(57)【要約】本発明は、細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、生存、保護、増殖、及び／または表現型調節を誘発するための、ならびに対象の疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。2018525335.tif 000006
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の抗アポトーシス因子、生存促進性因子、及び／または再生促進性因子を含む、標的細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、保護、生存、及び／もしくは増殖、ならびに／または表現型調節を誘発するための組成物であって、前記１つまたは複数の因子が、表Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに記載されるものから選択される、前記組成物。
【請求項２】
前記因子が、供給源細胞から分泌される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記供給源細胞が、真核細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記供給源細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記供給源細胞が、ヒト細胞である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記供給源細胞が、肝細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記供給源細胞が、組換えにより操作された細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記供給源細胞が、肝芽腫由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記供給源細胞が、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記供給源細胞が、親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記標的細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標的細胞が、肝臓由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記標的細胞が、肝芽腫由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的細胞が、疾患状態の肝臓の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記疾患が、肝硬変、肝炎または脂肪肝疾患である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記因子が、少なくともアンフィレギュリン（ＡＲ）または可溶性Ｆａｓ受容体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記因子が、少なくともアンフィレギュリン（ＡＲ）及び可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記因子が、表Ｉに列挙されるものから選択される１つまたは複数の付加的な因子をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記因子が、表Ｉに列挙されるものから選択される１つまたは複数の分裂促進因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記因子が、表Ｉに列挙されるものから選択される、非疾患関連細胞においてアポトーシス関連シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記因子が、表Ｉに列挙されるものから選択される、患関連細胞においてアポトーシスを促進する１つまたは複数の因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記因子が、表Ｉに列挙されるものから選択される、改善された細胞機能をもたらす表現型シフトを誘発する１つまたは複数の因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
複数の前記因子の各々が、少なくとも１、１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記因子が、活性化された星状細胞においてアポトーシスを誘発するが、しかし活性化されていない星状細胞ではアポトーシスを誘発しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、真核細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記真核細胞が、肝細胞または肝芽腫由来の細胞である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記真核細胞が、組換えにより操作された細胞である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記真核細胞が、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃ３Ａ細胞、または親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
標的細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、保護、生存、及び／もしくは増殖、ならびに／または表現型調節を誘発する方法であって、前記標的細胞を、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物と接触させ、それによって前記標的細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、保護、生存、及び／もしくは増殖、ならびに／または表現型調節を誘発することを含む、前記方法。
【請求項３１】
前記標的細胞が、真核細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的細胞が、哺乳類細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的細胞が、肝細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、肝芽腫由来の細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、疾患状態の肝臓の細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患が、肝硬変、肝炎または脂肪肝疾患である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的細胞が、インビトロで接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的細胞が、固体基質に接着している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的細胞が、半固体基質に埋め込まれている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的細胞が、インビボで接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
複数の前記因子が、前記標的細胞を含む対象に連結された体外血液解毒システムの活性カートリッジ内において生成される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
複数の前記因子を検出することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的細胞が、１、６、２４、４８、６０、７２または８４時間を超えて継続的に接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
対象の疾患または障害を治療する方法であって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与し、それによって前記疾患または障害を治療することを含む、前記方法。
【請求項４６】
前記疾患または障害が、炎症性疾患である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が、自己免疫疾患または自己炎症性疾患である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患が、肝硬変、肝炎及び脂肪肝疾患からなる群から選択される肝臓疾患である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が、前記対象の循環系に投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が、前記対象に連結された体外血液解毒システムを介して投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物が、前記血液解毒システムの活性カートリッジ内において細胞により生成される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記血液解毒システムが、
ａ）前記対象の循環系に連結され、かつ血液を前記対象から限外ろ過液発生器を通してまた前記対象へと通わせるよう作動する血液回路、
ｂ）前記限外ろ過液発生器に連結され、かつ前記限外ろ過液発生器から限外ろ過液を取り出すよう、及び前記血液の細胞成分とは独立に限外ろ過液を処理するよう作動する再循環回路であって、ここで処理は、複数の前記因子を含む前記組成物を生成する細胞を含む活性カートリッジに前記限外ろ過液を通すことと、前記限外ろ過液に前記因子を導入することとを含む、前記再循環回路、ならびに
ｃ）前記対象に再導入する前に、前記再循環回路内の限外ろ過液と、前記血液回路内の細胞成分とを再び組み合わせるよう作動する導管接合部
を備える、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
複数の前記因子を検出することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物が、１、６、２４、４８、６０、７２または８４時間を超えて継続的に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
