(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドの合成方法、具体的には高含有量のグアニンモノマーを含むオリゴヌクレオチドの合成方法に関する。より詳細には、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせる方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの領域を含み、前記方法が、
（ｉ）カップリング溶液を生成する工程であって、前記カップリング溶液が、
（ａ）前記ヌクレオシドホスホロアミダイトと、
（ｂ）活性化試薬と、
（ｃ）１つ又は複数の溶媒であって、１つ又は複数の前記溶媒の１つがＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である、工程と、
（ｉｉ）前記カップリング溶液を、前記汎用担体、前記第一のヌクレオシド、又は前記伸長オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＭＦの容積が、前記１つ又は複数の溶媒の全容積の２５％に等しいか又はそれより高く、好ましくは３３％に等しいか又はそれより高く、更に好ましくは５０％に等しいか又はそれより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ又は複数の溶媒が、ＤＭＦ及びアセトニトリルを含むか、好ましくはそれらからなり、前記ＤＭＦのアセトニトリルに対する比率（ｖ／ｖ）が、１：３から３：１の間である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ又は複数の溶媒が、ＤＭＦ及びアセトニトリルからなり、前記ＤＭＦのアセトニトリルに対する比率（ｖ／ｖ）が、１：１である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ又は複数の溶媒が、厳密に１つの溶媒からなり、前記厳密に１つの溶媒がＤＭＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化試薬が、
（ａ）４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）；
（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；
（ｃ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；又は
（ｄ）５−（３，５−ビス−トリフルオロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化剤４２）
から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記カップリング溶液が、
（ａ）前記ヌクレオシドホスホロアミダイトと、
（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）である、前記活性化試薬と、
（ｃ）ＤＭＦである、厳密に１種類の溶媒と、
を含むか、好ましくはそれらからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のヌクレオシド及び／又は前記伸長オリゴヌクレオチドが、担体に固定される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記担体が、ポリスチレン担体であり、前記ポリスチレン担体が、ジビニルベンゼンによって架橋される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記担体が、リンカーを更に含み、前記リンカーが、次式Ｉによって、表され、
2018527311.tif 000006
式中、Ｘが、前記担体を表し、好ましくはＸが、ジビニルベンゼンによって架橋された前記ポリスチレン担体を表す、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも３０％のグアニンモノマーを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第一の領域と、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第二の領域とを含み、前記第一の領域が、前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置し、前記第二領域が前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）；
（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４）；
（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号５）；
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号６）；
（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）；
（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号８）；
（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号９）；
（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）；及び
（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１０）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１からなる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドの製造方法であって、前記方法が、
（ｉ）ヌクレオシドホスホロアミダイトを第一のヌクレオシドにカップリングさせる工程であって、前記カップリングが、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を含む、工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物を酸化することによって伸長オリゴヌクレオチドを生成する工程と、
（ｉｉｉ）ヌクレオシドホスホロアミダイトを、脱保護の後、工程（ｉｉ）の生成物にカップリングさせる工程であって、前記カップリングが、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を含む、工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の生成物を酸化することによって伸長オリゴヌクレオチドを生成すル工程と、
（ｖ）前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの配列を含むまで工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を繰り返す工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成方法、具体的には高含有量のグアニンモノマーを含むオリゴヌクレオチドの合成方法に関する。より詳細には、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ（「オリゴヌクレオチド」）並びにそれらの類似体は、大部分の分子生物学応用に用いられる。オリゴヌクレオチドの合成方法は、３０年超にわたって利用されてきており（Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２２７：２７−３４（１９７０）を参照）、現在でも最も一般的なオリゴヌクレオチドの合成方法は、ホスホロアミダイト化学を通して行われている（そのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２４：２４５−２４８（１９８３）；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ  ３．３．１−３．３．２０  （２０００）；米国特許第５，７５０，６６６号を参照されたい）。
【０００３】
ホスホロアミダイトの合成は、通常、３’−末端ヌクレオチドから開始し、５’−末端ヌクレオチドが結合するまで繰り返される４工程で構成される一連のサイクルを通して進行する。しかし、適切な立体構造の第一のヌクレオシド及びヌクレオシドホスホロアミダイトを選択することにより、５’−３’方向のホスホロアミダイト合成を確立させることは、当業者の通常技能の範囲内である。本明細書で開示される方法は、３’−５’方向の合成が一般に好ましい、両方向の合成に適用可能である。
【０００４】
この４工程は、脱保護、カップリング、キャッピング及び安定化（一般に酸化又は硫化）である。一変更形態では、脱保護工程中にレシピエントヌクレオチドの五炭糖の５’−炭素に結合したトリチル基が、ジクロロメタン又はトルエンなどの適切な溶媒中のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）又はジクロロ酢酸（ＤＣＡ）によって取り除かれ、反応性のヒドロキシル基を残す。次に、ホスホロアミダイトモノマーがカップリング工程で付加される。弱酸であるテトラゾールなどの活性化剤を用いて、カップリングヌクレオシドホスホロアミダイトと反応させ、テトラゾリルホスホロアミダイト中間体を形成する。この中間体は、次にこのレシピエントのヒドロキシル基と反応し、５’から３’への結合が形成される。このテトラゾールが再構成され、このプロセスが継続する。カップリングの失敗は、５’−末端上に反応性ヒドロキシル基をなおも有するオリゴヌクレオチドをもたらす。これらのオリゴヌクレオチドが次のサイクルに対して反応性のままとなる（ヌクレオチドが欠落したオリゴヌクレオチドを生成する）ことを防止するために、それらのオリゴヌクレオチドを、無水酢酸とＮ−メチルイミダゾールの混合物などのアセチル化試薬による不可逆的なキャッピングによって更なる合成から取り除く。この試薬は、オリゴヌクレオチドをキャッピングするために、遊離のヒドロキシル基のみと反応する。酸化工程において、この成長するオリゴヌクレオチドと直前に付加されたヌクレオチドの間のホスファイト結合は、典型的に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及び水中の穏和な酸化剤としてヨウ素の存在により安定化される。水は、酸素供与体として作用し、ヨウ素は、リンが結合した付加化合物を形成する。付加化合物は、水によって分解され、安定なホスホトリエステル結合を残す。
