(57)【要約】いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を含む骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）が提供される。いくつかの態様では、前記実施形態は、組換えＭＩＬを作製するための方法であって、ＭＩＬを含む骨髄を得ること；およびキメラ抗原受容体をコードする核酸で前記ＭＩＬをトランスフェクト、形質転換または形質導入することを含む方法に関する。いくつかの態様では、前記実施形態は、被験体における症状を処置するための方法であって、ＣＡＲを含むＭＩＬを前記被験体に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を含む細胞であって、
骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）であり；
前記ＣＡＲが、リガンドに結合し得る細胞外ドメインを含み；および
前記ＣＡＲが、細胞内シグナリングカスケードを開始させ得る細胞内ドメインを含む、細胞。
【請求項２】
ＣＤ３＋である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＣＤ４＋である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
ＣＤ８＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
ＣＤ４５ＲＯ＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ＣＤ６２Ｌ＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
ＣＸＣＲ４＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
４−１ＢＢ＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
インターフェロンγ＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
ＣＤ１３８＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
ＣＤ３３＋である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
ＣＤ３４−である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記リガンドが、新生細胞上で発現される分子である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記リガンドが、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、突然変異体ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺酸性ホスファターゼ（「ＰＡＰ」）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、メソテリン、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＧＰ１００、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（「ＭＡＲＴ−Ｉ」）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ｐ５３、Ｒａｓ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＥＢＶＡ、Ｅ６、Ｅ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰまたはＴＰＳである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記リガンドが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲまたはＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記リガンドが、α−葉酸受容体、炭酸脱水酵素９（「ＣＡＩＸ」）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ４４ｖ７、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、表皮成長因子−２（「ＥＧＦ−２」）、上皮糖タンパク質４０（「ＥＧＦ−４０」）、受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２；Ｎｅｕ；ＣＤ３４０）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−４（ＨＥＲ４）、葉酸結合タンパク質（「ＦＢＰ」）、胎児性アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、インターロイキン−１３受容体サブユニットα−２（「ＩＬ−１３Ｒα２」）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（「ＫＤＲ」；ＣＤ３０９）、κ軽鎖、ルイスＹ抗原（「ＬｅＹ」）、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ムチン１、細胞表面関連（「ＭＵＣ１」）、前立腺幹細胞抗原、前立腺特異的膜抗原、腫瘍関連糖タンパク質７２（「ＴＡＧ−７２」）またはＶＥＧＦ−Ｒ２である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
前記リガンドが、病原体によって発現される分子である、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫またはウイロイドである、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記ＣＡＲの前記細胞外ドメインが、一本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）ドメインを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ＣＡＲの前記細胞内ドメインが、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ２８の細胞内シグナリングドメインを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
被験体における症状を処置するための方法であって、上記請求項のいずれか一項に記載の細胞を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
複数の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細胞を前記被験体に投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組換えＭＩＬを作製するための方法であって、
ＭＩＬを含む骨髄を得ること；および
キメラ抗原受容体をコードする核酸で前記ＭＩＬをトランスフェクト、形質転換または形質導入すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記骨髄を被験体から得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体が新生物を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体が自己免疫疾患を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、病原体によって引き起こされる感染症を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＭＩＬを活性化することをさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＩＬをエクスパンションすることをさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
複数の組換えＭＩＬを作製することを含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸で前記ＭＩＬをトランスフェクト、形質転換または形質導入する前に、低酸素条件下で前記ＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記低酸素条件が約０．５％〜約５％の酸素ガスを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記低酸素条件が約１％〜約２％の酸素ガスを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
キメラ抗原受容体をコードする核酸で前記ＭＩＬをトランスフェクト、形質転換または形質導入した後に、正常酸素条件下で前記ＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
低酸素条件下で前記ＭＩＬをインキュベートする間に、前記ＭＩＬと抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズとを接触させることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年７月８日に出願された米国仮出願番号第６２／１８９，９２８号に基づく優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
悪性腫瘍患者の大多数は、それらの疾患で死亡する。これらの患者を処置する１つのアプローチは、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）の発現を介して腫瘍細胞上で発現される抗原をターゲティングするようにＭＩＬを遺伝子改変することである。ＣＡＲは、ヒト白血球抗原非依存的に細胞表面抗原を認識するように設計された抗原受容体である。ＣＤ１９ターゲティングアプローチの成功の他、ＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞を使用して他の悪性腫瘍を処置する試みは、限定的に成功している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を含む骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、リガンドに結合し得る細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（例えば、ＭＩＬにおける）細胞内シグナリングカスケードを開始させ得る細胞内ドメインを含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、被験体における症状を処置するための方法であって、ＣＡＲを含むＭＩＬを前記被験体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＭＩＬの集団を含む組成物を被験体に投与することを含み、ＭＩＬの集団の各ＭＩＬは、ＣＡＲを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、組換えＭＩＬを作製するための方法であって、ＭＩＬを含む骨髄を得ること；およびキメラ抗原受容体をコードする核酸で前記ＭＩＬをトランスフェクト、形質転換または形質導入することを含む方法が提供される。骨髄は、被験体、例えば新生物を有する被験体から得られ得る。被験体は、ヒトまたはマウスであり得る。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
いくつかの実施形態では、限定されないが、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む癌を処置するための組成物および方法が本明細書で提供される。態様は、限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように形質導入された骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）の養子細胞移入戦略に関する。ＣＡＲは、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性と、ＭＩＬ受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、所望のＣＡＲを安定発現するように遺伝子改変されたＭＩＬの使用が提供される。ＣＡＲを発現するＭＩＬは、本明細書ではＣＡＲ−ＭＩＬまたはＣＡＲ改変ＭＩＬと称される。いくつかの実施形態では、細胞は、その表面上で抗体結合ドメインを安定発現し、ＭＨＣ非依存的な新規抗原特異性を付与するように遺伝子改変され得る。いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、特異的抗体の抗原認識ドメインと、ＣＤ３ζ鎖またはＦｃγＲＩタンパク質の細胞内ドメインとを単一キメラタンパク質に統合したＣＡＲを安定発現するように遺伝子改変される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインの１つに天然に付随する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するこのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、アミノ酸置換によって選択または改変され得る。例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインであり得る。
【０００９】
細胞質ドメインに関して、ＣＡＲは、例えば、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢシグナリングドメインをそれ自体で含むか、またはＣＡＲとの関連で有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされるように設計され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインをさらに含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、限定されないが、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナリングモジュールならびにそれらの組み合わせを含み得る。したがって、実施形態は、ＣＡＲ−ＭＩＬと、養子療法のためのそれらの使用方法とを提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−ＭＩＬは、所望のＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９、膜貫通ドメインおよびヒト４−１ＢＢを含むＣＡＲ）を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入することによって生成され得る。例えば、ＣＡＲ−ＭＩＬはインビボで複製することができ、その結果、長期間存続して持続的な腫瘍制御をもたらし得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−ＭＩＬの注入を使用した新生物を有する患者の処置のための、ＣＡＲを発現する遺伝子改変ＭＩＬの投与が提供される。いくつかの実施形態では、自己注入が処置において使用される。自己ＭＩＬは、処置を必要とする患者から収集され、本明細書に記載される方法および当技術分野で公知の方法を使用して活性化およびエクスパンションされ、次いで、患者に注入して戻される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインの両方を含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＭＩＬが使用される。いくつかの場合では、患者に注入されたＣＡＲ  ＭＩＬは、インビボで患者の白血病細胞を排除し得る。しかしながら、実施形態は、ＣＤ１９をターゲティングするか、またはＣＤ３ζおよび／もしくは４−１ＢＢ媒介経路を介してシグナリングするＭＩＬに限定されない。例えば、実施形態は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナリングドメイン、ＣＤ２８シグナリングドメイン、ＣＤ３ζシグナルドメインおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたはそれを超える細胞内ドメインに融合された任意の抗原結合部分を含む。