親Ｃ３Ａ細胞株から誘導された適任のＣ３Ａ細胞株であって、前記細胞株の細胞が、表Ｉに記載される複数の因子を発現する、前記細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下で、２０１５年６月１５日に出願された、米国仮特許出願第６２／１７５，９４７号、及び２０１５年１１月６日に出願された、米国仮特許出願第６２／２５２，２１９号の優先権を主張し、それらの全体を、参照として本明細書に組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、細胞生物学に関し、及びより詳細には、細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、生存、保護、増殖、及び／または表現型調節を誘発するための、ならびに対象における疾患を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
非限定的に、細菌、ウイルス、身体的傷害、化学傷害（例えば、アルコール、薬物など）、がん、化学療法、及び放射線治療を含む、種々の作用物質は、特定の作用物質及びそれに曝される動物の遺伝子構造に応じて、細胞及び組織への直接的な損傷を引き起こし、または長期で過度の炎症の環境を作り出す。通常の状態では、炎症は、動物が傷害から回復するのに役立つプロセスである。急性炎症は、有害な刺激への組織の初期反応である。それには、マクロファージ、樹状細胞、組織球、クッパー細胞、及びマスト細胞を含む、損傷した組織に存在する細胞が、その傷害に関連している分子を感知し、及び活性化された場合に開始される、複雑で、高度に制御されたプロセスが関与する。活性化に際して、これら細胞は、血管拡張物質などの炎症性メディエーターを放出する。この血管拡張物質は、傷害の近傍において、血流及び血管透過性の増加を誘発する。これは、次に、その損傷した組織へ、血液からの血漿及び白血球（好中球及びマクロファージを含む）の移動の増加をもたらす。炎症性メディエーターは、一般に、急速に分解されるため、急性炎症は、それが維持されるためには、持続的な刺激を必要とする。その結果、有害な刺激が一旦取り除かれると、急性炎症は終焉する。
【０００４】
慢性炎症は、肝炎、肝硬変、及び脂肪肝疾患などの肝疾患、心疾患、がん、呼吸器疾患、脳卒中、アルツハイマー病などの神経疾患、糖尿病、及び腎疾患を含む、多数の、広範囲な衰弱性疾患への寄与要因であると考えられている。慢性炎症の結果は、正常組織の破壊及びそれのコラーゲン豊富な結合組織との交換である。コラーゲン豊富な結合組織は、瘢痕組織としても知られており、正常組織と比較して低下した組織機能を示す。瘢痕組織の持続的かつ長期的な形成は、次に、線維症を引き起こす。線維症は、肺、皮膚、肝臓、心臓、及び骨髄に影響を与える疾患の、一般的な症状の一つであり、及び特発性肺線維症、強皮、ケロイド、肝硬変、心筋線維症、糖尿病性腎疾患、骨髄異形成症候群、及びその他の障害などの疾患における、重要な要因である。
【０００５】
慢性炎症及び線維症の研究は、活性化物質及び影響を受ける組織とは無関係に、シグナル伝達タンパク質の一般的なネットワークが、炎症促進状態を確立するために、同時に機能する傾向があることを示している。このシグナル伝達タンパク質のネットワークは、多数の異なるサイトカイン、サイトカイン受容体、転写因子などを含んでいる。
【０００６】
血液処理は、肝炎などの炎症性肝疾患を含む治療目的に対応して、様々な血液成分を除去するために実施されてきた。血液処理方法の例示には、不十分な腎機能に苦しむ患者の血液から、代謝老廃物を除去することを可能にする透析を含む。患者から流れる血液は、これらの老廃物を除去するためにろ過され、及びその患者に戻される。血漿交換法ではまた、様々な疾患状態の治療に対応して、接線流膜分離を利用して血液を処理する。膜孔のサイズは、不要な血漿成分の除去に対応して選択できる。血液中に存在する生物学的成分を改変するために、生化学反応を利用した種々の装置を用いて、血液を処理することも可能である。例えば、ビリルビンまたはフェノールなどの血液成分を、膜表面に結合している酵素を介して、血液血漿の体外循環によって、糖化または硫酸化することができる。
【０００７】
現在利用されている技術は一般に、例えば、易感染性の肝機能を持つ患者を支援することに関しては、不十分である。従来のシステム及び方法では、移植のために適切なドナーの臓器を見つけことができるまで、またはその患者の元来の肝臓が健康な状態に再生できるまで、そのような患者を維持することに関連した、様々な問題に悩まされる。
【０００８】
肝臓は、損傷した際の組織の損失を再生し、及び交換する巨大な能力を持っている。肝細胞は、肝臓機能の大部分を提供し、及びＭＥＴ（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対応する受容体、及び様々な配位子と相互作用する、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ））などの、主として細胞表面受容体の活性化を介した再生刺激に反応する。仮に内在する肝細胞が増殖することができない場合、肝細胞機能は、胆管の近くに位置する、分化転換された胆管上皮細胞から派生すると考えられている、再生細胞プールからの機能で、置き換えられる。慢性アルコール摂取、ウイルス感染、または劇症毒物による肝炎の患者では、その内在肝細胞は、複製能を減少させている。
【０００９】
過度の炎症、及び／または細胞の増殖もしくは生存率の低下を引き起こす症状についての知識が、増加しているにもかかわらず、そのような症状の治療法が、ほとんど定まらないままになっている。したがって、そのような疾患を治療する、より先進的な組成物及び方法に対する要求がある。
【発明の概要】
【００１０】
１つの態様において、本開示は、細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、生存、保護、増殖、及び／または表現型調節を誘発するための組成物を提供する。当該組成物には、表ＩまたはＩＩに記載されるものから選ばれる、１つ以上の、抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、生存、保護、増殖、及び／または表現型調節の因子を含む。
【００１１】
他の態様において、本開示は、細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、保護、生存、及び／もしくは増殖、ならびに／または表現型調節を誘発する方法を提供する。この方法には、細胞を本開示の組成物と接触させ、それにより、細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、保護、生存、及び／もしくは増殖、ならびに／または表現型調節を誘発することを含む。
【００１２】
さらに他の態様において、本開示は、対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。当該方法には、本開示の組成物をその対象に投与し、それにより、その疾患または障害を治療することを含む。
【００１３】
またさらに他の態様において、本開示は、親Ｃ３Ａ細胞株から誘導された適任のＣ３Ａ細胞株を提供し、ここでその細胞株の細胞は、炎症誘発性サイトカインなどの炎症誘発性分子に反応して、表ＩまたはＩＩに記載されるものから選ばれる、１つ以上の因子を発現する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図２】本発明の実施形態に関連したデータを描写した、プロット図である。
【図３】従来技術の体外ろ過及び解毒システムを示す、簡略化したブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、特定のＣ３Ａクローン細胞株の細胞が、肝臓再生及び肝細胞増殖に関与する、種々の分泌因子を産生することが可能であるという、予期せぬ所見に基づいている。これらの因子は、対象の循環系への導入時に、直接的な肝細胞への直接刺激を介して、または間接的なその他の内在細胞集団との相互作用を介してのいずれかで、肝臓再生を促進する。この知識は、細胞の抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、保護、生存、及び／もしくは増殖、ならびに／または表現型調節を誘発し、さらに疾患を治療する、組成物及び方法を提供するための基礎をなす。
【００１６】
本発明の組成物及び方法のさらなる記載に先立ち、本発明は、記載された特定の組成物、方法、及び実験条件に限定されず、したがって、組成物、方法、及び条件は、変動する可能性があることが理解されよう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみに限定されるものであって、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、及び限定を意図してはいないこともまた、理解されよう。
【００１７】
本開示における方法の原則及び運用は、図面及び付随する説明を参照して、より良好に理解することができる。
【００１８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その文脈で明確に指示されない限り、複数参照を含む。したがって、例えば、「その方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する参照には、本開示を読む当業者などにとって明確になるように本明細書に記載される、１つ以上の方法、及び／または形式のステップを含む。
【００１９】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野において、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは同等の、任意の方法及び材料が、本開示の実践または試験に使用され得るが、いくつかの好ましい方法及び材料が記載される。
【００２０】
本明細書に記載される本発明は、１つ以上の、抗アポトーシス、生存促進性、及び／または再生促進性因子を含む組成物に関する。当該組成物は、炎症性疾患または障害などの、疾患、障害、またはそれ以外の異常な症状の治療での使用に対応した、医薬組成物を生み出すために使用されて良い。
【００２１】
本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳類の対象を指す。このように、類目が哺乳類の任意の動物の治療が想定される。そのような動物には、非限定的に、馬、猫、犬、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、非ヒトの霊長類及びヒトを含む。したがって、本開示の方法は、ヒトへの使用だけでなく、獣医学の用途に使用することが意図されている。
【００２２】
本明細書に記載の、対象の「治療」とは、治療的処置及び予防または予防対策の両方を指す。治療を必要とする者には、すでに疾患や障害を持つものだけではなく、それが防止されているものも含まれる。したがって、当該対象は、疾患または障害を有すると診断されている可能性があり、または疾患もしくは障害の傾向があるかまたは影響を受けやすい可能性がある。
【００２３】
