(57)【要約】  核酸配列のあらかじめ決められた変異体を各々コードするオリゴ核酸のライブラリーの生成のための方法が本明細書で開示される。変異の程度は完全で、飽和した変異体ライブラリーをもたらすこともあれば、変異の程度は完全なほどではなく、変異体の選択的なライブラリーをもたらすこともある。本明細書に記載される変異体オリゴ核酸ライブラリーは、転写または翻訳によるさらなる処理のために設計されてもよい。本明細書に記載される変異体オリゴ核酸ライブラリーは、変異体ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはタンパク質母集団を生成するように設計されてもよい。さらに、生物学的機能の調節や疾患を処置または減少させるための治療学の設計への応用を伴う、活性を増減させた変異体種を同定するための方法が本明細書で提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質活性を調節する方法であって、
前記方法は、
ａ）少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が、単一の基準配列と比較して、変異体コドン配列をコードする、ステップと、
ｂ）表面を有する構造を提供するステップと、
ｃ）少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸びる、ステップと、
ｄ）変異体核酸のライブラリーを形成するためにＤＮＡポリメラーゼを備える少なくとも３０，０００の同一でないオリゴ核酸と単一の基準配列を混合するステップと、
ｅ）変異体核酸のライブラリーを細胞へ移して、複数の変異体タンパク質を発現させるステップと、および、
ｆ）複数の変異体タンパク質の変異体タンパク質に関連した活性を特定するステップであって、活性が単一の基準配列によってコードされたタンパク質に関連して調節される、ステップ、を含む、方法。
【請求項２】
活性が細胞の複製、成長、接着、死亡、遊走、エネルギー生成、酸素利用、代謝活性、細胞シグナル伝達、老化、遊離基損傷に対する反応、あるいはその任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞が細菌、植物、マウス、あるいは霊長類の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
変異体核酸のライブラリーが変異体遺伝子あるいはそのフラグメントのための配列をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
変異体タンパク質が抗体、酵素、あるいはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
変異体タンパク質が別の分子に対する結合親和性を増強させたか、または低下させた、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
変異体タンパク質が酵素活性を増強させたか、または低下させた、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
変異体核酸のライブラリーによってコードされた単一の変異体核酸を、それを必要としている被験体に投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸が、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞活性を調節する方法であって、
前記方法は、
ａ）少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が、単一の基準配列と比較して、あらかじめ決められた変異体配列をコードする、ステップと、
ｂ）表面を有する構造を提供するステップと、
ｃ）少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸び、および、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸が複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、ステップと、
ｄ）変異体核酸のライブラリーを形成するためにＤＮＡポリメラーゼを備える少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸と単一の基準配列を混合するステップと、
ｅ）細胞の第１のセットに変異体核酸のライブラリーを移すステップと、
ｆ）細胞活性の変化を測定するステップであって、細胞活性が、細胞の第１のセットあるいは細胞の第２のセットについて測定され、細胞の第２のセットが、細胞の第１のセットから単離された少なくとも１つの発現産物で処理される、ステップを含む、方法。
【請求項１２】
細胞活性が、生殖、成長、接着、死亡、遊走、エネルギー生成、酸素利用、代謝活性、細胞シグナル伝達、遊離基損傷に対する反応、あるいはその任意の組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞の第１のセットあるいは細胞の第２のセットが、真核細胞または原核細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の第１のセットあるいは細胞の第２のセットが、細菌、植物、マウスあるいは霊長類の細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
変異体核酸のライブラリーが変異体遺伝子あるいはそのフラグメントのための配列をコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質を形成するために変異体遺伝子の各々の翻訳をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質が抗体、酵素、あるいはペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
変異体核酸のライブラリーが抗体の可変領域または定常領域の少なくとも一部をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
変異体核酸のライブラリーが抗体の少なくとも１つのＣＤＲ部分をコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質が別の分子に対する結合親和性を増強させたか、低下させたか、あるいは、タンパク質が酵素活性を増強させたか、低下させた、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
変異体核酸のライブラリーが転写調節配列をコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
転写調節配列がプロモーター、ＵＴＲ、あるいはターミネーター配列である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
変異体核酸のライブラリーが、転写時にｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、あるいはｓｈＲＮＡをコードする配列をコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
病状の処置あるいは低減のための方法であって、
前記方法は、
ａ）少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が、単一の基準配列と比較して、変異体コドン配列をコードする、ステップと、
ｂ）表面を有する構造を提供するステップと、
ｃ）少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸びる、ステップと、
ｄ）変異体核酸のライブラリーを形成するためにＤＮＡポリメラーゼを備える少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸と単一の基準配列を混合するステップと、
ｅ）変異体核酸のライブラリーを被験体から得られた細胞に移すステップと、
ｆ）変異体核酸のライブラリーによってコードされた変異体核酸に関連する有害な活性の減少を特定するステップと、
ｇ）変異体核酸のライブラリーによってコードされた変異体核酸を、必要としている被験体に投与するステップであって、それによって、病状を処置するか、あるいは低減させる、ステップ、を含む、方法。
【請求項２５】
病状が細胞増殖性、自己免疫性、ウイルス性、あるいは、細菌性の障害に関連付けられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸が、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
核酸合成の方法であって、
前記方法は、
ａ）複数の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、同一でないオリゴ核酸の各々が少なくとも２０の塩基の長さであり、複数の同一でないオリゴ核酸が、少なくとも１つの配列のための少なくとも３つのコドンの各々について最大で約１９の変異体をコードし、および、複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも１つの遺伝子とその変異体を集団的にコードする、ステップと、
ｂ）表面を有する構造を提供するステップと、
ｃ）複数の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸びる、ステップと、
ｄ）複数の同一でないオリゴ核酸から変異体核酸のライブラリーを組み立てるステップ、を含む、方法。
【請求項２８】
複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
複数の同一でないオリゴ核酸の部分集合が、その構造の表面上の単一のクラスター内に位置する単一の遺伝子とその変異体を集団的にコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
構造の表面が少なくとも６０００の単一のクラスターを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
各クラスターは直径が０．５〜２ｍｍのチャネル内にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
単一のクラスターは核酸の伸長のための５０〜５００の遺伝子座を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
複数の同一でないオリゴ核酸が１つを超える遺伝子の変異体を集団的にコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも５，０００の遺伝子の変異体を集団的にコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
変異体核酸のライブラリーが酵素、ペプチド、あるいは抗体の少なくとも一部をコードする、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１５年９月１８日に出願された米国仮出願６２／２２０，８７９号、２０１５年１２月４日に出願された米国仮出願６２／２６３，５４８号、および、２０１６年６月２３日に出願された米国仮出願６２／３５４，０３４号の利益を主張し、当該文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１６年９月１２日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４４８５４＿７１８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、７，８４１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
合成生物学の基礎は設計、構築、および試験のプロセス−−これらの特定用途向けの経路と生命体の迅速かつ手軽な生成と最適化のためにＤＮＡを入手可能であることを要求する反復するプロセスである。設計段階では、ＤＮＡを構成するＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧのヌクレオチドは、各々の配列変異体が試験される特定の仮説を表す、所望の遺伝子座あるいは経路を含む様々な遺伝子配列へ組み立てられる。こうした変異体遺伝子配列は、進化生物学から始まり、遺伝子、ゲノム、トランスクリプトーム、およびプロテオームを構築する配列の全体性に関係する概念である、配列空間の部分集合を表す。
【０００４】
多くの様々な変異体は典型的には、配列空間の適切なサンプリングを可能にし、かつ最適化された設計の可能性を最大化するために、それぞれの設計−構築−試験のサイクルを対象としている。概念上は直接的であるが、従来の合成方法の速度、スループット、および品質に関するプロセスの障害は、このサイクルが進行するペースを低下させ、開発時間を引き延ばす。現在の合成技術の非常に正確なＤＮＡの高いコストと制限のあるスループットにより配列空間を十分に探索することができないことは、律速段階のままである。
【０００５】
構造相から始まる、２つのプロセス：オリゴ核酸合成と遺伝子合成が注目に値する。歴史上、様々な遺伝子変異体の合成は分子クローニングを通じて遂行された。頑丈であるが、この手法はスケーラブルではない。初期の化学的な遺伝子合成の試みは、重複する配列相同性を有する多くのオリゴ核酸を生成することに重点を置いていた。その後、これらはプールされ、重複するオリゴ核酸の完全長の二重鎖の遺伝子への連結を可能にする、複数回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にさらされた。時間を消費し、かつたくさんの人手を要する構造、大量のホスホラミダイトという要件、高価な原料、および下流工程に必要とされるよりも著しく少ない最終生成物のナノモル量の生成を含む、多くの因子がこの方法を妨害し、１つの遺伝子の合成をセットアップするために多くの別々のオリゴ核酸は１つの９６ウェルプレートを必要とした。
【０００６】
マイクロアレイ上でのオリゴ核酸の合成は、遺伝子合成のスループットの有意な増大をもたらした。マイクロアレイ表面上で多くのオリゴ核酸を合成し、その後、切断して、まとめてプールすることができる。特定遺伝子に運命づけられたそれぞれのオリゴ核酸は、オリゴヌクレオチドのその特定の亜集団を取り除いて（ｄｅｐｏｏｌｅｄ）、所望の遺伝子へ組み立てることを可能にしたユニークなバーコード配列を含んでいる。プロセスのこの段階では、各サブプールを９６ウェルプレート中の１つのウェルへ移し、スループットを９６の遺伝子に増加させる。これは、古典的方法よりもスループットが２桁高いが、コスト効率に欠け、かつ、所要時間がかかることから、一度に数千もの配列を要求する設計、構築、試験サイクルを適切に支援するものではない。
【発明の概要】
【０００７】
タンパク質活性を調節する方法が本明細書に提供され、該方法は、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が、単一の基準配列と比較して、変異体コドン配列をコードする、ステップと、表面を有する構造を提供するステップと、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸びる、ステップと、変異体核酸のライブラリーを形成するためにＤＮＡポリメラーゼを備える少なくとも３０，０００の同一でないオリゴ核酸と単一の基準配列を混合するステップと、変異体核酸のライブラリーを細胞へ移して、複数の変異体タンパク質を発現させるステップと、および、複数の変異体タンパク質の変異体タンパク質に関連した活性を特定するステップであって、活性が単一の基準配列によってコードされたタンパク質に関連して調節される、ステップを含む。さらに、本明細書では、活性が細胞の複製、成長、接着、死亡、遊走、エネルギー生成、酸素利用、代謝活性、細胞シグナル伝達、老化、遊離基損傷に対する反応、あるいはその任意の組み合わせを含む、方法が提供される。さらに、細胞が真核細胞または原核細胞である方法が本明細書で提供される。さらに、細胞が細菌、植物、マウス、あるいは霊長類の細胞である方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが変異体遺伝子あるいはそのフラグメントのための配列をコードする方法が本明細書で提供される。さらに、変異体タンパク質が抗体、酵素、あるいはペプチドである、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体タンパク質が別の分子に対する結合親和性を増強させ、または低下させた、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体タンパク質が酵素活性を増強させた、または低下させた、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーによってコードされた単一の変異体核酸がそれを必要としている被験体に投与される、方法が本明細書で提供される。さらに、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸が、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、方法が本明細書で提供される。
【０００８】
細胞活性を調節する方法が本明細書で提供され、該方法は、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が、単一の基準配列と比較して、あらかじめ決められた変異体配列をコードする、ステップと、表面を有する構造を提供するステップと、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸び、および、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸が複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、ステップと、変異体核酸のライブラリーを形成するためにＤＮＡポリメラーゼを備える少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸と単一の基準配列を混合するステップと、細胞の第１のセットに変異体核酸のライブラリーを移すステップと、細胞活性の変化を測定するステップであって、細胞活性が、細胞の第１のセットあるいは細胞の第２のセットについて測定され、細胞の第２のセットが、細胞の第１のセットから単離された少なくとも１つの発現産物で処理される、ステップを含む。さらに、細胞活性が、生殖、成長、接着、死亡、遊走、エネルギー生成、酸素利用、代謝活性、細胞シグナル伝達、遊離基損傷に対する反応、あるいはその任意の組み合わせを含む、方法が本明細書で提供される。さらに、細胞の第１のセットあるいは細胞の第２のセットが、真核細胞または原核細胞である、方法が本明細書で提供される。さらに、細胞の第１のセットあるいは細胞の第２のセットが、細菌、植物、マウスあるいは霊長類の細胞である、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが変異体遺伝子あるいはそのフラグメントのための配列をコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、タンパク質を形成するために変異体遺伝子の各々の翻訳を含む方法が本明細書で提供される。さらに、タンパク質が抗体、酵素、あるいはペプチドである方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが抗体の可変領域または定常領域の少なくとも一部をコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが抗体の少なくとも１つのＣＤＲ部分をコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、タンパク質が別の分子に対する結合親和性を増強させたか、低下させ、あるいは、タンパク質が酵素活性を増強させたか、低下させた、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが転写調節配列をコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、転写調節配列がプロモーター、ＵＴＲ、あるいはターミネーター配列である、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが、転写時にｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、あるいはｓｈＲＮＡをコードする配列をコードする、方法が本明細書で提供される。
【０００９】
病状の処置あるいは低減のための方法が本明細書で提供され、該方法は、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が、単一の基準配列と比較して、変異体コドン配列をコードする、ステップと、表面を有する構造を提供するステップと、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸びる、ステップと、変異体核酸のライブラリーを形成するためにＤＮＡポリメラーゼを備える少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸と単一の基準配列を混合するステップと、変異体核酸のライブラリーを被験体から得られた細胞に移すステップと、変異体核酸のライブラリーによってコードされた変異体核酸に関連する有害な活性の減少を特定するステップと、変異体核酸のライブラリーによってコードされた変異体核酸を必要としている被験体に投与するステップであって、それによって、病状を処置するか、あるいは低減させる、ステップを含む。さらに、病状が細胞増殖性、自己免疫性、ウイルス性、あるいは、細菌性の障害に関連付けられる、方法が本明細書で提供される。さらに、少なくとも約３０，０００の同一でないオリゴ核酸が、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、方法が本明細書で提供される。
【００１０】
核酸合成の方法が本明細書で提供され、該方法は、複数の同一でないオリゴ核酸をコードするあらかじめ決められた配列を提供するステップであって、同一でないオリゴ核酸の各々が少なくとも２０の塩基の長さであり、複数の同一でないオリゴ核酸が、少なくとも１つの配列のための少なくとも３つのコドンの各々について最大で約１９の変異体をコードし、および、複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも１つの遺伝子とその変異体を集団的にコードする、ステップと、表面を有する構造を提供するステップと、複数の同一でないオリゴ核酸を合成するステップであって、同一でないオリゴ核酸の各々が表面から伸びる、ステップと、複数の同一でないオリゴ核酸から変異体核酸のライブラリーを組み立てるステップを含む。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸を含む、方法が本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸の部分集合が、その構造の表面上の単一のクラスター内に位置する単一の遺伝子とその変異体を集団的にコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、構造の表面が少なくとも６０００の単一のクラスターを含む、方法が本明細書で提供される。さらに、各クラスターが直径０．５〜２ｍｍのチャネル内にある、方法が本明細書で提供される。さらに、単一のクラスターが核酸の伸長のための５０〜５００の遺伝子座を含む、方法が本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が１つを超える遺伝子の変異体を集団的にコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも５，０００の遺伝子の変異体を集団的にコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、変異体核酸のライブラリーが酵素、ペプチド、あるいは抗体の少なくとも一部をコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、各変異体核酸が遺伝子の少なくとも８５％について配列をコードする、方法が本明細書で提供される。さらに、複数の発現構築物の発現によって生成されたタンパク質ライブラリーが、本明細書に記載された同一でないオリゴ核酸を集団的に含む、方法が本明細書で提供される。