【００１３】
定義
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、本明細書では、この冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素」は、１つの要素または１つよりも多くの要素を意味する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびそれらの活用形は、本明細書で使用される場合、「限定されないが、・・・を含む」を意味する。様々な構成要素または工程を「含む」（「限定されないが、・・・を含む」の意味として解釈される）という意味において、様々な組成物および方法が記載されるが、組成物、方法およびデバイスはまた、様々な構成要素および工程「から本質的になり」得るか、または様々な構成要素および工程「からなり」得、このような専門用語は、本質的に限定された要素群を定義するものとして解釈されるべきである。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＭＩＬの状態を指す。活性化はまた、サイトカイン産生の誘導および検出可能なエフェクター機能に関連し得る。「活性化ＭＩＬ」という用語は、とりわけ、細胞分裂中のＭＩＬを指す。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、インタクトな免疫グロブリンの免疫応答部分であり得る。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る。
【００１７】
「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方を伴い得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。したがって、当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書でその用語が使用される場合、「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。実施形態は、限定されないが、１つよりも多い遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するように様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。また、当業者は、抗原が、「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成的に作製され得るか、または生物学的サンプルに由来し得ることは容易に明らかである。このような生物学的サンプルとしては、限定されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液が挙げられ得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均寿命の増加、または癌性症状に関連する様々な生理的症候の改善によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、初期段階の腫瘍の発生を予防するペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって現れ得る。
【００２０】
「自己抗原」という用語は、免疫系によって外来性であると誤って認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、限定されないが、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質（細胞表面受容体を含む）を含む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答に起因する障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、とりわけ限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（１型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、尋常性白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、同じ個体に由来する任意の材料であって、前記個体にその後再導入される材料を指すものである。
【００２３】
「同種」は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
【００２４】
「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な成長を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は局所的に拡散し得るか、または血流およびリンパ系を介して体の他の部分に拡散し得る。様々な癌の例としては、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。
【００２６】
「共刺激リガンド」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子であって、ＭＩＬ上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えばペプチドが負荷されたＭＨＣ分子に対するＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、ＭＩＬ応答（限定されないが、増殖、活性化、分化などを含む）を媒介するシグナルを提供する分子を含む。共刺激リガンドとしては、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、ＭＩＬ上に存在する共刺激分子、例えば限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合する抗体、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを包含する。
【００２７】
「共刺激分子」は、ＭＩＬ上の同族結合パートナーであって、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、ＭＩＬによる共刺激応答（例えば限定されないが、増殖）を媒介する同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」は、一次シグナル（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション）と組み合わせて、ＭＩＬの増殖、および／または重要な分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。
【００２９】
「疾患」は、被験体が恒常性を維持し得ない被験体の健康状態であって、前記疾患が改善されない場合、動物の健康が悪化し続ける被験体の健康状態である。対照的に、被験体における「障害」は、前記被験体が恒常性を維持し得るが、前記被験体の健康状態が、前記障害の非存在下よりも好ましくない健康状態である。未処置の場合、障害は必ずしも、被験体の健康状態のさらなる低下を引き起こすわけではない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、治療利益または予防利益を提供する量を意味する。
【００３１】
「コードする」は、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の固有の特性であって、所定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または所定のアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する特性およびそれに起因する生物学的特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生体系においてタンパク質をもたらす場合、その遺伝子は、タンパク質をコードする。コード鎖（このヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表として提供される）および非コード鎖（これは、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される）は両方とも、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称され得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはそれらの内側で産生される任意の材料を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系から導入されるか、またはそれらの外側で産生される任意の材料を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
【００３５】
「発現ベクター」は、発現させるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターとしては、当技術分野で公知のものすべて、例えば組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドなもの、またはリポソームに含まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【００３６】
「相同」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。比較される２つの両配列における位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合（例えば、２つの各ＤＮＡ分子における位置がアデニンによって占有される場合）、前記分子は、その位置において相同である。２つの配列間の相同の割合は、２つの配列が共有する一致位置または相同位置の数を、比較される位置の数によって割ったものに１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置の６個が一致するかまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。一般に、比較は、最大の相同性が得られるように２つの配列をアラインメントして行われる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称されることもある。このタンパク質クラスに含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００３８】
「単離された」は、天然状態から変化または摘出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非天然環境（例えば、宿主細胞）において存在し得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、一般に存在する核酸塩基の以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点において、レトロウイルスの中で固有のものである；それらは、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達し得るので、それらは、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成するための手段を提供する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「骨髄浸潤リンパ球」（「ＭＩＬ」）は、骨髄に由来するリンパ球を指す。骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）は、末梢血リンパ球および腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）と多くの区別可能な差異を有する。骨髄（「ＢＭ」）微小環境は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）の豊富さに起因する特別な免疫学的ニッチである。これらの抗原提示細胞の存在により、抗原のプロセシングおよび提示が、骨髄区画に見られるより高レベルの中心記憶細胞を維持することが可能になる（Ｌｉ  ＪＭら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｄｅｃ  １５；１８３（１２）：７７９９−８０９）。これらのＭＩＬは、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ６２Ｌ＋などの記憶マーカーを発現し、ＰＢＬにおいて見られる記憶細胞よりも多くの記憶ＭＩＬが存在する。（Ｎｏｏｎａｎ  Ｋら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｒ  １；１８（５）：１４２６−３４）。さらに、記憶細胞を抗原に連続的にプライミングする能力により、ＭＩＬは、血液悪性腫瘍の「ＴＩＬ」というだけではない（Ｂｅｃｋｈｏｖｅ  Ｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４  Ｊｕｌ  １；１１４（１）：６７−７６；Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉ  Ｐら、６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１８０：４９５６−４９６４）。骨髄間質において多量に発現される同種抗原間質由来因子１型（「ＳＤＦ１」）により、ＭＩＬはまた、それらのＰＢＬカウンターパートよりも多くのＣＸＣＲ４を発現する（Ｎｏｏｎａｎ  Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ｍａｒ  １；６５（５）：２０２６−３４）。おそらくはＢＭ微小環境の低酸素性により、ＭＩＬでは、ＰＢＬと比較して４１ＢＢの発現も増加する。さらに、ＴＩＬとは対照的に、ＭＩＬは、すべての患者から採取およびエクスパンションされ得る（Ｎｏｏｎａｎ，Ｋら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  ２０；７（２８８）：２８８ｒａ７８）。ＴＩＬは、患者の約５０％においてのみ見られ、患者の約２５％のみが、エクスパンション可能なＴＩＬを含む。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）とは対照的に、ＭＩＬは、広い内因性抗原レパートリーを有し、これが、それら固有の腫瘍特異性（これは、ＰＢＬでは全く見られない特徴である）の主要因である（Ｎｏｏｎａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）。
【００４２】
特に指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであるすべてのヌクレオチド配列であって、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【００４３】
