(57)【要約】鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の害虫種に対する毒性活性を示す殺虫性タンパク質のクラスが開示され、それにはＴＩＣ５２９０が挙げられるが、これに限定されない。ＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含有するＤＮＡ構築物が提供される。本発明のＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含有し、鱗翅目、鞘翅目及び半翅目の侵襲に対して抵抗性のトランスジェニックの植物、植物細胞、種子及び植物の一部が提供される。生体試料にて本発明の組換え核酸配列またはタンパク質の存在を検出する方法、及びＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質を用いて鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の種の害虫を防除する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに操作可能に連結される異種プロモータを含む組換え核酸分子であって、
（ａ）前記殺虫性タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含み；または
（ｂ）前記殺虫性タンパク質が配列番号２に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントが配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、前記組換え核酸分子。
【請求項２】
（ａ）前記組換え核酸分子が植物にて前記殺虫性タンパク質を発現するように機能する配列を含む；または
（ｂ）前記組換え核酸分子が植物細胞で発現されて殺虫剤として有効な量の前記殺虫性タンパク質を産生する；または
（ｃ）前記組換え核酸分子がベクターとの操作可能な連結にあり、前記ベクターがプラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド、及び細菌のまたは酵母の人工染色体から成る群から選択される請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
宿主細胞内に存在すると定義され、前記宿主細胞が細菌細胞及び植物細胞から成る群から選択される請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記細菌宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａから成る群から選択される細菌の属に由来する請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓの種がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓがＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｕｓであり、または前記ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである請求項４に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
前記植物細胞が、双子葉植物または単子葉植物の細胞である請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
前記植物宿主細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ブラッシア、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、パーム、牧草、マメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞から成る群から選択される請求項６に記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
前記殺虫性タンパク質が鞘翅目の昆虫に対して活性を示す請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項９】
前記昆虫が、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシココーンルートワーム、ブラジルコーンルートワーム、またはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａとから成るブラジルコーンルートワーム複合体である請求項８に記載の組換え核酸分子。
【請求項１０】
前記殺虫性タンパク質が鱗翅目の昆虫種に対して活性を示す請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項１１】
前記昆虫が、ハッショウマメ毛虫、サトウキビ害虫、メイガ科のガの幼虫、アメリカタバコガの幼虫、ニセアメリカタバコガ、ダイズシャクトリムシ、クロアワヨトウの幼虫、サザンアワヨトウの幼虫、ツマジロクサヨトウの幼虫、シロイチモンジヨトウ、旧大陸ワタアカミムシガ、東洋リーフワーム、ピンクワタアカミムシガ、クロヨトウムシ、サウスウエスタンマツマダラメイガ、またはヨーロッパマツマダラメイガである請求項１０に記載の組換え核酸分子。
【請求項１２】
前記殺虫性タンパク質が半翅目の昆虫に対して活性を示す請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項１３】
前記昆虫が、ウエスタンミドリメクラガメ、ミドリメクラガメまたはワタノミハムシである請求項１２に記載の組換え核酸分子。
【請求項１４】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含む植物またはその一部。
【請求項１５】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である請求項１４に記載の植物またはその一部。
【請求項１６】
前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ブラッシア、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、パーム、牧草、マメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギから成る群から選択される請求項１４に記載の植物またはその一部。
【請求項１７】
請求項１４に記載の植物の種子であって、前記種子が前記組換え核酸分子を含む、前記種子。
【請求項１８】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含む昆虫阻害組成物。
【請求項１９】
さらに、前記殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１８に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ及び補助タンパク質から成る群から選択される請求項１９に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の１以上の害虫種に対して活性を示す請求項１９に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの他の殺虫性タンパク質が、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃ変異体、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａ変異体、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−ＡＸＭＩ−、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、及びＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ−１５０、ＡＸＭＩ−１７１、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９、ＡＸＭＩ−２０５、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ及びＡＸＭＩ−２２５ｚ、ＡＸＭＩ−２３８、ＡＸＭＩ−２７０、ＡＸＭＩ−２７９、ＡＸＭＩ−３４５、ＡＸＭＩ−３３５、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びその変異体、ＩＰ３及びその変異体、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−５、ＤＩＧ−１０、ＤＩＧ−６５７及びＤＩＧ−１１タンパク質から成る群から選択される請求項２１に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２３】
前記組換え核酸分子を発現する植物細胞を含むと定義される請求項１８に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２４】
請求項１４に記載の植物またはその一部から製造される商品生産物であって、前記商品生産物が検出可能な量の前記組換え核酸分子またはそれによってコードされる殺虫性タンパク質を含む、前記商品生産物。
【請求項２５】
穀類取扱業者によって袋詰めにされる商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、サイレージ用トウモロコシ、コーンスターチ、コーンシリアル、等、その全体または加工された綿実、綿油、リント布、種子及び飼料または食糧、繊維、紙、バイオマスのために加工される植物の一部、及び綿油または綿繰り機廃棄物に由来するペレットに由来する燃料のような燃料製品、その全体または加工されたダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズ糠、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、及びダイズ植物やダイズ植物の一部を用いて生産される燃料製品から成る群から選択される請求項２４に記載の商品生産物。
【請求項２６】
種子の生産方法であって、
（ａ）請求項１７に記載の少なくとも第１の種子を植え付けることと、
（ｂ）前記種子に由来する植物を生育させることと、
（ｃ）前記植物から種子を収穫することとを含み、その際、前記収穫された種子が前記組換え核酸分子を含む、前記生産方法。
【請求項２７】
昆虫の侵襲に対する植物の抵抗性であって、前記植物の前記細胞が請求項１に記載の組換え核酸分子を含む、前記植物の抵抗性。
【請求項２８】
鞘翅目または鱗翅目または半翅目の種の害虫または害虫の侵襲の防除方法であって、前記方法が、
（ａ）殺昆虫剤として有効な量の配列番号２で示されるような殺虫性タンパク質に前記害虫を接触させること、または
（ｂ）殺昆虫剤として有効な量の、配列番号２に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１以上の殺虫性タンパク質に前記害虫を接触させることを含む、前記防除方法。
【請求項２９】
植物のゲノムＤＮＡを含む試料にて請求項１に記載の組換え核酸分子の存在を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む植物に由来するゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリッド形成条件下にてハイブリッド形成するが、請求項１に記載の組換え核酸分子を含まない別の同系植物のゲノムＤＮＡとはそのようなハイブリッド形成条件下ではハイブリッド形成しない核酸プローブに前記試料を接触させ、その際、前記プローブは、配列番号１、配列番号３と相同性もしくは相補性である、または配列番号２に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列であることと、
（ｂ）前記試料とプローブとをストリンジェントなハイブリッド形成条件に供することと、
（ｃ）前記プローブの前記試料におけるＤＮＡとのハイブリッド形成を検出することとを含む、前記方法。
【請求項３０】
タンパク質を含む試料にて殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法であって、前記殺虫性タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含み；または前記殺虫性タンパク質が配列番号２に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ａ）前記試料を免疫反応性の抗体に接触させることと、
（ｂ）前記タンパク質の前記存在を検出することとを含む、前記方法。
【請求項３１】
検出する前記工程がＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１５年７月３０日に出願された米国仮特許出願番号６２／１９９，０２４の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組込み
配列表のコンピュータ可読形態を含有する「ＭＯＮＳ３９４ＷＯ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けたファイルを２０１６年７月１９日に作製した。このファイルは１６，０７７バイト（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定した）であり、電子出願（米国特許局ＥＦＳ−Ｗｅｂ出願システムを用いて）によって同時に出願され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般に昆虫阻害タンパク質の分野に関する。作物及び種子の農業に関連する害虫に対する昆虫阻害活性を示す新規クラスのタンパク質が開示される。特に、開示されているタンパク質は、作物及び種子の農業に関連する害虫、昆虫害虫の特に鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の種に対して殺虫剤としての活性がある。開示されている毒素タンパク質の１以上をコードする組換えポリヌクレオチド構築物を含有する植物、植物の一部及び種子が提供される。
【背景技術】
【０００４】
数ある中でもトウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、コメ、コムギ、野菜及び綿を含む農業上意義のある植物からの作物収量を改善することはますます重要になってきている。増え続ける人口を養い、衣類を着せ、エネルギーを供給するための農業生産物に対する増え続けるニーズに加えて、気候関連の影響及び農作業のため以外の土地を使用する増え続ける集団からの圧力は、農業に利用できる耕作可能な土地の量を減らすと予測されている。これらの因子は、特に植物バイオテクノロジー及び農学の実践における主要な改善がない状況で食糧安全保障の厳しい予想をもたらしている。これらの圧力を踏まえると、技術、農業技法及び害虫管理における環境的に持続可能な改善は農業に利用できる限られた量の耕作可能な土地で作物生産を拡大するために欠かせないツールである。
【０００５】
