(57)【要約】本開示は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を提供する。本開示のｒＡＡＶウイルス粒子は、標的細胞へのより高い感染性を示すことができる。本開示はまた、本開示のｒＡＡＶを個体に投与することによる、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法を提供する。本開示はまた、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法を提供する。2018514190.tif 000006
2018514190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；またはそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；ならびに
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項２】
ａ）配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項３】
ａ）配列番号１４に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項４】
ａ）配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；及び
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項５】
前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、標的細胞への高い感染性を付与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項６】
前記標的細胞が筋細胞またはグリア細胞である、請求項５に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項７】
野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の標的細胞感染性に比べて少なくとも５倍高い標的細胞感染性を示す、請求項５及び６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項８】
前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質が付与する標的細胞受容体依存性に比べて変化した標的細胞受容体依存性を付与する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項９】
感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて低いシアル酸またはヘパリン硫酸プロテオグリカン依存性を有する、請求項８に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１０】
前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、請求項１０に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１２】
前記分泌ポリペプチドが、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、α１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様増殖因子１、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼからなる群から選択される、請求項１１に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１４】
前記遺伝子産物がゲノム編集遺伝子産物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１５】
前記ゲノム編集遺伝子産物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムまたはその成分からなる群から選択される、請求項１４に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１６】
前記遺伝子産物が核酸遺伝子産物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１７】
前記核酸遺伝子産物が、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーである、請求項１６に記載のｒＡＡＶウイルス粒子。
【請求項１８】
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子；及び
ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤
を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を個体に投与することを含む、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法。
【請求項２０】
前記標的細胞が筋細胞またはグリア細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分泌ポリペプチドが、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、及びα１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様増殖因子１、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子産物が、ゲノム編集遺伝子産物である、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ゲノム編集遺伝子産物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓ９／ガイドＲＮＡシステムまたはその成分からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子産物が核酸遺伝子産物である、請求項１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸遺伝子産物が、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、単離された核酸。
【請求項３０】
前記変異型キャプシドタンパク質が、ＡＡＶウイルス粒子中に存在する場合、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べて高いＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性を提供する、請求項２９に記載の単離された核酸。
【請求項３１】
請求項２９及び３０のいずれか一項に記載の核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３２】
配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；またはそれぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３３】
野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べてそれぞれ高い筋細胞またはグリア細胞感染性を付与する、請求項３２に記載の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３４】
ｒＡＡＶウイルス粒子の初期ライブラリを標的細胞における第１選択ラウンドに供することであって、前記初期ライブラリ中の前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、それぞれ、ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を有する初期ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み、かつ前記ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の１つまたは複数の可変残基が互いに異なる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含み、それにより、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の第２のライブラリを生成する、前記供すること
を含む、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法。
【請求項３５】
ｉ）複数の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の系統樹を再構築すること；
ｉｉ）前記系統樹のノードを選択すること；及び
ｉｉｉ）前記ノードにおいて最も有望なアミノ酸配列を決定すること
によって、前記祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を決定することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、前記系統樹の各ノードにおける信頼値を推定することをさらに含み、かつ前記選択する段階が、前記ノードにおける推定された信頼値に基づいて前記系統樹のノードを選択することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記初期ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号７に記載の配列と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ｒＡＡＶウイルス粒子の前記第２のライブラリを第２選択ラウンドに供することを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２選択ラウンドが、前記第１選択ラウンドで使用した前記標的細胞と同じ標的細胞型で実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２選択ラウンドが、前記第１選択ラウンドに比べて高い厳密性を有する、請求項３８及び３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的細胞が、筋細胞、上皮細胞、皮膚細胞、グリア細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞からなる群から選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記供する段階が、
ａ）標的細胞に前記ｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを感染させること；
ｂ）感染した細胞にヘルパーウイルスを重感染させること；及び
ｃ）重感染した細胞から放出されたｒＡＡＶウイルス粒子を回収すること
を含む、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子を単離することを含み、単離されたｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて、高い感染性、増強された指向性、またはその両方を有する、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１３７，５８０号の恩典を主張し、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦支援研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所から拠出された助成金番号ＨＧ００４４８３及びＥＹ０２２９７５の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
諸言
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科及びディペンドウイルス属に属し、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染により複製する。ＡＡＶは、ヘルパーの非存在下で潜伏感染を確立することができる。ウイルス粒子は、２つのオープンリーディングフレーム：ｒｅｐ及びｃａｐを有する４．９ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを包み込む２５ｎｍの正２０面体のキャプシドからなる。非構造遺伝子ｒｅｐは、ウイルス複製に必須の４つの調節タンパク質をコードし、一方、ｃａｐは、複合化して６０ｍｅｒのキャプシドシェルとなる３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）をコードする。このウイルスキャプシドは、細胞表面受容体への結合、エンドサイトーシス、細胞内輸送、及び核内でのアンパッケージングを含む、ウイルス形質導入における生物学的な障壁の多くを克服するＡＡＶベクターの能力を媒介する。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を提供する。本開示のｒＡＡＶウイルス粒子は、標的細胞へのより高い感染性を示すことができる。本開示はまた、本開示のｒＡＡＶを個体に投与することによる、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法を提供する。本開示はまた、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法を提供する。
【０００５】
本開示の態様は、以下を含有するｒＡＡＶウイルス粒子を包含する：ａ）配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ、及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ、及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質；ならびにｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有する異種核酸。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１４に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶウイルス粒子中に存在する場合、高い標的細胞感染性をｒＡＡＶウイルス粒子に付与する。いくつかの場合には、標的細胞は筋細胞またはグリア細胞である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の標的細胞感染性に比べて少なくとも５倍高い標的細胞感染性を示す。
【０００７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質が付与する標的細胞受容体依存性に比べて変化した標的細胞受容体依存性を付与する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて低いシアル酸またはヘパリン硫酸プロテオグリカン依存性を有する。
【０００８】
本明細書で論じる任意の実施形態において、遺伝子産物はポリペプチド、例えば分泌ポリペプチドであってもよい。任意の実施形態において、ポリペプチドは、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ様１Ａ（ＬＡＲＧＥ１としても知られる）、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、またはイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質であってもよい。本明細書で論じる任意の実施形態において、分泌ポリペプチドは、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、α１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様成長因子１、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼであってもよい。
【０００９】
任意の実施形態において、遺伝子産物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）システムまたはその成分を含むゲノム編集遺伝子産物であってもよい。
【００１０】
任意の実施形態において、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、またはアプタマーを含む核酸遺伝子産物であってもよい。
【００１１】
本明細書では、ａ）上記または下記に示す任意の実施形態によるｒＡＡＶウイルス粒子、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤を含有する医薬組成物も提供する。
【００１２】
本明細書では、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法も提供し、前記方法は、上記または下記に示す任意の実施形態によるｒＡＡＶウイルス粒子を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞またはグリア細胞である。
【００１３】
本開示の他の態様は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離された核酸を包含し、前記変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１６に示す配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである。いくつかの実施形態では、変異型キャプシドタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子中に存在する場合、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べてそれぞれ高いＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性を付与する。
【００１４】
本明細書では、上記または下記のいずれかの実施形態の核酸を含有する、単離された遺伝子改変宿主細胞も提供する。
【００１５】
本明細書ではまた、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、変異型キャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子の筋細胞またはグリア細胞感染性に比べてそれぞれ高い筋細胞またはグリア細胞感染性を付与する。
【００１６】
本開示は、ｒＡＡＶウイルス粒子の初期ライブラリを標的細胞における第１選択ラウンドに供することを含む、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の作製方法も含み、ここで、初期ライブラリ中のｒＡＡＶウイルス粒子は、それぞれＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を有する初期ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有し、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の１つまたは複数の可変残基が互いに異なる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含有し、それにより、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の第２のライブラリを作製する。いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）複数の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の系統樹を再構築すること、ｉｉ）系統樹のノードを選択すること、及びｉｉｉ）そのノードにおいて最も有望なアミノ酸配列を決定することによって、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、系統樹の各ノードにおける信頼値を推定することをさらに含み、かつ選択する段階は、ノードにおける推定された信頼値に基づいて系統樹のノードを選択することを含む。いくつかの場合には、初期ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号７に記載の配列と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
任意の実施形態において、本方法は、ｒＡＡＶウイルス粒子の第２のライブラリを第２選択ラウンドに供することを含み得る。いくつかの実施形態では、第２選択ラウンドは、第１選択ラウンドで使用した標的細胞と同じ標的細胞型で実施する。いくつかの実施形態では、第２選択ラウンドは、第１選択ラウンドに比べて厳密性が高い。
【００１８】
任意の実施形態において、標的細胞は、筋細胞、上皮細胞、皮膚細胞、またはグリア細胞であってもよい。いくつかの場合には、標的細胞はヒト胎児由来腎臓細胞である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記供する段階は、ａ）標的細胞にｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを感染させること、感染細胞にヘルパーウイルスを重感染させること、及び重感染細胞から放出されたｒＡＡＶウイルス粒子を回収することを含む。
【００２０】
任意の実施形態において、本方法は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子を単離することを含んでもよく、ここで、単離されたｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶウイルス粒子に比べて高い感染性、増強された指向性、またはその両方を有する。
【００２１】
本発明のｒＡＡＶウイルス粒子またはｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを含み、本方法の実施において使用するキットも、本明細書において提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】祖先型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列の再構成を示す画像である。パネルＢ：ｈｕ．３１及びｈｕ．３２−配列番号１；ｃｙ．６及びｒｈ．１３−配列番号２；ｒｈ．２、ｒｈ．５０、ｈｕ．６７、ｒｈ．１０、及びｒｈ．５５−配列番号３；ｒｈ．５１−配列番号４；ｒｈ．４９−配列番号５；ｃｙ．４−配列番号６。パネルＣ：配列番号１８。
【図２】祖先型ＡＡＶ配列の再構成のための完全な系統樹を示す。
