(57)【要約】  分子で機能化された窒化金属表面であって、各分子が、少なくとも１つの結合基と抗菌部分とを含む窒化金属表面が提供される。分子は、当該分子の結合基と、窒化金属表面内の窒素原子との間の共有結合性相互作用のみによって表面に固定化される。機能化された窒化表面を含む物品は、頻繁に触られる表面上の微生物の増殖を抑制または低減する用途を見出される。機能化された窒化表面を製造する方法は、窒化金属表面を分子に接触させ、前記分子の結合基と、前記表面の窒素原子との間に共有結合を形成させ、これによって前記分子を前記金属表面に固定化させることを含む。
2018525521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を用いて機能化された窒化金属表面であって、
各分子は、少なくとも１つの結合基と、抗菌部分とを含み、
全ての前記分子は、当該分子の前記結合基と、前記窒化金属表面内の窒素原子との間の共有結合性相互作用のみによって前記表面上に固定化されていることを特徴とする窒化金属表面。
【請求項２】
前記結合基は、カルボキシル基であることを特徴とする請求項１に記載の窒化金属表面。
【請求項３】
前記分子の少なくともいくつかは、前記抗菌部分からなることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の窒化金属表面。
【請求項４】
前記各分子は、第１抗菌部分と、第２部分とを含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の窒化金属表面。
【請求項５】
前記第２部分は、前記金属表面と前記第１抗菌部分との間のスペーサとして機能することを特徴とする請求項４に記載の窒化金属表面。
【請求項６】
前記抗菌部分は、抗菌物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項７】
前記分子、またはその抗菌部分は、ペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項８】
前記ペプチド、またはその抗菌部分は、デフェンシンに由来することを特徴とする請求項７に記載の窒化金属表面。
【請求項９】
前記ペプチド、またはその抗菌部分は、デフェンシンペプチド配列、もしくはその断片もしくは変異体を含むか、または当該デフェンシンペプチド配列、もしくはその断片もしくは変異体からなることを特徴とする請求項７または請求項８に記載の窒化金属表面。
【請求項１０】
前記ペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸を有することを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項１１】
前記ペプチドは、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも３個のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項１２】
前記ペプチドは、以下の配列：ＲＲＹＩＧＲＧＹＩＲＲ、ＲＬＹＬＲＩＧＲＲ、ＣＲＶＲＧＧＲＣＡ、ＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧ、ＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧ、またはＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧのいずれか１つを含むか、または前記配列のいずれか１つからなることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項１３】
前記金属は、鉄、鋼、チタニウム、アルミニウム、クロミウム、もしくはモリブデン、またはそれらの合金である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項１４】
前記表面は、異なる抗菌部分を有する２以上の異なる分子で機能化されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の窒化金属表面。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の窒化金属表面を含むことを特徴とする物品。
【請求項１６】
前記窒化金属表面は、前記物品の表面の一部または全体を構成することを特徴とする請求項１５に記載の物品。
【請求項１７】
前記物品は、調理台、イス、机、テーブル、ドア、取っ手、手すり、キーパッド、もしくは医療器具であるか、またはその一部を形成することを特徴とする請求項１５または請求項１６に記載の物品。
【請求項１８】
前記分子の前記結合基と前記表面中の前記窒素原子との間に共有結合を形成するように、窒化金属表面を分子に接触させ、それによって、前記金属表面上に前記分子を固定化することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の窒化金属表面を作製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能化表面、特に、共有結合性相互作用のみによってその上に固定化された、ペプチドを含む分子を有する金属表面に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者１１人におよそ１人の割合で、イギリス国家健康保障制度（ＮＨＳ）病院にいる時はいつでも、院内感染する。これは、ＮＨＳに毎年数億ポンドの負担をかけている。今後病院内感染の拡大を減らしていくことが、ＮＨＳにとっては鍵となる優先事項である。
【０００３】
微生物は、ドアの取っ手、電話、キーボード、蛇口、プラスチック、手術着およびエプロンなどの織物など、これらに限定されない多数の表面を汚染することが示されている。さらに、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）に罹患した患者に直接接触した看護婦の６５％が衣類を汚染されたことが示されている。感染した患者に直接接触しなかったが、病院内の表面に接触した職員の４２％も衣類を汚染されている。このことは、感染を拡大し得るのは、人同士の伝染のみならず、無生物物体でもあり得ることを実証している。
【０００４】
多数の微生物が、表面のコロニーを形成した後、かなりの時間にわたって生存することが示されている。ＭＲＳＡのいくつかの株は、乾燥後９週間まで生存することが見出され、パラインフルエンザウイルスは、非吸収性表面上で１０時間、吸収性表面上で４時間まで持ちこたえていることが示されている。これらの比較的長い生存率は、それらが他の患者に感染することがあり得る期間を延ばすことによって、微生物の感染能力を高めることになる。
【０００５】
イギリスの病院では手洗いの手順を実行しているにもかかわらず、感染は、依然として拡大可能となっている。このことは、手順自体の順守が多様であるか、または手順が実際的ではないかが原因であり得る。なぜなら、職員は、流しに到達し手を洗うことができるようになる前に、多数の表面に接触するからである。このことは、職員および患者の両者からの表面汚染を可能にし、再感染する前に自分の手を洗浄する者にとっては、しばらくの間だけ汚染から救済されているにすぎない。また、衣類も汚染され得るものであり、微生物の蔓延にとっての別の経路を提供することになる。
【０００６】
