(57)【要約】本発明は、血液ＣＳＦ関門を調節するための、ならびに、軟膜転移を診断する、防止する、および／または処置するための方法および組成物に関する。本発明の特定の実施形態では、血液ＣＳＦ関門の透過性は、補体成分３（Ｃ３）またはその受容体のアゴニストまたはアンタゴニストにより調節される。本発明は、例えば、血液／脳脊髄液関門の透過性を低下させる処置を必要とする被験体において、血液／脳脊髄液関門の透過性を低下させる方法であって、有効な阻害量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを該被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
2018537459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液／脳脊髄液関門の透過性を低下させる処置を必要とする被験体において、血液／脳脊髄液関門の透過性を低下させる方法であって、有効な阻害量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前期被験体が、がんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が、軟膜転移を発症する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、感染性因子に曝露されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、毒素に曝露されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
血液／脳脊髄液関門の透過性を低下させる処置を必要とする被験体において、血液／脳脊髄液関門の透過性を低下させることにおいて使用するための、Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニスト。
【請求項９】
前期被験体が、がんを有する、請求項８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記被験体が、軟膜転移を発症する危険性がある、請求項８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記被験体が、感染性因子に曝露されている、請求項８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１２】
前記被験体が、毒素に曝露されている、請求項８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１３】
Ｃ３のアンタゴニストである、請求項８から１２のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項１４】
Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項８から１２のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項１５】
軟膜転移の危険性を低下させる処置を必要とする被験体において、軟膜転移の危険性を低下させる方法であって、有効な阻害量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記被験体が、がんと診断されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、乳がん、肺がんまたは黒色腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、Ｃ３またはＣ３ａＲアンタゴニストで該被験体を処置するステップを含む、方法。
【請求項２１】
第２の治療剤で前記被験体をさらに処置するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、乳がん、肺がんまたは黒色腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項２０から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項２０から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の治療剤が、化学療法剤である、請求項２１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、（ｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲアンタゴニスト、および（ｉｉ）治療剤と併用したＣ３またはＣ３ａＲアゴニストで該被験体を交互に処置するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記がんが、乳がん、肺がんまたは黒色腫である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の治療剤が、化学療法剤である、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
軟膜転移の危険性を低減させる処置を必要とする被験体において、軟膜転移の危険性を低減させることにおいて使用するための、Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニスト。
【請求項３２】
前記被験体が、がんと診断されている、請求項３１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３３】
前記がんが、乳がん、肺がんまたは黒色腫である、請求項３１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３４】
Ｃ３のアンタゴニストである、請求項３１から３３のいずれかに記載のアンタゴニスト
【請求項３５】
Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項３１から３３のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項３６】
がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、被験体のＣＳＦにおけるＣ３のレベルが、健常な対照被験体のＣＳＦにおけるレベルと比較して上昇していると決定することにより、該被験体における軟膜転移を診断するステップと、次いで、Ｃ３またはＣ３ａＲアンタゴニスト、および任意選択で第２の治療剤で該被験体を処置するステップとを含む、方法。
【請求項３７】
前記がんが、乳がん、肺がんまたは黒色腫である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の治療剤が、化学療法剤である、請求項３６から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
代謝性疾患、または毒素により媒介される疾患に罹患した被験体もしくは毒素に曝露された被験体を処置する方法であって、有効な阻害量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項４２】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
血液／脳脊髄液関門の透過性を増加させる処置を必要とする被験体において、血液／脳脊髄液関門の透過性を増加させる方法であって、有効量のＣ３またはＣ３ａＲのアゴニストを該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項４５】
第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体が、感染性疾患に罹患している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体が、がんに罹患している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体が、変性障害に罹患している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
中枢神経系の障害に罹患した被験体を処置する方法であって、有効量の（ｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアゴニスト、および（ｉｉ）第２の治療剤を該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５２】
前記被験体が、感染性疾患に罹患している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体が、がんに罹患している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験体が、変性障害に罹患している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アンタゴニストが、Ｃ３のアンタゴニストである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記アンタゴニストが、Ｃ３ａＲのアンタゴニストである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
第１のジェネレーター動物に親がん細胞を接種し、次いで、一定期間後、該第１のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップと、該収集した細胞を第２のジェネレーター動物中に接種し、次いで、一定期間後、前記第２のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップであって、該収集した細胞が「Ｉｎｔ」細胞である、ステップと、任意選択で該選択ステップを繰り返し、次いで、Ｉｎｔ細胞を宿主動物中に全身に導入するステップとを含み、それによって該宿主動物の髄膜に局在する導入された細胞が軟膜転移細胞である方法により調製される、１つまたは複数の導入されたレポーター構築物を含有する、軟膜転移細胞の精製された集団。
【請求項５８】
前記軟膜転移細胞が、細胞培養で維持される、請求項５７に記載の集団。
