(57)【要約】治療薬を含有するリン脂質でコーティングされたナノ粒子、該ナノ粒子を含む組成物、および該ナノ粒子および組成物を作製および使用する方法。
2018527289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子であって、該ナノ粒子が、投与のための水性送達ビヒクル中で安定であり、生理的流体に暴露されると実質的に瞬時に治療薬を放出する、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項２】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子であって、該ナノ粒子が、投与のための水性送達ビヒクル中で、治療薬を含有する合成高分子ミセル(Genexol-PM(登録商標))と同程度に安定であり、生理学的条件下で治療薬を放出するのに、ヒト血清アルブミンでコーティングされた治療薬(アブラキサン(登録商標))と同程度に有効である、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項３】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子であって、該リン脂質が、モノアシルリン脂質およびジアシルリン脂質を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項４】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子であって、該ナノ粒子が、リン脂質組成に基づいて実質的に電子的に中性である、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項５】
本質的に、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬からなる、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項６】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬からなる、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項７】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子であって、該リン脂質が、モノアシルリン脂質である、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項８】
1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子であって、該リン脂質が、炭素原子数10〜16の脂肪酸成分を有するジアシルリン脂質である、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子。
【請求項９】
該リン脂質が、ジアシルリン脂質である、請求項1、2、および4-6のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１０】
該リン脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジン酸、ならびにそれらの混合物から選択されるジアシルリン脂質である、請求項1-6および8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１１】
該リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジン酸、ならびにそれらのリゾホスファチジルおよびジアシルリン脂質対応物から選択される、請求項1-6および8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１２】
該リン脂質が、ホスファチジルコリンである、請求項1-6および8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１３】
該リン脂質が、炭素数10〜22の脂肪酸成分を有するホスファチジルコリンである、請求項1-6のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１４】
該リン脂質が、炭素数10〜12の脂肪酸成分を有するホスファチジルコリンである、請求項1-6および8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１５】
該リン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジリノレオイルホスファチジルコリン DLPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルリノレオイルホスファチジルコリン、ステアロイルリノレオイルホスファチジルコリン ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン、ステアロイルアラキドイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン(DDPC)、ジエルコイルホスファチジルコリン(DEPC)、ジリノレオイルホスファチジルコリン(DLOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン(MSPC)、ステアロイルミリストイルホスファチジルコリン(SMPC)、パルミトイルミリストイルホスファチジルコリン(PMPC)、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、ステアロイルパルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン(SOPC)、およびそれらのジアシルリゾ-ホスファチジルコリン対応物から選択されるジアシルホスファチジルコリンである、請求項1-6および8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１６】
該リン脂質が、モノアシルリン脂質である、請求項1、2、および4-6のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１７】
該リン脂質が、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、およびリゾホスファチジン酸、ならびにそれらの混合物から選択されるモノアシルリン脂質である、請求項1-7のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１８】
該リン脂質が、リゾホスファチジルコリンである、請求項1-7のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項１９】
該リン脂質が、炭素数10〜22の脂肪酸成分を有するリゾホスファチジルコリンである、請求項1-7のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２０】
リン脂質が、炭素数10〜12の脂肪酸成分を有するリゾホスファチジルコリンである、請求項1-7のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２１】
該リン脂質が、ジアシルリン脂質とモノアシルリン脂質との組み合わせである、請求項1、2、および4-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２２】
リン脂質が、ホスファチジルコリンとリゾホスファチジルコリンとの組み合わせである、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２３】
ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質の比が、約90：10〜約60：40重量/重量(w/w)パーセントである、請求項3、21、および22のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２４】
ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質の比が、約80：20 w/wパーセントである、請求項3、21、および22のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２５】
該治療薬が、2.0より大きいX logPを有する治療薬である、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２６】
該治療薬が、鎮痛薬/解熱薬、麻酔薬、抗喘息薬、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗真菌剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗不安剤、免疫抑制剤、抗片頭痛薬、鎮静薬/催眠薬、抗狭心症薬、抗精神病薬、抗躁病薬、抗不整脈薬、抗関節炎薬、抗痛風薬、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗線維素溶解剤、血液レオロジー剤、抗血小板剤、抗けいれん剤、抗パーキンソン薬、抗ヒスタミン薬/抗掻痒薬、カルシウム調節に有用な薬剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗感染薬、気管支拡張薬、ホルモン、低血糖症薬、脂質低下薬、タンパク質、核酸、赤血球形成促進に有用な薬剤、抗潰瘍剤/逆流防止剤、抗嘔吐剤/制吐剤、および油溶性ビタミンから選択される、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２７】
該治療薬が、アドリアマイシン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキセート、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン(BCNU)、メチル-CCNU、シスプラチン、エトポシド、テニポシド、ダウノマイシン、インドメタシン、ビフェニルジメチルジカルボキシレート、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、パクリタキセルおよびその誘導体、ドセタキセルおよびその誘導体、エポチロンおよびその誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、エトポシド、またはピポスルファンから選択される抗新生物剤である、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２８】
該治療薬が、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項２９】
該治療薬が、結晶形態である、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項３０】
該治療薬が、非晶質形態である、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項３１】
該ナノ粒子が、約30〜300nmの平均直径を有する、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項３２】
該ナノ粒子が、約80〜200nmの平均直径を有する、請求項1-8のいずれか1つに記載のナノ粒子。
【請求項３３】
請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項３４】
該ナノ粒子が、乾燥粉末の形態である、請求項33に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３６】
該ナノ粒子が、水性媒体中に安定に懸濁される、請求項35に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
該組成物が、粒径安定化剤をさらに含む、請求項35に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む注射用医薬組成物。
【請求項３９】
請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む、個体を治療するための単位投与剤形。
【請求項４０】
請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子を含む容器、該ナノ粒子を再構成するための薬学的に許容される担体を含む容器、および疾患または状態の治療においてキットを使用するための説明書を含むキット。
【請求項４１】
薬学的に許容される担体中に懸濁された請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子を含む容器、および疾患または状態の治療においてキットを使用するための説明書を含むキット。
【請求項４２】
請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体における疾患または状態の治療方法。
【請求項４３】
該疾患または状態が、増殖性の疾患または状態である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
該治療薬がパクリタキセルであり、該疾患がパクリタキセルを投与することによって治療可能な疾患である、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
該治療薬がパクリタキセルであり、該疾患がパクリタキセルを投与することによって治療可能な癌である、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の製造方法であって、それに分散された治療薬を含有する有機相と、リン脂質を含有する水性媒体とを高圧ホモジナイザー中で高せん断条件に付して、均質化されたリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子混合物を提供することを含む方法。
【請求項４７】
有機相を高せん断条件に付すことが、高圧ホモジナイザーを約3,000〜30,000psiの範囲の圧力で使用することを含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
