(57)【要約】  免疫応答を惹起するのに適したペプチドが開示される。該ペプチドはＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応し、ＲＡＳタンパク質の突然変異位置を含む８個のアミノ酸の領域を含む。該領域は突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有する。上記ペプチドは突然変異位置に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位又は１１７位である。【選択図】図１
2018518177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、該ペプチドがＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、
前記領域が突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、
前記領域が前記突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
前記領域が前記突然変異位置に点突然変異を有し、
前記突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である、
ペプチド。
【請求項２】
前記点突然変異がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ワクチン又は薬剤として用いられる、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
各々がＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する第１及び第２のペプチドを含む、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
前記第１のペプチドが第１の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
前記第２のペプチドが第２の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
前記第１及び第２のペプチドの領域が各々独立して、前記第１及び第２の突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
前記第１及び第２のペプチドが各々、前記第１及び第２の突然変異位置に点突然変異を有し、
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、
前記第１の突然変異位置の点突然変異が、前記第２の突然変異位置の点突然変異とは異なる、
ペプチド混合物。
【請求項５】
前記第１のペプチドの点突然変異がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異から選択される、請求項４に記載のペプチド混合物。
【請求項６】
前記第２のペプチドの点突然変異がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異から選択される、請求項４又は５に記載のペプチド混合物。
【請求項７】
前記ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも１つの更なるペプチドを含み、
前記少なくとも１つの更なるペプチドが、突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
前記少なくとも１つの更なるペプチドの前記領域が前記突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
前記少なくとも１つの更なるペプチドが前記突然変異位置に点突然変異を有し、
前記少なくとも１つの更なるペプチドの前記突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、
前記少なくとも１つの更なるペプチドの点突然変異が、前記第１及び第２のＲＡＳペプチドの各々の点突然変異とは異なる、
請求項４〜６のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項８】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位である、請求項４〜７のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項９】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位であり、前記少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位である、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１０】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位であり、前記少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の６１位である、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１１】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位であり、第１の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位に突然変異位置を有し、第２の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の６１位に突然変異位置を有する、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１２】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位であり、前記第１の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位に突然変異位置を有し、前記ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質の６１位に突然変異位置を有する第２の更なるペプチドを更に含む、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１３】
Ａ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、
Ｇ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、
Ｇ１３Ｖの突然変異を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドと、
を含む、請求項４〜８、１０及び１２のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項１４】
ＭＨＣ分子上に提示された場合に請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに特異的なＴ細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＴ細胞を含むＴ細胞製剤。
【請求項１６】
ＭＨＣ細胞上に提示された場合に請求項４〜１３のいずれか一項に記載のペプチド混合物の１つのペプチドの各々に特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物。
【請求項１７】
ＭＨＣ分子上に提示された場合に、
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、又は
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド
に対して特異的な、Ｔ細胞受容体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、又は
請求項１７に記載のＴ細胞受容体
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項１４に記載の、Ｔ細胞、
請求項１５に記載の、Ｔ細胞製剤、
請求項１６に記載の、Ｔ細胞混合物、
請求項１７に記載の、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項１８に記載の、核酸、
請求項１９に記載の、ベクター、又は
請求項２０に記載の、宿主細胞
と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
癌の予防及び／又は治療のために用いられる、
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項１４に記載の、Ｔ細胞、
請求項１５に記載の、Ｔ細胞製剤、
請求項１６に記載の、Ｔ細胞混合物、
請求項１７に記載の、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項１８に記載の、核酸、
請求項１９に記載の、ベクター、
請求項２０に記載の、宿主細胞、又は
請求項２１に記載の、医薬組成物。
【請求項２３】
前記癌が副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、及び／又は悪性黒色腫である、請求項２２に記載の、用途に用いられるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、医薬組成物、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、又は宿主細胞。
【請求項２４】
前記癌が大腸癌である、請求項２３に記載の、用途に用いられるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、医薬組成物、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、又はベクター。
【請求項２５】
癌の治療又は予防の方法であって、
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項１４に記載の、Ｔ細胞、
請求項１５に記載の、Ｔ細胞製剤、
請求項１６に記載の、Ｔ細胞混合物、
請求項１７に記載の、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項１８に記載の、核酸、
請求項１９に記載の、ベクター、又は
請求項２１に記載の、医薬組成物
を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答を惹起するＲＡＳタンパク質のペプチド、免疫応答を惹起するＲＡＳタンパク質のペプチドを含むペプチド混合物、ＭＨＣ分子上に提示された場合にかかるペプチドに特異的なＴ細胞、並びにＭＨＣ分子上に提示された場合にかかるペプチドに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物及びＴ細胞製剤を提供する。本発明は、かかるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、並びにＴ細胞混合物及び製剤を含む医薬配合物、癌の予防及び／又は治療のために用いられるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、並びにＴ細胞混合物及び製剤の使用、並びに癌の治療に対してペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物及びＴ細胞製剤を選択する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌発病の遺伝学的背景は、癌原遺伝子、癌遺伝子、及び腫瘍抑制遺伝子の改変である。癌原遺伝子は、癌遺伝子になる可能性のある細胞の正常な遺伝子である。全ての癌遺伝子はタンパク質をコードし、それによって機能する。ほとんどの場合、癌遺伝子は、シグナル伝達経路の構成要素であることが示されている。癌遺伝子は、点突然変異又は転座によって癌原遺伝子から自然に発生することにより、突然変異を持つ細胞の形質転換状態をもたらす。癌は、癌遺伝子及び腫瘍抑制細胞における幾つかの変異事象を含む多段階のプロセスにより発症する。
【０００３】
その最も単純な形態では、癌原遺伝子における単一の塩基置換が、コードされるタンパク質の１つのアミノ酸の相違を引き起こす場合がある。
【０００４】
マウスの腫瘍を含む実験モデルでは、細胞内の「自己」タンパク質における点突然変異が、正常なペプチドとは単一のアミノ酸が異なるペプチドからなる腫瘍拒絶抗原をもたらす場合があることが示されている。腫瘍細胞表面における主要組織適合性（ＭＨＣ）分子との関連でこれらのペプチドを認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を殺傷することができ、そのようにして宿主から腫瘍を拒絶する（非特許文献１）。
【０００５】
過去３０年間で、ヒト腫瘍抗原に対する抗体の分析に対して特別な努力がなされてきた。かかる抗体を診断及び治療の両方の目的で、例えば抗癌剤と組み合せて使用可能であることが示唆されている。１つの問題は、抗体が腫瘍細胞表面に露出される腫瘍抗原にしか結合することができないことである。この理由のため、身体の免疫系に基づく癌治療をもたらすための努力は、予想されていたほど成功していない。
【０００６】
抗体は、典型的には未変性の立体構造の遊離型抗原を認識し、抗原表面に露出されるほとんどの任意部位を潜在的に認識することができる。Ｂ細胞によって産生される抗体とは対照的に、Ｔ細胞は、ヒトではＨＬＡ（ヒト白血球抗原）と示されるＭＨＣ分子と関連してのみ、また通常はＭＨＣ分子の溝に適合するペプチドを生じる、そのタンパク質のタンパク質分解断片化からなる適切な抗原処理の後にのみ抗原を認識する。これによりＴ細胞が細胞内タンパク質に由来するペプチドを認識することを可能とする。したがって、ＭＨＣ分子によって腫瘍細胞の表面に提示された場合に、Ｔ細胞は腫瘍細胞のいずれかの部分に由来する異常なペプチドを認識することができる。その後、Ｔ細胞は、異常なペプチドを持つ腫瘍細胞を排除するように活性化され得る。
【０００７】
Ｔ細胞は、様々な機構によって癌の発症及び成長を制御し得る。細胞毒性Ｔ細胞、ＨＬＡクラスＩ制限ＣＤ８＋及びＨＬＡクラスＩＩ制限ＣＤ４＋の両方は、適切な腫瘍抗原を持つ腫瘍細胞を直接殺傷し得る。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞応答の誘導及び維持、また同様に抗体応答、並びにマクロファージ及びリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の殺傷の誘導に必要である。
【０００８】
多くの癌遺伝子及びそれらのタンパク質生成物が同定されている。さらに、健康な人のＴ細胞レパートリーは、適切なＨＬＡ分子上に提示された場合に、１つのｐ２１  ＲＡＳ癌遺伝子産物に由来する合成ペプチドフラグメントに対する特異性を有するＴ細胞を含むことが示されている。さらに、全ての癌のおよそ２０％がＲＡＳ癌遺伝子における突然変異と関連することが予想される。
【０００９】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体療法が癌治療の第一選択レジメンである。しかしながら、大腸癌では、ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２のコドン１２及び１３における点突然変異がＥＧＦＲ抗体による治療に対する耐性の前兆となり、ＥＧＦＲ抗体による治療が、かかる突然変異を発現する腫瘍を有する患者には効果がないことがわかっている。野生型ＫＲＡＳコドン１２及び／又は１３を発現する腫瘍を有する患者の半数以上がＥＧＦＲ抗体療法にも耐性を示すことが更にわかっている（非特許文献２）。さらに、任意のＲＡＳ突然変異を有する患者がパニツムマブ−ＦＯＬＦＯＸ４治療によっても傷害を受ける可能性があることが報告されている（非特許文献３）。特に、現在の臨床ガイドラインでは、ＲＡＳ野生型腫瘍を有する患者のみを、ＦＯＬＦＩＲＩ又はＦＯＬＦＯＸ化学療法と組み合わせたセツキシマブ又はパニツムマブによって治療すべきことが推奨されている（非特許文献４）。
【００１０】
非特許文献４（JCO、２０１５年１月２０日の発行に先立ってオンラインで公表された）は、ＫＲＡＳコドン１２及び１３以外の位置にＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を保有する大腸癌患者における、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比較したＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブの効果を判断する研究の結果を開示している。最もよく見られる突然変異部位（ＫＲＡＳコドン１２及び１３を除く）がＫＲＡＳエクソン４内にあり、ＦＯＬＦＩＲＩへのセツキシマブの添加が、コドン１２及び１３以外の遺伝子座に腫瘍ＲＡＳ突然変異を有する患者において治療有効性のいかなる改善ももたらさないことがわかった。しかしながら、この文献はＲＡＳ突然変異を有する患者のいかなる代替治療も開示又は示唆していない。
【００１１】
非特許文献５は、エクソン２の他にＮＲＡＳ又はＫＲＡＳ突然変異（「新たな」ＲＡＳ突然変異と称される）を有する腫瘍を有する転移性大腸癌患者における抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法の有効性を評価する研究を報告している。検討される「新たな」突然変異は、エクソン３（コドン５９及び６１）若しくはエクソン４（コドン１１７及び１４６）におけるＫＲＡＳ突然変異、又はエクソン２、３若しくは４におけるＮＲＡＳ突然変異であった。「新たな」ＲＡＳ突然変異を有する患者において抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法による無進行生存（ＰＦＳ）又は全生存（ＯＳ）の改善が見られず、野生型ＲＡＳを有する患者が、「新たな」ＲＡＳ突然変異を有する患者と比較して顕著に優れた抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ有効性を有することがわかった。この文献は、大腸癌患者の約１１％が「新たな」ＲＡＳ突然変異を有し、したがってＥＧＦＲ抗体療法に耐性を示す可能性があることを更に開示している。しかしながら、この文献はＥＧＦＲ抗体療法のいかなる代替治療も示唆していない。
【００１２】
非特許文献６は、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法がＲＡＳ遺伝子に突然変異を有する患者において効果がないことを開示し、大腸癌患者におけるＫＲＡＳ及びＮＲＡＳ突然変異の検出のための高解像度融解曲線分析（high-resolution melting）（ＨＲＭ）法を開発及び確認する研究を報告している。この文献は、野生型ＫＲＡＳエクソン２を有する研究した大腸癌患者の１５．３１％がＫＲＡＳエクソン３若しくは４、又はＮＲＡＳエクソン２、３若しくは４に突然変異を有することを開示している。特に、エクソン４突然変異は、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳエクソン３の各々の１．９１％と比較して、研究した患者におけるエクソン２以外のＲＡＳ突然変異の５．３％を占めていた。しかしながら、この文献はＲＡＳ突然変異を有する患者、特にＲＡＳエクソン２突然変異以外にＲＡＳ突然変異を有する患者に対するＥＧＦＲ抗体療法の代替治療を示唆していない。
【００１３】
非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６より前には、ＲＡＳタンパク質のエクソン４における突然変異が癌と関連することは知られていなかった。したがって、ＲＡＳタンパク質のエクソン４に対応するペプチドは、癌の治療におけるそれらの有用性について提案又は試験されていない。
【００１４】
特許文献１は、ＲＡＳに関連する癌に対するワクチン及び癌の治療用組成物として用いられる、Ｔ細胞免疫を惹起する合成ペプチド及び癌遺伝子のタンパク質生成物のフラグメントを開示する。上記ペプチドは、癌細胞によって提示される癌遺伝子の活性なフラグメントに対応し、癌遺伝子の突然変異に対応する１以上の位置において突然変異を含まなければならない。この文献は、ＲＡＳタンパク質の１２位、１３位及び６１位における突然変異を開示し、具体的には、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｋ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１３Ｖ及びＧ１３Ｄの突然変異のみを開示する。しかしながら、この文献は１２、１３及び６１以外のコドンに突然変異を有する任意のペプチドの使用、特にＲＡＳエクソン４に対応するペプチドの使用を開示していない。加えて、この文献は、ワクチンが、癌遺伝子タンパク質に最も共通して見られる突然変異を有するペプチドの選択を含んでもよいことに言及するが、ペプチドのいかなる具体的な組合せも示唆していない。
【００１５】
特許文献２は、癌ワクチンとして用いられるＴ細胞免疫を惹起する合成ペプチド混合物を考察する。該ペプチド混合物は、ＲＡＳ  ｐ２１変異体ペプチドからなり、この文献は具体的にはＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ及びＧ１３Ｄの突然変異のみを開示する。この文献は、ペプチドのカクテルによって惹起された免疫応答が単独のペプチドによって惹起されたものよりも著しく高かったことも開示しているが、コドン１２、１３若しくは６１以外に、又は特にエクソン４に突然変異を有するいかなるＲＡＳペプチドも示唆していない。加えて、この文献は、文献内に具体的に開示された以外のペプチドの任意の他の組合せが有用であり得ることを開示していない。
【００１６】
特許文献３は、特定の細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導することが可能なペプチド（ＣＤ８＋）がｐ２１  ＲＡＳ癌原遺伝子タンパク質の１２位及び／又は１３位又は６１位を含むｐ２１  ｒａｓ癌原遺伝子タンパク質の８個〜１０個のアミノ酸を含み、１２位、１３位又は６１位にアミノ酸置換を有することを開示している。この文献は、ペプチドを癌ワクチン及び抗癌治療用の組成物として使用し得ることも開示している。しかしながら、１２位、１３位又は６１位に突然変異を有するもの以外のペプチドは開示されておらず、特に有用なものとして具体的なペプチド混合物は開示されていない。
【００１７】
さらに、これらの文献のいずれも、特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかについては考察していない。
【００１８】
混合物中のペプチドの幾つかが免疫優性であり、他のペプチドのＨＬＡ提示を抑制するというリスクのために、患者のワクチン接種のためにペプチド混合物を使用することに関して大きな懸念がある（非特許文献７）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われた実験から、様々な突然変異ＲＡＳペプチドが関連Ｔ細胞への提示を担うＨＬＡ分子への結合について競合し、同じ長さであるが、異なる突然変異を示すペプチドが、異なる程度の有効性で別の突然変異を示すペプチドの結合及び認識を阻害する可能性があることが知られている（非特許文献８及び非特許文献９）。これらの事実から、免疫優性問題は突然変異ＲＡＳペプチドワクチンに関する問題とみなされているが、この問題は前段落で言及した文献のいずれにおいても考察されていない。
【００１９】
非特許文献１０は、合成変異体ＲＡＳペプチドと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを組み合せてワクチン接種した膵臓の腺癌を有する患者を含む第Ｉ相／第ＩＩ相の試験を開示する。この試験は、単独のペプチドワクチン又は４つの変異体ペプチドの混合物を使用した。該混合ワクチンは、膵臓腺癌に見られる４つの最も一般的なＫＲＡＳ突然変異、すなわちＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ又はＧ１２Ｒの突然変異を有するペプチドで構成された。しかしながら、この文献は、有用であり得るペプチドの任意の他の組合せを開示しておらず、癌と関連するＲＡＳタンパク質の任意の他の突然変異を開示しておらず、特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかを考察しておらず、免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題を考察していない。
【００２０】
非特許文献１１は、合成変異体ＲＡＳペプチドでワクチン接種した膵臓腺癌を有する患者の長期フォローアップを報告する。該ワクチンは、単独のＲＡＳペプチド又は７つのＲＡＳペプチドのカクテルのいずれかからなる。特に、この試験で使用された７つのＲＡＳペプチドは、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ又はＧ１３Ｄの突然変異を有した。しかしながら、この文献は特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかを考察しておらず、有用であり得るペプチドの任意の他の組合せを開示しておらず、免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題を考察していない。
【００２１】