【００１１】
複数の同一でないオリゴ核酸を含むオリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供され、同一でないオリゴ核酸の各々は少なくとも１２の塩基の長さであり、複数の同一でないオリゴ核酸は、少なくとも３つのコドンの各々について約１９の変異体をコードし、および、複数の同一でないオリゴ核酸は、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１５００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、２０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸の各々が少なくとも３０の塩基の長さである、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸の各々が少なくとも５０の塩基の長さである、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸の各々が少なくとも１２−１００の塩基の長さである、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が遺伝子の少なくとも８５％の配列を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が遺伝子の複数のエキソンの配列を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、遺伝子が抗体、酵素、あるいはペプチドの少なくとも一部をコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が、抗体の可変領域または定常領域をコードするオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードするオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が発現カセットの１つ以上のセグメントのための配列を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、発現カセットが少なくとも１つのプロモーター領域を含み、および、複数の同一でないオリゴ核酸がプロモーター領域の少なくとも一部をコードするオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、発現カセットが２つのプロモーター領域を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも３つのコドンが連続的である、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも３つのコドンが連続的ではない、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも少なくとも３つのコドンの少なくとも２つが少なくとも１つのコドン位置によって互いから離れている、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、ライブラリーが、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のコドン中のコドン変異体をコードする同一でないオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が、少なくとも４つのコドン中のあらゆる可能性のあるコドン変異体をコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、同一でないオリゴ核酸のいずれもが３つを超えるヒスチジン残留物のコドンをコードしない、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、同一でないオリゴ核酸のいずれもが４つを超えるヒスチジン残留物のコドンをコードしない、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。
【００１２】
少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸を含むオリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供され、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸の各々は、少なくとも３０の塩基の長さであり、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸は、少なくとも１つの配列の少なくとも３つのコドンの各々について少なくとも３つの変異体をコードし、および、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸は、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１５００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸の各々が少なくとも５０の塩基の長さを含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が遺伝子の少なくとも８５％の配列を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が同じ遺伝子の複数のエキソンの配列を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、遺伝子が抗体、酵素、あるいはアダプタータンパク質の少なくとも一部をコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が、抗体の可変領域または定常領域をコードするオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が、抗体の少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲをコードするオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が発現カセットの１つ以上のセグメントのための配列を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、発現カセットが少なくとも１つのプロモーター領域を含み、および、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸がプロモーター領域の少なくとも一部をコードするオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、発現カセットが２つのプロモーター領域を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも３つのコドンが連続的である、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも３つのコドンが連続的ではない、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも少なくとも３つのコドンの少なくとも２つが少なくとも１つのコドン位置によって互いから離れている、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、少なくとも７５，０００の同一でないオリゴ核酸が、少なくとも３つのコドン中のあらゆる可能性のあるコドン変異体をコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、同一でないオリゴ核酸のいずれもが３つを超えるヒスチジン残留物のコドンをコードしない、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、同一でないオリゴ核酸のいずれもが４つを超えるヒスチジン残留物のコドンをコードしない、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、ライブラリーが少なくとも１００，０００の同一でないオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、ライブラリーが少なくとも７００，０００の同一でないオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、ライブラリーが少なくとも１，０００，０００の同一でないオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。
【００１３】
複数の同一でないオリゴ核酸を含むオリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供され、各々の同一でないオリゴ核酸は約２０〜１３０の塩基の長さであり、複数の同一でないオリゴ核酸は、少なくとも１つの配列のための少なくとも３つのコドンの各々について約１９の変異体を集団的にコードし、および、複数の同一でないオリゴ核酸は、複数の同一でないオリゴ核酸向けのあらかじめ決められた配列と比較して、１０００の塩基中に１つ未満の総エラー率を有する。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも５０−５００の同一でないオリゴ核酸を含む、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、複数の同一でないオリゴ核酸が少なくとも５０の変異体遺伝子を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、５０−５００の同一でないオリゴ核酸が、構造の表面へ結合し、別々のクラスター内にある、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。さらに、５０−５００の同一でないオリゴ核酸が少なくとも５０の変異体遺伝子を集団的にコードする、オリゴ核酸ライブラリーが本明細書で提供される。
【００１４】
＜参照による組み込み＞
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示される程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＰＣＲ突然変異誘発工程を組み込む変異体生体分子の合成のためのプロセスワークフローを描く。
【図１Ｂ】ＰＣＲ突然変異誘発工程を組み込む変異体生体分子の合成のためのプロセスワークフローを描く。
【図１Ｃ】ＰＣＲ突然変異誘発工程を組み込む変異体生体分子の合成のためのプロセスワークフローを描く。
【図１Ｄ】ＰＣＲ突然変異誘発工程を組み込む変異体生体分子の合成のためのプロセスワークフローを描く。
【図２】Ａ−Ｄは、一つのあらかじめ決められたコドン部位の基準オリゴ核酸配列とは異なる核酸配列を含むオリゴ核酸の生成のプロセスワークフローを描く。
【図３Ａ】鋳型オリゴ核酸からの１セットのオリゴ核酸変異体の生成の代替的なワークフローを描いており、各変異体は１つのコドン位置で異なる核酸配列を含んでいる。各々の同一でないオリゴ核酸はその単一のコドン位置で異なるアミノ酸をコードし、異なるコドンはＸ、Ｙ、およびＺによって表わされる。
【図３Ｂ】鋳型オリゴ核酸からの１セットのオリゴ核酸変異体の生成の代替的なワークフローを描いており、各変異体は１つのコドン位置で異なる核酸配列を含んでいる。各々の同一でないオリゴ核酸はその単一のコドン位置で異なるアミノ酸をコードし、異なるコドンはＸ、Ｙ、およびＺによって表わされる。
【図３Ｃ】鋳型オリゴ核酸からの１セットのオリゴ核酸変異体の生成の代替的なワークフローを描いており、各変異体は１つのコドン位置で異なる核酸配列を含んでいる。各々の同一でないオリゴ核酸はその単一のコドン位置で異なるアミノ酸をコードし、異なるコドンはＸ、Ｙ、およびＺによって表わされる。
【図３Ｄ】鋳型オリゴ核酸からの１セットのオリゴ核酸変異体の生成の代替的なワークフローを描いており、各変異体は１つのコドン位置で異なる核酸配列を含んでいる。各々の同一でないオリゴ核酸はその単一のコドン位置で異なるアミノ酸をコードし、異なるコドンはＸ、Ｙ、およびＺによって表わされる。
【図３Ｅ】鋳型オリゴ核酸からの１セットのオリゴ核酸変異体の生成の代替的なワークフローを描いており、各変異体は１つのコドン位置で異なる核酸配列を含んでいる。各々の同一でないオリゴ核酸はその単一のコドン位置で異なるアミノ酸をコードし、異なるコドンはＸ、Ｙ、およびＺによって表わされる。
【図３Ｆ】鋳型オリゴ核酸からの１セットのオリゴ核酸変異体の生成の代替的なワークフローを描いており、各変異体は１つのコドン位置で異なる核酸配列を含んでいる。各々の同一でないオリゴ核酸はその単一のコドン位置で異なるアミノ酸をコードし、異なるコドンはＸ、Ｙ、およびＺによって表わされる。
【図４】Ａ−Ｅは、多くのアミノ酸を有する基準アミノ酸配列（Ａ）を描いており、各々の残基は１つの円によって示され、および変異体アミノ酸配列（Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）は本明細書に記載される方法を用いて生成される。基準アミノ酸配列と変異体配列は、本明細書に記載されたプロセスによって生成された核酸とその変異体によってコードされる。
【図５】Ａ−Ｂは、基準アミノ酸配列（Ａ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）と、変異体アミノ酸配列（Ｂ、出現する順でそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ  ２５−３１）のライブラリーを描いており、各々の変異体は（「Ｘ」によって示される）単一の残基変異体を含んでいる。基準アミノ酸配列と変異体配列は、本明細書に記載されたプロセスによって生成された核酸とその変異体によってコードされる。
【図６】Ａ−Ｂは、基準アミノ酸配列（Ａ）と、変異体アミノ酸配列（Ｂ）のライブラリーを描いており、各々の変異体は単一の位置変異体の２つの部位を含んでいる。変異体はそれぞれ異なる模様のある円によって示される。基準アミノ酸配列と変異体配列は、本明細書に記載されたプロセスによって生成された核酸とその変異体によってコードされる。
【図７】Ａ−Ｂは、基準アミノ酸配列（Ａ）と変異体アミノ酸配列（Ｂ）のライブラリーを描いており、各々の変異体は、一続きのアミノ酸を含んでおり（円のまわりのボックスによって示される）、それぞれの一続きのアミノ酸は、基準アミノ酸配列とは配列が異なる（ヒスチジンをコードする）位置変異体の３つの部位を有する。基準アミノ酸配列と変異体配列は、本明細書に記載されたプロセスによって生成された核酸とその変異体によってコードされる。
【図８】Ａ−Ｂは、基準アミノ酸配列（Ａ）と変異体アミノ酸配列（Ｂ）のライブラリーを描いており、各々の変異体は、２つの一続きのアミノ酸を含んでおり（円のまわりのボックスによって示される）、それぞれの一続きのアミノ酸は、基準アミノ酸配列とは配列が異なる（模様のある円によって例示される）単一の位置変異体の１つの部位を有する。基準アミノ酸配列と変異体配列は、本明細書に記載されたプロセスによって生成された核酸とその変異体によってコードされる。
【図９】Ａ−Ｂは、基準アミノ酸配列（Ａ）とアミノ酸配列変異体（Ｂ）のライブラリーを描いており、各々の変異体は（模様のある円によって示される）一続きのアミノ酸を含んでおり、それぞれの一続きのアミノ酸は、基準アミノ酸配列とは配列が異なる複数の位置変異体の１つの部位を有する。この図では、５つの位置が異なり、第１の位置は５０／５０  Ｋ／Ｒ比を有し、第２の位置は５０／２５／２５のＶ／Ｌ／Ｓ比を有し、第３の位置は５０／２５／２５のＹ／Ｒ／Ｄ比を有し、第４の位置はすべてのアミノ酸で等しい比を有し、第５の位置はＧ／Ｐで７５／２５の比を有する。基準アミノ酸配列と変異体配列は、本明細書に記載されたプロセスによって生成された核酸とその変異体によってコードされる。
【図１０】ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する抗体をコードする鋳型オリゴ核酸を描いており、各々のＣＤＲ領域は変異のための複数の部位を含み、各々の単一の部位（星で示される）は、鋳型オリゴ核酸配列とは異なる任意のコドン配列と交換可能な１つの位置、および／または、一続きの複数の連続する位置を含む。
【図１１】発現カセットの変異体ライブラリーを生成するために２つの発現カセット（例えば、プロモーター、オープンリーディングフレーム、およびターミネーター）の交換部分によって生成された変異体の典型的な数を描く。
【図１２】本明細書で開示されるような遺伝子合成のための典型的なプロセスワークフローを実証する工程の図を提示する。
【図１３】コンピュータシステムの例を例示する。
【図１４】コンピュータシステムの構造を例示するブロック図である。
【図１５】複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを実証する図である。
【図１６】共有仮想アドレスメモリ空間を用いる、マルチプロセッサーコンピュータシステムのブロック図である。
【図１７】ゲル電気泳動によって分離したＰＣＲ反応生成物のＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒプロットを描く。
【図１８】９６セットのＰＣＲ生成物を示す電気泳動図を描いており、各セットのＰＣＲ生成物は、１つのコドン位置の野生型の鋳型核酸とは配列が異なり、各セットの単一のコドン位置は野生型の鋳型核酸配列で異なる部位に位置している。ＰＣＲ生成物の各セットは１９の変異体オリゴ核酸を含み、各変異体は単一のコドン位置の異なるアミノ酸をコードする。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、別段の定めのない限り、当該技術の範囲内である従来の分子生物学的技術を採用する。別段の定めのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００１７】
定義
【００１８】
本開示の全体にわたって、様々な実施形態は範囲形式で提示される。範囲形式での記載は単に利便性と簡潔さのためのものに過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈されてはならないということを理解されたい。これに応じて、範囲の記載は、文脈で別段の定めのない限り、すべての可能性のある下位範囲と、下限の単位の小数第２位までのその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられなければならない。例えば、１乃至６などの範囲の記載は、１乃至３、１乃至４、１乃至５、２乃至４、２乃至６、３乃至６などの下位範囲と、例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９のその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。これらの介在する範囲の上限と下限は、より小さな範囲に独立して含まれることもあり、記載された範囲の任意の具体的に除外された限界に従って、本開示内にも包含される。記載された範囲が１つまたは両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲は、文脈に特段の定めのない限り、本開示にも含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためにあり、任意の実施形態を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用されるとき、明示される特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、そのおよび／またはその群の存在や添加を妨げない。本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。
【００２０】
別段の定めのない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるように、数あるいは数の範囲に関連して用語「約」とは、明示された数とその数＋／−１０％、あるいはある範囲の列挙された値について列挙された下限の１０％以下と列挙された１０％以上を意味する。
【００２１】
変異体ライブラリー合成
【００２２】
本明細書に記載された方法は、少なくとも１つのあらかじめ決められた基準核酸配列のあらかじめ決められた変異体を各々コードするオリゴ核酸のライブラリーの合成をもたらす。場合によっては、あらかじめ決められた基準配列はタンパク質をコードする核酸配列であり、変異体ライブラリーは、合成された核酸によってコードされたその後のタンパク質中の単一の残基の複数の様々な変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも１つのコドンの変異をコードする配列を含む。核酸配列の合成された特異的な変化は、ヌクレオチド変化を、重複または平滑端のオリゴ核酸プライマーに組み入れることにより導入可能である。代替的に、オリゴ核酸の母集団は、長い拡散（例えば、遺伝子）とその変異体を集団的にコードすることもある。この配置では、長い核酸（例えば遺伝子）とその変異体を形成するために、オリゴ核酸の母集団をハイブリダイズさせ、標準的な分子生物学技術に晒すことができる。長い核酸（例えば遺伝子）とその変異体が細胞中で発現される場合、異なるタンパク質ライブラリーが生成される。同様に、ＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）あるいはＤＮＡ配列（例えば、エンハンサー、プロモーター、ＵＴＲ、およびターミネーター領域）をコードする変異体ライブラリーの合成のための方法が本明細書で提供される。さらに、本明細書に記載される方法を用いて合成されたライブラリーから選択された変異体の下流の処理が本明細書で提供される。下流の処理は、例えば、生化学的な親和性、酵素活性、細胞活性の変化、および病状の治療または予防のための生物学的に関連する機能を増強させた、変異体核酸あるいはタンパク質配列の同定を含む。
【００２３】
合成とその後のＰＣＲ突然変異誘発
【００２４】
オリゴ核酸の変異体ライブラリーの合成のための第１のプロセスは、ＰＣＲ突然変異誘発方法のためのものである。このワークフローでは、複数のオリゴ核酸が合成され、各オリゴ核酸は、基準核酸配列のあらかじめ決められた変異体である、あらかじめ決められた配列をコードする。図１Ａ−図１Ｄで描かれた典型的なワークフローである図を参照すると、オリゴ核酸は表面上で生成される。図１Ａは、１２１の遺伝子座を備えた表面の単一のクラスターの拡大図を描く。図１Ｂで描かれるそれぞれのオリゴ核酸は、変異体の長い核酸のライブラリー（図１Ｃ）を生成するために基準核酸配列からの増幅に使用することができるプライマーである。変異体の長い核酸のライブラリーは、変異体ＲＮＡあるいはタンパク質ライブラリー（図１Ｄ）を生成するために、その後、随意に転写および／または翻訳に晒される。この典型的な図では、実質的に平面の表面を有する装置は、オリゴ核酸のデノボ合成に使用される（図１Ａ）。いくつかの例では、装置は、遺伝子座のクラスターを含み、それぞれの遺伝子座はオリゴ核酸伸長のための部位である。いくつかの例では、単一のクラスターは、所望の変異体配列ライブラリーを生成するために必要とされるオリゴ核酸変異体をすべて含む。代替的な配置では、プレートは、クラスターへ分離されない遺伝子座の領域（ａ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｌｏｃｉ）を含む。
【００２５】
