(57)【要約】生体適合性マトリックス材料内に組み込むことができる多孔質セラミック顆粒に骨誘導性物質を担持させた骨誘導性合成骨移植片を製造するためのシステム及び方法を提供する。顆粒による担持は、一部の場合、低ｐＨ緩衝液及び前処理によって促進される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
約１００μｍ約〜５００μｍの平均サイズを有する複数のマクロ孔を有する多孔質の生体適合性ポリマーマトリックスと；
前記多孔質の生体適合性マトリックスに接触しているカルシウムセラミック顆粒であって、前記カルシウムセラミック顆粒は、約４２５μｍ〜約８００μｍの平均直径を有し、当該顆粒の内側に少なくとも一つの表面を規定するミクロ孔の相互接続ネットワークを有するカルシウムセラミック顆粒と
を含む、前記組成物。
【請求項２】
カルシウムセラミック顆粒が約５．５〜約６．０のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも一つの内部表面に結合された骨誘導性タンパク質をさらに含み、カルシウムセラミック顆粒の重心付近の骨誘導性タンパク質の濃度がカルシウムセラミック顆粒の外表面上の骨誘導性タンパク質の濃度の約３３％を下回らない、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
多孔質の生体適合性マトリックスがさらに、約１ｍｍ〜２ｍｍの平均直径を有する複数のマクロ孔を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
多孔質の生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
多孔質の生体適合性マトリックスが合成ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が５０％の線形歪で少なくとも５０ｋＰａの圧力に耐える十分な柱強度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
骨誘導性タンパク質を担持し、当該骨誘導性タンパク質の少なくとも５０％を移植後少なくとも７日間保持するように構成された、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
患者の治療法であって、
患者の骨組織を組成物と接触させる工程を含み、前記組成物は、
約１００μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する複数のマクロ孔を含む、多孔質の生体適合性マトリックスと；
前記多孔質の生体適合性マトリックスに接触しているカルシウムセラミック顆粒であって、当該顆粒の内側に少なくとも一つの表面を規定するミクロ孔の相互接続ネットワークを有するカルシウムセラミック顆粒と；そして
当該顆粒の内側の少なくとも一つの表面に結合された骨誘導性タンパク質であって、前記骨誘導性タンパク質は当該顆粒の重心付近の少なくとも一つの表面の部分と当該顆粒の外側付近の少なくとも一つの表面の部分に分布している骨誘導性タンパク質と
を含む方法。
【請求項１０】
骨組織が、骨及び椎骨への外傷部位からなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カルシウムセラミック顆粒が約５．５〜約６．０のｐＨを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
多孔質の生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
多孔質の生体適合性マトリックスが合成ポリマーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
カルシウムセラミック顆粒の重心付近の骨誘導性タンパク質の濃度がカルシウムセラミック顆粒の外表面上の骨誘導性タンパク質の濃度の約３３％を下回らない、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を、骨誘導性タンパク質を含む溶液で湿らせ、それによって骨誘導性タンパク質を少なくとも一つの表面に結合させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
患者を治療するためのキットであって、
担体、すなわち
約１００μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する複数のマクロ孔を含む、多孔質の生体適合性マトリックス；および
前記多孔質の生体適合性マトリックスに接触しているカルシウムセラミック顆粒であって、当該顆粒の内側に少なくとも一つの表面を規定するミクロ孔の相互接続ネットワークを有するカルシウムセラミック顆粒
を含む担体と； 
骨誘導性タンパク質を、当該骨誘導性タンパク質を流体に加えて溶液を形成できる形態で保持する容器と
を含み、前記溶液は、担体を湿らせるように適合され、それによって骨誘導性タンパク質が当該顆粒の内側の少なくとも一つの表面に結合され、それによってインプラントが形成されるキット。
【請求項１７】
多孔質の生体適合性マトリックスがさらに、約１ｍｍ〜２ｍｍの平均直径を有する複数のマクロ孔を有する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
多孔質の生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
多孔質の生体適合性マトリックスが合成ポリマーを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
インプラントが５０％の線形歪で少なくとも５０ｋＰａの圧力に耐える十分な柱強度を有する、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本願は、２０１５年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６２／２４８，８６１号に基づく優先権及び利益を主張し、その全文を引用によって本明細書に援用する。
[0002]本願は、医療デバイス及び生物学的療法に関し、さらに詳しくは、骨セメント、骨パテ及び顆粒−バインダ複合材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003]骨移植片は、毎年およそ２００万件の整形外科的処置に使用されており、一般に三つの形態のうちの一つを取る。自家移植片は、典型的には、患者の一部位から同じ患者の別の部位に移植するために採取された骨からなるもので、これらの材料は骨伝導性である（新生骨成長の足場として働く）と同時に、骨誘導性でもあり（骨芽細胞の発生を促進する）、骨原性でもある（新生骨を形成する骨芽細胞を含有する）ので、骨移植材料の基準（ベンチマーク）である。しかしながら、自家移植片の供給には限りがあるため、死体由来の同種移植片の使用を余儀なくされてきた。しかしながら、同種移植片は、宿主−移植片免疫応答を誘起したり、感染症やプリオン病を伝播しうるので、滅菌されたり又はそれらの骨原性を排除するために細胞除去処理をされることが多く、これらの材料は自家移植片ほど理想的とは言えない。
