(57)【要約】  本発明は、発酵後の貯蔵中にラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させることを特徴とする、ラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌に関する。関連する実施形態では、本発明は、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品は、25℃で少なくとも14日間保存された場合pHを4.0超で維持し、ここで、該発酵乳製品は、少なくとも107CFU／gの濃度の前記ラクトバチルス・ファーメンタムとスターター培養物を有する乳をインキュベートすること；pHが4.6に達するまで発酵すること；発酵産物を撹拌して冷却すること；を含む方法によって得られることを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌も提供する。本発明は、更に、該細菌を含む組成物、該細菌を用いて発酵乳製品を製造する方法、並びに、これらから得られる製品にも関する。
2018532378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌であって、
発酵後の貯蔵中に該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させることを特徴とする、前記細菌。
【請求項２】
前記pHの上昇は、少なくとも0.1の値の上昇である、請求項1に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項３】
前記pHの上昇は、前記スターター培養物と少なくとも107cfu／gの濃度のラクトバチルス・ファーメンタムを用いて発酵させた製品を25℃で21日間保存した後に決定される、請求項1又は2に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項４】
ラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌であって、
該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品は、25℃で少なくとも14日間保存された場合pHを4.0超で維持し、
ここで、該発酵乳製品は、
少なくとも107CFU／gの濃度のラクトバチルス・ファーメンタムスターター培養物を有する乳をインキュベートすること；
pHが4.6に達するまで発酵すること；及び
発酵産物を撹拌して冷却すること；を含む方法によって得られることを特徴とする、前記細菌。
【請求項５】
前記発酵乳製品の調製に用いられる前記スターター培養物は、発酵中の乳製品のpHを10時間以内にpH4.6の値まで低下させることができる乳酸菌を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項６】
前記スターター培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの混合物を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項７】
発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を少なくとも50％低減する能力を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項８】
前記細菌は、発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも95％又は少なくとも98％低減する能力を有し、
前記アセトアルデヒドの濃度は、
（1）
（a）少なくとも107CFU／gの濃度のラクトバチルス・ファーメンタムとスターター培養物を乳に植菌すること、及び
（b）pHが4.6に達するまで発酵すること、により発酵乳製品を調製すること；
（2）発酵乳製品を7±1℃で14日間保存すること；並びに
（3）1gの発酵乳製品に対し200μlの4N H2S04を添加し、静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによってアセトアルデヒドの濃度を決定すること；を含むアッセイで決定される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項９】
前記細菌は、
（a）DSM32084として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（b）DSM32085として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（c）DSM32086として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（d）DSM32087として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（e）DSM32088として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（f）DSM32089として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（g）DSM32090として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（h）DSM32091として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（i）DSM32096として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；
（j）DSM22584として寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株；又は
（k）（a）〜（j）に記載の寄託細菌の1つから得ることができる変異株、ここで、該変異株は、発酵後の貯蔵中に該変異ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させることを特徴とする；
からなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム株の少なくとも1種を含む組成物。
【請求項１１】
（a）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM32092で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC15860株；
（b）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM23035で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC5366株；
（c）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24616で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC12697株；
（d）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24651で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC12777株；及び
（e）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM25612で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC14676株；より選択される少なくとも1種の更なる細菌を更に含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも1つの凍結保護化合物を更に含む、請求項10又は11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、冷凍物1gあたり少なくとも109コロニー形成単位の濃度、又は冷凍物1gあたり少なくとも1010コロニー形成単位の濃度、又は冷凍物1gあたり少なくとも1011コロニー形成単位の濃度で乳酸菌を含有する固体凍結又は凍結乾燥スターター培養物である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム菌又は請求項11〜13のいずれか1項に記載の組成物を乳又は乳製品に添加すること、及び、pHが4.6以下に達するまで混合物を約22℃〜約43℃の温度で発酵することを含む、発酵乳製品を製造する方法。
【請求項１５】
前記方法は、
（a）発酵終了時の発酵乳製品における請求項1に記載のラクトバチルス・ファーメンタム菌の濃度が少なくとも1×106cfu／g又は少なくとも1×107cfu／gである；及び／又は
（b）発酵乳製品の表面における請求項1に記載のラクトバチルス・ファーメンタム菌の濃度が少なくとも1×105cfu／cm2である；
ように、請求項1〜5のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム菌又は請求項6〜9のいずれか1項に記載の組成物を乳又は乳製品に添加し、混合物を発酵することを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵製品は、7℃を超える温度、好ましくは7℃〜25℃の温度で保存される、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