【０００５】
ホスホロアミダイト合成に対して、合成時間を減少し、高収率の生成物を生成するために多くの著しい改変が行われている。合成するために同様に追加の改変を必要とする改変ホスホロアミダイトモノマーが開発されている。
【０００６】
しかし、ある特定のオリゴヌクレオチドの合成では、いくつかの問題が依然として残っている。１つの課題は、グアニン（Ｇ）−リッチオリゴヌクレオチドの合成である。Ｇ−リッチ領域を有するオリゴヌクレオチドは、さまざまな応用にとって非常に有望である。Ｇ−リッチオリゴヌクレオチドは、一般的に、分子生物学及び医薬品において有用な応用を有する複雑な構造に折り畳まれる。密に充填された４本鎖構造（例えば、トロンビンアプタマー）に折り畳まれるさまざまなアプタマーが選択されている。核酸におけるＧ−リッチリピートは、ある特定の一価又はニ価の金属イオンの存在下で、さまざまな生物学的役割を有するこれらの４重鎖を形成する。（それぞれの全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｅｎｇら、ＰＮＡＳ（２００１），９８，１３６６５−１３６７０；Ｊｉｎら、ＰＮＡＳ（１９９２），８９，８８３２−８８３６；及びＬｅｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０），１８，６０５７−６０６０を参照されたい）。
【０００７】
特に連続するグアニン残基を有するグアニン（Ｇ）−リッチオリゴヌクレオチドの高品質合成は、おそらくカップリング工程において活性化ホスホロアミダイトが５’−ヒドロキシル基に近づきにくいために、達成することが困難である。特に、担体に結合して保護されたＧ−リッチオリゴマーは、ある特定の長さ又は基本的な組成物に到達した後、アセトニトリル中で何らかの凝集を起こすか又は溶解性の問題を有し、このことが、おそらく５’−ヒドロキシル基に近づきにくい原因となる。これは、例えば、１つ若しくは複数の末端グアニン（Ｇ）−残基などの１つ若しくは複数のヌクレオチドを欠損するオリゴヌクレオチド、又は１つ若しくは複数のグアニン（Ｇ）−残基などの１つ若しくは複数のヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドなどの不純物及び合成の失敗をもたらす。しかし、これらの不純物及び合成の失敗によって、これらの不純物の精製及び分離が難しいために所望の完全長生成物（ＦＬＰ）が減少し、ＦＬＰからの合成の失敗が起こる。
【０００８】
オリゴヌクレオチドの合成のための標準的な溶媒は、アセトニトリルである。しかし、国際公開第２００８／０７３９６０号は、オリゴヌクレオチドの合成方法、特にホスホロアミダイト化学を用いたＧ−リッチオリゴヌクレオチドの合成方法を提案し、極性非プロトン性溶媒などの代替溶媒の使用を示唆している。特にグアニンモノマーに富むオリゴマーの凝集又は溶解性の課題を改善するために、カップリング工程中のスルホランの使用が示唆されている。典型的に、スルホランは、オリゴマー、特にグアニン残基の含有量が高いオリゴマーに対してより良好な溶解性を提供するために、アセトニトリルとの１：１溶媒混合物中で用いられる。
【０００９】
国際公開第２００８／０７３９６０号は、不純物の量及び合成の失敗を減少させて、合成された粗Ｇ−リッチオリゴヌクレオチドの品質を改善することができたものの、依然として、この重要なクラスのオリゴヌクレオチドの合成を、特に不純物及び合成の失敗を減少することに関して、並びに所望のオリゴヌクレオチド生成物に対する純度及び収率に関して、更に改善する必要がある。
【００１０】
本発明者らは、今回、驚くべきことにホスホロアミダイト化学を用いたＧ−リッチオリゴヌクレオチドの合成に対して、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、好ましくはアセトニトリルとの溶媒混合物中で、更に好ましくは単独の溶媒として使用することによって、不純物及び合成の失敗を減少するだけでなく、更に、高純度及び高収率の合成オリゴヌクレオチドが得られることを見出した。特に、本発明の方法を用いて得られた粗オリゴヌクレオチドの品質がより良好であることにより、この粗製物の精製が容易となり、したがって、高純度及び高収率の合成オリゴヌクレオチドが得られる。このため、本発明の方法は、より大規模の製造を可能にするだけでなく、オリゴヌクレオチドが、治療上の使用を含む薬学的使用のために意図される場合、本発明の方法は、特に重要である。
【００１１】
したがって、第一の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせる方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの領域を含み、前記方法が、（ｉ）カップリング溶液を生成する工程であって、前記カップリング溶液が、（ａ）前記ヌクレオシドホスホロアミダイトと、（ｂ）活性化試薬と、（ｃ）１つ又は複数の溶媒とを含み、前記１つ又は複数の溶媒の１つが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であり、好ましくは前記ＤＭＦの容積が、前記１つ又は複数の溶媒の全容積の２５％に等しいか又はそれより高く、更に好ましくは３３％に等しいか又はそれより高く、及びなお更に好ましくは５０％に等しいか又はそれより高い、工程と、（ｉｉ）前記カップリング溶液を前記汎用担体、前記第一のヌクレオシド、又は前記伸長オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
を含む方法を提供する。
【００１２】
特に、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるために、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、好ましくはアセトニトリルとの溶媒混合物中で、更に好ましくは単独の溶媒として使用することが、大いに有益であることが見出されている。
【００１３】
本発明の理論に束縛されるものではないが、ＤＭＦは、Ｇ−リッチオリゴヌクレオチドによって典型的に形成される４重鎖構造の形成を回避すると予想され、したがって鎖伸長の際に次のアミダイトのカップリングを容易にすると考えられている。凝集を軽減することに加えて、本発明の方法は、グアニンモノマーに富むオリゴヌクレオチドに対してより良好な溶解性を提供すると考えられている。
【００１４】
第二の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法であって、本発明の前記第一の態様に従って、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるために、本明細書に記載される方法のうちのいずれか一つを含む、方法を提供する。
【００１５】
第三の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法であって、前記方法が、（ｉ）ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体又は第一のヌクレオシドにカップリングさせる工程であって、前記カップリングが、本発明の前記第一の態様に従って、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、第一のヌクレオシドにカップリングさせるために、本明細書に記載される方法のうちのいずれか一つを含む、工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物を酸化することによって伸長オリゴヌクレオチドを生成する工程と、（ｉｉｉ）脱保護の後、ヌクレオシドホスホロアミダイトを工程（ｉｉ）の生成物にカップリングさせる工程であって、前記カップリングが、本発明における前記第一の態様の方法を含む、工程と、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の生成物を酸化することによって伸長オリゴヌクレオチドを生成する工程と、（ｖ）前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの配列を含むまで工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）を繰り返す工程と、を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の更なる態様及びその好ましい実施形態は、本明細書が進行するにつれて明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての科学用語及び専門用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。
【００１８】
