(57)【要約】  本発明は、各遺伝子産物の発現の制御誘導が可能である誘導性共発現系において使用するための発現ベクターを提供する。【選択図】図５
2018518957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも１つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターがＬ−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の連続する塩基少なくとも３０００個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の連続する塩基少なくとも３２５０個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１５の連続する塩基少なくとも３０００個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１５の連続する塩基少なくとも３２５０個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号１５の連続する塩基少なくとも３５００個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号１５の連続する塩基少なくとも４０００個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｇ）配列番号１５の連続する塩基少なくとも５０００個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【請求項２】
２つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも１つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターがＬ−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含むヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【請求項３】
前記発現コンストラクトが、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９の連続する塩基少なくとも４２５個と少なくとも８７％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９の連続する塩基少なくとも４００個と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９の連続する塩基少なくとも３５０個と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４の連続する塩基少なくとも３５０個と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４の連続する塩基少なくとも３００個と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項４】
前記発現コンストラクトが、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９と少なくとも８７％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の発現コンストラクト。
【請求項５】
前記発現コンストラクトが、配列番号１５のヌクレオチド３１４０〜３１５１、及び配列番号１５のヌクレオチド５１７２〜５１８５からなる群から選択される、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項６】
前記発現コンストラクトが、配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９、及び配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４からなる群から選択される、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項７】
前記発現コンストラクトが、配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９、及び配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４を含む、請求項６に記載の発現コンストラクト。
【請求項８】
２つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも１つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターがＬ−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の連続する塩基少なくとも３０００個と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の連続する塩基少なくとも３２５０個と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の連続する塩基少なくとも３２５０個と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の連続する塩基少なくとも３２５０個と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【請求項９】
２つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであって、
少なくとも１つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターがＬ−アラビノース誘導性プロモーターであり、
前記発現コンストラクトが、
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【請求項１０】
前記発現コンストラクトが配列番号１５を含む、請求項８〜９のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項１１】
前記発現コンストラクトが染色体外にある、請求項１〜１０のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項１２】
ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びリン酸塩欠乏誘導性プロモーターからなる群から選択される、少なくとも１つの誘導性プロモーターをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項１３】
少なくとも１つの誘導性プロモーターが、前記ｒｈａＳＲプロモーター、前記ｘｌｙＡプロモーター、前記ｌａｃＺＹＡプロモーター、及び前記ｐｈｏＡプロモーターからなる群から選択される、請求項１２に記載の発現コンストラクト。
【請求項１４】
誘導性プロモーターに結合する転写調節因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項１５】
前記転写調節因子が、ＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ、及びＸｙｌＲからなる群から選択される、請求項１４に記載の発現コンストラクト。
【請求項１６】
誘導性プロモーターから転写される少なくとも１つの遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の発現コンストラクト。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の発現コンストラクトを含むキット。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の発現コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項１９の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、請求項１８〜２０のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記輸送タンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、及びｘｙｌＨからなる群から選択される、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記遺伝子機能の変異が、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項１８〜２３のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする前記遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択される、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項１８〜２５のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、及びｒｍｌＤからなる群から選択される、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、チオレドキシン還元酵素遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項１８〜２７のいずれか記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記チオレドキシン還元酵素遺伝子がｔｒｘＢである、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、少なくとも１つのグルタチオンシンテターゼ遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項１８〜２９のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記グルタチオンシンテターゼ遺伝子が、ｇｓｈＡ及びｇｓｈＢからなる群から選択される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記宿主細胞が、少なくとも１つのＡｈｐＣの突然変異型を発現する、請求項１８〜３１のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３３】
少なくとも１つのＬ−アラビノース誘導性プロモーターとＡｒａＣをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも１つの前記Ｌ−アラビノース誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、ａｒａＡ及びａｒａＢからなる群から選択される、請求項１８〜３２のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３４】
少なくとも１つのプロピオネート誘導性プロモーターとＰｒｐＲをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも１つの前記プロピオネート誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、ｐｒｐＢ及びｐｒｐＤからなる群から選択される、請求項１８〜３２のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞が、（ａ）前記ａｒａＢＡＤ遺伝子の欠失；（ｂ）前記ａｒａＥ遺伝子の変異した遺伝子機能；（ｃ）ｌａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）遺伝子；（ｄ）前記ｐｒｐＢ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｅ）前記ｓｂｍ／ｓｃｐＡ−ｙｇｆＤ／ａｒｇＫ−ｙｇｆＧＨ／ｓｃｐＢＣ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｆ）前記ｇｏｒ及びｔｒｘＢ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｇ）ＡｈｐＣの突然変異型をコードするポリヌクレオチド；（ｈ）前記ＡｓｃＧ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｉ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードするポリヌクレオチド；（ｊ）Ｅｒｖ１ｐをコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｋ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド、のうちの１つ以上を含む、請求項１８〜３４のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜１６のいずれかに記載の発現コンストラクトと、宿主細胞と、を含む、キット。
【請求項３７】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、請求項３６〜３８のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
前記輸送タンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、及びｘｙｌＨからなる群から選択される、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記遺伝子機能の変異が、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項３６〜４１のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】
少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする前記遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択される、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項３６〜４３のいずれかに記載のキット。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、及びｒｍｌＤからなる群から選択される、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記宿主細胞が、チオレドキシン還元酵素遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項３６〜４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
前記チオレドキシン還元酵素遺伝子がｔｒｘＢである、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記宿主細胞が、グルタチオンシンテターゼ遺伝子の遺伝子機能の低減したレベルを有する、請求項３６〜４７のいずれかに記載のキット。
【請求項４９】
前記グルタチオンシンテターゼ遺伝子が、ｇｓｈＡ及びｇｓｈＢからなる群から選択される、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、ＡｈｐＣの突然変異型を発現する、請求項３６〜４９のいずれかに記載のキット。
【請求項５１】
少なくとも１つのＬ−アラビノース誘導性プロモーターとＡｒａＣをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも１つの前記Ｌ−アラビノース誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、ａｒａＡ及びａｒａＢからなる群から選択される、請求項３６〜５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５２】
少なくとも１つのプロピオネート誘導性プロモーターとＰｒｐＲをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトを含み、前記宿主細胞が、少なくとも１つの前記プロピオネート誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、前記遺伝子が、ｐｒｐＢ及びｐｒｐＤからなる群から選択される、請求項３６〜５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５３】
前記宿主細胞が、（ａ）前記ａｒａＢＡＤ遺伝子の欠失；（ｂ）前記ａｒａＥ遺伝子の変異した遺伝子機能；（ｃ）ｌａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）遺伝子；（ｄ）前記ｐｒｐＢ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｅ）前記ｓｂｍ／ｓｃｐＡ−ｙｇｆＤ／ａｒｇＫ−ｙｇｆＧＨ／ｓｃｐＢＣ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｆ）前記ｇｏｒ及びｔｒｘＢ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｇ）ＡｈｐＣの突然変異型をコードするポリヌクレオチド；（ｈ）前記ＡｓｃＧ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｉ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードするポリヌクレオチド；（ｊ）Ｅｒｖ１ｐをコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｋ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド、のうちの１つ以上を含む、請求項３６〜５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５５】
遺伝子産物を産生する方法であって、請求項１８〜３５のいずれかに記載の宿主細胞の培養を増殖させることであって、前記宿主細胞が、各誘導性プロモーターから転写される少なくとも１つの遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現コンストラクトを含む、増殖させることと、前記培養に前記誘導性プロモーターの各々のための誘導物質を添加することと、を含む、方法。
【請求項５６】
前記方法が、少なくとも１つの遺伝子産物を前記培養から精製することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子産物が多量体産物の一部である、請求項５５〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの遺伝子産物が、（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、及び（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれかのフラグメントからなる群から選択される、請求項５５〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記多量体産物が抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記遺伝子産物がプレプロインスリンである、請求項５５〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記プレプロインスリンが、Ｌ−アラビノース誘導性プロモーターから発現される、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１２年８月５日出願の米国仮出願第６１／６７９，７５１号、及び２０１２年１２月２９日出願の米国仮出願第６１／７４７，２４６号の合衆国法典第３５編１１９条（ｅ）項に基づく優先権の利益を主張する、２０１３年８月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５３５６２号の合衆国法典第３５編３７１条に基づく国内段階移行である、米国出願第１４／４１９，６５３号の一部継続出願である、米国出願第１４／７４０，４７５号の一部継続出願であり、これら全ての開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
米国出願第１４／７４０，４７５号はまた、２０１２年８月５日出願の米国仮出願第６１／６７９，７５１号、及び２０１２年１２月２９日出願の米国仮出願第６１／７４７，２４６号の合衆国法典第３５編１１９条（ｅ）項に基づく優先権の利益を主張する、２０１３年８月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５３５６２号の利益を主張する、２０１４年２月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１４９６８号の一部継続出願であり、これら全ての開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列リストへの参照
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００４】
本発明は、分子生物学及び生物工学的生産の一般的な技術分野におけるものである。より具体的には、本発明は、組換えタンパク質発現の技術分野におけるものである。
【背景技術】
【０００５】
生物工学的な物質の産生は、所望の産物が、２つ以上の異なるポリペプチドから形成される多量体タンパク質のような、異なる遺伝子によりコードされる分子の組み合わせである場合にいっそう複雑なプロセスである。複合的な遺伝子産物の成功的な共発現は、１つ超の遺伝子産物の同時の発現により混ざり合ういくつかの課題を克服することを必要とする。克服しなければならない問題は、１つ超のタイプのベクターが使用される場合に適合性のある発現ベクターを作製することと、産物の正しい化学量論比を得ることと、正しく折り畳まれて、結合パートナーに対して適切な立体構造にある遺伝子産物を産生することと、所望の産物を、細胞ならびに不適当に折り畳まれた及び／または不適当な立体構造にあるタンパク質のような望ましくないタンパク質から精製することと、所望の産物（複数可）の収率の最大化の一態様として、封入体の形成を最小化することと、を含む。多くの異なるアプローチが、これらの課題を扱うためにとられてきたが、まだ、よりよい共発現方法についての必要性がある。
【０００６】
ｌａｃ及びａｒａプロモーターを含むプラスミドを含む、いくつかの誘導性の細菌性タンパク質発現系が、個々のタンパク質を発現させるために考案されてきた。これらの系は、それらが野生型大腸菌における増殖培養個体群の全体の中で均質にタンパク質を誘導し損なうため、発現が難しいタンパク質の共発現における有用性を限定していた（Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ  ａｎｄ  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌａｃＹ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｐｔａｃ  ａｎｄ  Ｐｔｒｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２００２  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１８（３）：６７２−６７４）。誘導物質についての輸送タンパク質の発現が誘導物質の存在に依存する場合、野生型大腸菌ｌａｃ及びａｒａ系の場合であるとして、誘導物質の細胞濃度は、輸送タンパク質の産生を開始するために閾値レベルに達しなければならないが、いったん閾値に達すると、制御されていないポジティブフィードバックループが生じ得、細胞における高いレベルの誘導物質、同様に誘導性プロモーター由来の高いレベルの発現、つまり「全か無か」の現象である結果を有する。増殖培地における誘導物質の濃度を増加させることは、高い発現モードである個体群における細胞の割合を増加させる。このタイプの系は、個体群の規模でタンパク質発現の濃度依存性誘導をもたらすが、毒性があり、可溶性に乏しく、または他の理由で特定の濃度を必要とするものを含む、発現の厳密な制御を必要とするタンパク質の発現及び産生には最適ではない。
【０００７】
誘導物質の誘導物質依存性輸送を排除することにより、単一のプロモーター発現系における「全か無か」の誘導現象を扱うためにいくつかの努力がなされてきた。一例は、ラクトースパーミアーゼ遺伝子（ｌａｃＹａｍ）における無発現変異を有しており、トランスポーターの不存在下である程度まで細胞膜を通り抜けることができるＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）のようなｌａｃプロモーターの代替誘導物質を用いている（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌａｃ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３  Ｊａｎ  １５；２１１（１−２）：１８１−１９１）。他のアプローチは、アラビノーストランスポーター遺伝子において欠損された系統における、アラビノース誘導性プロモーターの使用であるが、アラビノースを細胞内に輸送することを可能にする、ラクトースパーミアーゼ遺伝子、ｌａｃＹ（Ａ１１７Ｃ）における突然変異を有する（Ｍｏｒｇａｎ−Ｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｒａＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｌａｃｔｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｏｆ  ｒｅｌａｘｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２  Ｍａｙ  ２８；９９（１１）：７３７３−７３７７）。
【０００８】
個々のタンパク質発現の構成要素は不適合である場合が多いことにより、それらが異なる誘導物質プロモーター系間の「相互干渉」の影響による有害な影響を受ける得か、または相互に排他的なゲノムの変更を必要とし得るか、または一般的な代謝調節に供され得るため、共発現系におけるそれらの使用が不可能となる。ｌａｃ及びａｒａ誘導性プロモーター系間の「相互干渉」問題を扱うための試みは、ＡｒａＣ転写活性化因子がｌａｃプロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧの存在下でａｒａＢＡＤプロモーターを誘導する性能を向上させるために、それを定向進化させることを含んだ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡｒａＣ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ−  ａｎｄ  ｌａｃｔｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ”，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００７  Ｓｅｐ；７３（１８）：５７１１−５７１５；Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｊｕｌ  ２０）。しかしながら、ａｒａ及びｌａｃ誘導性プロモーターに基づく発現ベクター間の適合性は、相互に排他的なゲノムの変更、つまりアラビノースによるａｒａＢＡＤプロモーターの均質な誘導のためのｌａｃＹ点突然変異（ｌａｃＹ（Ａ１１７Ｃ））、及びＩＰＴＧによるｌａｃプロモーターの均質な誘導のためのヌルｌａｃＹ遺伝子の必要性により、未だに制限されている。一般的な代謝調節、例えば、炭素カタボライト抑制も、誘導性プロモーターの適合性に影響を及ぼし得る。ＣＣＲは、他の糖に先立つグルコースの優先的使用に見られるように、より好ましい化合物が存在する場合に、炭素含有化合物の利用に必要とされる遺伝子の抑圧を特徴とする。ａｒａ及びｐｒｐ誘導性プロモーター系の場合、アラビノースの存在は、ＣＣＲを伴うと考えられている効果である、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現を誘導するためのプロピオネートの性能を低下させる（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，Ｇｅｎｅ  ２０１２  Ａｕｇ  １；５０４（１）：１１６−１２１，Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｍａｙ  ３）。これらの問題を克服する誘導性共発現系の必要性が明らかである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、各遺伝子産物の構成要素の制御誘導が可能である誘導性共発現系において使用するための発現コンストラクトを提供する。本発明の一実施形態は、２つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトであり、該誘導性プロモーターのうちの少なくとも１つは、別の該誘導性プロモーターの誘導物質とは異なる誘導物質に反応性であり、誘導性プロモーターのいずれも、テトラサイクリン誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、及びメチオニン誘導性プロモーターからなる群から選択される誘導性プロモーターではない。いくつかの実施形態では、上記の発現コンストラクトはラクトース誘導性プロモーターを含まず、ある特定の実施形態では、上記の発現コンストラクトはリン酸塩欠乏によって誘導されるプロモーターを含まない。追加の実施形態では、発現コンストラクトは染色体外にある。本発明のさらなる実施形態は、２つ以上の誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトを提供し、該誘導性プロモーターのうちの少なくとも１つは、別の該誘導性プロモーターの誘導物質とは異なる誘導物質に反応性であり、（Ａ）各誘導性プロモーターは、Ｌ−アラビノース誘導性プロモーター、プロピオネート誘導性プロモーター、ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びリン酸塩欠乏によって誘導されるプロモーターからなる群から選択されるか、または（Ｂ）少なくとも１つの誘導性プロモーターは、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター、ｒｈａＳＲプロモーター、ｘｌｙＡプロモーター、ｌａｃＺＹＡプロモーター、及びｐｈｏＡプロモーターからなる群から選択されるか、または（Ｃ）発現コンストラクトは、いくつかの実施形態ではｐｒｐＢＣＤＥプロモーターである、少なくとも１つのプロピオネート誘導性プロモーターと、Ｌ−アラビノース誘導性プロモーター、ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びリン酸塩欠乏によって誘導されるプロモーターからなる群から選択される少なくとも１つの誘導性プロモーターとを含むか、または（Ｄ）発現コンストラクトは、いくつかの実施形態ではａｒａＢＡＤプロモーターである少なくとも１つのＬ−アラビノース誘導性プロモーターと、プロピオネート誘導性プロモーター、ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びリン酸塩欠乏によって誘導されるプロモーターからなる群から選択される少なくとも１つの誘導性プロモーターとを含むか、または（Ｅ）少なくとも１つの誘導性プロモーターはプロピオネート誘導性プロモーターであり、少なくとも１つの他の誘導性プロモーターはＬ−アラビノース誘導性プロモーターであるか、または（Ｆ）発現コンストラクトは、配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５１８５の少なくとも５０（もしくは少なくとも７５、もしくは少なくとも１００）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または（Ｇ）発現コンストラクトは、配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３１５１の少なくとも５０（もしくは少なくとも７５、もしくは少なくとも１００）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしく少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または（Ｈ）発現コンストラクトは、配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３１５１の少なくとも５０（もしくは少なくとも７５、もしくは少なくとも１００）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性、及び配列番号１５ヌクレオチド４９３７〜５１８５の少なくとも５０（もしくは少なくとも７５、もしくは少なくとも１００）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または（Ｉ）発現コンストラクトは、配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４の少なくとも３０００（もしくは少なくとも３２５０）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または（Ｊ）発現コンストラクトは、配列番号１５の少なくとも３０００（もしくは少なくとも３２５０、もしくは少なくとも３５００、もしくは少なくとも４０００、もしくは少なくとも５０００）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または（Ｋ）発現コンストラクトは、配列番号１５のヌクレオチド１８３３〜５３０４を含むか、または（Ｌ）発現コンストラクトは、配列番号１５を含むか、または（Ｍ）発現コンストラクトは、誘導性プロモーターと結合する転写調節因子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、いくつかの実施形態では、この転写調節因子は、ＡｒａＣ、ｐｒｐＲ、ｒｈａＲ、及びＸｙｌＲからなる群から選択されるか、または（Ｎ）発現コンストラクトは、誘導性プロモーターから転写される少なくとも１つの遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１０】