【請求項５９】
前記軟膜転移細胞が、レポーター構築物を発現する、請求項５７または５８に記載の集団。
【請求項６０】
前記レポーター構築物が、蛍光タンパク質をコードする、請求項５９に記載の集団。
【請求項６１】
前記レポーター構築物が、ルシフェラーゼをコードする、請求項５９に記載の集団。
【請求項６２】
請求項５７に記載の細胞を接種した宿主動物を含む、軟膜転移のモデル系。
【請求項６３】
被験体において軟膜転移を診断する方法であって、該被験体のＣＳＦにおけるＣ３のレベルが、健常な対照被験体のＣＳＦにおけるレベルと比較して上昇していると決定するステップを含む、方法。
【請求項６４】
被験体において軟膜転移性疾患の存在を検出するためのキットであって、Ｃ３を検出するための手段と、以下：（ｉ）該キットの使用およびＣＳＦにおけるＣ３レベルを決定することにおけるその使用のための指示または指示へのアクセス；（ｉｉ）二次抗体および／または検出剤；（ｉｉｉ）腰椎穿刺を実施するための材料もしくはＣＳＦリザーバータップ；（ｉｖ）ＣＳＦにおける乳がん細胞、肺がん細胞もしくは黒色腫細胞の検出に適している抗体；（ｖ）ＣＳＦにおけるグルコースのレベルを決定するための手段；ならびに／または（ｖｉ）軟膜転移性疾患の存在下および／もしくは非存在下における、ＣＳＦに存在するＣ３について陽性および／もしくは陰性の対照試料の１つまたは複数を含む、キット。
【請求項６５】
Ｃ３を検出するための前記手段が、抗Ｃ３抗体もしくは抗体断片または単鎖抗体の群から選択される、請求項６４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、米国仮出願第６２／２５８，０４４号の優先権を主張し、その内容全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、血液／脳脊髄液関門（「Ｂ−ＣＳＦ−Ｂ」）を調節するための、ならびに、軟膜転移および／または感染性疾患を診断する、防止する、および処置するための方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
軟膜は、脳および脊髄を取り巻き、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含有する。がんは、ＣＳＦ区画内に広がり、これは軟膜転移といわれ、厄介な臨床的課題を提示する。この流体で満たされた空間への転移は、中枢神経系中に急速に広まり、脳、脊髄、頭蓋および脊髄神経に定着および侵襲し、迅速な神経障害および死亡を引き起こす。処置していない患者は、診断後６〜８週間の軟膜腫瘍負荷（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）で死亡し（２０、７）、現行の処置は、この厳しい予後に対して改善をほとんど示さない（２１、２２）。任意の全身性のがんは、軟膜に播種し得るが、固形悪性腫瘍からの軟膜転移の大多数は、原発性乳がんおよび肺がんから生じる（２２）。固形腫瘍を有する患者のほぼ５〜１０％は、軟膜転移を抱え、この数は、上昇すると予想される（２３、２５）。この病的な、ますます蔓延しているがんの合併症の分子基盤は、不明なままである。
【０００４】
脈絡叢は、分極した分泌上皮であり、これは、脳室内にあり、ＣＳＦを分泌し、細胞および血漿成分の軟膜腔への進入を制限する。軟膜腔内では、転移性派生物が、懸濁液中で、ならびに薄い間葉組織層である軟膜（pia  matter）と接触して存在する。軟膜転移は、一旦確立されたら、実質を浸潤し、脊髄および脊髄根を含む神経軸索全体を被覆する場合がある。
【０００５】
ＣＳＦは、無細胞であり、タンパク質、グルコースおよびサイトカインの含有量が少ない（１８）。この組成のため、軟膜腔は、他の主な転移器官部位、例えば脳、骨髄、肝臓または肺の実質と比較して、転移微小環境として著しく異なる。間葉細胞、免疫細胞および上皮細胞、血管系、細胞外マトリックス構造物を含むこうした他の部位の間質成分、ならびに局所および全身的シグナルは、転移性派生物を支える源を提供し、これらの部位における細胞および分子の転移決定因子について、多くのことが研究されている（２４、２６）。それに反して、どのようにしてＣＳＦの組成的に単純な環境で軟膜腔を浸潤するがん細胞が増殖できるのかについて、ほとんどわかっていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、血液／脳脊髄液関門（「Ｂ−ＣＳＦ−Ｂ」）を調節するための、ならびに、軟膜転移（がん性髄膜炎または軟膜癌腫症としても公知である）を診断する、防止する、および／または処置するための、方法および組成物に関する。これは、遺伝子「シグネチャー」という、軟膜内で播種し、成長する細胞成分によって差次的に発現する別個の遺伝子セットの発見に少なくとも部分的に基づく。その「シグネチャー」セットにおいての、遺伝子の非限定的な一例は、補体成分３（「Ｃ３」または「Ｃ３」）である。
【０００７】
本発明のある非限定的な実施形態は、（ｉ）循環がん細胞が補体Ｃ３を生成する；（ｉｉ）細胞学的に、またはＭＲＩで証明された軟膜転移を有する患者からのＣＳＦ中で、Ｃ３が検出可能である；（ｉｉｉ）Ｃ３またはその受容体Ｃ３ａＲ（あるいはＣ３ａＲと称される）のアゴニストが、血液−ＣＳＦ−関門のがん細胞および他の作用剤に対する透過性を増加させる；ならびに（ｉｖ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストは、血液−ＣＳＦ−関門のがん細胞および他の作用剤に対する透過性を低下させ、この空間内のがん細胞の成長を阻害するという発見に、少なくとも部分的に基づく。
【０００８】
したがって、本発明は、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂそれ自体を操作するので、中枢神経系に関与する広範囲の髄膜の病変および状態に適用可能である。Ｂ−ＣＳＦ−Ｂを強制的に閉じると、がん細胞の髄膜への到達および／または髄膜内の生存を低減させることができる。反対に、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂを開くと、全身化学療法のＣＳＦ中への進入を改善できる。感染性髄膜炎の場合では、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂを開くと、抗菌剤のＣＳＦ中への透過が改善され得る。
【０００９】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、そのような処置を必要とする被験体において、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの透過性を増加させる方法であって、有効量のＣ３またはＣ３ａＲのアゴニストを被験体に投与するステップを含む、方法を提供し；ここで、例えば、限定されないが、被験体は、ＣＳＦ中に治療剤または診断剤が存在することから利益を得られる状態に罹患していることがある。そのような状態の例は、髄膜炎を含むが、それに限定されない細菌性、ウイルス性、真菌性、原虫性、もしくは寄生生物性（例えば、寄生虫の）感染症を含むが、それらに限定されない中枢神経系の感染性疾患；軟膜性髄膜炎を含むが、それに限定されない乳がん、肺がん、もしくは黒色腫を含むが、それらに限定されない中枢神経系の悪性疾患；神経系の変性疾患、例えば、以下に限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、もしくはピック病；脳血管疾患；ならびに／または例えば脳血管事故、手術もしくは外傷によるＣＮＳへの急激な損傷を含むが、それらに限定されない。様々な実施形態では、本発明は、有効量のＣ３またはＣ３ａＲのアゴニストを投与することにより、これらの状態を処置する方法を提供する。
【００１０】
さらにある特定の実施形態では、本発明は、そのような処置を必要とする被験体において、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの透過性を低下させる方法であって、有効量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを被験体に投与するステップを含む、方法を提供し；ここで、例えば、限定されないが、被験体は、（ｉ）悪性疾患に罹患していることがあり、したがって、がん細胞がＢ−ＣＳＦ−Ｂ関門を透過する危険性があり得る；（ｉｉ）軟膜疾患の存在と一致する所見を有し得る；（ｉｉｉ）乳がん、肺がん、または黒色腫に罹患していることがある；および／または（ｖ）代謝性疾患もしくは毒素により媒介される疾患に罹患していることがある。
【００１１】
さらにある特定の実施形態では、本発明は、被験体において軟膜転移を診断する方法であって、被験体のＣＳＦにおけるＣ３のレベルが、健常な対照被験体のＣＳＦにおけるレベルと比較して上昇していると決定するステップを含む、方法を提供する。関連した非限定的な実施形態では、本発明は、前記方法を実践するためのキットを提供し、前記キットは、以下に限定されないが、抗Ｃ３抗体もしくは抗体断片または単鎖抗体などＣ３を検出するための手段、ならびに任意選択で、キットの使用およびＣＳＦにおけるＣ３のレベルおよび軟膜転移性疾患とそれの関連を決定することにおけるその使用のための指示または指示へのアクセス；二次抗体および／もしくは検出剤、ならびに／または腰椎穿刺を行うための材料もしくはリザーバータップ（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｔａｐ）を含む。前記キットは、ＣＳＦ中の乳がん細胞、肺がん細胞、または黒色腫細胞の検出に適している抗体をさらに含み得る。前記キットは、ＣＳＦにおけるグルコースのレベルを決定するための手段をさらに含み得る。
【００１２】
さらにある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、Ｃ３もしくはＣ３ａＲアンタゴニスト、および／または第２の治療剤と併用したＣ３もしくはＣ３ａＲアンタゴニストで被験体を処置するステップを含む、方法を提供する。例えば、限定されないが、本発明は、がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、被験体において、被験体のＣＳＦにおけるＣ３のレベルが、健常な対照被験体のＣＳＦにおけるレベルと比較して上昇していると決定することにより、軟膜転移を診断するステップと、次いで、Ｃ３もしくはＣ３ａＲアンタゴニスト、および／または第２の治療剤と併用したＣ３もしくはＣ３ａＲアンタゴニストで被験体を処置するステップとを含む、方法を提供する。
