(57)【要約】ポロキサマー１８８および注入用水を含む滅菌された注入用溶液であって、ナトリウムが低減され、かつ/または実質的にナトリウムを含まない前記滅菌された注入用溶液を与える。前記溶液の使用方法も与える。
2018527312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポロキサマー１８８および注入用水を含む安定な滅菌された注入用溶液であって、
前記滅菌された注入用溶液は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まず、
前記ポロキサマー１８８は、１５％ｗ／ｖを超える濃度であり、
前記滅菌された注入用溶液は、約４〜約８のｐＨを有する、前記溶液。
【請求項２】
低血圧、頻脈、および息切れからなる群からの１つ以上から選択される臨床症状および徴候を示す、患者に投与されたときに臨床的に有意な補体活性化を引き起こさない、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
前記ポロキサマー１８８が、ポロキサマー１８８，Ｎ．Ｆ．である、請求項１に記載の溶液。
【請求項４】
前記ポロキサマー１８８が、精製ポロキサマー１８８である、請求項１に記載の溶液。
【請求項５】
前記ポロキサマー１８８が、式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有する長時間循環物不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８であり、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が約１．０７未満または１．０７未満であり、
対象に投与されたときのコポリマーの循環半減期が、コポリマーの分布における主成分の循環半減期よりも５．０倍以下長い、
請求項１に記載の溶液。
【請求項６】
前記ポロキサマー１８８が、
第１のアルカノール中のポロキサマー１８８の溶液を、第１の所定期間、超臨界二酸化炭素を維持するための温度および圧力下で、第２のアルカノールおよび前記超臨界二酸化炭素を含む抽出溶媒と混合する工程であって、
前記温度が、二酸化炭素の臨界温度を上回るが、４０℃以下であり、
前記圧力が、２２０バール〜２８０バールであり、
前記アルカノールを、全抽出溶媒の７重量％〜８重量％であるアルカノール濃度で与える工程と、
前記抽出溶媒中の前記第２のアルカノールの濃度を抽出方法の経時的な勾配ステップで複数回増加させる工程であって、
複数の回の各々が、さらに定められた期間に亘って生じ、
各連続ステップにおいて、前記アルカノール濃度が、前記第２のアルカノールの前の濃度と比較して１〜２％増加する工程と、
前記抽出溶媒を抽出容器から除去し、それによって、抽出された物質をポロキサマー製剤から除去する工程と、
を含む方法によって製造される、請求項５に記載の溶液。
【請求項７】
前記ポロキサマー１８８が、１５％ｗ／ｖを超え約３０％ｗ／ｖ以下の濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項８】
前記ポロキサマー１８８が、約１５％ｗ／ｖを超〜約２５％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項７に記載の溶液。
【請求項９】
前記ポロキサマー１８８が、２０％ｗ／ｖを超える濃度で存在する、請求項７に記載の溶液。
【請求項１０】
前記ポロキサマー１８８が、約２０％ｗ／ｖ〜約２５％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項７に記載の溶液。
【請求項１１】
前記ポロキサマー１８８が、約２０％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項７に記載の溶液。
【請求項１２】
前記ポロキサマー１８８が、約２２．５％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項７に記載の溶液。
【請求項１３】
前記ポロキサマー１８８が、約２５％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項７に記載の溶液。
【請求項１４】
１種以上の等張化剤をさらに含む、請求項５に記載の溶液。
【請求項１５】
前記１種以上の等張化剤が、グルコース、グリセリン（グリセロール）、デキストロース、スクロース、キシリトール、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、マンノース、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩からなる群から選択される、請求項１４に記載の溶液。
【請求項１６】
マグネシウム塩をさらに含む、請求項５に記載の溶液。
【請求項１７】
前記１種以上の等張化剤が、酢酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、フタル酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、コハク酸マグネシウム、酒石酸マグネシウム、およびそれらの混合物からなる群から選択される１種以上のマグネシウム塩である、請求項１５に記載の溶液。
【請求項１８】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムである、請求項１７に記載の溶液。
【請求項１９】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウム六水和物である、請求項１８に記載の溶液。
【請求項２０】
前記１種以上の等張化剤の濃度が約１ｍＭ〜約２０ｍＭである、請求項１５に記載の溶液。
【請求項２１】
前記１種以上の等張化剤の濃度が約１ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２０に記載の溶液。
【請求項２２】
前記１種以上の等張化剤の濃度が約１〜約５ｍＭである、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２３】
前記１種以上の等張化剤の濃度が約１ｍＭ〜約２ｍＭである、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２４】
前記溶液が抗酸化剤をさらに含む、請求項２３に記載の溶液。
【請求項２５】
前記抗酸化剤が、システイン、クエン酸、デキストロース、ジチオスレイトール、ヒスチジン、リンゴ酸、マンニトール、メチオニン、メタ重硫酸塩、および酒石酸から選択される、請求項２４に記載の溶液。
【請求項２６】
前記抗酸化剤がクエン酸である、請求項２５に記載の溶液。
【請求項２７】
前記抗酸化剤の濃度が約０．００１％〜約２％である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項２８】
前記抗酸化剤の濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２７に記載の溶液。
【請求項２９】
前記溶液が、約６〜約８のｐＨを有する、請求項２８に記載の溶液。
【請求項３０】
前記溶液が緩衝液をさらに含む、請求項２９に記載の溶液。
【請求項３１】
前記緩衝液が、クエン酸緩衝液（ｐＨ約２）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約５）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、リン酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約１０）、コハク酸緩衝液（ｐＨ約５．６）、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ約６．１）、炭酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、酢酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、メグルミン、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項３０に記載の溶液。
【請求項３２】
前記緩衝液が、約６に調整されたｐＨでクエン酸およびメグルミンを含む、請求項３１に記載の溶液。
【請求項３３】
ｐＨ調整剤をさらに含む、請求項３１に記載の溶液。
【請求項３４】
ｐＨ調整剤が、ＨＣｌ水溶液、水酸化アンモニウム、メグルミン、およびそれらの混合物から選択される、請求項３３に記載の溶液。
【請求項３５】
約２２５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８を含み、約０．６１０ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化マグネシウム六水和物をさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項３６】
オスモル濃度が約１００〜約２０００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項４または５に記載の溶液。
【請求項３７】
オスモル濃度が約３００〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項３６に記載の溶液。
【請求項３８】
オスモル濃度が約３００〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項３７に記載の溶液。
【請求項３９】
１種以上の他の活性成分をさらに含む、請求項３８に記載の溶液。
【請求項４０】
前記１種以上の他の活性成分が、アセトアミノフェン、アデノシン、ヒドロキシ尿素、アミオダロンＨＣｌ、硫酸アトロピン、ブメタニド、セファゾリン、クロロチアジドナト
リウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ジゴキシンＨＣｌ、ドブタミンジフェンヒドラミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、マレイン酸エナラプリル、エピネフリンＨＣｌ、クエン酸フェンタニル、フロセミド、硫酸ゲンタマイシン、ヘパリンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、イソプロテレノールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、マンニトール、メペリジンＨＣｌ、酒石酸メトプロロール、ミルリノン、ナフシリンナトリウム、ナロキソン、ネシリチド、ノルエピネフリン酒石酸水素、オンダンセトロンＨＣｌ、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、グルコン酸キニジン、およびベラパミルから選択される、請求項３９に記載の溶液。
【請求項４１】
密閉された薬学的に許容できる容器に入れられている、請求項３１に記載の溶液。
【請求項４２】
前記密閉された薬学的に受容できる容器がバイアルである、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４３】
前記バイアルが１型フリントガラスまたはホウケイ酸ガラスを含む、請求項４２に記載の溶液。
【請求項４４】
前記密閉された薬学的に受容できる容器が輸液バッグである、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４５】
前記輸液バッグが、ＰＶＣ、ＤＥＨＰ含有ＰＶＣ、ＴＯＴＭ含有ＰＶＣ、ポリオレフィン、ポリプロピレン、またはＥＶＡを含む、請求項４４に記載の溶液。
【請求項４６】
前記密閉された薬学的に許容できる容器内の雰囲気は、アルゴン、窒素、および／または二酸化炭素、または不活性雰囲気を含む、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４７】
前記密閉された薬学的に受容できる容器が箔ポーチに封入されている、請求項４６に記載の溶液。
【請求項４８】
前記薬学的に許容できる容器を含む密閉された箔ポーチ内の雰囲気は、アルゴン、窒素、および／または二酸化炭素、または不活性雰囲気を含む、請求項４７に記載の溶液。
【請求項４９】
約２．０ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素を含有する、請求項４８に記載の溶液。
【請求項５０】
治療有効量の請求項１または３６に記載の溶液を投与することを含む、対象における疾患または状態を治療する方法であって、前記疾患または状態が、急性冠不全症候群、虚血肢、ショック、脳卒中、心不全、冠動脈疾患、筋ジストロフィー、循環器疾患、血液中の病的な疎水性相互作用、炎症、鎌状赤血球症、静脈閉塞発作、急性胸部症候群、炎症、疼痛、神経変性疾患、黄斑変性、血栓症、腎不全、火傷、脊髄損傷、虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、血液濃縮、アミロイドオリゴマー毒性、糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢血管疾患、突然の難聴、末梢血管疾患、脳虚血、一過性虚血発作、重症虚血肢、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される、前記方法。
【請求項５１】
前記対象に１種以上の他の活性成分も投与する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１種以上の他の活性成分が、アセトアミノフェン、アデノシン、アミオダロンＨＣｌ、硫酸アトロピン、ブメタニド、セファゾリン、クロロチアジドナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ジゴキシンＨＣｌ、ドブタミンジフェンヒドラミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、マレイン酸エナラプリル、エピネフリンＨＣｌ、クエン酸フェンタニル、フロセミド、硫酸ゲンタマイシン、ヘパリンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、イソプロテレノールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、マンニ
トール、メペリジンＨＣｌ、酒石酸メトプロロール、ミルリノン、ナフシリンナトリウム、ナロキソン、ネシリチド、ノルエピネフリン酒石酸水素、オンダンセトロンＨＣｌ、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、グルコン酸キニジン、ヒドロキシ尿素、およびベラパミルから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
総濃度が約０〜約２０ｍＭである１種以上の等張化剤をさらに含んでもよい、請求項５に記載の溶液。
【請求項５４】
ｐＨが約７〜約７．２である、請求項３０に記載の溶液。
【請求項５５】
前記緩衝液が、約７〜約７．２の調整されたｐＨでクエン酸およびメグルミンを含む、請求項３０に記載の溶液。
【請求項５６】
オスモル濃度が約２７０〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項３６に記載の溶液。
【請求項５７】
オスモル濃度が約２７０〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項５６に記載の溶液。
【請求項５８】
等張化剤、抗酸化剤、緩衝液、またはｐＨ調整剤のうち１つ以上が実質的にナトリウムを含まない、請求項３４に記載の溶液。
【請求項５９】
ａ）ポロキサマー１８８
ｂ）水、
ならびに
ｃ）クエン酸緩衝液（ｐＨ約２）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約５）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、リン酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約１０）、コハク酸緩衝液（ｐＨ約５．６）、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ約６．１）、炭酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、酢酸緩衝液（ｐＨ約７．２）およびメグルミンから選択される１種以上の緩衝液、
を含む注入用医薬組成物であって、
ナトリウムの量が約１．５ｍｇ／ｍｌ以下である、
前記医薬組成物。
【請求項６０】
ポロキサマー１８８の濃度が、約１５％ｗ／ｖを超え約３０％ｗ／ｖ以下である、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
システイン、クエン酸、デキストロース、ジチオスレイトール、ヒスチジン、リンゴ酸、マンニトール、メチオニン、メタ重硫酸塩、および酒石酸から選択される抗酸化剤をさらに含む、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記ポロキサマー１８８が精製されている、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記ポロキサマー１８８が
式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーを含み、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージが前記コポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダル
トンであるような整数であり、
前記コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
前記コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
前記コポリマーの多分散性値は約１．０７未満または１．０７未満である、
請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記ポロキサマー１８８が長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）であり、ヒト対象への静脈内投与後に、前記コポリマーの分布における主ピークを含まないどの成分の循環血漿半減期も、前記コポリマーの分布における主成分の循環半減期の５倍以下である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記ポロキサマー１８８がＬＣＭＦであり、前記ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって評価される平均滞留時間（ｔＲ）が同じＲＰ−ＨＰＬＣ条件下での精製ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８よりも短く、ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価されたＬＣＭＦポロキサマー１８８の容量係数（ｋ’）が、同じＲＰ−ＨＰＬＣ条件下での精製ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８のｋ’より小さい、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
ｐＨが約６〜約８である、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
ｐＨ調整剤をさらに含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
ｐＨ調整剤が、ＨＣｌ水溶液、水酸化アンモニウム、メグルミン、およびそれらの混合物から選択される、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
請求項６８に記載の医薬組成物を治療が必要な対象に投与することを含む、対象における疾患または状態を治療する方法であって、前記疾患または状態が、急性冠不全症候群、虚血肢、ショック、脳卒中、心不全、冠動脈疾患、筋ジストロフィー、循環器疾患、血液中の病的な疎水性相互作用、炎症、鎌状赤血球症、静脈閉塞症、急性胸部症候群、炎症、疼痛、神経変性疾患、黄斑変性、血栓症、腎不全、火傷、脊髄損傷、虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、血液濃縮、アミロイドオリゴマー毒性、糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢血管疾患、突然の難聴、末梢血管疾患、脳虚血、一過性虚血発作、重症虚血肢、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される、前記方法。
【請求項７０】
溶液のオスモル濃度が約２７０〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
溶液のオスモル濃度が約３００〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項７０に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
溶液のオスモル濃度が約３００〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
溶液のオスモル濃度が約４００ｍＯＳｍ／ｋｇを超える、請求項７０に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
溶液のオスモル濃度が約３００〜約７００ｍＯＳｍ／ｋｇである、請求項７０に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
溶液が１種以上の他の活性成分をさらに含む、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
実質的にナトリウムを含まない、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記ポロキサマー１８８が、
第１のアルカノール中のポロキサマー１８８の溶液を、第１の所定期間、超臨界二酸化炭素を維持するための温度および圧力下で、第２のアルカノールおよび前記超臨界二酸化炭素を含む抽出溶媒と混合する工程であって、
前記温度が、二酸化炭素の臨界温度を上回るが、４０℃以下であり、
前記圧力が、２２０バール〜２８０バールであり、
前記アルカノールを、全抽出溶媒の７重量％〜８重量％であるアルカノール濃度で与える工程と、
前記抽出溶媒中の前記第２のアルカノールの濃度を抽出方法の経時的な勾配ステップで複数回増加させる工程であって、
複数の回の各々が、さらに定められた期間に亘って生じ、
各連続ステップにおいて、前記アルカノール濃度が、前記第２のアルカノールの前の濃度と比較して１〜２％増加する工程と、
前記抽出溶媒を抽出容器から除去し、それによって、抽出された物質をポロキサマー製剤から除去する工程と、
を含む方法によって製造される、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
溶液が約２．０ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素を含有する、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
低ナトリウム溶液である、請求項４９に記載の溶液。
【請求項８０】
実質的にナトリウムを含まない、請求項４９に記載の溶液。
【請求項８１】
０．１ｍｇ／ｍＬ未満のナトリウムを有する、請求項５に記載の溶液。
【請求項８２】
５℃±３℃での溶液の安定性が２４ヶ月以上である、請求項１または５に記載の溶液。
【請求項８３】
５℃±３℃での溶液の安定性が１２ヶ月以上である、請求項１または５に記載の溶液。
【請求項８４】
５℃±３℃での溶液の安定性が６ヶ月以上である、請求項１または５に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年７月７日に出願された米国シリアル番号６２／１８９，５８０、２０１５年１０月６日に出願された米国シリアル番号６２／２３８，０５９の優先権の利益を主張し、これらを、その全体で、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
本明細書に開示するのは、治療、特に心不全の分野で使用するための低ナトリウム製剤、および実質的にナトリウムを含まない製剤を含む、ポロキサマー１８８の製剤である。