混合物から有機相を除去することをさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
混合物から水性媒体を除去することをさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
有機相が、実質的に水と混和しない有機溶媒と水溶性有機溶媒との混合物を含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５１】
該水性媒体が、水、緩衝化水性媒体、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アミノ酸の溶液、糖の溶液、ビタミンの溶液、炭水化物の溶液、またはその組み合わせから選択される、請求項46に記載の方法。
【請求項５２】
該ナノ粒子が、約30〜300nmの平均直径を有する、請求項46に記載の方法。
【請求項５３】
滅菌濾過することをさらに含む、請求項46に記載の方法。
【請求項５４】
該ナノ粒子が、請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子である、請求項46に記載の方法。
【請求項５５】
混合物から水性媒体を除去することが、混合物を凍結乾燥してナノ粒子粉末を提供することを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５６】
該ナノ粒子が、請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の製造方法であって、
治療薬およびリン脂質を有機相に溶解して溶液を提供すること；
溶液を濃縮乾固して薄膜を提供すること；および
薄膜を水で水和させて、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の水性懸濁液を提供すること；
を含む方法。
【請求項５８】
該有機相が、エタノールを含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
溶液を濃縮乾固することが、回転蒸発を含む、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
水が、脱イオン水である、請求項57に記載の方法。
【請求項６１】
該粒子が、約30〜300nmの平均直径を有する、請求項57に記載の方法。
【請求項６２】
水性懸濁液を滅菌濾過することをさらに含む、請求項57に記載の方法。
【請求項６３】
該ナノ粒子が、請求項1-32のいずれか1つに記載のナノ粒子である、請求項57に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年6月1日出願の米国仮出願第62/169,397号、2015年12月4日出願の米国仮出願第62/263,453号、および2016年4月15日出願の米国仮出願第62/323,335号の利益を主張する。上記各出願の開示の全体は、参照することにより本出願に特に包含される。
【背景技術】
【０００２】
疎水性治療薬の効果的な送達は、製薬産業にとって依然として興味深い問題である。これらの課題は、投与のためのビヒクル中にこれらの治療薬を処方することの困難性に関する。歴史的に、疎水性治療薬は、治療薬の用量およびバイオアベイラビリティなどの送達特性に関して有利ではない送達ビヒクル中で投与される。さらに、ビヒクルそれ自体が重大な副作用を伴うことが観察されることがある。
【０００３】
長年にわたってパクリタキセルの製剤化は、多くの疎水性治療薬に関連する課題の一例である。
【０００４】
パクリタキセルは、最も有効な化学療法薬の1つであり、主に乳癌、肺癌および卵巣癌を治療するために使用される。タキソール(登録商標)は、本質的に水不溶性のパクリタキセルを可溶化して送達するために、溶媒、クレモフォールELを利用するパクリタキセル製剤である。タキソール(登録商標)の短所および副作用は、この溶媒と直接関連する。
【０００５】
パクリタキセルもナノ粒子として製剤化されている。Abraxane(登録商標)は、タキソール(登録商標)と比較して改善されたパクリタキセル溶解性(0.35-0.7μg/mL)を有するナノ粒子パクリタキセル製剤であり、有害な溶媒の使用を回避する。アブラキサン(Abraxane)(登録商標)は、ヒト血清アルブミンでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子である。生物学的ポリマーではなく生体適合性化学ポリマーを使用してナノ粒子を安定化する高分子ミセルパクリタキセル製剤であるCynviloq(登録商標)は、次世代のパクリタキセル製品である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既知の疎水性治療薬製剤に伴う欠点を克服する代替製剤の開発の進歩にもかかわらず、改善された特性を有する疎水性治療薬の新規製剤が必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たすことを追求し、さらに関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概略
本発明は、注射による投与に適したリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子、ナノ粒子を含む医薬組成物、治療薬によって治療可能な疾患および状態を治療する方法、およびナノ粒子の製造方法を提供する。
【０００８】
1つの態様では、本発明は、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を提供する。
【０００９】
1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、投与のための水性送達ビヒクル中で安定であり、生理的流体に暴露されると実質的に瞬時に治療薬を放出する、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含む。
【００１０】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該ナノ粒子は、投与のための水性送達ビヒクル中で、治療薬を含有する合成高分子ミセル(Genexol-PM(登録商標)、Cynviloq(登録商標))と同程度に安定であり、生理学的条件下で治療薬を放出するのに、ヒト血清アルブミンでコーティングされた治療薬(アブラキサン(登録商標))と同程度に有効である。
【００１１】
さらなる実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該リン脂質はモノアシルリン脂質である。
【００１２】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒状治療薬を含み、該リン脂質は、モノアシルリン脂質およびジアシルリン脂質を含む。
【００１３】
さらなる実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒状治療薬を含み、該リン脂質は、炭素原子数10〜16の脂肪酸成分を有するジアシルリン脂質である。
【００１４】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該ナノ粒子は、リン脂質組成に基づいて実質的に電子的に中性である。
【００１５】
さらなる実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、本質的に、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬からなる。
【００１６】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬からなる。
【００１７】
本発明のナノ粒子の特定の実施態様では、リン脂質は、ジアシルリン脂質である。好適なジアシルリン脂質として、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジン酸、ならびにそれらの混合物が挙げられる。特定の実施態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリンである。特定の実施態様では、リン脂質は、炭素数10〜22の脂肪酸成分を有するホスファチジルコリンである。他の実施態様では、リン脂質は、炭素数10〜12の脂肪酸成分を有するホスファチジルコリンである。
【００１８】
本発明のナノ粒子の特定の実施態様では、リン脂質は、モノアシルリン脂質である。好適なモノアシルリン脂質として、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、およびリゾホスファチジン酸、およびそれらの混合物が挙げられる。特定の実施態様では、リン脂質は、リゾホスファチジルコリンである。特定の実施態様では、リン脂質は、炭素数10〜22の脂肪酸成分を有するリゾホスファチジルコリンである。他の実施態様では、リン脂質は、炭素数10〜12の脂肪酸成分を有するリゾホスファチジルコリンである。
【００１９】
本発明のナノ粒子の特定の実施態様では、リン脂質は、ジアシルリン脂質とモノアシルリン脂質との組み合わせである。特定の実施態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリンとリゾホスファチジルコリンとの組み合わせである。ジアシルリン脂質とモノアシルリン脂質との組み合わせを含む特定の実施形態では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質の比は、約90：10〜約60：40重量/重量(w/w)％である。他の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質の比は、約80：20 w/w ％
【００２０】
特定の実施態様では、ナノ粒子は、2.0より大きいX logPを有する治療薬を含む。
【００２１】
適切な治療薬として、鎮痛薬/解熱薬、麻酔薬、抗喘息薬、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗真菌剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗不安剤、免疫抑制剤、抗片頭痛薬、鎮静薬/催眠薬、抗狭心症薬、抗精神病薬、抗躁病薬、抗不整脈薬、抗関節炎薬、抗痛風薬、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗線維素溶解剤、血液レオロジー剤、抗血小板剤、抗けいれん剤、抗パーキンソン薬、抗ヒスタミン薬/抗掻痒薬、カルシウム調節に有用な薬剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗感染薬、気管支拡張薬、ホルモン、低血糖症薬、脂質低下薬、タンパク質、核酸、赤血球形成促進に有用な薬剤、抗潰瘍剤/逆流防止剤、抗嘔吐剤/制吐剤、および油溶性ビタミンが挙げられる。特定の実施態様では、治療薬は、化学療法剤である。代表的な化学療法剤として、パクリタキセルおよびその誘導体、ならびにドセタキセルおよびその誘導体などのタキサンが挙げられる。特定の実施態様では、治療薬は、パクリタキセルである。
【００２２】
特定の実施態様では、治療薬は、結晶形態である。他の実施態様では、治療薬は、非晶質形態である。
【００２３】
特定の実施態様では、ナノ粒子は、約30〜300nmの平均直径を有する。他の実施態様では、ナノ粒子は、約80〜200nmの平均直径を有する。
【００２４】
もう1つの態様では、本発明は、本発明のナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
特定の実施態様では、ナノ粒子は、乾燥粉末の形態である。
【００２６】
特定の実施態様では、該組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００２７】
組成物の特定の実施態様では、ナノ粒子は、水性媒体中に安定に懸濁される。特定のこれらの態様では、組成物は、粒径安定化剤をさらに含む。
【００２８】
特定の実施態様では、組成物は、注射用の医薬組成物であり、本発明のナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、本発明のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む、個体を治療するための単位投与剤形を提供する。
【００３０】
本発明のもう1つの態様では、キットが提供される。1つの実施態様では、キットは、本発明のナノ粒子を含む容器と、ナノ粒子を再構成するための薬学的に許容される担体を含む容器とを含む。もう1つの実施態様では、キットは、薬学的に許容される担体中に懸濁された本発明のナノ粒子を含む容器を含む。キットは、任意に、疾患または状態の治療においてキットを使用するための説明書を含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様では、個体における疾患または状態を治療する方法が提供される。特定の実施態様では、方法は、それを必要とする個体に本発明のナノ粒子の有効量を投与することを含む。特定の実施態様では、疾患または状態は、増殖性の疾患または状態である。特定の実施態様では、治療薬はパクリタキセルであり、この疾患はパクリタキセルを投与することによって治療可能な疾患である。特定の実施態様では、治療薬は、パクリタキセルであり、疾患はパクリタキセルを投与することによって治療可能な癌である。
【００３２】
もう1つの態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を調製する方法が提供される。1つの実施態様では、ナノ粒子は、マイクロ流体化-溶媒除去法によって調製される。もう1つの実施態様では、ナノ粒子は、薄膜水和法によって調製される。
【００３３】