【図３】本発明の一実施形態による、祖先型ＡＡＶ  ｃａｐアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図４−１】祖先型ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質と天然血清型とのアライメントを示す（祖先型−配列番号７；ＡＡＶ１−配列番号８；ＡＡＶ６−配列番号９；ＡＡＶ７−配列番号１０；ＡＡＶ８−配列番号１１；ＡＡＶ９−配列番号１２）。
【図４−２】祖先型ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質と天然血清型とのアライメントを示す（祖先型−配列番号７；ＡＡＶ１−配列番号８；ＡＡＶ６−配列番号９；ＡＡＶ７−配列番号１０；ＡＡＶ８−配列番号１１；ＡＡＶ９−配列番号１２）。
【図４−３】祖先型ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質と天然血清型とのアライメントを示す（祖先型−配列番号７；ＡＡＶ１−配列番号８；ＡＡＶ６−配列番号９；ＡＡＶ７−配列番号１０；ＡＡＶ８−配列番号１１；ＡＡＶ９−配列番号１２）。
【図５】本開示の一実施形態による、６ラウンドの選択後の祖先型ＡＡＶ変異体のＡＡＶ  ｃａｐタンパク質中の可変位置にある優勢アミノ酸を示す。
【図６】選択後の祖先型ＡＡＶ変異体における、相同ＡＡＶ１の結晶構造にマッピングしたＡＡＶ  ｃａｐアミノ酸の可変残基を示す画像である。
【図７】本開示の一実施形態による、３ラウンドの選択後の祖先型ＡＡＶ変異体のＡＡＶ  ｃａｐタンパク質中の可変位置における優勢アミノ酸を示す。
【図８】本開示の一実施形態による、６ラウンドの選択後の祖先型ＡＡＶ変異体のＡＡＶ  ｃａｐタンパク質中の可変位置におけるアミノ酸頻度の変化を示す。
【図９】本開示の一実施形態による、３ラウンドの選択後の祖先型ＡＡＶ変異体のＡＡＶ  ｃａｐタンパク質中の可変位置におけるアミノ酸頻度の変化を示す。
【図１０−１】本開示の一実施形態による、ベイジアン・ディリクレ多項式モデル比較試験による、選択後の祖先型ＡＡＶ変異体のＡＡＶ  ｃａｐタンパク質における重要な可変残基を示す。
【図１０−２】本開示の一実施形態による、ベイジアン・ディリクレ多項式モデル比較試験による、選択後の祖先型ＡＡＶ変異体のＡＡＶ  ｃａｐタンパク質における重要な可変残基を示す。
【図１１】本開示の一実施形態による、天然ＡＡＶ血清型に対してベンチマーク評価した、進化させた祖先型ライブラリの形質導入効率を示す。
【図１２Ａ】本開示の一実施形態による、祖先型ＡＡＶ変異体のグリカン依存性の試験結果を示す。
【図１２Ｂ】本開示の一実施形態による、祖先型ＡＡＶ変異体のグリカン依存性の試験結果を示す。
【図１３】本開示の一実施形態による、細胞への進入に関する祖先型ＡＡＶ変異体の糖タンパク質依存性の試験結果を示す。
【図１４】ヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による、祖先型ＡＡＶ変異体の形質導入効率に対するインビトロ中和の結果を示す。
【図１５】本開示の一実施形態による、祖先型ＡＡＶ変異体による腓腹筋への形質導入の評価結果を示す。
【図１６】祖先型ＡＡＶ変異体のアミノ酸配列、Ｃ４（配列番号１３）、Ｃ７（配列番号１４）、及びＧ４（配列番号１５）を示す。
【図１７】祖先型ＡＡＶ変異体Ｃ４、Ｃ７及びＧ４のコンセンサスアミノ酸配列（上部、配列番号１６）、ならびに祖先型ＡＡＶ変異体Ｃ４及びＣ７のコンセンサスアミノ酸配列（下部、配列番号１７）を示す。
【図１８】選択後の祖先型ＡＡＶ変異体の熱安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含む場合があり、非ヌクレオチド成分によって中断される場合がある。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、それは、ポリマー構築の前または後に付与され得る。本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖及び一本鎖分子を互換的に指す。特に明記のない限り、または必要のない限り、本明細書に記載する本開示の任意の実施形態のポリヌクレオチドは、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが周知または予測される二本の相補的な一本鎖形態の各々、の両方を包含し得る。
【００２４】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して一定の割合の「配列同一性」を有しており、これはすなわち、アライメントを行い、その２つの配列を比較した場合に、その割合の塩基またはアミノ酸が同一であることを意味する。配列の類似性は、多くの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータープログラムを用いて、配列をアライメントすることができる。他のアライメントアルゴリズムはＦＡＳＴＡであり、これはＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全所有子会社である米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能である。アライメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。特に興味深いのは、配列中のギャップを許容するアライメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アライメントのギャップを許容するアルゴリズムの１種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）参照。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアライメント法を用いるＧＡＰプログラムを利用して配列をアライメントすることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）参照。
【００２５】
Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））を用いて配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムは興味深い。ギャップ生成ペナルティは、一般的に１〜５、通常は２〜４の範囲にあり、多くの実施形態では３である。ギャップ拡張ペナルティは、一般的に約０．０１〜０．２０の範囲にあり、多くの場合０．１０である。プログラムは、比較するべき入力配列によって決定するデフォルトパラメーターを有する。好ましくは、このプログラムが決定するデフォルトパラメーターを用いて配列同一性を決定する。このプログラムもまた、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージから入手可能である。
【００２６】
興味深い別のプログラムはＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに記載されている。配列同一性の割合は、ＦａｓｔＤＢによって、以下のパラメータに基づいて計算する：
ミスマッチペナルティ：１．００；
ギャップペナルティ：１．００；
ギャップサイズペナルティ：０．３３；及び
結合ペナルティ：３０．０。
【００２７】
「遺伝子」とは、転写、翻訳後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。
【００２８】
「低分子干渉ＲＮＡ」または「短鎖干渉ＲＮＡ」すなわちｓｉＲＮＡは、関心対象の遺伝子（「標的遺伝子」）を標的とする二本鎖ＲＮＡヌクレオチドである。「二本鎖ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ分子の２つの領域間において相補的対形成により形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、遺伝子に「標的指向」されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二本鎖は、鎖長２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の鎖長は１９〜２５ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含む場合がある。ループの鎖長はさまざまであり得る。いくつかの実施形態では、ループは、鎖長５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドである。ヘアピン構造は、３′突出部または５′突出部を含むこともできる。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、鎖長０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの３′または５′オーバーハングである。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、用語「マイクロＲＮＡ」とは、内在性マイクロＲＮＡ及び人工マイクロＲＮＡ（例えば、合成ｍｉＲＮＡ）を含むが、必ずしもこれらに限定されない任意のタイプの干渉ＲＮＡを指す。内在性マイクロＲＮＡとは、ゲノムに天然にコードされており、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる短鎖ＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡとは、内在性マイクロＲＮＡ以外の、ｍＲＮＡの活性を調節可能な任意のタイプのＲＮＡ配列であり得る。マイクロＲＮＡ配列は、これらの配列の任意の１つまたは複数からなるＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）配列は、例えば、Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１−１００８，Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０，Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２，Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５８−８６１，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７、及びＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，ＲＮＡ，９，１７５−１７９などの刊行物に記載されている。マイクロＲＮＡの例として、長鎖ＲＮＡの断片であるか、またはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、もしくは他の小分子非コードＲＮＡである任意のＲＮＡが挙げられる。例えば、米国特許出願２００５０２７２９２３、２００５０２６６５５２、２００５０１４２５８１、及び２００５００７５４９２参照。「マイクロＲＮＡ前駆体」（または「プレｍｉＲＮＡ」）とは、マイクロＲＮＡ配列が組み込まれたステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（または「成熟ｍｉＲＮＡ」）は、マイクロＲＮＡ前駆体（「プレｍｉＲＮＡ」）から切り出されたか、または合成した（例えば、実験室で無細胞合成によって合成した）、約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドの鎖長を有するマイクロＲＮＡを含む。例えば、成熟マイクロＲＮＡは、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、または２７ｎｔの鎖長を有することができる。成熟マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００３０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書中では同じ意味で用いられ、これらは任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識化成分との複合体化などにより修飾したアミノ酸ポリマーも包含する。哺乳類対象に遺伝子産物及びその組成物を送達する状況について考察する場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのポリペプチドは、インタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するそれぞれのインタクトなポリペプチド、またはその任意の断片もしくは遺伝子改変誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び哺乳類対象への遺伝子産物の送達に使用するための他のそのような核酸（レシピエント細胞に送達するための「導入遺伝子」と呼ばれることもある）を指す場合、それには、所望の生化学的機能を有するインタクトなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または任意の断片もしくは遺伝子改変誘導体が含まれる。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、用語「治療」、「治療する」などは、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、及び／または疾患及び／または疾患に起因する有害な影響に対して、部分的または完全に治癒させるという点で治療的であってもよい。本明細書中で使用する「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、以下を含む：（ａ）疾患にかかりやすいかまたは疾患に罹患するリスクがあるが、まだその疾患を有するとは診断されていない対象における疾患の発症を予防すること；（ｂ）疾患を阻害、すなわちその進展を阻止すること；及び（ｃ）疾患を緩和、すなわち疾患を退縮させること。
【００３２】
用語「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」は、本明細書中では同じ意味で用いられ、ヒト及び非ヒト霊長類を含むが必ずしもこれらに限定されない哺乳類を指し、例えば、サル及びヒト；哺乳類の競技用動物（例えば、ウマ）；哺乳類の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳類のペット（犬、猫など）；ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）が挙げられる。
【００３３】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用してもよい。この用語は、他に必要な場合を除いて、すべてのサブタイプならびに天然型及び組換え型の両方を包含する。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（すなわち「ｒＡＡＶベクター」）をも指す。用語「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ−９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、などである。
【００３４】
本明細書中で使用する「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）を有し、一般的には細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般的に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、通常２つのＡＡＶ末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）に隣接している。用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子及びｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。
【００３５】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（通常は、野生型ＡＡＶのすべてのキャプシドタンパク質）と、キャプシド形成したポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達するトランスジーンのような野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは一般的には「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶウイルス粒子」と呼ぶ。したがって、そのようなベクターがｒＡＡＶウイルス粒子内に含まれるため、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生は必然的にｒＡＡＶベクターの産生を含む。
【００３６】
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の構築及びキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。
【００３７】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製及びキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書中ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ぶ。
【００３８】
ＡＡＶ用の「ヘルパーウイルス」とは、哺乳類細胞がＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）を複製及びパッケージングすることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアなどのポックスウイルスを含む、そのような様々なＡＡＶ用のヘルパーウイルスが当該分野で公知である。アデノウイルスのサブグループＣのタイプ５が最も一般的に使用されるが、アデノウイルスは多数の異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳類及びトリ由来の多数のアデノウイルスが公知であり、寄託機関、例えばＡＴＣＣより入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとして、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ；これらはＡＴＣＣのような寄託機関からも入手可能である。
【００３９】
「ヘルパーウイルス機能」とは、（本明細書に記載の複製及びパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶ複製及びパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされた機能を指す。本明細書に記載するように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をプロデューサー細胞にトランスに提供することを含む多くの方法で提供してもよい。
【００４０】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、そのウイルス種が指向性を有する細胞に送達可能なポリヌクレオチド成分を含むものである。この用語は、ウイルスの複製能力を必ずしも意味するものではない。本明細書中で使用する場合、「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、標的細胞にアクセス可能であり、標的細胞に感染可能であり、標的細胞において異種核酸を発現することができる。したがって、「感染性」は、ウイルス粒子が標的細胞にアクセスし、標的細胞に感染し、標的細胞に異種核酸を発現させる能力を指す。感染性は、インビトロでの感染性またはインビボでの感染性を意味し得る。感染性ウイルス粒子数を計測するためのアッセイは、本開示及び当該技術分野の他の箇所に記載されている。ウイルス感染性は、全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比として表すことができる。全ウイルス粒子は、ウイルスゲノムのコピー数として表すことができる。ウイルス粒子が細胞内で異種核酸を発現する能力は、「形質導入」と呼ぶことができる。ウイルス粒子が細胞内で異種核酸を発現する能力は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ（例えば、そこではウイルスはＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む）においてウイルス粒子に感染した細胞中でＧＦＰを産生し、これを検出及び／または測定するなどのマーカー遺伝子の評価；または、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による産生タンパク質の測定を含む多くの技術によって分析することができる。
【００４１】
「複製可能型」ウイルス（例えば、複製可能型ＡＡＶ）とは、表現型が野生型の感染性ウイルスを指し、感染細胞（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下）で複製可能である。ＡＡＶの場合、複製能力は、通常、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。一般的に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数のＡＡＶパッケージング遺伝子が欠如していることにより、哺乳類細胞（特にヒト細胞）において複製不能である。通常、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と、進入してくるｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって複製可能型ＡＡＶが生成する可能性を最小限に抑えるために、ＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠失している。多くの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、複製可能型ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも呼ばれる）をほとんど含まない（例えば、ｒＡＡＶ粒子１０２個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０４個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０８個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０１２個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、またはｒｃＡＡＶなし）。
【００４２】
ｒＡＡＶウイルス粒子の「ライブラリ」とは、構造（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質の構造）及び／またはそこに含まれる核酸の配列が互いに異なる２つ以上のｒＡＡＶウイルス粒子を表す複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含有する組成物である。