発現の「有効量」とは、疾患または障害を、予防し、改善しもしくは治療するために有効である、抗アポトーシス、生存促進性、及び／または再生促進性因子の量を指す。そのような有効量は一般に、疾患または障害の兆候、症状、またはその他の指標において、改善をもたらす。例えば、肝疾患においては、有効量は、弱った肝機能を示す、生化学的マーカーの減少をもたらす。
【００２４】
疾患または障害の「症状」は、任意の病的な現象、またはその対象及び疾患または障害を示す者が経験した、構造、機能、もしくは感覚における正常からの逸脱である。
【００２５】
本明細書に使用される「炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状」には、非限定的に、敗血症、感染症（ウイルス、細菌または真菌感染症など）、尋常性座瘡、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、自己免疫疾患、セリアック病、慢性（プラーク）前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、クローン病、潰瘍性大腸炎）、骨盤内炎症疾患、再かん流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶、血管炎、間質性膀胱炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー（タイプ１、２、及び３の過敏症、花粉症）、全身性硬化症としての炎症性筋疾患などの、炎症に関連する疾患を含み、または炎症成分を有していて良く、及び皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫性疾患、ビタミンＡ欠乏症、がん（固形腫瘍、胆嚢がん）、歯周炎、肉芽腫性炎症（結核、ハンセン病、サルコイドーシス、及び梅毒）、線維素性炎症、化膿炎症、漿液性炎症、潰瘍性炎症、ならびに虚血性心臓病、Ｉ型糖尿病、及び糖尿病性腎症を含む。
【００２６】
特定の実施形態において、当該炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状には、炎症と関連するか、または炎症成分を有する、例えば過敏症の１つ以上のタイプに対応する、多数の自己免疫性の疾患または障害を含む。過敏症の１つ以上のタイプに対応する、例示的な自己免疫疾患または障害には、アトピーアレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性じんましん、セリアック病、寒冷凝集素症、接触皮膚炎、クローン病、１型糖尿病、円板状エリテマトーデス、胎児赤芽球症、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、エリテマトーデス、メニエール病、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、デビック病、神経性筋強直症、眼瘢痕類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連付けられている小児自己免疫神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、側頭動脈炎（または「巨細胞性動脈炎」とも呼ばれる）、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、じんましん様血管炎、及び血管炎を含む。
【００２７】
肝臓における、炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状には、脂肪肝疾患、肝硬変、肝臓がん、及びウイルス感染によって引き起こされる、急性または慢性肝炎（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎）、アルコール性肝炎、薬物または化学的中毒（例えば、四塩化炭素、アメトプテリン、テトラサイクリン、アセトアミノフェン、フェノプロフェンなど）、単核球症、アメーバ赤痢、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による、その他の系統の感染症、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、または細菌を含んで良い。
【００２８】
腎臓における、炎症性の疾患、傷害、またはその他の異常症状は、急性または慢性腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症（ベルガー病）、糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、慢性腎臓病（ＣＫＤ）及び炎症に関連する自己免疫疾患、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、腎盂腎炎、運動腎炎、腎臓結石、及び痛風と関連していて良い。
【００２９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、大腸と小腸の炎症症状の一群である。ＩＢＤの主要なタイプは、クローン病及び潰瘍性大腸炎である。ＩＢＤのその他の形態には、通常、常にＩＢＤとして分類されるわけではないが、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸に発生した腸炎、ベーチェット病、及び不確定大腸炎を含む。
【００３０】
炎症性疾患、障害、またはそれ以外の膵臓の異常症状には、さまざまな原因及び症状を持つ膵炎の種々の形態を含み、アルコール、胆石、薬（例えば、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ジダノシン及びペンタミジンなどのＨＩＶ薬、利尿剤、抗痙攣性バルプロ酸、化学療法薬のＬ−アスパラギナーゼ及びアザチオプリン、血液トリグリセリドを増加する方法によるエストロゲン、コレステロール低下スタチン、及びメトホルミン、ビルダグリプチン、シタグリプチン、ならびに糖尿病薬のグリプチン）、外傷、おたふく風邪、自己免疫疾患、サソリ刺傷、高血中カルシウム、高血中トリグリセリド、低体温症、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、膵臓癒合、妊娠、２型糖尿病、膵臓がん、膵管結石、血管炎（膵臓の小さな血管の炎症）、コクサッキーウイルス感染症、及びポルフィリン症−特に急性間欠性ポルフィリン症ならびに赤血球増殖性プロトポルフィリン症、ウイルス感染症（コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、おたふく風邪、水痘帯状疱疹ウイルスによる）、細菌感染症（レジオネラ、レプトスピラ、マイコプラズマ、サルモネラ）、真菌感染症（アスペルギルス）、または寄生感染症（回虫、クリプトスポリジウム、トキソプラズマ）によって引き起こされる膵炎を含む。
【００３１】
本発明は、概してタンパク質である、１つ以上の、抗アポトーシス、生存促進性、及び／または再生促進性の因子を含む組成物を提供する。実施形態において、当該１つ以上の因子は、表ＩまたはＩＩに記載されるものから選択され、いずれのものも、任意のそれらの組み合わせを含んで良い。
【００３２】
（表Ｉ）本開示の因子（例えば、抗アポトーシス、生存促進性、及び／または再生促進性因子）
2018525335.tif 000003
【００３３】
（表ＩＩ）本開示の因子（例えば、抗アポトーシス、生存促進性、及び／または再生促進性因子）
2018525335.tif 000004
【００３４】
多様な実施形態において、１つ以上の因子には、少なくともＡＲまたはｓＦＡＳを含む。１つの実施形態において、当該１つ以上の因子には、ＡＲ及びｓＦＡＳの両方、ならびに既知の分裂促進因子、非疾患関連細胞における、アポトーシス関連シグナル伝達を阻害する因子、疾患関連細胞における、アポトーシスを促進する因子、及び／または改善された細胞機能をもたらす、表現型シフトを誘発する因子などの、表ＩまたはＩＩからの任意の１つ以上の付加的な因子を含む。
【００３５】
１つの態様において、当該１つ以上の因子には、表Ｉに記載されたもののすべてを含む。１つの態様において、当該１つ以上の因子には、表ＩＩに記載されたもののすべてを含む。
【００３６】
１つ態様において、当該１つ以上の因子には、ＡＲ、ｓＦＡＳ及び１つ以上の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ、ヘパリン結合性表皮増殖因子、血小板由来増殖因子ＢＢ、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子Ｃ、胎盤増殖因子、アンジオポエチン２、エリスロポエチン、幹細胞因子または任意のそれらの組み合わせを含む。実施形態において、当該１つ以上の因子には、ＡＲ、ｓＦＡＳ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ、ヘパリン結合性表皮増殖因子、血小板由来増殖因子ＢＢ、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子Ｃ、胎盤増殖因子、アンジオポエチン２、エリスロポエチン、及び幹細胞因子を含む。
【００３７】
１つの実施態様において、当該１つ以上の因子には、ＡＲ、ｓＦＡＳ及びＡＡＴ、Ａ２Ｍａｃｒｏ、Ａｐｏ  Ａ−Ｉ、Ａｐｏ  Ａ−ＩＩ、Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ、Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ、Ａｐｏ  Ｈ、β２Ｍ、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、エオタキシン−１、第ＶＩＩ因子、フェリチン（ＦＲＴＮ）、フィブリノゲン、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質１（ＰＡＩ−１）、セロトランス（トランスフェリン）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＴＩＭＰ−１、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、またはそれらの任意の組み合わせの１つ以上を含む。１つの実施態様において、当該１つ以上の因子には、ＡＲ、ｓＦＡＳ、ＡＡＴ、Ａ２Ｍａｃｒｏ、Ａｐｏ  Ａ−Ｉ、Ａｐｏ  Ａ−ＩＩ、Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ、Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ、Ａｐｏ  Ｈ、β２Ｍ、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、エオタキシン−１、第ＶＩＩ因子、フェリチン（ＦＲＴＮ）、フィブリノゲン、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質１（ＰＡＩ−１）、セロトランス(トランスフェリン)、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＴＩＭＰ−１、及びトランスサイレチン（ＴＴＲ）を含む。
【００３８】