「オリゴヌクレオチド」本明細書で用いられるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ又はそれ超のヌクレオチド、好ましくは６から２００ヌクレオチド、更に好ましくは１０から１００、及び更により好ましくは２０から約１００ヌクレオチド、更により好ましくは２０から５０、及びなお更に好ましくは２０から４０ヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。非常に好ましくはオリゴヌクレオチドは、約３０ヌクレオチドを含み、より好ましくはオリゴヌクレオチドは、厳密に３０ヌクレオチドを含み、最も好ましくはオリゴヌクレオチドは、厳密に３０ヌクレオチドからなる。更に好ましいオリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであり、好ましくは、（ａ）非改変ＲＮＡ又は非改変ＤＮＡ、及び（ｂ）改変ＲＮＡ又は改変ＤＮＡから選択される。改変は、当業者に公知の骨格又はヌクレオチド類似体を含み得る。好ましいヌクレオチド改変／類似体は、ホスホロチオエート改変又はアルキルホスホロチオエート改変である。ホスホジエステル結合ヌクレオチドのみからなる非改変オリゴヌクレオチドに加えて、ホスホロチオエート化ヌクレオチドは、細胞又は生物での分解から保護され、したがって好ましいヌクレオチド改変である。更に、ホスホジエステル結合ヌクレオチド及びホスホロチエート化ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが包含される。本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的に及び好ましくは一本鎖デオキシリボヌクレオチドを意味する。典型的に、オリゴヌクレオチドは、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの領域を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個連続するグアニンモノマーの第一の領域を含み、本明細書において好ましくは前記第一の領域は、前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置する。更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個連続するグアニンモノマーの第二の領域を含み、好ましくは前記第二の領域は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％のグアニンモノマーを含む。更に好ましいオリゴヌクレオチドは、以下に定義される少なくとも１つのポリＧ鎖を含む。より好ましいオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の前記ポリＧ鎖を含む。非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、厳密に２つのポリＧ鎖を含み、好ましくは前記２つのポリＧ鎖の１つは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端に位置する。更により好ましいオリゴヌクレオチドは、厳密に２つのポリＧ鎖を含み、前記２つのポリＧ鎖の１つが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、前記２つのポリＧ鎖の１つが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは１、２、３又は４つのＣｐＧモチーフを含む非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。より一層好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは前記パリンドローム配列は、少なくとも１つ、好ましくは１、２、３又は４つのＣｐＧモチーフを含む。より一層好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは前記パリンドローム配列は、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）を含むか、又は好ましくはそれからなる。より一層好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、前記パリンドローム配列は、その５’末端でポリＧ鎖に隣接し、前記パリンドローム配列は、その３’末端でポリＧ鎖に隣接し、好ましくは前記パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号：２）である。非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、前記パリンドローム配列は、その５’末端で少なくとも３から１０、好ましくは４から１０のグアノシン単位に隣接し、前記パリンドローム配列は、その３’末端で少なくとも３から１０、好ましくは４から１０のグアノシン単位に隣接し、好ましくは前記パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）である。
【００１９】
「ポリＧ鎖」：本明細書で用いられる、用語「ポリＧ鎖」は、少なくとも３連続グアノシン残基からなるオリゴヌクレオチドのセグメントを意味する。好ましいポリＧ鎖は、３から２５、好ましくは４から２０、より好ましくは４から１５及び最も好ましくは４から１０個連続するグアノシン単位からなる。更に好ましいポリＧ鎖は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個連続するグアノシン単位からなる。
【００２０】
「ＣｐＧモチーフ」：本明細書で用いられる、用語「ＣｐＧモチーフ」は、少なくとも１つの非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチドを含有するオリゴデオキシヌクレオチドを意味し、好ましくは、前記ＣＧジヌクレオチドはホスホジエステル結合している。
【００２１】
「非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」：本明細書で用いられる、用語「非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」又は「ＣｐＧ」は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチドを意味する。好ましくは、ＣｐＧは、３’にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含有する一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、前記非メチル化シトシン及び前記グアノシンは、リン酸結合によって連結し、好ましくは前記リン酸結合は、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合であり、更に好ましくは前記リン酸結合は、ホスホジエステル結合である。
【００２２】
第一の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせる方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの領域を含み、前記方法が、（ｉ）カップリング溶液を生成する工程であって、前記カップリング溶液が、（ａ）前記ヌクレオシドホスホロアミダイトと、（ｂ）活性化試薬と、（ｃ）１つ又は複数の溶媒とを含み、前記１つ又は複数の溶媒の１つが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である、工程と、（ｉｉ）前記カップリング溶液を、前記汎用担体、前記第一のヌクレオシド、又は前記伸長オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、
を含む方法を提供する。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記ＤＭＦの容積は、前記１つ又は複数の溶媒の全体積の２５％に等しいか又はそれより高く、好ましくは３３％に等しいか又はそれより高い。別の好ましい実施形態では、前記ＤＭＦの体積は、前記１つ又は複数の溶媒の全容積の５０％に等しいか又はそれより高い。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、前記１つ又は複数の溶媒は、アセトニトリルを更に含み、前記アセトニトリルの体積は、前記１つ又は複数の溶媒の全容積の７５％より低いか又は多くてそれに等しく、好ましくは６７％より低いか又は多くてそれに等しく、更に好ましくは５０％より低いか又は多くてそれに等しい。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、前記１つ又は複数の溶媒は、ＤＭＦ及びアセトニトリルを含み、好ましくはそれらからなり、前記ＤＭＦのアセトニトリルに対する比率（ｖ／ｖ）は、１：３から３：１の間である。別の好ましい実施形態では、前記１つ又は複数の溶媒は、ＤＭＦ及びアセトニトリルからなり、前記ＤＭＦのアセトニトリルに対する比率（ｖ／ｖ）は、１：１である。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、前記ＤＭＦの容積は、前記１つ又は複数の溶媒の全容積の６７％に等しいか又はそれより高く、好ましくは７５％に等しいか又はそれより高く、更に好ましくは９０％に等しいか又はそれより高い。
【００２７】
非常に好ましい実施形態では、前記１つ又は複数の溶媒は、ＤＭＦである、厳密に１つの溶媒からなる。このため、非常に好ましい実施形態では、前記カップリング溶液は、ＤＭＦである、厳密に１つの溶媒を含む。好ましくは、前記ＤＭＦは、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、なおより好ましくは少なくとも９９．５％、及びなおより好ましくは少なくとも９９．８％の純度を有する。
【００２８】
適切な活性化剤は、当業者に公知であり、例えば、それぞれが参考として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０３１，０９２号及び米国特許第６，４７６，２１６号に記載されている。好ましい実施形態では、前記活性化試薬は、（ａ）４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）；（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；（ｃ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；又は（ｄ）５−（３，５−ビス−トリフルオロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化剤４２）から選択される。別の好ましい実施形態では、前記活性化試薬がは（ａ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）；（ｂ）５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）；又は（ｃ）５−（３，５−ビス−トリフルオロメチル）フェニル−１Ｈ−テトラゾール（活性化剤４２）から選択され、好ましくは前記活性化試薬は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）である。別の好ましい実施形態では、前記活性化試薬は、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）又は５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）である。非常に好ましい実施形態では、前記活性化試薬は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）である。なお非常に好ましい実施形態では、前記カップリング溶液は、（ａ）前記ヌクレオシドホスホロアミダイト；（ｂ）５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）である前記活性化試薬、；及び（ｃ）ＤＭＦである、厳密に１つの溶媒、を含み、好ましくはそれらからなる。別の好ましい実施形態では、前記カップリング溶液中の前記活性化試薬の濃度は、０．０５から０．９０Ｍであり、好ましくは前記カップリング溶液中の前記活性化試薬の濃度は、０．４０から０．８０Ｍである。
