(57)【要約】  本開示は、心臓または血管の毒性が化学療法剤の投与に関連する化学療法剤を受ける対象における心臓または血管への毒性を治療または予防するための組成物および方法を提供する。また、内皮機能障害を治療または予防し、内皮機能および酸化ストレスを調節するための組成物および方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）で示される配列と、少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって；
Ｘ1が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるホスホミメティック残基であり、単離されたペプチドはＴＥＲＴ核移行を防止することができ、前記単離されたペプチドが２０アミノ酸未満であるペプチド。
【請求項２】
配列番号２で示される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の単離されたペプチドを含むペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１の６位のセリン残基と比較して非リン酸化可能な置換基を含む単離されたペプチドであって、前記単離されたペプチドが２０アミノ酸未満であり、配列番号１によって示される配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、ＴＥＲＴ核移行を予防することができるペプチド。
【請求項６】
配列番号３によって示される、請求項５に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドがＢＢＢ透過性である、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
請求項５に記載の単離されたペプチドを含むペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
ＴＥＲＴ核移行の阻害剤にヒト細胞を接触させることを含む、ヒト細胞におけるテロメラーゼ酵素の核移行を防止する方法。
【請求項１０】
前記ＴＥＲＴ核移行の阻害剤がペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤が、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を含むペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤が、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を有するペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与が非経口投与である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
対象における心臓への副作用の低減方法であって、ＴＥＲＴ核移行の阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含み、該合成ペプチドを投与することが対象における心臓への副作用の発生を減少させる方法。
【請求項１５】
前記心臓への副作用が、前記対象への化学療法剤の投与に伴う心毒性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が化学療法剤を受けるであろう、または受けている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＥＲＴ核移行の阻害剤がペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が非経口投与である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
対象に過剰増殖性疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の単離されたペプチドを投与することを含み、前記単離されたペプチドは２０アミノ酸未満であり、少なくとも８０％が配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）によって示される配列に相同であり；
Ｘ1は、配列番号１の対応する位置に対してアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるホスホミメティック残基であり、前記単離されたペプチドはＴＥＲＴ核移行を防止し、それにより過剰増殖性疾患を治療することができる、方法。
【請求項２１】
前記過剰増殖性疾患が癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＥＧ化ペプチドが、配列番号４に記載の配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
有効量のＴＥＲＴ核移行の阻害剤を対象に投与することを含む、酸化ストレスを減少させる方法。
【請求項２６】
ＴＥＲＴ核移行の阻害剤がペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＥＲＴミトコンドリア移行の阻害剤にヒト細胞を接触させることを含む、ヒト細胞におけるテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）酵素のミトコンドリア移行を防止する方法。
【請求項２９】
前記阻害剤が、配列番号５を含むペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１１，５２４号の優先権を主張し、その利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する声明
適用なし。
【背景技術】
【０００３】
テロメラーゼの過剰発現は、心臓および血管の保護に関連する。しかし、特定の細胞型におけるテロメラーゼ酵素の再活性化は、細胞の不死化および増殖におけるテロメラーゼの役割を考慮すると、発癌性形質転換における重要な事象であり得る。心臓および血管疾患の予防および改善におけるテロメラーゼ再活性化の有効性の基礎となる作用機構は解明されていない。
【０００４】
従って、標準的なプロトコルの欠点を克服し、癌の化学療法における有害あるいはオフターゲットな副作用を緩和しつつ、血管疾患に対する新しい治療の規範を提供する組成物、治療方法、および予防方法を開発できれば有益である。かかる目的を達成するための組成物および方法のニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、本明細書に記載の組成物および方法を提供することによって、前述の欠点を克服する。
【０００６】
本明細書における第１の態様は、配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）によって示される配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであり、Ｘ1はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるホスホミメティック残基であり、単離されたペプチドはＴＥＲＴ核移行を防止することができ、前記単離されたペプチドは２０アミノ酸未満であるペプチドを提供する。
【０００７】
本明細書における別の態様では、本明細書で提供される単離されたペプチドを含むペプチドをコードする、核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本明細書における別の態様では、配列番号１の６位のセリン残基に対して非リン酸化可能な置換を含む単離されたペプチドであって、前記単離されたペプチドが２０アミノ酸未満であり、アミノ酸配列番号１によって示される配列と少なくとも８０％相同であり、ＴＥＲＴ核移行を予防することができる。単離されたペプチドは、配列番号３として示される配列を有することができる。ペプチドは血液脳関門透過性であり得る。また本明細書は、配列番号１の６位のセリン残基に対して非リン酸化可能な置換を含むペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【０００９】
さらに別の態様では、本明細書は、ヒト細胞におけるテロメラーゼ酵素の核移行を防止する方法であって、ヒト細胞をＴＥＲＴ核移行の阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。ＴＥＲＴ核移行の阻害剤はペプチドであり得る。前記阻害剤は、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択される配列を含むペプチドであり得る。前記阻害剤は、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択される配列を有するペプチドであり得る。投与は、非経口投与であり得る。
【００１０】
さらなる態様では、対象における有害な心臓の影響を低減する方法であって、前記方法は、ＴＥＲＴ核移行の阻害剤の治療有効量を対象に投与する工程を含み、前記合成ペプチドを投与する工程は対象における有害な心臓作用の発生を減少させる工程を含む。有害な心臓効果は、対象への化学療法剤の投与に伴う心毒性であり得る。前記対象は化学療法剤を受けるであろう、または受けている。ＴＥＲＴ核移行の阻害剤はペプチドであり得る。前記ペプチドは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択される配列を有することができる。前記投与は、非経口投与であり得る。いくつかの場合において、本明細書は、心臓および血管の重大な損傷を引き起こし、高血圧および他の多くのＣＶ疾患状態に関連する、アンジオテンシンＩＩ（ANG II）の有害な心臓効果を拮抗する方法も提供する。
【００１１】
別の態様では、治療有効量の単離されたペプチドを対象に投与することを含む、対象における過剰増殖性疾患を治療する方法であって、前記単離されたペプチドが２０アミノ酸未満であり、配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）によって示される配列と、少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含む。ここで、Ｘ1はアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるホスホミメティック残基であり、配列番号１の対応する位置と比較して、ＴＥＲＴ核移行を防止し、それによって過剰増殖性疾患を治療することができる。前記過剰増殖性疾患は癌であり得る。前記ペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことができる。前記ペプチドはＰＥＧ化することができる。前記ＰＥＧ化ペプチドは、配列番号４に記載の配列を含むことができる。
【００１２】
本明細書において、酸化ストレスを減少させる方法であって、有効量のＴＥＲＴ核移行の阻害剤を対象に投与することを含む方法もまた提供される。前記ＴＥＲＴ核移行の阻害剤はペプチドであり得る。前記ペプチドは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選ばれる配列を含み得る。
【００１３】
さらなる態様では、本明細書は、ヒト細胞におけるテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）酵素のミトコンドリア移行を防止する方法であって、ヒト細胞をＴＥＲＴミトコンドリア移行の阻害剤に接触させることを含む方法を提供する。前記阻害剤は、配列番号５を含むペプチドであり得る。
【００１４】