【００１３】
さらにある特定の実施形態では、本発明は、軟膜転移のモデル系であって、第１のジェネレーター動物（ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ａｎｉｍａｌ）のくも膜下腔中に親がん細胞を接種し、次いで、一定期間後、第１のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップと、前記収集した細胞を、第２のジェネレーター動物のくも膜下腔中に接種し、次いで、一定期間後、第２のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップと、任意選択で前記選択ステップを１回または複数回を繰り返すステップとを含み、それによりモデル動物を生成するために使用される軟膜転移細胞（「Ｉｎｔ」細胞）の集団を得る方法により調製される、軟膜転移細胞を接種したモデル動物を含む、モデル系を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、軟膜転移細胞の前記集団は、宿主動物の全身循環中にさらに注入され得、次いで、一定期間後、宿主動物の髄膜から、「ＬｅｐｔｏＭ」細胞といわれるがん細胞が収集できる。髄膜中に検出可能なＬｅｐｔｏＭ細胞を有する動物は、本発明によるモデル系である（Ｉｎｔ細胞の接種後、髄膜での成長が確立された宿主動物を含む）。非限定的な実施形態では、モデル動物および／またはジェネレーター動物は、非ヒト動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヒツジであってよいが、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、軟膜転移マウスモデルを開発するための方法論を示す概略図である。細胞は、生物発光マーカー（ルシフェラーゼ）を発現し、生物発光イメージング（「ＢＬＩ」）により検出できる。ルシフェリンおよびＧＦＰを発現する親細胞を、大槽中に注入する。腫瘍成長を生物発光イメージング（ＢＬＩ）によりモニターする。細胞を頭蓋底髄膜（basilar  meninges）から収集し、培養で維持する。これを３回繰り返して、「Ｉｎｔ」細胞を作り出す。次いで、Ｉｎｔ細胞を心臓内に注入し、腫瘍負荷をＢＬＩによりモニターする。細胞を上記と同様に収集し、「ＬｅｐｔｏＭ」と称する。心臓内に注入され、続いて脳転移を生じる親細胞を、「ＢｒＭ」細胞と称する。
【００１５】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、軟膜転移マウスモデル：ＭＤＡ２３１モデルのバリデーションである。（Ａ）大槽に注入した、ルシフェリンおよびＧＦＰを発現する２×１０４個の親細胞を、ＢＬＩにより経時的にモニターし、ｉｎ  ｖｉｖｏ選択の連続する各ラウンドが示されている。（Ｂ）軟膜の腫瘍細胞を抱えるマウスの、経時的な代表的ＢＬＩ画像。頭蓋底髄膜および脳の死亡後のＢＬＩは、「体腔」および「脳」としてそれぞれ示されている。（Ｃ）軟膜腔における細胞の蓄積を実証する、５×１０４個のＩｎｔ細胞を心臓内に注入した後の代表的マウス。
【００１６】
【図３ＡＢＣ】図３Ａ〜Ｅは、軟膜転移マウスモデルが表現型で実質転移モデルと異なることを示す。（Ａ）親細胞株の特性。Ｂ〜Ｅ．５×１０４個の親ＢｒＭ細胞またはＬｅｐｔｏＭ細胞を、レシピエントマウス中の心臓内に注入し、腫瘍成長をＢＬＩによりモニターし、最終的な頭蓋内の局在は、組織の病的変化により決定した。転移なしの生存率、代表的組織の病的変化およびＢＬＩが、各モデル系に対して示されている。
【図３ＤＥ】図３Ａ〜Ｅは、軟膜転移マウスモデルが表現型で実質転移モデルと異なることを示す。（Ａ）親細胞株の特性。Ｂ〜Ｅ．５×１０４個の親ＢｒＭ細胞またはＬｅｐｔｏＭ細胞を、レシピエントマウス中の心臓内に注入し、腫瘍成長をＢＬＩによりモニターし、最終的な頭蓋内の局在は、組織の病的変化により決定した。転移なしの生存率、代表的組織の病的変化およびＢＬＩが、各モデル系に対して示されている。
【００１７】
【図４】図４は、軟膜転移マウスモデルが実質転移モデルとトランスクリプトーム的に（transcriptomally）異なることを示す。各モデル系に対して、ＲＮＡＳｅｑを、ＢｒＭ細胞（それぞれ３回の技術的反復）、Ｉｎｔ細胞（それぞれ２回の生物学的反復）およびＬｅｐｔｏＭ細胞（それぞれ３回の生物学的反復）で実施した。さらなる解析に対して、倍率変化＞２または＜０．０５、塩基平均＞５０、ｐ＜０．０５の遺伝子を収集した。主成分分析が描かれた。
【００１８】
【図５】図５Ａ〜Ｃは、補体Ｃ３が軟膜転移マウスモデルにおいて、上方制御することを示す。ＲＮＡＳｅｑは、図４に記載されているように着手した。（Ａ）各モデル系から差次的に発現した遺伝子を、一般的にはベン図にプロットする。５５２は、ＭＤＡ２３１およびＨＣＣ１９５４に共有され；２４１は、ＰＣ９およびＬＬＣに共有され；２０は、４つすべてに共有される。（Ｂ）ＤＡＶＩＤ経路解析による、差次的に（diffrentially）発現した遺伝子の遺伝子オントロジー解析により、補体および凝固カスケードの上方制御が明らかになる。ＰＣ９モデルの代表的解析が示されている。（Ｃ）すべてのモデルにおける遺伝子の差次的発現を、補体および凝固カスケードのダイアグラムにプロットする。
【００１９】
【図６ＡＢＣ】図６Ａ〜Ｄは、Ｃ３遺伝子のバリデーションである。Ａ〜Ｃ．Ｃ３に対してショートヘアピンを発現するＰＣ９細胞、ＬＬＣ細胞およびＭＤＡ２３１−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、レシピエントマウス中の大槽内に注入した；腫瘍成長をＢＬＩによりモニターした。Ｄ．ＬＬＣ−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、Ｃ３  ｗｔ（＋／＋）またはＣ３ノックアウト（−／−）遺伝的背景を有するレシピエントマウス中の大槽内に注入した；腫瘍成長を、ＢＬＩによりモニターした。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、Ｃ３遺伝子のバリデーションである。Ａ〜Ｃ．Ｃ３に対してショートヘアピンを発現するＰＣ９細胞、ＬＬＣ細胞およびＭＤＡ２３１−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、レシピエントマウス中の大槽内に注入した；腫瘍成長をＢＬＩによりモニターした。Ｄ．ＬＬＣ−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、Ｃ３  ｗｔ（＋／＋）またはＣ３ノックアウト（−／−）遺伝的背景を有するレシピエントマウス中の大槽内に注入した；腫瘍成長を、ＢＬＩによりモニターした。
【００２０】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜Ｅは、Ｃ３ａＲ活性化がＢ−ＣＳＦ−関門の完全性を変更することを示す。（Ａ）Ｃ３ａＲ（赤）および先端に発現したＳＰＡＫ（緑）に対するマウス脈絡叢の免疫蛍光。（Ｂ）ヒト脈絡叢上皮細胞（ＨｕＣＰＥｐｉ）を用いた、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるＣ３ａに応答する経上皮抵抗。（Ｃ）組換えマウスＣ３ａ（白丸）またはビヒクル（黒丸）を補充したＭＤＡ２３１親細胞（緑）からの馴化培地を使用して、ＴＥＥＲ測定の前に単層を処理した。（Ｄ）ＭＤＡ２３１  ＬｅｐｔｏＭ細胞からの馴化培地は、ＴＥＥＲ測定前に、抗体で処理しなかった（黒丸）、または抗Ｃ３（白丸）もしくはＩｇＧ対照（黒四角）で、免疫枯渇させた。（Ｅ）マウス（Ｃ３ａＲ＋／＋または−／−）は、混合した蛍光標識デキストランの心臓内注入前に、組換えマウスＣ３ａまたはビヒクルで非経口的に前処理した。３０分後、ＣＳＦおよび血液をサンプリングし、蛍光光度法で分析した。棒グラフでは、各デキストランの大きさに対して、ｒｍＣ３ａで処理した動物の蛍光は、右側の棒で表されている（ビヒクルは左側の棒で表されている）。（Ｆ）ＺＯ−１およびクローディンについて固定および染色前に、Ｃ３ａまたはビヒクルで２時間処理したマウス脈絡叢。
【図７ＣＤＥ】図７Ａ〜Ｅは、Ｃ３ａＲ活性化がＢ−ＣＳＦ−関門の完全性を変更することを示す。（Ａ）Ｃ３ａＲ（赤）および先端に発現したＳＰＡＫ（緑）に対するマウス脈絡叢の免疫蛍光。（Ｂ）ヒト脈絡叢上皮細胞（ＨｕＣＰＥｐｉ）を用いた、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるＣ３ａに応答する経上皮抵抗。（Ｃ）組換えマウスＣ３ａ（白丸）またはビヒクル（黒丸）を補充したＭＤＡ２３１親細胞（緑）からの馴化培地を使用して、ＴＥＥＲ測定の前に単層を処理した。（Ｄ）ＭＤＡ２３１  ＬｅｐｔｏＭ細胞からの馴化培地は、ＴＥＥＲ測定前に、抗体で処理しなかった（黒丸）、または抗Ｃ３（白丸）もしくはＩｇＧ対照（黒四角）で、免疫枯渇させた。（Ｅ）マウス（Ｃ３ａＲ＋／＋または−／−）は、混合した蛍光標識デキストランの心臓内注入前に、組換えマウスＣ３ａまたはビヒクルで非経口的に前処理した。３０分後、ＣＳＦおよび血液をサンプリングし、蛍光光度法で分析した。棒グラフでは、各デキストランの大きさに対して、ｒｍＣ３ａで処理した動物の蛍光は、右側の棒で表されている（ビヒクルは左側の棒で表されている）。（Ｆ）ＺＯ−１およびクローディンについて固定および染色前に、Ｃ３ａまたはビヒクルで２時間処理したマウス脈絡叢。
【図７Ｆ】図７Ａ〜Ｅは、Ｃ３ａＲ活性化がＢ−ＣＳＦ−関門の完全性を変更することを示す。（Ａ）Ｃ３ａＲ（赤）および先端に発現したＳＰＡＫ（緑）に対するマウス脈絡叢の免疫蛍光。（Ｂ）ヒト脈絡叢上皮細胞（ＨｕＣＰＥｐｉ）を用いた、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるＣ３ａに応答する経上皮抵抗。（Ｃ）組換えマウスＣ３ａ（白丸）またはビヒクル（黒丸）を補充したＭＤＡ２３１親細胞（緑）からの馴化培地を使用して、ＴＥＥＲ測定の前に単層を処理した。（Ｄ）ＭＤＡ２３１  ＬｅｐｔｏＭ細胞からの馴化培地は、ＴＥＥＲ測定前に、抗体で処理しなかった（黒丸）、または抗Ｃ３（白丸）もしくはＩｇＧ対照（黒四角）で、免疫枯渇させた。（Ｅ）マウス（Ｃ３ａＲ＋／＋または−／−）は、混合した蛍光標識デキストランの心臓内注入前に、組換えマウスＣ３ａまたはビヒクルで非経口的に前処理した。３０分後、ＣＳＦおよび血液をサンプリングし、蛍光光度法で分析した。棒グラフでは、各デキストランの大きさに対して、ｒｍＣ３ａで処理した動物の蛍光は、右側の棒で表されている（ビヒクルは左側の棒で表されている）。（Ｆ）ＺＯ−１およびクローディンについて固定および染色前に、Ｃ３ａまたはビヒクルで２時間処理したマウス脈絡叢。