本明細書に記載されたデノボ合成されたオリゴ核酸ライブラリーはは複数のオリゴ核酸を含むことがあり、各々は第１の位置、位置「Ｘ」で少なくとも１つの変異体配列を有し、各変異体オリゴ核酸は第１の伸長生成物を生成するためにＰＣＲの第一ラウンドでプライマーとして使用される。この例において、第１のオリゴ核酸（２２０）中の位置「ｘ」は、変異体コドン配列、つまり、基準配列からの１９の可能性のある変異体の１つをコードする。図２のＡを参照する。第１のオリゴ核酸の配列に重複する配列を含む第２のオリゴ核酸（２２５）は、第２の伸長生成物を生成するためにＰＣＲの別のラウンドでプライマーとして使用される。さらに、外部のプライマー（２１５、２３０）は、長い核酸配列からのフラグメントの増幅に使用されてもよい。結果として生じた増幅産物は長い核酸配列（２３５、２４０）のフラグメントである。図２のＢを参照する。その後、長い核酸配列（２３５、２４０）のフラグメントはハイブリダイズされ、長い核酸（２４５）の変異体を形成するために伸長反応に晒される。図２のＣを参照する。第１と第２の伸長生成物の重複する末端は、ＰＣＲの第２のラウンドのプライマーとして役立つこともあり、それによって、変異体を含む第３の伸長生成物（図２Ｄ）を生成する。収率を増加させるために、長い核酸の変異体は、ＤＮＡポリメラーゼ、増幅試薬、外部のプライマー（２１５、２３０）を含む反応で増幅される。いくつかの例では、第２のオリゴ核酸は、変異体部位に隣接するがこれを含まない配列を含む。代替的な配置では、第２のオリゴ核酸と重複する領域を有する第１のオリゴ核酸が生成される。このシナリオでは、第１のオリゴ核酸は最大で１９の変異体向けの単一のコドンで変異により合成される。第２のオリゴ核酸は変異体配列を含まない。随意に、第１の母集団は第１のオリゴ核酸変異体と、異なるコドン部位の変異体をコードする追加のオリゴ核酸とを含む。代替的に、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸は平滑末端ライゲーションのために設計されてもよい。
【００２６】
代替的な突然変異誘発では、ＰＣＲ方法が図３のＡ−Ｆで描かれる。こうしたプロセスでは、第１、第２の鎖（３０５、３１０）を含む鋳型核酸分子（３００）は、第１のプライマー（３１５）と第２のプライマー（３２０）（図３Ａ）を抑えるＰＣＲ反応で増幅される。増幅反応はヌクレオチド試薬としてウラシルを含む。ウラシルで標識された伸長生成物（３２５）（図３のＢ）が生成され、随意に精製され、第１の伸長生成物（３４０と３４５）（図３のＣ−Ｄ）を生成するために第１のオリゴ核酸３３５と複数の第２のオリゴ核酸（３３０）を使用する後のＰＣＲ反応のための鋳型として役立つ。このプロセスでは、複数の第２のオリゴ核酸（３３０）は、変異体配列（図３のＣではＸ、Ｙ、およびＺとして描かれる）をコードするオリゴ核酸を含む。ウラシルで標識された鋳型核酸は、ウラシルに特異的な切除試薬（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されているＵＳＥＲ  ｄｉｇｅｓｔ）により消化される。変異体３３５と、変異体Ｘ、Ｙ、およびＺを備える様々なコドン（３３０）が加えられ、図３Ｄを生成するために限定的なＰＣＲ工程が行われる。ウラシルを含有する鋳型が消化された後、伸長生成物の重複する末端はＰＣＲ反応を刺激する役目を果たし、第１の伸長生成物（３４０と３４５）は第１の外部のプライマー（３５０）と第２の外部のプライマー（３５５）と組み合わされてプライマーとして作用し、それによって、変異体部位図３Ｆで複数の変異体Ｘ、Ｙ、およびＺを含む核酸分子（３６０）のライブラリーを生成する。
【００２７】
長い核酸の変異体と非変異体の部分を備えた母集団のデノボ合成
【００２８】
変異体ライブラリーの合成のための第２のプロセスにおいて、表面は長い核酸の複数のフラグメントのデノボ合成に使用され、フラグメントの少なくとも１つは複数のバージョンで合成され、それぞれのバージョンは異なる変異体配列である。この配置では、変異体長距離（ｌｏｎｇ  ｒａｎｇｅ）核酸のライブラリーを組み立てるために必要とされるフラグメントのすべてが、デノボ合成される。合成されたフラグメントは重複する配列を有することがあり、合成後、フラグメントライブラリーはハイブリダイゼーションに晒される。ハイブリダイゼーションに続いて、伸長反応はどんな相補的なギャップも埋めるために行なわれることがある。
【００２９】
代替的に、合成されたフラグメントはプライマーで増幅され、その後、平滑末端ライゲーションあるいは重複ハイブリダイゼーションのいずれかに晒されることもある。いくつかの例では、装置は、遺伝子座のクラスターを含み、それぞれの遺伝子座はオリゴ核酸伸長のための部位である。いくつかの例では、単一のクラスターは、所望の変異体核酸配列ライブラリーを生成するために、あらかじめ決められた長い核酸のすべてのオリゴ核酸変異体と他のフラグメント配列を含む。クラスターは約５０〜５００の遺伝子座を含むことがある。いくつかの配置では、クラスターは、５００を超える遺伝子座を含む。
【００３０】
第１のオリゴ核酸母集団中のそれぞれのオリゴ核酸は、クラスターの別々の個々にアドレス（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）可能な遺伝子座の上で生成されることがある。１つのオリゴ核酸変異体は複数の個々にアドレス可能な遺伝子座によって表されることがある。第１のオリゴ核酸母集団中のそれぞれの変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、あるいはそれ以上の回数で表されることもある。いくつかの例では、第１のオリゴ核酸母集団中のそれぞれの変異体は３つ以下の遺伝子座で表される。いくつかの例では、第１のオリゴ核酸母集団中のそれぞれの変異体は２つの遺伝子座で表される。いくつかの例では、第１のオリゴ核酸母集団中のそれぞれの変異体は単一の遺伝子座だけで表される。
【００３１】
冗長性を減少させた核酸ライブラリーを生成する方法が本明細書で提供される。いくつかの例では、変異体オリゴヌクレオチドは、所望の変異体オリゴヌクレオチドを得るために、１回を超える回数、変異体オリゴヌクレオチドを合成する必要なく、生成されることがある。いくつかの例では、本開示は、所望の変異体オリゴヌクレオチドを生成するために、１、２、３、４、５回を超える回数、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の回数、変異体オリゴヌクレオチドを合成する必要なく、変異体オリゴヌクレオチドを生成する方法を提供する。
【００３２】
変異体オリゴヌクレオチドは、所望の変異体オリゴヌクレオチドを得るために、１を超える別々の部位で変異体オリゴヌクレオチドを合成する必要なく、生成されることがある。本開示は、所望の変異体オリゴヌクレオチドを生成するために、１つの部位、２つの部位、３つの部位、４つの部位、５つの部位、６つの部位、７つの部位、８つの部位、９つの部位、あるいは１０の部位を超える部位で変異体オリゴヌクレオチドを合成する必要なく、変異体オリゴヌクレオチドを生成する方法を提供する。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドは、せいぜい６、５、４、３、２、あるいは１つの別々の部位で合成される。同じオリゴヌクレオチドは、表面上の１、２、あるいは３つの別々の遺伝子座で合成されることがある。
【００３３】
いくつかの例では、単一の変異体オリゴヌクレオチドを表す遺伝子座の量は、下流の処理（例えば増幅反応または細胞のアッセイ）に必要な核酸材料の量に応じる。いくつかの例では、単一の変異体オリゴヌクレオチドを表す遺伝子座の量は、単一のクラスター中の利用可能な遺伝子座に応じる。
【００３４】
基準核酸中の複数の部位で異なる変異体オリゴ核酸を含むオリゴ核酸のライブラリーの生成のための方法が本明細書で提供される。そのような場合、それぞれの変異体ライブラリーは遺伝子座のクラスター内の個々にアドレス可能な遺伝子座で生成される。オリゴ核酸ライブラリーによって表される変異体部位の数は、クラスター中の個々にアドレス可能な遺伝子座の数と各部位における所望の変異体の数とによって決定されることが理解されよう。いくつかの例では、それぞれのクラスターは約５０〜５００の遺伝子座を含む。いくつかの例では、それぞれのクラスターは１００〜１５０の遺伝子座を含む。
【００３５】
典型的な配置では、１９の変異体は、１９の可能性のある変異体アミノ酸の各々をコードする変異体部位の対応するコドンで表される。別の典型的な場合では、６１の変異体は、１９の可能性のある変異体アミノ酸の各々をコードする変異体部位の対応するトリプレットで表される。非限定的な例において、クラスターは１２１の個々にアドレス可能な遺伝子座を含む。この例において、オリゴ核酸母集団は、６つの複製物（単一部位変異体の各々（６の複製物ｘ１の変異体部位ｘ１９の変異体＝１１４遺伝子座）、３つの複製物（二重部位変異体の各々（３の複製物ｘ２変異体部位ｘ１９の変異体＝１１４遺伝子座）、２つの複製物（三重部位変異体（２の複製物ｘ３の変異体部位ｘ１９の変異体＝１１４遺伝子座）を含む。いくつかの例では、オリゴ核酸母集団は、４、５、６、あるいは６を超える変異体部位で変異体を含む。
【００３６】
コドン変異
【００３７】
本明細書に記載された変異体オリゴ核酸ライブラリーは複数のオリゴ核酸を含み、それぞれのオリゴ核酸は、基準核酸配列と比較して、変異体コドン配列をコードする。いくつかの例では、第１のオリゴ核酸母集団のそれぞれのオリゴ核酸は単一の変異体部位で変異体を含む。いくつかの例では、第１のオリゴ核酸母集団は、同じ変異体部位で１つを超える変異体を含むように、単一の変異体部位で複数の変異体を含む。第１のオリゴ核酸母集団は、同じ変異体部位で複数のコドン変異体を集団的にコードするオリゴ核酸を含むことがある。第１のオリゴ核酸母集団は、同じ位置で最大で１９以上のコドンを集団的にコードするオリゴ核酸を含むことがある。第１のオリゴ核酸母集団は、同じ位置で最大で６０変異体トリプレットを集団的にコードするオリゴ核酸を含むことがあり、あるいは、第１のオリゴ核酸母集団は、同じ位置で最大で６１のコドンの異なるトリプレットを集団的にコードするオリゴ核酸を含むことがある。それぞれの変異体は翻訳中に異なるアミノ酸をもたらすコドンをコードすることがある。表１は、異なる部位にとって可能性のあるそれぞれのコドン（と代表的なアミノ酸）のリストを提供する。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
オリゴ核酸母集団は、複数の位置で最大で２０のコドン変異を集団的にコードする様々なオリゴ核酸を含むことがある。このような場合、母集団中のそれぞれのオリゴ核酸は、同じオリゴ核酸中の１つを超える位置でのコドンの変異を含む。いくつかの例では、母集団中のオリゴ核酸はそれぞれ、単一のオリゴ核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のコドンでのコドンの変異を含む。いくつかの例では、それぞれの変異体の長い核酸は、単一の長い核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のコドンにおけるコドンの変異を含む。いくつかの例では、変異体オリゴ核酸母集団は、単一のオリゴ核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のコドンにおけるコドンの変異を含む。いくつかの例では、変異体オリゴ核酸母集団は、単一のオリゴ核酸中の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のコドンにおけるコドンの変異を含む。
【００４０】
本明細書では、第２のオリゴ核酸母集団が複数の個々にアドレス可能な遺伝子座を含む第２のクラスター上で生成されるプロセスが提供される。第２のオリゴ核酸母集団は、各コドン位置には一定である（つまり、各位置で同じアミノ酸をコードする）、複数の第２のオリゴ核酸を含むことがある。第２のオリゴ核酸は第１のオリゴ核酸の少なくとも一部で重複することがある。いくつかの例では、第２のオリゴ核酸は、第１のオリゴ核酸上で表される変異体部位を含まない。代替的に、第２のオリゴ核酸母集団は１つ以上のコドン位置について異なる複数の第２のオリゴ核酸を含むことがある。
【００４１】
オリゴ核酸のライブラリーを合成する方法が本明細書で提供され、オリゴ核酸の単一の母集団は複数のコドン位置に変異体を含んで生成される。第１のオリゴ核酸母集団は複数の個々にアドレス可能な遺伝子座を含む第１のクラスター上で生成されることがある。そのような場合、第１のオリゴ核酸母集団は異なるコドン位置で変異体を含む。いくつかの例では、様々な部位は連続的である（つまり、連続するアミノ酸をコードする）。第１のオリゴヌクレオチド酸母集団は、同じまたは追加の変異体部位で最大で１９のコドン変異体を集団的にコードする様々なオリゴ核酸を含んでもよい。第１のオリゴヌクレオチド酸母集団は、位置ｘで最大で１９の変異体を、位置ｙで最大で１９の変異体を、および位置ｚで最大で１９の変異体を含む、複数の第１のオリゴ核酸を含んでもよい。このような配置では、最大で１９のアミノ酸変異体が様々な変異体部位の各々でコードされるように、変異体はそれぞれ異なるアミノ酸をコードする。追加の例では、第２のオリゴ核酸母集団は複数の個々にアドレス可能な遺伝子座を含む第２のクラスター上で生成される。第２のオリゴ核酸母集団は、各コドン位置について一定である（つまり、各位置で同じアミノ酸をコードする）、複数の第２のオリゴ核酸を含むことがある。第２のオリゴ核酸は第１のオリゴ核酸の少なくとも一部と重複することがある。第２のオリゴ核酸は、第１のオリゴ核酸上で表された変異体部位を含まないことがある。
【００４２】
本明細書に記載されたプロセスによって生成された変異体核酸ライブラリーは、変異体タンパク質ライブラリーの生成をもたらす。第１の典型的な配置では、鋳型オリゴ核酸は、転写および翻訳時に、単一の円によって示される多くのコドン位置を有する基準アミノ酸配列（図４のＡ）をもたらす配列をコードする。鋳型のオリゴ核酸変異体は本明細書に記載された方法を用いて生成可能である。いくつかの例では、単一の変異体は単一のアミノ酸配列（図４のＢ）をもたらすオリゴ核酸の中にある。いくつかの例では、１つを超える変異体はオリゴ核酸の中にあり、変異体は１つ以上のコドンによって分離され、変異体残基の間に間隔をおいたタンパク質をもたらす（図４のＣ）。いくつかの例では、１つを超える変異体はオリゴ核酸の中にあり、変異体は連続し、かつ互いに対して隣接するか、連続的であり、残基の間隔をおいた変異体の伸長をもたらす（図４のＤ）。いくつかの例では、２つの一続きの変異体はオリゴ核酸の中にあり、それぞれの一続きの変異体は連続し、隣接する、または連続的な変異体を含む（図４のＥ）。
【００４３】
オリゴ核酸変異体のライブラリーを生成する方法が本明細書で提供され、それぞれの変異体は単一の位置コドン変異体を含む。１つの例では、鋳型オリゴ核酸は多くのコドン位置を有し、典型的なアミノ酸残基はそれぞれの１文字のコードタンパク質コドンを用いて円によって示されている（図５のＡ）。図５のＢは、変異体核酸のライブラリーによってコードされたアミノ酸変異体のライブラリーを描いており、各変異体は、異なる一つの部位に位置し、「Ｘ」によって示される、単一の位置変異体を含む。第１の位置変異体は、アラニンを交換するための任意のコドン、トリプトファンを交換するために変異体核酸のライブラリーによってコードされた任意のコドンを有する第２の変異体、イソロイシンを交換するために任意のコドンを有する第３の変異体、リジンを交換するために任意のコドンを有する第４の変異体、アルギニンを交換するために任意のコドンを有する第５の変異体、グルタミン酸を交換するために任意のコドンを有する第６の変異体、およびグルタミンを交換するために任意のコドンを有する第７の変異体を有する。すべての、あるいは、すべてよりも少ないコドン変異体が変異体核酸ライブラリーによってコードされ、結果として生じるアミノ酸配列変異体の対応する母集団は、タンパク質発現後（つまり、ＤＮＡ転写の標準的な細胞的事象と、その後の翻訳と処理の事象）に生成される。
【００４４】
いくつかの配置では、ライブラリーは単一の位置変異体の複数の部位で生成される。図６のＡで描かれるように、野生型の鋳型が提供される。図６のＢは、単一の位置コドン変異体の２つの部位を有する結果として生じたアミノ酸配列を描いており、異なるアミノ酸をコードする各コドン変異体は異なる模様のある円によって示されている。
【００４５】
本明細書では、多くの部位、単一の位置変異体を有するライブラリーを生成する方法である。それぞれの一続きのオリゴ核酸は１、２、３、４、５、またはそれ以上の変異体を有することがある。それぞれの一続きのオリゴ核酸は少なくとも１つの変異体を有することがある。それぞれの一続きのオリゴ核酸は少なくとも２つの変異体を有することがある。それぞれの一続きのオリゴ核酸は少なくとも３つの変異体を有することがある。例えば、一続きの５つのオリゴ核酸は１つの変異体を有することがある。一続きの５つのオリゴ核酸は２つの変異体を有することがある。一続きの５つのオリゴ核酸は３つの変異体を有することがある。一続きの５つのオリゴ核酸は４つの変異体を有することがある。例えば、一続きの４つのオリゴ核酸は１つの変異体を有することがある。一続きの４つのオリゴ核酸は２つの変異体を有することがある。一続きの４つのオリゴ核酸は３つの変異体を有することがある。一続きの４つのオリゴ核酸は４つの変異体を有することがある。
【００４６】
幾つかの事例では、単一の位置変異体はすべて、同じアミノ酸、例えばヒスチジンをコードし得る。図７のＡに示されるように、基準アミノ酸配列が提供される。この配置では、一続きのオリゴ核酸は、単一の位置変異体の複数の部位をコードし、発現されたときに、結果として、すべての単一の位置変異体を有するアミノ酸配列は、ヒスチジンをコードすることになる（図７のＢ）。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって合成された変異体ライブラリーは、結果として生じたアミノ酸配列において４つを超えるヒスチジン残基をコードしない。
【００４７】
幾つかの事例では、本明細書に記載される方法によって生成された核酸の変異体ライブラリーは、別々の一続きの変異を有するアミノ酸配列の発現を提供する。鋳型アミノ酸配列は図８のＡに示される。一続きのオリゴ核酸は、二続きでは１つのみの変異体コドンを有し得、発現されたときに、結果として、図８のＢに示されるアミノ酸配列をもたらす。アミノ酸における変異が、一続きでは異なる位置にあることを示すために、異なってパターン化する円によって図８のＢに変異体が示される。
【００４８】
本明細書には、オリゴ核酸ライブラリーを１、２、３、またはそれ以上のコドン変異体と合成するための方法および装置が提供され、ここで各部位に対する変異体は選択的に制御される。単一の部位変異体に対する２つのアミノ酸の比率は、約１：１００、１：５０、１：１０、１：５、１：３、１：２、１：１であり得る。単一の部位変異体に対する３つのアミノ酸の比率は、約１：１：１００、１：１：５０、１：１：２０、１：１：１０、１：１：５、１：１：３、１：１：２、１：１：１、１：１０：１０、１：５：５、１：３：３、または１：２：２であり得る。図９のＡは、野生型の核酸配列によってコードされた野生型の基準アミノ酸配列を示す。図９のＢは、アミノ酸変異体のライブラリーを示し、ここで、各変異体は一続きの配列を含み（パターン化された円によって示される）、各位置は、結果として生じた変異体タンパク質ライブラリーにおいてアミノ酸の特定の比率を有し得る。結果として生じた変異体タンパク質ライブラリーは、本明細書に記載される方法によって生成された変異体核酸ライブラリーによってコードされる。この例証では、５つの位置が変えられる：第１の位置（９００）は５０／５０のＫ／Ｒ比率を有し；第２の位置（９１０）は５０／２５／２５のＶ／Ｌ／Ｓ比率を有し、第３の位置（９２０）は５０／２５／２５のＹ／Ｒ／Ｄ比率を有し、第４の位置（９３０）は２０のアミノ酸すべてに対する等しい比率を有し、および第５の位置（９４０）はＧ／Ｐに対する７５／２５の比率を有する。本明細書に記載される比率は単なる例である。
【００４９】
幾つかの事例では、合成された変異体ライブラリーが生成され、これは、タンパク質のアミノ酸配列に最終的に翻訳される核酸配列をコードする。典型的に、アミノ酸配列は、含む、小さなペプチドの他に大きなペプチドの少なくとも一部もコードする配列、例えば抗体配列を含む。幾つかの事例では、各々が合成されたオリゴ核酸は、抗体配列の一部において変異体コドンをコードする。変異体により合成されたオリゴ核酸の一部がコードする典型的な抗体配列は、抗原結合領域またはその可変領域、またはそれらのフラグメントを含む。本明細書に記載されるオリゴ核酸が一部をコードする実例となる抗体フラグメントは、限定することなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。本明細書に記載されるオリゴ核酸が一部をコードする実例となる抗体領域は、限定することなく、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、Ｆａｂ領域の可変領域、Ｆａｂ領域の定常領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）、あるいはＶＨまたはＶＬの特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本明細書に開示される方法によって生成された変異体ライブラリーは、本明細書に記載される抗体領域の１つ以上の変異をもたらし得る。１つの典型的なプロセスでは、変異体ライブラリーは、幾つかのＣＤＲをコードするする核酸のために生成される。図１０を参照。ＣＤＲ１ １０１０、ＣＤＲ２ １０２０、およびＣＤＲ３ １０３０の領域を有する抗体をコードする鋳型核酸は、本明細書に記載される方法によって修飾され、ここでＣＤＲ領域はそれぞれ、変異のための複数の部位を含む。重鎖または軽鎖の単一の可変ドメインにおける３つのＣＤＲ １０１５、１０２５、および１０３５の各々に対する変異が生成される。☆によって示される各部位は、鋳型オリゴ核酸配列とは異なるコドン配列と交換可能である、単一の位置、一続きの複数の連続する位置、またはその両方を含んでもよい。変異体ライブラリーの多様性は、本明細書に提供される方法を使用して、〜１０１０まで、またはそれ以上劇的に増大し得る。
【００５０】
＜発現カセットにおける変異＞
幾つかの事例では、合成された変異体ライブラリーが生成され、これは、発現構築物の一部をコードする。発現構築物の典型的な部分は、プロモーター、オープンリーディングフレーム、および終端領域を含む。幾つかの事例では、発現構築物は、１、２、３またはそれ以上の発現カセットをコードする。オリゴヌクレオチドライブラリーが生成され、これは、図１１に示されるように、発現構築物カセットの部分を構成する、生成するかもしれない、単一の部位または複数の部位の別々の領域でコドン変異をコードする。２つの構築物を発現するカセットを生成するために、変異体オリゴ核酸は合成され、これは、第１のプロモーター（１１１０）、第１のオープンリーディングフレーム（１１２０）、第１のターミネーター（１１３０）、第２のプロモーター（１１４０）、第２のオープンリーディングフレーム（１１５０）、または第２のターミネーター配列（１１６０）の変異体配列の少なくとも一部をコードする。増幅のラウンド後に、前の例において記載されるように、１，０２４の発現構築物のライブラリーが生成された。
図１１は一例の配置を提供する。幾つかの事例では、非翻訳制御領域（ＵＴＲ）またはエンハンサー領域などの、追加の制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）も、本明細書で言及される発現カセットに含まれる。発現カセットは、本明細書に記載される方法によって変異体配列が生成される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の構成要素を含んでもよい。幾つかの事例では、発現構築物は、マルチシストロン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターに１つを超える遺伝子を含む。一例では、合成されたＤＮＡのオリゴ核酸は、ウイルスベクター（例えばレンチウイルス）へと挿入され、その後、細胞への形質導入のためにパッケージ化されるか、または細胞への移動のために非ウイルスベクターへと挿入され、その後、スクリーニングおよび分析される。
【００５１】
