(57)【要約】  本開示は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、およびＧＩＴＲリガンドの受容体結合ドメインを含む、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを提供し、ここで、融合ポリペプチドサブユニットは、六量体タンパク質に自己組織化することができる。また、融合ポリペプチドサブユニットおよび六量体タンパク質を調製する方法、ならびに使用方法、例えば、がんの治療方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ  Ｆｃドメイン；機能的多量体化ドメイン；およびグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）の受容体結合ドメインを含む単離された一本鎖ポリペプチドサブユニットであって、三量体または六量体タンパク質に自己組織化し得る、ポリペプチドサブユニット。
【請求項２】
前記多量体化ドメインが三量体化ドメインである、請求項１に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３】
アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、前記ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、その後に前記多量体化または三量体化ドメイン、その後に前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインを含む、請求項１または２に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインのカルボキシ末端が、第１のリンカー領域を介して前記多量体化または三量体化ドメインのアミノ末端に融合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項５】
前記多量体化または三量体化ドメインのカルボキシ末端が、第２のリンカー領域を介して前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインのアミノ末端に融合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項６】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインのカルボキシ末端が、前記多量体化または三量体化ドメインのアミノ末端に直接的に融合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項７】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、そのアミノ末端にＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項５または６に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項８】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、完全な重鎖間ジスルフィド結合形成を与える突然変異を含む、請求項５または６に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項９】
前記ＩｇＧヒンジ領域が、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ４ヒンジ領域、またはその変異体を含む、請求項７または８に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１０】
前記ＩｇＧ４ヒンジ領域が、ＥＵ付番に従う２２８位にセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ）を有する（ＩｇＧ４Ｐ）、請求項９に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１２】
前記多量体化または三量体化ドメインのカルボキシ末端が、前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインのアミノ末端に直接的に融合される、請求項１〜４または６〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１３】
前記第１のリンカー領域、前記第２のリンカー領域、または前記第１および第２のリンカー領域が、存在する場合、（Ｇｌｙ４）ｎモチーフ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（配列番号１９）、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＬ（配列番号２３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号２４）、およびそれらの組み合わせ（式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である）を含有するリンカー領域からなる群から独立して選択される、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１４】
前記第１および第２のリンカー領域が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２５）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２６）からなる群から独立して選択される、請求項１３に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１５】
前記第１のリンカー領域がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０）であり、かつ前記第２のリンカー領域が（Ｇｌｙ４）モチーフである、請求項１３または１４に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１６】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧ４Ｐ  Ｆｃドメイン、またはその変異体を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１７】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５６Ｅ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を有し、ここで前記残基はＥＵ付番に従って付番される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１８】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがＣＨ２領域を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項１９】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがＣＨ３領域をさらに含む、請求項１８に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２０】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、配列番号２１に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２１】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２２】
前記三量体化ドメインが、α−ヘリカルコイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２３】
前記三量体化ドメインが、マトリリン１、コロニン１ａ、筋強直性ジストロフィーキナーゼ（ＤＭＰＫ）、ランゲリン、またはそれらの組み合わせから誘導される、請求項２２に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２４】
前記三量体化ドメインが、マトリリン１またはコロニン１ａから誘導される、請求項２３に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２５】
前記三量体化ドメインが、コロニン１ａから誘導される、請求項２４に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２６】
前記三量体化ドメインが、配列番号１１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するコロニン１ａ三量体化ドメインを含む、請求項２５に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２７】
前記コロニン１ａ三量体化ドメインが配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２８】
前記三量体化ドメインが、配列番号１０のコロニン１ａ三量体化ドメインを含む、請求項２６に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項２９】
前記コロニン１ａ三量体化ドメインが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、またはその任意の組み合わせもしくは変異体のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３０】
前記三量体化ドメインが、配列番号２８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するマトリリン１三量体化ドメインを含む、請求項２４に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３１】
前記三量体化ドメインが、配列番号３０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＭＰＫ三量体化ドメインを含む、請求項２３に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３２】
前記三量体化ドメインが、配列番号３２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するランゲリン三量体化ドメインを含む、請求項２３に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３３】
前記三量体化ドメインが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３４】
前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが、配列番号３４に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３５】
前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが、配列番号３７に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで残基１６１はアスパラギル残基ではない、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３６】
前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３７】
前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ここで残基１６１はアスパルチル残基である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３８】
前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項３９】
前記ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４０】
６つの前記ポリペプチドサブユニットから構築される六量体タンパク質が、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し得る、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４１】
前記タンパク質がグリコシル化されない、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４２】
配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４３】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４４】
アゴニスト活性を有する、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４５】
関連の異種薬剤をさらに含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４６】
前記異種薬剤が異種ポリペプチドであり、かつ前記ポリペプチドサブユニットとペプチド結合を介して融合される、請求項４５に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４７】
前記異種ポリペプチドが前記ＩｇＧ−ＦｃドメインのＮ末端に融合されるか、ＧＩＴＲＬの前記受容体結合ドメインのＣ末端に融合されるか、前記ＩｇＧ−ＦｃドメインのＣ末端および前記三量体化ドメインのＮ末端に融合されるか、またはＧＩＴＲＬの前記三量体化ドメインのＣ末端および前記受容体結合ドメインのＮ末端に融合される、請求項４６に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４８】
前記異種薬剤が、前記ポリペプチドサブユニットに化学的に結合される、請求項４５に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項４９】
前記異種薬剤が、細胞傷害性分子、安定化剤、免疫応答修飾因子、または検出可能な薬剤を含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の３つのポリペプチドサブユニットを含む三量体タンパク質。
【請求項５１】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の６つのポリペプチドサブユニットを含む六量体タンパク質。
【請求項５２】
ヒト、または非ヒト霊長類、任意選択的にはカニクイザル、アカゲザル、またはそれらの任意の組み合わせに由来するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞で発現されるようなグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合し得、ここで前記ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞またはＢ細胞が任意選択的に抗原を経験するか、または前記ＮＫ細胞が任意選択的に活性化される、請求項５１に記載の六量体タンパク質。
【請求項５３】
ヒト、または非ヒト霊長類、任意選択的にはカニクイザル、アカゲザル、またはそれらの任意の組み合わせに由来する一次ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞で発現されるようなＧＩＴＲに特異的に結合し得る、請求項５２に記載の六量体タンパク質。
【請求項５４】
前記ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞が抗原を経験する、請求項５２または５３のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項５５】
ヒトＧＩＴＲに対する結合親和性が、動力学的排除アッセイによって測定されるとき、約５４ｎＭ〜約１１１ｎＭである、請求項５１または５４に記載の六量体タンパク質。
【請求項５６】
前記結合親和性が、動力学的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）において測定されるとき、約８２ｎＭである、請求項５５に記載の六量体タンパク質。
【請求項５７】
ＧＩＴＲ陽性免疫細胞からの用量依存性増殖および用量依存性サイトカイン放出を誘導し得る、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項５８】
前記ＧＩＴＲ陽性免疫細胞が、プレートに基づくアッセイにおけるＴ細胞である、請求項５７に記載の六量体タンパク質。
【請求項５９】
前記細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＮＫ、またはＢ細胞である、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項６０】
前記ＧＩＴＲ陽性免疫細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＢ細胞が抗原を経験し、かつ／またはＮＫ細胞が活性化される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項６１】
チミジン取り込みによって測定されるとき、約０．１〜約２．７ｎＭのＥＣ５０で、一次抗原を経験したヒトＴ細胞の増殖を刺激し得る、請求項６０に記載の六量体タンパク質。
【請求項６２】
前記ＥＣ５０が約０．５ｎＭである、請求項６１に記載の六量体タンパク質。
【請求項６３】
前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５７に記載の六量体タンパク質。
【請求項６４】
ＧＩＴＲ発現細胞における下流シグナル伝達経路を活性化し得、任意選択的には前記下流シグナル伝達経路はＮＦκＢ経路またはＭＡＰＫ経路である、請求項５１〜６３のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項６５】
前記ＧＩＴＲ発現細胞がＴ細胞である、請求項６４に記載の六量体タンパク質。
【請求項６６】
前記ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞が、前記ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを生成する、ＧＩＴＲを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞である、請求項６４に記載の六量体タンパク質。
【請求項６７】
がん治療を必要とする被験者への有効用量の投与が、前記被験者における腫瘍成長を阻害し得る、請求項５１〜６６のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項６８】
前記腫瘍成長阻害が、ＧＩＴＲ陽性免疫細胞、任意選択的にはＴ細胞またはＮＫ細胞の存在下で達成される、請求項６７に記載の六量体タンパク質。
【請求項６９】
腫瘍成長が、アイソタイプに合致した対照の投与と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも１００％阻害される、請求項６７または６８に記載の六量体タンパク質。
【請求項７０】
前記ポリペプチドサブユニットが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃドメインを含み、かつＧＩＴＲへの結合を通じてＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン活性化を誘導し得るが、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的に誘導しない、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項７１】
前記ポリペプチドサブユニットが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ高レベルのＧＩＴＲを発現する細胞に対してＦｃ受容体依存性細胞傷害性を誘導する、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項７２】
前記ポリペプチドサブユニットが、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩＧ４Ｐ  Ｆｃドメインを含み、かつＧＩＴＲへの結合を通じてＧＩＴＲ発現細胞の増殖を誘導し得る、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の六量体タンパク質。
【請求項７３】
前記Ｆｃ受容体依存性細胞傷害性が、抗体依存細胞傷害性または抗体依存性食作用である、請求項７１に記載の六量体タンパク質。
【請求項７４】
高レベルのＧＩＴＲを発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項７１に記載の六量体タンパク質。
【請求項７５】
高レベルのＧＩＴＲを発現する前記細胞が、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞または抗原を経験したＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−Ｔ細胞である、請求項７１に記載の六量体タンパク質。
【請求項７６】
対照と比べて、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度における減少をもたらす、請求項７１に記載の六量体タンパク質。
【請求項７７】
対照と比べて、腫瘍内部のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度における減少をもたらす、請求項７１に記載の六量体タンパク質。
【請求項７８】
請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質、および担体を含む組成物。
【請求項７９】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット、または請求項５１〜７８のいずれか一項に記載の六量体タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記ポリペプチドサブユニットに作動可能に連結されるシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記シグナルペプチドをコードする前記核酸が、前記ポリペプチドサブユニットの前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインのアミノ末端をコードする核酸に作動可能に連結される、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
配列番号５を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
請求項７９〜８２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８４】
請求項７９〜８２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８５】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチドサブユニット、または請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質を産生する方法であって、請求項８４に記載の宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる前記ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質が発現される条件下で培養するステップと、前記ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質を回収するステップと、を含む、方法。
【請求項８６】
抗原を経験したＴ細胞および／またはＮＫ細胞の生存または増殖を促進するための方法であって、抗原を経験したＴ細胞および／またはＮＫ細胞を、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質または請求項７８に記載の組成物と接触させるステップを含み、ここで前記六量体タンパク質は前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法。
【請求項８７】
活性化されたＧＩＴＲを発現する免疫細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、これらの細胞を、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質または請求項７８に記載の組成物と接触させるステップを含み、ここで前記六量体タンパク質はこれらの細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法。
【請求項８８】
前記サイトカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＧＩＴＲを発現する免疫細胞が、抗原を経験したＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原を経験したＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞またはそれらの組み合わせである、請求項８７または８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記活性化ＮＫ細胞、抗原を経験したＣＤ４＋もしくは抗原を経験したＣＤ８＋Ｔ細胞が、ヒトＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、カニクイザルＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、アカゲザルＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性化を促進する方法であって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質または請求項７８に記載の組成物と接触させるステップを含み、ここで前記六量体タンパク質は前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法。
【請求項９２】
前記六量体タンパク質を、前記ＦｃドメインとＦｃγＲを発現する細胞との相互作用を通じて架橋するステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＦｃγＲを発現する前記細胞が、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄もしくは形質細胞様樹状細胞、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、血小板、肥満細胞、一次ヒト腫瘍もしくは腫瘍灌流もしくは非灌流リンパ節に由来するＣＤ４５＋細胞、他の二次もしくは三次リンパ様構造に由来するＣＤ４５＋細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
ＮＫ細胞またはＴ細胞活性化が、前記ＮＦκＢまたはＭＡＰＫシグナル伝達経路の刺激を通じて測定され得る、請求項９１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＮＫまたはＴ細胞が、活性化ＮＫ細胞、抗原を経験したＣＤ４＋Ｔ細胞、抗原を経験したＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項９１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞が、一次ヒトＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、カニクイザルＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、アカゲザルＮＫ細胞、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記接触させるステップが、前記六量体タンパク質または前記六量体タンパク質を含む組成物を有効量で被験者に投与するステップを含む、請求項８６〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
被験者におけるがんを治療する方法であって、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質、または請求項７８に記載の組成物を有効量で治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項９９】
前記被験者がヒト被験者またはイヌ被験体である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記がんが固形腫瘍である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記固形腫瘍が、結腸直腸がん、乳がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、頭頚部がん、胃がん、膵がん、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、睾丸がん、甲状腺がん、前立腺がん、および食道がんからなる群から選択されるがんに関連する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記がんが血液がんである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記血液がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、および慢性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記六量体タンパク質または組成物の投与により、腫瘍成長が阻害され得るか、腫瘍減少が促進され得るか、またはその双方である、請求項９８〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
腫瘍成長阻害が、ＮＫ細胞またはＴ細胞の存在下で達成される、請求項９８〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
腫瘍成長が、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが欠如したアイソタイプに合致した対照の投与と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％阻害される、請求項１０４または請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記六量体タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃドメインを含み、かつ抗原を経験したＧＩＴＲ発現免疫細胞の増殖をＧＩＴＲへの結合を通じて誘導し得るが、前記活性化免疫細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的に誘導しない、請求項９８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＧＩＴＲ発現免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記六量体タンパク質が、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ高レベルのＧＩＴＲを発現する細胞のＮＫ細胞および／またはマクロファージ媒介性の抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞食作用を誘導する、請求項９８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
高レベルのＧＩＴＲを発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
高レベルのＧＩＴＲを発現する前記細胞がＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記六量体タンパク質が、対照と比べて、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度における減少をもたらす、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記六量体タンパク質が、対照と比べて、腫瘍内部のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度における減少をもたらす、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
被験者における免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする被験者に請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質、または請求項７８に記載の組成物を治療有効量で投与するステップを含む、方法。
【請求項１１５】
前記被験者が、ヒト被験者またはイヌ被験体である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
それを必要とする前記被験者ががんを有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記被験者が、結腸直腸がん、乳がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、中皮腫、頭頚部がん、胃がん、膵がん、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、睾丸がん、甲状腺がん、前立腺がん、食道がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、血液がん、またはそれらの組み合わせを有する、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記がんが血液がんである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記血液がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、および慢性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記六量体タンパク質または組成物の投与により、腫瘍成長が阻害され得るか、腫瘍減少が促進され得るか、またはその双方である、請求項１１４〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
腫瘍成長阻害が、ＮＫ細胞またはＴ細胞の存在下で達成される、請求項１１４〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
腫瘍成長が、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインが欠如したアイソタイプに合致した対照の投与と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％阻害される、請求項１２１または１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記六量体タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃドメインを含み、かつ活性化されたＧＩＴＲ発現免疫細胞の増殖をＧＩＴＲへの結合を通じて誘導し得るが、前記活性化免疫細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的に誘導しない、請求項１１４〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＧＩＴＲ発現免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記六量体タンパク質が、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含み、かつ高レベルのＧＩＴＲを発現する細胞のＮＫ細胞および／またはマクロファージ媒介性の抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞食作用を誘導する、請求項１１４〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
高レベルのＧＩＴＲを発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
高レベルのＧＩＴＲを発現する前記細胞がＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記六量体タンパク質が、対照と比べて、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度における減少をもたらす、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記六量体タンパク質が、対照と比べて、腫瘍内部のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度における減少をもたらす、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
被験者における固形腫瘍を治療する方法であって、請求項１に記載の単離された一本鎖ポリペプチドサブユニットおよびＯＸ４０アゴニストを前記被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１３２】
前記ＯＸ４０アゴニストが、ＯＸ４０リガンド融合タンパク質または抗ＯＸ４０抗体の１つ以上である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ＯＸ４０リガンド融合タンパク質がＭＥＤＩ６３８３である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記抗ＯＸ４０抗体がＭＥＤＩ０５６２である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
被験者におけるがんを治療する方法であって、Ｔ細胞プライミング剤と組み合わせて、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の六量体タンパク質、または請求項７８に記載の組成物を有効量で治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１３６】
前記Ｔ細胞プライミング剤が、Ｅ７合成ロングペプチド（ＳＬＰ）にＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを加えたものである、請求項１３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
本願とともに提出された、ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称ＧＩＴＲＬＦ−１００Ｐ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：５６，１５９バイト；および作成日：２０１６年６月１５日）にて電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲまたはＣＤ３５７としても公知のグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）は、制御性Ｔ細胞上に発現され、抗原を経験したＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞ならびに活性化ＮＫ細胞上で上方制御される（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１７３（８）：５００８−５０２０；Ｃｌｏｔｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｔｔｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．（２０１４））。ＧＩＴＲは、抗原曝露によるＴ細胞活性化を制御することに関与する受容体およびリガンドの複雑系の一部である。ＧＩＴＲは、緩い三量体型で存在し、ＧＩＴＲをクラスター化し、Ｔ細胞内で強力な細胞シグナル伝達事象をもたらし得る、１つの公知の内因性リガンド、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）を有する（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（４９）：１９４５２−１９４５７）。ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬとの相互作用により、正の同時刺激性シグナルがＴ細胞へ送達され、抗原曝露によるその増殖および活性化が増強され、メモリー細胞産生が促進され、制御性Ｔ細胞が再プログラム化されやすくなり、その抑制性機能が低下する（Ｃｌｏｔｈｉｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｔｔｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．（２０１４）Ｊａｎ  ４；Ｓｃｈａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２））。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、ポリペプチドサブユニットに関し、各々は、融合ポリペプチドとして、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）の受容体結合ドメイン、多量体化ドメイン、例えば三量体化ドメイン、およびＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、それらは安定な多量体タンパク質、例えば六量体タンパク質を形成する能力がある。がん免疫療法およびウイルス感染の治療にとって有用な組成物および方法が提供される。
【０００４】
特定の態様では、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン；機能的多量体化ドメイン；およびグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）の受容体結合ドメインを含む、単離された一本鎖ポリペプチドサブユニットであって、三量体または六量体タンパク質に自己組織化し得る、ポリペプチドサブユニットが提供される。
【０００５】
特定の態様では、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン；機能的多量体化ドメイン；およびグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）の受容体結合ドメインを各々含む、３つの一本鎖ポリペプチドサブユニットを含む三量体タンパク質が提供される。
【０００６】
特定の態様では、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン；機能的多量体化ドメイン；およびグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）の受容体結合ドメインを各々含む、６つの一本鎖ポリペプチドサブユニットを含む六量体タンパク質が提供される。
【０００７】
特定の態様では、六量体タンパク質および担体を含む組成物が提供される。
【０００８】
特定の態様では、一本鎖ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０００９】
