(57)【要約】本発明は、修飾された第ＩＸ因子をコードする配列、発現カセット、ウイルス（例えば、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス）ベクター等のようなベクター、及び、遺伝子導入の方法及び使用に関する。特に、第ＩＸ因子の発現（転写）のための細胞、組織又は器官に対する第ＩＸ因子核酸を目的とする。
2018522529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする核酸配列であって、
前記核酸は、ヒト第ＩＸ因子をコードする野生型配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸配列。
【請求項２】
ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はプラスミドであって、
前記核酸は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然の配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有し、及び／又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする核酸配列に１つ以上のさらなる配列が、前記ベクター又は前記プラスミドの中に存在する場合に、前記さらなる配列は、任意に、同等の天然の又は野生型の配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、発現ベクター又はプラスミド。
【請求項３】
イントロン、発現制御因子、１つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列をさらに含み、
任意に、前記イントロン、前記発現制御因子、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、及び／又は、前記フィラーポリヌクレオチド配列は、同等の天然の又は野生型の発現制御因子、同等の天然の又は野生型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、及び／又は、同等の天然の又は野生型のフィラーポリヌクレオチド配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、請求項１に記載の、ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする核酸配列、請求項２に記載の発現ベクター若しくはプラスミド、又は、請求項３に記載の組成物。
【請求項４】
前記イントロンが、前記ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする配列内に存在するか、又は、
前記発現制御因子が、前記ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする配列と作用可能に連結されているか、又は、
前記ＡＡＶＩＴＲが、前記ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする配列の５’末端又は３’末端に隣接しているか、又は、
前記フィラーポリヌクレオチド配列は、前記ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする配列の５’末端又は３’末端に隣接している、
請求項４に記載の、ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする核酸配列。
【請求項５】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より１〜５個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項６】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より５〜１０個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項７】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より１０〜１５個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項８】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より１５〜２０個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項９】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より２０〜２５個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１０】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より２５〜３０個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１１】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より３０〜４０個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１２】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列より４０〜５５個少ない数のＣｐＧジヌクレオチドを有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１３】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列、イントロン、発現制御因子、ＩＴＲ、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、すべてのＣｐＧジヌクレオチドを欠損している、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１４】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列は、配列番号：１０に対して８０％又はそれ以上の同一性を有する配列を含み、凝固分析によって測定される機能する因子ＩＸをコードする、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１５】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列は、配列番号：１０に対して９０％又はそれ以上の同一性を有する配列を含み、凝固分析によって測定される機能する因子ＩＸをコードする、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１６】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列は、配列番号：１０に対して９５％又はそれ以上の同一性を有する配列を含み、凝固分析によって測定される機能する因子ＩＸをコードする、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１７】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列は、配列番号：１０、配列番号：２５又は配列番号：２６を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１８】
前記ヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列は、配列番号：１１に記載されている配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項１９】
前記イントロン配列は、配列番号：１７に記載されている配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２０】
前記発現制御因子は、配列番号：１４に記載されている配列を含むエンハンサー配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２１】
前記発現制御因子は、配列番号：１５に記載されている配列を含むプロモーター配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２２】
前記１つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）の配列は、配列番号：１３及び／又は配列番号：２０に記載されている配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２３】
前記フィラーポリヌクレオチド配列は、配列番号：２１に記載されている配列を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２４】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列は、免疫反応を誘導する能力を低下させる、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２５】
前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列は、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少していないヒト第ＩＸ因子をコードする天然配列よりも高いレベル又は該天然配列と同等のレベルで発現される、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２６】
前記発現制御因子は、恒常的な若しくは制御可能な制御因子、又は、組織特異的な発現制御因子若しくはプロモーターを含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２７】
前記発現制御因子は、肝臓において発現を与える因子を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２８】
前記発現制御因子は、ヒトα1−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）ＨＣＲ−１、及び／又は、ＨＣＲ−２エンハンサーを含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項２９】
前記ヒト第ＩＸ因子をコードする核酸配列の３’に配置されたポリアデニル化配列をさらに含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項３０】
前記ヒト第ＩＸ因子をコードする核酸配列の３’に配置された前記ポリアデニル化配列は、ｂＧＨポリアデニル化配列を含む、
請求項２９に記載の、ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする核酸配列。
【請求項３１】
前記ヒト第ＩＸ因子をコードする核酸配列の３’に配置された前記ポリアデニル化配列は、すべてのＣｐＧジヌクレオチドが除去されたポリアデニル化配列を含む、
請求項２９に記載の、ヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする核酸配列。
【請求項３２】
前記ポリアデニル化配列は、配列番号：１９に記載されている配列を含む、
請求項３１に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項３３】
前記フィラーポリヌクレオチド配列は、前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列の３’に配置されている、
請求項４又は請求項５に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項３４】
前記ＡＡＶは、前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列の３’末端に隣接する、
請求項４又は請求項５に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項３５】
前記フィラーポリヌクレオチド配列は、前記ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列の３’末端に隣接するＡＡＶ  ＩＴＲの３’に配置されている、
請求項３４に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項３６】
前記フィラーポリヌクレオチド配列は、ラムダファージ配列を含む、
請求項４又は請求項５に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列。
【請求項３７】
請求項１〜請求項３６のいずれかに記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列を含む、ヒトＦＩＸタンパクをコードするプラスミド配列であって、
１つ以上の複製開始点及び／又は抗生物質に対する耐性をコードする核酸をさらに含む、
プラスミド配列。
【請求項３８】
配列番号：１２又は配列番号：２６を含むヒトＦＩＸタンパクをコードするプラスミド配列。
【請求項３９】
ヒトＦＩＸタンパク又は発現ベクターをコードする配列を含むウイルスベクターであって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列を含む、
ウイルスベクター。
【請求項４０】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項３９に記載のウイルスベクター。
【請求項４１】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３９に記載のウイルスベクター。
【請求項４２】
以下のいずれか：
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のＩＴＲ配列を含む請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４３】
前記ベクターのキャプシド配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又は、ＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１配列、ＶＰ２配列又はＶＰ３に対して９０％以上の同一性を有するＶＰ１キャプシド配列、ＶＰ２キャプシド配列及び／又はＶＰ３キャプシド配列を含む、
請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４４】
前記ベクターのキャプシド配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又は、ＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型から選択されるＶＰ１キャプシド配列、ＶＰ２キャプシド配列又はＶＰ３キャプシド配列を含む、請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４５】
前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号：１に対して９０％以上の配列同一性を有し、若しくは、当該配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠損若しくは付加されたＶＰ１配列；
配列番号：２に対して９０％以上の配列同一性を有し、若しくは、当該配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠損若しくは付加されたＶＰ２配列；及び／又は、
配列番号：３に対して９０％以上の配列同一性を有し、若しくは、当該配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠損若しくは付加されたＶＰ３配列を含む、
請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４６】
配列ベクターの前記キャプシドは、配列番号：１に記載されているＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５、１９９、２０１又は２０２のいずれか１つにおいてアミノ酸置換を有し、又は、
配列番号：１に記載されているＶＰ１キャプシド配列のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸置換を有する、請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４７】
前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号：１に記載されているＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５、１９９、２０１又は２０２のいずれか１つにおいてＡ、Ｖ、Ｐ又はＮアミノ酸のいずれかの残基を有する、請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４８】
前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号：１に記載されているＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５のＡ残基、アミノ酸位置１９９のＶ残基、アミノ酸位置２０１のＰ残基、又は、アミノ酸位置２０２のＮ残基を有する、
請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４９】
前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号：４として記載されたＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５のＡ残基、アミノ酸位置１９９のＶ残基、アミノ酸位置２０１のＰ残基、又は、アミノ酸位置２０２のＮ残基のいずれか２つ、３つ又は４つを有する、
請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５０】
前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号：４−９のいずれかに対して９０％以上の同一性を有するＶＰ１キャプシド配列を含む、
請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５１】
前記ベクターのキャプシド配列は、配列番号：４−９のいずれか含むＶＰ１キャプシド配列を含む、
請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５２】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載のヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列、及び／又は、請求項３９〜５１のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項５３】
空キャプシドＡＡＶをさらに含む、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記空キャプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１の血清型ＡＡＶから選択される、
請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
配列番号：１１又は配列番号：２５を含む発現ベクター。
【請求項５６】
配列番号：１４に記載されている配列を含むエンハンサー配列をさらに含む、
請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５７】
配列番号：１５に記載されている配列を含むプロモーター配列をさらに含む、
請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５８】
配列番号：１２又は配列番号：２６に記載されている上流の及び／又は下流のＡＡＶ２  ＩＴＲをさらに含み、
前記上流のＩＴＲが、前記エンハンサーの５’に配置されており、及び／又は、前記下流のＡＡＶ２  ＩＴＲが、配列番号１２又は２６に記載されているｈＦＩＸエクソン２〜８の３’に配置されている、
請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５９】
配列番号：１２又は２６に記載されているｈＦＩＸエクソン２〜８の３’に配置され、かつ、前記下流のＡＡＶ２  ＩＴＲの５’に配置されたｐｏｌｙＡ配列をさらに含む、
請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項６０】
請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の発現ベクターを含むＡＡＶベクター。
【請求項６１】
前記キャプシド配列は、配列番号：４−９のいずれかを含むＶＰ１キャプシド配列を含む、
請求項６０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６２】
細胞中に核酸配列を届け又は移す方法であって、
前記細胞の遺伝子導入を可能にする条件下で、請求項１〜６１のいずれかに記載の核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターを哺乳動物細胞と接触させ、それによって前記哺乳動物細胞中に核酸配列を届け又は移すステップを含む、方法。
【請求項６３】
哺乳動物又は哺乳動物の細胞の中に核酸配列を届け又は移す方法であって、
請求項１〜６１のいずれかに記載の核酸配列、発現ベクター、又は、ウイルスベクターを哺乳動物又は哺乳動物の細胞に投与し、それによって前記哺乳動物又は前記哺乳動物の細胞の中に前記核酸配列を届け又は移すステップを含む、方法。
【請求項６４】
第ＩＸ因子タンパクの必要がある哺乳動物を治療する方法であって、
（ａ）核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターを提供するステップと、
（ｂ）請求項１〜６１のいずれかに記載の核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターの所定量を前記哺乳動物に投与するステップを含み、
前記第ＩＸ因子が前記哺乳動物中で発現される、方法。
【請求項６５】
前記哺乳動物の細胞、組織又は器官において前記第ＸＩ因子タンパクが発現される、
請求項６２〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が分泌細胞を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が内分泌細胞を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、肝細胞、神経系細胞、膠細胞、網膜細胞、上皮細胞、肺細胞、又は、分化全能性の、複数分化性の若しくは多能性の幹細胞を含む、
請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物の組織又は器官が、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、目、網膜又は肺を含む、
請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記哺乳動物が、不充分な量の第ＩＸ因子タンパク、又は、不完全な若しくは異常な第ＩＸ因子タンパクを生産する、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記哺乳動物が血友病Ｂを有する、請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターは、
静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経口、挿管によって、カテーテルによって、皮膚、頭蓋内、吸入によって、腔内、又は、粘膜の経路で哺乳動物に届けられる、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記哺乳動物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ−Ｒｈ７４の血清型に対して血清反応ポジティブ又は血清反応ネガティブである、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
空キャプシドＡＡＶを投与するステップをさらに含む、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／又はＡＡＶ−Ｒｈ７４の血清型の空キャプシドを投与するステップをさらに含む、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
投与されたＡＡＶベクターと同じ血清型の空キャプシドＡＡＶを投与するステップをさらに含む、請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記第ＩＸ因子タンパクが、前記哺乳動物に対して治療効果を有するレベルで前記哺乳動物において発現される、請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記の第ＩＸ因子タンパクは、哺乳動物において、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日、数週間、又は、数ヶ月間に亘って治療効果を有するレベルで発現される、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第ＩＸ因子タンパクは、哺乳動物において、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日の連続した日、数週間、又は、数か月に亘って、約２０％のＦＩＸ活性又は２０％を超える活性のレベルで存在する、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ウイルスベクターは、哺乳動物１キログラム当たり、概ね、１×１０10〜１×１０11、１×１０11〜１×１０12、１×１０12〜１×１０13、又は、１×１０13〜１×１０14のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲内の用量で投与される、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記ウイルスベクターは、哺乳動物１キログラム（ｖｇ／ｋｇ）当たり１×１０12ベクターゲノム未満の用量で投与され、その哺乳動物において、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って、約２０％の活性又は２０％を超える活性のレベルで第ＩＸ因子タンパクが生産される、
請求項６２〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記ウイルスベクターは、哺乳動物１キログラム（ｖｇ／ｋｇ）当たり約５×１０11ベクターゲノムの用量で投与され、その哺乳動物において、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日、数週間又は数ヶ月間に亘って、約２０％の活性又は２０％を超える活性のレベル第ＩＸ因子タンパクが生産される、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記哺乳動物に投与される核酸配列、発現ベクター又はウイルスベクターは、第ＩＸ因子タンパク及び／又はウイルスベクターに対する本質的な免疫反応を生じない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
第ＩＸ因子タンパク及び／又は前記ウイルスベクターに対する本質的な免疫反応は、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って生じない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記哺乳動物は、第ＩＸ因子タンパクに対する本質的な免疫反応を生じない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記哺乳動物は、第ＩＸ因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分な、第ＩＸ因子タンパクに対する免疫反応を発達させない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記哺乳動物は、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日、数週間又は数ヶ月間に亘って、第ＩＸ因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分な第ＩＸ因子タンパクに対する本質的な免疫反応を生じない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記の哺乳動物は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３若しくは１４日の連続した日、数週間又は数ヶ月に亘って、第ＩＸ因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分な第ＩＸ因子タンパクに対する免疫反応を発達させない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記哺乳動物は、第ＩＸ因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分なＡＡＶベクターに対する免疫反応を発達させない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記哺乳動物は、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日の連続した日、数週間、又は、数ヶ月間に亘って、第ＩＸ因子タンパク治療効果を低減又はブロックするのに充分なＡＡＶベクターに対する免疫反応を発達させない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第ＩＸ因子タンパクは、前記哺乳動物において、免疫抑制剤（例えば、ステロイド）を投与することなく、前記哺乳動物に治療効果を有する量又は活性レベルで発現される、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記第ＩＸ因子タンパクは、前記哺乳動物において、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３若しくは１４日、数週間又は数ヶ月に亘って、免疫抑制剤（例えば、ステロイド）を投与することなく、治療効果を有する量で又は活性レベルで発現される、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記哺乳動物は、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って、肝臓のＡＬＴ酵素、ＡＳＴ酵素及び／又はＬＤＨ酵素の異常に高い値を生じない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記哺乳動物は、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日の連続した日、数週間又は数ヶ月間に亘って、免疫抑制剤（例えば、ステロイド）を使用することを必要とする肝臓のＡＬＴ酵素、ＡＳＴ酵素及び／又はＬＤＨ酵素の異常に高い値を生じない、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第ＩＸ因子タンパクは、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日、数週間又は数ヶ月間に亘って、自然に生じる間接出血又は脳出血の期間、重症度又は頻度を低減するために必要とされるＦＩＸの血中濃度より高いレベルで哺乳動物において発現される、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記第ＩＸ因子タンパクは、少なくとも、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日若しくは１４日、数週間又は数ヶ月間に亘って、ＡＡＶベクター投与後に組み換えＦＩＸタンパクを必要とすることがない又は投与されることないレベルで哺乳動物において発現される、
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
血友病Ｂを治療するための組み換えＡＡＶベクターであって、
前記組み換えＡＡＶベクターは、キャプシド及びゲノムを含み、
前記キャプシドは配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶＰ１タンパクを含み、
前記ゲノムは単鎖であり、５’から３’の順序で、
（ａ）第１のＡＡＶ２  ＩＴＲ
（ｂ）ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサー
（ｃ）ＡＡＴプロモーター
（ｄ）ヒト第ＩＸ因子Ｐａｄｕａをコードするコドン最適化された核酸であって、前記核酸は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを欠損しているか、そうでなければ存在しているもの
（ｅ）ポリアデニル化配列
（ｆ）第２のＡＡＶ２  ＩＴＲ
の因子を含む、組み換えＡＡＶベクター。
【請求項９９】
請求項９８に記載のｒＡＡＶベクターであって、
（ａ）第１のＡＡＶ２  ＩＴＲの核酸配列は、配列番号：１２のヌクレオチド１〜１４１からなり、
（ｂ）ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサーの核酸配列は、配列番号：１２のヌクレオチド１５２〜４７２からなり、
（ｃ）ＡＴＴプロモーターの核酸配列は、配列番号：１２のヌクレオチド４８２〜８７８からなり、
（ｄ）ヒト第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ変異体をコードする前記核酸の核酸配列は、配列番号：１２のヌクレオチド９０８〜３７３１からなり、
（ｅ）前記のポリアデニル化配列の核酸配列は、配列番号：１２のヌクレオチド３８２０〜４０４７からなり、
（ｆ）前記第２のＡＡＶ２  ＩＴＲの核酸配列は、配列番号：１２のヌクレオチド４０９７〜４２０４からなる。
【請求項１００】
前記ゲノムが、配列番号：１２のヌクレオチド１〜４２０４に対応する核酸配列を含む、請求項９９に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項１０１】
請求項９８又は９９のいずれか１項に記載の治療的有効量のｒＡＡＶベクターを前記被検体に投与するステップを含む、血友病Ｂを有するヒト被検体を治療する方法。
【請求項１０２】
前記の被検体が重度の血友病Ｂを有し、前記治療が血友病Ｂの症状を重度から中程度又は軽度に緩和するのに有効である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記治療は、少なくとも、正常なＦＩＸ活性の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％である血漿ＦＩＸ活性のレベルを達成するのに有効である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記治療は、少なくとも、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年又は５年の持続時間に亘って、血漿ＦＩＸ活性の前記レベルを達成するのに有効である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記治療は、少なくとも、６か月、１年、２年、３年、４年又は５年の持続時間に亘って少なくとも１％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記治療は、少なくとも、６か月、１年、２年、３年、４年又は５年の持続時間に亘って少なくとも５％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記治療は、少なくとも、６か月、１年、２年、３年、４年又は５年の持続時間に亘って少なくとも１０％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記治療は、少なくとも、６か月、１年、２年、３年、４年又は５年の持続時間に亘って少なくとも２０％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記治療は、少なくとも、６か月、１年、２年、３年、４年又は５年の持続時間に亘って少なくとも３０％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
前記の治療は、少なくとも、６か月、１年、２年、３年、４年又は５年の持続時間に亘って少なくとも４０％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
前記治療は、少なくとも、６か月の持続時間に亘って少なくとも２０％の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＡＡＶベクターの治療的有効量が、約５．０×１０11ｖｇ／ｋｇである請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記治療は、重度の血友病Ｂを有する平均的ヒト被検体が、適切な止血を維持するためのＦＩＸタンパク置換療法を必要とする頻度を、概ね、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減するのに有効である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記治療は、重度の血友病Ｂを有する治療されていない平均的ヒト被検体と比較して、重度の血友病Ｂを有するヒト被検体の関節中への自然出血の頻度を、概ね、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減するのに有効である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＡＡＶベクターは、投与の少なくとも４週間後に測定した場合、キャプシドに対して、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５又は１：２０以下の抗体価をもたらす、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＡＡＶベクターは、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を使用して測定したときに、投与の少なくとも４週以降に測定した場合、キャプシドに対するＴ細胞免疫反応が、１００万ＰＢＭＣ当たり、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００以下のスポット・フォーミング・ユニットをもたらす、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＡＡＶベクターは、肝臓酵素の上限の正常（ＵＬＮ）値の０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％又は５００％以下の上昇した肝臓酵素レベルをもたらす、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）又は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記治療は、ベクターを投与した後少なくとも８週間以降に測定した場合、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１未満の標準偏差で、少なくとも、正常値の１％、５％、１０％、２０％、３０％又は４０％である平均血漿ＦＩＸ活性を達成するのに有効である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２０】
前記のＡＡＶベクターが、空キャプシドを含む医薬組成物の中に投与され、
前記空キャプシドが、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶＰ１タンパクを含む、
請求項１０１−１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＡＡＶベクターに対する前記空キャプシドの比率は、概ね、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１又は１０：１である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
配列番号：１２の１〜４２０４から得た核酸配列と同一の隣接する核酸配列を含むホスト細胞。
【請求項１２３】
ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク、ＡＡＶキャプシドタンパク、及び、アデノウイルス・ヘルパー・タンパクをさらに含む、請求項１２２に記載のホスト細胞。
【請求項１２４】
前記ＡＡＶキャプシドタンパクが、配列番号：４を含む又は当該配列番号に対して９０％以上の同一性を有する配列を含む、請求項１２３に記載の宿主細胞。
【請求項１２５】
前記ホスト細胞がＦＩＸＰａｄｕａタンパクを発現する、請求項１２３に記載のホスト細胞。
【請求項１２６】
配列番号：１２の１〜４２０４の核酸配列を含むＡＡＶベクターを生産する方法であって、
配列番号：１２の１〜４２０４に由来する核酸配列をＡＡＶ粒子中に詰め込むことを可能にする条件下で請求項１２３に記載のホスト細胞をインキュベートし、それによってＡＡＶベクターを生産するステップを含む、方法。
【請求項１２７】
そのように生産されたＡＡＶベクターを、精製又は分離するステップをさらに含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
請求項１２６に記載の方法によって生産されたＡＡＶベクター。
【請求項１２９】
請求項１２７に記載の方法によって生産、分離又は精製されたＡＡＶベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この特許出願は、２０１５年６月２３日に提出された米国特許出願第６２／１８３，５９９号、２０１６年３月３０日に提出された米国特許出願第６２／３１５，４５３号、２０１６年５月１８日に提出された米国特許出願第６２／３３８，３１５号、２０１６年６月１０日に提出された米国特許出願第６２／３４８，７８１号、及び、２０１６年６月１３日に提出された米国特許出願第６２／３４９，５７２号の利益を主張する。これらの全出願の全体が参照よりに明示的に本明細書に組み込まれる。
イントロダクション
【０００２】
望ましい遺伝子欠損若しくは欠乏（機能の損失）、又は、望ましくない遺伝子若しくは欠陥遺伝子の発現（機能の獲得）によって生じる遺伝障害は、様々な疾病に至る。機能喪失の遺伝疾患の一例は、凝固ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ、血友病Ａ）又は第ＩＸ因子（ＦＩＸ、血友病Ｂ）のいずれかの欠失によって生じる遺伝性出血性疾患である血友病である。機能獲得の遺伝疾患の一例は、特に基底核及び大脳皮質の中に蓄積し、ニューロンの徐々の破壊に結びつく変異タンパクをコードする病的「ＨＴＴ」遺伝子（ハンチンチンタンパクをコードする）によって引き起こされる疾病であるハンチントン病である。
【０００３】
血友病の現行の治療は、出血が生じた場合に必要に応じて又は予防的に、組み換え凝固因子を静脈内に投与することにある。しかしながら、この治療のアプローチは、繰り返される注入の必要、治療のコスト、抗治療因子免疫反応を発達させるリスク、及び、潜在的に致命的な出血のリスク等のいくつかの欠点を有する。これらの限界は、血友病のための遺伝子をベースとした治療の開発を促した。この目的のために、血友病は、１）治療濃度域が非常に広く、正常の１％を超えるレベルは既に重篤から中程度に表現型を変化させることができ、１００％のレベルはいかなる副作用を伴わず、２）治療導入遺伝子の組織特異的発現は厳密に必要ではなく、３）治療効力の終了点の測定に多くの経験があるので、遺伝子導入をベースとした治療に理想的である。
【０００４】
現在、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、インビボでの遺伝子送達のための最良の安全性及び効能プロフィールを有するので、遺伝子導入ベクターとして最適なものと認識されている。今までに単離されたＡＡＶ血清型のうち、ＡＡＶ２とＡＡＶ８は、重度の血友病Ｂに罹患したヒトの肝臓をターゲットとするために使用されてきた。
