(57)【要約】本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断方法に関する。本発明は、対象におけるＴＢＩの進行の監視方法にも関する。【選択図】図１
2018522558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断方法であって、
ａ）前記対象から採取した生物試料中の１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のレベル（複数可）を決定すること、及び
ｂ）ＴＢＩに罹患していないと決定された対照対象からの同じ１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）に対して、前記１つ以上のｍｉＲＮＡの前記決定されたレベル（複数可）を比較すること
を含み、
ＴＢＩに罹患していないと決定された前記対照対象からの前記１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）と比較した前記１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の上昇は、前記対象がＴＢＩに罹患していることを示す、前記方法。
【請求項２】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＢＩが、軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）または重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＢＩが、ｍＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＢＩが、ｓＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈａｓ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＢＩが、閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）または爆風による外傷性脳損傷（ｂＴＢＩ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、ヒトである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物試料が、血清試料または脳脊髄液試料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物試料が、外傷性の事象が疑われた後の１日未満に前記対象から採取される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物試料が、前記外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日未満に前記対象から採取される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、ＴＢＩを罹患するリスクがある、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、リアルタイムＰＣＲによって決定される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２による正規化後に測定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａを除外する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の進行の監視方法であって、
ａ）異なる時点で採取した前記対象からの少なくとも２つの生物試料を分析して、前記少なくとも２つの生物試料の各々中の１つ以上の特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のレベル（複数可）を決定すること、及び
ｂ）前記１つ以上の特定のｍｉＲＮＡの前記決定されたレベル（複数可）を経時的に比較して、前記１つ以上の特定のｍｉＲＮＡの前記対象のレベル（複数可）が経時的に変化しているかどうかを決定することを含み、
前記１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の経時的な上昇は、ＴＢＩを罹患する前記対象のリスクが経時的に上昇していることを示す、前記方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＢＩが、軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）または重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＢＩが、ｍＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＢＩが、ｓＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＢＩが、閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）または爆風による外傷性脳損傷（ｂＴＢＩ）である、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、ヒトである、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物試料が、血清試料または脳脊髄液試料である、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物試料が、外傷性の事象が疑われた後の１日未満に前記対象から採取される、請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物試料の少なくとも１つが、前記外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日未満に前記対象から採取される、請求項２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、ＴＢＩを罹患するリスクがある、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、リアルタイムＰＣＲによって決定される、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２による正規化後に測定される、請求項２０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａを除外する、請求項２０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
生物試料中のマイクロＲＮＡまたは複数のマイクロＲＮＡの検出方法であって、
外傷性脳損傷の臨床症状を呈している対象から第１の生物試料を得ること、
前記第１の生物試料を、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに結合するプローブと接触させて、マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡタンパク質複合体を生成すること、及び
ノーザンブロットまたはリアルタイムＰＣＲで前記マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体の存在または不在を検出することを含み、
前記複合体の不在は、前記第１の生物試料中の前記マイクロＲＮＡの不在を示す、前記方法。
【請求項４０】
前記プローブが、検出可能に標識される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿素、唾液、または組織である、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物試料が、前記対象が外傷性脳損傷を罹患した後の、前記外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日未満に得られる、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
第２の時点で前記対象から生物試料を得ること、
前記第２の時点からの前記生物試料を、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに結合するプローブと接触させて、マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を生成すること、
ノーザンブロットまたはリアルタイムＰＣＲで前記第２の時点からの前記生物試料中の前記マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体の存在または不在を検出して、前記対象における前記外傷性脳損傷の進行を追跡することをさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａを除外する、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断方法に関する。本発明は、対象におけるＴＢＩの進行の監視方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、民間人、兵役の隊員、及びプロスポーツ選手のいずれにも関与する流行規模の問題である。米国では、１３０万人超の救急外来受診がＴＢＩを占めており、全ての損傷関連死のほぼ１／３の原因である。米国におけるＴＢＩの経済的負担は、生涯の直接総医療費及び生産性の損失において年間７６５億ドルであると推定される。
【０００３】
軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）は、震盪とも呼ばれ、米国で報告された全てのＴＢＩケースの７７％超を占める。これらのケースのうちで、損傷のうちの約４０％は、無視されることが多く、治療を求めないことが推定される。ｍＴＢＩは、最近の戦争から帰還した退役軍人、及びｍＴＢＩを経験したイラク及びアフガニスタンにおける最近の戦争から帰還した退役軍人の２０％超における罹患率の主要な原因でもある。ｍＴＢＩに関連する症状のほとんどは、損傷の数日または数週以内に解決し、ほとんどのケースではかなり回復する。しかしながら、ｍＴＢＩ患者のおおよそ１０〜２０％は、長期間の問題を訴えており、一部は、１年を超えて持続する症状を経験している。ｍＴＢＩは、個体における神経機能、認知、及び行動の変化を誘発し得る。臨床症状には、頭痛、睡眠障害、記憶障害、不安、及びうつ病を含み得る。頭部への衝突時の加速及び減速力は、白質への損傷ももたらし、これは、びまん性軸索損傷を引き起こす。軸索損傷は、損傷の２４時間後にピークを迎え、損傷後に最長で１年間進行し得る。この連続的な進行が、ｍＴＢＩ後の予後不良の原因因子であり得ると考えられる。