特定の態様では、一本鎖ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００１０】
特定の態様では、一本鎖ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１１】
特定の態様では、ポリペプチドサブユニットを生成するかまたは六量体タンパク質を生成する方法であって、ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを、ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされるポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質が発現されるような条件下で含む宿主細胞を培養するステップと、ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質を回収するステップと、を含む、方法が提供される。
【００１２】
特定の態様では、抗原を経験したＴ細胞および／または活性化ＮＫ細胞の生存または増殖を促進するための方法であって、抗原を経験したＴ細胞および／または活性化ＮＫ細胞を六量体タンパク質または組成物と接触させるステップを含み、ここで六量体タンパク質はＴ細胞および／またはＮＫ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法が提供される。
【００１３】
特定の態様では、活性化されたＧＩＴＲを発現する免疫細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、これらの細胞を、六量体タンパク質または組成物と接触させるステップを含み、ここで六量体タンパク質はこれらの細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法が提供される。
【００１４】
特定の態様では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性化を促進する方法であって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、六量体タンパク質または組成物と接触させるステップを含み、ここで六量体タンパク質はＴ細胞またはＮＫ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法が提供される。
【００１５】
特定の態様では、被験者におけるがんを治療する方法であって、六量体タンパク質、または組成物を有効量で治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００１６】
特定の態様では、被験者における免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする被験者に六量体タンパク質、または組成物を治療有効量で投与するステップを含む、方法が提供される。
【００１７】
特定の態様では、被験者における固形腫瘍を治療する方法であって、上で開示される単離された一本鎖ポリペプチドサブユニットおよびＯＸ４０アゴニストを被験者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００１８】
別の態様では、被験者における固形腫瘍を治療する方法であって、上で開示される単離された一本鎖ポリペプチドサブユニットおよびＴ細胞プライミング剤を被験者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プロテインＧおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製された組換えＧＩＴＲＬ融合タンパク質（ＦＰ）（マトリリン１  ｗｔ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ  ｗｔ）タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析。
【図２Ａ−Ｂ】六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体のＧＩＴＲを発現するＣＨＯ細胞への結合特性を示すグラフ。
【図２Ｃ−Ｄ】六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体のＧＩＴＲを発現するＣＨＯ細胞への結合特性を示すグラフ。
【図３Ａ−Ｂ】三量体ＧＩＴＲＬのＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合に対する六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の競合での阻害特性を示すグラフ。
【図３Ｃ−Ｄ】三量体ＧＩＴＲＬのＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合に対する六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の競合での阻害特性を示すグラフ。
【図４Ａ−Ｂ】ヒトＧＩＴＲが遺伝子導入されたＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子レポーター細胞株を用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力を示すグラフ。
【図４Ｃ−Ｄ】ヒトＧＩＴＲが遺伝子導入されたＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子レポーター細胞株を用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力を示すグラフ。
【図５】（Ａ−Ｄ）六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ＧＣＮ４  ｐＩＩ）、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ  ｗｔ）、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ランゲリンｗｔ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ランゲリン変異体）のアンフォールディング転移。
【図６】溶出ピークのモル質量組成。グラフは、溶液中の多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰマトリリン−１タンパク質（点線）が、容易に同定可能でない主要な種とともに、６１２、３１２および２１５ｋＤａの重量−平均モル質量（左から右へ）を有する３種を形成することを示す。他方、多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ  ｗｔ；破線）および多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ＧＣＮ４  ｐＩＩ；実線）タンパク質質量の９０％超が単一のタンパク質種として溶出する。にもかかわらず、これらのピークは完全に単分散であるあるわけでなく、これはタンパク質に付着されるグリカンの異質性に起因する可能性が最も高い。
【図７】六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の模式図。
【図８】代表的なＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１融合ポリペプチドサブユニットのヌクレオチドおよび翻訳されたタンパク質配列。個別のドメインは、強調され、注釈付けられる。ＥＣＤ＝細胞外ドメイン；ＧＩＴＲＬ＝グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体リガンド；ＨＡ＝ヘマグルチニン。図８の核酸配列は配列番号７として提供され、コードされる前駆体タンパク質配列は配列番号８として提供される。
【図９】還元されたＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰサブユニットにおけるデコンボリュートされたＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳスペクトル。四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析（ＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ）と共役される液体クロマトグラフィーにより測定された、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ単量体サブユニット（配列番号６）の正確な質量は、Ｆｃドメイン内の基準のグリコシル化部位で１鎖あたり１つの二分岐グリカン（主にＧ０ｆ）の付加を伴う予想されるアミノ酸配列に一致する。
【図１０】ユーロピウムクリプテートに複合されたヒトＧＩＴＲ−Ｆｃが、均一時間分解蛍光アッセイにおいてｈＧＩＴＲＬ−ＨＡに結合する。ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の適定では、この結合は阻害されない。配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰは、ｈＧＩＴＲとｈＧＩＴＲＬとの間の結合を０．５６２ｎＭの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で阻害する。実験は２連ウェルで実行された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。ＧＩＴＲ（Ｌ）＝グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（リガンド）。
【図１１】六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ＧＩＴＲ受容体の強力なアゴニストである。被験物質が、ｈＧＩＴＲおよびＮＦκＢプロモーターに連結されたルシフェラーゼレポーター遺伝子が遺伝子導入されたＪｕｒｋａｔ細胞に、指定される濃度で溶液へ添加された。発光として測定されたルシフェラーゼ活性が３時間後に判定された。配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰまたは配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰが、発光における濃度依存的増加をもたらした。この効果に関連する六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのＥＣ５０は１８２ｐＭであった。この効果に関連する六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰのＥＣ５０は２８９ｐＭであった。アイソタイプ対照抗体は効果を全く有しなかった。実験は３連ウェルで実行された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１２】六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に応答して一次ヒトＴ細胞の増殖を増強する。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に応答した一次ヒトＴ細胞の増殖は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含むプレートに結合した六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰまたは配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰの添加によって増強された。効果は濃度依存的であり、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰにおけるＥＣ５０は０．３ｎＭであり、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰにおけるＥＣ５０は０．５ｎＭであった。アイソタイプ対照抗体の添加は全く効果を有しなかった。実験は３連ウェルで実行された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１３】抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に応答した一次ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの放出は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含むプレートに結合した六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰまたは配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰの添加によって増強された。効果は濃度依存的であり、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰにおけるＥＣ５０は０．６ｎＭであり、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰにおけるＥＣ５０は０．８ｎＭであった。アイソタイプ対照抗体の添加は全く効果を有しなかった。実験は３連ウェルで実行された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１４】六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰは、ＮＫ細胞による一次ヒトＴ細胞のＡＤＣＣを媒介する。抗原を経験した一次ヒトＴ細胞は、蛍光標識され、一次ヒトＮＫ細胞と１つのＴ細胞に対する３２のＮＫ細胞の比で混合された。被験物質が指定のように添加され、２４時間のインキュベーション後、Ｔ細胞の％溶解が計算された。配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ＩｇＧ１は、溶解の百分率における増加をもたらす。効果は濃度依存的であり、ＥＣ５０は２３９ｐＭであった。負の対照、配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰは、Ｔ細胞の百分率溶解における増加を全くもたらさなかった。
【図１５】六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰによって媒介されるＡＤＣＣは、増加したＣＤ８：ＣＤ４Ｔ細胞比の生成を支持する。抗原を経験した一次ヒトＴ細胞は、蛍光標識され、一次ヒトＮＫ細胞と１つのＴ細胞に対する３２のＮＫ細胞の比で混合された。被験物質が指定のように添加され、２４時間のインキュベーション後、全Ｔ細胞集団内に存在するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率がフローサイトメトリーによって評価された。配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰは、ＣＤ８：ＣＤ４Ｔ細胞比における濃度依存的変化をもたらし、それはＣＤ８Ｔ細胞を支持する。
【図１６】六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰは、エフェクターＴ細胞増殖の制御性Ｔ細胞媒介性抑制を克服する。分裂したＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の百分率は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体での５日間の刺激後、フローサイトメトリーによって分析された。分裂細胞の百分率は、増加する数のＴ−ｒｅｇの存在下で減少した。プレートに結合したアイソタイプ対照の添加により、分裂細胞の百分率がさらに減少した。配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含むプレートに結合した六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの指定される濃度での添加により、分裂細胞の百分率が、Ｔ−ｒｅｇの不在下で認められる百分率までに回復した。エフェクター単独を用いる実験は、単一のウェル内で行われた。すべての他の実験は２連ウェルで実行された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１７】ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰで治療されたマウスの生存はアイソタイプ依存性である。マウスは、ＣＴ２６細胞の皮下移植後の６日目から２３日目にかけて毎日、ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａまたはｍＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのいずれも５もしくは１０ｍｇ／ｋｇでの腹腔内投与によって治療された。生理食塩水は、負の対照として投与された。
【図１８】ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰは、Ｔ細胞の増殖の増加をもたらす。Ｋｉ６７の発現は、単回用量として０．２ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのいずれかのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰを用いる治療後の７日目、膵臓Ｔ細胞内でフローサイトメトリーによって測定された。丸を伴う黒色ライン＝ＣＤ８Ｔ細胞；四角を伴う暗灰色ライン＝ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−；三角を伴う明灰色ライン＝ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞。有意性は、スチューデントｔ検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を用いて計算された。
【図１９】ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰは、Ｔ細胞上での活性化マーカーＩＣＯＳの発現の増加をもたらす。ＩＣＯＳの発現は、単回用量として０．２ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰを用いる治療後の７日目、膵臓Ｔ細胞内でフローサイトメトリーによって測定された。丸を伴う暗灰色ライン＝ＣＤ８Ｔ細胞；四角を伴う黒色ライン＝ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３。有意性は、スチューデントｔ検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を用いて計算された。ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰを用いる治療は、腫瘍内部でのＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−ヘルパー細胞の頻度における減少をもたらしたが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を変化させなかった。結果全体は、腫瘍微小環境内部でのＣＤ８：ＣＤ４比の増加であった。
【図２０】ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰは、腫瘍内部でのＣＤ８：ＣＤ４比の増加をもたらす。ＣＤ８Ｔ細胞（丸を伴う黒色ライン）；ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−細胞（四角を伴う暗灰色ライン）；ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞（三角を伴う明灰色ライン）の頻度は、単回用量として０．２ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのいずれかのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰを用いる治療後の７日目、腫瘍内部でフローサイトメトリーによって測定された。有意性は、スチューデントｔ検定（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を用いて計算された。
【図２１】六量体ｈＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰがヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃに結合することを示すＥＬＩＳＡデータ。配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含むビオチン化六量体ｈＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの組換えヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＧＩＴＲへの結合。ＣＤ１３７−Ｆｃは、アッセイにおけるバックグラウンドシグナルを決定するための負の対照として用いられた。実験は３連ウェルで実行された。エラーバーは標準偏差を表す。ＣＤ１３７＝表面抗原分類１３７（ＴＮＦＲＳＦ９）；ＣＤ１３７−Ｆｃ＝ｈＩｇＧ１のＦｃドメインに連結された表面抗原分類１３７細胞外ドメイン；Ｃｙｎｏ＝カニクイザル；ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着測定；ＧＩＴＲ−Ｆｃ＝ｈＩｇＧ１のＦｃドメインに連結されたグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体細胞外ドメイン；ＯＤ４５０ｎＭ＝４５０ｎＭの波長での光学密度読み取り値。
【図２２】六量体ｈＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰで治療されるカニクイザルにおける％ＫＩ６７陽性Ｔ細胞亜集団の測定。カニクイザルは、％ＫＩ６７陽性Ｔ細胞亜集団のベースラインレベルについて２０日間監視され、０日目に媒体対照（丸）、１ｍｇ／ｋｇのｈＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ（三角）、または１０ｍｇ／ｋｇのｈＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ（四角）のいずれかで治療され、次に１、３、５、９、１１、１５、１８、２２、および２９日目に％ＫＩ６７陽性Ｔ細胞亜集団について監視された。
【図２３】（Ａ−Ｂ）三量体ｈＧＩＴＲＬのｈＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合に対するｈＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質の競合についての阻害特性およびＩＣ５０値。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ、Ｎ９２ＤおよびＮ１０４Ｄ（Ａ）ならびにｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ、Ｎ１６１Ｄ（Ｂ）。
【図２４】ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質のｈＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合における結合特性およびＫｄ値。
【図２５Ａ】ヒトＧＩＴＲ遺伝子が導入されたＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子レポーター細胞株を用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力およびＥＣ５０値を示すグラフ。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ（Ａ）；ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１２９ＡおよびＮ１２９Ａ／Ｎ１６１Ｄ（Ｂ）；Ｎ１６１ＤおよびＮ１２９Ａ／Ｎ１６１Ｄ（Ｃ）。
【図２５Ｂ−Ｃ】ヒトＧＩＴＲ遺伝子が導入されたＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子レポーター細胞株を用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力およびＥＣ５０値を示すグラフ。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ（Ａ）；ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１２９ＡおよびＮ１２９Ａ／Ｎ１６１Ｄ（Ｂ）；Ｎ１６１ＤおよびＮ１２９Ａ／Ｎ１６１Ｄ（Ｃ）。
【図２６Ａ】チミジン取り込みの読み取りを伴うヒト一次ＣＤ３＋Ｔ細胞再刺激アッセイを用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力を示すグラフ。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ（Ａ）；ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ、Ｎ９２ＤおよびＮ１０４Ｄ（Ｂ）；ｗｔおよびＮ１６１Ｄ（Ｃ）。
【図２６Ｂ】チミジン取り込みの読み取りを伴うヒト一次ＣＤ３＋Ｔ細胞再刺激アッセイを用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力を示すグラフ。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ（Ａ）；ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ、Ｎ９２ＤおよびＮ１０４Ｄ（Ｂ）；ｗｔおよびＮ１６１Ｄ（Ｃ）。
【図２６Ｃ】チミジン取り込みの読み取りを伴うヒト一次ＣＤ３＋Ｔ細胞再刺激アッセイを用いてのＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の相対的効力を示すグラフ。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ（Ａ）；ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ、Ｎ９２ＤおよびＮ１０４Ｄ（Ｂ）；ｗｔおよびＮ１６１Ｄ（Ｃ）。
【図２７】ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ変異体のアンフォールディング転移。
【図２８】チャイニーズハムスター卵巣細胞内で産生されるｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ中で見出される主要なオリゴ糖構造；複合型（Ａ）；高マンノース（Ｂ）Ｍａｎ＝マンノース；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｆｕｃ＝フコース；Ｇａｌ＝ガラクトース；ＮＡＮＡ＝Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）。
【図２９Ａ】ＧＩＴＲＬ  ＦＰのペプチドマッピング。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ（Ａｉ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ（Ａｉｉ）における、Ｆｃ  Ｎ−グリコシル化部位を含むトリプシンペプチド７（Ｔ７）における抽出されたイオンクロマトグラム。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ（Ａｉｉｉ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ（Ａｉｖ）における主要なグリコフォームを示す、Ｔ７における組み合わされたデコンボリュートされた質量スペクトル。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ（Ｂｉ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ（Ｂｉｉ）における、ＧＩＴＲＬ  ＥＣＤ  Ｎ１２９  Ｎ−グリコシル化コンセンサス配列を含むトリプシンペプチド４０（Ｔ４０）における抽出されたイオンクロマトグラム。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ（Ｂｉｉｉ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ（Ｂｉｖ）における、Ｎ１２９でのＮ−グリコシル化の不在に合致する質量を示す、Ｔ４０における組み合わされたデコンボリュートされた質量スペクトル。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ（Ｃｉ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ（Ｃｉｉ）におけるトリプシンペプチド４２〜４３（Ｔ４２〜４３）および４３（Ｔ４３）の各々における抽出されたイオンクロマトグラム。ＧＩＴＲＬ  ＥＣＤ  Ｎ１６１  Ｎ−グリコシル化部位での主要なグリコフォームを示す、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ（Ｃｉｉｉ）におけるＴ４２〜４３における組み合わされたデコンボリュートされた質量スペクトル。Ｎ１６１Ｄ置換およびＮ−グリコシル化の不在を確認する質量を示す、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ（Ｃｉｖ）におけるＴ４３における組み合わされたデコンボリュートされた質量スペクトル。
【図２９Ｂ】図２９Ａの続き。
【図２９Ｃ】図２９Ａの続き。
【図３０】（Ａ−Ｃ）マウスＧＩＴＲリガンド融合タンパク質の構造およびアゴニストとしての可能性。（Ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）もしくは２ａ（ＩｇＧ２ａ）の結晶性断片（Ｆｃ）領域、多量体化ドメイン（ＭＤ）およびマウスＧＩＴＲリガンドの細胞外（ＧＩＴＲ結合）ドメイン（ＥＣＤ）からなるマウスＧＩＴＲＬ−ＦＰの模式図。（Ｂ）精製されたマウスＧＩＴＲＬ−ＦＰのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法。（Ｃ）ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ、ＤＴＡ−１  ｒＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照またはｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰによる治療後の、マウスＧＩＴＲ受容体が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株におけるＮＦ−κＢに関連する発光。データは、少なくとも２つの独立実験を代表する。
【図３１Ａ−Ｃ】網羅的なＦｃγＲの会合が抗腫瘍活性を増強するが、ＧＩＴＲの下流でのＴ細胞増殖の増加を駆動しない。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍成長。マウスは、指定のように、生理食塩水対照、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１またはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの腹腔内注射により、１回治療された。退縮数は個別の各グラフで示される。（Ｂ）ＣＴ２６腫瘍保有マウスの治療後４日にわたる脾臓Ｔ細胞内でのＫｉ６７発現の頻度。（Ｃ）腫瘍内Ｔ細胞サブセットの頻度および（Ｄ）指定のように、１０ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰまたは生理食塩水対照によるＣＴ２６腫瘍保有マウスの治療後４日にわたる腫瘍内ＣＤ８＋対ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞の比。（Ｂ）および（Ｃ）においては、二元分散分析による計算によると、＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；Ｃにおける有意性は、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞における変化として黒色であり、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−細胞における変化として灰色である。
【図３１Ｄ−Ｅ】網羅的なＦｃγＲの会合が抗腫瘍活性を増強するが、ＧＩＴＲの下流でのＴ細胞増殖の増加を駆動しない。（Ｃ）腫瘍内Ｔ細胞サブセットの頻度および（Ｄ）指定のように、１０ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰまたは生理食塩水対照によるＣＴ２６腫瘍保有マウスの治療後４日にわたる腫瘍内ＣＤ８＋対ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞の比。（Ｅ）治療後４日にわたる脾臓および腫瘍内Ｔ細胞サブセットでのＧＩＴＲ発現の中央値蛍光強度。エラーバーは平均の標準誤差を示す（ｎ＝７〜１０マウス／群）。（Ｄ）においては、一元分散分析による計算によると、＊Ｐ＜０．０５；（Ｅ）においては、スチューデントｔ検定による計算によると、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３２】（Ａ−Ｂ）ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａまたはｍＩｇＧ１による治療後の腫瘍内Ｔ−ｒｅｇ枯渇およびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−：Ｔ−ｒｅｇ比。ＣＴ２６腫瘍保有マウスに、生理食塩水対照、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）またはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかが、ＣＴ２６移植後の６日目、腹腔内に１回注射された。（Ａ）治療後４日にわたる腫瘍内のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ−ｒｅｇの割合を示すフローサイトメトリープロット。ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋フローサイトメトリー分析ゲートは、ＦＯＸＰ３蛍光−１つの（ＦＭＯ）対照に基づいて位置づけられる。（Ｂ）腫瘍内ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−：Ｔ−ｒｅｇ比が、指定のように治療後４日目に測定された。統計学的分析が一元分散分析を用いて実施された（＊＊＊＊はＰ値＜０．０００１を示す）。
【図３３Ａ−Ｂ】マウスＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａは、用量およびスケジュールに依存する様式で抗腫瘍活性を媒介する。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍成長。マウスは、（Ａ）指定の用量レベルでのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの単回用量または（Ｂ）毎日［Ｑ１Ｄ］または毎週［Ｑ１Ｗ］に投与される０．２ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの複数回用量の腹腔内注射によって治療された。
【図３３Ｃ】（Ｃ）ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの、指定される用量およびスケジュールを用いての投与後の予測される血清濃度。点線は、最大抗腫瘍活性を達成するのに必要とされるｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの血液濃度閾値を示す。
【図３４】（Ａ−Ｄ）マウスＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａは、用量およびスケジュールに依存する様式でのＴ細胞増殖および活性化におけるＰＤ変化を媒介する。３日毎［Ｑ３Ｄ］または毎日［Ｑ１Ｄ］に１回の０．２ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ２ａ  ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰによる治療後７日にわたるＣＴ２６腫瘍保有マウスの腫瘍流入リンパ節における（Ａ）Ｋｉ６７、（Ｂ）ＩＣＯＳ、（Ｃ）ＰＤ−１および（Ｄ）ＯＸ４０陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度。エラーバーは７〜８マウス／群からの平均値の標準誤差を示す。一元分散分析による計算によると、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊０＜０．０００１。
【図３５】（Ａ−Ｂ）マウスＯＸ４０リガンド融合タンパク質の結合および効力特性。（Ａ）ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａの各々が、組換えマウスＯＸ４０−Ｆｃに対してでなく、組換えマウスＧＩＴＲ−Ｆｃ（黒色バー）に特異的に結合することと、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａの各々が、組換えマウスＧＩＴＲに対してでなく、組換えマウスＯＸ４０（灰色バー）に特異的に結合することを示す結合ＥＬＩＳＡ。ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  Ｙ１８２Ａアイソタイプ対照は、組換えマウスＯＸ４０−Ｆｃに最小限に結合する。（Ｂ）ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１（黒色丸）またはＹ１８２Ａアイソタイプ対照（白色丸）のＪｕｒｋａｔヒトＯＸ４０  ＮＦ−κＢレポーター細胞株上のヒトＯＸ４０への結合。レポーターアッセイにおいて、マウスＯＸ４０Ｌ  ＦＰ  ｍＩｇＧ１はＮＦκＢシグナル伝達を誘導したが、これはｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  Ｙ１８２Ａアイソタイプ対照においては明白でなかった。
【図３６Ａ】ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの抗腫瘍活性は、ＣＴ２６モデルにおいてｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰの場合よりも優れる。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍成長。マウスは、５ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ２ａまたはｍＩｇＧ１のｍＧＩＴＲＬ−ＦＰまたはｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ、５ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ１融合タンパク質アイソタイプ対照または生理食塩水の腹腔内注射で週２回治療された。全退縮の数が個別の各グラフで示される。
【図３６Ｂ】（Ｂ）指定のように治療後１０日目のＣＴ２６腫瘍保有Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍内ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋Ｔ−ｒｅｇの頻度。
【図３７】（Ａ−Ｅ）ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１によって媒介される薬力学（ＰＤ）変化は、差次的であり、組み合わせを通じて増強され得る。２５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ、１５ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１または両分子の組み合わせのいずれかによる週２回治療後の１４日にわたるＣＴ２６腫瘍保有マウスの脾臓における（Ａ）ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−もしくはＣＤ８＋、Ｋｉ６７＋（Ｂ）ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋、ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ  Ｌｏ／−エフェクターメモリー、（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー、（Ｄ）ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋、Ｔ−ｂｅｔ＋および（Ｅ）ＣＤ４＋ＥＯＭＥＳ＋Ｔ細胞の頻度。一元分散分析による計算によると、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊０＜０．０００１。
【図３８】（Ａ−Ｂ）ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１の組み合わせが、Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２およびＣＴ２６腫瘍保有マウスにおいて抗腫瘍活性の増強を誘導するように協同する。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２およびＣＴ２６腫瘍保有マウスにおける腫瘍成長。（Ａ）Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２腫瘍保有マウスに、生理食塩水、２週間、隔週での２５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ、３週間、隔週での１５ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１、または両分子の組み合わせが腹腔内投与され、腫瘍成長が測定された。（Ｂ）ＣＴ２６腫瘍保有マウスは、非治療であるか、またはアイソタイプ対照、２用量、週２回での７．５ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１、単一準最適用量での０．１ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａもしくは両分子の組み合わせの腹腔内注射によって治療された。全退縮の数が個別の各グラフの横に示される。
【図３９】ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１の組み合わせは、単独療法治療と比べて、Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２腫瘍を有するマウスの生存の増加を誘導する。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２腫瘍保有マウスに、生理食塩水、２週間、隔週での２５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ、３週間、隔週での１５ｍｇ／ｋｇのｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１、または両分子の組み合わせが腹腔内投与され、生存が測定された。＊＊＊はＰ値＜０．００１を示し、＊＊はＰ値＜０．０１を示し、かつ＊はＰ値ｏｆ＜０．０５を示す場合のログランク検定。