本発明の、前述の、および他の態様、および利点は、以下の詳細な説明により明らかにされるであろう。詳細な説明では、本発明の一部を構成する添付図面を参照し、本発明の好ましい実施態様を例示として示す。かかる実施態様は必ずしも本発明の全範囲を表すものではないが、本発明の範囲の解釈のために、特許請求の範囲および明細書を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】正常条件下で、テロメラーゼが、Ａｋｔを含むキナーゼによってＮＬＳでリン酸化され、核内移行に至ることを示す。テロメラーゼは主に核に局在する。
【図１Ｂ】ｎｕｃＸＴＥＲＴはデコイペプチドとして働き、ＮＬＳをリン酸化するのに関与するキナーゼについてテロメラーゼと競合する。これは、細胞質およびミトコンドリアにおけるテロメラーゼの核内移行およびテロメラーゼの蓄積を減少させる。
【図２Ａ】解剖されたヒト微小血管を示す。上のパネルは明視野の画像であり、下の３つのパネルは５−ＦＡＭからの放射を視覚化するためのフィルタを備えたレーザ励起下の同じ血管の画像である。容器を１０μＭ濃度の５−ＦＡＭ標識ペプチド（ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｗ）で８時間（ｈ）、または未処理（対照）のまま処理した。
【図２Ｂ】Ｈ１２９９非小細胞肺癌細胞をスライド上に播種し、０，５０または１００μＭの５−ＦＡＭ標識ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｗで８時間処理した。ＤＡＰＩ＝青；５−ＦＡＭ標識ペプチド＝緑。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、指示された用量でｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｗで一晩処理した後の核および細胞質ゾル区画に分画したＨ１２９９細胞を用いたウェスタンブロッティング。ＧＡＰＤＨは細胞質ローディングコントロールとして機能し、ヒストンＨ３は核負荷コントロールとして機能する。図３Ｂは、核の比として表される、Ａで示されるウェスタンブロットのデンシトメトリー定量化：核および細胞質ローディングコントロールに対する標準化後の細胞質シグナル。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、ｎｕｃＸＴＥＲＴペプチドがヒト血管をストレッサーから保護することを示す。生存ヒト微小血管を健康なドナーの脂肪から解剖し、ＢＩＢＲ１５３２（テロメラーゼ阻害剤）、ｍｉｔｏＸＴＥＲＴ、またはｎｕｃＸＴＥＲＴ（およびｎｕｃＸＴＥＲＴ＋ＢＩＢＲ１５３２）のいずれかで一晩処理した。次いで、血管に、ANG IIストレッサーの有無にかかわらず、アセチルコリン（ＡＣｈ）拡張刺激を負荷した。
【図４Ｂ】Ａのように調製したヒト微小血管をＢＩＢＲ１５３２、ｍｉｔｏＸＴＥＲＴまたはｎｕｃＸＴＥＲＴ（およびｎｕｃＸＴＥＲＴ＋ＢＩＢＲ１５３２）で一晩処理した。次に、ANG IIの有無にかかわらず、圧力勾配拡張刺激で血管を処理した。
【図５Ａ】ヒト微小血管を一晩処理するために、ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ａ（Ｃで詳述される配列）を使用した。ANG IIの有無にかかわらず、血流およびＡＣｈを拡張刺激として使用した。
【図５Ｂ】ヒト微小血管を一晩処理するために、ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅ（Ｃで詳述された配列）を用いた。ANG IIの有無にかかわらず、血流およびＡＣｈを拡張刺激として使用した。
【図５Ｃ】試験した種々のｎｕｃＸＴＥＲＴ変異体の配列および有効性を詳述する表
【図６】ｎｕｃＸＴＥＲＴペプチドが冠状動脈疾患のヒト微小血管の機能を回復させることを実証する。生きたヒト微小血管を、臨床的に確認された冠状動脈疾患（ＣＡＤ）を有する個体から脂肪から解剖した。容器は、媒体またはＬ−ＮＡＭＥまたはＰＥＧ−カタラーゼのいずれかの存在下でｎｕｃＸＴＥＲＴにより処理した。圧力勾配（血流）刺激に対する応答を評価した。健康なヒトドナーの脂肪由来の微小血管を、ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）またはＰＥＧ−カタラーゼの有無にかかわらず、ビヒクルまたはｍｉｔｏＸＴＥＲＴのいずれかで処理した。圧力勾配（血流）に応答して血管が拡張する能力を評価した。
【図７Ａ−Ｃ】Ａは、単離された血管研究におけるＰＥＧ化ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅの用量滴定を示す。ＳからＥへの置換を有するｎｕｃＸＴＥＲＴを、Ｃ末端でＰＥＧ化して生物学的安定性および細胞透過性を増加させた。１０μＭ〜１ｎＭの有効用量を試験した。ＰＥＧ化ペプチドは、血管保護効果を伴って１ｎＭまで滴定することができた。Ｂは、非ＣＡＤ血管を処理し、残存する酸化窒素（ＮＯ）を媒介した（Ｌ−ＮＡＭＥ阻害可能、Ｂ）。Ｃは、ANG II誘発内皮機能障害（Ｃ）に対して保護した場合、血流依存性拡張（ＦＭＤ）の機構は変化しなかった。Ｎ＝３〜４。
【図８Ａ】インビボでのペプチドの生体内分布を示す。ＰＥＧ化ペプチド（５０ｎＭ）を、放射泳動のためにテクネチウム（Ｔｃ９９ｍ）で放射性標識した。テクネチウム標識ペプチド（０．７７ｎＭ）を正常Ｃ５７マウスの尾静脈に注射した。（Ａ〜Ｋ）注射後２時間、４時間および８時間でマウスを安楽死させ、残留放射能を個々の器官で測定した。シグナルは血液に標準化された。各主要臓器において、シグナルの有意な増加が注射後８時間まで観察され、この時点でペプチドが分解されなかったことが示唆された。図８Ａは肝臓のデータを示す。
【図８Ｂ】心臓のデータを示す。
【図８Ｃ】腎臓のデータを示す。
【図８Ｄ】肺のデータを示す。
【図８Ｅ】脾臓のデータを示す。
【図８Ｆ】胃のデータを示す。
【図８Ｇ】小腸のデータを示す。
【図８Ｈ】大腸（ｃｏｌｏｎ）のデータを示す。
【図８Ｉ】筋肉のデータを示す。
【図８Ｊ】脳のデータを示す。
【図８Ｋ】尾のデータを示す。
【図８Ｌ】マウスに放射性標識ペプチド（０．７７ｎＭ）を皮下注射（ｓｕｂＱ）し、２４時間および４８時間後に血液中の残存活性を測定した。Ｎ＝５〜６。
【図９】Ｐｅｇ−ｎｕｃＸＴＥＲＴのインビボ効果を示す。マウスは、高血圧および内皮機能不全を誘発するために一般に使用されるストレッサーで治療された。ANG II（１０００ｎｇ／ｋｇ／分）の高速加圧投与量を、浸透圧ミニポンプを介して１４日間注入した。動物のサブグループを、ANG IIに加えて、ｎｕｃＸＴＥＲＴ（３０μｇ／日、浸透圧ミニポンプを介して）と共に、同じ持続時間および同じ送達系を用いて共処理した。曲線をヒストリカルコントロール（ビヒクル）と比較した。ANG IIは、アゴニスト誘発内皮依存性拡張（ＡＣｈ、Ａ）またはＦＭＤ（Ｂ）を有意に減少させたが、ｎｕｃＸＴＥＲＴとの併用療法はANG II誘発内皮機能障害の発症を防止した。血管拡張薬パパベリンに応答する平滑筋依存性の拡張は影響を受けなかった（データは示されていない）。＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．ビヒクル一元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、Ｎ＝５。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書に引用された特許および特許出願を含むがこれらに限定されないすべての刊行物および参考文献は、個々の刊行物または参照物が、本明細書中で参考として援用されるように具体的および個別に示されているかのように、完全に述べられている。本出願が優先権を主張するいずれの特許出願もまた、刊行物および参考文献について上に記載された方法で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
全般
【００１８】
ＴＥＲＴ調節異常は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）に関連する血管機能不全を含む多くの血管疾患表現型において重要な役割を果たすこと、およびＭＩ後の成体マウス心臓におけるＴＥＲＴ発現が心臓保護を付与することが知られていたが、癌の状況におけるＴＥＲＴ機能の全体的阻害は、血管および心臓の損傷を含む標的外の毒性をもたらす。
【００１９】
本明細書で提供される組成物および方法は、ペプチド阻害剤投与後に核内のＴＥＲＴ蓄積が有意に減弱するという発見に少なくとも部分的に基づいている。さらに、テロメラーゼ活性に関連する心血管保護の原因であるミトコンドリア関連テロメラーゼ（核テロメラーゼではない）が、ＮＬＳペプチド阻害剤は、ストレスに応答して孤立したヒト血管を損傷から保護し、肺腫瘍細胞の移動を減少させる可能性があることが判明した。テロメラーゼの触媒サブユニットであるＴＥＲＴの核輸送の阻害は、細胞質（ミトコンドリアを含む）テロメラーゼ局在および活性を増加させる。したがって、癌リスクを増大させることなく心臓および血管疾患におけるテロメラーゼ過剰発現の利点を利用する組成物および方法が提供され、毒性の低い方法で癌における核テロメラーゼを阻害する改善された手段を提供する。本明細書で提供されるＮＬＳペプチド阻害剤組成物は、脈管構造および心臓への毒性を最小限に抑えるために、伝統的および標的化された癌療法と組み合わせて使用することができる。
【００２０】
組成物
【００２１】
第１の態様では、テロメラーゼ核局在化シグナル（ＮＬＳ）またはミトコンドリア局在化シグナル（ＭＬＳ）を含む合成ペプチドまたは複数の合成ペプチドが提供され、この合成ペプチドは、細胞内のキナーゼによる修飾のために内因性の局在化シグナルと効果的に競合可能である。本明細書に記載のＮＬＳ含有ペプチド組成物およびＭＬＳ含有ペプチド組成物はそれぞれ、ＴＥＲＴの核およびミトコンドリア機能のみを特異的に阻害する最初のテロメラーゼ阻害剤であると考えられている。
【００２２】
いくつかの場合において、合成ペプチドは、ＴＥＲＴ核局在化／転座の阻害剤である。本明細書に記載のペプチドは、ＴＥＲＴの核機能のみを特異的に阻害する第１のテロメラーゼ阻害剤であると考えられている。ＴＥＲＴの核局在シグナルを模倣することにより、阻害ペプチドは、内因性テロメラーゼが細胞質から核に移動する能力をブロックするか、または弱める。
【００２３】
別の場合において、合成ペプチドは、ＴＥＲＴミトコンドリア局在化阻害剤である。ＴＥＲＴのミトコンドリア局在シグナルを模倣することにより、阻害ペプチドは、内因性テロメラーゼが細胞質ゾルからミトコンドリアに移動する能力をブロックするか、または弱める。
【００２４】
本明細書において、本発明の合成ペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ペプチドである。血液脳関門透過性ペプチドは、脳毛細血管内皮細胞によって形成される血液脳関門を透過するペプチドの能力により特徴付けられる。本明細書で使用する「血液脳関門」または「ＢＢＢ」という用語は、脳毛細血管内皮細胞の膜特性、構造およびタイトジャンクションによって形成される薬物、イオン、ペプチド、タンパク質および毒素の生物学的輸送に対する障害を指す。
【００２５】
本明細書において、用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のアミノ基が第２のアミノ酸のカルボキシル基と結合する化学結合によって結合された２つ以上のアミノ酸からなる任意の有機化合物を含むと広く定義される。本明細書において、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、ならびにアミノ酸部分を含む分子等のアミノ酸類似体および誘導体を含む天然に存在しないアミノ酸も含むと広く定義される。したがって、本明細書において、用語「アミノ酸」は、例えば、天然に存在するプロテオジェニックＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸類似体および誘導体等の化学的に修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等の天然に存在する非タンパク性アミノ酸；天然でないβ−アミノ酸、非天然側鎖を含むもの、およびＤ−アミノ酸ならびにインベルソおよびレトロインベルソペプチド配列を含む、アミノ酸に特徴的な当該分野で公知の特性を有する化学的に合成された化合物を含む。