本明細書に開示される核酸を挿入するための発現ベクターは、真核ベクター（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）（例えば、細菌性および真菌性）および原核ベクター（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）（例えば、哺乳動物、植物および昆虫の発現ベクター）を含む。典型的な発現ベクターは、限定することなく、哺乳動物の発現ベクター：ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＮＥＯ−ＮＨ２−ＰＰＴ−３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＮＥＯ−ＣＯＯＨ−３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＵＲＯ−ＮＨ２−ＧＳＴ−ＴＥＶ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−ＣＯＯＨ−ＴＥＶ−ＦＬＡＧ（Ｒ）−６Ｈｉｓ、ｐＣＥＰ４ ｐＤＥＳＴ２７、ｐＳＦ−ＣＭＶ−Ｕｂ−ＫｒＹＦＰ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＭＤＶ−ｄａＧＦＰ、ｐＥＦ１ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ１ａ−ｔｄＴｏｍａｔｏ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＭＤＶ−Ｈｙｇｒｏ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ、ｐＭＣＰ−ｔａｇ（ｍ）、およびｐＳＦ−ＣＭＶ−ＰＵＲＯ−ＮＨ２−ＣＭＹＣ；細菌性の発現ベクター：ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−ＢｅｔａＧａｌ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０−Ｆｌｕｃ、ｐＳＦ−ＯＸＢ２０、およびｐＳＦ−Ｔａｃ；植物の発現ベクター：ｐＲＩ １０１−ＡＮ ＤＮＡおよびｐＣａｍｂｉａ２３０１；および酵母発現ベクター：ｐＴＹＢ２１およびｐＫＬＡＣ２、および昆虫のベクター：ｐＡｃ５．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＡおよびｐＤＥＳＴ８を含む。典型的な細胞は、限定することなく、原核細胞および真核細胞を含む。典型的な真核細胞は、限定することなく、動物、植物および真菌の細胞を含む。典型的な動物細胞は、限定することなく、昆虫、魚および哺乳動物の細胞を含む。典型的な哺乳動物細胞は、マウス、ヒト、および霊長類の細胞を含む。本明細書に記載される方法によって合成された核酸は、細胞へと移され、これは、限定することなく、トランスフェクション、形質導入、およびエレクトロポレーションを含む、当該技術分野において既知の様々な方法によって行われる。試験される典型的な細胞機能は、限定することなく、細胞増殖における変化、遊走／接着、代謝活性、および細胞シグナル伝達活性を含む。
【００５２】
＜非常に並列な核酸合成＞
本明細書には、革新的な合成プラットフォームを作るために、シリコン上のナノウェル内のオリゴ核酸合成から遺伝子アセンブリへの末端間プロセスの小型化、並列化、および垂直的統合を利用するプラットフォームアプローチが提供される。本明細書に記載される装置は、９６ウェルのプレートと同じフットプリントを提供し、シリコン合成プラットフォームは、従来の合成方法と比較して、１，０００倍まで又はそれ以上スループットを増加させることができ、単一の高度に並列されたラン（ｒｕｎ）で、およそ１，０００，０００まで又はそれ以上のオリゴ核酸、または１０，０００またはそれ以上の遺伝子を産生することができる。
【００５３】
次世代配列決定の出現で、高解像度のゲノムデータは、正常な生態および病因両方において様々な遺伝子の生物学的役割を深く探究する研究に対する重要な因子となった。この研究の中心となるのは、分子生物学のセントラルドグマおよび「順次情報の残基ごとの移動」の概念である。ＤＮＡにおいてコードされたゲノム情報は、メッセージへと転写され、これはその後、与えられた生物学的経路内の活性産物であるタンパク質へと翻訳される。
【００５４】
研究の別の刺激的な領域は、高特異的な細胞標的に焦点を置いた治療用分子の発見、開発および製造に関するものである。高い多様性のＤＮＡ配列ライブラリーは、標的とされた治療薬のための開発パイプラインの中心にある。治療標的に対して高い親和性を有するタンパク質の高い発現のために理想的には遺伝子の最適化に達する、設計、構造および試験のタンパク質工学サイクルにおいてタンパク質を発現するために、遺伝子突然変異体が使用される。一例として、受容体の結合ポケットを考察されたい。結合ポケット内ですべての残基のすべての配列の並べ替えを同時に試験する能力によって、徹底的な診査が可能になり、成功の可能性が増大する。研究者が受容体内の特定部位であらゆる可能な突然変異を発生させる試みを行う、飽和突然変異誘発は、この開発課題に対する１つの手段を表わす。高価であり、時間および労働集約的ではあるが、これによって、各変異体を各位置へと導入することができる。対照的に、少数の選択位置または短い一続きのＤＮＡが広範囲に修飾され得る、組み合わせの突然変異誘発は、偏った提示（ｂｉａｓｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）で変異体の不完全なレパートリーを発生させる。
【００５５】
薬物開発のパイプラインを促進するために、試験に利用可能な正しい位置において意図した頻度で利用可能な望ましい変異体を有するライブラリー、言い換えれば、高精度ライブラリー（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ）は、コストの削減に加えて、スクリーニングの所要移管の短縮も可能にする。本明細書には、望ましい頻度で各々の意図した変異体の正確な導入をもたらすオリゴ核酸合成の変異体ライブラリーを合成する方法が提供される。エンドユーザーにとって、これは、配列空間を徹底的にサンプリングするだけでなく、効率的な方法でこれらの仮説を問うことができる能力に翻訳され、コストおよびスクリーニング時間を削減する。ゲノム全体の編集は、重要な経路、各変異体および配列の並べ替えが最適な機能性に関して試験され得るライブラリーを解明することができ、全経路を再構築するために何千もの遺伝子を使用することができ、創薬のための生物系を再設計するためにゲノムを使用することができる。
【００５６】
第１の実施例では、薬物自体は、本明細書に記載される方法を使用して最適化され得る。例えば、抗体の指定された機能を改善するために、抗体の一部をコードする変異体オリゴ核酸ライブラリーが設計され、合成される。その後、抗体に対する変異体核酸ライブラリーが、本明細書に記載されるプロセス（例えば、ＰＣＲ突然変異誘発に続くベクターへの挿入）によって生成され得る。その後、抗体は、生産細胞株（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）において発現され、活性の増強のためにスクリーニングされる。スクリーニングの例は、抗原に対する結合親和性、安定性、またはエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、補体、またはアポトーシス）の調節を検査することを含む。抗体を最適化する典型的な領域は、限定することなく、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、Ｆａｂ領域の可変領域、Ｆａｂ領域の定常領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）、およびＶＨまたはＶＬの特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００５７】
代替的に、最適化するための分子は、活性化剤または競合的阻害剤として使用される受容体結合エピトープである。核酸の変異体ライブラリーの合成に続いて、核酸の変異体ライブラリーは、ベクター配列へと挿入され、その後、細胞において発現され得る。受容体抗原は、細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞または細菌細胞）において発現され、その後、精製され得るか、または配列の変更からの機能的な結果を検査するために細胞（例えば哺乳動物細胞）において発現され得る。機能的な結果は、限定することなく、タンパク質発現、結合親和性および安定性の変化を含む。細胞の機能的な結果は、限定することなく、繁殖、成長、接着、死亡、遊走、エネルギー産生、酸素利用、代謝活性、細胞シグナル伝達、老化、遊離基損傷に対する反応、またはそれらの任意の組み合わせの変化を含む。幾つかの実施形態では、最適化のために選択されるタンパク質のタイプは、酵素、輸送タンパク質、Gタンパク質共役型受容体、電位型イオンチャネル、転写因子、ポリメラーゼ、アダプタータンパク質（酵素活性のないタンパク質、２つの他のタンパク質を一緒に集める働き）、および細胞骨格タンパク質である。酵素の典型的なタイプは、限定することなく、シグナル伝達酵素（タンパク質キナーゼ、タンパク質フォスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびＧＴＰアーゼなど）を含む。
【００５８】
本明細書には、全経路または全ゲノムに関与する分子のための変異体を含む変異体核酸ライブラリーが提供される。典型的な経路は、限定することなく、代謝、細胞死、細胞周期進行、免疫細胞活性化、炎症反応、血管新生、リンパ球新生、低酸素ストレス応答、酸化ストレス応答、または細胞接着／遊走の経路を含む。細胞死の経路における典型的なタンパク質は、限定することなく、Ｆａｓ、Ｃａｄｄ、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）３、カスパーゼ６、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、ＩＡＰ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ２、ＮＦ−ｋＢ、ＴＲＡＦ、ＡＳＫ、ＢＡＤ、およびＡｋｔを含む。細胞周期の経路における典型的なタンパク質は、限定することなく、ＮＦｋＢ、Ｅ２Ｆ、Ｒｂ、ｐ５３、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、およびｃｄｃ ２５を含む。細胞遊走の経路における典型的なタンパク質は、限定することなく、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＬＣ、コフィリン、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＭＬＰ、ＬＩＭＫ、ＲＯＣＫ、ＲｈｏＡ、Ｓｒｃ、Ｒａｃ、Ｍｙｏｓｉｎ ＩＩ、ＡＲＰ２／３、ＭＡＰＫ、ＰＩＰ２、インテグリン、タリン、キンドリン（ｋｉｎｄｌｉｎ）、ミグフィリン（ｍｉｇｆｉｌｉｎ）およびフィラミンを含む。
【００５９】
本明細書に記載される方法によって合成された核酸ライブラリーは、様々な細胞タイプにおいて発現され得る。典型的な細胞タイプは、原核細胞（例えば、細菌細胞および真菌細胞）および真核細胞（例えば、植物細胞および動物細胞）を含む。典型的な動物は、限定することなく、マウス、ウサギ、霊長類、魚、および昆虫を含む。典型的な植物は、限定することなく、単子葉植物および双子葉植物を含む。典型的な植物はまた、限定することなく、微細藻類、ケルプ、シアノバクテリア、および緑藻類、褐藻類、および紅藻類、小麦、タバコ、およびトウモロコシ、米、綿、野菜、および果実を含む。
【００６０】
本明細書に記載される方法によって合成された核酸ライブラリーは、疾患状態に関連付けられた様々な細胞において発現され得る。疾患状態に関連付けられた細胞は、被験体からの細胞株、組織サンプル、初代細胞、被験体からの増殖された培養細胞、またはモデル系における細胞を含む。典型的なモデル系は、限定することなく、疾患状態の植物および動物のモデルを含む。
【００６１】
本明細書に記載される方法によって合成された核酸ライブラリーは、様々な細胞タイプにおいて発現され得、細胞活性における変化が評価される。典型的な細胞活性は、限定することなく、増殖、周期進行、細胞死、接着、遊走、繁殖、細胞シグナル伝達、エネルギー産生、酸素利用、代謝活性、および老化、遊離基損傷に対する反応、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００６２】
疾患状態の予防、低減または処置に関連付けられた変異体分子を特定するために、本明細書に記載される変異体核酸ライブラリーが、疾患状態に関連付けられた細胞または疾患状態が誘発され得る細胞において発現される。幾つかの事例では、細胞において疾患状態を誘発するために薬剤が使用される。疾患状態の誘発のための典型的なツールは、限定することなく、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系、ＬＰＳ炎症誘発、および低血糖症を誘発するストレプトゾトシンを含む。疾患状態に関連付けられた細胞は、モデル系からの細胞または培養細胞の他に、特定の病状を有する被験体からの細胞であり得る。典型的な病状は、細菌性、真菌性、ウイルス性、自己免疫性、増殖性の障害（例えば癌）を含む。幾つかの事例では、変異体核酸ライブラリーは、モデル系、細胞株、または被験体由来の初代細胞において発現され、少なくとも１つの細胞活性における変化のためにスクリーニングされる。典型的な細胞活性は、限定することなく、増殖、周期進行、細胞死、接着、遊走、繁殖、細胞シグナル伝達、エネルギー産生、酸素利用、代謝活性、および老化、遊離基損傷に対する反応、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００６３】
＜基質＞
本明細書には、複数のクラスターを含む基質が提供され、ここでクラスターはそれぞれ、オリゴ核酸の付着および合成を支持する複数の遺伝子座を含む。本明細書で使用されるような用語「遺伝子座」は、表面から伸長する単一の予め決められた配列をコードするオリゴヌクレオチドに対する支持をする構造上の離散的領域を指す。幾つかの事例では、遺伝子座は、二次元表面、例えば、実質的に平らな表面上にある。幾つかの事例では、遺伝子座は、表面上の離散的な隆起した又は沈降した部位、例えば、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストを指す。幾つかの事例では、遺伝子座の表面は、オリゴ核酸合成のための少なくとも１つのヌクレオチド、または好ましくは、オリゴ核酸の集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に付着するために活発に官能基化される物質を含む。幾つかの事例では、オリゴ核酸は、同じ核酸配列をコードするするオリゴ核酸の集団を指す。幾つかの事例では、装置の表面は、基質の１つまたは複数の表面を包含する。
【００６４】
提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対する平均エラー率は、１０００で１未満、１２５０で１未満、１５００で１未満、２０００で１未満で、３０００で１未満であるか、または頻度は低い。幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対する平均エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満であるか、またはそれより低い。幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対する平均エラー率は、１／１０００未満である。
【００６５】
幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対する総エラー率は、予め決められた配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満であるか、またはそれより低い。幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対する総エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満である。幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対する総エラー率は、１／１０００未満である。
【００６６】
幾つかの事例では、エラー補正酵素が、使用することができる提供される方法およびシステムを使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に使用され得る。幾つかの事例では、エラー補正を有するオリゴ核酸に対する総エラー率は、予め決められた配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満、またはそれ以下であり得る。幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対するエラー補正を有する総エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満であり得る。幾つかの事例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたオリゴ核酸に対するエラー補正を有する総エラー率は、１／１０００未満であり得る。
【００６７】
エラー率は、遺伝子変異体のライブラリーの産生のための遺伝子合成の値を制限し得る。１／３００のエラー率では、１５００の塩基対遺伝子におけるクローンの約０．７％は正しくなる。オリゴヌクレオチド合成からのエラーのほとんどが、結果としてフレームシフト突然変異をもたらすため、そのようなライブラリーにおけるクローンの９９％以上が、全長タンパク質を生成しない。エラー率を７５％低下させることによって、正しいクローンの画分は４０倍増加するだろう。本開示の方法および組成物は、超並列および時間効率の良い方法で可能になる合成の質の改善およびエラー補正方法の適用性の両方が要因で、一般に観察される遺伝子合成方法よりも低いエラー率での大規模なオリゴヌクレオチドおよび遺伝子のライブラリーの速いデノボ合成を可能にする。したがって、ライブラリーは、ライブラリー全体にわたって、またはライブラリーの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％  ９９．５％  ９９．８％  ９９．９％  ９９．９５％  ９９．９８％  ９９．９９％、またはそれ以上にわたって、塩基の挿入、欠失、置換、あるいは１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれ以下である合計のエラー率で合成され得る。本開示の方法および組成物はさらに、予め決められた／予め選択された配列と比較して、エラーのない配列に関連するライブラリーの少なくともサブセットにおいて、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上に関連付けられた低いエラー率での大規模な合成オリゴヌクレオチドおよび遺伝子のライブラリーに関する。幾つかの事例では、ライブラリー内の単離した量でのオリゴヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。幾つかの事例では、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上の類似性または同一性に関連する、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０���、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。幾つかの事例では、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子上の指定された遺伝子座と関連するエラー率は、最適化される。したがって、大規模なライブラリーの一部としての１つ以上のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子の複数の選択された遺伝子座の与えられた遺伝子座は各々、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれより低いエラー率を有し得る。様々な事例では、そのようなエラーを最適化した遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、５００００、７５０００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上の遺伝子座を含み得る。エラーを最適化した遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、７５０００、１０００００、５０００００の、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子に分布され得る。
【００６８】
エラー率は、エラー補正を用いて又はそれなしで達成され得る。エラー率は、ライブラリー全体にわたって、またはライブラリーの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上にわたって達成され得る。
【００６９】
本明細書には、共通の支持体上のアドレス可能位置で異なる予め決められた配列を有している複数のオリゴ核酸の合成を支持する表面を含み得る構造が提供される。幾つかの事例では、装置は、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００、またはそれ以上の同一でないオリゴ核酸の合成のための支持を提供する。幾つかの事例では、装置は、２，０００；５，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；１０，０００，０００を超える、またはそれ以上のオリゴ核酸の合成のための支持を提供する。幾つかの事例では、オリゴ核酸の少なくとも一部は、同一の配列を有しているか、または同一の配列で合成されるように構成されている。
【００７０】
本明細書には、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００の塩基の長さであるオリゴ核酸の製造および成長のための方法および装置が提供された。幾つかの事例では、形成されるオリゴ核酸の長さは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５の塩基の長さである。オリゴ核酸は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００の塩基の長さであり得る。オリゴ核酸は、１０〜２２５の塩基の長さ、１２〜１００の塩基の長さ、２０〜１５０の塩基の長さ、２０〜１３０の塩基の長さ、または３０〜１００の塩基の長さであり得る。
【００７１】
幾つかの事例では、オリゴ核酸は、基質の別々の遺伝子座上で合成され、ここで遺伝子座はそれぞれ、オリゴ核酸の集団の合成を支持する。幾つかの事例では、遺伝子座はそれぞれ、別の遺伝子座上で成長させられたオリゴ核酸の集団とは異なる配列を有するオリゴ核酸の集団の合成を支持する。幾つかの事例では、装置の遺伝子座は複数のクラスター内に位置する。幾つかの事例では、装置は、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００またはそれ以上のクラスターを含む。幾つかの事例では、装置は、２，０００；５，０００；１０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，１００，０００；１，２００，０００；１，３００，０００；１，４００，０００；１，５００，０００；１，６００，０００；１，７００，０００；１，８００，０００；１，９００，０００；２，０００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；１，２００，０００；１，４００，０００；１，６００，０００；１，８００，０００；２，０００，０００；２，５００，０００；３，０００，０００；３，５００，０００；４，０００，０００；４，５００，０００；５，０００，０００；または１０，０００，０００を超える、または以上の別々の遺伝子座を含む幾つかの事例では、装置は、約１０，０００の別々の遺伝子座を含む。単一のクラスター内の遺伝子座の量は、異なる事例では変更される。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００または以上の遺伝子座を含む．幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約５０−５００の遺伝子座を含む。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約１００−２００の遺伝子座を含む。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約１００−１５０の遺伝子座を含む。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約１０９、１２１、１３０または１３７の遺伝子座を含む。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約１９、２０、６１、６４またはそれ以上の遺伝子座を含む。