【図４０Ａ−Ｂ】（Ａ）ＣＴ２６細胞が５×１０５個の細胞／マウスでＢａｌｂ／Ｃマウスに皮下移植された。マウスは６日目に腫瘍体積により無作為化され、投与が開始された（群ｎ＝マウス１０匹）。マウスに、ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ＩｇＧ２ａが（Ｂ）単回用量または（Ｃ）一日おきに９用量（Ｑ２Ｄ×９）のいずれかで腹腔内投与された。それらは、５、１、０．５、０．２、０．１および０．０４ｍｇ／ｋｇで投与された。示されるデータは、２回の反復実験を代表する。
【図４０Ｃ−Ｅ】マウスに、ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ＩｇＧ２ａが（Ｂ）単回用量または（Ｃ）一日おきに９用量（Ｑ２Ｄ×９）のいずれかで腹腔内投与された。それらは、５、１、０．５、０．２、０．１および０．０４ｍｇ／ｋｇで投与された。示されるデータは、２回の反復実験を代表する。（Ｄ）１１日目、マウスは腫瘍サイズに基づいて無作為化され、全く治療されないか、ＤＴＡ−１（抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ）で治療されたか、またはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで治療された（群ｎ＝９）。（Ｅ）マウスは、ＣＤ８Ｔ細胞が８、１０、１２、１４、および１６日目に枯渇した。１１日目、マウスは腫瘍サイズに基づいて無作為化され、全く治療されないか、ＤＴＡ−１で治療されたか、またはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療された。
【図４０Ｆ−Ｇ】（Ｆ）中央値生存。（Ｇ）１８日目、脾臓および腫瘍におけるＣＤ８Ｔ細胞およびＴｒｅｇでのＧＩＴＲ発現を試験するため、ＣＴ２６腫瘍を有する非治療マウスは屠殺された。
【図４１Ａ−Ｃ】（Ａ）ＣＴ２６細胞が５×１０５個の細胞／マウスで、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに皮下移植された。１０日目、マウスは腫瘍体積によって無作為化され、投与が開始された。マウスに、全部で４用量、隔週でｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａが腹腔内投与された。１８日目、（Ｂ）Ｔｒｅｇ、（Ｃ）ＣＤ８Ｔ細胞を試験するため、マウスは屠殺された。
【図４１Ｄ−Ｈ】（Ｄ）マウス脾臓および腫瘍は、１０μｇ／ｍＬのＡＨ１ペプチド／タンパク質輸送阻害剤で５時間再刺激され、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについて染色された。（Ｅ）ＣＤ８細胞上でのＧＩＴＲ発現。（Ｆ）脾臓、リンパ節、および腫瘍におけるＴｒｅｇ上でのＧＩＴＲ発現。（Ｇ）ＣＤ４Ｔ細胞上でのＫＩ−６７。（Ｈ）ＣＤ８Ｔ細胞上でのＫＩ−６７。
【図４２Ａ−Ｂ】ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰは、抗原特異的Ｔ細胞を用量依存的様式で拡大する。（Ａ）単回用量のｍＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療されたＣＴ２６腫瘍保有マウスは、腫瘍が除去され、８５日目［Ｒ矢印］に５×１０５個のＣＴ２６細胞／マウスを再負荷することから保護される。（Ｂ）ＣＴ２６の再負荷後１２０日目［ＰＤ矢印］、マウス脾臓が収集され、単一細胞に処理され、１０μｇ／ｍＬのＡＨ１ペプチド／タンパク質輸送阻害剤で５時間再刺激された。マウスは、ＡＨ１特異的Ｔ細胞における用量依存的増加を有した。
【図４２Ｃ】（Ｃ）各群からのマウス５匹の代表的プロット。比較のため、ナイーブマウスおよびＣＴ２６腫瘍を有する非治療マウス（１０日目）が含まれる。
【図４３】（Ａ−Ｄ）（Ａ）−（Ｂ）ＴＣ−１細胞が２×１０４個の細胞／マウスで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠に移植された。１４日目、マウスは腫瘍体積によって無作為化され、投与が開始された。マウスに、全部で４用量のｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａが隔週で腹腔内投与された。２４日目、（Ｃ）Ｔｒｅｇ上でのＧＩＴＲ発現およびＣＤ８Ｔ細胞上でのＧＩＴＲ発現を試験するため、非治療マウスを屠殺した。マウスをＥ７特異的Ｔ細胞について評価し、Ｅ７再刺激またはデキストラマーにより何も検出されなかった。
【図４４Ａ−Ｃ】（Ａ）Ｅ７特異的Ｔ細胞を作製するため、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの尾の付け根に、ＣｐＧ（Ａｄｄａｖａｘ）中、１０ｕｇのＥ７  ＳＬＰを注射した。次に、マウスは、３用量、１ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療された。マウスは、脾臓の（Ｂ）ＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ）ＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）Ｅ７デキストラマー＋Ｔ細胞（Ｅ）Ｔｒｅｇ、（Ｆ）抗原特異的細胞上のＧＩＴＲレベルについて評価された。
【図４４Ｄ−Ｆ】マウスは、脾臓の（Ｂ）ＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ）ＣＤ８Ｔ細胞（Ｄ）Ｅ７デキストラマー＋Ｔ細胞（Ｅ）Ｔｒｅｇ、（Ｆ）抗原特異的細胞上のＧＩＴＲレベルについて評価された。
【図４４Ｇ−Ｉ】（Ｇ）ＴＣ−１細胞が２×１０４個の細胞／マウスで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠に移植された。１４日目、マウスは腫瘍体積によって無作為化され、投与が開始された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾の付け根に、ＣｐＧ（Ａｄｄａｖａｘ）中、１０ｕｇのＥ７  ＳＬＰが注射された。２８日目、マウスは屠殺された。脾臓および腫瘍が、（Ｈ）−（Ｉ）Ｅ７および特異的ＣＤ８Ｔ細胞（Ｊ）−（Ｋ）について評価された。
【図４４Ｊ−Ｋ】脾臓および腫瘍が、（Ｈ）−（Ｉ）Ｅ７および特異的ＣＤ８Ｔ細胞（Ｊ）−（Ｋ）について評価された。
【図４５Ａ−Ｃ】（Ａ）ＴＣ−１細胞が２×１０４個の細胞／マウスで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠に移植された。１４日目、マウスは腫瘍体積によって無作為化され、投与が開始された。（Ｂ）ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾の付け根に、ＣｐＧ（Ａｄｄａｖａｘ）中、３．３ｕｇのＥ７  ＳＬＰが注射された。治療されたマウスに、全部で４用量のＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａが隔週で腹腔内投与された。（Ｃ）Ｐ＜０．０５でのＴＣ−１移植後のマウスのカプラン・マイヤー生存。
【図４５Ｄ−Ｆ】（Ｄ）群の中央値生存。（Ｅ）薬力学的効果を試験するため、（Ａ）と治療されたマウス群は屠殺され、脾臓および腫瘍が収集された。腫瘍はプールされ、脾臓は個体として残された。（Ｆ）腫瘍内のＣＤ４５＋細胞が評価された。
【図４５Ｇ】（Ｇ）マウスの脾臓および腫瘍が、１μｇ／ｍＬのＥ７ペプチド／タンパク質輸送阻害剤で５時間再刺激され、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについて染色され、脾臓および腫瘍のＴｒｅｇが測定された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
抗原による予備刺激の間またはその直後でのＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＧＩＴＲ受容体の会合の結果、Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原に対する応答が増強する。例えば活性化シグナル（例えば、抗原曝露）による予備刺激の間またはその直後でのＮＫ細胞またはＢ細胞上のＧＩＴＲ受容体の会合の結果、ＮＫ細胞またはＢ細胞の応答が増強する。本開示との関連では、用語「会合」は、ＧＩＴＲ受容体への結合およびＧＩＴＲ受容体よって媒介される少なくとも１つの活性の刺激を指す。例えば、抗原特異性のあるもの、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＧＩＴＲ受容体の会合の結果、抗原単独に対する応答と比べて、Ｔ細胞増殖が増強され、かつサイトカイン産生が増加する。抗原に対する増強された応答は、ＧＩＴＲ受容体会合の不在下よりも実質的に長い期間、維持され得る。したがって、ＧＩＴＲ受容体を介する刺激は、非自己、例えば腫瘍抗原またはウイルス抗原のＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞認識を追加免疫することにより、抗原特異的免疫応答を増強する。ＧＩＴＲは、特定の慢性ウイルス感染のＴ細胞媒介性制御に関与している（Ｐａｓｃｕｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１５  Ｍａｒ４；１１（３）；Ｃｌｏｕｔｈｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１５  Ｊａｎ  １５；１１（１））。
【００２１】
ＧＩＴＲアゴニストは、被験者、例えばヒト被験者において、抗原によるＴ細胞の予備刺激の間またはその直後に被験者に投与されるとき、抗原特異的免疫応答を増強し得る。ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲリガンド（「ＧＩＴＲＬ」）、例えば可溶性ＧＩＴＲＬ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体またはその断片を含む。具体例が、ＧＩＴＲＬの受容体結合ドメイン、多量体化ドメイン、例えば三量体化ドメイン、例えばコロニン１ａから誘導されるαヘリカルコイルドコイルドメイン、およびＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドサブユニットであり、ここでポリペプチドサブユニットは多量体（例えば三量体または六量体）融合タンパク質に自己組織化する。さらに本明細書に記載されるのは、かかる融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸である。本開示はまた、多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質を用いて被験者における抗原特異的免疫応答を増強するための方法を提供する。ＧＩＴＲＬ融合タンパク質に関連して本明細書で開示される組成物および方法は、より一般には、例えば、がんを治療する方法、ウイルス感染を治療する方法、または被験者における免疫応答を増強する方法における、多量体（例えば三量体および六量体）受容体に結合する融合タンパク質の生成および使用に適用され得る。
【００２２】
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「ポリペプチドサブユニット」は、１つまたは複数のポリペプチドサブユニットを表すと理解される。従って、用語「１つの（ａ）」（もしくは「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００２３】
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
【００２４】
単位、接頭辞、および符号は、国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）承認の形態で表記する。数値の範囲は、範囲を定める数もふくむ。別に記載のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で、左から右に向かって記載する。本明細書に記載する見出しは、本開示の様々な態様または態様の限定ではなく、全体として本明細書の参照により援用され得る。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書への参照により、その全体がより詳細に定義される。
【００２５】
本明細書で用いられるとき、語句「抗原を経験した」は、抗原に曝露されている細胞を説明するために用いられ、ここでその抗原への曝露は細胞における応答を誘発している。
【００２６】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」および複数形「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖状に結合しているモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、規定の長さの生成物を指さない。したがって、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、それらの用語のいずれにも代えて、またはそれらの用語と互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾、例として、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、または非標準アミノ酸による修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然生物学的資源に由来し得、または組換え技術により産生することができるが、指定される核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、任意の様式、例として化学合成により生成することができる。
【００２７】
本明細書において使用される「タンパク質」は、単一ポリペプチド、すなわち、上に定義した通りの単一のアミノ酸鎖を指し得るが、例えば、ジスルフィド結合、水素結合、または疎水性相互作用により、結合して、多量体タンパク質を生成する２つ以上のポリペプチドを指す場合もある。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドサブユニット」は、同一または異なる他のポリペプチドサブユニットと相互作用して、多量体タンパク質、例えば、本明細書に記載する六量体タンパク質を形成することができるアミノ酸からなるポリペプチド鎖を指す。
【００２８】
本明細書に開示のポリペプチドは、約３アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、７５アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、５００アミノ酸以上、１０００アミノ酸以上、または２０００アミノ酸以上のサイズであり得る。ポリペプチドは、定義された３次元構造を有し得るが、それらは、そのような構造を必ずしも有さない。定義された３次元構造を有するポリペプチドは、フォールドと称され、定義された３次元構造を有さないが、多数の異なる立体構造を採り得るポリペプチドは、アンフォールドと称される。
【００２９】
物質、組成物、または実体、またはその任意の文法的変形の「単離された」物質、組成物、実体、および／または任意の組み合わせ、例えば単離された生物学的材料は、その天然環境下でない物質である。特定レベルでの精製が必要とされない。例えば、単離された抗体は、その天然または自然環境下で産生されないかまたは位置しない抗体である。非天然細胞内で生成される材料、例えばハイブリドーマのように、組換え的に生成された生物学的材料は、本明細書で開示される通りに単離されたと考えられる。物質、例えば生物学的材料もまた、それが任意の好適な技法により、分離されている、分画されている、または部分的もしくは実質的に精製されている場合、「単離された」と考えられる。特定の態様では、単離された物質、例えば単離された生物学的材料は、「非天然」であり得る。
【００３０】
本明細書で用いられるとき、物質、組成物、または実体、またはその任意の文法的変異体の用語「非天然起源の」物質、組成物、実体、および／または任意の組み合わせは、当業者により「天然起源の」として十分に理解されているか、あるいは審査官または米国特許商標局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）などの行政機関、または裁判機関により随時、「天然起源の」であると判定または解釈され得る、物質、組成物、実体、および／または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせの形態を単に除外するのではなく、明示的に除外する条件付き用語である。例えば、用語「非天然起源抗体は、天然に存在する抗体、例えば、通常の抗原刺激環境に曝露されるマウスの免疫系において天然に存在することになる抗体、または行政機関、例えば米国特許商標局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）、もしくは裁判機関、例えば連邦裁判所により、「天然起源の」であると最終的に判定される抗体を明示的に除外する。
【００３１】
本明細書に開示する他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、およびこれらの任意の組み合わせである。本明細書に開示するポリペプチドサブユニットまたは多量体タンパク質に関して、用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、完全なポリペプチドまたはタンパク質の活性の少なくとも一部を保持するが、構造的に異なる任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含し得る。ポリペプチドの断片として、例えば、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が挙げられる。バリアントとしては、前述した断片、さらには、アミノ酸置換、欠失、または挿入により改変したアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。バリアントは、自然に発生したものであってもよいし、または意図的に構築したものでもよい。意図的に構築したバリアントは、当分野で公知の突然変異誘発技術を用いて生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存または非保存アミノ酸置換、欠失もしくは付加を含んでもよい。誘導体は、天然ポリペプチドに見出されない追加的特徴を呈示するように改変されたポリペプチドである。例として、融合タンパク質がある。バリアントポリペプチドはまた、本明細書において、「ポリペプチド類似体」と呼ぶこともできる。本明細書で使用される「誘導体」は、官能側基の反応により化学的に誘導体化した１つまたは複数のアミノ酸を有する対象のポリペプチドを指す。また、「誘導体」として、２０個の標準アミノ酸からなる１つまたは複数の標準もしくは合成アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換することができ；５−ヒドロキシリシンでリシンを置換することができ；３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換することができ；ホモセリンで、セリンを置換することができ；オルニチンでリシンを置換することができる。
【００３２】
「保存アミノ酸置換」は、１アミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸により置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当分野において定義されており、これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。例えば、フェニルアラニンによるチロシンの置換は、保存置換である。タンパク質活性を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存置換を同定する方法は、当分野ではよく知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１  １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：．４１２−４１７（１９９７））。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「抗体」（またはその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、抗原、Ｂ細胞により産生される典型的抗体の場合には、重鎖（ＶＨ）の可変ドメインおよび軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインに結合することができる抗体の少なくとも最小部分を指す。脊椎動物系における基本的な抗体構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）参照。
【００３４】
抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体として、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生される断片が挙げられる。ｓｃＦｖ分子は、当分野において公知であり、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。本開示により包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。
【００３５】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸および複数形の核酸を包含するものとし、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用のホスホジエステル結合または非慣用結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示の単離とみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに合成により産生されたそのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得、またはそれらを含み得る。
【００３６】
本明細書において使用される「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含む核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それは、コード領域の一部とみなすことができるが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部でない。２つ以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば、単一ベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一コード領域を含有し得、または２つ以上のコード領域を含み得、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードし得る。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、ポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する融合タンパク質をコードする核酸に融合されておりまたは融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されるものではないが、特殊化エレメントまたはモチーフ、例えば分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。
【００３７】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つまたは複数のコード領域と作動可能に会合しているプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に配置するように１つまたは複数の調節配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと会合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指向する発現調節配列の能力もＤＮＡテンプレートの転写される能力も妨害しない場合、「作動可能に会合している」または「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらし得る場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合している。プロモーターは、所定の細胞中でのみＤＮＡの実質的な転写を指向する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加え、他の転写制御エレメントは、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが細胞特異的転写を指向するためにポリヌクレオチドと作動可能に会合していてよい。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示される。
【００３８】
種々の転写制御領域は、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、脊椎動物において機能する転写制御領域、例えば、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（イントロンＡと連携する前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御し得る他の配列が含まれる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が含まれる。
【００３９】
同様に、種々の翻訳制御エレメントは、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が含まれる。
【００４０】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態であり得る。
【００４１】
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載するポリペプチドサブユニットをコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指向する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合していてよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を越える成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から開裂されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態を産生するために完全または「全長」ポリペプチドから開裂されるポリペプチドのＮ末端に融合しているシグナルペプチドを有することに精通している。ある実施形態において、ネイティブシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、または作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指向する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、インフルエンザＡヘマグルチニン、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置換することができる。
【００４２】
「ベクター」は、核酸分子であり、宿主細胞に導入されると、形質転換宿主細胞が生成される。ベクターは、これが宿主細胞で複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターはさらに、１つまたは複数の選択マーカ遺伝子および当分野で公知の他の遺伝エレメントを含んでもよい。
【００４３】
「形質転換」細胞、または「宿主」細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で用いられるように、形質転換という用語は、核酸分子をこうした細胞に導入することができるあらゆる技術、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、およびパーティクル・ガン加速によるネイキッドＤＮＡの導入などが挙げられる。形質転換細胞または宿主細胞は、細菌細胞または真核細胞であってよい。
【００４４】
「特異的に結合する」とは、一般に、分子、例えば、ＧＩＴＲＬまたはその受容体結合断片が、その受容体結合ドメインを介して別の分子、例えば、ＧＩＴＲに結合すること、ならびに、結合が、抗原結合リガンドと受容体との間にある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、リガンドは、それがその受容体結合ドメインを介して、ランダムの無関連な分子に結合するよりも容易に受容体に結合する場合、その受容体に「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書において、あるリガンドがある受容体に結合する相対親和性を特定するために使用される。例えば、リガンド「Ａ」は、所与の受容体についてリガンド「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、またはリガンド「Ａ」は、それが関連受容体「Ｄ」について有するよりも高い特異性で受容体「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００４５】
「受容体結合ドメイン」とは、リガンド、例えば、本明細書に開示するＧＩＴＲＬに含まれる結合ドメインを意味する。
【００４６】
リガンド、例えば、本明細書に開示するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１または１０−３秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で受容体、例えば、ＧＩＴＲに結合することができる。リガンド、例えば、本明細書に開示するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で受容体、例えば、ＧＩＴＲに結合することができる。
【００４７】
用語「阻害する」、「ブロックする」および「抑制する」は、本明細書において互換的に用いられ、完全な活性のブロックを含む、あらゆる統計的に有意な生物活性の減少を指す。例えば、「阻害」は、生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少を指し得る。
【００４８】
本明細書において使用される用語「親和性」は、リガンドとそのコグネイト受容体との結合の強さの尺度を指す。本明細書において使用される用語「アビディティー」は、リガンドの集団と受容体との複合体の総合安定性、すなわち、リガンドと受容体の組み合わせ、例えば、六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ融合タンパク質（ＧＩＴＲＬ  ＦＰ）と細胞表面ＧＩＴＲの相互作用の機能的組み合わせ強度を指す。アビディティーは、集団における個々の受容体結合ドメインと規定の受容体との親和性、ならびにまたリガンドと受容体の価数の両方に関する。
【００４９】
リガンド、例えば、本明細書に開示するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質は、リガンドに対するそれらの結合親和性に関して記載または規定することもできる。例えば、リガンドは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数またはＫＤで受容体に結合し得る。
【００５０】
リガンド、例えば、本明細書で開示されるようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質は、受容体、例えばＧＩＴＲに、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１もしくは５×１０４Ｍ−１秒−１のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合し得る。リガンド、例えば、本明細書で開示されるようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質は、受容体、例えばＧＩＴＲに、１０５Ｍ−１秒−１以上、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１もしくは１０７Ｍ−１秒−１のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合し得る。
【００５１】
ＧＩＴＲ、または「ＧＩＴＲ受容体」は、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ関連タンパク質、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１８、ＴＮＳＦ１８、活性化誘導性ＴＮＦ関連受容体、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、およびＲＰ５−９０２Ｐ８．２とも様々に称されるタンパク質であり、活性化ＮＫ細胞および抗原を経験したＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上、ならびにＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞上に発現される（Ｔｒｅｇｓ；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１７３（８）：５００８−５０２０）。ＧＩＴＲは、例えば配列番号４７のタンパク質である。グルココルチコイド誘導ＴＮＦ関連リガンド、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１８リガンド、ＴＮＦＳＦ１８リガンド、ＴＬ６、活性化誘導性ＴＮＦ関連リガンド、ＡＩＴＲリガンド、ＡＩＴＲＬ、およびＲＰ１−１５Ｄ２３とも様々に称される「ＧＩＴＲリガンド」（「ＧＩＴＲＬ」）は、主に抗原提示細胞上に見出される（ＡＰＣｓ；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）１７３（８）：５００８−５０２０）。ＧＩＴＲＬは、細胞の表面上に発現され、細胞内、膜貫通および細胞外受容体結合ドメインを含む。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、用語「ＧＩＴＲＬ」は、全ＧＩＴＲリガンド、可溶性ＧＩＴＲリガンド、およびＧＩＴＲリガンドの機能活性部分を指す。また、ＧＩＴＲＬの天然対立遺伝子変異体、天然ＧＩＴＲリガンド分子からのアミノ酸配列が変化したＧＩＴＲリガンド変異体、およびかかる変異体の組み合わせのいずれもがＧＩＴＲＬの定義の中に含まれ、その場合、変異体はＧＩＴＲ受容体に特異的に結合する能力を保持する。アミノ酸残基置換を含むＧＩＴＲＬの特定の変異体は、本明細書で配列番号１の成熟ＧＩＴＲＬタンパク質中の残基数によって同定される。例えば、Ｎ１６１Ｄは、配列番号１の成熟ヒトＧＩＴＲＬの１６１位のアスパラギル残基とアスパルチル残基との置換、ならびに配列番号６および配列番号８のヒトＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン内の対応位置における同じ置換も指す。配列番号１のＧＩＴＲＬ配列における様々な置換については、配列番号１のＧＩＴＲＬポリペプチド以外のＧＩＴＲＬポリペプチド中の対応残基の相当する置換もまた、本明細書で提供される。かかる対応残基は、配列番号１配列を置換されるべきＧＩＴＲＬ配列と整列することにより容易に同定され得る。例えば、配列番号１への単一アミノ酸のＮ末端付加を有するＧＩＴＲＬペプチドであれば、配列番号１の１６１位でのアスパラギル残基の置換に相当することになる１６２位でのアスパラギル残基の置換を有し得る。
【００５３】
本明細書で用いられるとき、用語「ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット」または「ＧＩＴＲＬ  ＦＰサブユニット」は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン；機能的三量体化ドメイン；およびグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）の受容体結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドサブユニットを指し、ここでポリペプチドサブユニットは、多量体、例えば三量体もしくは六量体タンパク質に自己組織化し得る。用語「多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質」または「多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ」は、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットの自己組織化された多量体（例えば三量体および六量体を含む）を指す。特定のアイソタイプのＩｇＧ  ＦｃドメインがＧＩＴＲＬ  ＦＰサブユニット内で用いられるとき、そのアイソタイプを有するＧＩＴＲＬ  ＦＰは、「ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧＸ  ＦＰ」（Ｘは、１、２、２ａ、３、４、もしくは４Ｐであり得る）、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ２  ＦＰ、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ２ａ  ＦＰ、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ３  ＦＰ、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４  ＦＰ、およびＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４Ｐ  ＦＰとして記載される。
【００５４】
本明細書で用いられるとき、「ＯＸ４０ポリペプチド」は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３３１８に対して少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。ＯＸ４０は、抗原活性化された哺乳動物のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面上に発現される受容体のＴＮＦＲ−スーパーファミリーのメンバーである。例えば、Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，１２８１−１２９０（１９８７）；Ｍａｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ９，１０６３−１０６８（１９９０）；およびＣａｌｄｅｒｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１，５２６１−５２７１（１９９３））を参照のこと。ＯＸ４０は、ＣＤ１３４、ＡＣＴ−４、およびＡＣＴ３５とも称される。ＯＸ４０受容体配列は、当該技術分野で公知であり、例えばジェンバンク受入番号：ＡＡＢ３３９４４またはＣＡＥ１１７５７で提供される。
【００５５】
例示的なヒトＯＸ４０アミノ酸配列が以下に提供される。
【化１】
2018522571.tif 000003
【００５６】
「ＯＸ４０リガンド」は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３３１７に対して少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、かつＯＸ４０受容体に特異的に結合するポリペプチドまたはその断片を意味する。例えば、Ｂａｕｍ  Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１（１９９４））を参照のこと。ＯＸ４０Ｌという用語は、全ＯＸ４０リガンド、可溶性ＯＸ４０リガンド、および第２の部分、例えばタンパク質ドメインに共有結合したＯＸ４０リガンドの機能活性部分を含む融合タンパク質を含む。また、ＯＸ４０Ｌの定義の中に、天然ＯＸ４Ｌからアミノ酸配列が変化するが、ＯＸ４０受容体に特異的に結合する能力を保持する変異体が含まれる。さらに、ＯＸ４０Ｌの定義の中に、ＯＸ４０の生物学的活性を増強する変異体が含まれる。ＯＸ４０リガンド配列は、当該技術分野で公知であり、例えばジェンバンク受入番号：ＮＰ＿００３３１８で提供される。
【００５７】
例示的なヒトＯＸ４０リガンドアミノ酸配列が以下に提供される。
【化２】
2018522571.tif 000004
【００５８】
本明細書で用いられるとき、「ＯＸ４０アゴニスト」は、ＯＸ４０受容体と特異的に相互作用し、ＯＸ４０受容体の生物学的活性を増強するＯＸ４０リガンドを意味する。望ましくは、生物学的活性は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくはさらに１００％増強される。特定の態様では、本明細書で開示されるようなＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０結合ポリペプチド、例えば抗ＯＸ４０抗体（例えばＯＸ４０アゴニスト抗体）、ＯＸ４０リガンド、またはこれらの分子の断片もしくは誘導体を含む。
【００５９】
本明細書で用いられるとき、「ＯＸ４０抗体」は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体を意味する。ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０およびその抗原結合断片に特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。特定の態様では、本明細書に記載されるような抗ＯＸ４０抗体は、モノクローナル抗体（またはその抗原結合断片）、例えば、マウス、ヒト化、もしくは完全ヒトモノクローナル抗体である。１つの特定の実施形態では、ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０受容体アゴニスト、例えばＷｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２９，５７５−５８５（２００６）によって記載されるマウス抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体（９Ｂ１２）である。他の実施形態では、ＯＸ４０またはその抗原結合断片に特異的に結合する抗体は、ｍＡｂ  ９Ｂ１２と同じＯＸ４０エピトープに結合する。別の態様では、抗体はＭＥＤＩ０５６２である。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１３７７４０号明細書を参照のこと。
【００６０】
本明細書で用いられるとき、「ＯＸ４０リガンド融合タンパク質（ＯＸ４０Ｌ  ＦＰ）」は、ＯＸ４０受容体に特異的に結合し、免疫応答を増強するタンパク質を意味する。一実施形態では、ＯＸ４０リガンド融合タンパク質のＯＸ４０受容体への結合は、Ｔ細胞認識をブーストすることにより腫瘍抗原特異的免疫応答を増強する。例示的なＯＸ４０リガンド融合タンパク質は、「Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ＯＸ４０  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」という表題の米国特許７，９５９，９２５号明細書に記載されている。他のＯＸ４０リガンド融合タンパク質は、例えば米国特許第６，３１２，７００号明細書に記載されている。一実施形態では、ＯＸ４０リガンド融合タンパク質は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を増強する。一実施形態では、ＯＸ４０リガンド融合タンパク質はＭＥＤＩ６３８３（配列番号５０）である。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００２４１７６号明細書を参照のこと
