されている。部位特異的リコンビナーゼは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトに位置している必要はない。しかしながら、一態様では、発現コンストラクトは、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００６１】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；  ２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列の発現を制御するために使用される部位特異的リコンビナーゼは、種々の好適な部位特異的リコンビナーゼから選択することができる。例えば、各種態様において、部位特異的リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ＳＳＶ１、ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｔ、ｐｈｉ  Ｃ３１  Ｉｎｔ、ＨＫ０２２、Ｒ、Ｇｉｎ、Ｔｎ１７２１、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、Ｔｎ５０５３、Ｂｘｂ１、ＴＰ９０７−１、またはＵ１５３である。部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである。不安定化融合ポリペプチドは、ＴＥＴＲ（Ｇ１７Ａ）〜ＣＲＥまたはＥＳＲ（Ｇ１７Ａ）〜ＣＲＥであり得る。
【００６２】
一態様では、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している。好適な発生調節プロモーターとしては、ＧＬＢ１、ＯＬＥ、およびＬｉｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＬＴＰ２）（Ｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：８４９−８６０および米国特許第５５２５７１６号明細書）が挙げられる。好適な誘導性プロモーターとしては、環境的に誘導される熱ショックプロモーター、例えば、ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６またはＨＳＰ１８Ａが挙げられる。あるいは、部位特異的リコンビナーゼに作動可能に連結している誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーター、例えば、ＸＶＥプロモーターが挙げられる。
【００６３】
一態様では、部位特異的リコンビナーゼに作動可能に連結している化学誘導性プロモーターは、ＸＶＥである。化学誘導性プロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴＥＴＲ）、エタメツルフロンリプレッサー（ＥＳＲ）またはクロルスルフロンリプレッサー（ＣＲ）により抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる。リプレッサーはＴＥＴＲであり得、テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである。（Ｇａｔｚ、Ｃ．，Ｆｒｏｈｂｅｒｇ、Ｃ．ａｎｄ  Ｗｅｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．（１９９２）Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，３９７−４０４）。あるいは、リプレッサーはＥＳＲであり得、スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１１０２８７９３６号明細書）。
【００６４】
一態様では、発現コンストラクトが、部位特異的リコンビナーゼ切除部位を含む場合、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列は、オーキシン誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーターまたは構成的プロモーターに作動可能に連結することができる。これに関連して有用な構成的プロモーターの例としては、ＵＢＩ、ＬＬＤＡＶ、ＥＶＣＶ、ＤＭＭＶ、ＢＳＶ（ＡＹ）ＰＲＯ、ＣＹＭＶ  ＰＲＯ  ＦＬ、ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ、ＳＩ−ＵＢ３  ＰＲＯ、ＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ（ＡＬＴ１）、ＵＳＢ１ＺＭ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＧＯＳ２  ＰＲＯ、ＺＭ−Ｈ１Ｂ  ＰＲＯ（１．２ＫＢ）、ＩＮ２−２、ＮＯＳ、３５Ｓ  ＰＲＯの−１３５バージョン（または、３５Ｓ  プロモーターのより長いバージョン）およびＺＭ−ＡＤＦ  ＰＲＯ（ＡＬＴ２）が挙げられる。これに関連して有用なオーキシン誘導性プロモーターの例としては、ＡＸＩＧ１およびＤＲ５が挙げられる。これに関連して有用な発生調節プロモーターの例としては、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、ＰＬＴＰ３、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４ＡおよびＬＥＡ−Ｄ３４が挙げられる。
【００６５】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列の適切な発現期間は、発生調節プロモーター、例えば、リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）などのプロモーターを使用することによって達成可能である。ＰＬＴＰプロモーターとしては、以下にさらに記載するようなＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２およびＰＬＴＰ３が挙げられる。ある特定の態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１のいずれか１つを含む。使用されるＰＬＴＰプロモーターは、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）またはモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）ＰＬＴＰプロモーター、例えば、配列番号１または２であり得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／２７１２３０号明細書）。本開示の方法で使用され得る他の適切な発生調節プロモーターとしては、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼタンパク質、ＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマン・フォールドタンパク質、アジポサイトプラズマ膜結合タンパク質様タンパク質、Ｒｉｅｓｋｅ［２Ｆｅ−２Ｓ］鉄・硫黄ドメインタンパク質、クロロレスピラトリー還元６タンパク質（Ｃｈｌｏｒｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｄ−グリセリン酸３−キナーゼ、葉緑体様タンパク質、クロロフィルａ−ｂ結合タンパク質７、葉緑体様タンパク質、紫外線Ｂ抑制性タンパク質、Ｓｏｕｌヘム結合ファミリータンパク質、光科学系Ｉ反応中心サブユニットｐｓｉ−Ｎタンパク質、および短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼタンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、トウモロコシ、イネまたはソルガムなどの単子葉植物における前述のタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。本開示の方法で使用され好適な発生調節プロモーターとして、配列番号１〜２、２８〜４０、５５〜６１、８１〜８３、８６〜８８および１０６で示されるものが挙げられる。
【００６６】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列の適切な発現期間は、オーキシン誘導性プロモーターに作動可能に連結し得る。各種態様において、オーキシン誘導性プロモーターは、ＡＸＩＧ１であり得る。特に、オーキシン誘導性プロモーターは、配列番号３９であり得る。プロモーターはまた、１つ以上のオーキシン応答エレメントを含み得る。さらなる態様では、プロモーターは、１つ以上のＤＲ５モチーフを含み得る。特に、プロモーターは、配列番号４０であり得る。
【００６７】
一態様では、プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである。さらなる態様において、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターは、プロモーター中に、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写開始部位の近傍に、または重なって位置する、１つ以上のオペレーター配列を含む。例えば、このタイプの好適なプロモーターとしては、限定はされないが、ＮＯＳ、ＩＮ２−２、３５Ｓの−１３５バージョン、ＣＣ−ＵＢＩ１−ＰＲＯおよびＺＭ−ＡＤＦ４−ＰＲＯプロモーターが挙げられる。
【００６８】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列は、発生調節プロモーターに作動可能に連結し得る。好適な発生調節プロモーターとしては、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマン・フォールドタンパク質、アジポサイトプラズマ膜結合タンパク質様タンパク質、Ｒｉｅｓｋｅ［２Ｆｅ−２Ｓ］鉄・硫黄ドメインタンパク質、クロロレスピラトリー還元６タンパク質（Ｃｈｌｏｒｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｄ−グリセリン酸３−キナーゼ、葉緑体様タンパク質、クロロフィルａ−ｂ結合タンパク質７、葉緑体様タンパク質紫外線Ｂ抑制性タンパク質、Ｓｏｕｌヘム結合ファミリータンパク質、光科学系Ｉ反応中心サブユニットｐｓｉ−Ｎタンパク質、および短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼの植物遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。各種態様において、これらのプロモーターは、トウモロコシ、イネなどの単子葉植物中の対応する遺伝子に由来する。あるいは、これらのプロモーターは、双子葉植物中の対応する遺伝子に由来し得る。特定の態様では、発生調節プロモーターは、配列番号１〜２、２８〜４０、５５〜６１、８１〜８３、８６〜８８および１０６のいずれか１つを含む。
【００６９】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または両ヌクレオチド配列は、脱抑制プロモーターに作動可能に連結し得る。有用な脱抑制プロモーターとしては、３５Ｓ：Ｔｏｐ３、ＮＯＳ：：Ｔｏｐ、ＮＯＳ：Ｔｏｐ２、ＵＢＩ：Ｔｏｐ３、ＢＳＶ：Ｔｏｐ３、ＡＸＩＧ１：Ｔｏｐ、ＩＮ２−２：ＴｏｐおよびＤＲ５：Ｔｏｐ（ここで、Ｔｏｐは、発現抑制のためにＴＥＴＲ、ＥＳＲおよびＣＲのいずれかが結合する１８塩基オペレーター配列を示す略語である）が挙げられる。
【００７０】
一態様では、本開示は、ポジティブな成長選択を可能にする形質転換方法を提供する。当業者であれば、従来の植物形質転換法の多くが、抗生物質または除草剤（ネガティブ選択剤）の使用によって、形質転換していない細胞または組織の成長を阻害または死滅させ、トランスジェニック細胞または組織は、耐性遺伝子の発現によって成長し続ける、ネガティブ選択スキームによるものであったことを認識している。対照的に、本開示の方法は、ネガティブ選択剤を適用せずに使用することができる。したがって、開示した野生型細胞は阻害されずに成長し得るが、開示のＷＵＳ２およびＯＤＰ２発現カセットを含む細胞は、周囲の野生型組織と比較して成長速度が速いため、容易に識別することができる。成長の速さを容易に観察できることに加えて、本開示の方法は、形質転換していない細胞と比べて、より急速な形態形成を示し、再生可能な植物構造体の形成として現れる、ＷＵＳ２およびＯＤＰ２発現カセットを含むトランスジェニック細胞を提供する。したがって、そのような成長および形態発生の差によって、再生可能なトランスジェニック植物構造体を、周囲の非形質転換組織から容易に識別することができ、そのプロセスを、本明細書では「ポジティブ成長選択」と称する。
【００７１】
各種態様において、本開示の方法は、発根培地を使用せずに実施することができる。あるいは、一態様において、各種態様において、本開示の方法は、発根培地を使用して実施することができる。本明細書で使用する場合、「発根培地」または「選択発根培地」は、基礎塩、炭素源、ビタミン、ミネラルおよび植物ホルモンを含む組織培養培地を指す。一態様では、植物ホルモンは、様々な濃度または割合で供給することができ、選択発根培地上に置かれた細胞から根組織が成長し増殖する。一態様では、選択発根培地は、グルホシネート、イマザピル、エタメツルフロン、マンノースまたは他の選択剤を含有する。一態様では、選択発根培地は、オーキシンおよびサイトカイニンを含むか、サイトカイニンを単独で含むか、または植物ホルモンを含まない。
【００７２】
一態様では、本開示の方法は、再生可能な植物構造体の形成期間、および／または発芽期間中、サイトカイニンを使用せずに実施し得る。さらなる態様では、本開示の方法は、形質転換と形質転換開始から少なくとも約７日の間、サイトカイニンを使用せずに実施し得る。さらなる態様では、本開示の方法は、形質転換と形質転換開始から少なくとも約１４日の間、サイトカイニンを使用せずに実施し得る。
【００７３】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または各ヌクレオチド配列は、ＰＬＴＰプロモーターに作動可能に連結している。ＰＬＴＰプロモーターとしては、ＰＬＴＰ、ＰＬＴＰ１、ＰＬＴＰ２、およびＰＬＴＰ３が挙げられる。ＰＬＴＰプロモーターは、例えば、限定はされないが、トウモロコシ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、サトウキビ、キビ、ソルガム、コムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、またはイネなどの単子葉植物由来であり得る。さらなる態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種ＰＬＴＰプロモーターである。ある特定の態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１〜２および５５〜６１を含む。さらなる態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、トウモロコシまたはイネのＰＬＴＰプロモーターである。さらなる態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、トウモロコシのＰＬＴＰプロモーターである。さらなる態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、イネのＰＬＴＰプロモーターである。一態様では、ＰＬＴＰプロモーターは、配列番号１または２を含む。ＰＬＴＰプロモーターはまた、例えば、限定はされないが、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタなどの双子葉植物由来であり得る。これに関連して有用な他の発生調節プロモーターとしては、ＬＧＬ、ＬＥＡ−１４ＡおよびＬＥＡ−Ｄ３４が挙げられる。ある特定の態様では、本方法に有用な他のプロモーターとして、配列番号２８〜４０、８１〜８３、８６〜８８、および１０６のいずれか１つが挙げられる。
【００７４】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされ；２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１８、２０、６３、６５および６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つを含むヌクレオチド配列によってコードされる方法を含む。
【００７５】
再生可能な植物構造体は、形質転換から約０〜７日または約０〜１４日以内に作製される。一態様では、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、再生可能な植物構造体の形成を促進することができる。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、再生可能な植物構造体の形成を促進することができる。
【００７６】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＯＤＰ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含み；ＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含むか；またはＷＵＳ２ポリペプチドが配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされ；ＯＤＰ２ポリペプチドが配列番号１８、６３、６５もしくは６７のアミノ酸配列を含むか；または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号１７、２１、６２、６４、６６および６８のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる方法を含む。
【００７７】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を含む。
【００７８】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を含む。
【００７９】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を含む。
【００８０】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を含む。
【００８１】
本明細書中の用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子、およびこれらの子孫を指す。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子由来の細胞が挙げられる。
【００８２】
植物部には、分化組織および未分化組織が含まれ、それらの組織としては、次のものに限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）が挙げられる。植物組織は、植物であっても、植物の器官、組織、もしくは細胞培養物であってもよい。
【００８３】
本開示はまた、本明細書に開示の方法および組成物のいずれかで得られた植物を含む。
【００８４】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物の生産方法であって、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、約１４日〜約６０日でトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法を含む。
【００８５】
本開示はまた、本明細書に開示の方法および組成物のいずれかで得られた植物の種子を含む。
【００８６】
一態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成するための説明書とを含むキットを含む。
【００８７】
一態様では、本開示は、（ａ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成するための説明書とを含むキットを含む。
【００８８】
一態様では、本開示は、（ａ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトと；（ｂ）外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を得る（但し、カルスは形成されない）ための説明書と；（ｃ）再生可能な植物構造体を発芽させて、トランスジェニック植物を形成するための説明書とを含むキットを含む。
【００８９】
本開示のキットはさらに、再生可能な植物構造体を発芽させて、外植体の形質転換後、約１４日〜約６０日以内でトランスジェニック植物を形成するための説明書を含むことができる。
【００９０】
ＩＩ．ＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインタンパク質（ＯＤＰ２／ＢＢＭ）
本開示の方法は、胚珠発育タンパク質２（ＯＤＰ２）ポリペプチド、および、例えばベビーブーム（Ｂａｂｙｂｏｏｍ）（ＢＢＭ）タンパク質ファミリータンパク質などの関連ポリペプチドの、ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２、ＢＢＭ２、ＢＭＮ２またはＢＭＮ３ポリペプチドである。本開示のＯＤＰ２ポリペプチドは、２つの予測ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）ドメインを含み、ＡＰ２タンパク質ファミリーに属する（ＰＦＡＭアクセッション  ＰＦ００８４７）。トウモロコシＯＤＰ２ポリペプチドのＡＰ２ドメインは、配列番号２のアミノ酸の略Ｓ２７３〜Ｎ３４３および略Ｓ３７５〜Ｒ４３７に位置している。推定転写因子のＡＰ２ファミリーは、広範な発達プロセスを調節することがわかっており、ファミリーのメンバーは、ＡＰ２  ＤＮＡ結合ドメインを有することを特徴としている。この保存コアはＤＮＡに結合する両親媒性のアルファヘリックスを形成すると予想される。ＡＰ２ドメインは最初にＡＰＥＴＡＬＡ２、すなわち、分裂組織の決定、花器の特定、種皮の発達、および花芽のホメオティック遺伝子の発現を調節するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のタンパク質で確認された。今では、ＡＰ２ドメインは様々なタンパク質で見出されている。
【００９１】
本開示のＯＤＰ２ポリペプチドは、ＡＰ２ファミリーのいくつかのポリペプチドと相同性を共有する（例えば、米国特許第８４２０８９３号明細書の図１を参照されたい（この文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれ、そこには２つのＡＰ２ドメインを有する８種の他のタンパク質と共に、トウモロコシおよびイネのＯＤＰ２ポリペプチドのアライメントが示されている）。米国特許第８４２０８９３号明細書のアライメントに示されている全タンパク質のコンセンサス配列もまた、その図１に示されている。
【００９２】
２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物由来であり得る。各種態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギ由来である。一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、キビ、ソルガム、コムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種またはイネ由来である。さらなる態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。またさらなる態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。さらなる態様では、単子葉植物はトウモロコシである。さらなる態様では、単子葉植物はイネである。
【００９３】
２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物由来であり得る。２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタ由来であり得る。
【００９４】
２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属する植物由来であり得る。２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが由来し得る好適な植物の非限定的な例としては、限定はされないが、オオムギ、トウモロコシ（トウモロコシ）、カラスムギ、イネ、ライムギ、ソルガム、コムギ、キビ、ライコムギなどの穀類；限定はされないが、タケ、マーラム、タチイチゴツナギ、アシ、ライグラス、サトウキビなどの葉茎作物；シバ（ｌａｗｎ  ｇｒａｓｓ）、パンパスグラス、ならびに、スイッチグラスおよびシバ（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）などのその他の草が挙げられる。
【００９５】
さらなる態様において、本開示の方法で使用される２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、高等植物、例えば、被子植物綱（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）および裸子植物綱（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）などを含む任意の植物由来であり得る。双子葉植物亜綱（Ｄｉｃｏｔｙｌｏｄｅｎａｅ）および単子葉植物亜綱（Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｅ）の植物が好適である。好適な種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）およびブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。
【００９６】
２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが由来し得る好適な種としては、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）に属するものが挙げられる。
【００９７】
さらなる態様において、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、農業、園芸、液体燃料分子および他の化学物質の製造するためのバイオマス、ならびに／または林業にとって重要な、または興味深い植物由来であり得る。非限定的な例として、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ワタ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）（トウジンビエ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）種、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）種、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ヒロハノウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）、タケ、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（レタス）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔ���ｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャ）、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ココア）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ）（トウガラシ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（タマネギ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（メロン）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）（カボチャ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（カボチャ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチゴ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）、キナノキ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、ベラトラム・カリフォルニカ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ）（＝トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、インドジャボク属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、アカネグサ（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ナツシロギ���（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ゴム）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）、アルストロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）種（ペチュニア）、ポインセチア（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ルピン）、ウニオラ・パニクラータ（Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（アスペン）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（カエデ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（バーリー）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）（ティモシー）、および球果植物が挙げられる。興味深いのは、エネルギー生成のために生育する植物、いわゆるエネルギー作物であり、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（トールフェスク）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）およびタケ（Ｂａｍｂｏｏ）などのセルロース系エネルギー作物、ならびにトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）お���びキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）などのデンプン系エネルギー作物、ならびにサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、およびテンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）などの糖系エネルギー作物、ならびにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）などのバイオディーゼル生成エネルギー作物である。
【００９８】
２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、バイオマス再生可能エネルギー源植物由来であり得る。バイオマス再生可能エネルギー源植物の例としては、上記のものが挙げられる。
【００９９】
特に、本開示は、配列番号１８、２０、６３、６５および６７に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。さらに、本明細書に記載の核酸分子（配列番号１７、１９、２１、６２、６４、６６および６８）によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、その断片および多様体が提供される。
【０１００】
一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＯＤＰ２ポリペプチドである。さらなる態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチド由来である。ある特定の態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、トウモロコシ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、サトウキビ、キビ、ソルガム、コムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種またはイネ由来である。一態様では、ＯＤＰ２ポリペプチドは、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種由来である。一態様ではＯＤＰ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネ由来である。ある特定の態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドはトウモロコシ由来である。ある特定の態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドはイネ由来である。さらなる態様においては、ＯＤＰ２ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチド由来である。ある特定の態様において、ＯＤＰ２ポリペプチドは、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタ由来である。本開示の方法および組成物の発現コンストラクトによって発現するＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１８、６３、６５または６７を含むポリペプチドであり得る。ＯＤＰ２ポリペプチドは、配列番号１７、２１、６２、６４、６６または６８ポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０１０１】