【０００３】
[0004]ヒト由来骨移植片材料の欠点を考えると、合成骨移植材料の分野には長年にわたる需要があった。合成移植片は、典型的には、カルシウムセラミック及び／又はセメント（ペースト又はパテの形態で送達される）を含む。これらの材料は骨伝導性ではあるが、骨誘導性でも骨原性でもない。それらの効果を改良するために、合成カルシウム含有材料には、骨誘導性材料、特に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、又はその他の成長（増殖）因子、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及び／又は形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を担持(load)させてきた。しかしながら、重大な技術的課題のために合成骨移植片代替物への骨誘導性材料の効率的な組込みができず、それゆえに高品質な骨誘導性合成骨移植片材料の開発が制限されている。
【０００４】
[0005]一つのそのような課題は、骨誘導性材料を１回の短いバースト放出ではなく長期間送達し、かつ新生骨成長を支援する適切な物理的特性を有する移植片マトリックスを開発することであった。適切な物理的特性を備えた材料の製造は、とりわけ、そのような材料が移植の最中及び後に移植片にかかるであろう荷重に耐えられるほどの剛性を有することという要件と、細胞及び組織浸潤を可能にするほど多孔質の状態を保持し、新生骨による移植片の置換を可能にする速度で分解又は溶解するという要件、そして骨生成に適切な時間的及び空間的様式で骨誘導性材料を溶出するという別の要件とのバランスを取ることを必要とする。新生骨形成と最終的な治癒を促進するための最適な移植片マトリックスをもたらすのは、上記設計基準の組合せのみである。例えば、現在商業的に入手可能なＢＭＰ溶出合成骨移植片はこれらの要件を満たしていないので、ＢＭＰなどの骨誘導性材料を送達するために最適化された骨移植片材料を求めるニーズは存在する。
【発明の概要】
【０００５】
[0006]本発明は、骨誘導性タンパク質の改良された溶出と共に最適な物理的特性も備えた合成骨移植片材料、ならびにその製造及び使用法を提供することにより、当該分野で未だ満たされていない重要なニーズに対処する。一側面において、本発明は、１００〜５００ミクロンの範囲の平均サイズを有する複数のミクロ孔を有する多孔質の生体適合性マトリックスと、生体適合性マトリックスに接触しているカルシウムセラミック顆粒（必ずしもそうでなくてもよいが、任意に３０ｍ２／ｇを超える比表面積を有する）とを含み、前記顆粒は、顆粒の内側に少なくとも一つの表面を規定するミクロ孔の相互接続ネットワークを有する組成物に関する。一部の場合において、セラミック顆粒は５．５〜６．０の範囲のｐＨを有する（顆粒と水又は別の中性非緩衝溶液のスラリー中での測定）。本発明の組成物は、骨誘導性タンパク質を担持し、そのような骨誘導性タンパク質の少なくとも５０％を患者への移植後７日間以上保持するように構成できる。この線に沿って、一部の場合においては、組成物は、カルシウムセラミック顆粒の重心付近の骨誘導性タンパク質の濃度がカルシウムセラミック顆粒の外表面上の骨誘導性タンパク質の濃度に類似する（例えば、その約３３％を下回らない）ようにするために、顆粒の内側の少なくとも一つの表面に結合（association）された骨誘導性タンパク質を含む。例えば、一部の場合において、重心付近（すなわち、重心から外表面までの平均距離のおよそ２０％の半径以内、又は場合によっては１０％の半径以内）の内部表面上の骨誘導性タンパク質の濃度は、顆粒の外表面上に見出されるタンパク質の濃度の少なくとも３３％でありうる（例えば、重心付近の濃度に対する表面上のタンパク質の濃度比は３未満でありうる）。コラーゲン又は合成ポリマーから形成されうる生体適合性マトリックスは、任意に、１〜２ｍｍ範囲の平均直径を有する複数のマクロ孔を含んでいてもよく、任意に又はさらに、５０％の線形歪で少なくとも５０ｋＰａの圧力に耐える十分な柱強度(column strength)を特徴とする。
【０００６】
[0007]別の側面において、本発明は患者の治療法に関する。該方法は、患者の骨組織を組成物と接触させる工程を含み、該組成物は、（ａ）多孔質の生体適合性マトリックスであって、前記マトリックスは約１００μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する複数のマクロ孔を含む多孔質の生体適合性マトリックスと、（ｂ）カルシウムセラミック顆粒であって、前記多孔質の生体適合性マトリックスに接触し、顆粒の内側に少なくとも一つの表面を規定するミクロ孔の相互接続ネットワークを有するカルシウムセラミック顆粒と、そして（ｃ）顆粒の内側の少なくとも一つの表面に結合された骨誘導性タンパク質であって、前記骨誘導性タンパク質は顆粒の重心付近の少なくとも一つの表面の部分と顆粒の外側付近の少なくとも一つの表面の部分に分布している骨誘導性タンパク質とを含む。骨組織は、任意に、骨及び／又は椎骨への外傷部位でもよい。一部の場合において、カルシウムセラミック顆粒は約５．５〜約６．０のｐＨを有し、そして／又はカルシウムセラミック顆粒の重心付近の骨誘導性タンパク質の濃度はカルシウムセラミック顆粒の外表面上の骨誘導性タンパク質の濃度の約３３％を下回らない。生体適合性マトリックスは、コラーゲン又は場合によっては合成ポリマーを含みうる。あるいは又はさらに、該方法は、組成物を骨誘導性タンパク質を含む溶液で湿らせ、それによって骨誘導性タンパク質を少なくとも一つの表面に結合させる工程を含むこともできる。
【０００７】
[0008]さらに別の側面において、本発明は、患者を治療するためのキットにも関し、該キットは、担体と、骨誘導性タンパク質を、骨誘導性タンパク質を流体に加えると溶液が形成できる形態で保持する容器とを含む。担体は、約１００μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する複数のマクロ孔を含む多孔質の生体適合性マトリックスと、前記多孔質の生体適合性マトリックスに接触するカルシウムセラミック顆粒とを含み、前記顆粒は、顆粒の内側に少なくとも一つの表面を規定するミクロ孔の相互接続ネットワークを有する。骨誘導性タンパク質を保持する容器に流体を添加することによって形成される溶液は、その間に担体を湿らせるように適合される。それによって骨誘導性タンパク質は顆粒の内側の少なくとも一つの表面に結合され、それによってインプラントが形成される。様々な場合において、多孔質の生体適合性マトリックスは、さらに約１ｍｍ〜２ｍｍの平均直径を有する複数のマクロ孔を有し、及び／又はコラーゲンから形成され、及び／又は合成ポリマーから形成される。あるいは又はさらに、キットの構成要素から形成されたインプラントは、５０％の線形歪で少なくとも５０ｋＰａの圧力に耐える十分な柱強度を有する。
