(57)【要約】  本発明は、サンプルの逸脱状態の決定を含む核酸ベースの診断アプローチのための方法およびデバイスに関し、このとき、逸脱状態とは好ましくは健康状態および/または病原性状態である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(a) サンプル供給源由来の少なくとも1種の特異的核酸を含むサンプルを提供するステップ、
(b) 該特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットを含むデータベースを提供するステップであって、該データセットが、対照群での該特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率を示す、上記ステップ、
(c) 該サンプル中の該少なくとも1種の核酸を配列決定して該サンプル中の該少なくとも1種の特異的核酸の正体および存在量を決定するステップ、
(d) ステップ(c)で決定される該少なくとも1種の特異的核酸の正体を、ステップ(b)で提供される該データベースのデータセットに割り当てるステップであって、該データセットは、ステップ(c)で決定される同じ特異的核酸に関連している、上記ステップ、
(e) ステップ(c)に従って決定される該サンプルの該少なくとも1種の特異的核酸の該存在量およびステップ(b)で提供される同じ特異的核酸の該少なくとも1種の特定の存在量の該出現についての該確率に基づいて、該サンプルの逸脱状態を示す有意性スコアを計算するステップ
を含む、サンプルの逸脱状態の決定のための方法。
【請求項２】
逸脱状態が、病原性状態および/または健康状態、好ましくは病原性状態である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
(a) サンプル供給源由来の少なくとも1種の特異的核酸を含むサンプルを提供するステップ、
(b) 該特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットを含むデータベースを提供するステップであって、該データセットが、対照群での該特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率を示す、上記ステップ、
(c) 該サンプル中の少なくとも1種の核酸を配列決定して該サンプル中の該少なくとも1種の特異的核酸の正体および存在量を決定するステップ、
(d) ステップ(c)で決定される該少なくとも1種の特異的核酸の正体を、ステップ(b)で提供される該データベースのデータセットに割り当てるステップであって、該データセットは、ステップ(c)で決定される同じ特異的核酸に関連している、上記ステップ、
(e) ステップ(c)に従って決定される該サンプルの該少なくとも1種の特異的核酸の該存在量およびステップ(b)で提供される該対照群での同じ特異的核酸の該少なくとも1種の特定の存在量の該出現についての該確率に基づいて、該サンプルの病原性状態を示す有意性スコアを計算するステップ
を含む、サンプルの病原性状態の決定のための方法。
【請求項４】
特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットが、該特異的核酸、または該特異的核酸に類似する核酸、または同じ起源に由来する核酸を意味する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル供給源が、生物体、好ましくはヒト生物体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが、全血、血清、血漿、体液（liquor）、尿、組織、唾液、糞便または洗浄液からなる群より選択されるサンプル供給源から、好ましくは血漿の無細胞画分から取得される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが血漿である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
配列決定ステップが、分子的ハイスループット配列分析により行なわれる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
病原性状態が、少なくとも1種のウイルス、細菌、真菌または寄生生物の核酸の出現により、または病原的な量の該核酸により特徴付けられる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
健康状態が、少なくとも1種の癌細胞の核酸の出現により、または閾値を超える量の該核酸により特徴付けられる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
病原性状態が、移植物の拒絶された細胞の出現により、または閾値を超える量の該拒絶された細胞により特徴付けられる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
病原性状態が、抗生物質抵抗性を示すものである核酸の出現により、または病原的な量の該核酸により特徴付けられる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が、ステップ(c)に先立って富化されない、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(c)に続いて、かつステップ(d)に先立って、核酸配列の分類が行なわれる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
対照群が、非逸脱状態、健康な状態または非病原性状態により特徴付けられる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
対照群が、徴候特異的状態（indication specific condition）により特徴付けられる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
逸脱または疾患の診断のための方法であって、逸脱または疾患の診断を可能にするサンプルの病原性状態を決定する請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法が行なわれる、上記方法。
【請求項１８】
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法を行なうためのデバイスであって、サンプルの逸脱状態および/または病原性状態を示す有意性スコアが、ステップ(c)に従って決定される前記少なくとも1種の特異的核酸の前記存在量およびステップ(b)で提供される前記対照サンプルでの同じ特異的核酸または少なくとも1種の第2の特異的核酸の前記少なくとも1種の特定の存在量の前記出現についての前記確率に基づいて、該デバイスの中央処理装置により計算される、上記デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルの逸脱状態の決定を含む核酸ベースの診断アプローチのための方法およびデバイスに関し、このとき、逸脱状態とは好ましくは健康状態および/または病原性状態である。
【背景技術】
【０００２】
サンプルでの逸脱状態、特に健康状態または病原性状態の、信頼性が高くかつ迅速な検出および特性決定は、それを必要とする被験体での疾患の発生の防止または治療のために最も重要である。サンプルの健康状態または病原性状態は、複合的疾患または感染症などの、進行中または既存の疾患の指標を表わす。
【０００３】
感染症は、集中治療医学での課題であり続けている。この数十年間、感染症の発生率は継続的に増加していることが示された。研究での大規模な努力にもかかわらず、新規の治療アプローチは稀であり、感染症を有する患者での死亡率は依然として容認できないほど高いままである。早期の病巣の管理に加えて、近年のガイドラインは、敗血症の診断からできるだけ早い、好ましくは1時間以内での経験的抗生物質療法の開始を推奨している。しかしながら、原因となる病原体ならびにその抵抗性パターンの同定は、抗微生物薬治療レジメンの早期の最適化に対して非常に重要である。これに関して、培養に基づく診断手順、例えば、血液培養は、重要な欠点、特に(i)微生物の増殖に依存して、結果が入手可能になるまで最大で5日間かかることが多いこと、および(ii)培養に基づく診断手順は、多くの場合、経験的抗生物質療法の投与に起因する偽陰性結果を生じることを伴うことが公知であるが、最大の標準的治療として知られている。
【０００４】
したがって、感染症を罹患している患者は、抗微生物剤の過剰治療、抗生物質に関連する毒性および広スペクトルの抗生物質の不適切かつ長期の使用に起因する多剤抵抗性病原体の選択に関する高いリスクを有する。これに関して、培養に依存しない分子的診断手順、例えば、PCRベースの技術が、感染症患者での原因となる病原体の同定のために既に導入されている。国際公開第2012/135815号は、被験体体内の病原体に由来する標的核酸を検出するための方法を開示している。該方法は、(a)被験体由来の血液サンプルの無細胞画分から得られる標的核酸の核酸配列を増幅するステップ、および(b)二本鎖DNAを検出するステップを含む。二本鎖DNAの存在は、被験体体内での標的核酸の存在を示す。
【０００５】
しかしながら、不明瞭な結果の発生ならびに患者のサンプル中の細菌量の定量的測定および抗生物質抵抗性マーカーの検出での制限が、これらのPCRベースの診断アプローチの公知の弱点である。同定された生物体が感染症の病因であるか否か、または混合感染があり得るか否かははっきりしないままである。感染症の特定に関して種々の標的化された分子検査が利用可能であるが、時間がかかる血液培養アプローチが未だに最も標準的である。
【０００６】
つまり、逸脱状態、特に病原体、例えば微生物またはウイルスの被験体での存在の、迅速かつ効率のよい定性的および定量的検出ならびに決定は、微生物学的分析および診断での大きな挑戦である。このことは、多数の具体的な病原体を別々に分析するための時間のかかる分析を防止する、総合的に病原体を網羅する被験体の完全な健康状態または病原性状態を検出する分析および診断に、より一層当てはまる。
【０００７】
つまり、疾患に対して関連性が高い、生物学的サンプル中の、特に感染中の微生物およびウイルスの特定に関する十分に感度が高い迅速かつ効率のよい診断アプローチに対する強い必要性が未だに存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2012/135815号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の基礎となる技術的課題は、上記で特定された欠点および短所を克服する、特に、被験体での重要な病原体の定量的および定性的決定のための、迅速かつ効率がよく、信頼性が高く、正確かつ感度が高い方法である、被験体での、特に重要な病原体の、逸脱状態、特に健康状態または病原性状態の定量的および定性的決定のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の技術的課題は、特に、独立項の発明により解決される。
【００１１】
本発明は、特に、以下のステップを含み、特に以下のステップからなる、サンプルの逸脱状態の決定のための方法およびデバイスに関する：
(a) サンプル供給源由来の少なくとも1種の特異的核酸を含むサンプルを提供するステップ、
(b) 該特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットを含むデータベースを提供するステップであって、該データセットは対照群での該特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率を示す、上記ステップ、
(c) 該サンプル中の該少なくとも1種の核酸を配列決定して該サンプル中の該少なくとも1種の特異的核酸の正体および存在量を決定するステップ、
(d) ステップ(b)で提供されたデータベースのデータセットに、ステップ(c)で決定された該少なくとも1種の特異的核酸の正体を割り当てるステップであって、該データセットは、ステップ(c)で決定された同じ特異的核酸に関連する、上記ステップ、
(e) ステップ(c)に従って決定された該サンプルの該少なくとも1種の特異的核酸の存在量およびステップ(b)で提供された同じ特異的核酸の該少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率に基づいて、該サンプルの逸脱状態を示す有意性スコアを計算するステップ。
【００１２】
好ましくは、プロセスステップの順序は(a)、(b)、(c)、(d)および(e)であるか、または、別の実施形態では、(b)、(a)、(c)、(d)および(e)である。さらなる好ましい実施形態では、ステップ(b)に従うデータベースは、ステップ(c)の後に提供される。
【００１３】
好ましくは、逸脱状態とは、健康状態および/または病原性状態である。
【００１４】
好ましくは、逸脱状態とは、病原性状態である。本発明は、好ましくはまた、以下のステップを含む、サンプルの病原性状態の決定のための方法に関する：
(a) サンプル供給源由来の少なくとも1種の特異的核酸を含むサンプルを提供するステップ、
