(57)【要約】本発明は、ＰＬＡ２Ｒ１エピトーププロファイルの分析に基づいて対象における特発性膜性腎症の予後を評価するための方法に関する。本発明はさらに、ＰＬＡ２Ｒ１エピトープスプレッディングの分析に基づいて特発性膜性腎症の進行をモニタリングするための方法に関する。本発明は、３つのＰＬＡ２Ｒ１ドメイン（ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７）が抗ＰＬＡ２Ｒ１活性に関与すること、そして、そのうちの２つ（ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７）は、活動性特発性膜性腎症と、より密接に関連し、おそらくエピトープスプレッディングの機序によって関連づけられることに着目する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における特発性膜性腎症の予後を評価するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中の、ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定するステップａ）を含み、ＣＴＬＤ１に対する自己抗体の存在は予後不良を示す、方法。
【請求項２】
前記ステップａ）が、ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定するステップをさらに含み、ＣＴＬＤ１に対する自己抗体および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在は予後不良を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップａ）が、ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１、ＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在は予後良好を示し、かつ／または
ＣｙｓＲのみに対する自己抗体の存在は予後良好を示し、
ＣｙｓＲに対する自己抗体ならびにＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在は予後不良を示す、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予後良好とは、寛解の可能性が高いこと、および好ましくは、血液透析を必要とするリスクまたは腎不全を発症するリスクが低いことをいい、かつ
予後不良とは、後に腎不全などの腎合併症を発症する可能性が高いこと、または再燃の可能性が高いことをいう、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
予後不良が、
タンパク尿の増加、典型的にはタンパク尿＞４ｇ／ｇ、および／または
３０％を超えて増加した血清中クレアチニン、および／または
ｅＧＦＲ＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２
と関連する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が全血試料、血漿および血清からなる群より選択され、好ましくは血清である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が腎生検などの生検によって得られる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）がＥＬＩＳＡによって行われ、より好ましくはＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体に関する力価を評価することを目的とする特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己抗体がＩｇＧ４である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＬＡ２Ｒ１が、ヒトＰＬＡ２Ｒ１、ウサギＰＬＡ２Ｒ１もしくはマウスＰＬＡ２Ｒ１、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＬＡ２Ｒ１がマウスＰＬＡ２Ｒ１またはそのフラグメントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ）が、以下のサブステップ：
患者から得られた生物学的試料をマウスＰＬＡ２Ｒ１と接触させるサブステップ、および
形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するサブステップ、
を含み、形成された任意の抗原−抗体複合体の存在は予後不良を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
第１時点において前記対象から得られた生物学的試料中の、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの自己抗体のレベルを、前記第１時点において決定するステップ、
第２時点において前記対象から得られた生物学的試料中の、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの自己抗体のレベルを、前記第２時点において決定するステップ、および
前記２つの時点の前記自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
前記第２時点における、それぞれＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在またはそれぞれＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する前記自己抗体のレベルの減少は、前記処置が有効であることを示し、かつ／または
前記第２時点における、ＣＴＬＤ１および／もしくはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在、またはＣＴＬＤ１および／もしくはＣＴＬＤ７に対する前記自己抗体のレベルの増加は、前記処置が有効でないことを示す、
方法。
【請求項１５】
前記第２時点における、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在、または前記自己抗体のレベルの減少は、前記処置が有効であることを示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記処置が、シクロスポリン、タクロリムス、アザチオプリン、インフリキシマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブおよびラパマイシン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ならびにリツキシマブからなる群より選択される免疫抑制治療である、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対症処置がレニン・アンジオテンシン系の遮断に基づく、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象における特発性膜性腎症を診断するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料において、
ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）に対する自己抗体、および／または
ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体、および／または
ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体
からなる群より選択される少なくとも１つの自己抗体を検出するステップａ’）を含み、ＰＬＡ２Ｒ１のＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１、および／またはＣＴＬＤ７に対する１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの相異なる自己抗体の存在は、特発性膜性腎症を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＬＡ２Ｒ１エピトーププロファイルの分析に基づいて対象における膜性腎症の予後を評価するための方法に関する。本発明はさらに、ＰＬＡ２Ｒ１エピトープスプレッディングの分析に基づいて膜性腎症の進行をモニタリングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性膜性腎症（ｉＭＮ：ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）は自己免疫疾患であり、成人におけるネフローゼ症候群の一般的な原因である。疾患の進展は、自然寛解、持続性タンパク尿または末期腎臓病など、極めて多様である。２００９年に、Ｂｅｃｋらは、ｉＭＮにおける主要ポドサイト抗原として、Ｍ型ホスホリパーゼＡ２受容体（ＰＬＡ２Ｒ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）１）を同定した。抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体の存在は、その後の研究において、ｉＭＮ患者の５３〜８０％に広く確認されている。これらの自己抗体の病因的役割はまだ判明していないが、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体価は、ほとんどの研究対象集団において、疾患活動度と相関するようである。
【０００３】
しかし、抗ＰＬＡ２Ｒ１価からの個々のアウトカムの予測は不確かである。実際、対症処置下または免疫抑制処置下のいずれかでの寛解中は大半の患者において自己抗体が消失するものの、レニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ：ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ）遮断下での明らかな臨床的寛解中に自己抗体が持続する場合もある。さらにまた、高い抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体価は、ほとんどの場合、その後の不良な腎アウトカムと相関するようであるが、発症時に自己抗体価が高い患者の一部は、抗ＰＬＡ２Ｒ１活性の急激な減少および疾患の寛解を呈する。
【０００４】
ｉＭＮの処置には議論の余地がある。ＫＤＩＧＯ（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ）ガイドラインでは、ｉＭＮを持つすべての患者におけるレニン・アンジオテンシン系の遮断および利尿薬による支持的対症処置、ならびに腎機能低下または持続性ネフローゼ症候群の場合に限った免疫抑制治療が推奨された。
【０００５】
それゆえに免疫抑制処置は、非可逆的である可能性を秘めた重大な合併症が起こるまで開始されないことが多い。その一方で、必要以上に早い免疫抑制の開始は、対症処置で寛解を生じるかもしれない患者では無駄になりうる。それゆえに、特発性膜性腎症を患っている患者のアウトカムについて、より良い予測因子が必要とされている。
【０００６】
このように、特発性膜性腎症の予後のための包括的で高感度かつ特異的な方法は、長年にわたって必要とされてきた。加えて、無効な治療レジメンに必要な変更を加えるために、患者をそれぞれの処置に対する応答性に関して層別化するための方法も、必要とされながらまだ実現していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｍ型ホスホリパーゼＡ２受容体（ＰＬＡ２Ｒ１）は、７〜１７ｋＤａの１０個の相異なる球状ドメイン、すなわちシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ＦＮＩＩ：ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ）および８つの相異なるＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ（Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ）１〜８）を含む大きな細胞外領域を持つ、１８０ｋＤａの膜受容体である。各ドメインは約１０アミノ酸の小さなリンカー配列によって隔てられている。
【０００８】
本発明者らはまず、ｉＭＮ患者５０人のコホートを、受容体の１０個の細胞外ドメインのそれぞれを逐次的に欠失させた９個のＰＬＡ２Ｒ１突然変異体に対するそれぞれの反応性について、スクリーニングした。本発明者らは、３つの相異なるドメイン、
−  ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）；
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）；および
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）
に、エピトープを同定した。
【０００９】
次に本発明者らは、これらのドメインの可溶型を多数使って、ウェスタンブロットとＥＬＩＳＡとの両方により、各ドメインの独立した反応性を確認した。次に本発明者らはエピトープ特異的ＥＬＩＳＡを設定し、患者６９人のコホートを３つのエピトープ特異的サブグループに層別化して、それぞれのエピトーププロファイルと疾患活動度との間の関係を分析した。こうして本発明者らは、血清試料採取時のＣｙｓＲに対する抗ＰＬＡ２Ｒ１反応性が好ましいアウトカムと関連し、一方、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する反応性は活動的疾患および不良な腎予後と関連することを明らかにした。