一態様では、２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドは、ＢＢＭ２ポリペプチドである。ＢＢＭ２ポリペプチドは、限定はされないが、トウモロコシ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、サトウキビ、キビ、ソルガム、コムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種またはイネなどの単子葉植物のポリペプチドである。ある特定の態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種である。さらなる特定の態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。またさらに特定の態様において、単子葉植物はトウモロコシである。あるいは、ＢＢＭ２ポリペプチドは、限定はさないが、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタなどの双子葉植物のポリペプチドであり得る。一態様では、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ＢＢＭ２ポリペプチドは、配列番号１９の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１０２】
本開示は、単離された、または実質的に精製された核酸またはタンパク質ＯＤＰ２／ＢＢＭ組成物を包含する。「単離された」または「精製された」核酸分子またはタンパク質、あるいはその生物活性部分は、その天然の環境で見出される核酸分子またはタンパク質に通常付随または相互作用する構成要素を実質的または基本的に含んでいない。したがって、単離または精製された核酸分子またはタンパク質は、組み換え技術によって生成されたときには、他の細胞物質または培地を含んでおらず、また、化学的に合成された場合には、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含んでいない。最適には、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接している配列（最適には、タンパク質コード配列）（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を有していない。例えば、各種態様において、単離された核酸分子が含有する、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、天然では核酸に隣接しているヌクレオチド配列は、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満であり得る。細胞物質を実質的に含んでいないタンパク質としては、夾雑タンパク質の含有量が約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）のタンパク質調製物が挙げられる。本開示のタンパク質、またはその生物活性部分が組み換え技術によって作られた場合、最適には、培養培地中の前駆的化学物質または非目的タンパク質の化学物質は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量で）である。
【０１０３】
開示のヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるタンパク質の断片および多様体もまた、本開示に包含される。「断片」は、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、およびしたがってそれによってコードされるタンパク質を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、天然のタンパク質の生物活性を保持しており、したがってＯＤＰ２活性を有しているタンパク質断片をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物活性を保持している断片タンパク質を一般にコードしない。したがって、ヌクレオチド配列の断片は、その範囲が、少なくとも約２０個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチドから、本開示のタンパク質をコードする完全長のヌクレオチド配列にまで及び得る。
【０１０４】
「ＯＤＰ２活性」、すなわち「Ｏｖｕｌｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２活性」は、ＯＤＰ２ポリペプチドが以下に例示する活性の少なくとも１つを有することを意味する：植物細胞の再生能力の増大、植物細胞の胚発生、植物細胞の形質転換効率の増大、植物細胞の油分の改質、ＤＮＡへの結合、非生物的ストレスに対する耐性の増大、非生物的ストレス下での  収穫量の増大もしくは維持、無性胚形成の増大、デンプン成分の改質、胚サイズの変更または転写の活性化。そのような活性の測定方法は、当該技術分野で知られており、以下により詳しく説明する。
【０１０５】
本開示のＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質の生物活性部分をコードするＯＤＰ２／ＢＢＭヌクレオチド配列の断片は、少なくとも１５個、２５個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７０９個の隣接するアミノ酸、または最大で、本開示の完全長のＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質に存在する全アミノ酸をコードするであろう。ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なＯＤＰ２ヌクレオチド配列の断片は、一般に、ＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質の生物活性部分をコードする必要はない。
【０１０６】
したがって、ＯＤＰ２／ＢＢＭヌクレオチド配列の断片は、ＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質の生物活性部分をコードするか、あるいは、以下に開示する方法によりハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用し得る断片であり得る。ＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質の生物活性部分は、本開示のＯＤＰ２／ＢＢＭヌクレオチド配列の１つの一部を単離し、ＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質のコード部分を発現させ（例えば、インビトロでの組み換え発現により）、そして、ＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質のコード部分の活性を評価することにより調製することができる。ＯＤＰ２／ＢＢＭヌクレオチド配列の断片の核酸分子は、少なくとも１６個、２０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，１００個、１，２００個、１，３００個、１，４００個、１，５００個、１，６００個、１，７００個、１，８００個、１，９００個、２，０００個、２，１００個、２，２００個の隣接するヌクレオチド配列、または最大で、本明細書に開示の完全長のＯＤＰ２／ＢＢＭヌクレオチド配列（例えば、配列番号１７、１９および２１）に存在する全ヌクレオチドを含む。
【０１０７】
「多様体」は、実質的に類似した配列を意味するものである。ポリヌクレオチドでは、多様体は、天然ポリヌクレオチドの１つ以上の内部部位での１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加、ならびに／あるいは天然ポリヌクレオチドの１つ以上の部位での１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用する場合、「天然の」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドでは、保護多様体は、遺伝子コードの縮重のため、本開示のＯＤＰ２／ＢＢＭポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。ＯＤＰ２／ＢＢＭ２ポリヌクレオチド多様体はまた、例えば、部位特異的変異誘発法により生成されたもの（しかし、本開示のＯＤＰ２タンパク質を依然としてコードする）など、合成で誘導されたポリヌクレオチドを含む。一般に、開示されたある特定のポリヌクレオチドの多様体は、本明細書の他の箇所に記載された配列アライメントプログラムおよびパラメータによる決定で、その特定のポリヌクレオチドに対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。
【０１０８】
「多様体」は、天然タンパク質の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加、ならびに／あるいは天然タンパク質の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換により、天然タンパク質から生成されるタンパク質を意味するものである。本開示に包含される多様体タンパク質は、生物活性を有する。すなわち、それらは、天然タンパク質に必要な生物活性を保持している、すなわち、そのポリペプチドは、本明細書に記載したような、ＯＤＰ２／ＢＢＭ活性（すなわち、植物の再生能力の調節、植物の胚発生、植物の形質転換効率の増大、植物の油分の改質、細胞増殖の増大、非生物的ストレスに対する耐性の増大、非生物的ストレス下での収穫量の増大もしくは維持、無性胚形成の増大、ＤＮＡへの結合または転写の調節）を有している。そのような多様体は、例えば、遺伝的多型、または人工的操作により生じ得る。生物活性を有する本開示の天然ＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質の多様体は、本明細書の他の箇所に記載された配列アライメントプログラムおよびパラメータによる決定で、天然タンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。生物活性を有する本開示のタンパク質の多様体は、そのタンパク質と、僅かに１〜１５個のアミノ酸残基、僅かに１〜１０個、例えば６〜１０個、僅かに５個、僅かに４個、３個、２個、またはたった１個のアミノ酸残基だけで異なっていることがある。
【０１０９】
本開示のＯＤＰ２／ＢＢＭタンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション、融合および挿入などの様々な方法で改変することができる。そのような操作の方法は、当該技術分野で一般に知られている。例えば、ＯＤＰ２タンパク質のアミノ酸配列多様体は、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異を誘発する方法やヌクレオチド配列を改変する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ、ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）および、本明細書中で引用されている参考文献を参照されたい。目的タンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）で見出すことができる。１つのアミノ酸を、それと類似の特性を有する他のアミノ酸と交換するような保存置換が最適であり得る。
【０１１０】
ＩＩＩ．ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチド
本開示の方法は、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。Ｗｕｓｃｈｅｌタンパク質（以下、ＷＵＳという）は、多能性幹細胞プールを含む頂端分裂組織の開始および維持に重要な役割を果たす（Ｅｎｄｒｉｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：９６７−９７９；Ｌａｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：８７−９６；およびＭａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：８０５−８１５）。ＷＵＳ遺伝子用のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物変異体は、特定されておらず、分化するように見える幹細胞を含む。ＷＵＳは、転写調節因子として機能すると推定される新規のホメオドメインタンパク質をコードする（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｅｌｌ９５：８０５−８１５）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）シュート分裂組織の幹細胞集団は、器官の開始を促進するＣＬＡＶＡＴＡ（ＣＬＶ）遺伝子と幹細胞同一性に必要なＷＵＳ遺伝子との間の調節ループによって維持される（ＣＬＶ遺伝子が転写レベルでＷＵＳを抑制し、ＷＵＳが分裂組織細胞同一性と幹細胞マーカーＣＬＶ３の発現を十分に誘導し得るだけ発現する）と考えられている（Ｂｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：６１７−６１９；Ｓｃｈｏｏｆ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：６３５−６４４）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＷＵＳの構成的発現が葉からの不定のシュート増殖（植物内で）に導くことが示された（Ｌａｕｘ，Ｔ．，第ＸＶＩ回国際植物科学会議（ｔｈｅ  ＸＶＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｍｅｅｔｉｎｇ），Ａｕｇ．１−７，１９９９，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．での発表）。
【０１１１】
一態様では、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１、ＷＵＳ２、ＷＵＳ３、ＷＯＸ２Ａ、ＷＯＸ４、ＷＯＸ５またはＷＯＸ９ポリペプチドである（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｒａａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：２４８）。ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、単子葉植物のＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドであり得る。各種態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギのＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドであり得る。あるいは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、双子葉植物のＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドであり得る。特に、本開示は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。さらに、本明細書に記載の核酸分子（配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５）によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、その断片および多様体が提供される。
【０１１２】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属する植物由来であり得る。ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが由来し得る好適な植物の非限定的な例としては、限定はされないが、オオムギ、トウモロコシ（トウモロコシ）、カラスムギ、イネ、ライムギ、ソルガム、コムギ、キビ、ライコムギなどの穀類；限定はされないが、タケ、マーラム、タチイチゴツナギ、アシ、ライグラス、サトウキビなどの葉茎作物；シバ（ｌａｗｎ  ｇｒａｓｓ）、パンパスグラス、ならびに、スイッチグラスおよびシバ（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）などのその他の草が挙げられる。
【０１１３】
さらなる態様において、本開示の方法で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、高等植物、例えば、被子植物綱（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）および裸子植物綱（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）などを含む任意の植物由来であり得る。双子葉植物亜綱（Ｄｉｃｏｔｙｌｏｄｅｎａｅ）および単子葉植物亜綱（Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｅ）の植物が好適である。好適な種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）およびブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。
【０１１４】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドが由来し得る好適な種としては、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）に属するものが挙げられる。
【０１１５】
さらなる態様において、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、農業、園芸、液体燃料分子および他の化学物質の製造するためのバイオマス、ならびに／または林業にとって重要な、または興味深い植物由来であり得る。非限定的な例として、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ワタ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）（トウジンビエ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）種、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）種、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ヒロハノウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）、タケ、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅ  ｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（レタス）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏ���ｕｍ）（ジャガイモ）、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャ）、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ココア）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ）（トウガラシ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（タマネギ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（メロン）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）（カボチャ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（カボチャ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチゴ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）、キナノキ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、ベラトラム・カリフォルニカ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ）（＝トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、インドジャボク属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、アカネグサ（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ナツシロギク（Ｃｈｒ���ｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ゴム）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）、アルストロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）種（ペチュニア）、ポインセチア（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ルピン）、ウニオラ・パニクラータ（Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（アスペン）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（カエデ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（バーリー）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）（ティモシー）、および球果植物が挙げられる。興味深いのは、エネルギー生成のために生育する植物、いわゆるエネルギー作物であり、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（トールフェスク）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）およびタケ（Ｂａｍｂｏｏ）などのセルロース系エネルギー作物、ならびにトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウモロコシ）およびキャッサ���（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）などのデンプン系エネルギー作物、ならびにサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、およびテンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）などの糖系エネルギー作物、ならびにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）などのバイオディーゼル生成エネルギー作物である。
【０１１６】
ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、バイオマス再生可能エネルギー源由来であり得る。バイオマス再生可能エネルギー源植物の例としては、上記のものが挙げられる。
【０１１７】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ１ポリペプチドであり得る。一態様では、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ１ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ１ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＵＳ１ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ１ポリペプチドである。特に、ＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはＷＵＳ１ポリペプチドは、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１８】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ２ポリペプチドであり得る。各種態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギのＷＵＳポリペプチドである。一態様では、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ２ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＵＳ２ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ２ポリペプチドである。特に、ＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはＷＵＳ２ポリペプチドは、配列番号５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１９】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＵＳ３ポリペプチドであり得る。一態様では、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＵＳ３ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ３ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＵＳ３ポリペプチドは、トウモロコシのＷＵＳ３ポリペプチドである。特に、ＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはＷＵＳ３ポリペプチドは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２０】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ２Ａポリペプチドであり得る。一態様では、ＷＯＸ２Ａポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ２Ａポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ２Ａポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ２Ａポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ２Ａポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ２Ａポリペプチドである。特に、ＷＯＸ２Ａポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または配列番号９を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２１】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ４ポリペプチドであり得る。一態様では、ＷＯＸ４ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ４ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ４ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ４ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ４ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ４ポリペプチドである。特に、ＷＯＸ４ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１１を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２２】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ５Ａポリペプチドであり得る。一態様では、ＷＯＸ５Ａポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ５Ａポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ５Ａポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ５Ａポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ５Ａポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ５Ａポリペプチドである。特に、ＷＯＸ５Ａポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１３を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２３】
本開示の方法および組成物で使用されるＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドは、ＷＯＸ９ポリペプチドであり得る。一態様では、ＷＯＸ９ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）種のＷＯＸ９ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ９ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのＷＵＳ９ポリペプチドである。さらなる態様において、ＷＯＸ９ポリペプチドは、トウモロコシのＷＯＸ９ポリペプチドである。特に、ＷＯＸ９ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１５を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２４】
本開示は、単離された、または実質的に精製された核酸またはタンパク質ＷＵＳ／ＷＯＸ組成物を包含する。ＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるタンパク質の断片および多様体もまた、本開示に包含される。「断片」は、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、およびしたがってそれによってコードされるタンパク質を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、天然のタンパク質の生物活性を保持しており、したがってＷＵＳ／ＷＯＸ活性を有しているタンパク質断片をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物活性を保持している断片タンパク質を一般にコードしない。したがって、ヌクレオチド配列の断片は、その範囲が、少なくとも約２０個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチドから、本開示のタンパク質をコードする完全長のヌクレオチド配列にまで及び得る。
【０１２５】
本開示のＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質の生物活性部分をコードするＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列の断片は、少なくとも１５個、２５個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７０９個の隣接するアミノ酸、または最大で、本開示の完全長のＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質に存在する全アミノ酸をコードするであろう。ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列の断片は、一般に、ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質の生物活性部分をコードする必要はない。
【０１２６】
したがって、ＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列の断片は、ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質の生物活性部分をコードするか、あるいは、以下に開示する方法によりハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用し得る断片であり得る。ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質の生物活性部分は、本開示のＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列の１つの一部を単離し、ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質のコード部分を発現させ（例えば、インビトロでの組み換え発現により）、そして、ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質のコード部分の活性を評価することにより調製することができる。ＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列の断片の核酸分子は、少なくとも１６個、２０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、８００個、９００個、１，０００個、１，１００個、１，２００個、１，３００個、１，４００個、１，５００個、１，６００個、１，７００個、１，８００個、１，９００個、２，０００個、２，１００個、２，２００個の隣接するヌクレオチド配列、または最大で、本明細書に開示の完全長のＷＵＳ／ＷＯＸヌクレオチド配列（例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５）に存在する全ヌクレオチドを含む。