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって、後者の発現をもたらす機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関係で配置されている場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を接続することが必要な場合には同じリーディングフレーム内にある。
【００４４】
「過剰発現」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または器官内の固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または器官からの正常細胞における発現のレベルと比べて異常レベルであることを示すものである。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で公知の標準的なアッセイによって決定され得る。
【００４５】
免疫原性組成物の「非経口的」投与は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または胸骨内注射技術または注入技術が挙げられる。
【００４６】
「患者」、「被験体」、「個体」などの用語は本明細書で互換的に使用され、インビトロまたはインサイチューにかかわらず、本明細書に記載される方法に適している任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、被験体または個体は、ヒトである。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドとしては、ペプチド結合によって互いに接続された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、短鎖（これは例えば、当技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される）および長鎖（これは、当技術分野では一般にタンパク質と称される）の両方（これらは、多くの種類がある）を指す。「ポリペプチド」は、例えばとりわけ、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチドまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構または導入合成機構によって認識されるＤＮＡ配列であって、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要なＤＮＡ配列と定義される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現のために必要な核酸配列を意味する。いくつかの場合では、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の場合では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントを含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現させるものであり得る。
【００５０】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されると、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、細胞における遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
【００５１】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されると、プロモーターに対応する誘導因子が細胞中に存在する場合にのみ実質的に、細胞における遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
【００５２】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドに作動可能に連結されると、細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ実質的に、細胞における遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
【００５３】
「刺激」という用語は、その同族リガンドに対する刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の結合によって誘導される一次応答であって、それにより、シグナル伝達イベント（例えば限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達）を媒介する一次応答を意味する。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えばＴＧＦ−βのダウンレギュレーションおよび／または細胞骨格構造の再構成などを媒介し得る。
【００５４】
「刺激分子」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドに特異的に結合するＭＩＬ上の分子を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在すると、ＭＩＬ上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称される）に特異的に結合し得るリガンドであって、それにより、ＭＩＬによる一次応答（限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含む）を媒介するリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【００５６】
「被験体」という用語は、免疫応答が誘発され得る生きている生物（例えば、哺乳動物）を含むものである。被験体の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、処置および／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
【００５８】
「治療有効量」という用語は、組織、系または被験体の生物学的反応または医学的反応を誘発するであろう主題化合物の量であって、研究者、獣医、医師または他の臨床医が探求している量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されると、処置されている障害または疾患の徴候または症候の１つまたはそれよりも多くの発症を予防するために、またはそれらをある程度改善するために十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに処置すべき被験体の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
【００５９】
疾患の「処置」は、この用語が本明細書で使用される場合、被験体が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症候の頻度または重症度を軽減することを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入されたものである。細胞は、初代被験細胞およびその子孫を含む。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「転写制御下」または「作動可能に連結された」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために前記ポリヌクレオチドとの関係で正しい位置および方向にあることを意味する。
【００６２】
「ベクター」は、単離された核酸を含む組成物であって、前記単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物である。多数のベクターが当技術分野で公知であり、限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが挙げられる。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミド化合物および非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどを含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
【００６３】
説明
本開示は、他の疾患の中でも特に癌を処置するための組成物および方法を提供する。癌は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発腫瘍または転移腫瘍であり得る。癌は、慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）などの血液悪性腫瘍であり得る。本明細書に記載および提供される組成物および方法を使用して処置可能な他の疾患としては、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症ならびに自己免疫疾患が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（すなわち、ＭＩＬ）であって、ＣＡＲ−ＭＩＬが抗腫瘍特性を示す細胞（すなわち、ＭＩＬ）が提供される。ＣＡＲは、例えば、ＭＩＬ抗原受容体複合体ζ鎖（例えば、ＣＤ３ζ）の細胞内シグナリングドメインに融合された抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作され得る。ＣＡＲは、例えば、ＭＩＬにおいて発現される場合、抗原結合特異性に基づいて抗原認識を再指令することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９は悪性Ｂ細胞上で発現されるので、抗原はＣＤ１９である。しかしながら、実施形態は、ＣＤ１９のターゲティングに限定されない。むしろ、実施形態は、その同種抗原に結合すると、腫瘍細胞が成長せずその死が促進されるように腫瘍細胞に影響を与えるか、または患者の腫瘍負荷が縮小もしくは排除されるように腫瘍細胞に別様に影響を与える任意の抗原結合部分を含む。抗原結合部分は、共刺激分子およびζ鎖の１つまたはそれよりも多くに由来する細胞内ドメインに融合され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナリングドメイン、ＣＤ２８シグナリングドメイン、ＣＤ３ζシグナルドメインおよびそれらの任意の組み合わせの群から選択される１つまたはそれを超える細胞内ドメインに融合される。抗原結合部分はまた、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）などの細胞内ドメインに融合され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナリングドメインを含む。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、これは、この実施形態が、共刺激ドメインの追加によってＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答がさらに増強され得るという知見に部分的に基づくものであるためである。
【００６６】
Ｉ．キメラ抗原受容体
細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。細胞外ドメインは、抗原結合部分と別様に称される標的特異的結合エレメントを含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナリング領域および／またはζ鎖の一部を含み得る。共刺激シグナリング領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であって、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要な細胞表面分子である。
【００６７】
スペーサードメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に組み込まれ得る。本明細書で使用される場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般に、ポリペプチド鎖中の膜貫通ドメインを細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能するアミノ酸のストレッチを意味する。スペーサードメインは、最大３００アミノ酸、好ましくは２〜１００アミノ酸、例えば２５〜５０アミノ酸を含み得る。
【００６８】
ＩＩ．細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合部分と別様に称される標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインのためのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびに癌細胞に関連するものが挙げられる。例えば、リガンドは、細菌、ウイルスまたは寄生虫のタンパク質であり得る。同様に、リガンドは、癌細胞の表面上でアップレギュレートされるタンパク質であり得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合部分の操作によって、目的の腫瘍抗原をターゲティングするように操作され得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原（ｈｙｐｅｒｐｏｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、癌などの特定の過剰増殖性障害に一般的な抗原を指す。本明細書で議論される抗原は、一例として挙げられているに過ぎない。リストは排他的なものではなく、さらなる例は当業者に容易に明らかであろう。
【００７０】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合部分の選択は、処置すべき癌の特定の種類に依存するであろう。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、突然変異体ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメソテリンが挙げられる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つまたはそれを超える抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得る多くのタンパク質を発現する。これらの分子としては、限定されないが、メラノーマにおけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの組織特異的抗原が挙げられる。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、腫瘍胎児性抗原などの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の別の候補である。これらの抗原のいくつか（例えば、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されているが、成功は限定的である。
【００７２】
言及される腫瘍抗原の種類はまた、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上に存在しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下では、正常細胞上でも発現される。腫瘍上における抗原の発現は、抗原に対する免疫系の応答を可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答することができない胎児発生中に正常細胞上で発現される抗原であり得るか、またはそれらは、正常細胞上では極めて低レベルで通常存在するが腫瘍細胞上でははるかに高レベルで発現される抗原であり得る。
【００７３】