【００６１】
「三量体化ドメイン」は、三量体へのポリペプチドの組織化を促進するポリペプチド内のアミノ酸配列である。例えば、三量体化ドメインは、他の（同じまたは異なるアミノ酸配列を有する別のポリペプチドの）三量体化ドメインとの結合を介して三量体への組織化を促進する。この用語はまた、ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すためにも用いられる。
【００６２】
用語「Ｆｃ」ドメインは、抗体定常領域の一部を指す。伝統的に、Ｆｃドメインという用語は、抗体の対合ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含む、プロテアーゼ（例えば、パパイン）切断生成物を指す。本開示に関連して、ＦｃドメインまたはＦｃという用語は、生成の手段とは関係なく、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の全部または一部を含む、任意のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を指す。
【００６３】
本明細書で用いられるとき、用語「ＩｇＧ  Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃドメイン、およびかかるＦｃドメインの変異体を指す。ＩｇＧ４  Ｆｃドメインの変異体は、限定はされないが、ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃドメインを含む。
【００６４】
本明細書において使用される用語「ＣＨ２ドメイン」には、例えば、慣用の番号付与スキームを使用して、抗体の概ねアミノ酸２４４からアミノ酸３６０に及ぶ重鎖分子のＦｃドメインの部分が含まれる（アミノ酸２４４から３６０、Ｋａｂａｔ番号付与系；およびアミノ酸２３１〜３４０、ＥＵ番号付与系）。また、ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端に及んで、約１０８アミノ酸を含むことも十分に立証されている。
【００６５】
本明細書で用いられるとき、用語「リンカー領域」は、２つのタンパク質ドメインを融合または連結するために用いられる任意のペプチドを含む。かかるリンカーは、限定はされないが、（Ｇｌｙ４）ｎモチーフ（複数可）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（複数可）（配列番号１９）、およびＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（複数可）（配列番号２２）を含むペプチドを含む。
【００６６】
本明細書において使用される用語「ＩｇＧヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結させる重鎖ＩｇＧ分子のＦｃドメインの部分が含まれる。このヒンジ領域は、約２５アミノ酸を含み、フレキシブルであり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能とする。ヒンジ領域は、３つの区別されるドメイン：上部、中央部、および下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））に下位分類することができる。
【００６７】
本明細書において使用される用語「ジスルフィド結合」には、２つの硫黄原子間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、第２のチオール基とのジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。本明細書に記載するいくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、２つのヒンジ領域の間にジスルフィド結合形成を、具体的には、２２８位（ＥＵ番号付与に従う）でのセリンからプロリンへの突然変異を確実にするように、ヒンジ領域で突然変異させることができる。Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、本明細書において「ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン」と呼ばれる。
【００６８】
本明細書において使用される用語「結合している」、「融合している」または「融合」は、互換的に使用され得る。これらの用語は、あらゆる手段、例として化学コンジュゲーションまたは組換え手段によるさらに２つのエレメントまたは構成成分の連結を指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持する様式で連続するより長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の連結を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦ（セグメントが通常、天然では連結されていない）によりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質であり、例えば、本明細書に記載するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットである。リーディングフレームはこうして融合セグメント全体にわたり連続的とされるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的または空間的に分離することができる。
【００６９】
ポリペプチドに関して、「直鎖配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接するアミノ酸がポリペプチドの１次活性化構造中で連続する、アミノからカルボキシ末端方向におけるポリペプチド中のアミノ酸の順序である。
【００７０】
本明細書において使用される用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスには、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕在化、例として、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現および安定的発現の両方が含まれる。それには、限定されるものではないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終所望産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆体の作出が含まれる。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用される遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生される核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれでもよい。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解開裂などを有するポリペプチドがさらに含まれる。
【００７１】
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療」または「〜の治療」（例えば、「がん患者を治療する」段階において）は、がん治療の文脈において使用される場合、例えば、対象が、より長期の生存率を有するか、またはその不快が軽減される程度までの、疾患病状の強度の低減、疾患の症状の発生の低下を指す。例えば、治療は、療法が、対象に投与されたとき、疾患症状、兆候、または原因を軽減する能力を指す。治療はまた、少なくとも１つの臨床症状の緩和もしくは軽減および／または病状の進行の阻害もしくは遅延および／または疾患もしくは疾病の発症の予防もしくは遅延も指す。
【００７２】
本明細書で用いられるとき、用語「治療する」、「治療」または「〜の治療」は、（例えば「ウイルス感染を治療する」という語句で）ウイルス感染を治療することに関連して用いられるとき、ウイルス感染に伴う病態および／または症状を軽減することを指す。
【００７３】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜動物、農場動物、競技動物、および動物園動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、クマなどが含まれる。
【００７４】
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物活性を有効にするような形態を採り、しかも、組成物が投与される対象に対して、許容されないほど毒性の追加成分を含有しない製剤を指す。このような組成物は、無菌であってよい。
【００７５】
本明細書に開示する抗体の「有効量」は、具体的に記載される目的を実施するのに十分な量である。「有効な量」は、記載される目的に関して、実験により、常用的方法で決定することができる。
【００７６】
ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット
本開示は、限定はされないが、遺伝子導入された哺乳動物細胞培養液中で発現されるときの改善された収量；ＧＩＴＲに対する改善された結合親和性；様々な生物検定における改善された活性および／または精製または部分精製されるときのＧＩＴＲＬを含有する以前に開示されたポリペプチドと比べて改善された均一性を含む、改善された特性を有する多量体、例えば三量体または六量体タンパク質に組織化し得るＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットに関する（例えば、Ｗｙｚｇｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；１８３：１８５１−１８６１を参照）。本明細書で提供されるＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、およびヒトＧＩＴＲＬの受容体結合ドメインを含み得る。例示的な実施形態は、図７に概略的に図示される。典型的には、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、三量体化ドメインおよびＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向に配列される。例示的なＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１融合ポリペプチドサブユニットは、配列番号６によって表される。
【００７７】
特定の実施形態では、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインは、ヒトＧＩＴＲＬの細胞外ドメインである。１つのかかるドメインの配列は、配列番号３７によって表される。
【００７８】
特定の態様では、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインは、ＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメインである。使用可能なＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメインは、限定はされないが、配列番号３７の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の態様では、ＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメインは、配列番号３４の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドである。特定の態様では、配列番号１のアスパラギル１６１に対応するＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメイン残基は、任意のアミノ酸またはアスパルチル残基と置換される。配列番号１のアスパラギル１６１に対応する残基が任意のアミノ酸またはアスパルチル残基と置換される場合のＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメインは、限定はされないが、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。かかる置換は、ＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメイン内のこの部位のＮ結合グリコシル化を低減または除去し得る。特定の態様では、配列番号１のアスパラギル１０６に対応するＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメイン残基は、アラニル残基と置換される。特定の状況では、ｈＧＩＴＲＬのＮ１０６Ａ置換の結果、ＧＩＴＲへの結合が増加し、Ｔ細胞増殖応答が改善し得る（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（４９）：１９４５２−１９４５７）。特定の態様では、Ｇｌｕ５２、Ｐｈｅ６２、Ｐｒｏ６６、Ｐｒｏ６７、Ｍｅｔ７１、Ｐｒｏ７７、Ｖａｌ７９、Ａｓｎ９２、Ｓｅｒ８３、Ｇｌｙ９９、Ａｓｎ１０４、Ｐｒｏ１１２、Ａｒｇ１１６、Ｍｅｔ１２３、Ａｓｎ１５３、Ｖａｌ１５８、Ａｓｎ１６１、Ｉｓｏ１６７、Ｉｓｏ１６８、およびこれらの組み合わせに対応するＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメイン残基は、非天然アミノ酸残基または対立遺伝子変異体のアミノ酸残基と独立して置換される。ＧＩＴＲＬ変異体細胞外ドメインの非限定例が、配列番号３５で提供される（式中、Ｘ１＝ＧｌｕまたはＡｌａ、Ｘ２＝ＳｅｒまたはＰｈｅ、Ｘ３＝ＴｈｒまたはＰｒｏ、Ｘ４＝ＬｅｕまたはＳｅｒ、Ｘ５＝ＴｈｒまたはＭｅｔ、Ｘ６＝ＬｅｕまたはＰｒｏ、Ｘ７＝ＭｅｔまたはＶａｌ、Ｘ８＝Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、またはＳｅｒ、Ｘ９＝ＳｅｒまたはＧｌｙ、Ｘ１０＝ＡｒｇまたはＰｒｏ、Ｘ１１＝ＴｒｐまたはＡｒｇ、Ｘ１２＝ＬｅｕまたはＭｅｔ、Ｘ１３＝ＳｅｒまたはＡｓｎ、Ｘ１４＝ＰｈｅまたはＶａｌ、Ｘ１５＝ＡｓｎまたはＡｓｐ以外の任意のアミノ酸、Ｘ１６＝ＶａｌまたはＩｌｅ、Ｘ１７＝ＬｅｕまたはＩｌｅであり、かつＸ１〜Ｘ１７は独立して選択され、任意の組み合わせで存在し得る）。
【００７９】
ＧＩＴＲ受容体に結合するという所望される特性を保持する任意のＧＩＴＲＬポリペプチド配列が、本明細書に記載の融合ポリペプチドおよび方法において好適である。
【００８０】
ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインに隣接するのが三量体化ドメインである。用語「隣接する」は、例えば、リンカー領域もしくは異種薬剤と隣接する、またはリンカー領域もしくは異種薬剤を介して会合することを含む。かかるドメインは、互いに隣接するとき、互いに直接的に融合されるドメインである。三量体化ドメインは、個別のＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットの三量体タンパク質または六量体タンパク質への自己組織化を促進することに役立つ。特定の実施形態では、三量体化ドメインを有するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、六量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質に自己組織化する。一実施形態では、三量体化ドメインは、コイルドコイルドメイン、例えばロイシンジッパードメインである。例示的な三量体ロイシンジッパードメインは、Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−１４０７（その開示内容は、あらゆる目的のために本明細書に組み込む）により記載されている、エンジニアリングされた酵母ＧＣＮ４ｐＩＩバリアントである。例示的な三量体化ドメインとして、以下のものが挙げられる：ＴＮＦ受容体結合因子２（ＴＲＡＦ２）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｑ１２９３３［ｇｉ：２３５０３１０３］；アミノ酸３１０〜３４９）；トランボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）１（アクセッション番号ＰＯ７９９６［ｇｉ：１３５７１７］；アミノ酸２９１〜３１４)；マトリリン（Ｍａｔｒｉｌｉｎ）−４（アクセッション番号Ｏ９５４６０［ｇｉ：１４５４８１１７］；アミノ酸５９４〜６１８；軟骨基質タンパク質（マトリリン−１）（アクセッション番号ＮＰ００２３７０［ｇｉ：４５０５１１１］；アミノ酸４６３〜４９６；熱ショック転写因子（ＨＳＦ）（アクセッション番号ＡＡＸ４２２１１［ｇｉ：６１３６２３８６］；アミノ酸１６５〜１９１；およびクビリン（Ｃｕｂｉｌｉｎ）（アクセッション番号ＮＰ００１０７２［ｇｉ：４５５７５０３］；アミノ酸１０４〜１３８。
【００８１】
特定の態様では、三量体化ドメインは、α−ヘリカルコイルドコイルドメインを含む。有用なα−ヘリカルコイルドコイルドメインは、限定はされないが、マトリリン１、コロニン１ａ、筋強直性ジストロフィーキナーゼ（ＤＭＰＫ）、ランゲリン、およびそれらの組み合わせから誘導されるものを含む。かかる誘導体は、限定はされないが、野生型配列を有するコイルドコイルドメイン、ならびにコイルドコイルドメイン野生型配列内に１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体を含む。コロニン１ａ三量体化ドメインを含むコロニン１ａタンパク質はまた、時として、コロニン様タンパク質Ａ、Ｃｌｉｐｉｎ−Ａ、コロニン様タンパク質ｐ５７、トリプトファンアスパラギン酸を含有するコートタンパク質およびＨＵＧＯ：ＣＯＲＯ１Ａのいずれかとしても同義的に称される。使用可能な様々なタンパク質から誘導される野生型コイルドコイルドメインの非限定例として、マトリリン１（配列番号２８）、ＤＭＰＫ（配列番号３０）、ランゲリン（配列番号３２）、およびコロニン１ａ（配列番号１１）が挙げられる。α−ヘリカルコイルドコイルドメインの変異体は、対立遺伝子変異体、改変変異体、およびそれらの組み合わせを含み得る。α−ヘリカルコイルドコイルドメインは、典型的には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、またはバリン残基を有するリピートの１つ以上における「ｈ」位（「ａ」位および／または「ｄ」位）の１つ以上で独立して置換され得る７つ組の配列リピート「ｈｐｐｈｃｐｃ」（またはａｂｃｄｅｆｇ）中に構築される。かかる「ｈｐｐｈｃｐｃ」の７つ組のリピートでは、ｈは疎水性残基を表し、ｃは典型的には荷電残基を表し、またｐは極性（ひいては親水性）残基を表す。マトリリン１、コロニン１ａ、筋強直性ジストロフィーキナーゼ（ＤＭＰＫ）、およびランゲリンのα−ヘリカルコイルドコイルドメイン変異体が、それら三量体化ドメインの７つ組のリピートの１つ以上における「ａ」位および／または「ｄ」位の１つ以上がアラニン、ロイシン、イソロイシン、またはバリン残基と置換される場合に提供される。使用可能なα−ヘリカルコイルドコイルドメイン変異体の非限定例として、マトリリン１（配列番号２９）、ＤＭＰＫ（配列番号３１）、ランゲリン（配列番号３２）、およびコロニン１ａ（配列番号１２〜１８）が挙げられる。特定の態様では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット内で用いられるマトリリン１三量体化ドメイン変異体は、限定はされないが、配列番号２９の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。特定の態様では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット内で用いられるＤＭＰＫ三量体化ドメイン変異体は、限定はされないが、配列番号３１の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。特定の態様では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット内で用いられるランゲリン三量体化ドメイン変異体は、限定はされないが、配列番号３３の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。特定の態様では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット内で用いられるコロニン１ａ三量体化ドメインは、限定はされないが、配列番号１１の全長にわたり少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。特定の態様では、コロニン１ａ三量体化ドメイン変異体のコンセンサス配列が、それら三量体化ドメインの７つ組のリピートの１つ以上における「Ａ」位および／または「Ｄ」位の１つ以上がＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット内で使用可能なアラニン、ロイシン、イソロイシン、またはバリン残基と置換される場合に、配列番号１０として提供される。ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット内で使用可能な例示的なコロニン１ａ野生型および変異体配列が表Ａに提示される。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
本明細書で提供される特定の三量体化ドメイン（例えば、コロニン１ａ三量体化ドメインまたはその変異体）を有するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、異なる三量体化ドメインを有する他のＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットと比べられる場合に改善された特性を呈し得る。より詳細には、コロニン１ａ三量体化ドメインまたはその変異体を有するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、限定はされないが、形質転換された哺乳動物細胞培養物、例えばＣＨＯ細胞において発現されるときの改善された収量；ＧＩＴＲに対する改善された結合親和性；様々な生物検定における改善された活性（例えば、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化）；および／または精製もしくは部分精製されるときの改善された均一性を含む、改善された特性を呈し得る。理論によって制限されることを求めない限り、コロニン１ａ三量体化ドメインまたはその変異体を有するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットのかかる改善された特性が、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットの作製を促進し得、かつ／または様々な治療用途における多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質の有効性を改善し得ると考えられる。
【００８４】
ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインおよび三量体化ドメインに加えて、本明細書で提供されるようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、免疫グロブリンドメイン、例えば定常領域または「Ｆｃ」ドメインを含む。特定の態様では、本開示は、少なくともヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４  Ｆｃドメインの双方を提供する。特定の態様では、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインをさらに含む。特定の態様では、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインをさらに含む。特定の態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインまたはその変異体である。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインは、配列番号２１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含み得る。使用可能なＩｇＧ  Ｆｃドメイン（例えばＩｇＧ１  Ｆｃドメイン）の変異体は、限定はされないが、２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５６Ｅ、およびそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される１つ以上のアミノ酸残基を有するＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、ここでそれら残基はＥＵ付番に従って付番される。特定の態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域のヒンジ領域は、完全な重鎖間ジスルフィド結合形成をもたらす、（ＥＵ付番に従う）２２８位でのセリンからプロリンへの突然変異を含み得る。特定の態様では、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列番号４０のアミノ酸１〜１２を含む。特定の態様では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、配列番号３８のＳ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４Ｐ−Ｆｃドメインである。
【００８５】
３つのＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインを一緒にする三量体化ドメインと組み合わせて、２つのＩｇＧ  Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合形成は、六量体タンパク質の形成をもたらす（図７）。従って、免疫グロブリンドメインは、非対合免疫グロブリンドメイン同士の相互作用を介して、２つの三量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質同士を安定した六量体（６つのＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを含有する多量体である）に組織化するのを促進する二量体化ドメインとして役立つ。いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性などのエフェクター機能を促進することなく、六量体タンパク質に安定性を賦与する。他の態様では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、六量体タンパク質に安定性を提供する一方、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性などのエフェクター機能を促進する。
【００８６】
いくつかの態様では、本開示は、自己組織化して、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる六量体タンパク質を形成する単鎖ポリペプチドサブユニットを提供する。例示的なポリペプチドサブユニットは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン、機能性三量体化ドメイン、およびＧＩＴＲＬの受容体結合ドメインを含む。具体的な態様では、ポリペプチドサブユニットは、六量体タンパク質に自己組織化することができる。いくつかの態様では、ポリペプチドサブユニットは、以下のように、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって配置される：ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン、次に三量体化ドメイン、続いてＧＩＴＲＬ受容体結合ドメイン。３つのドメインは、直接隣接していてもよい。例えば、いくつかの態様では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインのカルボキシ末端は、三量体化ドメインのアミノ末端に直接融合し、且つ、三量体化ドメインのカルボキシ末端は、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインのアミノ末端に直接融合している。あるいは、２つまたは３つのドメインは、１つまたは複数のリンカー、スペーサ、またはその他の異種ポリペプチドによって隔てることもできる。有用なリンカーとして、限定はされないが、（Ｇｌｙ４）ｎモチーフ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（配列番号１９）、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモチーフ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＬ（配列番号２３）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号２４）、およびそれらの組み合わせが挙げられる（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される正の整数である）。
【００８７】
いくつかの態様では、本明細書に記載するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、非ヒト霊長類ＧＩＴＲ、例えば、カニクイザルＧＩＴＲまたはアカゲザルＧＩＴＲに特異的に結合することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、マウスＧＩＴＲまたはラットＧＩＴＲに結合しない。
【００８８】
本明細書に記載するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、１つまたは複数の保存的アミノ酸変化、例えば、最大１０の保存的変化（例えば、２つの置換されたアミノ酸、３つの置換されたアミノ酸、４つの置換されたアミノ酸、または５つの置換されたアミノ酸など）を含有し得るが、ただし、これらの変化は、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの生化学的機能を変えることなく、ポリペプチドに達成できるものとする。
【００８９】
例えば、１つまたは複数の保存的変化は、ＧＩＴＲに結合するその能力を変えることなく、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインに実施することができる。同様に、１つまたは複数の保存的変化は、三量体化するその能力を改変することなく、三量体化ドメインに実施することができる。
【００９０】
本明細書で提供されるＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットはまた、ＧＩＴＲＬのアスパラギル残基１６１のＮ結合グリコシル化を遮断または低減する、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含み得る。特定の態様では、ＧＩＴＲＬのアスパラギル残基１６１は、グリコシル化を遮断または低減するため、アスパラギル残基以外の任意のアミノ酸と置換される。特定の態様では、ＧＩＴＲＬのアスパラギル残基１６１は、アスパルチル残基と置換され、例えば、配列番号４で示されるようなＧＩＴＲＬのＮ１６１Ｄ変異体である。特定の態様では、ＧＩＴＲＬのアスパラギル残基１６１のＮ結合グリコシル化は、ＧＩＴＲＬ残基１６１〜１６３のＮ結合グリコシル化部位配列ＮＮＴを、もはや基準のＮ結合グリコシル化部位配列ＮＸ（Ｔ、Ｓ、またはＣ）に一致しないように破壊するアミノ酸の置換、挿入、または欠失により遮断または低減される。特定の実施形態では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質の生化学的機能を改変することなくポリペプチド中に変化を設けることができると仮定すると、ＧＩＴＲＬのアスパラギル残基１６１のＮ結合グリコシル化を遮断または低減するため、スレオニル残基１６３とセリニルまたはシステイニル以外のアミノ酸残基との置換を用いることができる。
【００９１】
さらに、ポリペプチドドメインの一部は、その機能の全てを損傷または排除することなく、欠失させることもできる。同様に、以下に記載するように、その機能を損傷または排除することなく、ポリペプチド鎖に挿入または付加を実施することができる。ポリペプチドの１つまたは複数の機能を実質的に損傷することなく実施することができる他の修飾として、例えば、特異アミノ酸を組み込むインビボまたはインビトロ化学および生化学修飾が挙げられる。こうした修飾として、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、例えば、放射性核種による標識、ならびに酵素修飾が挙げられ、これらは、当業者には容易に認識されよう。ポリペプチドの様々な標識方法、こうした目的に有用な標識は、当分野においてよく知られており、放射性同位体、例えば、３２Ｐ、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および抗リガンドが挙げられる。
【００９２】
融合ポリペプチドサブユニットは、異種薬剤、例えば、安定剤、免疫応答改質剤、または検出可能な薬剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、異種薬剤は、ペプチド結合を介して、ポリペプチドサブユニットに融合した１つまたは複数の追加のポリペプチド配列、例えば、シグナル配列（例えば、分泌シグナル配列）、リンカー配列、アミノ酸タグもしくは標識、または精製を容易にするペプチドもしくはポリペプチド配列を含む。いくつかの態様では、異種ポリペプチドは、ＩｇＧ−ＦｃドメインのＮ末端に融合させることができ、異種ポリペプチドは、ＧＩＴＲＬの受容体結合ドメインのＣ末端に融合することができ、異種ポリペプチドは、ＩｇＧ−ＦｃドメインのＣ末端および三量体化ドメインのＮ末端に融合させることができ、または異種ポリペプチドは、三量体化ドメインのＣ末端およびＧＩＴＲＬの受容体結合ドメインのＮ末端に融合させることができる。あるいは、異種ポリペプチドは、ドメインの機能的特徴が維持される限りにおいて、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、三量体化ドメイン、またはＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインのいずれかの内部に融合させることもできる。
【００９３】
いくつかの態様では、異種薬剤は、ポリペプチドサブユニットに化学的にコンジュゲートすることができる。ポリペプチドサブユニットにコンジュゲートすることができる例示的な異種薬剤として、限定されるものではないが、リンカー、薬物、毒素、造影剤、放射性化合物、有機および無機ポリマー、ならびにポリペプチドサブユニット自体によって賦与されない所望の活性を提供し得るいずれか他の組成物が挙げられる。具体的な薬剤として、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞傷害性薬剤、放射性核種、造影剤、ビオチンが挙げられる。
【００９４】
特定の態様では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットならびにそれらのサブユニットを含む任意の三量体または六量体タンパク質は、対照、（例えば、投与決定のための）診断アッセイを開発または実行するための参照標準、または研究ツールとして用いることができる。例えば、本開示は、上記のようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを提供し、ここでＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインは、配列番号３４、３５、３６、または３７のいずれかを含む。特定の態様では、対照、参照標準、またはツールは、配列番号６に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを含み得る。別の例では、本開示は、上記のような多量体タンパク質を形成し得るＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを提供するが、ここでは、ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインは、マウスまたはラットＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインであり、かつＦｃドメインは、ヒトまたはマウス起源のＦｃドメインであり、かつ多量体化ドメインは、例えば三量体化ドメイン、例えばコロニン１ａ三量体化ドメインである。この融合タンパク質は、齧歯類におけるインビボ実験を実行するため、用いることができる。理論によって制限されることを求めないが、マウスにおける異なるＩｇＧアイソタイプによって与えられるＩｇＧ  Ｆｃドメインエフェクター機能は一般に、ヒトにおける同じＩｇＧアイソタイプによって与えられるものと異なる。しかし、特定のマウスＩｇＧアイソタイプがヒトにおける他のＩｇＧアイソタイプに類似または匹敵すると考えられ、例えばマウスＩｇＧ２ａがヒトＩｇＧ１と類似すると考えられ、またマウスＩｇＧ１がヒトＩｇＧ４に匹敵すると考えられることが以前に示されている。そのようなものとして、所与のマウスＩｇＧ  Ｆｃドメインアイソタイプを有するマウスにおいて得られる結果は、類似または匹敵するヒトＩｇＧアイソタイプを有するヒトにおいて得られる結果を予測するため、用いることができる。
【００９５】
多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質
上記のようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットは、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰに自己組織化し得る。したがって、本開示は、上記のような６つのポリペプチドサブユニットを含む六量体タンパク質を提供する。実施例に記載の例示的なポリペプチドサブユニットは、本明細書中で「六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ」と称される六量体タンパク質に自己組織化する。六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰに自己組織化するＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットのアミノ酸配列の非限定例が、配列番号６で提供される。にもかかわらず、当業者は、本開示に照らして、極めて多数の他の配列についても本明細書で示される六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰについての判定基準を満たすことを理解するであろう。配列番号６に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％の配列同一性を有する６つのＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰもまた、本明細書で提供される。
【００９６】
特定の態様では、本明細書で提供される特定のＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットはまた、３つのＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを含む三量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰに自己組織化し得る。これは、例えば、三量体タンパク質を作製するため、二量体化できないＦｃドメインがＧＩＴＲＬ  ＦＰ中で用いられる場合に生じ得る。二量体化できず、それ故に三量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの作製に適したＦｃドメインの例として、限定はされないが、単量体ＩｇＧ１  Ｆｃ分子（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎ  １，２０１２；２８７（２３）：１９３９９−１９４０８）および一価ＩｇＧ４分子（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．ＭＡｂｓ．Ｍａｙ  １，２０１３；５（３）：４０６−４１７）が挙げられる。
【００９７】
本明細書で提供されるような多量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質、例えば六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、一次抗原を経験したＴ細胞上、例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、またはそれらの任意の組み合わせに由来する一次抗原を経験したＴ細胞上で発現されるようなＧＩＴＲに特異的に結合し得る。
【００９８】
本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、組換えＧＩＴＲに特異的に結合し得る。特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、約１ｎＭ〜約１２０ｎＭ、例えば約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、例えば約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、例えば約６０ｎＭ〜約１００ｎＭの結合親和性（すべては動力学的排除アッセイによって測定された）で、組換えヒトＧＩＴＲに結合し得る。例えば、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、約０．１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１２０ｎＭ、約２５０ｎＭもしくは約５００ｎＭの結合親和性（すべては動力学的排除アッセイによって測定された）で組換えヒトＧＩＴＲに結合し得る。特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、約０．１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、もしくは約７０ｎＭのいずれかから約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１２０ｎＭ、約２５０ｎＭ、もしくは約５００ｎＭのいずれかの結合親和性（すべては動力学的排除アッセイによって測定された）で組換えヒトＧＩＴＲに結合し得る。特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、約８２ｎＭの結合親和性（動力学的排除アッセイによって測定された）で組換えヒトＧＩＴＲに結合し得る。当業者によって十分に理解されているように、結合親和性は、幾つかの異なる方法および／または機器によって測定され得、また相対的結合親和性は、方法または機器に応じて変動し得る。
【００９９】
別の例では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、一次抗原を経験したカニクイザルＴ細胞、例えばＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞で発現されるカニクイザルＧＩＴＲに結合し得る。
【０１００】
