(57)【要約】本発明は、クモ毒由来のジスルフィドリッチペプチドおよび特に神経保護剤としてのそれらの使用に関する。本発明はさらに、それらのペプチドをコードする核酸分子ならびにそれらの核酸分子を含む構築物および宿主細胞に関する。2018522555.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経保護活性を有する、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドであって、該ペプチドが式（Ｉ）：
Ｘ−Ｌ−Ｙ    （Ｉ）
の配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になり、式中、ＸおよびＹはそれぞれ、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）フォールドを有するペプチド配列を表し、Ｌはリンカーであり、
該ペプチドが好ましくは酸感受性イオンチャンネルサブタイプ１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）に特異的に結合することができる、
前記単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項２】
Ｘが、配列番号２の５５〜８７番目の残基、配列番号６の５２〜８４番目の残基、または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項３】
Ｙが、配列番号２の９４〜１２９番目の残基、配列番号４の９４〜１２９番目の残基、配列番号６の１０１〜１５１番目の残基、配列番号８の９３〜１２８番目の残基、または配列番号１０の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項４】
Ｌが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸からなるペプチド配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項５】
Ｌが、配列番号２の８８〜９３番目の残基、配列番号６の８５〜１００番目の残基、または配列番号８の８５〜９２番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項６】
Ｘが、配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有し、Ｌが、配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有し、かつＹが、配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項７】
約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項８】
ＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０が約１ｎＭ未満である、請求項７に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のジスルフィドリッチペプチドの機能的に活性な神経保護断片、誘導体、またはアナログであって、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、前記機能的に活性な神経保護断片、誘導体、またはアナログ。
【請求項１０】
約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０を有する、請求項９に記載の機能的に活性な神経保護断片、誘導体、またはアナログ。
【請求項１１】
ＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０が、約１ｎＭ未満である、請求項１０に記載の機能的に活性な神経保護断片、誘導体、またはアナログ。
【請求項１２】
神経保護ペプチドであって、該ペプチドにおいて２つのＩＣＫモチーフが６残基のリンカーによって頭尾結合されており、該ペプチドが好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、前記神経保護ペプチド。
【請求項１３】
前記リンカーが、配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１２に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１４】
Ｎ末端側の前記ＩＣＫモチーフが、配列番号２の５５〜８７番目の残基、配列番号６の５２〜８４番目の残基、または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１２または１３に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１５】
Ｃ末端側の前記ＩＣＫモチーフが、配列番号２の９４〜１２９番目の残基、配列番号４の９４〜１２９番目の残基、配列番号６の１０１〜１５１番目の残基、配列番号８の９３〜１２８番目の残基、または配列番号１０の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１６】
約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０を有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１７】
ＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０が、約１ｎＭ未満である、請求項１６に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１８】
対で共有結合して６つのジスルフィド結合を形成する１２個のシステイン残基を含む神経保護ペプチドであって、２つのＩＣＫモチーフを含み、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、前記神経保護ペプチド。
【請求項１９】
前記神経保護ペプチドが２つの連結されたＩＣＫモチーフを含むように前記２つのＩＣＫモチーフが頭尾結合されている、請求項１８に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２０】
前記２つのＩＣＫモチーフが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸を含むリンカーによって結合されている、請求項１９に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２１】
前記リンカーが、配列番号２の８８〜９３番目の残基、配列番号６の８５〜１００番目の残基、または配列番号８の８５〜９２番目の残基によって規定される配列を有する、請求項２０に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２２】
Ｎ末端側の前記ＩＣＫモチーフが、配列番号２の５５〜８７番目の残基、配列番号６の５２〜８４番目の残基、または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１９〜２１に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２３】
Ｃ末端側の前記ＩＣＫモチーフが、配列番号２の９４〜１２９番目の残基、配列番号４の９４〜１２９番目の残基、配列番号６の１０１〜１５１番目の残基、配列番号８の９３〜１２８番目の残基、または配列番号１０の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２４】
約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０を有する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２５】
ＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０が、約１ｎＭ未満である、請求項２４に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２６】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定されるヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有するヌクレオチド配列によってコードされる配列；または
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、神経保護活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項２７】
配列番号１６を含む配列を有する、請求項２６に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項２８】
配列番号１４からなる配列を有する、請求項２６に記載の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項２９】
ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、クモ毒由来の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載のジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、または請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換え核酸分子。
【請求項３１】
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；あるいは
（ｃ）少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１１のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体とハイブリダイズする配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、請求項３０に記載の単離、合成、または組換え核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１３を含む、請求項３０に記載の単離、合成、または組換え核酸分子。
【請求項３３】
発現ベクター内の１つ以上の制御配列に機能的に連結されている請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸を含む、遺伝子構築物。
【請求項３４】
請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項３３に記載の遺伝子構築物を用いて形質転換された、宿主細胞。
【請求項３５】
原核または真核宿主細胞から選択される、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、または請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチドを生成する方法であって、請求項３４または３５に記載の形質転換された宿主細胞を培養する工程、および培養された該宿主細胞から得られたペプチド、断片、誘導体、またはアナログを単離する工程を含む、前記方法。
【請求項３７】
治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、または請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項３８】
非経口投与用に製剤化されている、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記非経口投与が脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与である、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、賦形剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤、保存料、または酸化防止剤をさらに含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与用に製剤化されている、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記医薬組成物が、前記ペプチド、断片、誘導体、またはアナログを鼻粘膜を越えて輸送するのに役立つ少なくとも１つの送達促進剤をさらに含み、該少なくとも１つの送達促進剤が、脂質、ポリマー、リポソーム、エマルジョン、およびナノ粒子からなる群より選択される、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
対象における脳卒中を治療するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記投与する工程が、脳卒中の発症後８時間以内に実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記投与する工程が、脳卒中の発症後１〜８時間の間に実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、脳室内経路を介して投与される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、１〜３ｎｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、２ｎｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与する工程が、脳卒中の発症後４時間以内に実施される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、鼻腔内投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、１〜３ｕｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、２ｕｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象がヒトである、請求項４３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５５】
対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記投与する工程が、脳卒中の発症後８時間以内に実施される、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記投与する工程が、脳卒中の発症後１〜８時間の間に実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、脳室内経路を介して投与される、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、１〜３ｎｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、２ｎｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記投与する工程が、脳卒中の発症後４時間以内に実施される、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、鼻腔内投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、１〜３ｕｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物が、２ｕｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象がヒトである、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
脳卒中を治療するための、治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための、治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための、治療有効量の少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、または請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記治療有効量が１〜３ｎｇ／ｋｇである、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物。
【請求項７０】
前記治療有効量が２ｎｇ／ｋｇである、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物。
【請求項７１】
前記治療有効量が１〜３ｕｇ／ｋｇである、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物。
【請求項７２】
前記治療有効量が２ｕｇ／ｋｇである、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物。
【請求項７３】
脳卒中を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、または請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチドの使用。
【請求項７４】
前記医薬が、非経口投与用に製剤化される、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
前記非経口投与が脳室内経路による、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
前記医薬が、１〜３ｎｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
前記医薬が、２ｎｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
前記医薬が、鼻腔内投与用に製剤化される、請求項７３に記載の使用。
【請求項７９】
前記医薬が、１〜３ｕｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項７８に記載の使用。
【請求項８０】
前記医薬が、２ｕｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、または請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチドの使用。
【請求項８２】
前記医薬が、非経口投与用に製剤化される、請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
前記非経口投与が脳室内経路による、請求項８２に記載の使用。
【請求項８４】
前記医薬が、１〜３ｎｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
前記医薬が、２ｎｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
前記医薬が、鼻腔内投与用に製剤化される、請求項８１に記載の使用。
【請求項８７】
前記医薬が、１〜３ｕｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
前記医薬が、２ｕｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための医薬の製造における、少なくとも１つの請求項１〜８もしくは２６〜２９のいずれか一項に記載の単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の断片、誘導体、もしくはアナログ、または請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチドの使用。
【請求項９０】
前記医薬が、非経口投与用に製剤化される、請求項８９に記載の使用。
【請求項９１】
前記非経口投与が脳室内経路による、請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
前記医薬が、１〜３ｎｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
前記医薬が、２ｎｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項９２に記載の使用。
【請求項９４】
前記医薬が、鼻腔内投与用に製剤化される、請求項８９に記載の使用。
【請求項９５】