【０００８】
[0009]本発明の一定の態様を添付の図面によって説明する。図面は必ずしも正確な縮尺ではないこと、そして本発明の理解に不要な詳細又はその他の詳細の理解を困難にする詳細は省略されうることは理解されるであろう。本発明は、本明細書中に例示された特定の態様に必ずしも限定されないことも理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[0010]図１は、吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）で送達されたＢＭＰ−２による処置に応答したヒト以外霊長類の腓骨骨切りモデルにおける８週時点における仮骨形成を、顆粒化リン酸カルシウムマトリックス（ＣＰＭ）で送達されたＢＭＰ−２による処置と比較して示す。パネルＡ及びＢに示されたＢＭＰ−２／ＡＣＳで処置された骨切りは、ミクロ孔質ＡＣＳ担体の内部ではなくＡＣＳ担体の外側に骨が形成されたことにより、中空の仮骨構造を有している。これに対し、パネルＣ及びＤに示されたＢＭＰ−２／ＣＰＭで処置された修復は、顆粒化されたマクロ孔質担体間に骨が形成されたことにより、はるかに均一な仮骨構造を有している。
【図２】[0011]図２は、ウサギ尺骨骨切りモデルにおけるｒｈＢＭＰ−２／リン酸カルシウムマトリックス（ＣＰＭ、０．７及び４．２ｍｇ／ｍＬ）の注入後のｒｈＢＭＰ−２の原位置(in situ)保持率（初期用量の％、平均±ＳＤ）対時間（日）を、吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）で送達された０．２ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ及び緩衝液で送達されたｒｈＢＭＰ−２（０．７ｍｇ／ｍＬ）と比較して示す。
【図３】[0012]図３は、ラット筋肉内パウチモデルにおけるリン酸カルシウム（ＣａＰ）セメントで送達されたＢＭＰ−２の保持プロフィールを、予備形成ＣａＰセメント顆粒の表面上に担持されたＢＭＰ−２及び吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）で送達されたＢＭＰ−２と比較して示す。ＣａＰセメント内に含有されたＢＭＰ−２の保持は、予備形成ＣａＰセメント顆粒の表面上に担持されたＢＭＰ−２の保持よりも著しく長い。表面被覆ＣａＰセメント顆粒からのＢＭＰ−２保持は、ＢＭＰ−２がＡＣＳで送達された時に観察された最適とは言えない保持に類似している。
【図４】[0013]図４は、ＣＤＨＡ多孔質高ＳＳＡ（比表面積）顆粒、ＣＤＨＡ非多孔質高ＳＳＡ顆粒、マクロ孔質リン酸カルシウムセメント（ＣａＰ）、６０：４０  ＨＡ／ＴＣＰ多孔質顆粒、１５：８５  ＨＡ／ＴＣＰ多孔質顆粒で送達されたＢＭＰ−２のインビトロにおける保持プロフィール（初期の％）を、日で表した時間の関数として、吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）と比較して示す。ＢＭＰは、ＢＭＰ緩衝液中で１時間、担体上に担持された。次に、ＢＭＰ担持顆粒を、インビボでの血清タンパク質への暴露を模倣するために、２０％ウシ血清を含有する溶液中でインキュベートした。多孔質であるなしにかかわらず高比表面積ＣＤＨＡ顆粒及びＣａＰセメントが、ＡＣＳ及び低ＳＳＡ顆粒（単独でもコラーゲンスポンジ内に含有されていても）と比べて優れたＢＭＰのインビトロ保持を有していた。
【図５】[0014]図５Ａ−Ｂは、本発明の一定の態様に従って、担持用緩衝液を（Ａ）使用せずに、及び（Ｂ）使用して、ＢＭＰベースの骨誘導性タンパク質を担持させた顆粒の顕微鏡写真を示す。５Ａは、蛍光標識されたＢＭＰが弱緩衝溶液で送達された場合、タンパク質はセラミック顆粒の表面に限定されることを示している。これに対し、蛍光標識されたＢＭＰが十分に緩衝化された低ｐＨ溶液で送達された場合、タンパク質は、セラミック顆粒の内側表面に浸透し、局在化することができる。
【図６】[0015]図６Ａ−Ｆは、様々な緩衝液組成で蛍光標識ＢＭＰを担持させた未処理（Ａ−Ｃ）顆粒及び酸による前処理（“エッチング”）（Ｄ−Ｆ）顆粒の顕微鏡写真を示す。第１のカラム（Ａ＆Ｄ）では、顆粒に、低緩衝能のｐＨ４．０緩衝液（“１ｘｄＢＭＰ緩衝液”；組成については表１参照）中でタンパク質を担持させた。第２のカラム（Ｂ＆Ｅ）では、顆粒に、中間緩衝能のｐＨ３．５緩衝液（“５ｘｄＢＭＰ緩衝液”）中でタンパク質を担持させた。第３のカラムでは、顆粒に、高緩衝能のｐＨ３．０緩衝液（“１０ｘｄＢＭＰ緩衝液”）中でタンパク質を担持させた。タンパク質の分布は、緩衝能の増大とｐＨの低下に従って、Ａ＆Ｄでの顆粒表面における集中から、より均一な分布へと移行している（すなわち、タンパク質は、顆粒の重心付近の孔表面に沿って及び外表面付近に分布している）。エッチング顆粒と１０ｘｄＢＭＰの組合せはタンパク質の最も均一な分布をもたらした。
【図７】[0016]図７Ａ−ＢはＢＭＰ担持顆粒の蛍光顕微鏡写真を示し、図７Ｃ−Ｄは、弱緩衝液（１ＸｄＢＭＰ緩衝液）又は強緩衝液（１Ｍ酢酸）で送達された場合の顆粒全体の蛍光標識ＢＭＰタンパク質からのシグナルを定量化したグラフを示す。図７Ａ−Ｃは、弱緩衝化系では大部分のＢＭＰは顆粒の外側付近に限定されているが、強緩衝化系ではＢＭＰは重心と外側の両方の間により均一に分布していることを示している。周辺対重心の蛍光比は強緩衝液では低く（例えば１：１に近い）、全シグナルの少なくとも３０％が重心に見出されている。図７Ｄは、このことが、少なくとも一部は、顆粒の重心におけるシグナルの増大によるもであることを示している。
【図８】[0017]図８は、ＢＭＰと未処理顆粒又はエッチング顆粒とを様々な組成の緩衝液中でインキュベーションした後の生理食塩水洗浄とグアニジンＨＣｌ抽出との間のタンパク質の分配を示す。生理食塩水洗浄液中のタンパク質は顆粒に緩く結合していたと見なされるが、グアニジンＨＣｌ抽出物中のタンパク質は顆粒に堅く結合していたと見なされる。未処理顆粒においては、緩く結合されていたＢＭＰの量は緩衝能が増大しｐＨが低下すると減少する（すなわち“１ｘｄＢＭＰ”から“１０ｘｄＢＭＰ”への緩衝液条件）。エッチング顆粒の場合、高緩衝能ｐＨ３緩衝液（１０ｘｄＢＭＰ）中でＢＭＰを担持させるまでは同様のパターンが観察された。その場合、緩く結合されたタンパク質のフラクションが１ｘｄＢＭＰ及び５ｘｄＢＭＰ条件のそれよりも劇的に増加した。
【図９】[0018]図９は、アルカリ性顆粒（例えばｐＨ８．５）では、ＢＭＰは凝集傾向にあり（高Ａ３２０値）、凝集の程度は一般的に緩衝液の強さが増大するに従って（１ｘ→５ｘ→１０ｘｄＢＭＰ緩衝液）低下する。さらに、低ｐＨ顆粒（例えばｐＨ５．２）では、ＢＭＰは全体的に凝集傾向が少なくなるので、顆粒の内側へのより良好な送達が可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
骨誘導性組成物