(b) 該特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットを含むデータベースを提供するステップであって、該データセットは対照群での該特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率を示す、上記ステップ、
(c) 該サンプル中の該少なくとも1種の核酸を配列決定して該サンプル中の該少なくとも1種の特異的核酸の正体および存在量を決定するステップ、
(d) ステップ(b)で提供されたデータベースのデータセットに、ステップ(c)で決定された該少なくとも1種の特異的核酸の正体を割り当てるステップであって、該データセットは、ステップ(c)で決定された同じ特異的核酸に関連する、上記ステップ、
(e) ステップ(c)に従って決定された該サンプルの該少なくとも1種の特異的核酸の存在量およびステップ(b)で提供された対照群での同じ特異的核酸の該少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率に基づいて、該サンプルの病原性状態を示す有意性スコアを計算するステップ。
【００１５】
したがって、本発明は、その特異的核酸の出現、存在量または出現および存在量が、該サンプルの逸脱状態、好ましくは病原性状態を潜在的に示すものである、サンプル中の少なくとも1種の特異的核酸が、その方法に従って配列決定され、データベースのデータセットに割り当てられ、該データセットが対照群中の同じ特異的核酸および/または対照群中の該特異的核酸に関連する核酸の出現および存在量に対するデータを含み、かつ対照群に由来する該特異的核酸に関連するデータセットが有意性スコアを計算するために用いられ、このとき、該有意性スコアは、該サンプルの逸脱状態、好ましくは病原性状態を示す、サンプルの逸脱状態、好ましくは病原性状態の決定のための方法を提供する。
【００１６】
つまり、ステップ(c)で配列決定および特定されるサンプル中に存在する少なくとも1種の特異的核酸の、出現、存在量またはその両方が、対照群に存在する該特異的核酸または該特異的核酸に関連する核酸の出現、存在量またはその両方に対する、ステップ(b)に従ってデータベースにより提供される知識と計算上で組み合わせられ、それにより、好ましくはサンプル中の病原体の存在を示すものである、逸脱状態、好ましくは病原性状態が示される。ステップ(b)で提供されるデータベースは、対照群での該特異的核酸および/または該特異的核酸に関連する核酸の、出現および存在量を好ましくは通知し、かつそこから特定の存在量、好ましくはいずれかの存在量の出現の確率が得られるデータを含む少なくとも1種のデータセットを提供する。ステップ(b)で提供される少なくとも1種のデータセットは、好ましくは、対応する、すなわち、対照群で特定される、同じかもしくは少なくとも類似する核酸、または特異的核酸に関連する核酸に対する、ステップ(c)で特定される特異的核酸のステップ(d)での割り当てを可能にし、特に、対照群中の同じかもしくは少なくとも類似する核酸、または特異的核酸に関連する核酸に対して、およびそれにより、対照群での該核酸の出現、存在量（数または量とも称される）またはその両方に関するデータを含むデータセットに対して、ステップ(c)で特定される核酸の正体を割り当てることを可能にする。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットとは、特異的核酸または特異的核酸に類似する核酸または同じ起源に由来する核酸を意味する。
【００１８】
好ましい実施形態では、ステップ(c)で特定されるサンプル由来の特異的核酸は、少なくとも73％、好ましくは少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％の類似性を有し、より好ましくは全く同じである、対照群で特定される核酸のデータセットに対して、ステップ(d)で割り当てられる。好ましい実施形態では、ステップ(c)で特定される特異的核酸は、同じ生物種の、ステップ(b)で提供されるデータセットに対して、ステップ(d)で割り当てられる。
【００１９】
あるいは、ステップ(b)で提供される少なくとも1種のデータセットは、好ましくは、ステップ(c)で特定される特異的核酸に関連する少なくとも1種の核酸に対する、ステップ(c)で特定される特異的核酸のステップ(d)での割り当てを可能にする。
【００２０】
ステップ(b)で提供される少なくとも1種のデータセットは、ステップ(c)で特定される特異的核酸に関連する。このことは、ステップ(b)で提供される少なくとも1種のデータセットが、ステップ(c)で特定されるサンプル由来の特異的核酸についての、類似する核酸についての、かつ/またはステップ(c)で特定される特異的核酸に関連する少なくとも1種の核酸についてのデータを提供することを意味する。
【００２１】
ステップ(c)で特定される特異的核酸に関連する核酸は、好ましくは、同じ起源、特に同じ特異的かつ関連付け可能な起源を有する核酸であり、すなわち、両方とも同じ起源、例えば、同じ微生物、ウイルス、真菌生物または癌細胞のタイプに由来する。
【００２２】
データベースは、好ましくは、ステップ(c)で特定される特異的核酸の起源についての情報を提供する。さらに、データベースは、好ましくは、少なくとも1種のデータセットを提供し、該データセットは、対照群での特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率を示す。このデータセットは、ステップ(c)で特定される特異的核酸についての情報、および/または類似する核酸についての情報および/またはステップ(c)で特定される特異的核酸に関連する核酸についての情報のいずれかに基づく。
【００２３】
前記割り当ては、サンプル中に見出される少なくとも1種の特異的核酸の正体および存在量を、対照群での該特定される特異的核酸に関する該特定される存在量の出現についての確率と比較することを可能にし、したがって、逸脱状態に関するサンプル中の特定されかつ定量的に測定される核酸に対する有意性を示す有意性スコアを提供することを可能にする。好ましい実施形態では、データベースは核酸データベースであり、好ましくは、データベースは対照群での少なくとも1種の特異的核酸の確率分布を提供する。好ましい実施形態では、データベースは、特異的核酸の逸脱関連性または病原的関連性についての情報を提供する。
【００２４】
つまり、本発明は、逸脱状態、好ましくは病原性状態を決定するために、サンプル中の少なくとも1種の特異的核酸の出現、存在量、ならびに/または出現および存在量に関する、配列決定ステップ(c)により提供されるデータを使用し、このとき、該決定はさらに、特異的核酸に関連する少なくとも1種のデータセットを含むステップ(b)で提供されるデータベースを使用し、該データセットは、対照群での特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量、好ましくは多数の存在量、好ましくはいずれかの存在量の出現についての確率を示す。サンプル中の特異的核酸の出現および存在量を決定するステップならびに該データを対照群由来のデータセットに含まれる上記で特定されるデータと比較するステップであって、該データセットが、ステップ(c)で特定されるサンプル中の特定される特異的核酸の特定される存在量の出現についての確率をはじめとする、サンプル中で見出される該特異的核酸配列の多数の存在量の出現についての確率に関するデータを含む、上記ステップは、有意性スコアを計算することを可能にし、すなわち、サンプル中に提供される該核酸の出現、存在量、または出現および存在量が、逸脱状態、例えば病原性状態に関連性があるか否かを結論付けることを可能にする。対照群での該核酸または該核酸に関連する核酸の出現、存在量または出現および存在量と比較して、配列決定されかつ特定される少なくとも1種の核酸の出現、存在量または出現および存在量がより有意であれば、逸脱状態が存在している可能性がより高くなる。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明は、サンプルの逸脱状態、好ましくは病原性状態の決定のための方法を提供し、このとき、サンプル供給源由来の、少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、好ましくは少なくとも3種、好ましくは少なくとも4種、好ましくは少なくとも5種、好ましくは少なくとも6種、好ましくは少なくとも10種、好ましくは少なくとも20種、好ましくは少なくとも30種、好ましくは少なくとも50種、好ましくは少なくとも100種もしくは好ましくは少なくとも200種以上または多数の核酸、好ましくは少なくとも500種、好ましくは少なくとも1000種、好ましくは少なくとも5000種、好ましくは少なくとも10000種、好ましくは少なくとも50000種、好ましくは少なくとも100000種の核酸が、ステップ(c)で配列決定され、データベースの、特に、それらのうちのそれぞれがステップ(d)でのサンプル由来の特定される特異的核酸に対応する対照群の特異的核酸に関連する、少なくとも対応する数のデータセットを含むデータベースの少なくとも1種のデータセットに割り当てられ、かつ有意性スコアがステップ(e)で計算される。
【００２６】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、サンプル中のすべての核酸、好ましくはサンプル中の非ヒト起源のすべての核酸をステップ(c)で配列決定し、続いて、それらのうちのそれぞれがステップ(d)でのサンプル由来の特定される特異的核酸に対応する対照群に存在する核酸に関連する、少なくとも対応する数のデータセットを含むデータベース由来のデータセットに対して、該核酸の正体を割り当て、かつステップ(e)では有意性スコアを計算する。
【００２７】
つまり、本発明の方法は、有利なことに、サンプルのすべての核酸を配列決定し、かつそれに対して正体を割り当てることを可能にする。
【００２８】
有利なことに、本発明の方法は、サンプル中の少なくとも1種の核酸の定量的検出、すなわち、サンプル中でのその存在量の決定を、その存在量が好ましくはサンプル中の少なくとも1種の微生物、ウイルスおよび/または癌細胞を示すものであり、好ましくは、その存在量が、対照群と、好ましくは健康な対照群と比較して増加している、該少なくとも1種の核酸の存在量の確率的解釈と組み合わせる。病原体の単なる存在は、常にかつ必然的に疾患の原因であるか、または疾患により引き起こされるものではないから、サンプル中の様々な生物種（好ましくは、病原体）の存在量を対照群と比較することができ、したがって、逸脱状態（好ましくは、病原性状態）に関する所定の生物種（好ましくは、病原体）の関連性を決定することができる。方法はまた、サンプル中のすべての微生物、ウイルスおよび/または癌細胞（好ましくは、病原体）の量についての情報を提供し、かつ、異常な出現または出現の異常な存在量により表わされる逸脱状態の異常性（好ましくは、特異的な病原体の異常性）を示す。
【００２９】
本発明の通りのワークフローは、有利なことには、特異的プライマー設計を必要としないデータ分析に基づいて、事前の徴候を有しない被験体の状態を特定し、かつ1回のアッセイで微生物、ウイルスおよび/または癌細胞、ならびに被験体の逸脱状態を検出する機会を提供する。
【００３０】
本発明の通りのワークフローは、特に、特異的プライマー設計を必要としないデータ分析に基づいて、事前の徴候を有しない被験体の状態を特定し、かつ1回のアッセイで病原体（好ましくは細菌性、真菌性およびウイルス性病原体）、および被験体の健康状態を検出する機会を提供する。したがって、本発明の方法は、好ましくは、核酸の定性的および定量的分析と、それに対して有意性を割り当てることを組み合わせることにより、サンプル中の（特に、関連性の高い病原体の）逸脱状態を決定することができる。
【００３１】
有利なことに、方法は、バイアスのない核酸の配列分析に基づく完全な診断ワークフローを提供することにより、被験体での（特に、関連性の高い病原体の、好ましくは感染性病原体の）逸脱状態の、迅速かつ効率がよく、感度の高い決定を可能にする。好ましい実施形態では、方法は、サンプルでの逸脱状態の決定を可能にし、該逸脱状態は、サンプル中の多数の異なる病原体の出現により特徴付けられ、このことは、混合型感染症の特定を可能にする。
【００３２】
本方法は、対照群から得られる結果と比較することにより評価される定量的結果を含めることにより、特定される微生物、ウイルスおよび/または、好ましくは病原体が、感染または汚染に対して関連性があるか否かについての情報を提供し、このとき、感染または汚染に対して関連性がある生物が測定される。少なくとも1種の病原体のこの効率的かつ特異的な特定は、数日間の微生物の培養に依存せず、つまり、はるかに迅速である。適切でない増殖条件の選択に起因して、潜在的な病原体が検出および特定されないというリスクはない。さらに、本方法は、定性的な出現を意味する出現のみ、すなわち、病原体が検出可能であるか否かのみを考慮するのでなく、病原体の存在量もまた考慮し、それにより、そのような病原体の出現の存在量が、潜在的な逸脱状態、好ましくは潜在的な病原性状態を実際に示すか否かを格付けすることを可能にする。一連の潜在的病原体を網羅することはまた、被験体で同時に生じる数種類の疾患（例えば、混合型感染症）を特定することも可能にする。このことは、確かな症状の徴候がなく、したがって探索すべき微生物、ウイルスまたは疾患が開始時に明らかでない場合に、被験体の診断に対して特に重要である。