前記医薬が、１〜３ｕｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項９４に記載の使用。
【請求項９６】
前記医薬が、２ｕｇ／ｋｇを提供するように製剤化される、請求項９５に記載の使用。
【請求項９７】
脳卒中を治療するための、クモ毒に由来する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチ神経保護ペプチドの使用。
【請求項９８】
以下の工程を含む、ＡＳＩＣ１ａの活性化を阻害することができるペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を同定または設計するための方法：
（ｉ）ＡＳＩＣ１ａと少なくとも１つのジスルフィドリッチペプチドとの間の相互作用のコンピューターモデリングを行う工程であって、該ジスルフィドリッチペプチドが請求項１〜２９のいずれか一項に規定されている、工程；
（ｉｉ）該コンピューターモデリングによって生成されたデータを使用して、ＡＳＩＣ１ａに結合してＡＳＩＣ１ａの活性化を阻害することができるペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を同定または設計する工程；ならびに任意で、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を生成する工程；ならびに任意で、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を、ＡＳＩＣ１ａへの結合およびＡＳＩＣ１ａの活性化の阻害について試験する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クモ毒由来のジスルフィドリッチペプチドおよび特に神経保護剤としてのそれらの使用に関する。より詳細には、１つの態様では、本発明は、脳卒中後の神経保護活性を有するジスルフィドリッチペプチド、およびそのようなペプチドを含有する組成物、ならびに脳卒中の治療におけるそれらの使用に関する。本発明はさらに、それらのペプチドをコードする核酸分子ならびにそれらの核酸分子を含む構築物および宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は、世界第２位の死亡原因であり（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、オーストラリアにおける第３位の死亡原因である（Ｓｅｎｅｓ，２００６）。死亡率が極めて高いことに加えて、脳卒中生存者における罹病率は極めて高いので、このため脳卒中は先進工業国における就業不能の主原因となっている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００３】
脳虚血の発症から数分間以内に、梗塞コアは致死的に損傷し、壊死性細胞死を起こす。脳卒中の梗塞コア（もしくは線条体領域）は、一般に救済不能であると考えられている。壊死性コアは、虚血性ペナンブラもしくは梗塞周囲帯として公知である重症度の低い罹患組織帯によって取り囲まれており、これは脳卒中後療法を介して救済できる可能性がある（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。虚血性領域への血流の回復に役立つ組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔＰＡ）の使用は、現在まで、急性虚血性脳卒中を治療するための唯一の承認薬剤である。ｒｔＰＡは、治療濃度域が狭く、頭蓋内出血を誘導する危険性があるために（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、全脳卒中患者の３〜４％でしか使用されていない（Ｂｅｓａｎｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。そこでより効果的な神経保護剤に対する明確な必要がある。治療的インターベンションのための時間窓がより長ければ、より有益であろう。
【０００４】
脳虚血中には、重度の酸素枯渇が発生し、脳を酸化的リン酸化から嫌気的解糖へ強制的に切り替えさせ、乳酸濃度が増加する結果としてアシドーシスが引き起こされる。細胞外ｐＨは、正常血糖条件下の虚血コア内で約７．３から６．０〜６．５へ低下する可能性があり、重度の虚血中には６．０未満に低下する可能性がある（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｉｓａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。細胞外ｐＨの低下は酸感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）を活性化するので、これらのチャンネルの活性化は、脳卒中誘導性ニューロン損傷において決定的な役割を果たすと考えられている。数多くの研究が、脳アシドーシスと梗塞サイズとの間に直接相関があることを証明している（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００５】
ＡＳＩＣは１９９０年代後半に発見され、その約２０年後には感覚ニューロンがｐＨの突然の低下に反応して脱分極することが観察された（Ｋｒｉｓｈｔａｌ，２００３）。ＡＳＩＣは受容体の上皮ナトリウムチャンネル／デジェネリンファミリーに属するが、それらは脊索動物への限定、主としてニューロン分布および細胞外ｐＨにおける低下による活性化によって識別される（Ｇｒｕｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２０１０）。４種のＡＳＩＣコーディング遺伝子の選択的スプライシングは、それらのｐＨ感受性、動態および脱感作に対する感受性が異なるヘテロ三量体もしくはホモ三量体チャンネルを合体して形成する６つのサブユニット（ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３およびＡＳＩＣ４）の発現をもたらす（Ｗｅｍｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００６】
シナプス後ＡＳＩＣ１ａチャンネルは、哺乳動物の脳内で主要なＡＳＩＣサブタイプである（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＡＳＩＣ１ａの５０％活性化のためのｐＨ（ｐＨ０．５）は、ヒト皮質ニューロンでは６．６（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）およびラットプルキンエニューロンでは６．４であり、結果としてそれらは脳虚血中に発生する細胞外ｐＨの低下によって強力に活性化される。重要なことに、ホモマーＡＳＩＣ１ａチャンネルは、Ｎａ＋およびプロトンに加えてＣａ２＋の取込みを媒介することができる（Ｇｒｕｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２０１０）。したがって、脳ＡＳＩＣ１ａは脳卒中の発症中に発生する細胞内Ｃａ２＋過負荷の原因となる可能性があり、ＡＳＩＣ１ａのプロトン透過性は、約７から脳虚血の発症中の６．１５という低さへの細胞内ｐＨにおける急勾配の低下に対して少なくとも一部には責任を担っている可能性がある（Ｉｓａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００７】
現在は、脳アシドーシスがＡＳＩＣ１ａを活性化すること、およびこの活性化が脳卒中の結果として生じるニューロン損傷にとっての主要な寄与因子であることは知られている（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。例えば、脳虚血の齧歯類モデルでは、梗塞サイズおよび神経障害は、ＡＳＩＣ１ａのノックアウトもしくは薬理学的遮断によって大きく減少させられる（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００８】
現在までに記載されたＡＳＩＣ１ａの最も強力で選択的な遮断薬は、トリニダード・シェブロン・タランチュラのクモであるプサルモポエウス・ケンブリッジイ（Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ  ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ）の毒から単離された４０残基のペプチドであるＰｃＴｘ１（π−テラホトキシン−Ｐｃ１ａとしても公知である）である。ＰｃＴｘ１は約１ｎＭのＩＣ５０でラットＡＳＩＣ１ａ（ｒＡＳＩＣ１ａ）を阻害するが、他のＡＳＩＣホモマーもしくはヘテロマーを阻害することはない。一過性限局性虚血（中大脳動脈閉塞；ＭＣＡＯ）のラットモデルではＰ．ケンブリッジイ（ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ）粗毒（すなわち、純粋ＡＳＩＣ１ａ阻害性ペプチドが単離されていない）の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注射は、梗塞サイズを６０％減少させた。これがＡＳＩＣ１ａによって媒介される作用であることに一致して、ＡＳＩＣ１−／−マウスにおいても梗塞サイズは同様に６１％減少させられた（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。さらに、梗塞サイズは、Ｐ．ケンブリッジイ（ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ）粗毒がＭＣＡＯの５時間後と遅延してｉ．ｃ．ｖ．送達された場合にも約３０％減少させられた（Ｐｉｇｎａｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００９】
ＰｃＴｘ１は脳卒中を治療する目的で神経保護剤を開発するための前途有望な主要な分子であると思われるが、効果的な神経保護療法の基礎を形成できる化合物に対する重要な必要が依然としてある。脳卒中後の臨床症状の発現が遅延することを前提にすると、治療的インターベンションのための時間窓がより長ければ、より有益であろう。
【００１０】
本明細書で先行技術の刊行物が言及された場合、この言及はその刊行物がオーストラリアおよび任意の他の国における一般的知識の一部を形成するという承認をなすものではないことは明白に理解されるであろう。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、クモ毒に由来するジスルフィドリッチペプチドならびに特に脳卒中の治療における神経保護剤としてのそれらの使用を広く対象とする。
【００１２】
第１態様では、本発明は、神経保護活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。このペプチドは、式（Ｉ）：
Ｘ−Ｌ−Ｙ    （Ｉ）
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）フォールドを有するペプチド配列を表し、Ｌはリンカーである）の配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になり、かつ前記ペプチドは、好ましくは酸感受性イオンチャンネルサブタイプ１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）に特異的に結合することができる。
【００１３】
第２態様では、本発明は、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、第１態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチドの機能的に活性な神経保護断片、誘導体、またはアナログを提供する。
【００１４】
第３態様では、本発明は、２つのＩＣＫモチーフが６残基のリンカーによって頭尾結合されている神経保護ペプチドであって、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、神経保護ペプチドを提供する。
【００１５】
第４態様では、本発明は、対で共有結合して６つのジスルフィド結合を形成する１２個のシステイン残基を含む神経保護ペプチドであって、２つのＩＣＫモチーフを含み、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、神経保護ペプチドを提供する。
【００１６】
第５態様では、本発明は、神経保護活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドであって、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定されるヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有するヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。
【００１７】
第６態様では、本発明は、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、クモ毒由来の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。
【００１８】
第７態様では、本発明は、第１もしくは第６態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換え核酸分子を提供する。一部の実施形態では、この核酸分子は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１１のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体とハイブリダイズする配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる。
【００１９】
第８態様では、本発明は、第７態様によって提供された（例えば、商業的量で組換えペプチドを作製するための）核酸分子を発現させるための遺伝子構築物を提供する。その遺伝子構築物は、概して、発現ベクター内の１つ以上の制御配列に機能的に連結されている、第７態様によって提供された単離核酸分子を含む。
【００２０】
第９態様では、本発明は、第７態様によって提供された核酸分子または第８態様によって提供された遺伝子構築物を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２１】
第１０態様では、本発明は、第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドを生成する方法であって、第９態様によって提供された形質転換された宿主細胞を培養する工程、および培養された前記宿主細胞から得られたペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２２】
第１１態様では、本発明は、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドを含む、医薬組成物を提供する。
【００２３】
第１２態様では、本発明は、対象における脳卒中を治療するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２４】
第１３態様では、本発明は、対象における脳卒中後の神経損傷の予防または治療のための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２５】
第１４態様では、本発明は、対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させる方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２６】
第１５態様では、本発明は、脳卒中を治療するための、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【００２７】
第１６態様では、本発明は、対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【００２８】
第１７態様では、本発明は、対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【００２９】
第１８態様では、本発明は、脳卒中を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドの使用を提供する。
【００３０】
第１９態様では、本発明は、対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドの使用を提供する。
【００３１】
第２０態様では、本発明は、対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための医薬の製造における、少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドの使用を提供する。
【００３２】
第２１態様では、本発明は、脳卒中を治療するための、クモ毒に由来する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチ神経保護ペプチドの使用を提供する。
【００３３】
第２２態様では、ＡＳＩＣ１ａの活性化を阻害することができるペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を同定または設計するための方法であって、
（ｉ）ＡＳＩＣ１ａと少なくとも１つのジスルフィドリッチペプチドとの間の相互作用のコンピューターモデリングを行う工程であって、該ジスルフィドリッチペプチドが第１〜第６態様のいずれか１つに規定されている、工程；
（ｉｉ）該コンピューターモデリングによって生成されたデータを使用して、ＡＳＩＣ１ａに結合してＡＳＩＣ１ａの活性化を阻害することができるペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を同定または設計する工程；および任意で、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を生成する工程；および任意で、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を、ＡＳＩＣ１ａへの結合およびＡＳＩＣ１ａの活性化の阻害について試験する工程
を含む方法が提供される。
【００３４】
本発明はさらに、クモ毒に由来するジスルフィドリッチペプチドおよび治療薬もしくは予防薬としてのそれらの使用を広く対象とする。そのようなペプチドは、ＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたは生物学的経路におけるＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態のための治療薬もしくは予防薬として使用することができる。
【００３５】
第２３態様では、本発明は、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。そのペプチドは、式（Ｉ）：
Ｘ−Ｌ−Ｙ    （Ｉ）
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）フォールドを有するペプチド配列を表し、Ｌはリンカーである）の配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になり、かつ前記ペプチドは、好ましくは酸感受性イオンチャンネルサブタイプ１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）に特異的に結合することができる。
【００３６】
第２４態様では、本発明は、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、第２３態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチドの機能的に活性な断片、誘導体、またはアナログを提供する。
【００３７】
第２５態様では、本発明は、２つのＩＣＫモチーフが６残基のリンカーによって頭尾結合されているペプチドであって、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを提供する。
【００３８】
第２６態様では、本発明は、対で共有結合して６つのジスルフィド結合を形成する１２個のシステイン残基を含むペプチドであって、２つのＩＣＫモチーフを含み、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを提供する。
【００３９】
