(57)【要約】  本発明は、自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の治療における抗体のFc断片の使用であって、前記Fc断片が、Fc受容体(FcR)の少なくとも1つに関して改変されたアフィニティー、特にFcRnに対して増大したアフィニティーを有する単離組換えFc断片である使用に関する。
2018524355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の治療において使用するための、抗体Fc断片を含む組成物であって、前記Fc断片が、親Fc断片と比較してFcγRIII受容体に対して改善されたアフィニティーを有する単離Fc断片である組成物。
【請求項２】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号11の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異T260Aと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号12の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異E258Iと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号13の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異K290Yと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号14の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異E294Aと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号15の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異Y296Wと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号16の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異K334N/P352S/A378V/V397Mの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号19の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異G316D/K326E/A378Vの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号20の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異A378V/P396L/N421Tの組合せを有し、好ましくはFc断片が配列番号21の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異T260Aを有し、好ましくはFc断片が配列番号17の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
野生型IgG1の親Fc断片と比較して、Fc断片が変異K290Yを有し、好ましくはFc断片が配列番号18の配列からなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の治療において使用するための、抗体Fc断片を含む組成物であって、前記Fc断片が、親Fc断片と比較して少なくとも1つのFc受容体(FcR)に対して改変されたアフィニティーを有する単離Fc断片である組成物。
【請求項１４】
Fc受容体が、FcRn、Fcγ受容体、及び補体C1qから選択される、請求項13に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項１５】
前記Fc断片が1つ又は複数のアミノ酸の変異を有する、請求項1、13又は14に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項１６】
変異が1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入である、請求項15に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項１７】
Fc断片が、親Fc断片と比較して1つ又は複数のアミノ酸の少なくとも1つの変異を有する、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4免疫グロブリンのFc断片である、請求項1又は13から15のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項１８】
Fc断片が組換えによって得られる、請求項1から17のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項１９】
変異が親Fc断片の半減期と比較した半減期の増大に関与する、請求項15から18のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２０】
変異が、アミノ酸226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、293、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446又は447における変異からなる群から選択され、Fc断片アミノ酸のナンバリングがEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングを指す、請求項15から19のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２１】
変異が、アミノ酸240、241、242、243、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304又は305における変異からなる群から選択され、Fc断片アミノ酸のナンバリングがEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングを指す、請求項15から19のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２２】
変異が、位置293又は294におけるアミノ酸の欠失(del293又はdel294)であり、Fc断片アミノ酸のナンバリングがEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングを指す、請求項21に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２３】
変異が、Fc断片のグリコシル化、好ましくは過剰シアル化に関与する、請求項21又は22に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２４】
前記Fc断片がそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンが65%より低い、好ましくは60%より低い、好ましくは55%より低い、好ましくは50%より低い、より好ましくは45%より低い、好ましくは40%より低い、好ましくは35%より低い、好ましくは30%より低い、好ましくは25%より低い、好ましくは20%より低いフコシル化度を有することを特徴とする、請求項1から23のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２５】
前記Fc断片がそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンが、短鎖、低シアル化を有するバイアンテナリー型グリカン構造であって、末端マンノース及び/又は非挿入型末端N-アセチルグルコサミンを有するバイアンテナリー型グリカン構造を有することを特徴とする、請求項1から24のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２６】
前記Fc断片がそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンの60%超がG0+G1+G0F+G1F型であり、G0F+G1F型が50%未満であることを特徴とする、請求項1から25のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２７】
前記Fc断片がそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンの60%超がG0+G1+G0F+G1F型であり、フコース含有率が65%より低いことを特徴とする、請求項1から25のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２８】
前記Fc断片がそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンの40%未満がG0F+G1F型であることを特徴とする、請求項26又は27に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項２９】
疾患が特発性血栓性紫斑病、慢性脱髄性炎症性多発根ニューロパチー(CDIP)、臓器又は移植片拒絶反応、移植片対宿主病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、異なるタイプの硬化症、原発性シェーグレン症候群(又はグジュロー-シェーグレン症候群)、多発性硬化症等の自己免疫性多発ニューロパチー、1型糖尿病、自己免疫性肝炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、痛風性関節炎、セリアック病、クローン病、橋本甲状腺炎(甲状腺機能低下症)、アジソン病、自己免疫性肝炎、バセドウ病(甲状腺機能亢進症)、潰瘍性大腸炎、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連全身性血管炎等の血管炎、自己免疫性血球減少症並びに成人及び小児における他の血管系合併症、例えば、急性又は慢性自己免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、新生児溶血性疾患(HDN)、寒冷凝集素症、血小板減少性血栓性紫斑病及び後天性自己免疫性血友病等、グッドパスチャー症候群、膜外腎症、自己免疫性水疱性皮膚障害、難治性筋無力症、混合型クリオグロブリン血症、乾癬、若年性慢性関節炎、炎症性筋炎、抗リン脂質抗体症候群を含めた小児における皮膚筋炎及び全身性自己免疫疾患、結合組織病、異なるタイプの硬化症、自己免疫性肺炎、ギランバレー症候群、川崎病、多巣性運動ニューロパチー(MMN)、自己免疫性甲状腺炎、糖尿病(mellitus)、重症筋無力症、眼部の自己免疫性炎症疾患、天疱瘡、インスリン抵抗性による糖尿病、多発性筋炎、ビールメル貧血、糸球体腎炎、ウェゲナー病、巨細胞性動脈炎、結節性動脈周囲炎及びチャーグ-シュトラウス症候群、スティル病、萎縮性多発性軟骨炎、ベーチェット病、単クローン性ガンマグロブリン血症、ウェゲナー肉芽腫症、ループス、潰瘍性大腸炎、乾癬性リウマチ、サルコイドーシス、膠原線維性大腸炎、ヘルペス性皮膚炎、家族性地中海熱、IgAの沈着を伴う糸球体腎炎、ランバート-イートン筋無力症候群、交感性眼炎、フィサンジェ-ルロワ-ライター症候群及びぶどう膜髄膜脳炎症候群、視神経脊髄炎(ドヴィック病)及び強皮症から選択される、請求項1から28のいずれか一項に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【請求項３０】
