(57)【要約】  本発明は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を改善する組成物および方法を提供する。特に、本発明は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ２機能または発現を低減させた細胞およびその使用方法を提供する。本発明は、さらにＣＡＲ  Ｔ細胞と関連させたＴｅｔ２阻害剤およびその使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように改変された細胞(例えば、細胞の集団)であって、ここで、ＣＡＲは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該細胞におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能が減少しているかまたは消失している、細胞。
【請求項２】
抗原結合ドメインがＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥＡ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍抗原に結合する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
腫瘍抗原がＣＤ１９である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
抗原結合ドメインが例えば、ＷＯ２０１２／０７９０００号またはＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載される抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
膜貫通ドメインが
配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列；または
配列番号１２の配列を含む、
請求項１〜４の何れかに記載の細胞。
【請求項６】
抗原結合ドメインが膜貫通ドメインにヒンジ領域により結合され、ここで、該ヒンジ領域が配列番号２または配列番号６またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜５の何れかに記載の細胞。
【請求項７】
細胞内シグナル伝達ドメインが一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ここで、一次シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲIIａ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜６の何れかに記載の細胞。
【請求項８】
一次シグナル伝達ドメインが
配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列または
配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、
請求項１〜７の何れかに記載の細胞。
【請求項９】
細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激性シグナル伝達ドメインまたは一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ここで、共刺激性シグナル伝達ドメインがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜８の何れかに記載の細胞。
【請求項１０】
共刺激性シグナル伝達ドメインが配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜９の何れかに記載の細胞。
【請求項１１】
共刺激性シグナル伝達ドメインが配列番号１４または配列番号１６の配列を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の細胞。
【請求項１２】
細胞内ドメインが配列番号１４または配列番号１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを構成する配列が同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項１〜１１の何れかに記載の細胞。
【請求項１３】
さらに配列番号２の配列を含むリーダー配列を含む、請求項１〜１２の何れかに記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団)である、請求項１〜１３の何れかに記載の細胞。
【請求項１５】
免疫エフェクター細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
Ｔ細胞がＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはこれらの組み合わせである、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
細胞がヒト細胞である、請求項１〜１７の何れかに記載の細胞。
【請求項１９】
細胞がＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含む、請求項１〜１８の何れかに記載の細胞。
【請求項２０】
Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤が(１）Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)該遺伝子編集システムの１以上の成分をコードする核酸または(３)これらの組み合わせである、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
遺伝子編集システムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステムおよびメガヌクレアーゼシステムからなる群から選択される、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
遺伝子編集システムがＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２をコードする遺伝子の早期エキソンまたはイントロンにおける標的配列に結合する、請求項２０または２１に記載の細胞。
【請求項２３】
遺伝子編集システムがｔｅｔ２をコードする遺伝子の標的配列に結合し、該標的配列がエキソン４、例えば、エキソン１、エキソン２またはエキソン３、例えばエキソン３の上流にある、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
遺伝子編集システムがＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２をコードする遺伝子の後期エキソンまたはイントロンにおける標的配列に結合する、請求項２０〜２３の何れかに記載の細胞。
【請求項２５】
遺伝子編集システムがｔｅｔ２をコードする遺伝子の標的配列に結合し、該標的配列がエキソン８の下流であり、例えば、エキソン９、エキソン１０またはエキソン１１、例えばエキソン９にある、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
遺伝子編集システムがＴｅｔ２遺伝子の標的配列とハイブリダイズするターゲティング配列を含むｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、請求項１８〜２５の何れかに記載の細胞。
【請求項２７】
ターゲティング配列が表３に挙げるターゲティング配列である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
ターゲティング配列が表５に挙げるターゲティング配列である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
Ｔｅｔ２の阻害剤がＴｅｔ１、Ｔｅｔ２、Ｔｅｔ３に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項３０】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＴｅｔ２  ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、例えば、表４に挙げるｓｈＲＮＡの標的配列を含む、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤が小分子である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項３２】
Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤がタンパク質、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３のドミナントネガティブ結合パートナー(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３と相互作用するヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ))または該Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２およびＴｅｔ３のドミナントネガティブ結合パートナーをコードする核酸である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項３３】
Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤がタンパク質、例えば、ドミナントネガティブ(例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３または該ドミナントネガティブＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする核酸である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項３４】
ＣＡＲ発現細胞の治療有効性を増加させる方法であって、例えば、請求項１〜３３の何れかに記載の細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)、該細胞における５−ヒドロキシメチルシトシンのレベルを減少させる工程を含む、方法。
【請求項３５】
ＣＡＲ発現細胞、例えば、請求項１〜３４の何れかに記載の細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)の治療有効性を増加させる方法であって、該細胞とＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を接触させる工程を含む、方法。
【請求項３６】
該工程が該細胞とＴｅｔ阻害剤を接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
該Ｔｅｔ阻害剤がＴｅｔ２阻害剤である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｔｅｔ阻害剤が(１)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその対応する制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現を阻害する核酸(例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ)、(３)タンパク質(例えば、ドミナントネガティブ、例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３またはＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の結合パートナー、(４)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現および／または機能を阻害する小分子、(５)(１)〜(３)の何れかをコードする核酸および(６)(１)〜(５)の何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
Ｔｅｔ阻害剤がＴｅｔ２阻害剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該接触がエクスビボで起こる、請求項３６〜３９の何れかに記載の方法。
【請求項４１】
接触がインビボで起こる、請求項３６〜３９の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
接触がＣＡＲをコードする核酸の細胞への送達前にインビボで起こる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
接触が、細胞がそれを必要とする対象に投与された後にインビボで起こる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
処置を必要とする対象を処置する方法において使用するための細胞であって、方法が該対象に有効量の請求項１〜３３の何れかに記載の細胞を投与することを含む、細胞。
【請求項４５】
方法がさらに該対象にＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を投与することを含む、請求項４４に記載の使用のための細胞。
【請求項４６】
処置を必要とする対象を処置する方法において使用するためのＣＡＲ発現細胞療法であって、方法が該対象にＣＡＲ発現細胞療法およびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項４７】
対象がＣＡＲ発現細胞療法開始前にＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤での前処置を受けている、請求項４６に記載の使用のためのＣＡＲ発現細胞療法。
【請求項４８】
対象がＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤およびＣＡＲ発現細胞療法での同時処置を受ける、請求項４６に記載の使用のためのＣＡＲ発現細胞療法。
【請求項４９】
対象がＣＡＲ発現細胞療法後にＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤での処置を受ける、請求項４６に記載の使用のためのＣＡＲ発現細胞療法。
【請求項５０】
対象が腫瘍抗原の発現と関係する疾患、例えば、増殖性疾患、前癌状態、癌および腫瘍抗原の発現と関係する非癌関連兆候を有する、請求項４４〜４９の何れかに記載の使用のためのＣＡＲ発現細胞療法。
【請求項５１】
癌が慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性白血病、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症または前白血病の１以上から選択される血液癌である、請求項５０に記載の使用のためのＣＡＲ発現細胞療法。
【請求項５２】
癌が結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓もしくは輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発癌、該癌の組み合わせおよび該癌の転移病変からなる群から選択される、請求項５０に記載の使用のためのＣＡＲ発現細胞療法。
【請求項５３】
対象の処置において使用するためのＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤であって、ここで、該対象ＣＡＲ発現細胞を含む治療を受けている、受けるまたは受けようとしている、阻害剤。
【請求項５４】
ＣＡＲ発現細胞を製造する方法であって、ＣＡＲをコードする核酸を、細胞に、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３発現および／または機能が減少または消失するように、該核酸(またはそのＣＡＲコード化部分)が該細胞のゲノムのＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子内(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子のイントロンまたはエキソン内)に統合されるように導入することを含む、方法。
【請求項５５】
ＣＡＲ発現細胞を製造する方法であって、該ＣＡＲ発現細胞とＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤をエクスビボで接触させることを含む、方法。
【請求項５６】
阻害剤がＴｅｔ２阻害剤である、請求項４０〜５５の何れかに記載の方法。
【請求項５７】
ＣＡＲをコードする配列およびＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤をコードする配列を含む、ベクター。
【請求項５８】
Ｔｅｔ阻害剤が(１)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその対応する制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現を阻害する核酸(例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ)、(３)タンパク質(例えば、ドミナントネガティブ、例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３またはＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の結合パートナーおよび(４)(１)〜(３)の何れかをコードする核酸またはこれらの組み合わせである、請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
ＣＡＲをコードする配列およびＴｅｔ阻害剤をコードする配列が２Ａ部位により離される、請求項５７または５８に記載のベクター。
【請求項６０】
Ｔｅｔ遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３遺伝子またはその制御エレメントの配列に特異的である遺伝子編集システム。
【請求項６１】
遺伝子編集システムがＴｅｔ２遺伝子の配列に特異的である、請求項６１に記載の遺伝子編集システム。
【請求項６２】
遺伝子編集システムが(１)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、(２)亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステムおよびメガヌクレアーゼシステムである、請求項６０または６１に記載の遺伝子編集システム。
【請求項６３】
遺伝子編集システムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムである、請求項６２に記載の遺伝子編集システム。
【請求項６４】
Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列およびＣａｓ９タンパク質を含むｇＲＮＡ分子；
Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列およびＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むｇＲＮＡ分子；
Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列およびＣａｓ９タンパク質を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸；または
Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列をコードする核酸およびＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むｇＲＮＡ分子
を含む、請求項６３に記載の遺伝子編集システム。
【請求項６５】
さらに鋳型ＤＮＡを含む、請求項６０〜６４の何れかに記載の遺伝子編集システム。
【請求項６６】
鋳型ＤＮＡがＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸配列を含む、請求項６５に記載の遺伝子編集システム。
【請求項６７】
Ｔｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤を含む、ＣＡＲ発現細胞をエクスビボで製造するための組成物。
【請求項６８】
Ｔｅｔ阻害剤がＮ−[３−[７−(２,５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ)−１−メチル−２−オキソ−１,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド[４,５−ｄ]ピリミジン−３−イル]−４−メチルフェニル]−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド、２−[(２,６−ジクロロ−３−メチルフェニル)アミノ]安息香酸および２−ヒドロキシグルタレートから選択される、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
請求項１〜３３の何れかに記載の細胞の１以上を含む細胞の集団であって、ここで、細胞の集団が細胞におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能が減少しているかまたは消失している１以上の細胞を含まない細胞の集団より、Ｔｓｃｍ細胞(例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ９５＋  Ｔ細胞)を高いパーセンテージで含む、細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月１７日出願の米国出願番号６２／２２０,１９６号に基づく優先権を主張し、その内容を引用により本明細書に全体として包含させる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提供されている配列表を含み、その全体を引用により本明細書に包含させる。該ASCIIコピーは２０１６年９月１４日に作成し、N2067-7098WO_SL.txtなる名称であり、５０７,９９６バイトサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、腫瘍抗原の発現と関係する疾患を処置するための、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
自己Ｔ細胞、特にキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形質導入したＴ細胞を用いる養子細胞移入(ＡＣＴ)療法は、血液癌治験で有望性が示されている。Ｔ細胞療法、特に有効性が改善されたＣＡＲ  Ｔ細胞療法に対する医学的必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
本発明は、メチルシトシンジオキシゲナーゼ遺伝子(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、Ｔｅｔ３)を破壊する組成物および方法ならびに改変細胞(例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞のような遺伝子修飾抗原特異的Ｔ細胞)の機能活性の増大のための、このような組成物および方法の使用を提供する。特に、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞の治療有効性を支持するための、方法および組成物を提供する。理論に拘束されないが、Ｔｅｔ遺伝子(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３)の単一アレルの破壊は、増殖増強、エフェクターサイトカイン産生および脱顆粒制御と関係する５−ヒドロキシメチルシトシンの総レベルを減少させ、それにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖および／または機能を増加させる。
【０００６】
従って、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように改変された細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団のような細胞の集団)を提供し、ここで、ＣＡＲは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで該細胞におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能は減少しているかまたは消失している。ある実施態様において、該細胞におけるＴｅｔ２の発現および／または機能は減少しているかまたは消失している。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍抗原に結合する。ある実施態様において、腫瘍抗原はＣＤ１９である。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１２／０７９０００号またはＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載する、抗体または抗体フラグメントである。
【０００７】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲを発現するように改変された細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団のような細胞の集団)を提供し、ここで、該細胞におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能は減少しているかまたは消失している。ある実施態様において、該細胞におけるＴｅｔ２の発現および／または機能は減少しているかまたは消失している。ある実施態様において、該ＣＡＲの膜貫通ドメインは、(ｉ)配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列または(ii)配列番号１２の配列を含む。
【０００８】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲを発現するように改変された細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団のような細胞の集団)を提供し、ここで、該細胞におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能は減少しているかまたは消失している。ある実施態様において、該ＣＡＲの抗原結合ドメインは膜貫通ドメインにヒンジ領域により結合され、ここで、該ヒンジ領域は、配列番号２または配列番号６またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ここで、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲIIａ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【０００９】
ある実施態様において、該ＣＡＲの一次シグナル伝達ドメインは、(ｉ)配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列または(ii)配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激性シグナル伝達ドメインまたは一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ここで、共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ  アルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【００１０】
ある実施態様において、該ＣＡＲの共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、該ＣＡＲの細胞内ドメインは配列番号１４または配列番号１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを構成する配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、配列番号２の配列を含むリーダー配列をさらに含む。
【００１１】
ある実施態様において、本発明の免疫エフェクター細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。ある実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはこれらの組み合わせである。ある態様において、本発明の細胞はヒト細胞である。ある態様において、本発明の細胞(例えば、改変免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞)は、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含む。ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤は、(１)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)該遺伝子編集システムの１以上の成分をコードする核酸または(３)これらの組み合わせである。
【００１２】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤はＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システムであり、ここで、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステムおよびメガヌクレアーゼシステムからなる群から選択される。
【００１３】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤はＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システムであり、ここで、遺伝子編集システムは、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２をコードする遺伝子の早期エキソンまたはイントロンにおける標的配列に結合する。
【００１４】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤はＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システムであり、ここで、遺伝子編集システムはｔｅｔ２をコードする遺伝子の標的配列に結合し、該標的配列は、エキソン４、例えば、エキソン１、エキソン２またはエキソン３、例えばエキソン３の上流にある。
【００１５】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤はＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システムであり、ここで、遺伝子編集システムは、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２をコードする遺伝子の後期エキソンまたはイントロンにおける標的配列に結合する。
【００１６】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤はＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システムであり、ここで、遺伝子編集システムはｔｅｔ２をコードする遺伝子の標的配列に結合し、該標的配列はエキソン８の下流であり、例えば、エキソン９、エキソン１０またはエキソン１１、例えばエキソン９にある。
【００１７】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤はＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ２またはその制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システムであり、ここで、遺伝子編集システムは、Ｔｅｔ２遺伝子の標的配列とハイブリダイズするターゲティング配列を含むｇＲＮＡ分子を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。ある実施態様において、ターゲティング配列は、表３に挙げるターゲティング配列である。ある実施態様において、標的配列は、表５に挙げるターゲティング配列である。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤は、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、Ｔｅｔ３に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸である。ある実施態様において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡはＴｅｔ２  ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、例えば、表４に挙げるｓｈＲＮＡの標的配列を含む。
【００１９】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、該阻害剤は小分子である。
【００２０】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、阻害剤はタンパク質、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３のドミナントネガティブ結合パートナー(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３と相互作用するヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ))または該Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２およびＴｅｔ３のドミナントネガティブ結合パートナーをコードする核酸である。
【００２１】
ある実施態様において、本発明の細胞はＣＡＲおよびＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の阻害剤を含み、ここで、阻害剤はタンパク質、例えば、ドミナントネガティブ(例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３または該ドミナントネガティブＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする核酸である。
【００２２】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、何れかの前記細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)の治療有効性を増加させる方法であって、該細胞における５−ヒドロキシメチルシトシンのレベルを減少させる工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、該工程は、該細胞とＴｅｔ(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３)阻害剤を接触させることを含む。ある実施態様において、該Ｔｅｔ阻害剤はＴｅｔ２阻害剤である。ある実施態様において、本発明のＴｅｔ(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３)阻害剤は、(１)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその対応する制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現を阻害する核酸(例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ)、(３)タンパク質(例えば、ドミナントネガティブ、例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３またはＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の結合パートナー、(４)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現および／または機能を阻害する小分子、(５)(１)〜(３)の何れかをコードする核酸および(６)(１)〜(５)の任意の組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、本発明のＴｅｔ阻害剤はＴｅｔ２阻害剤である。
【００２３】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、何れかの前記細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)の治療有効性を増加させる方法であって、該細胞における５−ヒドロキシメチルシトシンのレベルを減少させる工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、該工程は、該細胞とＴｅｔ(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３)阻害剤を接触させることを含む。ある実施態様において、該接触はエクスビボで起こる。ある実施態様において、該接触はインビボで起こる。ある実施態様において、該接触は、ＣＡＲをコードする核酸の細胞への送達前にインビボで起こる。ある実施態様において、該接触は、細胞がそれを必要とする対象に投与された後にインビボで起こる。
【００２４】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現済細胞、例えば、何れかの前記細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)の治療有効性を増加させる方法であって、該細胞とＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を接触させる工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、該Ｔｅｔ阻害剤はＴｅｔ２阻害剤である。ある実施態様において、本発明のＴｅｔ(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３)阻害剤は、(１)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその対応する制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現を阻害する核酸(例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ)、(３)タンパク質(例えば、ドミナントネガティブ、例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３またはＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の結合パートナー、(４)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現および／または機能を阻害する小分子、(５)(１)〜(３)の何れかをコードする核酸および(６)(１)〜(５)の任意の組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、本発明のＴｅｔ阻害剤はＴｅｔ２阻害剤である。
【００２５】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現済細胞、例えば、何れかの前記細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)の治療有効性を増加させる方法であって、該細胞とＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を接触させる工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、該工程は、該細胞とＴｅｔ(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３)阻害剤を接触させることを含む。ある実施態様において、該接触はエクスビボで起こる。ある実施態様において、該接触はインビボで起こる。ある実施態様において、該接触は、ＣＡＲをコードする核酸の細胞への送達前にインビボで起こる。ある実施態様において、該接触は、細胞がそれを必要とする対象に投与された後にインビボで起こる。
【００２６】
ある態様において、本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、該対象に有効量のここに記載する細胞、例えば、ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を投与し、そして、所望により、該対象にＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞療法開始前に、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤の前処置を受ける。ある実施態様において、対象は、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤およびＣＡＲ発現細胞療法での同時処置を受ける。ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞療法後にＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤での処置を受ける。ある実施態様において、対象は腫瘍抗原の発現と関係する疾患、例えば、増殖性疾患、前癌状態、癌および腫瘍抗原の発現と関係する非癌関連兆候を有する。ある実施態様において、対象は、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性白血病、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症または前白血病の１以上から選択される、血液癌を有する。
【００２７】
本発明は、癌の処置のためのここに記載する組成物および／または方法の使用を提供し、ここで、癌は結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓もしくは輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発癌、該癌の組み合わせおよび該癌の転移病変からなる群から選択される。
【００２８】
本発明は、対象の処置において使用するためのＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤を提供し、ここで、該対象ＣＡＲ発現細胞を含む治療を受けている、受けるまたは受けようとしている。
【００２９】
本発明は、さらに、ＣＡＲ発現細胞を製造する方法であって、ＣＡＲをコードする核酸を、細胞に、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３発現および／または機能が減少または消失するように、該核酸(またはそのＣＡＲコード化部分)が、該細胞のゲノムのＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子内(例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子のイントロンまたはエキソン内)に統合されるように導入することを含む、方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、ＣＡＲ発現細胞を製造する方法であって、該ＣＡＲ発現細胞とＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤をエクスビボで接触させることを含む、方法を提供する。ある実施態様において、阻害剤はＴｅｔ２阻害剤である。
【００３１】
本発明は、さらに、ＣＡＲをコードする配列およびＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤をコードする配列を含む、ベクターを提供する。ある実施態様において、Ｔｅｔ阻害剤は、(１)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３をコードする遺伝子またはその対応する制御エレメント内の１以上の部位を標的とする遺伝子編集システム、(２)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の発現を阻害する核酸(例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ)、(３)タンパク質(例えば、ドミナントネガティブ、例えば、触媒不活性)Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３またはＴｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３の結合パートナーおよび(４)(１)〜(３)の何れかをコードする核酸またはこれらの組み合わせである。ある実施態様において、ＣＡＲをコードする配列およびＴｅｔ阻害剤をコードする配列は、２Ａ部位により離される。
【００３２】
本発明は、Ｔｅｔ遺伝子またはその制御エレメント、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ３遺伝子またはその制御エレメントの配列に特異的である遺伝子編集システムを提供する。ある実施態様において、遺伝子編集システムは、Ｔｅｔ２遺伝子の配列に特異的である。ある実施態様において、遺伝子編集システムは(１)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、(２)亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステムおよびメガヌクレアーゼシステムである。ある実施態様において、遺伝子編集システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムである。ある実施態様において、遺伝子編集システムは、Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列およびＣａｓ９タンパク質を含むｇＲＮＡ分子、Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列およびＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むｇＲＮＡ分子、Ｔｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列およびＣａｓ９タンパク質を含むｇＲＮＡ分子をコードする核酸またはＴｅｔ２遺伝子の配列またはその制御エレメントに特異的なターゲティング配列をコードする核酸およびＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むｇＲＮＡ分子を含む。ある実施態様において、遺伝子編集システムは、さらに鋳型ＤＮＡを含む。ある実施態様において、鋳型ＤＮＡは、核酸ＣＡＲをコードする配列、例えば、ここに記載するＣＡＲを含む。
【００３３】
本発明は、さらに、Ｔｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤を含む、ＣＡＲ発現細胞をエクスビボで製造するための組成物を提供する。ある実施態様において、Ｔｅｔ阻害剤はＮ−[３−[７−(２,５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ)−１−メチル−２−オキソ−１,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド[４,５−ｄ]ピリミジン−３−イル]−４−メチルフェニル]−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド、２−[(２,６−ジクロロ−３−メチルフェニル)アミノ]安息香酸および２−ヒドロキシグルタレートから選択される。
【００３４】
本発明は、さらに、１以上のここに記載する細胞を含む細胞の集団を提供し、ここで、細胞の集団は、細胞におけるＴｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能が減少しているかまたは消失している１以上の細胞を含まない細胞の集団より、Ｔｓｃｍ細胞(例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ９５＋  Ｔ細胞)を高いパーセンテージで含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１：ＣＤ１９発現ＣＡＲＴ細胞を、ＣＬＬの処置のために患者(ＵＰＣＣ０４４０９−１０)に投与した。患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０におけるＣＡＲＴ細胞を、採血により経時的にモニターした。細胞におけるＢＢＺ発現の量を決定した(赤色)。Ｖｂｅｔａ５.１  ＴＣＲファミリーからの配列のコピー数を決定した(青色)。両方の測定を、ＣＡＲＴ細胞の２回目の注入後、指定した日に採取したサンプルで行った。
【００３６】
【図２】図２Ａおよび２Ｂ：患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＴ細胞受容体レパートリーを、ＣＡＲＴ注入後２８日目(図２Ａ)または５１日目(図２Ｂ)に採取したサンプルから決定した。これは、５１日目にＴ細胞受容体のＴＣＲＢＶ０５−０１ファミリーが豊富であることを明らかにし、経時的なクローン性増殖を示す。
【００３７】
【図３】図３：患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０から単離したＴ細胞を、ＣＡＲ１９および２種の異なるＴＣＲファミリー遺伝子の同時発現について経時的に(５０日目および５１日目)分析し、投入した材料(生産物)用量と比較した：上部パネルはＴＣＲファミリーＶｂ１３.１であり；下部パネルはＴＣＲファミリーＶｂ５.１を示す。データは、ＣＡＲ１９陽性細胞が、５０〜５１日目に急速に富化された単一ＴＣＲファミリー遺伝子(Ｖｂ５.１)を含むことを示す。
【００３８】
【図４】図４：患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＣＤ８陽性細胞のＴ細胞受容体レパートリーをＣＡＲＴ注入後５１日目に採取したサンプルから決定した。これは、５１日目のＴ細胞受容体のＴＣＲＢＶ０５−０１ファミリーの存在量を明らかにし、ＣＤ８陽性細胞の経時的なクローン性増殖を示す。
【００３９】
【図５】図５：患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＴ細胞受容体を配列決定しており、アルファ鎖およびベータ鎖の配列を示す(アミノ酸配列は配列番号１２９７〜１２９８として開示し、ヌクレオチド配列は配列番号１２９９〜１３０１として開示し、全て、それぞれ、出現順)。
【００４０】
【図６】図６：音波断片化ＤＮＡを、患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０のＴ細胞から産生した。この材料を使用して、ＣＡＲ１９挿入に隣接するゲノム配列を増幅した。示す遺伝子は、ゲノムにおけるＣＡＲ１９に隣接する注入生成物(Ｄ０)に比して富化されているとして同定された。ＣＡＲＴ注入後の指定する種々の時点で(ｄ＝日；ｍ＝月)、隣接遺伝子の異なる相対的存在量が見られ、Ｔｅｔ２存在量は、末梢血(ＰＢＭＣ)およびＣＡＲ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞サンプル両方で５１日目にピークであった。
【００４１】
【図７】図７：ＣＡＲ１９遺伝子の挿入部位をＴｅｔ２遺伝子にマッピングした。より具体的に、挿入は、Ｔｅｔ２遺伝子のエキソン９と１０の間で生じた。Ｔｅｔ２の触媒ドメインはエキソン１１に存在した。この位置での挿入は、異常ｍＲＮＡ転写物発現または機能的(野生型)Ｔｅｔ２発現減少に至り得る。
【００４２】
【図８】図８：患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０から単離したｍＲＮＡからのＴｅｔ２遺伝子の転写物を、図の右手側に示すとおり、Ｔｅｔ２またはＣＡＲ１９または両者の指定領域にまたがるプライマーを使用するＲＴＰＣＲにより評価した。Ｒｘｎ  ３は、エキソン９および１０にまたがるＴｅｔ２転写物の領域を増幅するために設計したプライマーを含む。Ｒｘｎ、６、７、８、９および１０は、ＣＡＲ１９レンチウイルスの指定部分を増幅するために設計したプライマーである。Ｒｘｎ  １２〜１６は、Ｔｅｔ２転写物のエキソン９配列ならびにＣＡＲ１９レンチウイルス構築物からの配列を含むプライマー対である。これらのデータは、転写物がＴｅｔ２配列ならびにＣＡＲ１９配列の両方を含むＴｅｔ２座位から製造されることを示す。
【００４３】
【図９】図９：図１０Ａおよび１０Ｂにおいて発見されたＴｅｔ２座位由来の転写物の模式図を示す。この図は、患者サンプルにおいて検出されたこのＴｅｔ２／ＣＡＲ１９融合のスプライスバリアントを示す。この分析は、Ｔｅｔ２へのＣＡＲ１９挿入がエキソン１１の上流に停止コドンを含む転写物をもたらすことを確認している。エキソン１１は、Ｔｅｔ２機能に重要であることが示されている。これは、Ｔｅｔ２機能がＣＡＲ１９挿入により破壊されていることを示唆する。これはまた、Ｔｅｔ２機能の破壊が、この個々のＣＡＲＴクローンの有利な増大(expand)をもたらしていることも示唆する。
【００４４】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂ：Ｔｅｔ２の酵素活性を図式化する(図１０Ａ)。Ｔｅｔファミリータンパク質は５−メチルシトシン(５−ｍｃ)を５−ヒドロキシメチルシトシン(５−ｈｍｃ)に、次いで５−ホルミルシトシン(５−ｆｍｃ)に変換し、脱メチル化シトシンをもたらす。メチル化ＤＮＡは、転写プロファイルに影響することが知られる、エピジェネティックな状態である。患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＴ細胞のメチル化状態を評価した(図１０Ｂ)。患者のＴ細胞をＴＣＲＶｂ５.１(Ｔｅｔ２にＣＡＲ１９挿入を含む)について染色し、５−ｈｍｃおよび５−ｆｍｃを、フローサイトメトリーによりＴＣＲＶｂ５.１陽性(赤色)およびＴＣＲＶｂ５.１陰性(青色)集団において評価した。このデータは、Ｔｅｔ２遺伝子におけるＣＡＲ１９挿入を含む細胞が脱メチル化欠損であることを示す。
【００４５】
【図１１】図１１：ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡは、正常ヒトＴ細胞における５−ｈｍｃレベルを減少する。ＭＣｈｅｒｒｙを発現するＴＥＴ２およびスクランブル制御ｓｈＲＮＡ構築物を正常ヒトＴ細胞に導入した。５−ｈｍｃレベルを、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで増大後６日目に、ＦＡＣＳによる細胞内染色により決定した。ＴＥＴ２のノックダウンは全体的５−ｈｍｃレベルを減少させた。
【００４６】
【図１２】図１２：ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡはＴｓｃｍ  Ｔ細胞を増大させる。ＭＣｈｅｒｒｙを発現するＴＥＴ２およびスクランブル制御ｓｈＲＮＡ構築物を正常ヒトＴ細胞に導入した。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ９５＋  Ｔｓｃｍ  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで増大後、１１日目に、ＦＡＣＳ染色により決定した。ＴＥＴ２のノックダウンは、Ｔｓｃｍ表現型を有するＴ細胞の増大を促進した。
【００４７】
【図１３】図１３Ａ：ＣＡＲ＋細胞の定量のためのゲーティング戦略。図１３Ｂ：非トランスフェクト細胞と比較した、Ｔｅｔ２をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをエレクトロポレーションした細胞におけるＣＡＲ発現レベル。
【００４８】
【図１４】図１４：ＣＡＲ形質導入およびＴｅｔ２編集後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の定量。
【００４９】
【図１５】図１５：ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ増大に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５０】
【図１６】図１６：ＣＡＲ  Ｔ細胞による抗原依存的インターロイキン−２(ＩＬ−２)産生に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５１】
【図１７】図１７：ＣＡＲ  Ｔ細胞による抗原依存的インターフェロンガンマ産生に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５２】
【図１８】図１８：抗原駆動ＣＡＲ＋  Ｔ細胞増殖に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５３】
【図１９】図１９：抗原駆動Ｔ細胞増殖に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５４】
【図２０】図２０：抗原駆動ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５５】
【図２１】図２１：抗原駆動ＣＡＲ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５６】
【図２２】図２２：抗原駆動ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５７】
【図２３】図２３：抗原駆動ＣＡＲ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖に対するＴｅｔ２阻害の効果。
【００５８】
【図２４】図２４：ＮＧＳにより測定する、Ｔｅｔ２をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの導入による、％編集および％フレームシフト編集。
【００５９】
【図２５】図２５：指定するＴＥＴ２エキソン３−ターゲティングｇＲＮＡ(それぞれ、出現順で、配列番号１３０２〜１３２６)に含まれるＲＮＰ添加後の、Ｔ細胞で観察された頻度が上位５位までのインデル。非修飾ｗｔ配列からの変化を示し、挿入を小文字で表し(“ａ”、“ｔ”、“ｇ”および“ｃ”)、欠失をダッシュ(“−“)で表す。インデル頻度は、最右カラムに示す。
【００６０】
【図２６】図２６：指定するＴＥＴ２エキソン９ターゲティングｇＲＮＡ(それぞれ、出現順で、配列番号１３２７〜１３５６)に含まれるＲＮＰ添加後の、Ｔ細胞で観察された頻度が上位５位までのインデル。非修飾ｗｔ配列からの変化を示し、挿入を小文字で表し(“ａ”、“ｔ”、“ｇ”および“ｃ”)、欠失をダッシュ(“−“)で表す。インデル頻度は、最右カラムに示す。
【００６１】
【図２７】図２７：ｓｈＲＮＡ  ＴＥＴ２阻害剤をコードするレンチウイルスに応答するジャーカット細胞におけるＴＥＴ２ノックダウンの決定のための模式的実験プロトコール。
【００６２】
【図２８】図２８：ｓｈＲＮＡ感染ジャーカット細胞におけるＲＦＰ発現。ＲＦＰ発現をピューロマイシン処理６日後、ＦＡＣＳにより決定した。ＲＦＰ発現に基づき、９９％を超えるｓｈＲＮＡ導入ジャーカット細胞が、ピューロマイシン処理により選択された。
【００６３】
【図２９】図２９：ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ感染ジャーカット細胞におけるｔｅｔ２のノックダウン効率。ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。ｔｅｔ１およびｔｅｔ３の発現レベルも測定した。β−アクチンは、試験したサンプル間の相対的遺伝子発現を定量するための内部対照として役立った。ＱＲＴ−ＰＣＲの信頼性を高めるために、２個のβ−アクチンプライマーおよび１個のＲＰＬＰ１プライマーをこの実験で使用した。
【００６４】
【図３０】図３０：ジャーカット細胞におけるｓｈＲＮＡに応答したＴＥＴ２タンパク質のノックダウン。ウェスタンブロット実験を実施した。
【００６５】
【図３１】図３１Ａ：Ｔｅｔ２破壊した患者からのＣＡＲ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＡＴＡＣピークを、Ｔｅｔ２破壊していない一致した時点での同患者からのＣＡＲ−ＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較したベン図。四角の中のプロットは、２細胞集団間のＡＴＡＣ富化の際を示す。図３１Ｂ：Ｔｅｔ２破壊した細胞集団において、そのカウンターパートと比較して、より密接にＡＴＡＣピークと関係しているＧＯ用語。
【００６６】
【図３２】図３２Ａ：定量的ＰＣＲにより測定した、健常ドナーからの初代ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるｓｈＲＮＡによるＴｅｔ２のサイレンシング。ＧＡＰＤＨに対して正規化した発現(平均、ＳＥＭ)を、非ターゲティング対照ｓｈＲＮＡに対する変化倍率として表す。図３２Ｂおよび３２Ｃ：Ａに示したのと同じ健常ドナーにおける、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激により増大後１４日目の中央記憶(図３２Ｂ)およびエフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞(図３２Ｃ)の相対的頻度。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここに記載する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されているのと同じ意味を有する。
【００６８】
単数表現は、１または１を超える(すなわち、少なくとも１)、文法的対象をいう。例として、“エレメント”は１エレメントまたは１を超えるエレメントを意味する。
【００６９】
用語“約”は、量、期間などのような測定可能な値に言及するとき、特定の値からの±２０％またはある場合±１０％またはある場合±５％またはある場合±１％またはある場合±０.１％の変動を、このような変動が開示される方法の実施に適する限り、包含することを意味する。
【００７０】
用語“キメラ抗原受容体”または代替的に“ＣＡＲ”は、一般に最も単純な実施態様においては２個のポリペプチドの一組をいい、これは、免疫エフェクター細胞にあるとき、細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性を提供し、細胞内シグナル産生を伴う。ある実施態様において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激性分子および／または共刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも称する)を含む。ある態様において、ポリペプチドの一組は互いに連続する。ある実施態様において、ポリペプチドの一組は、二量体化分子存在下、ポリペプチドを互いに結合でき、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体に結合するゼータ鎖である。ある態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義する少なくとも一つの共刺激性分子由来の１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、共刺激性分子は、ここに記載する共刺激性分子、例えば、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択される。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激性分子由来の２機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１以上の共刺激性分子由来の２機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意のリーダー配列を含む。ある態様において、ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、所望により細胞プロセスおよびＣＡＲの細胞膜への局在化中、抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から開裂される。
【００７１】
ここに記載するような特異的腫瘍マーカーＸを標的とする抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ)を含むＣＡＲを、ＸＣＡＲと称する。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲをＣＤ１９ＣＡＲと称する。
【００７２】
用語“シグナル伝達ドメイン”は、二次メッセンジャーを産生することにより規定されたシグナル伝達経路を経てまたはこのようなメッセンジャーに応答するエフェクターとして機能することにより、細胞活性を制御するために、細胞内で情報伝達に作用するタンパク質の機能的部分をいう。
【００７３】
ここで使用する用語“抗体”は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも、多鎖でも一本鎖でもまたはインタクト免疫グロブリンでもよく、天然供給源または組み換え供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
【００７４】
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと特異的相互作用する(例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間的分布による)能力を保持する、抗体の少なくとも一つの部分をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨ何れか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異的抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントをまたフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づく足場に移植できる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
【００７５】
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質であり、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーにより連続的に結合され、単一鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ここで、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持する。明記しない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して、何れかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を有し、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るかまたはＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【００７６】
本発明のＣＡＲの抗体またはその抗体フラグメントを含む部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二特異的抗体を含む、抗原結合ドメインが連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在できる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。あるＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Kabat”ナンバリングスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948(“Chothia”ナンバリングスキーム)に記載のものまたはこれらの組み合わせを含む、任意の数の周知のスキームを使用して決定できる。
【００７７】
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施態様において、抗体分子は、多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、ここで、複数のうちの第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第一エピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第二エピトープに対する結合特異性を有する。ある実施態様において、多特異的抗体分子は二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超える抗原に特異性を有しない。二特異的抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
【００７８】
本発明のＣＡＲの抗体またはその抗体フラグメントを含む部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二特異的抗体を含む、抗原結合ドメインが連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【００７９】
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する形態での抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きい方をいい、通常抗体が属するクラスを決定する。
【００８０】
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する形態での抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さい方をいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、二つの主要抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【００８１】
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生されており、該ＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知である組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーにより産生されている、抗体も意味すると解釈すべきである。
【００８２】
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を引き起こす分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫適格細胞活性化または両方に関与し得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる高分子が抗原として働き得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それ故に、ここで使用する用語“抗原”をコードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明が、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原がそもそも“遺伝子”によりコードされる必要がないことを理解する。抗原は合成により産生できまたは生物学的サンプルに由来できまたはポリペプチド以外の高分子であるかもしれない。このような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。
【００８３】
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存減少または癌性状態と関連する種々の生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”は、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体がそもそも癌発生を予防する能力によっても顕在化し得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存減少を含むが、これらに限定されない、種々の手段により顕在化され得る、生物学的効果をいう。
【００８４】
用語“自己”は、後に再挿入する個体であるのと同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
【００８５】
用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位での遺伝子が同一ではないとき、互いに同種であると言うべきである。ある態様において、同じ種の個体由来の同種物質は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なるかもしれない。
【００８６】
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
【００８７】
用語“癌”は、異常細胞の未制御の増殖により特徴付けられる疾患である。癌細胞は局所的にまたは血流およびリンパ系を経て体の他の部分に広がり得る。種々の癌の例がここに記載され、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”はここでは相互交換可能に使用し、例えば、両用語は、固形および液性、例えば、汎発性または循環、腫瘍を包含する。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は前悪性ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
【００８８】
ここで使用する用語“由来する”は、第一および第二分子の関係を示す。これは、一般に第一分子および第二分子の構造類似性をいい、第二分子から誘導される第一分子の製法または起源の限定を含意または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適当な条件下でシグナルを発生させる能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の方法の限定を暗示または包含せず、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、望まない配列を欠失させまたは変異させ、細胞内シグナル伝達ドメインに到達すべきであることを意味しない。
【００８９】
用語“ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または前癌状態、例えば骨髄異形成、骨髄異形成症候群または前白血病またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関係する非癌関連兆候のような、増殖性疾患を含む、ここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関係するここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患または状態をいう。ある態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する癌は血液癌である。ある態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する癌は固形癌である。さらにここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する非癌関連兆候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたはある時点で発現する。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で腫瘍抗原タンパク質を検出可能なレベルで産生し、その後実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
【００９０】
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾はアミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾を、本発明の抗体または抗体フラグメントに、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、本発明のＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換え、改変ＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験し得る。
【００９１】
用語“刺激”は、刺激性分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)の結合により誘発される一次応答をいい、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル伝達または適切なＮＫ受容体もしくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を含むが、これらに限定されないシグナル伝達事象が仲介される。刺激は、ある分子の発現改変に介在し得る。
【００９２】
用語“刺激性分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある態様で、刺激性方向に免疫細胞の活性化を刺激する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発現される分子をいう。ある態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドと共に充填されたＭＨＣ分子の結合により開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の仲介に至る、一次シグナルである。刺激性方式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも称する)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２に由来するものを含むが、これらに限定されない。特定の本発明のＣＡＲにおいて、本発明の任意の１以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。特定の本発明のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１８として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基である。特定の本発明のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２０に提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基である。
【００９３】
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面で主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)と複合化した外来抗原を提示する、アクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用して、これら複合体を認識いし得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それをＴ細胞上に提示させる。
【００９４】
ここで使用する“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを発生させる。例えば、ＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性を含む。
【００９５】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激を担う分子に由来するものまたは抗原依存的刺激を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含み得る。共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激性シグナルを担う分子に由来するものまたは抗原非依存的刺激を含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含んでよく、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激性分子からの細胞質配列を含み得る。
【００９６】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２に由来するものを含むが、これらに限定されない。
【００９７】
用語“ゼータ”または代替的に“ゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲ−ゼータ”は、GenBan Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基として定義され、“ゼータ刺激性ドメイン”または代替的に“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”または“ＴＣＲ−ゼータ刺激性ドメイン”は、ゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基またはＴ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分であるその機能的誘導体として定義される。ある態様において、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Acc. No. BAG36664.1の残基５２〜１６４またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基を含む。ある態様において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”は、配列番号１８として提供される配列である。ある態様において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”は、配列番号２０として提供される配列である。
【００９８】
用語“共刺激性分子”は、共刺激性リガンド、と特異的に結合し、それにより、増殖のような、しかし、これに限定されないＴ細胞による共刺激性応答に介在する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激性分子は、効率的免疫応答に寄与する、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含むが、これらに限定されない。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。
【００９９】
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分であり得る。共刺激性分子は、次のタンパク質ファミリーにより代表される。ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)および活性化ＮＫ細胞受容体。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどを含む。
【０１００】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含み得る。
【０１０１】
用語“４−１ＢＢ”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基をいい、“４−１ＢＢ共刺激性ドメイン”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基として定義される。ある態様において、“４−１ＢＢ共刺激性ドメイン”は、配列番号１４として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価残基である。
【０１０２】
ここで使用する用語“免疫エフェクター細胞”は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄系由来貪食細胞を含む。
【０１０３】
ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の、機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは成長もしくは増殖を阻害する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の性質をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０１０４】
用語“コードする”は、規定したヌクレオチド配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)または規定したアミノ酸配列およびそれらに由来する生物学的性質を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列に固有の性質をいう。それ故に、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、ｍＲＮＡの転写および翻訳が、その遺伝子が細胞または他の生物学的システムにおけるタンパク質の産生に対応するならば、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用された非コード鎖の両方が、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。