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５１８５の少なくとも２２５（もしくは少なくとも２４０）個の連続する塩基と少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４の少なくとも３００（もしくは少なくとも３５０）個の連続する塩基と少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９の少なくとも３５０（もしくは少なくとも３７５、もしくは少なくとも４００、もしくは少なくとも４２５）個の連続する塩基と少なくとも８７％（もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号２のヌクレオチド１０〜１８２２の少なくとも４００（もしくは少なくとも４５０、もしくは少なくとも５００）個の連続する塩基と少なくとも９０％（もしくは少なくとも９５％）配列同一性を有するヌクレオチド配列、（ｅ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９、（ｆ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５１８５、（ｇ）配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４、（ｈ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９及び配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５１８５、（ｉ）配列番号１５のヌクレオチド２８１８〜３２５９及び配列番号１５のヌクレオチド４９３７〜５３０４、（ｊ）配列番号２のヌクレオチド１０〜１８２２、ならびに（ｋ）配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１５からなる群から選択される、ヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクトも、本発明によって提供される。本発明の所定の実施形態では、上記の発現コンストラクトは、いくつかの実施形態ではａｒａＢＡＤプロモーターであるＬ−アラビノース誘導性プロモーター、いくつかの実施形態ではｐｒｐＢＣＤＥプロモーターであるプロピオネート誘導性プロモーター、いくつかの実施形態ではｒｈａＳＲプロモーターであるラムノース誘導性プロモーター、いくつかの実施形態ではｘｌｙＡプロモーターであるキシロース誘導性プロモーター、いくつかの実施形態ではｌａｃＺＹＡプロモーターであるラクトース誘導性プロモーター、及びいくつかの実施形態ではｐｈｏＡプロモーターであるリン酸塩によって誘導されるプロモーター、からなる群から選択される誘導性プロモーターを含み、いくつかの実施形態では、上記の発現コンストラクトは、誘導性プロモーターから転写される少なくとも１つの遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１１】
本発明の追加の実施形態では、発現コンストラクトは、ポリヌクレオチド配列を、ｐＢＡＤ２４０、ｐＰＲＯ４３、ｐＰＲＯ４４、ｐＰＲＯ４５、ｐＰＲＯ４３０、ｐＰＲＯ４３０ＣｌｏＤＦ、及びｐＳＯＬからなる群から選択されるプラスミドに挿入するステップを含む方法によって産出される。
【００１２】
本発明は、少なくとも１つの誘導性プロモーターを含む、上の段落に記載した少なくとも１つの本発明の発現コンストラクトを含む宿主細胞をさらに提供する。本発明のいくつかの実施形態では、この宿主細胞は原核細胞であり、いくつかの例では、それは大腸菌細胞であり、この大腸菌細胞は、ある特定の実施形態では、大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞である。本発明の他の実施形態では、宿主細胞は真核細胞であり、いくつかの例では、それは酵母細胞であり、さらにいくつかの例では、それはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。（ａ）ａｒａＢＡＤ遺伝子の欠失；（ｂ）ａｒａＥ及び／またはａｒａＦＧＨ遺伝子の変異した遺伝子機能；（ｃ）ｌａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）遺伝子；（ｄ）ｐｒｐＢ及び／またはｐｒｐＤ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｅ）ｓｂｍ／ｓｃｐＡ−ｙｇｆＤ／ａｒｇＫ−ｙｇｆＧＨ／ｓｃｐＢＣ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｆ）ｇｏｒ及びｔｒｘＢ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｇ）ＡｓｃＧ遺伝子の低減した遺伝子機能；（ｈ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードするポリヌクレオチド；（ｉ）Ｅｒｖ１ｐをコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｊ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）等のシャペロンをコードするポリヌクレオチド、のうちの１つ以上をさらに含む宿主細胞も本発明よって提供される。ある特定の追加の実施形態では、（Ａ）宿主細胞は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有し、別の例として、輸送タンパク質をコードする遺伝子は、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、及びｘｙｌＨからなる群から選択されるか、もしくは特にａｒａＥであり、または遺伝子機能の変異は、より具体的には、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現であり、（Ｂ）宿主細胞は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能レベルを有し、さらなる例として、少なくとも１つの該誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする遺伝子は、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択され、（Ｃ）宿主細胞は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能レベルを有し、この遺伝子は、さらなる実施形態では、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、及びｒｍｌＤからなる群から選択され、（Ｄ）宿主細胞は、チオレドキシン還元酵素遺伝子、特にｔｒｘＢの低減した遺伝子機能レベルを有し、（Ｅ）宿主細胞は、グルタチオン還元酵素遺伝子及び／またはグルタチオンシンテターゼ遺伝子の低減した遺伝子機能レベルを有し、この遺伝子は、ある特定の実施形態では、グルタチオン還元酵素遺伝子ｇｏｒならびに／またはグルタチオンシンテターゼ遺伝子ｇｓｈＡ及びｇｓｈＢのう���の１つ以上であり、（Ｆ）宿主細胞は、少なくとも１つのＡｈｐＣの突然変異型を発現し、（Ｇ）宿主細胞は、少なくとも１つのＬ−アラビノース誘導性プロモーターと、ＡｒａＣをコードするポリヌクレオチド配列とを含む、発現コンストラクトを含み、宿主細胞は、少なくとも１つの該Ｌ−アラビノース誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、この遺伝子は、ａｒａＡ及びａｒａＢからなる群から選択され、かつ／または（Ｈ）宿主細胞は、少なくとも１つのプロピオネート誘導性プロモーターと、ＰｒｐＲをコードするポリヌクレオチド配列とを含む、発現コンストラクトを含み、宿主細胞は、少なくとも１つの該プロピオネート誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有し、この遺伝子は、ｐｒｐＢ及びｐｒｐＤからなる群から選択される。
【００１３】
本発明の他の態様では、２つ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞を提供し、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、各タイプの発現コンストラクトは、各他のタイプの発現コンストラクトの誘導性プロモーターではない該誘導性プロモーターを含み、または各タイプの前記発現コンストラクトは、各他のタイプの前記発現コンストラクトの複製起点と異なる複製起点を含む。
【００１４】
本発明の追加の実施形態では、宿主細胞により含まれる少なくとも１つの発現コンストラクトは、誘導性プロモーターに結合する転写制御因子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、いくつかの実施形態では、転写制御因子及び該転写制御因子が結合する誘導性プロモーターをコードするポリヌクレオチド配列は、同じ発現コンストラクトにおけるものであり、及びさらなる例では、転写制御因子は、ＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ、及びＸｙｌＲからなる群から選択され、またはとりわけＡｒａＣであるが、もしくはＰｒｐＲである。
【００１５】
少なくとも１つの誘導性プロモーターを含む上の段落に記載した少なくとも１つの発現コンストラクトを含む宿主細胞も本発明によって提供され、この少なくとも１つの発現コンストラクトは、誘導性プロモーターから転写される少なくとも１つの遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む。本発明の他の例は、少なくとも１つの誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターから転写される遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現コンストラクトを含む、宿主細胞を含み、ある特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子産物は、ポリペプチドであるか、あるいはシグナル配列を各ポリペプチドであるか、あるいは少なくとも１つから２０未満のジスルフィド結合、または少なくとも２つから１７未満のジスルフィド結合、または少なくとも１８から１００未満のジスルフィド結合、または少なくとも３から１０未満のジスルフィド結合、または少なくとも３から８未満のジスルフィド結合を形成するポリペプチドであるか、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、及び９からなる群から選択されるジスルフィド結合数を形成するポリペプチドであるか、あるいは免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはその断片であるか、あるいはインフリキシマブ重鎖もしくは軽鎖またはその断片である。
【００１６】
また、遺伝子産物を産出する方法が提供され、本方法は、例えば、上記のように本発明の宿主細胞の培養物を増殖させること、またいくつかの実施形態では、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を培養物に添加すること、またさらなる実施形態では、遺伝子産物を培養物から精製することによる。本発明の特定の態様では、上記の方法によって産出された遺伝子産物は、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成するか、あるいは少なくとも２つから１７未満のジスルフィド結合を形成するか、あるいは少なくとも２から１０未満のジスルフィド結合を形成するか、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、及び９からなる群から選択されるジスルフィド結合数を形成するか、あるいは免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはその断片である、ポリペプチドである。また、本発明は、上記の方法によって産出される遺伝子産物を提供し、この遺伝子産物は、シグナルペプチドを欠き、かつある特定の実施形態では、少なくとも１つのジスルフィド結合、あるいは少なくとも２つから１７未満のジスルフィド結合、あるいは少なくとも１８から１００未満のジスルフィド結合、あるいは少なくとも３から１０未満のジスルフィド結合、あるいは少なくとも３から８未満のジスルフィド結合を形成するか、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、及び９からなる群から選択されるジスルフィド結合数を形成するか、あるいは免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはその断片である、ポリペプチドである、ポリペプチドである。この方法によって産出される遺伝子産物、本明細書によって提供され、これは、いくつかの実施形態では多量体産物の一部であり、ある特定の実施形態では、抗体であるか、またはより具体的な例では、アグリコシル化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。
【００１７】
上の段落に記載した発現コンストラクトを含むキット；宿主細胞を含むキットであって、宿主細胞が上の段落に記載した少なくとも１つの本発明の発現コンストラクトを含むキット；及びいくつかの実施形態では少なくとも１つの誘導物質を培養物に添加することを含む本発明の宿主細胞の増殖によって産出される遺伝子産物または多量体産物を含むキットであって、いくつかの実施形態では、多量体産物が抗体であるか、またはより具体的な例では、アグリコシル化抗体、キメラ抗体、もしくはヒト抗体である、キットも、本発明の系及び方法によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】誘導性共発現系の概略図であり、誘導物質（５）の適用で異なる遺伝子産物を発現し、多量体産物（６）を形成する、２つの異なる誘導性発現ベクター（３）及び（４）を含む宿主細胞（１）を含む。
【図２】誘導性共発現系の特定の使用の概略図であり、大腸菌宿主細胞ゲノム（２）が、シグナルペプチドを欠くジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣの細胞質の形態をコードし、発現ベクターｐＢＡＤ２４（またはＬ−アラビノース誘導性プロモーターを含む別の発現ベクター、例えば、ｐＢＡＤ２４０）（３）が免疫グロブリン重鎖のＬ‐アラビノース誘導性発現を提供し、発現ベクターｐＰＲＯ３３（またはプロピオネート誘導性プロモーターを含む別の発現ベクター、例えば、ｐＰＲＯ４３、ｐＰＲＯ４３０、ｐＰＲＯ４３０（ＣｌｏＤＦ１３）、ｐＰＲＯ４４、もしくはｐＰＲＯ４５）（４）が免疫グロブリン軽鎖のプロピオネート誘導性発現を提供し、多量体抗体産物（６）を誘導（５）で形成する。
【図３】誘導性共発現系の概略図であり、誘導物質（５）の適用時に異なる遺伝子産物を発現し、多量体産物（６）を形成する、２つの異なる誘導性発現ベクター（３）及び（４）を含む宿主細胞（１）を含む。
【図４】誘導性共発現系の特定の使用の概略図であり、大腸菌宿主細胞ゲノム（２）が、シグナルペプチドを欠くジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣの細胞質型等の遺伝子改変を含み、ｐＳＯＬ等の多重プロモーター発現ベクターが（３）免疫グロブリン重鎖のＬ‐アラビノース誘導性発現（４）及び免疫グロブリン軽鎖のプロピオネート誘導性発現を提供し、多量体抗体産物（６）を誘導（５）で形成する。
【図５】誘導性共発現系において使用するためのベクター（「ｐＳＯＬ」とも称される「二重ベクター」）の略図である。
【図６】細菌細胞における蛍光タンパク質の共発現の経過を示し、このグラフでは、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現された赤色蛍光タンパク質（ＲｅｄＦＰ）からの蛍光を示す。「ｐＳＯＬ」：大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞におけるｐＳＯＬ−ＹｅｌｌｏｗＦＰ−ＲｅｄＦＰ「ｐＰＲＯ、ｐＢＡＤ」：大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞におけるｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ／ｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰ。平均化したサンプル群の各々に関する誘導物質濃度を凡例に示し、ここでは、最初にプロピオネート濃度（０ｍＭ、５ｍＭ、または２０ｍＭ）、続いてＬ−アラビノース濃度（０マイクロモル、６．６６マイクロモル、または６６．６１マイクロモル）を挙げる。
【図７】細菌細胞における蛍光タンパク質の共発現の経過を示し、このグラフでは、Ｌ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターから発現された黄色蛍光タンパク質（ＹｅｌｌｏｗＦＰ）からの蛍光を示す。「ｐＳＯＬ」：大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞におけるｐＳＯＬ−ＹｅｌｌｏｗＦＰ−ＲｅｄＦＰ「ｐＢＡＤ、ｐＰＲＯ」：大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞におけるｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ／ｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰ。平均化したサンプル群の各々に関する誘導物質濃度を凡例に示し、ここでは、最初にＬ−アラビノース濃度（０マイクロモル、６．６６マイクロモル、または６６．６１マイクロモル）、続いてプロピオネート濃度（０ｍＭ、５ｍＭ、または２０ｍＭ）を挙げる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
相互に不適合な共発現系構成要素の問題には、相互適合性のある均質的に誘導性をもったプロモーター系を別々の発現コンストラクト上に配置して、いくつかの実施形態では種々の誘導物質によって活性化して、利用する、整合性の取れた細菌共発現系の開発によって取り組む。本発明の利点としては、以下に限定するものではないが、１）誘導性共発現系内の構成要素の相互適合性向上、２）多量体を一緒に形成する遺伝子産物または遺伝子産物のその他の組み合わせの、誘導性発現（２つ以上の遺伝子産物の共発現）、３）独立的滴定可能な誘導による、遺伝子産物共発現の制御向上、４）多量体産物及び、ジスルフィド結合を形成する産物等、発現させることが困難な遺伝子産物複合体及び他の産物の発現向上、５）遺伝子産物共発現の最新式最適化、が挙げられる。
【００２０】
共発現遺伝子産物。本発明の誘導性共発現系は、所望の産物に役立つ２つ以上の異なる遺伝子産物を共発現するように設計する。所望の産物は共発現遺伝子産物から形成する多量体であってもよく、または、共発現を用いて、所望の産物と、所望の産物の発現を助ける追加的な１つの産物または複数の産物とを組み合わせたものを産生してもよい。
【００２１】
「多量体産物」は、ともに会合して多量体産物の機能を果たす一式の遺伝子産物を指し、遺伝子産物と他の分子の間の一過性会合物、例えば修飾酵素（キナーゼ、ペプチダーゼ及び同種のもの）、シャペロン、トランスポーター等は指さない。本発明の所定の実施形態では、多量体産物はヘテロ多量体である。多くの実施形態では、共発現遺伝子産物は、多量体タンパク質のサブユニットであるポリペプチドであってもよい。しかしながら、本発明の誘導性共発現系を使用して、複数の異なる非コードＲＮＡ分子、またはポリペプチド及び非コードＲＮＡ遺伝子産物の組み合わせを共発現させることもまた可能である。非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）とも称される非コードＲＮＡ分子、非メッセンジャーＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ）及び機能ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）には多くの異なる種類のＲＮＡ分子が含まれ、例えば、メッセンジャーＲＮＡでない、したがって翻訳を通してポリペプチドを形成するための鋳型でないマイクロＲＮＡが含まれる。
【００２２】
多くの生物学的に重要な産物は異なるポリペプチド鎖の組み合わせから形成される。抗体及び抗体断片に加えて、本発明の誘導性共発現方法によって産生することができる他の多量体産物としては、Ｇ結合タンパク質受容体及びイオンチャネル内蔵型受容体、例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡＡ受容体、グリシン受容体、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体と、Ｐ２Ｘ受容体等のＡＴＰゲーティッド（ＡＴＰ−ｇａｔｅｄ）受容体とが挙げられる。ボツリヌス神経毒素（しばしばＢｏＴＮ、ＢＴＸ、または市販されている形式の１つであるＢＯＴＯＸ（登録商標）（オナボツリヌス毒素Ａ）と称される）は、ジスルフィド結合によって連結される重鎖及び軽鎖から形成される（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｉｎ  ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ”，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００４  Ｍａｒ；３０８（３）：８５７−８６４，Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｎｏｖ  １４）。異なるポリペプチド鎖から形成される産物の別の例はインスリンで、これは真核生物においてまず単一ポリペプチド鎖として翻訳され、折り畳まれ、次いで切断されて、最終的にはジスルフィド結合によって結合された２つのポリペプチド鎖になる。単一宿主細胞においてボツリヌス神経毒素または成熟インスリンを効率的に産生することは、本発明の誘導性共発現方法の使用例である。
【００２３】
本発明の方法は、遺伝子産物を産生するように設計しており、この遺伝子産物は、機能的産物の中に正確に折り畳まれかつ／または会合し、そのような機能的産物の中で所望の位置において所望の数のジスルフィド結合を有するものである（これは、実施例１１等の方法によって測定することができる）。ポリペプチド等の遺伝子産物のジスルフィド結合の数は、その遺伝子産物が所望の機能的産物の中に存在するときにその産物によって形成される分子内及び分子間結合の総数である。例えば、ヒトＩｇＧ抗体の軽鎖は典型的に３つのジスルフィド結合（２つの分子内結合及び１つの分子間結合）を有し、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖は典型的に７つのジスルフィド結合（４つの分子内結合及び３つの分子間結合）を有する。いくつかの実施形態では、所望の遺伝子産物は、所望の遺伝子産物の産生に有益なシャペロン等の他の遺伝子産物で共発現される。シャペロンは、他の遺伝子産物の非共有結合フォールディングもしくはアンフォールディング及び／または会合もしくは分解を助けはするが、結果として生じる単量体または多量体遺伝子産物構造が（折り畳み及び／または会合のプロセスを完了した後）その通常の生体機能を遂行しているときにはその構造中には現れないタンパク質である。シャペロンは、発現コンストラクト内で誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターから発現することができ、あるいは宿主細胞染色体から発現することができ、好ましくは、宿主細胞におけるシャペロンタンパク質（複数可）の発現は、所望の産物の中へ適切に折り畳み及び／または会合する共発現遺伝子産物を産生するのに十分高いレベルにある。大腸菌宿主細胞に存在するシャペロンの例としては、フォールディング因子のＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（トリガー因子）、及びＦｋｐＡが挙げられ、これらを用いて細胞質または周辺質タンパク質のタンパク質凝集を防いできた。ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、及びＣｌｐＢは、タンパク質フォールディングを助ける上で相乗的に機能することができ、したがってこれらのシャペロンを組み合わせて発現することは、タンパク質発現に有益であることが示されている（Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  ２０１１  Ｍａｙ  １４；１０：３２）。原核生物宿主細胞において真核生物タンパク質を発現するとき、同じまたは関連の真核生物種に由来するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）等の真核生物シャペロンタンパク質は、本発明の所定の実施形態では所望の遺伝子産物と共発現または誘導的共発現をする。
【００２４】
誘導性プロモーター。以下、発現コンストラクトにおいて遺伝子産物の発現または共発現に用いることのできる誘導性プロモーターについて、そのような発現コンストラクトを含有する宿主細胞に対して行える遺伝子修飾のいくつかとともに記載したものである。これらの誘導性プロモーター及び関連遺伝子の例は、他に断りがなければ、エシェリキア・コリ（大腸菌）菌株ＭＧ１６５５（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託ＡＴＣＣ  ７００９２６）に由来するものであり、これは大腸菌Ｋ−１２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託ＡＴＣＣ  １０７９８）の亜株である。表１は、誘導性プロモーター及び関連遺伝子のこれらの例について、大腸菌ＭＧ１６５５におけるヌクレオチド配列の遺伝子位置を列記する。ヌクレオチド及び他の遺伝子の配列で、表１にある遺伝子位置に従って参照されるものは、本明細書に明示的に組み込まれるものとする。本明細書に記載される大腸菌のプロモーター、遺伝子、及び菌株に関する追加情報は、オンラインでｅｃｏｌｉｗｉｋｉ．ｎｅｔにあるＥｃｏｌｉＷｉｋｉの情報源等、多くの公開情報源に見つけることができる。
【００２５】