ＴＳＡ抗原またはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原、およびＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５などの腫瘍特異的多系列抗原；過剰発現される胎児抗原、例えばＣＥＡなど；過剰発現される癌遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなど；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；ならびに、ウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大型タンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが挙げられる
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合基部分は、限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲなどを含む抗原をターゲティングする。
【００７５】
ターゲティングすべき所望の抗原に応じて、ＣＡＲは、所望の抗原標的に特異的な適切な抗原結合部分を含むように操作され得る。例えば、ＣＤ１９が、ターゲティングすべき所望の抗原である場合、ＣＡＲに組み込むための抗原結合部分として、ＣＤ１９に対する抗体が使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合基部分は、ＣＤ１９をターゲティングする。
【００７６】
ＣＡＲの細胞外ドメインは、例えば、本明細書に記載される標的のいずれか１つに結合する一本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）を含み得る。
【００７７】
細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、多種多様なものが当技術分野で公知である。いくつかの場合では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）である。他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）およびヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）およびヒト化バージョン、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）ならびに「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に適切である。いくつかの場合では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメイン、例えば一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ννβを含有する一本鎖二ドメインＴＣＲ）もまた使用に適切である。
【００７８】
実施形態では、当技術分野で公知の他の細胞外ドメインも使用され得る（例えば、国際公開第２０１４／１２７２６１号；米国特許第８，９７５，０７１号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００７９】
ＩＩＩ．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインの１つに天然に付随する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合では、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するこのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、アミノ酸置換によって選択または改変され得る。
【００８０】
膜貫通ドメインは天然供給源に由来し得るか、または膜貫通ドメインは、（例えば、α−ヘリックスを形成する１８〜３０個の疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）のストレッチから）設計されたものであり得る。供給源が天然のものである場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。特定の使用のための膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは設計されたものであり得、この場合、それは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含むであろう。設計された膜貫通ドメインでは、フェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはチロシンが膜／水界面の近くに見られ得る。場合により、２〜１０アミノ酸長の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインおよび細胞質シグナリングドメインを連結し得る。グリシン−セリンスペーサーは、特に適切なリンカーを提供する。
【００８１】
ＩＶ．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、ＭＩＬの正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、ＭＩＬのエフェクター機能は、細胞溶解活性またはヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む）であり得る。したがって、「細胞内シグナリングドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するタンパク質の部分であって、細胞が特殊な機能を発揮するように指令するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナリングドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、細胞内ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナリングドメインの短縮部分が使用される程度において、このような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖に代えて使用され得る。したがって、細胞内シグナリングドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な細胞内シグナリングドメインの任意の短縮部分を含むものである。
【００８２】
ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナリングドメインのいくつかの非限定的な例としては、抗原と受容体との係合後にシグナル伝達を開始させるように協調的に作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列と、同じ機能的能力を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列とが挙げられる。
【００８３】
ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルは、リンパ球の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要である。したがって、ＭＩＬ活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナリングによって媒介される：ＴＣＲを介して抗原依存的な一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナリング配列）、および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナリング配列）。
【００８４】
一次細胞質シグナリング配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的または阻害的に調節する。刺激的に作用する一次細胞質シグナリング配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆｓ）すなわちＩＴＡＭとして公知のシグナリングモチーフを含有し得る。
【００８５】
使用され得るＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナリング配列の例としては、限定されないが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞質シグナリング分子は、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナリング配列を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナリングドメインそれ自体を含むか、またはＣＡＲとの関連で有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされるように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖の一部および共刺激シグナリング領域を含み得る。共刺激シグナリング領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であって、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要な細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態は、共刺激シグナリングエレメントとして４−１ＢＢを用いて例示されるが、他の共刺激エレメントも使用され得る。
【００８７】
ＣＡＲの細胞質シグナリング部分内の細胞質シグナリング配列は、ランダムな順序または指定の順序で互いに連結され得る。場合により、好ましくは２〜１０アミノ酸長の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、連結を形成し得る。グリシン−セリンスペーサーは、特に適切なリンカーを提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインと、ＣＤ２８のシグナリングドメインとを含むように設計される。いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインと、４−１ＢＢのシグナリングドメインとを含むように設計される。いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインと、ＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナリングドメインとを含むように設計される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける細胞質ドメインは、４−１ＢＢのシグナリングドメインと、ＣＤ３ζのシグナリングドメインとを含むように設計される。
【００９０】
Ｖ．ベクター
ＣＡＲをコードする天然核酸または合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、前記構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物における複製および組み込みに適切なものであり得る。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーターと、開始配列と、所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターとを含有する。
【００９１】
レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期安定な組み込みおよび娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期の遺伝子導入を達成するために適切なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入し得るという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターよりも付加的な利点を有する。それらはまた、低い免疫原性という付加的な利点を有する。
【００９２】
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが公知のベクターからそれを生成することによって、または標準的な手法を使用して、細胞およびそれを含有する組織から直接単離することなどによって得られ得る。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングではなく合成によって生産され得る。
【００９３】
発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用した核酸免疫化および遺伝子治療のために使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、実施形態は、遺伝子治療ベクターを提供する。核酸配列はまた、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術を使用して挿入され得る。
【００９４】
核酸は、多くの種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むベクターにクローニングされ得る。特定の目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターが挙げられる。
【００９５】
発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（４ｔｈ  ｅｄ．，２０１２））ならびにウイルス学および分子生物学の他のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点と、プロモーター配列と、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位と、１つまたはそれを超える選択マーカーとを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；および米国特許第６，３２６，１９３号を参照のこと）。
【００９６】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、多くのウイルスベースの系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当技術分野で公知の手法を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングし得る。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで被験体の細胞に送達し得る。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【００９７】
さらなる調節エレメント（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１００，０００ｂｐ上流に位置するが、最近、多くのプロモーターは、開始部位の下流においても機能的エレメントを含有することが示されている。エレメントが互いに反転または移動した場合にプロモーター機能が保持されるように、プロモーターエレメント間の間隔はフレキシブルであることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔は５０ｂｐ離され得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協調的にまたは独立して機能して、転写を活性化し得る。
【００９８】