【背景技術】
【０００３】
平均的なアメリカ人は、３．４グラムより多いナトリウムを毎日摂取しており、これは、２．３ｇ／日の推奨されている１日量を超えている（Dietary Guidelines For Americans 2015-2020 8th edition, found at health.gov）。しかしながら、米国で現在推奨さ
れているナトリウムの１日量は、高血圧ならびにその他の循環器および腎臓の異常に関連していることを示唆する証拠がある（Kaplan, N.M., Am J. Clin Nutr 2000; 71:1020-6
）。米国心臓協会は、高血圧を予防し、心臓の健康を増進するために、１日当り１．５ｇを超える塩を摂取しないように勧めている（米国心臓協会のウェブサイト参照）。
【０００４】
食塩摂取のもう一つの要因は薬剤である。Georgeらは、発泡性および可溶性薬剤などのナトリウムを含有する薬剤は、同じ薬剤の標準製剤を服用している人々と比較して、有害な心血管イベントの機会の増加と統計的に関連していたことを示している（George J et al., BMJ 2013;347:f6954）。したがって、薬剤は、ナトリウム摂取量を注意深く観察す
る必要がある人々の集団において予想外のナトリウム源である可能性がある。
【０００５】
ポロキサマー１８８は、レオロジー的、抗血栓性、抗炎症性、および細胞保護的活性を有し、循環器疾患、血液中の病的な疎水性相互作用、炎症、脳卒中、心不全、鎌状赤血球症に関連する静脈閉塞発作（ＶＯＣ）、腎不全、虚血／再灌流傷害、物理的外傷、電気ショック、放射線、浸透ストレス、心筋梗塞、火傷、凍傷、筋ジストロフィー、出血性ショック、血液濃縮、アミロイドオリゴマー毒性、脊髄損傷を含む多くの疾患および状態の潜在的治療薬として示唆されている。ポロキサマー１８８は現在、（血流閉塞発作の持続時間を短縮する）鎌状赤血球症および心不全における使用のための臨床試験において研究されている（米国特許第５，６０５，６８７号；第５，６９６，２９８号、米国シリアル番号１２／８１４，９５３；１４／７９３，６７０；１２／６７２，９０７；１４，７９３，６６２；１４／７９３，７３０；１３／７８３，１５８；１５／０２９，６１４、およびHunter et al., Ann, Clin.Lab.Sci.2010;40(2):115-125参照。これらは全て本明細書
の一部を構成するものとして援用される）。
【０００６】
ポロキサマー１８８（および精製ポロキサマー１８８）を含むポロキサマーは、経口バイオアベイラビリティーがほとんどまたはまったくないポリマー分子であり、一般に、治療的使用のために静脈内投与を必要とする。ポロキサマー１８８（および精製ポロキサマー１８８）は効力が限られており、最適な活性のためには最大５．０ｍｇ／ｍｌの循環中の濃度を必要とする。したがって、治療的使用に適したポロキサマー１８８の製剤は、生理的に許容される量の流体中で目標濃度を達成可能とするのに十分に濃縮されていなければならない。ＰＣＴ国際公開公報第１９９４／０８５９６号には、クエン酸ナトリウム緩衝化ポロキサマー１８８ＮＦ（未精製ポロキサマー１８８）の１５％製剤が記載されている。１５％クエン酸ナトリウム緩衝化精製ポロキサマー１８８の同様の製剤が、鎌状赤血球症患者の臨床研究で使用されている（Orringer et al.,  JAMA (2001); 286(17):2099 
- 2106）。これらの製剤は、補体を活性化することが示されているが、血液細胞と適合性（等浸透性）であった（Moghimi et al., Biochemica et Biophysica Acta (2004); 1689: 103 - 113）。製剤は循環系に直接注入もされるので、製剤は滅菌に適していなければ
ならず、微生物増殖を支持する能力が限られていなければならない。さらに、ポロキサマー１８８は酸素の存在下で容易に分解するので、製剤は酸化から安定でなければならない。
【０００７】
ポロキサマー１８８ＮＦおよび精製ポロキサマー１８８の従前の製剤は、（抗酸化剤として）クエン酸ナトリウムおよび（等張性を達成するための）塩化ナトリウムを含む１５％ｗ／ｖ製剤を用いて、上記目標の大部分を達成している。（国際公開第１９９４／０８５９６号）しかしながら、上記のように、最近の研究では、ナトリウム塩を用いて製剤化した薬剤が心血管イベントのリスクを増加させることが示されている。（George et al.,
(2013);  BMJ 347: f6954）さらに、心不全、肝臓病、および腎不全などの特定の臨床状態では、ポロキサマーの１５％溶液の使用は、意図する治療濃度を達成するために許容できない液量の投与を必要とすることがある。したがって、ナトリウムが低減されており、かつ／または実質的にナトリウムを含まず、より少ない液量を用いるポロキサマー１８８の投与を可能にするために、ポロキサマー１８８の濃度が１５％よりも高い、ポロキサマー１８８の製剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に開示されるのは、ポロキサマー１８８および注入用水を含有する滅菌された安定な注入用溶液および／または医薬組成物であり、前記滅菌された安定な注入用溶液は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まず、前記ポロキサマー１８８は、１５％ｗ／ｖを超える濃度であり、前記滅菌された注入用溶液は、約４〜約８のｐＨを有する。この実施形態の態様では、ポロキサマー１８８を精製しないこと、または精製することができる。他の態様において、精製ポロキサマーは、長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）である。
【０００９】
いくつかの態様において、ポロキサマー１８８は、式
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有し、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、式
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有し、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルト
ンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が、約１．０７未満または１．０７未満である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、以下の式：
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有するＬＣＭＦであり、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値は約１．０７未満または１．０７未満であり、
対象に投与されたときのコポリマーの循環半減期が、コポリマーの分布における主成分の循環半減期よりも５．０倍以下長い。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦを
第１のアルカノール中のポロキサマー１８８の溶液を、第１の所定期間、超臨界二酸化炭素を維持するための温度および圧力下で、第２のアルカノールおよび前記超臨界二酸化炭素を含む抽出溶媒と混合することであって、
前記温度が、二酸化炭素の臨界温度を上回るが、４０℃以下であり、
前記圧力が、２２０バール〜２８０バールであり、
前記アルカノールを、全抽出溶媒の７重量％〜８重量％であるアルカノール濃度で与えることと、
前記抽出溶媒中の前記第２のアルカノールの濃度を抽出方法の経時的な勾配ステップで複数回増加させることであって、
複数の回の各々が、さらに定められた期間に亘って生じ、
各連続ステップにおいて、前記アルカノール濃度が、前記第２のアルカノールの前の濃度と比較して１〜２％増加することと、
前記抽出溶媒を抽出容器から除去し、それによって、抽出された物質をポロキサマー製剤から除去することと、
を含む方法によって製造する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、溶液／医薬品は、約１５％ｗ／ｖ超約３０％ｗ／ｖ以下、約１５ｗ／ｖ超〜約２５％ｗ／ｖ、２０％超、約２０％ｗ／ｖ〜約２５％ｗ／ｖ、約２０％ｗ／ｖ、約２２．５％ｗ／ｖ、または約２５％ｗ／ｖの濃度でポロキサマー１８８を含有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、溶液/医薬組成物は、マグネシウム塩、例えば、限定す
るものではないが、酢酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、フタル酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、コハク酸マグネシウム、酒石酸マグネシウム、およびそれらの混合物を含有する。いくつかの態様において、溶液/医薬組成物は塩化
マグネシウムを含有する。いくつかの態様において、塩化マグネシウムは、０．６１ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、溶液/医薬組成物は、１種以上の等張化剤、例えば、限
定するものではないが、グルコース、グリセリン（グリセロール）、デキストロース、スクロース、キシリトール、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、マンノース、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩を含有する。他の態様において、等張化剤は、マグネシウム塩、例えば、限定するものではないが、酢酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、フタル酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、コハク酸マグネシウム、酒石酸マグネシウム、およびそれらの混合物である。この実施形態のいくつかの態様において、等張化剤は、０を僅かに超える、１ｍＭ〜約１０ｍＭ、１〜約５ｍＭ、または１ｍＭ〜約２ｍＭの濃度である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、溶液/医薬組成物は抗酸化剤を含有する。いくつかの態
様において、抗酸化剤は、限定するものではないが、システイン、クエン酸、デキストロース、ジチオスレイトール、ヒスチジン、リンゴ酸、マンニトール、メチオニン、メタ重硫酸塩、および酒石酸から選択される。いくつかの態様において、抗酸化剤は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の溶液／医薬組成物は、４〜８または約６〜８、または約７〜約７．２のｐＨを有することができる。
【００１８】
さらに他の実施形態において、本明細書に開示される溶液／医薬組成物は、緩衝液を含有し、本実施形態のいくつかの態様において、緩衝液は、限定するものではないが、クエン酸緩衝液（ｐＨ約２）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約５）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、リン酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約１０）、コハク酸緩衝液（ｐＨ約５．６）、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ約６．１）、炭酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、酢酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、メグルミン、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、緩衝液は、約６、または約７〜約７．２の調整されたｐＨのクエン酸およびメグルミンである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶液／医薬組成物は、ＨＣｌ水溶液、水酸化アンモニウム、メグルミン、およびそれらの混合物などのｐＨ調整剤を含有する。
【００２０】
他の実施形態において、本明細書に開示される溶液／医薬組成物は、オスモル濃度が約１００〜約２０００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または３００〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または約３００〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または約２７０〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または約２７０〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または４００ｍＯＳｍ／ｋｇ超である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶液／医薬組成物は、１種以上の他の活性成分を含有する。いくつかの態様において、他の活性成分は、限定するものではないが、アセトアミノフェン、アデノシン、ヒドロキシ尿素、アミオダロンＨＣｌ、硫酸アトロピン、ブメタニド、セファゾリン、クロロチアジドナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ジゴキシンＨＣｌ、ドブタミンジフェンヒドラミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、マレイン酸エナラプリル、エピネフリンＨＣｌ、クエン酸フェンタニル、フロセミド、硫酸ゲンタマイシン、ヘパリンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、イソプロテレノールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、マンニトール、メペリジンＨＣｌ、酒石酸メトプロロール、ミルリノン、ナフシリンナトリウム、ナロキ
ソン、ネシリチド、ノルエピネフリン酒石酸水素、オンダンセトロンＨＣｌ、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、グルコン酸キニジン、およびベラパミルから選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶液/医薬組成物は、限定するも
のではないがフリントガラスまたはホウケイ酸ガラスであり得るバイアルなどの密閉された薬学的に許容できる容器に入れられている。いくつかの態様において、許容できる容器は、輸液バッグであり、例えば限定するものではないが、ＰＶＣ製、ＤＥＨＰ含有ＰＶＣ製、ＴＯＴＭ含有ＰＶＣ製、ポリオレフィン製、ポリプロピレン製、またはＥＶＡ製の輸液バッグである。いくつかの態様において、薬学的に許容できる容器は、箔ポーチに封入され、薬学的に許容できる容器を含む密閉された箔ポーチ内の雰囲気は、アルゴン、窒素、および/または二酸化炭素、または不活性雰囲気を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、封入される溶液／医薬組成物は、約２．０ｍｇ／ｍＬ以下の溶存酸素を含有する。
【００２４】
治療有効量の本明細書に開示される溶液/医薬組成物を投与することによって対象にお
ける疾患または状態を治療する方法も、本明細書に開示され、限定するものではないが、前記疾患または状態は、例えば、急性冠不全症候群、虚血肢、ショック、脳卒中、心不全、冠動脈疾患、筋ジストロフィー、循環器疾患、血液中の病的な疎水性相互作用、炎症、鎌状赤血球症、静脈閉塞発作、急性胸部症候群、炎症、疼痛、神経変性疾患、黄斑変性、血栓症、腎不全、火傷、脊髄損傷、虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、血液濃縮、アミロイドオリゴマー毒性、糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢血管疾患、突然の難聴、末梢血管疾患、脳虚血、一過性虚血発作、重症虚血肢、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、循環器疾患、または血液中の病的な疎水性相互作用である。当該方法のいくつかの態様において、溶液／医薬組成物を、１種以上の活性成分、例えば、アセトアミノフェン、アデノシン、アミオダロンＨＣｌ、硫酸アトロピン、ブメタニド、セファゾリン、クロロチアジドナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ジゴキシンＨＣｌ、ドブタミンジフェンヒドラミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、マレイン酸エナラプリル、エピネフリンＨＣｌ、クエン酸フェンタニル、フロセミド、硫酸ゲンタマイシン、ヘパリンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、イソプロテレノールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、マンニトール、メペリジンＨＣｌ、酒石酸メトプロロール、ミルリノン、ナフシリンナトリウム、ナロキソン、ネシリチド、ノルエピネフリン酒石酸水素、オンダンセトロンＨＣｌ、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、グルコン酸キニジン、ヒドロキシ尿素、およびベラパミルと共に投与する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、等張化剤、抗酸化剤、緩衝液、またはｐＨ調整剤のうち１つ以上は、実質的にナトリウムを含まない。
【００２６】
いくつかの実施形態において、溶液/医薬組成物はナトリウムが低減されている。
【００２７】
いくつかの実施形態において、溶液/医薬組成物は実質的にナトリウムを含まない。当
該実施形態の一態様では、溶液／医薬組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ未満のナトリウムを有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、溶液／医薬組成物は、６ヶ月以上、または１２ヶ月以上、または２４ヶ月以上の間、５℃±３℃で安定である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、溶液／医薬組成物は、低血圧、頻脈、および息切れなどの臨床徴候および症状よって示される、対象に投与されたときの補体活性化を有意に起こ
さない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】低用量または高用量の実質的にナトリウムを含まないポロキサマー１８８ＬＣＭＦの投与後に、血漿ＴｎＩレベルが漸進的に低下したことを示す。
【図２】低用量または高用量の実質的にナトリウムを含まないポロキサマー１８８ＬＣＭＦの投与後に、血漿ｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルが漸進的に低下したことを示す。
【図３Ａ】表１０に記載の種々のポロキサマー１８８ＬＣＭＦ製剤、ＰＢＳ（Ｐ）、およびザイモサン（０．１ｍｇ／ｍｌ：Ｚ）によるヒト正常血清における補体活性化（ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９）（平均±ＳＤ）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａのつづき。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、ポロキサマー１８８の従前の製剤と比較して、ナトリウムが低減されている、またはいくつかの実施形態では実質的にナトリウムを含まないポロキサマー１８８の安定な医薬組成物を記載し、ポロキサマー１８８の従前の製剤は、例えば、約１．７７ｍｇ／ｍｌのナトリウム濃度で、１５０ｍｇ／ｍｌポロキサマー１８８、３．０８ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、２．３８ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム（二水和物）、および０．３６６クエン酸無水物を含有する、水中のポロキサマー１８８の１５％製剤を開示する国際公開第１９９４／９８５９６号、１５０ｍｇ／ｍｌのＬＣＭＦポロキサマー１８８、３．０８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、２．３８ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（二水和物）、０．３６６ｍｇ／ｍｌのクエン酸、および注入用水を含有する心不全治療用長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８製剤を開示する国際公開第２０１６／００７５４２号に記載されている。溶液のｐＨは約６．０であり、オスモル濃度は約３１２ｍＯｓｍ／Ｌであり、約１．７７ｍｇ／ｍｌのナトリウムを含有し、米国公報第２０１１／００４４９２９号は、５％ｗ／ｖポロキサマー１８８、５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム注入液を含有し、そのため約３．５ｍｇ／ｍｌナトリウムを含有するポロキサマー１８８製剤を開示している。
【００３２】
また、本明細書に記載されているポロキサマー１８８の製剤は、減少させた液量で対象へポリマーを投与することを可能にするために、当該技術分野で公知のポロキサマー１８８の従前の製剤（１５％ポロキサマー１８８）よりも高い濃度である。
【００３３】
これらの製剤は、ポロキサマー１８８（精製または非精製）を賦形剤と混合する。これらの賦形剤は、様々な機能、例えば限定するものではないが、ポロキサマー１８８の可溶化、張度調整、懸濁、希釈、緩衝化、および安定化を果たし得る。本明細書に開示される製剤は、安定で、有効で、投与が容易であり、血液と適合し、耐容性が良好な製剤をもたらす。
【００３４】
本明細書に開示される製剤はまた、ポロキサマー１８８が大気中の酸素によって分解または破壊されるのを防止する。治療濃度で血液に添加する場合、製剤は、補体活性化の可能性が低い。本明細書に開示される製剤は、滅菌することができ、粒状物質を含まない。製剤は、微生物増殖を支持する可能性が低く、少なくとも６ヶ月の保存の間に微生物汚染から安定である（データは示さず）。
【００３５】
ナトリウム含有量が低く、場合によってはポロキサマー１８８が高濃度であるので、製剤は、心不全および/もしくは腎不全、または過剰量および/もしくは大量のナトリウム摂取が患者の健康に有害であり得るその他の状態などの状態に有用である。
【００３６】
患者が液量の増加に敏感である疾患および状態の治療のために、製剤中のポロキサマー
１８８の濃度を最大化する必要があった。そのため、精製ポロキサマー１８８（ＬＣＭＦ）の水溶性を、水にＡＰＩを添加することによって、１５０ｍｇ／ｍｌから４００ｍｇ／ｍｌまで５０ｍｇずつ増加させて測定し、追加のサンプルを５００ｍｇ／ｍｌで調製した。精製ポロキサマー１８８は、４００ｍｇ／ｍｌまで水に可溶性であることが測定された。５００ｍｇ／ｍｌのサンプルは溶液を形成せずに透明なゲルを形成したので（データは示さず）、注入には適さなかった。
【００３７】
溶解性試験の間、溶液濃度が増加すると粘性も上昇することが観察された。粘性および注入可能性（注入に必要な力）を、ある範囲の濃度に亘って測定した（表１７）。濃度が直線的に増加すると両方の特性が指数関数的に増加した。
【００３８】
ポロキサマー１８８の送達速度に対する粘性の増大の影響を測定し、試験した製剤が注入可能性の必要性を満たしていることがデータにより示された（表１８および１９）。ポロキサマー１８８ＬＣＭＦの濃度と送達速度との間には、観測可能な相関はなかった。ある範囲のポロキサマー１８８ＬＣＭＦの濃度に亘る密度値は、ポロキサマー１８８ＬＣＭＦ濃度の増加に伴って線形増加を示した（データは示さず）。
【００３９】