前記発酵製品は、少なくとも14日間の期間保存され、発酵乳製品のpHが4.0超で維持される、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項14〜17のいずれか1項に記載の発酵乳製品を製造する方法を含む、食料、飼料又は医薬製品を製造する方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法によって得られる食料、飼料又は医薬製品。
【請求項２０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌、並びに；
（a）ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、リューコノストック属、シュードレノコストック属、ペディオコッカス属、ブレビバクテリウム属及びエンテロコッカス属の1つ又は複数より選択される少なくとも1種の更なる細菌；
（b）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM32092で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC15860株；
（c）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM23035で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC5366株；
（d）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24616で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC12697株；
（e）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24651で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC12777株；及び
（f）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM25612で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC14676株；の1種又は複数種を含む食料、飼料又は医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷蔵温度以上の温度で保存された発酵乳製品で頻繁にみられる現象である後酸性化（post-acidification）を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム菌に関する。本発明は、更に、該細菌を含む補助培養物（adjunct cultures）、該細菌又は培養物を用いて発酵乳製品を製造する方法、並びに、これらから得られる食料、飼料、医薬製品を含めた発酵乳製品を提供する。
【背景技術】
【０００２】
何十年もの間、乳酸菌は、食料の貯蔵寿命を延ばすために使用されてきた。発酵中、乳酸菌は、乳酸その他の有機酸を産生するので発酵産物のpHが下がる。酸性pHを有する製品では、病原菌や腐敗生物を含めほとんどの微生物のさらなる増殖が起こりにくい。
【０００３】
しかしながら、低いpHの影響を受けずに増殖する酵母やカビが、しばしば発酵乳製品の腐敗を引き起こす。
【０００４】
伝統的に、ヨーグルトは、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの2種の乳酸菌の混合物からなる特定のヨーグルトスターター培養物を用いて乳を発酵させることによって製造される。ヨーグルトの製造におけるスターターの主な役割は、（i）乳糖を乳酸に変換することによる酸性化、（ii）粘性のある質感の生成（例えばタンパク質の変性やエキソポリサッカライドの産生による）、および（iii）典型的なヨーグルトフレーバーの生成によって特徴づけられる（1）。
【０００５】
典型的なヨーグルトフレーバーは、酸味があり爽やかな味を与える乳酸、並びに、アセトン、ジアセチルおよびアセトアルデヒドといった種々のカルボニル化合物の混合物（後者は主要なフレーバー成分とみなされる）によるものである（2）。
【０００６】
発酵の終了後、ヨーグルトは消費されるまで保存される。この保存期間中に、乳酸菌は、特に冷蔵温度を超えて貯蔵された場合、製品のさらなる酸性化を引き起こすことがある。この現象は後酸性化と呼ばれ、一般に、ほとんどのタイプのヨーグルトにおいて時間の経過とともにみられる望ましくない性質であると考えられている。後酸性化は、離漿、生菌数の減少の増加、製品中の乳酸の蓄積および望ましくない風味の発生といった欠点にもたらし得る。これは主に、低いpH値と冷蔵温度ではラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの株の増殖が制御不能なことによるものである（4）。適切な製造を行うことや後酸性化が少ない培養物、例えば、Chr. Hansen Mild 2.0（登録商標）等を使用することによって、影響を限られた程度にすることができる。この問題を回避するための別の可能な方法として、製造後にヨーグルトを低温殺菌することがある。この方法だと、製造業者の取り扱いや配送がしやすいものの、多くの消費者はラクターゼ活性が損なわれていない生きた微生物を含有する発酵乳製品を望んでいるので、ヨーグルトの低温殺菌は一般には行われない。さらに、ラクトバチルス・アシドフィルスおよびビフィズス菌を含む酸性化が穏やかなヨーグルト関連の培養物は、後酸性化が少ないという利点がある。
【０００７】
同時に、抗真菌作用を有するスターター培養物、すなわち生物防除性（bioprotective）の細菌スターター培養物としても知られる培養物（例えば、Holdbac（登録商標）YM-C plusおよびFreshQ（登録商標）4）は、特に発酵製品が周囲温度で保存されている場合、発酵乳製品を製造する方法において後酸性化を促進する。
【０００８】
これらの知見の結果として、発酵乳製品を製造する方法において後酸性化の制御を改善する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、発酵後の貯蔵中にラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させる（つまり、後酸性化に対抗する）ことを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌を提供する。このpHの上昇の程度は任意でよいが、好ましくは少なくとも0.1の値の上昇である。この上昇は、発酵製品を25℃で21日間保存した後に測定することが好ましい。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、後酸性化をもたらさないのみならず、実際にこれらの株を用いて製造した発酵乳製品のpH値を上昇させることによって後酸性化に対抗することを見出した。以下の実施例に示されるように、この効果は、多くの市販のスターター培養物を含め顕著な後酸性化を示すスターター培養物を用いる発酵方法や特に市販の抗真菌細菌と一緒に使用される場合において特に顕著である。スターター培養物の後酸性化を阻害する、合計10種の異なるラクトバチルス・ファーメンタム株が同定された。
【００１１】
関連する実施形態では、本発明は、以下のことを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌も提供する；該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品は、25℃で少なくとも14日間保存された場合pHを4.0超で維持する、ここで、該発酵乳製品は、以下の工程を含む方法によって得られる：少なくとも107CFU／gの濃度の前記ラクトバチルス・ファーメンタムとスターター培養物を有する乳をインキュベートすること；及び、pHが4.6に達するまで発酵すること；発酵産物を撹拌して冷却すること。
【００１２】
本発明の細菌は、スターター培養物における他の細菌によって産生されるアセトアルデヒドを低減するという特徴をさらに有してもよい。例えば、本発明の特定のラクトバチルス・ファーメンタム株は、発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を少なくとも50％低減する能力を有するという特徴をさらに有してもよい。
【００１３】
関連する実施形態では、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、0〜5ppmの範囲内のジアセチルを分泌することを更に特徴としてもよい。
【００１４】
したがって、本発明は、上述の細菌、該細菌を含む組成物、発酵乳製品を製造するために該細菌を用いる方法、並びに、これらから得られる製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、（A）7±1℃及び（B）25±1℃で21日間保存した発酵乳製品におけるpHの経時的な変化を示す。これらの製品は、スターター培養物のみ（基準、△）、又はスターター培養物をFreshQ（登録商標）4（◇）、Holdbac（登録商標）YM-C Plus（〇）又はラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591（□）と組み合わせて用いて発酵させた。