第２７態様では、本発明は、治療活性もしくは予防活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドであって、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定されるヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有するヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｅ）少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。
【００４０】
第２８態様では、本発明は、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合し、かつＡＳＩＣ１ａ生物学的経路を阻害することができる、クモ毒由来の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。
【００４１】
第２９態様では、本発明は、第２３もしくは第２８態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換え核酸分子を提供する。一部の実施形態では、この核酸分子は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１１のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体と少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる。
【００４２】
第３０態様では、本発明は、第２９態様によって提供された（例えば、商業的量で組換えペプチドを作製するための）核酸分子を発現させるための遺伝子構築物を提供する。遺伝子構築物は、概して、発現ベクター内の１つ以上の制御配列に機能的に連結されている、第２９態様によって提供された単離核酸分子を含む。
【００４３】
第３１態様では、本発明は、第２９態様によって提供された核酸分子または第３０態様によって提供された遺伝子構築物を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４４】
第３２態様では、本発明は、第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドを生成する方法であって、第３１態様によって提供された形質転換された宿主細胞を培養する工程、および培養された前記宿主細胞から得られたペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４５】
第３３態様では、本発明は、治療有効量の少なくとも１つの第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドを含む、医薬組成物を提供する。
【００４６】
第３４態様では、本発明は、対象におけるＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態を予防または治療するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチド、または第３３態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４７】
第３５態様では、本発明は、対象におけるＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態を予防または治療するための、治療有効量の少なくとも１つの第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチド、または第３３態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【００４８】
第３６態様では、本発明は、対象におけるＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態を予防または治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの第２１もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドの使用を提供する。
【００４９】
本明細書の全体を通して、文脈上別段の解釈が必要でない限り、用語「含む」は、規定の整数もしくは整数群を包含するが、任意の他の整数もしくは整数群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。
【００５０】
本明細書に記載した特徴のいずれも、本発明の範囲内で本明細書に記載した任意の１つ以上の他の特徴との任意の組み合わせで組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】π−ヘキサトキシン−Ｈｉ１ａ（Ｈｉ１ａ）スーパーファミリーのメンバーのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。システイン残基は、黒色背景上の白色文字で強調されている。Ｈｉ１ａ内の対応する位置で見いだされる残基とは異なる残基は、グレーの背景上の黒色文字で強調されている。アラインメントの上方の残基数は、Ｈｉ１ａに関する。
【図２】純粋な組換えＨｉ１ａの特性解析を示す図である。（Ａ）同一質量を備える３つのピークとして溶出する純粋な組換えＨｉ１ａの分析的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（単一ピークの再注入は、３つのピークの出現を再び生じさせる）。これは立体配座異性の指標である。上方および下方の波形は、それぞれ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度に対応する。（Ｂ）純粋な組換えＨｉ１ａのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）スペクトル。８７２３Ｄａの平均質量は、このペプチドが予想された６つのジスルフィド結合を含有することを示している。
【図３】組換えＨｉ１ａの機能的特性解析を示す図である。（Ａ）Ｈｉ１ａによるｒＡＳＩＣ１ａおよびｈＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度反応曲線（備考：データは平均値±ＳＥＭである；実験回数＝８）。Ｉ／Ｉｍａｘ：試験電流／制御電流。（Ｂ）様々なＡＳＩＣサブタイプおよび点変異体へｐＨ７．４５での３０ｎＭのＨｉ１ａが及ぼす作用（備考：データは、平均値±ＳＥＭである；実験回数＝５）。（Ｃ）アメリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞において発現した様々なＡＳＩＣサブタイプにｐＨ７．４５での１ｎＭおよび１μＭのＨｉ１ａが及ぼす作用。個々のデータポイントは同様に平均値±ＳＥＭとして示されている；実験回数＝５。（Ｄ）アメリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞において発現した野生型ｒＡＳＩＣ１ａおよびＦ３５０Ａ変異体ｒＡＳＩＣ１ａチャンネル上へのＨｉ１ａの濃度依存性作用。
【図４】ｒＡＳＩＣ１ａチャンネルを発現するアメリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞上で実施された実験の代表的記録を示す図である。ホールセル電流は、６０秒間毎（およびペプチドウォッシュアウト中の５分間毎）に７．４５から６．０への細胞外ｐＨの低下によって誘発された。卵母細胞発現チャンネルは、１２０秒間にわたり２回、ｐＨ７．４５で（Ａ）ＰｃＴｘ１および（Ｂ）Ｈｉ１ａに（１０ｎＭの濃度で）曝露させた。（Ｃ）１μＭ（飽和濃度）のＨｉ１ａを用いた不完全電流阻害を示しているＨｉ１ａ（０．１ｎＭおよび１μＭ）の非存在下（コントロール）および存在下での代表的な電流波形。（Ｄ）Ｈｉ１ａの阻害作用の極めて遅い可逆性と比較してＰｃＴｘ１によるＡＳＩＣ１ａの迅速な完全に可逆性の阻害を示している、ペプチドウォッシュアウト後の時間に対するＡＳＩＣ１ａ電流のグラフ（ウォッシュアウトの３０分後の電流振幅の約４０％の回復）（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝５）。
【図５】Ｈｉ１ａがＡＳＩＣ１ａ定常状態脱感作に及ぼす調節作用を示す図である。ｒＡＳＩＣ１ａの定常状態脱感作（ＳＳＤ）にＨｉ１ａの濃度上昇が及ぼす作用。コントロール電流は、ｐＨ７．４５から５へのｐＨ低下を用いて入手し、次にＳＳＤ曲線は、ペプチドの非存在下および存在下においてｐＨ７．９、７．７５、７．６、７．４５、７．３、７．２、７．０で１２０秒間にわたりチャンネルを状態調節することによって入手された（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝５）。
【図６】Ｈｉ１ａがＡＳＩＣ１ａ活性化に及ぼす調節作用を示す図である。Ｈｉ１ａの濃度上昇が（Ａ）ｒＡＳＩＣ１ａおよび（Ｂ）ｈＡＳＩＣ１ａの酸誘発活性化に及ぼす作用。活性化曲線は、組換えペプチドの非存在下および存在下において、ｐＨ７から５へ酸性刺激が増加する間に６０秒間にわたりｐＨ７．４５でチャンネルを状態調節することによって入手された（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝５）。
【図７】Ｈｉ１ａがｒＡＳＩＣ１ａ（左側のパネル）およびｈＡＳＩＣ１ａ（右側のパネル）の活性化およびＳＳＤのｐＨ依存性に及ぼす作用を示す図である。活性化曲線は、５０秒間毎にプロトンの濃度上昇を適用することによって得られた。プロトンの連続的存在下（ｒＡＳＩＣ１ａに対しては約７．２未満のｐＨ値）では、ＡＳＩＣは迅速に脱感作し、十分に脱プロトン化されるまでは再開することができない（ｐＨ値＞ｒＡＳＩＣ１ａに対して約７．３）。ＳＳＤプロファイルは、ｐＨを低下させながら１２０秒間にわたりチャンネルを状態調節することによって入手された（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝６）。記号は、両方のパネルで同一の意味を有する：●、ペプチドなし；△、０．５ｎＭのＨｉ１ａ；□、５ｎＭのＨｉ１ａ。
【図８】Ｈｉ１ａの構造を示す図である。核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて決定されるＨｉ１ａの三次元構造の略図（タンパク質データバンクアクセッション番号２Ｎ８Ｆにおける２０の構造の集合中の第１構造）。Ｎ末端側およびＣ末端側のインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）ドメインがドメイン間リンカーに加えて標識されている。標識「Ｎ」および「Ｃ」は、それぞれペプチドのＮ末端側およびＣ末端側を示す。太いチューブは、ジスルフィド結合（各ＩＣＫドメイン中の３つ）を表す。
【図９】個々のＨｉ１ａのインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）ドメインの機能的特性解析を示す図である。上：Ｈｉ１ａ中の２つのＩＣＫドメインのアミノ酸配列のアラインメント。システイン残基は、黒色背景上の白色文字によって強調されている。下：このグラフは、Ｎ末端側ＩＣＫドメイン（Ｈｉ１ａ−Ｎ）およびＣ末端側ＩＣＫドメイン（Ｈｉ１ａ−Ｃ）のバリアントによるｒＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度作用曲線を示している（実験回数＝５）。Ｉ／Ｉｍａｘ：試験電流／制御電流。
【図１０】ｒＡＳＩＣ１ａを発現する卵母細胞からの代表的記録を示す図である。ホールセル電流は、６０秒間毎に７．４５から６．０への細胞外ｐＨにおける変化によって誘発された。卵母細胞発現チャンネルは、６０秒間にわたりｐＨ７．４５でペプチドに曝露させた。上のパネル：最初に３μＭで適用されたＨｉ１ａ−Ｎ；中央パネル：最初に１０μＭで適用されたＨｉ１ａ−Ｃ；下のパネル：Ｈｉ１ａ−ＮおよびＨｉ１ａ−Ｃは、適用前にそれぞれ３μＭおよび１０μＭで溶液中にて混合された。
【図１１】Ｈｉ１ａ変異体の機能的特性解析を示す図である。上：ＰｃＴｘ１およびＨｉ１ａのアミノ酸配列のアラインメント。ＰｃＴｘ１中の重要なファーマコフォア残基Ｋ８、Ｗ２４およびＲ２８は、Ｈｉ１ａ中でそれぞれＬｅｕ、ＴｙｒおよびＨｉｓと置換されている。これらの残基は、黒色背景上の白色文字で強調されている。このグラフは、野生型Ｈｉ１ａ（ＷＴ）および３つのＨｉ１ａ変異体（Ｌ８Ｋ、Ｙ２４ＷおよびＨ２８Ｒ）によるｒＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度作用曲線を示している。対応するＩＣ５０値は、右側に示されている（実験回数＝５）。Ｉ／Ｉｍａｘ：試験電流／制御電流。
【図１２】Ｈｉ１ａ様二重ＩＣＫペプチドがｒＡＳＩＣ１ａに及ぼす作用を示す図である（全部について、実験回数＝５）。上：Ｈｉ１ａおよび改変Ｈｉ１ａ様ペプチドのアミノ酸配列のアラインメント。２つのＩＣＫドメイン間のリンカー領域は、グレーの箱で強調されている。グラフは、野生型Ｈｉ１ａ（Ｈｉ１ａ  ＷＴ）および４つのＨｉ１ａバリアント（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＰｃＴｘ１／Ｈｉ１ａ＿Ｃ）によるｒＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度作用曲線を示している；対応するＩＣ５０値は、右側に示されている。Ｉ／Ｉｍａｘ：試験電流／制御電流。
【図１３】組換えＨｉ１ｄの機能的特性解析を示す図である。上：Ｈｉ１ａおよびＨｉ１ｄのアミノ酸配列のアラインメント。２つのペプチド内で同一である残基は、グレーの背景上に黒色で強調されている。このグラフは、Ｈｉ１ｄによるｒＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度作用曲線を示している（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝６）。Ｉ／Ｉｍａｘ：試験電流／制御電流（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝５）。
【図１４】ＳＨＲ（特発性高血圧ラット）の脳卒中から２時間後に、ＡＳＩＣ１ａに非活性であるＰｃＴｘ１二重変異体（「ＰｃＴｘ１変異体イソ２」；１ｎｇ／ｋｇ）であるＰｃＴｘ１（１ｎｇ／ｋｇ）、Ｈｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）またはビヒクル（食塩液）が脳室内投与（ｉ．ｃ．ｖ．）された。ＰｃＴｘ１およびＨｉ１ａは、どちらも脳の（Ａ）皮質（梗塞周囲帯）領域および（Ｂ）線条体（壊死性コア）領域における梗塞サイズを減少させたが、Ｈｉ１ａの方がより効果的であった。非活性ＰｃＴｘ１変異体は梗塞サイズに作用を全く及ぼさなかった。データポイントは、平均値±ＳＥＭであった（実験回数＝７）。＊Ｐ＜０．０５、ビヒクルに対して（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図１５】脳卒中から２、４もしくは８時間後のＨｉ１ａの脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与は、皮質（梗塞周囲帯）領域および線条体（壊死性コア）領域両方における梗塞サイズを減少させる。（ａ）脳卒中から２、４もしくは８時間後のビヒクル（食塩液）またはＨｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与。ビヒクル：２時間後、実験回数＝１０；４時間後、実験回数＝７；８時間後、実験回数＝９。Ｈｉ１ａ：２時間後、実験回数＝５；４時間後、実験回数＝７；８時間後、実験回数＝１０。データポイントは、平均値±ＳＥＭである。脳卒中から７２時間後に体積を測定し、浮腫について補正した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ビヒクルに対して（一元配置ＡＮＯＶＡ）。（ｂ）脳卒中から８時間後にビヒクルまたはＨｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）のいずれかでｉ．ｃ．ｖ．処置されたＳＨＲ（特発性高血圧ラット）からの典型的な梗塞（より暗色領域）および非梗塞領域を示している冠状断面。
【図１６】Ｈｉ１ａ投与による梗塞サイズの減少は、脳卒中後の改良された行動スコアと相関している。（ａ）脳卒中前（ＰＳ）ならびに脳卒中後（ｐｓ）２４および７２時間の時点で測定された神経学的スコア。データポイントは、平均値±ＳＥＭである。＃＃ｐ＜０．０１、脳卒中前性能に対して；＊＊ｐ＜０．０１、ビヒクル処置群における対応する時間に対して（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、その後にテューキー事後検定）。（ｂ）脳卒中前（ＰＳ）ならびに脳卒中後（ｐｓ）２４および７２時間の時点で測定された運動スコア（レッジド・ビーム（ｌｅｄｇｅｄ  ｂｅａｍ）試験におけるエラー率（％））。データポイントは、平均値±ＳＥＭである。＃＃脳卒中前性能に対してｐ＜０．０１；＊ビヒクル処置群における対応する時間に対してｐ＜０．０５、＊＊ビヒクル処置群における対応する時間に対してｐ＜０．０１、（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、その後にテューキー事後検定）。
【図１７】Ｈｉ１ａ投与を用いた梗塞サイズの減少（図１５）は、改良されたニューロンの生存と相関する。損傷のペナンブラ（皮質）領域およびコア（線条体）領域におけるニューロンの生存は、脳卒中から７２時間後に測定された。データは、非閉塞（対側）および閉塞（同側）半球内で、０．４ｍｍ２当たりＮｅｕＮ免疫陽性（ＮｅｕＮ＋）細胞の数（平均値±ＳＥＭ）として表示されている。＊＊ビヒクル処置群（同側）に対してｐ＜０．０１；＃＃非梗塞半球上のマッチした領域に対してｐ＜０．０１（二元配置ＡＮＯＶＡの後にテューキー事後検定）。
【図１８】Ｈｉ１ａの鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与は、皮質（梗塞周囲帯）領域および線条体（壊死性コア）領域両方における梗塞サイズを減少させる。ビヒクルのｉ．ｎ．投与と比較して、脳卒中から４時間後の２μｇ／ｋｇの用量でのＨｉ１ａのｉ．ｎ．投与は脳の（Ａ）皮質領域および（Ｂ）線条体領域の両方において梗塞サイズを減少させ、（Ｃ）レッジド・ビームアッセイを用いて測定した知覚運動障害を減少させ、（Ｄ）全体的神経学スコアを改善し、（Ｅ）重量損失を最小限に抑える。梗塞体積は、脳卒中から７２時間後に測定された。行動試験は、脳卒中前（ＰＳ）ならびに脳卒中後（ｐｓ）２４および７２時間の時点で実施された。データポイントは、平均値±ＳＥＭである。ビヒクル：実験回数＝６。Ｈｉ１ａ（２μｇ／ｋｇ）：実験回数＝７。＊ビヒクルにおける対応する時点に対してＰ＜０．０５、＊＊ビヒクルにおける対応する時点に対してＰ＜０．００１。
【００５２】
配列の簡単な説明
配列番号１＝Ｈｉ１ａ前駆体の核酸コーディング配列（３９０個の核酸）。
配列番号２＝Ｈｉ１ａ前駆体のペプチド配列（１２９個のアミノ酸）。
配列番号３＝Ｈｉ１ｂ前駆体の核酸コーディング配列（３９０個の核酸）。
配列番号４＝Ｈｉ１ｂ前駆体のペプチド配列（１２９個のアミノ酸）。
配列番号５＝Ｈｉ１ｃ前駆体の核酸コーディング配列（４５６個の核酸）。
配列番号６＝Ｈｉ１ｃ前駆体のペプチド配列（１５１個のアミノ酸）。
配列番号７＝Ｈｉ１ｄ前駆体の核酸コーディング配列（３８７個の核酸）。
配列番号８＝Ｈｉ１ｄ前駆体のペプチド配列（１２８個のアミノ酸）。
配列番号９＝Ｈｉ１ｅ＿１前駆体の核酸コーディング配列（３９０個の核酸）。
配列番号１０＝Ｈｉ１ｅ＿１前駆体のペプチド配列（１２９個のアミノ酸）。
配列番号１１＝Ｈｉ１ｅ＿２前駆体の核酸コーディング配列（３９０個の核酸）。
配列番号１２＝Ｈｉ１ｅ＿２前駆体のペプチド配列（１２９個のアミノ酸）。
配列番号１３＝大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現させるためのＨｉ１ａの核酸コーディング配列（２２８個の核酸）。
配列番号１４＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現した組換えＨｉ１ａのペプチド配列（プロテアーゼ切断部位の痕跡であるＮ末端セリンを含む７６個のアミノ酸）。
配列番号１５＝天然成熟ＰｃＴｘ１のペプチド配列（４０個のアミノ酸）。
配列番号１６＝天然成熟Ｈｉ１ａのペプチド配列（７５個のアミノ酸）。
配列番号１７＝Ｈｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメインのペプチド配列（３７個のアミノ酸）。
配列番号１８＝修飾Ｃ末端を備えるＨｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメイン（ＶＰ）のペプチド配列（３５個のアミノ酸）。
配列番号１９＝修飾Ｃ末端を備えるＨｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメイン（ＩＰ）のペプチド配列（３７個のアミノ酸）。