非経口溶液の張度は極めて重要である。低張溶液が静脈内に与えられた場合、赤血球は浸透圧を等しくしようとして水を取り込み、それにより赤血球が膨潤し、破裂する可能性がある。高張溶液の場合は、逆のことが言え、血球から水が出ていくため、血球が収縮ししぼむ（円鋸歯状になる）。水中のポロキサマー１８８ＬＣＭＦのオスモル濃度を、２５ｍｇ／ｍｌ〜４００ｍｇ／ｍｌの範囲に亘って評価した。溶液中のポロキサマー１８８の濃度が増加するにつれて、オスモル濃度の指数関数的増加が観察された（表７）。等張溶液は、典型的には、オスモル濃度値２７０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ水を有するものとして定義される。２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満または３００ｍＯｓｍ／ｋｇ超のオスモル濃度値を有する溶液は、それぞれ低張および高張と考えられる。これらの結果は、驚くべきことに、２００〜２５０ｍｇ／ｍＬの濃度が、最小量の張度調整剤を添加して、または張度調整剤を添加することなく、等張溶液を達成するために目標とされるべきであることを示唆した。６つの異なる濃度のポロキサマー１８８ＬＣＭＦ（１５％〜４０％）を全血について試験して、赤血球の円鋸歯状化が起きたかどうかを判定した（表８および９）。ＮａＣｌ溶液を含むがポロキサマー１８８を含まない全ての高張溶液は、細胞を円鋸歯状化したことが分かった。ポロキサマー１８８ＬＣＭＦを含有する溶液は、円鋸歯状細胞の徴候を示さず、このことは、ポロキサマー１８８が非等張溶液中でさえも赤血球を保護することを示し、したがって、ポロキサマー１８８は、ＡＰＩであることに加えて、本明細書に開示される高張製剤において等張化剤としても作用し得る。
【００４０】
ポロキサマー１８８ＬＣＭＦを含有する様々な実質的にナトリウムを含まない製剤を、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ヒト血清補体因子、Ｂｂ断片およびｓＣ５ｂ−９複合体の生体外活性化および定量化について試験した。表１０および図３を参照されたい。３人の健康なヒトドナーからの血清サンプルを採取し、１９の試験製剤または対照品で活性化し、ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９含有量について分析した。合計１９の製剤を使用して、３つの個々の正常ヒト血清サンプルを活性化し、ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９含有量についてＥＬＩＳＡによって分析した。試験製剤による血清の処置は、ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９レベルを異なる程度で誘発した。ＰＢＳ誘発レベルと比較して、標準偏差（ＳＤ）間隔の重複なしで、製剤番号１、４、５、１２、１７、１８、および１９によって、Ｂｂレベルの最大の増加が誘発された。ｓＣ５ｂ−９レベルの最大の増加は、製剤番号１１によって誘発され（２．１９倍の増加）、３つの正常ヒト血清の全てのレベルが、それぞれのＰＢＳ誘発レベルを上回って増加した。しかしながら、３つの血清値全ての平均値を比較した場合、ＳＤ間隔の重複なしに、平均バックグラウンドレベルより高いｓＣ５ｂ−９レベルを誘発した製剤はなかった（図３）
【００４１】
緩衝液中でのポロキサマー１８８ＬＣＭＦの安定性を、加速条件下で２〜１０のｐＨ範囲でクエン酸、リン酸、酢酸、ヒスチジン、コハク酸、酒石酸、グリシン、硫酸、ＴＲＩＳ、炭酸、およびホウ酸緩衝液中で評価して、ポロキサマー１８８ＬＣＭＦの溶液安定性におけるｐＨおよび緩衝液種の役割を評価した（表１１）。高いｐＨの溶液は、より酸性の溶液と比較してより大きな安定性を示した。ポロキサマー１８８ＬＣＭＦは、ｐＨ範囲６〜８において許容可能な安定性を示した。緩衝液種は安定性に影響する可能性を示した。クエン酸緩衝化製剤は、同様のポロキサマー１８８ＬＣＭＦ濃度の他の緩衝液種と比較した場合、ｐＨおよびオスモル濃度の変動量が最小であるようであった。初期濃度に関して、本明細書では、ポロキサマー１８８ＬＣＭＦ濃度の増加は分解速度を増加させないことが示されている（表１１）。
【００４２】
実質的にナトリウムを含まない１５％ポロキサマー１８８ＬＣＭＦのバッチで見られる粒子形成の原因を決定するために、粒子研究を行った。９つの異なるポロキサマー１８８ＬＣＭＦ製剤の試験は、沈殿がおそらくマグネシウム、クエン酸塩、およびポロキサマーの間の複合体化によるものであることを示した（表６）。
【００４３】
抗酸化剤であるアスコルビン酸、システイン、クエン酸、デキストロース、ジチオスレイトール、ヒスチジン、リンゴ酸、マンニトール、メチオニン、メタ重硫酸ナトリウム、および酒石酸を、ｐＨ６の２０ｍＭリン酸緩衝液中のポロキサマー１８８ＬＣＭＦの２％および２５％溶液中で、４０℃でｔ＝０およびｔ＝１月に評価した。結果を表Ｃに示す。データは、２５％のポロキサマーの濃縮溶液について、マンニトール、メチオニン、およびクエン酸塩で、１月時点で良好な安定性が達成されたことを示す。
【００４４】
注入用のポロキサマー１８８の医薬製剤が本明細書で開示される。当該製剤は、先行技術のポロキサマー１８８製剤と比較して、ナトリウムが低減されているか、かつ／または実質的にナトリウムを含まない。当該製剤は、１５％を超えるポロキサマー１８８の濃度を含み、より少量の流体および少量のナトリウムの送達を可能にし、液量および／またはナトリウム含有量の増加の影響を受けやすい患者集団、例えば、限定するものではないが、心臓病患者、腎不全患者、および鎌状赤血球症患者における有害作用を防止する。
【００４５】
ポロキサマー１８８および注入用水を含む滅菌された注入用溶液であって、先行技術の製剤と比較してナトリウムが低減されているか、かつ/または実質的にナトリウムを含ま
ず、前記ポロキサマー１８８が酸化分解から安定であり、約４〜約８、または約６〜約８のｐＨを有する、前記滅菌された注入用溶液が、本明細書に開示される。
【００４６】
開示された製剤は、他の薬剤、例えば、限定するものではないが、ヒドロキシ尿素、鎮痛薬、例えば、オピオイド、抗血栓薬、例えば、限定するものではないが、ｔ−ＰＡ、利尿薬、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬、血管拡張薬、例えば、限定するものではないが、硝酸塩、亜硝酸塩、およびシルデナフィル、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン受容体遮断薬、アンギオテンシンＩＩ拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、陽性変力薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、ベータ−アドレナリン受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、アルファ遮断薬、中枢アルファアンタゴニスト、スタチン、強心配糖体、ジゴキシン、クロルタリドン、アムロジピン、リシノプリル、ドキサゾシン、抗炎症剤、セレクチン阻害剤、例えば、限定するものではないが、リビパンセル、ＳｅｌＧＩ、Ｓｅｖｕｐａｒｉｎ、プロプラノロール、レガデノソン、ＮＫＴＴ１２０、モンテルカスト、ジロートン、ＩＶＩｇ、シンバスタチン、酪酸アルギニン、ＨＱＫ−１００１、ポマリドミド、ＳＣＤ−１０１、ＭＰ４ＣＯ、Ｓａｎｇｕｉｎａｔｅ、Ｓｅｎｉｃａｐｏｃ、Ａｅｓ−１０３、ヘパリンおよび抗凝固剤、例えば、限定するものではないが、ダルテパリン、未分画ヘパリン、リバーロキサバン、アピキサバン、ｎ−アセチルシステイン、抗血小板薬、例えば、
限定するものではないが、プラスグレル、アスピリン、およびＴｉｃａｇｒｅｌｏｒ、ならびにこれらの薬剤の組み合わせとの併用で与えられ得る。いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８製剤は、他の薬剤の前、同時に、もしくはその後に、または３つ全てからなる組み合わせで与えられ得る。
【００４７】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における疾患または状態を治療する方法も与える。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、急性冠不全症候群、虚血肢、ショック、脳卒中、心不全、例えば、限定するものではないが、収縮期性、拡張期性、鬱血性、および心筋症、冠動脈疾患、筋ジストロフィー、循環器疾患、血液中の病的な疎水性相互作用、炎症、鎌状赤血球症、例えば、静脈閉塞発作、および急性胸部症候群、炎症、疼痛、神経変性疾患、黄斑変性、血栓症、腎不全、火傷、脊髄損傷、虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、血液濃縮、アミロイドオリゴマー毒性、糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢血管疾患、突然の難聴、末梢血管疾患、脳虚血、一過性虚血発作、重症虚血肢、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される。
【００４８】
別段の定めがないかぎり、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。特に断りのない限り、本明細書中の全開示を通して言及されている全ての特許、特許出願、公開された出願および公報、データベース、ウェブサイト、ならびにその他の刊行物は、その全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。本明細書中の用語の定義が複数ある場合は、このセクションの定義が優先される。ＵＲＬまたはその他の識別子もしくはアドレスへの参照がなされている場合、そのような識別子は変わり得、インターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、インターネットを検索することによって同等の情報を見つけることができると考えられる。それらへの参照は、そのような情報の入手可能性および公衆の普及を明示している。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ポロキサマー１８８」（Ｐ−１８８またはＰ１８８とも呼ばれる）は、以下の化学式： 
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨ
を有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーを表し、
式中、ａ’およびａは同一または異なっていることができ、それぞれは、（Ｃ２Ｈ４Ｏ）で表される親水性部分（すなわち、コポリマーのポリオキシエチレン部分）が約６０％〜９０％、例えば約８０％または８１％を構成するような整数であり、ｂは、（Ｃ３Ｈ６Ｏ）で表される疎水性部分が約１，３００〜２，３００Ｄａ、例えば１，４００〜２，０００Ｄａ、例えば約１，７５０Ｄａの分子量を有するような整数である。例えば、ａは約７９であり、ｂは約２８または２８である。化合物の平均総分子量は、約７２００〜９７００Ｄａ、または約７，６８０〜９，５１０Ｄａ、または７３５０〜８８５０Ｄａ、例えば、通常８，４００〜８，８００Ｄａ、例えば約８，４００Ｄａまたは８，４００Ｄａ、または約８５００Ｄａである。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの重量比は約４：２：４である。仕様によれば、Ｐ１８８は、ポリオキシエチレンの重量パーセントが８１．８±１．９％であり、不飽和レベルが約０．０１０〜０．０３４ｍＥｑ／ｇ、または例えば０．０２６±０．００８ｍＥｑ／ｇである。不飽和レベルは、公知技術、例えばMoghimi et al, Biochimica et Biophysica Acta (2004); 1689:103-
113.に記載の技術により測定することができる。
【００５０】
ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーの命名法は、そのモノマー組成物に関連している。ポロキサマー数の最初の２桁に１００を乗じたものは、疎水性ポリオキシプロピレンブロックのおおよその分子量を与える。最後の桁に１０を掛けたものは、親水性ポリオキシエチレン含有量のおおよその重量パーセントを与える。例えば、ポロキ
サマー１８８は、約１，８００Ｄａのポリオキシプロピレン疎水性部分を含有し、全分子量の約８０％の親水性ポリオキシエチレンブロック含有量を有するポリマーを表す。
【００５１】
ポロキサマー１８８は、主としてポリマーの全鎖長が異なるが、不飽和部分を有する切断されたポリマー鎖および特定の低分子量グリコールを含むポリマー種の不均一分布を含む。ポロキサマー１８８分子には、低分子量（ＬＭＷ）ポリマー種および高分子量（ＨＭＷ）ポリマー種を表す両側に主ピークおよび「肩」ピークを含む（例えば、ＧＰＣによって測定される）種プロフィールを示すものが含まれる。
【００５２】
ポロキサマーは、最初にポリオキシプロピレンコアを構築し、次いでポリオキシプロピレンコアの末端にポリオキシエチレンを添加することによって２段階で合成される。両方のステップの間の重合速度の変動のために、ポロキサマーは分子量の異なる不均一なポリマー種を含むことができる。ポリマー種の分布は、標準的な技術、例えば、限定はされないが、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて特徴付けることができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「精製ポロキサマー１８８」または「Ｐ１８８−Ｐ」または「精製された長時間循環物質（ＬＣＭ）含有ポロキサマー１８８」は、ポロキサマーの多分散性値が約１．０７以下、例えば１．０５以下または１．０３以下であるポロキサマー１８８を表し、そのため、精製ポロキサマー１８８は、減少した量の低分子量成分を有する。「低分子量物質が除去された」または「低分子量物質が低減された」またはこれらの類似する変形表現のポロキサマー１８８は、成分の全分布の３．０％以下または未満、一般的には２．０％以下もしくは未満、または１．５％以下もしくは未満、または約１．０％以下の低分子量成分の分布がある精製ポロキサマー１８８を表す。典型的には、当該ポロキサマー１８８は、より高いまたはより大きいパーセンテージの低分子量成分を含有するポロキサマー１８８の形態と比較して、低下した毒性を示す。ポロキサマー１８８は、低分子量成分を除去または低減するために精製される。
【００５４】
例示的な精製ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８は、商標ＦＬＯＣＯＲ（登録商標）として入手可能なポロキサマー１８８である（ＬＣＭ含有ポロキサマーを記載する米国特許第５，６９６，２９８号およびGrindel et al.(2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103も参照されたい）。精製ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８を静脈内注入として
哺乳類、特にヒトに投与する場合、治療した対象から得られた血液のＧＰＣ分析は、２つの循環ピークを示し、１つのピークは、ポリマー分布の主成分を含む主ピークと呼ばれるピークであり、もう１つのピークは、主ピークと比較してより高い分子量のピークであって、（本明細書に示されているように、主ピークよりも５倍以上、典型的には３０時間以上、７０時間も）実質的により遅い循環からの消失の速度を示す、すなわち長時間循環物質（ＬＣＭ）を示すピークである（Grindel et al.(2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103）。
【００５５】
本明細書で使用される場合、ポロキサマー１８８製剤に関する「主成分」または「主ピーク」は、平均分子量が約７２００〜９７００Ｄａ、または約７，６８０〜９，５１０Ｄａ、または７３５０〜８８５０Ｄａ、例えば、通常８，４００〜８，８００Ｄａ、または約８，２００〜８，８００Ｄａ、例えば、約８，４００Ｄａまたは約８５００Ｄａである、約１３，０００Ｄａ未満かつ約４，５００Ｄａ超の分子量を有するコポリマー分子の種を表す。主ピーク種には、クロマトグラフィー条件に応じて１４〜１５分でゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって溶出するものが含まれる（米国特許第５，６９６，２９８号およびGrindel et al., Biopharm Drug Dispos 2002; 23(3):87-103を参照された
い）。
【００５６】
本明細書で使用される場合、ポロキサマー１８８製剤の種または成分に関する「低分子
量」または「ＬＭＷ」は、通常４，５００Ｄａ未満の分子量を有する成分を表す。ＬＭＷ種には、クロマトグラフィー条件に応じて１５分後にゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって溶出するものが含まれる。（米国特許第５，６９６，２９８号およびGrindel et al.(2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103を参照されたい）。
このような不純物は、低分子量ポロキサマー、ポロキサマー分解生成物（アルコール、アルデヒド、ケトン、およびヒドロペルオキシドを含む）、ジブロックコポリマー、不飽和ポリマー、ならびにオリゴ（エチレングリコール）およびオリゴ（プロピレングリコール）を含むオリゴマーグリコールを含み得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、ポロキサマー１８８製剤の種または成分に関する「高分子量」または「ＨＭＷ」は、通常１３，０００Ｄａ超、例えば１４，０００Ｄａ超、１５，０００Ｄａ超、１６，０００Ｄａ超、またはそれ以上の分子量を有する成分を表す。ＨＭＶ種には、クロマトグラフィー条件に応じて１３〜１４分でゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって溶出するものが含まれる（米国特許第５，６９６，２９８号およびGrindel et al., Biopharm Drug Dispos 2002; 23(3):87-103を参照されたい）。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「多分散性」または「Ｄ」は、ポリマー組成物の分子量分布の幅を指す。単分散サンプルは、全ての分子が同一であるものとして定義される。このような場合、多分散性（Ｍｗ/Ｍｎ）は１である。狭い分子量標準は１に近いＤの値を有
し、典型的なポリマーは２〜５の範囲を有する。いくつかのポリマーは、２０を超える多分散性を有する。したがって、高い多分散性値は、所与の製剤中の分子集団のサイズの幅広いバリエーションを示し、より低い多分散性値は、より少ないバリエーションを示す。多分散性を評価する方法は、当技術分野で公知であり、米国特許第５，６９６，２９８号に記載されている方法を含む。例えば、クロマトグラムから多分散性を測定することができる。多分散性値は、特定のクロマトグラフィー条件、分子量標準、および使用されるゲル透過カラムのサイズ排除特性に依存して変化し得ることが理解される。本明細書において、言及されている多分散性は、米国特許第５，６９６，２９８号に記載されており、カラムヒーターモジュール、Ｍｏｄｅｌ  ４１０屈折率検出器、Ｍａｘｉｍａ  ８２０ソフトウェアパッケージ（全て、マサチューセッツ州ミルフォードＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＷａｔｅｒｓ，  Ｄｉｖ．から）、直列した２つのＬｉＣｈｒｏｇｅｌ  ＰＳ−４０カラムおよびＬｉＣｈｒｏｇｅｌ  ＰＳ−２０カラム（ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびポリエチレングリコール分子量標準（マサチューセッツ州アマーストのＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を備えたＭｏｄｅｌ  ６００Ｅ  Ｐｏｗｅｒｌｉｎｅクロマトグラフィーシステムを用いて得られたクロマトグラムから測定されるものである。異なる分離方法を使用して得られる多分散性値を、両方のシステムで単一のサンプルを流し、次いで各クロマトグラムからの多分散性値を比較することだけによって、本明細書に記載の値に変換することは、当業者のレベルの範囲内である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、ポロキサマー１８８に関する「長時間循環物質不含」または「ＬＣＭＦ」は、精製ポロキサマー１８８について上述したように、低分子量成分の量が低減されており、かつ、対象への静脈内投与後、ポリマー分布の成分が、より均一な様式で循環から消えて、長時間循環物質が主ピークの循環半減期よりも５倍以下長い半減期を示す、精製ポロキサマー１８８製剤を表す。したがって、ＬＣＭＦは、主成分のｔ１／２よりも５．０倍以上大きく、通常、コポリマーの分布中の主成分の半減期より４．０倍、３．０倍、２．０倍、または１．５倍以下大きいｔ１／２を有する循環物質であるか、または前記循環物質を生じる、本明細書に記載の高分子量成分または低分子量成分などの成分を含まないポロキサマー１８８である。いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、約０．０１８〜約０．０３４ｍＥｑ／ｇの不飽和レベルを有する。典型的には、ＬＣＭＦポロキサマーは、ポリマー分布の全ての成分が循環からより一様な速
度で消えるポロキサマーである。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「コポリマーの分布」は、ポロキサマー製剤中のポリマー分子の分子量分布を表す。分子量の分布は、当業者に公知の様々な技術、例えば、限定されるものではないが、束一性測定、光散乱法、粘度測定法、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって測定することができる。特に、ポリマーの流体力学的容量に基づいて分子量分布を測定するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法を用いることができる。ポリマーの分子量または質量の分布は、多分散性によって要約することができる。例えば、ポロキサマーの分子量分布のばらつきが大きいほど、多分散性は高い。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「不純物」は、ポロキサマー製剤中の望ましくない成分を表す。典型的には、不純物は、４，５００ダルトン未満のＬＭＷ成分および１３，０００ダルトンを超える高分子量成分を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「滞留時間」またはｔＲまたはＲＴは、ＬＣＭＦポロキサマー１８８サンプルなどのサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ用逆相カラムへの注入と蒸発光散乱検出器によるピーク応答との間に経過した時間を意味する。サンプルがより疎水性である場合、滞留時間はより長い。
【００６３】