昆虫、特に鱗翅目、鞘翅目及び半翅目の範囲内での昆虫は、農作物の損傷の主要な原因と見なされ、それによって被害領域にわたって作物収量が低下する。農業に悪い影響を与える鱗翅目の害虫種には、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ及びＰｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａが挙げられるが、これらに限定されない。農業に悪い影響を与える鞘翅目の害虫種には、Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｔｏｍａｒｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｔｉｂｉａｌｉｓ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｕｒｃｕｌｉｏ  ｓｐｐ．、Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｐ．、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｅｍｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ  ｓｐｐ．、Ｏｒｙｃａｅｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｈｌｙｃｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ  ｓｐｐ．、Ｓｃａｒａｂｅｉｄａｅ、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ  ｓｐｐ．、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．及びＴｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐが挙げられるが、これらに限定されず、特にその際、害虫は、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ（メキシココーンルートワーム、ＭＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ（ブラジルコーンルートワーム（ＢＺＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ（サザンルートワーム、ＳＣＲ）、及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａから成るブラジルルートワーム複合体（ＢＣＲ））である。農業に悪い影響を与える半翅目の害虫種には、Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ、Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ及びＰｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００６】
歴史的には、農業における害虫駆除剤として合成化学殺虫剤の広範な適用が当てにされていた。出現している耐性の問題に加えて環境及びヒトの健康に関する懸念が生物学的殺虫剤の研究と開発のきっかけとなった。この研究尽力によって細菌を含む種々の昆虫病原性微生物種の漸進的な発見及び使用がもたらされた。
【０００７】
昆虫病原性細菌、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の潜在力が発見され、生物学的害虫駆除剤として開発されると、生物防除の枠組みが変わった。細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）株が特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されて以来、細菌Ｂｔの株は殺虫性タンパク質の供給源として用いられている。Ｂｔ株は、胞子形成の開始時及び増殖の定常期の間に副胞子結晶封入体の中に位置する（たとえば、Ｃｒｙタンパク質）δエンドトキシンを産生することが知られ、及び分泌される殺昆虫性タンパク質を産生することも知られている。受容昆虫による摂取の際、δエンドトキシンは分泌された毒素と同様に中腸上皮の表面にてその効果を発揮し、細胞膜を破り、細胞の破壊と細胞死をもたらす。殺昆虫性タンパク質をコードする遺伝子は、他のＢａｃｉｌｌｕｓ及びたとえば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（以前はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓとして知られた「Ｌｓ」）及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅのような多様な追加の細菌種を含む、Ｂｔ以外の細菌種でも特定されている。
【０００８】
結晶性及び分泌される可溶性の殺昆虫性毒素はその宿主に高度に特異的であり、化学殺虫剤の代替物として世界中で広く受け入れられている。たとえば、種々の農業応用にて殺昆虫性毒素タンパク質を採用して昆虫の侵襲から農業上重要な植物を保護し、化学殺虫剤の適用の必要性を減らし、収量を高めている。殺昆虫性毒素タンパク質を用いて、たとえば、種々の細菌株を含有する微生物製剤を植物表面に分散させる噴霧のような機械的な方法によって、及び殺昆虫性毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック植物や種子を作出する遺伝的形質転換法を使用することによって、作物の農業上関連する害虫を防除する。
【０００９】
殺昆虫性毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック植物の使用は世界中で適応している。たとえば、２０１２年では、２６，１００，０００ヘクタールにＢｔ毒素を発現しているトランスジェニック作物が植えられた（Ｊａｍｅｓ，Ｃ．，Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＭ  Ｃｒｏｐｓ：２０１２．ＩＳＡＡＡ  Ｂｒｉｅｆ  Ｎｏ．４４）。昆虫から保護されるトランスジェニック作物の世界的な使用とこれらの作物で使用される限られた数の殺昆虫性毒素タンパク質とが、現在利用されている殺昆虫性タンパク質に対する耐性を付与する既存の昆虫対立遺伝子について選択圧を作り出している。
【００１０】
殺昆虫性毒素タンパク質に対する標的害虫における耐性の発生は、殺昆虫性毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック作物に対する昆虫の耐性の上昇を管理するのに有用である新しい形態の殺昆虫性毒素タンパク質の発見及び開発のための連続する必要性を作り出している。改善された有効性を持ち、受容昆虫種の広いスペクトルにわたって防除を示す新しいタンパク質毒素は耐性対立遺伝子を発生することができる生き延びる昆虫の数を減らすであろう。加えて、１つの植物での同じ昆虫害虫に対して毒性であり、異なる作用様式を示す２以上のトランスジェニック殺昆虫性毒素タンパク質の使用は単一の標的昆虫種における耐性の可能性を低くする。
【００１１】
従って、本発明者らは本明細書にて、標的の鱗翅目、鞘翅目及び半翅目の害虫種に対して、特にウエスタンコーンルートワームに対して殺昆虫活性を示す、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに由来する新規のタンパク質毒素ファミリーと共に類似の毒素タンパク質、変異タンパク質、及び例となる組換えタンパク質を開示する。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書で開示されているのは、本明細書ではＴＩＣ５２９０と呼ばれ、作物の１以上の害虫に対して阻害活性を呈することが示されている昆虫阻害活性を持つ殺虫性タンパク質（毒素タンパク質）の新規の群である。ＴＩＣ５２９０タンパク質及びＴＩＣ５２９０タンパク質毒素のクラスにおけるタンパク質は単独で使用することができ、または製剤及び植物内で他の殺昆虫性タンパク質及び毒物との併用で使用することができるので、農業系で現在使用されている殺昆虫性タンパク質及び殺虫性化学物質の代替物を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本出願で開示されているのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに操作可能に連結される異種プロモータを含む組換え核酸分子であり、その際、（ａ）前記殺虫性タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は配列番号２に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントは配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成する；または（ｄ）殺虫性タンパク質またはその断片をコードする前記ポリヌクレオチドセグメントは配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；または（ｅ）前記組換え核酸分子はベクターとの操作可能な結合にあり、前記ベクターはプラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド及び細菌または酵母の人工染色体から成る群から選択される。組換え核酸分子は、植物にて殺虫性タンパク質を発現するように機能する；または植物細胞で発現させて殺虫剤として有効な量の殺虫性タンパク質を産生する配列を含むことができる。
【００１４】
本出願の別の実施形態では、宿主細胞は本出願の組換え核酸分子を含み、その際、該宿主細胞は細菌細胞及び植物細胞から成る群から選択される。熟考される宿主細胞には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａが挙げられる。特定の実施形態では、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓはＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｕｓであり、または前記ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。熟考される植物宿主細胞には、双子葉植物細胞及び単子葉植物細胞が挙げられる。さらに熟考される植物宿主細胞には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ブラッシア、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐ．）、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、パーム、牧草、マメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞が挙げられる。
【００１５】
さらに別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシココーンルートワーム、ブラジルコーンルートワーム、またはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａとから成るブラジルコーンルートワーム複合体を含む鞘翅目昆虫に対する活性を示す。
【００１６】
別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、ハッショウマメ毛虫、サトウキビ害虫、メイガ科のガの幼虫、アメリカタバコガの幼虫、ニセアメリカタバコガ、ダイズシャクトリムシ、クロアワヨトウの幼虫、サザンアワヨトウの幼虫、ツマジロクサヨトウの幼虫、シロイチモンジヨトウ、旧大陸ワタアカミムシガ、東洋リーフワーム、ピンクワタアカミムシガ、クロヨトウムシ、サウスウエスタンマツマダラメイガ、コナガ、またはヨーロッパマツマダラメイガを含む鱗翅目昆虫に対して活性を示す。
【００１７】
さらに別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、ウエスタンサビイロメクラガメ、サビイロメクラガメ、またはワタノミハムシを含む半翅目昆虫に対して活性を示す。
【００１８】
本出願で熟考されるのはまた、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに操作可能に連結される異種プロモータを含む組換え核酸分子を含む植物であり、その際、（ａ）前記殺虫性タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は配列番号２に対して少なくとも６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントはストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリッド形成し；または（ｄ）前記植物は検出可能な量の前記殺虫性タンパク質を提示する。特定の実施形態では、殺虫性タンパク質は配列番号２を含む。一実施形態では、植物は単子葉植物または双子葉植物のいずれかである。別の実施形態では、植物は、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ブラッシア、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、パーム、牧草、マメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギから成る群から選択される。
【００１９】
さらなる実施形態では、組換え核酸分子を含む種子が開示される。
【００２０】
別の実施形態では、本出願で開示されている組換え核酸分子を含む昆虫阻害組成物が熟考される。昆虫阻害組成物はさらに、前記殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。少なくとも１つの他の殺虫剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子及び補助タンパク質から成る群から選択される。昆虫阻害組成物における少なくとも１つの他の殺虫剤は鱗翅目、鞘翅目または半翅目の１以上の害虫種に対して活性を示す。昆虫阻害組成物における少なくとも１つの他の殺虫剤は一実施形態では、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃ変異体、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａ変異体、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−ＡＸＭＩ−、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、及びＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ−１５０、ＡＸＭＩ−１７１、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９、ＡＸＭＩ−２０５、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ及びＡＸＭＩ−２２５ｚ、ＡＸＭＩ−２３８、ＡＸＭＩ−２７０、ＡＸＭＩ−２７９、ＡＸＭＩ−３４５、ＡＸＭＩ−３３５、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びその変異体、ＩＰ３及びその変異体、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−５、ＤＩＧ−１０、ＤＩＧ−６５７及びＤＩＧ−１１タンパク質から成る群から選択される。