特定の実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の製造方法は、それに分散された治療薬を含有する有機相と、リン脂質を含有する水性媒体とを高圧ホモジナイザー中で高せん断条件に付して、均質化されたリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子混合物を提供することを含む。特定の実施態様では、方法は、混合物を滅菌濾過するステップをさらに含む。1つの実施態様では、有機相を高せん断条件に付すことは、高圧ホモジナイザーを約3,000〜30,000psiの範囲の圧力で使用することを含む。特定の実施態様では、該方法は、混合物から有機相を除去することをさらに含む。特定の実施態様では、該方法は、混合物から水性媒体を除去することをさらに含む。特定の実施態様では、混合物から水性媒体を除去することは、混合物を凍結乾燥してナノ粒子粉末を提供することを含む。
【００３４】
他の実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の製造方法は、治療薬およびリン脂質を有機相に溶解して溶液を提供すること、溶液を濃縮乾固して薄膜を提供すること、および薄膜を水で水和させて、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の水性懸濁液を提供することを含む。特定の実施態様では、有機相は、エタノールである。特定の実施態様では、溶液を濃縮乾固することは回転蒸発を含む。特定の実施態様では、水は、脱イオン水である。特定の実施態様では、方法は、水性懸濁液を滅菌濾過することをさらに含む。
【００３５】
特定の実施態様では、本発明の方法は、本発明のナノ粒子を提供する。
【００３６】
図面の説明
本発明の前述の態様および付随する多くの利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるようになるにつれて、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】パクリタキセル療法の製剤の進化を比較する概略図である。
【図２】本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を製造するのに有用なリン脂質(ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリン)の化学構造を模式的に示す。
【図３】マイクロ流動化-溶媒蒸発法によって調製された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子のナノ粒子サイズおよびサイズ分布を比較するグラフである。
【図４】本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、ナノ粒子サイズおよび治療薬封入効率におけるリン脂質およびリゾリン脂質比の効果を比較する。
【図５】マイクロ流動化-溶媒蒸発法によって調製された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、ナノ粒子サイズおよび治療薬封入効率における押出サイクル数の効果を比較する。
【図６】本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、粒子サイズを時間の関数として比較する。
【図７】マイクロ流動化法および薄膜蒸発法によって調製された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、粒子サイズ(t=0における)およびパクリタキセル封入(％)を比較する。
【図８】マイクロ流動化法および薄膜蒸発法によって調製された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子(PC12：リゾ12)について、電気化学的応答(サイクリックボルタンメトリー：電流(mA)対印加電位(V))を比較する。
【図９】パクリタキセル濃度(μg/mL)の関数としての粒子サイズ(nm)を示す、脱イオン水(DI)、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、およびヒト血漿(50mg/mLヒト血清アルブミン/PBS)中の本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子の溶出を比較する。
【図１０Ａ−１０Ｃ】パクリタキセル濃度(μg/mL)の関数としての粒子サイズ(nm)を示す、脱イオン水(水)、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、血清(0.1X：5mg/mL HSA/PBS)、血清(1.0X：50 mg/mL HSA/PBS)、人工血漿(50 mg/mL HSA/PBS)、および血漿中のアブラキサン(登録商標)ナノ粒子(10A)、Genexol-PM(登録商標)ナノ粒子(10B)、および本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子(10C)の溶出を比較する。
【図１１】マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)および薄膜-水和蒸発法(方法2)によって調製された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子について、パクリタキセルローディング(%)を比較する。
【図１２】マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)および薄膜-水和蒸発法(方法2)によって調製された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子について、粒子サイズ(nm)を比較する。
【図１３】薄膜-水和蒸発法(方法2)によって調製された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、PC炭素長(6-22)の関数として、パクリタキセルローディング(%)を比較する。
【図１４】薄膜-水和蒸発法(方法2)によって調製された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、再水和の水温の関数として、パクリタキセルローディング(%)を比較する。
【図１５】マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)によって調製された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子(LM-101)について、凍結保護剤および凍結保護剤の量の関数として、粒子サイズを比較する。
【図１６】マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)によって調製された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子(LM-101)について、3.2mMヒスチジン緩衝液(pH5.5)で再構成した後の時間(t=0時間および4時間)の関数として、粒子サイズを比較する
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な記載
本発明は、注射による投与に適したリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子、ナノ粒子を含む医薬組成物、治療薬によって治療可能な疾患および状態を治療するための方法、およびナノ粒子の製造方法を提供する。
【００３９】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子
１つの態様では、本発明は、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を提供する。
【００４０】
1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該ナノ粒子は、投与のための水性送達ビヒクル(たとえば、注射用のビヒクル)中で安定であり、生理的流体に暴露されると実質的に瞬時に治療薬を放出する。本明細書で使用される場合、用語「実質的に瞬時に」とは、血液、血清、血漿などの生理的流体に接触(たとえば、静脈内注射)した後、約1秒以内、約2秒以内、約5秒以内、約10秒以内、または約30秒以内のナノ粒子からの治療薬の放出を示す。
【００４１】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該ナノ粒子は、投与のための水性送達ビヒクル中で、治療薬を含有する合成高分子ミセル(Genexol-PM(登録商標)、Cynviloq(登録商標))と同程度に安定であり、生理学的条件下で治療薬を放出するのに、ヒト血清アルブミンでコーティングされた治療薬(アブラキサン(登録商標))と同程度に有効である。
【００４２】
さらなる実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、１つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該リン脂質は、モノアシルリン脂質である。1つの実施態様では、リン脂質に関して、該ナノ粒子は、モノアシルリン脂質のみを含んでもよく、またはジアシルリン脂質をさらに含んでもよい。
【００４３】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、１つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該リン脂質は、モノアシルリン脂質およびジアシルリン脂質を含む。
【００４４】
さらなる実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、１つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該リン脂質は、炭素原子数10〜16の脂肪酸成分を有するジアシルリン脂質である。1つの実施態様では、リン脂質に関して、該ナノ粒子は、モノアシルリン脂質をさらに含んでもよい。
【００４５】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬を含み、該ナノ粒子は、リン脂質組成に基づいて実質的に電子的に中性である。
【００４６】
さらなる実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、本質的に、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬からなる。
【００４７】
もう1つの実施態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒子状治療薬からなる。
【００４８】
上記のように、本発明は、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を提供する。本明細書中で使用される「リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子」は、1つ以上のリン脂質でコーティングされた粒状形態の治療薬を含むナノ粒子を示す。本発明のナノ粒子では、粒子状治療薬をコーティングするリン脂質は、治療薬を有利に安定化させ、その有効な投与を容易にする。
【００４９】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子が、疎水性または実質的に水不溶性の治療薬の有効な製剤および送達を提供するのが有利である。本発明のナノ粒子として有利に製剤される治療薬は、疎水性または実質的に水不溶性の薬理学的に活性な薬剤(すなわち、水性または親水性環境において制限された溶解度を有する任意の生物活性剤)を包含する。たとえば、20〜25℃におけるこれらの薬剤の水への溶解度は、約5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、または0.01mg/mL未満であり得る。
【００５０】
本発明のナノ粒子としての製剤から利益を得る候補治療薬として適切である治療薬の特徴は、それらのオクタノール/水分配係数X logPによって定義される、化学療法薬などの治療薬を包含する(Wang et al. Chem. Inf. Comput. Sci. 1997、37、615-621)。例えば、パクリタキセルの係数は3.0である。本発明の実施において、2.0より大きいX logPを有する治療剤は、本発明のナノ粒子への封入のための優れた候補である。この特徴は、非経口投与のために現在使用されている承認された医薬品の半分以上を包含する。
本明細書で使用される「疎水性」および「実質的に水不溶性」および「水難溶性」という用語は、2.0より大きいオクタノール/水分配係数X log P、および特定の実施態様では3.0より大きいオクタノール/水分配係数X logP、および他の実施態様では4.0より大きいオクタノール/水分配係数X logPを有する治療薬を示す。
【００５１】
代表的な治療薬として、鎮痛薬/解熱薬、麻酔薬、抗喘息薬、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗真菌剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗不安剤、免疫抑制剤、抗片頭痛薬、鎮静薬/催眠薬、抗狭心症薬、抗精神病薬、抗躁病薬、抗不整脈薬、抗関節炎薬、抗痛風薬、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗線維素溶解剤、血液レオロジー剤、抗血小板剤、抗けいれん剤、抗パーキンソン薬、抗ヒスタミン薬/抗掻痒薬、カルシウム調節に有用な薬剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗感染薬、気管支拡張薬、ホルモン、低血糖症薬、脂質低下薬、タンパク質、核酸、赤血球形成促進に有用な薬剤、抗潰瘍剤/逆流防止剤、抗嘔吐剤/制吐剤、および油溶性ビタミンが挙げられる。
【００５２】
特定の実施態様では、治療薬は、アドリアマイシン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキセート、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン(BCNU)、メチル-CCNU、シスプラチン、エトポシド、テニポシド、ダウノマイシン、インドメタシン、ビフェニルジメチルジカルボキシレート、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、パクリタキセルおよびその誘導体、ドセタキセルおよびその誘導体、エポチロンおよびその誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、エトポシド、またはピポスルファンから選択される抗新生物剤である。代表的な抗新生物剤として、パクリタキセルなどのタキサンおよびその誘導体が挙げられる。