【０００４】
ｍＴＢＩは、通常、臨床医にとって診断することが難しく、それは脳損傷の明らかな兆候が欠如しているためである。現在、ｍＴＢＩは、患者の眼、発語、及び運動反応を評価することによってスコアを測定するグラスゴー・コーマ・スケール（ＧＣＳ）を用いて評価する。ＧＣＳスコア及び意識の消失または変化を使用して、損傷の重症度を判定する。ＧＣＳスコアは、多発性外傷、アルコールの乱用、鎮静剤の使用、及び心理的ストレスの存在により、ｍＴＢＩ診断での使用が限定され得る。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して、脳損傷の程度を検出するが、しかしながら、震盪の場合には、ＣＴ及びＭＲＩは、感度が制限されており、微小出血がないことにより任意の特定の損傷傷害の検出に失敗することが多い。新しい技術の進歩により、ＭＲＩは、ＣＴよりも感度が高くなっているが、それらの利用度が限定されること、かつ、スキャンのコストが、軍人及び民間人の双方における急性期の診断にこの技術を利用するのを困難にしている。
【０００５】
生物流体におけるバイオマーカーは、血液、尿素、及び唾液などの末梢組織から測定でき、かつ、既存の方法を用いて容易に定量化できるため、ｍＴＢＩ診断に対して多くの利点を提供する。血清及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のいくつかのタンパク質マーカー、例えば、Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質（Ｓ−１００β）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ−Ｌ１（ＵＣＨ−Ｌ１）は、軽度から重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）のバイオマーカーとしてそれらの効用について広範囲に研究されている。しかしながら、研究されたタンパク質バイオマーカーのほとんどは、頭蓋内傷害のないｍＴＢＩに対する感度が比較的小さい。ｍＴＢＩ診断に対して２つ以上のタンパク質バイオマーカーの組み合わせについて最近研究されており、これらは、単一マーカーと比較してより良好な診断精度を示している。広範な研究にもかかわらず、ほとんどのタンパク質マーカーは前臨床試験中であり、臨床使用に利用可能なマーカーはない。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後レベルでタンパク質合成を調節する小さな（１９〜２８ｎｔ）内因性ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、血清中で検出することができ、神経細胞を含む起源細胞における疾患病理学のインジケーターになり得る。この疾患状態を反映する性質により、中枢神経系（ＣＮＳ）病理学のバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡに対する注目が最近集まっている。血清ｍｉＲＮＡは、比較的安定で、繰り返し凍結融解、酵素分解に耐性があり、可変のｐＨ条件で生存できるため、ｍＴＢＩに対して好適なバイオマーカー候補になる。
【０００７】
ｍｉＲＮＡは、多くのＣＮＳ疾患の特異的かつ感度の高いバイオマーカーとして最近報告されている。閉鎖性頭部損傷モデルにおける震盪性の軽度損傷に応答したｍｉＲＮＡの血清発現が最近報告され、９つのｍｉＲＮＡの指標物質が、損傷直後に血清中で調節することが判明した。ｍｉＲＮＡ調節は、外傷後ストレスの齧歯類モデルでも分析され、９つのｍｉＲＮＡの指標物質が同定され、これらのｍｉＲＮＡは外傷後ストレスへの暴露２週間後の動物の血清及び扁桃体中で上方調節された。興味深いことに、この研究で報告されたｍｉＲＮＡは、ＴＢＩ研究で報告されたｍｉＲＮＡといずれの類似点も有さず、血清中のｍｉＲＮＡ発現が、脳の物理的状態の変化の特定のインジケーターになり得ることが示唆された。ＴＢＩを診断し、監視する非侵襲的で感度の高い信頼性テストの必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断方法に関し、該方法は、（ａ）対象から採取した生物試料中の１つ以上の特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のレベル（複数可）を決定すること、及び（ｂ）ＴＢＩに罹患していないと決定された対照対象からの同じ１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）に対して、１つ以上のｍｉＲＮＡの決定されたレベル（複数可）を比較することを含み、ＴＢＩに罹患していないと決定された対照対象からの１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）と比較した１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の上昇は、対象がＴＢＩに罹患していることを示す。
【０００９】
別の態様では、本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の進行の監視方法にも関し、該方法は、（ａ）異なる時点で採取した対象からの少なくとも２つの生物試料を分析して、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）を決定すること、及び（ｂ）１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）を経時的に比較して、対象の１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）が経時的に変化しているかどうかを決定することを含み、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の経時的な上昇は、ＴＢＩを罹患する対象のリスクが経時的に上昇していることを示す。
【００１０】
別の態様では、本発明は、生物試料中のマイクロＲＮＡまたは複数のマイクロＲＮＡの検出方法にも関し、該方法は、ＴＢＩの臨床症状を呈している対象から第１の生物試料を得ること、第１の生物試料を少なくとも１つのｍｉＲＮＡに結合するプローブと接触させること、及びノーザンブロットまたはリアルタイムＰＣＲでマイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体の存在または不在を検出することを含み、複合体の不在は、第１の生物試料中のマイクロＲＮＡの不在を示す。
【００１１】
一態様では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上、または全てを除外する。
【００１２】
別の態様では、ＴＢＩは、軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）または重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）である。別の態様では、ＴＢＩは、閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）または爆風による外傷性脳損傷（ｂＴＢＩ）である。別の態様では、対象は、ヒトである。別の態様では、生物試料は、血清及び／または血漿試料である。別の態様では、生物試料は、外傷性の事象が疑われた後の１日未満、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日未満に、対象から採取される。
【００１３】
別の態様では、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）は、リアルタイムＰＣＲによって決定される。本明細書のいくつかの実施形態によるＴＢＩの診断方法は、ｍｉＲＮＡを増幅することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異なる実験群における発現のパターンを理解するために、それらのΔＣｔ値を用いた全ての試料のほとんどのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡプロファイルの階層的クラスタリングを示す。対照群とＴＢＩ群は、異なる変化を示した。整形外科的損傷群は、対照とは異なったが、これらの試料のほとんどは、ＴＢＩ群とは別にクラスタ化された。
【図２】いくつかの実施形態における対照試料に対するｍＴＢＩ、ｓＴＢＩ、及び整形外科的損傷対照群におけるｍｉＲＮＡの顕著な発現を示す２つの例示のベン図を示す。ｍｉＲＮＡ発現は、グローバル正規化アルゴリズムを用いて正規化された。損傷群の各々を対照試料で正規化し、損傷群における大幅に調節されたｍｉＲＮＡを同定した。
【図３】ＴＢＩ  ｍｉＲＮＡ候補；上方調節発現を示すｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６の直接の標的を同定するｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析プログラムを示す。
【図４】ＴＢＩ  ｍｉＲＮＡ候補の直接の標的を同定する別のｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析プログラムを示す。
【図５】ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩの血清試料中のｍｉＲＮＡ特異的検証アッセイを示す。値は、線形目盛において対照に対する倍率変化±ＳＤとして表される。有意性は、対応スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）を用いて算出した。
【図６】ｓＴＢＩのＣＳＦ試料中のｍｉＲＮＡ特異的検証アッセイを示す。特定のｍｉＲＮＡアッセイは、５つの候補ｍｉＲＮＡについて行った。正規化は、最小標準偏差を示し、かつ、正規化対照として選択されたｍｉＲ−２０２で行った。試験した５つのうち、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｍｉＲ−４８６は、有意に上方調節された。値は、線形目盛において対照に対する倍率変化±ＳＤとして表される。有意性は、対応スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）を用いて算出した。
【図７】ｓＴＢＩのＣＳＦ試料における追加のｍｉＲＮＡ特異的検証アッセイを示す。
