(57)【要約】  本発明は、全体として、乳房新生物を有する患者、より詳細には、エストロゲン受容体−／プロゲステロン受容体−／ＨＥＲ−２−（「トリプルネガティブ」）である乳房新生物を有する患者の生存を予後判定する方法に関する。本発明の方法は、より具体的には、ＩＲＦ９発現をスクリーニングすることにより、乳癌患者の生存、特に転移拡散のリスクを予後判定する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者、特に低い生存率の予後を特徴とするトリプルネガティブ乳房新形成を有する患者、さらにより詳細には転移拡散のリスクが高い患者を、Ｉ型ＩＦＮレベルをアップレギュレートすることにより治療的または予防的に治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者の生存を予後判定する方法であって、前記新生物をＩＲＦ９の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルが低い生存率の予後(poor survival prognosis)を示し、前記中央値レベル以上のＩＲＦ９の発現レベルが、長期生存予後(prolonged survival prognosis)を示す方法。
【請求項２】
前記新生物が原発腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生存転帰(survival outcome)が転移拡散のリスクである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
転移拡散の高いリスクの予後が、生存転帰不良(poor survival outcome)を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記低い生存率の予後が３年未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記スクリーニング方法が、ＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのスクリーニングに関する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記スクリーニング方法が、ＩＲＦ９発現産物のスクリーニングに関する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記スクリーニング方法が、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの低下をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
個体におけるトリプルネガティブ乳房新形成の治療方法であって、前記個体においてＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルを特徴とするトリプルネガティブ乳房新生物を治療する方法であって、
（ｉ）免疫賦活剤および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；または
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤および新生細胞の増殖をダウンレギュレートする毒素、
の有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
個体におけるトリプルネガティブ乳房新生物の治療のための医薬の製造における、Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤の使用。
【請求項１２】
トリプルネガティブ乳房腫瘍を個体において治療するための医薬の製造における使用であって、
（ｉ）免疫賦活剤および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；または
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤および新生細胞の増殖をダウンレギュレートする毒素；
の、対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルを特徴とする、使用。
【請求項１３】
前記新生物が原発腫瘍である、請求項９もしくは１０に記載の方法、または請求項１１もしくは１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記新生物が転移拡散のリスクがあるか、または転移拡散している、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１５】
前記Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮ−αである、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１６】
前記Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮ−βである、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１７】
前記薬剤が、
（ｉ）Ｉ型ＩＦＮタンパク質またはこの機能的断片；
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮまたはこの機能的断片をコードする核酸分子；
（ｉｉｉ）Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の転写または翻訳制御を調節するなどして、Ｉ型ＩＦＮの発現をアップレギュレートするタンパク質性または非タンパク質性の分子；および
（ｉｖ）例えば、ＴＬＲ７／８アゴニストイミキモドまたはＴＬＲ３アゴニストポリＩ：Ｃ、ポリＡ：Ｕ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ：Ｌ：ＣまたはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧを含む、Ｔｏｌｌ様受容体などのパターン認識受容体と相互作用する、タンパク質性または非タンパク質性の分子；
から選択される、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記方法が、
（ｉ）ポリＩ：Ｃおよび抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｉｉ）放射線療法および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｉｉｉ）化学療法および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｉｖ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｖ）化学療法およびポリＩ：Ｃ；
（ｖｉ）化学療法およびＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤；
（ｖｉｉ）放射線療法およびポリＩ：Ｃ；
（ｖｉｉｉ）放射線療法およびＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤；
から本質的になるリストから選択される併用を施す工程を含む、請求項１０または１２から１４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記化学療法剤が、アクチノマイシンＤ、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルビジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンである、請求項１８に記載の方法または使用。
【請求項２０】
前記化学療法剤がドキソルビシンである、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２１】
前記抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１が抗体である、請求項１８に記載の方法または使用。
【請求項２２】
治療対象がヒトである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、乳房新生物を有する患者、より具体的には、エストロゲン受容体−／プロゲステロン受容体−／ＨＥＲ−２−（「トリプルネガティブ」）である乳房新生物を有する患者の生存を予後判定する方法に関する。本発明の方法は、より具体的には、ＩＲＦ９発現をスクリーニングすることにより、乳癌患者の生存、特に転移拡散のリスクを予後判定する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者、特に低い生存率の予後を特徴とするトリプルネガティブ乳房新形成を有する患者、さらにより具体的には転移拡散のリスクが高い患者を、Ｉ型ＩＦＮレベルをアップレギュレートすることにより治療的または予防的に処置する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、任意の先行する出版物（またはそれから派生した情報）、または任意の公知の事項への言及は、その先行する出版物（またはそれから派生した情報）または公知の事項が、本明細書が関連する試みの分野において共通の一般知識の一部を形成することの容認または承認または任意の形の示唆としてみなすものではない、またはみなすべきものではない。
【０００３】
本明細書において著者が言及する出版物の書誌情報詳細は、説明の最後にアルファベット順に収録される。
【０００４】
新生物は、組織の比較的自律的な新たな成長によって産生される細胞の異常な集合体またはコロニーである。ほとんどの新生物は、新生物性形質転換を受けた単一細胞のクローン性増殖から生じる。正常細胞の新生細胞への形質転換は、細胞ゲノムを変化させる化学的、物理的または生物学的作用物質（または事象）によって引き起こされ得る。新生細胞は、いくつかの特殊な機能の喪失および新しい生物学的特性の獲得、主に比較的自律的な成長の特性によって特徴付けられる。それらは遺伝的な生物学的特徴を子孫細胞に伝える。新生物は、有糸分裂可能な細胞を含むほぼすべての組織に由来し得る。
【０００５】
新生物の過去、現在、および将来の予測される生物学的挙動または臨床経過は、診断、治療、および予後における非常に重要な差異により良性または悪性にさらに分類される。悪性新生物は、より大きな自律性を示し、浸潤および転移拡散の可能性があり、治療に抵抗性であり、死を引き起こす可能性がある。しかし、良性新生物は、自律性の程度が低く、通常浸潤性でなく、転移しない。
【０００６】
乳癌は、オーストラリアでは生涯に８人に１人の女性に直接影響を与える。乳癌患者の約１５％が、肺や骨などの遠隔の器官への拡散（転移）を発症する。遠隔転移がほとんど治療不能であるという事実のために、乳癌は、依然として女性において癌関連死の第２の主因のままである。乳癌の最も侵攻性なサブタイプの１つは、「基底様（basal-like）」乳癌であり、症例の１５％までを占める。ほとんどの基底様乳癌は、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体を発現せず、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）−２を発現しないことを意味する「トリプルネガティブ」である。これは、トリプルネガティブ基底様癌を有する患者が、これらのタンパク質を発現する他のサブタイプに使用される抗エストロゲンまたはＨＥＲ２標的治療薬から利益を得ないことを意味するため、臨床的に重要である。実際、トリプルネガティブ乳癌患者の治療選択肢は非常に限られており、標的化されておらず、一部の患者だけが化学療法にうまく応答している。ルミナール（ＥＲ陽性）乳癌と比較して、基底様乳癌は若年女性に起こり、急速な転移および診断後１〜５年で死亡のリスクが高くなる。これらの理由から、このサブタイプの患者における疾患拡散を予測するための新しいバイオマーカーの開発、および最終的には患者の死亡率を減少させるための新規標的療法の開発を含む、基底様乳癌の生物学を理解することが不可欠である。
【０００７】
トリプルネガティブ乳癌は、現在のところ転帰良好および不良の群に階層化することが困難な異種サブタイプであると考えられている（Ａｂｒａｍｓｏｎ  ＶＧ，Ｌｅｈｍａｎｎ  ＢＤ，Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ  ＴＪ，Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ  ＪＡ．Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；１２１（１）：８−１６）。トリプルネガティブ乳癌患者の中には、化学療法薬によく応答する患者もいるが、これは少数の患者であり、事前に同定できない（Ｒｏｕｚｉｅｒ  Ｒ，Ｐｅｒｏｕ  ＣＭ，Ｓｙｍｍａｎｓ  ＷＦ，Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｎ，Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ  Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋら、Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ  ｔｏ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５；１１（１６）：５６７８−８５）。しかし、これらの非応答者または部分応答者において、遠隔再発のリスクは他のサブタイプよりも大きい。重要なことには、増殖指数だけでは完全な応答を予測することはできず、化学療法薬に対する応答以外の他の信頼性のある予測マーカーは現在のところ存在しない。さらに、トリプルネガティブ乳癌患者の疾患再発および乳癌関連死を予測する強力なバイオマーカーは存在しない。しかし、腫瘍浸潤リンパ球と、化学療法感受性および疾患再発の両方との関連は、多数のグループによって報告されており（Ｄｅｍａｒｉａ  Ｓ，Ｖｏｌｍ  ＭＤ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＲＬ，Ｙｅｅ  ＨＴ，Ｏｒａｔｚ  Ｒ，Ｆｏｒｍｅｎｔｉ  ＳＣら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００１；７（１０）：３０２５−３０；Ｌａｄｏｉｒｅ  Ｓ，Ａｒｎｏｕｌｄ  Ｌ，Ａｐｅｔｏｈ  Ｌ，Ｃｏｕｄｅｒｔ  Ｂ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｆ，Ｃｈａｕｆｆｅｒｔ  Ｂら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８；１４（８）：２４１３−２０）、抗腫瘍免疫応答が化学療法薬に対する応答およびトリプルネガティブ乳癌の進行の重要な要素であることが示唆されている。リンパ球浸潤物の性質を解明するさらなる研究により、トリプルネガティブ乳癌が他の乳癌サブタイプと比較してＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤物を増加させることが確認された（Ｊｉａ  Ｙ，Ｘｕ  Ｌ，Ｌｉｎ  Ｑ，Ｚｈｕ  Ｍ，Ｄｉｎｇ  Ｌ，Ｗｕ  Ｋら、Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｉｏｒ  ｔｒｅ���ｔｍｅｎｔ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｍｅｄｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１４；３１（６）：９８１）。調節性Ｔ細胞の動員は、基底様乳癌の予後不良と関連している（Ｌａｄｏｉｒｅ  Ｓ，Ｍｉｇｎｏｔ  Ｇ，Ｄａｂａｋｕｙｏ  Ｓ，Ａｒｎｏｕｌｄ  Ｌ，Ａｐｅｔｏｈ  Ｌ，Ｒｅｂｅ  Ｃら、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１１；２２４（３）：３８９−４００；Ｙａｎ  Ｍ，Ｊｅｎｅ  Ｎ，Ｂｙｒｎｅ  Ｄ，Ｍｉｌｌａｒ  ＥＫ，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  ＳＡ，ＭｃＮｅｉｌ  ＣＭら、Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＢＣＲ．２０１１；１３（２）：Ｒ４７）。高トリプルネガティブ乳癌における免疫モジュールの発現増加、化学療法薬に対する応答の増加と、転移リスクの低下との間の関連が他者によって報告されている（Ｎａｇａｌｌａ  Ｓ，Ｃｈｏｕ  ＪＷ，Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ＭＣ，Ｒｕｉｚ  Ｊ，Ｖａｕｇｈｎ  ＪＰ，Ｄｕｂｅｙ  Ｐら、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１３；１４（４）：Ｒ３４）。
【０００８】
さらに、腫瘍細胞からのＩ型ＩＦＮの分泌は、癌における転移拡散を制御する腫瘍免疫監視機構を活性化することが示されている。これに関して、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の２つの調節因子がＩＦＮ調節因子ＩＲＦ７およびＩＲＦ９であることが示されており、ＩＲＦ７結合部位またはＩＲＦ９を含む遺伝子の、腫瘍における発現レベルのダウンレギュレーションが、原発腫瘍の転移表現型への移行を示すことが示されている。それにもかかわらず、免疫の抑制または活性化状態を促進する原発腫瘍の重要な特徴についてはほとんど知られておらず、原発腫瘍部位を越えた腫瘍細胞の播種に続く転移拡散の調節にどのような機序が働いているか、どの要因が患者の生存の問題に関連するかも知られていない。
【０００９】
本発明につながる研究において、ＩＲＦ７およびＩＲＦ９の発現は、原発腫瘍の転移表現型への移行を示すことが示されているが、乳癌細胞の特定の亜集団、具体的には、トリプルネガティブ乳癌細胞型の場合、ＩＲＦ９の発現レベルが、患者の生存および治療応答性を予後判定することが、想定外に判定された。患者の生存可能性の問題は、原発腫瘍の転移移行自体が起こっているかどうか、または起こる可能性があるかどうかよりもはるかに複雑なものである。生存を考慮すると、新生細胞の成長速度、細胞分裂の数の増加、細胞分裂の期間の長さの短縮、細胞分裂の期間の頻度の増加、アポトーシスの回避、転移移行発症までの時間、転移拡散の速度などの問題もまた大きく関係する。しかし、今日まで、これらの要因を予測することは事実上不可能であったため、早期に生存の可能性を予後判定することは推測以上のものではなかった。トリプルネガティブ乳癌に関しては、これらは治療が困難な侵攻性の癌とみなされ、したがって患者は一般的に予後転帰不良を示すとみなされている。したがって、実際に、高レベルの正確さで、患者の生存可能性、特に遠隔転移拡散のリスクの予後判定が可能であるという判定は、想定外であり、非常に価値がある。さらに、このような生存予後の指標は、他の乳癌のタイプについては同様に当てはまらないことが判明している。