前記Fc断片が位置293又は294にアミノ酸の欠失(del293又はdel294)を有し、疾患が移植片対宿主病である、請求項29に記載の使用のためのFc断片を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者への外因性抗体の投与からなる免疫療法は、様々な病状、特に自己免疫疾患及び炎症性疾患の病状を治療するため今日広く使用されている。
【０００３】
2タイプの免疫グロブリンベースの療法、i)患者へのヒト血漿プール由来の免疫グロブリン(IgGであることが最も多い)の静脈内投与からなる、静注用免疫グロブリン製剤(IVIg)に基づく療法、及びii)組換え抗体(即ち、遺伝子操作によって得られた抗体)の使用に基づく療法が、これらの疾患を治療するため典型的に提言される。自己免疫疾患及び炎症性疾患を有する患者の管理において後者は確かに改善されている。特にこれらの療法が、血漿由来の免疫グロブリンの使用に関する欠点、特に供給不足のリスク、及びおそらく血漿中に存在する病原体の伝播のリスクを回避する可能性をもたらすからである。
【０００４】
免疫グロブリン中のFab断片の存在は、治療患者における重大な有害反応の原因である可能性がある。これらの副作用を回避するため、特許出願WO2004/099374は、患者、特に自己免疫疾患を有する患者を治療するための、単離組換えFc断片の使用を開示する。
【０００５】
しかしながら、これらのFc断片を最適化して、特にそれらの半減期及び/又は治療有効性を増大することが依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許出願WO2004/099374
【特許文献２】特許出願WO2010/106180
【特許文献３】特許出願WO01/77181
【特許文献４】出願WO02/038756
【特許文献５】文書WO200748077
【特許文献６】文書US7700321
【特許文献７】文書US2010291628
【特許文献８】US20090228994
【特許文献９】EP1500698
【特許文献１０】EP1792987
【特許文献１１】US7846725
【特許文献１２】文書US7393683
【特許文献１３】文書WO2006133148
【特許文献１４】文書WO0200879
【特許文献１５】文書EP1176195
【特許文献１６】US7214775
【特許文献１７】US6994292
【特許文献１８】US7425449
【特許文献１９】US2010223686
【特許文献２０】WO2007099988
【特許文献２１】EP1705251
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kabatら、Sequences of proteins of immunological interest、5thEd.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)
【非特許文献２】Basic and Clinical Immunology、8th Edition、Daniel P.Stites、Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.)、Appleton and Lange、Norwalk、Conn.、1994、71頁及び第6章
【非特許文献３】Ravetch及びKinet、Annual Review of Immunology、Vol.9:457〜492頁(1991)
【非特許文献４】Uananue及びBenacerraf、Textbook of Immunology、2nd Edition、Williams and Wilkins、218頁(1984)
【非特許文献５】Muta Tら、Nature、1994、368:70〜73頁
【非特許文献６】Ayala M、Gavilondo J、Rodriguez M、Fuentes A、Enriquez G、Perez L、Cremata J、Pujol M.Production of plantibodies in Nicotiana plants.Methods Mol Biol.2009;483:103〜34頁
【非特許文献７】Pollock、D.P.,J.P.Kutzko、E.Birck-Wilson、J.L.Williams、Y.Echelard and H.M.Meade.(1999).Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies.Journal of Immunological Methods.231:147〜157頁
【非特許文献８】Popovら、Mol.Immunol.33:521〜530頁(1996)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、親Fc断片と比較して少なくとも1つのFc受容体(FcR)に対して改変されたアフィニティーを有するFc断片の使用をここで提言する。本発明によれば、Fc断片は単離状態であり、即ちそれらはFab断片と結合していない状態であり、又は任意の他のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドとコンジュゲート又は融合していない状態である。特に、それらは完全な免疫グロブリンではない。
【０００９】
本発明は、自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の治療において使用するための抗体Fc断片を含む組成物であって、前記Fc断片は、親Fc断片と比較してFc-γ受容体III(FcγRIII)に対して改善されたアフィニティーを有する単離Fc断片である組成物に関する。
【００１０】
好ましい態様では、Fc断片は以下のものである。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくは配列番号11の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異T260Aと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくは配列番号12の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異E258Iと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくは配列番号13の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異K290Yと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、配列番号14の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異E294Aと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくは配列番号15の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異Y296Wと315D/330V/361D/378V/434Yの組合せを有し、好ましくは配列番号16の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異K334N/P352S/A378V/V397Mの組合せを有し、好ましくは配列番号19の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異G316D/K326E/A378Vの組合せを有し、好ましくは配列番号20の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異A378V/P396L/N421Tの組合せを有し、好ましくは配列番号21の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異T260Aを有し、好ましくは配列番号17の配列からなるFc断片。
-  野生型IgG1の親Fc断片と比較して変異K290Yを有し、好ましくは配列番号18の配列からなるFc断片。
【００１１】
本発明は、より一般的に、自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の治療において使用するための抗体Fc断片を含む組成物であって、前記Fc断片は、親Fc断片と比較して少なくとも1つのFc受容体(FcR)に対して改変されたアフィニティーを有する単離Fc断片である組成物も提供する。
【００１２】
詳細な実施形態では、組成物は1つ又は複数のアミノ酸の少なくとも1つの変異を有する及び/又はそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有する抗体Fc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンは65%より低いフコシル化度を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】(EUインデックスに従った)位置216〜447に関する、天然ヒトIgG1、並びにヒトIgG2(配列番号7)、ヒトIgG3(配列番号8)及びヒトIgG4(配列番号9)の対応する配列の配列アライメントを示す図である。IgG1配列はG1m1,17アロタイプ(配列番号6)、及びG1m3アロタイプ(配列番号10)を指す。IgG1の「CH2-CH3下部ヒンジ」ドメインは位置226で始まる(矢印参照)。CH2ドメインはグレーで強調しCH3ドメインはイタリック体で示す。
【図２】IgG1Fc(A)及びscFc(B)の概略を示す図である。CH2はグレーで表しCH3は白色で表す。ジスルフィド架橋は薄いグレーの点線によって表す。scFc中では、2つのCH2-CH3ポリペプチドが、太字の点線によって表されるペプチドリンカーによって結合する。
【図３】本発明のFc断片において存在し得るG0、G0F、G1及びG1F型のグリカン構造を示す図である。
【図４】様々な量の多価免疫グロブリン(IVIg)、又は非変異型若しくは変異型組換えFc断片(変異315D/330V/361D/378V/434Yを含有するFc断片)の添加後に観察した、モノクローナル抗アカゲザルD(RhD)抗体の存在下でのアカゲザルD+赤血球のエフェクター細胞媒介溶解率を示すグラフである。
【図５】様々な量の多価免疫グロブリン(IVIg)、又は非変異型若しくは変異型組換えFc断片(表1に従う変異を含有するFc断片)の添加後に観察した、モノクローナル抗アカゲザルD(RhD)抗体の存在下でのアカゲザルD+赤血球細胞のエフェクター細胞媒介溶解率を示すグラフである。「rFcWT」は野生型組換えFc断片を示す。陽性対照は、IVIG(即ち、ヒト血漿から抽出した血漿抗体の混合物、IVIGは特発性血小板減少性紫斑病(ITP)の参照治療剤である)、及びハーセプチンFc断片(哺乳動物においてトランスジェニック生成し次いでFc断片を作製するためのパパイン酵素消化に施した抗体)に相当する「IgGMabs出発物質(IgG Mabs starting)」によって表す。
【図６】Biacoreを使用し表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した、WT(野生型)並びにヒトFcRn(A)及びCD16aV(CD16の位置158におけるV多型)(B)変異型Fc断片のアフィニティー(Kd)を測定したin vitro結合アッセイを表す図である。