【００２１】
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂは、臨床的バリデーションである。（Ａ）軟膜転移の疑いがある患者、ｎ＝６９例の試料から得られた脳脊髄液からＥＬＩＳＡにより測定したＣ３。（Ｂ）軟膜転移が疑われる患者からの原発腫瘍の免疫組織化学。Ｃ３が低いおよび高い染色病変ｎ＝３１例の試料の代表的画像が示されている。（Ｃ）臨床的転帰は、生存率曲線として提示されている。Ｃ３に対する原発および脳転移の免疫組織化学。マッチしていない（Ｄ）、およびマッチした（Ｅ）対の試料が提示されている。
【図８ＢＣＤ】図８Ａ〜Ｂは、臨床的バリデーションである。（Ａ）軟膜転移の疑いがある患者、ｎ＝６９例の試料から得られた脳脊髄液からＥＬＩＳＡにより測定したＣ３。（Ｂ）軟膜転移が疑われる患者からの原発腫瘍の免疫組織化学。Ｃ３が低いおよび高い染色病変ｎ＝３１例の試料の代表的画像が示されている。（Ｃ）臨床的転帰は、生存率曲線として提示されている。Ｃ３に対する原発および脳転移の免疫組織化学。マッチしていない（Ｄ）、およびマッチした（Ｅ）対の試料が提示されている。
【図８Ｅ】図８Ａ〜Ｂは、臨床的バリデーションである。（Ａ）軟膜転移の疑いがある患者、ｎ＝６９例の試料から得られた脳脊髄液からＥＬＩＳＡにより測定したＣ３。（Ｂ）軟膜転移が疑われる患者からの原発腫瘍の免疫組織化学。Ｃ３が低いおよび高い染色病変ｎ＝３１例の試料の代表的画像が示されている。（Ｃ）臨床的転帰は、生存率曲線として提示されている。Ｃ３に対する原発および脳転移の免疫組織化学。マッチしていない（Ｄ）、およびマッチした（Ｅ）対の試料が提示されている。
【００２２】
【図９】図９は、がん細胞により産生された補体Ｃ３であるが、血液−ＣＳＦ−関門の完全性を低減させ、血漿内容物をＣＳＦ中へと通過させ、転移がん細胞についてのさらに快適な環境を作り出すことを示す。
【００２３】
【図１０ＡＢＣ】図１０Ａ〜Ｄは、血液−ＣＳＦ−関門を開くことによりＣ３で馴化したＣＳＦである。（Ａ）商用のドットブロットアレイを用いて、軟膜転移がなく、その後軟膜転移を発症した患者２名のＣＳＦに存在するタンパク質を測定した。有意に上方制御された検体が提示されている。（Ｂ）ＬＬＣ−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、Ｃ３ａＲ野生型（＋／＋）またはノックアウト（−／−）同系マウスの大槽に点滴注入した。腫瘍成長をＢＬＩによりモニターした。（Ｃ）軟膜転移（metatasis）の疑いがあるものからのＣＳＦのアンフィレグリンに対するＥＬＩＳＡ。最終的な臨床的診断が指し示されている。（Ｄ）マウスは、図７Ｅに記載されているように、組換えマウスＣ３（紫色）またはビヒクル（緑色）で非経口的に前処理した。アンフィレグリンを、ＣＳＦおよび血漿中でＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｄは、血液−ＣＳＦ−関門を開くことによりＣ３で馴化したＣＳＦである。（Ａ）商用のドットブロットアレイを用いて、軟膜転移がなく、その後軟膜転移を発症した患者２名のＣＳＦに存在するタンパク質を測定した。有意に上方制御された検体が提示されている。（Ｂ）ＬＬＣ−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、Ｃ３ａＲ野生型（＋／＋）またはノックアウト（−／−）同系マウスの大槽に点滴注入した。腫瘍成長をＢＬＩによりモニターした。（Ｃ）軟膜転移（metatasis）の疑いがあるものからのＣＳＦのアンフィレグリンに対するＥＬＩＳＡ。最終的な臨床的診断が指し示されている。（Ｄ）マウスは、図７Ｅに記載されているように、組換えマウスＣ３（紫色）またはビヒクル（緑色）で非経口的に前処理した。アンフィレグリンを、ＣＳＦおよび血漿中でＥＬＩＳＡにより測定した。
【００２４】
【図１１ＡＢ】図１１Ａ〜Ｃは、軟膜転移における治療標的としてのＣ３ａＲである。（Ａ）２，０００個のＭＤＡ２３１−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、０日目に大槽中に導入した。マウスを、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｃ３ａＲアゴニスト（Ａｇ）、１０ｍｇ／ｋｇアンタゴニスト（Ａｎｔ）またはビヒクル（Ｖｅｈ）で１週間に２回Ｉ．Ｐ．処置し、腫瘍細胞の成長をＢＬＩによりモニターした。１群当たりｎ＝１０のマウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（Ｂ）（Ａ）において処置したマウスの生存率分析。（Ｃ）２，０００個のＭＤＡ２３１−ＬｅｐｔｏＭ細胞、ＰＣ９−ＬｅｐｔｏＭ細胞、ＨＣＣ１９５４−ＬｅｐｔｏＭ細胞またはＬＣＣ−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、０日目にＣＳＦ中に導入し、（Ａ）に記載されているようにＶｅｈまたはＡｎｔで処置した。１群当たりｎ＝１０のマウス。１４日目のＢＬＩが例証されている。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、軟膜転移における治療標的としてのＣ３ａＲである。（Ａ）２，０００個のＭＤＡ２３１−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、０日目に大槽中に導入した。マウスを、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｃ３ａＲアゴニスト（Ａｇ）、１０ｍｇ／ｋｇアンタゴニスト（Ａｎｔ）またはビヒクル（Ｖｅｈ）で１週間に２回Ｉ．Ｐ．処置し、腫瘍細胞の成長をＢＬＩによりモニターした。１群当たりｎ＝１０のマウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（Ｂ）（Ａ）において処置したマウスの生存率分析。（Ｃ）２，０００個のＭＤＡ２３１−ＬｅｐｔｏＭ細胞、ＰＣ９−ＬｅｐｔｏＭ細胞、ＨＣＣ１９５４−ＬｅｐｔｏＭ細胞またはＬＣＣ−ＬｅｐｔｏＭ細胞を、０日目にＣＳＦ中に導入し、（Ａ）に記載されているようにＶｅｈまたはＡｎｔで処置した。１群当たりｎ＝１０のマウス。１４日目のＢＬＩが例証されている。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
説明を明確にするために、詳細な説明は、これらに限定されないが、以下の項に分けられる：
（ｉ）軟膜転移性疾患のモデル；
（ｉｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアゴニスト；
（ｉｉｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニスト；
（ｉｖ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアゴニストを使用した方法；
（ｖ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを使用した方法；ならびに
（ｖｉ）診断方法および関連処置。
【００２６】
５．１  軟膜疾患のモデル
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、軟膜転移細胞（「ＬｅｐｔｏＭ」細胞）を接種した宿主動物を含む、軟膜転移のためのモデル系であって、第１のジェネレーター動物に親がん細胞を接種し、次いで、一定期間後、第１のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップと、前記収集した細胞を第２のジェネレーター動物中に接種し、次いで、一定期間後、第２のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップであって、前記収集した細胞が「Ｉｎｔ」細胞である、ステップと、任意選択で前記選択ステップを繰り返し、次いで、Ｉｎｔ細胞を宿主動物中に全身に導入するステップとを含み、それによって宿主動物の髄膜に局在する導入された細胞が「ＬｅｐｔｏＭ」細胞であり、１つまたは複数のさらなる宿主動物において、全身的にまたはくも膜下腔中に接種するために収集および使用でき、それにより、その後の宿主動物（複数可）において軟膜のがん細胞成長を形成させることができる方法により、前記ＬｅｐｔｏＭ細胞が調製される、モデル系を提供する。Ｉｎｔ細胞およびＬｅｐｔｏＭ細胞は、収集後および再導入の前に、任意選択で、培養で拡大させてもよく、かつ／またはさらなる使用のために保存してもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞の表現型は、培養中に選択して、本質的に均一な細胞集団を生成できる。ある特定の非限定的な実施形態では、親細胞、Ｉｎｔ細胞、および／またはＬｅｐｔＭ細胞は、構成的に、または誘導的に、１つまたは複数の検出可能なマーカー（すなわち、導入レポーター構築物）、例えば、以下に限定されないが、ＧＦＰ（もしくは別の蛍光（fluoresent）タンパク質（２７））および／またはルシフェラーゼを含有し、発現するように操作できる。
【００２７】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、軟膜転移のモデル系であって、第１のジェネレーター動物のくも膜下腔中（例えば脳槽（a  cistern  in  the  brain）中）に親がん細胞を接種し、次いで、一定期間後、第１のジェネレーター動物の髄膜からがん細胞を収集するステップと、前記収集した細胞を、第２のジェネレーター動物のくも膜下腔中に接種するステップと、任意選択で前記選択ステップを１回または複数回繰り返すステップとを含み、それにより軟膜転移性「Ｉｎｔ」細胞の集団を得る方法により調製される、軟膜転移細胞を接種したモデル動物を含む、モデル系を提供する。Ｉｎｔ細胞は、収集後および再導入の前に、任意選択で、培養で拡大させてもよく、かつ／またはさらなる使用のために保存してもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞の表現型は、培養中に選択して、本質的に均一な細胞集団を生成できる。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｉｎｔ細胞は、構成的に、または誘導的に１つまたは複数の検出可能なマーカー、例えば、以下に限定されないが、ＧＦＰ（または別の蛍光タンパク質（２７））および／またはルシフェラーゼを含有し、発現することができる。前記Ｉｎｔ細胞は、次いで、上記のように宿主動物中に導入して、ＬｅｐｔｏＭ細胞を生成できる。