【図８】ヒト対象の２つの群におけるｍｉＲＮＡのレベルの比較を示す、頭部にＣｔ傷害を有する対象対頭部にＣｔ傷害を有さない対象におけるマイクロＲＮＡバイオマーカーのレベルを示す。１群は、頭部ＣＴにあらゆる傷害を有さない対象（ＴＢＩ、及び対照）（ｎ＝１９）からなる。２群は、頭部ＣＴに傷害を有するＴＢＩ対象（ｎ＝１２）である。全ての対照（正常及び外傷）が陰性ＣＴスキャンを有すると仮定した。選択されたｍｉＲＮＡの２つを除いた全て：ｍｉＲ−１９５（ｐ＜０．００１）；ｍｉＲ−３０ｄ（ｐ＜０．００１）；ｍｉＲ−４５１（ｐ＜０．０１１）；ｍｉＲ−３２８（ｐ＝０．１０１）；ｍｉＲ−９２ａ（ｐ＜０．００１）；ｍｉＲ−４８６（ｐ＝０．００６）；ｍｉＲ−５０５（ｐ＝０．００８）；及びｍｉＲ−３６２（ｐ＝０．０３５）；ｍｉＲ−１５１（ｐ＝０．０６５）；及びｍｉＲ−２０ａ（ｐ＝０．０１２）（アスタリスクを参照）について２つの群で有意差があった。
【図９】ＲＯＣ曲線を用いて診断精度を評価し、ＴＢＩを対照と区別するための曲線下面積を決定したことを示す。ＡＵＣは、ｍｉＲ−１９５（０．８１）、ｍｉＲ−３０ｄ（０．７５）、ｍｉＲ−４５１（０．８２）、ｍｉＲ−３２８（０．７３）、ｍｉＲ−９２ａ（０．８６）、ｍｉＲ−４８６（０．８１）、ｍｉＲ−５０５（０．８２）、ｍｉＲ−３６２（０．７９）、ｍｉＲ−１５１（０．６６）、ｍｉＲ−２０ａ（０．７８）であった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、軽度及び重度の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する対象からのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）バイオマーカー、及びそれらの使用に関する。ｍｉＲＮＡは、小ＲＮＡ分子（例えば、長さが２２ヌクレオチド）であり、標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）上の相補配列に結合し、通常、翻訳抑制及び遺伝子サイレンシングをもたらす転写後調節因子であることが多いが、そうである必要はない。ｍｉＲＮＡは、繰り返し凍結融解、酵素分解、及び極端なｐＨ条件に耐える能力により血清中で非常に安定であるため、良好なバイオマーカーとして役割を果たし得る。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）という用語は、天然に存在し得る、ヒトｍｉＲＮＡ、成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲ）、及びそれらの変異体を含む。ある場合には、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一次ｍｉＲＮＡ転写物及び２重鎖ｍｉＲＮＡも含む。特に断りのない限り、本明細書で使用される場合、特定のｍｉＲＮＡの名称は、成熟ｍｉＲＮＡを指す。例えば、ｍｉＲ−１９４は、プレｍｉＲ−１９４から導かれる成熟ｍｉＲＮＡ配列を指す。ヒトの成熟配列及び前駆体配列を含む特定のｍｉＲＮＡの配列は、例えば、ウェブ上の配列データベース：ｍｉＲＢａｓｅ：（２０１３年６月に公開された第２０版）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，３６，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１５４−Ｄ１５８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に報告されている。ある特定のｍｉＲＮＡの場合、単一の前駆体は、２つ以上の成熟ｍｉＲＮＡ配列を含有する。他の例では、多数の前駆体ｍｉＲＮＡは、同じ成熟配列を含有する。ある場合には、成熟ｍｉＲＮＡは、新しい科学的コンセンサスに基づいて改めて命名されている。当業者は、所与のｍｉＲＮＡについての、具体的には成熟型のｍｉＲＮＡについての正確な核酸配列に関する科学的コンセンサスは時間とともに変化し得ることを理解されたい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象から採取した生物試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）を決定すること、及び（ｂ）ＴＢＩに罹患していないと決定された対照対象からの同じ１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）に対して、１つ以上のｍｉＲＮＡの決定されたレベル（複数可）を比較することを含む。ＴＢＩに罹患していないと決定された対照対象からの１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）と比較した１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の上昇は、対象がＴＢＩに罹患し得ることを示し得る。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の進行の監視方法にも関する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）異なる時点で採取した対象からの少なくとも２つの生物試料を分析して、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）を決定すること、及び（ｂ）１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）を経時的に比較して、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡの対象のレベル（複数可）が経時的に変化しているかどうかを決定することを含む。１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の経時的な上昇は、ＴＢＩを罹患する対象のリスクが経時的に上昇していることを示し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）は、種々の条件下で一貫性のあることが判明した１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）によって正規化されてもよい。いくつかの実施形態では、「１つ以上の」ｍｉＲＮＡとは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のｍｉＲＮＡを指す。
【００１８】
「診断すること」という用語は、疾患の診断または予後判定または予測を行うことを含む。ある場合には、「診断すること」は、対象がＴＢＩなどの疾患を有するかどうか同定することを含む。さらに、「診断すること」は、ｍＴＢＩを有する患者を、ｓＴＢＩを有する患者から区別することを含む。他の状況では、「診断すること」は、疾患状態のステージまたは攻撃性を決定すること、またはＴＢＩに対する適切な治療方法を決定することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＴＢＩに対するマーカーとしてｍｉＲＮＡを使用する。いくつかの実施形態では、ＴＢＩを有する対象の生物試料（例えば、血清または血漿）中に存在するレベルが上昇しているｍｉＲＮＡを、マーカーとして使用する。他の実施形態では、レベルが低下しているｍｉＲＮＡをマーカーとして使用する。いくつかの実施形態では、生物試料からの２つ以上のｍｉＲＮＡをマーカーとして使用してもよい。２つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーを使用する場合、全てのｍｉＲＮＡのレベルが上昇していてよい、全てのｍｉＲＮＡのレベルが低下していてよい、または、レベルが上昇しているｍｉＲＮＡとレベルが低下しているｍｉＲＮＡの混合物を使用してもよい。
【００２０】
「１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）の上昇」という用語は、試験している対象のＴＢＩを有さないコホートまたは複数のコホートからの生物試料中のｍｉＲＮＡの量と比較した、対象からの生物試料中のｍｉＲＮＡの量を指す。例えば、生物試料中のｍｉＲＮＡのレベルの上昇は、ＴＢＩの存在または予後を示す。さらなる実施形態では、ある特定のｍｉＲＮＡは、ＴＢＩを有する対象において存在するレベルが低下してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡマーカーのレベルを対照と比較して、レベルが低下したか、または上昇したかどうかを決定する。対照は、例えば、ＴＢＩがないことが既知である対象からの生物試料中のｍｉＲＮＡなどであってもよい。他の実施形態では、対照は、組織試料のような非血清試料からのｍｉＲＮＡまたは既知量の合成ＲＮＡであってもよい。さらなる実施形態では、対照は、異なる時点での同じ対象からの生物試料中のｍｉＲＮＡであってもよい。
【００２１】
一態様では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡは、ＴＢＩを有する患者由来の血清中のレベルが上昇している。例示のｍｉＲＮＡは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＢｈｏｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：２８１４８に報告されている。これらのｍｉＲＮＡは、本発明に従って使用してもよい。これらのｍｉＲＮＡは、軽度と重度のＴＢＩを区別することを含む、ＴＢＩを診断するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上、または全てを除外する。
【００２２】
加えて、これらのｍｉＲＮＡを使用して、ＴＢＩの攻撃性または転帰を予測し得る。別の態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈａｓ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡを使用して、ｍＴＢＩを診断してもよい。別の態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡを使用して、ｓＴＢＩを診断してもよい。別の態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡを使用して、ｍＴＢＩまたはｓＴＢＩのいずれかを診断してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上、または全てを除外する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈａｓ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡを使用して、ｍＴＢＩを診断してもよい。別の態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡを使用して、ｓＴＢＩを診断してもよい。別の態様では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａからなる群から選択される。これらのｍｉＲＮＡを使用して、ＴＢＩ、またはｍＴＢＩもしくはｓＴＢＩのいずれかを診断してもよい。