【００５３】
特定の実施態様では、治療薬は、シクロスポリン、アザチオプリン、ミゾリビン、またはFK506(タクロリムス)から選択される免疫抑制剤である。
【００５４】
本発明の治療薬ナノ粒子は、治療薬をコーティングする1つ以上のリン脂質を含む。本明細書で使用される用語「リン脂質」は、疎水性テール(たとえば、1つまたは2つ)およびリン酸頭部基を有する一群の脂質を示す。親水性は、リン酸頭部基によってリン脂質に与えられ、疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、および1つ以上の芳香族、脂環式または複素環式基で置換されたそのような基(たとえば、脂肪酸アシル基)を含む非極性基によってリン脂質に付与される。
【００５５】
本明細書で使用される用語「リン脂質」は、ホスファチジン酸、ホスホグリセリドおよびホスホスフィンゴ脂質を示す。ホスファチジン酸には、モノまたはジアシル化されていてもよい、グリセロール基に結合したリン酸基が含まれる。ホスホグリセリド(またはグリセロリン脂質)には、モノまたはジアシル化されていてもよい、有機基(たとえば、コリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール)およびグリセロール基の中間のリン酸基が含まれる。ホスホスフィンゴ脂質(またはスフィンゴミエリン)には、有機基(たとえば、コリン、エタノールアミン)およびスフィンゴシン(非アシル化)またはセラミド(アシル化)基の中間のリン酸基が含まれる。
【００５６】
特定の実施態様では、本発明の組成物および方法において有用なリン脂質が、それらの塩(たとえば、ナトリウム、アンモニウム)を含むことが理解されるであろう。炭素-炭素二重結合を含むリン脂質については、個々の幾何異性体(シス、トランス)および異性体の混合物が含まれる。
【００５７】
代表的なリン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジン酸、およびそれらのリゾホスファチジル対応物(たとえば、リゾホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルエタノールアミン)およびジアシルリン脂質対応物(たとえば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジン酸)が挙げられる。
【００５８】
リン脂質のアシル基は、同じであっても異なっていてもよい。特定の実施態様では、アシル基は、C10-C24炭素鎖を有する脂肪酸から誘導される(たとえば、デカノイル(C10)、ドデカノイル(ラウロイルとしても知られる)(C12)、テトラデカノイル(ミリストイルとしても知られる)(C14)、ヘキサドデカノイル(パルミトイルとしても知られる)(C16)、オクタデカノイル(ステアロイルとしても知られる)(C18)、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、アラキドノイル基などのアシル基)。
【００５９】
代表的なジアシルホスファチジルコリン(すなわち、1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)として、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジリノレオイルホスファチジルコリン(DLPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルリノレオイルホスファチジルコリン、ステアロイルリノレオイルホスファチジルコリン ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン、ステアロイルアラキドイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン(DDPC)、ジドデカノイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルコリン(DEPC)、ジリノレオイルホスファチジルコリン(DLOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン(MSPC)、ステアロイルミリストイルホスファチジルコリン(SMPC)、パルミトイルミリストイルホスファチジルコリン(PMPC)、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、ステアロイルパルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、およびステアロイルオレオイルホスファチジルコリン(SOPC)が挙げられる。
【００６０】
代表的なジアシルホスファチジルエタノールアミン(すなわち、1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン(DEPE)、ジデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、およびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)が挙げられる。
【００６１】
代表的なジアシルホスファチジルグリセロール(すなわち、1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール)として、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジエルコイルホスファチジルグリセロール(DEPG)、ジラウロイルホスファチジルグリセロール(DLPG)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジデカノイルホスファチジルグリセロール、ジドデカノイルホスファチジルグリセロール、およびパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)が挙げられる。
【００６２】
代表的なジアシルホスファチジルセリン(すなわち、1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン)として、ジラウロイルホスファチジルセリン(ジドデカノイルホスファチジルセリンとしても知られる)(DLPS)、ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)、ジデカノイルホスファチジルセリン、およびジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)が挙げられる。
【００６３】
代表的なジアシルホスファチジン酸(すなわち、1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスフェート)として、ジエルコイルホスファチジン酸(DEPA)、ジラウロイルホスファチジン酸(ジドデカノイルホスファチジン酸としても知られる)(DLPA)、ジミリストイルホスファチジン酸(DMPA)、ジオレオイルホスファチジン酸(DOPA)、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、ジデカノイルホスファチジン酸、およびジステアロイルホスファチジン酸(DSPA)が挙げられる。
【００６４】
代表的なリン脂質として、セラミドホスホリル脂質、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミンなどのリン脂質が挙げられる。
【００６５】
本発明のナノ粒子は、2つ以上の異なるリン脂質を含む。特定の実施態様では、ナノ粒子は、2つの異なるリン脂質を含む。他の実施態様では、ナノ粒子は、3つの異なるリン脂質を含む。さらなる実施態様では、ナノ粒子は4つの異なるリン脂質を含む。
【００６６】
特定の実施態様では、本発明のナノ粒子は、ステロール(たとえば、コレステロール)をさらに含む。
【００６７】
上記のように、特定の実施形態では、リン脂質は、ジアシルリン脂質である。代表的なジアシルリン脂質として、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルイノシトール、およびジアシルホスファチジン酸が挙げられる。
【００６８】
特定の実施態様では、ジアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン)は、10〜22個の炭素(たとえば、10、12、14、16、18、20、22個の炭素)を有する脂肪酸成分(アシル基)を有する。特定の実施態様では、ジアシルリン脂質は、10〜20個の炭素(たとえば、10、12、14、16、18、20個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。
他の実施態様では、ジアシルリン脂質は、10〜16個の炭素(たとえば、10、12、14、16個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらなる実施態様では、ジアシルリン脂質は、10〜14個の炭素(たとえば、10、12、14個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらに他の実施態様では、ジアシルリン脂質は、10〜12個の炭素(たとえば、10、12個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。特定の実施態様では、ジアシルリン脂質は、10個の炭素を有する脂肪酸成分を有する。上記の特定の実施態様では、ジアシルリン脂質中の脂肪酸成分の各々が、1,2-ジデカノイルホスファチジルコリンなど、同じ炭素数(たとえば、10、12、14、16、18、20、22個の炭素)を有すること、および上記の他の実施態様では、ジアシルリン脂質中の脂肪酸成分の各々が、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリンなど、異なる炭素数を有することが理解されるであろう。
【００６９】
特定の実施態様では、リン脂質は、ホスファチジルコリンである。適当なホスファチジルコリンとして、10〜22個の炭素(たとえば、10、12、14、16、18、20、22個の炭素)を有する脂肪酸成分(アシル基)を有するホスファチジルコリンが挙げられる。特定の実施態様では、ホスファチジルコリンは、10〜20個の炭素(たとえば、10、14、16、18、20個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。他の実施態様では、ホスファチジルコリンは、10〜16個の炭素(たとえば、10、12、14、16個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらなる実施態様では、ホスファチジルコリンは、10〜14個の炭素(たとえば、10、12、14個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらに他の実施態様では、ホスファチジルコリンは、10〜12個の炭素(たとえば、10、12個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。特定の実施態様では、ホスファチジルコリンは、10個の炭素を有する脂肪酸成分を有する。代表的なホスファジルコリンとして、図2に示されるもの(たとえば、PC-12、PC-14、PC-16、PC-18、PC-20)およびPC-10(図示せず)が挙げられる。特定のリン脂質の脂肪酸成分が、同じである必要はない(すなわち、異なるアシル基によるジアシル)ことが理解されるであろう。
【００７０】
特定の実施態様では、リン脂質は、たとえば、負に荷電したリン酸基および正に荷電したアミン基を有する電子的に中性のリン脂質である(たとえば、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン)。他の実施態様では、リン脂質は、負に荷電したリン酸基を有する電子的に陰性のリン脂質である(たとえば、ホスファチジルグリセロール)。
【００７１】
上記のように、特定の実施態様では、リン脂質は、リゾリン脂質である。特定のこれらの態様では、リゾリン脂質は、モノアシルリン脂質である。代表的なリゾリン脂質として、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、およびリゾホスファチジン酸(たとえば、モノアシルホスファチジル化合物)が挙げられる。
【００７２】
特定の実施態様では、モノアシルリン脂質(たとえば、リゾホスファチジルコリン)は、10〜22個の炭素(たとえば、10、12、14、16、18、20、22個の炭素)を有する脂肪酸成分(アシル基)を有する。特定の実施態様では、モノアシルリン脂質は、10〜20個の炭素(たとえば、10、12、14、16、18、20個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。他の実施態様では、モノアシルリン脂質は、10〜16個の炭素(たとえば、10、12、14、16個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらなる実施態様では、モノアシルリン脂質は、10〜14個の炭素(たとえば、10、12、14個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらに他の実施態様では、モノアシルリン脂質は、10〜12個の炭素(たとえば、10、12個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。特定の実施態様では、モノアシルリン脂質は、10個の炭素を有する脂肪酸成分を有する。
【００７３】