特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、プレートに基づくアッセイにおいて、抗原を経験したＣＤ３＋Ｔ細胞の用量依存性増殖を誘導し得る。例えば、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬを用いるインビトロアッセイでは、約０．０３ｎＭ〜約０．２ｎＭ、例えば約０．１６ｎＭの六量体タンパク質濃度で一次抗原を経験したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞において２０％の最大増殖応答（ＥＣ２０）が達成され得、約０．２ｎＭ〜約１ｎＭ、例えば約０．４ｎＭの六量体タンパク質濃度で一次抗原を経験したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞において５０％の最大増殖応答（ＥＣ５０）が達成され得、また約０．７ｎＭ〜約５ｎＭ、例えば約１．８ｎＭの六量体タンパク質濃度で一次抗原を経験したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞において９０％の最大増殖応答（ＥＣ９０）が達成され得る（すべてはチミジン取り込みによって測定された）。
【０１０１】
特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ融合タンパク質は、抗原を経験したＴ細胞、例えば、ヒト一次抗原を経験したＣＤ３＋Ｔ細胞からの用量依存性サイトカイン放出を誘導し得る。特定の態様では、放出されたサイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、またはそれらの任意の組み合わせである。特定の態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはそれらの任意の組み合わせである。同様に、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、一次抗原を経験したカニクイザルＴ細胞および一次抗原を経験したアカゲザルＴ細胞におけるＴ細胞増殖およびサイトカイン放出を増強し得る。
【０１０２】
さらなる態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＮＦκＢ経路を活性化し得る。例えば、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを生成するＧＩＴＲ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞におけるＮＦκＢ経路を、六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１ＦＰに対して約２０ｐＭ〜約３００ｐＭ、例えば約１８２ｐＭ、また六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４ＦＰに対して２８９ｐＭのＥＣ５０で活性化し得る。あるいは、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ヒトＧＩＴＲ、カニクイザルＧＩＴＲまたはアカゲザルＧＩＴＲを発現する細胞におけるＮＦκＢ経路を活性化し得る。
【０１０３】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、がん治療を必要とする被験者に有効用量として投与されるとき、例えば腫瘍成長を緩徐化するか、腫瘍成長を停止させるか、または既存の腫瘍のサイズを低減することにより、がん治療を促進し得る。特定の態様では、がん治療の促進は、Ｔ細胞の存在下で達成され得る。特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、治療を必要とする被験者に有効用量として投与されるとき、腫瘍成長を、アイソタイプに合致した対照分子の投与と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも１００％減少させ得る。
【０１０４】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、治療を必要とする被験者、例えばウイルスに感染した被験者に有効用量として投与されるとき、例えば、ウイルス増殖を緩徐化するか、ウイルス増殖を停止させるか、または感染再発もしくは感染再発頻度を減少させることにより、ウイルス感染の治療を促進し得る。かかる被験者は、慢性または潜在性のいずれかのウイルス感染を有し得る。特定の態様では、治療は、潜在性ウイルス感染を有する被験者に対象とし、感染再発または感染再発頻度をプラセボで治療された被験者と比べて低下させる。特定の態様では、ウイルス感染の治療の促進は、Ｔ細胞の存在下で達成され得る。特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、治療を必要とする被験者に有効用量として投与されるとき、ウイルス負荷を、アイソタイプに合致した対照分子の投与と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも１００％低下させ得る。特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、治療を必要とする被験者に有効用量として投与されるとき、ウイルス感染の再発を、アイソタイプに合致した対照分子の投与と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも１００％低下させ得る。
【０１０５】
さらなる態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４融合タンパク質は、抗原を経験したＧＩＴＲ発現Ｔ細胞の増殖をＧＩＴＲへの結合を通じて誘導し得るが、抗原を経験したＴ細胞に対する補体依存性または抗体依存性細胞傷害性を実質的に誘導することはない。さらに、特定の態様では、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば多量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１融合タンパク質は、抗原を経験したＧＩＴＲ発現Ｔ細胞の増殖をＧＩＴＲへの結合を通じて誘導し得るが、Ｃ１ｑに結合し、抗原を経験したＣＤ４＋Ｔ細胞、特にＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞のＦｃ受容体媒介性の抗体依存細胞傷害性または食作用を誘導する。
【０１０６】
ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ融合ポリペプチドサブユニットをコードするポリヌクレオチド
本開示は、本明細書で提供されるようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードする核酸を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号５によって表される。特定の態様では、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、三量体化ドメインおよびＧＩＴＲＬ受容体結合ドメインをコードする核酸配列は、５’から３’の方向へ連結され、例えば５’から３’の方向へ隣接して連結される。他の態様では、提供されるポリヌクレオチドは、例えば分泌シグナルペプチドまたは膜局在化配列をコードするシグナル配列をさらに含み得る。ありとあらゆるＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットまたは多量体、例えばそのサブユニットを含む六量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、本開示によって提供される。
【０１０７】
特定の態様では、本開示は、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。特定の態様では、核酸配列は配列番号５を含む。
【０１０８】
本明細書で提供されるようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）またはリボデオキシヌクレオチド（ＲＮＡ）配列、またはいずれかのヌクレオチドの修飾形態を含む。同用語は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。
【０１０９】
さらに、１つまたは少数の欠失、付加および／または置換を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。こうした変化は、連続的であってもよいし、または核酸内で異なる位置に分布させてもよい。実質的に同一の核酸配列、例えば、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上のヌクレオチド欠失、付加および／または置換を含有することができる。いくつかの態様では、１つまたは複数の欠失、付加および／または置換は、ポリヌクレオチド配列によりコードされるリーディングフレームを改変しないため、修飾されている（「突然変異体」）が、実質的に同一のポリペプチドが、核酸の発現時に生成される。
【０１１０】
アミノ酸（および／または核酸）配列同士の類似性は、配列同士の類似性（あるいは、配列同一性とも呼ばれる）として表現される。配列同一性は、同一性（または類似性）パーセンテージとして測定されることが多く；パーセンテージが高いほど、２つの配列の一次活性化構造も類似している。「同一性パーセント（％）」は、本明細書において、配列をアラインメントし、必要であれば、最大配列同一性パーセントを達成するために、候補および／または選択した配列にギャップを導入した後、保存的アミノ酸置換を配列同一性としてみなさずに、選択した配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【０１１１】
したがって、本明細書で提供されるようなＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、配列番号５またはそれに対する少なくとも１つの部分配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも９６％、多くは少なくとも９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。相同性パーセント（すなわち、配列類似性）または同一性パーセントの決定を目的とするアラインメントは、例えば、公知または専有のアルゴリズムを用いて、当業者の技能範囲内の様々な方法で達成することができる。例えば、配列類似性は、ペアワイズ・アラインメント法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、もしくはＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣｌｕｓｔａｌＷもしくはＴ−Ｃｏｆｆｅｅソフトウェアなどの複数の配列アラインメント法を用いて、決定することができる。当業者は、適切なスコア関数、例えば、ギャップペナルティまたはアラインメントを測定するためのスコアマトリックスを決定することができ、これには、比較する配列の全長にわたって最適なアラインメントクォリティを達成する上で必要なあらゆるアルゴリズムが含まれる。さらに、配列アラインメントは、構造アラインメント法（例えば、二次元もしくは三次元構造情報を用いて、２つ以上の配列をアラインメントする方法）、または配列、構造、および分子系統情報を組み合わせて、候補タンパク質配列を同定し、最適にアラインメントするハイブリッド法を用いて、達成することができる。
【０１１２】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．）などの複数のソースから、およびインターネットで入手可能である。このプログラムを用いて、配列同一性を決定する方法についての記載は、インターネットのＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。
【０１１３】
このように、配列番号５と実質的に同一か、または実質的に類似した核酸配列は、本開示に包含される。配列が、あるヌクレオチドについてヌクレオチド基準により、参照配列（例えば、配列番号４）の少なくともサブ配列と同一であれば、その配列は、配列番号５と実質的に同一である。こうした核酸は、例えば、配列番号４に対して、挿入、欠失、および置換を含み得る。例えば、こうした核酸は、参照核酸配列と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または参照ポリペプチド配列、例えば、配列番号４と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である。
【０１１４】
さらに、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、核酸の発現または複製を促進するポリヌクレオチド配列、例えば、発現調節配列および／またはベクター配列を含んでもよい。同様に、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドに機能的属性を付与する追加のコード配列を含んでもよい。かかる配列は、限定はされないが、分泌シグナル配列および膜局在化シグナルを含む。ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットをコードする核酸に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする核酸の非限定例が、配列番号７で提供される。
【０１１５】
ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、慣用の技術により、真核細胞発現ベクターなどのベクターに導入することができる。従って、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。発現ベクターは、ｃＤＮＡの転写を開始および増強すると共に、その適正なスプライシングおよびポリアデニル化を確実にする調節配列を賦与することによって、細胞中のＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードするポリヌクレオチド配列の転写を可能にするように設計される。多数の発現ベクターが当業者には周知であり、市販されているか、または慣用の分子生物学手順に従い個々の成分から組織化することができる。
【０１１６】
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択に左右される。多様な発現宿主／ベクター組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとして、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、周知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびこれらの誘導体を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、より広宿主域のプラスミド、例えば、Ｍ１３および繊維状単鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【０１１７】
ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰの発現に好適な宿主細胞としては、適切なプロモータの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫または高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌が挙げられる。高等真核生物細胞としては、以下に記載する哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。また、無細胞翻訳系を使用してもよい。抗体生成を含むタンパク質生成方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書および米国特許第６，６６０，５０１号明細書、ならびに国際公開第２００４／００９８２３号パンフレットに記載されており、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０１１８】
また、本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も提供される。有利には、ポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する六量体タンパク質を発現するために、様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系を使用することができる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、こうしたタンパク質が、概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、しかも完全に機能性であることから、実施することができる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＨＥＫ−２９３およびＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）により記載されるサル腎臓細胞のＣＯＳ−７株、ならびに例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株などの他の細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結した好適なプロモータおよびエンハンサー、ならびに他の５’もしくは３’フランキング非転写配列、および５’もしくは３’フランキング非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、およびアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでもよい。昆虫細胞における異種タンパク質の生成のためのバキュロウイルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）により論じられている。
【０１１９】
ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰのようなタンパク質の発現および精製は、標準的実験技術を用いて実施することができる。こうした方法の例は、論じられているか、または本明細書で参照される。発現の後、精製されたタンパク質は、例えば、機能分析、抗体生成、および診断学、ならびに後述する予防および治療用途を含む多くの用途を有する。例えば、ポリペプチドサブユニットまたは本明細書に記載する六量体タンパク質を用いて、予防および／または治療投与に好適なワクチン組成物を含む医薬組成物を生成することができる。
【０１２０】
形質転換宿主によって産生されたＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰのようなタンパク質は、任意の好適な方法に従い精製することができる。こうした標準的方法として、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のためのいずれか他の標準的技術が挙げられる。適切なアフィニティカラムの通過による容易な精製を可能にするために、ヘキサヒスチジン（配列番号１１）、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティタグをタンパク質に結合することができる。単離したタンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ線結晶学などの技術を用いて物理的に特性決定することもできる。
【０１２１】
例えば、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ超濾過ユニットを用いて、培地中に組換えタンパク質を分泌する系からの上清を最初に濃縮することができる。濃縮ステップの後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般に使用されるその他のタイプであってよい。あるいは、カチオン交換ステップを使用することもできる。好適なカチオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、インフルエンザＢ／ヤマガタ（Ｙａｍａｇａｔａ）ウイルス結合分子をさらに精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ担体、例えば、ペンダントメチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用した１つまたは複数の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを使用することができる。均質な組換えタンパク質を提供するために、前述した精製ステップの一部または全部を様々な組み合わせで使用することもできる。
【０１２２】
ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニット、または本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、細菌培養で産生されたＧＩＴＲＬは、例えば、細胞ペレットからの初回抽出ステップ、続いて、１回または複数回の濃縮ステップ、塩析ステップ、水性イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製ステップのために、使用することができる。組換えタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクルの繰り返し、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用など、任意の慣用の方法により破砕することができる。
【０１２３】
医薬組成物および投与方法
本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えば本明細書で提供されるようなＧＩＴＲＬ  ＦＰを調製し、投与する方法は、それを必要とする被験者へは、例えばがん患者における免疫応答を増強する、例えば腫瘍成長を阻害もしくは低減するため、またはウイルス感染を有する患者へは、例えばウイルス負荷を低減するかまたはウイルス感染の再発を低減するため、当業者に周知であるかまたは当業者によって容易に決定され得る。本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰの投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入または局所であってよい。本明細書で使用される非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。これらの投与形態は全て、好適な形態として明らかに考慮されるが、別の投与形態の例として、特に、静脈内もしくは動脈内注射または滴注がある。通常、好適な医薬組成物は、限定されるものではないが、バッファー（例えば、酢酸、リン酸もしくはクエン酸バッファー）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。本明細書の教示内容に適合可能な別の方法では、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、本明細書に記載のＧＩＴＲＬ  ＦＰは、有害な細胞集団の部位に直接送達され、これによって治療薬に対する患部組織の曝露を増大することができる。
【０１２４】
本明細書に記載する特定の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液などの許容される剤形で経口投与することができる。また、特定の医薬組成物は、鼻内エアゾールまたは吸入によって投与することもできる。こうした組成物は、ベンジルアルコールまたはその他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、および／またはその他の慣用の可溶化もしくは分散剤を使用して、食塩溶液として調製することができる。
【０１２５】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰの量は、治療する対象および具体的な投与方法に応じて変動し得る。組成物は、単回用量、複数回用量として、または既定期間にわたる注入で投与することができる。また、最適な所望の応答（例えば、治療または予防応答）をもたらすように、投与レジメンを調節することもできる。
【０１２６】
「治療に有効な用量もしくは量」または「有効量」とは、治療しようとする疾患または状態を有する患者の治療に関して、投与されると、プラスの治療応答をもたらす本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰの量を意味する。
【０１２７】
キット
本開示は、さらに、本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰを含み、本明細書に記載する方法を実施するために用いることができるキットも提供する。いくつかの態様では、キットは、少なくとも１種の本明細書に記載する精製六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰを１つまたは複数の容器内に含む。当業者は、本明細書で提供される開示した六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰが、当分野でよく知られている既定のキットフォーマットの１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識されよう。
【０１２８】
免疫アッセイ
本明細書に記載する六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、当分野で公知の任意の方法により、特異的および／または選択的結合についてアッセイすることができる。用いることができる免疫アッセイとして、いくつか挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、蛍光フォーカスアッセイ（ＦＦＡ）、マイクロ中和アッセイ、血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降反応、免疫核酸アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定、蛍光免疫アッセイなどの技法を用いる競合または非競合アッセイシステムがあるが、これらに限定されるものではない。こうしたアッセイは、当分野ではよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）Ｖｏｌ．１を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ＦＦＡ、マイクロ中和アッセイ、およびＨＡＩは、以下の実施例に詳述する。
【０１２９】
本明細書に記載する六量体タンパク質の結合特性の決定に好適な方法および試薬は、当分野では公知であり、および／または市販されている。こうした速度論的分析のために設計された装置およびソフトウェアは市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
【０１３０】
免疫増強および治療の方法
抗原活性化の間または後に抗原を経験したＴ細胞上、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＧＩＴＲに会合することによる被験者（例えば哺乳動物被験者、例えばヒト被験者）における抗原特異的免疫応答の増強は、多種多様な方法を用いて達成され得る。選択方法は主に、免疫応答を増強することが所望される場合の抗原のタイプに依存することになり、また利用可能な様々な方法が以下で考察される。いかなる方法が選択されても、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰは、被験者、例えばヒト患者に、被験者のＴ細胞に提示されるように、抗原によるＴ細胞の予備刺激の間または直後に投与され得る。ＯＸ４０六量体タンパク質を用いて被験者、例えばヒト被験者における免疫応答を活性化する例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１６／００２４１７６号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に提示されており、本明細書で提供されるＧＩＴＲＬ  ＦＰとの併用に適応され得る。
【０１３１】
特定の態様では、本開示は、抗原を経験したＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の生存または増殖を促進するための方法であって、抗原を経験したＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰと、六量体タンパク質がＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る場合の条件下で接触させるステップを含む、方法を提供する。特定の態様では、接触させるステップはインビトロである。特定の態様では、接触させるステップはインビボであり、例えば治療を必要とする被験者への六量体タンパク質の有効用量での投与を介する。特定の態様では、接触させるステップは、Ｔ細胞活性化、例えば抗原活性化と同時に行うことができ、特定の態様では、接触させるステップは、Ｔ細胞活性化後に行うことができる。
【０１３２】
さらなる態様では、本開示は、抗原を経験したＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞からのサイトカイン放出を増強する方法であって、抗原を経験したＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰと接触させるステップを含み、ここで六量体タンパク質は、抗原を経験したＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法を提供する。特定の態様では、接触させるステップはインビトロである。特定の態様では、接触させるステップはインビボであり、例えば治療を必要とする被験者への六量体タンパク質の有効用量での投与を介する。特定の態様では、接触させるステップは、Ｔ細胞活性化、例えば抗原活性化と同時に行うことができ、特定の態様では、接触させるステップは、Ｔ細胞活性化後に行うことができる。特定の態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１３３】
特定の態様では、抗原を経験したＴ細胞、例えば抗原を経験したＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、カニクイザルＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、アカゲザルＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである。
【０１３４】
本開示は、Ｔ細胞活性化を促進する方法であって、Ｔ細胞を本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ融合タンパク質と接触させるステップを含み、ここで六量体タンパク質はＴ細胞の表面上のＧＩＴＲに特異的に結合し得る、方法をさらに提供する。特定の態様では、接触させるステップは、抗原、例えば腫瘍抗原の存在下で行われる。特定の態様では、本方法は、ＧＩＴＲＬ  ＦＰのＩｇＧ−Ｆｃドメインと、ＦｃγＲを発現する細胞、例えば、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、骨髄性もしくは形質細胞様樹状細胞、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、血小板、肥満細胞、原発性ヒト腫瘍または腫瘍灌流もしくは非灌流リンパ節に由来するＣＤ４５＋細胞、他の二次もしくは三次リンパ様構造に由来するＣＤ４５＋細胞、またはそれらの組み合わせとの相互作用を介する六量体ＧＩＴＲＬ融合タンパク質の架橋をさらに含む。特定の態様では、Ｔ細胞活性化は、ＮＦκＢシグナル伝達経路の刺激として測定され得る。特定の態様では、Ｔ細胞活性化を促進するＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４  ＦＰ、またはそれらの変異体である。特定の態様では、接触させるステップはインビトロである。特定の態様では、接触させるステップはインビボであり、例えば治療を必要とする被験者への六量体タンパク質の有効用量での投与を介する。
【０１３５】
さらに本明細書で提供されるのは、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ、およびＯＸ４０アゴニスト（例えば、ＯＸ４０リガンド融合タンパク質またはＯＸ４０アゴニスト抗体）の投与を含む、がんを治療するための方法である。ＧＩＴＲＬ  ＦＰおよびＯＸ４０リガンド融合タンパク質の投与の結果、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍体積が減少し、かつ生存が増加する。特定の態様では、固形腫瘍を呈する患者にＧＩＴＲＬ  ＦＰおよびＯＸ４０リガンド融合タンパク質（例えばＭＥＤＩ６３８３）が投与される。
【０１３６】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰおよびＯＸ４０アゴニストを含むがん治療薬による効果的治療は、例えば、原発性腫瘍の部位、または１つ以上の転移のいずれかにおける、がんの進行速度の減少、腫瘍もしくは転移成長の遅延または安定化、腫瘍縮小、および／または腫瘍退縮を含む。一部の態様では、腫瘍成長の低下または遅延は、統計学的に有意であり得る。腫瘍成長における低下は、想定される腫瘍成長、大規模患者集団に基づく想定される腫瘍成長、または対照集団の腫瘍成長に対して、患者の腫瘍のベースラインでの成長と比べることにより、測定され得る。他の実施形態では、本発明の方法は、生存を増加させる。
【０１３７】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰおよびＯＸ４０アゴニストを含むがん治療薬の投与に対する臨床応答は、臨床医に公知の診断技術、例えば限定はされないが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析、組織学、肉眼所見、および血液化学など、例えば限定はされないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびクロマトグラフィーによって検出可能な変化などを用いて評価され得る。
【０１３８】
本開示は、被験者におけるがんまたはウイルス感染を治療する方法であって、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰ、または六量体タンパク質を含む組成物もしくは製剤を有効量で、治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、方法をさらに提供する。特定の態様では、がんは固形腫瘍である。本方法によると、六量体タンパク質または組成物の投与により、腫瘍成長が阻害され得るか；腫瘍減少が促進され得るか、または双方であり得る。特定の態様では、腫瘍成長阻害は、Ｔ細胞の存在下で達成される。
【０１３９】
用語「がん」、「腫瘍」、「がん性」、および「悪性」は、典型的には制御されない細胞成長によって特徴づけられる、哺乳類における生理学的状態を指すかまたは描写する。がんの例として、限定はされないが、腺がん、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、および白血病を含むがんが挙げられる。かかるがんのさらなる特定例として、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃腸がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵がん、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝細胞がんおよび肝腫瘍などの肝臓がん、膀胱がん、乳がん（例えばホルモン媒介性乳がんなど、例えば、Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１０５７−１０６５を参照）、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺がん、腎細胞がんおよびウィルムス腫瘍などの腎臓がん、基底細胞がん、黒色腫、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、睾丸がん、食道がん、限定はされないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む血液がん、限定はされないが、扁平上皮細胞がんを含む様々なタイプの頭頚部がん、および粘液を起源とするがん、例えば、粘液性卵巣がん、胆管がん（肝臓）および腎乳頭がん、が挙げられる。特定の実施形態では、血液がんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、および慢性骨髄性白血病からなる群から選択される。
【０１４０】
一部の実施形態は、治療を必要とする被験者におけるがんまたはウイルス感染を予防または治療する方法であって、本明細書で提供されるような六量体タンパク質、例えばＧＩＴＲＬ  ＦＰ、本明細書に記載のような六量体タンパク質もしくはポリヌクレオチドを含む組成物もしくは製剤、ベクター、または宿主細胞を有効量で被験者に投与するステップを含む、方法を対象とする。
【０１４１】
治療を必要とする被験者におけるウイルス感染を治療する方法であって、六量体タンパク質または六量体タンパク質を含む組成物を有効量で被験者に投与するステップを含む、方法もまた提供される。特定の実施形態では、ウイルス感染は、慢性もしくは潜在性ウイルス感染であり得る。かかる慢性ウイルス感染は、ビリオン増殖が生じる場合での数週、数か月、または数年のウイルス感染によって特徴づけられるウイルス感染である。かかる潜在性ウイルス感染は、ビリオンが増殖していない期間によって特徴づけられるウイルス感染である。治療を必要とする被験者は、特定の実施形態では、被験者または被験者から得られる試料におけるウイルスの存在について診断するアッセイを実施することによって同定され得る。特定の実施形態では、治療は、ウイルス負荷における減少、ウイルス再活性化における低下、前記感染に伴う症状の寛解、またはそれらの組み合わせを提供し得る。特定の実施形態では、ウイルス負荷における減少、再活性化における低下、または症状における軽減は、プラセボで治療された対照被験者と比較される。上記方法のいずれかの特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（ＡｄＶ）、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＺＶ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるウイルスによる。
【０１４２】
本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻腔、バッカル、経膣または植込リザーバーを介して投与することができる。本明細書において使用される用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。
【０１４３】
本開示はさらに、対象における免疫応答を増強する方法であって、治療が必要な対象に、治療に有効な量の本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ、または六量体タンパク質を含有する組成物もしくは製剤を投与するステップを含む方法も提供する。
【０１４４】
治療しようとする対象は、治療を必要とするいずれかの動物、例えば、哺乳動物であってよく、いくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。
【０１４５】
その最も単純な形態では、対象に投与しようとする調製物は、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰであり、これは、慣用の剤形で、また、好ましくは、本明細書の他所に記載する製剤用賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて、投与される。
【０１４６】
本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、本明細書の他所に記載する任意の好適な方法によって、例えば、ＩＶ注入を介して投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の六量体タンパク質、例えば、ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、腫瘍中に、または腫瘍細胞の近傍に導入することができる。
【０１４７】
あらゆる種類の腫瘍が、このアプローチによる治療を受ける可能性を有し、こうした腫瘍として、限定されるものではないが、乳房、肺、膵臓、卵巣、腎臓、結腸および膀胱のがん腫、ならびに黒色腫、肉腫およびリンパ腫が挙げられる。
【０１４８】
Ｔ細胞プライミング剤
Ｔ細胞プライミング剤と組み合わせて、六量体タンパク質または六量体タンパク質を含む組成物を有効量で被験者に投与するステップを含む、治療を必要とする被験者におけるがんを治療する方法もまた提供される。特定の態様では、Ｔ細胞プライミング剤は、ＤＮＡワクチン＋アジュバントである。特定の態様では、この組み合わせは、例えば、Ｅ７合成ロングペプチド（ＳＬＰ）とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである。さらなる態様では、Ｔ細胞プライミング剤は、エピジェネティック修飾因子、例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジンまたはヒストン修飾因子、例えばＨＤＡＣ阻害剤である。さらなる態様では、Ｔ細胞プライミング剤は、ウイルス、例えば、ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、またはニューキャッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）である。
【０１４９】
本開示は、別に記載のない限り、当業者の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用の技術を使用する。こうした技術は、文献に十分に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ．）。
【０１５０】
抗体改変の一般原理は、以下：Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。タンパク質改変の一般原理は、以下：Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は、以下の文献に記載されている：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；およびＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）。さらに、当分野において公知であり、詳細に記載していない免疫学の標準的方法は、概して、以下の文献に記載のように実施する：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）ならびにＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）。
【０１５１】
免疫学の一般原理を記載する標準的参照文献には、以下のものが含まれる：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１５２】
上に引用した参照文献の全て、ならびに本明細書で引用する全ての参照文献は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１５３】
以下の実施例は、例示として提供されるのであって、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１５４】
【表２】
2018522571.tif 000006
【０１５５】
実施例１：ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の改変
多量体ヒトＧＩＴＲＬ−ＦＰ分子を作製するために用いることができる好適なヒト三量体化モチーフの同定