実施形態において、当該１つ以上の因子は、表Ｉに記載されるものなどの、ポリペプチドである。実施形態において、当該組成物は、ポリペプチドなどの１つ以上の因子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって、その他方の１つに連結したアミノ酸残基の直鎖系列を指定することと、本明細書では同義に使用される。
【００３９】
実施形態において、当該組成物は、ＡＲまたはｓＦＡＳなどの、表Ｉからの単独の因子を含む。その他の実施形態において、当該医薬組成物は、ＡＲ及びｓＦａｓなどの、表Ｉからの２つ以上の因子の組み合わせを含む。実施形態において、当該組成物は、血液中に見出される血液タンパク質及び／または代謝産物を、実質的に含まない。その他の実施形態において、当該組成物は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む。実施形態において、当該組成物中に存在する任意のポリペプチド因子は、組換えで生産される。実施形態において、当該組成物中に存在する任意のポリペプチド因子は、対象からの血液、またはそれらの断片に反応したＣ３Ａ細胞によって、産生される。
【００４０】
当該組成物はさらに、表Ｉに記載される因子の、１つ以上の発現または活性を増加させる、１つ以上の作用物質を含む。本発明に有用な作用物質は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプチドビニローグなどのペプチド、有機分子または有機小分子などの化合物などの、任意の種類の分子であり得る。多様な実施形態において、発現または活性は、当該作用物質との接触前の発現または活性と比べて、少なくとも、２．０、５．０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００倍、またはそれ以上増加する。
【００４１】
実施形態において、当該作用物質は、表Ｉに記載される因子を持つ細胞において、発現及び／または活性（直接的または間接的に）を増加させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、またはＲＮＡ分子である。多様な態様において、当該作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、またはマイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ分子であって良い。
【００４２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一本鎖のＲＮＡ分子であり、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、転写されたＤＮＡからの遺伝子にコードされるが、しかしｍｉＲＮＡは、タンパク質に翻訳されず、代わりに、各一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる、短いステムループ構造になり、及び最終的に機能的なｍｉＲＮＡになる。成熟したｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と完全にまたは部分的に相補的であり、及びその主たる機能は、遺伝子発現を下方調節することである。マイクロＲＮＡは、独立した遺伝子によってコードされ得るが、しかしまたイントロン、ｍＲＮＡの３′ＵＴＲｓ、長い非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びトランスポゾンを含む、多様に異なるＲＮＡ種から（酵素ダイサーを介して）処理され得る。本明細書で使用される、マイクロＲＮＡにはまた、それらの内因性の相手と、同じかまたは実質的に同じ機能を持つ細胞に、外的に導入されたマイクロＲＮＡを意味する、「模倣構造」のマイクロＲＮＡを含む。したがって、当業者は、ある作用物質が、外的に導入されたＲＮＡであって良いと理解するであろうが、一方で、作用物質はまた、細胞においてマイクロＲＮＡの発現を増加または低下させる化合物、またはそのような物を含む。
【００４３】
用語「低分子干渉ＲＮＡ」及び「ｓｉＲＮＡ」がまた、本明細書において使用され、種々の生物学的役割を担う、短い二本鎖ＲＮＡ分子の分類である、短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡを指す。中でも注目すべき点は、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡが特定遺伝子の発現に干渉する場合に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与していることである。そのＲＮＡｉ経路におけるそれらの役割に加えて、ｓｉＲＮＡはまた、ＲＮＡｉ関連経路（例えば、抗ウイルスメカニズムとして、またはゲノムのクロマチン構造の形成において）においても作用する。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」もしくは「核酸分子」がまた、本明細書において幅広く使用され、ホスホジエステル結合によって結ばれる、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味する。したがって、当該用語には、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、ｃＤＮＡ、合成したデオキシリボヌクレオチド酸配列などの、遺伝子またはその一部であり得て、及び一本鎖または二本鎖、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドであり得る。さらに、本明細書において使用される当該用語には、細胞から単離することができる、天然に存在する核酸分子、同様に例えば、化学合成法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの酵素法よって調合できる、合成ポリヌクレオチドを含む。多様な用語は、例えば、組成物の異なる成分を区別するためなどの、考察の便宜上の目的だけで使用されていることを、認識する必要がある。
【００４５】
本明細書において考察するように、本開示の組成物は、単独の表Ｉに記載される因子、またはそれらの組み合わせを含むことができる。この組成物は、表Ｉのもの以外のタンパク質を、実質的に含まないことが可能である。当該組成物は、任意の炎症誘発性分子を、実質的に含まないことが可能である。本明細書で使用される用語「表Ｉのもの以外のタンパク質を、実質的に含まない」とは、その組成物の５％未満のタンパク質含有量が、表Ｉに記載されないタンパク質から構成されることを意味する。本明細書で使用される用語「炎症誘発性分子を、実質的に含まない」とは、その組成物の５％未満の含有量が、炎症誘発性分子から構成されることを意味する。表Ｉのもの以外のタンパク質を実質的に含まない組成物は、表Ｉのもの以外のタンパク質を、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％未満（例えば、０．０％）であるか、またはそれ以下で有することができる。炎症誘発性分子を実質的に含まない組成物は、そのような分子を、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％未満であるか、またはそれ以下で有することができる。したがって、当該組成物は、血清アルブミン、グロブリン、フィブリノゲン、及び凝固因子などの血液タンパク質を、実質的に含まないことが可能である。あるいは、当該組成物は、血清アルブミン、グロブリン、フィブリノゲン、及び凝固因子の１つ以上を含むことができる。
【００４６】
実施形態において、当該組成物のペプチド因子は、ヒトまたはその他の哺乳類もしくは動物に、天然には見出されない。例えば、当該因子は、合成、組換えなどであって良い。しかしながら、本発明の組成物は、ヒトまたはその他の哺乳類もしくは動物に、天然に見出される、ペプチド因子を含むことができる。
【００４７】
実施形態において、当該ペプチド因子は、非天然に存在するアミノ酸を含んで良い。「アミノ酸」は、天然由来及び合成のアミノ酸、ならびに天然由来のアミノ酸と同じ方法で機能する、アミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然由来アミノ酸は、その遺伝子コードによってコードされるものであり、同様に、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンなどの、その後に改変される、それらのアミノ酸である。「アミノ酸類似体」とは、天然由来のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有しているが、しかし天然由来のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有する化合物を指すが、しかし天然由来のアミノ酸と類似した方法で機能する。アミノ酸は、本明細書においては、通常知られている３文字表記によるか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字表記によるものを指して良い。
【００４８】
実施形態において、当該組成物は、表Ｉに記載される因子の、１つ以上の保存的に改変された変異体を含む。実施形態において、その保存的に改変された変異体は、天然由来のポリペプチドと比べたアミノ酸のレベルにおいて、少なくとも８０％の配列類似性、しばしば少なくとも８５％の配列類似性、９０％の配列類似性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列類似性を有している。
【００４９】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列において、単一アミノ酸またはアミノ酸の少ない割合を変更、追加または欠失するような、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列への個別の置換、欠失または追加は、その変更が、化学的に類似したアミノ酸を伴うアミノ酸置換となる、「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的置換の表は、当技術分野では良く知られている。そのような保存的に改変された変異体は、さらに本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子を排除しない。
【００５０】
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、またはＶ）が、そのグループの他の一員で置換される、またはアルギニンでリジンを、グルタミンでアスパラギン酸を、またはグルタミンでアスパラギンをなどのように、１つの極性残基で他を置き換えるなどの方法で、置換が行われて良い。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）の、８グループの各々は、他の１つに対して保存的置換となる、その他の例示的なアミノ酸を含む。
【００５１】