【０１０５】
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列なる用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンでイントロンを含む限り、イントロンも含み得る。
【０１０６】
用語“有効量”または“治療有効量”はここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果の達成に有効である、ここに記載する化合物、製剤、材料または組成物の量をいう。
【０１０７】
用語“内因性”は、生物、細胞、組織または系由来のまたはその内部で産生されるあらゆる物質をいう。
【０１０８】
用語“外因性”は、生物、細胞、組織または系の外側から導入されたまたは外側で産生されるあらゆる物質をいう。
【０１０９】
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
【０１１０】
用語“導入ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞内部に送達するのに使用できる、組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む。それ故に、用語“導入ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への送達を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
用語“発現ベクター”は、発現させるヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロ発現系で提供され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを含む、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドまたはリポソームに包含される)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てを含む。
【０１１２】
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科の属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できる点でレトロウイルスの中で独特であり、相当量の遺伝情報を宿主細胞ＤＮＡに送達でき、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。
【０１１３】
用語“レンチウイルスベクター”は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターであり、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に提供される自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaからのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenからのLENTIMAXTMベクターシステムなどを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
【０１１４】
用語“相同”または“同一性”は、２重合分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子のような、２核酸分子間または２ポリペプチド分子間の、サブユニット配列同一性をいう。２分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占拠されているとき、例えば、２ＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンで占拠されているならば、それらはその位置で相同または同一である。２配列の相同性は、整合または相同位置の数の直接関数であり、例えば、２配列における位置の半分(例えば、ポリマー１０サブユニット長中５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０中９)が整合または相同であるならば、２配列は９０％相同である。
【０１１５】
“ヒト化”形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。大部分、ヒト化抗体およびその抗体フラグメントはヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)であり、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基に置き換えられる。いくつかの例で、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに微調整し、最適化し得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも１個の、かつ一般には２個の、可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、一般にヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照。
【０１１６】
“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源であるかまたは抗体または免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
【０１１７】
用語“単離”は、天然状態から変えられているまたは取り出されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、天然状態での共存物質から一部または完全に分離された同核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在でき、または、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存在できる。
【０１１８】
本発明において、通常存在する核酸塩基について、次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、“Ｕ”はウリジンをいう。
【０１１９】
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、制御配列および異種核酸配列において、後者の発現をもたらす機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係に位置しているとき、第二核酸配列と操作可能に連結する。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、該コード配列に操作可能に連結する。操作可能に連結したＤＮＡ配列は、互いに連続的であり、例えば、２タンパク質コード領域を結合させる必要があれば、同じリーディングフレームに置かれる。
【０１２０】
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)、胸骨内または腫瘍内への注射もしくは点滴技術を含む。
【０１２１】
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、主題核酸と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する態様で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた保存的に修飾したそのバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰｓおよび相補配列ならびに明示的に示す配列を、黙示的にも包含する。特に、縮重コドン置換は、１以上の選択(または全)コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の作成により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【０１２２】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は相互交換可能に使用され、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列に含まれ得るアミノ酸の最大数に限定はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、例えば、当分野でペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも一般的に呼ばれる短鎖および多くのタイプがある当分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方をいう。“ポリペプチド”は、例えば、とりわけ、生物活性フラグメント、実質的に同族のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【０１２３】
用語“プロモーター”は、細胞の合成機構により認識されまたは導入された合成機構であって、ポリヌクレオチド配列の特異的転写の開始に必要なＤＮＡ配列をいう。
【０１２４】
用語“プロモーター／制御配列”は、プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。いくつかの例で、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列は遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御エレメントを含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０１２５】
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞の大部分または全ての生理学的条件下で、細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１２６】
用語“誘導可能”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在するときのみ細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１２７】
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によりコードまたは特定されるポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１２８】
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、相互交換可能に、全体的にまたはフラグメントとして(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)癌細胞表面に発現され、癌細胞への薬物の優先的ターゲティングに有用な、分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。ある実施態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞両方により発現されるマーカー、例えば、系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある実施態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して１倍過発現、２倍過発現、３倍またはそれ以上過発現している細胞表面分子である。ある実施態様において、腫瘍抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現される分子と比較して、欠失、付加または変異を含む分子である。ある実施態様において、腫瘍抗原は癌細胞の細胞表面に排他的、全体的にまたはフラグメントとして(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)発現され、正常細胞で合成されずまたは表面に発現されない。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体(ＴＣＲｓ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞で構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法の細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況におけるウイルスまたは腫瘍抗原に由来するＴＣＲ様抗体ターゲティングペプチドが記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングから同定され得る。
【０１２９】
用語“腫瘍支持抗原”または“癌支持抗原”は、相互交換可能に、それ自体は、癌性ではないが、癌細胞を、例えば、その成長または生存、例えば、免疫細胞への抵抗性の促進により、支持する、細胞表面に発現される分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。このタイプの細胞の例は、間質細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣｓ)を含む。腫瘍支持抗原それ自体は、抗原が癌細胞を支持する細胞に存在する限り、腫瘍細胞の支持に役割を有する必要はない。
【０１３０】
ｓｃＦｖの文脈で使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖および可変軽鎖領域を連結するために、単独でまたは組み合わせで使用されるグリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある実施態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(式中、ｎは１以上の正の整数である)である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０(配列番号２８)。ある実施態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２９)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３０)を含むが、これらに限定されない。他の実施態様において、リンカーは(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号３１)の複数反復を含む。また本発明の範囲内に含まれるのは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／１３８４７５号に記載のリンカーである。
【０１３１】
ここで使用する、５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称する)は、転写開始直後の真核生物メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに結合した末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結びつき、共転写的に、各々が互いに影響するように怒る。転写開始直後、合成されるｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合するキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分を修飾して、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節できる。
【０１３２】
ここで使用する“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡはインビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの産生に使用される鋳型を含む。
【０１３３】
ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ポリアデニル化によりｍＲＮＡに結合される一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３４)、好ましくは６４より大きく、より好ましくは１００より大きく、最も好ましくは３００または４００より大きい。ポリ(Ａ)配列は、化学的または酵素的に修飾して、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節し得る。
【０１３４】
ここで使用する“ポリアデニル化”は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分またはその修飾バリアントの共有結合形成をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチドの長配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。それに結合するポリ(Ａ)テイルおよびタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護することを助ける。ポリアデニル化はまた転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出および翻訳に重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に核で生じるが、さらに後に細胞質でも生じ得る。転写が修了した後、ｍＲＮＡ鎖はＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は通常開裂部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ｍＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基は開裂部位の遊離３’末端に付加される。
【０１３５】
ここで使用する“一過性”は、非統合導入遺伝子のある時間、日または週の発現をいい、ここで、発現期間はゲノムに統合されるか宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含まれる場合の遺伝子の発現期間より短い。
【０１３６】
ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療(例えば、本発明のＣＡＲのような１以上の治療剤)の投与に起因する、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の低減または改善または増殖性障害の１以上の症状(好ましくは、１以上の認識できる症状)の改善をいう。特定の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、患者により必ずしも認識されない、腫瘍増殖のような増殖性障害の少なくとも一つの測定可能な身体パラメータの改善をいう。他の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、身体的に、例えば、認識できる症状の安定化により、生理学的に、例えば、身体パラメータの安定化によりまたは両者により、増殖性障害の進行を阻止することをいう。他の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の低減または安定化をいう。
【０１３７】
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を有する、多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け取り、シグナルを細胞の膜を超えて伝達できる分子および分子の複合体をいう。
【０１３８】
用語“対象”は、免疫応答を誘発可能な生存生物を含むことを意図する(例えば、哺乳動物、ヒト)。
【０１３９】
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型が本質的にない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまたその天然に存在する状態で通常結合している他の細胞型から離されている細胞もいう。いくつかの例で、実質的に精製された細胞の集団は、同質細胞の集団をいう。他の例において、この用語は、単に、天然状態で当然結合している細胞から離されている細胞をいう。ある態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
【０１４０】
ここで使用する用語“治療”は処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制寛解または根絶により得られる。
【０１４１】
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態の阻止または防止的処置を意味する。
【０１４２】
本発明において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関連する抗原”は、特異的過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある態様において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌のような腺癌などを含むが、これらに限定されない癌由来である。
【０１４３】
用語“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸を宿主細胞に伝達または導入する方法をいう。“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来性核酸がトランスフェクト、形質転換または形質導入されているものである。細胞は初代細胞およびその子孫を含む。
【０１４４】
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する結合パートナー(例えば、腫瘍抗原)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、該抗体またはリガンドはサンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない。
【０１４５】
ここで使用する用語“制御可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、ＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター性質を最適化できる制御可能細胞内シグナル発生または増殖を伴い、ＲＣＡＲＸ細胞にあるとき、ＲＣＡＲＸ細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性を付与する、一組の、一般に最も単純な実施態様では２個のポリペプチドをいう。ＲＣＡＲＸ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインに結合される抗原を含む標的細胞への特異性の提供を抗原結合ドメインに依存する。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子存在下、細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。
【０１４６】
ここで使用する“膜係留”または“膜拘束ドメイン”は、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に係留するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
【０１４７】
ここで使用する用語“スイッチドメイン”は、例えばＲＣＡＲに言及するとき、二量体化分子存在下、他のスイッチドメインと結合するエンティティ、一般にポリペプチドベースのエンティティをいう。結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば、融合した第一エンティティおよび第二スイッチドメインに結合、例えば、融合した第二エンティティの機能的結合をもたらす。第一および第二スイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ばれる。ある実施態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同一であり、例えば、それらは同一の一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。ある実施態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、それらは異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。ある実施態様において、スイッチは細胞内である。ある実施態様において、スイッチは細胞外である。ある実施態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのエンティティ、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある実施態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのエンティティ、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチド、例えば、ｍｙｃリガンドの多量体または１以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドの多量体である。ある実施態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのエンティティ、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
【０１４８】
ここで使用する用語“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲに言及するとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある実施態様において、二量体化分子は対象に天然に存在せずまたは相当な二量体化をもたらすであろう濃度で生じない。ある実施態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０１４９】
用語“生物学的同等性”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により生じる効果と同等な効果を生じるのに必要な、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬物の量をいう。ある実施態様において、効果は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定して、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価して、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害レベルである。ある実施態様において、効果は、細胞選別により測定して、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変を達成する量または用量である。
【０１５０】
用語“低い、免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒ｍＴＯＲ阻害剤と共に使用したとき、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を完全ではなく、一部阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤の用量をいう。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害による、ｍＴＯＲ活性を評価する方法はここに記載される。用量は、完全な免疫抑制をもたらすには不十分であるが、免疫応答増強には十分である。ある実施態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比増加をもたらす。ある実施態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞数増加をもたらす。ある実施態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は次の１以上をもたらす。
次の１以上マーカーの発現増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体におけるＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体におけるＫＬＲＧ１発現減少；および
次の特性の任意の一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化の何れも、例えば、未処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。
【０１５１】
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある実施態様において、難治性癌は、処置以前または処置開始時から処置に耐性であり得る。他の実施態様において、難治性癌は処置中に耐性となり得る。難治性癌はまた耐性癌とも称される。
【０１５２】
ここで使用する“再発”は、改善期間後、例えば、先の治療の処置剤、例えば、癌処置後の、疾患(例えば、癌)または癌のような疾患の徴候および症状の回帰をいう。
【０１５３】
範囲：本明細書をとおして、本発明の種々の態様は範囲形式で提供され得る。範囲形式での記載は単に簡便さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲の確固たる制限として解釈してはならないことは理解されるべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能性のある範囲内の部分範囲ならびに個々の数字を特異的に開示すると見なすべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６を具体的に開示していると見なすべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性のどれかを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の広さと無関係に適用される。
【０１５４】
ここで使用する用語“Ｔｅｔ”は、１０−１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼファミリーの遺伝子および該遺伝子によりコードされるタンパク質のファミリーをいう。Ｔｅｔは、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２およびＴｅｔ３を含む。
【０１５５】
ここで使用する用語“Ｔｅｔ２”は、遺伝子、ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２および該遺伝子によりコードされるタンパク質、ｔｅｔ２メチルシトシンジオキシゲナーゼをいい、これはメチルシトシンから５−ヒドロキシメチルシトシンへの変換を触媒する。“ＫＩＡＡ１５４６”、“ＦＬＪ２００３２”および“ｔｅｔ癌遺伝子ファミリーメンバー２”と称されることもある。コード化タンパク質は、骨髄造血に関与し、この遺伝子における欠損は、いくつかの骨髄増殖性障害と関連している。ヒトゲノムにおいて、ＴＥＴ２は染色体４ｑ２４に存在する。現在６個のＴＥＴ２アイソフォームが記載されており、そのGenebankはNM_001127208.2、XM_005263082.1、XM_006714242.2、NM_017628.4、XM_011532044.1およびXM_011532043.1である。
【０１５６】
ヒトＴｅｔ２のタンパク質配列の例は、UniProt accession number Q6N021として提供される。
【表１】
2018527008.tif 000002
【表２】
2018527008.tif 000003
【０１５７】
ｔｅｔ２遺伝子は染色体４、位置GRCh38.p2(GCF_000001405.28)(NC_000004.12(105145875〜105279803); Gene ID 54790に位置する。
【０１５８】
Ｔｅｔ２をコードする核酸配列の例を下に提供する。ヒトＴｅｔ２の６個の同定されたアイソフォームがある。ｍＲＮＡ配列を下に提供する(ある実施態様において、各配列において、ＴはＵに置き換えられ得る)。ある実施態様において、Ｔｅｔ２は、下の配列の各々によりコードされるタンパク質を含む。
【表３】
2018527008.tif 000004
【表４】
2018527008.tif 000005
【０１５９】
【表５】
2018527008.tif 000006
【表６】
2018527008.tif 000007
【０１６０】
【表７】
2018527008.tif 000008
【表８】
2018527008.tif 000009
【０１６１】
【表９】
2018527008.tif 000010
【表１０】
2018527008.tif 000011
【０１６２】
【表１１】
2018527008.tif 000012
【表１２】
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【０１６３】
【表１３】
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【表１４】
2018527008.tif 000015
【０１６４】
【表１５】
2018527008.tif 000016
【表１６】
2018527008.tif 000017
【０１６５】
【表１７】
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【表１８】
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【０１６６】
【表１９】
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【表２０】
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【０１６７】
【表２１】
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【表２２】
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【０１６８】
【表２３】
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【表２４】
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【０１６９】
【表２５】
2018527008.tif 000026
【表２６】
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【０１７０】
【表２７】
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【表２８】
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【０１７１】
ここで使用する用語“Ｔｅｔ阻害剤”または“Ｔｅｔ[ｘ]阻害剤”(例えば、“Ｔｅｔ１阻害剤”、“Ｔｅｔ２阻害剤”または“Ｔｅｔ３阻害剤”)は、対応するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の機能および／または発現を低減または排除する、分子または一群の分子(例えば、システム)をいう。ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害する、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を低減または排除する分子をいう。ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の機能を阻害する分子である。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤の例は、遺伝子編集システム結合部位のまたはその近辺の核酸の修飾がＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を低減または排除するように修飾されるような、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子またはその制御エレメント内の核酸を標的とした、例えば、ここに記載する、遺伝子編集システムである。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤の他の例は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２  ｍＲＮＡとハイブリダイズでき、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２翻訳の低減または排除をもたらす、核酸分子、例えば、ＲＮＡ分子、例えば、小ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)または低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤はまた、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２発現を阻害する分子をコードする核酸(例えば、抗Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２  ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする核酸または抗Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子編集システムの１以上の、例えば、全成分をコードする核酸)も含む。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の機能を阻害する分子の例は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の１以上の活性を阻害する分子、例えば、タンパク質または小分子である。例は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の小分子阻害剤である。他の例は、ドミナントネガティブＴｅｔ、例��ば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２タンパク質である。他の例は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２結合パートナー、例えば、関連ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)のドミナントネガティブバージョンである。他の例は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２結合パートナー、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２関連ＨＤＡＣ阻害剤を阻害する分子、例えば、小分子である。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤はＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２機能の阻害剤をコードする核酸も含む。
【０１７２】
遺伝子編集またはＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害と関連してここで使用する用語“システム”は、所望の機能を発揮するように一緒に働く、一群の分子、例えば、１以上の分子をいう。
【０１７３】
ここで使用する用語“遺伝子編集システム”は、該システムにより標的とされるゲノムＤＮＡまたはその近辺の部位の１以上の核酸の改変、例えば、欠失を指示および実施する、システム、例えば、１以上の分子をいう。遺伝子編集システムは当分野で知られ、下により詳細に記載する。
【０１７４】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２結合パートナーと共にここで使用する用語“結合パートナー”は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２タンパク質と相互作用、例えば、結合する、分子、例えば、タンパク質をいう。理論に縛られないが、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２は１以上のＨＤＡＣタンパク質に結合すると考えられる。このようなＨＤＡＣタンパク質はＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２結合パートナーの例と考えられる。
【０１７５】
“ドミナントネガティブ”遺伝子産物またはタンパク質は、他の遺伝子産物またはタンパク質の機能を妨害するものである。影響される他の遺伝子産物は、ドミナントネガティブタンパク質と同一でも異なってもよい。ドミナントネガティブ遺伝子産物は、切断、点変異を有する完全長タンパク質またはそのフラグメントまたは完全長野生型または変異体タンパク質またはそのフラグメントと他のタンパク質の融合体を含む、多くの携帯であり得る。観察される阻害レベルは極めて低くてよい。例えば、効果を見るために、機能的タンパク質またはタンパク質と比較して、大過剰のドミナントネガティブタンパク質が過程に必要であり得る。通常の生物学的アッセイ条件下で効果を見るのは困難であり得る。ある実施態様において、ドミナントネガティブＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２は触媒不活性Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２である。他の実施態様において、ドミナントネガティブＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２結合パートナーは触媒不活性Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２結合ＨＤＡＣ阻害剤である。
【０１７６】
記載
本発明は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤およびその使用方法を提供する。特に、本発明は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤を含むＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＣＡＲ  Ｔ細胞と組み合わせたＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の使用を提供する。本発明のＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤は、その使用方法と共に、下により詳細に記載される。ＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞および使用方法は、下にさらに記載される。
【０１７７】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤
本発明は、組成物、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤およびこのような組成物および／またはここに記載する他の手段を使用する、免疫エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲ発現細胞機能を増強する方法を提供する。当分野で知られるあらゆるＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤を、本発明のＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤として使用できる。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤の例を下に記載する。
【０１７８】
遺伝子編集システム
本発明によると、遺伝子編集システムをＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、阻害剤として使用できる。本発明によりまた企図されるのは、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子編集システムの１以上の成分をコードする核酸の使用である。
【０１７９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システム
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％に見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。このシステムはプラスミドおよびファージのような外来遺伝要素に対する抵抗生を付与し、獲得免疫の一形態を提供するタイプの原核生物免疫系である。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845。
【０１８０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集(特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変化)において使用されるために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8。これは、例えば、特別に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを真核生物細胞に導入することにより、達成される。
【０１８１】
ＣＲＩＳＰＲ配列は、ＣＲＩＳＰＲ座位とも呼ばれ、交互反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは通常プラスミドまたはファージ配列のような細菌に対して外来の配列を含み、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例において、スペーサーはＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子配列またはその制御エレメントの配列に由来する。
【０１８２】
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは構成的に発現され、小ＲＮＡに処理される。これらは、反復配列が横にあるスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外因性遺伝要素をサイレンスするようにガイドする。Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7。スペーサーは、こうして、ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ分子の鋳型として役立つ。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０１８３】
これらが多くの種々のタイプの細菌で天然に存在するため、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置ならびにＣａｓ遺伝子およびその産物の構造、機能および数は種毎に幾分異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663；およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、それはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物をそのＣａｓｃａｄｅが保持されるスペーサー−反復単位に処理する。Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６はＣＲＩＳＰＲ転写物を処理する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２は必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、それは相補標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲシステムは、２活性切断部位を有し、一つは二重螺旋の各鎖のためである、タンパク質Ｃａｓ９に依存する。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせは、遺伝子編集用システムに使用され得る。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０１８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、こうして１以上の核酸、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子またはＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子制御エレメントの修飾、例えば欠失または、機能的Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現をこうして低減させる未成熟終止の導入に使用できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、あるいはＲＮＡ干渉のように使用でき、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子を可逆性形式で遮断する。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡはＣａｓタンパク質をＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、プロモーターにガイドし、ＲＮＡポリメラーゼをリッ滝的に遮断できる。
【０１８５】
真核生物細胞における遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、一般に、(１)ターゲティング配列(ゲノムＤＮＡ標的配列とハイブリダイズできる)を含むガイドＲＮＡ分子(ｇＲＮＡ)およびＣａｓ、例えば、Ｃａｓ９酵素に結合できる配列および(２)Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９、タンパク質を含む。ターゲティング配列およびＣａｓ、例えば、Ｃａｓ９酵素に結合できる配列は同じまたは異なる分子に配置され得る。異なる分子に配置されたら、各々は、分子を、例えば、ハイブリダイゼーションにより結合させる、ハイブリダイゼーションドメインを含む。
【０１８６】
本発明のｇＲＮＡ分子の例は、配列(ここで、“ｎ”はターゲティング配列(例えば、表３に、例えば、記載)の残基をいい、１５〜２５ヌクレオチドからなってよく、例えば、２０ヌクレオチドからなる)：
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号４０)；
を有する第一核酸および配列：
AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC、(所望により３’末端にさらに１、２、３、４、５、６または７(例えば、４または７、例えば、７)Ｕヌクレオチドを伴う(配列番号４１))
を有する第二核酸配列を含む、例えば、これからなる。
【０１８７】
第二核酸分子は、あるいは上記配列のフラグメントからなり、ここで、このようなフラグメントは第一核酸とハイブリダイズできる。このような第二核酸分子の例は：
AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
(所望により３’末端にさらに１、２、３、４、５、６または７(例えば、４または７、例えば、７)Ｕヌクレオチドを伴う(配列番号４２))
である。
【０１８８】
本発明のｇＲＮＡ分子の他の例は、配列(ここで、“ｎ”はターゲティング配列(例えば、表３に、例えば、記載)の残基をいい、１５〜２５ヌクレオチドからなってよく、例えば、２０ヌクレオチドからなる)：
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号４３)
を有する第一核酸(所望により３’末端にさらに１、２、３、４、５、６または７(例えば、４または７、例えば、４)Ｕヌクレオチドを伴う)を含む、例えば、これからなる。と分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開２０１４００６８７９７号、ＷＯ２０１５／０４８５７７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを産生できる。例えば、内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるTsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号、８,８６５,４０６号、８,７９５,９６５号、８,７７１,９４５号および８,６９７,３５９号に記載される、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムも産生できる。例えば、ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の配列とハイブリダイズするターゲティング配列を含むｇＲＮＡ分子を含むように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを改変することにより、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を阻害するこのようなシステムを産生できる。ある実施態様において、ｇＲＮＡは、ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の１５〜２５ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチドと完全相補性であるターゲティング配列を含む。ある実施態様において、ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の１５〜２５ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質により認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ(ＰＡＭ)配列の直ぐ５’に配置される(例えば、システムがストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質を含むとき、ＰＡＭ配列はＮＧＧ(ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣの何れかである)を含む)。ある実施態様において、ｇＲＮＡのターゲティング配列は、表２に挙げる配列と相補性であるＲＮＡ配列を含む、例えば、これからなる。ある実施態様において、ｇＲＮＡは表３に挙げるターゲティング配列を含む。
【０１８９】
ある実施態様において、外来ＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えば、ここに記載する、例えば、ＣＡＲをコードするＤＮＡと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡおよび染色体配列の配列によって、この工程は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより標的とされる部位またはその近辺で、例えば、ここに記載する、ＣＡＲをコードするＤＮＡを統合するために使用する。ここに示すとおり、この例において、しかし、理論に縛られないが、このような組込みはＣＡＲの発現ならびにＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子の破壊に至り得る。このような外来ＤＮＡ分子はここでは“鋳型ＤＮＡ”と称する。ある実施態様において、鋳型ＤＮＡは、さらに目的の１以上の分子をコードする(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする)鋳型ＤＮＡの核酸の５’、３’または５’および３’両方に相同性アームを有し、ここで、該相同性アームは、標的配列の横にあるゲノムＤＮＡ配列に相補的である。
【０１９０】
ある実施態様において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓ９、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９およびＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子の配列とハイブリダイズするターゲティング配列を含むｇＲＮＡを含む。ある実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、ｇＲＮＡをコードする核酸およびＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９をコードする核酸を含む。ある実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９をコードする核酸を含む。
【０１９１】
本発明を使用して製造できるｇＲＮＡが相補的ターゲティング配列を含むＴｅｔ２のゲノム標的配列の例を下の表２に記載する。ある実施態様において、ｇＲＮＡは、下表の標的配列のＲＮＡ相補体である(例えば、ｓｇＴＥＴ２＿１、ｇＲＮＡについて、CCUUGGACACCUUCUCCUCC(配列番号４４)を含む)。ある実施態様において、ｇＲＮＡは、下記表２の標的配列のＲＮＡアナログである(例えば、ｓｇＴＥＴ２＿１について、ｇＲＮＡはＧGAACCUGUGGAAGAGGAGG(配列番号４５)を含む)。ある実施態様において、Ｔｅｔ２阻害剤は、Ｔｅｔ２に特異的なｇＲＮＡ分子をコードする核酸であり、ここで、核酸は、例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター制御下、下記表２の標的配列の配列を含む。
【表２９】
2018527008.tif 000030
【０１９２】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ２阻害のために本発明の種々の実施態様に有用なｇＲＮＡターゲティング配列の例を下の表３に提供する。ある実施態様において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、表３に挙げる配列を含むターゲティング配列を含む、ｇＲＮＡ分子を含む。ある実施態様において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、表３に挙げる配列であるターゲティング配列を含む、ｇＲＮＡ分子を含む。
【表３０】
2018527008.tif 000031
【表３１】
2018527008.tif 000032
【０１９３】
【表３２】
2018527008.tif 000033
【表３３】
2018527008.tif 000034
【０１９４】
【表３４】
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【表３５】
2018527008.tif 000036
【０１９５】
【表３６】
2018527008.tif 000037
【表３７】
2018527008.tif 000038
【０１９６】
【表３８】
2018527008.tif 000039
【表３９】
2018527008.tif 000040
【０１９７】
【表４０】
2018527008.tif 000041
【表４１】
2018527008.tif 000042
【０１９８】
【表４２】
2018527008.tif 000043
【表４３】
2018527008.tif 000044
【０１９９】
【表４４】
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【表４５】
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【０２００】
【表４６】
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【表４７】
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【０２０１】
【表４８】
2018527008.tif 000049
【表４９】
2018527008.tif 000050
【０２０２】
【表５０】
2018527008.tif 000051
【表５１】
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【０２０３】
【表５２】
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【表５３】
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【０２０４】
【表５４】
2018527008.tif 000055
【表５５】
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【０２０５】
【表５６】
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【表５７】
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【０２０６】
【表５８】
2018527008.tif 000059
【表５９】
2018527008.tif 000060
【０２０７】
【表６０】
2018527008.tif 000061
【表６１】
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【０２０８】
【表６２】
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【表６３】
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【０２０９】
【表６４】
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【表６５】
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【０２１０】
【表６６】
2018527008.tif 000067
【表６７】
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【０２１１】
【表６８】
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【表６９】
2018527008.tif 000070
【０２１２】
【表７０】
2018527008.tif 000071
【表７１】
2018527008.tif 000072
【０２１３】
【表７２】
2018527008.tif 000073
【表７３】
2018527008.tif 000074
【０２１４】
【表７４】
2018527008.tif 000075
【表７５】
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【０２１５】
【表７６】
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【表７７】
2018527008.tif 000078
【０２１６】
【表７８】
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【表７９】
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【０２１７】
【表８０】
2018527008.tif 000081
【０２１８】
ＴＡＬＥＮ遺伝子編集システム
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ開裂ドメインへの融合により人工的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の一部を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように改変され得る。改変ＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素が産生され得る。これらを次いで細胞に導入でき、ここで、これらはゲノム編集のために使用され得る。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6；およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。
【０２１９】
ＴＡＬＥは、キサントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、反復された、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２カ所は高度に可変であり、特異的ヌクレオチド認識との強い相関を示す。これらは、それ故に所望のＤＮＡ配列に結合するよう改変され得る。
【０２２０】
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、例えば、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、ヌクレアーゼ(Ｎ)と融合させる。ＦｏｋＩへの数変異が、ＴＡＬＥＮにおけるその使用についてなされており、これらは、例えば、開裂特異性または活性を改善する。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
【０２２１】
ＦｏｋＩドメインは、適切な配向および間隔を備えた標的ゲノムにおける部位に対する特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２構築物を必要とする、二量体として機能する。Ｂｏｔｈ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数および２つの独立したＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数が、高レベルの活性の達成に重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8。
【０２２２】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、ＴＡＬＥＮは、細胞内で二本鎖切断(ＤＳＢ)産生に使用できる。変異は、修復機構が非相同末端結合により切断を不適切に修復するならば、該切断部位に導入され得る。例えば、不適切な修復はフレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮ、例えば、ここに記載する、例えば、ＣＡＲをコードするＤＮＡと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡおよび染色体配列の配列によって、この過程は、ＴＡＬＥＮにより標的とされる部位またはその近辺に、例えば、ここに記載する、ＣＡＲをコードするＤＮＡを統合させるために使用できる。ここに示すとおり、例において、しかし、理論には拘束されないが、このような組込みはＣＡＲの発現ならびにＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の破壊に至り得る。このような外来ＤＮＡ分子をここでは“鋳型ＤＮＡ”と称する。ある実施態様において、鋳型ＤＮＡは、さらに、目的の１以上の分子をコードする(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする)鋳型ＤＮＡの核酸に５’、３’または５’および３’両方に相同性アームを有し、ここで、該相同性アームは、標的配列の横にあるゲノムＤＮＡ配列に相補的である。
【０２２３】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２における配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー成分を使用する種々のスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築され得る。内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるZhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509；ＵＳ８,４２０,７８２号、ＵＳ８,４７０,９７３号参照。
【０２２４】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”は、所望の核酸配列、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の１以上の核酸の修飾、例えば、欠失に使用できる、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、人工ヌクレアーゼをいう。
【０２２５】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
【０２２６】
亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造的モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含んでよく、約３bp配列を認識し得る。既知特異性の種々の亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生し得る。ファージディスプレイ、酵母ワン・ハイブリッドシステム、細菌ワン・ハイブリッドおよびツー・ハイブリッドシステムおよび哺乳動物細胞を含む、種々の選択およびモジュラーアセンブリ技法が、特定の配列を認識する亜鉛フィンガー(およびこれらの組み合わせ)の産生に利用可能である。
【０２２７】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮはＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。それ故に、ＺＦＮの対が、非回文ＤＮＡ部位の標的に必要である。２個の独立したＺＦＮは、適切な空間を空けて、ＤＮＡのそれらのヌクレアーゼと逆の鎖に結合しなければならない。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。
【０２２８】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは不適切に修復されたならばフレームシフト変異を作製できるＤＮＡにおける二本鎖切断を作製でき、細胞におけるＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現および量の減少に至る。ＺＦＮを、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子を変異するためまたは標的配列部位にもしくはその近辺にＣＡＲをコードする核酸を導入するために、相同組み換えと共に使用してもよい。上記のとおり、ＣＡＲをコードする核酸は鋳型ＤＮＡの一部として導入され得る。ある実施態様において、鋳型ＤＮＡは、さらに、目的の１以上の分子をコードする(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする)鋳型ＤＮＡの核酸に５’、３’または５’および３’両方に相同性アームを有し、ここで、該相同性アームは、標的配列の横にあるゲノムＤＮＡ配列に相補的である。
【０２２９】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子における配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築され得る。例えば、その内容を、引用により本明細書にその全体を包含させる、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号および米国特許公開２０１２／００６０２３０号参照。ある実施態様において、ＺＦＮ遺伝子編集システムは、ＺＦＮ遺伝子編集システム、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を標的とするＺＦＮ遺伝子編集システムの１以上の成分をコードする核酸も含み得る。
【０２３０】
理論には拘束されないが、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を標的とする遺伝子編集システム(例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム)の使用は、例えば、切断Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現をもたらす編集事象を引き起こすことにより、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の１以上の機能を阻害することを可能にし得ると考えられる。同様に、理論には拘束されないが、このような切断Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２タンパク質は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の１以上の他の機能(例えば、触媒機能)を阻害しながら、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の１以上の機能(例えば、足場機能)を維持でき、これ自体、好ましいものであり得る。Ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の後期エキソンまたはイントロンを標的とする遺伝子編集システムがこの点で特に好ましい可能性がある。ある態様において、本発明の遺伝子編集システムＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、ｔｅｔ遺伝子の後期エキソンまたはイントロンを標的とする。ある態様において、本発明の遺伝子編集システムＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、エキソン８の下流のエキソンまたはイントロンを標的とする。ある態様において、遺伝子編集システムＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、ｔｅｔ２遺伝子のエキソン８またはエキソン９、例えば、エキソン９を標的とする。
【０２３１】
理論には拘束されないが、他の実施態様において、例えば、遺伝子産物を発現させないまたは完全に非機能的な遺伝子産物を発現させる、標的遺伝子における未成熟停止コドンを導入するために、Ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の早期エキソンまたはイントロンを標的とするのも好ましいことがある。Ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の早期エキソンまたはイントロンを標的とする遺伝子編集システムがこの点で特に好ましい可能性がある。ある態様において、本発明の遺伝子編集システムＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、ｔｅｔ遺伝子の早期エキソンまたはイントロンを標的とする。ある態様において、本発明の遺伝子編集システムＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、エキソン４の上流のエキソンまたはイントロンを標的とする。ある実施態様において、遺伝子編集システムＴｅｔ阻害剤、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３阻害剤、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、ｔｅｔ２遺伝子のエキソン１、エキソン２またはエキソン３、例えば、エキソン３を標的とする。
【０２３２】
理論には拘束されないが、他の実施態様において、ｔｅｔの１以上のアイソフォーム(例えば、ｔｅｔ２遺伝子)に特異的であるが、ｔｅｔの１以上の他のアイソフォーム(例えば、ｔｅｔ２)には影響しない、Ｔｅｔ遺伝子、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子の配列を標的とすることも好ましいことがある。ある実施態様において、特に触媒ドメインを含むｔｅｔ(例えば、ｔｅｔ２)のアイソフォームを標的とすることが好ましいことがある。
【０２３３】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２のｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、阻害剤
本発明によると、二本鎖ＲＮＡ(“ｄｓＲＮＡ”)、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤として使用し得る。本発明によりまた企図されるのは、該ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤をコードする核酸である。
【０２３４】
ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤は、核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２をコードする核酸に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡおよび／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２をコードするゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡである。
【０２３５】
本発明のある態様は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２核酸配列の配列(例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２をコードするゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ)に相補性(例えば、１００％相補性)である、少なくとも１５連続的ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５連続的ヌクレオチド、例えば、２１連続的ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、組成物を提供する。ある実施態様において、少なくとも１５連続的ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５連続的ヌクレオチド、例えば、２１連続的ヌクレオチドは、上の表４に挙げるＴｅｔ２  ｓｈＲＮＡをコードするｓｈＲＮＡまたは核酸の標的配列の連続的ヌクレオチドを含む。標的配列および／またはｓｈＲＮＡ分子のいくつかは、ＤＮＡとして提示されるが、これらの配列をターゲティングし、これらの配列を含むｄｓＲＮＡ剤はＲＮＡまたは、分子がなおＲＮＡ干渉に介在できる限りここに開示するおよび／または当分野で知られる任意のヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは置換体であり得ることは理解される。
【０２３６】
ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子がＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、プロモーター、例えば、Ｈ１−またはＵ６由来プロモーターに操作可能に連結される。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi)参照。Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553;  Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500。ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全ての成分をコードする核酸分子を含むのと同じベクター、例えば、レンチウイルスベクターに存在する。このような実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター上、ＣＡＲの成分、例えば、全ての成分をコードする核酸の５’または３’に位置する。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全ての成分をコードする核酸と同じ方向で転写されても異なる方向で転写されてもよい。ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全ての成分をコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある実施態様において、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。
【０２３７】
ｓｈＲＮＡ配列をコードする核酸配列の例を下に提供する。標的配列は、Ｔｅｔ２ゲノムＤＮＡ(または周囲ＤＮＡ)内の配列をいう。Ｔｅｔ２  ｓｈＲＮＡをコードする核酸は、本発明において有用なｓｈＲＮＡ分子をコードする。ある実施態様において、Ｔｅｔ２阻害剤は、下記標的配列に特異的なまたはそのｍＲＮＡ相補体に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。ある実施態様において、Ｔｅｔ２阻害剤は、下の表４のＴｅｔ２  ｓｈＲＮＡをコードする核酸によりコードされるｓｈＲＮＡである。ある実施態様において、Ｔｅｔ２阻害剤は、下の表４のＴｅｔ２  ｓｈＲＮＡをコードする核酸を含む核酸であり、例えば、これは、Ｔｅｔ２  ｓｈＲＮＡが産生されるように、Ｕ６またはＨ１プロモーターの制御下にある。ある実施態様において、本発明は、ｓｈＲＮＡの標的配列、例えば、表４のｓｈＲＮＡの何れかのｓｈＲＮＡの標的配列のＲＮＡアナログ(すなわち、全Ｔ核酸残基がＵ核酸残基に置換)である配列を含む、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを提供する。
【０２３８】
【表８１】
2018527008.tif 000082
【０２３９】
Ｔｅｔ２、例えば、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ分子のさらなるｄｓＲＮＡ阻害剤は、当分野で知られるおよびここに記載する方法を使用して、設計および試験できる。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１３５８の配列を標的とする。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１３５９の配列を標的とする。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１３６０の配列を標的とする。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１３６１の配列を標的とする。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１３６２の配列を標的とする。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１３６３の配列を標的とする。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、Ｔｅｔ２をコードするｍＲＮＡを標的とする。
【０２４０】
ある実施態様において、阻害剤は、上記実施態様の何れかのｄｓＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする、核酸、例えば、ＤＮＡである。ある実施態様において、核酸、例えば、ＤＮＡを、ベクター、例えば、ここに記載する、例えば、任意の慣用の発現系、例えば、レンチウイルスベクターに配置する。
【０２４１】
理論には拘束されないが、Ｔｅｔ  ｍＲＮＡ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３遺伝子、例えば、Ｔｅｔ２  ｍＲＮＡの配列を標的とするｄｓＲＮＡ  ＴＥＴ阻害剤(例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ)は、ｔｅｔの１以上のアイソフォーム(例えば、ｔｅｔ２)に特異的であるが、ｔｅｔの１以上の他のアイソフォーム(例えば、ｔｅｔ２)には影響しない(例えば、特有のスプライスジャンクションのターゲティングまたはｔｅｔの１以上のアイソフォーム、例えば、ｔｅｔ２に存在するが、ｔｅｔの１以上の他のアイソフォーム、例えば、ｔｅｔ２に存在しないドメインのターゲティングによる)。ある実施態様において、特に触媒ドメインを含むｔｅｔ(例えば、ｔｅｔ２)のアイソフォームを標的とすることが好ましいことがある。
【０２４２】
小分子
Ｔｅｔ阻害剤
ある実施態様において、Ｔｅｔ阻害剤は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現および／または機能を阻害する小分子である。
【０２４３】
Ｔｅｔ２阻害剤
ある実施態様において、Ｔｅｔ２阻害剤は、Ｔｅｔ２発現および／または機能を阻害する小分子である。例えば、本発明のＴｅｔ２阻害剤は２−ヒドロキシグルタレート(CAS #2889-31-8)である。
【０２４４】
他の例において、本発明のＴｅｔ２阻害剤は次の構造を有する。
【化１】
2018527008.tif 000083
【０２４５】
