(57)【要約】本発明は、１）ＣＤＡＰで活性化され、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）またはその組合わせから選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１５Ｂ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される少なくとも１２種類の莢膜多糖類、ならびに２）医薬的に許容できるキャリヤーを含む、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＣＤＡＰで活性化され、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）またはその組合わせから選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１５Ｂ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される少なくとも１２種類の莢膜多糖類、ならびに
ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー
を含む多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物。
【請求項２】
ａ）ＣＤＡＰで活性化され、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはその組合わせにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される少なくとも１４種類の莢膜多糖類、ならびに
ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー
を含む多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物。
【請求項３】
さらに、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の６Ｃ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、２３Ａ、２３Ｂおよび３５Ｂから選択される１種類以上の血清型を含む、請求項１および２に記載の組成物。
【請求項４】
それぞれの血清型に由来する多糖類の量が１〜１０μｇである、請求項１および２に記載の組成物。
【請求項５】
多糖類にコンジュゲートしたキャリヤータンパク質の量が３〜３０μｇである、請求項１および２に記載の組成物。
【請求項６】
０．５ｍＬの単回量が、２μｇのそれぞれの多糖類；３０〜４０μｇのＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質；０．２〜１ｍｇのリン酸アルミニウムアジュバント；塩化ナトリウムおよび緩衝剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
約３２μｇのＣＲＭ１９７にそれぞれ個別にコンジュゲートした、２μｇの血清型１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ、４μｇの血清型６Ｂそれぞれの莢膜多糖類；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝剤を含む、１４価の無菌液体肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）配合物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない配合物。
【請求項８】
約３２μｇのＣＲＭ１９７にそれぞれ個別にコンジュゲートした、２μｇの血清型１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆおよび３３Ｆ、４μｇの血清型６Ｂそれぞれの莢膜多糖類；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝剤を含む、１３価の無菌液体肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）配合物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない配合物。
【請求項９】
約３２μｇのＣＲＭ１９７にそれぞれ個別にコンジュゲートした、２μｇの血清型１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ、４μｇの血清型６Ｂそれぞれの莢膜多糖類；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝剤を含む、１３価の無菌液体肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）配合物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない配合物。
【請求項１０】
下記を含む、１３価ＰＣＶを配合するための血清型組成物：
ａ）ＣＤＡＰを用いて活性化された血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆおよび３３Ｆ由来の既知サイズの肺炎球菌莢膜多糖類を、個別に免疫原キャリヤータンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせる；
ｂ）個別の一価肺炎球菌コンジュゲートを透析濾過し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する；
ｃ）画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、一価肺炎球菌コンジュゲートを含有する画分をプールした後、０．２μｍフィルターを用いてフィルター滅菌する；
ｄ）血清型６Ｂについては４．４μｇ、残りの血清型については２．２μｇの１３種類の一価肺炎球菌コンジュゲート、およびＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）アジュバントを、適切な賦形剤および緩衝剤と共に用いて１３価ＰＣＶを配合し、続いて無菌充填する；
ｅ）１３価ＰＣＶは血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない。
【請求項１１】
下記を含む、１４価ＰＣＶを配合するための血清型組成物：
ａ）ＣＤＡＰを用いて活性化された血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ由来の既知サイズの肺炎球菌莢膜多糖類を、個別に免疫原キャリヤータンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせる；