２つ以上のポリペプチド配列の状況下において、用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、デフォルトのパラメータを伴った、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用した測定で、または手動整列及び目視検査によって、同じであるかまたは同じアミノ酸残基の特定の割合を有する、２つ以上の配列または部分配列（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域を超えた、最大対応を比較し及び整列した場合、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または指定領域を超えたより高い同一性）を指す。その様な配列を指して、「実質的に同一の」状態であるという。
【００５２】
実施形態において、当該組成物は、インビボにおいて本発明の１つ以上の因子に関連しているか、またはその因子と同時精製される、生体分子（ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、及び代謝産物など）を、実質的に含まない。本明細書で使用される用語「生体分子を実質的に含まない」とは、その組成物の乾燥重量で５％未満が、表Ｉに記載されない生体分子で構成されていることを意味する。そのような生体分子を実質的に含まない組成物は、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％未満、またはそれ以下の、表Ｉに記載されない生体分子を有し得る。したがって、例えば、当該組成物は、例えば、脂肪酸、コレステロール、非タンパク質凝固因子、代謝産物等などである、血液中に豊富な生体分子を、実質的に含まないことが可能である。さらに、当該組成物は、赤血球、白血球、血小板、及び細胞断片を含む細胞を、実質的に含まないことが可能である。
【００５３】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｍｇ（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ、またはそれ以上）の、表Ｉに記載される１つ以上の因子を含む。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｍｇから約１０００ｍｇ（例えば、約５ｍｇから約９００ｍｇ、約５ｍｇから約８００ｍｇ、約５ｍｇから約７００ｍｇ、約５ｍｇから約６００ｍｇ、約１０ｍｇから約５００ｍｇ、約１０ｍｇから約４００ｍｇ、約１０ｍｇから約３００ｍｇ、約１０ｍｇから約２５０ｍｇ、約１０ｍｇから約２００ｍｇ、約１０ｍｇから約１５０ｍｇ、約１０ｍｇから約１００ｍｇ、約５０ｍｇから約５００ｍｇ、約５０ｍｇから約４００ｍｇ、約５０ｍｇから約３００ｍｇ、約５０ｍｇから約２５０ｍｇ、約５０ｍｇから約２００ｍｇ、約５０ｍｇから約１５０ｍｇ、約５０ｍｇから約１００ｍｇ、約７５ｍｇから約５００ｍｇ、約７５ｍｇから約４００ｍｇ、約７５ｍｇから約３００ｍｇ、約７５ｍｇから約２５０ｍｇ、約７５ｍｇから約２００ｍｇ、約７５ｍｇから約１５０ｍｇ、約７５ｍｇから約１００ｍｇ、約１００ｍｇから約５００ｍｇ、約１００ｍｇから約４００ｍｇ、約１００ｍｇから約３００ｍｇ、約１００ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約２００ｍｇ、または前記２つの終点を含む、任意のその他の範囲）に等しい量の、１つ以上の因子を含むことができる。
【００５４】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上）の、表Ｉに記載される１つ以上の因子を含む溶液を含むことができる。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｍｇ／ｍｌから約１０００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約５ｍｇ／ｍｌから約９００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約７００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約６００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約４００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の濃度の、表Ｉに記載される１つ以上の因子を有する溶液を含むことができる。
【００５５】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｐｇ（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｐｇ、またはそれ以上）の、表Ｉに記載される１つ以上の因子を含む。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｐｇから約１０００ｐｇ（例えば、約５ｐｇから約９００ｐｇ、約５ｐｇから約８００ｐｇ、約５ｐｇから約７００ｐｇ、約５ｐｇから約６００ｐｇ、約１０ｐｇから約５００ｐｇ、約１０ｐｇから約４００ｐｇ、約１０ｐｇから約３００ｐｇ、約１０ｐｇから約２５０ｐｇ、約１０ｐｇから約２００ｐｇ、約１０ｐｇから約１５０ｐｇ、約１０ｐｇから約１００ｐｇ、約５０ｐｇから約５００ｐｇ、約５０ｐｇから約４００ｐｇ、約５０ｐｇから約３００ｐｇ、約５０ｐｇから約２５０ｐｇ、約５０ｐｇから約２００ｐｇ、約５０ｐｇから約１５０ｐｇ、約５０ｐｇから約１００ｐｇ、約７５ｐｇから約５００ｐｇ、約７５ｐｇから約４００ｐｇ、約７５ｐｇから約３００ｐｇ、約７５ｐｇから約２５０ｐｇ、約７５ｐｇから約２００ｐｇ、約７５ｐｇから約１５０ｐｇ、約７５ｐｇから約１００ｐｇ、約１００ｐｇから約５００ｐｇ、約１００ｐｇから約４００ｐｇ、約１００ｐｇから約３００ｐｇ、約１００ｐｇから約２５０ｐｇ、約１００ｐｇから約２００ｐｇ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）に等しい量の、１つ以上の因子を含むことができる。
【００５６】
実施形態において、本発明の当該組成物は、少なくとも１ｐｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上）の、表Ｉに記載される１つ以上の因子を含む溶液を含むことができる。したがって、例えば、当該組成物は、約１ｐｇ／ｍｌから約１０００ｐｇ／ｍｌ（例えば、約５ｐｇ／ｍｌから約９００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約８００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約７００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約６００ｐｇ／ｍｌ、約５ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約１００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、約５０ｐｇ／ｍｌから約１００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、約７５ｐｇ／ｍｌから約１００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約５００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約４００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約３００ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約２５０ｐｇ／ｍｌ、約１００ｐｇ／ｍｌから約２００ｐｇ／ｍｌ、約１０ｐｇ／ｍｌから約１５０ｐｇ／ｍｌ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の濃度の、表Ｉに記載される１つ以上の因子を有する溶液を含むことができる。
【００５７】
本発明の当該組成物は通常、医薬組成物である。そのような医薬組成物は、表ＩまたはＩＩに記載される因子の１つ以上と、薬学的に許容される担体とを含むことができる。医薬組成物はさらに、表ＩまたはＩＩに記載される因子以外のタンパク質を含むことができる。その他のタンパク質は、ポリペプチド製剤などの、治療薬であり得る。あるいは、その他のタンパク質は、担体タンパク質であり得る。
【００５８】
実施形態において、本発明の当該組成物は、ヘパリンまたはクエン酸塩などの、抗凝固剤を含む。本明細書で使用される「クエン酸塩」は、クエン酸（３つのプロトンと複合化されたクエン酸陰イオン）、クエン酸陰イオンを含む塩類、及びクエン酸陰イオンの部分キャスターを含む、いずれかの形態におけるクエン酸陰イオンを指す。クエン酸陰イオンは、有機トリカルボン酸塩である。ＣＡＳ登録番号７７−９２−２を割り当てられているクエン酸は、分子式ＨＯＣ（ＣＯ２Ｈ）（ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）２、及び式重量１９２．１２ｇ／ｍｏｌを有している。クエン酸塩（すなわち、クエン酸陰イオンを含む塩）は、１つ以上の生理的に許容される陽イオンと共存する、１つ以上のクエン酸陰イオンからなる。例示的な生理学的に許容される陽イオンには、非限定的に、プロトン、アンモニウム陽イオン及び金属陽イオンを含む。適切な金属陽イオンには、非限定的に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムを含み、ここでナトリウム及びカリウムが好ましく、ならびにナトリウムがさらに好ましい。クエン酸陰イオンを含む組成物は、生理的に許容される陽イオンの混合物を含んでいて良い。
【００５９】
１つの実施形態において、当該組成物は、クエン酸ナトリウムを含む。クエン酸ナトリウムは、乾燥した化学品粉末、結晶、丸薬または錠剤の形態であって良い。クエン酸またはクエン酸ナトリウムの生理学的に許容される形態が、利用されて良い。例えば、当該クエン酸またはクエン酸ナトリウムは、一水和物を含む、水和物の形態であって良い。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、所望の純度を有する表Ｉに記載される因子の１つ以上を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、調合されて良い（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、採用された投与量及び濃度で、受容者に無毒であり、及びリン酸塩、クエン酸塩などの緩衝剤、ならびにその他の有機酸、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル・アンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含むその他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成の対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、及び/またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、非イオン性界面活性剤を含んで良い。