【００４３】
用語「指向性」とは、１つまたは複数の他の細胞型に比べて、１つの細胞型に対してより高い感染性を有するウイルス粒子を指す。指向性はまた、ウイルス粒子の組織特異性を指す場合もある。例えば、筋細胞に対する指向性を有するウイルス粒子は、非筋細胞に対する感染性に比べて、筋細胞に対して高い感染性を有する。ＡＡＶにおいては、指向性はＡＡＶキャプシド血清型、すなわちＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に影響を受ける。対照的に、ウイルス粒子は、ウイルス粒子が広範囲の細胞型に対して感染性を示す場合には、無差別的であると言われる。場合によっては、ウイルス粒子は、１つまたは複数の細胞型に対して指向性を示し、無差別的でもあり得る。
【００４４】
ポリヌクレオチドに適用する「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限酵素切断、またはライゲーション段階、及び天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の、様々な組合せの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語はそれぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物及び元のウイルス構築物の子孫を包含する。
【００４５】
「調節エレメント」または「調節配列」は、ポリヌクレオチドの複製、倍化、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、スピード、または特異性に影響を及ぼし、本質的に促進または阻害する場合がある。当該分野で公知の調節エレメントとして、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常、プロモーターの下流（３′方向）に位置するコード領域の転写を開始させることが可能なＤＮＡ領域である。
【００４６】
「機能的に連結した」または「作動可能に連結した」とは、遺伝要素が並置されており、これらの要素が期待通りに作用可能な関係にあることを意味している。例えば、プロモーターがコード配列の転写を開始するのを支援する場合、プロモーターはコード領域に機能的に連結している。この機能的関係を維持する限りにおいて、プロモーターとコード領域の間に介在残基が存在していてもよい。
【００４７】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、目的の標的細胞においてタンパク質を発現させるために用いる。発現ベクターはまた、コード領域に機能的に連結した調節エレメントを含み、標的中のタンパク質の発現を促進する。調節エレメントと、それらが発現のために作動可能に連結している遺伝子との組合せは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、その多くは当該分野で公知であり、利用可能であるか、または当該技術分野で利用可能な成分から容易に構築することができる。
【００４８】
「異種」とは、それを比較する残りの実体の遺伝子型とは異なる遺伝子型の実体に由来することを意味する。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに対して遺伝子工学技術によって導入したポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から取り出され、それが天然には結合していないコード配列に機能的に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードする異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶが通常であればコードしない遺伝子産物である。
【００４９】
用語「遺伝的改変」及び「遺伝子改変」（及びその文法上の変異形）は、本明細書中では同じ意味で用いられ、遺伝因子（例えば、ポリヌクレオチド）を、有糸分裂または減数分裂以外の方法で細胞内に導入するプロセスを指す。因子は、細胞に対して異種であってもよく、または細胞に既に存在する因子の追加のコピーまたは改良版であってもよい。遺伝的改変は、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触のような、当該分野で公知の任意のプロセスを介して、細胞に組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドを形質移入することによって行ってもよい。遺伝的改変はまた、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターによる形質導入または感染によって行ってもよい。一般的には、遺伝因子は、細胞内の染色体またはミニ染色体に導入するが；この用語には、細胞及びその子孫の表現型及び／または遺伝子型を変化させる任意の改変が含まれる。
【００５０】
インビトロでの細胞の長期培養の間、遺伝子配列がその機能を発現するために利用可能である場合、細胞はその配列によって「安定的に」改変され、形質導入され、遺伝子改変され、または形質転換されていると言われる。一般的に、改変した細胞の子孫にも継承され得る遺伝子改変を導入するという点で、そのような細胞は、「遺伝的に」改変（遺伝子改変）されている。
【００５１】
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ウイルス粒子、宿主細胞、または他の物質とは、類似の物質が自然発生するか、または最初に調製されて存在し得る他の成分の少なくともいくつかが欠如した物質の調製物を意味する。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を用いて原料混合物から濃縮することによって調製し得る。濃縮は、溶液の体積当たりの重量のような絶対的な基準で測定可能であり、または原料混合物中に存在する潜在的に干渉する第２の物質に関して測定することができる。本発明の実施形態をより濃縮することにより、より単離が促進される。いくつかの実施形態では、単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質を、例えば、約８０％〜約９０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度、または少なくとも約９９％、もしくはそれ以上の純度で精製する。
【００５２】
用語「祖先型」とは、オーソロガス配列から推定され、オーソロガス配列がそれに由来するであろう配列を表すと思われる１つまたは複数のアミノ酸配列を指す。場合によっては、オーソロガス配列は、自然界のメンバーに見出される野生型配列である。祖先型配列に沿ったいくつかの残基におけるアミノ酸の同一性は、しばしば、信頼度の閾値レベルを上回る（例えば、９０％を上回る）レベルで推定することができない。したがって、祖先型配列のアミノ酸の同一性は、一般的には残基の９０％〜９９％、例えば９２％〜９８％、９３％〜９７％、または９４％〜９６％で決定され、一方、閾値信頼度を上回るレベルで推定することができない残基のアミノ酸は可変となる。したがって、祖先型アミノ酸配列は、ある残基が互いに異なる、例えば残基の最大約５％まで互いに異なる２つ以上の配列の集合であってもよい。
【００５３】
用語「ゲノム編集」とは、異種ヌクレアーゼを用いて配列を挿入、置換または除去することによって細胞内の遺伝子配列を改変するプロセスを指す。異種ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）システム、または改変メガヌクレアーゼのメンバーを含む、遺伝子改変したヌクレアーゼであってもよい。
【００５４】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載する特定の実施形態に必ずしも限定されるものではなく、当然のことながら変化し得ることは理解されたい。本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであって、必ずしも限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００５５】
ある範囲の値を提供する場合、文脈上、明確な指示のない限り、その範囲の上限と下限との間における、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値、及び任意の他の記載する値またはその記載する範囲内の介在値は、本発明に包含される。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、独立してより狭い範囲に含めてもよく、記載する範囲内の任意の特定の除外される限界を前提として、本発明に包含してもよい。記載する範囲が限界の一方または両方を含む場合、含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本発明に包含される。
【００５６】
他に定義のない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同等の意味を有する。本明細書中に記載する方法及び物質と類似または等価な任意の方法及び物質も本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び物質を記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物は、参照として本明細書に組み入れられ、刊行物の引用に関連する方法及び／または物質を開示及び記載する。
【００５７】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確な指定のない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「１つのｒＡＡＶウイルス粒子」への言及は、複数のそのようなｒＡＡＶウイルス粒子を包含し、「その単離された核酸」への言及は、１つまたは複数の単離された核酸及び当業者に公知のその均等物への言及を包含する、などである。請求項は任意選択的な要素を排除するように作成してもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙に関連する「専ら」、「のみ」などの排他的な用語の使用または「否定的」限定の使用のための先行詞として役立つことを意図している。
【００５８】
明確にするために別個の実施形態の文脈で記載する本発明の特定の特徴は、それらを組み合わせて単一の実施形態として提供してもよいことを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載する本発明の様々な特徴を、別々にまたは任意の適切な部分的組合せで提供してもよい。本発明に属する実施形態のすべての組合せは、本発明によって具体的に包含され、あたかも各組合せを個々にまたは明示的に開示するかのように本明細書に開示する。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべての部分的な組合せも、本発明によって具体的に包含され、あたかもそのような各部分的組合せを本明細書に個々に及び明示的に開示するかのように本明細書に開示する。
【００５９】
本明細書に記載する刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供する。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような刊行物に先行する資格を有さないことを認めるものとして解釈されるものではない。さらに、提供する公開日は、実際に公開された日付とは異なる場合があり、それは独立して確認する必要がある場合がある。
【００６０】
詳細な説明
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を提供する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子は、筋細胞及びグリア細胞などの標的細胞へのより高い感染性を示す。変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子を個体に投与することによる、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法も本明細書において提供する。本開示はさらに、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法を提供する。
【００６１】
組換えアデノ随伴ウイルスウイルス粒子
本開示は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子を提供する。
【００６２】
祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子
本開示の態様は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、ヒト、マカク、アカゲザルなどの異なる宿主種に由来する野生型ＡＡＶ血清型由来ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列から推定する。任意の適切な方法、例えば以下にさらに記載する方法などを用いて、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を推定してもよい。
【００６３】
特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号７に記載の配列に対し、少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号７の２６４位、２６６位、２６８位、４４８位、４５９位、４６０位、４７０位、４７１位、４７４位、４９５位、５１６位、５３３位、５４７位、５５１位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５７７位、５８３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、６６５位、７１０位、７１７位、７１８位、７１９位及び７２３位のアミノ酸残基を除くすべての位置で、配列番号７に記載の配列と同一である。
【００６４】
本開示の特定の態様は、複数のｒＡＡＶウイルス粒子、例えば祖先型ＡＡＶライブラリを含有する組成物を包含し、各ｒＡＡＶウイルス粒子は、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。したがって、特定の実施形態では、祖先型ライブラリは、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する複数の祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する。特定の実施形態では、祖先型ライブラリ中の複数の祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸残基２６４位、２６６位、２６８位、４４８位、４５９位、４６０位、４７０位、４７１位、４７４位、４９５位、５１６位、５３３位、５４７位、５５１位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５７７位、５８３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、６６５位、７１０位、７１７位、７１８位、７１９位、及び７２３位は、異なる祖先型ＡＡＶライブラリ間で異なっている。いくつかの実施形態では、これらの残基に存在するアミノ酸の種類の分布が、野生型ＡＡＶ血清型由来のＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列から推測される理論的分布を反映するように、祖先型ライブラリを合成して作製する。したがって、そのような実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列中の可変残基のそれぞれに存在する最も一般的なアミノ酸の頻度は、推定される理論的分布における頻度に比べて、平均−１０％〜１０％、例えば−６％〜６％、−４％〜４％といった範囲で異なる。いくつかの実施形態では、これらの残基に存在するアミノ酸の種類の分布は、祖先型ライブラリをパッケージングし、パッケージングしたライブラリを宿主細胞に形質移入し、そして複製されたウイルスを回収することによって得られるｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリ中の分布である。いくつかの実施形態では、これらの残基に存在するアミノ酸の種類の分布は、以下にさらに記載するように、標的細胞における１回または複数回の選択後に得られたｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリにおける分布である。特定の実施形態では、標的細胞は、筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）、肺上皮細胞株（ＩＢ３−１）、神経膠芽腫細胞、メラノーマ細胞株（Ｂ１６）またはヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞株である。これらの残基に存在するアミノ酸の種類の例示的な分布を図３に示す表に示す。
【００６５】
特定の実施形態では、上記のような祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含有する祖先型ＡＡＶライブラリは、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の感染性に比べて、標的細胞への高い感染性を示す。
【００６６】
特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含有する祖先型ＡＡＶライブラリは、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子の依存性に比べて、感染性に関して、標的細胞受容体に対する変化した依存性を示す。標的細胞受容体に対する依存性は、例えば、目的の標的細胞受容体を有する親細胞株に対するウイルス粒子の形質導入効率と、標的細胞受容体を欠く誘導細胞株に対する形質導入効率とを比較することによって決定してもよい。したがって、誘導細胞株に対するウイルス粒子の形質導入効率が親細胞株に比べて低下していない場合、感染性に関してウイルス粒子は標的細胞受容体への依存性を示さない。
【００６７】
したがって、特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含有する祖先型ＡＡＶライブラリは、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、感染性に関して５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の標的細胞受容体に対する依存性の低下を示す。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶライブラリは、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、感染性に関して５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上のヘパリン硫酸プロテオグリカンに対する依存性の低下を示す。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶライブラリは、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、感染性に関して５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上のシアル酸に対する依存性の低下を示す。
【００６８】
特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含有する祖先型ＡＡＶライブラリは、標的細胞感染性に関して無差別性を示す。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶライブラリは、複数の標的細胞型のそれぞれに対して、少なくともバックグラウンドよりも高い感染性を示す。複数の標的細胞型に対して無差別的な感染性を示すそのような祖先型ＡＡＶライブラリは、以下にさらに記載するように、定向進化によって、非許容細胞型を含む特定の細胞型に対する指向性を有する変異型ｒＡＡＶウイルス粒子を誘導するのに適している場合がある。
【００６９】
特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含有する祖先型ＡＡＶライブラリは、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の突然変異耐性及び／または進化性に比べて、より高い突然変異耐性及び／または進化性を有する。突然変異耐性は、ウイルス粒子を一時的に（例えば、１０分間）高温に曝露した後の、高温に曝していないウイルス粒子に比べての、標的細胞に対する少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、または少なくとも３０％の感染性を保持する能力として測定されるウイルス粒子の熱処理耐性に反映され得る。理論にとらわれるものではないが、熱安定性を高めたＡＡＶウイルス粒子は、キャプシド全体の安定性を損ねる突然変異に対してより高耐性であり得る。したがって、祖先型ＡＡＶライブラリのｒＡＡＶウイルス粒子は、７５〜７９℃、例えば７６〜７８℃、７６．５〜７８℃、７７〜７８℃といった範囲の温度への一時的な曝露（例えば、１０分間の曝露）に耐性である。いくつかの例では、祖先型ＡＡＶライブラリのｒＡＡＶウイルス粒子を一過性に曝露する（例えば、１０分）温度であって、高温に曝していないウイルス粒子に対して感染性が５０％にまで低下する温度は、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子に比べて、２〜２０℃、例えば２〜１５℃、３〜１０℃、３〜５℃といった範囲でより高い。
【００７０】
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子
本開示のさらなる態様は、上記のような祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質に由来する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ａ）配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位、及び７２３位のアミノ酸が、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびにｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有する異種核酸を含む。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【００７１】
したがって、本開示の一態様は、ａ）配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質と、ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有する異種核酸とを含むｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【００７２】