【０１２７】
「多様体」は、実質的に類似した配列を意味するものである。ポリヌクレオチドでは、保護多様体は、遺伝子コードの縮重のため、本開示のＷＵＳ／ＷＯＸポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。ポリヌクレオチド多様体はまた、例えば、部位特異的変異誘発法により生成されたもの（しかし、本開示のＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質を依然としてコードする）など、合成で誘導されたポリヌクレオチドを含む。一般に、開示されたある特定のポリヌクレオチドの多様体は、本明細書の他の箇所に記載された配列アライメントプログラムおよびパラメータによる決定で、その特定のポリヌクレオチドに対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。
【０１２８】
「多様体」は、天然タンパク質の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加、ならびに／あるいは天然タンパク質の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換により、天然タンパク質から生成されるタンパク質を意味するものである。本開示に包含される多様体タンパク質は、生物活性を有する。すなわち、それらは、天然タンパク質に必要な生物活性を保持している、すなわち、そのポリペプチドは、ＷＵＳ／ＷＯＸ活性を有している。そのような多様体は、例えば、遺伝的多型、または人工的操作により生じ得る。本開示の天然ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質の生物活性を有する多様体は、本明細書の他の箇所に記載された配列アライメントプログラムおよびパラメータによる決定で、天然タンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。生物活性を有する本開示のタンパク質の多様体は、そのタンパク質と、僅かに１〜１５個のアミノ酸残基、僅かに１〜１０個、例えば６〜１０個、僅かに５個、僅かに４個、３個、２個、またはたった１個のアミノ酸残基だけで異なっていることがある。
【０１２９】
本開示のＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション、融合および挿入などの様々な方法で改変することができる。そのような操作の方法は、当該技術分野で一般に知られている。例えば、ＷＵＳ／ＷＯＸタンパク質のアミノ酸配列多様体は、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異を誘発する方法やヌクレオチド配列を改変する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ、ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）および、本明細書中で引用されている参考文献を参照されたい。目的タンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）で見出すことができる。１つのアミノ酸を、それと類似の特性を有する他のアミノ酸と交換するような保存置換が最適であり得る。
【０１３０】
ＩＶ．形質転換方法
本開示の方法および組成物は、様々な形質転換の方法に適宜使用することができる。すなわち、形質転換のプロトコル、およびヌクレオチド配列を植物へ導入するためのプロトコルは、形質転換の標的とする植物または植物細胞の種類に応じて、すなわち、単子葉植物であるか双子葉植物であるかに応じて変えることができる。ヌクレオチド配列の植物細胞への導入、およびその後の植物ゲノムへの挿入に好適な方法としては、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション法（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：５６０２−５６０６、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５６３，０５５号明細書、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９８１，８４０号明細書）、遺伝子直接導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）および弾道粒子加速法（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，９４５，０５０号明細書、Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８７９，９１８号明細書、Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８８６，２４４号明細書、Ｂｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９３２，７８２号明細書、Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、”ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；およびＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照）が挙げられる。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７、Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７−３７（タマネギ）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）、ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）、Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）、Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（���ウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓの米国特許第５，２４０，８５５号明細書、Ｂｕｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，３２２，７８３号明細書および同第５，３２４，６４６号明細書、Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、”ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）、Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４、Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））、Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ、ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５およびＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（イネ）、Ｏｓｊｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（トウモロコシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による）（これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０１３１】
本開示の方法および組成物は、限定はされないが、単子葉植物および双子葉植物などの、任意の植物種の形質転換に使用することができる。目的とする植物種の例としては、限定はされないが、トウモロコシ（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、特に、種子油源として有用なアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、イネ（イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（例えば、トウジンビエ（トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）））、ヒマワリ（ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ））、ベニバナ（ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、コムギ（パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））、タバコ（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ラッカセイ（ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ））、ワタ（海島綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、サツマイモ（サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）種）、ココナッツ（ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ））、パイナップル（パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ））、カンキツ樹（ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））、チャ（チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（バショウ属（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ））、グアバ（グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイア（パパイア（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ））、カシュー（カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、テンサイ（テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ（サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種）、カラスムギ、オオムギ、野菜類、観賞植物および球果植物が挙げられる。
【０１３２】
野菜類としては、トマト（トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、レタス（例えば、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ））、サヤマメ（インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、ライマメ（ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ））、エンドウマメ（レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種）、ならびに、キュウリ（キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ））、カンタロープ（ククミス・カンタルペンシス（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ））、およびマスクメロン（メロンＣ．ｍｅｌｏ））などのキュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）に属するものが挙げられる。観賞植物としては、アザレア（ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種）、アジサイ（アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ））、バラ（バラ属（Ｒｏｓａ）種）、チューリップ（チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）種）、ラッパズイセン（スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種）、ペチュニア（ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ））、カーネーション（カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ポインセチア（ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））、およびキクが挙げられる。
【０１３３】
本開示を実施するにあたり使用可能な球果植物としては、例えば、テーダマツ（テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ））、およびモントレーパイン（ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ））などのマツ；ダクラスファー（ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；カナダツガ（カナダツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；アメリカツガ（アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ））；マウンテンヘムロック（マウンテンヘムロック（Ｔｓｕｇａ  ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ））；アメリカカラマツまたはカラマツ（ラリックス・オキシデンタリス（Ｌａｒｉｘ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））；ベイトウヒ（カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ））；セコイア（セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ））およびバルサムモミ（バルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ））などのトゥルーモミ；ならびにベイスギ（ベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ））およびイエローシーダー（イエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））などのシーダーが挙げられる。ユーカリ種、例えば、ユーカリプツス・グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）（および、その交配種「ウロガンディス（ｕｒｏｇｒａｎｄｉｓ）」）、ユーカリ・グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、ユーカリ・テレチコルニス（Ｅ．ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ）、ユーカリ・ビミナリス（Ｅ．ｖｉｍｉｎａｌｉｓ）、ユーカリ・ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、ユーカリ・サリグナ（Ｅ．ｓａｌｉｇｎａ）およびユーカリ・ウロフィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）を、本開示の実施において使用することができる。本開示の植物は、好ましくは、作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、ソルガム、コムギ、キビ、タバコなど）であり、より好ましくは、トウモロコシ植物およびダイズ植物であり、より一層好ましくは、トウモロコシ植物である。
【０１３４】
特に目的とする植物としては、目的とする種子を提供する穀物植物、油糧種子植物およびマメ科植物が挙げられる。目的とする種子としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギなどの穀物の種子が挙げられる。油糧種子植物としては、限定はされないが、ワタ、ダイズ、ベニバナ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツなどが挙げられ、マメ科植物としては、マメおよびエンドウマメが挙げられる。マメとしては、限定はされないが、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、およびヒヨコマメが挙げられる。
【０１３５】
選択マーカーは、多くの場合、特定の条件下で、ある分子またはこの分子を含む細胞を同定または選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、活性（限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生など）をコードすることができる、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機の化合物もしくは組成物などの結合部位を提供することができる。選択マーカーの例としては、限定はされないが、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；他の毒性化合物に耐性を示す産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）などの抗生物質）；受容細胞において別に欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定することができる産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳなどの表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質；および細胞表面タンパク質など）；新しいＰＣＲ用プライマー部位の世代（例えば、前に並置されていない２つのＤＮＡ配列の並列）；制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質などの作用を受けていない、または作用を受けたＤＮＡ配列の含有物、ならびに、同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）に要求されるＤＮＡ配列の含有物が挙げられる。
【０１３６】
選択マーカーのさらなる例としては、グリホサート、スルホニル尿素、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノンおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）などの除草化合物に耐性を付与する遺伝子が挙げられる。一般に、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８、Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：２４１９−２４２２、Ｂａｒｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ、ｐｐ．１７７−２２０、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２、Ｆｉｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２５４９−２５５３、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｒｅｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１、Ｌａｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６、Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６、Ｂａｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３、Ｈｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２、Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９、Ｈｌａｖｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−７２４）を参照されたい。そのような開示は参照により本明細書に組み込まれる。上に掲げた選択マーカーは、それらに限定することを意図するものではない。本方法および組成物においては、任意の選択マーカーを使用することができる。
【０１３７】
この記載の方法における体細胞胚発生および胚成熟の期間は非常に短縮されているので、したがって、選択レジームは、非トランスジェニック胚および得られる発芽したＴ０植物を効率良く取り除くために迅速に起こらなければならない。その結果、短期間にわたり、選択剤のストリンジェンシーに応じて、「エスケープ」（すなわち、野生型の再生Ｔ０植物）が増加する。エスケープを取り除くために、穀類のトランスジェニックイベントの従来のインビトロでの選択は、１．５〜３ヶ月の間に起こり、選択培地上の多数の継体培養は再生に十分なカルス組織を蓄積する必要があった（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８、Ｎｅｇｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．８，３２３−３３３、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．５０：９−１８；Ｋａｎ  Ｗａｎｇ，２０１４，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．１，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｆｏｒ  ｒｅｖｉｅｗを参照）。本開示は、カルス培養を除外することによって、この長期の選択の多くを除き、代わりに、迅速に働く選択剤を必要とする、迅速な胚発生および独立したＴ０植物（それぞれが個別の統合イベントを示す）への発芽を直接進行させる。
【０１３８】
本方法に有用な選択マーカーとしては、限定はされないが、スルホニル尿素およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するトウモロコシのＨＲＡ遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：１２４１−１２４８）、グリホサートに対する耐性を付与するＧＡＴ遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１１５１−１１５４）、ａａｄＡ遺伝子などの、スペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４：１９７−２０５）、およびグルホシネートアンモニウムに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１０６２）が挙げられ、ＰＡＴ（または、トウモロコシのためのｍｏＰＡＴ（Ｒａｓｃｏ−Ｇａｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２１：５６９−７６を参照））、およびマンノース含有培地での成長を許容するＰＭＩ遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２２：６８４−６９０）は、本方法の体細胞胚形成および胚成熟に含まれる短い経過時間における迅速な選択に非常に有用である。しかしながら、使用する選択マーカーや、形質転換されている作物、近交系または種に応じて、野生型エスケープの割合は変わり得る。トウモロコシおよびソルガムでは、ＨＲＡ遺伝子は、野生型エスケープの頻度の低減に有効である。
【０１３９】
Ｖ．植物の形質および特性を向上させる方法
本開示は、高効率かつ高速で形質転換されたトランスジェニック植物を産生するための新規な組成物および方法を提供する。本開示の方法および組成物は、さらに、良好な形質および特性を与えるポリヌクレオチドを含む。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「形質」は、植物、または特定の植物材料もしくは植物細胞の生理学的、形態学的、生化学的または物理的特性を指す。いくつかの例において、この特性は、種子または植物体の大きさなど、ヒトの目で視ることができ、あるいは、種子もしくは葉に含まれるタンパク質、デンプンもしくは油の量を検出するなどの生化学的手法により、例えば、二酸化炭素の取り込み量を測定することによって、代謝もしくは生理的プロセスを観察することにより、例えば、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイ、もしくはレポーター遺伝子発現システムを使用して、遺伝子もしくは遺伝子群の発現レベルを観察することにより、または、ストレス耐性、収量、病原体耐性などの農学的観察により測定することができる。本開示の態様の記載の中で使用する「形質の強化」には、水使用効率もしくは耐乾性の改善もしくは強化、浸透圧ストレス耐性、高塩分ストレス耐性、熱ストレス耐性、低温発芽耐性などの耐寒性の増大、収穫量の増大、窒素利用効率の強化、植物の早い成長および発達、植物の遅い成長および発達、種子タンパク質の増大、ならびに種子油の生産性の増大が含まれる。
【０１４１】
本開示の方法には任意の目的ポリヌクレオチドを使用することができる。目的とする表現型の様々な変化としては、植物中の脂肪酸組成の変更、植物のアミノ酸含有量、デンプン含有量または炭水化物含有量の改変、植物の病原体防御機構の改変、実サイズの変更、スクロースの付加などが挙げられる。目的遺伝子はまた、栄養の取り込みの調節、およびフィチン酸塩遺伝子の発現の調節、特に、種子中のフィチン酸塩濃度を低下させるような調節に関与していてもよい。これらの結果は、植物において異種産物を発現させることにより、または内因性産物の発現を増大させることにより得ることができる。あるいは、これらの結果は、１種以上の内因性産物、特に、植物中の酵素または補因子の発現を低減させることにより得ることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。
【０１４２】
目的遺伝子は、商業市場、および作物の開発に従事している者の関心を反映している。目的とする作物や市場が変わり、国の発展が世界市場を切り開くにつれ、新しい作物や技術もまた出現してくるであろう。さらに、収量や雑種強勢などの農学上の形質や特性に対する理解が深まるにつれ、形質転換のための遺伝子の選択もそれに応じて変化するであろう。目的遺伝子の一般的なカテゴリーとしては、例えば、ジンクフィンガーなどの情報に関与する遺伝子、キナーゼなどの伝達に関与する遺伝子、および熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関与する遺伝子が挙げられる。導入遺伝子のより具体的なカテゴリーとしては、例えば、農学、虫害抵抗性、病気抵抗性、除草剤抵抗性、不稔性、穀類特性および商業生産に重要な形質をコードする遺伝子が挙げられる。目的遺伝子としては、一般に、油、デンプン、炭水化物、または栄養の代謝に関与するもの、ならびに、実サイズ、スクロース量に影響するものが挙げられる。
【０１４３】
本開示の方法および組成物により外植体に導入されたポリヌクレオチドは、適切なプロモーターに作動可能に連結することができる。「プロモーター」は、転写開始点の上流のＤＮＡ領域を意味し、ＲＮＡポリメラーゼ、および転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与しており、５’ＵＴＲを含むかまたは含まない。「植物プロモーター」は、それが植物細胞由来であるか否かに関わりなく、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターである。植物プロモーターの例としては、限定はされないが、植物、植物ウイルス、ならびにアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）からなどの植物細胞で発現する遺伝子を含む細菌から得られるものが挙げられる。発生制御下のプロモーターの例としては、葉、根または種子などの特定の組織で優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは「組織優先的」を呼ばれる。特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、１種以上の器官の特定の細胞型、例えば根または葉の血管細胞における発現を主に駆動する。「誘導性」または「抑制性」プロモーターは、環境制御または外的制御下にあるプロモーターであり得る。誘導性プロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、嫌気的条件、特定の化学物質、または光の存在が挙げられる。あるいは、誘導性または抑制性のプロモーターの外的制御は、標的ポリペプチドとの相互作用によって、プロモーターを誘導または抑制する、適切な化学物質または他の薬剤を与えることによって影響され得る。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーター類を構成する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの条件下で活性を有するプロモーターである。本明細書で使用する場合、「アンチセンス配向」は、アンチセンス鎖が転写される方向で、プロモーターに作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列を指す。アンチセンス鎖は、内因性転写産物に十分に相補的であり、そのため内因性転写産物の翻訳は多くの場合抑制される。「作動可能に連結している」とは、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片が、１つの断片の機能が他の断片に影響されるような関係にあることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【０１４４】
油、デンプンおよびタンパク質の含有量などの農学的に重要な形質は、従来の育種方法に加え、遺伝子的に改変することができる。変更には、オレイン酸、飽和油および不飽和油の含有量の増加、リシンおよび硫黄濃度の上昇、必須アミノ酸の提供、またデンプンの変更が含まれる。ホルドチオニンタンパク質は、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第、５，８８５，８０２号明細書および同第５，９９０，３８９号明細書に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。他の例としては、米国特許第５，８５０，０１６号明細書に記載のダイズ２Ｓアルブミンによりコードされるリシンおよび／または硫黄リッチ種子タンパク質、ならびにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６に記載の、オオムギ由来のキモトリプシン阻害剤がある（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４５】
コード配列の誘導体は、予め選択したアミノ酸の、コードされたポリペプチドにおける濃度を高めるため、部位特異的変異誘発法によって作ることができる。例えば、ヒマワリの種子（Ｌｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．）、ｐｐ．４９７−５０２；この文献は参照により本明細書に組み込まれる）；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７１：３５９；これらの両文献は参照により本明細書に組み込まれる）；およびイネ（Ｍｕｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）などからのメチオニンリッチ植物タンパク質を使用することができよう。他の農学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ  ２、成長因子、種子貯蔵因子および転写因子をコードする。
【０１４６】
虫害抵抗性遺伝子は、穀粒収穫量の低下（ｙｉｅｌｄ  ｄｒａｇ）をもたらす根切り虫、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガなどの害虫に対する耐性をコードすることができる。このような遺伝子としては、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書、同第５，７４７，４５０号明細書、同第５，７３６，５１４号明細書、同第５，７２３，７５６号明細書、同第５，５９３，８８１、およびＧｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９）などが挙げられる。病気抵抗性形質をコードする遺伝子としては、解毒遺伝子、例えばフモニシンに対する解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）；非病原性（ａｖｒ）および病気抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）などが挙げられる。
【０１４７】
