(57)【要約】有効量の放射線を、有効量のパクリタキセルと１７−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方とを含むミセル組成物と併用して、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することを含む治療方法であって、前記ミセルがポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を含む、方法を提供する。2018518488.tif 000007
2018518488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の放射線を、有効量のパクリタキセルと１７−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方とを含むミセル組成物と併用して、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することを含む治療方法であって、前記ミセルがポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を含む、方法。
【請求項２】
前記放射線及び前記ミセル組成物が、連続的に、同時に、または別々に前記がん細胞に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記放射線が、前記ミセルと連続的に、同時に、または別々に１日〜５日間にわたって投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
放射線が、１Ｇｙ／日〜８Ｇｙ／日の線量で投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ミセル中のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンの薬物負荷が、約５重量％〜約４０重量％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡが、約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリ（エチレングリコール）−ブロックと、約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリ（乳酸）ブロックとを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ミセル組成物が、約２：２：１〜約５：１：１の質量比のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ミセル組成物が、約２：２：１の質量比のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
放射線及び前記ミセル組成物が、インビトロで肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞が対象内に存在する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ミセル組成物が、水性担体を含み、かつ、前記対象に静脈内投与または腹腔内投与される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１３】
前記水性担体が生理食塩水または炭水化物水溶液を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
前記肺がん細胞が非小細胞肺がん細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非小細胞肺がん細胞が、腺がん細胞、扁平上皮がん細胞、または肺大細胞がん細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺がん細胞が小細胞肺がん細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ミセル組成物が、有効量の、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ミセル組成物が、有効量のパクリタキセル及びラパマイシンを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ミセル組成物が、有効量のパクリタキセル及び１７−ＡＡＧを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
有効量の放射線、ならびに、パクリタキセルと１７−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方とを含む有効量のミセル組成物を、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に投与することを含む治療方法であって、前記ミセル組成物が、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）ポリマーである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，１６６号の優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＡＩ１０１１５７に基づき政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本技術は一般に、肺がんの、薬物及び放射線療法の組み合わせ治療に関するものであり、肺がん細胞の増殖及び腫瘍成長の阻害に有用である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本技術は、多剤化学療法と放射線療法との組み合わせを用いた肺がん及び他のがんの治療方法を提供する。驚くべきことに、パクリタキセル、１７−アリルアミノ−１７−ジメトキシ−ゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）、及び／またはラパマイシンの多剤併用を含むミセルが、インビボで肺がん細胞の強力な放射線増感剤であることが見出された。このミセルは、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を含み、このような疎水性抗がん剤を可溶化するのに非常に有効である。扁平上皮細胞がん、腺がん、及び大細胞がんのような非小細胞肺がんを含む、様々な肺がんを本方法によって治療することができる。さらに、脳腫瘍及び食道がんを、本方法を用いて治療することができる。
【０００５】
特に、本方法は、抗がん剤の多剤複合薬の有効量を含むミセル組成物と併用して、有効量の放射線を肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することを含む。このミセルは、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）を含み、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンのうちの２つまたは３つを含み得る。これらのミセルは、同じポリマー及びパクリタキセル単独から調製されたミセルと比較して、改善したがん細胞の放射線増感作用を提供する。特定の実施形態では、ミセル組成物は、約２：２：１〜約５：１：１の質量比のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含み得る。例えば、ミセル組成物は、約２〜８０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル、２〜８０ｍｇ／ｋｇの１７−ＡＡＧ、及び１〜４０ｍｇ／ｋｇのラパマイシンの、２：２：１質量比を有し得る。いくつかの実施形態では、ミセル組成物は、約５重量％〜約４０重量％の、パクリタキセル、ならびに１７−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方の、薬物負荷を含む。本発明の方法のミセルは、ポリ（エチレングリコール）ブロックが約１，５００ｇ／ｍｏｌ〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し得、ポリ（乳酸）ブロックが約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し得る、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを含む。
【０００６】
本方法において、放射線及びミセル組成物は、肺がん細胞（または脳腫瘍細胞もしくは食道がん細胞）に連続的に、同時に、または別々に投与することができる。放射線療法は、例えば、約１〜約８Ｇｙ／日の線量で、及び／または約１日〜約５日間の期間にわたって投与され得る。本方法はまた、インビボまたはインビトロでのがん細胞への投与を含み、インビボ投与は、対象、例えばヒト対象の肺がん細胞（または脳腫瘍細胞もしくは食道がん細胞）に対するものであり得る。生理食塩水またはグルコース溶液などの水性担体を含むミセル組成物は、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に静脈内または腹腔内投与することができる。したがって、いくつかの態様では、本方法は、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシンを含むミセル組成物と併用して有効量の放射線を、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に投与することを含む。
【０００７】
上記の概要は例示的なものに過ぎず、決して限定することを意図するものではない。上記の例示的な態様、実施形態、及び特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、及び特徴が、以下の図面及び詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】薬物であるパクリタキセル（ＰＴＸ）、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン（ＲＡＰ）を含有する１、２、または３薬物負荷ミセルと、放射線処置（ＸＲＴ）とで処置したＡ５４９非小細胞肺がん腺がん（Ａ５４９細胞）の生存率を示す、インビトロクローン原性アッセイの結果を示す。
【図２】放射線（ＸＲＴ）線量（０〜８Ｇｙ）の関数としての、薬物であるパクリタキセル（ＰＴＸ）、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン（ＲＡＰ）を含有する１、２、または３薬物負荷ミセルで処理したＡ５４９細胞の生存率を示す、インビトロクローン原性アッセイの結果を示す。
【図３】時間（日数）の関数としての相対的腫瘍体積の増加率で示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、パクリタキセル負荷ミセル組成物で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ抗がん剤有効性を示す。
【図４】時間（日数）の関数としての相対的体重の増加率として示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ薬物毒性作用を示す。
【図５】時間（日数）の関数としての相対的腫瘍体積の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、高用量（６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセル組成物（トリオリムス（Ｔｒｉｏｌｉｍｕｓ））またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ抗がん剤有効性を示す。
【図６】時間（日数）の関数としてのマウスの相対的体重の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）の有り及び無しでの高用量（６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセル組成物（トリオリムス）またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ薬物毒性作用を示す。
【図７】時間（日数）の関数としての相対的腫瘍体積の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、低用量（１５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセル組成物（トリオリムス）またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ抗がん剤有効性を示す。
【図８】時間（日数）の関数としてのマウスの相対的体重の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）の有り及び無しでの低用量（１５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセル組成物（トリオリムス）またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ薬物毒性作用を示す。
【図９】時間（日数）の関数としての相対的腫瘍体積の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル（ＰＴＸ）／１７−ＡＡＧ負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ抗がん剤有効性を示す。
【図１０】時間（日数）の関数としてのマウスの相対的体重の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル（ＰＴＸ）／１７−ＡＡＧ負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ薬物毒性作用を示す。
【図１１】時間（日数）の関数としての相対的腫瘍体積の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル（ＰＴＸ）／ラパマイシン（ＲＡＰ）負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ抗がん剤有効性を示す。