【００１０】
関連する態様において、今日までに治療するのが非常に難しいとみなされてきたトリプルネガティブ乳癌亜集団は、たとえＩＲＦ９により判定された予後が不良であっても、実際には治療可能であることが判定された。具体的には、Ｉ型ＩＦＮ発現をアップレギュレートすることにより、長期生存を達成することができる。したがって、これは、トリプルネガティブ乳癌を治療する方法の開発を可能にするだけでなく、治療すべき癌、および同様に重要な、治療不能な癌または予後良好を示す他の癌のどちらであるかを同定し、それによって、これらの患者が十分に説明を受けた上で治療しない選択ができるようにする手段の開発が可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｂｒａｍｓｏｎ  ＶＧ，Ｌｅｈｍａｎｎ  ＢＤ，Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ  ＴＪ，Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ  ＪＡ．Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；１２１（１）：８−１６
【非特許文献２】Ｒｏｕｚｉｅｒ  Ｒ，Ｐｅｒｏｕ  ＣＭ，Ｓｙｍｍａｎｓ  ＷＦ，Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｎ，Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ  Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋら、Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ  ｔｏ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５；１１（１６）：５６７８−８５
【非特許文献３】Ｄｅｍａｒｉａ  Ｓ，Ｖｏｌｍ  ＭＤ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＲＬ，Ｙｅｅ  ＨＴ，Ｏｒａｔｚ  Ｒ，Ｆｏｒｍｅｎｔｉ  ＳＣら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００１；７（１０）：３０２５−３０
【非特許文献４】Ｌａｄｏｉｒｅ  Ｓ，Ａｒｎｏｕｌｄ  Ｌ，Ａｐｅｔｏｈ  Ｌ，Ｃｏｕｄｅｒｔ  Ｂ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｆ，Ｃｈａｕｆｆｅｒｔ  Ｂら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８；１４（８）：２４１３−２０
【非特許文献５】Ｊｉａ  Ｙ，Ｘｕ  Ｌ，Ｌｉｎ  Ｑ，Ｚｈｕ  Ｍ，Ｄｉｎｇ  Ｌ，Ｗｕ  Ｋら、Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｉｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｍｅｄｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１４；３１（６）：９８１
【非特許文献６】Ｌａｄｏｉｒｅ  Ｓ，Ｍｉｇｎｏｔ  Ｇ，Ｄａｂａｋｕｙｏ  Ｓ，Ａｒｎｏｕｌｄ  Ｌ，Ａｐｅｔｏｈ  Ｌ，Ｒｅｂｅ  Ｃら、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１１；２２４（３）：３８９−４００
【非特許文献７】Ｙａｎ  Ｍ，Ｊｅｎｅ  Ｎ，Ｂｙｒｎｅ  Ｄ，Ｍｉｌｌａｒ  ＥＫ，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  ＳＡ，ＭｃＮｅｉｌ  ＣＭら、Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＢＣＲ．２０１１；１３（２）：Ｒ４７
【非特許文献８】Ｎａｇａｌｌａ  Ｓ，Ｃｈｏｕ  ＪＷ，Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ＭＣ，Ｒｕｉｚ  Ｊ，Ｖａｕｇｈｎ  ＪＰ，Ｄｕｂｅｙ  Ｐら、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１３；１４（４）：Ｒ３４
【発明の概要】
【００１２】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、文脈が他を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を除外しないこと意味すると理解される。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、特定の整数または整数の群が指定された種から生じるが、必ずしも特定の供給源から直接得られるとは限らないことを示すものと解釈される。さらに、本明細書で使用されるように、単数形の「１つの（ａ）」、「および（ａｎｄ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００１４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００１５】
本発明の一態様は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者の生存を予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルが低い生存率の予後を示し、中央値レベル以上のＩＲＦ９の発現レベルが、長期生存予後を示す方法に関する。
【００１６】
関連する態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者における転移拡散のリスクを予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートにおいて発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルが転移拡散のリスク増加を示し、対応する新生物コホートにおいて発現される中間値レベル以上のＩＲＦ９の発現レベルが、転移拡散のリスクが低いことを示す方法に関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者における転移拡散のリスクを予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９タンパク質の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートにおいて発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９タンパク質の発現レベルが転移拡散のリスク増加を示し、対応する新生物コホートにおいて発現される中間値レベル以上のＩＲＦ９タンパク質の発現レベルが、転移拡散のリスクが低いことを示す方法に関する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者における転移拡散のリスクを予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートにおいて発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルが転移拡散のリスク増加を示し、対応する新生物コホートにおいて発現される中間値レベル以上のＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルが、転移拡散のリスクが低いことを示す方法に関する。
【００１９】
本発明のさらに別の態様において、個体におけるトリプルネガティブ乳房新形成の治療方法であって、当該個体においてＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含む方法に関する。
【００２０】
一実施形態において、前記新形成は転移拡散のリスク増加の予後を特徴とする。
【００２１】
別の実施形態において、前記新形成は、低い生存率の予後を特徴とする。
【００２２】
別のさらなる態様において、患者におけるトリプルネガティブ乳房新生物の治療方法であって、前記患者においてＩＦＮ−αのレベルをアップレギュレートする薬剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００２３】
さらに別の態様において、患者におけるトリプルネガティブ乳房新生物の治療方法であって、当該個体においてＩＦＮ−βのレベルをアップレギュレートする薬剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００２４】
関連する態様において、個体におけるトリプルネガティブ乳房新生物の治療のための医薬の製造における、Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】トリプルネガティブ乳癌におけるＩｒｆ９タンパク質の発現が、遠隔転移および癌関連死のリスクの低下を予測することを示す画像である
【図２】宿主のＩＦＮ応答の喪失が転移を増加させることを示す画像である。腫瘍細胞（６６ｃｌ４および４Ｔ１−チェリー細胞）をｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺に注射した。終点（２８〜３２日目）において、組織を切除し、腫瘍量を、チェリーのＤＮＡ発現のＱＰＣＲ検出によって測定した（Ａ）。
【図３】Ｉｆｎａｒ１−／−マウスにおける腫瘍特異的ＮＫ細胞の活性化および機能の喪失を示す画像である。ＷＴマウスおよびＩｆｎａｒ１−／−ｂａｌｂ／ｃマウスに１×１０５の４Ｔ１細胞を第４乳腺に注射した。表示された日に、血液サンプルを採取し、リンパ球を単離し、ＮＫｐ４６およびＣＤ６９（Ａ）またはＮＫｐ４６およびＩＦＮ−γ（Ｂ）と反応するｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｃ）ＷＴまたはＩｆｎａｒ−／−マウス由来のポリＩ：Ｃ活性化ＮＫ細胞を濃縮し、カルセイン−ＡＭ細胞傷害アッセイにおいて４Ｔ１細胞に対して使用した。＊ｐ＜０．０５、結果は２回の独立した実験からプールされた、ｎ＞４。
【図４】配列決定（Ａ）およびウェスタンブロッティング（Ｂ）によるＩｒｆ９  ＤＮＡ結合ドメインの一部の削除の確認を示す画像である。
【図５】ポリ（Ｉ：Ｃ）処置が肺および骨への転移を減少させることを示す画像である。４Ｔ１．２−ｌｕｃ２細胞をｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪パッドに注射した（０日目）。４日目から、マウスを２５ｕｇのポリ（Ｉ：Ｃ）または対照により３×週１回をＩＶで処置した。０．４ｇの原発腫瘍を切除後、マウスを生物発光によって（Ａ）および終点においてビメンチンと比較したルシフェラーゼ発現のＱＰＣＲ分析によって（Ｂ）転移についてモニターした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図６】心臓内注入後の、ＩＲＦ９を発現する腫瘍細胞によるＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の増加のグラフ表示である。
【図７】抑制状態に対する免疫応答を歪めるＩＲＦ９ノックアウト癌細胞におけるサイトカイン分泌の変化を実証するグラフ表示である。
【図８】インターフェロン処理が癌細胞のＰＤ−Ｌ１発現を増強し、ＩＲＦ９を欠く細胞がより多くのＰＤ−Ｌ１を誘導することを示すグラフ表示である。ＩＲＦ９の喪失は、ＩＦＮα刺激後にＰＤ−Ｌ１発現を増加させる。ＰＥタグ化抗ＰＤ−Ｌ１、ＭＩＨ５（１：５０）を用いるＰＤ−Ｌ１細胞表面発現（ｅｄｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のＦＡＣＳ分析。細胞を、ＩＦＮα（１０００ＩＵ／ｍｌ）またはＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）でＦＡＣＳの４８時間前に処理した。データは、正規化された平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝３である。統計的有意性値は＊＊ｐ＜０．０１に等しい。
【図９】ポリＩ：Ｃと抗ＰＤ１との組み合わせが、侵攻性Ｅ０７７１における転移を効果的に減少させ、生存を延長することを実証するグラフ表示である。Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺および脊椎における４Ｔ１．２腫瘍量は、抗ＰＤ−１およびポリ（Ｉ：Ｃ）による処置後に減少する。肺における相対腫瘍量（ＲＴＢ）を、基礎蛍光の変化が検出された増幅サイクルに基づいてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。スコアは、Ｅｃｋｈａｒｄｔら（２００５）によって記載された式に従って平均回帰定量サイクル（Ｃｑ）値を使用して計算した。播種した腫瘍細胞をｍＣｈｅｒｒｙによって同定し、ｍＶｉｍｅｎｔｉｎを負荷対照として用いた。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝１０である。統計的有意性値：＊＊＊ｐ＝０．０００５、＊＊ｐ＝０．００５２。
【図１０】抗ＰＤ−１およびポリ（Ｉ：Ｃ）を含む併用療法が、生存時間を有意に延長させるグラフ表示である。１０匹のｂａｌｂ／ｃマウスの群に、５ｘ１０４の４Ｔ１．２細胞ＩＭＦＰを注射した。マウスは、２〜１２日目にポリ（Ｉ：Ｃ）を５回および抗ＰＤ−１を４回投与された。原発腫瘍の切除は１２日目に行った。マウスは転移の徴候において選別し、生存時間は腫瘍接種後の日数として表される。Ｐ＜０．００１
【図１１】ＩＲＦ９が、トリプルネガティブ乳癌を有する患者の別の独立したコホートにおける良好な予後因子であることを示すグラフ表示である、カプランマイヤー累積生存率（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  Ｃｕｍ）。ＦＵから死亡までの生存プロット、検閲変数：ＢｒＣａ死スコア；グループ化変数：平均ＩＲＦ％＞中央値１３％；ＲＰＡコホート：ＴＮＢＣ患者１４７人。
【図１２】ＩＲＦ９およびＰＤ−Ｌ１の喪失によりＴＮＢＣ患者においてはるかに悪い転帰が予測されることを示すグラフ表示である；ＢｒＣａ  死ＦＵのカプランマイヤー累積生存率プロット；検閲変数：ＢｒＣａ死亡スコア；グループ分け変数：ＰＤ−Ｌ１ストロマ・陰性およびＩＲＦＰ９陰性。ＲＰＡコホート：ＴＮＢＣ患者１４７人。
【図１３】ポリ（Ｉ：Ｃ）およびドキソルビシン併用療法が、後期転移の治療設定において生存を延長することを示す画像である。雌のＢａｌｂ／ｃマウスは原発腫瘍を有し、細胞接種（１００，０００の４Ｔ１．２−Ｌｕｃ２  ＩＭＦＰ）の１２日後に外科的に除去された。示されるように、ポリ（Ｉ：Ｃ）（２５μｇ、Ｉ．Ｖ．、週３回）および／またはドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｖ．、週２回）の療法を腫瘍細胞注射後１４日後に開始し、毎週生物発光イメージングを行った。（Ａ）は、腫瘍細胞接種から２３日後のすべての群の代表的な画像であり、（Ｂ）生存に対する療法の影響を検査するために、転移性苦痛の最初の徴候において個別にマウスを選別した。１群当たりｎ＝１５マウス、＊ｐ＜０．０５、マンテル・コックス検定使用。
【図１４】新アジュバントポリ（Ｉ：Ｃ）療法が原発腫瘍成長を減少させることを示す画像である。８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスへの、ポリ（Ｉ：Ｃ）（週２５μｇ、Ｉ．Ｖ．、週３回）および／またはドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ、週２回）の投与を腫瘍細胞接種（１００，０００の４Ｔ１．２−Ｌｕｃ２  ＩＭＦＰ）の２日後に開始した。原発腫瘍成長の差異は、（より大きなコホートを代表する４匹のマウスの）生物発光イメージング（Ａ）を用いて、腫瘍細胞接種の６日後に検出可能であった。腫瘍細胞注射の１２日後に療法を中止し、原発腫瘍を外科的に取り出し、秤量した（Ｂ）。群当たりｎ＝１０マウス、エラーバーは９５％ＣＩを表す、スチューデントｔ検定を用いて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を表す。
【図１５】新アジュバントポリ（Ｉ：Ｃ）療法が生存を延長することを示す画像である。図２で使用されたマウスは、毎週の生物発光イメージングを受け続け、転移拡散の動態を視覚化した。（Ａ）腫瘍細胞接種の１９および２３日後に撮影した画像は、同一の順序で同じ４匹のマウスであり、より大きなコホートを代表する。（Ｂ）転移苦痛の最初の徴候でマウスを個別に屠殺し、日付を記録して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存推定値を生成した。群間の生存の差を、マンテル・コックス検定を用いて有意性について試験した。群当たりｎ＝１０マウス、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、部分的には、ＩＲＦ９の発現レベルが、エストロゲン受容体−／プロゲステロン受容体−／ＨＥＲ−２−（トリプルネガティブ）の乳癌を有する患者の、転移拡散のリスクなど、長期生存の予後因子であるという判定について述べる。さらに、従来の治療に応答する可能性のある癌とそうでない癌とを識別することができることが判定された。したがって、この知見は、見込まれる生存転帰を判定する患者のスクリーニング方法の開発を容易にするだけでなく、トリプルネガティブ乳癌患者、特に低い生存率の予後であるか、従来の療法に抵抗性の腫瘍を有する患者を合理的に治療する手段の開発を可能にした。
【００２７】
したがって、本発明の一態様は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者の生存を予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルが低い生存率の予後を示し、前記中央値レベル以上のＩＲＦ９の発現レベルが、長期生存予後を示す方法に関する。
