(57)【要約】  本明細書の発明は、結腸直腸がんを含む、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのヒスタミン産生細菌株を開示する。本発明はまた、男性の結腸直腸がんを含む、がんの治療のための薬剤を製造するためのヒスタミン産生細菌株の使用を開示する。
2018510631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項２】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株が、炎症関連性結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのものである、請求項１に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項３】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株が、男性患者における結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのものである、請求項１又は２に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項４】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株が、結腸直腸がんに罹患している患者における腫瘍の数及び／又はサイズの減少における使用のためのものである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項５】
放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療におけるアジュバントとしての使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項６】
放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療に伴う胃腸障害の予防、阻害又は治療における使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項７】
前記がん治療に伴う下痢の予防、阻害又は治療における使用のための、請求項６に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項８】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株が活性ヒスチジンオペロンを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項９】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株がジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生することができる、請求項１から８までのいずれか一項に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１０】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株がヒスタミン産生ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１１】
前記ヒスタミン産生ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５である、請求項１０に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１２】
前記ヒスタミン産生ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９である、請求項１０に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１３】
前記ヒスタミン産生ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３である、請求項１０に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１４】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株が、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、インターロイキン２２及びインターロイキン６からなる群から選択される少なくとも１種のがん関連サイトカインの産生を抑制することができる、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１５】
前記ヒスタミン産生乳酸菌株が、脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋未成熟骨髄細胞の存在量を低減することができる、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株。
【請求項１６】
結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択する方法であって、
活性ヒスチジンオペロンの存在について乳酸菌をスクリーニングすること；及び
活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生が可能である乳酸菌株として同定された、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択すること
を含む上記方法。
【請求項１７】
前記乳酸菌をスクリーニングすることが、前記活性ヒスチジンオペロンの存在及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力について乳酸菌をスクリーニングすることを含み；並びに
前記乳酸菌株を選択することが、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能である乳酸菌株として同定された、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択する方法であって、
乳酸菌を活性ヒスチジンオペロンの存在及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力についてスクリーニングすること；並びに
活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能である乳酸菌株として同定された、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択すること
を含む上記方法。
【請求項１９】
前記乳酸菌株を選択することが、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能である乳酸菌株として同定された、結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん、及び膵臓がんからなる群から選択されるヒスタミン関連性がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択する方法であって、
乳酸菌を活性ヒスチジンオペロンの存在及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力についてスクリーニングすること；並びに
活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能である乳酸菌株として同定された、炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択すること
を含む上記方法。
【請求項２１】
前記乳酸菌株を選択することが、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能である乳酸菌株として同定された、結腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室症、歯肉炎、乳腺炎及び膣炎からなる群から選択される炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３。
【請求項２３】
薬剤としての使用のためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３。
【請求項２４】
がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３。
【請求項２５】
前記がんが、結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん、及び膵臓がんからなる群より選択されるヒスタミン関連性がんであり、好ましくは結腸直腸がんである、請求項２２に記載の使用のためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３。
【請求項２６】
炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３。
【請求項２７】
前記炎症状態が、結腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室症、歯肉炎、乳腺炎及び膣炎からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ  ３２２７３。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、乳酸菌株、及び特にはヒスタミン産生乳酸菌株、並びに、例えば、がんにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミンが様々な正常及び悪性細胞の増殖を調節し得ることを示す初期的な証拠が集まっている。ヒスタミン受容体を伴う高いヒスタミン生合成及び含量が、メラノーマ、結腸がん及び乳がんを含む様々なヒトのがんにおいて報告されている。
【０００３】
結腸がん、直腸がん、又は腸がんとも呼ばれる結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、３番目に最も一般的ながんであり、がん関連死亡率の第３の主要原因である。結腸直腸発癌は、遺伝的要因及び環境的要因の両方に関連している。結腸直腸がんは、結腸及び／又は直腸におけるがんである。
【０００４】
ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）は、多様な鳥類及び哺乳動物の種の胃腸管において広く蔓延している腸管のファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）及びプロバイオティックである。この生物は一般的に安全（ＧＲＡＳ）と認識され、且つ有益な微生物と考えられており、約２０年間、プロバイオティックとして世界的に使用されている。Ｌ．ロイテリ（Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ）は、様々なげっ歯類モデル内の腸上皮細胞、単球、及び腸の炎症における炎症促進性サイトカインを抑制することが報告されている。
【０００５】
ＷＯ２０１３／０１１１３７は、ヒスタミンを産生する特異的なプロバイオティック乳酸菌株の選択、及び哺乳動物についての有益な効果のためのそのような株の使用を開示する。選択された細菌株は、特に炎症状態の治療又は予防における使用のための、哺乳動物におけるヒスタミンの局所産生において使用され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、結腸直腸がんを含むがんの治療の使用のためのヒスタミン産生細菌株を本明細書において開示する。
【０００７】
本発明者らは、ヒスタミン産生プロバイオティック細菌が、結腸直腸がんのＨｄｃ−／−における炎症関連ＣＲＣの頻度及び重症度を低減させることが可能であることを見出した。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５は、結腸直腸腫瘍又は結腸腫瘍の数及びサイズを有意に減少させた。一方、ヒスタミンを産生する活性を欠損しているＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の同質遺伝子的なｈｄｃＡ突然変異体は、そのような効果を示さず、胃腸のマイクロバイオームにおける細菌性ｈｄｃＡ遺伝子の重要な役割及び結腸直腸腫瘍形成の抑制のためのヒスタミン産生を示した。
【０００８】
従って、本実施形態の態様は、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株に関する。
【０００９】
本実施形態の別の態様は、放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療におけるアジュバントとしての使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株に関する。
【００１０】
本実施形態のさらなる態様は、放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療に関連する胃腸障害の予防、阻害又は治療における使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株に関する。
【００１１】
本実施形態の別の態様は、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株の選択方法に関する。本方法は、活性ヒスチジンオペロンの存在について乳酸菌をスクリーニングすることを含む。本方法はまた、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンを産生することが可能な乳酸菌株として同定された、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００１２】
本実施形態のさらなる態様は、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択する方法に関する。本方法は、乳酸菌を活性ヒスチジンオペロンの存在について、及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力についてもスクリーニングすることを含む。本方法はまた、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン及びＤａｇＫを産生することが可能な乳酸菌株として同定された、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００１３】
本実施形態のさらなる態様は、炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択する方法に関する。本方法は、活性ヒスチジンオペロンの存在及びＤａｇＫを産生する能力について乳酸菌をスクリーニングすることを含む。本方法はまた、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン及びＤａｇＫを産生することができる乳酸菌株として同定された、炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択することも含む。
【００１４】