【００３３】
本発明に従えば、好ましくはシーケンシングにより、より好ましくはハイスループットシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング（NGS））により、患者（例えば、感染患者）のサンプル（好ましくは、血漿サンプル）由来の核酸（好ましくは、遊離血中DNA（cfDNA））のバイアスのない配列分析に基づく、例えば、感染性微生物により引き起こされる逸脱状態の決定のための、改善された方法、好ましくは診断方法、およびデバイスが提供される。血液培養に基づく分析手順と比較した、7名の感染患者、腹部大手術後の6名の非感染患者ならびに12名の健康なボランティア（対照として）での菌血症の早期検出およびモニタリングに対する本教示の好適性が、本明細書中に記載されている。さらに、抗生物質抵抗性マーカーの検出に関する本教示の能力が示される。サンプル調製から生物種特定報告までの完全なワークフローを約30分間で完了させることができ、このことが、本発明の方法を、感染症に罹患した重症患者に対する強力な診断ツールにする。方法の結果は、配列決定法の改良および利用可能なデータセットの数に沿って、信頼性および時間に関して改善することができる。驚くべきことに、核酸（好ましくは、遊離血中DNA）のレベルは、感染患者および非感染術後対照では有意に高かったが、健康な対照では高くなかったことが見出されている。方法は、1種類のサンプル中に見出された異なる微生物種同士の絶対的比較を可能にする。したがって、臨床検体中の病原体のデータ駆動型の特定に加えて、本方法はまた、被験体の細菌量ならびに標的化された治療および補完的な標準的臨床微生物学に対する応答のモニタリングでも非常に有用である。
【００３４】
図5は、ステップ(a)で、少なくとも特異的核酸を含有するサンプルを提供するステップ、ステップ(b)で、特異的核酸の存在量に対するデータ（特に、ステップ(c)で特定されるのと同じ核酸の出現についての確率、特に特定される存在量の出現についての確率および任意により該核酸についてのさらなるパラメータ）を含むデータベースを提供するステップ、およびステップ(c)で、その存在量を決定することをはじめとするサンプル中の少なくとも1種の特異的核酸を配列決定するステップ、およびステップ(d)で、ステップ(b)で提供されるデータベースに含まれる対応する同じ核酸の対応するデータセットに対してステップ(c)で決定および定量化される少なくとも1種の特異的核酸の正体を割り当てるステップ、およびそれにより、ステップ(c)で、確率演算を用いて、特に、好ましくはそれによりSIQスコア（有意性特定定量因子；significance identifying quantifier）を生じるSIQスコア演算を提供する、逆累積分布関数の対数を用いて、有意性スコア、すなわち、サンプル中の配列決定された核酸の出現および存在量の有意性を示す値を計算するステップを含む、サンプルの逸脱状態の決定のための本発明の方法の概要を模式的に示す。
【００３５】
好ましい実施形態では、プロセスステップ(d)の実行中に、またはそれに引き続いて、本プロセスは、サンプル中の配列決定された少なくとも1種の特異的核酸の品質を分析するプロセスステップ、および/またはそれに従ってステップ(c)で特定される少なくとも1種の核酸がヒト参照ゲノム上にマッピングされるプロセスステップおよび/または核酸配列に対して取得されたデータを複雑性フィルタリングするプロセスステップおよび/または特定された少なくとも1種の特異的核酸を分類学的に分類するさらなる任意的プロセスステップを含むことができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、ステップ(c)で特定される特異的病原体を示すものであると考えられるすべての特異的核酸に対する、統計学的推定量、好ましくは最尤推定（MLE）が、ステップ(e)で算出され、これは好ましくは、対照群または対照サンプルでの特異的病原体（好ましくは、その存在量）を検出するための確率を推定し、このとき、好ましくは、病原体特異的パラメータを含む好ましくは健康な個体から誘導される分布、最も好ましくはポアソン分布を計算し、ステップ(c)で配列決定されるサンプル中に存在する特異的核酸の存在量に対して比較する。
【００３７】
好ましい実施形態では、ステップ(e)で提供される本決定方法の結果は、好ましくは、サンプル中で見出されるすべての微生物、ウイルス、癌細胞および/または病原体についての結果の解釈および任意によりその可視化を含み、有意性スコア、好ましくはSIQスコアとして提供される。有意性スコアは、サンプル中の特異的核酸の存在量と、対照群でのすべての微生物、ウイルス、癌細胞および/または病原体についての特異的核酸の存在量の有意性、好ましくは対照群での該特異的核酸の出現の確率とを統合して計算され、このとき、特定された核酸の量に関する標準化されたデータが、被験体と対照との間で、各微生物、ウイルス、癌細胞および/または病原体について比較された。有意性スコアは、サンプルの逸脱状態を示しており、好ましくはサンプル中の関連性が高い病原体を示している。
【００３８】
定義：
本発明の文脈では、用語「逸脱状態」とは、健康状態および/または病原性状態、好ましくは、標準的または正常と考えられるものから変化している特性、好ましくは対照群から変化している特性を有する状態を意味する。好ましい実施形態では、逸脱状態は、特異的核酸の出現により、または特異的核酸の逸脱した量もしくは異常な量、例えば、特異的核酸の病原的な量により特徴付けられる。
【００３９】
本発明の文脈では、用語「病原性状態」とは、特定の疾患の発症または/および存在を示す状態、特に、特定の疾患の発症または/および存在に伴う状態を意味する。本発明の文脈では、用語「病原性状態」とは、特に、その出現、存在量または出現および存在量が特定の疾患の発症または存在を示すものである、すなわち、常に、通常はまたはおそらくは特定の疾患に伴い、かつ対照群では見出されないかまたは有意に低い頻度でしか見出されない、サンプル中の特異的核酸の出現、存在量または出現および存在量を示す状態を意味する。
【００４０】
好ましい実施形態では、病原性状態は、少なくとも1種の特異的核酸の出現により、または少なくとも1種の特異的核酸の病原的な量により特徴付けられる。
【００４１】
本発明の文脈では、用語「健康状態」とは、特に、その出現、存在量または出現および存在量が、微生物叢、環境状態および/またはライフスタイル状態、好ましくは疾患を引き起こさないかまたは疾患を生じさせない状態、好ましくは非病原性状態を示すものである、サンプル中の特異的核酸の出現、存在量または出現および存在量を示す状態を意味する。さらなる実施形態では、健康状態は、複合的疾患または病原的疾患を示すものである。
【００４２】
本発明の文脈では、用語「ライフスタイル」とは、習慣、考え方、嗜好、道徳的基準、経済的レベルなどであり、これらは一緒になって個体または群の生活様式を構成する。
【００４３】
本発明の文脈では、「複合的疾患」とは、好ましくは、心臓疾患、糖尿病、癌および肥満などの疾患であり、場合によりライフスタイルおよび環境因子と組み合わされて、複数の遺伝子の影響と関連付けられる疾患である。
【００４４】
本発明の文脈では、「疾患」とは、被験体の異常な状態、特に、器官の一部またはすべてに影響を及ぼす、構造または機能の障害である。疾患は、外因的な発生源に起因する因子により引き起こされる場合があり（感染性疾患など）、または内因的な機能不全により引き起こされる（自己免疫疾患または遺伝的障害など）。好ましい実施形態では、疾患は、病原体の核酸の出現により、特に病原体の出現により特徴付けられる疾患である。そのような疾患は、感染性疾患とも称される。
【００４５】
本発明の文脈では、用語「病原体」とは、好ましくは、感染性物質、好ましくは、疾患を引き起こすウイルス、細菌、真菌、ウイロイド、または寄生生物などの物質を意味する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、疾患は、感染性疾患、特に、生存物質により引き起こされる疾患、好ましくは、細菌、真菌および/もしくは寄生生物により、またはウイルスもしくはウイロイドにより引き起こされる疾患、特に敗血症であり得る。さらなる好ましい実施形態では、疾患は、複合的疾患、例えば癌である。
【００４７】
好ましい実施形態では、感染性疾患は、感染性物質、特に生存物質により引き起こすことができ、生存物質としては、限定するものではないが、細菌、真菌、寄生生物、酵母、原虫、蠕虫および幼虫期昆虫ならびにウイルスおよびウイロイドをはじめとする他の核酸含有物質が挙げられる。
【００４８】
好ましい実施形態では、疾患は、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、ぜんそく、関節炎、移植拒絶、感染性疾患、癌、ライム病、眼感染症、皮膚障害、乾癬、強皮症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、または別の疾患から選択される。
【００４９】
好ましい実施形態では、逸脱状態は、複合的疾患（特に、癌）を示すものである、特に癌細胞を示すものである特異的核酸の出現により、または癌もしくは癌細胞を示すものである核酸の関連する量の出現により、特徴付けられる。
【００５０】
決定される逸脱状態が、例えば病原体により引き起こされる、感染性疾患を示す、本発明の好ましい実施形態では、総核酸、好ましくはDNAが、被験体から単離され、ステップ(a)でサンプルの形態で提供され、ステップ(c)で配列決定され、このとき、例えばヒトゲノムへのマッピング後に、配列決定結果からヒトDNAが除去され、マッピングされない核酸がステップ(d)でさらに処理される。好ましい実施形態では、ステップ(a)で提供される特異的核酸は、ステップ(c)の前またはステップ(c)の後に、好ましくはステップ(c)と(d)との間に、富化される。
【００５１】
富化ステップが用いられる場合、対照群の核酸は、好ましくは、同じ富化ステップにより処理される。
【００５２】
好ましい実施形態では、マッピングされない核酸から、好ましくは、病原体、感染性疾患を生じる物質（微生物種など）が分類され、核酸は標準化され、カウントされ、その存在量により選別され、続いてステップ(d)で処理される。被験体で特定される各特異的核酸に関して、ステップ(d)および(e)での結果を、同様に処理された非感染対照のサンプルと比較し、このとき、サンプルならびに非感染対照で特定される微生物種は、病因に対して関連性がないと考えられる。微生物種がサンプルでのみ高存在量で見出され、非感染対照のいずれでも見出されない場合、高い有意性、結果として高いSIQスコア（SIQプロットでのそのデータ点の半径により示される）が割り当てられる（図2Aおよび2E）。一般的でない病原体に関しては、SIQスコアは、対照群で頻繁に検出されるものよりも高いであろう。
【００５３】
好ましい実施形態では、逸脱状態は、抗生物質抵抗性を示す核酸（特に、遺伝子）の出現、または病原的な量のその存在により特徴付けられる。つまり、本発明は、抗生物質抵抗性を示すものである核酸の出現、特に特定の存在量を、逸脱状態と見なす。
【００５４】
本発明の文脈では、用語「抗生物質抵抗性」とは、抗生剤の殺傷特性または増殖阻害特性に対する、細菌の感受性の喪失を意味する。抗生物質抵抗性は、それにより引き起こされる感染症の治療のために元来は有効であった抗微生物薬に対する微生物の抵抗性にも関する。細菌、真菌、ウイルスおよび寄生生物をはじめとする抵抗性微生物は、抗細菌薬、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および抗マラリア剤などの抗微生物薬による攻撃に耐えることができ、それにより、標準治療が有効でなくなり、感染症が持続する。
【００５５】
本発明の文脈では、用語「健康な」とは、特定の疾患の徴候を示さず、特に、現在その疾患を発症していない被験体を指すことを意味し、好ましくは、被験体は健康であると見なされる。
【００５６】
本発明の文脈では、対照群は、健康であるかまたは健康であると見なされる被験体の群由来のサンプルの群である。対照群は、少なくとも1名の被験体由来の少なくとも1種のサンプルを含み、好ましくは、多数の被験体由来の多数のサンプル、例えば、対応する数の健康な被験体由来の、少なくとも10種、少なくとも20種、少なくとも30種、少なくとも50種、少なくとも100種、少なくとも1000種または少なくとも5000種のサンプルを含む。好ましくは、1種の対照サンプルは、1名の健康な被験体に由来する。対照群中の多数かつより高い多様性の対照サンプルにより、汚染を介して導入されるばらつきに対して影響を有するすべての考えられる生物種を捕捉する確率が高まる。一般的に、ここで提供される有意性スコア（好ましくは、SIQスコア）の信頼性は、関連性の高いゲノムの最も完全なデータベースおよび健康な個体の微生物叢中の少ない種類を捕捉するために、かつ/または混入した生物体を排除するために可能な限りの大きな対照群を用いることにより、高められる。
