(57)【要約】  対象の非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）状態を特徴付けするための方法、組成物、キット、および系が提供される。一部の実施形態において、方法、組成物、キット、および系は、表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に発現されるｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、方法、組成物、キット、および系は、対象の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）状態を特徴付けするため、対象における肝線維症の出現を特徴付けするため、および／または対象における肝細胞バルーニングの出現を特徴付けするためのものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）状態を特徴付けする方法において、表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に発現されるｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を有するバイオマーカーパネルを形成することと、前記対象の試料中の前記パネル中の前記Ｎ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、Ｎが、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０であることを特徴とする方法。
【請求項３】
対象におけるＮＡＦＬＤ状態を特徴付けする方法において、
前記対象からの試料中の表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個または少なくとも１５個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含み、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記対象におけるＮＡＦＬＤの存在および／またはより進行したＮＡＦＬＤ状態の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記対象のＮＡＦＬＤ状態の特徴付けが、前記対象の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）状態を特徴付けすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを、前記対象からの試料中で検出し、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記対象におけるＮＡＳＨの存在および／またはより進行したステージのＮＡＳＨの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記ＮＡＳＨが、ステージ１、ステージ２、ステージ３またはステージ４のＮＡＳＨであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記対象のＮＡＦＬＤ状態の特徴付けが、前記対象における肝線維症の出現を特徴付けすることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを、対象からの試料中で検出し、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記対象における肝線維症の存在および／またはより進行した肝線維症の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記対象のＮＡＦＬＤ状態の特徴付けが、前記対象における肝細胞バルーニングの出現を特徴付けすることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルの検出を、前記対象からの前記試料中で検出し、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記対象における肝細胞バルーニングの存在および／またはより進行した肝細胞バルーニングの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１１】
対象がＮＡＳＨを有するか否かを判定する方法において、
ＮＡＳＨを有することが疑われている対象からの試料を提供することと、
表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のマイクロＲＮＡのｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記Ｎ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、Ｎが、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
対象がＮＡＳＨを有するか否かを判定する方法において、ＮＡＳＨが疑われている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記対象がＮＡＳＨを有することを示すことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法において、前記対象が、これまでＮＡＳＨと診断されていないことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法において、前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１３の何れか１項に記載の方法において、前記対象が、ＮＡＦＬＤと既に診断されていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、前記対象が、ＮＡＳＨの少なくとも１つの臨床的症状を呈していることを特徴とする方法。
【請求項２１】
対象におけるＮＡＳＨ療法をモニタリングする方法において、
ＮＡＳＨのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、
表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のマイクロＲＮＡのｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記Ｎ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、Ｎが、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
対象におけるＮＡＳＨ療法をモニタリングする方法において、ＮＡＳＨのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記ＮＡＳＨの重症度が増加していることを示し、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルの不存在は、前記ＮＡＳＨの重症度が増加していないことを示すことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法において、前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
ＮＡＦＬＤを有する対象がＮＡＳＨを発症するリスクを特徴付けする方法において、ＮＡＦＬＤが疑われている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、前記対象がＮＡＳＨを発症するリスクの増加を示し、および／または
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルの不存在は、前記対象がＮＡＳＨを発症するリスクの減少を示すことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
対象が肝線維症を有するか否かを判定する方法において、
肝線維症が疑われている対象からの試料を提供することと、
表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記Ｎ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、Ｎが、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
対象が肝線維症を有するか否かを判定する方法において、肝線維症が疑われている対象からの試料を提供することと、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、肝線維症の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、表１５〜１７の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−２２４であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法において、表１８に列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法において、ｍｉＲ−２２４および／またはｍｉＲ−１９１のレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法において、前記肝線維症が、ステージ１、２、３、または４の肝線維症であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３１に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３１に記載の方法において、前記試料が、ＮＡＳＨと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３９に記載の方法において、前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定する方法において、
肝細胞バルーニングが疑われている対象からの試料を提供することと、
表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、
前記対象からの前記試料中の前記パネル中の前記Ｎ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、Ｎが、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定する方法において、肝細胞バルーニングが疑われている対象からの試料を提供することと、前記対象からの前記試料中の表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、
それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、肝細胞バルーニングの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表３０に列記されるペアから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法において、前記対象からの前記試料中の表３５に列記されるペアから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法において、前記試料が、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法において、前記試料が、ＮＡＳＨと診断された対象からのものであることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法において、前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨであることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項１乃至４７の何れか１項に記載の方法において、前記検出が、ＲＴ−ＰＣＲを含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法において、前記検出が、定量的ＲＴ−ＰＣＲを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項１乃至４９の何れか１項に記載の方法において、前記試料が体液であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、前記試料が、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、前記試料が血清であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項１乃至５２の何れか１項に記載の方法において、医療保険料または生命保険料を決定する目的のために前記対象のＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ状態を特徴付けすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記対象についての医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５５】
対象からの試料のＲＮＡまたは対象からの試料の前記ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡと、
表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５６】
請求項５５に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とする組成物。
【請求項５７】
請求項５５に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とする組成物。
【請求項５８】
請求項５５に記載の組成物において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とする組成物。
【請求項５９】