本実施形態のさらなる態様は、薬剤としての使用、特にがんの予防、阻害、治療若しくは再発の危険性の低減における使用のための、又は炎症状態の予防、阻害、若しくは治療における使用のための、新しいＬ．ロイテリ株ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ  ３２２７３、Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３株などに関する。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、男性結腸直腸がんの治療のための薬剤の製造のためのヒスタミン産生細菌株の使用を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、有効量の前記細菌株及び薬学的に許容されるビヒクルを含む男性結腸直腸がんを治療するための組成物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５はインビボでＡＯＭ／ＤＳＳ誘導性結腸がんを減弱するが、ｈｄｃＡ突然変異株では減弱しないことを示す図である。（Ａ）マウス実験のタイムライン。１１週齢のＨｄｃ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスを、陰性対照群、陽性対照群、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置群及びＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異処置群を含む４つの群に無作為に分けた。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置群又はｈｄｃＡ突然変異体処置群のマウスに、それぞれ５×１０９  ＣＦＵの野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５又は同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ変異株を、０．２ｍｌのＭＲＳ中で、経口胃での強制投与により、１日１回、７日間、及びその後３日間に１回、与えた。陰性及び陽性対照群のマウスには、豊富な微生物培地（ＭＲＳ）のみを与えた。１２週齢で、これらのマウスに腹腔内注射により１用量のＡＯＭ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）で負荷をかけ、その後、２サイクルの飲料水中の２％ＤＳＳ処置を６日間行い、ＤＳＳ投与期の間は、飲料水のみ２週間の回復期間を置いた。陰性対照群のマウスには、ＡＯＭ及びＤＳＳの代わりに１用量のＰＢＳ及び飲料水のみを与えた。マウスを２７週齢で犠牲にし、結腸発癌を各群で評価した。（Ｂ）陰性対照群（ＭＲＳ／ＰＢＳ−Ｈ２Ｏ）、陽性対照群（ＭＲＳ／ＡＯＭ−ＤＳＳ）、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置群（Ｌ．ロイテリ６４７５／ＡＯＭ−ＤＳＳ）及び同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体処置群（ｈｄｃＡ突然変異体／ＡＯＭ−ＤＳＳ）におけるマウスの代表的な結腸画像。（Ｃ）上述の各群のマウス由来の大きい（＞３ｍｍ）及び小さい（＜３ｍｍ）結腸腫瘍の両方の数値。データは、メジアン値並びに１０及び９０パーセンタイルを示すボックス及びウィスカープロットとして提示される（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、各群についてｎ＝８〜１０）。（Ｄ）陰性対照群（ＭＲＳ／ＰＢＳ−Ｈ２Ｏ）、陽性対照群（ＭＲＳ／ＡＯＭ−ＤＳＳ）、野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置群（Ｌ．ロイテリ６４７５／ＡＯＭ−ＤＳＳ）及び同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体処置群（ｈｄｃＡ突然変異体／ＡＯＭ−ＤＳＳ）におけるマウスの代表的な顕微鏡結腸画像（Ｈ＆Ｅ染色させた）。
【図２】ＰＥＴ画像化による結腸腫瘍形成減弱の検出を示す図である。（Ａ）ＰＥＴ画像化の手順。（Ｂ）各群のＰＥＴ／ＣＴスキャンによって画像取り込みされた代表的なマウスの画像。コードバーは、ＦＤＧ信号強度を表す。（Ｃ）各群のＳＵＶを用いた全マウス結腸におけるＦＤＧ信号の定量化によって、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与によりマウス結腸におけるＦＤＧ強度がＭＲＳ培地対照と比較して有意に減少したが、同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体はそのような効果を欠いていた（盲検的に解析された）ことが示された。散布図としてデータを提示する（＊Ｐ＜０．０５、各群についてｎ＝６）。
【図３】ネズミ血漿中のサイトカイン産生は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与により影響を受けることを示す図である。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与により、雄のＨｄｃ−／−マウス血漿における炎症促進性サイトカインＫＣ（Ａ）、ＩＬ−２２（Ｂ）及びＩＬ−６（Ｃ）産生がルミネックスアッセイによって決定されたタンパク質レベルで有意に減少した一方で、ヒスタミン産生能を欠く同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体は、そのような効果を示さなかった。散布図としてデータを提示する（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、各群についてｎ＝８〜１０）。
【図４】Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与は、結腸におけるサイトカイン遺伝子発現に影響を及ぼすことを示す図である。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与により、雄のＨｄｃ−／−マウス結腸粘膜における炎症促進性サイトカインＫＣ（Ａ）、ＩＬ−２２（Ｂ）、ＩＬ−６（Ｃ）、ＴＮＦ（Ｄ）及びＩＬ−１α（Ｅ）遺伝子発現がＲＴ−ｑＰＣＲによって決定されたｍＲＮＡレベルで有意に減少した一方で、ヒスタミン産生能を欠く同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体は、そのような効果を示さなかった。散布図としてデータを提示する（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、各群についてｎ＝５〜６）。
【図５】Ｈ２Ｒ発現はＡＯＭ／ＤＳＳの負荷によって低減し、Ｌ．ロイテリによって誘導されたことを示す図である。（Ａ）Ｈ２Ｒ特異的抗体を用いた免疫組織化学研究によって、Ｈ２ＲがＨｄｃ−／−マウスの結腸で発現されたことが示された。ＡＯＭ及びＤＳＳ処置は、健常対照と比較してＨ２Ｒの強度を低減し、Ｌ．ロイテリ投与はＨ２Ｒ発現を誘導した。（Ｂ）Ｈｄｃ−／−の雄マウスにおいて、結腸粘膜におけるＨ２Ｒ遺伝子の発現は、ＡＯＭ／ＤＳＳの負荷又はＬ．ロイテリの投与によって有意に変化しなかった（各群についてｎ＝５〜６）。
【図６】Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与によって脾臓中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣが減少したことを示す図である。ＡＯＭ／ＤＳＳ処置により、健常対照と比較して脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの割合が有意に増加することが、Ｈｄｃ−／−雄マウスの骨髄（Ａ）及び脾臓（Ｂ）サンプルから取得したフローサイトメトリー解析により示された。ＡＯＭ／ＤＳＳによって負荷をかけたマウスにおけるＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５投与は、細菌を与えなかったマウスと比較して、脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの割合を有意に減少させた（＊＊＊ｐ＜０．００１、平均±ｓ．ｄ．；各群についてｎ＝３〜４）。
【図７】Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５はＨｄｃ−／−雌マウスにおいて大きな結腸腫瘍を減少させたことを示す図である。（Ａ）陰性対照群（ＭＲＳ／ＰＢＳ−Ｈ２Ｏ）、陽性対照群（ＭＲＳ／ＡＯＭ−ＤＳＳ）、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置群（Ｌ．ロイテリ６４７５／ＡＯＭ−ＤＳＳ）及びｈｄｃＡ突然変異処置群（ｈｄｃＡ突然変異体／ＡＯＭ−ＤＳＳ）におけるマウスの代表的な結腸画像。（Ｂ）Ｈｄｃ−／−雌マウスからの大きな（＞３ｍｍ）結腸腫瘍の数は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５投与によって有意に減少したが、Ｈｄｃ−／−雌マウスからの小さい（＜３ｍｍ）結腸腫瘍の数は、有意に変化しなかった。データは、メジアン値並びに１０及び９０パーセンタイルを示すボックス及びウィスカーとして提示される（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、各群についてｎ＝８〜１０）。
【図８】炎症関連性発癌のモデルにおけるＬ．ロイテリの機構を示す図である。炎症関連性発癌のマウスモデルにおけるＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のプロバイオシスの潜在的機構を模式的に図に示す。
【図９】Ｌ．ロイテリＷＴ並びにｈｄｃＡ突然変異ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を生産することを示す図である。各々の細菌の３、６、２４及び４８時間の培養液から、ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＢに対すし正規化された相対的なｍＲＮＡ標的遺伝子発現レベルを示す。各々の細菌の３時間の培養液から得られたｍＲＮＡを１．０に設定し、ｍＲＮＡが相対的に何倍異なるかを同定するためのキャリブレーターとして使用した。
【図１０】Ｌ．ロイテリＤａｇＫアミノ酸配列を示す図である。Ｌ．ロイテリＤａｇＫのアミノ酸配列（配列番号２５）をトリプシン切断部位（縦線）と共に示す。太字のアミノ酸は、そのようなトリプシン処理の後に得られたペプチド配列を示す。黒色の棒は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で見出されたペプチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、がん、特に、結腸直腸がんを含むがこれに限定されないヒスタミン依存性がん、において使用するためのプロバイオティックヒスタミン産生細菌株を開示する。本発明は、がんにおける使用のためのプロバイオティックヒスタミン産生細菌株の選択を開示する。選択されたヒスタミンを産生する細菌株は、ヒスタミン受容体アゴニストとしてのヒスタミンの局所送達のために使用され得る。
【００１９】
本発明の一実施形態は、ヒスタミンを産生することが可能な特定のプロバイオティック細菌を選択することである。これらの選択された細菌は、がん、特には、例えば結腸直腸がんのようなヒスタミン依存性がんの治療に使用することができる。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、ヒスタミンを産生することが可能であり、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生及び分泌するなど、ＤａｇＫを産生すること、又はＤａｇＫを少なくとも放出して細胞外効果を有することもまた可能な、特定のプロバイオティック細菌を選択することである。これらの選択された細菌は、がん、特には、例えば結腸直腸がんのようなヒスタミン依存性がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減において使用することができる。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、ヒスタミンを産生することが可能で、ＤａｇＫを産生することが可能な特定のプロバイオティック細菌を選択することである。これらの選択された細菌は、例えば結腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、憩室症、歯肉炎、乳腺炎又は膣炎などの炎症状態の予防、阻害又は治療において使用することができる。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、選択された細菌株は、好ましくは男性がん患者に使用され、本発明のさらに別の実施形態においては、細菌株は、大きな結腸腫瘍又は直腸腫瘍を有する男性患者に使用される。
【００２３】
選択された細菌株は、古典的放射線療法又は化学療法のアジュバントとして使用することができる。
【００２４】
選択された細菌株はまた、がんの放射線療法又は化学療法に伴う下痢及び他の胃腸障害を最小限にするための生成物として使用することができ、同時にがんを軽減するためのそのような治療を改善するためのアジュバントとしても働く。
【００２５】
微生物由来のヒスタミンは、組織発現パターンが異なる特異的ヒスタミン受容体の活性化に依存して、宿主において様々な効果を生じ得る。特に、ＣＲＣについては、結腸直腸がんの１０例の手術患者において摘出されたヒト腫瘍由来の検体において、顕著に増加したヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）活性が見出され、結腸直腸腫瘍細胞の進行においてＨＤＣの酵素活性が重要な役割を果たすことが示された（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｂａｌｌｅｒｏら、１９８８）。他方、ＨＤＣの欠乏は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの蓄積による炎症関連性ＣＲＣを促進することが示された（Ｙａｎｇら、２０１１）。Ｈ２Ｒについては、Ｈ２Ｒをそのアンタゴニストを介して阻害することにより、ＣＲＣを有する患者の生存率が増加した（Ａｄａｍｓ及びＭｏｒｒｉｓ、１９９４；Ｋｅｌｌｙら、１９９９）。
【００２６】
本発明者らは、アゾキシメタン／デキストラン硫酸ナトリウム（ＡＯＭ／ＤＳＳ）により誘導された炎症関連性結腸直腸がんモデルにおいて、結腸の巨視的及び顕微鏡的評価、並びに１８Ｆ−ＦＤＧ生体動物ＰＥＴ画像化によって評価した結腸腫瘍の数及びサイズの減少によって示されるように、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のようなヒスタミン産生細菌が雄Ｈｄｃ−／−マウスを防御したことを見出した。一方、本発明者らは、ｈｄｃＡ突然変異体の抗腫瘍形成効果の喪失によって示されるように、生物活性化合物としてヒスタミンを生成するために、酵素機構であるヒスチジン脱炭酸酵素が腸内マイクロバイオームに存在しなければならないことを見出した。ヒスタミン産生株の投与により炎症／腫瘍関連サイトカインが減少するが、非ヒスタミン産生株では減少しないことが、サイトカイン研究（血漿におけるタンパク質量及び結腸粘膜におけるｍＲＮＡ量）により示されたが、これは表現型の観察と一致している。
【００２７】