【００７２】
装置上で合成された別々のオリゴ核酸の数は、基質における利用可能な別々の遺伝子座の数に左右され得る。幾つかの事例では、装置のクラスター内の遺伝子座の密度は、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１の遺伝子座、１ｍｍ２当たり１０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり２５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり５０遺伝子座、１ｍｍ２当たり６５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり７５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり１００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり１３０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり１５０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり１７５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり２００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり３００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり４００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり５００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり１，０００の遺伝子座、またはそれ以上である。幾つかの事例では、装置は、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２当たり約１０の遺伝子座、１ｍｍ２から約４００ｍｍ２当たり約２５の遺伝子座、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２当たり約５０の遺伝子座、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２当たり約１００の遺伝子座、１ｍｍ２から約５００ｍｍ２当たり約１５０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２５０ｍｍ２当たり約１０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２５０ｍｍ２当たり約５０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２００ｍｍ２当たり約１０の遺伝子座、１ｍｍ２から約２００ｍｍ２当たり約５０の遺伝子座を含む。幾つかの事例では、クラスター内の２つの隣接した遺伝子座の中心からの距離は、約１０μｍから約５００μｍ、約１０μｍから約２００μｍ、または約１０μｍから約１００μｍである。幾つかの事例では、隣接した遺伝子座の２つの中心からの距離は、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍまたは１００μｍより長い。幾つかの事例では、２つの隣接した遺伝子座の中心からの距離は、約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍまたは１０μｍ未満である。幾つかの事例では、遺伝子座それぞれの幅は、約０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍまたは１００μｍである。幾つかの事例では、遺伝子座それぞれの幅は、約０．５μｍから１００μｍ、約０．５μｍから５０μｍ、約１０μｍから７５μｍ、または約０．５μｍから５０μｍである。
【００７３】
幾つかの事例では、装置内のクラスターの密度は、１００ｍｍ２当たり少なくとも又は約１のクラスター、１０ｍｍ２当たり１のクラスター、５ｍｍ２当たり１のクラスター、４ｍｍ２当たり１のクラスター、３ｍｍ２当たり１のクラスター、２ｍｍ２当たり１のクラスター、１ｍｍ２当たり１のクラスター、１ｍｍ２当たり２のクラスター、１ｍｍ２当たり３のクラスター、１ｍｍ２当たり４のクラスター、１ｍｍ２当たり５のクラスター、１ｍｍ２当たり１０のクラスター、１ｍｍ２当たり５０のクラスター、またはそれ以上である。幾つかの事例では、装置は、１０ｍｍ２当たり約１のクラスターから１ｍｍ２当たり約１０のクラスターを含む。幾つかの事例では、２つの隣接したクラスターの中心からの距離は、約５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、または５０００μｍ未満である。幾つかの事例では、２つの隣接したクラスターの中心からの距離は、約５０μｍから約１００μｍ、約５０μｍから約２００μｍから、約５０μｍから約３００μｍ、約５０μｍから約５００μｍ、および約１００μｍから約２０００μｍである。幾つかの事例では、２つの隣接したクラスターの中心からの距離は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約０．５〜２ｍｍ、約０．５〜１ｍｍ、または約１〜２ｍｍの１寸法に沿った直径または幅を有している。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２ｍｍの１寸法に沿った直径または幅を有している。幾つかの事例では、クラスターはそれぞれ、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．１５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２ｍｍの１寸法のに沿った内部の直径または幅を有している。
【００７４】
装置は、例えば、約１００〜２００ｍｍ×約５０〜１５０ｍｍの、およその標準の９６ウェルプレートのサイズであり得る。幾つかの事例では、装置は、約１０００ｍｍ、５００ｍｍ、４５０ｍｍ、４００ｍｍ、３００ｍｍ、２５０ｎｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１００ｍｍまたは５０ｍｍ以下の直径を有している。幾つかの事例では、装置の直径は、約２５ｍｍから１０００ｍｍ、約２５ｍｍから約８００ｍｍ、約２５ｍｍから約６００ｍｍ、約２５ｍｍから約５００ｍｍ、約２５ｍｍから約４００ｍｍ、約２５ｍｍから約３００ｍｍ、または約２５ｍｍから約２００である。装置サイズの限定しない例は、約３００ｍｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１３０ｍｍ、１００ｍｍ、７６ｍｍ、５１ｍｍおよび２５ｍｍを含む。幾つかの事例では、装置は、少なくとも約１００ｍｍ２；２００ｍｍ２；５００ｍｍ２；１，０００ｍｍ２；２，０００ｍｍ２；５，０００ｍｍ２；１０，０００ｍｍ２；１２，０００ｍｍ２；１５，０００ｍｍ２；２０，０００ｍｍ２；３０，０００ｍｍ２；４０，０００ｍｍ２；５０，０００ｍｍ２またはそれ以上の平面の表面積を有している。幾つかの事例では、装置の厚さは、約５０ｍｍから約２０００ｍｍ、約５０ｍｍから約１０００ｍｍ、約１００ｍｍから約１０００ｍｍ、約２００ｍｍから約１０００ｍｍ、または約２５０ｍｍから約１０００ｍｍである。装置の厚さの限定しない例は、２７５ｍｍ、３７５ｍｍ、５２５ｍｍ、６２５ｍｍ、６７５ｍｍ、７２５ｍｍ、７７５ｍｍおよび９２５ｍｍを含む。幾つかの事例では、装置の厚さは、直径によって変わり、基質の組成物に左右される。例えば、シリコン以外の物質を含む装置は、同じ直径のシリコン装置とは異なる厚さを有している。装置の厚さは、使用される物質の機械強度によって判定され、扱いの間に割れることなく、それ自体の重量を支えるのに十分でなければならない。幾つかの事例では、構造は、本明細書に記載される複数の装置を含む。
【００７５】
＜表面物質＞
本明細書に提供される基質、装置およびリアクターは、本明細書に記載される方法および組成物に適したあらゆる様々な物質から作り上げられる。特定の事例では、低レベルのヌクレオチド結合を示すために、装置用の材料が作り上げられる。幾つかの事例では、装置用の材料は、高レベルのヌクレオチド結合を示す別々の表面を生成するために修正される。幾つかの事例では、装置用の材料は、可視光及び／又はＵＶ光に対して透過性である。幾つかの事例では、装置用の材料は、十分に導電性である、例えば、基質のすべて又は一部にわたって均一な電場を形成することができる。幾つかの事例では、導電性材料は電気接地（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｇｒｏｕｎｄ）に接続される。幾つかの事例では、装置は、熱伝導性であるか又は断熱される。幾つかの事例では、材料は、化学的または生化学的な反応、例えばオリゴ核酸合成反応プロセスを支持するために耐薬品性および耐熱性である。幾つかの事例では、装置は可撓性材料を含む。可撓性材料は、限定することなく、改質ナイロン、非改質ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレンなどを含む。幾つかの事例では、装置は剛性材料を含む。剛性材料は、限定することなく、ガラス、石英ガラス（ｆｕｓｅ ｓｉｌｉｃａ）、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、および混合物など）、および金属（例えば、金、白金など）を含む。幾つかの事例では、装置は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせを含む材料から作り上げられる。幾つかの事例では、装置は、本明細書にリストされた材料または当該技術分野において既知の他の適切な材料の組み合わせで製造される。
【００７６】
＜表面のアーキテクチャ＞
本明細書には、隆起した及び／又は沈降した特徴を含む装置が提供される。そのような特徴を有している１つの利点は、オリゴ核酸合成を支持する表面積の増大である。幾つかの事例では、隆起した及び／又は沈降した特徴を有する装置は、三次元基質と呼ばれる。幾つかの事例では、三次元装置は１つ以上のチャネルを含む。幾つかの事例では、１つ以上の遺伝子座はチャネルを含む。幾つかの事例では、チャネルは、オリゴ核酸シンセサイザーなどの堆積装置によって試薬の堆積に利用可能である。幾つかの事例では、試薬及び／又は流体は、１つ以上のチャネルと流体連通してより大きなウェルに集まる。例えば、装置は、クラスターを有する複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスターの１つのウェルと流体連通している。幾つかの方法では、オリゴ核酸のライブラリーは、クラスターの複数の遺伝子座において合成される。
【００７７】
幾つかの事例では、その構造は、表面上のオリゴ核酸合成に関する流れの制御および物質移動経路制御を可能にするように構成されている。幾つかの事例では、装置の構成は、オリゴ核酸合成の間の物質移動経路、化学暴露時間、及び／又は洗浄効果の制御およびその分布さえを可能にする。幾つかの事例では、装置の構成は、例えば、成長しているオリゴ核酸による排除体積が、オリゴ核酸の成長に利用可能な又は適した最初に利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％を超えて、またはそれ以下を占めないほど十分な、オリゴ核酸の成長に対する体積を提供することによって、奏効率の増大を可能にする。幾つかの事例では、三次元構造は、化学暴露の急速な交換を可能にするために流体の流れの管理を可能にする。
【００７８】
本明細書には、１ｆＭ、５ｆＭ、１０ｆＭ、２５ｆＭ、５０ｆＭ、７５ｆＭ、１００ｆＭ、２００ｆＭ、３００ｆＭ、４００ｆＭ、５００ｆＭ、６００ｆＭ、７００ｆＭ、８００ｆＭ、９００ｆＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、２５ｐＭ、５０ｐＭ、７５ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、またはそれ以上の量のＤＮＡを合成する方法が提供される。幾つかの事例では、オリゴヌクレオチドライブラリーは、遺伝子の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の長さに及び得る。遺伝子は、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％まで変えられ得る。
【００７９】
同一でないオリゴ核酸はまとめて、遺伝子の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％に対する配列をコードし得る。幾つかの事例では、オリゴ核酸は、遺伝子の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。幾つかの事例では、オリゴ核酸は、遺伝子の８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。
【００８０】
幾つかの事例では、物理構造によって隔離が達成される。幾つかの事例では、オリゴ核酸合成に対する能動領域および受動領域を発生させる表面の差次的な官能基化によって、隔離が達成される。差次的な官能基化はまた、装置表面にわたる疎水性を交互にし、それによって、堆積した試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）または湿りを引き起こす水接触角の効果を作り出すことによって達成される。より大きな構造を利用することで、飛び散り（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）および隣接するスポットの試薬による別々のオリゴ核酸合成位置の相互汚染を減少させることができる。幾つかの事例では、オリゴ核酸シンセサイザーなどの装置は、別々のオリゴ核酸合成位置のための試薬を堆積させるために使用される。三次元の特徴を有する基質は、低いエラー率（例えば、約１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２，０００、１：３，０００、１：５，０００、または１：１０，０００未満）で多数のオリゴ核酸（例えば約１０，０００を超える）の合成を可能にする方法で構成される。幾つかの事例では、装置は、１ｍｍ２当たり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００または５００、またはそれらを超える特徴の密度で特徴を含む。
【００８１】
装置のウェルは、基質の別のウェルと同じ又は異なる幅、高さ、及び／又は量を有し得る。装置のチャネルは、基質の別のチャネルと同じ又は異なる幅、高さ、及び／又は量を有し得る。幾つかの事例では、クラスターの幅は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍおから０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。幾つかの事例では、クラスターを含むウェルの幅は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍから、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍからの１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍおよび約２ｍｍである。幾つかの事例では、クラスターの幅は、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍまたは０．０５ｍｍ未満である。幾つかの事例では、クラスターの幅は、約１．０から１．３ｍｍである。幾つかの事例では、クラスターの幅は約１．１５０ｍｍである。幾つかの事例では、ウェルの幅は、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍまたは０．０５ｍｍ未満である。幾つかの事例では、ウェルの幅は、約１．０から１．３ｍｍである。幾つかの事例では、ウェルの幅は約１．１５０ｍｍである。幾つかの事例では、クラスターの幅は約０．０８ｍｍである。幾つかの事例では、ウェルの幅は約０．０８ｍｍである。クラスターの幅は、二次元または三次元の基質内のクラスターを指し得る。
【００８２】
幾つかの事例では、ウェルの高さは、約２０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約１０００μｍ、約１００μｍから約１０００μｍ、約２００μｍから約１０００μｍ、約３００μｍから約１０００μｍ、約４００μｍから約１０００μｍ、または約５００μｍから約１０００μｍである。幾つかの事例では、ウェルの高さは、約１０００μｍ未満、約９００μｍ未満、約８００μｍ未満、約７００μｍ未満、または約６００μｍ未満である。
【００８３】
幾つかの事例では、装置は、クラスター内の複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、チャネルの高さまたは深さは、約５μｍから約５００μｍ、約５μｍから約４００μｍ、約５μｍから約３００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、または約１０μｍから約５０μｍである。幾つかの事例では、チャネルの高さは、１００μｍ未満、８０μｍ未満、６０μｍ未満、４０μｍ未満または２０μｍ未満である。
【００８４】
幾つかの事例では、チャネル、遺伝子座（例えば、実質的に平面の基板における）またはチャネルおよび遺伝子座の両方の直径（例えば、遺伝子座がチャネルに対応する三次元構造装置における）は、約１μｍから約１０００μｍ、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、または約１０μｍから約１００μｍ、例えば、約９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍまたは１０μｍである。幾つかの事例では、チャネル、遺伝子座、またはチャネルおよび遺伝子座の両方のの直径は、約１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍまたは１０μｍ未満である。幾つかの事例では、２つの隣接チャネル、遺伝子座、またはチャネルおよび遺伝子座の中心からの距離は、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、または約５μｍから約３０μｍ、例えば、約２０μｍである。
【００８５】
＜表面改質＞
様々な事例では、装置表面あるいは装置表面の選択された部位または領域の１つ以上の化学的及び／又は物理的な物性を変更する付加または削除のプロセスによって、表面の化学的及び／又は物理的な変更のために、表面改質が利用される。例えば、表面改質は、限定することなく、（１）表面の湿潤性を変更すること、（２）表面を官能基化すること、つまり、表面官能基を提供する、修飾する、または置換すること、（３）表面を脱官能基化すること、つまり、表面官能基を除去すること、（４）そうでなければ、例えば、エッチングによって、表面の化学組成を変更すること、（５）表面粗さを増大させるか又は低減すること、（６）表面上にコーティング、例えば、表面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングを提供すること、及び／又は（７）表面上に粒子を堆積させることを含む。
【００８６】
幾つかの事例では、表面上の化学層（接着促進剤と呼ばれる）の追加は、基質の表面上の遺伝子座の構造化したパターン化を促進する。接着促進の適用のための典型的な表面は、限定することなく、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素および窒化ケイ素を含む。幾つかの事例では、接着促進剤は、高い表面エネルギーを有する化学物質である。幾つかの事例では、基質の表面上に第２の化学層が堆積される。幾つかの事例では、第２の化学層は、低い表面エネルギーを有している。幾つかの事例では、表面上にコーティングされた化学層の表面エネルギーは、液滴の局在化を支持する。選択されるパターン化の配置によって、遺伝子座の接近及び／又は遺伝子座での流体接触の領域は変更可能である。
【００８７】
幾つかの事例では、例えばオリゴ核酸合成のために、核酸または他の部分が堆積される、装置表面、または分解された遺伝子座は、滑らか又は実質的に平面である（例えば、二次元）か、あるいは隆起した又は沈降した特徴などの不規則性を有している（例えば三次元の特徴）。幾つかの事例では、装置表面は、化合物の１つ以上の異なる層で修飾される。対象のそのような修飾層は、限定することなく、金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子などの無機層および有機層を含む。限定しないポリマー層は、ペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの模倣物（例えば、ペプチド核酸など）、多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、および本明細書に記載される又はそうでなければ当該技術分野に既知の他の適切な化合物を含む。幾つかの事例では、ポリマーは ヘテロポリマーである。幾つかの事例では、ポリマーはホモポリマーである。幾つかの事例では、ポリマーは、官能性部分を含むか又は結合される。
【００８８】
幾つかの事例では、装置の分解された遺伝子座は、表面エネルギーを増大させる及び／又は低減する１つ以上の部分で官能基化される。幾つかの事例では、部分は化学的に不活性である。幾つかの事例では、部分は、オリゴ核酸合成反応における望ましい化学反応、例えば、１つ以上のプロセスを支持するように構成されている。表面の表面エネルギー、すなわち疎水性は、表面上へと付着するヌクレオチドの親和性を測定するための因子である。幾つかの事例では、装置の官能基化に対する方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する装置を提供する工程；および（ｂ）本明細書に記載される又はそうでなければ当該技術分野で既知の適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、表面をシラン処理する工程を含む。
【００８９】
幾つかの事例では、有機官能性アルコキシシラン分子は、ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン、メチルジクロロ−オクトデシル−シラン、トリクロロ−オクトデシル−シラン、トリメチル−オクトデシル−シラン、トリエチル−オクトデシル−シラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの事例では、装置の表面は、ポリエチレン／ポリプロピレン（ガンマ線照射またはクロム酸酸化、およびヒドロキシアルキル表面への還元によって官能基化された）、高度に架橋されたポリスチレン−ジビニルベンゼン（クロロメチル化によって誘導体化され、ベンジルアミン官能面にアミノ化された）、ナイロン（末端のアミノヘキシル基は直接反応性である）で官能基化されるか、または還元されたポリテトラフルオロエチレンでエッチングされる。他の方法および官能基化剤は、米国特許第５，４７４，７９６号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
幾つかの事例では、装置の表面は、典型的に装置の表面上に存在する反応性の親水性部分を介して、装置の表面にシランを結合するのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含有している誘導体化組成物との接触によって官能基化される。シラン処理は、一般に、自己組織化によって有機官能性アルコキシシラン分子で表面を覆う。
【００９１】
当該技術分野において現在知られているように、例えば、表面エネルギーを低下させる又は増大させるのための様々なシロキサンを官能基化する試薬がさらに使用され得る。有機官能性アルコキシシランは、それらの有機官能に従って分類され得る。