【図１２】時間（日数）の関数としてのマウスの相対的体重の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）のパクリタキセル（ＰＴＸ）／ラパマイシン（ＲＡＰ）負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ薬物毒性作用を示す。
【図１３】時間（日数）の関数としての相対的腫瘍体積の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）１７−ＡＡＧ／ラパマイシン（ＲＡＰ）負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ抗がん剤有効性を示す。
【図１４】時間（日数）の関数としてのマウスの相対的体重の増加率を示す、照射（ＸＲＴ）有り及び無しでの、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）１７−ＡＡＧ／ラパマイシン（ＲＡＰ）負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物のみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのインビボ薬物毒性作用を示す。
【図１５】１ｎＭ、２ｎＭ、及び３ｎＭのトリオリムス薬物負荷ミセルで処理したＡ５４９細胞の生存率を示す、インビトロクローン原性アッセイの結果を示す。
【図１６】放射線（ＸＲＴ）線量（０〜８Ｇｙ）の関数として、１ｎＭ及び２ｎＭのトリオリムス薬物負荷ミセルで処理したまたは無処理のＡ５４９細胞の生存率を示す、インビトロクローン原性アッセイの結果を示す。
【図１７】（６０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＸ、（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）Ｐ／１７、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）Ｐ／Ｒ、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）１７／Ｒ負荷ミセル組成物、またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスの腫瘍壊死を示す。
【図１８】（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：２．４／２．４／１．２ｍｇ／ｋｇ）低ＴＲＩＯ、（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：１２／１２／６ｍｇ／ｋｇ）中ＴＲＩＯ、及び（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）高ＴＲＩＯ負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスの腫瘍壊死を示す。
【図１９】１日目に（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）ＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置及び１日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ  １日目）、１日目にＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置、３Ｇｙで５日間分割照射（ＸＲＴ）及び６日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ）、１日目にＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置、照射無し、及び６日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ  ６日目）、ビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）、またはビヒクル＋ＸＲＴで処置したＡ５４９細胞接種マウスの腫瘍壊死を示す。
【図２０】（６０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＸ、（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）Ｐ／１７、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）Ｐ／Ｒ、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）１７／Ｒ負荷ミセル組成物、またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）で処理したＡ５４９細胞接種マウスのＫｉ−６７増殖指数を示す。
【図２１】（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：２．４／２．４／１．２ｍｇ／ｋｇ）低ＴＲＩＯ、（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：１２／１２／６ｍｇ／ｋｇ）中ＴＲＩＯ、及び（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）高ＴＲＩＯ負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのＫｉ−６７増殖指数を示す。
【図２２】１日目に（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）ＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置及び１日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ  １日目）、１日目にＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置、３Ｇｙで５日間分割照射（ＸＲＴ）及び６日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ）、１日目にＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置、照射無し、及び６日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ  ６日目）、ビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）、またはビヒクル＋ＸＲＴで処置したＡ５４９細胞接種マウスのＫｉ−６７増殖指数を示す。
【図２３】（６０ｍｇ／ｋｇ）ＰＴＸ、（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）Ｐ／１７、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）Ｐ／Ｒ、（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）１７／Ｒ負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのアポトーシスの測定値としての切断型カスパーゼ３のレベルを示す。
【図２４】（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：２．４／２．４／１．２ｍｇ／ｋｇ）低ＴＲＩＯ、（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：１２／１２／６ｍｇ／ｋｇ）中ＴＲＩＯ、及び（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）高ＴＲＩＯ負荷ミセル組成物またはビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）で処置したＡ５４９細胞接種マウスのアポトーシスの測定値としての切断型カスパーゼ３のレベルを示す。
【図２５】１日目に（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）ＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置及び１日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ  １日目）、１日目にＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置、３Ｇｙで５日間分割照射（ＸＲＴ）及び６日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ）、１日目にＴＲＩＯ負荷ミセル組成物での処置、照射無し、及び６日目に安楽死させた（ＴＲＩＯ  ６日目）、ビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇでのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）、またはビヒクル＋ＸＲＴで処置したＡ５４９細胞接種マウスのアポトーシスの測定値としての切断型カスパーゼ３のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面において、類似の記号は、文脈が他に指示しない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定を意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、他の変更が行われてもよい。
【００１０】
個々の刊行物、特許出願、発行された特許、または他の文書が、その全体の参照により本明細書に組み入れられることが具体的かつ個別に示されているように、本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、発行された特許、及び他の文書は、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる本文に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲で除外される。
【００１１】
本技術は、特定のタイプのミセルによって送達される放射線療法と抗がん剤の多剤組み合わせを併用する驚くべき効果を利用する、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを治療する新しい方法を提供する。ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）は、水難溶性薬物には有利であるが、これに限定されないミセル多剤送達系を形成する。例えば、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡは、肺がん治療において、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンのうちの２つ及び３つの薬物の組み合わせ（例えば、３つの薬物すべてを含むトリオリムスまたはＴＲＩＯ）を安全に送達することができる。パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシンの組み合わせと放射線療法との併用は、併用放射線療法及びパクリタキセル単独のミセル送達よりも大きな抗がん効果をもたらすことが今や発見されている。放射線療法と併用する、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンのような特定の組み合わせは、腫瘍成長を遅くするだけでなく、それらを一緒に停止または逆転させることができる。
【００１２】
したがって、本技術は、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンの有効量を含むミセル組成物と併用して、有効量の放射線療法を投与することを含む、肺がんを治療する方法または肺がん細胞の増殖を阻害する方法を提供し、このミセル組成物は、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、扁平上皮がん、腺がん、及び肺大細胞がんを含むがこれらに限定されない非小細胞肺がん細胞を治療することを含む。他の実施形態では、本方法は、小細胞肺がんを治療することを含む。
【００１３】
ラパマイシン、パクリタキセル、及び／または１７−ＡＡＧの１、２及び３薬製剤は、例えばＵＳ８，８５８，９６５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのような両親媒性ジブロックポリマーを用いて調製することができる。理論に縛られることは望まないが、ポリマーの疎水性ポリ（乳酸）ブロックが各ミセルの内部に向いており、ポリマーの親水性ポリ（エチレングリコール）ブロックが各ミセルの外側に向いていると考えられる。本明細書に記載の薬物は、薬物がミセルによって可溶化され、それによって薬物送達系を形成するように、ミセルと非共有結合的に連関している。例えば、本明細書中に記載される薬物は、ミセルによってカプセル化され、及び／またはミセル膜の中及び／または上に存在し得る。
【００１４】
本方法では、ミセルを形成するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡの各ポリマーブロックは、得られたポリマーが水溶液中でミセルを形成することができる限り、ある範囲の分子量を包含することができる。例えば、ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌであってよく、ポリ（乳酸）ブロックの分子量は約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌであることができる。ポリ（エチレングリコール）ブロックの適切な分子量は、約１，５００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、約８，０００、約１０，０００、約１２，０００、約１４，０００、約２０，０００、約２５，０００、または約３０，０００ｇ／ｍｏｌ、または上記の値の任意の２つの間の範囲内及びそれを含む範囲である。ポリ（乳酸）ブロックの適切な分子量には、約１，５００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約１０，０００、約１２，０００、約１４，０００、約２０，０００、約２５，０００または約３０，０００ｇ／ｍｏｌ、または上記の値の任意の２つの間の範囲内及びそれを含む範囲である。本技術のいくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は約４，０００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌであってよく、ポリ（乳酸）ブロックの分子量は約２，０００〜約５，０００ｇ／ｍｏｌであってよい。特定の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は約１０，０００〜約１４，０００ｇ／ｍｏｌであってよく、ポリ（乳酸）ブロックの分子量は約５，０００〜約７，０００ｇ／ｍｏｌであってよい。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡの分子量の適切な組み合わせの例には、約２，０００〜２，０００（２Ｋ〜２Ｋ）、約３Ｋ〜５Ｋ、約５Ｋ〜３Ｋ、約５Ｋ〜６Ｋ、約６Ｋ〜５Ｋ、約６Ｋ〜６Ｋ、約８Ｋ〜４Ｋ、約４Ｋ〜７Ｋ、約７Ｋ〜３Ｋ、約３Ｋ〜７Ｋ、約１２Ｋ〜６Ｋ、及び／または約６Ｋ〜７Ｋ  ｇ／ｍｏｌが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
