(57)【要約】本開示は、短縮型リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列に融合された異種抗原を発現する組み換えリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株を含有する免疫療法組成物と、抗生物質処方の混合使用に関するものであり、それらはリステリアの残存、播種および／またはリステリアのバイオフィルムの形成を阻害しながら、抗腫瘍／抗癌または抗感染性疾患の免疫療法応答が発生するよう連続的に投与されてもよい。上述の組成物を投与することを含む、免疫応答を誘導する方法、および癌もしくは腫瘍を治療、阻害、または抑制する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア系免疫療法処方の投与後の、疾患を有する対象内の組織上のリステリア株の残存を防ぐ方法であって、前記方法は、前記組み換えリステリア系免疫療法の投与後に、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、前記リステリア株は核酸分子を含み、前記核酸分子は組み換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記組み換えポリペプチドは、免疫原性のタンパク質もしくはペプチドに融合された異種抗原またはその断片を含み、それにより、前記対象内の前記リステリア株の残存を防止する、方法。
【請求項２】
リステリア系免疫療法処方の投与後の、疾患を有する対象内の組織上のリステリア株の残存を防ぐ方法であって、前記方法は、前記組み換えリステリア系免疫療法の投与後に、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、前記リステリア株は核酸分子を含み、前記核酸分子は１つ以上のネオエピトープをコードする１つ以上のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記１つ以上のペプチドは、免疫原性のタンパク質またはペプチドに融合され、それにより、前記対象内の前記リステリア株の残存を防止する、方法。
【請求項３】
リステリア系免疫療法処方の投与後の、疾患を有する対象内の組織上のリステリア株の残存を防ぐ方法であって、前記方法は、前記組み換えリステリア系免疫療法の投与後に、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、前記リステリア株は核酸分子を含み、前記核酸分子は組み換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記組み換えポリペプチドは、異種抗原に融合されていない免疫原性のタンパク質またはペプチドを含み、それにより、前記対象内の前記リステリア株の残存を防止する、方法。
【請求項４】
前記免疫原性タンパク質またはペプチドが、短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗生物質処方の投与が、前記リステリア株の播種または付着を防ぐ、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗生物質処方の投与が、前記リステリア株のバイオフィルム形成を防ぐ、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗生物質処方が、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、アジスロマイシン、バンコマイシン、ホスホマイシン、リネゾリド、リファンピシン、ミノサイクリン、テリスロマイシン、ペフロキサシン、ベータ−ラクタム、フシジン酸、マクロライド、フルオロキノロン、メロペナム  ボス、モキシフロキサシン  ボス、アンピシリン、ダプゾン、トリメトプリム／スルファ（バクトリウム）またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗生物質は、無傷の細胞内にはほとんど取り込まれない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗生物質は、細胞に侵入し、細胞内細菌を除去することができる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約１時間〜約８時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約１時間〜約６時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約１時間〜約４時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約１時間〜約１２時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約２時間〜約８時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約２時間〜約６時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約２時間〜約４時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後約１時間〜約２４時間以内に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗生物質処方の前記投与を、前記組み換えリステリア株免疫療法の投与後２〜２４時間以内に行うこと、または前記リステリア株が前記対象内から除去されるまで、しかし抗原が前記対象において提示された後に行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質処方の投与は、前記リステリア株免疫療法の前記投与から生じた治療目的が達成された後の投与を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療目的は、抗疾患免疫応答を獲得することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療目的は、腫瘍または癌の退縮の達成を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象に投与される前記リステリア株免疫療法は、前記対象において抗疾患免疫応答を惹起させる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗生物質処方の投与は、前記抗疾患応答が開始された後の投与を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗生物質処方の前記投与は、前記対象の前記抗疾患免疫応答に干渉しない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗生物質処方の前記投与が、前記対象内の前記リステリア株の存在を消去する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記異種抗原は、ＰＳＡ抗原、キメラＨＥＲ２抗原、ＨＰＶ株１６  Ｅ７またはＨＰＶ株１８  Ｅ７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＳＡが、配列番号８を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記キメラＨＥＲ２が、配列番号１７を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＰＶ−Ｅ７抗原が、配列番号２２を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号１５に記述されるアミノ酸配列を含むＰＳＡ抗原に融合された短縮型ＬＬＯを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号２１に記述されるアミノ酸配列を含むｃＨＥＲ２抗原に融合された短縮型ＬＬＯを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号２３に記述されるアミノ酸配列を含むＨＰＶ−Ｅ７抗原に融合された短縮型ＬＬＯを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上のネオエピトープが、前記疾患または状態を有する対象の疾患もしくは状態を担持する組織または細胞中に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子が、前記組み換えリステリア株のプラスミド内にある、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プラスミドが、組み込み型プラスミドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記プラスミドが、エピソーム性プラスミドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
抗生物質選択の非存在下では、前記プラスミドは、前記組み換えリステリア株内で安定して維持される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記プラスミドは、前記組み換えリステリアに対し、抗生物質抵抗性を与えない、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記組み換えリステリア株が弱毒化されている、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記弱毒化リステリアが、内因性遺伝子内に突然変異、欠失、置換、破損、または不活化を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記内因性遺伝子は、ａｃｔＡ病原性遺伝子を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記内因性遺伝子は、Ｄ−アラニンラセマーゼ（Ｄａｌ）遺伝子またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（Ｄａｔ）遺伝子を含む、請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記内因性遺伝子は、前記ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔ遺伝子を含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記リステリア株内の前記組み換え核酸分子が、第二のオープンリーディングフレームを含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第二のオープンリーディングフレームが、代謝酵素をコードする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記代謝が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組み換えポリペプチドが、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターから発現される、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つ以上のペプチドが、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターから発現される、請求項２に記載の方法。
【請求項４９】
前記組み換えリステリア株が、組み換えリステリア・モノサイトゲネス株である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組み換えリステリア株が、動物宿主を介して継代されている、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与が、追加的腫瘍抗原に対するエピトープ拡大を誘導する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が、腫瘍もしくは癌、前癌状態、感染性疾患、または寄生虫性疾患を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記腫瘍または癌が、乳房の腫瘍もしくは癌、胃の腫瘍もしくは癌、前立腺の腫瘍もしくは癌、脳の腫瘍もしくは癌、頸部の腫瘍もしくは癌、子宮内膜の腫瘍もしくは癌、グリア芽腫、肺癌、膀胱の腫瘍もしくは癌、膵臓の腫瘍もしくは癌、メラノーマ、大腸の腫瘍もしくは癌、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記腫瘍または前記癌が、転移性である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、前記腫瘍または癌を有する対象を治療することを含む、請求項５３〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療が、前記腫瘍または前記癌の増殖を低下させるか、または停止させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療が、前記腫瘍または前記癌の転移を減少させるか、または停止させる、請求項５５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療は、前記対象において、抗腫瘍性または抗癌性の免疫応答を惹起させ、および維持する、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療が、前記対象の生存期間を延長させる、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、短縮型リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列に融合された異種抗原を発現する組み換えリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株を含有する免疫療法組成物と、抗生物質処方の混合使用に関するものであり、それらはリステリアの残存、播種および／またはリステリアのバイオフィルムの形成を阻害しながら、抗腫瘍／抗癌または抗感染性疾患の免疫療法応答が発生するよう連続的に投与されてもよい。上述の組成物を投与することを含む、免疫応答を誘導する方法、および癌もしくは腫瘍を治療、阻害、または抑制する方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
多くの前臨床証拠および早期治験データが、免疫系の抗腫瘍の能力が、癌が確定した患者の治療に利用できることを示唆している。ワクチン戦略は、様々なタイプの癌に関連性のある腫瘍抗原を利用する。腫瘍との関連性のある抗原を発現するウイルスまたは細菌ベクターなどの生ワクチンでの免疫化は、腫瘍に対する強いＣＴＬ応答を誘発するための一つの戦略である。
【０００３】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、主としてリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の孔形成活性によって、マクロファージおよび樹状細胞といった抗原提示細胞の細胞質を直接利用できるグラム陽性の通性細胞内細菌である。ＬＬＯは、細胞による呑食の後にＬｍによって分泌され、ファゴリソソーム膜に孔をあけ、細菌が空胞を逃れて細胞質に入るようになる。ＬＬＯは、免疫系に対してＭＨＣクラスＩ分子を介して非常に効果的に提示される。その上、Ｌｍ由来ペプチドは、ファゴリソソームを介してＭＨＣクラスＩＩ提示を利用することもできる。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネスは、たとえばステンレススチール、ガラス、およびポリスチレンなどの様々な表面に結合してコロニーを形成することができ、そして処理中の食品を汚染する。リステリア・モノサイトゲネスのバイオフィルムはたとえば殺生物剤作用に対する防御など、重要な生態上の利点に関連している。たとえば鞭毛、バイオフィルム関連タンパク質（Ｂａｐ：ｂｉｏｆｉｌｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＳｅｃＡ２、および細胞−細胞のコミュニケーション系など、いくつかの分子決定因子が、種内で、バイオフィルム構築に関与していることが示されている。リステリア・モノサイトゲネスのバイオフィルムマトリクス内にエキソ多糖類成分の兆候はないが、初期細胞付着および特定の増殖条件下でのバイオフィルムの組織化に細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）が関与していることが示されている。この種によるバイオフィルムの形成は、たとえば温度、ｐＨ、および栄養素の変動などの環境条件に強く依存している。リステリア・モノサイトゲネスはもともと日和見病原体であり、全身感染には３パターンある：孤立性の菌血症、中枢神経系感染、そして母子感染である。局所感染の報告は滅多にないが、３６件の骨関節感染が文献に記載されており、すべて孤立性の症例と報告され、一部が文献レビューがあり、それらすべてがおそらくバイオフィルム関連である。さらに、欧州（フランスにおいては２００６年から）において、特に高頻度で人工関節となる高齢者で、散在性およびクラスター関連の全身性リステリア症の症例が近年増加しており、骨関節リステリア症の症例増加に関する懸念が増している。
【０００５】
たとえばマラリア、結核およびＨＩＶ−１、または特に他の慢性もしくは潜在性のウイルス性感染症などの感染性疾患は、世界中の多くの人々にとっていまだ大きな疾病負担となっている。ここ数十年の努力にもかかわらず、マラリアやＨＩＶ−１に対するワクチンは無く、他の慢性もしくは潜在性のウイルス性感染症も同様である。さらに、アフリカの多くの地域で９０％を超える罹患率であり、サハラ以南の国の人々の大半は、免疫応答を抑制し、ヒトおよび動物の宿主免疫系を２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）へと傾け、ワクチン特異的応答を抑制する１種以上の寄生性蠕虫に感染している。ゆえに、安全性および有効性が改善された、細菌系免疫療法を含む抗感染症および抗寄生虫疾患の改良免疫療法の開発に対するニーズが存在している。
【０００６】
同様に、癌、および癌に繋がる前癌状態も、世界中の人々にとっていまだ大きな疾病負担となっている。しかしながら癌は非常に複雑な疾患であり、癌の各々で特定のタイプの治療法が必要であり、ゆえに、混合治療法が最も成功の可能性のある方法である。したがって、安全性と有効性が改善された抗腫瘍性／抗癌性の細菌系改良免疫療法に対するニーズも存在している。本開示は、宿主においてリステリアが残存してしまうこと避けるために、および／または治療後に同宿主においてバイオフィルムが形成されてしまう可能性を防ぐために、抗生物質処方を投与することを含む、リステリア系免疫療法の治療法を提供することにより、このニーズを満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様において、本開示は、リステリア系免疫療法処方の投与後の、対象内の組織上のリステリア株の残存を防ぐ方法に関するものであり、前述の方法は、組み換えリステリア系免疫療法の投与に続いて、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、それによって、対象内の前述のリステリア株の残存を防止する。
【０００８】
関連する態様において、前述の抗生物質処方は、リステリア株の播種または付着を防ぐ。別の態様において、前述の抗生物質処方の投与は、前述の対象内組織上のリステリア株のバイオフィルム形成を防止する。別の態様において、前述の抗生物質は、無傷の細胞（ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌ）内にはほとんど取り込まれず、または細胞に侵入し、細胞内細菌を除去することができる。
【０００９】
１つの態様において、本開示方法の一部として対象に投与されるリステリア系免疫療法は、前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる。関連態様において、抗生物質処方の投与は、前述の抗疾患応答が開始された後の投与を含む。別の関連態様において、抗生物質処方の投与は、前述の対象の抗疾患免疫応答に干渉しない。さらに別の関連態様において、前述の抗生物質処方の投与が、前述の対象内のリステリア株の存在を除去する。
【００１０】
１つの態様において、前述の抗生物質処方の投与は、前述のリステリア系免疫療法の投与から生じた治療目的が達成された後の投与を含む。関連態様において、前述の治療目的は、抗疾患免疫応答を獲得することを含む。別の関連態様において、前述の治療目的は、腫瘍または癌の退縮の達成を含む。
【００１１】
以下の詳細な記載、実施例、および図面から、本開示の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、本開示の主旨および範囲の内の様々な変更および改変が、この詳細な記載から当分野の当業者には明白であり、本開示の好ましい実施形態を示しているが、この詳細な記載および特定の実施例は、単なる解説を目的として提示されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本明細書の開示内容に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本開示の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面と併せて読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｂ。（図１Ａ）ｋｌｋ３統合およびａｃｔＡ欠失の後の、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子は、ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれの構築物からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、野生型タンパク質の分泌シグナル配列を欠失しているｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４ｂｐのバンドが増幅される。
【００１４】
【図２】図２Ａ〜２Ｄ。（図２Ａ）ｐＡＤＶ１３４プラスミドのマップである。（図２Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、短縮型ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）からなる。（図１１Ｃ）ｐＡＤＶ１４２プラスミドのマップである。（図２Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【００１５】
【図３】図３Ａ〜３Ｂ。（図３Ａ）選択圧（Ｄ−アラニン）のある場合とない場合とで培養した場合の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプラスミド安定性。株および培養条件が先に挙げられており、ＣＦＵ決定に使用されたプレートが後に挙げられている。（図３Ｂ）インビボでのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの除去、およびこの間の潜在的なプラスミド損失を評価したものである。細菌が静脈内注入され、示された時点で脾臓から単離された。ＣＦＵは、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンプレート上で決定された。
【００１６】
【図４】図４Ａ〜４Ｂ。（図４Ａ）１０８ＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株のｉｎ  ｖｉｖｏ除去。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上でのプレーティングにより決定された。この方法での検出限界は１００ＣＦＵであった。（図４Ｂ）１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＸＦＬ７菌株を用いたＪ７７４細胞の細胞感染アッセイ。
【００１７】
【図５】図５Ａ〜５Ｅ。（図５Ａ）追加免疫投与後６日目における未感作マウスおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＰＳＡ四量体特異的な細胞。（図５Ｂ）無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色が、ＰＳＡペプチドで５ｈにわたり刺激された。異なるエフェクター／標的比での、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図５Ｄ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよび無処置マウスからのインビトロで刺激したエフェクターＴ細胞を含むＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の特異的溶解である。ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチドなし（図５Ｅ）で、刺激後２４時間にわたり取得した、無処置および免疫化の脾細胞内のＩＦＮγスポット数。
【００１８】
【図６】図６Ａ〜６Ｃ。ＬｍｄｄＡ−１４２を用いた免疫化で、Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退縮が誘導される。マウスは、未処置のまま（ｎ＝８）（図６Ａ）または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図６Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（図６Ｃ）で腹腔内投与で免疫化した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、それらの値がミリメートル単位での平均直径として表されている。それぞれの線は個別のマウスを示す。
【００１９】
【図７】図７Ａ〜７Ｂ。（図７Ａ）未処置マウス、およびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析。（図７Ｂ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内での、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。
【００２０】
【図８】図８Ａ〜８Ｂ。（図８Ａ）ｋｌｋ３統合およびａｃｔＡ欠失後のＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図８Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各構築物からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０ｂｐのバンドが増幅される。
【００２１】
【図９】図９Ａ〜９Ｃ。（図９Ａ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３はＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌する。細菌培養上清からのタンパク質を沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロットにより検出したＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質。（図９Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３により生成されたＬＬＯでは溶血活性が保持された。ヒツジ赤血球が細菌培養上清の段階希釈で培養され、溶血活性が５９０ｎｍでの吸光度により測定された。（図９Ｃ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様のＪ７７４細胞内部で成長した。細菌と共にＪ７７４細胞を１時間にわたって培養し、続いてゲンタマイシン処理を行って細胞外の細菌を殺菌した。表示した時点で獲得したＪ７７４溶菌液の段階希釈物のプレーティングにより細胞内増殖を測定した。これらの実験でＬｍ  １０４０３Ｓが対照として使用された。
【００２２】
【図１０】図１０。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３でのマウスの免疫がＰＳＡ特異的な免疫応答を誘導する。１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、またはＬｍｄｄＡ−１４２を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを１週間間隔で２回免疫し、７日後に脾臓を採取した。モネンシンの存在下で脾細胞を１μＭのＰＳＡ６５−７４ペプチドで５時間にわたり刺激した。ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γについて細胞を染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター内で分析した。
【００２３】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂ。ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（図１１Ａ）ＬｍｄｄＡ株における染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補用の、構造性リステリアｐ６０プロモーター制御下のバシラス・サブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子を保有するｐＡｄｖ１６４のプラスミド地図。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、短縮型ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する（図１１Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットされた、ＴＣＡ沈殿細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内で、ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。約１０４ＫＤの差次的なバンドがｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内在性ＬＬＯは５８ＫＤのバンドとして検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【００２４】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃ。ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性能（図１２Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激物として、および３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的物として使用して、免疫化マウス由来の脾細胞内でＨｅｒ２／ｎｅｕリステリア系ワクチンにより惹起した細胞障害性Ｔ細胞応答を検証した。Ｌｍ対照は、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現することを除いて全ての点で同一であるＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づいた。（図１２Ｂ）免疫化ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によって細胞培養培地中へと分泌されたＩＦＮ−γは、マイトマイシンＣ処置されたＮＴ−２細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（図１２Ｃ）タンパク質の異なる領域由来のペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションに反応した、キメラワクチンで免疫化されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。７２時間のコインキュベーションの後に採取された細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各データ点は３回のデータの平均値±標準誤差であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【００２５】
【図１３】図１３。リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンのための腫瘍防止研究Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回注射した。６週齢で免疫を開始し、２１週目まで３週ごとに免疫を継続した。腫瘍の外観を毎週観察し、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージとしてそれを表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。
【００２６】
【図１４】図１４。脾臓中のＴｒｅｇのパーセンテージに対するＡＤＸＳ３１−１６４を用いる免疫の効果を示す図である。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。２回目の免疫の７日後に脾臓を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、および抗ＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋細胞または全ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【００２７】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂ。ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇのパーセンテージに対する、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。２回目の免疫の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、および抗ＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（図１５Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット（図１５Ｂ）。異なる投与群の間での全ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表され（左のパネル）、且つ、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）として表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。データは２つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭとして示される。
【００２８】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃ。ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は、乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延させることができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリアワクチンを用いて３回免疫化した。麻酔をかけたマウスの頭蓋内にＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００細胞）を注射した。（１６Ａ）指定日に、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用してマウスのＥｘ  ｖｉｖｏ撮像を遂行した。（図１６Ｂ）ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として示される。（図１６Ｃ）抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ウエスタンブロットにより、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。マウスのマクロファージ様細胞株のＪ７７４．Ａ２細胞を負の対照として使用した。
【００２９】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｄ。Ｌｍ−ワクチン後、２時間、４時間、および６時間での早い時点でのアンピシリン投与の結果。ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のパーセント（図１７Ａ）、ＳＨＩＩＮＥＦＥＫＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のパーセント（図１７Ｂ）、ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数（図１７Ｃ、およびＳＨＩＩＮＥＦＥＫＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数（図１７Ｄ）。
【図１７−２】同上。
【００３０】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂ。ＬＭ−ＰＳＡ−ＳＶＮ処置マウスの２時間、４時間、または６時間での早期ゲンタマイシン治療＋アンピシリンの２４時間追撃からの脾細胞。ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のパーセント（図１８Ａ）、ＳＨＩＩＮＥＦＥＫＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のパーセント（図１８Ｂ）。
【００３１】
【図１９】図１９。実施例１７のＬＭ処置スケジュール。
【００３２】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂ。早期アンピシリン処置が伴う、または伴わないＡＤＸＳ１１−００１治療の結果。ＴＣ１腫瘍の退縮（図２０Ａ）、および生存率（図２０Ｂ）。
【００３３】
【図２１】図２１。実施例１８のＬＭ処置スケジュール。
【００３４】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂ。早期アンピシリン処置が伴う、または伴わないＡＤＸＳ３１−１４２治療の結果。ＴＣ１腫瘍の退縮（図２２Ａ）、および生存率（図２２Ｂ）。
【００３５】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下の発明を実施するための形態では、本開示の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本明細書の開示内容は、本明細書において具体化されるように、これら特定の詳細を含まずに実施され得ることが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本開示を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【００３７】
１つの実施形態では、リステリア系免疫療法処方の投与に続く、疾患を有する対象内の組織上のリステリア株の残存を防止する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与に続いて、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、それにより前述の対象内の前述のリステリア株の前述の残存を防止する。
【００３８】
別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株は核酸分子を含み、前述の核酸分子は組み換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで前述の組み換えポリペプチドは、免疫原性タンパク質または免疫原性ペプチドに融合された異種抗原を含む。
【００３９】
別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株は核酸分子を含み、前述の核酸分子は組み換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで前述の組み換えポリペプチドは、異種抗原に融合されていない免疫原性タンパク質または免疫原性ペプチドを含む。
【００４０】
別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株またはリステリア系免疫療法処方は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５１７４８、ＰＣＴ／ＵＳ０９／４４５３８、ＰＣＴ／ＵＳ１５／４０９１１、ＰＣＴ／ＵＳ１５／４０８５５、ＰＣＴ／ＵＳ１０／２６２５７、ＰＣＴ／ＵＳ１０／５６５３４、ＰＣＴ／ＵＳ１２／５１１８７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１７５５９、ＰＣＴ／ＵＳ１５／２４０４８、ＰＣＴ／ＵＳ１１／５４６１３、ＰＣＴ／ＵＳ１２／２８７５７、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１６４５２、ＰＣＴ／ＵＳ１３／０３０５２１、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４７４１、ＰＣＴ／ＵＳ０５／３２６８２、ＰＣＴ／ＵＳ０８／０６０４８、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２４３５７、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９７３６、ＰＣＴ／ＵＳ０７／０６２９２、ＰＣＴ／ＵＳ０７／１０６３５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／０３０６７、ＰＣＴ／ＵＳ０９／４８０８５、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０００３６６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２５６９０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１６３４８、ＰＣＴ／ＵＳ１５／１８９１５、ＰＣＴ／ＵＳ１５／５５４６２、ＰＣＴ／ＵＳ１５／４０９２２、ＰＣＴ／ＵＳ１５／６６８８５、ＰＣＴ／ＵＳ１５／４０９１６、ＰＣＴ／ＵＳ１５／５５６０４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７２２０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６６８９６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２０５７１、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１６４５５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２１８２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４３０１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３２２、ＰＣＴ／ＵＳ０５／２８８９５、ＰＣＴ／ＵＳ０８／０４８６１に解説されており、それらは参照により本明細書に援用される。
【００４１】
別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性タンパク質または免疫原性ペプチドは、短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列を含む。
【００４２】
１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方は、本明細書に開示される免疫療法を受ける対象内の組織に、リステリア株が播種または付着することを防止する。
【００４３】
１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方の投与は、対象内の組織上のリステリア株の残存を防止する。１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方の投与は、対象内の組織上のリステリア株の播種を防止する。別の実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方の投与は、対象内の組織上のリステリア株のバイオフィルム形成を防止する。別の実施形態では、リステリア株は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の一部として対象に投与される。１つの実施形態では、対象は疾患を有している。別の実施形態では、対象は、疾患が無い健常な対象である。
【００４４】
別の実施形態において、対象に投与されるリステリア系免疫療法は、前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる。
【００４５】
１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方は、以下のうちの少なくとも１つを投与することを含む：クリンダマイシン、ゲンタマイシン、アジスロマイシン、バンコマイシン、ホスホマイシン、リネゾリド、リファンピシン、メロペナム  ボス（Ｍｅｒｏｐｅｎａｍ  Ｂｏｔｈ）、バクトリウム、モキシフロキサシン  ボス（Ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ  Ｂｏｔｈ）、ミノサイクリン、ダプゾン（ｄａｐｚｏｎｅ）、トリメトプリム／スルファ（バクトリウム（Ｂａｃｔｒｉｍ））、テリスロマイシン、ペフロキサシン、ベータ−ラクタム、フシジン酸、マクロライド、フルオロキノロン、アンピシリン、またはそれらの任意の組み合わせ。１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方は、少なくともアンピシリンの投与を含む。１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方は、少なくともゲンタマイシンの投与を含む。１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質処方は、少なくともアンピシリンとゲンタマイシンの投与を含む。
【００４６】
１つの実施形態では、前述の抗生物質処方の対象への投与は、前述の対象へ投与されるリステリア系免疫療法の結果として抗疾患免疫応答が開始された後に、前述の対象に投与することを含む。別の実施形態では、抗生物質処方の投与は、前述の対象の抗疾患免疫応答に干渉しない。別の実施形態では、抗生物質処方の投与は、抗原提示が発生した後の投与、および次のリステリア系免疫療法の投与後の投与を含む。
【００４７】
１つの実施形態では、本明細書に開示される抗生物質は、対象において、無傷の細胞内にはほとんど取り込まれない。１つの実施形態では、無傷の細胞内にほとんど取り込まれない抗生物質は、本明細書において、「細胞外抗生物質」と呼称される。当業者には、細胞外抗生物質には、クリンダマイシン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、ホスホマイシン、アジスロマイシン、リネゾリド、または当分野に公知の任意のその他の抗生物質が包含され得ることが明らかであろう。当業者には、細胞外抗生物質は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与の約８時間後、対象組織上にリステリア株が播種される前に対象に投与されることが明らかであろう。別の実施形態では、前述の細胞外抗生物質は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後約１〜２時間以内、対象組織上にリステリア株が播種される前に対象に投与される。別の実施形態では、前述の細胞外抗生物質は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後約２〜４時間以内、対象組織上にリステリア株が播種される前に対象に投与される。別の実施形態では、前述の細胞外抗生物質は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後約４〜６時間以内、対象組織上にリステリア株が播種される前に対象に投与される。別の実施形態では、前述の細胞外抗生物質は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後約６〜８時間以内、対象組織上にリステリア株が播種される前に対象に投与される。別の実施形態では、前述の細胞外抗生物質は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後約８〜１０時間以内、対象組織上にリステリア株が播種される前に対象に投与される。
【００４８】
１つの実施形態では、リステリア系免疫療法の投与後に対象に投与される抗生物質は、対象の細胞に侵入し、細胞内リステリアを除去することができる。別の実施形態では、対象の細胞に侵入し、たとえばリステリアなどの細胞内細菌を除去することができる抗生物質は、本明細書において、「細胞内抗生物質」と呼称される。当業者には、細胞内抗生物質には、リファンピシン、ベータ−ラクタム、アンピシリン、テリスロマイシン、マクロライド、フルオロキノロン、または当分野に公知の任意のその他の抗生物質が包含され得ることが明らかである。また当業者には、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与の約８時間後に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去することが明らかであろう。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２〜４時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約４〜６時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約６〜８時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約８〜１０時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１０〜１２時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１２〜１４時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１４〜１６時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１６〜１８時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１８〜２０時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２０〜２２時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２２〜２４時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２４〜４８時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、細胞内抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約４８〜７２時間以内に投与され、治療される対象からすべてのリステリア株を除去する。別の実施形態では、前述の細胞内抗生物質は、すべてのリステリア株が対象から根絶されるまで、しかし対象においてリステリア株により抗原が提示された後に、対象に投与される。
【００４９】
１つの実施形態では、細胞外抗生物質は、リステリア系免疫療法の投与後１日目に投与され、その後、細胞外抗生物質は２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に投与される。当業者には、リステリア株を対象から除去するために、初回投与後および必要に応じて細胞外抗生物質を反復投与することは、本明細書に開示される方法に包含され得ること、および本明細書に開示される方法により予期されることが明らかであろう。１つの実施形態では、対象の細胞に侵入する抗生物質を投与することで、前述の対象内のリステリア株の存在が除去される。１つの実施形態では、対象の細胞に侵入する抗生物質の投与は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法を使用して治療目的が達成された後に行われる。別の実施形態において、治療目的は、抗疾患免疫応答を獲得することを含む。別の実施形態において、治療目的は、腫瘍または癌の退縮の達成を含む。
【００５０】
１つの実施形態では、対象に抗疾患免疫応答を惹起させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、組み換え核酸分子を含む組み換えリステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前述の対象に投与する工程を含み、前述の核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ここで前述の融合ポリペプチドは、異種抗原またはその免疫原性断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸の配列を含み、ここで前述の各リステリアは、組み換えポリペプチドを発現し、それによって前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる。
【００５１】