【要約】
【０００５】
本発明は、核酸配列、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）及びプラスミド、組成物、並びに、ウイルスベクターであって、その核酸が第ＩＸ因子（例えばヒト第ＩＸ因子）をコードするものを提供する。第ＩＸ因子をコードする核酸は、ＦＩＸをコードする配列と比較して、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数が減るように修飾されている。特別な実施形態において、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸は、ヒト第ＩＸ因子をコードする野生型又は天然の配列と比較して、減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する。
【０００６】
ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸は、ウイルスベクター等のベクターに含まれていてもよい。代表的なウイルスベクターは、例えば、他の細胞種の中でも、肝臓の肝細胞をターゲットとするレンチウイルスベクター及びパーボウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）を含む。核酸配列送達のためのベクターとして、ＡＡＶベクターは、細胞中でポリヌクレオチドを発現させる。第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸等のような、タンパクをコードするポリヌクレオチドは、投与した後に、任意に治療レベルで発現されることができる。
【０００７】
従って、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸を含むベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜、包んでいる）組み換えＡＡＶベクターが提供される。特定の実施形態において、組み換えＡＡＶ粒子は、ベクターゲノムをキャプシドで包膜しているか又は包んでいる。そのような発明の組み換えＡＡＶ粒子は、異種起源のポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸ等のような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）を含むウイルスベクターゲノムを含む。ある実施形態において、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸ等のような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸を含むベクターゲノムは、ＡＡＶキャプシド又はＡＡＶキャプシド変異体によってキャプシドで包膜されているか又は包まれている。
【０００８】
本発明の組み換えＡＡＶベクターにおいて、異種起源ポリヌクレオチド配列は、転写され、続いて、タンパクに翻訳されることができる。様々な態様において、異種起源ポリヌクレオチド配列は、治療用タンパクをコードする。特別な態様において、タンパクは、血液凝固因子（例えば、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、又は、プロテインＣ）である。さらなる特別な態様において、ベクターは第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸（例えばＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）を含む。
【０００９】
ＡＡＶ及びキャプシド変異体等のＡＡＶの変異体は、望ましい又は治療上の利益を提供するポリヌクレオチド及び／又はタンパクを届けることができ、それによって、様々な疾病を治療する。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ−２ｉ８、及び、これらの変異体、並びに、ＡＡＶキャプシド変異体（例えば、４−１）は、血友病Ａ、Ｂ等を治療するための治療遺伝子（例えば、第ＩＸ因子）を、細胞、組織及び器官に届けるために有用なベクターである。
【００１０】
ベクターゲノム（ウイルス又はＡＡＶ）を含む（キャプシドで包膜する、包む）本発明の組み換えウイルス及びＡＡＶベクターは、シス又はトランスで機能するさらなる因子を含む。特定の実施形態において、ベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）組み換えのウイルスの（例えばＡＡＶ）ベクターは、さらに；（例えば、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸ等の第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）異種起源ポリヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に隣接する１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列；構造的因子又は制御可能な制御因子等のような、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）を転写させる発現制御因子（例えば、プロモーター又はエンハンサー）、又は、組織特異的発現制御因子；イントロン配列、スタッファー又はフィラーポリヌクレオチド配列；及び／又は、異種起源ポリヌクレオチド配列の３’に位置するポリアデニル化配列を有する。
【００１１】
従って、ベクターは、さらに、イントロン、発現制御因子（例えば、構造的因子若しくは制御可能な制御因子、又は、組織特異的発現制御因子若しくはプロモーター（例えば、ヒトα1−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、及び／又は、アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）ＨＣＲ−１、及び／又は、ＨＣＲ−２エンハンサー等の肝臓発現のためのもの））、１つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のいずれかのＩＴＲ配列）、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列を含むことができる。そのようなさらなる因子の位置は変わってもよい。特別な態様において、イントロンは、ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列中に存在し、及び／又は、発現制御因子は、ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列に作用可能に連結され、及び／又は、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列の５’又は３’に隣接し、及び／又は、前記フィラーポリヌクレオチド配列の末端は、ヒトＦＩＸタンパクをコードする配列の５’末端又は３’末端に隣接する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸ核酸は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然の配列又は野生型の配列よりも、１〜５個少ない、５〜１０個少ない、１０〜１５個少ない、１５〜２０個少ない、２０〜２５個少ない、２５〜３０個少ない、３０〜４０個少ない、４０−５５個少ない、５５−７５個少ない、７５−１００個少ない、１００−１５０個少ない、１５０−２００個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有していてもよい。特別な態様において、本明細書に記載されている修飾されたＦＩＸ核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少していないヒト第ＩＸ因子をコードする野生型の配列又は天然の配列よりも多いか又は同等のレベルで発現されるヒトＦＩＸタンパクをコードする
【００１３】
さらなる実施形態において、イントロン、発現制御因子（例えば、構造的因子若しくは制御可能な制御因子、又は、組織特異的発現制御因子若しくはプロモーター（例えば、ヒトα1−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、及び／又は、アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）ＨＣＲ−１、及び／又は、ＨＣＲ−２エンハンサー等の肝臓発現のためのもの））、１又はそれ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のいずれかのＩＴＲ配列）、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、同等の天然又は野生型の発現制御因子、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列と比較して、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されていてもよい。特別な態様において、発現制御因子、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、天然又は野生型の同等配列より、１〜５個少ない、５〜１０個少ない、１０〜１５個少ない、１５〜２０個少ない、２０〜２５個少ない、２５〜３０個少ない、３０〜４０個少ない、４０−５５個少ない、５５−７５個少ない、７５−１００個少ない、１００−１５０個少ない、１５０−２００個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有する。
【００１４】
典型的なＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ−２ｉ８のいずれかのＡＡＶキャプシド配列、又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ−２ｉ８のキャプシド変異体を含む。また、本発明の組み換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、若しくは、ＡＡＶ−２ｉ８、並びに、これらの変異体を含む。特別なキャプシド変異体は、アミノ酸の置換、欠損又は挿入／付加を有するキャプシド配列等のような、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８等のキャプシド変異体を含む。特別な態様において、置換は、Ｒｈ７４  ＶＰ１キャプシド配列（配列番号：１）において、例えば、アミノ酸位置１９５、１９９、２０１又は２０２のいずれか１つでなされる。さらなる特別な態様において、置換された残基は、Ｒｈ７４  ＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５、１９９、２０１又は２０２のいずれか１つにおけるＡ、Ｖ、Ｐ又はＮのアミノ酸に対応する。さらに特別な態様において、キャプシド配列は、Ｒｈ７４  ＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５のＡ残基；アミノ酸位置１９９のＶ残基、アミノ酸位置２０１のＰ残基、又は、アミノ酸位置２０２のＮ残基を有する。さらなる特別な態様において、キャプシド配列は、Ｒｈ７４  ＶＰ１キャプシド配列のアミノ酸位置１９５のＡ残基、アミノ酸位置１９９のＶ残基、アミノ酸位置２０１のＰ残基、又は、アミノ酸位置２０２のＮ残基の任意の２つ、３つ、又は、４つすべてを有する。
【００１５】
さらなる特別な態様において、キャプシド変異体は、配列番号４−９のいずれかを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型の任意のＶＰ１、ＶＰ２及び／又ＶＰ３に対して、９０％又はより高い配列同一性を有する、ＡＡＶ  ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列を有するキャプシド配列を有する。特別な態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列に対して９０％又はより高い同一性を有する、ＶＰ１キャプシド配列、ＶＰ２キャプシド配列又はＶＰ３キャプシド配列を有するキャプシド配列を有する。さらなる特別な態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のＡＡＶ血清型のいずれかより選択される、ＶＰ１キャプシド配列、ＶＰ２キャプシド配列又はＶＰ３キャプシド配列を有するキャプシド配列を有する。
【００１６】
さらなる実施形態において、組み換えベクターゲノムは、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数を減らすように修飾されたＦＩＸ等のような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸と、フィラーポリヌクレオチド配列若しくはスタッファポリヌクレオチド配列を含む。特別な態様において、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸は、約４．７ｋｂ未満の長さを有する。さらに特別な態様において、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸は、４．７ｋｂ未満の長さを有し、１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲに隣接しているか、又は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列内に配置されている。さらなる特別な態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸と結合した場合に、第ＩＸ因子をコードする核酸配列と、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列との合計の結合した長さが概ね３．０ｋｂ〜５．５ｋｂの間、概ね４．０ｋｂ〜５．０ｋｂ、又は、概ね４．３ｋｂ〜４．８ｋｂの間となる長さを有する。
【００１７】
フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、そのベクターの機能又は活性を阻害しないベクター配列中のいかなる所望の位置に配置されることができる。一態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸ等のような第ＩＸ因子コード核酸配列のそれぞれの５’及び／又は３’の末端に隣接する５’及び／又は３’のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲ及びそれらの変異体）の間に配置されている。別の態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸ等のような第ＩＸ因子コード核酸配列のそれぞれの５’及び／又は３’の末端に隣接する５’及び／又は３’のＩＴＲの内部に配置されている。さらなる態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子コード核酸配列のそれぞれの５’及び／又は３’末端に隣接する５’及び／又は３’のＩＴＲに隣接して配置されている。さらなる一態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された（例えば、ゲノム核酸内のイントロンと類似した）核酸の内部に配置されている。
【００１８】
従って、様々な実施形態において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接して配置され；２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列内に配置され；２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列の外部に配置され；又は、２つのフィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列が存在し、第１のフィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列が、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列の内部に配置され、第２のフィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列が、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列の外部に配置される。
【００１９】
さらなる特別な態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列の内部に配置されている場合、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸と結合したときに、その異種起源ポリヌクレオチド配列と、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列との合計の結合した長さが、概ね３．０ｋｂ〜５．５ｋｂ、概ね４．０ｋｂ〜５．０ｋｂ又は概ね４．３ｋｂ〜４．８ｋｂとなるような長さを有する。さらに別の特別な態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列の外部に配置されている場合、４．７ｋｂを超える、概ね５．０ｋｂ〜１０．０ｋｂ又は概ね６．０ｋｂ〜８．０ｋｂの長さを有する。
【００２０】
典型的に、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、不活性であるか又は無毒性であり、また、機能又は活性を有しない。様々な特別な態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列はバクテリアのポリヌクレオチド配列ではなく、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列はタンパクをコードする配列ではなく、又は、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、発現制御因子、複製開始点、選択可能なマーカー又はポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列のいずれからも区別される配列である。
【００２１】
様々な追加的な特別な態様において、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）と関係がある又は関係がないイントロン配列である。特別な態様において、イントロン配列は、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）の内部に配置される。他の特別な態様において、イントロンが、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）によってもコードされるタンパクをコードするゲノムＤＮＡのようなゲノムＤＮＡ中に存在するように、イントロン配列は、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）と関係がある。
【００２２】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のような組み換えレンチウイルス及びパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、並びに、組み換えＡＡＶベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）キャプシド変異体（例えば、４−１）粒子のような変異体が、細胞内に含まれていてもよい。そのような実施形態において、細胞は、ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生産することができる、若しくは、溶解してウイルス（ＡＡＶ）粒子を生産することができるパッケージング細胞で構成されてもよいし、又は、異種起源ポリヌクレオチド配列を発現することが望まれる標的細胞で構成されてもよい。従って、ＣｐＧジヌクレオチド数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸のベクター、並びに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のようなレンチウイルス及びパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター及び変異体（例えば、４−１等）の粒子を含む細胞が提供される。
【００２３】
さらなる実施形態において、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列であって、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然の配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸、又は、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列を含む発現ベクター又はプラスミドであって、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然の配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する核酸が、組成物中に含まれる。特別な態様において、そのような核酸配列は、医薬組成物中に含まれていてもよい。従って、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のように組み換えのレンチウイルス及びパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、並びに、ベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）変異体（例えば、４−１等）粒子が、医薬組成物中に含まれてもよい。そのような組成物は、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）、及び、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のようなウイルス粒子、並びに、ベクター（例えば、ＡＡＶ）ゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）変異体（例えば４−１）の被検体への投与に有用である。
【００２４】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のような組み換えレンチウイルス及びパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、並びに、ベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）変異体（例えば、４−１等）粒子は、様々な方法及び用途において使用することができる。従って、哺乳動物又は哺乳動物の細胞のような生物又は細胞中に、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）を届け又は移すための方法及び使用が提供される。
【００２５】
一実施形態において、方法又は使用は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のようなレンチウイルス若しくはパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）のベクター、又は、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）粒子をベクターゲノム中に含む（キャプシドで包膜する、包む）変異体を適切な条件下で哺乳動物又は哺乳動物の細胞に投与して、哺乳動物又は哺乳動物の細胞中に異種起源ポリヌクレオチド配列を届け又は移すことを含む。一態様において、この方法又は使用は、哺乳動物及び／又は細胞中に異種起源のポリヌクレオチド（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）を移し／届ける。別の態様において、この方法は、異種起源のポリヌクレオチド（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）の細胞中への転送／送達、続いて起こる転写物を形成する転写、及び、続いて起こる遺伝子産物（例えば第ＩＸ因子）を形成する翻訳を可能にする。
【００２６】
さらなる実施形態において、方法又は使用は、タンパクの発現又は機能の欠乏又はタンパクの発現又は機能の必要性のある被検体（例えば、哺乳動物）を治療するためのものであり、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のようなレンチウイルス若しくはパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター若しくは変異体、複数のそのようなウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子、又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ−２ｉ８のようなレンチウイルス若しくはパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター若しくは変異体、粒子、若しくは、複数のそのようなウイルス（例えばＡＡＶ）粒子の医薬組成物を提供すること；及び、ウイルス粒子、複数のウイルス粒子、又は、ウイルス粒子若しくは複数のウイルス粒子の医薬組成物を被検体（例えば哺乳動物）に投与することを含む。そのように投与された異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）は、続いて被検体（例えば、哺乳動物）中で発現されることができる。
【００２７】
投与又は送達のための方法及び用途は、被検体に適合するあらゆるモードを含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のようなレンチウイルス又はパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター及び変異体、又は、複数のそのようなウイルス粒子は、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、皮下に又はカテーテル経由等のように、非経口的に投与又は送達される。
【００２８】
被検体は、ヒト及び非ヒト（例えば、霊長類）等のような哺乳動物を含む。特定の実施形態において、被検体は、異種起源ポリヌクレオチド配列の発現から利益を受け、又は、異種起源ポリヌクレオチド配列の発現を必要とするであろう。さらなる特別な実施形態において、被検体は、例えば、低減された量の第ＩＸ因子を発現する血友病Ｂに罹患した被検体のような被検体等のように、第ＩＸ因子の発現又は機能から利益を得るだろう。
【００２９】
本発明に従って、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のような組み換えのレンチウイルス及びパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、並びに、ベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）変異体を生産する方法が提供される。ある実施形態において、１つの方法は、増殖性のウイルス感染を生じさせるために、パッケージング細胞中に組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミドを導入すること；及び、組み換えウイルス粒子を生産する条件下でパッケージング細胞をインキュベートすることを含む。別の一実施形態において、組み換えウイルスベクターが混入核酸を含み、低減された量の組み換えウイルス粒子を有する組み換えウイルス又はＡＡＶ粒子を生産する方法であって、前記方法は、パッケージング細胞中に組換えベクター（例えばＡＡＶ）プラスミドを導入すること；及び、組み換えウイルス粒子を生産する条件下で前記パッケージング細胞をインキュベートすることであって、生産される組み換えウイルス粒子が、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列が組み換えウイルスベクターに存在しない状態で生産される混入核酸を含むウイルス粒子の数と比較して、混入核酸を含むベクターゲノムを有するウイルス粒子の数が減少していることを含む。特別な態様において、混入核酸は、バクテリアの核酸であるか；又は、前記異種起源ポリヌクレオチド配列若しくはＩＴＲ、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、ポリＡ配列、又は、選択可能なマーカー以外の配列である。
【００３０】
パッケージング細胞は哺乳動物細胞を含む。特定の実施形態において、パッケージング細胞は、（異種起源のポリヌクレオチド）配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）をウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）中にパッケージするためのヘルパー（例えばＡＡＶ）機能を含む。特別な態様において、パッケージング細胞は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク及び／又はＣａｐタンパク（例えば、Ｒｅｐ７８、及び／又は、Ｒｅｐ６８タンパク）を提供し；パッケージング細胞は、Ｒｅｐタンパク配列及び／又はＣａｐタンパク配列をコードするポリヌクレオチドが安定的に又は一時的に導入され；及び／又は、パッケージング細胞は、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパクポリヌクレオチドコード配列を安定的に又は一時的に導入される。
【００３１】
本発明において、組み換えレンチウイルス又はパーボウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター、及び、それに伴うシス（例えば、発現制御因子、ＩＴＲ、ｐｏｌｙＡ）因子、又は、トランス（例えば、キャプシドタンパク、Ｒｅｐ／Ｃａｐタンパク等のパッケージ機能）因子は、任意の生物、種、株又は血清型をベースとしてもよい。組み換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、典型的には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８並びに変異体をベースとするが、異なる複数の血清型のハイブリッド又はキメラを含む。代表的なＡＡＶ血清型は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８の血清型を含む。従って、ベクターゲノムを含む組み換えウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８の血清型のＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３キャプシドタンパクのような異なる血清型、複数の血清型の混合、又は、異なる複数の血清型のハイブリッド若しくはキメラに由来するキャプシドタンパクを含んでいてもよい。更に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８のような組み換えレンチウイルス又はパーボウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター、配列、プラスミド、ベクターゲノムは、いずれか１つの血清型、血清型の混合、又は、異なる複数の血清型のハイブリッド若しくはキメラに由来する因子を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、組み換えＡＡＶベクターは、ＩＴＲ、Ｃａｐ、Ｒｅｐ、及び／又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及び／若しくはＡＡＶ−２ｉ８血清型、又は、前述のＡＡＶ血清型の混合、ハイブリッド若しくはキメラに由来する配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図１はＲｈ７４  ＶＰ１のアミノ酸配列を示す。
【００３３】
図２はＲｈ７４  ＶＰ２のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
図３は、Ｒｈ７４  ＶＰ３のアミノ酸配列を示す。
【００３５】
図４は、キャプシド変異体４−１  ＶＰ１タンパクのアミノ酸配列を示す。
【００３６】
図５は、キャプシド変異体１５−１のアミノ酸配列を示す。
【００３７】
図６は、キャプシド変異体１５−２のアミノ酸配列を示す。
【００３８】
図７は、キャプシド変異体１５−３／１５−５のアミノ酸配列を示す。
【００３９】
図８は、キャプシド変異体１５−４のアミノ酸配列を示す。
【００４０】
図９は、キャプシド変異体１５−６のアミノ酸配列を示す。
【００４１】
図１０は、ＦＩＸ３９の核酸配列を示す。
【００４２】
図１１は、ＦＩＸ１９の核酸配列を示す。
【００４３】
図１２Ａは、ＦＩＸ３９プラスミドの配列を示す。
【００４４】
図１２Ｂは、ｐｈＦＩＸ３９ｖ２プラスミドの配列を示す。
【００４５】
図１３は、ＦＩＸ３９プラスミドのマップを示す。
【００４６】
図１４はイントロンＡ核酸配列を示す。
【００４７】
図１５は、ＦＩＸ３９＋イントロンＡの核酸配列を示す。
【００４８】
図１６は、インビトロセッティングにおいて分析された、ＡＡＶ−４−１キャプシド変異体（配列番号：４）の形質導入効率を示す。
【００４９】
図１７は、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９−Ｐａｄｕａ（四角／円）及びＡＡＶ−ＦＩＸ１９−Ｐａｄｕａ（ダイヤモンド／六角形）を１×１０11又は１×１０12ｖｇ／ｋｇのいずれか第８週に静脈内注射した後の野生型マウスの血漿中のｈＦＩＸのレベルを示す。ヒトＦＩＸ血漿中濃度は、ＥＬＩＳＡによって分析され、試験期間中に動物の同じグループを続けて出血させることによって得た複数の測定を示している。エラーバーは標準誤差を示す。
【００５０】
図１８は、５μｇのｐＦＩＸ１９−Ｐａｄｕａプラスミド又はｐＦＩＸ３９−Ｐａｄｕａプラスミドの水圧尾静脈注入の２４時間後のマウス血漿中のヒトＦＩＸの血中濃度を示す。Ｐ＝０．３３３７
【００５１】
図１９は、本発明によるＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた４人のヒト血友病Ｂ患者のデータ要約、及び、その後の評価期間（それぞれ、１８３日、１０２日、６９日及び５０日）に亘るＦＩＸ活性（％）を示す。
【００５２】
図２０Ａは、１８３日間の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第１のヒト血友病Ｂ患者のＦＩＸ活性（％）データを示す。
【００５３】
図２０Ｂは、１８３日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第１のヒト血友病Ｂ患者の肝臓機能検査（ＡＬＴ酵素、ＡＳＴ酵素及びＬＤＨ酵素）データを示す。プロットされているＬＤＨ値（ＬＤＨ１）は、ＡＬＴ値及びＡＳＴ値と共に示すために１０で除されている。
【００５４】
図２１Ａは、１０２日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第２のヒト血友病Ｂ患者のＦＩＸ活性（％）データを示す。
【００５５】
図２１Ｂは、１０２日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第２のヒト血友病Ｂ患者の肝臓機能検査（ＡＬＴ酵素、ＡＳＴ酵素及びＬＤＨ酵素）データを示す。プロットされているＬＤＨ値（ＬＤＨ１）は、ＡＬＴ値及びＡＳＴ値と共に示すために１０で除されている。
【００５６】
図２２Ａは、６９日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第３のヒト血友病Ｂ患者のＦＩＸ活性（％）データを示す。
【００５７】
図２２Ｂは、６９日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第３のヒト血友病Ｂ患者の肝臓機能検査（ＡＬＴ酵素、ＡＳＴ酵素及びＬＤＨ酵素）データを示す。プロットされているＬＤＨ値（ＬＤＨ１）は、ＡＬＴ値及びＡＳＴ値と共に示すために１０で除されている。
【００５８】
図２３Ａは、５０日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第４のヒト血友病Ｂ患者のＦＩＸ活性（％）データを示す。
【００５９】
図２３Ｂは、５０日の評価期間に亘る、ＡＡＶ−ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（ＦＩＸ３９）を有するベクターの単独注入を受けた第４のヒト血友病Ｂ患者の肝臓機能検査（ＡＬＴ酵素、ＡＳＴ酵素及びＬＤＨ酵素）データを示す。プロットされているＬＤＨ値（ＬＤＨ１）は、ＡＬＴ値及びＡＳＴ値と共に示すために１０で除されている。
【００６０】
図２４Ａは、ヒト被検体中のＡＡＶ−ＦＩＸ３９  Ｐａｄｕａの相対的な免疫原性プロフィールを示す。
【００６１】
図２４Ｂは、ヒト被検体のＡＡＶ−ＦＩＸ３９パドヴァ及びＡＡＶ８−ＦＩＸ１９の相対的な免疫原性プロフィールを示す。
【詳細な説明】
【００６２】
本発明は、ヒトＦＩＸタンパクのような、タンパクをコードする修飾された核酸配列の開発に少なくとも一部分において基づいている。いくつかの実施形態において、修飾された核酸は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列のような、第ＩＸ因子をコードする基準核酸配列と比較して、ＣｐＧ（シトシン・グアニン）ジヌクレオチドの数が減少している。さらなる実施形態において、核酸（例えば、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然の配列）をコードする基準第ＩＸ因子と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したそのような修飾された核酸は、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）又はプラスミド中に含まれている。
【００６３】
本発明は、さらにヒトＦＩＸをコードする修飾された核酸配列を含む組成物のような組成物を含む。そのような組成物において、修飾された核酸は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）配列のような参照配列に対してＣｐＧジヌクレオチドの数が減少している。また、組成物は、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター／ベクターゲノム）、及び、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したヒトＦＩＸタンパクをコードするそのような修飾された核酸配列を含むプラスミドを含む。
【００６４】
特別な態様において、ヒトＦＩＸタンパクをコードする核酸配列は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然の配列より１〜５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より５〜１０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より１０〜１５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より１５〜２０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より２０〜２５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より２５〜３０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より３０〜４０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、ヒト第ＩＸ因子をコードする天然（野生型）の配列より４０〜５５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、あらゆるＣｐＧジヌクレオチドが完全に欠けている。
【００６５】
ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸は、１つ以上のさらなるシス因子をさらに含んでいてもよい。代表的なシス因子は、限定されるものではないが、発現制御因子、イントロン、ＩＴＲ、停止コドン、ｐｏｌｙＡ配列及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、そのようなシス作用因子は修飾されていてもよい。例えば、発現制御因子、イントロン、ＩＴＲ、ポリＡ配列及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列のようなシス作用エレメントは、ＣｐＧジヌクレオチドの減少した数を有していてもよい。１つの態様において、発現制御因子、イントロン、ＩＴＲ、ポリＡ配列及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列のような１つ以上のシス作用因子は、ＣｐＧジヌクレオチドが欠けている。特別な態様において、発現制御因子、イントロン、ＩＴＲ、ポリＡ配列及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列のような１つ以上のシス作用因子は、対照標準シス作用エレメントより１〜５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス作用エレメントより５〜１０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス作用エレメントより１０〜１５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス作用因子より１５〜２０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス作用因子より２０〜２５個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス作用因子より２５〜３０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス作用因子より３０〜４０個少ないＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、対照標準シス要素より４０〜５５の少数のＣｐＧジヌクレオチドを有し；又は、あらゆるＣｐＧジヌクレオチドが欠けている。
【００６６】
本発明は、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、ヒトＦＩＸタンパクをコードする修飾された核酸配列を含むウイルスベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクターのような、レンチウイルスベクター又はパーボウイルスベクターを含む。より特別な実施形態において、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのようなヒトＦＩＸタンパクをコードする修飾された核酸配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれる。
【００６７】
さらに特別な実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８に由来するキャプシド、並びに、それらの変異体（例えば、アミノ酸の挿入、付加及び置換等のキャプシド変異体）を含む。当業者に理解されるように、ＡＡＶキャプシドは、典型的には、ＶＰ１タンパクと、本質的にＶＰ１のアミノ末端基切断であるＶＰ２及びＶＰ３と呼ばれる２つのより短いタンパクとを含む。キャプシド及び当業者に知られている他の要因に依存して、３つのキャプシドタンパク、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、典型的には、それぞれ１：１：１０に接近する比率でキャプシド中に存在する。ただし、この比率、特にＶＰ３の比率は、著しく変わる場合があり、いかなる態様においても限定するものとして解釈してはならない。
【００６８】