ヒト六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰを作製するための努力は、元々、ＧＩＴＲＬ三量体を安定化させ、六量体タンパク質を形成するため、ＧＣＮ４  ｐＩＩ三量体化モチーフの使用に注目していた。しかし、このモチーフは、酵母タンパク質から誘導され、非ヒトモチーフを有するＧＩＴＲＬ  ＦＰのヒトへの投与が免疫原性をもたらすことがある。したがって、ヒトタンパク質から誘導される三量体化モチーフを有する等価なＧＩＴＲＬ  ＦＰを作製することが望ましいと考えられた。三量体コイルドコイルモチーフを形成する５１タンパク質に由来するアミノ酸配列は、その三次元結晶構造またはオルソログの場合によって示される通り、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ；ワールドワイドウェブサイト「ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ」経由でインターネットによりアクセス可能）を介して同定し、経験による実験的試験におけるＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子への組み込みとして、４つのコイルドコイルモチーフのサブセットを選択した。
【０１５６】
方法
コロニン１Ａ（ＰＤＢコード：２ａｋｆ）、マトリリン１（１ａｑ５）、ランゲリン（３ｋｑｇ）および筋強直性ジストロフィーキナーゼＤＭＰＫ（ＰＤＢコード：１ｗｔ６）コイルドコイルモチーフの三次元結晶構造を、ＰｙＭｏｌ  Ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓソフトウェアを用いて分析した。
【０１５７】
結果
５１の候補配列を同定した三量体コイルドコイルタンパク質配列についてのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の検索後、多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの作製に用いるため、４つの配列を選択した（表１−１）。これら４つの配列は、ヒトタンパク質のコロニン１ａ、マトリリン１、ランゲリンおよびＤＭＰＫに由来するコイルドコイル配列であった。マウスコロニン１ａ（ＰＤＢコード：２ａｋｆ）由来のコイルドコイルモチーフの構造は、溶液中で安定な三量体であることが報告されている（Ｋａｍｍｅｒｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，ｖｏｌ：１０２，ｐ１３８９１−１３８９６（２００５））。ヒトコロニン１ａのコイルドコイル配列は、マウスタンパク質に対して高い配列同一性（７８．１％の配列同一性）を示すことから、三量体コイルドコイル構造を形成することが予測された。同様に、ニワトリマトリリン１（ＰＤＢコード：１ａｑ５）由来のコイルドコイルモチーフの構造は、三量体であることが報告されている（Ｄａｍｅｓ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＮＡＴ．ＳＴＲＵＣＴ．ＢＩＯＬ．５：６８７−６９１（１９９８）；ＰＤＢコード：１ａｑ５）。ヒトマトリリン１のコイルドコイル配列は、三量体コイルドコイル構造を、ニワトリオルソログに対するその高い配列同一性（６０．０％の配列同一性）に基づいて形成することが予測された。ヒトランゲリン（ＰＤＢコード：３ｋｑｇ）およびヒトＤＭＰＫ（ＰＤＢコード：１ｗｔ６）のコイルドコイル配列もまた、三量体であることが報告されており（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２８５：１３２８５−１３２９３（２０１０））、多量体ヒトＧＩＴＲＬ融合タンパク質の作製に用いるために選択した。
【０１５８】
ＧＩＴＲＬ融合タンパク質において用いられるさらなるコイルドコイル配列を提供するため、ヒトコロニン１Ａ、マトリリン−１、ランゲリンおよびＤＭＰＫに由来する野生型コイルドコイル配列の変異体を作製した。これらの変異体配列を作製するため、ＰｒｏＣｏｉｌアルゴリズムのオンライン実行（ワールドワイドウェブサイト「ｂｉｏｉｎｆ．ｊｋｕ．ａｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｏｃｏｉｌ／」経由でインターネットによりアクセス可能）を用いた。このアルゴリズムは、所与の配列が二量体および三量体コイルドコイル構造を形成する確率を予測する。上述の野生型コイルドコイル配列の幾つかの変異体が、三量体を形成することについて、野生型配列と比べてより高い確率スコアを有することが予測された。六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの作製に用いるため、三量体であることについて最高の確率を有する変異体配列を選択した。
【０１５９】
上記の４つすべてのヒトタンパク質に対して選択した変異体コイルドコイル配列を表１−１に示す。
【０１６０】
【表３】
2018522571.tif 000007
【０１６１】
三量体化モチーフをランクづけるためのインシリコ分析
より安定なＧＩＴＲＬ三量体、ひいてはより安定な多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰを生成することになるモチーフのインシリコ予測は、表１−１中の配列をそれらのオリゴマー状態を予測するためのアルゴリズム（ＬＯＧＩＣＯＩＬ）を用いて分析することによって行った。さらに、平行三量体の形成において得られたスコアを、２つのアルゴリズム（ＭＡＲＣＯＩＬおよびＬＯＧＩＣＯＩＬ）の組み合わせを介して、全ヒトプロテオームから同定されたコイルドコイルからのスコアと比べた。
【０１６２】
方法
ｆｔｐサイト「ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｍＲＮＡ＿Ｐｒｏｔ／ｈｕｍａｎ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｆａａ．ｇｚ．」からダウンロードしたヒトプロテオームに対して、ゲノムワイドな予測を実施した。このバージョンは、総数７１８６１のタンパク質配列を含む。これらの配列をスキャンし、ワールドワイドウェブサイト「ｂｃｆ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ／Ｍａｒｃｏｉｌ／Ｍａｒｃｏｉｌｃｏｄｅ．ｔａｒ．ｇｚ」からダウンロードしたソフトウェアＭＡＲＣＯＩＬを実行することにより、コイルドコイルモチーフを同定した。コイルドコイル配列のオリゴマー形成状態（平行もしくは抗平行二量体、三量体または四量体）を予測するため、特定の具体的な閾値（すなわち、０．０１、０．１０、０．５０、０．９０および０．９９）を通るモチーフのすべてを、ワールドワイドウェブサイト「ｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌｓ．ｃｈｍ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ＬＯＧＩＣＯＩＬ／ＬＯＧＩＣＯＩＬ＿Ｓｏｕｒｃｅ．ｚｉｐ」経由でインターネットからダウンロードしたＬＯＧＩＣＯＩＬアルゴリズムを用いてさらに分析した。このパッケージをＲ言語（バージョン３．０．２−２０１３−０９−２５）において実行した。ＭＡＲＣＯＩＬからの出力をＬＯＧＩＣＯＩＬによって想定されるファイルフォーマットに変換するため、アドホックｐｅｒｌスクリプトを開発した。ｌａｔｔｉｃｅパッケージ（バージョン０．２０〜２３）を用いて、ヒストグラムをＲでプロットした。
【０１６３】
結果
Ｒｅｆｓｅｑからのすべてのヒト配列内のコイルドコイルモチーフを（ＭＡＲＣＯＩＬを用いて）予測した。異なる閾値に対するＭＡＲＣＯＩＬアルゴリズムによって予測されるコイルドコイルモチーフの数を表１−２に示す。次に、０．９９の閾値からのすべてのモチーフのオリゴマー状態を、表１−２での８つの選択した三量体コイルドコイルドメインとともに、ＬＯＧＩＣＯＩＬを用いて予測した。
【０１６４】
本試験で用いるこれらのスコアの分布およびモチーフのランキングを表１−３に示す。
【０１６５】
【表４】
2018522571.tif 000008
【０１６６】
【表５】
2018522571.tif 000009
【０１６７】
異なるヒト三量体化モチーフを有するＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の作製
選択した三量体化モチーフの各々における配列は、ＧＣＮ４  ｐＩＩ配列に加えて、適切な立体配置で、ＧＩＴＲＬ  ＦＰの他の要素（すなわち、短い可動性アミノ酸リンカー配列によって分離された、ヒトＦｃドメインとヒトＧＩＴＲＬの細胞外ドメインとの間にあるもの）をコードするＤＮＡベクターにクローン化した。これらのベクターを、哺乳動物細胞を一過性に遺伝子導入するために用いて、組換え六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質の分泌とその後の精製を可能にした。
【０１６８】
方法
懸濁ＣＨＯ細胞に、ＰＥＩを用いて、異なる六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードするＤＮＡベクターを一過性に遺伝子導入し、８０％の湿度下、１４０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で８日間成長させた。分泌タンパク質を含有する条件培地４０ｍＬを、１，６００×ｇでの遠心分離および濾過により細胞および細胞片から分離した。タンパク質をＭａｂ  ＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（商標）樹脂を用いて精製し、そのサイズおよび完全性を還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析した。
【０１６９】
その後、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ  ｗｔ）および六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（マトリリン１  ｗｔ）に対して、より大規模な発現および２段階精製プロトコルを用いた。ここで、より大きい体積のＣＨＯ条件培地（４００ｍｌ）にプロテインＧクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーステップ（Ｓ２００  １６／６０）を施した。これらの精製タンパク質をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析に用いた。
【０１７０】
結果
組換え六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質のすべてが類似レベルで発現したが、中でもコロニン１ａ  ｗｔモチーフを有する六量体ＧＩＴＲＬ−ＦＰは、他のタンパク質よりも高収量をもたらすように思われた（表１−４：図１）。
【０１７１】
【表６】
2018522571.tif 000010
【０１７２】
異なるヒト三量体化モチーフを有するＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の特徴づけ
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体のＧＩＴＲを発現する細胞への結合
六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子が細胞表面に発現されるＧＩＴＲに結合し得るか否かを判定するため、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子を、ＧＩＴＲを過剰発現する細胞とともにインキュベートし、それらの結合をそれらのＦｃドメインを介して検出した。
【０１７３】
方法
固定濃度のＤｙＬｉｇｈｔ−６４９に複合した抗ヒトＩｇＧ抗体緩衝液、その後、セクション１．３中の上記の２倍希釈した精製六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質およびアイソタイプ対照抗体（ＮＩＰ２２８）を、２連ウェルで３８４ウェルの黒色壁付きの透明な底板に添加した。ＧＩＴＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞をすべてのウェルに添加し、プレートを室温で４時間インキュベートした。ＣＨＯ−ＧＩＴＲ細胞への結合を、６４０ｎＭのレーザーを用いるＭｉｒｒｏｒｂａｌｌ（商標）プレート血球計数器を用いて測定し、蛍光を測定した。
【０１７４】
結果
結果を図２Ａ〜Ｄに提示する。得られた結合特性は、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの濃度がＤｙＬｉｇｈｔ−６４９に複合した検出抗体の濃度を超えるときに認められる「フック効果」を示す結果、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの濃度が高まるにつれて結合の低下が検出され、それ故、釣鐘状の結合特性がもたらされる。この現象にもかかわらず、異なる六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子は、酷似した結合特性をもたらす。
【０１７５】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体と組換え三量体リガンドとのＧＩＴＲへの結合に対するＧＩＴＲＬ競合の競合
ヒトＧＩＴＲＬのヒトＧＩＴＲへの結合に対する六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の効果を、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いて測定した。
【０１７６】
方法
六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子を、ＧＩＴＲＬ−ＨＡ（ヘマグルチニンタグ）のＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合が測定されるＨＴＲＦアッセイで滴定した。ヒトＧＩＴＲ  Ｆｃをユーロピウムクリプテートと複合させ、ＸＬ６６５と複合させた抗ＨＡ抗体を用いてＧＩＴＲＬ−ＨＡタンパク質を検出した。Ｐｒｉｓｍ  ５．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析データを４つのパラメータロジスティック方程式にカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０値を判定した。
【０１７７】
結果
結果を図３Ａ〜Ｄおよび表１−５に提示する。異なる三量体化モチーフを有する六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子はすべて、三量体ＧＩＴＲＬ−ＨＡのＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合への強力な阻害剤である。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ＧＣＮ４）よりも８倍低い効力を示すＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ランゲリンｗｔ）を例外として、大部分のＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体が、類似の阻害特性およびＩＣ５０値をもたらした。ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ）は、０．６１ｎＭで最低のＩＣ５０値を有した。
【０１７８】
【表７】
2018522571.tif 000011
【０１７９】
レポーターアッセイにおけるＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の活性
異なるＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子（六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ（配列番号６）および六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ４  ＦＰ（配列番号４０）の機能的活性を、ＧＩＴＲを安定的に発現するＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞を用いるアッセイにおいて測定した。ＧＩＴＲのアゴニズムおよびその後のＮＦκＢ経路の活性化によって駆動される発光を測定した。
【０１８０】
方法
６ポイントデータ曲線のため、ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質を４倍に連続希釈し、３通りに９６ウェルプレートに添加した。次に、ヒトＧＩＴＲを遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター細胞を、アッセイプレートのすべてのウェルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬をアッセイプレートのすべてのウェルに添加することにより、ルシフェラーゼ発現を検出した。プレートを室温で５分間インキュベートし、次に発光を測定し、対数（アゴニスト）対応答のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ）での可変勾配非線形曲線フィットを用いてＥＣ５０値を生成した。
【０１８１】
結果
結果を図４Ａ〜Ｄおよび表１−６に示す。すべての六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質がＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導する。タンパク質は、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ＧＣＮ４）に対して類似の効力特性およびＥＣ５０値を生成した。
【０１８２】
【表８】
2018522571.tif 000012
【０１８３】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の融解温度
ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質の融解温度を、放射特性が折り畳まれていないタンパク質の存在下で変化する蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ）を用いて測定した。
【０１８４】
方法
多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の熱安定性を、融解温度（Ｔｍ）を計算するためのＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅに基づくアッセイを用いて評価した。異なるタンパク質を、９６ウェルＰＣＲプレートに懸濁する前、最初に２×ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）をプレート上の各ウェルに添加し、次に密封した。プレートを、Ｃｈｒｏｍｏ４（商標）連続蛍光検出器を用いてリアルタイム（商標）ＰＣＲ装置上で読み取った。温度は、１℃ごとの読み取りと１秒の保持時間で２０℃から９０℃に高めるように設定した。アンフォールディング転移を、蛍光強度および蛍光誘導体を温度の関数としてプロットすることによって判定した。各多量体ＧＩＴＲＬ−ＦＰタンパク質を二通りに分析した。
【０１８５】
結果
結果を図５Ａ〜Ｄに示す。９つの多量体ＧＩＴＲＬ−ＦＰタンパク質の各々における融解温度を下の表１−７にまとめる。すべての変異体は、他の大部分、すなわち低温（４５〜５０℃）で追加的な転移ピークを呈する（これは一部の構造的不安定性を示唆する）ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ランゲリンｗｔ）およびＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ランゲリン変異体）の双方における６２〜６４℃と比べて５９℃で単一の転移ピークを呈するＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ＤＭＰＫ  ｗｔ）以外では、類似の特性を有する。
【０１８６】
【表９】
2018522571.tif 000013
【０１８７】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体のインシリコ免疫原性分析
８つのコイルドコイルドメインおよびそれら周囲の配列の予測される免疫原性を、ＰｒｏＰｒｅｄアルゴリズムを用いて判定した。
【０１８８】
方法
ＰｒｏＰｒｅｄ［Ｓｉｎｇｈ＆Ｒａｇｈａｖａ（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（１２）］を用いて、８つの選択したヒト三量体化モチーフ、および酵母ＧＣＮ４  ｐＩＩのＴスコアを評価した。任意のアミノ酸配列のＴスコアにより、アミノ酸配列の全長に対して強力に結合するＭＨＣクラスＩＩエピトープの数が定量される。ＰｒｏＰｒｅｄが１０，０００の無作為に生成される９−ｍｅｒ配列セットを評価することによって得られる９５パーセンタイル超のスコアに位置する結合スコアを戻す場合、９−ｍｅｒの部分配列は強力に結合するエピトープであると考えられる。Ｔスコアは、８つの最も一般的なヒト対立遺伝子に対して、モチーフに先行する２×［Ｇ４Ｓ］配列ならびにモチーフに後続する［Ｇ４］配列およびＧＩＴＲＬドメインの最初の４アミノ酸を含む各モチーフにつき計算した。次に、個別の対立遺伝子のＴスコアの合計として、総Ｔスコアを形成した。
【０１８９】
結果
各三量体化モチーフおよびその周囲の配列における総Ｔスコアを表１−８に示す。最大スコアが８に等しく、それは配列内のすべての９−ｍｅｒが試験対象の８つの対立遺伝子すべてに対して強力に結合するエピトープである場合に対応することに注目されたし。興味深いことに、このグローバル分析によると、ＤＭＰＫ  ｗｔを除くほぼすべての候補がＧＣＮ４よりもやや強力な免疫原性特性を有することが予測される。マトリリンｗｔと変異体の双方は、最高の総Ｔスコアを有する。
【０１９０】
【表１０】
2018522571.tif 000014
【０１９１】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析
方法
ＢｉｏＳｅｐ−Ｓｅｃ−Ｓ（商標）４０００（ボイドボリューム、Ｖ０＝５．７ｍｌ）でタンパク質を分析し、０．５ｍｌ／分の流速で３０分間、すべてのランを実施した。ＵＶ２８０、屈折率および多角度レーザー光散乱検出器を用いて、溶出を監視した。試料を（１〜２ｍｇ／ｍｌで）カラム上に負荷し、次にモル質量および粒子径を計算した。
【０１９２】
結果
多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（マトリリン１  ｗｔ）
マトリリン−１三量体化モチーフを有するＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ゲル濾過カラム上に３つの異なるピークを生成したが、ピーク２は、グリコシル化六量体の予想されたモル質量に一致する３１２ｋＤａの重量−平均モル質量を有し、総タンパク質質量の４０．９％を占める一方、ピーク１は、六量体の二量体に対応する重量−平均モル質量（約６１０ｋＤａ）を有し、注射される総質量の４１．３％を占める。ピーク３は、予想される質量（約２１５ｋＤａ）より低い質量を有するならば、それは断片化の結果または六量体からの二量体の欠損のいずれかであり得る。それは総タンパク質質量の１７．７％を占める。したがって、このタンパク質製剤の組成物は異質性であるとともに、支配的なオリゴマー種は単一ではない。
【０１９３】
多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ  ｗｔ）
ＵＶ２８０のオーバーレイ、屈折率および９００レーザー散乱トレースの分析によると、このタンパク質の９３．９％が３００ｋＤａの単分散種として１６．４分で溶出することが示される。この観測質量は、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰポリペプチドの予測された質量（２７４．９５ｋＤａ）に一致する。計算質量と２５ｋＤａの観側質量との間の差異は、グリコシル化に起因する可能性が最も高い。１４．７分後の小さいピークは、６９０ｋＤａの重量−平均モル質量を有し、それは六量体の二量体に起因し得る。
【０１９４】
多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ＧＣＮ４  ｐＩＩ）
同様に、ＧＣＮ４  ｐＩＩ三量体化モチーフを有するＧＩＴＲＬ  ＦＰのレーザー散乱および屈折率クロマトグラムの分析によると、このタンパク質の９３．７５％が、グリコシル化六量体に一致する、３３０ｋＤａの単分散種として溶出することが示される。１５分後のピーク溶出物は、総タンパク質のわずか６．２５％を含有し、おそらくは六量体での二量体の存在を反映する約７００ｋＤａの重量−平均モル質量を有する。
【０１９５】
モル質量対時間特性
図６は、３つの多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質の各々に対する溶出ピークのモル質量組成を示す。３つすべてのタンパク質においては、約１５分の保持時間を伴う初期ピークにわたるモル質量は、特に同一ピークの最初に溶出される分子の質量と終了時に溶出される分子の質量が１００ｋＤａより大きく異なるようなＧＩＴＲＬ  ＦＰ（マトリリン１  ｗｔ）の場合、非常に変化しやすい。約１７分後の溶出ピークはそれらの分子組成においてあまり異質ではなく、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（コロニン１ａ  ｗｔ）における最大モル質量の変動は２０ｋＤａ未満である。重量−平均モル質量におけるその変動は、同一ピーク内で溶出されている糖タンパク質のグリカン含量における差異に起因する可能性が最も高い。
【０１９６】
特性データの概要
多量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ中の様々なコイルドコイル三量体化ドメインの性能を比較する表１−９に示すような収集データの分析において、コロニン１ａコイルドコイルドメインは、改善された発現収量をもたらす。しかし、コロニン１ａコイルドコイルモチーフおよび三量体コイルドコイルとして分類されるヒト配列からのモチーフの予測スコアの比較によると、コロニン１ａ  ｗｔが５のＬＯＧＩＣＯＩＬランキングを有したことが示される。
【０１９７】
【表１１】
2018522571.tif 000015
【０１９８】
実施例２：ＧＩＴＲＬ融合タンパク質の作製および特徴づけ、それの特徴づけ、およびマウスＧＩＴＲＬ融合タンパク質の特徴づけ
誘導および組成
配列番号６のアミノ酸配列を有する単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１融合タンパク質を構築した。配列番号６の各ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ単量体サブユニットは、３つの異なるドメイン：１）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン；２）ヒトコロニン１Ａタンパク質から誘導されるαヘリカルコイルドコイル三量体化ドメインおよび３）唯一の占有されるグリコシル化部位を排除するヒトＧＩＴＲＬ  ＥＣＤにおける単一の点突然変異（Ｎ１６１Ｄ）を有するヒトＧＩＴＲＬ  ＥＣＤ、を含む。各ドメインは、可動性グリシンおよびセリンリッチもしくはグリシンリッチの例えば（Ｇｌｙ）４リンカーによって分離される（図８）。各単量体中のヒトＧＩＴＲＬ  ＥＣＤドメインは、溶液中に２つのさらなる単量体を伴う弱い非共有結合三量体を形成し、この会合は、ヒトコロニン１Ａ三量体化ドメイン間の相互作用を通じて強化され、安定化された三量体構造をもたらす。各三量体中に存在するＩｇＧ１  Ｆｃドメインの相互作用が、その後のＧＩＴＲＬ三量体の二量体の形成につながり、最終的な六量体立体構造をもたらす。
【０１９９】
配列番号８のアミノ酸配列を有する前駆体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰポリペプチドサブユニットをコードする、配列番号７で示されるＤＮＡ分子を、標準の分子生物学技術を用いて、合成し、効率的な一過性組換えタンパク質の発現を可能にする発現ベクターにクローン化した。
【０２００】
配列番号６で示される、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰポリペプチドサブユニットのサブユニット単量体のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を図８に示す。
【０２０１】
組換えタンパク質の発現および精製
ウエーブバッグバイオリアクター内、ＣＤ−ＣＨＯ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に類似した合成培地中の懸濁液中で成長するＣＨＯ細胞に、異なる六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰをコードするＤＮＡベクターを遺伝子導入した。培養物を、ＣＨＯ  ＣＤ−Ｆｅｅｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に類似した栄養素フィードを用いて、流加培養として１０〜１２日間維持し、次いでそれらを細胞除去用の濾過を用いて収集した。次に、馴化培地を精製前に冷蔵した。
【０２０２】
タンパク質を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（商標）樹脂を用いて条件培地から精製した。溶出されたピークを、ヒドロキシアパタイトタイプ１樹脂上でのさらなる精製前に中和し、濾過した。塩勾配を用いて溶出を行った。プロセス全体を通じて、純度をＳＥＣ  ＨＰＬＣによって監視した。
【０２０３】
ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰポリペプチドサブユニットのグリコシル化分析
配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰポリペプチドサブユニットのグリコシル化状態を、四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析（ＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ）と共役した液体クロマトグラフィー、および質量分析を用いるペプチドマッピングを用いて判定した。結果を図９に示す。
【０２０４】
還元されたポリペプチドサブユニットのＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析によって得られた、配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰポリペプチドサブユニットの正確な質量は、１つの鎖あたり１つの二分岐グリカン（主にＧ０ｆ）の付加により、予想されたアミノ酸配列に一致する。質量特性は、ペプチドマッピングによって確認される通り、配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰポリペプチドサブユニットのＧＩＴＲＬ  ＥＣＤ中のＮ１２９（融合タンパク質中のＮ３６９）でのＮ−グリカンの占有を伴わないＦｃドメインのグリコシル化に合致する。これらのデータでは、ＧＩＴＲＬ  ＥＣＤ中のＮ１６１Ｄ突然変異（融合タンパク質中のＮ４０１）が、脱グリコシル化ＧＩＴＲＬ  ＥＣＤをもたらすとともに、Ｎ−グリコシル化がＦｃドメイン内の基準のグリコシル化部位に限って存在することも確認される。
【０２０５】
六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのインビトロ特性
リガンド−受容体結合に対する六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの効果
配列番号６の単量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰサブユニット配列を有する六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのヒトＧＩＴＲＬのヒトＧＩＴＲへの結合に対する効果を、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いて判定した。ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰを、ＧＩＴＲＬ−ＨＡ（ヘマグルチニンタグ）のＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合が測定されるＨＴＲＦアッセイで滴定した。ヒトＧＩＴＲ  Ｆｃをユーロピウムクリプテートと複合し、ＸＬ６６５と複合した抗ＨＡ抗体を用いて、ＧＩＴＲＬ−ＨＡタンパク質を検出した。Ｐｒｉｓｍ  ６．０ｘソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、分析データを４つのパラメータロジスティック方程式にカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０値を判定した。図１０に示す代表的な結果は、ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰがＧＩＴＲＬ−ＨＡのＧＩＴＲへの結合を０．５６２ｎＭのＩＣ５０で阻害することを示す。アイソタイプ対照抗体ＮＩＰ２２８では阻害が認められなかった。
【０２０６】
ＧＩＴＲアゴニズム
この実験の目的は、ＧＩＴＲＬ融合タンパク質（ＦＰ）がＧＩＴＲ受容体を介してシグナルを送達する能力を判定することであった。
【０２０７】
方法
六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰを、ｈＧＩＴＲおよび核内因子κＢ（ＮＦκＢ）プロモーターに連結されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ細胞に、溶液へ添加した。このアッセイでは、ＧＩＴＲ受容体の活性化がＮＦκＢ経路を介したシグナル伝達をもたらし、次いで発光を介して測定可能なルシフェラーゼ活性における増強をもたらす。
【０２０８】
結果
六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰのアッセイ系への添加により、発光の増加がもたらされる。観察された効果は濃度依存性があり、ＥＣ５０は約１８０ｐＭであった。それに対し、アイソタイプ対照抗体の添加は、全く効果を有しなかった。結果を図１１に示す。これらのデータは、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰがＧＩＴＲ受容体の強力なアゴニストであることを示す。
【０２０９】
一次Ｔ細胞活性化
この実験は、ヒトＴ細胞の増殖および機能に対する、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰによって媒介されるＧＩＴＲアゴニズムの影響を評価するために実行した。
【０２１０】
方法
ＧＩＴＲ発現を上方制御するため、全ヒトＴ細胞を健常ヒト血液から単離し、プレートに結合した抗ＣＤ３の存在下での４日間の培養により、抗原を経験させた。抗原を経験した細胞を、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの存在下で亜最適濃度の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で再刺激する前、培地中での単独培養により２日間静止させた。細胞の増殖は、チミジンの細胞への取り込みを１８時間かけて定量化するこによって評価した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の放出を、メソスケールディスカバリーを用いて定量化した。
【０２１１】
結果
抗ＣＤ３を抗ＣＤ２８と一緒に添加した結果、最小レベルの増殖とＩＦＮ−γの最小放出がもたらされた。プレートに結合した六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰをプレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８と一緒に添加した結果、増殖のレベルおよびＩＦＮ−γの放出における濃度依存性増加がもたらされた。代表的なデータを図１２および図１３に示す。アイソタイプ対照抗体は、増殖またはサイトカインの放出に対する効果を全く有しなかった。
【０２１２】
ＡＤＣＣ
マウス六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰは、ＦＯＸＰ３陽性制御性Ｔ細胞を含む腫瘍内ＣＤ４陽性Ｔ細胞を枯渇させ、腫瘍内でのＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の増加をもたらすことがインビボで示されている。この実験は、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰがＡＤＣＣを介してヒトＴ細胞の枯渇を媒介する能力を判定し、生存細胞集団において生じるＣＤ８：ＣＤ４比の変化を評価するために実行した。
【０２１３】
方法
ＧＩＴＲ発現を上方制御するため、健常ヒト血液から単離した一次ヒトＴ細胞は、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）およびＩＬ−２で抗原を経験させた。次にそれらを蛍光色素で標識し、指定濃度で、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰとの指定される比で、一次ＮＫ細胞とともに２４時間インキュベートした。フローサイトメトリーを用いて、アッセイの終了時に存在する生きたＴ細胞の百分率を定量化し、これを用いて、非処理ウェルに対する処理ウェルにおける溶解百分率を計算した。ＣＤ４およびＣＤ８細胞の割合についても、フローサイトメトリーによって定量化した。
【０２１４】
結果
ＮＫ細胞は単独で一次Ｔ細胞の少量の溶解を媒介し、それはＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する配列番号６で示されるＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰを濃度依存的様式で添加することにより著しく増強された。ＮＫ細胞上のＦｃγ受容体に結合することができない、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを有する配列番号４０のＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドサブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰは、負の対照として用い、測定した溶解レベルに対する効果を全く有しなかった（図１４）。
【０２１５】
アッセイの終了時に存在するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率のフローサイトメトリー分析によると、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰによって媒介されるＡＤＣＣが増加したＣＤ８：ＣＤ４Ｔ細胞比の生成を支持することが示された（図１５）。
【０２１６】
制御性Ｔ細胞アッセイ
ＧＩＴＲは制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）上で増加したレベルで発現され、ＧＩＴＲを介するシグナル伝達がＴ−ｒｅｇの他のＴ細胞を抑制する能力に影響することが示唆されている。この実験は、Ｔ−ｒｅｇ機能に対する六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの影響を評価するために実行した。
【０２１７】
方法
ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇを健常ヒトドナーの末梢血から単離した。エフェクターＴ細胞は、指定される比での抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、Ｔ−ｒｅｇおよび被験物質の存在下での培養前、ＣＦＳＥで標識した。増殖するエフェクターＴ細胞の百分率をフローサイトメトリーによって分析した。
【０２１８】
結果
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の添加に応答して、エフェクターＴ細胞の増殖が認められた。増加する数のＴ−ｒｅｇの添加により、アッセイ中に分裂したエフェクターＴ細胞の百分率における減少がもたらされた。プレートに結合したアイソタイプ対照の添加により、分裂した細胞の百分率がさらに減少した一方、プレートに結合した六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰの添加により、Ｔ−ｒｅｇの不在下で認められる百分率まで分裂した細胞の百分率が回復した。結果を図１６に示す。
【０２１９】
この試験では、六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰが他のＴ細胞に対する制御性Ｔ細胞媒介性抑制の効果を克服する能力が示される。
【０２２０】
生物学的／機能的活性についてのインビボ試験
アイソタイプ依存性の抗腫瘍活性
ヒトＧＩＴＲＬがマウスＧＩＴＲと交差反応しないことから、ヒトＧＩＴＲＬ  ＦＰはがんの免疫担当マウスモデルにおいて試験することができない。この試験を可能にするため、代理マウスのｍＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰおよびｍＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ２ａ  ＦＰを作製した。この試験は、がんのＣＴ２６モデルにおけるｍＧＩＴＲＬ  ＦＰの抗腫瘍活性を評価し、またこの活性の規模に対するＦｃアイソタイプの影響を判定するために実行した。
【０２２１】
方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６マウス結腸直腸がん細胞株を移植した。移植後６日目、動物にｍＧＩＴＲＬ  ＦＰを１７日間で１回もしくは毎日のいずれかで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰの２つの異なるバージョン（一方はｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインを有し、もう一方はｍＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する）について試験した。５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの２つの異なる用量レベルの各ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰを試験した。生理食塩水治療を負の対照として用いた。
【０２２２】
結果
生理食塩水治療群の中央値生存は２２日であり、このグループ内のマウスのいずれも試験終了まで生存しなかった。１０ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰでの治療により、中央値生存が３２日まで延長され、試験終了時に５０％生存率が得られた。５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰで治療した群では、試験終了時に１０匹中９匹のマウスが生存し、中央値生存時間を全く確定できなかった。５もしくは１０ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｍＩｇＧ１での治療により、中央値生存が各々、２８日および２２．５日まで延長され、試験終了まで１０匹中２匹のマウスの生存が得られた。結果を図１７に示す。
【０２２３】
この試験は、ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰが抗腫瘍活性を媒介する可能性を示し、ＦＰのアイソタイプが観察される抗腫瘍活性のレベルに影響し得ることを示す。
【０２２４】
薬力学的効果