本発明者らはまた、Ｈｄｃ−／−マウスの結腸におけるＨ２Ｒ発現の潜在的変化を観察した。ＡＯＭ及びＤＳＳの処置は、健常対照と比較してＨ２Ｒの強度を低減させ、Ｌ．ロイテリ投与はＨ２Ｒ発現を誘導させた。この観察は、Ｈ２Ｒ発現と炎症又はＣＲＣとの間の関連性を示唆した。結腸がん誘導のためにマウスをＡＯＭ／ＤＳＳで処置すると、Ｈ２Ｒ発現が低減する。Ｌ．ロイテリを投与すると、Ｈ２Ｒ発現が誘導された。ｈｄｃＡ突然変異体の投与はまた、ＡＯＭ／ＤＳＳを受けたが細菌は存在しない陽性対照マウスと比較して、Ｈ２Ｒ発現の上昇を示した（Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５群ほど高くはない）ことを考慮すると、Ｌ．ロイテリは、ヒスタミンに加えＨ２Ｒを誘導するかもしれないいくつかの物質を生産する可能性がある。
【００２８】
本発明の目的は、結腸直腸（結腸）がん、メラノーマ、乳がん、膵臓がんなどを含む、ヒスタミン依存性がんを治療及び予防するヒスタミンを産生する細菌である。
【００２９】
別の目的は、おそらく特定のヒスチジン源と共に送達される、ヒスタミン受容体アゴニストとしてのヒスタミンの局所送達のための特定の細菌を使用することである。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、選択された細菌株は、特にがんに罹患している男性患者、特に結腸直腸がんにおいて使用される。
【００３１】
さらに別の実施形態において、選択された細菌株は、特に、大きな結腸腫瘍又は直腸腫瘍を有する男性患者について使用される。
【００３２】
別の実施形態において、ヒスタミン産生株は、古典的放射線療法又は化学療法のアジュバントとして使用される。
【００３３】
別の実施形態は、ヒスタミンを産生する株を含む製品であり、がんの放射線療法又は化学療法に伴う下痢及び他の胃腸障害を最小限に抑えると同時に、ヒスタミン依存性のがんを低減するためのそのような治療を改善するためのアジュバントとして働く。
【００３４】
Ｈｄｃ−／−マウスにおけるＡＯＭ／ＤＳＳにより誘導された結腸直腸がんの別の特徴は、脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの蓄積である。Ｈｄｃ遺伝子発現が欠損しているがん保有マウスの脾臓において、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの大量蓄積が見られる（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００８）（Ｙａｎｇら、２０１１）。本発明者らは、ヒスタミン産生細菌の投与がＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣを低減することを見出し、外因性ヒスタミンがＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの分化を調節することを確認した。
【００３５】
これらの研究に基づいて、本発明者らは、炎症関連性発癌のマウスモデルにおけるＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のプロバイオシス（ｐｒｏｂｉｏｓｉｓ）の有望なメカニズムをまとめた（図８）。巨視的に観察される結腸腫瘍、遺伝子発現データによる結腸ＫＣ、ＩＬ−２２、ＩＬ−６、ＴＮＦ、及びＩＬ−１αの増加した量、並びに血漿ＩＬ−６、ＩＬ−２２及びＫＣの増加した量で示されるように、ＡＯＭの腹腔内注射、それに続く飲料水でのＤＳＳ処置は炎症関連性結腸がんを誘導した。マウスにヒスチジン含有飼料を与えた場合、経口胃での強制投与によりマウスに投与されたｈｄｃ＋Ｌ．ロイテリは、ヒスチジン脱炭酸酵素（ＨｄｃＡ）によりＬ−ヒスチジンをヒスタミンに変換し、ヒスタミンをヒスチジン／ヒスタミン・アンチポーター（ＨｄｃＰ）によって管腔に輸送した（Ｔｈｏｍａｓら、２０１２）。Ｌ．ロイテリ由来のヒスタミンは、上皮細胞上のヒスタミンＨ２受容体（Ｈ２Ｒ）を活性化させ、結腸における抑制ＫＣ、ＩＬ−２２、ＩＬ−６、ＴＮＦ、及びＩＬ−１α遺伝子発現、並びに血漿におけるＩＬ−６、ＩＬ−２２及びＫＣ産生によって示されるように、抗腫瘍形成経路を誘発する。一方、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５投与は、脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの相対的存在量を低減させ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの低減もまた潜在的な抗腫瘍形成効果に寄与した。
【００３６】
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５はインビボで結腸発癌を減弱するが、ｈｄｃＡ突然変異体は減弱させない
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のコロニー形成が抗腫瘍形成の役割を果たすかどうかを調べるために、本発明者らはＡＯＭプラスＤＳＳ処置を用いて、１２週間のＨｄｃ−／−  ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて結腸炎関連結腸がんを誘導させた（図１Ａ）。結腸腫瘍形成の重症度は、ＡＯＭ注射後１５週間で結腸腫瘍の数とサイズによって評価した。雄については、ＡＯＭ及び２％ＤＳＳの代わりに緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び飲料水を与えた陰性対照マウスは、腫瘍を発症しなかった。ＡＯＭ／ＤＳＳの負荷をかけ、ＭＲＳ培地で強制投与した一方で、外因性細菌を与えなかった陽性対照マウスは、結腸腫瘍を発症した。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５を指数増殖期において投与すると、陽性対照群と比較して、結腸腫瘍の数及びサイズを顕著に低減した。しかし、ｈｄｃＡ突然変異体の投与はそのような効果を示さなかった（図１Ｂ〜１Ｃ）。雌については、同様のパターンが観察された。陰性対照マウスは結腸腫瘍をもたらさず、陽性対照マウスは結腸腫瘍を発症した。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与は、陽性対照群と比較して大きな（＞３ｍｍ）結腸腫瘍の数を顕著に低減したが、小さい（＜３ｍｍ）腫瘍の数は低減しなかった。Ｌ．ロイテリのｈｄｃＡ突然変異株の投与は、大きい又は小さい結腸直腸腫瘍の量を低減しなかった（図７）。
【００３７】
Ｈ＆Ｅ染色による雄の結腸の組織学的解析により、野生型の、ヒスタミンを産生するＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の抗腫瘍形成効果が確認された。陰性対照マウスは予期される結腸の組織像を示した一方で、陽性対照マウスは広範な結腸腫瘍の証拠を示した。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置マウスは、陽性対照群と比較して、結腸腫瘍のサイズ及び数が低減したが、同質遺伝子的なＬ．ロイテリのｈｄｃＡ突然変異株は、同様の効果をもたらさなかった（図１Ｄ）。
【００３８】
ＰＥＴイメージングは、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の抗腫瘍形成効果を支持した
【００３９】
結腸がんのＡＯＭ／ＤＳＳ誘発マウスモデルにおけるＬ．ロイテリの抗腫瘍形成効果の可能性をさらに解析するために、臓器機能をトレースするための最も強力な非侵襲的診断ツールの１つであるＰＥＴイメージングを、犠牲にする前のマウスに適用した（図２Ａ）。［１８Ｆ］ＦＤＧをトレーサーとして使用したが、体内のその濃度はグルコースの取り込みとリン酸化の分布を反映している（Ｂｒｅｗｅｒら、２００８）。結腸腫瘍形成の間、結腸における活性化リンパ球によるＦＤＧの取り込みは、トレーサーシグナルの高い強度によって検出することができる。陰性対照マウスにおいて、ＦＤＧシグナルは、高いグルコースの取り込みと代謝が起こる「正常な」身体部位であると提案された領域であるマウスの膀胱及び上胸部で大部分検出された（Ｇａｌｉｔｏｖｓｋｉｙら、２０１３）。微量のＦＤＧシグナルは、結腸領域で明らかであり、健康なマウスの結腸における低いグルコースの取り込みを示す（図２Ｂ〜２Ｃ）。陽性対照マウスにおいては、結腸内にいくつかのホットスポットが観察され、全マウス結腸内のＦＤＧ強度は陰性対照群（図２Ｂ〜２Ｃ）と比較して顕著に増加したが、これはＡＯＭプラスＤＳＳ処置を受け、ＭＲＳ培地で強制投与されたマウスの結腸において結腸腫瘍が検出されたこととグルコースの取り込みが増加したことを示す。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置マウスは、結腸内のホットスポットの数の低減、及び陽性対照と比較してＦＤＧ強度の顕著な低減を示し、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の抗腫瘍形成効果を実証した。一方、同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体は、同様の効果をもたらさず、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置マウスと比較して、顕著に増加したＦＤＧ強度に加えて、結腸内のホットスポット数の増加を示した。これらの結果は、腸内マイクロバイオーム中の完全な細菌性ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子の欠損が、抗腫瘍形成効果の喪失をもたらすことを示しており、観察された結腸の数及びサイズと一致している。
【００４０】
マウス血漿における全身サイトカイン濃度はＬ．ロイテリの抗腫瘍形成効果と関連していた
特定の炎症促進性サイトカインは、腫瘍支持性の微小環境の形成を促進することによって結腸腫瘍形成の発達に寄与することが報告されている（Ｌａｎｄｓｋｒｏｎら、２０１４）。ルミネックス・システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を活用して、少ないサンプル体積（２５μｌ）を使用した単一のマイクロプレートで分析物を多重化する（同時に測定する）ことができた。血漿中の１６のサイトカイン（表１）のタンパク質レベルを、４つのサイトカイン多重化キットを使用して測定した。興味深いことに、本発明者らは、ＫＣ、ＩＬ−２２及びＩＬ−６を含む３つのサイトカインが同様のパターンを示すことを見出した（図３）：雄のＨｄｃ−／−マウスにおけるＡＯＭ／ＤＳＳ処置は、ＰＢＳ／Ｈ２Ｏを与えた対照マウスと比較して、血漿中のこれらのサイトカインの生成を顕著に増加させた；Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５投与は、これらのサイトカインの生成を顕著に減少させた一方で、ヒスタミン産生能力を欠損した同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体は、ＡＯＭ／ＤＳＳで処置したＨｄｃ−／−雄マウスにおいてこれらのサイトカインを減少させなかった。
【００４１】
ＫＣは、結腸がんの増殖、進行及び転移を促進することが報告されているＩＬ−８と多くの機能的特性を共有している（Ｏｑｕｅｎｄｏら、１９８９）（Ｌｅｅら、２０１２）。ＩＬ−２２はまた、胃がん細胞の浸潤（Ｆｕｋｕｉら、２０１４；Ｊｉら、２０１４）及び結腸がんの幹細胞性（Ｋｒｙｃｚｅｋら、２０１４）を促進することが示された。ＩＬ−６は、結腸直腸がん発症の重要な調節因子とみなされており（Ｗａｌｄｎｅｒら、２０１２）、高いレベルの血漿ＩＬ−６は結腸がんを含む様々ながんにおける予後不良と相関している（Ｎａｇａｓａｋｉら、２０１４）。これらの報告された証拠に基づくと、本発明者らの研究における異なるマウス群の血漿中のこれらのサイトカインの変化は、疾患表現型：ＡＯＭ／ＤＳＳの負荷によるＣＲＣ誘導に関連するサイトカインの健常対照と比較しての増加、ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５投与によるＣＲＣの減弱に関連するサイトカインの減少、及び非ヒスタミン産生ｈｄｃＡ突然変異体による抗腫瘍形成効果の欠損に関連するサイトカインの増加、と関連及び一致している。
【００４２】
結腸粘膜におけるサイトカイン遺伝子の発現はＬ．ロイテリの投与によって調節された
サイトカインとＣＲＣ重症度との間の関連性をさらに調査するために、血漿中の全身サイトカイン量の測定に加えて、ＧＡＰＤＨを内部標準として使用したＲＴ−ｑＰＣＲによる結腸粘膜サンプルにおける選択されたサイトカイン（表２）の遺伝子発現を解析した。ＡＯＭ／ＤＳＳによる負荷は、炎症促進性サイトカインＫＣ、ＩＬ−２２、ＩＬ−６、ＴＮＦ及びＩＬ−１αの遺伝子発現を、健康な雄Ｈｄｃ−／−マウス（図４）と比較して顕著に誘導した。ＡＯＭ／ＤＳＳで負荷をかけたマウスのＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置は、これらのサイトカインの相対的な遺伝子発現を顕著に低減した一方、ヒスタミン産生を欠いている同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体は、野生型細菌を強制投与したマウスと比較して、これらの炎症促進性サイトカインの増加した相対的遺伝子発現をもたらした。ｑＰＣＲによる他のサイトカインｍＲＮＡの検出は、検出不能な結果（ＩＬ−１７）であった、又は群（ＩＬ−１２、ＩＬ−２３及びＩＦＮ−γ）の間で有意差を生じなかった。
【００４３】
Ｈ２Ｒ発現はＬ．ロイテリの投与によって誘導された
ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与は、雄のＨｄｃ−／−マウスにおいてＡＯＭ／ＤＳＳで誘導したＣＲＣを減弱させた一方で、ヒスタミン非産生ｈｄｃＡ突然変異体はそのような効果を失っており、ＣＲＣの減弱における管腔内ヒスタミンの重要な役割を示している。しかし、ヒスタミンがその抗炎症作用及び抗発癌効果を発揮する可能性があるシグナル伝達経路は明らかではない。ヒスタミンは、４つのヒスタミン受容体（Ｈ１Ｒ、Ｈ２Ｒ、Ｈ３Ｒ及びＨ４Ｒ）を介して様々な病態生理学的機能を発揮する生体アミンであり（Ｏ’Ｍａｈｏｎｙら、２０１１）、Ｈ２Ｒ活性化は抗炎症効果と関連している（Ｆｒｅｉら、２０１３；Ｊｕｔｅｌら、２００１；Ｏ’Ｍａｈｏｎｙら、２０１１）。さらに、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５がＨ２Ｒの活性化によってＴＮＢＳ誘導性結腸炎を減弱させることが本発明者らの以前の研究により示されている。従って、本発明者らの今回の研究においては、Ｈ２Ｒ特異的抗体を使用した免疫組織化学による雄Ｈｄｃ−／−マウスの様々な群における相対的なＨ２Ｒ発現を調べた。Ｈ２Ｒ発現は、陰窩において比較的高い強度で、健康な雄Ｈｄｃ−／−マウスの結腸で検出された（図５Ａ）。興味深いことに、ＡＯＭ／ＤＳＳによる負荷は、健常対照と比較して、結腸内のＨ２Ｒの相対強度を低減した。ＡＯＭ／ＤＳＳで負荷をかけられたマウスにＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５又は同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体を与えた場合、いかなる細菌も与えていない対照群と比較して、Ｈ２Ｒ発現の増加が観察された。Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与は最も高いＨ２Ｒ強度をもたらしたが、これは、Ｈ２Ｒ活性化が特定の腸内細菌によって誘発され、ヒスタミンがＣＲＣの減弱において重要な役割を果たしていることを示唆している。Ｈ２Ｒの低減は、ＡＯＭ／ＤＳＳにより負荷をかけたマウスにおけるＣＲＣの発生と関連し、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与によるＨ２Ｒの誘導は、減弱したＣＲＣに関連する。ｈｄｃＡ突然変異体の投与もまたＨ２Ｒ強度を増加させるので（野生型株ほどには高くはないものの）、マウスに投与されたＬ．ロイテリは、ヒスタミンに加えて、マウス結腸においてＨ２Ｒ発現を誘導し得るシグナルを生成するようである。