除草剤抵抗性形質としては、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素系除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、そのような抵抗性に導く変異、特にＳ４および／またはＨｒａ変異を含むアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノスリシンもしくはバスタ（例えば、ｂａｒ遺伝子）、またはグリホサート（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子およびＧＡＴ遺伝子；例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書および国際公開第０３／０９２３６０号パンフレットを参照）に対する抵抗性をコードする遺伝子、あるいは当該技術分野で知られる他のそのような遺伝子を挙げることができる。ｂａｒ遺伝子は除草剤ｂａｓｔａに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質カナマイシンおよびｇｅｎｅｔｉｃｉｎに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子変異体は除草剤クロロスルフロンに対する耐性をコードする。
【０１４８】
不稔性遺伝子はまた、発現カセットにおいてコードされ、物理的な雄穂除去に代わる方法として提供され得る。そのような方法に使用される遺伝子の例としては、雄性組織優先性遺伝子、および米国特許第５，５８３，２１０号明細書に記載されているＱＭなどの雄性不稔性表現型を有する遺伝子が挙げられる。他の遺伝子としては、キナーゼ、および雄性または雌性の配偶体の成長に有害な化合物をコードするものが挙げられる。
【０１４９】
穀類の品質は、油の濃度や種類、飽和および不飽和、必須アミノ酸の質および量、ならびにセルロースの濃度などの形質に反映される。トウモロコシでは、改変ホルドチオニンタンパク質が、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書および同第５，９９０，３８９号明細書に記載されている。
【０１５０】
商業的形質もまた、例えばエタノール産生用デンプンなどを増加させ得る、またはタンパク質発現の提供し得る遺伝子もしくは遺伝子群でコードされ得る。形質転換植物の他の重要な商業利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書に記載されているようなポリマーおよびバイオプラスチックの生成である。β−ケトチオラーゼ、ＰＨＢ酵素（ポリヒドロキシ酪酸合成酵素）、およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７を参照）などの遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。
【０１５１】
外因性産物としては、植物酵素および植物性産物、ならびに、原核生物および他の真核生物などの、他のソースからのものが挙げられる。そのような産物としては、酵素、補因子、ホルモンなどが挙げられる。タンパク質の濃度、特に、アミノ酸分布を改善して植物の栄養価を高めた改変タンパク質の濃度を上昇させることができる。これは、アミノ酸含有量を増大させたそのようなタンパク質の発現によって達成される。
【０１５２】
一態様において、外植体に高効率かつ高速で導入することができるさらなる目的農業形質は、収穫量の増大などの形質、または植物価値を高めるその他の形質、例えば種子の品質の向上などである。特に興味深い形質は、水使用効率もしくは耐乾性の改善もしくは強化、収穫量の増大、窒素利用効率の強化、植物の早い成長および発達、植物の遅い成長および発達、種子タンパク質の増大、ならびに種子油の生産性の増大である。
【０１５３】
多くの農業形質、「収穫」、例えば、限定はされないが、植物の高さ、莢の数、植物体における莢の位置、節間部の数、莢の破損の発生率、穀粒の大きさ、根粒形成効率および窒素固定効率、栄養の消化効率、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する耐性、炭素同化、植物構造、耐倒伏性、種子の発芽率、苗の成長力、ならびに幼植物の形質が、「収穫」に影響を及ぼし得る。収穫に影響を及ぼし得る他の形質としては、発芽効率（たとえば、ストレス条件下での発芽効率）、成長速度（例えば、ストレス条件下での成長速度）、穂の数、穂１個当たりの種子数、種子の大きさ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、登塾特性が挙げられる。全植物の収穫量を増大させるか否かはわからないが、所望の表現型特性を示すトランスジェニック植物の世代もまた目的とされる。そのような特性としては、植物形態学的増強、植物生理学的増強、またはトランスジェニック植物から得られる成熟種子の成分の改善が挙げられる。
【０１５４】
本開示のトランスジェニック植物の「収穫量の増大」は、多くの方法、例えば、重量の測定、１植物体当たりの種子数、種子重量、単位面積当たりの種子数（すなわち、１エーカー当たりの種子、もしくは種子重量）、１エーカー当たりのブッシェル数、１エーカー当たりのトン数、１へクタールあたりのキロ数で評価し測定することができる。例えば、トウモロコシの収穫量は、例えば、１エーカー当たりのブッシェル数または１へクタール当たりのメートルトン数を単位とした、生産面積１単位当たりの、皮を剥いたトウモロコシ粒の産生量として測定することができ、それは、多くの場合、水分調節ベースで、例えば、水分１５．５％で報告される。収穫量の増大は、キーとなる生化学化合物、例えば、窒素、リンおよび炭水化物などの利用の改善、または、環境ストレス、例えば、寒さ、熱、乾燥、塩分、および害虫もしくは病原体などに対する耐性の向上によりもたらされ得る。形質強化組み換えＤＮＡはまた、植物成長調節物質の発現の改変、または細胞周期もしくは光合成経路の変更の結果として、成長調節物質成長および発達が改善され、ひいては収穫量が増大するトランスジェニック植物を提供するために使用することができる。
【０１５５】
多くの農業形質、例えば、限定はされないが、植物の高さ、莢の数、植物体における莢の位置、節間部の数、莢の破損の発生率、穀粒サイズ、根粒形成効率および窒素固定効率、栄養の消化効率、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する耐性、炭素同化、植物構造、耐倒伏性、種子の発芽率、苗の成長力、ならびに幼植物の形質が、「収穫」に影響を及ぼし得る。収穫に影響を及ぼし得る他の形質としては、発芽効率（たとえば、ストレス条件下での発芽効率）、成長速度（例えば、ストレス条件下での成長速度）、穂の数、穂１個当たりの種子数、種子の大きさ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、登塾特性が挙げられる。全植物の収穫量を増大させるか否かはわからないが、所望の表現型特性を示すトランスジェニック植物の世代もまた目的とされる。そのような特性としては、植物形態学的増強、植物生理学的増強、またはトランスジェニック植物から得られる成熟種子の成分の改善が挙げられる。
【０１５６】
ＶＩ．遺伝子の抑制方法
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物中の標的遺伝子の抑制に有用なポリヌクレオチドを高効率かつ高速で植物に導入するために使用することができる。植物における遺伝子操作のいくつかの態様では、特定の遺伝子の活性低下（遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制としても知られる）が望まれる。多くの遺伝子サイレンシング技術が当業者に知られており、例えば、限定はされないが、アンチセンス技術（例えば、Ｓｈｅｅｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８０５−８８０９、ならびに米国特許第５，１０７，０６５号明細書、同第５，４５３，５６６号明細書および同第５，７５９，８２９号明細書を参照）；コサプレッション（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１２４５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（１２）：３４０−３４４、Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３４９０−３４９６、Ｆｉｎｎｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８およびＮｅｕｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１）；ＲＮＡ干渉（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９、米国特許第５，０３４，３２３号明細書；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１３９−１４１、Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３、Ｊａｖｉｅｒ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：２５７−２６３、およびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１５５０２−１５５０７）；ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：６９１−７０５、およびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．２：１０９−１１３）；標的ＲＮＡ特異的リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１）；ヘアピン構造（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３１９−３２０、国際公開第ＷＯ９９／５３０５０号パンフレット、同第０２／００９０４号パンフレットおよび同第９８／５３０８３号パンフレット）；リボザイム（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１５２５、米国特許第４，９８７，０７１号明細書、およびＰｅｒｒｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２５３）；オリゴヌクレオチド媒介標的改変（例えば、国際公開第０３／０７６５７４号パンフレットおよび同第９９／２５８５３号パンフレット）；Ｚｎフィンガー標的分子（例えば、国際公開第０１／５２６２０号パンフレット、同第０３／０４８３４５号パンフレットおよび同第００／４２２１９号パンフレット）；人工マイクロＲＮＡ（ＵＳ８１０６１８０、Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：１１２１−１１３３）；および当業者に知られる他の方法、または上記方法の組み合���せが挙げられる。
【０１５７】
ＶＩＩ．ゲノム編集技術を植物へ導入する方法
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物体のゲノムの改変に特異的な部位を標的とするのに有用なポリヌクレオチドを高効率かつ高速で植物に導入するために使用することができる。本開示の方法および組成物によって導入することができる部位特異的改変としては、部位特異的改変を導入する任意の方法によるもの、例えば、限定はされないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチドの使用（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書）、または、ＴＡＬＥＮ、マガヌクレオチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓなどの二本鎖切断技術によるものが挙げられる。例えば、植物もしくは植物細胞のゲノム中の標的配列の改変のために、植物を選択するために、塩基または配列を欠失させるために、遺伝子編集のために、そして目的ポリヌクレオチドを植物のゲノムに挿入するために、本開示の方法および組成物を使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを植物細胞へ導入することができる。したがって、本開示の方法および組成物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと共に使用して、植物体、植物細胞または種子のゲノム中の標的部位および目的ヌクレオチドを変更または改変するのに提供することができる。
【０１５８】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物を生産するための方法および組成物を含む。その方法は、植物細胞のゲノム中の標的部位に目的ポリヌクレオチドを導入することを含み、その方法は（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程とを含み；形質転換はさらに、ガイドヌクレオチドを発現可能な第１の発現コンストラクトと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現可能な第２の組み換えＤＮＡコンストラクトとを含み、ガイドヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに標的部位での二本鎖切断の導入を可能にする複合体を形成することができる。あるいは、ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトはまた、ガイドヌクレオチドを発現可能なヌクレオチド配列と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現可能なヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５９】
一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、その植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ゲノム標的配列の植物ゲノムに結合し、二本鎖を作ることができる。
【０１６０】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、植物体、植物細胞または種子のゲノム中の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。さらに、細胞のゲノム中の標的部位の改変、細胞のゲノム中のヌクレオチドの編集に有効なガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法および組成物を提供する。ゲノム標的部位が特定されたなら、様々な方法を用いて、様々な目的ポリヌクレオチドを含むように標的部位をさらに改変することができる。本発明の組成物および方法を使用して、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列の編集を行うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを導入することができる。編集されるべきヌクレオチド配列（目的ヌクレオチド配列）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識される標的部位中にあっても標的部位外にあってもよい。
【０１６１】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）（ＳＰＩＤＲ―スペーサー散在型ダイレクトリピートとしても知られる）は、最近記載されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短く、かつ高度に保存されたＤＮＡリピート（通常２４〜４０ｂｐ、１〜１４０回の繰り返し―ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）から構成され、部分的に回文を形成している。反復配列（通常、種に固有である）間は一定の長さの可変配列（通常、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座により２０〜５８ｂｐ）がスペーサーとして存在している（国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット、２００７年３月１日公開）。
【０１６２】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は最初にエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見出された（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３；Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６を参照）。同様の間隔短配列リピートが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で特定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はリピート配列の構造により他のＳＳＲと異なり、短等間隔リピート（ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と呼ばれていた（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．６：２３−３３、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。リピートは、クラスターの形態で生じる短い要素であり、常に一定の長さの可変配列により等しい間隔をおいて存在している（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。
【０１６３】
Ｃａｓ遺伝子としては、フランキングするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合して、関連して、または近接もしくは隣接して存在する。用語「Ｃａｓ遺伝子」および「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書では互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的レビューは、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に記載されている。
【０１６４】
４つの当初記載された遺伝子ファミリーに加え、さらに４１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。この文献には、ＣＲＩＳＰＲシステムが、異なるリピート配列パターン、遺伝子群および種の範囲を有する異なる分類に属することが示されている。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣａｓ遺伝子の数は、種によって変わり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質と関連しており、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ標的配列へ二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」には、ＤＮＡ標的部位に二本鎖切断を導入することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチドとの複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位に近接したＤＮＡ二本鎖をほどき、標的配列を認識すると同時に、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端に位置している限り、２本のＤＮＡ鎖をガイドヌクレオチドによって切断する（２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの図２Ａおよび図２Ｂを参照）。
【０１６５】
一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、限定されないが、２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）の配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５、および５１８に挙げられているＣａｓ９遺伝子である。他の態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物、トウモロコシまたはダイズ最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの図１Ａに示されたものである。他の態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域上流のＳＶ４０核標的シグナル、およびＣａｓコドン領域下流の二分核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７４４２−６）に作動可能に結合している。
【０１６６】
一態様において、配列番号１、１２４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、１９３のＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子または配列番号５のヌクレオチド２０３７〜６３２９は、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子、またはその機能的断片もしくは多様体である。
【０１６７】
用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機能的に等価な断片」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの一部またはサブ配列を指す。
【０１６８】
用語「機能的多様体」、「機能的に等価である多様体」および「機能的に等価な多様体」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの多様体を指す。断片および多様体は、部位特異的変異誘発法および合成構築などの方法によって得ることができる。
【０１６９】
一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｎ（１２−３０）ＮＧＧ型の任意のゲノム配列を認識することができる、植物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子であり、原則として標的とし得る。
【０１７０】
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖のリン酸ジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷することなく特定の部位でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、これらはさらに亜型を含む。Ｉ型およびＩＩＩ型系においては、メチラーゼ活性および制限活性の両活性が単一複合体内に含まれる。エンドヌクレアーゼはまた、ホーミングヌクレアーゼ（ＨＥ酵素）としても知られるメガヌクレアーゼを含み、この酵素は、制限エンドヌクレアーゼのように、特定の認識部位に結合し切断するが、メガヌクレアーゼの認識部位は通常長く、約１８ｂｐ以上である。（２０１２年３月２２日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、それらのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−ＨおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスのファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびリン酸ジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、その長い認識部位と、そのＤＮＡ基質の配列多型性を許容していることで知られている。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、それぞれ独立ＯＲＦ、イントロンおよびインテインによってコードされる酵素に対して付される接頭辞のＦ−、Ｉ−またはＰＩ−で特徴付けられる。遺伝子組み換えプロセスの１つの工程は、認識部位またはその近傍でのポリヌクレオチドの切断を含む。この切断活性は、二本鎖の切断に使用され得る。部位特異的リコンビナーゼおよびその認識部位のレビューには、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ５：５２１−７、およびＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７を参照されたい。いくつかの例では、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーからのものである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、植物または他の有機体のゲノム中の特定の標的配列での二本鎖切断に使用することができる配列特異的ヌクレアーゼの新しい分類である。（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８）．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび二本鎖切断誘発物質ドメインからなる人工の二本鎖切断誘発物質である。認識部位特異性は、ジンクフィンガードメインによって与えられ、このジンクフィンガードメインは、通常、例えば、Ｃ２Ｈ２構造を有する、２、３または４つのジンクフィンガーを含むが、しかしながら他のジンクフィンガー構造も知られており、作られてきている。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドの設計に適している。ＺＦＮとしては、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合した人工ＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、ＦｏｋｌなどのＭｓ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインが挙げられる。さらなる機能性は、ジンクフィンガー結合ドメイン、例えば、転写活性因子ドメイン、転写抑制因子ドメインおよびメチラーゼに融合することができる。いくつかの例では、切断活性にヌクレアーゼドメインの二量体化が要求される。核ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡの３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、ヌクレアーゼの二量体化要件で、９個の連続するヌクレオチドからなる配列を認識し、２組のジンクフィンガートリプレットが、１８個のヌクレオチドからなる認識配列に結合するために使用される。
【０１７１】
細菌および古細菌は、短鎖ＲＮＡを使用して外来核酸を分解する、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させた（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的へガイドするのにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に相補的な領域と、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を有する塩基対とを含む。
【０１７２】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドヌクレオチド」は、２つのＲＮＡ分子、可変標的領域を含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡの合成的融合に関する。一態様において、ガイドヌクレオチドは、１２〜３０ヌクレオチド配列からなる可変標的ドメインと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し得るＲＮＡ断片とを含む。
【０１７３】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連している。このガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であってよい。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾を含むことができ、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるがこれらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドもまた、「ガイドヌクレオチド」と称される。
【０１７４】
ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインとも呼ばれる）とを含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。この二本鎖分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の個別の分子を含む。この２個の個別の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であってよい。一態様においては、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、または「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片を含むことができる。一態様においては、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上のヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。
【０１７５】
一態様においては、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、「ｔｒａｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」、または「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。一態様においては、ＲＮＡ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
【０１７６】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む一本鎖分子であってもよい。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続区間を意味する。一本鎖ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一態様においては、一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、「一本鎖ガイドヌクレオチド」（ＲＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、「一本鎖ガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、または「一本鎖ガイドヌクレオチド−ＤＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称することができる。本開示の一態様においては、一本鎖ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡまたはｃＲＮＡ断片、およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して一本鎖ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、一本鎖ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１７７】
用語「可変標的ドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書において互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の％相補性は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。一態様においては、可変ターゲティングドメインは１２〜３０ヌクレオチドからなる連続区間を含む。可変標的ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０１７８】
ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」は本明細書において互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に記載する改変を参照されたい）、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０１７９】
一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一態様においては、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドであり得る。他の態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
【０１８０】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用またはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、および細胞透過性の増大の群から選択される。
【０１８１】
一態様において、ガイドヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼとは、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を導入するのを可能にする複合体を形成することができる。
【０１８２】
本開示の一態様において、可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。
【０１８３】
本開示の一態様において、ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ（またはｃＲＮＡ断片）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。一態様において、ガイドヌクレオチドは、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、限定はされないが、粒子衝撃法または局所的適用法により植物体または植物細胞に導入することができる。