表面の洗浄は、感染の拡大を低下させることが示されているが、再コロニー化を防止しない。さらに、最初の洗浄工程が、全ての微生物を徐菌するわけではない。たとえば、ＭＲＳＡは、洗浄後も生存していることが知られている。また、可視洗浄度は、微生物汚染のレベルに必ずしも相関せず、さらなる微生物試験を実施することなく、表面が正確に洗浄されたか否かを評価することを困難にしている。許容可能な表面微生物量についての基準は、合意を得ておらず、感染量は、患者間および各研究間で大きく異なり、どの程度、そしていつ洗浄を実施しなければならないのかを評価することを困難にしている。
【０００７】
表面が、個体間における感染病原体の移動に重要な役割を果たしていることは明らかである。現在の洗浄工程は、一時的であり、非効率的である。改良された長期間の抗菌管理が必要とされている。医療の場におけるだけではなく、公共施設、営業所、住宅、公共輸送機関、農場、および食品製造に関連する領域などの多くの他の環境においても、感染病原体の拡大は重要である。
【０００８】
環境の、特に、表面の抗菌管理のための改良されたメカニズムが明らかに必要とされている。
【０００９】
本発明は、これらの問題を念頭に考え出されている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１態様によれば、分子を用いて機能化された窒化金属表面であって、各分子は、少なくとも１つの結合基と抗菌部分とを含み、全ての分子が、分子の結合基と、窒化金属表面内の窒素原子との間の共有結合性相互作用のみによって表面に固定化されている、窒化金属表面が提供される。
【００１１】
金属表面上の固定化分子への共有結合性相互作用の使用は、有利である。なぜなら、共有結合性相互作用は、分子を表面に対して強く結合させ、それによってそれらの解放を防止または減少させるからである。
【００１２】
結合基は、金属表面内の窒素原子と共有結合を形成することができる官能基を含む、または当該官能基からなる。官能基は、カルボキシル基、アミン、イミン、チオアミド、またはエナミンであってもよく、これらに限定される必要はない。いくつかの実施形態において、結合基は、カルボキシル基を含むか、またはカルボキシル基からなる。そのような実施形態において、共有結合性相互作用は、各分子のカルボキシル基と金属表面の窒素原子との間に形成されたアミド結合である。
【００１３】
したがって、窒化金属表面の使用は、リンカ、または金属表面の追加の機能化の必要なしに、分子を金属表面に直接に結合させることを可能にする。窒化金属表面は、多数の分子を用いて機能化されてもよい。
【００１４】
試験者は、これまでも共有結合性相互作用を用いて金属表面に分子を結合させることができたが、これはポリマーまたは樹脂を用いて金属を被覆し、分子を当該被覆に付加させることによるものであった。しかし、ポリマーを用いる金属表面の被覆は、金属に非常に様々な物質特性をもたらし、表面に耐久性が大幅に減少した材料をもたらす。
【００１５】
また、共有結合を介して分子に直接結合することを可能にするために、窒化金属表面の使用は、有利である。なぜなら、表面における窒素原子の存在は、金属の浸食耐性を増加させるからである。
【００１６】
機能性を表面に与えるための分子の付加は、たとえば、汚染の検出、または環境管理などの検出などの分野においても望まれている。
【００１７】
分子は、抗菌活性を有する全ての分子であってもよい。分子またはその抗菌部分は、抗菌活性、抗ウイルス活性、および／または抗真菌活性を有してもよい。いくつかの実施形態において、分子またはその抗菌部分は、抗生物質である。分子またはその抗菌部分は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、またはその両方に対して静菌作用または殺菌効果を有してもよい。いくつかの実施形態において、分子またはその抗菌部分は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ）などの、ヒトまたは動物の病原体に対して有効である。
【００１８】
金属表面とともに共有結合を形成する結合基は、抗菌部分の一部を形成してもよく、抗菌部分から離れていてもよい。共有結合を形成する結合基が抗菌部分の一部である実施形態において、抗菌部分は、金属表面に直接結合することが理解されるであろう。言い換えれば、金属表面と抗菌部分との間にスペーサは存在しない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、分子のいくつかは、または分子のすべては、抗菌部分からなる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、各分子は、第１抗菌部分と第２部分とを含む。第２部分は、非抗菌性であってもよい。
【００２１】
第２部分は、任意の所望の機能を有してもよい。たとえば、第２部分は、たとえば流体システムにおいて、汚染の検出のための１以上の触媒基を含んでもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第２部分は、金属表面と第１抗菌部分との間のスペーサとして機能する。スペーサは、第１抗菌部分が自由に動くことを可能にし、分子が表面に結合したとき立体障害を減少させることができる。スペーサは、たとえば、１〜１００原子、２〜５０原子、または５〜２０原子の任意の所望の寸法または長さを有してもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態において、分子またはその抗菌部分は、ペプチドである。したがって、一実施形態において、本発明は、ペプチドを用いて機能化された窒化金属表面であって、全てのペプチドが、ペプチドの結合基と、金属表面内の窒素部位との間の共有結合性相互作用のみによって表面上に固定化される窒化金属表面を提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端カルボキシル基と金属表面内の窒素部位との間の共有結合性相互作用のみによって表面に固定化される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、各ペプチドは、第１抗菌部分と、第２部分とを含む。第２部分は、非抗菌性であってもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、第２部分は、当該第２部分が金属表面と第１抗菌部分との間のスペーサとして機能するように、ペプチドのＣ末端を形成する。スペーサは、任意の所望の長さ、たとえば、１〜５０個、２〜２０個、または５〜１０個のアミノ酸の長さであってもよい。スペーサは、有利には、第１部分が自由に動き、ペプチドが表面に結合したときに立体障害を減少させてもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、分子、ペプチド、またはその抗菌部分は、検出可能な標識を含むか、または当該標識を付されてもよい。任意の好適な検出可能な標識を使用することができる。検出可能な標識は、たとえば、蛍光標識またはＵＶ可視標識であってもよい。好適な蛍光標識は、ＦＩＴＣおよびローダミンを含む。好都合なＵＶ可視標識は、ペプチド鎖に組み込むことができるトリプトファンである。より多くのトリプトファンが鎖中に存在すればするほど、読み取りが強くなる。検出可能な標識を組み込むための他の手段は、当業者に周知であろう。検出可能な標識は、表面上の分子またはペプチドの存在が検出可能であることによって便利な手段を提供する。このことは、たとえば、分子が製造工程の間に表面に十分に固定化されたことを確かめるために、品質管理に使用することができる。また、固定化分子の存在は、表面がその抗菌活性を保持しているか否かを示すために、表面を含む物品の耐用期間の間に調べることができる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、分子、ペプチド、またはその抗菌部分は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および／またはＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して、１０ｍｇ／ｍｌ以下、５ｍｇ／ｍｌ以下、２．５ｍｇ／ｍｌ以下、１．２５ｍｇ／ｍｌ以下、１．０ｍｇ／ｍｌ以下、または０．５ｍｇ／ｍｌ以下の最少抑制濃度を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ペプチド（またはその抗菌部分）は、デフェンシンに由来する。