【００９２】
本明細書には、ヌクレオシドに結合することができる薬剤のパターン化を含み得る装置が提供される。幾つかの事例では、装置は、活性薬剤でコーティングされてもよい。幾つかの事例では、装置は、受動剤（ｐａｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ）でコーティングされてもよい。本明細書に記載されるコーティング材に含有する典型的な活性薬剤は、限定することなく、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＨＡＰＳ）、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）、３−ヨード−プロピルトリメトキシシラン、ブチル−アルデヒド−トリメトキシシラン（ｂｕｔｙｌ−ａｌｄｅｈｙｄｒ−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、二量体二次アミノアルキルシロキサン、（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、および（３−アミノプロピル）−トリメトキシシラン、（３−グリシドキシプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、グリシドキシ−トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン、３−４エポキシシクロヘキシル−エチルトリメトキシシラン、および（３−メルカプトプロピル）−メチル−ジメトキシシラン、アリルトリクロロクロロシラン、７−オクタ−１−エニルトリクロロクロロシラン、またはビス（３−トリメトキシシリルプロピル）アミンを含む。
【００９３】
本明細書に記載されるコーティング材に含有する典型的な受動剤は、限定することなく、ペルフロオロオクチルトリクロロシラン；トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン；１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−フルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＯＳ）；トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ  −ペルフロオロオクチル）シラン；ｔｅｒｔ−ブチル−［５−フルオロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）インドール−１−イル］−ジメチル−シラン；ＣＹＴＯＰ（商標）；Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）；ペルフロオロオクチルトリクロロシラン（ＰＦＯＴＣＳ）；ペルフロオロオクチルジメチルクロロシラン（ＰＦＯＤＣＳ）；ペルフロオロデシルトリエトキシシラン（ＰＦＤＴＥＳ）；ペンタフルオロフェニル−ジメチルプロピルクロロ−シラン（ＰＦＰＴＥＳ）；ペルフロオロオクチルトリエトキシシラン；ペルフロオロオクチルトリメトキシシラン；オクチルクロロシラン；ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン；メチルジクロロ−オクトデシル−シラン；トリクロロ−オクトデシル−シラン；トリメチル−オクトデシル−シラン；トリエチル−オクトデシル−シラン；またはオクタデシルトリクロロシランを含む。
【００９４】
幾つかの事例では、官能基化剤は、オクタデシルトリクロロシランなどの炭化水素シランを含む。幾つかの事例では、官能基化剤は、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピル／トリメトキシシランおよびＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む。
【００９５】
＜オリゴヌクレオチド合成＞
オリゴ核酸合成のための本開示の方法は、ホスホラミダイトの化学作用を含むプロセスを含み得る。幾つかの事例では、オリゴ核酸合成は、塩基をホスホラミダイトと結合することを含む。オリゴ核酸合成は、結合条件下でホスホラミダイトの堆積によって塩基を結合することを含んでもよく、ここで同じ塩基が、随意に、１回を超えて、即ち、二重の結合でホスホラミダイトとともに堆積される。オリゴ核酸合成は、未反応の部位のキャッピングを含んでもよい。幾つかの事例では、キャッピングは随意である。オリゴ核酸合成はまた、酸化または酸化工程を含んでもよい。オリゴ核酸合成は、非ブロック化、脱トリチル化、および硫化を含んでもよい。幾つかの事例では、オリゴ核酸合成は、酸化または硫化のいずれかを含む。幾つかの事例では、オリゴ核酸合成反応中の１つ又は各々の工程間で、装置は、例えば、テトラゾールまたはアセトニトリルを使用して洗浄される。ホスホラミダイト合成方法における任意の１工程に対する時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒および１０秒未満であり得る。
【００９６】
ホスホラミダイト方法を使用するオリゴ核酸合成は、亜リン酸塩トリエステル結合の形成のために成長しているオリゴ核酸鎖へのホスホラミダイト建築ブロック（例えば、ヌクレオシドホスホラミダイト）の続く追加を含んでもよい。ホスホラミダイト  オリゴ核酸合成は、３’方向から５’方向に進む。ホスホラミダイトオリゴ核酸合成は、１合成サイクル当たりの成長している核酸鎖への１つのヌクレオチドの追加の制御を可能にする。幾つかの事例では、各合成サイクルは結合工程を含む。ホスホラミダイト結合は、活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトと、例えばリンカーによって基質に結合されたヌクレオシドとの間の亜リン酸塩トリエステル結合の形成を伴う。幾つかの事例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、起動された装置に提供される。幾つかの事例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、アクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で装置に提供される。幾つかの事例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、基質に結合されたヌクレオシドよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍、またはそれ以上の過剰量で、装置に提供される。幾つかの事例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加は、無水環境において、例えば、無水アセトニトリルにおいて実行される。ヌクレオシドホスホラミダイトの追加に続いて、装置は随意に洗浄される。幾つかの事例では、結合工程は、随意に、基質へのヌクレオシドホスホラミダイトの追加間の洗浄工程とともに、追加で１回以上繰り返される。幾つかの事例では、本明細書に使用されるオリゴ核酸合成方法は、１、２、３またはそれ以上の連続する結合工程を含む。結合前に、多くの場合において、装置に結合されたヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、ここで、保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。
【００９７】
結合に続いて、ホスホラミダイトオリゴ核酸合成方法は、随意にキャッピング工程を含む。キャッピング工程では、成長しているオリゴ核酸は、キャッピング剤で処置される。キャッピング工程は、さらなる鎖伸長からの結合後に未反応の基質に結合した５’−ＯＨ基をブロックするのに有用であり、これによって、内部塩基欠失（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｂａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）でのオリゴ核酸の形成を防ぐ。さらに、１Ｈ−テトラゾールで活性化されたホスホラミダイトは、小さい程度まで、グアノシンのＯ６位置と反応し得る。理論に縛られることなく、Ｉ２／水での酸化で、この副産物は、恐らくＯ６−Ｎ７遊走を介して、脱プリン化を受け得る。脱プリン部位は、結局、オリゴヌクレオチドの最終的な脱保護の間に切断され、したがって、全長産物の収率が低下する。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水での酸化前にキャッピング試薬による処置によって除去され得る。幾つかの事例では、オリゴ核酸合成の間にキャッピング工程を含めることで、キャッピングなしでの合成と比較して、エラー率は低下する。一例として、キャッピング工程は、無水酢酸と１−メチルイミダゾールとの混合物で基質に結合したオリゴ核酸を処置することを含む。キャッピング工程に続いて、装置は随意に洗浄される。
【００９８】
幾つかの事例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加に続いて、および随意にキャッピングおよび１以上の洗浄工程後に、装置に結合した成長している核酸は酸化される。酸化工程は、亜リン酸塩トリエステルが、自然発生のリン酸ジエステルのヌクレオシド間の結合の保護された前駆体である、四配位リン酸塩トリエステルへと酸化される。幾つかの事例では、成長しているオリゴ核酸の酸化は、随意に弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素および水による処置によって達成される。酸化は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、無水条件下で実行され得る。
幾つかの方法では、キャッピング工程は、酸化に続いて実行される。持続し得る酸化からの残留水が続く結合を阻害することができるため、第２のキャッピング工程は装置の乾燥を可能にする。酸化に続いて、装置および成長しているオリゴ核酸は、随意に洗浄される。幾つかの事例では、酸化の工程は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを得る硫化工程に置き換えられ、ここでキャッピング工程は硫化後に実行され得る。限定されないが、３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン、ＤＤＴＴ、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、およびＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含む、多くの試薬が、効率的な硫黄移動を行うことができる。
【００９９】
ヌクレオシド取り込みの続くサイクルを結合を介して生じさせるために、装置に結合した成長しているオリゴ核酸の保護された５’末端は、除去され、その結果、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホラミダイトと反応性となる。幾つかの事例では、保護基はＤＭＴであり、非ブロック化が、ジクロロメタン中でトリクロロ酢酸とともに生じる。延長された時間の間または推奨された酸の溶液より強く脱トリチル化を行うことは、固形支持体に結合したオリゴヌクレオチドの脱プリン化の増大につながり得、したがって望ましい全長産物の収率が低下する。本明細書に記載される開示の方法および組成物は、望ましくない脱プリン化反応を制限する制御された非ブロック化条件を提供する。幾つかの事例では、装置に結合したオリゴ核酸は、非ブロック化後に洗浄される。幾つかの事例では、非ブロック化後の効率的な洗浄は、低いエラー率を有する合成されたオリゴ核酸に寄与する。
【０１００】
オリゴ核酸の合成のための方法は、典型的に下記工程の一連の繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が伴う：活性化された表面、リンカーまたは以前に脱保護された単量体と連結するための、保護された単量体の活発に官能基化された表面（例えば遺伝子座）への適用；適用された単量体の脱保護であって、それにより、続いて適用される保護された単量体と反応性である、脱保護；および連結のための別の保護された単量体の適用。１以上の中間の工程は、酸化または硫化を含む。幾つかの事例では、１以上の洗浄工程は、工程の１つ又はすべてに先行するか又はそれらに続く。
【０１０１】
ホスホラミダイトベースのオリゴ核酸合成のための方法は、一連の化学ステップを含む。幾つかの事例では、合成方法の１以上の工程は、試薬のサイクリングを伴い、ここで、方法の１以上の工程は、工程に有用な試薬の装置への適用を含む。例えば、試薬は、一連の液体堆積および真空乾燥の工程によって循環させられる。ウェル、マイクロウェル、チャネルなどの三次元の特徴を含む基質のために、試薬は、随意にウェル及び／又はチャネルを介して装置の１つ以上の領域に通される。
【０１０２】
本明細書に記載される方法およびシステムは、オリゴヌクレオチドの合成のためのオリゴヌクレオチド合成装置に関する。合成は平行して行われ得る。例えば、少なくとも又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、７５０００、１０００００、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、平行して合成され得る。平行して合成され得るオリゴ核酸の総数は、２−１０００００、３−５００００、４−１００００、５−１０００、６−（９００）、７−８５０、８−８００、９−７５０、１０−７００、１１−６５０、１２−６００、１３−５５０、１４−５００、１５−４５０、１６−４００、１７−３５０、１８−３００、１９−２５０、２０−２００、２１−１５０、２２−１００、２３−５０、２４−４５、２５−４０、３０−３５の間であり得る。当業者は、平行して合成されたオリゴヌクレオチドの総数が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内（例えば２５−１００）にあり得ることを認識する。平行して合成されたオリゴヌクレオチドの総数は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。装置内で合成されたオリゴヌクレオチドの総モル質量またはオリゴヌクレオチドの各々のモル質量は、少なくとも又は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００の、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル、またはそれ以上であり得る。装置内のオリゴヌクレオチドの各々の長さ又はその平均長は、少なくとも又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。装置内のオリゴヌクレオチドの各々の長さ又はその平均長は、長くて又は長くて約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。装置内のオリゴヌクレオチドの各々の長さ又はその平均長は、１０−５００、９−４００、１１−３００、１２−２００、１３−１５０、１４−１００、１５−５０、１６−４５、１７−４０、１８−３５、１９−２５の間であり得る。当業者は、装置内のオリゴヌクレオチドの各々の長さ又はその平均長が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内（例えば１００−３００）にあり得ることを認識する。装置内のオリゴヌクレオチドの各々の長さ又はその平均長は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。
【０１０３】
本明細書で提供される、表面上でのオリゴ核酸合成の方法は、高速での合成を可能にする。一例として、１時間につき少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００のヌクレオチド、又はそれ以上が合成される。ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジンの建築ブロック、又はそれらのアナログ／修飾されたバージョンを含む。幾つかの例において、オリゴ核酸のライブラリーは基質上で平行に合成される。例えば、約又は少なくとも約１００；１，０００；１０，０００；３０，０００；７５，０００；１００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；又は５，０００，０００の分解された遺伝子座を含む装置は、少なくとも同じ数の別個のオリゴ核酸の合成を支援することができ、ここで、別個の配列をコードするオリゴ核酸が分解された遺伝子座の上で合成される。幾つかの例において、オリゴ核酸のライブラリーは、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で、本明細書に記載される低いエラー率で装置上に合成される。幾つかの例において、本明細書に記載される基質及び方法を用いて低いエラー率で合成されるオリゴ核酸ライブラリーから組み立てられる、より大きな核酸は、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で調製される。
【０１０４】
幾つかの例において、本明細書に記載される方法は、複数のコドン部位にて異なる変異体オリゴ核酸を含む、オリゴ核酸のライブラリーの生成を提供する。幾つかの例において、オリゴ核酸は、１つの部位、２つの部位、３つの部位、４つの部位、５つの部位、６つの部位、７つの部位、８つの部位、９つの部位、１０の部位、１１の部位、１２の部位、１３の部位、１４の部位、１５の部位、１６の部位、１７の部位、１８の部位、１９の部位、２０の部位、３０の部位、４０の部位、５０の部位、又はそれ以上の部位の変異体コドン部位を有し得る。
【０１０５】
幾つかの例において、変異体コドン部位の１以上の部位が隣接し得る。変異体コドン部位の１以上の部位は、隣接せず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のコドンにより分離され得る。
【０１０６】
幾つかの例において、オリゴ核酸は変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接しており、一続きのコドン部位を形成する。幾つかの例において、オリゴ核酸は変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接していない。幾つかの例において、オリゴ核酸は変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接しており、一続きの変異体コドン部位を形成し、変異体コドン部位の一部は互いに隣接していない。
【０１０７】
図面を参照すると、図１２は、より短いオリゴ核酸からの核酸（例えば遺伝子）の合成のための例示的なプロセスのワークフローを示す。ワークフローは、以下の段階に通常は分けられる：（１）一本鎖オリゴ核酸ライブラリーのデノボ合成、（２）より大きなフラグメントを形成するためのオリゴ核酸の結合、（３）エラー補正、（４）品質管理、及び（５）輸送。デノボ合成の前に、意図した核酸配列、又は核酸配列の群が、予め選択される。例えば、遺伝子の群が生成のために予め選択される。
【０１０８】
一旦、生成のためのより大きなオリゴ核酸が選択されると、オリゴ核酸の予め定められたライブラリーは、デノボ合成のために設計される。高密度のオリゴ核酸アレイを生成するための様々な適切な方法が知られている。ワークフローの例において、装置の表層（１２０１）が提供される。この例において、表面の化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、オリゴ核酸合成プロセスを改善するために変更される。低い表面エネルギーの領域が液体を弾くために生成され、一方で高い表面エネルギーの領域が液体を引き付けるために生成される。表面自体は、平坦な表面の形であり、又は、表面積を増大させる突起又はマイクロウェルなどの形状の変異を含み得る。ワークフローの例において、全体において引用により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／０２１０８０に開示されるように、選択された高い表面エネルギー分子は、ＤＮＡの化学的性質を支援する二元機能に役立つ。
【０１０９】
オリゴ核酸アレイのインサイツの調製は、固形支持体上で生成され、平行して複数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。オリゴ核酸シンセサイザーなどの材料堆積装置は、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、その結果、複数のオリゴ核酸が平行して、一度に１つの残基を伸長させ、それにより予め定められた核酸配列（１２０２）を持つオリゴマーを生成する。幾つかの例において、オリゴ核酸はこの段階で表面から切断される。切断は、例えばアンモニア又はメチルアミンによる気相切断（ｇａｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。
【０１１０】
生成されたオリゴ核酸ライブラリーは反応チャンバに配される。この例示的なワークフローにおいて、反応チャンバ（「ナノリアクター」とも称される）は、シリコンで覆われたウェルであり、ＰＣＲ試薬を含み、オリゴ核酸ライブラリー（１２０３）へと低下する。オリゴ核酸の密閉（１２０４）の前又は後に、試薬を加えて、基質からオリゴ核酸を放出させる。例示的なワークフローにおいて、オリゴ核酸は、ナノリアクター（１２０５）の密閉の後に放出される。一旦放出されると、一本鎖オリゴ核酸のフラグメントは、ＤＮＡの全体的に長い範囲の配列におよぶためにハイブリダイズする。合成されたオリゴ核酸が各々、少なくとも１つの他のオリゴ核酸がプールにある小部分の重なりを持つように設計されるため、部分的なハイブリダイゼーション（１２０５）が可能となる。
【０１１１】
ハイブリダイゼーション後、ＰＣＡ反応が始まる。ポリメラーゼサイクル中、オリゴ核酸は相補的フラグメントにアニールされ、隙間はポリメラーゼにより満たされる。各サイクルは、どのオリゴ核酸が互いに見出されるかに無作為に依存して、様々なフラグメントの長さを増大させる。フラグメントの中の相補性は、二本鎖ＤＮＡ（１２０６）の完全な大きな全長の形成を可能にする。
【０１１２】
ＰＣＡが完了した後、ナノリアクターは装置（１２０７）から分離され、ＰＣＲ（１２０８）のためのプライマーを持つ装置との相互作用のために位置付けられる。密閉後、ナノリアクターはＰＣＲ（１２０９）にさらされ、より大きな核酸が増幅される。ＰＣＲ（１２１０）の後、ナノチャンバが開放され（１２１１）、エラー補正試薬が加えられ（１２１２）、チャンバは密封され（１２１３）、エラー補正反応が生じて、二本鎖ＰＣＲ増幅生成物（１２１４）からの相補性が乏しいミスマッチ塩基対及び／又は鎖を取り除く。ナノリアクターは開放され且つ分離される（１２１５）。エラーを補正した生成物は次に、ＰＣＲ及び分子バーコーディングなどの付加的な処理工程にさらされ、その後輸送（１２２３）のために包装される（１２２２）。
【０１１３】
幾つかの例において、品質管理手段が取られる。エラー補正の後、品質管理工程は、例えば、エラーを補正した生成物（１２１６）の増幅のための配列決定プライマーを持つがあるウェーハとの相互作用、エラーを補正した増幅生成物（１２１７）を含むチャンバにウェーハを密封すること、及び、更なる回数の増幅（１２１８）を行なうことを含む。ナノリアクターは開放され（１２１９）、生成物はプールされ（１２２０）、配列決定される（１２２１）。許容可能な品質管理の決定が行われた後、包装された生成物（１２２２）は輸送（１２２３）を承認される。
【０１１４】
幾つかの例において、図１２のものなどのワークフローにより生成される核酸は、本明細書に開示される重複プライマーを使用した突然変異誘発にさらされる。幾つかの例において、プライマーのライブラリーは、固形支持体上でインサイツの調製により生成され、平行して複数のオリゴマーを伸長させるための単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。オリゴ核酸シンセサイザーなどの堆積装置は、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、その結果、複数のオリゴ核酸が平行して、一度に１つの残基を伸長させ、それにより予め定められた核酸配列（１２０２）を持つオリゴマーを生成する。