【００２６】
いくつかの場合において、合成ペプチドは、ホスホミメティックペプチドであり、ペプチドが、天然に存在するリン酸化アミノ酸の代わりに、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）等の「ホスホミメティック」アミノ酸を含むことを意味する。細胞内では、タンパク質は、一般に、リン酸基を付加することによって、セリン、チロシン、およびトレオニンのアミノ酸で修飾される。本発明のホスホミメティック（「ホスホミミッキング」とも呼ばれる）ペプチドは、リン酸化残基（例えば、セリン残基）を負に荷電したアミノ酸残基（リン酸基の負電荷を模倣する）で置換することによって得ることができ、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）として存在する。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、リン酸化されたセリン（「ホスホセリン」）と化学的に類似している。例えば、アスパラギン酸がセリンを置換する場合、それはホスホセリンのホスホミメティックであり、得られたペプチドは常にそのリン酸化形態であり、したがって構成的に活性である。いくつかの場合において、本明細書で提供されるホスホミメティックなペプチドは、配列番号２（ＲＲＲＧＧＥＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）に示されるアミノ酸配列を有する。実施例の節においてｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅと呼ばれるこのペプチドは、配列番号１の６位に見出されるセリン残基の代わりにグルタミン酸（Ｅ）を含む（ＲＲＲＧＧＳＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）。別の場合において、本明細書で提供されるホスホミメティックペプチドは、配列番号７（ＲＲＲＧＧＤＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）に示されるアミノ酸配列を有し、このペプチドは、配列番号１の６位のセリン残基の代わりにアスパラギン酸（Ｄ）を含む。配列番号１の６位のセリン（実施例の節ではｎｕｃＸＴＥＲＴ／ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｗと呼ばれる）は、テロメラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列（ＯＭＩＭ  ＩＤ１８７２７０；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ３００３７．１）の２２７位に対応する。野生型テロメラーゼ配列の２２７位のセリンのリン酸化は、テロメラーゼの核内導入を可能にする。
【００２７】
いくつかの場合において、合成ペプチドは配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）に示される配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）相同であるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであり、ここで、Ｘ1は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるホスホミメティック残基であり、単離されたペプチドはＴＥＲＴ核移行を防止することができ、かかるペプチドは２０アミノ酸未満である。
【００２８】
特定の実施態様では、本明細書に記載されているようなホスホミメティックペプチドは、医薬品としての使用または１つ以上の治療剤との併用のために提供される。より具体的な実施態様によれば、このようなホスホミメティックペプチドは、酸化ストレスを軽減または緩和するために、または末梢血管疾患を含む心臓および／または血管疾患の治療における癌の治療における使用のために提供される。末梢血管疾患としては、肥大、糖尿病性網膜症、脂肪血管疾患および他の血管床が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
別の場合において、本明細書で提供される合成ペプチドは、ホスホ欠損（phospho-deficient）であり、アミノ酸置換は、得られたペプチドまたはポリペプチドからリン酸化アミノ酸を除去する。例えば、ホスホ欠損ペプチドは、配列番号１に記載のペプチド配列中のリン酸化アミノ酸の代わりにアラニンなどの非リン酸化可能アミノ酸残基の置換を含んでもよい。特定の実施態様では、本明細書で提供されるようなリン酸化不全合成ペプチドは、配列番号３（ＲＲＲＧＧＡＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）に示されるアミノ酸配列を有する。実施例の節においてｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ａと呼ばれるこのペプチドは、配列番号１の６位のセリン残基の代わりにアラニン（Ａ）を含む（ＲＲＲＧＧＳＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）。上記のように、配列番号１の６位のセリン（実施例の節ではｎｕｃＸＴＥＲＴ／ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｗと呼ばれる）は、テロメラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の２２７位に対応する（ＯＭＩＭ  ＩＤ１８７２７０；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ３００３７．１）。
【００３０】
いくつかの場合において、本明細書で提供される合成ペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部位を含む。そのようなペプチドは、本明細書ではＰＥＧ化ペプチドと呼ばれる。本明細書で使用される「ＰＥＧ化」という用語は、ＰＥＧ化によって本明細書で提供されるペプチドへのポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）残基の共有結合を指す。いくつかの場合において、ペプチドは、生体安定性および細胞透過性を増加させるために、Ｎ末端および／またはＣ末端でＰＥＧ化される。例えば、本発明の合成ペプチドはＰＥＧ化アミノ酸配列を有してもよい（Ａｃ−ＣＧＧＲＲＲＧＧＥＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ−ｐｅｇ１２−アミド、ここで、「Ａｃ」はＮ−末端分解を防止することによりペプチドの安定性を増加させることができるアセチル化を意味する）。ペプチドのＮ末端システインのアセチル化は、誘導体Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを形成する。
【００３１】
本明細書で使用する「ＰＥＧ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端におけるポリ（エチレングリコール）残基および／または内部リジン残基の共有結合を意味する。タンパク質のＰＥＧ化は、従来技術において広く知られており、例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２２（２００１）４０５−４１７に概説されている。ＰＥＧは、異なる分子量、直鎖状、分岐状、および分岐ＰＥＧと同様に異なる連結基を有する異なる官能基およびポリエチレングリコールを用いて連結することができる（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６８（１９９８）１−１８；Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｃ．，ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ９（１９９２）２４９−３０４を参照のこと）。本明細書で使用される「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」または「ポリ（エチレングリコール）」という用語は、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を指し、構造−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−（ここで、ｎは２〜約８００の整数である）を含有する分子を含む。一般的に使用されるＰＥＧはエンドキャップされたＰＥＧであり、ＰＥＧの一方の末端はアルコキシのような比較的不活性な基でキャップされ、他方の末端はさらに修飾されていてもよいヒドロキシル基である。しばしば使用されるキャッピング基はメトキシであり、対応する末端キャップＰＥＧはしばしばｍＰＥＧと呼ばれる。ｍＰＥＧの代わりにＰＥＧという概念がしばしば用いられる。
【００３２】
一般に、ＰＥＧ化反応で使用されるＰＥＧポリマー分子は、約１０ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有する（本明細書で使用される「分子量」とは、高分子化合物としてのＰＥＧが定義された分子量では得られないが実際には分子量分布を有するので、ＰＥＧの平均分子量と理解されるべきである。「約」という用語は、前記ＰＥＧ調製物において、いくつかの分子が、示された分子量よりも多く、そしてある程度よりも軽く、すなわち、用語「約」は、ＰＥＧ分子の９５％が示された分子量の＋／−１０％以内の分子量を有する分子量分布を指す）。
【００３３】
ＰＥＧは、多くの水性および有機溶媒中で良好な溶解性を有する周知のポリマーであり、毒性が低く、免疫原性がなく、透明、無色、無臭、安定である。これらの理由および他の理由から、ＰＥＧは付着（attachment）のための好ましいポリマーとして選択されてきたが、説明のためのみに用いるものであり、これに限定するものではない。類似の製品は、他の水溶性ポリマーを用いて得ることができ；ポリ（プロピレングリコール）などの他のポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化グリセロール）などのポリ（オキシエチル化ポリオール）、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルパロリドン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸、およびポリアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、および他の考察に基づいて所望のポリマーを選択しうるだろう。
【００３４】
多種多様なＰＥＧ誘導体は、市販されており、本発明のＰＥＧ結合ペプチドの調製に使用するのに適している。適切なＰＥＧ誘導体は、約５〜約４０ｋＤａ、一実施態様では約２０〜約４０ｋＤａ、好ましくは約３０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は、一実施態様では、直鎖状ＰＥＧまたは分枝状ＰＥＧである。本明細書で提供されるＰＥＧ化ペプチドの調製における使用に適した多種多様なＰＥＧ誘導体は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ）から入手可能である。