【００２９】
更に好ましい実施形態では、前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシドホスホロアミダイトの濃度は、少なくとも０．０３Ｍであり、好ましくは前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシドホスホロアミダイトの濃度は、０．０３から０．６０Ｍであり、更に好ましくは前記カップリング溶液中の前記ヌクレオシドホスホロアミダイトの濃度は、０．０３から０．３０Ｍである。
【００３０】
更に好ましい実施形態では、前記第一のヌクレオシド及び／又は前記伸長オリゴヌクレオチドは、担体上で固定され、好ましくは、前記担体は、（ａ）ポリマー担体、好ましくはポリスチレン担体；及び（ｂ）シリカ担体、好ましくは多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））担体から選択される。更に好ましい実施形態では、前記第一のヌクレオシド及び／又は前記伸長オリゴヌクレオチドは、担体上で固定され、好ましくは、前記担体は、（ａ）ポリスチレン担体；及び（ｂ）シリカ担体、好ましくは多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））担体から選択される。いくつかのポリマービーズ担体は、それぞれの全体が本明細書に組み込まれる、以下の特許において開示される。：米国特許第６，０１６，８９５号；米国特許第６，０４３，３５３号；米国特許第６，３００，４８６号；米国特許第８，５４１，５９９号；及び米国特許第８，１５３，７２５号Ｂ２。
【００３１】
非常に好ましい実施形態では、前記担体はポリスチレン担体である。更に非常に好ましい実施形態では、前記担体は、ジビニルベンゼンによって架橋されたポリスチレン担体であり、好ましくは前記ポリスチレン担体は、官能性ヒドロキシル基によって特徴づけられ、；更に好ましくは前記ポリスチレン担体は、約８０から９０μｍの平均粒子サイズを有する。前記担体は、当業者に公知である。本発明に関してこれらの好ましい担体の１つは、日東電工株式会社（Ｎｉｔｔｏ  Ｄｅｎｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ固相担体である。これらは、本発明において提供される実施例に使用されている。
【００３２】
かかる担体は、当該技術分野において一般に用いられ、典型的に及び好ましくはリンカーを更に含み、典型的に及び好ましくはスクシナート−リンカー又はスクシナート部分を含むリンカーである。したがって、本発明の好ましい実施形態では、前記担体は、リンカーを更に含み、好ましくは前記リンカーは、スクシナート部分を含む。
【００３３】
非常に好ましい実施形態では、担体は、次式Ｉによって表されるリンカーであって
2018527311.tif 000002
式中、Ｘが、前記担体を表し、式中、好ましくはＸが、ジビニルベンゼンによって架橋された前記ポリスチレン担体を表す、
リンカーを含む。
【００３４】
非常に好ましい実施形態では、前記担体は、リンカーを更に含み、前記担体は、ポリスチレン担体であり、前記ポリスチレン担体は、ジビニルベンゼンによって架橋され、及び前記リンカーは、次式Ｉによって表され、式中、Ｘが、ジビニルベンゼンによって架橋された前記ポリスチレン担体を表す。前記リンカーを有する非常に好ましい前記担体は、２００から４００μｍｏｌ／ｇの好ましいローディング量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が可能である。実施例の章で用いられる前記リンカーを有する前記担体（ＮＰＨＬ２５０）は、更に非常に好ましく、リンカーを有する前記担体は、２５０μｍｏｌ／ｇのローディング量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が可能である。これらの非常に好ましい担体とリンカーの組合せは、９２０５８  カリフォルニア州  オーシャンサイド（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ）のＫｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．から市販されており、名称はＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（商標）  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ＆ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）固相担体である。
【００３５】
オリゴマーの固相合成用のさまざまなリンカーが記載され、当業者に公知である。本発明の好ましいリンカー及び担体とリンカーの組合せは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、国際公開第２００５／０４９６２１号に開示される。更に、これらのリンカー及び担体／リンカーの組合せの合成は、また国際公開第２００５／０４９６２１号にも記載される。
【００３６】
この担体とリンカーの組合せに加えて、当業者に公知の合成プライマーは、典型的に、実際に合成されるオリゴヌクレオチドの配列に応じて適切なヌクレオシドを含み得る。これらの合成プライマーは、典型的に、適切な前記ヌクレオシドを、前記リンカーを通して前記担体に共有結合により連結することによって調製される。多数の前記合成プライマーは、市販品を購入することもできる。
【００３７】
好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのポリＧ鎖を含む。別の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％のグアニンモノマーを含む。更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも４０％のグアニンモノマーを含む。別の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも５０％のグアニンモノマーを含む。
【００３８】
更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第一の領域を含有する。更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第一の領域を含有する。更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第一の領域を含有する。別の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個連続するグアニンモノマーの第一の領域を含む。好ましくは、前記第一の領域は、前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置する。
【００３９】
更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第二の領域を含有する。更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第二の領域を含有する。更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第二の領域を含有する。別の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個連続するグアニンモノマーの第二の領域を含む。好ましくは、前記第二の領域は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第一の領域と、３つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第二の領域とを含み、前記第一の領域は、前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置し、前記第二領域は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、４つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第一の領域と、４つ又はそれ超連続するグアニンモノマーの第二の領域とを含み、前記第一の領域は、前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に位置し、前記第二の領域は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に位置する。
【００４２】
更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、１０から５０、好ましくは２０から４０、及び最も好ましくは３０ヌクレオチドモノマーを含む。
【００４３】