ＡＡＶ変異体は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４変異体（例えば、Ｒｈ７４  ＶＰ１キャプシド配列、配列番号：１、図１のＡＡＶキャプシド変異体）を含み、これらに限定されるものではないが、表１に示されている変異体４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び１５−６を含む。Ｒｈ７４  ＶＰ２及びＲｈ７４  ＶＰ３アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２（図２）及び配列番号：３（図３）において提供される。
【表１】
2018522529.tif 000003
【００６９】
４−１変異体（配列番号：４）は、ＶＰ１キャプシドの、アミノ酸位置１９５、１９９、２０１及び２０２において、それぞれ、アラニン、バリン、プロリン及びアスパラギンの置換を有していた。下線及び太字になっている置換された残基ａ、ｖ、ｐ及びｎを有する４−１変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列は、図４（配列番号：４）に示されている。変異体４−１については、それぞれ、ＶＰ２配列が配列番号２７からなり、ＶＰ３配列が配列番号３からなる。
【００７０】
１５−１、１５−２、１５−３、１５−４、１５−５及び１５−６変異体もまた、ＶＰ１キャプシドのアミノ酸位置１９５、１９９、２０１及び２０２において、それぞれ、ラニン、バリン、プロリン及びアスパラギンの置換を有していた。さらに、これらの変異体は、様々な位置においてリジンのアルギニン置換を多数有していた。１５−１変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：５）は、図５に示されており；１５−２変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：６）は、図６に示されており；１５−３／１５−５変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：７）は、図７に示されており；１５−４変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：８）は、図８に示されており；また、１５−６変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：９）は、図９に示されている。ここで使用することができるキャプシドの例は、限定されるものではないが。米国特許出願公報第２０１５／００２３９２４号に開示されているものを含む。
【００７１】
従って、ＡＡＶベクターのようなレンチウイルスベクター及びパーボウイルスベクター、並びに、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、ヒトＦＩＸタンパクをコードする修飾された核酸配列を含むベクターゲノムを含む（キャプシドで包膜する、包む）ＡＡＶ変異体（例えば、４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び１５−６のようなキャプシド変異体）のようなウイルスベクター変異体が提供される。
【００７２】
例示的研究において、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、他のいくつかの血清型より有意に高い、遺伝子の導入／送達で生成されるタンパク発現レベルを媒介した。特に、ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及びキャプシド変異体（例えば、４−１）の肝臓に対する送達のための標的遺伝子は、肝臓への遺伝子導入のための究極の判断基準である、血友病Ｂのイヌ及び／又はマウス及び／又はマカクにおけるＡＡＶ８に少なくとも匹敵する効率を有する。
【００７３】
本明細書に開示されているように、ＡＡＶ血清型及び変異体を含む、レンチウイルス及びパーボウイルスベクターのようなウイルスベクターは、エクスビボ、インビトロ及びインビボにおいてポリヌクレオチド配列を細胞中に送達するための手段を提供し、そのポリヌクレオチド配列は、タンパクをコードすることができ、そのコードされるタンパクを細胞が発現することができる。例えば、組み換えＡＡＶベクターは、望まれるタンパク又はペプチド（例えば、第ＩＸ因子）をコードする異種起源のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。従って、被検体（例えば、哺乳動物）に対するベクター送達又は投与は、コードされたタンパク及びペプチドを被検体に提供する。従って、ＡＡＶ血清型とキャプシド変異体（例えば、４−１）のような変異体を含む、レンチウイルス及びパーボウイルスベクターのようなウイルスベクターは、発現のための及び任意に様々な疾病の治療のための異種起源のポリヌクレオチドを移動／送達するために使用することができる。
【００７４】
特定の実施形態において、組換えベクター（例えばＡＡＶ）は、パルボウイルスベクターである。パルボウイルスは一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小さいウイルスである。「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）はパルボウイルスファミリーに属する。
【００７５】
ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞に浸透することができ、核酸／遺伝物質を導入することができ、その核酸／遺伝物質が細胞中に安定して維持されるので、遺伝子治療ベクターとして有用なウイルスである。さらに、これらのウイルスは、例えば、染色体１９における特定部位のように、特定部位に核酸／遺伝物質を導入することができる。ＡＡＶはヒトにおいて病原性疾病に関係していないので、ＡＡＶベクターは、本質的なＡＡＶ発病又は疾病を引き起こすことなく、ヒト患者に異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、治療タンパク及び治療剤）を届けることができる。
【００７６】
ＡＡＶ及びＡＡＶ変異体（例えば、４−１のようなキャプシド変異体）の血清型（例えば、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列）は、例えば、ＡＡＶ１−ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４又はＲｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型とは異なっていてもよい（例えば、ＡＡＶ１−ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４又はＲｈ１０血清型のいずれかのＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列とは異なっていてもよい）し、異なっていなくてもよい。
【００７７】
本明細書で使用されているように、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に区別されるキャプシドを有するＡＡＶを表すために使用される区別である。他のＡＡＶと比較して、血清学的独自性は、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の差は、通常、キャプシドタンパク配列／抗原決定基群の差による（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列差による）。キャプシド変異体を含むＡＡＶ変異体が対照標準ＡＡＶ又は他のＡＡＶ血清型とは血清学的に区別できないかもしれない可能性にもかかわらず、ＡＡＶ変異体は、対照標準又は他のＡＡＶ血清型と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。
【００７８】
従来の定義の下では、血清型は、中和活性に関して区別されたすべての既存の血清型に特異的な漿液に対して、対象とするウイルスを試験し、対象とするウイルスを中和する抗体が見つからなかったことを意味する。より多くの天然ウイルス分離株が発見され、及び／又は、より多くのキャプシド変異体が生成されても、現在存在する血清型のいずれかと血清学的な違いがあってもよいし、なくてもよい。従って、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的な違いを有しない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は対応する血清型のサブグループ又は変異体であろう。多くの場合、キャプシド配列修飾を有する変異ウイルスに対しては、それらが血清型の従来の定義に従って別の血清型のものであるかを判断するための、中和活性に関する血清学的試験がまだおこなわれていない。従って、便宜のために、また、繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に区別されるウイルス（例えば、ＡＡＶ）及び血清学的に区別されないウイルス（例えば、ＡＡＶ）であって、所定の血清型のサブグループ又は変異体に属することができるものの両方を広く表す。
【００７９】
組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミド、ベクター（例えば、ＡＡＶ）ゲノム、並びに、方法及び使用は、あらゆるウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミド又はベクター（例えば、ＡＡＶ）ゲノムは、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０又はＡＡＶ−２ｉ８のような任意のＡＡＶゲノムをベースとするものであってもよい。そのようなベクターは、同じ株又は血清型（あるいは、サブグループ又は変異体）をベースとしていてもよいし、又は、互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムをベースとした組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミド又はベクター（例えば、ＡＡＶ）ゲノムは、そのベクターを包むキャプシドタンパクの１つ以上と同一であってもよい。さらに、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）プラスミド又はベクター（例えば、ＡＡＶ）のゲノムは、そのベクターを包むキャプシドタンパクの１つ以上とは異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムをベースとしていてもよく、その場合、３つのキャプシドタンパクの少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ−２ｉ８、又は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４変異体（例えば、４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び１５−６のようなキャプシド変異体）のような変異体であってもよい。
【００８０】
従って、ＡＡＶベクターは、特定の血清型に特徴的な遺伝子／タンパク配列と同一の遺伝子／タンパク配列を含む。ここで使用されているように、「ＡＡＶ１と関係するＡＡＶベクター」は、１つ以上のＡＡＶタンパク（例えば、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列）であって、ＡＡＶ１を構成する１つ以上のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に対する本質的な配列同一性を有するものを表す。同様に、「ＡＡＶ８と関係するＡＡＶベクター」は、１つ以上のＡＡＶタンパク（例えば、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列）であって、ＡＡＶ８を構成する１つ以上のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に対する本質的な配列同一性を有するものを表す。「ＡＡＶ−Ｒｈ７４と関係するＡＡＶベクター」は、１つ以上のＡＡＶタンパク（例えば、ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列）であって、ＡＡＶ−Ｒｈ７４を構成する１つ以上のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に対する本質的な配列同一性を有するものを表す（例えば、図１ないし図３のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３を参照されたい）。従って、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８等の他の血清型に関連づけられたそのようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ−２ｉ８とは区別される１つ以上の配列を有していてもよいが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８の１つ以上の遺伝子及び／若しくはタンパクに対する本質的な配列同一性を示すものであってもよいし、並びに／又は、それらの１つ以上の機能的特性（例えば、細胞／組織指向性等）を有していてもよい。典型的な非限定的なＡＡＶ−Ｒｈ７４のようなＡＡＶ−Ｒｈ７４若しくは関連ＡＡＶ、又は、（例えば、４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び１５−６のようなキャプシド変異体）のようなＡＡＶ−Ｒｈ７４変異体及び関連ＡＡＶ変異体の配列は、例えば、図１ないし図９に記載されているＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３を含む。
【００８１】
様々な典型的な実施形態において、対照標準血清型と関係するＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８（例えば、図１ないし図９に記載されているＡＡＶ−Ｒｈ７４  ＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列等）に対して少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一の配列を含むか又は当該配列からなるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は、その部分配列を有する。
【００８２】
本発明の方法及び使用は、ＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）、ＡＡＶ−Ｒｈ７４配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）、及び、それらの部分配列であって、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０又はＡＡＶ−２ｉ８、例えば、ＡＡＶ−Ｒｈ７４の遺伝子又はタンパク配列（例えば、図１〜図９に記載されているＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列）のような対照標準ＡＡＶ血清型に対して１００％未満の配列同一性を示すが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４ＡＡＶ−２ｉ８の遺伝子又はタンパクのような既知のＡＡＶ遺伝子又はタンパクから区別され、同一でないものを含む。一実施形態において、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８のような任意の対照標準ＡＡＶ配列又はその部分配列（例えば、図１〜図９に記載されているＶＰ１配列、ＶＰ２配列及び／又はＶＰ３配列）に対して少なくとも８０％以上（例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、つまり、最大１００％）同一の配列を含むか又は当該配列からなる。特別な態様において、ＡＡＶ変異体は、４個のアミノ酸置換のうちの１個、２個、３個又は４個を有する（例えば、キャプシド変異体４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び１５−６）。
【００８３】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８、並びに、変異体、関連するハイブリッド配列及びキメラ配列を含む組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）は、機能する１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接した１つ以上の異種起源ポリヌクレオチド配列（遺伝子組み換え）を含むために、当業者に知られている組み換え技術を使用して構築することができる。そのようなベクターは、野性型ＡＡＶ遺伝子の１つ以上の全体又は一部分（例えば、Ｒｅｐ遺伝子及び／又はＣａｐ遺伝子）が削除されていてもよいが、救助、複製、及び、ＡＡＶベクター粒子中への組換えベクターのパッケージングに必要であるので、少なくとも１つの機能する隣接ＩＴＲ配列を保持していてもよい。従って、ＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのためにシスにおいて必要とされる配列（例えば、機能するＩＴＲ配列）を含むであろう。
【００８４】
「ポリヌクレオチド」との用語及び「核酸」との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、オリゴヌクレオチド、核酸のすべての形態を表すために交換可能に用いられる。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びに、スプライシングされた若しくはスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び、阻害性のＤＮＡ若しくはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小さい又は短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい又は短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又は、アンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、天然の、合成の、及び、意図的に修飾若しくは変更された（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドが減少した）ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、単鎖、二重鎖、若しくは、三重鎖、線状、又は、環状であってもよく、また、任意の長さであってもよい。ポリヌクレオチドについて議論する際には、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’の方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載されている。
【００８５】
「異種起源」のポリヌクレオチドは、細胞中へのポリヌクレオチドのベクターを介した移入／送達の目的のためのベクター（例えば、ＡＡＶ）中に挿入されたポリヌクレオチドを表す。異種起源のポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、ＡＡＶ）核酸とは典型的に異なる。つまり、異種起源のポリヌクレオチドは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）の核酸に対しては外来種である。細胞中に移され／届けられると、ベクター中に含まれる異種起源のポリヌクレオチドは、発現することができる（例えば、適切な場合には、転写され、翻訳される）。あるいは、ベクター中に含まれ、細胞中の移された又は届けられた異種起源のポリヌクレオチドは、発現される必要はない。「異種起源」という用語は、本明細書において必ずしもポリヌクレオチドに関して使用されるとは限らないが、「異種起源」との修飾がないポリヌクレオチドへの言及が、その省略にもかかわらず異種起源のポリヌクレオチドを含むように意図されている。異種起源配列の一例は、対照標準核酸配列と比較してＣｐＧジヌクレオチドの数が減少した核酸等のような、第ＩＸ因子をコードする核酸（例えば、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）であろう。
【００８６】
「ポリヌクレオチド配列」によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク」及び「ペプチド」は、天然のタンパクのような全長の天然配列のみならず、機能する部分配列、修飾された形態又は配列変異体であって、天然の全長のタンパクの機能性をある程度保持している部分配列、修飾された形態又は配列変異体を含む。本発明の方法及び使用において、ポリヌクレオチド配列によってコードされるそのようなポリペプチド、タンパク及びペプチドは、不完全である内因性タンパク、又は、治療される哺乳動物においてその発現が不十分であるか若しくは欠乏している内因性タンパクと同一であってもよいが、同一である必要はない。
【００８７】
本発明において、アデノウイルスベクターのような、また、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８及びＡＡＶ−Ｒｈ７４変異体のような関連ＡＡＶ変異体（例えば、４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び１５−６のようなキャプシド変異体）を含むＡＡＶベクターのようなレンチウイルスベクター及びパーボウイルスベクターは、細胞及びその後代にポリヌクレオチドを安定的に又は一時的に導入／送達するために使用することができる。本明細書において、「導入遺伝子」との用語は、細胞又は生命体の中に導入された又は導入されるように意図された異種起源のポリヌクレオチドを便宜的に表すために使用される。導入遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク（例えば、第ＩＸ因子）をコードする遺伝子のような、あらゆるポリヌクレオチドを含む。
【００８８】
例えば、導入遺伝子を有する細胞において、導入遺伝子は、ＡＡＶのようなベクター、細胞の「形質導入」又は「トランスフェクション」によって導入／移動される。「形質導入する」との用語及び「トランスフェクトする」との用語は、細胞又はホスト生物の中へのポリヌクレオチドのような分子の導入を表す。
【００８９】
導入遺伝子が導入された細胞は「形質導入細胞」と呼ばれる。従って、「形質導入された」細胞（例えば、細胞又は組織又は器官細胞のような哺乳動物中のもの）は、外因性分子（例えば、細胞中へのポリヌクレオチド又はタンパク（例えば、導入遺伝子））の取り込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。従って、「形質導入された」細胞は、例えば、外因性分子が導入された細胞又はその後代である。その細胞は増殖させることができ、導入されたタンパクは発現され、又は、導入された核酸が転写される。遺伝子治療の使用及び方法に関して、形質導入される細胞が被検体中に存在していてもよい。
【００９０】
導入されるポリヌクレオチドは、レシピエントの細胞又は生物の核酸中に統合されてもよいし、統合されなくてもよい。導入されるポリヌクレオチドがレシピエントの細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）中に統合される場合、その導入されるポリヌクレオチドは、その細胞又は生物で維持され、さらに、そのレシピエントの細胞又は生物の子孫の細胞又は生物に受け継がれるか又は継承される。最後に、導入される核酸は、レシピエントの細胞又はホスト生物に一時的にだけ存在してもよい。
【００９１】
遺伝子導入することができる細胞は、あらゆる起原（例えば、中胚葉、外胚葉又は内胚葉）のあらゆる組織種又は器官種の細胞を含む。細胞の非限定的な例は、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、ベータ島細胞）、肺、脳（例えば、神経、神経膠、又は、上衣細胞）若しくは脊椎のような中枢神経系若しくは末梢神経系、腎臓、眼（例えば、レチナール、細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓）、筋肉若しくは腰筋、腸（例えば、内分泌腺）、脂肪組織（白、褐色又はベージュ）、筋肉（例えば、繊維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、又は、造血細胞（例えば、血液又はリンパ）を含む。さらなる例は、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、ベータ島細胞）、肺、脳（例えば、神経、神経膠、又は、上衣細胞）若しくは脊椎のような中枢神経系若しくは末梢神経系、腎臓、眼（例えば、レチナール、細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓）、筋肉若しくは腰筋、腸（例えば、内分泌腺）、脂肪組織（白、褐色又はベージュ）、筋肉（例えば、繊維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、又は、造血細胞（例えば、血液又はリンパ）に進化又は分化することができる多能性又は分化多能性の前駆細胞のような幹細胞を含む。
【００９２】
一実施形態における「治療分子」は、細胞又は被検体におけるタンパクの欠如又は不足に起因する症状を緩和又は低減することができるペプチドかタンパクである。あるいは、導入遺伝子によってコードされる「治療」用のペプチド又はタンパクは、例えば、遺伝子（発現又は機能的）欠陥を修正し、遺伝子欠損を修正するように、被検体に利益を与えるものである。
【００９３】
本発明に従った有用な遺伝子産物（例えば、治療用タンパク）をコードする異種起源のポリヌクレオチドの非限定的な例は、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア病及び貧血のような血液凝固疾患を含むが、これらに限定されない疾病又は疾患の治療において使用できるものを含む。
【００９４】
本明細書に開示されている非限定的な遺伝子及びタンパクを含む、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの哺乳類及び哺乳類以外の形式のすべては、既知であっても既知でなくても、明示的に含まれる。従って、本発明は、非哺乳動物、非ヒト哺乳動物、及び、ヒトに由来する遺伝子及びタンパクであって、本明細書に記載されているヒトの遺伝子及びタンパクと実質的に同様の態様で機能する遺伝子及びタンパクを含む。非ヒト哺乳類の第ＩＸ因子配列の非限定的な例は、Yoshitakeら, 1985, supra; Kurachi ら, 1995, supra; Jallatら, 1990, supra; Kurachi ら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464; Jayeら, 1983, Nucl. Acids Res. 11:2325-2335; Ansonら, 1984, EMBO J. 3: 1053-1060; Wuら, 1990, Gene 86:275-278; Evansら, Proc Natl Acad Sci USA  86:10095 (1989), Blood 74:207-212; Pendurthiら, 1992, Thromb. Res. 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics 1990, 6:133-143; 及び、Katayamaら, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4990-4994に記載されている。
【００９５】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド及びそれらの部分配列は、修飾された形態及び変異体形態を含む。本明細書で使用されているように、「修飾する」との用語又は「変異体」との用語並びにそれらの文法的な変形は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は、それらの部分配列が参照配列から逸脱していることを意味する。従って、修飾された配列及び変異体配列は、基準配列と実質的に同じ、より大きい、又は、より小さい活性又は機能を有していてもよいが、少なくとも基準配列の部分な活性又は機能を保持していてもよい。特別な実施形態において、修飾された核酸は、第ＩＸ因子をコードし、対照標準の第ＩＸ因子をコードする核酸（例えば、ヒト又は他の哺乳類の第ＩＸ因子遺伝子配列のような野生型の第ＩＸ因子配列）と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの数が少なくなるように修飾されている。
【００９６】
また、変異体は、機能の獲得又は損失した変異体を含む。例えば、野生型のヒト第ＩＸ因子ＤＮＡ塩基配列であって、そのタンパクの変異体又は変種が、活性を保持し、又は、治療的に有効であるか、又は、変異体ではないヒト第ＩＸ因子と同等に又はさらに治療的に活性であるものが、本発明の方法及び使用に含まれる。天然のヒト第ＩＸ因子変異体の非限定的な一例において、「Ｐａｄｕａ」と呼ばれるヒト第ＩＸ因子は、位置３３８においてＲ（アルギニン）に代えてＬ（ロイシン）を有する。Ｐａｄｕａ  ＦＩＸは、Ｐａｄｕａ変異がないヒト第ＩＸ因子と比較して、より大きい触媒活性及び凝固活性を有する。ヒト第ＩＸ因子の残基３３８をアルギニンからアラニンに変更することは、触媒活性の向上を生じさせる（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：１２０８９−９４、１９９８）。他の特別な一例において、コラーゲンＩＶは、第ＩＸ因子を捕捉する役割を果たし、哺乳動物の筋組織中に導入されたときに、筋組織中の間質腔内に保持されるので、第ＩＸ因子のうちのいくらかが血液凝固への関与には利用可能でないことを意味する。コラーゲンＩＶに対する結合が減少したタンパクが生じる第ＩＸ因子の配列の変異（例えば、機能の損失）は、例えば、血友病の治療のために有用な変異である。そのような変異体第ＩＸ因子遺伝子の一例は、成熟タンパクの始めから５番目のアミノ酸位置のリジンに代えてアミノ酸アラニンを有するヒトＦＩＸタンパクをコードする。
【００９７】
修飾の非限定的な例は、導入遺伝子において他のジヌクレオチドによりＣｐＧを置換すること（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸコード遺伝子のような、第ＩＸ因子コード遺伝子）のような、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸（例えば、１〜３個、３〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個又は５０〜１００個以上のヌクレオチド又は残基）の置換を含む。アミノ酸置換の一例は、キャプシド配列の保存アミノ酸の置換である。アミノ酸置換の他の一例は、リジン残基に代えたアルギニン（例えば、４−１、１５−１、１５−２、１５−３／１５−５、１５−４及び／又は１５−６のいずれかに記載されているリジンのアルギニン置換の１つ以上）である。さらなる修飾は、基準配列への付加（例えば、１〜３個、３〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個又は５０〜１００個以上のヌクレオチド又は残基の挿入）、及び、基準配列の欠損（例えば、部分配列又はフラグメント）を含む。特別な実施形態において、修飾された配列又は変異体配列は、修飾されていない配列の機能又は活性の少なくとも一部を保持している。そのような修飾された形態及び変異体は、例えば、本明細書に記載されている基準配列と同じ、より少ない、又は、より大きいが、少なくとも部分的な機能又は活性を有していてもよい。
【００９８】
本明細書に記載されているように、変異体は、１つ以上の非保存的な又は保存的なアミノ酸配列の相違若しくは修飾又はその両方を有していてもよい。「保存的置換」は、生物学的、化学的又は構造的に類似の残基による１つのアミノ酸の置換である。生物学的類似は、その置換が生物活性を破壊しないことを意味する。構造的類似は、それらのアミノ酸が、アラニン、グリシン及びセリンのように、同様の長さの側鎖を有するか、又は、同様のサイズを有することを意味する。化学的類似は、それらの残基が同じ電荷を有しているか、又は、いずれもが親水性若しくは疎水性であることを意味する。特別な例は、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンを他の１つに置換するような、１つの疎水性残基の置換を他の１つの残基に置換すること、又は、リジンに代えたアルギニンによる置換、アスパラギン酸に代えたグルタミン酸による置換、アスパラギンに代えたグルタミンによる置換、トレオニンに代えたセリンによる置換などのように、１つの極性残基を他の１つの残基に置換することを含む。保存的置換の特別な一例は、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンを他の１つに置換すること、及び、リジンに代えたアルギニンによる置換、アスパラギン酸に代えたグルタミン酸による置換、アスパラギンに代えたグルタミンによる置換、トレオニンに代えたセリンによる置換などのような、１つの極性残基を他の１つの残基に置換することを含む。例えば、保存アミノ酸置換は、典型的には、以下のグループ：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及び、フェニルアラニン、チロシンの範囲内での置換を含む。また、「保存的置換」は、置換されていない親アミノ酸に代えて置換されるアミノ酸の使用を含む。
【００９９】
従って、本発明は、１つ以上の生物活性（例えば、血液凝固等の機能）を保持する（例えば、本明細書に記載されているタンパクをコードするポリヌクレオチドの）遺伝子変異体及びタンパク変異体を含む。変異体は、天然のポリヌクレオチド、タンパク又はペプチドのような基準配列と異なっていてもよい。ポリヌクレオチド、タンパク又はポリペプチドのそのような変異体は、そのポリヌクレオチド、タンパク又はポリペプチドが変更された特性又はさらなる特性を有するように組み換えＤＮＡ技術を使用して修飾された又は修飾することができるタンパク又はポリペプチドを含む。
【０１００】
ヌクレオチド配列レベルでは、天然の変異体遺伝子と非天然の変異体遺伝子は、基準遺伝子に対して、典型的には少なくとも約５０％、より典型的には約７０％、さらに典型的には約８０％同一である。従って、例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸ遺伝子は、野生型のＦＩＸ遺伝子に対して８０％以上の同一性、又は、野生型のＦＩＸ遺伝子に対して、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、又は、より高い（例えば、野生型のＦＩＸ遺伝子に対して９６％、９７％、９８％、９９％の）同一性を有していてもよい。
【０１０１】
アミノ酸配列レベルでは、天然の変異体タンパク又は非天然の変異体タンパクは、基準タンパクに対して、典型的には少なくとも約７０％同一であり、より典型的には約８０％同一であり、さらに典型的には約９０％又はそれ以上同一である。とはいえ、非同一性の本質的部位は、非保存領域に存在することが許される（例えば、６０％未満、５０％未満又は４０％未満のような７０％のより小さい同一性）。他の実施形態において、配列は、基準配列に対して少なくとも６０％、７０％、７５％又はそれより高い同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はより高い同一性）を有する。
【０１０２】
「同一性」、「相同」及びそれらの文法的変形は、２つ以上の言及されている構成要素が、「整列された」配列である場合に、同じであることを意味する。従って、例として、２つのポリペプチド配列が同一である場合、それらのポリペプチド配列は、少なくとも参照された領域又は部分の範囲内において同じアミノ酸配列を有する。２つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、それらのポリヌクレオチド配列は、少なくとも参照された領域又は部分の範囲内において同じアミノ酸配列を有する。同一性は、配列の明らかにされているエリア（領域又はドメイン）に亘るものであってもよい。同一性の「エリア」又は「領域」は、参照される２つ以上の同一の構成要素の一部分を表す。従って、２つのタンパク又は核酸配列が配列の１つ以上のエリア又は領域に亘って同一である場合、それらのタンパク又は核酸配列は、その領域内での同一性を共有する。「整列された」配列は、複数のポリヌクレオチド又はタンパク（アミノ酸）の配列を表し、多くの場合、基準配列と比較して欠損した又は付加された塩基又はアミノ酸（ギャップ）のための訂正を含む。
【０１０３】
同一性は、配列の全長又は一部分に亘るものであってもよい。特別な態様において、同一性パーセンテージを共有する配列の長さは、２個、３個、４個、５個又はそれ以上の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸（例えば、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個等の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸）である。さらなる特別な態様において、同一性を共有する配列の長さは、２１個又はそれ以上の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸（例えば、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸）である。さらなる特別な態様において、同一性を共有する配列の長さは、４１個又はそれ以上の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸（例えば、４２個、４３個、４４個、４５個、４５個、４７個、４８個、４９個、５０個の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸）である。またさらなる特別な態様において、同一性を共有する配列の長さは、５０個又はそれ以上の連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸（例えば、５０個〜５５個、５５個〜６０個、６０個〜６５個、６５個〜７０個、７０個〜７５個、７５個〜８０個、８０個〜８５個、８５個〜９０個、９０個〜９５個、９５個〜１００個、１００個〜１１０個等のような連続するポリヌクレオチド又はアミノ酸）である。
【０１０４】
「相同の」との用語又は「相同性」との用語は、言及されている２つ以上の構成要素が、所定の領域又は部分に亘って少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。相同性又は同一性の「エリア、領域又はドメイン」は、言及されている２つ以上の構成要素の一部が、相同性を共有するか又は同一であることを意味する。従って、２つの配列が１つ以上の配列領域に亘って同一である場合、それらの２つの配列は、それらの領域において同一性を共有する。「本質的な相同性」は、１つの分子が、該１つの分子が相同性を共有している対照標準分子又は該対照標準分子の関連する／対応する領域若しくは部分の構造又は機能（例えば、生物学的機能又は活性）の１つ以上の部分的な構造又は機能を少なくとも有する又は有すると期待されるように構造的に又は機能的に保存されていることを意味する。
【０１０５】
２つの配列間の同一性（相同性）の程度は、コンピュータプログラム及び／又は数学アルゴリズムを使用して確認することができる。配列の同一性（相同性）パーセンテージを計算するアルゴリズムは、一般的に、比較する領域又はエリアに亘って配列ギャップ及びミスマッチを説明する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）サーチアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３  （１９９０）、ＮＣＢＩにより公開されているものを参照されたい。）は：ミスマッチ−２；ギャップオープン５；ギャップエクステンション２のような典型的なサーチパラメーターを有する。ポリペプチド配列比較のために、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、典型的には、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２又はＢＬＯＳＵＭ５０のようなスコアリングマトリックスと組み合わせて使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムもまた、同一性の程度を定量するために使用される（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）；  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３２：１８５  （２０００）；  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７：１９５  （１９８１））。ドローネーをベースとした位相写像を使用してタンパク構造の類似性を定量するためのプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０４：３２０  （２００３））。
【０１０６】
ポリヌクレオチドは、付加及び挿入（例えば、１つ以上の異種起源ドメイン）を含む。付加（例えば、異種起源ドメイン）は、合成物に対する任意の種類の分子の共有結合又は非共有結合であってもよい。典型的に、付加及び挿入（例えば、異種起源ドメイン）は、補完的な又は別個の機能又は活性を付与する。
【０１０７】
付加及び挿入は、キメラ配列又は融合配列を含み、対照標準の天然（野性型）の配列に通常は存在せず、配列に共有結合により結合した１つ又はそれ以上の分子を有するポリヌクレオチド又はタンパクの配列である。「融合」との用語又は「キメラ」との用語並びにそれらの文法的変形は、１つの分子に関して使用された場合、当該１つの分子の一部又は部分が、その分子とは区別される（異種の）異なる構成要素を含み、それらが典型的には天然では一緒に存在しないことを意味する。すなわち、例えば、融合又はキメラの１つの部分は、天然には一緒に存在しない部分を含むか又は当該部分からなり、また、構造的に区別されるものである。
【０１０８】
「ベクター」との用語は、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）又は他の輸送手段であって、ポリヌクレオチドの挿入又は組み込みによって操作されることができるものを表す。そのようなベクターは、細胞中にポリヌクレオチドを導入／移動し、並びに、細胞中の挿入されたポリヌクレオチドを転写若しくは翻訳するために、遺伝子操作（つまり、「クローニングベクター」）用に使用することができる。ベクター核酸配列は、一般的に、細胞中での増殖のための複製開始点を少なくとも含み、任意に、異種起源ポリヌクレオチド配列、発現制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニン（ポリアデニル化とも呼ばれる）配列のようなさらなる因子を含む。
【０１０９】
ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ以上の核酸因子に由来し又は該核酸因子をベースとしたものである。特別なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのようなレンチウイルス及びパーボウイルスベクターを含む。
【０１１０】
本明細書で使用されているように、「組み換え」との用語は、組み換えレンチウイルス又は組み換えパーボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターのように、ウイルスベクターの修飾語として、並びに、組み換えポリヌクレオチド及び組み換えポリペプチドのように、配列の修飾後として、その構成（例えば、ＡＡＶ又は配列）が、通常天然には生じない態様で操作されている（つまり、変更されている）ことを意味する。ＡＡＶベクターのような組換えベクターの特別な一例は、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノム中に通常は存在しないポリヌクレオチドが、そのウイルスゲノム中に挿入されている場合であろう。例えば、組み換えポリヌクレオチドの一例は、タンパクをコードする異種起源のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）がベクター中にクローンされた場合であって、５’、３’領域及び／又はイントロン領域の有無にかかわらず、その遺伝子が通常はそのウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノムの内部に結びついている場合であろう。「組み換え」との用語は、本明細書において必ずしも、ウイルス及びＡＡＶベクターのようなベクター、並びに、ポリヌクレオチド及びポリペプチドのような配列に関して使用されるとは限られないが、ウイルス、ＡＡＶ、並びに、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む配列の組み換え形態は、あらゆるそのような省略にもかかわらず、明示的に含まれる。