商標ＦＬＯＣＯＲ（登録商標）で入手可能なポロキサマーなどのＬＣＭ含有精製ポロキサマー１８８は、平均滞留時間（ｔＲ）が９．８８３であり、ｋ’が３．６９７であり、ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、平均滞留時間（ｔＲ）が８．８９７であり、平均ｋ’が３．２０２である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「実質的にナトリウムを含まない」とは、溶液が約３ｐｐｍ（百万分率）未満のナトリウム、または約２ｐｐｍ未満のナトリウム、または約１ｐｐｍ未満のナトリウム、または約０．７００ｐｐｍ未満のナトリウムを含有することを意味する。いくつかの実施形態において、実質的にナトリウムを含まないとは、投与前の溶液が、約０．７μｇ／ｍｌ未満のナトリウム、または約０．５μｇ／ｍｌ未満のナトリウム、または約０．３μｇ／ｍｌ未満のナトリウム、または約０．１μｇ／ｍｌのナトリウム、または約０．０８μｇ／ｍｌ未満または約０．０７μｇ／ｍｌ未満のナトリウム、または約０．０６μｇ／ｍｌ未満のナトリウムを含有することを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「低ナトリウム」は、溶液が、約１．５ｍｇ／ｍｌ未満、または約１．４ｍｇ／ｍｌ未満、または約１．３ｍｇ／ｍｌ未満、１．２ｍｇ／ｍｌ未満、または約１．１ｍｇ／ｍｌ未満、または約１．０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．９ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．８ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．７ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．６ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５ｍｇ／ｍｌ未満または約０．４ｍｇ／ｍｌ未満または約０．３ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．２ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．１ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０９ｍｇ／ｍｌ未満または約０．０８ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０７ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０６ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０４ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０３ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０２ｍｇ／ｍｌ、または約０．０１ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．００９ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．００１ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．０００８ｍｇ／ｍｌ未満のナトリウム、または約０．０００８ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌのナトリウムを含有することを意味する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、製剤中の賦形剤のいずれもナトリウム塩ではない。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、溶液の調製に使用されない。
【００６７】
酸化分解は、ポロキサマーの安定性に影響を及ぼす主要な分解経路である。このプロセスは、ポリマー鎖の構造変化を生じ、過酸化物およびカルボニルを生じる。「酸化的分解から安定」は、ポロキサマー１８８またはＬＣＭＦポロキサマー１８８または精製ポロキサマー１８８の溶液のｐＨが５〜７の範囲内に維持され、アセトアルデヒド含有量が、周囲光下、室温で保存した場合、６ヶ月以上の期間２９９ｐｐｍ未満であることを意味する。アセトアルデヒドの測定値は、Moghimi et al, Biochimica et Biophysica Acta (2004); 1689:103- 113に記載されているようなヘッドスペースガスクロマトグラフィーによって測定される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「補体活性化」は、当技術分野で公知の方法、例えば、（１）Ｃ３およびＣ３断片に結合するペプチド；（２）種々の溶血アッセイ；（３）Ｃ３転換酵素媒介性のＣ３の切断の測定；（４）Ｄ因子によるＢ因子切断の測定；ならびに（５）酵素結合免疫吸着検査キットを用いる２つの補体分解産物、ＳＣ５ｂ−９およびＢｂの測定により、測定し得る。本明細書で使用される場合、溶液は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ＩＮＨ、Ｃ３、Ｃ４、またはＢ因子などの補体活性化因子の血漿レベルに（基底レベルまたは曝露前レベルからの）倍加がある場合、血液との接触後に補体活性化を誘導する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「臨床的に有意な補体活性化」は、臨床徴候および症状、例えば、限定するものではないが、低血圧、頻脈、および息切れによって示される補体の全身活性化を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「等張化剤」または「張度調整剤」は、水溶液のオスモル濃度を変える薬剤を表す。典型的には、等張化剤は、溶液のオスモル濃度を調節して、溶液のオスモル濃度を血液または血漿などの体液の浸透圧に近づけるために使用される。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「治療」は、疾患または状態に関連する症状を改善または軽減することを表す。治療とは、状態、障害、または疾患の症状を改善するか、または有益に変えるあらゆる方法を意味する。したがって、治療は、予防、治療、および/または
治癒を包含する。治療はまた、本明細書の組成物のあらゆる薬学的使用も包含する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、疾患または状態を有する対象を「治療する」とは、本明細書で与えられ、または記載される組成物または他の生成物を対象に投与し、それにより対象の治療を行うことを意味する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、治療による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の症状の緩和は、組成物または治療薬の投与に起因または関連し得る、症状の永続的または一時的、持続的または一過的なあらゆる軽減を表す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「防止」または「予防」は、疾患または状態を発症するリスクを低減する方法を表す。予防は、疾患もしくは状態を発症するリスクの低減、および／または疾患の症状の悪化もしくは進行の防止、または疾患の症状の悪化もしくは進行のリスクの低減を含む。
【００７５】
本明細書で使用される場合、特定の疾患を治療するための化合物または組成物の「有効量」は、症状を改善して、または何らかの形で症状を軽減して所望の生理的効果を達成するのに十分な量である。このような量を、単回投与として投与することができ、またはレジメンに従って投与し、それによって有効にすることができる。有効量は、通常の手順に従って当業者によって容易に決定される。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「治療有効用量」は、少なくとも治
療効果を生じるのに十分な化合物を含有する薬剤、化合物、物質、または組成物を表す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「短期注入」は、２４時間未満の期間に亘って投与される静脈内注入を意味する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「単回注入」は、１回のみの注入または投与で有効量の化合物または医薬組成物を与える注入を表す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」または「状態」は、原因または条件、例えば、限定はされないが、感染、後天的条件、遺伝的条件に起因し、識別可能な症状によって特徴付けられる生物体における病的状態を表す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、治療される「患者」または「対象」は、哺乳類を含むヒトおよび/または非ヒト動物を含む。哺乳類には、霊長類、例えばヒト、チンパンジー、ゴ
リラ、およびサル、家畜、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウシ、ならびにげっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、およびスナネズミが含まれる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、複数の指示対象を含む。
【００８２】
量、時の持続時間などの測定可能な値を表すときに本明細書で使用される「約（about
）」または「約（approximately）」は、明記されている値から±３０％〜±１０％、よ
り好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％の変分を包含することが意図されており、このような変分は、開示された方法を実施するのに適している。また、ちょうどの量も含まれる。したがって、「約０．０５ｍｇ／ｍＬ」は「約０．０５ｍｇ／ｍＬ」および「０．０５ｍｇ／ｍＬ」を意味する。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「任意の」または「任意に」は、続いて記載されている事象または状況が起こるかまたは起こらないことを意味し、その記載には、前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合が含まれる。例えば、置換されていてもよい基は、その基が置換されていないかまたは置換されていることを意味する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、保護基、アミノ酸、およびその他の化合物の略語は、別段の定めがない限り、それらの一般的な使用法、認識されている略語、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名法委員会（IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature）に従う（(1972) Biochem.11:1726を参照されたい）。
【００８５】
本明細書に与えられるのは、滅菌された安定な注入用溶液および／または医薬組成物であり、前記溶液および／または医薬組成物は、ナトリウムが低減されているか、かつ／または実質的にナトリウムを含まず、ＬＣＭＦなど、精製されていることができる、または未精製であり得るポロキサマー１８８を含有し、ｐＨが約４〜約８である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、溶液は、血液との接触後に有意な補体活性化を誘発しない。
【００８７】
いくつかの実施形態において、溶液は５℃±３℃で６ヶ月以上、１２ヶ月以上、または２４ヶ月以上の間安定である（実施例２０）。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、ポロキサマー１８８，Ｎ．Ｆ、例えば市販のポロキサマー１８８を含む。いくつかの実施形態において、ポロキサマー１
８８は、約８４００ダルトンまたは約８５００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、商標Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ  １８８、８０％ＰＯＥで入手可能である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は精製ポロキサマー１８８を含む。いくつかの実施形態において、精製されたポロキサマー１８８は、ヒト対象に投与された場合、血漿中の半減期（ｔ１／２）が約７時間である。（Grindel et al.(2002) Journal
of Pharmaceutical Sciences, 90:1936-1947 (Grindel et al.2002a)またはGrindel et al.(2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103 (Grindel et al.2002b)）。いくつかの実施形態において、精製ポロキサマー１８８は、平均分子量が約１６，０００ダルトンであり、ｔ１／２が約７０時間で約１０倍以上の半減期の増加を示した、より高分子量の成分からなる長時間循環物質を含む。
【００９０】
精製ポロキサマー１８８と比較して、Ｐ１８８の未精製形態は、主として全鎖長が異なる、ベル型分布のポリマー種を含む。さらに、不完全重合によって形成される種々の低分子量（ＬＭＷ）成分（例えば、グリコールおよび切断されたポリマー）ならびに高分子量（ＨＭＷ）成分（例えば、二量化ポリマー）が存在し得る。典型的には、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるＰ１８８のキャラクタリゼーションは、Ｐ１８８の主ピークを同定し、「肩」ピークは、意図しないＬＭＷおよびＨＭＷ成分を表す（Emanuele and
Balasubramaniam (2014) Drugs R D, 14:73-83)。例えば、ＢＡＳＦ（ニュージャージー州パーシッパニー）から入手可能なＰ１８８の製剤は、約１，７５０ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する疎水性ブロック、重量でポリマーの８０％を構成するＰＯＥブロック、および約８，４００Ｄａの総分子量によって特徴付けられる公開された構造を有する。実際の化合物は、意図されたＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥコポリマーからなるが、１，０００Ｄａ未満から３０，０００Ｄａを超える分子量に亘る他の分子も含有する。市販のポロキサマー１８８の分子多様性および分子の分布は、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて検出される広い一次ピークおよび二次ピークによって説明される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８を含み、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が約１．０７未満または１．０７未満であり、
対象に投与されたときのコポリマーの循環半減期が、コポリマーの分布における主成分の循環半減期よりも５．０倍以下長い。
【００９２】
いくつかの実施形態において、コポリマーのポリマー分布を含むＬＣＭＦポロキサマーの全ての成分は、対象の血漿中の循環半減期が、対象への静脈内投与後のコポリマーの主成分の循環半減期よりも５倍または４．０倍、または３．０倍以下長い。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの分布中の全ての成分は、対象に投与された場合、対象の血漿中の循環半減期が、ＬＣＭＦポロキサマーの分布中の主成分の循環半減期よりも４倍以下長い。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの分布中の全ての成分は、ヒト対象に投与された場合、対象の血漿中の半減期が、３０時間、２５時間、２０時間、１５時間、１０時間、９時間、８時間、または７時間以下である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの分布中の全ての成分は、ヒト対象に投与された場合、対象の血漿中の半減期が、１０または１２時間以下である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーは、約１，４００〜２，０００Ｄａまたは１，４００〜２，０００Ｄａの分子量を有する疎水性部分、およびコポリマーの約７０〜９０重量％または７０〜９０重量％を構成する親水性部分を有するポロキサマーである。いくつかの実施形態において、疎水性部分［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量は約１，７５０Ｄａまたは１，７５０Ｄａである。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの平均分子量は、７１００〜９５１０ダルトン、または７６８０〜９５１０ダルトン、または８，４００〜８，８００ダルトン、または８，２００〜８，８００ダルトンである。
【００９８】
いくつかの実施形態において、１３，０００ダルトンを超えるＬＣＭＦポロキサマー中の高分子量成分のパーセンテージは、成分の全分布の１％未満を構成し、対象への静脈内投与後に、主ピークの循環血漿半減期の４倍を超える循環半減期を有する成分をもたらすことはない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、１３，０００ダルトンを超えるＬＣＭＦポロキサマー中の高分子量成分のパーセンテージは、成分の全分布の１．５％未満、１．２％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％以下を構成する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの多分散性値は、１．０６、１．０５、１．０４、または１．０３未満である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約０．０１０〜０．０３４ｍＥｑ／ｇまたは０．０２６±０．００８ｍＥｑ／ｇの不飽和レベルを有するＬＣＭＦを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８を含み、
前記ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーであり、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が約１．０７未満または１．０７未満であり、
対象への静脈内投与後、主ピークを含まない成分の循環血漿半減期が、主ピークの循環
半減期よりも５．０倍以上長い。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８を含み、
前記ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーであり、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、
ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が約１．０７未満または１．０７未満であり、
ＬＣＭＦコポリマーが、長時間循環物質（ＬＣＭ）を含有する精製ポロキサマー１８８よりもより親水性である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８を含み、
前記ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーであり、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が約１．０７未満または１．０７未満であり、
ＬＣＭＦが、精製ポロキサマー１８８よりも短い、逆相高速液体クロマトグラフィーによって評価される平均滞留時間（ｔＲ）を有する。
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの平均ｔＲは約８．７〜８．８であり、ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８の平均ｔＲは約９．９〜１０または９．９〜１０であり、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は以下の通りである（表１）。
【表１】
2018527312.tif 000003
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８を含み、
前記ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、式ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ’−［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨを有するポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーであり、
ａおよびａ’の各々が、親水性（Ｃ２Ｈ４Ｏ）のパーセンテージがコポリマーの全分子量の約６０重量％〜９０重量％であるような整数であり、
ａおよびａ’が、同じかまたは異なり、ｂが、疎水性［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ］ｂの分子量が約１，３００〜２，３００ダルトンであるような整数であり、
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が４，５００ダルトン未満の低分子量成分であり；
コポリマーの分布における全成分の１．５％以下が、平均分子量が１３，０００ダルトンを超える高分子量成分であり；
コポリマーの多分散性値が約１．０７未満または１．０７未満であり、
ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価された容量係数（ｋ’）が、精製ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８のｋ’より小さい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＬＣＭＦポロキサマーの平均ｋ’は、約３．２〜３．３または３．２〜３．３であり、ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８の平均ｋ’は約３．６〜３．７または３．６〜３．７である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８を
第１のアルカノール中のポロキサマー１８８の溶液を、第１の所定期間、超臨界二酸化炭素を維持するための温度および圧力下で、第２のアルカノールおよび前記超臨界二酸化炭素を含む抽出溶媒と混合することであって、
前記温度が、二酸化炭素の臨界温度を上回るが、４０℃以下であり、
前記圧力が、２２０バール〜２８０バールであり、
前記アルカノールを、全抽出溶媒の７〜８重量％、例えば約７．４重量％であるアルカノール濃度で与えることと、
前記抽出溶媒中の前記第２のアルカノールの濃度を抽出方法の経時的な勾配ステップで複数回増加させることであって、
複数の回の各々が、さらに定められた期間に亘って生じ、
各連続ステップにおいて、前記アルカノール濃度が、前記第２のアルカノールの前の濃度と比較して１〜２％増加することと、
前記抽出溶媒を抽出容器から除去し、それによって、抽出された物質をポロキサマー製剤から除去することと、
を含む方法によって製造する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ポロキサマーと第１のアルカノールとの重量比は、約２：１〜３：１または２：１〜３：１である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、複数回は、２、３、４、または５つの勾配ステップで起こる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抽出溶媒中の第２のアルカノールの濃度を増加させることは、
ｉ）第２の所定の期間、第２のアルカノールの濃度を約７％〜８％から約８．２％〜９．５％、例えば約９．１％に増加させるステップ、および
ｉｉ）第３の所定の期間、第２のアルカノールの濃度を約８．２％〜９．５％から約９．６％〜１１．５％、例えば約１０．７％に増加させるステップ、