この試験は、腫瘍保有マウスの脾臓および腫瘍におけるＴ細胞の活性化状態および割合に対するｍＧＩＴＲＬ  ＦＰの影響を判定するために実行した。
【０２２５】
方法
７〜９週齢のＣＴ２６腫瘍保有Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスを、指定される通りの０．２ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのいずれかのｍＧＩＴＲＬ  ＦＰの腹腔内注射により治療した。生理食塩水治療を負の対照として用いた。マウスを治療開始から７日後に屠殺し、フローサイトメトリーを用いて、脾臓および腫瘍における細胞の頻度および表現型を評価した。
【０２２６】
結果
ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰによる治療は、脾臓におけるすべてのＴ細胞サブセットでの増殖マーカーＫｉ６７の発現における増加をもたらし、これはこれらの細胞の増殖における増加を示唆する。図１８を参照のこと。
【０２２７】
ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰによる治療は、脾臓におけるすべてのＴ細胞サブセットでの活性化マーカーＩＣＯＳの発現における増加をもたらし、これはこれらの細胞の活性化における増加を示唆する。図１９を参照のこと。
【０２２８】
ｍＧＩＴＲＬ  ＦＰによる治療は、腫瘍内部のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−ヘルパー細胞の頻度における減少をもたらしたが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を変化させなかった。全体的結果は、腫瘍微小環境内でのＣＤ８：ＣＤ４比の増加であった。図２０を参照のこと。
【０２２９】
方法
細胞株および試薬
ＴＣ−１腫瘍株は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ６４７５，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。ＣＴ２６腫瘍株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。ＤＴＡ−１およびアイソタイプ抗体は、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）から購入した。
【０２３０】
腫瘍モデル
ＴＣ−１実験では、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（カタログ番号０００６６４）マウスを用いた。ＣＴ２６実験では、Ｅｎｖｉｇｏ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いた。マウスは、腫瘍移植時、６〜８週齢の間であった。すべての動物実験は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって確立されたガイドラインに従って実行した。ＴＣ−１腫瘍移植においては、２×１０４個の生存可能なＴＣ−１細胞を左後足蹠に皮下移植した。ＣＴ２６腫瘍移植においては、５×１０５個の細胞を右側腹部に移植した。腫瘍成長は、ノギス１を用いた直接的測定により評価した。双方向的な測定結果を２〜４日ごとに収集し、腫瘍体積は体積＝（長さ・幅２）／２を用いて計算した。腫瘍を６〜１４日間発生させておき、次に腫瘍保有マウスを腫瘍体積により治療群に無作為化した。マウスは、ＩＡＣＵＣプロトコルに従い、原発性腫瘍がＴＣ−１／足蹠において１０００ｍｍ３、ＣＴ２６／側腹部において２０００ｍｍ３を超えたとき、安楽死させた。ＰＤ試験においては、マウスを安楽死させ、腫瘍および脾臓を収集し、７０ｕＭのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して粉砕し、単一の細胞懸濁液に処理した。
【０２３１】
機能的Ｔ細胞応答およびフローサイトメトリー
抗原特異的刺激のため、１〜２×１０６個の生細胞に、１ウェルあたり１ｕｇのＡＨ１ペプチド配列ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号５６）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を蒔いた。すべての株における染色の順序は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）、細胞外タンパク質、ＦＯＸＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、それに続いて細胞内サイトカインであった。抗体は、ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ−１）を含んだ。すべての試料は、ＬＳＲ−ＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のいずれかで走らせた。すべてのデータは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。
【０２３２】
結果
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは極めて有効なＧＩＴＲアゴニストであり、これはＣＴ２６腫瘍の拒絶をもたらす
ＧＩＴＲアゴニズムがＢａｂｌｃマウスにおけるＣＴ２６腫瘍の退縮および消失を引き起こす上で有効であることが以前に示されている。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を移植し、６日後に腫瘍体積により無作為化し（群ｎ＝１０）、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａ（Ｑ２Ｄ×９）の単回投与または反復投与で治療した。用量範囲は、５ｍｇ／ｋｇ体重から０．０４ｍｇ／ｋｇ体重に減少した。単回投与においては、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの用量を１ｍｇ／ｋｇまで減少させることで、３０日目にかけてＣＴ２６マウス腫瘍の１つを残して全部が消失した（図４０Ｂ）。最低用量として、０．２ｍｇ／ｋｇ群では３つの消失、０．１ｍｇ／ｋｇ群では２つの消失が得られた。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰのさらなる投与を追加することで有効性が高まり、０．０４ｍｇ／ｋｇの最低用量群を除く全部で１００％の排出速度が認められた（図４０Ｃ）。最低反復投与群では、４つの消失が認められた。
【０２３３】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ機能の評価においては、それを公知のモノクローナルＧＩＴＲアゴニストであるＤＴＡ−１と比較した。１００ｕｇ〜５００ｕｇの範囲の用量／マウスの使用については以前に記載がなされている。各マウスは約２０グラムであると評価されたので、用量は５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲であった。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を移植し、１０日後に腫瘍体積により無作為化し（群ｎ＝１０）、次に１ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａまたは５ｍｇ／ｋｇもしくは２５ｍｇ／ｋｇのＤＴＡ−１のいずれかの単回投与で治療した（図４０Ｄ）。
【０２３４】
しかし、ＤＴＡ−１の用量増加により有効性が高まり、１ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、５ｍｇ／ｋｇのＤＴＡ−１の場合と同様の有効性および腫瘍成長動態を示した。ＣＤ８Ｔ細胞が我々の薬剤効果にとって必要であったか否かを判定するため、選択的に枯渇されたＣＤ８Ｔ細胞を除く同一群を、モノクローナル枯渇抗体を用いて評価した（図４０Ｅ）。ＣＤ８Ｔ細胞の不在下で、ＤＴＡ−１またはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰのいずれかにおけるＣＴ２６腫瘍を完全に消失させる能力が有意に低下した。各群からのわずか１〜２匹のマウスが腫瘍のない状態で生存した。
【０２３５】
加えて、ＣＤ８Ｔ細胞の不在下で、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、増加する中央値全生存でＤＴＡ−１よりも大して有効でなかった（図４０Ｆ）。いかにｍＧＩＴＲＬ−ＦＰがＣＤ８と相互作用するかを理解するため、個別のリンパ系集団でのＧＩＴＲ発現を評価した。ＣＤ４＋ＴｒｅｇはＣＤ８Ｔ細胞よりも高レベルのＧＩＴＲを発現するが、腫瘍内のＴｒｅｇおよびＣＤ８Ｔ細胞の双方は、脾臓内のそれら各々の集団よりも高レベルのＧＩＴＲを発現する（図４０Ｇ）。
【０２３６】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰはＴｒｅｇを枯渇させ、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞を増加させる
ＧＩＴＲアゴニストがＴｒｅｇを減少させるとともに、高結合活性のＴ細胞応答を増強することが以前に示されている。どの薬力学的効果をＧＩＴＲＬ−ＦＰが媒介する能力があるかを理解するため、ＣＴ２６モデルを腫瘍退縮中に評価した。ＣＴ２６を有するＢａｌｂ／ｃマウスをｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療し、投与開始から８日後、脾臓および腫瘍を収集した。試験の２つのアーム、すなわちＴＧＩ（腫瘍成長阻害）群（ｎ＝５）およびＰＤ（薬力学）群（ｎ＝５）を含めた。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで治療した単一マウス以外のすべてのＣＴ２６を治療した（図４１Ａ）。１８日目、ＰＤ群を屠殺し、脾臓および腫瘍に存在する免疫細胞の両表現型を評価した。次に、ＣＤ８Ｔ細胞機能を、ＣＴ２６免疫優勢エピトープＡＨ１での再刺激によって評価した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰが有意に増加することで、脾臓および腫瘍におけるＴｒｅｇの数が減少した（図４１Ｂ）。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、ＣＤ８の百分率を変化させなかった一方、ＡＨ１に特異的な抗原であるＣＤ８の数を有意に増加させた（図４１Ｃ〜Ｄ）。脾臓では、全ＣＤ８の５〜１０％が抗原特異的であり、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生する能力があった。腫瘍では、その数は５〜１５％であった。これは腫瘍浸潤リンパ球と抹消貯蔵所（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の双方の有意な拡大である。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰがＣＤ４  ＴｒｅｇおよびＣＤ８Ｔ細胞の双方に結合していたか否かを評価するため、ＤＴＡ−１抗体を用いることを意図してＧＩＴＲを染色した（図４１Ｅ〜Ｆ）。Ｔｒｅｇは、ＧＩＴＲ  ＭＦＩ（平均蛍光強度）において７５％を超える減少を示した。これと同じ効果がＣＤ８Ｔ細胞上で認められ、これはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰがＤＴＡ−１のＣＤ８Ｔ細胞上での結合を改変していることを示した。このデータに基づき、Ｔ細胞がＫＩ−６７増殖の増加を示すと仮定された。治療後８日目の評価後、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の双方は、腫瘍と脾臓の双方において有意により多くのＫＩ−６７陽性細胞を示す（図４１Ｇ〜Ｈ）。
【０２３７】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは抗原特異的なＣＤ８Ｔ細胞を用量依存的様式で拡大させる
次に、ＣＴ２６を治療したマウスが同じ腫瘍の再負荷から保護されるか否かを検討した。これを評価するため、治療したマウスを、単回用量として１．０、０．５、もしくは０．２ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療した群から再負荷した（図４２Ａ）。８５日目での治療したマウスのみを除くすべてのマウスを、初期用量から減少させて再負荷した。ＣＴ２６を最初に治療したすべてのマウスが腫瘍の再負荷から保護されたが、最低用量群では、小さい腫瘤が測定されたが迅速に排除された。この結果を精査するため、１２０日目にマウスを屠殺し、脾細胞を採取し、ＡＨ１ペプチドに対して再刺激した。ＡＨ１に特異的なＴ細胞の数において用量依存的増加が認められた（図４２Ｂ〜Ｃ）。１ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ群では、脾臓ＣＤ８Ｔ細胞の２５％がＣＴ２６の単一エピトープに特異的である。これらのマウスは、再負荷中に腫瘍サイズにおける増加を全く示さなかった。最低用量０．２ｍｇ／ｋｇは、６％の抗原特異的ＣＤ８を有し、１２０目までに除かれる再負荷時に少し成長しつつある腫瘤を示した。
【０２３８】
六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのヒトＧＩＴＲに対する結合親和性
組換えヒトＧＩＴＲに対する配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの溶液のＫＤ（解離定数）を、ＫｉｎＥｘＡ  ３２００装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ  Ｉｄａｈｏ）を用いる動力学的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）を用いて測定した。
【０２３９】
Ｄ−ＰＢＳ、０．０２％のナトリウムおよび１ｍｇ  ｍＬ−１のウシ血清アルブミン緩衝液中、六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの２ｎＭ溶液を、組換えヒトＧＩＴＲで滴定し、２５℃で一晩平衡化した。試料を２５℃で温度制御されたＫｉｎＥｘＡ  ３２００装置に移した。平衡化混合物のサンプリングを、最小にアミン−ビオチン化したヒトＧＩＴＲで滴定された、アズラクトンビーズに結合されたストレプトアビジンを用いて行った。用いた二次検出試薬は、Ｆｃ特異的試薬ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０で標識されたプロテインＧ’（Ｓｉｇｍａから入手可能なプロテインＧの断片）であった。データを、ＫｉｎＥｘＡＰｒｏソフトウェア（バージョン３．６．８．）を用いて処理し、解釈した。六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのヒトＧＩＴＲへの結合について、８２ｎＭのＫＤが得られた。
【０２４０】
ＫｉｎＥｘＡによる組換えカニクイザルＧＩＴＲへの六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの結合
組換えカニクイザルＧＩＴＲに対する配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの溶液のＫＤを、ヒトＧＩＴＲについてのセクション６．１に記載と同様の方法でＫｉｎＥｘＡを用いて測定した。六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのカニクイザルＧＩＴＲへの結合におけるＫＤとして１０７ｎＭ得られた。
【０２４１】
ＥＬＩＳＡによる組換えカニクイザルＧＩＴＲへの六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰの結合
配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのカニクイザルＧＩＴＲに対する交差反応性を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰをビオチン化し、固定化されたカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆへの結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を用いて検出した。図２１は、六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰのカニクイザルＧＩＴＲへの結合がヒトＧＩＴＲに酷似し、かつ負の対照ＣＤ１３７−Ｆｃタンパク質に対する結合が全く認められないことを示す。
【０２４２】
実施例３：カニクイザルにおける静脈内ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ治療のインビボ薬力学的効果
カニクイザルにおける六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１融合タンパク質（ＦＰ）の薬力学的パラメータを決定するため、配列番号６のＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰ単量体サブユニットを含む六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰを、雄カニクイザルの群（５／群）に静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって投与した。
【０２４３】
方法
１日目、３日目および５日目、動物の別々の群に、１もしくは１０ｍｇ／ｋｇの六量体ＧＩＴＲＬ  ＩｇＧ１  ＦＰを注射した。対照動物は、溶媒（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２３０ｍＭスクロース、０．０２％Ｐ８０、ｐＨ７．５）を受けた。薬力学的エンドポイントの測定のため、前投与期間中と１、３、５、９、１１、１５、１８、２２、および２９日目に、血液試料を採取した。
【０２４４】
標準のフローサイトメトリー法を用いて、全血由来のＫｉ６７陽性Ｔ細胞集団を測定した。
【０２４５】
結果
細胞増殖を示す、％Ｋｉ６７陽性Ｔ細胞亜集団、例えば（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ９５ｈｉｇｈＣＤ２８＋／ｄｉｍ／−全メモリーＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ９５ｈｉｇｈＣＤ２８＋／ｄｉｍ／−全メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞）における増加が認められた（図２２）。この観察によると、１１日目もしくは１５日目の投与期間に最大に達し、次に試験終了に向けて減少した。
【０２４６】
実施例４：ＧＩＴＲＬ  ＦＰ内部のアミノ酸の突然変異およびそれらの受容体結合、アゴニスト活性および熱安定性に対する影響
ＧＩＴＲＬ受容体結合ドメイン内に突然変異を有するｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の作製
ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体を作製し、ＧＩＴＲに対して結合し、刺激するその能力について試験した。場合によっては、その熱安定性についても評価した。
【０２４７】
方法
遺伝子合成および標準のＤＮＡクローニング技術を用いて、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体をコードするＤＮＡベクターを作製した。懸濁ＣＨＯ細胞に、異なる六量体ｈＧＩＴＲＬ融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを、ＰＥＩを用いて一過性に遺伝子導入し、８０％の湿度下、１４０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で８日間成長させた。分泌タンパク質を含有する４０ｍＬの条件培地を、１，６００×ｇでの遠心分離および濾過により、細胞および細胞片から分離した。Ｍａｂ  ＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（商標）樹脂を用いてタンパク質を精製し、そのサイズおよび完全性を還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。
【０２４８】
ＧＩＴＲへの結合に対するＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体と組換え三量体リガンドとの競合
ヒトＧＩＴＲＬのヒトＧＩＴＲへの結合に対するＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の効果を、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いて判定した。
【０２４９】
方法
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子を、ＧＩＴＲＬ−ＨＡ（ヘマグルチニンタグ）のＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合が測定されるＨＴＲＦアッセイで滴定した。ヒトＧＩＴＲ  Ｆｃはユーロピウムクリプテートと複合させ、ＸＬ６６５と複合した抗ＨＡ抗体を用いて、ＧＩＴＲＬ−ＨＡタンパク質を検出した。Ｐｒｉｓｍ５．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析データを４つのパラメータロジスティック方程式にカーブフィッティングすることにより、ＩＣ５０値を判定した。
【０２５０】
結果
突然変異した六量体ＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子（ｈＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｗｔ、Ｎ９２Ｄ、Ｎ１０４ＤおよびＮ１６１Ｄ）はすべて、三量体ＧＩＴＲＬ−ＨＡのＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合の強力な阻害剤であり、類似の阻害特性およびＩＣ５０値をもたらした（図２３Ａ、Ｂ）。
【０２５１】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の組換えＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合
異なるｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の機能的活性を、ｈＧＩＴＲを安定的に発現するＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞を用いるアッセイにて測定した。ｈＧＩＴＲのアゴニズムとその後のＮＦκＢ経路の活性化によって駆動される発光を測定した。
【０２５２】
方法
ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子を、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰのｈＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合が測定されるＨＴＲＦアッセイで滴定した。ヒトｈＧＩＴＲ  Ｆｃはユーロピウムクリプテートと複合させ、ＸＬ６６５と複合した抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質を検出した。Ｐｒｉｓｍ５．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析データを１つの部位の飽和結合方程式にカーブフィッティングすることにより、ＫＤ値を判定した。
【０２５３】
結果
ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄにおける結合特性は酷似していた一方（各々、１．２２５ｎＭおよび１．０７９ｎＭのＫＤ）、Ｎ１２９Ａ突然変異ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰは、ｈＧＩＴＲＦｃに対する結合低下を示した（ＫＤ＝３．７７４ｎＭ）。Ｎ１２９Ａ突然変異をＮ１６１Ｄ突然変異と組み合わせるとき、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の結合能力はさらなる負の影響を受けた（ＫＤ＝１１．８５ｎＭ）（図２４を参照）。
【０２５４】
レポーターアッセイにおけるＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の活性
異なるｈＧＩＴＲＬ−ＦＰ分子の機能的活性を、ｈＧＩＴＲを安定的に発現するＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞を用いるアッセイにて測定した。ｈＧＩＴＲのアゴニズムとその後のＮＦκＢ経路の活性化によって駆動される発光を測定した。
【０２５５】
方法
６ポイントデータ曲線のため、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質を４倍に連続希釈し、３通りに９６ウェルプレートに添加した。次に、ヒトＧＩＴＲを遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ  ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター細胞を、アッセイプレートのすべてのウェルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬をアッセイプレートのすべてのウェルに添加することにより、ルシフェラーゼ発現を検出した。プレートを室温で５分間インキュベートし、次に発光を測定し、対数（アゴニスト）対応答のＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ＵＳＡ）での可変勾配非線形曲線フィットを用いてＥＣ５０値を生成した。
【０２５６】
結果
すべてのＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質がＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導する。Ｎ９２ＤおよびＮ１６１Ｄ突然変異体ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質は、ＧＩＴＲＬ  ＦＰ（ｗｔ）と類似の効力特性およびＥＣ５０値をもたらした。Ｎ１２９ＡおよびＮ１２９Ａ／Ｎ１６１Ｄ突然変異は、このアッセイにおけるｈＧＩＴＲＬ  ＦＰのＧＩＴＲを刺激する能力に負の影響を与えた（図２５Ａ〜Ｃ）。
【０２５７】
Ｔ細胞再刺激アッセイにおけるＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の活性
異なるｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子の機能的活性を、一次ヒトＴ細胞およびチミジン取り込みの読み出しを用いる同時刺激アッセイにて測定した。
【０２５８】
方法
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のＣＤ３＋Ｔ細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３抗体でコーティングしたＴＣ処理プレート内でのインキュベーションを介して３７℃で４日間刺激した。次に、それらを遠心分離によってペレット化し、アッセイ培地に再懸濁し、ＴＣ処理プレートに添加し、３７℃で２日間インキュベートした（静止期）。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ分子を、１０ポイントにわたりアッセイ培地で２倍に連続希釈し、マウス抗ヒトＣＤ３で予備コーティングしたＴＣ処理プレートに３通りに添加した。２時間後、アッセイプレートを洗浄し、以前に調製したＣＤ３＋Ｔ細胞を各ウェルに添加し、３７℃で４日間インキュベートした。４日後、アッセイ培地中のトリチウム標識チミジンを各ウェルに添加し、プレートを３７℃でさらに１８時間インキュベートした。インキュベーション後、チミジンの取り込みを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（商標）を用いて測定した。
【０２５９】
結果
試験したすべてのｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ突然変異体は、２つの独立実験において低下した活性を有するＮ９２Ｄを例外として、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔに等価な活性を示した（図２６Ａ〜Ｃ）。
【０２６０】
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の融解温度
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄタンパク質の融解温度を蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅ）を用いて測定したが、その放射特性は折り畳まれていないタンパク質の存在下で変化する。
【０２６１】
方法
ＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ９２Ｄ  ＧＩＴＲＬ  ＦＰ変異体の熱安定性を、融解温度（Ｔｍ）を計算するためのＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅに基づくアッセイを用いて評価した。タンパク質を、９６ウェルＰＣＲプレートに懸濁する前、最初に２×ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。Ｓｙｐｒｏ（商標）Ｏｒａｎｇｅをプレート上の各ウェルに添加し、次に密封した。プレートを、Ｃｈｒｏｍｏ４（商標）連続蛍光検出器を用いてリアルタイムＰＣＲ装置上で読み取った。温度は、１℃ごとの読み取りと１秒の保持時間で２０℃から９０℃に高めるように設定した。アンフォールディング転移を、蛍光強度および蛍光誘導体を温度の関数としてプロットすることによって判定した。各ＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質を二通りに分析した。
【０２６２】
結果
２つのＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質における融解温度を下の表４−１にまとめる。両変異体は６７℃で転移ピークを有するが、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰＮ９２Ｄは、低温（５４℃）で追加的な幅広い転移ピークを呈し、これは構造的不安定性を示唆する（図２７）。
【０２６３】
【表１２】
2018522571.tif 000016
【０２６４】
データの概要および結論
Ｎ１０４ＤＧＩＴＲＬ  ＦＰタンパク質は、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ競合結合アッセイおよび一次Ｔ細胞再刺激アッセイにおいて野生型ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ対応物に等価な活性を示したが、これはＮ１０４がｈＧＩＴＲＬ  ＦＰの活性における主要な役割を果たさないことを示唆する。Ａｓｐに対するＡｓｎ１６１の突然変異は、Ｎ結合グリコシル化部位の除去を表し（実施例４におけるデータを参照）、この突然変異体（ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄ）はすべてのアッセイ（ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ競合結合、直接結合、レポーターおよび一次Ｔ細胞再刺激アッセイ）において活性を保持したが、これはＡｓｎ１６１、およびこの部位のグリカンがＧＩＴＲの結合およびアゴニズムなどの重要な機能に関与しないことを示唆する。
【０２６５】
Ｎ１２９Ａ突然変異体は、レポーターアッセイにおいてｈＧＩＴＲへの結合低下および活性低下を示したが、これはそれがｈＧＩＴＲへの結合とその後のｈＧＩＴＲのアゴニズムにおける役割を果たすことを示唆する。興味深いことに、この突然変異をＮ１６１Ｄ突然変異（単独で活性に影響しない）と組み合わせたとき、ＧＩＴＲの結合およびアゴニズムはさらに低下した。
【０２６６】
Ｎ９２Ｄ突然変異は、レポーターアッセイにて試験した時、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰの活性に影響するように思われなかったが、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ９２Ｄの活性低下が一次Ｔ細胞再刺激アッセイにおいて認められた。Ｎ９２Ｄ突然変異体の熱安定性を検討した時、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰと比べてより低い追加的な非常に幅広い融解温度転移ピークが認められ、これは（３７℃を含む）より低温での一部の構造的不安定性を示唆する。一次Ｔ細胞アッセイのより長い時間経過（４日）に起因して、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰＮ９２Ｄ分子が不安定化し、かつ折り畳まれず、このアッセイではレポーターアッセイ（３時間）と比べて活性の低下をもたらすことが予想され得る。したがって、Ａｓｎ９２のＡｓｐへの突然変異は、構造的安定性の観点で好ましくないように思われる。
【０２６７】
実施例５：グリコシル化されるｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ内部のアミノ酸残基の同定
ＧＩＴＲ結合ドメイン内部に２つの有望なＮ−グリコシル化コンセンサス部位（Ｎ１６１およびＮ１２９）が存在する。これらの部位、ならびにＦｃドメイン内部の基準のＮ−グリコシル化部位（ＩｇＧとの関連でのＮ２９７；成熟ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ配列内のＮ７８）でのグリカンの存在および構造を質量分析によって測定した。
【０２６８】
方法
組換えタンパク質の発現および精製
組換えｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびＮ１６１Ｄタンパク質を、親和性クロマトグラフィーとその後のサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、関連タンパク質をコードするベクターを一過性に遺伝子導入したＣＨＯ細胞の条件培地から精製した。
【０２６９】
トリプシンペプチドマッピング
ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄの試料を変性させ、還元し、還元したシステインをアルキル化した。次に、試料をトリプシンで消化した。３７℃で４時間後、消化物を酸の添加によりクエンチした。ペプチドをＵＰＬＣ上で逆相によって分離し、ＵＶ検出器および質量分析計を用いて測定した。得られたトリプシンペプチド配列を表５−１に提示する。
【０２７０】
結果：
【０２７１】
【表１３】
2018522571.tif 000017
【０２７２】
様々なｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ中に見出されるオリゴ糖構造のタイプの模式図を図２８に提示する。質量分析データを図２９Ａ、Ｂ、およびＣに提示する。
【０２７３】
結論
ＧＩＴＲＬおよびＦｃドメインにおけるＮ−グリコシル化部位の占有、ならびに各部位での主要なオリゴ糖の構造を判定するため、ペプチドマッピング分析を用いた。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔおよびｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄタンパク質の双方では、基準のＦｃ  Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ７８）がグリコシル化され、主要な炭水化物構造がＣＨＯ細胞内で発現されるＩｇＧ  Ｆｃ領域に典型的な中性の二分岐複合型オリゴ糖であった。ＧＩＴＲＬ  ＲＢＤ内部のＮ１２９のＮ−グリコシル化コンセンサス部位は、ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔまたはｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄのいずれかにおける任意のオリゴ糖構造で占有されなかった。ＧＩＴＲＬ  ＲＢＤ内部のＮ１６１のＮ−グリコシル化コンセンサス部位はｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  ｗｔ中で占有され、主要な炭水化物構造は中性の帯電した二分岐複合型オリゴ糖であることが見出された。ｈＧＩＴＲＬ  ＦＰ  Ｎ１６１Ｄタンパク質では、ペプチドマッピングにより、ＧＩＴＲＬ  ＲＢＤからＮ１６１Ｎ−グリコシル化コンセンサス部位を除去する、Ｎ１６１Ｄアミノ酸置換が確認された。予想通り、Ｎ−グリコシル化がＤ１６１で全く検出されなかった。
【０２７４】
実施例６：マウスモデルおよびＯＸ４０組み合わせ試験
ＧＩＴＲの標的化をより理解するため、マウスＧＩＴＲＬ−ＦＰの活性および薬力学的効果を、アゴニストのマウスＯＸ４０Ｌ  ＦＰを標的化するＯＸ４０の場合と比較した。
【０２７５】
材料および方法
ＮＦ−κＢレポーターアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ  ｍＧＩＴＲまたはヒトＯＸ４０  ＮＦκＢ細胞を、指定の通り、５０，０００個の細胞（Ｊｕｋａｔ  ｍＧＩＴＲ）または２００，０００個の細胞（ＪｕｒｋａｔヒトＯＸ４０）で、抗ＧＩＴＲ抗体ＤＴＡ−１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＮＩＰ  ｒＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａまたはプレートに固定化されたｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１もしくはアイソタイプ対照（タンパク質のＯＸ４０を介するシグナル伝達を不能にする（Ｙ１８２Ａ）位での単一アミノ酸突然変異を含む）と一緒に、９６ウェルプレート内、３７℃、５％ＣＯ２および８５％の湿度下で培養した。ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１を有するアッセイにおいて、ルシフェリン基質を含有する定常Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を５時間後または１６時間後にプレートに添加し、プレートをプレートシェーカー上、暗所で３０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、アッセイシグナルを検出した。
【０２７６】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
５μｇのタンパク質を、負荷緩衝液および還元剤と混合し、８０℃で１０分間変性させ、タンパク質分子量マーカー（Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍａｒｋｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と一緒に、４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）上に負荷した。タンパク質を２００Ｖで４５分間電気泳動し、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。
【０２７７】
マウスおよび腫瘍モデル
８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ  Ｌｔｄ．またはＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手した。ＰＢＳ中ＣＴ２６またはＢ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２細胞の５×１０６個の細胞／ｍＬまたは５×１０４個の細胞／ｍＬの細胞密度での懸濁液１００μＬを、各動物の右側腹部に皮下注射した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２細胞株にルシフェラーゼレポーターをＣＡＧプロモーターの制御下で組み込み、細胞を５０％ＰＢＳおよび５０％成長因子（還元）およびフェノールレッドフリーマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移植した。測定可能な腫瘍を腫瘍体積に基づいて無作為化した。各腫瘍の長さ（ｍｍ）および幅（ｍｍ）を電子ノギスで週３回測定した。腫瘍の体積（ｍｍ３）を、式（長さ［ｍｍ］×幅［ｍｍ］２）／２に基づいて計算した。腫瘍成長応答を、試験終了時に体積が２００ｍｍ３未満であるように測定可能な腫瘍が存在しないかまたは持続的な腫瘍成長阻害が認められる場合の応答として分類した。各スパイダープロット上に示される退縮の数は、移植された腫瘍の総数に対する割合である。同系腫瘍の移植後６日目、またはそれらが２００ｍｍ３の体積に達した時、マウスにｍＧＩＴＲＬ−ＦＰまたはｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰのいずれかを腹腔内投与した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２保有マウスにおける２５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの投与に限り、４用量に対して耐性を示した。
【０２７８】
フローサイトメトリー
腫瘍、脾臓または腫瘍流入リンパ節を切断し、氷上のＲＰＭＬ−１６４０培地中に置いた。組織を、各々を４０もしくは１００μｍのナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を通過させることにより脱凝集させ、細胞を遠心分離によってペレット化し、赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。室温で２分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁した。腫瘍組織試料を、穏やかなＭＡＣＳディソシエーターおよび腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて製造業者の使用説明書に従って処理した。
【０２７９】
試料を、生存度を意図して、ｌｉｖｅ  ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って染色し、次に蛍光色素結合抗体で染色する前に抗ＣＤ１６／３２（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロッキングした。ＣＤ４（Ｒｍ４．５）、ＦＯＸＰ３（ＦＪＫ−１６Ｓ）、Ｋｉ６７（Ｓｏｌ  Ａ１５）、ＩＣＯＳ（７Ｅ．１７Ｇ９）、Ｅｏｍｅｓ（Ｄａｎ１１ｍａｇ）、Ｔ−ｂｅｔ（Ａｐｒ−４６）およびＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）をｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＰＤ−１（２９Ｆ．１Ａ１２）、およびＯＸ４０（ＯＸ８６）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ＣＤ８（５３−６．７）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。細胞内抗原の染色においては、ＦＯＸＰ３染色キット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の使用説明書に従って用いた。Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いての試料の取得前に、試料を３．７％ホルマリンに固定した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。