【００２４】
別の態様では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｍｉＲ−４８６のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つのｍｉＲＮＡを含む。例えば、方法は、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｍｉＲ−４８６のみを評価することを含み得る。別の実施形態では、方法は、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、さらに、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上、または全てを除外する。
【００２５】
別の態様では、ＴＢＩは、ｍＴＢＩまたはｓＴＢＩとして分類され得る。いくつかの実施形態では、ＴＢＩは、閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）または爆風による外傷性脳損傷（ｂＴＢＩ）である。
【００２６】
一態様では、損傷重症度は、意識消失期間、及び／または昏睡評価スケールまたはスコア、外傷後健忘（ＰＴＡ）、及び／または脳イメージング結果に基づいていてもよい。ある場合には、ｍＴＢＩは、短時間の意識消失（例えば、数秒または数分）、ＴＢＩの１時間未満のＰＴＡ、及び正常な脳イメージング結果によって特徴付けられ得る。さらなる実施形態では、軽度の外傷性脳損傷の場合は、監視期間中に頭部損傷に起因する以下の条件の１つ以上による鈍的外傷または加速または減速力からもたらされる頭部への損傷の発生であってもよい：（ｉ）一過性の混乱、見当識障害、または意識障害が任意の期間に観察または自己報告された；（ｉｉ）損傷の前後に記憶障害（健忘症）が任意の期間に観察または自己報告された；（ｉｉｉ）頭部損傷後の急性発作、幼児及び低年齢小児の間での、並びに年長の小児及び成人の間での頭部損傷後の易刺激性、無気力、または嘔吐、損傷後すぐに同定された場合の頭痛、眩暈、易刺激性、疲労、または集中力の低下などの、他の神経機能または神経心理学的機能障害の兆候が観察された；及び／または（ｉｖ）３０分またはそれ未満で持続する意識消失が任意の期間に観察または自己報告された。他の場合には、ｓＴＢＩは、２４時間を超える意識消失または昏睡、ＴＢＩの２４時間を超えるＰＴＡ、及び／または異常な脳イメージング結果によって特徴付けられ得る。
【００２７】
別の態様では、対象は、ヒトまたは動物である。別の態様では、本明細書に記載された生物試料としては、これらに限定されないが、均質化組織（例えば、これらに限定されないが、脳組織、脊髄組織）、及び中枢神経系の特定領域からの組織、血液、血漿、血清、尿素、喀痰、脳脊髄液、母乳、及び乳管液試料が挙げられる。いくつかの実施形態では、生物試料は、血清及び／または血漿試料である。血清は、典型的には、液体、凝固血液の非細胞部分である。血漿は、非細胞血液試料でもあるが、血清とは異なり、血漿は、凝固因子を含有する。いくつかの実施形態では、血清または血漿試料は、他の診断方法を用いてＴＢＩに対して予めスクリーニングされたヒト対象から得てもよい。さらなる実施形態は、ＴＢＩに対して以前または現在治療を受けている対象からの試料中のｍｉＲＮＡを測定することを含む。本明細書に記載された方法で得られ、使用した血漿または血清の体積は、臨床的な目的に応じて変動してよい。
【００２８】
当業者は、血清試料を得、調製するための多くの方法が存在することを理解されよう。一般に、血液は、標準の方法を使用して採取管中に抜き取り、凝固させる。次いで、凝固した血液の細胞部分から血清を分離する。本発明のいくつかの実施形態による方法では、シリカ粒子などの凝固活性化因子を採血管に加える。他の方法では、血液は、凝固を容易にするために処理しない。採血管は、多くの供給源から、種々の形式で市販されている（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブＳＳＴ（商標）、ガラス血清チューブ、またはプラスティック血清チューブ）。
【００２９】
いくつかの実施形態では、血液を静脈穿刺によって採取し、抜き取った後３時間以内に処理して溶血を最小限にし、血液中の無傷細胞からのｍｉＲＮＡの放出を最小にする。いくつかの方法では、血液は、使用するまで氷上で保存する。血液は、遠心分離によって分別して、細胞構成成分を除去してもよい。いくつかの実施形態では、血清を調製するための遠心分離は、少なくとも５００×Ｇ、１０００×Ｇ、２０００×Ｇ、３０００×Ｇ、４０００×Ｇ、または５０００×Ｇのスピードであってもよい。ある特定の実施形態では、血液を少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、または１５０分間インキュベートして凝固させることができる。他の実施形態では、血液を最大３時間インキュベートする。血漿を使用する場合、細胞構成成分及び無細胞構成成分を分離する前に血液を凝固させない。血清または血漿は、血液の細胞部分から分離した後、さらにアッセイするまで凍結させることができる。
【００３０】
本発明による方法を行う前に、当該技術分野で公知の方法を使用して、ＲＮＡを生物試料（例えば、限定されないが、血清または血漿）から抽出し、精製してもよい。全ＲＮＡを単離するための、またはｍｉＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを特異的に抽出するための多くの方法が公知である。ＲＮＡは、市販のキット（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＲＮＡ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ−Ｔｈｒｅｅ  Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．；ｍｉｒＶａｎａ（商標）キット、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して抽出してもよい。あるいは、哺乳動物の細胞内ＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを抽出するための以前に公開されたＲＮＡ抽出方法を、公開された通りに、または改変を伴って、血漿及び血清からＲＮＡを抽出するために適合させてもよい。ＲＮＡは、米国特許出願公開第２００８／００５７５０２号に記載の方法または適応において見られるように、シリカ粒子、ガラスビーズ、または珪藻を使用して血漿または血清から抽出してもよい。
【００３１】
別の態様では、生物試料は、外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日を超えて対象から回収してもよい。別の態様では、生物試料は、外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日未満に対象から回収してもよい。
【００３２】
別の態様では、１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）は、リアルタイムＰＣＲによって決定される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡを増幅することを含む。
【００３３】
ｍｉＲＮＡのレベルまたは量を測定する多くの方法が考えられている。信頼でき、感度がよく、特異的な任意の方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡを、測定する前に増幅する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルを、増幅プロセス中に測定する。さらに他の方法では、ｍｉＲＮＡは、測定する前に増幅しない。
【００３４】
成熟ｍｉＲＮＡ、一次ｍｉＲＮＡ、及び前駆体ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡの核酸配列を増幅するための多くの方法が存在する。適切な核酸の重合技術及び増幅技術としては、逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ））、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応、多重ライゲーション可能なプローブ増幅、インベーダー技術（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ）、ローリングサークル増幅、インビトロ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、及び当業者に公知の他の方法が挙げられる。ある特定の実施形態では、逆転写の後にリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など、２つ以上の増幅方法を使用する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３（２０）：ｅ１７９（２００５））。
【００３５】
典型的なＰＣＲ反応は、標的核酸種を選択的に増幅する多数の増幅ステップまたはサイクル：標的核酸を変性させる変性ステップ；ＰＣＲプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）が相補的なＤＮＡ鎖にアニーリングするアニーリングステップ；及び熱安定性のＤＮＡポリメラーゼによってプライマーが伸長する伸長ステップを含む。これらのステップを多数回繰り返すことにより、ＤＮＡ断片が増幅されて、標的ＤＮＡ配列に対応するアンプリコンが産生される。典型的なＰＣＲ反応は、変性、アニーリング、及び伸長のサイクルを２０回以上含む。多くの場合、アニーリングステップ及び伸長ステップは、同時に実施することができ、その場合、サイクルは、２つのステップのみを含有する。成熟ｍｉＲＮＡは一本鎖であるので、逆転写反応（相補的なｃＤＮＡ配列が産生される）は、ＰＣＲ反応の前に実施してもよい。逆転写反応は、例えば、ＲＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）及びプライマーの使用を含む。
【００３６】
ＰＣＲ法及びｑ−ＰＣＲ法では、例えば、各標的配列に対してプライマーセットを使用する。ある特定の実施形態では、プライマーの長さは、これらに限定されないが、プライマー間の望ましいハイブリダイゼーション温度、標的核酸配列、及び増幅される異なる標的核酸配列の複雑さを含む多くの因子に左右される。ある特定の実施形態では、プライマーは、長さが約１５〜約３５ヌクレオチドである。他の実施形態では、プライマーは、長さが１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、または３５ヌクレオチド以下である。さらなる実施形態では、プライマーは、長さが少なくとも３５ヌクレオチドである。