【００１０】
さらにまた本発明者らは、エピトーププロファイルが経過観察中に変化しうることも明らかにした。抗ＣＴＬＤ１抗体および抗ＣＴＬＤ７抗体が疾患の寛解と共に消失し、疾患の再燃と共に再び出現したのに対し、抗ＣｙｓＲ限定的活性は安定かつ軽度の疾患活動度と関連した。
【００１１】
したがって、第１の側面において本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の予後を評価するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中の、ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定するステップａ）を含み、ＣＴＬＤ１に対する自己抗体の存在は予後不良を示す、方法に関する。
【００１２】
第２の側面において、本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の予後を評価するための方法であって、
−  前記患者から得られた生物学的試料をマウスＰＬＡ２Ｒ１と接触させるステップ、および
−  形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するステップ
を含み、形成された任意の抗原−抗体複合体の存在は予後不良を示す、方法に関する。
【００１３】
第３の側面において、本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
−  第１時点において前記対象から得られた生物学的試料中の、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの自己抗体のレベルを、前記第１時点において決定するステップ、
−  第２時点において前記対象から得られた生物学的試料中の、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの自己抗体のレベルを、前記第２時点において決定するステップ、および
−  ２つの時点の自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
−  第２時点における、それぞれＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在またはそれぞれＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルの減少は、処置が有効であることを示し、かつ／または
−  第２時点における、ＣＴＬＤ１および／もしくはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在、またはＣＴＬＤ１および／もしくはＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルの増加は、処置が有効でないことを示す、
方法に関する。
【００１４】
第４の側面において、本発明は、対象における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料において、
−  ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）に対する自己抗体、および／または
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体、および／または
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体
からなる群より選択される少なくとも１つの自己抗体を検出するステップａ’）
を含み、ＰＬＡ２Ｒ１のＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１、および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体のうちの１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの存在は、膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症を示す、
方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特発性膜性腎症を予後判定するための方法
Ｍ型ホスホリパーゼＡ２受容体（ＰＬＡ２Ｒ１）は、特発性膜性腎症における主要自己抗原であり、臨床的意義の不明な２つのエピトープが最近同定されている。ここでは、５０人のＰＬＡ２Ｒ１陽性患者の血清を、１０個の細胞外ドメインをカバーする一連のＰＬＡ２Ｒ１欠失突然変異体でのウェスタンブロットによって、スクリーニングした。本発明者らはＣｙｓＲドメイン、ＣＴＬＤ１ドメインおよびＣＴＬＤ７ドメイン中のエピトープを同定し、各ドメインの可溶型で、それら３つのドメインに対する反応性を確認した。ドメイン特異的ＥＬＩＳＡにより、６９人のＰＬＡ２Ｒ１陽性患者は、３つのサブグループ、すなわち２３人のＣｙｓＲ、１４人のＣｙｓＲ＋ＣＴＬＤ１、および３２人のＣｙｓＲ＋ＣＴＬＤ１＋ＣＴＬＤ７に層別化することができた。完全長ＰＬＡ２Ｒ１抗原を使って測定されるメジアンＥＬＩＳＡ力価は、患者サブグループ間で有意差がなかった。抗ＣｙｓＲ限定的活性を持つ２３人の患者の方が、若く（ｐ＝０．００８）、ネフローゼ域のタンパク尿が少なく（ｐ＝０．０１８）、経過観察中に、より多くの自然寛解（ｐ＝０．０３）、低い腎不全進行速度（ｐ＝０．００２５）および少ない末期腎臓病（ｐ＝０．０１）を呈した。実際、６９人中３１人の患者はＫＤＩＧＯによる不良な腎予後を有した（経過観察の最後に４ｇ／ｇを上回る尿タンパク質／クレアチニン比またはｅＧＦＲ＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２）。高い抗ＰＬＡ２Ｒ１活性およびＣｙｓＲエピトープを越えるエピトープスプレッディングは、多変量ｃｏｘ回帰分析において、不良な腎予後の独立したリスク因子であった。経過観察中のエピトープスプレッディングが疾患の悪化と関連したのに対し（ｎ＝３）、ＣＴＬＤ７プロファイルからＣｙｓＲに戻る逆スプレッディングは好ましいアウトカムと関連した（ｎ＝１）。
【００１６】
本発明者らは、血清試料採取時のＣｙｓＲに対する抗ＰＬＡ２Ｒ１反応性が好ましいアウトカムと関連すると同時に、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する反応性は活動性疾患および不良な腎予後と関連することを明らかにする責務を果たした。さらに本発明者らは、ＣＴＬＤ１に対する反応性が、特発性膜性腎症の予後の評価にとって、十分な関連性を有することに着目した。
【００１７】
それゆえに、第１の側面において本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の予後を評価するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中の、ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定するステップａ）を含み、ＣＴＬＤ１に対する自己抗体の存在は予後不良を示す、方法に関する。
【００１８】
本発明者らは、ＣＴＬＤ１に対する自己抗体に加えて、Ｃ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体の検出は、疾患の悪化と関連することを明らかにした。したがって、さらなる実施形態において、前記ステップａ）はさらに、ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定する工程を含む。この実施形態において、ＣＴＬＤ１に対する自己抗体および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在は、予後不良を示す。
【００１９】
好ましい一実施形態において、前記ステップａ）はさらに、ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）に対する自己抗体のレベルを検出および／または測定する工程を含む。
【００２０】
さらなる好ましい一実施形態において、本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の予後を評価するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中の、
−  ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）に対する自己抗体、および
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体、および
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体
のレベルを検出および／または測定するステップａ）を含み、
−  ＣＴＬＤ１に対する自己抗体および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在は予後不良を示す、
方法に関する。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法はさらに、
−  それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１、ＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在は予後良好を示し、かつ／または
−  ＣｙｓＲのみに対する自己抗体の存在は予後良好を示す、
ことを特徴とする。
【００２２】
典型的に、ＣｙｓＲに対する自己抗体ならびにＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在は、予後不良を示す。
【００２３】
「膜性腎症」という用語は、当技術分野におけるその一般的意味を有し、成人ネフローゼ症候群の原因になることが多い腎疾患を指す。この用語は、全身性エリテマトーデス、Ｂ型肝炎、または梅毒（．．．）などの二次的要因によって引き起こされる続発性膜性腎症、および「特発性膜性腎症」とも呼ばれる原発性自己免疫膜性腎症を包含する。「特発性膜性腎症」は、腎糸球体を標的とする自己免疫疾患であるとみなされ、主要な既知標的自己抗原はＰＬＡ２Ｒ１である。
【００２４】
「ＰＬＡ２Ｒ１」または「分泌型ホスホリパーゼＡ２受容体」という用語は、Ｍ型ホスホリパーゼＡ２受容体を指し、これは、ヒトではＰＬＡ２Ｒ１遺伝子によってコードされている受容体であって、特に、特発性膜性腎症主要自己抗原として知られている。例示的ヒト天然ＰＬＡ２Ｒ１アミノ酸配列はＮＰ＿００１００７２６８（ＧｅｎＰｅｐｔデータベース）に掲載されている。
【００２５】
「自己抗体」という用語は当技術分野におけるその一般的意味を有し、対象の免疫系によって生産される抗体であって、対象自身のタンパク質（例えばＰＬＡ２Ｒ１の特定ドメイン）に対する抗体を指す。自己抗体は、身体自身の細胞、組織、および／または器官を攻撃して、炎症および細胞傷害を引き起こしうる。
【００２６】
本明細書において使用する表現「ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体」および「本発明の自己抗体」は、それぞれＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）、ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）、およびＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）を認識する自己抗体を指す。
【００２７】
本明細書において使用する用語「対象」または「患者」は、特発性膜性腎症を患っている症状を有しかつ／または特発性膜性腎症を患っていると疑われる個体を指す。本発明の文脈において、対象または患者は、好ましくは、特発性膜性腎症を患っている対象、または特発性膜性腎症を患っていると疑われる対象である。
【００２８】
本発明の方法は、採用すべき適当な治療戦略を実務家が決定しかつ／または患者が治療の恩恵を受けうるかどうかを実務家が判断するために、極めて重要な情報を実務家に提供する。典型的に、本方法は、血液透析を必要とするかもしれない患者または腎不全のリスクがある患者の同定を可能にする。
【００２９】
「予後」という表現は、本明細書において使用する場合、対象における特発性膜性腎症状態の経過またはアウトカムを予測することを指す。この表現は、状態の経過またはアウトカムを１００％の正確度で予測できることを指しているわけではなく、所与の経過またはアウトカムが、バイオマーカーのパターンに基づいて、予測可能に起こりそうであることまたは起こりそうにないことを指しているわけでさえない。そうではなく、「予後」という表現は、或る経過またはアウトカムが起こる確率の増加を指すことを、当業者は理解するであろう。
【００３０】
好ましくは、本発明の文脈において「予後良好」とは、寛解の可能性が高いことおよび／または好ましくは、血液透析を必要とするリスクが低いこと、および／または腎不全を発症するリスクが低いことを指す。
【００３１】
したがって、本発明の方法によって良好な予後を有するとみなされる対象は、血液透析を必要としないであろう。さらに前記対象は、積極的免疫抑制処置を受ける必要がないであろう。実際、本発明の方法は自然寛解の可能性が高い患者の同定を可能にする。典型的には、「自然寛解」は、免疫抑制処置を伴わない対症処置（ＲＡＳ遮断薬および利尿薬など）によって誘発される寛解によって定義される。
【００３２】
好ましくは、本発明の文脈において、「予後不良」とは、後に腎不全などの腎合併症を発症する可能性が高いこと、および／または再燃の可能性が高いことを指す。