ｂ）個別の一価肺炎球菌コンジュゲートを透析濾過し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する；
ｃ）画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、一価肺炎球菌コンジュゲートを含有する画分をプールした後、０．２μｍフィルターを用いてフィルター滅菌する；そして
ｄ）血清型６Ｂについては４．４μｇ、残りの血清型については２．２μｇの一価肺炎球菌コンジュゲート、およびＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）アジュバントを、適切な賦形剤および緩衝剤と共に用いて１４価ＰＣＶを配合し、続いて無菌充填する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)（肺炎球菌）は、かなりの罹患率および死亡率（特に幼児および高齢者における）の原因となるグラム陽性細菌であり、侵襲性疾患、たとえば肺炎、菌血症および髄膜炎、ならびに集落形成に関連する疾患、たとえば急性中耳炎を引き起こす。米国における６０歳を超える者についての肺炎球菌性肺炎の割合は１００，０００人当たり３〜８人と推定される。２０％の症例で、これは菌血症、および他の症状発現、たとえば髄膜炎に至り、抗生物質治療を用いてすら死亡率は３０％近い。
【０００３】
肺炎球菌は化学結合した多糖類で被包されており、それが血清型特異性を付与する。９０種類を超える血清型の肺炎球菌が知られており、莢膜は細菌の内面を補体から防御するだけでなく、莢膜は肺炎球菌の主な病原性決定因子であるが、それ自体は免疫原性に乏しい。
【０００４】
肺炎球菌ワクチンには肺炎球菌多糖類ワクチンおよび肺炎球菌コンジュゲートワクチンが含まれる。市販の肺炎球菌多糖類ワクチンの防御効力が多かれ少なかれワクチン接種に際して誘導される抗体の濃度に関係することは一般に認められている；実際に、２３種類の多糖類が承認され、それぞれの成分多糖類の免疫原性についてのみ商品名Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）２３でＭｅｒｃｋにより市販されている。Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）２３は、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに属する非コンジュゲート多糖類を含む。
【０００５】
長年認可されている多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、成人、特に高齢者および高リスク者において肺炎球菌感染症を阻止するのに有用であることが証明された。しかし、乳児および幼児は非コンジュゲート肺炎球菌多糖類に対する応答が乏しい。幼児および乳児に同時に侵襲性肺炎球菌感染症(invasive pneumococcal disease)（ＩＰＤ）を引き起こす最も単離頻度の高い７種類の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含有する肺炎球菌コンジュゲートワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）は、米国で２０００年２月に最初に認可された。米国でＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）−７が広く用いられるのに伴って、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）−７中に存在する血清型により小児におけるＩＰＤが有意に減少した。世界の特定地域ではＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）−７による血清型適応範囲に限界があるため、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する１３価コンジュゲートワクチンが開発され、商品名Ｐｒｅｖｅｎａｒ−１３（登録商標）で承認された。多糖類の活性化は、過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸を用いて炭水化物反復単位中の隣接（ビシナル(vicinal)）ヒドロキシル基を部分酸化することにより達成される。
【０００６】
プロテインＤ(protein D)（ＰＤ）にコンジュゲートした多糖類血清型１、４、５、６Ｂ、７、９、１４、２３Ｆ、破傷風トキソイド(tetanus toxoid)（ＴＴ）にコンジュゲートした血清型１８Ｃ、およびジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)（ＤＴ）にコンジュゲートした血清型１９Ｆを含有する、１０価肺炎球菌ワクチンが商品名Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ（登録商標）で承認された。コンジュゲートを調製するために、ＰＤ、ＤＴまたはＴＴのいずれかへの肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)血清型多糖類それぞれのカップリングが、試薬としてＣＤＡＰ（１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート）を用いて制御ｐＨ下で行なわれる。
【０００７】
U.S. Patent 5,360,897には、病原性細菌である肺炎連鎖球菌の少なくとも２つのカルボニル基をもつ無傷莢膜高分子の還元アミノ化生成物および細菌性トキシンまたはトキソイドを含む免疫原性コンジュゲートが開示され、そのコンジュゲートは莢膜高分子とトキシンまたはトキソイドとの間に直接共有結合がある架橋コンジュゲートを含む。
【０００８】
U.S. Patent 7,862,823は、少なくとも２種類の異なるキャリヤータンパク質を含む多価コンジュゲートワクチン組成物を主張している。
U.S. Patent 7,955,605には、１９Ａからなる免疫原性コンジュゲートの作成方法が開示され、その方法では活性化された血清型１９Ａ多糖類およびキャリヤータンパク質をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁してコンジュゲートを形成している。
【０００９】
U.S. Patent 8,603,484には、多価免疫原組成物の作成方法が開示され、その方法では血清型３を緩和な酸と反応させてそれを加水分解し、この加水分解された血清型を二価カチオンの存在下で酸化剤と反応させて、活性化された血清型３を生成させ、次いでそれをキャリヤータンパク質とコンジュゲートさせる：それは、この活性化された生成物を還元剤と反応させて血清型３多糖類：キャリヤータンパク質コンジュゲートにすることを伴う。