非特許文献１２は、第１のエンドポイントとして安全性、第２のエンドポイントとしてＲＡＳペプチドの免疫原性を含む、ＲＡＳペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性の臨床予備実験を報告する。黒色腫の患者を４つのコドン６１の突然変異を有するＮ−ｒａｓペプチド（残基４９〜７３）を用いて皮内に免疫した。８名の患者は陽性ＤＴＨ応答を示した。しかしながら、この文献は特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかを考察しておらず、有用であり得るペプチドの任意の他の組合せを開示しておらず、免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題を考察していない。
【００２２】
非特許文献１３は、異なる種類の癌は、特定のＲＡＳアイソフォームの突然変異と結び付けられ、各アイソフォームは独特のコドン突然変異の特徴を有することを開示する。さらに、非特許文献１３は、ＲＡＳタンパク質の１２位、１３位及び６１位の各位置において６つの突然変異が生じることによって合計１８の突然変異が起こることを開示する。また、この総説は、ＲＡＳ機能に対するこれらの突然変異の効果、及びＲＡＳアイソフォーム突然変異の差次的なパターンをもたらす可能性のある機構を考察する。しかしながら、この文献は癌の治療若しくは予防、又は免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題に対処していない。加えて、癌に対するワクチン又は治療は開示されておらず、この文献は有用であり得るペプチドの任意の組合せを開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第９２／１４７５６号
【特許文献２】国際公開第００／６６１５３号
【特許文献３】英国特許第２３２８６８９号
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Boon, T. et al, Cell 1989, Vol. 58, p.293-303
【非特許文献２】Vaughn C P et al., Genes Chromosomes Caner, 2011, 50, 307-12
【非特許文献３】Douillard J Y et al., N Eng J Med 2013, 369, 1023-34
【非特許文献４】Van Cutsem et al., JCO, 2015 Jan 20; National Comprehensive Cancer Network: NCCN Guidelines Colon cancer, version 2.2015
【非特許文献５】Sorich et al. (Annals of Oncology, 26: 13-21, 2015)
【非特許文献６】Negru et al. (BMJ Open 2014, 4)
【非特許文献７】Pion S, et al., Blood, 1999 Feb 1; 93(3): p952-62
【非特許文献８】T. Gedde-Dahl III et al., Human Immunol. 1994, 33, p. 266-274
【非特許文献９】B. H. Johanssen et al., Scand. J. Immunol., 1994, 33, p. 607-612
【非特許文献１０】Gjertsen et al. (Int. J. Cancer 2001, 92, p.441-450)
【非特許文献１１】Weden et al. (Int. J. Cancer 2010, 128(5), p. 1120-1128)
【非特許文献１２】Hunger et al. (Exp. Dermatol. 2001, 10: 161-167)
【非特許文献１３】Prior et al. (Cancer Res. 2012, 72(10), p. 2457-2467)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
したがって、ＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を保有する癌患者に対して行うことができる、ＥＧＦＲ抗体療法の代替治療を提供する必要がある。特に、ＲＡＳエクソン４突然変異を有する腫瘍を保有する患者、特に大腸癌を有する患者に対するＥＧＦＲ抗体療法の代替治療を提供することが望ましい。加えて、免疫優性及び余剰性の問題を克服し、コスト効率がよい、特定の癌に対して標的化された代替治療を提供する必要がある。さらに、可能な限り多くの大腸癌患者に対してワクチン及び／又は治療を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、ＲＡＳ遺伝子のエクソン４のコドンに対応するアミノ酸に点突然変異を有するペプチド、及び少なくとも１つのかかるペプチドを含むペプチド混合物を、ＲＡＳタンパク質突然変異と関連する癌に対するワクチン及び／又はその治療として使用し得ることが今回わかったことから、上で考察される問題に対する解決策を提供する。特に、本発明のペプチド混合物の少なくとも幾つかを、ＲＡＳタンパク質の突然変異と関連する癌の９９％超に対するワクチン及び／又はその治療、また全ての大腸癌の１０％に対するワクチン及び／又はその治療として使用し得ることがわかった。特に、ＴＧ０２として知られるペプチド混合物（本明細書で更に考察する）との組合せで検討した場合、本発明のペプチド及びペプチド混合物は全ての大腸癌の少なくとも５０％の治療に使用することができる。本発明のペプチド及びペプチド混合物は、ＥＧＦＲ抗体療法に耐性を示す患者に対する代替治療をもたらす。さらに、本発明のペプチド及びペプチド混合物は免疫優性の問題を軽減し、医薬組成物における有効成分の余剰性を低減することで、ペプチド及びペプチド混合物をよりコスト効率のよいワクチン及び／又は治療とする。加えて、本発明は、特定のタイプの癌に標的化されたワクチン接種及び／又は治療、並びに特定のタイプの癌に標的化されたペプチドの混合物を選択する方法を可能とする。
【００２７】
したがって、本発明の第１の態様では、免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、該ペプチドがＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、
上記領域が突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、
上記領域が上記突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
上記領域が上記突然変異位置に点突然変異を有し、
上記突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である、
ペプチドが提供される。
【００２８】
有利には、点突然変異がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異である。
【００２９】
好ましくは、ペプチドは、ワクチン又は薬剤として用いられる。
【００３０】
本発明の第２の態様では、各々がＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する第１及び第２のペプチドを含む、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
第１のペプチドが第１の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
第２のペプチドが第２の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
第１及び第２のペプチドの上記領域が各々独立して、上記第１及び第２の突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
第１及び第２のペプチドが各々、上記第１及び第２の突然変異位置に点突然変異を有し、
第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、
第１の突然変異位置の点突然変異が、第２の突然変異位置の点突然変異とは異なる、
ペプチド混合物が提供される。
【００３１】
有利には、第１のペプチドの点突然変異がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異から選択される。
【００３２】
便利には、第２のペプチドの点突然変異がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異から選択される。
【００３３】
第１のペプチドがＲＡＳタンパク質の１４６位に点突然変異を有し、第２のペプチドがＲＡＳペプチドの６１位に突然変異を有するのが好ましい。
【００３４】
有利には、ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも１つの更なるペプチドを含み、
上記少なくとも１つの更なるペプチドが、突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
上記少なくとも１つの更なるペプチドの上記領域が上記突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
上記少なくとも１つの更なるペプチドが上記突然変異位置に点突然変異を有し、
少なくとも１つの更なるペプチドの上記突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、
上記少なくとも１つの更なるペプチドの点突然変異が、第１及び第２のＲＡＳペプチドの各々の点突然変異とは異なる。
【００３５】
好ましくは、第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位である。
【００３６】
有利には、第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位であり、少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位である。
【００３７】
便利には、第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位であり、少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の６１位である。
【００３８】
好ましくは、第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位であり、第１の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位に突然変異位置を有し、ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質の６１位に突然変異位置を有する第２の更なるペプチドを更に含む。
【００３９】
有利には、第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位であり、第１の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位に突然変異位置を有し、ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質の６１位に突然変異位置を有する第２の更なるペプチドを更に含む。
【００４０】
便利には、ペプチド混合物は、Ａ１４６Ｔの突然変異を有する第１のペプチドと、Ｇ１３Ｒの突然変異を有する第２のペプチドと、Ｇ１３Ｖの突然変異を有する第３のペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有する第４のペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有する第５のペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有する第６のペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有する第７のペプチドとを含む。
【００４１】
ペプチド混合物は、配列番号１又は配列番号２によって表される配列を含む第１のペプチドと、配列番号３３によって表される配列を含む第２のペプチドと、配列番号３４によって表される配列を含む第３のペプチドと、配列番号３５によって表される配列を含む第４のペプチドと、配列番号３６によって表される配列を含む第５のペプチドと、配列番号３７によって表される配列を含む第６のペプチドと、配列番号３８によって表される配列を含む第７のペプチドとを含むか、又はそれらから本質的になるのが好ましい。
【００４２】
本発明の第３の態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に上に記載される第１又は第２の態様によるペプチドに特異的なＴ細胞が提供される。
【００４３】
本発明の第４の態様では、上に記載される第３の態様によるＴ細胞を含むＴ細胞製剤が提供される。
【００４４】
本発明の第５の態様では、ＭＨＣ細胞上に提示された場合に、上に記載される第２の態様によるペプチド混合物の１つのペプチドの各々に特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物が提供される。
【００４５】
本発明の第６の態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に、上に記載される第１の態様によるペプチド又は第１の態様による用途に用いられるペプチドに特異的なＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００４６】
本発明の第７の態様では、上に記載される第１の態様によるペプチド、上に記載される第１の態様による用途に用いられるペプチド、又は上に記載される第６の態様によるＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００４７】
本発明の第８の態様では、上に記載される第７の態様による核酸を含むベクターが提供される。
【００４８】
本発明の第９の態様では、上に記載される第８の態様によるベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００４９】
本発明の第１０の態様では、上に記載される第１の態様によるペプチド、上に記載される第１の態様による用途に用いられるペプチド、上に記載される第２の態様によるペプチド混合物、上に記載される第３の態様によるＴ細胞、上に記載される第４の態様によるＴ細胞製剤、上に記載される第５の態様によるＴ細胞混合物、上に記載される第６の態様によるＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、上に記載される第７の態様による核酸、上に記載される第８の態様によるベクター、又は上に記載される第９の態様による宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００５０】
本発明の第１１の態様では、癌の予防及び／又は治療のために用いられる、上に記載される第１の態様によるペプチド、上に記載される第１の態様による用途に用いられるペプチド、上に記載される第２の態様によるペプチド混合物、上に記載される第３の態様によるＴ細胞、上に記載される第４の態様によるＴ細胞製剤、上に記載される第５の態様によるＴ細胞混合物、上に記載される第６の態様によるＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、上に記載される第７の態様による核酸、上に記載される第８の態様によるベクター、上に記載される第９の態様による宿主細胞、又は上に記載される第１０の態様による医薬組成物が提供される。
【００５１】
有利には、癌が副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、及び／又は悪性黒色腫である。
【００５２】
癌は大腸癌であるのが好ましい。
【００５３】
本発明の第１２の態様では、上に記載される第１の態様によるペプチド、上に記載される第１の態様による用途に用いられるペプチド、上に記載される第２の態様によるペプチド混合物、上に記載される第３の態様によるＴ細胞、上に記載される第４の態様によるＴ細胞製剤、上に記載される第５の態様によるＴ細胞混合物、上に記載される第６の態様によるＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、上に記載される第７の態様による核酸、上に記載される第８の態様によるベクター、又は上に記載される第９の態様による医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌の治療又は予防の方法が提供される。
【００５４】
本発明の第１３の態様では、
ａ）患者から採取された試料中のＲＡＳタンパク質突然変異を同定することと、
ｂ）試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含む本発明の第１の態様によるペプチド；試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含む本発明の第１の態様による用途に用いられるペプチド；試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドを含む本発明の第２の態様によるペプチド混合物；ＭＨＣ分子上に提示された場合に、試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的な本発明の第３の態様によるＴ細胞；ＭＨＣ分子上に提示された場合に、試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞を含む本発明の第４の態様によるＴ細胞製剤；ＭＨＣ分子上に提示された場合に、試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞を含む本発明の第５の態様によるＴ細胞混合物；試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的な本発明の第６の態様によるＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント；試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする本発明の第７の態様による核酸；試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする本発明の第８の態様によるベクター；又は試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチド、ワクチン若しくは薬剤として用いられるペプチド、ペプチド混合物、若しくはＭＨＣ分子上に提示された場合に、試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞、Ｔ細胞製剤若しくはＴ細胞を含むＴ細胞混合物、若しくは試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、若しくは試料中で同定されたＲＡＳタンパク質突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする核酸若しくはベクターを含む本発明の第９の態様による医薬組成物を選択することと、
ｃ）ペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、又はベクターを患者に投与することと、
を含む癌の治療又は予防の方法が提供される。
【００５５】
本明細書で使用される「ペプチド」の用語は、より長いタンパク質のフラグメントである（又はそれに対応する配列を有する）アミノ酸残基のポリマーを指す。また、該用語は、１以上のアミノ酸残基が改変残基、又は非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物である、アミノ酸ポリマー、また同じく天然アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５６】
本明細書で使用される「アミノ酸」の用語は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様の機能を有するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は遺伝コードによってコードされるもの、及び細胞内で翻訳後に改変されるものである（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリン）。「アミノ酸アナログ」の表現は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基及びＲ基に結合したα炭素）を有するが、改変Ｒ基又は改変主鎖を有する化合物（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣物」の表現は、異なる構造を有する化学化合物を指す。
【００５７】
２つの配列間のパーセント「同一性」は、デフォルトのパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２．２．２（Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を使用して決定されてもよい。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＵＲＬ  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/を使用してインターネット上でアクセス可能である。
【００５８】
本明細書で使用される「免疫応答」の用語は、幾つかの実施の形態では、細胞表面の主要組織適合性（ＭＨＣ）分子によるペプチドの提示に応じたＴ細胞媒介免疫応答を指し、特に、ペプチドの提示に応じたＴ細胞の活性化を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質」の用語は、ｒａｓ癌原遺伝子によってコードされる一群の小さなＧＴＰアーゼタンパク質を指し、ＲＡＳタンパク質の３つのアイソフォームであるＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳの全てを含む。幾つかの実施の形態では、「ＲＡＳタンパク質」の用語は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１１１２．１に対応し、配列番号３９に示されるタンパク質、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１１１６に対応し、配列番号４４に示されるタンパク質、又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１１１１に対応し、配列番号４５に示されるタンパク質を指す。
【００６０】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の１１７位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において１１７番目のアミノ酸を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の１４６位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において１４６番目のアミノ酸を指す。
【００６２】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の１３位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において１３番目のアミノ酸を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の１２位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において１２番目のアミノ酸を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の６１位」の用語は、Ｎ末端から数えて、野生型ＲＡＳタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において６１番目のアミノ酸を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「１１７位に対応するアミノ酸」の用語は、Ｎ末端から数えて、ＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列の１１７番目のアミノ酸に対応する位置におけるそのペプチドのアミノ酸鎖に位置するＲＡＳタンパク質のペプチド中のアミノ酸を意味する。対応する意味は、「１２位に対応するアミノ酸」、「１３位に対応するアミノ酸」、「６１位に対応するアミノ酸」及び「１４６位に対応するアミノ酸」の用語に与えられる。
【００６６】
本明細書で使用される「ペプチド混合物」の用語は、混合されているが、化合していない２つ以上のペプチドを指す。混合物は乾燥粉末、溶液、懸濁液又はコロイドとして存在してもよく、均一であっても又は不均一であってもよい。
【００６７】
本明細書で使用される「ＲＡＳタンパク質の突然変異」の用語は、被験体から採取された試料に存在するＲＡＳタンパク質中に存在する１以上の点突然変異を指す。
【００６８】
本明細書で使用される「点突然変異」の用語は、異なるアミノ酸残基を有するタンパク質生成物のポリペプチド鎖における単一のアミノ酸残基の置換を指す。
【００６９】