【００２８】
様々な非限定的な実施形態では、本発明は、Ｉｎｔ細胞またはＬｅｐｔｏＭ細胞の、任意選択で、保存液または培地中の精製した集団を提供する。上記のように、前記細胞は、１つまたは複数の検出可能なマーカーをコードする、導入された遺伝子を含有し得る。ある実施形態では、本発明は、前記細胞を含有するキットを提供する。
【００２９】
例えば、限定されないが、モデル系は、以下のように調製され得る。任意選択で、１つまたは複数の検出可能なマーカー（例えば蛍光マーカーおよび／または生物発光マーカー、例えば、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ）で標識したがん細胞株、例えば、以下に限定されないが、乳がん細胞株、肺がん細胞株、または黒色腫細胞株の細胞が、第１のジェネレーター動物に接種され得る。非限定的な具体例として、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを安定的に発現する２０，０００個の親細胞が、マウスの大槽中に注入され得る（１７）。次いで、細胞の成長が、例えば、生物発光イメージングにより１日おきにモニターされ得、マウスの健康状態が、定期的にモニターされ得る。軟膜転移の（metastasic）成長がＣＮＳ全体に影響を与える場合、または有意な病的状態が現れた場合、マウスは、安楽死させてよく、検出可能なマーカー（複数可）（例えば、生物発光）を保有するがん細胞の存在を確認するために、脳を取り出し頭蓋底髄膜を撮像できる。がん細胞が存在する場合、頭蓋底髄膜は、次いで、ＰＢＳですすいで、この空間にある細胞を収集できる。収集した細胞は、次いで、例えば、存在する細胞の大多数または本質的にすべてが、レポーター構築物（例えばＧＦＰ）を有する細胞になるまで、培養で成長させてよい。本質的に純粋な集団が得られたら、培養した細胞は、次いで、第２のジェネレーターマウスの大槽に注入でき、成長させて収集することができる。ある特定の実施形態では、そのような選択を、少なくとも３ラウンド実施する。生じた細胞は、本明細書において「Ｉｎｔ」細胞と呼ばれる。Ｉｎｔ誘導物は、軟膜内の生存能力について選択された細胞を表す。モデル動物を形成するために、有効な数のＩｎｔ細胞を全身循環に注入してよく、例えば、５０，０００個のＩｎｔ細胞を、宿主マウス中の心臓内に注入してよく、転移を形成することが可能である。軟膜内のがん細胞（「ＬｅｐｔｏＭ」）は、次いで、上記と同様に収集できる。「ＬｅｐｔｏＭ」といわれるこれらの細胞は、全身循環から軟膜に巧みに入り、ＣＳＦ内で生存した、血行性に播種したがん細胞を表す（図１を参照されたい）。
【００３０】
５．２  Ｃ３またはＣ３ａＲのアゴニスト
Ｃ３またはＣ３ａＲのアゴニストは、補体系におけるその機能、Ｃ３ａＲへのその結合親和性、および／またはアナフィラトキシンとしてのその活性を含むが、それらに限定されないＣ３またはＣ３ａの生物学的活性を増加させる、または促進する作用剤である。
【００３１】
Ｃ３ａＲ受容体アゴニストの非限定的な一例は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製の化合物Ｃ４４９４である、ベンゼンアセトアミド，α−シクロヘキシル−Ｎ−［１−［１−オキソ−３−（３−ピリジニル）プロピル］−４−ピペリジニル］−、ａ−シクロヘキシル−Ｎ−［１−［１−オキソ−３−（３−ピリジニル）プロピル］−４−ピペリジニル］−ベンゼンアセトアミド、ＣＡＳ番号９４４９９７−６０−８、以下に示されている構造を有するＣ２７Ｈ３５Ｎ３Ｏ２である。
【化１】
2018537459.tif 000003
【００３２】
使用できるＣ３およびＣ３ａＲアゴニストの他の非限定的な例は、Singhら、２０１５年、Bioor.  Med.  Chem.  Lett.２５巻：５６０４〜５６０８頁に記載されているもの、例えば、式Ｉの化合物：
【化２】
2018537459.tif 000004
（式中、Ｒは、フェニル、置換フェニル、アリール、ヘテロアリール、ピリジン、もしくは置換ピリジン、低級アルキルアルコキシ、または
【化３】
2018537459.tif 000005
であってよい）；
または式ＩＩの化合物：
【化４】
2018537459.tif 000006
（式中、Ｒは、フェニル、置換フェニル、アリール、ヘテロアリール、ピリジン、または置換ピリジン、例えば
【化５】
2018537459.tif 000007
または
【化６】
2018537459.tif 000008
であってよい）を含むが、それらに限定されず；
例えば、限定されないが、芳香族環に含有される２個の炭素によりアミドカルボニル基から分離されるヘテロ環式窒素を有する、式Ｉまたは式ＩＩの化合物を含む。
【００３３】
使用できるＣ３およびＣ３ａＲアゴニストの他の非限定的な例は、Scullyら、２０１０年、J.  Med.  Chem.５３巻：４９３８〜４９４８頁に記載されているもの、例えば、限定されないが、ヘキサペプチドＰｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ；Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ；Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ；Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ；Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ；Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ；およびＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒを含み得る。
【００３４】
他の非限定的な例では、アゴニストは、Jinmaaら、２００１年、Peptides  ２２巻（１号）：２５〜３２頁に記載されている配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを含むペプチドであってよい。
【００３５】
５．３  Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニスト
Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストは、補体系におけるＣ３の機能および／またはアナフィラトキシンとしてのその活性を含むが、それらに限定されない、Ｃ３またはＣ３ａの生物学的活性を低減させる、または阻害する作用剤である。
【００３６】
Ｃ３ａＲアンタゴニストの非限定的な一例は、ＳＢ  ２９０１５７（２８）であり、化学名Ｎ２−［２−（２，２−ジフェニルエトキシ）アセチル］−Ｌ−アルギニン，２，２，２−トリフルオロアセテート、化学式Ｃ２２Ｈ２８Ｎ４Ｏ４・ＣＦ３ＣＯＯＨ、および以下の化学構造を有する：
【化７】
2018537459.tif 000009
【００３７】
Ｃ３ａＲアンタゴニストの別の非限定的な例は、ＳＫ＆Ｆ  ６３６４９（２８）であり、以下の構造を有する：
【化８】
2018537459.tif 000010
【００３８】
Ｃ３ａＲアンタゴニストの他の非限定的な例は、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＣ３ａが誘導するカルシウム動員を阻害する（参考文献２８に記載されている）以下の式ＩＩＩ：
【化９】
2018537459.tif 000011
（式中、−Ｏ−に結合したＲは、アリール、ヘテロアリール、フェニル、ジフェニル、ジフェニル低級（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、低級アルキルジフェニル、ナフチル、ナフチル低級アルキル、低級アルキルナフチル、キノリン、キノリン低級アルキル、低級アルキルキノリン、プリン、低級アルキルプリン、プリン低級アルキルであってよく、上記のいずれかは、非置換であっても、または低級アルキル、ハロゲン、ヒドロキシもしくは低級アルコキシで置換されていてもよい）の化合物、または、ＩＣ５０が５から７５ｎＭの間の等価の細胞株を含む。
【００３９】
使用できるＣ３およびＣ３ａＲアンタゴニストの他の非限定的な例は、Scullyら、２０１０年、J.  Med.  Chem.５３巻：４９３８〜４９４８頁に記載されているもの、例えば、限定されないが、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−Ａｌａ−Ａｒｇを含む。
【００４０】
５．４  Ｃ３またはＣ３ＡＲのアゴニストを使用する方法
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、そのような処置を必要とする被験体において、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの透過性を増加させる方法であって、有効量のＣ３またはＣ３ａＲのアゴニスト、および任意選択で第２の治療剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供し、ここで、アゴニストでの処置は、ＣＳＦ中の第２の治療剤の量を増加させ、それにより、その効力を増強させる。アゴニストおよび第２の治療剤は、アゴニストが第２の治療剤の有効性を増強させ得るような手段で被験体に投与され、その結果、例えば、限定されないが、一緒に、または同時に、または逐次的に投与できる。