【００４４】
しかし、ｍＲＮＡレベルでのＨ２Ｒ発現を結腸粘膜内においてＲＴ−ｑＰＣＲで調べたところ、群間に有意差は観察されなかった（図５Ｂ）。この観察は、異なる量の細胞表面Ｈ２Ｒが、タンパク質産生及び局在化における転写後の差に起因することを示す。
【００４５】
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５は、脾臓においてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣを下方制御した
内因性ヒスタミンが存在しないと、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの増加をもたらし、これは哺乳動物におけるがん進行と関連している（Ｙａｎｇら、２０１１）。ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与がＩＭＣの分化に影響を与えるかどうかを評価するために、雄Ｈｄｃ−／−マウスを犠牲にした直後に採取した骨髄及び脾臓検体サンプル由来の細胞についてフローサイトメトリー解析を行った。脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣのパーセンテージは、健常対照と比較してＡＯＭ／ＤＳＳで負荷をかけたマウスで顕著に増加した（図６）。ＡＯＭ／ＤＳＳで負荷をかけたマウスにＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５を投与すると、培地のみ（ＭＲＳ）を与えた対照のマウスと比較して、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣのパーセンテージが顕著に減少した。これらの観察は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５がＡＯＭ／ＤＳＳで誘導したＣＲＣを減弱したという表現型の結果と一致する。ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の投与がＩＭＣの分化に影響を及ぼすことが示されている。
【００４６】
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＤＳＭ  ３２２７３発現ｄａｇＫ遺伝子
野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びｈｄｃＡ突然変異体は、Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３及びＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９と共に、ｄａｇＫ遺伝子を発現することができた。ｄａｇＫ遺伝子は、細菌の伸長期中に非常に高く発現した。ｄａｇＫ遺伝子を発現する他の細菌株は、他のＬ．ロイテリ株を含めて、本明細書に記載の方法を使用して検出することができる。ヒスタミンを産生できないＬ．ロイテリ株ＤＳＭ  １７９３８においては、このｄａｇＫ遺伝子は欠損している。
【００４７】
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５分泌／放出ＤａｇＫ
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のｄａｇＫ遺伝子によって発現されたタンパク質ＤａｇＫは、インタクトな細菌細胞を除去した後の培地の上清中に見出された。従って、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５は、ＤａｇＫを産生及び分泌する、又は他の方法で放出することができ、そのことによって細胞外のＤａｇＫ効果を達成する。
【００４８】
ＤａｇＫは、リン酸源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用してジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のホスファチジン酸（ＰＡ）への変換を触媒する酵素である。非刺激細胞においては、ＤａｇＫ活性が低く、ＤＡＧをグリセロリン脂質の生合成に使用することができる。しかし、ホスホイノシチド経路の受容体活性化において、ＤａｇＫ活性はＤＡＧをＰＡへ変換させることを促進する。ＤＡＧのＰＡへの変換は、さもなければプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化し得るＤＡＧを枯渇させる。
【００４９】
Ｈ１Ｒ下流シグナル伝達は、シグナル伝達に関わる脂質ＤＡＧを阻害することにより、Ｌ．ロイテリにおけるＤａｇＫ合成によって中断される。従って、本明細書に開示されるようなヒスタミン及びＤａｇＫ産生乳酸菌株は、ヒスタミンの炎症促進性効果を抑制する。これは次に、細菌株によって産生されたヒスタミンによるＨ２Ｒ活性化のみを可能にする。そのようなＨ２Ｒ活性化は抗炎症症状を促進する。
【００５０】
従って、ヒスタミンとＤａｇＫの両方を産生することができる乳酸菌株は、Ｈ１Ｒ下流シグナル伝達の抑制を引き起こすが、Ｈ２Ｒ活性化を誘導する。これは次に、ヒスタミンの炎症促進性効果を抑制し、抗炎症症状を促進する。活性なｄａｇＫ遺伝子発現を有する細菌株は、ＤａｇＫを産生し、場合により分泌する、又は他の方法で放出することができる。
【００５１】
本実施態様の態様は、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのヒスタミン産生乳酸菌株に関する。
【００５２】
本明細書中に開示される実施形態のヒスタミン産生乳酸菌株は、がん患者、又はがんを発症する危険性を有する患者に関連して利用することができる有益な特徴を有する。このことは、本実施形態のヒスタミン産生乳酸菌株を、患者のがんを治療するために、そして特に患者の結腸直腸がんを治療するために使用することができることを意味する。
【００５３】
ヒスタミン産生乳酸菌株を用いた治療は、放射線療法、化学療法及び外科手術を含むがこれに限定されない他のがん治療と組み合わせることができるであろう。ヒスタミン産生乳酸菌株は、そのような場合、がん治療におけるアジュバントとして使用され得る。従って、本実施形態の別の態様は、放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療においてアジュバントとして使用するためのヒスタミン産生乳酸菌株に関する。
【００５４】
本実施形態のヒスタミン産生乳酸菌株はまた、がん治療特性自体に加えて、がん治療を受ける患者又はがん治療に供せられる患者、特に放射線療法及び／又は化学療法に供せられる患者に有益な特性も有する。特に、ヒスタミン産生乳酸菌株は、例えばがん治療によって引き起こされるような、がん治療に関連する胃腸障害と闘う又はそのような胃腸障害を治療するために有用である。従って、本実施形態のさらなる態様は、放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療に伴う胃腸障害の予防、阻害又は治療に使用するヒスタミン産生乳酸菌株に関する。
【００５５】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、がん治療に伴う下痢の予防、阻害又は治療に使用される。特定の実施形態において、がん治療は、結腸直腸がんを治療するためのがん治療であり、すなわち、がん治療に供せられる患者は、結腸直腸がんに罹患している患者である。
【００５６】
しかし、患者へのヒスタミン産生乳酸菌株の投与は、必ずしも患者の結腸直腸がんの１００％の治療、すなわち、検出可能な腫瘍を全く有さない患者をもたらすこと、を起こす必要はない。従って、ヒスタミン産生乳酸菌株は、患者の結腸直腸がんを阻害又は低減するために使用することができるであろう。例えば、本明細書に提示される実験データは、ヒスタミン産生乳酸菌株が腫瘍の数を減少させ、腫瘍のサイズを減少させることができることを示している。従って、本実施形態において、結腸直腸がんの阻害又は低減は、患者の腫瘍の数を減少させ、患者の腫瘍のサイズを減少させ、又は患者の腫瘍の数及びサイズを減少させることを含む。従って、一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、結腸直腸がんに罹患している患者の腫瘍の数及び／又はサイズを低減させることについて使用するためのものである。
【００５７】
本実施形態のヒスタミン産生乳酸菌株はまた、又は代替的には予防、すなわち患者が結腸直腸がんを発症する危険性を低減するために使用することができるであろう。例えば、患者は、結腸直腸がんに対する遺伝的又は遺伝的素因のような、結腸直腸がんの素因を有する患者であり得る。その後、ヒスタミン産生乳酸菌株は、結腸直腸がんに罹患している患者の危険性を予防する、又は少なくとも危険性を低減するために、そのような患者に投与することができる。
【００５８】
本実施形態のヒスタミン産生乳酸菌株はまた、結腸直腸がんに罹患し、結腸直腸がんの治療を受けている患者にとっても有益な特徴を有する。このことにより、ヒスタミン産生乳酸菌株を、結腸直腸がんの再発の危険性を低減するために使用することができる。
【００５９】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、炎症関連結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のためのものである。
【００６０】
患者は、好ましくは哺乳動物患者であり、より好ましくはヒト患者である。特定の実施形態において、患者は男性のヒト患者である。従って、この実施形態においては、ヒスタミン産生乳酸菌株は、男性患者の結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減のために使用される。
【００６１】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、活性ヒスチジンオペロンを含む。特定の実施形態において、このヒスチジンオペロンは、ヒスチジン／ヒスタミンアンチポーター（ｈｄｃＰ）遺伝子、ヒスチジン脱炭酸酵素ピルボイルタイプＡ（ｈｄｃＡ）遺伝子及びヒスチジン脱炭酸酵素ピルボイルタイプＢ（ｈｄｃＢ）遺伝子からなるものなどを含む。従って、一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、ｈｄｃＰ遺伝子、ｈｄｃＡ遺伝子及びｈｄｃＢ遺伝子を含む。
【００６２】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生することができる。本明細書中に提示される実験データは、結腸直腸がんの予防、阻害若しくは治療、又は結腸直腸がんの再発の危険性の低減においてヒスタミン産生及びＤａｇＫ産生乳酸菌株を使用することが有利であり得ることを示す。
【００６３】
ＤａｇＫ産生は、Ｈ１Ｒ下流シグナル伝達を抑制するという点において、それによって、さもなければヒスタミンが引き起こす可能性のある炎症効果を抑制するという有益な効果を有する。従って、ヒスタミン及びＤａｇＫの両方の産生は、作用をＨ１Ｒ活性化からＨ２Ｒへと移行させ、これはヒスタミンの抗炎症効果を促進する。
【００６４】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、ヒスタミン産生ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株である。特定の実施形態において、ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリ株はＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５である。別の特定の実施形態において、ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリ株はＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９である。さらなる特定の実施形態において、ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリ株はＬ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３である。さらに別の実施形態において、ヒスタミン産生Ｌ．ロイテリ株は、ヒスタミンを産生することができ、場合によりさらにＤａｇＫを産生することができる少なくとも２つのＬ．ロイテリ株の混合物である。例えば、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９の混合物、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＤＳＭ  ３２２７３の混合物、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＤＳＭ  ３２２７３の混合物、又はＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＤＳＭ  ３２２７３の混合物を使用することができる。
【００６５】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）、インターロイキン２２（ＩＬ−２２）、及びインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群から選択される少なくとも１つのがん関連サイトカインの産生を抑制することができる。ＣＸＣＬ１はまた、当該技術分野において、ＧＲＯ１がん遺伝子、ＧＲＯα、ＫＣ、好中球活性化タンパク質３（ＮＡＰ−３）及びメラノーマ成長刺激活性、アルファ（ＭＳＧＡ−α）とも呼ばれる。これらの３つのサイトカインは全て結腸直腸がんに関わっていることが知られている。従って、これらのサイトカインの産生の抑制は、結腸がんの増殖、進行及び転移（ＣＸＣＬ１の抑制による）、胃がん細胞の浸潤及び結腸がんの幹細胞性の抑制（ＩＬ−２２の抑制による）並びに改善された結腸がんの予後（ＩＬ−６の抑制による）の点において有益な効果を有するであろう。これらのケモカインの産生の抑制は、様々な方法で誘導することができる。例えば、サイトカイン遺伝子の転写は、ヒスタミン産生乳酸菌株によって抑制又は低減することができる。代替的には、又は付加的には、サイトカインｍＲＮＡ分子の翻訳を、ヒスタミン産生乳酸菌株によって抑制又は低減させることができる。また、又はさらに、これらのサイトカインの産生を抑制するために翻訳後効果を関わらせることもできるだろう。本明細書に提示される実験データは、本実施形態のヒスタミン産生乳酸菌株が血漿中のこれらのサイトカインのタンパク質レベルを低減し、これらのサイトカインの相対的な遺伝子発現を低減することを示す。
【００６６】
一実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋未熟骨髄細胞（ＩＭＣ）の存在量を低減させることができる。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣは、哺乳動物におけるがんの進行と関連している。従って、実験データに示されているように、これらのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ＩＭＣの存在量を低減させることは、がんの進行を抑制することに関して有益な効果を有するであろう。
【００６７】