更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは前記パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）である。別の好ましい実施形態では、前記パリンドローム配列は、その５’−末端で少なくとも４個及び多くて２０、好ましくは多くて１０個のグアノシン単位に隣接する。別の好ましい実施形態では、前記パリンドローム配列は、その３’−末端で少なくとも４及び最大で２０、好ましくは多くて１０のグアノシン単位に隣接する。
【００４４】
更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、：（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣ  ＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴ  ＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４）；（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号５）；（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧ  ＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧ  ＧＧ（配列番号６）；（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣ  ＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ  ＧＧＧＧ（配列番号７）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡ  ＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧ  ＧＧＧＧＧＧ（配列番号８）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ  ＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号９）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ  ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）；及び（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＣＧ  ＡＣＧＡＣＧＡＴ  ＣＧＴＣＧＴＣＧ  ＧＧＧＧＧＧ（配列番号１０）からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含むか又は好ましくはそれらからなる。非常に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１を含むか又は好ましくはそれからなる。更に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０である。
【００４５】
更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドであり、好ましくは前記デオキシヌクレオチドは、ホスホジエステル結合モノマーのみからなる。より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１を含むか好ましくはそれからなり、前記オリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドであり、前記デオキシヌクレオチドは、ホスホジエステル結合モノマーのみからなる。
【００４６】
更なる態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法であって、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを、汎用担体、第一のヌクレオシド、又は伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるために、本明細書に記載される方法のうちのいずれか一つを含む、方法に関する。
【００４７】
更なる態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法であって、（ｉ）ヌクレオシドホスホロアミダイトを第一のヌクレオシドにカップリングさせる工程であって、前記カップリングが、オリゴヌクレオチドの合成の際にヌクレオシドホスホロアミダイトを第一のヌクレオシドにカップリングさせるために、本明細書に記載される方法のうちのいずれか一つを含む工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）の生成物を酸化することによって伸長オリゴヌクレオチドを生成する工程と、（ｉｉｉ）典型的に及び好ましくは脱保護の後、工程（ｉｉ）の生成物にヌクレオシドホスホロアミダイトをカップリングさせる工程であって、前記カップリングが、オリゴヌクレオチドの合成の際に、ヌクレオシドホスホロアミダイトを伸長オリゴヌクレオチドにカップリングさせるために、本明細書に記載される方法のうちのいずれか一つを含む工程と、；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の生成物を酸化することによって伸長オリゴヌクレオチドを生成する工程と、（ｖ）前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの配列を含むまで工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）を繰り返す工程とを含む、方法に関する。
【００４８】
好ましい実施形態では、前記方法は、変性条件下で前記オリゴヌクレオチドを精製する工程を更に含み、好ましくは前記変性条件は、１０から１４のｐＨ、好ましくは１０から１３のｐＨ、より好ましくは約１２のｐＨ、最も好ましくは１２のｐＨによって特徴づけられる。
【００４９】
更に好ましい実施形態では、前記方法は、１０から１４のｐＨ、好ましくは１０から１３のｐＨ、より好ましくは約１２のｐＨ、最も好ましくは１２のｐＨで前記オリゴヌクレオチドを精製する工程を更に含む。
【００５０】
更に好ましい実施形態では、前記精製は、陰イオン交換クロマトグラフィによって実施され、好ましくは前記陰イオン交換クロマトグラフィは、第四級アミン基で官能化された陰イオン交換マトリックスを用いて実施され、更に好ましくは前記陰イオン交換マトリックスは、ポリスチレン、ポリスチレン／ジビニルベンゼン又はポリメタクリレートから選択される材料で構成され、更に一層好ましくは前記材料は、ポリスチレン／ジビニルベンゼンである。
【００５１】
更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記第一のヌクレオシドに関して少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、なお好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも３０％のモル収率で生成される。
【００５２】
更に好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００５３】
本明細書に開示される本発明の方法は、オリゴヌクレオチド、特に例えばポリ−Ｇが隣接する非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどのＧ−リッチオリゴヌクレオチドの大規模合成に適している。かかる化合物は、特に薬学的応用に用いられる。
【００５４】
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含むすべての参照は、あたかもそれぞれの参照が、参照として組み込まれることを個別にかつ具体的に示され、本明細書にその全体が記述されることと同程度に参照として本明細書に組み込まれる。
【００５５】
記述する本発明の文脈内において、用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その」及び類似の言及の使用は、（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）本明細書でそれ以外であると示されている場合を除き、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の双方を含むと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に記載のない限り、制約のない用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書において値の範囲に関する記述は、本明細書でそれ以外であると示されている場合を除き、ただ単にこの範囲に含まれるそれぞれの分離した値を個別に指す短縮方法としての役割を有すると意図され、それぞれの分離した値は、あたかもその値が、個別に本明細書に記述されるがごとく、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書でそれ以外であると示されている場合を除き又は本文と明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書で提供される、任意の及びすべての実施例、又は例示的な言語の使用（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）は、特に主張しない限りただ単に本発明をより明らかにすると意図され、本発明の範囲について制限を課すものではない。本明細書におけるいかなる表現も、請求されていない要素を、本発明の実践に必須であるとして示すものと解釈すべきではない。
【００５６】
以下の実施例は、本発明を更に示すが、当然ながら、その範囲を制限するものとなんら解釈されるべきではない。
【００５７】
実施例
以下の実施例は、本発明を更に示すが、その範囲を制限するものとなんら解釈されるべきではない。
【００５８】
以下の略称は、特にこの実施例の章及び本明細書全体を通して用いられている。
ＡＣＮ            アセトニトリル
ＣＮＥＴ          シアノエチル保護基