を含む２つのステップで起こる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、第１および第２のアルカノールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、およびそれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、第１および第２のアルカノールは、同じか、または異なる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、第１のアルカノールは、メタノールである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、第２のアルカノールは、メタノールである。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、第１のアルカノールは、メタノールであり、第２のアルカノールは、メタノールである。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、１０．０ｍｇ／ｍＬ以上、２０ｍｇ／ｍＬ以上、３０ｍｇ／ｍＬ以上、４０ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上、６０ｍｇ／ｍＬ以上、７０ｍｇ／ｍＬ以上、８０ｍｇ／ｍＬ以上、９０ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１１５ｍｇ／ｍＬ以上、１３０ｍｇ／ｍＬ以上、１５０ｍｇ／ｍＬ以上、２００ｍｇ／ｍＬ以上、または２２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、２２５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で存在する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、１５０ｍｇ／ｍＬまたは約１５０ｍｇ／ｍＬ〜２２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、１５％以上、２０％以上、２５％以上、１０％〜２５％、２２．５％、３０％、４０％、５０％、１０％〜２０％、１０％〜５０％、１５％〜２０％、１５％〜３０％、１５％〜２８％、２０〜２３％、１５％〜２５％、または２０〜２５％の濃度で存在する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約１０〜約３０％の濃度で存在する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約１５％超約３０％以下の濃度で存在する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約１５〜約２５％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約１５％超約２５％以下の濃度で存在する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、１５％ｗ／ｖ超の濃度で存在する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約２０％〜約２５％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約２０％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約２２．５％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約２５％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８のナトリウム不含溶液を使用前に低濃度に希釈することができ、例えば、限定するものではないが、２５％溶液を１５％溶液に希釈することができ、または２２．５％溶液を１５％溶液に希釈することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の溶液／製剤は、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含有する。塩化マグネシウムは、粘度低下剤（米国特許第７，７５８，８６０号を参照）、安定剤（米国公開第２０１２／０２４５２３０号参照）、および張度調整剤（米国特許第９，３６４，５６４号参照）であり得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、溶液は、等張化剤をさらに含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、等張化剤は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まない。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、等張化剤は、グルコース、グリセリン（グリセロール）、デキストロース、スクロース、キシリトール、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、マンノース、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩から選択される。いくつかの実施形態において、等張化剤は、マグネシウム塩である。いくつかの実施形態において、マグネシウム塩は、酢酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、フタル酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、コハク酸マグネシウム、酒石酸マグネシウム、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの実施形態において、マグネシウム塩は、塩化マグネシウムである。いくつかの実施形態において、塩化マグネシウムは、塩化マグネシウム六水和物である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、等張化剤の濃度は、約０ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２０ｍＭである。いくつかの実施形態において、等張化剤の濃度は、約１〜約１０ｍＭである。いくつかの実施形態において、等張化剤の濃度は、約１〜約５ｍＭである。いくつかの実施形態において、等張化剤の濃度は、約１〜約２ｍＭである。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、溶液は、抗酸化剤をさらに含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、溶液は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まない抗酸化剤をさらに含む。
【０１３７】
いくつかの態様において、抗酸化剤は、システイン、クエン酸、デキストロース、ジチオスレイトール、ヒスチジン、リンゴ酸、マンニトール、メチオニン、メタ重硫酸塩、アスコルビン酸、および酒石酸から選択される。いくつかの実施形態において、抗酸化剤は、クエン酸である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、抗酸化剤の濃度は、約０．００１％〜約２％である。いくつかの実施形態において、抗酸化剤の濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、溶液は、約６〜約８のｐＨを有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、溶液は、緩衝液をさらに含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、溶液は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まない緩衝液をさらに含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、緩衝液は、クエン酸緩衝液（ｐＨ約２）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約５）、クエン酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、リン酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ約１０）、コハク酸緩衝液（ｐＨ約５．６）、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ約６．１）、炭酸緩衝液（ｐＨ約６．３）、酢酸緩衝液（ｐＨ約７．２）、メグルミン、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、緩衝液は、約６の調整されたｐＨでクエン酸およびメグルミンを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、溶液は、ｐＨ調整剤をさらに含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、溶液は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まないｐＨ調整剤をさらに含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ｐＨ調整剤は、ＨＣｌ水溶液、水酸化アンモニウム、メグルミン、または他の非ナトリウム緩衝液および成分、ならびにそれらの混合物から選択される。
【０１４６】
滅菌された注入用溶液であって、約２２５ｍｇ／ｍＬの濃度のポロキサマー１８８、約０．６１０ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化マグネシウム六水和物、および注入用水を含む、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まず、前記ポロキサマー１８８が酸化分解から安定であり、約４〜約８のｐＨを有する、前記滅菌された注入用溶液も与えられる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、溶液のオスモル濃度は、約１００〜約２０００ｍＯＳｍ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、溶液のオスモル濃度は、約３００〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または２７０〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または約２８０〜約１５００ｍＯＳｍ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、溶液のオスモル濃度は、約３００〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、約３５０〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇ、約３５０〜約７００ｍＯＳｍ／ｋｇ、約３００〜約７００ｍＯＳｍ／ｋｇ、または約２７０〜約５００ｍＯＳｍ／ｋｇである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、溶液は、１種以上の他の活性成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、１種以上の他の活性成分は、アセトアミノフェン、ヒドロキシ尿素、アデノシン、アミオダロンＨＣｌ、硫酸アトロピン、ブメタニド、セファゾリン、クロロチアジドナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ジゴキシン、ＨＣｌ、ドブタミンジフェンヒドラミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、マレイン酸エナラプリル、エピネフリンＨＣｌ、クエン酸フェンタニル、フロセミド、硫酸ゲンタマイシン、ヘパリンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、イソプロテレノールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、マンニトール、メペリジンＨＣｌ、酒石酸メトプロロール、ミルリノン、ナフシリンナトリウム、ナロキソン、ネシリチド、ノルエピネフリン酒石酸水素、オンダンセトロンＨＣｌ、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、グルコン酸キニジン、およびベラパミルから選択される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、溶液は、密閉された薬学的に許容できる容器に入れられている。いくつかの実施形態において、前記密閉された薬学的に許容できる容器内の雰囲気は、不活性ガスまたは雰囲気、例えば、限定するものではないが、アルゴン、窒素、および/または二酸化炭素を含み、または前記溶液容器は真空下で密閉される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、溶液中の溶存酸素は約２．０ｍｇ／Ｌ以下である。いくつかの実施形態において、溶液は約２．０ｍｇ／Ｌ以下の溶存酸素を含み、抗酸化剤を含まない。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、密閉された薬学的に許容できる容器は、バイアルである。いくつかの実施形態において、バイアルは、１型フリントガラスまたはホウケイ酸ガラスを含む。いくつかの実施形態において、バイアルは、１００ｍＬバイアルである。いくつかの実施形態において、バイアルは、５００ｍＬバイアルである。いくつかの実施形態において、バイアルは、約１０ｍｌ〜約６００ｍｌバイアルである。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、密閉された薬学的に受容できる容器は、輸液バッグであ
る。いくつかの実施形態において、輸液バッグは、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ジ（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）含有ＰＶＣ、（トリス（２−エチルヘキシル）トリメリテート）（ＴＯＴＭ）含有ＰＶＣ、ポリオレフィン、ポリプロピレン、またはエチレン−酢酸ビニル（ＥＶＡ）を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、密閉された薬学的に許容できる容器は、箔ポーチに封入されている。いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる容器を含む密閉された箔ポーチ内の雰囲気は、アルゴン、窒素、および／または二酸化炭素、または不活性雰囲気を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、溶液は投与前に希釈されない。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、溶液は投与前に希釈される。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、溶液は、ナトリウムが低減されているか、または実質的にナトリウムを含まない溶液に希釈される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、溶液は、水中のＤ５Ｗ−デキストロース５％に希釈される。
【０１５８】
ポロキサマー１８８を含む特定のポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーは、ヒトまたは動物に投与された場合、いくつかの障害に対して有益な生理的効果を有する。これらの活性は、例えば、多数の刊行物および特許に記載されている（例えば、米国特許第４，８０１，４５２号、第４，８３７，０１４号、第４，８７３，０８３号、第４，８７９，１０９号、第４，８９７，２６３号、第４，９３７，０７０号、第４，９９７，６４４号、第５，０１７，３７０号、第５，０２８，５９９号、第５，０３０，４４８号、第５，０３２，３９４号、第５，０３９，５２０号、第５，０４１，２８８号、第５，０４７，２３６号、第５，０６４，６４３号、第５，０７１，６４９号、第５，０７８，９９５号、第５，０８０，８９４号、第５，０８９，２６０号、第ＲＥ３６，６６５号（第５，５２３，４９２号の再発行）、第５，６０５，６８７号、第５，６９６，２９８号、第６，３５９，０１４号、第６，７４７，０６４号、第８，３７２，３８７号、第８，５８０，２４５号、米国特許公開第２０１１／００４４９３５号、第２０１１／０２１２０４７号、第２０１３／０１７７５２４号、ならびに国際出願国際公開第２００６／０３７０３１号（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４７９０として出願）、国際公開第２００９／０２３１７７号（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３７１５７として出願）および国際公開第２００６／０９１９４１号（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６８６２として出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１４／４５６２７を参照）。
【０１５９】
したがって、本明細書に記載の溶液は、細胞保護的、血液レオロジー的、抗炎症性、抗血栓性/線維素溶解促進性適用を含む広範囲の適用に使用することができ、多様な疾患に
おける臨床的有用性を有し、多様な疾患には、限定されるものではないが、急性冠不全症候群、虚血肢、ショック、脳卒中、心不全、例えば、限定するものではないが、収縮期性、拡張期性、鬱血性、および心筋症、冠動脈疾患、筋ジストロフィー、循環器疾患、血液中の病的な疎水性相互作用、移植のための臓器の保存、炎症、鎌状赤血球症、例えば、静脈閉塞発作、および急性胸部症候群、炎症、疼痛、神経変性疾患、黄斑変性、血栓症、腎不全、火傷、脊髄損傷、虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、保存された血液および血液製剤中の保存損傷を予防または治療すること、輸血用の保存血液の安全性および有効性を改善すること、血液濃縮、アミロイドオリゴマー毒性、糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢血管疾患、突然の難聴、末梢血管疾患、脳虚血、一過性虚血発作、重症虚血肢、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）が含まれる。本明細書に与えられる溶
液は、Ｐ１８８がこれまでに使用されてきた、または有効であることが知られている任意の疾患または状態を治療するために使用することができる。
【０１６０】
また、本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における疾患または状態を治療する方法も与えられ、前記疾患または状態は、急性冠不全症候群、虚血肢、ショック、脳卒中、心不全、鎌状赤血球症、神経変性疾患、黄斑変性、血栓症およびＡＲＤＳ、腎不全、肝臓疾患、鎌状赤血球症および関連静脈閉塞発作、ならびに急性胸部症候群から選択される。
【０１６１】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象におけるショックを治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、ショックは、敗血症性ショック、血液量減少性ショック、または血液分布異常性ショックである。
【０１６２】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における虚血肢を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、虚血肢は、末梢虚血肢または急性虚血肢である。
【０１６３】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における脳卒中を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、脳卒中は、血管痙攣性脳卒中、血栓性脳卒中、出血性脳卒中、または虚血性脳卒中である。
【０１６４】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における心不全を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、心不全は、急性心不全、慢性心不全、収縮期性心不全（駆出率が低下した心不全）、または拡張期性心不全（駆出率を維持した心不全）である。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、心不全は、不整脈、上昇した血圧、動脈の狭小化、カテーテル挿入、または心拍出量の変化のうち１つ以上の存在によって現れる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、心不全は収縮期性心不全である。いくつかの実施形態において、収縮期性心不全は、左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）の低下、ＬＶ収縮末期容量の増加、左心室肥大、またはＬＶ収縮末期圧の上昇によって現れる。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、心不全は拡張期性心不全である。いくつかの実施形態において、拡張期性心不全は、左心室の大きさは正常で心筋質量が増加すること、またはＬＶ拡張末期圧が上昇することによって現れる。
【０１６８】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における、鎌状赤血球症またはその症状を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、鎌状赤血球症またはその症状には、急性血流閉塞発作、急性胸部症候群、脾臓の赤血球捕捉、および/または持
続勃起症が含まれる。
【０１６９】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における血栓症を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、血栓症は、動脈血栓症または静脈血栓症である。
【０１７０】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における黄斑変性を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、黄斑変性には、乾性ＡＭＤおよび湿性ＡＭＤが含まれる。
【０１７１】
本明細書に記載の溶液を投与することを含む、対象における急性冠不全症候群を治療する方法も与えられる。いくつかの実施形態において、急性冠不全症候群には、急性心筋梗塞および不安定狭心症が含まれる。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の溶液は、１種以上の他の活性成分と共に投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の他の活性成分は、アセトアミノフェン、アデノシン、アミオダロンＨＣｌ、硫酸アトロピン、ブメタニド、セファゾリン、クロロチアジドナトリウム、ヒドロキシ尿素、リン酸デキサメタゾンナトリウム、ジゴキシン、ＨＣｌ、ドブタミンジフェンヒドラミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、マレイン酸エナラプリル、エピネフリンＨＣｌ、クエン酸フェンタニル、フロセミド、硫酸ゲンタマイシン、ヘパリンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、イソプロテレノールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、リドカインＨＣｌ、マンニトール、メペリジンＨＣｌ、酒石酸メトプロロール、ミルリノン、ナフシリンナトリウム、ナロキソン、ネシリチド、ノルエピネフリン酒石酸水素、オンダンセトロンＨＣｌ、フェニレフリンＨＣｌ、プロメタジンＨＣｌ、グルコン酸キニジン、およびベラパミルから選択される。
【０１７３】
熟練した医師もしくは薬剤師または他の当業者は、特定の対象、治療された状態、および目標循環濃度のための適切な濃度および投与条件を選択することができる。必要であれば、特定の投薬量および期間および治療プロトコルを経験的に決定または推定することができる。これまでにヒト対象に投与され、臨床試験で使用されたポロキサマー１８８の投薬量は、本明細書に記載の精製ポロキサマー１８８などのポロキサマー１８８の投薬量を決定するための指針として使用することができる。ポロキサマー１８８の投薬量は、関連する動物試験から決定または推定することもできる。このような決定を行うのに、ポロキサマー１８８の活性のレベルおよび半減期などの因子を使用することができる。特定の投薬量およびレジメンは、様々な因子に基づいて経験的に決定することができる。このような因子には、個体の体重、一般的健康状態、年齢、使用される特定の化合物の活性、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および経過、疾患に対する患者の素因、および治療担当医の判断が含まれる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、Ｐ１８８（例えば、ＬＣＭＦ  Ｐ１８８）などのポロキサマーは、治療される状態に応じて、約１００ｍｇ／ｋｇ〜２０００ｍｇ／ｋｇの投薬量で患者に投与するために製剤化される。