本開示の別の態様は、ａ）配列番号１４に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質と、ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有する異種核酸とを含むｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【００７３】
本開示の別の態様は、ａ）配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質と、ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有する異種核酸とを含むｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【００７４】
特定の実施形態では、標的細胞は、インビボでの組織内の細胞、組織片中の細胞、培養物中の解離した初代細胞、不死化細胞株を含む細胞株などである。いくつかの実施形態では、標的細胞は健康な細胞、例えば健康な組織中の細胞、または健康な組織から得られた細胞である。いくつかの場合には、標的細胞は病理学的細胞、例えば病変組織中の細胞、または疾患を有すると診断された個体中の、もしくは個体から得られた細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、肺上皮細胞株（限定されないが、ＩＢ３−１細胞など）；ヒト胎児由来腎臓細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）；マウス筋芽細胞株（例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞）；皮膚メラノーマ細胞株（例えば、Ｂ１６−Ｆ１０細胞）であり；及びＣＨＯ細胞を含み得る。標的細胞として適切な他の細胞株は、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から容易に取得し得る。場合によっては、標的細胞は、初代腫瘍細胞（例えば、神経膠芽腫細胞）である。いくつかの場合には、標的細胞は、骨格筋または心筋などの筋肉内；中枢神経系（脳、脊髄、網膜）または末梢神経系などの神経組織内；皮膚（表皮、真皮など）内；免疫系（骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、血液など）内などにおける細胞である。特定の実施形態では、標的細胞はグリア細胞（星状細胞、オリゴデンドロサイト、放射状グリア、神経膠芽腫など）、ニューロン、筋細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球などが挙げられる。本明細書中で使用する場合、グリア細胞は、インビトロまたはインビボでの健康なグリア細胞または異常なグリア細胞であってもよい。したがって、標的グリア細胞は、健康なグリア細胞または神経膠芽腫細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、健康なグリア細胞または神経膠芽腫細胞は、個体、例えば神経膠腫患者の神経膠芽腫細胞に存在する。
【００７５】
いくつかの場合において、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む本開示のｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞への感染性に比べて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍を上回る、高い標的細胞への感染性を示す。標的細胞への感染性は、ｒＡＡＶウイルス粒子が保有する核酸によりコードされ、発現される検出可能なマーカータンパク質を検出することによって決定してもよい。例えば、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ルシフェラーゼをコードする核酸を有してもよく、そして標的細胞への感染性を、標的細胞由来のルシフェラーゼ活性を測定することによって決定してもよい。そのような場合、野生型ｒＡＡＶウイルス粒子に感染した標的細胞で測定したルシフェラーゼ活性に比べて、変異型ｒＡＡＶウイルス粒子に感染した標的細胞で測定したルシフェラーゼ活性が高い場合、それは変異型ｒＡＡＶウイルス粒子が野生型ｒＡＡＶウイルス粒子よりも高い感染性を有することを示す。他の適切な検出可能なマーカータンパク質として、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００７６】
したがって、特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子の筋細胞への感染性に比べて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍を上回る、高い筋細胞への感染性を示す。特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子の筋細胞への感染性に比べて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍を上回る、高いグリア細胞または神経膠芽腫細胞への感染性を示す。
【００７７】
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有する本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、感染性に関して、変化した標的細胞受容体依存性を示す。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上低い標的細胞受容体依存性を示す。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上低いヘパリン硫酸プロテオグリカン依存性を示す。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質）を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上低いシアル酸依存性を示す。
【００７８】
遺伝子産物
本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の異種核酸中のヌクレオチド配列がコードする遺伝子産物は、必ずしも限定するものではないが、ポリペプチド、核酸、またはゲノム編集遺伝子産物のような任意の適切な遺伝子産物であってもよい。
【００７９】
ポリペプチド遺伝子産物として、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質などの任意の適切なポリペプチドが挙げられ得るが、必ずしもこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、分泌ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌ポリペプチドは治療用タンパク質である。適切な分泌ポリペプチドとして、リポタンパク質リパーゼ、第ＩＸ因子、α１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様増殖因子１、αガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、αグルコシダーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８０】
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）は、トリグリセリド加水分解に関与する脂質代謝酵素である。ＬＰＬ欠乏症は高トリグリセリド血症に関係している。本発明の異種核酸がコードする適切なＬＰＬアミノ酸配列として、ヒトＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：４０２３）、マウスＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：１６９５６）、ラットＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：２４５３９）、非ヒト霊長類ＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：４６４０３１）、ニワトリＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：３９６２１９）、イヌＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：４０３６２６）、ネコＬＰＬ（遺伝子ＩＤ：７２７６９６）などが挙げられる。
【００８１】
第ＩＸ因子（凝固因子ＩＸ）は、血液凝固において役割を果たすセリンプロテアーゼである。第ＩＸ因子欠乏症は血友病Ｂを引き起こす。本発明の異種核酸がコードする適切な第ＩＸ因子アミノ酸配列は、ヒト第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：２１５８）、マウス第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：１４０７１）、ラット第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：２４９４６）、非ヒト霊長類第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：４６５８８７）、ニワトリ第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：３７４２５８）、イヌ第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：４０４０１５）、ネコ第ＩＸ因子（遺伝子ＩＤ：４９３９７３）などが挙げられる。
【００８２】
α１アンチトリプシンは、炎症において役割を果たすプロテアーゼ阻害剤である。α１アンチトリプシン欠乏症は、肺気腫及び他の慢性的な組織壊死症状に関係している。本発明の異種核酸がコードする適切なα１アンチトリプシンアミノ酸配列として、ヒトα１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：５２６５）、マウスα１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：２０７００）、ラットα１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：２４６４８）、非ヒト霊長類α１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：４６７５４１）、ニワトリα１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：４２３４３４）、イヌα１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：４８０４２２）、ネコα１アンチトリプシン（遺伝子ＩＤ：１０１０９８１０７）などが挙げられる。
【００８３】
αガラクトシダーゼは、糖脂質及び糖タンパク質からαガラクトシル部分を加水分解する酵素である。αガラクトシダーゼ欠乏症はファブリー病に関与し、ファブリー病は組換え産生されたαガラクトシダーゼ（アガルシダーゼαまたはアガルシダーゼβ）によって治療し得る。本発明の異種核酸がコードする適切なαガラクトシダーゼアミノ酸配列として、ヒトαガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：２７１７）、マウスαガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：１１６０５）、ラットαガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：３６３４９４）、非ヒト霊長類αガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：４６５７６１）、ニワトリαガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：４２２１８８）、イヌαガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：４８０９８８）、ネコαガラクトシダーゼ（遺伝子ＩＤ：１０１０９１４２８）などが挙げられる。
【００８４】
イズロニダーゼは、皮膚、血管、心臓弁、腱及び肺に見出されるグリコサミノグリカンであるデルマタン硫酸中の非硫酸化α−Ｌ−イズロノシド結合の加水分解を触媒する酵素である。組換え産生されたイズロニダーゼは、ラロニダーゼとして公知である。イズロニダーゼ欠損は、ムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ型（ＭＰＳ−Ｉ、ハーラー症候群としても知られる）に関与している。本発明の異種核酸がコードする適切なイズロニダーゼアミノ酸配列として、ヒトイズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：３４２５）、マウスイズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：１５９３２）、ラットイズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：３６０９０４）、非ヒト霊長類イズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：４６１０５６）、ニワトリイズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：４２７２９４）、イヌイズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：１００５０５３８２）、ネコイズロニダーゼ（遺伝子ＩＤ：１０１０９５８９６）などが挙げられる。
【００８５】
イズロン酸−２−スルファターゼは、ヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸に対するリソソーム分解に必要とされるスルファターゼ酵素である。イズロン酸−２−スルファターゼの有害な突然変異は、ＭＰＳ−ＩＩ（ハンター症候群としても知られている）に関連している。イズロン酸−２−スルファターゼは、治療に使用するためのイズルスルファーゼとして組換え産生される。本発明の異種核酸がコードする適切なイズロン酸−２−スルファターゼアミノ酸配列として、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：３４２３）、マウスイズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：１５９３１）、ラットイズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：３６３５１３）、非ヒト霊長類イズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：４６５８９６）、ニワトリイズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：４２２３９２）、イヌイズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：４９２１９４）、ネコイズロン酸−２−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：１０１０８１４５０）などが挙げられる。
【００８６】
αグルコシダーゼはデンプン加水分解酵素であり、酵素の欠乏は糖原病ＩＩ型（ポンペ病としても知られる）に関与している。αグルコシダーゼ類似体は、治療用途のために組換え産生され、アルグルコシダーゼαとして公知である。本発明の異種核酸がコードする適切なイズロニダーゼアミノ酸配列として、ヒトαグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：２５４８）、マウスαグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：１４３８７）、ラットαグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：３６７５６２）、非ヒト霊長類αグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：４５４９４０）、ニワトリαグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：４１６４６２）、イヌαグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：４８３３５２）、ネコαグルコシダーゼ（遺伝子ＩＤ：１０１０８６３５９）などが挙げられる。
【００８７】
Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼは、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン４−硫酸ユニットの４−硫酸基の加水分解を触媒する酵素である。Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ欠損は、ＭＰＳ  ＩＶ（マロトー・ラミー症候群としても知られる）に関与している。Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼは、治療に用いるためにガルスルファーゼとして組換え産生される。本発明の異種核酸がコードする適切なＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼアミノ酸配列は、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：４１１）、マウスＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：１１８８１）、ラットＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：２５２２７）、非ヒト霊長類Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：７３７３１６）、ニワトリＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：７７１４５９）、イヌＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：６１０３６４）、ネコＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ（遺伝子ＩＤ：１００２１６３３１）などが挙げられる。
【００８８】
特定の実施形態では、分泌ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）に融合させて、融合複合体（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合複合体は、分泌タンパク質の産生または全身半減期を高めることが知られている。特定の実施形態では、分泌タンパク質のアミノ酸配列を改変して、内在性シグナルペプチドを、標的細胞由来のポリペプチドの分泌を促進する異種シグナルペプチドで置換してもよい。好適なシグナルペプチドは、例えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００６  １４：８２２；及び米国出願公開２００７０１４２６２３、２００４０１１５７７５に記載されており、上記文献は参照として本明細書に組み入れられる。
【００８９】
トロポニン（トロポニンＣ、トロポニンＩ、トロポニンＴ）は、骨格筋及び心筋収縮に関与する調節タンパク質である。トロポニンの欠損は、家族性肥大性心筋症に関与している。本発明の異種核酸がコードする適切なトロポニンアミノ酸配列として、ヒトトロポニン（遺伝子ＩＤ：７１３４、７１３７、７１３９）、マウストロポニン（遺伝子ＩＤ：２１９５４，２１９５６，２１９５７）、ラットα１トロポニン（遺伝子ＩＤ：２４８３８、２４８３７、２９２４８）、非ヒト霊長類α１トロポニン（遺伝子ＩＤ：４６６３１７、４５７６１８、７４６３６９）などが挙げられる。
【００９０】
単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１  Ｔｋ）は、神経膠腫などの癌の治療に使用される酵素である。理論にとらわれるものではないが、ＨＳＶ−１  Ｔｋを発現する細胞は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）などのチミジンキナーゼ基質類似体を、腫瘍細胞などの分裂細胞にとって極めて有毒な代謝産物に変換することができる。本発明の異種核酸がコードする適切なＨＳＶ−１  Ｔｋアミノ酸配列として、ヒトＨＳＶ−１  Ｔｋ（遺伝子ＩＤ：２７０３３７４）、ヒトＨＳＶ−２  Ｔｋ（遺伝子ＩＤ：１４８７３０７）などが挙げられる。
【００９１】
本開示で使用する他の例示的なポリペプチド遺伝子産物は、例えば、参照として組み入れられる米国特許出願公開第２００６／０２７６３７６号に記載されている。
【００９２】
ゲノム編集遺伝子産物として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣａｓ９／ｇＲＮＡシステムまたはその成分を挙げてもよく、ゲノム編集遺伝子産物は多成分遺伝子産物である。