本発明の方法において使用されるミセルの複合薬物負荷は、ミセルの重量に対して約５重量％〜約５０重量％（すなわち、重量％は（薬物の合計重量）／（ポリマーの重量）×１００に等しい）であり得る。そのような複合薬物負荷の例には、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％、約５０重量％、または上記の個々の値のいずれかの間の範囲及びそれを含む範囲である。したがって、いくつかの実施形態では、組み合わせた薬物負荷は約５重量％〜約４０重量％、約５重量％〜約３０重量％、約１０重量％〜約４０重量％、約１０重量％〜約３０重量％、約１０重量％〜約２０重量％、または約２０重量％〜約４０重量％である。
【００１６】
上記の複合薬物負荷を条件として、各個々の薬物についてのミセル中の薬物負荷は、ミセルの重量に対して約１重量％〜約２５重量％であってよい。各薬物の薬物負荷はまた、ミセルの重量に対して、約４重量％〜約２４重量％、または約５重量％〜約２０重量％、または約６重量％〜約１５重量％であってよい。個々の薬物負荷の例は、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約８重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％または約２５重量％、または上記の値の任意の２つの間の範囲内及びそれを含む範囲である。
【００１７】
ミセル中の薬物の重量比は変化してもよく、本開示及び特定のがん、使用される薬物の性質、ミセルのタイプ及びサイズ、患者の体重、年齢及び状態ならびに当技術分野で知られている他の関連パラメータを考慮して、当業者によって日常的に調整され得る。例えば、ミセル中の２つの薬物（例えば、パクリタキセル／ラパマイシン、パクリタキセル／１７−ＡＡＧ、及びラパマイシン／１７−ＡＡＧ）の重量比は、約２０：１〜約１：２０であり得る。適切な２つの薬物比は、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、約１：１０、約１：１５、約１：２０、または上記の比の任意の２つの間の範囲内及びそれを含む範囲である。同様に、本方法におけるミセル中の３つの薬物（例えば、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシン）の重量比は、薬物のいずれかが他の成分のいずれかの１０倍までの重量比を有するように変化し得る。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンの適切な３薬物比の例には、約１：１：１０、約１：１：５、約１：２：２、約２：１：２、約２：２：１、約３：２：１、約３：１：２、約２：１：３、約１：５：１、約１：１０：１、約５：１：１、約１：１：１、約１：１：１０または上記の比の任意の範囲内またはそれを含む範囲である。いくつかの実施形態において、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンの重量比は、約２：２：１〜約５：１：１である。
【００１８】
ミセル組成物を介して肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に投与される薬物（例えば、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシン）のそれぞれの量は、約１ｍｇ／ｋｇ（薬物重量／対象重量）〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇであり得る。薬物は、上記のミセル薬物負荷比に従った量で送達され得る。例えば、２：２：１の薬物負荷比では、ミセル組成物を調製し、約２〜約８０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル、約２〜約８０ｍｇ／ｋｇの１７−ＡＡＧ、及び約１〜約４０ｍｇ／ｋｇのラパマイシンを所定の比率で送達することができる。いくつかの実施形態において、約４０〜約８０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル、約４０〜約８０ｍｇ／ｋｇの１７−ＡＡＧ、及び約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇのラパマイシンを対象に投与することができる。２：２：１の質量比を有する送達される薬物の適切な量の例には、これらに限定することはないが、約２／２／１ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン、約１５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン、約３０／３０／１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン、約５０／５０／２５ｇｍ／ｋｇのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン、約６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン、または約７０／７０／３５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシンが挙げられる。
【００１９】
薬物は、個々のＰＥＧ−ＰＬＡミセルに一緒に組み込まれ、それにより、多剤ミセル（ＭＤＭ）を形成することができる。あるいは、薬物を個々にＰＥＧ−ＰＬＡミセルに組み込むことにより、単剤ミセル（ＳＤＭ）を形成することができる。次いで、異なる薬物を含む単剤ミセルを組み合わせて、単剤ミセル複合薬（ＳＤＭＤＣ）組成物を提供することができ、ミセルを単一の水性ビヒクル中で組み合わせて、治療薬物送達製剤を提供することができる。
【００２０】
ミセル組成物は、水性ビヒクルを含むことができ、薬物の濃度は、水性ビヒクルの体積に対して、約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬである。封入された薬物は、水性環境と接触した場合、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの水溶解度を有することができる。
【００２１】
ミセル組成物は、エタノール、ジメチルスルホキシド、ヒマシ油及びヒマシ油誘導体を含むがこれらに限定されない製薬上許容される有機溶媒を実質的に含まないことができる。例えば、ミセル組成物は、約２重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満、または約０．１重量％未満で、エタノール、ジメチルスルホキシド、ヒマシ油及びヒマシ油誘導体を含むがこれらに限定されない、有機溶媒を単独または組み合わせて含むことができる。
【００２２】
本方法において、放射線及びミセル組成物は、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に連続的に、同時に、または別々に投与され得る。例えば、放射線療法は、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシンを含むミセル組成物で細胞を前処理した後、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することができる。放射線療法はまた、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン負荷ミセルの投与前に、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することもできる。さらに、本発明の方法は、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン負荷ミセルの投与と同時に、すなわち同時にまたは重複して、放射線療法を投与することを含むこともできる。本技術の方法はまた、ミセル組成物すなわち、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン負荷ミセルの投与とは別に、例えばこのミセル組成物の投与前または投与後の数日間または数週間の間に、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に放射線療法を投与することを含めることができる。
【００２３】
本方法は、ミセルを用いた多剤複合薬の送達と併用して放射線療法を用いる。本方法のいくつかの態様では、有効量の放射線療法を肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に約１単位（グレイ）／日（Ｇｙ／日）〜約８Ｇｙ／日の範囲の線量で投与することができる。特定の実施形態では、９〜１０Ｇｙ／日のより高い線量を用いることができる。放射線療法の線量はまた、約１Ｇｙ／日〜約５Ｇｙ／日または約１Ｇｙ／日〜約３Ｇｙ／日の範囲で変化し得る。適切な放射線療法の線量の例には、約１、２、３、４、５、６、７、及び８Ｇｙ／日または本明細書に記載の個々の値の間の範囲またはそれを含むが、これらに限定されない。本発明の方法における有効量の放射線及び／または薬物負荷ミセル組成物の特定の量は、対象の、疾患の状態、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食事、投与間隔、投与経路、排泄速度、及び薬物の組み合わせに依存して調整できる。有効量を含有する上記の投与形態のいずれも、日常的な実験の範囲内であり、したがって、本技術の範囲内にある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、約１日〜約５日間にわたって、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に放射線療法を、ミセル組成物の投与と重複してまたは順次、与えることを含むことができる。例えば、放射線療法は、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシンの有効量を含むミセル組成物での前処置後、約１日〜約５日間、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することができる。放射線療法の適切な期間の例には、約１日または約１日〜約２、３、４、または約５日間が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法はまた、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン負荷ミセルの投与と同時にまたはそれとは別々に、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に放射線療法をある期間にわたって投与することを含むことができる。例えば、放射線療法は、薬物負荷ミセルと同時に、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ミセル組成物と併用して複数ラウンドの放射線量を投与することができる。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはさらに１０ラウンドの放射線／ミセル組成物用量を、数日間または数週間または数ヶ月間の各ラウンドの間に投与することができる。いくつかの実施形態において、ラウンドの放射線／ミセル組成物は、４、５、６、７、８、９、または１０日間の間隔で投与され、他の実施形態では、ラウンドは、１、２、３、４、５、６、７、または８週間の間隔で、または１、２、３、４、５、または６ヶ月間隔であってもよい。ラウンド数及び各ラウンド間の間隔の選択は、当技術分野の技術範囲及び日常的な実験の範囲内であり、したがって、本技術の範囲内にある。
【００２６】
いくつかの態様では、本発明の方法は、本明細書に記載のミセル組成物と併用する有効量の放射線療法の肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞へのインビトロ投与を含むことができる。例えば、本発明の方法は、実験室培養物または当業者に知られている任意の同様のインビトロ細胞増殖手法から採取した肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に、有効量の放射線療法をパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン負荷したミセルを併用して投与することを含むことができる。さらに、有効量の放射線療法は、薬物負荷ミセルと併用して本明細書に記載された線量範囲のいずれかで、連続的に、同時、または別々に、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞にインビトロで投与することができる。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明の方法は、インビボで、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に、薬物負荷ミセル組成物と併用して有効量の放射線療法を投与することを含む。いくつかの実施形態において、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞は、対象、例えばヒトまたは動物対象（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、サルなど）中に存在する。特定の実施形態では、ミセル組成物は水性担体を含み、かつ対象に静脈内投与または腹腔内投与される。
【００２８】