【００３３】
予後不良は、典型的には、
−  タンパク尿の増加、典型的にはタンパク尿＞４ｇ／ｇ、および／または
−  ３０％を超えて増加した血清中クレアチニン、および／または
−  推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ：ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２
と関連する。ｅＧＦＲは、初期腎損傷をスクリーニングして検出するために使用され、腎臓の状態をモニタリングするためにも使用される。これは、クレアチニン検査を行い、推定糸球体濾過量を算出することによって行われる。
【００３４】
典型的には、本発明の方法によって予後不良を有するとみなされる対象は、血液透析を必要とするであろう。さらに前記対象は、免疫抑制処置を受ける必要があるだろう。実際、本発明の方法は、自然寛解の可能性が低い患者の同定を可能にする。
【００３５】
本発明の方法は、生物学的試料中の本発明の自己抗体のレベルを検出および／または測定するステップを含む。好ましくは、前記生物学的試料は前記対象から得られる。そのような試料には、細胞を含んでも含まなくてもよい体液、例えば血液（例えば全血、血清または血漿）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのような試料には、生検（例えば腎生検）も含まれる。好ましくは前記試料は前記対象の体液である。試料の非限定的な例には、全血試料、血漿または血清が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、前記生物学的試料は血清である。生物学的試料という用語は、生物学的試料を処理することによって派生する任意の材料も包含する。派生材料には、試料から単離された細胞（もしくはそれらの子孫）または試料から抽出されたタンパク質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。生物学的試料の処理は、濾過、蒸溜、抽出、濃縮、干渉成分の不活化、試薬の添加などのうちの１つ以上を伴いうる。
【００３６】
ステップａ）は、本発明の自己抗体の定量的、半定量的または定性的測定のステップでありうる。好ましくは、前記ステップａ）は、前記対象から得られた生物学的試料中の、ＰＬＡ２Ｒ１のＣｙｓＲに対する自己抗体、ＰＬＡ２Ｒ１のＣＴＬＤ１に対する自己抗体、およびＰＬＡ２Ｒ１のＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルを測定するステップである。
【００３７】
一実施形態において、前記ステップａ）は、以下のサブステップ：
−  前記患者から得られた生物学的試料をＰＬＡ２Ｒ１と接触させるサブステップ、および
−  形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するサブステップ
を含み、抗原−抗体複合体の存在は膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症を示す。
【００３８】
好ましくは、ＰＬＡ２Ｒ１は、ヒトＰＬＡ２Ｒ、ウサギＰＬＡ２Ｒ１、マウスＰＬＡ２Ｒ１、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される。
【００３９】
本明細書にいうＰＬＡ２Ｒ１の「フラグメント」とは、ＰＬＡ２Ｒ１の連続する一要素を指す。典型的には、前記フラグメントは生物学的に活性なフラグメントである。すなわち前記フラグメントは、ＰＬＡ２Ｒ１の１つ以上の機能的性質を含む。
【００４０】
本発明の文脈において、ＰＬＡ２Ｒ１の「フラグメント」は、ＰＬＡ２Ｒ１の全アミノ酸配列のうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含み、好ましくは、それからなる。
【００４１】
好ましくは、前記フラグメントは、ＰＬＡ２Ｒ１の全アミノ酸配列のうちの少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１１２０、少なくとも１２５０、少なくとも１３００、少なくとも１３１０、少なくとも１３２０個のアミノ酸を含む。
【００４２】
好ましくは、前記フラグメントは、ＰＬＡ２Ｒ１に対する自己抗体によって認識される。好ましくは、前記フラグメントは、ＰＬＡ２Ｒ１のＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体によって認識される。前記自己抗体と相互作用するフラグメントの能力の決定は、直接的結合を決定するための上述の方法または当技術分野において既知の方法の一つによって行うことができる。
【００４３】
生物学的試料中の自己抗体のレベルを測定するための方法は、競合タイプ、直接反応タイプ、またはサンドイッチタイプのアッセイなどといったイムノアッセイを含む標準的な免疫診断技法を使用することによって測定されうる。そのようなアッセイには、凝集反応検査、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、免疫沈降が含まれるが、それらに限定されるわけではない。反応には、一般に、蛍光ラベル、化学発光ラベル、放射性ラベル、酵素ラベル、もしくは色素分子などの顕示ラベル（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）、または抗原と、それと反応した１つまたは複数の抗体との間の複合体の形成を検出するための他の方法が含まれる。
【００４４】
好ましい一実施形態において、ステップａ）はＥＬＩＳＡによって行われる。「ＥＬＩＳＡ」という用語は、本明細書において使用する場合、試料中の分析物の量を定量するために使用される抗体と検出可能なラベルとを含む競合結合アッセイの一タイプである、酵素結合免疫吸着アッセイを意味する。
【００４５】
こうして、本発明の前記ステップａ）は、ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体について、力価を評価することを可能にする。典型的に、ＥＬＩＳＡの場合であれば、マイクロタイタープレートのウェルを一組の標的抗原でコーティングする。生物学的試料をそれら被覆ウェルに加える。自己抗体−抗原複合体を形成させるのに十分なインキュベーション期間後に、プレートを洗浄して未結合部分を除去し、検出可能に標識された二次結合抗体を加える。二次結合分子を、捕捉された任意のヒト自己抗体と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野において周知の方法を使って、二次結合抗体の存在を検出する。
【００４６】
ヒト抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体が以下のアイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択されることに留意することは、注目に値する。好ましくは、ヒト抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体はＩｇＧ４である。基本的に、本発明の文脈においてＥＬＩＳＡを実行するために使用される抗原は、
−  ＨＥＫ２９３細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において生産されたＣｙｓＲドメイン、
−  ＨＥＫ２９３細胞または大腸菌において生産されたＣＴＬＤ１ドメイン、および
−  ＨＥＫ２９３細胞または大腸菌において生産されたＣＴＬＤ６−７またはＣＴＬＤ６コンストラクト
である。ＨＥＫ細胞において生産された２つの抗原ドメインは、抗ＨＡ抗体で予めコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにＨＡアフィニティー捕捉することができ、一方、大腸菌からのＣＴＬＤ１ドメインは、直接コーティングするか、抗ＨＡで捕捉することができる。次に、吸着させた抗原を患者の血清と共にインキュベートしてから、二次抗ヒトＩｇＧ特異的抗体で検出する。この二次抗ヒトＩｇＧ特異的抗体は、好ましくは、ペルオキシダーゼにカップリングされた抗ＩｇＧ４抗体であることができるが、抗トータルＩｇＧ（ａｎｔｉ−ｔｏｔａｌ）、抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２および抗ＩｇＧ３二次抗体などといった他の二次抗ＩｇＧであってもよい。
【００４７】
あるいは、このアッセイでは、以前に開示された抗原のすべてが使用されうる。
【００４８】
好ましい実施形態において、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体はＩｇＧ４である。実際、本発明者らは、患者に見いだされる抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体の大部分がＩｇＧ４サブクラスの抗体であることを明らかにした。しかし、抗ＰＬＡ２Ｒ１  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３のサブクラスも見いだされる。したがって、本発明の文脈において、ＣｙｓＲドメイン、ＣＴＬＤ１ドメインおよびＣＴＬＤ７ドメインに対する抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体のサブクラスは、好ましくは、ＩｇＧ４自己抗体であるが、それに限るわけではない。
【００４９】
自己抗体の存在または非存在は、自己抗体の群のそれぞれについて検出されたレベルまたは力価を参照レベルと比較することによって決定することができる。
【００５０】
自己抗体の存在を、参照レベルとの比較で高いレベルとみてもよいことは、注目に値する。同様に、自己抗体の非存在を、参照レベルとの比較で低いレベルとみてもよい。
【００５１】
本発明の文脈において、「対照」という用語は、それが対象を特徴づけるために使用される場合には、健常な対象、または腎疾患以外の特定疾患または特発性膜性腎症以外の腎疾患と診断された患者を指す。
【００５２】
「対照試料」という用語は、健常対象から得られた、または腎障害以外の疾患と診断された患者から得られた、１つまたは複数の試料を指す。
【００５３】
「正常」および「健常」という用語は、本明細書においては相互可換的に使用される。これらの用語は、腎障害に関係する症状を何も示していない対象および膜性腎症とも他の腎症とも診断されていない対象を指す。好ましくは、正常対象は、腎系に影響を及ぼす投薬を受けておらず、他のどの疾患とも診断されていない。一定の実施形態において、正常対象は、試験される生物学的試料が得られた対象と比較して、同様の性別、年齢、および／またはボディマス指数を有する。「正常」という用語は、本明細書において、健常対象から得られた試料を形容するためにも使用される。
【００５４】
本明細書において使用する用語「参照レベル」は、対照から得られた生物学的試料中のレベルを指すか、好ましくは、いくつかの対照から得られた生物学的試料において測定されたいくつかのレベルの平均を指す。典型的には、当業者は、健常であることがわかっている少なくとも１００個体の生物学的試料中、好ましくは血清中の前記参照レベルを、決定しうる。次に、ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の平均レベルが得られるように、得られた比の平均値が周知の統計分析によって決定される。次に、前記の値が正常であるとみなされ、よって閾値を構成する。特定の好ましい一実施形態において、予後に使用されるＰＬＡ２Ｒ１抗原は、マウスＰＬＡ２Ｒ１またはそのフラグメントである。
【００５５】
まさにこの特定実施形態では、ステップａ）が以下のサブステップ、すなわち前記患者から得られた生物学的試料をマウスＰＬＡ２Ｒ１と接触させるサブステップ、および形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するサブステップを含み、形成された任意の抗原−抗体複合体の存在は予後不良を示す。
【００５６】
実際、本発明者らのさらなる実験は、ｉＭＮの予後を評価するためにマウスＰＬＡ２Ｒ１を使用できることを明らかにした。
【００５７】
したがって、第２の側面において、本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の予後を評価するための方法であって、前記患者から得られた生物学的試料をマウスＰＬＡ２Ｒ１と接触させるステップ、および形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するステップを含み、形成された任意の抗原−抗体複合体の存在は予後不良を示す方法に関する。
【００５８】
したがって、この側面において本発明は、マウスＰＬＡ２Ｒ１に対する自己抗体の同定に依拠する。したがって本発明は、予後不良を示す患者を同定することを目的とする。
【００５９】
ｉＭＮの処置に対する応答の有効性をモニタリングするための方法
本発明者らは、特発性膜性腎症の経過観察中および治療的処置中にＰＬＡ２Ｒ１エピトーププロファイルが変化しうることに着目した。実際、本発明者らは、抗ＣＴＬＤ１抗体および抗ＣＴＬＤ７抗体が自発的なまたは治療による疾患の寛解と共に消失し、疾患の再燃と共に再び出現し、一方、抗ＣｙｓＲ限定的活性は安定した軽度の疾患活動度に関連することを明らかにした。
【００６０】
したがって本発明者らは、経過観察中のＰＬＡ２Ｒ１エピトーププロファイルおよびＰＬＡ２Ｒ１エピトープスプレッディングの分析は、疾患重症度をモニタリングし、患者を、異なる腎予後を持つサブグループへと層別化するための強力なツールであると結論した。したがって本発明は、例えばそれぞれの抗原ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７を標的とするさまざまな抗ＰＬＡ２Ｒ１特異的自己抗体の存在および力価を患者の血清中に検出することなどにより、臨床家が自己反応性の程度を定性的および定量的に測定できるようにすることによって、特発性膜性腎症の進行をモニタリングするための方法を提供する。これらの自己抗体は疾患の進行を示す。