他の例において、本発明のＴｅｔ２阻害剤はＮ−[３−[７−(２,５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ)−１−メチル−２−オキソ−１,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド[４,５−ｄ]ピリミジン−３−イル]−４−メチルフェニル]−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド(CAS #839707-37-8)であり、次の構造を有する。
【化２】
2018527008.tif 000084
【０２４６】
他の例において、本発明のＴｅｔ２阻害剤は２−[(２,６−ジクロロ−３−メチルフェニル)アミノ]安息香酸(CAS # 644-62-2)であり、次の構造を有する。
【化３】
2018527008.tif 000085
【０２４７】
ある実施態様において、本発明のＴｅｔ２阻害剤は、前記の何れかの薬学的に許容される塩である。
【０２４８】
ＨＤＡＣ阻害剤
あらゆる既知のＨＤＡＣ阻害剤が本発明により使用され得る。ＨＤＡＣ阻害剤の非限定的例は、ボリノスタット(ゾリンザ(登録商標))、ロミデプシン(イストダックス(登録商標))、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)、オキサムフラチン、ボリノスタット(ゾリンザ(登録商標)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸)、ピロキサミド(スベロイル−３−アミノピリジンアミドヒドロキサム酸)、トラポキシンＡ(ＲＦ−１０２３Ａ)、トラポキシンＢ(ＲＦ−１０２３８)、シクロ[(αＳ,２Ｓ)−α−アミノ−η−オキソ−２−オキシランオクタノイル−Ｏ−メチル−Ｄ−チロシル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−プロリル](Ｃｙｌ−１)、シクロ[(αＳ,２Ｓ)−α−アミノ−η−オキソ−２−オキシランオクタノイル−Ｏ−メチル−Ｄ−チロシル−Ｌ−イソロイシル−(２Ｓ)−２−ピペリジンカルボニル](Ｃｙｌ−２)、環状[Ｌ−アラニル−Ｄ−アラニル−(２Ｓ)−η−オキソ−Ｌ−α−アミノオキシランオクタノイル−Ｄ−プロリル](ＨＣ−トキシン)、シクロ[(αＳ,２Ｓ)−α−アミノ−η−オキソ−２−オキシランオクタノイル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−(２Ｓ)−２−ピペリジンカルボニル](ＷＦ−３１６１)、クラミドシン((Ｓ)−環状(２−メチルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−プロリル−η−オキソ−Ｌ−α−アミノオキシランオクタノイル)、アピシジン(シクロ(８−オキソ−Ｌ−２−アミノデカノイル−１−メトキシ−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−２−ピペリジンカルボニル)、ロミデプシン(イストダックス(登録商標)、ＦＲ−９０１２２８)、４−フェニルブチラート、スピルコスタチンＡ、ミルプロイン(バルプロ酸)、エンチノスタット(ＭＳ−２７５、Ｎ−(２−アミノフェニル)−４−[Ｎ−(ピリジン−３−イル−メトキシカルボニル)−アミノ−メチル]−ベンズアミド)、デプデシン(４,５：８,９−ジアンヒドロ−１,２,６,７,１１−ペンタデオキシ−Ｄ−トレオ−Ｄ−イド−ウンデカ−１,６−ジエニトール)、４−(アセチルアミノ)−Ｎ−(２−アミノフェニル)−ベンズアミド(またＣＩ−９９４として知られる)、Ｎ１−(２−アミノフェニル)−Ｎ８−フェニル−オクタンジアミド(またＢＭＬ−２１０として知られる)、４−(ジメチルアミノ)−Ｎ−(７−(ヒドロキシアミノ)−７−オキソヘプチル)ベンズアミド(またＭ３４４として知られる)、(Ｅ)−３−(４−(((２−(１Ｈ−インドール−３−イル)エチル)(２−ヒドロキシエチル)アミノ)−メチル)フェニル)−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド(ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４)、パノビノスタット(ファリーダック(登録商標))、モセチノスタットおよびベリノスタットを含む。
【０２４９】
タンパク質
ドミナントネガティブＴｅｔ２
本発明によると、ドミナントネガティブＴｅｔ２アイソフォームおよび該ドミナントネガティブＴｅｔ２をコードする核酸がＴｅｔ２阻害剤として使用され得る。ある実施態様において、ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、Ｔｅｔ２の触媒機能を欠く。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｒ１２６１Ｇを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｒ１２６２Ａを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｓ１２９０Ａを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異ＷＳＭＹＹＮ(配列番号１３５７からアミノ酸１２９１〜１２９６)からＧＧＳＧＧＳ(配列番号６７)を伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｍ１２９３ＡおよびＹ１２９４Ａを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｙ１２９５Ａを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｓ１３０３Ｎを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｈ１３８２Ｙを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｄ１３８４Ａを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ドミナントネガティブＴｅｔ２は、配列番号１３５７のナンバリングにより、変異Ｄ１３８４Ｖを伴う配列番号１３５７を含むまたはそれからなるタンパク質である。ある実施態様において、ドミナントネガティブＴｅｔ２は、上記変異の任意の組み合わせを含み得る。このような変異は、例えば、その内容を、引用により本明細書にその全体を包含させる、Chen et al., Nature, 493:561-564 (2013); Hu et al, Cell, 155:1545-1555 (2013)に記載される。
【０２５０】
ドミナントネガティブＴｅｔ２結合パートナー
理論には拘束されないが、Ｔｅｔ２は、１以上のＨＤＡＣ、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に発現される１以上のＨＤＡＣと相互作用、例えば、結合し、このようなＴｅｔ２：ＨＤＡＣ複合体が細胞におけるＴｅｔ２活性に貢献し得ると考えられる。ある実施態様において、本発明のＴｅｔ２阻害剤はドミナントネガティブＴｅｔ２結合パートナー、例えば、ドミナントネガティブＴｅｔ２結合ＨＤＡＣである。他の実施態様において、本発明のＴｅｔ２阻害剤は、ドミナントネガティブＴｅｔ２結合パートナー、例えば、ドミナントネガティブＴｅｔ２結合ＨＤＡＣをコードする核酸である。
【０２５１】
Ｔｅｔ２阻害剤をコードするベクター
ここに記載するとおり、本発明は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２(例えば、ここに記載する)の遺伝子編集システム、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ阻害剤またはドミナントネガティブ阻害剤のような、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤をコードする、例えば、ここに記載する、ベクターを提供する。
【０２５２】
らさに、例えば、ＣＡＲを含む、ある実施態様において、核酸は、さらに例えば、ここに記載する、ＣＡＲをコードする配列を含み得る。ある実施態様において、本発明は、ここに記載するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤をコードする核酸配列を含み、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸配列を含む、ベクターを提供する。ある実施態様において、核酸配列は別々のベクターに配置される。他の実施態様において、２以上の核酸配列は同じフレームにおける単一核酸分子により、単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この態様において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド開裂部位で分離され得る(例えば、細胞内プロテアーゼによる自己開裂部位または基質)。ペプチド開裂部位の例は、次のものを含み、ここで、ＧＳＧ残基は任意である。
T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P(配列番号６８)
P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(配列番号６９)
E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(配列番号７０)
F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(配列番号７１)。
【０２５３】
これらのペプチド開裂部位は、ここでは集合的に“２Ａ部位”と称する。ある実施態様において、ベクターは、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸配列およびここに記載するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ  Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸配列および核酸配列ここに記載するゲノム編集システム(例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム)Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤をコードする核酸配列を含む。
【０２５４】
Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤の使用方法
本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９)の治療有効性を上げる方法であって、該細胞における５−ヒドロキシメチルシトシンのレベルを減少させる工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、方法は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の機能または発現の低減または排除を含む。ある実施態様において、方法は、該細胞とここに記載するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤を接触させることを含む。
【０２５５】
本発明は、さらにＣＡＲ発現細胞、例えば、機能が改善された(例えば、有効性、例えば、腫瘍ターゲティングまたは増殖が改善された)ＣＡＲ発現細胞を製造する方法であって、該細胞における、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現または機能を低減または排除する工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、方法は、該細胞とここに記載するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤を接触させることを含む。ある実施態様において、接触はエクスビボで行われる。ある実施態様において、接触はインビボで行われる。ある実施態様において、接触は、該細胞をＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲを発現するように修飾する前、同時または後に行われる。
【０２５６】
ある実施態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＲ１９発現細胞(例えば、ＣＴＬ０１９発現細胞)における、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の機能または発現を阻害する方法であって、該細胞における５−ヒドロキシメチルシトシンのレベルを減少させる工程を含む、方法を提供する。ある実施態様において、方法は、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の機能または発現の低減または排除を含む。ある実施態様において、方法は、該細胞とここに記載するＴｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２阻害剤を接触させることを含む。
【０２５７】
ある実施態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸を、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２の発現が妨害されるように、Ｔｅｔ遺伝子またはその制御エレメントの部以内に導入することを含む、方法、例えば、上記方法を提供する。Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子内の部位への組込みは、例えば、上記Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２ターゲティング遺伝子編集システムを使用して達成される。
【０２５８】
ある実施態様において、本発明は、細胞に、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を標的とする遺伝子編集システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、例えば、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２、遺伝子の標的配列に相補的なターゲティング配列を有するｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを導入する工程を含む、方法、例えば、上記方法を提供する。ある実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、該細胞にｇＲＮＡのリボ核タンパク質複合体として導入され、Ｃａｓ酵素は、例えば、エレクトロポレーションにより導入される。ある実施態様において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの成分の１以上をコードする核酸の、該細胞への導入を含む。ある実施態様において、該核酸は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードするベクターに配置される。
【０２５９】
ある実施態様において、本発明は、細胞に、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を標的とする阻害性ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを導入する工程を含む、方法、例えば、上記方法を提供する。ある実施態様において、方法は、該細胞に、Ｔｅｔ、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３、例えば、Ｔｅｔ２を標的とする阻害性ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする核酸を導入する工程を含む。ある実施態様において、該核酸は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードするベクターに配置される。
【０２６０】
本発明に関係するＣＡＲおよびＣＡＲ  Ｔ細胞のさらなる成分および方法を下に記載する。
【０２６１】
ここに提供されるのは、本発明のＣＡＲで改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を使用して癌のような疾患を処置するための、組成物および使用方法である。
【０２６２】
ある態様において、本発明は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に特異的に結合するように改変された、抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含む、多数のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供する。ある態様において、本発明はＣＡＲを発現するように改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供し、ここで、改変免疫エフェクター細胞は抗癌作用を示す。ある態様において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは細胞表面に発現される。ある実施態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある実施態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。ある実施態様において、細胞はＣＡＲを安定に発現し得る。他の実施態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。ある実施態様において、細胞はＣＡＲを一過性に発現させ得る。
【０２６３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲの抗原結合ドメインはｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある態様において、このような抗体フラグメントは、等価な結合親和性を保持し、例えば、それが由来するＩｇＧ抗体と同等な親和性で同じ抗原に結合するという意味で、機能的である。他の実施態様において、抗体フラグメントは低結合親和性を示し、例えば、同じ抗原に由来する抗体より低い結合親和性で結合するが、ここに記載する生物学的応答を提供する点で、機能的である。ある実施態様において、ＣＡＲ分子は、標的抗原に１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗体フラグメントを含む。ある実施態様において、抗体フラグメントは、対照抗体、例えば、ここに記載する抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍または１,０００倍低い結合親和性を有する。
【０２６４】
ある態様において、このような抗体フラグメントは、当業者に理解されるとおり、免疫応答活性化、その標的抗原が起源のシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性阻害などを含み得るが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的である。
【０２６５】
ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、由来するマウス配列のｃＦｖと比較してヒト化されているｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【０２６６】
ある態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列が発現哺乳動物細胞のためにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。ある態様において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、配列全体が発現哺乳動物細胞のためにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。コドン最適化は、コードＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、種毎に偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能にする。多様なコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示の方法を含む。
【０２６７】
ある態様において、本発明のＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子を合わせる。例えば、ある態様において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある態様において、抗原結合ドメインはここに記載する腫瘍抗原に結合する。
【０２６８】
さらに、本発明は、ＣＡＲおよびＣＡＲ発現細胞および医薬におけるその使用または、数ある疾患の中で、癌またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍もしくは自己免疫性疾患を処置する方法を提供する。
【０２６９】
ある態様において、本発明のＣＡＲを、ここに記載する腫瘍抗原を発現する正常細胞の根絶に使用でき、それにより細胞移植前の細胞コンディショニング治療としての用途に適用可能である。ある態様において、ここに記載する腫瘍抗原を発現する正常細胞は正常幹細胞であり、細胞移植は幹細胞移植である。
【０２７０】
ある態様において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供し、ここで、改変免疫エフェクター細胞は抗腫瘍特性を示す。好ましい抗原はここに記載する癌関連抗原(すなわち、腫瘍抗原)である。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的ヒト化抗体フラグメントを含む。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは部分的ヒト化ｓｃＦｖを含む。従って、本発明は、ヒト化抗原結合ドメインを含み、そして細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に挿入されたＣＡＲおよび養子療法におけるその使用方法を提供する。
【０２７１】
ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナルドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、少なくとも一つの細胞内ドメインを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８以外の１以上の共刺激性分子からの少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２７２】
本発明のＣＡＲの種々の成分のいくつかの例の配列を表１に挙げ、ここで、ａａはアミノ酸を意味し、そしてｎａは対応するペプチドをコードする核酸を意味する。
【０２７３】
【表８２】
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【表８３】
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【０２７４】
【表８４】
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【表８５】
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【０２７５】
【表８６】
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【表８７】
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【０２７６】
【表８８】
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【表８９】
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【０２７７】
【表９０】
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【表９１】
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【０２７８】
【表９２】
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【０２７９】
癌関連抗原
本発明は、免疫エフェクター細胞を癌に指向させる、１以上のＣＡＲを含むように改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供する。これは、癌関連抗原に特異的であるＣＡＲ上の抗原結合ドメインにより達成される。本発明のＣＡＲにより標的とされ得る２群の癌関連抗原(腫瘍抗原)がある。(１)癌細胞表面に発現される癌関連抗原および(２)それ自体は細胞内であるが、このような抗原のフラグメントがＭＨＣ(主要組織適合性複合体)により癌細胞表面上に提示される癌関連抗原。
【０２８０】
従って、本発明は、次の癌関連抗原(腫瘍抗原)を標的とするＣＡＲを提供する。ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１。
【０２８１】
腫瘍支持抗原
ここに記載するＣＡＲは、腫瘍支持抗原(例えば、ここに記載する腫瘍支持抗原)に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含み得る。ある実施態様において、腫瘍支持抗原は、間質細胞または骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)に存在する抗原である。間質細胞は、微小環境において細胞分裂を促進するために増殖因子を分泌し得る。ＭＤＳＣ細胞はＴ細胞増殖および活性化を阻害できる。理論に縛られることを望まないが、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は腫瘍支持細胞を破壊し、それにより間接的に腫瘍増殖または生存を阻害する。
【０２８２】
ある実施態様において、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)およびテネイシンの１以上から選択される。ある実施態様において、ＦＡＰ特異的抗体は、シブロツズマブと結合を競合するまたは同じＣＤＲを有する。ある実施態様において、ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５およびＣＤ６６ｂの１以上から選択される。従って、ある実施態様において、腫瘍支持抗原は、骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)またはテネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５およびＣＤ６６ｂの１以上から選択される。
【０２８３】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明はＣＡＲをコードする配列を含む組み換えＤＮＡ構築物を包含し、ここで、ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含み、ここで、抗原結合ドメインの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続的であり、かつ同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激性シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激性分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含む部分をいう。
【０２８４】
具体的態様において、本発明のＣＡＲ構築物はｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖは配列番号２に提供するような任意のリーダー配列が前にあり、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０に提供するような任意のヒンジ配列、配列番号１２に提供するような膜貫通領域、配列番号１４または配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号１８または配列番号２０を含むＣＤ３ゼータ配列が続き、例えば、ここで、ドメインは、単一融合タンパク質を形成するように連続的であり、かつ同じリーディングフレームにある。
【０２８５】
ある態様において、ＣＡＲ構築物例は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内刺激性ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内刺激性ドメイン)を含む。ある態様において、ＣＡＲ構築物の例は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)、細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメイン)および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン)を含み得る。
【０２８６】
リーダー配列の例は配列番号２として提供される。ヒンジ／スペーサー配列の例は配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０として提供される。膜貫通ドメイン配列の例は配列番号１２として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は配列番号１４として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は配列番号１６として提供される。ＣＤ３ゼータドメイン配列の例は配列番号１８または配列番号２０として提供される。
【０２８７】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、例えば、ここに記載する、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、これは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続的であり、かつ同じリーディングフレーム内にある。
【０２８８】
ある態様において、本発明はＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続的であり、かつ同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用され得る細胞内シグナル伝達ドメインの例は、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。いくつかの例で、ＣＡＲはＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０２８９】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技法を使用する、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの核酸分子の誘導化またはそれを含む細胞および組織からの直接単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化ではなく、合成的にも産生できる。
【０２９０】
本発明は、細胞に直接形質導入され得るＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
【０２９１】
本発明はまた細胞に直接トランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションに使用するｍＲＮＡを産生する方法は、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)(例えば、ここに記載する３’および／または５’  ＵＴＲ)、５’キャップ(例えば、ここに記載する５’キャップ)および／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)(例えば、ここに記載するＩＲＥＳ)、発現する核酸およびポリＡテイル、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３２)を含む構築物を産生するための、特に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含む)。このように産生されたＲＮＡは、多種の細胞に効率的にトランスフェクトされ得る。ある実施態様において、鋳型はＣＡＲのための配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターを、エレクトロポレーションにより細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入する。
【０２９２】
抗原結合ドメイン
ある態様において、本発明のＣＡＲは、他に抗原結合ドメインとも称する標的特異的結合エレメントを含む。この部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして役立つリガンドを認識するように選択し得る。それ故に、本発明のＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫性疾患および癌細胞と関連するものを含む。
【０２９３】
ある態様において、ＣＡＲ介在Ｔ細胞応答を、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをＣＡＲに改変する方法で、目的の抗原に指向させ得る。
【０２９４】
ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０２９５】
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない機能的そのフラグメントならびに組み換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲなどのような抗原結合ドメインとして機能することが当分野で知られる代替的足場を含むが、これらに限定されない、抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。いくつかの例で、抗原結合ドメインがＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種に由来するのが有益である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むのが有益であり得る。
【０２９６】
ある実施態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、米国特許８,３９９,６４５号、米国特許７,４４６,１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013)または16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10(各々引用によりその全体を本明細書に包含させる)に記載のＣＤ１９  ＣＡＲである。ある実施態様において、ＣＤ１９に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００号(その全体を引用により本明細書に包含させる)に記載の、ＣＡＲ、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある実施態様において、ＣＤ１９に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１５３２７０号；Kochenderfer, J.N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009); Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０３１６８７；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995または米国特許７,４４６,１９０号(各々引用によりその全体を本明細書に包含させる)に記載の、ＣＡＲ、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０２９７】
ある実施態様において、メソテリンに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０９０２３０号(ある実施態様において、ＣＡＲは、内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２０１５／０９０２３０号に記載のＣＡＲである)に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬに由来するまたはそれらに由来し得る。ある実施態様において、メソテリンに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ１９９７／０２５０６８号、ＷＯ１９９９／０２８４７１号、ＷＯ２００５／０１４６５２号、ＷＯ２００６／０９９１４１号、ＷＯ２００９／０４５９５７号、ＷＯ２００９／０６８２０４号、ＷＯ２０１３／１４２０３４号、ＷＯ２０１３／０４０５５７号またはＷＯ２０１３／０６３４１９号(各々引用によりその全体を本明細書に包含させる)に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲｓ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬであるかまたはそれらに由来する。
【０２９８】
ある実施態様において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１３０６３５号号(その全体を引用により本明細書に包含させる)に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬであるまたはそれらに由来する。ある実施態様において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０２８８９６号(その全体を引用により本明細書に包含させる)に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬであるまたはそれらに由来する；ある実施態様において、ＣＡＲはＷＯ２０１６／０２８８９６号に記載のＣＡＲである。ある実施態様において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ１９９７／０２４３７３号、ＷＯ２００８／１２７７３５号(例えば、２６２９２、３２７０１、３７７１６または３２７０３のＣＤ１２３結合ドメイン)、ＷＯ２０１４／１３８８０５号(例えば、ＣＳＬ３６２のＣＤ１２３結合ドメイン)、ＷＯ２０１４／１３８８１９号、ＷＯ２０１３／１７３８２０号、ＷＯ２０１４／１４４６２２号、ＷＯ２００１／６６１３９号、ＷＯ２０１０／１２６０６６号(例えば、Ｏｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｏｌｄ１７、Ｏｌｄ１９、Ｎｅｗ１０２またはＯｌｄ６のＣＤ１２３結合ドメインの何れか)、ＷＯ２０１４／１４４６２２号またはＵＳ２００９／０２５２７４２号(各々引用によりその全体を本明細書に包含させる)に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＬおよびＶＨであるまたはそれらに由来する。
【０２９９】
ある実施態様において、ＣＤ２２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010); Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３００】
ある実施態様において、ＣＳ−１に対する抗原結合ドメインはエロツズマブ(ＢＭＳ)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲであり、例えば、Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37; Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63参照。
【０３０１】
ある実施態様において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、内容を全体として引用により本明細書に包含させるＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４５３５号に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬである。ある実施態様において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、Ｒ＆Ｄ、ebiosciences、Abcam、例えば、ＰE-CLL1-hu Cat# 353604 (BioLegend)；およびPE-CLL1(CLEC12A) Cat# 562566 (BD)から入手可能な抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３０２】
ある実施態様において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えば、Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001) (Gemtuzumab Ozogamicin, hP67.6),Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992) (Lintuzumab, HuM195),  Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012) (AVE9633), Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013) (AMG330, CD33 BiTE), Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012)およびPizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ＣＤ３３を標的とするＣＡＲ分子の例はここに記載され、ＷＯ２０１６／０１４５７６号、例えば、ＷＯ２０１６／０１４５７６号(その全体を引用により本明細書に包含させる)の表２に提供される。
【０３０３】
ある実施態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985), Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998),  Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある実施態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ  １４.１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４.１８、ｈｕ１４.１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６.１および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合部分であり、例えば、ＷＯ２０１２０３３８８５号、ＷＯ２０１３０４０３７１号、ＷＯ２０１３１９２２９４号、ＷＯ２０１３０６１２７３号、ＷＯ２０１３１２３０６１号、ＷＯ２０１３０７４９１６号およびＷＯ２０１３８５５５２号を参照のこと。ある実施態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国公開２０１００１５０９１０号またはＰＣＴ公開ＷＯ２０１１１６０１１９号に記載の抗体の抗原結合部分である。
【０３０４】
ある実施態様において、ＢＣＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１２１６３８０５号、ＷＯ２００１１２８１２号およびＷＯ２００３０６２４０１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある実施態様において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０１６３８０５号(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる)からの抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬ配列を使用して産生される。ある実施態様において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４５６５号(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる)からの抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬ配列を使用して産生される。ある実施態様において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１２２１４４号(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる)からの抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬ配列を使用して産生される。ある実施態様において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４７８９号(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる)からのＣＡＲ分子および／またはＢＣＭＡ結合ドメイン(例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬ配列)を使用して産生される。ある実施態様において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０８９３３５号(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる)からのＣＡＲ分子および／またはＢＣＭＡ結合ドメイン(例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬ配列)を使用して産生される。ある実施態様において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１４０２４８号(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させる)からのＣＡＲ分子および／またはＢＣＭＡ結合ドメイン(例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬ配列)を使用して産生される。
【０３０５】
ある実施態様において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ２０１４／０１７８３６５号、ＵＳ８,４４０,７９８号、Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)およびStone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３０６】
ある実施態様において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)、ＵＳ２０１１０２６８６５６号(Ｊ５９１  ＳｃＦｖ)；Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)(ｓｃＦｖＤ２Ｂ)；ＷＯ２００６１２５４８１号(ｍＡｂｓ  ３／Ａ１２、３／Ｅ７および３／Ｆ１１)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲおよび一本鎖抗体フラグメント(ｓｃＦｖ  Ａ５およびＤ７)である。
【０３０７】
ある実施態様において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)；ＷＯ２０１１１５９８４７号；およびＵＳ２０１３０１０１６０７号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３０８】
ある実施態様において、ＦＬＴ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１１０７６９２２号、ＵＳ５７７７０８４号、ＥＰ０７５４２３０号、ＵＳ２００９０２９７５２９号およびいくつかの商業用カタログ抗体(Ｒ＆Ｄ、ebiosciences、Abcam)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３０９】
ある実施態様において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲ;およびAbcam ab691である。
【０３１０】
ある実施態様において、ＦＡＰに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ostermann et al., Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)(ＦＡＰ５)、米国特許公開２００９／０３０４７１８号；シブロツズマブ(例えば、Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003参照);およびTran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１１】
ある実施態様において、ＣＤ３８に対する抗原結合ドメインは、ダラツムマブ(例えば、Groen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)参照)；ＭＯＲ２０２(例えば、ＵＳ８,２６３,７４６号)またはＵＳ８,３６２,２１１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１２】
ある実施態様において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えば、Casucci et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１３】
ある実施態様において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Chmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１４】
ある実施態様において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二特異的Ａｂ(例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ−１；およびアデカツムマブ(ＭＴ２０１)から選択される抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１５】
ある実施態様において、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合ドメインは、米国特許８,０８０,６５０号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１６】
ある実施態様において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＧＡ２７１(Macrogenics)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１７】
ある実施態様において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７９１５３９１号、ＵＳ２０１２０２８８５０６号およびいくつかの商業用カタログ抗体に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１８】
ある実施態様において、ＩＬ−１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１４６９１１号、ＷＯ２００４０８７７５８号、いくつかの商業用カタログ抗体およびＷＯ２００４０８７７５８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３１９】
ある実施態様において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７０９０８４３Ｂ１号およびＥＰ０８０５８７１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２０】
ある実施態様において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７２５３２６３号、ＵＳ８,２０７,３０８号、ＵＳ２０１２０２７６０４６号、ＥＰ１０１３７６１号、ＷＯ２００５０３５５７７号；およびＵＳ６４３７０９８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２１】
ある実施態様において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２２】
ある実施態様において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、Abcam(cat# ab55262)またはNovus Biologicals(cat# EPR5446)から入手可能な抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。他の実施態様において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインはペプチドであり、例えば、Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)参照のこと。
【０３２３】
ある実施態様において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007) (scFv 7F5); Nejatollahi et al., J of Oncology 2013(2013), article ID 839831 (scFv C5-II)；および米国特許公開２００９０３１１１８１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２４】
ある実施態様において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Chinnasamy et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２５】
ある実施態様において、ルイスＹに対する抗原結合ドメインは、例えば、Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)(hu3S193 Ab (scFvs)); Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)(NC10 scFv)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２６】
ある実施態様において、ＣＤ２４に対する抗原結合ドメインは、例えば、Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２７】
ある実施態様において、ＰＤＧＦＲ−ベータに対する抗原結合ドメインは、抗体Abcam  ａｂ３２５７０の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２８】
ある実施態様において、ＳＳＥＡ−４に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＣ８１３(Cell Signaling)または他の市販抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３２９】
ある実施態様において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブまたはＧＡ１０１の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３０】
ある実施態様において、葉酸受容体アルファに対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＧＮ８５３またはＵＳ２０１２０００９１８１号；ＵＳ４８５１３３２号(ＬＫ２６)：ＵＳ５９５２４８４号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３１】
ある実施態様において、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)に対する抗原結合ドメインは、抗体トラスツズマブまたはペルツズマブの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３２】
ある実施態様において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５８の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３３】
ある実施態様において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、抗体セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブまたはマツズマブの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある実施態様において、ＥＧＦＲｖIIIに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１３０６５７号(ある実施態様において、ＣＡＲは、その内容をその全体を引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１３０６５７号に記載のＣＡＲである)に記載の抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤＲ、ｓｃＦｖまたはＶＨおよびＶＬに由来するまたはそれらに由来し得る。
【０３３４】
ある実施態様において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン２−２Ｂ：ＭＡＢ５３２４(EMD Millipore)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３５】
ある実施態様において、エフリンＢ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Abengozar et al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３６】
ある実施態様において、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８３４４１１２Ｂ２号；ＥＰ２３２２５５０Ａ１号；ＷＯ２００６／１３８３１５号またはＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２９９５号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３７】
ある実施態様において、ＣＡＩＸに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン３０３１２３(R&D Systems)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３８】
ある実施態様において、ＬＭＰ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７,４１０,６４０号またはＵＳ２００５０１２９７０１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３３９】
ある実施態様において、ｇｐ１００に対する抗原結合ドメインは、抗体ＨＭＢ４５、ＮＫＩベータＢまたはＷＯ２０１３１６５９４０号またはＵＳ２０１３０２９５００７号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４０】
ある実施態様において、チロシナーゼに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ５８４３６７４号またはＵＳ１９９５０５０４０４８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４１】
ある実施態様において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Yu et al., Mol Ther 22(1):102-111 (2014)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４２】
ある実施態様において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、ＵＳ７２５３２６３号；ＵＳ８,２０７,３０８号；ＵＳ２０１２０２７６０４６号；ＥＰ１０１３７６１Ａ３号；２０１２０２７６０４６号；ＷＯ２００５０３５５７７号またはＵＳ６４３７０９８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４３】
ある実施態様において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ２０１００２９７１３８号またはＷＯ２００７／０６７９９２号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４４】
ある実施態様において、ｓＬｅに対する抗原結合ドメインは、抗体Ｇ１９３(ルイスＹに対する)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲであり、Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000)が参照され、またNeeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177.10にも記載される。
【０３４５】
ある実施態様において、ＧＭ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＣＡ  ２５２３４４９(ｍＡｂ  １４Ｆ７)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４６】
ある実施態様において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Kmiecik et al., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014)(PMID: 24575382)(mAb9.2.27)；ＵＳ６５２８４８１号；ＷＯ２０１００３３８６６号またはＵＳ２０１４０００４１２４号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４７】
ある実施態様において、ｏ−アセチル−ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、抗体８Ｂ６の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４８】
ある実施態様において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合ドメインは、Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006); Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221-232 (2011)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３４９】
ある実施態様において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＡＢ０２７(Ganymed Pharmaceuticals)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲであり、例えば、clinicaltrial.gov/show/NCT02054351参照。
【０３５０】
ある実施態様において、ＴＳＨＲに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８,６０３,４６６号；ＵＳ８,５０１,４１５号またはＵＳ８,３０９,６９３号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５１】
ある実施態様において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合ドメインは、抗体ＦＡＢ６３００Ａ(R&D Systems)またはＬＳ−Ａ４１８０(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５２】
ある実施態様において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ６,８４６,９１１号；de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)に記載の抗体またはＲ＆Ｄからの抗体：ＭＡＢ３７３４の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５３】
ある実施態様において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えば、Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５４】
ある実施態様において、ポリシアル酸に対する抗原結合ドメインは、例えば、Nagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５５】
ある実施態様において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５６】
ある実施態様において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、抗体ＶＫ９または、例えば、Kudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9 (1998), Lou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014) ; MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)に記載の抗体の抗原結合部分である。
【０３５７】
ある実施態様において、ＮＹ−ＢＲ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Jager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５８】
ある実施態様において、ＷＴ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)またはＷＯ２０１２／１３５８５４号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３５９】
ある実施態様において、ＭＡＧＥ−Ａ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Willemsen et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)(ＴＣＲ様ｓｃＦｖ)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６０】
ある実施態様において、精子タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、Song et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313); Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６１】
ある実施態様において、Ｔｉｅ  ２に対する抗原結合ドメインは、抗体ＡＢ３３(Cell Signaling Technology)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６２】
ある実施態様において、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２；ＵＳ７６３５７５３号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６３】
ある実施態様において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは、抗体１２Ｆ９(Novus Biologicals)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６４】
ある実施態様において、メランＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合ドメインは、ＥＰ２５１４７６６Ａ２号またはＵＳ７,７４９,７１９号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６５】
ある実施態様において、肉腫転座切断点に対する抗原結合ドメインは、例えば、Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６６】
ある実施態様において、ＴＲＰ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６７】
ある実施態様において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Maecker et al, Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６８】
ある実施態様において、ＲＡＧＥ−１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＡＢ５３２８(EMD Millipore)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６９】
ある実施態様において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、抗体cat no: LS-B95-100(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７０】
ある実施態様において、腸カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、抗体4F12: cat no: LS-B6190-50(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７１】
ある実施態様において、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２に対する抗原結合ドメインは、抗体Lifespan Biosciences：モノクローナル： cat no: LS-C133261-100(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７２】
ある実施態様において、ＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメインは、Abcamから入手可能な抗体抗ＣＤ７９ａ抗体[ＨＭ４７／Ａ９](ａｂ３１２１)；Cell Signalling Technologyから入手可能な抗体ＣＤ７９Ａ抗体＃３３５１またはSigma Aldrichから入手可能なウサギにおいて産生された抗体ＨＰＡ０１７７４８−抗ＣＤ７９Ａ抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７３】
ある実施態様において、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合ドメインは、Dornan et al., “Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma” Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9. doi: 10.1182/blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24に記載の抗ＣＤ７９ｂである抗体ポラツズマブベドチンまたは“4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Malignancies” Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, CA December 6-9 2014に記載の二特異的抗体抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７４】
ある実施態様において、ＣＤ７２に対する抗原結合ドメインは、Myers, and Uckun, “An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia.” Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22に記載の抗体Ｊ３−１０９またはPolson et al., “Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection” Cancer Res March 15, 2009 69; 2358に記載の抗ＣＤ７２(１０Ｄ６.８.１、ｍＩｇＧ１)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７５】
ある実施態様において、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合ドメインは、ProSpecから入手可能な抗体ＡＮＴ−３０１  ＬＡＩＲ１抗体またはBioLegendから入手可能な抗ヒトＣＤ３０５(ＬＡＩＲ１)抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７６】
ある実施態様において、ＦＣＡＲに対する抗原結合ドメインは、Sino Biological Inc.から入手可能な抗体ＣＤ８９／ＦＣＡＲ抗体(Catalog#10414-H08H)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７７】
ある実施態様において、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合ドメインは、Abnovaから入手可能な抗体ＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体(Ｍ１７)、クローン３Ｃ７またはLifespan Biosciencesから入手可能なマウス抗ＬＩＬＲＡ２抗体、モノクローナル(２Ｄ７)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７８】
ある実施態様において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメイン０ＬＦに対する抗原結合ドメインは、BioLegendから入手可能な抗体マウス抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル[ＵＰ−Ｄ２]またはR&D Systemsから入手可能なラット抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル[２３４９０３]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７９】
ある実施態様において、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合ドメインは、Noordhuis et al., “Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody” 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, December 10-13, 2011に記載の抗体Bispecific T cell Engager(ＢｉＴＥ)ｓｃＦｖ−抗体およびＡＤＣおよびＭＣＬＡ−１１７(Merus)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８０】
ある実施態様において、ＢＳＴ２(別名ＣＤ３１７)に対する抗原結合ドメインは、Antibodies-Onlineから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル[３Ｈ４]またはR&D Systemsから入手可能なマウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル[６９６７３９]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８１】
ある実施態様において、ＥＭＲ２(別名ＣＤ３１２)に対する抗原結合ドメインは、Lifespan Biosciencesから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル[ＬＳ−Ｂ８０３３]またはR&D Systemsから入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル[４９４０２５]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８２】
ある実施態様において、ＬＹ７５に対する抗原結合ドメインは、EMD Milliporeから入手可能な抗体マウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル[ＨＤ３０]またはLife Technologiesから入手可能なマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル[Ａ１５７９７]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８３】
ある実施態様において、ＧＰＣ３に対する抗原結合ドメインは、Nakano K, Ishiguro T, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916に記載の抗体ｈＧＣ３３またはFeng et al., “Glypican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer.” FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):377-82に全て記載されているＭＤＸ−１４１４、ＨＮ３またはＹＰ７の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８４】
ある実施態様において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合ドメインは、Elkins et al., “FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma” Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32に記載の抗ＦｃＲＬ５抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８５】
ある実施態様において、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合ドメインは、Lifespan Biosciencesから入手可能な抗体マウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル[ＡＴ１Ｇ４]、BioLegendから入手可能なマウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル[ＨＳＬ１１]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８６】
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、上記抗体からの１、２、３(例えば、全３)重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および／または上記抗体からの１、２、３(例えば、全３)軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、上記抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
【０３８７】
他の態様において、抗原結合ドメインはヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、非ヒト抗体はヒト化されており、ここで、抗体の特定の配列または領域が、ヒトまたはそのフラグメントにおいて天然に産生される抗体との類似性を高めるために修飾されている。ある態様において、抗原結合ドメインはヒト化されている。
【０３８８】
ヒト化抗体を、ＣＤＲ移植(例えば、各々その全体を引用により本明細書に包含させる、欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、各々その全体を引用により本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814;およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャッフリング(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる米国特許５,５６５,３３２号参照)および各々その全体を引用により本明細書に包含させる、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に開示の技法を含むが、これらに限定されない当分野で知られる多様な技法を使用して、産生できる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変える、例えば改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置き換えられる。これらのフレームワーク置換は、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置での異常フレームワーク残基を同定するための配列比較(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)による、当分野で周知の方法により同定できる。
【０３８９】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトである供給源からの１以上のアミノ酸残基がその中に残存している。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば“移入”残基と称され、これは一般に“移入”可変ドメインから採られる。ここで提供する、ヒト化抗体または抗体フラグメントは非ヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域からの１以上のＣＤＲを含み、ここで、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分ヒト生殖系列に由来する。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための複数の技法が当分野で周知であり、本質的にWinterおよび同僚(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))に記載の方法により、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換、すなわち、ＣＤＲ移植(その全体を引用により本明細書に包含させるＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号)により、実施され得る。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、実質的に１個未満のヒト天然可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列で置換される。ヒト化抗体は、しばしばあるＣＤＲ残基およびおそらくあるフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基で置換された、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化はまたベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994);およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))または鎖シャッフリング(米国特許５,５６５,３３２号)によっても達成でき、これらの全体を引用により本明細書に包含させる。
【０３９０】