アラビノースプロモーター。（本明細書で使用される場合、「アラビノース」はＬ−アラビノースを意味する。）いくつかの大腸菌オペロンは、アラビノース（ａｒａＢＡＤ、ａｒａＣ、ａｒａＥ、及びａｒａＦＧＨ）によって誘導性となるが、「アラビノースプロモーター」及び「ａｒａプロモーター」という用語は典型的に、ａｒａＢＡＤプロモーターを指して用いられる。Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＢＡＤ、及びＰＢＡＤ等、大腸菌ａｒａＢＡＤプロモーターを指して、いくつか別の用語も用いている。「ａｒａプロモーター」または上に記載の代替用語のいずれも、本明細書で使用される場合、大腸菌ａｒａＢＡＤプロモーターを意味する。別の用語「ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーター」が使用されることからも分かるように、ａｒａＢＡＤプロモーターは双方向性プロモーターの一部と考えられ、一方向にａｒａＢＡＤがａｒａＢＡＤオペロンの発現を制御し、他方向にａｒａＣプロモーターが、ａｒａＢＡＤプロモーターに隣接してかつａｒａＢＡＤプロモーターとは反対側の鎖上でａｒａＣコード配列の発現を制御する。ＡｒａＣタンパク質は、ａｒａＢＡＤプロモーターの正負両方の転写制御因子である。アラビノースの不存在下でＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤからの転写を抑制するが、アラビノースの存在下でＡｒａＣタンパク質はアラビノースに結合するとそのコンフォーメーションを変異させるので、ＰＢＡＤからの転写を可能とする正の調節要素になる。ａｒａＢＡＤオペロンはＬ−アラビノースを代謝するタンパク質をコードし、この代謝は、Ｌ−アラビノースを中間体であるＬ−リブロース及びＬ−リブロース−リン酸を経てＤ−キシルロース−５−リン酸に変換することによる。アラビノース誘導性プロモーターからの発現の誘導をできるだけ大きくする目的で、ＡｒａＡの機能を削除または低減することは有用であり、ＡｒａＡはＬ−アラビノースのＬ−リブロースへの変換を触媒し、任意でＡｒａＢ及びＡｒａＤの少なくとも１つの機能を削除または低減することができる。宿主細胞における有効濃度のアラビノースを減少させることができるその細胞の能力を削除または低減すると、その細胞がアラビノースを他の糖に変換できる能力を削除または低減することによって、アラビノース−誘導性プロモーターの誘導のためにより多くのアラビノースが得られるようになる。アラビノースを宿主細胞中へ移動させるトランスポーターをコードする遺伝子はａｒａＥ及びａｒａＦＧＨオペロンで、ａｒａＥは低親和性Ｌ−アラビノースプロトンシンポーターをコードし、ａｒａＦＧＨオペロンはＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｌ−アラビノーストランスポーターのサブユニットをコードする。Ｌ−アラビノースを細胞質中へ輸送できる他のタンパク質は、ＬａｃＹラクトース・ペルメアーゼの所定の突然変異体である、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）及びＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質であり、位置１７７でアラニンの代わりにシステインまたはバリンをそれぞれ有する（Ｍｏｒｇａｎ−Ｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｒａＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｌａｃｔｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｏｆ  ｒｅｌａｘｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２  Ｍａｙ  ２８；９９（１１）：７３７３−７３７７）。アラビノース誘導性プロモーターの均質的誘導を達成するために、アラビノースによる調節からは独立して細胞質へのアラビノースの輸送を行うことが有用である。これは、ＡｒａＦＧＨ輸送タンパク質の活性を削除または低減し、ａｒａＥの発現を変異させて、ａｒａＥのみが構成的プロモーターから転写されるようにすることによって、成し遂げることができる。ａｒａＥの構成的発現は、天然ａｒａＥ遺伝子の機能を削除または低減すること及び、構成的プロモーターから発現されたＡｒａＥタンパク質のためのコード配列を含む発現コンストラクトを細胞中に導入することによって達成できる。あるいは、ＡｒａＦＧＨ機能を欠く細胞において、宿主細胞の染色体ａｒａＥ遺伝子の発現を制御するプロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターから構成的プロモーターへ変化させることができる。同様に、アラビノース誘導性プロモーターの均質的誘導のためのさらなる代替方法として、ＡｒａＥ機能を欠く宿主細胞は、構成的プロモーターから発現された細胞中に存在する機能的ＡｒａＦＧＨコード配列を有することができる。別の代替方法として、宿主染色体において天然ａｒａＥ及びａｒａＦＧＨプロモーターを構成的プロモーターで置き換えることによって、ａｒａＥ遺伝子及びａｒａＦＧＨオペロンの両方を構成的プロモーターから発現することが可能である。ＡｒａＥ及びＡｒａＦＧＨアラビノーストランスポーターの両方の活性を削除または低減し、その状況で、ＬａｃＹラクトース・ペルメアーゼによるアラビノース輸送を可能とするそのタンパク質における突然変異を用いることもまた可能である。ｌａｃＹ遺伝子の発現はアラビノースによって正常に調節されないので、アラビノース誘導性プロモーターがアラビノースの存在によって誘導されるとき、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）またはＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）等のＬａｃＹ突然変異体の使用は、「全か無か」の誘導現象にはならない。ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質はアラビノースを細胞中に輸送する点でより有効であるように思われるので、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用は、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用より好ましい。
【００２６】
プロピオネートプロモーター。「プロピオネートプロモーター」または「ｐｒｐプロモーター」は大腸菌ｐｒｐＢＣＤＥオペロンのプロモーターであり、ＰｐｒｐＢとも称する。ａｒａプロモーターと同様、ｐｒｐプロモーターは双方向プロモーターの一部であり、一方向にｐｒｐＢＣＤＥオペロンの発現を制御し、他方向にはｐｒｐＲプロモーターがｐｒｐＲコード配列の発現を制御する。ＰｒｐＲタンパク質はｐｒｐプロモーターの転写制御因子であり、ＰｒｐＲタンパク質が２−メチルシトレート（「２−ＭＣ」）に結合するときにｐｒｐプロモーターからの転写を活性化する。プロピオネート（プロパノエイトとも称する）はプロピオン酸（即ち「プロパン酸」）のイオン、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ−であり、一般式Ｈ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨを有する「脂肪」酸の中で最も小さいものであり、この分類の分子がもつ所定の特性、即ち、水から塩析すると油状の層を生成して石鹸状カリウム塩を生成できるという特性を共有する。市販されるプロピオネートは概して固体であり、プロピオン酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＮａ）等のプロピオン酸一価カチオン塩または、プロピオン酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ）２）等の二価カチオン塩である。プロピオネートは膜透過性であり、ＰｒｐＥ（プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ）によってプロピオネートをプロピオニル−ＣｏＡに変換し、次いでＰｒｐＣ（２−メチルシトレートシンターゼ）によってプロピオニル−ＣｏＡを２−ＭＣに変換することによって、２−ＭＣに代謝される。ｐｒｐＢＣＤＥオペロン、ＰｒｐＤ（２−メチルシトレートデヒドラターゼ）及びＰｒｐＢ（２−メチルイソシトレートリアーゼ）がコードする他のタンパク質は、ピルビン酸及びコハク酸等のより小さい産物への２−ＭＣのさらなる異化作用に関与する。細胞増殖培地に加えたプロピオネートによってプロピオネート誘導性プロモーターの誘導をできるだけ大きくするためには、したがって、ＰｒｐＣ及びＰｒｐＥ活性をもった宿主細胞を有して、プロピオネートを２−ＭＣへ変換することが望ましいが、また、ＰｒｐＤ活性を削除または低減し、任意でＰｒｐＢ活性も削除または低減して、２−ＭＣが代謝されるのを防ぐことが望ましい。２−ＭＣ生合成に関与するタンパク質をコードする別のオペロンはｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣオペロンで、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨオペロンとも称する。これらの遺伝子は、コハク酸をプロピオニル−ＣｏＡへ変換し、次いでＰｒｐＣによって２−ＭＣに変換するのに必要とされるタンパク質をコードする。これらのタンパク質の機能の削除または低減は、２−ＭＣ誘導物質の産生のための平行経路を除去することがあり、したがって、プロピオネート誘導性プロモーターの発現のバックグラウンドレベルを低減し、外因的に供給されるプロピオネートに対するプロピオネート誘導性プロモーターの感度を増加させることがある。ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ−ｙｇｆＩの欠失を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して菌株ＪＳＢを作製すること（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，“Ａ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，��ｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５  Ｎｏｖ；７１（１１）：６８５６−６８６２）は、外因的に供給された誘導物質の不存在下でバックグラウンド発現を低減する際に役立っており、この欠失はまた菌株ＪＳＢにおけるｐｒｐプロモーターからの全体的発現を低減した。しかしながら、欠失ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ−ｙｇｆＩはまたｙｇｆＩに影響を与えると思われ、これは機能の不明な推定上のＬｙｓＲ−ファミリー転写制御因子をコードするということに留意されたい。遺伝子ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨは１つのオペロンとして転写され、ｙｇｆＩは反対側の鎖から転写される。ｙｇｆＨ及びｙｇｆＩのコード配列の３’末端はいくつかの塩基対でオーバーラップするので、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨオペロンの全てを取り除く欠失はｙｇｆＩコード機能をも取り除くように見える。ＹｇｆＧ（ＳｃｐＢ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼとも称す）等のｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ遺伝子産物のサブセットの機能を削除または低減すること、または、ｙｇｆＩの発現が影響されないようにｙｇｆＨ（またはｓｃｐＣ）遺伝子の十分な３’末端を残しながらｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ（またはｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣ）オペロンの大部分を欠失させることは、最大レベルの誘導発現を低減することなくプロピオネート誘導性プロモーターからバックグラウンド発現を低減するのに十分であると思われる。
【００２７】
ラムノースプロモーター。（本明細書で使用される場合、「ラムノース」はＬ−ラムノースを意味する。）「ラムノースプロモーター」即ち「ｒｈａプロモーター」、またはｒｈａＳＲは大腸菌ｒｈａＳＲオペロンのためのプロモーターである。ａｒａプロモーター及びｐｒｐプロモーターと同様、ｒｈａプロモーターは双方向プロモーターの一部であり、一方向にｒｈａＳＲオペロンの発現を制御し、他方向にはｒｈａＢＡＤプロモーターがｒｈａＢＡＤオペロンの発現を制御する。しかしながら、ｒｈａプロモーターは、発現の調節に関与する２つの転写制御因子、即ちＲｈａＲ及びＲｈａＳを有する。ＲｈａＲタンパク質はラムノースの存在下でｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化し、一方ＲｈａＳタンパク質はＬ−ラムノース異化及び輸送オペロンであるそれぞれｒｈａＢＡＤ及びｒｈａＴを活性化する（Ｗｉｃｋｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ  ｆａｍｉｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＲｈａＳ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｒｈａＳＲ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２０１０  Ｊａｎ；１９２（１）：２２５−２３２）。ＲｈａＳタンパク質はまたｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化することができるけれども、実際ＲｈａＳはこの発現を、ＲｈａＲとの発現を非常により大きなレベルに同時活性化できるサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）の能力に干渉することによって、負に自己調節する。ｒｈａＢＡＤオペロンは、Ｌ−ラムノースをＬ−ラムヌロースに変換するラムノース異化タンパク質ＲｈａＡ（Ｌ−ラムノースイソメラーゼ）と、Ｌ−ラムヌロースをリン酸化してＬ−ラムヌロース−１−Ｐを形成するＲｈａＢ（ラムヌロキナーゼ）と、Ｌ−ラムヌロース−１−ＰをＬ−ラクトアルデヒド及びＤＨＡＰ（リン酸ジヒドロキシアセトン）に変換するＲｈａＤ（ラムヌロース−１−リン酸アルドラーゼ）とをコードする。ラムノース誘導性プロモーターからの発現を誘導するために得られる細胞内ラムノースの量をできるだけ多くするためには、ＲｈａＡの機能または、任意でＲｈａＡとＲｈａＢ及びＲｈａＤの少なくとも１つとの機能を削除または低減することによって、触媒作用が分解するラムノースの量を低減することが望ましい。大腸菌細胞質はまた、ｒｍｌＢＤＡＣＸ（またはｒｆｂＢＤＡＣＸ）オペロンがコードするタンパク質ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ及びＲｍｌＤ（それぞれＲｆｂＡ、ＲｆｂＢ、ＲｆｂＣ及びＲｆｂＤとも称する）の活性を通して、Ｌ−ラムノースをアルファ−Ｄ−グルコース−１−Ｐから合成することができる。ラムノース誘導性プロモーターからのバックグラウンド発現を低減し、外因的に供給されるラムノースによるラムノース誘導性プロモーターの誘導の感度を高めるためには、ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ及びＲｍｌＤタンパク質の１つまたは複数の機能を削除または低減することが有益であると考えられる。Ｌ−ラムノースは、ＲｈａＴ、ラムノースパーミアーゼまたはＬ−ラムノース：プロトンシンポーターによって細胞内に輸送される。上に記される通り、Ｒ��ａＴの発現は転写制御因子ＲｈａＳによって活性化される。ラムノース（ＲｈａＳの発現を誘導する）による誘導からは独立してＲｈａＴの発現を行うためには、宿主細胞を変異させて、細胞内の全ての機能ａｌＲｈａＴコード配列が構成的プロモーターから発現されるようにすることができる。加えて、ＲｈａＳのコード配列は欠失または不活性化させて、機能的ＲｈａＳが産生されないようにすることができる。細胞内のＲｈａＳの機能を削除または低減することにより、ｒｈａＳＲプロモーターからの発現のレベルを、ＲｈａＳによる負の自己調節の不存在に基づいて増加させ、ラムノース触媒的オペロンｒｈａＢＡＤの発現のレベルを減少させ、ｒｈａプロモーターからの発現を誘導できるラムノースの能力をさらに増加させる。
【００２８】
キシロースプロモーター。（本明細書で使用される場合、「キシロース」はＤ−キシロースを意味する。）キシロースプロモーター即ち「ｘｙｌプロモーター」、またはＰｘｙｌＡは、大腸菌ｘｙｌＡＢオペロンのためのプロモーターを意味する。キシロースプロモーター領域は、ｘｙｌＡＢオペロン及びｘｙｌＦＧＨＲオペロンの両方が、隣り合うキシロース誘導性プロモーターから大腸菌染色体上で反対方向に発現されるという意味において、組織の点で他の誘導性プロモーターに類似している（Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ  ｏｐｅｒｏｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２：ＸｙｌＲ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ”，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９７  Ｎｏｖ；１７９（２２）：７０２５−７０３２）。ＰｘｙｌＡ及びＰｘｙｌＦの両方の転写制御因子はＸｙｌＲであり、キシロースの存在下でこれらのプロモーターの発現を活性化する。ｘｙｌＲ遺伝子はｘｙｌＦＧＨＲオペロンの一部として発現されるかまたはそれ自身の弱いプロモーターから発現され、このプロモーターはキシロースによる誘導性はなく、ｘｙｌＨ及びｘｙｌＲのタンパク質コード配列間に位置する。Ｄ−キシロースはＸｙｌＡ（Ｄ−キシロースイソメラーゼ）によって異化され、これがＤ−キシロースをＤ−キシルロースに変換し、これは次いでＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）によってリン酸化されてＤ−キシルロース−５−Ｐを形成する。キシロース誘導性プロモーターからの発現を誘導するために得られる細胞内キシロースの量をできるだけ多くするためには、少なくともＸｙｌＡの機能、または任意でＸｙｌＡとＸｙｌＢの両方の機能を削除または低減することによって、触媒作用が分解するキシロースの量を低減することが望ましい。ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｄ−キシローストランスポーターのサブユニットであるＸｙｌＦ、ＸｙｌＧ及びＸｙｌＨをコードする。ｘｙｌＥ遺伝子は、大腸菌低親和性キシロース−プロトンシンポーターをコードするもので、分離オペロンの代表的なものであり、このオペロンの発現はまたキシロースによって誘導性となっている。キシロースによる誘導からは独立してキシローストランスポーターの発現を行うためには、宿主細胞を変異させて、全ての機能キシローストランスポーターが構成的プロモーターから発現されるようにすることができる。例えば、ｘｙｌＦＧＨコード配列が欠失するようにｘｙｌＦＧＨＲオペロンを変異させ、ＸｙｌＲをキシロース誘導性ＰｘｙｌＦプロモーターから発現される唯一の活性タンパク質としておき、ｘｙｌＥコード配列はその天然プロモーターからではなく構成的プロモーターから発現されるようにすることも可能である。別の例として、ｘｙｌＲコード配列は発現コンストラクトにおいてＰｘｙｌＡまたはＰｘｙｌＦプロモーターから発現され、一方、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンが欠失してｘｙｌＥが構成的に発現されるか、あるいは、ｘｙｌＦＧＨオペロン（ｘｙｌＲコード配列は発現コンストラクトに存在するので欠けている）が構成的プロモーターから発���されてｘｙｌＥコード配列が活性タンパク質を産生しないように欠失または変異をされるか、する。
【００２９】
ラクトースプロモーター。「ラクトースプロモーター」という用語は、ｌａｃＺｐ１とも称されるプロモーターである、ｌａｃＺＹＡオペロンのためのラクトース誘導性プロモーターを指し、このラクトースプロモーターは、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．２，１１−ＪＡＮ−２０１２）のゲノム配列において約３６５６０３〜３６５５６８（マイナス鎖であり、ＲＮＡポリメラーゼ結合（「−３５」）部位が約３６５６０３〜３６５５９８、プリブノーボックス（「−１０」）が３６５５７９〜３６５５７３、転写開始点が３６５５６７）に位置する。いくつかの実施形態では、本発明の誘導性共発現系はｌａｃＺＹＡプロモーター等のラクトース誘導性プロモーターを含んでいてもよい。他の実施形態では、本発明の誘導性共発現系は、ラクトース誘導性プロモーターでない１つまたは複数の誘導性プロモーターを含む。
【００３０】
アルカリホスファターゼプロモーター。「アルカリホスファターゼプロモーター」及び「ｐｈｏＡプロモーター」は、リン酸塩飢餓下で誘導されるプロモーターである、ｐｈｏＡｐｓｉＦオペロンのためのプロモーターを指す。ｐｈｏＡプロモーター領域は、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．３，１６−ＤＥＣ−２０１４）のゲノム配列において約４０１６４７〜４０１７４６（プラス鎖、４０１６９５〜４０１７０１にプリブノーボックス（「−１０」）（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ（ｐｈｏＡ）ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８１  Ｎｏｖ  １１；９（２１）：５６７１−５６７８））に位置する。ｐｈｏＡプロモーターのための転写活性化因子は、センサータンパク質であるＰｈｏＲとともに大腸菌において２成分シグナル変換系を形成する転写調節因子であるＰｈｏＢである。ＰｈｏＢ及びＰｈｏＲは、ｐｈｏＢＲオペロンから転写され、ｐｈｏＢＲオペロンは、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．３，１６−ＤＥＣ−２０１４）のゲノム配列において約４１７０５０〜４１９３００（プラス鎖、４１７，１４２〜４１７，８３１にＰｈｏＢコード配列、及び４１７，８８９〜４１９，１８４にＰｈｏＲコード配列）に位置する。ｐｈｏＡプロモーターは、誘導物質の添加ではなくむしろ物質（細胞内のリン酸塩）の欠如によって誘導されるという点で、上記の誘導性プロモーターとは異なる。こ理由により、発酵後期等の宿主細胞がリン酸塩を欠乏している段階で産出される遺伝子産物の直接転写には、一般にｐｈｏＡプロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、本発明の誘導性共発現系はｐｈｏＡプロモーターを含み得る。他の実施形態では、本発明の誘導性共発現系は、ｐｈｏＡプロモーターでない１つ以上の誘導性プロモーターを含む。
【００３１】
【表１−１】
2018518957.tif 000003
【表１−２】
2018518957.tif 000004
【表１−３】
2018518957.tif 000005
【表１−４】
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【００３２】
発現コンストラクト。発現コンストラクトは関心の１つ以上の遺伝子産物を発現するように設計したポリヌクレオチドで、したがって天然の分子ではない。発現コンストラクトは宿主細胞染色体の中に組み込むか、またはプラスミドもしくは人工的染色体等の宿主細胞染色体から独立して複製するポリヌクレオチド分子として宿主細胞内に維持することができる。発現コンストラクトの例としては、１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を宿主細胞染色体の中に挿入して得られるポリヌクレオチドが挙げられ、挿入されたポリヌクレオチド配列は染色体コード配列の発現を変異させる。発現ベクターは、特に１つ以上の遺伝子産物の発現に用いられるプラスミド発現コンストラクトである。１つ以上の発現コンストラクトは宿主細胞染色体の中に組み込むかまたは、プラスミドもしくは人工的染色体等の染色体外ポリヌクレオチド上に維持することができる。以下、遺伝子産物の発現または共発現のために発現コンストラクトにおいて用いることができる特定のタイプのポリヌクレオチド配列に関する記載である。
【００３３】
複製起点。発現コンストラクトは、独立して複製するポリヌクレオチドとして宿主細胞内に維持されるためには、レプリコンとも称される複製起点を含まねばならない。複製のために同じメカニズムを用いる複数の異なるレプリコンは、繰り返される細胞分裂を通して単一の宿主細胞中に一緒に維持することができない。表２に示す通り結果としてプラスミドは、それが含有する複製起点によっては不和合性グループに分類することができる。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
複製起点は、発現コンストラクトにおける使用のために、他の基準とも併せて不和合性グループ、複製数及び／または宿主範囲に基づいて選択することができる。上に記載の通り、２つ以上の異なる発現コンストラクトを複数遺伝子産物の共発現のために同じ宿主細胞において用いる場合、その異なる発現コンストラクトは、例えば、１つの発現コンストラクトにはｐＭＢ１レプリコン、別の発現コンストラクトにはｐ１５Ａレプリコンといったように、異なる不和合性グループの複製起点を含有していれば最も良い。宿主染色体分子数との関係における、細胞における発現コンストラクトの平均複製数は、発現コンストラクトに含有される複製起点によって決まる。複製数は、細胞当たり数個から数百個の範囲であり得る（表２）。本発明の一実施形態では、同じ誘導物質によって活性化されるが異なる複製起点を有する誘導性プロモーターを含む複数の異なる発現コンストラクトを用いる。細胞中に各々異なる発現コンストラクトを所定のおおよその複製数で維持する複製起点を選択することによって、１つの発現コンストラクトから発現される遺伝子産物の全体的産生レベルを、異なる発現コンストラクトから発現される別の遺伝子産物との関連において調整することが可能である。一例として、多量体タンパク質のサブユニットＡ及びＢを共発現するために、ｃｏｌＥ１レプリコンと、ａｒａプロモーターと、ａｒａプロモーターから発現されるサブユニットＡのコード配列とを含む発現コンストラクト：「ｃｏｌＥ１−Ｐａｒａ−Ａ’」を作製する。別の発現コンストラクトとしては、ｐ１５Ａレプリコン、ａｒａプロモーター及び、サブユニットＢのコード配列を含む発現コンストラクト：「ｐ１５Ａ−Ｐａｒａ−Ｂ」を作製する。これらの２つの発現コンストラクトは、同じ宿主細胞中に一緒に維持することができ、サブユニットＡ及びＢの両方の発現は１つの誘導物質、アラビノースを増殖培地に加えることによって誘導する。２つのサブユニットの発現量の化学量論比を所望の比率に近づけるために、サブユニットＡの発現レベルをサブユニットＢの発現レベルに対して大きく増加させる必要がある場合、例えば、ｐＵＣ９プラスミドの複製起点（「ｐＵＣ９ｏｒｉ」）にあるような修飾ｐＭＢ１レプリコンを有する新しいサブユニットＡ用発現コンストラクト：ｐＵＣ９ｏｒｉ−Ｐａｒａ−Ａを作成できると考えられる。ｐＵＣ９ｏｒｉ−Ｐａｒａ−Ａ等の高複製数発現コンストラクトからサブユニットＡを発現することは、ｐ１５Ａ−Ｐａｒａ−ＢからサブユニットＢを発現することに比べて、産生されるサブユニットＡの量を増加させる筈である。同様に、低複製数で発現コンストラクトを維持するｐＳＣ１０１等の複製起点の使用は、コンストラクトから発現される遺伝子産物の全体的レベルを低減し得ると考えられる。複製起点の選択はまた、レプリコンを含む発現コンストラクトをどの宿主細胞が維持できるかを決定する。例えば、ｃｏｌＥ１複製起点を含む発現コンストラクトは比較的狭い範囲の利用可能な宿主、即ち腸内細菌ファミリー内の種を有し、一方、ＲＫ２レプリコンを含む発現コンストラクトは大腸菌、緑膿菌、プチダ菌、アゾトバクター・ビネランジー及びアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に維持することができ、発現コンストラクトがＲＫ２レプリコン及び、ＲＫ２プラスミドからのいくつかの調節遺伝子を含む場合は、それをシノリゾビウム・メリロティ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、カウロバクター・クレセンタス、アシネトバクター・カルコアセティカス及びロドバクター・スフェロイデス等、多種多様な宿主細胞に維持することができる（Ｋuｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｈｌ，“Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９８９  Ｄｅｃ；５３（４）：４９１−５１６）。
【００３６】
類似の考え方を用いて、真核生物細胞における誘導性発現または共発現のために発現コンストラクトを作製することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエの２ミクロン環状プラスミドは、他の酵母からのプラスミド、例えばｐＳＲ１（ＡＴＣＣ寄託番号４８２３３及び６６０６９；Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＳＲ１”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８５  Ｍａｒ  ２０；１８２（２）：１９１−２０３）、及びｐＫＤ１（ＡＴＣＣ寄託番号３７５１９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＫＤ１  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８６  Ｊｕｎ  １１；１４（１１）：４４７１−４４８１）と和合性がある。
【００３７】
選択マーカー。発現コンストラクトは通常、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含み、これは、選択培養培地において宿主細胞の残存または増殖に必要なタンパク質をコードするものである。選択遺伝子を含む発現コンストラクトを含有しない宿主細胞質は培養培地において残存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質もしくは他の毒素に耐性を与えるタンパク質または、宿主細胞の栄養要求性欠陥を補完するタンパク質をコードする。選択スキームの一例では、抗生物質等の薬剤を利用して宿主細胞の増殖を妨げる。選択マーカーを含む発現コンストラクトを含有するそれらの細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、選択レジメン後も残存する。選択マーカーの選択に概ね用いられる抗生物質のいくつかの例（及び、抗生物質耐性表現型を提供する遺伝子表示略語）としては、アンピシリン（ＡｍｐＲ）、クロラムフェニコール（ＣｍｌＲまたはＣｍＲ）、カナマイシン（ＫａｎＲ）、スペクチノマイシン（ＳｐｃＲ）、ストレプトマイシン（ＳｔｒＲ）及びテトラサイクリン（ＴｅｔＲ）が挙げられる。表２の代表的プラスミドの多くは、ｐＢＲ３２２（ＡｍｐＲ、ＴｅｔＲ）、ｐＭＯＢ４５（ＣｍＲ、ＴｅｔＲ）、ｐＡＣＹＣ１７７（ＡｍｐＲ、ＫａｎＲ）、及びｐＧＢＭ１（ＳｐｃＲ、ＳｔｒＲ）等の選択マーカーを含む。選択遺伝子の天然プロモーター領域は通常、その遺伝子産物のコード配列とともに、発現コンストラクトの選択マーカー部分の一部として含まれる。あるいは、選択遺伝子のコード配列は、構成的プロモーターから発現させることができる。