【００４１】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、中枢神経系の障害を有する被験体を処置する方法であって、有効量の（ｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲのアゴニストおよび（ｉｉ）第２の治療剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供し、ここで、アゴニストでの処置は、ＣＳＦ中における第２の治療剤の量を増加させ、それにより、その効力を増強させる。
【００４２】
例えば、限定されないが、そのような処置を必要とする被験体は、感染性髄膜炎を含むが、それに限定されない細菌性、ウイルス性、真菌性、原虫性、もしくは寄生生物性（例えば、寄生虫の）感染症を含むが、それらに限定されない中枢神経系の感染性疾患（ここで、第２の治療剤は、例えば、抗微生物剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗寄生虫剤、または駆虫剤であってよい）に罹患していることがある。
【００４３】
別の例として、被験体は、軟膜の髄膜炎を含むが、それに限定されない乳がん、肺がん、黒色腫、リンパ腫、または膠芽腫を含むが、それらに限定されない中枢神経系のがん／悪性疾患（ここで、第２の治療剤は、抗がん剤であってよい）に罹患していることがある。
【００４４】
別の例として、被験体は、神経系の変性疾患、例えば、以下に限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、またはピック病（ここで、第２の治療剤は、その状態の処置であってよい）に罹患していることがある。別の例として、被験体は、多発性硬化症に罹患していることがある。
【００４５】
他の例として、被験体は、脳血管疾患；および／または例えば脳血管事故、手術もしくは外傷によるＣＮＳへの急激な損傷に罹患していることがあり、第２の治療剤は、凝血を調節し、血管収縮、活性酸素種などを調節する作用剤であってよい。
【００４６】
ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、遺伝子改変細胞である。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は低分子である；他の実施形態では、これは生物製剤である。
【００４７】
したがって、本発明を使用して、全身的に投与される治療剤のＣＳＦ、髄膜およびＣＮＳへの到達を改善できる。
【００４８】
非限定的な実施形態では、被験体は、ヒトまたは非ヒト動物被験体、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヒツジであってよいが、それらに限定されない。
【００４９】
非限定的な実施形態では、Ｃ３またはＣ３ａＲアゴニストは、経口、静脈内、動脈内、髄腔内、経鼻、腹膜、皮下、筋肉内、直腸などを含むが、それらに限定されない、当技術分野で公知の任意の経路により被験体に投与され得る（may  be  adminstered）。
【００５０】
非限定的な実施形態では、Ｃ３またはＣ３ａＲアゴニストは、約０．０５から１００ｍｇ／ｋｇの間、または約０．５から５０ｍｇ／ｋｇの間、または約０．１から１０ｍｇ／ｋｇの間または約０．５から２ｍｇ／ｋｇの間、または０．５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与され得る。非限定的な実施形態では、前記用量は、１日１回、１日２回、１週間１回、１週間２回、１ヶ月１回、１ヶ月２回、１ヶ月おきに１回、または３ヶ月に１回、投与され得る。非限定的な実施形態では、処置の期間は、少なくとも１日、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月であってよい。
【００５１】
５．５  Ｃ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを使用する方法
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、そのような処置を必要とする被験体において、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの透過性を低下させる方法であって、有効な阻害量（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｍｏｕｎｔ）のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを被験体に投与するステップを含む、方法を提供する（ここで、「阻害」は、血液中のある物質（例えば、分子量、大きさ、電荷、疎水性の程度などに基づく）に対する、および／または転移がん細胞に対するＢ−ＣＳＦ−Ｂの透過性の低下を指す）。
【００５２】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、そのような処置を必要とする被験体において、軟膜転移の危険性を低下させる方法であって、有効な阻害量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを被験体に投与するステップを含む、方法を提供する（ここで、「阻害」は、転移がん細胞に対するＢ−ＣＳＦ−Ｂの透過性の低下を指す）。
【００５３】
例えば、限定されないが、被験体は、悪性疾患に罹患していることがあり、がん細胞がＢ−ＣＳＦ−Ｂ関門を透過する危険性があり；被験体が軟膜疾患を有する疑念を裏付ける所見を有し；または、軟膜疾患の診断を裏付ける所見を有し；かつ／または前記がんは、例えば、乳がん、肺がん、または黒色腫であるが、それらに限定されない。
【００５４】
別の非限定的な例として、被験体は、内因系もしくは外因系毒素、または感染性因子に曝露されている可能性があり、その結果、中枢神経系を感染性因子または毒素の到達から保護することが望ましい。例えば、本発明は、代謝性疾患、または毒素（例えばボツリヌス中毒）により媒介される疾患に罹患した被験体もしくは毒素に曝露された被験体を処置する方法であって、有効な阻害量のＣ３またはＣ３ａＲのアンタゴニストを被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。処置の前記方法は、感染性因子、代謝性疾患または毒素に向けられた第２の治療剤を投与するステップをさらに含み得る。
【００５５】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、有効量のＣ３またはＣ３ａＲアンタゴニスト、および任意選択で第２の治療剤で被験体を処置するステップを含む、方法を提供する。例えば、限定されないが、前記治療剤は、化学療法剤または免疫調節剤であってよい。
【００５６】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、（ｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲアンタゴニスト、および（ｉｉ）Ｃ３またはＣ３ａＲアゴニストおよび第２の治療剤で、被験体を交互に処置するステップを含む、方法を提供する。例えば、Ｃ３および／またはＣ３ａＲ受容体アンタゴニストで、一定期間被験体を処置して、ＣＮＳを転移性疾患から保護するが、次いで、Ｃ３またはＣ３ａＲアゴニストおよび第２の治療剤を投与して、第２の治療剤がＢ−ＣＳＦ−Ｂへと透過するのを補助することが望ましいことがある。
【００５７】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、がんを有する、またはがんを有する疑いがある被験体を処置する方法であって、被験体において、被験体のＣＳＦにおけるＣ３のレベルが、健常な対照被験体のＣＳＦにおけるレベルと比較して上昇していると決定することにより、軟膜転移を診断するステップと、次いで、Ｃ３もしくはＣ３ａＲアンタゴニスト、および／または任意選択で第２の治療剤と併用したＣ３もしくはＣ３ａＲアンタゴニストで被験体を処置するステップとを含む、方法を提供する。
【００５８】
非限定的な実施形態では、被験体は、ヒトまたは非ヒト動物被験体、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヒツジであってよいが、それらに限定されない。
【００５９】
非限定的な実施形態では、Ｃ３またはＣ３ａＲアンタゴニストは、経口、静脈内、動脈内、髄腔内、経鼻、腹膜、皮下、筋肉内、直腸などを含むが、それらに限定されない、当業界で公知の任意の経路により被験体に投与され得る。
【００６０】
非限定的な実施形態では、Ｃ３またはＣ３ａＲアンタゴニストは、約０．０５から１００ｍｇ／ｋｇの間、または約０．５から５０ｍｇ／ｋｇの間、または約０．１から１０ｍｇ／ｋｇの間または約０．５から２ｍｇ／ｋｇの間、または０．５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与され得る。非限定的な実施形態では、前記用量は、１日１回、１日２回、１週間１回、１週間２回、１ヶ月１回、１ヶ月２回、１ヶ月おきに１回、または３ヶ月に１回、投与され得る。非限定的な実施形態では、処置の期間は、少なくとも１日、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月であってよい。
【００６１】
５．６  診断方法および関連処置
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、被験体において、軟膜転移を診断する方法であって、被験体のＣＳＦにおけるＣ３のレベルが、健常な対照被験体のＣＳＦにおけるレベルと比較して上昇していると決定するステップを含む、方法を提供する。
【００６２】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、前記方法を実践するためのキットを提供し、前記キットは、以下に限定されないが、抗Ｃ３抗体もしくは抗体断片または単鎖抗体などのＣ３を検出するための手段、任意選択で、キットの使用およびＣＳＦにおけるＣ３のレベルおよび軟膜転移性疾患とそれの関連を決定することにおけるその使用のための指示または指示へのアクセス；二次抗体および／または検出剤、および／または腰椎穿刺を実施するための材料もしくはＣＳＦリザーバータップを含む。前記キットは、ＣＳＦ中の乳がん細胞、肺がん細胞、または黒色腫細胞の検出に適している抗体をさらに含み得る。前記キットは、ＣＳＦにおけるグルコースのレベルを決定するための手段をさらに含み得る。前記キットは、軟膜疾患の存在下および／または非存在下における、ＣＳＦに存在するＣ３について陽性および／または陰性の対照試料をさらに含み得る。