【００５７】
つまり、用語「対照群」とは、疾患に罹患していない健康な状態にある被験体由来の少なくとも1種の対照サンプルを意味し、好ましくは、対照群は、様々な点で患者群と適合する健康な個体由来の対照サンプルの群を含み、例えば、被験体同士は、類似する年齢および性別、同じ社会的クラスまたは同じ人種群の者であり得る。本発明は、好ましくは、対照群が非病原性状態により特徴付けられる方法に関する。本発明は、好ましくは、対照群が徴候特異的状態（indication specific condition）により特徴付けられる方法に関する。
【００５８】
「被験体」との用語は、哺乳動物生物体を意味し、哺乳動物としては、一般的に、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギが挙げられる。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００５９】
本発明の文脈では、用語「サンプル供給源」とは、精製形態または未精製形態での、少なくとも1種の核酸のいずれかの供給源を意味し、好ましくは、サンプル供給源は、生物体、好ましくはヒト生物体であり、好ましくは、サンプル供給源は、逸脱状態に関してスクリーニングされるか、または逸脱状態に見舞われている。
【００６０】
本発明の文脈では、用語「核酸」は、核酸または核酸断片、例えば、メッセンジャーRNAをはじめとするDNAまたはRNAを含み、DNAまたはRNAは、一本鎖もしくは二本鎖またはそれらの混合物であり得、好ましくは、核酸は遊離血中DNAまたはRNAである。一実施形態では、用語「核酸」はまた、「核酸配列」を意味するとも理解される。
【００６１】
本発明の文脈では、用語「シーケンシング」（配列決定）とは、非分岐型生体高分子の一次構造を決定すること、好ましくは少なくとも1種の核酸の配列を決定することを意味し、これには、少なくとも1種の核酸の鎖中の塩基の順序を決定するために用いられるいかなる方法も含まれ、好ましくは、ハイスループットシーケンシングが含まれる。
【００６２】
本発明の文脈では、用語「ハイスループットシーケンシング」とは、配列決定プロセスを並行させる配列決定技術を意味し、好ましくは、1回のランで同時に多数の配列を配列決定することを意味し、好ましくは次世代シーケンシング（NGS）、Ilummina、IONTorrentまたはNanoPoreシーケンシングを意味する。ステップ(c)での配列決定ステップは、好ましくは、分子的ハイスループットシーケンシング、好ましくは、次世代シーケンシングにより行なわれる。
【００６３】
本発明の文脈では、用語「データベース」とは、好ましくは電子ファイリングシステムとして、少なくとも1種のデータセットを含むデータの体系化された収集物を意味し、好ましくは、医療記録、科学実験、刊行された文献、臨床研究、ハイスループット実験技術、およびコンピューター分析により収集される。ステップ(b)に従うデータベースは、好ましくは、臨床研究から回収され、好ましくは、規定された対照群から収集される。好ましい実施形態では、データベースは、好ましくは公表されたデータから、好ましくは特異的状態により特徴付けられる選択された対照群から、所定の徴候に関して生成される。別の好ましい実施形態では、データセットは、対照群での特異的核酸またはその断片の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率を示す。
【００６４】
好ましい実施形態では、したがって、データベースは、それにより、例えば、特別な生物種、種類または突然変異体を特徴付ける特定の正体を有する特定の核酸に対して、それぞれの単独のデータセットが割り当てられる、少なくとも1種、特に10種超、特に20種超、特に50種超または特に100種超、特に200種超または特に1000種超のデータセットを含む。
【００６５】
好ましい実施形態では、データベースは、少なくとも5種、少なくとも10種、少なくとも20種、少なくとも30種、少なくとも40種、少なくとも50種、少なくとも60種、少なくとも70種、少なくとも80種、少なくとも90種、少なくとも100種、少なくとも200種、少なくとも300種、少なくとも500種、少なくとも1000種、少なくとも10,000種、少なくとも100,000種またはさらにそれ以上の、特異的核酸に関する、好ましくは規定された起源由来の特異的核酸に関するデータセットを含む。
【００６６】
本発明の文脈では、用語「データセット」とは、特異的核酸に関連するデータを意味し、このとき、これらのデータは、対照群での特異的核酸の出現、すなわち存在、存在量、すなわち頻度、数もしくは量について、または出現および存在量について通知する。好ましい実施形態では、出現、存在量、出現および存在量に関するこれらのデータは、対照群での該特異的核酸の少なくとも1種の、好ましくはより多くの、好ましくは多数の存在量の出現についての確率に関するデータである。好ましくは、データセットは、対照群での特異的核酸のすべてのあり得る存在量の出現についての確率を示すデータを含む。好ましい実施形態では、少なくとも1種のデータセットは、徴候特異的対照群（indication specific control group）に関して標準化される。
【００６７】
本発明の文脈では、用語「存在量」（abundance）とは、サンプル中に存在する、好ましくはサンプル中で特定される、特異的核酸の数、特に量または頻度を意味する。
【００６８】
本発明の文脈では、「出現についての確率」との用語は、対照群での特異的核酸の特定の存在量が見出される確率を意味する。
【００６９】
本発明の文脈では、用語「有意性スコア」とは、好ましくは、サンプル中の特異的核酸の決定された存在量と、対照群での同じ特異的核酸の少なくとも1種の決定された特定の存在量の出現についての確率とを組み合わせることにより、サンプルの逸脱状態に関する尤度を定量的に示す値である。好ましい実施形態では、有意性スコア（SIQスコア）（significance identifying quantifier；有意性特定定量因子）は、病原性である可能性があるか、逸脱状態の原因であるか、または逸脱状態により生じる核酸を、順位付けおよび選択する。好ましくは、SIQスコアは特定の疾患を示しており、より好ましくは、SIQスコアは、1種または数種の疾患に対する、特定の逸脱状態、特に病原体の関連性を示す。SIQスコアは、好ましくは、関連性があり得る少なくとも1種の特異的核酸を、混入物または共生生物種により引き起こされるノイズと区別し、該少なくとも1種の特異的核酸を定量的に評価する。好ましい実施形態では、有意性スコア（SIQスコア）は、敗血症を示すスコアである。
【００７０】
本発明の文脈では、用語「リード」（read）とは、配列決定ステップによりそれについてのヌクレオチド配列が決定され、かつ好ましくは生物体に割り当てられ、好ましくはそれぞれの生物体のゲノムにマッピングされる、特異的核酸を意味する。好ましい実施形態では、リードは、特定の生物体に分類され、好ましくは特定の微生物に分類され、好ましくは、それらの存在量により標準化および選別される。
【００７１】
さらなる実施形態での本発明は、被験体での逸脱状態または疾患の診断のための方法に関し、このとき、本発明に従って該被験体でのサンプルの逸脱状態を決定するための方法が実行される。
【００７２】
好ましい実施形態では、本発明は、被験体の感染状態をモニタリングするための、好ましくは治療中の被験体および療法に対する応答をモニタリングするための方法を提供し、このとき、本発明に従って該被験体でのサンプルの逸脱状態を決定するための方法が実行される。
【００７３】
そのような方法は、好ましくは、疾患に罹患している被験体の特定、好ましくは疾患についてのスクリーニング、好ましくは予防医学的分析に関する。好ましい実施形態では、そのような方法は、被験体での、病原体の出現と疾患の発症との相関を明らかにする。
【００７４】
本発明は、好ましくは、サンプルが、全血、血清、血漿、体液（liquor）、尿、組織、唾液、糞便および洗浄液（lavage）からなる群より選択されるサンプル供給源から取得され、好ましくは血漿の無細胞画分から取得される方法に関する。サンプルは、当技術分野で公知の標準的方法のうちのいずれかを用いて収集することができる。
【００７５】
本発明に従えば、サンプルは、ヒトまたは動物身体から取得される。本発明に従えば、該サンプルは、本方法に従って分析され、かつ方法中またはその後にヒトまたは動物身体に戻されない。本発明に従えば、逸脱状態の決定のための本方法または逸脱状態の診断のための本方法は、つまり、身体から取得されたサンプルを用いるだけであり、ヒトまたは動物身体の存在を必要としない。
【００７６】
好ましい実施形態では、サンプルは血漿である。好ましい実施形態では、サンプルは、サンプル供給源から直接的に取得することができる。ここで用いられる血漿は、好ましくは無細胞であり、好ましくはほとんど無細胞である。サンプル、好ましくは血漿は、ヒト核酸および非ヒト核酸を含む遊離血中核酸を含有することができる。
【００７７】
好ましい実施形態では、サンプルを、希釈または濃縮することができる。別の好ましい実施形態では、サンプルは配列決定ステップの前に処理され、好ましくは、サンプルは配列決定ステップの前に精製される。サンプルは、同じかまたは異なる場合がある2種類以上の所望の特異的核酸配列を含有することができる。
【００７８】
本発明の一実施形態では、サンプルは、少なくとも1種の特異的核酸に加えて、さらなる物質、例えば、さらなる核酸、特に逸脱状態を示すものではない核酸を含有することができる。
【００７９】
本発明は、好ましくは、病原性状態が、少なくとも1種のウイルス、細菌、真菌または寄生生物の核酸の異常な量、特に病原的な量により特徴付けられる方法に関する。
【００８０】
本発明は、好ましくは、逸脱状態が、移植物の拒絶された細胞の逸脱した量により特徴付けられる方法に関する。
【００８１】
本発明は、好ましくは、逸脱状態が、抗生物質抵抗性を示すものである少なくとも1種の遺伝子の、好ましくは少なくとも1種の抗生物質抵抗性遺伝子の存在により特徴付けられる方法に関する。好ましい実施形態では、そのような逸脱状態が、被験体の別の逸脱状態と同時に決定される。
【００８２】
好ましい実施形態では、ステップ(c)で特定される少なくとも1種の特異的核酸配列の量は、好ましくはステップ(c)中の、好ましくはステップ(c)後の、より好ましくはステップ(c)と(d)との間の、さらなるプロセスステップで分類される。
【００８３】
つまり、本発明の好ましい実施形態では、本方法は、分類ステップ、特に、疾患を示す特異的核酸を、本方法で対象となっていない核酸と区別することを可能にする分類ステップをさらに用いる。
【００８４】
好ましい実施形態では、任意的な分類ステップ中に、少なくとも1種の特異的核酸が、その起源により分類され、好ましくは生物体に対して分類され、好ましくは分類学的に分類され、好ましくはヒトまたは非ヒトとして分類され、好ましくは逸脱しているかまたは逸脱していないとして分類され、好ましくは病原体または非病原体を示すものとして分類される。
【００８５】
本発明は、好ましくは、任意的な分類ステップ（好ましくは、ステップ(c)もしくは(d)中に行なわれるか、またはステップ(c)と(d)との間に行なわれる）中に、関連性が高くない供給源（例えば、ヒト供給源）に由来する核酸と、すべての他の生物体（好ましくは、細菌、ウイルス、真菌および寄生生物）に由来する核酸とを区別する。逸脱の有意性の計算により、方法は、逸脱状態に関連性の高い供給源に由来する核酸（例えば、感染症に関与する微生物由来の核酸）と、正常なヒト細菌叢の核酸とを区別することができる。
【００８６】
本発明は、好ましくは、任意的な分類ステップ（好ましくは、ステップ(c)の前に、ステップ(c)もしくは(d)中に行なわれるか、またはステップ(c)と(d)との間に行なわれる）中に、関連性が高くない（例えば、非病原性生物体に由来する、例えば、正常な皮膚細菌叢に由来する）核酸と、関連性が高い（例えば、病原性生物体に由来する）核酸とを区別し、好ましくは、方法は、感染に起因する核酸とヒト細菌叢の微生物由来の核酸とを区別する。
【００８７】
本発明は、好ましくは、任意的な分類ステップ（好ましくは、ステップ(c)もしくは(d)中に行なわれるか、またはステップ(c)と(d)との間に行なわれる）中に、関連性が高くない起源に由来する核酸（例えば、ヒト核酸）と、関連性が高い核酸（例えば、微生物、ウイルスまたは癌細胞に由来する核酸）とを区別する。
【００８８】
好ましい実施形態では、少なくとも1種の核酸は、その配列を、核酸配列に対して、好ましくは既知の核酸配列に対してアライメントすることにより分類され、該核酸配列は、さらなる、すなわち第2のデータベースから提供される。核酸配列の分類は、当技術分野で公知のいずれかの方法により行なうことができる。好ましい実施形態では、特異的核酸は、その配列を、参照ゲノムに対して、好ましくはヒトゲノムに対して、マッピングすることにより分類される。
【００８９】
本発明の一実施形態では、サンプルは、少なくとも1種の特異的核酸に加えて、さらなる核酸、特に逸脱状態を示すものでない核酸を含有することができる。本発明の好ましい実施形態では、逸脱状態（好ましくは、病原性状態）を示すものではない核酸は、好ましくはステップ(a)の後かつステップ(c)の前またはステップ(c)の実行中に、サンプルから枯渇させられ、すなわち、サンプルから除去される。