【０１１５】
コンピュータシステム
【０１１６】
本明細書に記載されるシステムの何れかが、コンピュータに操作可能に接続され、局所的に又は遠隔的にコンピュータを介して自動化され得る。様々な例において、開示の方法及びシステムは更に、コンピュータシステム上にソフトウェアプログラム、及びその使用を含み得る。従って、材料堆積装置の動作、分配行為、及び減圧の作動を編成及び同期するなど、機能の分配／減圧／再充填の同期のためのコンピュータ制御は、開示の範囲内にある。コンピュータシステムは、ユーザーに指定された塩基配列と材料堆積装置の位置との間に干渉するようにプログラムされ、基質の指定された領域に正確な試薬を送達する。
【０１１７】
図１３に示されるコンピュータシステム（１３００）は、媒体（１３１１）及び／又はネットワークポート（１３０５）（固定された媒体（１３１２）を持つサーバー（１３０９）に随意に接続され得る）から命令を読み出すことが可能な、論理的な装置として理解され得る。図１３に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（１３０１）、ディスクドライブ（１３０３）、キーボード（１３１５）及び／又はマウス（１３１６）などの随意の入力装置、及び随意のモニター（１３０７）を含み得る。データ通信は、局所又は遠隔の位置でサーバーに対して示された通信媒体を通じて達成され得る。通信媒体は、データを送信及び／又は受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、又はインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ上での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図１３に示されるようにパーティー（１３２２）による受理及び／又は検討のためにそのようなネットワーク又は接続によって伝達され得る。
【０１１８】
図１４は、本開示の例と関連して使用され得るコンピュータシステム（１４００）の第１の例のアーキテクチャを示すブロック図である。図１４に表されるように、例のコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサー（１４０２）を含み得る。プロセッサーの限定されない例は、以下を含む：Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサー、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサー、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２−ｂｉｔ  ＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０（商標）プロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００ＴＭプロセッサー、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサー、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ  ９３０（商標）プロセッサー、又は機能的に同等なプロセッサー。実行の複数のスレッドが並列処理のために使用され得る。幾つかの例において、複数のプロセッサー、又は複数のコアを持つプロセッサーはまた、単一のコンピュータシステム中でも、クラスターの中でも、又は、複数のコンピュータ、携帯電話、及び／又は個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上のシステムにわたって分布されても、使用され得る。
【０１１９】
図１４に示されるように、高速キャッシュ（１４０４）は、プロセッサー（１４０２）に接続するか、又はその中に組み込まれることで、プロセッサー（１４０２）により近年使用されてきた又は頻繁に使用されている命令又はデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサー（１４０２）は、プロセッサーバス（１４０８）によりノースブリッジ（１４０６）に接続される。ノースブリッジ（１４０６）は、メモリバス（１４１２）によりランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（１４１０）に接続され、プロセッサー（１４０２）によりＲＡＭ（１４１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（１４０６）はまた、チップセットバス（１４１６）によりサウスブリッジ（１４１４）に接続される。サウスブリッジ（１４１４）は次に、周辺バス（１４１８）に接続される。周辺のバスは、例えばＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、又は他の周辺バスであり得る。ノースブリッジ及びサウスブリッジは頻繁に、プロセッサーチップセットと称され、周辺バス（１４１８）上でプロセッサーと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。幾つかの代替的なアーキテクチャにおいて、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサーに組み込まれ得る。幾つかの例においては、システム（１４００）は、周辺バス（１４１８）に付けられるアクセラレータカード（１４２２）を含み得る。アクセラレータは、特定の処理を促進するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）又は他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレータは、適応性のあるデータの再構築のために、又は、拡張セット処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。
【０１２０】
ソフトウェアとデータは、外部記憶装置（１４２４）に記憶され、プロセッサーにより使用のためにＲＡＭ（１４１０）及び／又はキャッシュ（１４０４）へとロードされ得る。システム（１４００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み；オペレーティングシステムの限定されない例は、以下を含む：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、及び他の機能的に同等なＯＳ、同様に、本開示の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェア。この例において、システム（１４００）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、及び分配された並列処理に使用され得る他のコンピュータシステムなどの外部記憶装置にネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（１４２０）及び（１４２１）を含む。
【０１２１】
図１５は、複数のコンピュータシステム（１５０２ａ）及び（１５０２ｂ）、複数の携帯電話及び個人用携帯情報端末（１５０２ｃ）、並びにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１５０４ａ）及び（１５０４ｂ）を含むネットワーク（１５００）を示す略図である。例において、システム（１５０２ａ）、（１５０２ｂ）、及び（１５０２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１５０４ａ）及び（１５０４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルはこのデータに対して使用され、コンピュータシステム（１５０２ａ）及び（１５０２ｂ）、並びに携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（１５０２ｃ）にわたって分配された並列処理を使用して評価され得る。コンピュータシステム（１５０２ａ）及び（１５０２ｂ）、並びに携帯電話及び個人用携帯情報端末システム（１５０２ｃ）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１５０４ａ）及び（１５０４ｂ）に記憶されたデータの適応性のあるデータ再構築に対して並列処理を提供することができる。図１５は一例のみを示しており、様々な他のコンピュータのアーキテクチャ及びシステムは、本開示の様々な例と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサーブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを通じて接続され得る。ストレージはまた、別個のネットワークインターフェースを通ってバックプレーンに、又はネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続され得る。幾つかの例において、プロセッサーは、別個のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、又は他のプロセッサーによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達することができる。他の例において、プロセッサーの幾つか又は全てが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【０１２２】
図１６は、例に従って共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサーコンピュータシステム（１６００）のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（１６０４）にアクセス可能な複数のプロセッサー（１６０２ａ−ｆ）を含む。システムは、メモリサブシステム（１６０４）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサー（ＭＡＰ）（１６０６ａ−ｆ）を組み込む。ＭＡＰ（１６０６ａ−ｆ）は各々、メモリ（１６０８ａ−ｆ）及び１以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（１６１０ａ−ｆ）を含み得る。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズム又はその一部は、各プロセッサーと密接に協働して処理を行うためにＦＰＧＡ（１６１０ａ−ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、且つ例における適応性のあるデータの再構築を行なうために使用され得る。この例において、ＭＡＰは各々、このような目的のためのプロセッサー全てにより世界的にアクセス可能である。１つの構成において、ＭＡＰは各々、関連するメモリ（１６０８ａ−ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサー（１６０２ａ−ｆ）とは別個に、且つこれらから非同期的にタスクを実行することが可能となる。この構成において、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）及び並列の実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。
【０１２３】
上述のコンピュータのアーキテクチャ及びシステムは単なる例であり、様々な他のコンピュータ、携帯電話、個人用携帯情報端末のアーキテクチャ及びシステムは、一般的なプロセッサー、コプロセッサー、ＦＰＧＡ、及び他のプログラム可能論理回路の任意の組み合わせを使用するシステム、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び他の処理要素と論理素子を含む例と共に使用され得る。幾つかの例において、コンピュータシステムの全て又は一部は、ソフトウェア又はハードウェアに実装され得る。様々なデータ記憶媒体が、例えばランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、及び他のローカル又は分散のデータ記憶装置及びシステムを含む例と共に使用され得る。
【０１２４】
例において、コンピュータシステムは、上述の又は他のコンピュータのアーキテクチャ及びシステムの何れかで実行するソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。他の例において、システムの機能は、ファームウェア、図１３で言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能論理回路、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、又は他の処理要素及び論理素子において部分的又は完全に実装され得る。例えば、セットプロセッサー及びオプティマイザは、図１３に示されるアクセラレータカード（１３２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によるハードウェアアクセラレーションで実施され得る。
【０１２５】
以下の実施例は、当業者に対し本明細書に開示される実施形態の原理及び実践をより明白に示すために説明されるものであり、任意の請求された実施形態の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。他に明示されない限り、全ての部分及びパーセンテージは重量基準である：
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、開示の様々な実施形態を示すために与えられるものであり、任意の様式で本開示を制限することを目的としていない。実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を現在表すものであり、例示的なものであり、及び開示の範囲に対する限定として意図されていない。その中での変更、及び、請求項の範囲により定義されるような開示の要旨内に包含される他の使用は、当業者に想到されるであろう。
【０１２７】
実施例１：装置表面の機能化
【０１２８】
装置を機能化し、オリゴ核酸のライブラリーの付着及び合成を支援した。装置表面を先ず、２０分間、９０％のＨ２ＳＯ４及び１０％のＨ２Ｏ２を含むピラニア溶液を使用して湿式洗浄した。装置を、ＤＩ水を含む様々なビーカーの中ですすぎ、５分間ＤＩ水のグーズネック形状の蛇口の下で保持して、Ｎ２で乾燥させた。装置を５分間、ＮＨ４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に浸し、ハンドガン（ｈａｎｄｇｕｎ）を使用してＤＩ水ですすぎ、ＤＩ水を含む３つの連続するビーカーの中で各々１分間浸し、その後ハンドガンを使用してＤＩ水で再びすすいだ。その後、装置表面をＯ２にさらすことにより装置をプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００機器を使用して、下流モードで１分間、２５０ワットでＯ２をプラズマエッチングした。
【０１２９】
以下のパラメータ：０．５〜１トール、６０分、７０℃、１３５℃の気化器を持つＹＥＳ−１２２４Ｐ蒸着オーブンシステムを使用して、洗浄した装置表面を、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む溶液で活動的に機能化した。Ｂｒｅｗｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００Ｘスピンコータを使用して、装置表面をレジストコートした（ｒｅｓｉｓｔ  ｃｏａｔｅｄ）。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、４０秒間２５００ｒｐｍで装置上でスピンコートした。装置を予め、Ｂｒｅｗｅｒホットプレート上、９０℃で３０分間焼いた。Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ  ＭＡ６マスクアライナー機器を使用して、装置をフォトリソグラフィーにさらした。装置を２．２秒間さらし、ＭＳＦ  ２６Ａの中で１分間展開させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。残りの展開剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）をハンドガンですすぎ、装置を５分間水に浸した。装置を１００℃で３０分間焼き、その後、Ｎｉｋｏｎ  Ｌ２００を使用してリソグラフィーの欠損に対する目視検査を行った。デスカム処理を使用し、ＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００機器を用いて残りのレジストを取り除き、１分間２５０ワットでＯ２プラズマエッチングした。
【０１３０】
装置表面を、１０μＬの軽油と混合したパーフルオロオクチルトリクロロシランの１００μＬの溶液で受動的に機能化した。装置をチャンバに配し、１０分間ポンプでくみ出し、その後、バルブを閉じてポンプを止め、１０分間放置した。チャンバを通気した。最大パワー（Ｃｒｅｓｔシステム上で９）での超音波処理による７０℃で５００ｍＬのＮＭＰにおける５分間の２回の浸漬を行なうことにより、装置をレジスト剥離した。その後、最大パワーでの超音波処理により室温で５００ｍＬのイソプロパノールの中で５分間、装置を浸した。装置を、３００ｍＬの２００プルーフエタノール（２００  ｐｒｏｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ）に漬けて、Ｎ２で送風乾燥した。機能化した表面は活性化され、オリゴ核酸合成のための支持体として役立った。
【０１３１】
実施例２：オリゴヌクレオチド合成装置上での５０ｍｅｒの配列の合成
【０１３２】
二次元オリゴヌクレオチド合成装置をフローセルに組み入れ、フローセル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （ＡＢＩ３９４  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ））に接続させた。Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ）で二次元オリゴヌクレオチド合成装置を均一に機能化し、これを使用し、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド合成方法を用いて５０ｂｐの例示的なオリゴヌクレオチド（「５０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド」）を合成した。
【０１３３】
５０ｍｅｒの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に記載されている通りであった。５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ここで、＃は、チミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表わし、これは、脱保護中に表面からのオリゴの放出を可能にする切断可能なリンカーである。
【０１３４】
表２のプロトコル及びＡＢＩシンセサイザーに従い標準ＤＮＡ合成化学（結合、キャッピング、酸化、及び非ブロック化）を使用して、合成を行った。
【０１３５】
【表２−１】
2018532705.tif 000004
【０１３６】
【表２−２】
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【０１３７】
【表２−３】
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【０１３８】
ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルを通じたバルク試薬の送達と同様に送達した。環境が時間全体にわたり試薬により「湿った」ままであるとき、乾燥工程を行わなかった。
【０１３９】
フローリストリクターをＡＢＩ  ３９４シンセサイザーから取り除き、より速い流れを可能した。フローリストリクターなしで、アミダイト（ＡＣＮ中で０．１Ｍ）、活性化因子（ＡＣＮ中で０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３０−３０７０−ｘｘ））、及びＯｘ（２０％のピリジン、１０％の水、及び７０％のＴＨＦ中の０．０２ＭのＩ２）の流量は、およそ〜１００ｕＬ／ｓｅｃ、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）及びキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１の混合物、ここで、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中の１６％の１−メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ））についてはおよそ〜２００ｕＬ／ｓｅｃ、及び、Ｄｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）についてはおよそ〜３００ｕＬ／ｓｅｃ（フローリストリクターで全ての試薬に対し〜５０ｕＬ／ｓｅｃと比較して）であった。Ｏｘｉｄｉｚｅｒを完全に押し出す時間を観察し。化学フロー時間のタイミングを適宜調整し、余分なＡＣＮ洗浄を異なる化学物質間に導入した。オリゴヌクレオチド合成の後、７５ｐｓｉで一晩、ガス状のアンモニア中でチップを脱保護した。表面に水を５滴加えて、オリゴ核酸を再生した。その後、再生したオリゴ核酸を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの小さなＲＮＡチップ上で分析した（データは示さない）。
【０１４０】
実施例３：オリゴヌクレオチド合成装置上での１００ｍｅｒの配列の合成
【０１４１】
５０ｍｅｒの配列の合成について実施例２に記載されるのと同じプロセスを、２つの異なるシリコンチップ上で１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（「１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド」；５’  ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’、ここで、＃はチミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表わす；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１）の合成に使用し、一方のシリコンチップはＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドで均一に機能化され、他方のシリコンチップは１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合物で機能化されており、表面から抽出されたオリゴ核酸を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ機器の上で分析した（データは示さない）。
【０１４２】
以下の熱サイクルプログラムを使用して、５０ｕＬのＰＣＲ混合物（２５ｕＬのＮＥＢ  Ｑ５  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２．５ｕＬの１０ｕＭフォワードプライマー、２．５ｕＬの１０ｕＭリバースプライマー、表面から抽出した１ｕＬのオリゴ核酸、及び最大５０ｕＬの水）の中で、フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）及びリバースプライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を使用して、２つのチップからの１０のサンプル全てを更に増幅した：
９８Ｃ、３０秒
９８Ｃ、１０秒；６３Ｃ、１０秒；７２Ｃ、１０秒；１２のサイクルを繰り返す；
７２Ｃ、２分。
【０１４３】