【００２１】
本出願で開示されている検出可能な量の組換え核酸分子を含む商品生産物が熟考される。そのような商品生産物には、穀類取扱業者によって袋詰めにされる商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、サイレージ用トウモロコシ、コーンスターチ、コーンシリアル、等、及びたとえば、その全体または加工された綿実、綿油、リント布、種子及び飼料または食糧、繊維、紙、バイオマスのために加工される植物の一部、及び綿油または綿繰り機廃棄物に由来するペレットに由来する燃料のような燃料製品のような相当する綿の商品生産物、及びたとえば、その全体または加工されたダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズ糠、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、及びダイズ植物やダイズ植物の一部を用いて生産される燃料製品のような相当するダイズの商品生産物、及び相当するコメ、コムギ、ソルガム、キマメ、ピーナッツ、果実、メロン、及び当てはまれば、ジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレードを含む野菜商品生産物、及び検出可能な量の本出願のそのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドを含有するそのような商品生産物の他の食用形態が挙げられる。
【００２２】
本出願で熟考されるのはまた、本出願で開示されている組換え核酸分子を含む種子を生産する方法である。該方法は、本出願で開示されている組換え核酸分子を含む種子の少なくとも１つを植えることと、種子に由来する植物を生育させることと、植物から種子を収穫することとを含み、その際、収穫された種子は本出願の組換え核酸分子を含む。
【００２３】
別の説明に役立つ実施形態では、昆虫侵襲に対する植物の抵抗性が提供され、その際、前記植物の細胞は、（ａ）殺虫剤として有効な量の配列番号２で示されるような殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子；または（ｂ）配列番号２に対して少なくとも６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫剤として有効な量のタンパク質を含む。
【００２４】
本出願で開示されているのはまた、鞘翅目または鱗翅目または半翅目の種の害虫を防除する方法及び植物、特に作物の鞘翅目または鱗翅目または半翅目の種の害虫侵襲を防除する方法である。方法は、一実施形態では、（ａ）殺虫剤として有効な量の配列番号２で示されるような１以上の殺虫性タンパク質に害虫を接触させること、または（ｂ）配列番号２に対して少なくとも６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫剤として有効な量の１以上の殺虫性タンパク質に害虫を接触させることを含む。
【００２５】
本明細書でさらに提供されるのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む組換え核酸分子の存在を検出する方法であり、その際、（ａ）前記殺虫性タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は配列番号２に対して少なくとも６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントは配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。本発明の一実施形態では、方法は、本明細書で提供されている殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む植物のゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリッド形成条件下にてハイブリッド形成するが、そのセグメントを含まない別の同系植物のゲノムＤＮＡとはそのようなハイブリッド形成条件下ではハイブリッド形成しない核酸プローブに核酸の試料を接触させることを含み、その際、プローブは、配列番号１、配列番号３に対して相同性もしくは相補性であり、または配列番号２に対して少なくとも６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列である。方法はさらに、（ａ）試料とプローブとをストリンジェントなハイブリッド形成条件に供することと、（ｂ）プローブの試料におけるＤＮＡとのハイブリッド形成を検出することとを含む。
【００２６】
本発明によって提供されるのはまた、タンパク質を含む試料にて殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法であり、その際、前記殺虫性タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み；または前記殺虫性タンパク質は配列番号２に対して少なくとも６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、方法は（ａ）免疫反応性の抗体に試料を接触させることと、（ｂ）タンパク質の存在を検出することとを含む。一部の実施形態では、検出する工程はＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】例となる葉緑体を標的とする及び標的としないＴＩＣ５２９０タンパク質の植物内でのウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）の阻害活性を示す図である。
【００２８】
配列の簡単な説明
配列番号１はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ種ＥＧ６６５７から得られたＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質の配列をコードする核酸である。
【００２９】
配列番号２はＴＩＣ５２９０タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号３は植物細胞での発現のために使用されるＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質をコードする合成コーディング配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
農業の害虫駆除の技術における課題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対してスペクトルの広い毒性を示し、望ましくない農業問題を起こすことなく植物にて発現させることができ、植物で商業的に使用されている現在の毒素に比べて代替モードの作用を提供する新しい毒素タンパク質の必要性として特徴づけることができる。
【００３２】
新規の殺昆虫性タンパク質が本明細書で開示され、鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の害虫に対して、さらに詳しくはコーンルートワーム害虫種に対して抵抗性を提供するＴＩＣ５２９０及び関連するファミリーメンバーによって例示される。開示されるのはまた、ＴＩＣ５２９０をコードする植物細胞での発現のために指定された合成コーディング配列である。さらに開示されるのは、ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質、または関連するファミリーメンバーまたはその断片をコードするコーディング配列への操作可能な連結にてプロモータを含む組換え核酸分子である。
【００３３】
本出願におけるＴＩＣ５２９０、「ＴＩＣ５２９０タンパク質」、「ＴＩＣ５２９０タンパク質毒素」、「ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質」、「ＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ５２９０−関連毒素」、または「ＴＩＣ５２９０−関連毒素タンパク質」等への言及は、タンパク質のＴＩＣ５２９０との配列比較が約６５〜約１００パーセントの分画比率のアミノ酸配列同一性を生じるのであれば、殺虫活性または昆虫阻害活性を示すそのようなタンパク質を含む、鞘翅目害虫、鱗翅目害虫及び半翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ５２９０（配列番号２）の殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質の配列及びその殺虫セグメントまたは昆虫阻害セグメントまたはそれらの組み合わせを含む、それらから成る、それらに実質的に相同である、それらに類似する、またはそれらに由来する新規の殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指す。
【００３４】
用語「セグメント」または「断片」は、ＴＩＣ５２９０タンパク質または関連するファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質を記載する完全なアミノ酸配列または核酸配列よりも短い連続するアミノ酸配列または核酸配列を記載するのに本出願では使用される。昆虫阻害活性を示すセグメントまたは断片は、そのようなセグメントまたは断片の配列番号２で示されるＴＩＣ５２９０タンパク質の対応する区分との配列比較がセグメントまたは断片とＴＩＣ５２９０タンパク質の対応する区分との間で約６５〜約１００パーセントの分画比率のアミノ酸配列同一性を生じるのであれば、本出願でも開示される。
【００３５】
用語「活性がある」または「活性」、「殺虫活性」または「殺虫性」または「殺昆虫活性」、「昆虫阻害」または「殺昆虫性」は、害虫を阻害すること（増殖、摂食、繁殖力または生存性を阻害すること）、抑制すること（増殖、摂食、繁殖力または生存性を抑制すること）、防除すること（有効量のＴＩＣ５２９０タンパク質を含有する特定の作物にて害虫の侵襲を防除すること、害虫の摂食活動を防除すること）、または害虫を殺傷すること（害虫の病的状態、死すべき運命または低下した繁殖力を引き起こすこと）におけるタンパク質毒素のような毒物の有効性を指す。これらの用語は、害虫の毒性タンパク質への曝露が病的状態、死すべき運命、低下した繁殖力または成長阻害を生じる、殺虫性剤として有効な量の毒性タンパク質を害虫に提供する結果を含むように意図される。これらの用語は、殺虫剤として有効な量の毒性タンパク質を植物内にまたは植物上に提供した結果としての、植物、植物の組織、植物の一部、種子、植物細胞からの、または植物が生育してもよい特定の地理的な位置からの害虫の撃退も含む。一般に、殺虫活性は、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の昆虫を含むが、これらに限定されない特定の標的害虫の、このタンパク質、タンパク質断片、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドの昆虫摂食によって引き起こされる増殖、発達、生存性、摂食行動、交配行動、繁殖力を阻害すること、または有害効果における測定可能な減少にて有効である毒性タンパク質の能力を指す。毒性タンパク質は、植物によって産生され得るし、または植物に、もしくは植物が位置づけられる位置の範囲内での環境に適用され得る。用語「生物活性」、「効果的な」、「有効な」またはその変形は、本発明のタンパク質の標的昆虫害虫に対する効果を記載するのに本出願で相互交換可能に利用される用語でもある。
【００３６】
殺虫剤として有効な量の毒物は、標的害虫の餌として提供されると、毒物が害虫に接触した際、殺虫活性を示す。毒物は殺虫性タンパク質または当該技術で既知の１以上の化学剤であることができる。殺虫性または殺昆虫性の化学剤及び殺虫性または殺昆虫性のタンパク質作用剤は単独で使用することができ、または互いに併用することができる。化学剤には、標的害虫にて抑制のために特定の遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子、有機塩化物、有機リン酸エステル、カルバメート、ピレスロイド、ネオニコチノイド、及びリアノイドが挙げられるが、これらに限定されない。殺虫性または殺昆虫性のタンパク質作用剤には、本出願で示されるタンパク質毒素と同様に鱗翅目、鞘翅目及び半翅目の害虫種を標的とするものを含む他のタンパク質様の毒物と同様に同翅目種を防除することにおいて使用するための当該技術で利用できるＣｒｙタンパク質のような他の植物害虫を防除するのに使用されるタンパク質毒素が挙げられる。
【００３７】
害虫、特に作物の害虫への言及は作物の昆虫害虫、特にＴＩＣ５２９０タンパク質によって防除されるものを意味することが意図される。しかしながら、害虫への言及はまた、これらの害虫を標的とする毒物がＴＩＣ５２９０タンパク質またはＴＩＣ５２９０に対して約６５〜約１００パーセント同一であるタンパク質と同時局在化するまたは一緒に存在する場合、植物の同翅目昆虫害虫と同様に線虫及び真菌も含むことができる。
【００３８】
ＴＩＣ５２９０タンパク質毒素クラスの殺昆虫性タンパク質は共通する機能によって関連付けられ、鞘翅目に由来する昆虫害虫、及び成虫、蛹、幼虫及び子虫を含む鱗翅目昆虫種、と同様に成虫及び若虫を含む半翅目昆虫種に向けた殺昆虫活性を示す。
【００３９】