【００９０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、逸脱状態を示すものでない核酸配列、特に、該核酸が逸脱状態を示すものではないことを示す分類ステップに供されたことがある核酸配列が、サンプルから枯渇させられる。
【００９１】
好ましい実施形態では、ステップ(c)で取得される核酸配列は、関連性が高くない核酸を予め選択し、好ましくは残余の核酸を分類し、かつ核酸が逸脱状態に対して関連性が高い可能性があることを示す、好ましくはバイオインフォマティクスワークフロー中で、ステップ(d)で処理される。最後に、結果が、好ましくは逸脱状態に関する特定された核酸の関連性を示す独自スコアの提示により、有意性スコア（SIQスコア）の形態で、ステップ(e)で取得される。好ましい実施形態では、有意性スコア、好ましくはSIQスコア、好ましくは対応するSIQプロットは、図2Aおよび2Eに模式的に表わされる通りに取得される。
【００９２】
富化または枯渇のための好適なバイオテクノロジーステップは、当業者に公知である。
【００９３】
好ましい実施形態では、サンプル中に存在する核酸が枯渇または富化され、好ましくは、核酸は、好ましくはステップ(c)の後に、好ましくはステップ(e)の前に、好ましくはバイオインフォマティクス法により、サンプルおよび対照群で枯渇または富化される。好ましい実施形態では、サンプル中に存在する核酸は、ステップ(c)の前に、好ましくはバイオテクノロジープロセスステップを用いることにより、枯渇または富化される。好ましい実施形態では、特異的核酸でありかつ特定の逸脱状態を示すものであるサンプル中に存在する核酸が、所望の場合に、富化される。
【００９４】
好ましい実施形態では、少なくとも1種の特異的核酸、好ましくは分類された特異的核酸、好ましくは、ヒトまたは非病原的核酸が、枯渇または富化され、ステップ(c)のサンプル中の特定された特異的核酸から選別され、好ましくは、ヒトまたは非病原的特異的核酸が選別され、このとき、少なくとも1種の特異的核酸は、サンプルおよび対照群中で枯渇または富化される。好ましい実施形態では、種々の特異的核酸の量が枯渇または富化され、好ましくは、ステップ(c)で取得される特異的核酸の存在量が枯渇させられて、それにより、好ましくは、特定された特異的核酸の複雑性が低下する。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態では、核酸は、好ましくはバイオテクノロジープロセスステップを用いることにより、またはバイオインフォマティクス法を用いることにより、富化または枯渇させられる。好ましい実施形態では、核酸は、関連性が高くない生物種またはヒト起源の核酸を除去することにより枯渇させられる。好ましい実施形態では、少なくとも1種の特異的核酸が、ステップ(b)で提供される少なくとも1種のデータセットに基づいて少なくとも1種の特異的核酸をフィルタリングすることにより、枯渇または富化される。
【００９６】
本発明は、好ましくは、核酸がステップ(c)の前に富化される方法に関する。
【００９７】
本発明は、好ましくは、逸脱状態を示す可能性がある核酸がステップ(c)の前に富化される方法に関する。
【００９８】
本発明は、好ましくは、逸脱状態を示さない可能性がある核酸がステップ(c)の前に枯渇させられる方法に関する。
【００９９】
好ましい実施形態では、サンプル中に存在する核酸は、バイオテクノロジープロセスステップを用いて枯渇または富化されない。有利には、枯渇または富化のためのそのようなバイオテクノロジープロセスステップは、本発明に従う方法では必須ではない。
【０１００】
富化または枯渇ステップが用いられる場合、対照群の核酸は好ましくは、同じ富化または枯渇ステップにより処理される。
【０１０１】
本発明はまた、本発明に従う方法を行なうためのデバイスにも関し、このとき、サンプルの逸脱状態を示す有意性スコアは、ステップ(c)に従って決定される少なくとも1種の特異的核酸の存在量およびステップ(b)で提供される対照サンプルでの同じ特異的核酸の少なくとも1種の特定の存在量の出現についての確率に基づいて、デバイスの中央処理装置により計算される。
【０１０２】
好ましい実施形態では、サンプル中の少なくとも1種の核酸の有意性スコアは、配列決定デバイスの処理装置で計算される。
【０１０３】
したがって、本発明は、核酸（特に、遊離血中DNA）のバイアスのない配列分析に基づく、サンプル中の感染性生物体の特定のための完全な診断ワークフローを提供する。方法は、有利なことに、疑わしい生物種の兆候なしでのデータ駆動型診断を提供し、特異的プライマー設計を必要とせず、かつ1回のアッセイで細菌性、真菌性およびウイルス性病原体を検出する機会を提供する。
【０１０４】
本発明の方法は、好ましくは、特異的な病原体の決定に制限されない。一実施形態では、本方法は、可能性のある病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物）の合計量を決定する。
【０１０５】
つまり、本発明は、被験体での疾患およびその対応する医学的原因を短時間以内に特定するための有用な方法を提供する。
【０１０６】
つまり、特定される逸脱状態に対する適切な療法を、短時間以内に選択することができる。
【０１０７】
したがって、この方法は、臨床検体での病原体のデータ駆動型特定に関して、ならびに被験体の細菌量および標的化された治療および補完的な標準的臨床微生物学に対する応答をモニタリングするために、非常に有用であり得る。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態は、従属項の発明である。
【０１０９】
配列表は、以下の内容を示す：
配列番号1：エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）の核酸配列mecA
配列番号2：ヒト血漿サンプル1由来の核酸配列SX2_r1
配列番号3：ヒト血漿サンプル2由来の核酸配列SX2_r2
配列番号4：ヒト血漿サンプル3由来の核酸配列SX2_r3
【０１１０】
本発明は、以下の図面および実施例により説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】様々な患者群および時点にわたる、cfDNA濃度の分布を示す図である。(A) 健康なボランティア（V）、敗血症の発症時点の敗血症患者（S T0）、および腹部大手術後の非感染患者（P）のcfDNA濃度の比較。(B) 試験の観察期間にわたって採取された敗血症患者の血漿サンプルのcfDNA濃度変化。サンプルは、敗血症発症時（T0）、24時間後（T1）、4日間後（T2）、7日間後（T3）、14日間後（T4）および28日間後（T5）に採取した。患者S60に関してT5とは敗血症発症後の21日目を意味し、T6とは28日目を意味することに留意されたい。 (C) 感染の徴候がない、腹部大手術を受けた患者でのcfDNA濃度の比較。術後群由来の血液サンプルは、手術前（T0）、外科的処置の終了直後（T1）、およびその24時間後（T2）に採取した。
【図２Ａ】SIQスコアおよびSIQプロットの原理を示す図である。(A) SIQスコアおよびSIQプロットを取得するための概要。総cfDNAを患者血漿から単離し、配列決定する。配列決定の結果から、マッピング後にヒトcfDNAを除去し、マッピングされなかったリードのみをさらに処理する。これらのマッピングされなかったリードから、微生物種を分類し、リードを標準化し、カウントし、その存在量によって選別する。患者から取得される各生物種に関して、結果を、非感染対照の同様に処理されたサンプルと比較する。この例では、微生物種Xが、患者サンプルならびに大多数の対象サンプルで見出され、したがって、混入物または一般的なヒト微生物叢のメンバーを表わす。しかしながら、生物種Yは患者サンプルのみで高存在量が見出され、対照のいずれでも見出されず、したがって、高い有意性および結果として高いSIQスコアを受け取り、このことは、SIQプロット中のそのデータ点の半径により示される。
【図２Ｂ】SIQスコアおよびSIQプロットの原理を示す図である。(B) 敗血症の発症時点（T0）で患者S9の血漿サンプル中に見出される各生物種についての標準化されたカウントの分布。最も存在量が大きい生物種であるエンテロバクター・クロアカのみを標識した。
【図２Ｃ】SIQスコアおよびSIQプロットの原理を示す図である。(C) すべてのサンプルにわたるエンテロバクター・クロアカについての標準化されたカウントの分布を分析した。黒色：敗血症患者、灰色：対照（手術待機中および健康なボランティア）。最も大きな存在量のE.クロアカリードを有するサンプルS9のみを標識した。
【図２Ｄ】SIQスコアおよびSIQプロットの原理を示す図である。(D) すべてのサンプルにわたるアクネ菌（Propionibacterium acnes）の標準化されたカウントの分布。黒色：敗血症患者、灰色：対照（手術待機中および健康なボランティア）。
【図２Ｅ】SIQスコアおよびSIQプロットの原理を示す図である。(E) 敗血症発症時（T0）での患者S9についてのすべての生物種の存在量および有意性を統合したSIQプロット。データ点（生物種）の座標は、x軸上が相対的存在量（log2）であり、y軸上が1-p値として表わされる有意性である。破線は、0.05のp値を示す。log2＞0およびp値＜0.05を有するデータ点を標識した。各サンプルでの生物種のSIQスコアは、データ点の半径として統合されている。
【図３Ａ】2名の患者に関するNGSデータおよび従来の臨床微生物学データを含む臨床的時間経過を示す図である。(A) 患者S10の時間経過。胃切除術を必要とする胃の腫瘍により受診した68歳男性患者。外科的処置後に、患者は、不十分な吻合についてのいかなる兆候も示すことなく、重症肺炎に起因する敗血性ショックに見舞われた。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）が、様々な分泌物（例えば、気管分泌物、腹部創傷スワブ、血液培養など）での主要な生物体であることが示された。そのメチシリン感受性に基づいて、続いて患者を、フルクロキサシリンを用いて2週間治療した。加えて、肺炎は、気管分泌物中の1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）の再活性化を伴う（それぞれ賦活化される）ことが示され、そのため、患者は、アシクロビルを11日間投与された。長期の離脱期に続いて、患者は、敗血性ショックの発症から6週間後に一般病棟に移ることができた。この図面では、抗生物質治療レジメン、NGS/SEPseqを介して特定される生物種に対するSIQスコアおよび各血漿サンプルのcfDNA濃度が、患者S10についての試験期間の時間軸に対してプロットされている。関連する（臨床微生物学の）検査室結果が、臨床検体が取得された日に対して矢印で示される。以下の略語を用いた：血液培養（BC）、中心静脈カテーテル（CVC）、気管分泌物（TS）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、シプロフロキサシン（ciproflocaxine）（CIP）、メトロニダゾール（MTZ）、メロペネム（MEM）、バンコマイシン（VAN）、カスポファンギン（CFG）、フルクロキサシリン（FLX）、フルコナゾール（FLC）、アシクロビル（ACV）、アニデュラファンギン（AFG）、チゲサイクリン（TGC）。抗感染症薬はそれぞれ、抗細菌性抗生物質が明灰色、抗真菌薬が黒色および抗ウイルス薬が濃灰色として表わされる。従来の臨床微生物学により見出される細菌の相対量は、多量（p）、中程度（m）または少量（s）を用いて示される。抗感染症薬の略称についての詳細なリストに関しては、図18を参照されたい。
