(57)【要約】本開示の実施形態は、HER2特異的キメラ抗原受容体（CAR）を発現する免疫細胞およびそれを用いたガンの治療を含む。特定の実施形態では、肉腫または神経膠芽腫が治療される。例えば、神経膠芽腫のような特定の実施形態では、HER2特異的CARを発現するT細胞は、pp65CMV特異的T細胞である。【選択図】図１
2018510652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記キメラ抗原受容体が、ただ１つだけの共刺激性エンドドメインを含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体が２つ以上の共刺激性エンドドメインを含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＯＸ４０  ＩＣＯＳ、Ｍｙｄ８８、ＣＤ４０、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子エンドドメインを含む、請求項１、２または４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記キメラ抗原受容体が、トラスツズマブ、ＦＲＰ５、ｓｃＦｖ８００Ｅ６、Ｆ５ｃｙｓ、ペルツズマブおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＨＥＲ２に特異的なｓｃＦｖを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７、８または９に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１１】
前記細胞が免疫細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞が別の抗原に特異的である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞がウイルス特異的である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、ｐｐ６５ＣＭＶ特異的Ｔ細胞、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞、水痘ウイルス特異的Ｔ細胞、インフルエンザウイルス特異的Ｔ細胞および／またはアデノウイルス特異的Ｔ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体以外のキメラ抗原受容体を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１０〜１７に記載のいずれかの複数の細胞またはＨＥＲ２キメラ抗原受容体を含む基質を治療的有効量で個体に提供する工程を含む、ガンの個体を治療する方法。
【請求項１９】
前記ガンがＨＥＲ２陽性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガンが難治性または再発性である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ガンが肉腫または神経膠芽腫である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記肉腫が骨肉腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の細胞の治療的有効量が、少なくとも１ｘ１０4／ｍ2、１ｘ１０5／ｍ2、１ｘ１０6／ｍ2、１ｘ１０7／ｍ2、１ｘ１０8／ｍ2、１ｘ１０9／ｍ2、または１ｘ１０10／ｍ2の用量である、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の細胞の治療的有効量が、１ｘ１０10／ｍ2、１ｘ１０9／ｍ2、１ｘ１０8／ｍ2、１ｘ１０7／ｍ2、１ｘ１０6／ｍ2、１ｘ１０5／ｍ2または１ｘ１０4／ｍ2以下の用量である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、１つ以上のケモカイン受容体を遺伝子導入により発現する免疫細胞である、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ケモカイン受容体が、ガンによって発現されるケモカインに対する受容体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ケモカインが、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、および／またはＣＣＬ１７である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記個体が、治療的有効量の更なるガン療法を提供される、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の細胞が個体に与えられる前、間および／または後に、前記更なるガン療法が個体に与えられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
更なる療法が、外科手術、薬物療法、化学療法、放射線療法、免疫療法、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の細胞が与えられる前に、個体はリンパ球除去療法を受ける、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の細胞が与えられる前に、個体はリンパ球除去療法を受けない、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫療法が、１つ以上のチェックポイント抗体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記チェックポイント抗体が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＢＬＴＡ、ＶＩＳＴＡおよび／またはＬＡＧ３を認識する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が阻害性受容体を含む、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、１つ以上のサイトカインの投与なしで、かつリンパ球除去療法なしで起こり、１×１０4／ｍ2から１×１０10／ｍ2の範囲の細胞用量で起こる、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、１つ以上のサイトカインの投与を含み、かつ個体へのリンパ球除去療法を提供する工程を含み、１×１０4／ｍ2から１×１０10／ｍ2の範囲の細胞用量で起こる、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２および／またはＩＬ１５である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所、皮内の経路により、注入により、注射により、またはそれらの組み合わせで、個体に与えられる、請求項１８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７〜９のいずれか１項に記載の発現ベクター、および／または請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の細胞を含み、ポリヌクレオチド、発現ベクター、および／または細胞は、適切な容器に収容される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる2015年3月18日に出願された米国仮特許出願第62/135,014号の優先権を主張する。
【０００２】
本開示の実施形態の分野は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、腫瘍学および医薬を含む。
【背景技術】
【０００３】
HER2/ERBB2抗原は、少なくとも乳ガン、卵巣ガン、肺ガン、および脳腫瘍を含む種々のガンで同定され、ガン細胞におけるその発現は個体の予後不良に関連する。
【０００４】
肉腫もHER2/ERBB2抗原に関連し、骨肉腫(OS)、ユーイング肉腫(EWS)、横紋筋肉腫(RMS)、及び非横紋筋肉腫性軟部肉腫(NRSTS)、例えば滑膜肉腫または線維形成性小円形細胞腫瘍を含む多様な悪性腫瘍群である。局所的疾患を有する患者は優れた転帰を有するが、進行期疾患患者の予後は不良なままである。自家幹細胞レスキューによる高用量化学療法の形態の細胞療法は、肉腫のために広範に研究されてきた。しかし、ほとんどの研究では、標準的な化学療法と比較して有意な生存期間の利点は示されておらず、結果を改善するためにより特異的な細胞療法が必要であることが示されている。
【０００５】
抗原特異的T細胞による免疫療法は、免疫媒介性死滅が、腫瘍がしばしば耐性である従来の療法によって使用される経路に依存しないので、肉腫患者にとって有益であり得る。キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝的に改変されたT細胞の養子移入は、CD19陽性悪性腫瘍の治療のための早期臨床試験において大きな期待を示している。キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝的に改変されたT細胞の養子移入は、CD19陽性悪性腫瘍の治療のための早い段階の臨床試験において大きな期待を示している。しかし、固形腫瘍に対するこのアプローチを用いた臨床経験はとても限定されている。CARは腫瘍細胞の細胞表面に発現する抗原を認識し、ヒト上皮増殖因子受容体2（HER2）、GD2、インターロイキン（IL）11Rα、およびB7H3を含むいくつかの潜在的なCAR標的抗原が肉腫で同定されている。
【０００６】
HER2の別名は、HER2/neu、NEU、V-Erb-B2鳥類赤芽球性白血病ウイルスガン遺伝子相同体2、V-Erb-B2、受容体チロシンタンパク質キナーゼErbB-2、プロトオンコジーンC-ErbB2、ErbB2、神経芽細胞腫/膠芽細胞腫由来ガン遺伝子相同体、CD340、TKR1、pl85erB2、MLN19、EC2.7.10.1、EC2.7.10（http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ERBB2）を含むが、これらに限定されない。肉腫細胞はしばしばHER2陽性であるが、HER2遺伝子座はこの疾患では増幅されない。したがって、肉腫は、HER2モノクローナル抗体が有効であるには低すぎるレベルでHER2を発現する、肺、卵巣、前立腺、および脳のガンを含む悪性腫瘍の大きな群に属する。
【０００７】
低レベルでHER2を発現する悪性腫瘍でさえ、HER2特異的CAR（HER2-CAR T細胞）を発現するT細胞の標的とすることができる。これらのHER2-CAR T細胞は、「バルク」腫瘍細胞および腫瘍開始細胞（バルク腫瘍発現レベルの3〜5倍でHER2を発現することが示されている）の両方を死滅させ、前臨床動物モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有する。
【０００８】
任意のタイプのHER2陽性ガンを有する個体に安全かつ有効な細胞療法を提供する必要性が当該技術分野において存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示の実施形態は、HER2陽性ガンを治療および予防するための方法および組成物に関する。HER2陽性のガンは、脳腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、上衣腫および転移性沈着物および/または中枢神経軸外のHER2陽性ガンからの浸潤）、肉腫、乳ガン、卵巣ガン、胃ガン、子宮ガン、子宮内膜ガン、肺ガン、前立腺ガンなどが挙げられる。個体が肉腫を有する場合、そのタイプは、例えば、柔部肉腫または骨肉腫であってもよい。肉腫は、例えば血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、骨肉腫、多形性肉腫、横紋筋肉腫、又は滑膜肉腫を含むいずれのサブタイプであってもよい。特定の実施形態では、ガンは再発性および/または難治性である。ガンは転移していても転移していなくてもよい。ガンは個体において固形腫瘍として存在し得る。個体は、任意の性別の幼児、子供、青年、または成人でもよい。
【００１０】
本開示の実施形態は、HER2標的キメラ抗原受容体（CAR）を発現する免疫細胞およびその使用を包含する。特定の態様において、CARは、HER2に特異的なscFv、またはHER2/ERBB2に特異的に結合し得る任意の天然または人工部分を含む。特定の実施形態では、CARは、当技術分野で公知のHER2に特異的な一本鎖可変断片（scFv）を利用するが、他の実施形態では、CARは当技術分野で公知のHER2に特異的なscFvを利用しない。
【００１１】
特定の実施形態では、CARは、当該分野で公知のモノクローナル抗体に由来するHER2に特異的なscFvを利用するが、他の場合には、CARは、当技術分野で公知のモノクローナル抗体に由来しないHER2に特異的なscFvを利用する。CARは、第2世代または第3世代のCARであってもよいが、特定の実施形態において、CARは第3世代のCARではなく、唯一の共刺激性のエンドドメインを含む。
【００１２】
特定の実施形態において、個体には、HER2を認識する免疫細胞のような、HER2陽性ガンを治療および予防するためのある種の免疫療法が与えられる。特定の実施形態では、免疫細胞は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である。他のエフェクター細胞には、生来抗腫瘍活性を示すか、またはこの効果を発揮するように改変されたものが含まれる。特定の実施形態では、免疫細胞はHER2特異的CARを含み、HER2特異的CAR以外のさらなる修飾が可能である。特定の実施形態において、HER2特異的CARは、例えば、トラスツズマブ、FRP5、800E6、F5cys、ペルツズマブまたはそれらの組み合わせに由来するscFvを含む。免疫細胞の別の遺伝子改変は、例えば、腫瘍部位へのT細胞誘導を増強するために利用されるように、1つ以上のケモカイン受容体を発現させることである。CAR T細胞の特定の実施形態では、1つ以上の複数の刺激性サイトカインを遺伝子導入により発現することができる。特定の実施形態では、HER2-CAR T細胞を阻害性腫瘍微小環境に対して耐性にすることができる。T細胞のエフェクター機能を腫瘍部位に限定する誘導性自殺遺伝子（例えば、カスパーゼ-9など）および/または阻害性受容体などの、安全性を高めるための遺伝的改変により「On標的上/offガン」の毒性を回避することもできる。
【００１３】
特定の実施形態では、HER2陽性のガンを有することがわかっているか、またはHER2陽性のガンを有することが疑われるような、それを必要とする個体には、本開示に包含される治療的有効量の免疫細胞が提供される。特定の実施形態において、個体は、与えられた投与において1x104/m2から1x1010/m2の間のHER2-CAR T細胞が与えられ得るが、他の用量が利用されてもよい。個体に細胞の複数回投与を提供することができる。特定の実施形態では、T細胞移動の前にリンパ球除去化学療法または放射線療法を使用するか、または使用しない。特定の実施形態では、IL2のようなサイトカインによる治療後の注入はないが、代替の実施形態では、サイトカインによる治療後の注入がある。特定の実施形態では、HER2-CAR免疫細胞を、T細胞活性化を増加させ、インビボ生存を延長するために、チェックポイント抗体、免疫調節剤、またはワクチンなどの1つ以上のさらなる免疫学的ガン療法と組み合わせることができる。手術、放射線療法、薬物療法、および/またはホルモン療法などの他のガン療法もまた使用され得る。
【００１４】
一実施形態では、HER2キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドがあり、キメラ抗原受容体は、CD3-ゼータ、CD28、CD8、4-1BB、CTLA4、CD27、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、複数の共刺激性エンドドメインを含むが、特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ただ１つだけの共刺激性エンドドメインを含む。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、CD28、CD27、4-1BB、OX40 ICOS、Myd88、CD40、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子のエンドドメインを含む。キメラ抗原受容体は、トラスツズマブ、FRP5、scFv800E6、F5cys、ペルツズマブおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるHER2に特異的なscFvを含み得る。
【００１５】
ある実施形態では、本開示に包含されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターがあり、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得るか、または非ウイルスベクターであってもよい。
【００１６】
特定の実施形態では、本開示に包含されるようなポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む細胞が存在する。特定の実施形態では、細胞は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞などの免疫細胞である。細胞は、場合によっては腫瘍抗原を含む別の抗原に特異的であり得る。特定の実施形態では、細胞は、pp65CMV特異的T細胞、CMV特異的T細胞、EBV特異的T細胞、水痘ウイルス特異的T細胞、インフルエンザウイルス特異的T細胞および/またはアデノウイルス特異的T細胞である。
【００１７】
一実施形態では、個体に、本開示に包含される細胞の複数の治療上有効な量を提供する工程を含む、ガンの個体を治療する方法がある。特定の実施形態では、ガンはHER2陽性である。ガンは難治性または再発性であり得る。特定の実施形態では、ガンは肉腫または神経膠芽腫である。肉腫は、例えば、骨肉腫であり得る。投与量は、例えば、体重または年齢などによって定式化することができる。ある実施形態において、複数の細胞の治療的有効量は、少なくとも1x104/m2、1x105/m2、1x106/m2、1x107/m2、1x108/m2、1x109/m2又は1x1010/m2の用量である。特定の実施形態では、複数の細胞の治療的有効量は、１x1010/m2、1x109/m2、1x108/m2、1x107/m2、1x106/m2、1x105/m2または1x104/m2以下の用量である。特定の実施形態では、この方法は、1つ以上のサイトカインの投与と共にまたは投与なしで、またはリンパ球除去療法を伴わないかまたは伴って起こり、1x104/m2から１x1010/m2の範囲の細胞用量である。サイトカインは、IL2、IL7、IL12および/またはIL15であってもよい。
【００１８】
特定の実施形態において、HER2特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の使用は、エクスビボで起こる。例えば、免疫細胞は、HER2を有する細胞（HER2発現ガン細胞を含む）を標的とする細胞の1つ以上の細胞、1つ以上の組織および/または1つ以上の器官にエクスビボで曝露されてもよい。特定の実施形態で、HER2特異的キメラ抗原受容体発現免疫細胞は、1つ以上の細胞、1つ以上の組織および/または1つ以上の器官をエクスビボで処理するために利用される。特定の例では、有効量のHER2特異的キメラ抗原受容体発現免疫細胞をエクスビボでそれぞれの組織又は器官に曝露することによって、いくつかまたはすべてのHER2発現ガン細胞を組織または器官から除去することができる。一例として、移植前にHER2特異的キメラ抗原受容体発現免疫細胞に骨髄をエクスビボで曝露してもよく、またはそれを必要とする宿主への導入前にHER2特異的キメラ抗原受容体発現免疫細胞を悪性腫瘍に罹患している器官を処理するために使用することができる。
【００１９】
HER2特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を生成する方法が、本明細書において企図される。特定の実施形態において、HER2特異的キメラ抗原受容体を発現するように操作される免疫細胞は、商業的または当業者を含む別の当事者から得られ、またはHER2特異的キメラ抗原受容体免疫細胞で処置される個体から単離されるかまたは別の個体から単離される。免疫細胞は、HER2特異的キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドの形質導入のための、当技術分野における標準的な手段を用いてHER2特異的キメラ抗原受容体を発現するように改変され得る。得られたまたは単離された免疫細胞がHER2特異的キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変され、且つさらに第2の遺伝子改変（別のキメラ抗原受容体または他のタイプの非天然受容体を発現するなど）を含む場合、遺伝的改変は任意の順序で起こり得る。HER2特異的キメラ抗原受容体または別のタイプの受容体をコードする任意のポリヌクレオチドは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのようなベクターを用いて細胞に形質導入することができる。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなどであってもよい。
【００２０】
特定の実施形態では、細胞は1つ以上のケモカイン受容体を遺伝子導入により発現する免疫細胞であり、例えばケモカイン受容体はガンによって発現されるケモカインに対する受容体である。特定の実施形態では、ケモカインはCXCL1、CXCL8、CCL2および/またはCCL17である。個体は、個体に複数の細胞が与えられる前、間および/または後に個体に与えられるような治療的有効量の更なるガン療法を提供することができる。特定の実施形態では、追加の治療は、外科手術、薬物療法、化学療法、放射線療法、免疫療法、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、複数の細胞を与える前に個体にリンパ球除去療法を施すが、いくつかの実施形態では、複数の細胞を与える前に個体にリンパ球除去療法を与えない。
【００２１】
特定の実施形態では、免疫療法は、CTLA4、PD-1、PD-L1、TEVI3、BLTA、VISTAおよび/またはLAG3を認識するチェックポイント抗体などの1つ以上のチェックポイント抗体を含む。特定の実施形態では、細胞は阻害性受容体を含む。
【００２２】
一実施形態では、本開示に包含されるポリヌクレオチド、本開示に包含される発現ベクター、および/または本開示に包含される細胞を含むキットが存在し、ポリヌクレオチド、発現ベクター、および/または細胞は、適切な容器に収容される。
【００２３】
特定の実施形態では、ガンにおいて使用するためのHER2キメラ抗原受容体で修飾されたCMV特異的T細胞が存在する。それらは、任意のタイプのガンを有する任意の個体に使用され得るが、特定の実施形態において、それらは、例えば、進行性神経膠芽腫に使用される。
【００２４】
上記は、以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解できるように、本発明の特徴および技術的に有利な点をかなり広く概説したものである。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明の追加の特徴および利点を以下に説明する。開示された概念および特定の実施形態は、本発明の同じ目的を実行するための他の構造を変更または設計するための基礎として容易に利用され得ることは、当業者には理解されるべきである。また、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲からその均等な構成が逸脱しないことも理解されるべきである。本発明の特徴であると考えられる新規な特徴は、さらなる構成および利点と共に、その構成および動作方法に関して、添付の図面に関連して考慮されるとき、以下の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、図面の各々は、例示及び説明のためだけに提供されており、本発明の制限の定義を意図するものではないことを明確に理解されたい。
【００２５】
本発明のより完全な理解のために、添付の図面と併せて以下の説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の血漿サイトカインレベル。ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の血漿サイトカインレベルを多重分析によって測定した。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６およびＩＬ８の結果を示す。Ｔ細胞注入１週後（ｐ＝０．０２８）、２週後（ｐ＝０．００６）、および４週後（ｐ＝０．００１）に、血漿ＩＬ８レベルの有意な増加があった。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ１３の結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