水性担体は、生理食塩水または炭水化物水溶液を含んでいてよい。水性担体は、生理食塩水または炭水化物水溶液、例えば、０．９％ＮａＣｌ溶液または５％糖水溶液を含み得る。糖水溶液は、例えば、デキストロースまたはグルコースであり得る。水性担体はまた、水溶性塩例えばＮａＣｌの、任意の滅菌水溶液であってもよい。水溶液はまた、等張であり得る。水溶液は、適切に緩衝されていてもよい。本明細書に記載の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、及び腫瘍内注射に適し得る。適切な滅菌水性媒体を購入することができ、または当業者に周知の標準的な技術によって調製することができる。
【００２９】
いくつかの態様では、本発明の方法は、薬物パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシンを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル組成物と併用して、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に有効量の放射線療法を投与することを含む。
【００３０】
定義
以下の用語は、以下で定義されて、全体を通じて使用される。
【００３１】
「及び／または」という用語は、項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、またはこの用語が関連するすべての項目を意味する。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「１つの（ｏｎｅ）」などの単数の冠詞は、単数形または複数形を指すものとする。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙または「否定的」制限の使用に関連して、「単独で」、「唯一の」などのような排他的な用語を使用するための前提として役立つことを意図している。
【００３３】
用語「約」は、指定された値の±１０％までの変動を指すことができる。例えば、「約５０」は、いくつかの実施形態では４５％〜５５％の変動を有することができる。他の実施形態において、「約」は、±１％、±２％、または±５％の変動を意味し得る。本明細書中で他に示されない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物または実施形態の機能に関して同等である列挙された範囲に最も近い値、例えば重量パーセントを含むことが意図される。さらに、本明細書で他に示されない限り、列挙された範囲（例えば、重量百分率）は、範囲内の各特定の値、整数、小数、または同一性を含む。
【００３４】
本発明の文脈内での「治療する」または「治療」は、障害または疾患に関連する症状の全部または一部の緩和、またはこれらの症状の進行または悪化の遅延または停止を意味する。治療の非限定的な例としては、本明細書に記載の１つ以上の化合物または組成物の有効量または治療有効量を投与により受けた後に、例えば、これらに限定するものではないが、対象が、腫瘍サイズの縮小（例えば、腫瘍体積の減少）、罹患率及び死亡率の低下、またはそれに関連する生活の質の改善などの、肺がんの１つ以上の徴候及び症状の、観察可能及び／または測定可能な減少、または消失を示す場合に、対象は肺がんを成功裏に治療できる。ヒトを含む哺乳動物の、本明細書で定義される治療は、哺乳動物の状態を直接的または間接的に改善する目的で、医療的援助を受けることである。治療は、典型的には、本明細書に記載されるような有効量の薬物負荷ミセル組成物の投与を指す。
【００３５】
有効量の薬物負荷ミセル組成物の「投与」には、例えば、非経口投与または局所投与が含まれる。非経口は、例えば、静脈内などの注入、注射によるものであり得、患者は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。非経口または全身投与には、皮下、静脈内、腹腔内、及び筋肉内注射が含まれるが、これらに限定されない。注射用投与形態または本発明の方法は、一般に、本明細書に記載の水性懸濁液などの水性懸濁液を含むが、これに限定されない。局所投与には、一般に、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液及びパッチが含まれるが、これらに限定されない。例えば、エアロゾルスプレーは、薬物負荷ミセル、オレイン酸、トリクロロモノフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、及び標準の計量投与エアゾルディスペンサーを用いて調製することができる。投与すると、ミセルは完全なままで循環し、個々のポリマー鎖に解離し、活性剤を放出し（拡散またはミセル組成解離のいずれかによって）、組織（例えば、腫瘍）に分配し、及び／または腎クリアランスを受ける。これらの事象のスケジュールは、特異的で予測することはできず、これらの事象は、パクリタキセル、ラパマイシンまたは１７−ＡＡＧなどの活性薬物の抗腫瘍活性に有意に影響を及ぼす。
【００３６】
「有効量」は、所望の効果を生じるために必要とされる化合物、組成物または治療（例えば、放射線療法）の量を指す。したがって、治療の文脈における本技術の化合物または組成物の「治療上有効な量」は、障害または疾患に関連する症状を全体的にまたは部分的に緩和するか、これらの症状のさらなる進行または悪化を遅らせるまたは止める。予防の文脈において、治療有効量は、疾患または障害を発症するリスクのある対象における疾患または障害を予防するまたは予防法を提供する。特定の障害または疾患を治療するための本明細書に記載の化合物の治療有効量を決定することは、本開示を考慮すると十分に当業者の範囲内にある。肺がんの場合、化合物または組成物の有効量は、肺がん細胞の数を減少でき、腫瘍のサイズを縮小でき、腫瘍成長をある程度阻害でき及び／または障害に関連する１つ以上の症状をある程度緩和でき、末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害でき（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害できる（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）。腫瘍休眠または微小転移巣の治療のためには、化合物または組成物の治療的有効量は、微小転移巣の数または増殖を減少させることができ、休眠している腫瘍の増殖を低減または予防でき、または（例えば、手術、放射線療法、または化学療法などの抗がん療法を使用する）治療または除去後の腫瘍の再発を低減または予防できる。化合物または組成物が既存のがん細胞の増殖を防止及び／または死滅させることができる範囲で、それは細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。がん治療のためには、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、無病生存期間（ＤＦＳ）、病期進行までの時間（ＴＴＰ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、奏効率（ＲＲ）、応答の持続時間、寛解の時間、及び／または生活の質を評価することによって測定することができる。有効量は、無病生存期間（ＤＦＳ）を改善でき、全生存期間（ＯＳ）を改善でき、再発の可能性を低下させ得、再発までの時間を延長でき、遠隔再発（すなわち、原発部位以外の再発）までの時間を延長でき、がんを治癒でき、がんの症状を改善でき（例えば、がん特異的調査を用いて測定される）、二次原発がんの出現を減少させ得ることなどを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される放射線及び１つまたは複数の薬物の有効量は、相乗的であり、例えば、それらは相加効果以上の効果を有するか、またはいずれかの薬物単独では生成できない効果を生じる。
【００３７】
用語「がん」及び「がん性」は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする動物細胞における生理学的状態を指し、または記載する。この定義には、良性及び悪性のがんならびに休眠腫瘍または微小転移が含まれる。がんの例には、がん腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例には、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんのような肺がんならびに脳腫瘍及び食道がんが含まれる。
【００３８】
本方法における「肺がん」または「肺がん細胞」という用語には、３つの主な型及び肺がんの対応するサブタイプが含まれるが、これらに限定されない。肺がんのタイプ及びサブタイプの例には、非小細胞肺がん（扁平上皮細胞がん、腺がん及び大細胞がんを含む）、小細胞肺がん（エン麦細胞がんを含む）及び肺カルチノイド腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
「転移」という用語は、原発部位から身体の他の場所へのがんの広がりを指す。がん細胞は、原発腫瘍から逸脱し、リンパ系及び血管に浸透し、リンパ系または血流を循環し、リンパまたは血管を出て、体内の他の正常組織に付着して増殖することによって転移し得る。転移は局所的または遠隔的であり得る。新しい部位では、細胞が再生し、血液供給を確立し、増殖して二次腫瘍、すなわち転移性腫瘍を形成することができる。腫瘍細胞内の刺激性及び阻害性の両方の分子経路がこの挙動を調節し、遠隔部位における腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用もまた重要である。
【００４０】
「微小転移」という用語は、原発腫瘍から身体の他の部分に広がっている少数の細胞を指す。微小転移は、スクリーニングまたは診断検査において検出されてもされなくてもよい。
【００４１】
「腫瘍」という用語は、悪性または良性のすべての新生物細胞成長及び増殖、ならびにすべての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。
【００４２】
新生物、腫瘍成長、または腫瘍もしくはがん細胞増殖の文脈における「阻害する」または「阻害」または「阻害すること」という用語。例えば、阻害には、原発腫瘍または二次腫瘍の出現の遅延、原発または二次腫瘍の発生の遅延、原発または二次腫瘍の発生の減少、疾患の二次的影響の鈍化または低下、腫瘍成長の停止、腫瘍の退行などが含まれ得るが、これらに限定されない。極端な場合、完全な阻害は、予防、化学予防、腫瘍退縮、または完全な腫瘍退行と呼ぶことができる。阻害は、治療の非存在下で生じるであろう進行に関して、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または約９０％阻害であり得る。
【００４３】
「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物、例えばネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類を指す。典型的には、対象はヒトであり、好ましくは肺がんのようながんを有するか有すると疑われるヒトである。用語「対象」及び「患者」は、交換可能に使用することができる。
【００４４】
当業者には理解されるように、任意の及びすべての目的のために、特に書面による説明を提供する観点から、本明細書に開示されるすべての範囲は、その可能な部分範囲及び部分範囲の組み合わせをも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも同等の半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に記述し、可能にすることを容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で説明する各範囲は、下方３分の１、中間３分の１及び上方３分の１などに容易に分解することができる。当業者には理解されるように、「〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、及び「より小さい」などのすべての用語は、列挙された数字を含み、上述したように部分的な範囲に分割することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の原子を有する基は、１、２、または３個の原子を有する基を指す。同様に、１〜５個の原子を有する基は、１、２、３、４、または５個の原子を有する基などを指す。
【００４５】
パクリタキセル（ＰＴＸまたはＰ）は、既知の化学療法薬である。本明細書の製剤においてパクリタキセルと交換され得るパクリタキセル誘導体には、ドセタキセル及び他の既知の誘導体が含まれる。
【００４６】
１７−アリルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧまたは１７）は、周知の天然物ゲルダナマイシンの誘導体である。ゲルダナマイシンは、生産生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｖａｒ．ｇｅｌｄａｎｕｓ  ＮＲＲＬ  ３６０２を培養することによって得ることができる。米国特許第４，２６１，９８９号（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されるように、化合物１７−ＡＡＧは、ゲルダナマイシンとアリルアミンとの反応により、半合成的にゲルダナマイシンから製造され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
放射線増感剤は、放射線療法に対するがん細胞の感受性を高める化合物または組成物である。
【００４８】
シロリムスとしても知られるラパマイシン（ＲＡＰまたはＲ）は、免疫抑制薬及び既知のｍＴｏｒ阻害剤である。ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）は、タンパク質合成及び血管新生を制御する様々なプロセスを制御することによって細胞増殖を駆動する。ｍＴＯＲＣ１の上流のシグナル伝達経路には、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）経路が含まれ、多くのがんにおいて調節不全になることが多い。例えば、肺がんの６０〜７０％がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲＣ１経路活性化を有する。本明細書の製剤においてラパマイシンと交換され得るラパマイシン誘導体には、デフォロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、及びＣＣＩ−７７９が含まれる。