【図３Ｂ】2名の患者に関するNGSデータおよび従来の臨床微生物学データを含む臨床的時間経過を示す図である。(B) 患者S60の時間経過。穿孔性S状結腸憩室炎の複雑な経過後の、腸の連続性の再構築のために受診した70歳女性患者。術後期に、患者は、手術のやり直しを必要とする腸からの漏出に起因する敗血性ショックを発症した。腹部創傷スワブは、大腸菌（Escherichia coli）およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）に対して陽性であることが示された。したがって、イミペネムおよびリネゾリドを用いる経験的抗生物質療法が適切であることが証明された。1日後に、患者は、外科的結腸切除術およびハルトマン法による腸末端の構築を必要とする結腸の穿孔に起因する2回目の敗血症に見舞われた。大腸菌およびエンテロコッカス・フェシウムが、腹部創傷スワブ中の主要生物体であることが再度特定された。さらに、モルガネラ属の種（Morganella sp.）ならびにカンジダ属の種（Candida sp.）を特定することができた。したがって、カスポファンギンを用いる治療が、次の14日間開始された。対照的に、イミペネムおよびリネゾリドは、患者の再回復期（reconvalescence）のために、7日間後に停止された。しかしながら、3日間後に、ハルトマン法による腸末端が不十分であったことに起因して、患者は、また敗血症に見舞われた。したがって、1回のさらなる試験開腹が行なわれ、徹底した腹部洗浄が開始された。腹部創傷スワブは、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、モルガネラ属の種、大腸菌、腸球菌ならびにバクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）について陽性であることが示された。したがって、イミペネムおよびリネゾリドを、それぞれさらに12日間および10日間投与した。並行して、患者は、気管分泌物中の1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）の再活性化を示し、それにより、患者はアシクロビルを14日間投与された。さらなる敗血症の経過では、患者は、大腸菌、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）ならびにクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）により惹起された人工呼吸器関連肺炎に起因して、4回目の敗血症を発症した。したがって、抗生物質療法は段階的にピペラシリン/タゾバクタム、コトリモキサゾール（cotrimoxazole）ならびにシプロフロキサシンへと変更された。しかしながら、長期の離脱期に続いて、患者を、3ヵ月のICU治療後に中間看護病棟へと移すことができた。最終的に、患者は、さらに2週間後に退院することができた。本図面では、抗生物質治療レジメン、NGSを介して特定された生物種に関するSIQスコアおよび各血漿サンプルのcfDNA濃度が、患者S60についての試験期間の時間軸に対してプロットされている。関連する（臨床微生物学の）検査室結果が、臨床検体が取得された日に対して矢印で示される。以下の略語を用いた：血液培養（BC）、中心静脈カテーテル（CVC）、気管分泌物（TS）、気管支肺胞洗浄液（BAL）、1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）、イミペネム（IPM）、リネゾリド（LZD）、カスポファンギン（CFG）、アシクロビル（ACV）、ピペラシリン-タゾバクタム（TZP）、コトリモキサゾール（CTX）、セフタジジム（CAZ）。抗細菌性抗生物質は、明灰色に着色した。従来の臨床微生物学により見出される細菌の相対量は、多量（p）、中程度（m）または少量（s）を用いて示される。抗感染症薬の略称についての詳細なリストに関しては、図18を参照されたい。
【図４−１】患者S9でのエンテロバクター・クロアカのゲノムカバレッジおよび抵抗性プロフィールを示す図である。(A) E.クロアカゲノム（5.2MB）の約1の平均ゲノムカバレッジ。
【図４−２】患者S9でのエンテロバクター・クロアカのゲノムカバレッジおよび抵抗性プロフィールを示す図である。(B) E.クロアカへと分類されたすべてのリードからのカード（CARD）データベースに対するヒットを示す表。カード（CARD）/Genbank登録番号が、遺伝子別名、遺伝子長に対するリード長の比率から算出された遺伝子カバレッジ、この遺伝子にマッピングされたリードの数および配列が割り当てられるそれぞれの生物体と共に列記される。(C) 市販の血漿サンプルであるSX2から特定されたmecAにマッピングされる3種類のリードの配列アライメント。
【図５】プロセスステップ(a)〜(e)を含む本発明のプロセスの模式的表示である。
【図６Ａ】敗血症患者、非感染手術（後）対照および健康なボランティアから単離されたcfDNAのバイオアナライザープロフィールを示す図である。(A) 高感度DNAチップを用いてAgilent Bioanalyzerで分析されたcfDNAプロフィールのゲル様表示。
【図６Ｂ−１】敗血症患者、非感染手術（後）対照および健康なボランティアから単離されたcfDNAのバイオアナライザープロフィールを示す図である。(B) 対応する電気泳動図であり、最も外側の2つのピークは、内部サイズ標準である。
【図６Ｂ−２】敗血症患者、非感染手術（後）対照および健康なボランティアから単離されたcfDNAのバイオアナライザープロフィールを示す図である。(B) 対応する電気泳動図であり、最も外側の2つのピークは、内部サイズ標準である。
【図６Ｂ−３】敗血症患者、非感染手術（後）対照および健康なボランティアから単離されたcfDNAのバイオアナライザープロフィールを示す図である。(B) 対応する電気泳動図であり、最も外側の2つのピークは、内部サイズ標準である。
【図６Ｂ−４】敗血症患者、非感染手術（後）対照および健康なボランティアから単離されたcfDNAのバイオアナライザープロフィールを示す図である。(B) 対応する電気泳動図であり、最も外側の2つのピークは、内部サイズ標準である。
【図７】NGSに基づく病原体特定および血液培養のワークフローおよび時間的分布を示す図である。細菌血症原因生物種のNGSに基づく特定および従来の血液培養に必要とされる個々のステップおよび時間のフローチャートおよびバーチャート。陽性を示すための時間が大幅に変化するので、血液培養に関しては24〜120時間の時間枠が設けられている。
【図８−１】敗血症状態での主要な病原体に関する、敗血症患者および対照での生物種特異的に標準化されたリードカウントの分布を示す図である。黒色：敗血症患者、灰色：対照（手術待機中（時点T0）および健康なボランティア）。
【図８−２】敗血症状態での主要な病原体に関する、敗血症患者および対照での生物種特異的に標準化されたリードカウントの分布を示す図である。黒色：敗血症患者、灰色：対照（手術待機中（時点T0）および健康なボランティア）。
【図９】混入物である可能性がある生物種に関する、敗血症患者および対照での生物種特異的に標準化されたリードカウントの分布を示す図である。黒色：敗血症患者、灰色：対照（手術待機中（時点T0）および健康なボランティア）。
【図１０】患者S9の時間経過を示す図である。拡大肝右葉切除術の必要がある、胆管の腫瘍により受診した82歳男性患者。外科的処置に続いて、患者は、オグルビー症候群（ogilvie syndrome）に起因する敗血性ショックに見舞われ、それにより右側部分の結腸切除術（right sided hemicolectomie）を行なわなくてはならなかった。敗血性ショックは、エンテロバクター・クロアカについて繰り返し陽性となる血液培養と並行していた。さらに、エンテロバクター・クロアカは、敗血症の発症から1週間後の人工呼吸器関連肺炎の原因であることが示された。抗生物質治療の後に、2種類のバイオタイプのエンテロバクター・クロアカを観察することができ、それらの両方が多剤抵抗性の基準を満たした。患者は、敗血性ショック発症の9週間後に死亡した。本図面では、抗生物質治療レジメン、NGSを介して特定された生物種に関するSIQスコアおよび各血漿サンプルのcfDNA濃度が、患者S9についての試験期間の時間軸に対してプロットされている。関連する（臨床微生物学の）検査室結果が、臨床検体が取得された日に対して矢印で示される。以下の略語を用いた：血液培養（BC）、中心静脈カテーテル（CVC）、気管分泌物（TS）、非溶解性（NL）、シプロフロキサシン（ciproflocaxine）（CIP）、メトロニダゾール（MTZ）、イミペネム（IPM）、リネゾリド（LZD）、フルコナゾール（FLC）、バンコマイシン（VAN）。抗感染症薬はそれぞれ、抗細菌性抗生物質が明灰色、抗真菌薬が黒色および抗ウイルス薬が濃灰色として表わされる。従来の臨床微生物学により見出される細菌の相対量は、多量（p）、中程度（m）または少量（s）を用いて示される。抗感染症薬の略称についての詳細なリストに関しては、図18を参照されたい。
【図１１】患者S11の時間経過を示す図である。肝左葉切除術の必要がある、多房性肝細胞癌により受診した62歳男性患者。外科的処置に続いて、患者は、血液培養ならびに気管分泌物中の主要生物体としてクレブシエラ・ニューモニエを有する重症肺炎に起因する敗血性ショックに見舞われた。イミペネムを用いた経験的抗生物質療法が行なわれ、続いて、感受性調査結果に基づいてモキシフロキサシンに変更された。さらなる疾患の経過中に、クレブシエラ・ニューモニエが多剤抵抗性であることが示された。抗生物質療法は感受性試験の結果に合わせられたが、肺の感染病巣は十分に除去できなかった。最後には、患者は、研究に含められてから2ヵ月後に、クレブシエラ・ニューモニエによる肺炎に起因する継続的な敗血性ショックにより死亡した。また、敗血症は、PCRベースの診断手順により評価した場合に、様々な分泌物中での1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の再活性化を伴うことが示された。これらの知見は、血漿のNGSとよく合致した。本図面では、抗生物質治療レジメン、NGSを介して特定される生物種に対するSIQスコアおよび各血漿サンプルのcfDNA濃度が、患者S11についての試験期間の時間軸に対してプロットされている。関連する（臨床微生物学の）検査室結果が、臨床検体が取得された日に対して矢印で示される。以下の略語を用いた：血液培養（BC）、中心静脈カテーテル（CVC）、気管分泌物（TS）、グラム陰性ブドウ球菌（GNST）、1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）、イミペネム（IPM）、バンコマイシン（VAN）、モキシフロキサシン（moxiflocaxin）（MXF）、シプロフロキサシン（CIP）、チゲサイクリン（TGC）、セフタジジム（CAZ）。抗細菌性抗生物質は、明灰色で表わされる。従来の臨床微生物学により見出される細菌の相対量は、多量（p）、中程度（m）または少量（s）を用いて示される。抗感染症薬の略称についての詳細なリストに関しては、図18を参照されたい。
【図１２】患者S23の時間経過を示す図である。急性腹症に起因する敗血性ショックにより受診した77歳男性患者。S状結腸（sigma）の穿孔を伴う虚血性大腸炎および重症腹膜炎が感染病巣であることが明らかになり、それにより患者は外科的結腸切除術を受けた。研究コホートに含められる2日前に、腹部創傷スワブならびに対応する血液培養が、エンテロコッカス・フェシウムについて陽性であることが示された。したがって、イミペネムおよびリネゾリドを用いた経験的抗生物質療法が適切であることが証明された。また、この患者については、気管分泌物中での1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）の再活性化も明らかになった。これらのPCRベースの知見は、血漿のNGSによっても確認できた。抗生物質治療レジメン、NGSを介して特定される生物種に対するSIQスコアおよび各血漿サンプルのcfDNA濃度が、患者S23についての試験期間の時間軸に対してプロットされている。関連する（臨床微生物学の）検査室結果が、臨床検体が取得された日に対して矢印で示される。以下の略語を用いた：血液培養（BC）、気管分泌物（TS）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（CoNST）、イミペネム（IMP）、リネゾリド（LZD）、タゾバクタム（TZP）、クリンダマイシン（CLI）、フルコナゾール（FLC）。抗感染症薬はそれぞれ、抗細菌性抗生物質が明灰色、および抗真菌薬が黒色に着色されている。従来の臨床微生物学により見出される細菌の相対量は、多量（p）、中程度（m）または少量（s）を用いて示される。抗感染症薬の略称についての詳細なリストに関しては、図18を参照されたい。
【図１３】術後患者P1-T1およびP2 T1についてのSIQプロットを示す図である。
【図１４】コホート統計を示す図である。本コホートでは、異なるサブグループ間で、明らかな傾向が認識できた。最も低いcfDNA濃度が、対照群Vについて取得され、その次が手術群P T0であった。術後（T1、T2）の群Pおよび敗血症群S（特に敗血症発症時）では比較的高濃度が測定された。群Pでは、平均値が、患者P2により強く増大した（この患者はまた、興味深いことに、PCT、CRPおよびIL-6のレベルもすべての時点で上昇していた（データ示さず））。患者P2を含まない群Pの平均値は、健康なボランティア群に比較的近く（P2を含まないP T0の平均：68.8ng/mL）、このことは、残余の相違が年齢に関連するものであり得ることを示唆した。7名の患者のうち6名に関して、最も高いcfDNA濃度は、敗血症の発症時または24時間後に測定された。7名の敗血症患者のうちの5名（S9、S10、S19、S23、S60）が、敗血症発症の2日間以内に腹部大手術を受け、このことがcfDNA濃度の上昇に寄与した可能性がある。S T0とP T0との間での分類されたリードの比較により、敗血症患者に関しては、顕著に高い割合のcfDNAを、微生物起源に対して割り当てられることを示すことができ、このことは、細菌からのDNAの直接的放出または食細胞からの共放出を示唆した。
【図１５】非ヒトリード中の微生物リードを特定するためのKrakenデータベースに含まれる真菌参照ゲノムのリストを示す図である。
【図１６−１】患者特性、標準化された病原菌リードカウントを含む配列決定統計および完全データセットに対するSIQスコアを示す図である。