【００９３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成する人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように改変することができ、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼがユニークな標的配列を切断することが可能になる。細胞に導入した場合、ＺＦＮを用いて二本鎖切断を誘導することにより、細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞ゲノム）を編集することができる。ＺＦＮの使用の詳細については、例えば：Ａｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｆｅｂ；２０（２）：３２９−３８；Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  Ｍａｙ  ２；３００（５６２０）：７６４；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １５；３３３（６０４０）：３０７；Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２０１０  Ａｕｇ；１５（８）：８７５−８５；Ｔａｋａｓｕ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  Ｏｃｔ；４０（１０）：７５９−６５；Ｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ２００８  Ｓｕｍｍｅｒ；５（２）：１２１−３；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ａｐｒ  ２６；１０８（１７）：７０５２−７；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１０  Ｍａｒ  ５；１４０（５）：６７８−９１；Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９  Ｊｕｌ  ２４；３２５（５９３９）：４３３；Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（６）：ｅ２１０４５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１０４５．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  １３；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊｕｌ  １９；１０８（２９）：１２０１３−７；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ；２１（ｌ１）：１６３８−４０参照；上記文献のすべては、ＺＦＮに関連するそれらの記載を参照として本明細書に組み入れられる。用語「ＺＦＮ剤」は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び／またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００９４】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成する人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように迅速に改変することができ、細胞に導入した場合、ＴＡＬＥＮを用いて二本鎖切断を誘導することによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞ゲノム）を編集することができる。ＴＡＬＥＮの使用の詳細については、例えば：Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｊｕｌ  ７；２９（８）：７３１−４；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １５；３３３（６０４０）：３０７；Ｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ  ５；２９（８）：６９５−６；及びＨｕａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ  ５；２９（８）：６９９−７００参照；上記文献のすべては、ＴＡＬＥＮに関連するそれらの記載を参照として本明細書に組み入れられる。用語「ＴＡＬＥＮ剤」は、ＴＡＬＥＮ及び／またはＴＡＬＥＮをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００９５】
Ｃａｓ９は、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質（またはその機能的均等物及び／または変異体、例えばＣａｓ９様タンパク質）であり、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる）２つの天然または合成ＲＮＡ分子を備えたタンパク質との会合に依存したＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの場合では、上記２つの分子は共有結合して単一分子を形成する（単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）。このように、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡ標的指向ＲＮＡと会合し（この用語は、二分子ガイドＲＮＡ構成と単一分子ガイドＲＮＡ構成の両方を包含する）、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、タンパク質を標的核酸配列へ誘導する。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質がその天然の酵素機能を保持する場合、上記タンパク質は、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成し、ゲノム改変（すなわち、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換など）を誘導し、それによって遺伝子発現を変化させる。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（これらの変異体はＣａｓ９様という用語に包含される）は、ＤＮＡ切断活性が低下するように改変されている（いくつかの場合には、それらは標的ＤＮＡの両方の鎖の代わりに単一の鎖を切断し、一方、他の場合には、ＤＮＡ切断活性がなくなるほどまで著しく活性が低下している）。ＤＮＡ切断活性が低下した（またはＤＮＡ切断活性が全くない）Ｃａｓ９様タンパク質は依然として、標的ＤＮＡに誘導されてＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害することができる。したがって、標的ＤＮＡの転写を阻害するために、酵素的に不活性なＣａｓ９様タンパク質を、ＤＮＡ標的指向ＲＮＡによって標的ＤＮＡの特定の位置に標的指向させることができる。
【００９６】
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムに関する詳細な情報は、例えば、（ａ）Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１：“Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”；（ｂ）Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３：“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、及び（ｃ）ＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができ；その各々は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。したがって、本明細書で使用する用語「ＣＲＩＳＰＲ剤」は、Ｃａｓ９ベースのシステムにおいて使用し得る、天然に存在する配列及び／または合成配列を含む任意の作用物質（またはそのような作用物質をコードする核酸）（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質；例えば、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一のガイドＲＮＡなどのＤＮＡ標的指向ＲＮＡの任意の成分；ドナーポリヌクレオチドなど）を包含する。
【００９７】
適切な核酸遺伝子産物として、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及びアプタマーが挙げられる。遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、適切なＲＮＡｉとして、細胞内の疾患関連タンパク質のレベルを低下させるＲＮＡｉが挙げられる。例えば、ＲＮＡｉは、筋細胞におけるＦＲＧ１、または神経膠芽腫細胞におけるＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）のレベルを低下させるｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであり得る。核酸遺伝子産物の適切な標的は、例えば、Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  １９：２０５５；米国特許公開第２０１３／０３４７１３６号、第２００９／００８７４３４号、第２０１１／００５９１１４号、第２０１１／０１６５２２７号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／１２８０６３、ＷＯ２０１１／１３４０２３に記載されている。
【００９８】
調節エレメント
上記のように、本開示のｒＡＡＶウイルス粒子は、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む。異種ヌクレオチド配列は、インビボにおいて、ヌクレオチド配列中のその転写または発現を導く調節エレメントに作動可能に連結することができる。そのような調節エレメントは、通常、選択した遺伝子に関連する調節配列（例えば、内在性細胞調節エレメント）を有し得る。あるいは、異種調節配列を用いることができる。有用な異種調節配列には、一般的に、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。例として、必ずしも限定するものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、目的の遺伝子に対して異種である内在性細胞プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子に由来する配列を使用することもできる。そのようなプロモーター配列は、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（サンディエゴ、カリフォルニア）から市販されている。
【００９９】
いくつかの実施形態では、細胞型特異的または組織特異的プロモーターは、異種遺伝子産物をコードする異種核酸に作動可能に連結し、その結果、遺伝子産物は特定の細胞型または組織において選択的または優先的に産生される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、異種核酸に作動可能に連結する。
【０１００】
ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するための方法
異種核酸を含み、ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するために使用するＡＡＶ発現ベクターは、当該技術分野で周知の方法を用いて構築することができる。例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：２０８８；Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１６：１７０３−１７０９；米国特許第７，４３９，０６５号、第６，９５１，７５８号及び第６，４９１，９０７号参照。例えば、異種配列を、そこから切除される主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有するＡＡＶゲノムに直接挿入することができる。ＡＡＶゲノムの他の部分もまた、複製及びパッケージング機能を可能にするために十分な量のＩＴＲが残っている限り、削除することができる。そのような構築物は、当該技術分野で周知の技術を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）及びＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５参照。
【０１０１】
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶ発現ベクターを、形質移入などの公知の技術を用いて適切な宿主細胞に導入する。多くの形質移入技術が当該技術分野において一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７参照。特に適切な形質移入法として、リン酸カルシウム共沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、電気穿孔法（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｇｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、リポソームを介した遺伝子移送（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０）、脂質を介した形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、及び高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）が挙げられる。
【０１０２】
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するのに適した宿主細胞として、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞が挙げられ、これらは異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができ、または使用されてきた。この用語には、形質移入した元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書中で使用する「宿主細胞」とは、通常、外来性ＤＮＡ配列を形質移入した細胞を指す。安定なヒト細胞株２９３（例えばアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関の受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３を介して容易に入手可能）由来細胞を使用することができる。例えば、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡフラグメント（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）で形質転換したヒト胎児由来腎臓細胞株であり、アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）。２９３細胞株は容易に形質移入され、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するための便利なプラットフォームを提供する。
【０１０３】
昆虫細胞内でＡＡＶウイルス粒子を産生する方法は、当該分野で公知であり、これを用いて、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子を産生することができる。例えば、米国特許公開第２００９／０２０３０７１号；米国特許第７，２７１，００２号；及びＣｈｅｎ（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：９２４参照。
【０１０４】
医薬組成物
本開示は、以下を含む医薬組成物を提供する：ａ）上記のような本発明のｒＡＡＶウイルス粒子；及びｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトにおける使用に適している。
【０１０５】
そのような賦形剤、担体、希釈剤、及び緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬剤が含まれる。薬学的に許容可能な賦形剤として、必ずしも限定するものではないが、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体が挙げられる。薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を、そこに含めることができる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などをそのようなビヒクルに存在させてもよい。多種多様な薬学的に許容可能な賦形剤が当該分野で周知であり、本明細書で詳細に論ずる必要はない。薬学的に許容可能な賦形剤は、例えばＡ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，」２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃを含む様々な刊行物に詳細に記載されている。
【０１０６】
本発明の組成物は、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子を、溶液中、懸濁液中、またはその両方において含有する液体を有し得る。本明細書中で使用する場合、液体組成物にはゲルが含まれる。いくつかの場合には、液体組成物は水性である。いくつかの実施形態では、組成物は、インサイチュでゲル化可能な水性組成物、例えばインサイチュでゲル化可能な水溶液である。水性組成物は、生理学的に適合するｐＨ及び浸透圧を有する。
【０１０７】
核酸及び宿主細胞
本開示の他の態様は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を包含し、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４位、４４８位、４５９位、４７０位、４９５位、５３３位、５４７位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、７１８位及び７２３位のアミノ酸は、それぞれＡ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ａ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｎ及びＳであるか；それぞれＱ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＳであるか；または、それぞれＡ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｓ及びＴである。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞感染性に比べて高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【０１０８】
特定の実施形態では、単離された核酸は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【０１０９】
特定の実施形態では、単離された核酸は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１４に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【０１１０】
特定の実施形態では、単離された核酸は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【０１１１】
特定の実施形態では、単離された核酸は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号７に記載の配列に対して少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞感染性に比べて高い標的細胞感染性を付与する。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、感染性に関して、野生型ＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子の標的細胞受容体依存性に比べて、変化した標的細胞受容体依存性を付与する。
【０１１２】
本発明はさらに、本発明の核酸を含む宿主細胞、例えば単離された（遺伝子改変した）宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、単離された細胞、例えば、インビトロ培養物中の細胞であり得る。本発明の宿主細胞は、以下に記載するように、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の産生に有用である。本発明の宿主細胞を本発明のｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために使用する場合、それは「パッケージング細胞」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明の核酸を用いて本発明の宿主細胞を安定的に遺伝子改変する。他の実施形態では、本発明の核酸を用いて本発明の宿主細胞を一過性に遺伝子改変する。
【０１１３】
電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、リポソームを介した形質移入、バキュロウイルス感染などを含むが必ずしもこれらに限定されない確立された技術を用いて、本発明の核酸を宿主細胞に安定的または一過性に導入する。安定な形質転換のために、本発明の核酸は、一般的に、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性などのいくつかの周知の選択マーカーのいずれかをさらに含む。
【０１１４】
本発明の宿主細胞は、例えば、哺乳類細胞、例えば、マウス細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む様々な細胞のいずれかに本発明の核酸を導入することによって生成する。適切な哺乳類細胞として、必ずしも限定するものではないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えばＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えばＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えばＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、Ｓｆ９細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変した宿主細胞は、上記のような変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つまたは複数のＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む。他の実施形態では、本発明の宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターをさらに含む。本発明の宿主細胞を用いてｒＡＡＶウイルス粒子を生成することができる。ｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法は、例えば、米国特許公開第２００５／００５３９２２号及び米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
【０１１６】
方法
本開示は、本開示のｒＡＡＶウイルス粒子を個体に投与することによる、個体における標的細胞への遺伝子産物の送達方法を提供する。本開示は、疾患の治療方法を提供し、本方法は、それを必要とする個体に、上記のような本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の有効量を投与することを含む。本開示は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法をさらに提供する。
【０１１７】
標的細胞への遺伝子産物の送達方法