【００２８】
「新生物状態」への言及は、新生細胞の被包性もしくは非被包性の成長(growth)または凝集物の存在または発達を特徴とする状態に対する言及として理解されるべきである。「新生細胞」への言及は、異常成長を示す細胞に対する言及として理解されるべきである。「新生物」への言及は、新生細胞を含む、病変、腫瘍、または他の被包性もしくは非被包性の集合体または他の形態の成長または細胞凝集物に対する言及として理解されるべきである。「成長(growth)」という用語は、その最も広い意味で理解されるべきであり、新生細胞のサイズの拡大および増殖(proliferation)に対する言及を含む。
【００２９】
この文脈における語句「異常成長」は、正常な細胞成長と比較して、個々の細胞サイズおよび核／細胞質比の増大、細胞分裂速度の増加、細胞分裂の数の増加、細胞分裂の期間の長さの短縮、細胞分裂の期間の頻度の増加または無制御な増殖、およびアポトーシスの回避の１または複数を示す細胞成長を指すことが意図される。本発明を何ら限定するものではないが、「新形成」という用語の一般的な医学的意味は、正常な成長制御に対する応答性の喪失の結果として生じる「新しい細胞成長」、例えば新生細胞成長を指す。新形成には、良性、前悪性または悪性であり得る「腫瘍」が含まれる。「新生物」という用語は、病変、腫瘍、または他の被包性もしくは非被包性の集合体または新生物細胞を含む他の形態の成長または細胞凝集物に対する言及として理解されるべきである。
【００３０】
本発明の文脈における「新生物」という用語は、病理組織学的タイプまたは浸潤性の状態に関係なく、あらゆるタイプの癌性成長または発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織または器官に対する言及を含むことを理解すべきである。
【００３１】
「癌腫」という用語は、当業者によって認識されており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。例示的な癌腫には、乳房の組織から形成されるものが含まれる。この用語には、癌腫組織および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含まれる。「腺癌」は、腺組織に由来するか、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。
【００３２】
新生物は、限定するものではないが、触診、生検、細胞増殖指数、マンモグラフィー、デジタルマンモグラフィー、超音波検査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ラジオグラフィー、放射性核種評価、ＣＴまたはＭＲＩ誘導吸入細胞診、および画像誘導針生検などを含む臨床スクリーニングまたは診断手順により、同定、モニターまたは評価することができる。このような診断技術は、当業者に周知である。
【００３３】
別の実施形態において、前記新生物は原発腫瘍である。
【００３４】
「トリプルネガティブ」乳癌への言及は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ−２タンパク質のそれぞれの発現に関して陰性の乳癌に対する言及として理解されるべきである。文献から明らかになったトリプルネガティブな癌の主な特徴は、若年患者（５０歳未満）に頻繁に発症し、しばしば中間期癌として存在し、他のサブタイプの腫瘍より有意に侵攻性であるという事実を含む、基底様癌との類似性を示す。この侵攻性は、再発のピークリスクが１年目から３年目の間であり、療法の後の最初の５年間に大部分が死亡するという事実によって最もよく例示される。トリプルネガティブ乳癌患者は、非基底様／非トリプルネガティブ対照と比較した場合、最初の転移事象後の生存期間が有意に短い。
【００３５】
トリプルネガティブ乳癌は一般的に非常に侵攻性であり、予後不良を示すと考えられているため、実際には、この癌の亜分類の中で、生存予後良好であり、腫瘍細胞によるＩＲＦ９の発現レベルを参照することによって容易かつ正確に同定できるさらなるサブクラスが存在することの判定は、これまで達成できなかったレベルの差別化が可能になった。したがって、患者は適切な治療についてより正確に評価され、それによって予後良好を示す患者に対する不必要に積極的な治療プロトコルが回避される。今まで、生存可能性を識別することができないため、すべてのトリプルネガティブ乳癌が非常に積極的かつ非特異的に治療されている。
【００３６】
「予後」への言及は、患者の見込まれる生存の予測に対する言及として理解されるべきである。本発明の方法は、トリプルネガティブ腫瘍を、最終的に進行し、患者の生存転帰不良（すなわち、より高悪性度への進行／より侵攻性になる）の可能性がある腫瘍と、そうでない可能性がある腫瘍に識別することに関する。したがって、本発明は、積極的に進行するか否かの所与の新生物の素因を検出することに関する。これらの知見は、生存転帰不良の可能性を予測し、それに応じて、例えば潜在的侵攻性細胞を除去するために根治手術を行うことなどにより、患者を治療する手段を提供する。良好な生存転帰が本発明の診断方法によって予測される限りにおいて、高度に浸潤性および／または毒性の治療は避けることができる。本発明はまた、患者の進行中の試験を実施して、本明細書に開示された知見に従って、対象新生物の性質に対する有害な変化をモニターして、生存転帰への変化の可能性を予測するための有用な手段を提供する。すなわち、生存転帰良好を示す患者をモニターし続け、侵攻状態および生存転帰不良への転換の可能性をスクリーニングすることができる。
【００３７】
「生存」に関しては、これは最初の診断後の数年の患者生存に対する言及として理解されるべきである。対象の生存期間が３年以上、好ましくは４年、より好ましくは５年以上であれば「長期」である。「無転移」の長期生存は、転移拡散が起こらない生存期間である。しかし、対象の長期生存は、無転移であっても、または無転移でなくてもよいことを理解すべきである。例えば、転移拡散が量的に減少しても、細胞分裂の速度の点で遅くなっても、両方とも生存期間を有意に改善することができる。本発明を何ら限定するものではないが、寛解とは、癌の徴候および症状が軽減されることを意味すると理解される。これに関して、寛解は部分的であっても、または完全であってもよい。完全な寛解では、癌のすべての徴候および症状が消失している。患者が５年以上完全寛解状態にある場合、患者は多くの場合治癒したとみなされる。本発明に関して、予後は生存に関するものであり、必ずしも治癒に関するものでないことを理解すべきである。したがって、本発明の方法に従って試験した場合、予後転帰良好を示す患者は、必ずしも新生物状態が完全にまたは部分的に解消された患者ではないが、新生物が転移していないか、転移していても３〜５年を超える生存が達成されるように過程が遅れているかのどちらかの患者であってよい。これらの症例において、治療レジメンを導入して、治癒を達成することによって、または完全または部分的な寛解を誘導することによって、生存転帰をさらに改善することができる。患者が予後転帰不良を示すと判定された場合、適切な治療レジメン、例えば、本明細書に開示される治療方法が迅速に展開されることが期待される。
【００３８】
一実施形態において、対象の生存転帰は、転移拡散のリスクである。先に詳述したように、腫瘍の転移拡散は、実際には、患者の見込まれる生存転帰の観点から考えると複雑な移行である。例えば、細胞分裂の速度、アポトーシスの回避、移行の開始までの時間ならびに拡散の速度および距離はすべて、見込まれる生存転帰に関連する因子である。本発明の文脈において、転移拡散、特に不良な生存転帰に関連する転移拡散を予後判定する手段が提供される。
【００３９】
したがって、関連する態様において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者における転移拡散のリスクを予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートにおいて発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルが転移拡散のリスク増加を示し、対応する新生物コホートにおいて発現される前記中間値レベル以上のＩＲＦ９の発現レベルが、転移拡散のリスクが低いことを示す方法に関する。
【００４０】
一実施形態において、転移拡散のリスクが高い予後は、患者の不良な生存転帰を示す。
【００４１】
好ましくは、前記不良な生存予後は３年未満である。
【００４２】
本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、一態様において、本発明は、原発腫瘍における細胞の転移表現型への移行がただ１つの因子である患者の生存を予後判定することに関すると理解すべきである。原発腫瘍が転移表現型に移行している可能性がある場合でも、患者の長期生存の問題は、表現型の相対的な侵攻性、細胞分裂の速度、転移拡散のタイミングおよび距離などに依然として依存することは理解されよう。本発明の方法は、患者の生存、特に３年を超える患者の無転移生存の判定を可能にする。
【００４３】
新生物の「転移拡散」への言及は、対象新生物の細胞が、原発器官または組織から別の器官または組織に、典型的にはリンパ管または血液循環を介して拡散する能力に対する言及として理解されるべきである。新生物が発症した患者の別の器官に実際に移動していても、していないくとも、対象細胞が転移表現型に既に移行していることが有り得ることを理解されたい。別の例において、腫瘍細胞が転移表現型に移行していない場合であっても、転移拡散の「リスク増加」を示す予後の識別は、前記移行可能性が高いだけでなく、侵攻性かつ迅速であり得るという事実を示す。このような転移拡散のリスク増加は、乳癌の初期診断後３年以内に起こる可能性が高い。前記転移拡散が「低リスク」であるという言及は、前記転移拡散が診断後３年以内に起こるとは予想されないという意味を意図する。一実施形態において、前記転移拡散は高リスクであり、初期診断の２年以内に起こり、別の実施形態において、初期診断の１年以内に起こる。しかし、新生物が転移表現型を示すか否かは、それだけで癌拡散の速度、侵攻性、転移性表現型への差し迫ったまたは侵攻的な移行の可能性のある細胞分裂の速度、および最終的には患者の死亡が起こるかどうかを示すものではない。
【００４４】
前述のように、本発明は、トリプルネガティブ乳癌細胞における転写因子ＩＲＦ９の発現レベルが患者の生存予後を示すものであり、これは他の乳癌サブタイプに当てはまらないという予想外の判定に基づいている。より具体的には、転移拡散のリスクを予後判定することができる。したがって、本発明の方法は、乳癌のこの特定のサブクラスに対してのみ有用である。本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）は、宿主防御、細胞周期調節、アポトーシス、腫瘍形成、免疫細胞発生およびホメオスタシスを含む多様な機能を有する転写因子のファミリーである。現在、哺乳動物ＩＲＦファミリーのメンバーは１０種存在し（ＩＲＦ１〜１０）、それらはすべて保存されたＤＮＡ結合ドメインを含む。ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＲＦのアミノ末端に位置し、ＩＦＮ刺激応答配列（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＩＳＲＥ）に類似する特定のＧＡＡＡゲノム配列に結合する５つのトリプトファンリピートからなる。ＩＲＦは、そのカルボキシル末端でのリン酸化により活性化され、その後、細胞質から核に移動してＩＳＲＥ含有遺伝子の転写を行う。さまざまなＩＲＦは、細胞局在、構造特性、活性化誘発刺激が異なり、したがって各ＩＲＦに独特の機能を付与する。
【００４５】
「ＩＲＦ９」への言及は、この遺伝子のすべての形態およびその変異体に対する言及として理解されるべきである。当業者には理解されるように、いくつかの遺伝子は、個体間の対立遺伝子変異または一塩基多型を示すことが知られている。ＳＮＰは、多様なサイズの挿入および欠失、ならびにジヌクレオチドおよびトリヌクレオチドリピートのような単純な配列リピートを包含する。変異体は、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を共有する、すなわち、本明細書に記載の遺伝子と比較して１または複数の欠失、付加、置換、逆方向配列などを有する同一領域由来の核酸配列を含む。したがって、本発明は、本診断適用に関して、実際の核酸配列間のわずかな遺伝的変異が個体間に存在し得るにもかかわらず、同じ転帰を達成するような変異体にまで及ぶと理解されるべきである。したがって、本発明は、任意の他の突然変異、多型または対立遺伝子変異から生じるすべてのＤＮＡの形態に及ぶと理解されるべきである。
【００４６】
本発明の方法に関して、ＩＲＦ９の「発現レベル」のスクリーニングは、この遺伝子から転写された任意の形態のＲＮＡまたはそれから作製されたｃＤＮＡまたはタンパク質発現産物のスクリーニングを含むさまざまな方法で達成され得る。「ＲＮＡ転写産物レベルのスクリーニング」への言及は、ＲＮＡの直接スクリーニング、またはそれから転写されたｃＤＮＡのスクリーニングに対する言及として理解されるべきである。これらの産物のいずれかのレベル変化は、対象遺伝子発現の変化を示す。上に詳述したように、トリプルネガティブ乳房新生物におけるＩＲＦ９の発現レベルは、生存転帰、特に転移拡散の可能性の予後兆候である。したがって、予後不良な患者から採取したサンプルでは、転写の低下、したがってｍＲＮＡ転写物およびコードされたＩＲＦ９タンパク質発現産物の喪失を観察することが予想される。予後良好な患者では、より高いレベルのＩＲＦ９発現を観察することが予想される。さらに、同定および測定される核酸分子またはタンパク質は、全分子であっても、またはその断片であってもよい。例えば、サンプルの処理に応じて、ＲＮＡの断片のみを同定することができる。前記断片は、その起源を特定の遺伝子またはタンパク質で示すのに十分な配列を含むならば、断片化された分子は、本発明の方法の文脈において有用である。
【００４７】
「核酸分子」への言及は、デオキシリボ核酸分子およびリボ核酸分子の両方ならびにそれらの断片に対する言及として理解されるべきである。したがって、本発明は、サンプル中のＲＮＡレベルの直接スクリーニング、または目的のＲＮＡ集団から逆転写された相補的ｃＤＮＡのスクリーニングにまで及ぶ。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のスクリーニングに関する方法を設計することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【００４８】
先の態様に従って、一実施形態において、前記スクリーニング方法は、ＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのスクリーニングに関する。
【００４９】
別の実施形態において、前記スクリーニング方法は、コードされたＩＲＦ９タンパク質発現産物のスクリーニングに関する。
【００５０】
したがって、一実施形態において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者における転移拡散のリスクを予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９タンパク質の発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートにおいて発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９タンパク質の発現レベルが転移拡散のリスク増加を示し、対応する新生物コホートにおいて発現される前記中間値レベル以上のＩＲＦ９タンパク質の発現レベルが、前記転移拡散のリスクが低いことを示す方法に関する。
【００５１】
さらに別の実施形態において、本発明は、トリプルネガティブ乳房新生物を有する患者における転移拡散のリスクを予後判定する方法であって、当該新生物をＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、対応する新生物コホートにおいて発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルが転移拡散のリスク増加を示し、対応する新生物コホートにおいて発現される前記中間値レベル以上のＩＲＦ９のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現レベルが、前記転移拡散のリスクが低いことを示す方法に関する。
【００５２】
新生物細胞の核内領域へのＩＲＦ９の局在をスクリーニングすることができ、これは、当該分子のリン酸化の成功およびそれによるシグナル伝達を示す。あるいは、ＩＲＦ９のリン酸化形態の細胞内存在をスクリーニングすることができる。ＩＲＦ９の絶対レベルの変化をスクリーニングすることはできるが、転移移行につながる細胞の欠陥はＩＲＦ９の機能的形態の喪失であり得ることを理解すべきである。この場合、このタンパク質は機能的な形態ではないにもかかわらず依然として存在し得る。
【００５３】
本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、ＩＲＦ９は、リン酸化を受け、その後細胞質から核に移行することによって機能する。一旦核に入ると、ＩＲＦ９は転写を誘導するために遺伝子プロモーターに結合する。したがって、非機能性タンパク質は、タンパク質の局在をスクリーニングすることによって検出することができ、細胞質局在化は、非機能性を示し、またはリン酸化は、リン酸化の欠如が非機能性を示す。この形態の試験は、タンパク質の絶対レベルまたは前記タンパク質のＲＮＡ転写産物についての試験と併せて行うことができる。
【００５４】
対象遺伝子の発現または機能的タンパク質レベルは、新生物の細胞において測定される。当業者であれば、腫瘍の検査は、多くの場合腫瘍が外科的に切除された後に行われることが理解されよう。しかし、外科的切除が不可能であるかまたは望ましくない限りにおいて、または即時の結果が求められる限りにおいて、生検標本を、最初の診断時または直後のいずれかで採取し、この標本について検査を行うことができる。
【００５５】
問題の個体の新生物から得られた結果は、対応する新生物コホートの中央値と比較して評価される。これが対照レベルである。「対応する」とは、試験の対象である腫瘍と同じ組織型の新生物、すなわちトリプルネガティブ乳房新生物を意味する。対照レベルは、問題の哺乳動物以外の個体から得られた集団結果を反映する標準的な結果であり得る。この形式の分析は、実際には、目的の試験サンプルである単一の生体サンプルの収集および分析のみを必要とするキットの設計を可能にするので、好ましい分析方法である。対照レベルを提供する標準的な結果は、当業者に周知の任意の適切な手段によって計算することができる。例えば、トリプルネガティブ新生物乳房組織サンプルの集団は、ＩＲＦ９遺伝子またはタンパク質発現のレベルに関して評価して標準的な中央値を提供することができ、これに対して将来のすべての試験サンプルが分析される。前記「中央値」は、個別の値でもよいし範囲であってもよい。