[0019]本発明の組成物を利用する合成骨移植片（互換的に“インプラント”又は“コンストラクト(construct)”とも呼ばれる）は、一般的に３つの構成要素、すなわち、カルシウムセラミック又はその他の固体鉱質体などの骨伝導性材料、骨形成タンパク質などの骨誘導性材料、及びコラーゲンスポンジなどの生体適合性マトリックスを含む。本明細書において、骨伝導性材料とは、骨芽細胞(osteoblast)、前骨芽細胞、骨前駆細胞、間葉幹細胞、及び骨格組織を合成及び／又は維持する細胞に分化できる又はさもなければそのような細胞の発生を促進できるその他の細胞を含む骨芽細胞(osteoblastic cell)の内方成長(ingrowth)又は表面成長(ongrowth)を促進する任意の材料のことを言う。本発明の好適な態様において、骨伝導性材料は、骨伝導性リン酸カルシウムセラミックを含む顆粒で、顆粒上に担持された骨誘導性物質の持続放出を提供するように適応されている。一部の場合において、顆粒は、相互接続された複雑な多孔質構造を含む。発明者らが見出した、ＢＭＰ結合及び本発明のコンストラクト、システム及び方法に使用するために最適化された溶出特性を示す例示的顆粒は、Ｖａｎｄｅｒｐｌｏｅｇらによる米国仮特許出願第６２／０９７，３９３号に記載されており、その全開示内容はすべての目的のために本明細書に取り込まれる。
【００１１】
[0020]顆粒は、一般的に、本発明のインプラントを所定の位置に保持し、骨誘導性材料を骨の形成及び治癒に最適な時間間隔（例えば数週間又は数ヶ月）にわたって放出することを可能にする適切な組成及び構造を有する任意の適切な骨伝導性材料から製造される。これらの特徴は用途によって変動しうるが、顆粒は、一般的に、リン酸一カルシウム一水和物、リン酸二カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、リン酸オクトカルシウム、沈降ヒドロキシアパタイト、沈降アモルファスリン酸カルシウム、リン酸一カルシウム、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、焼結ヒドロキシアパタイト、オキシアパタイト、リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト、及びそれらの組合せなどであるが、これらに限定されない。
【００１２】
[0021]骨誘導性材料は、一般的に、前駆細胞の集団から骨芽細胞の生成を刺激するペプチド及び非ペプチド増殖因子を含む。一部の態様において、骨誘導性材料は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバー、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、又はＢｅｒａｓｉらによる米国付与前出願公開第２０１２００４６２２７  Ａ１号、発明の名称“デザイナー骨誘導性タンパク質(Designer Osteoinductive proteins)”（その全開示内容はすべての目的のために引用によって本明細書に援用する）に記載されているデザイナーＢＭＰ、例えばＢＭＰ−ＧＥＲ又はＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲキメラＢＭＰである。他の態様において、骨誘導性材料は、線維芽細胞増殖因子、インスリン様成長因子、血小板由来増殖因子、小分子、ヌクレオチド、脂質、又は本明細書中に掲載されている一つ又は複数の因子の組合せである。
【００１３】
[0022]本発明によるインプラント（本明細書においては“コンストラクト”とも呼ばれる）の第三の構成要素は生体適合性マトリックスである。これは、（ａ）顆粒と共に使用される場合、移植されたときにかかる荷重に耐える十分な剛性及び／又は柱強度を示す、（ｂ）過剰な炎症（すなわち新生骨の形成又は骨折の治癒を阻害又は防止するほどの炎症）を起こさない、骨芽細胞の増殖を阻害しない、又はさもなければ顆粒及び／又は骨誘導性材料の活性を妨害しない、及び（ｃ）規定の領域内で新生骨の沈着を可能にする適切な間隔にわたって十分な凝集性を有する任意の適切な生体適合性材料でありうる。さらに、生体適合性マトリックスは、任意に分解性及び／又は骨伝導性であってもよい。生体適合性マトリックスは、様々な態様において、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びその官能化形又は変性形、コラーゲン（動物でも組換えヒトでも）、ゼラチン（動物又は組換えヒト）、フィブリン、キトサン、アルギネート、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその誘導体、官能化された又はさもなければ架橋可能な合成生体適合性ポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポロキサマー及び当該技術分野で公知のその他の感熱性又は逆感熱性(reverse-thermosensitive)ポリマー及び上記のいずれか一つ又は複数のコポリマー又は混合物である。
【００１４】
インプラント設計の技術的考察
[0023]上記のように骨誘導性材料、顆粒及び生体適合性マトリックスを含む本発明のインプラントは、一般的に、骨の成長及び治癒の促進に適合した、現在入手できる合成骨移植材料によって示されない特徴を有する。本発明によるインプラントの適切な特徴は、少なくとも（ａ）用途に適した骨誘導性材料の放出動態、（ｂ）新生骨形成を促進するが妨害しない適切な滞留時間、（ｃ）新生骨形成に伴う新血管組織を含む細胞及び組織の浸潤を可能にするマクロ孔性、及び（ｄ）インプラントにかかる荷重に耐える十分な剛性及び／又は耐圧縮性を含む。
【００１５】
[0024]ＢＭＰは、主に、骨膜(bone envelope)内の修復部位又は周辺軟組織外膜(soft tissue envelope)内のいずれかに存在する骨芽前駆細胞の分化を刺激することによって骨形成を誘導する。生理的骨修復は、骨の鉱質相に貯蔵されているピコグラム／フェムトグラム量のＢＭＰの放出と修復部位の骨前駆細胞によって分泌された新しく合成されたＢＭＰによって刺激される。これら二つのＢＭＰ源は、修復部位のＢＭＰ濃度を、骨修復の成功に導く適切な期間、生理的レベルに維持する。
【００１６】
[0025]外因性ＢＭＰは、生理的ＢＭＰ応答に似た量及び期間にわたってＢＭＰを溶出するコンストラクトで送達されるのが理想的である。しかしながら、細胞レベルで生理的ＢＭＰ濃度を達成し、適切な時間にわたって生理的濃度を維持するためには、かなり高い薬理学的ＢＭＰ濃度の投与が一般的に必要であることに注意すべきである。これは完全には理解されていない要因が重なった結果である。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、これらのコンストラクトに超生理学的ＢＭＰ濃度が必要となる一つの要因は、外因性のＢＭＰが、骨からの内因性ＢＭＰ及び細胞からの新しく形成された内因性ＢＭＰの生理的局所放出の効率を真似できないことであろう。さらに、ｒｈＢＭＰは一般的に生理的ｐＨで不溶性であるので、（ここでもいかなる理論にも拘束されることは望まないが）外因的に送達されたＢＭＰの多くは生理的に利用できないのであろう。
