(57)【要約】  酵母細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の破壊のための遺伝子カセットであって、（ｄ）マーカ遺伝子として使用することができるＵＲＡ３遺伝子；（ｅ）少なくとも１つの遺伝子破壊補助（gene disruption auxiliary：ｇｄａ）配列；および（ｆ）当該標的遺伝子の上流および下流配列を含み、当該ｇｄａ配列が、少なくとも３００ｂｐから６００ｂｐの長さであり、ならびに配列番号３９のヌクレオチド配列内から選択される、遺伝子カセットを提供する。
2018537109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の破壊のための遺伝子カセットであって、
（ａ）マーカ遺伝子として使用することができるＵＲＡ３遺伝子；
（ｂ）少なくとも１つの遺伝子破壊補助（gene disruption auxiliary：ｇｄａ）配列；および
（ｃ）該標的遺伝子の上流および下流配列、
を含み、
該ｇｄａ配列が、少なくとも３００ｂｐから６００ｂｐの長さであり、ならびに配列番号３９のヌクレオチド配列およびその変異体内から選択される、
遺伝子カセット。
【請求項２】
（ｂ）前記ｇｄａ配列が、３００ｂｐから５００ｂｐの長さである、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項３】
（ｂ）前記ｇｄａ配列が、配列番号４０のヌクレオチド配列内から選択される、請求項２に記載の遺伝子カセット。
【請求項４】
（ｂ）前記ｇｄａ配列が、配列番号４１のヌクレオチド配列内から選択される、請求項２に記載の遺伝子カセット。
【請求項５】
（ｂ）前記ｇｄａ配列が、配列番号４２のヌクレオチド配列内から選択される、請求項２に記載の遺伝子カセット。
【請求項６】
（ｂ）前記ｇｄａ配列が、配列番号４３のヌクレオチド配列内から選択される、請求項２に記載の遺伝子カセット。
【請求項７】
（ｂ）前記ｇｄａ配列が、配列番号１６、１４、１８、２１、および２４からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列である、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項８】
前記酵母細胞が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ・クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、クルイベレイ・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｅｉ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項９】
前記酵母細胞が、ウラシル栄養要求性Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）である、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項１０】
（ａ）前記ＵＲＡ３遺伝子が、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項１１】
（ｃ）前記標的遺伝子の前記上流および下流配列の長さが、それぞれ、≧５０ｂｐである、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項１２】
少なくとも１種の酵母細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、該酵母細胞を、請求項１に記載の遺伝子カセットを含む少なくとも１種のベクタで形質転換する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記酵母細胞が、ウラシル栄養要求性Ｃ．トロピカリスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｇｄａ配列が、配列番号１６、１４、１８、２１、および２４からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の遺伝子カセットを含む、遺伝子組換え酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種の酵母細胞での標的遺伝子の破壊における使用のための遺伝子カセットに関する。特に、当該遺伝子マーカは、再利用可能な選択マーカと、少なくとも１つの標的遺伝子の発現を阻害するために使用することができる少なくとも１つのさらなる破壊配列とを含み得る。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、特定の化合物および／または組成物を製造するための遺伝子工学の世界において、酵母の使用は周知である。特に、酵母株は、遺伝子を組み換えることによって特定の遺伝子の発現を阻害することができ、結果として、これらの遺伝子組換えされた株を、所望の化合物および／または組成物の製造において役立たせることができる。酵母株の改変は、様々な特性または改良された特性を有する酵母を得ることを可能にし、それらは、多くの可能な用途、中でも、パン製造、食品産業、健康、例えばアルコールなどの化合物の製造、酵母抽出物の製造など、において使用することができる。
【０００３】
例えば、出芽酵母（S.cerevisiae）などのいくつかの酵母種は、ヘキソース糖を、細菌によって典型的に産生される産生物の混合物よりもむしろ、エタノールへと支配的に発酵させることが知られている。いくつかの酵母は、それらを様々なタイプの発酵プロセスのための良好な候補にする他の特徴、例えば、低ｐＨ環境に対する耐性、酢酸およびフルフラールなどのある特定の発酵副産物に対する耐性、ならびにエタノール自体に対する耐性など、を有する。したがって、酵母細胞は、遺伝子操作の良好な標的となり、結果として、所望の特徴を有する遺伝子組換え細胞を生じる。
【０００４】
別の例において、Ｃ．トロピカリス（C.tropicalis）は、発酵産業においてますます使用されている。例えば、Ｃ．トロピカリスは、ω酸化経路の高効率の細胞内β酸化成分によって、唯一の炭素源およびエネルギー源としてアルカンおよび脂肪酸を使用して、長鎖ジカルボン酸（ＤＣＡ）を製造するために使用することができる。これらのＤＣＡは、化学産業および製薬産業における広範な用途において使用される。現在、Ｃ．トロピカリスは、二酸を製造するために最も一般的に使用される菌株である。Ｃ．トロピカリスは、キシリトール生産においても一般的に使用される。Ｃ．トロピカリスはさらに、環境保護の分野、特に産業および農業廃水の生物学的処理において多くの利点を示し、容易に生体分解可能な有機液体廃棄物を破壊する能力を示すだけでなく、同時に、単細胞タンパク質を産生し、環境汚染を減じ、ならびに有価物を産生することによって廃棄物を有益に変えることが見出されている。しかしながら、２倍体酵母であるＣ．トロピカリスは、有性生殖段階を有さず、無性のみにおいて繁殖する。Ｃ．トロピカリスは、多くの他の生理学的特性を有しており、その点において出芽酵母とは異なっており、したがって、Ｃ．トロピカリスの遺伝子操作は、はるかに複雑である。特に、Ｃ．トロピカリスに関与する代謝ネットワークは、非常に複雑であり、工業的生産におけるその直接的な適用には多くの欠点が存在する。この理由から、Ｃ．トロピカリスの代謝工学による菌株改良の新規の方法が出現している（Ｈａａｓ  Ｌ，Ｃｒｅｇｇ  Ｊら、１９９０）。この形質転換システムを使用して、Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏらは、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子の連続した破壊を実施することにより、β酸化経路が遮断された菌株を作製して、連続遺伝子破壊システムを確立した（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏ  Ｓ，Ｄｅａｎｄａ  Ｋら  １９９１）。ＵＲＡ３マーカを再利用するために、彼らは、自然突然変異をスクリーニングし、または導入されたＵＲＡ３遺伝子を破壊するために分子法を使用した。その一方で、Ｇａｏ  Ｈｏｎｇらは、単一コピーＣＡＴ遺伝子の破壊に対するハイグロマイシンＢの耐性を使用することに基づいて、第２の選択マーカとしてＧ４１８耐性を使用して、対応する破壊カセットを構築し、ＣＡＴ遺伝子二重コピー破壊を達成した（Ｇａｏ  Ｈｏｎｇ，２００５）。しかしながら、いくつかの菌株は抗生物質にあまり影響されないため、依然として、Ｃ．トロピカリスにおいて選択マーカとして抗生物質耐性を使用することに関連する多くの問題が存在しており、結果として、これは、遺伝子の形質転換および分子改良に制限を課している。さらに、Ｃ．トロピカリスは、セリンのようにＣＴＧコドン（通常、ロイシンとして翻訳される）を翻訳する特徴的特性を有しており、これは、さらに、外因性耐性遺伝子を使用する難しさを増加させている。さらに、多くの場合、多重コピー破壊を完了するために、２倍体酵母の遺伝子破壊において多重耐性マーカが必要であり、これは、さらに、耐性マーカの使用を制限する。これら、またはさらなる理由から、Ｃ．トロピカリスの遺伝子操作は、複雑であることが知られている。
【０００５】
Ａｌａｎｉら（Ａｌａｎｉ  Ｅ，Ｃａｏ  Ｌら  １９８７）のｕｒａブラスタ連続遺伝子破壊システムでは、ｈｉｓＧ配列が、ＵＲＡ３遺伝子のそれぞれの側に同じ方向において挿入され、これが、遺伝子破壊カセット全体をあまりに大きくするため、結果として、ＰＣＲによって当該破壊カセット全体を効果的に増幅することが非常に困難である（Ｒ．Ｂｒｙｃｅ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄａｎａ  Ｄａｖｉｓら  ２０００）。
【０００６】
酵母細胞を遺伝子組換えするための現在利用可能な方法における効率および簡素さの欠如は、遺伝子組換えされた酵母細胞を作製するプロセスを複雑にしている。したがって、依然として、より速く、実施が容易で、ならびに所望の改良を有する酵母菌株のより効率的な選択を可能にする、改良された酵母の菌株を得るための新規の方法を提供することが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の説明
本発明は、酵母細胞において標的遺伝子を破壊する手段を提供することにより、上記の問題を解決することを試みている。特に、酵母細胞を破壊する当該手段は、マーカ遺伝子、上流および下流配列を含む当該マーカ遺伝子の短鎖ＤＮＡ断片、ならびに当該標的遺伝子の上流および下流配列を含む、ヌクレオチド配列を含む。中でも特に、当該マーカ遺伝子は、ＵＲＡ３遺伝子であり得、当該マーカ遺伝子の短鎖ＤＮＡ断片は、ＵＲＡ３遺伝子の−４２０ｂｐから＋１１５８ｂｐの配列（すなわち、ＵＲＡ３の開始コドンの４２０ｂｐ上流およびＵＲＡ３の停止コドンの３５４ｂｐ下流）から選択される、約３００ｂｐから６００ｂｐの長さであり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様により、酵母細胞における少なくとも１つの標的遺伝子の破壊のための遺伝子カセットであって、
（ａ）マーカ遺伝子として使用することができるＵＲＡ３遺伝子；
（ｂ）少なくとも１つの遺伝子破壊補助（gene disruption auxiliary：ｇｄａ）配列；および
（ｃ）当該標的遺伝子の上流および下流配列、
を含み、
当該ｇｄａ配列が、少なくとも３００ｂｐから６００ｂｐの長さであり、ならびに配列番号３９およびその変異体のヌクレオチド配列内から選択される、遺伝子カセットが提供される。特に、当該ｇｄａ配列は、ＵＲＡ３断片であり得る。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、当該ｇｄａ配列がＵＲＡ３遺伝子の断片であり、酵母、一例においてＣ．トロピカリス、の染色体複製の間のＵＲＡ３遺伝子の非常に効果的な欠失を可能にし、したがって、ＵＲＡ３マーカ遺伝子を効果的に再利用することができるという事実を、賢く利用する。ＵＲＡ３マーカ遺伝子の両側に同じ方向において挿入されたネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｈｉｓＧ配列を使用する、従来の遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１と比較して、本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、非常に短いｇｄａ配列を使用し、１つだけのｇｄａ配列の挿入を必要とするため、破壊カセットの長さを著しく短くし、結果として、ＰＣＲなどの分子生物学操作における使用において便利である。さらに、当該破壊カセットの形質転換／組み換え効率は、著しく優れていると考えることができ、結果として、Ｃ．トロピカリス遺伝子破壊の効率全体において、さらなる大幅な改良をもたらす。
【００１０】
酵母選択マーカ遺伝子は、そのために選択することができる既知の遺伝子から選択することができ、そのような遺伝子としては、これらに限定されるわけではないが、栄養要求性マーカをコード化する遺伝子、例えば、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、およびＬＹＳ２など、が挙げられる。あるいは、宿主細胞に薬物耐性を付与するタンパク質をコード化する遺伝子を、酵母選択マーカとして使用することができる。そのような遺伝子としては、これらに限定されるわけではないが、ＣＡＮ１およびＣＹＨ２が挙げられる。特に、「酵母選択可能マーカ」は、本明細書において使用される場合、酵母において発現した場合に当該タンパク質の存在によって当該酵母細胞の選択を可能にするような、タンパク質をコード化する遺伝的要素を意味する。したがって、酵母選択可能マーカを含有し発現する任意の酵母細胞は、当該マーカを含有せず発現しない同様の酵母細胞と区別することができる。例としては、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、およびＬＥＵ２が挙げられる。特に、本発明の任意の態様に従って使用される酵母選択マーカは、ＵＲＡ３遺伝子であり得る。オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２３）（ＵＲＡ３遺伝子）をコードするＤＮＡは、本発明の任意の態様によるマーカ遺伝子として使用され得る。この酵素は、いくつかの酵母株において、ピリミジン生合成における必須酵素である。本発明の任意の態様に従って使用されるこの選択マーカは、再利用可能であり得る。ＵＲＡ３遺伝子配列またはＵＲＡ３遺伝子は、上流調節配列と、コード領域と、下流調節配列とを含むカセットを意味する。ＵＲＡ３遺伝子は、プロモータ領域を含む５’非翻訳領域と、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２３）をコードする領域と、ターミネータ領域を含む３’非翻訳領域とを含む遺伝子断片を表す。一実施例において、ＵＲＡ３遺伝子の当該塩基配列は、ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベースにおいてＤ１２７２０として開示され得るカンジダ・マルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）に由来し得る。別の実施例では、当該ＵＲＡ３遺伝子は、Ｃ．トロピカリスＳＴＸＸ２０３３６に由来し得る。特に、本発明の任意の態様によるＵＲＡ３遺伝子は、配列番号３の配列を含み得る。便利な選択可能マーカとして繰り返し使用できるその能力から、選択マーカとしてＵＲＡ３遺伝子を使用することは有利であると考えられ得る。栄養要求性マーカであるＵＲＡ３は、ノックアウト突然変異の導入にとって好都合であり得る。ＵＲＡ３などの選択されたマーカは、選択可能マーカおよび対抗選択マーカ（counter-selectable marker）の両方としても機能することができ、後続の選択工程において、最初にそのマーカを選択してそれから排除することを可能にする。当該ＵＲＡ３遺伝子のポップアウト効率は、安定していると考えられ得る。