ヒト化抗体の製造において使用する、軽および重両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるためである。いわゆる“ベスト・フィット”法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体にわたりスクリーニングする。齧歯類のものに最も近いヒト配列を、次いで、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として認める(その内容をその全体を引用により本明細書に包含させるSims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。あるフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体について使用できおる(例えば、その内容をその全体を引用により本明細書に包含させるNicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照)。ある実施態様において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域は、ＶＨ４＿４−５９生殖系列配列に由来する。ある実施態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸から、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る。ある実施態様において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域はＶＫ３＿１.２５生殖系列配列に由来する。ある実施態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸から、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る。
【０３９１】
ある態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体フラグメントを含む部分は、標的抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的性質を保持しながら、ヒト化される。本発明のある態様により、ヒト化抗体および抗体フラグメントは、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用するヒト配列および種々のヒト化産物着想の分析過程により作成される。三次元免疫グロブリンモデルは、当業者が一般に利用可能であり、熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造的構造を説明および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能となる。この方法で、ＦＲ残基を、標的抗原に対する親和性増加のような所望の抗体または抗体フラグメント特性が達成されるように、選択し、レシピエントおよび移入配列から組み合わせ得る。一般に、ＣＤＲ残基は直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【０３９２】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と類似の抗原特異性、例えば、本発明において、ここに記載するヒト癌関連抗原と結合する能力を維持する。ある実施態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ここに記載するヒト癌関連抗原への結合の親和性および／または特異性が改善され得る。
【０３９３】
ある態様において、本発明の抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特性または性質により特徴付けられる。例えば、ある態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ここに記載する腫瘍抗原と特異的に結合する。
【０３９４】
ある態様において、ここに記載する抗癌関連抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある態様において、ここに記載する抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能的(例えば二特異的)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))である。ある態様において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、ここに記載する癌関連抗原タンパク質と、野生型のまたは増強された親和性で結合する。
【０３９５】
いくつかの例で、ｓｃＦｖｓは、当分野で知られる方法により製造され得る(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してＶＨ領域とＶＬ領域を連結することにより産生され得る。ｓｃＦｖ分子は、最適化長および／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響する。事実、短ポリペプチドリンカーを用いるとき(例えば、５〜１０アミノ酸)、鎖内折り畳みは阻止される。鎖間折り畳みもまた機能的エピトープ結合部位を形成するために２可変領域を架橋するために必要である。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、引用により本明細書に包含させるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
【０３９６】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある実施態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の実施態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(式中、ｎは１以上の正の整数である)(配列番号２２)のようなグリシンおよびセリン反復セットを含む。ある実施態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２９)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３０)であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持または増強し、活性における優れた有効性を生じさせ得る。
【０３９７】
他の態様において、抗原結合ドメインはＴ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法は当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(引用文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる)。例えば、ｓｃＴＣＲは、リンカー(例えば、可動性ペプチド)により結合したＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含むように改変され得る。このアプローチは、それ自体は細胞内であるが、このような抗原(ペプチド)のフラグメントがＭＨＣにより癌細胞表面に提示される癌関連標的に極めて有効である。
【０３９８】
二特異的ＣＡＲ
ある実施態様において、多特異的抗体分子は二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超える抗原に特異性を有しない。二特異的抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある実施態様において、第一および第二エピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある実施態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある実施態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある実施態様において、第一および第二エピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに対する結合特異性を有する半抗体を含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
【０３９９】
ある実施態様において、抗体分子は多特異的(例えば、二特異的または三特異的)抗体分子である。二特異的またはヘテロ二量体抗体分子を産生するプロトコールは当分野で知られ、例えば、ＵＳ５７３１１６８号に記載の“ノブ・イン・ホール”アプローチ、例えば、ＷＯ０９／０８９００４号、ＷＯ０６／１０６９０５号およびＷＯ２０１０／１２９３０４号に記載の静電的ステアリングＦｃ対形成、例えば、ＷＯ０７／１１０２０５号に記載の鎖交換改変ドメイン(ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成、例えば、ＷＯ０８／１１９３５３号、ＷＯ２０１１／１３１７４６号およびＷＯ２０１３／０６０８６７号に記載のＦａｂアーム交換、例えば、ＵＳ４４３３０５９号に記載のアミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ官能能性剤を使用する二特異的構造を産生するための、例えば、抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート、例えば、ＵＳ４４４４８７８号に記載の、２個の重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルによる異なる抗体からの半抗体(重−軽鎖対またはＦａｂ)組み換えにより産生される二特異的抗体決定基、例えば、ＵＳ５２７３７４３号に記載のスルフヒドリル反応性基により架橋された三機能的抗体、例えば、三Ｆａｂ’フラグメント、例えば、ＵＳ５５３４２５４号に記載の、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋によりＣ末端テイルから架橋された生合成結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖの対、例えば、ＵＳ５５８２９９６号に記載の定常ドメインが置換されている、ロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)により二量体化されている異なる結合特異性を有する二機能性抗体、例えば、Ｆａｂフラグメント、例えば、ＵＳ５５９１８２８号に記載の二特異的およびオリゴ特異的単およびオリゴ価受容体、例えば、ある抗体のＣＨ１領域と一般に軽鎖を伴う他の抗体のＶＨ領域の間のポリペプチドスペーサーにより結合された２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域、例えば、ＵＳ５６３５６０２号に記載の二特異的ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖片による抗体またはＦａｂフラグメントの架橋、例えば、ＵＳ５６３７４８１号に記載の二特異的融合タンパク質、例えば、２個のｓｃＦｖｓとその間の親水性螺旋状ペプチドリンカーおよび完全定常領域を含む発現構築物、例えば、ＵＳ５８３７２４２号に記載の多価および多特異的結合タンパク質、例えば、一般に二重特異性抗と呼ばれる、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一ドメインおよびＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第二ドメインを有するポリペプチドの二量体(高次構造もまた二特異的、三特異的または四特異的分子の産生のために包含される)、例えば、ＵＳ５８３７８２１号に記載の二量体化して二特異的／多価分子を形成できる、抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域にペプチドスペーサーによりさらに結合したＶＬおよびＶＨ鎖が結合したミニボディ構築物、例えば、ＵＳ５８４４０９４号に記載の二特異的二重特異性抗体を形成するための二量体、三量体および四量体を形成できる、何れかの配向で短ペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)によりまたはリンカー無しで連結されたＶＨおよびＶＬドメイン、例えば、ＵＳ５���６４０１９号に記載の一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成するためにさらにＶＬドメインと結合したＣ末端で架橋可能基とペプチド結合により接続されたＶＨドメイン(またはファミリーメンバーにおけるＶＬドメイン)のストリングおよび例えば、ＵＳ５８６９６２０号に記載のｓｃＦＶまたは二重特異性抗体タイプ形態両方を使用する、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成するための非共有または化学架橋により多価構造に合わされたペプチドリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬドメインを伴う一本鎖結合ポリペプチドを例えば含むが、これらに限定されない。さらなる多特異的および二特異的分子およびその製造方法の例は、例えば、ＵＳ５９１０５７３号、ＵＳ５９３２４４８号、ＵＳ５９５９０８３号、ＵＳ５９８９８３０号、ＵＳ６００５０７９号、ＵＳ６２３９２５９号、ＵＳ６２９４３５３号、ＵＳ６３３３３９６号、ＵＳ６４７６１９８号、ＵＳ６５１１６６３号、ＵＳ６６７０４５３号、ＵＳ６７４３８９６号、ＵＳ６８０９１８５号、ＵＳ６８３３４４１号、ＵＳ７１２９３３０号、ＵＳ７１８３０７６号、ＵＳ７５２１０５６号、ＵＳ７５２７７８７号、ＵＳ７５３４８６６号、ＵＳ７６１２１８１号、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１号、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１号、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１号、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１号、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１号、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１号、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１号、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１号、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１号、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１号、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１号、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１号、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１号、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１号、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１号、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１号、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１号、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１号、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１号、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１号、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１号、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１号、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１号、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１号、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１号、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１号、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１号、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１号、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１号、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１号、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１号、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１号、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１号、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１号、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１号、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１号、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１号、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１号、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１号、ＥＰ３４６０８７Ａ２号、ＷＯ０００６６０５Ａ２号、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２号、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１号、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２号、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２号、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２号、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２号、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１号、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２号、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１号、ＷＯ９１０３４９３Ａ１号、ＷＯ９３２３５３７Ａ１号、ＷＯ９４０９１３１Ａ１号、ＷＯ９４１２６２５Ａ２号、ＷＯ９５０９９１７Ａ１号、ＷＯ９６３７６２１Ａ２号、ＷＯ９９６４４６０Ａ１号に見ることができる。上記引用文献の内容は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０４００】
二特異的抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨはＶＬの上流でも下流でもよい。ある実施態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)はそのＶＨ(ＶＨ１)と共にそのＶＬ(ＶＬ１)の上流に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ２)と共にそのＶＨ(ＶＨ２)の上流に配置され、その結果、全体的二特異的抗体分子は配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。他の実施態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)はそのＶＬ(ＶＬ１)と共にそのＶＨ(ＶＨ１)の上流に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)はそのＶＨ(ＶＨ２)と共にそのＶＬ(ＶＬ２)の上流に配置され、その結果、全体的二特異的抗体分子は配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。所望により、リンカーは２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)間、例えば、構築物がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置されているならばＶＬ１とＶＬ２の間または構築物がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置されているならばＶＨ１とＶＨ２の間に配置される。リンカーは、ここに記載のリンカー、例えば、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(式中、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)(配列番号７２)である。一般に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２個のｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるために十分長くなければならない。所望により、リンカーは第一ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。所望により、リンカーは第二ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。複数のリンカーを有する構築物において、リンカーの任意の２以上は同一でも異なってもよい。従って、ある実施態様において、二特異的ＣＡＲはＶＬ、ＶＨおよび所望により１以上のリンカーをここに記載する配置で有する。
【０４０１】
安定性および変異
ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子(例えば、可溶性ｓｃＦｖ)の安定性を、慣用の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理性質(例えば、熱安定性)を参照して評価できる。ある実施態様において、ヒト化ｓｃＦｖは、記載するアッセイにおいて対照結合分子(例えば慣用のｓｃＦｖ分子)より約０.１℃、約０.２５℃、約０.５℃、約０.７５℃、約１℃、約１.２５℃、約１.５℃、約１.７５℃、約２℃、約２.５℃、約３℃、約３.５℃、約４℃、約４.５℃、約５℃、約５.５℃、約６℃、約６.５℃、約７℃、約７.５℃、約８℃、約８.５℃、約９℃、約９.５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃または約１５℃大きな熱安定性を有する。
【０４０２】
ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの改善された熱安定性は、続いてＣＡＲ構築物の治療的性質をもたらす、ＣＡＲ構築物全体に貢献し得る。ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、慣用の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃改善し得る。ある実施態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、慣用の抗体と比較して１℃改善された熱安定性を有する。他の実施態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、慣用の抗体と比較して２℃改善された熱安定性を有する。他の実施態様において、ｓｃＦｖは、慣用の抗体と比較して４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃改善された熱安定性を有する。比較を、例えば、ここに開示するｓｃＦｖ分子と、ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが由来した抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂフラグメントの間で行い得る。熱安定性を、当分野で知られる方法を使用して測定し得る。例えば、ある実施態様において、Ｔｍが測定され得る。Ｔｍを測定する方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法を下により詳細に記載する。
【０４０３】
ｓｃＦｖにおける変異(可溶性ｓｃＦｖのヒト化または直接変異誘発により生じる)は、ｓｃＦｖの安定性を変え、ｓｃＦｖおよびＣＡＲ構築物の全体的安定性を改善し得る。ヒト化ｓｃＦｖの安定性を、Ｔｍ、変性温度および凝集温度のような測定値を使用して、マウスｓｃＦｖと比較する。
【０４０４】
変異体ｓｃＦｖの結合能を、当分野で知られるおよびここに記載するアッセイを使用して決定できる。
【０４０５】
ある実施態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物の安定性を改善するように、ヒト化過程に由来する少なくとも一つの変異を含む。他の実施態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物の安定性を改善するように、ヒト化過程に由来する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０変異を含む。
【０４０６】
タンパク質安定性を評価する方法
抗原結合ドメインの安定性を、例えば、下記方法を使用して、評価し得る。このような方法は、最小に安定のドメインがまずアンフォールドされるかまたは協同的にアンフォールドされる多ドメインユニット(例えば、単一アンフォールディング遷移を示す多ドメインタンパク質)の全体的安定性閾値を制限する、複数の熱アンフォールディング遷移の決定を可能とする。最小に安定のドメインは、多数のさらなる方法で決定され得る。変異誘発を実施して、どのドメインが全体的安定性を制限するかを探索できる。さらに、多ドメインタンパク質のプロテアーゼ抵抗性を、最小に安定のドメインが内因性にアンフォールドされる条件下、ＤＳＣまたは他のスペクトル方法により実施できる(Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692)。最小に安定のドメインが同定されたら、このドメインをコードする配列(またはその一部)を、本方法における試験配列として用い得る。
【０４０７】
ａ)熱安定性
組成物の熱安定性を、当分野で知られる多数の非限定的生物物理学的または生物化学的技法を使用して分析し得る。ある実施態様において、熱安定性を分析的スペクトロスコピーにより評価する。
【０４０８】
分析的スペクトロスコピー方法の例は、示差走査熱量測定(ＤＳＣ)である。ＤＳＣは、大部分のタンパク質またはタンパク質ドメインのアンフォールディングに付随する熱吸収に感受性である熱量計である(例えばSanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988参照)。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質のサンプルを熱量計に入れ、ＦａｂまたはｓｃＦｖがアンフォールドされるまで温度を上げる。タンパク質がアンフォールドする温度は、全体的タンパク質安定性の指標である。
【０４０９】
分析的スペクトロスコピー方法の他の例は円偏光二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーである。ＣＤスペクトロメトリーは、温度上昇の関数として組成物の光学活性を測定する。円偏光二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーは、構造的非対称による左手方向偏光対右手方向偏光の吸収の差を測定する。障害されたまたはアンフォールドされた構造は、規則的または折り畳まれた構造のものと極めて異なるＣＤスペクトルをもたらす。ＣＤスペクトルは、温度上昇の変性効果に対するタンパク質の感受性を反映し、それ故にタンパク質熱安定性の指標である(van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000参照)。
【０４１０】
熱安定性を測定するための分析的スペクトロスコピー方法の他の例は、蛍光発光スペクトロスコピーである(van Mierlo and Steemsma, supra参照)。熱安定性を測定する分析的スペクトロスコピー方法さらに他の例は、核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーである(例えばvan Mierlo and Steemsma, supra参照)。
【０４１１】
組成物の熱安定性は生化学的に測定され得る。熱安定性を評価する生物化学的方法の例は、熱チャレンジアッセイである。“熱チャレンジアッセイ”において、組成物を、設定した時間、ある範囲の温度上昇に付す。例えば、ある実施態様において、試験ｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子含有分子を、例えば、１〜１.５時間、ある範囲の温度上昇に付す。タンパク質の活性を、次いで適切な生物化学的アッセイによりアッセイする。例えば、タンパク質が結合タンパク質(例えばｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド)であるならば、結合タンパク質の結合活性を機能的または定量的ＥＬＩＳＡにより決定し得る。
【０４１２】
このようなアッセイはハイスループット形態であってよく、大腸菌およびハイスループットスクリーニングを使用する実施例に開示のものであり得る。例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖバリアントを含む、抗原結合ドメインのライブラリーを、当分野で知られる方法を使用して作製し得る。例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、発現を誘発でき、例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを熱チャレンジに付してよい。チャレンジした試験サンプルを、結合についてアッセイでき、安定である、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖｓをスケールアップし、さらに特徴付けし得る。
【０４１３】
熱安定性を、上記技法の何れか(例えば分析的スペクトロスコピー技法)を使用して、組成物の融解温度(Ｔｍ)を測定することにより評価する。融解温度は、組成物の分子の５０％が折り畳まれた状態である、熱遷移曲線の中点の温度である(例えば、Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692参照)。ある実施態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある実施態様において、ＩｇＧのＴｍ値は約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある実施態様において、多価抗体のＴｍ値は約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０４１４】
熱安定性はまた分析的熱量測定技法(例えばＤＳＣ)を使用する組成物の比熱または熱容量(Ｃｐ)測定により評価される。組成物の比熱は、１molの水の温度を１℃上げるのに必要なエネルギー(例えばkcal／mol)である。大Ｃｐが変性または不活性タンパク質組成物の特徴である。組成物の熱容量の変化(ΔＣｐ)は、熱遷移前後の組成物の比熱の決定により、測定する。熱安定性はまたアンフォールディングのギブズ自由エネルギー(ΔＧ)、アンフォールディングのエンタルピー(ΔＨ)またはアンフォールディングのエントロピー(ΔＳ)を含む熱力学的安定性の他のパラメータの測定または決定により評価され得る。上記生物化学的アッセイの１以上(例えば熱チャレンジアッセイ)を、組成物の５０％がその活性(例えば結合活性)を保持する温度(すなわちＴＣ値)の決定に使用する。
【０４１５】
さらに、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの変異を、非変異のここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖと比較して、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性が改変されるようになし得る。ヒト化ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物に取り込まれるとき、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ヒト化ｓｃＦｖは、本発明のＣＡＲ全体的な熱安定性に貢献する。ある実施態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性に貢献する一変異を含む。他の実施態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性に貢献する複数の変異を含む。ある実施態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖにおける複数の変異は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性に相加効果を有する。
【０４１６】
ｂ)％凝集
組成物の安定性は、その凝集傾向の測定により決定できる。凝集は、多数の非限定的生物化学的または生物物理学的技法により測定できる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して評価し得る。ＳＥＣは、サイズに基づき分子を分ける。カラムに、イオンおよび小分子をその内部に受け入れるが、大きい物はしない、重合ゲルの半固体ビーズを充填する。タンパク質組成物をカラムの上部に適用したとき、小型の折り畳まれたタンパク質(すなわち非凝集タンパク質)は、大タンパク質凝集物が利用可能であるよりも大きな体積の溶媒に分散される。結果的に、大凝集物はカラムを速く通り、この方法で、混合物がその成分に分離または分画され得る。各フラクションは、ゲルから溶出されるに連れて、別々に定量(例えば光散乱による)される。従って、組成物の凝集％は、フラクションの濃度とゲルに適用したタンパク質の総濃度の比較により決定され得る。安定な組成物はカラムから本質的に単一フラクションとして溶出され、溶出プロファイルまたはクロマトグラムにおいて本質的に単一ピークとして見られる。
【０４１７】
ｃ)結合親和性
組成物の安定性は、その標的結合親和性の決定により評価され得る。結合親和性を決定するための多種多様な方法が当分野で知られる。結合親和性を決定する方法の例は、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴は、例えばBIAcore system(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を使用する、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度における改変の検出による実時間生体分子特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象である。さらなる詳細について、Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131;およびJohnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277参照。
【０４１８】
ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原結合ドメインアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインはここに記載する抗原結合ドメインの所望の機能的性質を保持する。
【０４１９】
ある具体的態様において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０４２０】
種々の態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域内(例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ)、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上のアミノ酸の修飾により改変される。ある具体的態様において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０４２１】
本発明の抗体または抗体フラグメントを、アミノ酸配列が多様であるが(例えば、野生型から)、所望の活性は変わらないように、さらに修飾され得ることは、当業に理解される。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換に至るさらなるヌクレオチド置換を、タンパク質に行ってよく、例えば、分子における非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換え得る。他の実施態様において、一連のアミノ酸を、アミノ酸残基は類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似する一連のもので置き換えることができる。
【０４２２】
類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で同定されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
【０４２３】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈におけるパーセント同一性は、同じである２以上の配列をいう。次の配列比較アルゴリズムの一つまたは手動アラインメントおよび目視で測定して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最大対応について比較および整列したとき、２配列の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドが特定のパーセンテージであるならば、該２配列は“実質的に同一”である(例えば、特定の領域にわたりまたは、特定していないとき、配列全体にわたり６０％同一性、所望により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長である領域にわたりまたはより好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長の領域にわたり存在する。
【０４２４】
配列比較について、一般に一つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用したとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できまたは別のパラメータを指定してよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列のアラインメント方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性探索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実施(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology)により実施できる。
【０４２５】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適するアルゴリズムの２例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationにより公的に利用可能である。
【０４２６】
２アミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、
E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)のアルゴリズムにより決定でき、これは、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に取り込まれており、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。さらに、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを使用して決定でき、これはＧＣＧソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで利用可能)におけるＧＡＰプログラムに取り込まれており、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用する。
【０４２７】
ある態様において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する、出発抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)アミノ酸配列の修飾が企図される。ＣＡＲに含まれる、例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインのＶＨまたはＶＬ、例えば、ｓｃＦｖを、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域と少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾し得る。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、ＣＡＲ構築物全体の修飾、例えば、ＣＡＲ構築物の種々のドメインの１以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物と少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾され得る。
【０４２８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施態様において、ＣＡＲを、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合した膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域に結合した１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域に結合した１以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの一つと結合するものであり、例えば、ある実施態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激性ドメインまたはヒンジドメインが由来するのと同じタンパク質由来であり得る。他の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの任意の他のドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。いくつかの例で、膜貫通ドメインを、選択またはアミノ酸置換により修飾して、このようなドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避ける、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化する。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列を、同ＣＡＲ発現細胞に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために、修飾または置換し得る。
【０４２９】
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来しても組み換え供給源に由来してもよい。供給源が天然であるとき、ドメインはあらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合しているときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、少なくとも例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を含み得る。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域を含み得る。
【０４３０】
いくつかの例で、膜貫通ドメインを、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジにより、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合させ得る。例えば、ある実施態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ(例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ)、ＧＳリンカー(例えば、ここに記載するＧＳリンカー)、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の膜貫通ドメインを含む(例えば、それからなる)。
【０４３１】
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーはＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(配列番号６)のヒンジを含む。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ヌクレオチド配列GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(配列番号７)によりコードされるヒンジを含む。
【０４３２】
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーはＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(配列番号８)を含む。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ヌクレオチド配列AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(配列番号９)によりコードされるヒンジを含む。
【０４３３】
ある態様において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合ロイシンおよびバリンのような疎水性残基を優先的に含む。ある態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが組み換え膜貫通ドメインの各末端に見られ得る。
【０４３４】
所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴ−またはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある態様において、リンカーはアミノ酸配列GGGGSGGGGS(配列番号１０)を含む。ある実施態様において、リンカーはヌクレオチド配列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号１１)によりコードされる。
【０４３５】
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーはＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０４３６】
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般にＣＡＲが導入されている免疫細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも一つの活性化を担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。それ故に、用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化機能を実施するよう指示する、タンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いてよいが、多くの場合鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用する限り、このような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、故に、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断部分を含むことを意図する。
【０４３７】
本発明のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後シグナル伝達に協調して働くＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および共受容体の細胞質配列ならびにこれらの配列のあらゆる誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
【０４３８】
ＴＣＲ単独により発生されるシグナルは、Ｔ細胞の完全活性化に不十分であり、二次的および／または共刺激性シグナルもまた必要であることが知られる。それ故に、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる。ＴＣＲにより抗原依存性一次活性化に作用するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)および二次的または共刺激性シグナルを提供するために抗原非依存的方式で作用するもの(二次的細胞質ドメイン、例えば、共刺激性ドメイン)。
【０４３９】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方向または阻害方向にＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激性方式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０４４０】
本発明において特に有用なＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２のものを含む。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０４４１】
ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が改変されている(例えば、増加または低減)、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０４４２】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをそれのみで含んでよくまたは本発明のＣＡＲにおいて有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激性分子の細胞内ドメインを含む部分をいう。共刺激性分子は、抗原のリンパ球の効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増大、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／ＣｂｐおよびＣＤ１９ａを含む。
【０４４３】
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに無作為にまたは特定の順序で結合され得る。所望により、短オリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長が、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。ある実施態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用し得る。ある実施態様において、単一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用し得る。
【０４４４】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の、共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある実施態様において、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の、共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により分離される。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２個の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある実施態様において、リンカーはアラニン残基である。
【０４４５】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１４のシグナル伝達ドメインである。ある態様において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のシグナル伝達ドメインである。
【０４４６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号１６)を含む。ある態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、核酸配列AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号１７)によりコードされる。
【０４４７】
ある態様において、ＣＡＲ発現ここに記載する細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的または異なる標的(例えば、ここに記載する癌関連抗原以外の標的またはここに記載する異なる癌関連抗原)に対する、例えば、異なる抗原結合ドメインを含む第二ＣＡＲを含み得る。ある実施態様において、第二ＣＡＲは、癌関連抗原と同じ癌細胞型により発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインはない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。理論に縛られることを望まないが、共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の第一ＣＡＲへのおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、ＣＡＲ活性を、両標的が発現される細胞に限定させ得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性ドメインを含む第一癌関連抗原ＣＡＲおよび異なる標的抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第一標的抗原以外の抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【０４４８】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞はここに記載するＸＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、ＣＬＬも発現する正常細胞に見られるが、癌細胞にない抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害性分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦベータの細胞内ドメインであり得る。
【０４４９】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして含み、これは、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと相互作用しない。
【０４５０】
ある実施態様において、抗原結合ドメインは単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含み、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドである分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、単一ドメイン由来する慣用の４鎖抗体、改変ドメインおよび由来する抗体以外の単一ドメイン足場を含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は当分野のまたは将来的な単一ドメイン分子の何れでもよい。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないあらゆる種に由来し得る。この用語はまたラクダ科およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０４５１】
ある態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメ血清に見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプに由来するような、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子(“ＩｇＮＡＲｓ”)を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載される。
【０４５２】
他の態様によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示される。明確性のために、天然に軽鎖を欠くこの可変ドメイン由来する重鎖分子は、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコに由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を形成でき、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【０４５３】
ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生され得る(例えば、ファージディスプレイにより選択)。
【０４５４】
受容体の抗原結合ドメイン間で相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞が、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原に結合する能力を阻害するため、望ましくないことがあることもまた判明した。従って、ここに開示するのは、このような相互作用を最小化した抗原結合ドメインを含む、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を含む細胞である。またここに開示するのは、このような相互作用を最小化した抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸、ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法である。ある実施態様において、該第一および該第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。
【０４５５】
ある実施態様において、本発明は第一および第二ＣＡＲを含み、ここで、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはナノボディを含む。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０４５６】
ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０４５７】
ある実施態様において、細胞の表面に存在するとき、該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲにより実質的に減少されない。ある実施態様において、該第二ＣＡＲ存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲ非存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０４５８】
ある実施態様において、細胞の表面に存在するとき、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるより少なく互いに結合する。ある実施態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるより８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する少なく互いに結合する。
【０４５９】
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに他の薬物、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物を発現し得る。例えば、ある実施態様において、薬物は、阻害性分子を阻害する薬物であり得る。阻害性分子、例えば、ＰＤ１は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減させ得る。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータを含む。ある実施態様において、阻害性分子を阻害する薬物は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む薬物である。ある実施態様において、薬物は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦベータまたはこれらの何れかのフラグメント(例えば、これらの何れかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害性分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激性ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)である第二ポリペプチドを含む。ある実施態様において、薬物は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転され得る。
【０４６０】
ある実施態様において、薬物は膜貫通ドメインおよび４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような細胞内シグナル伝達ドメインに融合した阻害性分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む(ここではＰＤ１  ＣＡＲとも称する)。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、ここに記載するＸＣＡＲと組み合わせて使用するとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。ある実施態様において、ＣＡＲは、配列番号２６において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(配列番号２６)。
【０４６１】
ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、下に提供するアミノ酸配列を含む(配列番号３９)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(配列番号３９)。
【０４６２】
ある実施態様において、薬物は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列を下に示し、ＰＤ１  ＥＣＤは、下の配列番号２７で下線を引く。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(配列番号２７)。
【０４６３】
他の態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団を提供する。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する異なる癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される癌関連抗原と異なるここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有する第二細胞を発現するＣＡＲを含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載する癌関連抗原以外を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
【０４６４】
他の態様において、本発明は細胞の集団を提供し、ここで、集団における少なくとも一つの細胞は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞は、他の薬物、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物を発現する。例えば、ある実施態様において、薬物は阻害性分子を阻害する薬物であり得る。阻害性分子、例えば、ＰＤ−１は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を低減させ得る。阻害性分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータを含む。ある実施態様において、阻害性分子を阻害する薬物は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む薬物である。ある実施態様において、薬物は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦベータのような阻害性分子の第一ポリペプチドまたはこれらの何れかのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激性ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある実施態様において、薬物は、ＰＤ−１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【０４６５】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団、例えば、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を、他の薬物、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。他の態様において、本発明は、細胞の集団を投与することを含む方法を提供し、集団における少なくとも一つの細胞はここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、そして第二細胞は他の薬物、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物を、他の薬物、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて発現する。
【０４６６】
制御可能キメラ抗原受容体
ある実施態様において、ＣＡＲ活性が制御可能である制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)が、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するのに望ましい。ＣＡＲ活性が制御され得る、多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼ(例えば、Di et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を使用する、例えば、誘導可能アポトーシスを、本発明のＣＡＲ治療における安全性スイッチとして使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲは一組の、一般に最も単純な実施態様では２個のポリペプチドを含み、ここで、ここに記載する標準的ＣＡＲの成分、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、別々のポリペプチドまたはメンバーに分割される。ある実施態様において、ポリペプチドの一組は、二量体化分子の存在により、ポリペプチドを互いに結合できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。
【０４６７】
ある態様において、ＲＣＡＲは、１)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；２)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーの２個のポリペプチドまたはメンバーを含む。所望により、ＲＣＡＲはここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー、抗原結合メンバーまたはこの両者に配置され得る(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたはエレメントがここに記載されるとき、順序は適用されるとおりでよいが、他の順序も同様に包含される。換言すると、ある実施態様において、順序は本明細書に示すとおりであるが、他の実施態様において、順序は異なり得る。例えば、膜貫通領域のある側のエレメントの順序は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は異なっても、例えば、逆でもよい)。
【０４６８】
ある実施態様において、第一および第二スイッチドメインは細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある実施態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同じであるホモ二量体化スイッチまたは、例えば、第一および第二スイッチドメインは互いに異なるヘテロ二量体化スイッチを形成できる。
【０４６９】
ある実施態様において、ＲＣＡＲは“多スイッチ”を含み得る。多スイッチはヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、多数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、スイッチドメインを、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して含む。ある実施態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある実施態様において、第一メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。
【０４７０】
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【０４７１】
ある実施態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。ある実施態様において、抗原結合メンバーは、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、多数の、例えば、２または３のここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ある実施態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは含まない。ある実施態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む：４１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４１ＢＢ；４１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４１ＢＢまたは４１ＢＢ−ＣＤ２８。このような実施態様において、細胞内結合メンバーはＣＤ３ゼータドメインを含む。このような実施態様において、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２個の共刺激性ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバーおよび(２)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも一つの一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４７２】
ある実施態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞表面に繋留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、抗原結合メンバーをコードする配列で細胞をトランスフォームすることなく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対形成することを可能とする。このような実施態様において、ＲＣＡＲは、１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、そして、所望により、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、さらに３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合される抗原と異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーを含み得る。
【０４７３】
またここに提供されるのは、抗原結合メンバーが二特異的活性化およびターゲティング能を含む、ＲＣＡＲである。この実施態様において、抗原結合メンバーは、多数の、例えば、２、３、４または５抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各抗原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原の同一または異なるエピトープに結合する。ある実施態様において、複数の抗原結合ドメインはタンデムであり、所望により、リンカーまたはヒンジ領域は、抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域はここに記載される。
【０４７４】
ある実施態様は、増殖の切り替えを可能とする配置を有するＲＣＡＲを提供する。この実施態様において、ＲＣＡＲは、１)所望により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン；例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインおよびスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバーおよび２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないかまたは細胞内シグナル伝達メンバーのスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある実施態様において、抗原結合メンバーは共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達メンバーはホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような実施態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある実施態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
【０４７５】
ここに記載するＲＣＡＲ配置の何れにおいても、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０４７６】
またここに提供されるのは、ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように改変されたあらゆる細胞をＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある実施態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある実施態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。
【０４７７】
またここに提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの種々のエレメントをコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある実施態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が同じ核酸、例えば、ベクターに存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(単一翻訳産物の開裂によりまたは２個の別々のタンパク質産物の翻訳により２タンパク質の産生をもたらす)により達成できる。ある実施態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列は(ｉ)と(ii)の間に配置される。ペプチド開裂部位の例は次のものを含み、ここで、ＧＳＧ残基は何れかである。
Ｔ２Ａ： (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P(配列番号６８)
Ｐ２Ａ： (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(配列番号６９)
Ｅ２Ａ： (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(配列番号７０)
Ｆ２Ａ： (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(配列番号７１)
【０４７８】
ある実施態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列は(ｉ)と(ii)の間に配置される。これらの実施態様において、(ｉ)および(ii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある実施態様において、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。
【０４７９】
あるいは、ＲＣＡＲの種々のエレメントをコードする配列は異なる核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置される。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸、例えば、第一ベクターに存在でき、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸、例えば、第二ベクターに存在できる。
【０４８０】
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは非共有でも共有でもよい。非共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有的相互作用を促進する。共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有的相互作用を促進する。
【０４８１】
ある実施態様において、ＲＣＡＲはＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンの初期細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンはＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に十分なＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
【０４８２】
ある実施態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用できる。
【０４８３】
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(配列番号５４)
【０４８４】
ある実施態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、下記である配列番号５４の下線部分存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含むことができる。
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(配列番号５５)
【０４８５】
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(配列番号５６)
【０４８６】
ここで使用する用語“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有し、配列番号５４または５５のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するまたは最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基異なるＦＫＢＰそのフラグメントもしくはアナログを含む第一スイッチドメインおよび、ラパマイシンまたはラパログの存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有し、配列番号５６のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するまたは最大で３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基異なるＦＲＢフラグメントもしくはそのアナログを含む第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチを含む。ある実施態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号５４(または配列番号５５)に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインおよび配列番号５６に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。
【０４８７】
ある実施態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインと、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の間の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある実施態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８の変異から選択される、１以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は何れかの他の天然に存在するアミノ酸で変異される。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２はフェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)(例えば、配列番号５７)またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)(例えば、配列番号５８)への変異である。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)(例えば、配列番号５９)への変異である。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は何れかのアミノ酸への変異であり、ここで、Ｔ２０９８は何れかのアミノ酸への変異である(例えば、配列番号６０)。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む(例えば、配列番号６１)。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む(例えば、配列番号６２)。
【０４８８】
【表９３】
2018527008.tif 000097
【０４８９】
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供される指導により、このようなスイッチおよび適切な二量体化分子は、当業者には明らかである。
【０４９０】
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば、融合したポリペプチドと、第二スイッチドメインに結合、例えば、融合したポリペプチドの間のシグナル伝達を可能とする。非限定的レベルの二量体化分子存在下、例えば、ここに記載するシステムで測定して、シグナル伝達は、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増強される。
【０４９１】