【００２９】
デフェンシンは、上皮細胞および免疫細胞によって発現される小さなペプチドであり、多くのグラム陽性菌およびグラム陰性菌、真菌およびウイルスに対する抗菌活性を示す。デフェンシンは、アルファ、ベータ、またはガンマデフェンシンであってもよい。「由来する」によって、ペプチド、またはその抗菌部分は、デフェンシンのアミノ酸配列の一部または全部を含んでもよいことが理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態において、ペプチド、またはその抗菌部分は、デフェンシンペプチド配列、または機能的変異体もしくはその断片を含むか、デフェンシンペプチド配列、または機能的変異体もしくはその断片からなる。
【００３０】
デフェンシンペプチド配列の「変異体」との用語は、ペプチドまたはその抗菌部分が、デフェンシンペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むか、または当該配列からなることを意味することが理解されるであろう。
【００３１】
「断片」との用語は、ペプチド、またはその抗菌部分が、デフェンシンペプチドの一部を含むか、またはデフェンシンペプチドの一部からなることを意味することが理解されるであろう。断片は、デフェンシンペプチド全体の、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であってもよい。断片は、デフェンシンペプチドのＣ末端、またはＮ末端を含んでもよく、どちらの末端も含まなくてもよい。
【００３２】
「機能的」によって、変異体または断片は、それが由来するデフェンシン配列の抗菌活性の少なくともいくらかを保持していることが理解されるであろう。抗菌活性を依然として示す、変異体または断片を提供するために、デフェンシンペプチド配列の１個以上のアミノ酸を除去、付加、または置換してもよい。加えて、変異体または断片は、その親配列に比べて向上した抗菌活性を有してもよい。当業者は、どのように公知のデフェンシン配列の断片および変異体を製造し、標準的な技術を用いてそれらの抗菌特性を試験するかを知っているであろう。当業者は、ClustalW（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）などの周知の配列位置合わせツールを用いて、２つのアミノ酸配列の間の同一性の割合をどのように計算することができるか知っているであろう。
【００３３】
ペプチドまたはその抗菌部分は、５〜４０個のアミノ酸の長さであってもよい。いくつかの実施形態において、ペプチド（またはその抗菌部分）は、少なくとも６個、少なくとも８個、または少なくとも１０個のアミノ酸（残基）を有する。いくつかの実施形態において、ペプチド、またはその抗菌部分は、３０個未満、２０個未満、１５個未満、または１２個未満のアミノ酸を有する。
【００３４】
ペプチドなどの抗菌分子は、当該技術分野で公知である。当業者は、本発明の分子（またはその抗菌部分）として、任意の公知の抗菌分子を採用してもよい。しかし、本発明者らは、１以上の以下の特性を組み込んだペプチドが有用であることを見出した。
【００３５】
ペプチドまたはその抗菌部分は、正に帯電した側鎖を有する、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個のアミノ酸を含んでもよい。正に帯電した側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。正に帯電したアミノ酸は、連続して配列されてもよく、またはそれらは、１以上の残基によってお互いに離れていてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、細菌細胞膜と正電荷と間の結びつきは、孔を形成させ、細胞死を誘導すると考えられる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ペプチド、またはその抗菌部分は、少なくとも３個、または少なくとも４個のアルギニン残基を含む。アルギニン残基は、連続して配置されてもよく、または１個以上の残基によってお互いに離されてもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ペプチド、またはその抗菌部分は、５個以上の連続的なアルギニン残基の少なくとも１つの配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、１個以上の疎水性および中性アミノ酸残基を含む。疎水性および中性残基の包含は、広いスペクトラム活性をもたらすと考えられる。ペプチドまたはその抗菌部分は、１〜２０個、２〜１０個、または３〜６個の疎水性アミノ酸を含んでもよい。「疎水性および中性アミノ酸」によって、我々は、アルギニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、またはバリン（Ｖ）を表す。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、１個以上の疎水性アミノ酸残基を含む。ペプチドまたはその抗菌部分は、１〜２０個、２〜１０個、または３〜６個の疎水性アミノ酸を含んでもよい。「疎水性アミノ酸」によって、我々は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、またはグルタミン酸（Ｅ）を表す。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、少なくとも３個の正に帯電したアミノ酸と、少なくとも１個の疎水性アミノ酸と、任意に、少なくとも１個の親水性アミノ酸とを含む。さらなるいくつかの実施形態において、少なくとも２個の正に帯電したアミノ酸は、１個以上の疎水性および／または親水性残基によってお互いに離れている。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、Ａ（ｘ）Ｂ（ｙ）Ａ（ｘ）Ｂ（ｙ）の式を有する配列を含むか、または当該配列からなり、
Ａは、正に帯電したアミノ酸であり、
Ｂは、疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸であり、
ｘは、１〜１０の数字であり、
ｙは、１〜１０の数字である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、Ａ（ｘ）Ｚ（ｗ）Ｂ（ｙ）Ｚ（ｗ）Ａ（ｘ）Ｚ（ｗ）Ｂ（ｙ）Ｚ（ｗ）Ａ（ｘ）の式、またはＡ（ｘ）Ｂ（ｙ）Ｚ（ｗ）Ｂ（ｙ）Ａ（ｘ）Ｂ（ｙ）Ｚ（ｗ）Ｂ（ｙ）Ａ（ｘ）の式を有する配列を含み、
Ａは、正に帯電したアミノ酸であり、
Ｂは、疎水性アミノ酸であり、
Ｃは、親水性アミノ酸であり、
ｘは、１〜６の数字であり、
ｙは、１〜６の数字であり、