【００１６】
【図２】図2は、（A）7±1℃及び（B）25±1℃で28日間保存した発酵乳製品におけるpHの経時的な変化を示す。これらの製品は、スターター培養物のみ（基準）、又はスターター培養物をFreshQ（登録商標）4、Holdbac（登録商標）（登録商標）YM-C Plus、又はラクトバチルス・ファーメンタム株と組み合わせて用いて発酵させた。
【００１７】
【図３】図3は、スターター培養物のみ（基準）、又はスターター培養物をラクトバチルス・ファーメンタム株と組み合わせて用いて発酵させた発酵乳製品を7±1℃で14日間保存した後のアセトアルデヒドレベルを示す。LOD：検出限界（Limit of detection）。LOQ：定量限界（Limit of quantification）。
【００１８】
【図４】図4は、スターター培養物のみ（基準）、又はスターター培養物をラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591と組み合わせて用いて発酵させた発酵乳製品を7±1℃で14日間保存した後のアセトアルデヒドレベルを示す。LOD：検出限界（Limit of detection）。LOQ：定量限界（Limit of quantification）。
【００１９】
【図５】図5は、4種の市販のスターター培養物、FD-DVS YF-L812、F-DVS YF-L901、F-DVS YoFlex Mild 2.0、及びF-DVS CH-1を乳（1％脂肪及び4.5％タンパク質）において43℃で培養させた酸化曲線を示す。
【００２０】
【図６】図6は、4種の市販のスターター培養物、FD-DVS YF-L812、F-DVS YF-L901、F-DVS YoFlex Mild 2.0及びF-DVS CH-1のいずれか1つを用いて発酵させたヨーグルトを6℃で43日間まで保存後の後酸化曲線を示す。
【００２１】
【図７】図7は、スターター培養物、FD DVS YF-L812又はF-DVS CH-1のみ（基準）、又はスターター培養物を9種のラクトバチルス・ファーメンタム株と組み合わせて用いて発酵させた発酵乳製品を7±1℃で14日間保存した後のアセトアルデヒドレベルを示す。LOD：検出限界（Limit of detection）。LOQ：定量限界（Limit of quantification）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、発酵後の貯蔵中にラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させることを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌を提供する。このpHの上昇の程度は任意でよいが、好ましくは少なくとも0.1の値の上昇である。この上昇は、発酵製品を25℃で21日間保存した後に測定することが好ましい。
【００２３】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、例えば、発酵後の貯蔵中にラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させる（つまり、後酸性化に対抗する）ことを特徴としてもよく、ここでこのpHの上昇は、少なくとも0.1の値の上昇であり、発酵製品を25℃で21日間保存した後に測定し、ここで該発酵乳製品の調製に使用されるスターター培養物は、発酵中の乳製品のpHを10時間以内にpH4.6の値まで低下させることができる乳酸菌を含む。例えば、アッセイは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）とラクトバチルス・デルブルッキー亜種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）の混合物ベースでもよい。それぞれの混合物は、ヨーグルトの製造に多用され、後酸性化を引き起こすことが知られている。
【００２４】
代替的な態様では、本発明は、以下のことを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌も提供する；該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品は、25℃で少なくとも14日間保存された場合pHを4.0超で維持する、ここで、該発酵乳製品は、以下の工程を含む方法によって得られる：少なくとも107CFU／gの濃度の前記ラクトバチルス・ファーメンタムとスターター培養物を有する乳をインキュベートすること；pHが4.6に達するまで発酵すること；及び、発酵産物を撹拌して冷却すること。25℃で少なくとも14日間保存された場合pHを4.0超で維持することができるという本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株の特定事項は、単にこのような効果を決定するのに一般的に使用されるアッセイについての特徴であることが理解されるべきである。本発明の本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株やそれを含む組成物（食料又は飼料製品を含む）が実際にこれらの条件下で貯蔵される必要はなく、必須要件でもない。再度説明すると、一態様では、アッセイは、発酵中の乳製品のpHを10時間以内にpH4.6の値まで低下させることができる乳酸菌を含むスターター培養物を用いて実施してもよい。例えば、アッセイは、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの混合物ベースでもよい。
【００２５】
本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、後酸性化のリスクを低減し、これにより該細菌を用いて製造した食料製品の貯蔵安定性、特に冷凍温度を上回る条件下での貯蔵安定性を改善するという特別な利点を有する。
【００２６】
実施例に示されているように、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、発酵前の乳に少なくとも107CFU／gの濃度で添加すると、発酵乳製品のpHを上昇させるという効果が観察された。したがって、本発明は、少なくとも107CFU／gの濃度の本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株、それを含む組成物、並びにそれらを含む発酵食料製品を包含する。好ましい濃度範囲は、107CFU／g〜1011CFU／g、107CFU／g〜1010CFU／g、及び107CFU／g〜109CFU／gの濃度を含む。
【００２７】
市販のストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの混合物といった一般的なスターター培養物は、発酵製品の官能特性に大きく影響する揮発性化合物を産生することが知られている。
【００２８】
本発明の一態様によれば、本発明の細菌は、食料製品の官能特性に影響を及ぼす揮発性化合物を低量しか分泌しない又は本質的に分泌しないことをさらに特徴としてもよい。アセトアルデヒド、ジアセチル及びアセトインは、食料製品の官能特性に影響を及ぼす既知の揮発性化合物である。
【００２９】
関連する実施形態では、本発明の細菌は、スターター培養物中の他の細菌によって産生されるアセトアルデヒドの存在を減少させることを特徴とする。例えば、ある本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を少なくとも50％低減する能力を有することをさらに特徴としてもよい。発酵製品中のアセトアルデヒド濃度を決定するための様々なアッセイが該技術分野において知られており、本発明の目的のために使用することができる。発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を少なくとも50％を低減する能力は、好ましくは、以下を含むアッセイで決定される：
（1）
（a）少なくとも107CFU／gの濃度の前記ラクトバチルス・ファーメンタムとスターター培養物を有する乳をインキュベートすること、及び
（b）pHが4.6に達するまで発酵すること、により発酵乳製品を調製すること；
（2）発酵乳製品を7±1℃で14日間保存すること；並びに
（3）1gの発酵乳製品に対し200μlの4N H2S04を添加し、静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによってアセトアルデヒドの濃度を決定すること。
【００３０】
アセトアルデヒドは、発酵中に乳酸菌によって生成される味成分である。ある用途ではこの成分は望ましいものの、他の用途ではアセトアルデヒドの存在を低減又は回避することが有利である。したがって、発酵乳製品におけるアセトアルデヒドの濃度を低減するラクトバチルス・ファーメンタム菌は、特定の用途、例えば、甘味を加えたヨーグルトを調製する場合に有利である。本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、例えば、発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を、少なくとも75％、少なくとも95％又は少なくとも98％低減してもよい。