【００６１】
特に本発明者らは、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体がどちらも観察される場合に、疾患は悪化することを明らかにした。
【００６２】
「エピトープスプレッディング」とは、慢性自己免疫中または炎症性応答中の自己抗原の放出に続発する内在性エピトープに対する免疫応答の発生をいう。したがってエピトープスプレッディングは、最初の非交差反応性抗原部位から、同じ分子または異なる分子内の新しいエピトープが、Ｔ細胞またはＢ細胞によって次第に認識されるようになる現象である。ヒト抗糸球体基底膜抗体病、尋常性天疱瘡、関節リウマチ、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、多発性硬化症、１型糖尿病およびヘイマン腎炎などといった多くの自己免疫疾患において記載されているように、分子内エピトープスプレッディングは疾患の悪化と関連する。
【００６３】
「エピトープ」という用語には、抗体および／またはＴ細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意の抗原（例えばタンパク質）決定基が含まれる。すなわち、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位である。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などといった分子の化学的に活性な表面配置からなり、通常は、特異な三次元構造特徴および特異な電荷特徴を有する。エピトープは、典型的には少なくとも３、５または８〜１０個のアミノ酸を含む。アミノ酸は連続的であってもよいし、三次フォールディングによって並置された不連続アミノ酸であってもよい。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者はそうでない点で、区別される。本発明の文脈において定義される抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体はいずれも、コンフォメーショナルエピトープを認識する。
【００６４】
それゆえに、第３の側面において本発明は、対象における膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症の処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
−  第１時点において前記対象から得られた生物学的試料中の、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの自己抗体のレベルを、前記第１時点において決定するステップ、
−  第２時点において前記対象から得られた生物学的試料中の、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの自己抗体のレベルを、前記第２時点において決定するステップ、および
−  ２つの時点の自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
−  第２時点における、それぞれＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在またはそれぞれＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルの減少は、処置が有効であることを示し、ならびに／または
−  第２時点における、ＣＴＬＤ１および／もしくはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の存在、またはＣＴＬＤ１および／もしくはＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルの増加は、処置が有効でないことを示す、
方法に関する。
【００６５】
好ましくは、第２時点における、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在、または前記自己抗体のレベルの減少は、処置が有効であることを示す。より正確に述べると、それぞれＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体の非存在は、処置が成功しており有効であるという極めて良い徴候である。
【００６６】
前記方法は、特発性膜性腎症の進行のモニタリングも可能にする。
【００６７】
以前に開示された技術データおよび定義はすべて、ここでも適用可能である。
【００６８】
比較レベルより「増加したレベル」もしくは「高いレベル」または「減少したレベル」もしくは「低いレベル」、あるいは前記比較レベルからの「変化」または「逸脱」は、統計的に有意である。
【００６９】
比較レベルと比べて、レベルが、約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、または約５０％以上、比較レベルと異なる場合は、比較レベルから増加したレベルもしくは減少したレベル、または比較レベルからの変化もしくは逸脱が存在するとみなすことができる。本発明の文脈において、「比較レベル」とは、好ましくは、第１時点において得られる自己抗体のレベルを指す。
【００７０】
あるいは、統計的有意性（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）をＰ≦０．０５として計算してもよい。対照に存在しないマーカーの存在は、より高いレベルまたは変化もしくは逸脱とみることができる。対照に存在するマーカーの非存在は、より低いレベルまたは変化もしくは逸脱とみることができる。
【００７１】
免疫抑制治療ならびに対症処置では、特発性膜性腎症を処置するために使用されている現行の処置を使用することができる。
【００７２】
典型的には、特発性膜性腎症、とりわけ特発性膜性腎症の重症例に使用されている現行の処置は、免疫抑制治療である。前記免疫抑制治療は典型的には、シクロスポリン、タクロリムス、アザチオプリン、インフリキシマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブおよびラパマイシン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ならびにリツキシマブからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の投与に基づく。
【００７３】
好ましくは、特発性膜性腎症の処置は、シクロホスファミド、クロラムブシル、タクロリムス、およびリツキシマブの使用に基づく。
【００７４】
対症処置は、典型的には、レニン・アンジオテンシン系の遮断に基づく。
【００７５】
したがって本発明は、処置に付される患者の反応を実務家が予測する手段になりうる手段を提供する。
【００７６】
典型的には、ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より一層好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より一層好ましくは少なくとも７０％、さらにより一層好ましくは少なくとも８０％の減少が観察される場合、処置は有効とみなされる。これは、一般に、予後良好を示す。
【００７７】
逆に、第１時点において存在しなかったＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体が第２時点において検出される場合、処置は無効であるとみなされる。さらに、第１時点と第２時点との間で、レベルが安定しているか、ＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体の初期レベルの少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より一層好ましくは少なくとも３０％、さらにより一層好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より一層好ましくは少なくとも７０％、さらにより一層好ましくは少なくとも８０％またはそれ以上増加している場合も、処置は無効であるとみなされる。
【００７８】
典型的には、エピトーププロファイルに基づく群間の差はログ・ランク検定で、典型的にはＰｒｉｓｍ６およびＳＡＳ９．３ソフトウェアを使って分析され、ｐ値＜０．０５が統計的に有意とみなされる。
【００７９】
いくつかの状況が観察されうる。
【００８０】
一実施形態では、第２時点においてＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体が検出されない。これは患者が寛解期にあると考えられることを示している。
【００８１】
別の一実施形態では、安定したレベルの、ＣｙｓＲに対する自己抗体が、第２時点において観察されるか、第１時点および第２時点において得られるレベルが、統計分析分散内で比較的類似しており、両者間の偏差は、およそ１〜５％の偏差、好ましくは１〜３％の偏差である。これは、患者が寛解期にあると考えられることを示している。
【００８２】
別の一実施形態では、安定したレベルの、ＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体が観察される。すなわち、第１時点および第２時点において得られるレベルは統計分析分散内で比較的類似しており、両者間の偏差はおよそ１〜５％の偏差、好ましくは１〜３％の偏差である。これは安定した疾患を示し、この場合、処置は、その継続期間が不十分であった（したがって、その処置は継続されるべきであるか、または臨床的適応があれば、別のタイプの免疫抑制剤に変えるべきである）か、または処置は無効である。
【００８３】
別の一実施形態では、第２時点において、第１時点と比較して増加したレベルの、ＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体が観察される。これは、疾患の悪化および／または効率のよい処置の欠如を示す。少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、より一層好ましくは少なくとも２００％の増加は、状況の悪化および不良な予後を示すとみなされる。
【００８４】
本発明によれば、第１時点より後の第２時点が選ばれる。第１時点および第２時点は、例えば治療戦略に関して、および特発性膜性腎症を発症するリスクがある患者、または膜性腎症、特に特発性膜性腎症を既に患ったことがあり、再燃のリスクがある患者の経過観察のために、戦略的に選ばれうる。
【００８５】
例えば、第１時点は患者に何らかの処置を施行する前であることができ、第２時点は、処置が効果を示すべき時期または処置の終了時に置くことができるだろう。また、アッセイは、その後も繰り返されうる。
【００８６】
したがって、アッセイは数回再現することができ、自己抗体レベルは３つ以上の時点において評価されうる。基本的に、患者の健康の改善および処置の有効性は、その間に、抗自己抗体のレベル、とりわけＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体のレベルの、大幅な減少（ｇｌｏｂａｌ  ｄｅｃｒｅａｓｅ）が観察される場合に示される。
【００８７】
逆に、患者の健康の劣化および処置の無効性は、その間に、ＣＴＬＤ１および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体レベルの減少が観察されないか、大幅な増加（ｇｌｏｂａｌ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）が観察される場合に示される。
【００８８】
使用されるアッセイは、異なる時点において対象から収集されたすべての生物学的試料について、同一である。
【００８９】
無効な処置であった場合は、治療戦略を適合させる必要がある。
【００９０】
特発性膜性腎症を診断する方法
第４の側面において、本発明は、対象における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断するための方法であって、前記対象から得られた生物学的試料において、
−  ＰＬＡ２Ｒ１のシステインリッチドメイン（ＣｙｓＲ）に対する自己抗体、および／または
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン１（ＣＴＬＤ１）に対する自己抗体、および／または
−  ＰＬＡ２Ｒ１のＣ型レクチンドメイン７（ＣＴＬＤ７）に対する自己抗体
からなる群より選択される少なくとも１つの自己抗体を検出するステップａ’）を含み、ＰＬＡ２Ｒ１のＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１、および／またはＣＴＬＤ７に対する自己抗体のうちの１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの存在は、膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症を示す方法に関する。
【００９１】
一実施形態において、前記ステップａ’）は、以下のサブステップを含む：
−  前記患者から得られた生物学的試料をＰＬＡ２Ｒ１と接触させるサブステップ、および
−  形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するサブステップ。
【００９２】
この実施形態において、形成された抗原−抗体複合体の存在は、膜性腎症、好ましくは特発性膜性腎症を示す。
【００９３】
好ましくは、前記ＰＬＡ２Ｒ１は、ヒトＰＬＡ２Ｒ１、ウサギＰＬＡ２Ｒ１およびマウスＰＬＡ２Ｒ１からなる群より選択される。