適切なプロモーターの一例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列も使用され得、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられる。プロモーターは、構成的プロモーターに限定されない。誘導性プロモーターも使用され得る。誘導性プロモーターの使用は、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が望まれる場合にはこのような発現をオンにすることができ、または発現が望まれない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオネインプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【００９９】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトされるかまたは感染されようとしている細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするための選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有し得る。他の態様では、選択マーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持されて、コトランスフェクション手順において使用され得る。宿主細胞における発現を可能にするために、選択マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子は両方とも、適切な調節配列に隣接し得る。有用な選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏなどが挙げられる。
【０１００】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するために、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せずまたはそれらによって発現されない遺伝子であって、いくつかの容易に検出可能な特性（例えば、酵素活性）によってその発現が現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌性アルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光性タンパク質の遺伝子が挙げられ得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉら、２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、ｍＣｈｅｒｒｙである。
【０１０１】
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は、当技術分野で周知である。発現ベクターとの関連では、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的手段、化学的手段または生物学的手段によって、宿主細胞に移入され得る。
【０１０２】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生産するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（４ｔｈ  ｅｄ．，２０１２）を参照のこと）。
【０１０３】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞に挿入するために広く使用されている方法である。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来し得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照のこと）。
【０１０４】
核酸を宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０１０５】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。宿主細胞への核酸の導入のために、脂質製剤の使用が企図される（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）。別の態様では、核酸は、脂質に会合され得る。脂質に会合された核酸をリポソームの水性内部に封入し、リポソームの脂質二重層内に散在させ、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に会合された連結分子を介してリポソームに連結し、リポソーム中にトラップし、リポソームと複合体形成させ、脂質を含有する溶液中に分散させ、脂質と混合し、脂質と組み合わせ、懸濁液として脂質中に含め、ミセル中に含めるかもしくはミセルと複合体形成させ、または別様に脂質に会合させ得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造中に存在し、ミセルとして存在し、または「崩壊」構造で存在し得る。また、それらは単に溶液中に散在し得、サイズまたは形状が均一ではない凝集物を形成する可能性がある。
【０１０６】
ＶＩ．骨髄浸潤リンパ球
ＭＩＬのエクスパンションおよび遺伝子改変の前に、ＭＩＬの供給源は被験体から得られる。血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む多くの種類の癌のいずれかを有する患者では、Ｔ細胞は、末梢血と比較して高い腫瘍特異性を有する骨髄微環境から容易に得られ得る（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２２３１４６号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。血液悪性腫瘍を有する被験体由来のこれら２つの異なる区画から得られたＴ細胞を比較することによって、骨髄吸引物から得られた骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）のオリゴクローナルな制限が観察される。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コンジュゲート磁気ビーズを含むものなどの方法は、インビトロで骨髄細胞を活性化およびエクスパンションして活性化ＭＩＬを生成するために使用され得る。活性化ＭＩＬは、検査したすべての患者の末梢血リンパ球と比較して大きいエクスパンションおよび高い腫瘍活性を示す。これらの知見は、１）骨髄が腫瘍特異的Ｔ細胞の貯蔵庫であること；２）ＭＩＬが、（転移性メラノーマにおいて観察される限られた数と比較して）研究したすべての患者において活性化およびエクスパンションされ得ること；３）注入すると、これらの細胞が骨髄に移動すること；４）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける養子移入の２００日後まで存続すること；および５）活性化ＭＩＬが、事前に確立された疾患を根絶して骨髄腫幹細胞前駆体をターゲティングし、それにより、広範な抗原認識を示すことができることを示唆している。
【０１０７】
全骨髄細胞集団の少数派であるＴ細胞は、ほぼ完全な骨髄の存在下でエクスパンションされ得る。最大の腫瘍−Ｔ細胞接触を保証するために、吸引された骨髄は、リンパ球分離培地密度勾配によって分画され、細胞は、ほぼ赤血球ペレットレベルまで収集され得る。この分離方法は、実質的に赤血球および好中球のみを除去してほぼ完全な骨髄を提供し、Ｔ細胞および腫瘍細胞の両方の回収をもたらす。Ｔ細胞は、Ｔ細胞特異的分離工程および腫瘍細胞分離工程を用いずにエクスパンションされ得る。細胞型特異的分離工程は、例えば、抗体または他の細胞型特異的検出可能標識を使用した細胞標識、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した選別を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、このような標識方法および細胞選別方法を用いずに実施され得る。
【０１０８】
ビーズによる活性化のために、ビーズ−Ｔ細胞接触は、好ましくは、培養の最初の２４〜４８時間中に最大化される。Ｔ細胞は、集団における全細胞のごく少数派であるので、Ｔ細胞と抗体コーティングビーズとの接触は、ビーズ：細胞約１：１〜約５：１、好ましくはビーズ：細胞約２：１〜４：１、より好ましくはビーズ：細胞約２．５：１〜３．５：１の範囲内の、細胞に対して十分な数のビーズを使用することによって促進される。これらの比は、開示されるビーズに適用可能であり、ビーズのサイズおよび／またはビーズ上の抗体密度の変更は、ビーズ：細胞比を変化させ得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細胞を培養し、剛性の丸底平滑面を提供して、近接引力による細胞およびビーズの収集を促進するために、デバイスが利用され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２２３１４６号参照（これは、参照により本明細書に組み込まれる））。デバイスは、支持体上に載置された密閉セル容器を含む。ビーズの存在下における少なくとも最初の３日間の培養中、ビーズと細胞との間の接触をさらに促進するために、好ましくは、容器は固定されている（すなわち、撹拌または回転していない）。これらの工程および条件は、ビーズを使用して腫瘍特異的ＭＩＬのエクスパンションを最大化して、治療上有用であるために十分な細胞の生産を可能にするために好適である。さらに、これらの培養条件は、腫瘍細胞の成長を促進せずにＴ細胞の成長を促進する。
【０１１０】
ＭＩＬのいくつかの特質により、それらは、免疫療法の適切な候補である。具体的には、本明細書に記載される条件下で、それらは、刺激時にＰＢＬよりも急速にエクスパンションし、多くの場合、活性化時にスキュードＴ細胞レパートリーを維持しているが、これはおそらく、腫瘍特異性の増大を示唆している。非活性化ＭＩＬは、自己腫瘍に対して著しい低応答を示すのに対して、Ｔ細胞を活性化およびエクスパンションして腫瘍反応性を顕著に増強する能力は、この状況におけるＴ細胞不応答を媒介する推定機構としての欠損寛容と相反する。さらに、活性化ＭＩＬは、非悪性造血要素に対する交差反応をほとんど伴わずに腫瘍特異性を示し、より高いＣＸＣＲ−４発現を有し、より大きいＳＤＦ−Ｉ応答性を有するが、これは、ＭＩＬが骨髄に遊走する能力の増加を示唆している。まとめると、これらの知見は、記憶／エフェクター表現型（これは、成熟最終分化形質細胞およびそれらの前駆体の両方に存在する広範囲の腫瘍抗原をターゲティングすると思われる）を有し、ケモカイン受容体（これは、養子免疫療法の抗腫瘍免疫を最大化するために必要な特徴である骨髄区画への輸送を容易にすると思われる）を有する骨髄浸潤性Ｔ細胞を活性化およびエクスパンションする能力を示している。
【０１１１】
ＭＩＬの活性化およびエクスパンションは、以前に報告された２つの現象（腫瘍浸潤性リンパ球の腫瘍特異性の増強（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３３：１３１８）ならびにメラノーマ（Ｌｅｔｓｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３：５５８２−６）、乳癌（Ｆｅｕｅｒｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００１；７：４５２）および多発性骨髄腫（骨髄も腫瘍微小環境になる疾患）（Ｄｈｏｄａｐｋａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２；９９：１３００９）を有する患者の骨髄における腫瘍反応性Ｔ細胞の実証）に基づくものであった。
【０１１２】
不応答を克服し、活性化ＰＢＬと比較して腫瘍特異性を有意に増加させる手段として、ＭＩＬを活性化およびエクスパンションする能力が本明細書で提供される。骨髄微小環境における腫瘍の存在は、活性化ＭＩＬの抗原特異性の保存において重要な役割を果たし得る。いくつかの仮説により、活性化ＰＢＬよりも増加した活性化ＭＩＬの反応性が説明され得る。機構に縛られるものではないが、骨髄における抗原の存続は、記憶応答の維持に必須であり得ることが示唆される。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティングビーズ活性化は、骨髄Ｔ細胞集団における寛容を回復させ得る。同様に、プレートに結合されたおよび／または可溶性のＣＤ３および／またはＣＤ２８が活性化に使用され得る。しかしながら、ＭＩＬを活性化する手段は特に限定されず、任意の適切な活性化方法が様々な実施形態において使用され得る。本明細書で実証されているように、活性化ＭＩＬの腫瘍特異性は、Ｔ細胞活性化中の抗原の存在に依存していた。さらに、骨髄は、危険シグナル（感染、炎症、自己免疫および癌）の存在下で、反応性リンパ濾胞を介して一次免疫応答および二次応答の両方を開始させ得る機能的リンパ器官である。
【０１１３】
骨髄腫患者におけるＴ細胞は、ＶＢ  Ｔ細胞受容体レパートリーの相当なスキューイングを示す。このようなスキューイングは、顕著な腫瘍特異性を有するＴ細胞の選択的成長、または重大な腫瘍負荷を有する患者に特徴的な著しい基礎Ｔ細胞欠損の結果を示唆している。後者の場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コンジュゲート磁気ビーズによるＰＢＬのポリクローナル刺激の利益は、正常Ｔ細胞レパートリーを回復させて、基礎Ｔ細胞欠損を修正する能力である。対照的に、特定のＶＢファミリーのオリゴクローナル発現が、腫瘍特異性を有するＴ細胞の存在を反映する場合、維持された抗腫瘍活性およびＴ細胞受容体レパートリーのスキューイングを有するこのＴ細胞プールの活性化およびエクスパンションが好ましい場合がある。本明細書で実証されているように、ＰＢＬは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コンジュゲート磁気ビーズで活性化およびエクスパンションされると、それらのＶＢ  Ｔ細胞レパートリーを正常化したのに対して、ＭＩＬはＶＢ制限を維持した。活性化ＭＩＬの増強された腫瘍特異的応答を考慮すると、スキューイングされたそれらのＴ細胞レパートリーは、より高い腫瘍認識を示唆するものであり得る。機構に縛られるものではないが、Ｔ細胞エクスパンション中のＶＢスキューイングの程度を保存し、可能であれば増加させることが重要であり得る。
【０１１４】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コンジュゲート磁気ビーズによるＭＩＬの活性化およびエクスパンションは強力な抗腫瘍活性をもたらし、このエクスパンション中の抗原の存続は、腫瘍特異性の維持（および増強）において非常に重要であり得る。Ｄｈｏｄａｐｋａｒら（２００２）はまた、骨髄腫患者におけるＭＩＬの役割を研究している。本発明者らの知見と同様に、新たに単離されたＭＩＬまたはＰＢＬは、自己腫瘍または腫瘍ペプチドで刺激されても活性を示さなかった。しかしながら、この研究では、腫瘍パルス樹状細胞と共に１２〜１６日間インキュベートした後の酵素結合免疫スポットアッセイにおいて、末梢血から得られたＴ細胞と骨髄区画との間に有意差は見られなかったのに対して、本発明者らのシステムでは、検査したすべてのアッセイにおいて、活性化ＭＩＬの抗腫瘍応答は活性化ＰＢＬよりも１０倍超大きいことが観察された。これらの矛盾する結果は、ＭＩＬの樹状細胞活性化と比較して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激の効力に関連し得る。機構に縛られるものではないが、活性化およびエクスパンションされたＭＩＬ培養物における腫瘍反応性Ｔ細胞の頻度の増加であると思われるものは、腫瘍反応性Ｔ細胞の寛容の破壊および機能の回復を反映し得る。さらに、骨髄微小環境内のＭＩＬの刺激は、これらの結果を説明し得る別の重要な要因である。
【０１１５】
陰性選択によるＭＩＬ集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体のカクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。
