(57)【要約】【課題】本発明は、概して、インプラント、特に管腔組織インプラントの作製に用いられる方法及び材料に関する。【解決手段】このインプラントは、無細胞足場又はマトリックスに筋細胞前駆体及び線維芽細胞を播種すること、例えば特定の細胞比を用いた注入播種によって操作される。本発明は、改善された細胞の生着及び分化のために本明細書に記載される新規播種方法を利用することができる、対象への植え込みのためのティッシュエンジニアリングコンストラクトを作製する方法を提供する。加えて、本発明は、本発明のエンジニアリングコンストラクト又は組織を植え込むことによって個体を治療する方法を記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象への植え込みに好適な組織コンストラクトを作製する方法であって、
（ｉ）無細胞足場を提供する工程と、
（ｉｉ）前記足場内又はその上に中胚葉性血管芽細胞と線維芽細胞との組み合わせを播種する工程と、
（ｉｉｉ）前記播種足場を培養する工程であって、前記コンストラクトを作製する、工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織コンストラクトが、食道又は腸などの管腔臓器における植え込み又は前記臓器の置換に好適である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織コンストラクトが新生児又は乳児に好適な食道コンストラクトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
播種に用いられる中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の比が５０：５０〜９９：１、６５：３５〜９０：１０、７０：３０〜９０：１０、８０：２０〜９０：１０、又は８３：１７〜８７：１３である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
比が約８５：１５である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が同時に播種される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が互いに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６若しくは４８時間以内に又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６若しくは４８時間で逐次的に播種される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が液体又はゲル培地で送達される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地中の総細胞濃度が１×１０８〜１×１０１０細胞／ｍＬである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
播種が、前記足場、好ましくは前記足場の筋層への注入による、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
注入量が１〜５０μＬ又は５〜１０μＬである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の播種に用いられる流速が１〜２５μＬ／ｓ又は１〜１０μＬ／ｓの範囲である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記播種が、少なくとも１０５、１０６又は１０７細胞／５ｍｍ長の細胞密度、より好ましくは約１０６細胞／５ｍｍ長の密度を達成するための複数回の注入を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞が自家性である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が生検によって入手される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記中胚葉性血管芽細胞が以下のマーカー：ＡＰ、ＮＧ２を発現する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記中胚葉性血管芽細胞が播種前に少なくとも２回継代される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記足場が管状である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記足場が合成である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記足場が脱細胞化される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記足場が管腔臓器に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記足場が非ヒト起源である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記足場がブタ由来であり、好ましくは脱細胞化子ブタ食道である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉａ）生物学的供給源に由来する足場を提供する工程と、
（ｉｂ）前記足場を脱細胞化する工程であって、無細胞足場を提供する、工程と
を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞を前記足場の上に播種する工程の後、前記播種足場が培養培地に置かれる前にある期間にわたって前記細胞が前記足場に接着される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記足場が播種された後、バイオリアクター中で前記中胚葉性血管芽細胞の成長及び分化に好適な１つ以上の培地中で、前記コンストラクトが無菌条件下において培養される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記足場が静置培養条件下で培養され、続いて動的培養条件下で培養される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記足場が動的培養条件下で３〜２８日間、任意選択で４〜２１日間、任意選択で４〜１４日間にわたり培養される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
動的培養中、前記培地が増殖培地から分化培地に交換される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記動的培養が、少なくとも１日の増殖培地及び少なくとも６日の分化培地を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記コンストラクトが、前記中胚葉性血管芽細胞が分化して少なくとも以下のマーカー：ＮＧ２、アルカリホスファターゼを発現するまで培養される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養条件が前記コンストラクトを拍動性又は蠕動性の力に供する、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオリアクターが、着脱可能なカセットであって、脱細胞化バイオリアクターから移され、播種に供され、且つ次に再細胞化バイオリアクターに導入され得るカセットを組み込む、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｉｉｉ）の後、前記組織コンストラクトが血管新生のために対象の異所性部位に植え込まれる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組織コンストラクトを少なくとも１つの表面上で上皮化させる更なる工程を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記コンストラクトが管腔形状を有し、且つ管腔内表面上で上皮化される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることが可能な組織コンストラクト。
【請求項３９】
新生児、乳児、小児又は成人における植え込みに好適な食道コンストラクト又は腸コンストラクトである、請求項３８に記載のコンストラクト。
【請求項４０】
組織若しくは臓器の置換若しくは修復を必要としているか、又は組織若しくは臓器損傷若しくは欠損を患っている対象を治療する方法であって、請求項３８又は３９に記載の移植可能な管腔組織コンストラクトを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４１】
前記対象の体に前記コンストラクトを同所性に植え込むか又は移植する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
組織若しくは臓器の損傷若しくは欠損の治療に用いられるか、又は対象の組織若しくは臓器の修復若しくは置換に用いられる、請求項３８又は３９に記載のコンストラクト。
【請求項４３】
対象の組織若しくは臓器の損傷若しくは欠損を治療するための、又は対象の組織若しくは臓器を修復若しくは置換するための医薬の製造における請求項３８又は３９に記載のコンストラクトの使用。
【請求項４４】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法における請求項３８又は３９に記載のコンストラクトの使用。
【請求項４５】
前記コンストラクトが、前記対象から得られた自家細胞を含む、請求項４０若しくは４１に記載の方法、請求項４２に記載のコンストラクト、又は請求項４３若しくは４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記対象が、食道閉鎖症、特に食道無形成を患っているヒト新生児又は乳児であり、かつ前記コンストラクトが食道コンストラクトである、請求項４０若しくは４１に記載の方法、請求項４２に記載のコンストラクト、又は請求項４３若しくは４４に記載の使用。
【請求項４７】
脱細胞化生体足場の中胚葉性血管芽細胞による細胞生着及びコロニー形成を改善するための線維芽細胞の使用であって、前記線維芽細胞が、以下の比率の範囲５０：５０〜９９：１、６５：３５〜９０：１０、７０：３０〜９０：１０、８０：２０〜９０：１０、８３：１７〜８８：１２内の中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の比で使用される、使用。
【請求項４８】
前記改善された細胞生着及びコロニー形成が中胚葉性血管芽細胞移動の改善を含む、請求項４７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、概して、インプラント、特に管腔組織インプラントの作製に用いられる方法及び材料に関し、このインプラントは、無細胞足場又はマトリックスに筋細胞前駆体及び線維芽細胞を播種することによって操作(engineer)される。本発明は、改善された細胞の生着及び分化のために本明細書に記載される新規播種方法を利用することができる、対象への植え込み(implantation)のためのティッシュエンジニアリングコンストラクトを作製する方法を提供する。加えて、本発明は、本発明のエンジニアリングコンストラクト又は組織を植え込むことによって個体を治療する方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