【図７】以下に定義したバリアントT5A-74の発現に使用したpCEP4ベクターのマップ、及びバリアントT5A-74の発現に使用したOptiCHOベクターのマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書の記載全般を通じて、Fc断片における残基のナンバリングは、EUインデックスに従った、又は参照により明確に本明細書に組み込まれているKabatら、Sequences of proteins of immunological interest、5thEd.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)中に記載されたのと同様の免疫グロブリン重鎖のナンバリングである。「EUインデックス」又は「EUインデックス又はKabatの同等物」は、本明細書中ではヒトIgG1抗体の残基のナンバリングを指す。
【００１５】
用語「免疫グロブリン」は、(断片とも呼ばれる)定常領域と可変領域を含む、天然状態の生物型抗体で構成される構造を指す。免疫グロブリン分子は、その基本単位が、吊橋内及び吊橋間ジスルフィド架橋により1つに結合したそれぞれ約50〜70kDaの2本の重鎖(H)とそれぞれ約25kDaの2本の軽鎖(L)からなるヘテロテトラマーである分子である。
【００１６】
それぞれの鎖は、N-末端位置に軽鎖の場合VLと呼ばれ重鎖の場合VHと呼ばれる可変ドメイン又は領域、並びにC-末端位置に軽鎖の場合CLと呼ばれるシングルドメイン重鎖の場合CH1、CH2、CH3及びCH4と呼ばれる3つ又は4つのドメインからなる定常領域で構成される。
【００１７】
IgMとIgEのみがCH4ドメインを有する。
【００１８】
それぞれのドメインは約110個のアミノ酸を含み、類似した形式の構造をとる。2本の重鎖はCH2ドメインでジスルフィド架橋により連結しており、それぞれの重鎖はCH1とCLの間でジスルフィド架橋により軽鎖と連結している。抗原に対する抗体の特異性を決定する領域は可変部分によって保持され、一方で定常部分は、エフェクター細胞又は補体タンパク質等の分子のFc受容体(FcR)と相互作用して、様々な機能性を誘導することができる。抗体を構成する鎖の集合は特徴的なY形状三次元構造を画定することができ、この場合
- Yのベースは、補体及びFc受容体により認識されて分子のエフェクター機能を媒介する定常Fc領域(又はFc断片)に相当し、
- Yのアームの末端は軽鎖可変領域と重鎖可変領域の各集合に相当し、前記末端はFab断片を構成し抗原に対する抗体の特異性を決定する。
【００１９】
より正確には、5つの重鎖アイソタイプ(ガンマ、アルファ、ミュー、デルタ及びイプシロン)並びに2つの軽鎖アイソタイプ(カッパとラムダ、ラムダ鎖自体は2タイプ、ラムダ1とラムダ2に分けられる)が存在する。免疫グロブリンのクラスを決定するのは重鎖である。したがって、5クラスのIg、IgG(ガンマアイソタイプ)、IgA(アルファアイソタイプ)、IgM(ミューアイソタイプ)、IgD(デルタアイソタイプ)及びIgE(イプシロンアイソタイプ)が存在する。
【００２０】
カッパ及びラムダ軽鎖は、全クラス及びサブクラスによって共有される。ヒトでは、生成するカッパとラムダの割合は2対1の比である。
【００２１】
IgGは血清中で最も豊富な免疫グロブリンである(循環抗体の75%〜80%)。モノマー型で存在し、それらは全免疫グロブリンの中で最も長い血清中半減期を有する(約21日)。
【００２２】
4つのIgGサブクラスを決定する4タイプのガンマ重鎖が存在する(ガンマ1に関してIgG1、ガンマ2に関してIgG2、ガンマ3に関してIgG3及びガンマ4に関してIgG4)。これら4つのサブクラスは、可変領域数及びジスルフィド架橋の位置の点で異なる(Basic and Clinical Immunology、8th Edition、Daniel P.Stites、Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.)、Appleton and Lange、Norwalk、Conn.、1994、71頁及び第6章)。
【００２３】
4つのヒトIgGサブクラスは、非常に相同的な構造にもかかわらず(Fc領域に関して95%を超える配列相同性)それらの生物学的活性によって更に区別される。
【００２４】
用語「生物学的活性」は、補体タンパク質、詳細には(例えばタンパク質C1q[Basic and Clinical Immunology、8th Edition、Daniel P.Stites、Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.)])及び/又はIgG受容体:FcγR(FcγRI、FcγRII、FcγRIII;Ravetch及びKinet、Annual Review of Immunology、Vol.9:457〜492頁(1991))と結合するIgG定常領域の能力を特に指す。
【００２５】
結合のタイプに応じて、様々な作用機構、例えばオプソニン化、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞介在性細胞障害作用(ADCC)又は補体依存性細胞障害作用(CDC)を活性化することができる。更なる詳細に関しては、Uananue及びBenacerraf、Textbook of Immunology、2nd Edition、Williams and Wilkins、218頁(1984))を参照。
【００２６】
用語「Fc断片」は、第1の免疫グロブリン定常領域ドメインを除いた、完全長免疫グロブリンの定常領域を指す。したがって「Fc断片」は、IgA、IgD、IgGの最後の2つの定常ドメイン(CH2-CH3)、IgEとIgMの最後の3つの定常ドメイン(CH2-CH3-CH4)、及びこれらのドメインのN-末端柔軟性ヒンジを指す。IgAとIgMに関して、Fc断片はJ鎖を含むことができる。IgGに関して、Fc断片はCH2、CH3ドメイン、及びCH1とCH2の間に下部ヒンジ領域を含む。言い換えると、IgG1のFc領域はCH2-CH3下部ヒンジ、即ちアミノ酸C226からカルボキシ末端までの部分で構成され、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物に従い示される。他のIgGサブクラスに関するアナログドメインは、IgGサブクラスの重鎖又は重鎖断片のアミノ酸配列及びヒトIgG1のアミノ酸配列のアライメントから決定することができる(図1参照)。本発明に従い使用するFc断片は、(EUインデックスに従う)位置226の上流に上部ヒンジ領域の一部分を更に含むことができる。この場合、好ましくは、位置216と226の間に位置する領域の一部分を含むヒトIgG1のFc断片を使用する。この場合「ヒトIgG1のFc断片」は、アミノ酸216、217、218、219、220、221、222、223、224又は225からカルボキシ末端までの部分を指す。用語「Fc断片」は単鎖Fc(scFc)断片も指す。用語「scFc断片」は、ポリペプチドリンカーにより結合した2つのFcモノマーの遺伝子融合によって得られる単鎖Fc断片を指す。scFcは機能性ジマーFc領域へ自然とフォールディングする。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「親Fc断片」又は「親ポリペプチド」は、野生型Fc領域又は考慮した対象以外の変異を任意選択で含有するバリアントの中の参照ポリペプチドを指す。用語「野生型」又は「WT」は本明細書において、天然で見られる、即ち対立遺伝子変異を含む天然起源の、及び変異誘発等の分子生物学的技法により意図的に改変されていない、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。例えば「野生型」Fc領域は、配列番号1の配列を有するIgG1Fc領域(G1m1,17アロタイプ)、配列番号2の配列を有するIgG2Fc領域、配列番号3の配列を有するIgG3Fc領域、配列番号4の配列を有するIgG4Fc領域、及び配列番号5の配列を有するIgG1Fc領域(G1m3アロタイプ)を特に指す。
【００２８】
本発明中で使用するFc断片はモノマー型で存在する。即ち、それらは互いに融合又はコンジュゲートしていない状態である。
【００２９】
用語「改変されたアフィニティー」は、親Fc断片と比較して低下又は増大したアフィニティーを指す。
【００３０】
本明細書中で使用する用語「新生児Fc受容体」又は「FcRn」は、IgGFc領域と結合しFcRn遺伝子によって少なくとも一部分がコードされるタンパク質を指す。FcRnは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルだけには限られないが、これらを含めた任意の生物に由来してよい。当技術分野で知られているように、機能性FcRnタンパク質は、重鎖及び軽鎖の名称によって指定されることが多い2つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ2-マイクログロブリンであり、重鎖はFcRn遺伝子によってコードされる。本明細書中で他に指定しない限り、用語「FcRn」又は「FcRnタンパク質」はα鎖とβ2-マイクログロブリンの複合体を指す。ヒトでは、FcRnをコードする遺伝子はFCGRTと呼ばれる。
【００３１】
本明細書中で使用する用語「FcRn結合の増大」は、親ポリペプチドと比較したFcRnに関する本発明の変異型Fc断片の、in vivo又はin vitroでの結合アフィニティーの増大を指す。FcRnと結合する本発明の変異型Fc断片の能力は、例えば特許出願WO2010/106180中に記載されたようにELISAによりin vitroで評価することができる。
【００３２】
本発明において用語「半減期」は、Fc断片が投与される患者の血清中に存在した後、それが循環又は他の組織から半分除去される時間量を指す。
【００３３】
用語「Fcγ受容体」又は「FcγR」は、CD64(FcγRI)、CD32(FcγRII)及びCD16(FcγRIII)と呼ばれるIgG型免疫グロブリン受容体、特に5つの発現受容体(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)を指す。免疫細胞活性化を阻害する受容体であるヒトFcγRIIb以外、全てがエフェクター細胞活性化受容体である(Muta Tら、Nature、1994、368:70〜73頁)。
【００３４】
用語「エフェクター細胞」は、リンパ球、単核細胞、好中球、ナチュラルキラー(NK)細胞、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及び血小板等のFc受容体を有する任意の細胞を指す。
【００３５】
本発明の文脈では、用語「グリコシル化」は、酵素反応による、組換えFc断片の配列への1つ又は複数の炭水化物の付加を指す。
【００３６】
本発明の文脈では、用語「過剰シアル化」は、Fc断片の配列への1つ又は複数のシアル酸基の付加を指す。1つ又は複数のシアル酸基の付加は、酵素反応によって、細胞反応によって、又はFcシアル化に関与する1つ又は複数のアミノ酸を標的とするFcの定方向変異誘発によって実施することができる。
【００３７】
用語「患者」は、任意のヒト又は動物対象、好ましくは哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、患者は年齢及び性別とは無関係に人間である。
【００３８】