ＣＶ              カラム容積
ＤＣＡ            ジクロロ酢酸
ＤＣＩ            ジシアノイミダゾール
ＤＥＡ            ジエチルアミン
ＤＭＦ            ジメチルホルムアミド
ｅｑ              当量
ＥＴＴ            ３−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール
ＦＬＰ            完全長生成物
ＨＰＬＣ          高速液体クロマトグラフィ
ＮＭＩ            Ｎ−メチルイミダゾール
ＮＰＨＬ  ２５０  Ｎｉｔｔｏｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｌｏａｄｅｄ  ｕｎｙｌｉｎ  ｋｅｒ  ２５０
ＯＤ              光学密度
ＴＢＡ            Ｔｅｒｔ−ブチルアミン
ＵＶ              紫外線
【００５９】
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をアクロスオーガニクス（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のブランド）から購入し、純度は９９．８％であった。Ｎｉｔｔｏｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｌｏａｄｅｄ  ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ  ２５０（ＮＰＨＬ  ２５０）をカリフォルニア州  オーシャンサイド（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ）のＫｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【００６０】
実施例１
本実施例は、さまざまな溶媒と共溶媒の組合せの存在下でのオリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）の合成を記載する。本実施例は、ＡＣＮ／ＤＭＦの溶媒混合物及び純粋なＤＭＦが、完全長生成物の純度の点でＡＣＮ／スルホランより優れていることを証明する。本実施例は、更に純粋なＤＭＦが、オリゴヌクレオチドの全収率の点でＡＣＮ／ＤＭＦより優れていることを証明する。
【００６１】
活性化剤としてＤＣＩを用いたＡＣＮ／スルホラン中の合成
本実施例は、固相合成担体としてＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ  ２５０（ＮＰＨＬ  ２５０）を用いた、Ａｋｔａ  １００  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ上における、１．５１ｍｍｏｌのオリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）の脱トリチル化合成を記載する。ＡＣＮ／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中で膨潤させた５７．７ｍｌの合成担体（担体密度：０．１０９ｇ／ｍｌ）を合成カラム（カラム直径３．５ｃｍ、カラム高さ６ｃｍ）に充填し、ＡＣＮ（６４．１ｍｌ／分、２ＣＶ）を用いた合成前洗浄の後、以下の合成サイクルを用いた。：（１）トルエン中のＤＣＡを用いた脱トリチル化（第一サイクル：トルエン中１０％のＤＣＡ、３２．９ｍｌ／分；後続サイクル：トルエン中の３％のＤＣＡ、６４．１ｍｌ／分；２ＣＶ）、続いてＡＣＮによる洗浄（３２．１ｍｌ／分で２ＣＶ及び６４．１ｍｌ／分で２ＣＶ）；（２）ＡＣＮ／スルホランを用いたコンディショニング（１：１ｖ／ｖ；３２．９ｍｌ／分、１．５ＣＶ）；（３）カップリング（活性化剤：ＡＣＮ／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中の０．７ＭのＤＣＩ；デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（２．０ｅｑ／担体）：ＡＣＮ／スルホラン（１：１ｖ／ｖ）中の０．２Ｍ；充填容積：３０．２ｍｌ（１５．１ｍｌアミダイト＋１５．１ｍｌ活性化剤）、充填流速：５３．１ｍｌ／分；押出し容積：８ｍｌ、押出し流速：５３．１ｍｌ／分；再利用時間：１０分、再利用流速：４８．１ｍｌ／分）、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、６４．１ｍｌ／分）；（４）０．２ＣＶのＣａｐＡ（ＮＭＩ／ピリジン／ＡＣＮ、２：３：５ｖ／ｖ／ｖ）／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶ（ｖ／ｖ）の１：１ＣａｐＡ／ＣａｐＢ（イソ酪酸無水物／ＡＣＮ１：１ｖ／ｖ）を用いた酸化前キャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１７．３ｍｌ／分、押出し容積：１．１ｍｌ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：６４．１ｍｌ／分；（５）０．５ＣＶのＣａｐＡを用いた酸化前押出し（３４．８ｍｌ／分）；（６）ピリジン／水（９：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭのＩ２（３ｅｑ）を用いた酸化、充填容積：９０．６ｍｌ、接触時間：２．６分、充填／押出し流速：３４．８ｍｌ／分、酸化押出し容積：１．１ＣＶ、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、６４．１ｍｌ／分）；（７）１．５ＣＶのＡＣＮ／スルホランを用いたキャッピング前コンディショニング（１：１ｖ／ｖ、３２．９ｍｌ／分）；（８）０．２ＣＶのＣａｐＡ／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶの１：１（ｖ／ｖ）ＣａｐＡ／ＣａｐＢを用いたキャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１７．３ｍｌ／分、押出し容積：１．１ＣＶ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：６４．１ｍｌ／分。２ＣＶのＡＣＮ（６４．１ｍｌ／分）を用いた最後のカラム洗浄及び最後の脱トリチル化の後、このＣＮＥＴ保護基をＡＣＮ中の２０％のＤＥＡを用いてこのホスホジエステル結合から取り除いた（５ＣＶ、接触時間１０分、続いて４ＣＶのＡＣＮを用いて洗浄（９６．２ｍｌ／分））。振とう台上のボトル内で、５０°Ｃで４ＣＶ以上の２８から３０％のアンモニアを用いて、２４時間以上処理することによって、開裂及び脱保護を行い、続いて、４０ＯＤ��ｍｌ未満のＵＶ読み取りが得られるまで、それぞれ１ＣＶの水での洗浄工程を繰り返す。
【００６２】
２６０ｎｍでの吸光度測定によってＯＤを決定した。オリゴヌクレオチドの収率（ＯＤ／μｍｏｌ）を表１に示す。
【００６３】
粗オリゴヌクレオチドの純度を決定するために陰イオン交換分析をＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  システムを用いて、３０°ＣでＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００の４ｘ２５０ｍｍのカラム上で実施した。サンプルをＨＰＬＣ緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＯＨ）中で６．２５ＯＤ／ｍｌとなるように希釈し、その２０μｌをカラムに注入し、２５から４０％のＨＰＬＣ緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ、４０％のメタノール）の勾配を５分間用いて、続いて４０から５５％の緩衝液Ｂの勾配を３５分間用いて、１ｍｌ／分の流速で分離した。完全長生成物（％）を表１に示す。
【００６４】
活性化剤としてＤＣＩを用いたＡＣＮ／ＤＭＦ中の合成
本実施例は、固相合成担体としてＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ  ２５０（ＮＰＨＬ  ２５０）を用いた、Ａｋｔａ  １００  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ上における、１．５１ｍｍｏｌの配列番号１の脱トリチル化合成を記載する。ＡＣＮ／ＤＭＦ（１：１ｖ／ｖ）中で膨潤させた５７．７ｍｌの合成担体、（担体密度：０．１０９ｇ／ｍｌ）を合成カラム（カラム直径３．５ｃｍ、カラム高さ６ｃｍ）に充填し、ＡＣＮ（６４．１ｍｌ／分、２ＣＶ）を用いた合成前洗浄の後、以下の合成サイクルを用いた。：（１）トルエン中のＤＣＡを用いた脱トリチル化（第一サイクル：トルエン中１０％のＤＣＡ、３２．９ｍｌ／分；後続サイクル：トルエン中３％のＤＣＡ、６４．１ｍｌ／分；２ＣＶ）、続いてＡＣＮ洗浄（３２．１ｍｌ／分で２ＣＶ及び６４．１ｍｌ／分で２ＣＶ）；（２）ＡＣＮ／ＤＭＦを用いたコンディショニング（１：１ｖ／ｖ；３２．９ｍｌ／分、１．５ＣＶ）；（３）カップリング（活性化剤：ＡＣＮ／ＤＭＦ中の０．７ＭのＤＣＩ（１：１ｖ／ｖ）；デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（２．０ｅｑ／担体）：ＡＣＮ／ＤＭＦ（１：１ｖ／ｖ）中の０．２Ｍ；充填容積：３０．２ｍｌ（１５．１ｍｌアミダイト＋１５．１ｍｌ活性化剤）、充填流速：５３．１ｍｌ／分；押出し容積：８ｍｌ、押出し流速：５３．１ｍｌ／分；再利用時間：１０分、再利用流速：４８．１ｍｌ／分）、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、６４．１ｍｌ／分）；（４）０．２ＣＶのＣａｐＡ（ＮＭＩ／ピリジン／ＡＣＮ、２：３：５ｖ／ｖ／ｖ）／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶ（ｖ／ｖ）の１：１ＣａｐＡ／ＣａｐＢ（イソ酪酸無水物／ＡＣＮ１：１ｖ／ｖ）を用いた酸化前キャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１７．３ｍｌ／分、押出し容積：１．１ｍｌ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：６４．