【００１０】
U.S. Patent 8,808,708 B2には、多糖類−タンパク質コンジュゲートからなる１３価免疫原組成物が開示され、その際、血清型は１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｂおよび２３Ｆからなり、キャリヤータンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００１１】
U.S. Patent publication 2009/0017059 A1には、血清型１９Ａと１９Ｆが異なる細菌トキソイドにコンジュゲートした免疫原組成物が開示されている。
U.S. Patent publication 2010/0074922 A1には、１０種類以上の血清型を含有する免疫原組成物が開示され、その際、１９Ｆ莢膜糖類はジフテリアトキソイド（ＤＴ）にコンジュゲートし、血清型１８Ｃ莢膜糖類は破傷風トキソイドにコンジュゲートし、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ莢膜糖類はインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のプロテインＤにコンジュゲートしている。
【００１２】
U.S. Patent publication US 2010/0239604には、多価肺炎連鎖球菌莢膜糖類コンジュゲートを含む組成物が開示され、その際、肺炎連鎖球菌莢膜糖類の血清型１９Ａは第１の細菌トキソイドにコンジュゲートし、１９Ｆは第２の細菌トキソイドにコンジュゲートし、２〜９はプロテインＤにコンジュゲートしている。
【００１３】
US Patent publication 2012/321658 A1 (2010)には、免疫原組成物が開示され、その際、血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆはタンパク質キャリヤー（単数または複数）に直接連結し、または還元アミノ化以外の化学的方法によって間接的に連結し、１種類以上の異なる糖類は血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２グループから選択され、還元アミノ化によりタンパク質キャリヤー（単数または複数）に連結している。
【００１４】
U.S. Patent 8,192,746には、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ由来の莢膜多糖類を含む多価免疫原組成物が開示されている。
【００１５】
WO 2013/191459 A1には、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類に由来する種々の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含むコンジュゲート１５価組成物が開示されている。
【００１６】
WO 2014/092378 A1には、免疫原コンジュゲート組成物が開示され、その際、１２種類の血清型は１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから、残りの１種類は２２Ｆまたは３３Ｆから選択される。
【００１７】
WO 2014/092377 A1には、１３価組成物が開示され、その際、１２種類の血清型は１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから選択され、最後の血清型は１２または９Ｎのいずれかである。
【００１８】
Chinese Patent Application Publication No. CN 101590224には、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する１４価肺炎球菌多糖類−タンパク質コンジュゲートワクチンが記載されている。
【００１９】
Chinese Patent Application Publication No. CN 103623401には、１４多価肺炎球菌莢膜多糖類−タンパク質コンジュゲート組成物が開示され、その際、それら１４種類の異なる血清型は１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆである。
【００２０】
Chinese Patent Application Publication No. CN 103656632 Aには、血清型６Ａ、ならびに１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆからなるグループから選択される少なくとも１種類の別の血清型を含有する、多価肺炎球菌莢膜多糖類組成物が開示されている。そこに提示される多価肺炎球菌莢膜多糖類組成物は体液性免疫を発生するように生物を誘導するために使用でき、２４種類の一般的な血清型の肺炎球菌により引き起こされる感染性疾患に対して比較的良好な防御効果を発生させることができる。
【００２１】
Chinese Patent Application Publication No. CN 103656631 Aには、多価肺炎球菌莢膜多糖類−タンパク質コンジュゲート組成物およびその製造方法が開示されている。そのコンジュゲート組成物は、２４種類の異なる血清型の肺炎球菌の莢膜多糖類およびキャリヤータンパク質から共有結合法で製造され、その際、２４種類の異なる血清型は１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆである。
【００２２】
Chinese Patent Application Publication No. CN 104069488 Aには、１４種類の異なる血清型の多価肺炎球菌莢膜多糖類およびキャリヤータンパク質が開示され、その際、１４種類の血清型には１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆが含まれる。
【００２３】
シアニル化剤は当技術分野で周知である(Wilcheck et al., Affinity chromatography. Meth. Enzymol., 104C:3-55; Wakelsman et al., J.C.S Chem. Comm., 1976:21 (1976)。それは、タンパク質のシステイン基を修飾するために使用できる緩和な試薬としてレポートされた。一方で、ＣＤＡＰ、Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）およびシアン酸ｐ−ニトロフェニル（Ｐｎｐｃ）を比較したのはKohn et al., (Anal. Biochem, 115:375, 1981)であった。この比較は、これらの試薬によるアガロースの活性化を比較するために行なわれた。ＣＤＡＰは不溶性粒子、たとえばセファロースおよびグリセリル−コントロールド・ポア・ガラス(controlled pore glass)を活性化するためにも用いられている(Carpenter et al., Journal of Chromatography, 573:132-135, 1992)。