【実施例】
【００６３】
（６．実施例１）
軟膜転移の遺伝子「シグネチャー」
軟膜転移は、播種性がんの、まれであるが致命的な転帰を表す。そのため、本発明者らは、ＣＳＦ内におけるがん細胞生存に必要とされる分子特性から、軟膜腔に到達するがん細胞に必要とされる分子特性を分離する、調べることが可能な（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｂｌｅ）乳がんおよび肺がんマウスモデルを創製した。これらのモデルは、いずれも組織学的、およびトランスクリプトーム的に実質転移と異なる。異種移植系および同系の（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）系の両方における乳がんおよび肺がんを表すこれらの多様なモデルのトランスクリプトーム的プロファイリングは、軟膜内において播種し、成長する細胞成分によって差次的に発現される別個の遺伝子セット、または「シグネチャー」により同定された。このシグネチャーは、がん細胞の循環により補体Ｃ３が生成される証拠を提供する。Ｃ３は、細胞学的に、またはＭＲＩで証明された軟膜転移を有する患者からのＣＳＦ中で検出可能である。このタンパク質は、Ｃ３ａ＋Ｃ３ｂに自発的に加水分解する。いかなる特定の理論にも束縛されないが、本発明者らは、がんに由来するＣ３ａは、脈絡叢におけるＧ−タンパク質共役受容体であるＣ３ａＲに結合し、血液−ＣＳＦ−関門の機能停止および血漿内容物のＣＳＦ中への進入を引き起こし、これにより、軟膜腔が、ＣＳＦをがん細胞成長にさらに快適な環境にするように整えられると仮定している。したがって、Ｃ３またはＣ３ａＲのいずれかの遺伝的または薬理学的遮断を使用して、この空間内のがん細胞の成長を阻害できる。反対に、本発明者らは、Ｃ３ａＲアゴニスト作用は、血液−ＣＳＦ−関門を妨害し、その透過性を増加させることを見出した。Ｃ３−Ｃ３ａＲ軸の操作は、軟膜転移、また、潜在的な感染性髄膜炎のいずれに対しても、同様に、治療手段としての大いなる有用性を示す。
【００６４】
６．１  軟膜転移のマウスモデル化
Ｍａｓｓａｇｕｅ研究室でのこれまでの調査によれば、マウスモデルは、転移がんの試験に強力なツールに相当することが示されている（８〜１３）。このアプローチでは、ヒトまたはマウスの悪性細胞株が、特定の標的臓器に転移させるためにｉｎ  ｖｉｖｏで選択される。まず、がん細胞株は、血行性に播種され、転移を形成ことが可能になる。次いで、転移性腫瘍が標的部位（例えば脳）にて収集される。これらの細胞は、培養で拡張し、集団が、標的臓器への確実な転移を生じるまでマウス中に再接種される（１４）。親細胞株と転移細胞株を比較するトランスクリプトーム解析により、器官に特異的な転移遺伝子の同定が可能になる（１２、１５、１６）。
【００６５】
この系を軟膜転移に適応させるために、本発明者らは、主に２つの障壁に直面した。第１に、複数の解剖学的経路が、軟膜播種をもたらし得ると提起されている。血行性の播種は、乳がんおよび肺がんがＣＳＦ空間へ到達する最も可能性のある経路であるが、唯一の可能な進入経路ではない。第２に、軟膜転移は、がん患者においてまれな臨床的事象（５〜１０％）である。
【００６６】
こうした障害を乗り越えるために、本発明者らは、後続する血行性の播種の前に、軟膜腔内におけるがん細胞を選択することから始めた（図１）。
【００６７】
最初のステップとして、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを安定的に発現する親細胞を、マウスの大槽中に注入した（１７）。細胞の成長を生物発光イメージングにより１日おきにモニターし、マウスの健康状態を毎日モニターした。軟膜の転移性（metastasic）成長がＣＮＳ全体に関与する場合、または有意な病的状態が現れた場合、マウスは、安楽死させ、脳を取り出し頭蓋底髄膜を生物発光により撮像した。頭蓋底髄膜は、次いで、ＰＢＳですすいで、この空間にある細胞を収集した。存在する細胞が、レポーター構築物（ＧＦＰ）を有する細胞のみとなるまで、培養で細胞を成長させた。純粋な集団が得られたら、これらの細胞は、次いで、第２のマウスの大槽中に再注入し、成長させて収集した。３ラウンドの選択後、収集した細胞を「Ｉｎｔ」と称した。Ｉｎｔ誘導物は、軟膜内での生存能力について選択された細胞を表す。５０，０００個のＩｎｔ細胞を、心臓内に注入し、転移を形成させた。軟膜内のがん細胞を、上記と同様に収集した。「ＬｅｐｔｏＭ」といわれるこれらの細胞は、全身循環から軟膜に巧みに入り、ＣＳＦ内で生存した、血行性に播種したがん細胞を表す（図１）。
【００６８】
このｉｎ  ｖｉｖｏ選択プロセスの効率をアッセイするために、ＬｅｐｔｏＭ細胞を１つの群のマウス中の心臓内に注入した。第２の群には親細胞を施し、第３の群にはＢｒＭ細胞（本発明者らの研究室で以前に創製した、脳転移を優先的に生じさせる転移誘導物、図１を参照されたい）を施した（１２）。全体の転移負荷をＢＬＩによりモニターした。軟膜転移および実質転移は、いずれも生物発光シグナルを頭部領域において示すため、これらの動物において、転移の神経解剖学的な局在を、組織の病的変化によりアッセイした。
【００６９】
乳がんおよび非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、軟膜疾患を引き起こす最も一般的な原発腫瘍である（２）ため、本発明者らは、上の方法論を用いて、軟膜転移の乳がんモデル（すなわち、ＭＤＡ２３１およびＨＣＣ１９５４）および肺がんモデル（すなわち、ルイス肺癌（「ＬＬＣ」）およびＰＣ９）の両方を創製した（図３Ａ）。このモデル化系の目立った特徴は、代表的モデル、ＭＤＡ２３１の検査で明らかである（図２Ａ〜Ｃ）。
【００７０】
最初の大槽内の細胞接種により、選択の証拠が示された。図２Ｂに示されているように、最初に細胞消失（２日目にＢＬＩシグナルが低下したことにより証拠だてられた）、続いて細胞成長があった。さらに、後続する選択の各ラウンドでは、細胞は、軟膜における生存においてさらに秀でるようになった（図２Ａ）。これらのあらかじめ選択されたＩｎｔ細胞を血行性に播種した後で、図２Ｃで取り上げた代表的マウスにより例証されているように、注入されたマウスのうち７１％において、上記細胞が軟膜に到達した。
【００７１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ選択の効率をアッセイするために、２０匹のマウスに、ＭＤＡ２３１親（非選択）細胞、ＭＤＡ−ＢｒＭ（実質転移細胞）、またはＭＤＡ−ＬｅｐｔｏＭ細胞のいずれかを注入した（図３Ｂ）。エンドポイントでは、軟膜転移は、ＬｅｐｔｏＭ細胞を注入したマウスの８６％に存在し；がん細胞は、ＢＲＭまたは親細胞株では軟膜腔に達しなかった。反対に、ＬｅｐｔｏＭ細胞は、実質転移を生じなかった。これらのデータから、このモデル化系の２つの重要な特徴が強調される。第１に、圧倒的多数のｉｎ  ｖｉｖｏ選択が、最初の大槽内接種ラウンド中に起こり、これは、軟膜内の生存が、がん細胞にとって乗り越えるべき大きな関門を表すことを示唆している。第２に、実質転移および軟膜転移を生じる傾向に必要とされる形質は、独立して選択され得（図３Ｂ〜Ｅを参照されたい）、実質転移および軟膜転移は、生物学的に別個の実体（entity）であるという仮説が裏付けられる。重要なことには、これらのモデルは、軟膜転移に特有な組織の病的変化の特徴を示した。がん細胞は、大脳半球の軟膜上に層を形成し、小脳回を覆い、Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔を満たし、そこに浸潤した。
【００７２】
６．２  軟膜転移のトランスクリプトーム解析
軟膜の微小環境は、隣接した脳実質を含む他の転移部位と実質的に異なる。軟膜は、脈絡叢により分泌される循環脳脊髄液（ＣＳＦ）で満たされている。この生物学的流体は、識別可能な組成を有し、とりわけタンパク質、成長因子およびグルコースが血清または組織のいずれかより少ない（１８）。したがって、そのような環境で育つように適合したがん細胞は、別個の表現型を有する可能性がある。表現型の変化は、遺伝的変化またはトランスクリプトーム的変化のいずれかから生じ得る。しかし、Ｍａｓｓａｇｕｅ研究室で作り出されたマウスモデルの以前の網羅的なエクソームシーケンシングでは、対応する親集団からの転移誘導細胞株の遺伝的多様性がほとんどないことが見出された。したがって、親細胞株に由来する転移細胞株は、主に、それらの遺伝子発現プロファイルに関して互いに異なる（１９）。したがって、本発明者らは、軟膜の誘導物は、脳実質への転移性の細胞、すなわち「ＢｒＭ」細胞によって発現される遺伝子と異なる遺伝子のセットを発現すると仮定した（１２、１６、１９）。
【００７３】
「軟膜のシグネチャー」遺伝子を同定するために、親細胞株、およびそれらに対応する軟膜転移誘導細胞株および脳実質転移誘導細胞株（ＰＡＲ、ＬｅｐｔｏＡＳおよびＢＲＭ）の細胞を、培養で成長させ、全ＲＮＡを収集し、ｍＲＮＡの配列を決定し、分析した（Ｐｒｅｐｅａｓｅ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）。同じ初代のモデル間で保存された、同じ方向（上方制御または下方制御）で差次的に発現した遺伝子を収集した。実質（ＢｒＭ）モデルおよび軟膜（ＬｅｐｔｏＭ）モデルの両方で、上方制御した遺伝子を、推定される「軟膜のシグネチャー」のリストから除外した。
【００７４】
ＭＳＫ  ＩＧＯコア施設と協力し、軟膜転移（metasasis）の４種のマウスモデルからのＰＡＲ細胞、ＢＲＭ細胞およびＬｅｐｔｏＭ細胞において、ＲＮＡＳｅｑを、上で詳述されているように実施した（図３Ａ）。後続の差次的発現の解析は、バイオインフォマティクスコア施設が行った。解析用の標準パラメーターを用いた（倍率変化＞２、塩基平均＞５０、ｐ＜０．０５）。主成分分析により、ＰＡＲ細胞、ＢｒＭ細胞およびＬｅｐｔｏＭ細胞が、別個の発現プロファイルを有することが明らかである（図４）。これは、軟膜転移が、脳実質転移と生物学的に異なるという仮説と一致する。
【００７５】