例えば、本明細書で使用される「Ｇ１２Ｖの突然変異」の用語は、結果的に野生型ＲＡＳタンパク質の１２位のグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）で置換されている点突然変異を指す。同様の定義が、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｑ６１Ｈ等の類似する用語に適用される。
【００７０】
本明細書で使用される「核酸」又は「核酸分子」の用語は、多数のヌクレオチドのポリマーを指す。核酸は天然ヌクレオチドを含んでいても、又はペプチドヌクレオチド、モルホリン及びロックド（locked）ヌクレオチド、並びにグリコールヌクレオチド及びトレオースヌクレオチド等の人工ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７１】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」の用語は、細胞酵素によって認識される天然ヌクレオチド及び合成ヌクレオチドアナログを指す。
【００７２】
本明細書で使用される「医薬組成物」の用語は、意図されるヒト又は動物の被験体に対する治療目的の投与に適した医薬製剤を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】大腸癌におけるＲＡＳタンパク質の突然変異の発生率を示す図である。
【図２】全ての癌において存在するＲＡＳ突然変異の発生率を示すグラフである。
【図３】本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）中のペプチドに対応する全ての癌におけるＲＡＳ突然変異のそれぞれの発生率を示すグラフである。
【図４】本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）中のペプチドに対応する肺癌におけるＲＡＳ突然変異のそれぞれの発生率を示すグラフである。
【図５】本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）中のペプチドに対応する大腸癌におけるＲＡＳ突然変異のそれぞれの発生率を示すグラフである。
【図６】本発明の２つのペプチド混合物（ＴＧ０２及びＴＧ０３）中のペプチドに対応する悪性黒色腫におけるＲＡＳ突然変異のそれぞれの発生率を示すグラフである。
【図７】健常ドナーにおけるＧ１３Ｃの突然変異を有するＲＡＳペプチド（配列番号１９）とＧ１３Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチド（配列番号２７）との混合物による３回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に対する増殖性Ｔ細胞応答を示すグラフである。ＡＰＣ：抗原提示細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＰＭ：カウント毎分。
【図８】健常ドナーにおけるＧ１３Ｃペプチド（配列番号１９）、Ｇ１３Ｄペプチド（配列番号２０）、Ｇ１２Ａペプチド（配列番号２１）、Ｇ１２Ｃペプチド（配列番号２２）、Ｇ１２Ｄペプチド（配列番号２３）、Ｇ１２Ｒペプチド（配列番号２４）、Ｇ１２Ｓペプチド（配列番号２５）、Ｇ１２Ｖペプチド（配列番号２６）及びＧ１３Ｒペプチド（配列番号２７）からなるＲＡＳペプチド混合物による３回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に対する増殖性Ｔ細胞応答を示すグラフである。ＡＰＣ：抗原提示細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＰＭ：カウント毎分。
【図９】健常ドナーにおけるＴＧ０２＋１３Ｒによる３回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のＧ１３Ｃ  ＲＡＳペプチド（配列番号１９）に対するＴ細胞応答を示すグラフである。ＡＰＣ：抗原提示細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＰＭ：カウント毎分。
【図１０】ＲＡＳペプチド混合物（ＴＧ０２；マウス＃４及び＃７）及びＴＧ０２＋Ｖｉｓｃｏｇｅｌ（商標）（マウス＃２４、＃２９及び＃３０）をワクチン接種したマウスから摘出した脾細胞の増殖性応答を示すグラフである。ＣｏｎＡ：コンカナバリンＡ（陽性対照）。
【図１１】Ａ１４６Ｔペプチド（配列番号１）による健常ドナーに由来するバフィーコート（バフィー５）の刺激後のＴ細胞増殖を示すグラフである。
【図１２】Ａ１４６Ｔペプチド（配列番号１）、Ｇ１３Ｃペプチド（配列番号２５）、Ｇ１３Ｄペプチド（配列番号２６）及びＱ６１Ｒペプチド（配列番号３５）からなるペプチドカクテルによる健常ドナーに由来するバフィーコート（バフィー５）の刺激後のペプチド特異的Ｔ細胞増殖を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
配列表の簡単な説明
配列番号１はＡ１４６Ｔの突然変異を有するＫＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２はＡ１４６Ｔの突然変異を有するＮＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３はＡ１４６Ｖの突然変異を有するＫＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４はＡ１４６Ｖの突然変異を有するＮＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５はＫ１１７Ｎの突然変異を有するＫＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６はＫ１１７Ｎの突然変異を有するＮＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７はＧ１３Ｃの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号８はＧ１３Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９はＧ１３Ｄの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０はＧ１３Ｖの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１はＧ１３Ａの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２はＧ１３Ｓの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３はＧ１２Ａの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４はＧ１２Ｃの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５はＧ１２Ｄの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６はＧ１２Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７はＧ１２Ｓの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８はＧ１２Ｖの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９はＱ６１Ｒの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０はＱ６１Ｋの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１はＱ６１Ｈの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２はＱ６１Ｌの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３はＱ６１Ｅの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４はＱ６１Ｐの突然変異を有するＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５はＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６はＧ１３Ｄの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７はＧ１２Ａの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８はＧ１２Ｃの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９はＧ１２Ｄの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０はＧ１２Ｒの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１はＧ１２Ｓの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２はＧ１２Ｖの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３はＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４はＧ１３Ｖの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５はＱ６１Ｒの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６はＱ６１Ｋの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７はＱ６１Ｈの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８はＱ６１Ｌの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は野生型ＨＲＡＳタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号４０はＲＡＳタンパク質の１１７位を含む野生型ＫＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１はＲＡＳタンパク質の１１７位を含む野生型ＮＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２はＲＡＳタンパク質の１４６位を含む野生型ＫＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４３はＲＡＳタンパク質の１４６位を含む野生型ＮＲＡＳペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は野生型ＫＲＡＳタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号４５は野生型ＮＲＡＳタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
【００７５】
発明の詳細な説明
本発明は包括的に言えば、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含むＲＡＳタンパク質のペプチドであって、上記領域が突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、ペプチドが突然変異位置に点突然変異を有し、突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である、ペプチドに関する。上で考察されるように、これらのペプチドは癌に対するワクチン及び／又は癌の治療として使用することができ、これらの突然変異ペプチドが免疫原性であることが今回初めて示された。例えば、ＲＡＳタンパク質の１４６位に突然変異を有するペプチドが免疫原性であり、Ｔ細胞の誘導を刺激することが図１１に示される。
【００７６】
さらに、本発明は、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含むＲＡＳタンパク質の少なくとも第１及び第２のペプチドを含むペプチド混合物であって、上記領域が少なくとも８個のアミノ酸を含み、第１のペプチドが第１の突然変異位置を含み、第２のペプチドが第２の突然変異位置を含み、第１及び第２のペプチドが各々、第１及び第２の突然変異位置に点突然変異を有し、第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、突然変異の各々が互いに異なる、ペプチド混合物に関する。かかるペプチド混合物の一例がペプチド混合物だけでなく、ペプチド混合物中の個々のペプチドにも対するＴ細胞応答を誘導するのに効果的であることが図１２に示されるが、１４６位、１３位及び６１位に突然変異を有するペプチドを含むペプチド混合物が組み合わせて使用した場合に免疫原性であることが初めて示された。
【００７７】
本発明のペプチドはＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ又はＮＲＡＳのいずれかに対応するペプチドであってもよい。これらの３つのＲＡＳアイソフォームはいずれもＧＤＰ／ＧＴＰ結合を担うエクソン２及び３の領域の全てにおいて配列同一性を共有し、ＧＤＰ／ＧＴＰ結合を担うエクソン４の領域、すなわち、癌において突然変異に供される領域の全てにおいて非常に高い配列相同性を共有する。例えば、ＲＡＳタンパク質の１４６位を中心とする２５アミノ酸配列の領域において、野生型ＨＲＡＳ及び野生型ＮＲＡＳはどちらも野生型ＫＲＡＳと９２％の配列相同性（すなわち、２アミノ酸の差異）を有する。ＲＡＳタンパク質の１１７位を中心とする２５アミノ酸の領域において、野生型ＮＲＡＳは野生型ＫＲＡＳと９２％の相同性（すなわち、２アミノ酸の差異）を有し、野生型ＨＲＡＳは野生型ＫＲＡＳと８０％の相同性（すなわち、５アミノ酸の差異）を有する。野生型エクソン４によってコードされる配列中の差異はＧＤＰ／ＧＴＰ結合を妨げず、これはＧＤＰ／ＧＴＰ結合に影響をもたらす本明細書で指定される発癌突然変異である。
【００７８】
幾つかの実施形態では、上記ペプチドは、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２４個、又は少なくとも３０個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ペプチドは少なくとも８個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、ペプチドは少なくとも１７個のアミノ酸を含む。
【００７９】
幾つかの実施形態では、ペプチドは３０個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、ペプチドは或る特定の実施形態では２８個、２６個、２４個、２２個、２０個、１８個、１６個、１４個、１２個、１０個又は８個以下のアミノ酸を含む。
【００８０】
幾つかの実施形態では、ペプチドは、ＲＡＳタンパク質とは無関係の要素を含むより長いポリペプチドの一部として提示される。特に、より長いポリペプチドはＲＡＳタンパク質とは無関係の１つ以上の領域を含んでもよい。
【００８１】
ペプチドはＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位に点突然変異を有する。野生型ＲＡＳタンパク質は１１７位にリシン（Ｋ）、１４６位にアラニン（Ａ）を含む。したがって、１１７位の突然変異はリシンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であり、１４６位の突然変異はアラニンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。しかしながら、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ及びＡ１４６Ｖの突然変異が特に癌と関連することがわかっている。したがって、好ましい実施形態では、ペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ及びＡ１４６Ｖの突然変異の１つである。特に好ましい実施形態では、点突然変異はＡ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異である。更により好ましい実施形態では、点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であるが、かかるペプチドが免疫原性であり、Ｔ細胞増殖を誘導するのに効率的であることが図１１に示される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３７％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して１００％の配列同一性を有する。特に好ましい実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号４のうちの１つに対して１００％の配列同一性を有する。更により好ましい実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１及び配列番号２のうちの１つに対して１００％の配列同一性を有する。
【００８３】
上述のペプチド混合物の幾つかの実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々独立して少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２４個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々少なくとも８個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々少なくとも１７個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々独立して３０個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、或る特定の実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々２８個、２６個、２４個、２２個、２０個、１８個、１６個、１４個、１２個、１０個又は８個以下のアミノ酸を含む。第１及び第２のペプチドは同じ数のアミノ酸を有していても、又は異なる数のアミノ酸を有してもよい。
【００８４】
幾つかの実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々、突然変異位置を含む領域以外の位置においてＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３７％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは、突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうち１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号２４のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、第２のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号２４のうちの１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第２のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号２４のうちの１つに対して１００％の配列同一性を有する。
【００８５】
幾つかの実施形態では、第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して或る割合の配列同一性を有し、第２のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号２４のうちの異なる１つに対して異なる割合の配列同一性を有する。他の実施形態では、第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して或る割合の配列同一性を有し、第２のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号２４のうちの１つに対して同じ割合の配列同一性を有する。全ての実施形態において、第１及び第２のペプチドは各々、免疫応答を惹起することが可能である。
【００８６】
第１のペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位である場合、第１のペプチドの点突然変異はリシン（Ｋ）から任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。第１のペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位である場合、第１のペプチドの点突然変異はアラニン（Ａ）から任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。幾つかの実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ及びＡ１４６Ｖの突然変異の１つである。幾つかの実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、他の実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｖの突然変異である。更なる実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異である。
【００８７】
第２のペプチドの点突然変異は、野生型アミノ酸から任意の他のアミノ酸への点突然変異であってもよい。例えば、野生型ＲＡＳタンパク質は１２位及び１３位の各々にグリシン（Ｇ）、６１位にグルタミン（Ｑ）を含む。したがって、第２のペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位である場合、１３位の突然変異はグリシンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。同様に、第２のペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位又は６１位である場合、１２位又は６１位の突然変異はグリシン又はグルタミンから、必要に応じて任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。第２のペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である場合、突然変異位置での突然変異はリシン又はアラニンのそれぞれから任意の他のアミノ酸へのものであり得る。好ましい実施形態では、第２のペプチドの点突然変異は、第１のペプチドの点突然変異とは独立してＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異のいずれか１つである。
【００８８】
幾つかの実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置での点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、第２のペプチドの突然変異位置での点突然変異はＡ１４６Ｖ、Ｋ１１７Ｎ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異のいずれか１つである。幾つかの実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｖの突然変異である。他の実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異である。他の実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ又はＱ６１Ｒの突然変異である。
【００８９】
他の実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置での点突然変異はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第２のペプチドの突然変異位置での点突然変異はＡ１４６Ｔ、Ｋ１１７Ｎ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異のいずれか１つである。幾つかの実施形態では、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異である。
【００９０】
また他の実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置での点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異であり、第２のペプチドの突然変異位置での点突然変異はＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異のいずれか１つである。
【００９１】