１つの実施形態では、対象に抗疾患免疫応答を惹起させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、組み換え核酸分子を含む組み換えリステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前述の対象に投与する工程を含み、前述の核酸分子は、組み換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで前述の組み換えポリペプチドは、異種抗原に融合されていない短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸の配列を含み、ここで前述の各リステリアは、組み換えポリペプチドを発現し、それによって前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる。
【００５２】
別の実施形態では、対象に抗疾患免疫応答を惹起させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、組み換えリステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前述の対象に投与する工程を含み、前述のリステリア株は、組み換え核酸分子を含み、前述の核酸分子は、組み換えポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換えポリペプチドは、異種抗原またはその免疫原性断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸の配列を含み、前述のリステリアは、前述の組み換えポリペプチドを発現し、前述の核酸分子は、代謝酵素をコードする第二のオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換えリステリア株は、Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子をコードする内因性遺伝子において変異、ならびにＡｃｔＡ（ａｃｔＡ）タンパク質をコードする毒性遺伝子に変異を含み、それにより前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる。
【００５３】
１つの実施形態では、異種抗原またはその断片は、ネオエピトープ、ＰＳＡ抗原、キメラＨＥＲ２抗原、ＨＰＶ株１６  Ｅ７，、またはＨＰＶ株１８  Ｅ７、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００５４】
１つの実施形態では、ネオエピトープは以下の米国特許出願のうちのいずれか１つに開示されるように生成および取得される（ＵＳＳＮ  ６２／１６６，５９１；ＵＳＳＮ  ６２／１７４，６９２；ＵＳＳＮ  ６２／２１８，９３６；ＵＳＳＮ  ６２／１８４，１２５）。
【００５５】
１つの実施形態では、リステリア系免疫療法処方の投与後、対象内の組織上のリステリア株の残存を防止する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後に有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、それによって前述の対象内の前述のリステリア株の前述の残存が防止される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１時間〜約８時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１時間〜約６時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１時間〜約４時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１時間〜約１２時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２時間〜約８時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２時間〜約６時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２時間〜約４時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１時間〜約２４時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約２時間〜約２４時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約４時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約８時間以内に対象に投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法の投与後約１２時間以内に対象に投与される。
【００５６】
別の実施形態では、リステリア株は、１つ以上のネオエピトープをコードする１つ以上のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含み、前述の１つ以上のペプチドは免疫原性タンパク質またはペプチドに融合される。別の実施形態では、免疫原性タンパク質またはペプチドは、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）、短縮型ＡｃｔＡ（ｔＡｃｔＡ）、またはＰＥＳＴアミノ酸配列ペプチドを含む。
【００５７】
１つの実施形態では、組み換え弱毒化リステリア株が本明細書に開示され、リステリア株は１つ以上の個人用のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含み、ネオエピトープは、疾患または症状を有する対象の疾患または症状を持つ組織または細胞の中に存在する免疫原性エピトープを含む。別の実施形態では、１つ以上のネオエピトープは、疾患または症状を有する対象の疾患または症状を持つ組織または細胞の中に存在する。
【００５８】
別の実施形態では前述の疾患または症状を有する対象への前述のリステリア株の投与により前述の対象の疾患または症状を標的とした免疫応答が生じる。
【００５９】
別の実施形態では前述の株は前述の対象の疾患または症状を標的とした前述の対象向けの個別免疫療法ベクターである。
【００６０】
別の実施形態では、ペプチドは少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。
【００６１】
別の実施形態では、ペプチドは同じアミノ酸配列の１つ以上のネオエピトープの繰り返しを含む。
【００６２】
別の実施形態では前述のリステリア株は１つのネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は約１〜１００の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前述のリステリア株は約１〜５個、５〜１０個、１０〜１５個、１５〜２０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、４０〜５０個、５０〜６０個、６０〜７０個、７０〜８０個、８０〜９０個、９０〜１００個、５〜１５個、５〜２０個、５〜２５個、１５〜２０個、１５〜２５個、１５〜３０個、１５〜３５個、２０〜２５個、２０〜３５個、２０〜４５個、３０〜４５個、３０〜５５個、４０〜５５個、４０〜６５個、５０〜６５個、５０〜７５個、６０〜７５個、６０〜８５個、７０〜８５個、７０〜９５個、８０〜９５個、８０〜１０５個、または９５〜１０５個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前述のリステリア株は約５０〜１００個の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、前述のリステリア株は最大で約１００個のネオエピトープを含む。
【００６３】
別の実施形態では、リステリア株は約１００を超えるネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高約１０のネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高約２０のネオエピトープを含む。別の実施形態では、リステリア株は最高約５０のネオエピトープを含む。あるいは、リステリア株は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のネオエピトープを含む。
【００６４】
本明細書に記述される一実施形態では、検出された突然変異の各々の側に隣接する約５〜３０の範囲のアミノ酸の組み込みが生成される。追加的にまたは代替的に、様々なサイズのネオエピトープインサートが約８〜２７の範囲のアミノ酸配列長さで挿入される。追加的にまたは代替的に、様々なサイズのネオエピトープインサートが約５〜５０の範囲のアミノ酸配列長さで挿入される。
【００６５】
別の実施形態では、ネオエピトープ配列は腫瘍特異的、転移特異的、細菌感染特異的、ウイルス感染特異的、およびこれらの任意の組み合せである。追加的にまたは代替的に、ネオエピトープ配列は、炎症特異的、免疫調整分子エピトープ特異的、Ｔ細胞特異的、自己免疫疾患特異的、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）特異的、およびこれらの任意の組み合わせである。
【００６６】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープが直鎖状ネオエピトープを含む。加えて、または代わりに１つ以上のネオエピトープが溶媒曝露エピトープを含む。
【００６７】
別の実施形態では１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む。
【００６８】
１つの実施形態では、以下の要素を含むキメラタンパク質をコードする核酸構築物が本明細書において開示される：第一のネオエピトープアミノ酸配列に融合したＮ末端短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）であって、前述の第一のネオエピトープＡＡ配列は、リンカー配列を介して第二のネオエピトープＡＡ配列に動作可能に連結されており、前述の第二のネオエピトープＡＡ配列は、リンカー配列を介して少なくとも１個の追加的ネオエピトープアミノ酸配列に動作可能に連結されており、および最後のネオエピトープは、リンカー配列を介してＣ末端のヒスチジンタグに動作可能に連結されている、Ｎ末端短縮型ＬＬＯ。別の実施形態では前述の要素はＮ末端からＣ末端へと配置されているか、または機能的であるように連結されている。別の実施形態では各核酸構築物は前述の６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグをコードする配列の後に少なくとも１つの終止コドンを含む。別の実施形態では各核酸構築物は前述の６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む。別の実施形態では前述の６×ヒスチジンタグは機能的であるようにＮ末端でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに連結されている。別の実施形態では前述のリンカーは４×グリシンリンカーである。
【００６９】
別の実施形態では前述の核酸構築物は少なくとも１つの追加ネオエピトープアミノ酸配列を含む。別の実施形態では前述の核酸構築物は２〜１０個の追加ネオエピトープ、１０〜１５個の追加ネオエピトープ、１０〜２５個の追加ネオエピトープ、２５〜４０個の追加ネオエピトープ、または４０〜６０個の追加ネオエピトープを含む。別の実施形態では前述の核酸構築物は約１〜１０個、約１０〜３０個、約３０〜５０個、約５０〜７０個、約７０〜９０個、または最大で約１００個のネオエピトープを含む。別の実施形態では各ネオエピトープアミノ酸配列は１〜１０アミノ酸長、１０〜２０アミノ酸長、２０〜３０アミノ酸長、または３０〜４０アミノ酸長である。別の実施形態では各ネオエピトープアミノ酸配列は２１アミノ酸長であるか、または「２１−ｍｅｒ」ネオエピトープ配列である。
【００７０】
別の実施形態では前述の核酸構築物は、リンカー配列に隣接するネオエピトープの２１アミノ酸に融合したＮ末端短縮型ＬＬＯ、およびその後に続く、別のリンカーに隣接し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ｘＨｉｓタグと、オープンリーディングフレームを閉じる２つの終止コドンにより終わる少なくとも１つの第二のネオエピトープを含む、組み換えポリペプチド、キメラタンパク質、または融合ポリペプチドをコードする：すなわち、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−第一の２１ｍｅｒ−４ｘグリシンリンカーＧ１−第二の２１ｍｅｒ−４ｘグリシンリンカーＧ２−…−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ｘＨｉｓタグ−２×終止コドンをコードする。別の実施形態では上記の構築物の発現はｈｌｙプロモーターによって引き起こされる。
【００７１】
「核酸」という用語およびその文法的な同等物は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含む場合があるがこれに限定されない分子を指す場合があることを当業者は理解するであろう。この用語はＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【００７２】
１つの実施形態では、本開示組成物および方法は、疾患を治療、予防、阻害、または抑制するために使用される。別の実施形態では、本明細書に開示される疾患は、腫瘍もしくは癌、感染性疾患、前癌状態、自己免疫性疾患、または代謝障害を含む。本明細書で使用される場合、「癌」および「腫瘍」という用語は、すべて同一の意味と性質を有する場合があることは、当業者には明らかであろう。
【００７３】
別の実施形態では、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、腫瘍抗原は異種抗原である。別の実施形態では、腫瘍抗原は自己抗原である。別の実施形態では、感染性疾患抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、感染性疾患抗原は異種抗原である。
【００７４】
別の実施形態では、感染症疾患は、寄生虫感染症、細菌感染症、慢性ウイルス感染症、または潜伏ウイルス感染症を含む。
【００７５】
別の実施形態では、本明細書に開示される疾患は、新生物を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される疾患は、異形成を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される疾患は、非悪性の過形成状態を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される疾患は、子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）、膣上皮内新生物（ＶＩＮ）、もしくは肛門上皮内新生物（ＡＩＮ）、または当分野に公知の任意のその他の新生物を含む。
【００７６】
１つの実施形態では、前癌状態は、異形成を含む。別の実施形態では、前癌状態は、新生物を含む。別の実施形態では、
【００７７】
１つの実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって誘導される免疫応答は治療的な応答である。別の実施形態では、これは予防的な免疫応答である。別の実施形態では、本明細書に提示される疾患または症状を患う対象において免疫応答を誘導するための、当分野において利用可能な方法を超える、増強された免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は、対象を悩ます感染性疾患の除去をもたらす。
【００７８】
１つの実施形態において、感染性疾患は、以下の病原体のいずれか１つによって発生するものであるが、これらに限定されない。リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当分野で既知の任意の他の感染性疾患。
【００７９】
１つの実施形態では、感染性疾患は、病原性の原虫または蠕虫により引き起こされる。別の実施形態では、病原性の原虫感染症および蠕虫感染症としては、以下が挙げられる：アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、ニューモシスティス・カリニ、バベシア症、ランブル鞭毛虫症、旋毛虫病、フィラリア症、住血吸虫症、線虫症、吸虫症、または肝蛭症、および条虫（サナダムシ）症が挙げられる。
【００８０】
別の実施形態では、感染性疾患は、家畜の感染性疾患である。別の実施形態では家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態ではこれらの疾患に口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
本明細書に開示される方法を使用して、任意の感染性疾患を治療することができ、１つの実施形態では、当該感染性疾患は、細菌性、ウイルス性、寄生虫性、微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、微生物性（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、病原性、またはそれらの組み合わせの感染症であることを理解されたい。別の実施形態では、本開示の方法は、対象の細菌性、ウイルス性、寄生虫性、微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、微生物性（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、病原性、もしくはそれらの組み合わせの感染症を阻害または抑制するための方法である。別の実施形態では、本開示は、対象の細菌性、ウイルス性、寄生虫性、微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、微生物性（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、病原性、またはそれらの組み合わせの感染症に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を惹起させる方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、Ｔｈ１非応答性対象の細菌性、ウイルス性、寄生虫性、微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、微生物性（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）、病原性、またはそれらの組み合わせの感染症に対するＴｈ１免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの実施形態では、感染症はウイルス性であり、１つの実施形態では、ＨＩＶである。１つの実施形態では、感染症は細菌性であり、１つの実施形態ではマイコバクテリウムであり、１つの実施形態では、結核である。１つの実施形態では、感染症は真核生物性であり、１つの実施形態ではプラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）であり、１つの実施形態では、マラリアである。１つの実施形態では、感染性疾患または本明細書に開示される方法において使用される抗原は、当分野に公知の任意のもの、または以下の米国出願に解説される任意のものである（ＵＳＳＮ  １３／８７６，８１０；ＵＳＳＮ  １４／２０４，８０６；または米国出願番号９，０８４，７４７。これらすべて、その全体で参照により本明細書に援用される。
【００８２】
本明細書で開示した方法および組成物の標的である癌は、別の実施形態ではメラノーマである。別の実施形態では、この癌は肉腫である。別の実施形態では、この癌は上皮性悪性腫瘍である。別の実施形態では、この癌は中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。別の実施形態では、この癌は神経膠腫である。別の実施形態では、この癌は生殖細胞腫瘍である。別の実施形態では、この癌は絨毛癌である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態ではこの癌は大腸腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態ではこの癌は胃腺癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣表面上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態ではこの癌は口腔扁平上皮細胞癌である。別の実施形態では、この癌は非小細胞性肺癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮内膜癌である。別の実施形態ではこの癌は前立腺癌である。別の実施形態では、この癌は非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、この癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、この癌はカポジである。別の実施形態では、この癌は肉腫である。別の実施形態では、この癌は別の上皮性悪性腫瘍または肉腫である。別の実施形態ではこの癌は黒色腫である。
【００８３】
別の実施形態では、本明細書に開示される腫瘍または癌は、膵臓の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、卵巣の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、胃の腫瘍または癌である。別の実施形態では、癌は、膵臓の癌性病巣である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、膀胱の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、頭頸部の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、結腸の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、肺の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、卵巣の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、子宮の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、甲状腺の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、甲状腺の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、肝臓の腫瘍または癌である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、腎臓の腫瘍または癌である。別の実施形態では、癌は、グリア芽腫である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、子宮内膜の腫瘍または癌である。別の実施形態では、癌は転移性である。１つの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、本明細書に記述される癌のいずれかに関連する固形腫瘍、または本明細書に記述される癌のいずれかから生じる固形腫瘍を治療することができる。別の実施形態では、腫瘍は、ウイルムス腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は線維形成性小円形細胞腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍または癌は、当分野に公知の任意のその他の腫瘍または癌である。
【００８４】
また別の実施形態では、本開示の組成物および方法は、処置に続くエスケープ変異の発生を防止する。別の実施形態では、腫瘍または癌を患う対象に、無憎悪生存期間をもたらす組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、癌または腫瘍に対する免疫化を対象に行うための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、癌または腫瘍に対する免疫化を対象に行うための組成物および方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、癌は転移である。
【００８５】
別の実施形態では、感染性疾患は、以下の病原体のうちの任意の１つにより引き起こされる疾患であるが、しかしこれらに限定されない：ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患。
【００８６】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸配列は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅方法を使用してクローニングされる。別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のＤＮＡへと変換する。ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。
【００８７】
１つの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、本明細書に開示されるプラスミドを含む。
【００８８】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、たとえばリステリアなどの他の細菌宿主、酵母、ならびにたとえばＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株およびＨｅＬａ細胞株ならびに骨髄腫細胞株などの様々な高次真核生物細胞をはじめとする様々な宿主細胞へと形質転換される。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸配列は、各宿主に適した発現制御配列に動作可能に連結されている。プロモーター／調節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードするプラスミドは、追加的なプロモーター調節要素、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞については、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、等々に由来するプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【００８９】
一実施形態では、「動作可能に連結される」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、任意のコード配列に対して転写が開始されるような様式で位置することを意味する。一般的に、これはプロモーターおよび転写開始または始動配列がコード領域の５’側に配置されることを意味する。別の実施形態では「動作可能に連結される」という用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能することができるような関係にある。コード配列に「動作可能に連結される」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結される。別の実施形態では、「動作可能に連結した」という用語は、各々がタンパク質またはペプチドをコードする転写ユニット内でのいくつかのオープンリーディングフレームの結合を指し、これにより結果的に意図されるように機能するキメラタンパク質またはポリペプチドの発現をもたらす。
【００９０】
一実施形態では、本開示はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチド、またはその断片もしくはドメインを結合するアミノ酸配列を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。一般的に、リンカーは、ポリペプチドと共有結合して融合ポリペプチドを形成するアミノ酸配列である。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によってコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換え型信号から翻訳されたアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、そのリンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【００９１】
一つの実施形態では、「組み換え型ポリペプチド」および「融合ポリペプチド」という用語、ならびにそれらの文法的変形体は、本明細書において相互交換可能に使用される。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、たとえばクローニングおよび適切な配列の制限、または以下に検討される方法による直接化学合成をはじめとする任意の適した方法により調製されてもよい。あるいは、部分配列をクローニングし、適切な部分配列を適切な制限酵素を使用して分割してもよい。次いで断片を連結し、望ましいＤＮＡ配列を生産してもよい。一実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産することができる。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第一の断片の５’端は第二の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第三のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。抗原はプラスミドへと連結される。
【００９２】
当業者であれば、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はすべて、本明細書における意図されるその使用目的に対し、同じ意味と資質を有していることを理解するであろう。「抗原」、「抗原性ペプチド」、「抗原性ポリペプチド」、「抗原断片」という用語、またはそれらの文法的均等物は、本明細書で交換可能に使用され、また宿主の細胞の表面上でＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上に負荷および提示され、かつ宿主の免疫細胞によって識別または検出することができるポリペプチドまたはペプチド（組み換えペプチドを含む）を包含する場合があり、これによってポリペプチド、ペプチドまたはこれを提示する細胞に対する免疫応答の開始をもたらすことを当業者は理解するであろう。同様に、免疫応答は、宿主の中の同一のポリペプチドまたはペプチドを発現する腫瘍または癌細胞などの病的な細胞を含む他の細胞にも延長される場合がある。
【００９３】
１つの実施形態では、抗原は外来であってもよく、すなわち、宿主に対して異種であってもよく、本明細書では「異種抗原」と称される。別の実施形態では、異種抗原は、前述の抗原を組み換えによって発現する本明細書に開示されるリステリア株に対して異種である。別の実施形態では、異種抗原は、宿主および、前述の抗原を組み換えによって発現する本明細書に開示されるリステリア株に対して異種である。別の実施形態では、抗原は、自己抗原であり、これは宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない。当業者にとっては当然のことながら、異種抗原ならびに自己抗原は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または血管形成抗原を包含しうる。さらに、異種抗原は、感染性疾患抗原を包含する場合がある。別の実施形態では、「異種抗原」、「異種ポリペプチド」、および「抗原性ポリペプチド」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００９４】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるペプチドが誘導された抗原、または本明細書に開示される組み換えポリペプチドに含有される抗原は、腫瘍関連抗原であり、１つの実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの１つである：ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行癌と関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸癌と関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳癌と関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸癌と関連付けられたＣＥＡ（癌胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺癌と関連付けられたＰＳＡ抗原。別の実施形態では本明細書において提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これらは１つの実施形態ではＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合せである。当分野において公知の他の腫瘍関連抗原もまた本開示において予期される。
【００９５】
１つの実施形態において、ペプチドは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号１２／９４５，３８６号明細書に記載されるキメラＨｅｒ２抗原に由来する。１つの実施形態において、組み換えポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号１２／９４５，３８６号明細書に記載されるキメラＨｅｒ２抗原を含む。
【００９６】
別の実施形態では、ペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ７（ＨＰＶ１６株またはＨＰＶ１８株のどちらかに由来）、ＨＰＶ−Ｅ６（ＨＰＶ１６株またはＨＰＶ１８株のどちらかに由来）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、ＳＣＣＥ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、バキュロウイルスアポトーシス阻害性反復配列含有タンパク質５（ＢＩＲＣ５）、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、またはこれらの組み合せから選択される抗原から誘導され、または組み換えポリペプチドは当該抗原を含有する。
【００９７】
別の実施形態では、本明細書に開示されるＨＰＶ抗原は、乳頭腫疾患（いぼ）と関連付けられたＨＰＶ抗原である。
【００９８】
１つの実施形態では、「組み換えリステリア」および「弱毒化生リステリア」という用語は本明細書において相互交換可能に使用され、および少なくとも１つの弱毒化の変異、欠失または不活化を備え、本明細書に具現化される短縮型ＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴアミノ酸配列に融合された抗原（ＰＳＡまたはｃＨＥＲ２）のうちの１つの融合タンパク質を発現するリステリアを指す。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは組み換えリステリア・モノサイトゲネスである。
【００９９】
「その抗原性部分」、「その断片」、「その免疫原性部分」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドに関して本明細書で交換可能に使用され、また本明細書に記述されるように単独で、または融合タンパク質の状況でのいずれかで、宿主によって検出されるものの中にまたは一部の実施形態の中に存在する場合、免疫応答の搭載をもたらすドメインまたは区分を含むその組み換え型形態を含むタンパク質、ポリペプチド、ペプチドを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。
【０１００】
「核酸」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、または「ヌクレオチド分子」という用語は本明細書において相互交換可能に使用され、および当業者に認識されるように、少なくとも２個の一つなぎの塩基−糖−リン酸塩の組み合わせを包含し得る。当該用語は、１つの実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「核酸」という用語およびその文法的な同等物は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含む場合があるがこれに限定されない分子を指す場合があることを当業者は理解するであろう。この用語はＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。また当業者には、当該用語が核酸重合体の単量体単位を包含し得ることが認識されるであろう。たとえばＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそれに引用された参照文献）。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態であってよく、またはこれらの群の誘導体であってよい。加えて、これらの形態のＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖、二本鎖、三重鎖、または四重鎖であってもよい。当該用語は、同じ塩基であるが、他の種類の骨格を含み得る人工核酸も包含し得る。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は当業者に知られており、例えばＮｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載される。核酸の生産および使用が当業者に知られており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載される。
【０１０１】
「アミノ酸」または「アミノ酸」という用語は、２０の自然発生的なアミノ酸のほか、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトランスフェラーゼが含まれる、翻訳後にインビボで改変されることがよくあるアミノ酸、ならびに、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニチンを含むがこれに限定されないその他の珍しいアミノ酸を含むものとして理解される。その上、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含みうる。
【０１０２】
当業者であれば、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という用語は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生物体のゲノムの部分を包含し得ることを認識するであろう。別の実施形態ではＯＲＦの開始末端および終止末端はｍＲＮＡの末端と同等ではなく、それらの末端は通常ｍＲＮＡ内に含まれる。１つの実施形態ではＯＲＦは遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、１つの実施形態では内在性ポリペプチドとのオープンリーディングフレームとして機能可能であるようにゲノムに組み込まれた核酸分子は、内在性ポリペプチドと同一のオープンリーディングフレームとしてゲノムに組み込まれた核酸分子である。
【０１０３】
当業者であれば、「内因性」という用語は、基準生物体内で発生した、もしくは基準生物体内に由来する物品、または基準生物体内の要因から生じた物品を包含し得ることを認識するであろう。例えば、内因性は天然を指す。
【０１０４】
また当業者であれば、「断片」という用語は、タンパク質／ポリペプチドに関連した場合、全長タンパク質または全長ポリペプチドよりも短い、または全長タンパク質または全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含有するタンパク質またはポリペプチドを包含し得ることを認識するであろう。１つの実施形態では、断片はＮ末端断片である。別の実施形態では、断片はＣ末端断片である。さらに別の実施形態では、断片は、タンパク質またはペプチドの配列内部分である。当業者であれば、本明細書に開示される断片が機能性断片であり、免疫原性断片を包含し得ることを理解するであろう。１つの実施形態において、断片は、５アミノ酸超を有する。別の実施形態では、断片は、１０〜２０アミノ酸、２０〜５０アミノ酸、５０〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３５０アミノ酸、または３５０〜５００アミノ酸を有する。
【０１０５】
代わりの実施形態では、「断片」という用語は、全長核酸分子または全長タンパク質よりも短いか、または全長核酸分子または全長タンパク質よりも少ないヌクレオチドまたはアミノ酸を含有する核酸配列またはアミノ酸配列を指す。１つの実施形態では、断片は、５’末端断片または（タンパク質に対しては）Ｎ末端断片である。別の実施形態では、断片は、３’末端断片または（タンパク質に対しては）Ｃ末端断片である。さらに別の実施形態では、断片は、核酸分子またはタンパク質の配列内部分をコードする。１つの実施形態では、断片は、５個よりも多いヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、断片は、１０〜２０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、２０〜５０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、５０〜１００個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、１００〜２００個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、２００〜３５０個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、３５０〜５００個もしくは５００〜１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、断片は、タンパク質またはペプチドの配列内部分である。当業者であれば、本明細書に開示される断片が機能性断片であり、免疫原性断片を包含し得ることを理解するであろう。当業者であれば、本開示の意味の内にある「機能性」という用語が、タンパク質、ペプチド、核酸、生物活性を示すその断片またはバリアントの本来の能力を包含し得ることを認識するであろう。かかる生物活性は、本明細書に開示されるように、融合タンパク質の一部として使用され得る実例として使用された場合、免疫応答を惹起させる可能性を有することを包含し得る。かかる生物学的機能は、相互作用の相手、例えば、膜結合受容体へのその結合特性、またはその三量体形成特性を包含し得る。本開示内容の機能性断片および機能性バリアントの場合には、これらの生物学的機能は、例えば、特異性または選択性に関しては実際には変化しうるが、基本的な生物学的機能は保持される。
【０１０６】
当業者であれば、「断片」または「機能性断片」という用語が、単独で、または前述の免疫原性断片を発現する組み換えリステリア株を含有する医薬組成物の一部として対象に投与されたときに免疫応答を惹起することができる免疫原性断片を包含し得ることを認識するであろう。別の実施形態では、当業者は理解するであろうように、また本明細書にさらに開示されるように、機能的断片は生物活性を有する。
【０１０７】
別の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドの組み換え型核酸骨格は、以下の配列番号１を含有する。
ｇｇａｇｔｇｔａｔａｃｔｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｔｇａａｇｔｇｃｔｔｃａｔｇｔｇｇｃａｇｇａｇａａａａａａｇｇｃｔｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｇｔｃａｇｃａｇａａｔａｔｇｔｇａｔａｃａｇｇａｔａｔａｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔａｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃｇａａｃｇｇｇｇｃｇｇａｇａｔｔｔｃｃｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａｇｇａａｇａｔａｃｔｔａａｃａｇｇｇａａｇｔｇａｇａｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａａｇｃｃｇｔｔｔｔｔｃｃａｔａｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｃａａｇｃａｔｃａｃｇａａａｔｃｔｇａｃｇｃｔｃａａａｔｃａｇｔｇｇｔｇｇｃｇａａａｃｃｃｇａｃａｇｇａｃｔａｔａａａｇａｔａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｔｔｔｃｇｇｔｔｔａｃｃｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔａｔｇｇｃｃｇｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃａｔｔｃｃａｃｇｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｇｇｃａｇｔｔｃｇｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇａｃｔｇｔａｔｇｃａｃｇａａｃｃｃｃｃｃｇｔｔｃａｇｔｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔｔａｔｃｃｇｇｔａａｃｔａｔｃｇｔｃｔｔｇａｇｔｃｃａａｃｃｃｇｇａａａｇａｃａｔｇｃａａａａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔａａｔｔｇａｔｔｔａｇａｇｇａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｔｃａｔｇｃｇｃｃｇｇｔｔａａｇｇｃｔａａａｃｔｇａａａｇｇａｃａａｇｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｃｃａａｇｃｃａｇｔｔａｃｃｔｃｇｇｔｔｃａａａｇａｇｔｔｇｇｔａｇｃｔｃａｇａｇａａｃｃｔｔｃｇａａａａａｃｃｇｃｃｃｔｇｃａａｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃａｇａｇｃａａｇａｇａｔｔａｃｇｃｇｃａｇａｃｃａａａａｃｇａｔｃｔｃａａｇａａｇａｔｃａｔｃｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａａａａｔａｔｔｔｃｔａｇｃｃｃｔｃｃｔｔｔｇａｔｔａｇｔａｔａｔｔｃｃｔａｔｃｔｔａａａｇｔｔａｃｔｔｔｔａｔｇｔｇｇａｇｇｃａｔｔａａｃａｔｔｔｇｔｔａａｔｇａｃｇｔｃａａａａｇｇａｔａｇｃａａｇａｃｔａｇａａｔａａａｇｃｔａｔａａａｇｃａａｇｃａｔａｔａａｔａｔｔｇｃｇｔｔｔｃａｔｃｔｔｔａｇａａｇｃｇａａｔｔｔｃｇｃｃａａｔａｔｔａｔａａｔｔａｔｃａａａａｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｃａａａｃｇｇｔａｔｔｔｇｇｃａｔｔａｔｔａｇｇｔｔａａａａａａｔｇｔａｇａａｇｇａｇａｇｔｇａａａｃｃｃａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇａｃｔａｇｔｔｃｔａｇａｔｔｔａｔｃａｃｇｔａｃｃｃａｔｔｔｃｃｃｃｇｃａｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａａａｔａｃｔｔｔａｇｇｇａａａａａｔｇｇｔｔｔｔｔｇａｔｔｔｇｃｔｔｔｔａａａｇｇｔｔｇｔｇｇｔｇｔａｇａｃｔｃｇｔｃｔｇｃｔｇａｃｔｇｃａｔｇｃｔａｇａａｔｃｔａａｇｔｃａｃｔｔｔｃａｇａａｇｃａｔｃｃａｃａａｃｔｇａｃｔｃｔｔｔｃｇｃｃａｃｔｔｔｔｃｔｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｔｔｔｇｔｔｇｇｔｔｔａｔｃｔｇｇａｔａａｇｔａａｇｇｃｔｔｔｃａａｇｃｔｃａｃｔａｔｃｃｇａｃｇａｃｇｃｔａｔｇｇｃｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔａａｔｔｔｃｃｇｃｔｇｃｇｃｔａｔｃｃｇａｔｇａｃａｇａｃｃｔｇｇａｔｇａｃｇａｃｇｃｔｃｃａｃｔｔｇｃａｇａｇｔｔｇｇｔｃｇｇｔｃｇａｃｔｃｃｔｇａａｇｃｃｔｃｔｔｃａｔｔｔａｔａｇｃｃａｃａｔｔｔｃｃｔｇｔｔｔｇｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｔａｔｔａｔｔｇｔｔａｔｔｃｇｇａｃｃｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃａａｃａｔｔｇｃｔａｔｔａｇｇｔｃｔｇｃｔｔｔｇｔｔｃｇｔａｔｔｔｔｔｃａｃｔｔｔａｔｔｃｇａｔｔｔｔｔｃｔａｇｔｔｃｃｔｃａａｔａｔｃａｃｇｔｇａａｃｔｔａｃｔｔｃａｃｇｔｇｃａｇｔｔｔｃｇｔａｔｃｔｔｇｇｔｃｃｃｇｔａｔｔｔａｃｃｔｃｇｃｔｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｇｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｇｔｔｔａｇａｃｔｇｇａａｔｃｔｔｃｇｃｔａｔｃｔｇｔｃｇｃｔｇｃａａａｔａｔｔａｔｇｔｃｇｇｇｇｔｔａａｔｃｇｔａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃａｇｔａａｔｇａａａａｃｔａｃｃａｔｃａｔｃｇｃａｃｇｃａｔａａａｔｃｔｇｔｔｔａａｔｃｃｃａｃｔｔａｔａｃｔｃｃｃｔｃｃｔｃｇｔｇａｔａｃｇｃｔａａｔａｃａａｃｃｔｔｔｔｔａｇａａｃａａｇｇａａａａｔｔｃｇｇｃｃｔｔｃａｔｔｔｔｃａｃｔａａｔｔｔｇｔｔｃｃｇｔｔａａａａａｔｔｇｇａｔｔａｇｃａｇｔｔａｇｔｔａｔｃｔｔｃｔｔａａｔｔａｇｃｔａａｔａｔａａｇａａａａａａｔａｔｔｃａｔｇａａｔｔａｔｔｔｔａａｇａａｔａｔｃａｃｔｔｇｇａｇａａｔｔａａｔｔｔｔｔｃｔｃｔａａｃａｔｔｔｇｔｔａａｔｃａｇｔｔａａｃｃｃｃａａｃｔｇｃｔｔｃｃｃａａｇｃｔｔｃａｃｃｃｇｇｇｃｃａｃｔａａｃｔｃａａｃｇｃｔａｇｔａｇｔｇｇａｔｔｔａａｔｃｃｃａａａｔｇａｇｃｃａａｃａｇａａｃｃａｇａａｃｃａｇａａａｃａｇａａｃａａｇｔａａｃａｔｔｇｇａｇｔｔａｇａａａｔｇｇａａｇａａｇａａａａａａｇｃａａｔｇａｔｔｔｃｇｔｇｔｇａａｔａａｔｇｃａｃｇａａａｔｃａｔｔｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａａａａａｇｃｇａｔａｔａｃｔａｇａｔａｔａａｃｇａａａｃａａｃｇａａｃｔｇａａｔａａａｇａａｔａｃａａａａａａａｇａｇｃｃａｃｇａｃｃａｇｔｔａａａｇｃｃｔｇａｇａａａｃｔｔｔａａｃｔｇｃｇａｇｃｃｔｔａａｔｔｇａｔｔａｃｃａｃｃａａｔｃａａｔｔａａａｇａａｇｔｃｇａｇａｃｃｃａａａａｔｔｔｇｇｔａａａｇｔａｔｔｔａａｔｔａｃｔｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａｃｔｔａａａｔａｔｃｔｇｔａａａｃｃｃａｔｔａｔａｔｃｇｇｇｔｔｔｔｔｇａｇｇｇｇａｔｔｔｃａａｇｔｃｔｔｔａａｇａａｇａｔａｃｃａｇｇｃａａｔｃａａｔｔａａｇａａａａａｃｔｔａｇｔｔｇａｔｔｇｃｃｔｔｔｔｔｔｇｔｔｇｔｇａｔｔｃａａｃｔｔｔｇａｔｃｇｔａｇｃｔｔｃｔａａｃｔａａｔｔａａｔｔｔｔｃｇｔａａｇａａａｇｇａｇａａｃａｇｃｔｇａａｔｇａａｔａｔｃｃｃｔｔｔｔｇｔｔｇｔａｇａａａｃｔｇｔｇｃｔｔｃａｔｇａｃｇｇｃｔｔｇｔｔａａａｇｔａｃａａａｔｔｔａａａａａｔａｇｔａａａａｔｔｃｇｃｔｃａａｔｃａｃｔａｃｃａａｇｃｃａｇｇｔａａａａｇｔａａａｇｇｇｇｃｔａｔｔｔｔｔｇｃｇｔａｔｃｇｃｔｃａａａａａａａａｇｃａｔｇａｔｔｇｇｃｇｇａｃｇｔｇｇｃｇｔｔｇｔｔｃｔｇａｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇｃｇａｔｔｃａｃｇａａａａｔｃａａｇａｔａｃａｔｔｔａｃｇｃａｔｔｇｇａｃａｃｃａａａｃｇｔｔｔａｔｃｇｔｔａｔｇｇｔａｃｇｔａｔｇｃａｇａｃｇａａａａｃｃｇｔｔｃａｔａｃａｃｔａａａｇｇａｃａｔｔｃｔｇａａａａｃａａｔｔｔａａｇａｃａａａｔｃａａｔａｃｃｔｔｃｔｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔｇａｔａｔｔｃａｃａｃｇｇａａａａａｇａａａｃｔａｔｔｔｃａｇｃａａｇｃｇａｔａｔｔｔｔａａｃａａｃａｇｃｔａｔｔｇａｔｔｔａｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｇｔｔａａｔｔａｔｃａａａｔｃｔｇａｔａａａｇｇｔｔａｔｃａａｇｃａｔａｔｔｔｔｇｔｔｔｔａｇａａａｃｇｃｃａｇｔｃｔａｔｇｔｇａｃｔｔｃａａａａｔｃａｇａａｔｔｔａａａｔｃｔｇｔｃａａａｇｃａｇｃｃａａａａｔａａｔｃｔｃｇｃａａａａｔａｔｃｃｇａｇａａｔａｔｔｔｔｇｇａａａｇｔｃｔｔｔｇｃｃａｇｔｔｇａｔｃｔａａｃｇｔｇｃａａｔｃａｔｔｔｔｇｇｇａｔｔｇｃｔｃｇｔａｔａｃｃａａｇａａｃｇｇａｃａａｔｇｔａｇａａｔｔｔｔｔｔｇａｔｃｃｃａａｔｔａｃｃｇｔｔａｔｔｃｔｔｔｃａａａｇａａｔｇｇｃａａｇａｔｔｇｇｔｃｔｔｔｃａａａｃａａａｃａｇａｔａａｔａａｇｇｇｃｔｔｔａｃｔｃｇｔｔｃａａｇｔｃｔａａｃｇｇｔｔｔｔａａｇｃｇｇｔａｃａｇａａｇｇｃａａａａａａｃａａｇｔａｇａｔｇａａｃｃｃｔｇｇｔｔｔａａｔｃｔｃｔｔａｔｔｇｃａｃｇａａａｃｇａａａｔｔｔｔｃａｇｇａｇａａａａｇｇｇｔｔｔａｇｔａｇｇｇｃｇｃａａｔａｇｃｇｔｔａｔｇｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｇｃｃｔａｃｔｔｔａｇｔｔｃａｇｇｃｔａｔｔｃａａｔｃｇａａａｃｇｔｇｃｇａａｔａｔａａｔａｔｇｔｔｔｇａｇｔｔｔａａｔａａｔｃｇａｔｔａｇａｔｃａａｃｃｃｔｔａｇａａｇａａａａａｇａａｇｔａａｔｃａａａａｔｔｇｔｔａｇａａｇｔｇｃｃｔａｔｔｃａｇａａａａｃｔａｔｃａａｇｇｇｇｃｔａａｔａｇｇｇａａｔａｃａｔｔａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｃａａａｇｃｔｔｇｇｇｔａｔｃａａｇｔｇａｔｔｔａａｃｃａｇｔａａａｇａｔｔｔａｔｔｔｇｔｃｃｇｔｃａａｇｇｇｔｇｇｔｔｔａａａｔｔｃａａｇａａａａａａａｇａａｇｃｇａａｃｇｔｃａａｃｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｇｔｃａｇａａｔｇｇａａａｇａａｇａｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔａｔａｔｔａｇｃｇａａａａａａｇｃｇａｔｇｔａｔａｃａａ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ｇｇａａｇａａａｔｇｇｔｇｇｃａｔｔｃａａｃｔｔｇｃｔａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｇｔｔｇｃｔａｔｃｇａｔｃａｔｔａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａｃｇａｇａａａｇｃｔａｔａｔａａａｇｇｃｇｃｔｇａｃａｇｃｔｔｃｇｔｔｔａａｔｔｔａｇａａｃｇｔａｃａｔｔｔａｔｔｃａａｇａａａｃｔｃｔａａａｃａａａｔｔｇｇｃａｇａａｃｇｃｃｃｃａａａａｃｇｇａｃｃｃａｃａａｃｔｃｇａｔｔｔｇｔｔｔａｇｃｔａｃｇａｔａｃａｇｇｃｔｇａａａａｔａａａａｃｃｃｇｃａｃｔａｔｇｃｃａｔｔａｃａｔｔｔａｔａｔｃｔａｔｇａｔａｃｇｔｇｔｔｔｇｔｔｔｔｔｃｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔａｇｃｔｔａａｔｔｇｃｔｔａｔａｔｔｔａｃｃｔｇｃａａｔａａａｇｇａｔｔｔｃｔｔａｃｔｔｃｃａｔｔａｔａｃｔｃｃｃａｔｔｔｔｃｃａａａａａｃａｔａｃｇｇｇｇａａｃａｃｇｇｇａａｃｔｔａｔｔｇｔａｃａｇｇｃｃａｃｃｔｃａｔａｇｔｔａａｔｇｇｔｔｔｃｇａｇｃｃｔｔｃｃｔｇｃａａｔｃｔｃａｔｃｃａｔｇｇａａａｔａｔａｔｔｃａｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｇｇｃｃｔａｔｔａａｔｇｔｇａｃｔｔｔｔｇｔｇｃｃｃｇｇｃｇｇａｔａｔｔｃｃｔｇａｔｃｃａｇｃｔｃｃａｃｃａｔａａａｔｔｇｇｔｃｃａｔｇｃａａａｔｔｃｇｇｃｃｇｇｃａａｔｔｔｔｃａｇｇｃｇｔｔｔｔｃｃｃｔｔｃａｃａａｇｇａｔｇｔｃｇｇｔｃｃｃｔｔｔｃａａｔｔｔｔｃｇｇａｇｃｃａｇｃｃｇｔｃｃｇｃａｔａｇｃｃｔａｃａｇｇｃａｃｃｇｔｃｃｃｇａｔｃｃａｔｇｔｇｔｃｔｔｔｔｔｃｃｇｃｔｇｔｇｔａｃｔｃｇｇｃｔｃｃｇｔａｇｃｔｇａｃｇｃｔｃｔｃｇｃｃｔｔｔｔｃｔｇａｔｃａｇｔｔｔｇａｃａｔｇｔｇａｃａｇｔｇｔｃｇａａｔｇｃａｇｇｇｔａａａｔｇｃｃｇｇａｃｇｃａｇｃｔｇａａａｃｇｇｔａｔｃｔｃｇｔｃｃｇａｃａｔｇｔｃａｇｃａｇａｃｇｇｇｃｇａａｇｇｃｃａｔａｃａｔｇｃｃｇａｔｇｃｃｇａａｔｃｔｇａｃｔｇｃａｔｔａａａａａａｇｃｃｔｔｔｔｔｔｃａｇｃｃｇｇａｇｔｃｃａｇｃｇｇｃｇｃｔｇｔｔｃｇｃｇｃａｇｔｇｇａｃｃａｔｔａｇａｔｔｃｔｔｔａａｃｇｇｃａｇｃｇｇａｇｃａａｔｃａｇｃｔｃｔｔｔａａａｇｃｇｃｔｃａａａｃｔｇｃａｔｔａａｇａａａｔａｇｃｃｔｃｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃａｔｃｃｇｃｔｇｔｃｇｃａａａａｔｇｇｇｔａａａｔａｃｃｃｃｔｔｔｇｃａｃｔｔｔａａａｃｇａｇｇｇｔｔｇｃｇｇｔｃａａｇａａｔｔｇｃｃａｔｃａｃｇｔｔｃｔｇａａｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｇｔｔｔｔｔａｃａｃｃａａｇｔｃｔｇｔｔｃａｔｃｃｃｃｇｔａｔｃｇａｃｃｔｔｃａｇａｔｇａａａａｔｇａａｇａｇａａｃｃｔｔｔｔｔｔｃｇｔｇｔｇｇｃｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇｃｃａｔｔｃａａｃａｇａａｔａａｃｃｔｇｔｔａａｇｇｔｃａｃｇｔｃａｔａｃｔｃａｇｃａｇｃｇａｔｔｇｃｃａｃａｔａｃｔｃｃｇｇｇｇｇａａｃｃｇｃｇｃｃａａｇｃａｃｃａａｔａｔａｇｇｃｇｃｃｔｔｃａａｔｃｃｃｔｔｔｔｔｇｃｇｃａｇｔｇａａａｔｃｇｃｔｔｃａｔｃｃａａａａｔｇｇｃｃａｃｇｇｃｃａａｇｃａｔｇａａｇｃａｃｃｔｇｃｇｔｃａａｇａｇｃａｇｃｃｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔｃｔｇｃａｔｃａｃｃａｔｇｃｃｃｇｔａｇｇｃｇｔｔｔｇｃｔｔｔｃａｃａａｃｔｇｃｃａｔｃａａｇｔｇｇａｃａｔｇｔｔｃａｃｃｇａｔａｔｇｔｔｔｔｔｔｃａｔａｔｔｇｃｔｇａｃａｔｔｔｔｃｃｔｔｔａｔｃａｃｇｇａｃａａｇｔｃａａｔｔｔｃｃｇｃｃｃａｃｇｔａｔｃｔｃｔｇｔａａａａａｇｇｔｔｔｔｇｔｇｃｔｃａｔｇｇａａａａｃｔｃｃｔｃｔｃｔｔｔｔｔｔｃａｇａａａａｔｃｃｃａｇｔａｃｇｔａａｔｔａａｇｔａｔｔｔｇａｇａａｔｔａａｔｔｔｔａｔａｔｔｇａｔｔａａｔａｃｔａａｇｔｔｔａｃｃｃａｇｔｔｔｔｃａｃｃｔａａａａａａｃａａａｔｇａｔｇａｇａｔａａｔａｇｃｔｃｃａａａｇｇｃｔａａａｇａｇｇａｃｔａｔａｃｃａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａａｔ（配列番号１）。