特定の実施態様では、リン脂質は、リゾホスファチジルコリンである。適当なリゾホスファチジルコリンとして、10〜22個の炭素(たとえば、10、12、14、16、18、20、22個の炭素)を有する脂肪酸成分(アシル基)を有するリゾホスファチジルコリンが挙げられる。特定の実施態様では、ホスファチジルコリンは、10〜20個の炭素(たとえば、10、14、16、18、20個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。他の実施態様では、リゾホスファチジルコリンは、10〜16個の炭素(たとえば、10、12、14、16個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらなる実施態様では、リゾホスファチジルコリンは、10〜14個の炭素(たとえば、10、12、14個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。さらに他の実施態様では、リゾホスファチジルコリンは、10〜12個の炭素(たとえば、10、12個の炭素)を有する脂肪酸成分を有する。特定の実施態様では、リゾホスファチジルコリンは、10個の炭素を有する脂肪酸成分を有する。代表的なホスファジルコリンとして、図2に示されるもの(たとえば、PC-12、PC-14、PC-16、PC-18、PC-20)、およびPC-10が挙げられる。
【００７４】
特定の実施態様では、リゾリン脂質は、たとえば、負に荷電したリン酸基および正に荷電したアミン基を有する電子的に中性のリゾリン脂質である(たとえば、リゾホスファチジルコリンまたはリゾホスファチジルエタノールアミン)。他の実施態様では、リゾリン脂質は、負に荷電したリン酸基を有する電子的に陰性のリゾリン脂質である(たとえば、リゾホスファチジルグリセロール)
【００７５】
特定の実施態様では、本発明のナノ粒子は、ジアシルリン脂質およびモノアシルリン脂質を含む。特定のこれらの態様では、本発明のナノ粒子は、ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリンを含む。
【００７６】
ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質の比(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)は、約1：99 w/wパーセント〜約99：1 w/wパーセントである。特定の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約10：90〜約90：10 w/wパーセントである。他の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約20：80〜約80：20 w/wパーセントである。さらなる実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約30：70〜約70：30 w/wパーセントである。他の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約40：60〜約60：40 w/wパーセントである。特定の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約50：50 w/wパーセントである。特定の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約90：10〜約60：40 w/wパーセントである。他の実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約90：10〜約70：30 w/wパーセントである。さらなる実施態様では、ジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン)の比は、約80：20 w/wパーセントである。
【００７７】
ナノ粒子がジアシルリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン)およびモノアシルリン脂質(たとえば、リゾホスファチジルコリン)を含む本発明の特定の実施態様では、ジおよびモノアシルリン脂質の脂肪酸成分は同じである。たとえば、ジおよびモノアシルリン脂質のそれぞれは、C10(デカノイル)脂肪酸成分を含み、それぞれは、C12(ドデカノイル)脂肪酸成分を含み、それぞれは、C14(テトラデカノイル)脂肪酸成分を含み、それぞれは、C16(ヘキサデカノイル)脂肪酸成分を含み、またはそれぞれは、C18(ドデカノイル)脂肪酸成分を含む。あるいは、他の実施態様において、ジおよびモノアシルリン脂質の脂肪酸成分は異なる(たとえば、ジアシルリン脂質は、C10脂肪酸成分を含み、モノアシルリン脂質は、 C12脂肪酸成分を含む。
【００７８】
組成物中のリン脂質および治療薬は、さまざまな様式で会合され得る。たとえば、いくつかの実施態様では、リン脂質は、治療薬と混合された状態である。いくつかの実施態様では、リン脂質は、治療薬を封入または取り込む。いくつかの実施態様では、リン脂質は、治療薬に結合(たとえば、非共有結合)する。
【００７９】
粒子サイズ
本発明のナノ粒子は、約1000、900、800、700、600、500、400、300、200、または100nmのいずれかよりも大きくない平均(averageまたはmean)直径を有する。
いくつかの実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約30-300 nmである。いくつかの実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約20-200 nmである。いくつかの実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約80-200 nmである。特定の実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約30-180 nmである。いくつかの実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約40-160 nmである。特定の実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約80-140 nmである。他の実施態様では、粒子の平均(averageまたはmean)直径は、約90-120 nmである。いくつかの実施態様では、粒子は、滅菌濾過可能である。
【００８０】
粒子荷電
ナノ粒子のリン脂質の組成に依存して、ナノ粒子は電子的に中性または電荷を帯びることができる。特定の実施態様では、電子的に中性であるジおよび／またはモノアシルリン脂質などのリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、および／またはリゾホスファチジルエタノールアミン、それぞれ負に荷電したリン酸基および正に荷電したアミン基を有する)のみを含むナノ粒子の場合、ナノ粒子は、少なくともナノ粒子のリン脂質成分に関して電子的に中性である。他の実施態様では、電子的に陰性であるジおよび／またはモノアシルリン脂質などのリン脂質(たとえば、負に荷電したリン酸基を有し、対応する正に荷電した基を有さないホスファチジルグリセロール)を含むナノ粒子の場合、少なくともナノ粒子のリン脂質成分に関しては、ナノ粒子は電子的に陰性である。
【００８１】
特定の実施態様では、ナノ粒子は、ナノ粒子のリン脂質含有量に関して電子的に中性である。他の実施態様では、ナノ粒子は、ナノ粒子のリン脂質含有量に関して電子的に負(負に荷電している)である。
【００８２】
本発明の代表的なナノ粒子は、Taxol(登録商標)またはTocosol(登録商標)などの溶媒系パクリタキセル製剤と比較して、大きな体積の分布、低いAUCおよび低いCmaxを有するアブラキサン(登録商標)に対して薬物動態学的生物学的同等性を示す。Cynviloq(登録商標)は、アブラキサン(登録商標)に対して望ましい薬物動態学的生物学的同等性を提供するが、その賦形剤/ポリマーに対する望ましくない過敏性に苦しんでいる。これは、Cynviloq(登録商標)のmPEG-PDLLAの天然リン脂質による置換を促進した。
【００８３】
リン脂質でコーティングされたナノ粒子の特性
１つの態様では、本発明は、1つ以上のリン脂質でコーティングれた粒子状治療薬を含む、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を提供する。本発明のリン脂質ナノ粒子およびナノ粒子を含む製剤は、いくつかの理由から有利である。
【００８４】
本発明のナノ粒子は、安定な粒子サイズおよび治療薬ローディングという望ましい利益を提供する。本発明の代表的な粒子は、約20-200 nm〜約90-120 nmの平均直径(Zav)を有する。図3は、ジおよびモノアシルリン脂質の組み合わせでコーティングされた代表的なパクリタキセル粒子のサイズおよびサイズ分布を示す。これらの粒子は、約100nmの平均直径を有し、約0.1の多分散指数を有する。図4に示すように、約90：10〜約70：30のジアシルリン脂質：モノアシルリン脂質比を有する粒子について、治療薬の封入効率(薬物ローディング)および粒子サイズを相関させ、最適化する。本発明の代表的なナノ粒子の粒子サイズ、治療薬(パクリタキセル)含量(封入効率％)、およびリン脂質組成を、第2表、第3表および第4表(図7)に要約する。特定の実施態様では、約90〜120nmの平均直径(とえば、約100nm)、約0.1の多分散性指数を有し、約90：10〜約70：30の比のモノおよびモノアシルリン脂質の組み合わせ(たとえば、約80：20のジドデカノイルホスファチジルコリン： ジドデカノイルリゾホスファチジルコリン)であるリン脂質組成を有する本発明のナノ粒子について最適化された治療薬封入効率が観察される。
【００８５】
本発明の実施において、最適化されたナノ粒子を提供するのに有効なリン脂質の選択は、治療薬ローディング、粒子サイズおよびサイズ安定性、および治療薬放出プロファイルに基づいてなされた[生理学的条件下(血漿)での有効放出/粒子溶出ならびに投与条件(PBSまたはDI)下での安定性]。リン脂質の選択は、リン脂質中の治療薬の溶解度に基づいて行われなかった。リン脂質脂肪酸成分炭素数(C8-C20)の関数としての治療薬(パクリタキセル)ローディングを図13に示す。脂質成分の炭素数(C10-C14)を有するリン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリンなどの炭素数10〜14の脂肪酸成分を有するジおよびモノアシルリン脂質)について最適なローディングが観察された。図9および図10Cに示されるように、代表的なナノ粒子の有利なサイズおよびサイズ安定性が、実証された(DIおよびPBSの記録を参照)。
【００８６】
本発明の代表的なナノ粒子は、臨床的に有効な製剤[アブラキサン(登録商標)およびGenexol-PM(登録商標)(Cynviloq(登録商標))]の望ましい特性を組み合わせる治療薬放出(粒子溶出)プロファイルを示す。本発明のリン脂質でコーティングされたナノ粒子とは対照的に、アブラキサン(登録商標)はヒト血清アルブミンでコーティングされたナノ粒子であり、Genexol-PM(登録商標)は合成高分子ミセルの形態のナノ粒子である。アブラキサン(登録商標)は、望ましい血漿不安定性(薬物放出)を提供するが、送達ビヒクル(たとえば、PBS)中での望ましくない不安定性を有する(図10A参照)。Genexol-PM(登録商標)は、送達ビヒクル中での望ましい安定性および血漿中での望ましい不安定性を提供する(図10B参照)。有利なことに、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされたナノ粒子は、送達ビヒクル(注射用溶液に有用な水性緩衝液(生理食塩水)、デキストロース溶液、および脱イオン水などの静脈内、膀胱内および腹腔内投与のための水性ビヒクル中での安定性および血漿中での治療薬放出のための所望の血漿不安定性を実証する(図10C参照)。
【００８７】
上述の特定の実施態様では、本発明のナノ粒子は負に荷電していない。
【００８８】
上述の特定の実施態様では、本発明のナノ粒子もナノ粒子組成物もPEG系凍結防止剤(たとえば、PEG-6000)を含まない。
【００８９】
上述の代表的なナノ粒子は、治療的投与に有効な送達ビヒクル中に容易に配合される。これらの製剤が、粒径の安定性を示すのが有利である。粒子サイズの安定性は、ナノ粒子の治療的投与のための重要な因子であり得る。本発明のナノ粒子が凍結乾燥粉末として提供される実施態様において、ナノ粒子は、その後、被験者への投与の前(たとえば、直前)に水性送達ビヒクル中で再構成される。水性ビヒクル中のナノ粒子の再構成および任意のその後の濾過(0.2μm)は、粒子サイズ不安定性(たとえば、粒子凝集、粒子溶出、治療薬放出)に付され得る製剤を提供する。図16に示されるように、本発明の代表的なナノ粒子の粒子サイズは、適切な添加剤(たとえば、トレハロース、たとえば、約5％w/wトレハロースなどの粒径安定剤、)によって安定化されうる。したがって、特定の実施態様において、本発明のこれらの製剤は、粒径安定剤を含む。代表的な粒径安定剤としては、pHを制御するための緩衝剤、界面へのタンパク質吸着を阻害するための界面活性剤、微生物増殖を防ぐための防腐剤、凍結乾燥のための充填剤としての炭水化物、溶液粘度を増加させるポリマー、およびタンパク質を安定化させ、生理的等張性および浸透圧を得るための塩または糖が挙げられる。これらは、製剤の総重量に基づいて、約1〜15％w/wの濃度で製剤に使用されうる。
【００９０】
特定の実施態様において、本発明のナノ粒子が、本明細書に記載の成分を含むことが理解されるであろう。特定の他の実施態様では、本発明のナノ粒子は、本質的に本明細書に記載の成分からなり、これらの実施態様では、ナノ粒子は、ナノ粒子の特性(たとえば、治療機能、効果、または他の薬物動態的特性)に影響を及ぼす追加の成分を含まないことが理解されるであろう。特定のさらる実施態様では、本発明のナノ粒子は、本明細書に記載の成分からなり、これらの実施態様において、ナノ粒子は、追加の成分を含まないことが理解されるであろう。
【００９１】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子組成物
本発明のもう1つの態様では、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子組成物がを提供される。代表的な組成物として、乾燥組成物および液体組成物が挙げられる。
特定の実施態様では、組成物として、乾燥(たとえば、凍結乾燥)組成物が挙げられる。他の実施態様では、組成物は、乾燥組成物を再構成または再懸濁して得られる液体(たとえば、水性)組成物である。さらなる実施態様では、組成物は、乾燥(たとえば、凍結乾燥)されうる中間液体組成物である。