【００９４】
以前に開示された技術データはいずれも適用可能である。
【００９５】
本明細書において使用する用語「診断」は、その文法形のいずれにおいても、医学的状態または無症候性の状態を同定するためのプロセスを指す。本発明の文脈において、診断という用語は、特発性膜性腎症を患っている対象の同定を指す。
【００９６】
好ましくは、本明細書において開示される方法は、インビトロ法である。
【００９７】
以下の実施例によって本発明をさらに例証する。ただし、決して、これらの実施例が本発明の範囲を限定していると解釈してはならない。
【実施例】
【００９８】
実施例１：ＰＬＡ２Ｒ１におけるエピトープスプレッディングは膜性腎症における予後不良と関連する
方法
患者
フランスの腎センター５箇所から、生検で確定診断されたｉＭＮを持つ患者の血清を収集した。ｉＭＮは、抗核抗体に関する陽性、Ｂ型もしくはＣ型肝炎、がんまたは他の免疫病（クリオグロブリン血症、サルコイドーシス、移植片対宿主病など）の病歴などといった続発性ＭＮの特徴が存在しないことによって定義した。合計６９人の患者から血清を収集し、１６人の患者については逐次血清試料採取を行った。不良な腎予後は、ＫＤＩＧＯの推奨によって定義されるとおり、タンパク尿＞４ｇ／ｇおよび／または３０％を超える血清中クレアチニン増加および／またはｅＧＦＲ＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２によって定義した。活動性疾患は腎炎性タンパク尿＞３．５ｇ／ｇによって定義した。腎不全の進行は、２年間の経過観察後に分析して、ベースラインからの３０％を超える血清中クレアチニンの増加によって定義した。
【００９９】
膜結合型ＰＬＡ２Ｒ１欠失突然変異体の作成および発現
本発明者らはＰＣＲによって一連のヒトＰＬＡ２Ｒ１欠失突然変異体を作成し、それらを、野生型ヒトＰＬＡ２Ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００７３６６）について以前に記載されたように、ｐＬＰＣＸ発現ベクター（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））にクローニングした。欠失突然変異体はＰｈｕｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使って作成した。突然変異体はいずれも、ＰＬＡ２Ｒ１シグナルペプチド（Ｍｅｔ−１〜Ａｌａ−２０）およびＮ末リンカー配列（Ａｌａ−２１〜Ｔｒｐ−３５）を含み、その後ろに以下のドメインがリンカー領域において欠失しているＰＬＡ２Ｒ１配列が続いていた：Ｎ末ドメインＣｙｓＲの欠失（ΔＣ、Ｇｌｎ−３６〜Ａｓｐ−１６５までの欠失）、ＣｙｓＲドメインおよびＦＮＩＩドメインの欠失（ΔＦ、Ｇｌｎ−３６〜Ｔｈｒ−２２３）、ＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ１ドメインの欠失（Δ１、Ｇｌｎ−３６〜Ｔｙｒ−３５７）、ＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ２ドメインの欠失（Δ２、Ｇｌｎ−３６〜Ａｌａ−５０４）、ＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ３ドメインの欠失（Δ３、Ｇｌｎ−３６〜Ｐｒｏ−６６０）、ＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ４ドメインの欠失（Δ４、Ｇｌｎ−３６〜Ｌｙｓ−８０５）、ＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ５ドメインの欠失（Δ５、Ｇｌｎ−３６〜Ｌｙｓ−９４７）、ＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ６ドメインの欠失（Δ６、Ｇｌｎ−３６〜Ｈｉｓ−１１０５）、およびＣｙｓＲ〜ＣＴＬＤ７ドメインの欠失（Δ７、Ｇｌｎ−３６〜Ｐｒｏ−１２３５）。すべての突然変異体を、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングされたＣ末ＨＡタグ付き（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）バージョンのヒト完全長ＰＬＡ２Ｒ１  ｃＤＮＡから作成した。全配列決定後に、すべての欠失コンストラクトをｐＬＰＣＸレトロウイルスベクターにサブクローニングし、Ｃａ／ＰＯ４トランスフェクションキット（インビトロジェン（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ））またはＥｘｇｅｎ（Ｂｉｏｍｏｌ  ＧｍｂＨ）を使って、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞溶解物から、ウェスタンブロットにより、抗ＨＡ抗体を使って発現を確認した（下記参照）。
【０１００】
ＰＬＡ２Ｒ１の可溶性ドメインの作成および発現
可溶性ＰＬＡ２Ｒ１突然変異体を上述のようにＰＣＲによって作成し、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ−発現ベクター（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。それらはすべてＰＬＡ２Ｒ１シグナルペプチドを含み、その後ろに、次のとおり、異なるＰＬＡ２Ｒ１ドメインをコードするヒトＰＬＡ２Ｒ１配列が続いていた：ＣｙｓＲドメイン（ＣｙｓＲ、Ａｌａ−２１〜Ｌｙｓ−１６４まで）、ＣＴＬＤ１ドメイン（ＣＴＬＤ１またはＣ１、Ｔｈｒ−２２３〜Ａｓｎ−３５９）、ＣＴＬＤ２〜ＣＴＬＤ８（Ｃ２Ｃ８、３５７−Ｔｙｒ〜１３９７−Ｓｅｒ）、ＣＴＬＤ６〜ＣＴＬＤ８（Ｃ６Ｃ８、９４７−Ｌｙｓ〜１３９７−Ｓｅｒ）、ＣＴＬＤ６（Ｃ６、９４７−Ｌｙｓ〜１１１４−Ｐｒｏ）、ＣＴＬＤ７（Ｃ７、Ｇｌｕ−１０９７〜１２４６−Ｌｅｕ）、ＣＴＬＤ８（Ｃ８、Ｐｒｏ−１２３５〜１３９７−Ｓｅｒ）、ＣＴＬＤ６〜ＣＴＬＤ７（Ｃ６Ｃ７、９４７−Ｌｙｓ〜１２４６−Ｌｅｕ）、およびＣＴＬＤ７〜ＣＴＬＤ８（Ｃ７Ｃ８、Ｇｌｕ−１０９７〜１３９７−Ｓｅｒ）。すべての可溶性突然変異体のＣ末にＨＡタグを付けた。ＣｙｓＲ−ＦＮＩＩ−ＣＴＬＤ１ドメインは、ドメインのＣ末にＨＡタグが付けられている点以外はＫａｏらが記載したとおりに生産し、トロンビン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で切断した。すべての突然変異体を上述のようにＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、発現したタンパク質を含有する細胞培地を収集した。タンパク質の発現レベルが低い場合は、標準的手順を使って、培地をトリクロロ酢酸で沈殿させた。
【０１０１】
ＤｓｂＣ−Ｈｉｓ−ＨＡ−ＰＬＡ２Ｒ１融合タンパク質は、本質的に記載されているように大腸菌中で生産した。詳細な手順は別途公表する。大腸菌発現用に最適化されたコドンを持つＰＬＡ２Ｒ１ドメインを、精製用および検出用にそれぞれＨｉｓタグおよびＨＡタグが後続しているリーダーレスＤｓｂＣオープンリーディングフレームと、インフレームに付加した。挿入されたＰＬＡ２Ｒ１ドメインの配列は、ＣｙｓＲ：Ａｌａ−２６〜Ｌｙｓ−１６４、ＣＴＬＤ１：Ｔｈｒ−２２３〜Ａｓｎ−３５９、ＣＴＬＤ７：Ｔｈｒ−１１０２〜Ｇｌｕ−１２３７、ＣＴＬＤ６−７：９４７−Ｌｙｓ〜Ｇｌｕ−１２３７であった。ＣＴＬＤ１の一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）変異体も４種類、設計した。ＳＮＰ１：Ｖａｌ−２９２およびＡｓｐ−３００、ＳＮＰ２：Ｍｅｔ−２９２／Ａｓｐ−３００、ＳＮＰ３：Ｍｅｔ−２９２／Ｈｉｓ−３００、ならびにＳＮＰ４：Ｖａｌ−２９２／Ｈｉｓ−３００。
【０１０２】
ウェスタンブロット分析
さまざまな欠失突然変異体および可溶型のＰＬＡ２Ｒ１を、別段の表示がある場合を除き、非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。全タンパク質（各欠失突然変異体の異なる発現レベルを調節するために１０〜５０μｇ／ウェル）および細胞培地（トランスフェクトされた可溶型の場合）を４−１５％プレキャストＴＧＸ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で泳動し、メタノールに浸漬したＰＶＤＦメンブレンに、Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ（バイオ・ラッド）を使って２５Ｖ定電圧で１２分間、セミドライ条件下で転写した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）０．０５％を使って５％ミルク中、４℃で一晩、メンブレンをブロッキングした後、一次抗体および二次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。一次抗体はＰＢＳ−Ｔ中の０．５％粉乳で希釈した。メンブレンは複製を複数調製し、発現を検証するために１：５，０００のマウスモノクローナル抗ＨＡ抗体（シグマ）によってプローブするか、エピトーププロファイルについてスクリーニングするために、抗ＰＬＡ２Ｒ１価に応じて１：２５〜１：５００の作業希釈度で、５０の異なるｉＭＮ血清によってプローブした。抗ＨＡ用の二次抗体は、ＰＢＳ−Ｔ中に１：２０，０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（サザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）＃１０３０−０５）であった。ｉＭＮ血清用のＩｇＧ二次抗体は、ＰＢＳ−Ｔ中に１：３０，０００希釈したＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ４（サザンバイオテック＃９２００−０５）であった。抗ＰＬＡ２Ｒ１  ＩｇＧサブクラス分析（補足データ参照）のために、本発明者らは、サザンバイオテックのサブクラス特異的抗ＩｇＧパネルおよび２つの異なる抗トータルＩｇＧ（サザンバイオテックおよびサンタクルズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））も使用した。ＩｇＧサブクラス特異性を検証するための精製ＩｇＧはＦｉｔｚｇｅｒａｌｄから入手した。一次抗体および二次抗体とのインキュベーション後に、メンブレンをＰＢＳ−Ｔ中で５分間ずつ３回洗浄した。タンパク質バンドの検出は、化学発光基質（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））およびＦｕｊｉ  ＬＡＳ３０００イメージャーを使って行った。
【０１０３】
抗ＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡ
抗ＰＬＡ２Ｒ１アッセイは本質的に標準化された市販のＥＬＩＳＡについて記載されているとおりに行った。全細胞外ドメインに相当する純粋な組換えヒトＰＬＡ２Ｒ１タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中（１００μＬ／ウェル、１μｇ／ｍＬ）、４℃で、一晩、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。プレートをＳｅｒａｍｕｎＢｌｏｃｋ（Ｓｅｒａｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）で２時間ブロッキングした。患者の血清をＰＢＳ／０．１％粉乳に１：１００（または必要に応じてそれ以上）希釈し、二つ一組にして、ｉＭＮ標準血清の段階希釈液および（プレート間の）品質管理用較正物質も入っているＥＬＩＳＡプレートに加えた（１ウェルあたり１００μＬ）。プレート振とう機上、室温で２時間のインキュベーション後に、プレートをＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄し、ＳｅｒａｍｕｎＳｔａｂ  ＳＴ  ｐｌｕｓに１：７，５００希釈した抗ヒトＩｇＧ４−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（サザンバイオテック＃９２００−０５）を加え（１ウェルあたり１００μＬ）（Ｓｅｒａｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）、プレート振とう機上、室温で１時間インキュベートした。４回の洗浄後に、テトラメチルベンジジンを加え、反応を１５分間進行させた後、ＨＣｌ  １．２Ｎで反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。健常ドナーから得た６７の血清を使用し、平均＋３ＳＤを使って、正常範囲を画定した。カットオフは、受信者動作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）曲線分析によって最適化した。標準曲線および陰性対照を作成するために、各プレートにおいて、高陽性インデックス患者血清を使用した。
【０１０４】
可溶型のＰＬＡ２Ｒ１を使ったＥＬＩＳＡ