【００２４】
U.S. Patent 5,693,326には、コンジュゲートワクチンを製造するための一般法が示され、その際、ウイルス、真菌または細菌の多糖類を活性化するために１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート、Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート、およびシアン酸ｐ−ニトロフェニルの群からから選択される有機シアニル化剤を用いて活性化された炭水化物を形成し、次いでタンパク質またはキャリヤータンパク質にカップリングさせる。
【００２５】
U.S. Patent 8,465,749には、多糖類をＣＤＡＰと反応させかつタンパク質をヒドラジンまたはアジピン酸ジヒトラジドと特定のｐＨ範囲で反応させることによりコンジュゲートワクチンを製造するための一般法が開示されている。
【００２６】
U.S. Patent 8,557,250 B2には、複数のシアネート活性化された異なる免疫原性多糖類の混合物を少なくとも１種類のヒドラジド活性化タンパク質と接触させることを含む方法が開示されている。
【００２７】
Anderson P et al, (2003, Vaccine; 21 (13-14):1554-9)には、それぞれの多糖類タイプ６Ａ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆが個別に破傷風トキソイドもしくはジフテリアＣＲＭ１９７にカップリングしたものを含む４価コンジュゲートワクチン、または破傷風トキソイドおよびジフテリアＣＲＭ１９７に個別にカップリングした半量の多糖類タイプ６Ａ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆの混合物の比較試験が開示されている。
【００２８】
乳児に用いるための将来の多価多糖類コンジュゲートワクチンを予想すると、この戦略はさらなる研究に値する２つの想定される利点をもつであろう−各キャリヤー量の低減による“キャリヤーエピトープ過剰装填”の回避、およびそれぞれの多糖類に対する両キャリヤーによるヘルパーＴ活性の動員。
【００２９】
Wuorimaa et al. (2001, The Paediatric Infectious Disease Journal, Volume 20(3), pp 272-277)には、健康な幼児において、破傷風とジフテリアの両方のトキソイドをキャリヤーとして用いる１１価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの耐容性および免疫原性を査定するための試験が開示されている。
【００３０】
Gatchalian et al. (2001, 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis (ESPID), poster number 4, PIA Poster Session 1, IstanbulTurkey)には、１１価ワクチン投与を受けて、血清型３について他の被検血清型に匹敵するレベルの抗体応答を示さなかった乳児からのＯＰＡ結果が開示されている。
【００３１】
Nurkka et al. (2004, Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014)には、１１価肺炎球菌−プロテインＤコンジュゲートワクチンの免疫原性および安全性の試験が開示され、その際、３回のワクチン投与に続いて同一ワクチンまたは肺炎球菌多糖類ワクチンのブースター投与を受けた乳児において、血清型３についてプライミング効果がみられなかった。
【００３２】
以上に述べた参考文献には、種々の血清型に属する多糖類、および種々の方法によるそれらとキャリヤータンパク質とのコンジュゲーションが開示されている。しかし、特定の地域における血清型罹患率からみて、新たな血清型組成物を得ること、および簡単かつ効率的な方法でそれらを製造することに対するニーズがある。本発明者らは、６Ａを含まない血清型２２Ｆおよび３３Ｆと他の血清型との組合わせが血清型に対する免疫原性を改善することを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３３】
【特許文献１】U.S. Patent 5,360,897
【特許文献２】U.S. Patent 7,862,823
【特許文献３】U.S. Patent 7,955,605
【特許文献４】U.S. Patent 8,603,484
【特許文献５】U.S. Patent 8,808,708 B2
【特許文献６】U.S. Patent publication 2009/0017059 A1
【特許文献７】U.S. Patent publication 2010/0074922 A1
【特許文献８】U.S. Patent publication US 2010/0239604
【特許文献９】US Patent publication 2012/321658 A1 (2010)
【特許文献１０】U.S. Patent 8,192,746
【特許文献１１】WO 2013/191459 A1
【特許文献１２】WO 2014/092378 A1
【特許文献１３】WO 2014/092377 A1
【特許文献１４】Chinese Patent Application Publication No. CN 101590224
【特許文献１５】Chinese Patent Application Publication No. CN 103623401
【特許文献１６】Chinese Patent Application Publication No. CN 103656632 A
【特許文献１７】Chinese Patent Application Publication No. CN 103656631 A
【特許文献１８】Chinese Patent Application Publication No. CN 104069488 A
【特許文献１９】U.S. Patent 5,693,326
【特許文献２０】U.S. Patent 8,465,749
【特許文献２１】U.S. Patent 8,557,250 B2
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】Wilcheck et al., Affinityクロマトグラフィー. Meth. Enzymol., 104C:3-55
【非特許文献２】Wakelsman et al., J.C.S Chem. Comm., 1976:21 (1976)
【非特許文献３】Kohn et al., (Anal. Biochem, 115:375, 1981)