【００９２】
本発明の乾燥組成物は、再構成、再懸濁、または再水和されて、治療薬およびリン脂質(たとえば、リン脂質でコーティングされた治療薬)を含む粒子の安定な水性懸濁液を一般的に形成することができる。疎水性治療薬は、水性媒体中に懸濁したままであれば、長期間、たとえば、少なくとも、約0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、60、または72時間のいずれかの期間中、水性懸濁液中のリン脂質によって「安定化」(たとえば、目に見える沈殿または沈降を伴うことなく)される。懸濁液は、一般的には、必ずしもではないが、被験者(たとえば、ヒト)への投与に適している。いくつかの実施態様では、懸濁液の安定性は、室温(たとえば、20-25℃)または冷蔵条件(たとえば、4℃)で評価される。安定性は、約40℃より高い温度などの加速試験条件下でも評価されうる。
【００９３】
他の実施態様では、組成物は、生体適合性媒体中に乾燥組成物を再構成または再懸濁させることによって得られる液体(たとえば、水性)組成物である。適切な生体適合性の媒体として、水、緩衝化水性媒体、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、必要に応じて緩衝化されたアミノ酸の溶液、必要に応じて緩衝化されたタンパク質の溶液、必要に応じて緩衝化された糖の溶液、必要に応じて緩衝化されたビタミンの溶液、必要に応じて緩衝化された合成ポリマーの溶液、脂質含有エマルションなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
本明細書に記載の組成物中のリン脂質の量は、組成物中の治療薬および他の成分に応じて変化する。いくつかの実施態様では、組成物は、水性懸濁液中の治療薬担体を安定化させるのに十分な量で、たとえば、安定なコロイド懸濁液(たとえば、ナノ粒子の安定した懸濁液)の形態でリン脂質を含む。いくつかの実施態様では、リン脂質は、水性媒体中の治療薬の沈降速度を低下させる量で存在する。粒子含有組成物の場合、リン脂質の量はまた、治療薬の粒子のサイズおよび密度に応じて変わる。
【００９５】
いくつかの実施態様では、リン脂質は、特定の濃度の水性懸濁液中で治療薬を安定化させるのに十分な量で存在する。たとえば、組成物中の治療薬の濃度は、たとえば、約0.1〜約50 mg/ml、約0.1〜約20 mg/ml、約1〜約10 mg/ml、約2〜約8 mg/ml、および約4〜約6 mg/mlのいずれかなどの約0.1〜約100 mg/mlである。いくつかの実施態様では、治療薬の濃度は、少なくとも、約1.3 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml、25 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、および50 mg/mlのいずれかである。いくつかの実施態様では、リン脂質は、界面活性剤(Tween80またはクレモフォールまたは他の生体適合性ポリマーなど)の使用を回避する量で存在する。このように、特定の実施態様では、本発明の組成物は、界面活性剤(Tween 80およびクレモフォールなど)および他の生体適合性ポリマー(ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、および米国特許第6,322,805号に記載されているようなポリ(アルキレンオキシド)含有ポリマーなどの合成ポリマー)を含まないか、または実質的に含まないのが有利である。
【００９６】
いくつかの実施態様では、組成物は、液体形態において、約0.1%〜約50%(w/v)(たとえば、約0.5%(w/v)、約5%(w/v)、約10%(w/v)、約15%(w/v)、約20%(w/v)、約30%(w/v)、約40%(w/v)、約50%(w/v))のリン脂質を含む。いくつかの実施態様では、組成物は、液体形態において、約0.5%〜約5%(w/v)のリン脂質を含む。
【００９７】
いくつかの実施態様では、リン脂質：治療薬の重量比は、十分な量の治療薬が細胞に結合するか、または細胞によって輸送されるような量である。リン脂質：治療薬の重量比は、さまざまなリン脂質および治療薬の組み合わせに対して最適化されうるが、一般に、リン脂質：治療薬の重量比(w/w)は、たとえば、約0.02：1〜約50：1、約0.05：1〜約20：1、約0.1：1〜約20：1、約1：1〜約18：1、約2：1〜約15：1、約3：1〜約12：1、約4：1〜約10：1、約5：1〜約9：1、および約9：1のいずれかなどの約0.01：1〜約100：1である。いくつかの実施態様では、リン脂質：治療薬の重量比は、15：1未満、14：1未満、13：1未満、12：1未満、11：1未満、10：1未満、9：1未満、8：1未満、7：1未満、6：1未満、5：1未満、4：1未満および3：1未満のいずれかなどの18：1未満のいずれかである。
【００９８】
いくつかの実施態様では、リン脂質は、組成物が重大な副作用なしに被験者(たとえば、ヒト)に投与されることを可能にする。いくつかの実施態様では、リン脂質は、ヒトに治療薬を投与することによる1つ以上の副作用を軽減するのに有効な量で含まれる。「治療薬を投与することによる1つ以上の副作用を軽減する」とは、治療薬によって引き起こされる1つ以上の望ましくない影響、ならびに治療薬を送達するために使用される送達ビヒクル(治療薬を注射に適したものにする溶媒)によって引き起こされる副作用の軽減、緩和、排除または回避を意味する。このような副作用として、たとえば、骨髄抑制、神経毒性、過敏症、炎症、静脈刺激、静脈炎、疼痛、皮膚刺激、末梢神経障害、好中球減少性発熱、アナフィラキシー反応、静脈血栓症、血管外遊出、およびそれらの組み合わせが挙げられる。しかしながら、これらの副作用は単なる例示であり、さまざまな治療薬に伴う他の副作用または副作用の組合せが軽減されうる。
【００９９】
組成物中の他の成分
本明細書に記載の組成物は、組成物の特性を改善するための他の薬剤、賦形剤、または安定剤を含むことができる。適切な賦形剤および希釈剤の例として、これらに限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。製剤は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤または香味剤をさらに含むことができる。乳化剤の例として、コハク酸トコフェリルポリエチレングリコールなどのトコフェロールエステル、プルロニック、ポリオキシエチレン化合物をベースとする乳化剤、Span 80および関連化合物、および当技術分野で公知であり、動物またはヒト用投与剤形での使用が承認されている他の乳化剤が挙げられる。組成物は、当技術分野で周知の手順を用いることにより、患者への投与後に活性成分の迅速、持続的または遅延放出を提供するように製剤されうる。
【０１００】
注射による投与のための組成物として、界面活性剤(または湿潤剤または界面活性剤)とともに、またはエマルションの形態(たとえば、油中水または水中油エマルション)で、有効成分として治療薬を含む組成物が挙げられる。必要に応じて、他の成分、たとえば、マンニトールまたは他の薬学的に許容されるビヒクルを添加することができる。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、組成物はヒトへの投与に適している。いくつかの実施態様では、組成物は、獣医学の点から、家畜および農業動物などの哺乳動物への投与に適している。以下の製剤および方法は単なる例示であり、決して限定するものではない。経口投与に適した製剤は、(a)水、生理食塩水またはオレンジジュースなどの希釈液に溶解された有効量の化合物を含む液剤；(b)それぞれ所定量の有効成分を固体または顆粒として含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤；(c)適切な液体中の懸濁液剤；(d)適切なエマルション；および(e)散剤；からなりうる。錠剤は、乳糖、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、および薬理学的に適合性である賦形剤の1つ以上を含みうる。ロゼンジ形態は、香味剤(通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント)中に有効成分を含むことができ、ならびに有効成分に加えて、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア、エマルション、ゲルなどの当該分野で公知の賦形剤などの不活性基剤中に有効成分を含む香錠で有効成分を含むことができる。
【０１０２】
非経口投与に適した製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液に適合するようにする溶質を含みうる水性および非水性の等張滅菌注射溶液、および懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含みうる水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの1回または複数回単位投与量密封容器で提供されることが可能であり、使用の直前に滅菌液体賦形剤、たとえば、注射用水を添加するだけでよい凍結乾燥(凍結乾燥)状態で保存されうる。即時注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌散剤、顆粒および錠剤から調製されることが可能である 注射可能な製剤が好ましい。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、組成物は、約5.0〜約8.0、約6.5〜約7.5、および約6.5〜約7.0のいずれかの範囲のpHなどの、約4.5〜約9.0の範囲のpHを有するように製剤される。いくつかの実施態様では、組成物のpHは、たとえば、約6.5、7または8(約7.5または約8など)以上のいずれかなどの約6以上に製剤される。組成物はまた、グリセロールなどの適切な張性調整剤の添加によって、血液と等張性になるようにすることができる。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明の組成物は、本明細書に記載された成分を含む(たとえば、以下に記載されるような他の成分を含み得る)ことが理解されるであろう。特定の他の実施態様では、本発明の組成物が、本質的に本明細書に記載の成分からなり、これらの実施態様において、組成物が、ナノ粒子の特性(たとえば、治療機能、効果、または他の薬物動態的特性)に影響を及ぼす物質である追加の成分を含まないことが理解されるであろう。特定のさらなる実施態様は、本発明の組成物が、本明細書に記載された成分からなり、これらの実施態様では、組成物が、いかなる追加の成分も含まないことが理解されるであろう。
【０１０５】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を含む製品
さらなる態様において、本発明は、適切な包装容器に本明細書に記載の組成物を含む製品を提供する。本明細書に記載され、当技術分野で周知である、組成物のための適切な包装容器として、たとえば、バイアル(密封バイアルなど)、容器(密閉容器など)、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装材(密閉マイラーまたはプラスチック袋など)などが挙げられる。これらの製品は、さらに滅菌および/または密封されていてもよい。
【０１０６】
また、本明細書に記載の組成物を含む単位投与剤形が提供される。これらの単位投与剤形を、1回または複数回単位投与量で適切な包装容器に保存することができ、さらに滅菌および密封することもできる。
【０１０７】
本発明はまた、本明細書に記載される組成物(または単位投与剤形および/または製品)を含むキットを提供し、さらに本明細書にさらに記載される使用などの組成物の使用方法に関する指示書をさらに含み得る。いくつかの実施態様では、本発明のキットは、上記の包装容器を含む。他の実施態様では、本発明のキットは、上記の包装容器と、緩衝剤を含む第2の包装容器とを含む。本発明のキットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載の任意の方法を実施するための指示書を含むパッケージインサートなどの商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１０８】
1週間、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月またはそれ以上のいずれかなどの長期間にわたって個体に効果的な治療を提供するために、本明細書に開示される治療薬の十分な用量を含むキットも提供され得る。キットは、治療薬および医薬組成物の複数回の単位投与量および使用説明書を含み、薬局、たとえば、病院薬局および調剤薬局での保管および使用に十分な量で包装されてもよい。
【０１０９】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の使用方法
もう1つの態様では、本発明は、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の使用方法を提供する。
【０１１０】
特定の実施態様では、本発明は、有効量のリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を含む組成物を投与することを含む、治療薬に応答する疾患または状態を治療するための方法を提供する。たとえば、いくつかの実施態様では、有効量の抗新生物治療薬(パクリタキセルなど)およびリン脂質タンパク質を含む組成物を個体に投与することを含む、個体(たとえば、ヒト)の癌を治療する方法が提供される。
【０１１１】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、その症状の改善、寛解、軽減および/または遅延などの、特定の障害、状態または疾患を治療するのに十分な化合物または組成物の量を示す。癌または他の望ましくない細胞増殖に関して、有効量は、腫瘍を収縮させるおよび/または腫瘍増殖速度を低下させる(腫瘍増殖を抑制するなど)のに十分な量を含む。いくつかの実施態様では、有効量は、進行を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施態様では、有効量は、発症および/または再発を予防するのに十分な量である。有効量は、1回以上の投与で投与されうる。