本実施形態のさらなる態様は、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択する方法に関する。その方法は、活性ヒスチジンオペロンの存在について乳酸菌をスクリーニングすることを含む。方法はまた、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンを産生することができる乳酸菌株として同定された、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減のためにおける使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００６８】
従って、本実施形態のこの態様は、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用に適した乳酸菌株を選択及び同定するために使用することができる方法に関する。そのような選択された乳酸菌株は、活性ヒスチジンオペロンを有し、本明細書に記載されているようなヒスタミンを生成することができるものとして同定される。
【００６９】
活性ヒスチジンオペロンの存在は、ヒスチジン／ヒスタミンアンチポーター遺伝子、ヒスチジン脱炭酸酵素ピルボイルＡ型遺伝子及びヒスチジン脱炭酸酵素ピルボイルＢ型遺伝子の存在の検出、例えばｈｄｃＰ遺伝子、ｈｄｃＡ遺伝子及びｈｄｃＢ遺伝子の存在の検出に基づいて決定することができる。代替的には、活性ヒスチジンオペロンの存在は、例えば、タンパク質ＨｄｃＰ、ＨｄｃＡ及びＨｄｃＢの産生又は存在のような、ヒスチジン／ヒスタミンアンチポータータンパク質、ヒスチジン脱炭酸酵素ピルボイルＡ型タンパク質及びヒスチジン脱炭酸酵素ピルボイルＢ型タンパク質の産生又は存在の検出に基づいて決定することができる。
【００７０】
一実施形態において、乳酸菌のスクリーニングは、活性ヒスチジンオペロンの存在及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生するさらなる能力について乳酸菌をスクリーニングすることを含む。この実施形態において、乳酸菌株の選択には、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能な乳酸菌株として同定された、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００７１】
故に、一実施形態において、乳酸菌株は、ヒスタミンを産生するための活性ヒスチジンオペロンを含むだけでなく、ＤａｇＫを産生する能力も有する。ＤａｇＫを産生する能力は、そのゲノム中又は、例えばプラスミド中のような発現カセット中のいずれかにおける乳酸菌株中のｄａｇＫ遺伝子のようなジアシルグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の存在を検出することによっても評価することができる。代替的には、ＤａｇＫを産生する能力は、例えば、細菌の細胞質ゾル中などである、又は細菌株がさらにＤａｇＫを分泌することができる場合には、細菌株が培養された培地中において、ジアシルグリセロールキナーゼタンパク質の存在を検出することによって決定することができる。
【００７２】
一実施形態において、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択する方法には、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５以外の乳酸菌株を同定すること及び選択することが含まれる。
【００７３】
実施形態のさらなる態様は、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減に使用するために乳酸菌株を選択する方法に関する。この方法は、活性ヒスチジンオペロンの存在及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力について乳酸菌をスクリーニングすることを含む。方法はまた、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生及びＤａｇＫの産生が可能な乳酸菌株として同定された、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００７４】
この態様において、選択された乳酸菌株は、必ずしも結腸直腸がんの再発の危険性を予防、阻害、治療又は低減するために使用される必要はない。明らかに対照的に、ヒスタミンだけでなくジアシルグリセロールキナーゼも産生する能力は、結腸直腸がんに加えてメラノーマ、乳がん、膵臓がんなどを含む他のタイプのがんにおいても有益であろう。
【００７５】
一実施形態において、乳酸菌株の選択は、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンの産生、及びＤａｇＫの産生が可能な乳酸菌株として同定された、結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん及び膵臓がんからなる群から選択されるヒスタミン関連がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００７６】
一実施形態において、がんの再発の予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減における使用のための乳酸菌株を選択する方法は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５以外の乳酸菌株を同定すること及び選択することを含む。
【００７７】
実施形態のさらに別の態様は、炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択する方法に関する。この方法は、活性ヒスチジンオペロンの存在及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力について乳酸菌をスクリーニングすることを含む。方法はまた、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンを産生し、ＤａｇＫを産生することができる乳酸菌株として同定された、炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択することを含む。
【００７８】
ヒスタミン及びジアシルグリセロールキナーゼの両方を産生することができる乳酸菌株は、患者に投与された場合、様々な炎症状態の予防、低減又は治療の点で有益な効果を有する。産生されたＤａｇＫは、Ｈ１Ｒ下流シグナル伝達又は経路を抑制することによってヒスタミンの炎症特性を抑制する。従って、ヒスタミンは、Ｈ２Ｒの活性化による抗炎症性を発揮し得る。
【００７９】
結腸直腸がんに罹患している患者は、ヒスタミン欠乏によるＩＭＣの成熟の欠如を示す。従って、生物学的レベルでこれらの患者にヒスタミンを補充することは有益であり得る。しかし、これらの患者はまた、炎症促進性応答の増加を示し、彼らにヒスタミン分子を与えることは副作用を引き起こす可能性がある。従って、最良の治療アプローチは、外因性ヒスタミンを供給すること、及びまた、炎症促進性シグナル伝達を阻害することによって炎症性反応を抑制する能力を有する有益な細菌株を提供することであり得る。従って、ヒスタミン及びＤａｇＫの両方を産生することができる本実施形態の乳酸菌株は、骨髄機能不全を有する炎症促進性障害を治療するために非常に興味深いものである。
【００８０】
一実施形態において、乳酸菌株の選択には、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミンを産生し、ＤａｇＫを産生することができる乳酸菌株として同定された、結腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室症、歯肉炎、乳腺炎及び膣炎からなる群から選択される炎症状態の予防、阻害又は治療における使用のための乳酸菌株を選択することが含まれる。
【００８１】
従って、上記で開示した炎症状態は、例示的であるが、本明細書に開示されたように同定され選択された乳酸菌株によって予防され、阻害され又は治療され得る炎症状態の好ましい例である。
【００８２】
一実施形態において、炎症状態の予防、阻害又は治療に使用する乳酸菌株を選択する方法は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５以外の乳酸菌株を同定すること及び選択することを含む。
【００８３】
本実施形態のさらなる態様は、ヒスタミン及びＤａｇＫを産生するＬ．ロイテリ株であるラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ  ３２２７３に関する。ラクトバチルス・ロイテリ株ＤＳＭ  ３２２７３は、２０１６年３月８日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、Ｄ  −  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）において、ブダペスト条約に基づいて寄託された。この新しいＬ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３は薬剤として使用してもよい。例えば、Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３は、がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性の低減のために使用することができる。特定の実施形態において、がんは、結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん及び膵臓がん、好ましくは結腸直腸がんからなる群から選択されるヒスタミン関連がんである。Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３はまた、炎症状態の予防、阻害又は治療において使用することができる。特定の実施形態では、炎症状態は、結腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室症、歯肉炎、乳腺炎及び膣炎からなる群から選択される。Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３のさらなる使用には、乳児コリックの寛解、湿疹の緩和、職場病の発症の低減、ヘリコバクター・ピロリ感染の抑制が含まれる。
【００８４】
本実施形態はまた、結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性を低減するための薬剤の製造のためのヒスタミン産生乳酸菌株の使用、放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療におけるアジュバントの製造のためのヒスタミン産生乳酸菌株の使用、並びに放射線療法及び化学療法からなる群から選択されるがん治療に関連する胃腸障害の予防、阻害又は治療のための薬剤の製造のためのヒスタミン産生乳酸菌株の使用を含む。これらの実施形態において、ヒスタミン産生乳酸菌株は、好ましくは、ジアシルグリセロールキナーゼを産生し、場合により分泌することもできる。
【００８５】
さらなる実施形態は、対象における結腸直腸がんの予防、阻害、治療又は再発の危険性を低減するための方法を含む。方法は、有効量のヒスタミン産生乳酸菌株を対象に投与することを含む。別の実施形態は、放射線療法及び化学療法からなる群より選択されるがん治療に関連する胃腸障害の予防、阻害又は治療のための方法に関する。方法は、有効量のヒスタミン産生乳酸菌株を患者対象に投与すること、又はがん治療に供せられることを含む。ヒスタミン産生乳酸菌株は、好ましくは、ジアシルグリセロールキナーゼを産生し、場合により分泌することもできる。患者は、好ましくは哺乳動物患者であり、より好ましくは男性ヒト患者のようなヒト患者である。
【００８６】
株の適切な投与様式及び配合は、ヒスタミンの局所産生及び場合によりＤａｇＫが所望される部位に依存して選択される。しかしながら、投与の好ましい投与様式は経口であるが、いくつかの治療については局部的な、又は皮膚、直腸、膣又は歯肉への局所投与のいくつかの他の型も等しく適切であろうし、或いは、静脈内又は筋肉内注射も適切であろう。
【００８７】
ヒスチジンを含む食物混合物を、ヒスチジンの存在を確実にし、それにより細菌の効力を増加させるために使用してもよい。ヒスチジンは、単独、又は細菌と一緒に投与することができる。
【００８８】
細菌のヒスチジン供給を確実にする１つの可能性は、大豆タンパク質、チーズ、卵、鶏肉及び豚肉を含むがこれに限定されないヒスチジンが豊富な食物を食べることである。
【実施例】
【００８９】
（例１）
細菌株及び培養条件
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５（２００４年１２月２１日にＡＴＣＣ−アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０  ＵＳＡ）へブダペスト条約に基づき寄託されたもの）及び以前、記載されたそのｈｄｃＡ突然変異体（Ｔｈｏｍａｓら、２０１２）を使用して、マウスをコロニー形成させた。両方の株は、１０％  ＣＯ２、１０％  Ｈ２、及び８０％  Ｎ２の混合物を供給した嫌気性ワークステーション（ＭＡＣＳ  ＭＧ−５００、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）内でｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中、３７℃で培養した。
【００９０】
動物
Ｈｄｃ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスは、元来、Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｃ．  Ｗａｎｇ（コロンビア大学）により提供され、ベイラー薬科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で再び由来した（ｒｅｄｅｒｉｖｅｄ）ものである。再び由来したＨｄｃ−／−マウスは、テキサス子供病院（Ｔｅｘａｓ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で特定病原体未感染（ＳＰＦ）の条件下で維持された。マウスをフィルタートップケージの下に置き（１ケージあたり５匹のマウス）、蒸留水及びＰｉｃｏＬａｂげっ歯類５０ＩＦ／６Ｆ飼料に自由に接触させた。全てのマウスの実験は、テキサス州ヒューストンのベイラー薬科大学での施設動物飼育及び利用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ；ＩＡＣＵＣ）承認のマウスプロトコールに従って、ＳＰＦ動物施設において行った。
【００９１】
細菌の調製及びマウスへの投与
【００９２】
Ｌ．ロイテリ株及び培養条件は上記に記載した。細菌を対数増殖期（初期値ＯＤ６００ｎｍ＝０．０３のＭＲＳ培地で５．５時間）で採取し、２５００ｘｇで４分間遠心分離し、細菌ペレットを動物飼養用の滅菌ＭＲＳ培地に再懸濁した。全てのＬ．ロイテリ株は、マウスに投与する前に新しく調製した。各々のマウスには、経口胃での強制投与により０．２ｍｌのＭＲＳ中に５×１０９ＣＦＵの細菌を与える、又は対照としてＭＲＳ培地のみを与えた。細菌投与の頻度は、ＡＯＭ注射前は７日間の間、１日に１回で、その後、１５週間の間、３日に１回であり、マウスにＤＳＳの負荷をかけたときには休止した。
【００９３】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける結腸がんの誘導