【００５６】
また、本発明の方法は、１または複数のさらなるマーカーのスクリーニングを含み得ることも理解されるべきである。これに関して、ＩＲＦ９およびＰＤ−Ｌ１両方の発現のダウンレギュレーションが、転移拡散および予後転帰不良のリスクの７倍の増加を予測することが予想外に判定されている。本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、ＰＤ−Ｌ１はプログラム細胞死−リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １）、分化クラスター２７４（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２７４）（ＣＤ２７４）およびＢ７ホモログ１（Ｂ７  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）（Ｂ７−Ｈ１）としても知られている。腫瘍において、このタンパク質はＣＤ２７４遺伝子によってコードされる。ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患および肝炎などの他の疾患状態のような特定の事象中に免疫系を抑制するのに主要な役割を果たすと推測されている、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。
【００５７】
したがって、本発明の好ましい一実施形態において、前記方法は、ＩＲＦ９およびＰＤ−Ｌ１両方の発現レベルの低下のスクリーニングに関する。
【００５８】
本発明の方法に従って試験される生体サンプルは、直接試験されても、または試験前に何らかの形の処理を必要としてもよい。例えば、組織サンプルは、試験前に均質化を必要とすることがあり、またはＩＲＦ９の細胞内局在のインサイツ試験のために切片化を必要とすることがある。あるいは、細胞サンプルは、試験前に透過処理を必要とする場合がある。さらに、生体サンプルが液体の形態でない限り（試験のためにそのような形態が必要とされる場合）、サンプルを動態化するために緩衝液などの試薬を添加する必要があり得る。
【００５９】
生体サンプルを直接試験してもよく、あるいは、生体サンプル中に存在する核酸またはタンパク質材料のすべてまたは一部を試験前に単離してもよい。この目的のために、ＩＲＦ９の発現レベルの変化をスクリーニングする場合、ＲＮＡ転写産物それ自体またはそこから転写されたｃＤＮＡをスクリーニングすることができることは理解されよう。さらに別の例において、分析前にサンプルを部分的に精製してもよいし、濃縮してもよい。例えば、生ウイルスの不活性化またはゲル上での試験の前に、標的細胞集団またはそれに由来する分子を前処理することは、本発明の範囲内である。生体サンプルは、新たに採取してもよいし、試験前に（例えば、凍結により）保存しておいてもよいし、試験前に（例えば、培養を行うことによって）処理してもよい。
【００６０】
本明細書において使用する「個体」または「患者」という用語は、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）および捕獲野生動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは実験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６１】
転移拡散および生存転帰不良のリスク増加の予後兆候である、トリプルネガティブ新生物におけるＩＲＦ９の発現レベルの低下は、対照レベルと比較したＩＲＦ９の発現レベルの部分的な減少、または発現の完全な欠如のいずれであってもよいことは理解されるべきである。発現減少の程度は、患者によって異なり得ることも理解されるべきである。しかし、重要な問題は、ＩＲＦ９のレベルがその対応する対照と比較して減少していることである。
【００６２】
生体サンプル中に新生物マーカーを発現した対象を試験する手段は、以下の当業者には周知の任意の適切な方法によって達成されるが、これらに限定されるものではない：
【００６３】
（ｉ）インビボ検出。
ＩＲＦ９発現の変化を示すことができるイメージングプローブまたは試薬の投与後に、分子イメージングを使用することができる。
分子イメージング（Ｍｏｏｒｅら、ＢＢＡ，１４０２：２３９−２４９，１９８８；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３５１−３５５，２０００）は、「古典的」診断画像技術、例えば、Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩ、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）または内視鏡検査などを使用して現在視覚化されているマクロな特徴と相関する、分子発現のインビボイメージングである。
【００６４】
（ｉｉ）細胞において蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による、または細胞由来の抽出物において、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴＰＣＲ）または競合的ＲＴ−ＰＣＲ産物のフローサイトメトリー定量（Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８：９  １３９８−１４０５，２００２）、ＲＮＡシークエンシング、ＮｅｘｔＧｅｎシークエンシング、増幅などの技術による、ＲＮＡ発現のアップレギュレーションの検出。
【００６５】
（ｉｉｉ）例えばアレイ技術による、ＲＮＡの発現プロファイルの評価（Ａｌｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：９６，６７４５−６７５０，Ｊｕｎｅ  １９９９）。
「マイクロアレイ」は、好ましくは、固体支持体の表面上に形成された画定された領域をそれぞれ有する、好ましくは個別領域の線状または多次元配列である。マイクロアレイ上の個別領域の密度は、単一の固相支持体の表面上で検出される標的ポリヌクレオチドの総数によって決定される。本明細書において使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、複合核酸混合物から相補的オリゴヌクレオチドを検出するために使用される、チップまたは他の表面上に配置されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイである。アレイ中の各特定のプローブ群の位置は既知なので、標的ポリヌクレオチドの同一性は、マイクロアレイ中の特定の位置へのそれらの結合に基づいて決定することができる。
【００６６】
ＤＮＡマイクロアレイ技術の最近の進歩により、複数の標的核酸分子の大規模アッセイを単一の固相支持体上で行うことが可能になる。米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅら）および関連特許出願には、サンプル中の特異的核酸配列のハイブリダイゼーションおよび検出のためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイの固定化が記載されている。目的の組織から単離された目的の標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡチップにハイブリダイズされ、特異的配列は、標的ポリヌクレオチドの優先傾向および個別のプローブ位置におけるハイブリダイゼーションの程度に基づいて検出される。アレイの１つの重要な用途は、差次的遺伝子発現の分析にあり、異なる細胞または組織（しばしば目的の組織および対照組織）における遺伝子の発現プロファイルを比較し、それぞれの組織間の遺伝子発現の差異が特定される。このような情報は、特定の組織型において発現される遺伝子の型の同定および発現プロファイルに基づく状態の診断に有用である。
【００６７】
一例において、目的のサンプル由来のＲＮＡを逆転写に供して、標識されたｃＤＮＡを得る。米国特許第６，４１０，２２９号（Ｌｏｃｋｈａｒｔら）を参照されたい。次いで、ｃＤＮＡを既知の順序でチップまたは他の表面に配列された既知の配列のオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。別の例において、ＲＮＡを生体サンプルから単離し、ｃＤＮＡプローブが固定されているチップにハイブリダイズさせる。標識されたｃＤＮＡがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの位置はｃＤＮＡに関する配列情報を提供し、一方、ハイブリダイズした標識されたＲＮＡまたはｃＤＮＡの量は目的のＲＮＡまたはｃＤＮＡの相対的表示の推定値を提供する。Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０（１９９５）を参照されたい。例えば、ヒト癌における遺伝子発現パターンを分析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用は、ＤｅＲｉｓｉら、（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０（１９９６））に記載されている。
【００６８】
好ましい実施形態において、目的の核酸に対応する核酸プローブが作製される。マイクロアレイに結合された核酸プローブは、標的配列と本発明のプローブとの特異的ハイブリダイゼーションが起こるように、生体サンプルの核酸と実質的に相補的であるように設計される。この相補性は、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションに干渉する、任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る点で、必ずしも完全ではない。ヌクレオチドレベルでの遺伝子の全体的な相同性はおそらく約４０％以上、おそらく約６０％以上、さらに約８０％以上であると予想され、さらに、約８〜１２ヌクレオチドまたはそれ以上の対応する連続した配列が存在することが予想される。しかし、突然変異の数が非常に多く、たとえ最低限にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが起こらない場合、その配列は相補的な標的配列ではない。したがって、本明細書において「実質的に相補的」とは、プローブが、通常の反応条件、特に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするように、標的配列に十分に相補的であることを意味する。
【００６９】
特定の実施形態において、プローブはキメラ分子であってもよく、すなわち、２以上のタイプの塩基または糖サブユニットを含むことができ、および／またはその連結は同じプライマー内に２以上のタイプであってよい。プローブは、当技術分野で公知のように、例えばインターカレーターおよび／またはマイナーグルーブバインダーなどの、その標的配列とのハイブリダイゼーションを容易にする部分を含むことができる。プローブ上の任意のペンダント基の存在と同様に、塩基、糖およびヌクレオシド間骨格の変異は、標的配列と配列特異的に結合するプローブの能力に適合するであろう。これらの範囲内で多数の構造的変更が可能である。有利には、本発明によるプローブは、シグナル増幅を可能にするような構造的特徴を有することができ、そのような構造的特性は、例えばＵｒｄｅａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２４：１９７−２００（１９９１））または欧州特許第０２２５，８０７号に記載されている分岐型ＤＮＡプローブである。さらに、プローブを形成するさまざまな複素環塩基、糖類、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製および特定の所定の配列のオリゴヌクレオチドの調製のための合成方法は、十分に開発されており、当技術分野において公知である。オリゴヌクレオチド合成のための好ましい方法は、米国特許第５，４１９，９６６号の教示を組み込む。
【００７０】
標的核酸の多型および／または二次構造、データの冗長性などを考慮して、特定の標的核酸について複数のプローブを設計することができる。いくつかの実施形態において、配列当たり２つ以上のプローブが使用される場合、重複プローブまたは単一標的遺伝子の異なる部分に対するプローブのいずれかが使用される。すなわち、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のプローブが、特定の標的に対する冗長性を構築するために使用される。プローブは、重複する（すなわち、共通するいくつかの配列を有する）か、または遺伝子の固有の配列に特異的であり得る。複数の標的ポリヌクレオチドが本発明に従って検出される場合、特定の標的ポリヌクレオチドに対応する各プローブまたはプローブ群は、マイクロアレイの個別の領域に位置する。
【００７１】
当業者には理解されるように、核酸は、多種多様な方法で固体支持体に結合または固定することができる。本明細書において「固定された」とは、核酸プローブと固体支持体との会合または結合が、結合、洗浄、分析および除去の条件下で十分安定であることを意味する。結合は、共有結合であっても、または非共有結合であってもよい。本明細書における「非共有結合」および文法上の等価物は、静電気、親水性および疎水性相互作用の１または複数を意味する。非共有結合には、ストレプトアビジンのような分子の支持体への共有結合、およびビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有結合が含まれる。本明細書における「共有結合」および文法上の等価物は、２つの部分、固体支持体およびプローブが、シグマ結合、π結合および配位結合を含む少なくとも１つの結合によって結合されていることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体との間に直接形成されても、または固体支持体もしくはプローブのいずれか、または両方の分子にリンカーまたは特異的反応基を含めることによって形成されてもよい。固定化は、共有結合性および非共有結合性の相互作用の組み合わせを含むこともできる。
【００７２】
この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知のように合成され、次いで、固体支持体の表面に結合される。当業者には理解されるように、５’または３’末端のいずれかを固体支持体に結合させても、または内部ヌクレオシドを介して結合を行ってもよい。さらなる実施形態において、固体支持体への固定は、非共有結合性であっても非常に強力であり得る。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコーティングされた表面に結合するビオチン化オリゴヌクレオチドを作製して、結合をもたらすことができる。
【００７３】
アレイは、ポリヌクレオチドマイクロアレイ要素を予備形成し、その後それらを表面に安定に会合させるなどの任意の好都合な方法に従って製造することができる。あるいは、当技術分野で知られているように、オリゴヌクレオチドを表面上で合成してもよい。それらの製造のための多数の異なるアレイ構成および方法が当業者に公知であり、国際公開第９５／２５１１６号および国際公開９５／３５５０５号（フォトリソグラフィー技術）、米国特許第５，４４５，９３４号（フォトリソグラフィーによるインサイツ合成）、米国特許第５，３８４，２６１号（機械的に誘導された流路によるインサイツ合成）；および米国特許第５，７００，６３７号（スポッティング、プリンティングまたはカップリングによる合成）に開示されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ビーズにＤＮＡをカップリングするための別の方法は、ＤＮＡの末端に結合させた特異的リガンドを使用して、ビーズに結合させたリガンド結合分子に連結させる。リガンド−結合パートナー対の候補としては、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、またはさまざまな抗体／抗原対、例えばジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１１２２−１１２６（１９９２））が挙げられる。ＤＮＡと支持体との共有結合による化学的結合は、標準的なカップリング剤を使用して、ＤＮＡ上の５’−リン酸を、ホスホアミデート結合を介してコーティングされたミクロスフェアに連結することによって達成できる。固体基材へのオリゴヌクレオチドの固定方法は十分に確立されている。Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）を参照されたい。オリゴヌクレオチドを固体基材に結合させる好ましい方法は、Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。固定化は、インサイツＤＮＡ合成（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、上記）によって、または化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（Ｇｕｏら、上記）の共有結合をロボットアレイ技術と組み合わせることによって達成することができる。
【００７４】