プレートを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に１：５，０００希釈した抗ＨＡ抗体（シグマ）（１００μＬ／ウェル）を使って、４℃で一晩、コーティングした。次に、プレートをＳｅｒａｍｕｎＢｌｏｃｋ（Ｓｅｒａｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）で２時間ブロッキングした。次に可溶型のＰＬＡ２Ｒ１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの細胞培地（タンパク質発現量に応じて１０〜１００μｌ／ウェル）または精製大腸菌ＤｓｂＣ−ＨＡ−ＣＴＬＤ１融合タンパク質（５０ｎｇ／ウェル）を加え、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｉＭＮ標準血清の段階希釈液および（プレート間の）品質管理用較正物質も入っているＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳ／０．１％粉乳に１：１００（または必要に応じてそれ以上）希釈した患者の血清を、二つ一組にして加えた（１ウェルあたり１００μＬ）。プレート振とう機上、室温で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄した。ＳｅｒａｍｕｎＳｔａｂ  ＳＴ  ｐｌｕｓ（Ｓｅｒａｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）に１：７，５００希釈した抗ヒトＩｇＧ４−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（サザンバイオテック＃９２００−０５）を加え（１ウェルあたり１００μＬ）、プレート振とう機上、室温で１時間インキュベートした。サブクラス分析は上に示したように特異的抗ＩｇＧで行った。４回の洗浄後に、テトラメチルベンジジンを加え、反応を１５分間進行させてから、ＨＣｌ  １．２Ｎで反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。健常ドナーから得た２０の血清を使用し、平均＋３ＳＤを使って、正常範囲を画定した。カットオフは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析によって最適化した。標準曲線および陰性対照を作成するために、各プレートにおいて、高陽性インデックス患者血清を使用した。
【０１０５】
患者または正常対象について、次のようにして、各抗原に関するＥＬＩＳＡインデックス値を得た（平均試験結果−平均ドメイン陰性対照）／（平均ドメイン陽性対照−平均ドメイン陰性対照）×ドメイン補正因子×１００。ドメイン補正因子は、Ｗａｒｒｅｎら  ２００３に記載されているように、各ドメインについて、すべてのプレート上の当該ドメインに関するすべての陽性対照の平均から陰性対照の平均を引き、それを当該ドメインアッセイに関するカットオフで割ったものとして決定した。
【０１０６】
統計分析
記述統計のために、データを平均±標準偏差（ガウス分布を持つ変量の場合）またはメジアン（範囲）（非ガウス分布を持つ変量の場合）として表す。或る変量がガウス分布を有するかどうかを決定するために、本発明者らはシャピロ・ウィルク検定を使用した。定性的変量は、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定を、使用条件に従って使用することによって比較した。定量的変量はスチューデントｔ検定またはウィルコクソン・マン・ホイットニー検定（非ガウス分布を持つ変量の場合）を使って比較し、多重比較には通常の一元配置ＡＮＯＶＡ（ガウス分布を持つ変量の場合）、クラスカル・ウォリス検定（非ガウス分布を持つ変量の場合）およびテューキーの検定（２つずつの比較の場合）を使用した。不良な予後は、ＬＯＣＦ時に、ＫＤＩＧＯによって定義されるとおり、タンパク尿＞４ｇ／ｇおよび／または３０％を超えて増加した血清中クレアチニンおよび／またはｅＧＦＲ＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２によって定義した。腎生存に関する生存曲線は、生存分布のカプラン・マイヤー推定値を使って計算した。腎生存分析の終点は、本発明者らが血清中クレアチニンに３０％を超えるベースラインからの増加を観察した時とした。エピトーププロファイルに基づく群間の差は、ログ・ランク検定で分析した。多変量ｃｏｘ回帰分析を行った。分析では、予後に影響を及ぼすかもしれないすべての臨床パラメータ（年齢、性別、タンパク尿、クレアチン血症、免疫抑制処置および抗ＰＬＡ２Ｒ１価）を含め、調節した。ハザード比は、ＥＬＩＳＡによって測定されたＰＬＡ２Ｒ１抗体レベルの自然対数単位によって表され、性別、処置、および異なるドメイン群で二分される。統計処理はすべてＰｒｉｓｍ６およびＳＡＳ９．３ソフトウェアを使って行った。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０１０７】
結果
３つのエピトーププロファイルの同定
本発明者らはまず、部位特異的突然変異導入によって、一連の、ＰＬＡ２Ｒ１の欠失突然変異体、９種類を作成し、ここでは、膜結合型の受容体が残るように、各ドメインをＮ末端配列から逐次的に欠失させた。本発明者らは細胞質テールに小さなＨＡタグを導入した。この小さなＨＡタグにより、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞における組換えタンパク質の発現を検証することが可能になった。抗ＨＡ抗体では不十分にしか検出されなかったが一部の患者では明らかに検出されたΔ６を除いて、すべてのＰＬＡ２Ｒ１コンストラクトが容易に発現した。次に、本発明者らは、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体を持つ５０人のｉＭＮ患者からの血清を、野生型タンパク質と欠失突然変異体に対するそれらの反応性について、スクリーニングした。本発明者らは、患者をＩｇＧ４  抗ＰＬＡ２Ｒ１サブクラスについてスクリーニングすることにした。なぜなら、ＩｇＧ４はｉＭＮにおける主要なＩｇＧサブクラスであって、疾患活動度と最も相関することが、多くの研究によって示されているからである。ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７の逐次的欠失は、まず１２人の患者、次にさらに１１人の患者、そしてさらに２７人の患者での、ＰＬＡ２Ｒ１認識の漸進的喪失につながったことから、これら３つのドメインのそれぞれの中の相異なるエピトープに対応すると思われる３つのエピトーププロファイルが同定された。
【０１０８】
ＣｙｓＲドメインとＣＴＬＤ１ドメインは、２つの異なる抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体によって認識される相異なるエピトープを含んでいる
Ｆｒｅｓｑｕｅｔらは、最近、ＣｙｓＲドメインだけが抗ＰＬＡ２Ｒ１エピトープを含んでいると記載したのに対し、Ｋａｏらは、ＣｙｓＲドメインとＣＴＬＤ１ドメインとの間に１個または数個のエピトープが織り込まれていることを示唆した。本発明者らの上記のデータは、むしろ、ＣｙｓＲドメイン中およびＣＴＬＤ１ドメイン中に２つの独立したエピトープが存在することを示唆している。この仮説を確認するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞または大腸菌のどちらかにおいて、ＨＡタグ付きで可溶型のＣｙｓＲドメインのみおよびＣＴＬＤ１ドメインのみの発現を駆動する、４つのコンストラクトを設計した。本発明者らは、Ｋａｏらによって記載された２つのコンストラクトも調製した。これら２つのコンストラクトでは、３つのドメインＣｙｓＲ、ＦＮＩＩおよびＣＴＬＤ１が一緒に発現され（トリプルドメイン）、ＣｙｓＲとＦＮＩＩとの間またはＦＮＩＩとＣＴＬＤ１との間のリンカー領域のどちらかにトロンビンプロテアーゼ部位が挿入されている。ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＴＬＤ１のみの発現は極めて低く（データ省略）、Ｋａｏらによる過去のデータと合致した。他方、ＣｙｓＲドメインのみは、ＨＥＫ２９３細胞において、低いが有意なレベルで発現し、Ｆｒｅｓｑｕｅｔらによるデータと合致した。ＨＥＫ２９３細胞における２つの単一ドメインの弱い発現を回避するために、本発明者らはそれらを大腸菌中でＨＡタグ付きＤｓｂＣ融合タンパク質として生産し、可溶性の折りたたまれたＣｙｓＲタンパク質およびＣＴＬＤ１タンパク質を精製した。その場合、本発明者らは、非還元条件下でのウェスタンブロットにより、抗ＨＡ抗体で、容易にタンパク質を検出することができた。Ｋａｏらによる２つのコンストラクトについては、ＣｙｓＲとＦＮＩＩとの間にトロンビン部位を持つ第１コンストラクトだけが、ＨＥＫ２９３細胞中で十分に発現し、トロンビンによる切断前および切断後に、抗ＨＡで検出することができた。重要なことに、切断後に抗ＨＡで標識されたバンドは、切断されたＦＮＩＩ−ＣＴＬＤ１−ＨＡドメインに相当し、ＨＡタグを有しない切断されたＣｙｓＲドメインではなかった。要約すると、４つのコンストラクトを得て、それらを抗ＨＡ抗体によるウェスタンブロットで検証することができた。ＨＥＫ２９３細胞では、ＣｙｓＲドメインのみおよびＣｙｓＲ−ＦＮＩＩ−ＣＴＬＤ１トリプルドメインが発現し、大腸菌では、ＣｙｓＲドメインおよびＣＴＬＤ１ドメインが、単一ドメインとして発現した。次に本発明者らは、ＣｙｓＲプロファイルを持つ患者１からの血清、ならびにＣＴＬＤ１プロファイルを持つ患者２および患者３からの血清を、これらのコンストラクトに対して、ただしトリプルドメインはトロンビンで切断して、またはトロンビンで切断せずに、試験した。患者１からの血清は、ＣｙｓＲドメインを含むコンストラクトだけを、そしてそれが、ＤｓｂＣ融合タンパク質として単独で発現するか、トリプルドメインとして発現した場合（ただし、トロンビンによる切断後を除く）にのみ、またはＣｙｓＲ−ＨＡドメインを単独でロードした場合にのみ、認識することができた。実際には、ＣｙｓＲ−ＨＡドメインは、還元条件下では抗ＨＡ抗体で検出できたが、還元条件下では抗ＨＡ抗体で検出できなかったことから、ＣｙｓＲドメインには、単独では、本発明者らの条件下でウェスタンブロットＰＶＤＦメンブレンに適正に移行できるほど十分な疎水性がなく（同様の結果がニトロセルロースメンブレンでも観察された）、したがって患者の抗ＣｙｓＲ抗体では検出できないことが示唆される。他方、患者２および患者３からの血清は、ＤｓｂＣ融合タンパク質として単独で発現させた、またはトリプルドメインとして発現させた（この場合は、ＦＮ−ＣＴＬＤ１ドメインに関して、トロンビンで切断したもの、またはトロンビンで切断していないもの）、ＣＴＬＤ１ドメインとＣｙｓＲドメインとの両方を含むコンストラクトを認識することができた。興味深いことに、これら２つのドメインに対する相対的シグナルは異なっていた。これはおそらく、これら２つの患者血清における抗ＣｙｓＲ自己抗体と抗ＣＴＬＤ１自己抗体のそれぞれの力価が異なるからだろう。これらの結果を確認するために、本発明者らは、すべての抗原中に存在するＨＡタグを利用して、抗ＨＡ抗体で予めコーティングされたウェルにそれらをアフィニティー捕捉するＥＬＩＳＡを設定した。どの条件でも、抗ＨＡまたは抗原を省略した場合には、シグナルは得られなかった。このＥＬＩＳＡデータは、ウェスタンブロットと完全に一致しており、はるかに高感度かつ定量的であった。予想どおり、患者１は、ＣｙｓＲドメインおよびトロンビンで切断されていないＣｙｓＲ−ＦＮＩＩ−ＣＴＬＤ１トリプルドメインを認識したが、単独で発現されたＣＴＬＤ１ドメインと、トロンビンで効率よく切断されたＣｙｓＲ−ＦＮＩＩ−ＣＴＬＤ１トリプルドメイン（これは、実際には、抗ＨＡ被覆ウェルに結合することができず洗い流される遊離のＣｙｓＲドメインを生成し、一方、対応するＦＮＩＩ−ＣＴＬＤ１−ＨＡドメインはウェルに結合することになる）は、どちらも認識しなかった。本発明者らは、ウェスタンブロットから、患者２および患者３からの血清は、ＣｙｓＲドメイン中およびＣＴＬＤ１ドメイン中の異なるエピトープに対する２つの異なる自己抗体を有し、おそらく、患者２ではＣｙｓＲに対する力価の方が高く、患者３ではＣＴＬＤ１に対する力価の方が高いと推論した。この見解は、患者２ではＣＴＬＤ１よりＣｙｓＲでのシグナルの方が高く、かつトロンビン切断後のトリプルドメインではシグナルがなく、患者３では逆の結果であるというＥＬＩＳＡデータによって、明確に確認された。ＣｙｓＲまたはＣＴＬＤ１を標的とする２つの異なる自己抗体の存在をさらに明示するために、本発明者らは、ｉ）枯渇実験（ここでは、本発明者らは、患者２の血清（ＣｙｓＲ自己抗体およびＣＴＬＤ１自己抗体を含有する）を、ＣｙｓＲドメインまたはＣＴＬＤ１ドメインのどちらかがロードされた抗ＨＡビーズ上に予め吸収させ、フロースルー画分を、ここでもＣｙｓＲドメインおよびＣＴＬＤ１ドメインがロードされたウェスタンブロットにおいて、反応性について分析した）、およびｉｉ）競合実験（ここでは、本発明者らは、患者２の血清を、大腸菌からの過剰量のＣｙｓＲドメインまたはＣＴＬＤ１ドメインと共に、プレインキュベートしてから、ＣｙｓＲドメインおよびＣＴＬＤ１ドメインがロードされたウェスタンブロットにおいて、血清をプローブした）を行った。
【０１０９】
最後に、本発明者らは、大腸菌中で発現させたＣｙｓＲドメイン、ＣＴＬＤ１ドメインおよびＣＴＬＤ６−７ドメインを使って、完全長ＰＬＡ２Ｒ１に対する競合実験を、ＥＬＩＳＡによって行い、上記の結果と完全に一致するデータを観察した。ＣｙｓＲ抗原は、ＣｙｓＲプロファイルを持つ２人の患者の血清についてはＥＬＩＳＡシグナルを完全に遮断することができたが、ＣＴＬＤ１プロファイルを持つ他の２人の患者からの血清についてはＥＬＩＳＡシグナルを部分的にしか遮断できなかった。これと一致して、ＣＴＬＤ１抗原との競合は、ＣｙｓＲ血清についてはシグナルを阻害しなかったが、ＣＴＬＤ１血清のシグナルは部分的に阻害し、一方、それら２つの抗原の組合せは、ＰＬＡ２Ｒ１シグナルを完全に阻害した。最後に、ＣＴＬＤ６７の添加は、それだけでは効果がなかったことから、この抗原はＣｙｓＲドメインおよびＣＴＬＤ１ドメインを標的とする抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体の相互作用を妨害できないことが明示された。総合すると、この一連の実験は、一方はＣｙｓＲを認識し、他方はＣＴＬＤ１を認識する、２つの自己抗体の存在を明確に示している。これらの実験は、ＣｙｓＲドメインとＣＴＬＤ１ドメインが２つの異なる自己抗体によって独立して認識されうる相異なるエピトープを呈し、それら２つの自己抗体は異なる患者の血清には異なる力価で存在することも、極めて明確に示している。本発明者らは、以前に記載されたＳＮＰの４つの可能な組合せを持つＤｓｂＣ−ＨＡ−ＣＴＬＤ１ドメインも生産したが、ＣＴＬＤ１プロファイルまたはＣＴＬＤ７プロファイルのどちらか一方を持つ２人の患者からの血清ではシグナルに相違は観察されなかった。本発明者らは、非還元条件下でのウェスタンブロットとの対比で還元条件下でのウェスタンブロットも行った。本発明者らは、ＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ１に対する抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体の反応性が、これらのドメイン中に存在するジスルフィド結合に依存することを明示する。