用語「治療」又は「治療する」は、疾患若しくは障害、若しくはそれらと区別することができる少なくとも1つの症状の改善又は予防又は逆転、又は治療対象によって必ずしも区別できない治療する疾患若しくは障害と関連した少なくとも1つの測定可能な身体的パラメーターの改善又は予防又は逆転を指す。用語「治療」又は「治療する」は、身体的に疾患若しくは障害の進行の抑制又は緩化すること、例えば生理的に区別可能な症状を安定化させること、例えば身体的パラメーターを安定化させること、又は両方を更に含む。
【００３９】
本発明によるFc断片の組成物
本発明中で使用する抗体Fc断片は、好ましくは、親Fc断片と比較して少なくとも1つのFc受容体(FcR)に対して改変されたアフィニティーを有する、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4免疫グロブリンのFc断片である。
【００４０】
本発明によるFc断片は、親Fc断片と比較して少なくとも1つのFc受容体に対して低下したアフィニティー、及び/又は少なくとも1つのFc受容体に対して増大したアフィニティーを有する。
【００４１】
親Fcのアフィニティーと比較して、少なくとも2に等しい、好ましくは5を超える、好ましくは10を超える、好ましくは15を超える、好ましくは20を超える、好ましくは25を超える、及び好ましくは30を超える比でアフィニティーを優先的に増大させる。言い換えると、FcRに関する変異型Fc領域のアフィニティーは親ポリペプチドのアフィニティーより高い。或いは、前記変異型Fc領域は少なくとも1つのFcRに対して低下したアフィニティーを有する。親Fcのアフィニティーと比較して、少なくとも2に等しい、好ましくは5を超える、好ましくは10を超える、好ましくは15を超える、好ましくは20を超える、好ましくは25を超える、及び好ましくは30を超える比でアフィニティーを優先的に低下させる。言い換えると、FcRに関する変異型Fc領域のアフィニティーは親ポリペプチドのアフィニティーより低い。
【００４２】
FcRに関するFc領域を含むポリペプチドのアフィニティーは、従来技術でよく知られている方法によって評価することができる。例えば当業者は、表面プラズモン共鳴(SPR)の使用によりアフィニティー(Kd)を決定することができ、これはBiacoreシステムによって測定することができる。或いは、当業者は適切なELISAを実施することができる。適切なELISAを使用して、親Fcと変異型Fcの結合力を比較することができる。変異型Fcから検出される特異的シグナルと親Fcから検出される特異的シグナルを比較する。ポリペプチド全体を評価することにより、又はそこから単離したFc領域を評価することにより、結合アフィニティーを同様に決定することができる。
【００４３】
詳細には、本発明に従い使用するFc断片は、親Fc断片と比較して、FcRn、Fcγ受容体、及び補体C1qから選択される少なくとも1つのFc受容体に対して低下したアフィニティー、及び/又はFcRn、Fcγ受容体、及び補体C1qから選択される少なくとも1つのFc受容体に対して増大したアフィニティーを有する。
【００４４】
詳細な実施形態によれば、本発明に従い使用するFc断片は、FcRnに対して改変されたアフィニティー、有利には増大したアフィニティーを有する。このFcRn結合の増大は、in vivoで血清中保持の改善、及び結果として半減期の増大をもたらす。
【００４５】
Fc断片は単独又は混合物で使用することができる。例えば、異なる変異を有する数個のFc断片を混合物で、又は同時投与することができる。
【００４６】
本発明のFc断片は、1タイプの変異型Fc断片を含む組成物中に使用することもできる。言い換えると、その組成物は同一配列のFc断片の分子を含む。
【００４７】
本発明の一態様によれば、少なくとも1つのFc受容体に対して改変されたアフィニティーを有するFc断片は、親Fc断片と比較して少なくとも1つのアミノ酸の変異を含有する。関連変異は、免疫グロブリンアイソタイプを定義する天然変異ではなく人為的変異であり、その生成法によって所望の変異を含有するFc断片が生じる。
【００４８】
好ましくは、変異は、1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入である。変異型Fc断片は、数個、好ましくは2〜10個のアミノ酸に影響を与える数個の変異を有し得る。
【００４９】
好ましい実施形態では、Fc断片は、アミノ酸226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、293、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446又は447における変異からなる群から選択される変異を有し、Fc断片アミノ酸のナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングを指す。
【００５０】
前述の一覧からの特定アミノ酸位置、即ち226、230、241、256、259、264、307、315、330、342、361、362、378、382、383、389、396、397、421、428及び434が好ましい。詳細には、FcRnに対して高い結合アフィニティーを有する変異型Fc断片は、前記アミノ酸位置に少なくとも1つのアミノ酸変化を含む可能性がある。これらの中では、位置230、264、307、315、330、378及び434が好ましく、位置264、315、378及び434がより好ましい。
【００５１】
詳細な実施形態では、少なくとも2つ、実際は3、4又は5個のアミノ酸変異によって、親Fcと比較してFcRnに対する結合アフィニティーが大幅に改善される可能性がある。
【００５２】
詳細な実施形態では、変異は以下の変異である:
(i)位置226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421及び434、好ましくは230、264、307、315、330、378及び434、より好ましくは264、315、378及び434からなる群から選択される1つ又は2つの変異、及び
(ii)位置226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、293、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355 356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446及び447、好ましくは226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421及び434から選択される少なくとも1つの他の異なる変異。
【００５３】
好ましい実施形態では、位置378と434の少なくとも1つを、及び任意選択で226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421及び434からなる群から選択される少なくとも1つの他の位置も変異させる。
【００５４】
変異は226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q 292W、293del、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、3081、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447N及び447Eであることが好ましく、特許出願WO2010/106180中にも記載されている。
【００５５】
別の実施形態では、Fc断片は226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、293del、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S及び439R、好ましくは226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Y及び434Sからなる群から選択される少なくとも1つの変異を含む。
【００５６】
変異の詳細な組合せの例を以下に表す:
226G/330V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Y及び315D/434Y;又は
226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、259I/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、294del/307P/434Y、264E/307P/378V、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/378V/434Y、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y、330V/382V/434Y、330V/389T/434Y及び378V/383N/434Y
【００５７】
特に有利な実施形態では、Fc断片は315D/330V/361D/378V/434Y(「T5A-74」とも呼ばれる変異の組合せ。したがってこの変異の組合せを有するFc断片は「rFcT5A-74」とも呼ばれる)、230S/315D/428L/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、259I/315D/434Y、256N/378V/383N/434Y、E294del/T307P/N434Y(「C6A_66」とも呼ばれる変異の組合せ。したがってこの変異の組合せを有するFc断片は「rFcC6A_66」とも呼ばれる)から選択される変異の組合せを有する。
【００５８】
別の実施形態では、Fc断片は、前記Fc断片のV240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、Y296W、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R及びV305Sから選択される少なくとも1つの変異を有し、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
【００５９】
一実施形態では、本発明によるバリアントは、FcγRIIIa(CD16a)に対して増大したアフィニティーを有する。この詳細な実施形態では、前記バリアントは、前記Fc断片のS298A、S298R、F243S、F243L、L242A、L242F、L242G、L242I、L242K、L242S、L242V、V240I、V240M、V240N、V240S、E258I、T260A、K290D、K290E、K290G、K290H、K290Q、K290S、K290Y、Y296H、Y296Wから選択される少なくとも1つの変異i)を含み、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
【００６０】
詳細なFc断片は、配列番号17の配列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVACVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
の断片ZAC2-85(T260A)、
又は配列番号18の配列:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTYPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
の断片ZAC3-172(K290Y)である。
【００６１】