【図２】図２Ａ−２Ｆ：ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ持続性。（２Ａ−２Ｃ）各用量レベル（ＤＬ）でのＴ細胞のインビボ持続性。（２Ｄ）ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入３時間後の細胞用量と導入遺伝子検出レベルとの相関。（２Ｅ）注入から６週間後のＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の検出は、注入されたＴ細胞用量（≦１×１０6／ｍ2対＞１×１０6／ｍ2：ｐ＝０．００２）に依存した。（２Ｆ）ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞は注入後１８ヶ月まで検出された。
【図３】図３Ａおよび３Ｂ：腫瘍部位へのＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞誘導。（３Ａ）腫瘍生検におけるＣＤ３発現の免疫組織化学。（３Ｂ）腫瘍生検および対応する末梢血サンプルにおける導入遺伝子検出。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ：ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の転帰。（４Ａ）注入された全患者のカプラン−マイヤー曲線（ｎ＝１９）。（４Ｂ）ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の腫瘍の顕著な壊死（Ｐ１４）。（４Ｃ）ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入前および６週間後のＰＥＴ画像（Ｐ４）。
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ：ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の特徴付け。（５Ａ）非形質導入（ＮＴ）および形質導入Ｔ細胞のＨＥＲ２−ＣＡＲ発現（ＮＴ対ＨＥＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｐ＜０．０００１）。個々のデータ点および平均が示される。（５Ｂ）ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の表現型分析。ＣＭ：セントラルメモリー（ＣＤ３＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋）；ＥＭ：エフェクターメモリー（ＣＤ３＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）。箱ひげ図（Ｔｕｋｅｙ法）で示す。（５Ｃ）エフェクターとしてＮＴ−およびＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、並びに標的としてＨＥＲ２陰性（Ｋ５６２、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ））またはＨＥＲ２陽性（ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＬＭ７）細胞株を用いる細胞毒性アッセイ。エフェクター対標的比２０：１の標準偏差付きの平均を示す。Ｋ５６２：ＮＴ対ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｐ＝ＮＳ；ＭＤＡ：ＮＴ対ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｐ＝ＮＳ；ＮＣＩ−Ｈ１２２９：ＮＴ対ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｐ＜０．０００１；ＬＭ７：ＮＴ対ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｐ＜０．０００１。
【図６Ａ】ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の血漿サイトカインレベル。ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の血漿サイトカインレベルを、多重分析によって測定した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ１３の結果をここに示す。Ｔ細胞注入後の有意な変化はなかった。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６およびＩＬ８の結果を図１に示す。
【図６Ｂ】ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の血漿サイトカインレベル。ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の血漿サイトカインレベルを、多重分析によって測定した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ１３の結果をここに示す。Ｔ細胞注入後の有意な変化はなかった。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６およびＩＬ８の結果を図１に示す。
【図７】Ｔ細胞のインビボ持続性。６人の患者は少なくとも２回のＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞投与を受けた（患者５、７、１２、１４、および１８について示す）。ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、注入後ｑＰＣＲによって検出された。ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞持続性のパターンは、両方の注入後も同様であった。右パネルは、ＤＮＡ１μｇあたり２５０コピーのｙ軸最大値およびＤＮＡ１μｇあたり５０コピーのｙ軸最大値を有する左パネルを有するデータを示す。
【図８Ａ】進行性神経膠芽腫患者におけるヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞のインビボ持続性。（８Ａ）各用量レベルでｑＰＣＲによって検出されるインビボ持続性。
【図８Ｂ】進行性神経膠芽腫患者におけるヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞のインビボ持続性。（８Ｂ）２回以上の注入を受けた患者の末梢血中のＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の検出。
【図８Ｃ】進行性神経膠芽腫患者におけるヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞のインビボ持続性。（８Ｃ）ＨＥＲ２−ＣＡＲ導入遺伝子は、Ｔ細胞注入後１２ヶ月まで検出された。
【図９Ａ】ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞の静脈内注入後の神経膠芽腫患者における臨床転帰。（９Ａ）ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞注入前および６週間後の脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）。
【図９Ｂ】ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞の静脈内注入後の神経膠芽腫患者における臨床転帰。（９Ｂ）ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞で処置したすべての患者における病状および生存を示すスイマーズプロット。
【図９Ｃ】ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞の静脈内注入後の神経膠芽腫患者における臨床転帰。（９Ｃ）最初の注入からの全生存率（ＯＳ）（左上パネル）、診断からのＯＳ（右上パネル）、最初の注入からの進行までの時間（ＴＴＰ）および以前のサルベージ療法の生存を示す注入された全患者（ｎ＝１７）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。
【図１０】研究患者のＧＢＭにおける免疫組織化学によるＨＥＲ２、ＣＭＶ  ｐｐ６５およびＣＭＶ  ＩＥ１発現の検出。免疫組織化学法を用いて、ＨＥＲ２、ＣＭＶ  ｐｐ６５およびＣＭＶ  ＩＥ１発現を検出した。結果は以下のスキームに従って等級付けした：強度：対照スライドの陽性に基づく０〜３＋；グレード（陽性腫瘍細胞のパーセンテージ）：０＝無し、１＝１−２５％、２＝２６−５０％、３＝５１−７５％、４＝７６−１００％。代表的な画像が示されている（倍率は１００倍）。すべての患者の結果を表５に要約する。
【図１１Ａ】ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞産物の特徴付け。（１１Ａ）非形質導入（ＮＴ）および形質導入したＴ細胞のＨＥＲ２−ＣＡＲ発現。（ＮＴ対ＨＥＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞、ｐ＜０．０００１）。個々のデータ点および平均が示される。
【図１１Ｂ】ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞産物の特徴付け。（１１Ｂ）ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞産物の表現型分析。ＣＭ：セントラルメモリー（ＣＤ３＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋）；ＥＭ：エフェクターメモリー（ＣＤ３＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）。箱ひげ図（１０〜９０パーセンタイル）を示す。
【図１１Ｃ】ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞産物の特徴付け。（１１Ｃ）ＣＭＶおよびＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞をエフェクターとして使用し、ＨＥＲ２陰性（Ｋ５６２、自家（ａｕｔｏ）またはＨＬＡミスマッチ（ＭＭ）ＬＣＬ）またはＨＥＲ２陽性（Ｕ３７３）細胞株を標的として用いる細胞毒性アッセイ。エフェクター対標的比２０：１での標準偏差付きの平均を示す。ＬＣＬ−ＭＭ：ＣＭＶ対ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞，ｐ＝ＮＳ；ＬＣＬ−Ａｕｔｏ：ＣＭＶ対ＨＥＲ２／ＣＭＶ，ｐ＝ＮＳ；Ｋ５６２：ＣＭＶ対ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞，ｐ＝ＮＳ；Ｕ３７３：ＣＭＶ対ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞，ｐ＜０．０００１；ＬＣＬ−ＭＭ対ＬＣＬ−ａｕｔｏ：ｆｏｒ  ＣＭＶ及びＣＭＶ／ＨＥＲ２−Ｔ細胞：ｐ＜０．００１）．
【図１１Ｄ】ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞産物の特徴付け。（１１Ｄ）抗原特異性ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞産物を、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＣＭＶ  ＩＥ１、およびヘキソン／ペントン（Ａｄｖ）ｐｅｐｍｉｘｅｓを用いたＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイおよび刺激因子としてのａｕｔｏ−ＬＣＬによって決定した。ＰＨＡは陽性対照（ｐｏｓ  Ｃｏ）および培地を陰性対照（ｎｅｇ  Ｃｏ）として用いた。箱ひげ図（１０〜９０パーセンタイル）を示す。ｐ＜０．００１はＣＭＶ  ｐｐ６５対ＣＭＶ  ＩＥ１，  ＣＭＶ  ｐｐ６５対ＣＭＶ  ＩＥ１，ＣＭＶ  ｐｐ６５対Ａｄｖ，ＣＭＶ  ｐｐ６５対Ａｕｔｏ−ＬＣＬ，ＣＭＶ  ｐｐ６５対ｎｅｇ  Ｃｏである、及びＡｕｔｏ−ＬＣＬ対ＩＥ１；ｐ＜０．００５はＡｄｖ対ＣＭＶ  ＩＥ  １である。
【図１２】図１２：ＨＥＲ２／ＣＭＶ  Ｔ細胞注入後のＣＭＶ−、Ａｄｖ−およびＥＢＶ−特異的Ｔ細胞の前駆体頻度。Ｔ細胞注入前、並びに注入１、２、４および６週後に血液サンプルを得た。ＣＭＶ  ｐｐ６５−、ＣＭＶ  ＩＥ１−、Ａｄｖ−およびＥＢＶ−特異的Ｔ細胞の頻度は、刺激因子としてｐｅｐｍｉｘｅｓ（ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＣＭＶ  ＩＥ１、Ａｄｖ  ｈｅｘｏｎ／ｐｅｎｔｏｎ）またはａｕｔｏ−ＬＣＬを用いたＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって決定した。個々の患者（点線）および平均（実線）を示す。個々の時点間に有意差は認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
長年の特許法の慣習に従えば、単語「a」および「an」は、特許請求の範囲を含む本明細書で使用されるとき、「1以上」を意味する。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の1つ以上の構成、方法ステップ、および/または方法からなるか、またはそれらから本質的になることができる。本明細書に記載されている任意の方法または組成物は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示され、同様のまたは類似の結果を得る、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実施することができる。
【００２８】
本開示の実施形態は、任意のタイプのガンの治療または予防に関する。例えば、転移性または再発性肉腫患者の転帰は依然として貧弱である。腫瘍特異的T細胞による養子免疫療法は魅力的な治療法であるが、肉腫ではこれまで評価されていない。本明細書に記載の研究は、CD28ζシグナル伝達ドメイン（CARがHER2特異的MAb FRP5に由来するエクトドメインを含むHER2-CAR T細胞）を有するHER2特異的キメラ抗原受容体を発現するT細胞の一定の漸増用量（1×104/m2〜1×108/m2）を受けた、再発性/難治性HER2陽性肉腫を有する患者について行った。特定の実施形態では、IL2またはリンパ球除去化学療法の投与を伴わない単剤としてのHER2-CAR T細胞（1×104/m2）の超低用量を使用し、細胞用量を1×108/m2に漸増した。本開示は、注入された細胞の安全性、持続性および抗腫瘍活性を実証する。
【００２９】
本開示の他の実施形態において、HER2特異的CARは、神経膠芽腫（GBM）に利用される。本明細書に記載するように、HER2特異的キメラ抗原受容体（CAR）で修飾されたCMV特異的T細胞による養子免疫療法をGBMに利用した。本明細書で提供されるように、再発性/進行性HER2陽性GBMを有するCMV血清陽性患者は、CD28.ζシグナル伝達ドメインを有するHER2-CARを発現するように遺伝子改変されたCMV抗原pp65に特異的な自家T細胞（HER2/CMV T細胞）を受けた。例として、再発性/進行性のHER2陽性GBMを有する複数の成人および小児患者が、1×106/m2〜1×108/m2のHER2/CMV T細胞を１回以上受けた。T細胞注入は用量制限毒性なしでよい忍容性を示した。HER2/CMV T細胞は、リアルタイムqPCRによって判断した場合に、注入後12ヵ月まで末梢血において検出された。評価可能な16人の患者のうち、1人の患者は＞9ヶ月の部分応答を示し、7人の患者は安定した疾患（SD）を2.3ヶ月から＞30ヶ月有し、T細胞注入後に8人の患者が進行した。SDの3人の患者は、＞30ヶ月の追跡期間に進行の証拠がなく、現在生きている。研究コホート全体について、OSの中央値は、最初のT細胞注入から11.6ヶ月であり、診断から24.8ヶ月であった。特定の実施形態において、HER2/CMV T細胞は、単剤として、またはGBMのための他の免疫調節アプローチと組み合わせて利用され得る。
【００３０】
II. キメラ抗原受容体
腫瘍指向性キメラ抗原受容体（CAR）を発現する免疫細胞（ヒトTリンパ球など）の遺伝子工学は、タンパク質-抗原プロセシングおよび提示の異常に起因する腫瘍免疫逃避機序を迂回する抗腫瘍エフェクター細胞を産生することができる。さらに、これらのトランスジェニック受容体は、タンパク質由来ではない腫瘍関連抗原に向けることができる。本発明の特定の実施形態では、少なくとも1つのCARを含むように修飾されたCTLが存在する。特定の実施形態では、単一の免疫細胞が1つのタイプのCAR分子を発現するか、または単一の細胞が複数のタイプのCAR分子および/または他の非天然受容体（T細胞受容体、ケモカイン受容体、またはα/β受容体など）を発現してもよい。
【００３１】
特定の場合において、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）には、少なくとも部分的にヒトの手によって操作されたキメラ、非天然受容体が含まれる。特定の場合、操作されたCARは、1、2、3、4またはそれ以上の成分を有し、いくつかの実施形態では、1つ以上の成分が、Tリンパ球の腫瘍抗原含有ガン細胞への標的化または結合を促進する。特定の実施形態では、CARは、細胞質シグナル伝達ドメインの一部または全部、および/または1以上の共刺激分子（例えば共刺激分子のエンドドメイン）の一部または全部である、腫瘍抗原についての抗体を含む。特定の実施形態では、抗体は一本鎖可変断片（scFv）である。特定の態様において、抗体は、例えば、CD340（分化のクラスター340）、プロトオンコジーンNeu、またはERBB2（ヒト）としても知られるHER2（受容体チロシンタンパク質キナーゼerbB-2とも呼ばれる）に向けられる。特定の実施形態では、単一のCAR分子は、HER2を標的とするscFvを含むCARを含み、HER2以外の抗原を標的とする別のscFvを含むことによって、2つの抗原に対して二重特異性である。
【００３２】
特定の実施形態では、T細胞受容体ζ鎖に由来するものなどの細胞質シグナル伝達ドメインは、標的抗原とキメラ受容体の結合に続くTリンパ球増殖およびエフェクター機能のための刺激シグナルを生成するために、キメラ受容体の少なくとも一部として使用される。共刺激分子由来のエンドドメイン例としては、CD28、CD27、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、ICOS、Myd88および/またはCD40などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、共刺激分子は、抗原結合後にCARによって産生されるT細胞の活性化、増殖および細胞毒性を増強するために使用される。T細胞はまた、それらの機能を増強するためにさらに遺伝子改変され得る。例えば、サイトカイン（例えばIL2、IL7、IL15）のトランスジェニック発現、ネガティブレギュレーターのサイレンシング（例えばSHP-1、FAS、PD-L1）、ケモカイン受容体（例えばCXCR2、CCR2b）、ドミナントネガティブ受容体（例えば、ドミナントネガティブTGFβRII）および/またはポジティブシグナルをネガティブに変換するいわゆる「シグナルコンバーター」（例えば、IL4/IL2キメラサイトカイン受容体、IL4/IL7キメラサイトカイン受容体、またはTGFβRII/TLRキメラ受容体）を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
特定の実施形態では、CARをコードするポリヌクレオチド中のCARの成分は特定の順序であり、それにより発現されたCARタンパク質が特定の順序で対応するドメインを有する。例えば、特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、抗体ドメインとエンドドメインとの間に構成される。特定の実施形態では、コードされたCARタンパク質におけるドメインの順序は、N末端-抗体-膜貫通ドメイン-エンドドメインC末端であるが、ある場合にはコードされたCARタンパク質におけるドメインの順序は、N末端-エンドドメイン膜貫通ドメイン-抗体-C末端である。もちろん、細胞内または細胞表面に位置する膜貫通ドメインの適切な側に配置するよう注意しながら、この構成内に他のドメインを挿入してもよい。細胞内にあることを必要とするこれらのドメインは、例えば、タンパク質の膜貫通ドメインのエンドドメインが位置する側面に存在する必要がある。細胞外にあることを必要とするドメインは、タンパク質の膜貫通ドメインの抗体が位置する側面にある必要がある。
【００３４】
CARは、例えば、第1世代（CD3ζ鎖由来の細胞内ドメインを含むCAR）、第2世代（CARは様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、CD28、41BB、ICOS）由来の細胞内シグナル伝達ドメインも含む）または第3世代（シグナル伝達が、CD28および4-1BBまたはOX40のような腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーによって提供される共刺激とともにCDB-ζによって提供される場合など、複数のシグナル伝達ドメインが存在するCAR）であってもよい。特定の実施形態では、CARは単一の共刺激ドメインを含む。
【００３５】
CARは、HER2に特異的であってもよい。HER2特異的CARを発現する細胞は、1つ以上の追加のCAR、例えば、TAAまたはTSAに結合するCAR、例えば、EphA2、HER2、GD2、Glypican-3、5T4、8H9、αvβ6インテグリン、B細胞成熟抗原（BCMA）B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ軽鎖、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎児AchR、葉酸受容体α、GD2、GD3、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、ILl lRa、IL13Ra2、KDR、ラムダ、ルイスY、MCSP、メソセリン、Mucl、Mucl6、NCAM、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSCl、PSMA、RORl、Spl7、SURVIVIN、TAG72、TEMl、TEM8、VEGRR2、ガン胎児性抗原、HMW-MAA、VEGF受容体、および/またはフィブロネクチン、テネイシンまたは腫瘍の壊死領域のガン胎児性変異体のような細胞外マトリックスに存在する他の例示的な抗原および他の腫瘍関連抗原またはゲノム解析および/または腫瘍の示差的発現研究などによって同定される作用可能な突然変異などを含む。
【００３６】
特定の実施形態では、HER2に免疫細胞を誘導するCARは、（1）HER2に結合する細胞外抗原結合ドメイン、および（2）一次シグナル伝達部分（例えば一次T細胞活性化シグナルを提供するCD3ζ鎖）および場合により共刺激部分（例えばCD28ポリペプチドおよび/または4-1BB（CD 137）ポリペプチド）を含む細胞内ドメインを含む。
【００３７】
特定の場合において、CARはHER2に特異的であり、特定の実施形態において、本発明は、HER2特異的抗体に由来する細胞外抗原結合ドメインを、T細胞受容体ζ鎖に由来する細胞質シグナル伝達ドメインに、例示的な共刺激分子のエンドドメインCD28及びOX40とともに結合させることによって、HER2に特異的なキメラT細胞を提供する。このCARはヒトT細胞で発現され、HER2陽性ガンの標的化が本発明に包含される。いくつかの場合において、同じ細胞は、HER2に特異的なCARおよび別の腫瘍抗原に特異的なCARを含む。
【００３８】
特定の実施形態では、HER2に特異的なCARは、HER2を認識するscFv抗体を有するCARを指す。いくつかの実施形態において、HER2 scFvは任意の種類であるが、他の実施形態では、scFvは、トラスツズマブ、FRP5、800E6、F5cys、ペルツズマブおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるMAbに由来する。
【００３９】
特定の実施形態において、代表的なHER2ヌクレオチド配列は、国立センターバイオテクノロジー研究所のGenBank（登録商標）データベースのアクセッション番号NP_004439で示すタンパク質をコードするアクセッション番号NM_004448であり、両方とも本明細書の全体を参照する。当業者は、本開示に包含されるHER-2特異的CARSにおいて利用されるモノクローナル抗体を生成するためにHER2タンパク質配列を操作する方法を認識する。
【００４０】
特定の実施形態では、HER2 CARは免疫細胞から発現されるが、他の実施形態では、HER2 CARは基質上で個体に提供される。基質は、生体適合性であり、1つ以上のHER2 CAR分子が適切に付着される限り、任意の種類であり得る。特定の場合において、基質は細胞ではなく、エキソソームミクロソーム、ミセル、またはナノ粒子、ビーズなどの人工体を含む。個体へのHER2 CAR含有基質の有効量を提供することは、単一治療として利用してもよく、またはHER2 CAR発現免疫細胞および/または別の治療（薬物、免疫療法、外科手術、放射線など）に加えて、それらを必要とする個体に送達してもよい。コーティングされた基質は、抗腫瘍応答を誘発することができる。CAR分子は、コードする導入遺伝子として導入され得、これらの細胞産物は、発現する細胞または細胞株から回収される。あるいは、これらのCAR分子は分泌され、ミセルまたはリポソームに物理的に導入され得る。
【００４１】
III. HER2 CARを発現する宿主細胞