【００１１】
マーカとしてのこれらの遺伝子の使用は、当該マーカ遺伝子の機能的染色体コピーの不在により、関心対象の栄養物に対して栄養要求性である宿主株に制限される。当該マーカ遺伝子の機能的対立遺伝子によって原栄養性へと形質転換されない限り、栄養要求性酵母株は、適切な成長因子を含有する培地においてのみ、増殖させることができる。この栄養補足は、規定された合成培地に当該成長因子を含ませることによって、または関連する成長因子が豊富な複合培地成分（例えば、酵母抽出物またはペプトン）を使用することにより、達成することができる。
【００１２】
本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、さらに、少なくとも１つのＵＲＡ３遺伝子断片を含む。この遺伝子断片は、遺伝子破壊補助（ｇｄａ）配列と呼ばれ得る。驚くべきことに、それは、本発明の任意の態様に従って、
（ａ）マーカ遺伝子としてのＵＲＡ３；
（ｂ）−４２０ｂｐ（すなわち、当該開始コドンの４２０ｂｐ上流）においてその上流部位を有し、＋１１５８ｂｐ（すなわち、停止コドンの３５４ｂｐ下流）においてその下流部位を有するＵＲＡ３配列から選択されるｇｄａ配列、および
（ｃ）当該カセットの各末端における標的遺伝子のホモロジアーム
を有する遺伝子カセットが、酵母株において遺伝子を効率的に欠失することができる場合に見出される。さらに、当該ＵＲＡ３遺伝子選択マーカは、繰り返し使用することができる。本発明の任意の態様により、当該配列の位置が、−ｎｂｐおよび／または＋ｍｂｐ（ｎおよびｍが整数の場合）として表現される場合、位置基準は以下の通りである：コード領域におけるＵＲＡ３遺伝子の開始コドンＡＴＧにおけるＡの位置は＋１ｂｐとして指定され、当該開始コドンＡＴＧの上流における第１の塩基対（すなわち、Ａの左側に隣接する第１の塩基対）の位置は、−１ｂｐとして指定される。したがって、開始コドンＡＴＧのｎ塩基対上流の位置は−ｎｂｐとして指定され（開始コドンのｎｂｐ上流または−ｎｂｐとも呼ばれる）、当該開始コドンＡＴＧにおけるＴの位置は＋２ｂｐとして指定され、当該開始コドンＡＴＧの下流において、ＡＴＧのＡが第１の塩基（対）として指定される場合、ｍ塩基（対）の位置は、＋ｍｂｐとして指定される（開始コドンのｍｂｐ下流または＋ｍｂｐとも呼ばれる）。付番のこの方法は、図３に示されている。
【００１３】
特に、当該ｇｄａ配列は、配列番号３９内から選択することができる。
【００１４】
特に、当該ｇｄａ配列のサイズは、１００ｂｐから６００ｂｐであり得る。当該ｇｄａ配列の長さは変えることができる。配列がより短いほど、使用する必要のある原材料（すなわち、培地、ｄＮＴＰなど）は少なくて済むので、当該遺伝子カセットを作製するコストは安価になる。ｇｄａ配列のサイズを減らすことにより、同じ目的のために当技術分野において既知のカセットより小さいカセットを得ることができる。本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、ｈｉｓＧ配列を使用する従来の遺伝子破壊カセットと比較して、大幅に向上した形質転換または組み換え効率を示し得る。これは、提供される実施例によって確認される。中でも特に、当該ｇｄａ配列のサイズは、本発明の任意の態様により、３００ｂｐから５００ｂｐであり得る。驚くべきことに、本発明の任意の態様による遺伝子カセットのｇｄａ配列の長さが３００〜５００ｂｐである場合、酵母株、例えば、ウラシル栄養要求性Ｃ．トロピカリスなど、への形質転換後のＵＲＡ３遺伝子のポップアウト効率は、かなり増加され得ることも見出された。特に、酵母株への形質転換後のＵＲＡ３遺伝子のポップアウト効率は、従来のｈｉｓＧ遺伝子破壊カセットに匹敵し得る。本発明の任意の態様による遺伝子破壊カセットの形質転換効率は、従来の遺伝子破壊カセットより著しく高くあり得るため、酵母株、特にＣ．トロピカリス、の遺伝子破壊効率全体の著しい向上が達成され得る。一実施例において、当該ｇｄａ配列は、約１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、または６００ｂｐの長さであり得る。別の実施例において、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、１００〜６００ｂｐｂｐ、１５０〜６００ｂｐ、２００〜６００ｂｐ、２５０〜６００ｂｐ、３００〜６００ｂｐ、３５０〜６００ｂｐ、４００〜６００ｂｐ、１００〜５５０ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、１００〜４５０ｂｐ、１００〜４００ｂｐ、１００〜３５０ｂｐ、１００〜３００ｂｐ、１５０〜６００ｂｐ、１５０〜５５０ｂｐ、１５０〜５００ｂｐ、１５０〜４５０ｂｐ、１５０〜４００ｂｐ、１５０〜３５０ｂｐ、２００〜５５０ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、２００〜４５０ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５５０ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、２５０〜４５０ｂｐ、２５０〜４００ｂｐ、２５０〜３５０ｂｐ、３００〜５５０ｂｐ、３００〜５００ｂｐ、３００〜４５０ｂｐ、３００〜４００ｂｐ，３０２〜６００ｂｐ、３０２〜５００ｂｐ、３０２〜４８８ｂｐ、３０５〜４８８ｂｐなどの長さであり得る。当業者は、当該遺伝子カセットによって破壊される標的配列に応じて、各場合において好適であり得るｇｄａ配列の長さを識別することができ得る。特に、当該ｇｄａ配列のサイズは、２００ｂｐから５００ｂｐであり得る。中でも特に、当該ｇｄａ配列は、３００ｂｐから５００ｂｐであり得る。一実施例において、当該ｇｄａ配列の長さは、１４３ｂｐ、２４５ｂｐ、３０２ｂｐ、３０５ｂｐ、３２４ｂｐ、３２５ｂｐ、および４８８ｂｐの長さからなる群から選択され得る。特に、当該ｇｄａ配列の長さは、３２４ｂｐまたは３２５ｐｂの長さであり得る。
【００１５】
別の実施例において、本発明の任意の態様による遺伝子カセット内に２つ以上のｇｄａ配列が存在し得る。特に、当該遺伝子カセット内に２つまたは３つのｇｄａ配列が存在し得る。中でも特に、本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、ｇｄａ配列を１つだけ含み、それにより、形成された当該カセットはより短くなり、結果として作製および使用がより容易になる。
【００１６】
当該ｇｄａ配列の長さを変えることができるという事実は、本発明の任意の態様による遺伝子カセットの形成にとって有利であると考えることができる。特に、このことは、同じ染色体上の２つの隣接する遺伝子（例えば、Ｃ．トロピカリスのＰＯＸ４およびＰＯＸ２遺伝子など）の破壊にとって非常に好都合であり得、これは、Ｃ．トロピカリス遺伝子の研究における分子生物学的手法のさらなる使用のための基礎を確立する。
【００１７】
さらに、本発明の任意の態様による遺伝子カセットのｇｄａ配列の長さが３００ｂｐから５００ｂｐである場合、本発明の任意の態様による遺伝子カセットがＣ．トロピカリスに形質転換された後のＵＲＡ３遺伝子のポップアウト効率は、急激に増加し、結果として、Ｃ．トロピカリス遺伝子破壊の効率全体をさらに増加させる。本発明の任意の態様による他の利点は、本明細書を読んだ後に当業者に明らかとなるであろう。
【００１８】
本発明の任意の態様により、当該ｇｄａ配列は、配列番号３９のヌクレオチド配列およびその変異体の内から選択することができる。特に、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、配列番号３９のヌクレオチド配列およびＵＲＡ３遺伝子配列のその変異体の内から選択される１００〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、３００〜５００ｂｐであり得る。
【００１９】
用語「変異体」は、参照アミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性であるそれぞれアミノ酸または核酸配列を意味し得、この場合、好ましくは、当該機能、例えば、タンパク質の触媒活性、分子の折り畳みまたは構造など、にとって不可欠のアミノ酸以外のアミノ酸は、挿入によって欠失、置換、または置き換えられるか、あるいは必須アミノ酸が、参照配列またはそれらから誘導される分子の生物活性を保存する効果に対して保守的方法において置き換えられる。現状技術水準は、２つの所定の核酸またはアミノ酸配列を揃えるため、および同一性の程度を計算するために使用することができるアルゴリズムを含み、それについて、Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ（２００８），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，４６３７−４６８０，１９９４，ａｎｄ  Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，１６（１），２２−３３，２００５を参照されたい。そのような変異体は、アミノ酸または核酸配列への欠失、挿入、または置換を導入することによって、ならびにそのようなマクロ分子またはその変異体を含む融合によって調製することができる。一実施例において、アミノ酸配列に関して、用語「変異体」は、上記の配列同一性に加えて、それぞれの参照配列または野生型配列に対して１つまたは複数の保存アミノ酸の変化を含むか、あるいは、１つまたは複数の保存アミノ酸の変化を含むアミノ酸配列をコード化する核酸配列を含む、アミノ酸配列を含む。別の実施例において、アミノ酸配列または核酸配列の「変異体」なる用語は、上記の配列同一性の程度に加えて、それぞれ、アミノ酸配列または核酸配列の任意の活性部分および／または断片、あるいはアミノ酸配列の活性部分および／または断片をコード化する任意の核酸配列を包含する。特に、用語「活性部分」は、本明細書において使用される場合、それぞれ、全長未満のアミノ酸配列であるかまたは全長未満のアミノ酸配列をコードする、アミノ酸配列または核酸配列を意味し、この場合、当該アミノ酸配列またはコード化されたアミノ酸配列は、それぞれ、その不可欠の生物活性の少なくともいくらかを保持する。例えば、プロテアーゼの活性部分および／または断片は、ポリペプチドにおけるペプチド結合を加水分解することができる。一実施例において、用語「その不可欠の生物活性の少なくともいくらかを保持する」は、本明細書において使用される場合、関心対象のアミノ酸配列が、バックグラウンド活性を上回りそれと区別される生物活性を有し、ならびにそのような活性を特徴付ける動態パラメータ、より詳細にはｋcatおよびＫMが、特定の基質に関して参照分子によって示される値の、好ましくは３桁倍以内、より好ましくは２桁倍以内、最も好ましくは１桁倍以内であることを意味する。一実施例において、核酸の「変異体」なる用語は、その相補鎖が、好ましくはストリンジェントな条件下において、参照核酸または野生型核酸にハイブリダイズするような核酸を包含する。ＵＲＡ３または配列番号３の変異体の例は、これらに限定されるわけではないが、ＡＦ０４０７０２．１、ＧＱ２６８３２４．１、ＪＸ１００４１６．１、ＡＹ０３３３２９．１、ＥＵ２８８１９４．１、ＧＱ２６８３２４．１、ＡＦ３２１０９８．１、ＡＦ１０９４００．１、Ｕ４０５６４．１、Ｋ０２２０７．１などを包含し得る。
【００２０】
別の実施例において、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、ＵＲＡ３遺伝子の−４２０ｂｐから＋３１８ｂｐのヌクレオチド配列内から選択される１００〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、３００〜５００ｂｐであり得る（開始コドンの４２０ｂｐ上流から３１８ｂｐ下流まで）。特に、ｇｄａ配列は、配列番号４０内から選択され得る。別の実施例において、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、ＵＲＡ３遺伝子の＋５３３ｂｐから＋１１５８ｂｐ（停止コドンの２７２ｂｐ上流から３５４下流まで）のヌクレオチド配列内から選択される１００〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、３００〜５００ｂｐであり得る。特に、当該ｇｄａ配列は、配列番号４１内から選択することができる。さらなる実施例において、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、ＵＲＡ３遺伝子の＋８０４ｂｐから＋１１５８ｂｐ（停止コドンから停止コドンの３５４ｂｐ下流まで）のヌクレオチド配列内から選択される１００〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、３００〜５００ｂｐであり得る。特に、当該ｇｄａ配列は、配列番号４２内から選択することができる。さらなる別の実施例において、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、ＵＲＡ３遺伝子コード領域の開始コドンの４２０ｂｐ上流のヌクレオチド配列内から選択される１００〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、３００〜５００ｂｐであり得る。特に、当該ｇｄａ配列は、配列番号４３内から選択することができる。配列番号３を使用する場合のＵＲＡ３遺伝子の一部の様々な開始点および終了点の位置が図４に示される。
【００２１】