【００１７】
[0026]骨修復の刺激に必要な外因性ｒｈＢＭＰの量は種依存性のようである。実験的データによれば、齧歯類及びウサギなどの小動物では、イヌ、ヒツジ及びヤギなどのより大型動物と比べて、骨形成を刺激するために低い濃度の外因性ｒｈＢＭＰしか必要としないことが示唆されている。ヒト以外の霊長類及びヒトでは、骨修復を刺激するために最高濃度の外因性ｒｈＢＭＰが必要となるようである。例えば、イヌの骨修復のために吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）で送達されるｒｈＢＭＰ−２のＦＤＡ認可濃度は、ヒトで１．５ｍｇ／ｍＬであるのに対し、０．２ｍｇ／ｍＬである。繰り返すが、必要な外因性ｒｈＢＭＰ濃度におけるこの差に寄与する要因は明確に理解されてはいないが、当業者であれば、動物モデルにおける知見をヒト患者へのその適用性について評価する際に種間差を考慮せねばならないことは分かるであろう。
【００１８】
[0027]同様に、ＢＭＰを組織に送達せねばならない期間も種間で変動する。齧歯類及びウサギでは、修復のためのＢＭＰ滞留時間は、それらの迅速な固有の骨形成速度のために数日間ほどの短さでよいが、ヒト以外の霊長類及びヒト患者は一般的に数週間のＢＭＰ滞留時間を必要とする。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、霊長類及びヒトで観察されるより長い期間は、手術又は外傷によって生じた初期の異化炎症相から、骨芽前駆細胞の移動及び分化とそれに伴う癒合／修復過程を支持する新しい血管単位が関与する同化相に移行する治癒過程に要する時間に関係するようである。齧歯類に最適な短いＢＭＰ滞留時間だと、骨形成速度が遅い動物では骨修復を刺激するための十分な時間のあいだ生理学的ＢＭＰレベルを維持できない。反対に、より長い滞留プロフィールを有する担体からは、迅速な固有の骨形成速度を有する動物では骨形成を刺激するのに足る量でＢＭＰを放出できない。
【００１９】
[0028]一例として、緩衝液に入れて修復部位に局所送達されるＢＭＰの滞留時間は極端に短く、比較的多量のＢＭＰを溶液で送達したとしても、適切な骨応答は齧歯類モデルでしか刺激されない。ヒト以外の霊長類及びヒト患者に適用する場合、数週間にわたって治療部位にＢＭＰを局在化させるために、延長放出担体が使用されるのが好ましい。
【００２０】
[0029]延長された局所ＢＭＰ放出を提供するための一つの戦略は、内因性細胞外マトリックスへのＢＭＰの結合を模倣した担体を利用することである。一例として、コラーゲン担体は、ＢＭＰ溶液よりも長いＢＭＰ滞留時間を示す。それは、（いかなる理論にも拘束されるのではないが）内因性コラーゲンを含む細胞外マトリックス成分へのＢＭＰの固有の結合性のためである。リン酸カルシウムマトリックス（ＣＰＭ）を含むセラミック担体は、骨からのＢＭＰの生理的放出をより緊密に模倣し、非常に長い滞留時間を有する。セラミック担体からのＢＭＰ放出は、骨からのＢＭＰ放出で観察されるのと同じ破骨細胞性吸収を必要としうる。この特有の性質に基づき、本発明で使用されているような複合材料の担体内に包埋されたセラミック成分を含むインプラントは、その他の天然及び合成の生体材料と比べて、ＢＭＰ送達のための優れたビヒクルとなりうる。
【００２１】
[0030]骨応答を時間的に最適化することに加えて、理想的な担体は、最適な空間的骨応答も提供する。一部の送達システムで見られる一つの効果は、移植部位周囲の血腫／漿液腫の液体中へのＢＭＰの放出で、異所的(heterotopic)又は異所性(ectopic)骨形成に寄与している。ＢＭＰ−２はヒトでの使用が登録され、腰椎椎体間脊椎固定術では吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）を椎体間ケージに配置して、及び開放脛骨骨折修復ではＡＣＳスポンジ単独で送達される。ＡＣＳは担体の多くの要件に適合するが、ＡＣＳからのＢＭＰの放出は迅速で、特に最初の２４時間中である。迅速なＢＭＰ放出の結果は、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）の使用で観察される異所骨、術後軟組織腫脹／一過性の流体形成、及び一過性の骨吸収といった観察とある程度関連している。
【００２２】
[0031]ここでもいかなる理論にも拘束されることは望まないが、ＡＣＳスポンジからのＢＭＰの迅速放出は、主に、コラーゲンよりもＢＭＰに高い親和性を有する血清タンパク質のためであると考えられる。ＢＭＰのコラーゲンに対する親和性は、ＢＭＰの効率的な担持とＢＭＰ／担体から外科的修復部位への移動を可能にする。しかしながら、外科的出血に伴って修復部位内に存在する血清タンパク質とひとたび接触すると、ＢＭＰはスポンジから迅速に放出され、修復部位の血腫内に捕捉されてしまう。治癒過程の一部として修復のあと最初の１週間のあいだに血腫が漿液腫に変わると、放出されたＢＭＰは漿液腫の液体と共に利用可能な組織平面への移動が可能となり、異所的又は異所性骨形成に寄与することになる。
【００２３】
[0032]海綿骨吸収の回避に関して、骨幹端骨（metaphyseal bone）内への又は終板が貫通される椎体間固定術に伴う海綿骨へのＢＭＰ／ＡＣＳ投与後のＢＭＰの迅速放出は、相当数の破骨細胞前駆細胞もある場所での骨芽細胞前駆細胞の迅速なアップレギュレーションをもたらす。これら二つの細胞種間の正常なクロストークの結果、十分な成熟破骨細胞が生成し、骨形成前に一過性の海綿骨の吸収を引き起こす。この現象は、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）の使用に伴って椎体間固定術及び骨幹端骨修復で時折観察される骨溶解の原因の一部である。
【００２４】
構造的考察
[0033]時間的及び空間的に最適なＢＭＰの送達を提供するために、本発明の様々な態様による担体は、新しい血管及び骨形成細胞が修復部位に侵入して均一な全厚修復（図１）をもたらすことができるように、好ましくはマクロ孔性である。マクロ孔性でない担体は、修復部位内に十分侵入していない、機械的に劣る骨の殻を表面上に作るような修復をもたらすことが多い。ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）でＢＭＰ−２の送達に使用される吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）は、９０％を超える空隙率を有する。しかしながら、ＡＣＳの平均孔径は比較的小さい。マクロファージ及び単球などの個々の細胞はスポンジ内に侵入でき、担体の吸収と結合ＢＭＰの放出を開始できる。ＢＭＰも自由にスポンジの外に拡散できる。しかしながら、孔径は、骨形成の開始に必要な血管単位の侵入を可能にするほど大きくない。その結果、ＢＭＰ−２／ＡＣＳによる処置に応答する骨形成は、一般的に吸収性コラーゲンスポンジの内部ではなく、スポンジの外側の血管の多い肉芽組織で行われる。新しく形成された骨の吸収性ＡＣＳ周辺での迅速な石灰化は、図１Ａ〜Ｂに示されているような最適とは言えない中空の仮骨(callus)構造をもたらしうる。これに対し、３００ｕｍを超えるマクロ孔性を有する顆粒化リン酸カルシウムマトリックス又は担体は、ＢＭＰ誘導血管の担体内への迅速な侵入を可能にするので、より均一で、機械的にも優れた、誘導された組織修復仮骨コンストラクトをもたらす。