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は互換的に使用され得る。これらの用語のすべてには、その子孫、すなわち後継世代のすべても含まれる。故意または偶然の突然変異のために、すべての子孫が同一ではない可能性があることが理解される。異種核酸配列を発現する文脈において、「宿主細胞」とは、ベクターを複製し、および/またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することができる真核細胞をいう。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、かつこれまで使用されてきた。宿主細胞は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを意味する「形質導入」または「形質転換」されることができる。形質転換された細胞は、主要な対象細胞およびその子孫を含む。本明細書中で使用される場合、用語「操作された」および「組換え」細胞または宿主細胞は、外来核酸配列、例えばベクターなどが導入された細胞を意味することが意図される。したがって、組換え細胞は、組換え導入された核酸を含有しない天然に存在する細胞と区別される。本発明の実施形態では、宿主細胞は、細胞傷害性T細胞（TC、細胞傷害性Tリンパ球、CTL、T-キラー細胞、細胞溶解性T細胞、CD8 + T細胞、CD4 + T細胞、またはキラーT細胞）; NK細胞およびNKT細胞も本発明に包含される。HER2-CARをコードするポリヌクレオチドを生成するために、大腸菌などの細菌細胞を用いることができる。
【００４２】
一態様では、本明細書では、1以上のCARを発現するように遺伝子操作された細胞が提供される。特定の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、例えば、Tリンパ球（T細胞）、ナチュラルキラー（NK）T細胞、またはNK細胞である。特定の他の実施形態では、遺伝子操作された細胞は非免疫細胞、例えば間葉系幹細胞（MSC）、神経幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）、または胚性幹細胞である。特定の実施形態では、細胞は、遺伝子操作されたCARまたはその機能を増強し得る任意の他の遺伝子改変も含む。特定の実施形態では、CARの抗原結合ドメインはHER2に結合するが、特定の実施形態では、CARの抗原結合ドメインは異なる標的抗原を認識する。
【００４３】
特定の実施形態において、RNAまたはタンパク質性配列は、同一のCTLなどの同じ細胞内の他の選択されたRNAまたはタンパク質性の配列と同時発現され得ることが企図される。共発現は、CTLを2つ以上の異なる組換えベクターで同時トランスフェクトすることによって達成され得る。あるいは、RNAのための複数の異なるコード領域を含むように単一組換えベクターを構築することができ、単一ベクターでトランスフェクトされたCTLで発現させることができる。
【００４４】
いくつかのベクターは、原核細胞および真核細胞の両方で複製および/または発現させることを可能にする制御配列を使用することができる。当業者は、上記宿主細胞の全てをインキュベートしてそれらを維持し、ベクターの複製を可能にする条件をさらに理解するであろう。また、ベクターの大量生産、ならびにベクターおよびそれらの同種のポリペプチド、タンパク質またはペプチドによってコードされる核酸の産生を可能にする技術および条件も理解され、公知である。
【００４５】
細胞は、自家細胞、同系細胞、同種異系細胞、場合によっては異種細胞であってもよい。
【００４６】
多くの状況において、遺伝子的に改変されたT細胞を殺すことができることを望む場合がある。それは、治療の終了を望む場合、細胞が新生物性になった場合、研究で存在後に興味の細胞が存在しない場合あるいは他の目的である。この目的のために、誘導性自殺遺伝子などの制御された条件下で操作された細胞を殺すことができる特定の遺伝子産物の発現を提供することができる。そのような自殺遺伝子は、当該分野で公知であり、例えば、カスパーゼ9の修飾型が小分子（例えばAP1903）と二量体化可能であるiCaspase9システムである。例えば、Straathof et ah, Blood 105:4247-4254(2005)を参照されたい。
【００４７】
本開示の医薬組成物は、本明細書で定義されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を含むことがさらに想定される。宿主細胞は、上記のベクターの少なくとも1つまたは上記の核酸分子の少なくとも1つを宿主細胞に導入することによって産生され得る。宿主における少なくとも1つのベクターまたは少なくとも1つの核酸分子の存在は、上記の特異的な一本鎖抗体構築物をコードする遺伝子の発現を媒介し得る。
【００４８】
宿主細胞中に導入される、記載された核酸分子またはベクターは、宿主のゲノムに組み込まれるか、または体外で維持され得る。
【００４９】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得るが、特定の実施形態では、真核生物細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物または動物の細胞である。記載された宿主は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞またはヒト細胞株であり得ることが特に想定される。特に好ましい宿主細胞は、免疫細胞、CHO細胞、COS細胞、SP2/0またはNS/0のような骨髄腫細胞株を含む。
【００５０】
本開示の医薬組成物はまた、細胞増殖または細胞刺激に有用な免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することができるタンパク質性化合物を含み得る。本開示に照らして、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供する「タンパク質性化合物」は、例えばさらなるT細胞の活性化シグナル （例えば、さらなる共刺激分子：B7ファミリーの分子、OX40L、4-1BBL）、またはさらなるサイトカイン：インターロイキン（例えば、IL-2、IL-7またはIL-15）、またはNKG-2D係合化合物である。タンパク質性化合物はまた、非T細胞である免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供し得る。非T細胞である免疫エフェクター細胞の例は、とりわけ、NK細胞またはNKT細胞を含む。
【００５１】
一実施形態は、本開示の組成物の製造方法に関し、該方法は、構築物の発現を可能にする条件下で本明細書中で上で定義した宿主細胞を培養することを含み、細胞または複数の細胞は個体に提供される。
【００５２】
CAR分子の発現を可能にする発現構築物を含む細胞の培養条件は、所望される場合に構築物の精製/回収のための手順と同様に、当技術分野で公知である。
【００５３】
一実施形態では、宿主細胞は、CARを含む遺伝子操作されたT細胞（例えば、細胞傷害性Tリンパ球）であり、特定の実施形態では、細胞は、改変TCRをさらに含む。天然に存在するT細胞受容体は、2つのサブユニット、α-サブユニットおよびβ-サブユニットを含み、それぞれが各T細胞のゲノムにおける組換え事象によって産生される独特なタンパク質である。TCRのライブラリーは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングされ得る。「操作されたTCR」は、養子免疫療法ので使用するために選択され、クローニングされ、および/またはその後T細胞の集団に導入される標的抗原に対する高親和性および反応性を有する天然のTCRを指す。操作されたTCRとは対照的に、CARは、MHCに依存しない方法で標的抗原に結合するように操作される。
【００５４】
特定の実施形態では、細胞は、ケモカイン受容体がガンによって発現されるケモカインの受容体であることを含む、1つ以上のケモカイン受容体を遺伝子導入で発現する免疫細胞である。場合によっては、ケモカインはCXCL1、CXCL8、CCL2および/またはCCL17である。
【００５５】
CAR T細胞自体のさらなる遺伝子工学は、刺激性サイトカインのトランスジェニック発現を使用すること、またはHER2-CAR T細胞を阻害性腫瘍微小環境に対して耐性にすることを含むことができる。例えばIL15のようなサイトカインのトランスジェニック発現は、T細胞を制御性T細胞（Tregs）の阻害効果に対して抵抗性にする。あるいは、CAR T細胞におけるIL12のトランスジェニック発現は、阻害性腫瘍浸潤マクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）のアポトーシスを誘発することによって、免疫抑制性腫瘍環境を逆転させる。逆に、サイトカインを産生するように操作される代わりに、CAR T細胞は、細胞溶解性機能を阻害するサイトカインに対して耐性であるように操作することができる。TGFβは、腫瘍増殖を促進し、エフェクターT細胞機能を制限し、Tregを活性化するので、免疫回避戦略として腫瘍によって広く使用されている。ドミナントネガティブTGFβ受容体IIを発現させることにより、TGFβのこれらの有害な影響を打ち消すことができる。
【００５６】
HER2-CAR T細胞はまた、阻害を刺激シグナルに変換することにより、腫瘍環境によって生成される阻害シグナルから積極的に恩恵を受けるように遺伝子操作することができる。多くの腫瘍がIL4を分泌してTH2-極性環境を作り、IL4受容体のエクトドメインとIL7RαまたはIL-2RP鎖のエンドドメインからなるキメラIL4受容体の発現は、T細胞がIL4の存在下で増殖し、それらのTH1-分極を含むエフェクター機能を保持することを可能にする。キメラTGFβ受容体は、これらの「シグナルコンバーター」の別の例である。例えば、トール様受容体（TLR）4のTGFβ受容体IIエンドドメインの細胞外ドメインを連結すると、TGFβに耐性のT細胞とするだけではないキメラ受容体となる。
【００５７】
HER2-CAR T細胞の効力を増強すると、「On標的/offガン」の毒性がもたらされ得るため、誘導性自殺遺伝子（例えば、カスパーゼ-9）またはエフェクター機能を腫瘍部位に限定する阻害性受容体のような、安全を増加させるさらなる遺伝的改変が利用されてもよい。例えば、阻害性受容体は、腫瘍上には存在しない正常組織上の分子に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および例えばPD-1から生じるような「ネガティブシグナル」を伝達する細胞内ドメインを含んでもよい。
【００５８】
特定の実施形態では、HER2特異的CARを含む免疫細胞は、抗原特異的T細胞のように抗原特異的でもある。免疫細胞は、任意の種類の抗原に特異的であり得るが、特定の実施形態において、抗原は、ガン抗原、ウイルス、または細菌である。免疫細胞がウイルスに特異的である場合、例えば、ウイルスは任意の種類であり得、場合によっては、異なるウイルスに対して抗原特異的である複数のHER2特異的CAR免疫細胞が個体に提供される。例えば、個体に提供される複数のHER2特異的CAR免疫細胞において、1つの細胞は、CMVに特異的なHER2特異的CAR免疫細胞であり得るが、複数の他のHER2特異的CAR免疫細胞はEBVに特異的である。HER2特異的CAR免疫細胞が特異的であるいくつかのウイルスは少なくともEBV、CMV、アデノウイルス、BK、HHV6、RSV、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、LCMV、流行性耳下腺炎、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスB、西ナイルウイルスなどを含む。
【００５９】
IV. 医薬組成物
本明細書において、遺伝子操作された免疫細胞、例えば、遺伝子操作されたHER2特異的CAR T細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００６０】
本開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体に投与するための組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内または静脈内投与用の組成物またはガンへの直接注射用の組成物を含む。前記医薬組成物は、注入または注射によって個体に投与されることが特に想定される。適切な組成物の投与は、種々の方法、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内投与によって行うことができる。
【００６１】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。適切な薬学的担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルションなどのエマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、公知の従来の方法である。これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。
【００６２】
投与レジメンは、主治医および臨床的要因によって決定され得る。医学分野において周知であるように、任意のある患者のための投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与されるその他薬物のような多くの要因に依存する。投与の用量の例は、1×106/m2〜1×1010/m2の範囲であり得る。特に好ましい投与量は、本明細書において以下に列挙される。進行状況は定期的に評価することができる。
【００６３】
本開示のCAR細胞組成物は、局所的にまたは全身的に投与され得る。投与は、一般に、非経口（例えば静脈内）であり、また、DNAは直接投与され得、例えば遺伝子銃送達によって標的部位内部または外部へ、または動脈の部位へのカテーテルによって投与される。好ましい実施形態では、医薬組成物は皮下投与され、さらにより好ましい実施形態では静脈内投与される。非経口投与のための製剤には、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。さらに、本開示の医薬組成物は、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。本開示の医薬組成物は、タンパク質性二重特異性一本鎖抗体構築物またはそれをコードする核酸分子またはベクター（本明細書に記載されている）に加えて、医薬組成物の意図される用途に応じて、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。
【００６４】
本明細書に記載される組成物のいずれも、キットに含まれ得る。非限定的な例では、細胞治療で使用するための1つ以上の細胞および/または組換え発現ベクターを有する細胞療法で使用するための1つ以上の細胞を作製するための試薬をキットに含めることができる。キット構成要素は、適切な容器手段で提供される。
【００６５】
キットのいくつかの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかで包装することができる。キットの容器手段は、一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に構成要素が配置され、好ましくは適切に分注される。キット中に複数の構成要素がある場合、キットは一般に、第2、第3または他の追加の容器を含み、その中に追加の成分を別々に配置することができる。しかし、構成要素の様々な組み合わせをバイアルに含めることができる。キットには、通常、商業販売のために密閉してコンポーネントを収容する手段も含まれる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注入またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
【００６６】
キットの構成要素が1種および/または複数の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液は特に有益である。ある場合には、容器手段自体は注射器、ピペット、および/または他の同様の装置であってもよく、それから製剤は身体の感染領域に適用され、動物に注入され、および/またはキットの他のコンポーネントと混合されてもよい。
【００６７】
しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および/または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶剤の添加によって再構成され得る。溶媒は、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。キットはまた、滅菌した薬学的に許容される緩衝液および/または他の希釈剤を収容するための第2の容器手段を含んでもよい。
【００６８】
特定の実施形態では、細胞治療のために使用される細胞がキットで提供され、場合によっては、細胞は本質的にキットの唯一の構成要素である。キットは、所望の細胞を作製するための試薬および材料を含むことができる。特定の実施形態では、試薬および材料には、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、適切な緩衝液または緩衝液試薬、塩などが含まれ、いくつかの場合、試薬には、本明細書に記載のCAR分子をコードするベクターおよび/またはそのための制御要素を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、個体から1つ以上の試料を抽出するのに適した1つ以上の器具がキットに存在する。器具は、シリンジ、メスなどであってもよい。
【００７０】
いくつかの場合、キットは、本明細書に開示される細胞治療実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、および/または免疫療法などの第2のガン療法も含む。キットは、個体の特定のガンに合わせて調整され、個体のそれぞれの第2のガン療法を含むことができる。
【００７１】
V. CARおよびCARを含む宿主T細胞の治療的用途
種々の実施形態において、本明細書で企図されるCAR構築物、核酸配列、ベクター、宿主細胞および/またはそれを含む医薬組成物は、腫瘍性疾患などのガン性疾患、または血管系が損傷した任意の疾患の予防、治療または改善のために使用される。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば固形腫瘍を有するガンを含むガンの予防、改善および/または治療に特に有用であり得る。
【００７２】
特定の実施形態では、本開示の細胞のうちの複数の治療的有効量を個体に提供する工程を含む、個体をガンで治療する方法が本明細書で提供される。特定の態様では、ガンは固形腫瘍であり、腫瘍は任意の大きさであり得るが、特定の実施形態では、固形腫瘍は約2mm以上の直径である。特定の態様では、この方法は、治療的有効量のさらなるガン治療を個体に提供する工程をさらに含む。
【００７３】
本明細書で使用される「治療」または「治療する」は、疾患または病理学的状態の症状または病状に対する有益なまたは望ましい効果を含み、治療された疾患または病状（例えばガンである）の1以上の測定可能なマーカーの最小限の減少さえも含んでよい。治療は、任意に、疾患または状態の症状の軽減または改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。「治療」は、疾患または状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「予防」並びに「予防する」および「予防される」などの類似の用語は、疾患または病状、例えばガンの発生または再発の可能性を予防、阻害または低減するためのアプローチを示す。それはまた、疾患または病状の発症または再発を遅らせること、または疾患もしくは病状の症状の発生または再発を遅らせることを指す。本明細書中で使用される場合、「予防」および同様の言葉は、疾患または状態の発症または再発の前に、疾患または状態の強度、効果、症状および/または負担を軽減することも含む。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明は、単独で、または標準ベクターおよび/または遺伝子送達システムを用いて任意の組み合わせで、投与することができる細胞、CAR構築物、核酸分子およびベクターを部分的に企図し、および少なくともいくつかの態様において薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む。特定の実施形態では、投与に続いて、前記核酸分子またはベクターは、被験体のゲノムに安定に組み込まれ得る。
【００７６】
特定の実施形態では、特定の細胞または組織に特異的であり、前記細胞中に持続するウイルスベクターを使用することができる。適切な医薬担体および賦形剤は、当技術分野で周知である。本開示に従って調製された組成物は、上記の同定された疾患の予防または治療または遅延のために使用され得る。
【００７７】
さらに、本開示は、有効量の免疫細胞、例えば、本明細書に記載のおよび/または本明細書に記載の方法によって産生されたHER2 CARを有するT細胞または細胞傷害性T細胞、HER2 CARをコードする核酸配列; HER2 CARまたはその両方をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、それを必要とする被験体または個体に投与する工程を含む、腫瘍性疾患の予防、治療または改善のための方法に関する。
【００７８】
例示的なCAR細胞の組成物の投与の可能性のある適応症は、肉腫、神経膠芽腫、乳ガン、前立腺ガン、肺ガンおよび結腸ガンを含む腫瘍性疾患、または乳ガン、大腸ガン、前立腺ガン、頭頸部ガン、皮膚ガン、泌尿生殖路のガンなどの上皮ガン/ガン腫、例えば卵巣ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、及び腎臓ガン、肺ガン、胃ガン、小腸のガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、食道ガン、唾液腺のガンおよび甲状腺のガンを含むガン性疾患である。本開示の組成物の投与は、例えば、最小限の残存疾患、早期ガン、進行ガンおよび/または転移性ガンおよび/または難治性ガンを含み、病原性血管形成に関連する、すべてのステージおよび種類のガンに有用である。
【００７９】
本開示は、さらに、他の化合物（例えば二重特異性抗体構築物、標的毒素または免疫細胞を介して作用する他の化合物）との同時投与プロトコールを包含する。本発明の化合物の同時投与のための臨床レジメンは、他の成分の投与と同時、投与前または投与後を含み得る。特定の併用療法には、化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、または他のタイプの免疫療法が含まれる。
【００８０】
治療のための特定の用量は、当技術分野における常套の方法を用いて決定することができる。しかしながら、特定の実施形態では、T細胞は、それを必要とする個体に1回投与されるが、場合によっては2、3、4、5、6回以上を含む複数回投与される。複数の用量が与えられる場合、用量間の時間間隔は任意の適切な時間であり得るが、特定の実施形態では、用量の間は数週間または数ヶ月である。投与間隔は1回のレジメンで異なる場合がある。特定の実施形態では、投与間隔は、2、3、4、5、6、7、8、9、10週、またはそれ以上の週である。具体的なケースでは、例えば4-8または6-8週間である。特定の実施形態では、1回の用量は、少なくとも1x104/m2、1x105/m2、1x106/m2、1x107/m2、1x108/m2又は1x109/m2を含む。特定の実施形態では、1回の用量は、1x104/m2、1x105/m2、1x106/m2、1x107/m2、1x108/m2又は1x109/m2以下を含む。ある実施形態では、1x104/m2〜1x1010/m2、1x104/m2〜1x109/m2、1x104/m2〜1x108/m2、1x104/m2〜1x107/m2、1x104/m2〜1x106/m2、1x104/m2〜1x105/m2、1x105/m2〜1x1010/m2、1x105/m2〜1x109/m2、1x105/m2〜1x108/m2、1x105/m2〜1x107/m2、1x105/m2〜1x106/m2、1x106/m2〜1x1010/m2、1x106/m2〜1x109/m2、1x106/m2〜1x108/m2、1x106/m2〜1x107/m2、1x107/m2〜1x1010/m2、1x107/m2〜1x109/m2、1x107/m2〜1x108/m2、1x108/m2〜1x109/m2、1x108/m2〜1x1010/m2、または1x109/m2〜1x1010/m2の範囲の細胞容量が個体に与えられる。
【００８１】
実施形態は、本明細書で定義される細胞、本明細書で定義される二重特異性一本鎖抗体構築物、本明細書で定義される核酸配列、本明細書で定義されるベクターおよび/または本明細書で定義される宿主を含むキットに関する。本開示のキットが、単独で、または治療または介入を必要とする個体に投与されるさらなる薬剤と組み合わせて、上記の本明細書に記載の医薬組成物を含むことも企図される。
【００８２】
特定の実施形態では、HER2特異的CARを発現する細胞を含む医薬組成物が存在する。有効量の細胞が、それを必要とする個体に与えられる。
【００８３】
例示として、ガン患者またはガンに罹患しやすい、またはガンを有すると疑われる患者は、以下のように治療され得る。本明細書に記載のように修飾されたT細胞は、患者に投与され、長期間保持され得る。個体は、細胞の1回以上の投与を受け得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、免疫認識を阻害するためにカプセル化され、腫瘍の部位に配置される。
【００８４】