【００３１】
代替的又は追加的に、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、0〜5ppmの範囲内のジアセチルを分泌するという特徴を有しうる。再度説明すると、発酵製品中のジアセチル濃度を決定するための様々なアッセイが該技術分野において知られており、本発明の目的のために使用することができる。発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるジアセチルの濃度を少なくとも50％を低減する能力は、好ましくは、以下を含むアッセイで決定される：
（1）
（a）少なくとも107CFU／gの濃度の前記ラクトバチルス・ファーメンタムとスターター培養物を有する乳をインキュベートすること、及び
（b）pHが4.6に達するまで発酵すること、により発酵乳製品を調製すること；
（2）発酵乳製品を7±1℃で14日間保存すること；並びに
（3）1gの発酵乳製品に対し200μlの4N H2S04を添加し、静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによりジアセチルの濃度を決定すること。
【００３２】
低濃度のジアセチルを分泌するラクトバチルス・ファーメンタム菌は、これらの菌株を用いた食料製品を製造する方法において有利である。というのは、かかる揮発性化合物を高濃度で産生する菌株では、最終製品の味に影響を及ぼしてしまうので、すべての用途に使用できないからである。本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株は、0〜3ppm又は0〜2ppmの範囲内のジアセチルを分泌するということを特徴としてもよい。
【００３３】
本発明の細菌は、有利には、以下の寄託株の1つに由来してもよい：
（a）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32084で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC12798；
（b）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32085で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC12797；
（c）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32086で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC14591；
（d）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32087で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC14588；
（e）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32088で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15844；
（f）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32089で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15865；
（g）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32090で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15847；
（h）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32091で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15848；
（i）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：32096で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15926；
（j）ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）. Inhoffenstr. 7B. D-38124 Braunschweigに受託番号：22584で寄託されたラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC2008；
（k）（a）〜（j）に記載の寄託細菌の1つから得ることができる変異株、ここで、該変異株は、発酵後の貯蔵中に該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させることを特徴とする。
【００３４】
この変異株によるpHの上昇は任意でよいが、好ましくは少なくとも0.1の値の上昇である。この上昇は、発酵製品を25℃で21日間保存した後に測定することが好ましい。
【００３５】
本出願の文脈において、用語「乳酸菌（lactic acid bacteria）」又は「乳酸菌（LAB）」は、糖の発酵の主な代謝最終産物として乳酸を生産する食品グレードの細菌を指す。これらの細菌は、共通の代謝的特徴及び生理学的特徴を有し、通常、グラム陽性、低GC、酸耐性、非胞子形成性、非呼吸性、棒状の桿菌又は球菌である。発酵段階では、これらの細菌による乳糖の消費が乳酸の形成を引き起こし、pHを低下させてタンパク質凝集物の形成をもたらす。したがって、これらの細菌は乳の酸性化及び乳製品の質感に関与する。本明細書で使用される用語「乳酸菌」は、ラクトバチルス属の種（Lactobacillus spp.）、ビフィドバクテリウム属の種（Bifidobacterium spp.）、ストレプトコッカス属の種（Streptococcus spp.）、ラクトコッカス属の種（Lactococcus spp.）といった属の細菌、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、及びリューコノストック属の種（Leuconostoc spp.）に属する細菌を包含するが、これらに限定されない。
【００３６】
繁殖する最適温度によるが、乳酸菌は中温性又は好熱性乳酸菌としての特徴を有する。「中温性（mesophile）」という用語は、中程度の温度で最も良好に繁殖する微生物を指す。用語「中温発酵（mesophilic fermentation）」は、約22℃〜約35℃の間の温度での発酵を指す。用語「中温発酵乳製品（mesophilic fermented milk product）」は、中温性スターター培養物の中温発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、バターミルク、サワーミルク、カルチャードミルク、スメタナ、サワークリーム及びフレッシュチーズ、例えばクアーク、トバログ及びクリームチーズが挙げられる。産業上最も有用な中温性細菌として、ラクトコッカス属の種及びリューコノストック属の種が挙げられる。
【００３７】
用語「好熱性（thermophile）」は、高温で最も良好に繁殖する微生物を指す。用語「好熱発酵（thermophilic fermentation）」は、約35℃〜約45℃で行う発酵方法を指す。用語「好熱発酵乳製品（thermophilic fermented milk product）」は、好熱性スターター培養物を用いる好熱発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、セットヨーグルト、スタードヨーグルト、ステインドヨーグルト及び飲用ヨーグルトが挙げられる。産業上最も有用な好熱性細菌として、ストレプトコッカス属の種及びラクトバチルス属の種が挙げられる。
【００３８】
以下に概説するように、本発明は、中温発酵及び好熱発酵を用いる方法を包含する。
【００３９】
真菌、酵母及びカビに関して「阻害する」という用語は、例えば、本発明のラクトバチルス・ファーメンタム株を含む食料製品内部及び／又は食料製品表面上の真菌、酵母及びカビの増殖又は胞子形成又は胞子数又は濃度が、かかる細菌を含まない食料製品に比べて低減することを指す。本発明のラクトバチルス・ファーメンタム菌によってもたらされる阻害の程度は、好ましくは、ラクトバチルス・ファーメンタム菌の存在下及び非存在下での寒天固化発酵乳における増殖によって決定される。
【００４０】
本出願の文脈において、用語「変異株（mutant）」は、遺伝子操作、放射線照射及び／又は化学処理などの手段により作製された本発明の株に由来する株として理解されるべきである。変異株は、本発明の寄託株と比較して機能的に同等の変異株、例えば、特に後酸性化を阻害する効果に関し、実質的に同一、又は改善された特性を有する変異株である。そのような変異株は、本発明の一部である。特に、用語「変異株（mutant）」は、エタンメタンスルホン酸（EMS）又はN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトログアニジン（NTG）などの化学変異原やUV光などによる処理を含む通常使用される任意の突然変異形成処理に本発明の株を供することにより取得された株、又は自然発生した突然変異株を指す。変異株は、複数の突然変異形成処理（1つの処理は、1つの突然変異形成処理であって、その後にスクリーニング／選択工程が行われるものとして理解されるべきである）に供されたものでもよいが、好ましくは、20以下、又は10以下、又は5以下の処理（又はスクリーニング／選択工程）が実施されたものであることが望ましい。好ましい変異株では、親株と比較して、細菌ゲノム中のヌクレオチドの5％未満、又は1％未満、又は0.1％未満が、別のヌクレオチドによりシフトしているか又は欠失している。