【０２８０】
薬物動態モデリング
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５もしくは１５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａを１回投与した。１群あたりマウス３匹を治療から５分後、０．５、１、２、６、２４、７２、１４４、および２４０時間後に屠殺した。血清試料を収集し、存在する循環ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａのレベルを、捕獲と検出の双方として抗マウスＧＩＴＲＬ  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてのサンドイッチＥＬＩＳＡで評価した。
【０２８１】
２回投与群から得られる薬物動態（ＰＫ）データをプールし、同時に集団手法を用いてモデル化した。集団分析は、薬物統計学的ソフトウェアパッケージＮＯＮＭＥＭ（バージョン７．２，ＩＣＯＮ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｅｌｌｉｃｏｔｔ  Ｃｉｔｙ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて実施した。相互作用オプションを伴うＦＯＣＥ法を用いた。マウスＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ  ＰＫは、２区画モデルにより適切に特徴づけた。
【０２８２】
細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ−１７細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１１２６８）を、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ｖ／ｖ熱不活化ウシ胎仔血清（ＨＩ  ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ）および１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−１５２）を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ｖ／ｖＨＩ  ＦＢＳで維持した。Ｊｕｒｋａｔ  ｍＧＩＴＲ  ＮＦκＢ細胞を、１０％ＨＩ  ＦＢＳ、５μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０で維持した。
【０２８３】
細胞株の作製
Ｊｕｒｋａｔ  ｍＧＩＴＲ  ＮＦκＢ細胞株を、第３世代レンチウイルス系（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるレンチウイルス形質導入によって作製した。マウスＧＩＴＲ遺伝子（ＮＭ＿００９４００．２）をＣＡＧプロモーターの制御下でのピューロマイシン耐性遺伝子を有する発現プラスミドにクローン化した。ＮＦκＢレポーター発現プラスミドを、ブラストサイジン耐性遺伝子と一緒に、最小プロモーター下でのホタルルシフェラーゼレポーター（ｌｕｃ２，Ｐｒｏｍｅｇａ）の上流でＮＦκＢ応答要素の５つのコピーを発現するように設計した。各発現プラスミドを、パッケージングプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ−１７に同時導入した。ウイルス粒子を含有する上清を、遺伝子導入の４８時間後に収集し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を形質導入するために用いた。ウイルス形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を、形質導入の４８時間後から、選択抗生物質として５μｇ／ｍＬのブラストサイジンおよび５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加した培地で培養した。ＪｕｒｋａｔヒトＯＸ４０  ＮＦκＢ細胞株を、ヒトＯＸ４０を構成的に発現するように設計したレンチウイルスベクターを形質導入したことを除き、同様の手順を用いて作製した。マウスＯＸ４０ＬはヒトＯＸ４０に結合し、それ故、マウスＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の活性を評価するため、ヒトＯＸ４０を発現するＮＦκＢルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞株を用いることができる。
【０２８４】
ＥＬＩＳＡ
組換えマウスＧＩＴＲ−ＦｃおよびＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）糖タンパク質を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）上に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０１％ツイーン２０）で洗浄し、室温、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳで１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで再び洗浄した。アッセイ緩衝液［ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］で希釈した１μｇ／ｍＬのマウスＧＩＴＲＬまたはＯＸ４０Ｌ  ＦＰをウェルに２５μＬ添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。３回洗浄後、アッセイ緩衝液で希釈した１μｇ／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼに結合した抗マウスＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに２５μＬ添加し、プレートを１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、テトラメチルベンジジン基質溶液（ＫＰＬ）を各ウェルに２５μＬ添加し、プレートを５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．５Ｍの硫酸停止溶液をすべてのウェルに１５μＬ添加した。４５０ｎＭでの光学密度を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
【０２８５】
統計学
すべての統計学的分析は、Ｐｒｉｓｍ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン６を用いて実施した。
【０２８６】
結果
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰのインビトロ効力
インビボでの免疫細胞活性化および抗腫瘍活性に対するＧＩＴＲ受容体シグナル伝達の効果を検討するため、四量体ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰを作製した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、エフェクター細胞上のＧＩＴＲ受容体およびＦｃγＲへの貪欲な結合を誘導するように設計した。その分子は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結晶性断片（Ｆｃ）領域、イソロイシンジッパードメイン（ＩＬＺ）およびマウスＧＩＴＲリガンドの細胞外（ＧＩＴＲ結合）ドメイン（ＥＣＤ）からなるものであった（図３０Ａ）。変性した精製ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって可視化した時（図３０Ｂ）、それは高度な均一性および予想される分子量４８ｋＤａよりもやや高い分子量を示し、それはおそらくはＦｃおよびｍＧＩＴＲＬドメインのグリコシル化に起因する。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）の双方は、ＧＩＴＲ依存性ＮＦκＢレポーター遺伝子細胞アッセイにおいてＮＦ−κＢシグナル伝達を誘導することができた一方、マウスＯＸ４０Ｌ  ＦＰ  ｍＩｇＧ１（ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１）、およびアイソタイプ対照では任意の検出可能なシグナルが欠如していた（図３０Ｃ）。重要なことには、四量体ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、このアッセイにおけるＧＩＴＲアゴニズムに関連して０．０５ｎＭのＥＣ５０を示し、それは２．３１ｎＭのＥＣ５０を示したＤＴＡ−１よりも約５０倍強力であった。
【０２８７】
ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃで改変されたｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの抗腫瘍活性
以前の試験では、ＦｃγＲを活性化することがＤＴＡ−１抗体の抗腫瘍活性にとって必要であり、かつこの抗体の抗腫瘍活性が、それがｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃを有するとき、ｒＩｇＧ２ｂ  ＦｃまたはＮ２９７Ａ突然変異体Ｆｃ（ＦｃγＲへの結合が欠如する）と比べて増強されることが示されている。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの抗腫瘍活性に対するＦｃアイソタイプの影響を判定するため、ＣＴ２６腫瘍保有マウスを、ｍＩｇＧ２ａまたはｍＩｇＧ１  Ｆｃアイソタイプを有するｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで治療した。５もしくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかのアイソタイプでのマウスの治療により、腫瘍体積の減少によって明らかなように、生理食塩水で治療した対照と比べて著明な抗腫瘍活性が得られた（図３１Ａ）。しかし、抗腫瘍活性全体は、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａによる治療後、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１の場合（７／２０が全退縮、図３１Ａ）に対して増強した（１１／２０が全退縮）。
【０２８８】
Ｆｃ変異体の活性におけるこの差異がＴ細胞活性化とその後のＧＩＴＲアゴニズム下流での事象を媒介するその能力における差異に起因したか否かを判定するため、脾臓Ｔ細胞集団の増殖を、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−（エフェクターＴ細胞）、ＣＤ８＋（エフェクターＴ細胞）およびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋（Ｔ−ｒｅｇ）細胞でのＫｉ６７発現のフローサイトメトリー分析を用いて評価した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの両方のアイソタイプは、３つすべての脾臓Ｔ細胞サブセットの増殖において、生理食塩水対照と比べるときに同等の有意な増加を引き起こした（図３１Ｂ）。脾臓Ｔ−ｒｅｇ細胞集団は、治療後にＫｉ６７の最高の発現を呈し（ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ治療後に５３．９５％±０．７５、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１治療後に５８．４３％±１．２６）、それにＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−（ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１で９．５２％±０．５８、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１で１０．８９％±０．５６）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａで７．６０％±０．２７、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１で７．７９±０．４３）が続いた。このデータは、脾臓Ｔ細胞活性化単独がｍＧＩＴＲＬ−ＦＰのｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃアイソタイプの間で抗腫瘍免疫において認められた差異を説明することができないことを示唆した。
【０２８９】
次に、Ｔ細胞集団内での腫瘍内変化が、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰのｍＩｇＧ２ａ変異体対ｍＩｇＧ１変異体で認められる抗腫瘍活性の増強を説明し得るか否かについて検討した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａによるマウスの治療が、ｐ＜０．０００１の有意値で、腫瘍内Ｔ−ｒｅｇの頻度における生理食塩水治療動物での１３．３１％±１．０６から３．６０％±０．７９への有意な減少（図３１Ｃおよび図３２）と、それに続く対照治療動物と比べてのＣＤ８：Ｔ−ｒｅｇ（図３１Ｄ）比およびＣＤ４：Ｔ−ｒｅｇ（図３２Ｂ）比における増加を誘導した。それに対し、腫瘍内Ｔ−ｒｅｇにおける減少は、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰのｍＩｇＧ１  Ｆｃ変異体において明白でなかった（１２．９５％±１．３４）。また、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａでの治療後、腫瘍内ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−Ｔ細胞の割合における対照動物（１３．０１％±１．１２）と比べての有意な減少（８．６４％±１．２１）についての証拠があったが、これはＴ−ｒｅｇについて認められた場合の程度には至らなかった。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａによるＴ−ｒｅｇの優先的枯渇は、腫瘍内Ｔ−ｒｅｇに対するＧＩＴＲの高発現（図３１Ｅ）およびＣＴ２６腫瘍の腫瘍微小環境下での活性化ＦｃγＲの高発現に起因し得る可能性が高く、また抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）によるクリアランスを示唆する。まとめると、これらのデータは、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ治療後の最適な抗腫瘍活性において、腫瘍内Ｔ−ｒｅｇにおける減少と同時に生じる末梢ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が要求されることを示唆する。
【０２９０】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａに媒介される抗腫瘍活性
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａがｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１と比べて抗腫瘍活性の増強を誘導したことから、血液中のｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの曝露レベルおよび曝露時間がＣＴ２６腫瘍保有マウスにおける抗腫瘍応答にいかに関連するかを次に特徴づけた。第１に、１単回用量の生理食塩水対照または０．２、１、もしくは５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａでマウスを治療することによる、腫瘍成長に対する用量レベル増加の効果を測定した。０．２ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａによる治療の結果、わずか１／１０の完全退縮がもたらされたが、用量が０．２ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇに上昇した（各々、６／１０および９／１０の退縮をもたらした）時、抗腫瘍免疫における用量依存的増加における証拠が存在した（図３３Ａ）。さらに、抗腫瘍活性はまた、０．２ｍｇ／ｋｇ投与の頻度を毎日１回（Ｑ１Ｄ）または毎週１回（Ｑ１Ｗ）に増加させることにより改善することができた（図３３Ｂ）。これらの結果は、Ｑ１Ｄスケジュールを用いるときに限って到達される、完全腫瘍退縮および最小残留腫瘍体積によって規定されるような最適な抗腫瘍活性を誘導するのに必要とされるｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの要求される曝露レベルが存在することを示した。この閾値を判定するため、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの濃度を、２つの代替的な用量レベルのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで治療したマウスの血液中で測定し、次にこれらの結果をＰＫモデルに組み込んだ。このモデルに基づき、Ｑ１Ｄスケジュールによって持続される、また最適な抗腫瘍活性を維持するために必要と考えられるｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの血液濃度は１μｇ／ｍＬ以上であると計算された（図３３Ｃ）。
【０２９１】
次に、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ治療後、抗腫瘍活性のＰＤバイオマーカーを検討した。Ｋｉ６７の発現を用いて増殖を評価した一方、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１およびＯＸ４０（すべては活性化後にＴ細胞上に発現されることが知られている）についても分析した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの曝露を、用量レベルを増加させるかまたは投与頻度を増加させるかのいずれかによって増加させることにより、Ｋｉ６７、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１およびＯＸ４０を発現する末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度がさらに大幅に漸増した（図３４Ａ〜Ｄ）。
【０２９２】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ抗腫瘍活性の比較分析
ＯＸ４０標的化に対して、ＧＩＴＲの関連機構を理解するため、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの抗腫瘍活性を、類似のタンパク質構造を含み、ＧＩＴＲ受容体と交差反応せず、ＯＸ４０レポーター細胞アッセイにおいてＮＦκＢ発現を誘導することができるｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰと直接的に比較した（図３５ＡおよびＢ）。
【０２９３】
ＣＴ２６腫瘍保有マウスを、ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃアイソタイプのいずれかの５ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰまたはｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰで週２回治療し、腫瘍成長を測定した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで認められるように、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰで認められる抗腫瘍活性は、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプでの治療後（９／１０の退縮）、ｍＩｇＧ１での治療後（１／１０の退縮；図３６Ａ）よりも高まった。しかし、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１での治療（６／１０の退縮）は、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１での治療後に認められる場合と比べて増強された抗腫瘍活性を誘導し、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ（１０／１０）では、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａと比べてわずかに良好であった（図３６Ａ）。腫瘍内Ｔ−ｒｅｇにおける類似の枯渇が、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ（ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃアイソタイプを有する）の双方での治療後に認められたが、これはいずれの分子のｍＩｇＧ１  Ｆｃアイソタイプにおいて明白でなかった（図５Ｂ）。このデータは、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプが、ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおいてＧＩＴＲおよびＯＸ４０アゴニストの双方の抗腫瘍活性を誘導することにおいて、ｍＩｇＧ１よりも優れることを示す。
【０２９４】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１の組み合わせ試験
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａでの治療後におけるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０受容体の上方制御を仮定し（図３４Ｄ）、Ｔ細胞活性化を最大化する可能性についてさらに検討した。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１を用いて、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０経路を標的化する薬剤を組み合わせることの潜在的な利点を評価した。
【０２９５】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａおよびｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１の組み合わせによる隔週治療の結果、脾臓ＣＤ４＋（２９．１６％±１．５１）およびＣＤ８＋（２４．４％±０．８７）Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現が、生理食塩水対照（７．８２％±０．３０および９．２２％±０．３１）またはいずれかの単独療法での治療（ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで治療されたＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞において１４．２％±０．４５および１５．５２％±０．６６、またｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰで治療されたＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞において１７．０２％±０．４９および１６．２２％±１．２２；図３７Ａ）と比べて有意に増加したが、これは両分子を組み合わせた相加的効果を示す。脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団のさらなる分析によると、組み合わせ治療により、ＣＤ４４＋およびＣＤ６２ｌｏと定義されるＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターメモリー区画の双方の頻度（図３７Ｂ）、ならびにＣＤ４４＋およびＣＤ６２＋と定義されるＣＤ４＋セントラルメモリー集団の頻度（図３７Ｃ）が、単独療法治療の場合を超える程度に増加した。ＩＦＮｙの産生における冗長性およびＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞傷害性を示しており、ひいてはＴｈ１分化における役割を有する転写因子Ｔ−ｂｅｔ（図３７Ｄ）およびＥｏｍｅｓ（図３７Ｅ）のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上での発現もまた、組み合わせ治療中、いずれの単独療法の場合よりも大幅に増加した。ＧＩＴＲおよびＯＸ４０経路間の機構的差異は、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１で治療される動物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＴ−ｂｅｔおよびＥｏｍｅｓの発現が、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａで治療した動物と比べると有意に高いことであった。
【０２９６】
これらの知見に基づき、腫瘍成長に対してｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａをｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１と組み合わせる効果を判定した。次に、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１によるマウスの治療が、単回の亜最適用量のｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａと組み合わせることにより、さらに改善され得るか否かを検討した。ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１単独療法による治療により５／１０の退縮が誘導され、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａ単独療法治療により３／１０の退縮が誘導されたが、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａとｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１の双方を組み合わせた結果、８／１０の退縮を示す抗腫瘍活性の増強がもたらされた（図３８Ａ）。
【０２９７】
高用量のｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａでの単独療法治療により、ＣＴ２６モデルにおけるマウスの大部分で完全腫瘍退縮が誘導されたと仮定し、ｍＯＸ４０Ｌ−ＦＰ  ｍＩｇＧ１およびｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ｍＩｇＧ２ａの高用量での組み合わせを、Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ２モデルでの利益増加について検討した。いずれの単独療法での投与によっても、このモデルにおける腫瘍退縮が全く誘導されなかったが、両分子を組み合わせた結果、単独療法治療と比べて、改善された抗腫瘍活性；腫瘍成長における遅延および生存の増加がもたらされた（図３８Ｂおよび図３９）。
【０２９８】
実施例７：ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰと組み合わせたＴ細胞プライミング剤
材料および方法
細胞株および試薬
ＴＣ−１腫瘍株は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ６４７５，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンで維持した。ＣＴ２６腫瘍株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ＤＴＡ−１およびアイソタイプ抗体は、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）から購入した。
【０２９９】
Ｅ７  ＳＬＰおよびワクチン接種
４５−ｍｅｒのＨＰＶ１６−Ｅ７配列ＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号５７）からなるＥ７合成ロングペプチド（ＳＬＰ）を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）から合成した。Ｅ７  ＳＬＰを１０μｇもしくは３．３μｇで投与し、全体積５０μＬで、Ａｄｄａｖａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＰＢＳ中、２０μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ２３９５（ＴｒｉＬｉｎｋ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて製剤化した。ワクチン接種を、尾の付け根の背側表面皮下に施した。
【０３００】
腫瘍モデル
ＴＣ−１実験では、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（カタログ番号０００６６４）のマウスを用いた。ＣＴ２６実験では、Ｅｎｖｉｇｏ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から入手した雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いた。マウスは、腫瘍移植の時点で６〜８週齢の間であった。すべての動物実験は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって確立されたガイドラインに従って実行した。ＴＣ−１腫瘍移植においては、２×１０４個の生存可能ＴＣ−１細胞を左後足蹠に皮下移植した。ＣＴ２６腫瘍移植においては、５×１０５個の細胞を右側腹部に移植した。腫瘍成長は、ノギス１を用いる直接的測定により評価した。双方向的な測定結果を２〜４日ごとに収集し、腫瘍体積は体積＝（長さ・幅２）／２を用いて計算した。腫瘍を６〜１４日間発生させておき、次に腫瘍保有マウスを腫瘍体積により治療群に無作為化した。マウスは、ＩＡＣＵＣプロトコルに従い、原発性腫瘍がＴＣ−１／足蹠において１０００ｍｍ３、ＣＴ２６／側腹部において２０００ｍｍ３を超えたとき、安楽死させた。ＰＤ試験においては、マウスを安楽死させ、腫瘍および脾臓を収集し、７０ｕＭのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して粉砕し、単一の細胞懸濁液に処理した。
【０３０１】
機能的Ｔ細胞応答およびフローサイトメトリー
抗原特異的刺激のため、１〜２×１０６個の生細胞に、１ウェルあたり１ｕｇのＡＨ１ペプチド配列ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号５６）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）または１０ｕｇのＥ７ペプチド配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号５８）（Ａｎａｓｐｅｃ）およびタンパク質輸送阻害剤（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を蒔いた。５時間後、細胞を染色した。すべての染色における染色の順序は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）、細胞外タンパク質、ＦＯＸＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、それに続いて細胞内サイトカインであった。抗体は、ＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）、ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）ＣＤ８（クローン５３−６．７）、ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ−１）、ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２）、ＴＮＦα（クローンＭＰ６−ＸＴ２２）、ＦＯＸＰ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ）、ＫＩ−６７（クローンＳｏｌＡ１５）を含んだ。ＲＡＨＹＮＩＶＴＦを負荷したＨ２−Ｄｂ  Ｅ７デキストラマーをＩｍｍｕｄｅｘ（Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ）から購入し、我々は染色についてのそのプロトコルに従った。すべての試料は、ＬＳＲ−ＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のいずれかで走らせた。すべてのデータは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。
【０３０２】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは抗原特異的な細胞を必要とする
ＣＴ２６は、高い腫瘍内ＣＤ４５レベルおよび基礎ＣＴＬレベルを有する高免疫原性腫瘍モデルである。ＣＴ２６は、低レベルのＡＨ１特異的Ｔ細胞を自己刺激することが示されている。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰが抗原特異的応答の新規な生成をもたらし得るか否かを評価するため、Ｅ６／Ｅ７形質転換ＴＣ−１腫瘍モデルを用いた。このモデルは、公知のＣＤ８Ｔ細胞エピトープを有し、そのＥ７特異的免疫応答は、Ｅ７を有する腫瘍からの保護をもたらし得る。ＴＣ−１腫瘍細胞をＣ５７／ｂ６マウスの足蹠に移植した。マウスは、１４日目に測定し、腫瘍サイズに基づいて無作為化し、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療した（図４３Ａ）。腫瘍成長の遅延または阻害が任意の試験用量で認められた（図４３Ｂ）。２４日目、非治療および１ｍｇ／ｋｇ治療マウスのサブセットを屠殺し、脾臓および腫瘍を収集した。Ｔ細胞集団およびＥ７抗原特異的応答を評価した。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上に認められたＧＩＴＲレベルは、腫瘍内で有意に高めであった（図４３Ｃ）。Ｅ７予備刺激を伴わない場合、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、ＴＣ−１腫瘍成長を遅延させるかまたは抗腫瘍免疫応答を生成することができなかった。
【０３０３】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは予備刺激された抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を拡大する
ＤＮＡワクチンの接種は、ＴＣ−１腫瘍モデルの腫瘍成長の阻止および阻害をもたらすＥ７特異的応答の生成において有効であることが示されている。この試験では、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰが抗腫瘍応答を駆動するのに予備刺激された抗原特異的Ｔ細胞を必要とし得ることが仮定された。この応答を生成するため、ナイーブＣ５７／ｂ６マウスの尾の付け根に、ＣｐＧ（ａｄｄａｖａｘ）を有するＥ７合成ロングペプチド（ＳＬＰ）を１０ｕｇでワクチン接種した。この期間中、マウスを３用量のｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａで治療した。７日後、脾細胞を採取し、Ｔ細胞のＥ７デキストラマーとの抗原特異性について評価した（図４４Ａ）。ＣＤ４およびＣＤ８の百分率における差は認められなかったが、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰで治療した時、抗原特異的細胞における大幅な増加が認められた（図４４Ｂ〜Ｄ）。加えて、ワクチン接種マウス単独に対するＧＩＴＲレベルを評価し、抗原特異的Ｄｅｘ＋細胞は、Ｄｅｘ−ＣＤ８Ｔ細胞よりも高いＧＩＴＲ  ＭＦＩを有した（図４４Ｅ〜Ｆ）。ＧＩＴＲレベルが腫瘍微小環境下で最高であるように思われたことから、この差が腫瘍を有するマウスにおいてさらに高めであることが仮定された。Ｃ５７／ｂ６マウスに、ＴＣ−１腫瘍を移植し、Ｅ７  ＳＬＰ／ＣｐＧ（Ａｄｄａｖａｘ）をワクチン接種した（図４４Ｇ）。抗原特異的Ｅ７細胞の予備刺激が、双方の脾臓および腫瘍におけるデキストラマーによる測定として認められた（図４４Ｈ〜Ｉ）。デキストラマーで陽性染色した細胞もまた、脾臓および腫瘍の双方におけるＧＩＴＲについて高めであった（図４４Ｊ〜Ｋ）。Ｅ７  ＳＬＰは、腫瘍の存在の有無にかかわらず、Ｅ７特異的応答を高度に予備刺激することができ、予備刺激した抗原特異的細胞は、他のＣＤ８Ｔ細胞よりも高レベルのＧＩＴＲを発現した。
【０３０４】
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、Ｅ７  ＳＬＰにより予備刺激された抗原特異的細胞を拡大し、ＴＣ−１腫瘍に対する防御免疫応答を生成し得る
ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰがＴＣ−１腫瘍細胞に対するＥ７特異的応答を拡大できたか否かを評価するため、１４日目、ＴＣ−１腫瘍細胞を足蹠に移植し、マウスを腫瘍体積により無作為化した。尾の付け根に４用量でのｍＧＩＴＲＬ−ＦＰ  ＩｇＧ２ａとともにＣｐＧ（Ａｄｄａｖａｘ）を加えた単回用量のＥ７  ＳＬＰの投与がワクチン接種日に開始した（図４５Ａ）。試験に、ＴＧＩ（腫瘍成長阻害）群（ｎ＝１０）およびＰＤ（薬力学）群（ｎ＝５）の２つのアームを含めた。対照マウスの腫瘍は迅速に成長し、すべてのマウスが死亡し、中央値生存は２７日であった。Ｅ７  ＳＬＰ単独は、ＴＣ−１腫瘍を有するマウスに生存上の利点を提供し、８５日目に１０匹中１匹のマウスが生存し、腫瘍を含まず、中央値生存は４６．５日であった（図４５Ｂ）。Ｅ７  ＳＬＰ＋ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、腫瘍成長を有意に遅延させ、８５日目に３／１０のマウスが腫瘍を含まず、５／１０が生存し、中央値生存は８０．５日であった（図４５Ｃ〜Ｄ）。ワクチン接種単独は、腫瘍進行に遅延をもたらしたが、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰを最上部に添加することで進行がさらに遅延した。これは腫瘍特異的ＣＤ８の選択拡大が理由で生じると仮定された。２１日目、ＰＤマウス群を屠殺し、薬力学分析用に脾臓および腫瘍を採取した。足蹠からの腫瘍を、採取した組織量に応じてプールした（図４５Ｅ）。単独またはｍＧＩＴＲＬ−ＦＰとの組み合わせでのワクチン接種の結果、腫瘍内にＣＤ４５＋細胞が有意に増加した（図４５Ｆ）。抗原特異的機能を評価するため、腫瘍または脾臓の単一の細胞懸濁液を１ｕｇ／ｍＬのＥ７ペプチドで再刺激した。ワクチン接種は抗原特異的細胞における基礎増加をもたらし、ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰの添加により、これが脾臓および腫瘍の双方においてより高レベルにさらにブーストされた（図４５Ｇ）。ｍＧＩＴＲＬ−ＦＰは、Ｅ７  ＳＬＰワクチンの存在時、脾臓におけるＴｒｅｇを枯渇させないように思われ、腫瘍におけるＴｒｅｇに限って枯渇させることができた（図４５Ｇ）。
【０３０５】
実施例８：ヌクレオチドおよびタンパク質配列
本願で開示されるヌクレオチドおよびタンパク質配列の注釈付きバージョンを表６−１に提示する。
【０３０６】
【表１４】
2018522571.tif 000018
【０３０７】
【表１５】
2018522571.tif 000019
【０３０８】
【表１６】
2018522571.tif 000020
【０３０９】
【表１７】
2018522571.tif 000021
【０３１０】
【表１８】
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【０３１１】
【表１９】
2018522571.tif 000023
【０３１２】
【表２０】
2018522571.tif 000024
【０３１３】
【表２１】
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【０３１４】
【表２２】
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【０３１５】
【表２３】
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【０３１６】
【表２４】
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【０３１７】
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれかによって制限されるべきではなく、あくまで以下の特許請求の範囲およびその均等物に従って定義されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
2018522571.tif 000056
【図２５Ｂ−Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
2018522571.tif 000063
【図２９Ｂ】
2018522571.tif 000064
【図２９Ｃ】
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【図３０】
2018522571.tif 000066
【図３１Ａ−Ｃ】
2018522571.tif 000067
【図３１Ｄ−Ｅ】
2018522571.tif 000068
【図３２】
2018522571.tif 000069
【図３３Ａ−Ｂ】
2018522571.tif 000070
【図３３Ｃ】
2018522571.tif 000071
【図３４】
2018522571.tif 000072
【図３５】
2018522571.tif 000073
【図３６Ａ】
2018522571.tif 000074
【図３６Ｂ】
2018522571.tif 000075
【図３７】
2018522571.tif 000076
【図３８】
2018522571.tif 000077
【図３９】
2018522571.tif 000078
【図４０Ａ−Ｂ】
2018522571.tif 000079
【図４０Ｃ−Ｅ】
2018522571.tif 000080
【図４０Ｆ−Ｇ】
2018522571.tif 000081
【図４１Ａ−Ｃ】
2018522571.tif 000082
【図４１Ｄ−Ｈ】
2018522571.tif 000083
【図４２Ａ−Ｂ】
2018522571.tif 000084
【図４２Ｃ】
2018522571.tif 000085
【図４３】
2018522571.tif 000086
【図４４Ａ−Ｃ】
2018522571.tif 000087
【図４４Ｄ−Ｆ】
2018522571.tif 000088
【図４４Ｇ−Ｉ】
2018522571.tif 000089
【図４４Ｊ−Ｋ】
2018522571.tif 000090
【図４５Ａ−Ｃ】
2018522571.tif 000091
【図４５Ｄ−Ｆ】
2018522571.tif 000092
【図４５Ｇ】
2018522571.tif 000093
【配列表】
2018522571000001.app
【国際調査報告】
2018522571.tif 000094
2018522571.tif 000095
2018522571.tif 000096
2018522571.tif 000097