【０１０８】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリア株は、全長ＬＬＯポリペプチドを含み、１つの実施形態では、それは溶血性である。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、非溶血性ＬＬＯポリペプチドを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＬＯ断片である。別の実施形態では、ポリペプチドは、短縮型ＬＬＯである。別の実施形態では、オリゴペプチドは完全ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、ポリペプチドは、当分野で公知の任意のＬＬＯタンパク質またはその断片である。
【０１０９】
当業者であれば、「Ｎ末端ＬＬＯタンパク質」、「ＬＬＯ断片」、および「短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）」という用語はすべて、本明細書において意図されるその使用目的に対して同じ意味と素質を有しており、ゆえに本明細書において相互交換可能に使用されることを認識するであろう。
【０１１０】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片は、本明細書に開示される組成物および方法で利用される。１つの実施形態では、短縮型ＬＬＯタンパク質は、ポリペプチドを発現する本明細書で開示されているエピソーム発現ベクターによってコードされ、１つの実施形態では当該ポリペプチドは抗原であり、別の実施形態では血管形成因子であり、また別の実施形態では抗原および血管形成因子の両方である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＮ末端断片である。
【０１１１】
１つの実施形態では、短縮型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）のアミノ酸配列は、以下の配列番号２を含む。
M  K  K  I  M  L  V  F  I  T  L  I  L  V  S  L  P  I  A  Q  Q  T  E  A  K  D  A  S  A  F  N  K  E  N  S  I  S  S  M  A  P  P  A  S  P  P  A  S  P  K  T  P  I  E  K  K  H  A  D  E  I  D  K  Y  I  Q  G  L  D  Y  N  K  N  N  V  L  V  Y  H  G  D  A  V  T  N  V  P  P  R  K  G  Y  K  D  G  N  E  Y  I  V  V  E  K  K  K  K  S  I  N  Q  N  N  A  D  I  Q  V  V  N  A  I  S  S  L  T  Y  P  G  A  L  V  K  A  N  S  E  L  V  E  N  Q  P  D  V  L  P  V  K  R  D  S  L  T  L  S  I  D  L  P  G  M  T  N  Q  D  N  K  I  V  V  K  N  A  T  K  S  N  V  N  N  A  V  N  T  L  V  E  R  W  N  E  K  Y  A  Q  A  Y  P  N  V  S  A  K  I  D  Y  D  D  E  M  A  Y  S  E  S  Q  L  I  A  K  F  G  T  A  F  K  A  V  N  N  S  L  N  V  N  F  G  A  I  S  E  G  K  M  Q  E  E  V  I  S  F  K  Q  I  Y  Y  N  V  N  V  N  E  P  T  R  P  S  R  F  F  G  K  A  V  T  K  E  Q  L  Q  A  L  G  V  N  A  E  N  P  P  A  Y  I  S  S  V  A  Y  G  R  Q  V  Y  L  K  L  S  T  N  S  H  S  T  K  V  K  A  A  F  D  A  A  V  S  G  K  S  V  S  G  D  V  E  L  T  N  I  I  K  N  S  S  F  K  A  V  I  Y  G  G  S  A  K  D  E  V  Q  I  I  D  G  N  L  G  D  L  R  D  I  L  K  K  G  A  T  F  N  R  E  T  P  G  V  P  I  A  Y  T  T  N  F  L  K  D  N  E  L  A  V  I  K  N  N  S  E  Y  I  E  T  T  S  K  A  Y  T  D  G  K  I  N  I  D  H  S  G  G  Y  V  A  Q  F  N  I  S  W  D  E  V  N  Y  D（配列番号２）。
【０１１２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を含む：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号３）。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号３に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号３のホモログである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号３のバリアントである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号３の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号３のアイソフォームである。
【０１１３】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において使用されるＬＬＯタンパク質は、以下の配列を含有する：
【０１１４】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１３１２８、配列番号４、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７に示される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、それらは細菌によってＬＬＯが分泌されるときにそれから切断される。したがって、この実施形態では全長活性型ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本明細書に開示されるワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号４に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号４のホモログである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号４のバリアントである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号４の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、本明細書に開示される配列番号４のアイソフォームである。
【０１１５】
本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、次の配列を含む：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号５）。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号５に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号５のホモログである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号５のバリアントである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号５の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号５のアイソフォームである。
【０１１６】
１つの実施形態では、内因性ＬＬＯタンパク質のアミノ酸配列は、以下の配列番号６を含有する。
【０１１７】
M  K  K  I  M  L  V  F  I  T  L  I  L  V  S  L  P  I  A  Q  Q  T  E  A  K  D  A  S  A  F  N  K  E  N  S  I  S  S  V  A  P  P  A  S  P  P  A  S  P  K  T  P  I  E  K  K  H  A  D  E  I  D  K  Y  I  Q  G  L  D  Y  N  K  N  N  V  L  V  Y  H  G  D  A  V  T  N  V  P  P  R  K  G  Y  K  D  G  N  E  Y  I  V  V  E  K  K  K  K  S  I  N  Q  N  N  A  D  I  Q  V  V  N  A  I  S  S  L  T  Y  P  G  A  L  V  K  A  N  S  E  L  V  E  N  Q  P  D  V  L  P  V  K  R  D  S  L  T  L  S  I  D  L  P  G  M  T  N  Q  D  N  K  I  V  V  K  N  A  T  K  S  N  V  N  N  A  V  N  T  L  V  E  R  W  N  E  K  Y  A  Q  A  Y  S  N  V  S  A  K  I  D  Y  D  D  E  M  A  Y  S  E  S  Q  L  I  A  K  F  G  T  A  F  K  A  V  N  N  S  L  N  V  N  F  G  A  I  S  E  G  K  M  Q  E  E  V  I  S  F  K  Q  I  Y  Y  N  V  N  V  N  E  P  T  R  P  S  R  F  F  G  K  A  V  T  K  E  Q  L  Q  A  L  G  V  N  A  E  N  P  P  A  Y  I  S  S  V  A  Y  G  R  Q  V  Y  L  K  L  S  T  N  S  H  S  T  K  V  K  A  A  F  D  A  A  V  S  G  K  S  V  S  G  D  V  E  L  T  N  I  I  K  N  S  S  F  K  A  V  I  Y  G  G  S  A  K  D  E  V  Q  I  I  D  G  N  L  G  D  L  R  D  I  L  K  K  G  A  T  F  N  R  E  T  P  G  V  P  I  A  Y  T  T  N  F  L  K  D  N  E  L  A  V  I  K  N  N  S  E  Y  I  E  T  T  S  K  A  Y  T  D  G  K  I  N  I  D  H  S  G  G  Y  V  A  Q  F  N  I  S  W  D  E  V  N  Y  D  P  E  G  N  E  I  V  Q  H  K  N  W  S  E  N  N  K  S  K  L  A  H  F  T  S  S  I  Y  L  P  G  N  A  R  N  I  N  V  Y  A  K  E  C  T  G  L  A  W  E  W  W  R  T  V  I  D  D  R  N  L  P  L  V  K  N  R  N  I  S  I  W  G  T  T  L  Y  P  K  Y  S  N  K  V  D  N  P  I  E  （配列番号６）。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号６に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号６のホモログである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号６のバリアントである。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号６の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号６のアイソフォームである。
【０１１８】
１つの実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法のＬＬＯポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＺＰ＿０１９４２３３０、ＥＢＡ２１８３３に記載のあるリステリア・モノサイトゲネス１０４０３Ｓ株に由来するか、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載のある核酸配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で使用するためのＬＬＯ配列は、リステリア・モノサイトゲネス由来であり、これは一実施形態では、４ｂ  Ｆ２３６５株（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＹＰ＿０１２８２３）、ＥＧＤ−ｅ株（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４６３７３３）、または当該技術で既知のその他任意のリステリア・モノサイトゲネス株である。
【０１１９】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で使用するためのＬＬＯ配列は、フラボバクテリウム属細菌ＨＴＣＣ２１７０（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＺＰ＿０１１０６７４７またはＥＡＲ０１４３３；一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によりコードされる）由来である。一実施形態では、アルベオリシンなどの他の種のＬＬＯと相同的なタンパク質は、一実施形態では、パエニバチルス・アルベイ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｐ２３５６４またはＡＡＡ２２２２４；一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ６２７０９によってコードされる）で見られるが、本明細書で開示されている組成物および方法で使用されうる。こうしたその他の相同性タンパク質は当該技術分野で既知である。
【０１２０】
別の実施形態では、既知のリシンを含む他種に由来するＬＬＯのホモログ、またはその断片を使用して、ＬＬＯと、本明細書に開示される組成物および方法の抗原との融合タンパク質を生成してもよい。
【０１２１】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴドメインを含有する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＬＬＯ断片は、推定ＰＥＳＴドメインを含有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含有するＬＬＯ断片は、本明細書に開示される組成物の一部として、または本明細書に開示される方法において利用される。
【０１２２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はカルボキシ末端に活性化ドメインを含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はシステイン４８４を含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）を含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は非溶血性断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ配列は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【０１２３】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、５２９  ＡＡ完全長のＬＬＯタンパク質のうち最初のおよそ４００〜４４１  ＡＡを含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書に開示されたＬＬＯタンパク質のうちＡＡ  １〜４４１に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書に開示されたＬＬＯタンパク質のうちＡＡ  １〜４２０に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ２０〜４４２  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書に開示されたＬＬＯタンパク質のうちＡＡ  ２０〜４４２に対応する。別の実施形態では、システイン４８４を含む活性化ドメインを伴わない任意のΔＬＬＯ、特にシステイン４８４を伴わない任意のΔＬＬＯが、本明細書に開示される方法および組成物に適している。
【０１２４】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の４００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の３００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の２００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の１００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質のうち最初の５０  ＡＡに対応し、これは一実施形態では１つ以上のＰＥＳＴ配列を含む。
【０１２５】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、非溶血性ＬＬＯである。別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯは、１個以上のＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯは、１個以上の推定ＰＥＳＴ配列を含む。
【０１２６】
別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用するＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合のように、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はない。
【０１２７】
１つの実施形態では、本明細書に提供される組み換えリステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含む。１つの実施形態では、腫瘍関連抗原はＫＬＫ３ポリペプチドまたはその断片を含む。１つの実施形態では、本明細書に提供される組み換えリステリア株は、ＫＬＫ３タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１２８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を含む：
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号7；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３２９７）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号７のホモログである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号７のバリアントである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号７の断片である。
【０１２９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を含む：
【０１３０】
ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＹＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号８のホモログである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号８のバリアントである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号８の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号８の断片である。
【０１３１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を含む：
【０１３２】
ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５９９９５．１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号９のホモログである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号９のバリアントである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号９の断片である。
【０１３３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を含むヌクレオチド分子によりコードされる：
【０１３４】
ｇｇｔｇｔｃｔｔａｇｇｃａｃａｃｔｇｇｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｃａａａｇｇａｔｃｔａｇｇｃａｃｇｔｇａｇｇｃｔｔｔｇｔａｔｇａａｇａａｔｃｇｇｇｇａｔｃｇｔａｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃｃｔａｇａｔｇａａｇｔｃｔｃｃａｔｇａｇｃｔａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｔｃｃａｇｇｇｔｇａｔｃｔａｇｔａａｔｔｇｃａｇａａｃａｇｃａａｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｃａｃａｇｃｔｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｇｇｇｔｔｇｔｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃａｔｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｃａｇｃｃｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔｇａａｇｇｔｔｔｔａｔａｇｇｇｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃａｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｔｇｃａｇｇａｇａｇｇｇａｇｃｃａｇｃｃｃｔｇａｃｔｇｔｃａａｇｃｔｇａｇｇｃｔｃｔｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａｃｃｃａｇｃａｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇａｃａｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｃｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃａｃｔｔｃａａｇｃｃｃａｔａｃｃｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｔａｔｔｇｃａａｃａｇｔｃｃｔｃａｃｔｃｃｃａｃａｃｃａｇｇｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｃｔｔａｃｃｃｃａｇａａｃｔｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｔｇｃｃｃａｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｔｔａｃｔａａａｇｇｇｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｇｇｇｃｔｃａａａａｃｃｔｃｃａａｇｇａｃｃｔｃｔｃｔｃａａｔｇｃｃａｔｔｇｇｔｔｃｃｔｔｇｇａｃｃｇｔａｔｃａｃｔｇｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｔｃａａｔｃｃｔａｔｃａｃａｇｔｃｔａｃｔｇａｃｔｔｔｔｃｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｇａｇｔｇｔｃｃａａｃｃｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｃｃｔｔｇａｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔｃｃｃａａｔｃｔｔｇｃｃｃｔａｇｇａｔａｃｃｃａｇａｔｇｃｃａａｃｃａｇａｃａｃｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔａｇｃｃａｇｇｃｔａｔｃｔｇｇｃｃｔｇａｇａｃａａｃａａａｔｇｇｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｇｇｃａａｔｇｇｇａｃｔｃｔｇａｇａａｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｇａｃｔｃｔｔａｇｃｃｃｃａｇａｃｔｃｔｔｃａｔｔｃａｇｔｇｇｃｃｃａｃａｔｔｔｔｃｃｔｔａｇｇａａａａａｃａｔｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｇｃｃａｃａａｃｔｇｃｃａｇｃｔｃｔｃｔｇａｇｔｃｃｃｃａａａｔｃｔｇｃａｔｃｃｔｔｔｔｃａａａａｃｃｔａａａａａｃａａａａａｇａａａａａｃａａａｔａａａａｃａａａａｃｃａａｃｔｃａｇａｃｃａｇａａｃｔｇｔｔｔｔｃｔｃａａｃｃｔｇｇｇａｃｔｔｃｃｔａａａｃｔｔｔｃｃａａａａｃｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃａｇｃａａｃｔｇａａｃｃｔｃｇｃｃａｔａａｇｇｃａｃｔｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｇｃａｃｃｃｃｔｔａｔｃｃｃｃｔｃａｇａａｔｃｃａｃａａｃｔｔｇｔａｃｃａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｔｇａｇｔａｇｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃａｇａｇｇａａｔａａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｃａｇｇａｔａａｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇａｇａｇｇｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃａｃａｔｇｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｇａｃｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｃｃａｔａｔｃｔｃｃｃｃｃｔｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃｔｃｔｃｔａｇｃｃａｇｔｇｔｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｇｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃａｃｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｃｔｇａａｃａｃａｃｇｃａｃｇｇｇａｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａａａａｇｇａａｇｇｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃａｃａｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｃａｇｇｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇａｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａａｃｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃａｔｃｔｃｔａｃｔａａａａａｔａｃａａａａａａｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｃｇｃａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｃｃｃａｇｃｔａｃｔｃａｇｇａｇｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇａａｔｔｇｃａｔｔｇａａｃｃｔｇｇａｇｇｔｔｇａｇｇｔｔｇｃａｇｔｇａｇｃｃｇａｇａｃｃｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｔｇａｃａｇａｇｔｇａｇａｃｔｃｃｇｃｃｔｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇｇａａｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｃｃｔｇａｔｇｔｇｔｇｔｇｇｇｔａｔｇａｇｇｇｔａｔｇａｇａｇｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃａｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃａｇｇａｃａｔｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｔｔｇｇｇａｇａｃａｃａｇａｇａａｇｇｇｃｔｇｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇａｇｇｇｇｃａａｔｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇａａｇｇａｇａａｇｇｇｇｇａａｇｇａａａａｃａｇｇｇｔａｔｇｇｇｇｇａａａｇｇａｃｃｃｔｇｇｇｇａｇｃｇａａｇｔｇｇａｇｇａｔａｃａａｃｃｔｔｇｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃａｇｇｃｔａｃｃｔａｃｃｃａｃｔｔｇｇａａａｃｃｃａｃｇｃｃａａａｇｃｃｇｃａｔｃｔａｃａｇｃｔｇａｇｃｃａｃｔｃｔｇａｇｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃａｃｔｃａｇｃｔｃｃａａａｇｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｔｔｔｃｔｃｔｃｃｃａｃａｃｔｔｔａｔｃａｔｃｃｃｃｃｇｇａｔｔｃｃｔｃｔｃｔａｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇａｃｔｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃａｃｔｔｔｃｔｇｃｃｔｇｇｔｔｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｇｇｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｃｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｇｔａｔｔｔｔｃｇｇｃｔｃａｃｃｔｔｇｔｔｔｇｔｃａｃｔｇｔｔｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｔｔｃｔｇｔａｔｃｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｃｃｔｃｔｃａｃａｃｔｇｃｔｇｔｔｔｃｃｃａａｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｔｇｇｃｃｔｇａａｃｔｇｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｔｔｃｔｃａｃｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃｇｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｃｇｔｃｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇａｇｃｃｃａｇａｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇａｃａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｃｃａａｇｇａａｃｃａｇｇｔｇｇｇｇｔｃｃａｇｃｃｃａｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｇｔａｇｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｔｇａｇｔｃａｔｃｃｃｔａｃｔｃｃｃａａｇａｔｃｔｔｇａｇｇｇａａａｇｇｔｇａｇｔｇｇｇａｃｃｔｔａａｔｔｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｇｔｃｔａｇａａｇｃｃａａｃａａｇｇｃｇｔｃｔｇｃｃｔｃｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｔｇｔａｇｃｃａｔｇｃｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｃａｔｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｔｔｃｔｔｔｇａｃｔｃｃｃｔｃａａｇｇｃａａｔａｇｇｔｔａｔｔｃｔｔａｃａｇｃａｃａａｃｔｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔｃａｇｃａｃａｃｇｇｔｔａｃｔａｇｇｃａｃｃｔｇｃｔａｔｇｃａｃｃｃａｇｃａｃｔｇｃｃｃｔａｇａｇｃｃｔｇｇｇａｃａｔａｇｃａｇｔｇａａｃａｇａｃａｇａｇａｇｃａｇｃｃｃｃｔｃｃｃｔｔｃｔｇｔａｇｃｃｃｃｃａａｇｃｃａｇｔｇａｇｇｇｇｃａｃａｇｇｃａｇｇａａｃａｇｇｇａｃｃａｃａａｃａｃａｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｇａｇｇｔｇａｔｃａｇｇｃｔｃｔｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇａａｇｇｇｇｔｇｇｇｇａｇｔｇｔｇａｃｔｇｇｇａｇｇａｇａｃａｔｃｃｔｇｃａｇａａｇｇｔｇｇｇａｇｔｇａｇｃａａａｃａｃｃｔｇｃｇｃａｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｇｃｇｇｃａｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｃａｇａｇｇｇａａｃａｇｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇｃｃｔａｇａｇｇｇｃｇｔｃａｇｇａｇｃａｇａｇａｇｇａｇｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｔｇａａｇｇａｔｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇａａｃａａａｇｇａｃｃｃｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃａｃａｇｇａｇｇａｃａｃｔｇｃｔｔｔｔｃｃｔｃｔｇａｇｇａｇｔｃａｇｇａａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇａａｇｃａｇｇａｃａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｔｃａｇｇｔｇｔｃｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔａｔｇｇｇａｔｃａｇａｃｔｇｃａｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｃａｇｃａｇｇｇａｔｇｔｇｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｔｇｇｇｇｃｔｇａｃｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｃａｔｔｇｔｃｃｃｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｔａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｃｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｃａｔｔｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔ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【０１３５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を含む：ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＷＶＩＬＩＴＥＬＴＭＰＡＬＰＭＶＬＨＧＳＬＶＰＷＲＧＧＶ（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０１１２１８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１１のホモログである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１１のバリアントである。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１１の断片である。
【０１３６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によりコードされる：
【０１３７】
ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔｇｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｇａｔｇｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｇｔｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｇａｇｇｔｇｔｃｔａｇｔｃａｇａｇａｇｔａｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００１０３００４７）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１２の残基４２−７５８によりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１２のホモログによりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１２のバリアントによりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１２の異性体によりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１２の断片によりコードされる。
【０１３８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を含むヌクレオチド分子によりコードされる：
【化１】
2018537511.tif 000002
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１３のホモログによりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１３のバリアントによりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１３の異性体によりコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号１３の断片によりコードされる。
【０１３９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる：ＢＣ００５３０７、ＡＪ３１０９３８、ＡＪ３１０９３７、ＡＦ３３５４７８、ＡＦ３３５４７７、Ｍ２７２７４、およびＭ２６６６３。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は上記ＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる。
【０１４０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列によってコードされる：ＮＭ＿００１０３００５０、ＮＭ＿００１０３００４９、ＮＭ＿００１０３００４８、ＮＭ＿００１０３００４７、ＮＭ＿００８４８、ＡＪ４５９７８２、ＡＪ５１２３４６、またはＡＪ４５９７８４。本明細書において提供される方法および組成物の別個の実施形態により各可能性が表される。一つの実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列がＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲ（配列番号５３）を欠いている、本明細書に記述された配列のいずれかの変異体によってコードされる。
【０１４１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに示される配列を含む：Ｘ１３９４３、Ｘ１３９４２、Ｘ１３９４０、Ｘ１３９４１、およびＸ１３９４４。
【０１４２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３ペプチドである。別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは当該技術分野で既知の任意の他のＫＬＫ３ペプチドの断片である。
【０１４３】
「ＫＬＫ３ペプチド」とは、別の実施形態では、全長ＫＬＫ３タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを欠くＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３シグナルペプチドを除いてＫＬＫ３配列全体を含むＫＬＫ３タンパク質を指す。「ＫＬＫ３シグナル配列」とは、別の実施形態では、本質的にＫＬＫ３タンパク質上に見られる任意のシグナル配列を指す。別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のＫＬＫ３タンパク質はいずれのシグナル配列も含まない。
【０１４４】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で使用するためのＫＬＫ３ペプチダーゼの供給源であるカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３タンパク質）は、ＰＳＡタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はＰ−３０抗原タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はガンマセミノプロテインタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はカリクレイン３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はセメノゲラーゼタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はセミニンタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知のＫＬＫ３タンパク質の任意の他のタイプである。
【０１４５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライスバリアント１  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライスバリアント２  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライスバリアント３  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写バリアント１  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写バリアント２  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写バリアント３  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写バリアント４  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写バリアント５  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は転写バリアント６  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はスプライスバリアントＲＰ５  ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のスプライスバリアントＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他の転写バリアントＫＬＫ３タンパク質である。
【０１４６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は成熟ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質はプロＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、リーダー配列は、本明細書に提供される方法および組成物の成熟ＫＬＫ３タンパク質から除去されている。
【０１４７】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のＫＬＫ３ペプチドの供給源であるＫＬＫ３タンパク質は、ヒトＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は霊長類ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は当該技術分野で既知の任意の他の種のＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、上記ＫＬＫ３タンパク質の１つは、「ＫＬＫ３タンパク質」と当分野では呼称される。
【０１４８】
一実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＡタンパク質に融合された短縮型ＬＬＯを含む組み換え型ポリペプチドは、次の配列によりコードされる：
【０１４９】
【化２】
2018537511.tif 000003
別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４のホモログによりコードされる。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４のバリアントによりコードされる。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４の異性体によりコードされる。一実施形態では、融合タンパク質内の「ｃｔｃｇａｇ」配列は、腫瘍抗原をプラスミド内の短縮型ＬＬＯに結合するために使用されるＸｈｏ  Ｉ制限部位を表す。
【０１５０】
別の実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＡタンパク質に融合された短縮型ＬＬＯを含む組み換え型ポリペプチドは、次の配列を含む：
【０１５１】
【化３】