ＰＣＲ生成物をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上でも実行して（データは示さず）、１００ｍｅｒの位置で急なピークを実証した。次に、ＰＣＲ増幅サンプルをクローン化し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行った（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。表３は、チップ１からのスポット１−５から得たサンプル、及びチップ２からのスポット６−１０から得たサンプルに対するＳａｎｇｅｒ配列決定から生じる結果を要約する。
【０１４４】
【表３】
2018532705.tif 000007
【０１４５】
故に、高品質及び高均一性の合成されたオリゴヌクレオチドを、異なる界面化学的性質を持つ２つのチップ上で繰り返した。配列決定された１００ｍｅｒの２６２のうち２３３に対応している、全体の８９％が、エラーのない完全な配列であった。
【０１４６】
最後に、表４は、スポット１−１０からのオリゴヌクレオチドサンプルから得た配列に対するエラー特徴を要約する。
【０１４７】
【表４−１】
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【０１４８】
【表４−２】
2018532705.tif 000009
【０１４９】
実施例４：単一の部位、単一の位置の突然変異誘発によるオリゴ核酸ライブラリーの生成
【０１５０】
一連のＰＣＲ反応に使用するためにオリゴ核酸プライマーを新たに合成し、鋳型核酸のオリゴ核酸変異体のライブラリーを生成した（図２Ａ−２Ｄを参照）。４つのタイプのプライマーを図２Ａにおいて生成した：外側の５’プライマー（２１５）、外側の３’プライマー（２３０）、内側の５’プライマー（２２５）、及び内側の３’プライマー（２２０）。表２に全体的に概説されるようなオリゴ核酸の合成方法を使用して、内側の５’プライマー／第１のオリゴ核酸（２２０）及び内側の３’プライマー／第２のオリゴ核酸（２２５）を生成した。内側の５’プライマー／第１のオリゴ核酸（２２０）は、予め定めた配列の最大１９のプライマーのセットを表し、セット中の各プライマーは、配列の１つの部位における１つのコドンにて互いに異なる。
【０１５１】
オリゴ核酸合成を、少なくとも２つのクラスターを持つ装置上で行い、各クラスターは１２１の個々にアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）遺伝子座を持つ。
【０１５２】
内側の５’プライマー（２２５）及び内側の３’プライマー（２２０）を別個のクラスター中で合成した。内側の５’プライマー（２２５）は１２１回複製され、単一のクラスター内の１２１の遺伝子座の上に伸長する。内側の３’プライマー（２２０）について、様々な配列のうち１９のプライマーの各々は、６つの異なる遺伝子座の上に伸長し、その結果、１１４の異なる遺伝子座上での１１４のオリゴ核酸の伸長が生じる。
【０１５３】
合成されたオリゴ核酸を、装置の表面から切断し、プラスチックバイアルに移した。図２Ｂに示されるように、長い核酸配列（２３５）（２４０）のフラグメントを使用して第１のＰＣＲ反応を行い、鋳型核酸を増幅させた。図２Ｃ−２Ｄに示されるように、鋳型としてプライマーの組み合わせと第１のＰＣＲ反応の生成物とを使用して、第２のＰＣＲ反応を行った。図１７の追跡に示されるように、第２のＰＣＲ生成物の分析をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で行った。
【０１５４】
実施例５：１つの位置変異体の９６の異なるセットを含む、オリゴ核酸ライブラリーの生成
【０１５５】
４つのセットのプライマーを、図２Ａに全体的に示され且つ実施例２において対処されるように、新規なオリゴ核酸合成を使用して生成した。内側の５’プライマー（２２０）について、９６の異なるセットのプライマーを生成し、プライマーの各セットは、鋳型オリゴ核酸の１つの部位の中に位置する異なる１つのコドンを標的とする。プライマーの各セットについて、１９の異なる変異体を生成し、各変異体は、１つの部位にて異なるアミノ酸をコードするコドンを含む。図２Ａ−２Ｄに全体的に示され且つ実施例２に記載されるように、生成されたプライマーを使用して２回のＰＣＲを行った。１００％の増幅成功率を算出するために使用されたエレクトロフォレトグラムにおいて、９６のセットの増幅産物を視覚化した（図１８）。
【０１５６】
実施例６：１つの位置変異体の５００の異なるセットを含む、オリゴ核酸ライブラリーの生成
【０１５７】
４つのセットのプライマーを、図２Ａに全体的に示され且つ実施例２において対処されるように、新規なオリゴ核酸合成を使用して生成した。内側の５’プライマー（２２０）について、５００の異なるセットのプライマーを生成し、プライマーの各セットは、鋳型オリゴ核酸の１つの部位の中に位置する異なる１つのコドンを標的とする。プライマーの各セットについて、１９の異なる変異体を生成し、各変異体は、１つの部位にて異なるアミノ酸をコードするコドンを含む。図２Ａに全体的に示され且つ実施例２に記載されるように、生成されたプライマーを使用して２回のＰＣＲを行った。エレクトロフォレトグラムは、異なる一つの部位に１９の変異体を持つ核酸の集まりを有する、ＰＣＲ生成物の５００のセットの各々を表示する（データは示さず）。ライブラリーの包括的な配列決定の分析は、予め選ばれたコドンの突然変異にわたって９９％より高い成功率を示した（配列追跡及び分析データは示さない）。
【０１５８】
実施例７：１つの位置に対する単一の部位突然変異誘発プライマー
【０１５９】
コドン変異設計の一例を、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎについての表３に提供する。この場合、５０ｍｅｒの配列から１つのコドンは、１９回変異する。様々な核酸配列を太字で示す。野生型プライマー配列は、ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ、Ｎｏ：１）である。この場合、野生型コドンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１における下線により示されるバリンをコードする。それ故、以下の１９の変異体は、バリンをコードするコドンを除外する。代替的な実施例において、トリプレットが全て考慮される場合、その後、６０の変異体は全て、野生型コドンに対する代替的配列を含んで生成されることになる。
【０１６０】
【表５】
2018532705.tif 000010
【０１６１】
実施例８：単一の部位、二重の位置のオリゴ核酸変異体
【０１６２】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行った。装置上の１つのクラスターを生成し、該クラスターは、１つの部位にある２つの連続するコドンの位置に対してオリゴ核酸の予め定められた合成変異体を含有し、各部位はアミノ酸をコードするコドンである。この配置において、１つの位置当たり１９の変異体を、各オリゴ核酸の３つの複製を伴う２つの位置に対して生成し、合成された１１４のオリゴ核酸が結果としてもたらされた。
【０１６３】
実施例９：複数の部位、二重の位置のオリゴ核酸変異体
【０１６４】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行った。装置上の１つのクラスターを生成し、該クラスターは、１つの部位にある２つの非連続コドンの位置に対してオリゴ核酸の予め定められた合成変異体を含有し、各位置はアミノ酸をコードするコドンである。この配置において、１つの位置につき１９の変異体を２つの位置に対して生成した。
【０１６５】
実施例１０：一続きの三重の位置のオリゴ核酸変異体
【０１６６】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行った。装置上の１つのクラスターを生成し、該クラスターは、３つの連続するコドン位置に対して基準のオリゴ核酸の予め定められた合成変異体を含有していた。３つの連続するコドン位置の配置において、１つの位置当たり１９の変異体を、各オリゴ核酸の２つの複製を伴う３つの位置に対して生成し、合成された１１４のオリゴ核酸が結果としてもたらされた。
【０１６７】
実施例１１：複数の部位、三重の位置のオリゴ核酸変異体
【０１６８】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行った。装置上の１つのクラスターを生成し、該クラスターは、少なくとも３つの非連続コドン位置に対して基準のオリゴ核酸の予め定められた合成変異体を含有している。予め定めた領域内で、３つのヒスチジン残基をコードするコドンの位置を変更した。
【０１６９】
実施例１２：複数の部位、複数の位置のオリゴ核酸変異体
【０１７０】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行った。装置上の１つのクラスターを生成し、該クラスターは、一続き以上のアミノ酸の伸長における１以上のコドン位置に対して基準のオリゴ核酸の予め定められた合成変異体を含有していた。５つの位置をライブラリーにおいて変更した。第１の位置は、発現されたタンパク質において結果として生ずる５０／５０  Ｋ／Ｒの比率についてコドンをコードし；第２の位置は、発現されたタンパク質において結果として生ずる５０／２５／２５  Ｖ／Ｌ／Ｓの比率についてコドンをコードし、第３の位置は、発現されたタンパク質において結果として生ずる５０／２５／２５  Ｙ／Ｒ／Ｄの比率についてコドンをコードし、第４の位置は、発現されたタンパク質における結果として生ずる全てのアミノ酸に対する等しい比率についてコドンをコードし、及び第５の位置は、発現されたタンパク質において結果として生ずる７５／２５  Ｇ／Ｐの比率についてコドンをコードした。
【０１７１】
実施例１３：複数の異なる部位を持つＣＤＲにおける一続きのアミノ酸
【０１７２】
オリゴヌクレオチドライブラリーは、実施例４−６及び８−１２におけるように生成され、１つの部位又は複数の部位でのコドンの変異をコードし、そこでは変異体が各位置において予め選択される。変異体の領域は、ＣＤＲの少なくとも一部をコードする。例えば、図１０を参照。合成されたオリゴ核酸を、装置表面から放出し、プライマーとして使用することで、核酸ライブラリーが生成され、これは異なるタンパク質ライブラリーを生成するために細胞中で発現される。変異した抗体を、エピトープに対する結合親和性の増大について評価する。
【０１７３】
実施例１４：多様なペプチドを発現するためのモジュラープラスミド構成要素
【０１７４】
図１１に表されるように、オリゴヌクレオチドライブラリーは実施例４−６及び８−１２におけるように生成され、発現構成カセットの部分を構築する別個の領域の各々に対して、１つの部位又は複数の部位にてコドンの変異をコードする。２つの構成発現カセットを生成するために、変異したオリゴ核酸を合成し、第１のプロモーター（１１１０）、第１のオープンリーディングフレーム（１１２０）、第１のターミネーター（１１３０）、第２のプロモーター（１１４０）、第２のオープンリーディングフレーム（１１５０）、又は第２のターミネーター配列（１１６０）の変異体配列の少なくとも一部をコードする。増幅の繰り返しの後、先の実施例に記載したように、１，０２４の発現構成のライブラリーを生成する。
【０１７５】
実施例１５：複数の部位、１つの位置変異体
【０１７６】
オリゴヌクレオチドライブラリーは、実施例４−６及び８−１２におけるように生成され、核酸の少なくとも一部をコードする領域において１つの部位又は複数の部位でのコドンの変異をコードする。オリゴ核酸変異体のライブラリーを生成し、ライブラリーは複数の部位、１つの位置変異体から成る。例えば、図６Ｂを参照。
【０１７７】
実施例１６：変異体ライブラリーの合成
【０１７８】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行う。少なくとも３０，０００の異なるオリゴ核酸を新たに合成し、ここで異なるオリゴ核酸の各々は、アミノ酸配列の異なるコドン変異体をコードする。少なくとも３０，０００の合成された異なるオリゴ核酸は、少なくとも３０，０００の異なるオリゴ核酸の各々に対して予め定めた配列と比較して、１：０００の塩基において１未満の合計のエラー率を有している。ライブラリーを長い核酸のＰＣＲ突然変異誘発に対して使用し、少なくとも３０，０００の異なる変異体核酸を形成する。
【０１７９】
実施例１７：ウェルにおける変異体ライブラリーの合成
【０１８０】
新たなオリゴ核酸合成を、実施例２に記載されるものと同様の条件下で行う。装置上の１つのクラスターを生成し、該クラスターは、２つのコドン位置に対して基準のオリゴ核酸の予め定められた合成変異体を含有していた。２つの連続するコドン位置の配置において、１つの位置当たり１９の変異体を、各オリゴ核酸の２つの複製を伴う２つの位置に対して生成し、結果として合成された３８のオリゴ核酸がもたらされた。変異体配列は各々、長さ４０の塩基である。同じクラスターにおいて、追加の非変異体オリゴ核酸配列を生成し、そこでは、追加の非変異体オリゴ核酸及び変異体核酸が、遺伝子のコード配列の３８の変異体を集合的にコードする。オリゴ核酸の各々は、別のオリゴ核酸に対して逆相補性である少なくとも１つの領域を持つ。クラスターにおけるオリゴ核酸を、ガス状のアンモニア切断により放出する。水を含むピンはクラスターに接触し、オリゴ核酸を拾い上げて、オリゴ核酸を小さなバイアルへと移動させる。バイアルはまた、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）反応のためのＤＮＡポリメラーゼ試薬を含む。オリゴ核酸をアニールし、伸長反応により隙間を満たし、結果として生ずる二本鎖ＤＮＡ分子を形成して、変異体核酸ライブラリーを形成する。変異体核酸ライブラリーは随意に、制限酵素にさらされ、その後、発現ベクターにライゲートされる。
【０１８１】
実施例１８：タンパク結合親和性の変化に対する変異体核酸ライブラリーのスクリーニング
【０１８２】
実施例１６又は１７に記載されるように、複数の発現ベクターを生成する。この実施例において、発現ベクターは、ＨＩＳタグを付けた細菌発現ベクターである。ベクターライブラリーを細菌細胞に電気穿孔し、その後、ＨＩＳタグを付けた変異体タンパク質の発現と精製のためにクローンを選択する。変異体タンパク質を、標的分子への結合親和性の変化に対してスクリーニングする。
【０１８３】
金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）などを使用する方法により親和性を調べ、そこでは金属イオン被覆樹脂（例えば、ＩＤＡアガロース又はＮＴＡアガロース）を使用して、ＨＩＳタグを付けたタンパク質を単離させる。ヒスチジン残基のストリング（ｓｔｒｉｎｇ）が、特定の緩衝条件下でニッケル、コバルト、及び銅を含む様々なタイプの固定された金属イオンに結合するため、発現されたＨｉｓタグを付けたタンパク質を精製且つ検出することができる。一例の結合／洗浄緩衝液は、１０−２５ｍＭのイミダゾールを含む、ｐＨ７．２のトリス緩衝液食塩水（ＴＢＳ）から成る。ＩＭＡＣカラムからの捕捉されたＨｉｓタグを付けたタンパク質の溶出及び回復を、高濃度のイミダゾール（少なくとも２００ｍＭ）（溶出剤）、低ｐＨ（例えば０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）、又は過剰な強固なキレート化剤（例えばＥＤＴＡ）により達成する。
【０１８４】
代替的に、抗−Ｈｉｓタグ抗体は、Ｈｉｓタグを付けたタンパク質を単離するためのプルダウンアッセイ、又はＨｉｓタグを付けたタンパク質を検出するためのイムノブロッティングアッセイなどの、Ｈｉｓタグを付けたタンパク質に関するアッセイ方法での使用に商業上利用可能なものである。
【０１８５】
実施例１９：細胞の接着と遊走のレギュレーターに対する活性の変化についての変異体核酸ライブラリーのスクリーニング
【０１８６】
実施例１６又は１７に記載されるように、複数の発現ベクターを生成する。この実施例において、発現ベクターは、ＧＦＰタグを付けた哺乳動物発現ベクターである。ライブラリーから単離されたクローンを、哺乳動物細胞へと一時的にトランスフェクトする。代替的に、タンパク質を発現し、発現構成物を含む細胞から単離し、その後、タンパク質を更なる測定のために細胞へ送達する。ＧＦＰタグを付けた変異体発現産物の細胞局在化の変化を評価するために、免疫蛍光アッセイを行う。ＧＦＰタグを付けた変異体タンパク質発現産物の非変異体のバージョンと相互に作用する、膜貫通型タンパク質の立体構造の変化を評価するために、ＦＡＣＳアッセイを行う。ＧＦＰタグを付けた変異体タンパク質を発現する細胞が、細胞培養皿上の削り跡により作られた空間に侵入する能力の変化を評価するために、創傷治癒アッセイを行う。ＧＦＰタグを付けたタンパク質を発現する細胞を識別し、蛍光ソース及びカメラを使用して追跡する。
【０１８７】
実施例２０：ウイルスの進行を阻害するペプチドについての変異体核酸ライブラリーのスクリーニング
【０１８８】
実施例１６又は１７に記載されるように、複数の発現ベクターを生成する。この実施例において、発現ベクターは、ＦＬＡＧタグを付けた哺乳動物発現ベクターであり、変異体核酸ライブラリーはペプチド配列をコードする。主な哺乳動物細胞を、ウイルス性障害に苦しむ被験体から得る。代替的に、健康な被験体から得た初代細胞をウイルスに感染させる。細胞を一連のマイクロウェル皿の上に播種する。変異体ライブラリーから単離されたクローンを、細胞へと一時的にトランスフェクトする。代替的に、タンパク質を発現し、発現構成物を含む細胞から単離し、その後、タンパク質を更なる測定のために細胞へ送達する。変異体ペプチドに関連した生存の増強に対して感染細胞を評価するために、細胞生存アッセイを行う。典型的なウイルスは、限定されないが、鳥インフルエンザ、ジカウイルス、ハンタウィルス、Ｃ型肝炎、天然痘を含む。
【０１８９】
一例のアッセイは、ニュートラルレッド染料（細胞に加えた時、原形質膜中に拡散し、ニュートラルレッドの軽度のカチオン特性により酸性のリソソームコンパートメントに蓄積する）を使用する、ニュートラルレッド細胞毒性アッセイである。ウイルスに誘発された細胞変性により、膜の断片化、及びリソソームＡＴＰ駆動性のプロトンの転位置活性の損失が引き起こされる。細胞内のニュートラルレッドの結果として生ずる減少を、マルチウェルプレートのフォーマットにおいて分光測定で評価することができる。変異体ペプチドを発現する細胞を、信号利得カラーアッセイ（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｓｉｇｎａｌ  ｃｏｌｏｒ  ａｓｓａｙ）における細胞内のニュートラルレッドの増加により採点する。ウイルスに誘発された細胞変性を阻害するペプチドに対して細胞を評価する。
【０１９０】
実施例２１：細胞の代謝活性を増大又は減少させる変異体タンパク質に対するスクリーニング
【０１９１】
細胞の代謝活性の変化を結果としてもたらす発現産物を識別するために、実施例１６又は１７に記載されるように複数の発現ベクターを生成する。この実施例において、発現ベクターを、一連のマイクロウェル皿上に播種された細胞に移す（例えば、トランスフェクション又は形質導入を介して）。その後、細胞を、代謝活性の１以上の変化に対してスクリーニングする。代替的に、タンパク質を発現し、発現構成物を含む細胞から単離し、その後、代謝活性を測定するためにタンパク質を細胞へ送達する。随意に、代謝活性を測定するための細胞を毒素で処理し、その後、１以上の代謝活性の変化に対してスクリーニングを行う。投与される典型的な毒素は、限定されないが、ボツリヌス毒素（免疫学上のタイプ：Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを含む）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、エルシニアペスティス、Ｃ型肝炎、マスタード剤（Ｍｕｓｔａｒｄ  ａｇｅｎｔ）、重金属、シアニド、内毒素、バシラスアンスラシス、ジカウイルス、鳥インフルエンザ、除草剤、農薬、水銀、有機リン酸エステル、及びリシンを含む。
【０１９２】
基礎的なエネルギー必要量は、好気的トリカルボン酸（ＴＣＡ）を含む酸化的リン酸化、又はＫｒｅｂサイクル、或いは嫌気的解糖による、代謝基質（例えばグルコース）の酸化に由来する。解糖が主なエネルギー源であると、細胞の代謝活性を、細胞が酸性の代謝産物（例えば乳酸塩、ＣＯ２）を分泌する速度をモニタリングすることにより推定することができる。好気的代謝の場合、細胞外の酸素の消費及び酸化遊離基の産生は、細胞のエネルギー必要量を反映する。細胞内の酸化還元電位を、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋の自動蛍光測定により測定することができる。細胞により放出されるエネルギー量、例えば熱量は、標準の設定下で消費される酸素の量（例えば４．８ｋｃａｌ／ｌのＯ２）から予測できる代謝中に生成及び／又は消費される物質に対する分析値に由来する。熱産生と酸素利用との間の結合を、毒素により妨害することができる。直接のマイクロカロリメトリーは、熱により単離されたサンプルの温度上昇を測定する。故に、酸素消費量の測定と組み合わせる時、カロリメトリーを使用して、毒素の脱共役活性を検出することができる。
【０１９３】
代謝活性の様々なマーカーにおける変化を測定するための様々な方法及び装置が、当該技術分野で知られている。例えば、そのような方法、装置、及びマーカーは、その全体において引用により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７０４，７４５号で議論されている。簡潔に、以下の特徴の何れかの測定が、各細胞集団に対して記録される：グルコース、乳酸塩、ＣＯ２、ＮＡＤＨとＮＡＤ＋の比率、熱、Ｏ２消費、及び遊離基産生。スクリーニングされる細胞は、肝実質細胞、マクロファージ、又は神経芽腫細胞を含み得る。スクリーニングされる細胞は、細胞株、被験体からの初代細胞、又はモデル系（例えばマウスモデル）からの細胞であり得る。
【０１９４】
単細胞、又はマルチウェルプレートのチャンバ内にある細胞の集まりの酸素消費速度の測定のための様々な技術が、利用可能である。例えば、細胞を含むチャンバは、温度、電流、又は蛍光の変化を記録するためのセンサ、同様に、蛍光をモニタリングするために各チャンバに結合される光学系、例えばファイバー結合光学系を備え得る。この実施例において、各チャンバは、照明ソースがチャンバ内部の分子を刺激するための窓を持つ。ファイバー結合光学系は、細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比率及び電圧を測定するために自己蛍光を、及び、膜間電圧及び細胞内のカルシウムを判定するためにカルシウムに敏感な染料を検出することができる。加えて、ＣＯ２及び／又はＯ２に敏感な蛍光染料シグナルの変化が検出される。
【０１９５】
実施例２２：癌細胞の選択的な標的化についての変異体核酸ライブラリーのスクリーニング
【０１９６】
実施例１６又は１７に記載されるように、複数の発現ベクターを生成する。この実施例において、発現ベクターは、ＦＬＡＧタグを付けた哺乳動物発現ベクターであり、変異体核酸ライブラリーはペプチド配列をコードする。変異体ライブラリーから単離されたクローンを、癌細胞及び非癌細胞へと別個に、一時的にトランスフェクトする。細胞生存及び細胞死のアッセイを、癌細胞と非癌細胞の両方に対して行い、その各々が、変異体核酸（ｖａｒｉａｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ）によりコードされる変異体ペプチドを発現する。変異体ペプチドに関連する選択的な癌細胞の死滅に対して細胞を評価する。癌細胞は随意に、癌と診断された被験体からの癌細胞株又は原発性癌細胞である。癌と診断された被験体からの原発性癌細胞の場合、スクリーニングアッセイにおいて識別された変異体ペプチドが随意に、被験体への投与のために選択される。代替的に、タンパク質を発現し、タンパク質発現構成物を含む細胞から単離し、その後、タンパク質を更なる測定のために癌細胞及び非癌細胞へ送達する。
【０１９７】
本開示の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、これら特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｄ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図３Ｄ−３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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