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと称することもある)、例えば、ＲＡＤ００１を、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある実施態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択され得る。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチでの使用に適するさらなるラパマイシンアナログは、さらに“組み合わせ治療”なる表題のセクションまたは“ＭＴＯＲ阻害剤例”なる表題のサブセクションに記載される。
【０４９２】
スプリットＣＡＲ
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公開ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載される。簡潔には、スプリットＣＡＲシステムは、第一抗原結合ドメインおよび共刺激性ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞および第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲを発現する細胞を含む。細胞が第一抗原に遭遇したとき、共刺激性ドメインは活性化され、細胞は増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、殺細胞活性が開始される。それ故に、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
【０４９３】
ＲＮＡトランスフェクション
ここに開示するのは、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを製造する方法である。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するｍＲＮＡを産生する方法はまた、特に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現する核酸および、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３２)のポリＡテイルを含む、構築物を産生する。このように産生されたＲＮＡは、多種の細胞に効率的にトランスフェクトされ得る。ある態様において、鋳型はＣＡＲのための配列を含む。
【０４９４】
ある態様において、本発明のＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。ある態様において、ｍＲＮＡ  ｅｎコードここに記載するＣＡＲは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞の産生のために、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入される。
【０４９５】
ある実施態様において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを、一過性トランスフェクションの携帯で細胞に導入できる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。あらゆる供給源からの目的のＤＮＡを、ＰＣＲにより、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはＤＮＡの何れかの他の適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は、ここに記載するＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、ここに記載する腫瘍関連抗原に対する抗体の単一鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインのようなここに記載する膜貫通ドメイン)；および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞質領域を含む。
【０４９６】
ある実施態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列に由来し得る。ある実施態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全てを含み得る。核酸はエキソンおよびイントロンを含み得る。ある実施態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の実施態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’および３’  ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは天然に存在する生物に通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために、同時にライゲートされる、遺伝子の部分を含むものである。同時にライゲートされる、ＤＮＡの部分は、単一生物または１を超える生物由来であり得る。
【０４９７】
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用するＤＮＡの領域と実質的に相補的である領域を有するように設計される。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補的であるまたは１以上の塩基が非相補的または不整合である、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲで使用されるアニーリング条件下、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーを、ＤＮＡ鋳型の何れかの部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’および３’  ＵＴＲを含む、細胞における通常転写される核酸の部分(オープンリーディングフレーム)を増幅するように、設計できる。プライマーはまた目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある実施態様において、プライマーは、５’および３’  ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように、設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーをいう。“上流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列に対する５’の位置をいうためにここで使用する。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流にある、二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーをいう。“下流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列に対する３’の位置をいうためにここで使用する。
【０４９８】
ＰＣＲのために有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼが、ここに開示する方法において使用され得る。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給源から市販されている。
【０４９９】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造もまた使用され得る。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’  ＵＴＲを有する。ある実施態様において、５’  ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加する５’および３’  ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの種々の領域とアニールするＰＣＲのプライマーの設計を含むが、これに限定されない、種々の方法により改変され得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後の最適翻訳効率の達成に必要な５’および３’  ＵＴＲ長を修飾できる。
【０５００】
５’および３’  ＵＴＲは、目的の核酸に対する、天然に存在する、内因性５’および３’  ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に対して内因性ではないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順方向および逆方向プライマーに取り込むことによりまたは鋳型の何れかの他の修飾により、付加できる。目的の核酸に対して内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾に有用であり得る。例えば、３’  ＵＴＲ配列におけるＡＵ富エレメントがｍＲＮＡの安定性を低減させ得ることは知られている。それ故に、３’  ＵＴＲを、当分野で周知であるＵＴＲの性質に基づき、転写ＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計できる。
【０５０１】
ある実施態様において、５’  ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に対して内因性ではない５’が、上記のとおりＰＣＲにより付加されるとき、コンセンサスコザック配列が、５’  ＵＴＲ配列の付加により再設計され得る。コザック配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を上げることができるが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡについて必要であるようには見えない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の必要性は、当分野で知られる。他の実施態様において、５’  ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲである。他の実施態様において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、３’または５’  ＵＴＲにおいて使用できる。
【０５０２】
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能とするために、転写プロモーターを、転写する配列の上流でＤＮＡ鋳型に結合させなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に結合したとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写するオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り込まれることになる。ある好ましい実施態様において、プロモーターは、本明細書の他の所に記載する、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当分野で知られる。
【０５０３】
好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始および細胞におけるｍＲＮＡ安定性を決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイル上のキャップの両方を有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡで、ＲＮＡポリメラーゼは、真核生物細胞での発現に適さないコンカタマー状(concatameric)生産物を産生する。３’  ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても真核生物トランスフェクションに有効ではない、正常サイズｍＲＮＡをもたらす。
【０５０４】
直線状ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３’末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸ばすことができる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
【０５０５】
ＤＮＡ鋳型へのポリＡ／Ｔストレッチの組込みの慣用の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドを不安定にする可能性があり、これが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型が欠失およびその他の異常でしばしば高度に汚染されている理由である。これにより、クローニング方法は面倒で時間がかかるだけでなく、しばしば信頼できないものとなる。これが、クローニングを行わないポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチでのＤＮＡ鋳型の構築法が特に望まれる理由である。
【０５０６】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテイル(配列番号３５)(サイズは５０〜５０００Ｔ(配列番号３６)であり得る)のようなポリＴテイルを含む逆方向プライマーの使用によりＰＣＲ中またはＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組み換えを含むが、これらに限定されない何れかの方法によりＰＣＲ後に産生され得る。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、その分解を低減させる。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関する。ある実施態様において、ポリ(Ａ)テイルは、１００〜５０００アデノシンである(配列番号３７)。
【０５０７】
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルを、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後さらに伸長できる。ある実施態様において、ポリ(Ａ)テイルの長さの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３８)への増加は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加をもたらす。さらに、３’末端への種々の化学基の結合は、ｍＲＮＡの安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログを、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込み得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに高め得る。
【０５０８】
５’キャップはまたＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい実施態様において、ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは、当分野で知られ、ここに記載する技法を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
【０５０９】
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは、また配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列を含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進する、あらゆるウイルス、染色体または人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質が包含され得る。
【０５１０】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達システム(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない商業的に利用可能な方法の何れかを使用して、標的細胞に導入できる。
【０５１１】
非ウイルス送達方法
ある態様において、非ウイルス方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
【０５１２】
ある実施態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(別名転位因子)の使用を含む。ある実施態様において、トランスポゾンは、それ自体ゲノムのある位置に挿入できるＤＮＡの一片であり、例えば、自己複製およびそのコピーをゲノムに挿入可能な一個のＤＮＡまたは長い核酸からスプライスされ、ゲノムの他の位置に挿入され得る一個のＤＮＡである。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆方向反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む。
【０５１３】
トランスポゾンを使用して核酸送達をする方法の例は、Sleeping Beautyトランスポゾンシステム(ＳＢＴＳ)およびpiggyBac(PB)トランスポゾンシステムを含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65;およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照。
【０５１４】
ＳＢＴＳは、１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素源の２成分を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)からのトランスポゾンを、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡに転位させる。例えば、トランスポサーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al. supra.参照。
【０５１５】
トランスポゾンの例は、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。トランスポサーゼの例は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る、過活性トランスポサーゼ)を含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al.; Kebriaei et al.;およびGrabundzija et al.参照。
【０５１６】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾンシステムを使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。
【０５１７】
ここに記載する方法によって、ある実施態様において、ＳＢＴＳ成分を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが細胞(例えば、ＴまたはＮＫ細胞)に送達される。例えば、核酸は、例えば、ここに記載する、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある実施態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある実施態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、２核酸を用いるシステ例えば、第一プラスミドは導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドはトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、例えば、デュアルプラスミドシステムが提供される。例えば、第一および第二核酸は宿主細胞に共送達される。
【０５１８】
ある実施態様において、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入とヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮｓ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮｓ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは改変メガヌクレアーゼ再改変ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子編集の組み合わせの使用により、ここに記載するＣＡＲを発現する、細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞が産生される。
【０５１９】
ある実施態様において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞の再プログラミングおよび細胞の対象への直接注入を可能とする。非ウイルスベクターの利点は、患者数に見合う十分な量の産生が容易であり、比較的低コストであること、保存中の安定性および免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
【０５２０】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまた１以上のここに記載するＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。ある態様において、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。ある態様において、核酸分子はＤＮＡ構築物として提供される。
【０５２１】
従って、ある態様において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および刺激性ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するゼータ鎖)を含む細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐの、少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０５２２】
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは膜貫通ドメインにヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより結合される。ある実施態様において、ヒンジ領域は配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激性ドメインをコードする配列を含む。ある実施態様において、共刺激性ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。ある実施態様において、共刺激性ドメインは、配列番号１６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号１８または配列番号２０の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを構成する配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
【０５２３】
他の態様において、本発明は、配列番号２のリーダー配列、ここに記載するｓｃＦｖドメイン、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０(またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号１２の配列(またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号１４の配列を有する４−１ＢＢ共刺激性ドメインまたは配列番号１６の配列を有するＣＤ２７共刺激性ドメイン(またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)および配列番号１８または配列番号２０の配列(またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメインを含むＣＡＲ構築物をコードする、単離核酸分子に関する。
【０５２４】
他の態様において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子をコードする核酸分子に関し、ここで、該抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＲＳＳ２１、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥＡ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍抗原と結合する。
【０５２５】
ある実施態様において、コード化ＣＡＲ分子は、さらに共刺激性ドメインをコードする配列を含む。ある実施態様において、共刺激性ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、共刺激性ドメインは配列番号１４の配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある実施態様において、膜貫通ドメインは配列番号１２の配列を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４の配列および配列番号１８の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを構成する配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある実施態様において、ここに記載する抗癌関連抗原結合ドメインは膜貫通ドメインにヒンジ領域により結合される。ある実施態様において、ヒンジ領域は配列番号４を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は配列番号６または配列番号８または配列番号１０を含む。
【０５２６】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技法を使用する、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の誘導化またはそれを含む細胞および組織からの直接単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなく、合成的にも産生できる。
【０５２７】
本発明はまた本発明のＤＮＡが挿入される、ベクターを提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期の安定な組込みおよび娘細胞へのその伝播を可能にするため、長期遺伝子移入を達成するための適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞に形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来ベクターを超える付加的利点を有する。それらはまた低免疫原性の付加的利点を有する。レトロウイルスベクターはまた、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上の(例えば、２)末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造遺伝子を欠き得る。ガンマレトロウイルスベクターの例は、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびこれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクタは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
【０５２８】
他の実施態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、sleeping beauty、crisper、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンを使用して達成され得る。下記の引用により本明細書に包含させる、June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
【０５２９】
簡潔に要約すると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般に、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに操作可能に結合させ、該構築物を発現ベクターに導入することにより達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
【０５３０】
本発明の発現構築物はまた標準的遺伝子送達プロトコールを使用する、核酸免疫化および遺伝子治療に使用され得る。遺伝子送達のための方法が当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の実施態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０５３１】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化され得る。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化し得る。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
【０５３２】
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供し得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載される。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも一つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
【０５３３】
多数のウイルスベースのシステムが哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための好都合なプラットフォームを提供する。当分野で知られる技法を使用して、選択した遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装させ得る。次いで、組み換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達し得る。多数のレトロウイルスシステムが当分野で知られる。ある実施態様において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある実施態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０５３４】
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは開始部位の上流領域３０〜１１０bpに位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流で同様に機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば可動性であり、したがって、プロモーター機能は、エレメントが倒置されるかまたは互いに移動しても、保持される。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまで５０bp増加され得る。プロモーターによって、個々のエレメントが、転写の活性化に協同的にまたは独立的に機能し得る。プロモーターの例は、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
【０５３５】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲコード化核酸分子を発現できるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡからリボソームへの酵素送達を担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現により駆動される。ＥＦ１ａプロモーターは哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化した核酸分子からのＣＡＲ発現に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)参照。ある態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１として提供する配列を含む。
【０５３６】
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列もまた使用でき、サルウイルス４０(ＳＶ４０)早期プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導可能プロモーターもまた本発明の一部として企図される。誘導可能プロモーターの使用は、ポリヌクレオチド配列の発現が望ましいとき、操作可能に連結しているその発現をオンにできまたは発現が望まれないとき、発現をオフにできる分子スイッチを提供する。誘導可能プロモーターの例は、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０５３７】
ベクターはまた、例えば、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にするエレメント(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にするエレメント(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)を含み得る。
【０５３８】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクターはまた選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両方を含み、ウイルスベクターによるトランスフェクトまたは感染が探索される細胞の集団から発現細胞の同定および選択を促進し得る。他の態様において、選択可能マーカーは、別々のＤＮＡ片に担持され、共トランスフェクション方法で使用される。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子両方が、宿主細胞における発現を可能にするための適切な制御配列に隣接させ得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどのような抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０５３９】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞の同定および制御配列の機能性の評価に使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在または発現されず、発現が容易に検出可能な性質、例えば、酵素活性により顕在化するポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適当な時点でアッセイし得る。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技法を使用して製造できるかまたは商業的に入手される。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を伴う構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に結合され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬物を評価するのに使用され得る。
【０５４０】
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの場合、ベクターは、当分野の何れかの方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターを、宿主細胞に物理的、化学的または生物学的手段により導入できる。
【０５４１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子照射、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する好ましい方法はリン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０５４２】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターおよび特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子の挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
【０５４３】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する化学的手段は、高分子複合体のようなコロイド分散システム、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するためのコロイドシステムの例は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズ送達システムを用いるポリヌクレオチドの送達のような、核酸の標的化送達の最先端の他の方法が利用可能である。
【０５４４】
非ウイルス送達システムを利用する場合、送達媒体の例はリポソームである。脂質製剤の使用は、核酸の宿主細胞への導入のために企図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の態様において、核酸は脂質と結合させ得る。脂質と結合した核酸を、リポソームの水性内部に封入し、リポソームの脂質二層内に置き、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と結合する結合分子によりリポソームと結合させ、リポソームに封入させ、リポソームと複合体化させ、脂質含有溶液に分散させ、脂質と混合し、脂質と合わせ、脂質中の懸濁液として含ませ、ミセルに含ませまたはそれと複合体化させまたは他に脂質と結合させ得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液における何らかの特定の構造に制限されない。例えば、それらは、二層構造内に、ミセルとしてまたは“崩壊”構造として存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、おそらく、サイズまたは形が均一ではない凝集を形成する。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素および脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのようなその誘導体を含む、一群の化合物を含む。
【０５４５】
使用に適する脂質は、業者から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)はSigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の保存溶液は、約−２０℃で保存され得る。クロロホルムは、メタノールよりも容易に揮発し得るため、唯一の溶媒として使用される。“リポソーム”は、封入脂質二層または凝集の産生により形成される、多様な単一および多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体を伴う小胞構造と有するとして特徴付けされ得る。多層状リポソームは、水性媒体で分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたとい、自発的に形成される。脂質成分は、密閉構造が形成され、脂質二層の間に水および溶解溶質が封入される前、自己再配列を受ける(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、溶液で正常小胞構造以外の構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造または単に脂質分子の非均一凝集として存在すると考えられる。また企図されるのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。
【０５４６】
宿主細胞に外因性核酸を導入するまたは他に細胞を本発明の阻害剤に曝すのに使用した方法に拘わりなく、組み換えＤＮＡ配列の宿主細胞における存在を確認するために、多様なアッセイが実施され得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)またはここに記載する本発明の範囲内に入る薬物を同定するためのアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在を検出するような“生物化学的”アッセイを含む。
【０５４７】
本発明は、さらにＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを提供する。ある態様において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入され得る。ある態様において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されないベクターである。ある態様において、ベクターは、哺乳動物免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)でＣＡＲ構築物を発現できる。ある態様において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。ある態様において、哺乳動物ＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞である。
【０５４８】
細胞の供給源
増大および遺伝子修飾または他の修飾の前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の供給源を対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が誘発され得る生存生物を含むことを意図する(例えば、哺乳動物)。対象の例は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
【０５４９】
本発明のある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＦｉｃｏｌｌTM分離のような当業者に知られる何れかの多数の技法を使用して、対象から集めた血液一単位から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血からの細胞を、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球および血小板を含む。ある態様において、アフェレーシスにより集めた細胞を洗浄して血漿フラクションを除去し、所望により、細胞を続く処理工程に適切な緩衝液または媒体に加えてよい。ある実施態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の実施態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは二価カチオンを、全てではないにしても大部分欠いてよい。
【０５５０】
カルシウム非存在下の最初の活性化工程は、活性化を増強させ得る。当業者には容易に認識されるとおり、洗浄工程は、製造業者の指示に従い半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような、当業者に知られる方法により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、PlasmaLyte Aまたは緩衝液を伴うまたは伴わない他の食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を直接培養培地に再懸濁し得る。
【０５５１】
本発明の方法は、５％またはそれ未満、例えば２％、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用し、既知培養培地条件および組成物、例えばmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。
【０５５２】
ある態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配または対向流遠心溶出法により、単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。
【０５５３】
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、負の選択技法を使用する、例えば、Ｔ制御細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の特定の亜集団の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御細胞枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０５５４】
ある実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートさせるかまたは基質、例えば、ビーズ上に他の方法で被覆させる。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載する基質にコンジュゲートさせる。
【０５５５】
ある実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、集団から、ＭｉｌｔｅｎｙｉＴＭからのＣＤ２５枯渇試薬を使用して除去する。ある実施態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇試薬の比は１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある実施態様において、例えば、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇について、５億細胞／mlが使用される。さらなる態様において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度が使用される。
【０５５６】
ある実施態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞およびこの間の何れかの整数値を含む。ある実施態様において、得られたＴ制御枯渇細胞の集団は、２×１０９またはそれ以下のＴ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７またはそれ以下のＣＤ２５＋細胞)を有する。
【０５５７】
ある実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、１６２−０管のような、枯渇管セットと共にCliniMACシステムを使用して集団から除去する。ある実施態様において、CliniMACシステムを、例えば、DEPLETION2.1のような、枯渇設定で駆動させる。
【０５５８】
特定の理論に拘束されないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物製造中の対象における免疫細胞の負の制御因子のレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象が再発するリスクを減らす。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法が当分野で知られる。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ２５枯渇およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０５５９】
ある実施態様において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前にＴＲＥＧ細胞の数を減らす(例えば、枯渇させる)ことを含む。例えば、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物製造前に、例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させることを含む。
【０５６０】
ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造用細胞の採取前にＴＲＥＧ細胞を減少させる１以上の治療で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを減らす。ある実施態様において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、途中または後に行ってよい。
【０５６１】
ある実施態様において、対象はＣＡＲ発現細胞産物製造用細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを減らす。ある実施態様において、対象はＣＡＲ発現細胞産物製造用細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを減らす。
【０５６２】
ある実施態様において、除去される細胞の集団は、制御Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもないが、ＣＡＲＴ細胞の増大および／または機能に他に負に影響する細胞、例えば免疫抑制の可能性のある細胞で発現されるＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または他のマーカーを発現する細胞である。ある実施態様において、このような細胞は、制御Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後または他の順序で除去されることが意図される。
【０５６３】
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。負の選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、負に選択された細胞に特有の表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成され得る。一つの方法は、負に選択された細胞に存在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０５６４】
ここに記載する方法は、さらに、集団から、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞を、Ｔ制御、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、これを、細胞の除去に使用できるかまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに結合させ、その混合物を細胞の除去に使用することができる。他の実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は連続的であり、例えば、何れの順序で行ってもよい。
【０５６５】
また提供されるのは、チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上を集団から除去し、それによりＴ制御枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する、方法である。チェックポイント阻害剤の例は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１を含む。ある実施態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントは、同じビーズに結合にでき、これを、細胞の除去に使用できるかまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに結合させ、その混合物を細胞の除去に使用することができる。他の実施態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は連続的であり、例えば、何れの順序で行ってもよい。
【０５６６】
ここに記載する方法は、正の選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞を、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)−コンジュゲートビーズと、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間インキュベーションすることにより、単離できる。ある実施態様において、時間は約３０分である。さらなる実施態様において、時間は３０分〜３６時間またはそれ以上の範囲およびその間のすべての整数値である。さらなる実施態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の実施態様において、時間は１０〜２４時間、例えば、２４時間である。長いインキュベーション時間は、腫瘍組織または免疫無防備状態個体からの腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)の単離におけるような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況におけるＴ細胞の単離に使用し得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率を増加させ得る。それ故に、単純にＴ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合可能な時間を短くまたは長くすることによりおよび／またはビーズ対Ｔ細胞の比を増加または減少させることにより(さらにここに記載)、Ｔ細胞の亜集団が培養開始時または該過程中の他の何れかの時点で優先的に選択される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または他の所望の時点で優先的に選択される。
【０５６７】
ある実施態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するＴ細胞集団が選択され得る。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法により決定され得る。
【０５６８】
正のまたは負の選択による所望の細胞の集団の単離のために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある態様において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が混合される体積を顕著に減少させるのが(例えば、細胞の濃度増加)望ましいことがある。例えば、ある態様において、１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／mlまたは５０億／mlの濃度が使用される。ある態様において、１０億細胞／mlの濃度が使用される。さらにある態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度が使用され得る。
【０５６９】
高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化および細胞増大の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱くしか発現し得ない細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からの、より効率的な捕捉を可能とする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望ましい。例えば、高濃度の細胞を使用して、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的選択を可能とする。
【０５７０】
関連する態様において、細胞の低濃度での使用が望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を相当希釈することにより、粒子と細胞の相互作用は最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量発現する細胞について選択される。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋  Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。ある態様において、使用される細胞の濃度は５×１０６／mlである。他の態様において、使用される濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびこの間の何れかの整数値であり得る。
【０５７１】
他の態様において、細胞を回転子で種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温でインキュベートし得る。
【０５７２】
刺激のためのＴ細胞はまた洗浄工程後凍結させてよい。理論に拘束されないが、凍結および続く解凍工程は、細胞集団における顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結用溶液に懸濁し得る。多くの凍結用溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況で有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳまたは１０％デキストラン 40および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Plasmalyte-A、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン 40および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびPlasmaLyte Aを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を−８０℃まで１°／分の速度で冷却し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存することを含む。他の制御凍結の方法ならびに−２０℃までの急冷または液体窒素中での無制御の凍結方法も使用し得る。
【０５７３】
ある態様において、凍結保存細胞を解凍し、ここに記載するとおり洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に１時間、室温で休息させる。
【０５７４】
本発明においてまた企図されるのは、ここに記載する増大細胞が必要となる時点以前の対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス産物の採取である。従って、増大させるべき細胞の起源を、必要な何れかの時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を、ここに記載するような免疫エフェクター細胞療法により利益を受ける多数の何れかの疾患または状態のための免疫エフェクター細胞療法における後の使用のために単離および凍結し得る。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、全般的に健常な対象から採る。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、全般的に、疾患を発症するリスクにあるものの未発症の健常な対象から採取し、目的の細胞を後の使用のために単離および凍結する。ある態様において、Ｔ細胞は、後の時点で増大、凍結および使用され得る。ある態様において、サンプルは、ここに記載する特定の疾患の診断直後で、あらゆる処置の前に、患者から採取する。さらなる態様において、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および放射線照射のような他の免疫除去剤のような、しかし、これらに限定されない、あらゆる処置モダリティ以前の対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離する。
【０５７５】
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。これに関し、ある種の癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、患者が通常その処置から回復する期間に得られるＴ細胞の品質が、エクスビボで増大する能力について最適であるまたは改善されていることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、移植およびインビボ増大の増強について好ましい状態にあり得る。それ故に、本発明において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞を、この回復期に採取することが企図される。さらに、ある態様において、動員(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員)およびコンディショニングレジメンを、特に治療後の一定の時間枠で、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増大が好ましい対象における状態を作るために使用できる。細胞型の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および他の免疫系の細胞が含まれる。
【０５７６】
ある実施態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けている対象から得る。ある実施態様において、ＣＡＲを発現するために改変する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、対象におけるまたは対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤投与後十分な時間または十分な用量の後に採取する。
【０５７７】
他の実施態様において、ＣＡＲを発現するように改変されているまたは改変される免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処置され得る。
【０５７８】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないまたはＤＧＫ活性が低減または阻害された細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝的手法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを、ＤＧＫ発現の低減または阻止のために投与することにより、産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞を、ここに記載するＤＧＫ阻害剤で処理することにより、産生できる。
【０５７９】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はIkaros欠損である。Ikaros欠損細胞は、Ikaros  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないまたはIkaros活性が低減または阻害された細胞を含み、Ikaros欠損細胞は遺伝的手法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをIkaros発現の低減または阻止のために投与することにより、産生できる。あるいは、Ikaros欠損細胞は、Ikaros阻害剤、例えば、レナリドマイドで処理することにより、産生できる。
【０５８０】
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はＤＧＫ欠損およびIkaros欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびIkarosを発現しないまたはＤＧＫおよびIkaros活性が低減または阻害されている。このようなＤＧＫおよびIkaros欠損細胞は、ここに記載する方法の何れかにより産生され得る。
【０５８１】
ある実施態様において、ＮＫ細胞は、対象から得る。他の実施態様において、ＮＫ細胞はＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。
【０５８２】
同種ＣＡＲ
ここに記載するある実施態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
【０５８３】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面にあらゆる機能的ＴＣＲを発現しないように改変、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように改変またはその表面に産生される機能的ＴＣＲが極めて少ないように改変され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、変異または切断形態のＴＣＲのサブユニットの１以上の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが宿主における有害免疫反応を引き起こさないことを意味する。
【０５８４】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように改変され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように改変され得る。
【０５８５】
ある実施態様において、Ｔ細胞は機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。
【０５８６】
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、何れかの適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用する、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０５８７】
ある実施態様において、同種細胞は、例えばここに記載する何れかの方法により、阻害性分子を発現しないまたは発現が低レベルである細胞であり得る。例えば、細胞は、阻害性分子を発現しないまたは低レベルでしか発現しない、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を低減させ得る細胞である。阻害性分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータを含む。阻害性分子の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化させ得る。ある実施態様において、阻害性核酸、例えば、ここに記載する、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)が使用され得る。
【０５８８】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある実施態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現は、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、阻害され得る。
【０５８９】
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような何れかの慣用の発現系を使用して達成され得る。
【０５９０】
ＴＣＲの成分の発現を下方制御するｓｈＲＮＡの例は、例えば、米国公開２０１２／０３２１６６７号に記載される。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの例は、例えば、米国公開ＵＳ２００７／００３６７７３号に記載される。
【０５９１】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートまたはこのような一連の反復を含むシステムをいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”システムは、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の発現抑制または変異に使用できるＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来するシステムをいう。
【０５９２】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％に見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。このシステムはプラスミドおよびファージのような外来遺伝要素に対する抵抗生を付与し、獲得免疫の一形態を提供するタイプの原核生物免疫系である。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845。
【０５９３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集(特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変化)において使用されるために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8。これは真核生物細胞に特に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
【０５９４】
ＣＲＩＳＰＲ配列は、ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあり、交互反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは通常プラスミドまたはファージ配列のような細菌に対して外来の配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
【０５９５】
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに処理される。これらは、反復配列が横にあるスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外因性遺伝要素をサイレンスするようにガイドする。Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7。スペーサーは、こうして、ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ分子の鋳型として役立つ。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０５９６】
これらが多くの種々のタイプの細菌で天然に存在するため、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置ならびにＣａｓ遺伝子およびその産物の構造、機能および数は種毎に幾分異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663；およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、それはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物をそのＣａｓｃａｄｅが保持されるスペーサー−反復単位に処理する。Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６はＣＲＩＳＰＲ転写物を処理する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２は必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、それは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲシステムは、２活性切断部位を有し、一つは二重螺旋の各鎖のためである、タンパク質Ｃａｓ９に依存する。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせは、遺伝子編集用システムに使用され得る。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０５９７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、それ故に、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子編集(塩基対の付加または欠失)または未成熟終止の導入に使用でき、これは、こうして、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはあるいはＲＮＡ干渉のように使用でき、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を可逆性形式でオフにする。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡはＣａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬＡプロモーターに導き、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断し得る。
【０５９８】
例えば、米国公開２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載の当分野で知られるテクノロジーを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号、８,８６５,４０６号、８,７９５,９６５号、８,７７１,９４５号および８,６９７,３５９号に記載される、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムもまた産生され得る。
【０５９９】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
【０６００】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより、人工的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)を、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の一部を含む何れかの所望のＤＮＡ配列に結合するように、改変し得る。改変ＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む何れかの所望のＤＮＡ配列に特異的な、制限酵素が産生され得る。これらを次いで細胞に導入でき、ここで、これらはゲノム編集のために使用され得る。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6；およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。
【０６０１】
ＴＡＬＥは、キサントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、反復された、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２カ所は高度に可変であり、特異的ヌクレオチド認識との強い相関を示す。これらは、それ故に所望のＤＮＡ配列に結合するよう改変され得る。
【０６０２】
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合させる。ＦｏｋＩへの数変異が、ＴＡＬＥＮにおけるその使用についてなされており、これらは、例えば、開裂特異性または活性を改善する。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
【０６０３】
ＦｏｋＩドメインは、適切な配向および間隔を備えた標的ゲノムにおける部位に対する特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２構築物を必要とする、二量体として機能する。ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数および２つの独立したＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両方が、高レベルの活性の達成に重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8。
【０６０４】
ＨＬＡまたはＴＣＲ  ＴＡＬＥＮは、細胞内で二本鎖切断(ＤＳＢ)産生に使用できる。変異は、修復機構が非相同末端結合により切断を不適切に修復するならば、該切断部位に導入され得る。例えば、不適切な修復はフレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡが、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入され得て、外来ＤＮＡおよび染色体配列の配列によって、この過程がＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における欠損の補正またはこのような欠損のｗｔ  ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子への導入に使用され、こうして、ＨＬＡまたはＴＣＲの発現を低減させ得る。
【０６０５】
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー成分を使用する種々のスキームを含む、当分野で知られる何れかの方法を使用して構築され得る。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509。
【０６０６】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＺＦＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
【０６０７】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
【０６０８】
亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造的モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含んでよく、約３bp配列を認識し得る。既知特異性の種々の亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生し得る。ファージディスプレイ、酵母ワン・ハイブリッドシステム、細菌ワン・ハイブリッドおよびツー・ハイブリッドシステムおよび哺乳動物細胞を含む、種々の選択およびモジュラーアセンブリ技法が、特定の配列を認識する亜鉛フィンガー(およびこれらの組み合わせ)の産生に利用可能である。
【０６０９】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮはＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。それ故に、ＺＦＮの対が、非回文ＤＮＡ部位の標的に必要である。２個の独立したＺＦＮは、適切な空間を空けて、ＤＮＡのそれらのヌクレアーゼと逆の鎖に結合しなければならない。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。
【０６１０】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは不適切に修復されたならばフレームシフト変異を作製できるＤＮＡにおける二本鎖切断を作製でき、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量の減少に至る。ＺＦＮはまたＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子を変異するための相同組み換えに使用できる。
【０６１１】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる何れかの方法を使用して構築され得る。Ｓｅｅ、例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開２０１２／００６０２３０号参照。
【０６１２】
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある実施態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短いテロメアのために、患者において短期残留性であり、従って、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを長くし、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それ故に、ある実施態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、異所性にテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを発現する。ある態様において、本発明は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲがコードする構築物と接触させる前、同時または後に、該核酸と接触させ得る。
【０６１３】
ある態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の集団を製造する方法に関する。ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下、接触させることを含む。
【０６１４】
ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
【０６１５】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、アミノ酸配列GenBank Protein ID AAC51724.1 (Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)を有し、次のとおりである。
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(配列番号６３)
【０６１６】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは配列番号６３の配列を有する。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、最大５、１０、１５、２０または３０アミノ酸の)を含む。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、最大５、１０、１５、２０または３０アミノ酸の)を含む。
【０６１７】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコード化される(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
【表９４】
2018527008.tif 000098
【０６１８】
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコード化される。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６４の配列によりコード化される。
【０６１９】
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および増大
Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許６,３５２,６９４号、６,５３４,０５５号、６,９０５,６８０号、６,６９２,９６４号、５,８５８,３５８号、６,８８７,４６６号、６,９０５,６８１号、７,１４４,５７５号、７,０６７,３１８号、７,１７２,８６９号、７,２３２,５６６号、７,１７５,８４３号、５,８８３,２２３号、６,９０５,８７４号、６,７９７,５１４号、６,８６７,０４１号および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して、一般に活性化および増大され得る。
【０６２０】
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ制御細胞枯渇細胞の集団は、Ｔ細胞の表面の共刺激性分子を刺激する、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルおよびリガンドを刺激する薬物が結合した表面との接触により増大され得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面に固定化させた抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触によるような、ここに記載するとおり、刺激され得る。Ｔ細胞の表面のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が使用され得る。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３を含み、ＸＲ−ＣＤ２８(Diaclone, Besancon, France)を、当分野で一般に知られる他の方法で可能であるのと同様使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【０６２１】