本発明の代替的な実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むＲＡＳタンパク質の少なくとも１つの更なるペプチドを含んでもよい。少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置は、ＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、少なくとも１つの更なるペプチドは、第１及び第２のペプチドの点突然変異とは異なる突然変異位置での点突然変異を有し得る。少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置での点突然変異は、第１及び第２のペプチドの点突然変異とは独立してＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異のいずれか１つであり得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置は、第１及び第２のペプチドの点突然変異とは独立してＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位、好ましくはＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異である。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置は、第１及び第２のペプチドの点突然変異とは独立してＧ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ又はＱ６１Ｒの突然変異である。
【００９２】
ペプチド混合物は２つ以上の更なるペプチドを含んでもよい。例えば、ペプチド混合物は２つの更なるペプチド、３つの更なるペプチド、４つの更なるペプチド又はそれ以上を含んでもよい。ペプチド混合物が１つ以上の更なるペプチドを含む実施形態では、更なるペプチドは各々独立して、本明細書に記載される少なくとも１つの更なるペプチドの特徴を有する。
【００９３】
ペプチド混合物が少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、第１、第２及び少なくとも１つの更なるペプチドは各々独立して少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２４個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ペプチドは各々少なくとも８個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、ペプチドは各々少なくとも１７個のアミノ酸を含む。更なる実施形態では、ペプチドは各々少なくとも１８個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、第１、第２及び少なくとも１つの更なるペプチドは各々独立して３０個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、或る特定の実施形態では、第１及び第２のペプチドは各々２８個、２６個、２４個、２２個、２０個、１８個、１６個、１４個、１２個、１０個又は８個以下のアミノ酸を含む。概して、ペプチド混合物中の各々のペプチドは、ペプチド混合物中の１つ以上の他のペプチドとは異なる数のアミノ酸を含み得る。
【００９４】
ペプチド混合物が少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ＲＡＳタンパク質の突然変異位置に対応するアミノ酸は点突然変異を有する。第２のペプチドと同様に、突然変異位置での点突然変異は野生型アミノ酸から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。したがって、少なくとも１つの更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１４６位を含む場合、点突然変異はアラニン（Ａ）から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも１つの更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１１７位を含む場合、点突然変異はリシン（Ｋ）から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも１つの更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の６１位を含む場合、点突然変異はグルタミン（Ｑ）から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも１つの更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位を含む場合、点突然変異はグリシン（Ｇ）から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも１つの更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１２位を含む場合、点突然変異はグリシン（Ｇ）から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。
【００９５】
少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位である実施形態では、ペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号４のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００９６】
少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位である実施形態では、ペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、配列番号５又は配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００９７】
少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位である実施形態では、ペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドは、１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、ＲＡＳタンパク質の２以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、１３位に突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
【００９８】
少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位である実施形態では、ペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドは、１２位を含む領域以外の位置において、配列番号１３〜配列番号１８及び配列番号２７〜配列番号３２のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、ＲＡＳタンパク質の２以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、１２位に突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
【００９９】
少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の６１位である実施形態では、ペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの更なるペプチドは、６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２４及び配列番号３５〜配列番号３８のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、ＲＡＳタンパク質の２以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、６１位に突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
【０１００】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は第１、第２及び第３のペプチドを含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位であり、第２のペプチドの点突然変異は第３のペプチドの点突然変異とは異なる。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位又は６１位である。幾つかの実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であるが、他の実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位である。
【０１０２】
他の実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位又は６１位である。幾つかの実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位である。他の実施形態では、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位である。
【０１０３】
他の実施形態では、ペプチド混合物は第１、第２及び第３のペプチドを含み、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第３のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異である。第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号１又は配列番号２のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第２のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号３又は配列番号４のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第３のペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第３のペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、配列番号５又は配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は第１のペプチドと、第２のペプチドと、第３のペプチドとからなり、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第３のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異であり、ペプチドは上に記載されるようなものである。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むＲＡＳタンパク質の第４のペプチドを含む。第４のペプチドの突然変異位置は第１、第２及び第３のペプチドの突然変異位置とは独立してＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位である。第４のペプチドは第１、第２及び第３のペプチドの各々の点突然変異とは異なる突然変異位置で点突然変異を有する。上で考察される第３のペプチドと同様に、第４のペプチドの点突然変異は野生型アミノ酸から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。好ましい実施形態では、第４のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異である。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第１、第２、第３及び第４のペプチドを含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳペプチドの１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第４のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異であり、第３のペプチドの点突然変異はＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異であり、第４のペプチドの点突然変異はＱ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異であり得る。第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第２のペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、配列番号１３〜配列番号１８及び配列番号２７〜配列番号３２のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第４のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２４及び配列番号３５〜配列番号３８のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第１、第２、第３及び第４のペプチドを含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳペプチドの１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第４のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異であり、第３のペプチドの点突然変異はＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異は、第３のペプチドの点突然変異とは異なり、第４のペプチドの点突然変異はＱ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異であり得る。第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第２のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第４のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２４及び配列番号３５〜配列番号３８のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第１、第２、第３及び第４のペプチドを含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳペプチドの１１７位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第４のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第１のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異であり、第３のペプチドの点突然変異はＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異であり、第４のペプチドの点突然変異はＱ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異であり得る。第１のペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、配列番号５又は配列番号６のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第２のペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、配列番号１３〜配列番号１８及び配列番号２７〜配列番号３２のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第４のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２４及び配列番号３５〜配列番号３８のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第１、第２、第３、第４及び第５のペプチドを含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳペプチドの１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第３のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第４のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位であり、第５のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第１のペプチドの点突然変異はＡ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異であり、第２のペプチドの点突然変異はＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異であり、第３のペプチドの点突然変異はＧ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異であり、第４のペプチドの点突然変異はＱ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異であり、第５のペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎの突然変異であり得る。第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第２のペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは１２位を含む領域以外の位置において、配列番号１３〜配列番号１８及び配列番号２７〜配列番号３２のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第３のペプチドは１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第４のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第２のペプチドは６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２４及び配列番号３５〜配列番号３８のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第５のペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第５のペプチドは１１７位を含む領域以外の位置において、配列番号５又は配列番号６のうちの１つと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
【０１０９】
幾つかの実施形態では（表６及び表７を参照されたい）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１又は配列番号２及び配列番号９、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１又は配列番号２及び配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表６及び表７に、好ましくはこれらの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１０】
幾つかの実施形態では（表８及び表９を参照されたい）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１又は配列番号２及び配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１又は配列番号２及び配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表８及び表９に、好ましくはこれらの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、ＲＡＳペプチドの１１７位に点突然変異を有するペプチド及び／又は１４６位に点突然変異を有するペプチドに加えて、ペプチド混合物は配列番号２５〜配列番号３２に対してそれぞれ１００％の配列同一性を有するＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドとを含み、ＲＡＳペプチドの１２位又は１３位に突然変異を有するペプチドのこの特定の組合せを、本明細書においてＴＧ０２と呼ぶ。図３に、好ましくはＴＧ０２に存在するペプチドを示す。ＲＡＳ突然変異と関連する癌、肺癌及び大腸癌におけるこれらの突然変異の発生率を、それぞれ図２、図４及び図５に示す。ＴＧ０２によるマウスのワクチン接種後の脾細胞増殖アッセイの結果を図９に示すが、ＴＧ０２が免疫応答を誘導するのに効果的であることが示される。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１１７位に点突然変異を有するペプチド及び／又は１４６位に点突然変異を有するペプチドに加えて、ペプチド混合物はＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドとを含み、ペプチドは配列番号３３〜配列番号３８のそれぞれに対して１００％の配列同一性を有し、ＲＡＳペプチドの１３位又は６１位に点突然変異を有するペプチドのこの特定の組合せを、本明細書においてＴＧ０３と呼ぶ。図３にＴＧ０３のペプチドを示す。悪性黒色腫におけるこれらの突然変異の発生率を図６に示す。
【０１１３】
幾つかの実施形態では（表１０及び表１１を参照されたい；本明細書においてＴＧ０２＋Ａ１４６Ｔと呼ぶ）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）又は配列番号２（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）、及び配列番号７、配列番号９及び配列番号１３〜配列番号１８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）又は配列番号２（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）、及び配列番号２５〜配列番号３２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表１０及び表１１に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１４】
幾つかの実施形態では（表１２及び表１３を参照されたい；ＴＧ０２＋Ａ１４６Ｖ）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号３（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｖペプチド）又は配列番号４（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｖペプチド）、及び配列番号７、配列番号９及び配列番号１３〜配列番号１８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号３又は配列番号４、及び配列番号２５〜配列番号３２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表１２及び表１３に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１５】
幾つかの実施形態では（表１４及び表１５；ＴＧ０３＋Ａ１４６Ｔ）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）又は配列番号２（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）、及び配列番号８、配列番号１０及び配列番号１９〜配列番号２２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）又は配列番号２（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）、及び配列番号３３〜配列番号３８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表１４及び表１５に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１６】