【００４１】
本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「a」及び「an」及び「the」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特に示さない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものとして解釈すべきである。
【００４２】
本発明は、以下のことを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌を少なくとも1種含む組成物も提供する；該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品は、上述のアッセイにおいて25℃で少なくとも14日間保存された場合pHを4.0超で維持する。
【００４３】
それぞれの組成物は、乳酸菌を含め数多くのさらなる細菌を含んでもよい。本発明の好ましい組成物は、ラクトバチル属の種、ビフィドバクテリウム属の種、ストレプトコッカス属の種、ラクトコッカス属の種、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、及びリューコノストック属の種の一つ又は複数から選択される少なくとも1種の細菌を更に含むという特徴を有する。
【００４４】
特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、上述の後酸性化を阻害する少なくとも1種のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌、並びに1種又は複数種の第2の細菌を含む。一実施形態では、本発明の後酸性化を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム菌のいくつかの異なる株を組み合わせる。これらの更なる細菌は、例えば抗真菌活性を有する以下（a）〜（e）の細菌より選択されてもよい：
（a）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM32092で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC15860株；
（b）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM23035で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC5366株；
（c）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24616で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC12697株；
（d）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24651で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC12777株；及び
（e）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM25612で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC14676株。
【００４５】
本発明の組成物は、さらに、1つ以上の凍結保護化合物（cryoprotective compounds）及び香味化合物を含め、多くの追加成分を含んでもよい。
【００４６】
乳酸菌は、乳にスターター培養物の形態で添加するのが最も一般的である。本文脈において使用される用語「スターター」又は「スターター培養物」は、乳ベースの酸性化に関与する1種以上の食品グレードの微生物、特に乳酸菌の培養物を指す。スターター培養物は新鮮でもよいが、凍結又は凍結乾燥状態が最も頻繁に見られる。これらの製品は、「ダイレクトバットセット」ト（Direct Vat Set）」（DVS）培養物として知られ、発酵乳製品又はチーズなどの乳製品を製造するための発酵容器又はバットに直接植菌するように生産される。それぞれのスターター培養物は、多数の製造元から市販されており、その中には、F-DVS YoFlex Mild 2.0、F-DVS YF-L901、FD-DVS YF-812及びF-DVS CH-1が含まれる。これらの4つの培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの混合物を含み、Chr.Hansen社から市販されている。
【００４７】
したがって、本発明の一態様は、上記のような後酸性化を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌を含み、冷凍物1gあたり少なくとも109コロニー形成単位の濃度、又は冷凍物1gあたり少なくとも1010コロニー形成単位の濃度、又は冷凍物1gあたり少なくとも1011コロニー形成単位の濃度で乳酸菌を含有する固体凍結又は凍結乾燥スターター培養物の形態の組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、上記の特徴の複数を有することを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム菌及びそれを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、発酵後の貯蔵中に該ラクトバチルス・ファーメンタムを含む発酵乳製品のpHを、該ラクトバチルス・ファーメンタムを含まない同じスターター培養物を用いて発酵させた乳製品に比べて上昇させることを特徴とするラクトバチルス・ファーメンタム種を提供する：
ここで、このpHの上昇は、少なくとも0.1の値の上昇であり、このpHの上昇は、スターター培養物と少なくとも107cfu／gの濃度のラクトバチルス・ファーメンタムを用いて発酵した製品を25℃で21日間保存した後に測定され、
この細菌は、発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を少なくとも50％低減する能力を有する。
【００４９】
更なる実施形態では、本発明は、上述の後酸性化を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム菌又はそれを含む組成物を乳又は乳製品に添加すること、及び、pHが4.6未満に達するまで混合物を約22℃〜約43℃の温度で発酵することを含む、発酵乳製品を製造する方法を提供する。
【００５０】
本出願の文脈において、用語「乳」は、動物の乳腺又は植物によって産生される液体を指す一般的な意味で広範に使用される。本発明によれば、乳は加工されていてもよく、用語「乳」は、全乳、脱脂乳、無脂肪乳、低脂肪乳、全脂肪乳、低乳糖乳又は濃縮乳を含む。無脂肪乳は、無脂肪又はスキムミルクの製品である。低脂肪乳は、典型的には、約1％〜約2％の脂肪を含む乳として定義される。全脂肪乳は2％以上の脂肪を含むことが多い。用語「乳」は、各種哺乳類及び植物由来のミルクを包含する意図である。乳の哺乳類の由来源としては、牛、羊、山羊、水牛、ラクダ、ラマ、メア、及びシカが含まれるが、これらに限定されない。乳の植物由来源としては、大豆、エンドウ豆、ピーナッツ、大麦、米、オート麦、キヌア、アーモンド、カシュー、ココナッツ、ヘーゼルナッツ、麻、ゴマの種及びヒマワリの種子から抽出された乳が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法及び製品において、牛由来の乳は、発酵のための出発物質として最も好ましく使用される。
【００５１】
用語「乳」は、脂肪を低減した及び／又はラクトースを低減した乳製品も含まれる。それぞれの製品は、該技術分野で周知の方法を用いて調製することができ、市販されている（例えば、米国テキサス州Select Milk Producers Inc.から取得できる）。ラクトースを低減した乳は、ラクトースを、ラクトース酵素により、又はナノ濾過、電気透析、イオン交換クロマトグラフィー及び遠心分離によりグルコースやガラクトースに加水分解することを含む、該分野で公知の任意の方法に従って製造することができる。
【００５２】
用語「乳製品」又は「乳ベース」は、本出願では、乳酸菌の増殖及び発酵のための培地として使用することができる乳又は乳成分ベースの組成物を指すのに広範に使用される。乳製品又は乳ベースは、乳酸菌を増殖又は発酵させる目的で使用できる乳由来の成分及びその他の成分を含む。
【００５３】
発酵乳製品を製造する方法の発酵工程は、乳に乳酸菌を添加することを含む。乳製品の製造に用いられる発酵方法は周知であり、当業者は、温度、酸素、微生物の量及び特性、ならびに発酵時間を含む発酵方法の条件を選択することができる。
【００５４】