【０１１０】
ＣＴＬＤ７は抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体によって認識される第３のエピトープを含む
ＰＬＡ２Ｒ１細胞外領域中の第３の、より遠位にあるエピトープを示唆する初期の結果を確認するために、そしてまた、このエピトープがＰＬＡ２Ｒ１の他のドメインとは独立していることを明示するために、本発明者らは、ＣｙｓＲドメイン、ＦＮＩＩドメインおよびＣＴＬＤ１ドメインから切り離された一連の可溶型ＰＬＡ２Ｒ１を設計した。本発明者らは、ＣＴＬＤ７に収れんする合計８つのコンストラクト、すなわちＣＴＬＤ２〜ＣＴＬＤ８（Ｃ２Ｃ８）、ＣＴＬＤ２〜ＣＴＬＤ６（Ｃ２Ｃ６）、ＣＴＬＤ６〜ＣＴＬＤ８（Ｃ６Ｃ８）、ＣＴＬＤ６〜ＣＴＬＤ７（Ｃ６Ｃ７）、ＣＴＬＤ６（Ｃ６）、ＣＴＬＤ７（Ｃ７）、ＣＴＬＤ７〜ＣＴＬＤ８（Ｃ７Ｃ８）、そして最後にＣＴＬＤ８（Ｃ８）を調製した。これらのコンストラクトはいずれもＨＡタグを有し、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞におけるそれらの発現を、還元条件下での抗ＨＡ抗体によるウェスタンブロットによって確認することができた。しかし非還元条件下での抗ＨＡによる検出は、とりわけＣＴＬＤ７に絞り込んだ短い可溶型の場合は、より困難であった。それはおそらく、ＣＴＬＤ７およびその隣接ドメインの極性が高く（おそらくは可溶型の移動度から証明されるように高度のグリコシル化による）、非還元条件下では十分に移行しないからであろう（示さず）。この見解は、おそらく、ＣＴＬＤ７プロファイルを有する患者４は、Ｃ２Ｃ８可溶型およびＣ６Ｃ８可溶型を認識することができたが、それより短いコンストラクトは認識することができなかったという事実の説明になる。それでもなお、この患者が、ＣｙｓＲドメインとＣＴＬＤ１ドメインとを欠くＣ２Ｃ８およびＣ６Ｃ８を認識するという事実は、Ｃ６Ｃ８が、ＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ１に依存しない第３の抗ＰＬＡ２Ｒ１エピトープを含んでいることを明確に示している。この移行の問題を克服するために、本発明者らは、ＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ１について上で行ったような抗ＨＡ  ＥＬＩＳＡアッセイを使って、さまざまな可溶性コンストラクトをプローブした。本発明者らは、ＣＴＬＤ７ドメインを含むコンストラクトは、ＣＴＬＤ７だけを含むコンストラクトでさえ、ＣＴＬＤ７プロファイルを持つ患者４および患者５からの血清によって十分に認識されることを観察した。陰性対照として、本発明者らは、予想どおりどのコンストラクトも認識しない患者１からの血清を使用した。総合すると、これらのデータは、ＣＴＬＤ７中に第３の独立したエピトープが存在し、対応する自己抗体はＣＴＬＤ７プロファイルを持つ患者からの血清中にのみ存在することを明示している。ＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ１に関する上記と同様に、本発明者らは、非還元条件下でのウェスタンブロットとの対比で還元条件下でのウェスタンブロットを行った。本発明者らは、ＣＴＬＤ７に対する抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体の反応性がこのドメイン中に存在するジスルフィド結合に依存することを明示する。
【０１１１】
ＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７を抗原とする３つの特異的ＥＬＩＳＡの設定
上記の結果に基づいて、本発明者らは、ＣｙｓＲドメイン、ＣＴＬＤ１ドメインおよびＣＴＬＤ７ドメインを標的とする自己抗体を特異的に測定するために、３つのＥＬＩＳＡを設定した。本発明者らは、抗原として、ＨＥＫ２９３細胞中で生産されたＣｙｓＲドメイン、大腸菌中で生産されたＣＴＬＤ１ドメイン、そしてＣＴＬＤ６−７はＣＴＬＤ７単独よりも大量に生産することが容易であったのでＨＥＫ２９３細胞中で生産されたＣＴＬＤ６−７を使用した。上記のように、ＨＥＫ細胞中で生産された２つの抗原ドメインは、抗ＨＡ抗体で予めコーティングされているＥＬＩＳＡプレートにＨＡアフィニティー捕捉し、一方、大腸菌からのＣＴＬＤ１ドメインは、直接コーティングするか、抗ＨＡで捕捉した。次に、吸着させた抗原を患者の血清と共にインキュベートしてから、ペルオキシダーゼとカップリングされた二次抗ＩｇＧ４抗体による検出を行った。本発明者らは、６９人のＰＬＡ２Ｒ１陽性ｉＭＮ患者のコホート（下記表１）と２０人の健常ドナーとを使って、３つのＥＬＩＳＡを検証し、エピトープ特異的力価を測定した。６９人のｉＭＮ患者のコホートは、５０人の血清スクリーニング症例と１９人の追加症例とを含んだ。
【０１１２】
【表１】
2018524585.tif 000002
【０１１３】
患者は全員、臨床的に詳しく特徴づけられ、完全長ＰＬＡ２Ｒ１を抗原として使用するＥＬＩＳＡで抗ＰＬＡ２Ｒ１に関して陽性であった（表１）。大半の患者は、診断時に、ネフローゼ域のタンパク尿（３．５ｇ／ｇを上回る尿タンパク質／クレアチニン比（ＵＡＣＲ））を有し（７４％）、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによるＰＬＡ２Ｒ１アッセイの時点で、免疫抑制処置を受けたことがなかった（９１％）。患者はＰＬＡ２Ｒ１アッセイから３６ヶ月の平均経過観察期間を有した。すべての患者が対症処置を受けた。１８人の患者はＲＡＳ遮断下で寛解に入った。３６人の患者は免疫抑制処置を受け、２１人が寛解に入った。本発明者らは、患者の腎アウトカムを分析し、ＫＤＩＧＯに従って不良な腎予後を、最終観察繰越（ＬＯＣＦ：ｌａｓｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｃａｒｒｉｅｄ  ｆｏｒｗａｒｄ）時のＵＡＣＲ＞４．０ｇ／ｇおよび／または３０％を上回る血清中クレアチニンの増加および／または推定糸球体濾過量（簡易ＭＤＲＤ式を使ったｅＧＦＲ）＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２の存在と定義した。１２人の末期腎臓病（ＥＳＫＤ：ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）患者を含めて、３１人の患者は、経過観察の最後に不良な腎アウトカムを有した。本発明者らは、抗ＰＬＡ２Ｒ１アッセイの２４ヶ月後の腎生存も分析し、ベースラインからの３０％を上回る血清中クレアチニンの増加によって、イベントを定義した（表１）。
【０１１４】
１つを除いてすべての血清（ｎ＝６８）が、ＥＬＩＳＡによってＣｙｓＲドメインを認識した。４２の血清がＣＴＬＤ１ドメインを認識し、３２の血清がＣＴＬＤ７ドメインを認識した。次に本発明者らは、患者を、それぞれのＥＬＩＳＡパターンに基づいて、３つの群に分類した。
【０１１５】
２３人の患者は、ＣｙｓＲドメインを標的とする抗体だけを有するので、「ＣｙｓＲ群」と呼ばれる群に分類された。
【０１１６】
１４人の患者は「ＣｙｓＲＣ１群」と呼ばれる群に分類され、そのうちの１３人は、ＣｙｓＲドメインとＣＴＬＤ１ドメインとの両方に対して活性を有し、１人はＣＴＬＤ１に対する抗体だけを有した。
【０１１７】
最後に３２人の患者は「ＣｙｓＲＣ１Ｃ７群」と呼ばれる群に分類され、そのうちの２８人は３つのドメインＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７を標的とする抗体を有し、４人の患者はＣｙｓＲ、ＣＴＬＤ７を標的とするが、ＣＴＬＤ１は標的としなかった。
【０１１８】
ウェスタンブロットによって最初にスクリーニングされた５０人の患者を検討する際に、本発明者らは、ＥＬＩＳＡデータとそれらのウェスタンブロットエピトーププロファイルとの間に、完全な一致を観察した。最後に、本発明者らは、ＣｙｓＲＣ１群およびＣｙｓＲＣ１Ｃ７群では、ＣｙｓＲ群の場合と比較して、ＣｙｓＲ力価が有意に高いことを観察した。一方、ＣｙｓＲＣ１群とＣｙｓＲＣ１Ｃ７群との間にＣＴＬＤ１力価の差は観察されなかった。
【０１１９】
３つのエピトーププロファイルを持つ患者の臨床的特徴
本発明者らは、３つの群、すなわちＣｙｓＲ、ＣｙｓＲＣ１およびＣｙｓＲＣ１Ｃ７の患者の臨床的特徴を比較した（表２）。
【０１２０】
【表２】
2018524585.tif 000003
【０１２１】
３群の間で、性別、免疫抑制処置を受けている患者の数、および完全長ＰＬＡ２Ｒ１を用いるＥＬＩＳＡによって測定される抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体の力価に、統計的有意差はなかった。対照的に、本発明者らは年齢については有意差を観察し、ＣｙｓＲ群の患者はＣｙｓＲＣ１群およびＣｙｓＲＣ１Ｃ７群の患者より有意に若かった（ｐ＝０．００８；通常の一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用）。診察時の平均年齢は、ＣｙｓＲ群では４８歳、ＣｙｓＲＣ１群では５４歳、ＣｙｓＲＣ１Ｃ７群では６１歳であった。
【０１２２】
ＰＬＡ２Ｒ１検査時のタンパク尿は、ＣｙｓＲ群では有意に低かった（表２、ｐ＝０．０１８；クラスカル・ウォリス検定を使用）。次に本発明者らは、血清試料採取時の患者のＵＡＣＲに基づいて、患者を３つのサブグループ、３ｇ／ｇ未満（ｎ＝２２）、３〜５ｇ／ｇ（ｎ＝２２）および５ｇ／ｇ超（ｎ＝２５）に分類し、完全長ＰＬＡ２Ｒ１抗原、ＣｙｓＲ抗原、ＣＴＬＤ１抗原およびＣＴＬＤ７抗原を使って測定されるそれらのＥＬＩＳＡ力価を比較した。５ｇ／ｇ超のＵＡＣＲを持つ群では、他の２つの群と比較して、抗ＣＴＬＤ７力価だけが有意に高かった（クラスカル・ウォリス検定を使用してｐ＝０．００６）。さらにまた本発明者らは、タンパク尿の増加に伴うＣＴＬＤ７力価の漸進的増加も観察した。
【０１２３】
３つのエピトープ群における患者の進展
本発明者らのコホートでは、すべての患者がＲＡＳ遮断および／または利尿薬による対症処置を受け、４１人の患者は免疫抑制処置を受けた（５９％）。免疫抑制処置の使用およびメジアン経過観察期間は３つのエピトープ群の間で差がなかった（それぞれ、カイ二乗検定を使ってｎ＝０．６、クラスカル・ウォリス検定を使ってｐ＝０．２４）。
【０１２４】
ＣｙｓＲ群（ｎ＝２３）では、免疫抑制処置を受けた１２人の患者のうち、１０人が、４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２超のｅＧＦＲを伴う４ｇ／ｇ未満のＵＡＣＲによって定義される寛解を達成し、２人だけが経過観察の最後に不良な腎予後（ＵＡＣＲ＞４ｇ／ｇまたはｅＧＦＲ＜４５ｍｌ／分（ｍｎ）／１．７３ｍ２）を有した。免疫抑制処置を何も受けなかった１１人の患者のうち、１０人は寛解に入り、診察時に既に顕著な腎不全を有していた１人の患者はＬＯＣＦ時に不良な予後を有した。
【０１２５】
ＣｙｓＲＣ１群（ｎ＝１４）では、免疫抑制処置を受けた８人の患者のうち、３人が寛解に入り、５人は不良な腎予後を呈した（１人の患者はＥＳＫＤを発症した）。免疫抑制処置を何も受けなかった６人の患者のうち、４人は寛解に達し、２人は不良な腎予後を有した（１人の患者はＥＳＫＤに入った）。この群では患者の５０％が不良な腎予後を有した。
【０１２６】
ＣｙｓＲＣ１Ｃ７群（ｎ＝３２）では、免疫抑制処置を受けた２１人の患者のうち、８人が寛解を達成し（３８％）、７人のＥＳＫＤ患者を含む１３人がＬＯＣＦ時に不良な腎予後を有した。免疫抑制処置を受けなかった１１人の患者のうち、７人は診察時に既に腎不全を有し、４人は自然寛解に入った。
【０１２７】
本発明者らは、ＣｙｓＲ群において、より多くの自然寛解を観察した（カイ二乗検定を使ってｐ＝０．０３）。ＥＳＫＤは、ＣＴＬＤ１群およびＣＴＬＤ７群ではそれぞれ２人および１０人の患者に発症したが、ＣｙｓＲ群の患者には発症しなかった（カイ二乗検定を使ってｐ＝０．０１）。
【０１２８】
最後に、２年間の経過観察後にベースラインから３０％を上回る血清中クレアチニンの増加がない生存曲線分析は、ＣｙｓＲＣ１群およびＣｙｓＲＣ１Ｃ７群の患者ではＣｙｓＲ群と比較して、腎不全進行の際立った増加を示した（ログ・ランク検定を使ってｐ＝０．００２５）。また、腎不全進行は、ＣｙｓＲプロファイルを持つ患者では、免疫抑制処置を受けた患者３３人のサブグループにおいて有意に遅かった（ログ・ランク検定を使ってｐ＝０．０１４）。
【０１２９】
予後因子の同定
表３に要約するように、患者を、寛解群（ｎ＝３８）と、ＫＤＩＧＯガイドライン（ＵＡＣＲ＞４ｇ／ｇまたはｅＧＦＲ＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ２）に従って、経過観察の最後に不良な腎予後群（ｎ＝３１）とに分割した。
【０１３０】
【表３】
2018524585.tif 000004
【０１３１】