本開示は、個体における標的細胞、例えば、筋細胞またはグリア細胞への遺伝子産物の送達方法を提供し、本方法は、上記に記載するように、本開示のｒＡＡＶウイルス粒子を個体に投与することを含む。ｒＡＡＶウイルス粒子は、標的細胞に進入し、ｒＡＡＶウイルス粒子に存在する異種ポリヌクレオチドがコードする遺伝子産物を標的細胞中で産生する。いくつかの場合には、本方法は、本開示のｒＡＡＶウイルス粒子を、標的細胞の近傍部位に導入し、そこにおいて、ｒＡＡＶウイルス粒子が標的細胞に進入し、そこにおいて、ｒＡＡＶウイルス粒子中に存在する異種ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物を標的細胞内で生成する。
【０１１８】
遺伝子産物を筋細胞に送達する場合、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、任意の適切な方法、例えば、筋肉内注射などの非経口経路によって送達してもよい。ｒＡＡＶウイルス粒子を用いた筋肉への遺伝子産物の送達方法は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１１：３４５に記載されており、上記文献は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
遺伝子産物を脳に送達する場合、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の投与のための１つの方法は、例えば、直接注射（必要に応じて注射器の定位的な位置決めによって補助して）などの任意の適切な技術によって近傍部位に付着させることによって、または投与のためにオマヤレザバーの先端を空洞または嚢胞に配置することによって、行うことができる。あるいは、対流増加送達カテーテルを、上記部位に、天然または外科的に形成した嚢胞に、または正常な脳塊に、直接移植してもよい（例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第２００７０２５４８４２号参照）。そのような対流増加医薬組成物送達器具は、組成物の脳塊全体への拡散を大きく改善する。これらの送達器具のうち、移植したカテーテルは、拡散流ではなく、高流量の微小注入（約０．５〜１５．０μｌ／分の範囲の流速による）を利用してｒＡＡＶウイルス粒子を脳及び／または腫瘍塊に送達する。このような器具は、米国特許第５，７２０，７２０号に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
いくつかの場合には、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、個体の標的組織に導入された場合、ｒＡＡＶがコードする異種遺伝子産物の、標的組織における高レベルの産生を提供する。例えば、ｒＡＡＶがコードする異種ポリペプチドを、約１μｇ〜約５０μｇ、または５０μｇを上回るレベルで、標的組織において産生することができる。
【０１２１】
いくつかの場合には、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、個体の標的組織に導入された場合、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超の標的細胞において、ｒＡＡＶがコードする異種遺伝子産物の産生を提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、個体の標的組織に導入された場合、約２日〜約６か月の期間、例えば、約２日間〜約７日間、約１週間〜約４週間、約１か月間〜約２か月間、または約２か月間〜約６か月間にわたって、ｒＡＡＶがコードする異種遺伝子産物の産生を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、個体の標的組織に導入された場合、６か月を上回る期間、例えば約６か月間〜２０年間以上、または１年を上回る期間、例えば約６か月間〜約１年間、約１年間〜約２年間、約２年間〜約５年間、約５年間〜約１０年間、約１０年間〜約１５年間、約１５年間〜約２０年間、もしくは２０年超にわたって、ｒＡＡＶがコードする異種遺伝子産物の産生を提供する。
【０１２３】
疾患の治療方法
本開示は、疾患の治療方法を提供し、本方法は、それを必要とする個体に、上記のような本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の有効量を投与することを含む。本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、任意の他の簡便な投与様式または投与経路によって、上記のように病理学的組織への局所注射によって投与することができる。特定の実施形態では、個体は、上記のように、疾患、例えば神経膠腫などの癌、または先天的酵素欠損症もしくは変性疾患などの遺伝性障害を有すると診断された患者である。
【０１２４】
「治療有効量」は、比較的広い範囲に収まり、その範囲は実験及び／または臨床試験によって決定することができる。例えば、インビボ注入、例えば筋肉への直接注射の場合、治療有効量は、約１０６〜約１０１５オーダーのｒＡＡＶウイルス粒子、例えば、約１０８〜１０１２のｒＡＡＶウイルス粒子である。例えば、インビボ注入、例えば、筋肉への直接注射の場合、治療有効量は、約１０６〜約１０１５オーダーの感染単位、例えば約１０８〜約１０１２の感染単位である。他の有効薬量は、用量反応曲線を確立する慣例的な試験を通して、当業者であれば容易に確立することができる。
【０１２５】
いくつかの場合では、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の治療有効量とは、１回または複数回の投与で個体に投与する（例えば、個体の筋肉内注射によって投与する）場合の、個体の筋肉変性の進行を遅らせるのに有効な量である。例えば、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の治療有効量は、１回または複数回の投与で個体に投与する（例えば、個体に筋肉内注射によって投与する）場合の、ｒＡＡＶウイルス粒子による治療の非存在下での筋肉変性の進行に比べて、筋変性の進行を少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超、遅延させるのに有効な量とすることができる。
【０１２６】
いくつかの場合では、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の治療有効量とは、１回または複数回の投与で個体に投与する場合の、個体の罹患組織の機能を改善するのに有効な量である。例えば、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の治療有効量は、１回または複数回の投与で個体に投与する（例えば、筋肉内注射によって投与する）場合の、ｒＡＡＶウイルス粒子による治療の非存在下での個体の筋肉機能に比べて、筋肉機能を少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超、改善するのに有効な量とすることができる。
【０１２７】
いくつかの場合では、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子の治療有効量は、１回または複数回の投与で個体に投与する（例えば、筋肉内注射によって投与する）場合の、罹患した筋肉における筋力低下の速度を減少させるのに有効な量である。
【０１２８】
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子の生成方法
変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子を、複数ラウンドの選択を通して生成する方法も本明細書で提供する。特定の実施形態では、本方法は、複数のｒＡＡＶウイルス粒子、例えばｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを、標的細胞における第１選択ラウンドに供することを含み、ここで、初期ライブラリ中のｒＡＡＶウイルス粒子は、それぞれ、ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を有する初期ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有し、かつＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の１つまたは複数の可変残基が互いに異なる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含有し、それにより、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶウイルス粒子を生成する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列は、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来する。このような場合、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列は、本明細書に記載するように、複数のオーソログ野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質配列から推定する。したがって、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリは、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列において可変残基、すなわち、特定のアミノ酸に対して、信頼性の閾値レベルを超えて推測することができない残基を設定することによって得られる複数のＡＡＶキャプシドタンパク質配列のうちの１つをそれぞれが表すＡＡＶキャプシドタンパク質の多様な集団を含む。
【０１３０】
任意の適切な方法を使用して、複数のオーソログ野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質配列から祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を推定してもよい。一般的に言えば、複数のオーソロガスな現存するアミノ酸配列に基づいて祖先型アミノ酸配列を再構成することは、祖先型アミノ酸配列の統計的再構成を含む場合があり、祖先型アミノ酸配列の各残基は、現存するアミノ酸配列に基づくアミノ酸の信頼値に関連する。参照として本明細書に組み入れられるＷｅｓｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１２  ２８：１１７０に記載されているように、統計的再構成には、配列アライメントのマルコフ連鎖モンテカルロサンプリング、系統樹と進化モデルパラメータ、及び既知配列を与えたそれらの事後確率分布の推定が含まれる。
【０１３１】
通常、１つまたは複数の残基のアミノ酸同一性を信頼度の閾値を超えて決定することがないため、全長の祖先型配列が再構築されることはない。これらの残基を、祖先型配列中の多型部位として表してもよい。したがって、祖先型ライブラリは、各多型部位での残基のアミノ酸同一性が分子間で可変であってもよい複数のポリペプチドを含むが、ライブラリ全体にわたっては、統計的再構成に基づいて予測する確率によって表すアミノ酸の分布に対応する。特定の実施形態では、ライブラリ全体にわたっての各多型部位における残基のアミノ酸同一性は、統計的再構成によって予測する確率によって定義する２つまたは３つのアミノ酸の分布に適合する。特定の例において、推定した可変性の祖先型アミノ酸配列を含む祖先型ライブラリは、本明細書に記載の統計的再構成法に基づいて自動的に（すなわち手動選択なしで）設計してもよい。そのような場合、祖先型ライブラリ中のアミノ酸配列の任意の多型残基におけるアミノ酸の分布は、統計的再構成によって予測する確率を反映するように設計する。
【０１３２】
したがって、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を、複数のオーソログ野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質配列から推定する方法は、複数の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の系統樹を再構築し、系統樹のノードを選択し、そしてその系統における最も有望なアミノ酸配列を決定することによって達成される。いくつかの場合では、系統樹の各ノードにおける信頼値は、適切な方法、例えばベイジアンマルコフ連鎖モンテカルロシミュレーションを用いて推定する。各ノードにおける信頼値は、祖先型配列を推定するための系統樹の特定のノードを選択する決定を情報化し得る。系統樹の特定のノードを選択すると、ノードに属する野生型配列を、例えば上述のようにマルコフ連鎖モンテカルロアラインメント法によってアライメントすることによって、祖先型配列を推定してもよい。いくつかの例では、最も有望な祖先型キャプシドタンパク質アミノ酸配列は、所定の閾値よりも高い信頼レベルで特定のアミノ酸に割り当てられていない多型残基を含み得る。祖先型ＡＡＶライブラリ中の祖先型キャプシドタンパク質アミノ酸配列のこれらの多型残基のいずれかにおけるアミノ酸の分布は、上記のように野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質配列に基づく統計的再構成によって予測する確率を反映するように設計してもよい。
【０１３３】
祖先型配列を推定するための他の方法は、例えば、Ｓｔａｃｋｈｏｕｓｅ，Ｊ，Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，ＳＲ，ＭｃＧｅｅｈａｎ，ＧＭ，Ｎａｍｂｉａｒ，ＫＰ，ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｒ，ＳＡ（１９９０）．  Ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｅｘｔｉｎｃｔ  ｂｏｖｉｄ  ｒｕｍｉｎａｎｔ．  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６２：１０４−１０６；Ｇａｕｃｈｅｒ，ＥＡ，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ，ａｎｄ  Ｇａｎｅｓｈ，ＯＫ（２００８）．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：７０４−７０７；Ｏｒｔｌｕｎｄ，ＥＡ，Ｂｒｉｄｇｈａｍ，ＪＴ，Ｒｅｄｉｎｂｏ，ＭＲ，ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ＪＷ（２００７）．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１５４４−１５４８；Ｕｇａｌｄｅ，ＪＡ，Ｃｈａｎｇ，ＢＳ，ａｎｄ  Ｍａｔｚ，ＭＶ（２００４）．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ｒｅｃｒｅａｔｅｄ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１４３３；Ａｌｃｏｌｏｍｂｒｉ，Ｕ，Ｅｌｉａｓ，Ｍ，ａｎｄ  Ｔａｗｆｉｋ，ＤＳ（２０１１）．  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅｓ  ｂｙ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４１１：８３７−８５３；Ｋｏｔｈｅ，ＤＬ，Ｌｉ，Ｙ，Ｄｅｃｋｅｒ，ＪＭ，Ｂｉｂｏｌｌｅｔ−Ｒｕｃｈｅ，Ｆ，Ｚａｍｍｉｔ，ＫＰ，Ｓａｌａｚａｒ，ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５２：４３８−４４９；Ｄｕｃａｔｅｚ，ＭＦ，Ｂａｈｌ，Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｙ，Ｓｔｉｇｇｅｒ−Ｒｏｓｓｅｒ，Ｅ，Ｆｒａｎｋｓ，Ｊ，Ｂａｒｍａｎ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８：３４９−３５４；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ，Ｊｅｎｓｅｎ，ＭＡ，Ｎｉｃｋｌｅ，ＤＣ，Ｙａｎ，Ｊ，Ｌｅａｒｎ，ＧＨ，Ｈｅａｔｈ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：８５０７−８５１４；Ｇｕｌｌｂｅｒｇ，Ｍ，Ｔｏｌｆ，Ｃ，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｎ，Ｍｕｌｄｅｒｓ，ＭＮ，Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ−Ｋｏｐｒａ，Ｃ，Ｈｏｖｉ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：９６９５−９７０８に記載されており、上記文献は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、初期の、例えば祖先型のＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号７に記載の配列に対し、少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
ライブラリの個々のｒＡＡＶウイルス粒子が互いに競合して宿主細胞に感染及び複製する場合、選択を達成し得る。理論にとらわれるものではないが、ｒＡＡＶライブラリに存在する最初の、例えば祖先型のＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列のいくつかの変異体は、ウイルス粒子に対して異なる感染性を付与し、したがってより高い感染性を付与する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するウイルス粒子が、他のすべての変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質よりもより豊富になる傾向がある。特定の場合には、選択は、例えば複数の細胞型に対して概して高い感染性をウイルス粒子に付与する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶ変異体のライブラリを生成するか、または他の場合には、選択は、１つまたはいくつかの特定の細胞型、例えば、筋細胞及び／またはグリア／神経膠芽腫細胞に対して高い感染性を有するウイルス粒子を含有するｒＡＡＶ変異体ライブラリを生成する。
【０１３６】
いくつかの例では、ｒＡＡＶウイルス粒子の第２のライブラリは、ライブラリ中の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質の集団全体にわたる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の１つまたは複数の可変残基において、初期ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含有するｒＡＡＶウイルス粒子の初期ライブラリとは異なるアミノ酸分布を有する。いくつかの場合には、ｒＡＡＶウイルス粒子の第２のライブラリは、ライブラリ中の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質の集団全体にわたる配列番号７の残基２６４位、２６６位、２６８位、４４８位、４５９位、４６０位、４７０位、４７１位、４７４位、４９５位、５１６位、５３３位、５４７位、５５１位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５７７位、５８３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、６６５位、７１０位、７１７位、７１８位、７１９位及び７２３位の１つまたは複数において、初期ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含有するｒＡＡＶウイルス粒子の初期ライブラリとは異なるアミノ酸分布を有する。
【０１３７】
概して、上記の供する段階は、標的細胞に複数のｒＡＡＶウイルス粒子を感染させること、感染細胞にヘルパーウイルスを重感染させること、及び重感染した細胞から放出されたｒＡＡＶウイルス粒子を回収することを含み得る。感染させる、重感染させる、及び標的細胞からｒＡＡＶウイルス粒子を回収する方法は、上記で、宿主細胞内でのｒＡＡＶウイルス粒子の生成について記載した通りである。
【０１３８】
選択の厳密性は、任意の適切な方法によって制御してもよい。特定の実施形態では、選択の厳密性は、標的細胞にｒＡＡＶウイルス粒子を感染させる場合に使用する感染多重度（ＭＯＩ）と相関する。一般的に、ＭＯＩは、標的細胞にウイルス粒子を感染させる際に存在する標的細胞の数に対するウイルス粒子の数の比である。感染多重度が高いほど、選択の厳密性は低くなり、逆もまた同様である。
【０１３９】
特定の実施形態では、上記の選択方法に従って生成したｒＡＡＶ変異体を、第２選択ラウンドに供する。第２選択ラウンドは、いくつかの例では、第１選択ラウンドと同じかまたはより高い厳密性を有し得る。例えば、第１選択ラウンドのＭＯＩが５，０００である場合、第２選択ラウンドは、より高い厳密性のＭＯＩ  ５００などを有し得る。このようにして、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子の第三のライブラリを生成する。いくつかの例では、第２選択ラウンドの後に生成するｒＡＡＶウイルス粒子の第三のライブラリは、ライブラリ中の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質の集団全体にわたる祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列の１つまたは複数の可変残基において、ｒＡＡＶウイルス粒子の初期または第２のライブラリとは異なるアミノ酸分布を有する。特定の実施形態では、第２選択ラウンドの後に生成するｒＡＡＶウイルス粒子の第三のライブラリは、ライブラリ中の変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質の集団全体にわたる配列番号７の残基２６４位、２６６位、２６８位、４４８位、４５９位、４６０位、４７０位、４７１位、４７４位、４９５位、５１６位、５３３位、５４７位、５５１位、５５５位、５５７位、５６１位、５６３位、５７７位、５８３位、５９３位、５９６位、６６１位、６６２位、６６４位、６６５位、７１０位、７１７位、７１８位、７１９位及び７２３位の１つまたは複数において、ｒＡＡＶウイルス粒子の初期または第２のライブラリとは異なるアミノ酸分布を有する。
【０１４０】
特定の実施形態では、複数の選択ラウンド、例えば２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、または１０回以上の選択ラウンドを逐次的に実行してｒＡＡＶ変異体を生成する。特定の実施形態では、複数の選択ラウンドを、同じ標的細胞型で実施する。特定の場合には、複数の選択ラウンドは、概して高い感染性、すなわち、複数の細胞型に対してバックグラウンドを超える感染性をｒＡＡＶウイルス粒子に付与する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶ変異体を生成するか、または他の場合には、複数の選択ラウンドは、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するＡＡＶウイルス粒子に比べて、１つまたはいくつかの特定の細胞型、例えば、筋細胞及び／またはグリア／神経膠芽腫細胞に対してより高い感染性をｒＡＡＶウイルス粒子に付与する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶ変異体を生成する。