【００３８】
誘導性プロモーター。本明細書に記載される通り、本発明の誘導性共発現系の一部として発現コンストラクトに含めることができるいくつかの異なる誘導性プロモーターがある。好ましい誘導性プロモーターは、表１に記載する通り、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５ゲノム配列を参照して、プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも３０（より好ましくは少なくとも４０及び最も好ましくは少なくとも５０）の連続する塩基に対して少なくとも８０％ポリヌクレオチド配列同一性（より好ましくは少なくとも９０％同一性及び最も好ましくは少なくとも９５％同一性）を共有し、ポリヌクレオチド配列同一性のパーセントは実施例１１の方法を用いて測定する。「標準的」誘導条件（実施例５参照）の下では、好ましい誘導性プロモーターは、Ｄｅ  Ｍｅｙらの定量ＰＣＲ法（実施例６）を用いて測定して、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５の対応する「野生型」誘導性プロモーターの強度の少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも１００％及び最も好ましくは少なくとも１１０％）を有する。発現コンストラクト内で誘導性プロモーターは、誘導発現される遺伝子産物のコード配列の５’（即ち、「上流」）に配置され、誘導性プロモーターの存在は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのコード鎖に対して、遺伝子産物コード配列の転写を５’から３’の方向へ向かわせる。
【００３９】
リボソーム結合部位。ポリペプチド遺伝子産物については、誘導発現されるべき遺伝子産物のコード配列の転写開始点と開始コドンとの間の領域のヌクレオチド配列は、ポリペプチド遺伝子産物のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）に相当する。好ましくは、発現コンストラクトで５’ＵＴＲに相当する領域は、宿主細胞の種にあるコンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ、シャイン・ダルガノ配列とも称する）に類似のポリヌクレオチド配列を含む。原核生物（古細菌及び細菌）においてはＲＢＳコンセンサス配列はＧＧＡＧＧまたはＧＧＡＧＧＵであり、大腸菌等の細菌においてはＲＢＳコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧまたはＡＧＧＡＧＧＵである。ＲＢＳは典型的に、５〜１０の介在ヌクレオチドによって開始コドンから隔てられる。発現コンストラクトにおいて、ＲＢＳ配列は、ＡＧＧＡＧＧＵコンセンサス配列に対して好ましくは少なくとも５５％同一、より好ましくは少なくとも７０％同一、最も好ましくは少なくとも８５％同一であり、５〜１０介在ヌクレオチドによって、より好ましくは６〜９介在ヌクレオチドによって、最も好ましくは６または７介在ヌクレオチドによって開始コドンから分けられる。所与のＲＢＳが望ましい翻訳開始速度を生じさせることのできる能力は、ウェブサイトのｓａｌｉｓ．ｐｓｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＲＢＳＬｉｂｒａｒｙＣａｌｃｕｌａｔｏｒＳｅａｒｃｈＭｏｄｅで、ＲＢＳＣａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて計算することができ、同じツールを用いて、１００，０００倍以上の範囲の翻訳速度で合成ＲＢＳを最適化することができる（Ｓａｌｉｓ，“Ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０１１；４９８：１９−４２）。
【００４０】
多重クローニング部位。多重クローニング部位（ＭＣＳ）は、ポリリンカーとも称され、お互いに隣接するかまたはオーバーラップする多数の制限酵素認識部位を含有するポリヌクレオチドである。ＭＣＳにおける制限酵素認識部位は典型的に、ＭＣＳ配列内で一度生じ、好ましくはプラスミドの残りの内でまたは他のポリヌクレオチドコンストラクト内では生じず、制限酵素がＭＣＳ内でのみプラスミドまたは他のポリヌクレオチドコンストラクトを切断することを可能とする。ＭＣＳ配列の例としては、ｐＢＡＤ１８、ｐＢＡＤ１８−Ｃｍ、ｐＢＡＤ１８−Ｋａｎ、ｐＢＡＤ２４、ｐＢＡＤ２８、ｐＢＡＤ３０、及びｐＢＡＤ３３を含む、ｐＢＡＤシリーズの発現ベクターにあるもの（Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ＰＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ”，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９５  Ｊｕｌ；１７７（１４）：４１２１−４１３０）、またはｐＰＲＯ１８、ｐＰＲＯ１８−Ｃｍ、ｐＰＲＯ１８−Ｋａｎ、ｐＰＲＯ２４、ｐＰＲＯ３０、及びｐＰＲＯ３３を含む、ｐＢＡＤベクターに由来するｐＰＲＯシリーズの発現ベクターにあるもの（米国特許第８１７８３３８  Ｂ２号；Ｍａｙ  １５  ２０１２；Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊａｙ）が挙げられる。多重クローニング部位は発現コンストラクトの作製において用いることができ、即ち、プロモーター配列の３’（即ち、下流）に多重クローニング部位を配置することにより、遺伝子産物のコード配列の転写が生じるようにプロモーターとの関連において適切な位置でＭＣＳを用いてコード配列を挿入し、その遺伝子産物をコンストラクト中に発現または共発現させることができる。ＭＣＳ内でどの制限酵素を用いて切断を行うかにより、コード配列または他のポリヌクレオチド配列が発現コンストラクト中に挿入された後、ＭＣＳ配列の一部が発現コンストラクト内に残る可能性がある。残るＭＣＳ配列があれば、挿入する配列の上流、または下流、または両方にあり得る。リボソーム結合部位は、ＭＣＳの上流、好ましくはＭＣＳに直接隣接するか、またはＭＣＳからヌクレオチド数個だけ離れて配置されていてもよく、この場合にＲＢＳはＭＣＳに挿入される何らのコード配列の上流にあることになる。別の代替方法は、リボソーム結合部位をＭＣＳ内に含むことで、この場合には、ＭＣＳ内で切断を行うために用いる制限酵素の選択は、ＲＢＳが保持されるかどうか、挿入される配列にどのように関係するかを決定する。さらなる代替方法は、発現コンストラクトの中にＭＣＳにおいて挿入するべきポリヌクレオチド配列内にＲＢＳを含むことで、好ましくは、転写されるメッセンジャーＲＮＡから翻訳の開始を刺激するように、任意のコード配列に適切な関係で、含むことである。
【００４１】
構成的プロモーターからの発現。本発明の発現コンストラクトはまた、構成的プロモーターから発現されるコード配列を含んでもよい。誘導性プロモーターとは異なり、構成的プロモーターは大抵の増殖条件下で連続的遺伝子産物産生を開始する。構成的プロモーターの一例としては、Ｔｎ３ｂｌａ遺伝子の例が挙げられ、これはβラクタマーゼをコードし、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３１３４４）、ｐＡＣＹＣ１７７（ＡＴＣＣ３７０３１）及びｐＢＡＤ２４（ＡＴＣＣ８７３９９）を含む多くのプラスミドが宿主細胞に与えるアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）表現型の原因である。発現コンストラクトに用いることができる別の構成的プロモーターとしては、大腸菌ｌｉｐｏタンパク質遺伝子、ｌｐｐ、のプロモーターが挙げられ、これは大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５において位置１７５５７３１〜１７５５４０６（正鎖）に位置する（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，“Ｕｐ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｐｐ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８５  Ｍａｙ  １０；１３（９）：３１０１−３１１０）。大腸菌における異種遺伝子発現に用いた構成的プロモーターのさらなる例としてはｔｒｐＬＥＤＣＢＡプロモーターが挙げられ、これは大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５において位置１３２１１６９〜１３２１１３３（マイナス鎖）に位置する（Ｗｉｎｄａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｒｐ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８２  Ｎｏｖ  １１；１０（２１）：６６３９−６６５７）。本明細書に記載される通り、構成的プロモーターは、選択マーカーの発現のため、また、所望の産物の共発現に有用な他の遺伝子産物の構成的発現のために、発現コンストラクトにおいて用いることができる。例えば、ＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ及びＸｙｌＲ等の誘導性プロモーターの転写制御因子は、双方向誘導性プロモーターから発現しなければ、代わりに構成的プロモーターから、それが調節する誘導性プロモーターと同じ発現コンストラクトまたは異なる発現コンストラクト上で、発現することができる。同様に、ＰｒｐＥＣ、ＡｒａＥもしくはＲｈａ等の誘導物質の産生もしくは輸送に有用な遺伝子産物、または細胞の還元酸化環境を改変するタンパク質を数例として、発現コンストラクト内で構成的プロモーターから発現することができる。共発現される遺伝子産物の産生に有用な遺伝子産物及び得られる所望の産物としてはまた、シャペロンタンパク質、補助因子トランスポーター等が挙げられる。
【００４２】
シグナルペプチド。本発明の方法によって発現または共発現するポリペプチド遺伝子産物は、そのような遺伝子産物が宿主細胞の細胞質から周辺質に運び出されるのが望ましいのか、細胞質に保持されるのが望ましいのか、それぞれに従ってシグナルペプチドを含んでいても欠いていてもよい。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダー配列またはリーダーペプチドとも称す）は、単一αヘリックスを形成する傾向を有する一続きの疎水性アミノ酸で、アミノ酸が約５〜２０個の長さであり、しばしばアミノ酸が約１０〜１５個の長さであることを構造的な特徴とする。この疎水性の一続きはしばしばその直前が、正電荷をもつアミノ酸（特にリジン）中に濃縮されるさらに短い一続きである。成熟ポリペプチドから切断されるシグナルペプチドは典型的に、シグナルペプチダーゼによって認識され切断される一続きのアミノ酸となって終わる。シグナルペプチドは、原核生物の原形質膜（または大腸菌のようなグラム陰性菌の内膜）を通してかまたは真核生物細胞の小胞体の中へか、共翻訳的または翻訳後にポリペプチドの輸送を方向づける能力を機能的な特徴とし得る。シグナルペプチドが大腸菌のような宿主細胞の細胞膜周辺腔中へ輸送されるのを可能とできる程度は、例えば、実施例１２に記載するような方法を用いて、周辺質タンパク質を細胞質に保持されるタンパク質から分離することによって測定することができる。
【００４３】
宿主細胞。本発明の誘導性共発現系は複数遺伝子産物を発現するように設計し、本発明の所定の実施形態では、遺伝子産物は宿主細胞において共発現される。多量体産物の構成要素の効率的で費用効果的な誘導性共発現を可能とする宿主細胞の例を提供する。宿主細胞としては、培養中単離した細胞に加えて、多細胞生物の一部である細胞または、異なる生物内もしくは生物系内で増殖する細胞が挙げられる。加えて、本発明の誘導性共発現系の発現コンストラクトは、コムギ胚芽抽出物または細菌細胞抽出物に基づく系、大腸菌抽出物及びＲＴＳ  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等のインキュベーション装置を用いた連続交換無細胞（ＣＥＣＦ）タンパク質合成系等、無細胞系において用いることができる（Ｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ａｎ  ＲＮａｓｅ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００８  Ｍａｒ；４４（３）：３８７−３９１）。
【００４４】
原核生物宿主細胞。本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子産物の共発現のために設計する発現コンストラクトは、宿主細胞、好ましくは原核生物宿主細胞において提供する。原核生物宿主細胞としては、古細菌（ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）等）、グラム陽性菌（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）等）、またはグラム陰性菌、例えばアルファプロテオバクテリア（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、及びシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、ベータプロテオバクテリア（アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、及びガンマプロテオバクテリア（アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む）、セラチア菌（霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）を含む）、及び赤痢菌等の腸内細菌科ファミリーのガンマプロテオバクテリアが挙げられる。
【００４５】
真核生物宿主細胞。酵母菌（カンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、他のクリベロマイセス種、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）別名ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、デッケラ／ブレタノマイセス（Ｄｅｋｋｅｒａ／Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）種、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））；他の真菌（アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、アオカビ類（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ））；昆虫細胞株（キイロショウジョウバエ・シュナイダー２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２）細胞及びヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞）；不死化細胞株を含む哺乳動物細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ、２９３、またはＨＥＫ−２９３）細胞、及びヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２））等、真核生物細胞を含むさらに多くのタイプの宿主細胞を本発明の誘導性共発現系に用いることができる。上記宿主細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【００４６】
宿主細胞遺伝子機能への変異。誘導物質によって宿主細胞集団の効率的で均質的な誘導を促進するよう、誘導性発現コンストラクトを含む宿主細胞の遺伝子機能にある特定の変異を行ってもよい。好ましくは、発現コンストラクト、宿主細胞遺伝子型及び誘導条件の組み合わせによっては、誘導された各プロモーターから遺伝子産物を発現する培養において、実施例６に記載のＫｈｌｅｂｎｉｋｏｖらの方法によって測定して少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも８５％及び最も好ましくは少なくとも９５％）の細胞を生じることになる。大腸菌以外の宿主細胞については、これらの変異は、大腸菌遺伝子に構造的に似た遺伝子、または宿主細胞内で大腸菌遺伝子に似た機能を果たす遺伝子の機能の関与を必要とする。宿主細胞遺伝子機能への変異としては、遺伝子タンパク質コード配列を全て欠失させることによって遺伝子機能を削除または低減すること、または、遺伝子の十分大きな部分を欠失させること、あるいはそれ以外では、減少させたレベルの機能遺伝子産物が遺伝子から作られるようにその遺伝子の配列を変異させること、が挙げられる。宿主細胞遺伝子機能への変異としてはまた、遺伝子のより高レベルの転写を指示するさらに強いプロモーターを作成するように天然プロモーターを変異させること等によって遺伝子機能を増加させること、または、より活性の高い遺伝子産物を生じるタンパク質コード配列にミスセンス突然変異を導入すること、が挙げられる。宿主細胞遺伝子機能への変異としては、遺伝子機能のどのような変異の仕方も挙げられ、例えば、構成的に活性化したプロモーターを作製するように天然誘導性プロモーターを変異させることも挙げられる。誘導性プロモーターに関連して本明細書に記載される、誘導物質の輸送及び代謝のための遺伝子機能の変異、及びシャペロンタンパク質の発現の変異に加えて、宿主細胞の炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）制御系及び／または還元酸化環境を変異させることも可能である。
【００４７】
炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）。宿主内における活発なＣＣＲ制御系の存在は、誘導物質が誘導性プロモーターから転写を活性化できる能力に影響を与える可能性がある。例えば、大腸菌等の宿主細胞がグルコースを含有する培地で増殖される場合、アラビノース誘導物質またはプロピオネート誘導物質も増殖培地に存在していたとして、他の炭素源の利用に必要なａｒａＢＡＤオペロン及びｐｒｐＢＣＤＥオペロン等の遺伝子は仮に発現されるとしても低レベルで発現される。グルコース以外の炭素源の利用順位もあり、例えば、ａｒａ及びｐｒｐ誘導性プロモーター系の場合、アラビノースの存在が、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現を誘導するプロピオネートの能力を低減する（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，Ｇｅｎｅ  ２０１２  Ａｕｇ  １；５０４（１）：１１６−１２１；Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｍａｙ  ３）。したがって、細胞のＣＣＲメカニズムにより、誘導性共発現系において２つ以上の炭素源誘導物質を用いることがより困難となり、これは、好適な炭素源である誘導物質の存在がそれほど好適でない炭素源による誘導を阻害するからである。Ｐａｒｋらの著者は、ｃＡＭＰからは独立して機能することが可能な変異ｃＡＭＰ受容体タンパク質を産生する突然変異体ｃｒｐ遺伝子か、ＣＣＲの調節に関与するＰＴＳ（ホスホトランスフェラーゼ系）遺伝子の欠失か、いずれかを用い、アラビノースによるｐｒｐプロモーターの抑制を軽減しようと試みたが、どちらの方法もほとんど不成功であった。
【００４８】
しかしながら、Ｐａｒｋらの著者が用いたＰＴＳノックアウトは菌株ＴＰ２８１１に基づき、これは、大腸菌ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンの欠失したものである（Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ”，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１  Ｏｃｔ；５７（１−２）：１８６−１９１）。ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロン全体の欠失は、ｃｒｒ遺伝子だけの欠失よりも、ｃＡＭＰ合成総体に大きく影響を及ぼすことが分かっている（Ｌeｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｋｎｏｗｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｔｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｏｐｅｒｏｎ”，Ｇｅｎｅ  １９９０  Ｊａｎ  ３１；８６（１）：２７−３３）。異なった方法では、宿主細胞におけるｐｔｓＧ遺伝子の機能を削除または低減し、この遺伝子は、大腸菌におけるＣＣＲの重要要素であるグルコース特異的ＥＩＩ  Ａ（ＥＩＩ  Ａｇｌｃ）をコードするものである（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓｅ  ａｎｄ  ｈｅｘｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ：ａｎ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ”，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｎｏｖ；８８（５）：１０７７−１０８５，Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｓｅｐ  １４）。大腸菌等の宿主細胞のゲノムにおける別の変異で、ｐｒｐプロモーターの転写を増加させることになる変異は、ＡｓｃＧをコードするａｓｃＧ遺伝子の遺伝子機能を削除または低減することである。ＡｓｃＧは通常の増殖条件下でβ−Ｄ−グルコシド−利用オペロンａｓｃＦＢの抑制因子であり、また、ｐｒｐプロモーターの転写を抑制し、ＡｓｃＧコード配列の分裂はｐｒｐプロモーターからの転写を増加させることが示されている（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＡｓｃＧ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｐｅｒｏｎ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｐｅｒｏｎ”，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００９  Ｏｃｔ；１９１（１９）：６１３６−６１４４；Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｌ  ２４）。さらなる代替方法は、それほど好適ではない炭素源誘導物質によって誘導性であるプロモーターの転写制御因子の発現を、それを強い構成的プロモーターの制御下か、より好適な炭素源誘導物質の制御下か、どちらかに置くことによって増加させることである。例えば、より好適であるアラビノースの存在下でそれほど好適でない炭素源キシロースの利用に必要な遺伝子の誘導を増加させるためには、ＸｙｌＲのコード配列を大腸菌ａｒａＢＡＤオペロンの中へ入れる（Ｇｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＸｙｌＲ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｃｏｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ”，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１２  Ａｐｒ；７８（７）：２２２１−２２２９，Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊａｎ  ２７）。したがって、誘導性共発現コンストラクトを含む宿主細胞は、好ましくは、それほど好適でない炭素源誘導物質（複数可）によって誘導性であるプロモーターの転写制御因子の遺伝子機能レベルが高められていること、ならびにＣＣＲ系に関与するｃｒｒ及び／またはｐｔｓＧ及び／またはａｓｃＧ等の遺伝子の遺伝子機能が削除または低減されていること、を内包する。
【００４９】
誘導物質を別の化合物へと代謝する能力を欠くように遺伝子的に修飾された本発明の宿主細胞は、必ずしも、比較的好ましくない炭素源によって調節されるプロモーター上でその誘導物質によるＣＣＲを呈する必要はない。この顕著なＣＣＲ効果の欠如は、代謝されていない誘導物質の極めて低い濃度が使用される場合に観察され、驚くべきことに、これらの極めて低い濃度は、遺伝子産物の最適な収率を生むためにも最も効果的である。例えば、遺伝子産物の共発現は、一方の遺伝子産物成分をＬ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターから、もう一方の遺伝子産物をプロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現させることによって実行され得る。大腸菌ＥＢ０００１及びＥＢ０００２細胞等の宿主細胞（以下で実施例１に記載）では、共発現は、典型的には、細胞のＯＤ単位あたり１００マイクロモル（０．００１５％）未満のＬ−アラビノース誘導物質濃度で多量体遺伝子産物の最高収率を生み、これらのＬ−アラビノース濃度では、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターのＬ−アラビノース媒介性ＣＣＲは、ほとんどまたは全く観察されない。
【００５０】
補助因子の細胞性輸送。本発明の誘導性共発現系を用いて、機能のための補助因子を必要とする酵素を産生するとき、利用可能な前駆体から補助因子を合成することができるか、または環境からそれを取り出すことができる宿主細胞を用いることが役立つ。一般的な補助因子としては、ＡＴＰ、コエンザイムＡ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ及びヘムが挙げられる。
【００５１】
宿主細胞還元酸化環境。抗体等の多くの多量体遺伝子産物はジスルフィド結合を含有する。大腸菌の細胞質及び他の多くの細胞は通常、チオレドキシン及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系により、還元状態で維持される。これは、細胞質においてジスルフィド結合の形成を妨げ、ジスルフィド結合を必要とするタンパク質は周辺質へ運び出されて、周辺質でジスルフィド結合の形成と異性化が、ＤｓｂＡＢＣＤ及びＤｓｂＧを含むＤｓｂ系によって触媒される。システインオキシダーゼＤｓｂＡ、ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ、またはＤｓｂタンパク質の組み合わせは、通常全て周辺質へ輸送され、それらの発現の増加は、ジスルフィド結合を必要とする異種タンパク質の発現において利用されている（Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  ２０１１  Ｍａｙ  １４；１０：３２）。これらのＤｓｂタンパク質の細胞質型、例えばＤｓｂＣ（「ｃＤｓｂＣ」）の細胞質版を発現することも可能で、これはシグナルペプチドを欠き、したがって周辺質へ輸送されない。ｃＤｓｂＣ等の細胞質Ｄｓｂタンパク質は、宿主細胞の細胞質をより酸化性にし、したがって、細胞質に産生される異種タンパク質におけるジスルフィド結合の形成をより促すものとするために有益である。宿主細胞の細胞質はまた、チオレドキシン及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系を直接変異させることによってさらに酸化性にすることができ、グルタチオン還元酵素（ｇｏｒ）またはグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）に欠ける突然変異体菌株は、チオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ）とともに、細胞質を酸化性にする。これらの菌株は、リボヌクレオチドを還元することはできず、したがってジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の外因的還元体の非存在下において増殖することができない。ペルオキシレドキシンＡｈｐＣをコードする遺伝子ａｈｐＣにおける抑制因子突然変異体（ａｈｐＣ＊）は、それを、還元されたグルタチオンを生成するジスルフィド還元酵素に変換し、電子が酵素リボヌクレオチド還元酵素上に運ばれるようにし、ｇｏｒ及びｔｒｘＢに欠けるかまたはｇｓｈＢ及びｔｒｘＢに欠ける細胞質がＤＴＴの非存在下で増殖することを可能とする。別の分類の突然変異型のＡｈｐＣは、γグルタミルシステインシンテターゼ（ｇｓｈＡ）の活性とｔｒｘＢとに欠ける菌株がＤＴＴの非存在下で増殖することを可能にでき、これらとしては、ＡｈｐＣ  Ｖ１６４Ｇ、ＡｈｐＣ  Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ  Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ  Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びＡｈｐＣ  ｄｕｐ１６２〜１６９が挙げられる（Ｆａｕｌｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８  Ｍａｙ  ６；１０５（１８）：６７３５−６７４０，Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｍａｙ  ２）。酸化性の細胞質を有するそのよう��菌株において、露出したタンパク質システインは、それらの生理的機能の逆行という形で、チオレドキシンによって触媒されるプロセスで容易に酸化され、ジスルフィド結合の形成を生じる。
【００５２】