ｚは、１〜６の数字である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＲＲＹＩＧＲＧＹＩＲＲ（配列番号１）を含むか、または当該配列からなる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＲＬＹＬＲＩＧＲＲ（配列番号２）を含むか、または当該配列からなる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＣＲＶＲＧＧＲＣＡ（配列番号３）を含むか、または当該配列からなる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＲＲＲＲＲＲ（配列番号４）を含むか、または当該配列からなる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧ（配列番号５）を含むか、または当該配列からなる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧ（配列番号６）を含むか、または当該配列からなる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、配列ＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧ（配列番号７）を含むか、または当該配列からなる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、末端システイン残基を含む。さらなる実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分の配列は、各末端にシステイン残基を有する。たとえば、配列ＲＬＹＬＲＩＧＲＲ（配列番号２）は、配列ＣＲＬＹＬＲＩＧＲＲＣ（配列番号８）をもたらすために、末端システイン残基の包含によって修飾されてもよい。インシリコ試験は、システイン残基の包含が、環境に依存して、ジスルフィド結合の形成によって、抗菌部分を可逆的に環化可能にし得ることを示唆した。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、ペプチドまたはその抗菌部分の三次構造が、その抗菌活性に影響を与え得ると推測する。抗菌部分における三次元構造と正電荷との組み合わせは、ペプチドなどの分子の効力を向上させることに役立つ。
【００５１】
したがって、いくつかの実施形態において、ペプチド、またはその抗菌部分は、式ＣＡ（ｘ）Ｂ（ｙ）Ａ（ｘ）Ｂ（ｙ）Ｃを含むか、または当該式からなり、
Ａは、正に帯電したアミノ酸であり、
Ｂは、疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸であり、
ｘは、１〜１０の数字であり、
ｙは、１〜１０の数字であり、
Ｃは、システイン残基である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはその抗菌部分は、ＣＲＬＹＬＲＩＧＲＲＣ（配列番号８）、ＣＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＣ（配列番号９）、ＣＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＣ（配列番号１０）、ＣＲＶＲＧＧＲＣＡＣ（配列番号１１）、ＣＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号１２）、ＣＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧＣ（配列番号１３）、もしくはＣＲＲＹＩＧＲＧＹＩＲＲＣ（配列番号１４）を含むか、またはＣＲＬＹＬＲＩＧＲＲＣ（配列番号８）、ＣＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＣ（配列番号９）、ＣＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＣ（配列番号１０）、ＣＲＶＲＧＧＲＣＡＣ（配列番号１１）、ＣＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号１２）、ＣＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧＫＫＫＫＫＫＧＡＬＡＧＣ（配列番号１３）、もしくはＣＲＲＹＩＧＲＧＹＩＲＲＣ（配列番号１４）からなる。
【００５３】
これらの配列は、「合成デフェンシン」であると考えられてもよい。なぜなら、これらは、天然に生じたデフェンシンと同様の構造および機能を有するからである。
【００５４】
本明細書において使用されるように、「窒化金属表面」は、窒素を金属表面に分散させる工程で処理された金属表面を意味すると理解されるであろう。工程は、窒化処理、炭窒化処理（軟窒化処理など）、浸炭窒化、および／または酸炭窒化（軟酸窒化など）を含んでもよい。これらの技術は、当業者によく知られている。これらの工程は、通常、肌焼き表面を作製するために使用される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、金属表面における窒素の深さは、少なくとも０．０５，０．１０，０．１５，０．２０，または０．２５ｍｍである。いくつかの実施形態において、深さは、０．３０ｍｍ以下である。他の実施形態において、深さは、０．２５ｍｍ以下である。別の実施形態において、深さは、０．２０ｍｍ以下である。当業者は、窒素の深さを測定するための方法を知っているであろう。
【００５６】
当業者は、非窒化金属表面と窒化金属表面とを視覚的に識別することができるであろう。当業者は、代替的に、または付加的に、表面が窒化されたか否かを測定するために任意の公知の方法を採用してもよい。たとえば、窒化金属表面は、金属の硬化試験によって確認されてもよく、限定されないが、ビッカース硬さ試験、ヌープ硬さ試験、またはリーブリバウンド硬さ試験などの試験を用いることによって確認されてもよい。代替的に、または付加的に、当業者は、金属表面が、ＥＤＸおよびＸ線回折法、電気化学的分極法および電気化学的インピーダンス分光法の少なくとも１つを用いることによって窒化されることを確認してもよい。
【００５７】
窒化金属表面は、任意の金属から形成されてもよい。金属は、表面の使用目的に従って選択されてもよいことが理解されるであろう。
【００５８】
いくつかの実施形態において、金属は、鉄、鋼（たとえば、ステンレス鋼）、チタニウム、アルミニウム、クロミウム、銅、銀、もしくはモリブデン、またはその合金である。いくつかの特別な実施形態において、金属は、チタニウムまたはステンレス鋼である。いくつかの実施形態において、金属は、銅または銀である。銅および銀は、抗菌特性を有することが知られているので、抗菌表面を提供するために、抗菌分子と組み合わせてこれらの金属を使用することは、特に有益であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、金属は、鋼である。
【００６０】
窒化金属表面は、抗菌活性を有することから利益を受ける任意の表面であってもよい。たとえば、窒化金属表面は、調理台、イス、ドア、取っ手、もしくは手すり、またはヒトもしくは動物と通常接触する任意の他の物体の表面の少なくとも一部を含んでもよい。特に、金属表面は、健康管理、または食品調製において使用される、道具または装置の一部の外側の少なくとも一部を含んでもよい。その上に固定化された抗菌分子、たとえば抗菌ペプチドを有する金属表面は、医療、特に医療機器において特有の用途を見出される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、窒化金属表面は、生体親和性である。「生体親和性」によって、金属表面が、ヒトまたは動物に毒性、または他の有害効果を有することなしに、人体内または動物体内に存在可能であることが理解されるであろう。金属表面は、免疫応答を誘導しないことが特に好ましい。適切な生体親和性材料は、チタニウムもしくはその合金、ステンレス鋼、およびアルミニウムもしくはその合金を含む。