【０１４１】
有用性
上記のように、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、標的細胞内での異種遺伝子産物の発現が所望される多くの応用に用いられる。特定の実施形態では、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、特定の細胞型に対するより高い感染性をｒＡＡＶウイルス粒子に付与する場合、すなわち標的細胞型に対する指向性を付与する場合、ｒＡＡＶウイルス粒子を使用して、治療を必要とする患者の標的細胞を含む組織の内部または外部で、治療用遺伝子産物を発現させることができる。例えば、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子は、筋細胞への指向性を付与するＡＡＶキャプシドタンパク質と、患者の遺伝的欠損を治療するための遺伝子産物とを含み得る。特定の実施形態では、遺伝的欠損は、ＬＰＬ、第ＩＸ因子、α１アンチトリプシン、フォリスタチン、可溶性ミオスタチン受容体、アペリン、グルカゴン様ペプチド１、インスリン様増殖因子１、トロポニン、ラミニン、コラーゲン、ラミン、セレノプロテインＮ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、フクチン、ＬＡＲＧＥ、Ｏ結合型マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びイソプレノイドシンターゼドメイン含有タンパク質などのコード配列または調節配列における有害な突然変異を含む。特定の例では、患者は、上記のように、酵素及び他のタンパク質の機能的発現の欠如によって引き起こされる先天的病態と診断される。したがって、特定の例では、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子を、筋ジストロフィー、高トリグリセリド血症、血友病Ｂ、遺伝性気腫、家族性肥大型心筋症、嚢胞性線維症、早期発症網膜変性症、筋萎縮性側索硬化症、レーバー先天黒内障、カナバン病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症などと診断された患者に投与する。
【０１４２】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子を、遺伝子突然変異によって生じるか、または悪化する病態と診断された患者に投与してもよい。いくつかの例では、この病態は、腫瘍に関連する遺伝子突然変異によって生じるか、または悪化する。いくつかの例では、腫瘍は神経膠腫、悪性黒色腫、前立腺癌などである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子を、遺伝的突然変異によって生じるかまたは悪化する神経学的障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかんなど）と診断された患者に投与してもよい。遺伝子治療のためのＡＡＶウイルス粒子の例示的な使用は、例えば参照として本明細書に組み入れられるＳａｎｔｏｓ  Ｃｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．４：９９に記載されている。
【０１４３】
特定の実施形態では、患者の病理学的細胞への指向性を付与するＡＡＶキャプシドタンパク質と、患者を治療するための核酸遺伝子産物またはゲノム編集遺伝子産物とを含有する本発明のｒＡＡＶウイルス粒子を投与して、先天性疾患と診断された患者を治療する。いくつかの実施形態では、先天性疾患は、例えば、患者のゲノム中の突然変異遺伝子から発現した欠陥タンパク質によってもたらされるドミナントネガティブ効果によって生じる優性遺伝性障害であり得る。特定の実施形態では、突然変異した遺伝子がコードするｍＲＮＡを標的とする核酸遺伝子産物（例えば、干渉ＲＮＡ）によって、欠陥タンパク質の発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集遺伝子産物、例えばＺＦＮ剤、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ９／ｇＲＮＡシステムを構成して、患者のゲノム中の突然変異遺伝子を標的とし、優性遺伝性疾患を引き起こす遺伝子座の対立遺伝子特異的ノックダウンを達成する。特定の実施形態では、患者は、ハンチントン病、マルファン症候群などを有すると診断される。
【０１４４】
本開示のｒＡＡＶウイルス粒子及び方法はまた、意図する目的にとって望ましいものとなる、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてより高い感染性、指向性及び／または変化した宿主細胞受容体依存性を付与する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子を、選択を介して生成するのに使用する。特定の実施形態では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質配列を出発点として使用し、非許容性細胞型、すなわち、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子による感染に対して抵抗性の細胞型に対して高い感染性及び指向性を付与する変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子を生成してもよい。特定の実施形態では、非許容性細胞型は、神経膠芽腫細胞、ヒト巨核球性白血病細胞などである。
【０１４５】
キット
本明細書において、本発明のｒＡＡＶウイルス粒子またはｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを含み、開示する方法の実施において使用するキットも提供する。特定の実施形態では、キットは、上記のように、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質と、遺伝子産物をコードする異種核酸とを含有する感染性ｒＡＡＶウイルス粒子を含む。いくつかの場合では、遺伝子産物は、治療用遺伝子産物であってもよい。いくつかの実施形態では、キットはまた、感染性ｒＡＡＶウイルス粒子を保持する容器と同一のまたは別個の容器中に、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤を含有する場合がある。
【０１４６】
特定の実施形態では、キットは、感染性ｒＡＡＶウイルス粒子のライブラリを含有し、ライブラリは、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸配列に由来する複数のＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する。特定の場合では、祖先型ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶウイルス粒子に比べて高い熱安定性及び／または感染の無差別性をｒＡＡＶウイルス粒子に付与する。特定の実施形態では、キットはヘルパーウイルスをさらに含有する。特定の実施形態では、キットは、ｒＡＡＶウイルス粒子の複製のために、ｒＡＡＶウイルス粒子に感染した宿主細胞内で必要とされる遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを含有する。
【０１４７】
本発明のキットの成分は、別々の容器に入れることができるか；または単一の容器内で組み合わせることができる。
【０１４８】
上記の成分に加えて、本発明のキットは、キットの成分を使用するための、及び本発明の方法を実施するための指示書をさらに含むことができる。本発明の方法を実施するための指示書は、通常、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷してもよい。したがって、指示書は、キットの容器またはその構成要素（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連する）のラベルに存在する。他の実施形態では、指示書は、例えばＣＤ−ＲＯＭ、フレキシブルディスク、フラッシュドライブなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示書はキットには存在しないが、例えばインターネットを介したリモートソースから指示書を得るための手段を提供する。この実施形態の一例は、指示書を閲覧することができ、及び／または指示書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同じく、指示書を得るためのこの手段は、適切な基材上に記録される。
【実施例】
【０１４９】
以下の実施例は、本発明を製造及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者らが自らの発明とみなす範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が、実施する実験のすべてまたは唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。使用する数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保つための努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差を考慮すべきである。他に指定のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）などを使用する場合がある。
【０１５０】
実施例１：ＡＡＶ祖先型再構成ライブラリは、広範な感染性を有するウイルス変異体の選択を可能にする
方法
祖先型の再構成
ヒト及び非ヒト霊長類起源に由来するものを含む、Ｇｅｎｂａｎｋから取得したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｃａｐ配列（ｎ＝５２）を、以前の系統発生分析で公開されたＡＡＶ配列のリストから出発して本分析に組み入れた。ＭｒＢａｙｅｓパッケージを使用して、系統樹空間のベイジアンマルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）シミュレーションを実行し、各内部ノードの信頼値を推定した。次に、マルコフ連鎖モンテカルロアライメントサンプラーＨａｎｄＡｌｉｇｎを用いてアライメント空間を探索し、ノード２７での最も可能性の高いアライメントについての領域信頼度を推定し、このノードより低い配列を除くすべてを破棄した。ＨａｎｄＡｌｉｇｎは、列内にグループ化した残基が共通の祖先を共有するように、異なる変異体の配列をアライメント「列」に配置する多重配列アライメントを生成する。各アラインメント列は、アライメントしたタンパク質コード配列のデータベースから推定したアミノ酸及び経験的コドン置換速度行列を用いて、特徴進化の標準系統樹連続時間マルコフ過程の実装としてモデル化した。ＨａｎｄＡｌｉｇｎはアラインメントと同時に再構成を行い、配列の挿入、削除、及び文字の置換を考慮する。コドンレベルモデルを用いて、ＤＮＡレベルでの表現型を有する同義置換の可能性を考慮し；コドンレベルで両方の祖先型リーディングフレームを再構成することによって、重複リーディングフレーム（「オーバープリント」遺伝子）の二重選択の可能性もチェックした。これらの微妙な影響のいずれも、同義の（サイレントな、ＤＮＡレベルの）変異体を、多くの非同義のアミノ酸変異体に優先させるのに十分なほど有意ではないようであった。ＪａｌＶｉｅｗプログラムを使用して、組み立て後のキャプシド構造にマッピングした変異体のアミノ酸位置を視覚化した。
【０１５１】
ライブラリ構築とベクターのパッケージング
再構成した祖先型ＡＡＶ  ｃａｐ配列を、５．６×１０１１のライブラリサイズで合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、複製可能型ＡＡＶパッケージングプラスミドｐＳｕｂ２にライゲーションした。得られたライゲーション反応物をプラスミド産生及び精製のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に電気穿孔した。次いで、上記のように、複製可能型ＡＡＶをパッケージングし、ヨードキサノール密度勾配遠心分離によって精製した。Ｂｉｏｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュレーズ、カリフォルニア）及びＴａｑｍａｎプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ノバート、カリフォルニア）を用いて定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してＤＮａｓｅ耐性ゲノム力価を得た。
【０１５２】
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞、Ｂ１６−Ｆ１０皮膚メラノーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１、ｐｇｓＡ、Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１、及びＬｅｃ２細胞は、カリフォルニア大学バークレー校の組織培養施設から入手した。ＩＢ３−１肺上皮及びヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（マナサス、バージニア）から入手した。特に明記しない限り、すべての細胞株をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｌ０ヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍幹細胞は、ブレント・レイノルズ博士（フロリダ大学、ゲインスビル）によって提供され、これを上皮増殖因子（ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、及びヘパリン（リン酸緩衝生理食塩水で０．２％希釈、Ｓｉｇｍａ）を含有する無血清培地（Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ  ＮＳ−Ａ増殖キット、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてニューロスフェアアッセイ増殖条件下で増殖させた。ＩＢ３−１細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１及びｐｇｓＡ細胞をＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）中で培養し、Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１、及びＬｅｃ２細胞をＭＥＭαヌクレオシド（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＧＢＭ培養物以外のすべての培地に１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した。
【０１５３】
ライブラリの選択と進化
すべての細胞株を、１×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルの組織培養プレートに播種した。播種の１日後、細胞に複製可能型ＡＡＶライブラリを感染させた。曝露から２４時間後、細胞にアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）を重感染させた。約４８時間後、細胞変性効果を観察し、ウイルス粒子を３回の凍結／融解段階により回収し、続いてベンゾナーゼヌクレアーゼ（１ユニット／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃、３０分間処理した。次いでウイルス溶解物を５６℃で３０分間インキュベートしてＡｄ５を不活化した。ウイルスゲノム力価を上記のように測定した。ｃａｐ配列を分析するために、パッケージングならびに３及び６ラウンドの選択後に、ＡＡＶウイルスゲノムを抽出し、ＰＣＲにより増幅し、ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで配列決定した。
【０１５４】
進化させた祖先型ライブラリにおける可変位置の統計解析
各可変アミノ酸位置における２組の可変アミノ酸の比較を実施して、選択中にそのライブラリの割合が有意に変化した可変位置を同定した。２つの異なる確率分布から得られる２組の可変アミノ酸の事後確率を、まばらな観測カウントを反映するための低い擬似カウントを有するディリクレ分布の確率パラメータを仮定して計算した。合成及び理論ライブラリの比較のために、ディリクレ多項式を介して分布する合成後のアミノ酸頻度を、多項分布するライブラリからの理論的確率と比較した。
【０１５５】
インビトロ形質導入分析
６ラウンドの進化を介して選択した祖先型ライブラリウイルスゲノムを、ｐＸＸ２組換えＡＡＶパッケージングプラスミドにクローニングした。天然ＡＡＶ血清型のパネルに対する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶの）祖先型ライブラリの感染性をベンチマークするために、前述の一過性形質移入法を用いて、自己相補的なサイトメガロウイルス緑色蛍光タンパク質（ＣＭＶ−ＧＦＰ）カセットによってベクターをパッケージングした。９６ウェルプレートに１５，０００細胞／ウェルの密度で細胞株（２９３Ｔ、Ｃ２Ｃ１２、ＩＢ３−１、Ｂ１６−Ｆ１０、ＣＨＯ−Ｋ１、ｐｇｓＡ、Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１、及びＬｅｃ２）を播種した。播種の１日後、ゲノム感染多重度（ＭＯＩ）２，０００（２９３Ｔ、Ｃ２Ｃ１２、ＩＢ３−１、Ｂ１６−Ｆ１０、ＧＢＭ）、１０，０００（Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１、Ｌｅｃ２）、３２，０００（Ｃ２Ｃ１２）、または５０，０００（ＣＨＯ−Ｋ１、ｐｇｓＡ）（ｎ＝３）で、ｒＡＡＶを細胞に感染させた。糖タンパク質の使用を研究する実験のために、前述したように形質導入する前にＰｒｏ５細胞を、０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）で処理するか、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で擬似処理し、ゲノムＭＯＩ  ５，０００（祖先型ＡＡＶ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６）または１５，０００（ＡＡＶ５）で細胞を感染させた。抗体回避特性を分析するために、祖先型ｒＡＡＶライブラリを熱不活化ＩＶＩＧ（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）の連続希釈液を用いて３７℃で１時間インキュベートし、次いでゲノムＭＯＩ  ２０００（ｎ＝３）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。熱安定性を特徴付けるために、自己相補的ＣＭＶ−ＧＦＰと共にパッケージングしたウイルス粒子を、２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで希釈し、３７℃に冷却する前にサーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で５９．６℃〜７８℃の温度で１０分間インキュベートし、１，５００〜１６，０００のゲノムＭＯＩで２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。ＭＯＩは、分析のために十分な数のＧＦＰ陽性細胞を確保するように調整した。すべての研究において、感染の７２時間後に、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  ６ＨＴフローサイトメーター（ＥＭＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、バークレー、カリフォルニア）を用いて、ＧＦＰ発現細胞の画分を定量した。
【０１５６】
インビボ動物イメージング及びルシフェラーゼ発現の定量
高力価のｒＡＡＶ  ｄｓＣＡＧ−ルシフェラーゼベクターをイオジキサノール勾配により精製し、次いで濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳに交換した。骨格筋の形質導入を研究するために、５×１０１０のｒＡＡＶ−Ｌｕｃ  ＤＮａｓｅ耐性ゲノム粒子を、先に記載したように、７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｎ＝３）の各腓腹筋に３０μｌの容量で注射した。注射から６週間後、動物を殺処分し、腓腹筋を採取し、凍結させた。ルシフェラーゼ活性を測定し、前述のように全タンパク質に対して正規化した。すべての動物取扱手順は、カリフォルニア大学バークレー校の実験動物飼育室によって承認を受けており、実験動物飼育に関する国立衛生研究所（ＮＩＨ）ガイドラインに従って実施した。
【０１５７】
結果
祖先型ＡＡＶ配列の再構成
祖先型配列再構成の目標は、現存するＤＮＡ配列のセットが与えられれば、それらの配列に関係する系統樹及び配列アライメントを生成し、異なる祖先ノードにおける祖先型変異体の配列を推定することである。現存する変異体（系統樹形成段階に影響を及ぼす）間の進化的関係におけるあいまいさ、ならびに非常に可変性の高い残基（配列のアライメント及び祖先型の再構成段階に影響を及ぼす）での配列の相違性に起因して、正確な配列の再構成は困難である。ＡＡＶ祖先型再構成の出発点として、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｎ＝５２）から取得した選択したヒト、マカク及びアカゲザルＡＡＶ  ｃａｐ配列の系統発生を再構成した。系統樹空間のベイジアンマルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）シミュレーションを実行するＭｒＢａｙｅｓを用いて、各内部ノード（図１ａ及び２の中括弧で示す）の信頼値を推定した。本アプローチは、現存する配列に関連する系統樹を生成するものであり、それは本質的にＡＡＶの進化的履歴に関する仮説である。この系統樹上の各枝は、配列を多様化させる進化過程を記述し、各内部ノードは、２つのＡＡＶ系統が分枝する「分枝」イベントを表す。選択対象の多くの祖先ノードに対して、ノード２７を、その高い信頼値（１．００）に基づいて選択し（図１、パネルａ）、このことは不確定性（配列全体での系統関係のレベルにおける）の潜在的な原因の一つを最小限に抑え、個々のアミノ酸の進化的履歴のより精細な下流再構成における信頼性を向上させる。このノードは、臨床的有効性（ＡＡＶ１、Ｇｌｙｂｅｒａ）、生物医学的関心（ＡＡＶ６）、または中和抗体に対する相対的耐性（ＡＡＶ７）を有する血清型の祖先型でもある。
【０１５８】