別の実施形態では、本発明によるバリアントは、FcγRIIa(CD32a)に対して増大したアフィニティーを有する。この詳細な実施形態では、前記バリアントは、F241H、F241Y、F243L、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、V240H、V240I、V240M、V240S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、S267A、S267Q、S267V、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V259C、V259I、V259L、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、Q295I、Q295M、R292I、R292L、R301A、R301P、R301S、S304T、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303Y、V305A、V305F、V305L、V305R、V305S、Y300I、Y300V又はY300Wから選択される少なくとも1つの変異i)を含み、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
【００６２】
別の実施形態では、本発明によるバリアントは、FcγRIIb(CD32b)に対して増大したアフィニティーを有する。この詳細な実施形態では、前記バリアントは、前記Fc断片のE258R、E258Y、V262A、S267A、S267Q、S267V、V264S、V266L、V266M、K290R、R301A、R301M、S304T、V302A、V302L、V302R、V303S、V305A、V305F、V305I、V305R、Y300Vから選択される少なくとも1つの変異i)を含み、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
【００６３】
好ましくは、本発明によるバリアントは、親ポリペプチドのFc断片が少なくとも以下のものを含むことを特徴とする:
(i)前記Fc断片のV240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、Y296W、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R及びV305S、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
(ii)226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、361D、362R、378V、378T、389T、389K、434Y及び434Sから選択される少なくとも1つの変異、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(ii)と(iii)が同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００６４】
特に有利な実施形態では、Fc断片は以下から選択される変異の組合せを有する:
(i)T260Aと315D/330V/361D/378V/434Y(「T5A-74」とも呼ばれる変異の組合せ)。「T5A-74I」と指定する断片は、変異T260Aの付加によってのみ断片T5A-74と区別されるFc断片である。
又は
(ii)E258Iと315D/330V/361D/378V/434Y(「T5A-74」とも呼ばれる変異の組合せ)。「T5A-74J」と指定する断片は、変異E258Iの付加によってのみ断片T5A-74と区別されるFc断片である。
又は
(iii)K290Yと315D/330V/361D/378V/434Y(「T5A-74」とも呼ばれる変異の組合せ)。「T5A-74K」と指定する断片は、変異K290Yの付加によってのみ断片T5A-74と区別されるFc断片である。
又は
(iv)E294Aと315D/330V/361D/378V/434Y(「T5A-74」とも呼ばれる変異の組合せ)。「T5A-74L」と指定する断片は、変異E294Aの付加によってのみ断片T5A-74と区別されるFc断片である。
又は
(v)Y296Wと315D/330V/361D/378V/434Y(「T5A-74」とも呼ばれる変異の組合せ)。「T5A-74M」と指定する断片は、変異Y296Wの付加によってのみ断片T5A-74と区別されるFc断片である。
【００６５】
Fc断片T5A-74、T5A-74I、T5A-74J、T5A-74K、T5A-74L、T5A-74Mの配列は添付の配列表中に表す。
T5A-74 (N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y):
配列番号11 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74I (T260A/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
配列番号12 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVACVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74J (E258I/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
配列番号13 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPIVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74K (K290Y/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
配列番号14 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTYPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74L (E294A/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
配列番号15 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREAQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
T5A-74M (Y296W/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)
配列番号16
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQWNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
【００６６】
好ましくは、本発明によるバリアントは、親ポリペプチドのFc断片が少なくとも以下のものを含むことを特徴とする:
(i)前記Fc断片のV240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、Y296W、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R及びV305S、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
(ii)378V、378T、434Y及び434Sから選択される変異。
【００６７】
別の実施形態では、Fc断片は、
G316D、K326E、N315D、N361H、P396L、T350A、V284L、V323I、P352S、A378V、Y436H、V266M、N421T、G385R、K326T、H435R、K447N、N434K、K334N、V397M、E283G、A378T、F423L、A431V、F423S、N325S、P343S、K290E、S375R、F405V、K322E、K340E、N389S、F243I、T307P、N389T、S442F、K248E、Y349H、N286I、T359A、S383R、K334R、T394P、V259A、T393A、P352L、Q418P、V302A、L398P、F423P、S442P、V363I、S383N、S254F、K320E、G402D、I253F、V284A、A431T、N315H、Y319H、C226Y、F405L、T393I、N434S、R255W、A287T、N286Y、A231V、K274R、V308G、K414R、M428T、E345G、F243L、P247T、Q362R、S440N、Y278H、D312G、V262A、V305A、K246R、V308I、E380G、N276S、K439Q、S267G、F423Y、A231T、K320R、L410R、K320M、V412M、T307N、T366A、P230S、Y349S、A339T、K246E、K274E、A231P、I336T、S298N、L234P、S267N、V263A、E333G、V308A、K439R、K392R、S440G、V397I、I336V、Y373D、K288E、L309P、P227S、V379A、K288R、K320T、V282A、I377T、N421S及びC261R
から選択される少なくとも1つの変異を含み、そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングである。
【００６８】
詳細な実施形態では、Fc断片は少なくとも2つの変異の組合せを含み、前記組合せは以下から選択される:
(i)307N、326E、326T、334N、334R、352L、378V、378T、349P、396L、397M及び421T、並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nから選択される少なくとも1つの変異、
そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(i)が変異(ii)と同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００６９】
好ましくは、変異型Fc断片は補体C1qに対して増大したアフィニティーを有し、少なくとも2つの変異の組合せを含み、前記組合せは以下を含む:
i)378V、378T、396L、421T、334R及び326Eから選択される変異、並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D及び397Mから選択される少なくとも1つの変異、
そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(i)が変異(ii)と同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００７０】
好ましくは、変異型Fc断片はFcγRIIIa(CD16a)に対して増大したアフィニティーを有し、少なくとも2つの変異の組合せを含み、前記組合せは以下を含む:
i)378V、326E、397M、334N及び396Lから選択される変異、並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y及び298Nから選択される少なくとも1つの変異、
そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(i)が変異(ii)と同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００７１】