【００６２】
窒化金属表面は、一種類の分子で機能化されてもよい。言い換えれば、表面上に固定化された全ての分子は、同一であってもよい。代替的に、表面は、２以上の異なる分子で機能化されてもよい。いくつかの実施形態において、表面は、異なる抗菌部分を有する２以上の異なる分子で機能化されてもよい。たとえば、異なる微生物に対して効果的である抗菌部分を含むか、当該抗菌部分からなる２以上の異なる分子で表面を機能化することが有利であってもよい。
【００６３】
窒化金属表面は、同一種類のペプチドで機能化されてもよい。言い換えれば、表面に固定化される全てのペプチドは、同一であってもよい。代替的に、表面は、２以上の異なるペプチドで機能化されてもよい。いくつかの実施形態において、表面は、異なる抗菌部分を有する２以上の異なる抗菌ペプチドで機能化される。たとえば、異なる微生物に対して効果的である抗菌部分を含むか、または当該抗菌部分からなる２以上の異なるペプチドで表面を機能化することが有利であってもよい。
【００６４】
窒化金属表面は、分子で部分的に機能化されてもよく、すなわち金属表面の一部のみが機能化されてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の金属表面は、その上に固定化された分子を有する。いくつかの実施形態において、実質的に金属表面の全体が、その上に固定化された分子を有する。
【００６５】
窒化金属表面は、ペプチドで部分的に機能化されてもよく、すなわち金属表面の一部のみが機能化されてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の金属表面は、その上に固定化されたペプチドを有する。いくつかの実施形態において、実質的に金属表面の全てが、その上に固定化されたペプチドを有する。
【００６６】
分子の金属表面被覆率は、蛍光分子および顕微鏡の使用によって測定されてもよい。
【００６７】
ペプチドの金属表面被覆率は、蛍光ペプチドおよび顕微鏡の使用によって測定されてもよい。
【００６８】
金属表面の分子密度は、表面のｃｍ２あたり、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０マイクロモル濃度であってもよい。
【００６９】
金属表面のペプチド密度は、表面のｃｍ２あたり、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０マイクロモル濃度であってもよい。
【００７０】
当業者は、表面上の分子の任意の組み合わせ数を採用してもよく、それらの全ては、それらの結合基と金属表面内の窒素との間で共有結合（たとえば、アミド結合）によって結合している。
【００７１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも５つの分子で機能化された表面であって、各分子が他のものと異なる表面が提供される。いくつかの実施形態において、各分子は、化学的構造によって他のものから区別される。いくつかの実施形態において、各分子は、活性スペクトルによって他のものから区別される。いくつかの実施形態において、各分子は、作用機序によって他のものから区別される。いくつかの実施形態において、各分子は、種類によって他のものから区別される。当業者は、様々な種類の抗菌性を知っているであろう。
【００７２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも５つのペプチドで機能化された表面を提供し、各ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸によって他のものから区別される。
【００７３】
ペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって形成されてもよい。ＳＰＰＳに関するさらなる詳細は、当業者に公知であり、一般的な教科書（たとえば、Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman and Co Ltd, 2002）に見出すことができるであろう。
【００７４】
機能化金属表面は、長期間効果を有してもよい。長期間効果を有することによって、分子またはペプチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも１０週間、または少なくとも１５週間にわたって、表面上に固定化されてもよいことが理解されるであろう。
【００７５】
機能化金属表面は、耐久性があってもよい。いくつかの実施形態において、分子またはペプチドは、機械的処理および／または化学的処理の後、表面上に固定化されたままである。機械的処理は、ヒトおよび／または動物との通常の接触を含んでもよい。「通常の接触」によって、表面が、少なくとも毎日１回、少なくとも毎週１回、少なくとも毎月１回、少なくとも３月毎に１回、または少なくとも６月毎に１回接触され、各接触が、少なくとも１秒間続くことが理解されるであろう。化学的処理は、アルコール（たとえば、エタノール）、Ｄｅｔｔｏｌ（登録商標）、トリプシン、Ｖａｓｅｌｉｎｅ（登録商標）、界面活性剤、もしくは石鹸、またはそれらの任意の組み合わせを用いる処理を含んでもよい。表面は、少なくとも毎日１回、少なくとも毎週１回、少なくとも毎月１回、少なくとも３月毎に１回、または少なくとも６月毎に１回の化学的処理に接触し、各接触は、少なくとも１秒間続いてもよい。
【００７６】
誤解を避けるために、金属表面は、静電相互作用によって固定化される、ペプチドを含む任意の分子で機能化されなくてもよいことが理解されるであろう。
【００７７】
本発明の第２態様によれば、本発明の第１態様の金属表面を含む物品が提供される。
【００７８】
金属表面は、物品の表面の、一部または全部を構成してもよい。いくつかの実施形態において、物品全体は、金属から作製される。代替的に、物品は、本発明の第１態様に従って、コアと金属表面とを含んでもよい。
【００７９】
物品は、調理台、イス、机もしくはテーブル、ドア、取っ手もしくは手すり（たとえば、公共施設、営業所、家庭、農場もしくは公共輸送において見出される）、キーパッド（たとえば、現金自動支払機もしくはセキュリティパネルにおける）、配管設備（たとえば、水道、配管）、ケータリング設備（鍋、家庭用品、給仕用容器など）、装置もしくは機器の一部（工場もしくは農場において使用される装置もしくは機械など）、または医療装置であってもよく、これらの一部を形成してもよい。ペプチドなどの抗菌分子で機能化される窒化金属表面は、たとえばドアの取っ手などの、高頻度に接触される表面上における微生物の増殖を抑制、または低減するために有利に使用可能である。
【００８０】
医療装置は、インプラント（たとえば、歯科インプラント、ペースメーカ、人工内耳、もしくは整形インプラント）、人工器官（たとえば、人工股関節もしくは人工膝関節、またはその部分）、分析機器、または手術器具であってもよい。
【００８１】