【００４９】
「ミセル」という用語は、形成された溶液中の分子またはイオンと平衡状態で存在するコロイド状の寸法の粒子を指す。一般に、ミセルの例は、水溶液中で球状に凝集する脂質様分子を含むが、これに限定されない。溶液中のミセル形成は、表面活性分子またはイオンが凝集してミセルを形成するミセル化と呼ばれるプロセスによって生じる。例えば、ミセルは、両親媒性分子またはポリマーから形成することができる。本発明の方法は、カプセル化することができる親油性コアを含む両親媒性ポリマーから形成されたコア−シェル構造であるミセルを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）は、ミセルを形成する一種の両親媒性ブロックコポリマーである。
【００５０】
本技術のミセル組成物は、薬物で、例えば、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシンで負荷された本明細書で定義したミセルを含む組成物である。組成物は、水、生理食塩水、炭水化物水溶液などを含む水性担体を含むことができる。
【００５１】
用語「ＰＥＧ−ＰＬＡ」または「ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ」は、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）を意味する。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはポリ（エチレンオキシド）、ブロックは、エチレンオキシドの重合によって調製されたエチレンオキシドのポリマー（またはオリゴマー）である。ＰＥＧは、約３００ｇ／ｍｏｌ〜約１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量で市販されている。商業的、化学的、及び生物学的なものを含む、ＰＥＧの多くの用途がある。ＰＥＧの用途の１つの例は、ＰＥＧが両親媒性コポリマーの親水性ブロックとして使用されてミセル及び他のタイプの人工小胞を作製する化学的及び生物学的薬物の研究である。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ブロックは、（Ｄ−乳酸）、（Ｌ−乳酸）、（Ｄ、Ｌ−乳酸）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。ＰＬＡは、種々の周知の合成製剤を有する乳酸のポリエステルである。ＰＬＡは、しばしば、ミセル及び他のタイプの人工小胞を作製するための両親媒性コポリマーの疎水性ブロックとして役立つ。様々な形態のＰＥＧ及びＰＬＡが市販されているか、またはそれらは当業者に周知の方法に従って調製することができる。
【００５２】
用語「薬物負荷」は、ミセルによる、パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン、または本明細書に記載の誘導体の薬物及び／または薬物の組み合わせをカプセル化する能力を指す。多剤ミセルの薬物負荷は、単剤ミセルの薬物負荷能力に近似し、等しく、またはそれを上回ることができる。
【００５３】
本発明の方法における「放射線療法」、「放射線」または「照射」という用語は、その能力を制限するために細胞に十分な損傷を誘発して、正常に機能する能力を制限し、または細胞を完全に破壊することができる、指向性Ｘ線、ガンマ線、ベータ線または荷電粒子の使用を意味する。例えば、高線量のＸ線を用いてがんを治療することができる。放射線療法の投与は、外的または内的であり得る。例えば、体外照射療法は、Ｘ線照射療法（ＸＲＴ）を投与するために、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−ＲＡＤ  ３２０（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−Ｒａｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）などの高エネルギー線でがん細胞を標的にする機械によって投与することができる。治療の線量及び持続時間を決定するための多くの方法が当技術分野で知られていることが理解されるであろう。典型的な治療は１回投与として与えられ、典型的な線量は１日あたり約１〜２００単位（グレイ）の範囲である。例えば、肺がんを有する対象は、約１〜約８Ｇｙ／日で約１日〜約５日間照射することができる。
【００５４】
「化学療法薬（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」、「化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｇｅｎｔ）」、「化学療法薬剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｄｒｕｇ）」または「化学療法的薬剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ）」という用語は、転移もしくは新生物の増殖を低減、予防、緩和、制限、及び／または遅延させる薬物、または新生物または他の機構の壊死またはアポトーシスによって直接新生物細胞を死滅させる薬物、または他の方法で薬学的に有効な量で使用して、新生物疾患を有する対象における転移もしくは新生物の増殖を低減、予防、緩和、制限及び／または遅延させることができる薬物を指す。化学療法薬には、がんの治療に有用な化学化合物が含まれる。化学療法薬の例としては、タキソール及びパクリタキセルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書の実施例は、本技術の利点を説明し、本技術を使用して当業者をさらに補助するために提供される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本技術の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。実施例は、本明細書に記載の本技術の変形、態様または態様のいずれかを含むことができ、または取り込むことができる。本明細書に記載された変形形態、態様または態様はまた、本技術の任意のまたはすべての変形形態、態様または態様の変形形態をさらに含むかまたは組み込むことができる。
【実施例】
【００５６】
材料
この一般的手法のための材料には、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＣＡＮ）から購入した、分子量４０００ｇ／ｍｏｌのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及び分子量２２００ｇ／ｍｏｌのポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有するポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を含む。抗がん剤パクリタキセル（ＰＴＸ）、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）、及びラパマイシン（ＲＡＰ）は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から購入した。Ａ５４９非小細胞肺がん腺がん（Ａ５４９細胞）はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。クリスタルバイオレットはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。他のすべての試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ）から入手し、分析等級であった。６〜８週齢のメス無胸腺ヌードマウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。
【００５７】
一般的手法
１：薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの調製と特性評価
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを伴う抗がん剤ＰＴＸ、１７−ＡＡＧ、及びＲＡＰの１つ、２つまたは３つを、適切な水混和性溶媒、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールまたはアセトニトリルに、所望であれば、ミキシング及び／または超音波処理して、溶解した。溶媒を、例えば、凍結乾燥によって除去して、薬物負荷したミセルを得た。薬物負荷ミセルは、水性担体、例えば生理食塩水を用いて再水和され、そして例えば濾過及び／または遠心分離によって単離され得る。
【００５８】
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて、固定角１７３°で２５℃での薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのＺ平均直径及び多分散指数（ＰＤＩ）を測定した。測定前に、薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを生理食塩水で５０倍に希釈した。
【００５９】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの薬物含量を、逆相Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）によって定量化した。１０μＬの薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル溶液を９９０μＬのアセトニトリルに溶解した。溶解した溶液１０μＬを流速１．０ｍＬ／分、実行時間２０分及び４０℃のカラムオーブン温度で、Ｚｏｒｂａｘ  ＲＸ−Ｃ８分析カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、粒径５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に注入した。ＰＴＸ、１７−ＡＡＧ、及びＲＡＰの分離は、均一濃度条件下で５５％のアセトニトリル及び０．１％のリン酸及び１％メタノールを含有する４５％の水からなる移動相によって達成した。ＰＴＸ、１７−ＡＡＧ、及びＲＡＰは、それぞれ２２７、３３３、及び２７９ｎｍで検出された。ＰＴＸ、１７−ＡＡＧ、及びＲＡＰの保持時間は、それぞれ３分、４分、及び１１分であった。
【００６０】
２：Ａ５４９細胞培養
Ａ５４９細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。Ａ５４９細胞を加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で維持した。
【００６１】
３：インビトロクローン原性アッセイ
クローン原性アッセイ法では、１３７Ｃｓ照射器（ＪＬ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  Ｍｏｄｅｌ  １０９  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ、ＪＬ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、ＣＡ）を用いて、３０Ｇｙの照射によりＡ５４９細胞の支持細胞層を調製した。支持細胞層及び非照射Ａ５４９細胞を、６ウェルプレート上に合計２５００細胞／ウェルで播種した。播種後、細胞を一晩インキュベートした。次いで、Ａ５４９細胞を１、２、または３薬物負荷ミセルで１〜３ｎＭにて前処理した。その後、細胞を０〜８Ｇｙの電離放射線（ＸＲＴ）に供した。放射線処置の７日後、Ａ５４９細胞培地を１回リフレッシュし、さらに３日間インキュベートした。インキュベーション期間後、培地を除去し、Ａ５４９細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄した。次いで、０．５％クリスタルバイオレット／メタノール溶液でＡ５４９細胞を３７℃で１５分間染色し、５０個の凝集細胞のカットオフを用いてコロニー数を計数した。コロニー形成率（ＰＥ）は（コロニー数）／（接種した非照射細胞数）として計算した。Ａ５４９細胞のクローン原性生存は、（ＰＥ／無処置のＰＥ）として定義した。生存率（ＳＦ）は、各処置の（ＰＥ）／（０ＧｙでのＰＥ）として計算した。線形二次方程式：ＳＦ＝ｅｘｐ（αＤ＋βＤ２）を用いてフィッティング曲線をＳＦに適用し、式中、ＤはＦｒａｎｋｅｎ  ＮＡＰ、Ｒｏｄｅｒｍｏｎｄ  ＨＭ、Ｓｔａｐ  Ｊ、Ｈａｖｅｍａｎ  Ｊ、Ｂｒｅｅ  Ｃｖ．Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（５）：２３１５−９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００６．３３９．の手法による照射線量であった。カーブフィッティングの式から、各処置群の細胞の５０％を殺滅させるために必要な放射線量を計算し、薬物を伴わない５０％細胞殺滅をもたらす放射線量／薬物を伴う５０％細胞殺滅をもたらす放射線量として定義される増感剤増強比（ＳＥＲ）を評価した。
【００６２】
４：照射有りまたは無しでの薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのインビボ抗がん有効性