【０１１６】
陽性選択または陰性選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は変動し得る。特定の実施形態では、細胞およびビーズの最大接触を保証するために、ビーズおよび細胞を一緒に混合する容積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、より低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。ＭＩＬと表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を有意に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これにより、粒子に結合した多量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。
【０１１８】
本明細書に記載されるエクスパンション細胞が必要とされ得る前の被験体由来のＭＩＬを含むサンプルの収集物も本明細書で提供される。このようなものとして、必要な任意の時点において、エクスパンションすべき細胞の供給源は収集され、ＭＩＬなどの所望の細胞は単離され、ＭＩＬ療法から利益を受ける任意の数の疾患または症状（例えば、本明細書に記載されるもの）のためのＭＩＬ療法にその後使用するために凍結し得る。いくつかの実施形態では、ＭＩＬを含むサンプルは、一般健康被験体から採取される。いくつかの実施形態では、ＭＩＬを含むサンプルは、疾患を発症するリスクを有するがまだ疾患を発症していない一般健康被験体から採取され、目的の細胞は、その後に使用するために単離および凍結される。いくつかの実施形態では、ＭＩＬはエクスパンションされ、凍結され、その後の時点で使用される。いくつかの実施形態では、サンプルは、本明細書に記載される特定の疾患の診断直後であって、しかしあらゆる処置の前に、患者から収集される。いくつかの実施形態では、細胞は、限定されないが、薬剤、例えばナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６抗体、または他の免疫除去薬、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射による処置を含む任意の多くの関連処置方法の前に、被験体由来のＭＩＬを含むサンプルから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または成長因子誘導性シグナリングに重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）。いくつかの実施形態では、細胞は患者のために単離され、骨髄移植もしくは幹細胞移植、化学療法薬、例えばフルダラビン、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えばＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用したＭＩＬ除去療法と組み合わせて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）その後使用するために凍結される。いくつかの実施形態では、細胞は事前に単離され、Ｂ細胞除去療法（例えば、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサン）後の処置でその後使用するために凍結される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、処置後に患者から直接得られる。これに関して、特定の癌処置（特に、免疫系を損傷する薬物による処置）の後、患者が処置から通常回復している期間中の処置の直後において、得られたＭＩＬの品質は、エクスビボでエクスパンションする能力が最適であるか、または改善されていることが観察されている。同様に、本明細書に記載される方法を使用したエクスビボ操作の後において、これらの細胞は、増強された生着およびインビボエクスパンションについて好ましい状態であり得る。したがって、ＭＩＬは、この回収段階中に収集され得る。
【０１２０】
所望のＣＡＲを発現するようにＭＩＬを遺伝子改変する前後にかかわらず、ＭＩＬは、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；米国特許第６，５３４，０５５号；米国特許第６，９０５，６８０号；米国特許第６，６９２，９６４号；米国特許第５，８５８，３５８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第７，１４４，５７５号；米国特許第７，０６７，３１８号；米国特許第７，１７２，８６９号；米国特許第７，２３２，５６６号；米国特許第７，１７５，８４３号；米国特許第５，８８３，２２３号；米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，７９７，５１４号；米国特許第６，８６７，０４１号；ならびに米国特許出願公開第２００６０１２１００５号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して活性化してエクスパンションされ得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＭＩＬの表面上の共刺激分子を刺激するリガンドがそれに結合されている表面との接触によってエクスパンションされる。特に、ＭＩＬ集団は、本明細書に記載されるように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触などによって刺激され得る。ＭＩＬの表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、ＭＩＬの集団は、ＭＩＬの増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。ＣＤ４＋ＭＩＬまたはＣＤ８＋ＭＩＬのいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当技術分野で一般に公知の他の方法のように使用され得る（Ｂｅｒｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０１２２】
特定の実施形態では、ＭＩＬに対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中にあり得るか、または表面にカップリングされ得る。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面にカップリングされ得るか（すなわち、「シス」フォーメーション）、または別個の表面にカップリングされ得る（すなわち、「トランス」フォーメーション）。あるいは、一方の薬剤は表面にカップリングされ得、他方の薬剤は溶液中にあり得る。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合され、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるか、または表面にカップリングされる。特定の実施形態では、両薬剤は溶液中にあり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は可溶形態であり、次いで、表面（例えば、Ｆｃ受容体を発現する細胞、または薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤）に架橋され得る（一般に、例えば、特にＭＩＬの活性化およびエクスパンションにおける使用について企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および米国特許出願公開第２００６００３４８１０号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、２つの薬剤は、同じビーズ上に（すなわち、「シス」）または別個のビーズ上に（すなわち、「トランス」）のいずれかで、ビーズ上に固定化される。一例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片である；両薬剤は、等モル量で同じビーズに同時固定化される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋ＭＩＬのエクスパンションおよびＭＩＬ成長のために、ビーズに結合される各抗体の１：１の比が使用される。いくつかの実施形態では、１：１の比を使用して観察されるエクスパンションと比較してＭＩＬエクスパンションの増加が観察されるような、ビーズに結合される抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比が使用される。いくつかの実施形態では、１：１の比を使用して観察されるエクスパンションと比較して約１〜約３倍の増加が観察される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合されるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００およびその間のすべての整数値の範囲である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合される（すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は、１未満である）。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗ＣＤ２８抗体：抗ＣＤ３抗体の比は、２：１よりも大きい。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。いくつかの実施形態では、ビーズに結合される抗体について３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。
【０１２４】
１：５００〜５００：１およびその間の任意の整数値の細胞：粒子の比は、ＭＩＬを刺激するために使用され得る。当業者が容易に理解し得るように、細胞：粒子との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少数の細胞に結合し得るに過ぎないが、より大きいビーズは、多くに結合し得る。特定の実施形態では、細胞：粒子の比は、１：１００〜１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる実施形態では、比は、１：９〜９：１およびその間の任意の整数値を含み、ＭＩＬを刺激するためにも使用され得る。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８カップリング粒子と細胞との比であって、ＭＩＬの刺激をもたらす比は、上記のように変動し得るが、しかしながら、特定の値としては、限定されないが、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１が挙げられる。いくつかの実施形態では、粒子：細胞の比は、少なくとも１：１である。いくつかの実施形態では、１：１またはそれ未満の粒子：細胞の比が使用される。いくつかの実施形態では、粒子：細胞の比は、１：５である。いくつかの実施形態では、粒子：細胞の比は、刺激の日に応じて変動し得る。例えば、いくつかの実施形態では、粒子：細胞の比は、１日目において１：１〜１０：１であり、その後、さらなる粒子は、１：１〜１：１０の最終比（追加の日の細胞数に基づく）で、最大１０日間にわたって毎日または隔日で細胞に追加される。いくつかの実施形態では、粒子：細胞の比は、刺激の１日目において１：１であり、刺激の３日目および５日目において１：５に調節される。いくつかの実施形態では、粒子は、毎日または隔日で１日目において１：１の最終比まで追加され、刺激の３日目および５日目において１：５まで追加される。いくつかの実施形態では、粒子：細胞の比は、刺激の１日目において２：１であり、刺激の３日目および５日目において１：１０に調節される。いくつかの実施形態では、粒子は、毎日または隔日で１日目において１：１の最終比まで追加され、刺激の３日目および５日目において１：１０である。当業者は、様々な他の比も使用され得ることを理解するであろう。例えば、比は、粒子のサイズならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するであろう。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＭＩＬを薬剤コーティングビーズと組み合わせ、続いて、ビーズおよび細胞を分離し、次いで、細胞を培養する。いくつかの実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズおよび細胞を分離しないが、一緒に培養する。いくつかの実施形態では、最初に、磁力などの力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより、細胞刺激を誘導する。
【０１２６】
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合された常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＭＩＬと接触させることによってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、細胞およびビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ、１：１の比）は、緩衝液、好ましくは（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）ＰＢＳ中で組み合わされる。当業者は、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解するであろう。例えば、標的細胞は、サンプル中で非常に珍しいものであり得、サンプルのわずか０．０１％を構成し得るか、または全サンプル（すなわち、１００％）は、目的の標的細胞を含み得る。したがって、任意の細胞数が使用され得る。特定の実施形態では、細胞および粒子の最大接触を保証するために、ビーズおよび細胞を一緒に混合する容積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、細胞約２０億個／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、細胞１億個／ｍｌ超が使用される。いくつかの実施形態では、細胞１０００万個、１５００万個、２０００万個、２５００万個、３０００万個、３５００万個、４０００万個、４５００万個、または５０００万個／ｍｌの細胞濃度が使用される。いくつかの実施形態では、細胞７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個または１億個／ｍｌの細胞濃度が使用される。いくつかの実施形態では、細胞１億２５００万または１億５０００万個／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化および細胞エクスパンションの増加をもたらし得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞（例えば、ＣＤ２８陰性細胞）のより効率的な捕捉を可能にする。特定の実施形態では、このような細胞集団は治療価値を有し得、得ることが望ましいであろう。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）〜約１４日間またはその間の任意の整数値時間培養され得る。いくつかの実施形態では、混合物は、２１日間培養され得る。いくつかの実施形態では、ビーズおよびＭＩＬは、約８日間一緒に培養される。いくつかの実施形態では、ビーズおよびＭＩＬは、２〜３日間一緒に培養される。ＭＩＬの培養時間が６０日間またはそれを超えるものであり得るように、数サイクルの刺激も望ましい場合がある。ＭＩＬ培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−α、または当業者に公知の任意の他の細胞成長用添加剤を含む増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０または、Ｘ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のための他の添加剤としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネートおよび還元剤、例えばＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどが挙げられる。培地としては、さらなるアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを含み、無血清であるかまたはＭＩＬの成長およびエクスパンションのために十分な適切な量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモンのセットおよび／もしくは一定量のサイトカインが補充されたＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは実験培養物のみに含められ、被験体に注入すべき細胞の培養物には含められない。標的細胞は、成長を支援するために必要な条件下、例えば適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