配列番号２０＝修飾Ｃ末端を備えるＨｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメイン（ＩＰＧ）のペプチド配列（３８個のアミノ酸）。
配列番号２１＝Ｈｉ１ａのＣ末端側ＩＣＫドメインのペプチド配列（４０個のアミノ酸）。
配列番号２２＝組換えＨｉ１ａ  Ｌ８Ｋのペプチド配列（７６個のアミノ酸）。
配列番号２３＝組換えＨｉ１ａ  Ｙ２４Ｗのペプチド配列（７６個のアミノ酸）。
配列番号２４＝組換えＨｉ１ａ  Ｈ２８Ｒのペプチド配列（７６個のアミノ酸）。
配列番号２５＝組換え改変ペプチド＃１のペプチド配列（７８個のアミノ酸）。
配列番号２６＝組換え改変ペプチド＃２のペプチド配列（７８個のアミノ酸）。
配列番号２７＝組換え改変ペプチド＃３のペプチド配列（７９個のアミノ酸）。
配列番号２８＝ＰｃＴｘ１に結合したＨｉ１ａのＣ末端側ＩＣＫドメインである組換え改変ペプチド＃４、ＰｃＴｘ１：Ｈｉ１ａ＿Ｃのペプチド配列（８１個のアミノ酸）。
配列番号２９＝天然成熟Ｈｉ１ｂのペプチド配列（７５個のアミノ酸）。
配列番号３０＝天然成熟Ｈｉ１ｃのペプチド配列（１００個のアミノ酸）。
配列番号３１＝天然成熟Ｈｉ１ｄのペプチド配列（７７個のアミノ酸）。
配列番号３２＝天然成熟Ｈｉ１ｅ＿１のペプチド配列（７５個のアミノ酸）。
配列番号３３＝天然成熟Ｈｉ１ｅ＿２のペプチド配列（７５個のアミノ酸）。
配列番号３４＝組換えＨｉ１ａを生成するために使用されたコーディング配列の核酸配列（１，４１６個の核酸）。
配列番号３５＝組換えＨｉ１ａのための全前駆体タンパク質のアミノ酸配列（４７０個の残基）。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、一部には、Ｈｉ１ａと称する、オーストラリアジョウゴグモであるハドロニッケ・インフェンサ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ）の毒由来の新規なジスルフィドリッチペプチドの発見に基づいて記載されている。Ｈｉ１ａは、６つのジスルフィド結合を含有する８．６ｋＤａのペプチドである。Ｈｉ１ａは、２つのインヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフが６残基のリンカーによって頭尾結合されているダブルノット毒素（Ｂｏｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）である。ＩＣＫモチーフは、クモ毒ペプチドの一般的特徴であり、典型的には高レベルの化学的安定性および熱安定性ならびにプロテアーゼに対する抵抗性を有するこれらのペプチドを生じさせる。本発明者らは、Ｈｉ１ａが現在までに報告されたヒトＡＳＩＣ１ａの最も強力なインヒビターであること、およびこのペプチドが他のＡＳＩＣサブタイプに比してＡＳＩＣ１ａに対して高度に選択的であることを見いだした。
【００５４】
オーストラリアジョウゴグモであるハドロニッケ・インフェンサ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ）由来の毒腺トランスクリプトームを分析することによって、本発明者らは、Ｈｉ１ａおよび多数のパラロガスペプチドを同定した。
【００５５】
第１態様では、本発明は、神経保護活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。このペプチドは、式（Ｉ）：
Ｘ−Ｌ−Ｙ    （Ｉ）
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）フォールドを有するペプチド配列を表し、Ｌはリンカーである）の配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になり、かつ前記ペプチドは、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる。
【００５６】
本発明の目的に関して、「単離（された）」は、その天然状態から取り出されたか、またはそうではなくヒトの操作を受けている、物質を意味する。単離（された）物質は、その天然状態では通常は付随する構成成分から実質的もしくは本質的に分離されている可能性があるように、または人工状態にあるように操作することができる。単離（された）物質は、天然型もしくは組換え型の物質であってよい。用語「単離（された）」は、さらに例えば「精製（された）」および／または「合成」などの用語もまた含む。
【００５７】
ペプチドもしくはタンパク質に関して本明細書で使用する用語「組換え」は、組換え技術によって生成されたペプチドもしくはタンパク質を意味する。
【００５８】
本発明の文脈における「ジスルフィドリッチペプチド」は、３つのジスルフィド結合を形成するように対で結合されている６個のシステイン残基を有するペプチドを意味する。好ましくは、３つのジスルフィド結合は、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）モチーフとして公知であるシュードノットを形成する。本発明の特に好ましいジスルフィドリッチペプチドは、このペプチドが２個のＩＣＫモチーフを含むように対で共有結合して６つのジスルフィド結合を形成する１２個のシステイン残基を含む。
【００５９】
本明細書で使用する「神経保護活性」は、例えば脳卒中の発症中に発生する可能性があるようなニューロンおよび／またはグリア細胞または組織への損傷を低減または改善する作用を意味する。したがって、「神経保護活性」は、例えば、感覚運動機能および認識能力に関連する症状の重症度の低下をもたらす。
【００６０】
「からなる」は、語句「からなる」の直前に記載されているものを含みかつそれに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙した要素が必要または必須であり、かつ他の要素は全く存在してはならないことを示す。「から本質的になる」は、この語句の直前に列挙された任意の要素を含み、かつ列挙した要素のための本開示に規定した活性もしくは作用を妨害もしくは寄与しない他の要素に限定されるされることを意味する。したがって、語句「から本質的になる」は、列挙した要素が必要もしくは必須であるが、他の要素は任意選択的であり、それらが列挙した要素の活性もしくは作用に影響を及ぼすか否かに依存して存在してもよいし存在しなくてもよいことを示している。
【００６１】
式（Ｉ）の配列では、ＸおよびＹは、異なる配列であっても同一配列であってもよい。好ましい実施形態では、ＸおよびＹは、異なる配列であるが、どちらもフォールディングしてＩＣＫモチーフを形成する。このためＸおよびＹはそれぞれ、好ましくは約２５〜約５０個のアミノ酸、いっそうより好ましくは、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸の配列である。
【００６２】
特定の実施形態では、Ｘは、配列番号２の５５〜８７番目の残基、配列番号６の５２〜８４番目の残基、または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する。特に好ましい実施形態は、Ｘが配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する実施形態である。
【００６３】
Ｘとは無関係に、特定の実施形態では、Ｙは、配列番号２の９４〜１２９番目の残基、配列番号４の９４〜１２９番目の残基、配列番号６の１０１〜１５１番目の残基、配列番号８の９３〜１２８番目の残基、または配列番号１０の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する。特に好ましい実施形態では、Ｙは、配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する。
【００６４】
リンカーのＬは、結合、非アミノ酸ベースの化学的部分、単一アミノ酸、またはペプチド配列であってよい。Ｌが単一アミノ酸である実施形態については、Ｌは、天然型アミノ酸または合成の非天然型アミノ酸、例えば対応する天然型アミノ酸の化学的アナログであってよい。好ましい実施形態では、Ｌは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸からなるペプチド配列である。この配列のアミノ酸は、同一の天然もしくは非天然アミノ酸であってよいし、またはこの配列の各アミノ酸は、天然型アミノ酸もしくは合成の非天然型アミノ酸、例えば対応する天然型アミノ酸の化学的アナログなどから独立して選択することができる。特に好ましい実施形態では、Ｌは、６個の天然型アミノ酸のペプチド配列である。
【００６５】
所定の実施形態では、Ｌは、主として（すなわち、リンカーのアミノ酸残基の５０％超の）天然型疎水性アミノ酸を含む。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニンおよびプロリンが含まれる。
【００６６】
特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２の８８〜９３番目の残基、配列番号６の８５〜１００番目の残基、または配列番号８の８５〜９２番目の残基によって規定される配列を有することができる。特に好ましい実施形態では、リンカーは、配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有する。
【００６７】
式（Ｉ）のペプチドは、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができるジスルフィドリッチペプチドを提供するために、Ｘ、Ｙ、およびＬの任意の組み合わせを含むことができる。特に好ましい実施形態は、Ｘが配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有し、Ｌが配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有し、かつＹが配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有するペプチドであって、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを含む。
【００６８】
好ましくは、式（Ｉ）のペプチドは、約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いっそうより好ましくは、これらのペプチドは、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＳＩＣ１ａを阻害する。
【００６９】
第２態様では、本発明は、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、第１態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチドの機能的に活性な神経保護断片、誘導体、またはアナログを提供する。
【００７０】
本明細書で使用する用語「機能的に活性」は、第１態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチドの少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の神経保護活性を保持していることを意味する。
【００７１】
本明細書で使用する用語「断片」は、ジスルフィドリッチペプチドの１００％未満であるが、少なくとも２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％を構成する配列を意味する。
【００７２】
ジスルフィドリッチペプチドの「誘導体」は、例えば化学的部分とのコンジュゲーションもしくは錯化によって、翻訳後修飾（リン酸化、グリコシル化、アセチル化、脂質化もしくはペグ化を含むがそれらに限定されない）によって、または１つ以上のアミノ酸（例えば、精製に役立つためのタンパク質もしくはタグの付加を含む）によって改変されているペプチドである。非天然型アミノ酸の組込みもまた、「誘導体」に包含される。
【００７３】
本明細書で使用する用語「アナログ」は、第１態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチドに構造的に類似するが、一部の態様では異なる化合物を意味する。
【００７４】
好ましくは、機能的に活性な神経保護断片、誘導体もしくはアナログは、約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いっそうより好ましくは、機能的に活性な神経保護断片、誘導体もしくはアナログは、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＳＩＣ１ａを阻害する。
【００７５】
第３態様では、本発明は、２つのＩＣＫモチーフが６残基のリンカーによって頭尾結合されている神経保護ペプチドであって、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、神経保護ペプチドを提供する。
【００７６】
リンカーの６個の残基は、同一の天然型もしくは非天然型アミノ酸であってよいし、またはリンカーの各残基は、天然型および非天然型アミノ酸から独立して選択することができる。特に好ましい実施形態では、Ｌは、６個の天然型アミノ酸のペプチド配列である。
【００７７】
所定の実施形態では、リンカーは、主として、４、５、または６個の天然型疎水性アミノ酸である疎水性アミノ酸残基を含む。特に好ましい実施形態では、リンカーは、配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有する。
【００７８】
２つのＩＣＫモチーフは、異なる配列であってもよいし同一配列であってもよい。好ましい実施形態では、２つのＩＣＫモチーフは、異なる配列を有する。各ＩＣＫモチーフは、好ましくは約２５〜約５０個のアミノ酸、いっそうより好ましくは、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸の配列である。
【００７９】
特定の実施形態では、Ｎ末端側のＩＣＫモチーフは、配列番号２の５５〜８７番目の残基、配列番号６の５２〜８４番目の残基、または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する。特に好ましい実施形態は、Ｎ末端側のＩＣＫモチーフが配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する実施形態である。
【００８０】
Ｎ末端側のＩＣＫモチーフとは無関係に、特定の実施形態では、Ｃ末端側のＩＣＫモチーフは、配列番号２の９４〜１２９番目の残基、配列番号４の９４〜１２９番目の残基、配列番号６の１０１〜１５１番目の残基、配列番号８の９３〜１２８番目の残基、または配列番号１０の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する。特に好ましい実施形態では、Ｃ末端側のＩＣＫモチーフは、配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する。
【００８１】
これらのペプチドは、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる神経保護ペプチドを提供するために、ＩＣＫモチーフと６残基のリンカーとの任意の組み合わせを含むことができる。特に好ましい実施形態は、Ｎ末端側のＩＣＫモチーフが配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有し、リンカーが配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有し、かつＣ末端側のＩＣＫモチーフが配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有するペプチドであって、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを含む。
【００８２】
好ましくは、神経保護ペプチドは、約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いっそうより好ましくは、これらのペプチドは、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＳＩＣ１ａを阻害する。
【００８３】
第４態様では、本発明は、対で共有結合して６つのジスルフィド結合を形成する１２個のシステイン残基を含む神経保護ペプチドであって、２個のＩＣＫモチーフを含み、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、神経保護ペプチドを提供する。好ましくは、２つのＩＣＫモチーフは、このペプチドが連結された２つのＩＣＫモチーフを含むように頭尾結合されている。２つのＩＣＫモチーフは、直接的に（すなわち、ペプチド結合を介して）結合できるし、またはそれらはリンカーによって結合することができる。リンカーは、非アミノ酸ベースの化学的部分、単一アミノ酸、またはペプチド配列であってよい。リンカーが単一アミノ酸である実施形態については、リンカーは、天然型もしくは非天然型アミノ酸であってよい。リンカーがペプチド配列である実施形態については、このペプチド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸であってよい。リンカーのアミノ酸は、同一の天然型もしくは非天然型アミノ酸であってよいし、またはリンカー配列の各アミノ酸は、天然型および非天然型アミノ酸から独立して選択することができる。特に好ましい実施形態では、リンカーは、６個の天然型アミノ酸のペプチド配列である。
【００８４】
所定の実施形態では、リンカーは、主として（すなわち、リンカーのアミノ酸残基の５０％超の）天然型疎水性アミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２の８８〜９３番目の残基、配列番号６の８５〜１００番目の残基、または配列番号８の８５〜９２番目の残基によって規定される配列を有することができる。特に好ましい実施形態では、リンカーは、配列番号２の８８〜９３番目の残基によって規定される配列を有する。
【００８５】
２つのＩＣＫモチーフは、異なる配列であってもよいし同一配列であってもよい。好ましい実施形態では、２つのＩＣＫモチーフは、異なる配列を有する。各ＩＣＫモチーフは、好ましくは約２５〜約５０個のアミノ酸、いっそうより好ましくは、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸の配列である。
【００８６】
特定の実施形態では、Ｎ末端側のＩＣＫモチーフは、配列番号２の５５〜８７番目の残基、配列番号６の５２〜８４番目の残基、または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する。特に好ましい実施形態は、Ｎ末端側のＩＣＫモチーフが配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有する実施形態である。
【００８７】
Ｎ末端側のＩＣＫモチーフとは無関係に、特定の実施形態では、Ｃ末端側のＩＣＫモチーフは、配列番号２の９４〜１２９番目の残基、配列番号４の９４〜１２９番目の残基、配列番号６の１０１〜１５１番目の残基、配列番号８の９３〜１２８番目の残基、または配列番号１０の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する。特に好ましい実施形態では、Ｃ末端側のＩＣＫモチーフは、配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有する。
【００８８】
ペプチドは、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる神経保護ペプチドを提供するためにＩＣＫモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。特に好ましい実施形態は、Ｎ末端側のＩＣＫモチーフが配列番号２の５５〜８７番目の残基または配列番号１４の１〜３４番目の残基によって規定される配列を有し、Ｃ末端側のＩＣＫモチーフが配列番号２の９４〜１２９番目の残基によって規定される配列を有するペプチドであって、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを含む。
【００８９】
好ましくは、これらのペプチドは、約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いっそうより好ましくは、これらのペプチドは、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＳＩＣ１ａを阻害する。
【００９０】
第５態様では、本発明は、神経保護活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。このペプチドは、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定されるヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有するヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる。