請求項５５乃至５８の何れか１項に記載の組成物において、それぞれのポリヌクレオチドが、独立して、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、８〜３０、１２〜１００、１２〜７５、１２〜５０、１２〜４０、または１２〜３０ヌクレオチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６０】
請求項５５乃至５８の何れか１項に記載の組成物において、前記試料が体液であることを特徴とする組成物。
【請求項６１】
請求項６３に記載の組成物において、前記試料が、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項６２】
請求項６４に記載の組成物において、前記試料が血清であることを特徴とする組成物。
【請求項６３】
表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドのセット
を含むことを特徴とするキット。
【請求項６４】
請求項６３に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドのセットが、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とするキット。
【請求項６５】
請求項６３に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドのセットが、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とするキット。
【請求項６６】
請求項６３に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドのセットが、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とするキット。
【請求項６７】
請求項６３乃至６６の何れか１項に記載のキットにおいて、それぞれのポリヌクレオチドが、独立して、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、８〜３０、１２〜１００、１２〜７５、１２〜５０、１２〜４０、または１２〜３０ヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項６８】
請求項６３乃至６７の何れか１項に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドが、マルチプレックスアッセイにおける使用のための包装であることを特徴とするキット。
【請求項６９】
請求項６３乃至６７の何れか１項に記載のキットにおいて、前記ポリヌクレオチドが、非マルチプレックスアッセイにおける使用のための包装であることを特徴とするキット。
【請求項７０】
表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、
対象からの試料のＲＮＡまたは対象からの試料の前記ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡと、
を含むことを特徴とする系。
【請求項７１】
請求項７０に記載の系において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とする系。
【請求項７２】
請求項７０に記載の系において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とする系。
【請求項７４】
請求項７０に記載の系において、前記ポリヌクレオチドのセットが、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものであることを特徴とする系。
【請求項７５】
請求項７０乃至７４の何れか１項に記載の系において、それぞれのポリヌクレオチドが、独立して、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、８〜３０、１２〜１００、１２〜７５、１２〜５０、１２〜４０、または１２〜３０ヌクレオチドを含むことを特徴とする系。
【請求項７６】
請求項７０乃至７５の何れか１項に記載の系において、前記試料が体液であることを特徴とする系。
【請求項７７】
請求項７６に記載の系において、前記試料が、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択されることを特徴とする系。
【請求項７８】
請求項７７に記載の系において、前記試料が血清であることを特徴とする系。
【請求項７９】
請求項７０乃至７５の何れか１項に記載の系において、対象からの試料の前記ＲＮＡまたは対象からの試料の前記ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡが容器中に存在し、前記ポリヌクレオチドのセットが前記容器とは別個に包装されていることを特徴とする系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子形式にて提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩ複写物は２０１６年６月２日に作成され、１００７＿００２＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、３４，４６３バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールにより引き起こされない肝細胞中の余分な脂肪の蓄積である。肝臓がいくらかの脂肪を含有することは正常である。しかしながら、肝臓重量の５％〜１０％パーセント超が脂肪である場合、脂肪肝（脂肪変性）と呼ばれる。多くの人々は、肝臓中の脂肪の蓄積を有し、ほとんどの人々については、そのことは症状をもたらさない。ＮＡＦＬＤは、過体重もしくは肥満であり、または糖尿病、高コレステロールもしくは高トリグリセリドを有する人々において発症する傾向がある。ＮＡＦＬＤの最も重度の形態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。ＮＡＳＨは、肝硬変をもたらし得る肝臓の瘢痕化（線維症）を引き起こす。ＮＡＳＨは、長期の大量飲酒により引き起こされる肝疾患の種類と同様である。しかしＮＡＳＨは、アルコールを乱用しない人々において生じる。どのＮＡＦＬＤ患者がＮＡＳＨを発症するかを予測することは困難であり、ＮＡＳＨを有する人々は、自分がそれを有することを知らないことが多い。
【０００３】
肝生検は、ＮＡＳＨ診断のための代表的な判断基準である。線維症、小葉炎症、脂肪変性および肝細胞バルーニングの存在は、組織病理学的データから使用される重要な基準である。非侵襲性ＮＡＳＨ試験は利用可能でない。現在、肝細胞バルーニングおよび脂肪変性の検出は、生検試料からの組織病理学検査によってのみ達成される。これらのおよび他の理由のため、ＮＡＦＬＤ疾患状態、例として、ＮＡＳＨ、線維症、肝細胞バルーニングの診断および予後予測のための新たな方法、系、キット、および他のツールが必要とされている。本発明のある実施形態は、これらのおよび他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、対象の非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）状態に応じて対象の血清中でｍｉＲＮＡが示差的に発現されるという驚くべき発見をなした。これらのおよび他の観察により、部分的に、本発明者らが対象のＮＡＦＬＤ状態の特徴付けのための方法、組成物、キット、および系、ならびに本明細書に開示の他の発明を本明細書で提供することが可能となった。
【０００５】
一部の実施形態において、対象の非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）状態を特徴付けする方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に発現されるｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のＮ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Ｎは、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０である。
【０００６】
一部の実施形態において、対象におけるＮＡＦＬＤ状態を特徴付けするさらなる方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個または少なくとも１５個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、対象におけるＮＡＦＬＤの存在および／またはより進行したＮＡＦＬＤ状態の存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、ＮＡＦＬＤおよび／またはより進行したＮＡＦＬＤ状態を有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つのＮＡＦＬＤ療法を対象に施与することをさらに含む。
【０００７】
一部の実施形態において、対象のＮＡＦＬＤ状態を特徴付けする方法は、対象の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）状態を特徴付けすることを含む。方法の一部の実施形態において、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを、対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、対象におけるＮＡＳＨの存在および／またはより進行したステージのＮＡＳＨの存在を示す。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、ステージ１、ステージ２、ステージ３またはステージ４のＮＡＳＨである。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、ＮＡＳＨおよび／またはより進行したステージのＮＡＳＨを有すると診断する。一部の実施形態において、対象を、ステージ１、ステージ２、ステージ３またはステージ４のＮＡＳＨを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つのＮＡＳＨ療法を対象に施与することをさらに含む。
【０００８】
一部の実施形態において、対象のＮＡＦＬＤ状態を特徴付けする方法は、対象における肝線維症の出現を特徴付けすることを含む。方法の一部の実施形態において、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを、対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、対象における肝線維症の存在および／またはより進行した肝線維症の存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、肝線維症および／またはより進行した肝線維症を有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つの肝線維症療法を対象に施与することをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態において、対象のＮＡＦＬＤ状態を特徴付けする方法は、対象における肝細胞バルーニングの出現を特徴付けすることを含む。方法の一部の実施形態において、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルの検出を、対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、対象における肝細胞バルーニングの存在および／またはより進行した肝細胞バルーニングの存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、肝細胞バルーニングおよび／またはより進行した肝細胞バルーニングを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つの肝細胞バルーニング療法を対象に施与することをさらに含む。
【００１０】
一部の実施形態において、対象がＮＡＳＨを有するか否かを判定する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、ＮＡＳＨを有することが疑われている対象からの試料を提供することと、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のＮ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Ｎは、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０である。一部の実施形態において、方法は、ＮＡＳＨが疑われている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、対象がＮＡＳＨを有することを示す。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、対象は、これまでＮＡＳＨと診断されていない。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである。一部の実施形態において、対象は、これまでＮＡＦＬＤと診断されていない。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨの少なくとも１つの臨床的症状を呈している。一部の実施形態において、方法は、ＮＡＳＨが疑われている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、ＮＡＳＨを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つのＮＡＳＨ療法を対象に施与することをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態において、対象におけるＮＡＳＨ療法をモニタリングする方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、ＮＡＳＨのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のＮ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Ｎは、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０である。一部の実施形態において、方法は、ＮＡＳＨのための治療を受けている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、ＮＡＳＨの重症度が増加していることを示し；それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルの不存在は、ＮＡＳＨの重症度が増加していないことを示す。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである。