2018537511.tif 000004
別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は、配列番号１５のホモログである。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は、配列番号１５のバリアントである。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は、配列番号１５の異性体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は、配列番号１５の断片である。
【０１５２】
別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。
【０１５３】
１つの実施形態では、本明細書に開示される異種抗原は、キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原またはＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質（ｃＨＥＲ２）である。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２は、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片および１つの細胞内の断片を保有し、ここで別の実施形態では、キメラタンパク質は、３個のＨ２Ｄｑと、参照により本明細書にその全体で援用される米国特許出願第１２／９４５，３８６号明細書に記載されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープを少なくとも１７個保有する。別の実施形態ではそのＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合しており、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、リステリア−モノサイトゲネスのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１個のアミノ酸に融合されており、および本明細書に開示される組み換えリステリアの染色体から発現される一方で、追加の抗原は、本明細書に開示される組み換えリステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、リステリア−モノサイトゲネスのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１個のアミノ酸に融合されており、および本明細書に開示される組み換えリステリアのプラスミドから発現される一方で、追加の抗原は、本明細書に開示される組み換えリステリアの染色体から発現される。別の実施形態において、本明細書に開示される組み換えリステリアは、リステリアモノサイトゲネスの弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡである。
【０１５４】
別の実施形態では、キメラＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１６に記載される以下の核酸配列によりコードされる：
【０１５５】
ａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｔｃｔａｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇｇａａａｃｃｔｇｇａａｃｔｃａｃｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃａａｔｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｇａｔａｔｃｃａｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｃｔｃａｔｃｇｃｔｃａｃａａｃｃａａｇｔｇａｇｇｃａｇｇｔｃｃｃａｃｔｇｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｇａｔｔｇｔｇｃｇａｇｇｃａｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｇａｃａａｃｔａｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔａｇａｃａａｔｇｇａｇａｃｃｃｇｃｔｇａａｃａａｔａｃｃａｃｃｃｃｔｇｔｃａｃａｇｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｇａａｇｃｃｔｃａｃａｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｇｇｇｔｃｔｔｇａｔｃｃａｇｃｇｇａａｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃｃａｇｇａｃａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔａｔｃｃａｇｇａｇｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａａｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｇｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇａｇａｇｃｔｔｔｇａｔｇｇｇｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃａａｃａｃｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｔｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇａａｇａｇａｔｃａｃａｇｇｔｔａｃｃｔａｔａｃａｔｃｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｃｃｔｃａｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｇａａｃｃｔｇｃａａｇｔａａｔｃｃｇｇｇｇａｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｃａａｔｇｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａａｇｇｇｃｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｇａａｃｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃａｃｃａｔａａｃａｃｃｃａｃｃｔｃｔｇｃｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇｇｇａｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｃｇｇａａｃｃｃｇｃａｃｃａａｇｃｔｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃｔｇｃｃａａｃｃｇｇｃｃａｇａｇｇａｃｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃｃｇｇａａｇｔａｃａｃｇａｔｇｃｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａａａｃｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｃｔｇａｃａｃｃｔａｇｃｇｇａｇｃｇａｔｇｃｃｃａａｃｃａｇｇｃｇｃａｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａａａｇａｇａｃｇｇａｇｃｔｇａｇｇａａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａｇｔｃｔａｃａａｇｇｇｃａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇａｇａａｔｇｔｇａａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｃｃａｔｃａａａｇｔｇｔｔｇａｇｇｇａａａａｃａｃａｔｃｃｃｃｃａａａｇｃｃａａｃａａａｇａａａｔｃｔｔａｇａｃｇａａｇｃａｔａｃｇｔｇａｔｇｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃａｔａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｇｃｔｔａｔｇｃｃｃｔａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｇａｃ（配列番号１６）。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１６のホモログによりコードされる。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１６のバリアントによりコードされる。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１６の異性体によりコードされる。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１６の断片によりコードされる。
【０１５６】
１つの実施形態では、キメラＨＥＲ２タンパク質は、以下の配列を含む：
【０１５７】
ＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤ（配列番号１７）。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１７のホモログである。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１７のバリアントである。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１７の異性体である。別の実施形態では、ｃＨＥＲ２タンパク質は、配列番号１７の断片である。
【０１５８】
１つの実施形態では本明細書において提供される方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、そのシグナル配列の疎水性が高いため、そのシグナル配列の削除によりそのＨｅｒ２断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。
【０１５９】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質の断片はその膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含まない。１つの実施形態では、そのＴＭの疎水性が高いため、そのＴＭの削除によりそのＨｅｒ−２断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。
【０１６０】
１つの実施形態では、本明細書に開示される異種抗原に融合された、またはその断片に融合されたＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換えポリペプチドが本明細書に開示される。別の実施形態では、本開示の方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質は、ヒトのＨｅｒ２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はマウスＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はラットＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は霊長類Ｈｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は、当分野に公知の任意のその他の動物種またはその組み合わせのＨｅｒ−２キメラタンパク質である。
【０１６１】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株のＬｍｄｄＡ２４４Ｇは、ＬＬＯタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む内因性核酸に融合されたｃＨＥＲ２をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含む（配列番号１８）。
【０１６２】
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃｇｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｔｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｃｔｇａａｇｇｔａａｃｇａａａｔｔｇｔｔｃａａｃａｔａａａａａｃｔｇｇａｇｃｇａａａａｃａａｔａａａａｇｃａａｇｃｔａｇｃｔｃａｔｔｔｃａｃａｔｃｇｔｃｃａｔｃｔａｔｔｔｇｃｃｔｇｇｔａａｃｇｃｇａｇａａａｔａｔｔａａｔｇｔｔｔａｃｇｃｔａａａｇａａｔｇｃａｃｔｇｇｔｔｔａｇｃｔｔｇｇｇａａｔｇｇｔｇｇａｇａａｃｇｇｔａａｔｔｇａｔｇａｃｃｇｇａａｃｔｔａｃｃａｃｔｔｇｔｇａａａａａｔａｇａａａｔａｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｇｇｇｃａｃｃａｃｇｃｔｔｔａｔｃｃｇａａａｔａｔａｇｔａａｔａａａｇｔａｇａｔａａｔｃｃａａｔｃｇａａｇｔｃｇａｃＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣ
（配列番号１８）、ここで大文字の配列は、ｃＨＥＲ２をコードする核酸配列を表し、小文字の配列は内因性ＬＬＯタンパク質をコードする配列を表し、下線が引かれた「ｇｔｃｇａｃ」配列は、腫瘍抗原と内因性ＬＬＯをライゲートするために使用されるＳａｌＩ制限酵素部位を表す。１つの実施形態では、内因性ＬＬＯ−ｃＨＥＲ１８融合物は、配列番号１８のホモログである。別の実施形態では、内因性ＬＬＯ−ｃＨＥＲ１８融合物は、配列番号１８のバリアントである。別の実施形態では、内因性ＬＬＯ−ｃＨＥＲ１８融合物は、配列番号１８の異性体である。
【０１６３】
１つの実施形態では、ｃＨＥＲ２と内因性ＬＬＯの間の融合物のアミノ酸配列は、以下の配列番号１９を含む：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥＶＤＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤ（配列番号１９）。１つの実施形態では、内因性ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号１９のホモログである。別の実施形態では、内因性ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号１９のバリアントである。別の実施形態では、内因性ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号１９の異性体である。
【０１６４】
１つの実施形態では、ＬｍｄｄＡ１６４は、ｃＨＥＲ２に融合されたｔＬＬＯをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含み、前述の核酸配列は、以下の配列番号２０を含む：
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣ（配列番号２０）を含み、この中で大文字の配列はｃＨＥＲ２をコードし、小文字の配列はｔＬＬＯをコードし、また下線付きの「ｃｔｃｇａｇ」配列は腫瘍抗原をプラスミドの切断ＬＬＯに連結するために使用されるＸｈｏ  Ｉ制限部位を表す。別の実施形態では、プラスミドｐＡｄｖ１６８は、配列番号２０を含む。���つの実施形態では、短縮型ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号２０のホモログである。別の実施形態では、短縮型ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号２０のバリアントである。別の実施形態では、短縮型ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号２０の異性体である。
【０１６５】
１つの実施形態では、ｃＨｅｒ２に融合されたｔＬＬＯを含む組み換え型タンパク質のアミノ酸配列は、以下の配列番号２１を含む：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤ（配列番号２１）。１つの実施形態では、短縮型ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号２１のホモログである。別の実施形態では、短縮型ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号２１のバリアントである。別の実施形態では、短縮型ＬＬＯ−ｃＨＥＲ２融合物は、配列番号２１の異性体である。
【０１６６】
１つの実施形態では、抗原は、プラスミドを担持する細菌宿主に対し異種の抗原である。別の実施形態では、抗原は、プラスミドを担持するリステリア宿主に対し異種の抗原である。
【０１６７】
１つの実施形態では、組み換えリステリア株と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含む免疫療法組成物または免疫原性組成物が本明細書に開示される。１つの実施形態では、組み換えリステリア株と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含むワクチンが本明細書に開示される。別の実施形態では、組み換えリステリア株と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物が本明細書に開示される。
【０１６８】
本開示の１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは、核酸分子を含む組み換えリステリア株であり、前述の核酸分子は異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードし、ここで前述の核酸分子は、内因性ＬＬＯ遺伝子を有するオープンリーディングフレームにおいてリステリアのゲノムに組み込まれている。別の実施形態では、核酸分子は、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴ配列をコードする内因性核酸配列を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアのゲノムに動作可能に組み込まれている。一実施形態では、核酸分子は、ＬＬＯをコードする核酸配列を持つオープンリーディングフレームとして、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は、ＡｃｔＡをコードする核酸配列を持つオープンリーディングフレームとして、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。一実施形態では、統合はＬＬＯの機能性を除去しない。別の実施形態では、統合はＡｃｔＡの機能性を除去しない。一実施形態では、ＬＬＯまたはＡｃｔＡの機能性は、その未変性機能性である。
【０１６９】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリア株は内因性のｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡの遺伝子に突然変異、欠失または不活性化を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの遺伝子に突然変異を含む。１つの実施形態では、本明細書に提供される組み換えリステリア株は、弱毒化されている。別の実施形態では、組み換えリステリアは、ａｃｔＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換えリステリアは、ｐｒｆＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換えリステリアは、ｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換えリステリアは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のａｃｔＡ遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のｉｎｌＢ遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のｉｎｌＣ遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のａｃｔＡとｉｎｌＢ遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のａｃｔＡとｉｎｌＣ遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣの遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣの遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、内因性のａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣの遺伝子の不活化突然変異を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合わせの不活性化突然変異を含む。
【０１７０】
１つの実施形態では、ＬＬＯの機能性は、生物体がファゴリソソームから逃れるようにし、また別の実施形態では、ＬＬＯの機能性はそれが融合されているポリペプチドの免疫原性を高める。１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは、ＬＬＯの機能性を保持し、１つの実施形態ではそれは溶血性の機能であり、別の実施形態では、それは抗原性の機能である。ＬＬＯのその他の機能も当分野に公知であり、ＬＬＯの機能性を評価するための方法およびアッセイも当分野で公知である。
【０１７１】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは病原性が減弱されている。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは、非病原性である。１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは、充分に病原性があり、ファゴリソソームを逃れ、細胞質に入り込む。１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは融合抗原−ＬＬＯタンパク質を発現する。ゆえに１つの実施形態では、リステリアのゲノムへ核酸分子を統合しても、その構造を破壊せず、別の実施形態では内因性のＬＬＯ遺伝子またはＡｃｔＡ遺伝子の機能も阻害しない。１つの実施形態では、リステリアのゲノムに核酸分子を統合しても、前述のリステリアがファゴリソソームを逃れる能力を阻害しない。
【０１７２】
１つの実施形態では、リステリアのゲノムは内因性ａｃｔＡ遺伝子の欠失を含み、１つの実施形態ではこれが病原性因子である。一実施形態では、かかる欠失は、より弱毒化し、ひいてはヒトの使用のためにより安全なリステリア株を提供する。この実施形態によると、抗原性ポリペプチドは、リステリア染色体では、フレーム内でＬＬＯと統合される。別の実施形態では、組み込み核酸分子は、ＡｃｔＡ遺伝子座へと組み込まれる。別の実施形態ではＡｃｔＡをコードする染色体核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。別の実施形態では、リステリア株は、内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化を含む。別の実施形態では、リステリア株は、内因性ａｃｔＡ遺伝子の短縮を含む。別の実施形態では、リステリア株は、内因性ａｃｔＡ遺伝子の非機能性の交換を含む。別の実施形態では、リステリア株は、内因性ａｃｔＡ遺伝子の置換を含む。上述のすべての改変は、内因性ＡｃｔＡ遺伝子の「突然変異」であるとみなされる範囲内にある。
【０１７３】
別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株は、内因性のｄａｌ／ｄａｔおよびａｃｔＡの遺伝子の突然変異、欠失または不活性化を含み、かかるリステリア株は本明細書において「ＬｍｄｄＡ」株と呼称される。
【０１７４】
１つの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、リステリアの染色体に組み込まれないプラスミドベクターである。別の実施形態では、核酸分子は、リステリアゲノムへの部位特異的な相同組換え用に設計されたベクターである。別の実施形態では、構築物または異種遺伝子は、相同組換えを使用してリステリア染色体に組み込まれる。
【０１７５】
相同組換えの技法は、当該技術で周知であり、および例えば、Ｆｒａｎｋｅｌ，ＦＲ，Ｈｅｇｄｅ，Ｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ，ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｇａｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：  ４７６６  −  ４７７４．１９９５；  Ｍａｔａ，Ｍ，Ｙａｏ，Ｚ，Ｚｕｂａｉｒ，Ａ，Ｓｙｒｅｓ，Ｋ  ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１４３５−４５，２００１；  Ｂｏｙｅｒ，ＪＤ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＴＭ，Ｍａｃｉａｇ，ＰＣ，Ｐｅｎｇ，Ｘ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＳ，Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｇ，Ｌｅｗｉｓ，ＭＧ，Ｓｈｅｎ，Ａ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ，Ｒ，Ｂｒｏｗｎ，ＣＲ，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ，ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ．ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｂｏｏｓｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＳＩＶ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｄｅｌ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＩＶ２３９  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３３３：８８−１０１，２００５などに解説されている。別の実施形態では相同組換えは米国特許第６８５５３２０号に記載されるように実施される。別の実施形態では温度感受性プラスミドが組換え体を選択するために使用される。
【０１７６】
別の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、トランスポゾン挿入を使用してリステリアの染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入の技術は当技術分野において周知であり、とりわけＤＰ−Ｌ９６７の構築についてのＳｕｎらの著作（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，５８：３７７０−３７７８）に記載される。一実施形態では、トランスポゾン突然変異誘発は、安定したゲノム挿入変異体が形成されうるという利点を持つ。別の実施形態では、トランスポゾン突然変異誘発によって外来性遺伝子が挿入されたゲノム内の位置は不明である。
【０１７７】
別の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ＬＭ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。別の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態ではその構築物または異種遺伝子の組込みの前に利用される付着部位から内在性プロファージが除去される。別の実施形態ではこの方法により一コピー組込み体が生じる。
【０１７８】
別の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、プロモーター／調節性配列に動作可能に連結される。１つの実施形態では、プロモーター／調節性配列は、前述の核酸配列を含むエピソームプラスミド上に存在する。１つの実施形態では、内因性のリステリアプロモーター／調節性配列は、本開示方法および組成物の核酸配列の発現を制御する。
【０１７９】
１つの実施形態では、本明細書に開示される融合ポリペプチドは、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーター、または当分野に公知の任意のその他の適切なプロモーターから発現される。別の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、リステリア株においてコードされたペプチドの発現を誘導するプロモーター、調節性配列、またはその組み合わせに動作可能に連結される。遺伝子の構造性発現の誘導に有用なプロモーター、調節性配列およびその組み合わせは、当分野で公知であり、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰａｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に開示されるペプチドをコードする核酸の誘導性および組織特異的な発現は、誘導性または組織特異的なプロモーター／調節性配列の制御下に、ペプチドをコードする核酸を配置することによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘導性の調節性配列、プロモーター、およびその組み合わせの実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導されるプロモーターが利用される。ゆえに本開示は、公知または非公知のいずれかであり、およびこれらに動作可能に連結された所望されるタンパク質の発現を誘導することができる、任意のプロモーターまたは調節性配列の使用を含むことが認識されるであろう。一実施形態では、調節性配列はプロモーターであり、また別の実施形態では、調節性配列はエンハンサー、また別の実施形態では、調節性配列は抑制因子、また別の実施形態では、調節性配列はリプレッサー、また別の実施形態では、調節性配列はサイレンサーである。
【０１８０】
１つの実施形態では、リステリアゲノムへの組み込み用に使用される核酸構築物は、組み込み部位を含有する。１つの実施形態では、当該部位は、ＰｈＳＡ（Ｓｃｏｔｔ  Ａ由来のファージ）のａｔｔＰＰ’組み込み部位である。ＰｈＳＡは、別の実施形態では、Ｌ．モノサイトゲネス株Ｓｃｏｔｔ  Ａのプロファージであり（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｍ．Ｊ．，Ｉ．Ｂ．Ｋｒａｕｓｅ、Ｔ．Ｈｅｎｌｅ、およびＳ．Ｓｃｈｅｒｅｒ．１９９４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  １４  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｔｙｐｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７０１−７１０、参照により本明細書に組み込まれる）、これはヒトリステリア症の流行時に単離された血清型４ｂ株である。別の実施形態では、部位は当該技術で既知の別の任意の統合部位である。
【０１８１】
別の実施形態では、核酸構築物はインテグラーゼ遺伝子を含む。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子はＰｈＳＡインテグラーゼ遺伝子である。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は、当該技術で既知のその他任意のインテグラーゼ遺伝子である。
【０１８２】
一実施形態では、核酸構築物はプラスミドである。別の実施形態では、核酸構築物はシャトルプラスミドである。別の実施形態では、核酸構築物は組込み型ベクターである。別の実施形態では、核酸構築物は部位特異的な組込み型ベクターである。別の実施形態では、核酸構築物は、当該技術で既知のその他任意のタイプの核酸構築物である。
【０１８３】
本明細書に開示される方法および組成物の組み込み型ベクターは、別の実施形態では、ファージベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターは部位特異的な組込み型ベクターである。別の実施形態では、ベクターはさらにａｔｔＰＰ’部位を含む。
【０１８４】
別の実施形態では、組込み型ベクターはＵ１５３ベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターはＡ１１８ベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターはＰｈＳＡベクターである。
【０１８５】
別の実施形態では、ベクターはＡ５１１ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ９１０６９）である。別の実施形態では、ベクターはＡ００６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ５４５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ０２０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５００ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８５００９）である。別の実施形態では、ベクターはＢ０５１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ１０１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ１１０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ１ｌｌベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ１５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＤ４４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５３８ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ６５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５１３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５０２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５０５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５１９ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ６０４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＣ７０３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０２５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５２８ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０２４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０１２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０３５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＣ７０７ベクターである。
【０１８６】
別の実施形態では、ベクターはＡ００５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ６２０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ６４０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０２１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨＳＯ４７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１０Ｇベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ８／７３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１９ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ２１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ４３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ４６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１０８ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１１０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ８３／８４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３１２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３４０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３８７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３９１／７３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ６８４／７４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ９２４Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターはｆＭＬＵＰ５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはｓｙｎ（＝Ｐ３５）ベクターである。別の実施形態では、ベクターは００２４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは００６１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは０２９７１Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは０２９７１Ｃベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／４７６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／９１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／９３９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／１１３０２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／１１６０５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／１１７０４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１８４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５７５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは６３３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは６９９／６９４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは７４４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９００ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１０９０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１３１７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１４４４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１６５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１８０６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１８０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／９５９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１１３６７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１１５００ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１１５６６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１２４６０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１２５８２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９６７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２３８９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２４２５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２６７１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２６８５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３２７４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３５５０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３５５１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３５５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２７６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２７７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２９２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４４７７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３３７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１１３６３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１８４６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１２４３０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１２４３４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１００７２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１１３５５Ｃベクターである。別の実施形態では、ベクターは１１７１１Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは１２０２９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１２９８１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１３４４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９０６６６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９０８８ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９３２５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９０７５１５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９１０７１６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＮＮ−リステリアベクターである。別の実施形態では、ベクターはＯ１７６１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２８６ベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターは、リステリアを感染させることができる、当分野に公知の任意のその他の部位特異的な組込み型ベクターである。
【０１８７】
別の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドは、リステリア株に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、組込み型ベクターまたは統合プラスミドは、抗生物質抵抗性遺伝子を含まない。
【０１８８】
別の実施形態では、組み換えポリペプチドをコードする組み換え核酸が本明細書に開示される。１つの実施形態では、核酸は、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも８０％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、核酸は、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、核酸は、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも９０％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、核酸は、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも９５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、核酸は、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも９７％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、核酸は、本明細書に開示される組み換えポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。
【０１８９】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドは、染色体外性を維持するエピソーム性プラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドは組込み型プラスミドである。
【０１９０】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、タンパク質発現を促進する条件下で、本明細書に開示される抗原および融合タンパク質を発現することを含む。
【０１９１】
当業者であれば、本明細書に開示される核酸は、本明細書に開示される組成物のいずれかを生成するために、本明細書に開示される方法において使用され得るＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド（染色体外性および／または統合型）などを含むことが明白であろう。
【０１９２】
１つの実施形態では、本明細書に開示される異種抗原は局所の組織環境と関連づけられ、さらに癌の発生または癌の転移とも関連づけられる。別の実施形態では、本明細書に開示される異種抗原は、癌に対する腫瘍免疫回避または抵抗性と関連づけられる。
【０１９３】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリア株は、異種抗原をコードする核酸分子を含むエピソーム性発現ベクターを含む。別の実施形態では、核酸分子は、短縮型ＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴのアミノ酸配列ペプチドを有するオープンリーディングフレームにおいて、前述のエピソーム性発現ベクター中に存在する。
【０１９４】
別の実施形態では、本明細書に開示されるエピソーム性発現ベクターは、短縮型ＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴのアミノ酸配列をコードする核酸配列に、フレーム内で融合された抗原を含む。１つの実施形態では、抗原は、ネオ抗原、ＨＰＶ株１７  Ｅ７、ＨＰＶ株  １８  Ｅ７、ＰＳＡ、またはキメラＨＥＲ２（ｃＨＥＲ２）である。別の実施形態では、本明細書に列挙されているＰＥＳＴ  ＡＡ配列のうちの１つを含む任意のＬＬＯ配列と抗原の融合は、異種抗原に対する細胞介在性免疫を強化することができる。
【０１９５】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本明細書で開示された組み換え型ポリペプチドを生成する。（全体として、または断片の源としてのいずれかで）利用されるＥ７タンパク質は、以下の配列番号２２に記載されたアミノ酸配列を含む：
H  G  D  T  P  T  L  H  E  Y  M  L  D  L  Q  P  E  T  T  D  L  Y  C  Y  E  Q  L  N  D  S  S  E  E  E  D  E  I  D  G  P  A  G  Q  A  E  P  D  R  A  H  Y  N  I  V  T  F  C  C  K  C  D  S  T  L  R  L  C  V  Q  S  T  H  V  D  I  R  T  L  E  D  L  L  M  G  T  L  G  I  V  C  P  I  C  S  Q  K  P（配列番号２２）。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２のホモログである。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２のバリアントである。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２のホモログの断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２のバリアントの断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、配列番号２２の異性体の断片である。
【０１９６】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質に融合される短縮型ＬＬＯのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号２３）。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は、配列番号２３のホモログである。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２３のバリアントである。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は、配列番号２３の異性体である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は、配列番号２３の断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は、配列番号２３のホモログの断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は、配列番号２３のバリアントの断片である。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７の融合タンパク質は、配列番号２３の異性体の断片である。