幾つかの実施形態では（表１６及び表１７を参照されたい；ＴＧ０３＋Ａ１４６Ｖ）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号３（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｖペプチド）又は配列番号４（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｖペプチド）、及び配列番号８、配列番号１０及び配列番号１９〜配列番号２２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号３（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｖペプチド）又は配列番号４（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｖペプチド）、及び配列番号３３〜配列番号３８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表１６及び表１７に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１７】
幾つかの実施形態では（表１８及び表１９を参照されたい；ＴＧ０２＋Ｋ１１７Ｎ）、ペプチド混合物はＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号５（ＫＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）又は配列番号６（ＮＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）、及び配列番号７、配列番号９及び配列番号１３〜配列番号１８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号５（ＫＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）又は配列番号６（ＮＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）、及び配列番号２５〜配列番号３２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表１８及び表１９に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１８】
幾つかの実施形態では（表２０及び表２１を参照されたい；ＴＧ０３＋Ｋ１１７Ｎ）、ペプチド混合物はＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号５（ＫＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）又は配列番号６（ＮＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）、及び配列番号８、配列番号１０及び配列番号１９〜配列番号２２のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号５（ＫＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）又は配列番号６（ＮＲＡＳ  Ｋ１１７Ｎペプチド）、及び配列番号３３〜配列番号３８のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。表２０及び表２１に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
【０１１９】
幾つかの実施形態では（表２２及び表２３を参照されたい；ＴＧＸ３）、ペプチド混合物はＡ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）又は配列番号２（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）、及び配列番号７、配列番号９及び配列番号１９のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１（ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）又は配列番号２（ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔペプチド）、及び配列番号２５、配列番号２６及び配列番号３５のいずれかに対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ及びＱ６１Ｒペプチドは配列番号２５、配列番号２６及び配列番号３５のそれぞれに対して１００％の配列同一性を有し、Ａ１４６Ｔペプチドは配列番号１と１００％の配列同一性を有し、ペプチドのこの特定の組合せを本明細書においてＴＧＸ３と呼ぶ。表２２にＴＧＸ３に存在するペプチドを示し、このペプチド混合物がペプチド混合物、またＴＧＸ３中の個々のペプチドの各々に対してＴ細胞応答を誘導するのに効果的であることが図１２に示される。好ましくはＴＧＸ３の代替形態に存在するペプチドを表２３に示すが、Ａ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドは配列番号２と１００％の配列同一性を有する。
【０１２０】
他の実施形態では、ペプチド混合物はＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ又はＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は１１７位、１４６位、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１〜配列番号９及び配列番号１３〜配列番号１８に対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は１１７位、１４６位、１２位又は１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号１〜配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３３に対して独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するペプチドからなる。配列番号２５〜配列番号３３によって表されるペプチドからなるペプチド混合物によるＰＭＢＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のＴ細胞増殖アッセイの結果を図８に示すが、Ｔ細胞がこの混合物によって刺激されたことが示される。したがって、ＲＡＳペプチド混合物は免疫応答を誘導するのに効果的である。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第１、第２、第３、第４及び第５のペプチドからなり、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である。第２、第３、第４及び第５のペプチドの各々の突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位であり、第２、第３、第４及び第５のペプチドは各々独立して、１３位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第２、第３、第４及び第５のペプチドは各々独立して、１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。第２、第３、第４及び第５のペプチドは各々、ＲＡＳペプチドの１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、第２、第３、第４及び第５のペプチドは各々、他のペプチドの点突然変異とは異なる点突然変異を有する。一実施形態では、第１のペプチドはＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ又はＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドであり、第２のペプチドはＧ１３Ｒの突然変異を有するペプチドであり、第３のペプチドはＧ１３Ａの突然変異を有するペプチドであり、第４のペプチドはＧ１３Ｓの突然変異を有するペプチドであり、第５のペプチドはＧ１３Ｖの突然変異を有するペプチドである。
【０１２２】
代替的な実施形態は、ＲＡＳタンパク質の少なくとも６個のペプチドを含むペプチド混合物であって、６個のペプチドの各々がＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域が本明細書に記載される突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、少なくとも６個のペプチドの１つの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である、ペプチド混合物を含む。少なくとも６個のペプチドは各々独立して、突然変異位置を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は第１、第２、第３、第４、第５及び第６のペプチドを含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳペプチドの１１７位又は１４６位であり、第２、第３、第４、第５及び第６のペプチドの各々の突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位である。第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有し、第２、第３、第４、第５及び第６のペプチドは各々独立して、１３位を含む領域以外の位置において、配列番号７〜配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３及び配列番号３４のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。第１のペプチドはＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ及びＫ１１７Ｎの突然変異から選択される点突然変異を有し、第２、第３、第４、第５及び第６のペプチドは各々Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ又はＧ１３Ｖの突然変異から独立して選択されるＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、第２、第３、第４、第５及び第６のペプチドの各々の点突然変異は他のペプチドの点突然変異とは異なる。幾つかの実施形態では、第１のペプチドはＡ１４６Ｔの突然変異を有し、幾つかの実施形態では、第１のペプチドはＡ１４６Ｖの突然変異を有する。他の実施形態では、第１のペプチドはＫ１１７Ｎの突然変異を有する。
【０１２３】
別の実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物はＲＡＳタンパク質の７個のペプチドからなり、各ペプチドはＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域は突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、第２〜第７のペプチドの各々の突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位である。第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有し、及び／又は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。第２〜第７のペプチドの各々が、１２位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を独立して有し、及び／又は１２位を含む領域以外の位置において、配列番号１３〜配列番号１８、及び配列番号２７〜配列番号３２のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を独立して有する。第２〜第７のペプチドは各々、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ又はＧ１２Ｖの突然変異から選択されるＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、各ペプチドの点突然変異は他のペプチドの点突然変異と異なる。
【０１２４】
別の実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物はＲＡＳタンパク質の７個のペプチドからなり、各ペプチドはＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域は突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、第２〜第７のペプチドの各々の突然変異位置はＲＡＳタンパク質の６１位である。第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有し、及び／又は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。第２〜第７のペプチドの各々が、６１位を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を独立して有し、及び／又は６１位を含む領域以外の位置において、配列番号１９〜配列番号２４、及び配列番号３５〜配列番号３８のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を独立して有する。第２〜第７のペプチドは各々、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ又はＱ６１Ｒの突然変異から選択されるＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、各ペプチドの点突然変異は他のペプチドの点突然変異と異なる。
【０１２５】
更なる実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物はＲＡＳタンパク質の第１、第２、第３、第４及び第５のペプチドからなり、ペプチドは各々ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域は突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含む。第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、第２、第３及び第４のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位であり、第５のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１３位である。第１のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有し、及び／又は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号６のうちの１つに対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。第２、第３、第４及び第５のペプチドは各々、１２位若しくは１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ、ＲＡＳタンパク質と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有し、及び／又は１２位若しくは１３位を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号７〜配列番号１８、及び配列番号２５〜配列番号３４のうちの１つに対してそれぞれ独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する。第２、第３、第４及び第５のペプチドは各々、ＲＡＳタンパク質の上記１２位又は１３位に対応するアミノ酸にそれぞれ点突然変異を有する。幾つかの実施形態では、第２のペプチドはＧ１２Ａの突然変異を有するペプチドであり、第３のペプチドはＧ１２Ｒの突然変異を有するペプチドであり、第４のペプチドはＧ１２Ｓの突然変異を有するペプチドであり、第５のペプチドはＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドである。
【０１２６】
概して、本発明のペプチドは１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位を含む８個のアミノ酸の領域内に、１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位のそれぞれの残基以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有する。さらに、概して、本発明のペプチドはＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位を含む領域以外の位置において、配列番号１〜配列番号３８のうちの１つに対してそれぞれ独立して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％を有する。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物中に最大で１２個の異なるペプチドが存在する。他の実施形態では、最大で８個、１０個、１２個、１４個又は１６個の異なるペプチドが存在する。ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の突然変異位置を含む領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、突然変異位置での点突然変異を有する１個、２個、３個、４個、５個又は６個のペプチドを含む。ペプチドの突然変異位置は各々独立して１１７位、１４６位、１２位、１３位又は６１位であり、各ペプチドは他のペプチドとは異なる突然変異位置での点突然変異を有する。ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の１２位を含む領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、ＲＡＳペプチドの１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応する位置に点突然変異を有する１個、２個、３個、４個、５個又は６個のペプチドを含む。ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む領域を含み、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する１個、２個、３個、４個、５個又は６個のペプチドを含み、ペプチドは各々異なる点突然変異を有する。ペプチド混合物がＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含む少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む領域を含み、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する１個、２個、３個、４個、５個又は６個のペプチドを含み、ペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、ＲＡＳペプチドの１１７位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１０７位〜１２７位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１１７位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１０８位〜１２６位を含むが、他の実施形態では、ペプチドはＲＡＳタンパク質の１０９位〜１２５位を含む。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１１７位に対応するアミノ酸はペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１１７位に対応するアミノ酸はペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の１１７位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１１７位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなり得る。例えば、１１７位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の１１０位〜１１７位、１１１位〜１１８位、１１２位〜１１９位、１１３位〜１２０位、１１４位〜１２１位、１１５位〜１２２位、１１６位〜１２３位又は１１７位〜１２４位のアミノ酸からなり得る。幾つかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１１７位に対応するアミノ酸はペプチドの中央にある。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、ＲＡＳペプチドの１４６位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１３６位〜１５６位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１４６位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１３７位〜１５５位を含むが、他の実施形態では、ペプチドはＲＡＳタンパク質の１３８位〜１５４位を含む。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１４６位に対応するアミノ酸はペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１４６位に対応するアミノ酸はペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の１４６位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１４６位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなり得る。例えば、１４６位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の１３９位〜１４６位、１４０位〜１４７位、１４１位〜１４８位、１４２位〜１４９位、１４３位〜１５０位、１４４位〜１５１位、１４５位〜１５２位又は１４６位〜１５３位のアミノ酸からなり得る。幾つかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１４６位に対応するアミノ酸はペプチドの中央にある。
【０１３０】
ペプチド混合物の幾つかの実施形態では、ＲＡＳペプチドの１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１位〜３０位を含む。他の実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の５位〜２１位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸はペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１２位に対応するアミノ酸はペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１２位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなり得る。例えば、１２位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の５位〜１２位、６位〜１３位、７位〜１４位、８位〜１５位、９位〜１６位、１０位〜１７位、１１位〜１８位又は１２位〜１９位のアミノ酸からなり得る。
【０１３１】
ペプチド混合物の幾つかの実施形態では、ＲＡＳペプチドの１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の１位〜３０位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の５位〜２１位を含む。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸はペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の１３位に対応するアミノ酸はペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１３位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなり得る。例えば、１３位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の６位〜１３位、７位〜１４位、８位〜１５位、９位〜１６位、１０位〜１７位、１１位〜１８位、１２位〜１９位又は１３位〜２０位のアミノ酸からなり得る。
【０１３２】