【０１７５】
１回分のポロキサマーは、投与様式および患者の生理的必要性に適合する濃度および液量で投与される。一般に、より長期間の注入（例えば、１２、２４、または４８時間の連続注入）では、投与量は、通常、約５．０ｍＬ／ｋｇ／時以下、例えば、４．５ｍＬ／ｋｇ／時、４．０ｍｌ／ｋｇ／時、３．５ｍｌ／ｋｇ／時、３．０ｍｌ／ｋｇ／時、２．５ｍｌ／ｋｇ／時、２．０ｍｌ／ｋｇ／時、１．５ｍｌ／ｋｇ／時、１．０ｍｌ／ｋｇ／時、０．５ｍｌ／ｋｇ／時、０．２５ｍｌ／ｋｇ／時、または０．１２５ｍｌ／ｋｇ／時である。より短期間の投与（例えば、ボーラス投与または短期間注入）では、１回分のポロキサマーは、患者の必要性に応じて、５．０ｍｌ／ｋｇ／時より大きな容量、例えば、７．５ｍｌ／ｋｇ／時、または１０．０ｍｌ／ｋｇ／時、または１２．５ｍｌ／ｋｇ／時、または１５ｍｌ／ｋｇ／時、またはそれ以上で投与し得る。ポロキサマーは、単回投与または毎時、毎日、毎週、毎月など、様々な間隔で繰り返される複数回投与として投与することができる。注入では、注入は、典型的には１時間〜７２時間、例えば１２時間、２４時間、または４８時間の期間に亘って対象に適切な投薬量を与えることができる。いくつかの実施形態において、ポロキサマーの投与は、約０．５時間〜２時間、または約１〜２時間、または約１時間に２５〜１００ｍｇ／ｋｇなどの漸増投与を含み得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８は、約１００〜６００ｍｇ／ｋｇ患
者体重、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重、例えば、１００ｍｇ／ｋｇ〜４５０ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜４５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ〜４５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ〜４５０ｍｇ／ｋｇ、または４５０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重、例えば、約１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または６００ｍｇ／ｋｇ患者体重の投薬量で患者に投与するために製剤化される。いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、約２００〜４５０ｍｇ／ｋｇ、例えば４００ｍｇ／ｋｇ患者体重の投薬量で投与するために製剤化される。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、投与される体積は、対象の４．０ｍＬ／ｋｇ以下である。例えば、対象に投与される投与量の体積は、０．４ｍＬ／ｋｇ〜４．０ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ〜３．５ｍＬ／ｋｇ、０．４〜３．０ｍｌ／ｋｇ、０．４〜２．５ｍｌ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ〜２．０ｍＬ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ〜１．８ｍＬ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ〜１．４ｍＬ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ〜１．０ｍＬ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ〜０．６ｍＬ／ｋｇ、０．６ｍＬ／ｋｇ〜４．０ｍＬ／ｋｇ、０．６ｍＬ／ｋｇ〜３．０ｍＬ／ｋｇ、０．６ｍＬ／ｋｇ〜２．０ｍＬ／ｋｇ、０．６ｍＬ／ｋｇ〜１．８ｍＬ／ｋｇ、０．６ｍＬ／ｋｇ〜１．４ｍＬ／ｋｇ、０．６ｍＬ／ｋｇ〜１．０ｍＬ／ｋｇ、１ｍＬ／ｋｇ〜４ｍＬ／ｋｇ、１．０ｍＬ／ｋｇ〜３．０ｍＬ／ｋｇ、１ｍＬ／ｋｇ〜２．５ｍＬ／ｋｇ、１ｍＬ／ｋｇ〜２．０ｍＬ／ｋｇ、１ｍＬ／ｋｇ〜１．８ｍＬ／ｋｇ、１ｍＬ／ｋｇ〜１．４ｍＬ／ｋｇ、１．４ｍＬ／ｋｇ〜４．０ｍＬ／ｋｇ、１．４ｍＬ／ｋｇ〜３．０ｍＬ／ｋｇ、１．４ｍＬ／ｋｇ〜２．５ｍＬ／ｋｇ、１．４ｍＬ／ｋｇ〜２．０ｍＬ／ｋｇ、１．４ｍＬ／ｋｇ〜１．８ｍＬ／ｋｇ、１．８ｍＬ／ｋｇ〜４．０ｍＬ／ｋｇ、１．８ｍＬ／ｋｇ〜３．０ｍＬ／ｋｇ、１．８ｍＬ／ｋｇ〜２．５ｍＬ／ｋｇ、１．８ｍＬ／ｋｇ〜２．０ｍＬ／ｋｇ、２．０ｍＬ／ｋｇ〜４．０ｍＬ／ｋｇ、２．０ｍＬ／ｋｇ〜３．０ｍＬ／ｋｇ、２．０ｍＬ／ｋｇ〜２．５ｍＬ／ｋｇ、または２．５ｍＬ／ｋｇ〜３．０ｍＬ／ｋｇであり得る。例えば、１００ｋｇの対象に１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される２２．５％（すなわち、２２５ｍｇ／ｍＬ）の濃度を有する組成物は、その投与量を達成するために約４４ｍＬまたは約０．４ｍＬ／ｋｇの体積を必要とする。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、投与量は注入として投与される。一般に、注入は静脈内注入である。適切な投薬量を与えるために、注入を、１時間〜２４時間、１時間〜１２時間、１時間〜６時間、１時間〜３時間、１時間〜２時間、２時間〜２４時間、２時間〜１２時間、２時間〜６時間、２時間〜３時間、３時間〜２４時間、３時間〜１２時間、３時間〜６時間、６時間〜２４時間、６時間〜１２時間、または１２時間〜２４時間の期間に亘って、例えば通常、約１時間以下、２時間以下、３時間以下、４時間以下、５時間以下、６時間以下、７時間以下、８時間以下、９時間以下、１０時間以下、１２時間以下、１５時間以下、１８時間以下、２０時間以下、２２時間以下、またはそれ以上の時間以下の期間に亘って、対象に与えることができる。対象によって許容され得る有効用量を送達するための注入の適切な時間および速度を決定することは、治療担当医のレベル内である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ポロキサマー１８８の注入は、１週間以上の間に繰り返されることがない単回注入として与えられ、その後、１週間以上、通常２〜４週間までの間隔で繰り返されることができ、改善が観察されると、間隔はますます長くなり、かつ／または投薬量がより少なくなる。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、投与は、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週
間に１回、５週間に１回、または６週間に１回繰り返すことができる。例えば、投与は、前の投与の完了後７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、または４２日に繰り返すように、前の投与後１週間〜４週間繰り返すことができる。繰り返し投与で投与される投与量は、前の投与量と同じであること、または異なることができる。例えば、投与量を前の投与量から増加または減少させることができる。繰り返し投薬における投与の適切な頻度、および投薬のレベルまたは量を決定することは、治療担当医のレベル内である。
【０１８１】
投与サイクルの時間の長さは、経験的に決定することができ、治療すべき疾患、疾患の重症度、特定の患者、および治療担当医の技量レベル内の他の考慮事項に依存する。治療時間の長さは、１日、１週間、２週間、１ヶ月、数ヶ月、１年、数年、またはそれ以上であり得る。その期間に亘って、ポロキサマー１８８を、上記のように、週に１回以下、例えば、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、または２８日、またはそれ以上おきに投与することができる。もし治療が中止されていなくても病状が持続するならば、追加の期間、治療を続けることができる。治療の間、疾患および/または治療関連の毒性もしくは副作用の兆候をモニタリングすることが
できる。
【０１８２】
さらに、投与サイクルは、曝露から治療までの休息期間を与えるために中止治療期間を追加するように調整することができる。治療の中止の時間の長さは、所定の時間であり得るか、または患者がどのように応答しているかに、もしくは観察された副作用に依存して、経験的に決定され得る。例えば、治療を、１週間、２週間、１ヶ月、または数ヶ月間中止することができる。
【実施例】
【０１８３】
以下の実施例は、例示のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１８４】
実施例１
【０１８５】
滅菌された注入用ナトリウム不含溶液の製造
【０１８６】
以下の手順を用いて、２４ｍＭメグルミンでｐＨを調整した１０ｍＭクエン酸および３ｍＭ塩化マグネシウムを含む２２５ｍｇ／ｍＬ  ＬＣＭＦポロキサマー１８８の溶液を製造した（表２）。
【表２】
2018527312.tif 000004
１．ステンレス鋼のチューブおよびフリットを使用して、溶存酸素が２ｍｇ／Ｌ以下になるまで、１２００ｇ以上を１０分間以上激しくまき散らす。
２．タールを塗った２Ｌステンレススチール容器に約７００ｇのＳＷＦＩを移す。
３．オーバーヘッドミキサーを容器の上に置き、渦が観察されるまで２５０ＲＰＭ以上に設定する。
４．ゆっくりと１．９２ｇの無水クエン酸を約７００ｇのＳＷＦＩに攪拌しながら加える。目視検査によって判定される均一な溶液が得られるまで混合する。
５．撹拌しながら、０．６１ｇの塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）をゆっくりと容器に加え、目視検査で判定される均一な溶液が得られるまで混合する。
６．４．６９ｇのメグルミンをゆっくりと容器に加え、目視検査で判定される均一な溶液が得られるまで混合する。
７．ゆっくりと少量ずつ（発泡を避けるために）、２２５ｇのポロキサマー１８８製剤原料を容器に加え、均一な溶液が得られるまで（必要に応じて一晩）混合する。
８．窒素パージしたＳＷＦＩを容器に加え、１０３５．３ｇまたは１００％目標アッセイに到達させる。
【０１８７】
実施例２０の方法を用いて、この製剤の塩濃度は０．０４２９μｇ／ｍＬであることが分かった。
【０１８８】
実施例２
【０１８９】
滅菌された注入用ナトリウム不含溶液の製造
【０１９０】
１５０ｍｇ／ｍＬのＬＣＭＦポロキサマー１８８の溶液を、上記のように、下記の成分を用いて製造した（表３）。
【表３】
2018527312.tif 000005
【０１９１】
実施例３
【０１９２】
本明細書の研究における対照としての使用のための滅菌された注入用ナトリウム含有溶液の製造
【０１９３】
実施例１に記載され、（表４）に示されるように、下記の成分を用いて、０．４５％塩化ナトリウム（生理食塩水の半分）の総ナトリウム含有量を有する１５０ｍｇ／ｍＬのＬＣＭＦポロキサマー１８８の溶液を製造した。
【表４】
2018527312.tif 000006
【０１９４】
実施例４
【０１９５】
１５％ナトリウム不含ＬＣＭＦポロキサマー注入用溶液の様々な製剤に関する粒子研究
【０１９６】
粒子を、実質的にナトリウムを含まない１５％ポロキサマー１８８ＬＣＭＦのバッチで観察した。製剤の種々の成分の相互作用を評価して、粒子形成の原因を決定した。表５は、試験した９つの製剤の組成を示す。
【表５】
2018527312.tif 000007
【０１９７】
外観、ｐＨ、およびＤ．Ｏ．を表６に示すように各試料について測定した。
【表６】
2018527312.tif 000008
【０１９８】
これらのデータに基づいて、製剤３および６は、粒子形成が、マグネシウム、クエン酸塩、およびポロキサマーの間の複合体形成に起因したことを示唆している。
【０１９９】
実施例５
【０２００】
オスモル濃度
【０２０１】
水中でのＬＣＭＦポロキサマー１８８のオスモル濃度を、蒸気圧浸透圧測定法を用いて２５ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬの範囲で評価した（表７）。溶液中のポロキサマー１８８の濃度が増加するにつれて、オスモル濃度の指数関数的増加が観察された。等張溶液は、典型的には、オスモル濃度値２７０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ水を有するものとして定義される。２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満または３００ｍＯｓｍ／ｋｇ超のオスモル濃度値を有する溶液は、それぞれ低張および高張と考えられる。
【表７】
2018527312.tif 000009
【０２０２】
ポロキサマー１８８の全血１３溶液および２対照に対する効果をよりよく理解するために、血液塗抹標本を用いて評価した。製剤原料を注入用滅菌水に１５％〜４０％の範囲の６つの濃度で加え、溶液のオスモル濃度値を記録した。次いで、塩化ナトリウムを注入用の滅菌水に加えて、ポロキサマー１８８溶液のオスモル濃度値と一致するオスモル濃度値を有する６つの塩化ナトリウム溶液を作製した。等張性１５％ポロキサマー１８８溶液を対照として使用した。最後に、陽性対照および陰性対照を試験した（表８）。
【表８】
2018527312.tif 000010
【０２０３】
研究は、ポロキサマー１８８を含有する溶液中に円鋸歯状化または溶解赤血球の兆候はなかったことを明らかにした。しかしながら、ポロキサマー１８８を含まないＮａＣｌ溶液で作製したすべての塗抹標本には、円鋸歯状化細胞が存在していた。対照溶液（ナトリウム含有１５％ポロキサマー溶液）は、全血と混合したときに円鋸歯状細胞の兆候を示さなかった。これは、ポロキサマー１８８含有溶液が予想通りに挙動せず、非等張溶液中の赤血球に対する保護効果を潜在的に示すことを示唆している。
【０２０４】
ポロキサマー１８８の全血に対する効果を、１９のパイロット製剤および２つの対照を用いて再度血液塗抹標本により評価した。以下の表９は、調べた１９の溶液の組成を記載する。先の血液塗抹試験で見られたように、実質的にナトリウムを含まない溶液を含む、どのポロキサマー１８８含有溶液についても、円鋸歯状化または溶解は観察されなかった。この試験の結果により、先の血液塗抹試験で見られた赤血球に対するポロキサマー１８８の予想外の保護効果が確認された。これらのデータは、凍結点または蒸気圧浸透圧測定法によって測定された等張性は、いくつかのポロキサマー１８８溶液が全血と適合するために必要とされないことを示唆している。
【表９】
2018527312.tif 000011
【０２０５】
実施例６
【０２０６】
様々な試験溶液の補体活性化
【０２０７】
本研究の目的は、適格なＥＬＩＳＡ法を用いて、様々なポロキサマー１８８試験溶液による生体外活性化後のヒト血清補体因子を定量化することであった。Ｍｉｃｒｏｖｕｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂｂ  Ｐｌｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ａ０２７、供給者推奨の最小必要希釈度（ＭＲＤ）１／２０）およびＭｉｃｒｏｖｕｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ＳＣ５ｂ−９  Ｐｌｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ａ０２０、供給者推奨ＭＲＤ  １／４０）キットを使用して、ヒト血清中のＢｂおよびＳＣ５ｂ−９の方法認定および分析を行った。全部で３人の健康なヒトドナー由来の血清サンプルを収集し、１９の試験品製剤（表１０）または対照品で活性化し、ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９含有量について分析した。結果を表３に示す。概して、より高いマグネシウム濃度を有する溶液は、Ｂｂ含有量の上昇を示した。また、ポロキサマー１８８の濃度がより高い溶液
は、ｓＣ５ｂレベルの上昇を示した。
【表１０】
2018527312.tif 000012
【０２０８】
実施例７
【０２０９】
ｐＨ安定性および緩衝液相溶性
【０２１０】
溶液のｐＨは、多くの薬剤の分解速度に対して触媒作用を有する。ＬＣＭＦポロキサマー１８８の溶液安定性におけるｐＨおよび緩衝液種の役割を評価するために、以下の試験を行った。
・ポロキサマー１８８を、加速条件下でｐＨ範囲２〜１０に亘ってクエン酸、リン酸、およびホウ酸緩衝液中で評価した。
・溶液安定性に対する緩衝液種の作用を、ｐＨ５のクエン酸およびリン酸緩衝液ならびにｐＨ９のリン酸およびホウ酸緩衝液を重ね合わせることによって決定した。
・ポロキサマー１８８の初期濃度が分解速度に与える作用を、ｐＨ２、７．２、および１０で２０ｍｇ／ｍＬおよび３００ｍｇ／ｍＬで評価した。
・種々の緩衝液種とポロキサマー１８８との相溶性を、加速条件下で保存した場合に一定のｐＨおよび効力値を維持する溶液の能力に基づいて判定した。
【０２１１】
内在化ＥＬＳＤ  ＨＰＬＣ法を用いて、全てのサンプルをｐＨ、外観、オスモル濃度、および効力について分析した。ｐＨおよび効力に関する結果は、以下の表１１に見られる
。
【０２１２】
高いｐＨの溶液は、より酸性の溶液と比較してより大きな安定性を示した。非経口溶液の目標ｐＨ範囲は、典型的には６〜８である。ポロキサマー１８８は、この範囲において許容可能な安定性を示した。緩衝液種は、ｐＨ５のリン酸緩衝溶液と比較してクエン酸緩衝溶液の安定性が増加したことによって示されるように、安定性に影響を及ぼす可能性を示した。初期濃度に関して、ポロキサマー１８８濃度の増加は分解速度を増加させないことが示された。
【表１１】
2018527312.tif 000013
【０２１３】
２０％ポロキサマー１８８で評価した緩衝液種は、酢酸（ｐＨ７．１９）、硫酸塩、グリシン、およびトリスを除いて、３週間の加速条件に付した場合、目標の１単位内のｐＨ値を維持することができた。同様に、ポロキサマー１８８の％効力値は、８９．６％の酒石酸塩を除いて、全ての緩衝液について９０％を超えていた。酒石酸塩溶液（ｐＨ４．４）のより酸性の目標ｐＨは、その不安定性において役割を果たす可能性が高い。
【０２１４】
実施例８
【０２１５】
酸素含有量
【０２１６】
ポロキサマー１８８（精製ポロキサマー１８８およびＬＣＭＦポロキサマー１８８）は、酸素の存在下で分解する。ＳＷＦＩ中のポロキサマー１８８の２つの濃度に対する酸素含有量の影響をよりよく定量化するために評価した。試験のために、各濃度の５０ｍＬバッチを配合し、目標溶存酸素値を達成するためにサンプルに窒素ガスを一定時間まき散らした。約３ｍＬのアリコートを、窒素ガスでキャップしたスクリュートップバイアルに移した。全てのサンプルを溶存酸素（Ｄ．Ｏ．）含有量のみについて評価した。
【表１２】
2018527312.tif 000014
【０２１７】
上記溶存酸素試験では明確なパターンは観察されなかった。サンプルの溶存酸素含有量は、試験の経過とともに散発的に変化した。
【０２１８】
５℃および４０℃で保存した後、揮発性不純物および残留メタノールについて追加のサンプルを評価した。これらの分析の結果は、以下の表１３に見られる。サンプルは揮発性不純物の増加をもたらす酸素含有量の増加と強い相関関係した。
【表１３】
2018527312.tif 000015
【０２１９】
実施例９
【０２２０】
抗酸化剤の評価
【０２２１】
高濃度ポロキサマー１８８ＬＣＭＦ製剤に使用するための抗酸化剤候補を同定するための試験を行った。実施例８の酸素含有量試験の結果を使用して、表１４に挙げたポロキサマー溶液に適切に曝すのに必要な酸素レベルを決定した。抗酸化剤であるアスコルビン酸、システイン、クエン酸、デキストロース、ジチオスレイトール、ヒスチジン、リンゴ酸、マンニトール、メチオニン、メタ重硫酸ナトリウム、および酒石酸を種々のパーセンテージで添加した。製剤組成は、表１４に見られる。ＥＬＳＤによるｐＨ、溶存酸素、オスモル濃度、および効力を、ｔ＝０、１、および３ヶ月で４０℃で保存して評価した。使用したＨＰＬＣ法のパラメータおよび勾配は、以下の表ＡおよびＢに記載されている。結果は表Ｃに見られる。
【表１４】
2018527312.tif 000016
【表１５】
2018527312.tif 000017
【表１６】
2018527312.tif 000018
【表１７−１】
2018527312.tif 000019
【表１７−２】
2018527312.tif 000020
【０２２２】
実施例１０
【０２２３】
ｐＨ調整剤
【０２２４】
濃縮水酸化アンモニウムの取り扱いには安全性の懸念および困難さがあるため、水酸化アンモニウムに代わるｐＨ調整剤としてメグルミンを評価した。複数のナトリウム不含ポロキサマー１８８製剤を無菌的な条件下で配合し、評価のために５０ｍＬの滅菌バイアルに充填した。様々なパーセンテージのポロキサマー１８８、クエン酸、およびＭｇＣｌ２を含有する製剤を調製し、水酸化アンモニウムまたはメグルミンでｐＨを調整した。また、製剤のマグネシウムおよびクエン酸塩成分が粒子形成の原因である可能性があることを示す粒子形成研究の結果を受けて、ＭｇＣｌ２濃度を低下させた。これらの製剤を、血液塗抹試験によって分析し、ＩＶフロー試験によって評価もした。メグルミンでｐＨを調整したナトリウム不含ポロキサマー１８８製剤の第２のバッチを無菌的な条件下で配合し、５０ｍＬの滅菌バイアルに充填した。これらの製剤も血液塗抹試験によって分析した。
【０２２５】
ＥＬＳＤ法による外観、ｐＨ、溶存酸素、粘性、密度、オスモル濃度、および効力を全ての製剤について評価した。外観、ｐＨ、および溶存酸素を、製造過程で測定した。製剤組成および結果は、それぞれ、以下で表１５および表１６に見られる。
【０２２６】
メグルミンは、水酸化アンモニウムの好適な代替物質である。取り扱いがかなり容易であり、ｐＨの調整がより予測可能であった。製剤を含有する全てのポロキサマー１８８は、全血と適合性であった。
【表１８】
2018527312.tif 000021
【表１９】
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【０２２７】
実施例１１
【０２２８】
粘性および注入可能性
【０２２９】
粘性および注入可能性を、ある範囲の濃度に亘って測定した。粘性は転がり落球式粘度計（rolling ball viscometer）で２０℃で測定し、注入可能性は２７Ｇ１／２ニードル
および１ｍＬプラスチックシリンジを用いるテクスチャーアナライザーで測定した。濃度が直線的に増加すると両方の特性が指数関数的に増加した。結果を表１７に示す。
【表２０】
2018527312.tif 000023
【０２３０】
粘度の増加が送達速度に与える影響をさらに評価するために、さらなる試験を行った。濾過した、および濾過していないＩＶ投与セットを用いて、１０ｍＬ／分（６００ｍＬ／時）の目標速度で様々なＭＳＴ−１８８（ＬＣＭＦポロキサマー１８８）製剤を送達した（表１８および１９）。いずれの製剤も目標送達速度を達成しなかったが、ＭＳＴ−１８８の濃度と送達速度との間には観察可能な相関はなかった。
濾過した系列、速度：１０ｍＬ／分
【表２１】
2018527312.tif 000024
【表２２】
2018527312.tif 000025
【０２３１】
実施例１２
【０２３２】
メタノール／超臨界ＣＯ２共溶媒抽出によるポロキサマー１８８の連続精製法
【０２３３】
メタノール／超臨界ＣＯ２共溶媒を用いる抽出によるポロキサマー１８８の連続精製法を評価した。連続法は、高生産性を可能にする。メタノール中のポロキサマー１８８の供給溶液（日本の旭電化工業）を、好適な充填材料を充填した高圧抽出カラムの中点でポンプ輸送した。メタノールと混合した超臨界ＣＯ２（フランスのＣａｒｂｏｘｙｑｕｅ）を、抽出カラムを通して底部から向流様式（流速＝３０ｋｇ／ｈ〜４０ｋｇ／ｈ）でポンプ輸送した。メタノールの平均濃度は１３％であり、９〜１３．２重量％の勾配として得られた。カラムの中央の供給口でのメタノール、ＣＯ２、およびポロキサマーの流速、ならびにカラムの底部で導入されたＣＯ２／メタノールの流速を制御することによって、勾配を制御した。カラム圧力は２００±１５バールであった。供給溶液および超臨界ＣＯ２／メタノール溶媒の温度は３６〜４４℃の勾配であった。カラムジャケット温度および抽出温度は３６〜５４℃の勾配であった。
【０２３４】
低分子量（ＬＭＷ）ポリマーをカラムの頂部で除去し、メタノールを含有する精製された生成物を抽出カラムの底部から除去した。精製された生成物を１時間毎に回収し、ガス飽和・懸濁溶液（Particle from Gas Saturated Solutions）（ＰＧＳＳ）法により減圧
下で沈殿させた。精製された生成物を真空下で４０℃以下で乾燥させて残留メタノールを除去した。
【０２３５】
供給当りの精製ポロキサマーのおおよその収率は約６０％であった。ピーク平均分子量は約９，０００ダルトンであった。低分子量成分（４，５００ダルトン未満）は約１．０％であった。多分散性は約１．０であった。