１ｍｌ／分；（５）０．５ＣＶのＣａｐＡを用いた酸化前押出し（３４．８ｍｌ／分）；（６）ピリジン／水（９：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭのＩ２（３ｅｑ）を用いた酸化、充填容積：９０．６ｍｌ、接触時間：２．６分、充填／押出し流速：３４．８ｍｌ／分、酸化押出し容積：１．１ＣＶ、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、６４．１ｍｌ／分）；（７）１．５ＣＶのＡＣＮ／ＤＭＦを用いたキャッピング前コンディショニング（１：１ｖ／ｖ、３２．９ｍｌ／分）；（８）０．２ＣＶのＣａｐＡ／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶの１：１（ｖ／ｖ）ＣａｐＡ／ＣａｐＢを用いたキャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１７．３ｍｌ／分、押出し容積：１．１ＣＶ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：６４．１ｍｌ／分。２ＣＶのＡＣＮ（６４．１ｍｌ／分）を用いた最後のカラム洗浄及び最後の脱トリチル化の後、このＣＮＥＴ保護基をＡＣＮ中の２０％のＤＥＡを用いてこのホスホジエステル結合から取り除いた（５ＣＶ、接触時間４５分以上、続いて４ＣＶのＡＣＮを用いて洗浄（９６．２ｍｌ／分））。５０°Ｃで４ＣＶ以上の２８から３０％のアンモニアを用いて、カラム上で再循環させることによって、開裂及び脱保護が達成され、続いて、４０ＯＤ／ｍｌ未満のＵＶ読み取りが、到達されるまで、それぞれ１ＣＶの水での洗��工程を繰り返す。
【００６５】
２６０ｎｍでの吸光度測定によって、ＯＤを決定した。オリゴヌクレオチドの収率（ＯＤ／μｍｏｌ）を表１に示す。
【００６６】
粗オリゴヌクレオチドの純度を決定するために、陰イオン交換分析を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  システムを用いて、３０°ＣでＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００の４ｘ２５０ｍｍのカラム上で実施した。サンプルをＨＰＬＣ緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＯＨ）中に６．２５ＯＤ／ｍｌまで希釈し、その２０μｌをこのカラムに注入し、５分の間に２５から４０％のＨＰＬＣ緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ、４０％のメタノール）の勾配を５分間用いて、続いて３５分の間に４０から５５％の緩衝液Ｂの勾配を３５分間用いて、１ｍｌ／分の流速で分離した。この完全長生成物（％）を表１に示す。
【００６７】
活性化剤としてＤＣＩを用いたＤＭＦ中の合成
本実施例は、固相合成担体としてＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ  ２５０（ＮＰＨＬ  ２５０）を用いた、Ａｋｔａ  １００  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ上における、１．５１ｍｍｏｌの配列番号１の脱トリチル化合成を記載する。ＤＭＦ中で膨潤させた５７．７ｍｌの合成担体、（担体密度：０．１０９ｇ／ｍｌ）を合成カラム（カラム直径３．５ｃｍ、カラム高さ６ｃｍ）に充填し、ＡＣＮ（６４．１ｍｌ／分、２ＣＶ）を用いた合成前洗浄の後、以下の合成サイクルを用いた。：（１）トルエン中のＤＣＡを用いた脱トリチル化（第一サイクル：トルエン中１０％のＤＣＡ、３２．９ｍｌ／分；後続サイクル：トルエン中３％のＤＣＡ、６４．１ｍｌ／分；２ＣＶ）、続いてＡＣＮ洗浄（３２．１ｍｌ／分で２ＣＶ及び６４．１ｍｌ／分で２ＣＶ）；（２）ＤＭＦを用いたコンディショニング（３２．９ｍｌ／分、１．５ＣＶ）；（３）カップリング（活性化剤：ＤＭＦ中の０．７ＭのＤＣＩ；デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（２．０ｅｑ／担体）：ＤＭＦ中の０．２Ｍ；充填容積：３０．２ｍｌ（１５．１ｍｌアミダイト＋１５．１ｍｌ活性化剤）、充填流速：５３．１ｍｌ／分；押出し容積：８ｍｌ、押出し流速：５３．１ｍｌ／分；再利用時間：１０分、再利用流速：４８．１ｍｌ／分）、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、６４．１ｍｌ／分）；（４）０．２ＣＶのＣａｐＡ（ＮＭＩ／ピリジン／ＡＣＮ、２：３：５ｖ／ｖ／ｖ）／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶ（ｖ／ｖ）の１：１ＣａｐＡ／ＣａｐＢ（イソ酪酸無水物／ＡＣＮ１：１ｖ／ｖ）を用いた酸化前キャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１７．３ｍｌ／分、押出し容積：１．１ｍｌ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：６４．１ｍｌ／分；（５）０．５ＣＶのＣａｐＡを用いた酸化前押出し（３４．８ｍｌ／分）；（６）ピリジン／水（９：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭのＩ２（３ｅｑ）を用いた酸化、充填容積：９０．６ｍｌ、接触時間：２．６分、充填／押出し流速：３４．８ｍｌ／分、酸化押出し容積：１．１ＣＶ、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、６４．１ｍｌ／分）；（７）１．５ＣＶのＤＭＦを用いたキャッピング前コンディショニング（３２．９ｍｌ／分）；（８）０．２ＣＶのＣａｐＡ／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶの１：１（ｖ／ｖ）ＣａｐＡ／ＣａｐＢを用いたキャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１７．３ｍｌ／分、押出し容積：１．１ＣＶ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：６４．１ｍｌ／分。２ＣＶのＡＣＮ（６４．１ｍｌ／分）を用いた最後のカラム洗浄及び最後の脱トリチル化の後、ＣＮＥＴ保護基をＡＣＮ中の２０％のＴＢＡを用いてホスホジエステル結合から取り除いた（５ＣＶ、接触時間４５分以上、続いて４ＣＶのＡＣＮを用いて洗浄（９６．２ｍｌ／分））。５０°Ｃで４ＣＶ以上の２８から３０％のアンモニアを用いて、カラム上で再循環させることによって、開裂及び脱保護が達成され、続いて、４０ＯＤ／ｍｌ未満のＵＶ読み取りが到達されるまで、それぞれ１ＣＶの水での洗浄工程を繰り返す。
【００６８】
２６０ｎｍでの吸光度測定によって、ＯＤを決定した。オリゴヌクレオチドの収率（ＯＤ／μｍｏｌ）を表１に示す。
【００６９】
粗オリゴヌクレオチドの純度を決定するために陰イオン交換分析をＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  システムを用いて、３０°ＣでＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００の４ｘ２５０ｍｍのカラム上で実施した。サンプルをＨＰＬＣ緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＯＨ）中で６．２５ＯＤ／ｍｌとなるように希釈し、その２０μｌをカラムに注入し、２５から４０％のＨＰＬＣ緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ、４０％のメタノール）の勾配を５分間使用して、続いて４０から５５％の緩衝液Ｂの勾配を３５分間用いて、１ｍｌ／分の流速で分離した。この完全長生成物（％）を表１に示す。
【００７０】
データは、共溶媒としてＤＭＦを用いたとき（５７．９％）、及び溶媒として純粋なＤＭＦを用いたとき（５６．３％）、粗製物合成におけるＦＬＰの純度が、最も高いことを証明する。更に、全収率は、溶媒として純粋なＤＭＦを用いたとき、最も高い（１８１ＯＤ／μｍｏｌ）。更に、ＡＣＮ／スルホランの代わりにＤＭＦを用いたとき、Ｇ１０−１ｎ及びＧ１０＋１ｎ、すなわち目的とするＦＬＰに加えて、１つ若しくは複数のＧ残基が少ない化合物又は１つ若しくは複数のＧ残基を含む化合物などの不純物及び合成の失敗が、顕著に減少する。後者は、Ｇ１０＋１ｎに関して特にあてはまり、ＦＬＰからＧ１０＋１ｎ化合物を分離することが困難であることにより、非常に有益である。
【表１】
2018527311.tif 000003
【００７１】
実施例２
本実施例は、活性化剤としてＥＴＴを用いた純粋なＤＭＦの存在下での配列番号１の合成を記載する。本実施例は、オリゴヌクレオチドの収率及び完全長生成物の純度の点からＤＣＩよりＥＴＴが優れていることを示す。
【００７２】
活性化剤としてＥＴＴを用いたＤＭＦ中の合成