【非特許文献４】Carpenter et al., Journal of Chromatography, 573:132-135, 1992
【非特許文献５】Anderson P et al, (2003, Vaccine; 21 (13-14):1554-9)
【非特許文献６】Wuorimaa et al. (2001, The Paediatric Infectious Disease Journal, Volume 20(3), pp 272-277)
【非特許文献７】Gatchalian et al. (2001, 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis (ESPID), poster number 4, PIA Poster Session 1, Istanbul Turkey)
【非特許文献８】Nurkka et al. (2004, Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
本発明の主な目的は、新規な多価多糖類コンジュゲートワクチンを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、新規な多価多糖類コンジュゲートワクチンの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明は、
１）ＣＤＡＰで活性化され、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）またはその組合わせから選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１５Ｂ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される少なくとも１２種類の莢膜多糖類、ならびに
２）医薬的に許容できるキャリヤー
を含む多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(Pnemococcal conjugate vaccine)（ＰＣＶ）組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物に関する。
【００３７】
本発明は、
（１）ＣＤＡＰで活性化され、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはその組合わせにコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される少なくとも１４種類の莢膜多糖類、ならびに
（２）医薬的に許容できるキャリヤー
を含む多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１．配合物Ａによりウサギにおいて誘導された個々の肺炎球菌莢膜多糖類に対するＩｇＧの力価を間接ＥＬＩＳＡにより測定したもの。
【図２】図２．配合物Ｂによりウサギにおいて誘導された個々の肺炎球菌莢膜多糖類に対するＩｇＧの力価を間接ＥＬＩＳＡにより測定したもの。
【図３】図３．配合物Ｃによりウサギにおいて誘導された個々の肺炎球菌莢膜多糖類に対するＩｇＧの力価を間接ＥＬＩＳＡにより測定したもの。
【図４】図４．Ｐｒｅｖｎａｒ  １３（商標）によりウサギにおいて誘導された個々の肺炎球菌莢膜多糖類に対するＩｇＧの力価を間接ＥＬＩＳＡにより測定したもの。
【図５】図５．プラセボによりウサギにおいて誘導された個々の肺炎球菌莢膜多糖類に対するＩｇＧの力価を間接ＥＬＩＳＡにより測定したもの。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、免疫原性多価血清型組成物、より具体的には医薬的に許容できるキャリヤータンパク質ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートした少なくとも１３種類の肺炎球菌多糖類血清型を含むコンジュゲート肺炎球菌ワクチン組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜糖類を含有しない組成物を提供する。血清型６Ａと６Ｂは構造的および血清学的に類似する。血清型６Ａと６Ｂの莢膜はラムノース−リビトール結合においてのみ異なるイソポリマー(isopolymer)であり、そのため血清型６Ｂ莢膜多糖類に対して特異的な抗体は血清型６Ａ莢膜多糖類と交差反応する。したがって、血清型６Ａの除外は、多価ＰＣＶの価数を拡張せずに肺炎球菌感染症に対する防御を拡大するための追加の疫学関連血清型を含める効果をもたらす。
【００４０】
本発明はまた、肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する莢膜多糖類がキャリヤータンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした免疫原性多価血清型組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物を提供する。さらに本発明は、そのほか肺炎連鎖球菌の６Ｃ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、２３Ａ、２３Ｂおよび３５Ｂから選択される１種類以上の血清型を含むことができる。
【００４１】
好ましくは、本発明は１３価、１４価または１５価免疫原組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜糖類を含有しない組成物を提供する。
血清型２２Ｆおよび血清型３は、特定のクローンタイプの拡大が原因でＩＰＤを引き起こす最も一般的にみられる血清型である。血清型３３Ｆも最も一般的に遭遇する血清型に含まれる。
【００４２】
ＣＲＭ１９７はジフテリアトキシンのバリアントであり、それ自体はワクチンにおける使用について無毒性である（すなわち、トキソイド）。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸(casamino acid)および酵母エキスをベースとする培地で増殖させたジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。ＣＲＭ１９７は、U.S. Pat. No. 5,614,382に記載された方法に従って組換え製造できる。あるいは、ＣＲＭ１９７は文献中に知られている方法に従って、または我々のPCT publication WO 2016/079755に開示された方法に従って、組換え製造される。ＣＲＭ１９７は、当技術分野で周知の限外濾過法、硫酸アンモニウム沈殿法、およびイオン交換クロマトグラフィー法によって精製できる。
【００４３】
多糖類は一般法に従って微生物から抽出し、同様に精製できる。この多糖類を、抽出／精製後に天然形態で使用できる。あるいは、最初に抽出した多糖類のものより低い平均分子量をもつ多糖類を得るためにそれをフラグメント化することができる。