ある態様において、Ｔ細胞のための一次刺激性シグナルおよび共刺激性シグナルは異なるプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬物は溶液でも表面に結合してもよい。表面に結合するとき、薬物は同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別々の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、一方の薬物が表面に結合し、他方の薬物が溶液でよい。ある態様において、共刺激性シグナルを提供する薬物は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬物は溶液であるかまたは表面に結合する。ある態様において、両方の薬物は溶液でよい。ある態様において、薬物は可溶性形態であり、そうして、薬物に結合する、Ｆｃ受容体または抗体または他の結合剤を発現する細胞のような表面に架橋する。これに関し、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増大における使用が企図される、人工抗原提示細胞(ａＡＰＣｓ)について米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号参照。
【０６２２】
ある態様において、２剤は、ビーズに、同じビーズに、すなわち、“ｃｉｓ”でまたは別々のビーズに、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定過される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬物は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激性シグナルを提供する薬物は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両剤は同じビーズに等価分子量で共固定過される。ある態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増大およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体が使用される。本発明のある態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を使用して見られた増大と比較して、Ｔ細胞増大が増加するように使用する。ある特定の態様において、１：１の比を使用して観察される増大と比較して、約１から約３倍の増加が観察される。ある態様において、ビーズに結合するＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００の範囲およびその間の何れかの整数値である。ある態様において、抗ＣＤ２８抗体は、抗ＣＤ３抗体よりも粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。ある態様において、ビーズに結合する抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は２：１より大きい。ある特定の態様において、ビーズに結合する１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある態様において、ビーズに結合する１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。さらなる態様において、ビーズに結合する１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある態様において、ビーズに結合する１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある好ましい態様において、ビーズに結合する１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある態様において、ビーズに結合する１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。さらにある態様において、ビーズに結合する３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。
【０６２３】
１：５００〜５００：１およびその間の何れかの整数値の粒子対細胞の比が、Ｔ細胞または他の標的細胞刺激に使用され得る。当業者には容易に認められ得るとおり、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小型ビーズは数細胞としか結合できないが、大型ビーズは多数と結合できる。ある態様において、細胞対粒子の比は、１：１００〜１００：１の範囲およびその間の何れかの整数値であり、さらなる態様において比は１：９〜９：１およびその間の何れかの整数値を含み、またＴ細胞刺激に使用できる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は上記の通り多様であるが、しかしながらある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は、少なくとも１：１粒子：Ｔ細胞である。ある態様において、１：１以下の粒子対細胞の比が使用される。ある特定の態様において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる態様において、粒子対細胞の比は、刺激の日による。例えば、ある態様において、粒子対細胞の比は、１日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子を、その後、細胞に連日または隔日で１０日まで添加し、最終比１：１〜１：１０となる(添加した日の細胞数に基づく)。ある特定の態様において、粒子対細胞の比は刺激１日目１：１であり、刺激３日目および５日目に１：５に調節する。ある態様において、粒子を、最終比１日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：５に基づき、連日または隔日で添加する。ある態様において、粒子対細胞の比は、刺激１日目２：１であり、刺激３日目および５日目に１：１０に調節する。ある態様において、粒子を、最終比１日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：１０に基づき、連日または隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が、本発明における使用に適することを認識し得る。特に、比は、粒子径ならびに細胞サイズおよびタイプにより変わり得る。ある態様において、使用のための最も典型的な比は、１日目の約１：１、２：１および３：１である。
【０６２４】
さらなる態様において、Ｔ細胞のような細胞を、薬物被覆ビーズと合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。別の態様において、培養前に、薬物被覆ビーズおよび細胞を分離せず、一括して培養する。さらなる態様において、ビーズおよび細胞をまず磁力のような力の適用により濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘発する。
【０６２５】
例として、細胞表面タンパク質をライゲートし、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合する常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)をＴ細胞と接触させ得る。ある態様において、細胞(例えば、１０４〜１０９  Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズを１：１の比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)と合わせる。同様に、当業者は、あらゆる細胞濃度を使用し得ることを容易に理解できる。例えば、標的細胞はサンプル中に極めて稀であり、サンプルの僅か０.０１％を構成することもありまたサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞で構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明の範囲内である。ある態様において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一括して混合される体積を顕著に減少させるのが(例えば、細胞の濃度増加)望ましいことがある。例えば、ある態様において、約１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／ml、５０億／mlまたは２０億細胞／mlの濃度が使用される。ある態様において、１億細胞／mlを超えて使用される。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞の濃度が使用される。さらにある態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化および細胞増大の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱くしか発現し得ない細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からの、より効率的な捕捉を可能とする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望ましい。例えば、高濃度の細胞を使用して、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的選択を可能とする。
【０６２６】
ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲが形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法で増大する。ある実施態様において、細胞は、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間、培養において増大させる。ある実施態様において、細胞は、４〜９日の期間増大される。ある実施態様において、細胞は、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増大される。ある実施態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は５日の培養により増大され、得られた細胞は、同じ培養条件下、９日培養により増大された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより規定され得る。ある実施態様において、５日増大された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下、９日の培養により増大された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある実施態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞は５日の培養により増大され、得られた細胞は、同じ培養条件下、９日の培養により増大された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある実施態様において、５日増大された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下、９日の培養により増大された同じ細胞と比較して炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルのpg／mlの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の増加を示す。
【０６２７】
数イクルの刺激が、Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るために、また望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞の増殖用の何れかの他の添加剤を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５(Lonza))を含む。細胞増殖用の他の添加剤は、界面活性剤、plasmanateならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Optimizerを含み得て、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加されており、無血清であるかまたは適切な量の血清(または血漿)または規定されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および増大に十分な量のサイトカインが添加されている。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にしか含まれず、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖の支持に必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)に維持される。
【０６２８】
ある実施態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日の増大期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす、１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増大される。ある実施態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)存在下、増大される。
【０６２９】
ある実施態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造方法は、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、細胞集団から、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して除去することを含む。細胞集団からＴ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を除去する方法はここに記載され。ある実施態様において、方法、例えば、製造方法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のようなＴ制御細胞が枯渇されている細胞集団または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている細胞集団)と、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を接触させることを含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている)は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７存在下、増大される。
【０６３０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞製造中、例えば、エクスビボで接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞中、例えば、エクスビボで接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５  Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせを含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞中、例えば、エクスビボで接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と、ＣＡＲ発現細胞中、例えば、エクスビボで接触させる。
【０６３１】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と、エクスビボ増大中接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と、エクスビボ増大中接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と、エクスビボ増大中接触させる。ある実施態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
【０６３２】
種々の時間刺激に曝されているＴ細胞は、種々の特性を示し得る。例えば、典型的血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より多いヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有し得る。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体刺激によるＴ細胞のエクスビボ増大は、約８〜９日目前、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生じるが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団のＴＣ細胞の集団は大きく増加する。従って、処置の目的によって、対象に主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入するのは、有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されていたら、このサブセットをかなりの程度増大させるのは有利であり得る。
【０６３３】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが、著しく、しかし大部分、再現性よく細胞増大過程中に変わり得る。それ故に、このような再現性は、特定の目的のために、活性化Ｔ細胞産物を調節する能力を付与する。
【０６３４】
ここに記載するＣＡＲが構築されたら、種々のアッセイを使用して、適切なインビトロおよび動物モデルにおける、抗原刺激後Ｔ細胞を増大する能力、再刺激非存在下Ｔ細胞増大の持続および抗癌活性のような、しかし、これらに限定されない、分子の活性を評価できる。本発明のｃａｒの効果を評価するアッセイを、下にさらに詳細に記載する。
【０６３５】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を使用して、モノマーおよびダイマーの存在を検出できる。例えば、Milone et al., 分子Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の１：１混合物)は、１０日を超えてインビトロで増大され、溶解および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥが続く。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲは、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出される。同じＴ細胞サブセットを、共有二量体形成の評価を可能とするために、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
【０６３６】
抗原刺激後のＣＡＲ＋  Ｔ細胞インビトロ増大は、フローサイトメトリーを使用して測定され得る。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて、分析するプロモーターの制御下、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。プロモーターの例は、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光は、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットにおいて培養６日目に評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで０日目に刺激し、１日目に、２Ａリボソームスキッピング配列を使用してｅＧＦＰと共にＣＡＲを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲで形質導入する。培養は、ここに記載する癌関連抗原＋  Ｋ５６２細胞(ここに記載する癌関連抗原を発現するＫ５６２)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)またはＨＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)存在下、再刺激し、その後洗浄する。外因性ＩＬ−２を、１００IU／mlで、隔日で、培養に添加する。ＧＦＰ＋  Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより計数する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
【０６３７】
再刺激非存在下の持続性ＣＡＲ＋  Ｔ細胞増大もまた測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(fl)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目記載するＣＡＲでの形質導入後、培養８日目に、Coulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
【０６３８】
動物モデルもまたＣＡＲＴ活性測定に使用できる。例えば、免疫不全マウスにおける原発ヒトプレＢ  ＡＬＬを処置するためのここに記載するヒト癌関連抗原特異的ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を使用する異種移植モデルが使用され得る。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に関して無作為化する。異なる数の癌関連抗原特異的ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、１：１比で、Ｂ−ＡＬＬ担持ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスに注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおける癌関連抗原特異的ＣＡＲベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後種々の時点で評価する。動物を、週間隔で白血病について評価する。末梢血のここに記載する癌関連抗原＋  Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を、ここに記載する癌関連抗原−ζ  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を注射されたマウスで測定する。群の生存曲線をログ・ランク検定により比較する。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスにおけるＴ細胞注射４週後の絶対的末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数もまた分析できる。マウスに白血病細胞を注射し、３週後に、ｅＧＦＰに結合したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように改変したＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注射前にモック形質導入細胞と混合することにより、４５〜５０％投入ＧＦＰ＋  Ｔ細胞に正規化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、白血病について１週間間隔で評価する。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞群の生存曲線をログ・ランク検定を使用して比較する。
【０６３９】
用量依存的ＣＡＲ処置応答が評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、末梢血を、２１日目にＣＡＲ  Ｔ細胞もしくは等数のモック形質導入Ｔ細胞注射またはＴ細胞を注射していないマウスにおける白血病確立後、３５〜７０日に得る。各群からのマウスを末梢血のここに記載する癌関連抗原＋  ＡＬＬ芽細胞数決定のために無作為に採血し、３５日目および４９日目に屠殺する。残った動物を５７日目および７０日目に評価する。
【０６４０】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、Ｔ細胞と、ここに記載する癌関連抗原(Ｋ１９)またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)を発現するＫ５６２細胞を最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することにより、マイクロタイタープレートで実施する。Ｋ５６２細胞は、使用前にガンマ−放射線で照射される。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、Ｔ細胞増殖刺激のための陽性対照として働くようにＫＴ３２−ＢＢＬ細胞と共に培養に添加し、なぜなら、これらのシグナルは、エクスビボでの長期ＣＤ８＋  Ｔ細胞増大を支持するからである。Ｔ細胞を、製造業者の記載に従い、CountBrightTM蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養で計数する。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ−２Ａ結合ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで改変されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋  Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ビオチニル化組み換えのここに記載する癌関連抗原タンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートを用いて検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現はまた特異的モノクローナル抗体により同時に検出される(BD Biosciences)。サイトカイン測定を、製造業者の支持に従い、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して、再刺激２４時間後に採取した上清で実施する。蛍光を、FACScaliburフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。
【０６４１】
細胞毒性を、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(Ｋ５６２系統および初代プロＢ−ＡＬＬ細胞)を、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)と３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全なＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに入れる。エフェクターＴ細胞を、標的細胞と、完全なＲＰＭＩのウェル中、エフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)の比を変えながら混合する。媒体のみ(自発的放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００洗剤の１％溶液(総放出、ＴＲ)を含むさらなるウェルもまた調製する。３７℃で４時間インキュベーション後、各ウェルからの上清を採取する。次いで、放出５１Ｃｒを、ガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくともトリプリケートで実施し、溶解パーセンテージを、式：％溶解＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出された平均５１Ｃｒである)を使用して計算する。
【０６４２】
造影技術を使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載される。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後、Ｔ細胞をＣＡＲ構築物とエレクトロポレーション４時間後注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスはバイオルミネセンスについて造影される。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋  Ｔ細胞の単一注射の治療的有効性および特異性を、次のとおり測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するよう形質導入したＮａｌｍ−６ｔｏを注射し、その後７日後に本発明のｃａｒでエレクトロポレーションしたＴ細胞を一回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、各マウスの５日目(処置２日前)および８日目(ＣＡＲ＋  ＰＢＬの２４時間後)のホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
【０６４３】
ここでの実施例セクションに記載のものならびに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、ここに記載するＣＡＲの評価に使用できる。
【０６４４】
治療適用
ある態様において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する疾患を処置する方法を提供する。
【０６４５】
ある態様において、本発明は、ＸＣＡＲ(ここで、Ｘはここに記載する腫瘍抗原を表す)を発現するよう改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に提供することによる、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は該Ｘ腫瘍抗原を発現する。
【０６４６】
ある態様において、本発明は、ここに記載するＸＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に提供することによる、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＸを発現する。ある実施態様において、Ｘは正常細胞および癌細胞の両方で発現されるが、正常細胞では低レベルで発現される。ある実施態様において、方法は、さらに、例えば、ここに記載するアッセイにより決定して、ＸＣＡＲがＸを発現する癌細胞に結合し、殺すが、Ｘを発現する正常細胞の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％またはそれ以下が殺されることを可能にする、親和性でＸに結合するＣＡＲを選択することを含む。例えば、図１３Ａおよび１３Ｂに記載のアッセイまたはＣｒ５１  ＣＴＬに基づくフローサイトメトリーのような死滅アッセイを使用できる。ある実施態様において、選択したＣＡＲは、標的抗原に１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを有する。ある実施態様において、選択した抗原結合ドメインは、対照抗体、例えば、ここに記載する抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍または１,０００倍低い結合親和性を有する。
【０６４７】
ある実施態様において、本発明は、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＬＬ(慢性リンパ性白血病)、ＤＬＢＣＬ(汎発性大Ｂ細胞リンパ腫)、ＭＣＬ(マントル細胞リンパ腫)またはＭＭ(多発性骨髄腫)である。
【０６４８】
ある態様において、本発明は、ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＧＦＲｖIIIを発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。
【０６４９】
ある態様において、本発明は、メソテリン  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はメソテリンを発現する。ある実施態様において、処置する癌は中皮腫、膵臓癌または卵巣癌である。
【０６５０】
ある態様において、本発明は、ＣＤ１２３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１２３を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０６５１】
ある態様において、本発明は、ＣＤ２２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ２２を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０６５２】
ある態様において、本発明は、ＣＳ−１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＳ−１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０６５３】
ある態様において、本発明は、ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＬＬ−１を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０６５４】
ある態様において、本発明は、ＣＤ３３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３３を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０６５５】
ある態様において、本発明は、ＧＤ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＤ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経芽腫である。
【０６５６】
ある態様において、本発明は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢＣＭＡを発現する。ある実施態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０６５７】
ある態様において、本発明は、Ｔｎ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴｎ抗原を発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣癌である。
【０６５８】
ある態様において、本発明は、ＰＳＭＡ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＳＭＡを発現する。ある実施態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０６５９】
ある態様において、本発明は、ＲＯＲ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＯＲ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０６６０】
ある態様において、本発明は、ＦＬＴ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦＬＴ３を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０６６１】
ある態様において、本発明は、ＴＡＧ７２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＡＧ７２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０６６２】
ある態様において、本発明は、ＣＤ３８  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３８を発現する。ある実施態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０６６３】
ある態様において、本発明は、ＣＤ４４ｖ６  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ４４ｖ６を発現する。ある実施態様において、処置する癌は子宮頸癌、ＡＭＬまたはＭＭである。
【０６６４】
ある態様において、本発明は、ＣＥＡ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＥＡを発現する。ある実施態様において、処置する癌は消化器癌または膵臓癌である。
【０６６５】
ある態様において、本発明は、ＥＰＣＡＭ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＰＣＡＭを発現する。ある実施態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０６６６】
ある態様において、本発明は、Ｂ７Ｈ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢ７Ｈ３を発現する。
【０６６７】
ある態様において、本発明は、ＫＩＴ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＫＩＴを発現する。ある実施態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０６６８】
ある態様において、本発明は、ＩＬ−１３Ｒａ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＬ−１３Ｒａ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。
【０６６９】
ある態様において、本発明は、ＰＲＳＳ２１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＲＳＳ２１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣、膵臓、肺および乳癌から選択される。
【０６７０】
ある態様において、本発明は、ＣＤ３０  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３０を発現する。ある実施態様において、処置する癌はリンパ腫または白血病である。
【０６７１】
ある態様において、本発明は、ＧＤ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＤ３を発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０６７２】
ある態様において、本発明は、ＣＤ１７１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１７１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経芽腫、卵巣癌、黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌またはＮＳＣＬＣ(非小細胞性肺癌)である。
【０６７３】
ある態様において、本発明は、ＩＬ−１１Ｒａ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＬ−１１Ｒａを発現する。ある実施態様において、処置する癌は骨肉腫である。
【０６７４】
ある態様において、本発明は、ＰＳＣＡ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＳＣＡを発現する。ある実施態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０６７５】
ある態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＶＥＧＦＲ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０６７６】
ある態様において、本発明は、ルイスＹ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はルイスＹを発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣癌またはＡＭＬである。
【０６７７】
ある態様において、本発明は、ＣＤ２４  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ２４を発現する。ある実施態様において、処置する癌は膵臓癌である。
【０６７８】
ある態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲ−ベータ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＤＧＦＲ−ベータを発現する。ある実施態様において、処置する癌は乳癌、前立腺癌、ＧＩＳＴ(消化器間質腫瘍)、ＣＭＬ、ＤＦＳＰ(隆起性皮膚線維肉腫)または神経膠腫である。
【０６７９】
ある態様において、本発明は、ＳＳＥＡ−４  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＳＳＥＡ−４を発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経膠芽腫、乳癌、肺癌または幹細胞癌である。
【０６８０】
ある態様において、本発明は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ２０を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０６８１】
ある態様において、本発明は、葉酸受容体アルファ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は葉酸受容体アルファを発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣癌、ＮＳＣＬＣ、子宮内膜癌、腎臓癌または他の固形腫瘍である。
【０６８２】
ある態様において、本発明は、ＥＲＢＢ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)を発現する。ある実施態様において、処置する癌は乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌または他の固形腫瘍である。
【０６８３】
ある態様において、本発明は、ＭＵＣ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＵＣ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は乳癌、肺癌または他の固形腫瘍である。
【０６８４】
ある態様において、本発明は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＧＦＲを発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経膠芽腫、ＳＣＬＣ(小細胞肺癌)、ＳＣＣＨＮ(頭頸部扁平上皮細胞癌)、ＮＳＣＬＣまたは他の固形腫瘍である。
【０６８５】
ある態様において、本発明は、ＮＣＡＭ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＣＡＭを発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経芽腫または他の固形腫瘍である。
【０６８６】
ある態様において、本発明は、ＣＡＩＸ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＡＩＸを発現する。ある実施態様において、処置する癌は腎臓癌、ＣＲＣ、子宮頸癌または他の固形腫瘍である。
【０６８７】
ある態様において、本発明は、ＥｐｈＡ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥｐｈＡ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＧＢＭである。
【０６８８】
ある態様において、本発明は、ＧＤ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＤ３を発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０６８９】
ある態様において、本発明は、フコシルＧＭ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はフコシルＧＭを発現する。
【０６９０】
ある態様において、本発明は、ｓＬｅ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｓＬｅを発現する。ある実施態様において、処置する癌はＮＳＣＬＣまたはＡＭＬである。
【０６９１】
ある態様において、本発明は、ＧＭ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＭ３を発現する。
【０６９２】
ある態様において、本発明は、ＴＧＳ５  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＧＳ５を発現する。
【０６９３】
ある態様において、本発明は、ＨＭＷＭＡＡ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＨＭＷＭＡＡを発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫、神経膠芽腫または乳癌である。
【０６９４】
ある態様において、本発明は、ｏ−アセチル−ＧＤ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｏ−アセチル−ＧＤ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経芽腫または黒色腫である。
【０６９５】
ある態様において、本発明は、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある実施態様において、処置する癌は葉酸受容体ベータＡＭＬ、骨髄腫である。
【０６９６】
ある態様において、本発明は、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＥＭ１／ＣＤ２４８を発現する。ある実施態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０６９７】
ある態様において、本発明は、ＴＥＭ７Ｒ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＥＭ７Ｒを発現する。ある実施態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０６９８】
ある態様において、本発明は、ＣＬＤＮ６  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＬＤＮ６を発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣癌、肺癌または乳癌である。
【０６９９】
ある態様において、本発明は、ＴＳＨＲ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＳＨＲを発現する。ある実施態様において、処置する癌は甲状腺癌または多発性骨髄腫である。
【０７００】
ある態様において、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＰＲＣ５Ｄを発現する。ある実施態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７０１】
ある態様において、本発明は、ＣＸＯＲＦ６１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＸＯＲＦ６１を発現する。
【０７０２】
ある態様において、本発明は、ＣＤ９７  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ９７を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍、胃癌、膵臓癌、食道癌、神経膠芽腫、乳癌または結腸直腸癌である。
【０７０３】
ある態様において、本発明は、ＣＤ１７９ａ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１７９ａを発現する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７０４】
ある態様において、本発明は、ＡＬＫ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＡＬＫを発現する。ある実施態様において、処置する癌はＮＳＣＬＣ、ＡＬＣＬ(未分化大細胞リンパ腫)、ＩＭＴ(炎症性筋線維芽細胞性腫瘍)または神経芽腫である。
【０７０５】
ある態様において、本発明は、ポリシアル酸  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はポリシアル酸を発現する。ある実施態様において、処置する癌は小細胞肺癌である。
【０７０６】
ある態様において、本発明は、ＰＬＡＣ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＬＡＣ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＨＣＣ(肝細胞癌)である。
【０７０７】
ある態様において、本発明は、ＧｌｏｂｏＨ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧｌｏｂｏＨを発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、乳癌または膵臓癌である。
【０７０８】
ある態様において、本発明は、ＮＹ−ＢＲ−１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＹ−ＢＲ−１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は乳癌である。
【０７０９】
ある態様において、本発明は、ＵＰＫ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＵＰＫ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は膀胱癌である。
【０７１０】
ある態様において、本発明は、ＨＡＶＣＲ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＨＡＶＣＲ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は腎臓癌である。
【０７１１】
ある態様において、本発明は、ＡＤＲＢ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＡＤＲＢ３を発現する。ある実施態様において、処置する癌はユーイング肉腫である。
【０７１２】
ある態様において、本発明は、ＰＡＮＸ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＮＸ３を発現する。ある実施態様において、処置する癌は骨肉腫である。
【０７１３】
ある態様において、本発明は、ＧＰＲ２０  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＰＲ２０を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＧＩＳＴである。
【０７１４】
ある態様において、本発明は、ＬＹ６Ｋ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＹ６Ｋを発現する。ある実施態様において、処置する癌は乳癌、肺癌、卵巣癌または子宮頸癌である。
【０７１５】
ある態様において、本発明は、ＯＲ５１Ｅ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＯＲ５１Ｅ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７１６】
ある態様において、本発明は、ＴＡＲＰ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＡＲＰを発現する。ある実施態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７１７】
ある態様において、本発明は、ＷＴ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＷＴ１を発現する。
【０７１８】
ある態様において、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する。
【０７１９】
ある態様において、本発明は、ＬＡＧＥ−１ａ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＡＧＥ−１ａを発現する。
【０７２０】
ある態様において、本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＧＥ−Ａ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７２１】
ある態様において、本発明は、ＭＡＧＥＡ１ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＧＥＡ１を発現する。
【０７２２】
ある態様において、本発明は、ＥＴＶ６−ＡＭＬ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＴＶ６−ＡＭＬを発現する。
【０７２３】
ある態様において、本発明は、精子タンパク質１７  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は精子タンパク質１７を発現する。ある実施態様において、処置する癌は卵巣癌、ＨＣＣまたはＮＳＣＬＣである。
【０７２４】
ある態様において、本発明は、ＸＡＧＥ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＸＡＧＥ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌はユーイングまたはラブドイド癌である。
【０７２５】
ある態様において、本発明は、Ｔｉｅ  ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴｉｅ  ２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０７２６】
ある態様において、本発明は、ＭＡＤ−ＣＴ−１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＤ−ＣＴ−１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は前立腺癌または黒色腫である。
【０７２７】
ある態様において、本発明は、ＭＡＤ−ＣＴ−２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＤ−ＣＴ−２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は前立腺癌、黒色腫である。
【０７２８】
ある態様において、本発明は、Ｆｏｓ関連抗原１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦｏｓ関連抗原１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は神経膠腫、扁平上皮細胞癌または膵臓癌である。
【０７２９】
ある態様において、本発明は、ｐ５３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｐ５３を発現する。
【０７３０】
ある態様において、本発明は、プロステイン  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はプロステインを発現する。
【０７３１】
ある態様において、本発明は、サバイビンおよびテロメラーゼ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はサバイビンおよびテロメラーゼを発現する。
【０７３２】
ある態様において、本発明は、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＣＴＡ−１／ガレクチン８を発現する。
【０７３３】
ある態様において、本発明は、メランＡ／ＭＡＲＴ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はメランＡ／ＭＡＲＴ１を発現する。
【０７３４】
ある態様において、本発明は、Ｒａｓ変異体  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲａｓ変異体を発現する。
【０７３５】
ある態様において、本発明は、ｐ５３変異体  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｐ５３変異体を発現する。
【０７３６】
ある態様において、本発明は、ｈＴＥＲＴ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｈＴＥＲＴを発現する。
【０７３７】
ある態様において、本発明は、肉腫転座切断点  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は肉腫転座切断点を発現する。ある実施態様において、処置する癌は肉腫である。
【０７３８】
ある態様において、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＬ−ＩＡＰを発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７３９】
ある態様において、本発明は、ＥＲＧ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)を発現する。
【０７４０】
ある態様において、本発明は、ＮＡ１７  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＡ１７を発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７４１】
ある態様において、本発明は、ＰＡＸ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＸ３を発現する。ある実施態様において、処置する癌は肺胞横紋筋肉腫である。
【０７４２】
ある態様において、本発明は、アンドロゲン受容体  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はアンドロゲン受容体を発現する。ある実施態様において、処置する癌は転移前立腺癌である。
【０７４３】
ある態様において、本発明は、サイクリンＢ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はサイクリンＢ１を発現する。
【０７４４】
ある態様において、本発明は、ＭＹＣＮＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＹＣＮを発現する。
【０７４５】
ある態様において、本発明は、ＲｈｏＣ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲｈｏＣを発現する。
【０７４６】
ある態様において、本発明は、ＴＲＰ−２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＲＰ−２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７４７】
ある態様において、本発明は、ＣＹＰ１Ｂ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＹＰ１Ｂ１を発現する。ある実施態様において、処置する癌は乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、皮膚癌、リンパ節癌、脳癌または精巣癌である。
【０７４８】
ある態様において、本発明は、ＢＯＲＩＳ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢＯＲＩＳを発現する。ある実施態様において、処置する癌は肺癌である。
【０７４９】
ある態様において、本発明は、ＳＡＲＴ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＳＡＲＴ３を発現する。
【０７５０】
ある態様において、本発明は、ＰＡＸ５  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＸ５を発現する。
【０７５１】
ある態様において、本発明は、ＯＹ−ＴＥＳ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＯＹ−ＴＥＳ１を発現する。
【０７５２】
ある態様において、本発明は、ＬＣＫ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＣＫを発現する。
【０７５３】
ある態様において、本発明は、ＡＫＡＰ−４  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＡＫＡＰ−４を発現する。
【０７５４】
ある態様において、本発明は、ＳＳＸ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＳＳＸ２を発現する。
【０７５５】
ある態様において、本発明は、ＲＡＧＥ−１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＡＧＥ−１を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＲＣＣ(腎細胞癌)または他の固形腫瘍である。
【０７５６】
ある態様において、本発明は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はヒトテロメラーゼ逆転写酵素を発現する。ある実施態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０７５７】
ある態様において、本発明は、ＲＵ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＵ１を発現する。
【０７５８】
ある態様において、本発明は、ＲＵ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＵ２を発現する。
【０７５９】
ある態様において、本発明は、腸カルボキシルエステラーゼ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は腸カルボキシルエステラーゼを発現する。ある実施態様において、処置する癌は甲状腺癌、ＲＣＣ、ＣＲＣ(結腸直腸癌)、乳癌または他の固形腫瘍である。
【０７６０】
ある態様において、本発明は、プロスターゼ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はプロスターゼを発現する。
【０７６１】
ある態様において、本発明は、ＰＡＰ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＰを発現する。
【０７６２】
ある態様において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する。
【０７６３】
ある態様において、本発明は、ｇｐ１００  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｇｐ１００を発現する。
【０７６４】
ある態様において、本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｂｃｒ−ａｂｌを発現する。
【０７６５】
ある態様において、本発明は、チロシナーゼ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はチロシナーゼを発現する。
【０７６６】
ある態様において、本発明は、フコシルＧＭ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はフコシルＧＭ１を発現する。
【０７６７】
ある態様において、本発明は、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２を発現する。ある実施態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７６８】
ある態様において、本発明は、ＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ７９ａを発現する。
【０７６９】
ある態様において、本発明は、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ７９ｂを発現する。
【０７７０】
ある態様において、本発明は、ＣＤ７２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ７２を発現する。
【０７７１】
ある態様において、本発明は、ＬＡＩＲ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＡＩＲ１を発現する。
【０７７２】
ある態様において、本発明は、ＦＣＡＲ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦＣＡＲを発現する。
【０７７３】
ある態様において、本発明は、ＬＩＬＲＡ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＩＬＲＡ２を発現する。
【０７７４】
ある態様において、本発明は、ＣＤ３００ＬＦ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３００ＬＦを発現する。
【０７７５】
ある態様において、本発明は、ＣＬＥＣ１２Ａ  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＬＥＣ１２Ａを発現する。
【０７７６】
ある態様において、本発明は、ＢＳＴ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢＳＴ２を発現する。
【０７７７】
ある態様において、本発明は、ＥＭＲ２  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＭＲ２を発現する。
【０７７８】
ある態様において、本発明は、ＬＹ７５  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＹ７５を発現する。
【０７７９】
ある態様において、本発明は、ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＰＣ３を発現する。
【０７８０】
ある態様において、本発明は、ＦＣＲＬ５  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦＣＲＬ５を発現する。
【０７８１】
ある態様において、本発明は、ＩＧＬＬ１  ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＧＬＬ１を発現する。 
【０７８２】
ある態様において、本発明は、癌性腫瘍増殖が阻害されるように、ＰＤ１  ＣＡＲを使用する、対象のインビボでの処置に関する。ＰＤ１  ＣＡＲを、癌性腫瘍増殖阻害に単独で使用し得る。あるいは、ＰＤ１  ＣＡＲを、他のＣＡＲ、免疫原性剤、標準的癌処置または他の抗体と共に使用し得る。ある実施態様において、対象をＰＤ１  ＣＡＲおよびここに記載するＸＣＡＲで処置する。ある実施態様において、ＰＤ１  ＣＡＲを他のＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲおよびキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と共に使用する。
【０７８３】
他の態様において、対象における、過増殖性状態または障害(例えば、癌)、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移病変を、例えば、低減または改善する、対象を処置する方法が提供される。ここで使用する用語“癌”は、病理組織学的タイプまたは侵襲性ステージと無関係に、全タイプの癌性増殖または発癌性過程、転移組織または悪性形質転換細胞、組織または臓器を包含することを意図する。固形腫瘍の例は、肝臓、肺、乳房、リンパ系、消化器(例えば、結腸)、泌尿生殖管(例えば、腎臓、尿路上皮細胞)、前立腺および咽頭に影響するもののような、種々の臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌および癌を含む。腺癌は、大部分の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌のような悪性腫瘍を含む。ある実施態様において、癌は、黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前記癌の転移病変も、本発明の方法および組成物を使用して処置または予防できる。処置され得る他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓もしくは輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌および該癌の組み合わせを含む。転移癌、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移癌(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17：133-144)の処置は、ここに記載する抗体分子を使用して、実施され得る。
【０７８４】
増殖が阻害され得る癌の例は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫)、腎臓癌(例えば明細胞癌)、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、乳癌、結腸癌および肺癌(例えば非小細胞性肺癌)を含む。さらに、難治性または再発性悪性腫瘍がここに記載する分子を使用して処置され得る。
【０７８５】
ある態様において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)における発現のためのプロモーターに操作可能に連結したＣＡＲを含むベクターに関する。ある態様において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原を発現する癌の処置に使用する、本発明のＣＡＲを発現する組み換え免疫エフェクター細胞を提供する。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞が癌細胞を標的とし、癌の増殖が阻害されるように、腫瘍細胞と、その表面に発現されている少なくとも一つの癌関連抗原を接触させることができる。
【０７８６】
ある態様において、本発明は、ＣＡＲＴが抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とするように癌細胞と本発明のＣＡＲ発現細胞を接触させることを含み、ここで、腫瘍の増殖が阻害される、癌の増殖を阻害する方法に関する。
【０７８７】
ある態様において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。方法は、対象に、癌が対象において処置されるように、本発明のＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。ある態様において、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する癌は血液癌である。ある態様において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある態様において、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する癌は、例えば、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病を、例えば含むが、これらに限定されない癌および悪性腫瘍を含む。ここに記載する癌関連抗原の発現と関連するさらなる癌または造血状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)によりまとめら得る血液状態の雑多なコレクションである“前白血病”などを含む。さらにここに記載する癌関連抗原発現と関連する疾患は、例えば、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含む。
【０７８８】
ある実施態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞で処置され得る癌は多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄における形質細胞クローンの蓄積により特徴付けされる、血液の癌である。多発性骨髄腫の現在の治療は、サリドマイドアナログであるレナリドマイドでの処置を含むが、これに限定されない。レナリドマイドは、抗腫瘍活性、血管形成阻害および免疫調節を含む、活性を有する。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーによりここに記載する癌関連抗原発現については陰性であると考えられる。それ故に、ある実施態様において、例えば、ここに記載する、ＣＤ１９  ＣＡＲを、骨髄腫細胞を標的とするのに使用し得る。ある実施態様において、本発明治療のｃａｒを、１以上のさらなる治療、例えば、レナリドマイド処置と組み合わせで使用できる。
【０７８９】
本発明は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝的に修飾され、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、一種の細胞治療を含む。注入細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺すことができる。抗体治療と異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)はインビボで複製でき、持続性腫瘍制御に至る長期残留性をもたらし得る。種々の態様において、患者に投与した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)またはその子孫は、患者にＴ細胞またはＮＫ細胞投与後、患者で少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年持続する。
【０７９０】
本発明はまた免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)が、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロ転写ＲＮＡにより修飾され、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、一種の細胞治療に関する。注入細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺すことができる。それ故に、種々の態様において、患者に投与した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、患者にＴ細胞またはＮＫ細胞投与後、１ヶ月未満、例えば、３週、２週、１週持続する。
【０７９１】
何らかの特定の理論に拘束されないが、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動または受動免疫応答であってよくまたはあるいは直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。ある態様において、ＣＡＲ形質導入免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ここに記載する癌関連抗原を発現するヒト癌細胞に応答して特異的炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解活性を示し、ここに記載する癌関連抗原阻害を可溶性抵抗性とし、バイスタンダー死滅に介在しおよび確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、ここに記載する癌関連抗原発現腫瘍の不均一場内の低抗原腫瘍細胞は、隣接抗原陽性癌細胞に対して先に反応している、ここに記載する癌関連抗原再指示免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)による間接的破壊に感受性であり得る。
【０７９２】
ある態様において、本発明の完全ヒトＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のための一種のワクチンであり得る。ある態様において、哺乳動物はヒトである。
【０７９３】
エクスビボ免疫化に関して、哺乳動物への細胞の投与前に、インビトロで次の少なくとも一つが行われる。ｉ)細胞の増大、ii)ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入またはiii)細胞の凍結保存。
【０７９４】
エクスビボ方法は当分野で周知であり、下により詳細に記載する。簡潔には、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示するＣＡＲを発現するベクターで遺伝的に修飾する(すなわち、インビトロでの形質導入またはトランスフェクト)。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに、治療的利益を提供するために投与できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細胞はレシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
【０７９５】
造血幹および前駆細胞のエクスビボ増大の方法は、引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に開示され、本発明の細胞に適用可能である。他の適当な方法は当分野で知られ、それ故に本発明は、細胞のエクスビボ増大の何らかの特定の方法に限定されない。簡潔には、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)のエクスビボ培養および増大は、(１)末梢血採取または骨髄外植片から哺乳動物からのＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を採取し、そして(２)このような細胞をエクスビボで増大することを含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を、細胞の培養および増大に使用できる。
【０７９６】
エクスビボ免疫化の条件での細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた患者における抗原に対する免疫応答を誘発するインビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
【０７９７】
一般に、ここに記載の活性化および増大された細胞は、免疫無防備状態である個体で生じる疾患の処置および予防に使用し得る。特に、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する疾患、障害および状態の処置に使用する。ある態様において、本発明の細胞は、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用される。それ故に、本発明は、処置を必要とする対象に治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を投与することを含む、ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
【０７９８】
ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞を、癌または悪性腫瘍のような増殖性疾患または骨髄異形成、骨髄異形成症候群または前白血病のような前癌状態の処置に使用できる。さらにここに記載する癌関連抗原発現と関連する疾患は、例えば、ここに記載する癌関連抗原を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載する癌関連抗原の発現と関連する非癌関連兆候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。
【０７９９】
本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を単独でまたは医薬組成物として、希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて投与してよい。
【０８００】
血液癌
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病、リンパ腫および悪性リンパ増殖性状態のようなタイプの癌である。
【０８０１】
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類され得る。急性白血病は、さらに急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)として分類され得る。慢性白血病ｉは慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連状態は、骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)およびＡＭＬへの癌化によりまとめられる血液状態の雑多なコレクションである骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、以前は“前白血病”として知られる)を含む。
【０８０２】
リンパ腫は、リンパ球から進展する血液細胞腫瘍群である。リンパ腫の例は、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
【０８０３】
本発明は、癌を処置するための組成物および方法を提供する。ある態様において、癌は、白血病またはリンパ腫である血液癌を含むが、これに限定されない血液癌である。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞を、例えば、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない急性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および骨髄血液細胞の不正産生(または異形成)によって包括される血液状態の多様な集団である“前白血病”などを含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または造血状態を、例えば、含むが、これらに限定されない癌および悪性腫瘍の処置に使用され得る。さらにここに記載する癌関連抗原発現と関連する疾患は、例えば、ここに記載する癌関連抗原を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０８０４】
本発明はまたここに記載する癌関連抗原発現細胞を含む細胞の集団と、ここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む、ここに記載する癌関連抗原発現細胞集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を提供する。具体的態様において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原発現癌細胞集団と、ここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む、ここに記載する癌関連抗原を発現する癌細胞集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を提供する。ある態様において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原発現癌細胞集団と、ここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む、ここに記載する癌関連抗原を発現する癌細胞集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を提供する。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、細胞および／または癌細胞の含量、数、量またはパーセンテージを、陰性対照に対して、骨髄白血病またはここに記載する癌関連抗原発現細胞と関連する他の癌を有する対象または動物モデルにおいて、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある態様において、対象はヒトである。
【０８０５】
本発明はまた、ここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合する本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関連する疾患(例えば、ここに記載する癌関連抗原を発現する血液癌または非定型癌)を予防、処置および／または管理する方法を提供する。ある態様において、対象はヒトである。ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関連する障害の非限定的例は、自己免疫性障害(例えば狼瘡)、炎症性障害(例えばアレルギーおよび喘息)および癌(例えばここに記載する癌関連抗原を発現する血液癌または非定型癌)を含む。
【０８０６】