【００３５】
別の場合において、本明細書で提供される合成ペプチドは、ミリストイル化によりミリストイル基を含んでもよい。本明細書で使用される「ミリストイル化された（myristoylated）」および「ミリストイル化（myristoylation）」という用語は、ミリスチン酸に由来するミリストイル基がＮ−結合グリシン残基のα−アミノ基にアミド結合によって共有結合されている脂質修飾を指す。ミリストイル基は１４炭素飽和脂肪酸（Ｃ１４）であり、膜に十分な疎水性および親和性を付与するが、膜中にタンパク質を恒久的に固定するには不十分である。一般的に、Ｎ−ミリストイル化は、タンパク質コンフォメーション変化がペプチドまたはポリペプチドの膜結合に対する親和性に影響を及ぼすコンフォメーションの局在化スイッチとして作用する。この条件付き局在のために、膜に選択的に局在するシグナルタンパク質、例えばＳｒｃファミリーキナーゼは、Ｎ−ミリストイル化されて（N-myristoylated）いる。
【００３６】
本明細書で提供されるペプチドとの使用に適切な他のペプチド修飾には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ならびにシステインリンカーまたはスペーサーなどのペプチドリンカーの付加が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド修飾は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端で起こり得る。例えば、ペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾して、本発明の他の化合物を生成することができる。アミノ末端修飾には、メチル化（すなわち、−ＮＨＣＨ3または−Ｎ（ＣＨ3）2）、アセチル化（例えば、酢酸、またはα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸、あるいはα−ヨード酢酸等の酢酸のハロゲン化誘導体によるアセチル化）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基の付加、またはアミノ末端をＲＣＯＯ−で定義されるカルボキシレート官能基、またはＲ−ＳＯ2−で定義されるスルホニル官能基を含むブロッキング基、および類似の基でブロックすることが挙げられ、ここでＲは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、および類似の置換基から選ばれる。あるいは、プロテアーゼに対する感受性を低下させるために、またはペプチド化合物の立体配座を制限するために、Ｎ末端にデスアミノ酸を組み込むこともできる（Ｎ末端アミノ基が存在しないように）。好ましい実施態様において、Ｎ末端はアセチル化される。最も好ましい実施態様では、Ｎ−末端グリシンをアセチル化してＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）を得る。
【００３７】
いくつかの場合において、スペーサーまたはシステイン（Ｃｙｓ）リンカー等のリンカーは、本明細書で提供されるペプチドに種々の部位（例えば、放射性標識結合部位、キレート部位、スペーサー部位）またはカーゴ分子（例えば、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、抗体、または薬物）を結合するのに用いられる。例えばペプチドは、テクネチウム−９９ｍ等の放射性同位体と安定に複合体を形成している、放射性標識結合部位に共有結合させることができる。一般に、リンカー配列は、カーゴ分子に対するペプチドの化学結合を可能にする。いくつかの場合において、リンカー配列はペプチドを貨物から分離するためのスペーサーとして作用する。Ｃｙｓ含有リンカー配列に関して、システイン残基は、ジスルフィド、チオエーテル、またはチオール−マレイミド結合の形成を可能にする。好ましくは、アミノ酸スペーサーおよびカーゴ分子は、共有結合によって化学的に連結される。
【００３８】
別の態様では、本明細書は、ＴＥＲＴミトコンドリア局在の阻害剤である合成ペプチドを提供する。ＴＥＲＴのミトコンドリア局在シグナルを模倣することにより、阻害ペプチドは、内因性テロメラーゼが細胞質ゾルからミトコンドリアに移動する能力をブロックするか、または弱める。いくつかの場合において、ＴＥＲＴミトコンドリア局在を阻害する合成ペプチドは、配列番号５（ＭＰＲＡＰＲＣＲＡＶＲＳＬＬＲＳＨＹＲＥ）に示されるアミノ酸配列を有するペプチドである。このペプチドは、実施例ではｍｉｔｏＸＴＥＲＴと呼ばれる。
【００３９】
本発明のペプチドは、標準的な固相技術を用いてなど、生化学的に合成することができる。これらの方法は、排他的固相合成、部分固相合成法、フラグメント凝縮、古典的溶液合成を含む。これらの方法は、ペプチドが比較的短い場合（すなわち１０ｋＤａ）、および／またはペプチドが組換え技術では産生されない（すなわち、核酸配列によってコードされない）ため、異なる化学的性質（chemistry）を含む場合に好ましく用いられる。
【００４０】
固相ポリペプチド合成手順は当該技術分野において周知であり、さらにＪｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４）に記載されている。
【００４１】
合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｎ．Ｙ．）により精製することができ、その組成はアミノ酸配列決定によって確認できる。
【００４２】
組換え技術も、本発明のペプチドおよび／またはポリペプチドを生成するために使用することができる。組換え技術は、比較的長いポリペプチド（例えば、２０アミノ酸より長い）および大量生産に適しているので、ペプチドが異種タンパク質（すなわち、融合タンパク質）に連結される場合に適している。そのような組換え技術は、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１，Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３、Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５、およびＷｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１−４６３を参照のこと。異種タンパク質の例を以下に示す。
【００４３】
組換え技術を用いて本発明のペプチドおよび/またはポリペプチドを産生するために、本発明の核標的ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞における本発明のポリペプチドの構成的、組織特異的または誘導性転写を指向するのに適したシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を含む核酸発現ベクターに連結される。
【００４４】
挿入された（ポリペプチドをコードする）コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むほか、本発明の発現構築物はまた、発現されたペプチドの安定性、産生、精製、収量、または活性を最適化するように操作された配列を含み得る。
【００４５】
したがって、本発明のペプチドおよび／またはポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、および微量可溶化などの様々な標準タンパク質精製技術を用いて精製することができるが、これらに限定されない。
【００４６】
回収を促進するために、発現されたコード配列を操作して、本発明のポリペプチドをコードし、切断可能な部位を融合させることができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって容易に単離されるように、例えば、切断可能な部位に特異的なカラムで固定化することにより設計できる。切断部位がポリペプチドと切断可能部位との間で操作される場合、ポリペプチドは、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素または薬剤による処理によって、クロマトグラフィーカラムから放出される（例えば、Ｂｏｏｔｈら，Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｌｅｔｔ．１９：６５−７０（１９８８）；およびＧａｒｄｅｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）を参照のこと）。
【００４７】
本発明のペプチドおよび／またはポリペプチドは、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書において、「実質的に純粋な」という句は、本明細書に記載の用途におけるタンパク質の有効な使用を可能にする純度をいう。
【００４８】
「単離された」とは、天然の状態で通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。例えば、本明細書において、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」等は、その天然の細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から生じるペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロ単離および／または精製を含み、すなわちインビボ物質との有意な関連はない。
【００４９】
使用方法
【００５０】
本明細書は、本明細書に記載の１つ以上のＴＥＲＴ局在化阻害剤を用いる治療法を提供する。
【００５１】
一態様では、癌治療に関連する心毒性（例えば、化学療法剤による治療）を減少させる方法であって、本方法は、ＴＥＲＴ核移行の阻害剤を対象に投与するか、化学療法剤の投与中に投与することができる。いくつかの場合において、ＴＥＲＴ核局在化阻害剤は、そのような化学療法剤に伴う心臓および血管毒性を低下させるために、１つまたは複数の化学療法剤と連続的にまたは同時に投与される。心臓および血管の毒性に関連する化学療法剤としては、限定するものではないが、テロメラーゼを阻害するもの、ならびにドキソルビシン、およびチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。ＴＥＲＴを直接的に標的としない抗癌剤は、一般に酵素を阻害し、その結果、標的外効果を引き起こし得る。ＴＥＲＴ核局在化阻害剤の投与は、そうでなければ用量を制限する心臓および血管の毒性を低下させる。
【００５２】
核テロメラーゼ活性は、多くの腫瘍を化学療法に対して感受性にさせない重要な化学療法抵抗性機構である細胞および腫瘍のオートファジーの活性化にとって重要である。任意の特定の機構または作用様式に拘束されることなく、ＮＬＳペプチド阻害剤および他のＴＥＲＴ核局在化阻害剤は、テロメラーゼの核機能を低下または消失させながらミトコンドリアＴＥＲＴ機能を保存すると考えられる。実施例に記載されているように、テロメラーゼの核機能は、細胞の形質転換および腫瘍形成にとって重要である。したがって、化学療法を受ける対象にＴＥＲＴ核局在化阻害剤を投与すると、心臓および血管組織を化学療法関連の毒性から保護しながら、化学療法薬の有効性を高めることができる。
【００５３】