【０１８４】
一態様において、ガイドヌクレオチドは、植物細胞中でガイドヌクレオチド転写することができる、植物特異的プロモーターに作動可能に結合した、対応するガイドＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子を導入することによって、間接的に導入することができる。用語「対応するガイドＤＮＡ」は、ＲＮＡ分子の各「Ｕ」が「Ｔ」に置き替えられている以外はＲＮＡ分子と同じＤＮＡ分子を含む。
【０１８５】
一態様において、ガイドヌクレオチドは、粒子衝撃法により、または、植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に結合した、対応するガイドＤＮＡを含む組み換えＤＮＡコンストラクトをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換するための方法および組成物によって導入される。
【０１８６】
一態様において、ＲＮＡ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対してガイドヌクレオチドを使用する利点の１つは、融合ガイドヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１８７】
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」および「ゲノム標的遺伝子座」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって植物細胞ゲノムで二本鎖切断が誘発される、植物細胞ゲノム中のポリヌクレオチド配列（葉緑体ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡを含む）を指す。標的部位は植物ゲノム中の内在性部位であり得、あるいは、標的部位は植物体に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、あるいは標的部位は天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。
【０１８８】
本明細書で使用する場合、用語「内在性標的配列」および「天然標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物ゲノムに対して内在性または天然性のものであり、かつ植物ゲノム中の標的配列の内在性または天然の位置に存在する標的配列を指す。一態様において、標的部位は、ＤＮＡ認識部位、または特異的に認識し、かつ／または、ＬＩＧ３−４エンドヌクレアーゼ（２００９年５月２１日公開の米国特許出願公開第２００９／０１３３１５２Ａ１号明細書）、もしくはＭＳ２６＋＋メガヌクレアーゼ（２０１２年６月１９日出願の米国特許出願第１３／５２６９１２号明細書）などの二本鎖切断誘発物質によって結合する標的部位に類似する部位であり得る。
【０１８９】
「人工標的部位」または「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物のゲノム中に導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、植物ゲノム中の内在性標的配列または天然標的配列と配列が同じであり得、しかし、植物ゲノム中の異なる場所（すなわち、非内在性または非天然の場所）に存在し得る。
【０１９０】
「改変標的部位」、「改変標的配列」、「変更標的部位」および「変更標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、非改変標的配列を比較したとき、少なくとも１つの改変を含む本明細書に開示の標的部位を指す。そのような「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【０１９１】
ＶＩＩＩ．部位特異的組み込みのためのヌクレオチドの導入法
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物体へのヌクレオチド配列の標的組み込みに有用なポリヌクレオチドを、高効率かつ高速に植物へ導入するために使用することができる。例えば、本開示の方法および組成物は、標的部位を含む植物体を形質転換するために、非同一組み換え部位が隣接する目的ヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを導入するのに使用することができる。一態様では、標的部位は、トランスファーカセット上のそれに対応した、非同一組み換え部位を少なくとも１セット含む。組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列の置換は、リコンビナーゼにより影響を受ける。このように、本開示の方法および組成物は、ヌクレオチド配列の標的組み込みのためのトランスファーカセットの導入に使用することができ、非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、非同一組み換え部位を認識し、非同一組み換え部位で組み換えを行うリコンビナーゼにより認識される。したがって、本開示の方法および組成物は、再生可能な植物構造体由来の、非同一組み換え部位を含有する植物体の生長の効率および速度の改善に使用することができる。
【０１９２】
一態様では、本開示は、トランスジェニック植物を生産するための方法および組成物を含む。その方法は、植物細胞のゲノム中の標的部位に目的ポリヌクレオチドを導入することを含み、その方法は（ａ）（ｉ）ＷＵＳ／ＷＯＸホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）２つのＡＰ２−ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と；（ｂ）形質転換された各細胞中で（ａ）のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する（但し、カルスは形成されない）工程とを含み；形質転換はさらに、外植体の細胞を、異なる組換え部位が隣接している目的ヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットで形質転換する工程を含み；かつ外植体は、トランスファーカセットのフランキング部位に対応する、異なる組換え部位が隣接している標的部位を含むゲノムを有する植物由来である。この方法はさらに、異なる組換え部位を認識し、組み換えを行うリコンビナーゼを提供することを含み得る。そのリコンビナーゼは、外植体の１つ以上の細胞、再生可能な植物構造体、再生可能な植物構造体から生じた小植物体、または再生可能な植物構造体から生じた小植物体から生じた植物体に提供される。
【０１９３】
このように、本開示の方法および組成物は、外因性ヌクレオチドの形質転換植物への、方向性を有する標的組み込みを行うための組成物および方法をさらに含むことができることが提供される。一態様では、本開示の方法は、目的の遺伝子およびヌクレオチド配列の、以前に標的植物ゲノムに導入した対応する組み換え部位への、方向性を有するターゲティングを促進する遺伝子ターゲティングシステムにおいて、新規の組み換え部位を使用する。
【０１９４】
一態様では、２つの非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列が、目的ヌクレオチド配列の挿入のために標的部位が設けられた、標的生物のゲノム由来の外植体の１つ以上の細胞に導入される。安定な植物体または培養組織が確立されたなら、標的部位に隣接している組み換え部位に対応する部位が隣接した第２のコンストラクト、すなわち目的ヌクレオチド配列が、リコンビナーゼタンパク質の存在下に、安定に形質転換された植物体または組織に導入される。このプロセスで、標的部位の非同一組み換え部位とトランスファーカセットの間でヌクレオチド配列の置換が起こる。
【０１９５】
この方法で調製された形質転換植物体は、複数の標的部位、すなわち、非同一組み換え部位のセットを含み得ると認められる。この方法では、形質転換植物体の標的部位に対して複数の操作を行うことができる。形質転換植物体の標的部位とは、形質転換植物体のゲノムに挿入された、非同一組み換え部位を含むＤＮＡ配列を意味する。
【０１９６】
本開示の方法で使用する組み換え部位の例は当該技術分野で知られており、例えば、ＦＲＴ部位（例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：４４３−４４８；Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｓａｄｏｗｓｋｉ（１９９５）Ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５３−９１；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｃｏｘ（１９８９）Ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ，Ｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｏｗｅ（ｅｄｓ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１１６−６７０；Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）１８：４４９−４５８；Ｕｍｌａｕｆ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（１９８８）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１８４５−１８５２；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：３１１８−３１１９；Ｋｉｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．９：４１３−４２１：Ｒｏｓｓａｎｔ  ａｎｄ  Ｇｅａｇｙ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：５９２−５９４；Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６４９−６５９：Ｂａｙｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３−３６１；Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：３６９−３７８；およびＤａｌｅ  ａｎｄ  Ｏｗ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５５８−１０５６２０を参照されたい；これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）；Ｌｏｘ（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６４９−６５９；Ｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１７０６−１７１０；Ｓｔｕｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：９０１−９１３；Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｖｅｔ．２２３：３６９−３７８；Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：７９−８５；およびＢａｙｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３−３６１）が挙げられる。大部分の天然に存在するサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株に見出される２ミクロンのプラスミドは、２つの反転反復配列間のＤＮＡの反転を促進する、部位特異的リコンビナーゼをコードする。この反転はプラスミドのコピー数増幅に中心的な役割を果たす。
【０１９７】
タンパク質、指定されたＦＬＰタンパク質は、部位特異的組み換えイベントを触媒する。最小の組み換え部位（ＦＲＴ）が定義されており、非対称８ｂｐスペーサーを挟んだ、２つの反転１３塩基対（ｂｐ）の反復配列を含有する。ＦＬＰタンパク質は、繰り返し配列とスペーサーとの接合部で部位を切断し、３’末端リン酸エステルにより共有結合でＤＮＡに結合する。ＦＬＰのような部位特異的リコンビナーゼは、特定の標的配列でＤＮＡを切断し、再ライゲーションして、２つの同一部位間で正確に定義された組み換えをもたらす。機能させるには、システムは組み換え部位とリコンビナーゼを必要とする。補助的因子は必要でない。このようにして、システム全体を植物細胞に挿入し、機能させることができる。酵母のＦＬＰ￥ＦＲＴ部位特異的組み換えシステムが植物で機能することが示されている。今日では、このシステムは不要なＤＮＡの切除に利用されている。Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２１：  ９６９−９７５を参照されたい。
対照的に、本開示は、植物ゲノムにおけるヌクレオチド配列の置換、ターゲティング、配置、挿入および発現の制御に、非同一ＦＲＴを使用する。
【０１９８】
一態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含有する、植物体の外植体などの目的の形質転換生物を必要とする。標的部位は、非同一組み換え部位が隣接するという特徴を有する。形質転換生物の標的部位に含まれる部位に対応する非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列を含むターゲティングカセットがさらに要求される。非同一組み換え部位を認識し、部位特異的組み換えを触媒するリコンビナーゼが要求される。
【０１９９】
リコンビナーゼは当該技術分野で知られている任意の手段で提供できると認められる。すなわち、それは、生物中でリコンビナーゼを発現することができる発現カセットで生物を形質転換することにより、一過性発現により、またはリコンビナーゼもしくはリコンビナーゼタンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供することにより、生物または植物細胞中に提供され得る。
【０２００】
「非同一組み換え部位」とは、隣接する組み換え部位の配列が同一でなく、組み換えが生じないか、または部位間の組み換えが最少になるであろうことを意味する。すなわち、１つの隣接する組み換え部位がＦＲＴ部位で、第２の組み換え部位が変異したＦＲＴ部位であり得る。本開示の方法で使用される非同一組み換え部位は、２つの隣接する組み換え部位間の組み換え、およびそこに含まれるヌクレオチド配列の切除を妨げるか、または大きく抑制する。したがって、本開示においては、ＦＲＴおよび変異ＦＲＴ部位、ＦＲＴおよびｌｏｘ部位、ｌｏｘおよび変異ｌｏｘ部位、ならびに当該技術分野で知られている他の組み換え部位を含む、任意の適切な非同一組み換え部位を使用し得ると認められる。
【０２０１】
適切な非同一組み換え部位とは、活性なリコンビナーゼの存在下に、２つの非同一組み換え部位間の配列の削除がなされるとしても、植物ゲノムへのヌクレオチド配列の組み換えによる標的配置の置換よりもかなり低い効率で生じることを意味する。このように、本開示で使用される適切な非同一部位には、部位間の組み換え効率が低い部位、例えば、効率が約３０〜約５０％未満、好ましくは約１０〜約３０％未満、より好ましくは約５〜約１０％未満の部位が含まれる。
【０２０２】
上述のように、ターゲティングカセットの組み換え部位は、形質転換した植物体の標的サイトのそれに対応する。すなわち、形質転換植物体の標的部位が、ＦＲＴおよび変異ＦＲＴという隣接する非同一組み換え部位を含有するならば、ターゲティングカセットは同じＦＲＴおよび変異ＦＲＴの非同一組み換え部位を含有するであろう。
【０２０３】
さらに、本開示の方法で使用するリコンビナーゼは、形質転換植物体およびターゲティングカセットの標的部位の組み換え部位により変わってくると認められる。すなわち、ＦＲＴ部位が使用されるのであれば、ＦＬＰリコンビナーゼが必要になるであろう。同様に、ｌｏｘ部位が使用されるのであれば、Ｃｒｅリコンビナーゼが必要になる。非同一組み換え部位がＦＲＴおよびｌｏｘ部位の両者を含むのであれば、植物細胞中にＦＬＰおよびＣｒｅの両リコンビナーゼが必要となろう。
【０２０４】
ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製時に、サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンプラスミドのコピー数の増幅に関与する、部位特異的反応を触媒するタンパク質である。ＦＬＰタンパク質はクローン化され、発現されてきた。例えば、Ｃｏｘ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４２２３−４２２７を参照されたい。本開示で使用するＦＬＰリコンビナーゼはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から得ることができる。目的植物体での最適な発現のために、植物体に望ましいコドンを使用してリコンビナーゼを合成することが好ましいであろう。例えば、１９９７年１１月１８日出願の、発明の名称が「Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＦＬＰ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ」である米国特許出願第０８／９７２，２５８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２０５】
バクテリオファージリコンビナーゼＣｒｅは、２つのｌｏｘ部位間の部位特異的組み換えを触媒する。Ｃｒｅリコンビナーゼは当該技術分野で知られている。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：４０−４６；Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９−１５１４；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４７７−４８８；およびＳｈａｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５６９５−５７０２を参照されたい。これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。そのようなＣｒｅ配列はまた、植物体に望ましいコドンを使用して合成することができる。
【０２０６】
適切な場合には、植物ゲノムに挿入すべきヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現を増加させるために最適化することができる。本開示において哺乳動物、酵母または細菌の遺伝子が使用される場合、発現改善のために、植物体に望ましいコドンを使用してそれらを合成することができる。単子葉植物における発現では、単子葉植物に望ましいコドンを使用して双子葉植物の遺伝子も合成できると認められる。植物に望ましい遺伝子を合成するために、当該技術分野における各種方法が利用できる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書およびＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物に望ましいコドンは、目的植物で発現するタンパク質において、より頻繁に使用されるコドンから決定され得る。単子葉植物または双子葉植物に望ましい配列は、特定の植物種にとってその植物に望ましい配列と同様に構築できると認められる。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０３５９４７２号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０３８５９６２号明細書、国際公開第９１／１６４３２号パンフレット、Ｐｅｒｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３３２４−３３２８；およびＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：４７７−４９８．米国特許第５，３８０，８３１号明細書、米国特許第５，４３６，３９１号明細書など（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、遺伝子配列の全てまたは任意の部分が最適化されてもよく、また合成されてもよいと認められる。すなわち、完全に最適化されるか、または部分的に最適化された配列もまた使用することができる。
【０２０７】
配列のさらなる改変が、細胞宿主中で遺伝子発現を促進することが知られており、本開示で使用することができる。これらには、遺伝子発現に有害であり得る、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン−イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様反復配列、および他のそのような特徴を有する配列の削除が含まれる。配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現する既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均的なレベルに調節することができる。可能であれば、配列は、予測されるヘアピン二次的ＲＮＡ構造を避けるよう改変する。
【０２０８】
本開示はまた、新規なＦＬＰ組み換え標的部位（ＦＲＴ）を包含する。ＦＲＴは、次のような、８塩基スペーサーで分けられた、２つの１３塩基対からなる反復配列を含む最小配列として特定されている：５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’（ここで、カッコ内のヌクレオチドはスペーサー領域を示す）。２つの１３塩基反復配列が８ヌクレオチドで分離されている限り、スペーサー領域のヌクレオチドは、ヌクレオチドの組み合わせで置換することができる。スペーサーの実際のヌクレオチド配列は重要ではないが、しかしながら、本開示の実施のためには、スペース領域のヌクレオチドのいくつかの置換は、他の領域の置換より良く機能し得る。８塩基対のスペーサーは、鎖置換時のＤＮＡ−ＤＮＡの対合に関与する。この領域の非対称性は、組み換えイベントの部位アライメントの方向を決定し、これは、その後、逆方向になるか、または切除されるかに繋がる。上述のように、スペーサーの大部分は機能を失わずに変異することができる。例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２０９】
新規のＦＲＴ変異体部位は、本開示の方法の実施で使用することができる。そのような変異体部位はＰＣＲをベースとした変異誘発により構築することができる。変異ＦＲＴ部位は知られている（１９９９年５月２７日に公開された国際公開第１９９９／０２５８２１号パンフレットの配列番号２、３、４、および５を参照されたい）が、本開示の実施には別の変異ＦＲＴ部位を使用できると認められる。本開示では、特定のＦＲＴまたは組み換え部位が使用せず、異なる組み換え部位またはＦＲＴ部位が、植物ゲノム中のヌクレオチド配列のターゲティング挿入および発現に使用され得る。したがって、本開示に基づいて、他の変異ＦＲＴ部位が構築され、使用され得る。
【０２１０】
上で論じたように、リコンビナーゼの存在下に、非同一組み換え部位を有する標的部位を含むゲノムＤＮＡを、対応する非同一組み換え部位を有するトランスファーカセットを含むベクターと一緒にすると、組み換えが起こる。隣接する組み換え部位の間に位置するトランスファーカセットのヌクレオチド配列は、隣接する組み換え部位の間に位置する標的部位のヌクレオチド配列と置換される。このようにして、目的ヌクレオチド配列を、宿主のゲノムに正確に組み込むことができる。
【０２１１】
本開示の多くの変形を実施することができると認められる。例えば、複数の非同一組み換え部位を有する標的部位を構築することができる。このように、複数の遺伝子またはヌクレオチド配列を、植物ゲノムの正確な位置に積み重ねるか、またはオーダーすることができる。同様に、ゲノム内に標的部位が確立されたならば、トランスファーカセットのヌクレオチド配列内に追加の組み換え部位を組み込み、その部位を標的配列に移入することにより、追加の組み換え部位を導入することができる。このように、標的部位が確立されたならば、その後、組み換えにより部位を追加したり、部位を変更したりすることが可能である。
【０２１２】
別の変形として、生物の標的部位に作動可能に結合したプロモーターまたは転写開始領域を提供することが挙げられる。プロモーターは最初の組み換え部位の５’末端側にあることが好ましい。コード領域を含むトランスファーカセットで生物を形質転換することにより、コード領域の発現は、トランスファーカセットが標的部位に組み込まれたときに起こるであろう。この態様は、コード配列として選択マーカー配列を提供することにより、形質転換された細胞、特に植物細胞を選択する方法を提供する。
【０２１３】
本システムの別の利点として、上で論じたトランスファーカセットを使用することによる、導入遺伝子または導入ＤＮＡを生物に組み込むことの複雑さを軽減する能力、および単純な組み込みパターンによる生物の選択が挙げられる。同様に、数種の形質転換イベントを比較することにより、ゲノム内の好ましい部位を特定することができる。ゲノム内の好ましい部位としては、必須配列の発現を妨害せず、かつ導入遺伝子配列を十分に発現させるものが挙げられる。
【０２１４】
本開示の方法はまた、ゲノム内の１ヵ所に複数のカセットを結合させる手段を提供する。ゲノム内の標的部位で、組み換え部位を追加または切除することができる。
【０２１５】
本開示においては、本システムの３つの成分を一緒にする、当該技術分野で知られた手段を使用することができる。例えば、植物を安定に形質転換し、そのゲノム内に標的部位を宿させることができる。リコンビナーゼを一時的に発現させるか、または提供することができる。あるいは、リコンビナーゼを発現することができるヌクレオチド配列を植物ゲノムに安定的に組み込むことができる。対応する非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、対応する標的部位とリコンビナーゼの存在下に、形質転換植物のゲノムに挿入される。
【０２１６】
あるいは、形質転換植物を有性交雑させることにより、本システムの成分を一緒にすることができる。この態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含有する形質転換植物、すなわち第１の親は、第２の植物、すなわち第１の親に対応する隣接する非同一組み換え部位を含有するトランスファーカセットで遺伝子的に形質転換されている第２の親と有性交雑することができる。第１の植物または第２の植物は、そのゲノム内にリコンビナーゼを発現するヌクレオチド配列を含有する。リコンビナーゼを構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
【０２１７】
誘導性プロモーターとしては、本明細書で先述したもの、ならびに熱誘導性プロモーター、エストラジオール応答性プロモーター、化学誘導性プロモーターなどが挙げられる。病原体誘導性プロモーターとしては、病原体の感染後に誘導される感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）、例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼなどからのものが挙げられ。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．８９：２４５−２５４；Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：６４５−６５６；およびＶａｎ  Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１−１１６を参照されたい。このようにして、リコンビナーゼの発現およびその後の組み換え部位の活性を制御することができる。
【０２１８】
植物の遺伝子発現に使用する構成的プロモーターは、当該技術分野で知られている。そうしたプロモーターとして、限定はされないが、カリフラワーのモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３；Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２），ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９），ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  ｒｉｂｕｌｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：７８−９８），ａｃｔｉｎ（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：１６３−１７１），ｈｉｓｔｏｎｅ，ＤｎａＪ（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１８９−２０１）などが挙げられる。
【０２１９】
本開示の組成物および方法は、導入されるヌクレオチド配列を特定の染色体部位へ組み込むターゲティングに有用である。ヌクレオチド配列は任意の目的ヌクレオチド配列をコードすることができる。目的とする特定の遺伝子としては、宿主細胞および／または生物に容易に分析可能な機能的特徴を提供するもの、例えば、マーカー遺伝子や、受容細胞の表現型を変える他の遺伝子などが挙げられる。このように、本開示では、植物の生長、高さ、病気に対する感受性、昆虫、栄養価などに影響する遺伝子を使用することができる。ヌクレオチド配列はまた、遺伝子の発現を停止または改変させる「アンチセンス」配列をコードすることができる。
【０２２０】
ヌクレオチド配列は、機能性発現ユニットまたはカセットで使用できると認められる。機能性発現ユニットまたはカセットとは、機能性プロモーターおよびほとんどの場合に終止領域を有する目的ヌクレオチド配列を意味する。本開示の実施の中で機能性発現ユニットを実現させるには各種の方法がある。本開示の一態様では、目的核酸は機能性発現ユニットとしてゲノムに導入または挿入される。
【０２２１】
あるいは、ヌクレオチド配列はゲノム内のプロモーター領域の３’末端側の部位へ挿入することができる。この後者の場合、プロモーター領域の３’末端側へのコード配列の挿入が、組み込み時に機能性発現ユニットを実現させるものである。植物における発現では、便宜のために、標的部位をコードする核酸および目的ヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを発現カセットに含ませることができる。発現カセットは、目的ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した転写開始領域、すなわちプロモーターを含むであろう。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下とする、目的遺伝子または遺伝子群を挿入するための複数の制限部位を備えている。
【０２２２】
転写開始領域、すなわちプロモーターは、宿主にネイティブ、すなわち同種であっても、外来、すなわち異種であってもよく、あるいは、天然配列または合成配列とすることができよう。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に、転写開始領域が存在しないことを意味する。目的のコード配列に関し、ネイティブプロモーターまたは異種プロモーターを使用することができる。
【０２２３】
転写カセットは、転写の５’−３’方向に、植物内で機能する、転写および翻訳開始領域、目的ＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終止領域を含む。終止領域は、転写開始領域と共にネイティブであっても、目的ＤＮＡ配列と共にネイティブであっても、または他のソース由来であってもよい。使いやすい終止領域は、ジャガイモプロテイナーゼ阻害剤（ＰｉｎＩＩ）遺伝子から、またはノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼおよびオパリンシンターゼ終止領域などの、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドの配列から得ることができる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【０２２４】
発現カセットは、発現カセットコンストラクト中に５’末端リーダー配列をさらに含有することができる。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するよう作用し得る。翻訳リーダーは当該技術分野で知られており、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’末端非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．，Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ））（Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６））；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５４：９−２０）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質ＭＡＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２−６２５；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，ｐａｇｅｓ  ２３７−２５６，Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３２５７−３２７３）；トウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｒｎｍｅｌ、Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１：３８２−３８５）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８４：９６５−９６８も参照されたい；そして内因性トウモロコシ５’末端非翻訳配列。翻訳を促進することで知られている他の方法、例えば、イントロンなども使用することができる。
【０２２５】