【０１９７】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列はリステリアＡｃｔＡタンパク質からのＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号２４）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号２５）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号２６）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号２７）を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされるリステリア・シーリゲリ細胞溶解素由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号２８）を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ由来、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号２９）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ由来、例えば、ＡＡ  ３８〜５４のＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号３０）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は配列番号２４〜３０から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は配列番号２４〜３０から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、限定されないが、その全体で本明細書に参照により援用される米国特許出願公開２０１４／０１８６３８７号明細書に開示される配列を含む、当分野に公知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。
【０１９８】
ＰＥＳＴ配列の同定は当該技術で周知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｔｈｅ  ＰＥＳＴ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８、参照により本明細書に組み込まれる）およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（ＰＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６；２１（７）：２６７−７１、参照により本明細書に組み込まれる）に記載がある。「ＰＥＳＴ配列」は、別の実施形態では、プロリン（Ｐ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、セリン（Ｓ）残基、およびスレオニン（Ｔ）残基が豊富な領域を指す。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、いくつかの正に荷電したアミノ酸を含有する１つ以上のクラスターが脇にある。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はこれを含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｏｇｅｒｓらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は１つ以上の内部リン酸化部位を含有し、これらの部位におけるリン酸化はタンパク質の分解を進める。一実施形態では、本明細書でＰＥＳＴ配列と言及している配列は、ＰＥＳＴ配列である。
【０１９９】
一実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ配列は、例えば、Ｌｍに関するＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）、ならびにＲｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）に記述されている方法などの方法に従って同定することができる。あるいは、この方法に基づいて原核生物由来のＰＥＳＴ  ＡＡ配列を同定することもできる。ＰＥＳＴ  ＡＡ配列を含むことが期待される他の原核生物は、他のリステリア種に限定されない。一実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｏｇｅｒｓらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ−ｆｉｎｄプログラムを使用してＰＥＳＴ配列が同定される。
【０２００】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特異的なタンパク質配列の中の正に荷電したアミノ酸Ｒ、Ｈ、およびＫに対する初期のスキャンによって達成される。正に荷電した側の間のすべてのアミノ酸が計数され、これらのモチーフのみがさらに考慮され、これらはウィンドウサイズのパラメータと等しいかそれより大きい多数のアミノ酸を含有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有する必要がある。
【０２０１】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質は、重要なアミノ酸ならびにモチーフの疎水性の局所的な富化に基づいてパラメータをスコアリングする手段によって洗練される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴの富化は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表現され、ＤまたはＥと等価な１つに対して、Ｐと等価な１つに対して、およびＳまたはＴと等価な１つに対して修正される。別の実施形態では、疎水性の計算は、参照により本明細書に援用されるＪ．ＫｙｔｅおよびＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ，Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｏｔｌｉｔｔｌｅ，ＲＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５（１９８２）の方法に原則として従う。計算を簡略化するために、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性指標は、もともとはアルギニンについて−４．５からイソロイシンについて＋４．５までの範囲であるが、次の一次変換を使用して正の整数に変換され、アルギニンについて０からイソロイシンについて９０までの値が得られる。
疎水性指標＝１０＊Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性指標＋４５
【０２０２】
別の実施形態では、潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性は、各々のアミノ酸種に対するモルパーセントおよび疎水性指数の産物にわたる合計として計算される。以下の式で表現される場合、望ましいＰＥＳＴスコアは局所富化項および疎水性項の組み合わせとして得られる。
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指数。
【０２０３】
別の実施形態では、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴアミノ酸配列」または「ＰＥＳＴ配列ペプチド」は本明細書において相互交換可能に使用され、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを持つペプチドを指す。別の実施形態では、この用語は少なくとも６のスコアを有するペプチドを指す。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも７のスコアを有する。別の実施形態では、スコアは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１３である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４５である。
【０２０４】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，Ａｌｖｅｓ  Ｊ，Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を使用して同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【０２０５】
ＰＥＳＴ指数は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、適切な長さ（例えば、３０〜３５アミノ酸ストレッチ）の各々のストレッチに対して計算される。ＰＥＳＴ残基の各々に対する係数値（ＣＶ）は、１であり、また他のアミノ酸（非ＰＥＳＴ）の各々に対する係数値は０である。
【０２０６】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。
【０２０７】
１つの実施形態では、本開示内容は、融合タンパク質を提供し、１つの実施形態では、その融合物はリステリアによって発現される。１つの実施形態では、かかる融合タンパク質は、ｔＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列への融合を含む。当業者であれば、「ＰＥＳＴ配列」という用語には、タンパク質断片がＰＥＳＴ配列以外の周辺配列を有するＰＥＳＴ配列を含む場合も包含し得ることを理解するであろう。別の実施形態では、タンパク質断片はＰＥＳＴ配列から構成される。したがって、別の実施形態では、「融合」は、それぞれの末端で一つに連結されているか、または相手方の内部に埋め込まれるかのいずれかである２つのペプチドまたはタンパク質断片を意味する。当業者であれば、「融合された」という用語は、共有結合による動作可能な連結も包含し得ることを認識するであろう。一実施形態では、この用語は組み換え型融合（その核酸配列またはオープンリーディングフレームの）を包含する。別の実施形態では、この用語は化学的結合を包含する。
【０２０８】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは短縮型ＡｃｔＡに融合される抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（短縮型ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態ではその短縮型ＡｃｔＡは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７６５５２３８号明細書に記載されるように、野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、参照によりその全体で本明細書に援用される米国特許公開第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、短縮型ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその改変型（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフは欠失され、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有している。
【０２０９】
別の実施形態では、本明細書に開示されるＬｍｄｄＡ株は、突然変異を含む。
【０２１０】
１つの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の抗原はＡｃｔＡタンパク質に融合されるが、これは１つの実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片であり、これは１つの実施形態では、ＡｃｔＡの最初の３９０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の４１８  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の５０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の１００  ＡＡを含むか、またはそれからなるが、これは１つの実施形態では、本明細書に開示されるＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、ＡｃｔＡの最初の１５０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初のおよそ２００  ＡＡを含むか、それからなるが、これは１つの実施形態では、本明細書に記述されるとおり２つのＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、ＡｃｔＡの最初の２５０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の３００  ＡＡを含むかそれからなる。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。残基番号は、別の実施形態では、上記に列挙した残基番号ときっちりと対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で利用したＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を持つ場合には、残基番号は当業者にとって日常的であるとおり、それに従い、当該技術で周知のＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴなどの配列整列ツールを使用して調節できる。
【０２１１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端部分は、１つ、２つ、３つ、または４つのＰＥＳＴ配列を含み、これは１つの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書で具体的に言及されるＰＥＳＴ配列またはそのホモログであり、または本明細書に記述される方法およびアルゴリズムを使用して、または当分野で公知の別の方法を使用して決定されうるその他のＰＥＳＴ配列である。
【０２１２】
１つの実施形態では、「Ｎ末端ＡｃｔＡ」および「短縮型ＡｃｔＡ」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【０２１３】
１つの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、以下の配列番号３１に記載される配列を有している：ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号３１）別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号３１に記述される配列を含む。別の実施形態では、そのＡｃｔＡ断片は当分野において公知の任意のその他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１のホモログである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１のバリアントである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１のアイソフォームである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１のホモログの断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１のバリアントの断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３１のアイソフォームの断片である。
【０２１４】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換えヌクレオチドは、以下の配列番号３２に記述される配列を含む：ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号３２）。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、配列番号３２に記述される配列を有する。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意のその他の配列を含む。
【０２１５】
本明細書に開示される方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、以下の配列番号３３に記述される配列を有する：ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号３３）、これは、１つの実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３Ｓ由来のＡｃｔＡの最初の３９０  ＡＡである。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号３２に記述される配列を含む。別の実施形態では、そのＡｃｔＡ断片は当分野において公知の任意のその他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３のホモログである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３のバリアントである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３のアイソフォームである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３のホモログの断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３のバリアントの断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３３のアイソフォームの断片である。
【０２１６】
別の実施形態では、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、以下の配列番号３４に記述される配列を含む：
A  T  D  S  E  D  S  S  L  N  T  D  E  W  E  E  E  K  T  E  E  Q  P  S  E  V  N  T  G  P  R  Y  E  T  A  R  E  V  S  S  R  D  I  E  E  L  E  K  S  N  K  V  K  N  T  N  K  A  D  L  I  A  M  L  K  A  K  A  E  K  G  P  N  N  N  N  N  N  G  E  Q  T  G  N  V  A  I  N  E  E  A  S  G  V  D  R  P  T  L  Q  V  E  R  R  H  P  G  L  S  S  D  S  A  A  E  I  K  K  R  R  K  A  I  A  S  S  D  S  E  L  E  S  L  T  Y  P  D  K  P  T  K  A  N  K  R  K  V  A  K  E  S  V  V  D  A  S  E  S  D  L  D  S  S  M  Q  S  A  D  E  S  T  P  Q  P  L  K  A  N  Q  K  P  F  F  P  K  V  F  K  K  I  K  D  A  G  K  W  V  R  D  K（配列番号34）。
【０２１７】
別の実施形態では本明細書に開示される短縮型ＡｃｔＡ配列はＮ末端においてｈｌｙシグナルペプチドにさらに融合している。別の実施形態では、ｈｌｙシグナルペプチドに融合しているその短縮型ＡｃｔＡは、以下の配列番号３５を含む：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＳＲＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫ（配列番号３５）。別の実施形態では、配列番号３４で記述される短縮型ＡｃｔＡは、ＬＡ２２９と呼称される。
【０２１８】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換えヌクレオチドは、以下の配列番号３６に記述される配列を含む：atgcgtgcgatgatggtagttttcattactgccaactgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattccagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcagccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattgaggaactagaaaaatcgaataaagtgaaaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagcaaaagcagagaaaggtccgaataacaataataacaacggtgagcaaacaggaaatgtggctataaatgaagaggcttcaggagtcgaccgaccaactctgcaagtggagcgtcgtcatccaggtctgtcatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaagaaaagccatagcgtcgtcggatagtgagcttgaaagccttacttatccagataaaccaacaaaagcaaataagagaaaagtggcgaaagagtcagttgtggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagacgagtctacaccacaacctttaaaagcaaatcaaaaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccgatgcttctcggttttaatgctcctactccatcggaaccgagctcattcgaatttccgccgccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcattcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaattatgcgggaaacagcaccttcgctagattctagttttacaagcggggatttagctagtttgagaagtgctattaatcgccatagcgaaaatttctctgatttcccactaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca（配列番号３６）。１つの実施形態では、この配列は、リステリア・モノサイトゲネス１０４０３Ｓ株でＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、配列番号３６に記述される配列を有する。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意のその他の配列を含む。
【０２１９】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術で既知の別のＡｃｔＡ断片であり、これは一実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む任意の断片である。こうして、一実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１〜１００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１〜２００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸２００〜３００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸３００〜４００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１〜３００である。別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意のその他の配列を含む。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは全ＡｃｔＡタンパク質をコードする任意の他の配列を含む。
【０２２０】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法における使用のためのＡｃｔＡ配列は、リステリア・モノサイトゲネス由来であり、これは１つの実施形態では、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ  ５３４８株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６４）、または当分野で公知のリステリア・モノサイトゲネスの任意のその他の株である。
【０２２１】
一実施形態では、株ＬｍｄｄΔＡｃｔＡ内で欠失されたＡｃｔＡ領域の配列は、次のとおりである。
【化４】
2018537511.tif 000005
一実施形態では、下線の領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内に存在するａｃｔＡ配列要素を含有する。一実施形態では、太字の配列ｇｔｃｇａｃは、Ｎ−Ｔ配列およびＣ−Ｔ配列の結合部位を表す。
【０２２２】
本明細書に開示される方法および組成物によって誘導される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞性応答である。別の実施形態ではその免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態ではその応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【０２２３】
一実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法の組み換えリステリアは、血管新生ポリペプチドを含む。別の実施形態では、癌療法に対する抗血管形成アプローチは大変有望であり、また一実施形態では、かかる抗血管形成療法の１つのタイプは周皮細胞を標的にする。別の実施形態では、血管内皮細胞および周皮細胞上の分子標的は、抗腫瘍療法のために重要な標的である。別の実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）シグナル伝達は周皮細胞を新たに形成される血管に採用するために重要である。したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるような血管形成ポリペプチドは周皮細胞シグナル伝達に関与する分子を阻害し、これは一実施形態ではＰＤＧＦＲ−βである。
【０２２４】
１つの実施形態では、本明細書に開示される癌免疫療法は、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を破壊し、そして疾患を消失させることができるエフェクターＴ細胞を生成する。一実施形態では、自然に生じる腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、結腸、卵巣、およびメラノーマなどのいくつかの腫瘍ではより良い予後に関連付けられる。結腸癌では、微小転移巣の兆候を有しない腫瘍は免疫細胞の浸潤およびＴｈ１発現プロファイルの増加を有し、これは患者の生存の改善と相関する。さらに、Ｔ細胞による腫瘍の浸潤は、前臨床試験と人体試験との両方で免疫療法アプローチの成功に関連付けられた。一実施形態では、リンパ球の腫瘍部位の中への浸潤は、腫瘍血管系の内皮細胞内の接着分子の上方調節に依存し、一般的にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１などの炎症促進性のサイトカインによる。細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管内皮細胞接着分子１（Ｖ−ＣＡＭ−１）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）およびＥ−セレクチンを含む腫瘍内へのリンパ球の浸潤のプロセス中にいくつかの接着分子が暗示される。しかしながら、これらの細胞接着分子は腫瘍血管系内で一般に下方調節される。ゆえに１つの実施形態では、本明細書に開示される癌ワクチンは、ＴＩＬを増加させ、接着分子（１つの実施形態では、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、またはこれらの組み合せ）をアップレギュレートし、炎症促進性のサイトカイン（１つの実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、またはこれらの組み合せ）をアップレギュレートし、またはこれらの組み合せをアップレギュレートする。
【０２２５】
１つの実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法は、抗血管新生療法を提供し、１つの実施形態では、これにより免疫療法戦略が改善され得る。１つの実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法は、腫瘍血管内の接着分子をアップレギュレートし、白血球−血管の相互作用を高めることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの内皮細胞のアネルギーを回避し、これによりたとえばＣＤ８＋Ｔ細胞などの腫瘍浸潤性白血球数が増加する。興味深いことに、抗腫瘍保護の促進は、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍潤滑性Ｔ細胞数の増加と、ＶＥＧＦ遮断に伴う腫瘍内の制御性Ｔ細胞数の明白な減少と相関性がある。
【０２２６】
一実施形態では、抗血管形成抗原を腫瘍との関連性のある抗原と、本明細書で説明した腫瘍に罹患した宿主に同時に送達することで、腫瘍増殖およびより強力な治療有効性に影響を及ぼすにあたり相乗効果がある。
【０２２７】
別の実施形態では、ワクチン接種による周皮細胞の標的化は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）浸潤、周皮細胞の破壊、血管の不安定化および脈管炎症につながり、これは別の実施形態では、リンパ球の接着および遊出にとって重要である内皮細胞内の接着分子の上方制御に関連し、最終的に腫瘍組織を浸潤するリンパ球の能力を高める。別の実施形態では、腫瘍特異的抗原が付随的に送達されることにより、腫瘍部位に侵入し腫瘍細胞を殺すことができるリンパ球が生成される。
【０２２８】
一実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）シグナル伝達は周皮細胞を新たに形成される血管に採用するために重要である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２およびＰＤＧＦＲ−βを同時に抑制することで、内皮細胞のアポトーシスおよび腫瘍血管の退行（一実施形態では、腫瘍血管のおよそ４０％）が誘発される。
【０２２９】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリア株は、栄養要求性リステリア株である。別の実施形態では、前述の栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体である。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、核酸分子は組み換え型細菌性株内で安定して維持される。
【０２３０】
一実施形態では、ワクチンベクターとして有用な栄養要求性変異体は、数多くの方法で生成されうる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン栄養要求性変異体は、一実施形態では、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の両方を破壊してリステリアの弱毒化栄養要求性株を生成することで生成されうるが、これには、増殖のためにＤ−アラニンを外因的に追加する必要がある。
【０２３１】
一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射線照射を用い、その後で突然変異体を選択する伝統的な突然変異形成技術を使用して突然変異形成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰に伴われる低い可能性のため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に開示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体が、単純な実験室培養アッセイにおいて、Ｄ−アラニンの非存在下での増殖能力について試験されてもよい。別の実施形態では、この化合物の非存在下で増殖することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【０２３２】
別の実施形態では、本明細書に開示されるとおり、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【０２３３】
別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株の組み換え核酸分子は、代謝酵素をコードする第二のオープンリーディングフレームを含む。１つの実施形態では、前述のリステリア株は、前述の組み換えリステリア株の遺伝子突然変異、遺伝子欠失、もしくは遺伝子不活化、または栄養要求性を相補する代謝酵素を備えるエピソーム性発現ベクターを含む。別の実施形態では、その構築物はエピソーム様式でそのリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原は組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、前述のエピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。１つの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の抗原は、ＰＥＳＴ配列を含むオリゴペプチドに遺伝学的に融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む前述の内因性ポリペプチドはＬＬＯである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む前述の内因性ポリペプチドはＡｃｔＡである。
【０２３４】
別の実施形態ではその代謝酵素は、前述の組換え型細菌株の染色体の残りの部分に欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。１つの実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体から欠失している。１つの実施形態では、内因性代謝遺伝子は、染色体における突然変異、欠失、または不活化を含む。別の実施形態では、前述の代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、前述の代謝酵素は前述の組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、前述の代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、前述の代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【０２３５】
別の実施形態では、前述の代謝酵素は、細胞壁合成で使用されるアミノ酸（ＡＡ）の形成を触媒する。別の実施形態では、前述の代謝酵素は、細胞壁合成で使用されるＡＡの合成を触媒する。別の実施形態では、前述の代謝酵素は、細胞壁合成で使用されるＡＡの合成に関与する。別の実施形態では、ＡＡは細胞壁生物発生に使用される。
【０２３６】
別の実施形態では、代謝酵素は細胞壁の構成要素であるＤ−グルタミン酸のための合成酵素である。
【０２３７】
別の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）によりコードされる。別の実施形態では、ｄａｌ遺伝子は、アラニンラセマーゼをコードし、これがＬ−アラニン←→Ｄ−アラニンの反応を触媒する。
【０２３８】
本明細書で開示される方法および組成物の方法および組成物のｄａｌ遺伝子は、別の実施形態では、以下の配列によりコードされる：
【０２３９】
ａｔｇｇｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｃａｔｃｇｔｃｃａａｃａｔｇｇａｔｔｇａａａｔａｇａｃｃｇｃｇｃａｇｃａａｔｔｃｇｃｇａａａａｔａｔａａａａａａｔｇａａｃａａａａｔａａａｃｔｃｃｃｇｇａａａｇｔｇｔｃｇａｃｔｔａｔｇｇｇｃａｇｔａｇｔｃａａａｇｃｔａａｔｇｃａｔａｔｇｇｔｃａｃｇｇａａｔｔａｔｃｇａａｇｔｔｇｃｔａｇｇａｃｇｇｃｇａａａｇａａｇｃｔｇｇａｇｃａａａａｇｇｔｔｔｃｔｇｃｇｔａｇｃｃａｔｔｔｔａｇａｔｇａｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇａｇａａｇｃｔｇｇａｔｔｔｃａａｇａｔｇａｃｔｔｔａｔｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｇｔｇｃａａｃｃａｇａａａａｇａａｇａｔｇｃｔａａｔｃｔｇｇｃａｇｃｃａａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃａｃｔｔａｃｔｇｔｔｔｔｔａｇａｇａａｇａｔｔｇｇｃｔａｇａｇａａｔｃｔａａｃｇｃｔａｇａａｇｃａａｃａｃｔｔｃｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａａｇｔａｇａｔａｇｃｇｇｔａｔｇｇｇｇｃｇｔｃｔｃｇｇｔａｔｔｃｇｔａｃｇａｃｔｇａａｇａａｇｃａｃｇｇｃｇａａｔｔｇａａｇｃａａｃｃａｇｔａｃｔａａｔｇａｔｃａｃｃａａｔｔａｃａａｃｔｇｇａａｇｇｔａｔｔｔａｃａｃｇｃａｔｔｔｔｇｃａａｃａｇｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｇａａａｃｔａｇｔｔａｔｔｔｔｇａａｃａａｃａａｔｔａｇｃｔａａｇｔｔｃｃａａａｃｇａｔｔｔｔａａｃｇａｇｔｔｔａａａａａａａｃｇａｃｃａａｃｔｔａｔｇｔｔｃａｔａｃａｇｃｃａａｔｔｃａｇｃｔｇｃｔｔｃａｔｔｇｔｔａｃａｇｃｃａｃａａａｔｃｇｇｇｔｔｔｇａｔｇｃｇａｔｔｃｇｃｔｔｔｇｇｔａｔｔｔｃｇａｔｇｔａｔｇｇａｔｔａａｃｔｃｃｃｔｃｃａｃａｇａａａｔｃａａａａｃｔａｇｃｔｔｇｃｃｇｔｔｔｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｇｃａｃｔｔｇｃａｃｔｃｔａｔａｃｃｇａｇａｔｇｇｔｔｃａｔｇｔｇａａａｇａａｃｔｔｇｃａｃｃａｇｇｃｇａｔａｇｃｇｔｔａｇｃｔａｃｇｇａｇｃａａｃｔｔａｔａｃａｇｃａａｃａｇａｇｃｇａｇａａｔｇｇｇｔｔｇｃｇａｃａｔｔａｃｃａａｔｔｇｇｃｔａｔｇｃｇｇａｔｇｇａｔｔｇａｔｔｃｇｔｃａｔｔａｃａｇｔｇｇｔｔｔｃｃａｔｇｔｔｔｔａｇｔａｇａｃｇｇｔｇａａｃｃａｇｃｔｃｃａａｔｃａｔｔｇｇｔｃｇａｇｔｔｔｇｔａｔｇｇａｔｃａａａｃｃａｔｃａｔａａａａｃｔａｃｃａｃｇｔｇａａｔｔｔｃａａａｃｔｇｇｔｔｃａａａａｇｔａａｃｇａｔａａｔｔｇｇｃａａａｇａｔｃａｔｇｇｔａａｃａｃｇｇｔａａｃａｇｃａｇａｔｇａｔｇｃｃｇｃｔｃａａｔａｔｔｔａｇａｔａｃａａｔｔａａｔｔａｔｇａｇｇｔａａｃｔｔｇｔｔｔｇｔｔａａａｔｇａｇｃｇｃａｔａｃｃｔａｇａａａａｔａｃａｔｃｃａｔｔａｇ（配列番号３８、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３８）別の実施形態では、ｄａｌをコードするヌクレオチドは、配列番号３８に対し相同である。別の実施形態では、ｄａｌをコードするヌクレオチドは、配列番号３８のバリアントである。別の実施形態では、ｄａｌをコードするヌクレオチドは、配列番号３８の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、当分野で公知の任意の他のｄａｌ遺伝子によりコードされる。
【０２４０】
別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＶＴＧＷＨＲＰＴＷＩＥＩＤＲＡＡＩＲＥＮＩＫＮＥＱＮＫＬＰＥＳＶＤＬＷＡＶＶＫＡＮＡＹＧＨＧＩＩＥＶＡＲＴＡＫＥＡＧＡＫＧＦＣＶＡＩＬＤＥＡＬＡＬＲＥＡＧＦＱＤＤＦＩＬＶＬＧＡＴＲＫＥＤＡＮＬＡＡＫＮＨＩＳＬＴＶＦＲＥＤＷＬＥＮＬＴＬＥＡＴＬＲＩＨＬＫＶＤＳＧＭＧＲＬＧＩＲＴＴＥＥＡＲＲＩＥＡＴＳＴＮＤＨＱＬＱＬＥＧＩＹＴＨＦＡＴＡＤＱＬＥＴＳＹＦＥＱＱＬＡＫＦＱＴＩＬＴＳＬＫＫＲＰＴＹＶＨＴＡＮＳＡＡＳＬＬＱＰＱＩＧＦＤＡＩＲＦＧＩＳＭＹＧＬＴＰＳＴＥＩＫＴＳＬＰＦＥＬＫＰＡＬＡＬＹＴＥＭＶＨＶＫＥＬＡＰＧＤＳＶＳＹＧＡＴＹＴＡＴＥＲＥＷＶＡＴＬＰＩＧＹＡＤＧＬＩＲＨＹＳＧＦＨＶＬＶＤＧＥＰＡＰＩＩＧＲＶＣＭＤＱＴＩＩＫＬＰＲＥＦＱＴＧＳＫＶＴＩＩＧＫＤＨＧＮＴＶＴＡＤＤＡＡＱＹＬＤＴＩＮＹＥＶＴＣＬＬＮＥＲＩＰＲＫＹＩＨ（配列番号３９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３７４２８）別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９に対し相同である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９のバリアントである。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９の異性体である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９のホモログの断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９のバリアントの断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号３９の異性体の断片である。
【０２４１】
別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のリステリアｄａｌタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のグラム陽性ｄａｌタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のｄａｌタンパク質である。
【０２４２】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のｄａｌタンパク質は、その酵素活性を保持している。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の９０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の８０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の７０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の６０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の５０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の４０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の３０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の２０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の１０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の５％を保持する。
【０２４３】
別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）によりコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成は、部分的にｄａｔ遺伝子によって制御されるが、この遺伝子は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのアルファ−ケトグルタル酸塩＋Ｄ−ａｌａへの変換、およびその逆反応に関与している。
【０２４４】
別の実施形態では、本開示内容で利用されるｄａｔ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３９に記載されている配列を有する。別の実施形態では、ｄａｔ遺伝子は、当該技術で既知の別の任意のｄａｔ遺伝子である。
【０２４５】
本明細書で開示されている方法および組成物の方法および組成物のｄａｔ遺伝子は、別の実施形態では、次の配列によりコードされる。
ａｔｇａａａｇｔａｔｔａｇｔａａａｔａａｃｃａｔｔｔａｇｔｔｇａａａｇａｇａａｇａｔｇｃｃａｃａｇｔｔｇａｃａｔｔｇａａｇａｃｃｇｃｇｇａｔａｔｃａｇｔｔｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｔａｔａｔｇａａｇｔａｇｔｔｃｇｔｃｔａｔａｔａａｔｇｇａａａａｔｔｃｔｔｔａｃｔｔａｔａａｔｇａａｃａｃａｔｔｇａｔｃｇｃｔｔａｔａｔｇｃｔａｇｔｇｃａｇｃａａａａａｔｔｇａｃｔｔａｇｔｔａｔｔｃｃｔｔａｔｔｃｃａａａｇａａｇａｇｃｔａｃｇｔｇａａｔｔａｃｔｔｇａａａａａｔｔａｇｔｔｇｃｃｇａａａａｔａａｔａｔｃａａｔａｃａｇｇｇａａｔｇｔｃｔａｔｔｔａｃａａｇｔｇａｃｔｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃａａａａｃｃｃａｃｇｔａａｔｃａｔｇｔａａｔｃｃｃｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａａｇｇｃｇｔｔｔｔａａｃａｇｃａｇｃａｇｃｔｃｇｔｇａａｇｔａｃｃｔａｇａａａｃｇａｇｃｇｔｃａａｔｔｃｇｔｔｇａａｇｇｔｇｇａａｃｇｇｃｇａｔｔａｃａｇａａｇａａｇａｔｇｔｇｃｇｃｔｇｇｔｔａｃｇｃｔｇｔｇａｔａｔｔａａｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｔｔｔａｇｇａａａｔａｔｔｃｔａｇｃａａａａａａｔａａａｇｃａｃａｔｃａａｃａａａａｔｇｃｔｔｔｇｇａａｇｃｔａｔｔｔｔａｃａｔｃｇｃｇｇｇｇａａｃａａｇｔａａｃａｇａａｔｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａａａｃｇｔｔｔｃｔａｔｔａｔｔａａａｇａｔｇｇｔｇｔａｔｔａｔｇｇａｃｇｃａｔｇｃｇｇｃａｇａｔａａｃｔｔａａｔｃｔｔａａａｔｇｇｔａｔｃａｃｔｃｇｔｃａａｇｔｔａｔｃａｔｔｇａｔｇｔｔｇｃｇａａａａａｇａａｔｇｇｃａｔｔｃｃｔｇｔｔａａａｇａａｇｃｇｇａｔｔｔｃａｃｔｔｔａａｃａｇａｃｃｔｔｃｇｔｇａａｇｃｇｇａｔｇａａｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｃａａｇｔａｃａａｃｔａｔｔｇａａａｔｔａｃａｃｃｔａｔｔａｃｇｃａｔａｔｔｇａｃｇｇａｇｔｔｃａａｇｔａｇｃｔｇａｃｇｇａａａａｃｇｔｇｇａｃｃａａｔｔａｃａｇｃｇｃａａｃｔｔｃａｔｃａａｔａｔｔｔｔｇｔａｇａａｇａａａｔｃａｃｔｃｇｔｇｃａｔｇｔｇｇｃｇａａｔｔａｇａｇｔｔｔｇｃａａａａｔａａ（配列番号４０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３８）別の実施形態では、ｄａｔをコードするヌクレオチドは、配列番号４０に対し相同である。別の実施形態では、ｄａｔをコードするヌクレオチドは、配列番号４０のバリアントである。別の実施形態では、ｄａｔをコードするヌクレオチドは、配列番号４０の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のｄａｔ遺伝子によりコードされる。
【０２４６】
別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＫＶＬＶＮＮＨＬＶＥＲＥＤＡＴＶＤＩＥＤＲＧＹＱＦＧＤＧＶＹＥＶＶＲＬＹＮＧＫＦＦＴＹＮＥＨＩＤＲＬＹＡＳＡＡＫＩＤＬＶＩＰＹＳＫＥＥＬＲＥＬＬＥＫＬＶＡＥＮＮＩＮＴＧＮＶＹＬＱＶＴＲＧＶＱＮＰＲＮＨＶＩＰＤＤＦＰＬＥＧＶＬＴＡＡＡＲＥＶＰＲＮＥＲＱＦＶＥＧＧＴＡＩＴＥＥＤＶＲＷＬＲＣＤＩＫＳＬＮＬＬＧＮＩＬＡＫＮＫＡＨＱＱＮＡＬＥＡＩＬＨＲＧＥＱＶＴＥＣＳＡＳＮＶＳＩＩＫＤＧＶＬＷＴＨＡＡＤＮＬＩＬＮＧＩＴＲＱＶＩＩＤＶＡＫＫＮＧＩＰＶＫＥＡＤＦＴＬＴＤＬＲＥＡＤＥＶＦＩＳＳＴＴＩＥＩＴＰＩＴＨＩＤＧＶＱＶＡＤＧＫＲＧＰＩＴＡＱＬＨＱＹＦＶＥＥＩＴＲＡＣＧＥＬＥＦＡＫ（配列番号４１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３９）別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１に対し相同である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１のバリアントである。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１の異性体である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１のホモログの断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１のバリアントの断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４１の異性体の断片である。
【０２４７】
別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、当分野で公知の任意の他のリステリアｄａｔタンパク質である。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、当分野で公知の任意のその他のグラム陽性菌のｄａｔタンパク質である。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、当分野で公知の任意のその他のｄａｔタンパク質である。
【０２４８】
別の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物の方法および組成物のＤａｔタンパク質は、その酵素活性を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の９０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の８０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の７０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の６０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の５０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の４０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の３０％を保持している。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の２０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の１０％を保持している。別の実施形態では、Ｄａｔタンパク質は、野生型活性の５％を保持している。
【０２４９】
別の実施形態では、代謝酵素はｄｇａによってコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成はまた、部分的にｄｇａ遺伝子によって制御され、またＤ−グルタミン酸合成のための栄養要求性変異体は、Ｄ−グルタミン酸の不在下では成長しない（Ｐｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３３６−３４２）。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、Ｄ−グルタミン酸について栄養要求性である。さらなる例には、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が含まれる。こうした合成遺伝子は、β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、また不活性化した時、この合成経路のために変異体を栄養要求性にする（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９−３０２）。別の実施形態では、ｄｇａタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のリステリアｄｇａタンパク質である。別の実施形態では、ｄｇａタンパク質は、当該技術で既知のその他任意のグラム陽性ｄｇａタンパク質である。
【０２５０】
別の実施形態では、代謝酵素はａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によりコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アラニン合成に関与する当該技術分野で既知の任意の他の酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｌ−アラニン合成に関与する当該技術分野で既知の任意の他の酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｄ−アラニン合成に関与する当該技術分野で既知の任意の他の酵素である。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、Ｄ−アラニンについて栄養要求性である。アラニン合成について栄養要求性の細菌は、当該技術で周知であり、例えば、大腸菌（Ｓｔｒｙｃｈら、２００２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４３２１−４３２５）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｔａｕｃｈら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：７９−９１）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｆｒａｎｋｅｌら、米国特許第６，０９９，８４８号））、ラクトコッカス属の種、および乳酸杆菌属の種、（Ｂｒｏｎら、２００２、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６８：５６６３−７０）に記述されている。別の実施形態では、当該技術で既知の任意のＤ−アラニン合成遺伝子が不活性化される。