（ｉｖ）マイクロアレイアレイによって代表される固相技術に加えて、液相アッセイを用いて遺伝子発現を定量化することもできる。このような系の１つは、動的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。動的ＰＣＲは、特異的な核酸配列の増幅および定量化を同時に可能にする。特異性は、標的部位をブラケット化する一本鎖核酸配列に優先的に接着するように設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーに由来する。この一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列の各鎖上に特異的な非共有結合複合体を形成する。これらの複合体は、逆方向の二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写を促進する。反応混合物の温度サイクリングは、核酸の個々の鎖へのプライマー結合、転写、および再融解の連続サイクルを生成する。その結果、標的ｄｓＤＮＡ産物が指数関数的に増加する。この産物は、インターカレーティング色素または配列特異的プローブのいずれかを用いてリアルタイムで定量することができる。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  １は、インターカレーティング色素の一例であり、ｄｓＤＮＡに優先的に結合し、同時に蛍光シグナルの増加をもたらす。ＴａｑＭａｎ技術で使用されるような配列特異的プローブは、オリゴヌクレオチドの両端に共有結合した蛍光色素および消光分子からなる。プローブは、２つのプライマーの間の標的ＤＮＡ配列に選択的に結合するように設計されている。ＰＣＲ反応中にＤＮＡ鎖が合成されると、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって蛍光色素がプローブから切断され、シグナルの脱消光が生じる。プローブシグナル伝達法は、インターカレーティング色素法よりも特異的であり得るが、いずれの場合も、シグナル強度は、産生されるｄｓＤＮＡ産物に比例する。各タイプの定量方法は、各ウェルが目的の核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブを表す、マルチウェル液相アレイで使用することができる。組織または細胞系のメッセンジャーＲＮＡ調製物とともに使用する場合、プローブ／プライマー反応のアレイは、複数の目的遺伝子産物の発現を同時に定量することができる。Ｇｅｒｍｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：２５８−２６６（２０００）；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４（１９９６）。
【００７５】
（ｖ）例えばイムノアッセイによる、細胞抽出物中のＩＲＦ９タンパク質レベルの変化の測定。
生体サンプル中のタンパク質性新生物マーカー発現産物に関する試験は、当業者に周知の多数の適切な方法のいずれか１つによって行うことができる。適切な方法の例としては、組織切片、生検標本または体液サンプルの抗体スクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
抗体に基づく診断方法が使用される限りにおいて、マーカータンパク質の存在は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー手順などの多数の方法で決定することができる。これらには、当然のことながら、従来の競合結合アッセイと同様に、非競合型の単一部位および２部位の両方または「サンドイッチ」アッセイが含まれる。これらのアッセイは、標識された抗体の標的への直接結合も含む。
【００７７】
サンドイッチアッセイは、最も有用で一般的に使用されるアッセイの１つである。サンドイッチアッセイ技術の多数の変形例が存在し、これらのすべてが本発明に包含されるものとする。簡潔に述べると、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体を固体基材上に固定し、被験サンプルを結合分子と接触させる。適切なインキュベーション期間、抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間の後、検出可能なシグナルを生成することができるレポーター分子で標識された、抗原に特異的な二次抗体が添加され、抗体−抗原−標識抗体という別の複合体の形成に十分な時間インキュベートされる。未反応物質をすべて洗い流し、抗原の存在が、レポーター分子によって生成されたシグナルの観察によって判定される。結果は、可視シグナルの単純な観察によって定性的であってもよく、または対照サンプルと比較することによって定量化することもできる。フォワードアッセイの変形としては、サンプルと標識抗体の両方が、結合した抗体に同時に添加される同時アッセイが挙げられる。これらの技術は、当業者には周知であり、任意の小さな変形が含まれることは容易に明らかである。
【００７８】
典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、マーカーまたはその抗原性部分に特異性を有する一次抗体が、固体表面に共有結合または受動的に結合される。固体表面は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを行うのに適した任意の他の表面の形態であり得る。結合プロセスは当技術分野において周知であり、一般に架橋、共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は試験サンプルの調製において洗浄される。次いで、被験サンプルのアリコートを固相複合体に添加し、抗体中に存在する任意のサブユニットの結合を可能にするのに十分な時間（例えば２〜４０分）および適切な条件下（例えば２５℃）でインキュベートする。インキュベーション期間の後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥させ、抗原の一部に特異的な二次抗体と共にインキュベートする。二次抗体は、抗原に対する二次抗体の結合を示すために使用されるレポーター分子に連結される。
【００７９】
別の方法は、生体サンプル中の標的分子を固定し、次いで、固定された標的を特異的抗体に曝露することを含みこの特異的抗体はレポーター分子で標識しても、またはしなくてもよい。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に依存して、結合された標的は、抗体による直接標識によって検出可能であり得る。あるいは、一次抗体に特異的な標識二次抗体を、標的−一次抗体複合体に曝露して、標的−一次抗体−二次抗体の三次複合体を形成する。複合体は、レポーター分子によって放出されたシグナルによって検出される。
【００８０】
本明細書において使用される「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗原−結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。検出は定性的または定量的のいずれでもよい。このタイプのアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォアまたは放射性核種含有分子（すなわち放射性同位体）および化学発光分子のいずれかである。
【００８１】
酵素イムノアッセイの場合、酵素は一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩を用いて二次抗体にコンジュゲートされる。しかし、容易に認識されるように、当業者に容易に利用可能なさまざまな異なるコンジュゲーション技術が存在する。一般に使用される酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどが挙げられる。特定の酵素と共に使用される基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な変色を生じるように選択される。適切な酵素の例としては、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。上記発色基質ではなく蛍光産物を生じる蛍光発生基質を使用することも可能である。すべての場合において、酵素標識抗体が一次抗体ハプテン複合体に加えられ、結合され、次いで過剰の試薬が洗い流される。次いで、適切な基質を含有する溶液が、抗体−抗原−抗体の複合体に添加される。基質は、二次抗体に連結された酵素と反応して定性的な視覚シグナルをもたらし、これをさらに通常分光光度法で定量してサンプル中に存在する抗原の量を示すことができる。「レポーター分子」はまた、細胞凝集またはラテックスビーズ上の赤血球などの凝集阻害への使用にまで及ぶ。
【００８２】
あるいは、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長の光で照射することにより活性化されると、蛍光色素標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子内に励起状態を誘導し、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色で光を放出する。ＥＩＡの場合と同様に、蛍光標識された抗体は、一次抗体−ハプテン複合体に結合される。未結合の試薬を洗い流した後、残りの三次複合体を適切な波長の光に曝露し、観察された蛍光は目的のハプテンの存在を示す。免疫蛍光法およびＥＩＡ技術はいずれも当技術分野において非常によく確立されており、本方法にとって特に好ましい。しかし、放射性同位体、化学発光または生物発光分子のような他のレポーター分子も使用することができる。
【００８３】
（ｖｉ）これらのタンパク質のリン酸化状態をスクリーニングすることを選択する限り、これは定性的または定量的のいずれでも達成することができる。最も単純な場合には、放射性リン酸塩（例えば、［３２Ｐ］−γＡＴＰ）の取り込み後のオートラジオグラフ、または、リン酸化残基を特異的に認識する抗体を用いたイムノブロッティングなどに対して、単独（すなわち、任意のリン酸化の有無）または対照試験と比較して、発色したバンドの強度の目視による評価を実施することができ、より濃いおよび／またはより厚いバンドが、より淡いおよび／またはより薄いバンドよりも高いレベルのリン酸化を示す。対応するタイプの分析は、レポーターの読み出しで定性的または定量的に行うことができる。可視光または蛍光に基づく濃度計のような装置を利用して、より高度な分析を行うことができ、これは標準に対して所定のバンドにおけるリン酸化タンパク質の濃度を経験的に計算することができる。
【００８４】
関連する態様において、本知見は、トリプルネガティブ乳房新生物、特に、転移拡散のリスク増加および／または低い生存率の予後を特徴とするトリプルネガティブ乳房新生物、および／または従来の治療薬による治療レジメンに抵抗性であるトリプルネガティブ乳房新生物を治療する手段の開発を可能にした。この後者の腫瘍に関しては、これらの腫瘍が再感作され、それにより以下に記載される薬剤の組み合わせの使用に基づく新生物治療レジメン対する応答性が付与されることがさらに判定された。これらの治療は、それ自体で使用することも、または新形成を標的とするために選択された他の治療レジメンへの補助治療として使用することもできる。例えば、原発腫瘍が外科的に除去され、続いて、転移拡散を予防的または治療的に治療するために本治療法が適用されてもよい。別の例において、原発腫瘍は外科的に除去不能であり、放射線療法によって治療されており、それでもＩＦＮのみの投与を使用して、転移拡散に関して患者を同時に治療することもできる。あるいは、本明細書に記載の方法は、それ自体で使用することができる。
【００８５】
本発明を何ら限定するものではないが、本明細書に開示される診断方法は、転移拡散のリスクおよび生存転帰不良を同定することが理解されよう。場合により、転移拡散が既に始まっていることもあるが、他の臨床状況では、転帰不良が予後判定され、転移拡散の可能性が判断されていても、新生物細胞の他の器官への実際の拡散がまだ起こっていない場合もある。転移性腫瘍がさらに顕著に目に見えるようになる転移性癌のより進んだ段階以外では、原発腫瘍の転移拡散が起こったかどうかを確認できないことが予想される。したがって、予後転帰不良を示す原発腫瘍が外科的に除去できないが、実際には拡散していないような場合、本発明の方法は予防的に機能し、または転移拡散が始まっているが、これらの転移が従来の診断技術によって未だ検出不能であったとしても、本発明の方法は治療的に機能することができる。
【００８６】
本発明のこの態様の治療方法は、進行期または早期のいずれの疾患の治療にも有用であるが、早期の疾患の予防または治療におけるその適用は、この治療方法が、進行期疾患に付随する、後期の治療の有効性を低下させる可能性のある他の臨床的問題のために、衰弱させ、死に至らせ得る進行疾患の時点へ患者が到達することを予防するので、特に意味がある。しかし、今日まで、トリプルネガティブな癌を治療的応答性の観点から分類し、その後早期にこれらの癌を治療する有効な手段は存在しなかった。したがって、本発明の方法は非常に意味がある。化学療法はこれまで使用されてきた一次治療であり、これは非常に非特異的であり、この特に侵攻性で治療が困難な乳癌サブタイプに関して中程度の有効性しかない。臨床医はまた、その副作用のために、転移性疾患の臨床的兆候がない患者をこの治療レジメンに供することに消極的であった。しかし、転移が診断可能な時点では、それらは比較的進行しており、治療は無駄であることが多い。本発明の方法がここで初めて、この形態の乳癌に罹患している患者の有望な予後を正確かつ単純に判定する手段を提供しており、どの癌が特定の治療レジメンに応答する可能性が高いかを同定し、これらの癌を治療する手段は、腫瘍学の分野において重要な前進である。化学療法などの治療レジメンを使用しようとしている場合であっても、本発明の方法は、少なくとも好都合に応答する可能性のある癌を標的化することができる。予後良好が得られる場合であっても、治癒を達成するために患者を治療することが望ましいこと思われることを理解すべきである。しかし、意義深いことには、ＩＲＦ９およびＰＤ−Ｌ１のようなインターフェロン調節因子の発現の減少を示すトリプルネガティブ乳癌は、従来の新生物療法に抵抗性である可能性が高いことが判定されているので、本発明は新生物療法の合理的設計も可能にした。しかし、このトリプルネガティブな癌のサブグループは、再感作の可能性があり、併用療法を用いて治療が可能であることが判明している。
【００８７】
したがって、本発明のこの態様は、個体におけるトリプルネガティブ乳房新形成の治療方法であって、当該個体においてＩ型ＩＦＮレベルをアップレギュレートする薬剤を含む組成物の有効量を投与する工程を含む方法に関する。
【００８８】
一実施形態において、前記新形成は転移拡散のリスク増加の予後を特徴とする。
【００８９】
別の実施形態において、前記新形成は、低い生存率の予後を特徴とする。
【００９０】
「低い生存率の予後」である癌または「転移拡散のリスク増加」である癌に対する言及は、上記と同じ意味を有すると理解されるべきである。しかし、上で詳述したように、患者が予後良好または予後不良を示すかどうかに関わらず、この方法で任意のトリプルネガティブ乳癌を治療することを探求できるが、ＩＲＦ９発現が低下したトリプルネガティブな癌の標的化が、この療法が併用療法として投与される場合、治療応答性の改善を達成することが現在判定されていることは、理解されるべきである。前に詳述したように、トリプルネガティブ乳癌のこのサブグループは、しばしば従来の治療レジメンに対して抵抗性である。インターフェロン調節因子の発現のアップレギュレーションは、これらの細胞を再感作することが判定されており、化学療法または放射線療法と併用すると、これらの侵攻性かつ上述の大いに治療不能であった腫瘍の有効な治療が可能になった。さらに、抗ＰＤ１と一緒に免疫刺激（特に、Ｔｃおよび／またはＮＫ細胞の活性化）の組み合わせで患者を治療することも有効であることも判定されている。
【００９１】
したがって、関連する態様において、対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルを特徴とするトリプルネガティブ乳房新生物を治療する方法であって、
（ｉ）免疫賦活剤および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；または
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤および新生細胞の増殖をダウンレギュレートする毒素、
の有効量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００９２】
「免疫賦活剤」への言及は、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）および／またはＮＫ細胞を活性化する任意の薬剤に対する言及として理解されるべきである。この薬剤は、タンパク質性であっても、または非タンパク質性であってもよく、ポリＩ：Ｃ、放射線療法、化学療法、ＩＦＮまたはＩＦＮレベルをアップレギュレートする他の薬剤を含むが、これらに限定されない。化学療法および放射線療法は伝統的に細胞死を誘導すると考えられているが、これらの治療レジメンは免疫賦活にも効果がある。
【００９３】
「抗ＰＤ１」および「抗ＰＤＬ１」への言及は、ＰＤ−Ｌ１リガンドとＰＤ１受容体との相互作用を防止するために、ＰＤ１またはＰＤ−ＬＩのいずれかと相互作用する任意の分子に対する言及として理解されるべきである。一実施形態において、前記分子は抗体である。
【００９４】
「毒素」への言及は、細胞を死滅させるかまたは損傷するように作用する任意のタンパク質性または非タンパク質性の薬剤に対する言及として理解されるべきである。この薬剤は、細胞傷害性薬剤または非細胞傷害性薬剤であってよい。本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、多くのこのような薬剤はアポトーシス過程の誘導を介して機能する。しかし、これは、このような薬剤が機能する唯一のメカニズムではなく、他の何らかの機構によって目的細胞の死滅が誘発され得ると考えられる。薬剤の例としては、限定するものではないが、伝統的に理解されている化学療法剤、例えば、アクチノマイシンＤ、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルビジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンが挙げられる。細胞損傷を誘導する他の手段としては、電離放射線ならびにポリ−（ＡＤＰリボシル）トランスフェラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤などの分子または別の薬剤との相乗過程の一部として細胞損傷を誘導する薬剤、例えばゲムシタビンまたはイリノテカンおよびＣＨＫ１／２阻害剤、例えば、ＣＢＰ−５０１またはＡＺＤ７７６２の使用が挙げられる。さらに、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）などの新規クラスの抗新生物薬、例えばボリノスタット、ＢＨ３模倣物、例えば、ＡＢＴ７３７、および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、特に、従来の細胞傷害性薬剤と組み合わせて投与される場合、アポトーシス促進性である。一実施形態において、前記毒素は、化学療法または放射線療法である。
【００９５】