鱗翅目の昆虫には、ヤガ科におけるアーミーワーム、ネキリムシ、シャクトリムシ及びタバコガ、たとえば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、シロイチモンジョトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、バーサヨトウムシ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ）、クロネキリムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、キャベツシャクトリムシ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ハッショウマメイモムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、カリュウネキリムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、アーミーワーム（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、ウエスタンネキリムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）；Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科に由来する穿孔虫、繭を作る昆虫、ウエブワーム、コーンワーム、キャベツムシ及び葉を食い荒らす幼虫、たとえば、ヨーロッパマツマダラメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ネーブルオレンジワーム（Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、コーンルートウエブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、芝生ウエブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ヒマワリガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科におけるハマキガ、植物の芽を貪り食う虫、シードワーム、及び果実を食害する虫、たとえば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、グレープベリーモス（Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ）、オリエンタルフルーツモス（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、ヒマワリ芽ガ（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）；及び他の経済的に重要なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、たとえば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ワタアカミムシガの幼虫（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。鱗翅目の他の昆虫害虫には、たとえば、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、フルーツツリーハマキムシ（Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ）、ヨーロッパハマキムシ（Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ）及び他のＡｒｃｈｉｐｓ種、（Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、螟虫、またはミカメイガ）、コメハマキムシ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、コーンルートウエブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ブルーグラスウエブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ）、サウスウエスタンマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ミスジアオリンガ（Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ）、オオタバコガ（Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ）、旧大陸タバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、アメリカタバコガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、マメヒメサヤムシガ及びコットンボールワームとしても知られる）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、芝生ウエブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ヨーロッパグレープバインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ）、ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ）、大型モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、小型モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ、輸入されたアオムシとしても知られる）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ビートアワヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、タバコネキリムシ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ、ケブカノメイガとしても知られる）、及びトマトハモグリバエ（Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ）が挙げられる。
【００４０】
鞘翅目の昆虫には、特に害虫がウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、メキシココーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ、ＭＣＲ）、ブラジルコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ、ＢＺＲ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）及びブラジルコーンルートワーム複合体（ＢＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａから成る）である場合、Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｔｏｍａｒｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｔｉｂｉａｌｉｓ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｕｒｃｕｌｉｏ  ｓｐｐ．、Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｐ．、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｅｍｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ  ｓｐｐ．、Ｏｒｙｃａｅｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｈｌｙｃｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ  ｓｐｐ．、Ｓｃａｒａｂｅｉｄａｅ、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ  ｓｐｐ．、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．及びＴｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
半翅目の昆虫には、ウエスタンサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、サビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、及びワタノミハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
「単離されたＤＮＡ分子」または同等の用語もしくは語句への本出願での言及は、ＤＮＡ分子が単独でまたは他の組成物との組み合わせで存在するが、その天然の環境の範囲内にはないものであることを意味するように意図される。たとえば、生物のゲノムのＤＮＡの範囲内で天然に見いだされる、たとえば、コーディング配列、イントロン配列、未翻訳のリーダー配列、プロモータ配列、転写終結配列等のような核酸要素は、その要素が生物のゲノムの範囲内にあり、且つそれが天然に見いだされるゲノムの範囲内での位置である限り、「単離されている」とは見なされない。しかしながら、これらの要素のそれぞれ及びこれらの要素の下位区分は、その要素が生物のゲノムの範囲内になく、及びそれが天然に見いだされるゲノム内の位置にはないということであれば、本開示の範囲内で「単離」されることになる。同様に、殺昆虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に存在する殺昆虫性変異体をコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が、そのタンパク質コードする配列が天然に見いだされる細菌のＤＮＡの範囲内になかったということであれば、単離されたヌクレオチド配列であるということになる。天然に存在する殺昆虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は本開示の目的では単離されていると見なされる。本開示の目的では、トランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノムに挿入された、または染色体外ベクターに存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞を形質転換するのに使用されたプラスミドもしくは類似の構造の中に存在してもしなくても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在してもしなくても、または植物もしくは細菌に由来する組織、子孫、生体試料もしくは商品生産物にて検出可能な量で存在してもしなくても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされることになる。
【００４３】
本明細書でさらに記載されるように、ＴＩＣ５２９０をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＥＧ６６５７から得られたＤＮＡで発見された。コーディング配列をクローニングし、微生物宿主細胞で発現させてバイオアッセイで使用されるタンパク質（配列番号２）を産生させた。ＴＩＣ５２９０に最も近い毒素ホモログはＶｉｐ４Ａａタンパク質であり、５６．９％の配列同一性であるということは、ＴＩＣ５２９０は新規のＶｉｐ４サブファミリーを表すことを示している。ＴＩＣ５２９０の微生物宿主細胞に由来するタンパク質を用いたバイオアッセイは、鞘翅目害虫ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）；鱗翅目種、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ＦＡＷ）、アメリカタバコガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、ＣＥＷ）、ヨーロッパマツマダラメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、及びコナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）；と同様に半翅目害虫であるウエスタンサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）に対して活性を実証した。
【００４４】
ＴＩＣ５２９０に関連する追加の毒素タンパク質配列は、ＴＩＣ５２９０の天然に存在するアミノ酸配列を用いて新規の特性を持つ新規のタンパク質を作り出すことによって作り出すことができることが熟考される。ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質をＴＩＣ５２９０に類似する他のタンパク質と並べて、アミノ酸配列レベルでの差異を新規のアミノ酸配列変異体に統合し、及び変異体をコードする組換え核酸配列に対して適当な変更を行うことができる。
【００４５】
当該技術で既知の種々の遺伝子編集法を用いてＴＩＣ５２９０の改善された変異体を植物内で操作することができることがさらに熟考される。ゲノム編集に使用されるそのような技法には、ＺＦＮ（ジンク−フィンガーヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性因子様のエフェクターヌクレアーゼ）、及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサーが入った、短い回文型のリピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−関連の）システムが挙げられるが、これらに限定されない。これらのゲノム編集法を用いて植物細胞内で形質転換される毒素タンパク質のコーディング配列を異なる毒素コーディング配列に変更することができる。具体的には、これらの方法を介して毒素コーディング配列内での１以上のコドンを変更して新しいタンパク質のアミノ酸配列を操作する。或いは、コーディング配列内の断片を置換してもしくは欠失させて、または追加のＤＮＡ断片をコーディング配列に挿入して新しい毒素のコーディング配列を操作する。新しいコーディング配列は、たとえば、昆虫害虫に対する高い活性または活性スペクトルのような新しい特性を持つ毒素タンパク質をコードすることができると共に、元々の昆虫毒素タンパク質に対して耐性が発生している昆虫害虫種に対して活性を提供することができる。遺伝子編集された毒素コーディング配列を含む植物細胞は当該技術で既知の方法によって使用されて新しい毒素タンパク質を発現する植物全体を生成することができる。
【００４６】
ＴＩＣ５２９０タンパク質の断片またはそのタンパク質変異体は、１以上のアミノ酸をタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、真ん中から欠失させる切り詰められた形態、または昆虫阻害活性を持つその組み合わせであることができる。これらの断片はＴＩＣ５２９０の天然に存在する変異体もしくは合成の変異体、または導出されたタンパク質変異体であることができるが、ＴＩＣ５２９０の昆虫阻害活性を保持するべきである。
【００４７】
ＴＩＣ５２９０タンパク質に類似するタンパク質は、当該技術で既知の種々のコンピュータに基づいたアルゴリズムを用いて互いに比較することによって特定することができる。たとえば、ＴＩＣ５２９０に関連するタンパク質のアミノ酸配列同一性は、これらの初期設定パラメータ：加重マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ，ギャップ開放ペナルティ：１０．０，ギャップ拡張ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基−特異的ギャップペナルティ：オン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０）を用い、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ配列比較を用いて解析することができる。アミノ酸同一性百分率はさらに、（アミノ酸同一性／対象タンパク質の長さ）によって乗じられた１００％の積によって算出される。他の配列比較アルゴリズムも当該技術で利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ配列比較を用いて得られるものと類似の結果を提供する。
【００４８】
クエリタンパク質のＴＩＣ５２９０との配列比較がクエリタンパク質と対象タンパク質との間で約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲内での比率の分画）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも６５％〜約１００％のアミノ酸同一性を示すのであれば、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の昆虫種に対する昆虫阻害活性を示すそのようなタンパク質はＴＩＣ５２９０に関係することが意図される。