【０１１１】
組み換えウイルスの「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野性型ゲノムを取り除くための分子法を使用すること及び非天然の核酸で置換することによるＡＡＶのように、また、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、ヒトＦＩＸをコードする修飾された核酸配列）のように、ウイルスの野性型ゲノムに由来する。ＡＡＶに関して、典型的には、ＡＡＶゲノムの１つ又は両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、ＡＡＶベクター中に保持される。「組み換え」ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）は、そのウイルスゲノムのすべて又は一部が、異種起源ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、ヒトＦＩＸをコードする修飾された核酸配列）のように、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノムの核酸に対して非天然である配列で置換されているので、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノムとは区別される。従って、非天然の配列の組み込み（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、ヒトＦＩＸをコードする修飾された核酸配列）は、そのウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を「組み換え」ベクターとして定義し、ＡＡＶの場合には、「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。
【０１１２】
組換えベクター（例えば、レンチ、パーボ、ＡＡＶ）配列は、その後のエクスビボ、インビトロ又はインビボにおける細胞の感染（遺伝子導入）のために、本明細書において「粒子」と呼ばれるものに包まれてもよい。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子中にキャプシド包膜又される又は包まれる場合、その粒子を「ｒＡＡＶ」と呼ぶことができる。そのような粒子は、ベクターゲノムをキャプシド包膜する又は包むタンパクを含む。特別な例は、ウイルスエンベロープタンパクを含み、ＡＡＶの場合には、キャプシドタンパクを含む。
【０１１３】
組み換えプラスミドに関して、ベクター「ゲノム」は、組み換えプラスミド配列の部分であって、最終的に包まれるか又はキャプシド包膜されてウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成する部分を表す。組み換えベクターを構築又は製造するために組み換えプラスミドが使用される場合、ベクターゲノムは、その組み換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組み換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と呼ばれ、増殖及び組み替えウイルス生産に必要とされるプロセスである、プラスミドのクローニング及び増殖にとって重要であるが、それ自体は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子中に包まれ又はキャプシド包膜されない。
【０１１４】
従って、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によって包まれる又はキャプシド包膜され、異種起源ポリヌクレオチド配列を含むベクタープラスミドの部分を表す。組み換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」であり、そのプラスミド骨格は、プラスミドのクローニング及び増殖にとって重要であり、例えば、カナマイシンのような選択可能なマーカーを有するが、組み換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってそれ自体が包まれ又はキャプシド包膜されない。
【０１１５】
ベクターゲノムをキャプシド包膜する／包むｒＡＡＶの量は、例えば、定量的ＰＣＲによって測定することができる。例えば、この分析は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって、包まれているベクターゲノムの物理的な数を測定し、例えば、バルクＡＡＶベクター及び最終生産物に対して、製造／精製工程の様々な段階で行うことができる。
【０１１６】
組み換えベクター配列は、ポリヌクレオチドの挿入又は組み込みによって操作される。本明細書に開示されているように、ベクタープラスミドは、一般に、細胞における増殖のための複製開始点と、１つ又はそれ以上の発現制御因子とを少なくとも含む。
【０１１７】
ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ以上の「発現制御因子」を含んでいてもよい。典型的には、発現制御因子は、作用可能に連結したポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす核酸配列である。プロモーター及びエンハンサーのような本明細書に記載されている発現制御因子を含む、ベクター内に現在する制御因子は、適切な異種起源ポリヌクレオチドの転写、及び、適切な場合には、翻訳を促進するために含まれている（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正確なリーディングフレームのメンテナンス、及び、停止コドン等）。そのような因子は、典型的にはシスで作用し、「シス作用する」因子と呼ばれるが、トランスで作用してもよい。
【０１１８】
発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルで達成することができる。典型的には、転写を調整する発現制御因子は、転写されるポリヌクレオチドの（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸の）５’末端の近く（つまり、「上流に」）に配置される。発現制御因子は、転写配列の３’端末（つまり、「下流」）に配置されてもよいし、又は、転写物内に（例えば、イントロン中に）配置されてもよい。発現制御因子は、転写配列と隣接して配置されてもよいし、又は、距離を置いて（例えば、そのポリヌクレオチドから、１〜１０個、１０〜２５個、２５〜５０個、５０〜１００個、１００〜５００個、又は、それより多いヌクレオチド）、かなりの距離をおいて配置されていてもよい。しかしながら、ＡＡＶベクターのような特定のベクターのポリヌクレオチド長さ制約のために、そのような発現制御因子は、典型的には、転写されるポリヌクレオチドから１〜１０００個のヌクレオチドの範囲内に存在するであろう。
【０１１９】
機能的に、作用可能に連鎖した異種起源ポリヌクレオチドの発現は、その因子（例えば、プロモーター）がポリヌクレオチドの転写、及び、必要に応じて、転写物の翻訳を調整するように、その因子によって少なくとも部分的には制御可能である。発現制御因子の具体例は、通常は転写配列の５’に配置されるプロモーターである。発現制御因子の他の一例は、転写配列の５’、３’に、又は、転写配列内に配置されることができるエンハンサーである。
【０１２０】
本明細書で使用されているように、「プロモーター」は、組み換え産物をコードするポリヌクレオチド配列と隣接した位置にある核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を表すことができる。プロモーターは、典型的には、隣接した配列（例えば、異種起源ポリヌクレオチド、例えば第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸）に作用可能に連結されている。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、異種起源のポリヌクレオチドから発現される量を増加させる。
【０１２１】
本明細書で使用されているように、「エンハンサー」は、異種起源のポリヌクレオチドと隣接した位置にある配列を表すことができる。エンハンサーは、典型的にはプロモーター因子の上流に位置するが、ＤＮＡ配列（例えば、異種起源ポリヌクレオチド）の下流に又は該ＤＮＡ配列内に配置されることも可能であり、機能する。従って、エンハンサーは、異種起源のポリヌクレオチドの１００塩基対、２００塩基対又は３００塩基対以上上流又は下流に配置されることが可能である。エンハンサーは、典型的には、プロモーター因子によって与えられる発現増加を超えて、発現される異種起源のポリヌクレオチドを増加させる。
【０１２２】
発現制御因子（例えば、プロモーター）は、特定の組織種又は細胞種において活性なものを含み、本明細書において「組織特異的発現制御因子／プロモーター」と呼ばれる。組織特異的な発現制御因子は、典型的には、特定の細胞又は組織（例えば、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、目、網膜、硬骨、筋肉、肺、膵臓、心臓、腎臓細胞等）において活性である。発現制御因子は、その発現制御因子が、特定の細胞種、組織種又は器官種に対してユニークである転写活性化因子タンパク又は転写の他の制御因子によって認識されるので、典型的にはこれらの細胞、組織又は器官において活性である。
【０１２３】
骨格筋において活性なプロモーターの例は、骨格α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、及び、天然のプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーターを含む（例えば、Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７：２４１−２４５（１９９９）参照）。肝臓に対して組織特異的であるプロモーターの例は、ヒト・アルファ１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである；特に、ａｌｂｕｍｉｎ，  Ｍｉｙａｔａｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７１：５１２４−３２  （１９９７）；  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，  Ｓａｎｄｉｇ，ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ３：１００２−９  （１９９６）；  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  （ＡＦＰ），  Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，  ら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ．  Ｔｈｅｒ．，  ７：１５０３−１４  （１９９６）］，  ｂｏｎｅ  （ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，  Ｓｔｅｉｎ，ら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．，  ２４：１８５−９６  （１９９７）；  ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｈｅｎ，  ら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １１  ：６５４−６４  （１９９６）），  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  （ＣＤ２，  Ｈａｎｓａｌ，  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６１：１０６３−８  （１９９８）；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ；  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａ  ｃｈａｉｎ），  ｎｅｕｒｏｎａｌ  （ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ  （ＮＳＥ）  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  ら、Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １３：５０３−１５  （１９９３）；  ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ，  Ｐｉｃｃｉｏｌｉ，  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：５６１１−５  （１９９１）；  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｇｆ  ｇｅｎｅ，  Ｐｉｃｃｉｏｌｉ，  ら、Ｎｅｕｒｏｎ，  １５：３７３−８４  （１９９５）参照。肝臓において活性なエンハンサーの一例は、アポリポタンパクＥ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ−１及びＨＣＲ−２である（Ａｌｌａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２９１１３−１９  （１９９７））。
【０１２４】
発現制御因子は、さらに多くの異種細胞タイプ中でポリヌクレオチドの発現を駆り立てることができる、遍在か乱雑なプロモーター／エンハンサーを含む。そのような因子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列及び様々な哺乳動物細胞タイプにおいて活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は、天然には存在しない合成因子（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５））、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉還元酵素プロモーター、細胞質β−アクチン・プロモーター、及び、ホスホ・グリセロール・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
発現制御因子は、制御可能な態様で発現を与えることができる。すなわち、シグナル又は刺激は、作用可能に連鎖した異種起源ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させる。シグナル又は刺激に応じて作用可能に連結したポリヌクレオチドの発現を増加させる制御可能な因子は、「誘導可能な因子」と呼ばれる（つまり、シグナルによって誘導されるものである）。特別な例は、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導プロモーターを含むが、それに限定されるものではない。シグナル又は刺激に応じて作用可能に連結したポリヌクレオチドの発現を減少させる制御可能な因子は、「抑制性因子」と呼ばれる（つまり、そのシグナルは、そのシグナルが除去又は不存在であるときに、発現が増加するように、発現を減少させる）。典型的には、そのような因子によって与えられる増加又は減少は、存在するシグナル又は刺激の量に比例し；シグナル又は刺激の量が多いほど、発現の増加又は減少が大きい。特別な非限定的な例は、亜鉛誘導性のヒツジ・メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性のマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼ・プロモーター・システム（ＷＯ９８／１００８８）；テトラサイクリン抑制システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：５５４７−５５５１  （１９９２））；テトラサイクリン誘導系；（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５１２−５１８  （１９９８））も参照；ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９−２４３（１９９７）、及び、Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４：４３２−４４１  （１９９７）；及び、ラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００：２８６５−２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２：１０２８−１０３２  （１９９６）。この文脈において有用な他の制御可能な制御因子は、特定の生理的状態（例えば、体温、急性期、発生）によって制御されるものである。
【０１２６】
また、発現制御因子は、異種起源のポリヌクレオチドのための天然の因子を含む。異種起源のポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣することが望まれる場合、天然の制御因子（例えば、プロモーター）を使用することができる。異種起源のポリヌクレオチドの発現が、一時的に若しくは発展的に、又は、組織特異的な態様で、又は、特定の転写刺激に応じて、制御されることになる場合、天然の因子を使用することができる。イントロン、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列のような他の天然の発現制御因子を使用することもできる。
【０１２７】
本明細書で使用されているように、「作用可能な連結」又は「作用可能に連結された」との用語は、複数の構成要素の物理的又は機能的な隣接配置であって、意図した態様でそれらが機能することを可能にするものを表す。核酸との作用可能な連結における発現制御因子の例において、その関係は、制御因子が核酸の発現を調整する状態である。より詳しくは、例えば、作用可能に連結した２つのＤＮＡ塩基配列は、２つのＤＮＡが、それらのＤＮＡ塩基配列の少なくとも１つが他の配列に対して生理的影響を及ぼすことができる関係で配置されている（シス又はトランス）ことを意味する。
【０１２８】
従って、ヒトＦＩＸタンパクをコードする修飾された核酸配列、並びに、ＡＡＶベクターを含むレンチウイルスベクター及びパルボウイルスベクターのようなウイルスベクターを含むベクター及びプラスミドに加えて、それらの組成物は、さらなる核酸因子を含んでいてもよい。これらの因子は、限定されるものではないが、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、発現制御（例えば、プロモーター／エンハンサー）因子、転写終結シグナル若しくは停止コドン、ポリヌクレオチドに隣接する配列５’若しくは３’の非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列）、又は、ゲノムヒト第ＩＸ因子（配列番号：１３）のイントロンＩのすべて又は一部分のようなイントロンの１つ又は以上のコピーを含む。
【０１２９】
核酸因子は、例えば、詰め込みを改良して混入核酸の存在を減らすために（例えば、プラスミド骨格の詰め込みを減らすために）、例えば、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に開示されているように、ＡＡＶベクターは、典型的には、一般には約４ｋｂ〜約５．２ｋｂ又はそれよりわずかに大きい定義された範囲のサイズを有するＤＮＡの挿入物を取り込む。従って、より短い配列については、ウイルス粒子中に詰め込むＡＡＶベクターのために許容できるウイルスゲノム配列の正常なサイズに又はそれに近いサイズになるように長さを調節するために、挿入物フラグメント中にスタッファー又はフィラーを含めてもよい。いくつかの実施形態において、フィラー核酸配列／スタッファー核酸配列は、核酸の翻訳されない（タンパクをコードしない）セグメントである。ＡＡＶベクターの特定の実施形態において、異種起源ポリヌクレオチド配列は、４．７ｋｂ未満の長さを有し、フィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列は、その異種起源ポリヌクレオチド配列と結合した（例えば、ベクターに挿入された）場合、概ね３．０ｋｂ〜５．５ｋｂ、又は、概ね４．０ｋｂ〜５．０ｋｂ、又は、概ね４．３ｋｂ〜４．８Ｋｂの全体長さを有する。
【０１３０】
イントロンは、ウイルス粒子中に詰め込むＡＡＶベクターの長さを達成するためのフィラー配列又はスタッファポリヌクレオチド配列として機能することもできる。フィラーポリヌクレオチド配列又はスタッファポリヌクレオチド配列としての機能するイントロン及びイントロンフラグメント（例えば、ＦＩＸのイントロンＩの一部分）は、発現を増大させることもできる。イントロン因子の包含は、イントロン因子が存在しない状態における発現と比較して、発現を増大させることができる（Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５、ｓｕｐｒａ）。
【０１３１】
イントロンの使用は、第ＩＸ因子イントロンＩ配列の包含に限定されるものではないが、他のイントロンも含み、そのイントロンは、同じ遺伝子に関係していてもよいし（例えば、核酸が第ＩＸ因子をコードする場合、イントロンは、第ＩＸ因子のゲノムの配列中に存在するイントロンに由来する）、又は、完全に異なる遺伝子若しくは他のＤＮＡ塩基配列と関連していてもよい。また、従って、同族の（関連する）遺伝子（異種起源ポリヌクレオチド配列が、ゲノムの配列によってコードされる同じタンパクのすべて又は一部分をコードする）、及び、非同族の（無関係な）遺伝子（異種起源ポリヌクレオチド配列が、ゲノム配列によってコードされるタンパクとは区別されるタンパクをコードする）に由来するゲノム配列に見られるイントロンのような、核酸の他の翻訳されていない（タンパクをコードしない）領域は、本発明に従ってフィラーポリヌクレオチド配列又はスタッファポリヌクレオチド配列として機能することもできる。
【０１３２】
本明細書で用いられているように、「イントロンＩの一部分」は、約０．１ｋｂから約１．７ｋｂまでのヌクレオチド長さを有するイントロンＩの領域であって、イントロンＩの一部分が存在しない状態でのＦＩＸの発現と比較したときに、典型的には、プラスミド又はウイルスベクターのテンプレート上での第ＩＸ因子の発現を約１．５倍又はそれ以上増大させる領域を意味する。より特殊な一部分は、イントロンＩの１．３ｋｂの部分である。第ＩＸ因子イントロンＩの配列の非限定的な一例は、配列番号：１３に記載されているＦＩＸ第１のイントロンの５’部分及び３’部分で構成されたキメラである、イントロンＡである。
【０１３３】
発現制御因子、ＩＴＲ、ポリＡ配列、フィラー配列、又は、スタッファポリヌクレオチド配列は、長さが変わっていてもよい。特別な態様において、発現制御因子、ＩＴＲ、ｐｏｌｙＡ、又は、フィラーポリヌクレオチド配列若しくはスタッファポリヌクレオチド配列は、概ね、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜１，５００、１５００〜２０００、又は、２０００〜２５００のヌクレオチド長さの配列である。
【０１３４】
非限定的な一実施形態によれば、ＡＡＶベクターは、４−１キャプシド変異体ＶＰ１タンパク（配列番号：４）含むＡＡＶキャプシドと、形質導入された哺乳動物細胞において異種遺伝子を発現するためのゲノムとを含む。
【０１３５】
このベクターのキャプシドは、４−１キャプシド変異体に由来するＶＰ２タンパク及びＶＰ３タンパクを含む（それぞれ、配列番号：２７及び配列番号：３）。特定の非限定的な実施形態によれば、ＶＰ１タンパク及びＶＰ２タンパクは、概ね１：１（又は、また別の比率）の理論混合比で存在し、ＶＰ３タンパクは、ＶＰ１若しくはＶＰ２のいずれかに対して、又は、ＶＰ１及びＶＰ２の両社に対して、概ね、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１に近い比率で、又は、また別の比率で存在する。
【０１３６】
いくつかの実施例において、４−１キャプシド変異体タンパク（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を含むキャプシドを有するものを含むが、それに限定されないＡＡＶベクターのゲノムは、ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパクをコードする異種起源の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＦＩＸタンパクは、野性型であり、他の実施形態においては、ＦＩＸタンパクは、そのタンパクの活性を変化させる置換変異又は他の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、ＦＩＸ触媒活性、及び／又は、凝固促進剤としてのそのタンパクの活性を増大させる。いくつかの実施形態において、ＦＩＸタンパクは、Ｐａｄｕａ  ＦＩＸタンパクであり、ＦＩＸタンパクの位置３３８に対応するアミノ酸におけるアルギニンからアラニンへの置換を有する。いくつかの実施形態によれば、ヒトＦＩＸ（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを含む）をコードする遺伝子は、例えば、ＣｐＧジヌクレオチドを短縮又は除去することにより、最適化されたコドンである。他のタイプのコドン最適化は同様に可能である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターのゲノムは、ゲノムの左端及び右端（つまり、それぞれ、５’末端及び３’末端）に配置されている、ＡＡＶ２に由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、左のＩＴＲは、配列番号：１２に由来するヌクレオチド１〜１４１（本明細書に配列番号：１３として開示されている）を含むか若しくは該ヌクレオチドからなり、また、右のＩＴＲは、配列番号１２に由来するヌクレオチド４０９７〜４２０４（本明細書に配列番号：２０として開示されている）を含むか若しくは該ヌクレオチドからなる。各ＩＴＲは、可変長の核酸配列によって、ベクターゲノム中の他の因子から隔てられていてもよい。
【０１３８】
他の実施形態において、ＡＡＶベクターのゲノムは、プロモーターを含む発現制御因子をさらに含み、また、任意にエンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターとエンハンサーの両者を含み、それらは、恒常的、誘導性、又は、組織特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーター、エンハンサー、又は、両方は、組織特異的である。典型的な実施形態によれば、エンハンサーとプロモーターの両方は、他の特定の細胞種と比較して、肝細胞において選択的に活性である。一実施形態によれば、エンハンサーは、ヒトＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサーの全体又は一部分であり、また、プロモーターは、ヒト・アルファ−１抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーターの全体又は一部分である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムは、配列番号：１２に由来するヌクレオチド１５２〜４７２（本明細書に配列番号：１４として開示されている）を含むか又は当該ヌクレオチドからなるＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサーを含み、また、配列番号：１２に由来するヌクレオチド４８２〜８７８（本明細書に配列番号：１５として開示されている）を含むか又は該ヌクレオチドからなるＡＡＴプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサーは、ＡＡＴプロモーターの５’に配置されており、それらの配列は、隣接していてもよいし又は他のヌクレオチド配列によって隔てられていてもよい。いくつかの実施形態によれば、エンハンサーとプロモーターは、第ＩＸ因子をコードする核酸配列の５’に配置されており、また、第ＩＸ因子遺伝子の第１のエクソンに隣接して結合されていてもよいし、又は、ヒト第ＩＸ因子遺伝子に由来する５’非翻訳配列（ＵＴＲ）若しくはスペーサーとして機能するある他の配列によってそこから隔てられていてもよい。典型的な非限定的一実施形態において、５’ＵＴＲ配列は、配列番号：１２に由来するヌクレオチド８７９〜９０７を含むか又は当該ヌクレオチドからなる。
【０１３９】
いくつかの実施例において、天然のＦＩＸ  Ｐａｄｕａを含む、ＦＩＸをコードする遺伝子は、ヒト第ＩＸ因子のゲノム配列中に存在する１つ又はそれ以上のイントロンを含む。他の実施形態において、すべてのイントロンが除外されていてもよく、その一例は、配列番号：１０の核酸配列として開示されており、また、本明細書において「ＦＩＸ３９」のためのコーディング配列と呼ばれる。存在する場合、イントロンは、本明細書に記載されているように、スタッファー配列又はフィラー配列として作用することができる。遺伝子全体が、ＣｐＧジヌクレオチドを減少又は除去するように、コドン最適化されていてもよい。
【０１４０】
特別の非限定的一実施形態において、ＡＡＶベクター中で使用されるヒト第ＩＸ因子をコードする遺伝子は、配列番号：１２に由来するヌクレオチド９０８〜３７３１を含むか又は当該ヌクレオチドからなり、そのヌクレオチドは、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａをコードし、ＣｐＧジヌクレオチドを除去するようにコドン最適化されている。この配列は、エクソン１（配列番号：１２に由来するヌクレオチド９０８〜９９５）、第１のイントロン（時々イントロンＩとして知られている；配列番号：１２に由来するヌクレオチド９９６〜２４３３）、及び、エクソン２〜８（配列番号：１２に由来するヌクレオチド２４３４−３７３１）を含む。
【０１４１】
ある実施形態において、第ＩＸ因子をコードする遺伝子は、その３’端末に、ヒト第ＩＸ因子遺伝子に由来する３’ＵＴＲ配列（配列番号：１２に由来するヌクレオチド３７３２〜３７７９のような、これに限定されないもの）、及び／又は、第ＩＸ因子遺伝子若しくは他の遺伝子に由来するポリアデニレート（ｐｏｌｙＡ）配列が、繋がっていてもよい。非限定的な一例において、ｐｏｌｙＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子に由来してもよく、また、配列番号：１２に由来するヌクレオチド３８２０〜４０４７を含むか又は当該ヌクレオチドからなるものであってもよい。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、ヌクレオチドの介在配列によってｐｏｌｙＡ配列から可変的に間隔を置いて配置されていてもよい。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、上述されている因子は、１つのＡＡＶベクターゲノム中に組み合わされてもよい。非限定的な一例によれば、ＡＡＶベクターは、５’から３’の順序で、左のＡＡＶ  ＩＴＲ、ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサー（又はその一部分）、ｈＡＡＴプロモーター（又はその一部分）、ヒト第ＩＸ因子５’ＵＴＲの一部分、ヒト第ＩＸ因子Ｐａｄｕａをコードする核酸（イントロンＩのような、１つ以上のイントロンを任意に含む）、ヒト第ＩＸ因子３’ＵＴＲの一部分、ｂＧＨに由来するｐｏｌｙＡ配列（又は、その一部分）、及び、右のＡＡＶ２  ＩＴＲを含むゲノムを有していてもよい。これらの実施形態のいくつかにおいて、左のＡＡＶ２  ＩＴＲは、配列番号：１３の核酸配列を有し；ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１エンハンサーは、配列番号：１４の核酸配列を有し；ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号：１５の核酸配列を有し；５’ＵＴＲは、配列番号：１６の核酸配列を有し；ＦＩＸ  Ｐａｄｕａをコードする遺伝子（イントロンＩを含む）は、配列番号：１０の核酸配列によってコードされるＦＩＸタンパクをコードし；３’ＵＴＲは、配列番号：１８の核酸配列を有し；ｐｏｌｙＡ領域は、配列番号：１９の核酸配列を有し；また、右のＡＡＶ２  ＩＴＲは、配列番号：２０の核酸配列を有する。
【０１４３】
ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターのゲノムは、配列番号：１２に由来するヌクレオチド１〜４２０４、又は、当該ヌクレオチドに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含むか、又は、当該ヌクレオチド若しくは配列からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、キャプシドは、４−１  ＶＰ１キャプシドタンパク変異体（配列番号：４）及び対応するＶＰ２及びＶＰ２キャプシドタンパクを含む。ＡＡＶベクターの特定の非限定的一実施形態において、本明細書において「ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ」と呼ばれ、そのベクターは、４−１キャプシド変異体タンパク（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）から形成されたキャプシド、及び、配列番号：１２に由来するヌクレオチド１〜４２０４に対応する核酸配列を含む単鎖のゲノムを含む。
【０１４４】
本明細書で用いられているように、ＡＡＶ「空キャプシド」は、ＡＡＶベクターゲノムを含む「キャプシドを含むゲノム」とは対照的に、ベクターゲノムを含んでいない（従って、「中空」との用語）。空キャプシドは、完全な（ＡＡＶベクターを含むゲノム）ウイルスと反応する１つ又はそれ以上の抗体と反応するという点でウイルス様粒子である。
【０１４５】
空キャプシドは、ＡＡＶベクター調合物中に含まれていてもよい。もし望まれれば、ＡＡＶ空キャプシドは、ＡＡＶベクター調合物中に加えられてもよいし、又は、本明細書中の方法に従って被検体に別々に投与されてもよい。
【０１４６】
理論によって拘束されることを意図しないが、ＡＡＶ空キャプシドは、ＡＡＶベクターに対する抗体と結合又は反応し、それによって、ＡＡＶベクターの不活性化を減らすためのおとりとして機能すると信じられている。そのようなおとりは、ＡＡＶベクターを対象とする抗体を吸収するように作用し、それによって、細胞のＡＡＶベクター導入遺伝子の形質導入（導入遺伝子の導入）を増加又は改良し、次に、転写物及び／又はコードされるタンパクの細胞発現を増加させる。
【０１４７】
空キャプシドは、生成して所定の品質に精製することができ、その量を決定することができる。例えば、空キャプシドの濃度滴定は、（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２００３  Ｊａｎ；７（１）：１２２−８に基づいて）２８０ｎｍの波長における光学密度による吸光度測定法によって測定することができる。
【０１４８】
空のＡＡＶ又は空キャプシドは、時々、ＡＡＶベクター調合物中に天然に見つかる。そのような天然の混合物は、本発明に従って使用することができ、又は、もし望まれれば、空キャプシド及び／又はベクターの量を増加又は減少させるために操作されてもよい。例えば、空キャプシドの量は、任意に、被検体中でのベクターを介した遺伝子導入に使用されるように意図されているＡＡＶベクターと反応する抗体の阻害作用を減らすと予想される量に調節されてもよい。空キャプシドの使用は、米国公報２０１４／０３３６２４５に記載されている。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ空キャプシドは、ＡＡＶベクターと共に調剤され、及び／又は、被検体に投与される。特別な態様において、ＡＡＶ空キャプシドは、より少ない量又は同じ量のベクターと共に（例えば、ＡＡＶ空キャプシドに対して１．５倍〜１００倍のＡＡＶベクター、又は、ＡＡＶ空キャプシドに対するＡＡＶベクターの比率が約１：１で）調剤される。他の特別な態様において、ＡＡＶベクターは、過剰なＡＡＶ空キャプシド（例えば、ＡＡＶベクターに対して１倍超のＡＡＶ空キャプシド、例えば、ＡＡＶベクターに対して１．５倍〜１００倍のＡＡＶ空キャプシド）と共に調剤される。任意に、低位からネガティブまでの滴定濃度ＡＡＶ中和抗体を有する被検体は、より小さい量の空キャプシド（ＡＡＶベクターに対して１〜１０倍のＡＡＶ空キャプシド、ＡＡＶベクターに対して２〜６倍のＡＡＶ空キャプシド、又は、ＡＡＶベクターに対して約４〜５倍のＡＡＶ空キャプシド）を受け取ることができる。
【０１５０】
ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、組成物中に、４−１キャプシド変異体タンパク（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）を含むものを含み、ＡＡＶベクター（つまり、ベクターゲノムを含むもの）の濃度より多い過剰な空キャプシドを含む。ＡＡＶベクターに対する空キャプシドの比率は、概ね、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０〜１であってもよいし、又は、また別の比率であってもよい。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、空キャプシドは、ＡＡＶベクター中に存在するのと同じＶＰ１キャプシドタンパク、ＶＰ２キャプシドタンパク及びＶＰ３キャプシドタンパクを含む。他の実施形態において、空キャプシドは、ＡＡＶベクターでみられるものとは異なるアミノ酸配列を有するＶＰ１タンパク、ＶＰ２タンパク及びＶＰ３タンパクを含む。必ずではないが、典型的には、空キャプシドのキャプシドタンパクとＡＡＶベクターのキャプシドのキャプシドタンパクとが配列同一でない場合、それらは同じ血清型のものであろう。
【０１５２】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９  Ｐａｄｕａ（又は、同じキャプシドを有するもの、及び、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は、９９％同一のゲノム配列を有するもの）のような本明細書に記載されているＡＡＶベクターと、任意に、同じキャプシドタンパクを含む過剰の空キャプシドとを含み、ＡＡＶベクターに対する前記空キャプシドの比率は、概ね、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０〜１、又は、また別の比率である。いくつかの実施形態において、組成物中の空キャプシドに対するＡＡＶ−ＦＩＸ３９  Ｐａｄｕａの比率は、約１：５である。他の実施形態において、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９  Ｐａｄｕａと空キャプシドとを含む組成物は、重度の、中程度の、又は、軽度の血友病Ｂを含む血友病Ｂを有するヒト被検体に投与される。
【０１５３】
「選択可能な標識遺伝子」は、発現された場合、遺伝子導入された細胞に抗生物質耐性（例えば、カナマイシン）のような選択可能な表現型を与える遺伝子を表す。「リポーター」遺伝子は、検出できるシグナルを提供するものである。レポーター遺伝子の非限定的な一例は、ルシフェラーゼ遺伝子である。
【０１５４】
修飾された形態を含む、核酸、ポリヌクレオチド、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）、プラスミドは、様々な標準クローニング、組み換えＤＮＡ技術）を使用して、細胞発現によって又はインビトロにおける翻訳と化学合成技術によって作ることができる。ポリヌクレオチドの純度は、シーケンシング、ゲル電気泳動などによって測定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション、又は、コンピュータをベースとしたデータベーススクリーニング手法を使用して分離することができる。そのような技術は、以下のものを含むが、それらに限定されるものではない。
（１）複数の相同なヌクレオチド配列を検出するためのプローブを有するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション
（２）例えば、発現ライブラリーを使用した、共有された構造的特徴を有する複数のポリペプチドを検出する抗体スクリーニング
（３）対象とする核酸配列にアニールすることができるプライマーを使用したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
（４）関連配列に関する配列データベースのコンピュータ調査
（５）サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニング
【０１５５】
「分離された」との用語は、組成物の修飾語として使用された場合、その組成物が、人の手によって作られたこと、又は、それが自然発生したインビボ環境から完全に若しくは少なくとも部分的に分離されたことを意味する。一般に、分離された組成物は、それらの組成物が自然状態では通常伴う１つ又はそれ以上の物質（例えば、１つ又はそれ以上のタンパク、核酸、脂肪、炭水化物、細胞膜）を実質的に含まない。「分離された」との用語は、例えば、組み換えベクター配列（例えば、ｒＡＡＶ）、又は、ベクターゲノムを包む若しくはキャプシド包膜するウイルス粒子と医薬製剤等のような、人の手によって作られた組み合わせを除外しない。また、「分離された」との用語は、ハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシレーション、脂質付加）若しくは誘導された形式のような組成物の代替的物理的形態、又は、人の手によって作られたホスト細胞において発現される形態を除外しない。
【０１５６】
本発明の方法及び用途は、分裂細胞及び／又は非分裂細胞を含む、ホスト細胞中に異種起源ポリヌクレオチド（導入遺伝子）を届ける（遺伝子導入する）ための手段を提供する。本発明の組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、ベクターゲノム、組み替えウイルス粒子、方法、使用、及び、医薬製剤は、治療方法として、核酸又はタンパクをその必要のある被検体に送達、投与又は提供する方法においてさらに有用である。このように、核酸は転写され、タンパクは被検体中でインビボにおいて生産されることができる。被検体が核酸若しくはタンパクの欠乏を有するので、又は、被検体における核酸若しくはタンパクの生産が、治療法として若しくはそうでなくても、いくつかの治療効果を与えることができるので、被検体は、核酸若しくはタンパクから利益を得ることができ、又は、核酸若しくはタンパクを必要とすることができる。
【０１５７】
一般に、組み換えたレンチウイルス又はパーボウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の配列、ベクターゲノム、組み替えウイルス粒子、方法及び使用は、不充分な又は望ましくない遺伝子発現に関連したあらゆる疾患に伴う１つ又はそれ以上の症状を治療又は改善する生物学的作用を有するあらゆる異種起源ポリヌクレオチド（導入遺伝子）を届けるために使用することができる。組み換えたレンチウイルス又はパーボウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の配列、プラスミド、ベクターゲノム、組み替えウイルス粒子、方法及び使用は、様々な病状に療法を提供するために使用することができる。
【０１５８】
本発明の核酸、ベクター、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム及び組み替えウイルス粒子、方法及び使用は、遺伝子疾患の治療を可能にする。一般に、病状は、たいていは酵素の、一般に劣性遺伝する欠乏状態と、少なくとも時々は制御タンパク又は構造的タンパクを含み、優性遺伝するアンバランス状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の病気については、置換療法として正常な遺伝子を罹患した組織にもたらすために、及び、アンチセンス変異を使用したその病気のための動物モデルを作成するために、遺伝子導入を使用することができる。アンバランス状態の病気については、モデル系において病状を作るために遺伝子導入を使用することができ、その後、病状を打ち消すための取り組みにおいてそのモデル系を使用することができる。さらに、欠乏を治療するための核酸配列の部位特異的な組み込みを使用することもできる。