発現カセットは、形質転換植物に導入され発現する、１つ以上の遺伝子または核酸配列を含有することができる。したがって、各核酸配列は５’末端および３’末端の調節配列に作動可能に連結するであろう。あるいは、複数の発現カセットが提供され得る。
【実施例】
【０２２６】
実施例１：プラスミド
本明細書の下記実験では、表１に示すＴ−ＤＮＡを含むプラスミドを使用した。表１に示すプラスミドは、表示の成分を含有するＴ−ＤＮＡを宿す。
【０２２７】
【表１】
2018537080.tif 000002
【０２２８】
【表２】
2018537080.tif 000003
【０２２９】
【表３】
2018537080.tif 000004
【０２３０】
【表４】
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【０２３１】
【表５】
2018537080.tif 000006
【０２３２】
【表６】
2018537080.tif 000007
【０２３３】
実施例２：培養培地。
実施例では、形質転換および細胞培養で使用する各種培地が参照される。培地組成を下記の表２〜９に示す。
【０２３４】
【表７】
2018537080.tif 000008
【０２３５】
【表８】
2018537080.tif 000009
【０２３６】
【表９】
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【０２３７】
【表１０】
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【０２３８】
【表１１】
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【０２３９】
【表１２】
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【０２４０】
【表１３】
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【０２４１】
【表１４】
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【０２４２】
【表１５】
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【０２４３】
【表１６】
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【０２４４】
【表１７】
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【０２４５】
実施例３：粒子衝撃。
衝撃の前に、１０〜１２ＤＡＰにＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃトウモロコシの雌穂から未熟胚を分離し、１６％スクロースを加えた培養培地上に３時間置き、胚盤細胞を原形質分離した。
【０２４６】
各粒子衝撃では、通常、４種のプラスミドを使用した：１）リコンビナーゼ媒介カセット交換のためのＦＲＴ隣接ドナーカセットを含有するドナープラスミド（１００ｎｇ／μｌ）、２）発現カセットＵＢＩＰＲＯ：：ＦＬＰｍ：：ＰｉｎＩＩを含有するプラスミド（２．５ｎｇ／μｌ）、３）発現カセットＵＢＩＰＲＯ：：ＯＤＰ２：：ＰｉｎＩＩを含有するプラスミド（１０ｎｇ／μｌ）、および４）発現カセットＵＢＩ：：ＷＵＳ２：：ＰｉｎＩＩを含有するプラスミド（５ｎｇ／μｌ）。ＤＮＡを０．６μｍの金粒子に付着させるために、低結合性マイクロチューブ（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３９６４０Ｔ）内に各プラスミドを１０μｌ加え、全量を４０μｌとして混合した。この懸濁液に０．６μｍの金粒子５０μｌ（３０μｇ／μｌ）と１．０μｌのＴｒａｎｓｉｔ  ２０／２０（カタログ番号ＭＩＲ５４０４，Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）を加え、懸濁液をロータリーシェーカー上に１０分間置いた。１０，０００ＲＰＭ（約９４００×ｇ）で懸濁液を遠心分離し、上清は捨てた。１２０μｌの１００％エタノール中に金粒子を再懸濁させ、低出力で短時間の超音波処理を行い、ピペットで１０μｌを各フライヤー上に採った。その後、フライヤーを空気乾燥させ、全ての残留エタノールを除去した。２００ＰＳＩラプチャーディスクを使用し、水銀柱２８インチでＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ＰＤＦ−１０００により粒子衝撃を実施した。
【０２４７】
実施例４：トウモロコシのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換。
Ａ．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）マスタープレートの調製
バイナリードナーベクターを宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、−８０℃の凍結アリコートから固体１２Ｖ培地上にストリークし、２８℃の暗所で２〜３日間培養し、マスタープレートを作った。
【０２４８】
Ｂ．固体培地上でのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養。
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の単一コロニーまたは複数のコロニーをマスタープレートから採取し、８１０Ｉ培地を含有する第２のプレートにストリークし、２８℃の暗所で１〜２日間インキュベートした。フード中で、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地（７００培地；５ｍｌ）および１００ｍＭの３’−５’−ジメトキシ−４’−ヒドロキシアセトフェノン（アセトシリンゴン；５μＬ）を１４ｍＬのコニカルチューブに加えた。白金耳約３杯の、第２のプレートからのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）をチューブに懸濁させ、その後、チューブをボルテックスして、均一な懸濁液とした。懸濁液（１ｍｌ）を分光光度計のチューブに移し、懸濁液の光学濃度（５５０ｎｍ）を約０．３５〜２．０の読みに調節した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の濃度は約０．５〜２．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬであった。２ｍＬのマイクロ遠心チューブのそれぞれが懸濁液１ｍＬを含有するように、最終のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を分取した。その後、できるだけ早く懸濁液を使用した。
【０２４９】
Ｃ．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の固体培地上での培養。
あるいは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、液体培地での培養により形質転換用として調製することができる。感染の１日前に、３０ｍｌの５５７Ａ培地（１０．５ｇ／ｌのリン酸水素二カリウム、４．５ｇ／ｌのリン酸水素一カリウム無水物、１ｇ／ｌの硫酸アンモニウム、０．５ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム脱水物、１０ｇ／ｌのスクロース、１ｍＭの硫酸マグネシウム）、ならびに３０μＬのスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）および３０μＬのアセトシリンゴン（２０ｍｇ／ｍＬ）が入った１２５ｍｌのフラスコを準備した。白金耳に半量の、第２のプレートからのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）をフラスコに懸濁させ、２００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカーにセットし、２８℃で終夜インキュベートした。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除き、アセトシリンゴン溶液を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地を加えた。ボルテックスして細菌を再懸濁させ、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液の光学濃度（５５０ｎｍ）を約０．３５〜２．０の読みに調節した。
【０２５０】
Ｄ．トウモロコシの形質転換。
Ｔｗｅｅｎ２０を１滴加えた２０％（体積／体積）漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）中で、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ）品種の雌穂の表面を１５〜２０分間滅菌し、続いて滅菌水で３回洗浄した。未熟胚（ＩＥ）をトウモロコシの雌穂から分離し、アセトシリンゴン溶液を含む２ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地に移した。胚の最適サイズは近交系により変化するが、ＷＵＳ２およびＯＤＰ２による形質転換では、幅広いサイズの未熟胚を使用することができるであろう。溶液を抜き出し、１ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を胚に加え、チューブを５〜１０秒間ボルテックスした。フード内で５分間、マイクロチューブを静置した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と胚の懸濁液を７１０Ｉ共培養培地（表９を参照）上に注いだ。チューブ内に残った胚を、滅菌したスパチュラを使用してプレートに移した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を抜き出し、胚を軸側を下にして培地上に置いた。Ｐａｒａｆｉｌｍ  Ｍ（登録商標）フィルム（耐湿柔軟性プラスチック、ＢｅｍｉｓＣｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．，１  Ｎｅｅｎａｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ４ｔｈｆｌｏｏｒ，ＰＯＢｏｘ  ６６９，Ｎｅｅｎａｈ，ＷＩ  ５４９５７から入手可能）でプレートを密封し、２１℃の暗所で１〜３日間の共培養のためにインキュベートした。
【０２５１】
胚を、選択せずに静止培地（６０５Ｔ培地）に移した。３〜７日後、選択剤を補った成熟培地（２８９Ｑ培地）にそれらを移した。
【０２５２】
実施例５：ＯＤＰ２およびＷＵＳ２の発現。
以下の実験は、ＯＤＰ２およびＷＵＳ２の発現が、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染直後から直接的な体細胞胚の形成をもたらすことを示した。
【０２５３】
Ａ．ＯＤＰ２発現を駆動するＰＬＴＰプロモーターおよびＷＵＳ２発現を駆動するＮＯＳプロモーターは、迅速で直接的な体細胞胚の形成をもたらした。
授粉から約１１日後、Ｐｉｏｎｅｅｒトウモロコシ近交系ＰＨ１８４Ｃから未熟胚（長さ２〜２．５ｍｍ）を収穫し、実施例３の記載のように、以下の組成を有するＴ−ＤＮＡ含有アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１を感染させた；ＲＢ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：Ｔｏｐ２：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＴＰ２  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ。ＰＬＴＰ  ＰＲＯについては、配列番号１を参照されたい。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌を、光学密度が０．５（５２０ｎｍで）になるまで液体培地で培養し、未成熟胚（３つの別個の耳からの、約５３、５２、および５６の胚）をこのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液中で５分間インキュベートした後、液体から取り出して７１０Ｉ固体培地上に置いた。
【０２５４】
２４時間後、胚を６０５Ｔ培地に移し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を除去する選択を開始した。６日後、処理した１２４の未成熟胚のそれぞれの表面に多くの小さな体細胞胚が観察された。各未熟胚は、明確に定義された胚柄で多くが支持された、多数の、はっきりとした、個別の体細胞胚を含有した。ＯＤＰ２およびＷＵＳ２の発現により生じた代表的な胚を図１および図２に示すが、例えば、図１中、新たに生じた胚を指す矢印に注目されたい。新たに形成された蛍光胚はまた図２にも見られる。図１の像は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染の開始から４日後に、上から光を当てて実体顕微鏡を用いて撮影したものである。接合胚の全長は約１．５ｍｍであった。図２に示す胚は、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：：ＰＩＮＩＩ発現カセットと共に、ＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２：：ＩＮ２およびＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８発現カセットを用いて形質転換されたものである。この像は、開示した方法を用いた処理後に、最初に形質転換した接合胚の胚盤表面で、蛍光胚が成長していることを示している。この像は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染の開始から４日後に、落射蛍光アタッチメントおよび標準Ｌｅｉｃａ  ＧＦＰフィルターセットを備えた実体顕微鏡を使用して撮影したものである。接合胚の全長は約１．５ｍｍであった。
【０２５５】
アグロ感染から７日後、胚を成熟培地（０．１ｍｇ／ｌイマザピル含有の２８９Ｑ培地）に移し、イマダゾリノン系除草剤を使用して、トランスジェニック胚を選択した。成熟培地に１４日間置いた後、成熟胚を発根培地（１３１５８Ｈ培地；１３１５８培地＋２５ｍｇ／ｌセフォタキシム）に移し、ＰＣＲ分析用に葉片をサンプリングした。第１の雌穂から生じた５３個の胚から１２個の除草剤耐性植物体をＰＣＲで分析し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換を開始した時を実験の開始として、それから３２〜３４日後にこれらを温室に送った。植物体がキメラでないことを確認するために、各植物体から２種の試料、すなわち２つの相対する葉から（植物体の反対側の両方の葉から）の試料を採取することにより、植物体のＰＣＲ用の試料を得た。全植物体からの各試料ペアに対するＰＣＲの結果からは、キメラ植物体が生じていないこと、およびＴ０植物体は均質に遺伝子が導入されていることが示された。
【０２５６】
Ｂ．除草剤によらない選択、分枝アミノ酸を添加し、除草剤によらない選択、またはイマザピルによる選択の比較。
この実験は２回反復して行ったが、２回の反復間で、開始未熟胚の数と、実験の成功段階へ進む胚（または植物体）の数のみが相違した。両反復実験で、Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃからの未熟胚に、以下のＴ−ＤＮＡ（ＰＨＰ７７８３３からの）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１（ＴＨＹ−）を感染させた；ＲＢ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：Ｔｏｐ２：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＴＰ２  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）液体懸濁物中で５分間感染させた後、未熟胚を固体培養培地（２７０Ｉ培地）に移し、終夜置いた。翌日、胚を３種の培地、すなわち６０５Ｔ；０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロン（選択のための除草剤イマザピル（０．１ｍｇ／ｌ）も含有）に分枝アミノ酸（「ＡＡ」と略記、１００ｍＭのロイシン、イソロイシン、またはバリンを含有）を加えた６０５Ｔ；または０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロン（選択のための除草剤イマザピル（０．１ｍｇ／ｌ）も含有）を含むが、分枝アミノ酸は含まない６０５Ｔの１つに移した。１２日後、胚を成熟培地に移した。すなわち、６０５Ｔ培地の胚を０．１ｍｇ／ｌのイマザピル含有２８９Ｑ培地（成熟中に選択）へ移し、０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンおよびＡＡを含む培地６０５Ｔ培地の胚を２８９Ｑ培地（早期に選択され、成熟中は選択されない）へ移し、そして０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンを含む培地６０５Ｔの胚を２８９Ｑ培地（早期に選択）に移した。１６日後、健康な体細胞胚を有する胚を再生培地２７２Ｖ培地に移した。
【０２５７】
この実験の第１の反復では、２０６個の胚をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で処理し、１日後、１０６個、６７個、または３３個の胚をそれぞれ６０５Ｔ培地（最初の週で選択されない）、０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンおよびＡＡを含む６０５Ｔ培地（ＡＡを含む早期選択）、または０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンを含む６０５Ｔ培地（ＡＡを含まない早期選択）に移した。次の移行では、４５個、１６個および０個の胚をそれらのそれぞれの成熟培地に移した。発根培地への最終の移行では、１８個、１０個および０個の小植物体（個々のイベント）を移した。これらのイベントの中で、それぞれ、１６個および１０個をＰＣＲ用の試料とし、６個および２個の植物体は組み込まれた導入遺伝子についてシングルコピーであることが判明し、０個および２個のエスケープ（選択プロセスを生き残った野生型植物）が観察された。この反復の実験では、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染から温室までの全経過日数は４８日であった。これらの結果から、胚の成熟期まで選択を継続しない早期選択が、野生型エスケープを（いくつかのトランスジェニックイベントと共に）生存させることが示された。しかしながら、分枝アミノ酸が補足されない早期選択では、体細胞胚が形成される段階でストレスが多いようであり、したがって、イベントは発生しなかった。成熟段階の初めに選択を開始することは、エスケープのないイベントの回収には最も有効であった。
【０２５８】
第２の反復では、全部で１９６個の胚を液体中のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で５分間処理し、その後、７１０Ｉ培地で１日間共培養した。この時点で、９４個、６６個または３６個の胚を、それぞれ６０５Ｔ培地、０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンおよびＡＡを含む６０５Ｔ培地、または０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンを含む６０５Ｔ培地に移した。１２日後、６０５Ｔの９４個の胚を分割し（それぞれ４７個ずつ）、０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む２８９Ｑ培地か、または０．５ｍｇ／ｌのイマザピルを含む２８９Ｑ培地に移した。０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンおよびＡＡを含む６０５Ｔ培地、ならびに０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンを含む６０５Ｔ培地の両方の胚を２８９Ｑ（さらなる選択はない）に移した。成熟後、健康な小植物体（イベント）を発根培地１３１５８Ｈに移した。すなわち、上記４種の成熟処理からそれぞれ１４個、１１個、１３個および０個のイベントを移した。イベントが回収された３種の処理で、最終的に、４個、５個および２個の植物体を温室に送ったが、唯一のシングルコピーイベントは、成熟過程の０．５ｍｇ／ｌイマザピルによる選択から生じた。
【０２５９】
Ｃ．ＯＤＰ２の発現を駆動する２種のプロモーター、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：Ｔｏｐ１およびＤＲ５  ＰＲＯ：：Ｔｏｐ３の比較。
両処理で、Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃから未熟胚を収穫し、それぞれのプラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１（ＴＨＹ−）で処理し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む培地７１０Ｉで１日間の共培養を行った後、６０５Ｔ培地へ移し、６０５Ｔ培地で１０日間培養し、０．１ｍｇ／ｌのエタメツルフロンを含む１３２２６Ｄに移して２日間置き、その後成熟培地（０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む２８９Ｑ）に移して１３日間置いた。成熟後、小植物体（イベント）を発根（発芽）培地１３１５８に移して１０日間置いた（発根段階）。
【０２６０】
ｉ．ＺＭ−ＯＤＰ２発現を駆動するＺＭ−ＰＬＴＰ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ。
８０個の未熟胚をＰＨＰ７８１５７（配列番号２３）含有アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で処理した。最初、処理した全ての未熟胚は、各胚盤表面に多数の個々の体細胞胚を急速に生成することにより反応した。発根段階の終わりには、１８個の小植物体が生じた。１０個の植物体のサブセットを温室に送り、ＰＣＲ分析用の試料とした（温室までの全経過日数は４６日であった）。これら１０個の中で、６個はマルチコピーであり、かつ／またはプラスミド主鎖（ＢＢ）を含有しており、４個のエスケープがあった。
【０２６１】
ｉｉ．ＯＤＰ２発現を駆動するＤＲ５プロモーター。
７０個の未熟胚を、ＰＨＰ７８１５６を含有し、かつ下記のものを含有するＴ−ＤＮＡを宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で処理した：ＲＢ＋ＮＯＳ  ＰＲＯ：：Ｔｏｐ２：：ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＤＲ５  ＰＲＯ：Ｔｏｐ３：ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＴＰ２  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ（配列番号２４）。
【０２６２】
最初、処理した全ての未熟胚は、各胚盤表面に多数の個々の体細胞胚を急速に生成することにより反応した。発根段階の終わりには、１８個の小植物体が生成した。１２個の植物体のサブセットを温室に送り、ＰＣＲ分析用試料とした（温室までの全経過日数は４６日であった）。ＰＣＲ分析した１２個の植物体の中で、６個はマルチコピー／ＢＢ＋であり、４個はシングルコピーで主鎖を含んでおらず（ＢＢ−）、２個のエスケープがあった。
【０２６３】
実施例６：ＺＭ−ＰＬＴＰ：：ＺＭ−ＯＤＰ２＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２。
ＰＬＴＰプロモーターの制御下にあるＯＤＰ２の発現、およびＡＸＩＧ１プロモーターの制御下にあるＷＵＳ２の発現は、植物体回収の改善、温室へ送られる植物体の高頻度化、およびシングルコピーイベントの一層の高頻度化をもたらした。
【０２６４】
２種のトウモロコシ近交系（ＨＣ６９およびＰＨ１８４Ｃ）から未熟胚を収穫し、ＰＨＰ７９０２３（配列番号２５）またはＰＨＰ７９０２４（配列番号２６）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株）を感染させた。近交系ＨＣ６９では、６７個の未熟胚がＰＨＰ７９０２４で形質転換され、最終的に２６個の、０．１ｍｇ／ｌのイマザピルに耐性を有する植物体を生成した（開始時の胚の数に対して３８．８％の頻度）。これに対し、６５個のＨＣ６９胚がＰＨＰ７９０２３で形質転換され、このとき、１０個の除草剤耐性植物体が温室に送られた（１５．４％の頻度）。さらに、ＰＨＰ７９０２４を使用して生成された植物体は、温室中でより頑健で、より健康的であった。両出発プラスミドのトランスジェニック植物体は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から３３日後に温室に送られた。
【０２６５】
近交系ＰＨ１８４Ｃでは、６４個の未熟胚がＰＨＰ７９０２４で形質転換され、最終的に３０個の、０．１ｍｇ／ｌのイマザピルに耐性を有する植物体を生成した（開始時の胚の数に対して４６．８％の頻度）。これに対し、７３個のＰＨ１８４Ｃ胚がＰＨＰ７９０２３で形質転換され、このとき、２７個の除草剤耐性植物体が温室に送られた（３７％の頻度）。さらに、ＰＨＰ７９０２４を使用して生産された植物体は、温室中でより頑健で、より健康的であった。両出発プラスミドのトランスジェニック植物体は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から３３日後に温室に送られた。このように、両近交系では、ＷＵＳ２の発現を駆動するためにＤＲ５プロモーターを（ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２と共に）使用すると、トランスジェニックＴ０植物体へ成長し得るトランスジェニック体細胞胚を迅速に生産したが、ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２＋ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２の組み合わせは、トランスジェニック植物体の全頻度に関しても、また温室におけるＴ０の頑強さおよび健康度に関しても、より一層効果的であった。
【０２６６】
実施例７：支持胚盤からの体細胞胚の分離。
元の接合未熟胚の支持胚盤から体細胞胚を分離することにより、独立したトランスジェニック植物体の回収が改善された。
Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨＨ５Ｇからの未熟胚を、プラスミドＰＨＰ７９０６６（配列番号２８）（表１を参照）を宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１（ＴＨＹ−）を使用して形質転換した。４５個の未熟胚とアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とを、培地７１０Ｉ上で１日間共培養した後、未熟胚を静止培地（６０５Ｔ培地）に移して選択せずに１２日間置いた。胚を成熟培地に移して１３日間置いたところ、元は単一の接合未熟胚から得られたものであることが、複数の成熟体細胞胚で明瞭に観察された（図３）。この時点で、胚を固体培地から移し、液体培養液（２８９Ｒ培地）中に入れた。その後、組織が分散したように見えるまで、懸濁液を１０〜１５秒毎に目視で観察しながら、懸濁したトウモロコシ組織を含有するチューブを３０〜６０秒間、高出力でボルテックスした。その後、液体懸濁液を固体発根培地（０．１ｍｇ／ｌのイマザピル除草剤を含む１３１５８Ｈ培地）に注ぎ、液体分をピペットでプレートから取り除いた。この材料から、２００を超える植物体が生成され（代表的な植物体を図４に示す）、形質転換された各出発胚から平均４．４個の植物体が回収された。約２００個のＴ０植物体の中で、１５２個をＰＣＲ分析用の試料とし、その結果に基づけば全部が形質転換されており（エスケープなし）、４３植物体が導入遺伝子に関してアグロの主鎖を含まないシングルコピーであった（シングルコピーでＢＢなし  ２８．３％）。この頻度、回収されたＴ０植物体の総数および胚の出発時の数に基づけば、品質を伴った生成物、すなわち使用可能なＴ０イベント（シングルコピー、主鎖なし）は出発時の胚の数に対して１００％を超えた。
【０２６７】
実施例８：  ＣＲＥ媒介切除。
Ａ．ＵＢＩ：：ＣＲＥ：：ＰＩＮＩＩ媒介切除。
Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＨＣ６９（２９３個の胚）およびＰＨ１８４Ｃ（２４１個の胚）から未熟胚を収穫し、表１に示す遺伝子成分を含有するプラスミドＰＨＰ８０３３４（配列番号４２）を宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１（ＴＨＹ−）で形質転換した。液体培地７１０Ｉ中でアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に５分間曝露した後、終夜の共培養のために胚をプレートから寒天固化７１０Ｉ培地に移した。１日間の共培養の後、胚を静止培地（選択剤なしの６０５Ｔ）に移して７日間置き、成熟培地（０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む２８９Ｑ）に移して１４日間置き、その後、発根（発芽）培地に移して少なくとも１４日間置き、その後、植物体を温室に移した。形質転換された胚の元の数に対して、１９．１％および１３．８％の元の胚が、それぞれＨＣ６９およびＰＨ１８４Ｃでトランスジェニック植物体を生成した。切除の頻度を決定するために、７回のＰＣＲ反応を行って、ＣＲＥ、ＷＵＳ２、ＯＤＰ２、ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１およびＥＳＲ発現カセット（すなわち、当初Ｔ−ＤＮＡ内の２つのＬＯＸＰ部位間に存在した、全てのポリヌクレオチドセグメント）の非存在、ならびにＨＲＡ発現カセットの存在を試験した。ＰＣＲの結果により、ＨＲＡ発現カセット（除草剤イマザピルに対する耐性を付与する）のみを含有する、２１％のＨＣ６９植物体で、２つの元のＬＯＸＰ部位間の断片が切除されていることが明らかになった。したがって、これらの植物体はもはやＣＲＥ、ＷＵＳ２、ＯＤＰ２、ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１およびＥＳＲ発現カセットを含有していない。他の全てのカセットが切除され、ＨＲＡカセットが存在することを植物体で分析すると、ＰＨ１８４Ｃでの切除の頻度は、４７％の植物体で完全完璧な切除がなされたことを示しており、ＨＣ６９よりも高かった。
【０２６８】
ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＣＲＥ含有プラスミドと、切除を意図して設計されてはいないコンストラクトとを比較すると、初期の成長反応に差異があることが観察された。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から６日後には体細胞胚が見られた、ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２＋ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２を含有する非切除コンストラクトとは対照的に、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＣＲＥ処理では、この期間に蛍光を発する体細胞胚は観察されなかった。ユビキチンプロモーター（ＵＢＩ  ＰＲＯ）は、何年にもわたって広く使用されてきた、非常に強力な構成的プロモーターである（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｉｌ，（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：２１３−２１８）。その強力さとユビキタスな発現パターンのために、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＣＲＥは、細胞に導入されると直ちに発現を始めることが予測され、したがって、ＷＵＳおよびＯＤＰ２発現カセットは、体細胞胚の形成を刺激する前に切除され得ることが予測された。しかしながら、驚いたことに、当初の接合胚を成熟培地に置いたときに、当初単一の接合胚であったものの上に複数の胚が形成されるのが観察された。除草剤イマザピル上での成熟は、野生型の増殖に対して非常に厳密な選択を行うものであり、このことと一致して、ＰＣＲの結果は、得られた植物体がトランスジェニック体であり、ＰＣＲで分析されたシングルコピーＴ０植物体の６０％で、ＷＵＳ、ＯＤＰ２、ＣＲＥ、ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１およびＥＳＲの完全な切除の発生を示すことが確認された。ＰＨＰ８０３３４のＴ−ＤＮＡは、ｌｏｘＰ組み換え部位に位置するＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２、ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＣＲＥ、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮおよびＥＳＲ発現カセットを含有する。このＴ−ＤＮＡが未熟胚細胞に導入されても、緑色蛍光は観察されず、緑色蛍光タンパク質が可視レベルにまで蓄積する前（切除されていないＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ発現カセットでは、通常２４時間未満である）に切除されていることを示している。これらのデータは、トランスジェニックＴ０植物体を生成する、迅速な新生体細胞胚の形成およびこれらの体細胞の発芽に、ＷＵＳおよびＯＤＰ２の短いパルスが有効であることを示している。
【０２６９】
Ｂ．ＧＬＢ１：：ＣＲＥ媒介切除。
Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃから未熟胚を収穫し、表１に示す遺伝子成分を含有するプラスミドＰＨＰ８０３３８（配列番号４３）を宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１（ＴＨＹ−）で形質転換した。形質転換、選択および植物体の発芽方法は、上記実施例８−ＡのＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＣＲＥの実験で記載したものと同じであった。Ｔ０植物体のＰＣＲ分析では、シングルコピー植物体の５８％が、成長遺伝子（ＯＤＰ２およびＷＵＳ）ならびにＣＲＥの完全な切除を受けていたことが示された。胚の成長期（ＬＴＰ２、ＯＬＥ、ＥＮＤ−２）か、またはストレス（ＩＮ２−１）による刺激を受けて発現を駆動することが知られている代替プロモーターもまた、トランスジェニックＴ０植物体を生成する発芽の前に、成長遺伝子（ＯＤＰ２、ＷＵＳ２）およびＣＲＥの切除をもたらした。
【０２７０】
ＣＲＥの発現を駆動する異なるプロモーター間の比較では、Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＨＣ６９またはＰＨ１８４Ｃから未熟胚を収穫し、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡ含有プラスミドを宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４（Ｔｈｙ−）で形質転換した；ＲＢ−ｌｏｘＰ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２：：Ｉｎ２−１  ＴＥＲＭ＋ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋「Ｘ  ＰＲＯ」：：ＣＲＥ：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ−ｌｏｘＰ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ（ここで、「Ｘ  ＰＲＯ」は、ＷＵＳ、ＯＤＰ２およびＣＲＥの切除を駆動するのに使われるトウモロコシのＵＢＩ  ＰＲＯ、ＷＯＸ２ａ  ＰＲＯ、ＩＮ２  ＰＲＯ、ＬＴＰ２  ＰＲＯ、ＯＬＥ  ＰＲＯ、ＧＬＢ１  ＰＲＯ、ＨＳＰ１７．７  ＰＲＯまたはＨＳＰ２６  ＰＲＯである）。液体培地７１０Ｉ中でアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に５分間曝露した後、終夜の共培養のために胚をプレートから寒天固化７１０Ｉ培地に移した。１日間の共培養の後、胚を静止培地（選択剤なしの６０５Ｔ）に移して７日間置き、成熟培地（０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む２８９Ｑ）に移して１４日間置き、その後、発根（発芽）培地に移して少なくとも１４日間置き、その後、植物体を温室に移した。
【０２７１】
【表１８】
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【０２７２】
表１０に示すように、形質転換効率は、所与の出発未熟胚の数から、回収したＴ０植物体の数によって測定され、切除頻度はＷＵＳ２、ＯＤＰ２およびＣＲＥについて示される。表１０はまた、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を感染させた未熟胚の数、生成したＴ０植物の数、形質転換頻度の計算値［（Ｔ０植物体の数／感染させた胚の数）＊１００］ならびに、ＷＵＳ、ＯＤＰ２、ＣＲＥおよびＨＲＡの存在または非存在についてＰＣＲ分析に基づく最終的な切除の頻度を示す。近交系ＰＨ１８４Ｃでは、Ｔ−ＤＮＡがＷＯＸ２ａ：：ＣＲＥ：：ＰＩＮＩＩまたはＩＮ２：：ＣＲＥ：：ＰＩＮＩＩ（それぞれＰＨＰ８０５５８またはＰＨＰ８０５６０）を含有するネガティブコントロール処理において切除は観察されなかった。しかしながら、ＣＲＥを駆動するプロモーターが植物体全体で強く発現する（ＵＢＩ）か、成長中の胚で強く発現する（ＬＴＰ２、ＯＬＥ、ＧＬＢ１）か、または熱処理によって強く誘発される（ＨＳＰ１７．７、ＨＳＰ２６）処理では、切除の頻度は４０〜６０％の範囲であった。ＵＢＩ  ＰＲＯでは、ＷＵＳ２およびＯＤＰ２の切除は迅速であり、形質転換頻度の低下（９％）をもたらし、Ｔ０植物体で測定した切除の頻度は６０％と高かった。胚の成長の中期から後期に発現するプロモーター（ＬＴＰ２、ＯＬＥおよびＧＬＢ１）では、形質転換頻度はＵＢＩより高いが（それぞれ、３３％、２６％および２２％）、切除頻度はＵＢＩより僅かに低かった（それぞれ、５０％、４０％および４７％）。ＣＲＥの発現を調節するためにＨＳＰ１７．７を使用した処理では、最大形質転換頻度（５４％）および最大切除頻度（６７％）が得られ、両カテゴリーで最良の結果をもたらした。ＨＳＰ２６では、形質転換頻度および切除頻度がそれぞれ３２％および５４％と、胚−プロモーターと同じ範囲の結果をもたらした。
【０２７３】
胚−成長プロモーターを切除に使用すると、これらの処理で多数の体細胞胚（切除成分が存在しない実験に類似）が観察され、胚成長の比較的遅い段階まで発現が遅延されることを示したが、成長によるトリガーが引かれると、発現は胚全体に一様に強力であり、ＷＵＳ２、ＯＤＰ２およびＣＲＥの効率的切除をもたらした。熱応答性プロモーターでは、胚が成熟培地へ移されるまで、熱への曝露（すなわち、連続した３日間、４２℃に２時間の繰り返し）を延期したが、形質転換後、多数の体細胞胚が迅速に形成され、効率的な切除が遅れて続いた。
【０２７４】
実施例９：部位特異的組み換えイベント回収の改善。
ＰＨ１８４Ｃから未成熟の雌穂を収穫し、粒子衝撃処理の日に２．０ｍｍの未熟胚を穀粒から取り出した。粒子衝撃の前に、胚を高浸透性の培地（１３２２４Ｂ培地）に３時間置いた。以下の発現カセットを含有する等モル比のプラスミドを未熟胚に衝突させた；ＦＲＴ１：ＰＭＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ：ＦＲＴ８７＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：：ＭＯ−ＦＬＰ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ。粒子衝撃の後、未熟胚を終夜、高浸透性培地上に残し、その後静止培地（１５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含む１３２６６Ｋ培地）に移し８日間置いた。静止期間の後、胚を成熟培地（１５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含む２８９Ｏ培地）に移して２１日間置き、その後、発根培地（１５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含む２７２Ｘ培地）に移して１４〜１７日間（根が土壌に移植するのに十分な大きさになるまで）置いた。小植物体の段階で、元の標的遺伝子座のＦＲＴ１部位とＦＲＴ８７部位とに挟まれた内部の遺伝子がもはや存在せず、かつドナーカセット中の新しい遺伝子が標的遺伝子座に正しく組み換えられていることを確認するために、ＰＣＲ分析用として葉の組織を試料とし、そして正確なＲＭＣＥ（リコンビナーゼ媒介カセット交換（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ））イベントが同定された。これにより、ＳＳＩサイクル全体、すなわち形質転換から正確なＲＭＣＥで得られた植物体を温室で得るまでの日数が、根が十分に張るのに必要な期間に依存するものの、４３〜５０日に短縮された。代替として、ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２＋ＰＬＴＰ  ＰＴＯ：：ＯＤＰ２を含むコンストラクトを使用するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介ＳＳＩ法が開発された。次の２種のＴ−ＤＮＡを２つの別々の実験で送達した；第１のＴ−ＤＮＡは、ＰＭＩ、ＷＵＳ２、ＯＤＰ２およびＤｓＲＥＤ発現カセットをＦＲＴ１とＦＲＴ８７とで挟まれた組み換え部位に含有し（ＲＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：：ＭＯ−ＦＬＰ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＣａＭＶ３５Ｓ  ＴＥＲＭ＋ＦＲＴ１：ＰＭＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：：ＤｓＲＥＤ：ＦＲＴ８７−ＬＢ）（ＲＶ００３８６６）、第２のＴ−ＤＮＡは、ＰＭＩおよびＤｓＲＥＤのみをＦＲＴ１部位とＦＲＴ８７部位に含有する（ＲＢ−＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ  ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：：ＭＯ−ＦＬＰ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＣａＭＶ３５Ｓ  ＴＥＲＭ＋ＦＲＴ１：ＰＭＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：：ＤｓＲＥＤ：ＦＲＴ８７−ＬＢ）（ＲＶ００４８８６）。米国仮特許出願第６２／２９６６３９号明細書（参照により全体が本明��書に組み込まれる）に記載のように、ＦＲＴ１〜ＦＲＴ８７の着地部位を含む標的ラインに、アグロ媒介形質転換により各Ｔ−ＤＮＡを送達した。正確なＲＭＣＥイベントは、＃５９０７  ＵＳＰＳＰに記載されているように、マルチプレックスＰＣＲ分析を使用して同定し、そのデータを表１１に要約した。アグロＳＳＩにＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２＋ＰＬＴＰ  ＰＴＯ：：ＯＤＰ２発現カセットを使用することにより、ＳＳＩイベントを生成する通常の形質転換法と比べて、ＳＳＩプロセス全体が数週間（少なくとも３〜４週間）短縮された。
【０２７５】
【表１９】
2018537080.tif 000020
【０２７６】
実施例１０：ＣＡＳ９／ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変を含むイベント回収の改善。
トウモロコシゲノムのＣＡＳ９媒介切断を、トウモロコシのＡＬＳ２遺伝子に単一コドンの改変を導入するために使用する。ＡＬＳ２編集アレルを作製するために、７９４ｂｐの相同体断片をプラスミドベクターにクローニングし、天然配列と比べると数個のヌクレオチド改変を有する修復テンプレートとして、２つの１２７ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡオリゴを試験した。７９４ｂｐの修復テンプレートは、アミノ酸の１６５位置でプロリンに対応するＤＮＡ配列をセリン（Ｐ１６５Ｓ）に変える編集を指示する一塩基変異、ならびにＡＬＳ−ＣＲ４標的部位およびＰＡＭ配列内に３つの追加の改変を含む。修復テンプレート内のＰＡＭ配列の改変は、メチオニンコドン（ＡＵＧ）をイソロイシン（ＡＵＵ）に変えるが、これはＡＬＳ１遺伝子では自然に起こることである。粒子衝撃、選択および再生で使用した培地は、本明細書で使用するものに類似している。１回の処理当たり約１，０００個の未熟胚に、２つのオリゴまたは単一プラスミドの修復テンプレート、すなわちＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＣＡＳ９：：ＰＩＮＩＩ、ＰＯＬＩＩＩ  ＰＲＯ：：ＡＬＳ〜ＣＲ４ｇＲＮＡ、ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＭＯＰＡＴ〜ＤＳＲＥＤ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭおよびＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを衝突させる。粒子衝撃の後、未熟胚をビアラホス３ｍｇ／ｌを含む培地に置き、除草剤耐性体細胞胚を選択した。８日間の静止期間の後、胚をビアラホスを含む成熟培地に移して２１日間置き、その後、発根培地に移して１４〜１７日間（根が土壌に移植するのに十分な大きさになるまで）置いた。形質転換から５週後、選択培地で成長している２００個（１回の処理当たり）の、ランダムに選択した独立した若い小植物体を、ＰｌａｎｔＣｏｎ（商標）容器（高さ６”までの植物体を入れることができる滅菌プラスチック容器）内の新鮮なビアラホス培地に移した。残りの小植物体（１回の処理当たり約８００個）を、ＰｌａｎｔＣｏｎｓ（商標）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＬＬＣ，３  Ｈｕｔｔｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ  １００，Ｓａｎｔａ  Ａｎｎａ，ＣＡ  ９２７０７から入手可能な、予め殺菌されている植物組織培養容器）内の、編集されたＡＬＳ２遺伝子を直接選択するために１００ｐｐｍのクロロスルフロンを含有する固体培地に移した。１ヶ月後、ランダムにサンプリングした３８４個の小植物体（選択せず）およびクロロスルフロン選択で生存した７個の小植物体を分析用の試料とした。編集されたＡＬＳ２アレルが９個の小植物体で検出された：２個は、ビアラホス上で成長し、７９４ｂｐの修復ＤＮＡテンプレートを使用して生成した、ランダム選択の小植物体から得られ、残りの７個は、１２７ｎｔの一本鎖オリゴを使用して編集した、クロロスルフロン耐性小植物体から得られた。ＡＬＳ１遺伝子の分析からは、野生型配列のみが見出され、ＡＬＳ−ＣＲ４ｇＲＮＡの高い特異性が確認された。
【０２７７】
編集されたＡＬＳ２アレルを含有する９個の植物体全てを温室に送り、追加の分子分析および後代検定用の試料とした。ＡＬＳ２アレルのＤＮＡ配列分析により、Ｐ１６５Ｓの改変および、それぞれの修復テンプレートに関連する他のヌクレオチドの変化の存在が確認された。編集されたＡＬＳ２アレルの継承を評価するために、２つのＴ０植物体のＴ１およびＴ２子孫を分析した。野生型Ｈｉ−ＩＩ植物体の花粉を用いた交配から得られた子孫の植物体を、配列の決定により分析し、親植物体で観察された編集されたアレルの性感染は、期待された１：１の分離比を示した（それぞれ、５７：５６および４７：４９）。編集されたＡＬＳ配列が除草剤耐性を付与するかどうかを試験するために、選んだ４週齢の、編集されたＡＬＳ２アレルと野生型のＡＬＳ２アレルを含む別々のＴ１植物体に、４つの異なる濃度のクロルスルフロン（５０、１００（１×）、２００および４００ｍｇ／リットル）を噴霧した。処理から３週後、編集されたアレルを含む植物体は通常の表現型を示したが、野生型アレルのみを含む植物体は老化の強い兆候を示した。さらに、野生型ＨＩ−ＩＩ花粉で授粉した植物体から得た種子から分離した胚は、１００ｐｐｍのクロルスルフロンを含む培地で発芽した。発芽から１４日後、編集したアレルを含む植物体は、通常の高さとよく発達した根系を有したが、野生型アレルを含む植物体は背丈が低く、根を発達させなかった。
【０２７８】
上記の実験で、（２つの別々のプラスミド上の）ＯＤＰ２およびＷＵＳ２発現カセットが、修復テンプレート、Ｃａｓ９、ＡＬＳ−ＣＲ４ｇＲＮＡ、およびＭｏＰＡＴ−ＤｓＲＥＤを含むプラスミドに含まれないとき、Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨＨ５Ｇで、１０００個の未熟胚に粒子衝撃を行い、かつビアラホスで選択後、イベントは全く回収されなかった（ネガティブコントロール）。これに対し、ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩおよびＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを含有するプラスミドを、金粒子の調製および粒子衝撃のためのプラスミド混合物に加えたときは、ＡＬＳ遺伝子へのＣＡＳ／ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を含むイベントが回収された。Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨＨ５Ｇからの約１０００個の未熟胚に粒子衝撃を行った後、１０００個を超えるビアラホス耐性小植物体が回収され、これらの中の９個は、除草剤クロルスルフロン耐性を付与するゲノムＡＬＳ２遺伝子への編集を含有することが決定された。
【０２７９】
実施例１１：モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）での高効率の形質転換および迅速なＴ０植物体の生成。
最適化したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介プロトコル（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０：８−１４）を用いてモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）の形質転換を行った（その方法は下に要約されている）。
【０２８０】
Ａ．モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）材料および形質転換プロセス。
本研究では、タンニンを含まないソルガムの変種であるＴＸ４３０を使用した。温室の平均温度は、日中２９℃、夜間２０℃であり、光周期は昼／夜１２時間とし、メタルハライドランプ（１，０００Ｗ）と高圧ナトリウム（１，０００Ｗ）ランプを３：１の比で補助光として用いた。本研究で使用した培地成分を表２に示す。基準の形質転換プロトコルはＺｈａｏらの「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｃ」（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）４４：７８９−７９８）に詳しく説明されている。簡潔に説明すると、収穫した新鮮なソルガムの未成熟粒を、真空下、５０％の漂白剤および０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で３０分間滅菌し、その後、滅菌水で３回洗浄した。以下の連続する５工程を胚に供した。（１）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染：ＰＨＩ−Ｉ培地を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液（５５０ｎｍでＯＤ＝１．０）中で胚を５分間インキュベートした；（２）共培養：感染後、ＰＨＩ−Ｔ培地上、２５℃の暗所で胚を３日間培養した；（３）静止：１００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを加えたＰＨＩ−Ｔ培地上、２８℃の暗所で胚を７日間培養した；（４）選択：ＰＨＩ−Ｕ培地上で胚を２週間培養し、続いて二次培養の間隔を２〜３週間として、ＰＨＩ−Ｖ培地上、胚を２８℃の暗所で残りの選択過程の間培養した；（５）再生：シュートの成長を促進するために、ＰＨＩ−Ｘ培地上、暗所でカルスを２〜３週間培養し、続いて、２５℃で光照射１６時間（４０〜１２０μＥｍ−２ｓ−１）、および暗所８時間の条件で１週間培養し、根の成長を促すために、ＰＨＩ−Ｚ培地上で最終の二次培養を光照射下（１６時間、４０〜１２０μＥｍ−２ｓ−１）で２〜３週間行った。再生した小植物体を土壌に移植し、温室で栽培した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。Ｔ０植物体を自家授粉し、さらなる分析のためにＴ１の子孫を作った。
【０２８１】
別の実験では、次の連続する５工程に胚を供した。（１）ＰＨＰ７９０２３を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染：ＰＨＩ−Ｉ培地を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液（５５０ｎｍでＯＤ＝１．０）中で胚を５分間インキュベートした；（２）共培養：感染後、ＰＨＩ−Ｔ培地上、２５℃の暗所で胚を７日間培養した；（３）成熟期間の選択：０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む２８９Ｍ培地上で胚を４週間成熟させ、続いて０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む培地１３１１３Ａ（培地１３１１３Ａは、半分の強度のＭＳ塩およびビタミン、０．０５ｇ／ｌのミオイノシトール、２０ｇ／ｌのスクロースならびに３ｇ／ｌのフィタゲルを含有する、ｐＨ５．６）で根を成長させた。再生した小植物体を土壌に移植し、温室で栽培した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。Ｔ０植物体を自家授粉し、さらなる分析のためにＴ１の子孫を作った。
【０２８２】
Ｂ．モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）と共に使用するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株およびベクター。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６３−９６７）を使用した。これは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒ遺伝子を含む第１のプラスミド（Ｋｏｍａｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：３０３−３０６；Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １０：１６５−１７４）と、以下の成分を含むＴ−ＤＮＡを含有する第２のプラスミド（ＰＨＰ８０３３４）とを含有した：ＲＢ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ：ＳＢ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ−ＬＢ。比較のために、Ｔ−ＤＮＡ中にＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１  ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＰＭＩ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ発現カセットのみを含む（ＺＭ−ＷＵＳ２発現カセットもＺＭ−ＯＤＰ２発現カセットも含まない）第２のプラスミドを含有する、別のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用した。これは本実験ではコントロールの処理を意味する。
【０２８３】
Ｃ．モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）の形質転換の結果。
コントロールプラスミドを使用した場合、全体の形質転換頻度は２０％であり、温室に送られ、ｑＰＣＲで分析されたＴ０植物体の４０％は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の主鎖を含まない、シングルコピーであった。コントロール処理では、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染からＴ０植物体が温室へ送られるまでの日数は１０〜１３週であった。
【０２８４】
Ｚｍ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２＋ＤＲ５  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２を含有するプラスミド（表１のＰＨＰ７９０２３を参照）を使用した場合、全体の形質転換頻度は３２％であり、温室に送られ、ｑＰＣＲで分析されたＴ０植物体の４２％は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の主鎖を含まない、シングルコピーであり、当初感染した接合未熟胚から体細胞胚の形成へ直接進み、体細胞胚の成熟、インビトロでの発芽および根の形成へと続いた。プロモーターと成長遺伝子のこの組み合わせを使用した場合、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からＴ０植物体を温室へ送るまでの期間が、コントロール処理と比べて約半分に、大幅に短縮された。
【０２８５】
ＲＢ−ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＨＲＡ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋構成的ＤｓＲＥＤ発現カセット−ＬＢを含有するＴ−ＤＮＡを含むＰＨＰ８２２４０プラスミドを使用した追加の実験では、ＰＨＰ８２２４０を使用し、５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む７１０Ｉ培地上で７日間共培養すると、ソルガム体細胞胚の直接形成が改善されることが示された。プラスミドと７日間の共培養のこの組み合わせにより、全体の形質転換頻度は１７．７％から最終値の３８．９％へと倍増し、一方、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からＴ０植物体の温室までの日数が、コントロール処理と比べて約半分に短縮された（この時間枠を５〜６週の全経過日数に短縮）。
【０２８６】
実施例１２：コムギの高効率の形質転換および迅速なＴ０植物体の生成。
Ａ．コムギの形質転換法
目的のベクターを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４のアリコートを−８０℃の貯蔵場所から取り、選択剤（細菌株が含有するプラスミドによりカナマイシンまたはスペクチノマイシン）を含有する固体ＬＢ培地上にストリークした。ＬＢプレート上、２１℃の暗所でアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を２〜３日間培養し、その時点でプレートから単一のコロニーを選択し、選択剤を含有する８１０Ｄ培地プレート上にストリークし、その後、２８℃の暗所で終夜インキュベートした。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養物を滅菌スパチュラでプレートから移し、４００μＭのアセトシリンゴン（ＡＳ）を含む約５ｍＬのコムギ感染培地（ＷＩ４）に懸濁させた。同じ培地を使用して懸濁液の光学密度（６００ｎｍ）を約０．１〜０．７に調節した。
【０２８７】
未成熟の種子を含む４〜５本の穂（１．４〜２．３ｍｍの胚を有す）を採取し、未成熟の種子から未熟胚を分離した。Ｔｗｅｅｎ２０を１滴加えた２０％（体積／体積）漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）中で、コムギの穀粒表面を１５分間滅菌し、続いて滅菌水中で２〜３回洗浄した。実施例４および５で説明したように、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による感染、共培養、静止期間の培養、体細胞胚の成熟、および根の成長を含むコムギに対する残りのプロトコルがこれに続き、それには０．１ｍｇ／ｌのイマザピル上での選択工程およびトランスジェニックコムギＴ０植物体生成のための成熟工程が含まれた。
【０２８８】
Ｂ．コムギの形質転換の結果
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９６３−９６７）を使用した。これは、第１のスーパーバイナリーヘルパープラスミド（ｐＶＩＲ９、米国仮特許出願第６２／２５２２２９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、および、次の成分を含むＴ−ＤＮＡを含有する成長遺伝子を有する第２のプラスミド（ＰＨＰ７９０６６）を含有した；ＲＢ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＴＰ２  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ１  Ｎ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ。比較のために、以下のＴ−ＤＮＡを含む第２のプラスミド（ＰＨＰ２４６００）を含有する別のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用した：  ＲＢ＋ＣＡＭＶ３５Ｓ  ＴＥＲＭ：ＰＡＴ：ＣＡＭＶＳ  ＰＲＯ＋ＵＢＩＺＭ  ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＬＢ（これは、この実験ではコントロール処理を意味する）。
【０２８９】
Ｐｉｏｎｅｅｒ  ｅｌｉｔｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｗｈｅａｔの変種ＨＣ０４５６Ｄからのコムギの未熟胚を形質転換するためにコントロールプラスミドを使用した場合、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染から最初の７〜１０日間に再生可能な構造体は観察されなかったが、成長遺伝子コンストラクトＰＨＰ７９０６６を感染させた未熟胚は、実施例４および５に記載したトウモロコシ培養培地を使用して、感染から７〜１０日後に再生可能構造体を生成した。コントロールのコンストラクト（示さず）では増殖するカルスが観察されたのに対して、コンストラクトＰＨＰ７９０６６を感染させた胚は、２週間以内に植物体様の構造体を生成した（図５）。ＰＨＰ７９０６６による形質転換後、感染から６週以内に、発根した小植物体が回収された。
【０２９０】
ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＬＴＰ２：ＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを含有するプラスミドを形質転換に使用した場合、全体の形質転換頻度は６４％であった（これに対し、コントロールでは６％）。４つの植物体のサブセットをｑＰＣＲを使用して分析したところ、３つがＷＵＳおよびＺＳ−ＹＥＬＬＯＷ両方の導入遺伝子でポジティブであった。成長遺伝子のこの組み合わせを使用すると、感染から８〜１１週でＴ０植物体が再生し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からＴ０植物体を温室に送るまでの日数が２〜３週短縮された。
【０２９１】
実施例１３：トウモロコシの迅速なデノボ胚形成およびＴ０植物体生成の観察。
Ａ．成長中の体細胞胚の形態。
Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４Ｃからの未熟胚を、次の発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡを宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４で形質転換後、体細胞胚が急速に（すなわち、４〜６日以内に）胚盤表面に形成された；ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１Ｉ  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ。直接形成された、単一の体細胞胚を、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から２、４、７、および１２日後に観察した。近交系ＰＨ１８４Ｃでは、ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭの組み合わせを使用した場合、単一の体細胞胚が、胚柄を反復しているように見える薄い細胞の綱によって当初形質転換した接合胚の胚盤に結合しているのが観察された。胚の成長が続くと、頂端分裂組織の成長の発端で頂端分裂組織を囲む特色のある子葉鞘のリングの形成、および胚軸周りの胚盤の形成（これは白色かつ不透明になる）を含む、接合胚で通常見られる別の形態的特徴が観察された。
【０２９２】
急速に形成される体細胞胚の形態をさらに詳しく説明するために、膨隆している発生期の体細胞胚を有する接合胚を、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から２、４、６、および７日後にサンプリングし、回転数１００ｒｐｍ、室温で４時間、２．５％のＥＭ−グレードグルタールアルデヒドの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）溶液中で固定化した。それぞれ１５分間、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、試料を次のように段階的に乾燥させた；７０％ＥｔＯＨ中で１〜２時間、８０％ＥｔＯＨ中で１〜２時間、９５％ＥｔＯＨ中で１〜２時間、１００％ＥｔＯＨ中で１〜２時間、および１００％ＥｔＯＨ中で２時間。その後、製造業者の推奨に従って、組織に活性化Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００グリコールメタクリレートを２時間浸透させ、再度、新たな活性化Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００で終夜浸透させた。浸透させた組織試料を型に入れ、１５ｍｌの活性Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００に１ｍｌのＨａｒｄｅｎｅｒ  ＩＩを加えることにより、Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００を重合させた。型を真空デシケータに入れて家庭レベルの真空下に置き、終夜重合させた。やや薄い２μｍの薄片をスライドガラス上の数滴の水の上に置き、４５℃の加熱プレート上で乾燥させた。薄片を使用説明書に従って過ヨウ素酸シッフ試薬（Ｓｉｇｍａ）で染色し、その後、０．５％ナフトールブルーブラックを７％酢酸に加えた溶液で５分間対比染色を行い、再度、脱イオン水で洗浄した。その後、薄片をカバーガラスと共にＰｅｒｍｏｕｎｔに埋め込み、観察した。
【０２９３】
図６〜図１１に、以下を含有するＴ−ＤＮＡを含むＬＢＡ４４０４によりアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を感染させた後の、何日かのＨＣ６９接合未熟胚の経時変化を示す：ＲＢ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ−ＬＢ。局所的な成長促進の最も初期の兆候の１つは、感染した胚盤表面の細胞に垂層分裂が観察されたことであり（図６）、これは、通常は胚の成長に伴う並層分裂により拡大するこの表面層の最初の可視的な崩壊であった。継続的な局所的細胞分裂は、接合胚表面から突出し始める細胞の小クラスターになり（図６）、この成長は次第に大きくなる球形（図８）および球形／移行段階（図８）の胚を急速に生成させ、これは、感染から僅かに４日後には１体細胞胚当たり７００〜８００個までもの細胞を含有し、通常は前胚に見られる典型的な平滑表皮層を示し、下部の接合胚との導管の連結はなかった。成長中の体細胞胚がたとえ非常に近接して見えても（図１０）、それらは独立して生じた構造体であった。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から最初の６〜７日間の体細胞胚の成長を通して、これらの体細胞胚の極めて急速な成長速度の指標となる、高頻度の有糸分裂構造（すなわち、細胞は明瞭に前期、中期、後期または細胞質分裂を経る）が観察された（図１１）。