【００３７】
さらなる態様では、フォワードプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカーにアニーリングする少なくとも１つの配列を含んでよく、代わりに追加的な５’の非相補的領域を含んでもよい。別の態様では、逆転写されたｍｉＲＮＡの相補物にアニーリングさせるためにリバースプライマーを設計してもよい。リバースプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカー配列とは独立していてよく、同じリバースプライマーを使用して多数のｍｉＲＮＡバイオマーカーを増幅してもよい。あるいは、リバースプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカーに特異的であってもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡを単一の反応容積で増幅する。一態様は、２つ以上のプライマー対及び／または２つ以上のプローブを使用することにより、１つの反応容積で少なくとも２つの目的のｍｉＲＮＡを同時に増幅し、定量化することを可能にする、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などの複合ｑ−ＰＣＲを含む。プライマー対は、各ｍｉＲＮＡにユニークに結合する少なくとも１つの増幅プライマーを含み、プローブは、互いに区別可能になるように標識され、したがって多数のｍｉＲＮＡを同時に定量化することが可能になる。複合ｑＲＴ−ＰＣＲは、これらに限定されないが、診断、予後判定、及び治療に適用するためのｍｉＲＮＡを検出することを含む、研究用途及び診断用途を有する。
【００３９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、逆転写酵素及びＤＮＡベースの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの両方を含めることによって、逆転写反応とさらに組み合わせることができる。２つのポリメラーゼを使用する場合、「ホットスタート」手法を使用して、アッセイの性能を最大にしてもよい（米国特許第５，４１１，８７６号及び同第５，９８５，６１９号）。例えば、逆転写酵素反応及びＰＣＲ反応の構成成分を１つ以上の熱活性化法または化学的変性を使用して隔離して、重合効率を改善してもよい（米国特許第５，５５０，０４４号、同第５，４１３，９２４号、及び同第６，４０３，３４１号）。
【００４０】
ある特定の実施形態では、標識、色素、または標識されたプローブ及び／またはプライマーを使用して、増幅されたｍｉＲＮＡまたは増幅されなかったｍｉＲＮＡを検出する。当業者は、検出方法の感度及び標的の存在量に基づいて、どの検出方法が適切であるかを理解されよう。検出方法の感度及び標的の存在量に応じて、検出する前に増幅することが必要な場合がある、または必要でない場合がある。当業者は、ｍｉＲＮＡを増幅することが好ましい検出方法を理解されよう。
【００４１】
プローブまたはプライマーは、ワトソン−クリック塩基または修飾塩基を含んでもよい。修飾塩基としては、これらに限定されないが、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号、及び同第６，００１，９８３号に記載されているＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）が挙げられる。ある特定の態様では、塩基は、天然のホスホジエステル結合または別の化学結合によってつながっている。異なる化学結合としては、これらに限定されないが、例えば、米国特許第７，０６０，８０９号に記載されている、ペプチド結合またはロックド核酸（ＬＮＡ）結合が挙げられる。
【００４２】
さらなる態様では、増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、時間の関数として産生される増幅産物の量をモニターするために適している。ある特定の態様では、異なる一本鎖対二本鎖特性を有するプローブを使用して核酸を検出する。プローブとしては、これらに限定されないが、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号を参照されたい）、ステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号及び同第５，９２５，５１７号を参照されたい）、ステムレスまたは直鎖状のビーコン（例えば、ＷＯ９９２１８８１、米国特許第６，４８５，９０１号及び同第６，６４９，３４９号を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子ビーコン（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号及び同第６，５９３，０９１号を参照されたい）、直鎖状のＰＮＡビーコン（例えば、米国特許第６，３２９，１４４号を参照されたい）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照されたい）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）／ＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＢ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、ステムループ及び２重鎖のＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５８９，７４３号を参照されたい）、バルジループプローブ（例えば、米国特許第６，５９０，０９１号を参照されたい）、シュードノットプローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、サイクリコン（例えば、米国特許第６，３８３，７５２号を参照されたい）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（例えば、米国特許第６，５９６，４９０号を参照されたい）、ＰＮＡライトアッププローブ、アンチプライマークエンチプローブ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：６２４−６３３（２００６））、自己組織化ナノ粒子プローブ、及び、例えば米国特許第６，４８５，９０１号に記載のフェロセン修飾されたプローブが挙げられる。
【００４３】
ある特定の実施形態では、増幅反応におけるプライマーの１つ以上が標識を含んでもよい。さらに別の実施形態では、異なるプローブまたはプライマーは、互いに区別してもよい検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーなどの核酸を、２つ以上の、区別してもよい標識で標識してもよい。
【００４４】
いくつかの態様では、標識は、１つ以上のプローブに付着し、以下の性質の１つ以上を有する：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第２の標識によってもたらされる検出可能なシグナル、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を修飾する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、２重鎖の形成を安定化する；及び（ｉｖ）結合複合体または親和性のセット、例えば、親和性、抗体−抗原、イオン結合性錯体、ハプテン−リガンド（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバーを提供する。さらに他の態様では、標識の使用は、公知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件、分析方法及び精製方法を利用する多数の公知の技術のいずれか１つを使用して実現してもよい。
【００４５】
ｍｉＲＮＡは、直接的な方法または間接的な方法によって検出してもよい。直接的な検出方法では、核酸分子に連結した検出可能な標識によって１つ以上のｍｉＲＮＡを検出する。そのような方法では、ｍｉＲＮＡは、プローブに結合させる前に標識してもよい。したがって、結合は、プローブに結合している標識されたｍｉＲＮＡについてスクリーニングすることによって検出する。プローブは、場合によって、反応容積内のビーズに連結される。
【００４６】
ある特定の実施形態では、標識したプローブと直接結合させ、その後プローブを検出することによって核酸を検出する。本発明の一実施形態では、所望の核酸を捕捉するためのプローブとコンジュゲートしたＦｌｅｘＭＡＰミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して、増幅されたｍｉＲＮＡなどの核酸を検出する。
【００４７】
いくつかの方法は、例えば、蛍光標識で修飾したポリヌクレオチドプローブを用いた検出、または分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出を含んでもよい。
【００４８】
他の実施形態では、間接的な検出方法によって核酸を検出する。例えば、ビオチン化したプローブを、ストレプトアビジンとコンジュゲートした色素と組み合わせて、結合した核酸を検出してもよい。ストレプトアビジン分子が増幅されたｍｉＲＮＡ上のビオチン標識に結合し、結合したｍｉＲＮＡを、ストレプトアビジン分子に付着した色素分子を検出することによって検出する。一実施形態では、ストレプトアビジンとコンジュゲートした色素分子は、Ｐｈｙｃｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＲＯｚｙｍｅ）を含む。他のコンジュゲートした色素分子は、当業者に公知である。
【００４９】