【０１５９】
病状の説明に役立つ例は、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア及び貧血のような先天性血液凝固因子疾患を含むが、それらに限定されるものではない。
【０１６０】
本発明に従って、治療の方法及び使用であって、本発明の核酸、ベクター、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム、及び、組み替えウイルス粒子を含むものが提供される。本発明の方法及び用途は、遺伝子の発現又は機能、例えば、遺伝子の追加又は置換を提供し、又は、増加させ若しくは促進することに広く適用可能である。
【０１６１】
ある実施形態において、本発明の方法又は使用は：
（ａ）ベクター又はベクターゲノムなどにおいてＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸を提供するステップであって、
前記修飾された核酸配列が、前記配列の転写を与える発現制御因子に作用可能に連結されているステップと；
（ｂ）第ＩＸ因子が哺乳動物中で発現されるように、修飾された核酸の所定量を当該哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１６２】
別の一実施形態において、本発明の方法又は使用は、ベクターゲノムを含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子又は複数のウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子（例えば、キャプシド変異体（例えば４−１）等）を哺乳動物又は哺乳動物の細胞に投与することによって、減少した数のＣｐＧジヌクレオチドを有するＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸配列を哺乳動物又は哺乳動物の細胞の中に届け又は移すステップであって、前記ベクターゲノムが、減少した数のＣｐＧジヌクレオチド（及び、任意にＩＴＲ、イントロン、ｐｏｌｙＡ、フィラーポリヌクレオチド配列／スタッファポリヌクレオチド配列）を有するＦＩＸのような、第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸を含み、それによって哺乳動物又は哺乳動物の細胞の中に第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸を届け又は移すステップを含む。
【０１６３】
本発明の特別な態様において、本明細書に開示されている方法及び使用は、核酸の発現は、哺乳動物（例えば、ヒト）に治療的利益を提供する。より特別な態様において、第ＩＸ因子の発現は、血友病Ｂを有する哺乳動物のような哺乳動物（例えば、ヒト）に治療的利益を提供する。様々なさらなる特別な態様において、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少したＦＩＸのような第ＩＸ因子をコードする修飾された核酸と結合した長さが、概ね３．０Ｋｂ〜５．５Ｋｂ、又は、概ね４．０Ｋｂ〜５．０Ｋｂ、又は、概ね４．３Ｋｂ〜４．８ｋｂの全体長さを有するように、フィラーポリヌクレオチド配列／スタッファポリヌクレオチド配列がベクター配列中に含まれている。
【０１６４】
本発明の方法及び用途は、あらゆる治療的効果又は有利な効果をもたらす治療方法を含む。様々な発明の方法及び用途において、その病気によって引き起こされる又はその病気に関連した１つ又はそれ以上の不都合な（例えば、物理的）症状、疾患、疾病、病気又は合併症を抑制、減少又は低減することがさらに含まれる。血友病のような出血性疾患については、治療的効果又は有利な効果は、低減された傷、低減された血液凝固時間、低減された出血症状（継続期間、重症度、頻度）を含むが、それらに限定されるものではない。例えば、関節又は大脳（脳）の出血症状の継続期間、重症度又は頻度を低減した。血友病のような出血性疾患については、治療的効果又は有利な効果は、補足的凝固因子タンパク（例えば、第ＩＸ因子タンパク）の低減された量、又は、補足的凝固因子タンパク（例えば、第ＩＸ因子タンパク）の投与の廃止をさらに含むが、それらに限定されるものではない。
【０１６５】
従って、治療の治療的効果又は有利な効果は、特定の被検体に対して提供されるあらゆる客観的又は主観的な測定可能な又は検出可能な改良又は利益である。治療的効果又は有利な効果は、病気のすべて又は任意の特定の不都合な症状、疾病、疾患、又は、合併症の完全な除去であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。従って、満足な臨床的終了点は、短期間又は長期間（数時間、数日、数週、数か月等）に亘って、病気によって引き起こされる若しくは病気に伴う不都合な症状、疾患、疾病若しくは合併症における漸進的な改善若しくは部分的低下が存在する場合、又は、その病気によって引き起こされる若しくはその病気に伴う１つ以上の不都合な症状、疾患、疾病若しくは合併症の悪化若しくは進行の抑制、低減、抑止、抑制、予防、限定若しくは制御が存在するときに達成される。
【０１６６】
核酸、ベクター、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム、及び、ベクターゲノムを含む組み替えウイルス粒子のような、本発明の組成物、方法、及び、使用は、その必要がある被検体に対して充分な又は有効な量で投与することができる。「有効な量」又は「充分な量」は、一回投与又は複数回投与で、単独で又は組み合わされて、１つ又はそれ以上の他の組成物（薬剤のような治療剤）、治療、プロトコル又は治療療法剤と共に、任意の継続時間（長期間又は短期間）の検出可能なレスポンス、被検体における期待される若しくは望まれる結果、又は、任意の測定可能な若しくは検出可能な程度の若しくは任意の継続時間（例えば、数分、数時間、数日、数か月、数年、又は、治療された）に亘る利益を被検体に提供する量を表す。
【０１６７】
当業者は、一回のｒＡＡＶ／ベクター用量の投与が充分であるか、又は、ｒＡＡＶ／ベクターの複数回投与が必要であるかを判断することができる。例えば、ＦＩＸが前もって定めたレベルよりも低い（例えば、治療的利益を提供する最小よりも少ない）場合、当業者は、適切であれば、ｒＡＡＶ／ベクターの追加用量を投与することを決定することができる。
【０１６８】
治療効果を達成する用量、例えば、体重１キログラム当たりのベクターゲノムの用量（ｖｇ／ｋｇ）は、投与経路、治療効果を達成するために必要とされる異種起源ポリヌクレオチド発現のレベル、治療される特定の疾患、ウイルスベクターに対する任意の宿主免疫反応、異種起源のポリヌクレオチド又は発現産物（タンパク）に対する宿主免疫反応、及び、発現されるタンパクの安定性を含むが、それらに限定されないいくつかの要因によって変化するであろう。当業者は、前述の要因及び他の要因に基づいて、特定の疾病又は疾患を有する患者を治療するためのｒＡＡＶ／ベクターゲノムの用量範囲を決定することができる。一般に、用量は、治療効果を達成するために、被検体の重量１キログラム当たり、少なくとも１×１０8又はそれ以上、例えば、１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12、１×１０13又は１×１０14又はそれ以上のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）であろう。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のゲノム配列を有するものを含む）の治療的有効量は、血友病Ｂ又は他の第ＩＸ因子活性欠損を有する被検体（例えば、ヒト）に投与された場合に、重度の血友病Ｂを軽度又は中程度の血友病Ｂに転換するか又は明らかに病気でない状態にするのに充分な量である。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、血友病Ｂを有するヒト被検体が、第ＩＸ因子置換療法を完全に見合わせること又は適切な止血を維持するために置換ＦＩＸが投与される頻度を減らすことを可能にするのに充分な量である。当業者に理解されるように、因子置換療法は、血友病Ｂのための医療の現在のスタンダードであるが、患者が充分なレベルの機能する凝固因子を生産する能力の欠如を補うためには、組み換え技術によって生成されたヒト第ＩＸ因子の頻繁な注射を必要とする。
【０１７０】
重度の血友病Ｂが、多くの場合は自然な（先行する外傷がなく）、被検体の筋肉又は関節の中への、頻繁な出血（例えば、一週間に少なくとも1回又は２回）を特徴とすることは、一般的に認められている。健康なヒトにみられるＦＩＸ活性の１％未満は、重度の血友病Ｂに関係している。中程度の血友病Ｂを有する人は、重度の血友病Ｂを有する人よりも少ない頻度（例えば、１か月当たり約１回）で出血するが、手術、外傷、又は、歯の作業の後に正常な人よりも長い期間に亘って出血するであろうことが、一般的に認められている。中程度の疾病を有するヒトが自然に頻繁には出血しないことは一般的に認められている。正常に対して１％〜５％のＦＩＸ活性は、一般的に中程度の血友病Ｂに関係しており、中程度の血友病Ｂを有するヒト被検体は、仮にあっても、外科手術又は大きい外傷の結果としてだけ、過度に出血する。一般的に、軽度の血友病は、正常に対して６％〜４０％のＦＩＸ活性と関係している。一般的に、血友病Ｂの症状を有しない、健康であると考えられる個体は、正常に対して約５０％から１５０％の範囲のＦＩＸ活性を有する。さらなる情報は、Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔら、Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，  Ｂｒ．  Ｍｅｄ．  Ｊ．，  ３４４：３６−４０  （２０１２）で見ることができる。
【０１７１】
第ＩＸ因子活性は、当業者に知られている様々な方法で測定することができる。例えば、１つの典型的な非限定的分析は、被検体から得られた血漿サンプル中のＦＩＸ凝固活性を測定するための、一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  ｔｉｍｅ、ＡＰＴＴ）分析である。ＦＩＸ活性は、多くの場合、国際単位（ＩＵ）で表される。１ＩＵは、正常なドナーから得た１ｍｌのプール血漿中に存在するＦＩＸ凝固活性として定義される。この慣例を用いると、重度の血友病Ｂは、０．０１  ＩＵ／ｍｌ未満のＦＩＸレベルに関係しており、中程度の病気は、０．０２〜０．０５  ＩＵ／ｍｌのＦＩＸレベルに関係しており、軽度の病気は、０．０６−０．４０  ＩＵ／ｍｌのＦＩＸレベルに関係しており、また、病気がないことは、０．５０−１．５０  ＩＵ／ｍｌのＦＩＸレベルに関係している。
【０１７２】
当業者によって理解されるように、天然に生じるＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体のような第ＩＸ因子変異体であって、野生型ヒトＦＩＸと比較してより高い触媒活性を有するものは、「非Ｐａｄｕａ」ＦＩＸと比較して、より低い濃度の活性タンパクでＦＩＸ活性の所定のレベル（例えば、１  ＩＵ／ｍｌ）を作ることができる。
【０１７３】
ある実施形態において、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のゲノム配列とを有するものを含む）の治療的有効量は、重度の、中程度の、又は、軽度の血友病Ｂを有する被検体（例えば、ヒト）に投与された場合に、正常なＦＩＸ活性の概ね、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは、５０％、又は、それ以上の血漿ＦＩＸ活性を達成するのに充分な量である。他の実施形態において、治療的有効量は、他の点でそのような活性を欠いている被検体において１％又はそれ以上（例えば、被検体のＦＩＸ活性の１．５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％以上）のＦＩＸ活性を達成する量である。
【０１７４】
血友病Ｂを有する被検体の治療に関して、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のゲノム配列とを有するものを含む）の治療的有効量は、希望の治療効果を達成するために、被検体の重量の１キログラム当たり少なくとも１×１０10ベクターゲノム（ｖｇ）（ｖｇ／ｋｇ）、又は、被検体の重量の概ね１×１０10〜１×１０11ｖｇ／ｋｇ若しくは被検体の重量の概ね１×１０11〜１×１０12ｖｇ／ｋｇ（例えば、概ね１×１０11〜２×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね２×１０11〜３×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね３×１０11〜４×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね４×１０11〜５×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね５×１０11〜６×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね６×１０11〜７×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね７×１０11〜８×１０11ｖｇ／ｋｇ、概ね８×１０11〜９×１０11ｖｇ／ｋｇ、又は、概ね９×１０11〜１×１０12ｖｇ／ｋｇ）、又は、被検体の体重の概ね１×１０12〜１×１０13ｖｇ／ｋｇであってもよい。さらなる用量は、希望の治療効果を達成するために、被検体の重量１キログラム（ｖｇ／ｋｇ）当たり概ね５×１０10〜１×１０10のベクターゲノム（ｖｇ）の範囲内、又は、被検体の重量１キログラム当たり概ね１×１０10〜５×１０11ｖｇ／ｋｇの範囲内、又は、被検体の重量１キログラム当たり概ね５×１０11〜１×１０12ｖｇ／ｋｇの範囲内、又は、被検体の重量１キログラム当たり概ね１×１０12〜５×１０13ｖｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、概ね、２．０×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．１×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．２×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．３×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．４×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．６×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．７×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．８×１０11ｖｇ／ｋｇ、２．９×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．０×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．１×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．２×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．３×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．４×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．６×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．７×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．８×１０11ｖｇ／ｋｇ、３．９×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．０×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．１×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．２×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．３×１０11ｖｇ／ｋｇ  ４．４×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．５×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．６×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．７×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．８×１０11ｖｇ／ｋｇ、４．９×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．１×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．２×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．３×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．４×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．５×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．６×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．７×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．８×１０11ｖｇ／ｋｇ、５．９×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．０×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．１×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．２×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．３×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．４×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．５×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．６×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．７×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．８×１０11ｖｇ／ｋｇ、６．９×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．０×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．１×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．２×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．３×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．４×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．５×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．６×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．７×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．８×１０11ｖｇ／ｋｇ、７．９×１０11ｖｇ／ｋｇ、若しくは、８．０×１０11ｖｇ／ｋｇ又は他の用量である。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中に単独で被検体に投与されてもよいし、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共に、ベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１又は他の比率として被検体に投与されてもよい。
【０１７５】
病気の進行又は悪化を減少、低減、阻害、抑制、限定又は制御することが満足な結果ではあるが、治療のための（例えば、緩和するための、又は、治療的利益若しくは改善を提供するための）「有効な量」又は「充分な量」の用量は、典型的には、１つ、複数又はすべての病気の不都合な症状、結果又は合併症、例えば、病気によって引き起こされる又はその病気に関連する１つ以上の不都合な症状、疾患、病気、病理又は合併症に対する反応を測定可能な程度で提供するために有効である。
【０１７６】
有効な量又は充分な量は、１回の投与で提供されてもよいが、提供する必要はなく、複数回の投与を必要としてもよく、また、単独で、又は、他の組成物（例えば、薬剤）、治療、プロトコル若しくは治療計画と組み合わせて投与されてもよいが、必ずしもそうする必要はない。例えば、その量は、被検体の必要性、治療される疾病又は（もしあれば）治療の副作用の種類、状態及び重症度によって示されるのにつれて比例して増加してもよい。さらに、所定の被検体において有効若しくは充分であると考えられるために、そのような用量より多い上回るさらなる用量、量若しくは投与期間、又は、さらなる組成（例えば、医薬品又は作用物質）、治療、プロトコル若しくは治療計画が含まれてもよいので、有効な量又は充分な量は、もし第２の組成（例えば、他の薬剤又は作用物質）、治療、プロトコル又は治療計画を伴わずに１回の投与又は複数回の投与で与えられたときに有効である必要はない。また、有効であると考えられる量は、凝固障害（例えば、血友病Ａ又は血友病Ｂ）の治療のための組み換え凝固因子タンパクの投与のような、他の治療、治療計画又はプロトコルの使用の低減をもたらす量を含む。
【０１７７】
有効な量又は充分な量は、治療されるすべてのあらゆる被検体において有効である必要はなく、また、所定のグループ又は集団の治療される被検体の大多数において有効である必要もない。有効な量又は充分な量は、グループ又は一般人口ではなく、特定の被検体における有効性又は充分さを意味する。そのような方法には典型的であるように、与えられる治療の方法又は使用に対して、より大きい反応を示す被検体もあれば、より少ない反応を示すか又は反応を示さない被検体もある。
【０１７８】
「緩和する」との用語は、被検体の疾病又はその症状における検出可能な又は測定可能な改善、又は、根底にある細胞反応を意味する。検出可能な又は測定可能な改善は、病気の発生、頻度、重症度、進行若しくは継続期間における主観的若しくは客観的な減少、低下、阻害、抑制、限定若しくは制御、又は、その病気によって引き起こされる若しくはその病気に関連する合併症、又は、その病気の症状、根底にある原因若しくは結果における改善、又は、その病気の回復を含む。
【０１７９】
従って、成功した治療的成果は、被検体において、病気、又は、その病気の１つ以上の不都合な症状若しくは根本的原因若しくは結果の発生、頻度、重症度、進行若しくは持続期間を減少、低減、阻害、抑制、限定、制御又は予防することの「治療的効果」又は「利益」に結びつくことができる。従って、病気の根本原因又は不都合な症状の１つ以上に作用する治療の方法及び使用は、有益であると考えられる。また、病気を安定化すること等のような、悪化における又はその不都合な症状における減少又は低減は、成功した治療的成果である。
【０１８０】
従って、治療的な利益又は改善は、その病気の、又は、その病気と関連する不都合な症状、合併症、結果若しくは根本原因のいずれか１つ、大部分若しくはすべての、完全な除去である必要はない。従って、被検体の病気における漸進的な改善、又は、病気の発生、頻度、重症度、進行若しくは継続期間における部分的な減少、低減、阻害、抑制、限定、制御若しくは予防、又は、病気の阻害若しくは回復（例えば、１つ以上の症状又は合併症を安定化すること）が、短期間又は長期間（数時間、数日、数週、数か月等）に亘って存在するときに、満足な終了点が達成される。潜在的な治療的利益又は病気の改善を提供する治療等のような方法又は使用の有効性は、凝血形成時間等のような様々な方法によって確認することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、血友病Ｂを有するヒト被検体に投与された場合、一定時間に亘ってあるレベル以上のＦＩＸ活性をもたらすのに充分な量である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年又はそれ以上の持続時間に亘って、血友病Ｂを有するヒト被検体の少なくとも１％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも５％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも１０％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも１５％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも２０％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも２５％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも３０％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも３５％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも４０％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。他の実施形態において、ＡＡＶベクターの有効量は、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月若しくは１７か月、又は、少なくとも１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、５．５年、６年、６．５年、７年、７．５年、８年、８．５年、９年、９．５年、１０年若しくはそれ以上の持続時間に亘って少なくとも４５％の正常なＦＩＸ活性をもたらす。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成中に単独で被検体に投与されてもよいし、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共に、ベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として被検体に投与されてもよい。
【０１８２】
他の実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、重症の又は中程度の血友病Ｂを有するヒト被検体に投与された場合、正常に対して少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％又は４５％であるＦＩＸ活性を少なくとも６か月の持続時間に亘ってもたらすのに充分な量である。いくつかの実施例において、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものの用量は、約５．０×１０11ｖｇ／ｋｇであり、薬学的に許容できる組成中に単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共に、ベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、投与されてもよい。
【０１８３】
治療的有用量のＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものを含む）を摂取したいくつかのヒト被検体においては、ベクターに起因するＦＩＸ活性が、長い期間（例えば、数か月又は数年）の間に、もはや充分であると考えられないレベルに低下することが理解されるであろう（例えば、被検体は、中程度の又は重度の血友病Ｂの症状及び／又はＦＩＸ活性特性を示す。）そのような状況では、最初の治療と同じタイプのＡＡＶベクターを再び被検体に投薬することができる。他の実施形態においては、特に、被検体が最初のベクターに対して免疫反応を発達させた場合には、標的細胞においてＦＩＸを発現するが、最初のＡＡＶベクターと比較して免疫反応性が小さい、異なる又は変異体の血清型のキャプシドを有するように設計されたＡＡＶベクターをその患者に与えることができる。
【０１８４】
ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、血友病Ｂを有するヒト被検体に投与された場合、適切な止血を維持するための、被検体の組み換えのヒト第ＩＸ因子置換療法の必要性を低減又は除去するのに充分な量である。従って、いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、適切な止血を維持するために、中程度の又は重度の血友病Ｂを有する平均的なヒト被検体がＦＩＸ置換療法を必要とする頻度を、概ね、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減することができる。関連する実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、適切な止血を維持するために中程度の又は重度の血友病Ｂの有する平均的なヒト被検体が必要とする組み換えヒト第ＩＸ因子の用量を、概ね、５％１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％減らすことができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０１８５】
他の実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、重度の血友病Ｂを有するヒト被検体に投与された場合、関節中への自然出血を軽減する又はなくすのに充分な量である。従って、いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、重度の血友病Ｂを有するヒト被検体の関節中への自然出血の頻度を、重度の血友病Ｂを有する治療されていない平均的なヒト被検体と比較して、概ね、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減することができる。関節中への出血は、関節の磁気共鳴画像若しくは超音波検査、又は、当業者によく知られている他の技術を用いて検出することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０１８６】
血友病を治療するためのＡＡＶベクターを開発する先の努力は、成功したものではなく、少なくとも一部において、先の臨床試験においてＡＡＶキャプシドに対する頑強な免疫反応のせいであると考えられている（例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉら、ＮＥＪＭ  ２０１１；  ３６５（２５）：２３５７−２３６５；  及び、Ｍａｎｎｏら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６；  １２（３）：３４２−３４７参照）。進行中の臨床試験は、ＡＡＶベクターのある実施形態が、重度の血友病Ｂを有するヒト被検体において、ＡＡＶベクターを投与した６か月後（実施例５）にも免疫反応を生じさせないか又は最小限の免疫反応生じさせる一方で、高いレベルのＦＩＸ活性を作ることができることを実証した。従って、ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、重度の又は中程度の血友病Ｂを有する被検体に投与された場合に、意味のある期間に亘って、免疫反応を生じないか又は最小限の免疫反応を生じさせる一方で、止血を維持するのに適切なＦＩＸ活性をもたらす濃度である。ある実施形態において、免疫反応は、先天性免疫応答、体液性免疫反応、若しくは、細胞性免疫反応であってもよいし、又は、３つのタイプすべての免疫反応であってもよい。いくつかの実施形態において、免疫反応は、キャプシド、ベクターゲノム、及び／又は、形質導入細胞から生産される第ＩＸ因子タンパクを対象とするものであってもよい。
【０１８７】
ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、キャプシド、ゲノム及び／又は形質導入細胞から生産された第ＩＸ因子タンパクに対して免疫反応を生じないか又は最小限の免疫反応（つまり、抗体）を生じさせる一方で、血友病Ｂを有する被検体において止血を維持するのに適切なＦＩＸ活性をもたらす。ウイルス、又はＡＡＶベクターのようなウイルス様粒子に対する抗体応答は、被検体の漿液又は血漿中の抗体価を測定することによって、又は、免疫学の当業者によく知られている技術を用いて、測定することができる。キャプシドタンパクのようなＡＡＶベクターの任意の構成要素、又は、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ（若しくは他のＦＩＸ変異体）のようなベクターゲノムによってコードされる遺伝子産物及び形質導入細胞において生産される遺伝子産物に対する抗体価は、そのような技術を使用して測定することができる。抗体価は、典型的には、抗体の存在を検出するために使用されている特定の分析においてもはやその抗体シグナルを検知できなくなる前の希釈倍率を示す比率として表される。例えば、２倍、５倍、１０倍又は他のある希釈比のような、異なる希釈比を使用することができる。例えば、ＷＯ２０１５／００６７４３に記載されているようなＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又はレポーター遺伝子分析のような、抗体の存在に関するあらゆる適切な分析を用いることができるが、限定されるものではない。さらに、当業者の知識に従って、他の分析を使用することもできる。抗体価は、ＡＡＶベクターの最初投与後に異なる回数で測定することができる。
【０１８８】
ある実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、被検体がＡＡＶベクターを投与されてから１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、３か月後、４か月後、５か月後、６か月後、７か月後、８か月後、９か月後、１０か月後、１１か月後、１２か月後、１８か月後、２年後、３年後、４年後、５年後又はより長い期間の後に測定した場合に、キャプシド、ゲノム及び／又は形質導入細胞から生産される第ＩＸ因子タンパク（ＦＩＸパドヴァ等）に対して作る抗体価が１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００又はそれ以上である一方で、血友病Ｂを有する被検体において少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又はそれ以上のＦＩＸ活性をもたらす。典型的な非限定的一実施形態によれば、ＡＡＶベクターは、いずれもＡＡＶベクターが投与された時から６か月後に、キャプシド及び／又は形質導入細胞によって生産される第ＩＸ因子に対する抗体価を１：２、１：３又は１：４以下であるように誘導する一方で、重度の血友病Ｂを有する被検体において少なくとも２０％のＦＩＸ活性をもたらす。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０１８９】
上述したように、血友病Ｂのための、ＡＡＶを介した遺伝子治療を用いた先の試みは、免疫抑制を引き起こす高容量のステロイドの必要性がなく、意味のある期間に亘って自己制限的免疫反応がその治療を有効でないものとすることを防いだ。重要な要因は、研究下のＡＡＶベクターにより遺伝子導入された肝細胞を除去した細胞免疫反応であったと考えられる。この結果は、肝損傷を示唆する肝酵素の上昇、及び、被検体中のキャプシド特異的Ｔ細胞の存在の両方から検出することができた。
【０１９０】
ある実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、キャプシド及び／又は形質導入細胞から生産される第ＩＸ因子タンパクに対して細胞免疫反応を生じさせないか又は最小限の細胞免疫反応を生じさせる一方で、血友病Ｂを有する被検体において止血を維持するのに適切なＦＩＸ活性をもたらす。細胞免疫反応は、キャプシドタンパク若しくは第ＩＸ因子に対して特異的なＴ細胞活性に関する分析、及び、肝細胞に対するダメージを示す上昇した肝酵素値の存在に関する試験の少なくとも２つの方法で決定することができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、細胞免疫反応は、キャプシドタンパク及び／又は遺伝子導入された肝細胞によって生産される第ＩＸ因子タンパクに対して特異的なＴ細胞活性について分析することによって決定される。Ｔ細胞反応のための異なるいくつかの分析が当業界で知られている。典型的な非限定的一実施形態において、Ｔ細胞反応は、血友病Ｂの治療のためにＡＡＶベクターによって以前に治療された被検体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収することによって決定される。その後、その細胞は、ベクター中に使用されたＶＰ１キャプシドタンパクに由来するペプチド、及び／又は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのような遺伝子導入された肝細胞によって生産された第ＩＸ因子タンパクと共にインキュベートされる。キャプシドタンパク又は第ＩＸ因子タンパクを特異的に認識するＴ細胞は、刺激されてインターフェロンγ又は他のサイトカイン等のようなサイトカインを放出し、その後、それは、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を使用して又は当業者によく知られている他の分析を使用して検出及び定量することができる（例えば、Ｍａｎｎｏら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６；  １２（３）：３４２−３４７を参照されたい。）。血友病Ｂを治療するためのＡＡＶベクターの用量を被検体が摂取する前、及び、摂取した後に異なる時点で、例えば、週１回、月１回又はその他の間隔で、Ｔ細胞反応を監視することができる。従って、ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、毎週、毎月、若しくは、他の間隔で、又は、ＡＡＶベクターの投与後から２週間後、１か月後、２か月後、３か月後、６か月後、９か月後、１年後、２年後若しくは他の期間の後に測定した場合に、分析した１００万個のＰＢＭＣ当たりに、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００又はそれ以上を超えないスポット・フォーミング・ユニットである、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して測定されるＴ細胞反応を生じさせる一方で、血友病Ｂを有する被検体において止血を維持するのに適切なＦＩＸ活性（例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％又はそれ以上のＦＩＸ活性）をもたらす。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、ＡＡＶベクター・キャプシドタンパクに由来するペプチドによって促進されたインターフェロンγ（又は他のサイトカイン）生産、及び、遺伝子導入された肝細胞によって生産される第ＩＸ因子タンパク（ＦＩＸＰａｄｕａ又は異なる変異体を含む）を検出するように設計されている。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０１９２】
遺伝子導入された肝細胞に対する細胞免疫反応用の代用物として、標準的方法を使用して、正常より大きい肝臓酵素の存在を分析することができる。理論に拘束されることを意図するものではないが、先の臨床試験において使用されたもののような、特定のＡＡＶベクターに対して特異的なＴ細胞は、遺伝子導入された肝細胞を攻撃して殺すことができ、循環中へ肝臓酵素一時的に放出させる。典型的な肝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含むが、肝臓ダメージを示す他の酵素をモニターすることもできる。循環におけるこれらの酵素の正常値は、典型的には、それを超えて酵素レベルが上昇し、それによって肝臓ダメージを示すと考えられる値を有する範囲として定義される。正常な範囲は、一部分において、分析を行う臨床研究室によって使用される基準に依存する。ある実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、上昇したレベルの循環肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ又はＬＤＨ等）を生じさせる一方で、血友病Ｂを有する被検体中において止血を維持するのに適切なＦＩＸ活性（例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％又はそれより高いＦＩＸ活性）をもたらし、該上昇したレベルの循環肝臓酵素は、平均で、各範囲の正常な値の上限（ＵＬＮ）の０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、２０００％以下であるか、又は、ＡＡＶベクター投与後の異なる時点（例えば、毎週又は毎月の間隔）の治療下の同じ被検体から抽出した複数のサンプルにおいて測定される最高レベルの０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、２０００％以下である。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０１９３】
血友病Ｂを治療するためにＡＡＶベクターを使用した先の臨床試験において、調査者は、治療を受ける被検体が、第ＩＸ因子タンパクを生産する遺伝子導入細胞を除去する免疫反応を開始するのを防ぐために、ステロイド等のような免疫抑制剤を併用投与する必要があった。しかしながら、特定のＡＡＶベクターを用いた試験的治療を受けた被検体で見られた低減された免疫反応により、免疫抑制剤の併用投与は必要ではないかもしれない。従って、特定の実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、（ステロイド又は他の免疫抑制薬等のような）免疫抑制剤の併用投与（前に、同時に、又は、後に）の必要がなく、重度の又は中程度の血友病Ｂを有する被検体において適切な止血を維持するのに充分な量である。しかしながら、すべての被検体において免疫反応が予測可能ではないので、血友病Ｂのための治療の本発明における方法は、免疫抑制剤と共に併用投与されるＡＡＶベクターを含む。ＡＡＶベクターが血友病Ｂを有する被検体に投与される前に、投与と同時に、又は、投与の後に、免疫抑制剤の併用投与が存在してもよい。いくつかの実施例において、免疫抑制剤は、血友病Ｂを治療するためにＡＡＶベクターを投与された後に、数日、数週間又は数か月の期間に亘って被検体に投与される。典型的な免疫抑制剤は、ステロイド（例えば、限定されるものではないが、プレドニゾン又はプレドニゾロン）、及び、シクロスポリン、ラパマイシン等の非ステロイド免疫抑制剤を含む。いかなる薬剤用量及び治療時間が充分な免疫抑制を達成するのに必要とされるかは、治療を受ける各被検体に特有な要因に依存するが、用量及び治療時間は当業者の技術の範囲内であろう。いくつかの実施例において、免疫抑制薬は、１回以上投与される必要があるかもしれない。
【０１９４】