【００４４】
こうして得た多糖類を次いでＣＤＡＰによって活性化し、次いでキャリヤータンパク質、たとえばＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはその組合わせとコンジュゲートさせる。
【００４５】
他の態様において、コンジュゲーション方法はシアネートエステルを形成するＣＤＡＰによる糖類の活性化に依存する。活性化された糖類は、直接に、またはスペーサー（リンカー）基を介して、キャリヤータンパク質上のアミノ基にカップリングすることができる。たとえば、スペーサーはシスタミン(cystamine)またはシステアミン(cysteamine)であってチオール化多糖類を生成することができ、それをマレイミド活性化キャリヤータンパク質（たとえば、ＧＭＢＳを使用）またはハロアセチル化キャリヤータンパク質（たとえば、ヨードアセチミド(iodoacetimide［たとえば、エチルヨードアセチミドＨＣｌ］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートもしくはＳＩＡＢもしくはＳＩＡもしくはＳＢＡＰ)を使用）との反応後に得られたチオエーテル結合を介してキャリヤーにカップリングさせることができる。好ましくは、シアネートエステルをヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、そのアミノ誘導体化した糖類を、カルボジイミド（たとえば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を用い、キャリヤータンパク質上のカルボキシル基を介してキャリヤータンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、WO 93/15760、WO 95/08348およびWO 96/29094；ならびにChu et al., 1983, Infec. Immunity 40:245-256に記載されている。
【００４６】
莢膜多糖類をキャリヤータンパク質にコンジュゲートさせた後、その多糖類−タンパク質コンジュゲートを多様な手法で精製する（多糖類−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）。これらの手法には、濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィー、およびデプスフィルトレーション（深層濾過）(depth filtration)が含まれる。
【００４７】
個々の糖類コンジュゲートを精製した後、それらを調合して本発明の免疫原性組成物を配合し、それらをワクチンとして使用できる。
好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤＡＰで活性化され、ＣＲＭ１９７、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡまたはその組合わせから選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、肺炎連鎖球菌の血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される少なくとも１３種類の莢膜多糖類、ならびに
ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー
を含む多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）組成物であって、血清型６Ａ由来の莢膜多糖類を含有しない組成物を提供する。
【００４８】
他の態様において、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆそれぞれに由来する多糖類の量は、３〜３０μｇのＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質にコンジュゲートした１〜１０μｇ、好ましくは１〜５μｇである。多糖類−対−キャリヤータンパク質の比は０．３：３である。
【００４９】
本発明による組成物は一般法により製造できる。特に、それに医薬的に許容できる希釈剤またはビヒクル、たとえば水または塩類溶液を配合することができる。さらに、組成物は緩衝剤、保存剤または安定剤、ポリソルベート、アジュバント、たとえばアルミニウム化合物、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはヒドロキシリン酸アルミニウム、および凍結乾燥用賦形剤などの成分を含有することができる。一般に、これらの製品は投与の方式および経路との関連で、標準的な医薬慣習に基づいて選択できる。
【００５０】
本発明の組成物は、単回量バイアル、多数回量バイアル、またはプレフィルド注射器の形態に配合できる。組成物はさらに、チオメルサール、２−フェノキシエタノールなどから選択される１種類以上の保存剤（単数または複数）を含むことができる。保存剤の量は４から２０ｍｇ／ｍＬまでの範囲であってもよい。
【００５１】
本発明による組成物は、ワクチンの分野で用いられるいずれか一般的な経路により、特に全身経路、すなわち非経口経路により、たとえば皮下、筋肉内、皮内または静脈内経路により、あるいは粘膜経路により、たとえば経口または鼻経路により投与できる。
【００５２】
本発明の組成物の“有効量”は、後続の攻撃に際して肺炎連鎖球菌感染の可能性または重症度を有意に低減する抗体を誘発するために必要な用量を表わす。
一態様において、本発明はさらに、下記のものを含有する単回０．５ｍＬ量として投与される免疫原組成物を提供する：２μｇのそれぞれの多糖類；３０〜４０μｇのＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質；０．２〜１ｍｇのリン酸アルミニウムアジュバント；賦形剤としての塩化ナトリウムおよび緩衝剤。
【００５３】
さらに他の態様において、本発明は、下記を含む、１３価ＰＣＶを配合するための血清型組成物を提供する：
−  ＣＤＡＰを用いて活性化された１３種類の血清型に属する既知サイズの肺炎球菌莢膜多糖類を、個別に免疫原キャリヤータンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせる；
−  個別の一価肺炎球菌コンジュゲートを透析濾過し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する；
−  画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、一価肺炎球菌コンジュゲートを含有する画分をプールした後、０．２μｍフィルターを用いてフィルター滅菌する；そして