本発明はまた、ここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合する本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関連する疾患を予防、処置および／または管理する方法を提供する。ある態様において、対象はヒトである。
【０８０７】
本発明は、ここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合する本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関連する癌の再発を予防する方法を提供する。ある態様において、方法は、有効量のここに記載する癌関連抗原発現細胞に結合するここに記載するＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、有効量の他の治療と組み合わせて、処置を必要とする対象に投与することを含む。
【０８０８】
組み合わせ治療
ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、他の既知薬物および治療と組み合わせて使用し得る。ここで使用する“組み合わせて”投与は、２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害を有している過程で対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置は、対象が障害を有すると診断された後、かつ障害が治癒もしくは消失する前または処置が他の理由で中止される前に送達される。ある実施態様において、ある処置の送達は、二番目の送達開始後も行われ、従って、投与期間の重複がある。これは、ここでは、“同時”または“一括送達”と称されることもある。他の実施態様において、ある処置の送達は、他の処置の送達が開始する前に終わる。何れかの場合のある実施態様において、処置は、組み合わせ投与のために、より有効である。例えば、第二処置は、第二処置が第一処置の不存在下で投与されたときに見られるよりも、より有効であり、例えば、同等な効果が少ない第二処置で見られまたは第二処置は症状を大きな程度低減しまたは同様な状況が第一処置で見られる。ある実施態様において、送達は、障害と関連する症状または他のパラメータの減少が、他方が存在しないときの一方の処置の送達により見られるより大きいようなものである。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、第一処置送達の効果が、第二処置送達時なお検出可能である場合いもあり得る。
【０８０９】
ここに記載するＣＡＲ発現細胞および少なくとも一つのさらなる治療剤は、同時に、同じまたは別々の組成物でまたは逐次的に投与され得る。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与し、さらなる薬物を次に投与してよく、または投与の順序は逆で良い。
【０８１０】
ＣＡＲ治療および／または他の治療剤、方法またはモダリティを、障害の活動期または疾患の寛解期もしくはあまり活動性でない期に投与し得る。ＣＡＲ治療を、他の処置前に、処置と同時に、処置後にまたは障害の寛解中に投与し得る。
【０８１１】
組泡で投与するとき、ＣＡＲ治療およびさらなる薬物(例えば、第二または第三剤)または全てを、各薬物を個々に、例えば、単剤療法として使用する量または用量より高い、低いまたは同じ量または用量で投与し得る。ある実施態様において、ＣＡＲ治療、さらなる薬物(例えば、第二または第三剤)または全ての投与される量または用量は、各薬物を個々に、例えば、単剤療法として使用する量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の実施態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)をもたらすＣＡＲ治療、さらなる薬物(例えば、第二または第三剤)または全ての量または用量は、同じ治療効果を達成するために、必要な各薬物を個々に、例えば、単剤療法として使用する量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。
【０８１２】
さらなる態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療、cytoxin、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射のような他の免疫除去因子、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のようなペプチドワクチンと組み合わせで処置レジメンにおいて使用し得る。
【０８１３】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を化学療法剤と組み合わせて使用できる。化学療法剤の例は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドのような免疫調節剤またはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)を含む。
【０８１４】
組み合わせ治療について考慮される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Blenoxane(登録商標))、ブスルファン(ミレラン(登録商標))、ブスルファン注射(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、シスプラチン(Platinol(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはNeosar(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(DepoCyt(登録商標))、ダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Cosmegan)、塩酸ダウノルビシン(Cerubidine(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(DaunoXome(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Rubex(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Adrucil(登録商標)、Efudex(登録商標))、フルタミド(Eulexin(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(IFEX(登録商標))、イリノテカン(Camptosar(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(エルスパー(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Folex(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、phoenix(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロサン２０(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Vumon(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Tirazone(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Velban(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０８１５】
アルキル化剤の例は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン)：ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Chlorethaminacil(登録商標)、Demethyldopan(登録商標)、Desmethyldopan(登録商標)、Haemanthamine(登録商標)、Nordopan(登録商標)、ウラシル窒素マスタード(登録商標)、Uracillost(登録商標)、Uracilmostaza(登録商標)、Uramustin(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Mustargen(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、Clafen(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、プロシトックス(登録商標)、RevimmuneＴＭ)、イホスファミド(Mitoxana(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、ピポブロマン(アメデル(登録商標)、ベルシト(登録商標))、トリエチレンメラミン(Hemel(登録商標)、Hexalen(登録商標)、ヘキサスタット(登録商標))、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(Thioplex(登録商標))、ブスルファン(Busilvex(登録商標)、ミレラン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、ロムスチン(CeeNU(登録商標))、ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))およびダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))を含むが、これらに限定されない。さらなるアルキル化剤の例は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))、テモゾロミド(Temodar(登録商標)およびテモダール(登録商標))、ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン(登録商標))、メルファラン(別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標))、アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Hexalen(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、ベンダムスチン(Treanda(登録商標))、ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびミレラン(登録商標))、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、ロムスチン(別名CCNU、CeeNU(登録商標))、シスプラチン(別名ＣＤＤＰ、Platinol(登録商標)およびPlatinol(登録商標)−ＡＱ)、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびNeosar(登録商標))、ダカルバジン(別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、DTIC-Dome(登録商標))、アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Hexalen(登録商標))、イホスファミド(IFEX(登録商標))、プレドニマスチン、プロカルバジン(Matulane(登録商標))、メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Mustargen(登録商標))、ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))、チオテパ(別名チオホスホアミド、TESPAおよびTSPA、Thioplex(登録商標))、シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、プロシトックス(登録商標)、Revimmune(登録商標))およびベンダムスチンＨＣｌ(Treanda(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
【０８１６】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(ＦＣＲ)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７(ｄｅｌ(１７ｐ)、例えば、白血病細胞中の)の短アームにおける欠失を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含む。他の実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含まない。ある実施態様において、フルダラビンは、約１０〜５０mg／ｍ２(例えば、約１０〜１５、１５〜２０mg／ｍ２、２０〜２５mg／ｍ２、２５〜３０mg／ｍ２、３０〜３５mg／ｍ２、３５〜４０mg／ｍ２、４０〜４５mg／ｍ２または４５〜５０mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。ある実施態様において、シクロホスファミドは、約２００〜３００mg／ｍ２(例えば、約２００〜２２５、２２５〜２５０、２５０〜２７５または２７５〜３００mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。ある実施態様において、リツキシマブは、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ２、４５０〜５００mg／ｍ２、５００〜５５０mg／ｍ２または５５０〜６００mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。
【０８１７】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７(ｄｅｌ(１７ｐ)、例えば、白血病細胞中の)の短アームにおける欠失を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含む。他の実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含まない。ある実施態様において、ベンダムスチンは、約７０〜１１０mg／ｍ２(例えば、７０〜８０mg／ｍ２、８０〜９０mg／ｍ２、９０〜１００mg／ｍ２または１００〜１１０mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。ある実施態様において、リツキシマブは、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ２、４５０〜５００mg／ｍ２、５００〜５５０mg／ｍ２または５５０〜６００mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。
【０８１８】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび／またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(Ｒ−ＣＨＯＰ)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象は汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。ある実施態様において、対象は、大腫瘤がない限局期ＤＬＢＣＬ(例えば、７cm未満のサイズ／直径の腫瘍を含む)を有する。ある実施態様において、対象は、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせた放射線で処置される。例えば、対象にＲ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)、続いて放射線を投与する。ある場合、対象に、放射線後Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)を投与する。
【０８１９】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に用量調節ＥＰＯＣＨ−Ｒ(ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＢ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃ再構成高悪性度Ｂ細胞リンパ腫を有する。
【０８２０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて投与する。レナリドマイド((ＲＳ)−３−(４−アミノ−１−オキソ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル)ピペリジン−２,６−ジオン)は免疫調節剤である。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象は濾胞性リンパ腫(ＦＬ)またはマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する。ある実施態様において、対象はＦＬを有し、先に癌治療で処置されていない。ある実施態様において、レナリドマイドは、約１０〜２０mg(例えば、１０〜１５または１５〜２０mg)の用量を、例えば、連日、投与する。ある実施態様において、リツキシマブは、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。
【０８２１】
ｍＴＯＲ阻害剤例は、例えば、テムシロリムス、リダフォロリムス(以前はデフォロリムスとしても知られた、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３号に記載)、エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)、ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))、セマピモド(ＣＡＳ  １６４３０１−５１−３)、エムシロリムス、(５−{２，４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ  １０１３１０１−３６−４)およびＮ２−[１，４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、内部塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ  ９３６４８７−６７−１)(配列番号１２６２)およびＸＬ７６５を含む。
【０８２２】
免疫調節剤例は、例えば、アフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Neulasta(登録商標))、レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブラミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、アクチミド(ＣＣ４０４７)およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ  ９５１２０９−７１−５、IRX Therapeuticsから入手可能)を含む。
【０８２３】
アントラサイクリン例は、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびRubex(登録商標))、ブレオマイシン(lenoxane(登録商標))、ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Cerubidine(登録商標))、ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、DaunoXome(登録商標))、ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))、エピルビシン(EllenceTM)、イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))、マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ラビドマイシンおよびデスアセチルラビドマイシンを含む。
【０８２４】
ビンカアルカロイド例は、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Eldisine(登録商標)))、ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンコブラスチンおよびＶＬＢ、Alkaban-AQ(登録商標)およびVelban(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０８２５】
プロテオソーム阻害剤例は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))、カルフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)、マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)、クエン酸イキサゾミブ(ＭＬＮ−９７０８)、デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。
【０８２６】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体およびモノメチルオーリスタチンＥの抗体−薬物コンジュゲートである。ある実施態様において、対象はホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発または難治性ＨＬを有する。ある実施態様において、対象はＣＤ３０＋  ＨＬを有する。ある実施態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある実施態様において、対象は、ＡＳＣＴを受けていない。ある実施態様において、ブレンツキシマブは、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５、１.５〜２、２〜２.５または２.５〜３mg／kg)の用量を、例えば、静脈内に、例えば、３週毎に投与される。
【０８２７】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にブレンツキシマブおよびダカルバジンまたはブレンツキシマブおよびベンダムスチンとの組み合わせと組み合わせて投与する。ダカルバジンは、化学名５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミドのアルキル化剤である。ベンダムスチンは、化学名４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸のアルキル化剤である。ある実施態様において、対象はホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある実施態様において、対象は先に癌治療で処置されていない。ある実施態様において、対象は少なくとも６０歳、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳またはそれ以上である。ある実施態様において、ダカルバジンは、約３００〜４５０mg／ｍ２(例えば、約３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２または４２５〜４５０mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。ある実施態様において、ベンダムスチンは、約７５〜１２５mg／ｍ２(例えば、７５〜１００mg／ｍ２または１００〜１２５mg／ｍ２、例えば、約９０mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。ある実施態様において、ブレンツキシマブは、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５、１.５〜２、２〜２.５または２.５〜３mg／kg)の用量を、例えば、静脈内に、例えば、３週毎に投与される。
【０８２８】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単または二特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。抗ＣＤ２０抗体例は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010)：135-43参照。
【０８２９】
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfに記載のとおり、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０８３０】
ある実施態様において、リツキシマブは、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与される。例えば、各点滴は、約５００〜２０００mg(例えば、約５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１１００mg、１１００〜１２００mg、１２００〜１３００mg、１３００〜１４００mg、１４００〜１５００mg、１５００〜１６００mg、１６００〜１７００mg、１７００〜１８００mg、１８００〜１９００mgまたは１９００〜２０００mg)のリツキシマブを提供する。ある実施態様において、リツキシマブを、１５０mg／ｍ２〜７５０mg／ｍ２、例えば、約１５０〜１７５mg／ｍ２、１７５〜２００mg／ｍ２、２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜３００mg／ｍ２、３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２、４７５〜５００mg／ｍ２、５００〜５２５mg／ｍ２、５２５〜５５０mg／ｍ２、５５０〜５７５mg／ｍ２、５７５〜６００mg／ｍ２、６００〜６２５mg／ｍ２、６２５〜６５０mg／ｍ２、６５０〜６７５mg／ｍ２または６７５〜７００mg／ｍ２の用量で投与し、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。ある実施態様において、リツキシマブを少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投与間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週、例えば、０.５週、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週またはそれ以上の投与間隔で投与する。ある実施態様において、リツキシマブを、ここに記載の用量および投与間隔で、一定期間、例えば、少なくとも２週、例えば、少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週またはそれ以上投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載の用量および投与間隔で、処置サイクルあたり計少なくとも４用量(例えば、処置サイクルあたり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上の用量)で投与する。
【０８３１】
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約１４９kDaを有する抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生され、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)から発現および精製される。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdfおよびClinical Trial Identifier number NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352およびNCT01397591参照。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にオファツムマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０８３２】
ある実施態様において、オファツムマブを静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約１５０〜３０００mg(例えば、約１５０〜２００mg、２００〜２５０mg、２５０〜３００mg、３００〜３５０mg、３５０〜４００mg、４００〜４５０mg、４５０〜５００mg、５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１２００mg、１２００〜１４００mg、１４００〜１６００mg、１６００〜１８００mg、１８００〜２０００mg、２０００〜２２００mg、２２００〜２４００mg、２４００〜２６００mg、２６００〜２８００mgまたは２８００〜３０００mg)のオファツムマブを提供する。ある実施態様において、オファツムマブは、出発用量約３００mg、続いて２０００mgを、例えば、約１１回、例えば、２４週投与する。ある実施態様において、オファツムマブを少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投与間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、２４週、２６週、２８週、２０週、２２週、２４週、２６週、２８週、３０週またはそれ以上の投与間隔で投与する。ある実施態様において、オファツムマブを、ここに記載する用量および投与間隔で、一定期間、例えば、少なくとも１週、例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週、２２週、２４週、２６週、２８週、３０週、４０週、５０週、６０週またはそれ以上または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上の期間、とよする。例えば、オファツムマブを、ここに記載する用量および投与間隔で、処置サイクルあたり少なくとも計２用量(例えば、処置サイクルあたり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０またはそれ以上の用量)で投与する。
【０８３３】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はオクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、Clinical Trials Identifier Nos. NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87に記載の、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【０８３４】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブを含む。ベルツズマブは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。
【０８３５】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(別名オビヌツズマブまたはRO5072759)は、ヒト化および糖鎖改変抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Clinical Trial Identifier Numbers: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422およびNCT01414205;およびwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf参照。
【０８３６】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(別名ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブ)は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が高く、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性が増強された、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
【０８３７】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａへの結合が良好であり、ＡＤＣＣが増強されるように改変されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46;およびClinical Trial Identifier No. NCT00452127参照。
【０８３８】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメインに由来する抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５は、モノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合しているが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含む。
【０８３９】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＣＤ２０抗体は、ここに記載する治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または有糸分裂阻害剤)、抗アレルギー剤、抗悪心剤(または制吐剤)、鎮痛剤または細胞保護剤とコンジュゲートするかまたは他に結合している。
【０８４０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＢ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ−２)阻害剤(例えば、ベネトクラクス、別名ＡＢＴ−１９９またはＧＤＣ−０１９９)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にベネトクラクスおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ベネトクラクスは、抗アポトーシスタンパク質、ＢＣＬ−２を阻害する小分子である。ベネトクラクス(４−(４−{[２−(４−クロロフェニル)−４,４−ジメチルシクロヘキシ−１−エン−１−イル]メチル}ピペラジン−１−イル)−Ｎ−({３−ニトロ−４−[(テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)−２−(１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。
【化４】
2018527008.tif 000099
【０８４１】
ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ある実施態様において、対象は、再発ＣＬＬを有し、例えば、対象は先に癌治療を投与されている。ある実施態様において、ベネトクラクスは、約１５〜６００mg(例えば、１５〜２０、２０〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００または５００〜６００mg)の用量を、例えば、連日、投与する。ある実施態様において、リツキシマブは、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内に、例えば、毎月投与される。
【０８４２】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Ｔｒｅｇ細胞数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＧＩＴＲ機能を調節する、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与を含む。理論に縛られることを望まないが、対象におけるＴｒｅｇ細胞数をアフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前に減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象に制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲをターゲティングするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象に、シクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞投与前に投与する。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬもしくはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ある実施態様において、対象はＡＬＬを有する。ある実施態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。ＧＩＴＲアゴニスト例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
【０８４３】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスのようなラパログと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０８４４】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０８４５】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(またパルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも称される)のような、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤であり得る。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２のような、ここに記載するデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤であり得る。
【０８４６】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ、フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン、クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６)、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)、１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)、インジスラム(Ｅ７０７０)、ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)、ディナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)、Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)、４−[[９−クロロ−７−(２，６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５，４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)、５−[３−(４，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)、４−(２，６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)、４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０８４７】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(PD0332991)であり、パルボシクリブを、約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で一定期間連日、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日について連日または２１日サイクルの７〜１２日について連日投与する。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブが投与される。
【０８４８】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にサイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)４または６阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方を標的とする阻害剤)、例えば、ここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＭＣＬを有する。ＭＣＬは、現在利用可能な治療にほとんど応答しない、すなわち、本質的に治療不能な高悪性度癌である。ＭＣＬの多くの場合、サイクリンＤ１(ＣＤＫ４／６のレギュレーター)が、ＭＣＬ細胞において発現される(例えば、免疫グロブリンおよびサイクリンＤ１遺伝子に関与する染色体転座のため)。それ故に、理論には拘束されないが、ＭＣＬ細胞は、高特異性で(すなわち、正常免疫細胞の最小の影響で)ＣＤＫ４／６阻害に高度に感受性であると考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤単独でもＭＣＬの処置にある程度有効性が示されているが、部分的寛解しか達成されておらず、高再発率である。ＣＤＫ４／６阻害剤の例はＬＥＥ０１１(別名リボシクリブ)であり、その構造を下に示す。
【化５】
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【０８４９】
理論には拘束されないが、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、LEE011または他のここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤)の投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤単独と比較して、高い応答性を、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を達成すると考えられる。
【０８５０】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい実施態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２−誘導可能キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０８５１】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)である。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にイブルチニブ(別名ＰＣＩ−３２７６５)と組み合わせて投与する。イブルチニブ(１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン)の構造を下に示す。
【化６】
2018527008.tif 000101
【０８５２】
ある実施態様において、対象はＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)または小リンパ性リンパ腫(ＳＬＬ)を有する。例えば、対象は、染色体１７(ｄｅｌ(１７ｐ)、例えば、白血病細胞中の)の短アームにおける欠失を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある実施態様において、対象は、再発ＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、先に１、２、３または４の先の癌治療を受けている)。ある実施態様において、対象は難治性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の実施態様において、対象は濾胞性リンパ腫、例えば、再発または難治性濾胞性リンパ腫を有する。ある実施態様において、イブルチニブは、約３００〜６００mg／日(例えば、約３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０または５５０〜６００mg／日、例えば、約４２０mg／日または約５６０mg／日)の用量を、例えば、経口投与される。ある実施態様において、イブルチニブは、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量を、一定期間連日、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与される。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのイブルチニブが投与される。理論には拘束されないが、イブルチニブの付加はＴ細胞増殖性応答を増強し、Ｔ細胞をＴヘルパー２(Ｔｈ２)からＴヘルパー１(Ｔｈ１)表現型にシフトさせ得ると考えられる。Ｔｈ１およびＴｈ２はヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１とＴｈ２で異なる免疫応答経路を指向する。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルスまたは癌性細胞のような細胞を死滅させるためのまたは自己免疫性応答を永続化させるための、炎症誘発性応答と関連する。Ｔｈ２表現型は、好酸球蓄積および抗炎症性応答と関連する。
【０８５３】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス、リダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、エベロリムス(ＲＡＤ００１)、ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)、simapimod、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、内部塩(ＳＦ１１２６)(配列番号１２６２)およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
【０８５４】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンは、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で一定期間連日、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日、投与される。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのラパマイシンが投与される。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスは、約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で一定期間連日、例えば、２８日サイクルで連日投与される。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのエベロリムスが投与される。
【０８５５】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８、４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)、セルコスポラミド、ＥＴＣ−１７８０４４５−２および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【０８５６】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にホスホイノシチド３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載するＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはデュベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にイデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にデュベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。イデラリシブ(別名ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１; Gilead)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン)の構造を下に示す。
【化７】
2018527008.tif 000102
【０８５７】
デュベリシブ(別名ＩＰＩ−１４５; Infinity PharmaceuticalsおよびAbbvie)は、ＰＩ３Ｋ−δ,γを遮断する小分子である。デュベリシブ(８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン)の構造を下に示す。
【化８】
2018527008.tif 000103
【０８５８】
ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ある実施態様において、対象は、再発ＣＬＬを有し、例えば、対象は先に癌治療を投与されている(例えば、先に抗ＣＤ２０抗体を投与されているまたは先にイブルチニブを投与されている)。例えば、対象は、染色体１７(ｄｅｌ(１７ｐ)、例えば、白血病細胞中の)の短アームにおける欠失を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含む。他の実施態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病細胞を含まない。ある実施態様において、対象は、染色体１１(ｄｅｌ(１１ｑ))の長アームに欠失を有する。他の実施態様において、対象はｄｅｌ(１１ｑ)を有しない。ある実施態様において、イデラリシブは、約１００〜４００mg(例えば、１００〜１２５mg、１２５〜１５０mg、１５０−１７５mg、１７５〜２００mg、２００〜２２５mg、２２５〜２５０mg、２５０〜２７５mg、２７５〜３００mg、３２５〜３５０mg、３５０〜３７５mgまたは３７５〜４００mg)の用量を、例えば、ＢＩＤで投与される。ある実施態様において、デュベリシブは、約１５〜１００mg(例えば、約１５〜２５mg、２５〜５０mg、５０〜７５mgまたは７５〜１００mg)の用量を、例えば、１日２回投与される。ある実施態様において、リツキシマブは、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量を、例えば、静脈内投与される。
【０８５９】
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)、Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４，６−ジ−４−モルホリニル−１，３，５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)、２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４，５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)、アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)、２，４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)、８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４，５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)、３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’，２’：４，５]フロ[３，２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)、５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)およびＮ−[２−[(３，５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択される、デュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
【０８６０】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて投与する。ＡＬＫキナーゼの例は、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(別名ＡＰ２６１１３; Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、ＰＦ−０６４６３９２２(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT02048488参照)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。
【０８６１】
クリゾチニブの化学名は３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ４−[２−(ジメチルホスホリル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名はＮ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２の化学名は(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンズオキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学構造は(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６の化学名は(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。
【０８６２】
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)もまた使用され得る。さらなる態様において、本発明の細胞組成物を、骨髄移植と共に(例えば、前、同時または後)、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはキャンパスのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と共に患者に投与し得る。ある態様において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬物、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後に、投与される。例えば、ある実施態様において、対象は、高用量化学療法と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置を受ける。ある実施態様において、移植後、対象は、本発明の増大された免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施態様において、増大された細胞を、手術の前または後に投与する。
【０８６３】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にインドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と組み合わせて投与する。ＩＤＯは、アミノ酸、Ｌ−トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸、胃、卵巣、頭部および肺癌はＩＤＯを過発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣ)はＩＤＯを発現し得る。理論には拘束されないが、Ｌ−トリプトファン(例えば、ＩＤＯにより触媒される)の減少が、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシス誘発により免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それ故に、理論には拘束されないが、ＩＤＯ阻害剤は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または死滅の減少により、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を増大し得ると考えられる。ある実施態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸、胃、卵巣、頭または肺癌を有する。ＩＤＯ阻害剤の例は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01191216; NCT01792050)およびINCB024360(Incyte Corp.)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01604889; NCT01685255参照)を含むが、これらに限定されない。
【０８６４】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)のモジュレーターと組み合わせて投与する。ＭＤＳＣは、多くの固形腫瘍の腫瘍部位周辺およびその部位に蓄積される。これらの細胞はＴ細胞応答を抑制し、それによりＣＡＲ発現細胞療法の効果を阻害する。理論には拘束されないが、ＭＤＳＣモジュレーターの投与がここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を増大すると考えられる。ある実施態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。ＭＤＳＣのモジュレーターは、MCS110およびBLZ945を含むが、これらに限定されない。MCS110は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00757757参照。BLZ945は、コロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72参照。BLZ945の構造を下に示す。
【化９】
2018527008.tif 000104
【０８６５】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞(例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／０７９０００号に記載の、例えば、ＣＴＬ０１９)と組み合わせて投与する。ある実施態様において、対象はＣＤ１９＋リンパ腫、例えば、ＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ＣＤ１９＋  ＦＬまたはＣＤ１９＋  ＤＬＢＣＬを有する。ある実施態様において、対象は再発または難治性ＣＤ１９＋リンパ腫を有する。ある実施態様において、リンパ球枯渇化学療法を、対象に、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に投与する。ある例において、リンパ球枯渇化学療法を、対象にＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞投与前に投与する。例えば、リンパ球枯渇化学療法は、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞注入の１〜４日(例えば、１日、２日、３日または４日)前に修了する。ある実施態様において、複数の用量のＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞が、例えば、ここに記載するとおり、投与される。例えば、単一用量は、約５×１０８  ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞を含む。ある実施態様において、リンパ球枯渇化学療法を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ非発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に対象に投与する。ある実施態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲＴを、ＣＤ１９  ＣＡＲ非発現細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ非発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に対象に投与する。
【０８６６】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にインターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics, LLC)と組み合わせて投与する。ｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａのヘテロ二量体非共有複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、引用により本明細書に包含させる、米国８,１２４,０８４号、米国２０１２／０１７７５９８号、米国２００９／００８２２９９号、米国２０１２／０１４１４１３号および米国２０１１／００８１３１１号に開示される。ある実施態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５は、皮下投与される。ある実施態様において、対象は、癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある実施態様において、対象は、転移癌を有する。
【０８６７】
ある実施態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与と関連する副作用を軽減または改善する薬物を投与し得る。ＣＡＲ発現細胞の投与と関連する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも称される血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、摂食障害、筋肉痛、関節痛、悪心、嘔吐および頭痛のような臨床的体質性徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹のような臨床的皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧増大、低血圧、心拍出量増大(初期)およびおそらく心拍出量減少(後期)のような臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、ｄ−二量体上昇、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノーゲン血症のような臨床的凝固徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症のような臨床的腎臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症のような臨床的肝臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態変化、混乱、譫妄、喚語困難または率直に失語、幻覚、振戦、測定障害、歩調変化および発作のような臨床的神経徴候および症状を含み得る。
【０８６８】
従って、ここに記載する方法は、対象にここに記載するＣＡＲ発現細胞を投与し、さらにＣＡＲ発現細胞での処置に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理するための１以上の薬物を投与することを含み得る。ある実施態様において、対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある実施態様において、対象において上昇する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それ故に、この副作用を処置するために投与される薬物は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬物であり得る。ある実施態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような薬物の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦα阻害剤およびＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような、抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、elsilimomab、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301およびFM101のような抗ＩＬ−６抗体分子または抗ＩＬ−６受容体抗体分子である。ある実施態様において、抗ＩＬ−６受容体抗体分子はトシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例はアナキンラである。
【０８６９】
ある実施態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物を投与できる。例えば、ある実施態様において、薬物は、阻害性分子を阻害する薬物であり得る。阻害性分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ−１)、ｃａｎ、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を低減させる。阻害性分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータを含む。阻害性分子の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化させ得る。ある実施態様において、阻害性核酸、例えば、ここに記載する、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞における阻害性分子の発現を阻害し得る。ある実施態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある実施態様において、阻害性分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施態様において、阻害性分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの成分、例えば、全ての成分をコードする核酸に結合する。ある実施態様において、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害性分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬物は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る(例えば、イピリムマブ(MDX-010およびMDX-101とも称され、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、CP-675,206として知られる))。ある実施態様において、薬物は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施態様において、薬物は、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施態様において、薬物は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０８７０】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１に対する２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転され得る。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２ｎお抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載する本発明のｃａｒと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(BMS-936558またはMDX1106とも称する；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ−１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ−１に特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８，４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示される。ピジリズマブ(ＣＴ−０１１； Cure Tech)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１号に開示される。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとしても知られ、ＭＫ０３４７５とも称する; Merck)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示される。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合し、本リガンドとＰＤ１の相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech／Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ−Ｌ１に結合するＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７，９４３，７４３号および米国公開２０１２００３９９０６号に開示される。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(重および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示される)およびMDX-1105(BMS-936559とも称される、例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤)を含む。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体は、数ある中で、ＡＭＰ  ５１４(Amplimmune)、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ−１抗体を含む。
【０８７１】
ＴＩＭ−３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)もまた、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋  Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋  Ｔ細胞毒性１細胞においてＴ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞消耗に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンドの相互作用の阻害、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１は、免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３とそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤はＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合し、そのリガンドとの相互作用を阻害する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示される。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異的抗体は、ＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示される。
【０８７２】
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物はＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤は抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１号およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４または、例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に記載のその組み換え形態である。他の実施態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のとおりＣＥＡＣＡＭ−５に結合しまたは、例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のとおり、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応性である。
【０８７３】
理論に拘束されないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害に介在すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロフィリックリガンドとしておよびＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および消耗に役割を有するとして記載される(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号; Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848参照)。ある実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１とＴＩＭ−３の共遮断は、異種移植結腸直腸癌モデルにおける抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号; Huang, et al. (2014), supra参照)。他の実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１とＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載のとおり、Ｔ細胞耐容性を減少させる。それ故に、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と共に使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載する他の癌に対する免疫応答を増強できる。
【０８７４】
ＬＡＧ−３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞消耗に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３とそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は、枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分と、ＭＨＣクラスII分子に結合し、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化させるＩｇの組み換え融合タンパク質であるＩＭＰ３２１(Immutep)を含む。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示される。
【０８７５】
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害性分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは、正のシグナルと関連するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある実施態様において、正のシグナルと関連するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激性ドメイン、例えば、細胞内ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳおよび／または、例えば、ここに記載の、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある実施態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の実施態様において、融合タンパク質は、本発明のＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
【０８７６】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物はｍｉＲ−１７−９２である。
【０８７７】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬物は、サイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増大、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受けている対象に投与できるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい実施態様において、投与されるサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与し得る。サイトカインを、１日を超えて投与でき、例えば、サイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週または４週投与する。例えば、サイトカインを、１日１回、７日投与する。
【０８７８】
ある実施態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同時にまたは一括して投与でき、例えば、同日に投与する。サイトカインは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同じ医薬組成物に製剤されても、別の医薬組成物に製剤されてもよい。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与直後、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与し得る。ある実施態様において、ここで、サイトカインは、１日を超えて行う投与レジメンで投与され、サイトカイン投与レジメンの１日目はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与と同日であってよくまたはサイトカイン投与レジメンの１日目はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であってよい。ある実施態様において、１日目、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与し、第二日から、サイトカインを１日１回、７日投与する。好ましい実施態様において、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。
【０８７９】
他の実施態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞投与後の一定期間、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与後、少なくとも２週、３週、４週、６週、８週、１０週、１２週、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に投与する。ある実施態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象に、ここに記載の用量およびレジメンによりＣＡＲ発現細胞を投与する。腫瘍増殖阻害、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含むＣＡＲ発現細胞療法に対する対象の応答を、ここに記載する方法の何れかを使用して、ＣＡＲ発現細胞投与後、２週、３週、４週、６週、８週、１０週、１２週、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に評価する。ＣＡＲ発現細胞療法に対する十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。ＣＡＲ発現細胞療法に対する応答が最適以下である対象に対するサイトカインの投与は、ＣＡＲ発現細胞有効性または抗癌活性を改善し得る。好ましい実施態様において、ＣＡＲ発現細胞投与後に投与されるサイトカインはＩＬ−７である。
【０８８０】
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ある実施態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。
【０８８１】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが９０％を超えない、少なくとも１０％であるが９０％を超えない、少なくとも１５％であるが、９０％を超えない、少なくとも２０％であるが９０％を超えない、少なくとも３０％であるが９０％を超えない、少なくとも４０％であるが９０％を超えない、少なくとも５０％であるが９０％を超えない、少なくとも６０％であるが９０％を超えないまたは少なくとも７０％であるが９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８２】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが８０％を超えない、少なくとも１０％であるが８０％を超えない、少なくとも１５％であるが、８０％を超えない、少なくとも２０％であるが８０％を超えない、少なくとも３０％であるが８０％を超えない、少なくとも４０％であるが８０％を超えない、少なくとも５０％であるが８０％を超えないまたは少なくとも６０％であるが８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８３】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが７０％を超えない、少なくとも１０％であるが７０％を超えない、少なくとも１５％であるが、７０％を超えない、少なくとも２０％であるが７０％を超えない、少なくとも３０％であるが７０％を超えない、少なくとも４０％であるが７０％を超えないまたは少なくとも５０％であるが７０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８４】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが６０％を超えない、少なくとも１０％であるが６０％を超えない、少なくとも１５％であるが、６０％を超えない、少なくとも２０％であるが６０％を超えない、少なくとも３０％であるが６０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが６０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８５】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが５０％を超えない、少なくとも１０％であるが５０％を超えない、少なくとも１５％であるが、５０％を超えない、少なくとも２０％であるが５０％を超えない、少なくとも３０％であるが５０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが５０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８６】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが４０％を超えない、少なくとも１０％であるが４０％を超えない、少なくとも１５％であるが、４０％を超えない、少なくとも２０％であるが４０％を超えない、少なくとも３０％であるが４０％を超えないまたは少なくとも３５％であるが４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８７】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが３０％を超えない、少なくとも１０％であるが３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、３０％を超えない、少なくとも２０％であるが３０％を超えないまたは少なくとも２５％であるが３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８８】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが３０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３５、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが４０％を超えないまたは少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが４５％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８８９】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが９０％のｍＴＯＲ阻害と関連するまたは阻害を提供する。