特定の場合、個体には、HER2に特異的なCARを含むように操作された治療用T細胞が提供される。細胞は、同時にまたは異なる時間に送達することができ、HER2および別の抗原に対するCARは、別々の細胞内にある。細胞は、同じまたは別個の製剤で送達することができる。細胞は、個別の送達経路で個体に提供され得る。細胞は、例えば、腫瘍部位での注射によって、または静脈内もしくは経口的に送達され得る。そのような組成物の日常的な送達経路は当該分野で公知である。
【００８５】
HER2 CARをコードする発現ベクターは、1つ以上のDNA分子または構築物として導入することができ、構築物を含む宿主細胞の選択を可能にする少なくとも1つのマーカーが存在し得る。構築物は、遺伝子および制御領域が適切に単離され、連結され、適切なクローニング宿主にクローニングされ、制限または配列決定または他の便利な手段によって分析され得る従来の方法で調製され得る。特に、PCRを用いて、「プライマー修復」、ライゲーション、インビトロ突然変異誘発などを適宜用いて1つ以上の突然変異を導入することができる機能的単位の全部または一部を含む個々の断片を単離することができる。いったん完了し、適切な配列を有することが実証された構築物は、任意の都合のよい手段によってCTLに導入することができる。構築物は、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、または単純ヘルペスウイルス（HSV）あるいはレトロウイルスベクターを含むその他のものなどの複製しない欠陥のあるウイルスゲノムに、細胞への感染または形質導入のために、統合およびパッケージングすることができる。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入することができる。宿主細胞は、構築物の導入前に培養物中で成長させ、増殖させ、続いて構築物の導入および構築物の組み込みのための適切な処理を行うことができる。次いで、細胞を増殖させ、構築物中に存在するマーカーによりスクリーニングする。正常に使用され得る様々なマーカーには、hprt、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれる。
【００８６】
場合によっては、相同組換えのための標的部位を有することができ、構築物が特定の遺伝子座に組み込まれることが望ましい。例えば、内因性遺伝子をノックアウトし、相同組換えのための当技術分野で知られているような材料および方法を用いて（同じ場所または他の場所で）それを構築物によってコードされた遺伝子で置き換えることができる。相同組換えのために、オメガまたはO-ベクターのいずれかを使用することができる。例えば、Thomas and Capecchi, Cell (1987) 51, 503-512; Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352; and Joyner, et al., Nature (1989) 338, 153-156を参照ください。
【００８７】
構築物は、少なくともHER2特異的CARおよび場合により別の遺伝子、または1つ以上の遺伝子を有する異なるDNA分子をコードする単一のDNA分子として導入され得る。構築物は同時にまたは連続して導入することができ、各々は同じまたは異なるマーカーを有する。
【００８８】
細菌または酵母起源の複製、選択可能および/または増幅可能なマーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター/エンハンサー要素などを含むベクターであって、構築物DNAのストックを調製するために及びトランスフェクションを実施するために使用されうるものは、当該分野で周知であり、多くは市販されている。
【００８９】
次いで、HER2 CAR構築物を含むように操作された例示的T細胞を、選択的条件下で培養し、構築物を有するものとして選択された細胞を増殖させ、更に例えば、宿主細胞における構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して分析される。操作された宿主細胞が同定された後、それらは計画通りに使用され得る。例えば培養で増殖させるか、または宿主生物に導入される。
【００９０】
細胞の性質に依存して、細胞は、宿主生物、例えば哺乳動物に、様々な方法で導入することができる。特定の実施形態では、腫瘍の部位に細胞を導入することができるが、代替実施形態では、細胞はガンに狙いを定めるか、またはガンに狙いを定めるように改変されている。使用される細胞の数は、多数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば投与回数、細胞の増殖能力、組換え構築物の安定性などに依存する。細胞は、一般に関心のある部位またはその付近に注射される分散液として適用することができる。細胞は、生理学的に許容される培地中にあってもよい。
【００９１】
DNA導入は、いずれの場合にも組み込みをもたらす必要はない。いくつかの状況では、導入されたDNAの一過性の維持が十分であり得る。このやり方では短期間の効果があり、細胞が宿主に導入され、その後、例えば細胞が特定の部位に帰化した後に、所定の時間後に出すことができる。
【００９２】
細胞は、必要に応じて投与することができる。所望の応答、投与様式、細胞の寿命、存在する細胞の数、種々のプロトコルに応じて、使用することができる。投与回数は、上記の因子に少なくとも部分的に依存する。
【００９３】
この系は、リガンドに対する細胞応答、発現効率、および適切な場合には分泌レベル、発現産物の活性などの多くの変数の影響を受けやすいこと、時間および状況に応じて変化し得る患者のニーズ、細胞の損失または個々の細胞の発現活性の結果としての細胞活性の喪失の速度などを含む。したがって、個々の患者ごとに、集団に大量に投与することができる普遍的な細胞があったとしても、各患者はその個人の適切な投与量について監視され、患者を監視するそのようなプラクティスは常套手段である。
【００９４】
別の態様では、少なくともHER2特異的CARを発現する細胞の治療的有効量を個体に投与することを含む、腫瘍細胞を有する個体を治療する方法が本明細書で提供される。関連する態様では、少なくともHER2特異的CARを発現する細胞の治療的有効量を個体に投与することを含む、腫瘍細胞を有する個体を治療する方法が提供される。特定の実施形態において、前記投与は、個体における腫瘍の成長の測定可能な減少をもたらす。別の特定の実施形態において、前記投与は、個体における腫瘍の大きさの測定可能な減少をもたらす。様々な実施形態において、腫瘍のサイズまたは成長速度は、例えば直接画像化（例えば、CTスキャン、MRI、PETスキャンなど）、蛍光イメージング、組織生検および/または関連する生理学的マーカーの評価（例えば、前立腺ガンのPSAレベル;絨毛ガンのHCGレベルなど）が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、個体は、不良な予後に相関する高レベルの抗原を有する。いくつかの実施形態では、個体には、外科手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、またはそれらの組み合わせなどの追加のガン療法が提供される。
【００９５】
特定の実施形態では、リンパ球除去療法を利用するが、いくつかの実施形態ではT細胞移植前にリンパ球除去療法を利用しない。リンパ球除去療法の例には、特定の化学療法、放射線、化学療法プラス放射線、またはモノクローナル抗体などの他の手段が含まれる。
【００９６】
本開示の方法の特定の実施形態では、個体を本開示の細胞に曝露した後の1つ以上のサイトカインの送達はないが、別の実施形態では、個体の注入後に1つ以上のサイトカインの送達がある。サイトカインの例には、IL2、IL7、IL12、およびIL15が含まれる。
【００９７】
特定の実施形態では、HER2-CAR T細胞および1つ以上のチェックポイント抗体（CTLA4、PD-1、PD-L1、TIM3またはLAG3に対する抗体など）を投与し、それによりT細胞の活性化およびインビボでの生存を延長を増加させることができる。
【００９８】
実施形態は、本明細書で定義される細胞、本明細書で定義されるCAR構築物、本明細書で定義される核酸配列、および/または本明細書で定義されるベクターを含むキットに関する。本開示のキットが、単独で、または治療または介入を必要とする個体に投与されるさらなる薬剤と組み合わせて、上記の本明細書に記載の医薬組成物を含むことも企図される。
【００９９】
VI. CARをコードするポリヌクレオチド
本開示はまた、本明細書で定義されるCARをコードする核酸配列およびその核酸配列を有する細胞を含む組成物を包含する。核酸分子は組換え核酸分子、特に局面であり、合成であってもよい。それは、DNA、RNAならびにPNA（ペプチド核酸）を含み得、そしてそれらはそのハイブリッドであり得る。
【０１００】
当業者には、本開示の組成物に含まれる核酸分子に、1つ以上の制御配列を付加することができることは明らかである。例えば、本開示のポリヌクレオチドの誘導された発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサーおよび/または配列を用いることができる。適切な誘導性系は、例えば、以下に記載されるようなテトラサイクリン調節遺伝子発現である。GossenおよびBujard（Proc。Natl。Acad。Sci。USA 89（1992）、5547-5551）およびGossenら（Trends Biotech。12（1994）、58-62）、またはデキサメタゾン誘導性遺伝子発現系、例えば、Crook（1989）EMBO J. 8、513-519に記載されている。
【０１０１】
さらに、さらなる目的のために、核酸分子が、例えば、チオエステル結合および/またはヌクレオチド類似体を含み得ることが想定される。修飾は、細胞内のエンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用であり得る。核酸分子は、細胞内で前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写され得る。この点において、そのようなポリヌクレオチドは、「遺伝子標的化」または「遺伝子治療」アプローチのために使用され得ることも理解されるべきである。別の実施形態において、核酸分子は標識される。核酸の検出のための方法は、当技術分野で周知であり、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、PCRまたはプライマー伸長である。この実施形態は、遺伝子治療アプローチの間に上記の核酸分子の導入が成功したことを確認するためのスクリーニング方法に有用であり得る。
【０１０２】
核酸分子は、上記の核酸分子のいずれかを単独でまたは組み合わせて含む組み換え産生されたキメラ核酸分子であってもよい。特定の態様において、核酸分子はベクターの一部である。
したがって、本開示は、本開示に記載の核酸分子を含むベクターを含む組成物にも関する。
【０１０３】
多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、その選択は所望の機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学において従来使用されている他のベクターを含む。当業者に周知の方法を用いて、様々なプラスミドおよびベクターを構築することができる。例えば、Sambrook et al. (1989) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)に記載の技術を参照されたい。あるいは、本開示のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに再構成することができる。DNAの個々の配列を単離するためにクローニングベクターを使用することができる。関連配列は、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクターに移入することができる。典型的なクローニングベクターには、pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322およびpGBT9が含まれる。典型的な発現ベクターには、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CATが含まれる。
【０１０４】
特定の実施形態では、本明細書で定義されるCAR構築物をコードする核酸配列に作動可能に連結された制御配列である核酸配列を含むベクターがある。このような制御配列（制御エレメント）は当業者に公知であり、ベクターに挿入物を導入するためのプロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳および挿入部位を含み得る。特定の実施形態では、核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結され、真核細胞または原核細胞での発現を可能にする。
【０１０５】
ベクターは、本明細書で定義されるCAR構築物をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。特定の態様では、ベクターは、レンチウイルスベクターのようなウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは市販されており、例えばClontech（Mountain View、CA）またはGeneCopoeia（Rockville、MD）を含む。
【０１０６】
「制御配列」という用語は、それらが連結されるコード配列の発現を行うのに必要なDNA配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核生物では、一般に、制御配列は、プロモーター、ターミネーター、場合によってはエンハンサー、トランス活性化因子または転写因子を含む。「制御配列」という用語は、少なくともその存在が発現に必要な全ての成分を含むことを意図しており、さらに有利な成分を含んでいてもよい。
【０１０７】
「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載された成分が意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されることは当業者にとって明らかである。
【０１０８】
したがって、特定の実施形態では、列挙されたベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換するために使用することができ、選択された宿主におけるコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたは組込みベクターであり得る。発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの核酸分子の転写を含む。原核生物および/または真核生物細胞における発現を確実にする制御成分は、当業者に周知である。真核生物細胞の場合、それらは通常、転写の開始を保証するプロモーター、および必要に応じて転写の終結および転写物の安定化を保証するポリAシグナルを含む。原核生物宿主細胞における発現を可能にする可能性のある制御エレメントは、例えば、大腸菌におけるPL、lac、trpまたはtacプロモーターを含み、真核生物宿主細胞における発現を可能にする制御エレメントの例は、酵母におけるAOX1またはGAL1プロモーター、CMV-、SV40-、RSV-プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサー、または哺乳動物および他の動物細胞中のグロビンイントロンである。
【０１０９】
転写の開始に関与するエレメントのほかに、このような調節エレメントはポリヌクレオチドの下流にSV40ポリA部位またはtkポリA部位などの転写終結シグナルも含み得る。さらに、使用される発現系に依存して、ポリペプチドを細胞区画に誘導するか、またはそれを培地に分泌することができるリーダー配列を、記載された核酸配列のコード配列に付加することができ、当該分野で周知である。リーダー配列は、翻訳、開始および終止配列、好ましくは、翻訳タンパク質またはその一部の分泌をペリプラズム空間または細胞外培地に指向させることができるリーダー配列と適切な段階で組み立てられる。所望により、異種配列は、所望の特性（例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製）を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる（上掲）。これに関連して、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen）、pEF-DHFRおよびpEF-ADA（Raumら、Cancer Immunol Immunother（2001）50（3）、141-150）またはpSPORT1（GIBCO BRL）などの適切な発現ベクターが知られている。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、発現制御配列は、トランスフェクトする真核生物宿主細胞を形質転換することができるベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主の制御配列も使用することができる。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、必要に応じて、本発明のポリペプチドの回収および精製が続いてもよい。
【０１１１】
さらなる制御エレメントは、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーを含み得る。有利には、本開示の上記のベクターは、選択可能なマーカーおよび/またはスコア可能なマーカーを含む。形質転換細胞の選択に有用な選択可能なマーカー遺伝子は、当業者に周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr (Reiss, Plant Physiol. (Life-Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149)；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシンに耐性を与えるnpt（Herrera-Estrella、EMBO J. 2（1983）、987-995）およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro（Marsh、Gene 32（1984）、481-485）の選択の基礎としての抗代謝拮抗剤耐性を含む。さらなる選択可能な遺伝子、すなわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB;細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisD(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047)、マンノースを細胞に利用させるマンノース-6-リン酸イソメラーゼ（WO 94/20627）およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を与えるODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue、1987; In Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）又はBlasticidin Sに対する耐性を付与するAspergillus terreus由来のデアミナーゼ(Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)が記載されている。
【０１１２】
有用なスコア可能なマーカーも当業者に知られており、市販されている。有利には、このマーカーは、ルシフェラーゼ (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121)、緑色蛍光タンパク質(Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47)またはβ-グルクロニダーゼ(Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907) をコードする遺伝子である。この実施形態は、列挙されたベクターを含む細胞、組織および生物体の単純かつ迅速なスクリーニングに特に有用である。
【０１１３】
上記のように、列挙された核酸分子は、単独で、またはコードされたポリペプチドを細胞内で発現させるためのベクターの一部として、細胞内で使用することができる。本明細書に記載のCAR構築物のいずれか1つをコードするDNA配列を含む核酸分子またはベクターは、目的のポリペプチドを産生する細胞に導入される。列挙された核酸分子およびベクターは、直接導入またはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した細胞への導入のために設計され得る。特定の実施形態では、細胞は、例えば、T細胞、CAR T細胞、NK細胞、NKT細胞、MSC、神経幹細胞、または造血幹細胞である。
【０１１４】
上記にしたがって、本開示は、本明細書において定義されるCARのポリペプチド配列をコードする核酸分子を含み遺伝子工学において従来から使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージを得る方法に関する。ある場合には、該ベクターは、発現ベクターおよび/または遺伝子導入またはターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、列挙したポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団に送達するために使用することができる。組換えベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。例えば、Sambrook et al. (loc cit.), Ausubel (1989, loc cit.)または他の標準的なテキストブックである。あるいは、列挙された核酸分子およびベクターを、標的細胞に送達するためにリポソームに再構成することができる。本開示の核酸分子を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して変化する周知の方法によって宿主細胞に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に一般的に利用されるが、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に使用され得る。上掲のSambrookを参照されたい。
【０１１５】
VII. ベクター一般
本開示は、特定の実施形態では、発現構築物を有するベクターであるか、または発現ベクターと呼ばれるCAR発現DNAポリヌクレオチドを保持するように操作された免疫細胞を包含する。本開示のベクターは、HER2特異的CARの組み込みにおいて独特であるが、ベクターのエレメントは、当技術分野において日常的に選択され得る。
【０１１６】
「ベクター」という用語は、それが複製され得る細胞への導入のために核酸配列が挿入され得る担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は、「外因性」であってもよく、ベクターが導入される細胞に対して外来であるか、またはその配列が細胞内の配列に相同であるが宿主細胞核酸内の配列が通常ある位置に見つからないことを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、YAC）が含まれる。当業者は、標準的な組換え技術（例えば、Maniatisら、1988およびAusubelら、1994、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）を介してベクターを構築するために十分に備え付けられるであろう。
【０１１７】
「発現ベクター」という用語は、転写され得るRNAをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。場合によっては、RNA分子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主細胞において作動可能に連結されたコード配列の転写および場合により翻訳に必要な核酸配列を意味する種々の「制御配列」を含むことができる。転写および翻訳を制御する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他の機能を果たし、以下に記載される核酸配列を含み得る。
【０１１８】
A. プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、開始および転写速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝的要素を含み、特定の転写を核酸配列に開始し得る。「作動可能に配置された」、「作動可能に連結された」、「制御下にある」、および「転写制御下」という用語は、プロモーターが核酸配列に関して正確な機能的位置および/または配向にあり、その配列の転写開始および/または発現を制御することを意味する。
【０１１９】
プロモーターは、一般に、RNA合成の開始部位を配置するように機能する配列を含む。これの最もよく知られた例はTATAボックスであるが、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターのように、開始点を覆う別個の要素サイト自体が開始の場所を修正するのに役立ちます。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流の領域30〜110bpに位置するが、多くのプロモーターが開始部位の下流に機能的エレメントを含むことも示されている。「プロモーターの制御下にある」コード配列をもたらすために、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、3 '）の転写リーディングフレームの転写開始部位の5'末端を配置する。「上流」プロモーターは、DNAの転写を刺激し、コードされたRNAの発現を促進する。