１２週齢において、陽性対照群及び細菌処置群のマウスに、単一容量の遺伝毒性のある結腸発癌物質ＡＯＭ（体重１ｋｇあたり１２．５ｍｇ）を腹腔内注射により与えた。これらのマウスに、６日間、飲料水中２％（ｗ／ｖ）ＤＳＳで、ＡＯＭ注射の直後に１サイクル、２回目のサイクルの前に飲料水で２週間の回復期間を続けて、２サイクル、負荷をかけた。陰性対照群のマウスには、ＡＯＭ及び飲料水の代わりに１用量の緩衝食塩水（ＰＢＳ）を与えた。
【００９４】
腫瘍の評価及び組織の調製
ＡＯＭ注射から１５週間後、マウスを犠牲にし、検体を下記のように収集した。Ｋ２ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いた血液サンプル採取管中に心穿刺を介して鎮静化したマウスから採血し、４℃で１０分間、１７０００×ｇで遠心分離し、血漿を単離した。胃腸管を注意深く取り除き、回腸、盲腸及び結腸の内腔内容物を収集し、液体窒素中で急速に凍結した。マウスの結腸を切除し、縦に開き、腫瘍の数とサイズを数え、盲検的に測定した。腸管粘膜を手術用ナイフブレードで削り取り、後にｍＲＮＡ発現レベルを解析するためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に保存した。解析するまで、全てのサンプルを−８０℃で保存した。マウスの腸を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、ミクロトーム切片を５μｍに切った。切片化組織は、特異的抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ  ａｎｄ  Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ、ＭＡ、ＵＳ）を使用したＨ２Ｒ発現を標的とする組織学及び免疫組織化学研究のために使用した。マウスを犠牲にした直後にマウス脾臓サンプルを採取した。これらのサンプルをフローサイトメトリー研究に使用した。
【００９５】
統計解析
生物統計学的解析は、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）（バージョン５）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して行った。（コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して決定された）正規分布にフィットする数値変数については、データを標準偏差での算術平均として提示し、異なる群をｔ検定（２群）又は一方向ＡＮＯＶＡ（２群を超える）で比較した。そうでない場合には、データは、メジアン値、１０及び９０パーセンタイル又はメジアン値を示す散布図を示すボックス及びウィスカープロットとしてデータを提示した。異なる群は、非パラメトリックマン・ホイットニーＵ検定（２群）又はクラスカル・ワリス検定により比較した。群間の差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１で有意であるとみなした。
【００９６】
（例２）
例１に記載の調製。
フローサイトメトリー解析
大腿骨からの骨髄由来細胞及び各群からのマウスの脛骨を、１０％ＦＢＳを含む氷冷ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００２）ですぐに洗い流した。この手順の後に赤血球溶解緩衝液を添加してＲＢＣを枯渇させた（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。脾臓を取り出し、１０％ＦＢＳを含む氷冷ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００２）に保存した。このステップに続いて、滅菌ガラススライドを使用して脾臓細胞を単離し、ＲＢＣ溶解緩衝液を単離した細胞に添加した。単一細胞懸濁液は、４０μｍのフィルター系統（ｆｉｌｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）によって細胞を濾過することによって調製した。フローサイトメトリー解析のために、単一細胞懸濁液を抗体［１μｌのＡＰＣ−Ｃｙ７接合型抗Ｇｒ−１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５７６６１）及び５μｌのＦＩＴＣ接合型抗−ＣＤ１１ｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５７３９６）］で氷上、暗所で３０分間染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ細胞解析器を使用した多色フローサイトメトリーにより評価し、データをＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集した。蓄積したデータをＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で解析した。
【００９７】
（例３）
例１と同様の調製。
マウス血漿におけるマルチプレックスイムノアッセイによるサイトカイン測定
血漿中のマウスＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＫＣ、ＴＮＦ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２及びＩＬ−２３の濃度を、サイトカインマルチプレックスキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した（表１参照）。サイトカインの定量は、ルミネックス・システム（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して、製造元の取扱説明書に従って行った。簡潔に述べると、上述のように各マウスから集めた２５μｌの血漿サンプルを完全に解凍し、キット中に提供される同量のアッセイ緩衝液で希釈した。アッセイは盲検的に二重に実行した。ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）アナリスト５．１ソフトウェアが自動的に作成した報告書を精査し、検出値の限界を超え、飽和値未満のサイトカインのみを考察した。
【表１】
2018510631.tif 000003
【００９８】
（例４）
例１と同様の調製。
結腸粘膜におけるサイトカイン及びヒスタミン受容体のｍＲＮＡレベル
インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＫＣ及びヒスタミンＨ２受容体（Ｈ２Ｒ）の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを定量するために、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）を使用して結腸粘膜サンプルからＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  マイナスファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、１μｇのＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。逆転写酵素リアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物（Ｈ２Ｏで全量２５μｌに調整した）は、１μｌの鋳型ＤＮＡ、１２．５μｌのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（ＡＢＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）、及び０．５μｌのそれぞれのプライマー（各１０μＭ）を含めた。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−１８及びＩＬ−４の定量に使用したフォワード及びリバースプライマーは以前に記載されており（Ｇａｎｅｓｈら、２０１２）、他の遺伝子のプライマーは表２に示した。相対ｍＲＮＡ標的遺伝子発現レベル（比率＝［（Ｅｔａｒｇｅｔ）  ｄＣＰｔａｒｇｅｔ  （Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｓａｍｐｌｅ）］／［（Ｅｒｅｆ．）  ｄＣＰｒｅｆ．  （Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｓａｍｐｌｅ）］）をハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化し、参照として使用した。続いて、対照群の腸粘膜サイトカイン及びＨ２Ｒ遺伝子発現値を１．０に設定し、陰性対照群（ＭＲＳ／ＰＢＳ−Ｈ２Ｏ）、陽性対照群（ＭＲＳ／ＡＯＭ−ＤＳＳ）、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５処置群（Ｌ．ロイテリ６４７５／ＡＯＭ−ＤＳＳ）及び同質遺伝子的なＬ．ロイテリｈｄｃＡ突然変異体処置群（ｈｄｃＡ突然変異体／ＡＯＭ−ＤＳＳ）間でｍＲＮＡが相対的に何倍異なるかを同定するためのキャリブレーターとして使用した。
【表２】
2018510631.tif 000004
【００９９】
（例５）
例１と同様の調製。
生きたままのマウスのＰＥＴイメージング
ＡＯＭ注射の１５週間後、マウスを犠牲にする直前に、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを若干の改変を施しつつ記載（Ｂｒｅｗｅｒら、２００８）のように行った。簡潔に述べると、マウスをイソフルランで麻酔し、腹腔内（ＩＰ）注射によって２００μＣｉ  １８Ｆ−ＦＤＧを投与した。１時間後、これらのマウスに、３．５Ｆカテーテルを介して直腸内へ２００μＬのＭＤ−ガストロビュー（ＭＤ−Ｇａｓｔｒｏｖｉｅｗ）を走査開始直前に与えた。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを１０分間行った後、イノヴェオンＰＥＴ／ＣＴ多様式システム（Ｉｎｖｅｏｎ  ＰＥＴ／ＣＴ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＥＴスキャンを２０分間行った。マウスは、一定のイソフルラン吸入により、走査プロセス中は鎮静状態に保たれていた。画像を記録し、ＦＤＧ標準化取り込み値（ＳＵＶ）を、イノヴェオン・リサーチ・ワークプレイス・ソフトウェア（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して盲検的に解析した。マウスの２Ｄ画像は、ＯｓｉｒｉＸイメージングソフトウェア（Ｐｉｘｍｅｏ、Ｓｗｉｓｓ）によって生成された。
【０１００】
（例６）
ｑＲＴ−ＰＣＲによるｄａｇＫ  ｍＲＮＡ遺伝子発現の定量
野生型ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、ｈｄｃＡ突然変異体Ｌ．ロイテリ６４７５、野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９（２００２年９月１１日にブダペスト条約の下でＡＴＣＣ−アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０  ＵＳＡ）に寄託された）及び野生型Ｌ．ロイテリＤＳＭ  １７９３８（２００６年１月３０日にブダペスト条約の下で、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｅｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託された）は、ＭＲＳ培地中、３７℃で一晩増殖させ、厳密な無酸素条件下、気相としてＮ２／ＣＯ２（８０／２０；ｖ／ｖ）で培養した。１００μｌの新鮮な培養液を１０ｍｌの乳酸菌定義培地４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ  ４；ＬＤＭ４）中でインキュベートした。培養液は、厳密な無酸素条件下で３７℃のミニバイオリアクター内で保持した。サンプルを３時間、６時間、２４時間及び４８時間で収集した。培養液を４℃で６０００×ｇで１０分間処理することによって、細菌のペレットを得た。ペレットをＲＮａｓｅで処理した。細菌細胞からのｍＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ分離キットで抽出した。各群からの５００ｎｇのｍＲＮＡを使用してｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。処理したｃＤＮＡを１：２に希釈し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うために使用した。ストラタジーン  Ｍｘ３０００ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、ＵＳＡ）ｑＲＴ−ＰＣＲを増幅及び蛍光データ収集に使用した。マスターミックスは、１２．５μｌのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ２０００（ＡＢＩ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、０．５μｌの各プライマー（１０μＭ）、１μｌのサンプルからなり、水で調整することで、最終容量２５μｌ／ウェルとした。ＰＣＲ増幅後、プライマーの特異性を、融解曲線を検査することによりチェックし、アガロースゲル電気泳動（１％）によってアンプリコンのサイズを決定することによりチェックした。相対的ｍＲＮＡ標的遺伝子発現レベル（比率＝［（Ｅｔａｒｇｅｔ）  ｄＣＰｔａｒｇｅｔ  （ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓａｍｐｌｅ）］／［（Ｅｒｅｆ．）  ｄＣＰｒｅｆ．  （ｃｏｎｔｐｏｌ−ｓａｍｐｌｅ）］）を、ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＢに対して正規化し、参照として使用した。続いて、各細菌の３時間の培養物から得られたｍＲＮＡを１．０に設定し、キャリブレーターとして使用して、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＤＳＭ  １７９３８の６時間、２４時間及び４８時間のような同じ細菌株の異なる時点でｍＲＮＡが相対的に何倍異なるかを同定した。
【０１０１】
図９は、ｄａｇＫ遺伝子発現実験の結果を示す。この図は、野生型及びｈｄｃＡ突然変異体Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の両方は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９と共に、増加したｄａｇＫ発現を示す。しかしながら、ヒスタミンを産生できないＬ．ロイテリＤＳＭ  １７９３８も、ｄａｇＫ発現を欠いていた。興味深いことに、ｄａｇＫ  ｍＲＮＡ発現は、細菌の伸長期の間に非常に高く発現した。反復実験から、６時間と同様の発現を示したので、１２時間のインキュベーション時点を選択した。
【０１０２】
（例７）
細菌培養上清中のＤａｇＫタンパク質を検出するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