【００９１】
本明細書で使用する語句「およびその間のすべての整数パーセンテージ」は、２つの記載された数値の低い方を２つの記載された数値の高い方に達するまで整数「１」増加させることを意味する。例えば、「ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間のすべての整数パーセンテージ」は、少なくとも６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を意味する。
【００９２】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的置換を構成するアミノ酸または核酸のパーセンテージ数に関する。
【００９３】
本明細書で使用する用語「配列同一性」は、配列が比較ウィンドウにわたってヌクレオチド／ヌクレオチドベースまたはアミノ酸／アミノ酸ベースに基づいて同一である程度を意味する。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較すること、マッチした位置の数をもたらすために両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定すること、マッチした位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウのサイズ）内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ること、によって計算される。
【００９４】
「ハイブリダイズする」は、本明細書では、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成するための少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対合を意味する。相補的ヌクレオチド配列を含むハイブリッド配列は、対合を通して発生する。
【００９５】
「中もしくは高ストリンジェンシー条件」は、その下で配列がハイブリダイズするであろう温度およびイオン強度条件を意味する。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間で必要とされる相補性レベルが高くなるであろう。ストリンジェンシー条件は、当分野において周知であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために様々な要素を操作できることを認識できる（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２を参照されたい）。
【００９６】
好ましい実施形態では、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドは、配列番号１６を含む。特に好ましい実施形態では、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドは、配列番号１４からなる。
【００９７】
第６態様では、本発明は、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、クモ毒由来の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。特定の実施形態では、このペプチドは、ハドロニッケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属、アトラクス（Ａｔｒａｘ）属もしくはイラワラ（Ｉｌｌａｗａｒｒａ）属、または関連するジグモ内の任意のオーストラリアジョウゴグモの毒に由来することができる。
【００９８】
本明細書で使用する「に由来する」は、１つの意味では、単純にそのペプチドが最初にクモ毒内で同定されたことを意味する。また別の意味では、「に由来する」は、天然タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端からの天然タンパク質の配列内の１つ以上の位置での１つ以上のアミノ酸の欠失（切断）または付加によって、または天然タンパク質の配列内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換によって、天然ペプチドとは異なる、ジスルフィドリッチペプチドを意味する。
【００９９】
第７態様では、本発明は、第１もしくは第６態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換え核酸分子を提供する。一部の実施形態では、この核酸分子は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１１のいずれか１つに規定される配列またはそれらの相補体とハイブリダイズする配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる。
【０１００】
好ましい実施形態では、単離核酸分子は、配列番号１３を含む。特に好ましい実施形態では、単離核酸分子は、配列番号１３からなる。
【０１０１】
第８態様では、本発明は、第７態様によって提供された核酸分子を発現させるための遺伝子構築物を提供する。その遺伝子構築物は、発現ベクター内の１つ以上の制御配列に機能的に連結されている、第７態様によって提供された単離核酸分子を含む。
【０１０２】
典型的には、遺伝子構築物は、当分野において明確に理解されているように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母もしくは細菌性人工染色体の形態にあるか、またはそれらの遺伝子構成成分を含む（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）。遺伝子構築物は、組換えＤＮＡテクノロジーによる操作のため、および／または第２態様の核酸もしくは本発明のコードされたタンパク質を発現させるために、細菌もしくは他の宿主細胞内での単離核酸の維持および増殖のために好適な可能性がある。
【０１０３】
宿主細胞での発現のためには、遺伝子構築物は発現構築物である。典型的には、発現構築物は、第７態様によって提供された発現ベクター内の１つ以上の付加配列に機能的に連結されている核酸分子を含む。「発現ベクター」は、例えばプラスミドなどの自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノム内に組み込まれるベクターのいずれかであってよい（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）。
【０１０４】
本明細書で使用する語句「機能的に連結されている」は、遺伝子構築物内で第２態様の核酸に対して付加ヌクレオチド配列を配置することを意味するが、当該付加ヌクレオチド配列は、転写を開始する、調節する、またはさもなければ制御する。
【０１０５】
制御ヌクレオチド配列は、発現のために使用される宿主細胞にとって適切であるように選択される。様々な宿主細胞のために極めて多数の適切な発現ベクターおよび好適な制御配列が、当業者には周知である。制御配列には、（構成的もしくは誘導性）プロモーター配列、リーダーもしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および転写終結配列、翻訳開始および翻訳終結配列、ならびにエンハンサーおよびアクチベーター配列が含まれるがそれらに限定されない。
【０１０６】
一部の実施形態では、遺伝子構築物は、本発明のジスルフィドリッチペプチドが融合タンパク質として発現するように１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、融合タンパク質は、第１態様のジスルフィドリッチペプチドおよび１つ以上の部分を含む。その１つ以上の部分は、当分野においてはタンパク質タグとして公知である。タンパク質タグは、機能に基づいて選択され、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびポリ（Ｈｉｓ）タグ（通常はヘキサ−ヒスチジンタグ）などの親和性タグ、ならびに例えばＭＢＰおよびＧＳＴなどの可溶化タグが含まれる。親和性タグの存在は、融合タンパク質の精製に役立つことができる。例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグを含む融合タンパク質は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて容易に精製することができる。可溶化タグの存在は、発現タンパク質の可溶性およびフォールディングに役立つことができる。例えばＭＢＰおよびＧＳＴなどのタグは、親和性タグおよび可溶化タグとしての二重機能性を有する（Ｓａｃｈｅｖ  ａｎｄ  Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，２０００；Ｓｍｉｔｈ，２０００）。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、本発明のジスルフィドリッチペプチドが親和性タグおよび可溶化タグを含む融合タンパク質として発現するようなヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態では、親和性タグはポリ（Ｈｉｓ）タグであり、可溶化タグはＭＢＰである。融合タンパク質は、好ましくはタグからのジスルフィドリッチペプチドの遊離を容易にするための切断部位をさらに含む。
【０１０８】
第９態様では、本発明は、第７態様によって提供された核酸分子または第８態様によって提供された遺伝子構築物を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１０９】
宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。例えば、好適な宿主細胞には、哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔもしくはジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ））、酵母細胞（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、バキュロウイルス発現系を用いてもしくは用いずに利用される昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９もしくはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ））、または細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が含まれる（Ｋｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１１０】
特に好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【０１１１】
いっそうより好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、ジスルフィドリッチペプチドは、細胞のペリプラズム内に位置するジスルフィド結合機構（Ｄｓｂ系）を利用するためにペリプラズム内で発現する（Ｋｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１１２】
代替実施形態では、本発明のジスルフィドリッチペプチドは、無細胞発現系で生成される。無細胞タンパク質合成（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳とも呼ばれる）は、ジスルフィド結合タンパク質を含むタンパク質の生成のために使用されて成功を収めてきた（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，２００４；Ｂｕｎｄｙ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，２０１１）。
【０１１３】
第１０態様では、本発明は、第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドを生成する方法であって、第９態様によって提供された形質転換された宿主細胞を培養する工程、および培養された前記宿主細胞から得られたペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１１４】
本方法は、精製および／またはフォールディングを含むまた別の工程を含むことができる。例えば、ジスルフィドリッチペプチドが本明細書に記載した親和性タグを含む融合タンパク質として発現する実施形態では、本方法は、親和性タグに適した方法を用いる融合タンパク質の精製をさらに含むことができる。ポリ（Ｈｉｓ）タグの場合には、精製工程はＩＭＡＣを含むことができる。
【０１１５】
ジスルフィドリッチペプチドの発現は、正確なジスルフィド結合の形成を必ずしも生じさせないので、このため結果として非天然フォールド（三次元構造）が生じる可能性がある。このため、第１態様の単離ジスルフィドリッチペプチドの生成におけるまた別の工程は、正確なジスルフィド結合形成に役立つようにレドックス緩衝剤の使用をさらに含むことができる。不純物からの干渉を回避するために、好ましくは、レドックス緩衝剤は、発現タンパク質が細胞培養から精製された後に利用される。
【０１１６】
本方法は、任意の親和性タグおよび／または可溶化タグからの融合タンパク質の切断をさらに含むことができる。
【０１１７】
第１１態様では、本発明は、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドを含む、医薬組成物を提供する。
【０１１８】
本明細書で使用する語句「医薬組成物」は、医薬組成物および獣医学的組成物を含む。
【０１１９】
本発明の医薬組成物において使用できる医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者には公知であろう。英国薬局方（ＢＰ）および米国薬局方・国民医薬品集（ＵＳＰ−ＮＦ）は、それらの内容が相互参照により本明細書に組み込まれるＳｗｅｅｔｍａｎ  Ｓ（Ｅｄ．），“Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．”Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，３７ｔｈ  Ｅｄ．，（２０１１）、およびＲｏｗｅ  ＲＣ，Ｓｈｅｓｋｅｙ  ＰＪ，Ｑｕｉｎｎ  ＭＥ（Ｅｄ．），“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２００９）と同様に、好適な担体、希釈剤および賦形剤の詳細を含有している。
【０１２０】
医薬組成物は、任意の好適な経路によって投与用に製剤化することができる。所定の実施形態では、本組成物は、非経口投与のために好適である。本明細書で使用する用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、関節包内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内および頭蓋内注射もしくは注入技術が含まれる。特に好ましい投与様式は、鼻腔内（ｉ．ｎ．）である。
【０１２１】
ｉ．ｃ．ｖ．もしくは髄腔内投与のためには、医薬組成物は、例えば希釈剤、アジュバント、賦形剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤、保存料、または酸化防止剤などの担体中で製剤化することができる。好ましくは、組成物は、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液中で製剤化される。
【０１２２】
ｉ．ｎ．投与のためには、ペプチド、断片、誘導体もしくはアナログは、例えば鼻腔スプレーとして送達するために好適な液体担体中で製剤化することができる。本組成物は、ペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを鼻粘膜を越えて輸送するのに役立つように、送達促進剤をさらに含むことができる。送達促進剤は、例えば、脂質、ポリマー、リポソーム、エマルジョンもしくはナノ粒子を含むことができる。
【０１２３】
同様に、経口腔送達のためには、ペプチド、断片、誘導体もしくはアナログは、好適な液体担体中で製剤化することができる。本組成物は、好ましくは、ペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを口腔粘膜を越えて輸送するのに役立つように、送達促進剤をさらに含む。送達促進剤は、例えば、脂質、ポリマー、リポソーム、エマルジョンもしくはナノ粒子を含むことができる。
【０１２４】
第１２態様では、本発明は、対象における脳卒中を治療するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１２５】
治療の対象は、ヒト、哺乳動物または動物であってよい。好ましくは、対象は、ヒトまたは他のタイプの哺乳動物である。
【０１２６】
「治療有効量」は、神経学的機能、ニューロン損傷、感覚運動機能および認識能力を含む、脳卒中に関連する１つ以上の症状を治療もしくは重症度を軽減するために有効な量である。
【０１２７】
好ましい実施形態では、ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物の治療有効量は、ｉ．ｃ．ｖ．送達の場合は１〜１０ｎｇ／ｋｇであり、鼻腔内送達の場合は１〜１０μｇ／ｋｇである。
【０１２８】
好ましくは、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程は、脳卒中の発症後できる限り迅速に実施される。投与する工程は、好ましくは、脳卒中の発症からその約１２時間後までの間の任意の時点で実施される。このため、投与する工程は、脳卒中の発症後１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１時間以内に実施される。好ましくは、投与する工程は、脳卒中の発症後８時間以内に実施される。また別の好ましい実施形態では、投与する工程は、脳卒中の発症後４時間以内に実施される。
【０１２９】
ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物は、好ましくはｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｎ．経路によって投与される。
【０１３０】
第１３態様では、本発明は、対象における脳卒中後の神経損傷の予防または治療のための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１３１】
第１４態様では、本発明は、対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１３２】
治療の対象は、ヒト、哺乳動物または動物であってよい。好ましくは、対象は、ヒトまたは他のタイプの哺乳動物である。
【０１３３】
好ましい実施形態では、ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物の治療有効量は、ｉ．ｃ．ｖ．送達の場合は１〜１０ｎｇ／ｋｇであり、鼻腔内送達の場合は１〜１０μｇ／ｋｇである。
【０１３４】
投与する工程は、好ましくは、脳卒中の発症からその約１２時間後までの間の任意の時点で実施される。このため、投与する工程は、脳卒中の発症後１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１時間以内に実施される。好ましくは、投与する工程は、脳卒中の発症後８時間以内に実施される。また別の好ましい実施形態では、投与する工程は、脳卒中の発症後４時間以内に実施される。
【０１３５】
ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物は、好ましくはｉ．ｃ．ｖ．もしくはｉ．ｎ．経路によって投与される。
【０１３６】
第１５態様では、本発明は、脳卒中を治療するための、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【０１３７】
第１６態様では、本発明は、対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【０１３８】
第１７態様では、本発明は、対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための、治療有効量の少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチド、または第１１態様によって提供された医薬組成物の使用を提供する。
【０１３９】
治療のための対象は、ヒト、哺乳動物または動物であってよい。好ましくは、対象は、ヒトまたは他のタイプの哺乳動物である。