【０１２０】
プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、エレメントが互いに逆転または移動されるときにプロモーター機能が保存される。tkプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に50bp離れて増加することができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同的にまたは独立して機能することができるようである。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を意味する「エンハンサー」と併用してもしなくてもよい。
【０１２１】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび/またはエキソンの上流に位置する5 '非コード配列を単離することによって得られる場合、核酸配列に天然に関連するものであってもよい。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列と天然に関連するものであってもよい。あるいは、天然環境において核酸配列と通常は関連していないプロモーターを指す、組換えまたは異種プロモーターの制御下にコーディング核酸セグメントを配置することによって、特定の利点が得られる。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その自然環境において核酸配列と通常は関連しないエンハンサーをも指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、または他のウイルス、または原核もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在しない」プロモーターまたはエンハンサー（すなわち異なる転写制御領域の異なるエレメントおよび/または発現を変化させる突然変異を含むプロモーターまたはエンハンサー）を含む。例えば、組換えDNA構築において最も一般的に使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（trp）プロモーター系が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、本明細書中に開示される組成物に関連して、PCRTMを含む組換えクローニングおよび/または核酸増幅技術を用いて産生され得る（それぞれ米国特許第4,683,202号および第5,928,906号参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などのような非核細胞小器官内の配列の転写および/または発現を指示する制御配列も同様に使用することができると考えられる。
【０１２２】
当然のことながら、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、または生物中のDNAセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用を知っている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるSambrookら1989参照）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および/またはペプチドの大規模生産において有利であるように、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指示するための適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導可能および/または有用であり得る。プロモーターは、異種または内在性であり得る。
【０１２３】
さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組み合わせを用いて発現を駆動することもできる。T3、T7またはSP6細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現構築物のいずれかとして提供される場合、真核細胞は特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
【０１２４】
組織特異的プロモーターまたはエレメントの同一性、ならびにそれらの活性を特徴付けるアッセイは、当業者に周知である。
【０１２５】
コード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供する必要があり得る。当業者は、これを容易に決定し、必要な信号を提供することができるであろう。
【０１２６】
本発明の特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（IRES）エレメントの使用を用いて多遺伝子または多シストロン性のメッセージを作成し、これらを本発明で使用することができる。
【０１２７】
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニングサイト（MCS）を含むことができ、そのいずれもベクターを消化するために標準的な組換え技術と併用することができる。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、MCS内で切断して外来配列をベクターに連結することを可能にする制限酵素を用いてベクターを線状化または断片化する。「ライゲーション」とは、互いに連続していてもいなくてもよい2つの核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素およびライゲーション反応を含む技術は、組換え技術の当業者に周知である。
【０１２８】
スプライシング部位、終結シグナル、複製起点、および選択マーカーも使用することができる。
【０１２９】
B. プラスミドベクター
特定の実施形態において、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用が意図される。一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。非限定的な例において、大腸菌（E.coli）は、しばしば、大腸菌（E.coli）種に由来するプラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。また、pBRプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージは例えば、それ自身のタンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含むか、または含むように修飾されなければならない。
【０１３０】
さらに、宿主微生物と適合するレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ファージラムダGEM-11は、宿主細胞、例えば大腸菌LE392を形質転換するために使用することができる組換えファージベクターの作製に利用することができる。
【０１３１】
さらなる有用なプラスミドベクターには、pINベクター（Inouyeら、1985）;後の精製および分離または切断のためにグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）可溶性融合タンパク質を生成するために使用するための、pGEXベクターを含む。他の適切な融合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを有するものである。
【０１３２】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば大腸菌を、多数の適切な培地のいずれか、例えばLB中で増殖させる。特定のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当業者に理解されるように、例えばIPTGを培地に添加することによって、またはインキュベーションをより高い温度に切り替えることによって、宿主細胞を特定のプロモーターに特異的な物質と接触させることによって誘導することができる。さらなる期間、一般に2〜24時間の間、細菌を培養した後、遠心分離によって細胞を回収し、洗浄して残留培地を除去する。
【０１３３】
C. ウイルスベクター
受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に感染したり細胞に侵入したり、宿主細胞ゲノムに組み込まれてウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現させる特定ウイルスの能力のため、この特定ウイルスは、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移すための魅力的な候補である。本発明の構成要素は、本発明の1以上のCARをコードするウイルスベクターであり得る。本発明の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
【０１３４】
1. アデノウイルスベクター
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAへの組込みの能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる遺伝子導入の高効率によって相殺される。「アデノウィルス発現ベクター」は、（a）構築物のパッケージングを支持し、（b）最終的にその中にクローン化された組織または細胞特異的構築物を発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。36kbの線状二本鎖DNAウイルスである遺伝子構成やアデノウィルスについての知識は、アデノウィルスDNAの大部分を7 kbまでの外来配列で置換することを可能にする（Grunhaus and Horwitz、1992）。
【０１３５】
2. AAVベクトル
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを用いて細胞に導入することができる。増加したトランスフェクション効率は、アデノウイルス結合系を用いた細胞系において報告されている（Kelleher and Vos、1994; Cottenら、1992; Curiel、1994）。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、高頻度の組込みを有し、非分裂細胞に感染することができ、従って哺乳類細胞への遺伝子の送達(組織培養において（Muzyczka、1992）またはin vivoで有用であるので、本発明の細胞において使用するための魅力的なベクター系である。AAVは、感染性のための広い宿主範囲を有する（Tratschinら、1984; Laughlinら、1986; Lebkowskiら、1988; McLaughlinら、1988）。rAAVベクターの生成および使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号および第4,797,368号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３６】
3. レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来遺伝物質を移し、広範囲の種および細胞型を感染させ、特別な細胞株にパッケージングする能力（Miller、1992）のために送達ベクターとして有用である。
【０１３７】
レトロウイルスベクターを構築するために、あるウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに核酸（例えば、所望の配列をコードするもの）を挿入して、複製欠損ウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、gag、pol、およびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Mannら、1983）。cDNAを含む組換えプラスミドをレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともに特別な細胞系（例えばリン酸カルシウム沈殿法などにより）に導入すると、パッケージング配列により、組換えプラスミドのRNA転写産物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能になり、その後、培養培地に分泌される（Nicolas and Rubenstein、1988; Temin、1986; Mannら、1983）。次に、組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、任意に濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは広範囲の細胞型に感染することができる。しかしながら、組込みおよび安定発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。
【０１３８】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子gag、pol、およびenvに加えて、制御機能または構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である（例えば、Naldiniら、1996; Zuffereyら、1997; Blomerら、1997;米国特許第6,013,516号および第5,994,136号参照）。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：HIV-1、HIV-2およびシミアン免疫不全ウイルス：SIVが含まれる。レンチウイルスベクターは、HIV毒性遺伝子を多重に弱めることによって生成されており、例えば遺伝子env、vif、vpr、vpuおよびnefが欠失しており、ベクターを生物学的に安全にしている。
【０１３９】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボおよびエクスビボの遺伝子導入および核酸配列の発現の両方に使用することができる。例えば、適切な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわちgag、polおよびenvならびにrevおよびtatを有する2つ以上のベクターでトランスフェクトされた非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスは、米国特許第5,994,136号に記載されている。エンベロープタンパク質と抗体または特定の細胞型の受容体を標的とするための特定のリガンドとの結合によって、組換えウイルスを標的とすることができる。例えば、特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共に目的の配列（調節領域を含む）をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターは標的特異的である。
【０１４０】
4. 他のウイルスベクター
他のウイルスベクターは、本発明のワクチン構築物として使用することができる。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988; Baichwal and Sugden、1986; Couparら、1988）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを用いることができる。それらは、様々な哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989; Ridgeway、1988; Baichwal and Sugden、1986; Couparら、1988; Horwichら、1990）。
【０１４１】
D. 改変ウイルスを用いた送達
送達される核酸は、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容することができる。従って、ウイルス粒子は、標的細胞の同種受容体に特異的に結合し、その内容物を細胞に送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするために設計された新規アプローチは、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体による肝細胞の特異的感染を可能にすることができる。
【０１４２】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いた組換えレトロウイルスの標的化のための別のアプローチが設計されている。ストレプトアビジンを用いて抗体をビオチン成分を介してカップリングさせた（Rouxら、1989）。彼らは、主要組織適合抗原複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を用いて、インビトロでエコトロピックウイルスでこれらの表面抗原を産生する様々なヒト細胞の感染を証明した（Rouxら、1989）。
【０１４３】
E. ベクター送達および細胞形質転換
細胞のトランスフェクションまたは形質転換のための核酸送達のための適切な方法は、当業者に公知である。このような方法には、ex vivoトランスフェクションなどのDNAの直接送達、注射などが含まれるが、これに限定されない。当技術分野で公知の技術を適用することによって、細胞を安定的にまたは一時的に形質転換することができる。
【０１４４】
F. エクスビボ形質転換
エクスビボの環境で生物から取り出された真核細胞および組織をトランスフェクトするための方法は、当業者に公知である。したがって、本発明の核酸を用いて細胞または組織をエクスビボで除去およびトランスフェクションすることができると考えられる。特定の態様では、移植された細胞または組織は、生物に配置され得る。好ましい態様において、核酸は移植された細胞内で発現される。
【０１４５】
VIII. 併用療法
本発明の特定の実施形態において、臨床的側面のための本発明の方法は、抗ガン剤などの過剰増殖性疾患の治療に有効な他の薬剤と組み合わせられる。「抗ガン剤」は、例えば、ガン細胞を死滅させること、ガン細胞においてアポトーシスを誘導すること、ガン細胞の増殖速度を低下させること、転移の発生率または数を減少させること、腫瘍サイズを減少させることなどによって、ガン細胞または腫瘍に対する免疫応答の促進、ガンの進行の予防または抑制、またはガンを有する被験体の寿命の延長を含む、ガンの進行を予防または阻害する方法を提供する。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞の死滅または増殖を阻害するのに有効な組合せ量で提供される。このプロセスは、ガン細胞を発現構築物および薬剤または複数の因子と同時に接触させることを含み得る。これは、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞を接触させることによって、または一方の組成物が発現構築物を含み、他方が第2の組成物を含む2つの異なる組成物または製剤と細胞を接触させることによって達成され得る。
【０１４６】
化学療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学における主要な問題である。現在のガン研究の1つの目標は、化学療法および放射線療法の効果を遺伝子治療と組み合わせて改善する方法を見つけることである。例えば、ヘルペスシンプレックス - チミジンキナーゼ（HS-tK）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達されると、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を首尾よく誘発した（Culverら、1992）。本発明の文脈では、他のアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤に加えて、化学療法剤、放射線治療剤または免疫療法剤の介入と同様に細胞治療剤を同様に使用することができると考えられる。
【０１４７】
あるいは、本発明の療法は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤治療に先行しても後に行ってもよい。他の薬剤および本発明が個体に別々に適用される実施形態では、薬剤および本発明の治療法が依然として細胞に有利な組み合わせ効果を発揮できるように、各送達の時間の間に有意な期間が満了しないことが一般的に保証される。そのような場合、互いに約12〜24時間以内に、より好ましくはお互いに約6〜12時間以内に両方の様式で細胞と接触し得ることが企図される。いくつかの状況では、治療の期間を大幅に延ばすことが望ましいかもしれないが、個々の投与の間に複数の日数（2、3、4、5、6または7）から複数の週間（1、2、3、4、5、6、7または8）経過している。
【０１４８】
本開示の細胞が「A」であり、放射線療法、免疫療法、または化学療法などの第二の薬剤が「B」であるような様々な組み合わせを使用することができる。
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
【０１４９】
治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが期待される。また、本発明の細胞療法と組み合わせて、様々な標準的な療法および外科的な介入を適用することも考えられる。
【０１５０】
A. 化学療法
ガン治療には、化学療法と放射線療法の両方の併用療法も含まれる。併用抗ガン剤には、例えば、以下のものが含まれる：