【０２５１】
別の実施形態では、代謝酵素は、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である。
【０２５２】
別の実施形態では、代謝酵素はホスホセリン  アミノトランスフェラーゼであるｓｅｒＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は細胞壁成分ジアミノピメリン酸の合成に関与しているａｓｄ（アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタン酸塩からの５−アミノレブリン酸の形成を触媒するｇｓａＢ−グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタン酸塩からの５−アミノレブリン酸の形成を触媒するＨｅｍＬによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はＬ−アスパラギン酸塩および２−オキソグルタル酸塩からのオキザロ酢酸塩およびＬ−グルタミン酸塩の形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであるａｓｐＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアルギニン生合成に関連しているａｒｇＦ−１によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸生合成に関連しているａｒｏＥによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は３−デヒドロキナ酸塩生合成に関連しているａｒｏＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸生合成に関連しているａｒｏＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸生合成に関連しているａｒｏＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はヒスチジン生合成に関連しているｈｉｓＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はヒスチジン生合成に関連しているｈｉｓＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はヒスチジン生合成に関連しているｈｉｓＧによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はメチオニン生合成に関連しているｍｅｔＸによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はプロリン生合成に関連しているｐｒｏＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアルギニン生合成に関連しているａｒｇＲによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアルギニン生合成に関連しているａｒｇＪによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はチアミン生合成に関連しているｔｈｉＩによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はトリプトファン生合成に関連しているＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はトリプトファン生合成に関連しているａｒｏＡによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はバリンおよびイソロイシンの生合成に関連しているｉｌｖＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はバリンおよびイソロイシンの生合成に関連しているｉｌｖＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はロイシン生合成に関連しているｌｅｕＡによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はリジン生合成に関連しているｄａｐＦによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はスレオニン生合成（全ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２９７３）に関連しているｔｈｒＢによってコードされる。
【０２５３】
別の実施形態では、代謝酵素はｔＲＮＡ合成酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素をコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は当該技術分野で既知の任意の他のｔＲＮＡ合成酵素である。
【０２５４】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株の普及を減少する。別の実施形態では、継代は株を弱毒化し、または別の実施形態では、株の病毒性を少なくする。組み換え型リステリア株を動物宿主を通して継代する方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、米国特許出願番号第１０／５４１，６１４号に記述されている。
【０２５５】
本明細書に開示される方法および組成物の組み換えリステリア株は、別の実施形態では、組み換えリステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ｝株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。別の実施形態では、本明細書で開示された方法および組成物で使用するためのリステリアタンパク質の配列は、上述の任意の菌株からのものである。
【０２５６】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるリステリア・モノサイトゲネス株は、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株、Ｓ３株、ＮＣＴＣ  ５３４８株、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株、Ｍ７株、Ｓ１９株、または当分野で公知のリステリア・モノサイトゲネスの別の株である。
【０２５７】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株はワクチン株であり、これは一実施形態では細菌性ワクチン株である。
【０２５８】
別の実施形態では、本開示の方法で利用される組み換えリステリア株は、凍結細胞バンク内で保存されている。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は凍結細胞バンクに保存されている。
【０２５９】
別の実施形態では、本開示の方法および組成物の細胞バンクは、マスター細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクはワーキング細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは臨床グレード材料の生産を目的としている。別の実施形態では、細胞バンクはヒトへの使用のための規制実施に適合する。別の実施形態では、細胞バンクは当該技術分野で既知の任意の他のタイプの細胞バンクである。
【０２６０】
別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は米国連邦規則集の（２１  ＣＦＲ  ２１０−２１１）によって定義される。別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は、臨床グレードの材料生産のため、またはヒトの摂取のための他の基準、例えば、米国以外の国の基準などによって定義される。
【０２６１】
別の実施形態では、本開示方法で利用される組み換えリステリア株は、１バッチのワクチン用量からのものである。
【０２６２】
別の実施形態では、本開示方法で利用される組み換えリステリア株は、本明細書で開示される方法によって作製される冷凍ストックからのものである。
【０２６３】
別の実施形態では、本開示方法で利用される組み換えリステリア株は、本明細書で開示される方法によって作製される凍結乾燥ストックからのものである。
【０２６４】
別の実施形態では、本開示の細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン用量のバッチは、解凍時に９０％を越える生存能力を示す。別の実施形態では、解凍の後、凍結保存または冷凍保存のために２４時間保存する。別の実施形態では、保存は２日間である。別の実施形態では、保存は３日間である。別の実施形態では、保存は４日間である。別の実施形態では、保存は１週間である。別の実施形態では、保存は２週間である。別の実施形態では、保存は３週間である。別の実施形態では、保存は１か月である。別の実施形態では、保存は２か月である。別の実施形態では、保存は３か月である。別の実施形態では、保存は５か月である。別の実施形態では、保存は６か月である。別の実施形態では、保存は９か月である。別の実施形態では、保存は１年である。
【０２６５】
別の実施形態では、本開示の細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン用量のバッチは、栄養培地中でリステリア株の菌株を増殖させる工程と、グリセロールを含む溶液中でその菌株を凍結する工程と、リステリア株を−２０℃より低い温度で保存する工程とを含む方法により凍結保存される。別の実施形態では、温度は約−７０℃である。別の実施形態では、温度約−７０〜−８０℃である。
【０２６６】
本開示の方法および組成物の別の実施形態では、菌株（例えば、リステリア株の菌株で、リステリアワクチン用量のバッチを作製するために使用されたもの）は、細胞バンクから接種される。別の実施形態では、菌株は凍結ストックから接種される。別の実施形態では、菌株は種培養から接種される。別の実施形態では、菌株はコロニーから接種される。別の実施形態では、菌株は対数中期増殖期に接種される。別の実施形態では、菌株はほぼ対数中期増殖期に接種される。別の実施形態では、菌株は別の増殖期に接種される。
【０２６７】
本開示の方法および組成物の別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、２〜２０％の量のグリセロールを含む。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は２０％である。別の実施形態では、量は１％である。別の実施形態では、量は１．５％である。別の実施形態では、量は３％である。別の実施形態では、量は４％である。別の実施形態では、量は５％である。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は７％である。別の実施形態では、量は９％である。別の実施形態では、量は１０％である。別の実施形態では、量は１２％である。別の実施形態では、量は１４％である。別の実施形態では、量は１６％である。別の実施形態では、量は１８％である。別の実施形態では、量は２２２％である。別の実施形態では、量は２５％である。別の実施形態では、量は３０％である。別の実施形態では、量は３５％である。別の実施形態では、量は４０％である。
【０２６８】
別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、グリセロールの代わりに、別の束一的な添加物または凍結防止特性を備えた添加物を含む。別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、グリセロールに加えて、別の束一的な添加物または凍結防止特性を備えた添加物を含む。別の実施形態では、添加物はマンニトールである。別の実施形態では、添加物はＤＭＳＯである。別の実施形態では、添加物はショ糖である。別の実施形態では、添加物はその他任意の束一的な添加物または当該技術で既知の凍結防止特性を備えた添加物である。
【０２６９】
一実施形態では、ワクチンはその組成物に晒された結果として、組成物内の抗原またはポリペプチドに対する免疫応答を誘発する組成物である。別の実施形態では、ワクチンは追加的にアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはその組み合わせを含む。別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は追加的に、一実施形態では自家性、また別の実施形態では対象に対して異質遺伝子型の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。
【０２７０】
一実施形態では、「ワクチン」はその組成物に晒された結果として、組成物内の抗原またはポリペプチドに対する宿主内での免疫応答を誘発する組成物である。一実施形態では、免疫応答は、特定の抗原または抗原上の特定のエピトープに対するものである。一実施形態では、ワクチンはペプチドワクチン、別の実施形態ではＤＮＡワクチンとしうる。別の実施形態では、ワクチンは、細胞内に含められてもよく、また、別の実施形態では、細胞によって送達されてもよいが、これは一実施形態では細菌細胞であり、これは一実施形態ではリステリアである。一実施形態では、ワクチンは、対象が疾患または状態を縮小または成長させるのを防止してもよく、別の実施形態では、ワクチンは疾患または状態を持つ対象に対して療法的でもよい。一実施形態では、本開示のワクチンは、本開示の組成物と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２７１】
別の実施形態では、本開示は、本開示の組み換えリステリアを含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、本開示の方法および組成物の免疫原性組成物は、本開示の組み換え型ワクチンベクターを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、本開示のプラスミドを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物はアジュバントを含む。一実施形態では、本開示のベクターは、ワクチン組成物の一部として投与される。
【０２７２】
別の実施形態では、本開示のワクチンは、アジュバントと共に送達される。一実施形態では、アジュバントは主にＴｈ１媒介の免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントはＴｈ１タイプの免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントはＴｈ１媒介の免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントは、抗体媒介の応答よりも細胞媒介性免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で公知の任意の他のタイプのアジュバントであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は標的タンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘発する。
【０２７３】
別の実施形態では、アジュバントはＭＰＬである。別の実施形態では、アジュバントはＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、またはＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ作動薬である。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ４作動薬である。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲ９アゴニストである。別の実施形態では、アジュバントはＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）である。別の実施形態では、アジュバントはイミキモドである。別の実施形態では、アジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはサイトカインまたはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはケモカインまたはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはＩＬ−１２またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはＩＬ−６またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはリポポリサッカリドである。別の実施形態では、アジュバントは、参照により本明細書に援用されるＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌに記載されるものである。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントである。
【０２７４】
一実施形態では、本明細書には、組み換えリステリア株を前述の対象に投与する工程を含む、対象において抗原に対する免疫応答を誘導する方法が開示される。一実施形態では、本明細書には、組み換えリステリア株を前述の対象に投与する工程を含む、対象において抗原に対する抗血管新生免疫応答を誘導する方法が開示される。別の実施形態では、前述の組み換え型リステリア株は、第１および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの前述の核酸分子は異種抗原をコードする。なお別の実施形態では、前述の第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを持つオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。
【０２７５】
１つの実施形態では、対象において少なくとも１つの癌を治療、抑制、または阻害する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される組み換えリステリア株を前述の対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、前述の組み換えリステリア株は、核酸分子を含む。別の実施形態では、前述の核酸分子は、本明細書に開示される異種抗原をコードする。さらに別の実施形態では、前述の核酸分子は、前述のリステリアのプラスミドに存在する。別の実施形態では、前述の核酸分子は、短縮型ＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む内因性ポリペプチドをコードする核酸配列を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノム内に動作可能に組み込まれる。別の実施形態では、前述の抗原のうち少なくとも１つは、癌細胞のうちの少なくとも１つの細胞により発現される。別の実施形態では、治療方法は、腫瘍もしくは癌の転移を減少させるか、または腫瘍もしくは癌の転移を停止させる。別の実施形態では、治療方法は、前述の腫瘍もしくは前述の癌の増殖を低下させるか、または前述の腫瘍もしくは前述の癌の増殖を停止させる。
【０２７６】
１つの実施形態では、対象において感染性疾患の発生を減少または改善させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、本明細書に開示される組み換えリステリア株を投与する工程を含む。
【０２７７】
１つの実施形態では、対象において癌の発症を遅延させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、組み換えリステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、対象において癌への進行を遅延させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、組み換えリステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、対象において癌の寛解状態を延長させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、組み換えリステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、対象において既存の腫瘍の大きさを縮小させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、組み換えリステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、対象において既存の腫瘍の増殖を防止する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、組み換えリステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、対象において新たな腫瘍または追加的腫瘍の増殖を防止する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の対象に、組み換えリステリア株を投与する工程を含む。
【０２７８】
一実施形態では、癌または腫瘍は、特定の癌または腫瘍に対して影響を受けやすいことが分かっている特定の母集団で防止されうる。一実施形態では、こうした感受性は、一実施形態で、喫煙によってある母集団が肺癌になりやすくなる場合があるなど、環境的因子による場合があり、一方で別の実施形態では、こうした感受性は遺伝的因子による場合があり、例えば、ＢＲＣＡ１／２突然変異を持つ母集団は、一実施形態では乳癌に、また別の実施形態では卵巣癌に対する影響を受けやすい場合がある。別の実施形態では、染色体８ｑ２４、染色体１７ｑ１２、および染色体１７ｑ２４．３での１つ以上の突然変異は、当該技術で既知のとおり、前立腺癌に対する感受性を高めうる。癌感受性に寄与するその他の遺伝的因子および環境的因子は当該技術分野で既知である。
【０２７９】
１つの実施形態では、組み換えリステリア株は、対象に、１×１０６〜１×１０７ＣＦＵの用量で投与される。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、対象に、１×１０７〜１×１０８ＣＦＵの用量で投与される。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、対象に、１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量で投与される。別の実施形態では、組み換えリステリア株は、対象に、１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量で投与される。別の実施形態では、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１５×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。
【０２８０】
別の実施形態では、用量は１×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０８生命体である。
【０２８１】
別の実施形態では、用量は１×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０１０生命体である。
【０２８２】
１つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法を用いて対象に追加免疫することを含む。当業者には、「追加免疫する」という用語が、追加的なリステリア−−系免疫療法、免疫原性組成物、または組み換えリステリア系の用量を、対象に投与することが包含され得ることを理解するであろう。本開示方法の別の実施形態では、２回の追加免疫（すなわち総数で３回の接種）が投与される。別の実施形態では、３回の追加免疫が投与される。別の実施形態では、４回の追加免疫が投与される。別の実施形態では、５回の追加免疫が投与される。別の実施形態では、６回の追加免疫が投与される。別の実施形態では、７回以上の追加免疫が投与される。
【０２８３】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるリステリア系免疫療法または免疫原性組成物を用いた各追加免疫の後に抗生物質処方が投与される。
【０２８４】
別の実施形態では、本開示方法はさらに、組み換えリステリア株、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ  Ｔ細胞、治療的もしくは免疫調節性モノクローナル抗体、ＴＫＩ、免疫チェックポイント阻害剤、または受容体改変Ｔ細胞を用いて対象を追加免疫する工程を含む。別の実施形態では追加免疫接種で使用されるその組み換え型リステリア株は、最初の「初回免疫」接種で使用される株と同一である。別の実施形態ではその追加免疫株は初回免疫株と異なる。別の実施形態では、追加免疫接種で使用される組み換え型免疫チェックポイント阻害剤は、最初の「初回免疫」接種で使用される阻害剤と同一である。別の実施形態では、追加免疫阻害剤は、初回免疫阻害剤とは異なる。別の実施形態では初回免疫接種と追加免疫接種において同一の用量が使用される。別の実施形態ではより大きい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態ではより小さい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態では、本開示方法はさらに、前述の対象に追加免疫用量を投与する工程を含む。１つの実施形態では、追加免疫用量は、単回初回免疫用量の後に行われる。別の実施形態では、初回免疫用量の後に、単回追加免疫用量が投与される。別の実施形態では、初回免疫用量の後に、２回の追加免疫用量が投与される。別の実施形態では、初回免疫用量の後に、３回の追加免疫用量が投与される。１つの実施形態では、初回免疫株と追加免疫株の間の期間は、当業者により実験的に決定される。別の実施形態では、初回免疫株と追加免疫株の間の期間は、１週間であり、別の実施形態ではそれは２週間であり、別の実施形態ではそれは３週間であり、別の実施形態ではそれは４週間であり、別の実施形態ではそれは５週間であり、別の実施形態ではそれは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では追加免疫株は初回免疫株の８〜１０週間後に投与される。
【０２８５】
別の実施形態では、本開示方法は、本明細書に提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて対象を追加免疫する工程をさらに含む。別の実施形態では、本開示方法は、本明細書において提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物の追加免疫用量を投与する工程を含む。別の実施形態ではその追加免疫用量は前述の免疫原性組成物の代替的形態である。別の実施形態では、本開示の方法は、対象に追加免疫の免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。１つの実施形態では、追加免疫用量は、前述の免疫原性組成物の単回初回免疫用量の後に続く。別の実施形態では、初回免疫用量の後に単回追加免疫用量が投与される。別の実施形態では、初回免疫用量の後に２回の追加免疫用量が投与される。別の実施形態では、初回免疫用量の後に３回の追加免疫用量が投与される。１つの実施形態では、本明細書において提供される弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物の初回免疫用量と追加免疫用量との間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態ではこの用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、初回免疫用量と追加免疫用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態ではそれは２週間であり、別の実施形態ではそれは３週間であり、別の実施形態ではそれは４週間であり、別の実施形態ではそれは５週間であり、別の実施形態ではそれは６〜８週間であり、さらに別の実施形態ではその追加免疫用量は免疫原性組成物の初回免疫用量の８〜１０週間後に投与される。
【０２８６】
多数の病原体に対する免疫応答とそれらに対する保護の強化にとって非相同的「初回免疫・追加免疫」戦略が有効であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。初回免疫注射と追加免疫注射において異なる形態の抗原を提供することがその抗原に対する免疫応答を最大化するようである。ＤＮＡワクチンの初回免疫の後にアジュバント中のタンパク質用いた追加免疫、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが抗原特異的な抗体およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるようである。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種研究の最近のデータより、サルがＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡで初回免疫ワクチン接種され、続いてＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）で追加免疫ワクチン接種されるときにＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡにＣＲＬ１００５ポロキサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を添加することでＴ細胞応答が増強されることが示唆されている。ＤＮＡ／ポロキサマーでの初回免疫とそれに続くＡｄ５−ｇａｇ追加免疫についての細胞免疫応答は、（ポロキサマーを含まない）ＤＮＡ初回免疫とそれに続くＡｄ５−ｇａｇ追加免疫についての細胞免疫応答、またはＡｄ５−ｇａｇのみについての細胞免疫応答よりも大きかった。Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願公開第２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築物と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。その文書はＢ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られている。さらに、米国特許第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は同一の免疫応答時の、好ましくは互いに０〜１０日以内、または３〜７日間以内のそのポリヌクレオチドとそのポリペプチドの投与を意味する。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（全ての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属のもの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロ���菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。上記の参照文献の全ては全体が参照により本明細書に援用される。
【０２８７】
一実施形態では、本開示の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態ではそのプロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本開示の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況のために、乳癌または他のタイプの腫瘍などの癌のリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後の癌免疫療法として使用される。そのような処置に続いて本明細書に開示される免疫療法が投与され、これによってその免疫療法の腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が、残留転移癌を破壊し、癌からの寛解期間が長期化される。別の実施形態において、本明細書に開示される免疫療法を使用して、すでに確立された腫瘍の増殖に効果を発揮し、既存の腫瘍細胞を死滅させる。
【０２８８】
１つの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、異種抗原をコードし、および方法は、前立腺癌を治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原をコードし、方法は、卵巣癌を治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原をコードし、方法は、前立腺癌の転移を治療、阻害または抑制するものであり、１つの実施形態では骨への転移を含み、および別の実施形態では他器官への転移を含む。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原をコードし、方法は、骨への前立腺癌の転移を治療、阻害または抑制するためである。さらに別の実施形態では、方法は、他器官への前立腺癌の転移を治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原をコードし、方法は、乳癌を治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原をコードし、方法は、前立腺癌または乳癌の両方を治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子は、異種抗原またはその機能性断片をコードし、感染性病原体から発現され、または感染性病原体から誘導され、および方法は感染性疾患を縮小または改善するためである。
【０２８９】
１つの実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療法は、前立腺癌を治療、阻害、または抑制するためである。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療法は、卵巣癌を治療、阻害、または抑制するためである。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療法は、乳癌を治療、阻害、または抑制するためである。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療法は、前立腺癌の転移を治療、阻害、または抑制するためであり、１つの実施形態では骨への転移を含み、および別の実施形態では他器官への転移を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療法は、骨への前立腺癌の転移を治療、阻害、または抑制するためである。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療法は、他器官への前立腺癌の転移を治療、阻害、または抑制するためである。別の実施形態では、免疫原性組成物または治療法は、乳癌を治療、阻害、または抑制するためである。別の実施形態では、免疫原性組成物または治療法は、前立腺癌および乳癌の両方を治療、阻害、または抑制するためである。
【０２９０】
１つの実施形態では本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される疾患を有する対象を治療することを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、腫瘍または癌を有する対象を治療することを含む。別の実施形態では、治療は、前述の腫瘍もしくは前述の癌の増殖を低下または停止させる。別の実施形態では、治療は、前述の腫瘍もしくは前述の癌の転移を低下または停止させる。別の実施形態では、治療は、前述の対象において抗腫瘍性または抗癌性の免疫応答を惹起させ、および維持する。
【０２９１】
１つの実施形態では、本明細書に開示される治療方法は、前述の治療を受ける対象の生存期間を延長させる。
【０２９２】
前立腺癌ワクチンの有効性の評価方法は当分野に公知であり、たとえば、Ｄｚｏｊｉｃ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＲＡＭＰ−Ｃ２  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００６  Ｊｕｎ  １；６６（８）：８３１−８）、Ｎａｒｕｉｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＴＶＰ−１  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  Ｊｕｌ；１３（７）：６５８−６３）、Ｓｅｈｇａｌ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．２００６  Ａｕｇ  ２３；６：２１）、およびＨｅｉｎｒｉｃｈ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｎ  Ｌｏｂｕｎｄ−Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００７；５６（５）：７２５−３０）に解説されている。
【０２９３】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物を検証するために使用される前立腺癌モデルは、ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡを安定的に発現するＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞株から誘導された）マウスモデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、１７８−２  ＢＭＡ細胞モデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、ＰＡＩＩＩ腺癌細胞である。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、ＰＣ−３Ｍモデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、当分野に公知の任意のその他の前立腺癌モデルである。
【０２９４】
別の実施形態では、本明細書に開示される免疫療法は、ヒト対象で検証され、および有効性は、たとえばＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接測定することにより、または腫瘍転移の数と大きさを測定する、もしくは症状（咳、胸痛、体重減少など）をモニタリングすることにより疾患の進行を測定するなど、当分野に公知の方法を使用してモニタリングされる。ヒト対象における前立腺癌ワクチンの有効性を評価するための方法は当該技術で周知であり、例えば、Ｕｅｎａｋａ  Ａら（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚｅｄ  ｐｕｌｌｕｌａｎ（ＣＨＰ）ａｎｄ  ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．２００７  Ａｐｒ  １９；７：９）およびＴｈｏｍａｓ−Ｋａｓｋｅｌ  ＡＫら（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＰＳＣＡ  ａｎｄ  ＰＳＡ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＴＨ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６  Ｎｏｖ  １５；１１９（１０）：２４２８−３４）に記述されている。
【０２９５】
別の実施形態では、本開示は、対象の良性前立腺過形成（ＢＰＨ：ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、対象の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ：Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ）を治療する方法を提供する。
【０２９６】
１つの実施形態では、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれた核酸分子を含む組み換えリステリア株が本明細書において開示される。別の実施形態では、前述の核酸分子は、（ａ）ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドおよび（ｂ）オープンリーディングフレーム内に抗原を含むポリペプチドをコードする。
【０２９７】
１つの実施形態では、対象において少なくとも１つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、組み換えリステリア株を前述の対象に投与する工程を含む。
【０２９８】
一実施形態では、「抗原」という用語は、生物体と接触して配置された時に、その結果として生物体からの検出可能な免疫応答が生成される物質を意味する。抗原は、リピド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、またはその組み合わせおよび変形としうる。
【０２９９】
一実施形態では、「バリアント」は、母集団の大半とは異なるが、なおもそれに属すると考えられる共通の形態（例えば、スプライス異性体）と十分に類似した、アミノ酸または核酸配列（または他の実施形態では、生物体または組織）を意味する。
【０３００】
一実施形態では、「アイソフォーム」は、例えば、同一のタンパク質の別のアイソフォームまたは異形と比較してわずかな差異しかないタンパク質など、分子の異形を意味する。一実施形態では、アイソフォームは、異なるが関連した遺伝子から生成されうるか、または別の実施形態では、同一の遺伝子から選択的スプライシングによって生じることがある。別の実施形態では、アイソフォームは単一のヌクレオチド多型によってもたらされる。
【０３０１】
一実施形態では、「免疫原性」または「免疫原性」は、本明細書では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与された時に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の固有の能力を意味するために使用される。したがって、一実施形態では「免疫原性の促進」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与された時に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の固有の能力を増大することを意味する。免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の能力の増大は、一実施形態では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に対する抗体数の増加、抗原または生物体に対する抗体の多様性の増大、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に特異的なＴ細胞数の増加、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に対する細胞毒性またはヘルパーＴ細胞の応答の増大、およびこれに類するものによって測定されうる。
【０３０２】
一実施形態では、「ホモログ」は特定の核酸またはアミノ酸配列と一定割合の配列同一性を共有する核酸またはアミノ酸配列を意味する。１つの実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法に有用な配列は、本明細書に記載されているか、もしくは当分野で公知の、特定のＬＬＯ配列もしくはそのＮ末端断片、ＡｃｔＡ配列もしくはそのＮ末端断片、またはＰＥＳＴ配列のホモログであってもよい。１つの実施形態では、かかるホモログは維持する。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で有用な配列は、本明細書において開示される抗原性ポリペプチドのホモログであってもよく、１つの実施形態では、ＰＳＡまたはｃＨＥＲ２のその機能性断片である。１つの実施形態では、本開示のポリペプチドのホモログ、１つの実施形態では、かかるホモログをコードする核酸は、親ポリペプチドの機能的特徴を維持している。例えば、１つの実施形態では、本開示の抗原性ポリペプチドのホモログは、親ポリペプチドの抗原性の特徴を維持している。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法に有用な配列は、本明細書に記述されている任意の配列のホモログであってもよい。一実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも７０％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも７２％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも７５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも７８％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも８０％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも８２％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも８３％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも８５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも８７％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも８８％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９２％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９３％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９６％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９７％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９８％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも９９％の同一性を共有する。別の実施形態では、ホモログは、特定の配列と少なくとも１００％の同一性を共有する。
【０３０３】
１つの実施形態では、本明細書に開示されている、および／または本明細書に記述されている配列のいずれかのホモログは、本開示の一部であるとみなされることを理解されたい。
【０３０４】
一実施形態では、「治療する」という用語は、療法的な治療および予防または防止手段の両方を意味するが、目的は本明細書に記述されるように、標的化された病理学状態または障害を予防または少なくすることである。したがって、一実施形態では、治療することは、疾患、障害、もしくは病状、またはこれらの組み合わせに直接的に影響するもしくはそれを治癒すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を減少すること、その発症を遅延すること、それに関連する症状を減少することを含む場合がある。したがって、一実施形態では、「治療する」ことは、とりわけ、進行を遅延すること、寛解を早めること、寛解を誘発すること、寛解を増強すること、回復を加速すること、代替治療に対する有効性を増加することもしくは耐性を減少すること、またはこれらの組み合わせを意味する。一実施形態では、「防止する」または「妨げる」ことは、とりわけ、症状の発症を遅延すること、疾患の再発を防止すること、再発の発症の数または頻度を減少すること、症候性の症状の発現の間の潜伏を増加すること、またはこれらの組み合わせを意味する。一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」ことは、とりわけ、症状の重症度を減少すること、急性症状の発現の重症度を減少すること、症状の数を減少すること、疾患に関係した症状の発生率を減少すること、症状の潜伏を減少すること、症状を軽快すること、二次性症状を減少すること、二次感染を減少すること、患者の生存を延長すること、またはこれらの組み合わせを意味する。本明細書に開示されるすべての実施形態は、リステリア株の残存を減少させる方法も含む。１つの実施形態では、「〜の残存の減少」という用語は、抗生物質処方の投与を含まないリステリア系免疫療法処方と比較した、リステリアのＣＦＵ数の減少、リステリアの播種の減少、リステリアの付着の減少、またはリステリアのバイオフィルム形成の減少を指し、この場合において抗生物質処方は、リステリア株の免疫原性を変化させない。
【０３０５】
一実施形態では、症状は一次性であるが、一方で別の実施形態では、症状は続発性である。一実施形態では、「一次」は特定の疾患または障害の直接的な結果である症状を指すが、一方で一実施形態では、「続発性」は主因に由来する、その結果としての症状を指す。一実施形態では、本開示で使用するための化合物は、一次症状、または続発性症状、または二次合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は疾患または病的状態の何らかの兆候である場合がある。
【０３０６】
一部の実施形態では、「含む」という用語は、他の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列の含有、ならびに当分野に公知であり得る他のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列の含有を指し、１つの実施形態では、抗原、リステリアのポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、「本質的に〜からなる」という用語は、本明細書に開示される方法における使用のための組成物を指し、その組成物は、特定の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列もしくは核酸配列、またはその断片を有している。しかしながら、組み換えポリペプチドの有用性に直接は関与しない他のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列も含まれ得る。一部の実施形態では、「なる」という用語は、本明細書に開示されるいずれかの形態または実施形態にある、本明細書に開示される特定の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列もしくは核酸配列または断片、または組み換えポリペプチド、アミノ酸配列もしくは核酸配列または断片の組み合わせを有する、本明細書に開示される方法における使用のための組成物を指す。
【０３０７】
１つの実施形態では、本明細書で開示されている方法における使用のための免疫原性組成物は、静脈内に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫療法は経口投与され、また別の実施形態では、ワクチンは、非経口的（例えば、皮下、筋肉内、およびこれに類する方法）に投与される。
【０３０８】
さらに、別の実施形態では、組成物またはワクチンは、坐薬として、例えば、肛門坐剤または尿道坐剤として投与される。さらに、別の実施形態では、医薬組成物は、ペレットの皮下移植として投与される。さらなる実施形態では、ペレットはある期間にわたる薬剤の徐放を提供する。なお別の実施形態では、医薬組成物はカプセルの形態で投与される。
【０３０９】
一実施形態では、投与の経路は非経口的でもよい。別の実施形態では、経路は、眼内、結膜の、局所的、経皮的、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、経膣、直腸、腫瘍内、傍癌、経粘膜、筋肉内、血管内、脳室内、頭蓋内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、鼻腔内（点滴薬）、舌下、経口、エアロゾルまたは坐薬またはその組み合わせとしうる。吸入による鼻腔内投与または適用では、化合物の溶液または懸濁液が、適切な担体の存在下で混合およびエアロゾル化または噴霧化される。こうしたエアロゾルは、本明細書に記述されている任意の薬物を含みうる。一実施形態では、本明細書に記載された組成物は、頭蓋内投与に適した形態としうるが、これは一実施形態では、くも膜下腔内および脳室内の投与である。一実施形態では、投与の処方は、治療対象の状態の正確な性質、状態の重篤度、患者の年齢および一般的健康状態、体重、および個別の患者の反応などの因子に基づき、熟練した臨床医によって決定されることになる。
【０３１０】
一実施形態では、特に適した非経口適用は注射用の無菌溶液、できれば油性溶液または水溶液であり、また懸濁液、エマルション、または坐薬および浣腸剤を含めた移植である。アンプルは、便利な単位用量である。こうした坐薬は、本明細書に記述されている任意の薬物を含みうる。
【０３１１】
一実施形態では、例えば、リポソームまたは有効化合物が差動的に分解可能なコーティング（例えば、微小カプセル化、複数コーティングなど）で保護されているものなど、持続放出性または指定放出性の組成物を調製できる。こうした組成物は即放または徐放用に調製されうる。新しい化合物を凍結乾燥して、得られた凍結乾燥物を、例えば、注射用の製品の調製物として使用することも可能である。