【００６１】
実施形態において、本発明の当該組成物は、生細胞を含んで良い。１つの実施形態において、当該組成物は、肝細胞を含む。１つの実施形態において、当該組成物は、任意で組換えにより操作された、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞を含む。
【００６２】
本発明の当該組成物は、標的細胞の抗アポトーシス、生存、及び／または増殖を誘発し、及び／または炎症性疾患などの、疾患または障害を治療するための強力な手段を提供する。
【００６３】
結果として、本発明は、当該細胞を本開示の組成物と接触させることによって、細胞における抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、生存、保護、増殖、及び／または表現型調節を誘発する方法を提供する。実施形態において、その接触した細胞の増殖は、当該組成物と接触していない比較細胞の増殖と比べて、少なくとも、１．１、１．５、２．０、５．０、１０、２５、５０、１００倍、またはそれ以上増加する。関連する実施形態において、その細胞の生存は、当該組成物と接触していない比較細胞の生存と比べて、少なくとも、１．１、１．５、２．０、５．０、１０、２５、５０、１００倍、またはそれ以上増加する。
【００６４】
本発明はまた、対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。この方法には、表ＩまたはＩＩに記載される１つ以上の因子（または、例えば、表ＩまたはＩＩに記載される１つ以上の因子を含む、医薬組成物）を、対象、またはその細胞もしくは組織に投与することを含む。
【００６５】
本発明の方法において、１つ以上の当該因子は、接触した細胞または組織において、抗アポトーシス、抗パイロトーシス、抗ネクロトーシス、生存、保護、増殖、及び／または表現型調節を誘発する。実施形態において、その接触させる細胞（または、標的細胞と呼ばれる）は、哺乳類細胞などの、真核細胞である。１つの実施形態において、その接触させる細胞は、肝細胞である。１つの実施形態において、当該細胞は、肝芽腫由来の細胞である。１つの実施形態において、当該細胞は、ＨｅｐＧ２細胞またはＣ３Ａ細胞株のＣ３Ａ細胞である。１つの実施形態において、当該細胞は、親Ｃ３Ａ細胞株からのクローン誘導体である。１つの実施形態において、当該細胞は、組換えにより操作された細胞である。
【００６６】
用語「Ｃ３Ａ細胞株」とは、ヒト肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２のサブクローンを指す。このＣ３Ａ細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関で、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０７４１として寄託されている、適任の細胞株である。
【００６７】
当該組成物の投与は、例えば、静脈内に、腹腔内に、非経口で、同所的に、皮下に、局所に、鼻孔内に、経口で、舌下で、眼球内に、埋込デポによって、ナノ粒子ベースの送達システムを使用して、マイクロニードルパッチで、微小体で、ビーズ状で、浸透または機械式ポンプで、及び／またはその他の機械的手段によってなどを含む、任意の適切な方法で実施されて良い。
【００６８】
多様な実施形態において、細胞は、インビボまたはインビトロで、当該組成物と接触されうる。１つの実施形態において、当該細胞は、インビボで接触され、米国特許第８，１０５，４９１号に記載されるような、体外解毒システムによって治療される対象の体内で接触された細胞であって、その記載内容の全体が、参照として本明細書に組み入れられる。そのような実施形態において、当該組成物の１つ以上の因子は、そのシステムの活性カートリッジ（バイオリアクター）内に含まれる、Ｃ３Ａ細胞などの細胞によって、産生されて良い。多様な実施形態において、当該システムは、対象、または細胞もしくはそれらの臓器、例えば、肝臓に、流体的に連結されて良い。
【００６９】
図３に示すように、概して体外解毒システム１０は、患者に連結されるように構成され、かつ血液を患者から限外ろ過液発生器（ＵＦＧ）４０を通してまたその患者へと通わせるよう作動する血液回路１００；ＵＦＧ４０に連結され、そのＵＦＧ４０から限外ろ過液を取り出すよう、及び血液の細胞成分とは独立に限外ろ過液を処理するよう作動する再循環回路５０；患者に再導入する前に、再循環回路５０内の限外ろ過液と、血液回路１００内の細胞成分とを再び組み合わせるよう作動する導管接合部１５を備える。さらに図３で示すのは、再循環回路５０内の、活性カートリッジ７０及び酸素供給器６０である。この活性カートリッジ７０は、限外ろ過液の処理に活用される。
【００７０】
用語「活性カートリッジ」とは、治療用途及び解毒処理に有用性を持つ、細胞（例えば、Ｃ３Ａ細胞株の細胞など）を含む中空糸系カートリッジを指す。
【００７１】
用語「血液回路」とは、二重内腔カテーテルに接続され、かつ血液を患者から血液制御ユニットへと至らせてまた患者に戻して循環させるよう作動する、チューブの回路を指す。
【００７２】
用語「Ｃ３Ａ細胞株」とは、ヒト肝芽腫の細胞株ＨｅｐＧ２のサブクローンを指す。実施形態において、Ｃ３Ａ細胞は、1つ以上の活性カートリッジの毛細管外の空間に含まれている。このＣ３Ａ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関で、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０７４１として寄託されている。
【００７３】
用語「解毒装置」とは、流体の流れから、特定または非特定分子の除去の手段を提供する、カートリッジ、キャニスター、またはその他の装置を指す。例示として、透析カートリッジ、吸着カートリッジ、またはフィルタがある。
【００７４】
用語「毛細管外空間」（ＥＣＳ）とは、活性カートリッジまたは限外ろ過液発生器の中空糸の外側の空間を指す。活性カートリッジのＥＣＳは概して、当該Ｃ３Ａ細胞を収納する。
【００７５】
用語「毛細管内空間」（ＩＣＳ）とは、活性カートリッジまたは限外ろ過液発生器の中空糸の内側の空間を指す。このＩＣＳは、全血または限外ろ過液の流動経路である。
【００７６】
用語「再循環回路」とは、一般に限外ろ過液の流体のろ過、解毒、及び処理を可能にする回路を指し、いくつかの実装では、再循環回路は一般に、貯留部、酸素供給器、及び１つ以上の活性カートリッジを含む。
【００７７】
用語「限外ろ過液」（ＵＦ）とは、限外ろ過液発生器の半透過膜を通ってろ過された、血漿流体及び溶解した高分子物質を指す。
【００７８】
用語「限外ろ過液発生器」（ＵＦＧ）とは、「空の」活性カートリッジ（すなわち、治療活性細胞を含まない中空糸カートリッジ）を含みまたはそれと統合され、及び細胞の血液成分から血漿流体 （限外ろ過液）を分離するように構成されている装置を指す。この中空糸は、例えば、いくつかの実装において、約１００，０００ダルトンの公称分子量カットオフ値を有する半透過膜で構成されていて良い。このＵＦＧを使用中に、血液は中空糸のＩＣＳを通って循環され、血漿及び様々な高分子物質を含む限外ろ過液は、１つ以上の活性カートリッジを通って循環しながら、膜繊維の壁を通ってその再循環回路を通過する。
【００７９】
用語「限外ろ過」とは一般に、限外ろ過液が、ＵＦＧの半透過膜を通過した全血から抜き出される間のプロセスを指す。いくつかの実施形態において、限外ポンプは、限外ろ過液の産出速度を制御することができ、一方でＵＦＧの中空糸膜の細孔径は、膜を浸透する限外液の量を調節することができる。
【００８０】
臨床または治療的処置中に、ＵＦは、活性カートリッジ７０内の中空糸カートリッジの内腔（ＩＣＳ）を介して、ＵＦの毒素、栄養素、グルコース、及び溶存酸素が、膜を通してＥＣＳに拡散することができるようにポンプで送り出され、生細胞が、それらを代謝することができる。代謝産物は、その細胞により産生されたアルブミン及びその他のタンパク質と共に、その患者に戻されるように、膜を通してＵＦへ再び拡散される。
【００８１】
前述の説明及び本明細書で熟考されるように、当該Ｃ３Ａ細胞株は、ヒト肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２のサブクローンである。Ｃ３Ａなどの、この親細胞株のいくつかのサブクローンは、例えば、高アルブミン産生及びα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）産生、ならびに例えば、サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−１βを含む、本発明の炎症誘発性分子に反応した抗炎症性メディエータータンパク質のα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）及びＩＬ−１Ｒａの発現といった、肝臓に特異的な機能を示す。そのような細胞はまた、表ＩまたはＩＩに記載される１つ以上の因子を産生する能力がある。
【００８２】
多様な実施形態において、当該システムは、その対象、または細胞もしくはその臓器、例えば肝臓と、流体的に連結されて良い。本発明の組成物は、システム１０の血液回路に導入される。当該組成物は、その対象の循環系に導入されて良く、または当該システムの血液流動経路に直接導かれても良い。１つの実施形態において、表ＩまたはＩＩに記載される１つ以上の因子は、システム１０の活性カートリッジ７０内の細胞によって生成される。一旦、システム１０の血液回路１００において、その組成物の因子を含むように処理されたＵＦが、その対象へ再導入され、ここでその組成物の因子が、肝細胞などの、その対象の細胞と接触し、それによって疾患や障害の治療を促進する。
【００８３】
本実施形態において、活性カートリッジの細胞が、Ｃ３Ａ細胞として例示されているが、当業者は、当該活性カートリッジが、本明細書に開示される炎症性疾患などの、任意の多様な疾患の治療に有益である、任意の多数の適切な細胞種を含み得ることを理解されよう。実施形態において、当該活性カートリッジは、例えば、炎症誘発性分子などで、治療されている対象の体内で発生する刺激などの、刺激に反応して、ＡＲ及び／またはｓＦａｓなどの、表ＩまたはＩＩに記載される１つ以上の因子を産生するように、組換えにより操作された細胞を含んで良い。
【００８４】