本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定するものではないが、ヒトＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られる特定の細胞表面受容体複合体に結合する。ヒトＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−α（アルファ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−δ（デルタ）、ＩＦＮ−ε（イプシロン）、ＩＦＮ−τ（タウ）、ＩＦＮ−ω（オメガ）、およびＩＦＮ−ζ（ゼータ、リミチンと命名されている。したがって、「Ｉ型ＩＦＮ」への言及は、すべての前駆体、プロタンパク質または中間体を含むこのクラスに属するすべてのインターフェロン型への言及として理解されるべきである。さらに、「Ｉ型ＩＦＮ」への言及は、Ｉ型ＩＦＮ  ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じ得るすべてのイソ型またはＩ型ＩＦＮの多形体に対する言及を含む。Ｉ型ＩＦＮへの言及は、二量体、多量体または融合タンパク質として存在するいずれのＩ型ＩＦＮタンパク質にも及ぶ。一実施形態において、前記Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである。
【００９６】
したがって、一実施形態において、前記治療方法は、前記個体におけるＩＦＮ−αのレベルをアップレギュレートする薬剤の有効量を投与する工程を含む。
【００９７】
別の実施形態において、前記治療方法は、前記個体においてＩＦＮ−βのレベルをアップレギュレートする薬剤を含む、有効量の組成物を投与する工程を含む。
【００９８】
Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤に関して、これは、限定するものではないが、
（ｉ）Ｉ型ＩＦＮタンパク質またはこの機能的断片；
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮまたはこの機能的断片をコードする核酸分子；
（ｉｉｉ）Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の転写または翻訳制御を調節するなどして、Ｉ型ＩＦＮの発現をアップレギュレートするタンパク質性または非タンパク質性の分子；
（ｉｖ）例えば、ＴＬＲ７／８アゴニストイミキモドまたはＴＬＲ３アゴニストポリＩ：Ｃ、ポリＡ：Ｕ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ：Ｌ：ＣまたはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧを含むＴｏｌｌ様受容体などのパターン認識受容体と相互作用するタンパク質性または非タンパク質性の分子；
を含む、当業者に周知の任意の適切な分子であってよい。
【００９９】
一実施形態において、前記新形成は転移拡散のリスク増加の予後を特徴とする。
【０１００】
別の実施形態において、前記新形成は、生存転帰不良を特徴とする。
【０１０１】
さらに別の実施形態において、前記新形成は転移拡散を受けている。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、前記方法は、
（ｉ）ポリＩ：Ｃおよび抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｉｉ）放射線療法および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｉｉｉ）化学療法および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｉｖ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；
（ｖ）化学療法およびポリＩ：Ｃ；
（ｖｉ）化学療法およびＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤；
（ｖｉｉ）放射線療法およびポリＩ：Ｃ；
（ｖｉｉｉ）放射線療法およびＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤；
から選択される併用治療を施す工程を含む。
【０１０３】
さらに別の実施形態において、前記化学療法はドキソルビシンである。
【０１０４】
さらに別の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする前記薬剤は、Ｉ型ＩＦＮである。
【０１０５】
さらに別の実施形態において、前記抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体、より詳細には抗ＰＤ１抗体である。
【０１０６】
「有効量」は、少なくとも部分的に、所望の応答を得るため、または処置される特定の状態の発症を予防もしくは遅延させる、または進行を抑制する、または発症もしくは進行を完全に停止させるために必要な量を意味する。この量は、治療される個体の健康状態および身体状態、治療される個体の分類群、個体の免疫系が特定の免疫応答を刺激する能力、所望の保護の程度、ワクチンの処方、医療状況の評価、および他の関連する要因に応じて変動する。この量は、日常的な試験を通じてされ得る比較的広い範囲に入ると予想される。
【０１０７】
関連する態様において、個体におけるトリプルネガティブ乳房新生物の治療のための医薬の製造における、Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤の使用が提供される。
【０１０８】
別の実施形態において、
（ｉ）免疫賦活剤および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１；または
（ｉｉ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤および新生細胞の増殖をダウンレギュレートする毒素；
の、対応する新生物コホートによって発現される中央値と比較して低いＩＲＦ９の発現レベルを特徴とするトリプルネガティブ乳房腫瘍を個体において治療するための医薬の製造における使用が提供される。
【０１０９】
一実施形態において、前記Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである。
【０１１０】
別の実施形態において、前記方法は、
（ｉ）ポリＩ：Ｃと抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１との併用；
（ｉｉ）放射線療法と抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１との併用；
（ｉｉｉ）化学療法と抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１との併用；
（ｉｖ）Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤、例えばＩＦＮと抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１との併用；
（ｖ）化学療法とポリＩ：Ｃとの併用；
（ｖｉ）化学療法とＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤との併用；
（ｖｉｉ）放射線療法とポリＩ：Ｃとの併用；
（ｖｉｉｉ）放射線療法とＩ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする薬剤との併用；
から選択される併用治療を施す工程を含む。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、前記化学療法はドキソルビシンである。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮのレベルをアップレギュレートする前記薬剤は、Ｉ型ＩＦＮである。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、前記抗ＰＤ１または抗ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体、より詳細には抗ＰＤ１抗体である。
【０１１４】
２種の薬剤の上記同時投与が実施される限りにおいて、この同時投与への言及は、同じもしくは異なる経路を介した同一の製剤もしくは２種の異なる製剤の同時投与、または同じもしくは異なる経路による連続投与を意味する。「連続」投与とは、２種の分子の投与の間の数秒、数分、数時間または数日の時間差を意味する。これらの分子は、任意の順序で投与することができる。
【０１１５】
上記のタンパク質性分子は、天然源、組換え体または合成源などの任意の適切な供給源に由来してもよく、例えば天然産物のスクリーニング後に同定された融合タンパク質または分子を含む。非タンパク質性分子への言及は、例えば、核酸分子に対する言及であり得、または例えば天然産物のスクリーニングなどの天然の供給源に由来する分子であってもよく、または化学的に合成された分子であってもよい。本発明は、Ｉ型ＩＦＮ発現産物の類似体またはアゴニストとして作用することができる小分子を企図する。化学的アゴニストは、必ずしもＩ型ＩＦＮ発現産物に由来するとは限らないが、特定の立体配座類似性を共有することができる。または、化学的アゴニストは、特定の物理化学的特性を満たすように特別に設計されてもよい。
【０１１６】
上記の（ｉ）〜（ｉｖ）で言及されたＩ型ＩＦＮ分子のレベルをアップレギュレートするタンパク質性および非タンパク質性の薬剤は、本明細書においてまとめて「調節薬」と呼ばれる。
【０１１７】
上記の調節剤のスクリーニングは、限定するものではないが、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子またはその機能的等価物もしくは誘導体を含む細胞を薬剤と接触させる工程、およびＩ型ＩＦＮタンパク質の産生または機能活性の調節、Ｉ型ＩＦＮをコードする核酸分子の発現の調節、または下流のＩ型ＩＦＮ細胞標的の活性または発現の調節をスクリーニングする工程を含むいくつかの適切な方法のいずれか１つによって達成することができる。このような調節の検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動度シフトアッセイおよび／またはルシフェラーゼ、ＣＡＴなどのＩ型ＩＦＮ活性のレポーターの読み出しなどの技術を利用して達成することができる。
【０１１８】
Ｉ型ＩＦＮ遺伝子またはその機能的等価物もしくは誘導体は、試験の対象である細胞中に天然に存在しても、または試験の目的で宿主細胞にトランスフェクトされていてもよいことが理解されるべきである。さらに、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子が細胞にトランスフェクトされる限りにおいて、その分子はＩ型ＩＦＮ遺伝子全体を含んでも、またはＩ型ＩＦＮ産物の発現を調節する部分のような遺伝子の一部を含むだけであってもよい。例えば、Ｉ型ＩＦＮプロモーター領域を、試験の対象である細胞にトランスフェクトすることができる。これに関して、プロモーターのみが利用される場合、プロモーターの活性の調節の検出は、例えば、プロモーターをレポーター遺伝子に連結することによって達成することができる。例えば、プロモーターはルシフェラーゼまたはＣＡＴレポーターに連結され得、その遺伝子の発現調節は、それぞれ蛍光強度またはＣＡＴレポーター活性の調節を介して検出することができる。さらに別の例としては、最小レポーターに連結されたＩ型ＩＦＮ結合部位が挙げられる。
【０１１９】
これらの方法は、合成、コンビナトリアル、化学的および天然のライブラリを含むタンパク質性または非タンパク質性物質などの推定調節剤のハイスループットスクリーニングを行うための機序を提供する。これらの方法はまた、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子または発現産物そのもののいずれかを結合する薬剤か、または上流分子の発現を調節する薬剤の検出を容易にし、次いでこの上流分子はＩ型ＩＦＮの発現または発現産物の活性を調節する。したがって、これらの方法は、Ｉ型ＩＦＮの発現および／または活性を直接または間接的に調節する薬剤を検出する機序を提供する。
【０１２０】
本発明の方法に従って利用される薬剤は、任意の適切な形態をとることができる。例えば、タンパク質性薬剤は、さまざまな程度にグリコシル化または非グリコシル化、リン酸化または脱リン酸化されてもよく、および／またはアミノ酸などのタンパク質、脂質、炭水化物または他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に使用、連結、結合、または会合したさまざまな他の分子を含むことができる。同様に、本発明の非タンパク質性分子もまた、任意の適切な形態をとることができる。本明細書に記載されるタンパク質性物質および非タンパク質性物質は両方とも、任意の他のタンパク質性または非タンパク質性分子と連結、結合、または会合していてもよい。例えば、本発明の一実施形態において、前記薬剤は、局在化領域へのその標的化を可能にする分子と会合している。
【０１２１】
対象のタンパク質性または非タンパク質性分子は、直接的または間接的に作用して、Ｉ型ＩＦＮの発現またはＩ型ＩＦＮ発現産物の活性を調節することができる。前記分子は、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子または発現産物と会合して、それぞれ発現または活性を調節する場合、直接作用する。前記分子は、他の分子が、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子または発現産物のそれぞれ発現または活性を直接または間接的に調節する、Ｉ型ＩＦＮ核酸分子または発現産物以外の分子と会合する場合、間接的に作用する。したがって、本発明の方法は、調節段階のカスケードの誘導によるＩ型ＩＦＮ核酸分子の発現または発現産物の活性の調節を包含する。
【０１２２】
本明細書に記載される分子の「誘導体」には、天然源または非天然源いずれかに由来する断片、一部、部分または変異体が含まれる。非天然源としては、例えば、組換えまたは合成供給源が挙げられる。「組換え源」とは、対象分子が回収される細胞源が遺伝的に改変されていることを意味する。これは、例えば、その特定の細胞源による産生の速度および量を増加または増強するために行うことができる。一部または断片には、例えば、分子の活性領域が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換に由来し得る。アミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入が含まれる。挿入アミノ酸配列変異体は、１または複数のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されたものであるが、ランダムな挿入もまた、得られる産物の適切なスクリーニングで可能である。欠失変異体は、配列から１または複数のアミノ酸が除去されることを特徴とする。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸配列への付加としては、上で詳述したような他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合が挙げられる。
【０１２３】
誘導体はまた、ペプチド、ポリペプチドまたは他のタンパク質性もしくは非タンパク質性分子に融合された、特定のエピトープまたはタンパク質全体の一部を有する断片を含む。本明細書で企図される分子の類似体には、限定するものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、および架橋剤の使用、ならびにタンパク質性分子またはそれらの類似体に構造制約を課す他の方法が挙げられる。
【０１２４】
本発明の方法に従って利用可能な核酸配列の誘導体は、同様に、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または他の核酸分子との融合を含む付加に由来し得る。本発明で利用される核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制および融合における使用に適した分子が挙げられる。核酸配列の誘導体には、縮重変異体も含まれる。
【０１２５】
Ｉ型ＩＦＮの「変異体」または「突然変異体」は、Ｉ型ＩＦＮの形態の機能活性の少なくとも一部を示す、変異体または突然変異体分子を意味すると理解すべきである。変異または突然変異は、任意の形態をとることができ、天然または非天然に存在し得る。
【０１２６】
「ホモログ」は、分子が本発明の方法に従って処理されている種以外の種に由来することを意味する。これは、例えば治療されている種以外の種が、例えば、治療を受けている対象により天然に産生されるＩ型ＩＦＮと類似した適切な機能的特徴を示すＩ型ＩＦＮの形態を産生することが判定された場合に生じ得る。
【０１２７】
化学的および機能的等価物は、対象分子の機能活性の任意の１または複数を示す分子として理解されるべきであり、これらの機能的等価物は、化学的に合成されるか、または天然産物スクリーニングなどのスクリーニングプロセスを介して同定される任意の起源に由来し得る。例えば、化学的または機能的等価物は、コンビナトリアルケミストリーまたは組換えライブラリのハイスループットスクリーニングのような周知の方法を利用して、または天然産物のスクリーニング後に、設計および／または同定することができる。
【０１２８】
例えば、小さな有機分子を含むライブラリをスクリーニングすることができ、多数の特定の親基の置換を有する有機分子が用いられる。一般的な合成スキームは、公開された方法（例えば、Ｂｕｎｉｎ  ＢＡら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４７０８−４７１２；ＤｅＷｉｔｔ  ＳＨら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６９０９−６９１３）に従うことができる。簡潔に述べると、各連続合成ステップにおいて、複数の異なる選択された置換基の１つが、アレイの選択されたサブセットの各チューブに加えられ、チューブサブセットは、ライブラリの作製に用いられた異なる置換基のすべての順列候補を生じるように選択される。１つの適切な順列戦略が、米国特許第５，７６３，２６３号に概説されている。
【０１２９】