【０１１２】
本発明の組成物(たとえば、治療薬が抗増殖剤である場合、パクリタキセルなどである)は、とりわけ、癌、再狭窄および線維症などの増殖性疾患の治療に有効である。治療薬がパクリタキセルである場合、組成物は、パクリタキセルを投与することによって治療可能な疾患および状態の治療に有効である。
【０１１３】
本明細書に記載される組成物によって治療される癌として、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載される組成物によって治療され得る癌の例として、扁平上皮細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺の扁平上皮癌)、腹膜の癌、肝細胞癌、胃(gastric)癌または胃(stomach)癌(胃腸癌を含む)、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、直腸癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、B細胞リンパ腫(低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性(SL)NHL、中等度/濾胞性NHL、中等度びまん性NHL、高悪性度免疫芽球性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度小非開裂細胞NHL、巨大腫瘤(bulky disease)NHL、マントル細胞リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症など)、慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、骨髄腫、毛状細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性障害(PTLD)、ならびに乳房炎に伴う異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍に関連するものなど)、およびメイグス症候群が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様では、転移性癌(すなわち、原発性腫瘍から転移した癌)を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様では、細胞増殖および/または細胞移動を減少させる方法が提供される。いくつかの実施態様では、過形成を治療する方法が提供される。
【０１１４】
いくつかの実施態様では、進行した段階で癌を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様では、たとえば、進行乳癌、ステージIV乳癌、局所進行乳癌、および転移性乳癌などの乳癌(HER2陽性またはHER2陰性であり得る)を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様では、癌は、たとえば、非小細胞肺癌(進行性NSCLCなどのNSCLC)、小細胞肺癌(進行性SCLCなどのSCLC)、および肺の進行性固形悪性腫瘍などの肺癌である。いくつかの実施態様では、癌は、卵巣癌、頭頸部癌、胃悪性腫瘍、メラノーマ(転移性メラノーマなど)、結腸直腸癌、膵臓癌、および固形腫瘍(進行性固形腫瘍など)である。いくつかの実施態様では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、および多発性骨髄腫のいずれか(および、いくつかの実施態様では、これらから選択される)である。いくつかの実施態様では、癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様では、癌は、前立腺癌、結腸癌、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌および卵巣癌のいずれか(および、いくつかの実施態様では、これらから選択される)である。
【０１１５】
これらの組成物を投与されるのに適した個体は、治療薬の性質、ならびに治療および/または予防される疾患/状態/障害に応じて変わる。したがって、「個体」および「被験者」という用語は、意図された適切な使用に応じて、脊椎動物、哺乳動物およびヒトのいずれかを含む。いくつかの実施態様では、個体は、哺乳動物である。いくつかの実施態様では、個体は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類のいずれか1つまたはそれ以上である。いくつかの実施態様では、個体は、ヒトである。
【０１１６】
さらなる実施態様では、本発明は、有効量のリン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を含む組成物を個体に投与することを含む、個体における癌腫(結腸癌など)を治療する方法を提供する。
【０１１７】
本明細書に記載の組成物は、単独で、または難水溶性薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与されうる。たとえば、組成物がタキサン(たとえば、パクリタキセル)を含む場合、組成物は、限定的ではないが、カルボプラチン、ナベルビン(ビノレルビン)、アントラサイクリン(Doxil)、ラパチニブ(GW57016)、ハーセプチン、ゲムシタビン(Gemzar)、カペシタビン(Xeloda)、アリムタ、シスプラチン、5-フルオロウラシル、エピルビシン、シクロホスファミド、アバスチン、ベルケードなどの1つ以上の他の化学療法薬と共投与されうる。いくつかの実施態様では、タキサン組成物は、代謝拮抗物質(ヌクレオシド類縁体を含む)白金系薬剤、アルキル化剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アントラサイクリン系抗生物質、ビンカアルカロイド、プロテアソーム阻害剤、マクロライド、およびトポイソメラーゼ阻害剤から選択される化学療法薬と共投与されうる。これらの他の薬剤は、薬物(タキサンなど)と同じ組成物中に、または薬物(タキサン)含有組成物と同時にまたは連続して投与される別個の組成物中に存在することができる。
【０１１８】
個体に投与される本発明の組成物の用量は、特定の組成物、投与方法、および治療される特定の疾患によって変化する。用量は、特定の疾患または状態に対する治療または予防応答などの望ましい応答を達成するのに十分な量である。たとえば、投与される代表的な治療薬(たとえば、パクリタキセル)の用量は、たとえば、約10〜約300 mg/m2、約30〜約200 mg/m2、および約70〜約150 mg/m2などの約1〜約300 mg/m2でありうる。典型的には、組成物中の治療薬(たとえば、パクリタキセル)の用量は、3週間のスケジュールで投与される場合、約50〜約200 mg/m2、あるいは毎週のスケジュールで投与される場合、約10〜約100 mg/m2の範囲でありうる。さらに、メトロノーム投与計画(metronomic regimen)(たとえば、毎日または1週間に2、3回)で投与される場合、用量は、約1〜50 mg/m2の範囲でありうる。
【０１１９】
本発明の組成物の投与頻度として、少なくとも、約3週間ごとに1回、2週間ごとに1回、週に1回、週に2回、週に3回、週に4回、週に5回、週に6回、または毎日のいずれかが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様では、各投与間の間隔は、約6、5、4、3、2、または1日のいずれかより短いなどの、約1週間より短い期間である。いくつかの実施態様では、各投与間隔は一定である。たとえば、投与は、毎日、2日ごと、3日ごと、4日ごと、5日ごと、または毎週行われうる。いくつかの実施態様では、投与は、1日2回、1日3回、またはより頻繁に行われうる。
【０１２０】
本発明の組成物の投与は、約1ヶ月から約3年までなどの長期間にわたり延長されうる。たとえば、投与は、約、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、および36ヶ月のいずれかの期間にわたって延長されうる。いくつかの実施態様では、投薬スケジュールに中断はない。いくつかの実施態様では、各投与の間隔は、約1週間以下である。
【０１２１】
本明細書に記載される組成物は、たとえば、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、膀胱内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経粘膜および経皮などのさまざまな経路を介して個体に投与されうる。特定の実施態様では、組成物は、経口投与、筋肉内投与、経皮投与に、および静脈内投与などの許容しうる経路によって投与されるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
注射用組成物、特に静脈内送達用組成物を調製する場合、連続相が、約5〜約8.5のpH範囲に緩衝化された張性調整剤の水溶液を含むのが好ましい。pHは、7未満または6未満であってもよい。いくつかの実施態様では、組成物のpHは、約6.5、7、または8のいずれか(たとえば、約7.5または8)以上などの、約6以上である。
【０１２３】
本発明のナノ粒子は、硬または軟カプセルに封入されることが可能であり、錠剤に圧縮されることが可能であり、または飲料または食品に配合されることが可能であり、あるいは、食事に配合されることが可能である。カプセルは、ナノ粒子を不活性医薬希釈剤と混合し、その混合物を適切なサイズの硬ゼラチンカプセルに入れることによって製剤されうる。軟カプセルが望ましい場合、許容可能な植物油、軽質石油または他の不活性油とナノ粒子のスラリーを、機械によってゼラチンカプセルに封入することができる。
【０１２４】
使用方法の実施において、本発明は、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子を含む医薬組成物をヒトに投与することを含む、治療薬のヒトへの投与に伴う副作用を低減する方法を提供する。たとえば、本発明は、限定されるものではないが、骨髄抑制、神経毒性、過敏症、炎症、静脈刺激、静脈炎、痛み、皮膚刺激、末梢ニューロパシー、好中球減少熱、アナフィラキシー反応、血液毒性、および脳または神経毒性、ならびにそれらの組み合わせなどの、治療薬のヒトへの投与に伴うさまざまな副作用を低減する方法を提供する。いくつかの実施態様では、たとえば、重度の皮膚の発疹、蕁麻疹、潮紅、呼吸困難、頻脈、およびその他などの、治療薬の投与に伴う過敏反応を低減する方法が提供される。
【０１２５】
リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の製造方法
もう1つの態様では、本発明は、リン脂質でコーティングされた治療薬ナノ粒子の製造方法を提供する。
【０１２６】
特定の実施態様では、本発明のナノ粒子の形成方法として、高せん断力条件下(たとえば、音波処理、高圧均質化など)での調製が挙げられる。高せん断力条件下でのナノ粒子の代表的な形成方法は、米国特許第5,916,596号；第6,506,405号；および第6,537,579号に記載されており、これらは、参照することにより本願に組み込まれる。
【０１２７】
簡単に述べると、特定の実施態様において、治療薬を有機溶媒に溶解して得られる溶液を、水性リン脂質溶液と混合して、混合物を得る。混合物を高圧均質化に付す。所望のレベルまで均質化した後、有機溶媒を蒸発除去して、水性分散液を得る。得られた分散液をさらに凍結乾燥して、粒状固体を得ることができる。
【０１２８】
適当な有機溶媒として、治療薬が可溶であり、水溶液と混和性であり、そして、妥当な温度および圧力で蒸発させることによって除去されうる溶媒が挙げられる。代表的な有用な溶媒として、ケトン、エステル、エーテル、塩素化溶媒、および当技術分野で公知の他の溶媒が挙げられる。たとえば、有機溶媒は、塩化メチレンまたはクロロホルム/エタノール(たとえば、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、または9：1の比で)でありうる。
【０１２９】
医薬的に許容される賦形剤を組成物に添加することもできる。適当な医薬的に許容される賦形剤として、溶液、エマルション、または懸濁液が挙げられる。
【０１３０】
他のエマルションまたはナノ粒子製剤を調製することもできる。エマルションは、高圧および高せん断力下での均質化によって形成される。このような均質化は、典型的には約3,000から30,000psiまでの範囲の圧力で操作される高圧ホモジナイザーで実施されるのが都合がよい。このような工程が、約6,000から25,000psiまでの範囲の圧力で実施されるのが好ましい。得られるエマルションは、溶解された治療薬を含有する非水性溶媒の非常に小さなナノ液滴およびリン脂質の非常に小さなナノ液滴を含む。許容可能な均質化の方法として、たとえば、高圧均質化、高せん断ミキサー、音波処理、高せん断インペラーなどの高せん断およびキャビテーションを付与する工程が含まれる。
【０１３１】
本発明に従って調製されたコロイド系は、適切な温度-時間プロファイルで水を除去(たとえば、凍結乾燥)することによって、粉末形態にさらに変換されうる。凍結乾燥製品(たとえば、粒子粉末)は、マンニトール、スクロース、グリシンなどの従来の凍結保護剤を使用する必要なく、水、生理食塩水または緩衝液の添加によって容易に再構成される。必須ではないが、必要であれば、従来の凍結保護剤を医薬組成物に添加することができることはもちろん理解される。
【０１３２】
1つの実施態様では、実施例１に記載のように、ナノ粒子は、マイクロ流動化-溶媒蒸発法によって調製される。
【０１３３】
もう1つの実施態様では、実施例２に記載のように、ナノ粒子は、薄膜水和法によって調製される。簡単に述べると、この方法では、リン脂質およびパクリタキセルをエタノールに溶解し、薄膜が形成され、すべての溶媒が蒸発するまで回転蒸発に付した。次いで、薄膜を脱イオン(DI)水を用いて水和させて、パクリタキセル-ローディングされたリン脂質ナノ粒子を生成させた。
【０１３４】
本発明の方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを医薬的に許容される賦形剤と組み合わせることを含む、医薬組成物を調製する方法を含む。