インビボ薬物負荷ミセル有効性手法のために、Ａ５４９細胞を、トリプシン処理後のサブコンフルエントな培養物から採取した。マウスを１．５％イソフルラン／酸素で麻酔し、この状態を１％イソフルラン／酸素で維持した。次いで、マウスに、腰背部右側にＡ５４９細胞を皮下接種した（１００μＬ、２×１０６細胞／動物）。腫瘍体積は、０．５×ａ×ｂ２として計算され、腫瘍のより大きい直径として「ａ」、腫瘍のより小さい直径として「ｂ」が用いられた。約１５０ｍｍ３の腫瘍体積に達した後、マウスを以下のように１４群（ｎ＝４）に無作為化した：１．６０ｍｇ／ｋｇでのＰＴＸと放射線（ＰＴＸ＋ＸＲＴ）。２．６０ｍｇ／ｋｇでのＰＴＸ。３．ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）と放射線（Ｐ／１７＋ＸＲＴ）。４．ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）（Ｐ／１７）。５．ＰＴＸ／ＲＡＰ（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）と放射線（Ｐ／Ｒ＋ＸＲＴ）。６．ＰＴＸ／ＲＡＰ（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）（Ｐ／Ｒ）。７．１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）と放射線（１７／Ｒ＋ＸＲＴ）。８．１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）（１７／Ｒ）。９．高用量トリオリムス（６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ）と放射線（高ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ）。１０．高用量トリオリムス（６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ）（高ＴＲＩＯ）。１１．中用量トリオリムス（１５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ）と放射線（中ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ）。１２．中用量のトリオリムス（１５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ）（中ＴＲＩＯ）。１３．ビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇの空のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル）とＸＲＴ（ビヒクル＋ＸＲＴ）。１４．ビヒクル（１０５ｍｇ／ｋｇの空のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル）（ビヒクル）。各用量について、２００μＬ／マウス体重２０ｇを麻酔したヌードマウスに静脈内投与した。薬物負荷ミセルと放射線処置を組み合わせた群では、放射線照射前にＡ５４９細胞接種マウス（Ａ５４９マウス）を薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルで処置し、次いでこのＡ５４９マウスを５日間３Ｇｙ／日の放射線にかけた。Ａ５４９マウスの体重及び腫瘍の直径を、ポータブルスケール及びデジタルキャリパー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）によってそれぞれ記録した。この研究のために使用したすべてのマウスは、腫瘍体積が最初の腫瘍体積から４００％に達した、または８５日目に達したときに安楽死させた。すべての動物実験はＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、施設及びＮＩＨガイダンスに従って実施された。
【００６３】
５：血液学的、組織学的、及び免疫組織化学的分析
ＰＴＸ（６０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ／１７（６０／６０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ／Ｒ（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）、１７／Ｒ（６０／３０ｍｇ／ｋｇ）、高ＴＲＩＯ（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ）、中ＴＲＩＯ（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：１２／１２／６ｍｇ／ｋｇ）、低ＴＲＩＯ（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ：２．４／２．４／１．２ｍｇ／ｋｇ）、及びビヒクル対照（ＰＥＧ−ＰＬＡのみ：１０５ｍｇ／ｋｇ）を、Ａ５４９腫瘍を有するメス無胸腺ヌードマウスに静脈注射した。注射の２４時間後に動物を安楽死させた。トリオリムスの後にＸＲＴ処置群を評価するために、高ＴＲＩＯを１日目に静脈注射し、続いて３Ｇｙを５日間で分割照射した。６日目に、動物を安楽死させた（ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ群）。対照群は、ビヒクル注入後のＸＲＴ処置を受けた（ビヒクル＋ＸＲＴ群）。
【００６４】
安楽死させる直前に、リチウムヘパリン及びＫ２ＥＤＴＡ被覆管の両方で全血を採取した。リチウムヘパリン被覆管の全血を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、包括的生化学的検査の血漿を分離した。Ｋ２ＥＤＴＡ被覆管の全血を完全血球算定（ＣＢＣ）に使用した。ＣＢＣ及び包括的生化学的検査は、ウィスコンシン州マディソンのウィスコンシン大学の獣医学部の臨床病理学研究所によって実施された。
【００６５】
腫瘍及び正常組織を、１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、勾配したエチルアルコールで脱水し、パラフィン包埋し、５μｍで切断し、帯電ガラススライド上に載せた。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び脳を含む腫瘍及び正常組織のＨ＆Ｅ染色切片を、標準的な手法に従って調製した。組織壊死は、全腫瘍面積のパーセントとして光学顕微鏡検査によって評価した。正常組織切片を、処置を知らない観察者による臓器毒性の形態学的証拠について評価した。Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄプラットフォーム上で、ＤａＶｉｎｃｉ抗体希釈液及びＣａｔ−Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを除く独自のＶｅｎｔａｎａ−Ｒｏｃｈｅ試薬（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、Ｋｉ−６７、切断型カスパーゼ−３、Ａｋｔ、ホスホ−Ａｋｔ及びＨｓｐ７０に対する免疫染色を実施した。スライドを脱パラフィンし、約４４分間ＣＣ１緩衝液（ＥＤＴＡ緩衝液）を用いて「細胞コンディショニング」の形態で熱誘起エピトープ回収を行った。Ｋｉ−６７検出のために、次いで、スライドを抗ヒトＫｉ−６７抗体（ウサギモノクローナル、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と、１：１００、２８分間３７℃でインキュベートし、すすぎ、ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰと共に１２分間インキュベートした。切断型カスパーゼ−３については、スライドを抗ヒト切断型カスパーゼ−３抗体（ウサギポリクローナル、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と１：４００、２８分間３７℃でインキュベートし、すすぎ、ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰと共に１２分間インキュベートした。Ａｋｔについては、スライドを抗ヒトＡｋｔ抗体（ウサギモノクローナル、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、１：４００、１６分間３７℃でインキュベートし、すすぎ、ＯｍｎｉＭａｐ抗ウサギＨＲＰと共に８分間インキュベートした。ホスホ−Ａｋｔについては、スライドを抗ヒトリン酸−Ａｋｔ抗体（ウサギモノクローナル、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、１：５０、４時間２０℃でインキュベートし、すすぎ、ＵｌｔｒａＭａｐ抗ウサギＨＲＰと共に１２分間インキュベートした。ＨＳＰ７０については、スライドをＨＳＰ７０抗体（マウスモノクローナル、Ａｂｃａｍ）と、１：３２００、２８分間３７℃でインキュベートし、すすぎ、ＵｌｔｒａＭａｐ抗マウスＨＲＰと共に１２分間インキュベートした。次いで、スライドをすすぎ、ＣｈｒｏｍｏＤＡＢ検出試薬と共にインキュベートし、再びすすぎ、蒸留水で１：５に希釈したＢｉｏｃａｒｅ  ＭｅｄｉｃａｌのＣａｔ−Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対比染色した。免疫組織化学的染色は、以下のように評価した：Ｋｉ−６７列挙（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）では、ＩｍｍｕｎｏＲａｔｉｏソフトウェア［２２］を用いて、複製腫瘍１つ当たり４つの代表的な４００Ｘ領域を定量した。複製物１つにつき４回の測定の平均が取られた。切断型カスパーゼについては、陽性細胞を、光学顕微鏡を用いて４つの代表的な４００×生存腫瘍領域において手動で計数し、複製物１つごとに平均４回の測定を行った。細胞質Ａｋｔ、ｐＡＫＴ及びＨ��Ｐ７０免疫反応性を、光学顕微鏡法により半定量的に陰性（１％未満の細胞陽性）、限局性（１〜２５％の細胞陽性）またはびまん性（２５％を超える細胞陽性）と及び染色の強さに基づいて弱い、中程度、強いと評価した。すべての形態学的及び免疫組織化学的評価は、処置群を知らない病理学者によって行われた。
【００６６】
６：統計分析
スチューデントｔ検定を用いて統計解析を行った。両側のｐ値が０．０５未満であれば、差異は統計的に有意であるとみなされた。
【００６７】
実施例１：パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及び／またはラパマイシン負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの調製及び特性評価
薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、一般的手法１で上記した凍結乾燥法により調製した。簡単に説明すると、６ｍｇのＰＴＸ及び１７−ＡＡＧ、３ｍｇのＲＡＰ、及び１０５ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡをシリンダー状のガラス管中で、６０℃で予熱したｔｅｒｔ−ブチルアルコール１ｍＬに溶解し、６０℃で予熱した蒸留水１ｍＬを激しく攪拌しながら急速に添加する。その後、混合溶液をドライアイスで凍結し、凍結乾燥機で−２０℃、１００μＢａｒ（９．８７×１０−４ａｔｍ）で３日間凍結乾燥した。１薬物（ＰＴＸのみ）及び２薬物（ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ、ＰＴＸ／ＲＡＰ、及び１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ）負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルも同様に調製した。凍結乾燥した試料を使用するまで冷凍庫に保存した。使用時に、１．０ｍＬの生理食塩水を添加して、薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを再水和させ、続いて１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過して残渣を除去し、滅菌した。表１は、ミセルのサイズ、多分散性（ＰＤＩ）及び薬物負荷を示す。ＰＴＸ単剤または多剤を可溶化するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、内容物に関係なく、平均Ｚ−直径が約３５ｎｍで、ＰＤＩは０．１２であった。薬物負荷はわずかに粒径を増加させ、ＰＤＩを減少させた。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに負荷されたすべての薬物は、多剤製剤でさえ、高い水溶解性を有していた。ＰＴＸ単剤負荷ミセルは、生理食塩水での再水和の６時間後に沈殿したが、トリオリムス及び２薬物負荷ミセルは、再構成後２４時間まで室温で沈殿しなかった。
【００６８】
（表１）薬物負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのサイズ及びＰＤ１
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【００６９】
実施例２：インビトロでのＡ５４９細胞に対する放射線有りでの１、２、及び３薬物負荷ミセルの有効性
一般的手法３の後、Ａ５４９細胞を１〜３ｎＭでの薬物負荷ミセルＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ（トリオリムス）、または２ｎＭでのＰＴＸ、ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ、ＰＴＸ／ＲＡＰ、もしくは１７−ＡＡＧ／ＲＡＰで前処理した。特性評価を上記のように行った。
【００７０】
Ａ５４９細胞のクローン原性生存に対するトリオリムスの効果を図１５に示す。トリオリムスの阻害効果は用量依存的であり（１ｎＭ：０．９２±０．１３、２ｎＭ：０．５１±０．０７）、３ｎＭのトリオリムスに曝露した後、Ａ５４９細胞は生存しなかった。トリオリムスは、２ｎＭという低い濃度でさえも、クローン原性生存を効果的に阻害した。
【００７１】
放射線増感に対するトリオリムスの効果を図１６に示す。クローン原性生存の結果と同様に、トリオリムスの放射線増感効果は用量依存的であった。興味深いことに、トリオリムスは、２Ｇｙの放射線と組み合わせると、１ｎＭという低さでも有意な放射線増感効果を示した。この効果は、２ｎＭで増加した（１及び２ｎＭでのＳＥＲ値：それぞれ１．５８及び２．２３）。これらの結果は、トリオリムスが強力な放射線増感剤であることを示唆している。
【００７２】
放射線（ＸＲＴ）と共に薬物負荷ミセルとで処理されたＡ５４９細胞は、１、２、及び３薬物負荷ミセルに対して有効な抗がん活性を示した。Ａ５４９細胞のクローン原性生存に及ぼす複合製剤の影響を、固定濃度２ｎＭで単剤（ＰＴＸ）及び二剤Ｐ／１７、Ｐ／Ｒ及び１７／Ｒ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル及びＴＲＩＯを用いて評価した（図１）。興味深いことに、クローン原性生存を阻害した最も有効な複合製剤は、Ｐ／Ｒで、ＰＴＸ、ＴＲＩＯ、Ｐ／１７、及び１７／Ｒが続き、それぞれ以下のクローン原性生存率であった：０．１０±０．０６、０．１６±０．１５、０．５１±０．０７、０．６０±０．１１、及び１．０４±０．０９。放射線増感研究においても同様の傾向が観察された（図２）。Ａ５４９細胞は、８Ｇｙの電離放射線によるＰ／Ｒ処理に特に感受性であった。しかし、ＳＥＲ値が最も強い放射線増感効果はＰＴＸ（３．３４）、続いて、Ｐ／Ｒ（２．９５）、ＴＲＩＯ（２．２３）、Ｐ／１７（１．６２）、及び１７／Ｒ（１．４４）で処理することにより得られたことを明らかにした（表２）。興味深いことに、各製剤中のＲＡＰのモル比が同様であっても、ＰＴＸの放射線増感が１７−ＡＡＧよりも高いことを示唆しているにもかかわらず、Ｐ／Ｒの組み合わせのＳＥＲ値はＰ／１７よりも２倍超であった。トリオリムス及びＰ／１７を比較すると、トリオリムス中のＰＴＸ及び１７−ＡＡＧへのＲＡＰの添加は、ＰＴＸ及び１７−ＡＡＧモル比のわずかな減少にもかかわらず、放射線増感効力を大幅に高めた。トリオリムスにおいて、これらの３薬物の放射線増感効果は、インビトロで相乗効果を達成するようである。