現在、生物学的に活性な化合物を探索するために、ランダムな有機分子のコンビナトリアルライブラリを使用することに広く関心が集まっている（例えば、米国特許第５，７６３，２６３号を参照）。このタイプのライブラリをスクリーニングすることによって発見されたリガンドは、天然のリガンドを模倣または遮断すること、または生物学的標的の天然に存在するリガンドに干渉することに有用であり得る。現在の状況において、例えば、それらは、より強力な薬理学的効果などの特性を示すＩ型ＩＦＮ類似体を開発するための出発点として使用することができる。Ｉ型ＩＦＮまたはその機能的部分は、本発明によれば、さまざまな固相または溶液相合成法（例えば、米国特許第５，７６３，２６３号およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）によって形成された組み合わせライブラリに使用することができる。米国特許第５，７５３，１８７号に開示されているような技術の使用により、数百万の新しい化学的および／または生物学的化合物を数週間未満で日常的にスクリーニングすることができる。同定された多数の化合物のうち、適切な生物学的活性を示すもののみがさらに分析される。
【０１３０】
ハイスループットライブラリスクリーニング法に関して、選択された生物学的薬剤、例えば生体分子、巨大分子複合体または細胞などと特異的に相互作用することができるオリゴマーまたは小分子のライブラリ化合物は、上記のような周知の方法の範囲から、当業者により容易に選択されるコンビナトリアルライブラリデバイスを利用してスクリーニングされる。このような方法では、ライブラリの各メンバーは、選択された薬剤と特異的に相互作用する能力に関してスクリーニングされる。この方法を実践する際に、生物学的薬剤を化合物含有チューブに引き込み、各チューブ中の個々のライブラリ化合物と相互作用させる。相互作用は、所望の相互作用の存在をモニターするために使用可能な検出可能なシグナルを生成するように設計される。好ましくは、生物学的薬剤は水溶液中に存在し、さらなる条件は所望の相互作用に応じて適合される。検出は、例えば、物質検出のための任意の周知の機能的または非機能的な方法によって行うことができる。
【０１３１】
本明細書で企図されるＩ型ＩＦＮの類似体には、限定するものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および／または誘導体の組み込み、および架橋剤の使用、ならびに類似体に構造制約を課す他の方法が挙げられる。このような修飾がとり得る特定の形態は、対象分子がタンパク質性であるか非タンパク質性であるかに依存する。特定の修飾の性質および／または適合性は、当業者によって日常的に判定され得る。
【０１３２】
前記Ｉ型ＩＦＮの機能レベルの調節は、Ｉ型ＩＦＮ、Ｉ型ＩＦＮをコードする核酸分子、またはＩ型ＩＦＮ活性またはＩ型ＩＦＮ遺伝子発現の調節をもたらす薬剤（本明細書中ではまとめて「調節剤」と呼ばれる）の投与を介して達成することができる。
【０１３３】
用語「治療」は、必ずしも対象が完全回復まで治療されることを意味するものではないことを理解されたい。したがって、治療には、既存の状態の重篤度を軽減すること、特定の状態の症状を改善すること、または特定の状態を発症するリスクを予防するか、さもなければ低下させることが含まれる。
【０１３４】
医薬組成物の形態での本発明の組成物の投与は、任意の簡便な手段によって実施することができる。医薬組成物の成分は、特定の症例に応じた量で投与される場合、治療活性または予防活性を示すことが企図される。その変化は、例えば、ヒトであるか、または動物であるかに依存する。広範囲の用量が適用可能である。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調節することができる。例えば、いくつかの分割された用量が、毎日、毎週、毎月、または他の適切な時間間隔で投与されてもよく、または状況の緊急性によって示されるように用量が比例して減少してもよい。
【０１３５】
組成物は、経口、吸入、腹腔内、皮下、座薬経路または移植（例えば、遅効性分子を用いる）などの簡便な様式で投与することができる。それはまた、非粘膜経路を介して、適切な場合には静脈内経路または他のこのような経路を介して投与することもできる。組成物は、医薬として許容される非毒性塩、例えば酸付加塩、または例えば、亜鉛、鉄などとの金属錯体の形態（本出願の目的のための塩として考えられる）で投与することができる。このような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分が錠剤の形態で投与される場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含むことができる。
【０１３６】
本発明の調節剤は、医薬として許容される担体（賦形剤）と組み合わせて、薬理学的組成物を形成することができる。医薬として許容される担体は、本発明の医薬組成物の吸収速度またはクリアランス速度を安定させるか、またはそれを増減させるように作用する生理学的に許容される化合物を含んでよい。生理学的に許容される化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのクリアランスまたは加水分解を減少させる組成物、賦形剤または他の安定剤および／または緩衝剤を挙げることができる。界面活性剤もまた、リポソーム担体を含む医薬組成物の吸収を安定化させるか、またはそれを増減させるように使用することができる。ペプチドおよびポリペプチドのための医薬として許容される担体および製剤は当業者に公知であり、化学的および特許の文献に詳細に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照されたい。
【０１３７】
生理学的に許容される他の化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤または微生物の成長または作用の防止に特に有用な防腐剤が挙げられる。さまざまな防腐剤が周知であり、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む医薬として許容される担体の選択が、例えば、本発明のペプチドまたはポリペプチドの投与経路およびその特定の物理化学的特性に依存することは理解されよう。
【０１３８】
固形製剤は経腸（経口）投与に使用することができる。これらは、例えば、丸剤、錠剤、散剤またはカプセル剤として製剤化することができる。固形組成物の場合、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の非毒性固形担体を使用することができる。経口投与のために、医薬として許容される非毒性組成物は、通常使用される賦形剤、例えば前記の担体のいずれかを組み込むことによって形成される。非固形製剤も経腸投与に使用することができる。担体は、石油、動物、植物または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含むさまざまな油から選択することができる。適切な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが挙げられる。
【０１３９】
本発明の組成物は、経口投与される場合、消化から保護され得る。これは、本組成物を、酸加水分解および酵素加水分解に抵抗性の組成物と複合体化させるか、またはこれらの分子をリポソームなどの適切に耐性のある担体にパッケージするかのいずれかによって達成することができる。化合物を消化から保護する手段は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｆｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０−１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９−１３５；治療剤の経口送達のための脂質組成物を記載している米国特許第５，３９１，３７７号（リポソーム送達は、以下でさらに詳細に考察される）を参照されたい。
【０１４０】
本発明の組成物はまた、製剤を内部に送達することができる持続放出または持続放出機序で投与することもできる。例えば、ペプチドの持続送達が可能な、生分解性ミクロスフェアまたはカプセルまたは他の生分解性ポリマー構成を本発明の製剤に含めることができる（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３−１５７を参照されたい）。
【０１４１】
吸入のために、本発明の組成物は、乾燥粉末エアロゾル、液体送達システム、エアジェット噴霧器、噴霧剤システムなどを含む当技術分野で公知の任意のシステムを用いて送達することができる。例えば、Ｐａｔｔｏｎ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：１４１−１４３；Ｄｕｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｒａｄｉｇｍ（カリフォルニア州ヘイワード）、Ａｅｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンタクララ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サンカルロス）などによるポリペプチド巨大分子のための製品および吸入送達システムを参照されたい。例えば、Ｉ型ＩＦＮ製剤は、エアロゾルまたはミストの形態で投与することができる。エアロゾル投与の場合、製剤は、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分割した形態で供給することができる。別の態様において、製剤を呼吸器組織に送達するための装置は、製剤が気化する吸入器である。他の液体送達システムには、例えば、エアジェット噴霧器が含まれる。
【０１４２】
Ｉ型ＩＦＮは、患者への肺または呼吸器送達に適切な医薬として許容される組成物で製剤化される。特定の製剤としては、噴霧に適した乾燥粉末、溶液または懸濁液、および定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）での使用に適した噴霧製剤が挙げられる。このような製剤の調製は、特許文献、科学文献、および医学文献に十分に記載されており、以下の説明は例示的のみを意図している。
【０１４３】
噴霧器システムでの使用のためのＩ型ＩＦＮの液体製剤は、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤、等張性改良剤、不活性ガスなどを含む、化学的安定性を増強または維持する成分を含み得る。
【０１４４】
定量噴霧式吸入器での使用のために、本発明のＩ型ＩＦＮは、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）またはハイドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）などの適切なエアロゾル噴霧剤に溶解または懸濁される。適切なＣＦＣとしては、トリクロロモノフルオロメタン（噴霧剤１１）、ジクロロテトラフルオロエタン（噴霧剤１１４）、およびジクロロジフルオロメタン（噴霧剤１２）が挙げられる。適切なＨＦＣとしては、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ−１３４ａ）およびヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ−２２７）が挙げられる。
【０１４５】
好ましくは、エアロゾル噴霧剤に組み込むために、本発明のＩ型ＩＦＮは、乾燥粉末製剤について以下に記載するように吸入可能な粒子に加工される。次いで、典型的にはそれらの分散を高めるために界面活性剤で被覆された粒子を噴霧剤に懸濁させる。適切な界面活性剤としては、オレイン酸、ソルビタントリオレエート、およびさまざまな長鎖ジグリセリドおよびリン脂質が挙げられる。このようなエアロゾル噴霧製剤は、エタノールなどの低級アルコール（３０重量％まで）ならびに化学的安定性および生理学的許容性を維持または向上させるための他の添加剤をさらに含んでもよい。
【０１４６】
乾燥粉末製剤は、典型的には、肺の肺胞領域内に沈着するために好ましい範囲内の特定のサイズを有する、乾燥させた、通常は凍結乾燥させた形態のＩ型ＩＦＮを含む。好ましいサイズ範囲内のＩ型ＩＦＮの吸入可能な粉末は、ジェット粉砕、噴霧乾燥、溶媒沈殿などのさまざまな従来技術によって製造することができる。粉末を分散させるために装置により吸気呼吸を使用する従来の乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、または外部電源を使用してエアロゾル雲に粉末を分散させる空気支援装置で患者に乾燥粉末を投与することができる。
【０１４７】
乾燥粉末装置は、典型的には、単一のエアロゾル化用量（「パフ」）を生成するために、約１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲の粉末量を必要とする。Ｉ型ＩＦＮの必要用量はこの量よりも少なくてよいので、Ｉ型ＩＦＮを医薬として許容される乾燥増量粉末と組み合わせることができる。好ましい乾燥増量粉末としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびグリシンが挙げられる。他の適切な乾燥増量粉末には、セロビオース、デキストラン、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、マンニトールなどが含まれる。典型的には、適切な緩衝液および塩を使用して、粒子形成前の溶液中のＩ型ＩＦＮを安定化させることができる。適切な緩衝液としては、典型的には約５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度のリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、およびトリス−ＨＣｌが挙げられる。適切な塩としては、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。他の添加剤としては、肺内に溶解された場合に、Ｉ型ＩＦＮの生物学的活性を促進するキレート剤、ペプチダーゼ阻害剤などが適切である。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、ペプチダーゼ補因子である二価カチオンのキレーターとして有用である。
【０１４８】
本発明の医薬を調製する際に、さまざまな製剤改良物質を使用し、操作して、薬物動態および生体内分布を変化させることができる。薬物動態および生体内分布を改変するための多くの方法が当業者に公知である。このような方法の例としては、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム、下記参照）、炭水化物、または合成ポリマー（上記）などの物質から構成されるビヒクルにおける本発明の組成物の保護が挙げられる。薬物動態の一般的な考察については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、３７−３９章を参照されたい。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、投与方法に応じてさまざまな単位剤形で投与することができる。典型的な調節性医薬組成物の投薬量は、当業者に周知である。このような投薬量は、典型的には事実上助言的であり、特定の治療状況、患者の忍容性などに応じて調整される。これを達成するのに適切な調節剤の量は、「治療有効用量」と定義される。この使用に有効な投薬スケジュールおよび量、すなわち「投薬レジメン」は、疾患または状態の段階、疾患または状態の重篤度、患者の一般的健康状態、患者の身体的状態、年齢、医薬製剤および活性薬剤の濃度などを含むさまざまな要因に依存する。患者のための投薬レジメンを計算する際に、投与様式も考慮される。投薬レジメンはまた、薬物動態、すなわち医薬組成物の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮しなければならない。例えば、最新のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ｅｇｌｅｔｏｎ（１９９７）「Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ」Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：１４３１−１４３９；Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい。
【０１５０】
注射可能な使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液および滅菌注射液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられ、またはクリームもしくは局所適用に適した他の形態であってもよい。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと思われる。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物での使用によってもたらされ得る。
【０１５１】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙したさまざまな他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、必要に応じてその後濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、さまざまな滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上記のもののうち必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を、予め滅菌濾過したこれらの溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【実施例】
【０１５２】
本発明を、以下の限定されない実施例を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【０１５３】
乳癌における転移サプレッサーとしてのＩ型ＩＦＮ
４７９人の患者のコホートにおける原発腫瘍のＩＲＦ９発現の測定により、トリプルネガティブ乳癌サブタイプにおいて発現が有意に減少することが明らかにされた。トリプルネガティブ乳癌腫瘍の１０−１５％のみがＩＲＦ９の発現を保持し、これは非常に良好な転帰と関連していた（図１）。実際、Ｉｒｆ９発現の喪失は転移のリスクが８倍高く、ＩＲＦ９の原発腫瘍発現を保持したトリプルネガティブ乳癌患者で転移はほとんど観察されなかった（図１）。
【０１５４】