ある実施形態によれば、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、重度の又は中程度の血友病Ｂを有するヒト被検体の集団に投与された場合に、ＦＩＸ活性の一貫した上昇をもたらす。一貫性は、平均及び標準偏差（ＳＤ）又は当業者によく知られている他の統計的手法のような統計的手法を使用してヒト被検体の集団における反応の変動を計算することにより決定することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、重度の又は中程度の血友病Ｂを有するヒト被検体の集団に投与された場合に、投与後３か月、６か月、９か月、１２か月、１５か月、１８か月、２１か月又は２１か月において、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で１％〜５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で２．５％〜７．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で５％〜１０％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で７．５％〜１２．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で１０％〜１５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で１２．５％〜１７．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で１５％〜２０％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で１７．５％〜２２．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で２０％〜２５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で２２．５％〜２７．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で２５％〜３０％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で２７．５％〜３２．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で３０％〜３５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で３２．５％〜３７．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で３５％〜４０％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で３７．５％〜４２．５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で４０％〜４５％の平均ＦＩＸ活性；１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で４２．５％〜４７．５％の平均ＦＩＸ活性；又は、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満又は１未満の標準偏差で４５％〜５０％の平均ＦＩＸ活性をもたらす。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０１９５】
本発明の方法及び使用は、望まれる治療的な、有益な、付加的な、相乗的な又は相補的な活性又は効力を有する任意の化合物、作用物質、薬剤、治療又は他の治療計画若しくはプロトコルと組み合わされてもよい。典型的な組み合わせの組成及び治療は、生物製剤（タンパク）、作用物質及び医薬品等のような第２の活性成分を含む。そのような生物製剤（タンパク）、作用物質、医薬品、治療及び療法は、任意の他の方法又は本発明の使用（例えば、血液凝固疾病について被検体を治療する治療方法）に先立って、それと実質的に同時に、又は、その後に投与又は実行することができる。
【０１９６】
化合物、作用物質、薬、治療又は他の治療計画若しくは治療プロトコルは、組み合わせ組成として投与されてもよいし、又は、核酸、ベクター、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム若しくは組み替えウイルス粒子の送達若しくは投与（に先立って、又は、の後で）と同時に若しくは順番に若しくは連続して別々に投与することができる。従って、本発明は、本発明の方法か使用が、本明細書に記載されている又は当業者に知られている任意の化合物、作用物質、薬剤、治療計画、治療プロトコル、プロセス、治療薬又は組成物と組み合わされた組み合わせを提供する。その化合物、作用物質、薬剤、治療計画、治療プロトコル、プロセス、治療薬又は組成物は、被検体に対する本発明の核酸、ベクター、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム又は組み替えウイルス粒子の投与に先立って、該投与と実質的に同時に、又は、該投与の後で、投与又は実行することができる。
【０１９７】
ある実施形態において、１つの組み合わせ組成は、１つ以上の免疫抑制剤を含む。ある実施形態において、１つの方法は、哺乳動物に対して１つ以上の免疫抑制剤を投与するか又は届けることを含む。ある実施形態において、１つの組み合わせ組成物は、ＡＡＶ−ＦＩＸ粒子と１つ以上の免疫抑制剤を含む。ある実施形態において、１つの方法は、哺乳動物に対してＡＡＶ−ＦＩＸ粒子を投与又は届けること、及び、哺乳動物に対して免疫抑制剤を投与すること含む。当業者は、１つ以上の免疫抑制物質を有するそのような組み合わせ組成、及び、哺乳動物に対して免疫抑制剤を投与することの適切な必要性又はタイミングを決定することができる。
【０１９８】
また、本発明の方法及び使用は、特に、他の化合物、作用物質、薬剤、治療計画、治療プロトコル、プロセス又は治療薬の必要性又は使用を減らす方法及び使用を含む。例えば、血液凝固疾病について、本発明の方法又は使用は、所定の被検体において、被検体中の不充分な又は不完全な（異常な又は変異な）内因性凝固因子を補完するための、組み換え凝固因子タンパクの投与のより少ない頻度の又は低減した用量又は廃止を有する場合、治療的利益を有する。従って、本発明に従って、他の治療又は療法の必要性又は使用を減らす方法及び使用が提供される。
【０１９９】
本発明は、ヒト及び動物の医学的応用を含む動物において有用である。従って、適切な被検体は、ヒト等の哺乳動物、及び、ヒト以外の哺乳動物を含む。「被検体」との用語は、動物を表し、典型的には、ヒト等の哺乳動物、ヒト以外の霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家庭動物（イヌ及びネコ）、家畜動物（ニワトリ及びカモ等の飼鳥類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）、及び、実験動物（マウス、ラット、ラビット、モルモット）を表す。ヒト被検体は、胎児、新生児、幼児、若年者、及び、成人の被検体を含む。被検体は、動物の疾病モデル（例えば、血液凝固疾病のマウス及び他の動物モデル、並びに、当業者に知られている他の動物モデル）を含む。
【０２００】
治療するのに適切な被検体は、機能する遺伝子生成物（タンパク）の生産量が不充分であるか若しくは欠損している若しくはそのようなリスクのある者、又は、異常な、部分的にしか機能しない若しくは機能しない遺伝子産物（タンパク）であって、病気に至り得るものを生産する者を含む。本発明に従った治療に適切な被検体は、病気に結びつく異常な又は不完全な（変異体の）遺伝子産物（タンパク）を有するか又は作るリスクがあり、その異常な又は不完全な（変異体の）遺伝子産物（タンパク）の量、発現又は機能を減少させることが、その病気の治療に結びつくか又は１つ以上の症状を低減するか若しくはその病気を緩和することになる者をさらに含む。従って、ターゲット被検体は、血友病患者（例えば、血友病Ｂ）等のような、異常な若しくは不充分な血液凝固因子を作り、又は、血液凝固因子を作らない被検体を含む。
【０２０１】
本発明に従った治療のために適切な被検体は、補助タンパク（例えば、血友病を治療するためのＦＩＸ等のような組み換え血液凝固因子）で以前に又は現在治療されている者をさらに含む。本発明に従った治療に適切な被検体は、ＦＩＸタンパクに対して本質的な若しくは検出可能な免疫反応を発達させていない、又は、ＦＩＸをベースとした遺伝子治療を妨害若しくは阻害する抗ＦＩＸタンパクの阻害抗体の量を発達させていない者をさらに含む。
【０２０２】
他の実施形態において、（例えば、遺伝子型決定によって）血友病Ｂを有すると決定されたが、まだ血友病Ｂの症状のいずれをも示していない小児のヒト被験体は、最初の段階でいかなるそのような症状が生じることを防ぐために、又は、他の実施形態においては、治療しない状態であればそうでなると考えられるのと同じくらい重度になることを防ぐために、ＡＡＶベクターによって予防的に治療することができる。いくつかの実施例において、このように予防的に治療されるヒト被検体は、止血を維持し、ひいては、血友病Ｂの１つ以上の症状の重症度を防止又は低減するのに適切なＦＩＸ活性を生産及び維持するためにＡＡＶベクターが投与される場合、少なくとも３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月又はそれ以上の年齢である。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ、又は、それと同じキャプシドと、それに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のゲノム配列とを有するものであってもよく、薬学的に許容できる組成物中で単独で、又は、同じキャプシド種の空キャプシドと共にベクターに対する空キャプシドの比率を概ね２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１若しくは他の比率として、被検体に投与されてもよい。
【０２０３】
被検体に対する投与又はインビボ送達は、その病気によって引き起こされる又はその病気に関連する不都合な症状、病状、合併症等の発生に先立って行われてもよい。例えば、選抜（例えば、遺伝子的）は、そのような被検体を、本発明の組成、方法及び用途のための候補と確認するために使用されてもよい。従って、そのような被検体は、機能する遺伝子生成物（タンパク）の量が不充分であるか若しくは欠損していること、又は、異常な、部分的にしか機能しない若しくは機能しない遺伝子産物（タンパク）の生産についてポジティブであると選抜された者を含む。
【０２０４】
本発明の方法及び用途は、全身的な、局所的な若しくは部分的な、又は、任意の経路（例えば、注射又は注入による）の送達及び投与を含む。そのような送達及び投与は、非経口、例えば、血管内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、又は口腔粘膜内の送達及び投与を含む。典型的な投与及び送達の経路は、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、皮下、胸膜腔内、挿管、肺内、腔内、イオン導入、臓器内、リンパ管内への投与及び送達を含む。
【０２０５】
代替的に又は付加的に、ＡＡＶベクターは、門脈を経由して肝臓に届けられてもよい。他の選択肢において、肝動脈経由で肝臓にＡＡＶベクターを届けるために、大腿動脈中に導入されたカテーテルを使用することができる。肝臓にＡＡＶベクターを直接届けるために、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）等のような外科以外の手段を使用することもでき、それによって血流及びＡＡＶ中和抗体を回避することができる。抗ＡＡＶ抗体を発達させる又は先在する抗ＡＡＶ抗体を有する被検体中にＡＡＶベクターを届けるために入り口として、顎下腺の管等のような他の送管システムを使用することもできる。
【０２０６】
用量は、変わってもよく、その治療が対象としている病気の種類、発病、進行、重症度、頻度、持続期間若しくは見込み、望まれる臨床的終了点、以前の若しくは同時に行う治療、被検体の健康状態、年齢、性別、人種若しくは免疫適格性、並びに、当業者によって理解される要因に依存してもよい。治療又は療法の任意の不都合な副作用、合併症又は他の危険因子、並びに、被検体の状態によって示されるのに釣り合うように、用量、数、頻度又は継続期間を増加又は減少させることができる。当業者は、治療的な又は予防的な利益を提供するのに充分な量を提供するために必要となる用量及びタイミングに影響する可能性がある要因を理解するであろう。
【０２０７】
本発明の方法及び使用は、本明細書に記載されているように、被験者が、その治療が対象としている病気を有することが確認されたか、その病気の１つ以上の症状を有しているか、又は、その被験者がその病気の１つ以上の症状を有していないが、本明細書に記載されているように陽性であると選抜されて確認された後、１〜２時間、２〜４時間、４〜１２時間、１２〜２４時間又は２４〜７２時間以内に実行することができる。もちろん、本発明の方法及び使用は、被験者が、その治療が対象としている病気を有することが確認されたか、その病気の１つ以上の症状を有しているか、又は、その被験者がその病気の１つ以上の症状を有していないが、本明細書に記載されているように陽性であると選抜されて確認された後、１〜７日、７〜１４日、１４〜２１日、２１〜４８日、若しくは、それ以上の日数、数ヶ月、又は、数年の期間内に実行することができる。
【０２０８】
本発明の核酸、ベクター、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム及び組み替えウイルス粒子、並びに、他の組成物、作用物質、医薬品、生物製剤（タンパク）は、医薬的組成（例えば、薬学的に許容できる担体、賦形剤）の中に組み込まれてもよい。そのような医薬組成は、特に、被検体に対するインビボ又はエクスビボでの投与及び送達のために有用である。
【０２０９】
本明細書で使用されているように、「薬学的に許容できる」との用語及び「生理的に許容できる」との用語は、気体、液体若しくは固体又はそれらの混合物の、生物学的に許容できる製剤形態であり、その製剤形態が、インビボでの送達又は接触の１本以上の投与経路に適していることを意味する。「薬学的に許容できる」又は「生理的に許容できる」組成は、生物学的に又は他の点において望ましくないものではない材料であり、例えば、その材料は、望ましくない生物学的作用を本質的に引き起こさずに、被検体に投与できる。従って、そのような医薬組成は、例えば、被検体にウイルスベクター又はウイルス粒子を投与することにおいて使用されてもよい。
【０２１０】
そのような組成は、医薬投与又はインビボでの接触若しくは送達と適合する、溶剤（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、乳剤（例えば、水中油又は油中水）、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、分散液及び懸濁液、コーティング、等張剤、並びに、吸収促進剤及び吸収遅延剤を含む。水性溶剤及び非水性溶剤、溶液並びに懸濁液は、懸濁化剤と増粘剤を含んでいてもよい。そのような薬学的に許容できる担体は、錠剤（コーティングされた又はコーティングされていない）、カプセル剤（堅い又は軟らかい）、マイクロビーズ、パウダー、果粒剤及び結晶を含む。補助活性化合物（例えば、保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、及び、抗真菌剤）を組成中に組み込むこともできる
【０２１１】
医薬組成は、本明細書に記載されているように又は当業者に知られているように、特定の投与経路又は送達に適合するように調剤されてもよい。従って、医薬組成は、様々なルートによる投与に適した担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
【０２１２】
非経口適用に適した組成物は、活性化合物の水性溶液、非水性溶液、懸濁液又は乳濁液を含み、その調合薬は、典型的には無菌であり、意図されているレシピエントの血液と等張であってもよい。非限定的な説明に役立つ例は、水、食塩水、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、野菜油、又は、合成油を含む。
【０２１３】
共溶媒及び補助薬が剤形態に加えられてもよい。共溶媒の非限定的な例は、例えば、イソプロピルアルコール等のようなアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル等のようなグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルのように、水酸基又は他の極性基を含む。
補助薬は、例えば、大豆レシチン及びオレイン酸等のような界面活性剤；ソルビタントリオレエート等のようなソルビタンエステル；及び、ポリビニルピロリドンを含む。
【０２１４】
本発明の組成物、方法及び用途に適切な医薬組成及び送達システムは、当業界において知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２００３）  ２０th  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０）  １８th  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  （１９９６）  １２th  ｅｄ．，  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，  ＮＪ；  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  （１９９３），  Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ｐａ．；  Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｌｏｓａ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  （２００１）  １１th  ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ；  及び、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９８０），  Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｌｉａｎｏ，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．  ２５３−３１５を参照されたい。）。
【０２１５】
本明細書で使用されているように、「ユニット投薬形態」という用語は、治療される被検体のための単一量として適した物理的に分離した単位を表す。各単位は、任意に薬剤担体（賦形剤、希釈剤、媒体又は充満剤）を伴って、１又はそれ以上の用量で投与された場合に、所望の効果（例えば、予防的効果又は治療的効果）を生じさせると計算される所定の量を含む。単位用量形態は、例えば、アンプル及びバイアル中に存在していてもよい。単位用量形態は、液状組成物を含んでいてもよいし、又は、フリーズドライ又は凍結乾燥された状態の組成物を含んでいてもよい。例えば、インビボでの投与又は送達に先立って無菌の液状担体が加えられてもよい。個別の単位量形態は、複数用量キット又は包装容器中に含められてもよい。組み換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列、組み替えウイルス粒子、及び、それらの医薬組成物は、投与のしやすさ及び容量の均一性のために、単一の単位用量又は複数の単位用量でパッケージされてもよい。
【０２１６】
本発明は、パッケージング材及びその中の１つ以上の成分を有するキットを提供する。キットは、典型的には、成分の説明又は成分のインビトロ、インビボ、エスクビボでの使用説明書を含む、ラベル又はパッケージング挿入物を含む。キットは、例えば、核酸、組換え型のベクター、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター又はウイルス粒子等のそのような成分の集合物と、任意に、他の化合物、作用物質、薬剤又は組成物等のような第２の活性成分を含んでいてもよい。
【０２１７】
キットは、当該キットの１つ以上の成分を収容する物理構造を表す。パッケージング材は、その成分を無菌的に維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料からなるものであってもよい（例えば、紙、波形のファイバー、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブ等）。
【０２１８】
ラベル又は挿入物は、１つ以上の成分、用量、（作用機序、薬物動態学及び薬動力学を含む）有効成分の臨床薬理学を特定する情報を含んでいてもよい。ラベル又は挿入物は、製造業者、ロット番号、製造業者の居所及び日付、使用期限を特定する情報を含んでいてもよい。ラベル又は挿入物は、製造業者情報、ロット番号、製造業者の居所及び日付を特定する情報を含んでいてもよい。ラベル又は挿入物は、キットの成分を使用することができる疾病に関する情報を含んでいてもよい。ラベル又は挿入物は、方法、使用、又は、治療プロトコル若しくは治療規制の１つ以上においてキット成分を使用するための、臨床医又は被検体のための指示書を含んでいてもよい。指示書は、用量、頻度又は期間、及び、本明細書に記載されている、用途、治療プロトコル、又は、予防計画若しくは治療計画のいずれかを実行するための指示を含んでいてもよい。
【０２１９】
ラベル又は挿入物は、予防的利益又は治療的利益等のような、成分が提供することができるあらゆる利益に関する情報を含んでいてもよい。ラベル又は挿入物は、特定の組成物を使用することが適切でない状況に関する被検体又は臨床医に対する警告等のような、潜在的な不都合な副作用、合併症又は反応に関する情報を含んでいてもよい。被検体が、組成物と適合しない可能性がある１つ以上の他の薬物を有し、将来的に有し、若しくは、現在摂取している場合、又は、被検体が、組成物と適合しない他の治療プロトコル又は治療計画を有し、将来的に受け、若しくは、現在受けている場合、副作用又は合併症がさらに生じる可能性があり、従って、指示書は、そのような不適合性に関する情報を含んでいてもよい。
【０２２０】
ラベル又は挿入物は、「印刷物」、例えば、紙、厚紙であって、成分、キット若しくはパッケージ材料（例えば、箱）と分離した若しくは添付された、又は、キット成分を含むアンプル、チューブ若しくはバイアルに添付されたものを含む。ラベル又は挿入物は、バーコード付きのプリントされたラベル、ディスク、ＣＤ−若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ等の光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ、又は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等の電気的記憶媒体、又は、磁気／光記憶媒体、ＦＬＡＳＨメディア又はメモリ型カード等のハイブリッド、等のコンピュータ読取り可能なメディアをさらに含んでいてもよい。
【０２２１】
別段の定めがない限り、本明細書で使用されている技術的用語及び科学用語のすべては、この発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価の方法及び材料を本発明の実行又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料は本明細書に記載されている
【０２２２】
本明細書で引用されているすべての特許、特許出願、刊行物及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用並びにＡＴＣＣ引用は、参照することによってそれらの全体が組み込まれている。抵触する場合には、定義を含む明細書が規定する。
【０２２３】
本明細書に開示されているすべての特徴はあらゆる組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、等価、又は、類似の目的を果たす代替的特徴に置換されてもよい。従って、明示的に別段の記載が無い限り、開示されている特徴（例えば、核酸変異体、ベクタープラスミド、組換え型のベクター（例えばｒＡＡＶ）配列又は組み替え型のウイルス粒子）は、等価な又は同様の特徴の属の例である。
【０２２４】
本明細書で使用されているように、明示的に別段の定めがない限り、「１つの」（ａ）及び「その」（ｔｈｅ）という単数形は、複数の指示物を含む。従って、例えば、「核酸」（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）への言及は複数のそのような核酸を含む。「ベクター」（ａ  ｖｅｃｔｏｒ）への言及は複数のそのようなベクターを含む。「ウイルス」（ａ  ｖｉｒｕｓ）又は「粒子」（ａ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）への言及は複数のそのようなウイルス／粒子を含む。
【０２２５】
本明細書で使用されているように、明示的に別段の定めがない限り、数値又は数値範囲は、すべてそのような範囲内の整数と、範囲内の値又は整数の一部を含む。従って、説明のために、８０％又はそれ以上の同一性への言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等を含む。
【０２２６】
「より多い（より大きな）」又は「より少ない」を伴う整数への言及は、参照値より大きい任意の数又は参照値より小さい任意の数をそれぞれ含む。例えば、従って、「１００より小さい」への言及は、９９、９８、９７等、数１（１）に至る途中のすべての数を含む。また、「１０より小さい」は、９、８、７等、数１（１）に至る途中のすべての数を含む。
【０２２７】
本明細書で使用されているように、明示的に別段の定めがない限り、すべての数値又は範囲は、そのような範囲内の値及び整数の一部、並びに、そのような範囲内の整数の一部を含む。従って、説明のために、１−１０のような数値範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等、及び、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を含む。従って、１−５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、最大で５０まで、かつ、５０を含み、また、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等を含む。
【０２２８】
連続した範囲への言及は、その連続における異なる範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。従って、連続した範囲への言及を説明するために、例えば、１−１０、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７５、７５−１００、１００−１５０、１５０−２００、２００−２５０、２５０−３００、３００−４００、４００−５００、５００−７５０、７５０−８５０は、１−２０、１−３０、１−４０、１−５０、１−６０、１０−３０、１０−４０、１０−５０、１０−６０、１０−７０、１０−８０、２０−４０、２０−５０、２０−６０、２０−７０、２０−８０、２０−９０、５０−７５、５０−１００、５０−１５０、５０−２００、５０−２５０、１００−２００、１００−２５０、１００−３００、１００−３５０、１００−４００、１００−５００、１５０−２５０、１５０−３００、１５０−３５０、１５０−４００、１５０−４５０、１５０−５００等の範囲を含む。
【０２２９】
本発明は、多数の実施形態及び態様について記載するために、本明細書中において断定的な言葉を使用して一般的に開示されている。また、本発明は、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコル又は手続等の特定の主題が、全部又は一部分において除外された実施形態を特に含む。例えば、本発明のある実施形態又は態様において、材料及び／又は方法ステップが除外される。従って、本発明が含んでいないものという観点では、たとえ本発明が本明細書中に一般に表現されていなくても、本発明において明示的に除外されていない態様はそれにも拘わらず本明細書に開示されている。
【０２３０】
本発明の多くの実施形態が記載されている。しかし、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、様々な使用法及び状況に本発明を適応させるために、本発明に様々な変更及び修飾を加えることができる。従って、以下の実施例は、説明するように意図されており、いかなる態様においても特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
【０２３１】
従って、以下の実施例は、本発明の範囲を説明するが、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限しないように意図されている。
実施例１  ベクター設計／調製
【０２３２】
３３８Ｌ  Ｐａｄｕａ変異（Ｓｉｍｉｏｎｉ  Ｐら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９、３６１：１６７１）を有する高い特異的活性のヒト第ＩＸ因子タンパクをコードする新規な第ＩＸ因子核酸を設計した（「ＦＩＸ３９−Ｐａｄｕａ」、配列番号：１０、図１０）。ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａは、ＦＩＸコード配列及びイントロン配列の中のＣｐＧジヌクレオチドを完全に欠損している。比較試験のために、ＦＩＸ１９（Ｍｉｎｇｏｚｚｉら、Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１３）が調製され、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに起因するあらゆる潜在的な混乱させる結果を除外するために、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを含むように修飾された（「ＦＩＸ１９−Ｐａｄｕａ」、配列番号：１１、図１１）。
【０２３３】
プラスミド（「ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ＿ｈＡＡＴ−ＦＩＸ３９」、１１１２５塩基対、配列番号：１２、図１２Ａ）が合成され、そのプラスミドは、ＦＩＸ３９  Ｐａｄｕａ発現カセット及び表２に記載されている因子を含んでいた。ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ＿ｈＡＡＴ−ＦＩＸ３９のマップは図１３に示されている。
【表２】
2018522529.tif 000004
【０２３４】
ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａをコードする配列及びイントロンＡの配列は、配列番号：２５に記載されている（図１５）。また、ＦＩＸ１９ＰａｄｕａＣＤＳ及び同じ制御因子、同じアデノ随伴逆方向末端反復（ＩＴＲ）、並びに、ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ＿ｈＡＡＴＦＩＸ３９と同じ肝臓特異的ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーターを含むプラスミドも合成した。
【０２３５】
ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ（「ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ」）導入遺伝子及びＦＩＸ１９Ｐａｄｕａ（「ＡＡＶ−ＦＩＸ１９Ｐａｄｕａ」）導入遺伝子のために、トリプル・トランスフェクション・プロセス、及び、その後の二重塩化セシウム勾配遠心分離（Ａｙｕｓｏ  Ｅ，  Ｍｅｔら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１０、１７：５０３）を使用して、４−１キャプシド変異（配列番号：４）を有するＡＡＶベクターを調製した。標準物質として線状化したプラスミドを使用して、定量的ＰＣＲによって、ベクターを滴定した。実施例３に記載されている研究のために、尾静脈注入用として、マウス１匹当たり２００μＬの最終体積となるように、ＰＢＳ、５％ソルビトール、０．００１％のＦ６８によってベクターを希釈した。
実施例２  インビトロにおけるＡＡＶ変異体４−１の遺伝子導入
【０２３６】
細胞１個当たり５００から６２５００ベクターゲノムの範囲内の４つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）でルシフェラーゼを発現する４−１変異体キャプシド（配列番号：４）を用いて、カニクイザル及びヒトから得た初代肝細胞を形質導入した。遺伝子導入の７２時間後に、ルシフェラーゼ発現を分析した。図１６に示されているように、遺伝子導入されたヒト肝細胞の比率は、非ヒト霊長類の肝細胞と比較して、使用したＭＯＩに依存して、０．８〜１．５の範囲内であった。インビトロで生成されたこれらのデータは、カニクイザル及びヒトの被検体において凝固ＩＸ因子の発現を比較したとき、以前のインビボでの観察と一致しているようにみえる。
実施例３  効果研究
【０２３７】
マウスにおいて、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９ＰａｄｕａとＡＡＶ−ＦＩＸ１９Ｐａｄｕａの効果を比較評価するための研究を行った。５つのグループのマウスに、８〜１０週齢で、１×１０11ｖｇ／ｋｇ又は１×１０12ｖｇ／ｋｇのいずれかのＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ及びＡＡＶ−ＦＩＸ１９Ｐａｄｕａを注入した。ベクターの投与後に、ヘパリン処理されたキャピラリーチューブを使用して、眼窩後出血によって血液を回収した。血漿を４℃、１０分間の９０００ｒｐｍの遠心分離によって分離し、分析するまで−８０℃で冷凍保存した。
【０２３８】
ｈＦＩＸ導入遺伝子の発現を評価するために、回収された血漿を使用した。ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｎｃａｓｔｅｒ、ＯＮ、カナダ）を使用して、血漿中のヒトＦＩＸレベルを測定した。
【０２３９】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）分析によって、ヒトＦＩＸの活性レベルを測定した。サンプル血漿を、ヒトＦＩＸ欠損血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）及びａＰＴＴ試薬（Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１：１：１の体積比で混合し、その後に３７℃で１８０秒間インキュベーションをすることによって、ａＰＴＴ分析を実行した。２５ｍＭ塩化カルシウムを加えることによって凝固を開始した。ＳＴａｒｔ４凝析装置（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を使用して、血栓形成時間を測定した。ＴＢＳ  ｐＨ７．４（４８μｌ＋１９２μｌ）による１：５の希釈から始まり、その後の１：２の連続希釈（１２０μｌ＋１２０μｌ）を伴う、ジョージ・キングから得た正常なプール血漿を用いて、標準曲線を生成した。ベクター投与後第１７週に各サンプルの活性を計算するためにそのヒト標準曲線を使用した。２匹の治療していないマウスにおいても活性を測定した。治療していないマウスにおけるＦＩＸ活性を平均し、次に、その平均値を、ＦＩＸＰａｄｕａタンパクに起因する追加的（つまり、ヒト）活性を計算するために、治療されたサンプルから引いた。
【０２４０】
図１７に示されているように、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ及びＡＡＶ−ＦＩＸ１９Ｐａｄｕａは、実質的に等しいレベルのＦＩＸを発現するようにみえる。
【０２４１】
ベクター投与の１７週間後に、１×１０12ｖｇ／ｋｇのベクター用量で治療されたマウスにおいてヒトＦＩＸ活性を測定した。抗原に対する活性の比率は、５．２〜７．５の範囲内であり、ＦＩＸ１９Ｐａｄｕａグループ及びＦＩＸ３９Ｐａｄｕａグループの両方について平均は６．４であった（表３）。
【表３】
2018522529.tif 000005
【０２４２】
これらの結果は、両方の発現カセットの効力が実質的に類似していることを示唆しているが、プラスミド流体尾静脈注入の設定においてもその２つの構築物を分析した。裸のＤＮＡのインビボでの投与に由来するＦＩＸレベルの評価の理論的根拠は、ＡＡＶ滴定、ベクター製造等における差の潜在的干渉がない状態において、両方の発現カセットを比較することであった。
【０２４３】
図１８に示されているように、両方の裸の発現カセットは、ＦＩＸを発現させることにおいて同程度の効力があり、そのことは、ＡＡＶセッティングにおいて得られたデータを確かにしていた。これらの結果は、ＦＩＸ１９Ｐａｄｕａ及びＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ発現カセットが同様の効力を有することを示す。
実施例４  ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａ遺伝子治療
【０２４４】
ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａの単独の静脈注入の安全性及び動態を決定するために臨床研究を行う。使用したＡＡＶ４−１キャプシド変異体は、前臨床試験において、優れた安全性及び効力（１×１０12ｖｇ／ｋｇのベクター注入の３か月後に、ＮＨＰにおいて最大３５％の保持されたＦＩＸ活性レベルを達成する能力）を有することが示された。ＡＡＶ４−１キャプシド変異体に対してクロス反応する中和抗体（Ａｂ）は、ＡＡＶ８よりも約１０％少なく広まっている。この研究の設計は表４に提供されている。
【表４】
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実施例５  臨床結果
【０２４５】
血友病Ｂを有する４つの被検体に、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターを単独で静脈注射により投与した。最初の２人の被検体は、それぞれ、２３歳と１８歳であり、肝臓病の既往歴を有しておらず、一方、第３の被検体は、４７歳で、ＨＣＶ感染の既往歴を有していたが、自然になくなっていた。４人全員の被検体は、新規なＡＡＶキャプシドに対する中和抗体で選抜されており、ネガティブであることがわかった。
【０２４６】
被検体に、１時間以内の期間に亘って５×１０11ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターを静脈内に注入した。
各被検体に投与されたすべてのＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターが図２０〜図２３に示されており、示されているＡＡＶ空キャプシドの量と合計されている。
【０２４７】
図１９〜図２３は研究結果を示しており、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターが０日目に投与された。全研究評価期間を通じて増加したＦＩＸ活性によって反映されているように、その結果は、４つの被検体すべてにおいて増加した第ＩＸ因子の生産を示す。
【０２４８】
概ね０日目から３日目におけるＦＩＸ活性の最初の増加は、１００ＩＵ／ｋｇのＡｌｐｒｏｌｉｘ（商標）又はＢｅｎｅＦＩＸ（商標）の投与によるものであり、これらは、約８２時間の近似半減期を有する組み換えＦＩＸ−Ｆｃ融合タンパクである。ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターに起因する第ＩＸ因子活性は、ＡＡＶベクター注入後の概ね６日〜８日目後に始まる。
【０２４９】
図１９に要約されているように、また、図２０、図２１Ａ、図２２Ａ及び図２３Ａにおける個々の被検体について示されているように、４つの被検体すべてについて、第ＩＸ因子活性は、徐々に増加し、１８３日、１０２日、６９日及び５０日の評価期間の間に亘って安定していると思われる。これらのデータは、５×１０11ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターの１回の注入が、血友病Ｂ患者に、充分なかつ保持された第ＩＸ因子の生産及び活性をもたらし、止血を提供するための意味がありかつ有益な血液凝固活性を提供することを示す。
【０２５０】
図１９、２０Ａ、２１Ａ、２２Ａ及び２３Ａに示されているように、第ＩＸ因子活性レベルは、注入後１８３日、１０２日、６９日及び５０日において、被検体１−４のそれぞれについて、それぞれ、正常値の２８％、４１％、２６％及び３３％であった。半減期が延長された生成物を有する被検体＃３は、ベクター注入の２日後に足首出血が疑われ、自分自身を治療したが、それ以外には、評価期間中に因子は注入せず、出血も無かった。
【０２５１】
免疫抑制剤（ステロイド）は、被検体のいずれにも投与されていない。さらに、概して、正常値の上限を超えてトランスアミナーゼが持続的に上昇することはなく、治療の悪影響を示さなかった（図２０Ｂ、図２１Ｂ、図２２Ｂ及び図２３）。
【０２５２】
４つの被検体すべてにおいて、ＡＡＶに対する及びＦＩＸに対するＴ細胞応答をモニターするためにＥＬＩＳＰＯＴを使用した。反応は無いか又は非常に低かった。注目すべきことに、第ＩＸ因子レベルが安定レベルまで上昇する時間経過は、著しく日数と一致している（図１９）。第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ変異体の特異的活性が８倍増加したと仮定すると、抗原レベルの穏やかな変動は、活性レベルにおけるより大きい変化をもたらす。
【０２５３】
公表されているデータ（Ｎａｔｈｗａｎｉら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３７１（２１）：１９９４−２００４（２０１４））は、野生型の第ＩＸ因子を発現するＡＡＶ８ベクターを注入した血友病Ｂ患者における第ＩＸ因子の長期的発現を示している。しかしながら、発現のレベルは、最小用量（２×１０11ベクターゲノム［ｖｇ］／ｋｇ体重）における正常値の１．４％〜２．２、及び、最高用量（２×１０12ｖｇ／ｋｇ）における２．９％〜７．２％と低い範囲内であった。さらに、最高用量を注入した４／６の被検体は、最高用量に関連して増加するトランスアミナーゼ（しかし、２×１０11又は６×１０11ｖｇ／ｋｇの低用量では観察されなかった）を低減するために、免疫抑制薬（プレドニゾロン）の経過を必要とした。血友病患者の自然の歴史研究からのデータは、自然に起こる関節出血の年間回数をゼロまで減らすためには、〜１２％のＦＩＸの血中濃度を必要とすることを示唆している（ｄｅｎ  Ｕｉｊｌら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １７（１）：４１−４  （２０１１））。
【０２５４】
これらは、高い特異的活性の第ＩＸ因子導入遺伝子を発現する、生物工学によって作られた新規なＡＡＶキャプシドを使用した、最初の臨床結果である。被検体１−４において見られた、正常値の２８％、４１％、２６％及び３３％である第ＩＸ因子活性レベルは、先の研究において見られた、公表されているデータに基づいたものよりも実質的に高い循環因子ＩＸレベルであり、また、自然に生じる関節出血の年間回数をゼロにまで減らすために必要とされる循環因子ＩＸレベルを超える。
【０２５５】
更に、この研究においてみられた本質的な第ＩＸ因子活性レベルは、ベクター注入以後に組み換え因子ＩＸを使用することなく、また、免疫抑制剤（ステロイド）を使用することなく達成された。これらの結果は、その結果、免疫抑制が必要でないという、肝臓を対象とした遺伝子治療のための重要なゴールを可能にする、低薬量のＡＡＶベクター投与で高いレベルの凝固因子発現を導くことができるＡＡＶ−ＦＩＸベクターの開発を示している。この研究において観察された第ＩＸ因子活性レベルは、この研究期間の間に亘って保持された。
実施例６  ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターの低減された免疫原性
【０２５６】
現在のフェーズＩ／ＩＩ研究のために、有効化されたインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮｇ）エンザイム・リンクド・イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて、ＡＡＶベクターに対する潜在的な免疫反応について、５×１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａを摂取した４つの被検体をモニターした。毎週の採血から分離した精製されたＰＢＭＣを、インターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴ分析で調べた。２４〜２５個のペプチドをそれぞれ含む６個のＡＡＶキャプシドペプチドプールを、２ｅ５細胞中においてトリプリケートでインキュベートした。Ｔ細胞応答は、ＩＦＮｇに対するビオチン化抗体を使用して検出され、その後の比色定量現像により、１００万個の細胞当たりのスポット・フォーミング・ユニット（ＳＦＵ）として報告された。各時点において最も高い応答をするプールが、ＳＦＵ／１００万細胞として示されている。ポジティブとして歴史的に用いられている臨界点は、５０超のＳＦＵとメディアコントロールの３倍（青線）である。被検体８４０−００３−００１、８４０−００１−００２、８４０−００１−００４及び８４０−００１−００５（黒で示されている）は、２６週間、１４週間、１１週間及び８週間を超えるまでモニターした。ＥＬＩＳＰＯＴは、２つの被検体、ＣＰ−１６及びＰＴ１７が、１ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８−ＦＩＸ１９ベクターを摂取し、１つの被検体が、２ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８−ＦＩＸ１９を摂取した以前の試みから得たものであり、赤で示されている。