【０３１２】
一実施形態では、液剤用に、医薬的に許容される担体は水溶液または非水系の溶液、懸濁液、エマルションまたはオイルとしうる。非水系溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用の有機エステル（オレイン酸エチルなど）がある。水溶性の担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液が含まれる。オイルの例としては、鉱物、動物、植物、または合成を起源とするオイル、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ひまわり油、および魚肝油がある。
【０３１３】
１つの実施形態では、本開示組成物は薬学的に許容可能である。１つの実施形態では、「薬学的に許容可能」という用語は、安全であり、および本開示における使用のための化合物の少なくとも１種の有効量を望ましい投与経路で適切に送達する任意の製剤を指す。この用語は、緩衝化製剤の使用についても言及し、ここでｐＨは化合物の安定性および投与経路に基づきｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲の望ましい特定の値に維持される。
【０３１４】
１つの実施形態では、本開示の組成物、または本開示の方法で使用される組成物は、単独で投与され、または組成物内で投与されうる。別の実施形態では、本開示の組成物を従来型の賦形剤と混合したもの、すなわち、有効化合物と有害な反応をしない、非経口的、経腸的（例えば、経口的）または局所的適用に適した薬学的に許容可能な有機または無機の担体物質を使用してもよい。一実施形態では、適切な医薬的に許容される担体には、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物オイル、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロースまたはデンプンなど）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、流動パラフィン、白パラフィン、グリセロール、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これに限定されない。別の実施形態では、製剤は殺菌することができ、また望ましい場合には、有効な化合物と有害な反応をしない助剤、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、香味料および／または芳香剤およびこれに類するものと混合される。別の実施形態では、これらは、望ましい場合には、その他の有効な薬剤、例えば、ビタミンと混合することもできる。
【０３１５】
一実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物を使用するための組成物は、担体／希釈剤と共に投与されうる。固体担体／希釈剤には、ゴム、デンプン（例えば、コーンスターチ、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、ショ糖、デキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはその混合物が含まれるが、これに限定されない。
【０３１６】
１つの実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物の免疫原性組成物は、本明細書に開示される弱毒化リステリア株と、癌の予防または治療に有効な１つ以上の追加的化合物を含んでもよい。一部の実施形態では、追加的な化合物は、化学療法で有用な化合物を含みうるが、これは一実施形態ではシスプラチンである。別の実施形態では、イホスファミド、フルオロウラシル５−ＦＵ、イリノテカン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル、ゲムシタビン、トポテカンまたはその組み合わせが、本明細書で開示されている方法における使用のために、本明細書に開示されている組成物と共に投与されてもよい。別の実施形態では、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはその組み合わせが、本明細書で開示されている方法における使用のために、本明細書に開示されている組成物と共に投与されてもよい。
【０３１７】
別の実施形態では、追加的化合物は、ＰＤ１阻害物質、ＰＤ−Ｌ１阻害物質、ＣＴＬＡ−４阻害物質を含むリストから選択される免疫チェックポイント阻害剤である。別の実施形態では、追加的化合物は、抗４１ＢＢアゴニスト抗体または抗ＣＤ４０アゴニスト抗体を含むリストから選択される免疫刺激物質である。
【０３１８】
別の実施形態では、本明細書に開示されている融合タンパク質は、適切な配列をサブクローニングした後で、その結果生じるヌクレオチドを発現させる工程を含むプロセスによって調製される。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産される。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第一の断片の５’端は第二の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第三のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。次いでインサートをプラスミドへと連結する。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片が異種ペプチド内に埋め込まれたタンパク質を生成するために、類似した戦略が使用される。
【０３１９】
別の実施形態では、遺伝子またはタンパク質の発現は当該技術で周知の方法により決定されるが、これは別の実施形態では、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、免疫ブロットなどを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される抗原の発現は、誘導系によって制御される一方、別の実施形態では、発現は構造性プロモーターにより制御される。別の実施形態では、誘導性発現系が当該技術で周知である。
【０３２０】
細菌を形質転換する方法は当分野で公知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的、および物理的な形質転換技術（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が挙げられる。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株は、エレクトロポレーションにより形質転換される。
【０３２１】
１つの実施形態では、対象に抗原に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、組み換えリステリア株を前述の対象に投与する工程を含み、この場合において前述の組み換えリステリア株は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含み、この場合において前述の第一の核酸分子は、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドをコードする核酸を有するオープンリーディングフレームとして、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれている。別の実施形態では、対象に抗原に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、組み換えリステリア株を前述の対象に投与する工程を含み、この場合において前述の組み換えリステリア株は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片を含む組み換えポリペプチドをコードする核酸分子を含み、この場合において前述の組み換えポリペプチドはさらに、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列を含んでいる。
【０３２２】
別の実施形態では、癌の発症を阻害する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される異種抗原を含む組み換えポリペプチドを発現する組み換えリステリア組成物を投与する工程を含む。
【０３２３】
別の実施形態では、癌の発症を阻害する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、前述の癌において特異的に発現される異種抗原を含む組み換えポリペプチドを発現する組み換えリステリア組成物を投与する工程を含む。
【０３２４】
１つの実施形態では、腫瘍または癌を有する対象を治療する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される異種抗原を含む組み換えポリペプチドを発現する本明細書に開示される組み換えリステリアを含む医薬組成物または製剤を投与する工程を含む。
【０３２５】
１つの実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療モダリティの投与は、追加的腫瘍関連抗原へのエピトープ拡大（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を誘導する。
【０３２６】
別の実施形態では、対象において癌と関連した症状を改善する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療モダリティを投与する工程を含む。
【０３２７】
１つの実施形態では、対象を癌から保護する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療モダリティを投与する工程を含む。
【０３２８】
別の実施形態では、癌の発生を遅延させる方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療モダリティを投与する工程を含む。別の実施形態では、癌の転移を治療する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療モダリティを投与する工程を含む。別の実施形態では、転移癌または微小転移巣を防ぐ方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される免疫原性組成物または治療モダリティを投与する工程を含む。別の実施形態では、組み換えリステリア組成物は、静脈内投与され、経口投与され、または非経口投与される。
【０３２９】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアを含む医薬組成物は、静脈内投与され、皮下投与され、鼻内投与され、筋肉内投与され、または腫瘍部位内もしくは腫瘍内に注入される。
【０３３０】
１つの実施形態では、「抗原性ポリペプチド」とは、本明細書において上述されるように、宿主に対して異種であり、宿主内に存在する時、または別の実施形態では宿主によって検出されるときに、免疫応答の開始をもたらすポリペプチド、ペプチド、または組み換えペプチドを指す。
【０３３１】
別の実施形態では「安定的に維持される」は、選択（例えば、抗生物質選択）が無い状態での検出可能な損失を伴わない核酸分子またはプラスミドの１０世代にわたる維持を指す。別の実施形態ではその期間は１５世代である。別の実施形態ではその期間は２０世代である。別の実施形態ではその期間は２５世代である。別の実施形態ではその期間は３０世代である。別の実施形態ではその期間は４０世代である。別の実施形態ではその期間は５０世代である。別の実施形態ではその期間は６０世代である。別の実施形態ではその期間は８０世代である。別の実施形態ではその期間は１００世代である。別の実施形態ではその期間は１５０世代である。別の実施形態ではその期間は２００世代である。別の実施形態ではその期間は３００世代である。別の実施形態ではその期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定的に維持される。
【０３３２】
一実施形態では、「アミノ酸」または「アミノ酸」という用語は、２０の自然発生的なアミノ酸のほか、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトランスフェラーゼが含まれる、翻訳後にインビボで改変されることがよくあるアミノ酸、ならびに、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニチンを含むがこれに限定されないその他の珍しいアミノ酸を含むものとして理解される。その上、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含みうる。
【０３３３】
本明細書で開示される方法および組成物の１つの実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を介在するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。それらのリコンビナーゼと関連タンパク質は「組換えタンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０３３４】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書で開示される方法および組成物の核酸配列を、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞をはじめとする任意の細胞において、インビトロまたはインビボで、構造的にまたは誘導的に発現する目的のための任意のファージを基とする組み換え発現系を指す。典型的にはファージ発現ベクターは細菌細胞内で複製することも適切な条件下でファージ粒子を生成することも可能である。この用語は直鎖状または環状の発現系を含み、且つ、エピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０３３５】
当業者であれば、「動作可能に連結した」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、任意のコード配列に対して、転写が開始されるような様式で配置されることを意味する場合があることを認識するであろう。一般的に、これはプロモーターおよび転写開始または始動配列がコード領域の５’側に配置されることを意味する。
【０３３６】
１つの実施形態では、「形質転換」とは、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り込むように細菌細胞を操作することを指す。別の実施形態では「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現させるために細菌細胞を操作することを指す。
【０３３７】
別の実施形態では遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へ導入するために接合が用いられる。本明細書において開示されるように、結合の方法は当分野で公知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述されている。
【０３３８】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌の持続的増殖のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。本明細書において開示されるように、別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成に必要とされる。
【０３３９】
「弱毒化」という用語が細菌の動物内に疾患を発生する能力の減少を包含する場合があることが当業者によって理解されるであろう。つまり、その弱毒化リステリアは培養状態で増殖し、且つ、維持され得るが、その弱毒化リステリア株の病原特性は野生型リステリアと比較すると減少している。実施例として弱毒化リステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用した場合の、接種された動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０よりも少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがって、リステリアの弱毒化株は、それが投与された動物を殺さない株であるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺す株である。弱毒化細菌は、一般的な環境中ではその細菌の成長のために必要な栄養素が中に存在しないために複製する能力を有しない細菌を意味するとも解釈されるべきである。したがって、その細菌の複製は必要な栄養素が提供される制御環境中での複製に限定される。したがって、本開示の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０３４０】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるリステリアは、本明細書に開示されるように異種ポリペプチドを発現し、別の実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアは、異種ポリペプチドを分泌する。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリアは、異種ポリペプチドを発現および分泌する。別の実施形態では、本明細書に開示されるリステリアは異種ポリペプチドを含み、また別の実施形態では、異種ポリペプチドを含む組み換えポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０３４１】
１つの実施形態では、本明細書に開示されるリステリア株は、本明細書に記載されるワクチンまたは免疫療法の調製において使用され得る。
【０３４２】
１つの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のワクチンは、哺乳類であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい、宿主の脊椎動物に、単独、または薬学的に許容可能な担体との併用のいずれかで、投与されてもよい。別の実施形態では、ワクチンは、リステリア株それ自体に対する免疫応答の誘導に効果的な量で、またはリステリア種が発現するように改変された異種抗原に対する免疫応答の誘導に効果的な量で投与される。別の実施形態では、投与されるワクチンの量は、本開示を所持している時、当業者によって規定通りに決定されてもよい。別の実施形態では、医薬的に許容される担体としては、滅菌した蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液が挙げられるがこれに限定されない。別の実施形態では、選択された医薬的に許容される担体および使用するべき担体の量は、投与のモード、リステリアの株、ならびにワクチン接種を受ける人の年齢および疾患の状態を含むいくつかの因子に依存することになる。別の実施形態では、ワクチンの投与は経口経路によってもよく、またはこれは、非経口的、鼻腔内、筋肉内、血管内、直腸内、腹腔内、または様々な周知の投与の経路のうちの任意の１つであってもよい。別の実施形態では、投与の経路は治療される感染性病原体または腫瘍のタイプに従って選択されてもよい。
【０３４３】
本明細書において使用される時、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」で表される単数形は、文脈から明確に別段の指示が無い限り、複数の参照物を含む。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【０３４４】
本出願全体を通して、本開示の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本開示の範囲の一定不動の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記載はその範囲内の全ての可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６までなどのような範囲の記載は、１〜３まで、１〜４まで、１〜５まで、２〜４まで、２〜６まで、３〜６まで、等々などの部分的範囲、ならびにこの範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の程度と無関係に適用される。
【０３４５】
本明細書において数値的範囲が示されるときはいつも、表示された範囲内のあらゆる引用される数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１表示数と第２表示数と「の間にわたる／の間の範囲」という句、および第１表示数「から」第２表示数「までにわたる／までの範囲」という句は本明細書において互換的に使用され、第１表示数および第２表示数ならびにそれらの間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
【０３４６】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０３４７】
「対象」という用語は、一実施形態では、症状もしくはその後遺症の療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症を受けやすい、ヒトを含む哺乳類を指す。対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス、ならびにヒトを含んでもよい。一実施形態では、「対象」という用語は、あらゆる点で健康であり、また疾患または障害の徴候を持ったり見せたりしない個体を除外しない。
【０３４８】
１つの実施形態では、本明細書に開示される組み換えリステリアを含む医薬組成物または製剤を含むキットが本明細書に開示される。
【０３４９】
本明細書に記載される具体的な実施形態は、以下が挙げられる：
１．リステリア系免疫療法処方の投与後の、疾患を有する対象内の組織上のリステリアの残存を防ぐ方法であって、前述の方法は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後に、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、それにより、前述の対象内の前述のリステリア株の残存を防ぐ。
２．前述のリステリア株は核酸分子を含み、前述の核酸分子は組み換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前述の組み換えポリペプチドは免疫原性タンパク質もしくはペプチドに融合された異種抗原またはその断片を含む、実施形態１に記載の方法。
３．前述の免疫原性タンパク質またはペプチドが、短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列を含む、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の方法。
４．前述の抗生物質処方の投与が、前述のリステリア株の播種または付着を防ぐ、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．前述の抗生物質処方の投与が、前述のリステリア株のバイオフィルム形成を防ぐ、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前述の抗生物質処方は、以下のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法：クリンダマイシン、ゲンタマイシン、アジスロマイシン、バンコマイシン、ホスホマイシン、リネゾリド、リファンピシン、ミノサイクリン、テリスロマイシン、ペフロキサシン、ベータ−ラクタム、フシジン酸、マクロライド、フルオロキノロン、メロペナム  ボス、モキシフロキサシン  ボス、アンピシリン、ダプゾン、トリメトプリム／スルファ（バクトリウム）またはそれらの任意の組み合わせ。
７．前述の抗生物質は、無傷の細胞内にはほとんど取り込まれない、実施形態６に記載の方法。
８．前述の抗生物質は、細胞に侵入し、細胞内細菌を除去することができる、実施形態６に記載の方法。
９．前述の抗生物質処方の前述の投与を、前述の組み換えリステリア株免疫療法の投与後１〜８時間以内に行うことを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法
１０．前述の抗生物質処方の前述の投与を、前述の組み換えリステリア株免疫療法の投与後２〜２４時間以内に行うこと、または前述のリステリア株が前述の対象内から除去されるまで、しかし前述の抗原が前述の対象において提示された後に行うことを含む、実施形態１〜６または８のいずれか１つに記載の方法
１１．前述の抗生物質処方の投与は、前述のリステリア株免疫療法の投与から生じた治療目的が達成された後の投与を含む、実施形態１〜６または８のいずれか１つに記載の方法。
１２．前述の治療目的は、抗疾患免疫応答を獲得することを含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．前述の治療目的は、腫瘍または癌の退縮の達成を含む、実施形態１１に記載の方法。
１４．対象に投与される前述のリステリア株免疫療法は、前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前述の抗生物質処方の投与は、前述の抗疾患応答が開始された後の投与を含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前述の抗生物質処方の前述の投与は、前述の対象の前述の抗疾患免疫応答に干渉しない、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１７．前述の抗生物質処方の投与が、前述の対象内の前述のリステリア株の存在を消去する、実施形態１０に記載の方法。
１８．前述の異種抗原は、ＰＳＡ抗原、キメラＨＥＲ２抗原、ＨＰＶ株１６  Ｅ７またはＨＰＶ株１８  Ｅ７を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前述のＰＳＡが、配列番号８を含む、実施形態１８に記載の方法。
２０．前述のｃＨＥＲ２が、配列番号１７を含む、実施形態１８に記載の方法。
２１．前述のＨＰＶ−Ｅ７抗原が、配列番号を含む、実施形態１８に記載の方法。
２２．前述の組み換えポリペプチドが、配列番号１５に記述されるアミノ酸配列を含むＰＳＡ抗原に融合された短縮型ＬＬＯを含む、実施形態２〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前述の組み換えポリペプチドが、配列番号２１に記述されるアミノ酸配列を含むｃＨＥＲ２抗原に融合された短縮型ＬＬＯを含む、実施形態１８に記載の方法。
２４．前述の組み換えポリペプチドが、配列番号２３に記述されるアミノ酸配列を含むＨＰＶ  Ｅ７抗原に融合された短縮型ＬＬＯを含む、実施形態１８に記載の方法。
２５．前述の核酸分子が、前述の組み換えリステリア株のプラスミド内にある、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前述のプラスミドが、組み込み型プラスミドである、実施形態２５に記載の方法。
２７．前述のプラスミドが、エピソーム性プラスミドである、実施形態２５に記載の方法。
２８．抗生物質選択の非存在下では、前述のプラスミドは、前述の組み換えリステリア株内で安定して維持される、実施形態２５に記載の方法。
２９．前述のプラスミドは、前述の組み換えリステリアに対し、抗生物質抵抗性を与えない、実施形態２５〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前述の組み換えリステリア株が弱毒化されている、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前述の弱毒化リステリアが、内因性遺伝子内に突然変異、欠失、置換、破損、または不活化を含む、実施形態３０に記載の方法。
３２．前述の内因性遺伝子は、ａｃｔＡ病原性遺伝子を含む、実施形態３１に記載の方法。
３３．前述の内因性遺伝子は、Ｄ−アラニンラセマーゼ（Ｄａｌ）遺伝子またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（Ｄａｔ）遺伝子を含む、実施形態３１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前述の内因性遺伝子は、前述のａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔ遺伝子を含む、実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前述のリステリア株内の前述の組み換え核酸分子が、第二のオープンリーディングフレームを含む、実施形態２〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前述の第二のオープンリーディングフレームが、代謝酵素をコードする、実施形態３５に記載の方法。
３７．前述の代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態３６に記載の方法。
３８．前述の組み換えポリペプチドが、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターから発現される、実施形態２〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．前述の組み換えリステリア株が、組み換えリステリア・モノサイトゲネス株である、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前述の組み換えリステリア株が、動物宿主を介して継代されている、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．前述の投与が、追加的腫瘍抗原に対するエピトープ拡大を誘導する、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前述の疾患が、腫瘍もしくは癌、前癌状態、感染性疾患、または寄生虫性疾患を含む、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前述の腫瘍または癌が、乳房の腫瘍もしくは癌、胃の腫瘍もしくは癌、前立腺の腫瘍もしくは癌、脳の腫瘍もしくは癌、頸部の腫瘍もしくは癌、子宮内膜の腫瘍もしくは癌、グリア芽腫、肺癌、膀胱の腫瘍もしくは癌、膵臓の腫瘍もしくは癌、メラノーマ、大腸の腫瘍もしくは癌、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態４２に記載の方法。
４４．前述の腫瘍または癌が、転移性である、実施形態４３に記載の方法。
４５．前述の方法が、前述の腫瘍または癌を有する対象を治療することを含む、実施形態４３〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．前述の治療が、前述の腫瘍または前述の癌の増殖を低下させるか、または停止させる、実施形態４５に記載の方法。
４７．前述の治療が、前述の腫瘍または前述の癌の転移を減少させるか、または停止させる、実施形態４５〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．前述の治療は、前述の対象において、抗腫瘍性または抗癌性の免疫応答を惹起させ、および維持する、実施形態４５〜４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．前述の治療が、前述の対象の生存期間を延長させる、実施形態４５〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．リステリア系免疫療法処方の投与後の、疾患を有する対象内の組織上のリステリアの残存を防ぐ方法であって、前述の方法は、前述の組み換えリステリア系免疫療法の投与後に、有効量の抗生物質処方を投与する工程を含み、それにより、前述の対象内の前述のリステリア株の残存を防ぐ。
５１．前述のリステリア株は、核酸分子を含み、前述の核酸分子は、１つ以上のネオエピトープをコードする１つ以上のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで前述の１つ以上のペプチドは免疫原性のタンパク質またはペプチドに融合されている、実施形態５０に記載の方法。
５２．前述の免疫原性タンパク質またはペプチドが、短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列を含む、実施形態５０〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．前述の抗生物質処方の投与が、前述のリステリア株の播種または付着を防ぐ、実施形態５０〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前述の抗生物質処方の投与が、前述のリステリア株のバイオフィルム形成を防ぐ、実施形態５０〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前述の抗生物質処方は、以下のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５０〜５４のいずれか１つに記載の方法：クリンダマイシン、ゲンタマイシン、アジスロマイシン、バンコマイシン、ホスホマイシン、リネゾリド、リファンピシン、ミノサイクリン、テリスロマイシン、ペフロキサシン、ベータ−ラクタム、フシジン酸、マクロライド、フルオロキノロン、アンピシリン、メロペナム  ボス、モキシフロキサシン  ボス、ダプゾン、トリメトプリム／スルファ（バクトリウム）またはそれらの任意の組み合わせ。
５６．前述の抗生物質は、無傷の細胞内にはほとんど取り込まれない、実施形態５５に記載の方法。
５７．前述の抗生物質は、細胞に侵入し、細胞内細菌を除去することができる、実施形態５６に記載の方法。
５８．前述の抗生物質処方の前述の投与を、前述の組み換えリステリア株免疫療法の投与後１〜８時間以内に行うことを含む、実施形態５０〜５７のいずれか１つに記載の方法
５９．前述の抗生物質処方の前述の投与を、前述の組み換えリステリア株免疫療法の投与後２〜２４時間以内に行うこと、または前述のリステリア株が前述の対象内から除去されるまで、しかし前述の抗原が前述の対象において提示された後に行うことを含む、実施形態５０〜５７または５８のいずれか１つに記載の方法
６０．前述の抗生物質処方の投与は、前述のリステリア株免疫療法の投与から生じた治療目的が達成された後の投与を含む、実施形態５０〜５７または５８のいずれか１つに記載の方法。
６１．前述の治療目的は、抗疾患免疫応答を獲得することを含む、実施形態６０に記載の方法。
６２．前述の治療目的は、腫瘍または癌の退縮の達成を含む、実施形態６０に記載の方法。
６３．対象に投与される前述のリステリア株免疫療法は、前述の対象において抗疾患免疫応答を惹起させる、実施形態５０〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．前述の抗生物質処方の投与は、前述の抗疾患応答が開始された後の投与を含む、実施形態５０〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６５．前述の抗生物質処方の前述の投与は、前述の対象の前述の抗疾患免疫応答に干渉しない、実施形態５０〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前述の抗生物質処方の投与が、前述の対象内の前述のリステリア株の存在を消去する、実施形態６５に記載の方法。
６７．前述の１つ以上のネオエピトープが、前述の疾患または状態を有する対象の疾患もしくは状態を担持する組織または細胞中に存在する、実施形態５０〜６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前述の核酸分子が、前述の組み換えリステリア株のプラスミド内にある、実施形態５０〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．前述のプラスミドが、組み込み型プラスミドである、実施形態６８に記載の方法。
７０．前述のプラスミドが、エピソーム性プラスミドである、実施形態６８に記載の方法。
７１．抗生物質選択の非存在下では、前述のプラスミドは、前述の組み換えリステリア株内で安定して維持される、実施形態６８に記載の方法。
７２．前述のプラスミドは、前述の組み換えリステリアに対し、抗生物質抵抗性を与えない、実施形態６８〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．前述の組み換えリステリア株が弱毒化されている、実施形態５０〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．前述の弱毒化リステリアが、内因性遺伝子内に突然変異、欠失、置換、破損、または不活化を含む、実施形態７３に記載の方法。
７５．前述の内因性遺伝子は、ａｃｔＡ病原性遺伝子を含む、実施形態７４に記載の方法。
７６．前述の内因性遺伝子は、Ｄ−アラニンラセマーゼ（Ｄａｌ）遺伝子またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（Ｄａｔ）遺伝子を含む、実施形態７４〜７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．前述の内因性遺伝子は、前述のａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔ遺伝子を含む、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．前述のリステリア株内の前述の組み換え核酸分子が、第二のオープンリーディングフレームを含む、実施形態５１〜７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．前述の第二のオープンリーディングフレームが、代謝酵素をコードする、実施形態７８に記載の方法。
８０．前述の代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態７９に記載の方法。
８１．前述の１つ以上のペプチドが、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターから発現される、実施形態５１〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．前述の組み換えリステリア株が、組み換えリステリア・モノサイトゲネス株である、実施形態５０〜８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．前述の組み換えリステリア株が、動物宿主を介して継代されている、実施形態５０〜８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．前述の投与が、追加的腫瘍抗原に対するエピトープ拡大を誘導する、実施形態５０〜８３のいずれか１つに記載の方法。
８５．前述の疾患が、腫瘍もしくは癌、前癌状態、感染性疾患、または寄生虫性疾患を含む、実施形態５０〜８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．前述の腫瘍または癌が、乳房の腫瘍もしくは癌、胃の腫瘍もしくは癌、前立腺の腫瘍もしくは癌、脳の腫瘍もしくは癌、頸部の腫瘍もしくは癌、子宮内膜の腫瘍もしくは癌、グリア芽腫、肺癌、膀胱の腫瘍もしくは癌、膵臓の腫瘍もしくは癌、メラノーマ、大腸の腫瘍もしくは癌、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態８５に記載の方法。
８７．前述の腫瘍または癌が、転移性である、実施形態８６に記載の方法。
８８．前述の方法が、前述の腫瘍または癌を有する対象を治療することを含む、実施形態８５〜８８のいずれか１つに記載の方法。
８９．前述の治療が、前述の腫瘍または前述の癌の増殖を低下させるか、または停止させる、実施形態８５〜８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．前述の治療が、前述の腫瘍または前述の癌の転移を減少させるか、または停止させる、実施形態８８〜８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．前述の治療は、前述の対象において、抗腫瘍性または抗癌性の免疫応答を惹起させ、および維持する、実施形態８８〜９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．前述の治療が、前述の対象の生存期間を延長させる、実施形態８８〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０３５０】
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本開示の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０３５１】
実施例１：弱毒化リステリア株ＬｍｄｄΔａｃｔＡの構築、およびＬｍｄｄ株およびＬｍｄｄａ株内のｈｌｙ遺伝子へのフレーム内でのヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入。
材料および方法
ｔＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌する組み換え型Ｌｍ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）が開発されたが、この株は前立腺癌についてマウスモデルにおける腫瘍の退行に関連した強力なＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発し、ここでｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現は、ｐＧＧ５５（表１）に基づき、プラスミドに由来し、これはベクターに抗生物質抵抗性を与える。我々は、最近、ｐＡｄｖ１４２プラスミドに基づき、ＰＳＡワクチン用の新株を開発したが、これは、抗生物質抵抗性マーカーを持たず、ＬｍｄｄＡ−１４２（表１）と呼ぶ。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化されている。加えて、ＬｍｄｄＡ−１４２はＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも免疫原性がわずかに高く、且つ、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行に関して著しく有効であった。
【表１】
2018537511.tif 000006
【０３５２】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３ｂｐ）の配列は次のとおりであった：
ｃｇｇａｇｔｇｔａｔａｃｔｇｇｃｔｔａｃｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｔｇａａｇｔｇｃｔｔｃａｔｇｔｇｇｃａｇｇａｇａａａａａａｇｇｃｔｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｇｔｃａｇｃａｇａａｔａｔｇｔｇａｔａｃａｇｇａｔａｔａｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔａｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃｇａａｃｇｇｇｇｃｇｇａｇａｔｔｔｃｃｔｇｇａａｇａｔｇｃｃａｇｇａａｇａｔａｃｔｔａａｃａｇｇｇａａｇｔｇａｇａｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａａｇｃｃｇｔｔｔｔｔｃｃａｔａｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｃａａｇｃａｔｃａｃｇａａａｔｃｔｇａｃｇｃｔｃａａａｔｃａｇｔｇｇｔｇｇｃｇａａａｃｃｃｇａｃａｇｇａｃｔａｔａａａｇａｔａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｃｔｔｔｃｇｇｔｔｔａｃｃｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔａｔｇｇｃｃｇｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃａｔｔｃｃａｃｇｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｇｔｔｃｃｇｇｇｔａｇｇｃａｇｔｔｃｇｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇａｃｔｇｔａｔｇｃａｃｇａａｃｃｃｃｃｃｇｔｔｃａｇｔｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔｔａｔｃｃｇｇｔａａｃｔａｔｃｇｔｃｔｔｇａｇｔｃｃａａｃｃｃｇｇａａａｇａｃａｔｇｃａａａａｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔａａｔｔｇａｔｔｔａｇａｇｇａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｔｃａｔｇｃｇｃｃｇｇｔｔａａｇｇｃｔａａａｃｔｇａａａｇｇａｃａａｇｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｃｇｃｔｃｃｔｃｃａａｇｃｃａｇｔｔａｃｃｔｃｇｇｔｔｃａａａｇａｇｔｔｇｇｔａｇｃｔｃａｇａｇａａｃｃｔｔｃｇａａａａａｃｃｇｃｃｃｔｇｃａａｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃａｇａｇｃａａｇａｇａｔｔａｃｇｃｇｃａｇａｃｃａａａａｃｇａｔｃｔｃａａｇａａｇａｔｃａｔｃｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａａａａｔａｔｔｔｃｔａｇｃｃｃｔｃｃｔｔｔｇａｔｔａｇｔａｔａｔｔｃｃｔａｔｃｔｔａａａｇｔｔａｃｔｔｔｔａｔｇｔｇｇａｇｇｃａｔｔａａｃａｔｔｔｇｔｔａａｔｇａｃｇｔｃａａａａｇｇａｔａｇｃａａｇａｃｔａｇａａｔａａａｇｃｔａｔａａａｇｃａａｇｃａｔａｔａａｔａｔｔｇｃｇｔｔｔｃａｔｃｔｔｔａｇａａｇｃｇａａｔｔｔｃｇｃｃａａｔａｔｔａｔａａｔｔａｔｃａａａａｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｃａａａｃｇｇｔａｔｔｔｇｇｃａｔｔａｔｔａｇｇｔｔａａａａａａｔｇｔａｇａａｇｇａｇａｇｔｇａａａｃｃｃａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔｔａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃＴＡＡｃｃｃｇｇｇｃｃａｃｔａａｃｔｃａａｃｇｃｔａｇｔａｇｔｇｇａｔｔｔａａｔｃｃｃａａａｔｇａｇｃｃａａｃａｇａａｃｃａｇａａｃｃａｇａａａｃａｇａａｃａａｇｔａａｃａｔｔｇｇａｇｔｔａｇａａａｔｇｇａａｇａａｇａａａａａａｇｃａａｔｇａｔｔｔｃｇｔｇｔｇａａｔａａｔｇｃａｃｇａａａｔｃａｔｔｇｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａａａａａｇｃｇａｔａｔａｃｔａｇａｔａｔａａｃｇａａａｃａａｃｇａａｃｔｇａａｔａａａｇａａｔａｃａａａａａａａｇａｇｃｃａｃｇａｃｃａｇｔｔａａａｇｃｃｔｇａｇａａａｃｔｔｔａａｃｔｇｃｇａｇｃｃｔｔａａｔｔｇａｔｔａｃｃａｃｃａａｔｃａａｔｔａａａｇａａｇｔｃｇａｇａｃｃｃａａａａｔｔｔｇｇｔａａａｇｔａｔｔｔａａｔｔａｃｔｔｔａｔｔａａｔｃａｇａｔａｃｔｔａａａｔａｔｃｔｇｔａａａｃｃｃａｔｔａｔａｔｃｇｇｇｔｔｔｔｔｇａｇｇｇｇａｔｔｔｃａａｇｔｃｔｔｔａａｇａａｇａｔａｃｃａｇｇｃａａｔｃａａｔｔａａｇａａａａａｃｔｔａｇｔｔｇａｔｔｇｃｃｔｔｔｔｔｔｇｔｔｇｔｇａｔｔｃａａｃｔｔｔｇａｔｃｇｔａｇｃｔｔｃｔａａｃｔａａｔｔａａｔｔｔｔｃｇｔａａｇａａａｇｇａｇａａｃａｇｃｔｇａａｔｇａａｔａｔｃｃｃｔｔｔｔｇｔｔｇｔａｇａａａｃｔｇｔｇｃｔｔｃａｔｇａｃｇｇｃｔｔｇｔｔａａａｇｔａｃａａａｔｔｔａａａａａｔａｇｔａａａａｔｔｃｇｃｔｃａａｔｃａｃｔａｃｃａａｇｃｃａｇｇｔａａａａｇｔａａａｇｇｇｇｃｔａｔｔｔｔｔｇｃｇｔａｔｃｇｃｔｃａａａａａａａａｇｃａｔｇａｔｔｇｇｃｇｇａｃｇｔｇｇｃｇｔｔｇｔｔｃｔｇａｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇｃｇａｔｔｃａｃｇａａａａｔｃａａｇａｔａｃａｔｔｔａｃｇｃａｔｔｇｇａｃａｃｃａａａｃｇｔｔｔａｔｃｇｔｔａｔｇｇｔａｃｇｔａｔｇｃａｇａｃｇａａａａｃｃｇｔｔｃａｔａｃａｃｔａａａｇｇａｃａｔｔｃｔｇａａａａｃａａｔｔｔａａｇａｃａａａｔｃａａｔａｃｃｔｔｃｔｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔｇａｔａｔｔｃａｃａｃｇｇａａａａａｇａａａｃｔａｔｔｔｃａｇｃａａｇｃｇａｔａｔｔｔｔａａｃａａｃａｇｃｔａｔｔｇａｔｔｔａｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｇｔｔａａｔｔａｔｃａａａｔｃｔｇａｔａａａｇｇｔｔａｔｃａａｇｃａｔａｔｔｔｔｇｔｔｔｔａｇａａａｃｇｃｃａｇｔｃｔａｔｇｔｇａｃｔｔｃａａａａｔｃａｇａａｔｔｔａａａｔｃｔｇｔｃａａａｇｃａｇｃｃａａａａｔａａｔｃｔｃｇｃａａａａｔａｔｃｃｇａｇａａｔａｔｔｔｔｇｇａａａｇｔｃｔｔｔｇｃｃａｇｔｔｇａｔｃｔａａｃｇｔｇｃａａｔｃａｔｔｔｔｇｇｇａｔｔｇｃｔｃｇｔａｔａｃｃａａｇａａｃｇｇａｃａａｔｇｔａｇａａｔｔｔｔｔｔｇａｔｃｃｃａａｔｔａｃｃｇｔｔａｔｔｃｔｔｔｃａａａｇａａｔｇｇｃａａｇａｔｔｇｇｔｃｔｔｔｃａａａｃａａａｃａｇａｔａａｔａａｇｇｇｃｔｔｔａｃｔｃｇｔｔｃａａｇｔｃｔａａｃｇｇｔｔｔｔａａｇｃｇｇｔａｃａｇａａｇｇｃａａａａａａｃａａｇｔａｇａｔｇａａｃｃｃｔｇｇｔｔｔａａｔｃｔｃｔｔａｔｔｇｃａｃｇａａａｃｇａａａｔｔｔｔｃａｇｇａｇａａａａｇｇｇｔｔｔａｇｔａｇｇｇｃｇｃａａｔａｇｃｇｔｔａｔｇｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｇｃｃｔａｃｔｔｔａｇｔｔｃａｇｇｃｔａｔｔｃａａｔｃｇａａａｃｇｔｇｃｇａａｔａｔａａｔａｔｇｔｔｔｇａｇｔｔｔａａｔａａｔｃｇａｔｔａｇａｔｃａａｃｃｃｔｔａｇａａｇａａａａａｇａａｇｔａａｔｃａａａａｔｔｇｔｔａｇａａｇｔｇｃｃｔａｔｔｃａｇａａａａｃｔａｔｃａａｇｇｇｇｃｔａａｔａｇｇｇａａｔａｃａｔｔａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｃａａａｇｃｔｔｇｇｇｔａｔｃａａｇｔｇａｔｔｔａａｃｃａｇｔａａａｇａｔｔｔａｔｔｔｇｔｃｃｇｔｃａａｇｇｇｔｇｇｔｔｔａａａｔｔｃａａｇａａａａａａａｇａａｇｃｇａａｃｇｔｃａａｃｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｇｔｃａｇａａｔｇｇａａａｇａａｇａｔｔｔａａｔｇｇｃｔｔａｔａｔｔａｇｃｇａａａａａａｇｃｇａｔｇｔａｔａｃａａｇｃｃｔｔａｔｔｔａｇｃｇａｃｇａｃｃａａａａａａｇａｇａｔｔａｇａｇａａｇｔｇｃｔａｇｇｃａｔｔｃｃｔｇａａｃｇｇａｃａｔｔａｇａｔａａａｔｔｇｃｔｇａａｇｇｔａｃｔｇａａｇｇｃｇａａｔｃａｇｇａａａｔｔｔｔｃｔｔｔａａｇａｔｔａａａｃｃａｇｇａａｇａａａｔｇｇｔｇｇｃａｔｔｃａａｃｔｔｇｃｔａｇｔｇｔｔａａａｔｃａｔｔｇｔｔｇｃｔａｔｃｇａｔｃａｔｔａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａｃｇａｇａａａｇｃｔａｔａｔａａａ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【０３５３】
Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株を病毒性因子ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化した。下流遺伝子の発現に対するあらゆる極性効果を避けるようにａｃｔＡのフレーム内欠失をＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンドで構築した。そのＬｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ΔａｃｔＡはＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によってＮ末端の最初の１９アミノ酸とＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。
【０３５４】
そのａｃｔＡ欠失突然変異体は、ＰＣＲによってａｃｔＡの上流部分（６５７ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７１／２７２）および下流部分（６２５ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅し、且つ、結合することにより作製された。この増幅に使用されたプライマーの配列が表２に提示されている。ＡｃｔＡの上流および顆粒のＤＮＡ領域が、ｐＮＥＢ１９３内でＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位でクローン化され、またこのプラスミドから、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩがさらに、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内でクローン化され、その結果としてΔＡｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）が得られた。
【表２】
2018537511.tif 000007
【０３５５】