組織又は臓器損傷、機能不全又は欠損は、様々な医学的状態の特徴である。かかる状態の一部では、損傷組織又は臓器の置換が最良の選択肢であり、又は唯一の選択肢となることさえある。
【０００３】
例えば、食道閉鎖症は消化管に発症する先天性疾患であり、新生児２５００人に約１人の割合で発生する。これによって食道が正常に胃に接続するのでなく、途切れて盲端の袋状になる。食道閉鎖症の最も重症な例は食道無形成と称されることもあり、この場合、食道が全く存在しない。大多数の症例における最も即時的且つ有効な治療は、食道の両端を互いに再接合する外科的修復である。
【０００４】
ヒトドナー（生体又は死体のいずれも）からの移植(transplantation)は多大な成功を収めており、肝臓、心臓、及び腎臓移植などの手技はますます一般的になりつつある。しかしながら、深刻なドナー不足、臓器の摘出及びレシピエントの元へのその輸送の複雑さ、並びに病原菌感染の危険性は、小児患者へのその適用可能性と同様に、この手法の重大な欠点である。
【０００５】
例えば、国際公開第０２１４４８０号に説明されるとおり、ティッシュエンジニアリングは、実験室で代用組織及び臓器を培養する技術を開発しようとする発展分野である。
【０００６】
一般的な代用組織の作製戦略は、哺乳類細胞を利用し、これが細胞培養に適切な基材に播種される。細胞は、対象とするレシピエントから（例えば生検から）入手することができ、その場合、細胞は多くの場合に培養下で拡大した後に基材への播種に用いられる。細胞はまた、他の供給源（例えば樹立細胞株）から入手することもできる。播種後、実験室で及び／又はエンジニアリング組織の植え込み後に患者において細胞成長が継続する。
【０００７】
従って、例えば、損傷した管腔臓器（食道など）の再生又は置換用のコンストラクトの開発には、機能性の三次元組織を作り出す足場と細胞との組み合わせが必要である。
【０００８】
国際公開第０２１４４８０号（この開示は参照により本明細書に援用される）は、細胞をインビトロで基材上に成長させ、次にこのコンストラクトを脱細胞化して主に細胞外マトリックス成分からなる脱細胞化コンストラクトを作製することによってティッシュエンジニアリングコンストラクトを作製する方法について記載している。このコンストラクトは、即時使用しても又は必要になるまで保存してもよいことが報告されている。この脱細胞化コンストラクトは、コンストラクトの対象とするレシピエントから得た細胞をこのコンストラクトに播種することを含み得る更なるティッシュエンジニアリングに使用することができる。コンストラクトの作製に必要な成長段階のいずれにおいても、開発中のコンストラクトは、拍動性の力を含めた機械的刺激を加えるなど、様々なティッシュエンジニアリング工程に供され得る。これらの方法はまた、動物又はヒトから組織を採取し、その組織に対して１つ以上のティッシュエンジニアリング工程を実施し、及び組織を脱細胞化に供することによりエンジニアリング天然組織を作製することも含む。次に、脱細胞化されたエンジニアリング天然組織は、更なるティッシュエンジニアリング工程に供され得る。
【０００９】
国際公開第２００３０９２４７１号（米国特許出願公開第２００５／０２０２０５８号としても公開されている）は、細胞外マトリックス材料を追加の内皮細胞及び少なくとも１つの更なる追加の外因性細胞集団との組み合わせで含む組織グラフトコンストラクトについて記載している。
【００１０】
米国特許出願公開第２０１４／０３４１８６２号は、複数回継代されておらず、且つある含有量のＥＯＥＣ（初期増殖血管内皮前駆細胞）及びＬＯＥＣ（後期増殖血管内皮前駆細胞）を有する血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を使用する医療用組織コンストラクトを調製する方法に関する。これらの細胞並びに線維芽細胞及び／又は筋細胞、即ち、筋芽細胞、筋線維芽細胞、平滑筋細胞又はこれらのプロジェニターが生細胞の形態でマトリックスに播種されるか、又はマトリックスに導入されることにより、更なる処理工程後に組織コンストラクトが得られる。マトリックスは、好ましくはタンパク質製剤、より詳細にはフィブリノゲン製剤である。
【００１１】
米国特許出願公開第２００４／００２８６６２号は、細胞コロニー形成方法に関し、ここでは、生体細胞が合成又は天然組織マトリックス上にコロニー形成されて組織インプラント又は組織移植片を得る。共培養細胞によって供給されるメディエーター、因子又は補因子を加えることにより、細胞の成長が促進される。
【００１２】
国際公開第０３／０９５６３１号は、多能性幹細胞、その単離及びインビトロ拡大方法、そのインビトロ分化方法、及び生物組織の再生又は修復のためのその使用に関する。
【００１３】
残念ながら、ティッシュエンジニアリングにおける細胞播種技術及び細胞の組み合わせの既存の手法は、低い細胞生着率及び足場上の不均一な細胞集団を示すことが多い。これにより、機能性組織、特に管腔組織又は臓器の開発が阻まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、細胞生着率又は関連する特性が向上した移植可能な管腔組織又は臓器を作製するためのマトリックスの足場の新規播種方法があれば、当該技術分野に寄与をもたらすであろうことが理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の開示
意外にも、本発明者らは、本発明の方法に従って筋細胞前駆体と線維芽細胞との組み合わせを組織足場又はマトリックスに播種して、臓器の修復又は置換のためのコンストラクトを操作すると、三次元マトリックスの細胞生着及びコロニー形成が改善され得ることを実証した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい実施形態では、食道ティッシュエンジニアリングのための足場の壁に線維芽細胞と筋細胞前駆体との組み合わせが注入される。注入は、足場内部への直接的な細胞懸濁液の分布の成功をもたらす。
【００１７】
理論によって拘束されることを望むものではないが、上記の２つの細胞集団を送達すると、これらの２つの細胞系間にパラクリン作用を確立し得ると考えられる。これが、予想外にも、足場にわたる細胞の生着、増殖、及び移動／侵入、並びに筋細胞プロジェニターの成熟筋細胞への分化の改善をもたらす。更に、筋細胞及び線維芽細胞の存在は生体組織の不均一性を模倣し、これらの２つの細胞型の存在により、複数の外因性成長因子又は接着分子を培養物に加える必要がなくなり得る。
【００１８】
更に、本発明者らは、意外にも、等しい又はより高い筋細胞前駆体の線維芽細胞に対する比を用いると、細胞の均一な分布がもたらされる一方、線維芽細胞が過成長する可能性が低下することを見出した。従って、得られる生成物は、天然に存在する組織をより綿密に反映し、従って望ましい。
【００１９】
このように、本明細書に記載される好ましいプロトコルに従う細胞型の送達は、組織の種々の層を通じたより均一な細胞分布をもたらし、従って天然組織に一層類似したコンストラクトをもたらすことが示されている。
【００２０】
本発明は、改善された細胞の生着及び分化のために本明細書に記載される新規播種方法を利用する、体への植え込みのためのティッシュエンジニアリングコンストラクトを作製する方法を提供する。加えて、本発明は、本発明のエンジニアリングコンストラクト又は組織を植え込むことにより、組織又は臓器の置換又は増強（例えば修復）を必要としている個体を治療する方法を記載する。本発明のこれら及び他の態様をここで更に詳細に説明する。
【００２１】
一態様において本発明は、組織又は臓器コンストラクト、例えば管腔又は他の中空組織コンストラクトを作製又は操作する方法であって、
（ｉ）足場又はマトリックスを提供する工程と、
（ｉｉ）マトリックス内及び／又はその上に中胚葉性血管芽細胞と線維芽細胞との組み合わせを播種する工程であって、前記中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞が、別々に、同時に又は逐次的に播種される、工程と、
（ｉｉｉ）播種された足場を培養して植え込み可能なコンストラクトを作製する工程と
を含む方法を提供する。
【００２２】
本発明において、本組織又は臓器コンストラクトは、播種された中胚葉性血管芽細胞及び／又は線維芽細胞の増殖及び／又は分化により、好ましくは両方の細胞型の増殖により、及び提供された足場上及び／又は足場内での中胚葉性血管芽細胞の分化により作製される哺乳類組織を含む。本発明の作製方法、従って管腔組織又は臓器コンストラクトの生成は、概してインビトロで行われる。
【００２３】
しかしながら、更なる細胞増殖及び／又は分化並びにコンストラクトの生成が植え込み後にインビボで起こり得ることが理解されるであろう。このように、好ましくは、コンストラクトの作製は、対象への植え込みを成功させることが可能となるのに十分に細胞が集密したコンストラクトが生成されるまで、及び／又は前駆細胞（中胚葉性血管芽細胞）が十分に分化するところまでインビトロで行われる。
【００２４】
次に、例えば植え込み後に引き続き足場内及び／又は足場上で更なる細胞増殖が起こり得る。従って、対象への植え込みに有用となるのに、播種した細胞が足場に完全に集密する必要はないことが理解されるであろう（例えば、足場に播種細胞が存在しない範囲がある可能性があり、例えば、足場はその表面の少なくとも７０、８０、９０、９５又は９９％にわたって播種細胞を有してもよい）。
【００２５】
生成される組織又は臓器コンストラクトのサイズ及び／又は形状は、典型的には、前記組織又は臓器コンストラクトを必要としている対象又は患者の治療しようとする傷害及び／又は損傷のサイズ／形状に相当するものであり得る。
【００２６】
従って、例えば、対象が管腔組織／臓器の一部分を欠いている場合、作製される組織又は臓器コンストラクトは、その不足部分のサイズ／形状に対応し得る。或いは、生成される組織又は臓器コンストラクトは、対象の管腔臓器の傷害／損傷のサイズよりも大きいサイズであってもよく、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０％大きくてもよく、このようなより大きいコンストラクトは植え込まれてもよく、又はコンストラクトが作製後に適切なサイズ／形状にされてもよい。コンストラクトのサイズ及び寸法は、植え込む対象レシピエントの年齢及び体格に更に依存し得る。
【００２７】
「管腔」コンストラクトなどの表現は、厳密にコンストラクト自体の構造よりむしろ、以下に記載するような管腔臓器又は組織の置換又はそれへの植え込みに好適なコンストラクトを指す。組織コンストラクトという表現は、それに応じて理解されなければならない。従って、食道コンストラクトという表現は、食道への植え込みに又は代用食道として好適なコンストラクトを指し、及び腸コンストラクトという表現は、腸への植え込みに又は代用腸として好適なコンストラクトを指す。
【００２８】
一実施形態において、本コンストラクトは、例えば、前記コンストラクトが管腔臓器の不足部分又は欠如部分の提供又はその完全な置換に用いられる場合、管腔形状又は管形状を有し得る。しかしながら、管腔コンストラクトは必ずしも管腔形状又は管形状を有するとは限らず、上記で考察したとおり、形状は、置換、挿入又は修復しようとする組織に全面的に依存する。
【００２９】