アシビシン; アクラルビシン; 塩酸アコダゾール; アクロニン; アドゼルジン; アルデスロイキン; アルテラミン; アンボマイシン; アメタントロンアセテート; アムサクリン; アナストロゾール; アントラマイシン; アスパラギナーゼ; アスペリン; アザシチジン; アゼテパ; アゾトマイシン;バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチメール、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシラート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシラート、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ダウゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォスチン、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、ランレオチドアセテート、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾー、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲステロール、酢酸メレンゲステロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトジリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル、ミトーテン、塩酸マイトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルフォスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、ピリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトレゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、テコガランナトリウム、タキソテール、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテプルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン、20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD 3; 5-エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ALL-TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アムバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、脈管形成阻害剤、アンタゴニストD、アンタゴニストG、アントレリックス、抗背方化形態形成タンパク-1、抗アンドロゲン剤（前立腺ガン)、抗エストロゲン剤、アンチネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチデ、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子調節剤、アポトーシス制御剤、アプリン酸、アラ-CDP-DL-PTBA、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスチン1、アキシナスチン2、アキシナスチン3、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バカチンIII誘導体、バラノール、バチマスタット、BCR/ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン類、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、β-アレチン、ベタクラマイシンB、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンA、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルフォスチンC、カンプトテシン誘導体、カペシタビン、カルボキサミド-アミノ-トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN 700、軟骨誘導阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)、カスタノスペルミン、セクロピンB、セトロレリックス、クロルリン類、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス-ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンA、コリスマイシンB、コンブレタスタチンA4、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クラムベスシジン816、クリスナトール、クリプトフィシン8、クリプトフィシンA誘導体、クラシンA、シクロペンタンスラキノン類、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクフォスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンB、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシフォスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ジデムニンB、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ-5-アザシチジン、ジヒドロタキソール,9-、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフール、エピルビシン、エプリステライド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エクセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルビシン、フォルフェニメックス、フォルメスタン、フォストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモフォシン、イロマスタット、イマチニブ（例えば、グリベック（登録商標））、イミキモド、免疫活性化剤ペプチド、インスリン様成長因子-1受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン類、インターロイキン類、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール, 4-、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンB、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドF、ラメラリン-Nトリアセタート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、線状ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド7、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶菌ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンA、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、MIF阻害剤、ミフェプリストーン、ミルテフォシン、ミリモスチム、マイトグアゾン、マイトラクトール、マイトマイシン類似体、マイトナファイド、マイトトキシン線維芽細胞成長因子-サポリン、マイトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、アービタックス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質A+ミオバクテリウム細胞壁sk、モピダモール、マスタード抗ガン剤、マイカペロキシドB、マイコバクテリウム細胞壁抽出物、ミリアポロン、N-アセチルジナリン、N-置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチプ、ナロキソン+ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調整剤、ニトロキシド酸化防止剤、ニトルリン、オブリメルセン（ゲナセンス（登録商標））、O6-ベンジルグ���ニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導物質、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、パガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリスルフェートナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルフォスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニルアセタート、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンA、プラセチンB、プラスミノーゲン活性化物質阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金-トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス-アクリドン、プロスタグランジンJ2、プロテアソーム阻害剤、プロテインA免疫調整剤、タンパク質キナーゼC阻害剤、タンパク質キナーゼC阻害剤(微細藻類)、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン抱合体、rafアンタゴニスト、ラルチトレキシド、ラモステトロン、Rasガン遺伝子ファルネシルタンパクトランスフェラーゼ阻害剤、Rasガン遺伝子阻害剤、Rasガン遺伝子-GAP阻害剤、脱メチル化レテリピチン、エチドロン酸レニウムRe 186、リゾキシン、リボザイム、RIIレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビジノンB1、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、Sdi 1模倣体、セムスチン、老齢誘導阻害剤1、センスオリゴヌクレオチド、細胞情報伝達阻害剤、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォシン酸、スピカマイシンD、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン1、スクアラミン、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワ
インソニン、タリムスチン; タモキシフェンメチオジド; タウロムスチン; タザロテン; テコガランナトリウム; テガフール; テルラピリリウム; テロメラーゼ阻害剤; テモポリン; テニポシド; テトラクロロデカオキシド; テトラゾミン; タリブラスチン; チオコラリン; トロンボポエチン; トロンボポエチン模倣物; チマルファシン; チモポエチン受容体アゴニスト; チモトリナン; 甲状腺刺激ホルモン; スズエチルエチオプルプリン; チラパザミン; チタノセン二塩化物; トップセンチン; トレミフェン; 翻訳阻害剤; トレチノイン;トリアセチルウリジン; トリシリビン; トリメトレキセート; トリプトレリン; トロピセトロン; ツロステリド; チロシンキナーゼ阻害剤; チルホスチン; UBC阻害剤; ウベニメクス; 泌尿生殖洞由来増殖抑制因子; ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト; バプレオチド; バリオリンB; ベラレゾール; ベラミン; ベルジン類; ベルテポルフィン; ビノレルビン; ビンカルチン; ビタキシン; ボロゾール; ザノテロン; ゼニプラチン; ジラスコルブ; ジノスタチンスチマラマー、または上記の類似体もしくは誘導変異体、ならびにそれらの組み合わせ。
【０１５１】
特定の実施形態では、個体のための化学療法は、本発明の投与前、投与中および/または投与後に本発明と併用される。
【０１５２】
B. 放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広く使用されている他の要因には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達として一般に知られているものが含まれる。マイクロ波およびUV照射のようなDNA損傷因子の他の形態も考えられる。これらの要因のすべてが、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、および染色体のアセンブリおよび維持に広範な損傷を与える可能性が最も高い。X線の線量範囲は、1日線量が長期間（3から4週間）の場合50から200レントゲンの範囲であり、2000から6000レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位元素の投与量範囲は広く変化し、同位体の半減期、放出される放射線の強さおよびタイプ、腫瘍細胞による取り込みに依存する。
【０１５３】
細胞に適用された場合、用語「接触した」および「曝露された」は、本明細書では、治療構築物および化学療法剤または放射線治療剤が標的細胞に送達されるかまたは標的細胞に直接的に並置されるプロセスを記載するために使用される。細胞死滅または停止を達成するために、両方の薬剤は、細胞を殺すかまたは細胞が分裂するのを防ぐのに有効な合計量で細胞に送達される。
【０１５４】
C. 免疫療法
免疫治療薬は、一般に、ガン細胞を標的とし破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独は、治療のエフェクターとして働くことができ、または実際に細胞死をもたらすために他の細胞を補充することができる。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ、単にターゲティング剤として役立ち得る。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１５５】
したがって、本明細書に記載の本発明の療法以外の免疫療法は、本細胞治療と併せて併用療法の一部として使用することができる。併用療法の一般的なアプローチについては以下で説明する。一般に、腫瘍細胞は、標的化を受けやすい、すなわち他の細胞の大部分には存在しないいくつかのマーカーを保有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが本発明の文脈における標的化に適している可能性がある。
【０１５６】
特定の実施形態において、免疫療法は、HER2に対する抗体、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）として市販されている）、800E6、F5cys、またはペルツズマブなどの抗体である。
【０１５７】
D. 遺伝子
さらに別の実施形態では、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドを本発明の臨床的実施形態の前、後、または同時に投与する遺伝子治療である。細胞増殖のインデューサ、細胞増殖のインヒビター、またはプログラムされた細胞死のレギュレーターを含む、様々な発現産物が本発明に包含される。
【０１５８】
E. 手術
ガンを有する人の約60％は、予防的、診断的または病期診断的、治癒的および緩和的手術を含む何らかのタイプの手術を受ける。治癒手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および/または代替療法などの他の療法と併用することができるガン治療である。
【０１５９】
治癒手術は、ガン組織の全部または一部を物理的に除去、切除および/または破壊する切除を含む。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍切除の他に、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気外科、および顕微鏡下手術（モース手術）が含まれる。本発明は、表在性ガン、前ガン細胞、または付随する量の正常組織の除去と併せて使用することができるとさらに考えられる。
【０１６０】
ガン性細胞、組織、または腫瘍のすべての一部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。治療は、灌流、直接注射、または追加の抗ガン療法を用いたその領域の局所適用によって達成され得る。このような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6または7日ごと、または1、2、3、4および5週間ごとに、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ヶ月ごとに繰り返すことができる。これらの治療は、様々な投薬量であってもよい。
【０１６１】
F. その他の薬剤
治療の治療効果を改善するために、他の薬剤を本発明と組み合わせて使用することができると考えられる。これらのさらなる薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびGAP接合のアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、または過剰増殖性細胞のアポトーシス誘導剤に対する感受性を高める薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子;インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ;IL-2および他のサイトカイン;F42Kおよび他のサイトカイン類似体;またはMIP-1、MIP-1ベータ、MCP-1、RANTES、および他のケモカインを含む。Fas/Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAILなどの細胞表面受容体またはそれらのリガンドのアップレギュレーションは、過剰増殖性細胞に対するオートクリンまたはパラクリン効果の確立によって本発明のアポトーシス誘発能力を増強するとさらに考えられる。GAP接合部の数を増加させることによって細胞内シグナル伝達を増加させると、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増大する。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤を本発明と組み合わせて使用して、治療の抗増殖性効力を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善することが意図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。抗体c225などの過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる他の薬剤を本発明と組み合わせて使用して、治療効力を改善することができるとさらに考えられる。
【実施例】
【０１６２】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように発明者によって見出された技術を表し、従って、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることは、当業者には理解されるべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更がなされ得、同様のまたは類似の結果が得られることを認識すべきである。
【０１６３】
実施例１
自家HER2 CMVの第I相臨床試験
神経膠芽腫の養子免疫療法のための二重特異性キメラ抗原受容体T細胞
【０１６４】
神経膠芽腫（GBM）患者の転帰は依然として貧弱である。T細胞療法は、従来の療法の細胞傷害性機序に頼らないので、GBM患者の転帰を改善するという約束を保持する。前臨床試験では、HER2およびCMV由来タンパク質pp65（CMVpp65）がGBMのT細胞治療標的であることが示されている。これらの知見に基づいて、CD28.ζシグナル伝達ドメイン（HER2-CAR.CMV-T細胞）を有するHER2特異的キメラ抗原受容体（CAR）を発現するCMVpp65特異的T細胞を用いて第I/II相臨床試験（NCT01109095）を開発した。再発性/難治性HER2+ GBM患者における自家HER2-CAR.CMV-T細胞の漸増用量(1x106/m2 〜1x108/m2）の安全性、持続性、および抗GBM効果を決定するための第I / II相臨床試験を開発した。11〜70歳（49歳中央値）のHER2陽性GBMを有する16人のCMV血清陽性患者が登録された。HER2-CAR.CMV-T細胞は全ての患者から首尾よく生成された。HER2-CAR発現Ｔ細胞を含むT細胞産物は、FACS分析によって判断され（中央値67％（範囲46-82）％）、pp65CMV特異的T細胞はIFN-γElispotアッセイ（中間値985.5（範囲：390から1292）SFC/105T細胞）によって判断された。1x106/m2、3x106/m2、1x107/m2、3x107/m2または1x108/m2のHER2-CAR.CMV-T細胞の注入は、全身的な副作用なしに十分に忍容され、用量規定毒性は観察されなかった。HER2-CAR.CMV-T細胞は、リアルタイムPCRによって判断したところ注入後10週まで検出された。評価可能な15人の患者のうち10人が進行性疾患を有し、1人が部分応答を示して8ヶ月間にわたり腫瘍体積が〜62％減少し、1人の患者は安定疾患を有し4ヶ月間持続し、3人の患者は安定疾患を有し、T細胞注入後16〜>22月の追跡期間で現在生存している。GBM患者における自家HER2.CMV-T細胞の安全性および有効性についてのこの最初の評価は、細胞が明らかな毒性なしに10週間持続できることを示している。HER2-CAR.CMV-T細胞を他の免疫調節アプローチと組み合わせて、それらの増殖および抗GBM活性を増強する研究のためのステージを設定する患者の33％において、臨床的利益が観察された。
【０１６５】
実施例２
HER2陽性肉腫の免疫療法のためのHER2特異的キメラ抗原受容体で修飾されたｓT細胞
本実施例は、肉腫についてのＨＥＲ２特異的ＣＡＴ  Ｔ細胞の使用に関する。
患者の特徴
HER2-CAR T細胞を受けた19人の典型的な患者の臨床的および疾患特異的特徴を表１に要約する。
【表１】
2018510652.tif 000003
2018510652.tif 000004
【０１６６】
T細胞注入時の平均年齢は17歳（範囲：7.7〜29.6）であった。骨肉腫は16例、ユーイング肉腫は１例、原始神経外胚葉性腫瘍（PNET）は1例、線維形成性小円形細胞腫瘍（DSRCT）は1例であった。HER2陽性は免疫組織化学によって確認された（表2）。すべての患者は、T細胞注入時に難治性/再発性の転移性疾患を有し、1つ以上の従来の化学療法レジメンに失敗していた。T細胞注入前に、19例中17例が転移巣切除術（中央値4;範囲1〜6）、19例中１１例が放射線療法を経験しており、19例中18例が1以上のサルベージレジメンを受けていた（中央値3、範囲1〜5）。すべての登録患者は、≧60のパフォーマンスステータス（Karnofsky/Lanskyスケール）および正常な左室駆出率（LVEF）を有していた。
【０１６７】
HER2-CAR T細胞の作製と特徴付け
HER2-CAR T細胞は、全ての患者に対して首尾よく生成された。臨床使用のための細胞産物を製造するためのメジアン時間は13.5日（範囲：10〜21）であった。形質導入された細胞の97.8％が、CD3+（平均99.2％、範囲97.8-99.6％）、CD3+/CD8+（平均：62.7％、範囲：37.8-80.1％）およびCD3+/CD4+（平均：31.5％、範囲：17.2-55.3％）の両方のサブセットがすべての産物に存在した（図5A）。CAR T細胞産物は、ナイーブ(CD3+/CD45RA+、平均22.6%、範囲6.0-37.2%)、エフェクターメモリー(CD3+/CD45RO+/CCR7-/CD62L-、平均32.2%、範囲7.7-57.9%)、及びセントラルメモリーT細胞(CD3+/CD45RO+/CD62L+、平均45.8%、範囲17.9-88.0%)を含む。T細胞の中央値65.2％（範囲：36.2-88％）は、FACS分析（図5B）によって判断した場合、HER2-CAR発現について陽性であった。標準的な51クロム（Cr）放出細胞毒性アッセイでは、HER2陽性（NCI-H1299、LM7）標的細胞に対して有意な細胞傷害活性を有したが、非形質導入（NT）-T細胞は有しなかった（p<0.0001、図5C）。HER2陰性（K562、MDA-MB468）標的細胞をHER2-CARおよびNT-T細胞と共に培養した場合、バックグラウンド死滅のみが存在した。
【０１６８】
HER2-CAR T細胞の投与および安全性
患者は、1x104/m2から1x108/m2のHER2-CAR T細胞を8つの用量レベルで受容した。13人の患者が1回の注入、4人の患者2回の注入、1人の患者が4回の注入、および1人の患者が9回の注入を受けた。最高用量レベルでT細胞注入後12時間以内に発熱しイブプロフェンで治療した1人の患者（P16）を除いて、T細胞注入に関連した有害事象を有する患者はいなかった。
【０１６９】
血漿サイトカイン（GM-CSF、IFNγ、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL10、IL12p70、IL13およびTNFα）の濃度を、投与3時間後および再度1、2、4および6週間後の複数回の分析で決定した（図1、図6）。投与後早ければ１週間でIL8の血漿中濃度が有意に増加し（p<0.05）、これは4週間まで持続した。他のサイトカインには有意な変化は観察されなかった。注入から6週間後、反復心機能試験により、LVEFがベースラインから変化していないことが示された。
【０１７０】
【表２】
2018510652.tif 000005
【０１７１】
血漿サイトカイン（GM-CSF、IFNγ、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL10、IL12p70、IL13およびTNFα）の濃度を、投与3時間後および再度1、2、4および6週間後の複数回の分析で決定した（図1、図6）。投与後早ければ１週間でIL8の血漿中濃度が有意に増加し（p<0.05）、これは4週間まで持続した。他のサイトカインには有意な変化は観察されなかった。注入から6週間後、反復心機能試験により、LVEFがベースラインから変化していないことが示された。
【０１７２】
HER2-CAR T細胞のインビボ検出および持続性
【０１７３】
HER2-CAR T細胞は、PBMCのqPCR分析によってインビボで検出された。用量レベル3（1×105/m2）以上から、HER2-CAR T細胞が14/16人の患者の末梢血で検出され（中央値：DNA1μgあたり6.5コピー、範囲0-944）（図2A〜C）、コピー数は注入されたＴ細胞用量と相関していた（図2D）。1x106/m2より多くのHER2-CAR T細胞を受けた9人の評価可能な患者のうち7人において、注入後３時間の時点でHER2-CAR T細胞の頻度は急速に低下したが、注入後6週間で低レベルのシグナルが検出された(≦1x106/m2 対＞1x106/m2: p=0.002) (図2E)。T細胞は、３ヶ月で評価可能な被験者１３人中4人で、6ヶ月で7人中3人で、9ヶ月で2人中１人で、12ヶ月で5人中0人で、18ヶ月で2人中1人で、および24ヶ月で1人中0人で検出できた（図2F）。HER2-CAR T細胞は、注入後、末梢血中にHER2-CAR T細胞が広がることが認められなかったため、これらの細胞は長期間持続する可能性がある。５人の患者はHER2-CAR T細胞を少なくとも２回投与され、両方注入後HER2-CAR T細胞持続性の類似パターンが見られた（図7）。
【０１７４】
腫瘍部位へのHER2-CAR T細胞の往来
5人の患者は、HER2-CAR T細胞注入の9〜15週間後に腫瘍を除去した。2/5人の患者（P10、軟部組織転移; P18、転移病変左大腿骨）について、我々はホルマリン固定スライドおよび新鮮な凍結組織を受けとった。HER2-CAR T細胞からのqPCRシグナルが切除された腫瘍と同時に得られた末梢血で検出されなかったにもかかわらず（図3B）、両方の腫瘍において、CD3陽性T細胞は免疫組織化学では存在しており（図3A）、HER2-CAR T細胞はqPCR分析では存在していた（図3B）ので、HER2-CAR T細胞が腫瘍部位に優先的に居住するか、持続または拡大することが示された。T細胞は、CD3特異的抗体を使用することによって他の3つの腫瘍サンプル内で検出されたが、qPCR分析用には十分な材料がなかった。
【０１７５】
HER2-CAR T細胞注入後の臨床応答
臨床応答は、本明細書の他の箇所に詳述されているように、T細胞注入前後のイメージングによって測定した。これらのデータを表３に要約する。
【０１７６】
【表３】