【００４９】
ＴＩＣ５２９０タンパク質は、一次構造（保存されたアミノ酸モチーフ）によって、長さ（約９３７アミノ酸）によって、及び他の特徴によっても関連付けることができる。バイオインフォマティクス解析は、ＴＩＣ５２９０が孔形成タンパク質であり、標的昆虫の中腸における細胞受容体（複数可）への結合機能に関わりを持つ可能性があり、アミノ酸１６〜１４０にて検出されるＰＡ１４Ｐｆａｍドメイン（ＰＦ０７６９１）を有し、βバレル型膜貫通孔の形成に寄与し得るアミノ酸１８６〜５９３における二元＿ｔｏｘＢＰｆａｍドメイン（ＰＦ０３４９５）がその後に続くことを示唆している。これらのＰｆａｍは双方ともタンパク質の殺昆虫活性に寄与する可能性が高い。ＴＩＣ５２９０タンパク質毒素の特徴を表１にて報告する。
【表１】
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【００５０】
本出願の実施例でさらに記載されているように、ＴＩＣ５２９０をコードする組換え核酸分子の配列が植物での使用にために設計された。ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする植物での使用のために設計された例となる植物用に最適化された組換え核酸分子の配列は配列番号３で示されている。
【００５１】
これらの合成核酸分子の配列を含有する発現用のカセット及びベクターは当該技術で既知の形質転換の方法及び技法に従って構築し、トウモロコシ、ダイズ、綿または他の植物の細胞に導入することができる。たとえば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが介在する形質転換は、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開２００９／０１３８９８５Ａ１（ダイズ）、２００８／０２８０３６１Ａ１（ダイズ）、２００９／０１４２８３７Ａ１（トウモロコシ）、２００８／０２８２４３２（綿）、２００８／０２５６６６７（綿）、２００３／０１１０５３１（コムギ）、２００１／００４２２５７Ａ１（サトウダイコン）、米国特許第５，７５０，８７１号（キャノーラ）、同第７，０２６，５２８号（コムギ）、及び同第６，３６５，８０７号（コメ），及びＡｒｅｎｃｉｂｉａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．７：２１３−２２２（サトウキビ）に記載されている。ＴＩＣ５２９０を発現する形質転換された植物に形質転換された細胞を再生し、形質転換された植物から得られた植物葉片を用いて鱗翅目または半翅目の害虫の幼虫の存在下で実施されるバイオアッセイを介して殺虫活性を実証することができる。鞘翅目害虫に対する殺虫活性を調べるために、以下の実施例に記載されているようなルートワームアッセイにてＲ０及びＦ１世代の形質転換された植物が使用される。
【００５２】
従来の形質転換法に対する代替として、たとえば、導入遺伝子、発現カセット（複数可）等のようなＤＮＡ配列を、部位特異的組込みを介して植物または植物細胞のゲノムの中の特定の部位または遺伝子座に挿入してもよく、または組み込んでもよい。従って、本開示の組換えＤＮＡの構築物（複数可）及び分子（複数可）は、植物または植物細胞のゲノムへの挿入のための少なくとも１つの導入遺伝子、発現カセットまたは他のＤＮＡ配列を含むドナーの鋳型配列を含んでもよい。部位特異的な組込みのためのそのようなドナーの鋳型にはさらに、挿入配列（すなわち、植物ゲノムに挿入される配列、導入遺伝子、カセット等）に隣接する１または２の相同性アームが含まれてもよい。本開示の組換えＤＮＡ構築物（複数可）はさらに、部位特異的な組込みを行うための部位特異的なヌクレアーゼ及び／または関連するタンパク質（複数可）をコードする発現カセット（複数可）を含んでもよい。これらのヌクレアーゼを発現するカセット（複数可）は、ドナーの鋳型と同じ分子もしくはベクターに存在してもよく（シスで）、または別々の分子もしくはベクターに存在してもよい（トランスで）。ゲノムＤＮＡを切断して所望のゲノムの位置または遺伝子座で二本鎖の切断（ＤＳＢ）またはニックを生じる様々なタンパク質（またはタンパク質及び／またはガイドＲＮＡの複合体）が関与する部位特異的組込みの幾つかの方法が当該技術で既知である。当該技術で理解されているように、ヌクレアーゼ酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復する過程の間に、ドナーの鋳型ＤＮＡはＤＳＢまたはニックの部位でゲノムに組み込まれるようになってもよい。ドナーの鋳型における相同性アーム（複数可）の存在は、挿入事象は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じてもよいが、相同組換えを介した修復過程の間で植物ゲノムへの挿入配列の適合及び標的化を促進してもよい。使用されてもよい部位特異的ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたまたはネイティブのメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ、及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（たとえば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）が挙げられる。ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼ（たとえば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を用いる方法については、組換えＤＮＡ構築物（複数可）は植物ゲノムの範囲内での所望の部位にヌクレアーゼを差し向ける１以上のガイドＲＮＡをコードする配列も含むであろう。
【００５３】
ＴＩＣ５２９０をコードする組換え核酸分子組成物が熟考される。たとえば、ＴＩＣ５２９０タンパク質は、そのタンパク質をコードするＯＲＦを持つポリヌクレオチド分子が、プロモータのような遺伝子発現要素と、構築物が意図される系にて発現に必要な他の調節性要素とに操作可能に連結されている組換えＤＮＡ構築物によって発現させることができる。非限定例には、植物でのタンパク質の発現のためのＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列に操作可能に連結される植物で機能的なプロモータ、またはＢｔ細菌もしくは他のＢａｃｉｌｌｕｓ種におけるタンパク質の発現のためのＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列に操作可能に連結されるＢｔで機能的なプロモータが挙げられる。エンハンサ、イントロン、未翻訳リーダー、コードされるタンパク質不動化タグ（ＨＩＳタグ）、転座ペプチド（すなわち、色素体輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボソーム結合部位及びＲＮＡｉ標的部位を含むが、これらに限定されない他の要素を、ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列に操作可能に連結することができる。本明細書で提供される例となる組換えポリヌクレオチド分子には、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号１及び配列番号３のようなポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。異種プロモータはまた、色素体を標的とするＴＩＣ５２９０及び標的としないＴＩＣ５２９０をコードする合成ＤＮＡコーディング配列にも操作可能に連結することができる。本明細書で開示されているタンパク質をコードする組換え核酸分子のコドンは同義のコドンによって置換することができる（サイレント置換として当該技術で既知である）。
【００５４】
ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列を含む組換えＤＮＡ構築物はさらに、ＴＩＣ５２９０タンパク質、ＴＩＣ５２９０タンパク質とは異なるタンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子または補助タンパク質をコードするＤＮＡ配列に付随して発現するようにまたは同時発現するように構成することができる１以上の昆虫阻害剤をコードするＤＮＡの領域を含むことができる。補助タンパク質には、たとえば、その発現を助けること、植物におけるその安定性に影響を与えること、オリゴマー形成のための自由エネルギーを最適化すること、その毒性を増強すること、及び活性のそのスペクトルを増やすことによって昆虫阻害剤の有効性で役立つように機能する補因子、酵素、結合相手、または他の作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。補助タンパク質は例えば、１以上の昆虫阻害剤の取り込みを円滑にしてもよいし、または毒物の毒性効果を強化してもよい。
【００５５】
タンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子のすべてが１つのプロモータから発現されるように、またはタンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子のそれぞれが別のプロモータ若しくはそれらの一部の組み合わせのもとにあるように組換えＤＮＡ構築物を組み立てることができる。本発明のタンパク質は、ＴＩＣ５２９０が選択される発現系の種類に応じて他のオープンリーディングフレーム及びプロモータも含有する共通するヌクレオチドセグメントから発現される多重遺伝子発現系から発現させることができる。たとえば、植物の多重遺伝子発現系は単一のプロモータを利用して単一のオペロン内からの多重連結された／直列のオープンリーディングフレームの発現を推進することができる。別の例では、植物の多重遺伝子発現系は、それぞれ異なるタンパク質または１以上のｄｓＲＮＡ分子のような他の作用物質を発現させる多重で連結させない発現カセットを利用することができる。
【００５６】
ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列を含む組換え核酸分子または組換えＤＮＡ構築物はベクター、たとえば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターによって宿主細胞に送達することができる。そのようなベクターを用いて宿主細胞におけるＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列の安定なもしくは一時的な発現、またはコードされるポリペプチドのその後の発現を達成することができる。ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列を含み、宿主細胞に導入される外来性の組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物は本明細書では「導入遺伝子」と呼ばれる。
【００５７】
ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列の１以上を発現する組換えポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物及びトランスジェニック植物の一部が本明細書で提供される。用語「細菌細胞」または「細菌」には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍの細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。用語「植物細胞」または「植物」には、双子葉植物の細胞または単子葉植物の細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。熟考される植物及び植物細胞には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ブラッシア、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、パーム、牧草、マメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞または植物が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、トランスジェニック植物及びトランスジェニック植物細胞から再生されたトランスジェニック植物の一部が提供される。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、トランスジェニック種子から得ることができ、植物から一部を切断する、折取る、粉砕するまたはさもなければ切り離すことによって得ることができる。特定の実施形態では、植物の一部は、種子、丸莢、葉、花、茎、根、またはそれらの一部、またはトランスジェニック植物の一部の再生できない部分であることができる。この文脈で使用されるとき、トランスジェニック植物の一部の「再生できない」部分は、植物全体を形成するように誘導できない、または有性生殖及び／または無性生殖が可能である植物全体を形成するように誘導できない部分である。特定の実施形態では、植物の一部の再生できない部分は、トランスジェニックの種子、丸莢、葉、花、茎、または根の一部である。
【００５８】
鞘翅目または鱗翅目または半翅目の昆虫を阻害する量のＴＩＣ５２９０タンパク質を含むトランスジェニック植物を作製する方法が提供される。そのような植物は、本出願で提供されているＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、鞘翅目または鱗翅目または半翅目の昆虫を阻害する量のＴＩＣ５２９０タンパク質を発現している前記植物細胞に由来する植物を選択することによって作製することができる。植物は、再生法、種子法、花粉法または分裂組織の形質転換法によって植物細胞から導き出すことができる。植物を形質転換する方法は当該技術で既知である。
【００５９】
処理された植物生成物が検出可能な量のＴＩＣ５２９０タンパク質、その昆虫阻害セグメントまたは断片、またはその識別部分を含む、処理された植物生成物も本明細書で開示されている。特定の実施形態では、処理された生成物は植物の一部、植物バイオマス、油、粗びき粉、糖、動物飼料、粉、薄片、糠、リント布、外皮、加工種子及び種子から成る群から選択される。特定の実施形態では、処理された生成物は再生できない。植物生成物は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部に由来する商品または商業の他の製品を含むことができ、その際、商品または他の製品は、ＴＩＣ５２９０タンパク質の識別部分をコードするまたは含むヌクレオチドセグメントまたは発現されたＲＮＡまたはタンパク質を検出することによって商業を介して追跡することができる。
【００６０】
ＴＩＣ５２９０タンパク質を発現している植物は、他の毒素タンパク質を発現している及び／または、たとえば、除草剤耐性遺伝子、収量またはストレス耐性の形質を付与する遺伝子等のような他のトランスジェニック形質を発現しているトランスジェニック事象と繁殖させることによって交配することができ、またはそのような形質は形質がすべて連鎖されるように単一のベクター内で組み合わせることができる。