宿主細胞に行うことのできる別の変異は、宿主細胞の細胞質において酵母ミトコンドリアの内膜腔（ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｃｅ）からスルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖ１ｐを発現することで、これは、ｇｏｒまたはｔｒｘＢに突然変異体が存在しなくても、大腸菌の細胞質で種々の真核生物起源の複合体・ジスルフィド結合タンパク質の産生を増加させることが示されている（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｙｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ”  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  ２０１１  Ｊａｎ  ７；１０：１）。誘導性共発現コンストラクトを含む宿主細胞は、好ましくはまた、ｃＤｓｂＣ及び／またはＥｒｖ１ｐを発現し、ｔｒｘＢ遺伝子機能に欠け、ｇｏｒ、ｇｓｈＢまたはｇｓｈＡのいずれかの遺伝子機能に欠け、ならびに、宿主細胞がＤＴＴの非存在下で増殖できるように少なくとも１つの適切な突然変異型のＡｈｐＣを発現する。
【００５３】
ポリペプチド遺伝子産物のグリコシル化。宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化するその能力を変異させてもよい。例えば、真核生物宿主細胞では、グリコシルトランスフェラーゼ及び／またはオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子機能を削除または低減し、ポリペプチドの通常の真核生物グリコシル化が糖タンパク質を形成するのを低減することが可能である。大腸菌等の原核生物宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化するのが通常とは限らず、グリコシル化機能を提供する一連の真核生物遺伝子及び原核生物遺伝子を発現するよう変異させることもあり得る（ＤｅＬｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ”，ＷＯ２００９０８９１５４Ａ２，２００９  Ｊｕｌ  １６）。
【００５４】
遺伝子機能を変異させた利用可能な宿主細胞菌株。本発明の誘導性共発現系及び方法において用いる宿主細胞の好適菌株を作製するために、所望の遺伝子変異を既に含む菌株から始めることは有益である（表３）。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
宿主細胞遺伝子機能を変異させる方法。当技術分野には遺伝子機能を削除、低減、または変更するために宿主細胞遺伝子を変異させる多くの方法がある。大腸菌及び他の原核生物等の宿主細胞の遺伝子を標的破壊する方法については記載がなされており（Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｂｙ  ＥＴ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｍａｒ  １５；２７（６）：１５５５−１５５７；Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，“Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００  Ｊｕｎ  ６；９７（１２）：６６４０−６６４５）、類似のＲｅｄ／ＥＴ組換え方法を使うためのキットが市販されている（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されるｔｈｅ  Ｑｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。本発明の一実施形態では、宿主細胞の１つまたは複数の遺伝子の機能の削除または低減は、配列の遺伝子位置への参照によって本明細書に援用される大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５コード配列の１つ等、分解する遺伝子のコード配列内にヌクレオチド配列を特定すること、より具体的にはそのコード配列内に各々５０個のヌクレオチドをもつ２つの隣接する続きを選択することによって、行う。次いで、Ｔｈｅ  Ｑｕｉｃｋ＆Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製造者の指示に従って用い、選択マーカーを含有するポリヌクレオチドコンストラクトを、選択した隣接するコード配列の続きの間に挿入し、遺伝子の通常の機能を削除または低減する。また、Ｒｅｄ／ＥＴ組換え方法を用いて、プロモーターの配列を異なるプロモーター、例えば、所定の転写レベルを促進すると予想される構成的プロモーターまたは人工的プロモーターのそれに置き換えることもできる（Ｄｅ  Ｍｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｉｎｅ  ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ”，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｍａｒ  ２４；１０：２６）。また、宿主細胞遺伝子の機能は、ＲＮＡサイレンシング方法によって削除または低減することができる（Ｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１１  Ａｐｒ；３９（８）：ｅ５０，Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｆｅｂ  ３）。さらに、宿主細胞遺伝子機能を変異させる既知の突然変異を、伝統的な遺伝学的手法によって宿主細胞に導入することもできる。
【００５７】
本発明の誘導性共発現系。
本発明の誘導性共発現系は、２つ以上の発現コンストラクトを含む宿主細胞が関与し、発現コンストラクトは遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含み、宿主細胞は、遺伝子産物の均質的誘導性発現を可能とする変異した遺伝子機能を有する。図１は、本発明の誘導性共発現系の略図を示し、次の構成要素を有する：（１）宿主細胞、（２）宿主ゲノム（遺伝子変異を含む）、（３）遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含む発現ベクター「Ｘ」、（４）別の遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含む異なる発現ベクター「Ｙ」、（５）発現の化学的誘導物質、及び（６）多量体共発現産物。図３は、図１に示すものに類似の略図を示し、誘導性プロモーター（（３）及び（４））と、同じ発現ベクター上に存在する誘導性プロモーターによって発現される産物のためのコード配列とを有する。
【００５８】
図２は、均質的誘導性発現を可能とする適切なゲノム変異の入った大腸菌宿主細胞において、ｐＰＲＯ３３発現ベクター（米国特許第８１７８３３８Ｂ２号；Ｍａｙ  １５  ２０１２；Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊａｙ）（またはｐＰＲＯ４３、ｐＰＲＯ４３０、ｐＰＲＯ４３０（ＣｌｏＤＦ１３）、ｐＰＲＯ４４、もしくはｐＰＲＯ４５）上プロピオネート誘導性プロモーター（ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター）と組み合わせてｐＢＡＤ２４発現ベクター上ａｒａＢＡＤプロモーターを利用する、本発明の誘導性共発現系の一特定例の略図を示す。この様式で、多量体産物の各構成要素の発現を厳密に制御し最適化することを、いくつかの共発現用途で使用するために達成することができる。この実施形態では、宿主細胞（１）は、タンパク質発現用に当技術分野で一般的に用いられるグラム陰性菌大腸菌である。宿主ゲノム（２）は、シグナルペプチドを欠くジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣの細胞質型の発現等、均質的誘導性タンパク質共発現を容易にする突然変異または他の変異を有する、宿主細胞生物のゲノムである。一実施形態では、ゲノム変異は、ａｒａＢＡＤオペロンノックアウト突然変異と、構成的プロモーターからのａｒａＥ及びａｒａＦＧＨの発現かまたはａｒａＥＦＧＨ欠損バックグラウンドにおけるｌａｃＹ遺伝子（Ａ１１７Ｃ）中の点突然変異かのいずれかとの両方を含んで、外的に適用されたＬ−アラビノースでプラスミド系ａｒａプロモーターの均質的誘導を容易にし、また、不活性化プロピオネート代謝遺伝子、ｐｒｐＤを含んで、外的に適用されたプロピオネートでプラスミド系プロピオネートプロモーターの均質的誘導を容易にし、プロピオネートは生体内で２−メチルシトレートに変換される。誘導性共発現系に有用で宿主細胞に導入できる他のゲノム変異としては以下が挙げられるが、これらに制限されるものではない：ｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣオペロンの標的不活性化で、これはｐｒｐＢＣＤＥプロモーターからバックグラウンド発現を低減する；ａｒａＢＡＤプロモーター等のＬ−アラビノース誘導性プロモーターからそれほど好適でない炭素源（プロピオネート）の転写制御因子（ｐｒｐＲ）を発現すること、ならびに／またはｃｒｒ及び／もしくはｐｔｓＧ等、ＣＣＲ系に関与する遺伝子の遺伝子機能を削除または低減することで、これはＬ−アラビノースの存在下プロピオネートによる誘導をＣＣＲ系が抑制することを避ける；チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）とともにグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）もしくはグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）の遺伝子機能のレベルを低減すること、及び／または宿主細胞細胞質において酵母菌ミトコンドリアスルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖ１ｐを発現することで、これは比較的強くない還元環境を宿主細胞細胞質に提供し、ジスルフィド結合形成を促進する；例えば、強い構成的プロモーターからの、シャペロンタンパク質、例えば、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（トリガー因子）、及び／またはＦｋｐＡの発現のレベルを増強すること；ならびに、内在性プロテアーゼ活性（Ｌｏｎ及びＯｍｐＴプロテアーゼ等の活性）��びリコンビナーゼ活性を低減する他の突然変異。
【００５９】
図２に示す通り、２つの相互に適合する発現ベクター（３、４）は、宿主細胞中に維持し、２つの異なる遺伝子産物の同時発現（共発現）を可能とする。この実施形態では、１つの発現ベクター（「Ｌ−アラビノース誘導された発現ベクター」）は、Ｌ−アラビノース誘導されたプロモーターを含有し、ｐＢＡＤまたは関連プラスミドと類似または同等で、これにおいて、多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローン化される挿入発現配列の発現をａｒａＢＡＤプロモーターが推し進める。Ｌ−アラビノース誘導発現ベクターはまた、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ベータ−ラクタマーゼをコードし、アンピシリンへの耐性を与えるＴｎ３ｂｌａ遺伝子）のコード配列、またはアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼをコードし、カナマイシンへの耐性を与える）を含有し、インタクトな発現ベクターを含有する宿主細胞（細菌コロニー）の選択を容易にする。複製起点（ＯＲＩ）は細菌宿主細胞内でプラスミドを増殖するのに必要とされる。Ｌ−アラビノース誘導発現プラスミドはまたａｒａＢＡＤプロモーターのＬ−アラビノース誘導を可能とし、非誘導状態で「漏出性」バックグラウンド発現を転写抑制を通して低減する転写制御因子であるａｒａＣをコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。他の発現ベクター（「プロピオネート誘導発現ベクター」）は、ｐＰＲＯまたは関連プラスミドと類似または同等で、これにおいてプロピオネート誘導プロモーターが、多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローン化される挿入発現配列の発現を推し進める。そのプラスミドはまた、抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードし、クロラムフェニコールに耐性を与えるＴｎ３ｂｌａ遺伝子）のコード配列を含有し、インタクトな発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を容易にする。複製起点（ＯＲＩ）は細菌宿主細胞内でプラスミドを増殖するのに必要とされる。加えて、プロピオネート誘導発現ベクターは、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターのプロピオネート（２−メチルシトレート）誘導を可能とし、非誘導状態で「漏出性」バックグラウンド発現を低減する転写制御因子であるｐｒｐＲをコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。誘導の分離ティトラテイション（ｔｉｔｒａｔａｔｉｏｎ）、プラスミド和合性、及び発現ベクターの共増殖を容易にするために、発現ベクターが異なる誘導物質、和合複製起点、及び異なる抗生物質耐性マーカーに応答性のあるプロモーターを含むことは有益である。本発明の一実施形態では、Ｌ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターを含有するｐＢＡＤ２４（ｐＭＢ１または「ｐＢＲ３２２」ＯＲＩ、ＡｍｐＲ）、またはｐＢＡＤ２４０等の関連の発現ベクター（ｐＭＢ１  ＯＲＩ、ＫａｎＲ）は、宿主細胞において、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターを含有する、ｐＰＲＯ３３、ｐＰＲＯ４３、ｐＰＲＯ４３０、または関連の発現ベクター（ｐ１５Ａ  ＯＲＩ、ＣｍＲ）と組み合わせられる。
【００６０】
ｐＰＲＯ４３０（ＣｌｏＤＦ１３）、ｐＰＲＯ４４（ＲＳＦ１０３０  ＯＲＩ）、またはｐＰＲＯ４５（ＣｌｏＤＦ１３）等のプロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターを含む互換性のある発現ベクターも、ａｒａＢＡＤ−プロモーターを含む発現ベクター（ｐＭＢ１  ＯＲＩ）と併用され得る。発現ベクターは、好適な抗生物質である、アンピシリン、クロラムフェニコール、及び／またはカナマイシンを補充した増殖培地を用いて共増殖し維持する。一実施形態では、１つの発現ベクターは、完全長抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、他の発現ベクターは、完全長抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、各コード配列はそれぞれの発現ベクターのＭＣＳの中へインフレームにクローン化される。抗体等の所定の遺伝子産物の産生のためには、宿主生物の最適化（他の検討事項と併せて、コドンバイアス及びＧＣ含量のための調製を含む）が、共発現系の発現コンストラクトの中に挿入されるコード配列を決定することになる。
【００６１】
再度図２を参照すると、遺伝子産物の共発現は、廉価な外的に適用される化学的代謝産物であるＬ−アラビノース及びプロピオネート（５）によって誘導する。各遺伝子産物発現の誘導のレベルは、それ自身の化学的誘導物質で独立して滴定し、それによってタンパク質共発現の最適化を容易にする。これは、安定化のための結合パートナーを必要とするタンパク質複合体及びタンパク質の発現に有益であり、そうしなければ発現の困難なタンパク質、例えば、乏しい溶解性が乏しいかまたは細胞毒性のあるタンパク質等の発現を容易にし得る。この例では、誘導後に抗体重鎖及短鎖は各々別々に発現し、次いで、タンパク質が連結し、重鎖及び軽鎖を含む完全長抗体の形成と安定化を可能とする鎖間ジスルフィド架橋（細菌宿主の細胞質内に）を形成する。タンパク質は、宿主生物の種々の区画に向けることができる。例えば、大腸菌においては、タンパク質は細胞質、細胞膜、周辺質で発現し、媒介物へと分泌できる。適切なインキュベーション時間の後、細胞と媒介物を回収し、タンパク質全部を抽出すると、これは共発現遺伝子産物（６）を含む。抽出の後、所望の産物は、共発現系で産生される遺伝子産物の性質に従って、当技術分野で周知のいくつかの方法を用いて精製することができる（例えば、液体クロマトグラフィー）。図２に示される例では、多量体産物（完全長抗体）を抽出し、クロマトグラフィー方法を用いて精製する。精製されるインタクトな抗体を、タンパク質結合色素または免疫組織化学等、標準的な技術を用いて非変性ゲル上で視覚化する。次いで、完全長抗体産物をいくつかの研究、診断、その他用途に用いることができる。
【００６２】
図４は、図２に示すものに類似の略図を示し、アラビノース誘導性プロモーター（３）、プロピオネート誘導性プロモーター（４）、ならびに同じ発現ベクター上に存在する抗体重鎖及び軽鎖のコード配列を有する。抗体重鎖をプロピオネート誘導性プロモーターから、抗体軽鎖をアラビノース誘導性プロモーターから発現させることも可能である。
【００６３】
本発明の方法によって作られる産物。
多くの共発現用途での本発明の誘導性共発現系の利用、及び産物の特性においては、幅広い多用途性がある。
【００６４】
グリコシル化。本発明の方法による遺伝子産物共発現はグリコシル化しても非グリコシル化してもよい。本発明の一実施形態では、共発現遺伝子産物はポリペプチドである。グリコシル化ポリペプチドは、共有結合したグリコシル基を含むポリペプチドであり、それとしては、そのポリペプチドの特定の残基に通常通り結合した全てのグリコシル基を含むポリペプチド（完全にグリコシル化されるポリペプチド）、部分的にグリコシル化されるポリペプチド、グリコシル化が起こるとは限らない１つ以上の残基でのグリコシル化（変異グリコシル化）を有するポリペプチド、及び１つ以上の特定残基に通常通り結合するグリコシル基とは構造で異なる少なくとも１つのグリコシル基でグリコシル化（修飾グリコシル化）されるポリペプチド、も挙げられる。修飾グリコシル化の一例としては、「脱フコシル化」即ち「フコース欠損」ポリペプチド、即ち、ポリペプチドに結合するグリコシル基にフコース成分がないポリペプチドを、ポリペプチドをフコシル化する能力を欠く宿主細胞内でのポリペプチドの発現によって、産生させることが挙げられる。非グリコシル化ポリペプチドは、共有結合グリコシル基を含まないポリペプチドである。非グリコシル化されるポリペプチドはポリペプチドの脱グリコシル化の結果、またはアグリコシル化されるポリペプチドの産生の結果であり得る。脱グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチドを酵素的に脱グリコシル化することによって得られ、他方、アグリコシル化ポリペプチドは、原核生物細胞または、少なくとも１つのグリコシル化酵素の機能が削除もしくは低減された細胞等、ポリペプチドをグリコシル化する能力を有さない宿主細胞にポリペプチドを発現することによって産生できる。特定の実施形態では、共発現ポリペプチドをアグリコシル化し、より具体的な実施形態ではアグリコシル化ポリペプチドを大腸菌等の原核生物細胞で共発現する。
【００６５】
遺伝子産物の他の修飾。本発明の方法によって共発現される遺伝子産物は他のタイプの分子に共有結合していてもよい。共発現遺伝子産物に共有結合され得る分子の例としては、本発明の範囲を限定することなく、以下が挙げられる：ポリペプチド（例えば、受容体、リガンド、サイトカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＰＤＺドメイン等のタンパク質相互作用ドメイン、キナーゼドメイン、抗体、及びそのようなポリペプチドの断片）；水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチル化ポリオール（グリセロール等）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、及び類似の化合物、誘導体、またはその混合物）；ならびに細胞毒性剤（例えば、化学療法剤、増殖阻害、毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）、及び放射性同位体）。
【００６６】
加えて、本発明の方法によって共発現する遺伝子産物は、遺伝子産物の精製及び／または検出において補助となる分子成分を含むように設計することができる。多くのそのような成分が当技術分野で知られており、一例として、ポリペプチド遺伝子産物は、ポリヒスチジン「タグ」配列（６つ以上のヒスチジン、好ましくは６〜１０のヒスチジン残基、最も好ましくは６つのヒスチジンの列）を、そのＮ−またはＣ−末端で含むように設計することができる。ポリペプチドの末端にポリヒスチジン配列が存在することにより、それがコバルト系またはニッケル系親和性媒介物によって結合して他のポリペプチドから分離できるようになる。ポリヒスチジンタグ配列はエキソペプチダーゼによって除去できる。別の一例として、蛍光タンパク質のアミノ酸配列が好ましくはポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端で加えられたポリペプチド遺伝子産物の一部として、蛍光タンパク質配列を発現することができる。得られる融合タンパク質は、所定の波長の光が当てられると蛍光発光し、融合タンパク質の存在が視覚的に検出できるようになる。周知の蛍光タンパク質はオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質であり、多くの他の蛍光タンパク質が、それらをコードするヌクレオチド配列とともに市販されている。
【００６７】
抗体。本発明の一実施形態では、共発現遺伝子産物は抗体である。「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、具体的には、「天然」抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多選択性抗体（二重特異性抗体等）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、及び、抗原に結合可能な抗体から誘導される他のポリペプチドが挙げられる。本明細書で他に記載がなければ、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付け（「ＥＵ番号付け」）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭａｒｙｌａｎｄにあるＥＵインデックス（ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付け）のそれである。
【００６８】
「天然」抗体は通常、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖とからなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、鎖間ジスルフィド架橋の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖に従って変わる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔をあけて並べられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、そのＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖はそのＮ−末端（ＶＬ）で可変ドメインを、そのＣ−末端で定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと一線に並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一線に並ぶ。「可変」という用語は、可変ドメインの所定の部分は抗体によって配列が大きく異なり、抗原に対する各特定抗体の結合及び特異性の点から用いられる、という事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全域に均等に分布されている訳ではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのよりよく保存される部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＨＶＲによってつながれた４つのＦＲ領域を含み、他の鎖からのＨＶＲによって、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【００６９】
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を指し、天然Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基からかまたはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル−末端へ伸長するものと規定できる。あるいは、Ｆｃ領域は、保存ＣＨ２免疫グロブリン領域のＮ末端残基（Ａｌａ２３１）からＣ−末端まで伸長するものと規定することもでき、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４等の多重保存ドメインが挙げられる。天然Ｆｃ領域のＣ−末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに従って、残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に除去するかまたは、抗体の重鎖をコードする核酸を組み替えエンジニアリングすることによって除去してもよい。したがって、インタクトな抗体の組成は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基のある抗体とない抗体の混ざったものを有する抗体集団を含み得る。抗体のＦｃ領域は、免疫学的細胞のリクルートメント及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）に決定的に重要である。特に、抗体によって誘発されるＡＤＣＣ応答の性質は、多くの細胞タイプの表面に位置する受容体（ＦｃＲ）とＦｃ領域との相互作用に左右される。ヒトは少なくとも５つの異なる分類のＦｃ受容体を含有する。抗体のＦｃＲへの結合は、他の免疫学的細胞をリクルートするその能力、及びリクルートされる細胞のタイプを決定する。そのため、所定の種類の細胞のみをリクルートできる変異Ｆｃ領域を有する抗体をエンジニアリングする能力は、治療に決定的に重要である（米国特許出願第２００９０１３６９３６Ａ１号、０５−２８−２００９，Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇｅｏｒｇｅ）。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的に、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合する分岐型二分岐オリゴ糖を含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法によって産生される抗体は、例えば、Ｆｃ領域の残基２９７での置換、または、ポリペプチドをグリコシル化する能力を有しない宿主細胞での発現のために、グリコシル化しない、即ちアグリコシル化する。変異ＡＤＣＣ応答のために、非グリコシル化抗体はより低レベルの炎症反応、例えば神経炎症を刺激する。また、アグリコシル化Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体に対して非常に低い結合親和性を有するので、そのような抗体は、これらの受容体をもつ多数の免疫細胞に結合しないと考えられる。それは、非特異的結合を低減し、また生体内での抗体の半減期を増加させ、治療におけるこの属性を非常に有益なものとするので、これは重要な利点である。
【００７０】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、互換的に使用され、以下に定義するように、抗体断片でない実質的にインタクトな「天然」形式の抗体を指す。それらの用語は特に、可変ドメイン及びＦｃ領域を各々が含む重鎖を有する抗体を指す。「抗体断片」はインタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｃ、Ｆｄ、及びＦｖ断片；二特異性抗体；線状抗体；ｓｃＦｖ等の単一鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００７１】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有するものである。「キメラ」抗体はその重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導される抗体または特定の抗体分類もしくは下位分類に属する抗体における対応する配列と同一か、所定のアミノ酸配列同一性を共有する抗体であり、一方、鎖（複数可）の残りは別の種から誘導される抗体または別の抗体分類もしくは下位分類に属する抗体及びそのような抗体の断片と同一か、所定の程度のアミノ酸配列同一性を共有する。「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子から誘導される最小アミノ酸残基を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容抗体）において受容抗体のＨＶＲ残基がマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種の免疫グロブリンＨＶＲ（ドナー抗体）からの残基によって置き換えられたものである。いくつかの場合には、ヒト受容抗体のＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体またはドナー抗体に見られない残基を含んでいてもよい。「モノクローナル抗体」という用語は、少量で存在し得る天然の突然変異体等、あり得る突然変異体を除いて、抗体の集団を含む個々の抗体は同一であるという点で実質的に均質的な抗体の集団から得られる抗体を指す。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個々別々の抗体の混合物ではないという、抗体の特徴を示す。複数の異なる決定基（エピトープ）に対して向かう複数の異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製の各モノクローナル抗体は、抗原上の同じ単一の決定基に対して向かう。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。