2018510652.tif 000006
【０１７７】
評価可能な患者17人のうち、4人は12週間〜14ヶ月間、安定疾患を有していた。進行疾患の患者の1人（P4）は、転移性リンパ節疾患のためのT細胞の2回目の投与とその後の化学療法を受けた。この2回目の注入後、彼は9ヶ月間持続した部分応答を示した（図4C）。安定疾患の3人の患者（P11、P14、P18）は、追加の治療を受けず、残りの腫瘍を除去した。P14からのサンプルは≧90％の壊死を示し、注入されたHER2-CAR T細胞の抗腫瘍活性を示した（図4B）。これら3人の患者のすべては、6、12および16カ月後にさらなる治療を行わずに寛解状態を維持する。中央値10.1ヶ月（範囲：1.1〜37ヶ月）の追跡期間では、全生存期間（OS）は中央値10.3ヶ月（範囲：5.1〜29.1ヶ月）であった（図4A）。
【０１７８】
例示的な材料及び方法
被験者
【０１７９】
この研究（NCT00902044）は、Baylor College of Medicineの施設内倫理委員会とFDA（Food and Drug Administration）によって承認された。患者は、外科的切除によって治療できず、少なくとも1つの以前の全身療法を受けた後に進行疾患と診断された、難治性または転移性のHER2陽性骨肉腫（後に肉腫に変更された）が試験の対象となった。HER2陽性は免疫組織化学によって決定した。患者は治験開始の少なくとも4週間前に実験的または細胞毒性の療法を完了（または回復）していなければならなかった。異常な左心室機能（LVEF）を有する患者は除外された。さらに、血清ビリルビンが正常値上限>3x、ALTまたはASTが正常値上限>5x、Hgb<9g/dl、WBC<2,000/μl、ANC<1,000/μl、血小板<100,000/μ1の患者は、<50のKarnofsky/Lanskyスコアまたはヒト免疫不全ウイルスの血清学的陽性を有する患者と同様に除外された。
【０１８０】
研究の説明
すべての患者は、T細胞注入の前に全体的な疾患負担を評価するために、コンピュータ断層撮影法（CT）、磁気共鳴画像法（MRI）、および/または陽電子放出断層撮影法（PET）による画像化を行った。患者は、HER2-CAR T細胞の漸増用量（１Ｘ１０4-１Ｘ１０8/ｍ2）を、８つの用量レベル（ＤＬ）で受けた；ＤＬ１：１Ｘ１０4/ｍ2、ＤＬ２：３Ｘ１０4/ｍ2、ＤＬ３：１Ｘ１０5/ｍ2、ＤＬ４：１Ｘ１０6/ｍ2、ＤＬ５：３Ｘ１０6/ｍ2、ＤＬ６：１Ｘ１０7/ｍ2、ＤＬ７：３Ｘ１０7/ｍ2、ＤＬ８：１Ｘ１０8/ｍ2。末梢血サンプルは、毒性およびT細胞持続性および増殖（expansion）を評価するためにT細胞注入前及び注入後の所定の時点で得られた。HER2-CAR T細胞に対する臨床応答を、T細胞注入の6週間後のX線撮影画像によって評価した。患者は、完全応答、部分応答、または安定疾患と定義される臨床的利益を有する場合、追加のT細胞注入を受ける資格があった。すべての患者は、2010年6月から2013年3月の間に注入を受けた。フォローアップは2013年9月1日まで続けられた。
【０１８１】
HER2-CAR T細胞の生成および形質導入
【０１８２】
HER2-CAR T細胞は、現在のGood Manufacturing Practice（cGMP）ガイドラインに従って生成された。簡単に述べると、末梢血単核細胞（PBMC）を固定化CD3抗体（Ortho Biotech）または固定化CD3およびCD28抗体（P6、12、13、16、17、18; Miltenyi）及び組換えIL2（100U/ ml; Proleukin、Chiron)で活性化し、次いで、レトロネクチン（FN CH-296; Takara）でプレコートした24ウェルプレートにおいて、HER2.CD28ζ-CARをコードするレトロウイルス粒子で3日目に形質導入した。形質導入後、毎週2回添加するIL2（50-100U/ ml）の存在下でT細胞株を、指定された細胞用量に達するまで増殖させた。増殖後、HER2-CAR T細胞を、凍結保存時に無菌性、HLA同一性、免疫表現型およびHER2特異性について試験した。特異性は、4時間の51Cr放出細胞毒性アッセイにおいて試験した。
【０１８３】
臨床応答基準
T細胞注入に対する臨床的応答は、CT、MRI、および/またはPETイメージングによって同定された疾患を、注入前のイメージと注入後6週間または臨床的に示されたイメージと比較することによって評価した。研究参加者には、残存塊の再生検診は必須ではなかった。全ての反応はRECISTを用いて決定した。
【０１８４】
統計分析
第Ｉ／ＩＩ相試験では、最大耐性量を決定するために修正された連続再評価法（mCRM）を利用した。3人の患者が用量レベル1に、2人の患者が用量レベル2〜7に、4人の患者が用量レベル8に登録された。トランスジーン発現および多重分析は記述統計を用いて時間についてまとめられた。グループ間の有意性は、t検定またはフィッシャーの正確確立検定を用いて決定した。0.05未満のp値は統計的に有意であると考えられた。生存曲線はカプランマイヤー法を用いて構築した。
【０１８５】
HER2免疫組織化学
HER2は、以前に記載されているように、ホスホ-HER2免疫組織化学によって検出された。HER2染色は、％陽性細胞（グレード1（1-25％）、グレード2（26-50％）、グレード3（51-75％）、グレード4（76-100％））および強度（0、+、++、+++）について独立した病理学者によってスコア付けされた。患者がHER2陽性とみなされるためには、腫瘍は1％〜25％の陽性細胞（グレード1）および強度スコア「+」を有していなければならなかった。
【０１８６】
レトロウイルス構築物の作製
HER2-CARの生成は以前に記載されている。簡潔には、HER2特異的マウスscFv FRP5を、短いヒンジ、CD28膜貫通ドメイン、およびCD28ζシグナル伝達ドメインを含むSFGレトロウイルスベクターにクローニングした。以前に記載されているように、PG13細胞（gibbon ape白血病ウイルスシュードタイピングパッケージング細胞株; CRL-10686、ATCC）を用いて、臨床グレードのパッケージング細胞株を作製した。最も高い力価のクローンを用いて、マスター細胞バンクを確立し、ウイルスの臨床バッチを作製するために使用した。
【０１８７】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析には、FACSCalibur機器（Becton Dickinson、San Jose、CA）およびCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を用いた。モノクローナル抗体（MAbs）はBecton Dickinsonから得られ、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD16、抗CD19、抗CD56、抗CD62L、抗CCR7、抗TCRα/βおよび抗TCRy/δ抗体を含んでいた。マウスscFV特異的MAb（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いてHER2-CAR発現を検出した。陰性対照にはアイソタイプ抗体が含まれていた。
【０１８８】
多重分析
13-プレックスヒトサイトカイン/ケモカインビーズアレイアッセイキット（Millipore）を用いて測定した。GM-CSF、IFNγ、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL10、IL12p70、IL13およびTNFαを含む。各希釈されていない血漿サンプルを、製造業者によって提供されたプロトコールに従って２回重複でアッセイした。
【０１８９】
リアルタイムPCRアッセイ
HER2-CAR T細胞を検出するために、FRP5特異的プライマーおよびTaqManプローブ（Applied Biosystems）を用いた。DNAをQIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）で抽出し、qPCRをABI RPISM 7900HT Detection System（Applied Biosystems）を使用して３回重複で実施した。ベースライン範囲はサイクル6〜15で設定され、閾値はベースライン蛍光より10SDより上であった。DNA標準を生成するために、我々は、各特定のカセットをコードするDNAプラスミドの連続希釈を確立した。
【０１９０】
実施例３
進行性神経膠芽腫のためのHER2キメラ抗原受容体で修飾されたCMV特異的T細胞：第I相用量漸増試験
【０１９１】
本実施例は、神経膠芽腫治療のためのHER2特異的CARに関する実施例1の主題を拡張する。
【０１９２】
本実施例は、CD28.ζエンドドメインを有する第2世代のHER2-CARおよび肉腫患者で明らかな毒性を示さないがＴ細胞の持続性は限定的であった（文献１９）1×108/m2までのHER2-CAR T細胞の初期安全性評価を記載する。特定の実施形態では、ヒトヘルペスウイルスに特異的なT細胞を含む、規定された抗原特異性を有するT細胞におけるCARの発現に依存することにより、養子移入されたT細胞の増殖および持続性を増加させることができる。これらの細胞は、それらのCARを介して抗腫瘍活性を提供するだけでなく、プロフェッショナルな抗原提示細胞によって提示されるヒトヘルペスウイルス潜在抗原による天然のT細胞受容体（αβTCR）関与の後に適切な共刺激を受ける（文献11）。ヒトヘルペスウイルス5（サイトメガロウイルス、CMV）は潜伏感染白血球およびGBMのサブセットの両方に存在するので(文献20〜23)、CD28.ζシグナル伝達ドメインを有するHER2-CARを発現するように遺伝子改変されたCMV抗原pp65に特異的な自家T細胞（HER2/CMV T細胞）の第Ｉ相用量漸増研究が開発された。この実施例は、再発性/進行性GBM患者に注入された細胞の安全性、持続性および抗腫瘍活性を示す。
【０１９３】
初めに
神経膠芽腫（GBM）は最も攻撃的な原発性脳腫瘍である（文献1、2）。最大限の外科的切除と術後補助化学療法とを組み合わせたマルチモード療法にもかかわらず、5年間の全生存率（OS）は悪いままである（大人＜４％、子供〜16％）（文献1、2）。腫瘍標的免疫療法は、GBM細胞が耐性を有する従来の療法の細胞傷害性機序に依存しないため、転帰を改善する可能性がある。実際、GBM患者におけるペプチド、腫瘍細胞、または樹状細胞（DC）ワクチンによる初期段階臨床試験の結果は有望であり、臨床的利益を実証している（文献3-5）。
【０１９４】
免疫療法の他の形態の中でも、キメラ抗原受容体（CAR）（文献6）で修飾されたT細胞の養子移入は、CD19陽性血液学的悪性腫瘍の治療に関する臨床研究において有意な抗腫瘍活性を示している（文献7-9）。しかし、固形腫瘍および脳腫瘍の臨床経験は限られている（文献10〜13）。CARはガン細胞の細胞表面に発現する抗原を認識し、GBMに対するCAR T細胞療法では、IL13Roc2、EphA2、EGFRvIII、およびHER2を含むいくつかの抗原が、前臨床モデルにおいて活発に研究されている(文献14-17)。例えば、HER2-CAR T細胞は、「バルク」神経膠腫細胞およびグリオマイニング細胞の両方を殺し、前臨床的GBM異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有する（文献14）。
【０１９５】
本発明者らは、CD28.ζエンドドメインを有する第2世代のHER2-CARを開発し、肉腫患者の1×108/m2までのHER2-CAR T細胞の初期安全性評価で明らかな毒性は示されなかった。しかし、T細胞の持続性は限られていた（文献19）。養子移入されたT細胞の増殖および持続を増加させる1つの戦略は、例えば、ヒトヘルペスウイルスに特異的なT細胞を含む、規定された抗原特異性を有するT細胞におけるCARの発現に依存する（文献11）。これらの細胞は、CARを介して抗腫瘍活性を提供するだけでなく、プロフェッショナルな抗原提示細胞によって提示されるヒトヘルペスウイルス潜在抗原によるネイティブT細胞受容体（αβTCR）関与の後に適切な共刺激を受ける（文献11）。
【０１９６】
ヒトヘルペスウイルス（サイトメガロウイルス、CMV）は潜伏感染白血球およびGBMのサブセットの両方に存在するので（文献20-23）、CD28.ζシグナル伝達ドメインを有するHER2-CARを発現するように遺伝子改変されたCMV抗原pp65に特異的な自家T細胞（HER2/CMV T細胞）の第Ｉ相用量漸増研究が開発された。この実施例は、再発性/進行性GBM患者に注入された細胞の安全性、持続性および抗腫瘍活性を示す。ヒトヘルペスウイルス（サイトメガロウイルス、CMV）は潜伏感染白血球およびGBMのサブセットの両方に存在するので（文献20-23）、遺伝的に存在するCMV抗原pp65に特異的な自己T細胞の第1相用量漸増試験が開発されたCD28.c.シグナル伝達ドメイン（HER2/CMV T細胞）でHER2-CARを発現するように改変された。この例は、再発性/進行性GBM患者における注入細胞の安全性、持続性および抗腫瘍活性を実証するものである。
【０１９７】
方法
研究設計と参加者
このオープンラベル第I相臨床試験は、Baylor College of Medicineの施設内倫理委員会および米国食品医薬品局に承認された(臨床試験政府番号: NCT01109095)。研究に登録する前に患者または保護者から文書による同意が得られた。この試験は、最大耐性量（MTD）を決定するために、用量レベル当たり3人の患者のコホートサイズを有する修正された連続評価方法（mCRM）を利用した。患者は、自家HER2/CMV T細胞の1回以上の静脈内注入を5つの用量レベルで受けた（１ｘ１０6/ｍ2、３ｘ１０6/ｍ2、１ｘ１０7/ｍ2、３ｘ１０7/ｍ2、１ｘ１０8/ｍ2）。2011年7月21日から2014年4月21日の期間に、すべての患者に注入された。フォローアップは2015年7月1日まで続けられた。
【０１９８】
第１次療法後に再発性または進行性のいずれかであった組織学的に確認されたGBM患者（WHOグレードIV神経膠腫）は、2人の独立した病理学者によって診断が確認された後に研究に登録された。すべての患者は、T細胞注入前の病状を評価するために磁気共鳴画像法（MRI）を行った。適格基準には、HER2陽性GBM、CMV血清陽性、正常な左心室駆出率（LVEF）、Karnofsky/Lansky性能スコア>50、T細胞注入時の余命>6週間が含まれた。患者は、T細胞注入の少なくとも4週間前に細胞傷害性療法を完了（または回復）していなければならなかった。1つの例外はテモゾロミド（TMZ）であった。非常に短い半減期のため、患者はT細胞注入の2日前までにTMZを受けることができた。HIV陽性、肝機能不全、腎機能不全の患者は除外した。
【０１９９】
手順
患者のGBMのHER2陽性およびCMV抗原の存在（pp65、IE１）を免疫組織化学によって決定した（文献24、25）。HER2/CMV T細胞は、標準的な血液採取で得られた患者の自家末梢血単核細胞（PBMC）を用いた現行のGood Manufacturing Practice（GMP）ガイドラインに従って製造された。以前に記載されているように、CMVに特異的なT細胞、エプスタインバーウイルス（EBV）およびアデノウイルス（Ad）を含む単一細胞株を産生する3ウイルスアプローチの一部としてCMV特異的T細胞を生成した（文献24、26）。以前に記載されているように、臨床グレードのSFG-FRP5-CD28ζレトロウイルスベクターを用いて、T細胞にHER2特異的CARを形質導入した（文献27）。HER2/CMV T細胞を無菌性、HLA同一性および免疫表現型について試験した。HER2特異性およびCMV特異性を、以前に記載され、以下に詳述するように、それぞれ細胞毒性およびElispotアッセイを用いて決定した。
【０２００】
NCI有害事象共通用語規準（CTCAE、バージョン4.X）を用いて毒性をモニターした。末梢血試料は、すべての患者から各T細胞注入の前に、その後、定期的に所定の時点で採取して、注入関連毒性を評価し、補足方法の項で詳述した相関研究を行った。T細胞注入に対する臨床的応答は、T細胞注入の前および6週間後にMRIを実施することによって評価した。疾患応答は、完全応答（CR;疾患の初期マーカーの欠如）、部分応答（PR;少なくとも50％までの疾患マーカーの減少）、安定疾患（SD;疾患マーカーの変化なし）または応答なし（疾患マーカーの測定値の増大）と規定した。6週間の評価でSDまたは応答の形態の臨床的利益のエビデンスを有する患者は、T細胞の追加投与を受ける資格があった。
【０２０１】
HER2/CMV T細胞の生成
オーバーナイトの付着工程後に、免疫優性CMV pp65抗原（Ad5f35pp65）をコードする臨床グレードのアデノウイルスベクターでPBMCに形質導入した。形質導入後10日目から開始し、同じAd5f35pp65ベクター（Ad5f35pp65-LCL）で形質導入した照射した自家EBV形質転換リンパ芽球細胞株で細胞を毎週再刺激した。第2のAd5f35pp65-LCL刺激の3〜4日後、マウスscFv FRP5、短いヒンジ、CD28膜貫通ドメインおよびおよびCD28ζシグナル伝達ドメインを含むHER2特異的CARをコードする臨床グレードのレトロウイルスベクターでT細胞に形質導入した（文献27）。HER2/CMV T細胞は、4回目の刺激の7〜10日後に凍結保存した。
【０２０２】
転帰
この研究の第一の目的は、GBM患者由来の自家HER2/CMV T細胞の産生の可能性を評価すること、MTDの定義、および治療関連毒性の決定であった。第二の目的は、末梢血中の注入されたT細胞の増殖および持続性、CMV特異的免疫を増強する能力、およびそれらの抗GBM活性を測定することであった。
【０２０３】
統計的方法
安全性データは、治療に関連する毒性を有する患者の数および割合によって記載された。無増悪生存期間（PFS）およびOSは、Kaplan-Meier法を用いて分析した。導入遺伝子発現およびElispotアッセイを、記述統計を用いて時間とともにまとめた。グループ間の有意性は、t検定またはフィッシャーの正確確立検定を用いて決定した。0.05未満のp値は統計的に有意であると考えられた。単変量または多変量ロジスティックおよびCox回帰モデルを使用して、潜在的な危険因子と応答および生存転帰との関連性をそれぞれ分析した。
【０２０４】
補足方法
HER2/CMV T細胞の生成
以前に記載されているように（文献１）、現行のGood Manufacturing Practice（cGMP）ガイドラインに従って、末梢血単核細胞（PBMC）から、自家HER2-CARで修飾されたCMVpp65特異的T細胞（HER2/CMV T細胞）を製造した。末梢血単核細胞（PBMC）に、オーバーナイトの付着工程後に免疫優性CMV pp65抗原（Ad5f35pp65）をコードする臨床グレードのアデノウイルスベクターで形質導入した。形質導入後10日目から、同じAd5f35pp65ベクター（Ad5f35pp65-LCL）で形質導入され照射された自家EBV形質転換リンパ芽球細胞株（LCL）で細胞を毎週再刺激した。第2のAd5f35pp65-LCL刺激の3〜4日後、マウスscFv FRP5、短いヒンジ、CD28膜貫通ドメインおよびおよびCD28ζシグナル伝達ドメインを含むHER2特異的CARをコードする臨床グレードのレトロウイルスベクターでT細胞に形質導入した（文献2、３）。HER2/CMV T細胞は、4回目の刺激の7〜10日後に凍結保存した。
【０２０５】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析には、FACSCalibur装置（Becton Dickinson、San Jose、CA）およびCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を用いた。Becton Dickinsonからモノクローナル抗体（MAb）を得ており、抗CD3、-CD4、-CD8、-CD16、-CD19、-CD56、-CD62L、-CCR7、-TCRα/βおよび-TCRγ/δを含む。マウスscFV特異的MAb（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いてHER2-CAR発現を検出した。ネガティブコントロールにはアイソタイプ抗体が含まれていた。
【０２０６】
リアルタイムPCRアッセイ
HER2-CAR T細胞を検出するために、FRP5特異的プライマーおよびTaqManプローブ（Applied Biosystems）を用いた(文献３)。DNAをQIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）で抽出し、qPCRをABI RPISM 7900HT Detection System（Applied Biosystems）を使用して３回重複で実施した。ベースライン範囲はサイクル6〜15で設定され、閾値はベースライン蛍光より10SDより上であった。DNA標準を生成するために、我々は、各特定のカセットをコードするDNAプラスミドの連続希釈を確立した。
【０２０７】
酵素結合免疫スポット（Elispot）アッセイ
HER2/CMV T細胞産物および患者の末梢血中の抗原特異的T細胞の頻度を、インターフェロンγ（IFN-γ）Elispotアッセイを用いて前述のように測定した（文献1、4）。簡単に説明すると、HER2/CMV T細胞またはPBMCを、pp65、IE1、ヘキソンおよびペントンの重複ペプチドミックスで刺激した。ペプチデミックスは、11アミノ酸重複を有する対応するタンパク質の全長をカバーする15アミノ酸のペプチドを含む（pepmixes; JPT Peptide Technologies、Berlin、Germany）。培地（ペプチドなし）は陰性対照として、フィトヘマグルチニン（PHA、Sigma）は陽性対照として用いた。開発されたElispotsは、ZellNet Consulting（New York、NY）によって分析された。スポット形成細胞（SFC）は、T細胞産物については105細胞あたりのSFCとして、PBMCについては2×105細胞として計算し表した。
【０２０８】
細胞毒性アッセイ
標的に対するHER2/CMV T細胞の細胞傷害活性を、標準51Cr放出アッセイによって決定した（文献２）。1x106標的細胞を50μCi51Crで標識し、1時間インキュベートした。次に、標的を洗浄し、異なるエフェクター対標的（E：T）比でエフェクターT細胞と5×103細胞を共培養した。上清を、4時間のインキュベーション後に、Packard Cobra QuantumガンマカウンターモデルE5010（Perkin Elmer、Shelton CT）で分析した。溶解（lysis）は、先に記載したようにして計算した。
【０２０９】
免疫組織化学（IHC）
GBMのホルマリン固定パラフィン包埋切片（6μm）は以前に記載したように処理し（文献４−６）、HER2検出のためにホスホ-HER2 MAb（CB11、Abeam、Cambridge、MA）で、またはそれぞれのCMVタンパク質検出のためにCMV IE1 MAb（1：100; Chemicon、Temecula、CA、USA））およびCMV pp65 Mab（1:40; Leica Microsystems Inc.、Bannockburn、IL、USA）を用いて染色されたそれぞれのCMVタンパク質を検出した。
【０２１０】
すべてのスライドをハリスヘマトキシリンで対比染色した。既知のHER2発現乳ガン試料およびCMV感染肺試料をそれぞれ陽性対照として用いた。二次Mabのみで染色されたスライドが陰性対照として使用された。
【０２１１】
（追加方法のための文献）
1. Leen AM, Myers GD, Sili U, et al. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nature medicine 2006; 12(10): 1160-6.
2. Ahmed N, Salsman VS, Kew Y, et al. HER2-specific T cells target primary glioblastoma stem cells and induce regression of autologous experimental tumors. ClinCancer Res 2010; 16(2): 474-85.
3. Ahmed N, Brawley VS, Hegde M, et al. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) -Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for the Immunotherapy of HER2- Positive Sarcoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2015; 33(15): 1688-96.
4. Ghazi A, Ashoori A, Hanley PJ, et al. Generation of polyclonal CMV-specific T cells for the adoptive immunotherapy of glioblastoma. JImmunother 2012; 35(2): 159-68.
5. Wakefield A, Pignata A, Ghazi A, et al. Is CMV a target in pediatric glioblastoma? Expression of CMV proteins, pp65 and IEl-72 and CMV nucleic acids in a cohort of pediatric glioblastoma patients. Journal of neuro-oncology 2015.
6. Ahmed N, Ratnayake M, Savoldo B, et al. Regression of experimental medulloblastoma following transfer of HER2-specific T cells. Cancer Res 2007; 67(12): 5957-64.