前述のいずれかの方法と併せて、当該組成物は、毎日（または１日おきに、もしくは毎週）投与され得て、ここで表ＩまたはＩＩの１つ以上の因子の量が、約１ｍｇから約１０００ｍｇ（例えば、約５ｍｇから約９００ｍｇ、約５ｍｇから約８００ｍｇ、約５ｍｇから約７００ｍｇ、約５ｍｇから約６００ｍｇ、約１０ｍｇから約５００ｍｇ、約１０ｍｇから約４００ｍｇ、約１０ｍｇから約３００ｍｇ、約１０ｍｇから約２５０ｍｇ、約１０ｍｇから約２００ｍｇ、約１０ｍｇから約１５０ｍｇ、約１０ｍｇから約１００ｍｇ、約５０ｍｇから約５００ｍｇ、約５０ｍｇから約４００ｍｇ、約５０ｍｇから約３００ｍｇ、約５０ｍｇから約２５０ｍｇ、約５０ｍｇから約２００ｍｇ、約５０ｍｇから約１５０ｍｇ、約５０ｍｇから約１００ｍｇ、約７５ｍｇから約５００ｍｇ、約７５ｍｇから約４００ｍｇ、約７５ｍｇから約３００ｍｇ、約７５ｍｇから約２５０ｍｇ、約７５ｍｇから約２００ｍｇ、約７５ｍｇから約１５０ｍｇ、約７５ｍｇから約１００ｍｇ、約１００ｍｇから約５００ｍｇ、約１００ｍｇから約４００ｍｇ、約１００ｍｇから約３００ｍｇ、約１００ｍｇから約２５０ｍｇ、約１００ｍｇから約２００ｍｇ、または前記２つの終点を含む、任意のその他の範囲）の間である。
【００８５】
前述のいずれかの方法と併せて、当該組成物は、毎日（または１日おきに、もしくは毎週）投与され得て、ここで表ＩまたはＩＩの１つ以上の因子の量が、約１ｐｇから約１０００ｐｇ（例えば、約５ｐｇから約９００ｐｇ、約５ｐｇから約８００ｐｇ、約５ｐｇから約７００ｐｇ、約５ｐｇから約６００ｐｇ、約１０ｐｇから約５００ｐｇ、約１０ｐｇから約４００ｐｇ、約１０ｐｇから約３００ｐｇ、約１０ｐｇから約２５０ｐｇ、約１０ｐｇから約２００ｐｇ、約１０ｐｇから約１５０ｐｇ、約１０ｐｇから約１００ｐｇ、約５０ｐｇから約５００ｐｇ、約５０ｐｇから約４００ｐｇ、約５０ｐｇから約３００ｐｇ、約５０ｐｇから約２５０ｐｇ、約５０ｐｇから約２００ｐｇ、約５０ｐｇから約１５０ｐｇ、約５０ｐｇから約１００ｐｇ、約７５ｐｇから約５００ｐｇ、約７５ｐｇから約４００ｐｇ、約７５ｐｇから約３００ｐｇ、約７５ｐｇから約２５０ｐｇ、約７５ｐｇから約２００ｐｇ、約７５ｐｇから約１５０ｐｇ、約７５ｐｇから約１００ｐｇ、約１００ｐｇから約５００ｐｇ、約１００ｐｇから約４００ｐｇ、約１００ｐｇから約３００ｐｇ、約１００ｐｇから約２５０ｐｇ、約１００ｐｇから約２００ｐｇ、または前記２つの終点を含む任意のその他の範囲）の間である。
【００８６】
前述のいずれかの方法と併せて、当該組成物は、その疾患または障害の治療に有益な作用物質との併用で、投与され得る。１つの実施形態において、当該組成物は、抗生物質と共に投与される。本発明の組成物と相乗効果のある療法に対して、有用な抗生物質の特定分類の例示には、アミノグリコシド（例えば、トブラマイシン）、ペニシリン（例えば、ピペラシリン）、セファロスポリン（例えば、セフタジジム）、フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）、カルバペネム（例えば、イミペネム）、テトラサイクリン、及びマクロライド（例えば、エリスロマイシン及びクラリスロマイシン）を含む。上記に列挙される抗生物質に加えて、典型的な抗生物質には、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシン・エストレート／エチルコハク酸塩／グルセプト酸塩／ラクトビオン酸塩／ステアリン酸塩）、ペニシリンなどのベータ−ラクタム（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、及びピペラシリン）、またはセファロスポリン（例えば、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セホテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、及びセフスロジン）を含む。抗生物質のその他の分類には、カルバペネム（例えば、イミペネム）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、キノロン（例えば、フレロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、及びシノキサシ）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）、及び糖ペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン）を含む。その他の抗生物質には、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、ムピロシン、及び陽イオン性ペプチドを含む。
【００８７】
前述の本発明のいずれの方法もさらに、治療的処置の有効性を評価するステップを含む。本発明の当該因子は、標的細胞の抗アポトーシス、生存、及び／または増殖を誘発する、明白な能力を有するため、生物学的経路に関連する因子（例えば、血清中で）のレベルを測定することを含む、それぞれの生物学的経路の側面を測定することによって、治療的処置の有効性が評価され得る。
【００８８】
以下の実施例は、本発明の実施形態の例示をさらに提供するが、しかし本発明の範囲を限定する意図はない。それらは、使用される実施形態に特有であるが、その他の手順、方法論、または当業者に公知の技術が、代わりに使用されて良い。
【実施例】
【００８９】
実施例１：肝臓再生因子の分泌
目的
本研究の目的は、肝細胞複製及び／または肝臓再生に有益な効果を有するとして文献に報告されている因子を分泌するために、本開示のシステムの活性カートリッジに存在するＣ３Ａ細胞の能力を評価することであった。
【００９０】
材料及び方法
肝臓再生に関与していると文献に示されている、既知の分裂促進因子、血管新生因子、またはその他のタンパク質に対して、化学発光多重配列検出（Ａｕｓｈｏｎ）及び／または多重免疫測定の受託サービス（Ｍｙｒｉａｄ  Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を利用して、Ｃ３Ａ細胞カートリッジの使用済み媒体を評価した。システムの定常状態濃度を、通常の健常者の文献値と比較して、灌流流量と時間を乗じて「投与量」に変換し、及び投与量が、それらのレベルを、上方に増加させると予想される量を決定した。
【００９１】
結果
（表ＩＩＩ）分泌された因子
2018525335.tif 000005
１実験的に決定された、定常状態増殖システムの濃度×カートリッジ当たりの流速×時間
２正常血清レベル×３Ｌの平均体内血漿容量
３投与量×３Ｌの平均体内血漿容量
【００９２】
考察
これらのデータは、Ｃ３Ａ細胞は、増殖、血管新生及び造血因子を含む、肝臓再生に関与していると報告された、様々なタンパク質を分泌することを示している。
【００９３】
ほとんどの増殖因子、サイトカイン、及びホルモンは、その細胞表面上の受容体チロシンキナーゼを介して作用し、細胞内シグナル伝達カスケードを誘発する。肝細胞については、これらには、ＭＥＴ及びＥＧＦＲを含む。Ｆａｓ受容体に作用するリガンドは、アポトーシス経路をシグナル伝達することができる。これらの複数のシグナル伝達経路の統合は、細胞が増殖、生存、またはアポトーシスに向かって誘導されるかどうかに帰結する。
【００９４】
ＨＧＦは、最も広く知られている肝細胞の分裂促進因子であるが、しかしその他の分裂促進因子には、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、及び血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を含む。これら増殖因子のすべては、Ｃ３Ａ細胞によって測定可能な量で分泌された。
【００９５】
肝細胞分裂促進因子に加えて、肝臓再生には、増加した組織質量をサポートするために、増加した血管の供給が必要である。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、最も広く認められた血管新生因子である。これは、類洞内皮細胞を刺激し、ＨＧＦを分泌する。ＶＥＧＦ及びその他の血管新生因子、ＶＥＧＦ−Ｃ、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、ならびにアンジオポエチン２（ＡＮＧ２）が、Ｃ３Ａ細胞によって産生された。
【００９６】
また、Ｃ３Ａ細胞によって分泌されたものは、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）であった。ＳＣＦは、骨髄性細胞の造血を刺激し、ＧＭ−ＣＳＦと相乗的に作用して、胆管及び肝細胞の増殖を誘発し、ならびにＩＬ−１βへの暴露に応答してＣ３Ａ細胞を増加させる。ＥＰＯは、ラットの肝切除モデルにおいて、肝臓重量の増加及び高い有糸分裂指数を伴って、生存率を向上させる。
【００９７】
これらのタンパク質は、肝細胞集団に直接的に作用し、または内皮細胞、星状細胞、もしくは免疫細胞などの、その他の内在する細胞集団を刺激して、肝細胞に間接的に作用して、肝細胞に有益な因子を産生することができた。
【００９８】
さらに、これらの恒常的な分泌因子の多くは、Ｃ３Ａ細胞が、肝炎患者に存在し得る、炎症誘発性サイトカインに曝露された際に、上方調節されることが示された。したがって、患者を処置している間に、タンパク質の分泌のレベルは、更に増加する可能性がある。
【００９９】
これらのデータは、Ｃ３Ａ細胞が、治療上の利点のための複数のメカニズムの一部として、肝細胞誘発性メディエーターの環境を与えることによって、肝臓の再生に寄与することを示唆している。
【０１００】
結論
Ｃ３Ａ細胞は、肝臓の再生に関与することが知られている、多様な分泌因子を産生することが可能である。これは、肝臓障害患者の治療中に、直接的な肝細胞の直接刺激を介して、間接的なその他の内在細胞集団との相互作用を介してのいずれかで、肝臓の再生を促進することが可能である。
【０１０１】
実施例２：肝細胞の抗アポトーシス、生存及び／または増殖能の促進
本研究では、肝臓再生の後段で、様々な肝細胞の型の、細胞の生存及び増殖能を促進するために、Ｃ３Ａ細胞が分泌した因子の、潜在的な役割を示す。
【０１０２】
目的
本研究の目的は、肝細胞の生存、複製及び／または肝臓の再生に有益な効果を有するとして文献に報告されている因子を分泌する、Ｃ３Ａ細胞の能力を評価することであった。次いで、このような因子を見いだし、種々の肝細胞の型に対して選択された因子の影響を、評価することであった。
【０１０３】
材料及び方法
本開示のシステムは、急性肝細胞障害及びアルコール摂取に続発する肝不全の対象を、継続的に治療することを目的とした補助装置部及びサポート回路を持つ、４つの代謝活性細胞カートリッジ（Ｃ３Ａ細胞）で構成される、ヒト肝細胞に基づいた肝臓治療用である。Ｃ３Ａ細胞の使用済みカートリッジを、既知の分裂促進因子、血管新生及びその他の再生因子に対して、受託サービスのＥＬＩＳＡ多重（Ｍｙｒｉａｄ）アッセイ、または化学発光多重配列検出（Ａｕｓｈｏｎ  Ｃｉｒａｐｌｅｘ）アッセイを利用して評価した。
【０１０４】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）アポトーシスモデルを、Ｂｅｒａｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０（１９）：１９０１２−２０（２００５））から受け入れた。ウィリアムスＥ培地（ｗ／サプリメント、ｗ／ｏデキサメタゾン、［Ｇｉｂｃｏ］）と共に、または成熟Ｃ３Ａ細胞のカートリッジにおけるウィリアムスＥ培地の静置培養よって調合されたシステム馴化培地（ＣＭ）と共に３時間培養した後、抗ＣＤ９５（Ｆａｓ）抗体（ＥＯＳ９．１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＰＨＨ（Ｇｉｂｃｏ）において、アポトーシスを誘発した。アポトーシスを、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、アネキシンＶ（Ｒｏｃｈｅ）及びウェスタン免疫ブロッティング(一次抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ)によって測定した。