図１．祖先型ＡＡＶ配列の再構成。ａ）ノード２７に現存するＡＡＶ変異体のサブセットを関連付ける系統樹。括弧内の数字はクレードの事後確率を示す。系統樹のグラフィックはＤｅｎｄｒｏｓｃｏｐｅで生成した。ｂ）一桁の数字で最上部に沿って色付けし、アノテーションした列特異的な信頼度を有するＡＡＶ変異体サブセットの多重配列アライメント（ｈｕ．３１及びｈｕ．３２−配列番号１；ｃｙ．６及びｒｈ．１３−配列番号２；ｒｈ．２、ｒｈ．５０、ｈｕ．６７、ｒｈ．１０、及びｒｈ．５５−配列番号３；ｒｈ．５１−配列番号４；ｒｈ．４９−配列番号５；ｃｙ．４−配列番号６）。０．９以上から０．３〜０．４までの信頼度の範囲を上の行に示す。ｃ）ノード２７、残基４５１〜４８１について予測した祖先型アミノ酸配列の分布。各アミノ酸の文字の高さは事後確率に比例する。
【０１５９】
図２．ＡＡＶ祖先型配列の再構成のための完全な系統樹。中括弧の数字はクレードの事後確率を示す。系統樹のグラフィックはＤｅｎｄｒｏｓｃｏｐｅで生成した。
【０１６０】
次いで、マルコフ連鎖モンテカルロアライメントサンプラーＨａｎｄＡｌｉｇｎを用いて、アライメント空間を探索し、ノード２７で最も可能性の高いアライメントの祖先型配列を予測した。ＨａｎｄＡｌｉｇｎは、多重配列アライメントを生成し、異なる変異体の配列をアライメント‘列’に整列させ、それによって、ある列にグループ分けした残基は共通の祖先を共有する（図１、パネルｂ）。ＨａｎｄＡｌｉｇｎは、アライメントと同時に祖先型の再構成を行い、配列の挿入、削除、及び文字の置換を考慮に入れる。図１ｃは、予測されるアミノ酸の分布を配列ロゴとして示しており、配列ロゴは事後確率に比例した文字の高さを有する。アミノ酸位置の大部分は、高い信頼度（０．９０以上）で予測することができ、したがって、進化中に高度に保存された残基を表す。しかしながら、祖先型の再構成に共通する点として、他の位置は進化的に保存されておらず、したがってより低い確率で予測可能であった。
【０１６１】
これらの結果に基づいてＤＮＡライブラリを設計し、信頼値が０．９０より高い残基は固定する一方で、この信頼水準より低いが閾値０．０８より高い残基は、２つまたは３つの最も有望なアミノ酸を導入して多様化させ、その結果として、所与の位置に各アミノ酸を含むライブラリメンバーの割合は、配列再構成において出現するそのアミノ酸の確率を反映したものとなる。３２個の可変残基の位置、同一性及び合成頻度を表１に示し、すべての祖先型ｃａｐアミノ酸配列を図３（配列番号７）に示し、図４の現存する血清型とアライメントした。祖先型ｃａｐライブラリを合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、このライブラリから６１個の配列クローンを分析したところ、可変位置のアミノ酸頻度はライブラリからの理論的確率と有意に異ならないことが明らかとなり（Ｐ＜０．００１、材料及び方法参照）、このことはライブラリ合成の正確さを強く示すものであった。
【０１６２】
図３．祖先型ＡＡＶ  ｃａｐアミノ酸配列。可変残基は、太字の下線付き文字Ｘでラベル付けされている。
【０１６３】
図４．祖先型ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質の天然血清型とのアライメント。キャプシドのアミノ酸は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓプログラム（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）を用いてアライメントした。着色したアミノ酸は、参照祖先型のｃａｐ配列との不一致を表す。祖先型ライブラリの可変位置を黒でアノテーションし、文字Ｘで示す。
【０１６４】
（表１）
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【０１６５】
祖先型ＡＡＶライブラリの遺伝的選択
３２か所の可変位置でのアミノ酸の初期合成分布を確認した後、ＡＡＶの自然進化における効果的なウイルス複製適応度についての重要な因子であるパッケージング及び感染性に対する選択圧にさらした場合に、これらの位置がどのように変化するかということについて分析した。祖先型ライブラリをＡＡＶパッケージングプラスミドにクローニングし、前述のようにヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞に形質移入することによって、ウイルス粒子を産生した。ウイルスゲノム力価は、現存するＡＡＶ血清型に基づいてライブラリをパッケージングする場合に得られたレベルに匹敵し、祖先型ライブラリが強力なパッケージング力価を支持し得ることを示した。可変位置でのアミノ酸分布は、１ラウンドのパッケージングではわずかに変化するのみであったが（図５）、感染性に対するさらなる選択圧によって、各可変位置の重要性がより鮮明になり得ると考えられた。異なる組織を代表する５つの細胞株：Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞、ＩＢ３−１肺上皮細胞、Ｂ１６−Ｆ１０皮膚黒色腫細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞、及びＬ０ヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍幹細胞を選び出し、選択ラウンドを開始した。簡潔に述べると、イオジキサノールで精製した複製可能型ＡＡＶライブラリを、１×１０５個の細胞に初期ゲノム感染多重度（ＭＯＩ）１０４で感染させた。２日後、アデノウイルスタイプ５で重感染させることにより、有効なウイルス粒子を回収した。各細胞株について６ラウンドの選択を実施し、ゲノムＭＯＩを減少させることによって、その後のラウンド中における選択の厳密性を増加させた（表２）。
【０１６６】
図５．６ラウンドの選択後の可変位置における優勢アミノ酸。異なるライブラリの各位置で最も一般的なアミノ酸の頻度に基づいて、ヒートマップを生成した。個々のクローンｎ＝６１（合成ライブラリ）、ｎ＝２３（パッケージング後）、及びｎ＝１４（各細胞株での選択後の祖先型ライブラリ）からの配列決定結果に基づいて、各位置での優勢アミノ酸及び頻度を決定した。
【０１６７】
（表２）祖先型ＡＡＶライブラリ選択に適用した選択の厳密性
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【０１６８】
各可変位置での選択の進行を評価するために、初期ウイルスパッケージング後（以後、パッケージング後と呼ぶ）、３ラウンドの選択後、及び６ラウンドの選択後に各ライブラリからクローンを配列決定した（ｎ≧１４）。この分析は、異なる細胞株にわたる各可変位置についての成果の範囲を明らかにした。図６は、ＡＡＶ１（構造が解明された最も相同な血清型）の結晶構造上にマッピングした可変アミノ酸の位置を示し、図５及び７は、６または３ラウンドの選択後の、選択した各プールについての優勢アミノ酸を示す。予想通り、細胞株の感染性に関する選択は収束の増加をもたらし、図８及び９は、パッケージング後に対する、ラウンド６及び３におけるアミノ酸頻度の変化率をそれぞれ示す。いくつかのアミノ酸位置は、すべての細胞株にわたって、同一の残基への完全な収束へと近づく（２６８位、４６０位、４７４位、５１６位、５４７位、５８３位、６６５位、７１０位、７１７位、７１９位）；これらの位置はキャプシド全体に分布しており、例えば、キャプシドの安定性、非コーティング、またはエンドソーム脱出などのコアウイルス機能にとって重要な場合がある。他のものは、異なる細胞株にわたってより多様な成果を示し（２６４位、４６７位、５９３位、６６４位、７２３位）、全体の適応度に関して中立的な場合がある。最後に、いくつかの位置（４５９位、４７０位、４７１位、５３３位、５５５位、５９６位、６６２位、７１８位）は、所与の細胞株に特異的な同一性を獲得し、それぞれの細胞株に感染性に関する利点を与え得る。これらの特定の残基の大部分は、キャプシドの表面上に露出しており、したがって、例えば、キャプシドと細胞表面受容体との相互作用の親和性を変化させる際に、役割を果たす可能性がある。
【０１６９】
図６．相同ＡＡＶ１、すなわち利用可能な構造に相対的に最も近いＡＡＶの結晶構造にマッピングした可変残基。ＡＡＶ１キャプシドの３次元分子モデルをＰｙＭＯＬにおいて生成した。祖先型ＡＡＶ配列とＡＡＶ１とのアミノ酸アライメントを用いて、強調表示した残基をａ）個々の非対称ユニット及びｂ）完全な生物学的組立体にマッピングした。
【０１７０】
図７．選択の３ラウンド後の可変位置における優勢アミノ酸。異なるライブラリの各位置での最も一般的なアミノ酸の頻度に基づいて、ヒートマップを生成した。個々のクローンからの配列決定結果に基づいて、各位置での優勢アミノ酸及び頻度を決定した（ｎ≧１４）。
【０１７１】
図８．６ラウンドの選択後の可変位置におけるアミノ酸頻度の変化。各細胞株における６ラウンドの選択後の、パッケージング後ライブラリと進化ライブラリとの間のアミノ酸頻度の増減率を計算した。優勢アミノ酸の同一性が変化しなかった場合、頻度の増減を示す。選択によって、その位置でのアミノ酸同一性が変化した場合、新しいアミノ酸及び頻度を示す。
【０１７２】
図９．３ラウンドの選択後の可変位置におけるアミノ酸頻度の変化。各細胞株における３ラウンドの選択後の、パッケージング後ライブラリと進化ライブラリとの間のアミノ酸頻度の増減率を計算した。優勢アミノ酸の同一性が変化しなかった場合、頻度の増減を示す。選択によって、その位置でのアミノ酸同一性が変化した場合、新しいアミノ酸及び頻度を示す。
【０１７３】
遺伝的選択によって与えられたアミノ酸頻度の変化が初期合成分布と統計的に有意に異なるかどうかを決定するために、ベイズ・ディリクレ多項式モデル比較試験（材料及び方法に記載するように）を実施し、２組の可変アミノ酸が異なる分布に由来する事後確率を計算した。この解析は、選択後に有意に異なるいくつかのアミノ酸位置を同定し（Ｐ＜０．０５）、中程度に異なるより多くのアミノ酸位置を同定した（Ｐ＜０．５）（図１０）。
【０１７４】
図１０．ベイジアン・ディリクレ多項式モデル比較試験による主要な可変残基の同定。可変アミノ酸の２つのセットの比較を実施し、選択中に有意に変化した位置を同定した。２つの異なる確率分布に由来する２組のアミノ酸の事後確率を、まばらな観測配列を反映するための低い擬似カウントでディリクレ分布する確率パラメータを仮定して計算した。緑色の結果は、＞９５％の確率でセットが異なる分布に由来し、黄色は＞５０％の確率、赤色は＞５％の確率、及び無色は＜５％の確率であることを示す。Ｓｙｎｔｈ：合成ライブラリ；ＰＰ：パッケージング後；Ｒ３：選択の３ラウンド目；Ｒ６：選択の６ラウンド目。
【０１７５】
進化した祖先型ライブラリの形質導入効率
遺伝的選択は、所与の細胞株への特異的感染性をもたらし得るか、または代わりに、感染性を全体的に、しかしすべての細胞型にわたって無差別的な様式で増加させる場合がある。これらの可能性を、進化した祖先型ライブラリの細胞株パネル上の形質導入効率を評価することによって調べた。選択上の利点を与えない潜在的に中立的な位置が存在したため、６ラウンドの選択では、単一の配列への完全な収束をもたらすことはなかった。したがって、個々のクローンをパッケージングするのではなく、最初に、進化したライブラリ全体を組換えウイルスとしてパッケージングし（モザイクキャプシドを最小限にするために産生細胞あたりのＡＡＶヘルパープラスミドの比率を低くして）、結果は、全体的または平均的なライブラリの感染性を示す。形質導入効率及び指向性の比較のために、祖先型ライブラリ及び天然血清型ＡＡＶ１〜６、８及び９について、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする高力価のイオジキサノール精製組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生した。ゲノムＭＯＩ  ２，０００（またはＣ２Ｃ１２の場合は３２，０００）での感染は、ある範囲の特性を明らかにした（図１１）。進化した祖先型ライブラリは、ＡＡＶ１及びＡＡＶ６に最も匹敵し、概してＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９より優れた高い形質導入効率を媒介した。祖先型ライブラリは、天然血清型に比べてＣ２Ｃ１２及びＧＢＭ細胞株に対する感染において特に効果的であった。重要な点として、合成した祖先型ライブラリと進化した祖先型ライブラリとを比較した場合に、感染性の大幅な増加が観察され、このことは可変位置で有効なアミノ酸が遺伝子選択されたことを示唆している。興味深いことに、進化したライブラリは、概して、すべての細胞株にわたる広範な感染性を示し、このことは祖先型ＡＡＶが無差別的であったことを示唆するものであり、この性質は自然進化適応性にとって有利なものとして知られる特性である。
【０１７６】
図１１．天然ＡＡＶ血清型に対してベンチマークした進化した祖先型ライブラリの形質導入効率。６ラウンドの進化の後、ウイルスゲノムＤＮＡを祖先型ライブラリから回収し、野生型ＡＡＶ１〜６、８及び９とともにｒＡＡＶ  ｓｃＣＭＶ−ＧＦＰとしてパッケージングした。細胞株は感染多重度（ＭＯＩ）２，０００（２９３Ｔ、ＩＢ３、Ｂ１６−Ｆ１０、ＧＢＭ）または３２，０００（Ｃ２Ｃ１２）で感染させた。７２時間後、ＧＦＰ発現細胞の画分をフローサイトメトリーで定量した。データを平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として示す。祖先型：祖先型ライブラリ。
【０１７７】
祖先型ＡＡＶグリカン依存性および中和抗体に対する感受性の特徴付け
本発明者らのインビトロ形質導入実験は、再構成した変異体の広範な感染性を実証した。祖先ノード２７がＡＡＶ１及びＡＡＶ６を生じさせたことを考慮して、祖先クローンが同じグリカン依存性を共有しているかどうか、または後に進化したものかどうかを決定した。ＡＡＶ１及びＡＡＶ６は、α２，３及びα２，６Ｎ結合型シアル酸の両方をそれらの主要な受容体として利用し、ＡＡＶ６はヘパラン硫酸プロテオグリカンに対して中程度の親和性を有する。ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＰＳＧ）が使用されていることを調べるために、ＣＨＯ−Ｋ１親細胞及びＨＰＳＧを欠損したｐｇｓＡ  ＣＨＯ変異株に形質導入した。シアル酸依存性を調べるために、Ｎ結合型シアル酸及びＯ結合型シアル酸の両方を有するグリカンを提示するＰｒｏ５  ＣＨＯ親細胞、すべてのＮ結合型シアル酸及びＯ結合型シアル酸を欠損したＬｅｃ２  ＣＨＯ変異細胞株、ならびにシアル酸を有する複合型及びハイブリッド型Ｎ−グリカンを欠損したＬｅｃ１株に形質導入した（図１２、パネルｂ）。興味深いことに、祖先型ＡＡＶは、ＨＰＳＧまたはＮ及びＯ結合シアル酸への依存性を示さなかった（図１２、パネルａ）。さらに、Ｐｒｏ５細胞のプロテアーゼ処理は、祖先型ＡＡＶ及び対照血清型の両方における形質導入の低下をもたらし、このことは何らかの種類の糖タンパク質が細胞結合に利用されることを示している（図１３）。
【０１７８】
図１２．祖先型ＡＡＶ変異体のグリカン依存性。ａ）ゲノムＭＯＩ  ２，０００（Ｐｒｏ５、Ｌｅｃ１、Ｌｅｃ２）及び５０，０００（ＣＨＯ−Ｋ１、ｐｇｓＡ）で感染させてから７２時間後に、フローサイトメトリーによってｓｃＣＭＶ−ＧＦＰを保有する祖先型ＡＡＶ変異体Ｃ４、Ｃ７、及びＧ４の形質導入効率を定量した。ＣＨＯ−Ｋ１／ｐｇｓＡの比較はヘパラン硫酸プロテオグリカン依存性を調べるものであり、一方、Ｐｒｏ５／Ｌｅｃ１及びＰｒｏ５／Ｌｅｃ２はシアル酸依存性を調べるものである。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として示す。ｂ）ＣＨＯグリコシル化突然変異体上に存在するグリカン。祖先型：祖先型ライブラリ。
【０１７９】
図１３．祖先型ＡＡＶ変異体は、細胞へ進入するために糖タンパク質を使用する。Ｐｒｏ５細胞をトリプシンで処理するか、またはＰＢＳで擬似的に処理した後、祖先型ＡＡＶか、または糖タンパク質を利用することが知られている天然の血清型を用いて、形質導入を行った。ゲノムＭＯＩ  ５，０００（祖先型ＡＡＶ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６）または１５，０００（ＡＡＶ５）での感染から４８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を定量した。トリプシン処理した試料と、同一ウイルスを形質導入した各擬似処理試料との間の差異は、すべて統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として示す。祖先型：祖先型ライブラリ。
【０１８０】
現存する血清型に対するポリクローナル抗体を含むヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）によって祖先型ＡＡＶが中和されるか否かを試験した。ＩＶＩＧ存在下でのインビトロインキュベーションは、祖先型ライブラリ及びＡＡＶ１対照の形質導入を大幅に低下させ（図１４）、祖先型がその子孫と血清学的に高度に異なるわけではないことを示した。
【０１８１】
図１４．インビトロにおいて祖先型ＡＡＶ変異体はヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）によって中和される。組換えラウンド６の祖先型ＡＡＶライブラリ及びＡＡＶ１を、自己相補性ＣＭＶ−ＧＦＰカセットと共にパッケージングし、熱不活化ＩＶＩＧの連続希釈物とともに３７℃で１時間インキュベートし、次にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にゲノムＭＯＩ  ２，０００（ｎ＝３）で感染させるために使用した。７２時間後、ＧＦＰ発現細胞の画分をフローサイトメトリーで定量した。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として示す。祖先型：祖先型ライブラリ。
【０１８２】
マウス腓腹筋におけるインビボ祖先型変異体の特徴決定
祖先型ＡＡＶライブラリが、代表的な組織由来細胞株のパネル上の現存する血清型に匹敵するか、または場合によってはそれよりも高い効率を示すことを見出したことから、インビボでの感染性について調べた。最も非許容性の高い細胞株（Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞）に対する祖先型ＡＡＶの高い形質導入効率に基づいて、マウス腓腹筋のインビボ形質導入を評価した。Ｃ２Ｃ１２（クローンＣ４、Ｃ７）及び神経膠芽腫細胞（クローンＧ４）において進化させたライブラリのコンセンサス配列に最も近い選択したウイルスプール（表３）由来の個々の祖先型変異体クローンを、インビトロでＣ２Ｃ１２筋芽細胞に形質導入する際のこれらのライブラリの効率に基づいて選択した。筋肉標的指向遺伝子治療におけるその臨床的有効性を考慮して、変異体をＡＡＶ１に対してベンチマークした。ハイブリッドＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン／βグロビン遺伝子のスプライスアクセプター）プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現する自己相補性ＡＡＶベクターを作製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの各腓腹筋に３０μｌのＤＮａｓｅ耐性ゲノム粒子（５×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ））を注入し、６週間後にマウスを殺処分し、組織ルシフェラーゼ活性を分析した（図１５）。祖先型変異体は、腓腹筋におけるＡＡＶ１よりも１９〜３１倍高い導入遺伝子発現をもたらし、変異体Ｃ７は最も高い発現をもたらした。興味深いことに、変異体Ｃ７は、Ｃ２Ｃ１２細胞において進化した祖先型ライブラリの可変位置における優勢アミノ酸のコンセンサス配列に正確に一致する。これらの結果は、無差別的な祖先型ＡＡＶが、インビボにおいても高い感染性を示し、さらには遺伝子治療応用において最良の天然血清型の性能を超える可能性を提供することを示している。
【０１８３】
図１５．腓腹筋の形質導入の評価。成体マウスの祖先型クローンＣ４、Ｃ７、Ｇ４、または野生型ＡＡＶ１の５×１０１０個のウイルス粒子を筋肉内投与してから４８日後に、腓腹筋組織ホモジネート中で、タンパク質１ｍｇあたりの相対発光量（ＲＬＵ）を測定することによってルシフェラーゼ活性を測定した。リン酸緩衝生理食塩水を注入した対照は活性を示さなかった。＊：両側スチューデントｔ検定による統計的差異がＰ＜０．０５。
【０１８４】
（表３）インビボで評価した祖先型クローン中に存在する３２個の可変アミノ酸の同一性
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【０１８５】
実施例２：祖先型ＡＡＶの熱安定性
高い熱安定性及び突然変異に対する耐性の向上はまた、祖先型ウイルスキャプシドに進化上の利点を与えることができる特性でもある。再構成プールから選択したＡＡＶ変異体の、天然血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ６と比較しての熱安定性を、熱処理後の形質導入効率をアッセイすることによってベンチマークした。具体的には、初期分析のために、Ｃ２Ｃ１２細胞上で選択した祖先型ライブラリ及びこのライブラリの代表的な変異体Ｃ７を選択した。自己相補性ＣＭＶ−ＧＦＰと共にパッケージングしたウイルス粒子を、温度勾配を用いて異なる温度で１０分間処理した後、３７℃に冷却し、２９３Ｔ細胞に感染させた。各温度で処理した後に得られたＧＦＰ発現細胞画分を、３７℃でインキュベートした試料に対して正規化した（図１８）。祖先型変異体は、天然の血清型よりも高い熱安定性を示し、天然血清型による形質導入を消失させる最も高い処理温度である７８℃においても中等度の形質導入レベルを示した。得られる熱安定性は、ＡＡＶ５がＡＡＶ１より安定であり、ＡＡＶ２が両者より安定性が低いことを示した以前の天然血清型についての報告を追認するものである。一般的に祖先型変異体の耐熱性が高まると、不安定化突然変異に対する耐性がより高くなり、結果的に進化適応性が高まる可能性がある。
【０１８６】
図１８．候補祖先型変異体は天然血清型よりも高い熱安定性を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞において選択した祖先型ライブラリ及び代表的な祖先型変異体Ｃ７の熱安定性を特徴付け、天然血清型１、２、５、及び６の熱安定性と比較した。ｓｃＣＭＶ−ＧＦＰと共にパッケージングしたウイルス粒子を、５９．６℃〜７８℃で１０分間インキュベートした後、３７℃に冷却し、２９３Ｔ細胞に感染させるために使用した。７２時間後、ＧＦＰ発現細胞の画分をフローサイトメトリーで定量した。データは、３７℃でのインキュベーション後のＧＦＰ発現細胞の画分に対して正規化した後、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として提示する。
【０１８７】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよく、均等物に置換してもよいことを理解すべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、工程、工程段階または段階を本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために、多くの改変を行ってもよい。このような改変はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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