本発明の第３態様によれば、本発明の第１態様に従って、窒化金属表面を作製するための方法が提供され、当該方法は、分子の結合基と表面の窒素原子との間に共有結合を形成するために、少なくとも１つの結合基と抗菌部分とを含む分子に窒化金属表面を接触させ、それによって、金属表面の分子を固定化することを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、触媒の存在下において、窒化金属表面を分子に接触させることを含む。触媒の種類は、結合基の性質に従って選択されなければならないことが理解されるであろう。当業者は、異なる結合基を金属表面の窒化原子に結合させるために適切な触媒を知っているであろう。分子が、ペプチドであるか、またはペプチドを含む実施形態において、適切な触媒は、ＨＢＴＵ（ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム）、およびＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）の混合物である。
【００８３】
窒化金属表面は、任意の適切な手段によって分子に接触させられてもよい。たとえば、表面は、分子と、任意に触媒とを含む溶液に、浸漬被覆または浸けられてもよい。
【００８４】
窒化金属表面は、所望密度の分子が表面上にもたらされるように、共有結合が分子の結合基と表面の窒素原子との間に形成されるために適切な期間にわたって分子に接触されてもよい。いくつかの実施形態において、表面は、１〜２４時間、たとえば、約１２時間にわたって、分子に接触される（たとえば、分子を含む溶液に浸漬または浸けられる）。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１０〜３０℃の温度、たとえば室温で実施される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、分子、またはその抗菌部分は、ペプチドを含むか、またはペプチドからなる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ペプチドの結合基（たとえば、Ｃ末端カルボキシル基）と金属表面内の窒素部位との間に共有結合を形成するために、窒化金属表面をペプチドに接触させることを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、窒化金属表面を作製することをさらに含む。「窒化金属表面」は、窒素原子を金属の表面に拡散させる工程によって処理された金属表面を意味すると理解されるであろう。工程は、窒化、炭窒化（軟窒化など）、浸炭窒化、および／または酸炭窒化（軟酸窒化など）を含んでもよい。窒化は、窒素が金属の表面に拡散する処理工程であると理解されるであろう。炭窒化は、窒素と炭素とが金属の表面に拡散される処理工程であると理解されるであろう。浸炭窒化は、窒素と炭素とが金属の表面に拡散される処理工程であると理解されるであろう。酸炭窒化は、炭素、窒素、および酸素が、金属の表面に拡散される処理工程であると理解されるであろう。工程は、鉄系材料における処理工程を意味すると理解されるであろう。
【００８８】
金属表面を窒化するための３つの主要な方法が存在する。窒素豊富な気体、通常アンモニアが、窒素を提供するために使用される気体窒化；窒素提供媒体が、シアン化塩などの窒素含有塩である塩浴窒化；および強い電界が、イオン化された気体分子（通常、純粋な窒素）を作製するために、窒化される金属表面の周囲に使用されるプラズマ窒化である。窒化のこれらの方法は、当業者に公知であろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
本発明の実施形態は、添付図面を参照して一例として以下に説明される。
【図１】様々な種類の鋼におけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図２】様々な環境的処理後の窒化鋼におけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図３】様々な環境的処理後の窒化鋼におけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図４】様々な処理後のα１〜３鋼におけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図５】様々な処理後のβ１〜３鋼におけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図６】様々な処理後のｐ１またはｐ２鋼におけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図７】コントロールと様々な表面に置かれた窒化鋼のペプチド被覆部分とから取得されたコロニー形成単位を示すグラフである。
【図８】期間中のＭｅｔａｌｔｅｃｈ社の窒化チタニウム上のペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図９】様々な処理後のＭｅｔａｌｔｅｃｈ社の窒化チタニウムにおけるペプチド蛍光のレベルを示すグラフである。
【図１０】Ｍｅｔａｌｔｅｃｈ社の窒化チタニウムの表面上のペプチド活性を示すグラフである。
【図１１】３ヶ月間にわたって病院環境において使用されたペプチド被覆窒化鋼表面の抗菌効果を示すグラフである。（Ａ）表面からの全細菌数。エラーバーは、平均標準誤差を示す。（Ｂ）コントロール表面と比較した被覆表面の有効率は、実験期間にわたって低下した。９９％以上の効率が、全ての時点において観察された。
【図１２】３ヶ月間にわたって市立病院の環境において使用されたペプチド被覆窒化鋼表面の抗菌効果を示すグラフである。（Ａ）表面からの全細菌数。エラーバーは、平均標準偏差を示し、点線は、病院表面上における現在推奨される細菌量を示す。（Ｂ）コントロール表面に比べて被覆表面の有効率は、実験期間にわたって低下した。９９％以上の効力が全ての時点で観察された。
【図１３】ペプチド被覆窒化表面の有効性の長期試験の結果を示すグラフである。このデータは、一年間にわたって観察された、医科大学における処理表面および非処理表面にて数えられた細菌増殖を示す。
【図１４】細菌で処理されたペプチド被覆窒化金属表面におけるクリスタルバイオレットの吸光度を示すグラフである。染料の量は、細菌の数に直接に関連する。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
［実施例］
実施例１
ペプチドの合成および精製
ペプチドは、Ｌｉｂｅｒｔｙ  ｂｌｕｅペプチド合成機における標準的なＦｍｏｃ固相合成技術を用いて合成された。ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製された。簡潔には、水およびアセトニトリルは、固体ペプチドを含む試験管に添加された。溶液は、ペプチドが完全に溶解するまで撹拌された。試料は、２μｍシリンジフィルタを用いて濾過され、Ｃ１８カラムを含むＨＰＬＣ機器を用いて分析された。精製後、両者ともに０．０５％トリフルオロ酢酸を有する、水溶媒とアセトニトリル溶媒とが、０〜１００％アセトニトリル勾配を用いて４０分間にわたって使用された。これは、１００％アセトニトリルを用いて１０分間と、１００％水を用いて１０分間とからなる２０分間の洗浄サイクルに続いた。
【００９１】
金属表面の作製
金属の窒化
金属表面は、プラズマ窒化ユニットにおいて、Metaltech, Consett, Co. Durhamによる標準的なプラズマ窒化工程を用いて作製された。工程の変数は、表１に示される。
【表１】
2018525521.tif 000003
【００９２】
金属のポスト酸化を用いるプラズマ軟窒化処理
金属表面は、Ｍｅｔａｌｔｅｃｈ社による標準的な工程を用いてプラズマ軟窒化処理された。様々な種類の金属は、表２に示される。
【表２】
2018525521.tif 000004
【００９３】
窒化金属表面へのペプチドの固定化