【０１０５】
トランスウェル内でのＣ３Ａ細胞との共培養によって、または成熟カートリッジ内での、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）の静置培養によって調合されたＣＭで処理された、肝類洞ＥＣ（ＬＳＥＣ）の代用として、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）血管新生因子モデルを開発した。選択された血管新生因子の累積発現は、Ａｕｓｈｏｎ  Ｃｉｒａｐｌｅｘによって、２４、４８及び７２時間での上清で測定した。
【０１０６】
結果
Ｃ３Ａ細胞カートリッジの使用済み培地
システムの使用済み培地（成熟したカートリッジから採取された培地、定常状態で、流れを保った培地）の評価は、Ｃ３Ａ細胞が、多数の、一般に認められている増殖及び血管新生因子を産生することを示した（実施例１の表ＩＩＩ）。
【０１０７】
肝臓の様々な細胞における、これら因子の潜在的影響を評価するために、一連の細胞に基づくモデルを開発した。
【０１０８】
ＰＨＨアポトーシスモデル
Ｆａｓアゴニスト抗体を伴ったＰＨＨ培養に取り掛かる、３時間前に投与されたＣＭは、カスパーゼ活性による測定で、Ｆａｓ媒介アポトーシスを著しく減少させた（図１）。ＣＭはまた、未処理の肝細胞において、自発的アポトーシスを減少させた。ＣＭで処理されたＰＨＨは、アネキシンＶ染色による視覚化で、Ｆａｓアゴニストで処理されたＰＨＨに対して、より多くの正常サイズ及び敷石状形状を維持していた（データ示さず）。
【０１０９】
ウェスタン免疫ブロッティングは、ＣＭまたはＣＭとＦａｓアゴニストの併用で処理した細胞からの溶解物において、ＥＧＦＲ（ＡＫＴ、ＥＲＫ１／２及びＳＴＡＴ３）に関連する、シグナル伝達タンパク質のリン酸化を示した。しかしながら、未処理の対照サンプルにおいても、Ｆａｓ処理された細胞を変化させる程度に、それらと同じシグナル伝達タンパク質のリン酸化があった（データ示さず）。
【０１１０】
ＨＡＥＣ血管新生因子モデル
７２時間に及ぶＣＭの毎日投与は、時間依存的に、ＨＡＥＣによるＰＬＧＦの分泌を著しく増加させた（図２）。
【０１１１】
図の説明
図１：ＣＭは、ＰＨＨにおけるアポトーシスを減少させ、カスパーゼ活性は、ＣＭの存在において、未処理及びＦａｓアゴニスト処理のＰＨＨ培養の両方で減少した。誤差表示は、９６−ウェルフォーマットにおける、ｎ＝８ウェルのＳＤ（標準偏差）である（＊＊＊ｐ＜０．００１は、 ２つのＣＭ処理対その他各々を除いた、すべての比較に対して。Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ（テューキーの事後検定）を用いたｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析））。
【０１１２】
図２：ＣＭは、ＨＡＥＣによるＰＬＧＦ分泌を増加させる。ＨＡＥＣ培養は、ＥＧＭ−２培地より、ＣＭの存在で、著しく多いＰＬＧＦを分泌する。誤差バーは、２４ウェルフォーマットにおける、ｎ＝２の実験の標準偏差である。
【０１１３】
考察
肝臓の再生は、複数の経路及び細胞型が関与する、高度に組織的な事象である。代謝活性のＣ３Ａ細胞は、細胞に基づかない治療法が達成しそうにない方法で、これらの複数の細胞型及び経路に影響を与えることによって、肝臓再生に対して潜在的に寄与する可能性を与える。
【０１１４】
この研究では、細胞増殖、生存、再生、及び造血において一般に認められている役割を持つ、Ｃ３Ａ細胞によって分泌される、１１の因子を取り上げる。製造時に、４つの活性カートリッジによって生成される、各因子の定常状態の量は、表ＩＩＩで、正常血清値と比較する。ここでは、治療対象において、薬物動態モデルで期待される血漿濃度は、与えられていない。
【０１１５】
肝細胞上でのこれら因子の潜在的な影響を評価すること、及び当該システムの作用メカニズムをより良く理解することから始めるために、培養で、ＰＨＨにＣＭを投与した。ＣＭは、未処理細胞、及びＦａｓアゴニスト抗体によりアポトーシスに誘導されたものの両方において、生存を促進することが見出された（図１）。
【０１１６】
同様のモデルは、部分切除後の肝臓再生のために最も必要なＥＧＦＲリガンドである、ＡＲに依存することが示めされた。しかしながら、このモデルにおいて、ＡＲは、２０ｎＭでは保護されなかった（データ示さず）。ＣＭの生存促進性の効果が、ＥＧＦＲの活性化によって媒介されたかどうかを判断するために、ウェスタン免疫ブロッティングによって、ＣＭの有無に伴う、未処理及びＦａｓアゴニスト処理のＣ３Ａ細胞からの、細胞溶解物を評価した。ＡＫＴ、ＥＲＫ１／２及びＳＴＡＴ３のリン酸化が見出され、ＥＧＦＲの活性化が示唆された。このＣ３Ａ細胞は、多くのＥＧＦＲリガンド（ＴＧＦα、ＡＲ、ＨＢ−ＥＧＦ）を分泌する。ＣＭのＰＨＨの生存促進性効果は、培養で、ＨｅｐＧ２細胞（Ｃ３Ａ細胞の親細胞株）からのＣＭが、ヒトの胎児肝細胞の増殖を支える重要な因子を含むことを示すデータと、一致している。
【０１１７】
ＬＳＥＣ及びＬＳＥＣの骨髄前駆細胞（ＢＭＳＰＣ）は、肝臓のＶＥＧＦに反応して、ＨＧＦの産生を増加させることによって、肝臓再生に参加することが示された。Ｃ３Ａ細胞が分泌したＶＥＧＦの効果を、ＬＳＥＣのＨＡＥＣ共培養代用モデルにおいて評価した（ＨＡＥＣの有用性が高いため）。ＨＧＦは、著しく増加はしなかったが（ＤＮＳ）、ＰＬＧＦの分泌は、ＣＭ投与の２４時間後に、未処理のＨＡＥＣに比べて５倍増加した。このＨＡＥＣは、当該モデルで７２時間にわたり、ＣＭの存在下で、増加したＰＬＧＦを生成し続けた（図２）。ＰＬＧＦは、器官形成のために、骨髄から、ＶＥＧＦＲ１＋幹細胞を補充するといわれている。
【０１１８】
ＳＣＦ及びＥＰＯの両方が、Ｇ−ＣＳＦと相乗的に働く。非代償性肝硬変の患者において、ＳＣＦは、胆管細胞及び肝細胞の増殖を誘発し、ならびにＥＰＯは、生存を高める。Ｇ−ＣＳＦ分泌は、ＩＬ−１β及びＩＬ−６に反応して、Ｃ３Ａ細胞で増加する（データ示さず)。
【０１１９】
結論
本開示のＣ３Ａ細胞は、細胞増殖、生存、再生、及び造血において、明確な役割を持つ様々な分泌因子を産生する。当該細胞に基づくモデルは、ＰＨＨアポトーシスを防ぎ、及びＨＡＥＣのＰＬＧＦ分泌を高めた。これは、直接的な肝細胞の刺激によって、または治療中に、間接的なその他の内在細胞集団との相互作用によって、肝臓の再生を促進する可能性がある。
【０１２０】
実施例３：Ｃ３Ａ細胞の、初代ヒト肝細胞における、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化及び可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）の分泌を介した、Ｆａｓ誘発アポトーシスの阻害
アルコール性肝炎（ＡＨ）の顕著な特徴は、肝細胞死を増加させ、死亡細胞が、効果的に排出されない場合、肝機能不全及びさらに炎症反応を増大させることである。本発明者らは、重症急性ＡＨ（ｓＡＡＨ）の治療において、本開示のＣ３Ａ細胞を用いた本開示のシステムを、臨床的に評価している。本発明者らは、これまでに（実施例２）、３次元バイオリアクターで増殖したＣ３Ａ細胞からの馴化培地（ＣＭ）が、肝細胞の分裂促進因子（アンフィレギュリン、ＴＧＦα、ＨＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、及びＰＤＧＦ−ＢＢ）を含み、及びカスパーゼ３／７活性及びアネキシンＶ染色によって測定される、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）培養における、Ｆａｓ誘発アポトーシスを阻害することができることを示した。しかしながら、そのメカニズムは、これまで知られていなかった。
【０１２１】
このＣＭにおける、リガンドによる表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化が、観察された肝臓保護効果の原因となる可能性がある、という仮説をたてた。本研究の目的は、Ｆａｓ誘発アポトーシスのモデルにおいて、ＣＭが、肝細胞の生存を促進するメカニズムを決定することであった。
【０１２２】
インビトロのＰＨＨで、抗Ｆａｓアゴニスト抗体によってアポトーシスを誘発した。ＣＭの添加は、カスパーゼ３／７活性及びアネキシンＶ染色により測定したアポトーシスを、著しく阻害し、これまでに報告された結果を確認した。アポトーシスの尺度として、カスパーゼ８の開裂産物を検出するために、ウェスタン免疫ブロッティングを利用して得られた新しいデータは、ＣＭによるＥＧＦＲの活性化と一致するパターンを示した。Ｆａｓアゴニスト処理のＰＨＨ溶解物は、増加した開裂産物を示しが、一方で、ＣＭの存在下において、Ｆａｓアゴニストで処理されたＰＨＨからの溶解物は、対照サンプルと比べて開裂産物の減少を示した。さらに、Ｆａｓアゴニスト／ＣＭ処理のＰＨＨへの、ＥＧＦＲ阻害剤カネルチニブの添加で、Ｆａｓアゴニスト単独の場合と同様レベルの、開裂産物を産生した。
【０１２３】
ＥＧＦＲの活性化と関連することが知られているタンパク質のリン酸化（例えば、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、及びＳＴＡＴ３）は、ＣＭ処理のＰＨＨの溶解物中では増加し、カネルチニブで処理したサンプルでは、減少した。
【０１２４】
組換えのヒトのアンフィレギュリンによる治療では、ＰＨＨのアポトーシスを減少させ、その治療にカネルチニブを添加した場合には、効果がブロックされた。しかしながら、アンフィレギュリンの肝臓保護効果は、ＣＭに比べて少なかったため、追加のメカニズム及び／またはＥＧＦＲリガンドが関与する可能性が示唆された。
【０１２５】
Ｃ３Ａ細胞は、可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）を生成することが見出された。組換えのヒトｓＦａｓは、ＰＨＨにおけるアポトーシスを抑制するのに効果的であり、このＦａｓ誘発アポトーシスモデルにおいて、ＰＨＨの生存に寄与する、追加の及び新規の因子としての、Ｃ３Ａ細胞によるｓＦａｓの分泌を支持している。
【０１２６】
これらの結果は、Ｃ３Ａ細胞が、複数のメカニズムを介して肝細胞の生存を促進し、及び本発明のシステムによる治療が、ｓＡＡＨ対象に利益を提供する可能性があるという、潜在的な意味を示唆していることを示す。
【０１２７】
本発明を、上記実施例を参照して説明してきたが、改変及び変更は、本発明の趣旨及び範囲内に包含されることは理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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