【図１６−２】患者特性、標準化された病原菌リードカウントを含む配列決定統計および完全データセットに対するSIQスコアを示す図である。
【図１６−３】患者特性、標準化された病原菌リードカウントを含む配列決定統計および完全データセットに対するSIQスコアを示す図である。
【図１６−４】患者特性、標準化された病原菌リードカウントを含む配列決定統計および完全データセットに対するSIQスコアを示す図である。
【図１７】水対照から特定された混入生物種のリストを示す図である。
【図１８】抗感染症薬略称を示す図である。
【図１９】プールされたヒト敗血症血漿中の生物体のリストを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
［実施例］
実施例1
ヒトデータは、RAMMSES治験（独国臨床試験登録番号：DRKS00000505）に参加する患者のサブセットの二次分析から得られている。この観察的臨床試験は、最初に、地域倫理委員会により、2009年6月8日に承認された（Trial-Code-Nr.：S123-2009）。提示されるNGS手順に関して、地域倫理委員会に対して補正が提出され、これは最終的に2014年11月28日に承認された。
【０１１３】
観察的臨床試験は、ハイデルベルク大学病院（Heidelberg University Hospital, Germany）の外科集中治療室で行なわれた。被験患者および対照患者または彼らの法的被指名者が、書面によるインフォームドコンセントに署名した。合計で、3つの群の120名の患者が、2009年8月から2010年7月まで、連続的に研究に登録された。3つの群は、以下の群を含んだ：(1) ICUでの感染症の定義に関する国際敗血症フォーラムコンセンサス会議の基準[3]に従って記録されたかまたは疑われた感染症を理由として、国際敗血症定義会議の基準[2]に従う敗血性ショックを有する60名の患者、(2) 感染症のいかなる徴候もない腹部大手術後の30名の術後対照、および(3) 30名の健康なボランティア。敗血性ショックを有する患者由来の血漿サンプルを、敗血症の発症時（T0）、ならびに24時間後（T1）、4日間後（T2）、7日間後（T3）、14日間後（T4）、および28日間後（T5）に採取した。術後群由来の血漿サンプルは、手術前（T0）、外科的処置の終了直後（T1）および24時間後（T2）に採取した。ボランティア群由来の血漿サンプルは、1回（T0）採取した。
【０１１４】
この二次分析のために、敗血症の間の血液培養試験からの結果について、患者の電子カルテを過去に遡ってスクリーニングした。ハイデルベルク大学病院では、血液培養試験は、以前に記載された通りに慣用的に行われている[4]：全血サンプルを、無菌技術を用いる直接静脈穿刺（例えば、肘正中静脈）を介して取得し、10mLの血液を、それぞれ、好気的および嫌気的液体培養培地（BACTEC PLUS, BD Biosciences, Heidelberg, Germany）に接種する。培養物を、5日間インキュベートし（BACTEC, BD Biosciences, Heidelberg, Germany）、陽性の培養物を、VITEK2（Biomerieux, Nuertingen, Germany）またはMALDI TOF（Bruker, Madison, WI, USA）および自動化抗微生物剤感受性試験（VITEK 2）による同定をはじめとする、承認された院内での標準的技術に従って分析する。
【０１１５】
血漿または気管分泌物由来のHSV1 DNAおよびCMV DNAの定量は、以前に記載された通りに[5]、定量的リアルタイムPCRを介して行なった。創傷スワブおよび糞便サンプルは、以前に公表された通りに培養した[6,7]。
【０１１６】
血漿は、292×g（1,200rpm）、4℃で10分間の遠心分離により血液サンプルから調製し、急速凍結し、さらなる処理まで−80℃で保存した。1,000×gでの5分間の遠心分離ステップ後の解凍血漿から、以下の例外を伴って製造業者のプロトコールに従ってCirculating Nucleic Acid Kit（Qiagen社）を用いて、核酸を単離した：130μL〜790μLの遠心分離後の血漿体積を、滅菌リン酸緩衝生理食塩液を用いて1mLに調整した。スピンカラムからの核酸の最終溶出は、30μLの分子生物学グレードの水（5 Prime, Germany）を用いて行なった。cfDNAを、Qubit dsDNA HSアッセイキット（Life Technologies社）を用いて定量し、Bioanalyzer（Agilent社）でHigh Sensitivity DNAキットを用いて品質を評価した。NGSのためのライブラリーは、Nextera XTライブラリー調製キット（Illumina社）を、ビーズ洗浄後の最終溶出を34μLの再懸濁バッファー（Illumina社）中で行なったこと以外は製造業者のプロトコールに従って用いて、1ngのcfDNAから調製した。ライブラリーの配列決定は、サンプル当たり25,000,000〜30,000,000個の100bp単一末端リードの深度（depth）を用いて、HiSeq2500（Illumina社）を使用して行なった。サンプルV6、V22およびP6は、当初、無視できないほど多くのリードを伴って配列決定されたので、それらのサンプルは、30,000,000個の代表的な部分サンプリングリードまで、コンピューター上で無作為に減少させた。
【０１１７】
リードは、考えられるアダプター混入について清浄化され、品質管理され、必要な場合にはBBDukを用いてトリミングされた［https://sourceforge.net/project/bbmap/］。品質フィルターに合格するためには、リードの品質は、20のPhredスコアを超過し、かつ低品質塩基およびアダプター塩基のトリミング後に50bpの最小限の長さを達成することが必要である。それに続いて、NextGenMap [8]が、リードと参照ゲノムとの間の80％の最小同一性を要求しながら、品質管理されたリードをヒト参照ゲノム[hg19]とアライメントした。ヒト参照ゲノムにマッピングされたリードは、さらなる分析から除外された。マッピングアルゴリズムは、二塩基反復または三塩基反復をはじめとする低複雑性領域を含むリードをヒトゲノムに対して信頼性高くマッピングできないので[9]、対応するリードは除去された。低複雑性リードの除外は、下流の分析中の擬陽性分類を減少させた。最後に、複雑性フィルタリングに合格したリードに関して、Kraken [10]は、参照データベースとして、12種類の選択された真菌ゲノムにより補完された35,749種類の細菌ゲノムおよび4,340種類のウイルスゲノム（図15）を含むRefSeqリリース（バージョン68）を用いて、それらの系統的位置を割り当てた。これにより、系統樹の節に対するサンプル由来の分類されたリードの分布がもたらされる。換言すれば、リードは、細菌/真菌/ウイルスクレードを明らかにする。しかしながら、数種類のキサントモナス属の生物種はすべてのサンプルの混入物として説明されているので、それらのすべてならびにIllumina配列決定スパイクイン（spike-in）であるPhiX [11]は排除された。
【０１１８】
異なるサンプル同士で、異なる微生物系統分類へとマッピングされるリードの数を定量的に比較するために、リードカウントを、サンプルのライブラリーサイズにより標準化した。それぞれの特定された生物種に関する残余のリードカウントを、続いて、n×(s＋1)次元カウント行列Dによりさらに分析し、式中、nは対照サンプルの数であり、sはすべてのサンプル中で検出されたすべての生物種の数である。つまり、Di,jは、生物種jに対して対照サンプルi中に見出されたリードの数を定義する。Di,(s+1)は、いずれの生物種にも割り当てることができないリードの数を定義する。
【０１１９】
1種類の生物種に対するリードの数は典型的には少ないので、生物種j（j＝1, ... , s）に対するリードカウントは、以下のパラメータ：
【数１】
2018527938.tif 000002
を有してポアソン分布していると仮定するのが安全である。
【０１２０】
各生物種に関してこの仮定を検定するために、標準的なカイ二乗適合度検定が行なわれる。
【０１２１】
患者血漿から配列決定されたリードに関して、同じデータ処理パイプラインが適用され、これによりリードカウントベクトルC＝(C1, ..., Cs, Cs+1)が得られる。生物種特異的パラメータλjを有するポアソン分布に基づいて、患者サンプル中で少なくともCjのリードカウントを観察するためのp値は、以下の通りに計算される：
【数２】
2018527938.tif 000003
【０１２２】
p値は、帰無分布のサイズ（すなわち、対照サンプルの数）に直接的に依存する。p値が小さい場合には、患者サンプル中の生物種jのリードカウントは健康な個体から誘導されるポアソン分布に従うという仮説は否定されるであろうし、かつそれぞれの生物種が該患者で頻繁に存在し過ぎると結論付けられるであろう。
【０１２３】
患者サンプル中で見出されるすべての生物種に関する結果の異なる解釈および可視化を可能にするために、生物種jに対するSIQスコア（敗血症指示定量因子）（Sepsis Indicating Quantifier）が以下の通りに導入される：
【数３】
2018527938.tif 000004
【０１２４】
存在し得る抵抗性遺伝子を特定するために、患者S9で最も可能性が高い感染性物質（エンテロバクター・クロアカ）に分類されたリードを、ダウンロードされたカード（CARD）抵抗性遺伝子データベース[12]に対して、以下のパラメータを使用してNextGenMapを用いてマッピングした：0.9の、感度（-s）、最小同一性（-i）およびマッピングされた残基の最小数（-R）。
【０１２５】
結果
敗血症患者での上昇したcfDNAレベルは、微生物DNA断片を明らかにする
敗血症患者で感染中の微生物を特定するためのcfDNAの診断能力を試験する目的で、本研究では合計62種類の血漿サンプルを分析した。敗血症群（S、n＝7）は、敗血症の発症時から開始して、1（T0）から6（T6）までの血漿検体を含んでいた（32サンプル）。健康なボランティアおよび腹部大手術を受けた患者は、非感染対照として機能した。健康なボランティア（V；n＝12）は、1種類の血漿サンプル（T0）を提供し、術後対照群の患者（P；n＝6）は、3種類の血漿検体（T0〜T2）を提供した。平均年齢は、S、VおよびPの群について、それぞれ70.5歳、26.4歳および64.2歳であった（図14）。
【０１２６】
図14：患者特性、cfDNA濃度および配列決定統計。
【０１２７】
患者は、敗血症患者（S）、健康なボランティア（V）および腹部大手術後の非感染患者（P）にグループ分けされた。リード全体（配列決定深度；sequencing depth）のうち、ヒト参照ゲノムhg19にマッピングされたすべてのリードはヒトリードに分類され、残余のリードが未マッピングとして記録される。Krakenを用いていずれかの生物種に分類された未マッピングリードの割合は、本明細書中では分類されたものとして記載される。
【０１２８】
敗血症患者は、総合的な臨床微生物学精密検査によりモニタリングされ、これには、定期的な血液培養、他の分泌物またはカテーテル先端、スワブの培養、ならびに適応である場合には真菌およびウイルスについての検査が含まれた。7名の患者のうちの5名が28日間の試験期間に生存していた。患者および対照は、最初に、敗血性ショックのバイオマーカーとしてのメチルグリオキサールの評価[1]に参加し、続いて、試験はNGSベースの診断へと変更された。患者および対照血漿からのcfDNA単離は、ヌクレオソームDNAについて予測される、特徴的な、主要なアポトーシス関連サイズパターン[13,14]を明らかにした（図6）。cfDNA単離に続いて、溶出されたDNAの濃度を入力血漿体積の関数として算出し、1mLへと標準化した。cfDNAの濃度は、敗血性ショックを有する患者で有意に増大し（平均S 197.23ng/mL）、特に敗血症の発症時に増大していた（平均S T0 377.30ng/mL）（図1）。
【０１２９】
上昇した濃度は、手術前の非感染対照および健康なボランティア（P T0平均149.33ng/mL；V平均55.43ng/mL）と比較して、術後患者の血漿でも測定された（P T1-T2平均451.63ng/mL）。単離されたcfDNAから配列決定ライブラリーが調製され、100bp長および約26,000,000リードの平均カバレッジを用いてIlluminaハイスループットシーケンシングにより分析された。患者血漿中の非ヒト核酸を定量的に特定するための、本発明に関するワークフローを用いて（図7）、血漿から開始する合計のターンアラウンド時間は約30時間であり、このうち最も時間がかかるステップは配列決定であり、これは16時間以内にHiSeq2500で高速ランモードで遂行された。これは、陽性判定までの時間が24〜120時間である標準的な血液培養に対して非常に対抗力がある。自動化システムでは、血液培養は慣用的には5日間インキュベートされる[17]。
【０１３０】