【０２１２】
結果
2011年7月25日〜2014年4月21日の間に、17人の患者（女性8人、男性9人）が研究に登録された（表4）。17人の患者のうち10人が≧18歳であった（中央値57歳、範囲：30-69歳）。7人の患者は＜18歳であった（中央値14歳;範囲：10〜17歳）。
【０２１３】
【表４】
2018510652.tif 000007
【０２１４】
全ての患者（患者1を除く）はCMV陽性であった。すべての患者はT細胞注入時に再発性または進行性のGBMを有し、HER2陽性はIHCによって確認された（図10、表5）。
【表５】
2018510652.tif 000008
【０２１５】
全ての患者（患者4を除く）は外科的切除を受け、続いてTMZと併用で放射線療法（RT）を行った。17人中8人の患者（47％）は２回以上の外科的切除を受けた。すべての成人患者と7人のうち3人の子供患者がTMZを6ヶ月超受けた。患者2および3は、サルベージRT/手術を受けた。10人の患者（59％）が1〜5次の追加サルベージ療法に失敗し、１７人中6人が試験登録前に治験薬を受けた。診断からT細胞注入まで期間の中央値は13.3ヶ月（範囲：3.5〜27.7ヶ月）であった。
自家HER2/CMV T細胞産物は、全ての患者について成功裏に生成された。平均HER2-CAR形質導入効率は39％であった（範囲18〜67％;図11A）。細胞産物は、CD3+/CD8+（平均71％;範囲16-97％）およびCD3+/CD4+（平均24％;範囲：0.3-88％）のT細胞を含んでいた。大部分のT細胞は、エフェクター（CD45RO+/CCR7-/CD62L-;平均74％;範囲42-94％）及びメモリーT細胞サブセット（CD45RO+/CD62L+;平均：20％;範囲：2-49％）からなるメモリー表現型（CD45RO+;平均94％;範囲86-100％）を有していた（図11B）。標準的な細胞毒性アッセイにおいて、HER2/CMV T細胞は、未修飾CMV T細胞とは対照的に、HER2陽性神経膠腫細胞系U373に対して有意な細胞傷害性を有していた。HER2陰性K562に対してバックグラウンド死滅のみが観察された。IFN-γElispotアッセイで判定した場合、全１６人のCMV血清陽性GBM患者のHER2/CMV T細胞産物にCMV-、アデノウイルス（Adv）-、およびEBV-特異的T細胞が含まれていた（図11C、11D）。
【０２１６】
17人の患者が合計30回の注入を受け、6人の患者が複数の注入を受けた（3人の患者は2回、1人の患者3回、1人の患者4回、1人の患者6回;表6）。
【０２１７】
【表６】
2018510652.tif 000009
【０２１８】
患者のいずれも、T細胞注入に関連する有害事象を有さなかった。試験に無関係のグレード2〜4の有害事象を表7に要約する。注入6週後の心機能試験では、LVEFは注入前の値から不変であることが示された。
【０２１９】
【表７】
2018510652.tif 000010
【０２２０】
HER2/CMV T細胞は、注入後の全ての患者において定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を使用することによって検出された。17人中15人の患者が、注入3時間後にHER2/CMV T細胞の頻度が最も高かった（平均7-8コピー/μg DNA、範囲：1.4〜27.8コピー/μg DNA）、１週の１人の患者（2.0コピー/μg DNA）、および2週で1人の患者（7.2コピー/μg DNA;図8Aおよび8B）。注入6週間後、HER2/CMV T細胞は、15人中7人に存在した（平均：2.0コピー/μg DNA、範囲：0.7〜3.8コピー/μg DNA）。
【０２２１】
HER2/CMV T細胞は、３月で分析した6つの試料の１つで検出され、6月で分析した７つの試料の２つで検出され、9月で分析した３つの試料の２つで検出され12月で分析した４つの試料の２つで検出され、18月と24月で分析した１つの試料では検出されなかった（図8C）。qPCRを使用して、15〜17人の患者におけるHER2/CMV T細胞増殖の証拠はなかったが、これらの細胞は、繰り返し注入により最長12月、末梢循環中に維持することができる。
【０２２２】
末梢血中のCMV pp65特異的T細胞の頻度を決定するために、我々は刺激剤としてCMV pp65ペプチドミックス（pepmixes）を用いてIFN-γElispotアッセイを行った。さらに、アデノウイルスヘキソン/ペントンpepmixesおよび自家リンパ芽球様細胞株（LCL; EBV不死化B細胞）をそれぞれアAdenoおよびEBV特異的T細胞を検出するための刺激剤として使用した。対照として、CMV抗原IE1に特異的なT細胞の頻度を測定した。HER2/CMV T細胞注入後のpp65-、ヘキソン/ペントンおよびLCL特異的T細胞の頻度の有意な低下または増加はなかった。さらに、内因性IE1特異的T細胞免疫に変化はなかった（図12）。
【０２２３】
HER2/CMV T細胞の抗GBM活性を評価するために、脳MRIをT細胞注入6週間後に行った（図9A）。患者14は、T細胞注入の最初の6週間以内に化学療法を受け、応答分析から除外した。最初のT細胞注入の2.3から>29月後（表6）、16人の評価可能な患者のうち、１人の患者（6％;患者4）はPRを有し、７人の他の患者（41％）はSDを有していた。切除不能な右視床GBM（4〜6cm）を有する17歳男性の患者4は、1x106/m2のHER2/CMV T細胞を受け、9.2ヶ月間持続したPRを有していた（図9A）。彼は、その後、同じ用量レベルで2回目の注入後にSDを有し、最初の注入から27.3ヶ月間生存した（表7）。3人の患者（18％;患者8、9および13）は、フォローアップの29、28.8および24月間SDで生きている。RECIST基準に基づくPD患者は8例であった。病気の進行にもかかわらず、5人の患者は≧5.5ヶ月間生存した（範囲：5.5〜13.6ヶ月;図9B）。
【０２２４】
研究コホート全体について、進行までの中央値は3.5ヶ月であった。中央値ＯＳは最初のT細胞注入後の11.6月であり、診断後24.8ヶ月であった（図9C）。小児科（診断時＜18歳）と成人患者（ｐ=0.4;図9C）との間で、PFSとOSに有意差はなかった。Cox回帰分析は、注入前にサルベージ療法を受けていない患者は、サルベージ療法後に注入されたものに比べ、有意に長いOSの確率（27ヶ月）を有することを示した(7月; p=0.018;図9C)。他の測定基準の単変量および多変量解析は、応答または生存結果と相関しなかった（表8）。
【０２２５】
【表８】
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【０２２６】
特定実施形態の意義
この第１相用量漸増試験において、自家HER2/CMV T細胞の安全性は、再発性/進行性GBMを有する17人の患者において確立された。HER2/CMV T細胞は増殖しなかったが、それらは末梢血において最大12ヶ月間検出可能であった。PR（n=1）およびSD（n=7）によって定義されるように、8人の患者が臨床的利益を有していた。中央値OSはT細胞注入後11.6ヶ月であり、診断から24.8ヶ月であった。最後のフォローアップ時に病気の進行がないSDの３人の患者が生存していた。
【０２２７】
CART細胞療法は、GBM患者の転帰を改善する魅力的な戦略である。これまでに、3人のGBM患者が第1世代のIL13Roc2特異的CARで遺伝子改変されたT細胞の腫瘍内注射を受けた1つの研究しか発表されていない（文献１３）。局所注射は耐容性が良好であり、3例中2例の患者は一時的な臨床的反応を示した（文献１３）。本研究では、中枢神経の移植後リンパ増殖性疾患（CNS-PTLD)のEBV特異的T細胞の養子移入後の臨床的応答（文献28）、メラノーマ脳転移の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）への応答、およびCNS B-前駆細胞白血病患者の脳脊髄液からのCD19 CAR T細胞の単離によって証明されるように、T細胞が静脈内注射後に脳に輸送され得るので、HER2/CMV T細胞を静脈内に注入した（CNS-PTLD）。
【０２２８】
1x108/m2までのHER2/CMV T細胞の注入は、明らかな毒性なしに十分に忍容され、同じCARを発現するCD3/CD28活性化T細胞が注入されたという以前の研究が確認された（文献19）。HER2/CMV T細胞は、注入12月後まで検出可能であったが、qPCRによって判断した場合、注入された患者の末梢血における顕著なインビボ増殖は観察されなかった。さらに、注入後のCMV特異的T細胞応答の頻度に有意な変化はなかった。この知見は、GBM患者が未改変のCMV特異的T細胞を受けたという以前の研究（文献30）またはGD2-CAR（GD2-CAR/EBV T細胞）を発現するように遺伝子改変されたEBV特異的T細胞を神経芽細胞腫患者を受けたという以前の研究と一致する（文献12）。両方の研究におけるCMVおよびEBV特異的T細胞のインビボ増殖の欠如は、重度にリンパ枯渇し、対応するウイルスの再活性化を有する造血幹細胞移植レシピエントにおけるこれらの細胞の有意な増殖と対照的である（文献31、32）。
【０２２９】
本研究のGBM患者は、T細胞注入時に正常な絶対リンパ球数（ALC、平均1130、範囲421-2318）を有していた。したがって、GBM患者における養子移入されたHER2/CMV T細胞のインビボ増殖を増加させるために、少なくとも1つの実施形態において、リンパ球除去化学療法および/またはワクチンの形態のウイルス抗原の提供が有用である。実際、リンパ球除去化学療法は、血液悪性腫瘍患者におけるCD19-CAR T細胞の長続きする増殖にとって重要であることが示されており、前臨床モデルにおけるCAR/ウイルス特異的T細胞の増殖を促進するためにワクチンがうまく使用されている（文献33）。
【０２３０】
末梢血中にHER2/CMV T細胞の観察された拡大はなかったが、T細胞はGBM部位で増殖した可能性がある。T細胞注入6週間後の5人の患者のMRIは、腫瘍周囲浮腫の増加を示した。これらの患者はPDを有すると分類されたが、これらの患者のうちの5人は>5.5ヶ月間生存していたため、これらの患者の何人かの画像変化は炎症反応、局所Ｔ細胞増殖によるものである可能性が高い（文献4）。これに関して、神経腫瘍研究のための応答評価（RANO）ワーキンググループは、最近、免疫療法研究のための推奨を発表した（文献34）。
【０２３１】
GBMで発現されたHER2およびpp65を潜在的に認識し得るT細胞を注入した。5人の患者のGBMはpp65陽性であり、そのうち2人はPDおよび3人はSDを有した。明らかに、pp65発現がHER2/CMV T細胞の抗GBM活性を予測するかどうかを決定するために、pp65陽性GBMを有する患者のより大きなコホートを利用することができる。
【０２３２】
GBM患者における増悪後生存期間（post-progression survival：PPS）に関する結果データは限られている。ある最近のイタリアの研究は、RT/TMZ後の疾患増悪で第二次化学療法を受けた232人のGBM患者の転帰の後ろ向き分析を行った。中央値PFSは2.5ヶ月であり、中央値PPSは8.6ヶ月であった（文献３５）。無作為化比較対照第2相試験では、フロントライン療法に失敗したGBM患者のベバシズマブ＋ロムスチン併用と、ベバシズマブ単独またはロムスチン単独とを比較した（文献36）。ベバシズマブまたはロムスチンは十分に忍容されたが、血液学的毒性のために、ベバシズマブ+ロムスチンではロムスチンの用量を減らす必要があった。ベバシズマブを2週間に1回およびロムスチンを6週間に1回投与された52人の患者は、中央値OSが12ヶ月であり、20.0％のＯＳが18ヶ月という最良の転帰を示した（文献36）。
【０２３３】
すでに2次治療に失敗した10人の患者を含む、17人のGBM患者のこのコホートにおいて、中央値1（範囲1-6）のHER2/CMV T細胞注入で明らかな毒性のない同様の転帰（中央値OS：11-6ヶ月；18ヶ月OS：29.4％）を達成した。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、HER2/CMV T細胞の抗GBM活性を改善することができる。養子移入されたT細胞のインビボでの増殖および持続を促進するためのリンパ球除去および/またはワクチン接種の他に、特定の実施形態では、免疫系の他の操作が有用であり、それは細胞表面上に発現する阻害分子（例えばPD-Ｌ１）または神経膠腫細胞によって分泌される阻害因子（例えばTGF-β）をブロックすること等である（文献37-39）。GBMにおける抗原発現は不均質であるため、複数の抗原を標的とすることは、応答率および転帰を改善する可能性がある（文献16）。
【０２３５】
まとめると、HER2/CMV T細胞による再発性/進行性GBMの治療は実行可能かつ安全であり、17人の患者のうち8人に臨床的利益をもたらした。これらのデータはより大きな研究を支持するが、HER2/CMV T細胞の増殖、機能および持続性を増強することによって、それらの抗GBM活性を改善する必要性を強調している。
【０２３６】
[文献リスト]
1. Stupp, R., et al. Maintenance Therapy With Tumor- Treating Fields Plus Temozolomide vs Temozolomide Alone for Glioblastoma: A Randomized Clinical Trial. Jama 314, 2535-2543 (2015).
2. Cohen, K.J., et al. Temozolomide in the treatment of high-grade gliomas in children: a report from the Children's Oncology Group. Neuro-oncology 13, 317-323 (2011).
3. Pollack, I.F., et al. Antigen- specific immune responses and clinical outcome after vaccination with glioma-associated antigen peptides and polyinosinic-polycytidylic acid stabilized by lysine and carboxymethylcellulose in children with newly diagnosed malignant brainstem and nonbrainstem gliomas. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 32, 2050-2058 (2014).
4. Okada, H., et al. Induction of CD8+ T-cell responses against novel glioma-associated antigen peptides and clinical activity by vaccinations with [ alpha]-type 1 polarized dendritic cells and polyinosinic-polycytidylic acid stabilized by lysine and carboxymethylcellulose in patients with recurrent malignant glioma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 29, 330-336 (2011).
5. Terasaki, M., et al. Phase I trial of a personalized peptide vaccine for patients positive for human leukocyte antigen-A24 with recurrent or progressive glioblastoma multiforme. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 29, 337-344 (2011). 
6. Eshhar, Z., Waks, T., Gross, G. & Schindler, D.G. Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 720-724 (1993).
7. Grupp, S.A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England journal of medicine 368, 1509-1518 (2013).
8. Lee, D.W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 385, 517-528 (2015).
9. Porter, D.L., Levine, B.L., Kalos, M., Bagg, A. & June, C.H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England journal of medicine 365, 725-733 (2011).
10. M, M. T-cell Therapy Targets for Glioblastoma. (Cancer Discovery May 2015 5:458; Published OnlineFirst March 17, 2015).
11. Pule, M.A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor- specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nature medicine 14, 1264- 1270 (2008).
12. Louis, C.U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood 118, 6050-6056 (2011).
13. Brown, C.E., et al. Bioactivity and Safety of IL13Ralpha2-Redirected Chimeric Antigen Receptor CD8+ T Cells in Patients with Recurrent Glioblastoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 21, 4062-4072 (2015).
14. Ahmed, N., et al. HER2-specific T cells target primary glioblastoma stem cells and induce regression of autologous experimental tumors. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 16, 474-485 (2010).
15. Chow, K.K., et al. T cells redirected to EphA2 for the immunotherapy of glioblastoma. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 629-637 (2013).
16. Hegde, M., et al. Combinational targeting offsets antigen escape and enhances effector functions of adoptively transferred T cells in glioblastoma. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 2087-2101 (2013).
17. Johnson, L.A., et al. Rational development and characterization of humanized anti-EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells for glioblastoma. Science translational medicine 7, 275ra222 (2015).
18. Morgan, R.A., et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 843-851 (2010).
19. Ahmed, N., et al. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) -Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for the Immunotherapy of HER2-Positive Sarcoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology (2015).
20. Scheurer, M.E., Bondy, M.L., Aldape, K.D., Albrecht, T. & El-Zein, R. Detection of human cytomegalovirus in different histological types of gliomas. Acta neuropathologica 116, 79-86 (2008).
21. Cobbs, C.S., et al. Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma. Cancer research 62, 3347-3350 (2002).
22. Lucas, K.G., Bao, L., Bruggeman, R., Dunham, K. & Specht, C. The detection of CMV pp65 and IE1 in glioblastoma multiforme. Journal of neuro-oncology 103, 231-238 (2011).
23. Mitchell, D.A., et al. Sensitive detection of human cytomegalovirus in tumors and peripheral blood of patients diagnosed with glioblastoma. Neuro-oncology 10, 10-18 (2008).
24. Ghazi, A., et al. Generation of polyclonal CMV-specific T cells for the adoptive immunotherapy of glioblastoma. Journal of immunotherapy 35, 159-168 (2012).
25. Wakefield, A., et al. Is CMV a target in pediatric glioblastoma? Expression of CMV proteins, pp65 and IEl-72 and CMV nucleic acids in a cohort of pediatric glioblastoma patients. Journal of Neuro-oncology 125, 307-315 (2015).
26. Leen, A.M., et al. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nature medicine 12, 1160-1166 (2006).
27. Ahmed, N., et al. Regression of experimental medulloblastoma following transfer of HER2-specific T cells. Cancer research 67, 5957-5964 (2007).
28. Bollard, CM., Rooney, CM. & Heslop, H.E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature reviews. Clinical oncology 9, 510-519 (2012).
29. Hong, J. J., et al. Successful treatment of melanoma brain metastases with adoptive cell therapy. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 16, 4892-4898 (2010).
30. Schuessler, A., et al. Autologous T-cell therapy for cytomegalovirus as a 
consolidative treatment for recurrent glioblastoma. Cancer research 74, 3466-3476 (2014).
31. Rooney, CM., et al. Infusion of cytotoxic T cells for the prevention and treatment of Epstein-Barr virus-induced lymphoma in allogeneic transplant recipients. Blood 92, 1549-1555 (1998).
32. Heslop, H.E., et al. Long-term outcome of EBV- specific T-cell infusions to prevent or treat EBVrelated lymphoproliferative disease in transplant recipients. Blood 115, 925-935 (2010).
33. Cooper, L.J., et al. Enhanced antilymphoma efficacy of CD19-redirected influenza MPl-specific CTLs by cotransfer of T cells modified to present influenzaMPl. Blood 105, 1622-1631 (2005).
34. Okada, H., et al. Immunotherapy response assessment in neuro-oncology: a report of the RANO working group. The Lancet. Oncology 16, e534-542 (2015).
35. Franceschi, E., et al. Post progression survival in glioblastoma: where are we? Journal of neurooncology 121, 399-404 (2015).
36. Taal, W., et al. Single-agent bevacizumab or lomustine versus a combination of bevacizumab plus lomustine in patients with recurrent glioblastoma (BELOB trial): a
randomised controlled phase 2 trial. The Lancet. Oncology 15, 943-953 (2014).
37. Berghoff, A.S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-oncology 17, 1064-1075 (2015).
38. Nduom, E.K., et al. PD-L1 expression and prognostic impact in glioblastoma. Neurooncology 18, 195-205 (2016).
39. Wei, J., et al. Glioma-associated cancer-initiating cells induce immunosuppression. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 16, 461-473 (2010).
【０２３７】
本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換および変更を行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者が本発明の開示から容易に理解するように、本明細書に記載された対応する実施形態と本質的に同じ機能を果たすかまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するかまたは後に開発されるプロセス、機械、製造物、組成物、手段、方法または工程は、本発明に従って利用されることが可能である。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法または工程をその範囲内に含むことが意図されている。
【図１】
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【図２】
2018510652.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2018510652.tif 000019
【図８Ａ】
2018510652.tif 000020
【図８Ｂ】
2018510652.tif 000021
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2018510652.tif 000024
【図９Ｃ】
2018510652.tif 000025
【図１０】
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【図１１Ａ】
2018510652.tif 000027
【図１１Ｂ】
2018510652.tif 000028
【図１１Ｃ】
2018510652.tif 000029
【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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