【０２９４】
Ｂ．成長中の体細胞胚の脂質の蓄積を示す染色。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを含有するＴ−ＤＮＡを含む）媒介形質転換後に、未熟接合胚の胚盤表面で成長している直接形成の体細胞胚を、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から２、４および７日後にサンプリングし、７０％のイソプロパノール中で５分間洗浄し、その後、７０％のイソプロパノール中の０．５％「オイルレッドＯ」溶液中で２０分間染色し、イソプロパノールで２分間洗浄し、その後水中でそれぞれ５分間の洗浄を２回行った（全て室温で）。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から２日後、組織内の赤色発色によって証拠付けられる非常に小さい脂質の染色が未熟接合胚に存在した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後には、多数の球形構造体（新たに形成した体細胞胚）が、当初形質転換された接合胚表面で成長しているのが明らかに目視でき、これらの新たな体細胞胚は明瞭に赤色に染められており、脂質の蓄積を示した。７日目に、次のような構造体の混合が観察された；成長を続け、赤く染色された明らかに体細胞胚であるもの（図１２中、黒色の矢印）、および、脂質の蓄積に関係する赤色染色を既に失い始めている分裂組織および葉を分化させ始めているいくつかの体細胞胚（図１２）を形質転換することができた。図１２によれば、また、当初アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感染した接合胚の胚盤は、これらの培養条件下では脂質をほとんど有さなかった。
【０２９５】
別の方法として、体細胞胚をカバーガラスとスライドガラスの間に置き、１層の細胞が押し出されるまで圧力を加えることにより、脂質を可視化した。上記のオイルレッドＯ染色法を使用した後、光学顕微鏡で観察したところ、多数のオイルの液滴が体細胞胚の細胞に散在しているのが観察された（図１３）。
脂質は、類似の染色プロトコルを使用して、薄片にした体細胞胚の中に検出することができる。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から、２、４、８、および１２日後に、直接形成の単一の体細胞胚をサンプリングし、上記のように、固定化し、乾燥させ、プラスチックを染み込ませ、薄片にした。脂質の染色用に、０．５％「オイルレッドＯ」溶液を加えた６０％トリエチルリン酸（水溶液）を調製し、ろ過した。スライドガラス上の組織の薄片を６０％トリエチルリン酸で短時間濯ぎ、その後「オイルレッドＯ」中で１０〜２０分間染色した。染色後、薄片を再度トリエチルリン酸で１〜２秒間濯ぎ、その後、蒸留した脱イオン水で洗浄した。その後、薄片を０．５％セレスチンブルーを加えた５％硫酸第二鉄アンモニウム水溶液で１５分間対比染色し、再度ＤＩ水で洗浄した。その後、水性封入培地を用いて薄片を埋め込み、観察した。成長中の体細胞胚の中に、胚盤中で蓄積している脂質が赤く現れ、薄片全体（胚盤および胚軸を含む）にわたって各細胞の核が青色に染色されることになろう。
【０２９６】
実施例１４：ＷＵＳ２単独、ＯＤＰ２単独、またはＷＵＳ／ＯＤＰ２の組み合わせによる形質転換。
３種のＰｉｏｎｅｅｒ近交系（ＰＨ１８４Ｃ、ＨＣ６９およびＰＨＨ５Ｇ）から未熟胚を収穫し、以下のＰＨＰ７９０６６（配列番号２７）、ＰＨＰ８０９１２（配列番号５３）およびＰＨＰ８０９１３（配列番号５４；それぞれ表１に詳しく説明されている）を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４で形質転換するために、各近交系からの胚を等しく分取した。
【０２９７】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換の後、３種の異なる近交系は、異なる導入遺伝子の組み合わせに対して異なる反応を示した（表１２）。近交系ＰＨ１８４Ｃでは、各処理で２３０個の未熟胚を感染させ、ＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２を単独で、ＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２を単独で、またはＷＵＳ２およびＯＤＰ２両者を組み合わせて発現させたとき、当初感染させた接合胚のそれぞれ８４、１０および１００％に胚盤表面で体細胞胚が生成した。７日後、全ての胚を成熟培地に、その後、発芽培地に移し、３種の処理それぞれで６８個、８個および５２個の胚がＴ０植物体を生成した（Ｔ０の形質転換効率はそれぞれ３０％、３％および２３％）。近交系ＨＣ６９では、各処理で８０個の未熟胚を使用し、全ての処理で体細胞胚およびＴ０植物体が効率良く生成され、最終のトランスジェニックＴ０植物体の頻度（開始時の胚の数に対して）は、ＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２、ＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２または組み合わせたＷＵＳ２＋ＯＤＰ２処理で、それぞれ８５％、５６％および６８％であった。最後に、近交系ＰＨＨ５Ｇでは、３種の各処理で１６８個の未熟胚を感染させ、最終のトランスジェニックＴ０植物体の頻度（開始時の胚の数に対して）は、ＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２、ＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２または組み合わせたＷＵＳ２＋ＯＤＰ２処理で、それぞれ２７％、０％および４８％であった。これらのデータから、近交系は、ＷＵＳ単独、ＯＤＰ２単独、または組み合わせに対して異なる反応を示すが、個々の転写因子の発現は、トランスジェニック体細胞胚およびＴ０植物体の生成に有効であることが示された。
【０２９８】
【表２０】
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【０２９９】
実施例１５：単一の体細胞胚から生成した小植物体の温室への移行の改善。
３種の遺伝子型（ＨＣ６９、ＰＨＨ５ＧおよびＰＨ１８４Ｃ）の未熟胚（９−１１ＤＡＰ）にＰＨＰ７９０６６を感染させた。胚を共培養培地（７１０Ｉ）へ移して１〜３日間置き、静止培地６０５Ｇ（６０５Ｊ培地＋２ｍｇ／ｌのメロペネム）に７日間、その後、成熟培地１３３２９（２８９Ｏ＋０．１ｍｇ／ｌのイマザピル）に移した。成熟培地に３〜４週間置いた後、強い１本のシュートをＥＸｃｅｌ  Ｐｌｕｇｓ（４０／８０）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ，２４１０  Ａｉｒｌｉｎｅ  Ｈｗｙ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ，９５０２３）に移し、Ｍｏｉｓｔｕｒｉｎ（ＷｅｌｌＰｌａｎｔ，Ｉｎｃ．，９４０  Ｓｐｉｃｅ  Ｉｓｌａｎｄｓ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｐａｒｋｓ，ＮＶ，８９４３１）を散布した。Ｖａｌｏｙａ（Ｖａｌｏｙａ  Ｏｙ，Ｌａｕｔｔａｓａａｒｅｎｔｉｅ  ５４Ａ，００２００  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）Ｒ−シリーズＮＳ２  ＬＥＤ光（２２０−３０５μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃ）の下、２７℃で２〜３週間シュートを培養した。必要に応じて、２〜３日毎に、６Ｎ塩およびビタミンに０．１ｍｇ／Ｌのイマザピルを加えたもので灌水した。根付いた後、Ｔ０を受け入れる温室へプラグを移し、さらに２週間栽培した。この時間枠の終わりに、各遺伝子型について生存データを収集した。これを下記表１３に示す。
【０３００】
【表２１】
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【０３０１】
実施例１６：トウモロコシの体細胞胚を直接生成するためにモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）ＰＬＴＰプロモーターを使用したことの結果。
モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）のＰＬＴＰプロモーター（ＳＢ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ）は、配列番号２で示される。Ｐｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１８４ＣまたはＰＨＨ５Ｇからの未熟胚をＴ−ＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５），ＲＢ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＰＬＴＰ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ：ＳＢ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ−ＬＢを含有するプラスミドＲＶ０１２６０８を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４で形質転換した。４〜６日間の培養後、近交系の接合胚表面に、多くの目立たない体細胞胚が形成された。これらの初期の体細胞胚は、互いを明瞭に区別でき（すなわち、形成中の体細胞胚の間に非トランスジェニック組織が介在して）、緑色蛍光タンパク質の発現に基づきトランスジェニック体であると確認された。これらの胚を０．１ｍｇ／ｌのイマザピルを含む成熟培地に移すと胚は成長を続け、発芽培地に移すとシュートと根が伸長した。
【０３０２】
実施例１７：トウモロコシの体細胞胚を生成するために、トウモロコシのＯＤＰ２相同体、ＷＵＳ２相同体および相同遺伝子源からのＰＬＴＰプロモーターを使用したことの結果。
ＷＵＳ／ＷＯＸパラログ（ファミリーのメンバー遺伝子であり、タンパク質をコードする）およびＯＤＰ２／ＢＢＭファミリーメンバーのリスト、ならびにそれらの対応する配列番号を下記表１４に示す。
【０３０３】
【表２２】
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【０３０４】
下記セクションＡ、ＢおよびＣに記載するこれらの研究では、以下のポジティブコントロールから始まる単一のＴ−ＤＮＡ構造を使用した（配列番号１０４）：  ＲＢ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ：ＳＢ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ−ＬＢ。このＴ−ＤＮＡの中で、下記の３つの可変体を除いて、Ｔ−ＤＮＡの全ての成分は変わらなかった。第１の可変体においては、ＺＭ−ＷＵＳ２（コントロールプラスミド内の）は、ＺＭ−ＷＯＸ２Ａ、ＺＭ−ＷＯＸ４、ＺＭ−ＷＯＸ５Ａ、またはソルガム（ＳＢ）ＷＵＳ１で置き換えられた。第２の可変体においては、ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ（コントロール処理の）は、２種のトウモロコシパラログ（ＺＭ−ＰＬＴＰ１およびＺＭ−ＰＬＴＰ２）からのプロモーターで、または３種のイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）のオーソログ（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）ＳＢ−ＰＬＴＰ１、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）ＳＩ−ＰＬＴＰ１もしくはイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＯＳ−ＰＬＴＰ１）からのプロモーターで置き換えられた。コントロールＴ−ＤＮＡ（上記の全てのトウモロコシ成分）をＰｉｏｎｅｅｒ近交系ＰＨ１Ｖ５Ｔ、ＰＨ１Ｖ６９およびＰＨＨ５Ｇの胚盤に導入すると、７日後には、胚盤表面積の約半分が新たに成長した体細胞胚で覆われた。この反応のスコアを「２」とした。この反応スペクトルの上限では、感染後４〜７日で胚盤は個々の成長中の一面の体細胞胚で完全に覆われた。この反応には相対スコア「４」を与え、そして他の処理全てを「０」（反応なし）から「４」（体細胞胚が最も多く生成）にランク付けした。ＷＵＳ２またはＯＤＰ２発現カセットが、例えば、ＰＨＰ２４６００、配列番号６９、に導入されないと、ＰＨ１Ｖ５Ｔは低レベルの体細胞胚を生成した（スコア１）が、ＰＨ１Ｖ６９およびＰＨＨ５Ｇの両者は反応なしであった（スコア０）。
【０３０５】
Ａ．ＺＭ−ＷＵＳ２に対してＺＭ−ＷＯＸファミリーメンバーまたはソルガムＷＵＳ１で置換すると、急速に形成する体細胞胚を様々な程度に生成した。
この実験では、Ｔ−ＤＮＡ（配列番号１０４）にＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２を含有するポジティブコントロールプラスミドは、近交系ＰＨ１Ｖ５ＴおよびＰＨＨ５Ｇで中程度（スコア２）の反応を示したが、近交系ＰＨ１Ｖ６９ではより低いスコア「１」であった。これに対し、ＺＭ−ＷＵＳ２を３種のトウモロコシのＷＯＸファミリーメンバーに代えると、ＺＭ−ＷＯＸ２Ａからの比較的高い体細胞胚反応から、ＺＭ−ＷＯＸ４での低反応ないし無反応およびＷＯＸ５での低反応（Ｔ−ＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１００、配列番号１０１および配列番号１０２で与えられる）まで変動する体細胞胚形成の反応範囲が観察された（表１５）。ＷＯＸ５およびＷＯＸ４は形質転換された未熟胚表面に生成される体細胞胚は少なかったが、ＷＯＸ５を含む３種全ての近交系およびＷＯＸ４を含む近交系のサブセットで依然としてポジティブな反応を示した。低レベルの反応を示した処理では、近交系ＰＨ１Ｖ５Ｔは、ＷＵＳ２およびＯＤＰ２発現カセットの非存在下では低レベルの成長を示すため、解釈は困難であった。しかしながら、そのような処理で、他の２種の近交系は、バックグラウンドの成長を示さず、そして低レベル反応（１）であることが明白であったので、はるかに多くの情報を有するものになった。
【０３０６】
【表２３】
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【０３０７】
形質転換後の急速な成長反応の促進について、ＺＭ−ＷＵＳ１およびＺＭ−ＷＵＳ３をまたＺＭ−ＷＵＳ２と比較した。この実験では、トウモロコシの標準粒子衝撃プロトコル（Ｓｖｉｔａｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６９：９３１−９４５を参照）を使用し、ＵＢＩ：：ＧＦＰ：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを含有するプラスミドと、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭまたはＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＷＵＳ３：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭを含有するプラスミドとを等モル比で共衝突させた。ＧＦＰフィルターを備えたＬｅｉｃａ  Ｍｚｆｌ  ＩＩＩ落射蛍光顕微鏡で胚を観察した。７日後、衝突を受けた胚盤の表面は、中心にＧＦＰ蛍光を有する、急速に成長中の多細胞構造体で覆われた。３種のＷＵＳ３パラログの全てで、成長速度は速く、反応は衝突を受けた胚盤表面の広い範囲に及び、３種のＷＵＳパラログで違いを識別できなかった。これらの観察に基づき、トウモロコシ未熟胚の形質転換で、ＺＭ−ＷＵＳ１およびＺＭ−ＷＵＳ３をＡＸＩＧ１プロモーターの後ろに置き、Ｔ−ＤＮＡ中でＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２と組み合わせるならば、ＺＭ−ＷＵＳ２と同程度の急速な体細胞胚の形成が期待されるであろう。
【０３０８】
この実験の最後の処理は、トウモロコシＷＵＳ２をソルガム（ＳＢ）ＷＵＳ１（配列番号１０３で示されるＴ−ＤＮＡ配列）に代えることであった。この処理は、任意の処理の最も急速で豊富な体細胞胚反応を発生させ、感染した胚の約８０％が体細胞胚で完全に覆われた。
【０３０９】
Ｂ．トウモロコシパラログまたは３種の異なるイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）オーソログによるＰＬＴＰプロモーター置換は、様々な程度の急速体細胞胚の形成をもたらした。
様々な「相同の」プロモーターを使用すると、３種の異なるＰｉｏｎｅｅｒ近交系で、スコアが１と２の間であるコントロール処理（ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ）と比べて、ある範囲の急速体細胞胚の形成をもたらした（表１６）。
【０３１０】
【表２４】
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【０３１１】
この実験では、ＺＭ−ＰＬＴＰ１プロモーターは、感染の７日後に、３（ＰＨ１Ｖ５Ｔでは約７５％が体細胞胚で覆われた）から４（ＰＨ１Ｖ６９およびＰＨＨ５Ｇでは全体が覆われた）の範囲をとる、最高の体細胞形成スコアを獲得した。ＺＭ−ＰＬＴＰ２もまたコントロールより良い結果を生じ、３種の近交系を通してスコアが揃っていた。イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の他のメンバーのＰＬＴＰ１プロモーター、すなわちソルガムおよびイネのプロモーターでは、２種の近交系で中間レベルの反応（２）そして１種の近交系で低反応（１）を示したが、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）では、２種の近交系で低レベルの反応そして１種の近交系で中間レベルの反応を示した。試験した全てのＰＬＴＰプロモーターは、７日後に体細胞胚形成にポジティブな刺激を与えた。
【０３１２】
Ｃ．ＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２またはＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２と組み合わせたＺＭ  ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＬＥＣ１は体細胞胚の急速な生成をもたらした。
前の実験では、ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＬＥＣ１は、形質転換可能なトウモロコシハイブリッドＨｉ−ＩＩで形質転換頻度を刺激したことが示された（Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、米国特許第７，２６８，２７１号明細書を参照）。
【０３１３】
この実験では、３種の近交系の急速体細胞胚形成に対する影響を評価するために、コントロールベクター中のＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２またはＰＬＴＰ：：ＯＤＰ２をＺＭ−ＰＬＴＰ：：ＺＭ−ＬＥＣ１に代えた。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染、組織培養および７日目の胚形成へのスコアの付与の条件は先の実施例で説明した通りである。表１７に見られるように、新規の組み合わせは両者ともコントロールより高いスコアを得たが、ＡＸＩＧ１：：ＷＵＳ２＋ＰＬＴＰ：：ＬＥＣ１は３種の近交系を通して最強の体細胞胚反応をもたらした。このように、ＷＵＳ２発現カセットまたはＯＤＰ２発現カセットと組み合わせたＰＬＴＰ：：ＬＥＣ１は、体細胞胚の急速な形成を刺激することに有効であった。
【０３１４】
【表２５】
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【０３１５】
Ｄ．イネのＷＵＳおよびＯＤＰ２の組み合わせ、またはエノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）のＷＵＳおよびＯＤＰ２の組み合わせの使用は、トウモロコシ未熟胚の形質転換後に体細胞胚の形成をもたらした。
ＮＯＳ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：：ＰＩＮＩＩを含有するトウモロコシのコンストラクトから出発して、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）およびアワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）で同定されたＷＵＳ２およびＯＤＰ２のオーソログを合成し、上のコンストラクト中のトウモロコシの遺伝子を置換した。ＰＨＰ８０９１１（トウモロコシＷＵＳ２およびＯＤＰ２）、ＰＨＰ７９５３０（イネの遺伝子）またはＰＨＰ７９５３１（アワの遺伝子）を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４を使用して、近交系ＰＨＨ５ＧおよびＰＨ１８４Ｃからの未熟胚を形質転換した。培養培地上で１４日後、解剖顕微鏡および落射蛍光実体顕微鏡で未熟胚を観察し、先に説明した体細胞胚形成基準（０〜４）を使用してスコアを付けた。近交系ＰＨ１８４Ｃでは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から１４日後の体細胞胚のスコアは、２、２および１（それぞれ、トウモロコシ、キビおよびイネの遺伝子対で）であった。近交系ＰＨＨ５Ｇでは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から１４日後の体細胞胚のスコアは、３、３および２（それぞれ、トウモロコシ、キビおよびイネの遺伝子対で）であった。これらの未熟胚は、上記セクション５Ａ、５Ｂおよび５Ｃの２倍の時間、ＷＵＳ２およびＯＤＰ２の発現を経験しており、このため、データが７日目に収集され場合より高い体細胞胚形成スコアが付与された。それぞれの種からの同族のＷＵＳおよびＯＤＰ２遺伝子の組み合わせは、体細胞胚の形成を促進した。ＷＵＳ２またはＯＤＰ２が存在しない場合、ＰＨＨ５Ｇで体細胞胚の形成は観察されなかった。
【０３１６】
イネ（Ｐｏａｃｅａｅ）科の中では、トウモロコシとイネが系統発生の正反対の位置にあり、キビが中間にある。上記のＷＵＳ、ＯＤＰ２およびＰＬＴＰの分岐した配列での結果に基づけば、この研究は、形質転換後の急速な体細胞胚形成を促進するのに、イネ科植物全体のメンバーからの組み合わせが有効に使用できることを示した。
【０３１７】
実施例１８．ダイズの形質転換の改善を目的に、ＷＵＳの発現をコントロールするためのダイズのＬＴＰ３プロモーターの使用。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＷＵＳ遺伝子を用いて形質転換を改善し得る新規のプロモーターを見出すために、この遺伝子の使用を再検討した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換直後およびカルスの成長期間を通じて発現した、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳの高レベルの発現（例えば、ダイズＥＦ１Ａ  ＰＲＯ使用の場合）により、イベントの生成速度が増大した。しかしながら、この転写因子のこのレベルの発現を継続させると、イベントの再生が妨げられた。可能性のある解決策としては、小植物体の再生前に、この遺伝子を切除し、体細胞胚の分化および成熟に際してシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＷＵＳの異所性発現を制限することであろう。このことに基づき、培養細胞、胚、および成長中の未成熟種子で発現し、別の植物組織では発現が全くないかまたは非常に低レベルである新規のプロモーターを探索した。ダイズＬＴＰ３プロモーターがこれらの基準を満たした。これまでに確認されていないダイズのリン脂質トランスフェラーゼ遺伝子である。図１４および図１５に示すように、ＥＦ１Ａ  ＰＲＯの構成的発現（図１４）と比較すると、ＬＴＰ３の発現（図１５）は、ｉ）成長中の未成熟種子で強く、かつｉｉ）別の試料および植物の部分では弱いかまたは発現しないが、ＥＦ１Ａの発現は全ての組織で観察された。
【０３１８】
発現カセット  ＧＭ−ＬＴＰ３  ＰＲＯ：：ＡＴ−ＷＵＳ：：ＵＢＩ１４  ＴＥＲＭ＋ＧＭ−ＵＢＱ  ＰＲＯ：：ＴＡＧＲＦＰ：：ＵＢＱ３  ＴＥＲＭを含むＴ−ＤＮＡ含有アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１を使用し、Ｐｉｏｎｅｅｒダイズ変種ＰＨＹ２１を形質転換した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染開始から４日後、組織を滅菌培養培地で洗浄し、過剰の細菌を除いた。９日後、組織を体細胞胚成熟培地に移し、２２日後にトランスジェニック体細胞胚はドライダウンの準備が整った。この時点で、十分に形成された成熟体細胞胚は、ＲＦＰフィルターを備えた落射蛍光実体顕微鏡下で赤色の蛍光を発した。成長した体細胞胚は、機能的であり発芽して温室で健康な植物体に育った。この急速な、体細胞胚の生成方法、および発芽させて植物体を形成する方法により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染からトランスジェニックＴ０植物体を温室に移すまでの通常の時間枠が、４ヵ月（従来のダイズの形質転換）から２ヵ月に短縮された。
【０３１９】
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から２週後の、未成熟子葉外植体の体細胞胚形成反応の分布を示す図１６のボックスプロットで示すように、Ａｔ−ＷＵＳの発現を駆動するＬＴＰ３プロモーターを使用すると、体細胞胚の形成が大きく改善された（試験した他のプロモーター、またはＷＵＳ発現カセットを含まないネガティブコントロールと比較して（図１６を参照））。
【０３２０】
感染した未成熟子葉集団の体細胞胚反応の増加はまた、急速な体細胞胚の成長を伴い、これは形態を評価する光学顕微鏡（図１７Ａ）および赤色蛍光を観察する落射蛍光顕微鏡（図１７Ｂ）の両方で観察された。それは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から僅か５週後に、乾燥およびその後の発芽準備が整った、成熟したトランスジェニックダイズの体細胞胚を示すものである。未成熟子葉をＬＴＰ３：：Ａｔ−ＷＵＳを用いずに形質転換（コントロール処理）すると、成熟体細胞胚は極めて低い頻度で生成する（図１６を参照）だけでなく、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染から体細胞胚が同等の成熟度になるまでに９週間の培養期間を必要とした。
【０３２１】
実施例１９．ＷＵＳ２、ＯＤＰ２およびＣＲＥ発現カセットが切除され、残りの形質遺伝子はシングルコピーであるＴ０植物体の回収を増加させる切除−活性化選択マーカーＨＲＡ。
切除−活性化ＨＲＡ発現をもたらすベクターを構築するために、単一のｌｏｘＰ標的部位を中心に有するＳＴ−ＬＳ１イントロンをＨＲＡ遺伝子に割り込ませ、ｌｏｘＰ含有イントロンが適切に機能することを示すためにその遺伝子を試験した。ＨＲＡ発現カセットを半分にしたもの２つ（ｌｏｘＰ部位で分割）をＴ−ＤＮＡの反対側の端部に移動させ、それぞれの半分にそれ自身の内部ｌｏｘＰ部位を持たせて、ｌｏｘＰ部位がＨＲＡの半分よりもＴ−ＤＮＡの中心に近くなるようにした。２つのｌｏｘＰ部位内には、ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＷＵＳ２：：ＩＮ２  ＴＥＲＭ、ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ、ＺＭ−ＧＬＢ１  ＰＲＯ：：ＣＲＥ：：ｐｉｎＩＩおよびＳＢ−ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：：ＯＳ−ＵＢＩ  ＴＥＲＭ発現カセットが存在した（表１のＰＨＰ８１８１４および配列番号８０を参照）。
【０３２２】
このコンストラクトでは、一体化したＷＵＳ／ＯＤＰ２／ＣＲＥ／ＺＳ−ＧＲＥＥＮカセットが切除されてＨＲＡの発現を活性化させた高頻度の急速体細胞胚が形成され、シングルコピーのＴ０植物体が回収された。１セットの実験では、全部で２３３２個の混ぜ合わせた未熟胚（近交系ＰＨＨ５Ｇからの）を、ＰＨＰ８１８１４を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４  ＴＨＹ−による形質転換に使用した。感染した全部の胚のうち全部で６０４個のＴ０植物体を回収し、これら６０４個のＴ０植物体のうち全部で２１５個はＷＵＳ２、ＯＤＰ２、ＣＲＥおよびＳＺ−ＧＲＥＥＮ発現カセットを含有していなかった（完全な切除）。全体としての高品質イベントの回収は９．２％（出発胚の数に対する完全なイベントの数）であった。
【０３２３】
近交系ＨＣ６９を用いた別々の３セットの実験では、７４１個の未熟胚をＰＨＰ８１８１４含有アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で形質転換し、温室で３１５個のＴ０植物体を生成させ、そのうち４％の高品質イベントに当たる３０個は、ＨＲＡについてシングルコピーであり、他の全ての遺伝子は切除された。
【０３２４】
実施例２０．ＷＵＳ２および／またはＯＤＰ２の発現を駆動する胚特異的発現パターンを有するプロモーターの、トウモロコシの形質転換を改善するための使用。
これらの実験では、ポジティブコントロールとして以下の構造でスタートし、単一のＴ−ＤＮＡ構造を使用する：ＲＢ＋ＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１  ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８  ＴＥＲＭ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ  ＩＮＴＲＯＮ：ＥＳＲ：：ＳＢ−ＳＡＧ１２  ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＡＬＳ  ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＳＢ−ＰＥＰＣ１  ＴＥＲＭ＋ＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ１：：ＰＩＮＩＩ  ＴＥＲＭ：ＳＢ−ＡＣＴＩＮ  ＴＥＲＭ−ＬＢ。ポジティブコントロールをＷＵＳ２およびＯＤＰ２の発現を駆動する胚特異的プロモーターを有するプラスミドと比較する。比較のベースラインを与えるために、ネガティブコントロールとして、プラスミドＰＨＰ２４６００を使用する（ＷＵＳ２およびＯＤＰ２導入遺伝子の発現はない）。
【０３２５】
このコンストラクトでＷＵＳ２の発現を駆動するＺＭ−ＡＸＩＧ１  ＰＲＯを置換するために、ＺＭ−ＳＲＤ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＬＧＬ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＬＥＡ１４−Ａ  ＰＲＯまたはＺＭ−ＬＥＡ−Ｄ−３４プロモーター（それぞれ配列番号３８、配列番号８１、配列番号８２および配列番号８３）を使用すると、形質転換頻度の増加および急速体細胞胚形成の促進は、ポジティブコントロールベクターで観察されるものと類似し、両者ともネガティブコントロール処理（ＰＨＰ２４６００）よりかなり高くなることが期待される。同様に、このコンストラクトでＯＤＰ２の発現を駆動するＺＭ−ＰＬＴＰ  ＰＲＯを置換するために、ＺＭ−ＳＲＤ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＬＧＬ  ＰＲＯ、ＺＭ−ＬＥＡ１４−Ａ  ＰＲＯまたはＺＭ−ＬＥＡ−Ｄ−３４プロモーターを使用すると、形質転換頻度の増加および急速体細胞胚形成の促進は、この場合もポジティブコントロールベクターで観察されるものと類似し、両者ともネガティブコントロール処理（ＰＨＰ２４６００）よりかなり高くなることが期待される。
【０３２６】
実施例２１．配列番号
本開示では様々な配列に言及する。配列番号を下記表１８に示す。
【０３２７】
【表２６】
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【０３２８】
【表２７】
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【０３２９】
【表２８】
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【０３３０】
【表２９】
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【０３３１】
【表３０】
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【０３３２】
本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、そのような細胞を複数種含み、「タンパク質」への言及は、１つ以上のタンパク質および当業者に知られたその同等物などを含む。別途明確な指示がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【０３３３】
本明細書で言及した全ての特許、刊行物および特許出願は、本開示が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。全ての特許、刊行物および特許出願は、あたかも個々の特許、刊行物または特許出願が、明確にかつ個々に参照により全体的に組み込まれるよう指示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３４】
以上の開示は、理解を明確にする目的で、図面および実施例を使ってある程度の詳しく説明してきたが、添付の請求項の範囲内で一定の変更および修正を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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