【００２５】
[0034]最適なＢＭＰ担体は、周辺の軟組織からの妨害なしに新生骨の形成空間を確保するために、好ましくは十分に耐圧縮性でもあるべきである。これは、軟組織が修復部位に突き出る可能性がある部分欠損及び後側方脊椎固定術にとって特に重要である。ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）でＢＭＰ−２の送達に使用される吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）は、上方の軟組織が後側方固定術塊の大きさを制限しないようにするほどの耐圧縮性を提供しない。Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社（ミネソタ州ミネアポリス）が開発したＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）などの一部の製品は、後側方脊椎固定術に使用するためにＨＡ／ＴＣＰ顆粒を含浸させたコラーゲンで作られた耐圧縮性コラーゲンマトリックス（ＣＲＭ）を用いてＢＭＰを送達するが、そのような製品は現時点でヒトへの使用が認可されていない。それでも、リン酸カルシウム顆粒の添加は、ヒトの後側方固定術において効果を示すのに十分な耐圧縮性をＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）製品に付与しうる。しかしながら、コラーゲン内のマクロ孔性の欠如及びＣＲＭ担体の最適とは言えないＢＰＭ結合特性のために、より高いＢＭＰ濃度が必要となる。
【００２６】
顆粒のタンパク質担持のために溶液及びキット
[0035]本発明のコンストラクトでは、ＢＭＰは主にコンストラクト内に包埋されたセラミック顆粒に担持されている。一般に、現行法を用いると、ＢＭＰは顆粒の外表面上に蓄積し、本発明の様々な態様で好適に使用される高多孔質構造の顆粒に侵入するというより、タンパク質の“リム (縁、rim)”を作り出す。タンパク質のリムは、コンストラクトの移植後、ＢＭＰのバースト放出に寄与しうるが、顆粒内へのＢＭＰの侵入は、顆粒の内表面に結合されたＢＭＰが、移植された顆粒が例えば移植部位における破骨細胞活性のために分解するまで、放出から保護される限り、延長放出プロフィールに寄与しうる。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、一般に、ＢＭＰは、低ｐＨ、低イオン強度の緩衝液に非常に可溶性であると考えられている。これらの特徴を備えた最先端のＢＭＰ緩衝液は、一般的に緩衝能が低い。他方、本発明のコンストラクトに使用される顆粒は、一般的にアルカリ性である。この差が、現行法を用いると顆粒へのＢＭＰの侵入が比較的制限されることに寄与していると見られる。
【００２７】
[0036]発明者らは、顆粒の内部孔構造へのＢＭＰの侵入を促進する二つの要因を発見した。第一に、発明者らは、顆粒をＢＭＰ含有溶液とインキュベーション（“タンパク質担持”工程と呼ばれる）する前に、顆粒を酸溶液（例えば、５０ｍＭの塩酸（ＨＣｌ）又はより好ましくは５００ｍＭの酢酸）で前処理すると（顆粒の“エッチング”とも呼ばれる）、顆粒の内部孔構造へのＢＭＰの運搬に役立つことを見出した。第二に、発明者らは、一般的に比較的高い緩衝能を有する緩衝液を含め、ある種の組成物は、顆粒の内部孔へのＢＭＰの輸送を促進することも見出した。これらの要因のそれぞれについては以下で順に議論する。
【００２８】
[0037]タンパク質担持前の顆粒のエッチングに関して、発明者らは、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト（ＣＤＨＡ）顆粒１グラム重量あたり１０ｍＬの比率で、酸性溶液、好ましくは５００ｍＭの酢酸中で１５分間〜４時間インキュベーションすることによって顆粒を前処理すると、ＢＭＰの顆粒内への侵入が改良されることを見出した。酸で顆粒を処理することにより、顆粒のｐＨがｐＨ５．５〜６．０に低下する。エッチングは、緩衝液が十分に高い緩衝能を有し、十分に低いｐＨである一定の場合において、例えば顆粒の洗浄中にＢＭＰの溶液中への放出増大ももたらしうる。当業者であれば、さらに、顆粒のエッチングによって得られるのと同様のタンパク質担持及び溶出結果は、一部の場合においては、製造されたままの状態で元来低い（例えば７．０未満）ｐＨを持つ顆粒を利用することによっても得られることは分かるであろう。
【００２９】
[0038]新規ＢＭＰ緩衝液に関し、発明者らは、いくつかの緩衝液の成分及び／又は組成は、顆粒の内部孔へのＢＭＰの改良された侵入をもたらしうることを見出した。本発明による緩衝液の非制限的リスト（ならびに比較のための臨床使用されているｒｈＢＭＰ−２緩衝液）を表１に示す。
【００３０】
【表１−１】
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【００３１】
【表１−２】
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【００３２】
[0039]発明者らは、“５Ｘ”及び“１０Ｘ”の緩衝液処方は、以前使用されていたＢＭＰ−２緩衝液に比べて顆粒へのＢＭＰの侵入を改良することを見出した。より一般的には、いかなる理論にも拘束されることは望まないが、顆粒とインキュベーションした場合に低ｐＨ（例えば５．０未満）を維持するに足る緩衝能を有する弱酸性の緩衝液が、本発明の様々な態様において好適である。具体的には、表１に示されている溶液はグルタミン酸及び／又はグリシンによって緩衝化されているが、本発明のタンパク質担持用溶液には様々なその他の緩衝剤、例えば、乳酸、酢酸、ギ酸、リンゴ酸、マロン酸、アスパラギン酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、フマル酸及び／又はコハク酸も有用である。好適な場合において、緩衝剤は約２．３〜４．５のｐＫａを有するが、緩衝液は全体として好ましくは３．５〜４．０のｐＨを有する。
【００３３】
[0040]緩衝剤のほかに本発明の溶液は一つ又は複数の添加剤を配合することもできる。制限なしに挙げると０．０１％〜０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０、０．５％〜５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．５％〜５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、０．５％〜５％（ｗ／ｖ）のソルビトール又は０．５％〜５％（ｗ／ｖ）マンニトールなどである。