先述のとおり、作製又は生成された組織又は臓器コンストラクトは、足場又はマトリックス（特に無細胞マトリックス又は足場、例えば脱細胞化足場又はポリマー足場など）と、均一な分布の細胞（分化中胚葉性血管芽細胞／非分化中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞）とを含むことになる。任意選択で、これは、レシピエントの体に結び付けるか又は取り付けるための他の手段によって更に改良され得、又はそれと組み合わせられ得る。
【００３０】
更に、組織又は臓器コンストラクトは、他の細胞型、特に上皮及び／若しくは内皮細胞又は神経堤細胞を含み得る。更なる実施形態において、本発明の方法は、植え込み前に上皮細胞をコンストラクト上又は足場内及び／若しくは足場上に播種する追加の工程を含む。
【００３１】
用語「組織」又は「臓器」は、文脈上特に要求されない限り、本明細書ではコンストラクトに関連して同義的に使用される。
【００３２】
本明細書に記載される強く弾力性のある平滑筋を含有するコンストラクトを作製するためのプロトコルは、食道、気管、血管、腸管、尿道、腸などの管腔／中空（これらの用語は文脈上特に要求されない限り同義的に使用される）臓器に適用し得る。本発明の方法によって作製される組織又は臓器コンストラクトは、特に食道コンストラクトとして有用性がある。更に、上記の方法により作製される組織又は臓器コンストラクトは、特に腸コンストラクトとして有用性がある。本発明の方法によって作製されるコンストラクト（例えば食道及び腸コンストラクト）は、新生児又は乳児の治療に特に好適である。
【００３３】
上記に記載したとおり、本発明者らは、意外にも、等しい又はより高い中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の比を導入すると、組織コンストラクトにおける細胞の有利な均一分布が得られることを見出した。従って、好ましい実施形態では、足場又はマトリックスへの導入に以下の比率の範囲５０：５０〜９９：１、６５：３５〜９０：１０、７０：３０〜９０：１０、８０：２０〜９０：１０、８３：１７〜８８：１２内の中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の組み合わせが包含される。好ましくは、７０：３０以上の中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の比が用いられてもよく、約８５：１５の比が特に好ましい。
【００３４】
中胚葉性血管芽細胞と線維芽細胞との「組み合わせ」が同時に、逐次的に又は別々に播種され得ることは理解されるであろう。従って、細胞が一緒に及び／又は同じ時点で導入される必要はなく、これに関連して「組み合わせ」が細胞の同時送達を含意すると解釈されてはならない。逐次送達は、細胞集団を互いに少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは６０分以内、又は互いに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６若しくは４８時間以内、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６若しくは４８時間で送達することを含み得る。しかしながら、同時送達が好ましく、この場合、細胞は別々の供給源又は同じ供給源のいずれかから一緒に導入され、細胞は、好ましくは上記に記載したとおりの好適な比で予め一緒に混合されている。
【００３５】
播種のため、細胞は、当該技術分野において周知のものなどの好適な培地中に入れて送達され得る。例としては、MEGACELL、ＤＭＥＭ等、又はマトリゲル等などのゲルが挙げられる。培地はコラーゲン、フィブロネクチンなどを含有し得る。
【００３６】
適用される細胞密度は、典型的には１×１０８〜１×１０１０細胞／ｍＬ、例えば約１×１０９細胞／ｍＬの範囲であり得る。
【００３７】
好ましくは、播種は、足場又はマトリックス、好ましくはマトリックスの筋層内に注入することによって行われる。好適なマトリックス供給源について以下で更に詳細に考察する。本発明者らは、このように注入すると、細胞を表面に加えるのと比べて優れた生成物がもたらされることを明らかにしている。
【００３８】
特に好ましい実施形態において、細胞は、足場又はマトリックス上及び／又はその内部に共注入によって播種され得る。
【００３９】
適用する培地の容積は細胞密度に依存することになるが、好ましい注入では、これは、典型的には１〜５０μＬ、例えば１〜５０μＬ、最も望ましくは５〜１０μＬの範囲、例えば約５μＬであり得る。
【００４０】
最適には、注入液を送達する間の流速は１〜２５μＬ／ｓ、例えば１〜１０μＬ／ｓの範囲、例えば約５μＬ／ｓである。
【００４１】
足場上に細胞の複数回の播種が行われ得る。従って、好ましくは、播種は、細胞が可能な限り足場全体にわたって分散することを確実にするため、複数回の注入によって達成される。細胞の密度は、少なくとも１０５、１０６又は１０７細胞／５ｍｍ長、より好ましくは、極めて有効な生着につながることが示されている約１０６細胞／５ｍｍ長の密度であることが望ましい。従って、例えば、細胞の少なくとも１回の適用（例えば注入、特に少なくとも２、３、４、又は５回の適用（例えば注入）が行われる。注入回数は足場のサイズ及び形状に依存し得ることが理解されるであろう。
【００４２】
非限定的な例として、新生児に好適な典型的食道コンストラクトは、弛緩状態にあるときに直径約８〜１０ｍｍ及び長さ４〜５ｃｍであり得る。かかるコンストラクトは、例えば５ｍｍの輪毎に（円周方向に）３ヵ所の注入に供され得る。
【００４３】
管状足場には、例えばＮＧチューブが挿管されてもよく、播種のためのアクセス及び操作がより容易に可能になり得る。
【００４４】
「中胚葉性血管芽細胞」は、本明細書で使用されるとき、前駆又はプロジェニター筋細胞を指し、大血管に存在する平滑筋層の前駆細胞である。
【００４５】
中胚葉性血管芽細胞は、典型的にはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）及びＮＧ２などのマーカーを発現する。
【００４６】
用語「前駆細胞」は、完全には分化していないが、それ自体がより完全な分化型になる能力、又は更に分化可能な細胞（又は複数の細胞）を生じる能力のいずれかを有する細胞を指す。前駆細胞は１つ以上の異なる細胞型を生じ得る。前駆細胞が更に分化可能な細胞（又は複数の細胞）を生じる過程には、１ラウンド以上の細胞分裂が含まれ得る。用語「プロジェニター細胞」はまた、分化経路に沿った１つ以上の工程を経た可能性のある細胞、例えば、１つ以上の分化マーカー、例えば平滑筋分化マーカーＳＭ２２及びａＳＭＡを発現する細胞も含む。
【００４７】
用語「線維芽細胞」は、血中を循環している線維芽細胞を含め、最も一般的な意味で理解されるべきである。
【００４８】
本方法において使用される細胞は、典型的には自家性であり、即ち、本発明の方法によって生成される組織又は臓器コンストラクトの対象とするレシピエントが起源であるか、又はそれに由来することになる。しかしながら、本方法に用いられる細胞は同種異系であってもよく、即ち、生成する組織又は臓器コンストラクトのレシピエントではない対象から得られるか、又はそれに由来してもよい。更に、異種細胞、即ち、組織／臓器コンストラクトのレシピエントと異なる種に由来する細胞が使用されてもよい。
【００４９】
本方法に用いられる細胞は、患者の小生検（例えば筋肉の）から入手されてもよく、これらの細胞は、例えばＧＭＰグレードのコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを用いて単離されてもよい。
【００５０】
特に、本方法において使用される中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞は、好都合には同じ生検から入手され得る。他の細胞も本発明の方法において使用してよく、及び／又は作製された組織又は臓器コンストラクトに存在してよい。特に、上皮細胞が存在してもよく、これは、中胚葉性血管芽細胞／線維芽細胞と同じ又は異なる生検から入手され得る。更に、平滑筋細胞が存在してもよい。
【００５１】
１つの例示的なプロトコルでは、小さい（２〜３ｍｍ）筋生検を選択培地（Megacell）中のマトリゲル／コラーゲンゲルにプレーティングして細胞増殖を促進し得る。Megacell培地中で細胞を成長させて、６０〜７０％コンフルエントになった時点で継代し得る。
【００５２】
更に、本方法は、血管内皮前駆細胞の非存在下で実施されてもよく、従って、一実施形態において作製される組織又は臓器コンストラクトが内皮細胞を含まなくてもよい。
【００５３】
細胞の継代が終わると、それらの細胞は播種に利用することができる。例えば、細胞は、トリプシン処理し（例えば３、４、５、６又は７代継代間で）、次に選択のゲル又は培地中に懸濁して氷上に保管してもよい。
【００５４】
本発明の方法には、播種するための足場又はマトリックス（これらの用語は本明細書で同義的に使用される）が必要である。
【００５５】
特に、無細胞足場又はマトリックス、例えば、脱細胞化足場又はポリマー足場が使用される。かかる足場及びその作製方法は当該技術分野において周知である。例えば、国際公開第０２１４４８０号は、当該技術分野における足場の５つの一般的な分類に言及している：（１）非分解性合成ポリマー、（２）分解性合成ポリマー、（３）非多孔質である非ヒトコラーゲンゲル、（４）所望の多孔度に加工される非ヒトコラーゲンメッシュ、及び（５）ヒト（死体）脱細胞化コラーゲン組織。
【００５６】
「無細胞」足場は、典型的には細胞又は細胞成分を含まない。しかしながら、例えば生物学的供給源からの足場、例えば脱細胞化足場が使用される場合、以下で考察するとおり、一部の細胞が例えば脱細胞化後に足場に残り得る可能性があることが理解されるであろう。
【００５７】
本明細書における一実施形態において、足場は人工合成ポリマー足場である。
【００５８】
合成ポリマーの例としてはダクロン（Dacron）及びテフロン（Teflon）が挙げられ、これらは種々の繊維及び織布に加工し得る。合成組織マトリックスとして用いられる他のポリマーとしては、ポリガラクチド（polygalactide）及びポリジオキサノンが挙げられる。
【００５９】
他の合成足場は本質的にタンパク質性であってもよく、例えば主にコラーゲンなどの精製タンパク質からなってもよい。
【００６０】
非合成足場も本質的にタンパク質性であってもよく、又は主にコラーゲン性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からなってもよい。
【００６１】
好ましくは、足場は、例えば食道などの管腔臓器に由来する脱細胞化された（生物学的な）マトリックスであり得る。典型的には、足場は、作製した組織又は臓器コンストラクトの植え込みを必要とする管腔臓器又は組織型に由来する。例えば、組織又は臓器コンストラクトが食道への植え込みに必要な場合、典型的には、足場は、例えば別の供給源からの脱細胞化した食道から作製され得る。
【００６２】
一実施形態では、新生児ヒトドナー組織が使用されてもよい。別の実施形態では、足場はヒト死体に由来してもよい。
【００６３】
好ましくは、実現性の点で足場は異種であってもよく、即ち、足場は、レシピエント、例えばヒトレシピエントと異なる種のドナーが起源であるか又はそれに由来する。
【００６４】
これに関連して、脱細胞化に好適な基材は、とりわけ、脱細胞化した動物由来、例えばブタ由来、ラット由来又はウサギ由来の足場である。例えば、好ましい実施形態において、足場は脱細胞化した子ブタ食道であり得る。
【００６５】