【００７２】
抗体等の分子の「結合親和性」は一般的に、分子の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗体とそれが結合する抗原）との間の非共有結合性相互作用の全体の強さを指す。他に記載がなければ、「結合親和性」は結合対（例えば抗体と抗原）の要素間の１：１の相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。低親和性抗体（Ｋｄがより高い）は一般的にゆっくりと抗原に結合し簡単に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体（Ｋｄがより低い）は一般的に抗原により速く結合しより長く結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で知られており、そのいずれもが本発明の目的のために使用できる。結合親和性を測定する具体的な例示的方法を実施例８に記載する。本発明の方法によって産生及び／または使用する抗体及び抗体断片は、実施例８に記載の表面プラズモン共鳴法アッセイによって測定して好ましくは１００ｎＭ未満の結合親和性を有し、より好ましくは１０ｎＭ未満の結合親和性を有し、最も好ましくは２ｎＭ未満の結合親和性を有する。
【００７３】
アグリコシル化抗体を認識する抗体（二次）。大腸菌またはその他に基づく原核生物発現系においてグリコシル化酵素なしで抗体を産生すると、一般的にアグリコシル化抗体が得られ、一次抗体として用いることができる。本発明の誘導性共発現系を用いてアグリコシル化一次抗体を産生することに加えて、本発明の誘導性共発現系を用いて特異的にアグリコシル化一次抗体を認識する二次抗体を効率的に産生することもできる。本発明の一態様は、研究、分析、診断、または治療目的のために、非グリコシル化、即ちアグリコシル化一次抗体を検出できる二次抗体系である。一例として、二次抗体系は次の構成要素とともに提供される：エピトープ、一次抗体、二次抗体、及び検出系。エピトープは抗原（通常タンパク質）の一部であり、生きた動物に導入されるか別の方法で抗体によって認識されると免疫応答を生じさせる抗原決定基である。実際には、関心のエピトープは混合物または組織の中に存在し得る。一実施形態では、エピトープはヒトの組織の癌細胞において発現されるタンパク質である。一次抗体は、抗体断片、単一完全長抗体（モノクローナル）、または複数の異なる完全長抗体（ポリクローナル）の混合物であり、エピトープを認識してこれに結合し、好ましくは特異的にエピトープに結合する。この例における完全長抗体は、２つの重ポリペプチド鎖と２つの軽ポリペプチド鎖とがジスルフィド架橋で連結されたものを含む。鎖の各々は、定常領域（Ｆｃ）及び可変領域（Ｆｖ）を含む。完全長抗体には２つの抗原結合部位がある。本発明の一実施形態では、一次抗体は関心のエピトープを認識してこれに結合する完全長アグリコシル化抗体（大腸菌に基づく発現系において産生されるもの等）である。二次抗体は抗体断片、単一完全長抗体（モノクローナル）または複数の異なる完全長抗体（ポリクローナル）の混合物であり、アグリコシル化一次抗体を認識してこれに結合し、好ましくは特異的にアグリコシル化一次抗体に結合する。本発明の一実施形態では、二次抗体は、完全長一次抗体のアグリコシル化Ｆｃ部分を認識してこれに結合する完全長抗体である。この場合に、抗体結合部位はアグリコシル化一次抗体のＦｃ部分を特異的に認識するよう選択及び／またはエンジニアリングし、Ｃ−末端リジン残基はあってもなくてもよい。他の実施形態では、二次抗体はアグリコシル化一次抗体のさらなる領域（エピトープ）または一次抗体に共有結合するポリペプチド配列を含むがそれらに限定されないエンジニアリングされたさらなるエピトープ、を認識するようにエンジニアリングすることも考えられる。二次抗体は、完全長アグリコシル化抗体分子（ＩｇＧ、ＩｇＡ等の種々の免疫グロブリン分類を含む）またはＦｃもしくはＦａｂ等の抗体断片上に存在する、単一または複数部位（エピトープ）に向けることができる。したがって、この方法で生成されるいくつかの二次抗体はどのようなアグリコシル化完全長抗体に対しても広い特異性を有すると考えられる。本発明の一次及び二次抗体としてはまた、伝統的な方法（免疫化ウサギを用いたポリクローナル抗体産生またはマウスハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体産生）、及び抗原結合ポリペプチドを特定するファージディスプレイ方法等の組換えＤＮＡ技術によって産生するものも挙げられる。
【００７４】
検出系は一般的に、二次抗体に連結または結合して二次抗体の検出、視覚化、及び／または定量化を可能とする剤を含む。種々の検出系が当技術分野で周知であり、蛍光色素、酵素、放射性同位体または重金属を含むがこれらに限定されない。これらは、さらなるポリペプチドを二次抗体に直接物理的に連結させることを含んでいる場合もいない場合もある。この二次抗体系の応用としては、免疫組織化学的測定、ウエスタンブロッティング、及び酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、免疫組織化学的測定における使用の一実施形態では、関心のエピトープは、組織の薄片に存在し、次いでアグリコシル化一次抗体を組織に作用させ、エピトープに結合させる。非結合の一次抗体を除去し、次いでアグリコシル化一次抗体に特異的に結合できる二次抗体を組織に作用させ、一次抗体に結合させる。非結合二次抗体を除去し、次いで検出系試薬を作用させる。例えば、二次抗体を酵素に結合させる場合、色がきれいに出る酵素基質を組織に作用させ反応させる。次いで、直接顕微鏡または蛍光透視による反応酵素基質の視覚化を実施する。他の検出方法も当技術分野で周知である。アグリコシル化抗体を認識する二次抗体を用いた系の利点としては以下が挙げられるが、それらに限定されない：１）アグリコシル化しなければ真核生物組織に存在しない一次抗体のＦｃ部分をアグリコシル化してそれに二次抗体が結合するよう設計しているので免疫組織化学的測定の特異性が向上する；２）一次抗体に対する特異性の向上によりバックグラウンドの染色が低減される；３）一次及び／または二次抗体を大腸菌等の原核生物で生成できるので二次抗体系産生のコストが低減される；４）抗体開発のプロセス全体を大腸菌等の原核生物で実施するので、マウス及びウサギ等の哺乳動物を不必要に利用することが避けられる。
【００７５】
産業用途で用いられる酵素。多くの産業プロセスは本発明の方法によって産生できる酵素を利用する。これらのプロセスとしては、廃水処理ならびに他のバイオレメディエーション及び／または解毒プロセス；製紙繊維産業における材料漂白；バイオ燃料へと効率的発酵可能な材料にするバイオマスの分解が挙げられる。多くの場合、微生物宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞におけるこれらの用途で酵素を産生することが望ましいと考えられるが、活性酵素は酵素フォールディング及び／または補助因子必要性の問題により大量に発現することが困難である。本発明のある特定の実施形態では、本発明の誘導性共発現方法を用いて、産業用途を有する酵素、例えば、アラビノース及びキシロース利用酵素（例えば、キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５））またはリグニン分解ペルオキシダーゼ（例えば、リグニンペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．１４）、マンガンペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．１３、汎用性ペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．１６）、またはラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２））を産出する。
【００７６】
実施例１
共発現を促進するための宿主細胞内へのゲノム変異の導入
上記のように、宿主細胞の遺伝子発現におけるある特定の変化は、所望の遺伝子産物（複数可）の共発現を向上し得る。ある特定の宿主細胞、大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞を、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞から導出した。それらの表現型は、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ΔａｒａＢＡＤ  Δｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ  ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４として表される。大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞を以下の通りに産出した：欠失及び変異を、ゲノム配列をシームレスに取り除く、対抗選択による欠失として記載されるリコンビニアリング方法を用いて、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ宿主細胞ゲノムにおいて作製した。宿主細胞のａｒａＢＡＤオペロンの欠失を作製して、宿主細胞によるアラビノース異化反応を低減することで、アラビノース誘導物質のより多くを、ａｒａＢＡＤプロモーターを含む発現コンストラクトから共発現される遺伝子産物を誘導するために利用できるようにした。この欠失は、いくつかのコドンのＡｒａＤコード領域以外の全てを通る天然のａｒａＢＡＤプロモーターのほとんどが除去されるように、大腸菌ゲノム（ゲノムヌクレオチド配列内の位置は、表１におけるように全て付与される）の７０，１３５〜６５，８６７（マイナス鎖）の位置に対応する、ａｒａＢＡＤオペロンの４２６９塩基対を除去する。欠失接合部（位置７０，１３６｜位置６５，８６６）の周囲のヌクレオチド配列（マイナス鎖）は、ＴＴＡＴ｜ＴＡＣＧである。別の欠失をｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ（ｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣとも呼ばれる）オペロン内で作製することで、２−メチルシトレートの生合成に関与する遺伝子の機能を排除し、外的に供給されたプロピオネートに対する宿主細胞のプロピオネート誘導性プロモーターの感受性を増加させた。ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ欠失により５５４２塩基対（大腸菌ゲノムの位置３，０５８，７５４〜３，０６４，２９５）を除去することで、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨプロモーター、及びｙｇｆＨコード配列の最後のコドン以外の全てのオペロンを取り出しながら、隣接するｙｇｆＩコード配列及び停止コドンをそのまま残す。欠失接合部（位置３，０５８，７５３｜位置３，０６４，２９６）の周囲のヌクレオチド配列（プラス鎖）は、ＡＣＡＡ｜ＧＧＧＴである。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ宿主細胞ゲノムにおいて作製したこれらの欠失に加えて、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨは、位置３，４７２，５７４〜３，４７２，２００のマイナス鎖上に延びる、ゲノムｒｐｓＬ遺伝子コード配列における点突然変異を導入し、位置３，４７２，４４７でＡをＧに変更し、Ｌｙｓ４３のコドンをＡｒｇのコドンに変化させ、突然変異体ｒｐｓＬ‐Ａｒｇ４３遺伝子が発現されるときにストレプトマイシン耐性表現型をもたらす。上記のようなより厳密な制御誘導性の発現を可能にする、宿主細胞ゲノムに対する別の変異は、アラビノースに対して応答性ではなくむしろ常時発現性であるａｒａＥプロモーターを作製することである。ＣＲＰ−ｃＡＭＰ及びＡｒａＣ結合部位を含む、ほとんどの天然の���ｒａＥプロモーターを、９７塩基対（位置２，９８０，３３５〜２，９８０，２３９（マイナス鎖））を欠失させ、その配列を常時発現性Ｊ２３１０４プロモーターの３５塩基対で置き換えることにより取り除いた（配列番号１；Ｊ２３１０４のヌクレオチド配列は、ｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇのウェブサイト、ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｍａｉｎ＿Ｐａｇｅから得た）。結果として得られた、変異ａｒａＥプロモーター内の接合部部位配列は、ＴＧＡＡ｜ＴＴＧＡ  …ＴＡＧＣ  ｜  ＴＴＣＡであった。
【００７７】
ＥＢ０００１とも称される株である大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）の遺伝子型は、以下のように表すことができる。
ΔａｒａＢＡＤ  ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］ｏｍｐＴ  ａｈｐＣΔ  ｇａｌ  λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３−ｒ１−ｃＤｓｂＣ（Ｓｐｅｃ，ｌａｃＩ）ΔｔｒｘＢ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２［ｄｃｍ］Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４  ΔｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣ  ｅｎｄＡ１  ｒｐｓＬ−Ａｒｇ４３  Δｇｏｒ  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０
【００７８】
ＥＢ０００２株は、ＥＢ０００１  ｐｒｐＤまたは以下のように表すことができる遺伝子型を有する。
ΔａｒａＢＡＤ  ｆｈｕＡ２  ΔｐｒｐＤ［ｌｏｎ］  ｏｍｐＴ  ａｈｐＣΔ  ｇａｌ  λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３−ｒ１−ｃＤｓｂＣ（Ｓｐｅｃ，  ｌａｃＩ）ΔｔｒｘＢ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２［ｄｃｍ］  Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４  ΔｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣ  ｅｎｄＡ１  ｒｐｓＬ−Ａｒｇ４３  Δｇｏｒ  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０
【００７９】
これらのゲノム変異のいずれかまたはそれらの組み合わせのいずれかを有する、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ宿主細胞またはＥＢ０００１細胞もしくはＥＢ０００２細胞等の大腸菌宿主細胞を、遺伝子産物の誘導性共発現に用いることができる。
【００８０】
実施例２
誘導性プロモーターを含む発現ベクター
Ａ．発現ベクターｐＰＲＯ４３
発現ベクターｐＰＲＯ４３（配列番号２）を、関心の遺伝子産物をプロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現させるために使用し、ｐＰＲＯ３３発現ベクターのヌクレオチド配列を参照して構築した。Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ＰＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９５  Ｊｕｌ；１７７（１４）：４１２１−４１３０、及び米国特許第８１７８３３８Ｂ２号；Ｍａｙ  １５  ２０１２；Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊａｙに記載されているように、ｐＰＲＯ３３のヌクレオチド配列を、ｐＢＡＤ１８ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８１８３８．１）、ｐｒｐＲ‐ＰｐｒｐＢ領域の大腸菌ゲノム配列、及びｐＢＡＤ３３ベクターの配列からコンパイルした。ｐＰＲＯ３３ヌクレオチド配列をシーケンシングによって確認し、これを配列番号３に提供する。
【００８１】
ｐＰＲＯ４３では、転写活性化因子ｐｒｐＲをコードするヌクレオチド配列を、Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２００９  Ｓｅｐ  １４；４（９）：ｅ７００２；ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７００２に記載のもの等の方法を使用するＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって大腸菌における発現のために最適化した。ｐＰＲＯ４３中最適化したｐｒｐＲ配列は、示すものとは反対側の鎖上に、配列番号２のヌクレオチド１５９３〜７であるｐｒｐＲコード配列の上流にあるＲＢＳ及び他の配列を含む。ｐＰＲＯ４３ベクターもＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するが、ＭＣＳに１つ、ｐｒｐＲコード配列に１つ、という２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するｐＰＲＯ３３とは対照的に、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に１つしか有しない。
【００８２】
Ｂ．発現ベクターｐＰＲＯ４３０及びｐＰＲＯ４３０（ＣｌｏＤＦ１３）
発現ベクターｐＰＲＯ４３０（配列番号４）を、ｐＰＲＯ４３のヌクレオチド配列（配列番号２）に基づいてＤＮＡ２．０によって合成した。ｐＰＲＯ４３０ベクターは、ともに、ｐ１５複製起点、クロラムフェニコール（ＣｍＲ）への耐性を授ける遺伝子、上記の大腸菌における発現のために最適化したｐｒｐＲコード配列、及び中にコード配列を挿入することができる、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターの下流にあるクローニング部位を含むという点で、ｐＰＲＯ４３に類似している。ｐＰＲＯ４３０発現ベクターは、それがクローニング部位の上流に最適化されたＲＢＳ配列（ＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡ（配列番号４のヌクレオチド３５６６〜３５７９））を有するという点で、ｐＰＲＯ４３とは異なる。ｐＰＲＯ４３０発現ベクターはまた、一部のヌクレオチド配列の除去、及びより短いターミネーターの使用によって、ｐＰＲＯ４３と比較して簡素化されており、その結果、ｐＰＲＯ４３０ヌクレオチド配列（配列番号４）は、ｐＰＲＯ４３ヌクレオチド配列（配列番号２）の５８８３塩基と比較して、３６９８塩基しか有しない。ｐＰＲＯ４３０（ＣｌｏＤＦ１３）発現ベクター（配列番号５）は、ＢｆｕＡＩ制限部位に挟まれているｐＰＲＯ４３０におけるｐ１５複製起点が、ｐＰＲＯ４３０におけるよりコピー数の多いＣｌｏＤＦ１３複製起点（ＣｌｏＤＦ１３）によって置き換えられることを除いて、ｐＰＲＯ４３０と同一である。
【００８３】
Ｃ．発現ベクターｐＢＡＤ２４０
発現ベクターｐＢＡＤ２４０（配列番号６）を、ｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ受入番号Ｘ８１８３７．１（２５−ＯＣＴ−１９９５））のヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡ２．０によって合成した。発現ベクターｐＢＡＤ２４０は、中にコード配列を挿入することができるクローニング部位の上流にある最適化されたＲＢＳ配列（ＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡ（配列番号６のヌクレオチド３１２５〜３１３６）を有することにおいてｐＢＡＤ２４とは異なる。ｐＢＡＤ２４０ヌクレオチド配列はまた、一部のヌクレオチド配列の除去、及びより短いターミネーターの使用によって、ｐＢＡＤ２４と比較して簡素化されており、その結果、ｐＢＡＤ２４０ヌクレオチド配列（配列番号Ｃ）は、ｐＢＡＤ２４ヌクレオチド配列の４５４２塩基と比較して、３２５５塩基しか有しない。ｐＢＡＤ２４０発現ベクターはまた、ｐＢＡＤ２４のアンピシリン耐性遺伝子ではなく、カナマイシンへの耐性を授ける遺伝子（ＫａｎＲ）を含む。
【００８４】
Ｄ．発現ベクターｐＰＲＯ４４及びｐＰＲＯ４５
発現ベクターｐＰＲＯ４４（配列番号７）及びｐＰＲＯ４５（配列番号８）を、ｐＰＲＯ４３のヌクレオチド配列（配列番号２）に基づいて、ｐＰＲＯ４４（ＲＳＦ１０３０）発現ベクターとｐＰＲＯ４５（ＣｌｏＤＦ１３）発現ベクターとで異なる複製起点を使用して作製した。ｐＰＲＯ４３、ＲＳＦ１０３０複製起点、及びＣｌｏＤＦ１３複製起点のためのプライマーを、各複製起点配列の上流にＳｐｅＩ制限部位を、下流にＡａｔＩＩ制限部位を加えるために設計した。ｐＰＲＯ４３及びＲＳＦ１０３０ヌクレオチド配列を、これらのプライマー（それぞれ、配列番号９及び１０、ならびに配列番号１１及び１２）を使用して増幅し、増幅した産物をＳｐｅＩ及びＡａｔＩＩによって分解させ、所望の制限断片をゲル精製し、ともにライゲーションして、ｐＰＲＯ４４（配列番号７）を作製した。結果として得られたｐＰＲＯ４４発現ベクターを配列決定して、ＰＣＲ増幅の間に変異が導入されなかったことを確認した。ｐＰＲＯ４５を作製するために、ＣｌｏＤＦ１３ヌクレオチド配列を、プライマー（配列番号１３及び１４）を使用して増幅して、ＳｐｅＩ及びＡａｔＩＩ部位を加え、ＣｌｏＤＦ１３増幅産物及びｐＰＲＯ４４をＳｐｅＩ及びＡａｔＩＩ制限酵素によって分解させ、所望の断片をゲル精製した後、ともにライゲーションして、ｐＰＲＯ４５（配列番号８）を形成した。ｐＰＲＯ４５のＣｌｏＤＦ１３部分を配列決定して、ＰＣＲ増幅の間に変異が導入されなかったことを確認した。
【００８５】
実施例３
細菌細胞における蛍光タンパク質の誘導性共発現用二重プロモーターベクターｐＳＯＬの使用
Ａ．二重プロモーターｐＳＯＬ発現ベクターの構築。
「二重ベクター」または「ｐＳＯＬ」と称される、２つの異なる誘導性プロモーターを含む発現ベクターを図５に概略的に示す。このベクターは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって合成され、大腸菌宿主細胞における発現のために最適化されたいくつかのポリヌクレオチド配列、または「要素」を含む。ｐＳＯＬにおいて利用されるポリヌクレオチド要素の説明は表４で以下に提供し、ｐＳＯＬのヌクレオチド配列は配列番号１５として提供する。
【００８６】
【表４−１】
2018518957.tif 000009
【表４−２】
2018518957.tif 000010
【００８７】
具体的には、ｐＳＯＬ発現ベクターは、目的のタンパク質の誘導性共発現に使用することができる２つの異なる誘導性プロモーター、アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーター及びプロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターを含む。ｐＳＯＬの変異体、例えば、ａｒａＢＡＤプロモーターの位置及びｐｒｐＢＣＤＥプロモーターの位置が複製起点に対して入れ替わっているｐＳＯＬに基づく発現ベクターを、目的のタンパク質の誘導性共発現に使用することもできる。ｐＳＯＬ発現ベクターのさらに有用な変異体としては、ＡｒａＣ転写活性化因子のためのコード配列及び／またはＰｒｐＲ転写活性化因子のためのコード配列が、発現ベクター中に存在しない代わりに、異なる染色体外要素等の別々のポリヌクレオチド、または宿主ゲノムから発現される変異体が挙げられる。ｐＳＯＬ発現ベクターの追加の変異体としては、例えば配列番号１５のｐＳＯＬヌクレオチド５３０４位と２９位との間に挿入され、その結果、第３の誘導性プロモーターが、ｐｒｐＢプロモーターならびにその関連するクローニング部位及びターミネーターの下流にあり、ｐｒｐＢプロモーターと同じ方向を向くようになる、第３の誘導性プロモーターが挙げられる。このようなｐＳＯＬ発現ベクターの変異体における第３の誘導性プロモーターは、例えば、ｒｈａＳＲプロモーター等のラムノース誘導性プロモーター、ｘｙｌＡＢプロモーター等のキシロース誘導性プロモーター、またはｐｈｏＡプロモーター等のリン酸塩欠乏によって誘導されるプロモーターであり得る。
【００８８】
Ｂ．蛍光タンパク質の誘導性共発現
二重プロモーターｐＳＯＬベクターからの共発現のレベルをｐＢＡＤ２４発現ベクターとｐＰＲＯ３３発現ベクターとの組み合わせからの共発現と比較するために、ｐＢＡＤ２４及びｐＰＲＯ３３ベクターを使用して、それぞれ、蛍光タンパク質黄色蛍光タンパク質（ＹｅｌｌｏｗＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲｅｄＦＰ）を発現させた。ｐＳＯＬ中のＬ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターを使用してＹｅｌｌｏｗＦＰを発現させ、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターを使用してＲｅｄＦＰを発現させた。ＹｅｌｌｏｗＦＰは、５１５ｎｍの励起により５２８ｎｍ〜５３０ｎｍで最大の発光を有し（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ｊａｎ；２０（１）：８７−９０）、ＲｅｄＦＰは、５８７ｎｍの励起により６１０ｎｍで最大の発光を有する（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｄ，ｏｒａｎｇｅ  ａｎｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００４  Ｄｅｃ；２２（１２）：１５６７−１５７２；Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｎｏｖ  ２１）。
【００８９】
ｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ及びｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰプラスミドを構築するために、ＹｅｌｌｏｗＦＰ及びＲｅｄＦＰのためのコード配列を、ＤＮＡ  ２．０によって、大腸菌における発現のために最適化した。ＹｅｌｌｏｗＦＰ及びＲｅｄＦＰのための最適化されたコード配列を、ＮｈｅＩとＳａｌＩとの両方によって分解し、分解された挿入物をライゲーションして、それぞれ、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩ−ｃｕｔ  ｐＢＡＤ２４及びｐＰＲＯ３３にした。ｐＳＯＬの場合、ＤＮＡ２．０は、増幅系Ｅｌｅｃｔｒａクローニング系を使用して、ＹｅｌｌｏｗＦＰ及びＲｅｄＦＰのための最適化されたコード配列を、それぞれ、ａｒａＢＡＤプロモーター領域及びｐｒｐＢＣＤＥプロモーター領域における最適化されたリボソーム結合部位の下流にあるｐＳＯＬ発現ベクターに挿入した。ｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ及びｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰ発現コンストラクトを同時形質転換して、大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞（大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞は実施例１に記載）にし、ｐＳＯＬ−ＹｅｌｌｏｗＦＰ−ＲｅｄＦＰ発現コンストラクトも、別に形質転換して、大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞にした。
【００９０】
ＡＳＥ（ＤＧＨ）（「ｐＢＡＤ、ｐＰＲＯ」）中のｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ／ｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰの培養物、及びＡＳＥ（ＤＧＨ）（「ｐＳＯＬ」）中のｐＳＯＬ−ＹｅｌｌｏｗＦＰ−ＲｅｄＦＰの培養物を、それぞれ、クロラムフェニコール及びアンピシリンを含むか、またはカナマイシンを含むＬＢ培地において、２７５ＲＰＭで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。０．７のＯＤ６００にて、細胞を、抗生物質を加えた２×６ｍＬのＬＢ培地中で０．０１のＯＤ６００に希釈し、ＯＤ６００が０．７５に達するまで、２７５ＲＰＭで振盪しながら３０℃で増殖させた。細胞を３０℃で７分間３８００×ｇでペレット化し、ＯＤ６００が０．７になるまで、追加の炭素源を含まない抗生物質を加えたＭ９培地中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、以下のように、ウェル当たり２００マイクロリットルでマルチウェルプレートにプレーティングした。
行Ａ、Ｂ：ＡＳＥ（ＤＧＨ）コロニー１中のｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ／ｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰ
行Ｃ、Ｄ：ＡＳＥ（ＤＧＨ）コロニー２中のｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ／ｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰ
行Ｅ、Ｆ：ＡＳＥ（ＤＧＨ）コロニー１中のｐＳＯＬ−ＹｅｌｌｏｗＦＰ−ＲｅｄＦＰ
行Ｇ、Ｈ：ＡＳＥ（ＤＧＨ）コロニー２中のｐＳＯＬ−ＹｅｌｌｏｗＦＰ−ＲｅｄＦＰ
【００９１】
異なる濃度のプロピオネート（手動により）及びＬ−アラビノース（デジタルディスペンサーにより）を、プロピオネート濃度０ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、及び２０ｍＭ、ならびにＬ−アラビノース濃度０マイクロモル、０．６７マイクロモル、３．３３マイクロモル、６．６６マイクロモル、及び６６．６１マイクロモルで添加して、細胞を誘導した。
【００９２】