文献によると、ＤａｇＫはグラム陽性菌に可溶性アイソフォームを有すると考えられている。本発明者らは、ＤａｇＫがＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５から放出され、それが宿主の腸上皮脂質シグナル伝達と相互作用し、ヒスタミン放出と一緒になって炎症環境下における抗炎症挙動を促進すると仮定した。本発明者らはＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のｄａｇＫ遺伝子を突然変異させ、ＤＡＧＫ突然変異体Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５で無菌（ＧＦ）マウスをコロニー形成したところ、野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５でコロニー形成した無菌マウスで観察されたものと同じようなＩＬ−６及びＩＬ−１αの抑制は見られなかった。基底の炎症促進性サイトカインレベルは顕著に抑制された。このことにより、本発明者らはＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５がＨ１Ｒ及びＨ２Ｒ活性化のためにヒスタミンを必要とするという結論に至った。しかしながら、Ｈ１Ｒ下流シグナル伝達は、Ｌ．ロイテリにおけるＤａｇＫ合成によって、シグナル伝達に関わる脂質ＤＡＧを阻害することにより中断され、それによってヒスタミンの炎症促進性効果が抑制される。これは、Ｌ．ロイテリ由来ヒスタミンによるＨ２Ｒ活性化のみを可能にし、Ｈ２Ｒ活性化は、抗炎症性症状を促進することが知られている。
【０１０３】
ｄａｇＫが宿主免疫応答に何らかのポジティブな効果を示すためには、宿主−ＤＡＧ脂質を発現させるべきである。ＤＡＧが活性化されるためには、Ｈ１Ｒシグナル伝達を活性化しなければならない。これが、Ｌ．ロイテリ内のｄａｇＫを突然変異させ、マウスをコロニー形成させた際に、炎症促進性サイトカイン抑制が見られなかったことの理由である。このことは、ＰＫＣ及びＰＫＡ活性化によってさらに確認された。さらに、Ｌ．ロイテリ野生型又はｈｄｃＡ突然変異体又はｄａｇＫ突然変異株でコロニー形成した群間で、組織（ｆ−ＩＨＣ）におけるＨ１Ｒ及びＨ２Ｒ発現にはいかなる差異は見られなかったが、これは、これらの無菌マウスが内在性ヒスタミンもまた発現するからである。
【０１０４】
ＨＤＣノックアウトマウスにｈｄｃＡ突然変異体Ｌ．ロイテリを与えた場合、内因性及び外因性ヒスタミンの両方が欠如しているため、炎症及びがんから自分自身を保護することができなかった。しかし、ｈｄｃＡ突然変異体Ｌ．ロイテリでコロニー形成したＧＦマウスでは、内在性ヒスタミンが存在し、受容体を活性化した。しかしながら、ｈｄｃＡ突然変異体Ｌ．ロイテリによって産生されたＤａｇＫは、Ｈ１Ｒの発現活性化を抑制することを助けた。それが、ｈｄｃＡ突然変異体でコロニー形成した群で炎症促進性バイオマーカーの抑制が見られた理由である。しかし、Ｌ．ロイテリにおいてｄａｇＫがノックアウトされた場合（ｄａｇＫ突然変異体）、Ｈ１Ｒ及びＨ２Ｒの両方を活性化する内因性及び外因性のヒスタミンが存在したが、Ｈ１Ｒを抑制するＤａｇＫは存在しなかった。従って、細菌を有さないＧＦマウスと同様の炎症促進性シグナル伝達の上昇が見られた。ＧＦマウスにおいて、内在性ヒスタミンは、Ｈ１Ｒ及びＨ２Ｒの両方を活性化する。
【０１０５】
これにより実験データは、野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５でマウスをコロニー形成させた後に基底の免疫レベルが停止したことを示しており、そのためそれは完全な免疫抑制因子であり、攻撃的免疫応答を有する患者においてこの細菌株は優れた治療薬であり得る。
【０１０６】
Ｌ．ロイテリからＤａｇＫアイソフォームが分泌されているか否かをさらに示すために、本発明者らは細菌細胞培養実験を行った。無酸素条件下、３７℃で、一晩ＭＲＳで増殖させた１００μｌのＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５を１０ｍｌのＬＤＭ４培地に加え、無酸素条件下、３７℃で１２時間放置した。細菌細胞を、４℃で１０分間、６０００×ｇの遠心分離によって取り除いた。１：１の比率のプロテナーゼ及びプロテインキナーゼ阻害剤を上清に添加した。０．２２μｍのフィルターにより上清を濾過して、残存の細菌を除去した。ＤａｇＫは１０〜１３ｋＤａのタンパク質であるため、バックグラウンドを低減する必要がある。従って、上清を５０ｋＤａの濾液で処理した。フロースルーを３ｋＤａの濾液に加え、５０００×ｇで３０分間回転させた。トリプシン消化後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実行するために、上相の濃縮物を使用した。図１０は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５からのＤａｇＫタンパク質のアミノ酸配列をトリプシン消化又は切断部位（Ｔｒｙｐｓ）と共に示す。
【０１０７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験の結果を表３及び図１０に提示する。Ｌ．ロイテリＤａｇＫタンパク質と一致する配列が上清中に見出された。従って、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５は、ＤａｇＫタンパク質を産生すること及び分泌することができる。
【表３】
2018510631.tif 000005
【０１０８】
表３のペプチドＡ−Ｆ：
Ａ  ＥＥＲＮＭＲ                          配列番号１５
Ｂ  ＤＶＡＡＧＧＶＬＩＳＡ                配列番号１６
Ｃ  ＤＫＨＱＴＥＫ                        配列番号１７
Ｄ  ＮＭＲＹＨＬＬＡＡＣＬＡＩ            配列番号１８
Ｅ  ＥＥＲＮＭＲＹ                        配列番号１９
Ｆ  ＫＡＫＤＶＡＡＧＧＶＬＩＳＡＩＦＳＶＬＶＧＬＩＩＦＩＰ      配列番号２０
【０１０９】
（例８）
ＤａｇＫを産生することができる株の同定
細菌はＭＲＳプレート上で嫌気性大気中、１６時間３７℃で培養する。細菌性コロニーを滅菌プラスチックループで収集し、１００μｌの滅菌水（ＰＣＲ品質）中に懸濁する。或いは、任意の適切な方法を使用して細菌培養物からＤＮＡを調製することができ、例としては例６を参照されたい。
【０１１０】
ｄａｇＫ遺伝子の存在は、例えばＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）並びに各０．４ｍＭのプライマー対ｄａｇＫ＿ＬｒＦ（ＴＧＧＡＣＴＣＡＣＧＣＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡ、配列番号２１）及びｄａｇＫ＿ＬｒＲ（ＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＴＣＧ、配列番号２２）をＰＣＲにより検査される。細菌懸濁液又はＤＮＡ調製物（０．５μｌ）をＰＣＲ混合液に添加し、ＰＣＲ反応を９５℃、５分間；３０×（９５℃、３０秒；５８℃、３０秒；７２℃、３０秒）；７２°、１０分のプログラムを実行することにより行った。標準的なアガロースゲル電気泳動を使用してＰＣＲ産物を分離し及び可視化し、ＰＣＲに使用したフォワードプライマー（ｄａｇＫ＿ＬｒＦ）を使用して、標準的なサンガー配列決定により配列決定する。
【０１１１】
（例９）
ヒスタミン及びＤａｇＫを産生することができるラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ  ３２２７３の解析
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ  ３２２７３（ブダペスト条約に基づき２０１６年３月８日にＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、Ｄ  −  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託した）細菌を、ＭＲＳ培地中、３７℃で一晩増殖させた。細菌懸濁液を３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１μｌのペレットを１００μｌのＰＢＳに懸濁させた。
【０１１２】
ｈｄｃＡ４２５ｆｄｅ（ＣＧＴＣＡＹＴＡＴＣＣＷＧＣＴＣＣＷＧＧ、配列番号２３）及びｈｄｃＡ８６７ｒｄｅ（ＴＣＣＡＴＲＴＣＡＧＴＡＴＣＷＧＧＫＧＴ、配列番号２４）のプライマーを用いて、ＰＣＲ解析（ヒスチジン脱炭酸酵素（ｈｄｃ））を行った。得られたＰＣＲ産物は、４４２ｂｐのサイズを有していた。ＰＣＲプライマーは、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ヒルガルディイ（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、Ｌ．ブクネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）及びＬ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）からのｈｄｃのアライメントから設計した。ＤｒｅａｍＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（２Ｘ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号Ｋ１０８１）をＰＣＲ反応に使用した。ここに記載のＰＣＲ反応：
プライマーを有するマスターミックス            反応あたりの容量
水（ＰＣＲ品質）                              １０．０μｌ
プライマー、フォワード（１０ｐｍｏｌ／μｌ）    １．０μｌ
プライマー、リバース（１０ｐｍｏｌ／μｌ）      １．０μｌ
ＤｒｅａｍＴａｑ                              １２．５μｌ
２４．５μｌのマスターミックスを０．５μｌの細菌懸濁液と混合し、以下のＰＣＲプログラムを実行した：９５℃、１０分；３０×（９５℃、３０秒；４８℃、３０秒；７２℃、３０秒）；７２℃、５分。
【０１１３】
Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３におけるｄａｇＫ遺伝子のＰＣＲ解析を、例８に記載のように行った。
【０１１４】
結果は、Ｌ．ロイテリＤＳＭ  ３２２７３がヒスチジン脱炭酸酵素及びｄａｇＫ遺伝子をコードする遺伝子に対して陽性であることを示した。表４を参照されたい。細菌株Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＤＳＭ  １７９３８を対照として含めた。
【表４】
2018510631.tif 000006
【０１１５】
上に記載の実施形態は、本発明のいくつかの例示的な例として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変、組合せ、及び変更を実施形態に為し得ることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分解決策は、技術的に可能な場合には、他の構成で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【０１１６】
参考文献
Ａｄａｍｓ，  Ｗ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｄ．Ｌ．  （１９９４）．
短期間のシメチジン及び結腸直腸がんでの生存時間。（Ｓｈｏｒｔ−ｃｏｕｒｓｅ  ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．）Ｌａｎｃｅｔ  ３４４，  １７６８−１７６９．
Ｂｒｅｗｅｒ，  Ｓ．，  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｄ．，  Ｔｕｒｏｖｓｋａｙａ，  Ｏ．，  Ｚｉｒｉｎｇ，  Ｄ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｌ．，  Ｔａｋｅｄａｔｓｕ，  Ｈ．，  Ｔａｒｇａｎ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｗｅｉ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｂｒａｕｎ，  Ｊ．  （２００８）．
２−デオキシ−２−［１８Ｆ］フルオロ−Ｄ−グルコース及び陽電子放出断層撮影法によるマウス腸炎症の分子イメージング。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ２−ｄｅｏｘｙ−２−［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．）
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３５，  ７４４−７５５．
Ｆｒｅｉ，  Ｒ．，  Ｆｅｒｓｔｌ，  Ｒ．，  Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ，  Ｐ．，  Ｚｉｅｇｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｔ．，  Ｒｕｇｅｌｅｓ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｍａｉｌａｎｄ，  Ｓ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｔ．，  Ｌａｕｅｎｅｒ，  Ｒ．，  Ａｋｄｉｓ，  Ｃ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）．ヒスタミン受容体２は、微生物リガンドに対する樹状細胞応答を改変する。（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ．）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３２，  １９４−２０４．
Ｆｕｋｕｉ，  Ｈ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｓｕｎ，  Ｃ．，  Ｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｙａｍａｓａｋｉ，  Ｔ．，  Ｋｏｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｔｏｍｉｔａ，  Ｔ．，  Ｏｓｈｉｍａ，  Ｔ．，  Ｗａｔａｒｉ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．がん関連性線維芽細胞によって産生されるＩＬ−２２は、胃がん細胞浸潤をＳＴＡＴ３及びＥＲＫシグナル伝達を介して促進する。（ＩＬ−２２  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｖｉａ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ＥＲＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．）Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １１１，  ７６３−７７１．
Ｇａｌｉｔｏｖｓｋｉｙ，  Ｖ．，  Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ，  Ｓ．，  Ｓｅｖｒｉｏｋｏｖ，  Ｅ．，  Ｃｏｒｃｈｅｓ，  Ａ．，  Ｐａｎ，  Ｍ．，  Ｋａｌａｎｔａｒｉ−Ｄｅｈａｇｈｉ，  Ｍ．，  Ｃｈｅｒｎｙａｖｓｋｙ，  Ａ．，  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｒａｎｄｏ，  Ｓ．  （２０１３）．ＮＮＫで治療したＡ／Ｊマウスを使用した１８Ｆ−ニフェンＰＥＴ／ＣＴを用いた肺がんの診断イメージングへの新規アプローチの開発。（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  １８Ｆ−Ｎｉｆｅｎｅ  ＰＥＴ／ＣＴ  ｕｓｉｎｇ  Ａ／Ｊ  Ｍｉｃｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＮＮＫ．）Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １，  １２８−１３７．