窒化金属表面は、それぞれ９：０．５：０．５の比率のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＤＩＰＩＡ、およびＨＢＴＵと、蛍光標識を付された０．５μｇ／ｍｌのペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧとを含む溶液中でロータミキサにおいて室温で一晩インキュベートされた。インキュベート後、表面は、風乾にさらされる前に５０分間にわたって５分毎に補充された生理食塩水の後、５０分間にわたって５分毎に補充されたＤＭＦで洗浄された。
【００９４】
ペプチド付着の分析
金属表面のペプチド被覆割合は、蛍光ペプチドと顕微鏡との使用によって評価された。ペプチド被覆された金属は、１０×の拡大率を用いて１．５５ｓの露光時間で蛍光顕微鏡によって観察された。鋼の１ｃｍ２片毎に９画像を取得した。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて分析された。ペプチドで処理されなかった窒化金属から得られたコントロール画像からの閾値は、全ての画素が除去され、画像に染色が残らなくなるまで調整された。これは、コントロールベースラインとして機能する。対応する実験試料からの画像は、続いてこの閾値まで調整され、残余の画素数は、続いてペプチド付着の測定値として記録された。
【００９５】
結果
図１によれば、ペプチドは、８種類の鋼に付着可能であることがうまく示されたからである。なぜなら、全ての平均画素数が、０を超えたからである。ｘ軸の表示Ａ１〜３は、α１〜３鋼を示し、Ｂ１〜３は、β１〜３鋼を示し、Ｐ１〜Ｐ２は、ｐ１〜ｐ２鋼を示すことに留意すべきである。ペプチド付着レベルと鋼の種類との間の相違は、有意であり（Ｐ＝０．００６，ボンフェローニ補正とクラスカル・ウォリス一元配置分散分析）、このことは、ペプチドが、特定の種類の鋼に優先的に結合することを示す。これは、ペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧが、アルファ鋼について最も高い結合アフィニティを有するグラフから分かる。
【００９６】
実施例２
軟鋼は、Ｍｅｔａｌｔｅｃｈ社による４４０℃における１９時間にわたる標準的工程を用いて窒化された。蛍光標識を付されたペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧは、実施例１に記載されたような窒化鋼の表面に固定化された。ペプチド被覆鋼は、使用された処理に依存して好適な時間にわたって室温において適切な環境的処理でインキュベートされた。試料は、処理後に生理食塩水で洗浄され、ペプチド付着は、実施例１に詳述された顕微鏡によって分析された。
【００９７】
図２は、窒化鋼のペプチド被覆が、様々な環境的処理の前後で同様のレベルに保持されることを示す。
【００９８】
軟鋼は、Ｍｅｔａｌｔｅｃｈ社による標準的工程を用いて窒化された。蛍光標識を付されたペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧは、実施例１に記載されたような窒化鋼の表面に固定化された。ペプチド被覆鋼は、使用される処理に依存して好適な時間にわたって室温において好適な環境的処理でインキュベートされた。試料は、処理の後、生理食塩水で洗浄され、ペプチド付着は、実施例１に詳述されるように顕微鏡を用いて分析された。
【００９９】
図３は、窒化鋼のペプチド被覆が、環境的処理の後、一定のままであることを示す。このことは、窒化表面上におけるペプチドの耐久性および長期固定化が、様々な鋼および金属に適用可能であることを示唆する。
【０１００】
実施例３
鋼は、蛍光標識を付されたペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧが、実施例１に記載されたような窒化表面上に固定化された後、実施例１に記載されたような、窒化、またはプラズマ軟窒化された。
【０１０１】
ペプチド被覆されたアルファ鋼試料は、使用された処理に依存した好適な時間にわたって室温において、様々な標準的な洗浄または被覆処理にてインキュベートされた。図４は、特定の処理後、窒化表面、ペプチド被覆表面について閾値（ペプチド被覆の程度の指標）を超える画素を示す。統計的な有意差は、α１鋼（Ｈ＝１９．４  ｐ＝０．００４）と、α３鋼（Ｈ＝１２．８，ｐ＝０．０４７）とのための処理の間の画素数において見出された。この減少は、３週間の期間にわたる蛍光の減少によって部分的に説明されてもよい。なぜなら、鋼片が光に繰り返しさらされたからである。しかしながら、α２鋼の様々な環境的処理後、画素数の間に有意差は、観察されなかった（Ｈ＝１２．４，ｐ＝０．０５３）。
【０１０２】
図５は、各窒化ペプチド被覆されたベータ鋼についての閾値を超えるピクセルを示す。統計的分析は、環境的処理が、β１およびβ３鋼のペプチド被覆率に影響を与えないことを示した。なぜなら、各処理（Ｈ＝１０．６，ｐ＝０．１０３）および（Ｈ＝１０．９，ｐ＝０．０９）の間で有意差が観察されなかったからである。有意差は、β２鋼群（Ｈ＝１３．７，ｐ＝０．０３３）についての異なる処理の間で観察された。
【０１０３】
図６は、環境的処理後、ペプチド被覆されたＰｌａｓＯｘ鋼について閾値を超える画素を示す。多くの場合、画素数は、ＰｌａｓＯｘ１鋼よりもＰｌａｓＯｘ２鋼の方が多いことが見出された。処理の間の画素数の相違は、両方の金属（ＰｌａｓＯｘ１鋼，Ｈ＝１５．４  ｐ＝０．０１７およびＰｌａｓＯｘ２鋼，Ｈ＝１２．７  ｐ＝０．０４８）について有意であることが見出された。
【０１０４】
実施例４
α２鋼は、標準的な窒化工程を用いて作製され、実施例１に記載されたような方法を用いて、１μｇ／ｍｌの非標識ペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧで被覆された。ペプチド被覆された鋼試料、またはコントロールの非被覆鋼試料は、続いて高いコロニー形成単位（ＣＦＵ）数が予測された領域（たとえば、便座、台所の流しなど）に取り付けられた。生理食塩水に浸された綿棒は、１日目、２日目、７日目、８日目、および９日目に表面を拭き取るために使用された。綿棒は、ｓｔｅｒｅｌｉｎチューブに静置され、血液寒天プレートをインキュベートするために使用され、その後、ＣＦＵが取得される前に、プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１０５】
図７は、特定の表面に付加された後、ペプチド被覆対コントロール窒化アルファ２鋼表面における平均ＣＦＵを示す。この結果は、鋼のペプチド被覆部分に比べて、試験された全ての領域からの金属コントロール片において非常に高い平均ＣＦＵを示した。
【０１０６】
実施例５
鋼表面上における固定化ペプチドの、耐久性および効力が確認され、チタニウム表面上に固定化されたペプチドの効力が評価された。窒化チタニウムは、Ｍｅｔａｌｔｅｃｈ社によって作製された。蛍光標識を付されたＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧは、上述のように窒化チタニウムの表面上に固定化された。ペプチド被覆試料は、蛍光に続いて、第１週と第４週との間に室温でＰＢＳ溶液中においてインキュベートされ、閾値を超える得られた画素数は、蛍光顕微鏡によって上述されたように評価された。
【０１０７】
図８は、ＰＢＳ溶液中において、１，２，３，または４週間後、窒化チタニウムの表面上における閾値を超える平均画素数を示す。最も高い平均画素数は、溶液中においてさらに１週間観察された。画素数は、第１週と第２週との間に顕著に減少したが、第２週後画素数は、比較的一定に保たれた。画素は、溶液中において、１、２、３、および４週間後、閾値を超えることが観察され、このことは、ペプチドと窒化チタニウム表面との間の相互作用が長期間効果を有することを示している。