【０１２８】
ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞エクスパンションのプロセスにおいて大きく、しかし大部分は再現可能に変動する。したがって、このような再現性は、活性化ＭＩＬ生成物を特定の目的に合わせる能力を可能にする。
【０１２９】
加えて、腫瘍浸潤リンパ球を調製するための方法は、ＭＩＬを調製するために使用され得る。例えば、高用量ＩＬ−２成長条件は、「若い」ＴＩＬを作製するために使用され得、これらの方法は、ＭＩＬの調製に適用可能である（例えば、米国特許第８，３８３，０９９号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＭＩＬはまた、低酸素条件下で活性化および／またはエクスパンションされ得る。低酸素条件下におけるＭＩＬの成長の例は、例えば、国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、被験体由来の骨髄、リンパ球および／または骨髄浸潤リンパ球（「ＭＩＬ」）中の細胞を摘出すること；低酸素環境下で前記細胞をインキュベートし、それにより、活性化ＭＩＬを生産すること；および前記活性化ＭＩＬを被験体に投与することを含み得る。細胞はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体およびサイトカインの存在下で活性化され得る。サイトカイン（Ｃｙｏｔｋｉｎｅｓ）はまた、本明細書に記載されるＭＩＬを活性化するために使用され得る。ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、本明細書に記載されるものの１つ）は、低酸素環境下でＭＩＬをインキュベートする前または後に、細胞にトランスフェクトまたは感染され得る。
【０１３２】
低酸素環境は、約２１％未満の酸素、例えば約２０％未満、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％または約３％未満の酸素を含み得る。例えば、低酸素環境は、約０％の酸素〜約２０％の酸素、例えば約０％の酸素〜約１９％の酸素、約０％の酸素〜約１８％の酸素、約０％の酸素〜約１７％の酸素、約０％の酸素〜約１６％の酸素、約０％の酸素〜約１５％の酸素、約０％の酸素〜約１４％の酸素、約０％の酸素〜約１３％の酸素、約０％の酸素〜約１２％の酸素、約０％の酸素〜約１１％の酸素、約０％の酸素〜約１０％の酸素、約０％の酸素〜約９％の酸素、約０％の酸素〜約８％の酸素、約０％の酸素〜約７％の酸素、約０％の酸素〜約６％の酸素、約０％の酸素〜約５％の酸素、約０％の酸素〜約４％の酸素または約０％の酸素〜約３％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約１％〜約７％の酸素を含む。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約１％〜約２％の酸素である。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約０．５％〜約１．５％の酸素である。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約０．５％〜約２％の酸素である。低酸素環境は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または約０％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態では、低酸素環境は、約７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の酸素を含む。
【０１３３】
低酸素環境下におけるＭＩＬのインキュベートは、例えば、組織培養培地中でＭＩＬを少なくとも約１時間、例えば少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも約１４日間インキュベートすることを含み得る。インキュベートは、ＭＩＬを約１時間〜約３０日間、例えば約１日間〜約２０日間、約１日間〜約１４日間または約１日間〜約１２日間インキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、低酸素環境下におけるＭＩＬのインキュベートは、低酸素環境下でＭＩＬを約２日間〜約５日間インキュベートすることを含む。前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間インキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約３日間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約２日間〜約４日間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素環境下でＭＩＬを約３日〜約４日間インキュベートすることを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、例えば、低酸素環境下でＭＩＬをインキュベートした後に、正常酸素環境下でＭＩＬをインキュベートすることをさらに含む。
【０１３５】
正常酸素環境は、少なくとも約２１％の酸素を含み得る。正常酸素環境は、約５％の酸素〜約３０％の酸素、例えば約１０％の酸素〜約３０％の酸素、約１５％の酸素〜約２５％の酸素、約１８％の酸素〜約２４％の酸素、約１９％の酸素〜約２３％の酸素または約２０％の酸素〜約２２％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態では、正常酸素環境は、約２１％の酸素を含む。
【０１３６】
正常酸素環境下におけるＭＩＬのインキュベートは、例えば、組織培養培地中でＭＩＬを少なくとも約１時間、例えば少なくとも約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、６０時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間またはさらに少なくとも約１４日間インキュベートすることを含み得る。インキュベートは、ＭＩＬを約１時間〜約３０日間、例えば約１日間〜約２０日間、約１日間〜約１４日間、約１日間〜約１２日間または約２日間〜約１２日間インキュベートすることを含み得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、細胞は、正常酸素環境下に置かれた後に、または正常酸素環境に置かれる前に、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸分子をトランスフェクトまたは感染される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、被験体から骨髄サンプルを抽出し、本明細書に記載されるように細胞を培養／インキュベートすることによって得られる。いくつかの実施形態では、骨髄サンプルは、赤血球を除去するために遠心分離される。いくつかの実施形態では、骨髄サンプルは、アフェレーシスに供されないか、またはアフェレーシスによって得られない。いくつかの実施形態では、骨髄サンプルは、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を含まないか、または骨髄サンプルは、ＰＢＬを実質的に含まない。これらの方法は、ＴＩＬとして公知のものと同じものではない細胞を選択する。したがって、ＭＩＬはＴＩＬではない。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、次いで、細胞は、プレート、フラスコまたはバッグにプレーティングされ得る。いくつかの実施形態では、低酸素条件は、９５％窒素および５％ＣＯ２ガス混合物で低酸素チャンバーまたは細胞培養バッグのいずれかを３分間フラッシュすることによって達成され得る。これは、例えば、容器内のＯ２ガスを１〜２％またはそれ未満にし得る。次いで、細胞は、本明細書または国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）の例に記載されているように培養され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲを含む低酸素ＭＩＬが提供される。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約０．５％〜約５％の酸素ガスの環境下にある。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約１％〜約２％の酸素ガスの環境下にある。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約１％〜約３％の酸素ガスの環境下にある。いくつかの実施形態では、低酸素ＭＩＬは、約１％〜約４％の酸素ガスの環境下にある。低酸素ＭＩＬは、低酸素環境（例えば、本明細書に記載される環境）下で一定期間（例えば、本明細書に記載される期間）インキュベートされたＭＩＬである。本明細書に記載されるように、低酸素ＭＩＬはまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズまたは他の類似の活性化試薬の存在下で活性化され得る。したがって、ＣＡＲを含む低酸素ＭＩＬはまた、活性化低酸素ＭＩＬであり得る。
【０１４１】
ＶＩＩ．処置方法
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、ＭＩＬ）が提供される。細胞（または親細胞）は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むベクターでトランスフェクトされ得る。ベクターは、レンチウイルスベクター（ＬＶ）であり得る。例えば、ＬＶは、特異的抗体の抗原認識ドメインと、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢの細胞内ドメインまたはそれらの任意の組み合わせとを併せ持つＣＡＲをコードする。したがって、いくつかの場合では、形質導入ＭＩＬは、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答を誘発し得る。
【０１４２】
一次ＭＩＬの特異性を腫瘍抗原に再指向するためのＣＡＲの使用が本明細書で提供される。したがって、いくつかの実施形態では、哺乳動物における標的細胞集団または組織に対するＭＩＬ媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、ＣＡＲを発現するＭＩＬを前記被験体に投与する工程を含み、前記ＣＡＲが、所定の標的と特異的に相互作用する結合部分と、例えばヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインを含むζ鎖部分と、共刺激シグナリング領域とを含む方法が提供される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現するようにＭＩＬを遺伝子改変し、ＣＡＲ−ＭＩＬをそれを必要とするレシピエントに注入する細胞療法が提供される。注入細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞（または他の標的）を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ−ＭＩＬはインビボで複製して、持続的腫瘍制御につながり得る長期存続をもたらし得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−ＭＩＬは、ロバストなインビボＭＩＬエクスパンションを受けることができ、長期間存続することができる。
【０１４５】
処置され得る癌としては、血管形成されていないかまたはまだ実質的に血管形成されていない腫瘍、ならびに血管形成されている腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。ＣＡＲで処置すべき癌の種類としては、限定されないが、癌腫、芽細胞腫および肉腫、特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫およびメラノーマが挙げられる。成人腫瘍／癌および小児腫瘍／癌も含まれる。
【０１４６】
血液癌は、血液または骨髄の癌である。血液（または造血性）癌の例としては、白血病、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性の白血病および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無症候型およびハイグレード型）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病および骨髄異形成が挙げられる。
【０１４７】