本実施例は、固相合成担体としてＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ  ２５０（ＮＰＨＬ２５０）を用いた、Ａｋｔａ  １００  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ上における、１．２６ｍｍｏｌの配列番号１の脱トリチル化合成を記載する。ＤＭＦ中で膨潤させた４８．１ｍｌの合成担体、（担体密度：０．１０９ｇ／ｍｌ）を合成カラム（カラム直径３．５ｃｍ、カラム高さ５ｃｍ）に充填し、ＡＣＮ（４２４ｃｍ／時、２ＣＶ）を用いた合成前洗浄の後、以下の合成サイクルを用いた。：（１）トルエン中のＤＣＡを用いた脱トリチル化（第一サイクル：トルエン中１０％のＤＣＡ、５０ｃｍ／時；後続サイクル：トルエン中の３％のＤＣＡ、４２４ｃｍ／時；２ＣＶ）、続いてＡＣＮ洗浄（２００ｃｍ／時で２ＣＶ、４２４ｃｍ／時で２ＣＶ）；（２）ＤＭＦを用いたコンディショニング（２０５ｃｍ／時、１．５ＣＶ）；（３）カップリング（活性化剤：ＤＭＦ中の０．６ＭのＥＴＴ；デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（２．０ｅｑ／担体）：ＤＭＦ中の０．２Ｍ；充填容積：２６．４ｍｌ（１２．６ｍｌアミダイト＋１３．８ｍｌ活性化剤）、充填流速：１９．３ｍｌ／分；押出し容積：８ｍｌ、押出し流速：１２０ｃｍ／時；再利用時間：１０分、再利用流速：２１２ｃｍ／時）、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、４２４ｃｍ／時）；（４）０．５ＣＶのＣａｐＡを用いた酸化前押出し（ＮＭＩ／ピリジン／ＡＣＮ、２：３：５ｖ／ｖ／ｖ、２９．０ｍｌ／分）；（５）ピリジン／水（９：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭのＩ２（３当量）を用いた酸化、充填容積：７５．５ｍｌ、接触時間：２．６分、充填／押出し流速：２９．０ｍｌ／分、酸化押出し容積：１．１ＣＶ、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、４２４ｃｍ／時）；（６）１．５ＣＶのＤＭＦを用いたキャッピング前コンディショニング（２０５ｃｍ／時）；（７）０．２ＣＶのＣａｐＡ／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶの１：１（ｖ／ｖ）ＣａｐＡ／ＣａｐＢ（イソ酪酸無水物／ＡＣＮ、１：４ｖ／ｖ）を用いたキャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１４．４ｍｌ／分、押出し容積：１．１ＣＶ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：４２４ｃｍ／時。最後の脱トリチル化の後、ＣＮＥＴ保護基を、ＡＣＮ中の２０％のＴＢＡを用いてこのホスホジエステル結合から取り除いた（５ＣＶ、接触時間４５分以上、続いて４ＣＶのＡＣＮを用いて洗浄（４２４ｃｍ／時））。５０°Ｃで５ＣＶの２８から３０％のアンモニアを用いて、１６から２４時間、カラム上で再循環させることによって、開裂及び脱保護が達成され、続いて、４０ＯＤ／ｍｌ未満のＵＶ読み取りが到達されるまで、それぞれ１ＣＶの水での洗浄工程を繰り返す。
【００７３】
２６０ｎｍでの吸光度測定によって、ＯＤを決定した。オリゴヌクレオチドの収率（ＯＤ／μｍｏｌ）を表２に示す。
【００７４】
粗オリゴヌクレオチドの純度を決定するために陰イオン交換分析をＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  システムを用いて、３０°ＣでＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００の４ｘ２５０ｍｍのカラム上で実施した。サンプルをＨＰＬＣ緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＯＨ）中に６．２５ＯＤ／ｍｌとなるように希釈し、その２０μｌをこのカラムに注入し、２５から４０％のＨＰＬＣ緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ、４０％のメタノール）の勾配を５分間用いて、続いて４０から５５％の緩衝液Ｂの勾配を３５分間用いて、１ｍｌ／分の流速で分離した。完全長生成物（％）について活性化剤としてＤＣＩを用いた実施例１の合成と比較して表２に示す。データは、活性化剤としてＥＴＴを用いることによって、粗オリゴヌクレオチドの収率及びＦＬＰの純度の双方が、更に大きく増加することを証明する。加えて、Ｇ１０−１ｎ及びＧ１０＋１ｎ、すなわち目的とするＦＬＰに加えて、１つ若しくは複数のＧ残基が少ない化合物、又は１つ若しくは複数のＧ残基を含む化合物などの不純物及び合成の失敗が、活性化剤としてＤＣＩを用いた合成と比較して更に減少する。
【表２】
2018527311.tif 000004
【００７５】
実施例３
本実施例は、１０５ｍｍｏｌ規模での実施例２の合成を記載する。本実施例は、このプロセスが製造規模に拡大可能であることを証明する。
【００７６】
本実施例は、固相合成担体としてＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ  ２５０（ＮＰＨＬ  ２５０）を用いた、ＧＥ  ＯｌｉｇｏＰｒｏｃｅｓｓオリゴヌクレオチド合成装置上における、１０５ｍｍｏｌの配列番号１の脱トリチル化合成を記載する。ＤＭＦ中で膨潤させた３．８５リットルの合成担体、（担体密度：９．１７ｍｌ／ｇ）を合成カラム（カラム直径３５ｃｍ、カラム高さ４ｃｍ）に充填し、ＡＣＮ（４２４ｃｍ／時、２ＣＶ）を用いた合成前洗浄の後、以下の合成サイクルを用いた。：（１）トルエン中のＤＣＡを用いた脱トリチル化（第一サイクル：トルエン中１０％のＤＣＡ、６２ｃｍ／時；後続サイクル：トルエン中の３％のＤＣＡ、４２４ｃｍ／時；２ＣＶ）、続いてＡＣＮ洗浄（２００ｃｍ／時で２ＣＶ及び４２４ｃｍ／時で２ＣＶ）；（２）ＤＭＦを用いたコンディショニング（２０５ｃｍ／時、１．５ＣＶ）；（３）カップリング（活性化剤：ＤＭＦ中の０．６ＭのＥＴＴ；デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（２．０ｅｑ／担体）：ＤＭＦ中の０．２Ｍ；充填容積：２．２１Ｌ（５２．４％活性化剤容積）、充填流速：１．６８Ｌ／分；押出し流速：１．６８Ｌ／分；再利用時間：１０分、再利用流速：３．４０Ｌ／分）、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、４２４ｃｍ／時）；（４）０．５ＣＶのＣａｐＡを用いた酸化前押出し（ＮＭＩ／ピリジン／ＡＣＮ、２：３：５ｖ／ｖ／ｖ、２．４２Ｌ／分）；（５）ピリジン／水（９：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭのＩ２（３ｅｑ）を用いた酸化、充填容積：６．３０Ｌ、接触時間：２．６分、充填／押出し流速：２．４２Ｌ／分、酸化押出し容積：１．１ＣＶ、続いてＡＣＮ洗浄（１ＣＶ、４２４ｃｍ／時）；（６）１．５ＣＶのＤＭＦを用いたキャッピング前コンディショニング（２０５ｃｍ／時）；（７）０．２ＣＶのＣａｐＡ／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）、続いて０．７５ＣＶの１：１（ｖ／ｖ）ＣａｐＡ／ＣａｐＢ（イソ酪酸無水物／ＡＣＮ、１：４ｖ／ｖ）を用いたキャッピング、接触時間２．５分、充填／押出し流速：１．１５Ｌ／分、押出し容積：１．１ＣＶ、洗浄容積：１ＣＶ、洗浄流速：４２４ｃｍ／時。最後の脱トリチル化及び最後のカラム洗浄（２ＣＶのＡＣＮ、４２４ｃｍ／時）の後、このＣＮＥＴ保護基をＡＣＮ中の２０％のＴＢＡを用いて、このホスホジエステル結合から取り除いた（５ＣＶ、４５分以上の接触時間、続いて４ＣＶのＡＣＮを用いて洗浄（４２４ｃｍ／時））。５０°Ｃで５ＣＶの２８から３０％のアンモニアを用いて、１６から２４時間、カラム上で再循環させることによって、開裂及び脱保護が達成され、続いて、４０ＯＤ／ｍｌ未満のＵＶ読み取りが到達されるまで４ＣＶ以上の水で洗浄した。
【００７７】
２６０ｎｍでの吸光度測定によって、ＯＤを決定した。
【００７８】
粗オリゴヌクレオチドの純度を決定するために陰イオン交換分析をＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  システムを用いて、３０°ＣでＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００の４ｘ２５０ｍｍのカラム上で実施した。サンプルをＨＰＬＣ緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＯＨ）中で６．２５ＯＤ／ｍｌとなるように希釈し、その２０μｌをカラムに注入し、２５から４０％のＨＰＬＣ緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ、４０％のメタノール）の勾配を５分間使用して、続いて４０から５５％の緩衝液Ｂの勾配を３５分間用いて、１ｍｌ／分の流速で分離した。
【００７９】
粗オリゴヌクレオチドの収率は、６６．７％のＦＬＰ含量を有する１７８ＯＤ／μｍｏｌ（最大値の５１．６％）であり、この好ましいプロセスが製造規模に拡大可能であることを示す。
【００８０】
実施例４
本実施例は、実施例２に記載される合成された粗オリゴヌクレオチドの精製を記載する。本実施例は、好ましい方法を用いて合成された粗オリゴヌクレオチドを高純度に精製することができることを証明する。
【００８１】
実施例２に記載のとおり合成された粗オリゴヌクレオチドの２つのバッチを混合し、この精製プロセスに供するための１回供給分を作製した。混合した粗オリゴヌクレオチドのプール中におけるＦＬＰの純度は、６６．５％であると決定された。７．５ｃｍの直径のカラムに２０ｃｍのベッド高さまでＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ陰イオン交換マトリックスを充填し（圧縮係数１）、３ＣＶ以上の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＮａＯＨ、２ＭのＮａＣｌ）を用いて、１００ｃｍ／時の流速で洗浄し、続いて３ＣＶ以上の緩衝液Ａ（２５ｍＭのＮａＯＨ）を用いて、１００ｃｍ／時の流速で平衡化した。混合した粗オリゴヌクレオチドを５００ＯＤ／ｍｌの濃度、１００ｃｍ／時の流速でロードし、続いて、ＵＶシグナルが、ベースラインに戻るまで、１ＣＶ以上の緩衝液Ａを用いて、１００ｃｍ／時で洗浄工程を行った。溶出させるため、１０％の緩衝液Ｂから４４％の緩衝液Ｂの勾配を１００ｃｍ／時の流速で１７ＣＶを超えて適用し、画分サイズは、０．５ＣＶであった。ＯＤ（２６０ｎｍでの吸収測定）及びＦＬＰ純度（陰イオン交換ＨＰＬＣ）に関して分析した画分のモックプールの分析結果を表３に示す。モックプールは、９４％の範囲の高純度ＦＬＰ及び７１から８４％の高ＦＬＰ回収率を示す。
【表３】
2018527311.tif 000005
【００８２】
画分１７から３１を限外ろ過／透析濾過を通して更に処理するためにプールし（分子量カットオフ：３０００）、凍結乾燥することによって、純度９３．０％のＦＬＰ（１％のＧ１０−１ｎ及び０．５３％のＧ１０＋１ｎ）を有する６．６ｇのオリゴヌクレオチド（水分に対して補正済み）を得た。この全体的な処理の収率は２．６ｇ／ｍｍｏｌ（１９％）であった。
【配列表】
2018527311000001.app
【国際調査報告】
2018527311.tif 000007
2018527311.tif 000008