別の態様では、酸化ストレスに関連する酸化ストレスおよび代謝効果を緩和する方法であって、この方法は、本明細書で提供されるＴＥＲＴ核局在化を阻害するペプチドの治療有効量を対象に投与することを含み、またはそれによって、ペプチドの投与はミトコンドリア機能を高める。いかなる特定の機構または作用様式にも束縛されることなく、ＮＬＳペプチド阻害剤および他のＴＥＲＴ核局在化阻害剤は酸化ストレスを減少させ、ミトコンドリアＤＮＡ損傷を減少させると考えられている。酸化ストレスを緩和する手段として、本明細書に記載のペプチドおよびその誘導体は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、および他の神経変性状態を含む重大な酸化ストレス成分を伴う疾患の治療および改善において有用であり得る。
【００５４】
さらなる態様では、本明細書は、アンジオテンシンＩＩの投与に関連する負の血管収縮作用を軽減又は改善するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＴＥＲＴ核局在化を阻害するペプチドを、アンギオテンシンＩＩを投与する前、投与中、または投与後の対象に、投与することを含むか、本質的に投与することのみからなる（consists essentially）。以下の実施例に記載されているように、冠状動脈および脂肪血管は、本明細書に記載のＮＬＳペプチド阻害剤の存在下でアンギオテンシンＩＩの血管収縮特性に対して影響を受けにくい。アンギオテンシンＩＩ（ANG II）は、いくつかの高血圧状態を含む多くの異なる病状において上昇する。このように、本明細書に記載のペプチド阻害剤およびその誘導体は、慢性および急性高血圧症の治療に有用であり得る。
【００５５】
別の態様では、本明細書は、ＴＫＩ療法を受けている対象におけるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）療法の有害またはオフターゲット効果を減少させる方法を提供する。慢性骨髄性白血病などのいくつかの悪性疾患では、持続性チロシンキナーゼ阻害剤療法は長期の寛解を維持する。しかしながら、ＴＫＩは、患者がより長く生き続けるにつれて血管副作用を有することが、ますます認識されている。さらに、ＴＫＩ療法は、長年にわたり失敗している、おそらく腫瘍細胞がオートファジーを誘導することによってＴＫＩ療法による破壊を回避することができるためである。ＴＫＩの有害またはオフターゲット効果を減少させる方法は、それを必要とする対象にＴＥＲＴ核局在化阻害剤を投与することを含むか、または本質的に投与することのみからなり、投与は脈管構造に対するＴＫＩのオフターゲット効果を予防、治療、または改善する。
【００５６】
別の局面では、本明細書は、腫瘍転移を治療または予防する方法を提供する。また、本明細書は、腫瘍細胞移動を減少または阻害するための方法も提供する。この方法は、ＴＥＲＴ核局在化阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含むか、または本質的に投与することのみからなり、それにより脈管構造に対するＴＫＩのオフターゲット効果を予防、治療、または改善する。
【００５７】
別の態様では、本明細書は、心疾患を治療する方法を提供する。ＴＥＲＴ核局在化阻害剤の投与は、これらに限定されないが、冠状動脈疾患、高血圧、および心筋梗塞を含む心不全または心疾患（cardiac conditions and disorders）を、治療または予防するのに有効である。したがって、本明細書は、心不全または心疾患を予防または治療する方法であって、ＴＥＲＴ核移行の阻害剤を、素因労作に関連した心筋梗塞を発症した対象、血流依存性血管拡張反応の結果として心筋梗塞を発症する傾向がある対象、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）を有する対象、または正常な心血管を有し心疾患または心不全を発症した対象に、投与することを含むか、または本質的に投与することのみからなる方法を提供する。いくつかの場合において、この方法はさらに、心筋梗塞（ＭＩ）後に対象を治療することを含む。
【００５８】
別の態様では、本明細書は、内皮機能不全を予防または治療する方法であって、治療有効量のＴＥＲＴ核局在化阻害剤を、対象に投与することを含むか、または本質的に投与することのみからなる方法を提供する。内皮機能不全は、バリア機能の喪失および血管壁への細胞物質の浸潤および生理学的血管緊張の消失を特徴とする。本明細書において、「内皮機能障害の治療」への言及は、内皮機能障害に関連する疾患の処理における内皮機能の改善への言及として考慮されるべきである。そのような疾患としては、例えば一過性脳虚血発作、脳卒中、アンギナ、心筋梗塞、心不全、および末梢血管疾患等の大血管疾患（大きな血管に関する）、ならびに例えば糖尿病性網膜症（非増殖性、増殖性、黄斑浮腫）、ミクロアルブミン尿症、マクロ蛋白尿、末期腎臓病、勃起障害、自律神経障害、末梢性神経障害、骨髄炎および下肢虚血等の微小血管性疾患（小さな血管に関する）が挙げられる。ＴＥＲＴ核局在化阻害剤の投与は、対象における内皮機能を改善することができ、いくつかの場合において、損傷した血管の血管痙攣によって誘発される狭心症を治療することができる。本明細書で提供される方法が特に有用である他の疾患および状態としては、内皮機能不全に関連する疾患および状態が挙げられる。冠動脈疾患（ＣＡＤ）、微小血管疾患、虚血性疾患、末梢動脈疾患、血管痙攣（例えば、プリンツメタル狭心症）によって誘発される狭心症、前糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜症、子癇前症、および慢性腎疾患が挙げられる。この方法による治療は、内皮機能不全を伴う慢性の心臓および血管の病状を治療または予防する。
【００５９】
好ましくは、この方法は、冠動脈内皮機能不全（ＣＥＤ）を予防または治療する。いくつかの場合において、対象はＣＥＤを有すると診断され、ＣＥＤの疑いがあり、その結果、冠動脈疾患またはＣＡＤのリスクを予防または軽減するために治療の必要があると同定される。一旦ＣＥＤを有すると同定されるか、またはＣＥＤを有する疑いがある場合、対象はＣＡＤ事象を発症するリスクを予防または低減するために、ＴＥＲＴ核局在化阻害剤で治療され得る。
【００６０】
いくつかの場合において、ＴＥＲＴ核局在化阻害剤は、規定された期間にわたって１回以上投与される。好ましい実施態様では、阻害剤の短期投与が適切である。別の場合において、ＴＥＲＴ核局在化阻害剤の標的送達は、対象への投与時の全身暴露を制限するために好ましい。
【００６１】
治療剤の有効量は、使用される特定の作用物質の活性、投与の頻度、治療期間、治療される状態の重篤度、および疾患の状態および治療されている哺乳動物の病歴などの様々な要因に依存し得る。有効用量より低い用量を最初に哺乳動物に投与することができ、所望の効果が達成されるまで経時的に用量を徐々に増加することができる。
【００６２】
別の態様では、本明細書は、内皮機能を調節する方法であって、対象に、ＴＥＲＴミトコンドリア移行阻害剤の有効量を投与することを含むか、または本質的に投与することのみからなる方法であることにより、ＴＥＲＴミトコンドリア移行阻害剤の投与が、対象における内皮機能を調節する。
【００６３】
投与の頻度および持続時間は、毒性なしに、例えばＣＥＤの症状を改善する任意の頻度または持続時間とすることができる。例えば、治療剤は１日１回または２回、１日おきに１回、週に１回または２回、あるいは必要に応じて投与することができる。投与の頻度は、一定でも良いし治療期間中に変えてもよい。有効な治療期間は、数週間から数ヶ月または数年の範囲で変えることができる。例えば、有効な治療期間は、６ヶ月、５年、または生涯とすることができる。さらに、治療のコース（a course of treatment）は休薬期間を含んでもよい。複数の要因が、有効な頻度および治療期間に、実際に影響を及ぼす可能性がある。例えば、使用される特定の治療剤の活性、治療される状態の重篤度、投与される用量、および治療される哺乳動物の状態および病歴は、治療の有効頻度および持続期間に影響し得る。
【００６４】
本明細書で提供される組成物は、主に経口、静脈内、非経口、舌下、または経皮的に投与することができる。対応する薬剤組成物は、好ましくは液体または固体の形態で製造される。溶液は、この目的、特に滴剤、注射剤、またはエアロゾルスプレーの調製に適しており、さらに懸濁液、エマルジョン、シロップ、錠剤、フィルム錠剤、コーティング錠、カプセル、ペレット、散剤、トローチ剤、インプラント、坐剤、クリーム、ゲル剤、膏薬、硬膏剤、または他の経皮システムが挙げられる。
【００６５】
用語「約（about）」または「約（approximately）」は、当業者によって決定されるような特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの限界に部分的に依存する。例えば「約（about）」は、当該技術分野において、１回の標準偏差または１を超える標準偏差を意味する。あるいは、組成物に関する「約（about）」は、プラスまたはマイナス２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％までの範囲を意味することができる。
【００６６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「分子」への言及は、そのような分子の１つ以上を含み、「試薬」は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「抗体」への言及は、１つ以上のそのような抗体を含み、「方法」は、本明細書に記載の方法および医薬組成物を修飾または置換することができる当業者に公知の同等の工程および方法への言及を含む。
【００６７】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の多くの変形が、上記の詳細な説明に照らして当業者に示唆されるであろう。そのような明らかな変更はすべて、添付の特許請求の範囲の意図された範囲内である。以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００６８】
実施例
テロメラーゼの過剰発現は、心臓および血管の保護に関連する（Ｂａｒら，２０１４）が、特定の細胞型におけるテロメラーゼ酵素の再活性化は、細胞の不死化および増殖におけるテロメラーゼの役割を考慮すると、発癌性形質転換における重要な事象であり得る。心臓および血管疾患の予防および改善におけるテロメラーゼ再活性化の有益な効果の基礎となる機構は、この点については不明である。本明細書では、ミトコンドリア関連テロメラーゼおよび核テロメラーゼがテロメラーゼ活性に関連する心血管保護の原因であるという発見を報告する。本発明者らは、テロメラーゼ局在を特異的に変化させることができる新規なペプチド治療薬を開発した。テロメラーゼの触媒サブユニットであるＴＥＲＴの核輸送の阻害は、細胞質（ミトコンドリアを含む）テロメラーゼの局在化、そしてより重要なことに活性を増加させる。これは、癌リスクを増加させることなく、心臓および血管疾患におけるテロメラーゼ過剰発現の利点を活用する戦略を表し、毒性の低い方法で癌の核テロメラーゼを阻害する全く新しい斬新な手段を提供する。さらに、これらの新規治療剤は、脈管構造および心臓への毒性を最小限に抑えるために、伝統的および標的化された癌療法と組み合わせることができる。我々のデータは、テロメラーゼ局在の調節が、慢性および急性状態の両方を含む微小血管、血管および心疾患を治療する全く新しい方法の基礎であり得ることを示唆している。具体的には、ＴＥＲＴのミトコンドリア移行の増加（核移行を阻害することによる）が、アンギオテンシンＩＩ（ANG II）誘発内皮機能障害および酸化ストレスの予防、いくつかの心臓血管イベントのための十分に確立された予測因子を含む有益な効果を有することを示す。
【００６９】
（実施例１）テロメラーゼ局在を調節するためのペプチドの使用：
血管機能および疾患に対する示唆
【００７０】
方法
【００７１】