プレートを、「早い」振盪速度を使用して３０℃でＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）４マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）中でインキュベートし、蛍光を、８時間の間、１５分ごとにモニタリングした。蛍光値を、同じ誘導物質濃度で培養したサンプルの蛍光値を平均化し、経時的な蛍光を図６及び７に示すようにプロットした。図６は、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現された、経時的なＲｅｄＦＰからの蛍光レベルを示す。平均化したサンプル群の各々に関する誘導物質濃度を凡例に示し、ここでは、最初にプロピオネート濃度、続いてＬ−アラビノース濃度を挙げる。図７は、Ｌ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターから発現された、経時的なＹｅｌｌｏｗＦＰからの蛍光レベルを示す。平均化したサンプル群の各々に関する誘導物質濃度を凡例に示し、ここでは、最初にＬ−アラビノース濃度、続いてプロピオネート濃度を挙げる。誘導物質濃度の各組み合わせについて、観察された蛍光レベルによって示すように、測定する蛍光タンパク質の発現は、ｐＳＯＬ二重プロモーター発現ベクター上に存在する誘導性プロモーターの方が、ｐＢＡＤ２４−ＹｅｌｌｏｗＦＰ／ｐＰＲＯ３３−ＲｅｄＦＰの組み合わせに存在する対応する誘導性プロモーターよりも高かった。ｐＢＡＤ２４及びｐＰＲＯ３３と比較して増加したこのｐＳＯＬからの蛍光タンパク質発現レベルは、図６及び７に示す誘導物質濃度の組み合わせだけでなく、明確化のためのグラフから省略した誘導物質濃度の組み合わせについても観察された。
【００９３】
Ｃ．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼとのプレプロインスリンの誘導性共発現
二重プロモーターｐＳＯＬベクターを使用するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）とのプレプロインスリンの共発現によって産出されるプレプロインスリンの量を、ｐＢＡＤ２４０（配列番号６）発現ベクターとｐＰＲＯ４３０（配列番号４）発現ベクターとの組み合わせを使用する共発現によって産出されるプレプロインスリンの量と比較した（これらのベクターの構築については実施例２を参照）。
【００９４】
ｐＢＡＤ２４０及びｐＰＲＯ４３０ベクターを使用して、それぞれ、プレプロインスリン及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を発現させた。ｐＳＯＬ中のＬ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターを使用してプレプロインスリンを発現させ、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターを使用してＰＤＩを発現させた。塩化カルシウムによる処理によって形質転換に適格にしたＥＢ０００１細胞（大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞とも称される；実施例１参照）を、ｐＢＡＤ２４０−プレプロインスリンとｐＰＲＯ４３０−ＰＤＩベクターとの両方を含む溶液に添加した後、２０秒間４２℃の熱ショックを行い、５分間氷上で休ませた。同時形質転換した細胞を、２７５ＲＰＭで振盪しながら１時間３７℃で９００マイクロリットルのＳＯＣ増生培地（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｂ９０２０Ｓ）中で回収した後、２５マイクログラム／ｍＬのカナマイシン及び１２マイクログラム／ｍＬのクロラムフェニコールを含む寒天プレートにプレーティングした。ｐＰＲＯ４３０を含む細胞増殖のための５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシン及び１２マイクログラム／ｍＬのクロラムフェニコールの抗体濃度を液体培養条件下で使用した。ＥＢ０００１細胞を、類似の様式で単一のｐＳＯＬ−プレプロインスリン−ＰＤＩベクターによって形質転換したが、寒天プレートにプレーティングし、その後、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンのみを含む液体培養中で増殖させた。各形質転換からの単一のコロニーを選択し、固定相に達するまで一晩２７５ＲＰＭで振盪しながら３０℃で適切な抗生物質（複数可）を加えたＬＢ培地中で培養し、これらの培養物を使用して、ＥＢ０００１株におけるｐＢＡＤ２４０−プレプロインスリン／ｐＰＲＯ４３０−ＰＤＩ及びＥＢ０００１株におけるｐＳＯＬ−プレプロインスリン−ＰＤＩのグリセロール原液を確立した。
【００９５】
インキュベーションに備えて細胞を増殖させるため、各グリセロール原液から適切な抗生物質（複数可）を含む１００ｍＬのＬＢ培地に直接植え付けを行い、２７５ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩培養した。適切な抗生物質（複数可）を含む１００ｍＬの新鮮なＬＢ培地へと希釈して０．２のＯＤ６００に到達させた後、ＯＤ６００が０．６〜０．８に到達するまで、細胞を再度、２７５ＲＰＭで振盪しながら３０℃で培養した。このとき、適量をペレット化（３８００×ｇ、１０分）し、その結果、８０ｍＬの誘導培地（適切な抗生物質（複数可）を加えたＭ９）中の再懸濁により０．７〜０．７５のＯＤ６００が得られるようにした。
【００９６】
誘導培地中に再懸濁した細胞を、３ｍＬ／ウェルでの誘導のために２４ウェルのディープウェル培養プレートにプレーティングした。その後、培養物を、各誘導物質条件について１０マイクロリットルの３００×誘導物質原液中でスパイクすることにより誘導し、２７５ＲＰＭで振盪しながら２７℃で６時間インキュベートした。各ウェル中の培養物のＯＤ６００を、１００マイクロリットルの培養物を１００マイクロリットルの再蒸留水に添加することと、キュベットＯＤに変換するための曲線適合：ＯＤ６００＿ｃｕｖｅｔｔｅ＝（ＯＤ６００＿プレート＊１．９７９６）−０．０７を使用するＥｐｏｃｈプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）とを使用して、６時間のインキュベーション後に測定した。その後、室温で７分、３８００×ｇでペレット化することで、各ウェル中の細胞を採取した。上清をペレットから吸引し、細胞ペレットサンプルを−８０℃で保管した。
【００９７】
各細胞ペレット中のプレプロインスリンの量を、製造者の指示に従ってＷＥＳ系（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で実行したキャピラリーウエスタンブロットを使用して決定した。保管した細胞ペレットを１０分間氷上で解凍した後、溶解緩衝液（ｐＨ８のリン酸カリウム、１％のオクチルグルコシド；１×プロテアーゼ阻害剤；培養物１ｍＬあたり２Ｕのベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（ＥＭＤ＃７０７４６、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）；及び培養物１ｍＬあたり２．２５ｋＵ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＥＭＤ＃７１１１０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））において、誘導後の培養濃度よりも２倍高い細胞濃度で溶解させた。１０分間の氷上でのインキュベーションによって溶解を進めた後、サンプルを、４℃で１５分間２０，０００×ｇでスピン精製した。ＷＥＳ分析に備えて、溶解物を０．１×ＷＥＳ緩衝液中に希釈して、０．０２×の最終濃度にした。各サンプルについて、５マイクロリットルの希釈サンプルを、１．２５マイクロリットルの還元５×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（蛍光標準、及び最終濃度２００ｍＭまでのＤＴＴの添加を伴う）に添加した。ＷＥＳ系に充填する前に、サンプルを１０分間９５℃で加熱した。プレプロインスリンの検出のための一次抗体はマウス抗インスリン抗体であり、二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ抗マウス抗体であった。ＷＥＳ分析の結果を表５及び６に示す。
【００９８】
【表５】
2018518957.tif 000011
【００９９】
【表６】
2018518957.tif 000012
【０１００】
表５及び表６における結果を比較すると、同等の誘導物質濃度では、ｐＳＯＬベクターは、２つのベクター共発現系よりも２〜８倍多い量のプレプロインスリンを産出することが示される。
【０１０１】
実施例４
インフリキシマブの誘導性共発現
インフリキシマブは、ＴＮＦアルファ、炎症性サイトカインに結合するキメラモノクローナル抗体であり、自己免疫疾患（クローン病、リウマチ性関節炎、乾癬等）のようなＴＮＦアルファを伴う症状の治療において使用される。インフリキシマブは、重鎖（配列番号１６として示されるアミノ酸配列）及び軽鎖（配列番号１７として示されるアミノ酸配列）から形成され、これらの鎖の各々は、マウス抗ＴＮＦアルファ抗体の可変ドメイン配列、及びヒト定常ドメインを有する。大腸菌における発現のためのコドン最適化及び配列番号１６及び１７をコードするポリヌクレオチドの合成を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって行った。
【０１０２】
ＤＮＡ２．０  Ｅｌｅｃｔｒａクローニング法（ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｓ／ｅｌｅｃｔｒａ−ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、インフリキシマブ発現コンストラクトを作製した。ｐＢＡＤ２４０発現ベクターのＥｌｅｃｔｒａクローニング部位内にインフリキシマブ重鎖についての最適化コード配列を挿入することにより形成される発現コンストラクトは、ｐＢＡＤ２４０−インフリキシマブ＿ＨＣであり、これは、配列番号１８として示されるヌクレオチド配列を有する。ｐＰＲＯ４３０発現ベクターのＥｌｅｃｔｒａクローニング部位内にインフリキシマブ軽鎖についての最適化コード配列を挿入することにより形成される発現コンストラクトは、ｐＰＲＯ４３０−インフリキシマブ＿ＬＣであり、これは、配列番号１９として示されるヌクレオチド配列を有する。最適化されたインフリキシマブの重鎖コード配列と軽鎖コード配列との両方を、類似の方法でｐＳＯＬ発現ベクター（配列番号１５）へとクローニングし、重鎖はａｒａＢＡＤプロモーターから発現され、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現された。結果として得られたｐＳＯＬ−インフリキシマブ発現ベクターは、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を有する。ｐＢＡＤ２４０−インフリキシマブ＿ＨＣ及びｐＰＲＯ４３０−インフリキシマブ＿ＬＣ発現コンストラクトを使用して、大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞を４２℃の熱ショックによって同時形質転換した後、一晩３７℃で増殖させると、ｐＳＯＬ−インフリキシマブ発現コンストラクトは大腸菌ＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞へと同様に形質転換され、これによりＡＳＥ（ＤＧＨ）（ｐＢＡＤ２４０−インフリキシマブ＿ＨＣ／ｐＰＲＯ４３０−インフリキシマブ＿ＬＣ）細胞及びＡＳＥ（ＤＧＨ）（ｐＳＯＬ−インフリキシマブ）細胞が作製された。
【０１０３】
これらの細胞を、必要に応じたカナマイシン及び／またはクロラムフェニコール等の選択的な化合物の添加を含めて概して実施例３に記載の通りに増殖させ、抗体発現を誘導するために、細胞を約０．７（０．６〜１．０）のＯＤ６００で追加の炭素源を含まないＭ９培地中に再懸濁した。その後、細胞を、アラビノース（最初は０．１％を含む濃度にて）及びプロピオネート（最初は５０ｍＭを含む濃度にて）の添加によって誘導する。アラビノース及びプロピオネートの濃度の調整は、実施例５に記載のように行うことができる。誘導の後、中で抗体が産出された宿主細胞を、リゾチーム等の酵素を使用する化学的溶解、またはＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓモデルＭ−１１０Ｙマイクロフルーダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用する超音波処理もしくは微小溶液操作等の機械的破壊方法によって、破壊する。室温で１５分間、２０，０００×ｇでの遠心分離を使用して、不溶性分画を分離して除き、発現された抗体を含む可溶性タンパク質を含む上清を収集する。
【０１０４】
インフリキシマブ抗体を、製造者の指示に従ってＷＥＳ系（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で実行したキャピラリー電気泳動ウエスタンブロットを使用して検出し定量化する（実施例３も参照）。可溶性タンパク質抽出物をキャピラリーセットに充填し、タンパク質をサイズごとに電気泳動によって分類した後、サンプル中の抗体を、ブロッキングステップ（一次抗体を使用する代わりに）、ならびにヒト抗体重鎖及び軽鎖を認識するＨＲＰ抱合型ヤギ抗ヒト二次抗体とのインキュベーションによって検出する。抗体検出を、化学発光基質のキャピラリーへの添加、及び酵素触媒反応中に放出された光の直接捕捉によって達成する。推定分子量を、各実行につき１２ｋ〜２３０ｋＤａの６つのビオチン化タンパク質を使用して生成した標準曲線を使用して計算する。蛍光標準をサンプル添加緩衝液に含めることで、各サンプルに、サンプルを分子量標準と合わせるために使用する内部標準を付与する。
【０１０５】
所与の分子量で存在するタンパク質の量を決定するために、既知量のタンパク質標準をキャピラリーのいくつかに泳動させる。この場合、例えば１０マイクログラム／ｍＬから初めて１．０ナノグラム／ｍＬまで希釈する、既知のタンパク質濃度を有する市販のインフリキシマブの連続希釈物を調製する。約５つのＷＥＳ系キャピラリーを使用して、連続希釈物を泳動させる。実験用キャピラリーと連続希釈物用キャピラリーとの両方における各インフリキシマブタンパク質バンドについて、タンパク質バンドの化学発光強度を表す曲線をＷＥＳ系ソフトウェアによって生成し、各曲線下面積を評価し、これらの面積の標準曲線をインフリキシマブ連続希釈物キャピラリーにおけるインフリキシマブタンパク質バンドについてプロットする。実験用サンプルの濃度を決定するために、実験用インフリキシマブサンプルの化学発光強度を表す各曲線下面積を、既知のインフリキシマブ濃度の使用について生成した標準曲線と比較することができる。
【０１０６】
インフリキシマブ抗体を実施例７に記載の通りにさらに精製してもよく、インフリキシマブ抗体の追加の特性評価を実施例８（抗体結合親和性の測定）及び実施例９（共発現産物中に存在するジスルフィド結合の特性評価）で説明する。
【０１０７】
実施例５
誘導物質を変化させることによる共発現の滴定
本発明の発現系を用いて多量体産物の産生を最適化するために、誘導物質の濃度を独立して調整または滴定することができる。誘導性プロモーター（Ｌ−アラビノース誘導性、プロピオネート誘導性、Ｌ−ラムノース誘導性、またはＤ−キシロース誘導性プロモーター等）を含む発現コンストラクトを含有する宿主細胞を、適切な抗生物質を含むＭ９最小培地で、所望の濃度（例えば、約０．５のＯＤ６００）に増殖させ、その後、細胞を、グリセロール等の炭素源なしで、適切な抗生物質、及び様々な濃度の各誘導物質によって任意に調製した、少量のＭ９最小培地にアリコートする。少量の滴定を、２００〜５００ｍｌの振盪フラスコ中で行った。発現を誘導するのに必要なＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、またはＤ−キシロースの濃度は、典型的には、細胞のＯＤ単位あたり０．０２％未満である（多くの場合、０．０２％を大きく下回る）。滴定実験では、Ｌ−アラビノースの試験濃度は、全て細胞のＯＤ単位あたり、２％〜１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％、０．０００２％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００２％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００２％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００２％、０．００００００１％、０．０００００００５％、０．０００００００２％、及び０．０００００００１％の範囲であり得る。６６．６１マイクロモルのＬ−アラビノースの濃度は、０．００１％のＬ−アラビノースに相当する。Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、またはＤ−キシロースについての代替的な滴定実験は、モル濃度に関して表した以下の濃度の試験であろう：全て細胞のＯＤ単位あたり、２５０ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５００マイクロモル、２５０マイクロモル、１００マイクロモル、７５マイクロモル、５０マイクロモル、２５マイクロモル、１０マイクロモル、５．０マイクロモル、２．５マイクロモル、１．０マイクロモル、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５．０ｎＭ、２．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭ、５．０ｐＭ、２．５ｐＭ、及び１．０ｐＭ。プロピオネートについては、試験する濃度は、全て細胞のＯＤ単位あたり、１Ｍ〜７５０ｍＭ、５００ｍＭ、２５０ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、７５０マイクロモル、５００マイクロモル、２５０マイクロモル、１００マイクロモル、５０マイクロモル、２５マイクロモル、１０マイクロモル、５．０マイクロモル、２．５マイクロモル、１．０マイクロモル、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５．０ｎＭ、２．５ｎＭ、及び１．０ｎＭの範囲であり得る。
【０１０８】
試験されるＬ‐アラビノース（またはＬ−ラムノースまたはＤ−キシロース）の各濃度「ｘ」について、濃度「ｘ」の最初の誘導物質を含む試験管の各々に添加する、プロピオネート等の異なる誘導物質の濃度は、一連のサンプル各々で変更する。代替的に、滴定実験は、誘導物質濃度の「標準的」組み合わせで開始することができ、これは、誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減した遺伝子機能を有する宿主細胞については、細胞のＯＤ単位あたり０．００１５％（１００マイクロモル）のＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、もしくはＤ−キシロースのうちのいずれか、及び／または細胞のＯＤ単位あたり１００マイクロモル（もしくは５０マイクロモル〜２５０マイクロモルの濃度）のプロピオネートである。誘導物質を代謝するタンパク質が機能性である宿主細胞については、誘導物質濃度の「標準的」組み合わせは、細胞のＯＤ単位あたり０．２％（１３ｍＭ）のＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、もしくは細胞のＯＤ単位あたりＤ−キシロースのいずれか、及び／または８３ｍＭ（もしくは５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度）のプロピオネートである。「標準的」濃度のものとは異なる誘導物質濃度の追加の組み合わせを試験し、一連の滴定実験において、最初の実験からの結果を使用して、その後の実験で使用する誘導物質濃度を微調整することができる。同様の滴定実験は、本発明の誘導性共発現系で使用する、Ｌ‐アラビノース、プロピオネート、Ｌ‐ラムノース、及びＤ‐キシロースを含むがこれらに限定されない誘導物質のあらゆる組み合わせで行うことができる。６時間の誘導物質の存在下で増殖された後、細胞をペレット化し、所望の産物を細胞から抽出し、細胞の質量値あたりの産物の収率を、ＥＬＩＳＡ等の定量的免疫学的分析により、または産物の精製及び２８０ｎｍでのＵＶ吸光度による定量化により測定する。
【０１０９】
また、ハイスループットアッセイを用いて誘導物質濃度を滴定することも可能であり、発現されるタンパク質は、ｍＫａｔｅ２赤色蛍光タンパク質（Ｅｖｒｏｇｅｎ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）またはオワンクラゲ及びバチルス・セレウス由来の増強緑色蛍光タンパク質により提供されるもの等の、蛍光タンパク質部分を含むように操作される。ハイスループット滴定実験における誘導物質の異なる濃度により産生される遺伝子産物の量と活性を測定するための別のアプローチは、表面プラスモン共鳴を検出するセンサーまたはバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステム、ｆｏｒｔｅＢＩＯ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡより）を採用するセンサーの等の、生体分子の結合相互作用を測定することが可能なセンサーを用いることである。発現される遺伝子産物に十分な特異性で結合する抗体が利用可能である場合、遺伝子産物は、上の実施例３に記載のＷＥＳ系で実行されるもの等のキャピラリー電気泳動ウエスタンブロットを使用して検出及び定量化することができる。
【０１１０】
実施例６
プロモーターの強度の測定及び誘導性発現の均質性
プロモーターの強度を、適切な対照に対して相対的な、そのプロモーターで開始される遺伝子産物の転写の量として測定する。発現コンストラクトにおける遺伝子産物の発現を方向づける構成的プロモーターについて、適切な対照は、「野生型」バージョンのプロモーター、または「ハウスキーピング」遺伝子由来のプロモーターが、試験されるプロモーターの代わりに使用されることを除いて、同じ発現コンストラクトを使用し得る。誘導性プロモーターについては、プロモーター由来の遺伝子産物の発現を誘導条件下及び非誘導条件下で比較することができる。
【０１１１】
Ａ．プロモーターから転写されたＲＮＡのレベルを測定するために定量的ＰＣＲを用いてプロモーター強度を測定する
Ｄｅ  Ｍｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の方法（”Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｉｎｅ  ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ”，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０  Ｍａｒ  ２４；１０：２６）を使用して、培養で増殖され得る宿主細胞におけるプロモーターの相対的な強度を測定する。試験されるプロモーターを有する発現コンストラクトを含む宿主細胞、及び対照の発現コンストラクトを含む対照宿主細胞を、３通りに培養で増殖する。１ｍｌサンプルを、ｍＲＮＡ及びタンパク質収集のためにＯＤ６００＝１．０で収集する。ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて総ＲＮＡ抽出を行う。ＲＮＡの純度を、ＱＩＡＧＥＮにより推奨されるように、ＦＡアガロースゲル上で確認し、ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍの吸光度を測定することにより決定する。２マイクログラムのＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成し、この合成には、ランダムプライマー及びＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｍ‐ＭｕｌＶリバース転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用した。プロモーターの強度は、プロモーターから産生される転写物に対応するｃＤＮＡを増幅するために設計されたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｉＣｙｃｌｅｒ  ＩＱ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で行われるＲＴ‐ｑＰＣＲにより測定する。（この目的のために、Ｄｅ  Ｍｅｙ  ｅｔ  ａｌ．著者は、Ｆｗ−ｐｐｃ−ｑＰＣＲ及びＲｖ−ｐｐｃ−ｑＰＣＲプライマー、ならびに対照ハウスキーピング遺伝子  ｒｐｏＢ由来のＦｗ−ｒｐｏＢ−ｑＰＣＲ及びＲｖ−ｒｐｏＢ−ｑＰＣＲプライマーを使用した。）ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ  ｑＰＣＲスーパーミックス（ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して、簡潔にＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）インキュベーション（５０℃で２分間）を行い、すぐにＰＣＲ増幅（９５℃で８．５分、９５℃で１５秒、及び６０℃で１分の４０サイクル）及び融解曲線分析（９５℃で１分、５５℃で１分、及び１０秒の５５℃＋０．５℃／サイクルの８０サイクル）を続け、プライマー二量体の存在を確認し、反応の特異性を分析する。ＰＣＲサイクル前のこのＵＤＧインキュベーション工程は、前の反応由来のあらゆる混入ｄＵ含有産物を破壊する。その後、ＵＤＧをＰＣＲサイクル中の高温により不活化することで、真の標的配列の増幅を可能にする。各サンプルは、３通りで行われる。相対的な発現の比を、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の「デルタデルタＣＴ法（Ｄｅｌｔａ−ｄｅｌｔａ  ｃｔ  ｍｅｔｈｏｄ）」を用いて計算する。
【０１１２】
Ｂ．蛍光レポーター遺伝子を用いて、誘導の均一性及び誘導性プロモーター強度を測定する
これらの実験は、Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．の方法を用いて行う（”Ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ａｌｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ａ  ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ；１８２（２４）：７０２９−７０３４）。誘導性プロモーターの誘導を測定する実験は、炭素源として３．４％グリセロールを補充したＣ培地で行う（Ｈｅｌｍｓｔｅｔｔｅｒ，“ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ／ｒ”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６８  Ｆｅｂ  １４；３１（３）：５０７−５１８）。蛍光レポーター遺伝子の発現を制御する少なくとも１つの誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトを含む大腸菌株を、０．６〜０．８の６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学的密度に対する抗生物質選択下で３７℃で増殖する。細胞を遠心分離（１５，０００×ｇ）により収集し、炭素源のないＣ培地で洗浄し、抗生物質、グリセロール、及び／または誘導物質（遺伝子発現誘導用）を含む新鮮なＣ培地で０．１〜０．２のＯＤ６００に再懸濁し、６時間インキュベートする。分析のため、サンプルを増殖中定期的に採取する。培養の蛍光を、３６０／４０ｎｍの波長の励起及び５２０／１０ｎｍの波長のエミッションフィルタで、Ｖｅｒｓａｆｌｕｏｒ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において測定する。誘導での誘導性プロモーター由来の発現の強度は、誘導された細胞の最大個体群の平均化された蛍光（蛍光／ＯＤの比）の対照（例えば、非誘導）細胞のそれに対する比として表す。細胞の個体群内の誘導の均質性を測定するために、アルゴンレーザー（１５ｍＷ及び４８８ｎｍの波長で放射）及び５２５ｎｍの波長バンドパスフィルタを備えるＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）においフローサイトメトリーを行う。分析前に、サンプリングした細胞を、濾過した（フィルタ孔径０．２２マイクロメートル）リン酸緩衝食塩水で洗浄し、希釈して０．０５のＯＤ６００にし、氷上に置く。各サンプルについて、５００〜１，０００事象／秒の速度で３０，０００事象を収集する。各サンプルにおける誘導された（蛍光）細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーデータから計算することができる。
【０１１３】
実施例７
抗体の精製
溶解した宿主細胞を１０分間１０，０００×ｇで遠心分離することによって、本発明の誘導性共発現系により産生された抗体を精製し、あらゆる細胞及び破片を取り除く。上清を、０．４５マイクロメートルのフィルタを通して濾過する。１ｍＬの組換えタンパク質Ｇ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、１ｍｌ／分の流量に達するように設定し、結合緩衝液（ｐＨ７．０の０．０２Ｍリン酸ナトリウム）、溶出緩衝液（ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ）、及び中和緩衝液（ｐＨ９．０の１Ｍトリス−ＨＣｌ）とともに使用する。カラムを５カラム体積（５ｍｌ）の結合緩衝液で平衡化した後、サンプルをカラムに適用する。カラムを５〜１０カラム体積の結合緩衝液で洗浄して不純物及び非結合材料を取り除き、タンパク質が溶出液に検出されなくなるまで継続する（２８０ｎｍのＵＶ吸光度により決定）。その後、カラムを５カラム体積の溶出緩衝液で溶出し、カラムを５〜１０カラム体積の結合緩衝液ですぐに再平衡化する。
【０１１４】
実施例８
抗体結合親和性の測定