固形腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常含有しない組織の異常腫瘤である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なる種類の固形腫瘍が、それらを形成する細胞の種類によって命名されている（例えば、肉腫、癌腫およびリンパ腫）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞種、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、メラノーマ、ならびにＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合神経膠腫）、神経膠芽細胞腫（多形性神経膠芽細胞腫としても公知である）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が挙げられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの一部分に結合する抗原は、特定の癌を処置するように設計される。例えば、ＣＤ１９をターゲティングするように設計されたＣＡＲは、限定されないが、プレＢ  ＡＬＬ（小児適応）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後サルベージなどを含む癌および障害を処置するために使用され得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２をターゲティングしてびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を処置するように設計され得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、癌および障害としては、限定されないが、プレＢ  ＡＬＬ（小児適応）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種骨髄移植後サルベージなどが挙げられ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＲＯＲ１をターゲティングするＣＡＲの組み合わせを使用して処置され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、メソテリンをターゲティングして中皮腫、膵癌、卵巣癌などを処置するように設計され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、標的ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａをターゲティングして急性骨髄性白血病などを処置するように設計され得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ｃ−Ｍｅｔをターゲティングしてトリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌などを処置するように設計され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＭＡをターゲティングして前立腺癌などを処置するように設計され得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、糖脂質Ｆ７７をターゲティングして前立腺癌などを処置するように設計され得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩをターゲティングして神経膠芽細胞腫などを処置するように設計され得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＧＤ−２をターゲティングして神経芽細胞腫、メラノーマなどを処置するように設計され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲをターゲティングして骨髄腫、肉腫、メラノーマなどを処置するように設計され得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲをターゲティングして骨髄腫、肉腫、メラノーマなどを処置するように設計され得る。
【０１６０】
しかしながら、実施形態は、本明細書に開示される抗原標的および疾患のみに限定されるとみなされるべきではない。むしろ、実施形態は、疾患を処置するためにＣＡＲが使用され得る疾患に関連する任意の抗原標的を含むとみなされるべきである。
【０１６１】
ＣＡＲ改変ＭＩＬはまた、ヒトなど被験体におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のためのワクチンの一種として機能し得る。
【０１６２】
エクスビボ免疫化に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、以下の少なくとも１つをインビトロで行う：ｉ）細胞のエクスパンション、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。いくつかの実施形態では、細胞を哺乳動物に投与する前に、すべての工程を実施する。
【０１６３】
エクスビボ手順は当技術分野で周知であり、以下でより詳細に議論される。簡潔に言えば、細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離され、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変される（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトされる）。治療利益を提供するために、ＣＡＲ−ＭＩＬは、哺乳動物レシピエントに投与され得る。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、ＣＡＲ−ＭＩＬはレシピエントにとって自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントにとって同種、同系または異種であり得る。
【０１６４】
エクスビボ免疫化に関して細胞ベースのワクチンの使用に加えて、患者における抗原に対する免疫応答を誘発するためのインビボ免疫化のための組成物および方法も本明細書で提供される。
【０１６５】
一般に、本明細書に記載されるように活性化およびエクスパンションされた細胞は、免疫不全の個体において生じる疾患の処置および予防において利用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ改変ＭＩＬは、ＣＣＬの処置において使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＣＬを発症するリスクを有する患者の処置において使用される。したがって、ＣＣＬの処置または予防のための方法であって、治療有効量のＣＡＲ改変ＭＩＬをそれを必要とする被験体に投与することを含む方法が提供される。
【０１６６】
ＣＡＲ改変ＭＩＬは単独で、または希釈剤および／または他の成分、例えばＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。簡潔に言えば、医薬組成物は、１つまたはそれを超える薬学的または生理的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；ブドウ糖、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【０１６７】
医薬組成物は、処置（または予防）すべき疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量および回数は、患者の症状、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定され得る。
【０１６８】
「免疫有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が示される場合、投与される組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度の個体差、および患者（被験体）の症状を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＭＩＬを含む医薬組成物は、細胞１０４〜１０９個／ｋｇ体重、好ましくは細胞１０５〜１０６個／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内のすべての整数値を含む）で投与され得ると一般に述べられ得る。ＭＩＬ組成物はまた、これらの投与量で多数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に公知の注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。特定の患者のための最適な投与量および処置レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニタリングし、それに応じて処置を調整することによって、医療分野の当業者によって容易に決定され得る。
【０１６９】
主題組成物の投与は、エアゾール吸引、注射、経口摂取、輸液、植え付けまたは移植を含む任意の好都合な様式で行われ得る。本明細書に記載される組成物は、患者に皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、結節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹腔内投与され得る。いくつかの実施形態では、ＭＩＬ組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＩＬ組成物は、静脈内注射によって投与される。ＭＩＬの組成物は、例えば、腫瘍内、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、または当技術分野で公知の他の方法であって、ＭＩＬを治療レベルまでエクスパンションさせる方法を使用して活性化およびエクスパンションされた細胞は、限定されないが、薬剤による処置、例えばＭＳ患者の場合には抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知である）もしくはナタリズマブ処置、または乾癬患者の場合にはエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者の場合には他の処置を含む任意の多くの関連処置方法と併せて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）、患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去薬、例えばＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または成長因子誘導性シグナリングに重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ  ７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ  ５：７６３−７７３，１９９３）。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、骨髄移植、化学療法薬、例えばフルダラビン、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えばＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用したＭＩＬ除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）、患者に投与される。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法（例えば、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサン）の後に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、高用量の化学療法による標準処置を受け、続いて末梢血幹細胞移植を受け得る。いくつかの実施形態では、移植後に、被験体は、本明細書に記載されるエクスパンション免疫細胞の注入を受ける。いくつかの実施形態では、エクスパンション細胞は、手術の前または後に投与される。
【０１７１】
患者に投与すべき処置の投与量は、処置される症状および処置のレシピエントの正確な性質に応じて変動するであろう。ヒトへの投与のための投与量のスケーリングは、当技術分野で認められている慣例にしたがって実施され得る。例えば、ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、一般に、成人患者の場合には１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常、１〜３０日間にわたって毎日投与される。いくつかの実施形態では、１日用量は１〜１０ｍｇ／日であるが、いくつかの場合では、最大４０ｍｇ／日のより多くの用量が使用され得る（米国特許第６，１２０，７６６号に記載されている）。
【０１７２】
ＶＩＩＩ．被験体
被験体は、ＭＩＬを含む任意の生物であり得る。例えば、被験体は、齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマおよび霊長類から選択され得る。被験体は、マウスまたはヒトであり得る。
【０１７３】
被験体は、新生物を有し得る。新生物は、良性新生物、悪性新生物または二次新生物であり得る。新生物は、癌であり得る。新生物は、リンパ腫または白血病、例えば慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）または急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）であり得る。被験体は、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、乳癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病およびＢ系統悪性腫瘍を有し得る。被験体は、多発性骨髄腫を有し得る。
【０１７４】
被験体は、急性骨髄性白血病、腺癌、骨肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ系統リンパ悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、上皮癌、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、白血病、リンパ腫、肺癌、マンテル細胞リンパ腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、前立腺癌、濾胞性リンパ腫、腎細胞癌腫、横紋筋肉腫を有し得る。
【実施例】
【０１７５】
以下の実施例は、本明細書に記載される方法および組成物の例示であり、限定するものではない。治療において通常直面する様々な条件およびパラメータに関する他の適切な改変および適合であって、当業者に明らかな改変および適合は、実施形態の思想および範囲内である。
【０１７６】
実施例１：ＭＩＬ−ＣＡＲは、Ｂ細胞リンパ腫を処置するために使用される
Ｂ細胞リンパ腫を有する被験体から、ＭＩＬを得る。簡潔に言えば、国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、被験体から骨髄サンプルを得た後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズおよびサイトカインの存在下、低酸素条件下で細胞をインキュベートする。ＣＤ１９の細胞外ドメインと、ＣＤ１９の膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢの細胞内ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸分子をＭＩＬにトランスフェクトする。次いで、正常酸素条件下で細胞を成長させ、エクスパンションする。活性化およびエクスパンションしたＭＩＬを、Ｂ細胞リンパ腫を有する被験体に投与する。被験体のＢ細胞リンパ腫が緩和される。要約すると、本明細書で提供される実施形態および実施例は、ＣＡＲを発現する細胞を有効に使用して癌を処置し得ることを示している。
【０１７７】
実施例２：ＭＩＬ−ＣＡＲは、多発性骨髄腫を処置するために使用される
多発性骨髄腫を有する被験体から、ＭＩＬを得る。簡潔に言えば、国際公開第２０１６０３７０５４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、被験体から骨髄サンプルを得た後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズおよびサイトカインの存在下、低酸素条件下で細胞をインキュベートする。ＣＤ３８の細胞外ドメインと、ＣＤ８の膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢの細胞内ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸分子をＭＩＬにトランスフェクトする。次いで、正常酸素条件下で細胞を成長させ、エクスパンションする。活性化およびエクスパンションしたＭＩＬを、多発性骨髄腫を有する被験体に投与する。被験体の多発性骨髄腫が緩和される。
【０１７８】
本明細書で言及され、および／または出願書類に列挙されている米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献（ＣＡＳ番号を含む）はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
2018518978.tif 000002
2018518978.tif 000003