任意の公知の脱細胞化方法を用いて足場を提供することができる。一般に、脱細胞化方法は、種々の化学的、生化学的、及び／又は物理的手段を用いて細胞成分を破砕し、分解し、及び／又は破壊し、及び／又は細胞が埋め込まれているマトリックスを修飾することにより細胞及び細胞成分の除去を促進し、典型的にはＥＣＭ足場が残る。国際公開第０２１４４８０号（前掲）は、天然組織の脱細胞化方法について記載している。本発明は、マトリックスを実質的にインタクトなままとして相当な割合の細胞を除去する任意の脱細胞化技法によって作製された脱細胞化足場の使用を包含する。
【００６６】
「相当な割合」の細胞の除去とは、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５又は９９％の細胞の除去を指す。マトリックスを「実質的にインタクトな」ままとするという表現は、マトリックス、例えばＥＣＭの少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９％の存在が保たれることを指す。
【００６７】
本発明は、適切な基材（例えば上記に提示したとおりのもの、特にブタ由来基材）の脱細胞化によって足場又はマトリックスを得る工程を更に含む、上記に記載したとおりの方法を更に提供する。
【００６８】
足場は、典型的には任意の形状又はサイズであってよく、特に対象における置換、修復又は処置が必要な組織のサイズ／形状に対応してもよい。或いは、足場は傷害より大きくても又は更には小さくてもよい（インビボで細胞増殖が起こり得る）。
【００６９】
細胞の播種後、本発明の特定の実施形態では、細胞集団は、播種足場を培養培地に置く前にある期間にわたりマトリックスに接着される。必ずしも全ての播種細胞がマトリックスに接着しなくてもよいことが理解されるであろう。しかしながら、特に播種細胞の少なくとも６０、７０、８０又は９０％は接着し得る。
【００７０】
更に、国際公開第０２１４４８０号に説明されるとおり、足場への細胞の接着を増強するために様々な処理を適用し得る。適切な処理については、例えば米国特許第５，６１３，９８２号に記載されている。かかる処理には、足場又は成長中のコンストラクトへの様々なタンパク質、例えば成長因子又は細胞外マトリックスタンパク質の適用が含まれる。例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はプロテオグリカンを基材に適用し得る。基材に成長因子を含浸させることができ、又は培養培地にこれらの薬剤を供給してもよい。
【００７１】
本発明の方法では、細胞が播種されたコンストラクトは、細胞の成長に好適な環境で成長期間にわたって培養されることによりエンジニアリングコンストラクトを形成する。
【００７２】
培養下の哺乳類細胞に適切な成長条件は当該技術分野において周知である。細胞培養培地は、概して、必須栄養素、及び任意選択で成長因子、塩、ミネラル、ビタミン等の追加的な要素を含む。詳細な成分は、細胞成長、分化、特定のタンパク質の分泌等が増強されるように選択し得る。一般に、標準成長培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地、低グルコース（ＤＭＥＭ）、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸塩及びグルタミン含有、１０〜２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）又は仔ウシ血清及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン補足が挙げられ、これが適切であるが、当業者に周知の様々な他の標準培地も同様に適切である。
【００７３】
好ましくは、細胞は、無菌条件下で約５％ＣＯ２雰囲気中において、細胞の起源の動物の体温又はそれに近い温度で培養される。例えば、ヒト細胞は、好ましくは約３７℃で培養される。
【００７４】
一般に、成長期間の長さは、作製する詳細なティッシュエンジニアリングコンストラクトに依存することになる。成長期間は、コンストラクトが所望の特性を獲得するまで、例えば、コンストラクトが特定の厚さ、サイズ、強度、タンパク質成分組成、細胞密度、又は適切な細胞マーカーの発現（例えば、中胚葉性血管芽細胞由来の平滑筋細胞は、ＳＭ２２、αＳＭＡ、カルポニンなどのマーカーを発現するはずである）を達成するまで続き得る。これらのパラメータの評価方法については、米国特許第５，６１３，９８２号及び以下の実施例に記載される。
【００７５】
典型的には、播種したコンストラクトの培養は「バイオリアクター」内であり得る。
【００７６】
例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３４１８６２号に考察されるとおり、極めて幅広い種々の組織コンストラクトに好適なリアクターが先行技術において公知である。管状コンストラクトには、例えば、独国特許出願公開第１９９  １５  ６１０号（Bader）に示されるとおりのリアクター、又は欧州特許出願公開第０  ３２０  ４４１号（Sulzer）に記載されるとおりのものが好適である。かかるリアクターに管状血管がクランプ固定され、そのようにして、続く体内における自然の統合状態に最も近くなるように培地又は血液のスルーフローに供され得る。以下の実施例では、例えば細胞分布及び移動の向上の点で動的培養が静置条件よりも優れていることが示されている。
【００７７】
スルーフローは連続フローであってもよい。スルーフローは、心拍動及び血液循環の影響を模擬するために拍動流方式で生じさせてもよい。これらの手段は、得られるコンストラクトの機械的強度を向上させ、細胞の組織化を刺激して自然の集合体をもたらすことができる。好ましい動的培養システムは、筋肉生着指標を改善するための機械的刺激（「蠕動様」培養）を取り入れるものである。米国特許出願第０９／１０９，４２７号は、どのようにしてチャンバ内で本体の内部と連通しているポンプを用いて周期的に増加する圧力を供給し、コンストラクトの管腔内で膨張性本体を膨張させて拍動性の伸縮力をコンストラクトに付与し得るかについて記載している。
【００７８】
このバイオリアクターは、着脱可能なカセットであって、脱細胞化バイオリアクターから移され、播種に供され、且つ次に再細胞化バイオリアクターに導入され得る着脱可能なカセットを組み込み得る。
【００７９】
使用時、チャンバの内側区画と外側区画との分離を可能にする２つのインサート（例えばガラス又はプラスチック）に管状コンストラクトを縫合糸で固定し得る。次に、培養チャンバ（バイオリアクター及びリザーバに接続されている）の両方の区画に増殖用培地を充填し得る。
【００８０】
次に、チャンバを静置条件でインキュベートした後、動的培養のため内側チャンバにおいてフローを開始し得る。
【００８１】
所定の培養時間（例えば約２４又は４８時間）が経った後、チャンバ及びリザーバの両方を増殖培地から分化培地に交換することができる  −  例えば、好ましいプロトコルは、メガセル（Megacell）などの増殖培地で約１〜２日、続いて分化培地（高濃度ＴＧＦβのＤＭＥＭ低血清など）で９日である。典型的には、６〜１４日、例えば９日である適切な時間が経った後、動的培養を停止させることができ、この時間中に少なくとも１回の全培地交換がある。しかしながら、培養は、より長時間、例えば最長２１又は２８日間であってもよい。
【００８２】
任意選択で、足場は、大網(omentum)又は他の異所性部位に例えば４〜６週間にわたり植え込んだ後に同所性移植して、血管新生を増進させてもよい。
【００８３】
更に、培養後及び使用前に、足場の１つ以上の表面、例えば使用時に管腔表面となる表面を上皮化させることが求められる場合もある。足場又はコンストラクトがそれ自体管腔形状又は管形状である場合、足場又はコンストラクトの管腔側面又は表面（即ち管形状又は管腔形状の足場又はコンストラクトの内表面）を上皮化させることが望ましい場合もある。
【００８４】
従って、本発明の方法は、コンストラクトに上皮細胞を播種する追加の工程を含み得る。次に、このコンストラクトは、必要に応じて更なる培養に供され得る。
【００８５】
中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞の入手に関連してなされる説明は、コンストラクト上への送達及び播種について上皮細胞の提供に適宜修正して適用される。例えば、コンストラクトが意図される対象の生検、詳細にはその対象の管腔臓器（損傷しているか又は退化していることがあり得る）に由来する初代細胞である。
【００８６】
上皮細胞の播種後、コンストラクトは、更に培養して上皮層の成長又は拡大を可能にした後に使用されることになる。
【００８７】
本発明の別の態様では、本発明の方法により得られるか又は得ることが可能な組織又は臓器コンストラクト（例えば管腔組織又は臓器）が提供される。特に、この組織又は臓器コンストラクトは、その対象とする部位における植え込み及び吻合に好適である。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法によって得られるか又は得ることが可能な食道又は腸コンストラクトを提供する。詳細な態様において、この食道コンストラクトは、新生児又は乳児への植え込みに好適であり得る。先に考察したとおり、コンストラクトの寸法は、コンストラクトを受ける対象及び起こった臓器傷害又は損傷に依存し得ることが理解されるであろう。
【００８９】
更に、前記コンストラクトは、足場、線維芽細胞並びに分化及び非分化中胚葉性血管芽細胞を含み得ることが理解されるであろう。特に、このコンストラクトでは、導入／播種された中胚葉性血管芽細胞の分化が起こっていることが好ましい。従って、詳細な実施形態では、播種された中胚葉性血管芽細胞の全てが筋細胞に分化していることになる。しかしながら、播種された中胚葉性血管芽細胞の一部がコンストラクトにおいて分化していないか、又は完全には分化していないことが可能である。特に、コンストラクトにおいて、中胚葉性血管芽細胞の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９％は筋細胞（平滑筋細胞）に分化しているか、又は分化し始めていてもよい。筋細胞への中胚葉性血管芽細胞の分化は、マーカーＳＭ２２の計測、又は本明細書に記載される別法によって容易に評価することができる。
【００９０】
更なる実施形態において、足場、平滑筋細胞、線維芽細胞を含み、且つ任意選択で中胚葉性血管芽細胞を含む管腔組織又は臓器コンストラクトが提供され、ここで、好ましくは、前記平滑筋細胞及び／又は中胚葉性血管芽細胞は線維芽細胞と比較して５０：５０〜９９：１の比、最も詳細には少なくとも７０：３０又は８５：１５の比で存在する。
【００９１】
別の態様において、本発明は、組織若しくは臓器の置換若しくは修復を必要としているか、又は組織若しくは臓器損傷及び／若しくは欠損を患っている対象を、本発明の組織又は臓器コンストラクト、好ましくはその個体の自家細胞を組み込むものを使用して治療する方法を提供する。
【００９２】
用語「対象」又は「患者」は、本明細書で使用されるとき、任意の哺乳類、例えば、イヌ、ネコ等の家庭内動物、ウマ、ブタ又は雌ウシ等の農業用動物、又はヒトを指す。特に、対象又は患者は、新生児又は乳児、特にヒト新生児又は乳児、例えば食道閉鎖症を患っている者であってもよく、これにより、コンストラクトは食道コンストラクトとなる。
【００９３】
組織又は臓器の置換という表現は、先述したものなどの管腔組織又は臓器の一部又は全ての置換を指す。従って、臓器置換とは、例えば臓器又は組織の少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％の置換を指し得る。臓器又は組織の置換は、臓器又はその一部が不足、罹患又は損傷している場合、及び／又は臓器又はその一部が機能していないか又は機能が低下している場合に必要となり得る。