【０８９０】
ここに記載するとおり、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化減少による、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性低下レベルにより決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、ここに記載する方法により、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイによりまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により、評価できる。
【０８９１】
ｍＴＯＲ阻害剤例
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒阻害剤である。
【０８９２】
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(ラパログとも称する)を含む、ラパマイシンと構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む。
【０８９３】
ラパマイシンは、式Ａで示される構造を有する、ストレプトミセス・ハイグロスコピクスにより産生される、既知マクロライド抗生物質である。
【化１０】
2018527008.tif 000105
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許３,９２９,９９２号参照。種々のナンバリングスキームがラパマイシンについて提案されている。混乱を避けるため、ここで特定のラパマイシンアナログを命名するとき、名称を、式Ａのナンバリングスキームを用いるラパマイシンを参照して付ける。
【０８９４】
本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基がＯＲ１(式中、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置換されているＯ−置換アナログであり；例えば、引用により内容を本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載の、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシンアナログは、２６位または２８位が置換されているものを含む。ラパマイシンアナログは、上記アナログのエピマー、特に４０位、２８位または２６位に同等に置換されたエピマーであってよく、所望により、例えば、内容を引用よりここに包含するＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のとおり、さらに水素化されていてよく、例えば、ゾタロリムスとして知られるＡＢＴ５７８または内容を引用よりここに包含するＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシンアナログ、例えばリダフォロリムスとして知られるＡＰ２３５７３であり得る。
【０８９５】
ＵＳ５,６６５,７７２号からの本発明における使用に適するラパマイシンアナログの例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０８９６】
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されているアナログであり、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８に見られるラパマイシンアナログ、例えばテムシロリムスが知られる。
【０８９７】
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、例えば内容を引用により本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載の、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ−置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび／または３９位のメトキシ基が、３９番の炭素と共に欠失しており、ラパマイシンのシクロヘキシル環が、３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環となっているものを含む。アナログは、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化および／または３２位カルボニルが還元されるように、さらに修飾され得る。
【０８９８】
ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシンアナログは、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０８９９】
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシンアナログは、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０９００】
他の適当なラパマイシンアナログは、内容を引用により本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のウミロリムスである。
【０９０１】
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、化学名(１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ)−１，１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有する。
【０９０２】
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(別名テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９)およびリダフォロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含む。アロステリックｍＴｏｒ阻害剤の他の例は、ゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。
【０９０３】
これとは別にまたはこれに加えて、触媒、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方を標的とすることが判明している。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するため、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりも有効なｍＴＯＲＣ１の阻害剤である。
【０９０４】
触媒阻害剤は、ＢＥＺ２３５または２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態。ＢＥＺ２３５の合成はＷＯ２００６／１２２８０６号に記載；化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノールを有するＣＣＧ１６８(ＡＺＤ−８０５５としても知られる、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)；３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)；３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３号およびＷＯ２０１３０２３１８４号)；Ｎ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)；化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ｄｉモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素を有するＰＫＩ−５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)；化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドを有するＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)、(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)を含む。
【０９０５】
触媒ｍＴＯＲ阻害剤は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびＫｕ−００６３７９４を含む(Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42.. Ku-0063794 is a specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin (mTOR))。ＷＹＥ−３５４は、触媒ｍＴｏｒ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
【０９０６】
本発明において有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた前記の何れかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩またはアナログを含む。
【０９０７】
ラド００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の用量に基づき、当分野で十分に確立された方法に基づき、送達用に製剤され得る。特に、米国特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤に有用な製剤の例を提供する。
【０９０８】
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲは、キナーゼＰ７０  Ｓ６をリン酸化し、それによりＰ７０  Ｓ６キナーゼを活性化し、その基質をリン酸化させる。ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化減少による、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性低下レベルにより決定できる。ｍＴＯＲ阻害レベルを、阻害剤非存在下、例えば、阻害剤の投与前および存在下阻害剤または阻害剤投与後、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性(Ｐ７０  Ｓ６キナーゼが基質をリン酸化する能力)の測定により決定できる。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害のレベルはｍＴＯＲ阻害レベルをもたらす。それ故に、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼが４０％阻害されたら、ｍＴＯＲ活性は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性により測定して、４０％阻害される。阻害の程度またはレベルは、ここでは、投与と投与の間の阻害の平均レベルをいう。例として、阻害剤を週１回投与するならば、阻害のレベルは、その間隔、すなわち１週間にわたる平均阻害レベルである。
【０９０９】
引用によりここに包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、ｍＴＯＲ阻害レベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここではＢｏｕｌａｙアッセイと称する)。ある実施態様において、アッセイは、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１投与前後の生物学的サンプルからのＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の測定に依存する。サンプルを、ｍＴＯＲ阻害剤で処置後予定した時間、例えば、処置２４時間、４８時間および７２時間後に採り得る。例えば、皮膚または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣｓ)からの生物学的サンプルが使用され得る。総タンパク質抽出物をサンプルから調製する。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を使用する免疫沈降によりタンパク質抽出物から単離する。単離Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイにより測定できる。単離キナーゼを、４０Ｓリボソームサブユニット基質(Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの内因性基質である)およびガンマ−３２Ｐと、基質のリン酸化を可能にする条件下、インキュベートできる。次いで、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、３２ＰシグナルをPhosphorImagerを使用して分析できる。４０Ｓリボソームサブユニットのサイズに対応する３２Ｐシグナルが、リン酸化基質およびＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性を示す。キナーゼ活性の増減を、リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant, Molecular Dynamicsを使用)、任意単位値を定量シグナルに割り当て、投与後の値を、投与前の値または参照値と比較することにより計算できる。例えば、パーセントキナーゼ活性阻害を、次の式で計算できる：１−(投与後に得た値／投与前に得た値)×１００。上記のとおり、ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与と投与の間の阻害の平均レベルである。
【０９１０】
キナーゼ活性、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性を評価する方法はまた引用により本明細書に包含させる、ＵＳ７,７２７,９５０号にも提供される。
【０９１１】
ｍＴＯＲ阻害レベルはまたＰＤ１陰性対ＰＤ１陽性Ｔ細胞比の変化によっても評価できる。末梢血からのＴ細胞を、当分野で知られる方法によりＰＤ１陰性または陽性として同定できる。
【０９１２】
低用量ｍＴＯＲ阻害剤
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量ｍＴＯＲ阻害剤を使用し、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤の用量の使用である。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制的であり、例えば、臓器移植拒絶の予防に使用される。さらに、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログは腫瘍細胞増殖も阻害し、多様な癌の処置に使用される(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition.  Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
【０９１３】
本発明は、少なくとも一部、現在の臨床現場で使用されるより遙かに低い用量のｍＴＯＲ阻害剤が、対象における免疫応答増加およびＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比の増加に優れた効果を有するとの驚くべき発見に基づく。ｍＴＯＲ活性の部分的阻害しか生じない低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、ヒト対象における免疫応答を効率的に改善でき、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比を増加させるのは驚くべきことであった。
【０９１４】
これとは別にまたはこれに加えて、何らかの理論に拘束されないが、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、、例えば、非処置対象と比較して、ナイーブＴ細胞数を、例えば、少なくとも一過性に増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、同様に理論に拘束されないが、ｍＴＯＲ阻害剤での処置は、十分な時間または十分な投与の後、次の１以上をもたらすと考えられる。
次の１以上マーカーの発現増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体におけるＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体におけるＫＬＲＧ１発現減少；および
次の特性の何れかの一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化の何れも、例えば、未処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶Ｔ細胞前駆体は、分化プログラムの早期にある記憶Ｔ細胞である。例えば、記憶Ｔ細胞は、次のＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少および／またはＢＣＬ２増加の１以上の特性を有する。
【０９１５】
ある実施態様において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒ｍＴＯＲ阻害剤の組成物または投与形態に関し、これは、選択した投与レジメン、例えば、１日１回または週に１回で投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制と関連しないが、免疫応答の増強と関連するレベルのｍＴＯＲ阻害をもたらす。
【０９１６】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒ｍＴＯＲ阻害剤は、持続性放出製剤で提供され得る。ここに記載する組成物または単位投与形態の何れも持続性放出製剤で提供できる。ある実施態様において、持続性放出製剤は、即時放出製剤よりバイオアベイラビリティが低い。例えば、ある実施態様において、即時放出製剤と同等の治療効果を達成するために、持続性放出製剤は、即時放出製剤に提供されるより約２〜約５倍、約２.５〜約３.５倍または約３倍量の阻害剤を有する。
【０９１７】
ある実施態様において、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mg／単位投与形態を有する、一般に週１回投与で使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する持続性放出形態に対応する。ある実施態様において、両方の形態を、週１回基準で投与する。
【０９１８】
ある実施態様において、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mg／単位投与形態を有する、一般に１日１回投与で使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれmg、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する持続性放出形態に対応する。週１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する持続性放出形態に対応する。
【０９１９】
ある実施態様において、０.０１〜１.０mg／単位投与形態を有する、一般に１日１回投与で使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.０３〜３mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する持続性放出形態に対応する。週１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.２〜２０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する持続性放出形態に対応する。
【０９２０】
ある実施態様において、０.５〜５.０mg／単位投与形態を有する、一般に週１回投与で使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、１.５〜１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する持続性放出形態に対応する。
【０９２１】
上記のとおり、ｍＴＯＲ経路の一つの標的はＰ７０  Ｓ６キナーゼである。それ故に、ここに記載する方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性  ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性に比して、８０％を超えない阻害を達成するのに十分なものである。さらなる態様において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性に比して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の３８％を超えない阻害を達成するのに十分なｍＴＯＲ阻害剤の量を提供する。
【０９２２】
ある態様において、本発明の方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ヒト対象に投与したとき、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の９０±５％(すなわち、８５〜９５％)、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％または１０±５％阻害を達成するのに十分である。
【０９２３】
対象におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性は、、例えば、米国特許７,７２７,９５０号に記載の方法により、ホスホＰ７０  Ｓ６Ｋレベルおよび／またはホスホＰ７０  Ｓ６レベルの免疫ブロット分析またはインビトロキナーゼ活性アッセイにより、当分野で知られる方法を使用して、測定し得る。
【０９２４】
ｍＴＯＲ阻害剤の用量に関連してここで使用する用語“約”は、ｍＴＯＲ阻害剤の用量の±１０％までの変動性をいうが、記載した用量から変動がないものも含み得る。
【０９２５】
ある実施態様において、本発明は、標的トラフレベル内の用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む、方法を提供する。ある実施態様において、トラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンに付随するトラフレベルより顕著に低い。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果をもたらすトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルをもたらすように投与する。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応症に使用するためのＦＤＡ承認添付文書に提供されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルをもたらすように投与する。
【０９２６】
ある実施態様において、ここに開示する方法は、０.１〜１０ng／ml、０.１〜５ng／ml、０.１〜３ng／ml、０.１〜２ng／mlまたは０.１〜１ng／mlである標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０９２７】
ある実施態様において、ここに開示する方法は、０.２〜１０ng／ml、０.２〜５ng／ml、０.２〜３ng／ml、０.２〜２ng／mlまたは０.２〜１ng／mlである標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０９２８】
ある実施態様において、ここに開示する方法は、０.３〜１０ng／ml、０.３〜５ng／ml、０.３〜３ng／ml、０.３〜２ng／mlまたは０.３〜１ng／mlである標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０９２９】
ある実施態様において、ここに開示する方法は、０.４〜１０ng／ml、０.４〜５ng／ml、０.４〜３ng／ml、０.４〜２ng／mlまたは０.４〜１ng／mlである標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０９３０】
ある実施態様において、ここに開示する方法は、０.５〜１０ng／ml、０.５〜５ng／ml、０.５〜３ng／ml、０.５〜２ng／mlまたは０.５〜１ng／mlである標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０９３１】
ある実施態様において、ここに開示する方法は、１〜１０ng／ml、１〜５ng／ml、１〜３ng／mlまたは１〜２ng／mlである標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０９３２】
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の濃度または２投与間の最小薬物濃度をいう。
【０９３３】
ある実施態様において、標的トラフレベルのＲＡＤ００１は、約０.１〜４.９ng／mlの範囲である。ある実施態様において、標的トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml以下〜３ng／mlである。ある実施態様において、標的トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml以下〜１ng／mlである。
【０９３４】
さらなる態様において、本発明は、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＡＤ００１について特定した標的トラフレベルと生物学的同等である標的トラフレベルが付随する用量で利用できる。ある実施態様において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の標的トラフレベルは、ここに記載するするＲＡＤ００１のトラフレベルと同レベルのｍＴＯＲ阻害をもたらすレベルである(例えば、ここに記載する方法、例えば、Ｐ７０  Ｓ６阻害により測定して)。
【０９３５】
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害剤
ある態様において、本発明は、ＣＡＲここに記載する細胞と組み合わせて使用するために製剤された、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【０９３６】
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載する、添加剤と組み合わせた投与のために製剤される。
【０９３７】
一般に、本発明の化合物は、治療有効量で、上記のとおり当分野で知られる通常の許容される方式の何れかにより、単独でまたは１以上の治療剤と組み合わせて投与される。
【０９３８】
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造され得る。例えば、原体医薬物質(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合体化剤との複合体)を、ここに記載する添加物の１以上の存在下、適当な溶媒に溶解する。ｍＴＯＲ阻害剤は、一般に、薬物の用量が容易に制御でき、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を提供するために、医薬投与形態に製剤される。
【０９３９】
本発明の化合物を、慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、経口で、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態でまたは非経腸的に、例えば、注射可能溶液剤または懸濁液剤の形態で、局所的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形態でまたは経鼻または坐薬形態で、医薬組成物として投与できる。ｍＴＯＲ阻害剤をここに記載する他の薬物と組み合わせて投与するとき(同時にまたは別々に)、ある態様において、両成分を同じ経路(例えば、非経腸的)で投与できる。あるいは、他方の薬物を、ｍＴＯＲ阻害剤と異なる経路で投与してよい。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤は経口で投与されてよく、他方の薬物は非経腸的に投与されてよい。
【０９４０】
持続性放出
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤または触媒ｍＴＯＲ阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび／または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内変動減少、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少および／または食事の影響減少のような即時放出(ＩＲ)錠剤を超える有利な薬物動態性質を有する、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む経口固体投与形態の医薬製剤で提供できる。提供された医薬製剤は、より正確な用量調節および／または有害事象頻度減少を可能にし、そうして、患者にここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１でのより安全な処置を提供する。
【０９４１】
ある実施態様において、本発明は、多粒子システムであり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な徐放性製剤を提供する。
【０９４２】
用語“ここで使用する徐放性、多粒子製剤”は、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の、長時間にわたる、例えば少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間にわたる放出を可能にする製剤をいう。徐放性製剤は、活性成分を摂取後長時間利用可能とするような方法で製剤される、例えば、ここに記載する、特別な添加物からなる、マトリクスおよびコーティングを含み得る。
【０９４３】
用語“徐放性”は、用語“持続性放出”(ＳＲ)または“長期放出”と相互交換可能に使用される。用語“徐放性”は、欧州薬局方(第七版の)錠剤に関するモノグラムおよび米国薬局方の医薬投与形態に関する一般的章＜１１５１＞の定義に従う、活性薬物物質を経口投与直後に放出しない医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(ＩＲ)は、“Guidance for Industry: Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従う、活性薬物物質の８５％が６０分未満の放出する医薬製剤をいう。ある実施態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、錠剤からのエベロリムスの３０分以内の放出をいう。
【０９４４】
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な徐放性製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような、当分野で知られるアッセイを使用する、インビトロ放出プロファイルにより特徴付けできる。溶解容器を３７℃で、ナドデシル硫酸ナトリウム０.２％を含む９００mL  リン酸緩衝液  ｐＨ６.８を満たし、溶解を、米国薬局方試験モノグラム７１１および欧州薬局方試験モノグラム２.９.３にそれぞれ従う、７５rpmでのパドル法により行う。
【０９４５】
ある実施態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な徐放性製剤は、インビトロ放出アッセイにおいて、次の放出仕様に従いｍＴＯＲ阻害剤を放出する。
０.５時間：＜４５％または＜４０、例えば、＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば、３０−６０％
２時間：＞５０％または＞７０％、例えば、＞７５％
３時間：＞６０％または＞６５％、例えば、＞８５％、例えば、＞９０％。
【０９４６】
ある実施態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な徐放性製剤は、インビトロ溶解アッセイで４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分または１２０分より速くｍＴＯＲ阻害剤の５０％を放出しない。
【０９４７】
バイオポリマー送達方法
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の１以上を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより、対象に投与または送達できる。バイオポリマー足場は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の送達、増大および／または分散を支持または増強する。バイオポリマー足場は、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および／または生分解性ポリマーを含む。
【０９４８】
適当なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸／リン酸カルシウムセメント(ＣＰＣ)、ベータ−ガラクトシダーゼ(β−ＧＡＬ)、(１,２,３,４,６−ペンタアセチル−Ｄ−ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(３−ヒドロキシブチラート−コ−３−ヒドロキシ−ヘキサノエート)(ＰＨＢＨＨｘ)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(ＰＣＬ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリ(乳−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)、ポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)、ポリビニルアルコール)(ＰＶＡ)、絹、大豆タンパク質および大豆タンパク質単離物を、単独でまたは任意の他のポリマー組成物と組み合わせて、任意の濃度および任意の比で含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび／または送達する細胞の送達、増大または機能、例えば、抗癌活性を増大する刺激性分子で増強または修飾され得る。バイオポリマー足場は、注射可能、例えば、ゲルまたは半固体または固体組成物であり得る。
【０９４９】
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、対象への送達前にバイオポリマー足場に播種される。ある実施態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに取り込まれたまたはコンジュゲートされた、さらに１以上のここに記載するさらなる治療剤(例えば、他のＣＡＲ発現細胞、抗体または小分子)またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬物を含む。ある実施態様において、バイオポリマー足場は、例えば、腫瘍内に、注射されまたは腫瘍にまたは腫瘍の抗腫瘍効果の仲介に十分に近位の範囲内に外科的にインプラントされる。バイオポリマー組成物およびその送達方法のさらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101；およびＷＯ２０１４／１１０５９１号に記載される。
【０９５０】
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて、ここに記載する、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を含み得る。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、ある態様において、静脈内投与用に製剤される。
【０９５１】
本発明の医薬組成物を、処置(または予防)する疾患に適する方式で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は臨床治験により決定され得る。
【０９５２】
ある実施態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残存抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される、汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルの汚染物がない。ある実施態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびＡ型ストレプトコッカス・ピオゲネスからなる群から選択される、少なくとも一つである。
【０９５３】
“免疫学的に有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、投与する本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態における個々の差異を考慮に入れて、医師が決定できる。一般にここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物は、範囲内の全整数値を含み、１０４〜１０９細胞／kg体重、ある場合１０５〜１０６細胞／kg体重の用量で投与され得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの用量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られる注入技法を使用して、投与され得る(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
【０９５４】
ある態様において、活性化免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を対象に投与し、続いて採血し(またはアフェレーシス実施)、本発明により免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を活性化し、これらの活性化および増大免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を患者に再注入することが望ましいかもしれない。この方法を、数週毎に複数回実施できる。ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、１０cc〜４００cc採った血液から活性化する。ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００cc採った血液から活性化する。
【０９５５】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植え込みまたは移植を含む、任意の好都合な方式により実施できる。ここに記載する組成物は、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内(ｉ.ｖ.)または腹腔内注射により投与し得る。ある態様において、本発明のＴ細胞組成物は、患者に皮内または皮下注射により投与される。ある態様において、本発明のＴ細胞組成物はｉ.ｖ.注射により投与される。免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。
【０９５６】
具体的な例示的態様において、対象は、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離するために、白血球が採取され、エクスビボで富化または枯渇される、白血球除去を受ける。これらのＴ細胞単離物を、当分野で知られる方法により増大でき、本発明の１以上のＣＡＲ構築物が導入され、それにより本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞が作られるように、処理される。処置を必要とする対象は、その後、高用量化学療法と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置を受け得る。ある態様において、移植の後または同時に、対象は、本発明の増大されたＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増大された細胞を、手術の前または後に投与する。
【０９５７】
患者に投与すべき上記処置剤の用量は、処置する状態の正確な性質およびレシピエントの処置により変わる。ヒト投与のための用量のスケーリングは、当分野で認められる実務に従い実施され得る。ＣＡＭＰＡＳの用量は、例えば、一般に成人患者に１〜約１００mg範囲であり、通常１〜３０日の期間、連日投与する。好ましい１日用量は、１〜１０mg／日であるが、ある場合４０mg／日までの高用量が使用され得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
【０９５８】
ある実施態様において、ＣＡＲを、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に、例えば、インビトロ転写を使用して導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の最初の投与と、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１以上の続く投与を受け、ここで、１以上の続く投与は、先の投与後１５日未満、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日で投与される。ある実施態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１を超える用量が、対象(例えば、ヒト)に週あたり投与され、例えば、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の２、３または４用量が、週あたり投与される。ある実施態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１を超える投与を週あたり受け(例えば、２、３または４投与／週)(またサイクルとも称する)、続いて、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)投与がない週があり、次いでＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１以上のさらなる用量(例えば、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の週あたり１を超える投与)が対象に投与される。他の実施態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１を超えるサイクルを受けおよび各サイクル間の時間は、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日未満である。ある実施態様において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、週あたり、隔日で３回投与する。ある実施態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週またはそれ以上、投与される。
【０９５９】
ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。この方法で産生された細胞、例えば、ＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
【０９６０】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
【０９６１】
ある態様において、ＣＡＲＴは、形質導入後４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクター送達により行い得る。ある態様において、ＣＡＲ  ＲＮＡを、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入する。
【０９６２】
一過性に発現するＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)(特にＣＡＲＴ担持マウスｓｃＦｖ)を使用して処置される患者で起こり得る可能性のある問題は、複数の処置後のアナフィラキシーである。
【０９６３】
この理論には拘束されないが、このようなアナフィラキシー応答は、患者が液性抗ＣＡＲ応答、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を獲得することにより引き起こされると考えられる。細胞を産生する患者の抗体は、抗原曝露に１０〜１４日間中断があったとき、ＩｇＧアイソタイプ(アナフィラキシーを引き起こさない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチが起こる。
【０９６４】
患者が一過性ＣＡＲ治療の経過中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高いリスクがあるならば(例えばＲＮＡ形質導入により産生されたもの)、ＣＡＲＴ注入中断は１０〜１４日を超えて起こるべきではない。
【実施例】
【０９６５】
本発明を、次の実施例よって、さらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明の目的でのみ提供し、特に断らない限り、限定を意図しない。それ故に、本発明は、次の実施例により限定されると解釈されてはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果としての証拠となる任意かつ全ての変更を包含すると解釈されるべきである。
【０９６６】
ＣＡＲＴ１９でのＣＬＬを有する患者の処置
患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０を、ＣＬＬについて自己ＣＡＲＴ１９  Ｔ細胞で処置した。処置は、ＣＬＬの完全な寛解をもたらした。
【０９６７】
ＣＡＲＴ細胞集団の分析
図１に示すとおり、患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０におけるＣＡＲＴ細胞を、採血により経時的にモニターした。細胞におけるＢＢＺ発現の量を決定した(赤色)。Ｖｂｅｔａ５.１  ＴＣＲファミリーからの配列のコピー数を決定した(青色)。両方の測定を、ＣＡＲＴ細胞の２回目の注入後、指定した日に採取したサンプルで行った。図２に示すとおり、ＣＡＲＴ注入後２８日目(図２Ａ)または５１日目(図２Ｂ)に採取したサンプルからの、患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＴ細胞受容体レパートリーを決定した。これは、５１日目にＴ細胞受容体のＴＣＲＢＶ０５−０１ファミリーが豊富であることを明らかにし、経時的なクローン性増殖を示す。図３に示すとおり、患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０から単離したＴ細胞を、ＣＡＲ１９および２種の異なるＴＣＲファミリー遺伝子の同時発現について経時的に(５０日目および５１日目)分析し、投入した材料(生産物)用量と比較した：上部パネルはＴＣＲファミリーＶｂ１３.１であり；下部パネルはＴＣＲファミリーＶｂ５.１を示す。データは、ＣＡＲ１９陽性細胞が、５０〜５１日目に急速に富化された単一ＴＣＲファミリー遺伝子(Ｖｂ５.１)を含むことを示す。Ａｓ  ｓｈｏｗｎ  ｉｎ  図４、患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＣＤ８陽性細胞のＴ細胞受容体レパートリーをＣＡＲＴ注入後５１日目に採取したサンプルから決定した。これは、５１日目のＴ細胞受容体のＴＣＲＢＶ０５−０１ファミリーの存在量を明らかにし、ＣＤ８陽性細胞の経時的なクローン性増殖を示す。
【０９６８】
残存ＣＡＲＴクローンの分析
図６に示すとおり、音波断片化ＤＮＡを、患者＃のＴ細胞から産生した。この材料を使用して、ＣＡＲ１９挿入に隣接するゲノム配列を増幅した。示す遺伝子は、ゲノムにおけるＣＡＲ１９に隣接する注入生成物(Ｄ０)に比して富化されているとして同定された。ＣＡＲＴ注入後の指定する種々の時点で(ｄ＝日；ｍ＝月)、隣接遺伝子の異なる相対的存在量が見られ、Ｔｅｔ２存在量は、末梢血(ＰＢＭＣ)およびＣＡＲ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞サンプル両方で５１日目にピークであった。
図７に示すとおり、ＣＡＲ１９遺伝子の挿入部位をＴｅｔ２遺伝子にマッピングした。より具体的に、挿入は、Ｔｅｔ２遺伝子のエキソン９と１０の間で生じた。Ｔｅｔ２の触媒ドメインはエキソン１１に存在した。この位置での挿入は、異常ｍＲＮＡ転写物発現または機能的(野生型)Ｔｅｔ２発現減少に至り得る。
図８に示すとおり、患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０から単離したｍＲＮＡからのＴｅｔ２遺伝子の転写物を、図の右手側に示すとおり、Ｔｅｔ２またはＣＡＲ１９または両者の指定領域にまたはるプライマーを使用するＲＴＰＣＲにより評価した。Ｒｘｎ  ３は、エキソン９および１０にまたはるＴｅｔ２転写物の領域を増幅するために設計したプライマーを含む。Ｒｘｎ、６、７、８、９および１０は、ＣＡＲ１９レンチウイルスの指定部分を増幅するために設計したプライマーである。Ｒｘｎ  １２〜１６は、Ｔｅｔ２転写物のエキソン９配列ならびにＣＡＲ１９レンチウイルス構築物からの配列を含むプライマー対である。これらのデータは、転写物がＴｅｔ２配列ならびにＣＡＲ１９配列の両方を含むＴｅｔ２座位から製造されることを示す。
【０９６９】
Ｔｅｔ２機能の分析
図１０に示すとおり、Ｔｅｔ２の酵素活性を図式化する(図１０Ａ)。Ｔｅｔファミリータンパク質は５−メチルシトシン(５−ｍｃ)を５−ヒドロキシメチルシトシン(５−ｈｍｃ)に、次いで５−ホルミルシトシン(５−ｆｍｃ)に変換し、脱メチル化シトシンをもたらす。メチル化ＤＮＡは、転写プロファイルに影響することが知られる、エピジェネティックな状態である。患者ＵＰＣＣ０４４０９−１０からのＴ細胞のメチル化状態を評価した(図１０Ｂ)。患者のＴ細胞をＴＣＲＶｂ５.１(Ｔｅｔ２にＣＡＲ１９挿入を含む)について染色し、５−ｈｍｃおよび５−ｆｍｃを、フローサイトメトリーによりＴＣＲＶｂ５.１陽性(赤色)およびＴＣＲＶｂ５.１陰性(青色)集団において評価した。このデータは、Ｔｅｔ２遺伝子におけるＣＡＲ１９挿入を含む細胞が脱メチル化欠損であることを示す。
【０９７０】
Ｔ細胞のｓｈＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤での処理
材料および方法
レンチウイルス調製およびジャーカット細胞への感染
レンチウイルスを１５cm  ２９３Ｔ細胞から調製した。簡潔には、１千万２９３Ｔ細胞を、コラーゲン被覆１５cm皿に−１日目に播種した。０日目、１５μg  ｓｈＲＮＡベクター(すなわち、ＴＥＴ２−ターゲティングまたは対照ｓｈＲＮＡをコードする配列を含むベクター)、１５μg  Ｇａｇ／ｐｏｌベクターおよび５μg  ＶＳＶ−Ｇベクターを、Lipofectamin 2000(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。２４時間後(１日目)、培地を交換した。培地交換後、ウイルス上清を２日目および３日目に採取した。ウイルスを、Lenti-X Concentrator(３：１体積比、Clonetech, Cat#: 631231)で濃縮した。１００μlのウイルスを、６μg／mlのポリブレン存在下、５０万ジャーカット細胞に添加した。細胞を２０００rpm、９０分、３２℃で回転感染させた。３７℃インキュベーターで、１時間インキュベーション後、新鮮ＲＰＭＩ  １６４０培地を添加し、２４ウェルプレートに移した。６日目、細胞を、最終濃度２μg／mlのピューロマイシン存在下、６ウェルプレートに６日移した。
【０９７１】
抗体
ウェスタンブロッティングに使用した抗体は次のとおりである。β−アクチン(クローン番号８Ｈ１０Ｄ１０、Cell Signaling)；ＴＥＴ２(クローン番号ｈＴ２Ｈ２１Ｆ１１、Millipore)；マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(ＨＲＰコンジュゲート、Cat#: 115-035-166, Jackson ImmunoResearch)；ウサギＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(ＨＲＰコンジュゲート、Cat#: 111-035-114, Jackson ImmunoResearch)。
【０９７２】
ウェスタンブロッティング
ジャーカット細胞においてＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡノックダウン効率をタンパク質レベルで試験するために、細胞ライセートを、ＲＩＰＡ緩衝液を含むプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)で調製した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce, Item#: 3603904)により測定した。２０μgのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、続いてタンパク質をiBot transfer system (Invitrogen, 20V, 11min 30sec)を使用して、ニトロセルロース膜に移した。膜を、ＴＢＳＴ含有５％ＢＳＡで、３０分、室温で遮断した。抗体を、膜と１：０００希釈で４℃で一夜インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベーション後、シグナルを化学発光検出機(Chemidoc; Bio-Rad)を使用して検出した。
【０９７３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ジャーカット細胞におけるＤＮＡレベルでのＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡノックダウン効率を試験するために、定量的逆方向転写ポリメラーゼ連鎖反応(ｑＲＴ−ＰＣＲ)を実施した。RNeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して、ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡは、SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)で一本鎖相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)に逆転写した。実時間ＰＣＲをC1000 Touch Thermal Cycler(Biorad)で実施した。ＳＹＢＲベースのプロトコールを使用して、遺伝子発現を検出した(SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, Biorad)。ＰＣＲ反応を９６ウェルプレートで実施し、製造業者が推奨するサイクリングパラメータを使用して、トリプリケートで流した(９５℃で３分、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒および６０℃で３０秒)。目的の遺伝子のサイクル閾値(Ｃｔ)値を、β−アクチンのＣｔに対して正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは次のとおりであった。β−アクチン＃１(順方向プライマー：CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC(配列番号１２６３)、逆方向プライマー：CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT(配列番号１２６４)；産物サイズ２５０bp)；β−アクチン＃２(順方向プライマー：CTC ACC ATG GAT GAT GAT ATC GC(配列番号１２６５)、逆方向プライマー：CCA CAT AGG AAT CCT TCT GAC CC(配列番号１２６６)；産物サイズ１６９bp)；ＴＥＴ１(順方向プライマー：CAG AAC CTA AAC CAC CCG TG(配列番号１２６７)、逆方向プライマー：TGC TTC GTA GCG CCA TTG TAA(配列番号１２６８)；産物サイズ１４１bp)；ＴＥＴ２(順方向プライマー：ATA CCC TGT ATG AAG GGA AGC C(配列番号１２６９)、逆方向プライマー：CTT ACC CCG AAG TTA CGT CTT TC(配列番号１２７０)；産物サイズ１９７bp)；ＴＥＴ３(順方向プライマー：CAC CCG GCT CTA TGA AAC CTT(配列番号１２７１)、逆方向プライマー：CCA GCC ACT CGA GGT AGT CA(配列番号１２７２)；産物サイズ２０９bp)；ＲＰＬＰ１(cat#: PPH17813G-200, Qiagen)。
【０９７４】
フローサイトメトリー
細胞をFACS Fortessa(ＢＤ)で得た。提示に関するデータ処理を、FlowJo(Treestar Inc.)プログラムを使用して実施した。
【０９７５】
結果
Ｔｅｔ２  ｓｈＲＮＡのノックダウン効率の検証
図２７に示すとおり、Ｔｅｔ２  ｓｈＲＮＡのノックダウン効率の検証は模式化される。Ｒｅｄ蛍光タンパク質(ＲＰＦ)およびピューロマイシン耐性遺伝子を発現するＴＥＴ２およびスクランブル制御ｓｈＲＮＡ構築物をジャーカット細胞に導入して、Ｔｅｔ２  ｓｈＲＮＡのノックダウン効率をｑＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット実験により検証した。
図２８に示すとおり、ｓｈＲＮＡ感染ジャーカット細胞はＲＦＰを発現する。ＲＦＰ発現をピューロマイシン処理６日後、ＦＡＣＳにより決定した。ＲＦＰ発現に基づき、９９％を超えるｓｈＲＮＡ導入ジャーカット細胞が、ピューロマイシン処理により選択された。注目すべきは、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＃３および＃４感染ジャーカット細胞はピューロマイシン存在下で増殖しなかった。それ故に、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＃３および＃４感染ジャーカット細胞は、さらに処理しなかった。このデータは、ピューロマイシンがｓｈＲＮＡ感染ジャーカット細胞の選択に有効であることを示す。
図２９に示すとおり、ｔｅｔ２のノックダウン効率はｓｈＲＮＡに依存する。ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ感染ジャーカット細胞におけるｔｅｔ１およびｔｅｔ２およびｔｅｔ３のｍＲＮＡ発現レベルを決定するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。スクランブルｓｈＲＮＡと比較して、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＃１、＃２、＃８および＃９は、それぞれｔｅｔ２遺伝子を３５.６％、２２.７％、２１.６％および７６.７％ノックダウンした。驚くべきことに、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＃９はｔｅｔ２を効率的にノックダウンするが、またｔｅｔ１およびｔｅｔ３発現をそれぞれ４３.４％および６７.３％下方制御もする。β−アクチンは、試験したサンプル間の相対的遺伝子発現を定量するための内部対照として役立った。ＱＲＴ−ＰＣＲの信頼性を高めるために、２個のβ−アクチンプライマーおよび１個のＲＰＬＰ１プライマーをこの実験で使用した。このデータは、いくつかのＴＥＴ２−ターゲティングｓｈＲＮＡがｍＲＮＡレベルでＴＥＴ２を減少でき、ｓｈＲＮＡ＃９が最も強固なｔｅｔ２のノックダウン効果を示し、同時にまたＴＥＴ１およびＴＥＴ２レベルに影響することを示す。
図３０に示すとおり、ｓｈＲＮＡに応答したＴＥＴ２タンパク質のノックダウンは、ｍＲＮＡレベルのＴＥＴ２のノックダウンと相関する。ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ感染ジャーカット細胞におけるＴＥＴ２のタンパク質発現レベルを決定するために、ウェスタンブロット実験を実施した。図２９に示すｑＲＴ−ＰＣＲデータと同様、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＃１、＃２、＃８および＃９は、スクランブルｓｈＲＮＡと比較して、ＴＥＴ２タンパク質レベルを減少させ、一方β−アクチンは試験した全サンプルで構成的に発現された。このデータは、いくつかのＴＥＴ２−ターゲティングｓｈＲＮＡがジャーカット細胞においてＴＥＴ２タンパク質レベルを減少でき、ｓｈＲＮＡ＃９がＴｅｔ２の最も強固なノックダウン効果を示すことを示す。
【０９７６】
ｓｈＲＮＡ  Ｔｅｔ２阻害剤での初代Ｔ細胞の処理
図１１に示すとおり、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡは、正常ヒトＴ細胞における５−ｈｍｃレベルを減少する。ＭＣｈｅｒｒｙを発現するＴＥＴ２およびスクランブル制御ｓｈＲＮＡ構築物を正常ヒトＴ細胞に導入した。５−ｈｍｃレベルを、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで増大後６日目に、ＦＡＣＳによる細胞内染色により決定した。ＴＥＴ２のノックダウンは全体的５−ｈｍｃレベルを減少させた。
図１２に示すとおり、ＴＥＴ２  ｓｈＲＮＡはＴｓｃｍ  Ｔ細胞を増大させる。ＭＣｈｅｒｒｙを発現するＴＥＴ２およびスクランブル制御ｓｈＲＮＡ構築物を正常ヒトＴ細胞に導入した。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ９５＋  Ｔｓｃｍ  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで増大後、１１日目に、ＦＡＣＳ染色により決定した。ＴＥＴ２のノックダウンは、Ｔｓｃｍ表現型を有するＴ細胞の増大を促進した。
【０９７７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを使用するＴｅｔ２阻害
本実施例において、ＴＥＴ２阻害をキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)発現Ｔ細胞において探索した。
【０９７８】
方法
ガイドＲＮＡ分子
表５に挙げるターゲティング配列を含むｇＲＮＡ分子を、実施例のこの小区分に記載する実験に使用した。特に断らない限り、全ｇＲＮＡ分子を、実施例のこの小区分に記載するｔｒａｃｒおよびｃｒＲＮＡ配列を含むデュアルｇＲＮＡ分子として試験した。
【表９５】
2018527008.tif 000106
【０９７９】
ＣＲＩＳＰＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の産生
単離および凍結したＰａｎ  Ｔ細胞を解凍し、０日目にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(CD3/CD28 CTS DYNABEADS(登録商標)43205D)で活性化した。活性化Ｔ細胞に、１日目に、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ(ＷＯ２０１６／００４６７２４号に記載のＢＣＭＡ−１０(１３９１０９)；ここではＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲと称する)またはＣＤ１９  ＣＡＲ(ＷＯ２０１２／０７９０００号の配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤ１９  ＣＡＲ；ここではＣＤ１９  ＣＡＲと称する)をコードするレンチウイルスを形質導入した。Ｏｎ日３、形質導入ＣＡＲ  Ｔ細胞をエレクトロポレーションして、予め複合体化されたｇＲＮＡ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質(“ＲＮＰ”)の形態でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを導入した。ＲＮＰを形成するために、全ＲＮＡサンプルを９５℃に加熱した。ストレプトコッカス・ピオゲネスＣＡＳ９タンパク質(ＮＬＳ  ＣＡＳ９  ｉＰＲＯＴ１０６１５４、３７μM)を緩衝液で希釈し、ｔｒａｃｒＲＮＡ(配列：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGUUUUUUU(配列番号１２９６)を有する；AXO Labs)をそれに添加した。ＣＡＳ９タンパク質とｔｒａｃｒＲＮＡを混合後、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを添加し(何れの場合も、各ｃｒＲＮＡは配列nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号４０)を含み、ここで、ｎ残基は記載するターゲティング配列の２０リボ核酸残基を表す)。予め複合体化されたＲＮＰを、次いで、計１００万細胞まで添加し、ＲＮＰ濃度は３.２μMであった。エレクトロポレーションを、ネオンエレクトロポレーターにより、Neon(登録商標)Transfection System 100 μL Kit(MPK10096)を１６００Ｖ、１０ms、３パルスで使用して実施した。細胞を、７日以上培養で維持した。次いで、細胞を分け、一部をフローサイトメトリーの実施に使用した：ＣＡＲ(ＰＥ)、ＣＤ３(ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５)、ＣＤ４(Ｖ４５０)およびＣＤ８(ＡＰＣ)で染色。残ったＴ細胞を凍結し、機能的アッセイおよび次世代シークエンシング(ＮＧＳ)サンプル生成に使用した。
【０９８０】
次世代シークエンシング(ＮＧＳ)サンプル生成
凍結編集細胞ペレット(上記)を解凍し、DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, 69506)を使用して処理して、ゲノムＤＮＡを単離した。溶出ＤＮＡをTitanium Taq PCRキット(Clontech Laboratories, 639211)およびＴＥＴ２プライマー(ｇＲＮＡの予測標的部位に隣接するように設計されたプライマー)を使用するＰＣＲの実施に使用した。ＰＣＲ産物を QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, 28104)を使用して精製した。次いで、精製ＰＣＲ産物を、塩基対不整合を検出し、遺伝子編集を確認するＴ７Ｅ１アッセイに使用した。ＰＣＲアンプリコンを、標準的Nextera NGS library prep(Illumina)に付し、Illumina MiSeqシークエンサーでペアードエンド読み取りデータにより配列決定した。シークエンシング読み取りデータを参照ゲノムに対して整列させ、バリアントをコールした。
【０９８１】
サイトカイン産生アッセイ
エフェクター細胞(ＣＡＲ  Ｔ細胞)をアッセイの日に解凍し、Cellometer(Nexelcom)で計数する。次いで、これらの細胞を種々の標的細胞と、エフェクター：標的細胞比２：１で共培養する。１００μlの共培養上清を２０時間後採取する。次いで、これらの上清を使用して、製造業者のプロトコールに従いMeso Scale Discovery, Proinflammatory Panel 1 catalog # N05049A-1を使用して、放出されたサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇを測定する。
【０９８２】
Ｔ細胞増殖アッセイ
ＢＣＭＡ−またはＣＤ１９発現標的細胞に応答したＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を評価した。標的細胞株は、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株、ＮＣＩ−Ｈ９２９−ｌｕｃ、ＫＭＳ−１１−ｌｕｃおよびＢＣＭＡ陰性Ｎａｌｍ６ｌｕｃ(ＣＤ１９陽性細胞株)であった。ＣＡＲ  Ｔ細胞を解凍し、２時間、Ｔ細胞培地とインキュベートして、回復させた。細胞をCellometerで計数した。標的細胞を１０,０００ラドで照射した。照射後、標的細胞を完全Ｔ細胞培地で２回洗浄し、計数した。次いで、３０,０００照射標的細胞をＣＡＲＴ細胞と１：１比で共培養した。陰性対照として、ＣＡＲ  Ｔ細胞に培地のみを添加した。
共培養物を４日、３７℃でインキュベートした。４日目に、共培養細胞を、２０分、氷上でCD3-percp cy5.5(Ebioscience:45-0037)、CD4-eflor450(Ebioscience:48-0047)およびCD8-APC(Ebioscience 17-0087)で染色し、CountBright Absolute Counting Beads(Life Technologies)に対してフローサイトメトリーで測定して、相対細胞数を決定した。ＣＡＲ発現を、各２０分、氷：ビオチニル化−タンパク質Ｌ＋ストレプトアビジン−ＰＥ(Jackson immuno research)上の２段階インキュベーションにより測定した。フローサイトメトリーデータをBD 5 laser Fortessaを使用して獲得し、FlowJoソフトウェアで分析した。
【０９８３】
結果
図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｔｅｔ２  ＣＲＩＳＰＲ存在下および非存在下エレクトロポレーションした細胞におけるＣＡＲ発現を示す。図１３Ａは、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を決定するゲーティング戦略を示す。リンパ球を、囲んだとおり、前方散乱光(ＦＳＣ−Ａ)および側方散乱光(ＳＳＣ−Ａ)を使用して選択した。次いで、ＣＤ３発現細胞を選択した(中央パネル)。棒により示したＣＡＲ陽性(ビオチニル化タンパク質およびストレプトアビジン−ＰＥによるＣＡＲ検出を使用するＰＥ陽性細胞)細胞を、次いで、陰性対照ピークに対するゲーティングにより決定した。図１３Ｂは、ＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージの定量を示す。細胞を、示すＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲまたはＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入した。細胞を、Ｃａｓ９タンパク質、トレーサーＲＮＡおよび記載するガイドＲＮＡターゲティングＴｅｔ２(Ｅｘ３−３ターゲティングエキソン３またはＥｘ９−６ターゲティングエキソン９)を含むＲＮＰでエレクトロポレーションするか、エレクトロポレーションしなかった。ＣＡＲ発現を、細胞をビーズで活性化１０日後決定した。これらのデータは、Ｔｅｔ２の編集がＴ細胞におけるＣＡＲ発現に影響しないことを示す。
【０９８４】
図１４は、ＣＡＲ形質導入およびＴｅｔ２編集後のＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の定量を示す。細胞を、１０日のビーズ増大の最後にＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現について染色した。左パネルは、ＣＤ３＋細胞の総集団におけるＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞のパーセンテージを示す。右パネルは、ＣＡＲ＋でもあるＣＤ３＋細胞の集団におけるＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞のパーセンテージを示す。細胞を、記載するとおり、ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲまたはＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入するか、未形質導入(ＵＴＤ)のままにした。細胞をＣａｓ９タンパク質、トレーサーＲＮＡおよび記載するガイドＲＮＡターゲティングＴｅｔ２(Ｅｘ３−３ターゲティングエキソン３およびＥｘ９−６ターゲティングエキソン９)を含むＲＮＰでエレクトロポレーションするかまたはエレクトロポレーションしなかった。これらのデータは、Ｔｅｔ２の編集が、小さな、しかし、一貫した、ＣＤ８細胞のパーセンテージおよびＣＤ４パーセンテージ増加を、ビーズベースの増大過程のウィンド時間の間示すことを示す。
【０９８５】
図１５は、１０日のビーズ増大後の細胞収率および生存能を示す。mLあたりの細胞数(左パネル)および細胞の生存能(右パネル)を、１０日ビーズ増大過程後Cellometerにより測定した。細胞を、記載するとおり、ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲまたはＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入するか、未形質導入(ＵＴＤ)のままにした。細胞を、Ｃａｓ９タンパク質、トレーサーＲＮＡおよび記載するガイドＲＮＡターゲティングＴｅｔ２(Ｅｘ３−３ターゲティングエキソン３およびＥｘ９−６ターゲティングエキソン９)を含むＲＮＰでエレクトロポレーションするかまたはエレクトロポレーションしなかった。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を有しない細胞と比較して細胞数および生存能を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ｅｘ９−６)が、非形質導入ならびにＣＡＲ形質導入細胞に最大の影響を示すことを示す。
【０９８６】
図１６は、ＣＡＲにより認識される抗原について陽性または陰性である細胞に応答したＩＬ−２産生を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)をＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)と共培養し、培地へのサイトカイン分泌を測定した。ＩＬ−２(pg／ml)レベルを示す。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＩＬ−２産生を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(Ｅｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９８７】
図１７はインターフェロンガンマ産生を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)をＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)と共培養し、培地へのサイトカイン分泌を測定した。インターフェロンガンマ(ＩＦＮ−ｇ)(pg／ml)レベルを示す。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるインターフェロンガンマ産生を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(Ｅｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９８８】
図１８は、抗原駆動ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)を、ＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)または無標的細胞(培地)と共培養し、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖を測定した。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＣＡＲ＋  Ｔ細胞増殖を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ＣｒＥｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９８９】
図１９は、抗原駆動総Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)を、ＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)または無標的細胞(培地)と共培養し、全ＣＤ３＋  Ｔ細胞の増殖を測定した。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＣＤ３＋  Ｔ細胞増殖を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ＣｒＥｘ９−６)が最大効果を示す。
【０９９０】
図２０は、抗原駆動ＣＡＲ＋  Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)を、ＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)または無標的細胞(培地)と共培養し、全ＣＤ４＋  ＣＤ３＋  Ｔ細胞の増殖を測定した。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ＣｒＥｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９９１】
図２１は、抗原駆動ＣＡＲ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)を、ＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)または無標的細胞(培地)と共培養し、全ＣＡＲ＋ＣＤ４＋  ＣＤ３＋  Ｔ細胞の増殖を測定した。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＣＡＲ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ＣｒＥｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９９２】
図２２は、抗原駆動ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)を、ＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)または無標的細胞(培地)と共培養し、全ＣＤ８＋  ＣＤ３＋  Ｔ細胞の増殖を測定した。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ＣｒＥｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９９３】
図２３は、抗原駆動ＣＡＲ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞(ＵＴＤ)を、ＢＣＭＡ陽性／ＣＤ１９陰性細胞(ＫＭＳ１１およびＮＣＩＨ９２９)またはＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性細胞(ＮＡＬＭ６)または無標的細胞(培地)と共培養し、全ＣＡＲ＋ＣＤ８＋  ＣＤ３＋  Ｔ細胞の増殖を測定した。細胞は上記のとおり調製した。これらのデータは、Ｔｅｔ２編集が抗原に応答するＴ細胞によるＣＡＲ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を増加させ、エキソン９ターゲティングガイド(ＣｒＥｘ９−６)が最大効果を示すことを示す。
【０９９４】
図２４は、Ｔｅｔ２ターゲティングＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの導入による、％編集および％フレームシフト編集を示す。Ｃａｓ９タンパク質、トレーサーＲＮＡおよびＴｅｔ２のエキソン３またはエキソン９の何れかをターゲティングする記載するガイドＲＮＡを含むＲＮＰのエレクトロポレーション後の初代Ｔ細胞における編集レベルを示す。参照ゲノムと比較した、観察されるヌクレオチドの挿入または欠失パーセンテージを中央カラム(平均％挿入／欠失)に示す。オープンリーディングフレームのシフトをもたらす編集は最右カラム(平均％フレームシフト)に示す。これらのデータはトリプリケートの平均である。これらのデータは、これらのガイドＲＮＡ配列での初代Ｔ細胞における高度に効率的なゲノム編集を示す。
【０９９５】
各ｇＲＮＡの標的部位またはその近辺に存在する挿入および欠失パターンを、次世代シークエンシングにより評価した。簡潔には、Ｔ細胞を、記載するガイドＲＮＡを含むＲＮＰでエレクトロポレーションした。４８時間後、ＤＮＡを単離し、シークエンシングのために処理した。図２５は、Ｔｅｔ２のエキソン３をターゲティングするガイドＲＮＡについて初代Ｔ細胞で観察される５個の最も共通のインデル(挿入および／または欠失)を示す。図２６は、Ｔｅｔ２のエキソン９をターゲティングするガイドＲＮＡについて初代Ｔ細胞で観察される５個の最も共通のインデル(挿入および／または欠失)を示す。パーセンテージは、ある編集パターンが観察された頻度を示す。挿入は小文字ヌクレオチド(“ａ”、“ｇ”、“ｃ”または“ｔ”)により示し、一方欠失はダッシュ(“−”)により示す。
【０９９６】
ＡＴＡＣ−Ｓｅｑ実験
Ｔｅｔ２挿入されたまたはされていないＣＤ８＋  Ｔ細胞を、患者の注入後サンプルから増大した。クロマチンアクセシビリティを、Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing(ＡＴＡＣ−ｓｅｑ)を使用して、評価した。これは、本質的に“バーコード化”ＤＮＡフラグメントの転位に基づく包括的クロマチンマッピングの技法である。これらのＤＮＡフラグメントは、開放型クロマチンの領域に取り込まれ、これは、どのクロマチン領域が開放か閉鎖であるかの決定を可能とする。開放または閉鎖領域の位置に基づき、“開放”は“発現”に等しく、“閉鎖”は“抑制”に等しいとの仮定を元に、経路分析が実施できる。図３０Ａは、Ｔｅｔ２破壊した患者からのＣＡＲ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＡＴＡＣピークを、Ｔｅｔ２破壊していない一致した時点での同患者からのＣＡＲ−ＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較したベン図を示す。図２８Ｂは、Ｔｅｔ２破壊した細胞集団において、そのカウンターパートと比較して、より密接にＡＴＡＣピークと関係しているＧＯ用語を示す。図３０Ｂの重要性は、少なくとも一部、Ｔｅｔ２破壊されたＣＤ８＋  Ｔ細胞のクロマチン景観が、より“早期の記憶様”および低“エフェクター様”であり得る低分化細胞とおそらくいっちすることである。これらは、強固なおよび長期抗腫瘍活性を提供するために持続すると考えられる種の細胞である。
【０９９７】
ＳｈＲＮＡ試験
健常ドナーからのＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズで２４時間活性化し、続いて、非ターゲティング(対照)ｓｈＲＮＡまたはＴｅｔ２  ｓｈＲＮＡでレンチウイルス形質導入した。図３２Ａに示すとおり、ノックダウン効率をｑＰＣＲにより評価し、５０％であることが示された(Ｔｅｔ２がレンチウイルス組込みにより破壊された患者において何が起こっているかを反映し得る)。分化表現型を、１４日目にＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯの試験により試験した。中央記憶細胞はＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋として、エフェクター細胞はＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ−として定義する。特に５０％Ｔｅｔ２ノックダウンされた細胞における分化表現型を試験するために、ＧＦＰインディケーターをｓｈＲＮＡ構築物で使用した。結果を図３２Ｂおよび３２Ｃに示す。
【０９９８】
さらなる記載を要することなく、当業者は、上記および以下の実施例を使用して、本発明の化合物を製造し、本発明方法を実施できる。実施例は、本発明の種々の態様を特定的に記載しており、本記載は如何なる意味においても限定的に解釈されてはならない。
【０９９９】
等価物
ここに引用する各々および全特許、特許出願および刊行物の記載は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は特定の態様を参照して開示しているが、他の当業者により、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変更が考案され得ることは明らかである。添付する特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価な変動を含むと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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