【００１２】
一部の実施形態において、ＮＡＦＬＤを有する対象がＮＡＳＨを発症するリスクを特徴付けする方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、ＮＡＦＬＤを有する対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、対象がＮＡＳＨを発症するリスクの増加を示し、および／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルの不存在は、対象がＮＡＳＨを発症するリスクの減少を示す。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものである。
【００１３】
一部の実施形態において、対象が肝線維症を有するか否かを判定する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、肝線維症が疑われている対象からの試料を提供することと、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のＮ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Ｎは、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０である。一部の実施形態において、方法は、対象が肝線維症を有する否かを判定することを含み、肝線維症を有することが疑われている対象からの試料を提供することと、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、肝線維症の存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、肝線維症を有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つの肝線維症療法を対象に施与することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、表１５〜１７の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２２４である。一部の実施形態において、方法は、表１８に列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、ｍｉＲ−２２４および／またはｍｉＲ−１９１のレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、肝線維症は、ステージ１、２、３、または４の肝線維症である。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、試料は、ＮＡＳＨと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである。
【００１４】
一部の実施形態において、対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、肝細胞バルーニングを有すると疑われている対象からの試料を提供することと、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるＮ個のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを形成することと、対象からの試料中のパネル中のＮ個のｍｉＲＮＡのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、Ｎは、１〜２０、１〜５、６〜１０、１１〜１５、または１５〜２０である。一部の実施形態において、方法は、対象が肝細胞バルーニングを有するか否かを判定することを含み、肝細胞バルーニングを有すると疑われている対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルは、肝細胞バルーニングの存在を示す。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出し、対象を、肝細胞バルーニングを有すると診断する。一部の実施形態において、方法は、その診断に基づき少なくとも１つの肝細胞バルーニング療法を対象に施与することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表３０に列記されるペアから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表３５に列記されるペアから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は、軽度、中程度、または重度のＮＡＦＬＤと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、試料は、ＮＡＳＨと診断された対象からのものである。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、ステージ１、２、３、４のＮＡＳＨである。
【００１５】
本開示の方法の一部の実施形態において、方法は、ＰＣＲを含むプロセスにより検出することを含む。一部の実施形態において、検出は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。
【００１６】
本開示の方法の一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、試料は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。
【００１７】
本開示の方法の一部の実施形態において、方法は、医療保険料または生命保険料を決定する目的のために対象のＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ状態を特徴付けすることを含む。一部の実施形態において、方法は、対象についての医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態において、組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、対象からの試料のＲＮＡまたは対象からの試料のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡと、表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、組成物中のそれぞれのポリヌクレオチドは、独立して、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、８〜３０、１２〜１００、１２〜７５、１２〜５０、１２〜４０、または１２〜３０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、試料は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。
【００１９】
一部の実施形態において、キットが提供される。一部の実施形態において、キットは、表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドのセットを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、キット中のそれぞれのポリヌクレオチドは、独立して、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、８〜３０、１２〜１００、１２〜７５、１２〜５０、１２〜４０、または１２〜３０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、マルチプレックスアッセイにおける使用のために包装されている。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、非マルチプレックスアッセイにおける使用のための包装である。
【００２０】
一部の実施形態において、系が提供される。一部の実施形態において、系は、表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドのセットと、対象からの試料のＲＮＡまたは対象からの試料のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡと、を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドのセットは、表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のＲＮＡを検出するためのものである。一部の実施形態において、系中のそれぞれのポリヌクレオチドは、独立して、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、８〜３０、１２〜１００、１２〜７５、１２〜５０、１２〜４０、または１２〜３０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、試料は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。一部の実施形態において、対象からの試料のＲＮＡまたは対象からの試料のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡは容器中に存在し、ポリヌクレオチドのセットは容器とは別個に包装されている。
【００２１】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡの示差的発現を検出する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表１〜４、１０〜１４、および２８〜２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個または少なくとも１５個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤを有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＦＬＤを有する。
【００２２】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡの示差的発現を検出する追加の方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表１〜４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨを有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨを発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、ＮＡＳＨを有する。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、ステージ１、ステージ２、ステージ３またはステージ４のＮＡＳＨである。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表５に列記されるペア１〜１０から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。
【００２３】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡの示差的発現を検出する追加の方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、表１０〜１４の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含み、それを対象からの試料中で検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、肝線維症を有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、肝線維症を発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、肝線維症を有する。一部の実施形態において、方法は、表１５〜１７の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２２４である。一部の実施形態において、方法は、表１８に列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、ｍｉＲ−２２４および／またはｍｉＲ−１９１のレベルを検出することを含む。