【０２３６】
実施例１３
【０２３７】
ポロキサマー１８８の１２−Ｌスケール二重段階抽出バッチ精製法
【０２３８】
撹拌抽出容器、サイクロン分離器、ＣＯ２溶媒循環、およびメタノール共溶媒系を含む１２−Ｌ抽出系を漏れについて試験する。抽出系を、キャンペイン開始時にＣＯ２で３１０±１５バールに加圧する。メタノール（２ｋｇ）をライナー付きの供給混合タンクに分配し、４０℃に温める。約３７００グラムのポロキサマー１８８を供給タンクに加え、完全に混合するまで撹拌する。５１００グラムの混合溶液を抽出器にポンプ輸送する。ＣＯ２の流速を３９０ｇｍ／分に維持する。メタノール濃度を調整することにより、２回の連続抽出を行う。メタノールの流速が２７．６±１．０ｇｍ／分で７．６％ＭｅＯＨ／ＣＯ２で１２時間±３０分間抽出を行う。メタノールの流速が３６．６±１．０ｇｍ／分で８．６％ＭｅＯＨ／ＣＯ２で１２時間±１５分間抽出を続ける。
【０２３９】
２４時間の精製後、抽出器を急速減圧システム（ガス飽和・懸濁溶液（Particle from Gas Saturated Solutions）（ＰＧＳＳ））を通して排出し、湿った生成物はライナーに
回収する。湿った生成物のサンプル（約６００ｇｍ）をフラスコに移し、ロータリーエバポレーターを用いて室温かつ中程度の真空で約３時間、次いで室温かつ高真空で３０分間、３５℃でさらに３０分間乾燥する。乾燥した生成物を収集し、分子量分布についてゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって試験する。低分子量（ＬＭＷ）成分は、精製された生成物中に検出されない。精製された生成物は約４．５％の高分子量（ＨＭＷ）成分を含んでいた。ＧＰＣのための方法は当該分野、例えばGrindel et al.(2002) (Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103)で公知である。
【０２４０】
実施例１４
【０２４１】
メタノール／超臨界ＣＯ２共溶媒抽出によるポロキサマー１８８のバッチ精製法
【０２４２】
メタノール／超臨界ＣＯ２共溶媒を用いる抽出によるポロキサマー１８８のバッチ精製法を評価した。ポロキサマー１８８（日本の旭電化工業）を、抽出溶媒温度、圧力、およびメタノール共溶媒含有量を制御することにより溶媒特性を調整することによって、精製した。方法は、圧力および共溶媒含有量が異なっていた。
【０２４３】
ポロキサマー１８８（１３〜１４ｋｇ）を高圧抽出容器中でメタノール溶媒と混合した。メタノールと超臨界ＣＯ２（米国のＢＯＣガス）の共溶媒を混合し、抽出容器を通してポンプ輸送した。抽出をより低いメタノール濃度で開始し、抽出中に除去された画分の組成をモニタリングしながら、連続的に増加させた。平均メタノール濃度は７．３重量％であった。濃度を６．６％から７．６％および８．６％に段階的に増加させた。抽出容器圧力は３００±１５バールであった。メタノール／超臨界ＣＯ２溶媒温度および抽出器ジャケット温度は４０±５℃であった。抽出温度を３５〜４５℃に調整した。溶出画分をゲル
浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析した。抽出容器から回収された精製ポロキサマー１８８の分子量分布は、出発物質よりも狭かった。
【０２４４】
得られた収率は、約７５％であった。ピーク平均分子量は約９，０００ダルトンであった。低分子量成分（４，５００ダルトン未満）は約１．０％であった。多分散性は約１．０であった。
【０２４５】
実施例１５
【０２４６】
ポロキサマー１８８の１２−Ｌスケール多段階抽出バッチ精製法およびゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析
【０２４７】
ポロキサマー１８８の４つのバッチを、１２リットルの抽出容器でＳＦＥバッチ法によって精製した。各バッチを下記のように精製した。系をＣＯ２で加圧し、圧力をバッチ間で９００ｐｓｉｇ（６３バール）より高く維持した。メタノール（２０００±２０ｇｍ）を、ライナー付きの供給混合タンクに分配し、４０℃に温めた。ポロキサマー１８８（３６９６±２０ｇｍ）を供給タンクに分配し、混合するまで撹拌した。９０パーセント（９０％）のポロキサマー１８８溶液を抽出器にポンプ輸送し、系を３１０±１５バールに加圧した。ＣＯ２の流速を３９０ｇｍ／分に維持した。メタノール濃度を、制御した段階的増加で６．６重量％、７．６重量％、または８．６重量％を経て調節することにより、３回の連続抽出を行った。各メタノール濃度で、以下に記載するように、所定の期間抽出を行った（表１９）。各抽出の間に指定時間後、処理中サンプルを抽出器の底部から収集した。
【表２３】
2018527312.tif 000026
【０２４８】
２６時間の精製工程の終わりに、抽出器を急速減圧システムを通して排出し、湿った生成物をライナーに回収した。湿った生成物のサブロット（〜６００ｇ）をフラスコに移し、ロータリーエバポレーターを用いて室温かつ中程度の真空で約３時間、次いで室温かつ高真空で３０分間、３５℃かつ高真空でさらに３０分間乾燥した。乾燥した生成物をサブロットとして回収した。残りの湿った生成物でこの乾燥工程を繰り返して、３つの乾燥生成物のサブロットを作製した。３つのサブロットを１０Ｌのドラムにまとめ、３０分間混合して、精製ポロキサマー１８８を製造した。供給当りの収率は約５５％であった。
【０２４９】
出発および精製ポロキサマー１８８生成物をゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって評価した。出発ポロキサマー１８８のＧＰＣトレースは、低分子量側に小さな付加的なピークを有する狭い分子量分布を示す。低分子量成分の曲線下面積は約４〜７％であり、平均分子量は４，５００ダルトン未満である。これと比較して、精製ポロキサマー１８８のＧＰＣトレースは、著しく少ない量の低分子量ピーク（主ピークの面積の１．５％未満）を有する狭い分子量分布を示す。
【０２５０】
実施例１６
【０２５１】
長時間循環物質不含（ＬＣＭＦ）ポロキサマー１８８の製造および投与
【０２５２】
ポロキサマー１８８の多段階抽出バッチ法を、２４７±１５ａｔｍ（約２００〜２６０バール）の圧力、７．４、９．１、および１０．７重量％のメタノールという制御したメタノールの段階的増加で実施する抽出で行った。精製前に、ポロキサマー１８８原料（ニュージャージー州ワシントンのＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって特徴付けた。分子量分析により、原料は、主ピークの平均分子量が約８，５００±７５０Ｄａであり、６．０％以下の低分子量（ＬＭＷ）種が４，５００Ｄａ未満であり、１％以下の高分子量種（ＨＭＷ）が１３，０００Ｄａを超えることが示された。また、多分散性値は、１．２以下であった。
【０２５３】
５０Ｌの高圧ステンレス鋼抽出容器に、１４ｋｇの商用グレードのポロキサマー１８８（ニュージャージー州ワシントンのＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および７ｋｇのメタノールを充填し、ＣＯ２で加圧し（４９±１０ａｔｍ、すなわち７２０±１４７ｐｓｉ）（Ｍｅｓｓｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ，ＳＡＳ，Ｌａｖｅｒａ，フランス）、均質な溶液が得られるまで３５℃〜５０℃で４０〜８０分間加熱した。（主供給タンクから、または抽出系を介した再循環により、供給される）ＣＯ２を熱交換器で冷却し、温度制御された高圧のステンレススチールの溶媒リザーバに供給した。高圧ポンプは液体ＣＯ２の圧力を所望の抽出圧力に上昇させた。高圧ＣＯ２流を、第２の熱交換器によって工程温度まで加熱した。メタノール（ドイツのダルムシュタットのＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）を主供給タンクからＣＯ２溶媒流中に供給して、抽出メタノール／ＣＯ２共溶媒を生じさせ、これを、吸気系統を通して抽出容器に、２４７±１５ａｔｍ（３６００±ｐｓｉ）または２４０〜２６０バールの圧力、４０℃の温度で霧状ミストとして供給した。
【０２５４】
７．４％メタノール／ＣＯ２抽出共溶媒を、概して８ｋｇ／時（範囲６．８ｋｇ／時〜９．２ｋｇ／時；総流量１０８ｋｇ／時）のメタノール流量で３時間ポロキサマー溶液に浸透させた。概して１０ｋｇ／時（８．５ｋｇ／時〜１１．５ｋｇ／時の範囲；１１０ｋｇ／時の総流量）のメタノール流量で、さらに４時間９．１％メタノール／ＣＯ２共溶媒で抽出を続けた。概して１２ｋｇ毎時（１０．２ｋｇ／時〜１３．８ｋｇ／時の範囲；１１２ｋｇ／時の総流量）のメタノール流量で、さらに８時間１０．７％メタノール／ＣＯ２共溶媒で抽出をさらに続けた。抽出工程を通して、抽出器の頂部から可溶性種の抽出を連続的に行った。抽出溶媒を抽出器の頂部から取り出し、直列に配置された２つの高圧ステンレススチールサイクロン分離器に通して、系の圧力を２４７ａｔｍ（３６００ｐｓｉ）から５９ａｔｍ（８７０ｐｓｉ）に、次いで５９ａｔｍから４９ａｔｍ（７２０ｐｓｉ）に低減し、ＣＯ２をメタノール流から分離した。分離したＣＯ２を凝縮させ、熱交換器を通過させ、溶媒リザーバに保存した。メタノール廃棄流の圧力を、別のサイクロン分離器を通過することによってさらに低減させた。精製ポロキサマー１８８は抽出器中に残った。
【０２５５】
抽出後、精製ポロキサマー１８８溶液を、抽出器の底部から、撹拌機を備えたミキサー/乾燥器ユニットに排出した。ポロキサマー１８８生成物を、ガス飽和・懸濁溶液（Particle from Gas Saturated Solutions）（ＰＧＳＳ）法により減圧下で沈殿させた。沈殿物は約２０％〜３５％のメタノールを含有していた。精製ポロキサマー１８８を真空下で４０または４５℃以下で乾燥させて残留メタノールを除去した。生成物の供給収率は６５％の平均収率を与えた。
【０２５６】
ＧＰＣにより測定された精製生成物の分子量分析は、精製生成物が受入仕様を満たしていることを示した。主ピークの平均分子量が約８，５００±７５０Ｄａであり、平均分子量平均が８，５００±７５０Ｄａであり、１．５％以下の低分子量（ＬＭＷ）種が４，５
００Ｄａ未満であり、１．５％以下の高分子量種（ＨＭＷ）が１３，０００Ｄａを超えることが示された。また、多分散性値は、１．０５以下であった。したがって、結果は、手順により、ＬＭＷ種の測定可能な減少がもたらされ、精製された生成物の多分散性が改善されることを示した。
【０２５７】
得られた精製ポロキサマー１８８を、注入用水中の精製ポロキサマー１５０ｍｇ／ｍｌ、塩化ナトリウム３．０８ｍｇ／ｍｌ、クエン酸ナトリウム（二水和物）２．３８ｍｇ／ｍｌ、クエン酸無水物０．３６６ｍｇ／ｍｌを含有する透明で無色の滅菌された非発熱性水溶液に製剤化した。溶液を滅菌濾過し、１００ｍｌガラスバイアルに充填し、窒素ブランケットで覆い、ブチルゴムストッパーおよびアルミニウムオーバーシール（overseal）で閉じた。溶液の得られたオスモル濃度は約３１２ｍＯｓｍ／Ｌであった。ＬＣＭＦポロキサマー１８８組成物は、静菌剤または防腐剤を含まなかった。
【０２５８】
上記のように製造した精製ＬＣＭＦポロキサマー１８８を、評価の一部として６２名の健常志願者に静脈内投与して、ＱＴ／ＱＴｃ間隔に対するその効果を判定した。６２名の対象のうち８名を、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いる血漿ポロキサマーレベルの定量分析のために無作為に選択した。投与後、ベースライン、薬剤投与中（時間１、２、３、４、５、および６）、ならびに投与後１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、５時間、６時間、および１８時間で、血液サンプルを、静脈穿刺によってヘパリン抗凝固処理チューブに得た。血漿を遠心分離により分離し、分析まで凍結保存した。精製ポロキサマー１８８を、１時間の３００ｍｇ／ｋｇ／時の高用量の負荷投与量、続いて５時間の２００ｍｇ／ｋｇ／時の維持投与用量、または１時間の１００ｍｇ／ｋｇの低用量、続いて５時間の３０ｍｇ／ｋｇ／時として、投与した。０．９ｍｇ／ｍＬの投与した精製ポロキサマー１８８の平均最大濃度（Ｃｍａｘ）は、１時間負荷注入の終了時に達成された。約０．４ｍｇ／ｍｌの定常状態での平均濃度（Ｃｓｓ）は、維持注入中に達成された。維持注入の中止後に血漿濃度は急速に低下した。上記のように精製されたＬＣＭＦ生成物は、血漿中で、従前のポロキサマー１８８で観察され、本明細書に記載されている、より長い時間循環するより高分子量の物質を示さなかった。
【０２５９】
血漿中にこのような長時間循環物質が存在しないことを確認するために、高用量を受けている対象からの血漿を同様にＨＰＬＣ−ＧＰＣを用いて調べた。クロマトグラムは、経時的に、ポロキサマー１８８ポリマー分布の高分子量部分が、主ピークおよび低分子量成分に相対的比率で減少することを示している。したがって、ポリマー分布は、循環から実質的に均一な様式で消えることを示す。結果はまた、より高分子量の種が（他のポリマー成分に対して）より長い循環半減期を示さず、静脈内投与後循環に蓄積しないことを示す。
【０２６０】
（ＬＣＭ含有）精製ポロキサマー１８８を６人の健常志願者に、１００ｍｇ／ｋｇ／時の静脈内負荷投与量として１時間、続いて３０ｍｇ／ｋｇ／時で４８時間、安全性および薬物動態試験の一部として投与した（Grindel et al.(2002) Biopharmaceutics & Drug Disposition, 23:87-103）。薬剤投与前（ベースライン）、投与中（１時間、６時間、１
２時間、１８時間、２４時間、３６時間、および４８時間）、ならびに薬剤投与後３０分、１時間、１．５時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１４時間、２０時間、および２４時間に、血液サンプルを、静脈穿刺によってＥＤＴＡ抗凝固処理チューブに得た。血漿を分離し、ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いる分析まで凍結保存した。血漿サンプルの分析は、（ＬＣＭ含有）精製ポロキサマー１８８の主ピークおよびＨＭＷピークの消失動態を明らかにした。
【０２６１】
上記用量での投与後、（約１６，０００ダルトンのピークとしてＨＰＬＣ−ＧＰＣアッセイで検出された）ＨＭＷ成分は、薬剤投与期間中に蓄積し、薬剤投与の終了後２時間ま
でに、２２５μｇ／ｍｌ（ｎ＝６）の平均Ｃｍａｘ濃度に達しなかった。注入中止の６時間後まで、平均血漿レベルはＣｍａｘ値から約１０％だけ低下した濃度である２０２μｇ／ｍｌのままであった。２４時間の注入後の血液採取期間に亘って、平均血漿レベルは、２２．５％だけ低下して１６５μｇ／ｍｌの血漿濃度になった。血漿濃度の経時変化におけるこれらの変化に基づいて、＞４８時間の消失半減期が推定される。
【０２６２】
上記用量での投与後、主ピークは、薬剤注入の間に維持された５２２μｇ／ｍｌの明らかな平均定常状態濃度（ｎ＝６）を達成した。注入中止１時間後、血漿レベルは定常状態の濃度から５２％低下して２５５μｇ／ｍｌになった。中止後６時間までに、血漿レベルは８５％低下して８１μｇ／ｍｌになった。注入後２４時間までに、血漿レベルは９６％低下して約１９μｇ／ｍｌ（ｎ＝６）の血漿濃度になった。血漿濃度の経時変化におけるこれらの変化に基づいて、半減期は約５時間と推定される。
【０２６３】
ＬＣＭＦポロキサマーを、６２名の健常志願者に３００ｍｇ／ｋｇの用量で１時間、続いて２００ｍｇ／ｋｇ／時で５時間、評価の一部として投与して、前述のＱＴ／ＱＴｃ間隔に対するその効果を判定した。６２人の対象のうち８人を、上記のような類似のＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を用いて血漿ポロキサマーレベルの定量分析のために無作為に選択したが、より低い血漿レベルで改善された直線性を有していた。
【０２６４】
上記用量での投与後、約１６，０００ダルトンのピークとしてＨＰＬＣ−ＧＰＣアッセイで検出されたＨＭＷ成分は、薬剤投与中に僅かしか蓄積せず、注入の終了までにそのＣｍａｘ（平均値１１７μｇ／ｍｌ、ｎ＝８）を達成した。薬剤投与中止後１時間までに、血漿レベルはＣｍａｘ値から２７％低下して８６μｇ／ｍｌになった。薬剤投与終了後６時間までに、平均血漿レベルはＣｍａｘ値から７１％低下して３４μｇ／ｍｌになった。注入終了後１８時間までに、平均血漿レベルは８２％低下して１９μｇ／ｍｌ（ｎ＝８）の濃度になった。経時的な血漿中濃度におけるこれらの変化に基づいて、ＨＭＷ成分の消失半減期は６〜９時間と推定された。
【０２６５】
上記用量での投与後、主ピークは、６時間の注入期間の間に維持された２，６３７μｇ／ｍｌの明らかな平均定常状態濃度（ｎ＝８）を達成した。注入中止１時間後、平均血漿レベルは定常状態から６７％減少して８７２μｇ／ｍｌになり、中止６時間後までに、平均血漿レベルは、（定常状態から）９３％低下して１８４μｇ／ｍｌになった。注入中止後１８時間までに、平均血漿レベルは（定常状態から）９８％を超えて低下して約３４μｇ／ｍｌ（ｎ＝６）の血漿濃度になった。血漿濃度の経時変化におけるこれらの変化に基づいて、消失半減期は約３時間と推定される
【０２６６】
投与後の同様の時点での血漿からの消失の相対速度の比較を以下に示す。データは、（ＬＣＭ含有）精製ポロキサマー１８８とＬＣＭＦポロキサマー１８８との間の血漿濃度の低下率に顕著な差があることを示し、ＬＣＭＦポロキサマー１８８がより速く消失することを示している。ＨＭＷピークおよび主ピークについて差が明らかである。差は、ＨＭＷピークについて最も明らかである（表２１）。
【表２４】
2018527312.tif 000027
【０２６７】
逆相クロマトグラフィーでは、疎水性の固定相（カラム）およびより極性の移動相が存在する。この「逆」相条件に因り、ＲＰ−ＨＰＬＣは、相対的疎水性に基づいて化合物を分離するために一般的に使用される。より疎水性の化合物は、より親水性の化合物と比較して、より長いカラム滞留時間を示す。
【０２６８】
以下のＨＰＬＣ条件は、精製ポロキサマー１８８含有ＬＣＭとＬＣＭＦポロキサマー１８８とともに、その親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）に既知の相違を有する種々のポロキサマーについてカラム滞留時間を比較するために使用した（表２２）。
【表２５】
2018527312.tif 000028
＊ＥＬＳ＝蒸発光散乱
【０２６９】
結果は、ＬＣＭＦポロキサマー１８８が先行技術の精製ポロキサマー１８８とは異なることを示している。ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、長時間循環物質を含有する先行技術の物質よりも親水性であることを反映する、異なる薬物動態特性を有する。
【０２７０】
高親水性ポリマー（ＰＥＧ８０００）、ＬＣＭＦポロキサマー１８８、ＬＣＭ含有精製ポロキサマー１８８、およびＨＬＢ値が減少した（疎水性が増加した）２種のポロキサマーであるポロキサマー３３８およびポロキサマー４０７についてそれぞれＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを得た。最も親水性のポリマーであるＰＥＧ８０００は、高い親水性と合致して、カラムで少しの滞留性しか示さない。ポロキサマー３３８（ＨＬＢ＞２４）およびポロキサマー４０７（ＨＬＢ１８−２３）は、既知のＨＬＢ値に従って、はるかに長い滞留時間（ｔＲおよびｋ’値を加える）を示す。ＬＣＭＦ精製ポロキサマー１８８は、ＬＣＭ含有精製ポロキサマー１８８よりも速く溶出し、（ＬＣＭＦ精製ポロキサマーの平均ｔＲおよびｋ’は、それぞれ約８．８（８．８０７）および約３．２（３．２０２）であり、対して、ＬＣＭ含有精製ポロキサマーでは、約１０．０（９．８８３）および３．７（３．６９７）である）、精製ポロキサマー１８８が、ＬＣＭ含有精製ポロキサマー１８８よりも比較的親水性が高いことを示す。
【０２７１】
３つの異なるロットの精製ＬＣＭＦポロキサマー１８８および２つの異なるロットの精製（ＬＣＭ含有）ポロキサマー１８８について、クロマトグラムを得た。これらの結果は、異なるロットの物質についてロバストな再現性を実証し、２つの物質間の差異はアッセイの変動性によって説明できないことを示している。これらの結果は、ＬＣＭＦポロキサマー１８８のポリマー分布が精製ポロキサマー１８８よりも親水性であることを示している。
【０２７２】
本明細書に記載されているように、ＬＣＭＦポロキサマー１８８は、生体内投与後に長時間循環物質（ＬＣＭ）を含有する精製ポロキサマー１８８と比較した場合、ヒト対象への投与後に著しく異なる薬物動態挙動を示す。本実施例で提供されているデータは、ＬＣＭＦポロキサマー１８８が、長時間循環物質を生じる精製ポロキサマー１８８と比較してより親水性であることを示す。
【０２７３】
ポロキサマー１８８の精製された変種（精製ＬＣＭ含有ポロキサマー１８８およびＬＣＭＦポロキサマー１８８）のポリマーサイズ分布は、ＨＰＬＣ−ＧＰＣにより示されるサイズに関して類似している（表２３）。どちらも基準を満たしている：
【表２６】
2018527312.tif 000029
【０２７４】
本明細書でＲＰ−ＨＰＬＣによって示されているように、ＨＰＬＣ−ＧＰＣによって示
される両方の精製ポロキサマーのポリマーサイズ分布は、類似しているが、ＬＣＭＦポロキサマー１８８のポリマー分布を含む分子は、より親水性である。
【０２７５】
動物に注入すると、より親水性のポリマー分布が循環からより速い速度で消失する。これは、ＬＣＭＦポロキサマー１８８製剤中の長時間循環物質の存在の減少を説明する。結果はまた、上記で観察され、記載されているように、ポリマー分布の主ピークがより速く消失することを示している。例えば、臨床試験からの血漿濃度経時変化データは、ＬＣＭ含有精製ポロキサマー１８８と比較して、ＬＣＭＦポロキサマー１８８の主ピークおよび高分子量ピークについて、より短い消失半減期を示す。
【０２７６】
Ｐ１８８のレオロジー的、細胞保護的、抗接着性、および抗血栓性効果は、約８，４００〜９４００ダルトン（約４〜７時間の循環半減期を有する）の分布の主要または主コポリマー内で最適であるので、ポロキサマー１８８のより大きな、より疎水性の、より長い循環半減期の成分の存在は望ましくない。例えば、Ｐ１８８の所望の活性の中には、血液粘性を低下させ、赤血球（ＲＢＣ）凝集を阻害し、それにより損傷組織における血流を改善し得る、Ｐ１８８のレオロジー効果がある。対照的に、より疎水性でより高分子量のポロキサマー、例えばＰ３３８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８とも呼ばれる）およびＰ３０８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ９８）は、血液粘度およびＲＢＣ凝集を増加させる（Armstrong et al.(2001) Biorheology, 38:239-247）。これはＰ１８８の反対の効果であり、より高分子量の疎水性ポロキサマー種が望ましくない生理的効果を有し得ることを示す。
【０２７７】
実施例１７
【０２７８】
メタノール／高圧ＣＯ２共溶媒での抽出によるポロキサマー１８８のバッチ精製法
【０２７９】
メタノール／高圧ＣＯ２共溶媒を用いる抽出によるポロキサマー１８８のバッチ精製法を評価する。ポロキサマー１８８（１３〜１４ｋｇ）をメタノール／高圧ＣＯ２溶媒で抽出することにより精製する。ポロキサマー１８８を混合するまで高圧抽出容器中でメタノールと撹拌する。メタノールと高圧ＣＯ２の共溶媒を抽出容器を通してポンプ輸送する。抽出溶媒の溶媒特性を、抽出溶媒温度、圧力、およびメタノール共溶媒の量を制御することによって調整する。具体的には、これらの３つのパラメータの組み合わせを、商用グレードのポロキサマー１８８から低分子量（ＬＭＷ）成分および高分子量（ＨＭＷ）成分を除去するために選択する。メタノールの出発濃度は、約２．５重量％であり、連続的に２５重量％まで徐々に増加させる。抽出容器の圧力は７５±１０バールであり、抽出温度、メタノール／ＣＯ２共溶媒温度、および抽出器ジャケット温度は、２０〜２５℃である。抽出工程は、抽出器から種々の成分を連続的に除去するために逐次的に行われる。
【０２８０】
抽出溶媒を除去し、溶出画分をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析した。精製後、精製ポロキサマー１８８を抽出容器から回収し、ＧＰＣにより分析する。最初に、抽出中に低分子量（ＬＭＷ）成分を除去し、主要画分をより高濃度のメタノールで除去する。高分子量成分を、抽出工程の後の段階で除去する。精製ポロキサマー１８８の分子量分布は、出発物質よりも狭い。
【０２８１】
ポリマーの収率は、１．５％未満の低分子量成分（４，５００ダルトン未満）で６０〜８０％であると推定される。ピーク平均分子量は約８，５００±７５０ダルトンである。
【０２８２】
実施例１８
【０２８３】