【００６１】
実施例にてさらに記載されているように、植物にて使用するために設計されたＴＩＣ５２９０をコードする合成のまたは人工の配列が配列番号３で示されている。
【００６２】
植物細胞での発現については、ＴＩＣ５２９０タンパク質を細胞質ゾルに存在するように発現させることができ、または植物細胞の種々の細胞内小器官に対して標的化することができる。たとえば、葉緑体をタンパク質の標的にすることはトランスジェニック植物にて発現されたタンパク質のレベルの上昇を生じてもよい一方で、外れた表現型が生じるのを防ぐ。標的にすることはまたトランスジェニック事象にて害虫抵抗性の有効性での上昇も生じてもよい。標的ペプチドまたは輸送ペプチドは、核、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム及び原形質膜を含む細胞における特定の領域にタンパク質の輸送を向ける短い（３〜７０のアミン酸の長さ）ペプチド鎖である。一部の標的ペプチドはタンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。葉緑体を標的にすることについては、タンパク質は４０〜５０前後のアミノ酸である輸送ペプチドを含有する。葉緑体輸送ペプチドの使用の記載については、米国特許第５，１８８，６４２号及び同第５，７２８，９２５号を参照のこと。多数の葉緑体に局在するタンパク質が前駆体として核遺伝子から発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に対して向けられる。そのような単離された葉緑体タンパク質の例には、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）に関連するもの、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、光収穫複合体タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）、及び米国特許第７，１９３，１３３号に記載された輸送ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。非葉緑体タンパク質は異種ＣＴＰとのタンパク質融合体の使用によって葉緑体に対して標的指向化されてもよく、ＣＴＰはタンパク質が葉緑体を標的にするのに十分であることが生体内及び試験管内で実証されている。たとえば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（ＣＴＰ２）（Ｋｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：４３７−４４２，１９８７を参照）またはＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａのＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（ＣＴＰ４）（ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：６８７３−６８７７，１９８６を参照）のような好適な葉緑体輸送ペプチドの組込みは、トランスジェニック植物にて葉緑体を異種のＥＰＳＰＳタンパク質配列の標的にすることが示されている（米国特許第５，６２７，０６１号；同第５，６３３，４３５号；及び同第５，３１２，９１０号；及びＥＰ０２１８５７１；ＥＰ１８９７０７；ＥＰ５０８９０９；及びＥＰ９２４２９９を参照のこと）。葉緑体をＴＩＣ５２９０タンパク質の標的にすることについては、操作可能な結合にて、及び植物細胞での最適な発現のために設計されているＴＩＣ５２９０毒素タンパク質をコードする合成コーディング配列に対してインフレームで５’に葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を配置する。
【００６３】
当該技術で既知である形質転換の方法及び技法に従って、これらの合成のまたは人工のヌクレオチド配列を含有する発現用のカセット及びベクターを構築し、トウモロコシ、綿及びダイズの植物細胞に導入することができる。ＴＩＣ５２９０を発現していることが観察される形質転換された植物にて形質転換された細胞が再生される。殺虫活性を調べるために、鱗翅目、鞘翅目及び半翅目の害虫の存在下でバイオアッセイを実施する。
【００６４】
たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、熱増幅及びハイブリッド形成のような当業者に既知の方法を用いて、ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列及びＴＩＣ５２９０に対する実質的な比率の同一性を有する配列を特定することができる。たとえば、タンパク質ＴＩＣ５２９０を用いて関連するタンパク質に特異的に結合する抗体を作製することができ、それを用いて密接に関連する他のタンパク質メンバーをスクリーニングし、見いだすことができる。
【００６５】
さらに、熱サイクル増幅または等温増幅及びハイブリッド形成の方法を用いてクラスの他のメンバーを特定するためのスクリーニング用のプローブ及びプライマーとしてＴＩＣ５２９０毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用することができる。たとえば、配列番号３で示されるような配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて商品生産物に由来するデオキシリボ核酸試料におけるＴＩＣ５２９０導入遺伝子の存在または非存在を決定することができる。オリゴヌクレオチドを採用する特定の核酸の検出方法の感度を考えると、配列番号３で示されるような配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、商品生産物の一分画だけが配列番号３を含有するトランスジェニック植物に由来するプールされた供給源に由来する商品生産物にてＴＩＣ５２９０導入遺伝子を検出することができることが十分に理解される。そのようなオリゴヌクレオチドを用いて配列番号３におけるヌクレオチド配列の変異を導入することができることがさらに認識される。そのような「変異誘発」オリゴヌクレオチドは、トランスジェニック植物の宿主細胞にて様々な昆虫阻害活性または多様な発現を示すＴＩＣ５２９０のアミノ酸配列変異体の特定に有用である。
【００６６】
ヌクレオチド配列のホモログ、たとえば、ハイブリッド形成条件下にて本出願で開示されている配列のそれぞれまたはいずれかとハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされる殺昆虫性タンパク質も本発明の実施形態である。本発明はまた、第２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する第１のヌクレオチド配列を検出する方法も提供し、その際、第１のヌクレオチド配列（またはその逆相補鎖配列）は殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードし、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で第２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。そのような場合、第２のヌクレオチド配列はストリンジェントなハイブリッド形成条件下にて配列番号１または配列番号３として提示されるヌクレオチド配列であることができる。ヌクレオチドのコーディング配列は適当なハイブリッド形成条件下にて互いにハイブリッド形成し、これらのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は他のタンパク質のいずれか１つに対して作られた抗血清と交差反応する。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は本明細書で定義されているように、４２℃での少なくともハイブリッド形成と、その後の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる室温での各５分間の２回の洗浄と、その後の０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる６５℃での各３０分間の２回の洗浄を含む。さらに高い温度での洗浄は、一層さらにストリンジェントな条件、たとえば、６８℃でのハイブリッド形成条件と、その後の０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣにおける６８℃での洗浄を構成する。
【００６７】
当業者は、遺伝子コードの冗長性のために多数の他の配列がＴＩＣ５２９０に関連するタンパク質をコードすることができることを認識するであろうし、これらの配列は、それらがＢａｃｉｌｌｕｓ株または植物細胞にて殺虫性タンパク質を発現するように機能する限りにおいて本発明の実施形態であるということは、多数のそのような冗長なコーディング配列はＴＩＣ５２９０をコードするネイティブのＢａｃｉｌｌｕｓの配列とはこれらの条件ではハイブリッド形成しないであろうことを当然認識する。本出願は、ＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列及びＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする配列に対して実質的な比率の同一性を有する配列を特定するための、当業者に既知のこれら及び他の特定方法の使用を熟考する。
【００６８】
ＴＩＣ５２９０タンパク質によって昆虫、特に鱗翅目または鞘翅目または半翅目の昆虫の作物への侵襲を防除する方法も本出願で開示されている。そのような方法は、ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質の昆虫、鞘翅目または鱗翅目または半翅目を阻害する量のタンパク質を含む植物を生育させることを含むことができる。特定の実施形態では、そのような方法はさらに、（ｉ）ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質を含むまたはコードする任意の組成物を植物または植物を生じる種子に適用すること、及び（ｉｉ）ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって植物または植物を生じる植物細胞を形質転換することの任意の１以上を含むことができる。一般に、ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質は組成物にて提供され、微生物にて提供され、またはトランスジェニック植物にて提供されて、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の昆虫に対して昆虫阻害活性を付与することができることが熟考される。
【００６９】
特定の実施形態では、ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質の組換え核酸分子は、ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質を発現させるのに好適な条件下でＴＩＣ５２９０毒素タンパク質を発現するように形質転換された組換えＢａｃｉｌｌｕｓまたは任意の他の組換え細菌細胞を培養することによって調製される昆虫阻害組成物の殺昆虫性の有効成分である。そのような組成物は、前記組換えポリペプチドを発現している／産生しているそのような組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈殿または濃縮によって調製することができる。そのような過程は、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞浮遊液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液または細胞沈殿物を生じることができる。そのように産生された組換えポリペプチドを得ることによって、組換えポリペプチドを含む組成物は細菌細胞、細菌の胞子及び副胞子封入体を含むことができ、農業用昆虫阻害噴霧製品または餌バイオアッセイにおける昆虫阻害製剤を含む種々の用途のために製剤化することができる。
【００７０】
一実施形態では、耐性が発生する可能性を減らすために、ＴＩＣ５２９０を含む昆虫阻害組成物はさらに、同じ鱗翅目、鞘翅目または半翅目の昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すが、ＴＩＣ５２９０毒素タンパク質とは異なる少なくとも１つの追加のポリペプチドを含むことができる。そのような組成物のために考えられる追加のポリペプチドには、昆虫阻害タンパク質及び昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子が挙げられる。昆虫害虫を防御するためのそのようなリボヌクレオチド配列の使用のための一例はＢａｕｍら（米国特許公開２００６／００２１０８７  Ａ１）に記載されている。鱗翅目害虫の防御のためのそのような追加のポリペプチドは、Ｃｒｙ１Ａ（米国特許第５，８８０，２７５号）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許公開番号１０／５２５、３１８）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４号）、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｄａ及びその変異体、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、及びＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号；同第６，９６２，７０５号；及び同第６，７１３，０６３号）、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、たとえば、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、及びＴＩＣ１１００のような、しかし、これらに限定されないＣｒｙ１−型のキメラ（国際出願公開ＷＯ２０１６／０６１３９１（Ａ２））、ＴＩＣ２１６０（国際出願公開ＷＯ２０１６／０６１３９２（Ａ２））、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許第７，０６４，２４９号）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＶＩＰ３Ｂ、ＡＸＭＩ−００１、ＡＸＭＩ−００２、ＡＸＭＩ−０３０、ＡＸＭＩ−０３５、及びＡＸＭＩ−０４５（米国特許公開２０１３−０１１７８８４  Ａ１）、ＡＸＭＩ−５２、ＡＸＭＩ−５８、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００（米国特許公開２０１３−０３１０５４３  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５（米国特許公開２０１３−０１０４２５９Ａ１）、ＡＸＭＩ−１３４（米国特許公開２０１３−０１６７２６４  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１５０（米国特許公開２０１０−０１６０２３１  