【００２４】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡの示差的発現を検出する追加の方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料を提供することと、対象からの試料中の表２８および２９の少なくとも１つに列記される示差的に増加する、および示差的に減少するｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡのレベルを検出することと、を含む。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出する。一部の実施形態において、それぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも高い少なくとも１つの示差的に増加するｍｉＲＮＡのレベルおよび／またはそれぞれのｍｉＲＮＡの対照レベルよりも低い少なくとも１つの示差的に減少するｍｉＲＮＡのレベルを検出しない。一部の実施形態において、対象は、肝細胞バルーニングを有すると疑われている。一部の実施形態において、対象は、肝細胞バルーニングを発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、肝細胞バルーニングを有する。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表３０に列記されるペアから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、方法は、対象からの試料中の表３５に列記されるペアから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのペアのレベルを検出することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、異なるステージの線維症間でモジュレートされるｍｉＲＮＡの数を示すベン図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
表
表１〜３９を、本明細書の終わりにまとめて提示する。それらの表は、本出願の本文において言及され、本出願の一部を形成する。
【００２７】
本発明をある代表的な実施形態とともに記載する一方、本発明は、特許請求の範囲により定義され、それらの実施形態には限定されないことが理解される。
【００２８】
当業者は、本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料を本発明の実施において使用することができることを認識する。本発明は、文字のとおり記載される方法および材料に決して限定されるものではない。
【００２９】
特に定義のない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法、装置、および材料を本発明の実施において使用することができるが、ある方法、装置、および材料が本明細書に記載される。
【００３０】
本明細書に引用される全ての刊行物、公開特許文献、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、公開特許文献、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
添付の特許請求の範囲を含む本出願において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り複数形を含み「少なくとも１つ」および「１つ以上」と互換的に使用することができる。したがって、「ｍｉＲＮＡ」への言及は、ｍｉＲＮＡの混合物などを含む。
【００３２】
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、およびそれらの任意の変形語は、非排他的包含を包含するものとし、その結果、要素または要素のリストを含み（ｃｏｍｐｉｒｓｅｓ）、含み（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含有するプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または物質の組成物は、明示的に列記されていない他の要素を含み得る。
【００３３】
本出願は、対象がＮＡＦＬＤを有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系、およびキットを含む。本出願はまた、対象がＮＡＳＨを有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系およびキットを含む。一部の実施形態において、ＮＡＦＬＤを有する対象がＮＡＳＨを有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系およびキットが提供される。本出願はまた、対象が肝線維症を有するか否かを判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系、およびキットを含む。本出願はまた、対象が肝細胞バルーニングを有するか否か判定するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、系、およびキットを含む。
【００３４】
本明細書において使用される「非アルコール性脂肪肝疾患」または「ＮＡＦＬＤ」は、過剰のアルコール使用の不存在下で炎症および線維症を有し、または有さない、脂肪が肝臓中で堆積している病態（肝脂肪変性）を指す。
【００３５】
本明細書において使用される「非アルコール性脂肪性肝炎」または「ＮＡＳＨ」は、肝臓中に炎症および／または線維症が存在するＮＡＦＬＤを指す。ＮＡＳＨは４つのステージに分類することができる。ＮＡＳＨのステージを判定する例示的な方法は、例えば、Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１（６）：１３１３−１３２１、およびＢｒｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ，２０：Ｓ４０−Ｓ４８に記載されている。
【００３６】
本明細書において使用される「肝線維症」は、肝臓中での過剰の繊維状結合組織の形成を指す。
【００３７】
本明細書において使用される「肝細胞バルーニング」は、肝細胞死のプロセスを指す。
【００３８】
「マイクロＲＮＡ」は、１８〜２５核酸塩基長の内因性非コードＲＮＡを意味し、これは、酵素ＤｉｃｅｒによるプレマイクロＲＮＡの開裂産物である。成熟マイクロＲＮＡの例は、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）として公知のマイクロＲＮＡデータベースに見出される。ある実施形態において、マイクロＲＮＡは「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」と省略される。いくつかの例示的なｍｉＲＮＡが、それらの一般名およびそれらの核酸塩基配列により識別されて本明細書に提供される。
【００３９】
「プレマイクロＲＮＡ」または「プレｍｉＲＮＡ」または「プレｍｉＲ」は、ヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを意味し、これは、Ｄｒｏｓｈａとして公知の二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼによるプリｍｉＲの開裂産物である。
【００４０】
「ステム−ループ配列」は、ヘアピン構造を有し、成熟マイクロＲＮＡ配列を含有するＲＮＡを意味する。プレマイクロＲＮＡ配列およびステム−ループ配列は、重複し得る。ステム−ループ配列の例は、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）として公知のマイクロＲＮＡデータベースに見出される。
【００４１】
「プリマイクロＲＮＡ」または「プリｍｉＲＮＡ」または「プリｍｉＲ」は、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａの基質であるヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを意味する。
【００４２】
「マイクロＲＮＡ前駆体」は、ゲノムＤＮＡに由来し、１つ以上のマイクロＲＮＡ配列を含む非コード構造化ＲＮＡを含む転写物を意味する。例えば、ある実施形態において、マイクロＲＮＡ前駆体はプレマイクロＲＮＡである。ある実施形態において、マイクロＲＮＡ前駆体はプリマイクロＲＮＡである。
【００４３】
本開示の方法の一部は、試料中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することを含む。一部の実施形態において、試料は体液である。一部の実施形態において、体液は、血液、血液成分、尿、痰、唾液、および粘液から選択される。一部の実施形態において、試料は血清である。試料中のレベルの検出は、対象から得られた未処理試料中のレベルを直接検出する方法およびさらには試料の処理後にレベルを検出する方法も包含する。一部の実施形態において、未処理試料は、他の成分に対して試料中の核酸を濃縮することおよび／または他の成分に対して試料中の小分子ＲＮＡを濃縮することを含むプロセスにより処理する。
【００４４】
実施形態において、試料中のｍｉＲＮＡのレベルの検出は、試料中のｍｉＲＮＡ分子の直接検出を含む方法によるものであり得る。実施形態において、試料中のｍｉＲＮＡのレベルの検出は、ｍｉＲＮＡ分子の一部もしくは全部を逆転写させ、次いでｃＤＮＡ分子を検出すること、ならびに／または元のｍｉＲＮＡ配列に対応する部分およびｃＤＮＡに対応する部分を含む分子を検出することを含む方法によるものであり得る。
【００４５】
当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを検出することができる。このようなアッセイの１つのクラスは、固体担体上で固定化された１つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーは、高度に特異的に、かつ極めて高い親和性で標的分子にそれぞれ結合し得る。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号明細書、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」参照；例えば、米国特許第６，２４２，２４６号明細書、米国特許第６，４５８，５４３号明細書、および米国特許第６，５０３，７１５号明細書、それらのそれぞれの表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ」も参照。マイクロアレイを試料と接触させると、アプタマーが試料中に存在するそれらのそれぞれの標的分子に結合し、それにより試料中のｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡレベルの測定が可能となる。
【００４６】
本明細書において使用される「アプタマー」は、標的分子、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡによりコードされるｃＤＮＡに対して特異的な結合親和性を有する核酸を指す。親和性の相互作用は程度の問題であることが認識されており；しかしながら、この文脈において、アプタマーの標的に対する「特異的な結合親和性」は、アプタマーが、その標的に、一般に試験試料中の他の成分に結合する場合よりもかなり高い程度の親和性で結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する１つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得、任意数の化学修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。「アプタマー」は、２つ以上のこのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくは化学修飾核酸であり得、一本鎖、二本鎖であり得、または二本鎖領域を含有し得、より高次の構造を含み得る。以下にさらに記載されるとおり、アプタマーは、タグを含み得る。アプタマーがタグを含む場合、必ずしもアプタマーのコピー全てが同一のタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーそれぞれがタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同一のタグまたは異なるタグのどちらでも有し得る。
【００４７】
本明細書において使用される用語「示差的に調節される」ｍｉＲＮＡは、目的の疾患も病態も有さない対象からの試料中で生じるｍｉＲＮＡの対照レベルと比較して、目的の疾患または病態を有する対象からの同様の試料中の存在量が増加または減少するｍｉＲＮＡである。目的の疾患も病態も有さない対象は、いかなる関連疾患も病態も有さない対象（例えば、正常な対照対象）であり得、または対象は、異なる関連疾患または病態を有し得る（例えば、ＮＡＦＬＤを有するが、ＮＡＳＨを有さない対象）。
【００４８】
本明細書において使用される「示差的に増加する」ｍｉＲＮＡは、目的の疾患も病態も有さない対象からの対照試料中で生じるｍｉＲＮＡのレベルと比較して、目的の疾患または病態を有する対象からの試料中の存在量が増加するｍｉＲＮＡである。
【００４９】
本明細書において使用される「示差的に減少する」ｍｉＲＮＡは、目的の疾患も病態も有さない対象からの対照試料中で生じるｍｉＲＮＡのレベルと比較して、目的の疾患または病態を有する対象からの試料中の存在量が減少するｍｉＲＮＡである。
【００５０】
本明細書において使用されるｍｉＲＮＡの「対照レベル」は、参照集団からの同様の試料中に存在するレベルである。ｍｉＲＮＡの「対照レベル」は、本方法を実施するごとに測定する必要がなく、特定の試料中のレベルが正常レベルよりも高いか低いかを判定するために参照または閾値として使用されるレベルを事前に測定することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における対照レベルは、ＮＡＦＬＤを有さない１つ以上の対象において観察されたレベルである。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における対照レベルは、ＮＡＦＬＤを有するが、ＮＡＳＨを有さない１つ以上の対象において観察されたレベルである。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における対照レベルは、複数の正常対象、またはＮＡＦＬＤを有するがＮＡＳＨを有さない対象において観察された、場合により統計的変動で上下する平均または平均レベルである。
【００５１】