組み入れの時点において２つの群間で、年齢、診断時のタンパク尿、平均経過観察期間および免疫抑制治療を受けた患者のパーセンテージに、有意差はなかった。他の試験において記載されているとおり、年齢および診断時の血清中クレアチニンレベルは、寛解に達しなかった群の方が高かった（対応のないｔ検定およびマン・ホイットニー検定を使ってそれぞれｐ＝０．０００６およびｐ＝０．０００２）。完全長ＰＬＡ２Ｒ１特異的アッセイ、ＣｙｓＲ特異的アッセイ、ＣＴＬＤ１特異的アッセイおよびＣＴＬＤ７特異的アッセイに関するＥＬＩＳＡ力価はいずれも、不良な腎予後を持つ群の方が有意に高く、ＣＴＬＤ１特異的アッセイおよびＣＴＬＤ７特異的アッセイについては特にそうであった（それぞれｐ＝０．０４、ｐ＝０．０３、ｐ＝０．００３およびｐ＜０．０００１；マン・ホイットニー検定）。多重Ｃｏｘ回帰分析では、ＣｙｓＲＣ１群およびＣｙｓＲＣ１Ｃ７群ならびに完全長ＰＬＡ２Ｒ１での高力価が、不良な腎予後の独立リスク因子として同定された。このように、エピトーププロファイリングは、以後の腎イベントの発生に関する予後因子である。
【０１３２】
経過観察中のエピトープスプレッディング
また、本発明者らには、経過観察中に血清を入手することができる患者が１６人いた。本発明者らは、疾患経過中のＰＬＡ２Ｒ１エピトーププロファイルの転換について調査した。９人の患者は、経過観察中は安定したエピトーププロファイルを有し、免疫抑制処置または対症処置後に抗ＣｙｓＲ限定的活性が安定しているか減少して寛解に入った５人を含めて、疾患活動度も安定していた。患者９は腎臓移植後、シクロスポリン処置の下で、１４年間にわたって寛解状態を保っていたが、完全長ＰＬＡ２Ｒ１で測定されるＥＬＩＳＡ力価は高かった。この患者はＣｙｓＲに対する活性だけを有し、分子内スプレッディングを伴わなかった。１９９７年５月および２０１１年５月の２回の生検により、再発時および１４年後における免疫沈着物の存在が確認された。２人の患者は安定なＣＴＬＤ１プロファイルを有し、活動性疾患を伴った。２人の患者は安定なＣＴＬＤ７エピトーププロファイルを有し、活動性疾患状態にあった。
【０１３３】
４人の患者は、疾患活動度の変化に伴って、それぞれのエピトーププロファイルを転換させた。ＣｙｓＲＣ１Ｃ７群の患者の１人はＣｙｓＲ群へと転換し、免疫抑制処置下で寛解に入った。逆に、２人の患者はＣｙｓＲ群からＣｙｓＲＣ１群およびＣｙｓＲＣ１Ｃ７群へと転換して、腎炎性タンパク尿を伴って再燃し、最後の患者はＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ７に対する陽性を有して活動性疾患を伴い、２年後にはＣＴＬＤ１に対しても陽性になって、タンパク尿が増加した。
【０１３４】
最後に、３人の患者は、各ドメインに対する３つの抗体すべての漸進的減少を呈し、寛解に入った。
【０１３５】
ＩｇＧサブクラス
ｉＭＮの病理発生にはＩｇＧ４および抗ＰＬＡ２Ｒ１  ＩｇＧ４がより目だった役割を果たすという多くの証拠があるので、上記のエピトープ研究はいずれもＩｇＧ４  抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体を測定するように計画された。この見解を確認するために、本発明者らは、３つのエピトープ群から選択された患者からの血清の反応性を、ＰＬＡ２Ｒ１の欠失突然変異体でのウェスタンブロットにより、ならびにＣｙｓＲ抗原、ＣＴＬＤ１抗原およびＣＴＬＤ７抗原でのＥＬＩＳＡにより、異なるＩｇＧサブクラス（１、２、３および４）およびトータルＩｇＧを検出することで、比較した。本発明者らは、自らの結果を確かめるために、精製ＩｇＧを使ってＩｇＧサブクラス検出の特異性を検証し、次に、すべてのＩｇＧを同時に検出するウェスタンブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡを行った。本発明者らは、抗ＰＬＡ２Ｒ１  ＩｇＧ４抗体に加えて、一部の患者に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３  抗ＣｙｓＲおよび抗ＣＴＬＤ１自己抗体の存在を観察した。しかし本発明者らがＩｇＧ４とは異なる抗ＣＴＬＤ７自己抗体を観察することはなかった。最後に、ウェスタンブロットによりトータルＩｇＧで観察されたパターンは、ＩｇＧ４のそれと極めて類似していた。総合すると、これらの結果は、抗ＰＬＡ２Ｒ１  ＩｇＧ４を検出するという選択肢がおそらく最も強力であったこと、そしてもし本発明者らがトータルＩｇＧによる検出を選んでいたとしても、患者のエピトープ分類にはたぶん変化がなかったことを示している。
【０１３６】
考察
本発明者らは、ｉＭＮ疾患を持つ６９人の患者をスクリーニングして、ＰＬＡ２Ｒ１の３つのドメイン：Ｃｙｓ−Ｒ、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に、エピトープを同定した。興味深いことに、ｉＭＮに関連するいくつかの一般的な遺伝子変異体は、これらのドメイン中に、その位置が特定されている。本発明者らの結果は、それぞれＣｙｓＲ−ＣＴＬＤ１領域およびＣｙｓＲのみにエピトープを同定したＫａｏらおよびＦｒｅｓｑｕｅｔらによる結果を、さらに拡張するものである。データは、ＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ１が相異なる抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体によって認識される２つの独立したドメインであることを、明らかに示している。ＣＴＬＤ７をさらなるドメインとして同定できたこと、そして２つの別個のエピトープとしてＣｙｓＲおよびＣＴＬＤ１をより明確に同定できたことは、おそらく、本発明者らが、異なるフルセットのＰＬＡ２Ｒ１欠失突然変異体を作成すると共に、トータルＩｇＧよりも高感度なＩｇＧ４検出で、多数の患者をスクリーニングしたという事実によるのだろう。実際、２つの過去の研究は、非常に限られた数の患者しか使用しなかったか、５人の患者の血清のプールを使用した後、より多くの患者で競合アッセイを行った。さらにまた、血清が活動性疾患を持つ患者から収集されたのか、寛解中の患者から収集されたのかも、不明であった。
【０１３７】
次に、本発明者らは、血清試料採取時のＣｙｓＲに対する抗ＰＬＡ２Ｒ１反応性は好ましいアウトカムと関連し、一方、ＣＴＬＤ１およびＣＴＬＤ７に対する反応性は活動性疾患および不良な腎予後と関連することを観察した。さらにまた、本発明者らは、エピトーププロファイルが経過観察中に変化しうることを明らかにした。抗ＣＴＬＤ１抗体および抗ＣＴＬＤ７抗体は、疾患の寛解と共に消失し、疾患の再燃と共に再び出現した。一方、抗ＣｙｓＲ限定的活性は安定した軽度の疾患活動度と関連した。重要なことに、完全長ＰＬＡ２Ｒ１を使ったＥＬＩＳＡによって測定した場合、すべての患者が依然として抗ＰＬＡ２Ｒ１活性を有していた（表１）。これらの知見は、疾患活動度のレベルと抗ＰＬＡ２Ｒ１価との間に観察された矛盾の説明になりうる。
【０１３８】
これらの知見から、本発明者らは、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体は軽症候性ｉＭＮ疾患を伴ってまずＮ末のＣｙｓＲドメインに対して産生されるのだろうという仮説を立てた。ＣｙｓＲ群の患者は他の群より若いことから、これらの患者はおそらく疾患の初期にあることが示唆される。次に、２回目の免疫負荷（アレルギー、感染．．．）が、ＰＬＡ２Ｒ１においてＣ末端（ＣＴＬＤ１またはＣＴＬＤ７）に向かう分子内スプレッディングを誘発して、より活動性の高い疾患をもたらすのかもしれない。エピトープスプレッディングは、最初の非交差反応性抗原部位から、同じ分子または異なる分子内の新しいエピトープが、Ｔ細胞またはＢ細胞によって次第に認識されるようになる現象である。ヒト抗糸球体基底膜抗体病、尋常性天疱瘡、関節リウマチ、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、多発性硬化症、１型糖尿病およびヘイマン腎炎などといった多くの自己免疫疾患において記載されているように、分子内エピトープスプレッディングは疾患の悪化と関連する。そのうえ、分子内エピトープスプレッディングはｉＭＮの寛解および再燃も調整しうる。ＥＡＥにおいて記載されているように、エピトープスプレッディングは、マウスにおける疾患進行に大きな役割を果たし、短期間の共刺激遮断はＴ細胞応答の開始を特異的に阻害して、エピトープスプレッディングおよび疾患の悪化を防止することができる。
【０１３９】
結論として、上記の結果は、３つのＰＬＡ２Ｒ１ドメインが抗ＰＬＡ２Ｒ１結合に関与しており、そのうちの２つは活動性ｉＭＮとより密接に関連していて、おそらくはエピトープスプレッディングの機構によって関連づけられることを示している。
【０１４０】
実施例２：ｉＭＮを患っている患者のアウトカムを評価するためのマウスＰＬＡ２Ｒ１の使用
本発明者らは、マウスＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡを使った抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体のサブセットの特異的検出が、長期臨床アウトカムを予測できることを明らかにした。この目的のために、本発明者らは、まず、最初の血清試料分析時に、ｈＰＬＡ２Ｒ１（ヒト）ＥＬＩＳＡ、ｒｂＰＬＡ２Ｒ１（ウサギ）ＥＬＩＳＡおよびｍＰＬＡ２Ｒ１（マウス）ＥＬＩＳＡによって、４１人のｉＭＮ患者におけるＩｇＧ４抗ＰＬＡ２Ｒ１価を対照と対比して測定した。本発明者らは、４１のｉＭＮ血清すべての交差反応性を、最初の血清試料採取時に、３つのＰＬＡ２Ｒ１オルソログに対して、まずはＷＢによって、次に抗原特異的ＥＬＩＳＡを使って、調べた。ＷＢ分析においてｈＰＬＡ２Ｒ１を認識した血清はすべてが、ｒｂＰＬＡ２Ｒ１も認識したが、ｍＰＬＡ２Ｒ１には、４１人中２６人の患者しか反応しなかった。
【０１４１】
これらの結果を確認すると共に、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体のレベルを定量的に決定するために、本発明者らは、同じ血清をオルソログ特異的ＥＬＩＳＡで測定した。この目標に向けて、本発明者らは、ｒｂＰＬＡ２Ｒ１およびｈＰＬＡ２Ｒ１の場合と同様に、完全長細胞外ドメインを含む組換え可溶型ｍＰＬＡ２Ｒ１を使って、ｍＰＬＡ２Ｒ１用に別のＥＬＩＳＡを設定した。こうして本発明者らは、この組換え型ｍＰＬＡ２Ｒ１をＷＢおよびｓＰＬＡ２結合アッセイによって検証した。
【０１４２】
ｈＰＬＡ２Ｒ１およびｒｂＰＬＡ２Ｒ１の場合と同様に、ｍＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡはｉＭＮ患者に特異的であり、他の疾患または健常対照を認識しなかった。４１のｉＭＮ血清はすべてｈＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡおよびｒｂＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡにおいて反応したが、ｍＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡにおいて活性を有するのは、そのうちの３２（７８％）だけだった。さらにまた、ｈＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡおよびｒｂＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡとは対照的に、ｍＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡでは、ほんのわずかなｉＭＮ血清しか高い力価を与えなかった。
【０１４３】
次に、本発明者らは、最初の血清試料採取時の年齢、性別、タンパク尿、血清中クレアチニン、免疫抑制処置ならびにヒト、ウサギおよびマウスＰＬＡ２Ｒ１抗体価と、患者の臨床アウトカム、すなわち予後不良の患者対寛解状態にある患者との間の関連を分析した。抗ｍＰＬＡ２Ｒ１活性だけが、一変量分析（ｐ＝０．００７）でも多変量分析（ｐ＝０．００９）でも、持続的活動性疾患と有意に関連した。ｍＰＬＡ２Ｒ１  ＥＬＩＳＡ力価のＲＯＣ曲線分析により６０５ＲＵ／ｍＬの閾が規定され、これより上では１００％の患者（１２患者）が不良な予後を有した（特異度１００％、感度５７％、ＡＵＣ０．７６、ｐ＝０．００４、９５％ＩＣ０．６０〜０．９１）。
【０１４４】
したがって、カプラン・マイヤー法による腎アウトカムの分析は、抗ｍＰＬＡ２Ｒ１抗体の力価が高い患者は不良な腎アウトカムを有することを示した。実際、６０５ＲＵ／ｍＬを上回る抗ｍＰＬＡ２Ｒ１抗体価を持つ患者（ｎ＝１２）は、６０５ＲＵ／ｍＬ未満の抗ｍＰＬＡ２Ｒ１抗体価を持つ患者（ｎ＝２９）より早い血清中クレアチニンの倍加速度を有した（ログ・ランク検定を使ってｐ＜０．００１）。ＲＯＣ曲線は、ｈＰＬＡ２Ｒ１抗体価およびｒｂＰＬＡ２Ｒ１抗体価についてそのような閾を同定することができず、高い抗ｈＰＬＡ２Ｒ１価または抗ｒｂＰＬＡ２Ｒ１価を持つ患者１２人の対応するサブグループは、残りの患者と比較して統計的に有意な不良な腎アウトカムを有しなかった（それぞれｐ＝０．８８およびｐ＝０．２１）。
【０１４５】
これらの結果は、ｒｂＰＬＡ２Ｒ１が活動性疾患における抗ＰＬＡ２Ｒ１を測定するためのｈＰＬＡ２Ｒ１の代替抗原であるのに対し、ｍＰＬＡ２Ｒ１は、不良な予後のリスクがあるｉＭＮ患者にのみ高レベル（＞６０５ＲＵ／ｍＬ）で存在する抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体のサブセットを検出することができるユニークな抗原であり、それゆえにｉＭＮアウトカムを予測するのに有用であることを示している。
【国際調査報告】
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2018524585.tif 000007
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