−  血清型６Ｂについては４．４μｇ、残りの血清型については２．２μｇの１３種類の一価肺炎球菌コンジュゲート、およびＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）アジュバントを、適切な賦形剤および緩衝剤と共に用いて１３価ＰＣＶを配合し、続いて無菌充填する。
【００５４】
ＰＣＶ  １３の血清型組成物は、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆおよび３３Ｆを含有する。
さらに他の態様において、本発明は、下記を含む、１４価ＰＣＶを配合するための血清型組成物を提供する：
−  ＣＤＡＰを用いて活性化された１３種類の血清型に属する既知サイズの肺炎球菌莢膜多糖類を、個別に免疫原キャリヤータンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせる；
−  個別の一価肺炎球菌コンジュゲートを透析濾過し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する；
−  画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、一価肺炎球菌コンジュゲートを含有する画分をプールした後、０．２μｍフィルターを用いてフィルター滅菌する；そして
−  血清型６Ｂについては４．４μｇ、残りの血清型については２．２μｇの一価肺炎球菌コンジュゲート、およびＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）アジュバントを、適切な賦形剤および緩衝剤と共に用いて１４価ＰＣＶを配合し、続いて無菌充填する。
【００５５】
ＰＣＶ  １４の血清型組成物は、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する。
キャリヤータンパク質は、好ましくは無毒性かつ非反応原性(non-reactogenic)であって十分な量および純度で入手できるタンパク質である。キャリヤータンパク質を肺炎連鎖球菌多糖類とコンジュゲートまたは連結させて、多糖類の免疫原性を増強することができる。キャリヤータンパク質は標準的なコンジュゲーション処理を受けやすくなければならない。本発明の特定の態様において、ＣＲＭ１９７をキャリヤータンパク質として用いる。一態様において、それぞれの莢膜多糖類を単一のキャリヤータンパク質にコンジュゲートさせる。他の態様において、莢膜多糖類を２種類以上のキャリヤータンパク質にコンジュゲートさせる。
【００５６】
他の態様において、肺炎連鎖球菌に由来する莢膜多糖類を１種類以上のキャリヤータンパク質、たとえば下記のものにコンジュゲートさせることができる：不活化した細菌トキシン、たとえば破傷風トキソイド、百日咳トキソイド；コレラトキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のエキソトキシンＡ、細菌外膜タンパク質、たとえば外膜複合体ｃ(outer membrane complex c)（ＯＭＰＣ）、ポーリン(porin)、トランスフェリン(transferrin)結合タンパク質、ニューモリシン(pneumolysin)、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群連鎖球菌に由来するＣ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌プロテインＤ。他のタンパク質、たとえばオボアルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン(keyhole limpet hemocyanin)（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体(purified protein derivative)（ＰＰＤ）もキャリヤータンパク質として使用できる。
【００５７】
各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、有意の有害事象なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は肺炎球菌血清型に応じて異なる可能性がある。一般に、各ワクチン用量は０．１〜５０μｇ、好ましくは０．１〜１０μｇ、より好ましくは１〜５μｇのそれぞれの多糖類を含むであろう。
【００５８】
本発明の好ましい態様において、ＰＣＶは、個別にＣＲＭ１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆの莢膜多糖類からなる１４価の無菌液体配合物である。各０．５ｍＬ用量は下記のものを含有するように配合される：２μｇのそれぞれの多糖類、ただし６Ｂについては４μｇ；約３２μｇのＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝剤。
【００５９】
本発明のさらに他の好ましい態様において、ＰＣＶは、個別にＣＲＭ１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆおよび３３Ｆの莢膜多糖類からなる１３価の無菌液体配合物である。各０．５ｍＬ用量は下記のものを含有するように配合される：２μｇのそれぞれの多糖類、ただし６Ｂについては４μｇ；約３２μｇのＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝剤。
【００６０】
本発明のさらに他の好ましい態様において、ＰＣＶは、個別にＣＲＭ１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆおよび３３の莢膜多糖類からなる１３価の無菌液体配合物である。各０．５ｍＬ用量は下記のものを含有するように配合される：２μｇのそれぞれの多糖類、ただし６Ｂについては４μｇ；約３２μｇのＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；ならびに塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝剤。
【００６１】
本発明の方法によれば、対象はヒトである。特定の態様において、ヒト患者は乳児（１歳未満）、幼児（おおよそ１２〜２４か月）、または小児（おおよそ２〜５歳）である。他の態様において、ヒト患者は高齢患者（＞６５歳）である。本発明の組成物はより年長の児童、青年および成人（たとえば、１８〜４５歳または１８〜６５歳）について用いるのにも適する。
【００６２】
本発明はまた、免疫学的有効量の前記の多価免疫原組成物をヒトに投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖類コンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