【００３４】
[0041]例を挙げると（制限なしに）、本発明による一つの緩衝液は、５ｍＭのグルタミン酸、０．１５％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水の組成を有し（すなわち本質的にそれらの成分からなり）、ｐＨ４．０である。別の緩衝液は、５０ｍＭのグルタミン酸、１．５％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水で、ｐＨは塩酸で３．０に調整されている。別の適切な緩衝液は、５０ｍＭのグルタミン酸、０．７５％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水でｐＨ３．５である。さらに別の緩衝液は、２５ｍＭのグルタミン酸、０．７５％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水で、ｐＨはＨＣｌで３．５に調整されている。別の緩衝液は、２５ｍＭのグルタミン酸、０．７５％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水でｐＨ３．７である。別の緩衝液は、２５ｍＭのグルタミン酸、２％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水で、ｐＨ４．０である。さらに別の適切な緩衝液は、５０ｍＭのグルタミン酸、１．５％（ｗ／ｖ）のグリシン、１％のスクロース、及び水でｐＨ３．７である。
【００３５】
[0042]図６は、未処理顆粒（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）と、タンパク質担持工程中、様々なｐＨ及び緩衝能を有する緩衝液で処理されたエッチング顆粒（パネルＥ、Ｆ、Ｇ）の蛍光顕微鏡写真を含む。未処理顆粒では、すべての条件でタンパク質のリムが目で確認でき、未処理及びエッチング顆粒の双方で、緩衝液の緩衝能及び酸性度が増大するに従って顆粒の浸潤が改良された。重要なことには、顆粒へのＢＭＰの侵入は、中間緩衝能の緩衝液が使用された場合エッチングにより改良されたが（パネルＢ及びＥ）、良好な浸潤は、高緩衝能の緩衝液中で担持処理された未処理顆粒でも観察された。これらの結果は、顆粒への良好なＢＭＰ侵入を達成するためには、高緩衝能、低ｐＨのタンパク質担持用緩衝液と顆粒エッチングとの組合せが厳密には必要ないことを示している。従って、本発明の様々な態様では、エッチング及び／又は改良されたタンパク質担持用緩衝液が利用されている。
【００３６】
[0043]しかしながら、発明者らは、ＢＭＰ担持顆粒の生理食塩水洗浄液中に溶出したＢＭＰのフラクションから明らかなように、エッチングと緩衝液の様々な組合せは、様々な程度の顆粒とＢＭＰ間の見かけ結合をもたらしうることも見出した。図７は、生理食塩水洗浄（濃色バー）とその後の塩化グアニジンタンパク質抽出（淡色バー）で溶出したＢＭＰフラクションを示す。一般に、約２０％以下のＢＭＰが生理食塩水洗浄中に溶出するが、１０Ｘ  ＢＭＰ緩衝液で担持処理されたエッチング顆粒では、ほぼ４０％のＢＭＰが洗浄中に溶出する一方、５Ｘ  ＢＭＰ緩衝液で担持処理されたエッチング顆粒は、洗浄中にそれらのＢＭＰの１０％未満しか放出しなかった。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、これらの差は、移植されたコンストラクトによるＢＭＰ放出の差と相関しうると考えられるので、本発明は、ＢＭＰ担持用緩衝液及び／又は顆粒のエッチングを変えることによって調整可能なＢＭＰ放出動態を有するコンストラクトを包含する。
【００３７】
[0044]使用に際し、本発明の組成物及び方法を使用して製造されたタンパク質担持顆粒は、患者の治療に使用するための複数部品のコンストラクトの１部品を形成する。前述のように、これらのコンストラクトは、一般的に骨誘導性タンパク質を含み、該タンパク質は、様々なサイズのミクロ孔の複雑かつ相互接続されたネットワークを有する顆粒に好ましくは結合され、該顆粒から溶出する。そして該顆粒は、細胞及び血管の浸潤を促進するマクロ孔構造を有するポリマーマトリックスに包埋され、挿入され、又はさもなければ接触している。そして該マトリックスは、数週間ほどの滞留時間（上で詳述した通り、好都合なことに骨誘導性タンパク質の延長送達を可能にする）と、移植された場合にコンストラクトが無傷状態を保持し、新生骨成長のための構造的支持を提供するに足る剛性及び耐圧縮性を特徴とする。これらのコンストラクトは、典型的には、好ましくはコラーゲンを含む、しかし任意にその他の天然又は合成ポリマーを含んでいてもよい多孔質のポリマーマトリックスを含む。
【００３８】
次世代担体
[0045]さらに別の側面において、本発明は、上記の設計基準を満たす３部品コンストラクトに関する。表１に、包括的というより例示的な、本発明の様々な態様によるコンストラクトを示す。上記設計基準を満たすその他のコンストラクトも本発明の範囲内であることは理解されるであろう。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
[0046]表２のコンストラクトは、マクロ孔性の生体適合性マトリックス内に包埋されたＢＭＰ担持顆粒を含む。コンストラクトの剛性は、一部の場合においては、一つ又は複数のロッド、ファイバー、又はメッシュもしくは編組(braided)フレームワークなどの一つ又は複数の剛化要素を包含させることにより、増大する。そのような剛化要素が包含されていてもいなくても、本発明の様々な態様によるコンストラクトは、一般的に、移植の最中及び後にコンストラクトにかかる力に耐えられるほどの剛性を有する。
【００４１】
[0047]表２に記載されているコンストラクトは、当該技術分野で既知の方法を用いて形成できる。例えば、ＭｃＫａｙによる米国特許第９，１６３，２１２号（すべての目的のために引用によって本明細書に援用する）には、成形による“細胞送達マトリックス”の形成法が記載されている。該方法は、一般的には、水又は水溶液（例えば、生理食塩水、デキストラン又はスクロース溶液など）又はグリセロールもしくはグリセロールエステルなどの極性プロトン性溶媒でありうる液体溶媒中にコラーゲンなどのポリマーマトリックス材料とセラミック粒子を含むスラリーから開始される。液体溶媒は、混合スラリーの約５〜７０重量％を構成しうる。次に、スラリーを型に入れ、任意に、圧縮、加熱、凍結乾燥及び／又は架橋させる。架橋に関しては、
[0048]本発明のコンストラクトは、ＢＭＰ担持用溶液、担持用溶液をコンストラクトに適用するための及び／又はコンストラクトを患者の体内に配置するためのアプリケーター、及び本発明の方法を実施するためにキット又はその構成要素の使用について記載された教材の一つ又は複数を含みうるキットに同梱できる。本明細書においては例示的キットを記載するが、他の有用なキットの中味も、本開示に鑑みて当業者には明白であろう。これらのキットのそれぞれも本発明の範囲内に含まれる。
【００４２】