ＩＦＮ受容体Ｉｆｎａｒ１の喪失（Ｉｆｎａｒ１−／−マウスを使用）は、自発性ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ  Ｃ５７  Ｂｌ／６モデルならびに６６ｃｌ４および４Ｔ１同所性ＢＡＬＢ／ｃモデルにおいて転移を加速する（図２）。このデータは、Ｉ型ＩＦＮ駆動転移抑制が、腫瘍細胞の内因性シグナル伝達によって開始される抗腫瘍免疫応答によって駆動されることを示唆している。この点において、ＮＫ特異的腫瘍細胞傷害性におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達の重要な要件である（図３）。
【０１５５】
ＩＦＮシグナル伝達の変化は、ＮＫ細胞駆動腫瘍細胞傷害性に影響する
トリプルネガティブ乳癌のモデルを用いて得られたデータは、ＮＫ細胞抗腫瘍応答におけるＩＦＮシグナル伝達の重要な役割を裏付ける。ナイーブマウス（図３Ａ、Ｂ）と比較して、４Ｔ１細胞を保有するマウスは末梢血中のＮＫ細胞の蓄積および活性化を上昇させ、Ｒａｅ１などのストレスリガンドを発現し、ＭＨＣクラスＩ発現が低下したこれらの腫瘍系統に対する先天性免疫応答を示唆している。ＷＴおよびＩｆｎａｒ１−／−マウスにおいてＮＫ細胞活性化を比較すると、ＣＤ６９およびＩＦＮγ発現ＮＫ細胞の数の有意な減少が観察され、ＩＦＮシグナル伝達が腫瘍特異的ＮＫ細胞の活性化および機能において重要な役割を果たし（図３）、４Ｔ１腫瘍細胞は、ＮＫ細胞媒介殺傷に感受性であり、細胞傷害性はインタクトなＩ型ＩＦＮシグナル伝達に依存していることを示唆している（図３Ｃ）。
【実施例２】
【０１５６】
トリプルネガティブ乳癌患者の予後良好および予後不良群への階層化は、現在非常に困難である。ある割合の患者は転移性疾患を非常に迅速に発症し、この乳癌サブタイプに現在利用可能な非標的化治療法には応答しない。免疫浸潤およびストレスシグナルとの関連を含む、トリプルネガティブ乳癌におけるＩＲＦタンパク質の予後の可能性と、早期および後期両方の治療設定においてＩＦＮ誘発免疫を刺激することを目的とする療法の有効性の試験を行う。
【０１５７】
トリプルネガティブ乳癌の独立したコホートにおけるＩＲＦ発現と、予後および免疫浸潤および機能との関係を試験する
図１のデータを生成するために使用された最初の乳癌コホートは、トリプルネガティブ乳癌サブタイプを有する５３人の患者を含んでいた。この分析は、１６３人の患者の原発腫瘍の独立したトリプルネガティブ乳癌コホートに拡大されている。ＩＲＦ７およびＩＲＦ９の発現を測定し、転移までの時間および乳癌特異的生存を含むパラメータと相関させた。ＩＲＦタンパク質の発現と、ＴＩＬならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む特異的免疫浸潤物とは相関があり、ＭＩＣＡ／ＢおよびＵＬＢＰ１−６などのＮＫ細胞ストレスリガンドの腫瘍細胞発現を測定し、ＩＲＦ発現および／または予後との相関を判定する。
【０１５８】
ａ）臨床病理学データおよびフォローアップ情報を有する１６０人のトリプルネガティブ乳癌患者由来の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の切片（ホルマリン固定、パラフィン包埋）を、図１のように、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いてＩＲＦ９およびＩＲＦ３／５／７について分析した。染色を、強度および頻度に関してスコア化する。次いで、スコアを発現の高低および不在に階層化し、診断から転移再発および乳癌特異的死亡までの時間に対する対数順位検定を介して群を比較する。
【０１５９】
ｂ）トリプルネガティブ乳癌コホート（上記のとおり）からのＨ＆Ｅ染色切片を、腫瘍内および間質のＴＩＬの評価を含めて、スコア化する。しかし、ＴＩＬの測定は、免疫細胞浸潤物の性質の機能的評価を可能にはしない。この理由のために、ＩＨＣを使用し、確立された抗体およびプロトコルを用いて、連続したＴＭＡ切片中のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＴｒｅｇ浸潤物を評価する（Ｃｉｍｉｎｏ−Ｍａｔｈｅｗｓ  Ａ，Ｙｅ  Ｘ，Ｍｅｅｋｅｒ  Ａ，Ａｒｇａｎｉ  Ｐ，Ｅｍｅｎｓ  ＬＡ．Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｔ  ｆｉｒｓｔ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｈａｖｅ  ｆｅｗｅｒ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｈａｎ  ｔｈｅｉｒ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ：ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１３；４４（１０）：２０５５−６３）。浸潤物を患者の転帰と比較し、ＩＲＦ９および７の発現との相関を評価する。
【０１６０】
ｃ）活性化ＮＫ細胞受容体および／またはＭＨＣクラスＩ分子の腫瘍細胞リガンドが、トリプルネガティブ乳癌コホートにわたって発現の変化を示すか、および／またはＩＲＦ発現または免疫浸潤物と相関するかどうかを試験するために、ＩＨＣを用いてＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡ／Ｂ，ＵＬＢＰ−１およびＵＬＢＰ２の腫瘍細胞発現を先行して記載されているように（ｄｅ  Ｋｒｕｉｊｆ  ＥＭ，Ｓａｊｅｔ  Ａ，ｖａｎ  Ｎｅｓ  ＪＧ，Ｐｕｔｔｅｒ  Ｈ，Ｓｍｉｔ  ＶＴ，Ｅａｇｌｅ  ＲＡら、ＮＫＧ２Ｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａｎ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２：２４）測定し、ならびにＤＮＡＭ１リガンドＣＤ１５５の腫瘍細胞発現を測定する。
【０１６１】
トリプルネガティブ乳癌細胞系および同系モデルにおけるＩｒｆ９ノックアウトの結果を試験する
ｂａｌｂ／ｃ（６６ｃｌ４、４Ｔ１）およびＣ５７  Ｂｌ／６（ＥＯ７７１、ＰｙＭＴ）マウス細胞系においてＩｒｆ９の発現をノックアウトし、インビボでの腫瘍細胞増殖および同所性腫瘍成長および転移への影響を求める。腫瘍浸潤および循環免疫細胞における関連する変化、インビトロでの免疫エフェクター細胞に対する腫瘍細胞感受性への影響およびＩＦＮシグナル伝達のＮＫ細胞特異的喪失の影響を測定する。
【０１６２】
ａ）ＴＡＬＥＮ技術（Ｂｏｃｈ  Ｊ．ＴＡＬＥｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１１；２９（２）：１３５−６）を使用して、Ｉｒｆ９ノックアウト４Ｔ１細胞系を作製した（図５）。６６ｃｌ４、ＥＯ７７１およびＰｙＭＴ細胞系においてこれを繰り返す。Ｉｒｆ７がＳＴＡＴ１／２およびＩｒｆ９のＩＳＧＦ３複合体によって誘導されることを考えると、Ｉｒｆ９の喪失はＩｒｆ７の減少を直接もたらす可能性が高い。本発明者らはまた、これらの細胞においてＩｒｆ７を直接ノックアウトすることが可能である。
【０１６３】
Ｉｒｆ９の喪失の影響は、ＳＲＢアッセイを用いた細胞増殖において測定される。Ｉｒｆ９の転移への影響を測定するために、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＣ５７  Ｂｌ／６マウス（２０マウス／群）の第４乳腺に、インタクトまたはＩｒｆ９発現ノックアウト腫瘍細胞（１０００−１×１０５細胞）を注射する。肺、脊椎および大腿骨などの器官における原発腫瘍モニタリングおよび転移量の定量は、先行して記載されているように（Ｂｉｄｗｅｌｌ  ＢＮ，Ｓｌａｎｅｙ  ＣＹ，Ｗｉｔｈａｎａ  ＮＰ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｓ，Ｃａｏ  Ｙ，Ｌｏｉ  Ｓら、Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｒｆ７  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；１８（８）：１２２４−３１；Ｃａｏ  Ｙ，Ｓｌａｎｅｙ  ＣＹ，Ｂｉｄｗｅｌｌ  ＢＮ，Ｐａｒｋｅｒ  ＢＳ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＣＮ，Ｒａｕｔｅｌａ  Ｊら、ＢＭＰ４  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４；７４（１８）：５０９１−１０２；３２  Ｗｉｔｈａｎａ  ＮＰ，Ｂｌｕｍ  Ｇ，Ｓａｍｅｎｉ  Ｍ，Ｓｌａｎｅｙ  Ｃ，Ａｎｂａｌａｇａｎ  Ａ，Ｏｌｉｖｅ  ＭＢら、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２；７２（５）：１１９９−２０９；Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ＢＬ，Ｐａｒｋｅｒ  ＢＳ，ｖａｎ  Ｌａａｒ  ＲＫ，Ｒｅｓｔａｌｌ  ＣＭ，Ｎａｔｏｌｉ  ＡＬ，Ｔａｖａｒｉａ  ＭＤら、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＭＣＲ．２００５；３（１）：１−１３）生物発光イメージング、その後の組織学的検査（５匹のマウス／群）、またはリアルタイムｑＰＣＲ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００）およびＴａｑｍａｎ化学（１５匹のマウス／群）によって、腫瘍細胞中のチェリーまたはルシフェラーゼの、その器官の全細胞中に存在するビメンチン遺伝子に対する比率を比較して行う（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ＢＬ，Ｐａｒｋｅｒ  ＢＳ，ｖａｎ  Ｌａａｒ  ＲＫ，Ｒｅｓｔａｌｌ  ＣＭ，Ｎａｔｏｌｉ  ＡＬ，Ｔａｖａｒｉａ  ＭＤら、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＭＣＲ．２００５；３（１）：１−１３）．設定された時点での群間の原発腫瘍成長および転移量の差は、対応のないスチューデントｔ検定（データが正常に分布している場合）またはマン・ホイットニー順位和検定（Ｓｉｇｍａ−Ｓｔａｔ）を用いて試験する。無転移生存試験の場合、原発腫瘍を０．３〜０．４ｇに達した時点で切除し、転移の徴候が明白になるとマウスに最終的に麻酔をかける。単変量解析のために、カプラン−マイヤー曲線を作成し、対数順位検定と比較する。
【０１６４】
ｂ）免疫細胞サブセットの測定は、多色フローサイトメトリーを用いて行う。指定された時点で、末梢血、原発腫瘍ならびに肺および骨髄を含む器官を採取し、単一細胞懸濁液に処理した後、塩化アンモニウム赤血球溶解を行い、次いでＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋ＴＣＲβ−）、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＣＲβ＋）、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＴＣＲβ＋  Ｆｏｘｐ３＋／−ＣＤ２５＋／−）ならびにＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋Ｌｙ６Ｇ＋／−Ｌｙ６Ｃ＋／−）を検出するための抗体のパネルで染色する。ＮＫ細胞の活性化および機能を、ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１およびＩＦＮγの発現を測定することによって測定する。腫瘍細胞表面上に存在するＮＫ細胞リガンド（ＣＤ１５５、ＭＵＬＴ１、Ｒａｅ−１、Ｈ６０）またはＭＨＣクラスＩ分子（Ｈ２Ｄ（ｄ）、Ｈ２Ｋ（ｄ））に対する変化の分析のために、抗体のパネルを使用する（Ａｎｄｒｅｗｓ  ＤＭ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＬＣ，Ｂａｓｃｈｕｋ  Ｎ，Ｃｈａｎ  ＣＪ，Ｂｅｒｒｙ  Ｒ，Ｃｏｔｔｅｒｅｌｌ  ＣＬら、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｈ２−Ｍ３  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｙ４９Ａ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１３（１２）：１１７１−７；Ｃｈａｎ  ＣＪ，Ｍａｒｔｉｎｅｔ  Ｌ，Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ  Ｓ，Ｓｏｕｚａ−Ｆｏｎｓｅｃａ−Ｇｕｉｍａｒａｅｓ  Ｆ，Ｃｈｏｗ  ＭＴ，Ｔｏｗｎ  Ｌら、Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＤ９６  ａｎｄ  ＣＤ２２６  ｏｐｐｏｓｅ  ｅａｃｈ  ｏｔｈｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；１５（５）：４３１−８）。これにより、腫瘍内因性Ｉｒｆ９の喪失による免疫活性化および抑制の変化を同定することが可能になる。
【０１６５】
ｃ）Ｉｒｆ９喪失がＮＫ細胞の機能に及ぼす影響を試験するために、図３において実施するように、他に記載されているような細胞傷害性アッセイを使用する（Ｎｅｒｉ  Ｓ，Ｍａｒｉａｎｉ  Ｅ，Ｍｅｎｅｇｈｅｔｔｉ  Ａ，Ｃａｔｔｉｎｉ  Ｌ，Ｆａｃｃｈｉｎｉ  Ａ．Ｃａｌｃｅｉｎ−ａｃｅｔｙｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ：ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；８（６）：１１３１−５）。簡潔に述べると、ナイーブまたはポリ（Ｉ：Ｃ）により活性化された（２５０μｇ  Ｉ．Ｐ．４８時間）ＷＴまたはＩｆｎａｒ−／−動物由来の脾臓ＮＫ細胞を免疫磁気的に濃縮する。標的腫瘍細胞をカルセイン標識し、その後、４時間超にわたりさまざまな比率でＮＫ細胞と一緒に（または単独で）インキュベートして、カルセイン放出を蛍光定量する。
【０１６６】
ＮＫ細胞が腫瘍ＩＦＮ誘導性転移抑制の直接標的であるかどうかを試験するために、ａ）で概説した実験を、Ｉｆｎａｒ１をＮＫ細胞コンパートメント（ＮＫｐ４６−Ｃｒｅ−Ｉｆｎａｒ１）において選択的に欠損したマウスで実施する。
【０１６７】
トリプルネガティブ乳癌のモデルにおけるＩ型ＩＦＮベースの治療薬の影響および標的を測定する
腫瘍を有するマウスを、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）の安定した誘導体：現在臨床試験中であるポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（商標）、Ｏｎｃｏｖｉｒ）または組換えＩＦＮα１によって早期および後期治療の設定で処置し、免疫活性化および機能、原発腫瘍成長および転移に対するこのような処置の影響を測定する。次いで、トリプルネガティブ乳癌患者を治療するために一般的に使用される化学療法と併用して、治療上の付加価値を評価する。ＢＡＬＢ／ｃ（４Ｔ１、４Ｔ１．２）およびＣ５７  ＢＬ／６（ＥＯ７７１）同系腫瘍を有するマウスを、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＩＦＮα１により２つのアプローチを用いて処置する、１）原発腫瘍が触診可能になったら（だいたい３日目〜５日目）投与し、原発腫瘍の切除の日からその後転移を検出するまで処置を中止し、２）原発腫瘍（０．４ｇになったら）を切除し、生物発光によって転移量が認められたら、処置を開始する。
【０１６８】
ａ）トリプルネガティブ乳癌患者の現在の治療選択肢は、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｉｓｏｍｅｒａｓｅ）ＩＩ毒素であるドキソルビシンのような化学療法薬である。化学療法は、トリプルネガティブ乳癌を有する一部の患者に有効ではないだけでなく、ドキソルビシンなどの薬剤による治療は、以前に腫瘍細胞免疫原性の増加と関連していた。したがって、ポリ（Ｉ：Ｃ）とドキソルビシン化学療法との併用効果を試験する。腫瘍を有するマウスを、上記のようにポリ（Ｉ：Ｃ）を単剤として、または４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンと組み合わせて、静脈注射により週に２回処置する。
【０１６９】
ｂ）免疫細胞の蓄積、活性化および機能を療法の後で測定し、転移抑制が抗腫瘍免疫応答と関連するかどうかを判定する。これには、ＭＨＣクラスＩ分子およびＮＫＧ２Ｄリガンドの変化を含む、腫瘍浸潤および循環免疫エフェクターおよびサプレッサー細胞ならびに腫瘍細胞自体への変化の測定が含まれる。
【０１７０】
ＩＦＮベースの治療薬に対する応答の予測マーカーを評価する
Ｉｒｆ９を喪失した腫瘍がＮＫ細胞ストレスリガンドの発現を保持する場合、および活性ＩＦＮ経路の測定が全身的に治療応答の可能性を予測する場合、ＩＲＦ９が欠損した腫瘍を有するマウスにおいて転移を減少させるかどうかに関して、ポリ（Ｉ：Ｃ）療法を試験する。
【０１７１】
ａ）Ｉｒｆ９ノックアウト細胞系および対照４Ｔ１細胞系をポリ（Ｉ：Ｃ）により処理する。転移に対する影響は、上記の方法を用いて試験する。
【０１７２】
ｂ）Ｉｒｆ９ノックアウト細胞を、それらがＮＫＧ２ＤリガンドＲａｅ１、ＭＵＬＴ１およびＨ６０の細胞表面発現を保持するかどうかについて試験し、これらの活性化リガンドのバランスをＮＫ細胞阻害性（ｉｎｉｂｉｔｏｒｙ）ＭＨＣクラスＩ（Ｈ２Ｄ（ｄ）およびＨ２Ｋ（ｄ））タンパク質と比較する。細胞系を、フローサイトメトリーによってこれらの細胞表面タンパク質の発現について評価する。
【０１７３】
ｃ）全身的ＩＦＮ活性化を直接測定するために、血液サンプル中のリン酸化ＳＴＡＴ１を、Ｉｒｆ９発現が変化したマウスモデルまたはポリ（Ｉ：Ｃ）により処置したマウスモデルの両方から、ホスホフローサイトメトリーおよび抗マウス／ヒトｐＳＴＡＴ１抗体（ｐＹ７０１）を使用して測定する。
【０１７４】
当業者であれば、本明細書に記載された発明は、具体的に記載されたもの以外の変形および改良をしやすいことを理解するであろう。本発明は、このようなすべての変形および改良を含むことを理解するべきである。本発明はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または指示されたステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、ならびに前記ステップまたは特徴の任意の２以上のありとあらゆる組み合わせも含む。
ＢＩＢＬＩＯＧＲＡＰＨＹ
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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