一実施例において、当該ｇｄａ配列の上流部位は、ＵＲＡ３遺伝子のコード領域に位置されており、当該ｇｄａ配列の下流部位は、ＵＲＡ３遺伝子のコード領域の停止コドンとＵＲＡ３遺伝子のコード領域の停止コドンの３５４ｂｐ下流との間の領域に位置されており、例えば、それは、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
別の実施例において、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、ＵＲＡ３遺伝子コード領域に由来し得、例えば、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列を有するか、または当該ｇｄａ配列は、その下流部位としてＵＲＡ３遺伝子停止コドンを有する配列である。
【００２３】
さらなる別の実施例において、本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、配列番号１８、１６、２７、２４、１４、２１、および６からなる群から選択されるｇｄａ配列を含む。当該ｇｄａ配列は、配列番号１８、１６、２７、２４、１４、２１、および６からなる群から選択される配列のうちの任意の１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を含み得る。中でも特に、本発明の任意の態様によるｇｄａ配列は、配列番号１６、１４、または２１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を含み得る。中でも特に、ｇｄａ配列は、配列番号１６、１４、または２１からなる群から選択されるヌクレオチドに対して少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドを含み得る。
【００２４】
一実施例において、本発明の態様によるｇｄａ配列は、当該ＵＲＡ３遺伝子に直接結合され得る。特に、当該ｇｄａ配列は、制限酵素を使用して当該カセット内の適切な部位に挿入することができる。その結果、当該ｇｄａ配列は、本発明の任意の態様によるカセットのＵＲＡ３遺伝子に直接結合され得、この場合、当該ＵＲＡ３遺伝子に当該ｇｄａを接続するリンカ配列は存在していなくてもよい。これは、本発明の任意の態様によるカセットを製造するプロセスを、容易に、ならびに便利にする。本発明の任意の態様による遺伝子カセットはさらに、当該遺伝子カセットが酵母株でのその発現を阻害することができ得るような標的遺伝子の上流配列および下流配列を含み得る。当該遺伝子カセットは、当該標的遺伝子の上流（５’−）および下流（３’−）隣接配列に対して高い同一性を有する（すなわち、８０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の同一性スコア）。これらの領域のどちらかまたは両方は、標的遺伝子のコード領域の一部ならびにそれぞれのプロモータまたはターミネータ領域の一部または全てを含み得る。一実施例において、当該ｇｄａ配列および当該ＵＲＡ３マーカは、標的遺伝子の上流および下流隣接配列に対して高い同一性を有する領域の間に存し得る。使用される酵母株の任意のネイティブ遺伝子は、本発明の任意の態様による遺伝子カセットの挿入のための標的として機能し得る。
【００２５】
成功した形質転換体は、マーカ遺伝子が貢献する属性の利点を生かすことによって、または挿入された遺伝子が貢献する他の特性（例えば、乳酸を産生する能力、エタノールを産生しない能力、または特定の基質において増殖する能力など）によって、既知の方法において選択することができる。ＰＣＲまたはサザン解析によってスクリーニングを実施することにより、所望の挿入および欠失が生じていることを確認し、コピー数を確認し、ならびに宿主細胞のゲノム中への遺伝子の統合の位置を識別することができる。挿入された遺伝子によってコード化される酵素の活性および／または欠失された遺伝子によってコード化される酵素の活性の欠如は、既知のアッセイ方法を使用して確認することができる。
【００２６】
本発明の任意の態様によれば、「標的遺伝子」は、本明細書において使用される場合、サイレンシングまたは破壊によって病原性酵母の増殖、発生、再生、または生存の減少を生じるような遺伝子を意味する。一実施例において、酵母の必須遺伝子の部分的または完全なサイレンシングは、結果として、非必須遺伝子または当該酵母において天然には発現されない遺伝子を標的にするヌクレオチド配列が適用された酵母を管理することと比較して、そのような遺伝子がサイレント化される場合にかなりの酵母死亡率またはかなりの酵母管理を生じる。別の実施例において、使用される標的遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子および／またはＣＡＴ遺伝子であり得る。
【００２７】
本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、当該標的遺伝子の上流および下流配列を含み得る。「ホモロジアーム（Arms of Homology）」は、本明細書において使用される場合、本発明の任意の態様による遺伝子カセットに存在するＤＮＡセグメントの対を意味し、これらのセグメントは、標的遺伝子の２つの部分に対して相同である。このホモロジにより、当該ホモロジアームは、標的遺伝子との相同的組み換えを受けることができるであろう。ホモロジアームは、かなりの割合の相同的組み換えを酵母細胞において生じさせることができるように、少なくとも５０ｂｐの長さである。中でも特に、ホモロジアームは、≧４０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００の長さであり得る。「ホモロジアーム」はさらに、標的遺伝子に隣接する当該標的遺伝子の上流および下流配列とも呼ばれ得る。ゲノムＤＮＡ対して相同なＤＮＡの当該２つの配列（上流および下流配列）は、欠失／破壊されるＤＮＡ遺伝子配列（標的遺伝子）に隣接している。これらの隣接配列は、ホモロジアームと呼ばれる。特に、これらのホモロジアームは、酵母細胞の当該標的遺伝子における対応する隣接配列に対して実質的に同系である。標的遺伝子に対して実質的に同系であるＤＮＡの使用は、標的配列による高効率の組み換えを保証するのに役立つ。本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、組み換えのスコアリングを可能にするために、ホモロジアーム内に少なくとも陽性選択マーカ（ＵＲＡ３）を含む。そのような陽性選択マーカは、野生型酵母によっては通常は示されない表現型；例えば、標的細胞に対して通常は毒性である物質に対する耐性など、を付与することができる。別の実施例において、本発明の任意の態様によるカセットはさらに、適切な相同的組み換えの識別を容易にするために、当該ホモロジアームの外側に１つまたは複数の陰性選択マーカも含む。米国特許第５，４６４，７６４号には、そのような「陽性−陰性」選択方法の使用について記載されている。成功した遺伝子標的化および相同的組み換えの際に、当該陽性選択マーカは、標的化された遺伝子セグメントの代わりにホモロジアーム内のゲノム中に組み入れられ、ネガティブ選択マーカは排除される。したがって、相同的組み換えを富化するために、遺伝子標的化された細胞が、適切な陽性および陰性選択的化合物を含有する培養培地において培養される。
【００２８】
一実施例において、当該ホモロジアームは、当該ヌクレオチド鎖のうちの１つにおける当該標的遺伝子の、≧１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１，３２、３３、３４、３５、４０、４５、特に、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の隣接ヌクレオチドであり得る。当該上流および下流配列は、当該標的遺伝子の正確な配列を意味し得るわけではないが、当該標的遺伝子の開始コドンおよび停止コドンに隣接する領域を意味し得る。別の実施例において、当該開始コドンおよび停止コドンは、それぞれ、当該上流および下流配列の一部であり得る。さらなる実施例において、当該標的遺伝子の上流および下流配列は、それぞれ、≧５０ｂｐの長さであり得る。
【００２９】
本発明の任意の態様により、任意の酵母細胞を使用することができる。特に、当該酵母細胞は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ・クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、クルイベレイ・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｅｉ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択することができる。特に、当該酵母細胞は、Ｃ．トロピカリスであり得る。栄養要求性酵母株および対応するマーカ遺伝子の用途の重要な分野は、ネイティブタンパク質または異種タンパク質の高レベル生産のための発現ベクタの安定した保持である。一実施例において、本発明の任意の態様に従って使用される酵母細胞は、ウラシル栄養要求性Ｃ．トロピカリスであり得る。特定の一実施例において、本発明の任意の態様に従って使用されるＣ．トロピカリスのウラシル栄養要求性菌株は、Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ  ２０３３６の物理的または化学的突然変異誘発の後にスクリーニングして得ることができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様により、少なくとも１種の酵母細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、本発明の任意の態様による遺伝子カセットによる当該酵母細胞の形質転換工程を含む方法が提供される。
【００３１】
本発明の任意の態様による当該方法は、Ｃ．トロピカリスの２コピーおよび複数遺伝子破壊にとって好適であり得る。
【００３２】
一実施例において、本発明の任意の態様による遺伝子カセットの構築方法は、以下の工程を含み得る：
（１）．標的遺伝子の上流および下流配列の調製：標的遺伝子の既知の塩基配列に従ってプロモータを設計する工程、標的遺伝子の上流および下流配列を得るためにＰＣＲによって増幅する工程、または、標的遺伝子の既知の配列により標的遺伝子の上流および下流配列を合成する工程；この場合、標的遺伝子の上流および下流配列の長さは５０ｂｐ以上である；
（２）．ＵＲＡ３マーカ遺伝子の調製：Ｃ．トロピカリス、例えば、Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６、の染色体におけるＵＲＡ３配列によりプロモータを設計する工程、上流調節配列、コード領域、および下流調節配列を含む、Ｃ．トロピカリスのＵＲＡ３遺伝子を得るために、ＰＣＲによって増幅する工程；
（３）．ｇｄａ配列の調製：Ｃ．トロピカリス、例えば、Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６、の染色体におけるＵＲＡ３配列によりプロモータを設計する工程、ｇｄａ配列を得るためにＰＣＲによって増幅する工程、この場合、当該ｇｄａ配列は、ＵＲＡ３遺伝子コード領域および／または調節配列に由来し、ならびに３００〜５００ｂｐの長さを有する；
（４）．遺伝子崩壊カセットの構築：得られたｇｄａ配列を、ＵＲＡ３遺伝子配列の上流または下流に結合させて、ｇｄａ−ＵＲＡ３またはＵＲＡ３−ｇｄａ断片を得る工程；当該配列を、それぞれ、標的遺伝子配列の上流および下流においてｇｄａ−ＵＲＡ３断片の両側に結合させ、その結果として、本発明の遺伝子破壊カセットを得る工程。
【００３３】
本発明の遺伝子破壊カセットは、標的遺伝子の上流（または下流）配列−ｇｄａ配列−ＵＲＡ３遺伝子−標的遺伝子の下流（または上流）配列、または標的遺伝子の上流（または下流）配列−ＵＲＡ３遺伝子−ｇｄａ配列−標的遺伝子の下流（または上流）配列、のように表され得る。
【００３４】
当業者は、選択されたｇｄａ配列に基づいてｇｄａ−ＵＲＡ３断片またはＵＲＡ３−ｇｄａ断片を構築することを選択し得る。例えば、ｇｄａ配列が、ＵＲＡ３遺伝子の上流配列（コード領域の上流調節配列またはＮ末端コード配列を含む）に由来し、ＵＲＡ３遺伝子の３’末端に挿入される場合、ＵＲＡ３−ｇｄａ断片は、続く遺伝子結合およびＵＲＡ３遺伝子のポップアウト、すなわち、ＵＲＡ３遺伝子におけるｇｄａ配列とｇｄａ配列の対応する供給源配列との間の断片のポップアウト、を促進するように構築されるであろう。
【００３５】
本発明の別の態様により、酵母細胞、特にＣ．トロピカリス細胞、より詳細にはウラシル栄養要求性菌株Ｃ．トロピカリス細胞、の標的遺伝子の破壊における、本発明の任意の態様による遺伝子カセットの使用が提供される。
【００３６】
本発明のさらなる態様により、本発明の任意の態様による遺伝子カセットを含むベクタが提供される。
【００３７】
本発明のさらに別の態様により、本発明の任意の態様による遺伝子カセットを含む細胞が提供される。
【００３８】
本発明のさらなる態様により、本発明の任意の態様による遺伝子カセットを含む多細胞生物が提供される。
【００３９】
一実施例において、本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、Ｃ．トロピカリス株から標的遺伝子を欠失させる方法であって、以下の工程：
（１）本発明の任意の態様による遺伝子カセットの形質転換：酢酸リチウム法または塩化リチウム法によって、本発明の任意の態様による遺伝子カセットを、Ｃ．トロピカリス細胞、特にウラシル栄養要求性Ｃ．トロピカリス細胞に形質転換する工程、および形質転換体を作製するために、ＭＭ培養プレートに当該細胞を適用する工程；
（２）形質転換体の識別：ＭＭ培地において形質転換体の単一コロニを培養する工程、染色体ＤＮＡを抽出する工程、およびＰＣＲによって増幅する工程；
（３）マーカ遺伝子の欠失（またはポップアウト）：微生物濃度が適正なレベルに達するまで、３０℃および２００ｒｐｍでＳＭ培地において当該遺伝子カセットの形質転換を施されたＣ．トロピカリス株を培養する工程、遠心分離して当該微生物を収集する工程、滅菌脱イオン水で洗浄する工程、ＦＯＡプレート上に適用する工程、および３０℃で培養する工程；
（４）マーカ遺伝子の欠失の識別：当該増殖した単一微生物コロニをＳＭプレート上に播種し培養する工程、染色体ＤＮＡを抽出する工程、およびＰＣＲによって識別する工程、ならびにＵＲＡ３マーカ遺伝子欠失を示す突然変異株を得る工程、
を含む方法において使用することができる。
【００４０】
ＵＲＡ３マーカ遺伝子の欠失を示す突然変異株は、遺伝子破壊の第二ラウンドのための宿主株として使用することができる。この方法において、以下のような培養培地および配合が使用され得る：ＭＭ（アミノ酸＆硫酸アンモニウムを伴わない酵母窒素原基礎培地、６．７ｇ／ＬのＹＮＢ；２０ｇ／Ｌのグルコース；１０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4）；ＳＭ（ＭＭ＋６０ｍｇ／Ｌのウラシル）；ＦＯＡ培養培地（ＳＭ＋２ｇ／Ｌの５−フルオロオロト酸）。