本明細書において使用される「個体」および「対象」は、試験対象または患者を指すために互換的に使用される。種々の実施形態において、個体は哺乳動物である。哺乳動物個体は、ヒトでも非ヒトでもよい。種々の実施形態において、個体はヒトである。健常または正常個体は、慣用の診断法により目的の疾患も病態も（例えば、ＮＡＳＨ）検出可能でない個体である。
【００５２】
「診断する」、「診断すること」、「診断」、およびそれらの変形語は、個体の健康状態または病態を、その個体に関する１つ以上の徴候、症状、データまたは他の情報に基づき検出、決定、または認識することを指す。個体の健康状態は、健康／正常と診断され得（すなわち、疾患も病態も不存在であるという診断）、または疾病／異常と診断され得る（すなわち、疾患もしくは病態の特徴の存在という診断、または疾患もしくは病態の特徴の評価）。用語「診断する」、「診断すること」、「診断」などは、特定の疾患または病態に関して、疾患の初期の検出；疾患の特徴付けもしくは分類；疾患の進行、寛解もしくは再発の検出；および／または個体に治療もしくは治療法を施与した後の疾患応答の検出を包含する。ＮＡＦＬＤの診断は、ＮＡＦＬＤを有する個体と、それを有さない個体とを区別することを含む。ＮＡＳＨの診断は、ＮＡＳＨを有する個体と、ＮＡＦＬＤを有するがＮＡＳＨを有さない個体と、肝疾患を有さない個体とを区別することを含む。肝線維症の診断は、肝線維症を有する個体と、ＮＡＦＬＤを有するが、肝線維症を有さない個体とを区別することを含む。肝細胞バルーニングの診断は、肝細胞バルーニングを有する個体と、ＮＡＦＬＤを有するが肝細胞バルーニングを有さない個体とを区別することを含む。
【００５３】
「予後予測する」、「予後予測すること」、「予後予測」、およびそれらの変形語は、疾患または病態を有する個体における疾患または病態の将来的な経過の予測（例えば、疾患進行を予測すること）、および疾患も病態も有さない個体がその疾患または病態を発症するか否かの予測を指す。このような用語は、個体に治療または治療法を施与した後の疾患応答を評価することも包含する。
【００５４】
「特徴付けする」、「特徴付けすること」、「特徴付け」、およびそれらの変形語は、「診断する」および「予後予測する」の両方を包含し、さらに疾患を有さない個体における疾患または病態の将来的な経過に関する決定または予測、ならびに見かけ上、疾患が治癒した個体において疾患または状態が再発する見込みに関する決定または予測も包含する。用語「特徴付けする」は、治療法に対する個体の応答を評価すること、例えば個体が、治療剤に良好に応答する可能性が高いのか、治療剤に応答する可能性が低いのか（または例えば毒作用もしくは他の不所望な副作用を受けるのか）を予測すること、個体に投与するための治療剤を選択すること、または個体に施与された治療法に対する個体の応答をモニタリングもしくは決定することなども包含する。したがって、ＮＡＦＬＤを「特徴付けすること」は、例えば、以下の何れかを含み得る：個体におけるＮＡＦＬＤの将来的な経過を予後予測すること；ＮＡＦＬＤがＮＡＳＨに進行するか否かを予測すること；特定のステージのＮＡＳＨが、より上のステージのＮＡＳＨに進行するか否かを予測すること；ＮＡＦＬＤを有する個体が肝線維症を発症するか否かを予測すること；特定の状態の肝線維症が、次の状態の肝線維症に進行するか否かを予測すること；ＮＡＦＬＤを有する個体が肝細胞バルーニングを発症するか否かを予測することなど。
【００５５】
本明細書において使用されるｍｉＲＮＡレベルに関して「検出すること」または「測定すること」は、ｍｉＲＮＡレベルに対応するシグナルを観察および記録するために使用される機器ならびに、そのシグナルを生成するために要求される材料の両方の使用を含む。種々の実施形態において、レベルは、任意の好適な方法、例として、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面弾性波、質量分析、赤外分光分析、ラマン分光法、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡、電気化学的な検出方法、核磁気共鳴、量子ドットなどを使用して検出される。
【００５６】
本明細書において使用される「ＮＡＦＬＤを有する対象」は、ＮＡＦＬＤと診断された対象を指す。一部の実施形態において、ＮＡＦＬＤは、定型的な健康診断、メタボリックシンドロームおよび肥満のモニタリング、または薬物（例えば、コレステロール降下剤またはステロイド）の効果の考えられる副作用についてのモニタリングの間に疑われる。一部の例において、肝酵素、例えば、ＡＳＴおよびＡＬＴが高い。一部の実施形態において、対象は、腹部または胸部イメージング、肝超音波、または磁気共鳴イメージング後に診断される。一部の実施形態において、他の病態、過剰アルコール消費、Ｃ型肝炎、およびウィルソン病は、ＮＡＦＬＤ診断前に無視される。一部の実施形態において、対象は、肝生検後に診断されている。
【００５７】
本明細書において使用される「ＮＡＳＨを有する対象」は、ＮＡＳＨと診断された対象を指す。一部の実施形態において、ＮＡＳＨは、一般に、ＮＡＦＬＤについて上記した方法により診断される。一部の実施形態において、進行線維症は、ＮＡＦＬＤを有する患者において、例えば、Ｇａｍｂｉｎｏ  Ｒ，ｅｔ．ａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；４３（８）：６１７−４９に従って診断される。
【００５８】
本明細書において使用される「ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある対象」は、１つ以上のＮＡＦＬＤ共存症、例えば、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、および糖尿病を有する対象を指す。
【００５９】
本明細書において使用される「ＮＡＳＨを発症するリスクがある対象」は、１つ以上のＮＡＦＬＤ共存症、例えば、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、および糖尿病を有し続ける、脂肪変性を有する対象を指す。
【００６０】
一部の実施形態において、パネル中のｍｉＲＮＡの数およびアイデンティティは、ｍｉＲＮＡバイオマーカー値の特定の組合せについての感度および特異度に基づき選択される。用語「感度」および「特異度」は、生物学的試料中で検出される１つ以上のｍｉＲＮＡレベルに基づき個体を、疾患を有する、または疾患を有さないと正確に分類する能力に関して本明細書において使用される。一部の実施形態において、用語「感度」および「特異度」は、生物学的試料中で検出される１つ以上のｍｉＲＮＡレベルに基づき個体を、疾患もしくは病態を有する、または有さないと正確に分類する能力に関して本明細書において使用することができる。このような実施形態において、「感度」は、疾患または病態を有する個体を正確に分類することに関するｍｉＲＮＡの性能を示す。「特異度」は、疾患も病態も有さない個体を正確に分類することに関するｍｉＲＮＡの性能を示す。例えば、対照試料（例えば、健常個体またはＮＡＳＨを有さないことが既知の対象からの試料）および試験試料（例えば、ＮＡＳＨを有する個体からの試料）のセットを試験するために使用されるｍｉＲＮＡのパネルについての８５％の特異度および９０％の感度は、対照試料の８５％がパネルにより対照試料として正確に分類され、試験試料の９０％がパネルにより試験試料として正確に分類されたことを示す。
【００６１】
本明細書に記載のｍｉＲＮＡの任意の組合せは、好適なキット、例えば、本明細書に開示の方法の実施において使用されるキットを使用して検出することができる。さらに、任意のキットは、本明細書に記載の１つ以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含有し得る。一部の実施形態において、キットは、（ａ）生物学的試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡを検出するための１つ以上の試薬、および場合により、（ｂ）生物学的試料を得た個体が、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ（例えば、ステージ１、２、３、もしくは４のＮＡＳＨ、またはステージ２、３、もしくは４のＮＡＳＨ、またはステージ３もしくは４のＮＡＳＨ）、肝線維症（例えば、ステージ１、２、３、もしくは４の線維症、またはステージ３もしくは４の線維症）を有するか否かを予測するための１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータプログラムプロダクトを含む。あるいは、１つ以上のコンピュータプログラムプロダクトではなく、上記ステップを人力により手作業で実施するための１つ以上の説明書を提供することができる。
【００６２】
一部の実施形態において、キットは、本明細書に開示の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列に特異的に結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、シグナル生成材料をさらに含む。キットは、装置および試薬を使用するため、試料を取り扱うため、ならびにデータを分析するための説明書も含み得る。さらに、キットは、コンピュータシステムまたはソフトウェアにより使用して生物学的試料を分析し、その分析の結果を報告することができる。
【００６３】
キットは、生物学的試料を処理するための１つ以上の試薬（例えば、可溶化緩衝液、界面活性剤、洗浄液、または緩衝液）も含有し得る。本明細書に記載のキットの何れも、例えば、緩衝液、陽性対照試料、陰性対照試料、ソフトウェアおよび情報、例えば、プロトコル、指針および参照データも含み得る。
【００６４】
一部の実施形態において、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨおよび／または肝線維症および／または肝細胞バルーニングの分析のためのキットが提供され、キットは、本明細書に記載の１つ以上のｍｉＲＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマーを含む。一部の実施形態において、キットは、ｍｉＲＮＡの使用、およびｍｉＲＮＡと、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨおよび／または肝線維症および／または肝細胞バルーニング診断および／または予後予測との相関についての説明書をさらに含み得る。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの１つ以上の相補鎖、試料ＤＮＡを増幅もしくは単離するための試薬、および／または酵素を含有するＤＮＡアレイを含み得る。キットは、リアルタイムＰＣＲ、例えば、定量的リアルタイムＰＣＴのための試薬を含み得る。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例は、説明目的のためにのみ提供され、添付の特許請求の範囲により定義され、または他の点で本明細書に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【００６６】
実施例１：血清からの小分子ＲＮＡの単離
以下の試薬および器具を使用してヒト血清試料から小分子ＲＮＡ、例として、ｍｉＲＮＡを単離した。
2018518169.tif 000002
【００６７】
ｍｉＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１７０６１）を使用して、製造業者の説明書に従って１４０ｕＬの血清を抽出した。
【００６８】
実施例２：Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙプラットフォームを使用するマイクロＲＮＡプロファイリング
以下の試薬および器具を使用してｏｐｅｎ  ａｒｒａｙプラットフォームを使用してｍｉＲＮＡをプロファイリングした：
2018518169.tif 000003
【００６９】
以下の手順を使用した：
逆転写（ＲＴ）：
Ｍｅｇａｐｌｅｘ（商標）Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｏｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｏｌ  Ａ  ｖ２．１（４３９９９６）を使用して実施例１からの４ｕＬのＲＮＡを逆転写に供し、Ｍｅｇａｐｌｅｘ（商標）Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｏｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｏｌ  Ｂ  ｖ３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  ４４４４２８１）を使用して第２の４ｕＬのＲＮＡを逆転写に供した。製造業者の説明書は、１０ｕＬの総反応容量について従った。熱サイクリングパラメータは以下のとおりであった。
2018518169.tif 000004
【００７０】
ＲＴ試料の前増幅：
逆転写産物の前増幅は、パネルＡおよびパネルＢについてそれらのそれぞれの前増幅試薬を使用して製造業者の説明書に従って達成して４０ｕＬの反応を達成した。以下の熱サイクリングパラメータを使用した。
2018518169.tif 000005
【００７１】
リアルタイムＰＣＲ分析。３ｕｌの前増幅ｃＤＮＡ（上記のＲＴ反応産物）を、１１７ｕｌのＲＮアーゼ、ＤＮアーゼフリーＨ２Ｏ中に希釈した。３０ｕＬの希釈ｃＤＮＡを、製造業者の説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って調製された３０ｕＬのＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを含有する９６ウェルプレート中に移した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ａｃｃｕｆｉｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（４４７１０２１，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）を使用して、混合物をＴａｑＭａｎ（登録商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐａｎｅｌ（４４７０１８７，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）上にロードした。プレートをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（４４７１０９０，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）中にロードし、以下の熱サイクリングパラメータを使用してリアルタイム増幅を開始した。