標識としては、これらに限定されないが、検出可能な蛍光シグナル、化学発光シグナル、または生物発光シグナルを生成またはクエンチする光放射性化合物、光散乱性化合物、及び光吸収性化合物が挙げられる（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９２）及びＧａｒｍａｎ  Ａ．，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照されたい）。標識として有用な蛍光レポーター色素としては、これらに限定されないが、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号、同第６，００８，３７９号、及び同第６，０２０，４８１号を参照されたい）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号、同第５，８４７，１６２号、同第５，９３６，０８７号、同第６，０５１，７１９号、及び同第６，１９１，２７８号を参照されたい）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照されたい）、ドナーとアクセプターの対を含むエネルギー転移蛍光色素（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；及び同第５，９４５，５２６号を参照されたい）、及びシアニン（例えば、ＷＯ９７４５５３９を参照されたい）、リサミン、フィコエリトリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、及び／またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ、並びに検出可能なシグナルを生成してもよい任意の他の蛍光部分が挙げられる。フルオレセイン色素の例としては、これらに限定されないが、６−カルボキシフルオレセイン、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン、及び２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインが挙げられる。ある特定の態様では、蛍光標識は、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ、６−カルボキシフルオレセイン（「ＦＡＭ」）、ＴＥＴ、ＲＯＸ、ＶＩＣＴＭ、及びＪＯＥから選択される。例えば、ある特定の実施形態では、標識は、異なる、スペクトル的に解像可能な波長で光を放射することができる異なるフルオロフォア（例えば、異なる４色のフルオロフォア）であり；ある特定のそのような標識したプローブは、当該技術分野で公知であり、上記されており、米国特許第６，１４０，０５４号に記載されている。いくつかの実施形態では、レポーターフルオロフォア及びクエンチャーフルオロフォアを含む二重標識した蛍光プローブを使用する。フルオロフォアの対は���それらを容易に区別してもよいように、別個の発光スペクトルを有するように選択されることが理解されよう。
【００５０】
さらに別の態様では、標識は、２重鎖のハイブリダイゼーションを増強する、安定化する、またはそれに影響を及ぼす機能を果たすハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーター及びインターカレート色素（これらに限定されないが、臭化エチジウム及びＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎを含む）、副溝結合剤、並びに架橋官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．‘‘ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ’’、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）を参照されたい）。
【００５１】
さらなる態様では、オリゴヌクレオチドライゲーション（ＯＬＡ）法を含む、ｍｉＲＮＡを定量化するためにハイブリダイゼーション及び／またはライゲーションに頼る方法、及び標的核酸配列とハイブリダイズする区別可能なプローブを結合していないプローブから分離することを可能にする方法を使用してもよい。例として、米国特許出願公開第２００６／００７８８９４号に開示されているようなＨＡＲＰ様プローブを使用して、ｍｉＲＮＡの数量を測定してもよい。そのような方法では、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブとを区別するためにプローブを修飾する。その後、プローブを増幅し、及び／または検出してもよい。一般に、プローブ不活性化領域は、プローブの標的ハイブリダイゼーション領域内にヌクレオチドのサブセットを含む。その標的核酸とハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブの増幅または検出を低下させるまたは妨げるために、及びこのようにして標的核酸の検出を可能にするために、ハイブリダイゼーションの後にプローブを不活性化するステップを、その標的核酸配列とハイブリダイズしたＨＡＲＰプローブと、対応するハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブとを区別することができる作用剤を使用して行う。作用剤は、ハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブを、それが増幅できないように不活性化または修飾することができる。
【００５２】
方法のさらなる実施形態では、プローブライゲーション反応を使用して、ｍｉＲＮＡを定量化してもよい。多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）技術（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：ｅ５７（２００２））では、互いにすぐ隣接して標的核酸とハイブリダイズするプローブの対は、標的核酸が存在するときにのみ互いにライゲーションする。いくつかの態様では、ＭＬＰＡプローブは、フランキングＰＣＲプライマー結合部位を有する。ＭＬＰＡプローブは、ライゲーションしている場合にのみ増幅することができ、したがって、ｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出し、定量化することが可能になる。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示し、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
実験１
対照試料に対して、軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）、重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）、及び整形外科的損傷を有する対象からの試料のｍｉＲＮＡ発現データのグローバル正規化を行い、各群の候補を同定した。ｍＴＢＩ（ｎ＝８）、ｓＴＢＩ（ｎ＝８）、及び整形外科的損傷（ｎ＝７）を有する対象の各々からヒト血清試料を収集した。損傷の２４時間以内にｍＴＢＩ試料を収集し、損傷の４８時間以内にｓＴＢＩ試料を収集した。健康な対照対象からも対照試料（ｎ＝８）を収集した。
【００５５】
ＲＮＡ単離は、ｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ）を用いて行った。ＲＮＡの品質管理のため、全ての総ＲＮＡ試料をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析し、小ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ濃度を測定した。ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ  ＲＴキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で逆転写（ＲＴ）を行い、バイオアナライザーデータの総ＲＮＡからｍｉＲＮＡ量を測定し、ＲＴ反応のテンプレートＲＮＡ（１６μｌの総溶出ＲＮＡのうちの３μｌ）として使用した。１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、２．５０μｌのＭｅｇａｐｌｅｘ  ＰｒｅＡｍｐプライマーヒトプールＡ／Ｂ（ｖ３．０）、５μｌのヌクレアーゼフリー水、及び５μｌのＲＴ産物による最終容量が２５μｌの最終反応混合物を用いて、ＲＴ後のｃＤＮＡ産物の前増幅を行った。
【００５６】
軽度（ｎ＝８）、重度（ｎ＝８）、整形外科的損傷（ｎ＝７）及び健康な対照（ｎ＝８）の血清試料に対する一連の７９２個のヒトｍｉＲＮＡについてリアルタイムＰＣＲを行った。ＴａｑＭａｎ低密度ヒト用マイクロＲＮＡアレイカード（ＴＬＤＡ）でＰＣＲを実施し、ＡＢ７９００リアルタイムＨＴマシン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）中のデフォルト熱サイクル条件を用いた。血清ｍｉＲＮＡのＰＣＲ増幅により、対照血清試料中で１４０を超えるｍｉＲＮＡが検出された。血清試料中のｍｉＲＮＡの相対的量子化の場合、安定した内因性制御が主な制限である。リアルタイムＰＣＲ  ｍｉＲＮＡデータを分析するため、同じプレート中のｍｉＲＮＡの全体的な増幅に基づいて参照内因性制御を算出するグローバル正規化アルゴリズムを使用した。この方法は、血清試料中の多重化アッセイの正規化の一手段として広く受け入れられている。
【００５７】
正規化されたΔＣｔ値を使用して、実験群間の発現のパターンを理解するために階層的クラスタリングを行った。階層的クラスタリングは、対照、整形外科的損傷、及びＴＢＩ群に属した４つの差異的に発現する群の元で研究を分離し、これらの実験群間のｍｉＲＮＡ発現における明確な差異を示唆した（図１）。正規化の後、ｍＴＢＩ、ｓＴＢＩ、及び整形外科的損傷群における血清ｍｉＲＮＡの倍率変化は、ベースラインとして健康な対照対象を用いて算出した。２倍超に上方調節され、ｐ値≦０．０５に調整したｍｉＲＮＡをさらなる分析に選択した。この分析から、ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩの血清試料中で、３９及び３７個のｍｉＲＮＡがそれぞれ大幅に上方調節されることが判明したが、３３個のｍｉＲＮＡは、表１〜３に示すように整形外科的損傷群で調節されることが判明した。
【００５８】
【表１】
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2018522558.tif 000004
【００５９】
【表２】
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【００６０】
【表３】
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【００６１】
ｍＴＢＩ、ｓＴＢＩ、及び整形外科的損傷を有する対象からの試料のリアルタイムＰＣＲ結果を、対照試料のリアルタイムＰＣＲ結果に正規化した。８２、７４、及び５８個のｍｉＲＮＡが、それぞれ、ｍＴＢＩ、ｓＴＢＩ、及び整形外科的損傷を有する対象からの血清試料中で大幅に調節されたことが分析により示された。ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩを有する対象からの試料中のｍｉＲＮＡのレベルを、整形外科的損傷を有する対象からの試料中のｍｉＲＮＡのレベルと比較した。整形外科的損傷を有する対象からの試料中のｍｉＲＮＡの調節レベルと比較して、ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩを有する対象からの試料中の２２及び２６個のｍｉＲＮＡが上方調節されたことが結果により示された。ｍＴＢＩの２２個の独自のｍｉＲＮＡ、及びｓＴＢＩの２６個の独自のｍｉＲＮＡを、それらの発現レベルを示す正規化された倍率変化と一緒に表４及び５に示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