その染色体位置からの遺伝子の欠失は、ＡｃｔＡ欠失領域に外部的に結合するプライマーを使用して確認された。これは図１（ＡおよびＢ）において、プライマー３（Ａｄｖ  ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号４７）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号４８）として示されている。ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔａｃｔＡから単離された染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ分析を実施した。Ｌｍｄｄの染色体ＤＮＡ内でのプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットによる増幅後のＤＮＡ断片のサイズは３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂであると予期された。一方で、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ用のプライマー対１／２および３／４を使用するＰＣＲの期待サイズは１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂであった。したがって、図１（ＡおよびＢ）のＰＣＲ解析から、ａｃｔＡの１．８ｋｂ領域が、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内では欠失していることが確認される。ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内のａｃｔＡ含有領域の欠失を確認するためにＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシングも実施した。
実施例２：Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存的エピソーム発現系の構築。
【０３５６】
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質非依存的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４．７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に援用される）。リステリア株Ｌｍｄｄは染色体中に病原性遺伝子転写活性化因子の遺伝子である１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含むため、ｐｒｆＡをｐＴＶ３から欠失した。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌ用のカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換され、その結果としてプラスミドｐＡｄｖ１３４が得られた（図２Ａ）。リステリアとバチルスのｄａｌ遺伝子の類似性は約３０％であり、Ｌｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片とそのプラスミドとの間で組換えが起こる可能性が実質的に排除される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んだ。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現がウエスタンブロットによって確認された（図２Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質耐性マーカーを持っていない。
【０３５７】
さらに、ｐＡｄｖ１３４をＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限処理してヒトＰＳＡであるｋｌｋ３をクローニングしてプラスミドｐＡｄｖ１４２を得た。新しいプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図２Ｃ、表１）は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下でバシラスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。そのシャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９ならびにリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を相補した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータープロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図２Ｃ）。
【０３５８】
プラスミドｐＡｄｖ１４２でリステリアのバックグラウンド株であるＬｍｄｄａｃｔＡ株を形質転換してＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡを得た。株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された（図２Ｄ）。インビボでの２継代後にＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。
実施例３  ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株のインビトロおよびインビボでの安定性
【０３５９】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を選択圧の存在下または非存在下で８日間にわたり培養することによりプラスミドのインビトロでの安定性を検査した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株用の選択圧はＤ−アラニンである。したがって、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地およびＢＨＩ＋１００μｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニン培地中でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株を継代培養した。選択培地（ＢＨＩ）および非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地上にプレーティングした後に毎日ＣＦＵを決定した。プラスミドの喪失が非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）上へのプレーティング後のより高いＣＦＵにつながることが予期された。図３Ａに示すとおり、選択的および非選択的な培地でのＣＦＵ数には差異がなかった。このことは、実験が終了するときである少なくとも５０世代にわたってプラスミドｐＡｄｖ１４２が安定であったことを示唆する。
【０３６０】
インビボでのプラスミド維持が、５×１０７ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６  マウスに静脈内注入することにより決定された。２４時間および４８時間の時点でＰＢＳ中に均質化した脾臓から生存可能な細菌を分離した。ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋１００ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニン上で各時点について各試料のＣＦＵを決定した。選択培地および非選択培地への脾細胞のプレーティングの後、２４時間後にコロニーを回収した。この株は非常に弱毒化されているため、インビボにおいて２４時間で細菌負荷量が除去された。選択的および非選択的なプレートで有意なＣＦＵの差異は検出されず、これは分離されたすべての細菌内での組み換え型プラスミドの安定した存在を示している（図３Ｂ）。
実施例４  ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）株のインビボでの継代、病毒性およびクリアランス
【０３６１】
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソーム的に発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組み換え型リステリア株である。安全な用量を決定するために様々な用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡでマウスを免疫化し、毒性効果を決定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒性効果しか引き起こさなかった（データ非表示）。それらの結果より、１０８ＣＦＵの用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡはマウスによって充分に忍容されることが示唆された。病毒性研究によりＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株が非常に弱毒化されたことが示されている。
【０３６２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに安全な投与量１０８ＣＦＵを腹腔内投与した後での、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでのクリアランスが決定された。２日後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの肝臓および脾臓内には検出可能なコロニーが存在しなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで４８時間の時点で完全にクリアされた（図４Ａ）。
【０３６３】
マクロファージに感染して細胞内で成長するＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の能力がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化により低下するか決定するため、細胞感染アッセイを実施した。Ｊ７７４Ａ．１などのマウスのマクロファージ様細胞株にリステリア構成体をインビトロで感染させ、細胞内増殖を定量した。陽性対照株である野生型リステリア株１０４０３Ｓは細胞内で増殖し、ｐｒｆＡ変異体である陰性対照ＸＦＬ７は、ファゴリソソームを回避することができず、したがってＪ７７４細胞内で増殖しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内での増殖は、この株の細胞から細胞へと蔓延する能力の損失のため、１０４０３Ｓよりも遅かった（図４Ｂ）。それらの結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡがマクロファージに感染し、細胞質内で増殖する能力を持っていることを示す。
実施例５：Ｃ５７ＢＬ／６  マウスにおけるＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の免疫原性
【０３６４】
Ｃ５７ＢＬ／６  マウス内で構築物ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡにより誘発されたＰＳＡ特異的な免疫応答がＰＳＡ四量体染色を使用して決定された。１週間の間隔でマウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫し、追加免疫から６日後にＰＳＡ四量体について脾細胞を染色した。ＰＳＡ特異的な四量体での脾細胞の染色によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＰＳＡ四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％の誘発が示された（図５Ａ）。ＰＳＡペプチドでの５時間にわたる刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＰＳＡ特異的Ｔ細胞の機能的能力を、細胞内サイトカイン染色を使用して検査した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群でＰＳＡペプチドで刺激したＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γを分泌する細胞で、無処置マウスと比較して２００倍の増加があり（図５Ｂ）、これは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は非常に免疫原性が高く、また脾臓内のＰＳＡに対して高いレベルの機能的に活性のＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を初期刺激することを示している。
【０３６５】
マウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化した後でＰＳＡに対して生成された細胞毒性Ｔ細胞の機能性活性を決定するために、ＰＳＡ特異的なＣＴＬの持つインビトロアッセイでＨ−２ＤｂペプチドによりパルスしたＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウム放出（図５Ｄ）が、細胞溶解を測定するために使用された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの脾細胞は、ＰＳＡペプチドを標的抗原として提示する細胞に対して高い細胞溶解活性を持つＣＴＬを含んだ。
【０３６６】
抗原で２４ｈ刺激した後、エフェクターＴ細胞の持つＩＦＮ−γを分泌する機能性能力を決定するためにＥＬＩＳｐｏｔが実施された。ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、特異的ペプチドで刺激したＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスからの脾細胞内で、無処置マウスの脾細胞と比較した時に、ＩＦＮ−γのスポット数に２０倍の増加があったことが観察された（図５Ｅ）。
実施例６：ＬｍｄｄＡ−１４２株での免疫によりＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的ＣＴＬによる腫瘍の浸潤が誘導される。
【０３６７】
ＰＳＡを発現するように改変された前立腺腺癌細胞株（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を使用してＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）構築物の治療効力を決定した。マウスに２×１０６のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に腫瘍が４〜６ｍｍの触知可能なサイズに達したとき、１週間の間隔でマウスを３回にわたって１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２で免疫するか、１０７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（陽性対照）で免疫するか、または未処置のままとした。無処置マウスは腫瘍を徐々に成長させた（図６Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫化したマウスは、すべて３５日目まで腫瘍がなく、８匹のうち３匹のマウスが腫瘍を徐々に成長させたが、無処置マウスと比較してずっと遅い速度で成長した（図６Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスが７０日目まで腫瘍が無いままであった。予想されたとおり、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種したマウスは、無処置の対照よりも腫瘍が少なく、腫瘍の成長は対照よりもさらに遅かった（図６Ｃ）。したがって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築物は、ＴＰＳＡ細胞株によって確立された腫瘍の６０％を退行させ、且つ、他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせることができた。腫瘍が無いまま治癒したマウスは６８日目にＴＰＳＡ腫瘍に再曝露された。
【０３６８】
ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫化は、増殖を制御でき、また無処置群（図６Ａ）で無かったのと比較して、６０％を越える実験動物（図６Ｂ）でＰＳＡを発現するよう改変された、確定されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の７日目の退行を誘発できる。ＬｍｄｄＡ−１４２は、高度に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびプラスミドｐＡｄｖ１４２（表１）を使用して構築された。
【０３６９】
さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築物によって生成されたＰＳＡ特異的ＣＤ８リンパ球の腫瘍浸潤能力を調査した。マウスに腫瘍およびマトリゲルの混合物を皮下移植した後、７日間の間隔でマウスを未感作にするか、または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアもしくはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫した。２１日目に腫瘍を切除し、それらの腫瘍に浸潤しているＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の制御性Ｔ細胞集団についてそれらの腫瘍を分析した。
【０３７０】
未感作マウスおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照で免疫されたマウスの両方に存在する非常に少数のＰＳＡ特異的ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスでは、ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋  ＴＩＬの割合に１０〜３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓内のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋細胞の母集団は、腫瘍内よりも７．５倍少なかった（図７Ａ）。
【０３７１】
加えて、無処置マウスおよびリステリアで免疫されたマウスの腫瘍内でのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在が決定された。興味深いことに、リステリアでの免疫化によって、結果として、腫瘍内のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの数がかなり減少したが、脾臓内では減少しなかった（図７Ｂ）。ところが、構築物ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、無処置およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化群と比較した時に、腫瘍内でのＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの頻度の減少に強力な影響を及ぼした（図７Ｂ）。
【０３７２】
よって、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位を浸潤することができるＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発できる（図７Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化は、腫瘍内での制御性Ｔ細胞数の減少に関連し（図７Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性について、より好ましい環境が創出される。
実施例７  Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず機能的なＬＬＯを分泌する。
【０３７３】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、相同組換えにより染色体中のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入されたＰＳＡタンパク質をコードする全長型ヒトｋｌｋ３遺伝子を含む。これらの構築物は、温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組換えカセットを保有するｐＫＳＶ７プラスミド（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２；７４（７−８）ｐ７０５−７１１）を使用する相同組換えにより作製された。その第２の組換え事象後のプラスミドの切除のため、組込みの選択に使用される抗生物質耐性マーカーが失われている。さらに、ＡｃｔＡ遺伝子は、ＬｍｄｄＡ−１４３株内で除去される（図８Ａ）。ｈｌｙとインフレームのｋｌｋ３の染色体への挿入が、ＰＣＲにより確認され（図８Ｂ）、両方の構築物で配列決定がなされた（データ非表示）。
【０３７４】
これらの染色体構築物の一つの重要な面は、ＬＬＯ−ＰＳＡが生成されてもファゴソームからのリステリアの回避、細胞質侵入、およびＬ．モノサイトゲネスによって生じる効率的な免疫に必要とされるＬＬＯの機能が完全には消滅しないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清からの分泌タンパク質のウエスタンブロットにより、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する〜８１ｋＤａ帯域および予想されたＬＬＯのサイズである〜６０  ｋＤａ帯域（図９Ａ）が明らかにされるが、これは染色体内の融合遺伝子にもかかわらず、ＬＬＯがＬ．モノサイトゲネスによってＬＬＯ−ＰＳＡ融合から切断されたか、またはなおも単一のタンパク質から生成されたかのいずれかであることを示す。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によるＬＬＯ分泌により、野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、５０％の溶血活性が保持された（図９Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、マクロファージ様のＪ７７４細胞株内で、細胞内での複製ができた（図９Ｃ）。
実施例８：Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する。
【０３７５】
Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌できることを示した後、これらの株がＰＳＡ特異的免疫応答をインビボで誘導できるかという問題を調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを未処置のままにするか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、もしくはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫したＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をＰＳＡ６５〜７４ペプチドでの脾細胞の刺激、およびＩＦＮ−γについての細胞内染色により測定した。図１０に示すとおり、染色体およびプラスミドをベースにしたベクターにより誘発された免疫応答は同様であった。
実施例９：Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の生成：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築
【０３７６】
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については以下の通りであった。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によるＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）の直接融合によって作製された。そのキメラタンパク質はそのタンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの大半を有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子が、プラスミドのｐＡｄｖ１３８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を構築するために使用された）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、プラスミドｐＡｄｖ８４が得られた（図１１Ａ）。これらの２つのプラスミド骨格の間には２つの大きい違いがある。１）ｐＡｄｖ１３８が組換え型細菌のインビトロ選別のためにクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用するのに対し、ｐＡｄｖ８４は枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を保持しており、この遺伝子は、ｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を持たないＬｍｄｄＡ株でのインビトロ選別とインビボプラスミド保持に対し代謝相補経路を利用する。このワクチンプラットフォームは、改変リステリア株の抗生物質抵抗性に関するＦＤＡの懸念事項に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、ｐＡｄｖ８４は、プラスミド中のｐｒｆＡ遺伝子のコピーは、Ｌｍｄｄ株のインビボ補完に必須ではないため、有していない（以下の配列および図１１Ａを参照のこと）。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。インビトロで８時間増殖した後、この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、ＴＣＡ沈殿された細胞培養上清中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（図１１Ｂ）と同等であり、これはウエスタンブロット解析を使用し、約１０４ＫＤのバンドとして抗ＬＬＯ抗体により検出された。陰性対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株を使用した。
【０３７７】
ｐＡｄｖ８４配列（７０７５塩基対）（図１１Ａおよび１１Ｂを参照）：
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実施例１０：ＡＤＸＳ３１−１６４はＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である
【０３７８】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに融合されたＨｅｒ２細胞内断片のみを発現するリステリアで免疫されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラよりも低い溶解活性を示した。未感作動物、または無関係なリステリアワクチンが注射されたマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図１２Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウス由来脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできた（図１２Ｂ）。高レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する、マイトマイシンＣで処置されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清中で、これが検出された（図１２Ｃ）。
【０３７９】
ＡＤＸＳ３１−１６４での免疫後のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適切なプロセッシングと提示をＨＬＡ−Ａ２マウスで検査した。免疫されたＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入体に由来する脾細胞を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（配列番号５０のＨＬＹＱＧＣＱＶＶまたは配列番号５１のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）または細胞内ドメイン（配列番号５２のＲＬＬＱＥＴＥＬＶ）に位置する、マップ化ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対応するペプチドと共に７２時間にわたって共培養した（図１２Ｃ）。組換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として使用し、無関連のペプチドまたはペプチドなしを陰性対照として使用した。この実験のデータは、標的とされた抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答がＡＤＸＳ３１−１６４により誘発され得ることを示している。
実施例１１：ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である
【０３８０】
２０〜２５週齢でゆっくりと増殖する自然発生的乳腺腫瘍を発生するＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物においてＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果をＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の抗腫瘍効果と比較した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週目では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免疫されたマウスの２５％と対照的に、ＡＤＸＳ３１−１６４ワクチン接種マウスの５０％超（９匹のうち５匹）に未だに腫瘍が無かった。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍が無いままであったが、一方で他の実験群のマウスはすべて、すでに腫瘍を発症していた（図１３）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４は、より弱毒化されているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的乳腺腫瘍の発症の防止に関してＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも有効であることを示している。
実施例１２：ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異
【０３８１】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。どのワクチン接種されたた腫瘍試料のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子内にも突然変異が観察されなかった。これは代替的なエスケープ機構を示唆している（データを示さず）。
実施例１３：ＡＤＸＳ３１−１６４は腫瘍内制御性Ｔ細胞の著しい減少を引き起こす
【０３８２】
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫の後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Ｔｒｅｇを染色し、これらがＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞として明らかにされたが、別々に分析したときにＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのどちらかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、無関係なリステリアワクチンまたは未感作動物と比較して、脾臓内のＴｒｅｇの頻度に対しては効果が無かったことを示した（図１４）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を与えた（図１５Ａ）。処理されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図１５Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
実施例１４：ＡＤＸＳ３１−１６４での末梢免疫は転移性乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延させることができる
【０３８３】
ＡＤＸＳ３１−１６４または無関連Ｌｍ対照ワクチンを用いてマウスに腹腔内で免疫化し、次いでルシフェラーゼおよび低いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞５０００個を頭蓋内に移植した（図１６Ａ）。麻酔されたマウスの生体外撮像によって接種後の様々な時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に、すべての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスでは検出可能な腫瘍はまったく現れなかった（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。腫瘍接種後１１日目には陰性対照群の全てのマウスが既に腫瘍のために死んでいたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群の全てのマウスがまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであったので、ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延させることができた。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与を用いて得られた免疫応答が中枢神経系に到達することができる可能性があり、かつＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療のための使用の可能性を有する場合があることを強く示唆する。
実施例１５：リステリア系免疫療法投与後のバイオフィルム形成の防止
材料および方法
【０３８４】
骨移植片をマウスに移植し、その後、リステリア免疫療法（たとえばＡＤＸＳ３１−１４２またはＡＤＸＳ３１−１６４）接種物を投与して、骨移植片上へのリステリアの播種と、それに引き続くバイオフィルム形成を測定する。
【０３８５】
１日目に、マウス実験群にリステリア免疫療法用量を接種し、その後、リステリア免疫療法の投与後すぐに、または投与後１時間までにたとえばクリンダマイシンやゲンタマイシンなどの細胞に侵入しない抗生物質を投与する。リステリア免疫療法投与の１０時間、１２時間、１４時間および１６時間後、たとえばアンピシリンなどの宿主細胞に侵入して細胞内細菌を除去する抗生物質を使用して、第二の抗生物質用量をマウスに投与する。２日目、骨移植片を採取し、バイオフィルムの存在に関して組織分析を行う。１日目、対照マウスの第一群に、リステリア免疫療法の用量を接種し、骨移植片採取まで抗生物質で処置しないままとする。１日目、対照マウスの第二群に、リステリア免疫療法の用量を接種し、リステリア免疫療法投与の１０時間、１２時間、１４時間および１６時間後に、たとえばアンピシリンなどの宿主細胞に侵入して細胞内細菌を除去する抗生物質を使用した抗生物質用量も投与し、リステリアの完全除去の有効性を測定する。２日目、骨移植片を両方の対照群から採取し、バイオフィルムの存在に関して組織分析を行う。
【０３８６】
全群のマウスから脾臓と肝臓も採取し、リステリアの存在を測定する。
結果
【０３８７】
リステリア免疫療法の実験群は、免疫細胞に抗原提示し、抗腫瘍／抗癌免疫応答を惹起することができ、抗生物質処置後、そのリステリアはマウスから完全に除去されることが観察される。
実施例１６：早い時点の抗生物質投与では、ＰＳＡ−ＳＶＮ  Ｔａｇ（Ｐ２  ｇ６．１）の免疫原性は変化していない
【０３８８】
アンピシリンまたはゲンタマイシン／アンピシリンで処置し、ＰＳＡ−ＳＶＮ  Ｔａｇで免疫化されたマウスにおける、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的およびＰＳＡ特異的な免疫の発生を検証するためのアッセイを行った。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的な免疫応答は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＨ−２  Ｄｂ  ＰＳＡ６５−７３（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩ）およびＨ−２  Ｋｂ  ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対する公知のＴ細胞エピトープを使用した五量体染色により検出された。
【０３８９】
アンピシリンを用いた初回免疫と採取：０日目、全群にＰＳＡ−ＳＶＮ  Ｔａｇ  ＬＭ  ＩＰを感染させ、その後、２時間目、４時間目、６時間目、２４時間目から様々な時点で、１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰでアンピシリンを投与した。すべての動物（陰性対照は除く）に、２４時間で１用量のアンピシリンを投与した。０日目の感染の７日後、マウスを安楽死させ、脾臓を採取し、Ｈ−２  Ｄｂ  ＰＳＡ６５−７３（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩ）およびＨ−２  Ｋｂ  ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対する特異的Ｔ細胞エピトープに関し分析した。
【表３】
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【０３９０】
ゲンタマイシン＋アンピシリン追撃を用いた初回免疫−採取：０日目、全群にＰＳＡ−ＳＶＮ  Ｔａｇ  ＬＭ  ＩＰを感染させ、その後、２時間目、４時間目、６時間目、２４時間目から様々な時点で、５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰでゲンタマイシンを投与した。すべての動物（陰性対照は除く）に、ワクチン接種後２４時間で１用量のアンピシリン（１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）を投与した。０日目の感染の７日後、マウスを安楽死させ、脾臓を採取し、Ｈ−２  Ｄｂ  ＰＳＡ６５−７３（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩ）およびＨ−２  Ｋｂ  ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対する特異的Ｔ細胞エピトープに関し分析した。
【表４】
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処置の準備
【０３９１】
ＰＳＡ−ＳＶＮ−Ｔａｇ（Ｐ２  ｇ６．１）−力価：１．７  ｘ  １０９ＣＦＵ／ｍＬを、以下により調製した：１本のバイアルを、３７℃の水槽中で−８０℃から溶解させた。２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄した。１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄した。ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度を５ｘ１０８  ＣＦＵ／ｍＬとした。
【０３９２】
アンピシリンＡ８３５１  Ｓｉｇｍａ社、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ；溶媒；滅菌水；溶液の安定性；３日間。ワーキング濃度：（約１００ｍｇ／ｋｇ）１０ｍｇ／ｍＬ〜（２ｍｇ／２００ｕＬ／マウス  ＩＰ）。
【０３９３】
ゲンタマイシン  Ｇ１２７２  Ｓｉｇｍａ社（５ｍｇ／ｋｇ）０．１ｍｇ／２００ｕＬ／マウス  ＩＰ、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ；溶媒；滅菌水；溶液の安定性；３７℃で５日間；２〜８℃で月単位。ワーキング濃度：５ｍｇ／ｋｇ（マウスＩＰ当たり、１９０ｕｌのｄｄＨ２Ｏ中、ゲンタマイシンを１０ｕｌ）。
採取：単離された脾細胞の調製
【０３９４】
５ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地を含む個々のチューブに各マウスの脾臓を収集した。詳細な工程を以下に記載する；滅菌された鉗子と鋏を使用して脾臓を採取する。ｃ−ＲＰＭＩ中で実験室に移す。滅菌されたペトリ皿に各脾臓を注ぎ入れる。洗浄培地（ＲＰＭＩのみ）中で、２枚のガラススライドを使用して、または３ｍＬシリンジからのプランジャーの戻しを使用して、各脾臓をすりつぶす。培地中で細胞を管に移す。１個または２個の脾臓の場合には１５ｍｌ管、３個以上の脾臓がある場合には、５０ｍｌ管を使用する。１，０００ＲＰＭで５分間、室温で細胞を沈殿させる。上清を捨て、残りの洗浄緩衝液中に細胞をおだやかに再懸濁して、脾臓当たり２ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液を細胞ペレットに加える。管をタッピングすることにより溶解緩衝液と細胞を穏やかに混合させ、１分間待つ。ただちに細胞懸濁液に１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地を加え、溶解緩衝液を脱活性化させる。１，０００で５分間、室温で細胞を遠心する。セルストレーナーに細胞を通し、１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩを用いてもう１回洗浄する。ヘモサイトメーター／モキシフローを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色により生存をチェックする。各脾臓から、約１〜２×１０８個の細胞が得られるはずである。細胞を染色用に分ける。染色緩衝液の代わりに、細胞表面抗体（ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ）を２．４Ｇ２中に添加することを除き、イムデックス社のデキストラマー染色プロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｄｅｘ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／１２１３５／ｔｆ１００３．０３＿ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｉｎｉｎｇ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ＿ｍｈｃ＿ｄｅｘｔｒａｍｅｒ．ｐｄｆ）を使用した。
結果
【０３９５】
早い時点でのアンピシリン単独投与（図１７Ａ〜１７Ｄ）、またはゲンタマイシンと２４時間のアンピシリン追撃（図１８Ａ〜８Ｂ）投与の両方に関し、群間に有意な差は見いだされなかった。
骨髄中のリステリア・モノサイトゲネス播種に対する、早期抗生物質投与の効果
【０３９６】
様々なアンピシリンまたはゲンタマイシンの投与スケジュールでの、リステリア・モノサイトゲネスの骨髄への播種能力を、ＣＦＵ計数を介して確認する。骨髄を大腿骨から採取し、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ  ＢＨＩプレート上に置き、リステリア・モノサイトゲネスコロニーの存在を検出する。大腿骨をすべてのマウスから採取する。ｎ＝２５匹のマウス−総数で５０個の大腿骨。以下のように大腿骨から骨髄を単離する：滅菌された鉗子と鋏を使用して大腿骨を採取する。ＲＰＭＩ−１６４０ｗ／ｓｔｒｅｐ中で実験室に運搬し、滅菌された１２ウェルの組織培養プレートに置く（１ウェル当たり、１個の大腿骨）。膝関節下の後肢を靭帯を通って切断し、脛骨を除去して、確実に骨端が無傷なまま残るようにした。周辺筋肉から大腿骨を取り出し、余剰な組織を取り除いて、骨の末端部を無傷なまま維持する。大腿骨上に残った筋肉／組織をすべて取り除く。滅菌された１２ウェル組織培養プレート中の培養培地ＲＰＭＩ−１６４０ｗ／ｓｔｒｅｐに骨を移す（１ウェル当たり、大腿骨１個）。注意深く大腿骨の両端を切り取り、内部骨髄の軸を露出させる。２９Ｇｘ１／２針を備えた１ｍＬのインスリンシリンジを使用して、２〜３ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０ｗ／ｓｔｒｅｐで骨髄内容物を洗い流す。大腿骨それぞれから別々に内容物を集め、滅菌１５ｍＬ遠心管ｗ／５ｍＬｓのＢＨＩ／Ｓｔｒｅｐ培地に入れる。（すべての骨髄が完全に除去されたとき、骨は白く見えていなければならない）。同様に、洗い流された大腿骨を、別々の５ｍＬ管ｗ／  ＢＨＩ／ｓｔｒｅｐ培地に集める。試料を、３７℃で一晩置く。翌日、濁っていれば、ＢＨＩ／ｓｔｒｅｐ細菌プレート上で二倍連続希釈を行う。翌日何らかの細菌の増殖が認められる場合、コロニーＰＣＲを行う。
実施例１７：薬品ＡＤＸＳ１１−００１（ＨＰＶ  １．０）のＬｍ治療後の異なる時点でのアンピシリン投与の効果
【０３９７】
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスにおいて、ＴＣ−１肺上皮細胞を使用した腫瘍退縮実験を開始し、アンピシリン治療を伴う、または伴わない、異なるＬｍ治療の治療効果と、腫瘍微小環境が改変されたかどうかを評価した。
【０３９８】
腫瘍接種：この実験で用いる腫瘍モデルは、ＴＣ−１腫瘍モデルである。ＴＣ−１細胞を完全培地中で培養する。ＴＣ−１細胞用の完全培地：４５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、５０ｍｌの１０％ＦＢＳ、５ｍｌのＮＥＡＡ        （１００ｕＭ）、５ｍｌのＬ−グルタミン（２ｕＭ）、および５ｍＬのＰｅｎ／ｓｔｒｅｐ（１００Ｕ／ｍＬ）ペニシリン＋１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン）、    Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍＬ）（分けるときに細胞に加えられた）。マウスに腫瘍細胞を移植する２日前に、ＴＣ−１細胞を完全培地中に二次培養した。実験当日（０日目）に細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄した。細胞を計数し、注射用にマウス１匹当たり２００ｕｌのＰＢＳ中に１×１０５細胞の濃度で再懸濁した。各マウスの右脇腹に腫瘍細胞を皮下注射した。直径が１２ｍｍの大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定した。殺処理基準に腫瘍が達した時点でマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定した。
【０３９９】
ワクチン接種／アンピシリン治療：６日目、腫瘍が約５ｍｍの大きさになったとき、ワクチン接種と治療を開始した。全群にＤＰ  ＡＤＸＳ１１−００１（ＨＰＶ  １．０）Ｌｍを腹腔内注射（ＩＰ）し、その後、０時間、４時間、６時間、および２４時間の様々な時点でそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）でアンピシリンを投与した。４群および５群には、２４時間のアンピシリンＩＰ治療を行った。
【表５】
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ワクチン接種／治療の準備
【０４００】
ＬｍｄｄＡ−２７４は以下のように調製された：１本のバイアルを、３７℃の水槽中で−８０℃から溶解させる。２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄する。１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄する。ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度を５ｘ１０８  ＣＦＵ／ｍＬとする。
【０４０１】
ＤＰ  ＡＤＸＳ１１−００１（ＨＰＶ  １．０）（力価：２．２ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を以下のように調製した：１本のバイアルを、３７℃の水槽中で−８０℃から溶解させる。２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄する。１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄する。ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度を５ｘ１０８  ＣＦＵ／ｍＬとする。
【０４０２】
アンピシリンＡ８３５１  Ｓｉｇｍａ社、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ、溶媒：滅菌水、溶液の安定性：３日間。ワーキング濃度：（約１００ｍｇ／ｋｇ）１０ｍｇ／ｍＬ〜（２ｍｇ／２００ｕＬ／マウス  ＩＰ）。
結果
【０４０３】
腫瘍退縮（図２０Ａ）および生存率（図２０Ｂ）に関し、アンピシリン治療の有無で、ＬＭ治療群の間に有意な差はなかった。
実施例１８：薬品ＡＤＸＳ３１−１４２（ＰＳＡ  １．０）のＬｍ治療後の異なる時点でのアンピシリン投与の効果
【０４０４】
Ｃ５７ＢＬ／６オスマウスにおいて、ＴＰＳＡ２３前立腺癌細胞を使用した腫瘍退縮実験を開始し、アンピシリン治療を伴う、または伴わない、異なるＬｍ治療の治療効果を評価した。
【０４０５】
腫瘍接種：この実験で使用される腫瘍モデルは、ＴＰＳＡ２３腫瘍モデルである。ＴＰＳＡ２３細胞を完全培地中で培養する。ＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地：４３０ｍｌのグルコース入りＤＭＥＭ、４５ｍｌ  ＦＢＳ、２５ｍｌ  Ｎｕ−Ｓｅｒｕｍ  ＩＶ、５ｍｌ  Ｌ−グルタミン、５ｍｌ重炭酸ナトリウム、０．００５ｍｇ／ｍｌ  ウシインスリン−インスリンストック（２．５ｍｇ／ｍｌ）は酸性水（１０ｍｌの水＋１００ｕｌの氷酢酸）中で調製される（細胞を分けている間にフラスコに加えられる−６．４ｕＬ／８ｍＬｓ培地、１２．８ｕＬ／１６ｍＬｓ培地、１９．２ｕＬ／２４ｍＬｓ培地など）、および１０ｎＭ  デヒドロイソアンドロステロン（ＤＨＡ）−ＤＨＡストック（１０ｍＭ）はエタノール中で調製される。（細胞を分けている間にフラスコに加えられる−１４０ｕＬ／７０ｍＬｓ培地、７０ｕＬ／３５ｍＬｓ培地、３５ｕＬ／１７．５ｍＬｓ培地など）。マウスに腫瘍細胞を移植する２日前に、ＴＰＳＡ２３細胞を完全培地中に二次培養する。実験当日（０日目）に細胞をトリプシン処理し、培地で二回洗浄した。細胞を計数し、注射用にマウス１匹当たり２００ｕｌのＰＢＳ中に２×１０６細胞の濃度で再懸濁した。各マウスの右脇腹に腫瘍細胞を皮下注射した。直径が１２ｍｍの大きさに達するまで腫瘍を週に二回測定する。殺処理基準に腫瘍が達した時点でマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して測定した。
【０４０６】
ワクチン接種／アンピシリン治療：９日目、腫瘍が約９ｍｍの大きさになったとき、ワクチン接種と治療を開始した。全群にＤＰ  ＡＤＸＳ３１−１４２（ＰＳＡ  １．０）Ｌｍを腹腔内注射（ＩＰ）し、その後、０時間、４時間、６時間、および２４時間の様々な時点でそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）でアンピシリンを投与した。４群および５群には、２４時間のアンピシリンＩＰ治療を行った。
【表６】
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ワクチン接種／治療の準備
【０４０７】
ＬｍｄｄＡ−２７４は以下のように調製された：１本のバイアルを、３７℃の水槽中で−８０℃から溶解させる。２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄する。１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄する。ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度を５ｘ１０８  ＣＦＵ／ｍＬとする。
【０４０８】
ＤＰ  ＡＤＸＳ３１−１４２（ＰＳＡ  １．０）（力価：２ｘ１０９）を以下のように調製した：１本のバイアルを、３７℃の水槽中で−８０℃から溶解させる。２分間、１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄する。１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄する。ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度を５ｘ１０８  ＣＦＵ／ｍＬとする。
【０４０９】
アンピシリンＡ８３５１  Ｓｉｇｍａ社、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ、溶媒：滅菌水、溶液の安定性：３日間。ワーキング濃度：（約１００ｍｇ／ｋｇ）１０ｍｇ／ｍＬ〜（２ｍｇ／２００ｕＬ／マウス  ＩＰ）。
結果
【０４１０】
腫瘍退縮（図２２Ａ）および生存率（図２２Ｂ）に関し、アンピシリン治療の有無で、ＬＭ治療群の間に有意な差はなかった。
【０４１１】
添付の図面を参照して本開示の実施形態を解説したが、本開示は厳密な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるように、当業者によって本開示の範囲または主旨から逸脱することなくこれらに様々な変更および修正がなされ得ることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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