【００４１】
本発明の任意の態様による遺伝子カセットによって、本発明は、Ｃ．トロピカリスの二重コピー標的遺伝子を高効率において欠失する方法を提供する。一実施例において、本発明の任意の態様によるこの方法は、ＣＡＴ遺伝子およびＰＤＣ遺伝子を含む、Ｃ．トロピカリスからの他の標的遺伝子の欠失において使用することができる。別の実施例において、本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、同じ細胞において２つの対立遺伝子を欠失させるために使用することができる。例えば、当該遺伝子カセットは、Ｃ．トロピカリス細胞の２つのＣＡＴ対立遺伝子を欠失させるために使用することができる。
【００４２】
マーカ遺伝子のポップアウト後の当該菌株の標的遺伝子座（例えば、ＣＡＴ遺伝子座）の配列決定は、標的遺伝子の欠失がどこで生じるかを正確に特定するため、ならびに標的遺伝子の欠失を確認するために使用される手段であり得る。例えば、当該欠失は、単一ＣＡＴ対立遺伝子座の２つのＣＡＴホモロジアームと、ｇｄａ配列によって置換された断片との間において生じ得る。したがって、標的遺伝子（例えば、ＣＡＴ遺伝子の単一コピーなど）が首尾よく破壊され得ることが分子レベルにおいて実証され得る。さらに、配列決定によって、２コピー標的遺伝子の対立遺伝子の破壊を確認することができる。
【００４３】
本発明の任意の態様に従って使用される再利用可能な選択マーカに基づくＣ．トロピカリスの遺伝子破壊法において、最初に、相同的組み換えの原理を使用して、栄養要求性菌株の標的遺伝子座において遺伝子カセットによる部位特異的組み換えを実施し、標的遺伝子を機能的に破壊し得、次いで、マーカ遺伝子が、破壊された標的遺伝子を有する菌株をスクリーニングするために再利用され得る。この後、５−ＦＯＡ選択圧を使用することにより、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトを示す突然変異株を選別して除くことができ、ならびに、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトを示す当該突然変異株は、第２の対立遺伝子または他の遺伝子を破壊するために使用することができる。
【００４４】
本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、３つの構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）：
（ａ）マーカ遺伝子として使用することができるＵＲＡ３遺伝子；
（ｂ）少なくとも１つの遺伝子破壊補助（ｇｄａ）配列；および
（ｃ）標的遺伝子の上流および下流配列、
の全てを有し得る。
【００４５】
構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序のいくつかの例を図１に提供する。本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を任意の順序において含んでもよい。一実施例において、本発明の任意の態様による遺伝子カセットは、単一の（ｂ）ｇｄａ配列を含み得る。構成要素（ｂ）は、（ａ）ＵＲＡ３遺伝子の３’末端または５’末端に位置され得る。構成要素（ｃ）の上流または下流配列は、（ｂ）に結合していない、（ａ）の他方の末端に位置され得る。ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの間にＵＲＡ３遺伝子内のｇｄａ配列と同様の配列との間のＵＲＡ３遺伝子断片のみがポップアウトされ得ることが確立され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】様々な遺伝子破壊カセットの構造ダイヤグラム。
【図２】実施例におけるＣＡＴ遺伝子破壊のフローチャートであり、識別プロセスにおけるプライマの結合部位を示す。（ａ）は、第１のＣＡＴ遺伝子の破壊のフローチャートであり；（ｂ）は、第２のＣＡＴ遺伝子の破壊のフローチャートである。
【図３】開始コドンに関して配列内の塩基対をカウントする手段の図。
【図４】本発明の任意の態様によるｇｄａ配列を得るために使用した特定の塩基対でアノテートされたＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６のＵＲＡ３の部分配列（−４２３から＋４２０ｂｐ）。
【図５】遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸの第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜２４は、破壊カセットの様々な形質転換体に対するＰＣＲ識別結果であり、ＰＣＲプライマはＣＡＴＵおよびＣＡＴＲであった。レーン１、７、８、１１、１２、および１７は、単一コピーＣＡＴ遺伝子が破壊されている陽性形質転換体であり、他のレーンの全ては、偽陽性形質転換体である。２７０７ｂｐバンドは、破壊カセット（ＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１断片）の統合を示すバンドであり、１８８１ｂｐバンドは、ＣＡＴ１オリジナル遺伝子を示す。
【図６】Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１およびＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を有するゲルの写真。マーカの左側のレーン１〜８は、ｇｄａ３２４破壊カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示しており、全てのレーンが、マーカがポップアウトされた菌株を示している。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子と、下流ホモロジアームの外側の１４５ｂｐのＤＮＡとを有する配列）は、２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子をポップアウトした後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ１と、下流ホモロジアームの外側の１４５ｂｐのＤＮＡとを有する配列）は、１１１０ｂｐのサイズを有する。ＤＮＡ配列決定により、当該配列構造は理論予測と一致し、同じ方向を有する２つのｇｄａ配列の間のマーカ遺伝子断片がポップアウトされていることが明らかとなった。マーカの右側のレーン１〜６は、ｇｄａ４８８破壊カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示している。元のバンドは、２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ１と、下流ホモロジアームの外側の１４５ｂｐのＤＮＡとを有する配列）は、１２７４ｂｐのサイズを有する。レーンＸＺＸは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用した、２０２６ｂｐのサイズを有するＰＣＲ生成物を示している。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＬＤであった。
【図７】遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１およびＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸの第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。マーカの左側のレーン１〜１２は、破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１（２４６４ｂｐのサイズを有する）の様々な形質転換に対するＰＣＲ識別結果を示している。レーン１〜５、７〜９、および１１は、１９３１ｂｐのサイズのＰＣＲ生成物（ＵＲＡ３−ＣＡＴ１）による陽性形質転換体である。他のレーンは全て、特異的なバンドを有さない偽陽性形質転換体である。マーカの右側のレーン１〜１１は、破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の様々な形質転換体に対するＰＣＲ識別結果を示している。レーン１〜３および８は、１９３１ｂｐのサイズのＰＣＲ生成物（ＵＲＡ３−ＣＡＴ１）による陽性形質転換体であり、他のレーンは、全て特異的なバンドを有さない偽陽性形質転換体である。レーンＸＺＸは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅結果を示している。当該ＰＣＲプライマは、ＵＲＡＵ／ＣＡＴＲであった。
【図８】Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１およびＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を有するゲルの写真。マーカの左側のレーン１〜４は、ｇｄａ１４３カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示している。レーン１〜３は、陽性形質転換体であり、この場合、元のバンド（ＣＡＴ１の配列および当該遺伝子の下流配列）は２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子をポップアウトした後（ＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＣＡＴ１の配列およびホモロジアームの外側の１４５ｂｐのＤＮＡ）のバンドサイズは９２９ｂｐのサイズを有する。マーカの右側のレーン１〜２は、ｇｄａ２４５カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示しており、レーン１〜２は全て、陽性形質転換体である。元のバンドは、２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後（ＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＣＡＴ１および、下流ホモロジアームの外側の１４５ｂｐのＤＮＡ）のバンドは、１０３１ｂｐのサイズを有する。ＰＣＲ生成物の電気泳動法の結果は、マーカ遺伝子のポップアウト後の理論的に予想されるバンドのサイズに一致する。レーンＸＺＸは、２０２６ｂｐのサイズの、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用したＰＣＲ生成物を示している。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＬＤであった。
【図９】遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。レーン５、９〜１４、１６、２０、２３、および２４は、陽性形質転換体であり、他のレーンは全て、偽陽性形質転換体である。陽性形質転換体（ＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１）のＰＣＲ生成物は、２３８９ｂｐのバンドサイズを有し、元のバンド（元のＣＡＴ１遺伝子）は、１８８１ｂｐのサイズを有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＲであった。偽陽性形質転換体（ＣＡＴ１遺伝子）のバンドは、１８８１ｂｐのサイズを有する。
【図１０】遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１およびＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。マーカの左側のレーン１〜１１は、破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１の様々な形質転換体のＰＣＲ識別結果を示している。レーン１、４、５、および１０は、陽性形質転換体であり、他のレーンは全て、偽陽性形質転換体である。偽陽性形質転換体（ＣＡＴ１遺伝子）のバンドは、１８８１ｂｐのサイズを有し、遺伝子崩壊カセット（ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１）によって統合された形質転換体のバンドは、２５２４ｂｐのサイズを有する。マーカの右側のレーン１〜１２は、破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の様々な形質転換体のＰＣＲ識別結果を示している。レーン３、５、および１０〜１２は、陽性形質転換体であり、他のレーンは全て、偽陽性形質転換体である。偽陽性形質転換体（元のＣＡＴ１遺伝子）のＰＣＲ生成物のバンドは、１８８１ｂｐのサイズを有し、遺伝子崩壊カセット（ＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１）によって統合された形質転換体のバンドは、２５４４ｂｐのサイズを有する。レーンＸＺＸは、１８８１ｂｐ（ＣＡＴ１遺伝子）のサイズを有する、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用した、ＰＣＲ増幅の結果を示している。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＲであった。
【図１１】Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１およびＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を有するゲルの写真。マーカの左側のレーン１〜１２は、ｇｄａ３０５カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示している。レーン１〜１２は全て、マーカ遺伝子がポップアウトされた形質転換体である。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子）は、１８８１ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子がポップアウトされた後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１）は、９９３ｂｐのサイズを有する。マーカの右側のレーン１〜１１は、ｇｄａ３２５カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示している。レーン２〜１０は、陽性形質転換体である。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子）は、１８８１ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３遺伝子の＋８５８ｂｐから１１５８ｂｐまでの断片−ＣＡＴ１）は、１３３５ｂｐのサイズを有する。ＰＣＲ識別は、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンドの長さが理論予測と一致することに一致した。レーンＸＺＸは、１８８１ｂｐ（ＣＡＴ１遺伝子）のサイズを有する、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ生成物である。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＲであった。