ペプチド混合物の幾つかの実施形態では、ＲＡＳペプチドの６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の４７位〜７６位を含む。他の実施形態では、ＲＡＳペプチドの６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、ＲＡＳタンパク質の５３位〜６９位を含む。代替的な実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸はペプチドのＣ末端にある。更なる実施形態では、ＲＡＳタンパク質の６１位に対応するアミノ酸はペプチドのＮ末端にある。概して、ＲＡＳタンパク質の６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、１３位を含むＲＡＳタンパク質の任意の８個の位置からなり得る。例えば、６１位を含む少なくとも８個のアミノ酸を有する領域は、ＲＡＳタンパク質の５４位〜６１位、５５位〜６２位、５６位〜６３位、５７位〜６４位、５８位〜６５位、５９位〜６６位、６０位〜６７位又は６１位〜６８位のアミノ酸からなり得る。
【０１３３】
本発明のペプチド混合物は、等しい又は異なる比率でペプチドを含有し得る。幾つかの実施形態では、第１及び第２のペプチドは混合物中にペプチドの絶対数で等しい比率で存在し、すなわち、各ペプチドはペプチド混合物のペプチド構成要素中のペプチドの総数の５０％を占める。他の実施形態では、ペプチドの絶対数で第２のペプチドよりも大きな比率の第１のペプチドがペプチド混合物中に存在する。例えば、第１のペプチドは、ペプチド混合物のペプチド構成要素中のペプチドの総数の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％を占めることができる。代替的な実施形態では、第１のペプチドよりも大きな比率の第２のペプチドがペプチド混合物中に存在する。例えば、第２のペプチドはペプチド混合物のペプチド構成要素の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％を占めることができる。少なくとも１つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチドはペプチド混合物のペプチド構成要素中に等比率で存在する。他の実施形態では、第１、第２及び少なくとも１つの更なるペプチドは互いに異なる比率で存在する。例えば、第１、第２及び少なくとも１つの更なるペプチドは各々独立して、ペプチド混合物のペプチド構成要素の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％を占めることができる。
【０１３４】
更なる実施形態では、上に記載されるペプチドはワクチン又は薬剤として用いられる。ペプチドはＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応し、突然変異位置を含むＲＡＳタンパク質の少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である。少なくとも８個のアミノ酸の領域は、突然変異位置以外にＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有する。ワクチン又は薬剤として用いられるペプチドは突然変異位置での点突然変異を有し、突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である。幾つかの実施形態では、ペプチドの点突然変異はＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの突然変異の１つである。上で考察されるように、１１７位又は１４６位に点突然変異を有するＲＡＳタンパク質のペプチド、特にＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ及びＡ１４６Ｖペプチドが免疫原性であり、Ｔ細胞増殖を誘導することが今回わかった。特に、ＲＡＳタンパク質の１４６位に突然変異を有するペプチド（より具体的には、Ａ１４６Ｔペプチド）がＴ細胞の誘導を刺激することが図１１に示される。
【０１３５】
さらに、ペプチド混合物が野生型ＲＡＳタンパク質の異なる領域に由来するペプチドを含有する場合であっても、ペプチド混合物に対する免疫原性応答が得られることが図１２に示される。したがって、関連Ｔ細胞への提示を担うＨＬＡ分子の結合について混合物のペプチド間に競合が見られず、かかる免疫優性が本発明のペプチド混合物にとって重要な問題でないことが図１２に示される。
【０１３６】
本発明のペプチドは、細胞表面においてＭＨＣ  ＩＩ分子によって提示されるＲＡＳタンパク質フラグメントに対応するペプチドである。したがって、本発明のペプチドは、ＲＡＳタンパク質の細胞内タンパク質分解によって生じ、その後ＨＬＡ分子上に提示され得て、概して個体がＴ細胞レパートリー中にそれに対する応答性Ｔ細胞を有する、タンパク質フラグメントに対応するペプチドである。
【０１３７】
本発明の別の態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に、ＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位に突然変異位置を含む、上に記載される本発明のペプチドに特異的なＴ細胞及びＴ細胞を含むＴ細胞製剤が提供される。本発明の更なる態様では、本発明のペプチド混合物の１つの各々のペプチドに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物が提供される。
【０１３８】
Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤及びＴ細胞混合物は、少なくとも１つの応答性Ｔ細胞を、ＲＡＳタンパク質のペプチド又は少なくともＲＡＳタンパク質の第１及び第２のペプチドを含むペプチド混合物で刺激することによって作製することができる。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞又はＴ細胞製剤はＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応するペプチドに特異的であり、ペプチドはＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、Ｔ細胞はペプチドの突然変異位置での点突然変異に特異的である。別の実施形態では、例えば、Ｔ細胞製剤はＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応するペプチドに特異的な複数のＴ細胞を含み、ペプチドは突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、Ｔ細胞製剤中の各々のＴ細胞はペプチドの突然変異位置での点突然変異に特異的である。別の実施形態では、例えば、Ｔ細胞混合物は複数のＴ細胞を含み、第１及び第２のＴ細胞は、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する第１及び第２のペプチドにそれぞれ特異的であり、各ペプチドは突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、第１のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、第２のペプチドの突然変異位置はＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、第１及び第２のＴ細胞が各々、上記突然変異位置に対応するアミノ酸での点突然変異に特異的であり、第１のＴ細胞が特異的な点突然変異は第２のＴ細胞が特異的な点突然変異とは異なる。
【０１３９】
本発明の更なる態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に、本発明のペプチド又は本発明のペプチド混合物のペプチドに特異的なＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントが提供される。ＲＡＳタンパク質のペプチドに特異的なＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントであって、ペプチドがＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域が突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、該領域が突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸を含み、突然変異位置が点突然変異を有し、突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位である、Ｔ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントも提供される。Ｔ細胞受容体の抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞受容体の完全な可変領域又は好適なフレームワーク領域中のその相補性決定領域を含み得る。
【０１４０】
本発明の別の態様では、少なくとも上に記載されるような第１及び第２のＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントを含むＴ細胞受容体混合物が提供される。ＲＡＳタンパク質のペプチドに特異的な少なくとも第１及び第２のＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントを含むＴ細胞受容体混合物であって、ペプチドがＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域が突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、該領域が突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸を含み、突然変異位置が点突然変異を有し、各ペプチドの突然変異位置が独立してＲＡＳタンパク質の１１７位、１４６位、１２位、１３位又は６１位であり、第１及び第２のＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントの各々が異なる点突然変異を有するペプチドに特異的である、Ｔ細胞受容体混合物も提供される。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞受容体混合物は、上に記載されるペプチド混合物のいずれかのペプチドの各々に特異的なＴ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントを含む。
【０１４１】
本発明の別の態様では、ＭＨＣ分子上に提示された場合に、本発明のペプチド又は本発明のペプチド混合物のペプチドに特異的なＴ細胞受容体をコードするｍＲＮＡが提供される。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡを使用して宿主細胞にトランスフェクトし、コードされたＴ細胞受容体を宿主細胞上に提示させる。
【０１４２】
本発明の別の態様では、本発明のペプチド又は本発明のペプチド混合物のペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。核酸の混合物が本発明のペプチド混合物をコードするように、混合物の各核酸が本発明のペプチド混合物の異なるペプチドをコードする配列を含む核酸の混合物も提供される。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、核酸及びその混合物を使用して、本発明のペプチド又はペプチド混合物を合成する。例えば、本発明のペプチドは核酸を被験体に投与することによって合成することができるが、その際に核酸が被験体により発現され、それにより本発明のペプチドがｉｎ  ｓｉｔｕで生じる。産生されるペプチドはその後、被験体において免疫応答を惹起する。別の例では、宿主細胞が核酸を発現して本発明のペプチドを産生し、これをその後回収及び精製するように、核酸を使用して、宿主細胞を本発明の核酸で形質転換又はトランスフェクトすることによって本発明のペプチドを合成することができる。幾つかの実施形態では、本発明のペプチドは、当該技術分野で既知の方法を用いた化学合成によって作製される。
【０１４４】
本発明の別の態様では、本発明のペプチド又はＴ細胞受容体をコードする配列を含む核酸を含むベクターが提供される。更なる態様では、上に記載されるベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞をベクターでトランスフェクト又は形質転換することで、宿主細胞にベクターによりコードされる核酸を発現させる。
【０１４５】
ペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞受容体及びその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター及び宿主細胞が癌、特にＲＡＳ癌遺伝子の突然変異と関連する癌の治療及び／又は予防に使用される。癌としては、副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、並びに悪性黒色腫を挙げることができ、本発明のペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸、ベクター及び宿主細胞は、これらのタイプの癌の２つ以上の予防及び／又は治療に使用することができる。幾つかの実施形態では、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有する本発明のペプチド、第１のペプチドがＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有する本発明のペプチド混合物、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のＴ細胞、Ｔ細胞がＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のＴ細胞製剤、第１のＴ細胞がＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のＴ細胞混合物、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチド、若しくはペプチドに特異的なＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む本発明の核酸、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチド、若しくはペプチドに特異的なＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む本発明のベクター、又はＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ若しくはＫ１１７Ｎの突然変異を有するペプチド、若しくはペプチドに特異的なＴ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含むベクターを含む本発明の宿主細胞が癌の予防及び／又は治療に使用される。Ｔ細胞受容体又はその抗原結合フラグメントはトランスジェニックＴ細胞、例えばキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）の操作に有用である。かかるＣＡＲＴは、例えば静注による個別癌療法に使用することができる。かかる実施形態では、癌が大腸癌、肺癌及び膵臓癌の１つ以上であるのが好ましい。幾つかの実施形態では、癌は大腸癌である。特に、本発明のペプチド及びペプチド混合物から選択する場合に、ＲＡＳタンパク質の突然変異と関連する癌の９９％を治療し得ることがわかった。
【０１４６】
より具体的には、Ａ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｖの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｋの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｈの突然変異を有するペプチドと、Ｑ６１Ｌの突然変異を有するペプチドとを含むペプチド混合物を、ＲＡＳの突然変異と関連するかを問わず全ての大腸癌の１０％の治療に使用し得ることがわかった。さらに、全ての大腸癌の少なくとも５０％を上述のペプチド混合物のいずれか、又はＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１３Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ａの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｃの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｄの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｒの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｓの突然変異を有するペプチドと、Ｇ１２Ｖの突然変異を有するペプチドとを含むペプチド混合物（例えば、ＴＧ０２）により治療し得ることがわかった。したがって、本発明のペプチド及びペプチド混合物は、ますます多くの数の大腸癌患者のワクチン及び／又は治療をもたらす。
【０１４７】
上に記載されるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤又は核酸を含む医薬組成物も提供される。かかる医薬組成物は少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含んでもよい。幾つかの実施形態では、医薬組成物は１つ以上の付加的な有効成分及び／又はアジュバントを更に含む。或る特定の実施形態では、医薬組成物は同じ疾患の兆候に対して治療的に有効な１つ以上の成分を更に含んでもよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は１つ以上の更なる化学療法剤、１つ以上の抗体、１つ以上の小分子及び／又は１つ以上の免疫刺激剤（例えば、サイトカイン）を更に含んでもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、核酸又は医薬組成物は他の形態の免疫療法と組み合わせて使用することができる。
【０１４８】
或る特定のタイプの癌がＲＡＳタンパク質の或る特定の突然変異と関連することがわかっており、最近になって、図１に示されるようにＡ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ及びＫ１１７Ｎの突然変異が癌、特に大腸癌と関連することがわかってきた。したがって、或る特定のタイプの癌を標的とするようにペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞受容体又はその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター及び宿主細胞を調整することが可能である。
【０１４９】
本発明のペプチド、ペプチド混合物又は医薬組成物は、当業者に既知の任意の好適な送達技法によって被験体に投与されてもよい。例えば、他の技法のうち、ペプチド、ペプチド混合物又は医薬組成物は、溶液の形態、リポソームの形態又は乾燥形態（例えば、被覆粒子の形態等）で注射によって被験体に投与されてもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド又はペプチド混合物は、ＧＭ−ＣＳＦ等の免疫促進剤とともに投与される。ＧＭ−ＣＳＦを使用する実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦはどのようなＧＭ−ＣＳＦであってもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド、ペプチド混合物又は医薬組成物は、例えば１μｇ〜１ｇの各ペプチドの量で３日に１回、週１回、月１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回又は６ヶ月に１回投与することができる。
【０１５０】
本発明のＴ細胞、Ｔ細胞混合物及びＴ細胞製剤は、静脈内注射及び／又は点滴によって投与することができ、例えばペプチド混合物のペプチド又はペプチドに特異的な各Ｔ細胞を１０６〜１０１２の量で月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回又は年１回投与することができる。投薬量を２ヶ月〜５ヶ月にわたって月１回投与し、続いてより少ない頻度で投与するのが好ましい。
【０１５１】
本発明の核酸及び核酸の混合物は、筋肉内注射及び／又は皮下注射によって投与することができる。
【０１５２】
被験体への本発明のペプチド又はペプチド混合物の投与は、ペプチド又はペプチド混合物に対する免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を惹起する。ペプチド又はペプチド混合物の各ペプチドは抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってプロセシングされ、ＭＨＣ分子上に提示される。Ｔ細胞はＴ細胞受容体がＡＰＣによってＭＨＣ分子上に提示されるペプチドへ結合することによって活性化され、それにより投与されたペプチド（複数の場合もある）中に存在するものに対応する突然変異を有する腫瘍細胞に対する免疫応答が生じる。
【０１５３】
対応するＲＡＳ突然変異と関連する癌を有する被験体への本発明のＴ細胞又はＴ細胞混合物の投与は、投与されたＴ細胞による腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起する。特に、上述のように、Ｔ細胞が細胞内タンパク質に由来するペプチドを認識するため、投与されたＴ細胞は、ＭＨＣ分子により腫瘍細胞の表面上に提示された場合に腫瘍細胞の突然変異ＲＡＳタンパク質を認識することができる。
【０１５４】
上述のように、異なるタイプの癌がＲＡＳタンパク質の異なる突然変異と関連するという知見は、ワクチン及び治療を特定の癌に標的化し得ることを意味する。したがって、本発明の別の態様では、癌の診断及び適切な治療の選択を含む方法に使用されるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸及び／又はベクターが提供される。該方法は、ａ）患者から採取された試料中に存在するＲＡＳタンパク質の点突然変異を同定する工程と、ｂ）試料中で同定されたＲＡＳタンパク質の点突然変異の少なくとも１つに対応する点突然変異を含む、上に記載されるペプチド、ペプチドを含む上に記載されるペプチド混合物、上に記載されるＴ細胞、ペプチドに特異的なＴ細胞を含む上に記載されるＴ細胞混合物、ペプチドに特異的なＴ細胞を含む上に記載されるＴ細胞製剤、ペプチドをコードする配列を含む上に記載される核酸、及び／又はペプチドをコードする配列を含む核酸をコードする上に記載されるベクターを選択する工程とを含む。例えば、被験体から採取された試料がＡ１４６Ｔの突然変異を有するＲＡＳタンパク質を含有することがわかった場合、Ａ１４６Ｔの突然変異を含むペプチド、ペプチドを含むペプチド混合物、Ｔ細胞、ペプチドに特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物及び／又は製剤、ペプチドをコードする配列を含む核酸、及び／又はペプチドをコードする配列を含む核酸をコードするベクターを選択する。試料が、例えばＡ１４６Ｔの突然変異及びＧ１３Ｃの突然変異を含むＲＡＳタンパク質を含有する状況では、Ａ１４６Ｔの突然変異を含むペプチドとＧ１３Ｃの突然変異を含むペプチドとを含むペプチド混合物、Ａ１４６Ｔを含むペプチドに特異的なＴ細胞とＧ１３Ｃの突然変異を含むペプチドに特異的なＴ細胞とを含むＴ細胞混合物、Ａ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸及びＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸、及び／又はＡ１４６Ｔの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸をコードするベクター及びＧ１３Ｃの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸をコードするベクターを選択する。上記方法は選択されたペプチド混合物、ペプチド、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸及び／又はベクターを含む医薬組成物を患者に投与する工程を含んでもよい。したがって、幾つかの実施形態では、上記方法は、本明細書においてＴＧ０２及びＴＧ０３と呼ばれる表６〜表２３に記載のペプチド混合物の１つを投与する工程を含む。他の実施形態では、上記方法は、表６〜表２３の１つのペプチド混合物ＴＧ０２及びＴＧ０３に特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物、表６〜表２３の１つのペプチド混合物ＴＧ０２及びＴＧ０３をコードする核酸、及び／又は表６〜表２３の１つのペプチド混合物ＴＧ０２及びＴＧ０３をコードする配列（単数又は複数）を含む核酸をコードするベクター（単数又は複数）を投与する工程を含む。特に好ましい実施形態では、ペプチド混合物はＴＧ０２、ＴＧ０３、表１４の混合物及び表１５の混合物の１つである。
【０１５５】