親モデルとＢｒＭモデルとの間で差次的に発現した遺伝子を差し引くことを含めて、上のパラメーターを適用した後で、モデル４種すべてで、２０種の遺伝子が差次的に発現した（図５Ａ）。この遺伝子リストの遺伝子オントロジー解析により、補体および凝固カスケードの上方制御が明らかになった（図５Ｂ）。経路の上方制御以降、遺伝子の補体Ｃ３は、すべての軟膜転移モデルにおいて、上方制御していた（図５Ｃ）。この分泌されたタンパク質は、補体カスケードの重要な成分である。
【００７６】
軟膜転移におけるこの遺伝子の重要性は、まずｉｎ  ｖｉｖｏで検証された。２つの独立したｓｈＲＮＡを用いて、ＬｅｐｔｏＭ細胞において、Ｃ３発現をノックダウンした（図６Ａ〜Ｃ）。これらのノックダウン細胞、またはその対照ノックダウンカウンターパートを、レシピエントマウス中に接種して、ＣＮＳの生物発光シグナルをモニターした。ＬｅｐｔｏＭ細胞におけるこの遺伝子のほぼ完全なノックダウンにより、軟膜転移を発症する傾向の大幅な低下がもたらされた。同系Ｃ３ノックアウトマウスは、それらの野生型のカウンターパートと同等に、軟膜転移の宿主であった（図６Ｄ）。
【００７７】
６．３  Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの透過性を変更するためのＣ３ＡＲの操作
既存のＣ３ａＲアンタゴニストおよびアゴニストを、多彩なｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルで用いて、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの完全性を維持する際における、このシグナル伝達経路の関連性を実証した。
【００７８】
脈絡叢は、分極した上皮細胞で構成され、タイトジャンクションにより互いに積層している。これらのタイトジャンクションは、血液−ＣＳＦ−関門を含む。下層にある血管内皮細胞は有窓性であり、高分子、ならびに一部の循環細胞の自由な通過が可能である。
【００７９】
Ｃ３ａＲは、Ｇタンパク質共役受容体である。これは、多彩な細胞型で存在する。とりわけ、腎細管細胞ならびに一部の肺細胞で存在する。これらの状況のいずれにおいても、受容体の活性化により、タイトジャンクション（tight  juction）がゆるくなり、関門完全性の機能が低下する。腎細管では、これにより蛋白尿が生じることが示されており；肺では、これにより浮腫がもたらされることが示されている。脈絡叢の関門機能は、ＰＫＣシグナル伝達を必要とすることが以前に実証されている（ホルボールエステル処置が関門機能を低下させる）。
【００８０】
Ｃ３ａＲが脈絡叢において同様に機能できるという仮説に対処するために、本発明者らは、まず、脈絡叢上皮においてＣ３ａＲの存在を確立した（図７Ａ）。Ｃ３ａＲは、がん細胞で検出不可能であった。次に、本発明者らは、Ｂ−ＣＳＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでのＣ３ａに対するこれらの細胞の反応を検査した（図７Ｂ）。以前に実証されているように、ＨｕＣＰ上皮細胞（ＨｕＣＰＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）は、ラミニンコートトランスウェルで十分成長し、タイトジャンクションを確立させ、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定により測定されるように関門機能を確立させる。組換えＣ３ａを添加した後で、単層を通した抵抗は低減した（図７Ｃ）；Ｃ３ａの免疫枯渇により、この効果は取り除かれた（図７Ｄ）。したがって、Ｃ３ａ活性化は、関門を通したイオンの通過を増加させる。
【００８１】
蛍光標識したデキストランを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで通過させることにより、大きい分子の通過を評価した。野生型マウスまたはＣ３ａＲに対するノックアウトマウスを、蛍光誘導体化した１０、４０および５００ｋＤａのデキストランの心臓内注入前に、Ｃ３ａＲアゴニストで腹腔内処置した。この処置の３０分後、ＣＳＦを大槽タップによりサンプリングし、誘導体化したデキストランの存在を、蛍光によりアッセイした。４０ｋＤａおよびそれより小さいデキストランの、血液からＣＳＦへの通過は、Ｃ３ａＲ依存的様式で、Ｃ３ａによる処置後に増加した（図７Ｅ）。組換えＣ３ａによる処置で、クローディン免疫蛍光により測定されるように、脈絡叢上皮細胞間のタイトジャンクションの組織崩壊が引き起こされた（図７Ｆ）。
【００８２】
６．４  バリデーションおよびモデル
ヒトＣＳＦにおけるＣ３のレベルの増加は、軟膜転移の診断と相関することが見出された（図８Ａ）。軟膜転移を抱えている疑いがある患者からの原発腫瘍を、抗Ｃ３抗体で染色し、低いＣ３の染色および高いＣ３の染色カテゴリーに患者を分類した（図８Ｂ）。軟膜転移の臨床的転帰は、原発腫瘍におけるＣ３発現の上昇と相関した（図８Ｃ）。対照的に、脳実質転移を有する患者の原発腫瘍におけるＣ３発現の間に相関は明らかでなかった（図８Ｄ〜Ｅ）。
【００８３】
軟膜転移の促進におけるＣ３の役割の概略図は、図９に示されている。いかなる理論にも束縛されないが、がん細胞により生成される補体Ｃ３は、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂ関門の完全性を低減させ、血漿内容物のＣＳＦへの通過を可能にし、それにより、転移がん細胞にさらに快適な環境が作り出されると考えられる。がん細胞により生成されたＣ３は、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへと加水分解される。Ｃ３ａは、次いで、その同系受容体である、脈絡叢上皮上のＧＰＣＲに結合する。この受容体の活性化により、２つの別個の変化が生じる。１つめは、ＰＫＣおよびＭＬＣＫを介したシグナル伝達により、クローディンに基づくタイトジャンクションの弛緩がもたらされる。これにより、血漿内容物の傍細胞輸送が可能となる。２つめは、Ｃ３ａ受容体の活性化により、多彩な成長因子およびケモカインの上方制御がもたらされる。これらもまた、ＣＳＦ中に放出される。このように、がん細胞は、脈絡叢の関門機能を乗り越えて、必要な成長因子および代謝中間体を自ら供給する。Ｃ３およびＣ３ａＲは、このパラクリンシグナル伝達経路の中心である。
【００８４】
軟膜転移は、成長因子アンフィレグリン（図１０Ｃ）を含むＣＳＦの組成を変更する（図１０Ａ）。軟膜腔内のがん細胞成長は、本発明者らの軟膜転移モデルでは、Ｃ３ａの非経口投与後、Ｃ３ａＲの存在下で改善し（図１０Ｂ）、血清アンフィレグリンは、マウスモデルにおいてＣＳＦ内で上昇する。
【００８５】
（７．実施例２）
Ｃ３ａＲによる調節の効果
軟膜腔内の成長に関してＣ３に依存したがん細胞、ならびにＣＰ関門機能の維持におけるＣ３ａＲの重要性を踏まえ、本発明者らは、軟膜転移モデルにおいてＣ３ａＲアンタゴニストならびにアゴニストをアッセイすることを選択した。まず、２，０００個のＭＤＡ  ＬｅｐｔｏＭをレシピエントマウスの大槽に注入した。次に、ビヒクル、Ｃ３ａＲアゴニストまたはアンタゴニストでの処置を開始した。腫瘍成長に続いて、生物発光イメージングを行った、図１１Ａ。予想通り、軟膜内の腫瘍成長はＣ３ａＲアンタゴニストでの処置により遅くなり、Ｃ３ａＲアゴニスト処置で速くなり、Ｃ３ａＲアンタゴニストで処置したマウスの生存利益に一致していた、図１１Ｂ。
【００８６】
これらの結果を、単一のモデル以外に拡張するために、アンタゴニスト処置アプローチを軟膜転移モデル４種：ＭＤＡ２３１、Ｈｃｃ１９５４、ＰＣ９およびＬＬＣで試験した。これらのモデルのそれぞれに対応する細胞を、０日目にレシピエントマウスの軟膜腔中に接種した。Ｃ３ａＲアンタゴニストＳＢ２９０１５７での毎日の全身処置を１日目に始めた。腫瘍細胞の成長を定量するための生物発光イメージングは、モデルのそれぞれについて示されている、図１１Ｃ。Ｃ３ａＲアンタゴニストは、各モデルで、軟膜の腫瘍成長の抑制に関連していた。これらの結果は、軟膜転移を処置する方法としてのＣ３ａＲのアンタゴニスト作用の使用を裏付ける。このアプローチでは、Ｂ−ＣＳＦ−Ｂの完全性を維持すると、がん細胞が、タンパク質、成長因子および代謝中間体を含む血漿成分に到達することを阻害することにより、がん細胞生存が阻害される。
【００８７】
反対に、軟膜転移の処置における主な問題は、軟膜腔への治療剤の到達を確保することである。これは、感染性髄膜炎を含む他の軟膜の病変にも当てはまる。これらのシナリオでは、Ｃ３ａＲアゴニスト処置を用いてＢ−ＣＳＦ−Ｂを開き、これを、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤または抗寄生虫剤などの全身処置に対して透過性にすることができる。このように、Ｃ３ａＲアゴニスト作用を使用して、軟膜病変に対する治療レパートリーを効率的に拡張できる。
【００８８】
８．参考文献
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【００８９】
様々な参考文献が本明細書において引用されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３ＡＢＣ】
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【図３ＤＥ】
2018537459.tif 000015
【図４】
2018537459.tif 000016
【図５】
2018537459.tif 000017
【図６ＡＢＣ】
2018537459.tif 000018
【図６Ｄ】
2018537459.tif 000019
【図７ＡＢ】
2018537459.tif 000020
【図７ＣＤＥ】
2018537459.tif 000021
【図７Ｆ】
2018537459.tif 000022
【図８Ａ】
2018537459.tif 000023
【図８ＢＣＤ】
2018537459.tif 000024
【図８Ｅ】
2018537459.tif 000025
【図９】
2018537459.tif 000026
【図１０ＡＢＣ】
2018537459.tif 000027
【図１０Ｄ】
2018537459.tif 000028
【図１１ＡＢ】
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【図１１Ｃ】
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【国際調査報告】
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