【０２５７】
ポジティブなＴ細胞反応に関する基準として、歴史的に受け入れられている５０超のＳＦＵ及びバックグラウンド（メディア）コントロールの３倍の値を使用すると、注入後２６週間を過ぎても、３つの被検体における反応は、ほとんど無いか又はまったくなかった（図２４Ａ）。これは、３人の被検体にＦＩＸ導入遺伝子カセットを届けるためにコドン最適化されたＡＡＶ８ベクターを使用し、第２週の時点で早くも頑強なＩＦＮｇ  Ｔ細胞応答が観察された、我々のグループによる公開されていない以前の研究（図２４Ｂ）とはまったく対照的である。ＡＡＶ−２（Ｍａｎｎｏら、２００６  Ｎａｔ  Ｍｅｄ）を用いた以前に公表されている他の研究、及び、ＡＡＶ−８自己相補的ベクター（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２０１１  ＮＥＪＭ）を用いた以前に公表されている他の研究は、同様に、ＡＡＶキャプシドに対する初期のＴ細胞応答の証拠を示している。重要なことに、導入遺伝子の産物に対する反応は、この試みにおいて観察されていない。
【０２５８】
ＡＡＶキャプシドＴ細胞エピトープを提示する、遺伝子導入された肝細胞に対する免疫反応を介したＴ細胞の活性化は、導入遺伝子の発現が長続きせず、最終的に失われる被検体において役割を果たしている可能性があるという仮説が立つ。従って、ＡＡＶ−ＦＩＸ３９Ｐａｄｕａベクターの低減された免疫原性プロファイルは、全面的効力に向けた有望な改良を意味する。
Ｒｈ７４  ＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：１）
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＮＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＱＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＳＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
Ｒｈ７４  ＶＰ２アミノ酸（配列番号：２）
ＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
Ｒｈ７４  ＶＰ３アミノ酸（配列番号：３）
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４−１変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：４）
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４−１変異体ＶＰ２キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：２７）
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４−１変異体ＶＰ３キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：３）
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１５−１の変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：５）
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１５−２変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：６）
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１５−３／１５−５変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：７）
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１５−４変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：８）
１      ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰ  ＫＰＫＡＮＱＱＲＱＤ  ＮＧＲＧＬＶＬＰＧＹ  ＲＹＬＧＰＦＮＧＬＤ
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７２１  ＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
１５−６変異体ＶＰ１キャプシド・アミノ酸配列（配列番号：９）
１      ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＲＱＤＮＧＲＧＬＶＬＰＧＹ  ＲＹＬＧＰＦＮＧＬＤ
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１８１  ＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＰＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨ  ＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶ
２４１  ＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＲＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦ  ＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱ
３０１  ＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＲＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥ  ＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡ
３６１  ＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮ  ＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤ
４２１  ＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰ  ＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷ
４８１  ＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＲ  ＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳ
５４１  ＧＶＬＭＦＧＲＱＧＡＧＲＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮ  ＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳ
６０１  ＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬ  ＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰ
６６１  ＰＴＴＦＮＱＡＲＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳ  ＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥ
７２１  ＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
ＦＩＸ３９核酸配列（配列番号：１０）
ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＡＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡ
ＦＩＸ１９核酸配列（配列番号：１１）
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＧＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡＴＧＣＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＡＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＡＧＧＴＧＴＣＡＡＧＡＴＡＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡ
ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ＿ｈＡＡＴ−ＦＩＸ３９（配列番号：１２）
ＬＯＣＵＳ              ＦＩＸ３９                                    １１１２５  ｂｐ        ＤＮＡ          ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＵＮＡ
ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ    ＡＫＡ  ＦＩＸ３９  Ｓｔｅｐ  ４．
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ      ｕｒｎ．ｌｏｃａｌ．．．ｅ−３ｕｍ３ｏｍｋ
ＶＥＲＳＩＯＮ          ｕｒｎ．ｌｏｃａｌ．．．ｅ−３ｕｍ３ｏｍｋ
ＫＥＹＷＯＲＤＳ        ．
ＳＯＵＲＣＥ
ＯＲＧＡＮＩＳＭ
．
ＦＥＡＴＵＲＥＳ                          Ｌｏｃａｔｉｏｎ／Ｑｕａｌｉｆｉｅｒｓ
ｒｅｐｅａｔ＿ｒｅｇｉｏｎ      １．．１４１
／Ｉｍｐｏｒｔｅｄ＿ｆｒｏｍ＝"＜ａ
ｈｒｅｆ＝""ｈｔｔｐ：／／ｗｉｓｈａｒｔ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕａｌｂｅｒｔａ．ｃａ／ＰｌａｓＭａｐｐｅｒ""＞Ｐｌａ
ｓＭａｐｐｅｒ＜／ａ＞"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ＬＡＡＶ−２＿ＩＴＲ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"１００．００％"
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ＡＡＶ２  ＩＴＲ"
ｅｎｈａｎｃｅｒ                １５２．．４７２
／ｃｒｅａｔｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"１００．００％"
／ｌａｂｅｌ＝"ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１"
ｐｒｏｍｏｔｅｒ                ４８２．．８７８
／ｖｎｔｉｆｋｅｙ＝２１
／ＡｐＥｉｎｆｏ＿ｆｗｄｃｏｌｏｒ＝
"＃ｆｆｆｆ００"
／ＡｐＥｉｎｆｏ＿ｒｅｖｃｏｌｏｒ＝"＃００８０ｆｆ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ｈＡＡＴ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"１００．００％"
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＡＡＴ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ"
５'ＵＴＲ                      ８７９．．９０７
／ｃｒｅａｔｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ＦＩＸ  ５'ＵＴＲ"
ＣＤＳ                          ｏｒｄｅｒ（９０８．．９９５，２４３４．．３７３１）
／ｃｒｅａｔｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ｈＦＩＸ  ＣＤＳ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"７９．２２％"
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＦＩＸ  ＣＤＳ"
ｉｎｔｒｏｎ                    ９９６．．２４３３
／ｃｒｅａｔｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ｈＦＩＸ  Ｉｎｔｒｏｎ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"１００．００％"
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＦＩＸ  Ｉｎｔｒｏｎ"
３'ＵＴＲ                      ３７３２．．３７７９
／ｃｒｅａｔｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＦ９  ３'  ＵＴＲ"
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ            ３８２０．．４０４７
／Ｉｍｐｏｒｔｅｄ＿ｆｒｏｍ＝"＜ａ
ｈｒｅｆ＝""ｈｔｔｐ：／／ｗｉｓｈａｒｔ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕａｌｂｅｒｔａ．ｃａ／ＰｌａｓＭａｐｐｅｒ""＞Ｐｌａ
ｓＭａｐｐｅｒ＜／ａ＞"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ｂＧＨ＿ＰＡ  ｔｅｒｍ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"１００．００％"
／ｌａｂｅｌ＝"ｂＧＨ＿ＰＡ  ｔｅｒｍ"
ｒｅｐｅａｔ＿ｒｅｇｉｏｎ      ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（４０９７．．４２０４）
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ＡＡＶ２  ＩＴＲ"
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ        ４２１９．．８５７９
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"Ｌａｍｂｄａ  Ｓｔｕｆｆｅｒ"
Ｇｅｎｅ                        ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（８４９１．．８５８０）
／Ｉｍｐｏｒｔｅｄ＿ｆｒｏｍ＝"＜ａ
ｈｒｅｆ＝""ｈｔｔｐ：／／ｗｉｓｈａｒｔ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕａｌｂｅｒｔａ．ｃａ／ＰｌａｓＭａｐｐｅｒ""＞Ｐｌａ
ｓＭａｐｐｅｒ＜／ａ＞"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｆｒｏｍ＝"ｃｏｓＮ"
／Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ＿Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＝"１００．００％"
／ｌａｂｅｌ＝"ｃｏｓＮ"
ｒｅｐ＿ｏｒｉｇｉｎ            ８６８０．．８９８６
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"Ｆ１  Ｏｒｉ"
ｍｉｓｃ．＿ｍａｒｋｅｒ        ９２８４．．１００９６
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"Ｋａｎ  Ｒ"
ｒｅｐ＿ｏｒｉｇｉｎ            ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１０４５３．．１１１２０）
／ｍｏｄｉｆｉｅｄ＿ｂｙ＝"Ｕｓｅｒ"
／ｌａｂｅｌ＝"ｐＵＣ  Ｏｒｉ"
ＯＲＩＧＩＮ
１  ｃｃｔｇｃａｇｇｃａ  ｇｃｔｇｃｇｃｇｃｔ  ｃｇｃｔｃｇｃｔｃａ  ｃｔｇａｇｇｃｃｇｃ  ｃｃｇｇｇｃａａａｇ  ｃｃｃｇｇｇｃｇｔｃ
６１  ｇｇｇｃｇａｃｃｔｔ  ｔｇｇｔｃｇｃｃｃｇ  ｇｃｃｔｃａｇｔｇａ  ｇｃｇａｇｃｇａｇｃ  ｇｃｇｃａｇａｇａｇ  ｇｇａｇｔｇｇｃｃａ
１２１  ａｃｔｃｃａｔｃａｃ  ｔａｇｇｇｇｔｔｃｃ  ｔｇｃｇｇｃｃｔａｇ  ｔａｇｇｃｔｃａｇａ  ｇｇｃａｃａｃａｇｇ  ａｇｔｔｔｃｔｇｇｇ
１８１  ｃｔｃａｃｃｃｔｇｃ  ｃｃｃｃｔｔｃｃａａ  ｃｃｃｃｔｃａｇｔｔ  ｃｃｃａｔｃｃｔｃｃ  ａｇｃａｇｃｔｇｔｔ  ｔｇｔｇｔｇｃｔｇｃ
２４１  ｃｔｃｔｇａａｇｔｃ  ｃａｃａｃｔｇａａｃ  ａａａｃｔｔｃａｇｃ  ｃｔａｃｔｃａｔｇｔ  ｃｃｃｔａａａａｔｇ  ｇｇｃａａａｃａｔｔ
３０１  ｇｃａａｇｃａｇｃａ  ａａｃａｇｃａａａｃ  ａｃａｃａｇｃｃｃｔ  ｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃ  ｔｇａｃｃｔｔｇｇａ  ｇｃｔｇｇｇｇｃａｇ
３６１  ａｇｇｔｃａｇａｇａ  ｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇ  ｃｃｃａｔｇｃｃａｃ  ｃｔｃｃａａｃａｔｃ  ｃａｃｔｃｇａｃｃｃ  ｃｔｔｇｇａａｔｔｔ
４２１  ｃｇｇｔｇｇａｇａｇ  ｇａｇｃａｇａｇｇｔ  ｔｇｔｃｃｔｇｇｃｇ  ｔｇｇｔｔｔａｇｇｔ  ａｇｔｇｔｇａｇａｇ  ｇｇｇｔａｃｃｃｇｇ
４８１  ｇｇａｔｃｔｔｇｃｔ  ａｃｃａｇｔｇｇａａ  ｃａｇｃｃａｃｔａａ  ｇｇａｔｔｃｔｇｃａ  ｇｔｇａｇａｇｃａｇ  ａｇｇｇｃｃａｇｃｔ
５４１  ａａｇｔｇｇｔａｃｔ  ｃｔｃｃｃａｇａｇａ  ｃｔｇｔｃｔｇａｃｔ  ｃａｃｇｃｃａｃｃｃ  ｃｃｔｃｃａｃｃｔｔ  ｇｇａｃａｃａｇｇａ
６０１  ｃｇｃｔｇｔｇｇｔｔ  ｔｃｔｇａｇｃｃａｇ  ｇｔａｃａａｔｇａｃ  ｔｃｃｔｔｔｃｇｇｔ  ａａｇｔｇｃａｇｔｇ  ｇａａｇｃｔｇｔａｃ
６６１  ａｃｔｇｃｃｃａｇｇ  ｃａａａｇｃｇｔｃｃ  ｇｇｇｃａｇｃｇｔａ  ｇｇｃｇｇｇｃｇａｃ  ｔｃａｇａｔｃｃｃａ  ｇｃｃａｇｔｇｇａｃ
７２１  ｔｔａｇｃｃｃｃｔｇ  ｔｔｔｇｃｔｃｃｔｃ  ｃｇａｔａａｃｔｇｇ  ｇｇｔｇａｃｃｔｔｇ  ｇｔｔａａｔａｔｔｃ  ａｃｃａｇｃａｇｃｃ
７８１  ｔｃｃｃｃｃｇｔｔｇ  ｃｃｃｃｔｃｔｇｇａ  ｔｃｃａｃｔｇｃｔｔ  ａａａｔａｃｇｇａｃ  ｇａｇｇａｃａｇｇｇ  ｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃ
８４１  ｔｃａｇｃｔｔｃａｇ  ｇｃａｃｃａｃｃａｃ  ｔｇａｃｃｔｇｇｇａ  ｃａｇｔｇａａｔａｃ  ｃａｃｔｔｔｃａｃａ  ａｔｃｔｇｃｔａｇｃ
９０１  ａａａｇｇｔｔａｔｇ  ｃａｇａｇｇｇｔｇａ  ａｃａｔｇａｔｃａｔ  ｇｇｃｔｇａｇａｇｃ  ｃｃｔｇｇｃｃｔｇａ  ｔｃａｃｃａｔｃｔｇ
９６１  ｃｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ｔａｃｃｔｇｃｔｇｔ  ｃｔｇｃｔｇａａｔｇ  ｔａｃａｇｇｔｔｔｇ  ｔｔｔｃｃｔｔｔｔｔ  ｔａｔａａｔａｃａｔ
１０２１  ｔｇａｇｔａｔｇｃｔ  ｔｇｃｃｔｔｔｔａｇ  ａｔａｔａｇａａａｔ  ａｔｃｔｇａｔｔｃｔ  ｇｔｃｔｔｃｔｔｃａ  ｃｔａａａｔｔｔｔｇ
１０８１  ａｔｔａｃａｔｇａｔ  ｔｔｇａｃａｇｃａａ  ｔａｔｔｇａａｇａｇ  ｔｃｔａａｃａｇｃｃ  ａｇｃａｃｃｃａｇｇ  ｔｔｇｇｔａａｇｔａ
１１４１  ｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔ  ｇｔｔａｇｃｔａｇｇ  ｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔ  ｃｔｔｃａｃｔｔｔｔ  ａａａａｃｔａａａｔ  ａｇａｔｇｇａｃａａ
１２０１  ｔｇｃｔｔａｔｇａｔ  ｇｃａａｔａａｇｇｔ  ｔｔａａｔａａａｃａ  ｃｔｇｔｔｃａｇｔｔ  ｃａｇｔａｔｔｔｇｇ  ｔｃａｔｇｔａａｔｔ
１２６１  ｃｃｔｇｔｔａａａａ  ａａｃａｇｔｃａｔｃ  ｔｃｃｔｔｇｇｔｔｔ  ａａａａａａａｔｔａ  ａａａｇｔｇｇｇａａ  ａａｃａａａｇａａａ
１３２１  ｔａｇｃａｇａａｔａ  ｔａｇｔｇａａａａａ  ａａａｔａａｃｃａｃ  ａｇｔａｔｔｔｔｔｇ  ｔｔｔｇｇａｃｔｔａ  ｃｃａｃｔｔｔｇａａ
１３８１  ａｔｃａａａｔｔｇｇ  ｇａａａｃａａａａｇ  ｃａｃａａａｃａｇｔ  ｇｇｃｃｔｔａｔｔｔ  ａｃａｃａａａａａｇ  ｔｃｔｇａｔｔｔｔａ
１４４１  ａｇａｔａｔｇｔｇａ  ｃａａｔｔｃａａｇｇ  ｔｔｔｃａｇａａｇｔ  ａｔｇｔａａｇｇａｇ  ｇｔｇｔｇｔｃｔｃｔ  ａａｔｔｔｔｔｔａａ
１５０１  ａｔｔａｔａｔａｔｃ  ｔｔｃａａｔｔｔａａ  ａｇｔｔｔｔａｇｔｔ  ａａａａｃａｔａａａ  ｇａｔｔａａｃｃｔｔ  ｔｃａｔｔａｇｃａａ
１５６１  ｇｃｔｇｔｔａｇｔｔ  ａｔｃａｃｃａａａｇ  ｃｔｔｔｔｃａｔｇｇ  ａｔｔａｇｇａａａａ  ａａｔｃａｔｔｔｔｇ  ｔｃｔｃｔａｔｃｔｃ
１６２１  ａａａｃａｔｃｔｔｇ  ｇａｇｔｔｇａｔａｔ  ｔｔｇｇｇｇａａａｃ  ａｃａａｔａｃｔｃａ  ｇｔｔｇａｇｔｔｃｃ  ｃｔａｇｇｇｇａｇａ
１６８１  ａａａｇｃａａｇｃｔ  ｔａａｇａａｔｔｇａ  ｃａｃａａａｇａｇｔ  ａｇｇａａｇｔｔａｇ  ｃｔａｔｔｇｃａａｃ  ａｔａｔａｔｃａｃｔ
１７４１  ｔｔｇｔｔｔｔｔｔｃ  ａｃａａｃｔａｃａｇ  ｔｇａｃｔｔｔａｔｔ  ｔａｔｔｔｃｃｃａｇ  ａｇｇａａｇｇｃａｔ  ａｃａｇｇｇａａｇａ
１８０１  ａａｔｔａｔｃｃｃａ  ｔｔｔｇｇａｃａａａ  ｃａｇｃａｔｇｔｔｃ  ｔｃａｃａｇｔａａｇ  ｃａｃｔｔａｔｃａｃ  ａｃｔｔａｃｔｔｇｔ
１８６１  ｃａａｃｔｔｔｃｔａ  ｇａａｔｃａａａｔｃ  ｔａｇｔａｇｃｔｇａ  ｃａｇｔａｃｃａｇｇ  ａｔｃａｇｇｇｇｔｇ  ｃｃａａｃｃｃｔａａ
１９２１  ｇｃａｃｃｃｃｃａｇ  ａａａｇｃｔｇａｃｔ  ｇｇｃｃｃｔｇｔｇｇ  ｔｔｃｃｃａｃｔｃｃ  ａｇａｃａｔｇａｔｇ  ｔｃａｇｃｔｇｔｇａ
１９８１  ａａｔｃｃａｃｃｔｃ  ｃｃｔｇｇａｃｃａｔ  ａａｔｔａｇｇｃｔｔ  ｃｔｇｔｔｃｔｔｃａ  ｇｇａｇａｃａｔｔｔ  ｇｔｔｃａａａｇｔｃ
２０４１  ａｔｔｔｇｇｇｃａａ  ｃｃａｔａｔｔｃｔｇ  ａａａａｃａｇｃｃｃ  ａｇｃｃａｇｇｇｔｇ  ａｔｇｇａｔｃａｃｔ  ｔｔｇｃａａａｇａｔ
２１０１  ｃｃｔｃａａｔｇａｇ  ｃｔａｔｔｔｔｃａａ  ｇｔｇａｔｇａｃａａ  ａｇｔｇｔｇａａｇｔ  ｔａａｇｇｇｃｔｃａ  ｔｔｔｇａｇａａｃｔ
２１６１  ｔｔｃｔｔｔｔｔｃａ  ｔｃｃａａａｇｔａａ  ａｔｔｃａａａｔａｔ  ｇａｔｔａｇａａａｔ  ｃｔｇａｃｃｔｔｔｔ  ａｔｔａｃｔｇｇａａ
２２２１  ｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ  ｔａａａａｇｔａａａ  ａｔｔｇａａｔｔｔｔ  ａａｔｔｃｃｔａａａ  ｔｃｔｃｃａｔｇｔｇ  ｔａｔａｃａｇｔａｃ
２２８１  ｔｇｔｇｇｇａａｃａ  ｔｃａｃａｇａｔｔｔ  ｔｇｇｃｔｃｃａｔｇ  ｃｃｃｔａａａｇａｇ  ａａａｔｔｇｇｃｔｔ  ｔｃａｇａｔｔａｔｔ
２３４１  ｔｇｇａｔｔａａａａ  ａｃａａａｇａｃｔｔ  ｔｃｔｔａａｇａｇａ  ｔｇｔａａａａｔｔｔ  ｔｃａｔｇａｔｇｔｔ  ｔｔｃｔｔｔｔｔｔｇ
２４０１  ｃｔａａａａｃｔａａ  ａｇａａｔｔａｔｔｃ  ｔｔｔｔａｃａｔｔｔ  ｃａｇｔｔｔｔｔｃｔ  ｔｇａｔｃａｔｇａａ  ａａｔｇｃｃａａｃａ
２４６１  ａａａｔｔｃｔｇａａ  ｔａｇａｃｃａａａｇ  ａｇｇｔａｔａａｃｔ  ｃｔｇｇｃａａｇｃｔ  ｔｇａａｇａｇｔｔｔ  ｇｔａｃａｇｇｇｇａ
２５２１  ａｔｃｔｇｇａｇａｇ  ａｇａｇｔｇｔａｔｇ  ｇａａｇａｇａａｇｔ  ｇｃａｇｃｔｔｔｇａ  ｇｇａａｇｃｃａｇａ  ｇａａｇｔｇｔｔｔｇ
２５８１  ａａａａｔａｃａｇａ  ｇａｇａａｃａａｃｔ  ｇａａｔｔｔｔｇｇａ  ａｇｃａｇｔａｔｇｔ  ｇｇａｔｇｇｔｇａｔ  ｃａａｔｇｔｇａｇａ
２６４１  ｇｃａａｔｃｃｃｔｇ  ｃｔｔｇａａｔｇｇｇ  ｇｇｇａｇｃｔｇｔａ  ａａｇａｔｇａｔａｔ  ｃａａｃａｇｃｔａｔ  ｇａａｔｇｔｔｇｇｔ
２７０１  ｇｔｃｃｃｔｔｔｇｇ  ａｔｔｔｇａｇｇｇｇ  ａａａａａｃｔｇｔｇ  ａｇｃｔｔｇａｔｇｔ  ｇａｃｃｔｇｔａａｔ  ａｔｃａａｇａａｔｇ
２７６１  ｇｃａｇｇｔｇｔｇａ  ｇｃａａｔｔｔｔｇｃ  ａａｇａａｔｔｃｔｇ  ｃｔｇａｔａａｃａａ  ａｇｔｇｇｔｃｔｇｔ  ａｇｃｔｇｃａｃｔｇ
２８２１  ａｇｇｇａｔａｔａｇ  ｇｃｔｇｇｃｔｇａａ  ａａｃｃａｇａａｇａ  ｇｃｔｇｔｇａａｃｃ  ｔｇｃａｇｔｇｃｃｔ  ｔｔｔｃｃｃｔｇｔｇ
２８８１  ｇｇａｇａｇｔｇｔｃ  ｔｇｔｇａｇｃｃａａ  ａｃｃａｇｃａａｇｃ  ｔｇａｃｔａｇｇｇｃ  ｔｇａａｇｃａｇｔｃ  ｔｔｔｃｃｔｇａｔｇ
２９４１  ｔａｇａｔｔａｔｇｔ  ｇａａｔａｇｃａｃｔ  ｇａｇｇｃｔｇａｇａ  ｃａａｔｃｃｔｔｇａ  ｃａａｔａｔｃａｃｔ  ｃａｇａｇｃａｃａｃ
３００１  ａｇａｇｃｔｔｃａａ  ｔｇａｃｔｔｃａｃｃ  ａｇｇｇｔｇｇｔａｇ  ｇａｇｇｇｇａｇｇａ  ｔｇｃｃａａｇｃｃｔ  ｇｇｇｃａｇｔｔｃｃ
３０６１  ｃｃｔｇｇｃａｇｇｔ  ａｇｔｇｃｔｃａａｔ  ｇｇａａａａｇｔｇｇ  ａｔｇｃｃｔｔｔｔｇ  ｔｇｇａｇｇｔｔｃａ  ａｔｔｇｔａａａｔｇ
３１２１  ａｇａａｇｔｇｇａｔ  ｔｇｔｇａｃｔｇｃａ  ｇｃｃｃａｃｔｇｔｇ  ｔｇｇａａａｃｔｇｇ  ａｇｔｃａａｇａｔｔ  ａｃｔｇｔｇｇｔｇｇ
３１８１  ｃｔｇｇａｇａｇｃａ  ｃａａｔａｔｔｇａｇ  ｇａａａｃｔｇａｇｃ  ａｃａｃｔｇａｇｃａ  ｇａａｇａｇｇａａｔ  ｇｔｇａｔｃａｇｇａ
３２４１  ｔｔａｔｃｃｃｃｃａ  ｃｃａｃａａｃｔａｃ  ａａｔｇｃｔｇｃｔａ  ｔｃａａｃａａｇｔａ  ｃａａｃｃａｔｇａｃ  ａｔｔｇｃｃｃｔｃｃ
３３０１  ｔｇｇａａｃｔｇｇａ  ｔｇａａｃｃｃｃｔｇ  ｇｔｃｔｔｇａａｃａ  ｇｃｔａｔｇｔｇａｃ  ａｃｃｃａｔｃｔｇｔ  ａｔｔｇｃｔｇａｔａ
３３６１  ａａｇａｇｔａｃａｃ  ｃａａｃａｔｃｔｔｃ  ｔｔｇａａａｔｔｔｇ  ｇｇｔｃｔｇｇａｔａ  ｔｇｔｇｔｃｔｇｇｃ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇｇ
３４２１  ｔｇｔｔｃｃａｔａａ  ａｇｇｃａｇｇｔｃｔ  ｇｃｃｃｔｇｇｔａｔ  ｔｇｃａｇｔａｔｔｔ  ｇａｇｇｇｔｇｃｃｔ  ｃｔｇｇｔｇｇａｔａ
３４８１  ｇａｇｃａａｃｃｔｇ  ｃｔｔｇｃｔｇａｇｃ  ａｃｃａａｇｔｔｔａ  ｃａａｔｃｔａｃａａ  ｃａａｔａｔｇｔｔｃ  ｔｇｔｇｃａｇｇｇｔ
３５４１  ｔｃｃａｔｇａａｇｇ  ｔｇｇｔａｇａｇａｃ  ａｇｃｔｇｃｃａｇｇ  ｇａｇａｔｔｃｔｇｇ  ｇｇｇｔｃｃｃｃａｔ  ｇｔｇａｃｔｇａｇｇ
３６０１  ｔｇｇａｇｇｇａａｃ  ｃａｇｃｔｔｃｃｔｇ  ａｃｔｇｇｇａｔｔａ  ｔｃａｇｃｔｇｇｇｇ  ｔｇａｇｇａｇｔｇｔ  ｇｃｔａｔｇａａｇｇ
３６６１  ｇａａａｇｔａｔｇｇ  ｇａｔｃｔａｃａｃａ  ａａａｇｔａｔｃｃａ  ｇａｔａｔｇｔｇａａ  ｃｔｇｇａｔｔａａｇ  ｇａｇａａａａｃｃａ
３７２１  ａｇｃｔｇａｃｔｔｇ  ａｔｇａａａｇａｔｇ  ｇａｔｔｔｃｃａａｇ  ｇｔｔａａｔｔｃａｔ  ｔｇｇａａｔｔｇａａ  ａａｔｔａａｃａｇａ
３７８１  ｇａｔｃｔａｇａｇｃ  ｔｇａａｔｔｃｃｔｇ  ｃａｇｃｃａｇｇｇｇ  ｇａｔｃａｇｃｃｔｃ  ｔａｃｔｇｔｇｃｃｔ  ｔｃｔａｇｔｔｇｃｃ
３８４１  ａｇｃｃａｔｃｔｇｔ  ｔｇｔｔｔｇｃｃｃｃ  ｔｃｃｃｃｃｔｔｇｃ  ｃｔｔｃｃｔｔｇａｃ  ｃｃｔｇｇａａｇｇｔ  ｇｃｃａｃｔｃｃｃａ
３９０１  ｃｔｇｔｃｃｔｔｔｃ  ｃｔａａｔａａａａｔ  ｇａｇｇａａａｔｔｇ  ｃａｔｃａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｇａｇｔａｇｇ  ｔｇｔｃａｔｔｃｔａ
３９６１  ｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｃａｇｇａｃａｇｃａ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｔｔｇｇｇａａｇａｃ  ａａｔａｇｃａｇｇｃ
４０２１  ａｔｇｃｔｇｇｇｇａ  ｔｇｃａｇｔｇｇｇｃ  ｔｃｔａｔｇｇｃｔｔ  ｃｔｇａｇｇｃａｇａ  ａａｇａａｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｃｇａ
４０８１  ｇａｔｃｃａｃｔａｇ  ｇｇｃｃｇｃａｇｇａ  ａｃｃｃｃｔａｇｔｇ  ａｔｇｇａｇｔｔｇｇ  ｃｃａｃｔｃｃｃｔｃ  ｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔ
４１４１  ｃｇｃｔｃｇｃｔｃａ  ｃｔｇａｇｇｃｃｇｃ  ｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇ  ｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃ  ｃｔｃａｇｔｇａｇｃ  ｇａｇｃｇａｇｃｇｃ
４２０１  ｇｃａｇｃｔｇｃｃｔ  ｇｃａｇｇｇｇｃａｇ  ｃｔｔｇａａｇｇａａ  ａｔａｃｔａａｇｇｃ  ａａａｇｇｔａｃｔｇ  ｃａａｇｔｇｃｔｃｇ
４２６１  ｃａａｃａｔｔｃｇｃ  ｔｔａｔｇｃｇｇａｔ  ｔａｔｔｇｃｃｇｔａ  ｇｔｇｃｃｇｃｇａｃ  ｇｃｃｇｇｇｇｇｃａ  ａｇａｔｇｃａｇａｇ
４３２１  ａｔｔｇｃｃａｔｇｇ  ｔａｃａｇｇｃｃｇｔ  ｇｃｇｇｔｔｇａｔａ  ｔｔｇｃｃａａａａｃ  ａｇａｇｃｔｇｔｇｇ  ｇｇｇａｇａｇｔｔｇ
４３８１  ｔｃｇａｇａａａｇａ  ｇｔｇｃｇｇａａｇａ  ｔｇｃａａａｇｇｃｇ  ｔｃｇｇｃｔａｔｔｃ  ａａｇｇａｔｇｃｃａ  ｇｃａａｇｃｇｃａｇ
４４４１  ｃａｔａｔｃｇｃｇｃ  ｔｇｔｇａｃｇａｔｇ  ｃｔａａｔｃｃｃａａ  ａｃｃｔｔａｃｃｃａ  ａｃｃｃａｃｃｔｇｇ  ｔｃａｃｇｃａｃｔｇ
４５０１  ｔｔａａｇｃｃｇｃｔ  ｇｔａｔｇａｃｇｃｔ  ｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃ  ａａｔｇｃｃａｃａａ  ａｇａａｇａｇｔｃａ  ａｔｃｇｃａｇａｃａ
４５６１  ａｃａｔｔｔｔｇａａ  ｔｇｃｇｇｔｃａｃａ  ｃｇｔｔａｇｃａｇｃ  ａｔｇａｔｔｇｃｃａ  ｃｇｇａｔｇｇｃａａ  ｃａｔａｔｔａａｃｇ
４６２１  ｇｃａｔｇａｔａｔｔ  ｇａｃｔｔａｔｔｇａ  ａｔａａａａｔｔｇｇ  ｇｔａａａｔｔｔｇａ  ｃｔｃａａｃｇａｔｇ  ｇｇｔｔａａｔｔｃｇ
４６８１  ｃｔｃｇｔｔｇｔｇｇ  ｔａｇｔｇａｇａｔｇ  ａａａａｇａｇｇｃｇ  ｇｃｇｃｔｔａｃｔａ  ｃｃｇａｔｔｃｃｇｃ  ｃｔａｇｔｔｇｇｔｃ
４７４１  ａｃｔｔｃｇａｃｇｔ  ａｔｃｇｔｃｔｇｇａ  ａｃｔｃｃａａｃｃａ  ｔｃｇｃａｇｇｃａｇ  ａｇａｇｇｔｃｔｇｃ  ａａａａｔｇｃａａｔ
４８０１  ｃｃｃｇａａａｃａｇ  ｔｔｃｇｃａｇｇｔａ  ａｔａｇｔｔａｇａｇ  ｃｃｔｇｃａｔａａｃ  ｇｇｔｔｔｃｇｇｇａ  ｔｔｔｔｔｔａｔａｔ
４８６１  ｃｔｇｃａｃａａｃａ  ｇｇｔａａｇａｇｃａ  ｔｔｇａｇｔｃｇａｔ  ａａｔｃｇｔｇａａｇ  ａｇｔｃｇｇｃｇａｇ  ｃｃｔｇｇｔｔａｇｃ
４９２１  ｃａｇｔｇｃｔｃｔｔ  ｔｃｃｇｔｔｇｔｇｃ  ｔｇａａｔｔａａｇｃ  ｇａａｔａｃｃｇｇａ  ａｇｃａｇａａｃｃｇ  ｇａｔｃａｃｃａａａ
４９８１  ｔｇｃｇｔａｃａｇｇ  ｃｇｔｃａｔｃｇｃｃ  ｇｃｃｃａｇｃａａｃ  ａｇｃａｃａａｃｃｃ  ａａａｃｔｇａｇｃｃ  ｇｔａｇｃｃａｃｔｇ
５０４１  ｔｃｔｇｔｃｃｔｇａ  ａｔｔｃａｔｔａｇｔ  ａａｔａｇｔｔａｃｇ  ｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔ  ｔｔａｃａｃａｔｇａ  ｃｃｔｔｃｇｔｇａａ
５１０１  ａｇｃｇｇｇｔｇｇｃ  ａｇｇａｇｇｔｃｇｃ  ｇｃｔａａｃａａｃｃ  ｔｃｃｔｇｃｃｇｔｔ  ｔｔｇｃｃｃｇｔｇｃ  ａｔａｔｃｇｇｔｃａ
５１６１  ｃｇａａｃａａａｔｃ  ｔｇａｔｔａｃｔａａ  ａｃａｃａｇｔａｇｃ  ｃｔｇｇａｔｔｔｇｔ  ｔｃｔａｔｃａｇｔａ  ａｔｃｇａｃｃｔｔａ
５２２１  ｔｔｃｃｔａａｔｔａ  ａａｔａｇａｇｃａａ  ａｔｃｃｃｃｔｔａｔ  ｔｇｇｇｇｇｔａａｇ  ａｃａｔｇａａｇａｔ  ｇｃｃａｇａａａａａ
５２８１  ｃａｔｇａｃｃｔｇｔ  ｔｇｇｃｃｇｃｃａｔ  ｔｃｔｃｇｃｇｇｃａ  ａａｇｇａａｃａａｇ  ｇｃａｔｃｇｇｇｇｃ  ａａｔｃｃｔｔｇｃｇ
５３４１  ｔｔｔｇｃａａｔｇｇ  ｃｇｔａｃｃｔｔｃｇ  ｃｇｇｃａｇａｔａｔ  ａａｔｇｇｃｇｇｔｇ  ｃｇｔｔｔａｃａａａ  ａａｃａｇｔａａｔｃ
５４０１  ｇａｃｇｃａａｃｇａ  ｔｇｔｇｃｇｃｃａｔ  ｔａｔｃｇｃｃｔａｇ  ｔｔｃａｔｔｃｇｔｇ  ａｃｃｔｔｃｔｃｇａ  ｃｔｔｃｇｃｃｇｇａ
５４６１  ｃｔａａｇｔａｇｃａ  ａｔｃｔｃｇｃｔｔａ  ｔａｔａａｃｇａｇｃ  ｇｔｇｔｔｔａｔｃｇ  ｇｃｔａｃａｔｃｇｇ  ｔａｃｔｇａｃｔｃｇ
５５２１  ａｔｔｇｇｔｔｃｇｃ  ｔｔａｔｃａａａｃｇ  ｃｔｔｃｇｃｔｇｃｔ  ａａａａａａｇｃｃｇ  ｇａｇｔａｇａａｇａ  ｔｇｇｔａｇａａａｔ
５５８１  ｃａａｔａａｔｃａａ  ｃｇｔａａｇｇｃｇｔ  ｔｃｃｔｃｇａｔａｔ  ｇｃｔｇｇｃｇｔｇｇ  ｔｃｇｇａｇｇｇａａ  ｃｔｇａｔａａｃｇｇ
５６４１  ａｃｇｔｃａｇａａａ  ａｃｃａｇａａａｔｃ  ａｔｇｇｔｔａｔｇａ  ｃｇｔｃａｔｔｇｔａ  ｇｇｃｇｇａｇａｇｃ  ｔａｔｔｔａｃｔｇａ
５７０１  ｔｔａｃｔｃｃｇａｔ  ｃａｃｃｃｔｃｇｃａ  ａａｃｔｔｇｔｃａｃ  ｇｃｔａａａｃｃｃａ  ａａａｃｔｃａａａｔ  ｃａａｃａｇｇｃｇｃ
５７６１  ｃｇｇａｃｇｃｔａｃ  ｃａｇｃｔｔｃｔｔｔ  ｃｃｃｇｔｔｇｇｔｇ  ｇｇａｔｇｃｃｔａｃ  ｃｇｃａａｇｃａｇｃ  ｔｔｇｇｃｃｔｇａａ
５８２１  ａｇａｃｔｔｃｔｃｔ  ｃｃｇａａａａｇｔｃ  ａｇｇａｃｇｃｔｇｔ  ｇｇｃａｔｔｇｃａｇ  ｃａｇａｔｔａａｇｇ  ａｇｃｇｔｇｇｃｇｃ
５８８１  ｔｔｔａｃｃｔａｔｇ  ａｔｔｇａｔｃｇｔｇ  ｇｔｇａｔａｔｃｃｇ  ｔｃａｇｇｃａａｔｃ  ｇａｃｃｇｔｔｇｃａ  ｇｃａａｔａｔｃｔｇ
５９４１  ｇｇｃｔｔｃａｃｔｇ  ｃｃｇｇｇｃｇｃｔｇ  ｇｔｔａｔｇｇｔｃａ  ｇｔｔｃｇａｇｃａｔ  ａａｇｇｃｔｇａｃａ  ｇｃｃｔｇａｔｔｇｃ
６００１  ａａａａｔｔｃａａａ  ｇａａｇｃｇｇｇｃｇ  ｇａａｃｇｇｔｃａｇ  ａｇａｇａｔｔｇａｔ  ｇｔａｔｇａｇｃａｇ  ａｇｔｃａｃｃｇｃｇ
６０６１  ａｔｔａｔｃｔｃｃｇ  ｃｔｃｔｇｇｔｔａｔ  ｃｔｇｃａｔｃａｔｃ  ｇｔｃｔｇｃｃｔｇｔ  ｃａｔｇｇｇｃｔｇｔ  ｔａａｔｃａｔｔａｃ
６１２１  ｃｇｔｇａｔａａｃｇ  ｃｃａｔｔａｃｃｔａ  ｃａａａｇｃｃｃａｇ  ｃｇｃｇａｃａａａａ  ａｔｇｃｃａｇａｇａ  ａｃｔｇａａｇｃｔｇ
６１８１  ｇｃｇａａｃｇｃｇｇ  ｃａａｔｔａｃｔｇａ  ｃａｔｇｃａｇａｔｇ  ｃｇｔｃａｇｃｇｔｇ  ａｔｇｔｔｇｃｔｇｃ  ｇｃｔｃｇａｔｇｃａ
６２４１  ａａａｔａｃａｃｇａ  ａｇｇａｇｔｔａｇｃ  ｔｇａｔｇｃｔａａａ  ｇｃｔｇａａａａｔｇ  ａｔｇｃｔｃｔｇｃｇ  ｔｇａｔｇａｔｇｔｔ
６３０１  ｇｃｃｇｃｔｇｇｔｃ  ｇｔｃｇｔｃｇｇｔｔ  ｇｃａｃａｔｃａａａ  ｇｃａｇｔｃｔｇｔｃ  ａｇｔｃａｇｔｇｃｇ  ｔｇａａｇｃｃａｃｃ
６３６１  ａｃｃｇｃｃｔｃｃｇ  ｇｃｇｔｇｇａｔａａ  ｔｇｃａｇｃｃｔｃｃ  ｃｃｃｃｇａｃｔｇｇ  ｃａｇａｃａｃｃｇｃ  ｔｇａａｃｇｇｇａｔ
６４２１  ｔａｔｔｔｃａｃｃｃ  ｔｃａｇａｇａｇａｇ  ｇｃｔｇａｔｃａｃｔ  ａｔｇｃａａａａａｃ  ａａｃｔｇｇａａｇｇ  ａａｃｃｃａｇａａｇ
６４８１  ｔａｔａｔｔａａｔｇ  ａｇｃａｇｔｇｃａｇ  ａｔａｇａｇｔｔｇｃ  ｃｃａｔａｔｃｇａｔ  ｇｇｇｃａａｃｔｃａ  ｔｇｃａａｔｔａｔｔ
６５４１  ｇｔｇａｇｃａａｔａ  ｃａｃａｃｇｃｇｃｔ  ｔｃｃａｇｃｇｇａｇ  ｔａｔａａａｔｇｃｃ  ｔａａａｇｔａａｔａ  ａａａｃｃｇａｇｃａ
６６０１  ａｔｃｃａｔｔｔａｃ  ｇａａｔｇｔｔｔｇｃ  ｔｇｇｇｔｔｔｃｔｇ  ｔｔｔｔａａｃａａｃ  ａｔｔｔｔｃｔｇｃｇ  ｃｃｇｃｃａｃａａａ
６６６１  ｔｔｔｔｇｇｃｔｇｃ  ａｔｃｇａｃａｇｔｔ  ｔｔｃｔｔｃｔｇｃｃ  ｃａａｔｔｃｃａｇａ  ａａｃｇａａｇａａａ  ｔｇａｔｇｇｇｔｇａ
６７２１  ｔｇｇｔｔｔｃｃｔｔ  ｔｇｇｔｇｃｔａｃｔ  ｇｃｔｇｃｃｇｇｔｔ  ｔｇｔｔｔｔｇａａｃ  ａｇｔａａａｃｇｔｃ  ｔｇｔｔｇａｇｃａｃ
６７８１  ａｔｃｃｔｇｔａａｔ  ａａｇｃａｇｇｇｃｃ  ａｇｃｇｃａｇｔａｇ  ｃｇａｇｔａｇｃａｔ  ｔｔｔｔｔｔｃａｔｇ  ｇｔｇｔｔａｔｔｃｃ
６８４１  ｃｇａｔｇｃｔｔｔｔ  ｔｇａａｇｔｔｃｇｃ  ａｇａａｔｃｇｔａｔ  ｇｔｇｔａｇａａａａ  ｔｔａａａｃａａａｃ  ｃｃｔａａａｃａａｔ
６９０１  ｇａｇｔｔｇａａａｔ  ｔｔｃａｔａｔｔｇｔ  ｔａａｔａｔｔｔａｔ  ｔａａｔｇｔａｔｇｔ  ｃａｇｇｔｇｃｇａｔ  ｇａａｔｃｇｔｃａｔ
６９６１  ｔｇｔａｔｔｃｃｃｇ  ｇａｔｔａａｃｔａｔ  ｇｔｃｃａｃａｇｃｃ  ｃｔｇａｃｇｇｇｇａ  ａｃｔｔｃｔｃｔｇｃ  ｇｇｇａｇｔｇｔｃｃ
７０２１  ｇｇｇａａｔａａｔｔ  ａａａａｃｇａｔｇｃ  ａｃａｃａｇｇｇｔｔ  ｔａｇｃｇｃｇｔａｃ  ａｃｇｔａｔｔｇｃａ  ｔｔａｔｇｃｃａａｃ
７０８１  ｇｃｃｃｃｇｇｔｇｃ  ｔｇａｃａｃｇｇａａ  ｇａａａｃｃｇｇａｃ  ｇｔｔａｔｇａｔｔｔ  ａｇｃｇｔｇｇａａａ  ｇａｔｔｔｇｔｇｔａ
７１４１  ｇｔｇｔｔｃｔｇａａ  ｔｇｃｔｃｔｃａｇｔ  ａａａｔａｇｔａａｔ  ｇａａｔｔａｔｃａａ  ａｇｇｔａｔａｇｔａ  ａｔａｔｃｔｔｔｔａ
７２０１  ｔｇｔｔｃａｔｇｇａ  ｔａｔｔｔｇｔａａｃ  ｃｃａｔｃｇｇａａａ  ａｃｔｃｃｔｇｃｔｔ  ｔａｇｃａａｇａｔｔ  ｔｔｃｃｃｔｇｔａｔ
７２６１  ｔｇｃｔｇａａａｔｇ  ｔｇａｔｔｔｃｔｃｔ  ｔｇａｔｔｔｃａａｃ  ｃｔａｔｃａｔａｇｇ  ａｃｇｔｔｔｃｔａｔ  ａａｇａｔｇｃｇｔｇ
７３２１  ｔｔｔｃｔｔｇａｇａ  ａｔｔｔａａｃａｔｔ  ｔａｃａａｃｃｔｔｔ  ｔｔａａｇｔｃｃｔｔ  ｔｔａｔｔａａｃａｃ  ｇｇｔｇｔｔａｔｃｇ
７３８１  ｔｔｔｔｃｔａａｃａ  ｃｇａｔｇｔｇａａｔ  ａｔｔａｔｃｔｇｔｇ  ｇｃｔａｇａｔａｇｔ  ａａａｔａｔａａｔｇ  ｔｇａｇａｃｇｔｔｇ
７４４１  ｔｇａｃｇｔｔｔｔａ  ｇｔｔｃａｇａａｔａ  ａａａｃａａｔｔｃａ  ｃａｇｔｃｔａａａｔ  ｃｔｔｔｔｃｇｃａｃ  ｔｔｇａｔｃｇａａｔ
７５０１  ａｔｔｔｃｔｔｔａａ  ａａａｔｇｇｃａａｃ  ｃｔｇａｇｃｃａｔｔ  ｇｇｔａａａａｃｃｔ  ｔｃｃａｔｇｔｇａｔ  ａｃｇａｇｇｇｃｇｃ
７５６１  ｇｔａｇｔｔｔｇｃａ  ｔｔａｔｃｇｔｔｔｔ  ｔａｔｃｇｔｔｔｃａ  ａｔｃｔｇｇｔｃｔｇ  ａｃｃｔｃｃｔｔｇｔ  ｇｔｔｔｔｇｔｔｇａ
７６２１  ｔｇａｔｔｔａｔｇｔ  ｃａａａｔａｔｔａｇ  ｇａａｔｇｔｔｔｔｃ  ａｃｔｔａａｔａｇｔ  ａｔｔｇｇｔｔｇｃｇ  ｔａａｃａａａｇｔｇ
７６８１  ｃｇｇｔｃｃｔｇｃｔ  ｇｇｃａｔｔｃｔｇｇ  ａｇｇｇａａａｔａｃ  ａａｃｃｇａｃａｇａ  ｔｇｔａｔｇｔａａｇ  ｇｃｃａａｃｇｔｇｃ
７７４１  ｔｃａａａｔｃｔｔｃ  ａｔａｃａｇａａａｇ  ａｔｔｔｇａａｇｔａ  ａｔａｔｔｔｔａａｃ  ｃｇｃｔａｇａｔｇａ  ａｇａｇｃａａｇｃｇ
７８０１  ｃａｔｇｇａｇｃｇａ  ｃａａａａｔｇａａｔ  ａａａｇａａｃａａｔ  ｃｔｇｃｔｇａｔｇａ  ｔｃｃｃｔｃｃｇｔｇ  ｇａｔｃｔｇａｔｔｃ
７８６１  ｇｔｇｔａａａａａａ  ｔａｔｇｃｔｔａａｔ  ａｇｃａｃｃａｔｔｔ  ｃｔａｔｇａｇｔｔａ  ｃｃｃｔｇａｔｇｔｔ  ｇｔａａｔｔｇｃａｔ
７９２１  ｇｔａｔａｇａａｃａ  ｔａａｇｇｔｇｔｃｔ  ｃｔｇｇａａｇｃａｔ  ｔｃａｇａｇｃａａｔ  ｔｇａｇｇｃａｇｃｇ  ｔｔｇｇｔｇａａｇｃ
７９８１  ａｃｇａｔａａｔａａ  ｔａｔｇａａｇｇａｔ  ｔａｔｔｃｃｃｔｇｇ  ｔｇｇｔｔｇａｃｔｇ  ａｔｃａｃｃａｔａａ  ｃｔｇｃｔａａｔｃａ
８０４１  ｔｔｃａａａｃｔａｔ  ｔｔａｇｔｃｔｇｔｇ  ａｃａｇａｇｃｃａａ  ｃａｃｇｃａｇｔｃｔ  ｇｔｃａｃｔｇｔｃａ  ｇｇａａａｇｔｇｇｔ
８１０１  ａａａａｃｔｇｃａａ  ｃｔｃａａｔｔａｃｔ  ｇｃａａｔｇｃｃｃｔ  ｃｇｔａａｔｔａａｇ  ｔｇａａｔｔｔａｃａ  ａｔａｔｃｇｔｃｃｔ
８１６１  ｇｔｔｃｇｇａｇｇｇ  ａａｇａａｃｇｃｇｇ  ｇａｔｇｔｔｃａｔｔ  ｃｔｔｃａｔｃａｃｔ  ｔｔｔａａｔｔｇａｔ  ｇｔａｔａｔｇｃｔｃ
８２２１  ｔｃｔｔｔｔｃｔｇａ  ｃｇｔｔａｇｔｃｔｃ  ｃｇａｃｇｇｃａｇｇ  ｃｔｔｃａａｔｇａｃ  ｃｃａｇｇｃｔｇａｇ  ａａａｔｔｃｃｃｇｇ
８２８１  ａｃｃｃｔｔｔｔｔｇ  ｃｔｃａａｇａｇｃｇ  ａｔｇｔｔａａｔｔｔ  ｇｔｔｃａａｔｃａｔ  ｔｔｇｇｔｔａｇｇａ  ａａｇｃｇｇａｔｇｔ
８３４１  ｔｇｃｇｇｇｔｔｇｔ  ｔｇｔｔｃｔｇｃｇｇ  ｇｔｔｃｔｇｔｔｃｔ  ｔｃｇｔｔｇａｃａｔ  ｇａｇｇｔｔｇｃｃｃ  ｃｇｔａｔｔｃａｇｔ
８４０１  ｇｔｃｇｃｔｇａｔｔ  ｔｇｔａｔｔｇｔｃｔ  ｇａａｇｔｔｇｔｔｔ  ｔｔａｃｇｔｔａａｇ  ｔｔｇａｔｇｃａｇａ  ｔｃａａｔｔａａｔａ
８４６１  ｃｇａｔａｃｃｔｇｃ  ｇｔｃａｔａａｔｔｇ  ａｔｔａｔｔｔｇａｃ  ｇｔｇｇｔｔｔｇａｔ  ｇｇｃｃｔｃｃａｃｇ  ｃａｃｇｔｔｇｔｇａ
８５２１  ｔａｔｇｔａｇａｔｇ  ａｔａａｔｃａｔｔａ  ｔｃａｃｔｔｔａｃｇ  ｇｇｔｃｃｔｔｔｃｃ  ｇｇｔｇａｔｃｃｇａ  ｃａｇｇｔｔａｃｇｇ
８５８１  ｇｇｃｇｇｃｇａｃｃ  ｔｇｃｃｔｇａｔｇｃ  ｇｇｔａｔｔｔｔｃｔ  ｃｃｔｔａｃｇｃａｔ  ｃｔｇｔｇｃｇｇｔａ  ｔｔｔｃａｃａｃｃｇ
８６４１  ｃａｔａｃｇｔｃａａ  ａｇｃａａｃｃａｔａ  ｇｔａｃｇｃｇｃｃｃ  ｔｇｔａｇｃｇｇｃｇ  ｃａｔｔａａｇｃｇｃ  ｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇ
８７０１  ｇｔｇｇｔｔａｃｇｃ  ｇｃａｇｃｇｔｇａｃ  ｃｇｃｔａｃａｃｔｔ  ｇｃｃａｇｃｇｃｃｔ  ｔａｇｃｇｃｃｃｇｃ  ｔｃｃｔｔｔｃｇｃｔ
８７６１  ｔｔｃｔｔｃｃｃｔｔ  ｃｃｔｔｔｃｔｃｇｃ  ｃａｃｇｔｔｃｇｃｃ  ｇｇｃｔｔｔｃｃｃｃ  ｇｔｃａａｇｃｔｃｔ  ａａａｔｃｇｇｇｇｇ
８８２１  ｃｔｃｃｃｔｔｔａｇ  ｇｇｔｔｃｃｇａｔｔ  ｔａｇｔｇｃｔｔｔａ  ｃｇｇｃａｃｃｔｃｇ  ａｃｃｃｃａａａａａ  ａｃｔｔｇａｔｔｔｇ
８８８１  ｇｇｔｇａｔｇｇｔｔ  ｃａｃｇｔａｇｔｇｇ  ｇｃｃａｔｃｇｃｃｃ  ｔｇａｔａｇａｃｇｇ  ｔｔｔｔｔｃｇｃｃｃ  ｔｔｔｇａｃｇｔｔｇ
８９４１  ｇａｇｔｃｃａｃｇｔ  ｔｃｔｔｔａａｔａｇ  ｔｇｇａｃｔｃｔｔｇ  ｔｔｃｃａａａｃｔｇ  ｇａａｃａａｃａｃｔ  ｃａａｃｔｃｔａｔｃ
９００１  ｔｃｇｇｇｃｔａｔｔ  ｃｔｔｔｔｇａｔｔｔ  ａｇａｃｃｔｇｃａｇ  ｇｃａｔｇｃａａｇｃ  ｔｔｇｇｃａｃｔｇｇ  ｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔ
９０６１  ａｃａａｃｇｔｃｇｔ  ｇａｃｔｇｇｇａａａ  ａｃｃｃｔｇｇｃｇｔ  ｔａｃｃｃａａｃｔｔ  ａａｔｃｇｃｃｔｔｇ  ｃａｇｃａｃａｔｃｃ
９１２１  ｃｃｃｔｔｔｃｇｃｃ  ａｇｃｔｇｇｃｇｔａ  ａｔａｇｃｇａａｇａ  ｇｇｃｃｃｇｃａｃｃ  ｇａｔｃｇｃｃｃｔｔ  ｃｃｃａａｃａｇｔｔ
９１８１  ｇｃｇｃａｇｃｃｔｇ  ａａｔｇｇｃｇａａｔ  ｇｃｇａｔｔｔａｔｔ  ｃａａｃａａａｇｃｃ  ｇｃｃｇｔｃｃｃｇｔ  ｃａａｇｔｃａｇｃｇ
９２４１  ｔａａｔｇｃｔｃｔｇ  ｃｃａｇｔｇｔｔａｃ  ａａｃｃａａｔｔａａ  ｃｃａａｔｔｃｔｇａ  ｔｔａｇａａａａａｃ  ｔｃａｔｃｇａｇｃａ
９３０１  ｔｃａａａｔｇａａａ  ｃｔｇｃａａｔｔｔａ  ｔｔｃａｔａｔｃａｇ  ｇａｔｔａｔｃａａｔ  ａｃｃａｔａｔｔｔｔ  ｔｇａａａａａｇｃｃ
９３６１  ｇｔｔｔｃｔｇｔａａ  ｔｇａａｇｇａｇａａ  ａａｃｔｃａｃｃｇａ  ｇｇｃａｇｔｔｃｃａ  ｔａｇｇａｔｇｇｃａ  ａｇａｔｃｃｔｇｇｔ
９４２１  ａｔｃｇｇｔｃｔｇｃ  ｇａｔｔｃｃｇａｃｔ  ｃｇｔｃｃａａｃａｔ  ｃａａｔａｃａａｃｃ  ｔａｔｔａａｔｔｔｃ  ｃｃｃｔｃｇｔｃａａ