本発明の更なる態様では、本明細書に記載されるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸、核酸混合物、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び／又はｍＲＮＡを含むキットが提供される。ペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸、核酸混合物、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び／又はｍＲＮＡ自体がキット内に存在していてもよく、又はペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸、核酸混合物、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び／又はｍＲＮＡが医薬配合物としてキット内に存在してもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞混合物、Ｔ細胞製剤、核酸、核酸混合物、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び／又はｍＲＮＡを例えばバイアル、ボトル、フラスコ内にパッケージ化し、これを例えば箱、封筒又は袋内に更にパッケージ化してもよい。幾つかの実施形態では、キットはペプチド混合物、Ｔ細胞混合物、核酸混合物及び／又はＴ細胞受容体混合物を含み、ペプチド、Ｔ細胞、核酸及び／又はＴ細胞受容体が別個の容器内で提供され、ペプチド、Ｔ細胞、核酸及び／又はＴ細胞受容体は使用者によって混合される。
【０１５６】
【表１】
2018518177.tif 000003
【０１５７】
【表２】
2018518177.tif 000004
【０１５８】
【表３】
2018518177.tif 000005
【０１５９】
【表４】
2018518177.tif 000006
【０１６０】
【表５】
2018518177.tif 000007
【０１６１】
【表６】
2018518177.tif 000008
【０１６２】
【表７】
2018518177.tif 000009
【０１６３】
【表８】
2018518177.tif 000010
【０１６４】
【表９】
2018518177.tif 000011
【０１６５】
【表１０】
2018518177.tif 000012
【０１６６】
【表１１】
2018518177.tif 000013
【０１６７】
【表１２】
2018518177.tif 000014
【０１６８】
【表１３】
2018518177.tif 000015
【０１６９】
【表１４】
2018518177.tif 000016
【０１７０】
【表１５】
2018518177.tif 000017
【０１７１】
【表１６】
2018518177.tif 000018
【０１７２】
【表１７】
2018518177.tif 000019
【０１７３】
【表１８】
2018518177.tif 000020
【０１７４】
【表１９】
2018518177.tif 000021
【０１７５】
【表２０】
2018518177.tif 000022
【０１７６】
【表２１】
2018518177.tif 000023
【０１７７】
【表２２】
2018518177.tif 000024
【０１７８】
【表２３】
2018518177.tif 000025
【実施例】
【０１７９】
実施例１
本実施例では、バフィーコートを４人の正常ヒトドナーから収集し（バフィー１、バフィー２、バフィー３及びバフィー４）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＢＭＣを単独のＲＡＳペプチド又はＲＡＳペプチドの混合物で刺激し、Ｔ細胞増殖アッセイを行った。結果を図７〜図９に示す。
【０１８０】
方法
機器／試薬
Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ  ４２０（半径２１０）又は同等品
ＫＯＪＡＩＲ  Ｓｉｌｖｅｒｌｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｒｉｅｓラミナーフローフード又は同等品
ＣＯ２インキュベーター、Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ３１１１又は同等品
水浴３７℃
ＫＯＶＡ  Ｇｌａｓｓｔｉｃスライド（カタログ番号８７１４４Ｅ、Hycor Biomedical Inc，Garden Grove，USA）
ＴｏｐＣｏｕｎｔ、マイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard Instrument Company，Meriden，USA）
Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６ハーベスター（Packard Instrument Company，Meriden，USA）
Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃ（カタログ番号６−００５１７４、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−０シンチレーション液（カタログ番号６０１３６１１、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
Ｔｏｐｓｅａｌ−Ａ（カタログ番号６００５１８５、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
３Ｈ−チミジン（カタログ番号ＡＲＴ１７８−Ｄ、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（カタログ番号００２０８０１−０５００、CellGenix GmbH，Freiburg，Germany）又は同等品
ＲＰＭＩ−１６４０（カタログ番号Ｅ１５−８４０、PAA Labs，Linz，Austria）又は同等品
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（カタログ番号Ｄ５８７９−５００ＭＬ、Sigma-Aldrich Norway AS，Oslo，Norway）又は同等品
Ｍｕｃｏｍｙｓｔ（カタログ番号０１９２４９、Meda AS，Asker，Norway）又は同等品
組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（商標））（Chiron Therapeutics，Emeryville，USA）又は同等品
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー１Ｍ（カタログ番号Ｓ１１−００１、Fisher Scientific AS，Oslo，Norway）又は同等品
ＩＬ−７（カタログ番号２０７−ＩＬ−０２５、R & D Systems Europe Ltd，Abingdon，UK）又は同等品
ゲンタマイシン４０ｍｇ／ｍｌ（カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS，Lysaker，Norway）又は同等品
ヒト血清アルブミン２０％（カタログ番号ＳＷ２Ｇ００１３、Baxter AS，Oslo，Norway）又は同等品
２４ウェル組織培養プレート（カタログ番号７３４−１６０５、VWR International AS，Oslo，Norway）又は同等品
９６ウェル丸底マイクロプレート（カタログ番号７３４−１７９７、VWR International AS，Oslo，Norway）又は同等品
ブドウ球菌エンテロトキシンＣ型（ＳＥＣ−３）（カタログ番号ＣＴ３３３、Toxin Technology Inc，Sarasota，USA）。
【０１８１】
培養に使用する完全ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地：
以下のものを最終濃度で５００ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地に添加した：
ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ（６３０μＬの４０ｍｇ／ｍｌストックを５００ｍＬの培地に添加する）
Ｍｕｃｏｍｙｓｔ  １．６ｍｇ／ｍｌ（４ｍＬの２００ｍｇ／ｍｌストックを５００ｍＬの培地に添加する）
ＨＥＰＥＳバッファー０．０１Ｍ（５ｍｌの１Ｍストックを５００ｍＬの培地に添加する）
【０１８２】
手順
ａ．  凍結ＰＢＭＣの融解
手順は項目５まで室温で行わなければならない。開放での細胞の取扱いは全て垂直ラミナーフローフード内で行う。
１．  迅速にバフィーコート（バフィー１、バフィー２、バフィー３及びバフィー４）に由来する凍結ＰＢＭＣの入った各バイアルを、３７℃の水浴内に移す。
２．  バイアルを手作業により一定間隔（およそ２分〜３分）で振盪し、幾らかの氷が残っているうちに水浴から取り出す。
３．  全ての氷が融解した時点で、１ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地の液滴を細胞懸濁液に移す。
４．  細胞懸濁液を、２０ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地を含有する５０ｍｌ容チューブに移す。
５．  細胞を５００Ｇ、室温で５分間遠心分離する。
６．  細胞を５ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地に再懸濁する。
７．  ビルケルチャンバ又はＫＯＶＡ  Ｇａｌｓｓｔｉｃスライドを用いて生存細胞数を計数し、細胞濃度を完全ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（配合表を参照されたい）中で２×１０６細胞／ｍｌに調整する。総細胞数：バフィー１  −  ４５×１０６、バフィー２  −  ２７．５×１０６、バフィー３  −  ４０．５×１０６及びバフィー４  −  ４０．５×１０６細胞。
【０１８３】
ｂ．  ＲＡＳペプチド応答性Ｔ細胞の数を増大するためのバルク培養
１．  １ｍｌの融解ＰＢＭＣ（ＤＣ培地中２×１０６細胞／ｍｌ）を２４ウェルプレートの各ウェルに移す。
【０１８４】
【表２４】
2018518177.tif 000026
【０１８５】
２．  各２０μｌの１３Ｃ及び１３Ｒペプチド又は２０μｌの１３Ｒ及び６０μｌのＴＧ０２−ミックスを、ウェルに各ペプチド１０μＭの最終濃度で添加する。
３．  細胞を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３日間培養する。
４．  ３日目：最終濃度２０ｉＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（すなわち、１０００ｉＵ／ｍｌのストック溶液から５０μｌ）及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（すなわち、５００μｇ／ｍｌのストック溶液から１０μｌ）を細胞培養物に添加し、インキュベーションを３７℃／５％ＣＯ２で継続する。この工程は細胞が良好に成長する場合には任意である。
５．  ４日目〜６日目：細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割する（５００μｌを各ウェルから取り出し、４０ｉＵ／ｍｌ  ＩＬ−２及びＩＬ−７が添加された、５００μｌの新鮮ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地に置き換えた）。
６．  ７日目〜１４日目：細胞を毎日検査し、成長の遅い細胞を含むウェルを混合する。
【０１８６】
ｃ．  ｉ）３日間のＴ細胞増殖アッセイ
１．  工程ｂのバルク培養物中のＴ細胞を摘出、洗浄及び計数する。
【０１８７】
【表２５】
2018518177.tif 000027
【０１８８】
２．  １ウェル当たり５×１０４個のＴ細胞をバルク培養物から丸底９６ウェルプレートに移す。
３．  １バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を融解する。ＰＢＭＣに照射し（３０Ｇｙ）、計数し、５×１０４個の細胞を各ウェルに添加し、ＤＣ培地で総容量を２００μｌ／ウェルに調整する。
４．  以下の試料をプレートレイアウトに従って三連で調製する：
陰性対照：
Ｔ細胞のみ
各時点のＴ細胞＋照射ＰＢＭＣ
陽性対照：
各時点のＴ細胞＋照射ＰＢＭＣ＋１μｇ／ｍｌ  ＳＥＣ−３。
試験試料：
各時点のＴ細胞＋照射ＰＢＭＣ（１０μＭの各ペプチド）：
Ｉ）１３Ｃ＋１３Ｒで刺激したバルク培養物については：１３Ｃ＋１３Ｒミックス又は単独のＧ１３Ｃペプチド
ＩＩ）ＴＧ０２＋１３Ｒで刺激したバルク培養物については：ＴＧ０２＋１３Ｒ、１３Ｃ＋１３Ｒミックス又は単独のＧ１３Ｃペプチド
細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
５．  ２０μＬの３Ｈ−チミジン（３．７×１０４Ｂｑ）を添加する。
６．  ３７℃／５％ＣＯ２で１７時間インキュベートする。
７．  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６ハーベスターを用いて細胞をＵｎｉｆｉｌｔｅｒに摘出し、フィルターを４５℃で完全に乾燥するまで乾燥させる（通常は、これは１．５時間後に達成されるが、この後に４５℃で放置する時間数は重要でないため、プレートを６０時間後に計数してもよい）。
８．  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒの底面を接着カバー（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒとともに供給される）で覆い、２５μｌのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加する。プレートをＴｏｐＳｅａｌで覆い、フィルターをＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｐａｃｋａｒｄマイクロプレートシンチレーションベータカウンターに入れる。アッセイウィザードプログラムを入力する。プロトコル／プログラム３Ｈチミジンを三連で選択する。レポート定義及びＡＳＣＩＩファイルアウトプットを入力する。ディレクトリ下で、データフォルダを選択する（各使用者が別個のフォルダを有するものとする）。保存する実験ファイル名を選ぶ。スタッカをオン又はオフにする（２つ以上のプレートの場合にスタッカを使用する）。アッセイプログラムを開始する。
【０１８９】
ｉｉ）２回目のバルク培養物の刺激
残りの細胞（１×１０６〜２×１０６個のＴ細胞／ウェル）を、自己ＰＢＭＣ（１００万個／ウェル）及びペプチドミックス（工程ｂ．に記載される）でもう一度再刺激した。
【０１９０】
【表２６】
2018518177.tif 000028
【０１９１】
１．  細胞を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３日間培養する（工程ｂ．に記載される）。
２．  １７日目：最終濃度４０ｉＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７を細胞培養物に添加し、インキュベーションを３７℃／５％ＣＯ２で継続する。細胞を定期的に顕微鏡下で検査し、必要な場合には分割する。
３．  １９日目〜２１日目：５００μｌを各ウェルから取り出し、４０ｉＵ／ｍｌ  ＩＬ−２及びＩＬ−７が添加された、５００μｌの新鮮ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地に置き換えた。
４．  ２２日目〜２７日目：細胞を定期的に毎日検査し、成長の遅いＴ細胞を含むウェルを混合した（工程ｂ．と同様）。
【０１９２】
ｄ．  ｉ）３日間のＴ細胞増殖アッセイ
１．  バルク培養物中のＴ細胞を摘出、洗浄及び計数する。
【０１９３】
【表２７】
2018518177.tif 000029
【０１９４】
２．  １ウェル当たり５×１０４個のＴ細胞をバルク培養物から丸底９６ウェルプレートに移す。
３．  １バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を融解する。ＰＢＭＣに照射し（３０Ｇｙ）、計数し、５×１０４個の細胞を各ウェルに添加し、ＤＣ培地で総容量を２００μｌ／ウェルに調整する（工程ｃ．ｉ）に記載される）。
【０１９５】
ｉｉ）２７日目〜４２日目：３回目のバルク培養物の刺激
残りの細胞（１００万個〜２００万個のＴ細胞／ウェル）を、自己ＰＢＭ（１００万個／ウェル）及びペプチドミックス（工程ｂ．に記載される）でもう一度再刺激した。
【０１９６】
【表２８】
2018518177.tif 000030
【０１９７】
ｅ）３日間のＴ細胞増殖アッセイ
１．  バルク培養物中のＴ細胞を摘出、洗浄及び計数する。
【０１９８】
【表２９】
2018518177.tif 000031
【０１９９】
２．  １ウェル当たり５×１０４個のＴ細胞をバルク培養物から丸底９６ウェルプレートに移す。
３．  １バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を融解する。ＰＢＭＣに照射し（３０Ｇｙ）、計数し、５×１０４個の細胞を各ウェルに添加し、ＤＣ培地で総容量を２００μｌ／ウェルに調整する（工程ｃ．ｉ）に記載される）。
【０２００】
結果
バルク培養物の３回の刺激後のペプチド混合物を用いたＴ細胞増殖アッセイの結果を、それぞれ表３０〜表３２及び図７〜図９に示す。表３０〜表３２に、各反復試験物についてのカウント毎分（ＣＰＭ）及び各ドナーについての平均ＣＰＭを示す。
【０２０１】
【表３０】
2018518177.tif 000032
【０２０２】
【表３１】
2018518177.tif 000033
【０２０３】
【表３２】
2018518177.tif 000034
【０２０４】
陽性対照の結果を確認したが、倍率の理由から図７〜図９には含めていない。明らかなように、ペプチド混合物及び単独のペプチドの両方がＴ細胞増殖を誘導し、ペプチド及びペプチド混合物がヒトにおいて免疫応答を誘導可能であることが示された。
【０２０５】
実施例２
本実施例では、免疫応答を分析するために、マウスに繰り返しＴＧ０２を皮下ワクチン接種した。ワクチン接種後に脾細胞を摘出し、脾細胞の増殖性応答を測定した。結果を図１０に示す。
【０２０６】
方法
試験品の特性
名称：ＴＧ０２
製品：ＴＧ０２は等量（重量）の８つの異なるペプチド（１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｒ、１２Ｓ、１２Ｖ、１３Ｃ、１３Ｄ）からなる
バッチ番号：１２Ａ：ロット番号１０３４８０４；１２Ｃ：ロット番号１０３４８０３；
１２Ｄ：ロット番号１０３４８０１；１２Ｒ：ロット番号１０３４８０２；
１２Ｓ：ロット番号１０３４８０５；１２Ｖ：ロット番号１０３４８００；
１３Ｃ：ロット番号１０５０４６８；１３Ｄ：ロット番号１０３４８０６
治療指標：癌
物理的状態：粉末
色：白色
純度：バイアル１本当たり正味８０ｍｇのペプチド（正味１０ｍｇの各ペプチド）
保存条件：−１５℃〜−２０℃及び遮光
使用期限：２０１４年１２月３１日
安全措置：日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分であった。
【０２０７】
ビヒクル１の特性
名称：ＶｉｓｃｏＧｅｌ
バッチ番号：ＶＧ１４０５６
治療指標：癌
物理的状態：ゲル粒子
色：無色
含水量：９９％
保存条件：２℃〜８℃
使用期限：２０１５年６月１日
安全措置：日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分である。
【０２０８】
ビヒクル２の特性
本研究に使用するビヒクル２は注射用水である。供給業者により提供される仕様を以下に挙げる：
名称：注射用水
物理的状態：液体
保存条件：室温
安全措置：日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分であった。
【０２０９】
試験品の調製
５ｍｌの注射用水を１本のバイアルＴＧ０２（８０ｍｇ）に添加し、静かに回し（発泡を回避する）、１ｍＬ当たり１６ｍｇのＴＧ０２の均質なストック溶液を得た。
【０２１０】
群１（表２８を参照されたい）の動物については、１ｍＬのＴＧ０２ストック溶液をシリンジで抜き取り、１ｍＬの注射用水と混合して８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０２１１】
群２及び群３の動物については（表２８を参照されたい）、１ｍｌのＴＧ０２ストック溶液をシリンジで抜き取り、１ｍＬのＶｉｓｃｏＧｅｌ（商標）と混合して８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０２１２】
試験品配合物は、２℃〜８℃で６時間にわたって安定しているとみなした。
【０２１３】
試験システム
種／株：健常ＢＡＬＢ／ｃマウス（完全隔離）ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ
供給元：Charles River，97633 Sulzfeld，Germany
性別：雌
処理期間開始時の年齢：およそ６週齢〜８週齢
動物数：３０（１群当たり１０匹の動物）
【０２１４】
動物は、制御された完全隔離維持繁殖システム（ＳＰＦ）に由来するものであった。ドイツ動物福祉法第９条第２項第７文に従い、動物を実験目的で繁殖させた。
【０２１５】
飼育及び給餌の条件
空調室での完全隔離。
温度：２２±３℃。
相対湿度：５５±１０％。
人工光、１２時間明期、１２時間暗期の連続。
換気：１０回／時間。
ラット及びマウスのためのＡｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４維持食の自由摂取。
およそ２．８のｐＨまで硫黄酸性化した水道水（飲用水、都市用水残留物制御（municipal residue control）、定期的な微生物制御）の自由摂取。
動物は、１ケージ当たり５匹の動物の群でＩＶＣケージ、タイプＩＩ  Ｌ、ポリスルホンケージ内、Ａｌｔｒｏｍｉｎおがくず（saw fibre）敷料において維持する。
飼料、水及び敷料の証明書はBSL BIOSERVICEで提出された。
実験室条件下で適切な順化期間（少なくとも５日間）。
【０２１６】
動物の割当て及び識別
投与前に病理学的兆候を示す動物は研究から除外した。代わりに追加の同腹動物を準備した。個々の識別のために各動物に耳標により印を付けた。
【０２１７】
実験手順
研究を、各々が１０匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを含む３つの群で行った。研究の開始を２つの別々の日に行い、１群当たり５匹の動物を処理した。したがって、群をＩ部及びＩＩ部に分けた。動物を種々の時点で皮下処理した（表３０）。
【０２１８】
投与期間にわたって、動物を毒性の兆候について毎日精密に観察した。最終投与の４８時間後に動物を安楽死させ、肉眼で検査し、脾臓を更なる分析のために準備した。
【０２１９】
投薬量
全ての群に試験品を首筋と肩との間への皮下注射により反復時点（表３３）で投与した。全ての群に対する適用容量は０．１ｍＬ（０．８０ｍｇのＴＧ０２）とした。
【０２２０】
【表３３】
2018518177.tif 000035
【０２２１】
臨床観察
全ての動物を、２４日間の処理期間全体にわたって臨床兆候について観察した。
【０２２２】
全体的な臨床観察を少なくとも１日１回、好ましくは投薬後の予想される効果のピーク期間を考慮して毎日同じ時点で行った。動物の健康状態を記録した。
【０２２３】
各々の動物について、皮膚及び被毛、眼、並びに粘膜の変化を含む全体的な臨床観察を、好ましくは投薬後の予想される効果のピーク期間を考慮して毎日同じ時点で行った。呼吸器系、循環系、自律神経系及び中枢神経系、並びに身体運動（somatomotor）活動及び行動パターンも検査した。アナフィラキシー様反応、麻痺、振戦、痙攣、流涎、下痢、嗜眠、睡眠及び昏睡の兆候の観察に特に配慮した。さらに、注射部位に配慮した。
【０２２４】
病理−全身解剖
最終投与（研究２４日目）の４８時間後に動物を頸椎脱臼により屠殺し、身体の外表面、全ての開口部、並びに頭蓋腔、胸腔及び腹腔、並びにそれらの内容物の慎重な検査を含む詳細な全身解剖に供した。
【０２２５】
脾臓細胞の細胞培養及び刺激
全動物の脾臓を取り出し、細胞培養培地（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５０μＭ  β−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地）に移し、氷上で保管した。全工程を無菌で行い、細胞を氷上に維持した。
【０２２６】
セルストレーナーを用いて脾臓細胞から単一細胞懸濁液を生成した。遠心分離（３５０ｇ、５分間、５±３℃）後に、上清を除去し、細胞ペレットをＡＣＫバッファーに再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。１０ｍＬの細胞培養培地を添加した。試料を５分間ベンチトップ上に置き、細胞残屑を沈殿させた。細胞残屑上の懸濁液を別のチューブに移し、遠心分離した（３５０ｇ、５分間、５±３℃）。上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの細胞培養培地に再懸濁した。細胞を計数した後、０．２Ｍｉｏ細胞を９６ウェルプレートに播種した（１ウェル当たり１８０μＬ；１．１×１０６細胞／ｍＬ）。各脾臓について９つの反復試験物を各プレート上にプレーティングした。
（１）２４時間後のサイトカイン測定について上清を摘出するための１つのプレート（結果は示さない）
（２）４８時間後のサイトカイン測定について上清を摘出するための１つのプレート（結果は示さない）
（３）増殖アッセイのための１つのプレート
【０２２７】
以下の刺激を行った：
３つの反復試験物：刺激せず（２０μＬの細胞培養培地の添加）
３つの反復試験物：１０μＭ  ＴＧ０２による刺激（８つのペプチド、１ペプチド当たり１０μＭ最終濃度、２０μＬの細胞培養培地中での添加）