【０１４０】
好ましい実施形態では、ペプチド、断片、誘導体、アナログ、または医薬組成物の治療有効量は、ｉ．ｃ．ｖ．送達の場合は１〜１０ｎｇ／ｋｇであり、鼻腔内送達の場合は１〜１０μｇ／ｋｇである。
【０１４１】
投与する工程は、好ましくは、脳卒中の開始からその約１２時間後までの間の任意の時点で実施される。このため、投与する工程は、脳卒中の発症後１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間以内に実施される。好ましくは、投与する工程は、脳卒中の発症後８時間以内に実施される。また別の好ましい実施形態では、投与する工程は、脳卒中の発症後４時間以内に実施される。
【０１４２】
第１８態様では、本発明は、脳卒中を治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの、第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドの使用を提供する。
【０１４３】
この医薬は、非経口投与用に製剤化することができる。好ましくは、この医薬は、ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｎ．経路を介する投与用に製剤化される。
【０１４４】
好ましい実施形態では、この医薬は、１ｎｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇのペプチド、断片、誘導体、またはアナログを提供するために製剤化される。特に好ましい実施形態では、この医薬は、ｉ．ｃ．ｖ．送達の場合は１〜２ｎｇ／ｋｇを、鼻腔内送達の場合は１〜２μｇ／ｋｇを提供するように製剤化される。
【０１４５】
第１９態様では、本発明は、対象における脳卒中後の神経損傷を予防または治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドの使用を提供する。
【０１４６】
この医薬は、非経口投与用に製剤化することができる。好ましくは、この医薬は、ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｎ．経路を介する投与用に製剤化される。
【０１４７】
好ましい実施形態では、この医薬は、１ｎｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇのペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを提供するために製剤化される。特に好ましい実施形態では、この医薬は、ｉ．ｃ．ｖ．送達の場合は１〜２ｎｇ／ｋｇを、鼻腔内送達の場合は１〜２μｇ／ｋｇを提供するように製剤化される。
【０１４８】
第２０態様では、本発明は、対象における脳卒中後の梗塞サイズを減少させるための医薬の製造における、少なくとも１つの第１もしくは第６態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第３もしくは第４態様によって提供された神経保護ペプチドの使用を提供する。
【０１４９】
この医薬は、非経口投与用に製剤化することができる。好ましくは、この医薬は、ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｎ．経路を介する投与用に製剤化される。
【０１５０】
好ましい実施形態では、この医薬は、１ｎｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇのペプチド、断片、誘導体もしくはアナログを提供するために製剤化される。特に好ましい実施形態では、この医薬は、ｉ．ｃ．ｖ．送達の場合は１〜２ｎｇ／ｋｇを、鼻腔内送達の場合は１〜２μｇ／ｋｇを提供するように製剤化される。
【０１５１】
第２１態様では、本発明は、脳卒中を治療するための、クモ毒に由来する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチ神経保護ペプチドの使用を提供する。特定の実施形態では、このペプチドは、ハドロニッケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属、アトラクス（Ａｔｒａｘ）属およびイラワラ（Ｉｌｌａｗａｒｒａ）属、または関連するジグモ内の任意のオーストラリアジョウゴグモの毒に由来することができる。
【０１５２】
第２２態様では、ＡＳＩＣ１ａの活性化を阻害することができるペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を同定または設計するための方法であって、
（ｉ）ＡＳＩＣ１ａと少なくとも１つのジスルフィドリッチペプチドとの間の相互作用のコンピューターモデリングを行う工程であって、前記ジスルフィドリッチペプチドが第１〜第６態様のいずれか１つに規定されている、工程；
（ｉｉ）コンピューターモデリングによって生成されたデータを使用して、ＡＳＩＣ１ａに結合してＡＳＩＣ１ａの活性化を阻害することができるペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を同定または設計する工程；および任意で、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を生成する工程；および任意で、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のペプチド、ペプチドミメティック、または小分子を、ＡＳＩＣ１ａへの結合およびＡＳＩＣ１ａの活性化の阻害について試験する工程
を含む方法が提供される。
【０１５３】
好ましくは、ペプチド、ペプチドミメティック、または小分子は、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる。いっそうより好ましくは、ペプチド、ペプチドミメティック、または小分子は、約１０ｎＭ未満であるＡＳＩＣ１ａ阻害のＩＣ５０を有する。特に好ましい実施形態では、ペプチド、ペプチドミメティック、または小分子は、約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＳＩＣ１ａを阻害する。
【０１５４】
さらに好ましい実施形態では、ペプチド、ペプチドミメティック、または小分子は、第５態様の範囲内に含まれるペプチドである。
【０１５５】
本発明の他の特に好ましい態様は下記に規定されており、第１〜第２２態様に関連して記載した、または本明細書の他の場所で記載した１つ以上の特徴を有することができる。
【０１５６】
第２３態様では、本発明は、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。このペプチドは、式（Ｉ）：
Ｘ−Ｌ−Ｙ    （Ｉ）
（式中、ＸおよびＹはそれぞれ、インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）フォールドを表し、Ｌはリンカーである）の配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になり、かつ前記ペプチドは、好ましくは酸感受性イオンチャンネルサブタイプ１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）に特異的に結合することができる。
【０１５７】
第２４態様では、本発明は、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、第２３態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチドの機能的に活性な断片、誘導体、またはアナログを提供する。
【０１５８】
第２５態様では、本発明は、２つのＩＣＫモチーフが６残基のリンカーによって頭尾結合されているペプチドであって、好ましくは前記ペプチドはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを提供する。
【０１５９】
第２６態様では、本発明は、対で共有結合して６つのジスルフィド結合を形成する１２個のシステイン残基を含むペプチドであって、２個のＩＣＫモチーフを含み、好ましくはＡＳＩＣ１ａに特異的に結合することができる、ペプチドを提供する。
【０１６０】
第２７態様では、本発明は、治療活性もしくは予防活性を有する単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドであって、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定されるヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有するヌクレオチド配列によってコードされる配列；
（ｅ）少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。
【０１６１】
第２８態様では、本発明は、ＡＳＩＣ１ａに特異的に結合してＡＳＩＣ１ａ生物学的経路を阻害することができる、クモ毒由来の単離、合成、または組換えジスルフィドリッチペプチドを提供する。
【０１６２】
第２９態様では、本発明は、第２３もしくは第２８態様によって提供されたジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離、合成、または組換え核酸分子を提供する。一部の実施形態では、この核酸分子は、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つに規定される配列と少なくとも６５％（ならびに少なくとも６６％〜少なくとも９９％およびその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性もしくは配列同一性を共有する配列；
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１１のいずれか１つに規定される配列と少なくとも中もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、該配列からなる、または該配列から本質的になる。
【０１６３】
第３０態様では、本発明は、第２９態様によって提供された（例えば、商業的量で組換えペプチドを作製するための）核酸分子を発現させるための遺伝子構築物を提供する。遺伝子構築物は、概して、発現ベクター内の１つ以上の制御配列に機能的に連結されている、第２９態様によって提供された単離核酸分子を含む。
【０１６４】
第３１態様では、本発明は、第２９態様によって提供された核酸分子または第３０態様によって提供された遺伝子構築物を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１６５】
第３２態様では、本発明は、第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドを生成する方法であって、第３１態様によって提供された形質転換された宿主細胞を培養する工程、および培養された前記宿主細胞から得られたペプチド、断片、誘導体を単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１６６】
第３３態様では、本発明は、治療有効量の少なくとも１つの第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドを含む、医薬組成物を提供する。
【０１６７】
第３４態様では、本発明は、対象におけるＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態を予防または治療するための方法であって、治療有効量の少なくとも１つの第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチド、または第３３態様によって提供された医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１６８】
第３５態様では、本発明は、対象におけるＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態を予防または治療するための、治療有効量の少なくとも１つの第２３もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチド、または第３３態様によって提供された医薬組成物を提供する。
【０１６９】
第３６態様では、本発明は、対象におけるＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態を予防または治療するための医薬の製造における、少なくとも１つの第２１もしくは第２８態様によって提供された単離、合成、もしくは組換えジスルフィドリッチペプチド、第２４態様によって提供された断片、誘導体もしくはアナログ、または第２５もしくは第２６態様によって提供されたペプチドの使用を提供する。
【０１７０】
対象における、ＡＳＩＣ１ａの活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する状態は、本明細書の他の部分から、ならびにそれらの全内容が相互参照により本明細書に組み込まれている、本明細書で言及した参考文献から収集することができる。
【０１７１】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示する目的で提供されていることは理解されるであろう。このため、本発明は、これらの実施例に記載した特徴だけに限定されると見なすべきではないことは理解されるであろう。
【実施例】
【０１７２】
実施例１−トランスクリプトーム分析
オーストラリアジョウゴグモであるハドロニッケ・インフェンサ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ）の３例の検査サンプルは、それらの毒供給を枯渇させるためにミルキングし、それから３日後に検査サンプルに麻酔を施した。対の毒腺を各検査サンプルから切開して切除し、直後にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に配置した。全ＲＮＡを標準方法によって抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡからのｍＲＮＡ濃縮を実施した。ＲＮＡの品質および濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００  ｐｉｃｏ  ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。
【０１７３】
１００ｎｇのｍＲＮＡを用いて、標準ｃＤＮＡ高速ライブラリー調製法およびエマルジョンＰＣＲ法（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。シーケンシングは、オーストラリア・ゲノム研究施設のブリスベン・ノードでＲｏｃｈｅ  ＧＳ−ＦＬＸシークエンサーを使用して実施した。生の（未処理の）Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｉｌｅ（．ＳＦＦ）を処理し、Ｐｈｒｅｄスコアカットオフ２５を用いて質の低い配列を除いた（Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。新規アッセンブリーは、ＭＩＲＡソフトウエア（Ｃｈｅｖｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を使用して、下記のパラメーター：−ＧＥ：ｎｏｔ＝４−−ｐｒｏｊｅｃｔ＝Ｈｉｎｆｅｎｓａ−−ｊｏｂ＝ｄｅｎｏｖｏ，ｅｓｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ，４５４  ４５４＿ＳＥＴＴＩＮＧＳ−ＣＬ：ｑｃ＝ｎｏ−ＡＳ：ｍｒｐｃ＝１−ＡＬ：ｍｒｓ＝９９，ｅｇｐ＝１を用いて実施した。集合データセットは、ＴＡＢＬＥＴ（Ｍｉｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）またはＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウエア（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を使用して視覚化した。ＢＬＡＳＴおよび機能的注解（Ｃｏｎｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を入手するために、コンセンサス配列をＢｌａｓｔ２ＧＯソフトウエアスイート（ｗｗｗ．ｂｌａｓｔ２ｇｏ．ｃｏｍ）に提出した。シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を使用して決定した。推定プロペプチド切断部位は、ＡｒａｃｈｎｏＳｅｒｖｅｒデータベース（ｗｗｗ．ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒ．ｏｒｇ）（Ｈｅｒｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）上で報告されたすべての公知のクモ毒前駆体の配列ロゴ分析の結果を用いて予測した。すべての処理シグナルを決定した後に、毒素は、それらのシグナル配列およびシステインフレームワークに基づいてスーパーファミリーに分類した。１つのスーパーファミリーは、Ｈｉ１ａと称されるペプチドおよび高レベルのＨｉ１ａとの配列同一性を備える多数のオルソログを含んでいた。Ｈｉ１ａファミリーの５つのメンバーの配列アラインメントは、図１に示した。
【０１７４】
実施例２−組換えタンパク質の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させるために最適化されたコドンを用いて、Ｈｉ１ａをコードする合成遺伝子またはそれらの誘導体を生成し、（Ｋｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３に記載されたように）ＧｅｎｅＡｒｔによってｐＬｉＣｃベクター内にサブクローニングした。ｐＬｉＣｃプラスミドは、アンピシリンを使用した形質転換体の選択のためにイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）およびβ−ラクタマーゼ遺伝子によって誘導性であるＬａｃＩプロモーターを含有する。Ｈｉ１ａは、ＭａｌＥ−Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−Ｈｉ１ａ融合タンパク質としてコードされた。ＭａｌＥは、ジスルフィド結合形成を触媒するＤｓｂ酵素が所在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペリプラズムへ発現した融合タンパク質を標的化するシグナル配列である。Ｈｉｓ６タグはＩＭＡＣクロマトグラフィーによる融合タンパク質の容易な生成を可能にするが、他方ＭＢＰタグはタンパク質溶解性に役立つ。タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位は、ＴＥＶプロテアーゼを使用してＨｉ１ａを融合タンパク質から遊離させることができるように、ＭＢＰコーディング領域とＨｉ１ａコーディング領域との間に導入した。融合タンパク質からのＨｉ１ａの切断は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位の痕跡であるＨｉ１ａのＮ末端での追加のセリン残基を生じさせる。
【０１７５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞は、コドン最適化Ｈｉ１ａ遺伝子を含有するｐＬｉＣｃベクターを用いて形質転換させた。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株の培養を３０℃でルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ））培地中で増殖させ、次にＯＤ６００＝０．８〜１．３で０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いてＨｉ１ａの発現を誘導した。次に細胞を１６℃で一晩増殖させ、遠心分離によって採取し、その後に細胞障害物質（ＴＳ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ，，Ｄａｖｅｎｔｒｙ，ＵＫ）を使用して定圧（２７ｋｐｓｉ）下で溶解させた。溶解物はＢｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２６遠心分離機を使用して４℃で遠心し、次に上清にＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）の上方を通過させてＨｉｓ６−ＭＢＰ−Ｈｉ１ａ融合タンパク質を採取した。その後に非特異的結合剤を除去するために樹脂を１０ｍＭのイミダゾールで洗浄し、次に４００ｍＭのイミダゾールを用いてＨｉｓ６−ＭＢＰ−Ｈｉ１ａタンパク質を溶出させた。イミダゾールを除去するために、３０ｋＤａのカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、約５ｍＬのＴＮ緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中に融合タンパク質を濃縮させた。この溶液に、５ｍＬのレドックス緩衝剤（０．６ｍＭの還元グルタチオンおよび０．４ｍＭの酸化グルタチオン）を添加した。最後に、１００μｇのＴＥＶプロテアーゼを添加し、この混合物を室温で一晩インキュベートしてＨｉｓ６−ＭＢＰ融合タンパク質からＨｉ１ａを遊離させた。組換えＨｉ１ａの最終収率は、典型的には、細菌培養１Ｌ当たり約１００〜２００μｇである。組換えＨｉ１ａは、ＴＥＶ切断を容易にするために添加されたＮ末端で非天然セリン残基を含有している。