「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」として表される抗体結合親和性を、以下のアッセイに記載のように関心の抗体及びその抗原のＦａｂバージョンを用いて行う放射標識抗原結合分析（ＲＩＡ）により測定する。完全長抗体Ｆａｂバージョンの産生は、当該技術分野で周知である。抗原についてのＦａｂの溶液結合親和性を、非標識抗原の滴定シリーズの存在下で最小濃度の（１２５Ｉ）標識された抗原でＦａｂを平衡化することにより測定した後、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートと結合した抗原を捕捉する（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ  Ｆａｂ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ｎｏｖ  ５；２９３（４）：８６５−８８１参照）。分析のための条件を確立するために、マイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５マイクログラム／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で一晩かけてコーティングした後、室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を関心のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｏｃｔ  １５；５７（２０）：４５９３−４５９９における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。その後、関心のＦａｂを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡化に達していることを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続することとしてもよい。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、約１時間）のために捕捉プレートに移す。続いて、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０マイクロリットル／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を添加し、プレートを、１０分間、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で計数する。最大の結合の２０％以下である各Ｆａｂの濃度を、競合的結合測定で使用するために選択する。
【０１１５】
代替的に、ＫｄまたはＫｄ値を、約１０反応ユニット（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを有する２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いる表面プラズモン共鳴分析を用いることにより測定する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の説明に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化する。抗原をｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで５マイクログラム／ｍｌ（約０．２マイクロモル）に希釈した後、５マイクロリットル／分の流量で注入して、約１０ＲＵの結合タンパクを得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。動力学測定のために、Ｆａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）の倍数連続希釈物を、約２５マイクロリットル／分の流量で、２５℃で、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０（商標）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合及び解離センサーグラムを同時に適合させることにより、単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する。オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）が上記表面プラズモン共鳴分析により１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合には、オンレートは、蛍光クエンチング技術を用いることにより測定することができ、これは、分光度、例えば、計撹拌キュベットを有する、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ−ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）において測定して、漸増抗原濃度存在下におけるｐＨ７．２のＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定するものである。
【０１１６】
抗体抗原結合についての平衡解離定数（Ｋｄ）を決定するための別の方法は、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ系（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（ｗｗｗ．ｆｏｒｔｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｏｃｔｅｔ−ＲＥＤ９６．ｈｔｍｌ）を使用する。最初の測定ステップによりベースラインを決定した後、濃度２５ｎＭのＨｉｓ標識した抗原を、１×ＫＢ＋緩衝液（ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡ、０．００２％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中で１０分間、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーに充填したら、別のベースライン測定ステップ（１×ＫＢ＋緩衝液、２分のみ）を続ける。その後、センサーを、抗体を含むウェルに１０分間浸し（会合ステップ）、続いて１×ＫＢ＋緩衝液中で２０分間洗浄して解離を測定する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ速度を決定するＯｃｔｅｔソフトウェアを用いてｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する。
【０１１７】
実施例９
発現産物に存在するジスルフィド結合の特性評価
タンパク質発現産物におけるジスルフィド結合の数及び位置は、非還元条件下で、トリプシン等のプロテアーゼによるタンパク質の消化、及び結果として得られたペプチドフラグメントを、連続的電子移動解離（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＥＴＤ）と衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳステップ（ＭＳ２、ＭＳ３）とを組み合わせた質量分析（ＭＳ）に供することにより測定することができる（Ｎｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−５  ｂｙ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ”，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１２  Ｊａｎ  ６；２８７（２）：１５１０−１５１９；Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｎｏｖ  ２２）。
【０１１８】
共発現されたタンパク質の消化。ジスルフィド結合の再配列を防止するために、まずあらゆる遊離システイン残基をアルキル化によりブロックし、発現されたタンパク質を、４Ｍ尿素入りのバッファ中で、２０℃で３０分振盪しながら、アルキル化剤ヨードアセトアミド（５ｍＭ）を用いて光から保護した状態でインキュベートする。代替的に、ＮＥＭを、アルキル化試薬として、変性条件（６ＭのＧｕａＨＣｌ）下で実施する還元／アルキル化と組み合わせたトリプシンタンパク質分解とともに使用することが好ましい。アルキル化の後、共発現したタンパク質を、プレキャストゲルを使用する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離する。代替的に、共発現されたタンパク質を、ヨードアセトアミドもしくはＮＥＭとともに、または対照用にそれらなしで、電気泳動後のゲル中でインキュベートする。タンパク質バンドを染色し、２倍の脱イオン水で脱染し、切除し、２０℃で３０分間振盪しながら、５００マイクロリットルの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中で２回インキュベートする。タンパク質サンプルを、１００％アセトニトリルで約２分間脱水し、真空遠心分離により乾燥させ、氷上で１５分間、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌのトリプシンまたはキモトリプシンを用いて再水和させる。過剰な緩衝液を取り除き、酵素のない５０マイクロリットルの同じバッファで置き換えた後、振盪しながら、トリプシン及びキモトリプシンについて、それぞれ、３７℃または２０℃で、１６時間インキュベートする。３マイクロリットルの８８％ギ酸を添加し、短時間ボルテックスした後で分解を停止させ、上清を取り除き、分析まで−２０℃で保存する。トリプシン分解による配列包括度が不十分（７５％未満）である場合、代替的なタンパク質断片化法（ＬｙｓＣ、Ｇｌｕ−Ｃ、またはＣＮＢｒ）を使用する。還元剤ＴＣＥＰ（ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）をＮＥＭの存在下の酸性条件下で使用することにより、部分的にインタクトなジスルフィド結合を有する断片へのアクセスが得られる。ジスルフィドインタクト分解マップ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｉｎｔａｃｔ  ｄｉｇｅｓｔ  ｍａｐ）を還元（ＤＴＴまたはＴＣＥＰ）分解マップと比較する。
【０１１９】
質量分析によるジスルフィド結合の局在性。ペプチドを、０．１％ギ酸を含む移動相にて、２０マイクロリットル／分で、１ｍｍ×８ｍｍトラップカラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に注入する。その後、トラップカートリッジを、５ｍｍのＺｏｒｂａｘ  ＳＢ‐Ｃ１８固定相（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を含む０．５ｍｍ×２５０ｍｍカラムに沿って配置し、ペプチドを、１１００シリーズキャピラリーＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、１０マイクロリットル／分で９０分にわたる２％から３０％のアセトニトリル勾配により分離する。代替的に、ＵＰＬＣに好適なＣ１８カラムを使用する。ペプチドを、ＥＴＤソースによりＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓリニアイオントラップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて分析する。Ｃａｐｔｉｖｅ  Ｓｐｒａｙソース（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、または好ましくは３．０ｋＶのコーティングしていない引き裂いた溶融石英エミッタ（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｅｔｔｓ）を使用して、エレクトロスプレイイオン化を行った。代替的に、中型のタンパク質分解断片の分析を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ−ＦＴ  ＭＳ（７  Ｔｅｓｌａ）機器またはＳｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓｉ四重極進行波イオン移動度飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して行う。好ましくは、ペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析する。ジスルフィド結合ペプチドは、とカルボキシ末端にある２つのＮ−末端及び２つの塩基性残基（アルギニンまたはリジン）の存在に起因して、トリプシン処理後に＋４以上の電荷状態を有する。これらのジスルフィド結合ペプチドをＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）機器によって選択的に単離することで、ＥＴＤ断片化を使用してジスルフィド結合を破壊することができる。サーベイＭＳスキャンの後、サーベイスキャン中で最も強いイオンに対してＣＩＤ及びＥＴＤ  ＭＳ２スキャンからなる７つのデータ依存性スキャンを行い、その後、ＥＴＤ  ＭＳ２スキャン中で１〜５番目に強いイオンに対して５つのＭＳ３  ＣＩＤスキャンを行う。ＣＩＤスキャンは、正規化された３５の衝突エネルギーを使用し、ＥＴＤスキャンは、追加の活性化を有効にして、１００ｍｓの活性化時間を使用する。ＭＳ２  ＣＩＤ及びＥＴＤスキャンを開始するための最小のシグナルは１０，０００であり、ＭＳ３  ＣＩＤスキャンを開始するための最小シグナルは１０００であり、全てのＭＳ２及びＭＳ３スキャンの分離幅は３．０ｍ／ｚである。ソフトウェアの動的排除（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）機能は、１の繰返し回数、１００の排除リストサイズ、及び３０秒の排除期間で有効化する。ＥＴＤ  ＭＳ２スキャンの収集のための標的特異的架橋種に対する包含リストを使用する。ＭＳ２��びＭＳ３スキャンについての分離データファイルを、ＺＳＡ電荷状態分析を用いるＢｉｏｗｏｒｋｓ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により作製する。ペプチド配列に対するＭＳ２及びＭＳ３スキャンのマッチングを、Ｓｅｑｕｅｓｔ（Ｖ２７，Ｒｅｖ  １２，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により行う。分析は、酵素特異性、２．５の親イオン質量許容差、１．０のフラグメント質量許容差、及び酸化したメチオニン残基についての＋１６の変動質量なしで実行する。その後、結果を、最小のペプチド及びタンパク質確立９５％及び９９％を使用するプログラムＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｖ３＿００＿０８，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析する。データ解釈用ソフトウェアツールは、Ｄｉｓｕｌｆｉｎａｔｏｒ  ｎｏｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴うＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）２．０も含む。ＭＳ３結果からのペプチドをスキャン数によってソートし、ペプチドを含むシステインを、ＥＴＤ  ＭＳ２スキャンから観察される５つの最も強いイオンから産生されるＭＳ３スキャンのグループから同定する。ジスルフィド結合種に関与するシステインペプチドの同一性を、サーベイスキャン及びＥＴＤ  ＭＳ２スキャンで観察される親イオン質量を手動で検査することによってさらに確認する。
【０１２０】
実施例１０
細菌性の細胞ペリプラズム由来、スフェロプラスト由来、細胞全体由来の発現産物の分離
本発明の誘導性発現系は、細胞質またはペリプラズム等の、細胞の異なるコンパートメントに蓄積する遺伝子産物を発現させるために使用することができる。大腸菌またはＳ．セレビシエ等の宿主細胞は、外側の細胞膜または細胞壁を有し、外膜または壁が取り除かれる場合にスフェロプラストを形成し得る。このような宿主で作製される発現されたタンパク質は、以下の方法を用いて、特に、ペリプラズムから、またはスフェロプラストから、または細胞全体から精製され得る（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，“Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｒａｐｉｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ（商標）Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ  Ｋｉｔ”，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｆｏｒｕｍ  １９９８  ５（１）：５；ｗｗｗ．ｅｐｉｂｉｏ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ／ｆ５＿１／ｆ５＿１ｐｐ．ａｓｐ参照）。ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ（商標）Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ；ｗｗｗ．ｅｐｉｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｄｆｔｅｃｈｌｉｔ／１０７ｐｌ０６１２．ｐｄｆで実行可能な手順）を用いるこの方法は、大腸菌及び他のグラム陰性菌について設計されるが、一般的なアプローチは、Ｓ．セレビシエのような他の宿主細胞のために変更することができる。
【０１２１】
１．細菌性の宿主細胞培養は、固定相にあるより古い細胞培養が通常リゾチーム処理にいくらかの耐性を示すため、後期の対数期までしか増殖させない。組換えタンパク質の発現が過剰である場合、細胞が早期に溶解することがあるため、細胞培養は、過剰なタンパク質合成を誘導し得る富栄養培地またはより高い増殖温度では増殖させない。その後、タンパク質発現を誘導する。細胞は対数期または早期の固定期にあるべきである。
【０１２２】
２．細胞培養物を、室温で、１０分間、最低１０００×ｇでの遠心分離によりペレット化する。注記：細胞は新鮮でなければならず、凍結してはならない。本プロトコルに必要とされる試薬の量を計算するために、細胞ペレットの湿重量を決定する。
【０１２３】
３．細胞を、細胞１グラムにつき最低２ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ  Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５の２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び３０Ｕ／マイクロリットルのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）中に完全に再懸濁させる。注記：過剰な撹拌は、細胞質タンパク質によりペリプラズム分画の汚染をもたらすスフェロプラストの早期の溶解を引き起こす場合がある。
【０１２４】
４．室温で５分間インキュベートする。Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅを、室温で最適に活性化する。より低い温度（０℃〜４℃）での溶解には追加のインキュベーション時間が必要とされ、このような温度では、インキュベーション時間は２〜４倍に延びる。
【０１２５】
５．もとの細胞のペレット重量１グラムにつき３ｍｌの精製水を４℃で添加し（ステップ２）、倒置により混合する。
【０１２６】
６．１０分間氷上でインキュベートする。
【０１２７】
７．溶解された細胞を、室温で１５分間、最低４０００×ｇの遠心分離によりペレット化する。
【０１２８】
８．ペリプラズム分画を含む上清を清潔な試験管に移す。
【０１２９】
９．混入している核酸を分解するために、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ  ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅをＰｅｒｉＰｒｅｐｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに任意で添加する。ヌクレアーゼの包含は、概して、タンパク質の収率及び溶解物の操作の容易性を向上させるが、ヌクレアーゼの追加は、いくつかの場合で望ましくなく、例えば、ヌクレアーゼの使用は、残りのヌクレアーゼ活性またはマグネシウム補助因子に対する一次的な露出が、その後のアッセイまたは精製されたタンパク質の使用と干渉する場合には、避けるべきである。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅを不活化するための溶解物へのＥＤＴＡの添加は、同様に、その後のアッセイまたは精製されたタンパク質の使用に干渉し得る。ヌクレアーゼを添加する場合、２マイクロリットルのＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ及び１０マイクロリットルの１．０ＭのＭｇＣｌ２を、ステップ１０で必要とされるＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ１ミリリットルにつき１ｍｌまでＰｅｒｉＰｒｅｐｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のデオキシコール酸塩）で希釈する。
【０１３０】
１０．ペレットを、元の細胞ペレット重量１グラムにつき５ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。
【０１３１】
１１．ペレットを室温で１０分間インキュベートする（含まれる場合には、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性により粘度の著しい減少は生じ、インキュベーションは、細胞懸濁液が水の稠度になるまで継続する）。
【０１３２】
１２．細胞残屑を、４℃で１５分間、最低４０００×ｇでの遠心分離によりペレット化する。
【０１３３】
１３．スフェロプラスト分画を含む上清を清潔な試験管に移す。
【０１３４】
１４．ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼをＰｅｒｉＰｒｅｐｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに添加し、結果として得られるスフェロプラスト分画１ミリリットルにつき２０マイクロリットルの５００ｍＭのＥＤＴＡを添加して、マグネシウムをキレート化する（溶解物中のＥＤＴＡの最終濃度は１０ｍＭである）。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅによる核酸の加水分解後には、溶解物は相当量のモノまたはオリゴヌクレオチドを含み得る。これらの分解産物の存在は、溶解物のさらなる処理に影響を及ぼし得る。例えば、ヌクレオチドは、樹脂と相互作用することにより陰イオン交換樹脂の結合性能を低減させ得る。
【０１３５】
上記の手順は、以下の修正により、全細胞タンパク質を調製するために使用することができる。ステップ２でペレット化した細胞は、新鮮であっても、凍結させてもよく、ステップ４では、細胞を１５分間インキュベートし、ステップ５〜８を省略し、ステップ１０では、元の細胞ペレット重量１グラムにつき３ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを添加する。
【０１３６】
ペリプラズム、またはスフェロプラスト、または細胞全体のタンパク質サンプルの調製後、サンプルを、いくつかのタンパク質特徴化及び／または定量化方法のいずれかによって分析し得る。一例では、ペリプラズム及びスフェロプラストタンパク質の分画の成功は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペリプラズム分画及びスフェロプラスト分画の両方のアリコートを分析することにより確認する（２マイクロリットルの各分画が、概して、クーマシーブリリアントブルーで染色することによる可視化のために十分である）。所与の分画における特有のタンパク質の存在または特定のタンパク質の濃縮は、分画の成功を示す。例えば、宿主細胞が、アンピシリン耐性マーカーを有する高いコピー数のプラスミドを含む場合には、主にペリプラズム分画におけるβ−ラクタマーゼ（３１．５ｋＤａ）の存在が、分画の成功を示す。ペリプラズムスペースで見られる他の大腸菌タンパク質は、アルカリホスファターゼ（５０ｋＤａ）及び伸長因子Ｔｕ（４３ｋＤａ）を含む。所与の分画で見られるタンパク質の量は、いくつかの方法のいずれかを用いて定量化することができる（例えば、とりわけ、染色されたもしくは標識されたタンパク質バンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びデンシトメトリー分析、放射標識されたタンパク質のシンチレーション測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはシンチレーション近接アッセイ）。スフェロプラスト分画と比較してペリプラズム分画で見られるタンパク質の量を比較することで、タンパク質が細胞質からペリプラズム内にエクスポートされた程度が示される。
【０１３７】
実施例１１
ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列類似性の測定
ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列同一性のパーセンテージは、並んだ記号、つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸の、並んだ配置両方において同一である数を、ギャップを含む、２つの配列のならびにおける記号の総数で除したものとして定義される。２つの配列間の類似性の程度（同一性のパーセンテージ）は、ウェブサイトのｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを通じて利用可能である、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル配列アライメントツールにて国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）により実現されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のグローバルな配置法を用いて配列を配置することにより測定されることとしてもよい。一実施形態では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアライメントパラメータをデフォルトの値に設定する（それぞれ２及び−３のマッチ／ミスマッチスコア、ならびにそれぞれ５及び２のＥｘｉｓｔｅｎｃｅ及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎのＧａｐ  Ｃｏｓｔ）。配列比較分野の当業者により使用される他のプログラムを配列アラインメントに使用してもよく、他のプログラムとは、例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ  ウェブサイトに記載されるデフォルトのパラメータ設定を用いて、ＮＣＢＩにより実行されるような、ベーシックなローカルアライメントサーチツールまたはＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０  Ｏｃｔ  ５；２１５（３）：４０３−４１０）である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、以下のように使用され得る２つを含む、任意の多重パラメータを有する：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント、または好ましくは使用されないかもしくは「オフ」に設定される短周期性の内部反復からなるセグメントをマスクするためのフィルタの包含、及び（Ｂ）「エクスペクト」またはＥスコアと呼ばれる、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値（単に偶然に見出されるマッチの期待される確率、マッチに帰される統計学的有意性がこのＥスコア閾値よりも大きい場合、マッチは報告されないことになる）。この「エクスペクト」またはＥスコア値がデフォルト値（１０）から調整される場合、好ましい閾値は０．５、または０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、及び０．０００００１の順で優先性が増加する。
【０１３８】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術における多くの従来技術が任意に使用される。このような従来技術は、ベクター、宿主細胞、及び組換え方法に関する。これらの技術は、周知であり、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００６年を通して追補）で説明されている。例えば、細胞の分離及び培養について、ならびに続く核酸またはタンパク質分離についての他の有用な参照文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及び本書で引用されている参照文献、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｅｄｓ．）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（Ｅｄｓ．）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。核酸を作製する方法（例えば、インビトロ増幅、細胞からの精製、または化学合成による）、核酸を操作するための方法（例えば、部位特異的突然変異、制限酵素の消化、ライゲーション等による）、ならびに核酸を操作及び作製するのに有用な種々のベクター、細胞株等が、上記参考文献に記載される。さらに、本質的にあらゆるポリヌクレオチド（標識されたまたはビオチン化されたポリヌクレオチドを含む）が、様々な市販ソースのいずれかから、特別注文または標準注文することができる。
【０１３９】
本発明は、本発明の実施についての一定の様式を含むために見出されるまたは提案される特定の実施形態の見地から記載される。本開示に照らして、種々の変更及び変化が、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例証される特定の実施形態においてなされ得ることが当業者により理解されるであろう。
【０１４０】
特許公開公報を含む、全ての挙げられた参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。公開されている遺伝子位置または他の記載により言及される、ヌクレオチド及び他の遺伝子配列もまた、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【０１４１】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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