進行性心不全のイヌにおける左心室機能に対する１５％ナトリウム不含ＬＣＭＦポロキ
サマー１８８製剤の急性静脈内注入の効果
【０２８４】
方法
【０２８５】
本研究は、複数の連続した冠動脈微小塞栓術によって生じさせた進行性心不全（ＨＦ）を有する２１匹のイヌで行った（ＬＶ駆出率≦３０％）（１）。イヌを無作為に３群に分けた。第Ｉ群（ｎ＝７）を、２時間の期間に亘って投与する（実施例２に記載の）１５％ナトリウム不含ＬＣＭＦポロキサマー１８８製剤（４５０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入で処置し、注入から２４時間後、１週間後、および２週間後に完全に血行動態を追跡した。第ＩＩ群（ｎ＝７）を、２時間の期間に亘って同様に投与する１５％ナトリウム不含ＬＣＭＦポロキサマー１８８製剤の低用量のＭＳＴ−１８８（２２５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入で処置し、注入から２４時間後、１週間後、および２週間後に完全に血行動態を追跡した。第ＩＩＩ群（ｎ＝７）を、同様に２時間投与する生理食塩水の静脈内注入で処置し、２４時間、１週間、および２週間で完全に血行動態を追跡した。２時間に亘って投与した生理食塩水の体積は、第Ｉ群および第ＩＩ群において２時間に亘って投与した薬剤体積と同一であった。第ＩＩＩ群はプラセボ対照としての役割を果たした。血行動態、心室造影、心エコー、および心電図測定を、薬剤投与の前にベースラインで行い、２時間の薬剤注入の終わりで繰り返した。末梢静脈血サンプルを、ベースライン、２時間の薬剤注入の終わり、ならびに薬剤注入の２４時間後、１週間後、および２週間後に得た。血液サンプル（１０ｍＬ以上）を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿を採取し、凍結保存チューブに入れ、必要になるまで−７０℃で直立して保存した。トロポニン−Ｉ（ＴｎＩ）およびＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰ）を評価するために、血漿サンプルを使用した。
【０２８６】
２時間の薬剤注入の完了後２４時間、４８時間、１週間、および２週間に、全ての研究イヌにおいて、血行動態、心室造影、心エコー、心電図、および血漿バイオマーカーの全ての測定を繰り返した。全ての測定は、全身麻酔および無菌条件下で行った。静脈内ヒドロモルホン（０．２２ｍｇ／ｋｇ）およびジアゼパム（０．１７ｍｇ／ｋｇ）で麻酔導入を開始し、麻酔面を１〜１．５％イソフルランで維持した。プロトコルが、ヘンリーフォード保健システム機関動物実験委員会（Henry Ford Health System Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された後、研究を開始した。全ての研究は、国立衛生研究所「実験動物の使用に関するガイドおよびケア」（ＮＩＨ出版番号８５−２３）（the National Institute of Health "Guide and Care for Use of Laboratory Animals" (NIH publication No. 85-23)）に従った。
【０２８７】
血行動態および心室造影測定
【０２８８】
全ての血行動態測定は、麻酔をかけたイヌの左心および右心カテーテル挿入中に、指定された各研究時点で行った。以下のパラメータを全てのイヌで評価する：１）カテーテル先端微圧計（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いる大動脈圧およびＬＶ圧、２）等容性収縮（ピーク  ＋ｄＰ／ｄｔ）および弛緩（ピーク  ｄＰ／ｄｔ）中のＬＶ圧のピーク変化率、３）ＬＶ拡張終期圧、および４）心拍出量（ＣＯ）。さらに、以下のパラメータを計算した：１）ＬＶ一回拍出量（ＳＶ）および２）全身血管抵抗（ＳＶＲ）。
【０２８９】
血行動態測定の完了後、心臓カテーテル挿入中に左心室造影を行った。右側にイヌを配置して心室造影を行い、２０ｍｌの造影剤（ＩＳＯＶＵＥ−３００、ニュージャージー州プリンストンのＢｒａｃｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）のパワー注入中に３０フレーム／ｓｅｃでデジタル媒体に記録した。像倍率の補正は、ＬＶ心室造影カテーテルの遠位端に配置された放射線不透過性マーカーを用いて行った。面積長さ法を用いて、血管造影シルエットからＬＶ収縮末期（ＥＳＶ）および拡張末期（ＥＤＶ）容量を算出し
た（２）。期外収縮および期外収縮後収縮は分析から除外した。ＬＶ駆出率（ＥＦ）は、拡張末期容量に対する拡張末期容量と収縮末期容量との差の比に１００を掛けたものとして計算した。
【０２９０】
心エコーおよびドップラー測定
【０２９１】
３．５ＭＨＺのトランスデューサを備えたＶＩＶＩＤ  ７超音波システム（ゼネラルエレクトリック）を用いて、指定された全ての研究時点で、全てのイヌにおいて心エコー検査およびドップラー検査を行った。全ての心エコー測定は、イヌをその右側に置き、その後のオフライン分析のためにデジタル媒体に記録して行った。ＬＶ収縮機能の指標であるＬＶ短縮率（fractional area of shortening）（ＦＡＳ）は、乳頭筋のレベルで短軸方
向から測定した。ＬＶの長半軸および短半軸を測定し、ＬＶ拡張末期円周方向壁応力（ＥＤＷＳ）の計算に使用した（３）。壁応力は以下のように計算される：応力＝Ｐｂ／ｈ（１−ｈ／２ｂ）（１−ｈｂ／２ａ２），式中、ＰはＬＶ拡張末期圧であり、ａはＬＶ長半軸であり、ｂはＬＶ短半軸であり、ｈはＬＶ壁厚である。
【０２９２】
僧帽弁流入速度は、パルス波ドップラー心エコー検査によってＬＶ拡張機能の指標に測定した。速度波形は、１）拡張早期におけるピーク僧帽弁流速（ＰＥ）、ＬＡ収縮中のピーク僧帽弁流入速度（ＰＡ）、３）ＰＥ対ＰＡの比、４）早期充填を表す僧帽弁流入速度波形の時間速度積分（Ａｉ）、５）ＬＡ収縮を表す時間速度積分（Ａｉ）、６）Ｅｉ／Ａｉの比、７）早期僧帽弁流入速度の減速時間（ＤＣＴ）を計算するために使用した（４）。
【０２９３】
心電図測定
【０２９４】
心電図のリード−ＩＩを、研究中ずっとモニタリングし、指定された全ての研究時点で記録した。研究中のいつでも新規の心室性不整脈が発症した場合には、心電図を連続的に記録することとした。不整脈が発症し、血行動態の悪化と関連していた場合はいつでも、薬剤注入を中止し、その日に研究を終了することとした。
【０２９５】
トロポニンＩおよびｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰの循環血漿レベル
【０２９６】
血漿サンプルを、全ての研究時点で得て、将来の使用のために−７０℃で保存した。６匹の健常なイヌからの血漿サンプルも得て、比較のために保存した。ＴｎＩおよびｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰを、二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）の原理に基づいて血漿中で測定した。市販の検査キットを用いてＴｎＩおよびｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰを検査した。ＴｎＩのキットはニューハンプシャー州セーラムのＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入し、ｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰのキットはＫａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ番号ＫＴ−２３７７０）から購入した。標準曲線およびソフトウェアを用いて、ＴｎＩの濃度をｎｇ／ｍｌで、ｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰの濃度をｐｇ／ｍｌで表した。
【０２９７】
データ分析
【０２９８】
本研究は、主要評価項目としてＬＶ駆出率を用いて実施した。群内の比較は、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、アルファ設定をｐ≦０．０５にして行った。有意性が達成された場合、前処置から２時間、２４時間、１週間、および２週間、ならびに２時間から２４時間、１週間、および２週間の対比較を、スチューデントニューマンコイルス検定（Student-Newman-Keuls Test）を用いて、有意性設定をｐ＜０．０５にして行った。
同じ検定をＴｎＩおよびｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰの分析に用いた。全てのデータを、平均値
±の平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告する。
【０２９９】
結果
【０３００】
研究に入れられた２１匹の全てのイヌが研究を完了した。いずれのイヌも、ＭＳＴ−１８８の注入中または２週間の追跡期間中、新規の心室性または心房性不整脈を発症しなかった。研究期間中、臨床的な生存中の副作用または有害事象はなかった。
【０３０１】
対照イヌの所見
【０３０２】
対照イヌにおける血行動態、心室造影、およびドップラー心エコーの結果を、表２４に示す。心拍数、収縮期大動脈圧、平均大動脈圧、またはＬＶ拡張末期圧に有意な変化はなかった。収縮期および平均大動脈圧はいずれも１週間増加する傾向があったが、増加は、統計的有意性には達しなかった。ピークＬＶ  ＋ｄＰ／ｄｔおよび−ｄＰ／ｄｔは１週間で増加した。この増加は、大動脈血圧の上昇も１週間で見られたことに起因する可能性が最も高い。生理食塩水での処置は、ＣＯ、ＳＶ、ＦＡＳ、ＳＶＲ、またはＬＶ拡張機能の指標のいずれか、すなわちＰＥ／ＰＡ、Ｅｉ／Ａｉ、ＤＣＴ、およびＬＶ  ＥＤＷＳに有意な効果を及ぼさなかった。
【０３０３】
この群では、ＥＤＶは増加傾向にあったが、変化は統計的有意性に達しなかった。ＬＶ
ＥＳＶもまた２週間の間に増加する傾向があった。この増加は、前処置と比較して２４時間、１週間、および２週間の時点で統計的に有意に達した（表２４）。血漿ＴｎＩレベルは、正常レベルと比較して前処置で有意に増加したが、その後は前処置と比較して実質的に変化しなかった（図１）。血漿ｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルも、正常レベルと比較して前処置で有意に増加したが、その後は前処置と比較して実質的に変化しなかった（図１および２）。
【表２７】
2018527312.tif 000030
【０３０４】
低用量ＭＳＴ−１８８で処置したイヌにおける所見
【０３０５】
対照イヌにおける血行動態、心室造影、およびドップラー心エコーの結果を、表２５に示す。研究時点のいずれにおいても心拍数、ＬＶ拡張末期圧、またはＳＶＲに有意な変化
はなかった。収縮期および平均大動脈圧は、増加傾向にあり、治療後１週間で統計的有意に達した。ピークＬＶ  ＋ｄＰ／ｄｔおよびピークＬＶ  −ｄＰ／ｄｔに関しても同様の傾向が見られた。低用量ＭＳＴ−１８８は、前処置と比較して全ての研究時点でＣＯおよびＳＶを増加させる傾向があり、増加は、ＳＶについては２時間、２４時間、および１週間で、ＣＯについては２時間および１週間で、統計的有意に達した。ＦＡＳは、前処置と比較して、全ての研究時点で有意に増加した。ＬＶ拡張機能の指標は、処置後１週間までの間やや改善した。Ｅｉ／Ａｉ比は、処置の２時間後および２４時間後に有意に増加し、ＤＣＴは処置後２時間で有意に増加した。
【０３０６】
この群では、ＥＤＶは全ての研究時点で減少する傾向があったが、変化は統計的有意に達しなかった。同様に、ＥＳＶは追跡期間中に減少する傾向があった。前処置と比較した減少は２時間、２４時間、および１週間で有意であった。ＬＶ  ＥＦは、追跡期間中に増加する傾向があり、処置後２時間、２４時間、および１週間に有意に達した（表２５）。正常レベルと比較して前処置で有意に上昇した血漿ＴｎＩおよびｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルは、前処置と比較して、処置後１週間および２週間に有意に減少した（図１および２）。
【表２８】
2018527312.tif 000031
【０３０７】
高用量ＭＳＴ−１８８で処置したイヌにおける所見
【０３０８】
対照イヌにおける血行動態、心室造影、およびドップラー心エコーの結果を、表２６に示す。研究時点のいずれにおいても心拍数、ＬＶ拡張末期圧、またはＳＶＲに有意な変化はなかった。収縮期および平均大動脈圧は、増加傾向にあり、治療後１週間で統計的有意に達した。ピークＬＶ  ＋ｄＰ／ｄｔおよびピークＬＶ  −ｄＰ／ｄｔに関しても同様の傾向が見られた。高用量ＭＳＴ−１８８は、前処置と比較して全ての研究時点でＣＯおよびＳＶを増加させる傾向があり、増加は、ＳＶについては２時間および１週間で、ＣＯについては１週間で、統計的有意に達した。ＦＡＳは、２週間を除いて、前処置と比較して
全ての研究時点で有意に増加した。ＬＶ拡張機能の指標は、処置後１週間までの間やや改善した。比Ｅｉ／Ａｉは処置後２時間に有意に増加し、ＤＣＴは処置後２時間、２４時間、および１週間に有意に増加した。
【０３０９】
この群では、ＥＤＶは全ての研究時点で減少する傾向があり、処置後２４時間で有意に達した。同様に、ＥＳＶは追跡期間中に減少する傾向があった。前処置と比較した減少は２時間、２４時間、および１週間で有意であった。ＬＶ  ＥＦは、追跡期間中に増加する傾向があり、処置後２時間、２４時間、および１週間に有意に達した（表２６）。正常レベルと比較して前処置で有意に上昇した血漿ＴｎＩおよびｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルは、前処置と比較して、処置後２４時間、１週間、および２週間に有意に減少した（図１）。
【表２９】
2018527312.tif 000032
【０３１０】
結論
【０３１１】
本研究の結果は、進行性収縮期性心不全を有するイヌにおいて、２時間の期間に亘るＭＳＴ−１８８の静脈内投与が、薬剤投与の中止後１週間以上の間維持されるＬＶ収縮機能の改善をもたらすことを示している。この知見は、血漿ｎｔ−ｐｒｏ  ＢＮＰの漸減と一致する。ＬＶ拡張機能もこの時間経過に伴って改善する傾向があったが、改善はわずかであった。各研究時点中に心拍数は実質的に変化していなかったので、ＬＶ機能の改善は、変時性状態の変化に起因し得なかった。ＭＳＴ−１８８の投与はまた、ＬＶ拡張末期圧、拡張末期容量、および全身血管抵抗にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかったため、Ｌ
Ｖ機能の改善は、血管拡張、すなわち心臓負荷条件の変化に起因し得なかった。さらに、全身血圧は低下せず、むしろ増加し、血管抵抗の変化がない場合のＬＶ一回拍出量の増加を示唆した。
【０３１２】
本研究の一部として実施された実験は、ＭＳＴ−１８８の作用の可能なメカニズムを扱っていない。心筋細胞の機能不全および死に至る心不全において、カルシウム過負荷が起こる。ＭＳＴ−１８８（精製ポロキサマー１８８）は、心筋梗塞においてＬＶ機能を改善し、再梗塞を低減することが示された心臓保護剤およびレオロジー剤である。その活性は、損傷細胞膜の修復に起因し、心筋細胞への無制御のカルシウム流入を阻害し、かつ／または微小血管血流を改善し得る。ＭＳＴ−１８８は、心筋細胞におけるカルシウム過負荷を予防／最小化し、それにより心筋細胞の死および機能不全の進行による二次性ＬＶ機能不全を予防することも可能である。これは、部分的に、心筋細胞傷害および死のバイオマーカーであるＴｎＩの循環レベルの低下によって支持される。ＬＶ機能の改善をもたらす微小血管血流の改善を介してＭＳＴ−１８８が心筋灌流および酸素供給を改善（局所虚血／低酸素症の軽減）する可能性もある。
【０３１３】
実施例１９
【０３１４】
塩不含製剤の安定性
実施例１の２２．５％臨床製剤であるＬＣＭＦポロキサマー１８８の注入を、５℃±３℃の周囲ＲＨの推奨保存条件、２５℃±２℃／６０％±５％ＲＨの代替保存条件で６ヶ月間試験した。結果は、製品が両方の条件で安定であることを示す。５℃±３℃の周囲ＲＨの推奨保存条件で保存した場合、製品は２４ヶ月間使用可能であり続けることが予想される。
【表３０】
2018527312.tif 000033
【表３１】
2018527312.tif 000034
【表３２】
2018527312.tif 000035
【表３３】
2018527312.tif 000036
【０３１５】
実施例２０
【０３１６】
方法
【０３１７】
ナトリウムの検出
【０３１８】
ポロキサマー１８８注入中のナトリウム（Ｎａ）の存在２２．５％を、誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によって可能性のある不純物として分析した。製剤サンプルを調製し、意図的に添加した既知量のＮａを含むスパイクのセットを検量線に対して調べ、結果を計算した。
【０３１９】
使用した試薬：
高純度水（１８メガオーム以上の抵抗率），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ａ１０  Ｗａｔｅｒ  Ｓｙｓｙｔｅｍ；
Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｇｒａｄｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｈｙｄｒｏｃ
ｈｌｏｒｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＨＣｌ），  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；およびＳｉｎｇｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ，  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｇｒａｄｅ，  ＮＩＳＴ  ｔｒａｃｅａｂｌｅ，  ｆｒｏｍ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，  Ｉｎｃ．：
ナトリウム＝９９８μｇ／ｍＬ
【０３２０】
装置：
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ａ１０  Ｗａｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ
Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＡＧ２０４  Ｂａｌａｎｃｅ
Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＸＳ２０５ＤＵ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ６３００  Ｄｕｏ  ＩＣＰ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
【０３２１】
手順：
中間体標準：遠心管内で１．０  ＨＣｌおよび０．５ｍＬのＮａ標準品を５０ｍＬにＨ２Ｏで希釈する。同一の方法でチェック中間体標準も調製した。Ｎａ＝９．９８μｇ／ｍＬ
【０３２２】
校正標準：以下の表３１に従って、遠心管で調製する。Ｈ２Ｏで１００ｍＬに希釈し、よく混合する。
【表３４】
2018527312.tif 000037
【０３２３】
サンプル調製
【０３２４】
５．０ｍＬのサンプルおよび１．０ｍＬのＨＣｌを５０ｍＬの遠心管に移し、Ｈ２Ｏで容量に希釈し、よく混合し、これを３回行った。一組のスパイクも調製し、既知量の中間体標準を加えてから、Ｈ２Ｏで容量に希釈した。サンプルおよびスパイク調製の概要については、以下の表３２を参照されたい。
【表３５】
2018527312.tif 000038
【０３２５】
機器分析：
【０３２６】
結果は以下の機器条件を用いて得られた。
【０３２７】
元素／波長設定:
【表３６】
2018527312.tif 000039
【０３２８】
プラズマおよびトーチのパラメータ:
補助ガス流量（Ｌ／分）：０．５
プラズマビュー：ラジアル
ＲＦパワー（ｋＷ）：１．１５
ネブライザー流（Ｌ／分）：０．７０
フラッシュポンプ速度（ｒｐｍ）：１００
分析ポンプ速度（ｒｐｍ）：１００
繰り返し数：３
遅延時間（ｓ）：０
サンプルフラッシュ時間（ｓ）：４５
低波長帯（ｓ）：１０
高波長帯（ｓ）：１
ネブライザー：コニカル
スプレーチャンバー：サイクロン
サンプルチューブ：Ｔｙｇｏｎ−オレンジ／ホワイト
ドレインチューブ：Ｔｙｇｏｎ−ホワイト／ホワイト
【０３２９】
分析手順
【０３３０】
校正と品質管理: 発光ピークの積分面積を、分析信号として使用する。適切なバックグラウンド補正位置は、左側が１、右側が１２である。これらの位置は、条件が必要とする場合に、機器ソフトウェアによって自動的に変更または設定されることがある。
【０３３１】
システム適合性: 校正曲線の相関係数は≧０．９９５であり、実行中に点在する標準は１００±５％回復した。
【０３３２】
計算：
【０３３３】
計算：
【０３３４】
非スパイクサンプル中のＮａ含有量は以下のように計算した：
【数１】
2018527312.tif 000040
【０３３５】
非スパイクサンプルで得たナトリウム結果を組み入れて、スパイク回復を計算し、合計は以下となった。
【数２】
2018527312.tif 000041
【０３３６】
ｐｐｍ  Ｎａは、以下のようにＮａ／ｍｍｏｌに変換した：
【数３】
2018527312.tif 000042
【０３３７】
参考文献
１．Sabbah HN, Stein PD, Kono T, Gheorghiade M, Levine TB, Jafri S, et al.A canine model of chronic heart failure produced by multiple sequential coronary microembolizations.Am J Physiol.1991;260:H1379-84.
2．Dodge HT, Sandler H, Baxley WA, Hawley RR.Usefulness and limitations of radiographic methods for determining left ventricular volume.The American journal of cardiology.1966; 18:10-24.
3．Sabbah HN, Imai M, Cowart D, Amato A, Carminati P, Gheorghiade M. Hemodynamic
properties of a new-generation positive luso-inotropic agent for the acute treatment of advanced heart failure.The American journal of cardiology.2007; 99:41A-46A.
4．Rastogi S, Guerrero M, Wang M, Ilsar I, Sabbah MS, Gupta RC, Sabbah HN.Myocar
dial transfection with naked DNA plasmid encoding hepatocyte growth factor prevents the progression of heart failure in dogs.American journal of physiology Heart and circulatory physiology.2011; 300:H1501-H1509.
【０３３８】
本明細書に記載された例示的な実施例に対する様々な修正、追加、置換、および変形は、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変も、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０３３９】
上記の個々のセクションで言及された本発明の様々な特徴および実施形態は、必要に応じて他のセクションに適宜適用される。したがって、一つのセクションに定められている特徴を、必要に応じて、他のセクションに定められている特徴と組み合わせてもよい。
【図１】
2018527312.tif 000043
【図２】
2018527312.tif 000044
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018527312.tif 000046
【国際調査報告】
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2018527312.tif 000048
2018527312.tif 000049
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