発酵の前に、該技術分野で公知の方法に従い乳基質は均質化又は殺菌されてもよい。本明細書中、「均質化（homogenizing）」とは、可溶性の懸濁物又は乳液を取得するための激しい混合を意味する。均質化を発酵の前に行う場合、乳脂肪が乳から分離しないほど小さなサイズに分散するように均質化してもよい。これは、乳を高圧で小さなオリフィスを通して押し出すことにより達成され得る。本明細書中、「殺菌（pasteurizing）」とは、生きた生物、例えば微生物を減少又は死滅させるために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、殺菌は、一定時間、特定の温度で乳基質を維持することにより達成される。該特定の温度は、通常加熱により達成される。温度及び時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅又は不活性化するように選択され得る。急速冷却工程が続いてもよい。
【００５５】
特に有利な本発明の方法では、以下の（a）及び／又は（b）であるように、上述の後酸性化を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム菌又はそれを含む組成物を乳又は乳製品に添加し、混合物を発酵する：
（a）発酵終了時の発酵乳製品における後酸性化を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム菌の濃度が少なくとも1×106cfu／g又は少なくとも1×107cfu／gである；及び／又は
（b）発酵乳製品の表面における後酸性化を阻害するラクトバチルス・ファーメンタム菌の濃度が少なくとも1×105cfu／cm2である。
【００５６】
この方法は、ラクトバチルス・ファーメンタム菌の後酸性化を阻害する効果を十分に利用できるという利点を有する。
【００５７】
本発明は、発酵製品が7℃を超える温度、好ましくは7℃〜25℃の温度で保存される方法も提供する。この製品は、任意の時間保存されうるが、好ましくは少なくとも14日間保存され、保存中、発酵乳製品のpHが4.0超で維持される。
【００５８】
本発明はさらに、上述の発酵乳製品を製造する方法を含む、食料、飼料又は医薬製品を製造する方法、並びに、この方法によって得られる食料、飼料又は医薬製品を更に提供する。
【００５９】
発酵は、食料製品、飼料製品又は医薬品を製造するために行われる。用語「発酵乳製品」、「食品」又は「飼料」製品は、本発明の発酵方法によって得られる製品を指し、チーズ、ヨーグルト、フルーツヨーグルト、ヨーグルト飲料、水切りヨーグルト（ギリシャヨーグルト、ラブネ）、クワルク、フロマージュ・フレ及びクリームチーズを含む。食料という用語は、発酵ソーセージといった発酵肉及び発酵魚製品を含む他の発酵食品をさらに包含する。
【００６０】
用語「チーズ」は、以下のタイプのチーズ：カッテージ、フェタ、チェダー、パルメザン、モッツァレラ、エメンタール、ダンボ、ゴーダ、エダム、フェタタイプ、ブルーチーズ、塩漬けチーズ、カマンベール及びブリーチーズなどのハード、セミハード及びソフトチーズを含めたあらゆるチーズを包含すると理解される。当業者は、凝塊をチーズにどのように変換するか知っており、方法は、各文献中に見られる、例えば、Kosikowski,F.V.,and V.V.Mistry,“Cheese and Fermented Milk Foods”,1997,3rd Ed.F.V.Kosikowski,L.L.C.Westport,CTを参照のこと。本明細書中に使用されるとき、1.7％（w／w）未満のNaCl濃度を有するチーズは、「低塩チーズ（low-salt cheese）」と称される。
【００６１】
本出願の文脈において、用語「ヨーグルト」は、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス、そして場合により他の微生物、例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・パラカゼイ、又はそれらに由来する任意の微生物を含む製品を指す。ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス以外の乳酸菌株も、最終製品に様々な特性、例えば腸内叢の平衡を促進する特性、を付与するために含まれる。本明細書で使用される用語「ヨーグルト」は、セットヨーグルト、スタードヨーグルト、飲用ヨーグルト、プチスイス、熱処理ヨーグルト、高タンパク質量及びヨーグルト風の製品であるという特徴を有する水切りヨーグルト又はギリシャスタイルヨーグルトを包含する。
【００６２】
特に、用語「ヨーグルト」は、フランス及びヨーロッパの規制に従って定義される、特定の好熱性乳酸菌（つまり、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス及びストレプトコッカス・サーモフィルス）のみによる乳酸発酵によって得られた凝固乳製品であり、これらの菌が同時に培養され最終製品中に少なくとも10×106CFU（コロニー-形成単位）／gの量で生存しているヨーグルトも包含するが、これらに限定されない。ヨーグルトは場合により、酪農原料（例えば、クリーム）、あるいは砂糖又は甘味剤、1つ又は複数の香味料、果物、穀物、又は栄養物質、特にビタミン、ミネラル及び繊維、ならびに安定剤及び増粘剤といった他の成分を含有してもよい。必要に応じて、ヨーグルトはAFNOR NF 04-600規格及び／又はcodex StanA-lla-1975規格の発酵乳及びヨーグルトの基準を満たす。AFNOR NF 04-600規格を満たすためには、製品は発酵後に加熱してはならず、酪農原料は完成品の最低70％（m／m）を占める必要がある。
【００６３】
更なる実施形態では、本発明は、上述の後酸性化を阻害する1種又は複数種のラクトバチルス・ファーメンタム種の細菌、及び以下の（a）〜（f）の1種又は複数種を含む食料、飼料又は医薬製品を提供する：
（a）ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、リューコノストック属、シュードレノコストック属、ペディオコッカス属、ブレビバクテリウム属及びエンテロコッカス属の1つ又は複数の属より選択される少なくとも1種の更なる細菌；
（b）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM32092で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC15860株；
（c）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM23035で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC5366株；
（d）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24616で寄託されたラクトバチルス・ラムノサス菌CHCC12697株；
（e）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM24651で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC12777株；及び
（f）ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）に受託番号DSM25612で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ菌CHCC14676株。
【実施例】
【００６４】
実施例1：
ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591の後酸性化に対する影響の解析
均質化した低脂肪乳（1.5％ w／v）を、90±1℃で20分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（F-DVS Mild 2.0）を0.02％（v／w）で植菌し、植菌した乳を200 mlのボトルに分注した。1つのボトルには、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591を2×107 CFU／gの総濃度で植菌し、2つのボトルには、2種類の市販の生物防除培養物（FreshQ（登録商標）4及びHoldbac（登録商標） YM-C Plus）を、推奨される用量で（FreshQ（登録商標）4及びHoldbac（登録商標） YM-C Plusはそれぞれ100U／T及び20 DCU／100L）植菌し、そして、1つのボトルには、基準としてスターター培養物のみ植菌した。全てのボトルは、43±1℃の水槽内でインキュベートし、4.60±0.1のpHになるまでこの条件で発酵させた。発酵後、ボトルを激しく振とうして凝塊を破壊し、氷上で冷却した。
【００６５】
後酸性化に対する影響をモニターするために、4個の発酵乳サンプル（スターター培養物単独、並びにFreshQ（登録商標）4、Holdbac（登録商標）YM-C Plus及びラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591添加）を7±1℃及び25±1℃で21日間保存し、pHを1日目、7日目、14日目及び21日目に測定した。
【００６６】
後酸性化に対する影響を図1に示す。図1は、乳の発酵中にラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591を添加すると、スターター培養物単独のみを使用する場合と比べ、特に、いずれも後酸性化をもたらす2種類の市販の生物防除培養物を使用する場合と比べて、後酸性化が低減することを示す。