【００７３】
（表２）２ｎＭの濃度における薬物のモル比、及び各ミセルのＳＥＲ値
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【００７４】
実施例３〜８：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有りまたは無しでの１、２、及び３薬物負荷ミセルの有効性
実施例３〜８はすべてインビボ薬物負荷ミセル有効性のための一般的手法４に従い、マウスは腰背部右側にＡ５４９細胞（１００μＬ、細胞２×１０６個／動物）を皮下接種した。腫瘍サイズ１５０ｍｍ３を有するＡ５４９細胞（Ａ５４９マウス）を接種したマウスに、６０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ負荷ミセル（実施例３）、６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（「高ＴＲＩＯ」）（実施例４）、１５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（「中ＴＲＩＯ」）（実施例５）、６０／６０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ負荷ミセル（実施例６）、６０／３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／ＲＡＰ負荷ミセル（実施例７）及び６０／３０ｍｇ／ｋｇ  １７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（実施例８）を、２００μＬ／２０ｇマウス体重の用量で静脈内に投与した。Ａ５４９マウスを、２００μＬ／２０ｇマウス体重で非薬物負荷ミセル（ビヒクル、１０５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのみ）でも処置した。一般的手法４に従って、種々の薬物負荷ミセルまたはビヒクルで処置したＡ５４９マウスに、５日間の３Ｇｙ／日放射線（ＸＲＴ）照射を行った。ＸＲＴと共に種々の薬物負荷ミセルで、種々の薬物負荷ミセルのみで、ＸＲＴと共にビヒクルで、またはビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスの特性評価を、一般的手法４に従って実施した。
【００７５】
実施例３：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有り及び無しでのパクリタキセル負荷ミセルの有効性−（６０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ負荷ミセル）
図３は、時間（日数）の関数としてのＡ５４９細胞増殖速度の割合を示す。ビヒクル対照群と比較して、放射線のみ及びＰＴＸのみは、腫瘍成長をわずかに阻害した。ＸＲＴと共にＰＴＸ負荷ミセルで処理されたＡ５４９マウスは、腫瘍成長速度の適度な低下を示した。研究したすべてのＡ５４９マウスの体重を一般的手法４に従って記録し、図４に示すように時間（日数）の関数としてプロットした。ＸＲＴと共にＰＴＸ負荷ミセル、ＰＴＸ負荷ミセルのみ、ＸＲＴと共にビヒクル及びビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスの体重は、相対体重増加率にほとんど影響を示さなかった。薬物負荷ミセルで処理されたＡ５４９マウスの体重の減少は、高用量薬物治療法の毒性と相関する。図４に示すＰＴＸ負荷ミセル処理Ａ５４９マウスの相対的体重の適度な増加は、ＸＲＴの有無にかかわらず、低い薬物毒性を示唆している。
【００７６】
実施例４：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有り及び無しでの高用量のパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセルの有効性− ６０／６０／３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（高ＴＲＩＯ）
図５は、ＸＲＴと共に高ＴＲＩＯで処置したＡ５４９マウスが、９０日間にわたる腫瘍成長速度の大幅な低下及び１７０日後の完全な腫瘍退行を有することを示す。しかしながら、高ＴＲＩＯのみで処理したＡ５４９マウスまたはＸＲＴと共にビヒクルで処置したＡ５４９マウスは、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して、腫瘍成長速度の控えめな低下を示した。ＸＲＴと共に高ＴＲＩＯで処置したＡ５４９マウスについての結果は、実施例３で議論したＸＲＴを伴うＰＴＸ負荷ミセルで処置したＡ５４９マウス及び、実施例２で議論したインビトロＡ５４９肺がん細胞抗がん効果、と比較して予想外であった。この腫瘍抑制は最大２４週間持続し、その間に局所再発は観察されなかった。したがって、高ＴＲＩＯはインビボで強力な放射線増感剤であることが確認された。さらに、図６は、ＸＲＴと共に高ＴＲＩＯで、高ＴＲＩＯのみで、ＸＲＴと共にビヒクルで、またはビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスにおける低薬物毒性を示す。図６は、すべての高ＴＲＩＯまたはビヒクル処置Ａ５４９マウスについての時間の関数として測定したＡ５４９マウスにおける相対的体重の増加率を示す。
【００７７】
実施例５：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有りまたは無しでの中用量のパクリタキセル／１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセルの有効性− １５／１５／７．５ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（中ＴＲＩＯ）
図７は、ＸＲＴと共に中ＴＲＩＯで処置したＡ５４９マウスは、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して、９０日間にわたる腫瘍成長速度の中程度の低下を有することを示した。中ＴＲＩＯのみでまたはＸＲＴと共にビヒクルで処置したＡ５４９マウスは、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して、腫瘍成長速度の低下をほとんど示さなかった。さらに、図８はＸＲＴと共に中ＴＲＩＯで、中ＴＲＩＯのみで、ＸＲＴと共にビヒクルで、またはビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスにおける低薬物毒性を示す。図８は、すべての中ＴＲＩＯまたはビヒクルで処置したＡ５４９マウスについて、時間（日数）の関数として測定したＡ５４９マウスの相対的体重の増加率を示し、相対的体重増加率の有意な減少はなかった。
【００７８】
実施例６：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有り及び無しでのパクリタキセル／１７−ＡＡＧ負荷ミセルの有効性− ６０／６０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／１７−ＡＡＧ負荷ミセル（Ｐ／１７）
図９は、ＸＲＴと共にＰＴＸ／１７−ＡＡＧ負荷ミセル（Ｐ／１７＋ＸＲＴ）で処置したＡ５４９マウスは、９０日間にわたる腫瘍成長速度のわずかな低下を示したが、その放射線増感効果はＰＴＸと放射線の組み合わせよりも少なかった。Ｐ／１７のみで、またはＸＲＴと共にビヒクルで処置したＡ５４９マウスは、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して、腫瘍成長速度の低下をほとんど示さなかった。さらに、図１０は、Ｐ／１７＋ＸＲＴで、Ｐ／１７のみで、ＸＲＴと共にビヒクルで、またはビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスにおける低薬物毒性を示す。図１０は、すべてのＰ／１７でまたはビヒクルで処置したＡ５４９マウスについての時間（日数）の関数として測定したＡ５４９マウスの相対的体重の増加率を示し、相対的体重増加率の有意な減少はなかった。
【００７９】
実施例７：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有り及び無しでのパクリタキセル／ラパマイシン負荷ミセルの有効性− ６０／３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ／ＲＡＰ負荷ミセル（Ｐ／Ｒ）
図１１は、ＸＲＴと共にＰ／Ｒ（Ｐ／Ｒ＋ＸＲＴ）で、またはＰ／Ｒのみで処置したＡ５４９マウスが、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して最初の３０日間で腫瘍成長速度の有意な低下を示したことを示す。ＸＲＴと共にビヒクルで処理したＡ５４９マウスは、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して、腫瘍成長速度の低下をほとんど示さなかった。Ｐ／Ｒ＋ＸＲＴはＰ／１７＋ＸＲＴよりも強力であった。しかし、ＰＴＸ＋ＸＲＴと比較して、Ｐ／Ｒ＋ＸＲＴは腫瘍成長遅延を延長しなかった。さらに、図１２は、Ｐ／Ｒ＋ＸＲＴで、Ｐ／Ｒのみで、ＸＲＴと共にビヒクルでまたはビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスにおける低薬物毒性を示す。図１２は、すべてのＰ／Ｒ負荷ミセルまたはビヒクル処置Ａ５４９マウスについての時間（日数）の関数として測定したＡ５４９マウスの相対的体重の増加率を示し、相対的体重増加率の有意な減少はなかった
【００８０】
実施例８：インビボでのＡ５４９細胞に対する放射線有り及び無しでの１７−ＡＡＧ／ラパマイシン負荷ミセルの有効性− ６０／３０ｍｇ／ｋｇ  １７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（１７／Ｒ）
図１３は、他の単剤処置、二剤併用処置、及びトリオリムス処置よりも放射線感受性が低いことを示すインビトロ研究結果にもかかわらず、ＸＲＴと共に１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセル（１７／Ｒ＋ＸＲＴ）で処理したＡ５４９マウスが腫瘍成長を劇的に阻害したことを示す（図２、表２）。１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセルのみでまたはＸＲＴと共にビヒクルで処理したＡ５４９マウスは、ビヒクルのみの腫瘍成長速度と比較して、腫瘍成長速度の有意な低下を示さなかった。さらに、図１４は、１７／Ｒ＋ＸＲＴで、１７／Ｒのみで、ＸＲＴ共にビヒクルで、及びビヒクルのみで処置したＡ５４９マウスにおける低薬物毒性を示す。図１４は、すべての１７−ＡＡＧ／ＲＡＰ負荷ミセルでまたはビヒクルで処置したＡ５４９マウスについての時間（日数）の関数として測定したＡ５４９マウスの相対的体重の増加率を示し、相対的な体重増加率の有意な減少はなかった。
【００８１】
実施例９：腫瘍成長の組織学的及び免疫組織化学的分析
一般的手法５に従って、腫瘍成長の組織学的及び免疫組織化学的分析を行った。腫瘍壊死のパーセンテージを図１７〜１９に示す。単剤及び２薬物処置群では、壊死の量はＰＴＸ、Ｐ／Ｒ、及び１７／Ｒの間で類似していた。これらの３つの処置と比較して、Ｐ／１７処置群では比較的少ない壊死が観察された（図１７）。壊死率は、トリオリムス群（ＴＲＩＯ）において薬物濃度の増加と共に減少した（図１８）。ＴＲＩＯ（ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ）への放射線の添加は壊死の量を増加させなかった（図１９）。壊死はトリオリムス処置群で増強され、６日間持続した。壊死のレベルは、ＴＲＩＯ  ６日目とＴＲＩＯ＋ＸＲＴとで同様であり、壊死の誘発はトリオリムス投与によって引き起こされることを示唆している。
【００８２】
単剤、２薬物、及びトリオリムス処置群のＫｉ−６７増殖指数を図２０〜２２に示す。ＰＴＸ及びＰ／１７処置は腫瘍成長を増強した（図２０）。Ｐ／Ｒ及び１７／Ｒ処置の両方は、ビヒクル処置と同様にＫｉ−６７指数を導いた（図２０）。トリオリムス処置群の結果は、より低い薬物濃度がより効果的な抗増殖効果を発揮することを示している（図２１）。ビヒクル＋ＸＲＴ処置群からＫｉ−６７指数の劇的な低下が観察された（図２２）。ＴＲＩＯ群は１日目に抗増殖効果を誘導しなかったが、しかし、６日目のＫｉ−６７値は比較的低かった（図２２）。したがって、高用量トリオリムス（高ＴＲＩＯ）治療の抗増殖効果は即時ではなく、時間の経過と共に起こるようである。ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ群において最も低いＫｉ−６７値が観察され（図２２）、トリオリムスと放射線の組み合わせが腫瘍細胞増殖を強力に阻害することを示した。
【００８３】
理論に拘束されることは望まないが、これらの所見は、トリオリムスと放射線との組み合わせが、薬物治療単独での良好な腫瘍壊死及び放射線単独による好ましい抗増殖効果をもたらすと考えられることを示唆する。この前治療的二重性は、高ＴＲＩＯプラス放射線のインビボ有効性を裏付けている可能性がある。
【００８４】
アポトーシスの尺度としての切断型カスパーゼ３のレベルを図２３〜２５に示す。最も大きな切断型カスパーゼ３レベルがＰ／Ｒ処置群で観察された（図２３）。トリオリムス（図２４）及びＴＲＩＯ＋ＸＲＴ処理（図２５）は、切断型カスパーゼ３のレベルをわずかに増大させたが、これらの効果はＰ／Ｒ処理の効果よりもはるかに少なかった。
【００８５】
ＡＫＴ、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、及びＨＳＰ７０に対する免疫組織化学染色を、適切な対照を用いて行った。結果は、処置群間でわずかに異なっており、タンパク質発現の個体差が定性的免疫組織化学の解像度よりも低い可能性があることを示唆している。ビヒクル群及びＰＴＸ、低ＴＲＩＯ、中ＴＲＩＯ、高ＴＲＩＯ、ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ、及びＴＲＩＯの６日目の腫瘍において、ＡＫＴの中程度のびまん性発現が見られた（表３）。興味深いことに、Ｐ／１７、Ｐ／Ｒ、及び１７／Ｒにおいて、ＡＫＴ発現は、ほとんどが弱かった。ｐＡＫＴの発現は、１７／Ｒ群では本質的に陰性であり、有意な個体差無しに他の処置群では可変的な限局性が見られた。ＨＳＰ７０は、すべての群において強い拡散免疫染色を示した（データは示さず）。