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１８４（米国特許公開２０１０−０００４１７６  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ａｘｍｉ２０９（米国特許公開２０１１−００３００９６  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０（米国特許公開２０１４−０２４５４９１  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ、ＡＸＭＩ−２２５ｚ（米国特許公開２０１４−０１９６１７５  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２３８（米国特許公開２０１４−００３３３６３  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２７０（米国特許公開２０１４−０２２３５９８  Ａ１）、ＡＸＭＩ−３４５（米国特許公開２０１４−０３７３１９５  Ａ１）、ＡＸＭＩ−３３５（国際出願公開ＷＯ２０１３／１３４５２３（Ａ２））、ＤＩＧ−３  （米国特許公開２０１３−０２１９５７０  Ａ１）、ＤＩＧ−５（米国特許公開２０１０−０３１７５６９  Ａ１）、ＤＩＧ−１１（米国特許公開２０１０−０３１９０９３  Ａ１）、ＡｆＩＰ−１Ａ及びその誘導体（米国特許公開２０１４−００３３３６１  Ａ１）、ＡｆＩＰ−１Ｂ及びその誘導体（米国特許公開２０１４−００３３３６１  Ａ１）、ＰＩＰ−１ＡＰＩＰ−１Ｂ（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＡＥＣＦＧ−５９２７４０（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＤＩＧ−６５７（国際出願公開ＷＯ２０１５／１９５５９４（Ａ２））、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＧＳ−１３５及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０２３３７２６  Ａ１）、ＧＳ１５３及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０  Ａ１）、ＧＳ１５４及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０  Ａ１）、ＧＳ１５５及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０  Ａ１）、米国特許公開２０１２−０１６７２５９  Ａ１にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１２−００４７６０６  Ａ１にて記載されたような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１１−０１５４５３６  Ａ１にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１１−０１１２０１３  Ａ１にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１０−０１９２２５６  Ａ１にて記載されたような配列番号２及び４及びその誘導体、米国特許公開２０１０−００７７５０７  Ａ１にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１０−００７７５０８  Ａ１にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２００９−０３１３７２１  Ａ１にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１０−０２６９２２１  Ａ１にて記載されたような配列番号２または４及びその誘導体、米国特許第７，７７２，４６５号（Ｂ２）にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、ＷＯ２０１４／００８０５４  Ａ２にて記載されたようなＣＦ１６１＿００８５及びその誘導体、米国特許公開ＵＳ２００８−０１７２７６２  Ａ１、ＵＳ２０１１−００５５９６８  Ａ１、及びＵＳ２０１２−０１１７６９０  Ａ１にて記載されたような鱗翅目毒性タンパク質及びそれらの誘導体；ＵＳ７５１０８７８（Ｂ２）にて記載されたような配列番号２及びその誘導体、米国特許第７，８１２，１２９号（Ｂ１）にて記載されたような配列番号２及びその誘導体；等のような、しかし、これらに限定されない昆虫阻害タンパク質から成る群から選択されてもよい。
【００７１】
鞘翅目害虫の防御のためのそのような追加のポリペプチドは、Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許第６，５０１，００９号）、Ｃｒｙ１Ｃ変異体、Ｃｒｙ３Ａ変異体、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、ＡＸＭＩ１３４（米国特許公開２０１３−０１６７２６４  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１８４（米国特許公開２０１０−０００４１７６  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２０５（米国特許公開２０１４−０２９８５３８  Ａ１）、ＡＸＭＩ２０７（米国特許公開２０１３−０３０３４４０  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０（米国特許公開２０１４０２４５４９１  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ（米国特許公開  ２０１４−０１９６１７５  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２７９（米国特許公開２０１４−０２２３５９９  Ａ１）、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びその変異体（米国特許公開２０１０−０１９７５９２  Ａ１）、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ−１０（米国特許公開２０１０−０３１９０９２  Ａ１）、ｅＨＩＰｓ（米国特許出願公開番号２０１０／００１７９１４）、ＩＰ３及びその変異体（米国特許公開２０１２−０２１０４６２  Ａ１）、及びω−Ｈｅｘａｔｏｘｉｎ−Ｈｖ１ａ（米国特許出願公開ＵＳ２０１４−０３６６２２７  Ａ１）のような、しかし、これらに限定されない昆虫阻害タンパク質から成る群から選択されてもよい。
【００７２】
半翅目害虫の防御のためのそのような追加のポリペプチドは、ＴＩＣ１４１５（米国特許公開２０１３−００９７７３５  Ａ１）、ＴＩＣ８０７（米国特許第８６０９９３６号）、ＴＩＣ８３４（米国特許公開２０１３−０２６９０６０  Ａ１）、ＡＸＭＩ−０３６（米国特許公開２０１０−０１３７２１６  Ａ１）、及びＡＸＭＩ−１７１（米国特許公開２０１３−００５５４６９  Ａ１）のような、しかし、これらに限定されない半翅目で活性のあるタンパク質から成る群から選択されてもよい。鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の昆虫害虫の防除のための追加のポリペプチドは、Ｎｅｉｌ  Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅによって維持されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒素命名法ウェブサイト（ｏｎ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ａｔ  ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ）にて見いだすことができる。
【００７３】
他の実施形態では、そのような組成物／製剤はさらに、本発明の他の昆虫阻害タンパク質によって阻害されない昆虫に対して昆虫阻害活性を示して得られる昆虫阻害のスペクトルを拡大する少なくとも１つの追加のポリペプチドを含むことができる。
【００７４】
特定の殺昆虫剤に対する耐性を発生する昆虫についての可能性は当該技術で文書にされている。昆虫の耐性の管理戦略の１つは、異なる作用様式を介して作動する２つの異なる昆虫阻害剤を発現するトランスジェニック作物を採用することである。従って、いずれか一方の昆虫阻害剤に対して耐性を持つ昆虫は他方の昆虫阻害剤によって防除することができる。別の昆虫耐性管理戦略は、標的とされる鞘翅目または鱗翅目または半翅目の害虫種に対して保護されず、そのような保護されない植物のための避難を提供する植物の使用を採用する。特定の例の１つは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５５１，９６２号に記載されている。
【００７５】
種子処理、製剤での噴霧、滴下または拭き取りにおいてタンパク質と共に使用される本明細書で開示されているタンパク質によっても防除される害虫を防除するために設計される局所に適用される殺虫化学物質のような他の実施形態は、土壌に直接適用することができ（土壌水浸し）、本明細書で開示されているタンパク質を発現する植物を生育させることに適用することができ、または開示されているタンパク質の１以上をコードする１以上の導入遺伝子を含有する種子に適用されるように製剤化することができる。種子処理で使用するためのそのような製剤は当該技術で既知の種々の粘着剤及び粘着付与剤と共に適用することができる。そのような製剤は作用様式での開示されているタンパク質との相乗効果がある殺虫剤を含有することができるので、製剤殺虫剤は異なる作用様式を介して作用して、開示されているタンパク質によって防除することができる同じまたは類似の害虫を防除する、またはそのような殺虫剤は、ＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質によって効果的に防除されない広い宿主範囲もしくは植物害虫種の範囲内で作用して害虫を防除する。
【００７６】
前述の組成物／製剤はさらに、農業上許容できるキャリア、たとえば、餌、粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド状懸濁液、水溶液、Ｂａｃｉｌｌｕｓの胞子／結晶調製物、種子処理、タンパク質の１以上を発現するように形質転換された組換えの植物細胞／植物組織／種子／植物、またはタンパク質の１以上を発現するように形質転換された細菌を含むことができる。組換えポリペプチドにおける固有の昆虫阻害または殺昆虫性の阻害のレベル、及び植物または食餌アッセイに適用される製剤のレベルに応じて、組成物／製剤は種々の重量による量の組換えポリペプチド、たとえば、０．０００１重量％〜０．００１重量％〜０．０１重量％〜１重量％〜９９重量％の組換えポリペプチドを含むことができる。
【実施例】
【００７７】
前述を考慮して、当業者は開示されている特定の態様にて変更を行うことができ、それが本発明の精神及び範囲から逸脱することなく類似のまたは同様の結果を依然として得ることを十分に理解するべきである。従って、本明細書で開示されている特定の構造的な及び機能的な詳細は限定として解釈されるべきではない。本明細書で引用されている各参考文献の開示全体が本出願の開示の中に組み入れられることが理解されるべきである。
【００７８】
実施例１：ＴＩＣ５２９０の発見
この実施例は殺虫性タンパク質であるＴＩＣ５２９０の発見を記載する。
【００７９】
新規のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）殺虫性タンパク質をコードする配列が特定され、クローニングされ、配列が確認され、昆虫バイオアッセイで調べられた。配列番号１（Ｂｔをコードする配列）及び２（タンパク質）として本明細書で提示されている殺虫性タンパク質ＴＩＣ５２９０はＢｔ株ＥＧ６６５７から単離された。ＴＩＣ５２９０は９３７アミノ酸の長さのタンパク質であり、既知の殺昆虫性タンパク質毒素との相同性に基づいて、及び既知の殺昆虫性タンパク質ファミリーによってそれをクラスターにするＰｆａｍ解析の使用を介して特定された。バイオインフォマティクス解析は、ＴＩＣ５２９０が孔形成性タンパク質であることを示唆している。アミノ酸残基１６〜１４０でのＰＡ１４Ｐｆａｍドメイン（ＰＦ０７６９１）は結合機能に関与する可能性が高い。このドメインには、βバレル膜貫通孔の形成に寄与してもよいアミノ酸１８６〜５９３での二元＿ｔｏｘＢＰｆａｍドメイン（ＰＦ０３４９５）が続く。ＴＩＣ５２０９に最も密接なＢｔ毒素ホモログはＶｉｐ４Ａａタンパク質であり、５６．９％の配列同一性はＴＩＣ５２９０が新規のＶｉｐ４サブファミリーを表すことを示唆している。
【００８０】
株ＥＧ６６５７から単離された全ゲノムＤＮＡからＴＩＣ５２９０についてのコーディング領域の完全長コピーを増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲのアンプリコンはコーディング配列の開始コドンと停止コドンも含んだ。
【００８１】
当該技術で既知の方法を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓの胞子形成の間、作動中であるＢｔの発現可能プロモータと操作可能に結合したＢｔプラスミド発現ベクターにＴＩＣ５２９０のアンプリコンをクローニングした。加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系でのタンパク質の発現に使用されるベクターにアンプリコンをクローニングした。得られた組換え株は組換えタンパク質を発現することが観察された。
【００８２】
実施例２：ＴＩＣ５２９０は昆虫バイオアッセイにて鞘翅目、鱗翅目及び半翅目への活性を実証する。
この実施例は鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の種々の種に対するＴＩＣ５２９０タンパク質によって示される阻害活性を説明する。
【００８３】
新規の殺虫性タンパク質であるＴＩＣ５２９０をＢｔ及びＥ．ｃｏｌｉで発現させ、鞘翅目、鱗翅目、半翅目及び双翅目の種々の種に対する毒性についてアッセイした。Ｂｔ及びＥ．ｃｏｌｉに由来する各毒性の調製物を鞘翅目種Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドハムシ、ＣＰＢ）及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）に対してアッセイした。毒素調製物はまた、鱗翅目種アメリカタバコガの幼虫（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヨーロッパマツマダラメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ダイズシャクトリムシ（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンマツマダラメイガ（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコガ（ＴＢＷ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、及びコナガ（ＤＢＭ、（ｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）に対してもアッセイした。毒素調製物は、半翅目種ミドリメクラガメ（ＴＰＢ、Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）及びウエスタンミドリメクラガメ（ＷＴＰ、Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）；と同様に双翅目種、黄熱病カ（ＹＦＭ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）に対してもアッセイした。アメリカタバコガの幼虫（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）はダイズサヤムシガ（ＳＰＷ）及びコットンボウルワーム（ＣＢＷ）とも呼ばれる。