2018518169.tif 000006
【００７２】
実施例３：ＮＡＦＬＤ患者からの血清試料
１５６人のＮＡＦＬＤ患者からの凍結血清試料を入手し、最初に実施例１および２に記載の手順を使用してＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してプロファイリングした。未処理ＰＣＲデータをフィルタリングし、１０未満のＣｔ値は無視し、２８を超えるＣｔ値は無視し、または２８に設定した。後続の分析に、両方の値のセットを適用した。フィルタリングデータを、検出されたｍｉＲＮＡの幾何平均により正規化した。
【００７３】
これらのフィルタリング正規化値を、探索分析において使用した。主成分分析（ＰＣＡ）を適用してｍｉＲＮＡ発現データにおける技術的および生物学的バイアスを発見した。ＰＣＡ異常値、例えば、潜在的に分解されるＲＮＡを有する試料は排除した。合計１５３個のＮＡＦＬＤ試料をこれらの手順に付し；これらを、ＮＡＦＬ血清試料とＮＡＳＨ血清試料とを分ける多重ｍｉＲＮＡ分類因子の発見において使用した。さらに、線維症グレード、脂肪変性および肝細胞バルーニングを使用してそれぞれのグレードを分ける分類因子を発見した。
【００７４】
ＰＣＡ分析により、プロファイルと分類臨床パラメータ、例えば、性別、種別、民族性、喫煙、糖尿病（ＤＭ）、脂肪変性、線維症、小葉内炎症、門脈炎症、肝細胞バルーニング、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、門脈三管および臨床ＮＡＦＬ分類との間に強い相関が存在しないことが明らかになった（目下、データを示す）。データ中の分散の＜１０％を占める３つ目の主成分のみが、分類可変要素、例えば、肝細胞バルーニング、ＮＡＦＬ分類、ＮＡＳ、脂肪変性および線維症と統計的に有意に関連した（データ示さず）。
【００７５】
実施例４：ＮＡＳＨにおいて示差的に発現されるマイクロＲＮＡの同定。
Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１（６）：１３１３−１３２１に記載の分類基準および手順を使用して１５３個の試料を以下のカテゴリーのそれぞれに分類した：ＮＡＳＨ３（１１４）、ボーダーライン／疑い２（１７）、ＮＡＦＬＤ１（１８）、および非ＮＡＦＬＤ０（２）。２つの試料は、利用可能なＮＡＦＬ／ＮＡＳＨ分類を有さなかった。
【００７６】
表１は、ＮＡＳＨ患者の患者から得られた血清試料およびＮＡＳＨを有さないＮＡＦＬＤ患者から得られた血清試料中で示差的に発現される、３３個のｍｉＲＮＡについての平均ＮＡＳＨ対ＮＡＦＬＤの示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの２３個は、ＮＡＳＨを有さないと診断されたＮＡＦＬＤ患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対してＮＡＳＨ診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの１０個は、ＮＡＳＨを有さないと診断されたＮＡＦＬＤ患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対してＮＡＳＨ診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００７７】
表２は、ＮＡＦＬＤ１と診断された患者から得られた血清試料と比較して、ＮＡＳＨ３と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される２４個のｍｉＲＮＡについての平均ＮＡＳＨ３対ＮＡＦＬＤ１の示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの１７個は、ＮＡＦＬＤ１の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ＮＡＳＨ３を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの７つは、ＮＡＦＬＤ１の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ＮＡＳＨ３の診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００７８】
表３は、ボーダーライン２と診断された患者から得られた血清試料と比較して、ＮＡＳＨ３と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される１７個のｍｉＲＮＡについての平均ＮＡＳＨ３対ボーダーライン２の示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの９つは、ボーダーライン２の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ＮＡＳＨ３の診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの８つは、ボーダーライン２の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ＮＡＳＨ３の診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００７９】
表４は、ＮＡＦＬＤ１と診断された患者から得られた血清試料と比較して、ボーダーライン２と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される１０個のｍｉＲＮＡについての平均ボーダーライン２対ＮＡＦＬＤ１の示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの５つは、ＮＡＦＬＤ１の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ボーダーライン２の診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの５つは、ＮＡＦＬＤ１の診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ボーダーライン２の診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００８０】
表１〜４に提示されるデータは、異なるＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ疾患状態を有する患者から得られた血清試料中で示差的に発現されるｍｉＲＮＡのセットを同定する。同定されたｍｉＲＮＡを、個々に、または組合せとしてバイオマーカーとして使用して患者の血清試料中の選択ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの決定に基づき患者の疾患状態を同定することができる。
【００８１】
実施例５：ＮＡＳＨ対ＮＡＦＬＤについてのマイクロＲＮＡ発現分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロＲＮＡプロファイルをＮＡＳＨまたはＮＡＦＬに分類した：複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および／またはサポートベクターマシン。マイクロＲＮＡの数は２０（１０個のペア）に設定した。グリーディペアアプローチ（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を使用してマイクロＲＮＡのこれらの１０個のペアを同定した。グリーディペア法は、個々のｔ−スコアに基づき全てのマイクロＲＮＡをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロＲＮＡを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロＲＮＡと一緒に最良の区別を提供し、ペアｔ−スコアを最大化するマイクロＲＮＡを検索する。次いで、このペアをマイクロＲＮＡのセットから除去し、所望のマイクロＲＮＡのペア数に到達するまで、マイクロＲＮＡの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のＡＵＣを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロＲＮＡを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロＲＮＡのセットを漏らし得ることである（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。この手順は、表５に同定される１０ペア分類因子を同定した。二元分類因子のそれぞれについての２０個のｍｉＲＮＡについての遺伝子重量を表６に提供する。
【００８２】
３つの分類法からの予測規則：
予測規則は、有意な遺伝子の重量（ｗｉ）および発現（ｘｉ）の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。
【００８３】
試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σｉｗｉｘｉ＞閾値
の場合、ＮＡＦＬのクラスに分類する。
【００８４】
複合共変量予測因子についての閾値は、−２３７．５１１である。対角線形判別予測因子についての閾値は、−７１．９９６である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、２６．０９１である。
【００８５】
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
【００８６】
一部のクラスＡについて、
ｎ１１＝Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ１２＝非Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ２１＝Ａとして予測される非Ａ試料の数、
ｎ２２＝非Ａとして予測される非Ａ試料の数
とする。
【００８７】
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る：
感度＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ１２）、
特異度＝ｎ２２／（ｎ２１＋ｎ２２）、
陽性予測値（ＰＰＶ）＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ２１）、
陰性予測値（ＮＰＶ）＝ｎ２２／（ｎ１２＋ｎ２２）。
【００８８】
感度は、クラスＡ試料がクラスＡとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスＡ試料が非Ａとして正確に予測される確率である。ＰＰＶは、クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属する確率である。ＮＰＶは、非クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属さない確率である。
【００８９】
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表７に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表８に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表９に提示する。
【００９０】
分類因子の受信者動作特性（ＲＯＣ）をグラフ表示した。得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、３つの分類法を使用して平均０．６８であった：複合共変量予測因子（ＣＣＰ）により得られた０．６７６のＡＵＣ、対角線形判別予測因子（ＤＬＤＰ）により得られた０．７０８のＡＵＣおよびベイズ複合共変量予測因子（ＢＣＣＰ）により得られた０．６６９のＡＵＣ。
【００９１】
実施例６：肝線維症において示差的に発現されるマイクロＲＮＡの同定
実施例３に記載の１５３個のＮＡＦＬＤ試料を、以下のカテゴリーのそれぞれに分類した：６２個（および２つの非ＮＡＦＬＤ試料）は線維症を有さなかった（ステージ０）。不明のＮＡＦＬスコアを有する２つの試料も、線維症を有さなかった（ステージ０）。５１個の試料は線維症ステージ１を有し、１６個は線維症ステージ２を有し、１２個は線維症ステージ３を有し、１０個は線維症ステージ４を有した。
【００９２】
表１０は、ステージ３またはステージ４の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される２８個のｍｉＲＮＡについての平均線維症ステージ３および４対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの１５個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ３またはステージ４の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの１３個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ３またはステージ４の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００９３】