【００９４】
組織損傷又は臓器損傷は、疾患、例えば癌又は有害な作用剤、例えば化学物質又は熱への曝露、例えば熱傷に起因して起こり得る。従って、組織又は臓器の一部又は全てが損傷していることもある。更に、「組織又は臓器欠損」は、かかる損傷の結果として生じることもあり、又は例えば出生時及び出生前に存在することもある（例えば出生異常又は先天性病態）。組織又は臓器の欠損は臓器又は組織の部分的又は完全な欠損であり得る。
【００９５】
先に考察したとおり、本発明のコンストラクトを使用して、食道置換を必要としているか又は食道損傷若しくは欠損を患っている対象を治療し得る。かかる方法は、好ましくは、食道への植え込みに好適なコンストラクト、例えば食道由来の脱細胞化足場又はマトリックスを使用するものを利用する。
【００９６】
好ましい実施形態において、本発明は、食道閉鎖症又は食道無形成を患っている対象を本発明の管腔組織又は臓器コンストラクト（例えば食道コンストラクト）で治療する方法を提供する。
【００９７】
用語「食道閉鎖症」は、食道が盲端の袋状に途切れて胃に接続していない病態を指し、及び「食道無形成」は、本明細書で使用されるとき、食道が全く存在しない特に重症例の食道閉鎖症を指す。
【００９８】
本発明の更なる好ましい実施形態では、好ましくは、本発明の管腔コンストラクト（例えば、脱細胞化腸足場を使用して作製される腸コンストラクト）の投与により、腸損傷若しくは腸欠損を治療する方法、又は腸置換を必要としている対象を治療する方法が提供される。
【００９９】
特定の実施形態において、本方法は、本発明の（例えば本発明の方法に係る）植え込み可能な管腔組織又は臓器コンストラクトを提供すること、及び標準的な外科手技  −  例えば同所性植え込み又は移植  −  に従って個体の体にこのコンストラクト又は組織を植え込むことを含む。
【０１００】
植え込み後、個体の細胞がインビボでこの組織に移動し、播種された細胞集団を補充し得る。コンストラクトへの細胞の移動は、例えば、植え込み前又は植え込み後にコンストラクトを成長因子、走化性物質、又は他の化合物で処理することにより増進させ得る。
【０１０１】
従って、本発明に係る治療方法は、本発明のコンストラクトを患者に外科的に植え込む工程を含み得る。
【０１０２】
別の観点では、本発明は、組織若しくは臓器損傷若しくは欠損の治療に用いられるか、又は組織若しくは臓器置換のための本発明のコンストラクトを提供する。特に、本発明は、食道閉鎖症又は食道無形成の治療に用いられるコンストラクトを提供する。
【０１０３】
更に、本発明は、対象の組織若しくは臓器損傷若しくは欠損の治療のための、又は組織若しくは臓器の置換のための医薬の製造における本発明のコンストラクトの使用を提供する。
【０１０４】
また、本発明に係るコンストラクトの手術における使用も提供される。
【０１０５】
また、手術に用いられる本発明に係るコンストラクトも提供される。
【０１０６】
また、手術に用いられる製品の製造における本発明に係るコンストラクトも提供される。
【０１０７】
別の態様では、線維芽細胞を使用することにより、本明細書に記載されるとおりの３Ｄ足場又はマトリックス（例えば管腔臓器で用いられる管状のもの）の中胚葉性血管芽細胞による細胞生着及びコロニー形成を改善する（移動及び／又は均一性の改善を含む）、詳細には線維化を最小限に抑えることが提供される。好ましくは、線維芽細胞は、以下の比率の範囲５０：５０〜９９：１、６５：３５〜９０：１０、７０：３０〜９０：１０、８０：２０〜９０：１０、８３：１７〜８８：１２内の中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の比で使用される。好ましい比は約８５：１５である。
【０１０８】
細胞生着及びコロニー形成の「改善」には、例えば、線維芽細胞なしに又は最適以下の中胚葉性血管芽細胞：線維芽細胞の比で播種した足場と比較したときの、マトリックスに接着する播種細胞数の増加（例えば少なくとも１０、２０、３０又は４０％の増加）、及び／又は上記で考察したとおり足場にわたる中胚葉性血管芽細胞の移動の改善が含まれ得る。「移動の改善」には、中胚葉性血管芽細胞が足場に集密する速度の増加（例えば足場に集密するのにかかる時間の短縮）、足場にわたって移動する中胚葉性血管芽細胞数の増加及び／又は中胚葉性血管芽細胞が移動する距離の増加が含まれ得る。移動速度、移動する細胞数又は移動距離のうちの任意の１つ以上が、線維芽細胞の非存在下で対応する足場（即ち同じ又は実質的に同じ足場）に播種された中胚葉性血管芽細胞と比較して少なくとも１０、２０、３０又は４０％増加し得る。
【０１０９】
本明細書におけるいずれの小見出しも便宜上含まれるに過ぎず、決して本開示を限定するものと解釈されてはならない。
【０１１０】
ここで、以下の非限定的な図及び実施例を参照して本発明を更に説明する。これらを踏まえれば、本発明の他の実施形態が当業者に想起されるであろう。
【０１１１】
本明細書に引用する全ての参考文献の開示は、当業者によって本発明の実施に用いられ得る程度まで相互参照により本明細書に具体的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＮＧチューブの設置及び無菌条件での食道マトリックスの筋肉壁へのｆＭＡＢのマイクロインジェクションである。
【図２】マイクロインジェクションした足場及び表面播種した足場であり、長手方向に開き、２４マルチウェルプレートに置いて静置培養した。
【図３】コンストラクトの培養に利用した培養チャンバである。
【図４】バイオリアクター及び培養チャンバである。
【図５】免疫不全マウスへの播種食道足場の大網植え込みである。
【図６】増殖用培地で培養したｆＭＡＢはＡＰ及びＮＧ２マーカーを発現した。骨格筋分化培地で培養したとき、ｆＭＡＢは融合してＭＦ２０陽性の、ＭｙｏＤ陽性核を含有する筋管を形成した。ｆＭＡＢはまた、特異的培地と共に培養したときに平滑筋分化マーカーも示し、培養下でＳＭ２２及びａＳＭＡを発現した。
【図７】細胞をマイクロインジェクション又は表面播種によってマトリゲル又は培地のいずれかで送達した播種ラット食道足場のＤＡＰＩ画像からの細胞カウント（グラフ）である。
【図８】マウスＦＢと併せて又は単独で播種したｆＭＡＢの共播種実験である。ＤＡＰＩ染色による代表的な写真である。
【図９】最初の２４時間以内の初期静置培養における培養チャンバセットアップである。ｆＭＡＢを播種した動的培養足場の低温切片のＤＡＰＩ染色である。
【図１０】（Ａ）ヌードマウスの大網に２及び４週間植え込んだ播種足場の切片に関するＨ＆Ｅ及びヒト核免疫蛍光法である。（Ｂ）ＤＡＰＩ染色切片の無作為写真でカウントした面積当たりの細胞数である。（Ｃ）ヒト核及びＫｉ６７マーカーの共染色である。（Ｄ）ヒト核陽性細胞、ヒト核及びＫｉ６７（マウス細胞）二重陽性細胞又はＫｉ６７（マウス細胞）単独陽性細胞の割合である。これらの３つのカテゴリは、左側のバーに上から下に示される。以下に説明するとおり、１ヵ月後には主にヒト核細胞が存在する。
【図１１】マトリックス内部の細胞生着及び増殖を示す、培養した足場から得られた低温切片のＤＡＰＩ染色（図１１Ａ、図１１Ｂ）、動的培養条件によって刺激及び改善された細胞分布及び移動（Ｈ＆Ｅ、図１１Ｃ、図１１Ｄ）である。骨格筋前駆細胞の特異的マーカーであるＭｙｏＤ染色によって骨格筋分化が明らかになった（図１１Ｅ、図１１Ｆ）。
【図１２】ＥＣＭにおけるヒトＭＡＢ生着に対するＦＢの正の効果である。ｈＭＡＢ及びｍＦＢを８５：１５の比で播種すると、培養下で５日後にも細胞比率の維持が示され、一方、７０：３０比は培養中のより高い線維芽細胞増殖につながり、５日後に５０：５０比になった。細胞比率はヒト核染色で決定した。ｈＭＡＢは骨格筋マーカーＳＭ２２を発現し、筋肉分化コミットメントが裏付けられた。
【図１３】比率及び培養条件（増殖用培地における日数＋分化用培地における日数）を変えることによる、脱細胞化ラット足場で培養する中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞のインビトロ細胞播種及び培養条件の最適化である。
【図１４】脱細胞化ラット足場で培養する中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞のインビトロ細胞播種及び培養条件の最適化である。８５：１５混合物をｈＭＡＢ単独及び新鮮ラット食道の筋層と比較する。
【図１５】脱細胞化ウサギ食道足場におけるインビトロ細胞播種実験である。細胞分布及び移動をｈＭＡＢ単独及び平滑筋細胞（イヌ由来）の動的培養と静置培養で比較した。
【図１６】脱細胞化ウサギ食道足場におけるインビトロ細胞播種実験である。細胞分布及び移動をｈＭＡＢ単独及び平滑筋細胞（イヌ由来）の動的培養と静置培養で比較した。
【図１７】ラット及びウサギドナー動物由来の未播種無細胞足場のそれぞれラット及びウサギモデルへの同所性移植の最適化である。甲状腺葉及び筋肉を反転させて元の食道を露出させ、食道の一部分（１〜２．５ｃｍ、動物モデルに依存する）を除去した（図１７Ａ）。次に、遠位及び近位吻合を実施して（図１７Ｂ）、足場の両方の端部を既存の食道につないだ（ラット、図１７Ｃ；ウサギ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）。
【図１８】ＭＴＴ細胞生存アッセイである。Ａ）種々のｈＭＡＢ密度で播種したラット食道足場の画像である。細胞数は２４時間後にパープルホルマザン生成を間接的に計測して検出した、Ｂ）播種足場から抽出したホルマザンの吸光度読み取りによる細胞生存度の定量化である。
【図１９】Ａ）動的培養９日後のｈＭＡＢ播種又は共播種足場の代表的な画像であり、８５：１５試料はヒト核に関しても染色した；Ｂ）染色した切片の無作為写真でカウントした各層における代表的な視野当たりの細胞数（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１）である；Ｃ）各条件で生着した総細胞数に対する割合として表した層間の細胞分布である；Ｄ）未播種対照（０で表される）に対する播種足場層の面積間の比であり、Ｅ）無作為写真において細胞数及び細胞によって覆われた面積から計算した代表的な層当たりの細胞密度（Ｍ：筋肉、Ｓ：粘膜下層）である。
【図２０】Ａ）ＫＩ６７＋細胞の代表的な写真である。ヒト細胞（８５：１５）はヒト核に関しても標識した；Ｂ）無作為写真の各層でカウントした総細胞数に対する動的培養９日後のＫＩ６７＋細胞の割合（＊＊ｐ＜０．０１）である；Ｃ）割合として表した層間のＫＩ６７＋細胞の分布、及びｍＦＢの寄与（Ｍ：筋肉）である。
【図２１】Ａ）ＳＭ２２＋細胞の代表的な写真である。ヒト細胞（８５：１５）はヒト核に関しても標識した；Ｂ）無作為写真の各層でカウントした総細胞数に対するＳＭ２２＋細胞の割合（＊＊ｐ＜０．０１）である；Ｃ）割合として表した層間のＳＭ２２＋細胞の分布、及びｍＦＢの寄与（Ｍ：筋肉、Ｓ：粘膜下層）である。
【図２２】ＭＡＢ単独と比べた共培養を用いて達成された細胞密度の比較である  −  結果は共培養の優位性を実証している。
【図２３】マウス後肢骨格筋から単離したマウス線維芽細胞（ｍＦＢ）はインビトロ拡大後に特徴的な形態を呈し（増殖についてＫｉ６７染色）、ビメンチン及びＴＣＦ−４などの典型的なマーカーが陽性であった（バー：１００μｍ）。
【図２４】Ａ）静置培養６日後の足場内にある全ての細胞の代表的な図式的分布である。Ｂ）完全な円形の切片を仮定した同じ図式的分布マップの極座標分布である。Ｃ）ＤＡＰＩ及びヒト核に関して染色した無作為切片でカウントしたｈＭＡＢ単独播種又は共播種足場における面積当たりの総細胞数である。ｎ≧３。