図14では、ヒトリード、未マッピングリードおよび未マッピングリードの分類割合についての配列決定統計をまとめている。比較されたすべての群にわたるcfDNA濃度の変動にもかかわらず、ヒトリードの平均割合は同様であり（群S T0、VおよびP T0でそれぞれ、96.36％、96.52％および96.21％）、未マッピングリードの割合はそれに対応していた。分類されたリードの平均は、敗血症発症時の敗血症患者で比較的高かった（群S T0、VおよびP T0でそれぞれ、9.82％、3.50％および2.64％）。各群のすべての長期経過サンプルで、この傾向は小さくなった（群S、VおよびPでそれぞれ、ヒトリード：97.79％、96.52％および97.22％；分類されたリード：4.24％、3.50％および2.31％）。術後対照（T1およびT2）では、cfDNA量の増大（451.63ng/mL）は、ヒトリードの最も高い割合（97.72％）および非ヒトに分類されたリードの最も低い割合（2.14％）と関連していた。しかしながら、分類されたリードの割合には、混入PhiXリードおよびキサントモナス・カンペストリス（下流の分析で混入物として廃棄された）に分類されたリードが含まれることに留意すべきである。
【０１３１】
ライブラリーサイズに対する標準化後に、分類されたリードを用いて、非感染対照と比較した敗血症患者の微生物cfDNA画分に基づいて、原因病原体を診断した。
【０１３２】
病原体呼び出し（calling）のための定量的スコアとしての有意性指示定量因子（SIQ）（significance indicating quantifier）の確立
非感染対照との比較での患者に関する微生物リードの定量的評価のための原理が、図2Aに描画されている。原理は、1名の患者由来のデータを用いてさらに例示されている（図2B〜2E）。各血漿サンプルから、分類された非ヒトリードの標準化されたリードカウントが算出され、これは数種類の生物種の分類をもたらす。敗血症の発症時に血液培養がE.クロアカについて陽性であった患者S9の場合、明らかに大きな存在量のエンテロバクター・クロアカリードが、非常に少ない存在量の標準化リードを有する一連の生物種と比較して見出された（図2B）。分類されたすべての生物種に対するリード存在量の有意性を評価するために、すべての敗血症患者と対照との間で、各生物種に関して、標準化されたリードカウントを比較した。患者および対照でのE.クロアカに対する標準化されたリードの存在量は、患者S9の時点T0（1,907.33、図2C）を除いて、ゼロの近くで均一に分布していた。対照的に、アクネ菌などの一般的な皮膚共生生物についての標準化リードカウントは、すべてのサンプルにわたってランダムに分布しており、比較的大きな存在量は、非感染対照から取得されたサンプルで特に検出された（図2D）。この結果は、多数の考えられる偏在的な混入生物種について観察された（図17）。したがって、微生物由来核酸断片をカウントするための純粋に定量的なアプローチは、誤解を与えるものであり、かつ現行の分子的診断アプローチの主要な落とし穴である。それゆえ、臨床的判断を助けるために、サンプル中で見出された各生物種について観測されたリードカウントの存在量および可能性の低さを、統一された描出法で組み合わせた。標準化されたリードのlog2比率をx軸上にプロットし、1-p値をy軸上にプロットしている（図2E）。対照と比較してp値が0.05未満であったサンプル中で有意に現れている生物種が、有意であると見なされる（図2E）。これらの生物種同士をさらに区別するために、個別のSIQスコアが、データ点の半径により表わされる。したがって、敗血症発症時の患者S9のcfDNA中に見出された、存在量および有意性が最も高い生物種は、5,000のSIQスコアを有するエンテロバクター・クロアカである。このことはさらに、すべての他のサンプルおよび対照で偏在的に存在する場合には、高いリードカウントを有する生物種は低いSIQスコアを与えられるであろうことを暗示する。対照的に、非常にわずかなリードしか有しないが低い有病率である生物種は、高いSIQスコアを与えられるであろう。この原理は、高存在量かつ低有意性である混入物リードから、低存在量であるが有意な病原体関連リードを際立たせることを助ける。
【０１３３】
SIQスコアの臨床的重要性
SIQスコアは、1種類のサンプル中に見出される種々の微生物生物種同士の絶対的比較を可能にする。したがって、臨床検体中の病原体のデータ駆動型特定に加えて、本方法は、患者の細菌量ならびに標的化治療および補完的な標準的臨床微生物学に対する応答をモニタリングする際に非常に有用であり得る。臨床診断でのSIQスコアの重要性を評価するために、28日間の試験期間にわたって、配列決定結果を、抗感染症療法を用いて補助された、臨床微生物学データと比較した。データは、3種類以上の血漿採取物を有するすべての患者について編集され（7名の患者のうち5名、図10〜12）、患者S10およびS60について図3に示されている。患者S10（図3A）は、胃の腫瘍を除去するための胃切除術後の重症肺炎に起因する敗血性ショックを発症した。研究への参加時には、最初の血液培養および他の分泌物由来のその後のサンプルは黄色ブドウ球菌に陽性であった。黄色ブドウ球菌を別にすると、早期の呼吸器検体では、顕著なウイルス量（viral burden）（1型単純ヘルペスウイルス（HSV1）、9.87×106コピー/mL）および低い真菌量（fungal burden）（カンジダ・アルビカンス（Candida albicans））もまた、それぞれqPCRまたは培養により検出された。後期サンプル採取由来の血液の培養は陰性であったが、中心静脈カテーテルから採取された血液培養（BC CVC）は、エンテロコッカス・フェシウムおよび表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）に関して陽性培養物を生じ、このことは、血管内ラインから取得された血液培養に一般的な混入物の可能性を示唆した[18]。血漿サンプルの配列決定により、黄色ブドウ球菌が、125.24、720.41、12.86、2および0.03のSIQスコアを伴って、すべての観測された時点での患者血液中の主な生物体として確認された。黄色ブドウ球菌に関して最も高いSIQスコアは敗血症発症後の1日目に観測され、その後は大きく低下した。7日目には、最も高いSIQスコアはHSV1（43.07）について得られた。HSV1はまた、14日目の気管分泌物でもqPCRにより検出されたが（8.5×105コピー/mL）、それ以外には他のサンプルでは検出されなかった（qPCRまたはNGS）。軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum）および表皮ブドウ球菌が、NGSで少量だけ見出された。ゲノム配列は手動でデータベースに含められていたが、C.アルビカンスは、NGSにより血漿サンプル中に検出されなかった。同じく、E.フェシウムについてはリードが取得されなかった。黄色ブドウ球菌は臨床的に重要な生物体であること、およびそのメチシリンに対する感受性に従って、患者はフルクロキサシリンを用いて治療され、再活性化したHSV1はアシクロビルを用いて治療された。患者は、敗血性ショックの発症から6週間後に一般病棟に移された。cfDNA血漿濃度に関して、当初の高レベルから、1日目での急降下を伴って、段階的な低下がこの患者について観察できた。cfDNA濃度の漸減の同様の経過を、患者S60を除く他の患者で観察することができ、患者S60ではcfDNAの最高濃度は28日目に関して観測された（図3B）。患者S60は、数回の敗血症発症を伴う腸の漏出（bowel leakage）エピソードに反復して罹患し、腹部再建手術を繰り返し受けた。興味深いことに、敗血症の経過中に、この患者に関して陽性の血液培養物は得ることができず、例外は研究への参加の1日前に表皮ブドウ球菌について1本だけが陽性になったことであった���イミペネムおよびリネゾリドを用いた当初の経験的抗生物質療法は、大腸菌およびエンテロコッカス・フェシウムについて陽性の腹部創傷スワブの確証的結果を理由として継続された。腹腔内洗浄液および追加の創傷スワブを含む後期のサンプル採取（7日目、11日目、14日目および21日目に取得された）は、大腸菌（および一部は腸球菌）について引き続き陽性であった。加えて、プロテウス属（プロテウス・ブルガリス）、C.アルビカンスおよびモルガネラ属（モルガン菌（Morganella morganii））が検出された。気管分泌物がさらに検査され、HSV1および/またはC.アルビカンスについて陽性であった。感染症のさらなる経過中、患者は、大腸菌、ステノトロホモナス属およびクレブシエラ・ニューモニエを原因とする人工呼吸器関連肺炎を発症した。この患者の血漿のcfDNAについてのNGSに基づく結果は、全時間経過にわたって、臨床微生物学の結果と合致した。敗血症早期（0日目、1日目、4日目、7日目、14日目および21日目）に取得されたサンプルにより、大腸菌、E.フェシウムおよびバクテロイデス・フラギリスを原因とする多菌性腹部感染の臨床所見が確認された。1日目の血漿に関しては限定したリードカウントしか取得されず、それでもなお、大腸菌およびB.フラギリスは最も高いSIQスコアを有する生物種であることが見出された。4日目から14日目には、上昇した量のC.アルビカンスcfDNAが測定された（4日目、7日目および14日目についてSIQスコア8.17、1.97および290.53）。さらに、気管分泌物からのHSV1の定量的PCR由来の結果は、NGSによっても確認することができた（7日目）。モルガネラ属の細菌は培養を介して早くも1日目に検出されたが、モルガン菌に分類されるリードは、21日目に取得された血漿でのみ検出された。最後に、研究期間の終了時に、人工呼吸器関連肺炎に向かう患者の悪化が、28日目に取得された血漿でのK.ニューモニエ（K. pneumonia）について1341.37およびバクテロイデス・フラギリスについて68.58のSIQスコアを伴う配列決定結果により同じく確認された。しかしながら、ステノトロホモナス属DNAレベルの上昇は、血漿検体からは観察されなかった。この患者のcfDNAレベルは、2日目、7日目および28日目に上昇し、28日目が最高であった。患者は、3ヵ月のICU治療後に中間看護病棟へと移すことができ、最終的に、さらに2週間後に退院した。
【０１３４】
7名の患者のうちの7名について、陽性の血液培養物が得られた。しかしながら、1名の患者（S60）では、培養された細菌が1本の培養ボトルからの表皮ブドウ球菌のみであったので（図3B）、血液培養の混入物と考えられた[19]。さらに、7名の患者のうちの3名では、研究への参加前に陽性の培養物が既に得られており、7名のうちの6名は敗血症の発症前に抗感染症療法を既に受けていた。NGSを用いて、7症例のうちの6症例（S60以外）で血液培養の知見と合致する説得力のある結果がすべての患者について得られた。さらに、敗血症発症時（大腸菌、E.フェシウムおよびB.フラギリスによる多菌性感染）に患者S60について取得されたSIQ結果は、腹部手術中に得られた腹腔内スワブおよび腸の漏出により引き起こされた敗血症の臨床経過と合致し、このことは、標準的血液培養と比較して、本発明の通りの手順の優れた感度を示すものである。興味深いことに、血漿サンプルからのNGS結果は、分析したすべての患者に関して、気管分泌物、スワブまたはカテーテル培養などの他の検体由来のデータとも合致した（図10〜12）。
【０１３５】
生物種特異的リードは抵抗性遺伝子に割り当てることができた
患者S9の分析により、原因病原体であるE.クロアカに対して固有に割り当てることができる多量のリード（58,460個の未加工リード）が明らかになった。結果として、それぞれのゲノムが、約1の均一に分布したカバレッジを示す（図4A）。このことを利用して、この症例で内因性の抵抗性に関連する遺伝子を検出可能にすることができるであろう。ミスマッチなしでCARDデータベースに対してそれぞれのリードをマッピングすることにより、0.02〜0.6の遺伝子カバレッジを有するわずかなヒットのみが生じた（図4B）。このとき、特定された遺伝子はRNAポリメラーゼサブユニットB（rpoB）および転写調節因子RobAの数種類の変異体を含み、これらは抗生物質抵抗性遺伝子である可能性があるとしてデータベースの一部になっているが、抗生物質抵抗性自体は含まない。
【０１３６】
さらに、購入した、敗血症に罹患した5名のドナーのプール血漿サンプル（Seralab社）を分析した。5名のドナーのうちの3名は、黄色ブドウ球菌を原因病原体として診断され、1名は非炭疽菌バチルス属（Bacillus non-anthracis）、1名の患者は緑色連鎖球菌（viridans streptococci）を原因病原体として診断された（図19）。黄色ブドウ球菌に分類されるが、言及された他の属には分類されないリードを、NGSデータ中で特定した。330,000,000（330 Mio）個のリードという比較的高いカバレッジを有するサンプルを配列決定し、2150個の黄色ブドウ球菌リードが特定された。CARDデータベースに対するマッピングによる抵抗性遺伝子の探索により、とりわけ、mecAについて3個のヒットが特定された。
【０１３７】
参照文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図６Ｂ−４】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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