表１１は、ステージ２の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される３０個のｍｉＲＮＡについての平均線維症ステージ２対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの１５個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ２の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの１５個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ２の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００９４】
表１２は、ステージ１の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される１６個のｍｉＲＮＡについての平均線維症ステージ１対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの１０個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ１の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの６個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ１の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００９５】
表１３は、ステージ１またはステージ２の線維症と診断された患者から得られた血清試料および線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される２５個のｍｉＲＮＡについての平均線維症ステージ１および２対線維症なしの示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの１４個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ１またはステージ２の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの１１個は、線維症を有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ１またはステージ２の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００９６】
表１４は、ステージ１またはステージ２の線維症と診断された患者から得られた血清試料およびステージ３またはステージ４の線維症と診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される５個のｍｉＲＮＡについての平均線維症ステージ１／２対平均線維症ステージ３／４の示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの３個は、ステージ３またはステージ４の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ１またはステージ２の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの２個は、ステージ３またはステージ４の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ１またはステージ２の線維症診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【００９７】
表１０〜１４に提示されるデータは、異なるステージの線維症を有する患者から得られた血清試料中で示差的に発現され、線維症疾患状態の存在と線維症疾患状態の不存在とを区別し、軽度（ステージ１／２）および重度（ステージ３／４）の疾患状態を区別するｍｉＲＮＡのセットを同定する。同定されたｍｉＲＮＡを個々に、または組合せとしてバイオマーカーとして使用して患者の血清試料中の選択ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの決定に基づき患者の線維症疾患状態を同定することができる。
【００９８】
実施例７：肝線維症についてのマイクロＲＮＡ発現分類因子
ｍｉＲ−２２４は、実施例６に提示されるデータにおいて肝線維症との強い相関を示した。０より大きい線維症グレードを有するＮＡＦＬ患者の血清中のｍｉＲ−２２４の有意なモジュレーションが同定された。Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｌｉｍｍａ（マイクロアレイデータ用の線形モデル）を使用して示差的発現分析を行った。血清レベルは、ステージ１の肝線維症対線維症なし、ステージ２対線維症なし、ならびにステージ３および４対線維症なしの患者において１．８８、３．０１および３．４２倍高かった。したがって、ｍｉＲ−２２４の血清レベルは線維症の程度と相関し、単独で、または他のバイオマーカーとの組合せで使用して肝線維症の進行をモニタリングすることができる。
【００９９】
ｍｉＲ−２２４の血清レベルは、ｍｉＲ−１９１との組合せで、グレード３および４の肝線維症を有する患者と、線維症を有さない患者とを区別する能力を有する分類因子をもたらし、曲線下面積は約０．８５であった。
【０１００】
表１５は、表１２からの示差的に発現されるｍｉＲ（ステージ１対ステージ０）を列記し、調整Ｐ値は＜０．１であり；表１６は、表１１の示差的に発現されるｍｉＲ（ステージ２対ステージ０）を列記し、調整Ｐ値は＜０．１であり；表１７は、表１１からの示差的に発現されるｍｉＲ（線維症ステージ３または４対ステージ０を列記し、調整Ｐ値は＜０．１である。
【０１０１】
図１は、線維症の不存在下でのｍｉＲＮＡの存在量に対して異なるステージの線維症間でモジュレートされる同一のｍｉＲＮＡの数を示すベン図を示す。ｍｉＲ−２２４およびｍｉＲ−３４ａは、肝線維症を有さない試料に対して、全ての線維症ステージについてモジュレートされることが見出された。ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、およびｍｉＲ−１９３ａ−５ｐは、肝線維症ステージ２以上を有する試料からのみモジュレートされることが見出された。
【０１０２】
肝線維症についての１２マイクロＲＮＡ分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロＲＮＡプロファイルを、進行線維症（ステージ３または４）または線維症なし（ステージ０）に分類した：複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および／またはベイズ複合共変量分類因子。マイクロＲＮＡ選択は、最初に、一連の有意値（０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５）にわたる２つのクラス間の２試料ｔ検定において有意に異なるマイクロＲＮＡを同定することにより行った。それぞれの予測方法について、最低の交差検証誤分類率を有する有意値を予測因子について選択した。１２マイクロＲＮＡ分類因子の組成を表１８に提示する。３つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表１９に提示する。
【０１０３】
３つの分類法からの予測規則：
予測規則は、有意な遺伝子の重量（ｗｉ）および発現（ｘｉ）の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。
【０１０４】
試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σｉｗｉｘｉ＞閾値
の場合、進行線維症のクラスに分類する。
【０１０５】
複合共変量予測因子についての閾値は、１．６８３である。対角線形判別予測因子についての閾値は、７７．３２３である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、２．２６８である。
【０１０６】
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
【０１０７】
一部のクラスＡについて、
ｎ１１＝Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ１２＝非Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ２１＝Ａとして予測される非Ａ試料の数、
ｎ２２＝非Ａとして予測される非Ａ試料の数
とする。
【０１０８】
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る：
感度＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ１２）、
特異度＝ｎ２２／（ｎ２１＋ｎ２２）、
陽性予測値（ＰＰＶ）＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ２１）、
陰性予測値（ＮＰＶ）＝ｎ２２／（ｎ１２＋ｎ２２）。
【０１０９】
感度は、クラスＡ試料がクラスＡとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスＡ試料が非Ａとして正確に予測される確率である。ＰＰＶは、クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属する確率である。ＮＰＶは、非クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属さない確率である。
【０１１０】
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表２０に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表２１に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表２２に提示する。
【０１１１】
分類因子の受信者動作特性（ＲＯＣ）をグラフ表示した。得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、３つの分類法を使用して平均０．８１であった：複合共変量予測因子（ＣＣＰ）により得られた０．８２のＡＵＣ、対角線形判別予測因子（ＤＬＤＰ）により得られた０．８０８のＡＵＣおよびベイズ複合共変量予測因子（ＢＣＣＰ）により得られた０．８０３のＡＵＣ。
【０１１２】
肝線維症についての１ペア（２マイクロＲＮＡ）の分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロＲＮＡプロファイルを、進行線維症（ステージ３または４）または線維症なし（ステージ０）に分類した：複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および／またはサポートベクターマシン。マイクロＲＮＡの数を２（１つのペア）に設定した。グリーディペアアプローチ（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を使用してマイクロＲＮＡの１つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のｔ−スコアに基づき全てのマイクロＲＮＡをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロＲＮＡを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロＲＮＡと一緒に最良の区別を提供し、ペアｔ−スコアを最大化するマイクロＲＮＡを検索する。次いで、このペアをマイクロＲＮＡのセットから除去し、所望のペア数のマイクロＲＮＡに到達するまで、マイクロＲＮＡの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のＡＵＣを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロＲＮＡを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロＲＮＡのセットを漏らし得ることである（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【０１１３】
２マイクロＲＮＡ分類因子の組成を表２３に提示する。３つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表２４に提示する。
【０１１４】
３つの分類法からの予測規則：
予測規則は、有意な遺伝子の重量（ｗｉ）および発現（ｘｉ）の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σｉｗｉｘｉ＞閾値
の場合、進行線維症のクラスに分類する。
【０１１５】
複合共変量予測因子についての閾値は、−１２０．６３１である。対角線形判別予測因子についての閾値は、−２６．８７である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、−９．７８５である。
【０１１６】
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
【０１１７】
一部のクラスＡについて、
ｎ１１＝Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ１２＝非Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ２１＝Ａとして予測される非Ａ試料の数、
ｎ２２＝非Ａとして予測される非Ａ試料の数
とする。
【０１１８】
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る：
感度＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ１２）、
特異度＝ｎ２２／（ｎ２１＋ｎ２２）、
陽性予測値（ＰＰＶ）＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ２１）、
陰性予測値（ＮＰＶ）＝ｎ２２／（ｎ１２＋ｎ２２）。
【０１１９】