【００６７】
実施例2：10種のラクトバチルス・ファーメンタム株の後酸性化に対する影響の解析
均質化した低脂肪乳（1.5％ w／v）を、90±1℃で20分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（F-DVS YF-L901）を0.02％（v／w）で植菌し、植菌した乳を200 mlのボトルに分注した。10個のボトルには、ラクトバチルス・ファーメンタム株を1×107CFU／gの濃度で植菌し、そして、1つのボトルには、基準としてスターター培養物のみ植菌した。全てのボトルは、43±1℃の水槽内でインキュベートし、4.60±0.1のpHになるまでこの条件で発酵させた。発酵後、ボトルを激しく振とうして凝塊を破壊し、氷上で冷却した。
【００６８】
試験したラクトバチルス・ファーメンタム株は、以下の通りである：ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12798、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12797、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14588、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15844、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15865、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15847、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15848、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15926、及びラクトバチルス・ファーメンタムCHCC2008。
【００６９】
後酸性化に対する影響をモニターするために、11個の発酵乳サンプル（スターター培養物単独、並びに10種のラクトバチルス・ファーメンタム株と組み合わせたスターター培養物）を7±1℃及び25±1℃で28日間保存し、pHを1日目、7日目、14日目、21日目及び28日目に測定した。
【００７０】
後酸性化に対する影響を図2に示す。図2は、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12798、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12797、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14588、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15844、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15865、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15847、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15848、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15926、及びラクトバチルス・ファーメンタムCHCC2008はそれぞれ後酸性化をもたらさないあるいは基準ヨーグルトと比較して後酸性化を低減すらさせることを示す。
【００７１】
先行技術の抗真菌性食品グレードの細菌は、スターター培養物によって引き起こされる後酸性化効果を増大させることが観察されたので、これらの知見は予想外であり、非常に重要である。
【００７２】
実施例3：10種のラクトバチルス・ファーメンタム株のアセトアルデヒド含量に対する影響
10種のラクトバチルス・ファーメンタム株を、アセトアルデヒド含量を低減する能力について試験した。
【００７３】
均質化した低脂肪乳（1.5％ w／v）を、90±1℃で20分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（F-DVS YF-L901 Yo-Flex（登録商標））を0.02％（v／w）で植菌し、植菌した乳を200 mlのボトルに分注した。10個のボトルには、ラクトバチルス・ファーメンタム株を1×107CFU／gの濃度で植菌し、そして、1つのボトルには、基準としてスターター培養物のみ植菌した。全てのボトルは、43±1℃の水槽内でインキュベートし、4.60±0.1のpHになるまでこの条件で発酵させた。発酵後、ボトルを激しく振とうして凝塊を破壊し、氷上で冷却した。すべてのボトルは7±1℃で14日間保存した。
【００７４】
14日目に、複雑なマトリックス中の揮発性物質を分析する高感度な方法である静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（HSGC）によりサンプルをアセトアルデヒドについて解析した。セットアップは、FID（Flame Ionization Detector）を備えたガスクロマトグラフに接続された静的ヘッドスペースサンプラーから構成されていた。その目的のために、以下の装置を使用した：
HSオートサンプラー： HS40XI, TurboMatrix 110, Perkin Elmer.
HSソフトウェア： HSControl v.2.00, Perkin Elmer.
GC： Autosystem XL, Perkin Elmer.
GCソフトウェア： Turbochrom navigator, Perkin Elmer.
カラム： HP-FFAP 25 m×0.20 mm×0.33 μm, Agilent Technologies 
【００７５】
既知の濃度の標準液を用いて応答因子を決定し（較正）、使用した応答因子が分析希釈系内および希釈系間、そして経時的（月）にわたり安定であるよう制御するために対照を使用した。サンプルおよび対照における揮発性物質の濃度（ppm）は、標準液から得た応答因子を用いて決定した。1gのヨーグルトサンプルに200μlの4N H2SO4を添加することによってサンプルを調製し、直ちにHSGCで分析した。
【００７６】
結果を図3に示す。図3は、株ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12798、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12797、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14588、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15844、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15865、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15847、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15848、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15926、及びラクトバチルス・ファーメンタムCHCC2008はそれぞれ発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を低減する能力を有することを示す。
【００７７】
実施例4：1種のラクトバチルス・ファーメンタム株のアセトアルデヒド含量に対する影響
1種のラクトバチルス・ファーメンタム株を、アセトアルデヒド含量を低減する能力について試験した。
【００７８】
均質化した低脂肪乳（1.5％ w／v）を、90±1℃で20分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販のスターター培養物（F-DVS Mild 2.0）を0.02％（v／w）で植菌し、植菌した乳を2つの200mlのボトルに分注した。1つのボトルには、ラクトバチルス・ファーメンタム株を1×107CFU／gの濃度で植菌し、そして、1つのボトルには、基準としてスターター培養物のみ植菌した。両方のボトルは、43±1℃の水槽内でインキュベートし、4.60±0.1のpHになるまでこの条件で発酵させた。発酵後、ボトルを激しく振とうして凝塊を破壊し、氷上で冷却した。これらのボトルは7±1℃で14日間保存した。
【００７９】
14日目に、複雑なマトリックス中の揮発性物質を分析する高感度な方法である静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（HSGC）によりサンプルをアセトアルデヒドについて解析した。セットアップは、FID（Flame Ionization Detector）を備えたガスクロマトグラフに接続された静的ヘッドスペースサンプラーから構成されていた。その目的のために、以下の装置を使用した：
HSオートサンプラー： HS40XI, TurboMatrix 110, Perkin Elmer.
HSソフトウェア： HSControl v.2.00, Perkin Elmer.
GC： Autosystem XL, Perkin Elmer.
GCソフトウェア： Turbochrom navigator, Perkin Elmer.