９４８１  ａａａｔａａｇｇｔｔ  ａｔｃａａｇｔｇａｇ  ａａａｔｃａｃｃａｔ  ｇａｇｔｇａｃｇａｃ  ｔｇａａｔｃｃｇｇｔ  ｇａｇａａｔｇｇｃａ
９５４１  ａａａｇｃｔｔａｔｇ  ｃａｔｔｔｃｔｔｔｃ  ｃａｇａｃｔｔｇｔｔ  ｃａａｃａｇｇｃｃａ  ｇｃｃａｔｔａｃｇｃ  ｔｃｇｔｃａｔｃａａ
９６０１  ａａｔｃａｃｔｃｇｃ  ａｔｃａａｃｃａａａ  ｃｃｇｔｔａｔｔｃａ  ｔｔｃｇｔｇａｔｔｇ  ｃｇｃｃｔｇａｇｃｇ  ａｇａｃｇａａａｔａ
９６６１  ｃｇｃｇａｔｃｇｃｔ  ｇｔｔａａａａｇｇａ  ｃａａｔｔａｃａａａ  ｃａｇｇａａｔｃｇａ  ａｔｇｃａａｃｃｇｇ  ｃｇｃａｇｇａａｃａ
９７２１  ｃｔｇｃｃａｇｃｇｃ  ａｔｃａａｃａａｔａ  ｔｔｔｔｃａｃｃｔｇ  ａａｔｃａｇｇａｔａ  ｔｔｃｔｔｃｔａａｔ  ａｃｃｔｇｇａａｔｇ
９７８１  ｃｔｇｔｔｔｔｃｃｃ  ｇｇｇｇａｔｃｇｃａ  ｇｔｇｇｔｇａｇｔａ  ａｃｃａｔｇｃａｔｃ  ａｔｃａｇｇａｇｔａ  ｃｇｇａｔａａａａｔ
９８４１  ｇｃｔｔｇａｔｇｇｔ  ｃｇｇａａｇａｇｇｃ  ａｔａａａｔｔｃｃｇ  ｔｃａｇｃｃａｇｔｔ  ｔａｇｔｃｔｇａｃｃ  ａｔｃｔｃａｔｃｔｇ
９９０１  ｔａａｃａｔｃａｔｔ  ｇｇｃａａｃｇｃｔａ  ｃｃｔｔｔｇｃｃａｔ  ｇｔｔｔｃａｇａａａ  ｃａａｃｔｃｔｇｇｃ  ｇｃａｔｃｇｇｇｃｔ
９９６１  ｔｃｃｃａｔａｃａａ  ｔｃｇａｔａｇａｔｔ  ｇｔｃｇｃａｃｃｔｇ  ａｔｔｇｃｃｃｇａｃ  ａｔｔａｔｃｇｃｇａ  ｇｃｃｃａｔｔｔａｔ
１００２１  ａｃｃｃａｔａｔａａ  ａｔｃａｇｃａｔｃｃ  ａｔｇｔｔｇｇａａｔ  ｔｔａａｔｃｇｃｇｇ  ｃｔｔｃｇａｇｃａａ  ｇａｃｇｔｔｔｃｃｃ
１００８１  ｇｔｔｇａａｔａｔｇ  ｇｃｔｃａｔａａｃａ  ｃｃｃｃｔｔｇｔａｔ  ｔａｃｔｇｔｔｔａｔ  ｇｔａａｇｃａｇａｃ  ａｇｔｔｔｔａｔｔｇ
１０１４１  ｔｔｃａｔｇａｔｇａ  ｔａｔａｔｔｔｔｔａ  ｔｃｔｔｇｔｇｃａａ  ｔｇｔａａｃａｔｃａ  ｇａｇａｔｔｔｔｇａ  ｇａｃａｃａａｃｇｔ
１０２０１  ｇｇｃｔｔｔｇｔｔｇ  ａａｔａａａｔｃｇａ  ａｃｔｔｔｔｇｃｔｇ  ａｇｔｔｇａａｇｇａ  ｔｃａｇａｔｃａｃｇ  ｃａｔｃｔｔｃｃｃｇ
１０２６１  ａｃａａｃｇｃａｇａ  ｃｃｇｔｔｃｃｇｔｇ  ｇｃａａａｇｃａａａ  ａｇｔｔｃａａａａｔ  ｃａｃｃａａｃｔｇｇ  ｔｃｃａｃｃｔａｃａ
１０３２１  ａｃａａａｇｃｔｃｔ  ｃａｔｃａａｃｃｇｔ  ｇｇｃｔｃｃｃｔｃａ  ｃｔｔｔｃｔｇｇｃｔ  ｇｇａｔｇａｔｇｇｇ  ｇｃｇａｔｔｃａｇｇ
１０３８１  ｃｃｔｇｇｔａｔｇａ  ｇｔｃａｇｃａａｃａ  ｃｃｔｔｃｔｔｃａｃ  ｇａｇｇｃａｇａｃｃ  ｔｃｔｃｇａｃｇｇａ  ｇｔｔｃｃａｃｔｇａ
１０４４１  ｇｃｇｔｃａｇａｃｃ  ｃｃｇｔａｇａａａａ  ｇａｔｃａａａｇｇａ  ｔｃｔｔｃｔｔｇａｇ  ａｔｃｃｔｔｔｔｔｔ  ｔｃｔｇｃｇｃｇｔａ
１０５０１  ａｔｃｔｇｃｔｇｃｔ  ｔｇｃａａａｃａａａ  ａａａａｃｃａｃｃｇ  ｃｔａｃｃａｇｃｇｇ  ｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｇｇａｔｃａａ
１０５６１  ｇａｇｃｔａｃｃａａ  ｃｔｃｔｔｔｔｔｃｃ  ｇａａｇｇｔａａｃｔ  ｇｇｃｔｔｃａｇｃａ  ｇａｇｃｇｃａｇａｔ  ａｃｃａａａｔａｃｔ
１０６２１  ｇｔｔｃｔｔｃｔａｇ  ｔｇｔａｇｃｃｇｔａ  ｇｔｔａｇｇｃｃａｃ  ｃａｃｔｔｃａａｇａ  ａｃｔｃｔｇｔａｇｃ  ａｃｃｇｃｃｔａｃａ
１０６８１  ｔａｃｃｔｃｇｃｔｃ  ｔｇｃｔａａｔｃｃｔ  ｇｔｔａｃｃａｇｔｇ  ｇｃｔｇｃｔｇｃｃａ  ｇｔｇｇｃｇａｔａａ  ｇｔｃｇｔｇｔｃｔｔ
１０７４１  ａｃｃｇｇｇｔｔｇｇ  ａｃｔｃａａｇａｃｇ  ａｔａｇｔｔａｃｃｇ  ｇａｔａａｇｇｃｇｃ  ａｇｃｇｇｔｃｇｇｇ  ｃｔｇａａｃｇｇｇｇ
１０８０１  ｇｇｔｔｃｇｔｇｃａ  ｃａｃａｇｃｃｃａｇ  ｃｔｔｇｇａｇｃｇａ  ａｃｇａｃｃｔａｃａ  ｃｃｇａａｃｔｇａｇ  ａｔａｃｃｔａｃａｇ
１０８６１  ｃｇｔｇａｇｃｔａｔ  ｇａｇａａａｇｃｇｃ  ｃａｃｇｃｔｔｃｃｃ  ｇａａｇｇｇａｇａａ  ａｇｇｃｇｇａｃａｇ  ｇｔａｔｃｃｇｇｔａ
１０９２１  ａｇｃｇｇｃａｇｇｇ  ｔｃｇｇａａｃａｇｇ  ａｇａｇｃｇｃａｃｇ  ａｇｇｇａｇｃｔｔｃ  ｃａｇｇｇｇｇａａａ  ｃｇｃｃｔｇｇｔａｔ
１０９８１  ｃｔｔｔａｔａｇｔｃ  ｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔ  ｔｃｇｃｃａｃｃｔｃ  ｔｇａｃｔｔｇａｇｃ  ｇｔｃｇａｔｔｔｔｔ  ｇｔｇａｔｇｃｔｃｇ
１１０４１  ｔｃａｇｇｇｇｇｇｃ  ｇｇａｇｃｃｔａｔｇ  ｇａａａａａｃｇｃｃ  ａｇｃａａｃｇｃｇｇ  ｃｃｔｔｔｔｔａｃｇ  ｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃ
１１１０１  ｔｔｔｔｇｃｔｇｇｃ  ｃｔｔｔｔｇｃｔｃａ  ｃａｔｇｔ
ｐｈＦＩＸ３９ｖ２（配列番号：２６）
ＬＯＣＵＳ              ｐｈＦＩＸ３９ｖ２                            １１１９９  ｂｐ        ＤＮＡ          ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＵＮＡ
ＦＥＡＴＵＲＥＳ                          Ｌｏｃａｔｉｏｎ／Ｑｕａｌｉｆｉｅｒｓ
ｒｅｐｅａｔ＿ｒｅｇｉｏｎ      １．．１４１
／ｌａｂｅｌ＝"ＡＡＶ２  ＩＴＲ"
ｅｎｈａｎｃｅｒ                １５２．．４７２
／ｌａｂｅｌ＝"ＡｐｏＥ  ＨＣＲ−１"
ｐｒｏｍｏｔｅｒ                ４８２．．８７８
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＡＡＴ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ"
ＣＤＳ                          ｏｒｄｅｒ（９０８．．９９５，２４３４．．３７３１）
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＦＩＸ  ＣＤＳ"
ｉｎｔｒｏｎ                    ９９６．．２４３３
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＦＩＸ  Ｉｎｔｒｏｎ"
３'ＵＴＲ                      ３７３２．．３７７９
／ｌａｂｅｌ＝"ｈＦ９  ３'  ＵＴＲ"
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ            ３８２０．．４０４７
／ｌａｂｅｌ＝"ｂＧＨ＿ＰＡ  ｔｅｒｍ"          ｒｅｐｅａｔ＿ｒｅｇｉｏｎ      ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（４０９７．．４２３７）
／ｌａｂｅｌ＝"ＡＡＶ２  ＩＴＲ"
ｍｉｓｃ＿ｆｅａｔｕｒｅ        ４２４８．．８７１３
／ｌａｂｅｌ＝"Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｓｔｕｆｆｅｒ"
ｒｅｐ＿ｏｒｉｇｉｎ            ８７５４．．９０６０
／ｌａｂｅｌ＝"Ｆ１  Ｏｒｉ"
ＣＤＳ                          ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（９３５５．．１０１７０）
／ｌａｂｅｌ＝"Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ"
ｒｅｐ＿ｏｒｉｇｉｎ            ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１０５２７．．１１１９４）
／ｌａｂｅｌ＝"ｐＵＣ  Ｏｒｉ"
ＯＲＩＧＩＮ
１  ｃｃｔｇｃａｇｇｃａ  ｇｃｔｇｃｇｃｇｃｔ  ｃｇｃｔｃｇｃｔｃａ  ｃｔｇａｇｇｃｃｇｃ  ｃｃｇｇｇｃａａａｇ  ｃｃｃｇｇｇｃｇｔｃ
６１  ｇｇｇｃｇａｃｃｔｔ  ｔｇｇｔｃｇｃｃｃｇ  ｇｃｃｔｃａｇｔｇａ  ｇｃｇａｇｃｇａｇｃ  ｇｃｇｃａｇａｇａｇ  ｇｇａｇｔｇｇｃｃａ
１２１  ａｃｔｃｃａｔｃａｃ  ｔａｇｇｇｇｔｔｃｃ  ｔｇｃｇｇｃｃｔａｇ  ｔａｇｇｃｔｃａｇａ  ｇｇｃａｃａｃａｇｇ  ａｇｔｔｔｃｔｇｇｇ
１８１  ｃｔｃａｃｃｃｔｇｃ  ｃｃｃｃｔｔｃｃａａ  ｃｃｃｃｔｃａｇｔｔ  ｃｃｃａｔｃｃｔｃｃ  ａｇｃａｇｃｔｇｔｔ  ｔｇｔｇｔｇｃｔｇｃ
２４１  ｃｔｃｔｇａａｇｔｃ  ｃａｃａｃｔｇａａｃ  ａａａｃｔｔｃａｇｃ  ｃｔａｃｔｃａｔｇｔ  ｃｃｃｔａａａａｔｇ  ｇｇｃａａａｃａｔｔ
３０１  ｇｃａａｇｃａｇｃａ  ａａｃａｇｃａａａｃ  ａｃａｃａｇｃｃｃｔ  ｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃ  ｔｇａｃｃｔｔｇｇａ  ｇｃｔｇｇｇｇｃａｇ
３６１  ａｇｇｔｃａｇａｇａ  ｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇ  ｃｃｃａｔｇｃｃａｃ  ｃｔｃｃａａｃａｔｃ  ｃａｃｔｃｇａｃｃｃ  ｃｔｔｇｇａａｔｔｔ
４２１  ｃｇｇｔｇｇａｇａｇ  ｇａｇｃａｇａｇｇｔ  ｔｇｔｃｃｔｇｇｃｇ  ｔｇｇｔｔｔａｇｇｔ  ａｇｔｇｔｇａｇａｇ  ｇｇｇｔａｃｃｃｇｇ
４８１  ｇｇａｔｃｔｔｇｃｔ  ａｃｃａｇｔｇｇａａ  ｃａｇｃｃａｃｔａａ  ｇｇａｔｔｃｔｇｃａ  ｇｔｇａｇａｇｃａｇ  ａｇｇｇｃｃａｇｃｔ
５４１  ａａｇｔｇｇｔａｃｔ  ｃｔｃｃｃａｇａｇａ  ｃｔｇｔｃｔｇａｃｔ  ｃａｃｇｃｃａｃｃｃ  ｃｃｔｃｃａｃｃｔｔ  ｇｇａｃａｃａｇｇａ
６０１  ｃｇｃｔｇｔｇｇｔｔ  ｔｃｔｇａｇｃｃａｇ  ｇｔａｃａａｔｇａｃ  ｔｃｃｔｔｔｃｇｇｔ  ａａｇｔｇｃａｇｔｇ  ｇａａｇｃｔｇｔａｃ
６６１  ａｃｔｇｃｃｃａｇｇ  ｃａａａｇｃｇｔｃｃ  ｇｇｇｃａｇｃｇｔａ  ｇｇｃｇｇｇｃｇａｃ  ｔｃａｇａｔｃｃｃａ  ｇｃｃａｇｔｇｇａｃ
７２１  ｔｔａｇｃｃｃｃｔｇ  ｔｔｔｇｃｔｃｃｔｃ  ｃｇａｔａａｃｔｇｇ  ｇｇｔｇａｃｃｔｔｇ  ｇｔｔａａｔａｔｔｃ  ａｃｃａｇｃａｇｃｃ
７８１  ｔｃｃｃｃｃｇｔｔｇ  ｃｃｃｃｔｃｔｇｇａ  ｔｃｃａｃｔｇｃｔｔ  ａａａｔａｃｇｇａｃ  ｇａｇｇａｃａｇｇｇ  ｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃ
８４１  ｔｃａｇｃｔｔｃａｇ  ｇｃａｃｃａｃｃａｃ  ｔｇａｃｃｔｇｇｇａ  ｃａｇｔｇａａｔａｃ  ｃａｃｔｔｔｃａｃａ  ａｔｃｔｇｃｔａｇｃ
９０１  ａａａｇｇｔｔａｔｇ  ｃａｇａｇｇｇｔｇａ  ａｃａｔｇａｔｃａｔ  ｇｇｃｔｇａｇａｇｃ  ｃｃｔｇｇｃｃｔｇａ  ｔｃａｃｃａｔｃｔｇ
９６１  ｃｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ｔａｃｃｔｇｃｔｇｔ  ｃｔｇｃｔｇａａｔｇ  ｔａｃａｇｇｔｔｔｇ  ｔｔｔｃｃｔｔｔｔｔ  ｔａｔａａｔａｃａｔ
１０２１  ｔｇａｇｔａｔｇｃｔ  ｔｇｃｃｔｔｔｔａｇ  ａｔａｔａｇａａａｔ  ａｔｃｔｇａｔｔｃｔ  ｇｔｃｔｔｃｔｔｃａ  ｃｔａａａｔｔｔｔｇ
１０８１  ａｔｔａｃａｔｇａｔ  ｔｔｇａｃａｇｃａａ  ｔａｔｔｇａａｇａｇ  ｔｃｔａａｃａｇｃｃ  ａｇｃａｃｃｃａｇｇ  ｔｔｇｇｔａａｇｔａ
１１４１  ｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔ  ｇｔｔａｇｃｔａｇｇ  ｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔ  ｃｔｔｃａｃｔｔｔｔ  ａａａａｃｔａａａｔ  ａｇａｔｇｇａｃａａ
１２０１  ｔｇｃｔｔａｔｇａｔ  ｇｃａａｔａａｇｇｔ  ｔｔａａｔａａａｃａ  ｃｔｇｔｔｃａｇｔｔ  ｃａｇｔａｔｔｔｇｇ  ｔｃａｔｇｔａａｔｔ
１２６１  ｃｃｔｇｔｔａａａａ  ａａｃａｇｔｃａｔｃ  ｔｃｃｔｔｇｇｔｔｔ  ａａａａａａａｔｔａ  ａａａｇｔｇｇｇａａ  ａａｃａａａｇａａａ
１３２１  ｔａｇｃａｇａａｔａ  ｔａｇｔｇａａａａａ  ａａａｔａａｃｃａｃ  ａｇｔａｔｔｔｔｔｇ  ｔｔｔｇｇａｃｔｔａ  ｃｃａｃｔｔｔｇａａ
１３８１  ａｔｃａａａｔｔｇｇ  ｇａａａｃａａａａｇ  ｃａｃａａａｃａｇｔ  ｇｇｃｃｔｔａｔｔｔ  ａｃａｃａａａａａｇ  ｔｃｔｇａｔｔｔｔａ
１４４１  ａｇａｔａｔｇｔｇａ  ｃａａｔｔｃａａｇｇ  ｔｔｔｃａｇａａｇｔ  ａｔｇｔａａｇｇａｇ  ｇｔｇｔｇｔｃｔｃｔ  ａａｔｔｔｔｔｔａａ
１５０１  ａｔｔａｔａｔａｔｃ  ｔｔｃａａｔｔｔａａ  ａｇｔｔｔｔａｇｔｔ  ａａａａｃａｔａａａ  ｇａｔｔａａｃｃｔｔ  ｔｃａｔｔａｇｃａａ
２１０１  ｃｃｔｃａａｔｇａｇ  ｃｔａｔｔｔｔｃａａ  ｇｔｇａｔｇａｃａａ  ａｇｔｇｔｇａａｇｔ  ｔａａｇｇｇｃｔｃａ  ｔｔｔｇａｇａａｃｔ
２１６１  ｔｔｃｔｔｔｔｔｃａ  ｔｃｃａａａｇｔａａ  ａｔｔｃａａａｔａｔ  ｇａｔｔａｇａａａｔ  ｃｔｇａｃｃｔｔｔｔ  ａｔｔａｃｔｇｇａａ
２２２１  ｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ  ｔａａａａｇｔａａａ  ａｔｔｇａａｔｔｔｔ  ａａｔｔｃｃｔａａａ  ｔｃｔｃｃａｔｇｔｇ  ｔａｔａｃａｇｔａｃ
２２８１  ｔｇｔｇｇｇａａｃａ  ｔｃａｃａｇａｔｔｔ  ｔｇｇｃｔｃｃａｔｇ  ｃｃｃｔａａａｇａｇ  ａａａｔｔｇｇｃｔｔ  ｔｃａｇａｔｔａｔｔ
２３４１  ｔｇｇａｔｔａａａａ  ａｃａａａｇａｃｔｔ  ｔｃｔｔａａｇａｇａ  ｔｇｔａａａａｔｔｔ  ｔｃａｔｇａｔｇｔｔ  ｔｔｃｔｔｔｔｔｔｇ
２４０１  ｃｔａａａａｃｔａａ  ａｇａａｔｔａｔｔｃ  ｔｔｔｔａｃａｔｔｔ  ｃａｇｔｔｔｔｔｃｔ  ｔｇａｔｃａｔｇａａ  ａａｔｇｃｃａａｃａ
２４６１  ａａａｔｔｃｔｇａａ  ｔａｇａｃｃａａａｇ  ａｇｇｔａｔａａｃｔ  ｃｔｇｇｃａａｇｃｔ  ｔｇａａｇａｇｔｔｔ  ｇｔａｃａｇｇｇｇａ
２５２１  ａｔｃｔｇｇａｇａｇ  ａｇａｇｔｇｔａｔｇ  ｇａａｇａｇａａｇｔ  ｇｃａｇｃｔｔｔｇａ  ｇｇａａｇｃｃａｇａ  ｇａａｇｔｇｔｔｔｇ
２５８１  ａａａａｔａｃａｇａ  ｇａｇａａｃａａｃｔ  ｇａａｔｔｔｔｇｇａ  ａｇｃａｇｔａｔｇｔ  ｇｇａｔｇｇｔｇａｔ  ｃａａｔｇｔｇａｇａ
２６４１  ｇｃａａｔｃｃｃｔｇ  ｃｔｔｇａａｔｇｇｇ  ｇｇｇａｇｃｔｇｔａ  ａａｇａｔｇａｔａｔ  ｃａａｃａｇｃｔａｔ  ｇａａｔｇｔｔｇｇｔ
２７０１  ｇｔｃｃｃｔｔｔｇｇ  ａｔｔｔｇａｇｇｇｇ  ａａａａａｃｔｇｔｇ  ａｇｃｔｔｇａｔｇｔ  ｇａｃｃｔｇｔａａｔ  ａｔｃａａｇａａｔｇ
２７６１  ｇｃａｇｇｔｇｔｇａ  ｇｃａａｔｔｔｔｇｃ  ａａｇａａｔｔｃｔｇ  ｃｔｇａｔａａｃａａ  ａｇｔｇｇｔｃｔｇｔ  ａｇｃｔｇｃａｃｔｇ
２８２１  ａｇｇｇａｔａｔａｇ  ｇｃｔｇｇｃｔｇａａ  ａａｃｃａｇａａｇａ  ｇｃｔｇｔｇａａｃｃ  ｔｇｃａｇｔｇｃｃｔ  ｔｔｔｃｃｃｔｇｔｇ
２８８１  ｇｇａｇａｇｔｇｔｃ  ｔｇｔｇａｇｃｃａａ  ａｃｃａｇｃａａｇｃ  ｔｇａｃｔａｇｇｇｃ  ｔｇａａｇｃａｇｔｃ  ｔｔｔｃｃｔｇａｔｇ
２９４１  ｔａｇａｔｔａｔｇｔ  ｇａａｔａｇｃａｃｔ  ｇａｇｇｃｔｇａｇａ  ｃａａｔｃｃｔｔｇａ  ｃａａｔａｔｃａｃｔ  ｃａｇａｇｃａｃａｃ
３００１  ａｇａｇｃｔｔｃａａ  ｔｇａｃｔｔｃａｃｃ  ａｇｇｇｔｇｇｔａｇ  ｇａｇｇｇｇａｇｇａ  ｔｇｃｃａａｇｃｃｔ  ｇｇｇｃａｇｔｔｃｃ
３０６１  ｃｃｔｇｇｃａｇｇｔ  ａｇｔｇｃｔｃａａｔ  ｇｇａａａａｇｔｇｇ  ａｔｇｃｃｔｔｔｔｇ  ｔｇｇａｇｇｔｔｃａ  ａｔｔｇｔａａａｔｇ
３１２１  ａｇａａｇｔｇｇａｔ  ｔｇｔｇａｃｔｇｃａ  ｇｃｃｃａｃｔｇｔｇ  ｔｇｇａａａｃｔｇｇ  ａｇｔｃａａｇａｔｔ  ａｃｔｇｔｇｇｔｇｇ
３１８１  ｃｔｇｇａｇａｇｃａ  ｃａａｔａｔｔｇａｇ  ｇａａａｃｔｇａｇｃ  ａｃａｃｔｇａｇｃａ  ｇａａｇａｇｇａａｔ  ｇｔｇａｔｃａｇｇａ
３２４１  ｔｔａｔｃｃｃｃｃａ  ｃｃａｃａａｃｔａｃ  ａａｔｇｃｔｇｃｔａ  ｔｃａａｃａａｇｔａ  ｃａａｃｃａｔｇａｃ  ａｔｔｇｃｃｃｔｃｃ
３３０１  ｔｇｇａａｃｔｇｇａ  ｔｇａａｃｃｃｃｔｇ  ｇｔｃｔｔｇａａｃａ  ｇｃｔａｔｇｔｇａｃ  ａｃｃｃａｔｃｔｇｔ  ａｔｔｇｃｔｇａｔａ
３３６１  ａａｇａｇｔａｃａｃ  ｃａａｃａｔｃｔｔｃ  ｔｔｇａａａｔｔｔｇ  ｇｇｔｃｔｇｇａｔａ  ｔｇｔｇｔｃｔｇｇｃ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇｇ
３４２１  ｔｇｔｔｃｃａｔａａ  ａｇｇｃａｇｇｔｃｔ  ｇｃｃｃｔｇｇｔａｔ  ｔｇｃａｇｔａｔｔｔ  ｇａｇｇｇｔｇｃｃｔ  ｃｔｇｇｔｇｇａｔａ
３４８１  ｇａｇｃａａｃｃｔｇ  ｃｔｔｇｃｔｇａｇｃ  ａｃｃａａｇｔｔｔａ  ｃａａｔｃｔａｃａａ  ｃａａｔａｔｇｔｔｃ  ｔｇｔｇｃａｇｇｇｔ
３５４１  ｔｃｃａｔｇａａｇｇ  ｔｇｇｔａｇａｇａｃ  ａｇｃｔｇｃｃａｇｇ  ｇａｇａｔｔｃｔｇｇ  ｇｇｇｔｃｃｃｃａｔ  ｇｔｇａｃｔｇａｇｇ
３６０１  ｔｇｇａｇｇｇａａｃ  ｃａｇｃｔｔｃｃｔｇ  ａｃｔｇｇｇａｔｔａ  ｔｃａｇｃｔｇｇｇｇ  ｔｇａｇｇａｇｔｇｔ  ｇｃｔａｔｇａａｇｇ
３６６１  ｇａａａｇｔａｔｇｇ  ｇａｔｃｔａｃａｃａ  ａａａｇｔａｔｃｃａ  ｇａｔａｔｇｔｇａａ  ｃｔｇｇａｔｔａａｇ  ｇａｇａａａａｃｃａ
３７２１  ａｇｃｔｇａｃｔｔｇ  ａｔｇａａａｇａｔｇ  ｇａｔｔｔｃｃａａｇ  ｇｔｔａａｔｔｃａｔ  ｔｇｇａａｔｔｇａａ  ａａｔｔａａｃａｇａ
３７８１  ｇａｔｃｔａｇａｇｃ  ｔｇａａｔｔｃｃｔｇ  ｃａｇｃｃａｇｇｇｇ  ｇａｔｃａｇｃｃｔｃ  ｔａｃｔｇｔｇｃｃｔ  ｔｃｔａｇｔｔｇｃｃ
３８４１  ａｇｃｃａｔｃｔｇｔ  ｔｇｔｔｔｇｃｃｃｃ  ｔｃｃｃｃｃｔｔｇｃ  ｃｔｔｃｃｔｔｇａｃ  ｃｃｔｇｇａａｇｇｔ  ｇｃｃａｃｔｃｃｃａ
３９０１  ｃｔｇｔｃｃｔｔｔｃ  ｃｔａａｔａａａａｔ  ｇａｇｇａａａｔｔｇ  ｃａｔｃａｃａｔｔｇ  ｔｃｔｇａｇｔａｇｇ  ｔｇｔｃａｔｔｃｔａ
３９６１  ｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｃａｇｇａｃａｇｃａ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｔｔｇｇｇａａｇａｃ  ａａｔａｇｃａｇｇｃ
４０２１  ａｔｇｃｔｇｇｇｇａ  ｔｇｃａｇｔｇｇｇｃ  ｔｃｔａｔｇｇｃｔｔ  ｃｔｇａｇｇｃａｇａ  ａａｇａａｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｃｇａ
４０８１  ｇａｔｃｃａｃｔａｇ  ｇｇｃｃｇｃａｇｇａ  ａｃｃｃｃｔａｇｔｇ  ａｔｇｇａｇｔｔｇｇ  ｃｃａｃｔｃｃｃｔｃ  ｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔ
４１４１  ｃｇｃｔｃｇｃｔｃａ  ｃｔｇａｇｇｃｃｇｇ  ｇｃｇａｃｃａａａｇ  ｇｔｃｇｃｃｃｇａｃ  ｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔ  ｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇ
４２０１  ｇｃｃｔｃａｇｔｇａ  ｇｃｇａｇｃｇａｇｃ  ｇｃｇｃａｇｃｔｇｃ  ｃｔｇｃａｇｇｇｇｃ  ｃｃａｔｇｇｇｃａｇ  ａｔｇｃａｃｃａｃｃ
４２６１  ｔｇｔｃｔｃａｇｔｇ  ｃａａａｇｃｃｃｔｇ  ｃｃｔａａｇｔａｇｇ  ｃｔｇｇｔｃａｔａａ  ｇａｃｃａｔｇｔｇｔ  ｃｔｇｇｃｔｇｔａａ
４３２１  ｃｔｃｃａａｔｔｇａ  ｔｔｇｔｃａｇｃａｔ  ｃａａｔａａａａｃｔ  ｔｇｇｃｃａａｃａｃ  ｔｇｔｔａｔａｔａｃ  ｔｇｇｔａｔｔｇａｔ
４３８１  ａｇｔｔａｃａａｃｔ  ｇａａｃａｔａｔｔｔ  ｇｔｔｔａａｇｃａａ  ｔｔｇｇａａｔｔａａ  ｇａａｔｔｃａｃａｔ  ｇｃａａｔｇａｔａｔ
４４４１  ｃａｇｇｇｔｃｃｔｔ  ｃｔｃｃｔｃｔｇｇｔ  ｔａｇｔｇｔａｔｔｇ  ｇｇｇｇｇａａａｔｔ  ｇｇａｃａｔｃｔｃｔ  ｃａｇｃｔｃａｇｔａ
４５０１  ｇｇｃｔａｇｔｔａｇ  ｇｃｃａｇｇａｔｇｇ  ａｔｇａｃａｔｃｃａ  ｃａｇｃｃｃｃｔｇｇ  ｇｃａｇａｇａｇａｔ  ｔａｔｇａｔｇｔａｇ
４５６１  ｃｔａｇｔｃｔｇａｃ  ｔｃｃｔｇａｃａａａ  ｇａｃｔｔｇｃｔｔｃ  ｃｔｇｇａｇｃｔｔｃ  ｔａｃｔａｃｔｔｔｃ  ｔｇｇｔｇｇａｔｇｇ
４６２１  ｃｔａａｇａａａｔａ  ｔｇｇｔｔｇｔｇｔｔ  ｃｔｔｔｔａａｇｔｃ  ｔｇａａｇａｇｃａｔ  ｔａｔｔｔｔｔｇｃｃ  ａａｃｃｃｃｔｇａｃ
４６８１  ｃａａａｃａｔｃｃｔ  ｔｇｃｃａａｇｇａａ  ａａｇｇｃｃｔａａａ  ａｔａｔａｔｔｔｇｃ  ａｔｔｔａａａｇａｔ  ａｔｔａｃａａａｃｔ
４７４１  ａｃｔｔｇｇｔｔｔｔ  ｇｇａａｔｇｔｔｔｇ  ｇｃｃｔｔｔｃａｇｇ  ａｔｃａｔａｇｃｔａ  ｔｃａａａａｔａｔｔ  ａｇｃｔａｔｔｔｇｇ
４８０１  ｇｇｔａｔｇａｇａｔ  ｇｔｃｔｇｃｔｔｇｇ  ｔｃａａｇｇａｃａａ  ｇｔｔｃｔｔａａａｇ  ａｃａｔｃａｔｇｔｔ  ｇｇｇｇａａｔａａｔ
４８６１  ｇｇｇｇａａａａｔｇ  ｇｇａａｇｇｃｔｔａ  ｔｇｃｔｃｔｇａｇｔ  ａａｇａｃａｔｃｔｇ  ａｇｔｔａｔｃａｔｃ  ｔｇｔｃａａａｃａｔ
４９２１  ｔｔｔｔｇｔｔａｇｔ  ｃａｔａｇｔｃｔａａ  ｔｇｇｇａｇｃｃｔｇ  ｔｔｔｔｃｃｃｔｃｔ  ｔｔａａｔａｔａｃａ  ｔｔｃａｃａｔｃｔｇ
４９８１  ａａｔｔｔａｔｇｃｔ  ｃｔｔｃａｔｔｇａｃ  ａａｔｇｃｃａｇｃｃ  ｃａｇａａｃａａｃａ  ｇｃｔｃｔｔａｃｃｃ  ｔｔｔｇｇｔｔｔｔｃ
５０４１  ｔｔｃｃｔａａｃｃｔ  ｔｔａａｃｔｃｃａａ  ｔｇｔａａｃｃａｔｔ  ａｃｃｔｇｃｃａｔｔ  ｔｃａｇｔａａａａｃ  ｃａｔｔａｔｔｃｔｃ
５１０１  ｃｃｔａｃｔｔａｃｃ  ｃａｃｃｃａａｇｔｔ  ｇｔａｃａａｔａａａ  ｇａｇｔｇｔｔｔｇｃ  ｔｃｔｃａｃｔｃａｔ  ａｔａｃａａａｇｃａ
５１６１  ａａｔｔｃａｔｔｔｇ  ｔｔｔｇｔｇａｔｇｔ  ａｃａｇｃｔｔｇｃｔ  ａｔｇｃｃｃａｃａｇ  ａｔｇｔｇｇｔｔｔｇ  ｃｃｔａｇｔｃｃｔｔ
５２２１  ｔｇｃｔｃｔａｇｇｔ  ｃａｔｔｔｇａｃｔｇ  ｇｇａａｃａｇａｔｇ  ｇｇａｔｇｃｔｃａｃ  ｔｔｔｇｇｔｔｔｔｔ  ａａｔｇｇｔｔａａｃ
５２８１  ｔａｇｔｃａｔｔｇａ  ａａｔｇｃａｔｔｔｃ  ａｔｃａａａｔａａｔ  ｃｔｔａｇａｇｇａｔ  ａａｔｔｇｔｔｔａａ  ａｔｇｔｃｔｇｔｃｃ
５３４１  ａｇａｃｔａｇｃｔｔ  ｔｇｔａｇａｇｃｃａ  ｇｇｔｇｃｃａｔｔａ  ｃａｃａｔｇｔｃａｃ  ｃｔｔｃｔｔａｔｔｔ  ｃｔｃｔｔａａｔｔｇ
５４０１  ａａｔｔｔｔｔａｔｃ  ａｔｃｔｇａｇａｔａ  ｇｇａａｔａａｔａｇ  ａｇｇｇｃｔｔｔｔｔ  ｃａａｇｔｇａａｇａ  ｔａｔｔａｃｔａｔａ
５４６１  ｇｔｃｔａａａｇａｃ  ｃｔｔａｇｔｇｔａａ  ｃａｔｃｃｔｇｇｃｃ  ｃｃｔａａｇｇａａａ  ａａｃａａｇｔｔｃｔ  ｇｇｔｔｃａｔａｃａ
５５２１  ｔａｔａａｔａａｃｔ  ｔｔｇｃａｔｇｔｔａ  ｔｃｔｇｃｃａｃｔｇ  ａｇａｔｇｔｇｔｃｃ  ｔａａｔｃｃａａｃａ  ｇａａａｇｇａｔｔｇ
５５８１  ａａｔｃｔｃｔｇｔａ  ｇｃｔａｇｇｔｇｔａ  ｃａｇｇｇｃａａｇａ  ｇｃｔｇｔａｃａｇｇ  ｇａａｃｃｔｔｔａａ  ａｇａｔａｇｃｔｔｃ
５６４１  ａｇｇｃｃａａａｇｃ  ｔｇａｇｇａａａｇｔ  ｇｇａｔｇｇａｇａｃ  ｔｇｇｇｇａａａａｔ  ｇｃｔａａｇａｃａｔ  ｔｔｔａａａｇａｔｔ
５７０１  ｔｔｃｔｔｔａｇｇｔ  ｃａａａａａｔａｇａ  ａｔａａｇａａａｔａ  ｇａｃｃａｔｔｔｃｃ  ｃｔｇｇａｃａｔｔｔ  ｔｃｔｇｔａｇｇｔｔ
５７６１  ａａｔａｃｔｇｔｔａ  ａｃｔａｔｔｇｇｔａ  ａａｔｇｃａｔａｔｇ  ｃｔａｃａａｃｔｔａ  ａｔａｔｇｔｃｔｇｃ  ｔｔｔｇｔｇａｇｔｔ
５８２１  ｔａｇｃａｔｔｇｔｃ  ｔｃｃｔｔｇｔｃａｔ  ｔｃｃａｇａａａｔｇ  ａａａｔｇｇｃａａａ  ｔａｃａｔｔｔａａａ  ｔｃａｇａａｃｔａａ
５８８１  ａａａｇｇｇｇａａｃ  ａｇｇｇｔａｔａａａ  ｇｇｃｔｃａａｔｔｔ  ａｇｔｃａｃａｔｃａ  ｔｔｔｃｃｃｔｔｔｃ  ｔｃａｃｃｃａｃｃｃ
５９４１  ｃｃｔｔｔａａａｃｃ  ａｇａｔｇｔｔｔｇｃ  ｃａａｔｇｃａｔｔａ  ａｃａａｔｇｃａｇａ  ｔｇｔｔｔｃｃｔｇａ  ａａｇａａａｇｔｔｔ
６００１  ａｇｔａａｃｔｃａａ  ｇｃａｇａｃａｃｃｔ  ｔａｔｔｔｔｃｔｔｔ  ｔｃａａｇｃａｇａａ  ａａｇａｃｔａｔｇａ  ｇａｔｇｇｔｇｇｔｔ
６０６１  ｇｔｇｇｔｔｇｔｔｃ  ｔｇｇｇａｇｇｇａｇ  ａａｇａｔａｔａａａ  ｔｇａｔａｃａｃａｔ  ｔａｔｔｔｃａａａｔ  ｃａｔｔｔｃａｔｇａ
６１２１  ｃｃｔｃａｃｔｇｃａ  ｃａｃｔｔａｔａｇｔ  ｔａｔｔｇｔａｃｃｔ  ｇｔｔｇｔｃｔｔｔｔ  ｔｇｃｔｇｔｃａａｇ  ｃｃｔａｇｃｔａａｇ
６１８１  ａｔｃａｔｔｔｇｇａ  ａｔｇｔｔｃａａｇａ  ｔｃａｃｔｃａｔａｃ  ａｔｇｃａｔｇｔｇｃ  ａｃａｃａｔａｃａｃ  ａｔｇｃａｃａｔａｔ
６２４１  ｇｔｔｃａｃｔｃｃｃ  ｔａｔｔｔｃａｔｃｃ  ａｃａｔｇａａｃｔａ  ａｇａｔｔａｃｔｇａ  ｔｇｔｇｔａｃａｇａ  ｔｔｃａａａｇｃａｃ
６３０１  ｔｔｔｔａｔｔｃｔｔ  ｔｔｃｃａａａｇｇｃ  ａａｇａａｇｃｔｇａ  ｇｃｔａｃｔｔｔｃｃ  ａｇａａｔａｇｔｔｇ  ｔｇａａａｇａｃｃｃ
６３６１  ｔｇｔｃａｔａｃｔｔ  ｃｔｇｃａｔｔｇｔｔ  ｔｃｃｔｃｃａｃａｃ  ｃａｃｃｔｃｃａｔｃ  ｃａｇｔｔｃｃｔｔａ  ｔｇａａｔｇｇｔｔａ
６４２１  ｃｔｇｇｔｔｔｔｃａ  ａａａａｔａｔｇａｇ  ａｔａａａｔｔｇａｇ  ｔｇｔａｔａａａａｇ  ｔｃａｔｔｔｔｔａｇ  ａｃａａａａｔｇａａ
６４８１  ａｃａｇｇａａａｔｇ  ａａａｇａａａｃｃａ  ｇａａｔｃｔｃｔｃｃ  ｔｃａｔｔｔｇｔｇｇ  ａｔｇｇｇｃｃａｇｃ  ｔｃｃａｃｃａｔｇｔ
６５４１  ｃａｔｇｇｔｔａａｔ  ｃｔｇｃａｇｇｇａｇ  ｇａａａｔａｃｔａｇ  ａｔｔｔｇａｔｔｇｃ  ａｇａｔｃａｇａｃｔ  ｇｃａｇｃａａａｃｃ
６６０１  ｔｇｃｔｇｔｇａｃｔ  ａａｇｇｃａｔｃａａ  ｇａｇａａａｇｃａａ  ｇｃａａｃａｇｃｔｇ  ｇｇｇｃｔｔｃａｇｔ  ｇｇｔｇａａａａｃａ
６６６１  ｔｔａｔａｔａｔｃｔ  ａｇｃｔｔｔｇａａａ  ｔａｔｇａａａｔａｃ  ｔｇｔｔｔａｇｃａｇ  ｔｇｔｃａｃｃｔａｇ  ａａａａｇａｇｔｇｔ
６７２１  ｔｔｃａａａａｔｇｃ  ｔｇａｔｇｃｔｔｃａ  ｔａａｇａａｃｃｔｔ  ｔｃｔｃｔｔｃａｇａ  ｇｔｔｇｔｔｔｃｔｔ  ｔｔａｔｃｔｔｔｃａ
６７８１  ａａｔｔａｇｃｃａｇ  ｇｇｔｇｇｇａａａｔ  ａａａｇｔｇａｔｃａ  ｃｔｔｇｇｔｇａａｇ  ａａａｔｃｔｃａｃａ  ａａｇａａｇａａｃａ
６８４１  ｔａｇａｇａｇｔｔｃ  ａｃｔｔｔｃａｔｃｔ  ｇｇａｇｔａａｔｇａ  ａｃａｇａｔｔｇａａ  ｃａａａｃｔａｇａａ  ａｔｇｇｔｔａｇｔｃ
６９０１  ｔｇｔｔａａａｇａａ  ａａｇｇｔｇｔａｇｇ  ｔｇａｇｃｔｇｔｔｔ  ｇｃａａｇａｇｃｃａ  ｃａａｇｇｇａａａｇ  ｇｇｇａａｇａｃａａ
６９６１  ｃｔｔｃｔｔｔｇｔｇ  ｇａｃｔｔａａｇｇｇ  ｔｇａａａｇｔｔｇｃ  ａａｇｃａｇｇｃａａ  ｇａｃｃａｔｔｃｔｇ  ａｃｃｔｃｃａｔｔａ
７０２１  ａｇａａａｇｃｃｃｔ  ｔｔｃｃａａｃｃａａ  ｃａａｃｃａｃｔｇｇ  ｇｔｔｇｇｔｔａｃｔ  ｃａｇｇｔｔｇｇｇｃ  ａｇｃａｔｔｇｇｇａ
７０８１  ｇｃａａａｔｇｔｔｇ  ａｔｔｇａａｃａａａ  ｔｇｔｔｔｇｔｃａｇ  ａａｔｔｇｔｔｇａｃ  ｔｔａａａｇａｇｃｔ  ｇｔｔｃｔｇｔｃａｃ
７１４１  ｔｇｇｇｇａｃａｇｃ  ａｇｃａｇｃｔａｇａ  ｔａｇｃｃｃｃａｔｔ  ｃａｇｇｇａｇａｇｇ  ｇｃａｔｔｔｇｔｔｃ  ａｃｃｔｇｇｃｃａｇ
７２０１  ａｇａｔｃａｇａｇｃ  ａｇｇｃｔａａｇｇｇ  ａｃｔｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃｔｇｔｃｃａｇ  ｃｔｔｔｇａｇａｃｃ  ｃｔａｃａｇａｇｃｃ
７２６１  ａｔｇｔｔｃａｃｃｔ  ａｇｃａｇｇｔａｔｃ  ｃｃｔｔｃｔｇａｇｇ  ｔｃａｃｔｃｔｃａｔ  ｔｔｃｔｔａｃｃｔｔ  ａｔｔｃｃａｇｇｇｃ
７３２１  ｔｔｔｃａｃｃｔｃａ  ｇｃｔｔｇｃｃａｇｇ  ｃｔｇｇａｇｃｃａａ  ｇｇｇｃｃａａｇｇｃ  ａｇｃｃｔｃａｃｃｔ  ｔｇｔｔｇｇｃｔａｔ
７３８１  ｇｇｔａｇｃｔｔｃｃ  ｃａｇｇａｇｃｃｃｃ  ｃｔａｔｇｇｔｔｃａ  ｇｇａａｃａｇｃｔｃ  ｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃ  ａｔｃｃｔｇｔｔｔｇ
７４４１  ｃｔａｃｃｔｃｃｔａ  ａａｇｃｃａａａｇｇ  ｃａｃｔｇｇｔｇｇｇ  ｃｃａｇｇｃｃａｇｃ  ｔｔｃｔａａａｇｔｃ  ａｃａｃａａｇｇｔｔ
７５０１  ａｇａａｇｇｔｔｃｃ  ｔｇａｃａｇｇａａｇ  ｇｇｃｔｔｇａｇｇｃ  ｃａａｔｇｇａａｇｇ  ａｇｇｔａｃｔｔｃａ  ｇｔｔｔｃｃｃｔｃｃ
７５６１  ａｇａｔｇｃｃｃａｇ  ｔｇａｔｇｇｇｃｔｃ  ａｇａｇｃｔｃｃｔｔ  ｇａｇａａｃｔｔｇｇ  ｇａａａｇｇａａｇｃ  ａｇｇｇｔｃｔｃｔｇ
７６２１  ａａｇａａａｔａｃｔ  ｔｃａｇｇａｇｔａｇ  ａａａｇａｇｇａａｇ  ｃｔａｇａｇｇｇｔｔ  ａａａｔｇｃａｃｔａ  ｃａｃａｇｇａａｃａ
７６８１  ｇａａａｔｇａｇｔｔ  ｔｔｔｃｔｔａｇａｇ  ｔｔａｇｔａｔａｔｇ  ｔｃｔａｇａｇｇｔｇ  ｔａｇｔａａａｃｔａ  ａａａｃａａｇｔｃｔ
７７４１  ｔｇａａｔｔｇｃａｔ  ａｃａｇｃｃａｃｔｔ  ａｇｇｇａａｇａａａ  ｔｇａａａａｃｃｔｔ  ｔｇａａｔａｔｔａｇ  ｔｇａａａａａａｇｇ
７８０１  ｇａａａｃｔｇｃａａ  ｃｃｃｃｔｇｔａｔｔ  ａｃｔａｇａｔａｇｃ  ｔｔｔｃａｔｃａａｃ  ａｇｃｔｃａａａａｃ  ａｇａｃａｇａｔｔｔ
７８６１  ｔｔａｔａｇｇｔｔｔ  ａｃｔｇｔｇｔｇｃａ  ｃｔｔｔａａｔａｃａ  ａｇｇｇｃａｇｔｇｇ  ｔｔｃａｇａａｃｔａ  ｇｔｃａｇｇｔｃｃｔ
７９２１  ｇａａａａｇｇａｔｔ  ｔａｃｃａａａｔｇｔ  ｔｇａｇｔｇｔｇｃｃ  ｃｔｃｔａｇｔｇｔｔ  ｃａｃａｃｔｔｃｃｃ  ａｇｃｔｔｔｃｔｔｃ
７９８１  ｃｔａｔａａａｇｇｔ  ｇｇａｔｃａａｇｇｃ  ａｃｔｔｇｃｔｔａｃ  ａａｃｔｇｇａａｃｔ  ｇａａａｔｃｃｔｃｃ  ａａｇｔｇｇａａｃｔ
８０４１  ａｇａｃａｔｔｇａｇ  ａｔｇｇａｇａａａａ  ｔａｔｔｃａｔｔｇｔ  ｃｃａｃｔｇｔａａｔ  ｔａｔｇｃａａｇｇａ  ａｔａｔｃｃａｇｔｔ
８１０１  ｇａｇａｔａａｔｇｇ  ａｃｔｔｇｃｃｔｃｔ  ｔａｔｃｔａａｔａａ  ｔａｃｃｃａｇｇｃｔ  ｃａａｔｇｇｇｔｃａ  ｃｔｇｃｔｔｔｇｔｃ
８１６１  ｃａｃｔｔｔｇｃｃｃ  ａａａａｔｔｃａａｇ  ｃａｃａｇｃｔａａｇ  ｔｔｇａｔａｔｔｔｔ  ａｇｇａｃａａａｇｇ  ｃａｇｃｔｔａｃｔａ
８２２１  ｔｃｃａｇｃｃａｇａ  ｇｇｇｇａｇｔａｇａ  ａｔａｔｇｇｔｔａａ  ｇａｇａｇａｇｔｇｇ  ａａａｇａａｔｇａａ  ｔｇａｇｃｃｃｔｇｃ
８２８１  ｔａｔｔｃｃｔｃａｃ  ｔｇｃｃｔｇｇａｔｇ  ｇｃｔａｔａａｇｃａ  ｃａｇｃｃｃｔｔａｔ  ｇｇａｇｇｃｃｔｔａ  ｇｇｔｃｔｔｇｃｔｔ
８３４１  ｃａｔａａｔａｔｔｃ  ｃａｇｔｔｔｇａａａ  ａｇｇｇｔｔｔｇａａ  ａａｇａｃｃｔｃｃｔ  ａｇａａａａａｔｃａ  ｇｔａｇｔｔｔｔｔｃ
８４０１  ｔｃｔｔｔｔｇａｇｔ  ａａｃａｔｇｔａｇｃ  ａａａａａａａａｔｔ  ｔｃａｔｃａｔｇｔａ  ｇｇｔａｃａｇｇｇａ  ａｃａｃｃｃｔａａｔ
８４６１  ａａｃｔａｔｔａａｔ  ｃｔｃａａｇｇａｇｔ  ｃａａｇｃｃａｇｔｇ  ｔｇｔｔｔｃｃｔａａ  ｔｇｔａｔｃｔｇｃｔ  ｇｔａｔｃｃｃｃａｔ
８５２１  ｇａａｇｃａａａｔｔ  ｔｔｇｃｃａｔｃａｇ  ａｇａａａｃｔｇａｃ  ｔｃａｔｇｇｇｇａａ  ａａａａｔｃｃａａｇ  ｇａｃｃｔｃａａａｔ
８５８１  ｃａｃｃａａａａｇａ  ａｇｃｃａｔｔｃｃｔ  ｃａｇａｔｔｔｇｃｃ  ｔａａｇｃｔｔａａｇ  ｃｔｔｃｃｃｔｇｔｃ  ｔｃｔｃａｔｔｇｔｇ
８６４１  ｔｇｔｔｇｃｔｔｔｃ  ａａｔｇｃａｇｔｔａ  ｃａｔａａａｔｇｇｃ  ｔｔｔｔｔｔｇｔｔｔ  ａｔｇｃａｃｃａａａ  ａａｃａｃｔａａｔｔ
８７０１  ｃａｔｃｔｇｃａａａ  ｇｃｔａｔａｇｇｔｃ  ａａａｇｃａａｃｃａ  ｔａｇｔａｔｇｃａｃ  ｃｃｔｇｃｔａｇｃｔ  ｇｇｃｇｃａｔｔａａ
８７６１  ｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇ  ｔｇｔｇｇｔｇｇｔｔ  ａｃｇｃｇｃａｇｃｇ  ｔｇａｃｃｇｃｔａｃ  ａｃｔｔｇｃｃａｇｃ  ｇｃｃｔｔａｇｃｇｃ
８８２１  ｃｃｇｃｔｃｃｔｔｔ  ｃｇｃｔｔｔｃｔｔｃ  ｃｃｔｔｃｃｔｔｔｃ  ｔｃｇｃｃａｃｇｔｔ  ｃｇｃｃｇｇｃｔｔｔ  ｃｃｃｃｇｔｃａａｇ
８８８１  ｃｔｃｔａａａｔｃｇ  ｇｇｇｇｃｔｃｃｃｔ  ｔｔａｇｇｇｔｔｃｃ  ｇａｔｔｔａｇｔｇｃ  ｔｔｔａｃｇｇｃａｃ  ｃｔｃｇａｃｃｃｃａ
８９４１  ａａａａａｃｔｔｇａ  ｔｔｔｇｇｇｔｇａｔ  ｇｇｔｔｃａｃｇｔａ  ｇｔｇｇｇｃｃａｔｃ  ｇｃｃｃｔｇａｔａｇ  ａｃｇｇｔｔｔｔｔｃ
９００１  ｇｃｃｃｔｔｔｇａｃ  ｇｔｔｇｇａｇｔｃｃ  ａｃｇｔｔｃｔｔｔａ  ａｔａｇｔｇｇａｃｔ  ｃｔｔｇｔｔｃｃａａ  ａｃｔｇｇａａｃａａ
９０６１  ｃａｃｔｃａａｃｔｃ  ｔａｔｃｔｃｇｇｇｃ  ｔａｔｔｃｔｔｔｔｇ  ａｔｔｔａｇａｃｃｔ  ｇｃａｇｇｃａｔｇｃ  ａａｇｃｔｔｇｇｃａ
９１２１  ｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇ  ｔｔｔｔａｃａａｃｇ  ｔｃｇｔｇａｃｔｇｇ  ｇａａａａｃｃｃｔｇ  ｇｃｇｔｔａｃｃｃａ  ａｃｔｔａａｔｃｇｃ
９１８１  ｃｔｔｇｃａｇｃａｃ  ａｔｃｃｃｃｃｔｔｔ  ｃｇｃｃａｇｃｔｇｇ  ｃｇｔａａｔａｇｃｇ  ａａｇａｇｇｃｃｃｇ  ｃａｃｃｇａｔｃｇｃ
９２４１  ｃｃｔｔｃｃｃａａｃ  ａｇｔｔｇｃｇｃａｇ  ｃｃｔｇａａｔｇｇｃ  ｇａａｔｇｃｇａｔｔ  ｔａｔｔｃａａｃａａ  ａｇｃｃｇｃｃｇｔｃ
９３０１  ｃｃｇｔｃａａｇｔｃ  ａｇｃｇｔａａｔｇｃ  ｔｃｔｇｃｃａｇｔｇ  ｔｔａｃａａｃｃａａ  ｔｔａａｃｃａａｔｔ  ｃｔｇａｔｔａｇａａ
９３６１  ａａａｃｔｃａｔｃｇ  ａｇｃａｔｃａａａｔ  ｇａａａｃｔｇｃａａ  ｔｔｔａｔｔｃａｔａ  ｔｃａｇｇａｔｔａｔ  ｃａａｔａｃｃａｔａ
９４２１  ｔｔｔｔｔｇａａａａ  ａｇｃｃｇｔｔｔｃｔ  ｇｔａａｔｇａａｇｇ  ａｇａａａａｃｔｃａ  ｃｃｇａｇｇｃａｇｔ  ｔｃｃａｔａｇｇａｔ
９４８１  ｇｇｃａａｇａｔｃｃ  ｔｇｇｔａｔｃｇｇｔ  ｃｔｇｃｇａｔｔｃｃ  ｇａｃｔｃｇｔｃｃａ  ａｃａｔｃａａｔａｃ  ａａｃｃｔａｔｔａａ
９５４１  ｔｔｔｃｃｃｃｔｃｇ  ｔｃａａａａａｔａａ  ｇｇｔｔａｔｃａａｇ  ｔｇａｇａａａｔｃａ  ｃｃａｔｇａｇｔｇａ  ｃｇａｃｔｇａａｔｃ
９６０１  ｃｇｇｔｇａｇａａｔ  ｇｇｃａａａａｇｃｔ  ｔａｔｇｃａｔｔｔｃ  ｔｔｔｃｃａｇａｃｔ  ｔｇｔｔｃａａｃａｇ  ｇｃｃａｇｃｃａｔｔ
９６６１  ａｃｇｃｔｃｇｔｃａ  ｔｃａａａａｔｃａｃ  ｔｃｇｃａｔｃａａｃ  ｃａａａｃｃｇｔｔａ  ｔｔｃａｔｔｃｇｔｇ  ａｔｔｇｃｇｃｃｔｇ
９７２１  ａｇｃｇａｇａｃｇａ  ａａｔａｃｇｃｇａｔ  ｃｇｃｔｇｔｔａａａ  ａｇｇａｃａａｔｔａ  ｃａａａｃａｇｇａａ  ｔｃｇａａｔｇｃａａ
９７８１  ｃｃｇｇｃｇｃａｇｇ  ａａｃａｃｔｇｃｃａ  ｇｃｇｃａｔｃａａｃ  ａａｔａｔｔｔｔｃａ  ｃｃｔｇａａｔｃａｇ  ｇａｔａｔｔｃｔｔｃ
９８４１  ｔａａｔａｃｃｔｇｇ  ａａｔｇｃｔｇｔｔｔ  ｔｃｃｃｇｇｇｇａｔ  ｃｇｃａｇｔｇｇｔｇ  ａｇｔａａｃｃａｔｇ  ｃａｔｃａｔｃａｇｇ
９９０１  ａｇｔａｃｇｇａｔａ  ａａａｔｇｃｔｔｇａ  ｔｇｇｔｃｇｇａａｇ  ａｇｇｃａｔａａａｔ  ｔｃｃｇｔｃａｇｃｃ  ａｇｔｔｔａｇｔｃｔ
９９６１  ｇａｃｃａｔｃｔｃａ  ｔｃｔｇｔａａｃａｔ  ｃａｔｔｇｇｃａａｃ  ｇｃｔａｃｃｔｔｔｇ  ｃｃａｔｇｔｔｔｃａ  ｇａａａｃａａｃｔｃ
１００２１  ｔｇｇｃｇｃａｔｃｇ  ｇｇｃｔｔｃｃｃａｔ  ａｃａａｔｃｇａｔａ  ｇａｔｔｇｔｃｇｃａ  ｃｃｔｇａｔｔｇｃｃ  ｃｇａｃａｔｔａｔｃ
１００８１  ｇｃｇａｇｃｃｃａｔ  ｔｔａｔａｃｃｃａｔ  ａｔａａａｔｃａｇｃ  ａｔｃｃａｔｇｔｔｇ  ｇａａｔｔｔａａｔｃ  ｇｃｇｇｃｔｔｃｇａ
１０１４１  ｇｃａａｇａｃｇｔｔ  ｔｃｃｃｇｔｔｇａａ  ｔａｔｇｇｃｔｃａｔ  ａａｃａｃｃｃｃｔｔ  ｇｔａｔｔａｃｔｇｔ  ｔｔａｔｇｔａａｇｃ
１０２０１  ａｇａｃａｇｔｔｔｔ  ａｔｔｇｔｔｃａｔｇ  ａｔｇａｔａｔａｔｔ  ｔｔｔａｔｃｔｔｇｔ  ｇｃａａｔｇｔａａｃ  ａｔｃａｇａｇａｔｔ
１０２６１  ｔｔｇａｇａｃａｃａ  ａｃｇｔｇｇｃｔｔｔ  ｇｔｔｇａａｔａａａ  ｔｃｇａａｃｔｔｔｔ  ｇｃｔｇａｇｔｔｇａ  ａｇｇａｔｃａｇａｔ
１０３２１  ｃａｃｇｃａｔｃｔｔ  ｃｃｃｇａｃａａｃｇ  ｃａｇａｃｃｇｔｔｃ  ｃｇｔｇｇｃａａａｇ  ｃａａａａｇｔｔｃａ  ａａａｔｃａｃｃａａ
１０３８１  ｃｔｇｇｔｃｃａｃｃ  ｔａｃａａｃａａａｇ  ｃｔｃｔｃａｔｃａａ  ｃｃｇｔｇｇｃｔｃｃ  ｃｔｃａｃｔｔｔｃｔ  ｇｇｃｔｇｇａｔｇａ
１０４４１  ｔｇｇｇｇｃｇａｔｔ  ｃａｇｇｃｃｔｇｇｔ  ａｔｇａｇｔｃａｇｃ  ａａｃａｃｃｔｔｃｔ  ｔｃａｃｇａｇｇｃａ  ｇａｃｃｔｃｔｃｇａ
１０５０１  ｃｇｇａｇｔｔｃｃａ  ｃｔｇａｇｃｇｔｃａ  ｇａｃｃｃｃｇｔａｇ  ａａａａｇａｔｃａａ  ａｇｇａｔｃｔｔｃｔ  ｔｇａｇａｔｃｃｔｔ
１０５６１  ｔｔｔｔｔｃｔｇｃｇ  ｃｇｔａａｔｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｔｇｃａａａ  ｃａａａａａａａｃｃ  ａｃｃｇｃｔａｃｃａ  ｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔ
１０６２１  ｇｔｔｔｇｃｃｇｇａ  ｔｃａａｇａｇｃｔａ  ｃｃａａｃｔｃｔｔｔ  ｔｔｃｃｇａａｇｇｔ  ａａｃｔｇｇｃｔｔｃ  ａｇｃａｇａｇｃｇｃ
１０６８１  ａｇａｔａｃｃａａａ  ｔａｃｔｇｔｔｃｔｔ  ｃｔａｇｔｇｔａｇｃ  ｃｇｔａｇｔｔａｇｇ  ｃｃａｃｃａｃｔｔｃ  ａａｇａａｃｔｃｔｇ
１０７４１  ｔａｇｃａｃｃｇｃｃ  ｔａｃａｔａｃｃｔｃ  ｇｃｔｃｔｇｃｔａａ  ｔｃｃｔｇｔｔａｃｃ  ａｇｔｇｇｃｔｇｃｔ  ｇｃｃａｇｔｇｇｃｇ
１０８０１  ａｔａａｇｔｃｇｔｇ  ｔｃｔｔａｃｃｇｇｇ  ｔｔｇｇａｃｔｃａａ  ｇａｃｇａｔａｇｔｔ  ａｃｃｇｇａｔａａｇ  ｇｃｇｃａｇｃｇｇｔ
１０８６１  ｃｇｇｇｃｔｇａａｃ  ｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇ  ｔｇｃａｃａｃａｇｃ  ｃｃａｇｃｔｔｇｇａ  ｇｃｇａａｃｇａｃｃ  ｔａｃａｃｃｇａａｃ
１０９２１  ｔｇａｇａｔａｃｃｔ  ａｃａｇｃｇｔｇａｇ  ｃｔａｔｇａｇａａａ  ｇｃｇｃｃａｃｇｃｔ  ｔｃｃｃｇａａｇｇｇ  ａｇａａａｇｇｃｇｇ
１０９８１  ａｃａｇｇｔａｔｃｃ  ｇｇｔａａｇｃｇｇｃ  ａｇｇｇｔｃｇｇａａ  ｃａｇｇａｇａｇｃｇ  ｃａｃｇａｇｇｇａｇ  ｃｔｔｃｃａｇｇｇｇ
１１０４１  ｇａａａｃｇｃｃｔｇ  ｇｔａｔｃｔｔｔａｔ  ａｇｔｃｃｔｇｔｃｇ  ｇｇｔｔｔｃｇｃｃａ  ｃｃｔｃｔｇａｃｔｔ  ｇａｇｃｇｔｃｇａｔ
１１１０１  ｔｔｔｔｇｔｇａｔｇ  ｃｔｃｇｔｃａｇｇｇ  ｇｇｇｃｇｇａｇｃｃ  ｔａｔｇｇａａａａａ  ｃｇｃｃａｇｃａａｃ  ｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔ
１１１６１  ｔａｃｇｇｔｔｃｃｔ  ｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃ  ｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇ  ｃｔｃａｃａｔｇｔ
／／
イントロンＡ核酸配列（配列番号：１７）
ＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＡＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＡＴＧＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＡＴＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＡＧＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＡＡＴＴＡＧＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＧ
図１５
イントロンＡを含むＦＩＸ３９核酸配列（イントロンＡに下線）（配列番号：２５）
ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＡＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＡＴＧＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＡＴＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＡＧＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＡＡＴＴＡＧＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＴＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＡＴＧＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＡＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡ
【図１】
2018522529.tif 000008
【図２】
2018522529.tif 000009
【図３】
2018522529.tif 000010
【図４】
2018522529.tif 000011
【図５】
2018522529.tif 000012
【図６】
2018522529.tif 000013
【図７】
2018522529.tif 000014
【図８】
2018522529.tif 000015
【図９】
2018522529.tif 000016
【図１０】
2018522529.tif 000017
【図１１】
2018522529.tif 000018
【図１２Ａ−１】
2018522529.tif 000019
【図１２Ａ−２】
2018522529.tif 000020
【図１２Ａ−３】
2018522529.tif 000021
【図１２Ａ−４】
2018522529.tif 000022
【図１２Ｂ−１】
2018522529.tif 000023
【図１２Ｂ−２】
2018522529.tif 000024
【図１２Ｂ−３】
2018522529.tif 000025
【図１２Ｂ−４】
2018522529.tif 000026
【図１３−１】
2018522529.tif 000027
【図１３−２】
2018522529.tif 000028
【図１３−３】
2018522529.tif 000029
【図１３−４】
2018522529.tif 000030
【図１３−５】
2018522529.tif 000031
【図１３−６】
2018522529.tif 000032
【図１３−７】
2018522529.tif 000033
【図１３−８】
2018522529.tif 000034
【図１３−９】
2018522529.tif 000035
【図１３−１０】
2018522529.tif 000036
【図１３−１１】
2018522529.tif 000037
【図１３−１２】
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【図１３−１３】
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【図１３−１４】
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【図１３−１５】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018522529.tif 000059
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