感度は、クラスＡ試料がクラスＡとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスＡ試料が非Ａとして正確に予測される確率である。ＰＰＶは、クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属する確率である。ＮＰＶは、非クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属さない確率である。
【０１２０】
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表２５に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表２６に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表２７に提示する。
【０１２１】
分類因子の受信者動作特性（ＲＯＣ）をグラフ表示した。得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、３つの分類法を使用して平均０．８５であった：複合共変量予測因子（ＣＣＰ）により得られた０．８５５のＡＵＣ、対角線形判別予測因子（ＤＬＤＰ）により得られた０．８５９のＡＵＣおよびベイズ複合共変量予測因子（ＢＣＣＰ）により得られた０．８４２のＡＵＣ。
【０１２２】
実施例８：肝細胞バルーニングにおいて示差的に発現されるマイクロＲＮＡの同定
１５３個の試料を、肝細胞バルーニングについて分類した。３３個はステージ０を有し、８６個はステージ１を有し、２８個はステージ２を有し、１個はステージ３を有し、４個はステージ０〜１を有した（分析においてスコア１としてカウント）。
【０１２３】
表２８は、ステージ２またはステージ３の肝細胞バルーニングと診断された患者から得られた血清試料および肝細胞バルーニングを有さないと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される２９個のｍｉＲＮＡについての平均肝細胞バルーニングステージ２／３対肝細胞バルーニングなしの示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの１７個は、肝細胞バルーニングを有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ２またはステージ３の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの１２個は、肝細胞バルーニングを有さないと診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ２またはステージ３の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【０１２４】
表２９は、ステージ２またはステージ３の肝細胞バルーニングと診断された患者から得られた血清試料およびステージ１の肝細胞バルーニングと診断された患者から得られた血清試料中で示差的に発現される２０個のｍｉＲＮＡについての平均肝細胞バルーニングステージ２／３対肝細胞バルーニングステージ１の示差的発現データを提示する。これらのｍｉＲＮＡの６個は、ステージ１の肝細胞バルーニング診断を有すると診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ２またはステージ３の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で減少する。これらのｍｉＲＮＡの１４個は、ステージ１の肝細胞バルーニング診断を有すると診断された患者から得られた血清試料中のそれらの発現レベルに対して、ステージ２またはステージ３の肝細胞バルーニング診断を有する患者から得られた血清試料中で増加する。
【０１２５】
表２８および２９に提示されるデータは、異なるステージの肝細胞バルーニングを有する患者から得られた血清試料中で示差的に発現され、肝細胞バルーニング疾患状態の存在と肝細胞バルーニング疾患状態の不存在とを区別し、軽度（ステージ１／２）および重度（ステージ３）の疾患状態を区別するｍｉＲＮＡのセットを同定する。同定されたｍｉＲＮＡを個々に、または組合せとしてバイオマーカーとして使用して患者の血清試料中の選択ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの決定に基づき患者の肝細胞バルーニング疾患状態を同定することができる。
【０１２６】
実施例９：肝細胞バルーニングについてのマイクロＲＮＡ発現分類因子
実施例８に提示されるデータは、ｍｉＲ−２２４血清レベルと、肝細胞バルーニングの存在との相関の増加を同定する。この実施例は、肝細胞バルーニングスコア２または３と、スコア０（ＨＢの組織病理学的証拠を有さないＮＡＦＬ患者）とを区別する８ペアマイクロＲＮＡ分類因子ならびに肝細胞バルーニングスコア２または３と、肝細胞バルーニングスコア１とを区別する２ペア分類因子を記載する。
【０１２７】
肝細胞バルーニングについての８ペア（１６マイクロＲＮＡ）分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロＲＮＡプロファイルを、バルーニングスコア２もしくは３またはバルーニングスコア０に分類した：複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および／またはサポートベクターマシン。
【０１２８】
マイクロＲＮＡの数を１６（８つのペア）に設定した。グリーディペアアプローチ（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を使用してマイクロＲＮＡのこれら８つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のｔ−スコアに基づき全てのマイクロＲＮＡをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロＲＮＡを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロＲＮＡと一緒に最良の区別を提供し、ペアｔ−スコアを最大化するマイクロＲＮＡを検索する。次いで、このペアをマイクロＲＮＡのセットから除去し、所望のペア数のマイクロＲＮＡに到達するまで、マイクロＲＮＡの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のＡＵＣを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロＲＮＡを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロＲＮＡのセットを欠落し得ることである（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【０１２９】
８ペア分類因子の組成を表３０に提示する。３つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表３１に提示する。
【０１３０】
３つの分類法からの予測規則：
予測規則は、有意な遺伝子の重量（ｗｉ）および発現（ｘｉ）の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σｉｗｉｘｉ＞閾値
の場合、スコア＿０のクラスに分類する。
【０１３１】
複合共変量予測因子についての閾値は、４０１．７９６である。対角線形判別予測因子についての閾値は、１１．０２３である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、−４３．００７である。
【０１３２】
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
【０１３３】
一部のクラスＡについて、
ｎ１１＝Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ１２＝非Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ２１＝Ａとして予測される非Ａ試料の数、
ｎ２２＝非Ａとして予測される非Ａ試料の数
とする。
【０１３４】
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る：
感度＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ１２）、
特異度＝ｎ２２／（ｎ２１＋ｎ２２）、
陽性予測値（ＰＰＶ）＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ２１）、
陰性予測値（ＮＰＶ）＝ｎ２２／（ｎ１２＋ｎ２２）。
【０１３５】
感度は、クラスＡ試料がクラスＡとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスＡ試料が非Ａとして正確に予測される確率である。ＰＰＶは、クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属する確率である。ＮＰＶは、非クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属さない確率である。
【０１３６】
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表３２に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表３３に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表３４に提示する。
【０１３７】
分類因子の受信者動作特性（ＲＯＣ）をグラフ表示した。得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、３つの分類法を使用して平均０．８２であった：複合共変量予測因子（ＣＣＰ）により得られた０．８２４のＡＵＣ、対角線形判別予測因子（ＤＬＤＰ）により得られた０．８０９のＡＵＣおよびベイズ複合共変量予測因子（ＢＣＣＰ）により得られた０．８２１のＡＵＣ。
【０１３８】
肝細胞バルーニングについての２ペア（４マイクロＲＮＡ）分類因子
以下の二元分類因子を使用して血清マイクロＲＮＡプロファイルを、バルーニングスコア２もしくは３、またはバルーニングスコア１に分類した：複合共変量予測因子、対角線形判別分析、および／またはサポートベクターマシン。
【０１３９】
マイクロＲＮＡの数を４（２つのペア）に設定した。グリーディペアアプローチ（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を使用してマイクロＲＮＡのこれら２つのペアを同定した。グリーディペア法は、個々のｔ−スコアに基づき全てのマイクロＲＮＡをランク付けすることにより開始する。最高ランクのマイクロＲＮＡを選択し、次いで手順は、その最高ランクのマイクロＲＮＡと一緒に最良の区別を提供し、ペアｔ−スコアを最大化するマイクロＲＮＡを検索する。次いで、このペアをマイクロＲＮＡのセットから除去し、所望のペア数のマイクロＲＮＡに到達するまで、マイクロＲＮＡの残りのセットに対してこのプロセスを繰り返す。所望のペア数を先験的に規定する。種々のペア数を規定し、最良のＡＵＣを有するものをピックした。グリーディペア法の背景の概念は、それぞれのマイクロＲＮＡを別個に考慮する方法が、一緒には十分にクラスを分けるが、個々にはそれほど十分に分けないマイクロＲＮＡのセットを漏らし得ることである（Ｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【０１４０】
２ペア分類因子の組成を表３５に提示する。３つの方法のそれぞれにより割り当てられる遺伝子重量を表３６に提示する。
【０１４１】
３つの分類方法からの予測規則：
予測規則は、有意な遺伝子の重量（ｗｉ）および発現（ｘｉ）の内部合計により定義される。発現は、二重チャネルデータについての対数比および単一チャネルデータについての対数強度である。試料は、合計が閾値よりも大きい場合、すなわち、
Σｉｗｉｘｉ＞閾値
の場合、スコア＿１のクラスに分類する。
【０１４２】
複合共変量予測因子についての閾値は、７１．５７６である。対角線形判別予測因子についての閾値は、−８．１２である。サポートベクターマシン予測因子についての閾値は、−５．２６２である。
【０１４３】
交差検証を使用して分類因子の性能を以下のとおり検定した。
【０１４４】
一部のクラスＡについて、
ｎ１１＝Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ１２＝非Ａとして予測されるクラスＡ試料の数、
ｎ２１＝Ａとして予測される非Ａ試料の数、
ｎ２２＝非Ａとして予測される非Ａ試料の数
とする。
【０１４５】
次いで、以下のパラメータは、分類因子の性能を特徴付けし得る：
感度＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ１２）、
特異度＝ｎ２２／（ｎ２１＋ｎ２２）、
陽性予測値（ＰＰＶ）＝ｎ１１／（ｎ１１＋ｎ２１）、
陰性予測値（ＮＰＶ）＝ｎ２２／（ｎ１２＋ｎ２２）。
【０１４６】
感度は、クラスＡ試料がクラスＡとして正確に予測される確率である。特異度は、非クラスＡ試料が非Ａとして正確に予測される確率である。ＰＰＶは、クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属する確率である。ＮＰＶは、非クラスＡとして予測される試料が実際にクラスＡに属さない確率である。
【０１４７】
複合共変量予測因子の分類因子の性能を表３７に提示する。対角線形判別分析の分類因子の性能を表３８に提示する。サポートベクターマシンの分類因子の性能を表３９に提示する。
【０１４８】
分類因子の受信者動作特性（ＲＯＣ）をグラフ表示した。得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、３つの分類法を使用して平均０．７６であった：複合共変量予測因子（ＣＣＰ）により得られた０．７７のＡＵＣ、対角線形判別予測因子（ＤＬＤＰ）により得られた０．７５７のＡＵＣおよびベイズ複合共変量予測因子（ＢＣＣＰ）により得られた０．７５４のＡＵＣ。
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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