【図１２】遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜７は、破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１の様々な形質転換体に対するＰＣＲ識別結果を示しており、この場合、レーン５および７は陽性形質転換体であり、他のレーンは偽陽性形質転換体である。偽陽性形質転換体（元のＣＡＴ１遺伝子）のバンドは、１８８１ｂｐのサイズを有し、陽性形質転換体または破壊カセット統合形質転換体（ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１）は、２５２１ｂｐのバンドサイズを有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＲであった。
【図１３】Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜１２は、ｇｄａ３０２カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示している。全てのレーンが、マーカ遺伝子のポップアウトの成功した菌株を示している。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子の配列および下流配列）は、２０２６ｂｐのサイズを有する。マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ＵＲＡ３遺伝子の−４２３ｂｐから＋１６ｂｐまで−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１および下流配列）は、１４２５ｂｐのサイズを有する。レーンＸＺＸは、２０２６ｂｐのサイズ（ＣＡＴ１遺伝子および下流配列）を有する、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用したＰＣＲ生成物を示している。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＬＤであった。
【図１４】遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜４８は、様々な形質転換体のＰＣＲ識別結果を示している。レーン２および４２は陽性形質転換体であり、他のレーンは全て、特異的な増幅バンドを有さない偽陽性形質転換体である。陽性形質転換体または遺伝子破壊カセット統合形質転換体（ｈｉｓＧ１）のＰＣＲ増幅バンドは、１１４９ｂｐのサイズを有する。ＰＣＲプライマは、Ｈｉｓ−Ｆ１およびＨｉｓ−Ｒ１であった。
【図１５】Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後のＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜１２は、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトに対するｈｉｓＧ繰返し配列の効率の識別を示している。全てのレーンは、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株を示している。元のバンドは２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の配列および１つのＣＡＴ１遺伝子の下流配列）は、２０７８ｂｐのサイズを有する。レーンＸＺＸは、２０２６ｂｐのサイズ（ＣＡＴ１遺伝子および１つの下流配列）の、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用したＰＣＲ生成物を示している。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＬＤであった。
【図１６】遺伝子破壊カセットＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２の形質転換による、Ｃ．トロピカリス０２（ＵＲＡ３／ＵＲＡ３、ｃａｔ：：ｇｄａ３２４／ＣＡＴ）における第２のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜１２は、様々な形質転換体に対するＰＣＲ識別結果を示している。レーン１、３、５、８、および９は陽性形質転換体であり、他のレーンは全て、偽陽性形質転換体である。当該偽陽性形質転換体は、特異的な増幅バンドを有していない。当該破壊カセット統合形質転換体は、３０２７ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅バンド（ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２−ＣＡＴ２の下流ホモロジアームからＣＡＴ１の下流ホモロジアームまでの断片−ＣＡＴ１）を有する。レーンＸＺＸは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ生成物を示しており（ＣＡＴ２遺伝子上流ホモロジアームからＣＡＴ１下流ホモロジアームまでのＣＡＴ遺伝子断片）、１３１２ｂｐのサイズを有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴ２ｎｄＵ／ＣＡＴＲであった。
【図１７】Ｃ．トロピカリス０２における第２のＣＡＴ対立遺伝子が遺伝子破壊カセットＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２の形質転換によって破壊された後のＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を有するゲルの写真。レーン１〜３は、ｇｄａ３２４カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示している。全てのレーンは、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株を示している。マーカ遺伝子がポップアウトされたバンド（ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ２−ＣＡＴ２下流ホモロジアームとＣＡＴ１下流ホモロジアームとの間の断片−ＣＡＴ１）は、１４４４ｂｐのサイズを有する。レーンＸＺＸは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体によるＰＣＲ生成物を示しており、元のバンド（ＣＡＴ２上流ホモロジアームからＣＡＴ１下流ホモロジアームの間のＣＡＴ１遺伝子断片）は１３１２ｂｐのサイズを有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴ２ｎｄＵ／ＣＡＴＲであった。
【実施例】
【００４７】
上記において好ましい実施形態について説明したが、当業者であれば、特許請求の範囲を逸脱することなく、設計、構築、または操作において変形または変更を行うことができることは理解するであろう。これらの変形は、特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
【００４８】
方法および材料
ウラシル栄養要求性菌株Ｃ．トロピカリスＸＺＸを、遺伝子破壊のための標的菌株として使用した。当該ウラシル栄養要求性菌株は、物理的または化学的突然変異誘発の後にＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６のスクリーニングによって誘導し、当該突然変異株のＵＲＡ３遺伝子のオープンリーディングフレームは、アミノ酸配列を変更したミスセンス突然変異を含んでいた。
【００４９】
当該特異的な方法は、以下の通りである：出発菌株としてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６に突然変異誘発を１１回施し、ＦＯＡ選択培地によりスクリーニングし、合計で１２７のコロニが、ＦＯＡ選択培地（ＳＭ＋５−フルオロオロト酸２ｇ／Ｌ）から増殖した。増殖したコロニを、ＳＭプレートおよびＭＭプレートにおいて別々に培養した。最後に、１３株のＵＲＡ３／ＵＲＡ３突然変異株を識別した；１３の菌株のうちの３株を選択し、それぞれ、Ｃ．トロピカリスＸＺＷ、Ｃ．トロピカリスＸＺＸ、およびＣ．トロピカリスＸＺＢと命名した。ＤＮＡ配列決定分析により、ＵＲＡ３遺伝子配列における共通の突然変異は、位置＋６０８において塩基対に生じた塩基ＧからＡへの突然変異であることが示された。塩基におけるこの発生した突然変異は、タンパク質配列を変え、ＵＲＡ３遺伝子の機能上の欠陥の主原因であった（Ｚｈｅｎｇ  Ｘｉａｎｇ，Ｘｉａｎｚｈｏｎｇ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４を参照のこと）。
【００５０】
本発明の実施例において、以下の培養培地および組成物を使用した：ＭＭ（アミノ酸＆硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素原基礎培地、ＹＮＢ  ６．７ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；（ＮＨ4）2ＳＯ4  １０ｇ／Ｌ）；ＳＭ（ＭＭ＋ウラシル６０ｍｇ／Ｌ）；およびＦＯＡ培養培地（ＳＭ＋５−フルオロオロト酸２ｇ／Ｌ）。
【００５１】
表１に示された全ての実施例および結果において計算した組み換え効率は、以下の式に従って計算した：
組み換え効率
【数１】
2018537109.tif 000003
表２に示した、全ての実施例において計算したマーカ遺伝子ポップアウト効率および結果は、以下の式に従って計算した：
ポップアウト効率
【数２】
2018537109.tif 000004
【００５２】
実施例１
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６株の培養
Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６を、ＳＭまたはＭＭ培地に播種し、染色体ＤＮＡを抽出するために所望の微生物濃度に達するまで、振盪フラスコにおいて３０℃および２００ｒｐｍで培養した。
２．Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡの単離
（１）当該細胞を得るために遠心分離を実施し；（２）好適な量のソルビトール−Ｎａ2ＥＤＴＡバッファ溶液（１ｍｏｌ／Ｌのソルビトール、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を加えて、微生物懸濁液を形成し、次に、好適な量のＳｎａｉｌａｓｅ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を加え、均一になるまで混合した後、酵母細胞壁を除去するために、３７℃で４時間消化を行い；（３）遠心分離を行って当該細胞を収集し；上澄みを捨て、好適な量のトリス−ＨＣｌ−Ｎａ2ＥＤＴＡ溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を使用して当該細胞を穏やかに懸濁させ、好適な量のＳＤＳ溶液（１００ｇ／ＬのＳＤＳ）を加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、６５℃で３０分間インキュベートし；（４）微生物懸濁液が透明になった後、２００μＬの酢酸カリウム溶液（５ｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウム）を加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、それを氷浴に１時間位置し；（５）遠心分離を１２０００ｒｐｍにおいて５分間行った。当該上澄みを新鮮なＥＰチューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、次いで、室温で１５分放置し；（６）遠心分離を１２００ｒｐｍで５分間行い、上澄みを捨て、沈殿物を２００μＬの７０％エタノール溶液で洗浄した。当該エタノール溶液を捨て、沈殿物を自然乾燥させ、３３μＬの滅菌水を加えて当該沈殿物を溶解させ、２μＬのＲＮａｓｅＡを加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、それを、３７℃で１時間インキュベートして当該ＲＮＡを消化させ；（７）インキュベートが完了した後、Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡを得て、これは、ＰＣＲテンプレートとして直接適用することも、または−２０℃で貯蔵することもできた。
３．ＵＲＡ３遺伝子断片およびＴｍ−ＵＲＡ３ベクタの調製
Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＵＲＡ３遺伝子の上流プライマＵＲＡＵ：５’−ｔａｃｔｃｔａａｃｇａｃｇｇｇｔａｃａａｃ−３’（配列番号１）、および下流プライマＵＲＡＲ：５’−ａｃｃｃｇａｔｔｔｃａａａａｇｔｇｃａｇａ−３’（配列番号２）を、ＮＣＢＩのＣ．トロピカリスのＵＲＡ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００６２０７）に従って設計し、ＰＣＲ増幅を実施して１５８１ｂｐのサイズを有するＵＲＡ３遺伝子断片（配列番号３）を生成した。当該ＵＲＡ３遺伝子断片を商業的ベクタのｐＭＤ１８−Ｔベクタ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ、大連、中国）にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを得て、次いで、これを、増幅のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９に導入した。当該遺伝子組換えプラスミドを、Ｔｍ−ＵＲＡ３と命名した。
４．ｇｄａ４８８配列の調製（＋６７１から＋１１５８のＵＲＡ３遺伝子断片）
Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、上流プライマＵｇｄａ４８８：５’−ａａｃｔｇｃａｇｔｔｃｔｇａｃｔｇｇｔａｃｃｇａｔ−３’（配列番号４）および下流プライマＤｇｄａ：５’−ｇｃｇｔｃｇａｃａｃｃｃｇａｔｔｔｃａａａａｇｔｇｃａｇａ−３’（配列番号５）を使用して形成した合成ｇｄａ４８８をＰＣＲにおいて使用した。ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ４８８配列（配列番号６）を作製した。
５．ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを使用して、上記のｇｄａ４８８断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。次いで、遺伝子組換えプラスミドを形成するためにリゲートし、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。この新しい遺伝子組換えプラスミドをＴｍ−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３と命名した。
６．Ｃ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＣＡＴ遺伝子の上流プライマＣＡＴＵ：５’−ｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇｔｔｇｔｃｇｃ−３’（配列番号７）および当該下流プライマＣＡＴＲ：５’−ｔａｃａａｃｔｔａｇｇｃｔｔａｇｃａｔｃａ−３’（配列番号８）をＰＣＲにおいて使用した。１８８１ｂｐのサイズを有するＣＡＴ１遺伝子（配列番号９）を作製するためにＰＣＲ増幅を実施し、その後、それをｐＭＤ１８−Ｔ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ、大連、中国）商業的ベクタにリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを得て、増幅のためにそれを大腸菌ＪＭ１０９へと導入した。当該遺伝子組換えプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１と命名した。
７．遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１をテンプレートして使用し、逆ＰＣＲプライマｒＣＡＴＵ：５’−ａａｃｔｇｃａｇｃｃａａａａｔｔｃａｇｃｃａａｃｃａｇｔ−３’（配列番号１０）、およびｒＣＡＴＲ：５’−ｇｃｔｃｔａｇａａｇａｔｇａｔｔｃａａｃｃａｇｇｃｇａａｃ−３’（配列番号１１）を使用して、逆ＰＣＲによって増幅し、上流および下流ＣＡＴ遺伝子ホモロジアームを有する断片を得て、それを、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１と命名した。
８．制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＸｂａＩを使用して、ベクタＴｍ−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３断片を回収し、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストしたＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１断片によってリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成した。次いで、当該プラスミドを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。当該遺伝子組換えプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３と命名した。
９．テンプレートとしての遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３およびＣＡＴ遺伝子上流／下流プライマＣＡＴＵ／ＣＡＴＲを使用して、ＰＣＲ増幅を実施することにより、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットを得て、それをＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１と命名した。
１０．完全に構築した遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１を、塩化リチウム形質転換法を使用してウラシル栄養要求性Ｃ．トロピカリスＸＺＸに形質転換し、次いで、それをＭＭプレート上に適用した。当該形質転換体の増殖が完了した後、工程１および２の方法に従って単離した染色体ＤＮＡをＰＣＲ識別において使用し、正しい形質転換体として識別された菌株を菌株０１−１と命名した。当該ＰＣＲ識別プライマは、ＣＡＴＵおよびＣＡＴＲであった。ＭＭプレート上の形質転換体の総数は２８であり、識別された形質転換体の数は２４であり、正しい形質転換体として識別された形質転換体の数は６であり、遺伝子組換え効率は、１形質転換体／μｇＤＮＡであった（表１）。ＰＣＲ識別結果を図５に示す。
１１．菌株０１−１の単一のコロニをＳＭ液体培地に播種し、１３から１５のＯＤ600である指定された細胞濃度が達成されるまで、振盪フラスコにおいて３０℃および２００ｒｐｍにおいて培養した。次いで、当該細胞を希釈し、細胞濃度の統計的測定のためにＳＭプレートに適用し；それを、同時に、ＦＯＡプレートに適用して、３０℃で培養した。
１２．３日後、当該ＳＭプレートのカウントを計算し；５日後に、ＦＯＡプレートの突然変異株の数を計算し、単一のコロニを選んで、ＳＭ培養液に播種した。
１３．工程１および２の方法に従って単離した染色体ＤＮＡをＰＣＲによって識別した。ＰＣＲ識別プライマは、ＣＡＴＵおよび、ＣＡＴ遺伝子下流配列の外側からのプライマＣＡＴＬＤ：５’−ａａｔａｇａａａｃｔａｇｃａａｔｃｇｇａａ−３’（配列番号１２）であった。ＵＲＡ３マーカ遺伝子の欠失の成功を示す菌株を識別し、菌株０２と命名した。ＰＣＲを使用して、当該成功した菌株を識別し、これは、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ４８８−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１およびＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ポップアウトＵＲＡ３マーカ遺伝子の発現を有していた。ＤＮＡ配列決定により、マーカ遺伝子をポップアウトした後のＣＡＴ遺伝子座におけるＰＣＲ生成物ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ１−ＣＡＴＬＤの配列構造は、理論予測に一致し（２つの配列の同一性は９７．２３％であった）、同じ方向を有する２つのｇｄａ配列の間のマーカ遺伝子断片がポップアウトされていることが明らかとなった。当該結果はさらに、ｇｄａ４８８破壊カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別も示していた。元のバンドは、２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ１と、下流ホモロジアームの外側の１４５ｂｐのＤＮＡとを有する配列）は、１２７４ｂｐのサイズを有する。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。ＰＣＲ識別結果を図６に示す。
【００５３】
実施例２
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡ、プライマとして合成ｇｄａ３２４配列の上流プライマＵｇｄａ３２４：５’−ａａｃｔｇｃａｇａｃｔａａｇｃｔｔｃｔａｇｇａｃｇｔｃａｔ−３’（配列番号１３）および下流プライマＤｇｄａ（配列番号５）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ３２４配列（＋８３５から＋１１５８のＵＲＡ３遺伝子断片）（配列番号１４）を作製した。
２．ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを使用して、上記のｇｄａ３２４断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３をダブルダイジェストして、当該断片をリゲートすることにより、新規の遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｍ−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３と命名した。
３．ＰｓｔＩおよびＸｂａＩを使用して、ベクタＴｍ−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３断片を回収して、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストしたＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３と命名した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１を得た。
５．ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０に従って形質転換し、ＰＣＲ識別を実施した。ＰＣＲ識別結果を図７に示す。ＭＭプレート上の形質転換体の総数は１７であり、識別された形質転換体の数は１１であり、正しく形質転換されたとして識別された形質転換体の数は４であり、遺伝子組換え効率は、１．２４形質転換体／μｇＤＮＡであった（表１を参照のこと）。当該結果は、破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１（２４６４ｂｐのサイズを有する）の様々な形質転換体、ＰＣＲ生成物（ＵＲＡ３−ＣＡＴ１）が１９３１ｂｐのサイズを有する陽性形質転換体、特異的バンドを有さない偽陽性形質転換体、および破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の様々な形質転換体を明確に示していた。ＰＣＲの結果も、ＰＣＲ生成物（ＵＲＡ３−ＣＡＴ１）が１９３１ｂｐのサイズを有する陽性形質転換体を示した。テンプレートおよびコントロールとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用した。当該ＰＣＲプライマは、ＵＲＡＵ／ＣＡＴＲであった。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３に従って実施し、ＰＣＲ識別を行った。結果を図６に示す。マーカの左側のレーン１〜８は、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株である。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。
【００５４】
実施例３
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６染色体ＤＮＡ、プライマとして合成ｇｄａ２４５配列の上流プライマＵｇｄａ：５’−ａａｃｔｇｃａｇａａｔｇｇａｔｇｔａｇｃａｇｇｇａｔｇｇｔ−３’（配列番号１５）および下流プライマＤｇｄａ（配列番号５）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ２４５配列（＋９１４から＋１１５８のＵＲＡ３遺伝子断片）（配列番号１６）を作製した。
２．ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを、上記のｇｄａ２４５断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３のダブルダイジェストにおいて使用した。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｍ−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３と命名した。
３．ベクタＴｍ−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストした。当該ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３断片を回収し、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストしたＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３と命名した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１を得た。
５．ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０の方法に従って形質転換し、プライマＵＲＡＵ／ＣＡＴＲを用いてＰＣＲ識別を実施した。表７に示される識別結果は、ＭＭプレート上の形質転換体の総数は２１であり、識別された形質転換体の数は１２であり、正しく形質転換されたとして識別された形質転換体の数は９であり、遺伝子組換え効率は、２．２４形質転換体／μｇＤＮＡであることを示した（表１を参照のこと）。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３に従って実施し、Ｃ．トロピカリスにおけるＸＺＸ第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ２４５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトのＰＣＲ識別結果を図８に示しており、これは、当該ＰＣＲ生成物が、マーカ遺伝子のポップアウト後の理論的に予測されるバンドサイズと一致していることを示した。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。
【００５５】
実施例４
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６染色体ＤＮＡ、プライマとして合成ｇｄａ１４３配列の上流プライマＵｇｄａ１４３：５’−ａａｃｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｇａａｇｇｔａｔｔｃａｃｇｔａ−３’（配列番号１７）および下流プライマＤｇｄａ（配列番号５）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ１４３配列（＋１０１６から＋１１５８のＵＲＡ３遺伝子断片）（配列番号１８）を作製した。