好ましくは、変異型Fc断片はFcγRIIa(CD32a)に対して増大したアフィニティーを有し、少なくとも2つの変異の組合せを含み、前記組合せは以下を含む:
i)378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L及び334Nから選択される変異、並びに
ii)316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P及び439Rから選択される少なくとも1つの変異、
そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(i)が変異(ii)と同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００７２】
好ましくは、変異型Fc断片はFcγRIIb(CD32b)に対して増大したアフィニティーを有し、少なくとも2つの変異の組合せを含み、前記組合せは以下を含む:
i)326E、326T、378V、397M、352L、394P、396L及び421Tから選択される変異、並びに
ii)316D、334R、248E、334N、418P、231V、320E、402D、359A、383R、421T及び361Hから選択される少なくとも1つの変異、
そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(i)が変異(ii)と同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００７３】
好ましくは、変異型Fc断片は少なくとも3つの変異の組合せを含み、前記組合せは以下を含む:
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N及び394Pから選択される変異、並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nから選択される少なくとも2つの変異、
そのナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングであり、変異(i)が変異(ii)と同じアミノ酸上に存在しないという条件付である。
【００７４】
特に有利な実施形態では、Fc断片はK334N/P352S/V397M/A378V(「A3A-184A」とも呼ばれる変異の組合せ、したがってこの変異の組合せを有するFc断片は「A3A-184A」とも呼ばれる)、G316D/K326E/A378V(「A3A-105D」とも呼ばれる変異の組合せ、したがってこの変異の組合せを有するFc断片は「A3A-105D」とも呼ばれる)、P396L/N421T/A378V(「J3B-118A」とも呼ばれる変異の組合せ、したがってこの変異の組合せを有するFc断片は「J3B-118A」とも呼ばれる)から選択される変異の組合せを有する。
【００７５】
断片A3A-184A(K334N/P352S/A378V/V397M)の配列は、配列番号19として配列表中に表す:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００７６】
断片A3A-105D(G316D/K326E/A378V)の配列は、配列番号20として配列表中に表す:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNDKEYKCKVSNEALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００７７】
断片J3B-118A(A378V/P396L/N421T)の配列は、配列番号21として配列表中に表す:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGTVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００７８】
別の詳細な実施形態によれば、本発明中で使用する変異型Fc断片は、位置293又は294におけるアミノ酸の欠失(del293又はdel294)を有し、Fc断片アミノ酸のナンバリングはEUインデックス又はKabatの同等物のナンバリングを指す。この欠失はFc断片の唯一の変異である可能性があり、又は特に前述の変異の中の他の変異を伴う可能性がある。
【００７９】
この単一変異は断片の特異的グリコシル化、即ち過剰シアル化をもたらし、これは糖タンパク質半減期及び炎症プロセスに関して非常に有利である。
【００８０】
別のより詳細な実施形態によれば、本発明中で使用する変異型Fc断片は位置293又は294におけるアミノ酸の欠失を有し、以下の一覧:226、230、241、256、259、264、307、315、330、342、361、362、378、382、383、389、396、397、421、428及び434から選択される位置に1つ又は複数の変異を更に有する。
【００８１】
例えば、好ましいFc断片は欠失del294又はdel293と組み合わせた変異307P、434Yの組合せを有する。
【００８２】
本発明の別の態様によれば、全てが実質的に同じ配列を有し、全体的に見て特異的グリコシル化プロファイルを有する複数のFc断片を含む組成物を使用する。
【００８３】
詳細な態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物は、そのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンは65%より低い、好ましくは60%より低い、好ましくは55%より低い、好ましくは50%より低い、より好ましくは45%より低い、好ましくは40%より低い、好ましくは35%より低い、好ましくは30%より低い、好ましくは25%より低い、好ましくは20%より低いフコシル化度を有することを特徴とする。
【００８４】
更に別の態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物はFc断片を含み、前記Fc断片はそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンは、短鎖、低シアル化を有し、末端マンノース及び/又は非挿入型末端N-アセチルグルコサミン(non-intercalated terminal N-acetylglucosamine)を有するバイアンテナリー型グリカン構造を有することを特徴とする。
【００８５】
より詳細な態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物はFc断片を含み、前記Fc断片はそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンの60%超がG0+G1+G0F+G1F型であり、G0F+G1F型が50%未満であることを特徴とする。
【００８６】
別のより詳細な態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物はFc断片を含み、前記Fc断片はそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンの60%超がG0+G1+G0F+G1F型であり、フコース含有率が65%より低いことを特徴とする。
【００８７】
別の更により詳細な態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物はFc断片を含み、前記Fc断片はそのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンの40%未満がG1F+G0F型であることを特徴とする。
【００８８】
より詳細な態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物は、そのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンは0%に等しいフコシル化度を有する。したがって本発明は、そのグリコシル化部位Asn297上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンがフコースを含まないことを特徴とする組成物を提供する。
【００８９】
更に、詳細な態様によれば、本発明の文脈中で使用する組成物は、そのグリコシル化部位Asn297上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンは20%と55%の間の範囲のフコシル化度を有することを特徴とする。詳細には本発明は、そのグリコシル化部位Asn297上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンが20%と50%の間、25%と55%の間、25%と50%の間、20%と45%の間、又は25%と45%の間の範囲のフコシル化度を有することを特徴とする組成物を提供する。
【００９０】
より詳細な態様によれば、本発明による有用な組成物は、そのグリコシル化部位Asn297上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンの60%超、好ましくは80%超がG0+G1+G0F+G1F型であり、G0F+G1F型が50%未満、好ましくは40%、又は30%未満であることを特徴とする。
【００９１】
別のより詳細な態様によれば、組成物内のFc断片のN-グリカンの60%超がG0+G1+G0F+G1F型であり、そのフコース含有率は65%より低い。
【００９２】
更に別のより詳細な態様によれば、組成物内のFc断片のN-グリカンの50%未満、好ましくは40%、又は30%未満がG1F+G0F型である。
【００９３】
G0、G0F、G1及びG1F型は図3中に示す型から選択される。
【００９４】
組成物内のFc断片のN-グリカンは、25%、20%、15%又は10%、好ましくは5%、4%、3%又は2%未満の平均シアル酸率を有することが有利である。
【００９５】
本発明の文脈中で使用することができる組成物は、そのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有するFc断片を含み、Fc断片の前記N-グリカンは、短鎖、低シアル化を有し、末端マンノース及び/又は非挿入型末端N-アセチルグルコサミンを有するバイアンテナリー型グリカン構造を有し、例えば、N-グリカンの60%超がG0+G1+G0F+G1F型からなり、且つ低フコシル化であり、N-グリカンの50%未満がG0F+G1F型からなる。
【００９６】
詳細な実施形態では、本発明によるFc断片は、特許出願WO01/77181中に記載されたようなグリカン構造を有する。
【００９７】
有利な実施形態によれば、本発明中で使用するFc断片は、親Fc断片と比較して少なくとも1つのアミノ酸の変異を含み、そのグリコシル化部位(Asn297)上にN-グリカンを有し、Fc断片の前記N-グリカンは65%より低い、好ましくは60%より低い、好ましくは55%より低い、好ましくは50%より低い、より好ましくは45%より低い、好ましくは40%より低い、好ましくは35%より低い、好ましくは30%より低い、好ましくは25%より低い、好ましくは20%より低いフコシル化度を有する。好ましくは、Fc断片は、前述の位置から選択される位置、特に以下の一覧:226、230、241、256、259、264、307、315、330、342、361、362、378、382、383、389、396、397、421、428及び434から選択される位置に1つ又は複数の変異を有し、更にそのグリコシル化部位(Asn297)上に、55%より低い、好ましくは50%より低い、より好ましくは45%より低い、好ましくは40%より低い、好ましくは35%より低い、好ましくは30%より低い、好ましくは25%より低い、好ましくは20%より低いフコシル化度を有するN-グリカンを有する。