【図２５】Ａ）ｍＦＢと共に／無しに播種したときのｈＭＡＢの移動に対する効果の試験の概略図である。管状足場の中心に野生型ｍＦＢと共に／無しにルシフェラーゼ＋ｈＭＡＢを播種し、静置培養の５日間にわたって２４時間毎にＩＶＩＳで生物発光を計測した。Ｂ）培養１、３及び５日後の足場におけるルシフェラーゼ＋（Ｌｕｃ＋）細胞を示す代表的な生物発光画像である。注入点の中心から位置決めした８つの関心領域（ＲＯＩ）における放射輝度を計算して画像を分析した。Ｃ）培養１、３及び５日後にＲＯＩ３〜６で計測された放射輝度である。
【図２６】Ａ）ｍＦＢと共に／無しに８．５×１０５個のｈＭＡＢ又は１×１０６個のｈＭＡＢを播種し、平らに開き、ＭＴＴで染色した静置培養６日後の足場の代表的な画像である。細胞塊の中心から足場の縁部まで半径方向に描いた８本の無作為の線（区間Ａ−Ｂ）に沿って色の強度（グレー値）を計測して、注入点からの細胞移動を分析した。Ｂ）線Ａ−Ｂの計測から得られた代表的なグレー値グラフであり、ピクセル単位の距離を２つのプラトー間で計算した。Ｃ）注入点から移動した細胞が進んだ距離（ｍｍ単位）である。
【図２７】Ａ）静置培養又は動的培養後の足場内にある全ての細胞の代表的な図式的分布である。Ｂ）完全な円形の切片を仮定した同じ図式的分布マップの極座標分布である。Ｃ）ＤＡＰＩ及びヒト核に関して染色した無作為切片でカウントした静置条件又は動的条件で培養した足場における面積当たりの総細胞数（ｎ≧３）である。Ｄ）ＤＡＰＩ及びヒト核に関して染色した無作為切片における細胞数から決定される動的条件で培養した足場のｈＭＡＢとｍＦＢとの比率（ｎ≧３）である。
【図２８】Ａ）Ｌｕｃ＋ｈＭＡＢ及びｍＦＢを共播種してバイオリアクターで７日間培養した足場の生物発光画像であり、注入点からの細胞の移動／分布を示す。Ｂ）種々の時点で収集した画像から計算した放射輝度値である。
【図２９】Ａ）静置培養又は動的培養後の足場内にある全ての細胞（黒色）の代表的な図式的分布である。細胞はヒト核及びＳＭ２２に関して染色した。この図はまた、細胞ヒト核＋ＳＭ２２＋及び細胞ＤＡＰＩ＋（ヒト核−ＳＭ２２−）も示す。Ｂ）種々の切片の無作為画像でカウントした静置培養又は動的培養後のＳＭ２２＋細胞の割合（ｎ≧３）及び総％に対するｈＭＡＢ及びｍＦＢの両方の寄与（＊＊ｐ＜０．０１）である。Ｃ）ヒト核及びＳＭ２２染色の代表的な画像（バー：１００μｍ）である。Ｄ）種々の切片の無作為画像でカウントした静置培養又は動的培養後のＫｉ６７＋増殖細胞の割合（ｎ≧３）（＊＊ｐ＜０．０１）である。
【図３０】平滑筋細胞の成熟レベルを評価するためｈＭＡＢ及びｍＦＢを共播種してバイオリアクターで培養した足場のαＳＭＡ又はカルポニンとＳＭ２２との共染色である。
【実施例】
【０１１３】
実施例
中胚葉性血管芽細胞の単離及び特徴付け
在胎９〜１２週齢のヒト胎児の筋組織から胎性中胚葉性血管芽細胞（ｆＭＡＢ）を単離した。標本を希釈マトリゲルでコーティングしたプレートに播き、８日間培養下に置いた。筋組織から移動した細胞を回収し、培養拡大して特徴付けた。細胞は、培養４、５、６及び７代継代で免疫蛍光法、ＦＡＣＳ並びに平滑筋及び骨格筋への分化能によって特徴付けた。ＦＡＣＳ分析について、細胞をＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ９０及びＣＤ１４６に対する抗体と共にインキュベートした。分化能について、細胞を低血清培地と共に（骨格筋分化）、及びＴＧＦβを添加して（平滑筋分化用）インキュベートした。
【０１１４】
筋細胞株の樹立
調達前に患者の同意を得た上で、６つのドナー筋生検（１つは成人患者、５つは小児患者）を入手した。これらの６つの生検のうち、３つの初代中胚葉性血管芽細胞株の樹立に成功し、７代継代までかかって骨格筋及び平滑筋の両方に分化させた。細胞継代毎に中胚葉性血管芽細胞株を凍結保存して、後の特徴付け研究及び再培養のためのバンクを樹立した。中胚葉性血管芽細胞株はコラーゲン（胎盤由来）をコーティングしたＴ２５フラスコに樹立して、マトリゲルをコーティングしたペトリ皿を使用した手順との直接比較を可能にした。継代毎に中胚葉性血管芽細胞株の表現型を特徴付けるためにMACSQuantフローサイトメーターを使用して８カラーフローサイトメトリーパネルを樹立した。全ての抗体は力価測定し、パネルは中胚葉性血管芽細胞の特徴付けに関してバリデートした。
【０１１５】
続いて、インフォームドコンセントを得た後に２つの更なる成人筋生検を調達した。
【０１１６】
ＵＣＬのGiulio Cossu教授から伝授された手順を用いて、コラーゲンコーティングした培養フラスコでの初代中胚葉性血管芽細胞株の樹立に成功した。０代継代から７代継代までに合計５つの細胞株を凍結保存した。後の臨床製造過程を再現するため予備実験をセットアップして解凍した中胚葉性血管芽細胞株の細胞機能及び表現型を決定した。３代継代の２つの細胞株について、細胞機能、細胞分裂及び拡大並びに表現型への有害作用なく解凍して再培養することに成功した。骨格筋及び平滑筋分化の特徴付けを２つの中胚葉性血管芽細胞株でフローサイトメトリーによるα平滑筋アクチン及びミオシン重鎖の両方に関する細胞内染色によって調べた。ここで両方の抗体が最適化され、バリデートされた。
【０１１７】
筋生検からの初代線維芽細胞培養物の誘導
筋肉由来線維芽細胞の単離及び拡大を中胚葉性血管芽細胞単離に使用したのと同じ生検から樹立した。
【０１１８】
組織消化のためＧＭＰグレード試薬（コラゲナーゼ及び中性プロテアーゼ）を入手し、１つの成人筋生検で試験に成功した。標準的な操作手順を用いて線維芽細胞株を樹立し、４代継代まで拡大させた。
【０１１９】
１つの生検から２つの細胞株を誘導することにより、足場に共播種して中胚葉性血管芽細胞の付着を増大させることがより容易に可能になる。
【０１２０】
上皮細胞（ＥＣ）及び線維芽細胞培養
照射線維芽細胞のフィーダー層上で培養したＥＣで、ＥＣ及び線維芽細胞培養（ＭＲＣ５線維芽細胞を使用する）を実施した。
【０１２１】
データ（図示せず）は、ラット食道上皮を脱細胞化食道に有効に播種し得ることを実証している。
【０１２２】
ラット食道脱細胞化
連続流の脱イオン水を４℃で２４時間、４％デオキシコール酸ナトリウムを室温（ＲＴ）で４時間、及び１Ｍ  ＮａＣｌ中５０ｋＵ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩをＲＴで３時間送達することによる管腔灌流からなる洗剤酵素処理（ＤＥＴ）により、ラット食道を脱細胞化した。無細胞足場は１％Ｐ／Ｓ含有ＰＢＳ中４℃で最長１ヵ月保存した。
【０１２３】
細胞播種
無細胞足場における細胞播種のため、ｆＭＡＢ及びマウス線維芽細胞（共播種実験についてのみ）を両方ともに５〜７代継代間でトリプシン処理し、マトリゲル低成長因子（ＧＦＲ）１：２希釈物又は培地のみに懸濁して氷上に保管した。足場にＮＧチューブを挿管して、播種のためのより容易なアクセス及び操作を可能にした。細胞の注入にはインスリンシリンジを使用し、食道足場の可能な限り多くの範囲が覆われるように各約５μＬの注入を複数回実施した。細胞は、無菌フードに置いた実体顕微鏡を使用して、１０６細胞／５ｍｍ長の密度でマトリックスの筋層に直接注入した（図１）。或いは、マトリゲルＧＦＲ１：２希釈物又は培地に懸濁した細胞を足場の表面上に播種した。
【０１２４】
試験する播種条件及び結果に応じて、播種足場は、任意選択で、
−  増殖用又は分化用培地を有するマルチウェルプレートにおいて管状マトリックスとして静置条件で培養し、
−  長手方向に開き、増殖用又は分化用培地を有するマルチウェルプレートにおいて平らなマトリックスとして静置条件で培養し（図２）、
−  管状マトリックスとしてプラスチック又はガラスアーバに縫合糸で固定し、バイオリアクターに置いて２４時間静置培養し、続いて６〜７日間動的培養した。
【０１２５】
静置条件又は動的条件で培養したエンジニアリング食道を培養６〜７日目にホルマリンで固定し、組織学的分析及び免疫蛍光分析用に処理した。
【０１２６】
バイオリアクター
動的培養は、典型的には、好適に適合させたApplikon（登録商標）Biotechnologyによって供給されるバイオリアクターを使用して実施した。このバイオリアクターは、２つの構成要素：センサ及びスターラを備えたオートクレーブ処理可能なリザーバ；ｐＨ、温度、撹拌速度、泡の程度をモニタし、且つチュービングポンプを補助するコントローラからなった。加えて、インターフェースとしてＰＣを設置した。
【０１２７】
内部の試料の滅菌及び目視観察の両方を可能にするガラス製の（しかし、他の材料も同様に用いられ得る）カスタムチャンバ内に食道播種足場を置いた。足場の各縁部を組織培養フード内にある滅菌ディッシュにおいてガラスロッドに縫合糸で固定した。次に、ガラスチャンバからロッド及び足場をゆっくりと引きずり、両方のロッドが各端部からはみ出た状態にした。次に、キャップをワッシャ及びＯリングと共に固定し、閉鎖した。他方の端部では、培地の循環を確保するため、ルアーロックを備えたチュービングでロッドの開放端をリザーバに連結した。最後に、足場ホストチャンバを標準的なインキュベーター内に置いた。
【０１２８】
拍動性フローを確立するため、専用ポンプ（iPump）を利用した。
【０１２９】
使用時、ｆＭＡＢが播種された播種食道マトリックスをオートクレーブ処理可能な培養チャンバに取り付け（例えば図３を参照）、増殖用培地中で２４時間静置培養下に置いた。次に、チャンバ（外側区画及び内側区画の両方）から培地を除去し、分化用培地に交換し、及びチャンバを滅菌チュービング及びコネクタでApplikonバイオリアクターにつないで動的培養を開始した（図４）。バイオリアクターにより、リザーバ温度、培地中のＯ２及びＣＯ２圧、流速、外側／内側区画培地の再循環を制御することが可能であった。
【０１３０】
大網におけるエンジニアリング食道の移植
細胞の播種後、麻酔下で５ｍｍの管状足場をヌードマウスの腹腔内に植え込み、吸収性縫合糸を使用して大網で包み込んだ。足場には管腔内にＮＧチューブを植え込んでマトリックスが潰れるのを防ぎ、食道の構造を維持した（図５）。植え込み後２及び４週間で動物を犠牲にし、足場を回収して、組織学用に固定した。
【０１３１】
組織学的分析及び免疫蛍光分析
組織試料及び細胞培養物をＰＢＳ中１０％中性緩衝ホルマリン溶液に４℃で２４時間（組織）又は１０分間（細胞）固定し、次に蒸留水（ｄＨ２Ｏ）で洗浄した。組織をスクロース溶液で脱水し、凍結切片化のため液体窒素で凍結した。プレートに固定した７μｍ切片及び細胞をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲβ、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）、ミオゲニン、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）、ＳＭ２２、ヒト核、Ｋｉ６７、ＣＤ６８及びＭｙｏＤに関して免疫染色した。次に試料を蛍光二次抗体と共にインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色し、水性封入剤でマウントした。
【０１３２】
実施例１  −  胎性ＭＡＢの特徴付け
胎性ＭＡＢは、成人ＭＡＢと同等の形態、特徴及びマーカー発現を示した。ＦＡＣＳ分析から、低レベルのＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０（０〜１％）、高レベルのＣＤ４４（９７〜１００％）及び様々なレベルのＣＤ５６及びＣＤ１４６（０〜２５％）が検出された。増殖用培地での培養では、ｆＭＡＢは、ＭＡＢの２つの古典的マーカーであるＡＰ反応及びＮＧ２染色が陽性であった（図６）。骨格筋分化用培地とインキュベートすると、細胞は融合して、ＭＦ２０陽性の、核マーカーミオゲニン（ＭｙｏＧ）を発現する成熟筋管を形成することが可能であった。ｆＭＡＢはまた、高濃度化ＴＧＦβサイトカインを添加した低血清培地で培養したとき、平滑筋表現型への分化能も実証した。平滑筋分化用培地において６日後、細胞はＳＭ２２及びａＳＭＡなどの典型的な平滑筋マーカーを発現した。