Ｇａｎｅｓｈ，  Ｂ．Ｐ．，  Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｂｌａｕｔ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｌｏｈ，  Ｇ．  （２０１２）．エンテロコッカス・フェシウムＮＣＩＭＢ１０４１５はインターロイキン−１０ノックアウトマウスを慢性腸炎から保護しない。（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＮＣＩＭＢ  １０４１５  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｕｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．）Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ３，  ４３−５０．
Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，  Ｍ．，  Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，  Ｅ．，  Ｃａｍｐｏｓ，  Ｒ．，  Ｎｕｎｅｚ  ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｖａｒａ−Ｔｈｏｒｂｅｃｋ，  Ｃ．  （１９８８）．
ヒト結腸直腸がんにおけるヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）活性の上昇：１０名の患者についての研究結果。（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  （ＨＤＣ）  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｅｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ２３，  ３５７−３６０．
Ｊｉ，  Ｙ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  Ｌｉ，  Ｊ．，  Ｌｕ，  Ｚ．，  Ｌｉ，  Ｘ．，  Ｙｕ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｉ，  Ｎ．  （２０１４）．ＩＬ−２２は、ＩＬ−２２Ｒ１／ＡＫＴ／ＭＭＰ−９シグナル伝達を介して胃がん細胞の移動及び浸潤を促進する。（ＩＬ−２２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ＩＬ−２２Ｒ１／ＡＫＴ／ＭＭＰ−９  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７，  ３６９４−３７０３．
Ｊｕｔｅｌ，  Ｍ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｔ．，  Ｋｌｕｎｋｅｒ，  Ｓ．，  Ａｋｄｉｓ，  Ｍ．，  Ｔｈｏｍｅｔ，  Ｏ．Ａ．，  Ｍａｌｏｌｅｐｓｚｙ，  Ｊ．，  Ｚａｋ−Ｎｅｊｍａｒｋ，  Ｔ．，  Ｋｏｇａ，  Ｒ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｂｌａｓｅｒ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．ヒスタミンは、Ｈ１及びＨ２受容体の差次的発現によってＴ細胞及び抗体応答を調節する。（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ１  ａｎｄ  Ｈ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，  ４２０−４２５．
Ｋｅｌｌｙ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｃｈｅｒｉａｎ，  Ｍ．，  Ｄｗｅｒｒｙｈｏｕｓｅ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｆｉｎｌａｙ，  Ｉ．Ｇ．，  Ａｄａｍｓ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｌｕｂｏｗｓｋｉ，  Ｄ．Ｚ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｄ．Ｌ．  （１９９９）．腫瘍関連リンパ球の定量的評価での結腸直腸がん患者における術前シメチジンの無作為試験。（Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．）Ｃａｎｃｅｒ  ８５，  １６５８−１６６３．
Ｋｒｙｃｚｅｋ，  Ｉ．，  Ｌｉｎ，  Ｙ．，  Ｎａｇａｒｓｈｅｔｈ，  Ｎ．，  Ｐｅｎｇ，  Ｄ．，  Ｚｈａｏ，  Ｌ．，  Ｚｈａｏ，  Ｅ．，  Ｖａｔａｎ，  Ｌ．，  Ｓｚｅｌｉｇａ，  Ｗ．，  Ｄｏｕ，  Ｙ．，  Ｏｗｅｎｓ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．ＩＬ−２２（＋）ＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、ＳＴＡＴ３転写因子の活性化及びメチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの誘導を介して結腸直腸がんの幹細胞性を促進する。（ＩＬ−２２（＋）ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ  ｖｉａ  ＳＴＡＴ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＤＯＴ１Ｌ．）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０，  ７７２−７８４．
Ｌａｎｄｓｋｒｏｎ，  Ｇ．，  Ｄｅ  ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅ，  Ｍ．，  Ｔｈｕｗａｊｉｔ，  Ｐ．，  Ｔｈｕｗａｊｉｔ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｈｅｒｍｏｓｏ，  Ｍ．Ａ．  （２０１４）．腫瘍微小環境における慢性炎症及びサイトカイン。（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４，  １４９１８５．
Ｌｅｅ，  Ｙ．Ｓ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｉ．，  Ｎｉｎｇ，  Ｙ．，  Ｋｉｍ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｋｈａｔｃｈａｄｏｕｒｉａｎ，  Ｖ．，  Ｙａｎｇ，  Ｄ．，  Ｃｈｕｎｇ，  Ｈ．Ｋ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｄ．，  ＬａＢｏｎｔｅ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｌａｄｎｅｒ，  Ｒ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．腫瘍微小環境におけるインターロイキン−８及びその受容体ＣＸＣＲ２は、結腸がんの増殖、進行及び転移を促進する。（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＸＣＲ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．）Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １０６，  １８３３−１８４１．
Ｎａｇａｓａｋｉ，  Ｔ．，  Ｈａｒａ，  Ｍ．，  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｓａｔｏ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｔａｋｅｙａｍａ，  Ｈ．  （２０１４）．結腸がん関連性線維芽細胞によって放出されたインターロイキン−６は、腫瘍血管形成にとって重要である：抗インターロイキン−６受容体抗体は、血管形成を抑制し、腫瘍間質の相互作用を阻害する。（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｂｙ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｔｕｍｏｕｒ−ｓｔｒｏｍａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．）Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １１０，  ４６９−４７８．
Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ，  Ｌ．，  Ａｋｄｉｓ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ａｋｄｉｓ，  Ｃ．Ａ．  （２０１１）．
ヒスタミン及びヒスタミン受容体による免疫応答及び炎症の調節。（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２８，  １１５３−１１６２．
Ｏｑｕｅｎｄｏ，  Ｐ．，  Ａｌｂｅｒｔａ，  Ｊ．，  Ｗｅｎ，  Ｄ．Ｚ．，  Ｇｒａｙｃａｒ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｄｅｒｙｎｃｋ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｔｉｌｅｓ，  Ｃ．Ｄ．  （１９８９）．血小板由来増殖因子誘導性ＫＣ遺伝子は、血小板アルファ−顆粒タンパク質に関連する分泌タンパク質をコードする。（Ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＫＣ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｌｐｈａ−ｇｒａｎｕｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４，  ４１３３−４１３７．
Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｈｏｎｇ，  Ｔ．，  ｖａｎ  Ｐｉｊｋｅｒｅｎ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｈｅｍａｒａｊａｔａ，  Ｐ．，  Ｔｒｉｎｈ，  Ｄ．Ｖ．，  Ｈｕ，  Ｗ．，  Ｂｒｉｔｔｏｎ，  Ｒ．Ａ．，  Ｋａｌｋｕｍ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ，  Ｊ．  （２０１２）．プロバイオティックラクトバチルス・ロイテリ由来のヒスタミンは、ＰＫＡ及びＥＲＫシグナル伝達の調節を介してＴＮＦを抑制する。（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＴＮＦ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＫＡ  ａｎｄ  ＥＲＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，  ｅ３１９５１．
Ｔｊａｌｓｍａ，  Ｈ．，  Ｂｏｌｅｉｊ，  Ａ．，  Ｍａｒｃｈｅｓｉ，  Ｊ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｄｕｔｉｌｈ，  Ｂ．Ｅ．  （２０１２）．結腸直腸がんについての細菌のドライバー−乗客モデル：通常の被疑者を超えて。（Ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｒｉｖｅｒ−ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｕｓｕａｌ  ｓｕｓｐｅｃｔｓ．）Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０，  ５７５−５８２．
Ｗａｌｄｎｅｒ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｆｏｅｒｓｃｈ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｍ．Ｆ．  （２０１２）．インターロイキン−６−−結腸直腸がん発症の重要な調節因子。（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６−−ａ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，  １２４８−１２５３．
Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｓ．，  Ｄｅｇｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｚｈｅｎｇ，  Ｒ．，  Ｔａｍａｉ，  Ｈ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．Ｘ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｈｕ，  Ｓ．  （２００８）．腫瘍誘導性ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋骨髄細胞は、腫瘍流入領域リンパ節におけるＴ細胞感作を抑制する。（Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８１，  ３２９１−３３００．
Ｙａｎｇ，  Ｘ．Ｄ．，  Ａｉ，  Ｗ．，  Ａｓｆａｈａ，  Ｓ．，  Ｂｈａｇａｔ，  Ｇ．，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｒ．Ａ．，  Ｊｉｎ，  Ｇ．，  Ｐａｒｋ，  Ｈ．，  Ｓｈｙｋｉｎｄ，  Ｂ．，  Ｄｉａｃｏｖｏ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｆａｌｕｓ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．ヒスタミン欠乏は、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋未成熟骨髄細胞の骨髄成熟及び蓄積の低減を介して炎症関連性発癌を促進する。（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．）Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７，  ８７−９５．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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