本明細書において有効量は、免疫化された対象の感染重症度が低減するように抗体を誘発するのに十分であるかまたはその可能性が最も高い用量を表わす。
【実施例】
【００６３】
以下の例は本発明を説明するために提示され、説明の目的のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
実施例１
個別の肺炎球菌多糖類をキャリヤータンパク質にコンジュゲートさせて多糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを形成する
多糖類サイズの低減：
第１工程で、多糖類（Ｐｓ）溶液を高圧ホモジナイザーに通して多糖類の分子サイズを低減し、続いて１００ｋＤａのＭＷＣＯメンブレンを用いる濃縮および透析濾過工程を実施した。こうして調製したサイズ調整多糖類をコンジュゲーションに用いた。
【００６４】
多糖類の活性化およびキャリヤータンパク質とのコンジュゲーション：
おおよそ１：１の比率の多糖類（６．０ｍＬのＰｓ，濃度１０ｍｇ／ｍＬ）とＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍＬ，アセトニトリル中（ｗ／ｖ））をガラスバイアル内で混合し、１分間撹拌した。０．２Ｍトリエチルアミンで多糖類のｐＨを９．２５に調整し、室温（ＲＴ）で３分間撹拌した。（４．０ｍＬ，濃度１５．０ｍｇ／ｍＬ）ＣＲＭ１９７を活性化多糖類に１：１．５（Ｐｓ：キャリヤータンパク質）の比率になるように徐々に添加した。０．２Ｍトリエチルアミンで反応のｐＨを約９．０５に調整し、撹拌下に室温で５時間、反応を継続し、最後に過剰濃度のグリシンを添加することにより反応を停止した。
【００６５】
１００ｋＤａのＭＷＣＯメンブレンを用いて反応混合物を透析濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、コンジュゲートを含有する画分をプールし、０．２μｍフィルターで無菌濾過した。この材料を一価コンジュゲートバルクと呼んだ。１４種類の血清型についてのすべての一価コンジュゲートバルクを同様な方法で作成した。
【００６６】
実施例２
ワクチンへの多価多糖類−ＣＲＭ１９７の配合
３種類の個々の配合物、すなわち配合物Ａ（１３価：１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆおよび２３Ｆ）、配合物Ｂ（１３価：１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）および配合物Ｃ（１４価：１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）を調製した。上記配合物において、それらの組成に従って１３種類の血清型（１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）それぞれの一価コンジュゲート無菌バルク２．２μｇ、および６Ｂ一価コンジュゲート無菌バルク４．４μｇを正確に測定した。それぞれの一価バルクコンジュゲートを１種類ずつブレンディング容器に連続撹拌（約１５０ｒｐｍ）下で徐々に移し（滴状で）、ｐＨ６．５で２分間、撹拌を続けた。
【００６７】
上記のミックスに対して、Ａｌ＋３の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を正確に測定し、上記のブレンディング容器に連続撹拌（約１５０ｒｐｍ）下で徐々に滴状で移した。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の添加が完了した後、このシステムをそのまま２分間撹拌した。溶液の最終ｐＨを５．８±０．２に調整し、冷蔵庫内において約１５０ｒｐｍ／５℃±３℃で２時間、撹拌を続けた。撹拌が完了した後、ワクチンを空気層流ユニット内で無菌的にバイアルに充填し、５℃±３℃のチャンバーに保存した。
【００６８】
実施例３
免疫原性試験
本発明に従って製造した肺炎球菌コンジュゲート配合物の免疫原性を、ウサギ免疫モデルにおいて査定した。グループサイズ７の５グループの雌ウサギ（成体、未経産および非妊娠；体重２．０〜２．５ｋｇ）をこの試験に採用した。３種類の配合物、すなわち配合物Ａ、配合物Ｂ、配合物Ｃ；比較ワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ  １３（商標））およびプラセボをこの試験に含めた（表１）。配合物の価数に関係なく、単回ヒト用量相当量を０．５ｍｌの投与体積でウサギに投与した。各グループのウサギに、その部位を適宜準備した後、各配合物を用いて筋肉内経路により１４日間隔で１、１５および２９日目に３回投与した。それらを０、１２、２６および４０日目、すなわち正確に配合物投与の１１日後に人道的に試験採血した。凝固血液試料から血清試料を分離した後、それらを−２０℃でアリコートとして保存した。血清試料を免疫前血清(preimmune serum)（ＰＩＳ；０日目）、免疫血清−投与後１(post dose 1)（ＰＤ１；１２日目）、免疫血清−投与後２（ＰＤ２；２６日目）、および免疫血清−投与後３（ＰＤ３；４０日目）と表示した。
【００６９】
【表１】
2018518512.tif 000002
【００７０】
個々の肺炎球菌莢膜多糖類（ＣＰＳ）に対するＩｇＧの力価を、本質的に標準ＷＨＯ  ＥＬＩＳＡプロトコルに従い、わずかに変更したＥＬＩＳＡの使用により測定した。ＡＴＣＣ，ＵＳＡ／Ｓｔａｔｅｎｓ  ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（デンマーク）から入手したＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートを、精製した肺炎球菌ＣＰＳの固定化に用いた。２３価肺炎球菌多糖類ワクチンの２３種類の血清型に対する抗ＣＰＳ  ＩｇＧを含有することが知られている００７ｓｐ国際肺炎球菌標準血清を陽性対照として用いた。被験および対照血清試料を間接ＥＬＩＳＡにより試験する前にＣＷＰＳ  Ｍｕｌｔｉ（商標）で製造業者の指示に従って吸着することにより、非機能性の細胞壁多糖類(cell wall polysaccharide)（ＣＷＰＳ）反応性ＩｇＧを枯渇させた。プロテインＡとプロテインＧの結合特異性を合わせた組換えタンパク質Ａ／Ｇペルオキシダーゼコンジュゲートを、ウサギおよびヒトＩｇＧの万能検出に用いた。特定グループからの個々のウサギについての抗ＣＰＳ  ＩｇＧ力価を、方程式［ブランクの平均ＯＤ×２］を用いて計算したカットオフに基づいて決定した。最後に、配合物Ａ、配合物Ｂ、配合物Ｃ、Ｐｒｅｖｎａｒ  １３（商標）およびプラセボにより誘導された抗ＣＰＳ  ＩｇＧの幾何平均力価（ＧＭＴ）を計算した（図１〜５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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