表４では、グローバル正規化を用いてデータを正規化し、健康な対照及び整形外科的損傷試料と比較した。調整ｐ値＜０．０５は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇアルゴリズムを用いて算出した。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
表５では、グローバル正規化を用いてデータを正規化し、健康な対照及び整形外科的損傷試料と比較した。調整ｐ値＜０．０５は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇアルゴリズムを用いて算出した。
【００６６】
分析により、ｓＴＢＩ及びｍＴＢＩ群の両方において発現が上昇したｍｉＲＮＡの新規の指標物質を同定した後、これをさらなるバイオマーカー分析用に選択した（図２及び３）。
【００６７】
表６は、ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩを同定するのに使用したｍｉＲＮＡバイオマーカーの指標物質の一実施形態を示す。表６に示すｍｉＲＮＡバイオマーカーは、ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩを有する対象からの試料中に存在したが、整形外科的損傷を有する対象からの試料中に存在しなかった。
【００６８】
【表６】
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【００６９】
変性ｍｉＲＮＡ、及びそれらのＴＢＩ関連遺伝子標的との関連についての機能パスウェイ分析は、ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（ＩＰＡ）プログラム（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。ＩＰＡでは、関連がＴＢＩにおけるｍｉＲＮＡ調節とリンクしている８７個の標的分子が現在存在する。８７個のＴＢＩ関連分子を使用して、表６に示すある特定の候補ｍｉＲＮＡとの標的の直接関係を同定した。ＩＰＡのパスウェイエキスプローラー機能を使用して、ＴＢＩ  ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補とＴＢＩ関連分子との間の推定パスウェイを構築した。３０個の遺伝子が、ＴＢＩに対する直接標的として同定され、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−４８６、及びｍｉＲ−９４２を含む９個のｍｉＲＮＡ候補が、直接バイオマーカーとして同定された。これらの遺伝子を標準パスウェイカテゴリーに重ねることによってさらに分析した。ｍｉＲＮＡにより標的にされると予測されたほとんどの分子は、脊髄後角ニューロンにおけるエリスロポエチンシグナリング、Ｇタンパク質共役受容体シグナリング、ＧＡＢＡ受容体シグナリング、及び、神経因性疼痛シグナリングなどの主要なＴＢＩ関連標準パスウェイを伴うことが、この分析により同定された。全体的に、ほとんど全てのｍｉＲＮＡが、重要な神経機能経路を標的にすることが分かった（図３）。
【００７０】
上述したように、疾患及び機能カテゴリーで利用可能な８７個のＴＢＩ関連分子を使用して、１０個の候補ｍｉＲＮＡとこれらの標的の任意の直接関係も同定した。ＩＰＡのパスウェイエキスプローラー機能を使用して、ＴＢＩ  ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補とＴＢＩ関連分子の間の推定パスウェイを構築した。この分析により、８個のｍｉＲＮＡ候補ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−４８６、及びｍｉＲ−９２ａに対する直接標的として３０個の遺伝子を同定した。ＭｉＲ−５０５＊及びｍｉＲ−４５１は、ＩＰＡにおけるＴＢＩの標的分子のいずれかを標的にすると予測されなかった。これらの遺伝子を標準パスウェイカテゴリーに重ねることによってさらに分析した。ｍｉＲＮＡにより標的にされると予測されたほとんどの分子は、脊髄後角ニューロンにおけるエリスロポエチンシグナリング、Ｇタンパク質共役受容体シグナリング、ＧＡＢＡ受容体シグナリング、及び、神経因性疼痛シグナリングなどの主要なＴＢＩ関連標準パスウェイを伴うことが、この分析により同定された。特に、ｍｉＲ−３２８は、エリスロポエチンシグナリングの重要な仲介物質であるエリスロポエチン及びエリスロポエチン受容体を調節すると予測された。ＭｉＲ−４８６、ｍｉＲ−２７ａ、及びｍｉＲ−１９５標的分子は、グルタミン酸受容体シグナリング及びＧＡＢＡ受容体シグナリングに関与した。ＭｉＲ−１５１−５ｐ及びｍｉＲ−３６２−３ｐは、ニューロンの産生及び伝播を担当していることを示す分子ＳＣＮ４Ａを標的にする。また、ＭｉＲ−３０ｄは、アドレナリン受容体及びＧＡＢＡ受容体シグナリングを標的にすると予測された。全体的に、ほとんど全てのｍｉＲＮＡが、重要な神経機能経路を標的にすることが分かった（図４）。
【００７１】
ＴａｑＭａｎ低密度ヒトマイクロＲＮＡアレイカード（ＴＬＤＡ）プラットフォームを用いたｍｉＲＮＡレベルの検出方法の調査結果を検証するために、選択されたｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−５０５＊、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−４８６、及びｍｉＲ−９４２に対して特定のｍｉＲＮＡ  ＰＣＲを行った。特定のｍｉＲＮＡ  ＰＣＲアッセイを行うために、内因性制御が必要であった。特異的アッセイでは、グローバル正規化後に得られたΔＣｔ値における最小標準偏差でｍｉＲＮＡを選択することによって内因性制御を同定した。ＭｉＲ−２０２を同定し、全ての特定のＰＣＲ検証実験用に内因性制御として選択した。ＲＮＡを血清試料から再び単離し、ｃＤＮＡをプレ増幅せずにアッセイを行った。ｍｉＲＮＡプロファイリング結果で以前に観察されたように、ｍＴＢＩ及びｓＴＢＩ群の両方においてｍｉＲＮＡの大幅な上方調節が検証により示された（図５）。ｍｉＲ−１５１−５ｐの発現値は、しかしながら、ｍＴＢＩ損傷で大幅に上方調節されなかったが、その発現は、ｓＴＢＩで上方調節された（図５）。選択された全てのｍｉＲＮＡは、ＴＢＩ後に大幅に上方調節されたことが、結果により示される。
【００７２】
血清試験で観察されたｍｉＲＮＡの存在を検証するため、完全なｍｉＲＮＡプロファイリングは、ｓＴＢＩ患者（ｎ＝８）からのＣＳＦ試料及び対照ＣＳＦ試料（ｎ＝６）を用いて行った。ＭｉＲ−２０２は、ＣＳＦ試料における特異的ＰＣＲアッセイの内因性制御として選択された。従来のｍｉＲＮＡアッセイは、リアルタイムプライマーを用いて追加のプレ増幅された生成物を加えることで修正した。プレ増幅反応にはプライマーを１つだけ使用するため、このプレ増幅は、さらなるバイアスを導入しない。ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−４８６、及びｍｉＲ−９４２のリアルタイムデータは、ｍｉＲ−２０２を用いて正規化された。ＭｉＲ−２０２は、ＣＳＦ試料中で安定であることが判明し、損傷及び対照試料で、それぞれ２６．２及び２５．８の平均Ｃｔ値であった。ｍｉＲ−２０２による正規化は、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｍｉＲ−４８６の大幅な上方調節を示した（図６）。ｍｉＲ−１５１−５ｐの上昇も観察された。
【００７３】
候補ｍｉＲＮＡに対するさらなるｍｉＲＮＡアッセイにより、ＭＭＴＢＩ及びＳＴＢＩ群の両方におけるバイオマーカー候補として血清中で同定した。従来のｍｉＲＮＡアッセイ方法論を修正し、さらなるプレ増幅工程を分析に加えた。プレ増幅反応にはプライマーを１つだけ使用するため、このプレ増幅は、さらなるバイアスを導入しない。ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−５０５＊、及びｍｉＲ−９２ａのリアルタイムデータは、ｍｉＲ−２０２を用いて正規化された。ＭｉＲ−２０２は、ＣＳＦ試料中で非常に安定であることが判明し、損傷及び対照試料で、それぞれ２６．２及び２５．８の平均Ｃｔ値であった。ｍｉＲ−２０２による正規化は、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−４５１、及びｍｉＲ−４８６の大幅な上方調節を示した（図７）。ｍｉＲ−５０５＊及びｍｉＲ−１９５では、平均倍率上方調節は１０倍を超えたが、しかしながら、試料の５０〜６０％中でのみ観察された一方、残りの試料では検出されなかったため、これらは統計的検定に失敗した。ｍｉＲ−２０ａについても同様の観察が見られた。ｍｉＲ−１５１−５ｐの上昇が観察されたが、試料の異常値により有意ではなかった。ｍｉＲ−３０ｄのレベルの大幅な上方調節は、対照群と損傷群の間で観察されなかった。
【００７４】
ｍｉＲＮＡデータは、ＴＢＩ及び外傷対照群のリアルタイムＰＣＲデータからΔＣｔデータと分析し、ＣＴ傷害とｍｉＲＮＡの相関を同定した。絶対倍率変化がないため、ΔＣｔ値を用いてこれらの群間の比較を行った。ｍｉＲＮＡのレベルの比較は、（１）頭部ＣＴに任意の傷害を有さない対象（ＴＢＩ、及び全ての対照）（ｎ＝１９）；及び（２）頭部ＣＴに傷害を有するＴＢＩ対象（ｎ＝１２）からなる、２群のヒト対象で行った。全ての正常及び外傷対照は、陰性ＣＴスキャンを有すると仮定した。選択されたｍｉＲＮＡの２つを除いた全て：ｍｉＲ−１９５（ｐ≦０．００１）；ｍｉＲ−３０ｄ（ｐ≦０．００１）；ｍｉＲ−４５１（ｐ≦０．０１１）；ｍｉＲ−３２８（ｐ≦０．１０１）；ｍｉＲ−９２ａ（ｐ≦０．００１）；ｍｉＲ−４８６（ｐ≦０．００６）；ｍｉＲ−５０５（ｐ≦０．００８）；及びｍｉＲ−３６２（ｐ≦０．０３５）；ｍｉＲ−１５１（ｐ≦０．０６５）；及びｍｉＲ−２０ａ（ｐ≦０．０１２）について２つの群で有意差があった（図８）。
【００７５】
受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成して、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、ＴＢＩの診断におけるｍｉＲＮＡの精度を同定した。ｍｉＲ−１９５（０．８１、ｐ値＜０．００３）、ｍｉＲ−３０ｄ（０．７５、ｐ値＜０．０１６）、ｍｉＲ−４５１（０．８２、ｐ値＜０．００２）、ｍｉＲ−３２８（０．７３、ｐ値＜０．０３０）、ｍｉＲ−９２ａ（０．８６、ｐ値＜０．００１）、ｍｉＲ−４８６（０．８１、ｐ値＜０．００３）、ｍｉＲ−５０５（０．８２、ｐ値＜０．００２）、ｍｉＲ−３６２（０．７９、ｐ値＜０．００６）、ｍｉＲ−１５１（０．６６、ｐ値＜０．１２３）、ｍｉＲ−２０ａ（０．７８、０．００７）としてＡＵＣ値が分析により同定された。ｍｉＲ−１５１を除く全てのｍｉＲＮＡが、良好な診断精度を示した（図９）。