【０１３３】
実施例２  −  無細胞食道ＥＣＭにおける細胞播種最適化
細胞生存及び生着に対する媒体の効果を理解するため、マトリゲル又は培地中での細胞送達を比較して食道無細胞マトリックス播種を実施した。加えて、静置培養２４及び４８時間後の足場への細胞接着及び移動を分析して、マイクロインジェクションと表面播種の比較を評価した。ラット無細胞食道足場にマイクロインジェクション及び表面播種のいずれかによってマトリゲル中で送達された胎性ＭＡＢは、２４及び４８時間後に細胞接着及び生存を示した。マイクロインジェクション試料では、マトリックスの表面上への細胞接着がマトリックス内の細胞生着よりも効率的であった。しかしながらマイクロインジェクションしたマトリックスの場合、時間と共に細胞数が増加し、より高い細胞増殖が明らかになった（図７）。培地によってのみ播種された細胞は、より低い生着及び増殖を示し、静置培養の２４〜４８時間にわたり実質的な変化はなかった。これらのデータは、マトリゲルと培地との比較並びに細胞生存及び無細胞マトリックスへの増殖に対する播種技法の効果の理解の向上に役立った。
【０１３４】
実施例３  −  無細胞足場におけるｆＭＡＢとｍＦＢとの共播種
共播種実験を実施して、ｆＭＡＢと共に播種したときのマトリックス内部での細胞生存及び移動に対する線維芽細胞（ＦＢ）の効果を確立した。本発明者らは、ｆＭＡＢをマウスＦＢと８５：１５及び７０：３０の比で併せて、又は対照としてｆＭＡＢ単独で、１×１０６／５ｍｍ足場長さの総細胞密度となるようにマイクロインジェクションした。次に、試料を静置条件で５日間培養した。ＤＡＰＩで染色した播種足場の低温切片は、ｆＭＡＢ単独播種試料と比較して共播種足場において相当数の細胞及びより良好な細胞分布を示し、ＥＣＭにおけるｆＭＡＢ生着に対するＦＢの正の効果が示唆された（図８）。更に、ｆＭＡＢとｍＦＢとの最良の比は８５：１５であるように見え、明らかに多いマトリックス内部の細胞数を呈した。これらのデータは、共培養において６日後の播種試料におけるｆＭＡＢ及びｍＦＢ並びにそれらのマーカー発現の仕様を特定する追加の分析によって補完されるであろう。加えて、面積当たりの細胞の正確な数が無作為写真において決定されるであろう。
【０１３５】
実施例４  −  バイオリアクターによる動的培養
共播種実験と並行して、バイオリアクター及び中空臓器用の２つの異なる培養チャンバを使用して動的培養実験を実施した。チャンバは、同様の特徴：オートクレーブ処理可能であり、シリコン滅菌チュービング及びコネクタを介して培地リザーバと接続可能である、別個のフローを有する内側及び外側チャンバによって特徴付けられた。それにも関わらず、予備実験から、足場の汚染、チャンバ内部における一定の調節可能な培地レベルの維持、及びハーバへの管状足場の縫合糸による固定に関する幾つかの問題が浮かび上がった。このような理由で、最初の試行後、動的培養実験は上記に記載するカスタムメイドのガラスチャンバを使用して行った。
【０１３６】
胎性ＭＡＢを食道無細胞足場にマイクロインジェクションし、次にこのコンストラクトを、チャンバの内側区画と外側区画との分離を可能にする２つのガラスインサートに縫合糸で固定した。培養チャンバを組み立て、バイオリアクター及びリザーバに接続し、最後に両方の区画に増殖用培地を充填した。チャンバを静置条件で６時間インキュベートした後、内側チャンバにおいて培地フローを開始して動的培養を行った（図９）。培養２４時間後、チャンバ及びリザーバの両方ともに増殖培地を分化培地に交換した。培養３日目に全培地交換を伴い、６日後に動的培養を停止した。動的培養した播種足場から得た低温切片の予備的な分析では、マトリックス内部に明らかな細胞生着及び増殖があった（図９）。動的培養試料は、予備的エビデンスと比較して足場内での細胞移動が改善され、より良好な均一分布であるように見えた。更に、この実験で使用したバイオリアクターセットアップは全体的な培養の成功を改善し、汚染が回避され、より良好なフロー制御、温度制御、培地の酸素化及び足場操作が可能であった。
【０１３７】
実施例５  −  播種足場の大網植え込み
インビボでの無細胞足場の血管新生及びリモデリングを研究するため、後の同所性移植前の前血管新生工程として、ＭＡＢを播種した管状足場を免疫不全マウスの大網に植え込んだ。
【０１３８】
移植から２及び４週間後、ヒト核染色によって足場にヒトＭＡＢが同定された（図１０Ａ）。Ｈ＆Ｅ及び免疫蛍光分析は宿主（ヒト核陰性）からの細胞移動を示し、植え込まれたＥＣＭによる細胞ホーミング活性化が示された。組織学によればまた、移植から２週間後、食道ＥＣＭ層はなおも認識可能でありながら、中程度のマトリックスリモデリングも明らかになった。他方で、マトリックスリモデリングは移植１ヵ月後に更に明白となり、元の構造が失われた。ヒト細胞は、分析面積（ｃｍ２）に対してカウントしたとき、１ヵ月後の時点で少数となった（図１０Ｂ）。増殖マーカー（Ｋｉ６７）で分析したとき、移植後２週間で総細胞数の約５％が増殖性ヒトＭＡＢであった一方、残りの９％はこのマーカーに関して陰性であった（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。１ヵ月後、足場内に増殖細胞は認められなかった。これらの予備的データは、初期の前血管新生（Ｈ＆Ｅ染色切片における小さい新血管の存在がエビデンスとなる）及び元のＥＣＭ組織を維持する限定的なマトリックスリモデリングを達成するには、このインビボ工程にとって２週間が良好な妥協策であるように見えることを示している。マクロファージ（ＣＤ６８＋細胞）、平滑筋細胞（ａＳＭＡ＋細胞）及びＭｙｏＤ（骨格筋前駆細胞）の存在に関して試料を特徴付けた。ヒトＭＡＢは平滑筋及び骨格筋マーカーが陰性であったことから、移植から数日後にこれらの細胞の機能喪失によって増殖及び分化が停止したことが示された。細胞の挙動を理解し、且つその生着及び活性化を改善するには、更なる分析及び追加の実験を実施する必要がある。マクロファージは両方の時点で足場内において均一に分布していることが認められ、宿主細胞によって足場で進行中のリモデリング過程が裏付けられた。
【０１３９】
実施例６  −  脱細胞化ラット足場による前出の細胞播種実験の分析
中胚葉性血管芽細胞（ＭＡＢ）をラット食道無細胞足場に注入し、増殖用培地で２４時間、続いて（骨格筋への）分化培地で５日間培養した。培養した足場から得た低温切片の予備的分析（ＤＡＰＩ染色）から、マトリックス内部に明白な細胞生着及び増殖があった（図１１Ａ、図１１Ｂ）。更に深く分析すると、動的培養条件によって刺激及び改善された細胞分布及び移動が明らかになった（Ｈ＆Ｅ、図１１Ｃ、図１１Ｄ）。細胞はまた、骨格筋前駆細胞の特異的マーカーであるＭｙｏＤ染色で決定したとき、骨格筋分化への初期のコミットメントも示した（図１１Ｅ、図１１Ｆ）。
【０１４０】
先に指摘したとおり（図８）、ＭＡＢをマウス線維芽細胞（ｍＦＢ）と８５：１５及び７０：３０の比で共注入し、静置条件で５日間培養すると、相当数の細胞が生着し、ＭＡＢ単独を播種した試料と比較して細胞分布の改善があったことから、ＥＣＭにおけるヒトＭＡＢの生着に対するＦＢの正の効果が示された（図１２）。続く分析により、ｈＭＡＢ及びｍＦＢを８５：１５の比で播種すると、培養下で５日後にも細胞比率の維持が示され（図１２）、一方、７０：３０比は培養中のより高い線維芽細胞増殖につながり、５日後に５０：５０比になったことが明らかになった。細胞比率はヒト核染色で決定した（図１２）。更に、ｈＭＡＢは骨格筋マーカーＳＭ２２を発現し、筋肉分化コミットメントが裏付けられた。
【０１４１】
実施例７  −  脱細胞化ラット足場で培養する中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞のインビトロ細胞播種及び培養条件の最適化
最良の共播種条件のｈＭＡＢ：ｍＦＢ（８５：１５）を用いて、ｈＭＡＢ単独との比較で培養条件を最適化した。８５：１５共播種又は単独ｈＭＡＢを注入したラット足場を増殖用培地で２又は４日間、続いてＴＧＦβを含有する分化用培地で７日間（それぞれ２＋７及び４＋７日間）培養して平滑筋分化を誘導した。足場は静置及び動的セッティングで培養した。静置培養試料のＤＡＰＩ染色から、２＋７及び４＋７培養条件間の特別な違いは明らかにならなかった（図１３）。
【０１４２】
ｈＭＡＢ単独と比較したとき、８５：１５播種に関して２＋７及び４＋７条件が両方ともに、足場内でのより良好な生着、分布及び細胞配向を示した（図１３）。２＋７についての共播種又は単独ｈＭＡＢ播種足場の動的培養は、静置条件と比べて顕著な細胞生着及び増殖が明白であった。培養２＋７日後に検出された細胞数は、前出の静置培養実験のいずれと比較しても、新鮮ラット食道の筋層に一層類似していた（ＭＥ：外筋層、図１４）。
【０１４３】
実施例８  −  脱細胞化ウサギ食道足場におけるインビトロ細胞播種実験
ｈＭＡＢ単独を脱細胞化ウサギ食道足場に播種し、静置培養及び動的培養で７日間培養した。並行実験で平滑筋細胞（イヌ由来）を対照として使用した（図１５）。ウサギ足場播種により、動的培養を静置培養と比較したとき、ｈＭＡＢ単独の播種であったにも関わらずより良好な細胞分布及び移動が確認された。ＳＭＣ播種試料は高い細胞生着率及び生存率を示したが、注入部位からの細胞移動性は低かった（図１６）。ｈＭＡＢは全足場層における均一な分布及び既存の筋繊維に沿った配向を示した（Ｈ＆Ｅ、図１６）。
【０１４４】
実施例９  −  ラット及びウサギドナー動物由来の未播種無細胞足場のそれぞれラット及びウサギモデルへの同所性移植の最適化
無細胞食道足場の同所性移植手順を更に最適化した。事前の細胞播種なしに脱細胞化マトリックスの断片をラット及びウサギに植え込み、後のインビボでのエンジニアリングコンストラクト移植のための工程及び条件を定義した。この手順は、ラット及びウサギ動物モデルの両方について開発した。これは、甲状腺葉及び筋肉を反転させて元の食道を露出させ、食道の一部分（１〜２．５ｃｍ、動物モデルに依存する）を除去し、ＮＧチューブを通して吻合中の食道の安定化及び識別を助けることからなる（図１７Ａ）。次に、遠位及び近位吻合を実施して（図１７Ｂ）、足場の両方の端部を既存の食道につないだ（ラット、図１７Ｃ；ウサギ、図１７Ｄ、図１７Ｅ）。
【０１４５】
これらの実験から、本発明のコンストラクトが、（ｉ）即時漏出することのない有効な縫合、（ｉｉ）食物摂取量に対する良好な引張／応力特性、（ｉｉｉ）優れた生体適合性の能力を有することが明らかになった。
【０１４６】
実施例１０  −  細胞播種密度の最適化
生着の成功を達成するために必要な細胞の量を確立するため、生着した細胞の可視化及びそれらの間接的な定量化を可能にするＭＴＴ生存アッセイ及びイメージングを用いて種々のヒト中胚葉性血管芽細胞（ｈＭＡＢ）密度を試験した。生細胞は、供給される基質（ＭＴＴ）を代謝して目に見える色が変化した生成物（ホルマザン）を生じ、これを抽出して、吸光度の読み取りにより定量化することができる。足場断片に播種し、２４時間インキュベートしてからアッセイを始めた。
【０１４７】
ＭＴＴ溶液と共に４時間インキュベートした後、足場内にホルマザン陽性細胞が見え、注入部位からのそれらの移動が明らかになった（図１８Ａ）。写真の予備的分析から、１×１０６細胞／０．５ｃｍの注入が最も有効な生着につながることが示唆された。この結果は、反応生成物を定量化して更に確認された。吸光度の計測から、生細胞の数を反映するホルマザンの濃度が他と比較してこの条件では高いことが確認された（図１８Ｂ）。