３つの反復試験物：１μｇ／２００μＬ  ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）による刺激（２０μＬの細胞培養培地中１μｇのＣｏｎＡの添加）
２４時間（１）、４８時間（２）又は５日間（３）にわたる３７℃及び５％ＣＯ２でのインキュベーション。
【０２２８】
残りの細胞を遠心分離し（３５０ｇ、５分間、５±３℃）、１．５ｍＬ容のチューブに移し、再度遠心分離し（３５０ｇ、５分間、５±３℃）、上清を完全に除去し、細胞ペレットを−７０℃以下で凍結した。
（１）２４時間後に、対応するプレートを遠心分離し（３５０ｇ、室温）、１５０μＬの上清を摘出し、−７０℃以下で凍結した。
（２）４８時間後に、対応するプレートを遠心分離し（３５０ｇ、室温）、１５０μＬの上清を摘出し、−７０℃以下で凍結した。
【０２２９】
増殖アッセイ
（３）５日後に、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを試料に添加し、これを続いて３７℃及び５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次いで、プレートを−２０℃以下で凍結した。
【０２３０】
プレートを室温で融解させた。ハーベスターを洗い流した後、ハーベスターを用いて試料をフィルタープレートに移し、続いて水を用いて５回の洗浄工程を行った。フィルタープレートを室温で一晩乾燥させた。ホイルをフィルタープレートの底面に貼り付け、２０μＬのシンチレーション液をウェルに添加した。室温で１時間のインキュベーション後に、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴを用いて試料を測定し、刺激指数（ＳＩ）を算出した。ＳＩ＝刺激した試料のＣＰＭ／対照試料のＣＰＭ。
【０２３１】
結果
表３４及び図１０に脾細胞増殖アッセイの結果を示す。表３４に、各反復試験物のＣＰＭ及び各マウスについての平均ＣＰＭを示す。明らかなように、ＴＧ０２で刺激した脾細胞は刺激していない脾細胞と比較してＣＰＭの増大を示し、ＴＧ０２が免疫応答を誘導することが示された。
【０２３２】
【表３４】
2018518177.tif 000036
【０２３３】
実施例３
本実施例では、ＲＡＳにおけるエクソン２、３及び４突然変異を反映する選択ペプチドに対するＴ細胞応答を試験するために、バフィーコートを３人の正常ドナーから収集した（バフィー５、バフィー６及びバフィー７）。ＫＲＡＳペプチドワクチン接種（ＴＧ０１）による臨床研究におけるＴ細胞応答のモニタリングのための標準操作手順（ＳＯＰ）を、ペプチドカクテルＴＧＸ３及び個々のペプチドの試験に用いた。
【０２３４】
方法
試験ペプチド
【０２３５】
【表３５】
2018518177.tif 000037
【０２３６】
ペプチドカクテルＴＧＸ３は、等モル量のＡ１４６Ｔ＋Ｇ１３Ｃ＋Ｇ１３Ｄ＋Ｑ６１Ｒの混合物であった。
【０２３７】
機器／試薬
Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ  ４２０（半径２１０）又は同等品
ＫＯＪＡＩＲ  Ｓｉｌｖｅｒｌｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｒｉｅｓラミナーフローフード又は同等品
ＣＯ２インキュベーター、Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ３１１１又は同等品
水浴３７℃
ＫＯＶＡ  Ｇｌａｓｓｔｉｃスライド（カタログ番号８７１４４Ｅ、Hycor Biomedical Inc，Garden Grove，USA）
ＴｏｐＣｏｕｎｔ、マイクロプレートシンチレーションカウンター（Packard Instrument Company，Meriden，USA）
Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６ハーベスター（Packard Instrument Company，Meriden，USA）
Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃ（カタログ番号６−００５１７４、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−０シンチレーション液（カタログ番号６０１３６１１、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
Ｔｏｐｓｅａｌ−Ａ（カタログ番号６００５１８５、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
３Ｈ−チミジン（カタログ番号ＡＲＴ１７８−Ｄ、Nerliens Meszansky，Oslo，Norway）又は同等品
ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（カタログ番号００２０８０１−０５００、CellGenix GmbH，Freiburg，Germany）又は同等品
ＲＰＭＩ−１６４０（カタログ番号Ｅ１５−８４０、PAA Labs，Linz，Austria）又は同等品
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（カタログ番号Ｄ５８７９−５００ＭＬ、Sigma-Aldrich Norway AS，Oslo，Norway）又は同等品
Ｍｕｃｏｍｙｓｔ（カタログ番号０１９２４９、Meda AS，Asker，Norway）又は同等品
組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（商標））（Chiron Therapeutics，Emeryville，USA）又は同等品
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー１Ｍ（カタログ番号Ｓ１１−００１、Fisher Scientific AS，Oslo，Norway）又は同等品
ＩＬ−７（カタログ番号２０７−ＩＬ−０２５、R & D Systems Europe Ltd，Abingdon，UK）又は同等品
ゲンタマイシン４０ｍｇ／ｍｌ（カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS，Lysaker，Norway）又は同等品
ヒト血清アルブミン２０％（カタログ番号ＳＷ２Ｇ００１３、Baxter AS，Oslo，Norway）又は同等品
２４ウェル組織培養プレート（カタログ番号７３４−１６０５、VWR International AS，Oslo，Norway）又は同等品
９６ウェル丸底マイクロプレート（カタログ番号７３４−１７９７、VWR International AS，Oslo，Norway）又は同等品
【０２３８】
培養に使用する完全ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地
これは、以下のものを最終濃度で５００ｍｌの培地に添加したＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地である：
ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ（ストックは４０ｍｇ／ｍｌであり、６３０μＬのストックを５００ｍＬの培地に添加する）
Ｍｕｃｏｍｙｓｔ  １．６ｍｇ／ｍｌ（ストックは２００ｍｇ／ｍｌであり、４ｍＬのストックを５００ｍＬの培地に添加する）
ＨＥＰＥＳバッファー０．０１Ｍ（ストックは１Ｍであり、５ｍｌのストックを５００ｍＬの培地に添加する）
【０２３９】
実験手順
ａ）バフィーコートからのＰＢＭＣの単離
手順は室温で行った。開放での細胞の取扱いは全て垂直ラミナーフローフード内で行った。
１．  ３つのバフィーコートをBlodbanken（Ulleval，OUS，Norway）から注文した。
２．  ＰＢＭＣを方法Ｃ００１−００３（血小板−低）に従って単離した。
３．  ＫＯＶＡ  Ｇａｌｓｓｔｉｃスライドを用いて生存細胞数を計数し、細胞濃度を完全ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（配合表を参照されたい）中で４×１０６細胞／ｍｌに調整した。総細胞数：バフィー５  −  ５８５×１０６、バフィー６  −  ３６０×１０６及びバフィー７  −  ４０５×１０６細胞。
【０２４０】
ｂ）１回目の刺激−ＴＧＸ３及びペプチド応答性Ｔ細胞の数を増大させるためのバルク培養
１．  １ｍｌの異なるＰＢＭＣ（ＤＣ培地中４×１０６細胞／ｍｌ）を２４ウェルプレートの各ウェルに移した。
【０２４１】
【表３６】
2018518177.tif 000038
【０２４２】
２．  ＴＧＸ３−ミックス／単独のペプチドを、各ウェルに各ペプチド１０μＭの最終濃度で添加した。
３．  細胞を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３日間培養した。
４．  ３日目：最終濃度２０ｉＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ｒＩＬ−２、ｂ＃７７）及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（ｂ＃２５）を細胞培養物に添加し、インキュベーションを３７℃／５％ＣＯ２で継続した。これは細胞が成長する速度に左右され、Ｔ細胞培養の経験を有する訓練を受けた者によって決定する必要があった（Section for Cell Therapyの訓練チェックリストに従う）。
５．  ４日目〜１２日目：細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割し（５００μｌを各ウェルから取り出し、２０ｉＵ／ｍｌ  ＩＬ−２及び５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７が添加された、５００μｌの新鮮ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地に置き換えた）、成長の遅い細胞を含むウェルを混合した。
【０２４３】
ｃ）バルク培養物の２回目の刺激（１４日目）
１．  １４日目：６．２のバルク培養物中のＴ細胞を摘出、洗浄及び計数した。
【０２４４】
【表３７】
2018518177.tif 000039
【０２４５】
バルク培養細胞（約２×１０６個のＴ細胞／ウェル）を、自己照射（３０Ｇｙ）ＡＰＣ（約２×１０６個のＡＰＣ／ウェル）でもう一度再刺激し、それらのそれぞれのペプチドを添加した（上記工程ｂ）に記載される）。
２．  細胞を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３日間培養した。
３．  ２回目の刺激の３日後（すなわち、手順の１７日目）：最終濃度２０ｉＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ｒＩＬ−２、ｂ＃７７）及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（ｂ＃２５）を細胞培養物に添加し、インキュベーションを３７℃／５％ＣＯ２で継続した（上記工程ｂ）に記載される）。
４．  １８日目〜２６日目：細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割し（５００μｌを各ウェルから取り出し、２０ｉＵ／ｍｌ  ＩＬ−２及び５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７が添加された、５００μｌの新鮮ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地に置き換えた）、成長の遅い細胞を含むウェルを混合した（上記工程ｂ）を参照されたい）。
【０２４６】
ｄ）３回目の刺激（１９日目）及び３日間のＴ細胞増殖アッセイの特異性についての試験−バルク培養
１．  １９日目：６．３のバルク培養物中のＴ細胞を摘出、洗浄及び計数した。
【０２４７】
【表３８】
2018518177.tif 000040
【０２４８】
２．  １ウェル当たり５×１０４個のＴ細胞をバルク培養物から平底９６ウェルプレートのウェルに移した。
３．  １又は２バイアルのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地中の自己ＰＢＭＣ試料を融解した。ＰＢＭＣに照射し（３０Ｇｙ）、計数し、５×１０４個の細胞を各ウェルに添加し、それらのそれぞれのペプチドにより刺激した。
４．  ５×１０４個のＴ細胞をそれらのそれぞれのウェルに添加した（表３９を参照されたい）。
【０２４９】
【表３９】
2018518177.tif 000041
【０２５０】
５．  ３回目の刺激：残りの細胞を、照射自己ＡＰＣ（２００万個／ウェル）でもう一度再刺激し（約２×１０６個のＴ細胞／ウェル）、それらのそれぞれのペプチドを添加した（６．２に記載される）。
６．  ２１日目：２０μＬの３Ｈ−チミジン（３．７×１０４Ｂｑ）を添加した。
７．  ３７℃／５％ＣＯ２で１７時間インキュベートした。
８．  ２２日目：Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６ハーベスターを用いて細胞をＵｎｉｆｌｔｅｒに摘出し、フィルターを４５℃で完全に乾燥するまで乾燥させた（通常は、これは１．５時間後に達成されるが、この後に４５℃で放置する時間数は重要でないため、プレートを６０時間後に計数してもよい）。
９．  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒの底面を接着カバー（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒとともに供給される）で覆い、２５μｌのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加した。プレートをＴｏｐＳｅａｌで覆い、フィルターをＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｐａｃｋａｒｄマイクロプレートシンチレーションベータカウンターに入れた。アッセイウィザードプログラムを入力した。プロトコル／プログラム３Ｈチミジンを三連で選択した。レポート定義及びＡＳＣＩＩファイルアウトプットを入力した。
【０２５１】
結果
ペプチド混合物を用いたＴ細胞増殖アッセイの結果を図１１及び図１２に示す。特に、ＲＡＳタンパク質の１４６位に突然変異を有するペプチドが免疫原性であり、Ｔ細胞の誘導を刺激することが図１１に示される。ペプチド混合物ＴＧＸ３がペプチド混合物だけでなく、ペプチド混合物中の個々のペプチドにも対するＴ細胞応答の誘導に効果的であることが図１２に示される。したがって、各々が１３位、６１位又は１４６位に点突然変異を有するペプチドを含むペプチド混合物がＴ細胞応答を誘導し得ることが図１２に初めて示される。
【図１】
2018518177.tif 000042
【図２】
2018518177.tif 000043
【図３】
2018518177.tif 000044
【図４】
2018518177.tif 000045
【図５】
2018518177.tif 000046
【図６】
2018518177.tif 000047
【図７】
2018518177.tif 000048
【図８】
2018518177.tif 000049
【図９】
2018518177.tif 000050
【図１０】
2018518177.tif 000051
【図１１】
2018518177.tif 000052
【図１２】
2018518177.tif 000053
【配列表】
2018518177000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月5日(2018.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、該ペプチドがＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、
前記領域が突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸を含み、
前記領域が前記突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
前記領域が前記突然変異位置にアミノ酸置換を有し、
前記突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位である、
ペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸置換がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ又はＡ１４６Ｖの置換である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ワクチン又は薬剤として用いられる、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
各々がＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する第１及び第２のペプチドを含む、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
前記第１のペプチドが第１の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
前記第２のペプチドが第２の突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
前記第１及び第２のペプチドの領域が各々独立して、前記第１及び第２の突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
前記第１及び第２のペプチドが各々、前記第１及び第２の突然変異位置にアミノ酸置換を有し、
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１１７位又は１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、
前記第１の突然変異位置のアミノ酸置換が、前記第２の突然変異位置のアミノ酸置換とは異なる、
ペプチド混合物。
【請求項５】
前記第１のペプチドのアミノ酸置換がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ及びＡ１４６Ｖの置換から選択される、請求項４に記載のペプチド混合物。
【請求項６】
前記第２のペプチドのアミノ酸置換がＫ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ及びＱ６１Ｒの置換から選択される、請求項４又は５に記載のペプチド混合物。
【請求項７】
前記ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも１つの更なるペプチドを含み、
前記少なくとも１つの更なるペプチドが、突然変異位置を含む少なくとも８個のアミノ酸の領域を含み、
前記少なくとも１つの更なるペプチドの前記領域が前記突然変異位置以外に、ＲＡＳタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、
前記少なくとも１つの更なるペプチドが前記突然変異位置にアミノ酸置換を有し、
前記少なくとも１つの更なるペプチドの前記突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、６１位、１１７位又は１４６位であり、
前記少なくとも１つの更なるペプチドのアミノ酸置換が、前記第１及び第２のＲＡＳペプチドの各々のアミノ酸置換とは異なる、
請求項４〜６のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項８】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位、１３位又は６１位である、請求項４〜７のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項９】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位であり、前記少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位である、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１０】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位であり、前記少なくとも１つの更なるペプチドの突然変異位置がＲＡＳタンパク質の６１位である、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１１】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１２位であり、第１の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位に突然変異位置を有し、第２の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の６１位に突然変異位置を有する、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１２】
前記第１の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１４６位であり、前記第２の突然変異位置がＲＡＳタンパク質の１３位であり、前記第１の更なるペプチドがＲＡＳタンパク質の１３位に突然変異位置を有し、前記ペプチド混合物が、ＲＡＳタンパク質の６１位に突然変異位置を有する第２の更なるペプチドを更に含む、請求項７に記載のペプチド混合物。
【請求項１３】
Ａ１４６Ｔの置換を有するペプチドと、
Ｇ１３Ｒの置換を有するペプチドと、
Ｇ１３Ｖの置換を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｒの置換を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｋの置換を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｈの置換を有するペプチドと、
Ｑ６１Ｌの置換を有するペプチドと、
を含む、請求項４〜８、１０及び１２のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
【請求項１４】
ＭＨＣ分子上に提示された場合に請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドに特異的なＴ細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＴ細胞を含むＴ細胞製剤。
【請求項１６】
ＭＨＣ細胞上に提示された場合に請求項４〜１３のいずれか一項に記載のペプチド混合物の１つのペプチドの各々に特異的なＴ細胞を含むＴ細胞混合物。
【請求項１７】
ＭＨＣ分子上に提示された場合に、
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、又は
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド
に対して特異的な、Ｔ細胞受容体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、又は
請求項１７に記載のＴ細胞受容体
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項１４に記載の、Ｔ細胞、
請求項１５に記載の、Ｔ細胞製剤、
請求項１６に記載の、Ｔ細胞混合物、
請求項１７に記載の、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項１８に記載の、核酸、
請求項１９に記載の、ベクター、又は
請求項２０に記載の、宿主細胞
と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
癌の予防及び／又は治療のために用いられる、
請求項１若しくは２に記載の、ペプチド、
請求項３に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項１４に記載の、Ｔ細胞、
請求項１５に記載の、Ｔ細胞製剤、
請求項１６に記載の、Ｔ細胞混合物、
請求項１７に記載の、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項１８に記載の、核酸、
請求項１９に記載の、ベクター、
請求項２０に記載の、宿主細胞、又は
請求項２１に記載の、医薬組成物。
【請求項２３】
前記癌が副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、及び／又は悪性黒色腫である、請求項２２に記載の、用途に用いられるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、医薬組成物、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、又は宿主細胞。
【請求項２４】
前記癌が大腸癌である、請求項２３に記載の、用途に用いられるペプチド、ペプチド混合物、Ｔ細胞、Ｔ細胞製剤、Ｔ細胞混合物、医薬組成物、Ｔ細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、又はベクター。
【国際調査報告】
2018518177.tif 000054
2018518177.tif 000055
2018518177.tif 000056