[0049]本発明は、それを必要とする患者における骨量の喪失防止及び／又は骨量を増大させる治療のためのキットを含む。キットは、上記のコンストラクトと共に、凍結乾燥形もしくはその他の乾燥形態であるか又は溶液中の骨原性タンパク質を含む。タンパク質が凍結乾燥されているか又は溶液中でないその他の形態の場合、キットは上記の線に沿って希釈剤又は担持用緩衝液も含みうる。キットは、流体をタンパク質容器に加えるため及び／又はコンストラクトを湿らすためのシリンジ（これに限定されない）を含むアプリケーター、又は骨誘導性タンパク質を担持させたコンストラクトを患者の体内に配置するための送達装置も含む。さらに、キットは、任意に、患者における骨喪失の治療又は予防、骨折の癒合又は接合(knitting)の促進、及び／又はさもなければ骨量の増大又は骨状態の治療のためのキットの使用に関する関連情報を示す教材も含みうる。
【００４３】
結論
[0050]本願全体を通じて、“マクロ孔”“ミクロ孔”及びマクロ孔性及びミクロ孔性への言及がなされている。一般に、マクロ孔は１００ミクロンを超える断面直径を有するが、ミクロ孔は１００ｎｍ〜１００ミクロンである。１００ｎｍ未満の孔はナノ孔と呼ぶ。
【００４４】
[0051]注記されている場合を除いて、“患者”又は“対象”は互換的に使用され、ヒト患者及びヒト以外の霊長類などの哺乳動物のほか、ウサギ、ラット及びマウスなどの獣医学対象、及びその他の動物のことを言う。好ましくは、患者はヒトである。
【００４５】
[0052]“有効量”又は“治療上有効量”という用語は、本明細書においては互換的に使用されるが、組織又は哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合に、化合物が不在の場合に検出される応答と比べて、検出可能な治療応答を媒介する量である。線維化の阻害及び／又は低減、骨量又は骨密度の増大など（これらに限定されない）の治療応答は、本明細書中に開示されている方法を含む当該技術分野で承認されている多数の方法によって容易に評価できる。
【００４６】
[0053]本明細書において“治療する”とは、患者を冒している疾患又は状態（例えば、骨密度の低下、骨折、線維化など）の症状の頻度又は重症度を予防又は低減することを意味する。該用語には、疾患の症状、合併症、又は生化学的兆候の開始を防止又は遅延させて、症状を緩和し、又は疾患、状態、もしくは障害の更なる進行を停止又は抑制するために、本明細書中に記載の組成物、システム、及び方法を適用、投与又は使用することが含まれる。治療は、予防的であることも（疾患の開始を防止又は遅延させる、又はその臨床症状もしくは不顕性症状の発現を防止する）、又は疾患発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和のこともある。
【００４７】
[0054]本明細書中で使用されている“教材”という用語は、様々な疾患、障害又は状態に作用し、それらを緩和又は治療するためのシステム、装置、組成物、又はそれらの組合せの有用性を伝達するために使用できる出版物、記録、図表、又は任意のその他の表現手段を含む。任意に又はあるいは、教材には、細胞、組織、哺乳動物などにおける疾患又は障害を緩和する一つ又は複数の方法が記載されていてもよい。キットの教材は、例えば、本発明のシステム、装置及び／又は組成物が収容されている容器に添付されても、又はシステム、装置及び／又は組成物が収容されている容器と同送されてもよい。あるいは、受領者が教材と化合物を協調的に使用するものとして、教材を容器とは別送してもよい。
【００４８】
[0055]本明細書中で使用されている“及び／又は”という語句は、そのように結合された構成要素の“いずれか又は両方とも”を意味する、すなわち、ある場合には構成要素が結合的に存在し、他の場合には選言的に存在すると理解されるべきである。“及び／又は”節によって具体的に特定されている構成要素以外に、その他の構成要素も、具体的に特定された構成要素に関連しているいないに関わらず、それに反することが明記されていない限り、任意に存在してもよい。従って、非制限的例として、“Ａ及び／又はＢ”への言及は、“含む”などの制約のない（オープンエンドな）言語と共に使用されている場合、一態様においてはＢを除いてＡへの言及（Ｂ以外の構成要素が含まれてもよい）；別の態様においてはＡを除いてＢへの言及（Ａ以外の構成要素が含まれてもよい）；さらに別の態様においてはＡ及びＢの両方への言及（その他の構成要素が含まれてもよい）；などのことでありうる。
【００４９】
[0056]“本質的に〜からなる”という用語は、本明細書において別途定義されていない限り、機能するために寄与するその他の材料を除外することを意味する。それでも、そのようなその他の材料は、集合的に又は個別に微量存在することもある。
【００５０】
[0057]本明細書中で使用されている“実質的に”又は“およそ”という用語は、プラスマイナス１０％（例えば重量又は容積）、一部の態様においてはプラスマイナス５％を意味する。本明細書全体を通じて、“一実施例(one example)”、“ある実施例(an example)”、“一態様”、又は“ある態様”への言及は、その実施例に関連して記載されている特定の特徴、構造、又は特性が本技術の少なくとも一つの実施例に含まれることを意味する。従って、本明細書全体を通じて様々な場所で“一実施例”、“ある実施例”、“一態様”、又は“ある態様”という表現が見られる場合、必ずしもすべて同じ実施例を参照しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、日常的操作(routine)、工程、又は特性は、任意の適切な様式で技術の一つ又は複数の実施例と組み合わせることができる。本明細書で提供されている見出しは便宜的なものに過ぎず、特許請求されている技術の範囲又は意味を制限したり又は解釈することを意図したものではない。
【００５１】
[0058]上に本発明の一定の態様について記載してきた。しかしながら、本発明はそのような態様に限定されるのではなく、むしろ本明細書中で明示的に記載されている事柄への追加及び修正も本発明の範囲内に含まれるものとすることに特に注意する。さらに、本明細書中に記載されている様々な態様の特徴は、相互排他的でなく、様々な組合せ及び並び替えにおいて、たとえそのような組合せ又は並べ替えが本明細書中に表現されていなくても、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく存在しうることも理解されるはずである。実際、当業者であれば、本明細書中に記載されている事柄の変形、修正、及びその他の実施法が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく思い浮かぶであろう。従って、本発明は、前述の例示的記載によってのみ定義されるものではない。
【００５２】
[0059]特許請求の範囲
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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