カラム： HP-FFAP 25 m×0.20 mm×0.33 μm, Agilent Technologies 
【００８０】
既知の濃度の標準液を用いて応答因子を決定し（較正）、使用した応答因子が分析希釈系内および希釈系間、そして経時的（月）にわたり安定であるよう制御するために対照を使用した。サンプルおよび対照における揮発性物質の濃度（ppm）は、標準液から得た応答因子を用いて決定した。1gのヨーグルトサンプルに200μlの4N H2SO4を添加することによってサンプルを調製し、直ちにHSGCで分析した。
【００８１】
結果を図4に示す。図4は、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591は発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を低減する能力を有することを示す。
【００８２】
実施例5：市販のスターター培養物の機能的解析
本明細書に記載の3種の市販のスターター培養物を、異なる酸性化プロファイルに基づいて選択した。3種は冷凍されたF-DVS CH-1、F-DVS YoFlex Mild 2.0及びF-DVS YF-L901であり、1種は凍結乾燥されたFD-DVS YF-L812である。酸性化プロファイルの違いを試験するために、半脂肪乳を脱脂乳粉末で1％脂肪及び4.5％タンパク質に標準化し、85±1℃で30分間熱処理し、直ちに冷却した。4種の異なる市販のスターター培養物（F-DVS CH-1、F-DVS YoFlex Mild 2.0、F-DVS YF-L901又はFD-DVS YF-L812）のうち1種を0.02％（v／w）で植菌し、植菌した乳を200mlのボトルに分注した。これらのボトルは、43±1℃の水槽内でインキュベートし、4.5のpHになるまでこの条件で発酵させた。発酵の間中、pHを連続的に測定した。その後、これらのボトルは6℃で43日間保存し、pHを7日間の間隔で測定し、後酸性化のレベルを決定した。
【００８３】
3種の市販のスターター培養物（F-DVS CH-1、F-DVS YoFlex Mild 2.0、F-DVS YF-L901又はFD-DVS YF-L812）の酸性化プロファイルを図5に示す。F-DVS CH-1は、4.87時間でpH4.55に達する速い発酵時間を示した。F-DVS YoFlex Mild 2.0は、5.29時間でpH4.55に達する中程度の発酵時間を示した。FD-DVS YF-L812及びF-DVS YF-L901は、それぞれ6.45及び5.87時間でpH4.55に達する遅い発酵時間を示した。後酸性化プロファイルは、FD-DVS YF-L812とF-DVS YoFlex Mild 2.0では非常に低い後酸性化のレベルを示し（6℃で43日間の保存後ΔpH＝0.12及びΔpH＝0.11）、F-DVS YF-L901では中程度の後酸性化のレベルを示し（6℃で43日間の保存後ΔpH＝0.26）、F-DVS CH-1では高い後酸性化のレベルを示した（6℃で43日間の保存後ΔpH＝0.55）（図6）。
【００８４】
実施例6：2種の異なるスターター培養物で発酵させた場合における、9種のラクトバチルス・ファーメンタム株のアセトアルデヒド含量に対する影響
9種のラクトバチルス・ファーメンタム株を、アセトアルデヒド含量を低減する能力について試験した。
【００８５】
均質化した低脂肪乳（1.5％w／v）を、90±1℃で20分間加熱処理し、そして急速に冷却した。2種の市販のスターター培養物（F-DVS CH-1又はFD-DVS YF-L812）を0.02％（v／w）で植菌し、植菌した乳を2つの200mlのボトルに分注した。9つのボトルには、ラクトバチルス・ファーメンタム株を1×107CFU／gの濃度で植菌し、そして、1つのボトルには、基準としてスターター培養物のみ植菌した。全てのボトルは、43±1℃の水槽内でインキュベートし、4.55±0.1のpHになるまでこの条件で発酵させた。発酵後、ボトルを激しく振とうして凝塊を破壊し、氷上で冷却した。これらのボトルは7±1℃で14日間保存した。
【００８６】
試験したラクトバチルス・ファーメンタム株は、以下の通りである：ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12798、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12797、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14588、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15844、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15865、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15847、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15926、及びラクトバチルス・ファーメンタムCHCC2008。
【００８７】
14日目に、複雑なマトリックス中の揮発性物質を分析する高感度な方法である静的ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（HSGC）によりサンプルをアセトアルデヒドについて解析した。セットアップは、FID（Flame Ionization Detector）を備えたガスクロマトグラフに接続された静的ヘッドスペースサンプラーから構成されていた。その目的のために、以下の装置を使用した：
HSオートサンプラー： HS40XI, TurboMatrix 110, Perkin Elmer.
HSソフトウェア： HSControl v.2.00, Perkin Elmer.
GC： Autosystem XL, Perkin Elmer.
GCソフトウェア： Turbochrom navigator, Perkin Elmer.
カラム： HP-FFAP 25 m×0.20 mm×0.33 μm, Agilent Technologies 
【００８８】
既知の濃度の標準液を用いて応答因子を決定し（較正）、使用した応答因子が分析希釈系内および希釈系間、そして経時的（月）にわたり安定であるよう制御するために対照を使用した。サンプルおよび対照における揮発性物質の濃度（ppm）は、標準液から得た応答因子を用いて決定した。1gのヨーグルトサンプルに200μlの4N H2SO4を添加することによってサンプルを調製し、直ちにHSGCで分析した。
【００８９】
結果を図7に示す。図7は、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12798、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC12797、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14591、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC14588、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15844、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15865、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15847、ラクトバチルス・ファーメンタムCHCC15926、及びラクトバチルス・ファーメンタムCHCC2008のそれぞれの株は、発酵中の発酵乳製品におけるスターター培養物によって産生されるアセトアルデヒドの濃度を低減する能力を有することを示す。
【００９０】
参考文献
1. Tamime, A. Y., and H. C. Deeth. 1980. Yoghurt: technology and biochemistry. J. Food Prot. 43:939-977.
2. A. C. S. D. Chaves, M. Fernandez, A. L. S. Lerayer, I. Mierau, M. Kleerebezem, and J. Hugenholtz, 2002, Metabolic Engineering of Acetaldehyde Production by Streptococcus thermophilus
3. Lees, G. J., and G. R. Jago. 1976. Formation of acetaldehyde from threonine by lactic acid bacteria. J. Dairy Res. 43:75-83.
4. Kurmann, J.A. (1982) Die Obersauerung der Joghurtgallerte, ein haufig auftretender und zu wenig beachteter Produktionsfehler, dessen Entstehung und Bekampfung. Dt. Molkerei-Zeitung 103, 690-698.
【００９１】
寄託と専門家のソリューション
出願人は、下記の寄託された微生物の試料が、特許登録の日まで、専門家のみに利用可能であるべきことを要求する。
【００９２】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC12798は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32084で寄託された。
【００９３】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC12797は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32085で寄託された。  
【００９４】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC14591は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32086で寄託された。
【００９５】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC14588は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32087で寄託された。
【００９６】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15844は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32088で寄託された。
【００９７】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15865は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32089で寄託された。
【００９８】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15847は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32090で寄託された。
【００９９】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15848は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32091で寄託された。
【０１００】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC15926は、2015年7月22日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32096で寄託された。
【０１０１】
ラクトバチルス・ファーメンタム株CHCC2008は、2009年5月19日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：22584で寄託された。
【０１０２】
ラクトバチルス・ラムノサス株CHCC15860は、2015年7月16日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH； DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号：32092で寄託された。
【０１０３】
寄託は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って行われた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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