【０１７６】
Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−Ｈｉ１ａ切断反応の生成物を含有する溶液に、１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加した。次にＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用して、Ｈｉ１ａを塩類、ＴＥＶプロテアーゼ、Ｈｉｓ６−ＭＢＰおよび未切断Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−Ｈｉ１ａから単離した。分離は、５ｍＬ／分の流量および１０〜５０％の溶媒Ｂ（９０％のアセトニトリル、１０％のＨ２Ｏ、０．０４３％のＴＦＡ）の溶出勾配を３０分間にわたって使用するセミ分取Ｃ４逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ４、２５０×１０ｍｍ、粒径１０μｍ）上で実施した。
【０１７７】
精製ペプチドの分子量は、ＡＰＩ−２０００  ＥＳＩ−ＱｄＱトリプル四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して決定した。
【０１７８】
純粋組換えＨｉ１ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、図２Ａに示した。Ｈｉ１ａは、同一質量を有する３つのピークとして溶出する。これらの単一ピークのいずれかの再注入は３つのピークの再出現を生じさせ、これはこのペプチドが立体配座異性を受けることを示している。純粋組換えＨｉ１ａのＥＳＩ−ＭＳ波形は、図２Ｂに示した。８，７２３Ｄａの平均質量は、このペプチドが６つのジスルフィド結合を含有することを示している。
【０１７９】
実施例３−ペプチド活性
ホモマーＡＳＩＣチャンネルを発現するアメリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞上で実施した２電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）電気生理学実験を用いて、本発明のペプチドがＡＳＩＣ電流を調節する能力を評価した。アメリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞は、イオンチャンネル調節因子の機能的特性解析のための発現系として広く使用されている。ＴＥＶＣは、膜電位を制御しながらホールセルイオンチャンネル電流の測定を可能にする。
【０１８０】
卵母細胞は、麻酔を施した雌性アメリカツメガエル（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）から採取し、次にコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ型）を用いた処理により脱小胞化した。卵母細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＡＳＩＣ  ｃＲＮＡ（キャップドＲＮＡ）を用いて注入した。１７〜１８℃で９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのピルビン酸、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ｐＨ７．４）およびウマ胎児血清（２．５％）を含有するＮＤ９６溶液中で卵母細胞を維持し、実験はｃＲＮＡ注入の１〜３日後に室温（２１〜２２℃）で実施した。３ＭのＫＣｌを充填した場合は０．５〜２ＭΩ抵抗の２本の標準ガラスマイクロ電極を使用して、卵母細胞を−６０ｍＶでクランプした（Ｗａｒｎｅｒ  ＯＣ−７２５Ｃ卵母細胞クランプ；Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＴ，ＵＳＡ）。データ収集および分析は、ｐＣＬＡＭＰソフトウエア、バージョン１０（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。電流は、迅速な溶液交換を許容するために微小灌流システムを使用して、７．４５から６．０へのｐＨ低下によって誘導した。全実験は、プラスチックチュービングへのペプチドの吸着を最小限に抑えるために、０．１％のＢＳＡを用いてスパイクしたＮＤ９６溶液を使用して実施した。
【０１８１】
Ｈｉ１ａによるｒＡＳＩＣ１ａおよびｈＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度作用曲線は、図３Ａに示した（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝８；Ｉ／Ｉｍａｘ：試験電流／制御電流）。Ｈｉｌｌ方程式の濃度作用データへのフィッティングは、Ｈｉ１ａがラットＡＳＩＣ１ａを０．４６±０．１６ｎＭの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）およびヒトＡＳＩＣ１ａを０．５９±０．１４ｎＭのＩＣ５０で阻害することを明らかにした。これらの曲線はさらに、約３０％のｒＡＳＩＣ１ａおよび約２０％のｈＡＳＩＣ１ａ電流がＨｉ１ａペプチドの飽和濃度で残留していることから、Ｈｉ１ａによるＡＳＩＣ１ａの阻害が不完全であることも示している。
【０１８２】
様々なＡＳＩＣサブタイプへｐＨ７．４５での３０ｎＭのＨｉ１ａが及ぼす作用は、図３Ｂに示した（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝５）。この用量では、Ｈｉ１ａはｒＡＳＩＣ１ｂ、ｒＡＳＩＣ２ａおよびｒＡＳＩＣ３へのごくわずかな作用を有していたが、これはＨｉ１ａがこれらの他のサブタイプに比してＡＳＩＣ１ａに対する少なくとも５０倍の選択性を有することを示している。様々なＡＳＩＣサブタイプへｐＨ７．４５での１ｎＭおよび１μＭ  のＨｉ１ａが及ぼす作用は、図３Ｃに示した（平均値±ＳＥＭ；実験回数＝５）。１μＭでは、Ｈｉ１ａはホモマーｒＡＳＩＣ２ａもしくはｒＡＳＩＣ３に作用を全く有しておらず、ｒＡＳＩＣ１ｂを控えめに強化したが、これはこれらの他のサブタイプに比してＡＳＩＣ１ａの２，０００倍を超える力価を示している。
【０１８３】
図３Ｄは、Ｈｉ１ａがｒＡＳＩＣ１ａのＦ３５０Ａ変異体に活性を全く有していなかったことを示している。ニワトリＡＳＩＣ１の結晶構造（Ｊａｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）は、残基Ｆ３５０がこのチャンネルのプロトンゲーティングのために重要である酸性ポケット内のα−ヘリックス上に所在することを明らかにしている。このＰｈｅ残基からＡｌａへの変異は、また別のクモ毒ペプチドであるＰｃＴｘ１がＡＳＩＣ１ａを阻害する能力を無効にする（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。したがって、ＡＳＩＣ１ａ上のＰｃＴｘ１およびＨｉ１ａに対する結合部位は、少なくとも部分的に重複する。
【０１８４】
ＰｃＴｘ１によるＡＳＩＣ１ａの阻害は、このペプチドがウォッシュアウトされると、迅速に可逆性（約１５分間以内に完全可逆性）である。これとは対照的に、同一濃度（１０ｎＭ）でのＨｉ１ａの阻害作用は、極めて緩徐に可逆性であり、図４に示したように、ウォッシュアウトの３０分後に電流振幅の約４０％しか回復しなかった。
【０１８５】
実施例４−Ｈｉ１ａがＡＳＩＣ１ａに及ぼす作用機序
Ｈｉ１ａがＡＳＩＣ１ａに及ぼす作用機序は、ＴＥＶＣ電気生理学を用いて試験した。ＰｃＴｘ１は、ＡＳＩＣ１ａのプロトン化の作用を模倣し、７．４の生理学的ｐＨで慢性的脱感作をもたらす（定常状態脱感作（ＳＳＤ）曲線における極大電流における低下を伴わないよりアルカリ性の数値への平行シフトによって示された）。Ｈｉ１ａの２種の濃度がラットおよびヒトＡＳＩＣ１ａのＳＳＤ曲線に及ぼす作用を評価し、Ｈｉ１ａがＳＳＤ曲線におけるよりアルカリ性の数値への濃度依存性平行シフトを誘発しないことが決定された。その代りに、Ｈｉ１ａは、極大電流におけるｐＨ非依存性低下を誘発し（図５および７）、これはＨｉ１ａがＰｃＴｘ１とは異なる作用様式でＡＳＩＣ１ａを阻害することを示している。ＰｃＴｘ１とは異なり、Ｈｉ１ａは、むしろ脱感作状態を安定化することで活性化を阻害すると思われる。
【０１８６】
Ｈｉ１ａがＡＳＩＣ１ａのｐＨ依存性に影響を及ぼす能力についても評価した（図６および７）。Ｈｉ１ａ（ｐＨ７．４５で適用された）の存在下では、活性化のｐＨ５０は、ｒＡＳＩＣ１ａおよびｈＡＳＩＣ１ａの両方について、濃度依存法でわずかに低い数値へシフトする。これは、Ｈｉ１ａが活性化閾値を上昇させることによってＡＳＩＣ１ａを阻害し、このため活性化を防止することを示唆している。活性化へのこの作用は、ＰｃＴｘ１を用いて観察された作用とは反対の作用である。ｐＨ７．９で適用された場合、ＰｃＴｘ１はＡＳＩＣ１ａについての活性化曲線をよりアルカリ性の数値へシフトさせる、つまり、このチャンネルをプロトンに対してより感受性にさせる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。本実施例の結果は、Ｈｉ１ａがＡＳＩＣ１ａを圧倒的な方法でプロトンに対して低感受性（すなわち、拮抗作用が競合的ではない）にさせることを示している。
【０１８７】
実施例５−構造−活性関係
Ｈｉ１ａの構造は、異核ＮＭＲ分光法を用いて決定した。ＮＭＲデータは、極低温に冷却した三重共鳴プローブを装備したＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ＋９００ＭＨｚ分光計上の２９８Ｋで、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、０．０２％のＮａＮ３および５％のＤ２Ｏ中に溶解させた３００μＭの１３Ｃ／１５Ｎ標識Ｈｉ１ａのサンプルを使用して収集した。配列特異的共鳴帰属は、２Ｄの１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣ、２Ｄの１Ｈ−１３Ｃ−ＨＳＱＣ、３ＤのＨＮＣＡＣＢ、３ＤのＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、３ＤのＨＮＣＯおよび３ＤのＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトルの組み合わせを用いて入手した。側鎖共鳴帰属は、直接側鎖１３Ｃ−１Ｈ連結性を提供する利点を有する４ＤのＨＣＣ（ＣＯ）ＮＨ−ＴＯＣＳＹスペクトルを用いて実施した。全３Ｄおよび４Ｄスペクトルは、不均一サンプリング（ＮＵＳ）を用いて収集し、最大エントロピー再建法を用いて処理した。Ｈｉ１ａについての化学シフト配置は、アクセッションコード番号２５８４８を付してＢｉｏＭａｇＲｅｓＢａｎｋ（ＢＭＲＢ）に預託されている。
【０１８８】
構造計算のためのプロトン間距離制限は、２００ｍｓの混合時間を用いる均一サンプリングを用いて収集した１３Ｃ−脂肪族、１３Ｃ−芳香族および１５Ｎ−編集ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルに由来した。共鳴帰属ならびにＮＯＥＳＹスペクトルのピーク選別および積分は、手動でＳＰＡＲＫＹを用いて達成し（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅ／ｓｐａｒｋｙ／）、次にピークリストを配置し、構造の集合はねじれ角力学パッケージＣＹＡＮＡ  ３．０を用いて自動的に計算した。ＣＹＡＮＡにおける自動帰属のために使用された化学シフト公差は、直接および間接１Ｈ寸法に対してそれぞれ０．０２５ｐｐｍおよび０．０３０ｐｐｍであり、異核（１３Ｃ／１５Ｎ）に対しては０．３０ｐｐｍであった。ＴＡＬＯＳ化学シフト分析に由来するバックボーン上反角制限もまた、推定標準偏差を２倍にするために設定された制限範囲とともに構造計算に組み込まれた。ジスルフィド結合連結性は、第１ラウンドの構造計算において明白に決定され、対応するジスルフィド結合制限は、以前に記載したその後の計算において適用した。ＣＹＡＮＡを用いて無作為の出発立体配置から２００の構造を計算し、次にＨｉ１ａの溶液構造を表すためにＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙによって判定された最高立体化学的品質を備える２０の配座異性体を選択した。
【０１８９】
ＮＭＲを用いて決定したＨｉ１ａの構造は、Ｈｉ１ａが構造的に明確に規定された短いリンカーを介して結合された２つの相同インヒビターシスチンノット（ＩＣＫ）ドメインから構成されることを明らかにした（図８）。したがって、Ｈｉ１ａは、近年報告された「ダブルノット」毒素ファミリーのメンバーである。Ｈｉ１ａ構造の集合に対する原子座標は、タンパク質データバンク（アクセッション番号２Ｎ８Ｆ）内に預託されている。
【０１９０】
Ｈｉ１ａのＩＣＫドメインのいずれかが単離された場合に活性かどうかを決定するために、Ｎ末端側（Ｈｉ１ａ−Ｎ）およびＣ末端側（Ｈｉ１ａ−Ｃ）ＩＣＫドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現によって個別に生成した。機能的特性解析は、Ｈｉ１ａ＿ＮがＡＳＩＣ１ａを約１μＭ（すなわち、ＰｃＴｘ１もしくは全長Ｈｉ１ａいずれかの約１，０００分の１の力価）のＩＣ５０で完全に阻害できることを明らかにした。全長Ｈｉ１ａとは異なり、この作用は、完全に可逆性であった（下記で説明する）。Ｈｉ１ａ＿Ｃについては３０μＭの濃度まで阻害作用は観察されなかった（図９）；しかし、Ｈｉ１ａ＿Ｃは１μＭで電流の微細な強化を誘導した。様々なＣ末端配列を有するＨｉ１ａ＿Ｎの３種の構築物（配列番号２２〜２４）を調製した。３種のＨｉ１ａ＿Ｎ構築物によるｒＡＳＩＣ１ａの阻害についての濃度作用曲線（図９）は、Ｃ末端配列を修飾してもＨｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメインの活性が改善されないことを証明している。
【０１９１】
図１０は、Ｈｉ１ａ−ＮおよびＨｉ１ａ＿Ｃが同時適用された場合、またはＨｉ１ａ＿ＮおよびＨｉ１ａ＿Ｃが６０秒間をあけて連続的に適用された場合にｒＡＳＩＣ１ａを発現する卵母細胞からのホールセル記録を示している。これらの実験は、ペプチドのウォッシュアウトの６０秒間後のｒＡＳＩＣ１ａ電流の完全回復であると見なせるＨｉ１ａ＿ＮによるｒＡＳＩＣ１ａ阻害が、完全に可逆性であることを明らかにした。選択された濃度（１０μＭ）では、Ｈｉ１ａ＿Ｃによるほんのわずかな阻害が生じた。両方のペプチドの同時適用、または一方を他方より６０秒間後に行う適用は、Ｎ末端側ドメイン単独によって誘発された阻害に比してｒＡＳＩＣ１ａの有意な阻害を誘発しなかった。したがって、Ｈｉ１ａの固有の阻害活性のためには、２つのＩＣＫドメインの共有結合が必要である。
【０１９２】
実施例６−変異誘発試験
Ｈｉ１ａ点変異体
変異誘発試験は、Ｈｉ１ａ内の重要な機能的残基を同定するため、およびＩＣＫドメイン間の（リンカーによって指定される）空間的関係がＨｉ１ａ力価にとって決定的に重要であるかどうかを決定するために実施した。
【０１９３】
Ｈｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメインは、Ｃ末端側ドメインよりＰｃＴｘ１に対してより相同性であるが、Ｈｉ１ａは、ＰｃＴｘ１の変異誘発およびＰｃＴｘ１：ニワトリＡＳＩＣ１錯体の結晶構造を介して同定されたいくつかの重要なファーマコフォア残基（Ｋ８、Ｗ２４およびＲ２８）を含有していない。これらの重要なファーマコフォア残基内の変化がＨｉ１ａの力価に及ぼす作用を試験する目的で、それがＰｃＴｘ１により緊密に似るようにさせるために点変異Ｌ８Ｋ、Ｙ２４ＷおよびＨ２８ＲをＨｉ１ａ内に導入した。ｒＡＳＩＣ１ａへのこれらの変異体の活性は、図１１に示した。
【０１９４】
予想外にも、ＰｃＴｘ１ファーマコフォア残基をＨｉ１ａ内へ挿入しても、Ｈｉ１ａの活性にはわずかな作用しか生じなかった。変異Ｈ２８Ｒは、野生型Ｈｉ１ａに比較してわずかな力価の増加（すなわち、わずかに低いＩＣ５０値）をもたらしたが、Ｌ８Ｋは作用をほとんど有していなかった。最も顕著には、Ｙ２４Ｗ変異の導入は、飽和濃度で適用された場合にｒＡＳＩＣ１ａ電流の完全阻害を誘発した。これらの３つの変異（Ｌ８Ｋ、Ｈ２８Ｒ、Ｙ２４Ｗ）の作用は、ＰｃＴｘ１の以前の試験から予測することができなかった。３種の変異Ｈｉ１ａペプチドは、全部が野生型Ｈｉ１ａに類似してｒＡＳＩＣ１ａに極めて緩徐な可逆性で結合すると思われる。
【０１９５】
改変ペプチド
Ｈｉ１ａは、ＰｃＴｘ１との相同性を備えるＩＣＫペプチドの２つの連結された非同一コピーに似ている。Ｈｉ１ａの固有の作用機序および極めて緩徐な可逆性を理解するために、異なるリンカーを備える２つのＩＣＫモチーフを含有する数種のペプチドを設計し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生成した（配列番号２５〜２８）。ＥＰ１（配列番号２５）は、Ｈｉ１ａ内のリンカーの長さを用いて可能な限り天然ＰｃＴｘ１に近付くようにリンカーによって結合されたＰｃＴｘ１の２つのコピーからなる。ＥＰ２（配列番号２６）はＥＰ１と同一であるが、負電荷を除去して柔軟性を増加させるためにリンカー内でＧｌｕからＧｌｙへの変異を備える（この位置はＨｉ１ａリンカー内ではＧｌｙである）。ＥＰ３（配列番号２７）はＨｉ１ａと同一であるが、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ配列が５つのグリシン残基によって置換されている改変リンカーを備えており、他方ＰｃＴｘ１／Ｈｉ１ａ＿Ｃ（配列番号２８）ではＨｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメインがＰｃＴｘ１と置換され、このキメラペプチドはより長いリンカーを有する。
【０１９６】
ＥＰ１およびＥＰ２の機能的特性解析は、これらのペプチドが、ｒＡＳＩＣ１ａを６４ｎＭおよび２１５ｎＭのＩＣ５０値でそれぞれ阻害する（図１２）ことを明らかにしたが、これは野生型Ｈｉ１ａ（図２）と比較して、ＩＣ５０における約２００倍および５００倍の増加（すなわち、力価の低下）に一致する。ＥＰ１およびＥＰ２は、ＰｃＴｘ１と同様に、どちらもＡＳＩＣ１ａ電流の完全阻害を誘発する。しかし、６個のグリシン残基から構成されるリンカーによって結合されたＨｉ１ａの２つのＩＣＫドメインからなるＥＰ３は、１μＭまでで適用された場合に約２０％超までｒＡＳＩＣ１ａ電流を阻害しなかった。これは、このリンカー領域がＨｉ１ａの活性のために不可欠であることを証明している。ＰｃＴｘ１／Ｈｉ１ａ＿Ｃの活性はＨｉ１ａに類似する；ＰｃＴｘ１／Ｈｉ１ａ＿Ｃは、Ｈｉ１ａに比較して力価が３分の１と低いにもかかわらず、不完全な阻害を誘導する。興味深いことに、全３種の阻害性ペプチド（ＥＰ１、ＥＰ２およびＰｃＴｘ１／Ｈｉ１ａ＿Ｃ）は、野生型Ｈｉ１ａに類似して緩徐な可逆性方法でＡＳＩＣ１ａに結合すると思われる。
【０１９７】
Ｈｉ１ｄの活性
Ｈｉ１ｄは、ハドロニッケ・インフェンサ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ）の毒腺トランスクリプトーム内で見いだされるＨｉ１ａペプチドファミリーのまた別のメンバーである。Ｈｉ１ｄは、Ｈｉ１ａと同一のシステイン骨格を有し、これら２つのペプチドの配列は６３％同一である。Ｈｉ１ｄのＮ末端側ＩＣＫドメインは、Ｈｉ１ａのＮ末端側ＩＣＫドメインよりもＰｃＴｘ１に類似しており、Ｈｉ１ｄは、２つのＩＣＫドメイン（８残基、ＶＰＩＴＱＫＩＦ）間に、Ｈｉ１ａ（６残基、ＶＰＩＰＧＦ）とは実質的に異なるリンカーを有する。さらに、Ｃ末端側ＩＣＫドメイン内にはいくつかの実質的相違が存在する（図１３）。これらの相違の機能的有意性を決定するために、ＴＥＶＣを用いてＨｉ１ｄの活性を調査した。Ｈｉ１ｄは、１９３ｎＭのＩＣ５０でｒＡＳＩＣ１ａ電流の完全な濃度依存性阻害を誘発した（図１３）。さらに、Ｈｉ１ｄによるＡＳＩＣ１ａの阻害は、ウォッシュアウトから６０秒間以内は完全に可逆性であった。
【０１９８】
試験したペプチドの活性の概要は、表１にて提供した。
【０１９９】
（表１）ＡＳＩＣ１ａの阻害について試験したペプチドの概要
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【０２００】