デコイペプチドの開発：テロメラーゼＮＬＳを包含するデコイペプチドは、以前に行われたテロメラーゼＮＬＳの特徴付けに基づいて設計された（Ｃｈｕｎｇら，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，２０１２．１２５（Ｐｔ１１）：ｐ．２６８４−９７）。ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ；ＵｎｉＰｒｏｔＯ１４７４６）のアミノ酸配列に基づいてペプチド配列を設計した。
【００７２】
ペプチドの合成および取り扱い：ペプチド合成は、ＧｅｎｅＭｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）によって行った。すべてのペプチド配列を質量分析法によって確認し、９５％を超える純度でのみ使用した。凍結乾燥したペプチドを−２０℃で保存した。これらの研究で使用されたペプチドの電荷特性を考慮し、使用されるすべてのペプチドを溶解するために選択される溶媒としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を選択した。ＰＢＳ中のペプチドの溶解に続いて、ペプチドアリコート（凍結／融解サイクルを最小にするため）を−８０℃で保存した。標識ペプチドを用いた実験のために、５−カルボキシフルオレセインタグをＧｅｎｅＭｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓによって行われた合成プロセスでペプチド（Ｎ末端）に付加した。特定のペプチド配列を以下の表１に詳述する。
【００７３】
【表１】
2018532381.tif 000002
【００７４】
微小血管選択：主に脂肪からなる外科的廃棄組織から微小血管を切開した。さらなる研究のために、直径が３００マイクロメートル未満の血管のみを選択した。すべての微小血管は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのウィスコンシン州立メディカルカレッジのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ承認プロトコル（ＰＲＯ０００００１１４，ＰＲＯ０００１０８２８，ＰＲＯ００００１０９４）に従い、廃棄手術組織から得た。
【００７５】
解剖後、血管を、記載されたペプチドを含むかまたは含まない５％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）を補充した完全内皮細胞培地中で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、ペプチドを洗い流し、血管にカニューレを挿入し、生理食塩水に移した。ビデオ顕微鏡検査のセットアップにより、リアルタイムで血管のモニタリングが可能になった。血管は０．１〜１ｎＭの用量範囲でエンドセリン−１（ＥＴ−１）で予め狭窄させた。ベースラインから少なくとも２０％収縮可能な血管のみが本研究に用いた。次に、血流依存性血管拡張（ＦＭＤ）およびＡｃｈ誘発性拡張を評価し、その後、パパベリンに対する内皮非依存性拡張を評価した。ベースラインを確立した後、血管を再度ＥＴ−１で狭窄させ、以下に記載するようにアンジオテンシンＩＩ（ANG II）の存在下で繰り返す拡張曲線を繰り返した。
【００７６】
ＦＭＤは、２つのリザーバの高さを等しく反対方向に調節して、血管の中心圧力を変化させることで流れを発生させることによって評価した。圧力勾配の各変更後、血管の直径を測定し、ビデオ顕微鏡法を用いて評価した。ＦＭＤを測定する前に、試験したすべての血管を、エンドセリン−１を用いて予め収縮させた。
【００７７】
記載されている場合、薬理学的薬剤Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ；１００μｍｏｌ／Ｌ）およびポリエチレングリコール−カタラーゼ（ＰＥＧ−ｃａｔａｌａｓｅ；５００Ｕ／ｍＬ）を用いて、血管拡張のＮＯに対する過酸化水素シグナリングの依存性を評価した。
【００７８】
ＡＮＧ  ＩＩ  処理：上記のように、ＦＭＤに応答して拡張する能力を含むベースライン血管パラメータを評価した。評価後、血管を最終濃度１０ｎＭのANG IIで３０分間処理した後、ＦＭＤおよびＡＣｈに対する応答を再評価した。
【００７９】
細胞培養：ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞系をこの原稿に記載された細胞培養実験に使用した。細胞は１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。
【００８０】
細胞分画：処理したＨ１２９９細胞を、ＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて核および非核成分に分画した。
【００８１】
ｄｄＰＣＲ  ＴＲＡＰアッセイ：ＮｕｃＸＴＥＲＴペプチドで一晩処理したＨ１２９９細胞由来の細胞溶解物を得て、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＮＥ：Ｐｅｒキットに確立されたプロトコルに従って分画し、核および非核画分を生じた。修飾された定量的テロメラーゼ反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰアッセイ）を行った。簡潔には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＮＥ：Ｐｅｒプロトコルで単離された非核画分由来の核画分由来の２μｇの溶解産物および４μｇのタンパク質溶解産物を、先に記載したＴＳオリゴヌクレオチドとインキュベートし、Ｋｉｍらによって記載された元の手順をわずかに変更して生成物の伸長を生じさせた。繰り返して生成した後、油：水エマルジョンを使用して分析用の個々の液滴を生成するＱＸ２００（ＢｉｏＲａｄ）液滴発生器を使用しサンプルを液滴生成に供した。次いで、標準的なサーマルサイクラーを使用してサンプルをＰＣＲし、Ｋｉｍらによって概説された条件を実施した。ＰＣＲ後、サンプルをＱＸ２００液滴リーダーにロードし、液滴をサンプリングして、個々の各サンプル中に存在する陽性液滴の割合を決定した。
【００８２】
ウェスタンブロット：上記のように、Ｈ１２９９細胞を核および非核区画に分画した後、タンパク質溶解物を調製した。分画後、各試料内のタンパク質を、ＢＣＡアッセイを用いて定量した。各画分から３０μｇのタンパク質を得た。溶解物を煮沸し、変性させた。ローディング色素を含むサンプルを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに充填した。１１０Ｖの電流を７５分間流してタンパク質をサイズにより分離した。次いで、タンパク質をＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）に、氷上で冷却しながら１００Ｖで２時間移した。トランスファー後、Ｔｗｅｅｎ−２０Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）に溶解した１０％粉末ブロッキング試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて室温で２時間膜をブロックした。ブロッキング後、膜を、５％ブロッキング剤ＴＢＳＴに溶解した一次抗体（抗ＨＳＴＴ（ウサギ）、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、１：５００、抗ＧＡＰＤＨ（ウサギ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１，０００、抗ヒストンＨ３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１，０００）と、４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、膜をＴＢＳＴで完全に洗浄し、抗ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１：５０００希釈で２時間インキュベートした。完全に洗浄した後、膜をフェムト検出溶液（ｈＴＥＲＴ；ＨｉｓｔｏｎｅＨ３）またはＢｉｏＲａｄ  ＥＣＬ溶液（ＧＡＰＤＨ）と共にインキュベートした。次いで、膜を、ＥＣＬ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて画像化した。
【００８３】
結果
【００８４】
ｎｕｃＸＴＥＲＴ阻害剤は生体組織によって効果的に取り込まれる：テロメラーゼ局在を変化させる新規ペプチドの能力を評価する際に考慮すべき最初のハードルの１つは、生体組織によって内在化される能力である。ｎｕｃＸＴＥＲＴを５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）で標識した。５−ＦＡＭ標識ペプチドと共にインキュベートした単離したヒト微小血管を顕微鏡で分析した。ペプチドでパルス処理された血管には堅牢なシグナルが存在するが、ペプチドで処理されていない血管はシグナルがない。同様に、ヒト非小細胞肺癌（Ｈ１２９９）細胞を用いたインビトロ実験は、標識されたペプチドが細胞内に効率的に移動することを確認する。さらに、ペプチドは、核周辺での局在が確認される（図２）。ペプチドは血管によって取り込まれるので、方法に記載されるヒトの微小血管を用いて、血管生理学に対するペプチド処理の効果を研究することが可能であった。表２は、本章で行った残りの実験のために微小血管を単離した患者の特徴を詳述する。
【００８５】
【表２】
2018532381.tif 000003
【００８６】
ｎｕｃＸＴＥＲＴ阻害剤はテロメラーゼ局在を変化させる：図１および２に示すテロメラーゼ活性アッセイならびにウェスタンブロッティングは、ｎｕｃＸＴＥＲＴペプチドでパルスされたＨ１２９９細胞がテロメラーゼの核レベルを弱めることを明らかにする。これは、ＴＲＡＰアッセイ（図３Ｂ）で測定されるように、テロメラーゼ活性の低下に反映される。さらに、ｎｕｃＸＴＥＲＴによる処理は、非核区画内のテロメラーゼの蓄積を増加させる。
【００８７】
ｎｕｃＸＴＥＲＴは、ヒト微小血管をストレス因子から保護する：単離されたヒト微小血管をｎｕｃＸＴＥＲＴで前処理し、いくつかの疾患病理（肥満、高血圧、腎不全、ＣＡＤをいくつか挙げる）に関与する強力な血管収縮剤、および血管ストレッサーであるアンジオテンシンＩＩ（ANG II）を投与した。血管拡張は、増加した管腔内流（血流依存性血管拡張または「ＦＭＤ」）、または内皮依存性アゴニストアセチルコリン（ＡＣｈ）を使用して誘発した。平滑筋依存性、および内皮細胞非依存性の拡張は、パパベリンを用いて試験した。ANG IIによる微小血管の治療効果は、最大直径の比率で測定されるように、アセチルコリンおよびフローの両方に対する血管拡張剤応答を有意に減少した。グローバルなテロメラーゼ活性の、既知の特異的阻害剤であるＢＩＢＲ１５３２（Ｐａｓｃｏｌｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００２）による微小血管の治療は、血管が血流刺激に応答して拡張し続けても、アセチルコリン（図４Ａ、右上）に応答する血管拡張を効果的に排除する（図４Ｂ、右上）。血管をｎｕｃＸＴＥＲＴで前処理する場合、ＡＣｈまたは血流刺激のいずれかに応答する血管拡張は、ANG II処理の影響を受けない。しかし、ｎｕｃＸＴＥＲＴおよびＢＩＢＲ１５３２での処理は、ｎｕｃＸＴＥＲＴの血管拡張剤保護効果を効果的に排除し、ANG II処理に応答してベースライン血管拡張を維持するために触媒テロメラーゼ活性が必要であることを示唆している。
【００８８】
興味深いことに、血管をｍｉｔｏＸＴＥＲＴ阻害剤であるテロメラーゼＭＬＳの領域を含むデコイペプチドで前処理すると、血流またはＡＣｈ刺激のいずれかによるANG IIストレスからの内皮の保護は観察されない。我々は、これがこのペプチドがミトコンドリアへの持込のためにテロメラーゼと競合する能力に起因すると仮定する。しかしながら、ｍｉｔｏＸＴＥＲＴがテロメラーゼタンパク質のミトコンドリア蓄積に影響を及ぼすことができるかどうかを示すために、ミトコンドリア分画およびテロメラーゼ発現のためのウェスタンブロッティングを含むさらなる研究が必要である（図４Ａ〜４Ｂ、左下パネル）。