【００８６】
（表３）処置群におけるＡＫＴ及びｐＡＫＴの発現（陽性／総症例）
2018518488.tif 000005
Ｍｏｄ＝中程度。
【００８７】
実施例１０：薬物毒性の血液学的、代謝的、及び組織学的分析
一般的手法５に従って、薬物毒性の血液学的、代謝的、及び組織学的分析を行った。マウスの心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓及び脳の組織学的切片を光学顕微鏡下で検査し、臓器毒性を形態学的に評価した。ほとんどの組織は、病理学的に有意な異常を示さなかった。６匹の動物の肺には、非常に限局性の軽度のリンパ球間質性炎症があった（ビヒクル群で２つ、中ＴＲＩＯ群で１つ、低ＴＲＩＯ群で２つ、Ｐ／１７群で１つ）。２３匹の動物は、ビヒクル群の６匹の動物及びビヒクル＋ＸＲＴ群の２匹を含み、最小の非特異的な周辺慢性炎症を示した。これらの変化は意義不明であるが、それらが最小限であり、多数の対照動物に存在するとすれば、処置に関連する可能性は低い。
【００８８】
ビヒクル、ＰＴＸ、２薬複合製剤、ＴＲＩＯ、及びＴＲＩＯ＋ＸＲＴによる投薬後の包括的な代謝及び血液学的分析を表４に要約する。ＰＴＸ処置は、白血球数を有意に減少させた。統計学的に有意なヘモグロビンの減少が中ＴＲＩＯ群で観察された。低ＴＲＩＯ及びＰ／Ｒ処置群では、統計的に有意な白血球数の減少が観察された。さらに、Ｐ／Ｒ処置群でも赤血球数の統計的に有意な低下が観察された。ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ及びビヒクル＋ＸＲＴ群では、統計的に有意な白血球数の減少が見られた。しかし、この効果は、６日目のＴＲＩＯ群ではもはや明らかではなかった。これは、白血球数の顕著な減少が放射線によって引き起こされた可能性が高いことを示唆している。赤血球への影響は、赤血球数、ヘモグロビン、及びヘマトクリットの統計的に有意な低下がビヒクル＋ＸＲＴ処置群で観察されたため、主に放射線によるものと考えられる。赤血球数、ヘモグロビン及びヘマトクリットのわずかな減少もＴＲＩＯ＋ＸＲＴ処置群で観察され、放射線の悪影響はトリオリムスと組み合わせることによって増加しなかったことが示された。血漿電解質、クレアチニン及び血液尿素窒素の測定によって腎機能を評価した。Ｐ／１７及び１７／Ｒを除くほとんどすべての処置群は、尿素窒素の統計的に有意な増加を示した。クレアチニン値の有意差は、いずれの処置群においても観察されなかった。また、電解質レベルのいくつかは、薬物またはＸＲＴ処置後、Ｐ／１７処置群と１７／Ｒ処置群との両方でのナトリウムレベル及びＰ／Ｒ処置群でのクロライドレベルで統計的に増加した。これらの結果は、薬物及び／またはＸＲＴ治療が腎機能をわずかに混乱させるか、またはわずかな脱水をもたらし得ることを示唆している。
【００８９】
（表４）薬物処置及び放射線処置したマウスの血液学的分析
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＊：ビヒクル群と有意差がある（Ｐ＜０．００５）
＊＊：ビヒクル群と有意差がある（Ｐ＜０．０１）
＊＊＊：ビヒクル群と有意差がある（Ｐ＜０．０５）
ＲＢＣ：赤血球数、ＨＧＢ：ヘモグロビン、ＨＣＴ：ヘマトクリット、ＷＢＣ：白血球数
【００９０】
肝機能は、グルコース、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ及び総ビリルビンレベルを測定することによって評価した。いずれの群においても、グルコース、アルブミン、ＡＬＴ、またはアルカリホスファターゼレベルにおいて有意差は観察されなかった。総ビリルビンは各試料において検出できなかった。しかし、高ＴＲＩＯ、低ＴＲＩＯ、及びＴＲＩＯ＋ＸＲＴ処置群の総タンパク質レベル、ＴＲＩＯ＋ＸＲＴ処置群のグロブリンレベル、ならびに高ＴＲＩＯ及び中ＴＲＩＯ処置群のＡＳＴレベルは有意に増加した。したがって、ＸＲＴ処置の有無にかかわらず、トリオリムスは肝機能に影響を与える可能性があると考えられる。
【００９１】
中ＴＲＩＯ、ＰＴＸ、Ｐ／Ｒ、ビヒクル＋ＸＲＴ、及びＴＲＩＯ６日目処置群の総ＣＯ２レベル、及びＴＲＩＯ６日目処置群のアニオンギャップの有意差も認められ、潜在的に肺機能の変化が示唆された。
【００９２】
一般に、トリオリムスの生体化学反応への変更は、ＰＴＸのみ及び２薬物処置群に匹敵した。６日目にＴＲＩＯ群を試験することにより生体化学反応及び完全な血球数の変化は短い期間であることが明らかとなり、ＣＯ２、アニオンギャップ及び尿素窒素を除くすべての値は、ビヒクル処置群の値と有意差がなかった。
【図１】
2018518488.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月16日(2018.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の、パクリタキセルと、１７−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方とを含むミセル組成物であって、該ミセル組成物はポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）をさらに含み、該ミセル組成物は、有効量の放射線と併用して投与されるように用いられ、かつ該ミセル組成物と該放射線は、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与されるように用いられる、ミセル組成物。
【請求項２】
前記放射線及び前記ミセル組成物が、連続的に、同時に、または別々に前記がん細胞に投与されるように用いられる、請求項１に記載のミセル組成物。
【請求項３】
前記放射線が、前記ミセル組成物と連続的に、同時に、または別々に１日〜５日間にわたって投与されるように用いられる、請求項１〜２のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項４】
前記放射線が、１Ｇｙ／日〜８Ｇｙ／日の間の線量で投与されるように用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項５】
前記ミセル組成物中のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンの薬物負荷が、約５重量％〜約４０重量％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡが、約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリ（エチレングリコール）−ブロックと、約１，５００〜約３０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリ（乳酸）ブロックとを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項７】
約２：２：１〜約５：１：１の質量比のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項８】
約２：２：１の質量比のパクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項９】
前記放射線及び前記ミセル組成物が、インビトロで肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与されるように用いられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項１０】
前記肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞が対象内に存在する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項１１】
前記対象がヒトである、請求項１０に記載のミセル組成物。
【請求項１２】
前記ミセル組成物が、水性担体を含み、かつ、前記対象に静脈内投与または腹腔内投与されるように用いられる、請求項１０または１１に記載のミセル組成物。
【請求項１３】
前記水性担体が生理食塩水または炭水化物水溶液を含む、請求項１２に記載のミセル組成物。
【請求項１４】
前記ミセル組成物が、有効量の、
パクリタキセル、１７−ＡＡＧ、及びラパマイシン；
パクリタキセル及びラパマイシン；または
パクリタキセル及び１７−ＡＡＧ
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のミセル組成物。
【請求項１５】
有効量の、パクリタキセルと、１７−ＡＡＧ及びラパマイシンのうちの一方または両方とを含む、ミセル組成物であって、該ミセル組成物は、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）ポリマーをさらに含み、該ミセル組成物は、有効量の放射線と併用して投与されるように用いられ、かつ該ミセル組成物と該放射線は、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に投与されるように用いられる、ミセル組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
[本発明1001]
有効量の放射線を、有効量のパクリタキセルと17−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方とを含むミセル組成物と併用して、肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与することを含む治療方法であって、前記ミセルがポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を含む、方法。
[本発明1002]
前記放射線及び前記ミセル組成物が、連続的に、同時に、または別々に前記がん細胞に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記放射線が、前記ミセルと連続的に、同時に、または別々に1日〜5日間にわたって投与される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
放射線が、1Ｇｙ／日〜8Ｇｙ／日の線量で投与される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記ミセル中のパクリタキセル、17−ＡＡＧ、及びラパマイシンの薬物負荷が、約5重量％〜約40重量％である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡが、約1，500〜約30，000ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリ（エチレングリコール）−ブロックと、約1，500〜約30，000ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリ（乳酸）ブロックとを含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記ミセル組成物が、約2：2：1〜約5：1：1の質量比のパクリタキセル、17−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記ミセル組成物が、約2：2：1の質量比のパクリタキセル、17−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
放射線及び前記ミセル組成物が、インビトロで肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞に投与される、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記肺がん細胞、脳腫瘍細胞、または食道がん細胞が対象内に存在する、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記対象がヒトである、本発明1011の方法。
[本発明1012]
前記ミセル組成物が、水性担体を含み、かつ、前記対象に静脈内投与または腹腔内投与される、本発明1011または1012の方法。
[本発明1013]
前記水性担体が生理食塩水または炭水化物水溶液を含む、本発明1013の方法。
[本発明1014]
前記肺がん細胞が非小細胞肺がん細胞である、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記非小細胞肺がん細胞が、腺がん細胞、扁平上皮がん細胞、または肺大細胞がん細胞である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記肺がん細胞が小細胞肺がん細胞である、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記ミセル組成物が、有効量の、パクリタキセル、17−ＡＡＧ、及びラパマイシンを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記ミセル組成物が、有効量のパクリタキセル及びラパマイシンを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記ミセル組成物が、有効量のパクリタキセル及び17−ＡＡＧを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1020]
有効量の放射線、ならびに、パクリタキセルと17−ＡＡＧ及びラパマイシンの一方または両方とを含む有効量のミセル組成物を、肺がん、脳腫瘍、または食道がんを有する対象に投与することを含む治療方法であって、前記ミセル組成物が、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（乳酸）ポリマーである、方法。
上記の概要は例示的なものに過ぎず、決して限定することを意図するものではない。上記の例示的な態様、実施形態、及び特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、及び特徴が、以下の図面及び詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。
【国際調査報告】
2018518488.tif 000033
2018518488.tif 000034
2018518488.tif 000035