【００９８】
より好ましくは、本発明による組成物のFc断片は、315D/330V/361D/378V/434Y、230S/315D/428L/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、259I/315D/434Y、256N/378V/383N/434Y及びdel294/307P/434Yから選択される変異の組合せを有し、更にそのグリコシル化部位(Asn297)上に、55%より低い、好ましくは50%より低い、より好ましくは45%より低い、好ましくは40%より低い、好ましくは35%より低い、好ましくは30%より低い、好ましくは25%より低い、好ましくは20%より低いフコシル化度を有するN-グリカンを有する。
【００９９】
位置297のグリコシル化部位に改変グリコシル化、特に低フコシル化を有するFc断片は、Fc-ガンマ受容体(FcγR)、特にFcγRIIIa(CD16a)に対して高い結合性を有することが有利である。
【０１００】
好ましくは、前記Fc断片は、Scatchard分析又はBIAcore技術(ラベルフリー表面プラズモン共鳴ベースの技術)により測定して、少なくとも2×106M-1に等しい、少なくとも2×107M-1、2×108M-1又は2×109M-1に等しい、CD16aに対するアフィニティーを有する。
【０１０１】
非常に有利なことに、本発明の変異型Fc断片は、異なる変異を有する異なる変異型Fc断片と組合せて使用することができる。例えば、変異型FcFc- del294、(FcRnも標的化するため)変異型FcT5A-74、FcγRとの結合用に改良された変異型Fc(タイプA3A-184A)の混合物を有利に使用することができる。
【０１０２】
本発明によるFc断片の生成
本発明中で使用するFc断片は、当業者に知られている任意の方法によって、例えば化学合成によって、又は組換えによって生成することができる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明中で使用するFc断片は「組換え体」と呼ばれる、即ちそれらは組換えによって得られる。
【０１０４】
本発明によるFc断片が1つ又は複数のアミノ酸の変異を有するとき、遺伝子合成、定方向変異誘発等の周知の技法によって変異を任意選択で導入することができ、特に所望の変異を導入する特異的プライマーを用いたPCR、又はランダム変異誘発によって得ることができる。好ましくは、出願WO02/038756中に記載されたようなランダム変異誘発、即ちMutaGen技法を使用する。この技法は、ヒトDNAミューターゼ、特にDNAポリメラーゼβ、η及びτから選択されるポリメラーゼを使用する。従来の組換え技法は、細胞外媒体へのFc断片配列の分泌有り又は無しでの発現を可能にする1つ又は複数のベクターで形質転換した、宿主細胞における組換えを含む。ベクターは一般に、プロモーター、翻訳の開始と終了に関するシグナル、及び転写の制御に適した領域を含む。ベクターは宿主細胞中で安定的に維持することができ、翻訳タンパク質の分泌を指定する特定シグナルを任意選択で有することができる。これらの様々なエレメントは、使用する宿主細胞に応じて当業者により選択され最適化される。
【０１０５】
このようなベクターは、当業者により一般的に使用される方法によって調製され、生成したクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、ポリカチオン性物質の使用、ヒートショック、又は化学法等の標準的方法によって適切な宿主中に導入することができる。
【０１０６】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物系、例えば細菌細胞だけではなく酵母細胞又は動物細胞、特に哺乳動物細胞から選択することができる。昆虫細胞又は植物細胞を使用することもできる。
【０１０７】
本発明中で使用するFc断片は、適切な培地及び培養条件において、前記Fc断片を発現する宿主細胞を培養し、培養培地又は前記培養細胞からこのように生成した断片を回収することによって生成することができる。
【０１０８】
Fc断片を発現させるのに好ましい哺乳動物は、ラット細胞株YB2/0、細胞株Vero、ハムスター細胞株CHO、特に細胞株CHOdhfr-及びCHOLec13、CHO-lec10、CHO-lec1、CHOK1SV Potelligent(登録商標)(Lonza社、スイス)、CHOGnTIII(Glycart社、スイス)、PER.C6(商標)(Crucell社)、HEK293、T1080、EB66、K562、NS0、SP2/0、BHK又はCOSである。
【０１０９】
別の生成形式は、トランスジェニック生物中、例えば植物中(Ayala M、Gavilondo J、Rodriguez M、Fuentes A、Enriquez G、Perez L、Cremata J、Pujol M.Production of plantibodies in Nicotiana plants.Methods Mol Biol.2009;483:103〜34頁)又はウサギ、ヤギ、ラット若しくはブタ等のトランスジェニック動物の乳中(Pollock、D.P.,J.P.Kutzko、E.Birck-Wilson、J.L.Williams、Y.Echelard and H.M.Meade.(1999).Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies.Journal of Immunological Methods.231:147〜157頁)でのFc断片の発現である。この点に関しては文書WO200748077も参照。
【０１１０】
代替実施形態では、それ自体が変異した免疫グロブリンのタンパク質分解処理によってFc断片を得る。
【０１１１】
Fc断片のグリコシル化は周知の技法によって改変することができる。本発明によるグリコシル化を有するFc断片は、特に酵素パパインにより、WO01/77181中に記載された技法に従い生成した抗体の切断から特に生成することができる。わずかにフコシル化したFc断片を、例えば文書US7700321中に記載されたようにキフネンシンの存在下で培養した細胞中、又は例えばフコース生成サイクルの少なくとも1つの酵素の阻害によってGDP-フコース生成経路が阻害される細胞中での生成によって得ることもできる(特に、文書US2010291628又はUS20090228994、EP1500698、EP1792987又はUS7846725を参照)。文書US7393683又は文書WO2006133148中に記載されたように1,6-フコシルトランスフェラーゼを阻害する干渉RNA(RNAi)を使用することもできる。例えば文書WO0200879中に記載されたような、酵母における調製法も一事項であり得る。
【０１１２】
Fc断片が100%非フコシル化オリゴ糖を有する場合、即ちFc断片が全くフコースを含まないとき、例えば、この一覧だけには限られないが、文書EP1176195、US7214775、US6994292、US7425449、US2010223686、WO2007099988、EP1705251中に開示された調製法等の、当業者に知られている調製法を使用することができる。例えば、Fc断片をコードする少なくとも1つの核酸を発現する宿主細胞を使用する方法、及びα1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失による、又はα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性の除去、及び結果として無フコース抗体断片の発現のための前記遺伝子の変異の付加によるグリコシル化の改変も一事項であり得る。
【０１１３】
治療用途
有効性と最適化エフェクター機能の両方又は少ない副作用の点での、それらの多くの利点のため、本明細書中に記載するFc断片は自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患の治療において有用である。
【０１１４】
患者における自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患を治療するための方法であって、本明細書中に記載する少なくとも1つのFc受容体に対して改変されたアフィニティーを有する治療有効量のFc断片を前記患者に投与することを含む方法を、本明細書中に記載する。
【０１１５】
本発明において、表現「自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患」は、任意選択で病原性自己抗体と関連した、臓器特異的又は全身性、一次又は二次自己免疫疾患及び/又は炎症性疾患を指す。
【０１１６】
例えば疾患は、血小板減少性血栓性紫斑病(TTP)、特発性血栓性紫斑病(ITP)、臓器又は移植片拒絶反応、移植片対宿主病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、異なるタイプの硬化症、原発性シェーグレン症候群(又はグジュロー-シェーグレン症候群)、多発性硬化症等の自己免疫性多発ニューロパチー、1型糖尿病、自己免疫性肝炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、痛風性関節炎、セリアック病、クローン病、橋本甲状腺炎(甲状腺機能低下症)、アジソン病、自己免疫性肝炎、バセドウ病(甲状腺機能亢進症)、潰瘍性大腸炎、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連全身性血管炎等の血管炎、自己免疫性血球減少症並びに成人及び小児における他の血管系合併症、例えば、急性又は慢性自己免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、新生児溶血性疾患(HDN)、寒冷凝集素症、血小板減少性血栓性紫斑病及び後天性自己免疫性血友病等、グッドパスチャー症候群、膜外腎症、自己免疫性水疱性皮膚障害、難治性筋無力症、混合型クリオグロブリン血症、乾癬、若年性慢性関節炎、炎症性筋炎、抗リン脂質抗体症候群を含めた小児における皮膚筋炎及び全身性自己免疫疾患、結合組織病、異なるタイプの硬化症、自己免疫性肺炎、ギランバレー症候群、川崎病、多巣性運動ニューロパチー(MMN)、慢性脱髄性炎症性多発根ニューロパチー(CDIP)、自己免疫性甲状腺炎、糖尿病(mellitus)、重症筋無力症、眼部の自己免疫性炎症疾患、視神経脊髄炎(ドヴィック病)、強皮症、天疱瘡、インスリン抵抗性による糖尿病、多発性筋炎、ビールメル貧血、糸球体腎炎、ウェゲナー病、巨細胞性動脈炎、結節性動脈周囲炎及びチャーグ-シュトラウス症候群、スティル病、萎縮性多発性軟骨炎、ベーチェット病、単クローン性ガンマグロブリン血症、ウェゲナー肉芽腫症、ループス、潰瘍性大腸炎、乾癬性リウマチ、サルコイドーシス、膠原線維性大腸炎、ヘルペス性皮膚炎、家族性地中海熱、IgAの沈着を伴う糸球体腎炎、ランバート-イートン筋無力症候群、交感性眼炎、フィサンジェ-ルロワ-ライター症候群及びぶどう膜髄膜脳炎症候群から選択することができる。
【０１１７】