【００８９】
したがって、本発明者らのインビボおよびエキソビボデータは、ｎｕｃＸＴＥＲＴおよびｍｉｔｏＸＴＥＲＴペプチドが、有意な心臓および血管の損傷を引き起こし、高血圧および他の多くのＣＶ疾患状態に関連するアンギオテンシンＩＩ（ANG II）の有害な心臓効果に拮抗することを実証する。
【００９０】
ｎｕｃＸＴＥＲＴ改変ペプチドは、脈管構造を差異的に保護する：ＴＥＲＴ活性の全体的阻害がストレス誘発内皮機能障害に対する感受性を増加させ、心血管転帰に負の効果を有することは以前には知られていないか、または実証されていないが、核ＴＥＲＴ局在および核活性の特異的阻害は、ミトコンドリアＴＥＲＴ機能を維持することによって脈管構造に保護効果を有する。このセクションで説明したように、ＴＥＲＴペプチド阻害剤による単離されたヒト血管の治療は、ANG IIを含むストレッサーに対する血管応答をある様式で減弱させることが発見され、それはペプチド阻害剤が、多数の慢性病状、酸化的ストレッサーおよび血管および心臓毒性に関連する化学療法から生じる損傷から脈管構造を保護することができることを示唆している。
【００９１】
翻訳後修飾は、調節されたタンパク質の細胞輸送に重要な役割を果たす。野生型ｎｕｃＸＴＥＲＴは、テロメラーゼに存在する核局在化シグナルの１つと相同な合成ペプチドである。２２７位のセリン残基をリン酸化して、タンパク質の核移行を開始させることができる。本発明者らは、テロメラーゼ酵素コード配列の２２７位にアラニンを有する非リン酸化可能置換変異体と同様に、２２７位にグルタミン酸置換（ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅ）を含むホスホミメティックスを含むこの一次配列に基づいていくつかの変異体を合成した（ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ａ；表１に詳述されるペプチド配列を参照のこと）。興味深いことに、ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ａは、血流またはアセチルコリン（ＡＣｈ）拡張刺激（図５）のいずれかによるANG II処理に応答して、血管拡張剤容量の減弱から血管を保護しない。Ａペプチドと共に１０μＭの濃度で一晩インキュベートした血管は、平均直径１４２μｍ±３８を有した。Ｅペプチドと共にインキュベートした血管は、１４５μｍ±４９の平均直径を有した。ベースラインの血管狭窄は、ＡおよびＥペプチド処理した血管の両者で同様であり、処理された血管はＥＴ−１処理の１０分後にその最大直径の平均５３±１２％に収縮し、Ｅペプチド処理した血管はＥＴ−１処理の１０分後にその最大直径の平均４８±１８％に収縮した。ANG IIで処理し、流量勾配で刺激した後、ペプチド処理した血管を１００ｃｍの流量勾配で８２μｍ±１１の直径まで拡張させた。対照的に、ANG II処理（図５Ａおよび５Ｂ、右手パネル）後、Ｅペプチド処理した血管は、１００ｃｍの流量勾配で１３６μｍ±５１の平均直径まで拡張した。ペプチド処理した血管をANG IIで処理しＡＣｈで刺激した場合、血管は平均直径１２８μｍ±３３に拡張した。Ｅペプチド処理した血管をANG IIで処理し、ＡＣｈで刺激して平均直径１３１μｍ±２４に拡張した。本明細書においてｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅと呼ばれるホスホミメティックなｎｕｃＸＴＥＲＴは、血流およびＡＣｈ刺激条件下で、野生型配列による処理と区別できないレベルで、単離された微小血管におけるANG II誘発内皮機能不全を防止する。
【００９２】
ｎｕｃＸＴＥＲＴ阻害剤は、病気の組織における健康な血管拡張メカニズムを回復させる：血管機能不全を示す病的微小血管は、臨床的に確認された冠状動脈疾患を有するドナーの脂肪組織から得られた。ベースライン時に、これらの血管は、拡張を可能にするシグナル伝達機構としてのＨ2Ｏ2の使用により、血管拡張刺激に応答する。Ｈ2Ｏ2のスカベンジャーであるＰＥＧ−カタラーゼによる血管の治療は、血管拡張を効果的に減弱させる。しかしながら、一酸化窒素シンターゼの阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥによる治療は、罹患した血管の拡張能力に影響を与えない。対照的に、健康なドナーからの血管は逆の傾向を示す。ＰＥＧ−カタラーゼによる治療は拡張能に影響を与えないが、Ｌ−ＮＡＭＥでの治療は血管の流動性の能力を著しく低下させる。ＣＡＤを有する対象由来の血管では、Ｈ2Ｏ2が主要な血管拡張剤である。ｎｕｃＸＴＥＲＴで前処理された血管では、ＦＭＤの主要機構としてＮＯが回復する。さらに、ＰＥＧ−カタラーゼによる処理は、もはや拡張応答を阻害しない（図６、上部パネル）。著しく対照的に、ｍｉｔｏＸＴＥＲＴでの処理は、健康な血管にＮＯ媒介性の拡張からＨ2Ｏ2依存性の拡張への逆の変化を起こさせる（図６、下のパネル）。
【００９３】
単離された血管研究におけるＰＥＧ化ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅの用量滴定：ＳからＥへの置換を有するｎｕｃＸＴＥＲＴをＣ末端でＰＥＧ化して、生物学的安定性および細胞透過性を高めた。１０μＭ〜１ｎＭの有効用量を試験した（図７Ａ〜７Ｃ）。ＰＥＧ化ペプチドは、血管保護効果を伴って１ｎＭまで滴定することができた。ＦＭＤの機構は、ANG IIに誘導された内皮機能障害を改変せずに（Ｌ−ＮＡＭＥ阻害可能、図７Ｂ）保護した（図７Ｃ）。
【００９４】
インビボでのペプチド生体内分布：インビボでペプチド生体内分布をアッセイするために、ＰＥＧ化ペプチド（５０ｎＭ）を、放射泳動のためにテクネチウム（Ｔｃ９９ｍ）で放射標識した。テクネチウム標識ペプチド（０．７７ｎＭ）を正常Ｃ５７マウスの尾静脈に注射した。図８Ａ〜８Ｋに示すように、注射の２、４、８時間後にマウスを安楽死させ、残りの放射能を個々の器官で測定した。シグナルは血液に標準化された。各主要臓器において、シグナルの有意な増加が注射後８時間まで観察され、この時点でペプチドが分解されなかったことを示唆している。図８Ｌでは、マウスに、放射性標識ペプチド（０．７７ｎＭ）を皮下（ｓｕｂＱ）注射し、２４時間および４８時間後に血液中の残存活性を測定した。ＩＶ注入と比較してシグナルはｓｕｂＱマウスにおいて有意に低く、２４時間後ではバックグラウンドに対する増加シグナルが観察されたが、４８時間では観察されなかった。これらのデータは、ペプチドがサブＱ注射後少なくとも２４時間循環中に分布していることを示唆している。ペプチドが正に荷電しているので、本発明者らのデータは、ペプチドが血液脳関門を横切ることを実証する。これは、脳血管機能障害または神経学的障害の治療に重要である可能性がある本明細書で提供されるペプチドの有利な特性である。インビボでＣＮＳに生物活性を有するペプチドは、脳血管障害の神経学的疾患のための可能な治療選択肢の領域を開く。
【００９５】
Ｐｅｇ−ｎｕｃＸＴＥＲＴのインビボ効果：ｎｕｃＸＴＥＲＴマウスのインビボ効果を試験するため、高血圧および内皮機能不全を誘発するために一般に使用されるストレスでマウスを処理した。ANG II（１０００ｎｇ／ｋｇ／分）の高速圧力用量を、浸透圧ミニポンプを介して１４日間注入した。動物のサブグループを、ANG IIに加え、同様の持続時間と送達系でｎｕｃＸＴＥＲＴ（浸透圧ミニポンプにより３０μｇ／日）と同時処理した。曲線をヒストリカルコントロール（ビヒクル）と比較した。図９に示すように、ANG IIはアゴニスト誘発内皮依存性拡張（ＡＣｈ）、またはＦＭＤに対して有意な減少を引き起こした。ｎｕｃＸＴＥＲＴとの併用療法は、ANG II誘発内皮機能障害の発症を防止した。パパベリンに対する平滑筋依存性の拡張には影響を及ぼさなかった（データは示さず）。
【００９６】
ディスカッション
【００９７】
本発明者らは、本発明者らの合成核テロメラーゼ阻害剤（ｎｕｃＸＴＥＲＴ）ペプチドが、生きたヒト微小血管によって容易に取り込まれることを示している。さらに、インビトロ実験は、培養ヒト細胞系においてペプチド取り込みが起こり、ペプチドが核周囲領域に局在することを示している（図２）。ウェスタンブロッティングおよびドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いた改変ＴＲＡＰアッセイを用いたテロメラーゼ活性の分析により、ｎｕｃＸＴＥＲＴによる処理は核テロメラーゼ蓄積および活性を劇的に減少させ、対応する細胞質蓄積および活性の増加を明らかにした（図３）。
【００９８】
興味深いことに、健常な患者の脂肪組織から切開した単離ヒト微小血管の処理は、ｎｕｃＸＴＥＲＴ処理（図４）によって血管ストレッサーから保護される。内因性ＮＬＳの２２７位のセリン置換のためのグルタミン酸を含む改変ｎｕｃＸＴＥＲＴペプチドの使用はまた、顕著な血管保護効果を明らかにする。しかしながら、同じ位置でセリンをアラニンで置換することは、これがペプチドの機能にとって重要な残基であり、ペプチドの合成修飾が機能を増強し得ることを示唆している（図５）。我々はまた、ｎｕｃＸＴＥＲＴが、冠状動脈疾患の患者由来の組織における血管拡張に関与する機構を改変することができることを立証する。ｎｕｃＸＴＥＲＴによる治療は、健康な微小血管に見られるように、血管拡張を主に一酸化窒素（ＮＯ）依存性のメカニズムに回復させる。逆に、テロメラーゼのミトコンドリア局在化配列（ＭＬＳ）に対応するペプチドであるｍｉｔｏＸＴＥＲＴによる処理は、ＮＯ媒介性の拡張に通常依存する健康な組織を過酸化水素に依存して血流に応答して拡張させる（図６）。
【００９９】
血管のグローバルなテロメラーゼ活性化剤での前処理は、テロメラーゼ活性が、脈管構造がストレッサーに耐える能力に保護効果を有することを明らかにする。この点は、げっ歯類モデルにおいてＡＡＶベクターを用いたテロメラーゼ過剰発現が有意に良好な回復およびＭＩ後死亡率をもたらす心臓傷害および心筋梗塞のモデルにおいてインビボで劇的に証明されている（Ｂaｒら，２０１４）。テロメラーゼが血管拡張の機序を調節できることを示唆するデータが与えられた場合、その酵素が作用する問題は非常に顕著である。我々は、デコイペプチドを用いて、テロメラーゼプールを効果的に操作できることをここで実証した。具体的には、テロメラーゼを主に非核局在化にシフトさせることにより、血管保護がもたらされる。興味深いことに、この血管保護作用は、テロメラーゼの触媒活性が阻害されたときに廃止される。これは、血管保護性表現型がテロメラーゼ活性に依存し、阻害剤がテロメラーゼを特異的に操作していることを示唆している。いくつかの異なるペプチドの開発は、さらに、１残基の突然変異はペプチドが脈管構造を保護するのを効果的に防止するというｎｕｃＸＴＥＲＴの作用の特異性を明らかにする。これは、これが非常に特異的な治療薬であることを強く示唆し、エクスビボで観察される保護効果は組織を非特異的にペプチドで処理することによるものではなく、むしろこの特定のペプチドは特異的である。
【０１００】
最も顕著には、テロメラーゼの局在をシフトさせることは、冠状動脈疾患の患者由来の新たに単離されたヒト微小血管における正常な血管拡張能および正常な血管拡張（ＮＯ媒介対過酸化水素）のメカニズムを回復させることができる。これは、この患者集団においてこの疾患状態に関連する血管機能不全を矯正する際に、このアプローチおよびこれらの治療法の有用性を直ちに示唆している。さらに、ＣＡＤ、およびプリンツメタル狭心症等を含むが、これに限定されない微小血管機能不全を伴う他の心臓および血管疾患の治療におけるこのアプローチの有用性を示唆している。
【０１０１】