これらをまとめると、これらの結果は、ＡＳＩＣ１ａでのＨｉ１ａの固有の阻害活性を再現するためには、２つの同一ＩＣＫドメインを単純に一緒に結合することでは十分ではないことを証明している。これらの結果はさらに、リンカーの柔軟性または化学的性質のいずれか（または両方）がＡＳＩＣ１ａチャンネルに結合して阻害するペプチドの能力に影響を及ぼすことも示唆している。
【０２０１】
このため本発明者らは、酸感知イオンチャンネルサブタイプ１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）に特異的に結合することができる神経保護ペプチドが以下の一般構造：
Ｘ−Ｌ−Ｙ    （Ｉ）
（式中、ＸおよびＹは、それぞれＩＣＫフォールドを有するペプチド配列を表し、Ｌはリンカーである）を有すると予測する。
【０２０２】
リンカーは、結合、非アミノ酸ベースの化学的部分、単一アミノ酸またはペプチド配列であってよい。リンカーが単一アミノ酸である場合は、リンカーは、天然型アミノ酸もしくは合成の非天然型アミノ酸、例えば対応する天然型アミノ酸の化学的アナログであってよい。または、リンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸からなるペプチド配列であってよい。この配列のアミノ酸は、同一の天然型もしくは非天然型アミノ酸であってよい、またはこの配列の各アミノ酸は、天然型アミノ酸または合成の非天然型アミノ酸から独立して選択することができる。好ましくは、リンカーは、６個の天然型アミノ酸のペプチド配列である。
【０２０３】
ＸおよびＹは、異なる配列であってもよいし同一配列であってもよい。好ましくは、ＸおよびＹは、異なる配列であるが、どちらもフォールディングしてＩＣＫモチーフを形成する。このためＸおよびＹはそれぞれ、好ましくは約３０〜約５０個のアミノ酸、いっそうより好ましくは、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸の配列である。
【０２０４】
実施例７−神経保護アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｉ．ｃ．ｖ．投与
Ｈｉ１ａの神経保護有効性を限局性脳虚血のラットモデルにおいて評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、以前に報告されたように（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ９９，６５０−６５７，２０１５）、意識のある特発性高血圧ラット（ＳＨＲ）における脳卒中の限局性再潅流モデルを用いて実施した。脳卒中誘発の５日前に、麻酔（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ；キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）を施した動物の体内に２本の２３ゲージのステンレススチール製ガイドカニューレを定位埋植した。１本目のカニューレは脳卒中誘発のために右中大脳動脈の３ｍｍ背側に埋植した。２本目のカニューレは、薬物投与のために左側脳室内に埋植した。
【０２０５】
５日間の回復期間後、意識のあるラットに、事前に埋植したカニューレの下方で３ｍｍ突き出る３０ゲージ注射器を挿入することによって脳卒中を誘発した。以前に脳卒中重症度と相関した行動を動物が示すまで、エンドセリン−１（２０ｐｍｏｌ／μＬ）を３０秒間毎に０．２μＬの速度で投与した。本試験には、レベル４の脳卒中に達した動物だけを含めた。レベル４の脳卒中と関連する典型的な行動には、連続的な同側性の旋回、クレンチング、ドラッギング、左対側前肢の伸展不全、咀嚼、顎屈曲および前肢のひきずりが含まれる。
【０２０６】
動脈の外科的露出によって達成された中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のモデルと比較して、このモデルは、脳内での外科的インターベンションが最小限に抑えられるという利点を有し、脳卒中は薬物試験の結果を複雑化させる可能性がある麻酔薬の非存在下で誘発される（Ｃａｌｌａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。脳卒中誘発性運動障害は、ラットが徐々に狭くなるレッジド・ビームを横断する間に犯したフットフォールト数を計数することによって評価した（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ  ４０，１４８２−１４８９，２００９）。動物は、前脳卒中評価の連続２日間に梁を横断するように訓練した。神経学的スコアについては、ラットが平面を越えて尾を上昇させることおよび胸郭ねじれの重症度と前肢伸展角度を等級付けすることによって姿勢異常を評価した。神経学的健康の両方の指標は０〜３の間でスコアリングするが、０のスコアは胸郭ねじれなしまたは平面に向かう完全前肢伸展に対応する。３のスコアは、重度の胸郭ねじれおよび前肢伸展不全に対応する。胸郭ねじれおよび前肢伸展のスコアを合計すると、重度の神経障害を表す６の総合可能スコアが生じる。両方の行動試験は、脳卒中前ならびに脳卒中後２４および７２時間の時点で実施した。
【０２０７】
脳卒中から７２時間後に、ラットには再び麻酔を施し（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ；キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）、生理学的緩衝食塩液で経心的に潅流させた。脳を切除し、急速冷凍し、ブレグマに比較して８カ所の事前決定前脳レベル（−３．２０ｍｍ〜６．８ｍｍ）で切片作製した（１６μｍ）。切片を画像描出し、バリスティックライト法を用いて梗塞体積を測定し、浮腫について補正した（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ  ４０，１４８２−１４８９，２００９）。
【０２０８】
１つの実験シリーズでは、事前に埋植したガイドカニューレの３ｍｍ下方で突き出る３０ゲージ注射器を使用して、Ｈｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）、ＡＳＩＣ１ａ（１ｎｇ／ｋｇ）に対して不活性である二重変異ＰｃＴｘ１アナログ（Ｒ２７Ａ／Ｖ３２Ａ＝「ＰｃＴｘ１変異イソ２」；ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）であるＰｃＴｘ１（１ｎｇ／ｋｇ）または食塩液（ビヒクル）の単回脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与を用いてＳＨＲを脳卒中誘発の２時間後に処置した。Ｈｉ１ａおよびＰｃＴｘ１の用量は、Ｈｉ１ａがＰｃＴｘ１の分子量の２倍とほぼ同等モル濃度を生じるように選択した。薬物を食塩液中に溶解させ、３分間かけて体積３μＬで注入した。梗塞サイズを決定するために、脳卒中の３日後、脳を潅流し、切除し、次に急速冷凍して切片作製した。動物７匹を使用した実験からの平均値±ＳＥＭ（平均標準誤差）としてのデータポイントを含む結果は、図１４に示した。ＰｃＴｘ１およびＨｉ１ａはどちらもペナンブラ（皮質）領域および虚血性（線条体）コアの両方において梗塞体積の有意な減少を誘発したが、Ｈｉ１ａの方がＰｃＴｘ１より効果的であった。無害ＰｃＴｘ１変異体は、梗塞体積を減少させることに関しては完全に無効であった。
【０２０９】
別個の一連の実験では、Ｈｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）を、脳卒中誘発の２、４もしくは８時間後にＳＨＲにｉ．ｃ．ｖ．投与した。運動協調（レッジド・ビーム試験）および脳卒中関連性姿勢異常（神経学的試験）は、脳卒中の１日後および３日後に評価した。梗塞サイズを決定するために、脳卒中の３日後、脳を潅流し、切除し、次に急速冷凍して切片作製した。
【０２１０】
図１５ａは、脳卒中後（ｐｓ）２、４もしくは８時間の時点でのビヒクル（食塩液）またはＨｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）のｉ．ｃ．ｖ．投与後の梗塞体積を示している。Ｈｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）の単回投与は、梗塞サイズを６３〜８３％も劇的に減少させるために十分であった。図１５ｂにおける冠状断面は、脳卒中から８時間後にビヒクルまたはＨｉ１ａ（２ｎｇ／ｋｇ）のいずれかでｉ．ｃ．ｖ．処置されたＳＨＲからの典型的な梗塞および非梗塞領域を示している。明白に、Ｈｉ１ａは、虚血性（線条体）コアならびにペナンブラ領域（皮質もしくは梗塞周囲帯）において全時点で梗塞体積の減少を誘発した。
【０２１１】
Ｈｉ１ａ投与によって誘発された梗塞サイズの減少は症状に反映され、Ｈｉ１ａ処置動物は顕著に減少した神経障害（図１６ａ）および運動不全（図１６ｂ）を示し、さらにまたこれは、図１７ａおよび１７ｂに示したように無傷ニューロン染色によって証明されたように、損傷のペナンブラおよびコア領域の両方における神経構造の保存と相関している。
【０２１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ−鼻腔内投与
脳卒中誘発の４時間後に、Ｈｉ１ａ（２μｇ／ｋｇ）もしくはビヒクル（食塩液）の単回鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与によりＳＨＲを処置した。Ｈｉ１ａもしくはビヒクルは、鼻腔内に６ｍｍ挿入した軟質カテーテルを介して左鼻腔に３μＬでｉ．ｎ．送達した。運動協調（レッジド・ビーム試験）および脳卒中関連性姿勢異常（神経学的試験）は、脳卒中から２４および７２時間後に評価した。梗塞サイズを決定するために、脳卒中から７２時間後、脳を潅流し、切除し、次に急速冷凍して切片作製した。結果は図１８に示した。
【０２１３】
脳卒中誘発の４時間後のＨｉ１ａの鼻腔内投与は、梗塞サイズを劇的に減少させた。Ｈｉ１ａは、皮質帯（図１８Ａ）だけではなく線条体コア（図１８Ｂ）においても保護を提供した。脳組織の保存は症状的にも反映されており、Ｈｉ１ａ処置動物は、レッジド・ビームアッセイによって判定して未処置ラットに比較して脳卒中後のより少ない運動不全（図１８Ｃ）、神経障害の減少（図１８Ｄ）を経験し、さらに体重減損がより少なかった（図１８Ｅ）。
【０２１４】
治療使用
アシドーシスは、細胞外ｐＨが７．３５未満に低下した場合に発生する。これは、中心および／または末梢神経系に影響を及ぼす多数の病理生理学的条件における共通現象である。組織損傷（例えば、切開もしくは外傷）、炎症、関節炎、関節症、虚血、運動および癌は、ホモマーＡＳＩＣ１ａを活性化するために局所的ｐＨが十分に（＜７）低下することを誘発する（Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。齧歯類およびヒトの両方において、ＡＳＩＣ１ａは感覚ニューロンおよび中心ニューロンにおいて高度に発現し、これはこれらの状態に関連するアシドーシスを感知するためにそれらを理想的に配置する。さらに、ＡＳＩＣ１ａの機能は、虚血および炎症の期間中に放出される細胞外メディエーターによって実質的に強化される（Ｄｅｖａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ，２０１５；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＡＳＩＣ１ａのこれらの特性は、このチャンネルを数種の神経変性性および神経炎症性疾患にとっての強力な薬物標的にする。
【０２１５】
マウスにおける実験誘発性外傷後には、ヒトにおいて脳外傷後に観察されるように、脳皮質は酸性になる。結果として生じるアシドーシスはＡＳＩＣ１ａを活性化し、これは続発性細胞損傷および神経障害の原因となる。ＡＳＩＣ１ａの遺伝的ノックアウトは、外傷性脳損傷後の神経変性の減少をもたらす（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。このためＨｉ１ａを使用したＡＳＩＣ１ａの阻害は、外傷性脳損傷後の神経障害を減少させるための新規な治療アプローチを提供する可能性がある。
【０２１６】
てんかんは、脳ニューロンの過活動によって誘発される神経障害である。発作の発症（および関係するイオンチャンネル）については広範囲に研究されてきたが、それにより発作が終了する分子機構は依然として不明確なままである。活動電位の過剰な発火が脳ｐＨを低下させ、これは順に発作を中止させることが証明されている（Ｓｏｍｊｅｎ，１９８４）。マウスにおけるＡＳＩＣ１ａの妨害はより重度の発作を誘発するが、他方過剰発現するＡＳＩＣ１ａは発作の発症に影響を及ぼさないが、それらの持続時間は短縮する（Ｚｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これらのデータは、アシドーシスおよびＡＳＩＣ１ａ活性化が脳内の発作様活性を限定すること、このためＡＳＩＣ１ａを発作終結の潜在的マーカーであると同定して、抗てんかん薬の設計における新規な展望が開かれることを示唆している。
【０２１７】
ハンティントン病（ＨＤ）は、ＨＤ遺伝子内のＣＡＧリピートの拡張に関連する常染色体優性神経障害である。この拡張は、結果として筋痙攣および認知症を生じさせるその遺伝子産物であるハンティントンタンパク質のミスフォールディングを誘発する。脳細胞内のミスフォールディングされたハンティントンの凝集は、正常神経伝達物質および最終的には全ニューロントラフィッキングを妨害する封入小体の形成を誘発する（Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，２００３）。ＨＤは、ＣＮＳ内でのＡＳＩＣ１ａを活性化するために十分な酸性化と関連しており、これは病因および凝集体の形成の原因となる可能性がある。ＡＳＩＣ１ａの発現の阻害またはｉｎ  ｖｉｖｏでのその薬理学的阻害は、特異的プロテアソームの活性を強化し、これはハンティントンの凝集を減少させる（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。したがって、ＡＳＩＣ１ａは、この消耗性疾患にとっての潜在的に新規な薬物標的である。
【０２１８】
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄の軸索を取り囲んでいるミエリン鞘が損傷している自己免疫疾患である。この神経炎症性発作は軸索変性をもたらし、これは順に進行性の運動、感覚および認識障害を引き起こす（Ｆｉｌｉｐｐｉ，２０１１）。動物モデルおよびヒト組織両方を対象とする近年の試験は、ＭＳ病変由来のグリア細胞および軸索におけるＡＳＩＣ１ａ発現のレベル上昇を同定した（Ｖｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。さらに、ＡＳＩＣ１−／−マウスは、ＭＳのモデルにおいてはるかに重症度の低い症状を発現することが見いだされた。これらの観察所見は、ＡＳＩＣ１ａの活性化がＭＳにおいて見られる神経変性の根底にある可能性があること、およびＡＳＩＣ１ａ阻害剤はＭＳにおける神経保護および骨髄保護の両方の利点を提供する可能性を有することを示唆している。
【０２１９】
脊髄損傷は、結果として続発性細胞死を生じさせる組織外傷および虚血由来の局所性アシドーシスを引き起こす。ＡＳＩＣ１ａは損傷した脊髄神経および支持細胞内で過剰発現し、ＡＳＩＣ１ａが続発性損傷において実質的な役割を果たし、結果として機能消失をもたらすことは証明されている（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＡＳＩＣ１ａの阻害は、脊髄損傷において神経保護的であり（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｏｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６）、このため例えばＨｉ１ａなどのＡＳＩＣ１ａの新規な阻害剤は、脊髄損傷を治療するための潜在能力を有する。
【０２２０】
上述した以外の状態がＡＳＩＣ１ａ活性によって誘発されるかまたはＡＳＩＣ１ａ活性に起因する可能性があること、そのため式（Ｉ）によって記載されたペプチドはそれらの他の状態の予防または治療において使用できることを理解すべきである。つまり、このペプチドは、神経保護剤として以外にも治療的に機能する可能性がある。
【０２２１】
投与経路および用量
ＡＳＩＣ１ａは、虚血性事象後の臨床発現と一致する時間窓を備える治療標的である。純粋Ｈｉ１ａペプチドは、脳卒中誘発の４時間後までにｉ．ｃ．ｖ．注射または鼻腔内投与のいずれかを介して投与された場合に、ラットにおける線条体（コア）および皮質（梗塞周囲）領域の両方の素晴らしい神経保護を生じさせた。このため、ｉ．ｃ．ｖ．もしくは鼻腔内投与は、投与経路として使用することができる。
【０２２２】
通常の状況下では、イオン、小分子およびタンパク質の脳への進入は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって厳密に調節される。しかし、例えば脳卒中もしくは外傷性脳損傷などの脳への病理学的発作は、ＢＢＢの透過性の急速な増加を生じさせる。外傷性脳損傷後に、２８６〜１０，０００Ｄａの分子（Ｈｉ１ａは約８，７００Ｄａである）は、４日後までは脳へ自由に進入することができる（Ｈａｂｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。同様に、虚血後、発作の数時間以内に開始して３日間まで持続する（様々な群の金属プロテイナーゼの活性化によって媒介される）ＢＢＢの二相性開口が生じる（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１１）。したがって、脳卒中後の臨床状況における損傷したＢＢＢの存在下では、Ｈｉ１ａの静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、神経保護をもたらすことができる。
【０２２３】
好ましい場合には、肝代謝およびＢＢＢを完全に迂回するペプチド薬物送達の方法を使用できるであろう。鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与は非侵襲性であり、脳への直接的取込みをもたらし、さらに肝代謝およびＢＢＢの両方を回避する。市場にはすでに数種の鼻腔内投与されるペプチド薬が存在する（Ｃａｓｅｔｔａｒｉ  ａｎｄ  Ｉｌｌｕｍ，２０１４）。ＰｃＴｘ１粗毒の鼻腔内送達は脳卒中から４時間後まで神経保護を提供することが以前に証明されており（Ｐｉｇｎａｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、本発明者らは、少なくとも脳卒中から４時間後までのＨｉ１ａ単独の鼻腔内送達が高レベルの神経保護を提供することを証明した（図１８）。したがって、脳卒中後の臨床状況では、Ｈｉ１ａおよびその改良薬の治療的適用は、ｉ．ｃ．ｖ．、ｉ．ｎ．またはｉ．ｖ．投与を介して達成することができよう。
【０２２４】
意識のあるＳＨＲラットにおける機能的に重要な用量の純粋Ｈｉ１ａのｉ．ｃ．ｖ．投与は、脳卒中後に投与されると高度に神経保護的である。実施例において使用したＨｉ１ａの用量（２ｎｇ／ｋｇ、ｉ．ｃ．ｖ．）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づいて脳ＡＳＩＣ１ａ活性を約８０％阻害するはずの約１．２ｎＭの脳内濃度と同等である。したがって、ｉ．ｃ．ｖ．投与量は、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｋｇの範囲内であろう。
【０２２５】
本明細書の全体を通して「１つの実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「ある実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」についての言及は、その実施形態と結び付けて記載された特定の特徴、構造もしくは特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通して様々な場所での語句「１つの実施形態」または「ある実施形態」の出現は、必ずしも同一実施形態に関してではない。さらに、特定の特徴、構造もしくは特性は、１つ以上の組み合わせで任意の好適な方法で組み合わせることができる。
【０２２６】
本発明は、法律を順守して、構造的および方法的特徴に多かれ少なかれ特異的な言語で記載されている。本発明は、本明細書に記載した手段が本発明を実行する好ましい形態を含むので、本明細書に示した、または記載した特異的な特徴には限定されないことを理解すべきである。このため本発明は、当業者であれば適切に解釈される添付の特許請求項の適正な範囲内の（もしあれば）その形態もしくは変形のいずれかで要求される。
【０２２７】
参考文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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