【０１０８】
実施例６
窒化チタニウムの表面上に固定化されたペプチドの耐久性は、図９に示されるように、様々な環境的処理の後に評価された。ＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧ被覆チタニウムは、使用された処理に依存して好適な時間にわたって室温で、コントロールＰＢＳ溶液、トリプシン、Ｄｅｔｔｏｌ（登録商標）中でインキュベートされるか、またはサンドペーパを用いて処理された。閾値を超える平均画素数は、続いて蛍光顕微鏡によって評価された。重要なことに、ペプチド蛍光は、任意の環境的処理の後に保持され、このことは、ペプチドと金属との間の強く長期の相互作用を示す。ペプチド蛍光は、コントロール溶液、トリプシン、またはＤｅｔｔｏｌ（登録商標）で処理されるか否かで同様に保持された。さらに、ペプチド蛍光は、サンドペーパを用いる機械的撹拌後、低いレベルではあるが保持され、このことは、ペプチドと表面との間の共有結合が機械的処理または化学的処理に耐えることができることを示唆する。
【０１０９】
実施例７
窒化チタニウムは、窒化チタニウムが非抗菌ペプチドで被覆されたコントロール（ペプチド）群、および窒化チタニウムが被覆されないままのコントロール（チタニウム）群とは別に、Ｍｅｔａｌｔｅｃｈ社によって作製され、ペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧを用いて上述されたように被覆された。非被覆の組織培養プラスチックからなる陽性コントロール群も使用された。表面は、細菌の増殖プレートとして洗浄および使用された。抗菌ペプチド被覆チタニウム表面の１つの群は、細菌の増殖プレートとして直ちに使用された（処理（即時））。別の抗菌ペプチド被覆チタニウム群（処理（環境））は、ＰＢＳで処理され、続いてトリプシン／ＥＤＴＡ、続いてＤｅｔｔｏｌ、続いてサンドペーパによって処理され、続いて表面が、細菌の増殖プレートとして使用された。吸光度は、インキュベーション後、表面上で増殖する細菌数に関する（図１０）。低い値は、細菌の増殖がないことを示し、一方、高い値は、細菌の数が多いことを示す。図１０は、高い吸光度が観察されたコントロールに比べて、抗菌ペプチド被覆チタニウムについて非常に低い吸光度を示す。
【０１１０】
実施例８
窒化鋼表面は、ペプチドＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧで被覆された。表面は、ペプチド（金属のｃｍ２あたり３μｌの１０ｍｇ／ｍｌペプチド）と、ペプチドを表面に付着させる触媒（ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ混合物）との混合物に浸漬被覆された。被覆は、１２時間にわたって室温で実施された。
【０１１１】
被覆鋼および非被覆鋼表面は、病院各ユニット、救急救命室、手術室、病棟１および付属の浴室に設置された。コントロール表面と被覆表面とは、同一の場所に置かれ、３月間にわたって試験された。使用後、集められた試料およびデータは、分析のためにバーミンガム大学に送られた。
【０１１２】
得られたデータは、図１１に示される。被覆された表面は、細菌増殖の完全な抑制を示した。コロニー形成単位（ｃｆｕ）は、１つのプレートを除いて、ペプチドで被覆された任意の表面において見られなかった。これは、第２月において１つのｃｆｕを示した。これは、拭き取り工程、または平板培養工程の間の混入が原因であると考えられる。コントロールプレートは、細菌および真菌の両方の増殖を示した。
【０１１３】
被覆は、表面の摩耗耐性を減少させず、腐食を進めず、他の任意の作業上の問題をもたらさない。
【０１１４】
実施例９
さらなる試験は、市立病院の外来患者エリアにおいて実施された。これは、病院の非常に混雑するエリアであり、多くの患者および職員の往来が見られる。使用されるペプチドは、ＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧＲＲＲＲＲＲＧＡＬＡＧであり、被覆された鋼表面は、実施例８と同様に作製された。
【０１１５】
コントロール表面および被覆表面は、外来患者エリアのドアの取っ手に置かれた。コントロール表面は、病院内の細菌レベルが、病院表面の推奨基準（５ｃｆｕ）よりも顕著に高いことを示した。興味深いことに、細菌の増殖のみが観察され、菌類の増殖は観察されなかった。ペプチド被覆された表面は、９９％以上の有効性で細菌のレベルを１ｃｆｕまで顕著に減少させることが観察された（図１２）。我々は、表面の使用頻度が原因であると考えられる、表面から増殖した１コロニーを観察した。表面は、観察期間の間、平均して２分間毎に接触され、多くの場合、表面は、実施された拭き取り直前に接触された。そのような顕著な減少が観察されたという事実は、表面が、効力を有し、細菌による表面のコロニー化を防ぐことが可能であるが、表面が細菌細胞を殺すために３０秒間以上かかり得ることを示す。
【０１１６】
実施例１０
実施例８および９において記載されたペプチド被覆表面は、医科大学に設置された。表面は、トイレの蛇口に設置され、１年間にわたって拭き取られた。データ（図１３）は、細菌増殖の抑制が、１２月後、依然として処理表面に観察されたことを示す。
【０１１７】
実施例８〜１０は、抗菌ペプチドを用いて機能化された窒化金属表面が、細菌増殖を抑制し、臨床的環境において長期間にわたって同一レベルの効力を維持可能であることを示す。
【０１１８】
実施例１１
窒化鋼は、被覆表面を作製するために、ＤＭＦにおけるＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ触媒を用いて１時間にわたって室温で、配列ＲＲＩＹＧＲＧＹＩＲＲ（２５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ／ｃｍ２）を有する抗菌ペプチド溶液を用いてインキュベートされた。
【０１１９】
被覆された表面は、１×１０６細菌細胞（表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））を植え付けられ、３７℃で一晩インキュベートされた。表面は、続いてＰＢＳで洗浄され、室温で１５分間にわたってクリスタルバイオレット（核染色）を用いて染色された。表面は、任意の残存染色を除くために３回洗浄され、７０％エタノール中で染色を浮かされた。クリスタルバイオレットの吸光度は、染色レベルを定量するために、５６０ｎｍにおいて読み取られた（図１４）。染色量は、細菌の数に直接に関連する。このことは、表面上を被覆するペプチドが、表面に付着する細菌の数を顕著に減少可能であることを示す。
【０１２０】
本発明は、したがって、機能化表面、特に、共有結合性相互作用のみによってその上に固定化された、特にペプチドなどの分子を有する金属表面を提供する。本発明は、微生物数を減少させることと、長期間にわたって機能を保持することとによって、窒化金属表面上にペプチドを固定化するための共有結合性相互作用の使用が、有効な抗菌メカニズムであることを見出した。さらに、ペプチド被覆表面が、高いＣＦＵにさらされる領域でさえ、微生物に対して有効であることが示された。このことは、定期的に洗浄されない、または多数の病原菌にさらされる、洗浄することが困難な領域について有効なメカニズムであることを示している。
【図１】
2018525521.tif 000005
【図２】
2018525521.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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