２．ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを使用して、上記のｇｄａ１４３断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｍ−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３と命名した。
３．ベクタＴｍ−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩによってダブルダイジェストした。当該ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３断片を回収し、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストしたＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３と命名した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１を得た。
５．ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０の方法に従って形質転換して、ＰＣＲ識別を実施し、結果は、ＭＭプレート上の形質転換体の総数は３１であり、識別された形質転換体の数は２４であり、正しく形質転換されたとして識別された形質転換体の数は１１であり、遺伝子組換え効率は、１．９５形質転換体／μｇＤＮＡであることを示した（表１を参照のこと）。ＰＣＲ識別結果を図９に示す。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３の方法に従って実施し、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ１４３−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトのＰＣＲ識別結果は、ＰＣＲ生成物が、マーカ遺伝子のポップアウト後の理論的に予測されたバンドサイズと一致していることを示した。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。ＰＣＲ識別結果を図８に示す。
【００５６】
実施例５
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡ、プライマとして合成ｇｄａ３２５配列の上流プライマＵｇｄａ３２５：５’−ａａｃｔｇｃａｇｔｃｇｔｇａｔｔｇｇｇｔｔｃａｔｃｇｃ−３’（配列番号１９）および下流プライマＤｇｄａ３２５：５’−ｇｃｇｔｃｇａｃｃａａｔｇａｃｇｔｃｃｔａｇａａｇｃ−３’（配列番号２０）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ３２５配列（＋５３３から＋８５７のＵＲＡ３遺伝子断片）（配列番号２１）を作製した。
２．ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを使用して、上記のｇｄａ３２５断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｍ−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３と命名した。
３．ベクタＴｍ−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストした。当該ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３断片を回収し、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストしたＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３と命名した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１を得た。
５．ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０の方法に従って形質転換し、プライマＵＲＡＵ／ＣＡＴＲを用いてＰＣＲ識別を実施した（結果を図１０に示す）。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３の方法に従って実施し、ＰＣＲ識別結果は、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。特に、当該結果は、ｇｄａ３２５カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示した。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子）は、１８８１ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３遺伝子における＋８５８ｂｐから１１５８ｂｐまでの断片−ＣＡＴ１）は、１３３５ｂｐのサイズを有していた。ＰＣＲ識別（図１１に示される結果）は、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンドのサイズが理論予測と一致することを確認した。当該コントロールは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用したＰＣＲ生成物であり、１８８１ｂｐのサイズを有した（ＣＡＴ１遺伝子）。当該ＰＣＲ識別プライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＲであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。
【００５７】
実施例６
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡ、プライマとして合成ｇｄａ３０５配列の上流プライマＵｇｄａ３０５：５’−ｇｃｔｃｔａｇａｔｃｔａａｃｇａｃｇｇｇｔａｃａａｃｇａ−３’（配列番号２２）および下流プライマＤｇｄａ３０５：５’−ｃｇｇａａｔｔｃａｃｇｔｇａｃｔａｇｔａｔｇｇｃａａｔ−３’（配列番号２３）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ３０５配列（−４２０から−１１６のＵＲＡ３遺伝子断片）（配列番号２４）を作製した。
２．ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、上記のｇｄａ３０５断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｍ−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５と命名した。
３．ベクタＴｍ−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによってダブルダイジェストした。当該ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５断片を回収した。ＰｓｔＩおよびＸｂａＩを使用して、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１をダブルダイジェストした。次いで、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１およびｄｐｌ３０５−ＵＲＡ３断片の付着末端を満たすことにより、平滑末端ライゲーションを実施して遺伝子組換えプラスミドを得て、次いで、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５と命名した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１を得た。
５．当該ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０の方法に従って形質転換して、ＰＣＲ識別を実施し、識別結果は、遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３２５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１（実施例５）およびＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊を示した。次の工程のために、成功した形質転換体（真陽性）を選択した。ＰＣＲ識別結果を図１０に示す。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３の方法に従って実施し、ＰＣＲ識別結果は、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を破壊カセットＣＡＴ１−ｇｄａ３０５−ＵＲＡ３−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。特に、当該結果は、ｇｄａ３０５カセットによるＵＲＡ３のポップアウトの識別を示した。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子）は、１８８１ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子がポップアウトされた後のバンド（ＣＡＴ１−ｇｄａ３０５−ＣＡＴ１）は、９９３ｂｐのサイズを有した。ＰＣＲ識別は、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンドの長さが理論予測と一致することを確認した。当該コントロールは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用したＰＣＲ生成物であり、１８８１ｂｐのサイズを有した（ＣＡＴ１遺伝子）。当該ＰＣＲ識別プライマは、ＣＡＴＩ／ＣＡＴＲであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。ＰＣＲ識別結果を図１１に示す。
【００５８】
実施例７
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１の形質転換によるＣ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ遺伝子の破壊
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡ、プライマとして合成ｇｄａ３０２配列の上流プライマＵｇｄａ３０２：５’−ｇｃｔｃｔａｇａｃａｔａｃａｃａｇａａａｇｇｇｃａｔｃ  −３’（配列番号２５）および下流プライマＤｇｄａ３０２：５’−ｃｇｇａａｔｔｃｇｔａｃｔｇｃａａｃａｔｃａｃｇｇ  −３’（配列番号２６）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施して、ｇｄａ３０２配列（＋１７から＋３１８のＵＲＡ３遺伝子断片）（配列番号２７）を作製した。
２．ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、上記のｇｄａ３０２断片および遺伝子組換えベクタＴｍ−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｍ−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２と命名した。
３．ベクタＴｍ−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによってダブルダイジェストした。当該ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２断片を回収した。ＰｓｔＩおよびＸｂａＩを使用して、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１をダブルダイジェストした。次いで、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１およびＵＲＡ３−ｇｄａ３０２断片の付着末端を満たすことにより、平滑末端ライゲーションを実施して遺伝子組換えプラスミドを得て、次いで、それを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２と命名した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１を得た。
５．当該ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０の方法に従って形質転換し、ＰＣＲ識別を実施し、この場合、当該識別結果は、遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊の成功を示した。偽陽性形質転換体（元のＣＡＴ１遺伝子）のバンドは、１８８１ｂｐのサイズを有し、陽性形質転換体または破壊カセット統合形質転換体（ＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１）は、２５２１ｂｐのバンドサイズを有した。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＲであった。ＰＣＲ識別結果を図１２に示す。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３の方法に従って実施し、ＰＣＲ識別結果は、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ＵＲＡ３−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。全てのレーンが、マーカ遺伝子のポップアウトの成功した菌株を示している。元のバンド（ＣＡＴ１遺伝子の配列および下流配列）は、２０２６ｂｐのサイズを有した。マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ＵＲＡ３遺伝子の−４２３ｂｐから＋１６ｂｐまで−ｇｄａ３０２−ＣＡＴ１および下流配列）は、１４２５ｂｐのサイズを有した。使用したコントロールは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ生成物であり、２０２６ｂｐのサイズ（ＣＡＴ１遺伝子および下流配列）を有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＬＤであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。ＰＣＲ識別結果を図１３に示す。
【００５９】
比較例１
遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊
１．ｈｉｓＧ断片の単離：ＰＣＲ増幅を、２対のプライマｈｉｓＧ−Ｆ１：５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃｔｔｃｃａｇｔｇｇｔｇｃａｔｇａａｃｇｃ−３’（配列番号２８）およびｈｉｓＧ−Ｒ１：５’−ｃｇｃｇｇａｔｔｃｇｃｔｇｔｔｃｃａｇｔｃａａｔｃａｇｇｇｔ−３’（配列番号２９）ならびにｈｉｓＧ−Ｆ２：５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔｔｃｃａｇｔｇｇｔｇｃａｔｇａａｃｇｃ−３’（配列番号３０）およびｈｉｓＧ−Ｒ２：５’−ａａｃｔｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｃｃａｇｔｃａａｔｃａｇｇｇｔ−３’（配列番号３１）を使用して実施した。ＰＣＲを、テンプレートとしてプラスミドｐＣＵＢ６を使用して、Ｋｏら（２００６）において教示されるように実施して、２つの１１ｋｂのｈｉｓＧ断片を得た。これらを以下のように命名した：
・ｈｉｓＧ１（配列番号３２）、この場合、２つの末端はＥｃｏＲＩおよびＢａｍ  ＨＩ制限酵素の遺伝子座を有する；および
・ｈｉｓＧ２（配列番号３３）、この場合、２つの末端はＳａｌＩおよびＰｓｔＩ制限酵素の遺伝子座を有する。
２．制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ  ＨＩを使用して、ｈｉｓＧ１断片を消化し、次いで、当該消化した断片を、同じ酵素で消化したＴｍ−ＵＲＡ３プラスミドに挿入して、遺伝子組換えプラスミドＴｍ−ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３を得た。
３．制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを使用して、ｈｉｓＧ１断片を消化し、次いで、当該消化した断片を、同じ酵素で消化したＴｍ−ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３プラスミドに挿入して、Ｔｍ−ＨＵＨと略される、遺伝子組換えプラスミドＴｍ−ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ２を得た。
４．ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、当該遺伝子組換えプラスミドＴｍ−ＨＵＨをダブルダイジェストし、ゲル再生（gel recycling）を使用して、ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ２断片を得て；ＰｓｔＩおよびＸｂａＩを使用して、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１をダブルダイジェストし；次いで、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＣＡＴ１−Ｔｓ−ＣＡＴ１およびｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ２断片の付着末端を満たすことにより、平滑末端ライゲーションを実施して遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ２を得た。
５．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ１−ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ２を使用して、実施例１の工程９の方法に従ってＰＣＲ増幅を実施して、第１のＣＡＴ対立遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ１−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ２−ＣＡＴ１を得た。
６．当該ＸＺＸ菌株を実施例１の工程１０の方法に従って形質転換し、ＰＣＲ識別を実施し、この場合、当該識別結果は、遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の形質転換による、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子の破壊を示した。陽性形質転換体または遺伝子破壊カセット統合形質転換体（ｈｉｓＧ１）のＰＣＲ増幅バンドは、１１４９ｂｐのサイズを有した。使用したＰＣＲプライマは、Ｈｉｓ−Ｆ１およびＨｉｓ−Ｒ１であった。ＰＣＲ識別結果を図１４に示す。
７．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３の方法に従って実施し、この場合、ＰＣＲ識別結果は、Ｃ．トロピカリスＸＺＸにおける第１のＣＡＴ対立遺伝子を遺伝子破壊カセットＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の形質転換によって破壊した後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。全てのレーンは、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株を示している。元のバンドは２０２６ｂｐのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド（ＣＡＴ１−ｈｉｓＧ−ＣＡＴ１の配列および１つのＣＡＴ１遺伝子の下流配列）は、２０７８ｂｐのサイズを有した。当該コントロールは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを使用し、２０２６ｂｐのサイズを有した（ＣＡＴ１遺伝子および１つの下流配列）。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴＵ／ＣＡＴＬＤであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表２に示す。ＰＣＲ識別結果を図１５に示す。
【００６０】
実施例８
遺伝子破壊カセットＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２の形質転換による、Ｃ．トロピカリス０２における第２のＣＡＴ対立遺伝子の破壊（ＵＲＡ３／ＵＲＡ３、ｃａｔ：：ｇｄａ３２４／ＣＡＴ）
１．テンプレートとしてＣ．トロピカリスＡＴＴＣ２０３３６の染色体ＤＮＡ、プライマとしてＣＡＴ２上流プライマＣＡＴ２ｎｄＵ：５’−ｃｔｇａａｇｇｃｔｃｃｇａｃａｔｃａｃｃ−３’（配列番号３４）およびＣＡＴ２下流プライマＣＡＴ２ｎｄＲ：５’−ｃａａｃｃｔｔｇｔｃｇｇｃｇｃｔｇｃｔａ−３’（配列番号３５）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施してＣＡＴ２断片（配列番号３６）を作製し、その後に、それを市販のベクタであるｐＭＤ１８−Ｔ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒに結合させて遺伝子組換えプラスミドを得て、それを増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。当該遺伝子組換えプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ２と命名した。
２．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ２、プライマとして逆ＰＣＲの上流プライマｒＣＡＲ２ｎｄＵ：５’−ａａｃｔｇｃａｇａｔｃｔｇｔｔｔｔｇａｃｃｇｔｃｃｃｃｇｔｇ−３’（配列番号３７）および下流プライマｒＣＡＴ２ｎｄＲ：５’−ａａｃｔｇｃａｇａｔｃｔｇｔｔｔｔｇａｃｃｇｔｃｃｃｃｇｔｇ−３’（配列番号３８）を使用して、逆ＰＣＲ増幅を実施して、上流および下流ＣＡＴ２遺伝子ホモロジアームを有する断片を得て、それを、ＣＡＴ２−Ｔｓ−ＣＡＴ２と命名した。
３．ＰｓｔＩおよびＸｂａＩを使用して、ベクタＴｍ−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３をダブルダイジェストした。当該ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３断片を回収し、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでダブルダイジェストしたＣＡＴ２−Ｔｓ−ＣＡＴ２断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、このプラスミドをＴｓ−ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３と命名した。当該プラスミドを、増幅のために大腸菌ＪＭ１０９に導入した。
４．テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドＴｓ−ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３、プライマとしてＣＡＴ２遺伝子断片の上流および下流プライマＣＡＴ２ｎｄＵおよびＣＡＴ２ｎｄＲを使用して、ＰＣＲ増幅を実施することにより、第２のＣＡＴ対立遺伝子を得て、それをＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２と命名した。
５．実施例１からの菌株０２を、実施例１の工程１０の方法に従って形質転換し、プライマとしてＣＡＴ２ｎｄＵおよびＣＡＴＲを使用してＰＣＲ識別を実施することにより、遺伝子破壊カセットＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２の形質転換によるＣ．トロピカリス０２における第２のＣＡＴ対立遺伝子（ＵＲＡ３／ＵＲＡ３、ｃａｔ：：ｇｄａ３２４／ＣＡＴ）の破壊に成功した菌株を識別した。破壊カセット統合形質転換体は、３０２７ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅バンド（ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２−ＣＡＴ２の下流ホモロジアームからＣＡＴ１の下流ホモロジアームの断片−ＣＡＴ１）を有する。使用するコントロールは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体ＤＮＡを用いるＰＣＲ生成物（ＣＡＴ２遺伝子上流ホモロジアームからＣＡＴ１下流ホモロジアームのＣＡＴ遺伝子断片）であり、１３１２ｂｐのサイズを有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴ２ｎｄＵ／ＣＡＴＲであった。ＰＣＲ識別結果を図１６に示す。
６．マーカ遺伝子の欠失を、実施例１の工程１１〜１３の方法に従って実施し、ＰＣＲ識別を、プライマとしてＣＡＴ２ｎｄＵおよびＣＡＴＲを用いて実施した。ＰＣＲ識別の際、Ｃ．トロピカリス０２における第２のＣＡＴ対立遺伝子が遺伝子破壊カセットＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＵＲＡ３−ＣＡＴ２の形質転換によって破壊された後の、ＵＲＡ３マーカ遺伝子のポップアウトが識別された。全てのレーンは、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株を示している。マーカ遺伝子のポップアウトされたバンド（ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ２−ＣＡＴ２下流ホモロジアームとＣＡＴ１下流ホモロジアームとの間の断片−ＣＡＴ１）は、１４４４ｂｐのサイズを有した。使用したコントロールは、テンプレートとしてＣ．トロピカリスＸＺＸの染色体を用いたＰＣＲ生成物であり、１３１２ｂｐのサイズの元のバンド（ＣＡＴ２上流ホモロジアームからＣＡＴ１下流ホモロジアームの間のＣＡＴ１遺伝子断片）を有する。当該ＰＣＲプライマは、ＣＡＴ２ｎｄＵ／ＣＡＴＲであった。マーカ遺伝子のポップアウトは、配列決定によって検証した。ＰＣＲ識別結果を図１７に示す。
【００６１】
マーカ遺伝子が実施例１に従ってポップアウトされた後のＣＡＴ遺伝子座におけるＰＣＲ生成物ＣＡＴ１−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ１−ＣＡＴＬＤの配列決定により、単一ＣＡＴ対立遺伝子の２つのＣＡＴ１ホモロジアームの間に断片の欠失が存在し、当該欠失した断片がｇｄａ配列で置き換えられていることが明らかとなった。これは、配列比較を行うことによって確認した。したがって、ＣＡＴ配列のこの単一コピーの破壊が分子レベルで確認され、ならびに、マーカ遺伝子のポップアウトのプロセスでは、同じ方向を有する２つのｇｄａ配列の間のＵＲＡ３遺伝子断片のみがポップアウトされることも確認された（当該２つのｇｄａ配列において、一方のｇｄａ配列はＵＲＡ３遺伝子に存在し、他方のｇｄａ配列は、遺伝子破壊カセットに由来し、当該２つの配列は正確に同じである）。マーカ遺伝子が実施例８に従ってポップアウトされた後のＣＡＴ遺伝子座におけるＰＣＲ生成物ＣＡＴ２−ｇｄａ３２４−ＣＡＴ２−ＣＡＴ１の配列決定は、当該ＰＣＲ生成物の配列が理論予測による配列と一致し（２つの配列の同一性は９７．０５％であった）、当該２つのＣＡＴ２ホモロジアームの間の断片のみが、ｇｄａ断片によって置き換えられていることを示した。したがって、２コピーＣＡＴ対立遺伝子破壊を、分子レベルにおいてさらに検証し、それにより、使用した遺伝子破壊カセットがＣ．トロピカリスの２コピーおよび多重遺伝子破壊にとって好適であり得ることが示しされた。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
表１に示された統計的結果から、ｇｄａ１４３、ｇｄａ２４５、ｇｄａ３２４、ｇｄａ４８８を使用した遺伝子破壊カセットの形質転換／組み換え効率は、先行技術の遺伝子破壊カセット（ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ）より１桁高かったことが分かる。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
表２に示される統計結果から、遺伝子破壊カセットのｇｄａ断片の長さが１４３ｂｐの場合に、ＵＲＡ３遺伝子は効率的にポップアウトされることが分かる。ｇｄａ断片が３００ｂｐより長い場合、ＵＲＡ３遺伝子のポップアウト効率は、著しく高く、従来のＨｉｓＧ破壊カセットに匹敵し、さらに、Ｃ．トロピカリス遺伝子破壊の効率全体を向上させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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