【００８４】
ベクターのそれぞれで発現されるタンパク質のアッセイは昆虫の餌に加えられる様々な調製物を必要とした。胞子形成の間に活性があるプロモータを使用するベクターについては、培養での増殖の３日後、結晶／胞子の混合物を回収し、昆虫の餌（一般に昆虫の人工餌に適用され、種々の昆虫に別々に食べさせる）に使用した。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に由来するタンパク質の調製物を精製し、昆虫の餌でも提供した。
【００８５】
ＴＩＣ５２９０は、「＋」が活性を示す以下の表２で示されるようにＷＣＲ、ＣＥＷ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＤＢＭ及びＷＴＰに対して活性を示した。
【表２】
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【００８６】
実施例３：植物細胞での発現のためのＴＩＣ５２９０をコードする合成コーディング配列の設計
植物におけるＴＩＣ５２９０の発現で使用するために合成のまたは人工のコーディング配列を構築し、二元植物形質転換ベクターにクローニングし、植物細胞を形質転換するのに使用した。たとえば、ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチの植物ポリアデニル化配列のような特定の好ましくない問題配列を回避する一方で、ネイティブのＢｔタンパク質のアミノ酸配列を保存して、米国特許第５，５００，３６５号にて一般に記載された方法に従って合成の核酸配列を合成した。ＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質のための合成コーディング配列は配列番号３として提示され、配列番号２として提示されるタンパク質をコードする。
【００８７】
実施例４：植物細胞におけるＴＩＣ５２９０の発現のための発現カセット
配列番号３で示されるような配列によって種々の植物発現カセットを設計した。そのような発現カセットは植物のプロトプラストまたは植物細胞の形質転換における一時的な発現に有用である。典型的な発現カセットは植物細胞内でのタンパク質の最終的な置き換えに関して設計された。色素体を標的にしたタンパク質については、合成のＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質をコードする配列は葉緑体を標的とするシグナルペプチドをコードする配列にインフレームで操作可能に連結された。得られた植物形質転換ベクターは、５’でリーダーに操作可能に連結され、５’でイントロンに操作可能に連結され（または任意でイントロンはない）、色素体を標的にするまたは標的にしないＴＩＣ５２９０タンパク質をコードする合成コーディング配列に５’で操作可能に連結され、それは次に５’で３’ＵＴＲに操作可能に連結された構成的プロモータを含む殺虫性タンパク質の発現のための第１の導入遺伝子カセットと、グリホサート選択または抗生剤選択を用いた形質転換植物細胞の選択のための第２の導入遺伝子カセットとを含む。上述の要素のすべては、たとえば、制限エンドヌクレアーゼ部位またはライゲーションに無関係なクローニング部位のような発現カセットの構築のために提供される追加の配列と共に隣接して配置されることが多かった。
【００８８】
実施例５：ＴＩＣ５２９０は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物で発現されるとウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）に対する有効な抵抗性を提供する。
この実施例は、植物で発現され、餌として各昆虫害虫に提供された場合のコーンルートワームのような鞘翅目に対するＴＩＣ５２９０によって示される阻害活性を説明する。
【００８９】
色素体を標的にする及び標的にしないＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質の双方を発現させるように設計された導入遺伝子カセットを含む二元植物形質転換ベクターを、当該技術で既知の方法を用いてクローニングした。得られたベクターを用いてトウモロコシ植物を安定的に形質転換した。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択し、生育させた。安定的に形質転換されたトウモロコシ植物の根で食べる鞘翅目害虫であるウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）に対して殺虫活性をアッセイした。
【００９０】
Ｒ０の安定的に形質転換された植物を用いて、生成しているＦ１子孫と同様に鞘翅目への抵抗性についてアッセイした。各二元ベクターの形質転換から複数の単一コピー事象を選択した。各二元ベクターの形質転換から生じているこれらの事象の一部を鞘翅目のアッセイに使用した一方で、事象の別の部分はさらなる試験のためにＦ１子孫を生成するのに使用した。
【００９１】
Ｒ０アッセイの植物を８インチのポットに移植した。植物にウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）の卵を植菌した。植菌に先立ってほぼ１０日間、卵をインキュベートして植菌の４日後に孵化が起きるようにして確実に十分な数の幼虫が生き残り、トウモロコシの根を攻撃できるようにした。ほぼＶ２からＶ３の段階で形質転換された植物に植菌した。侵襲の後、およそ２８日間、植物を生育させた。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して土をすべて取り除いた。以下の表３で提示されたような１〜５の損傷評定尺度を用いて根への損傷を評価した。陰性対照との比較を行ってアッセイが適正に行われたことを保証した。根の損傷の低いスコアはＴＩＣ５２９０タンパク質によって付与された鞘翅目害虫に対する抵抗性を示す。ＷＣＲアッセイにて各二元ベクター形質転換について複数のＲ０事象を使用した。色素体を標的にする及び標的にしないＴＩＣ５２９０双方を発現するＲ０事象の多くはトランスジェニック対照と比較した場合、根の損傷の評定スコアによって決定されるＷＣＲへの抵抗性を実証した。
【表３】
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【００９２】
各二元ベクター形質転換から生じるＲ０の安定的に形質転換された事象の一部を用いてＦ１子孫を作出した。Ｒ０の安定的に形質転換された植物を自家受粉させ、Ｆ１子孫を作出した。Ｆ１種子を植え付けた。当該技術で既知の分子法を介してヘテロ接合体の植物を特定し、ＷＣＲに対するアッセイと同様にＴＩＣ５２９０毒素タンパク質のＥＬＩＳＡ発現測定に使用した。各事象に由来するヘテロ接合体のＦ１子孫の一部を昆虫アッセイに使用した一方で、別の部分はＴＩＣ５２９０の発現を測定するために使用した。
【００９３】
ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）の卵をおよそ１０日間インキュベートして植菌後４日以内の孵化を可能にした。植物はほぼＶ２〜Ｖ３の段階で植菌した。ＷＣＲについては、各ポットに約２０００個の卵を入れた。侵襲後、約２８日間植物を生育させた。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して土をすべて取り除いた。根に対する損傷は、以下の表４にて提示されるような０〜３の損傷評定尺度を用いて評価した。陰性対照との比較を行ってアッセイが適正に行われたことを保証した。根の損傷の低いスコアはＴＩＣ５２９０タンパク質によって付与された鞘翅目害虫に対する抵抗性を示した。Ｆ１事象の多くが対照と比べた場合のＷＣＲに対する有効な抵抗性を実証した。図１は、タンパク質が葉緑体を標的にするかどうかにかかわらず、Ｆ１トウモロコシ植物で発現された場合、ＴＩＣ５２９０のための幾つかの事象についての平均の根損傷の評定を示す。
【表４】
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【００９４】
実施例５：安定的に形質転換されたトウモロコシ、ダイズまたは綿植物にて発現される場合の鱗翅目害虫に対するＴＩＣ５２９０の活性のアッセイ
当該技術で既知の方法を用いて、色素体を標的にする及び標的にしない双方のＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含む二元植物形質転換ベクターをクローニングする。
【００９５】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが介在する形質転換法を用いて、上述の二元形質転換ベクターによってトウモロコシ、ダイズまたは綿を形質転換する。当該技術で既知の方法によって植物を形成するように形質転換した細胞を誘導する。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されたものに類似する植物の葉片を用いたバイオアッセイを行う。形質転換されていないトウモロコシ、ダイズまたは綿の植物を用いて陰性対照として使用される組織を得る。各二元ベクターに由来する複数の形質転換事象を、たとえば、アメリカタバコガの幼虫（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヨーロッパマツマダラメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ダイズシャクトリムシ（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンマツマダラメイガ（ＳＷＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコガ（ＴＢＷ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、及びコナガ（ＤＢＭ、（ｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）のような、しかし、これらに限定されない鱗翅目害虫に対して評価する。昆虫バイオアッセイにて成長阻害及び／または大量死を示すそれらの昆虫はＴＩＣ５２９０昆虫毒素の影響を受け易いと判定される。
【００９６】
実施例６：ＴＩＣ５２９０を発現している安定的に形質転換された綿植物を用いた半翅目害虫に対する活性のアッセイ
当該技術で既知の方法を用いて、色素体を標的にする及び標的にしない双方のＴＩＣ５２９０殺虫性タンパク質を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含む二元植物形質転換ベクターをクローニングする。得られたベクターを用いて綿植物を安定的に形質転換する。安定的に形質転換された綿植物を食べる半翅目害虫に対して殺虫活性をアッセイする。
【００９７】
色素体を標的にする及び標的にしないＴＩＣ５２９０を発現させる実施例３にて前に記載された二元ベクターを用いて綿植物を安定的に形質転換する。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択し、生育させる。Ｒ０の安定的に形質転換された植物を自家受粉させ、Ｒ１子孫を生産する。
【００９８】
非トランスジェニック対照に相当する種子と共に、ＴＩＣ５２９０のための発現カセットを含むＲ１トランスジェニック種子を１０インチのポットに植え付ける。摂氏３２度での１６時間の明期と摂氏２３度での８時間の暗期の光周期及び８００〜９００の間のマイクロアインシュタインの光強度を伴った環境チャンバーにて植物を維持する。植え付けの４０〜４５日後、通気性のあるプラスチックの「受粉」シート（Ｖｉｌｕｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＬ）で作られたケージに個々の植物を入れる。Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）のヒモを用いてシートのスリーブを土表面のすぐ上で主要な茎に固定する。実験室の培養に由来する２対の性的に成熟したオスとメスのＬｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓまたはＬｙｇｕｓ  ｈｅｓｐａｒｕｓの成虫（６日齢）を１４ｍＬの丸底プラスチック管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に回収し、各植物に使用する。ケージ側の小さな開口部を介して各個々のケージに成虫を解放し、次いでケージをしっかり閉じて昆虫が逃げないようにする。昆虫を交配させ、植物を２１日間ケージで保持する。２１日後、ケージの下で植物を切断し、各植物について昆虫を回収し、数える実験室に移動させる。ケージを開ける前に、植物を激しく振って確実に昆虫のすべてがその喰いつき部位からケージの底に落ちるようにする。次いでケージの底を開け、植物物質をすべて取り出し、黒色シート上に置く。吸引器を用いて昆虫を回収する。次いで植物全体を検査して残っている昆虫を回収する。各植物について昆虫の数及びその発生段階を記録する。Ｌｙｇｕｓの成熟度：３齢、４齢、５齢までの若虫及び成虫に基づいて昆虫のカウントをいくつかの群に分ける。形質転換されなかった綿対照植物に比べて若虫及び成虫の数の低下を示すトランスジェニック綿植物はＴＩＣ５２９０毒素タンパク質の発現を介して付与された半翅目害虫に対する抵抗性を実証している。
【００９９】
本明細書で開示され、請求されている組成物のすべては、本開示を踏まえて過度の実験を行うことなく作製し、実行することができる。本発明の組成物は前述の説明に役立つ実施形態という点で記載されてきた一方で、変異、変化、改変及び変更は本発明の真の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物に適用されてもよいことが当業者に明らかであろう。さらに具体的には、化学的に且つ生理的に関連する特定の作用物質が本明細書に記載されている作用物質の代わりに使用されてもよい一方で、同一のまたは類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置き換え及び改変はすべて、添付のクレームによって定義されるような本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあると見なされる。
【０１００】
本明細書で引用されている出版物及び公開された特許文書はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのようにと同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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