【００７６】
本明細書において引用された全ての参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれている刊行物及び特許または特許出願が本明細書に含有されている本発明と矛盾する場合には、矛盾する材料のいずれに対しても本明細書が取って代わる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月27日(2018.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の診断のための指標を提供する方法であって、
ａ）前記対象から採取された生物試料中の１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のレベル（複数可）を決定すること、及び
ｂ）ＴＢＩに罹患していないと決定された対照対象からの同じ１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）に対して、前記１つ以上のｍｉＲＮＡの前記決定されたレベル（複数可）を比較すること
を含み、
ＴＢＩに罹患していないと決定された前記対照対象からの前記１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）と比較した前記１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）が上昇している場合に、前記対象がＴＢＩに罹患しているとの指標が提供される、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＢＩが、軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）または重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＢＩが、ｍＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＢＩが、ｓＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈａｓ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＢＩが、閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）または爆風による外傷性脳損傷（ｂＴＢＩ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、ヒトである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物試料が、血清試料または脳脊髄液試料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物試料が、外傷性の事象が疑われた後の１日未満に前記対象から採取されたものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物試料が、前記外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日未満に前記対象から採取されたものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、ＴＢＩを罹患するリスクがある、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、リアルタイムＰＣＲによって決定される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２による正規化後に測定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａを除外する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の進行の監視のための指標を提供する方法であって、
ａ）異なる時点で採取された前記対象からの少なくとも２つの生物試料を分析して、前記少なくとも２つの生物試料の各々中の１つ以上の特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のレベル（複数可）を決定すること、及び
ｂ）前記１つ以上の特定のｍｉＲＮＡの前記決定されたレベル（複数可）を経時的に比較して、前記１つ以上の特定のｍｉＲＮＡの前記対象のレベル（複数可）が経時的に変化しているかどうかを決定することを含み、
前記１つ以上の特定のｍｉＲＮＡのレベル（複数可）が経時的に上昇している場合に、ＴＢＩを罹患する前記対象のリスクが経時的に上昇しているとの指標を提供する、方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＃、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＢＩが、軽度のＴＢＩ（ｍＴＢＩ）または重度のＴＢＩ（ｓＴＢＩ）である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＢＩが、ｍＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＢＩが、ｓＴＢＩであり、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡに加えて、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＢＩが、閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）または爆風による外傷性脳損傷（ｂＴＢＩ）である、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、ヒトである、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物試料が、血清試料または脳脊髄液試料である、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物試料が、外傷性の事象が疑われた後の１日未満に前記対象から採取されたものである、請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物試料の少なくとも１つが、前記外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日未満に前記対象から採取されたものである、請求項２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、ＴＢＩを罹患するリスクがある、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、リアルタイムＰＣＲによって決定される、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
１つ以上の特定のマイクロＲＮＡのレベル（複数可）が、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２による正規化後に測定される、請求項２０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａを除外する、請求項２０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
生物試料中のマイクロＲＮＡまたは複数のマイクロＲＮＡの検出方法であって、
外傷性脳損傷の臨床症状を呈している対象から得られた第１の生物試料を、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに結合するプローブと接触させて、マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡタンパク質複合体を生成すること、及び
ノーザンブロットまたはリアルタイムＰＣＲで前記マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体の存在または不在を検出することを含み、
前記複合体の不在は、前記第１の生物試料中の前記マイクロＲＮＡの不在を示す、方法。
【請求項４０】
前記プローブが、検出可能に標識される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿素、唾液、または組織である、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物試料が、前記対象が外傷性脳損傷を罹患した後の、前記外傷性の事象が疑われた後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日未満に得られたものである、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
第２の時点で前記対象から得られた生物試料を、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５Ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡに結合するプローブと接触させて、マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を生成すること、
ノーザンブロットまたはリアルタイムＰＣＲで前記第２の時点からの前記生物試料中の前記マイクロＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体の存在または不在を検出して、前記対象における前記外傷性脳損傷の進行を追跡するための指標を提供することをさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４２、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａを除外する、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2018522558.tif 000021
2018522558.tif 000022
2018522558.tif 000023
2018522558.tif 000024
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