他の炎症性疾患、例えば急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性敗血症性関節炎、アジュバント誘発関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性血管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌又はウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、冠動脈性心疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解症、急性及び遅延型過敏症反応と関連した炎症、腫瘍と関連した炎症、末梢神経損傷又は脱髄性疾患、火傷等の組織外傷及び虚血と関連した炎症、髄膜炎による炎症、多臓器機能不全症候群(MODS)、肺線維症、敗血症又は敗血症性ショック、スティーブンス-ジョンソン症候群、未分化型関節炎、及び未分化型脊椎関節炎等も含まれる。
【０１１８】
本発明の詳細な実施形態では、自己免疫疾患は特発性血栓性紫斑病(ITP)及び慢性脱髄性炎症性多発根ニューロパチー(CDIP)である。
【０１１９】
観察される影響の1つは、特にITP病状において観察される血小板破壊の限定又は減少、及びCDIPにおける末梢神経の髄鞘の消失の限定又は減少である。
【０１２０】
別の詳細な実施形態では、疾患は詳細には移植片対宿主病等の炎症性疾患である。この場合、位置294(del294)又は位置293(del293)におけるアミノ酸の欠失等の、過剰シアル化を誘導する変異を有するFc断片が特に有利である。
【０１２１】
任意の投与経路、特に非経口経路、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは局所経路等、又は粘膜経路による経路、例えば吸入による経路が想定される。腸内(経口、直腸)及びクモ膜下経路も考えられる。好ましくは、静脈内経路を使用する。
【０１２２】
本発明によるFc断片は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物内に一般に製剤化される。
【０１２３】
医薬組成物は、選択する投与経路に適した任意の剤形であってよい。
【０１２４】
本発明による有用な医薬組成物は、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤又は担体を有利なことに含む。例えば、医薬用途に適した当業者に知られる、食塩水、生理的、等張又は緩衝溶液等を言及することができる。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤等から選択される1つ又は複数の作用物質又は担体を含有することができる。製剤において有用な作用物質又は担体(液体及び/又は注射用及び/又は固体)は特にメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート80、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア等である。組成物は、長期及び/又は遅延型放出をもたらす剤形又はデバイスにより任意選択で製剤化することができる。このタイプの製剤に関しては、セルロース、カーボネート又はデンプン等の作用物質を使用することが有利である。
【０１２５】
投与する用量は、特に、当業者によって査定された患者の体重と年齢、及び疾患の重症度に従って変わり得る。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本発明によるFc断片の用量は、体重1kgあたり約0.05mg〜約1g、即ち成人に関して1日あたり約20mg〜約100gの範囲内である。好ましくは、用量は1日あたり約330mg/kg〜660mg/kgである。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定せずに本発明を例証する。
【０１２８】
組換えFc(野生型と変異型)用発現ベクターの構築:
組換えFc(アミノ酸221〜447)の配列を、標準的PCRプロトコールを使用して、HEK細胞中での発現用にpCEP4由来の一般的真核生物発現ベクター(Invitrogen社)、及びYB2/0細胞中での発現用にOptiCHOベクターにクローニングした。
【０１２９】
Fc断片における目的の全ての変異を、その変異を含有する2プライマーを使用した重複PCRにより発現ベクターに挿入した。PCRによりこのようにして得た断片を次いで組合せ、生成した断片は、標準的プロトコールを使用してPCRによって増幅した。PCR産物は1%(w/v)アガロースゲルにおいて精製し、適切な制限酵素で消化して、組換えFc用発現ベクターにクローニングした。
【０１３０】
図7は、HEK細胞中でのバリアントT5A-74の発現に使用したpCEP4ベクターのマップ、及びYB2/0細胞中でのバリアントT5A-74の発現に使用したOptiCHOベクターのマップを示す。
【０１３１】
HEK細胞における組換えFcの産生
HEK293細胞を、標準的プロトコール(Invitrogen社)に従い、組換えFc(野生型又は変異型)用pCEP4発現ベクターでトランスフェクトした。これらの細胞を培養して一過的に抗体を産生した。産生した抗体は、それらの特徴を鑑みて、当技術分野の標準的技法に従い単離し精製することができた。得られた産生率は約150〜500μg/mLである。産物の純度と質はSDS-PAGEとSECにより検証した。
【０１３２】
YB2/0細胞における組換えFcの産生
YB2/0細胞を、標準的プロトコールに従い、組換えFc(野生型又は変異型)用OptiCHO発現ベクターを用いたエレクトロポレーションにより安定的にトランスフェクトした。産生は安定的プール中又はYB2/0細胞のクローニング後に実施した。
【０１３３】
細胞培養によって抗体を産生するステップ、及びそれらを精製するステップを、それらの特徴を鑑みて、当技術分野の標準的技法に従い実施した。得られた産生率は約3〜30μg/mLである。産物の純度と質はSDS-PAGEとSECにより検証した。
【実施例１】
【０１３４】
有効性試験(赤血球細胞溶解の阻害):
ITP患者の自己抗体と関係があり、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)において観察される赤血球細胞溶解の状況を模倣するため、モノクローナル抗アカゲザルD(RhD)抗体の存在下でエフェクター細胞媒介赤血球細胞溶解を実施し、例えばエフェクター細胞表面へのFc受容体結合に関する抗RhDとの競合によって前記溶解を阻害する、様々な量の多価免疫グロブリン(IVIg)、又は変異型(以下の表1に従った変異を含有する組換えFc断片)及び非変異型組換えFc断片の能力を評価した。
【０１３５】
表1:本発明の好ましい変異型Fcバリアントの構築
以下の表は、有効性試験(赤血球細胞溶解の阻害)、及び表面プラズモン共鳴(SPR)によるヒトFcRnとCD16aVへの結合試験に関する実験において試験した、変異型Fc断片の異なるバリアントを表す。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
その目的のため、エフェクター細胞として、末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll勾配によって末梢血から精製した。健常Rh-D+血液ドナーから得たRh-D+赤血球細胞は抗RhDモノクローナル抗体と混合した。PBMCはオプソニン化Rh-D+赤血球細胞とインキュベートした(2:1のエフェクター/標的比)。
【０１３８】
Fc受容体の競合及び/又は飽和により抗RhD抗体によって誘導される細胞毒性を阻害する、候補物質(IVIg、及び表1に従い定義したように変異させた組換えFc断片、及び非変異型)の能力を評価するため、様々な濃度の候補物質(0〜9.75μM)をそれぞれのウェルに加えた。16時間後、溶解した赤血球細胞の割合を、上澄み中に放出されたヘモグロビン量の測定(光学濃度(OD)の測定)により色素体によって概算した。特異的溶解率を以下の式に従いパーセンテージで計算する:
【０１３９】
OD試料-OD対照0%/OD対照100%-OD対照0%×100=溶解%
上式で:
「OD対照100%」は赤血球の完全溶解に相当する(例えばNH4Cl)
「OD対照0%」は抗体を含まない反応混合物で観察した溶解に相当する
【０１４０】
これらの結果は特異的溶解率%として表す(図4及び5参照)。
【実施例２】
【０１４１】
BiacoreX100における表面プラズモン共鳴(SPR)によるヒトFcRnとCD16aVへの結合試験:
使用したタンパク質:
組換えヒトFcRn(FcRnα及びβ2-マイクログロブリン)を、以前に記載されたように(Popovら、Mol.Immunol.33:521〜530頁(1996))、GTP Technology社(Labege、フランス)によるバキュロウイルス細胞において産生した。組換えヒトCD16aVは市販されている(R and D Systems社)。
【０１４２】
FcRnに関する試験:
CM5チップ(Biacore、GE Healthcare社)のFC1及びFC2セルを、30μL/分で0.1MのN-ヒドロキシスクシンイミドと0.1Mの3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカルボジイミドの1:1混合物を用いて3分間活性化した。次いで組換えFcRnを、10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5)中32.6μg/mLでFC2セルに固定した(100秒間固定、350RUの最終固定レベル)。FC2と同様の形式ただし組換えFcRnの非存在下で調製したFC1セルを、陰性対照として使用した。試験対象の組換えFcを、FC1及びFC2セル上に10μL/分で8分間、50mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、0.05%のTween20バッファー(pH6)中6つの異なる濃度(300nM、150nM、75nM、30nM、15nM及び0)で注入した。FC1及びFC2セルは、50mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、0.05%のTween20バッファー(pH7.8)を1分間注入することにより各試料濃度間で再生した。作成したデータは、FC2で得た試験シグナルからFC1で得た対照シグナルを差し引くことにより、BIAevaluationバージョン3.1ソフトウエア(Biacore)で分析した。
【０１４３】
CD16aVに関する試験:
CM5チップ(Biacore、GE Healthcare社)のFC1及びFC2セルをHis捕捉キット(GE Healthcare社、アイテム28-9950-56)で調製して、50μg/mLで抗ヒスチジン抗体を固定した(FC1及びFC2で5μL/分の流速、7分間EDC/NHS活性化、7分間固定、12,000RUの最終固定レベル)。組換えヒトCD16aVを、5μL/分で60秒間FC2セル上に固定した(HBS-EP+中1μg/mL、Biacore、GE Healthcare社)。試験対象の組換えFcを、各濃度間の再生なしに60秒の接触時間、300秒の解離及び30μL/分の流速で、単一サイクル動態(SCK)条件においてHBS-EP+バッファー中5つの異なる濃度(1000nM、500nM、250nM、125nM及び25nM)でFC1及びFC2セルに注入した。各組換えFc間の最終再生は、FC1及びFC2セルにおいて30μL/分で、60秒間10mMグリシンバッファー(pH1.5)中で実施した。作成したデータは、FC2で得た試験シグナルからFC1で得た対照シグナルを差し引くことにより、BIAevaluationバージョン3.1ソフトウエア(Biacore)で分析した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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