【０１４８】
実施例１１  −  動的システムで培養した全ての足場における細胞分布及び分化の調査
足場内の細胞生着及び分布を増進させるため、動的培養手法を用いて連続培地フローを可能にし、栄養素及び酸素交換に有利となるようにした。既に決定されたとおり、ｈＭＡｂ播種及び共培養播種（ｈＭＡＢ及び線維芽細胞）食道を成長培地で２日間及び平滑筋分化培地で７日間培養した。ＴＧＦβを２ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日新鮮供給した。図１９Ａ〜図１９Ｂに示されるとおり、合計９日間の培養後、ｈＭＡＢ播種足場の筋層には共播種対応物と比較して有意に多い数の細胞が集まった。粘膜下層は逆の傾向を示し、共播種足場においてｈＭＡＢ単独よりも有意に多く集密した。
【０１４９】
加えて、共播種方法を用いると、細胞はｈＭＡＢ播種試料と比べて共播種足場に一層均一に分布し、静置で実施した前出の実験が確認された（図１９Ｃ）。興味深いことに、培養期間の終了時、両方の条件とも、未播種マトリックスと比較して全ての食道層の寸法が拡大する結果となった（図１９Ｄ）。詳細には、ｈＭＡＢ播種足場の筋層は共播種対応物と比べて太くなった。この厚さの増加が、生着ｈＭＡＢ数の増加と共に、８５：１５播種足場に匹敵する結果の細胞密度を生じさせた（図１９Ｅ）。
【０１５０】
ＫＩ６７＋細胞の検出による増殖分析（図２０Ａ）から、増殖細胞の割合がｈＭＡＢ播種足場（２４％）では共播種足場（１０％）と比較して有意に高いことが示された。特に、ｈＭＡＢ播種足場では、筋層に最も高い割合の増殖細胞（８５％）が検出され、一方、共播種足場では、細胞密度計算によって明らかになったとおり、ＫＩ６７＋細胞がより一様に分布しているように見えた（図２０Ｃ）。
【０１５１】
平滑筋分化に関して、ＳＭ２２＋細胞の％は、ｈＭＡＢ単独を播種した足場（４０％）において、共播種足場と比較してより高かった（図２１Ａ〜図２１Ｂ）。加えて、先に静置条件で明白になったとおり、ｈＭＡＢ播種足場（８５％）及び共播種足場（７０％）の両方で分化細胞の大多数が筋層に分布した（図２１Ｃ）。
【０１５２】
実施例１２  −  足場の選択
分析から、新生児ヒトドナー組織の供給は需要に対して不足し得ることが示された。従って、人造ヒト細胞由来足場と並行して脱細胞化動物由来足場を試験した。
【０１５３】
インビボで比較したとき、脱細胞化ブタ組織はインタクトなままであったが、人造ヒト細胞由来足場は分解し、従ってブタ組織の優位性が確認された。
【０１５４】
実施例１３  −  新生児に対する自家療法としての組織エンジニアリング食道の作成のための例示的プロトコル：
１．ブタ食道を摘出し、保存溶液に入れ、ＧＭＰ製造所に輸送する。
２．２サイクルのＤＥＴプロトコル（ＲＴで２４時間の水、ＲＴで４時間のデオキシコール酸ナトリウム及びＲＴで３時間のＤＮアーゼ）を用いて脱細胞化し、足場を照射して（滅菌し）、緩衝液中に保存する。
３．脱細胞化足場に中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞を注入する。中胚葉性血管芽細胞は患者の筋生検、線維芽細胞は皮膚生検に由来する  −  新生児については、胃瘻造設手技の際に両方を腹壁からまとめて採取してもよい。
４．チャンバ内においてチャンバ条件をバイオリアクターコントローラで外部制御しながら、加湿３７℃、５％ＣＯ２に維持した限定増殖培地で２日間及び限定分化培地で９日間播種足場を培養する。
５．上皮細胞を食道足場の管腔側面に送達する（患者の既存の痕跡的食道の生検に由来する初代細胞）。
６．更なる培養後、チャンバに入れて手術室に輸送し、取り出して患者に移植する。
【０１５５】
実施例１４  −  実施例１５〜１８で使用する線維芽細胞の特徴付け
以下に記載する全ての共播種実験で使用するマウス線維芽細胞（ｍＦＢ）は、酵素消化によって野生型マウス後肢骨格筋（長趾伸筋  −  ＥＤＬ）及び横隔膜から単離し、プレーティングして拡大した。細胞は古典的な細長い形態及びサイズを示し、培養下で拡大したときにＫｉ６７陽性で、数継代にわたる増殖能を呈した（図２３）。線維芽細胞はまた、ビメンチン及びＴＣＦ−４などの古典的マーカーも陽性であった。
【０１５６】
実施例１５  −  脱細胞化ラット足場上の細胞播種実験における図式的細胞分布の分析
ｈＭＡＢ又はｈＭＡＢ＋ｍＦＢ（８５：１５比）を播種して静置条件で培養した脱細胞化ラット足場を先述のとおり固定し、凍結切片化して、ヒト核及びＤＡＰＩに関して染色した。切片をスキャンして足場に存在する全ての細胞を検出及びカウントし、細胞の図式的分布を作成した（図２４Ａ）。図式的分布及び極座標分布（完全な円形の切片を仮定して補正した細胞分布、図２４Ａ、図２４Ｂ）の集合から、本発明者らは、ｈＭＡＢ単独と比較して、ｈＭＡＢ＋ｍＦＢ播種足場における組織切片に関して細胞生着及び分布の均一性の明らかな改善を見出した。面積当たりの総細胞数のカウントから、この傾向が確認された（ｎ≧３、図２４Ｃ）。
【０１５７】
実施例１６  −  ｈＭＡＢ又はｈＭＡＢ＋ｍＦＢ播種足場における細胞移動の調査
ラット脱細胞化足場におけるｍＦＢと共に又は無しに播種したｈＭＡＢの移動能力を評価するため、本発明者らは、ルシフェラーゼＺＳグリーンレンチウイルスで形質導入したｈＭＡＢ（ＺｓＧｒｅｅｎ＋Ｌｕｃ＋ｈＭＡＢ）を播種した。細胞の形質導入はフローサイトメトリーを用いて確認し、及び形質導入細胞の純粋集団はＦＡＣＳ選別を用いて得た。生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して足場上の細胞をトラッキングした。細胞は移動に関して２４時間毎に非侵襲的にトラッキングした（図２５Ａ）。播種細胞からのＢＬＩの検出に成功し、２４時間毎に画像を分析して発光の放射輝度を定量化した（図２５Ｂ）。細胞の移動を計算するため、注入点の中心から位置決めした８つの異なる関心領域（ＲＯＩ）からＢＬＩを決定した（図２５Ｃ）。培養１日後にＲＯＩ３〜６（中心ＲＯＩ）で計測された放射輝度から、ｈＭＡＢ単独を播種した足場でＢＬＩがより高いことが明らかになった（三角、図２５Ｄ）。ｈＭＡＢのみがＬｕｃ＋であり、その開始時の数は共播種条件（８５：１５比）と比べて多かったため、これは実験セットアップと完全に一致した。それにも関わらず、その後の数日で細胞数が予想どおり減少した後、培養３及び５日目には、ｈＭＡＢ＋ｍＦＢ足場（四角）から検出された総放射輝度は、ｈＭＡＢ単独による総放射輝度と同等か又はそれより高く、培養全体を通じた種々のＲＯＩにおける明らかな細胞成長及び移動が示された。５日目、共播種足場は、ｈＭＡＢ単独と比較したとき、詳細には注入点（ＲＯＩ４〜５）からより離れたＲＯＩ３及び６においてより高い放射輝度を示し、足場に沿って移動する細胞がより多数存在することが明らかになった（図２５Ｄ）。
【０１５８】
細胞移動はＭＴＴ生存アッセイを用いても決定し、このアッセイでは培養６日後の播種足場上の細胞を可視化することが可能であった（図２６）。８．５×１０５個のｈＭＡＢ又は１×１０６個のｈＭＡＢをｍＦＢ（８５：１５比）と共に／無しに播種した管状足場を静置条件で６日間培養し、次にＭＴＴ溶液で４時間インキュベートした。足場内にホルマザン陽性細胞が見られ、これらの３つの条件間の移動パターン及び程度の違いが明らかになった（図２６Ａ）。ImageJソフトウェアを使用して細胞塊の中心から足場の縁部まで半径方向に描いた８本の無作為の線に沿って色の強度を計測することにより、平らに開いた足場の画像を細胞移動に関して分析した（代表的な線Ａ−Ｂ、図２６Ａ、中央）。全ての線から得られたグレー値グラフを使用して、細胞が進んだピクセル単位の距離を２つのプラトー間の距離と見なして計算した（図２６Ｂに代表的なグラフ及び計測値）。共播種足場において細胞がｍｍ単位で進んだ平均距離は、ｈＭＡＢ単独による他の２つの条件よりも大きく（ｎ＝３、カウントは３人の独立した操作者によって盲検で実施した、図４Ｃ）、ＩＶＩＳによるＢＬＩ定量化で決定されたのと同じ傾向が確認された。
【０１５９】
実施例１７  −  静置条件及び動的条件で培養したｈＭＡＢ＋ｍＦＢ共播種足場における細胞分布の更に深い調査
ｈＭＡＢ＋ｍＦＢを共播種し、静置条件又は動的条件で培養した脱細胞化ラット食道の切片を先述のとおり染色及びスキャンして、足場に存在する全ての細胞を検出し、カウントした。細胞の図式的分布（図２７Ａ）及び極座標分布（完全な円形の切片を仮定して補正した細胞分布、図２７Ｂ）から、静置条件と比較してバイオリアクターで培養した足場における組織切片に関して全体的な組織成長及びより良好な分布均一性が示された。面積当たりの総細胞数のカウントにより、この有意な差が確認された（ｎ≧３、＊ｐ＜０．０５、図２７Ｃ）。ＤＡＰＩ及びヒト核に関して染色した無作為切片における細胞カウントから、動的条件で培養した足場におけるｈＭＡＢとｍＦＢとの比率を決定して、線維芽細胞の最終的な過成長を評価した。培養１１日後、ｍＦｂは総細胞数の１４％のみ存在し、足場内におけるこれらの細胞の制御されない拡大がないことが示された（ｎ≧３、図２７Ｄ）。
【０１６０】
更に、ラット足場に播種してガラスバイオリアクターで７日間培養した細胞（Ｌｕｃ＋ｈＭＡＢ＋ｍＦＢ）を、ＩＶＩＳを用いてトラッキングすることにより、本発明者らは、培養全体を通じた足場に沿った細胞分布を可視化することができた（図２８Ａ）。種々の時点でＩＶＩＳ画像を収集したところ、注入点（１日目における緑色〜黄色の読み取りクラスター）から始まって７日目のより均一な分布及び組織被覆範囲に向かう明らかな細胞浸潤が示された。種々の時点で収集した画像から検出された放射輝度値は、最初の数日間の培養後における細胞数の減少が７日後に回復したことを明らかにした（図２８Ｂ）。
【０１６１】
実施例１８  −  線維芽細胞の存在下における静置条件及び動的条件での中胚葉性血管芽細胞の増殖及び分化レベル
ｈＭＡＢ＋ｍＦＢを共播種して静置条件又は動的条件で培養した脱細胞化ラット食道の切片を、先述のとおりヒト核、ＳＭ２２（平滑筋分化マーカー）及びＤＡＰＩに関して染色し、スキャンすることにより、足場に存在する全ての細胞を検出し、カウントした（黒色の範囲、図２９Ａ）。図２９Ａにおける細胞の代表的な図式的分布は、分化細胞型間：ＳＭ２２＋ｈＭＡＢ；ＳＭ２２＋ｍＦＢ；ＳＭ２２−ｈＭＡＢ；ＳＭ２２−ｍＦＢの自動化された識別を示す（全てグレースケール）。これらのマップから、静置条件と比較してバイオリアクターで培養した足場における分化した細胞の分布が明らかになった。バイオリアクターが機械的刺激及び分化培地へのより良好なアクセスを提供したとき、足場の全ての層にＳＭ２２＋細胞が存在して均一に分布し、一方、静置条件で培養したコンストラクトはマトリックスの表面上にのみ平滑筋細胞を示した（図２９Ａ、図２９Ｃ）。種々の切片の無作為画像でカウントした静置及び動的培養後のＳＭ２２＋細胞の割合の計算から（ｎ≧３）、バイオリアクターで成長させた足場において平滑筋分化細胞の割合が有意に高いことが確認された（＊＊ｐ＜０．００１、図２９Ｂ）。興味深いことに、ＳＭ２２＋細胞の約１０％は線維芽細胞であり、その寄与はこれらの２つの培養条件で同等であった。ｈＭＡＢ＋ｍＦＢを共播種した動的培養試料では、αＳＭＡ及びカルポニンに関する免疫染色によって平滑筋への成熟分化が更に確認された（図３０）。細胞は足場の全ての層においてＳＭ２２とαＳＭＡ及びカルポニンの両方との共発現を示し、成熟レベルの分化が実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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