今日まで、根本的な血管機能不全に対処できる有効な治療法、すなわちほぼ全ての心血管疾患に必須な要素である、はほとんどない。本発明者らは、急性および慢性の冠状動脈、心臓および血管疾患の治療に有用であり得る新しいアプローチおよびいくつかの新しい化合物を提供する。テロメラーゼレベルを全体的に増加させる化合物の広範な使用は、細胞形質転換を、加速または可能にするというポテンシャルがあり関心が集まるだろうが、これらのペプチドは発癌リスクが有意に少ない。ｎｕｃＸＴＥＲＴペプチドが使用される場合に生じる核テロメラーゼ活性の阻害もまた、癌における治療として使用することができる。実際、核テロメラーゼ活性の天然阻害剤経路を活性化させる最近の戦略は、このアプローチが、自食作用の開始を阻害することによって化学療法剤に対する癌感受性を増大させることを首尾よく示した。既に、臨床試験中のテロメラーゼ阻害剤は、抗腫瘍効果を実証している。しかしながら、ＢＩＢＲ１５３２によって示されるように、テロメラーゼ酵素の触媒活性の全体的レベルにおける阻害は、重大な血管傷害を引き起こす可能性がある。これらの治療法は、内皮機能障害を増大させ、血栓症のようなリスクを増大させる可能性がある。これは、腫瘍に対する活性を見るために、患者が抗テロメラーゼレジメンを取る必要があるかもしれない時間の長さを考えると、特に厄介である。腫瘍細胞増殖に必要なテロメア伸長（核活性）を防ぐために内因性テロメラーゼプールを再動員しようとすると、腫瘍細胞の増殖を阻害する可能性があり、また、内皮のミトコンドリアでテロメラーゼ機能を維持することによって、内皮損傷または血栓症のリスクを有意に低下させる。多くの既存の抗癌治療はまた、間接的にテロメラーゼ活性を阻害し、血管損傷をもたらし、血栓症のリスクを増加させる。ｎｕｃＸＴＥＲＴペプチドは、テロメラーゼの核プールを移動させて内皮細胞の健康を保護することによって、これらの毒性に対処するのに役立つ。
【０１０２】
テロメラーゼが、実際には、細胞質プールだけでなく、より具体的には、ｎｕｃＸＴＥＲＴによる処理後のミトコンドリア区画に局在することを検証するために、多くのさらなる研究が行われるべきである。さらに、リン酸化欠損ペプチド（ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ａ）による処理と同様に、ホスホミメティックペプチド（ｎｕｃＸＴＥＲＴ−Ｅ）による処理後のテロメラーゼ局在の変化を確認するための実験を行うべきである。これらの実験は、処理された細胞および潜在的な血管を分裂させてその後、ウェスタンブロッティングおよびＴＲＡＰアッセイ実験を行い、ミトコンドリア区画内のタンパク質レベルおよび活性の上昇を検証することを含む。
【０１０３】
（実施例２）ＮＬＳペプチド阻害剤は、肺腫瘍細胞の移動を減少させる可能性がある
【０１０４】
最近の刊行物は、増加したテロメラーゼ活性の短期間の心臓保護効果を示しており（Ｂａｒら）、核テロメラーゼ活性の天然阻害の間接的活性化は、腫瘍の化学療法抵抗性の主要な要因の１つである、細胞オートファジーの活性化を阻害する。我々のデータは、ペプチド阻害剤が、高度に侵襲性で転移性の肺腫瘍細胞株の遊走能を低下させる可能性があることを示唆している。
【０１０５】
以下の参考文献のリストは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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【０１０６】
本発明を1つまたは複数の好ましい実施態様に関して説明したが、明らかに述べられている以外の多くの等価物、代替物、変形物および改変が可能であり、本発明の範囲内であることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月1日(2018.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）で示される配列と、少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって；
Ｘ1は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるリン酸模倣残基であり、単離されたペプチドはＴＥＲＴ核移行を防止することができ、前記単離されたペプチドは２０アミノ酸未満であるペプチド。
【請求項２】
配列番号２で示される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記ＰＥＧ化ペプチドが、配列番号４に記載の配列を含む、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
さらに、ＰＥＧ化、ミリストイル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、およびリンカーまたはスペーサーの付加から選ばれる１つまたは複数の修飾を含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、インベルソまたはレトロインベルソペプチドである、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載の単離されたペプチドを含むペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１の６位のセリン残基と比較して非リン酸化可能な置換基を含む単離されたペプチドであって、前記単離されたペプチドが２０アミノ酸未満であり、配列番号１で示される配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含み、ＴＥＲＴ核移行を予防することができるペプチド。
【請求項１０】
配列番号３で示される、請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドがＢＢＢ透過性である、請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
前記ＰＥＧ化ペプチドが、配列番号４に記載の配列を含む、請求項１２に記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
さらに、ＰＥＧ化、ミリストイル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、およびリンカーまたはスペーサーの付加から選ばれる１つまたは複数の修飾を含む、請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、インベルソまたはレトロインベルソペプチドである、請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１６】
請求項９に記載の単離されたペプチドを含むペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ヒト細胞におけるテロメラーゼ酵素の核移行を防止する方法であって、前記ヒト細胞をＴＥＲＴ核移行の阻害剤に接触させることを含む方法。
【請求項１８】
前記ＴＥＲＴ核移行の阻害剤がペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが、アミノ酸置換、ＰＥＧ化、ミリストイル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、およびリンカーまたはスペーサーの付加から選ばれる１つまたは複数の修飾を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記阻害剤が、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を含むペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与が非経口投与である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
対象における心臓への副作用を減少させる方法であって、ＴＥＲＴ核移行の阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含み、前記合成ペプチドを投与することは対象における心臓への副作用の発生を減少させる方法。
【請求項２３】
前記心臓への副作用が、前記対象への化学療法剤の投与に伴う心毒性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が化学療法剤を受けるであろう、または受けている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＥＲＴ核移行の阻害剤がペプチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが、アミノ酸置換、ＰＥＧ化、ミリストイル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、およびリンカーまたはスペーサーの付加から選ばれる1つまたは複数の修飾を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドが、インベルソまたはレトロインベルソペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与が非経口投与である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
対象に過剰増殖性疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の単離されたペプチドを投与することを含み、前記単離されたペプチドは２０アミノ酸未満であり、少なくとも８０％が配列番号６（ＲＲＲＧＧＸ1ＡＳＲＳＬＰＬＰＫＲＰＲＲ）によって示される配列に相同であり；
Ｘ1は、配列番号１の対応する位置に対してアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選ばれるリン酸模倣残基であり、前記単離されたペプチドはＴＥＲＴ核移行を防止し、それにより過剰増殖性疾患を治療することができる方法。
【請求項３１】
前記過剰増殖性疾患が癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＥＧ化ペプチドが、配列番号４に記載の配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
有効量のＴＥＲＴ核移行の阻害剤を対象に投与することを含む、酸化ストレスを減少させる方法。
【請求項３６】
前記ＴＥＲＴ核移行の阻害剤がペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが、アミノ酸置換、ＰＥＧ化、ミリストイル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、およびリンカーまたはスペーサーの付加から選ばれる１つまたは複数の修飾を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選ばれる配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが、インベルソまたはレトロインベルソペプチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ヒト細胞におけるテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）酵素のミトコンドリア移行を防止する方法であって、前記方法がＴＥＲＴミトコンドリア移行阻害剤にヒト細胞を接触させることを含む方法。
【請求項４１】
前記阻害剤が、配列番号５を含むペプチドである、請求項４０に記載の方法。
【国際調査報告】
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