【０１３５】
さらなる態様では、本発明は、医薬品の製造における本明細書に記載の組成物の使用を提供する。さらに詳しくは、本明細書に記載の状態の治療に使用するための医薬の製造である。さらに、本明細書に記載されるその医薬組成物はまた、本明細書に記載の方法に従って、本明細書に記載される状態の治療において使用するための医薬の製造における使用が意図される。
【０１３６】
代表的なナノ粒子：リン脂質でコーティングされたパクリタキセルナノ粒子
以下は、本発明の代表的なナノ粒子、リン脂質でコーティングされたパクリタキセルナノ粒子の説明である。
【０１３７】
1つの実施態様では、本発明は、次世代アブラキサン(登録商標)として、天然ポリマー(アブラキサン(登録商標))または化学ポリマー(Cynviloq(登録商標))よりもむしろリン脂質を利用するリン脂質でコーティングされたパクリタキセルナノ粒子製剤を提供する。図１参照。
【０１３８】
パクリタキセルをローディングされた、脂質でコーティングされたナノ粒子製剤の薬物ローディングおよび物理的安定性における脂質組成および製造方法の効果を評価した。
【０１３９】
ナノ粒子は、2つの方法、すなわち、マイクロ流動化-溶媒蒸発法および薄膜水和法によって調製された。製剤パラメータとして、リン脂質の種類、リン脂質脂肪酸鎖長、リン脂質とリゾリン脂質の組合せ、飽和-不飽和リン脂質の比、および薬物-リン脂質の比が挙げられる。マイクロ流動化圧力、マイクロ流動化サイクル数、および水和のための水温などのプロセスパラメータを研究し、薬物ローディング、粒子サイズ、および物理的安定性におけるそれらの影響を評価した。
【０１４０】
異なるリン脂質比を用いて調製されたナノ粒子の短期安定性評価は、粒子サイズが約200nmのパクリタキセルの60％以上のローディングを達成するのに最適なリン脂質-リゾリン脂質比として、4：1を実証した。ナノ粒子のサイズは、脂肪酸の炭素鎖長の増加に伴って増加したが、マイクロ流動化圧力またはサイクル数の変化を伴う薬剤ローディングについては有意な傾向は観察されなかった。リン脂質組成、リン脂質の種類およびプロセスパラメータの最適化は、貯蔵中にサイズ、電荷および完全性を維持する物理的に安定したパクリタキセルをローディングされたリン脂質でコーティングされたナノ粒子製剤をもたらした。
【０１４１】
リン脂質でコーティングされたパクリタキセル(PTX)ナノ粒子(NP)として、リン脂質(PL)、リゾリン脂質(リゾ-PL)、およびコレステロールなどの生分解性および生体適合性成分が挙げられる。リン脂質でコーティングされたNP中のPTXローディングの程度およびそのようなNPの安定性は、リン脂質の性質、種類、および濃度；製造方法；および薬物-脂質比によって決定される薬物-脂質相互作用に依存する。
【０１４２】
リン脂質でコーティングされたPTX NPの粒子サイズ、薬品ローディング、および物理的安定性に影響を及ぼす因子を決定した。
【０１４３】
マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)および薄膜水和法(方法2)によるPLおよびリゾ-PLの組み合わせ製剤
PL鎖で安定化されたPTX-NPを調製するために、組み合わせ物中の脂質間で異なる鎖長および有意な相転移温度差を有する2つの異なるPLおよびリゾ-PLを使用した。研究に用いた脂質の分子構造を図２に示す。PLおよびリゾ-PLの物理的性質を第1表に示す。PTXおよびリゾ-PLの一連の組み合わせを調査して、PTXのための安定した脂質でコーティングされたNP製剤を開発した。
【０１４４】
第1表：PTX-NPの調製に用いられるリン脂質およびリゾリン脂質の物理的性質
【表１】
2018527289.tif 000003
【０１４５】
観察：
ホスファチジルコリン(PC)の転移温度は、PCの炭素鎖長の増加とともに増加する；
PCおよびリゾ-PCのCMCは、炭素鎖長の増加とともに減少する；
しかしながら、リゾ-PCのCMCは、対応する(同じ炭素鎖長)PCのCMCよりもはるかに高い。
【０１４６】
第2表に示すように、一般的には、マイクロ流動化-溶媒蒸発法では、薄膜水和法よりも小さな粒子が生成された。PLまたはリゾ-PL単独では、いずれの方法でも約200nmの、より小さいサイズの粒子を生成しなかった。
【０１４７】
第2表：Prepared by マイクロ流動化-溶媒蒸発法および薄膜水和法によるPTX-NPの調製
【表２】
2018527289.tif 000004
【表３】
2018527289.tif 000005
【０１４８】
観察：
一般に、マイクロ流動化-溶媒蒸発法では、薄膜水和法よりも小さな粒子が生成された；
PLとリゾ-PLの組み合わせは、マイクロ流動化-溶媒蒸発法によって、200〜300nmの、より小さいサイズの粒子を生成した；
リン脂質またはリゾ-PL単独では、いずれの方法でも〜200nmの、より小さな粒子は生成しなかった。
【０１４９】
PTXローディングにおける、PCおよびリゾ-PC中の炭素鎖長の影響
方法1によるPCとリゾ-PCの組み合わせにおけるPTXの粒子サイズおよび封入効率を表3に示す。PC-12とリゾ-PC-12の組み合わせは、PTXのローディングが最も大きい最小サイズの粒子を生成した。ホスファチジルコリンとコレステロールの組み合わせは、PTXの封入効率が非常に低かった。
【０１５０】
第3表：PL、リゾ-PLおよびコレステロールの異なる組合せで調製されたPTX-NPを、マイクロ流動化-溶媒蒸発法によって調製した。
【表４】
2018527289.tif 000006
【０１５１】
観察：
PC-12とリゾ-PC-12の組み合わせは、PTXのローディングが最も大きい最小サイズの粒子を生成した；
ホスホコリンとコレステロールの組み合わせは、PTXの封入効率が非常に低い。
【０１５２】
図3は、PC-12とリゾ-PC-12との組み合わせによって安定化されたPTX-NP製剤の最適化された製剤についての動的レーザー光散乱による粒度分布グラフである。図3を参照すると、濾過されていない製剤中に大粒子がほとんど存在しない。製剤は、0.2μmのフィルターを通して容易に濾過可能であり、濾過されたPTXのNP製剤は、0.1の多分散指数を有する単峰性のサイズ分布を有する。最適化された製剤のZavは約100nmであった。
【０１５３】
押出サイクルが粒子サイズおよび薬物ローディングに及ぼす影響
脂質でコーティングされたPTX-NPの調製に使用される押出サイクルの数は、押し出しサイクル数に応じて薬物ローディングに影響しうる。粒子サイズおよび封入効率における押出サイクル数の影響を図4に示す。結果は、薬物-脂質比が1：5であり、PC-12-リゾ-PC-12が80：20であることを示す。NPのサイズは、押出サイクル数の増加に伴って変化しなかった。PTXの封入は、最大12回の押出サイクルで有意に増加した。
【０１５４】
PC-12とリゾ-PC-12比の最適化
同様の調製条件下でのPTXローディングにおけるPCおよびリゾ-PC比の効果を図5に示す。PTXの最大封入は、PC-12：リゾ-PC-12の比が4：1で得られた。粒子サイズは、リゾ-PC-12の量が増加するにつれて小さくなった。より高濃度のリゾ-PC-12での、より小さいサイズの粒子は、PTXローディングを伴わないリゾ-PC-12のミセル粒子よる可能性があった。
【０１５５】
PC-12とリゾ-PC-12の組み合わせは、最小サイズのPTX-NPを生成した。45％の最大封入効率は、12パスの製剤について達成された。製剤中のコレステロールの添加は、PTXローディングを改善しなかった。PC-12：リゾ-PC-12の80：20の比は、ナノ粒子のサイズ、薬物取り込みおよび安定性にとって最適であった。最適化された製剤は、約100nmの粒子サイズであった。最適化された製剤は、4℃にて24時間安定である。
【０１５６】
注射可能な、パクリタキセルをローディングされ、リン脂質でコーティングされたナノ粒子：組成、製造方法、電気化学的特徴決定および溶出プロファイル
成功したパクリタキセルナノ粒子製剤は、アブラキサン(アルブミン結合ナノ粒子パクリタキセル)およびGenexol-PM(登録商標)(ポリマー結合ナノ粒子パクリタキセル)を含む。Genexol-PM(登録商標)の開発は、疎水性コアおよび親水性シェルを含むパクリタキセルナノ粒子形成のための、メトキシ-ポリ(エチレングリコール)-ポリ(ラクチド)で構成された生分解性ジブロックコポリマーを用いるワンポット合成技術を利用した製造における重要な一歩前進であった(図1参照)。しかしながら、血清/血漿における臨床的過敏症および不安定性は依然として問題である。本発明は、アブラキサンの所望の血漿不安定性およびGenexol-PM(登録商標)のリン酸緩衝食塩水(PBS)安定性を保持するパクリタキセルナノ粒子製剤の、リン脂質を用いるワンポット合成を提供する。本発明のパクリタキセル粒子にでは天然リン脂質を使用するため、過敏症は問題とならない
【０１５７】
ナノ粒子の合成を、2つの方法を用いて行った：方法1、マイクロ流動化-溶媒蒸発法(アブラキサン(登録商標)法と同様)；および方法2、薄膜水和法(Genexol-PM(登録商標)法と同様のワンポット法)。簡単に述べると、方法2では、リン脂質およびパクリタキセルをエタノールに溶解し、薄膜が形成されてすべての溶媒が蒸発するまで回転蒸発に付した。次いで、薄膜を脱イオン(DI)水を用いて水和させ、パクリタキセルローディングリン脂質ナノ粒子を生成させた。ナノ粒子の大きさおよびゼータ電位をMalvern ZS DLSシステムを用いて測定した。製剤を、1.2μm、0.8μm、0.45μmおよび0.2μmのシリンジフィルターを用いる連続濾過に付した。リン脂質ナノ粒子の薬物取り込み/ローディングを、ELISAを用いて測定した。製剤の電気化学的特性を、DropSens製のスクリーン印刷されたカーボンナノチューブ電極およびMetrohm製のPGSTAT204 Autolabステーションを用いて測定した。ヒト血漿、50mg/mLのヒト血清アルブミン(HSA)溶液、PBSおよびDI水中でのナノ粒子の溶出試験を、動的光散乱を用いるナノ粒子サイズを測定することによって行った。
【０１５８】
一連のリン脂質およびリゾリン脂質をパクリタキセルナノ粒子の集合について試験した。
【０１５９】
図7は、マイクロ流動化および薄膜蒸発法によって調製された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、粒子サイズ(t=0における)およびパクリタキセル取り込み(％)を比較する。
【０１６０】
調査結果は以下の通りであった：PC10(1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、PC 12(1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、リゾPC10(1-デカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)およびリゾPC12(1-ラウロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)などの短鎖脂質は、良好な薬物ローディング、最適サイズおよび安定性を有する粒子を生成した。方法2は、方法1と比較して、より高い薬物ローディングおよびより高い安定性を有するナノ粒子を生成した。方法1および方法2を用いて合成された製剤の電気化学的特性は、おそらくPCおよびリゾ-PCの中性特性により、弱く負に帯電したものと弱く正に帯電したものとでは異なった。各製剤は、明確なサイクリックボルタンメトリー(CV)スキャンを示した(図8)。2つの異なる方法によって生成された粒子の電荷の差異は、方法1および方法2によって生成された粒子の周りの脂質構成が異なることを示す。
【０１６１】
図8は、マイクロ流動化法および薄膜蒸発法によって製造された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子(PC 12：リゾ 12)についての電気化学的応答(サイクリックボルタンメトリー：電流(mA)対印加電位(V))を比較する。
【０１６２】
方法2(LM-101)を用いて製造されたリン脂質ナノ粒子は、ヒト血漿中で急速に崩壊したが、このことは、これらのナノ粒子(図10C)が、アブラキサン(登録商標)(図10A)およびGenexol-PM(登録商標)(図10C)と同様の溶出特性を有することを示している。Genexol-PM(登録商標)と同様に、ナノ粒子は、非常に低いパクリタキセル濃度(1〜10μg/ ml)であっても、脱イオン水およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中でそのままであった。この特性により、LM-101は、卵巣癌の治療のためにPBS希釈溶液として腹膜腔に投与されるか、または膀胱癌の治療のために膀胱内へ放散(distilled)される。結果は、Genexol-PM(登録商標)の高い血漿/血清不安定性が排除され、LM-101が血清/血漿中のアブラキサン(登録商標)と類似の挙動を獲得したことを示す。これにより、乳癌、肺癌、膵癌および黒色腫癌の治療のために、LM-101を、アブラキサン(登録商標)の薬物動態学的特性をもって静脈内投与することが可能になる。
【０１６３】
図9は、脱イオン水(DI)、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、およびヒト血漿(50mg/mLヒト血清アルブミン/PBS)中の本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子の溶出を比較し、パクリタキセル濃度(μg/mL)の関数としての粒子サイズ(nm)を示す。
【０１６４】
図10A、10Bおよび10Cは、脱イオン水(DI)リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、血清(0.1X：5mg/mL HSA/PBS)、血清(1.0X：50mg/mL HSA/PBS)、模擬血漿(50mg/mL HSA/PBS)、および血漿中のアブラキサン(登録商標)ナノ粒子(10A)、Genexol-PM(登録商標)ナノ粒子(10B)および本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子(10C)の溶出を比較し、パクリタキセル濃度(μg/mL)の関数としての粒子サイズ(nm)を示す。
【０１６５】
注射可能な、パクリタキセルをローディングされ、リン脂質でコーティングされたナノ粒子：脂質組成、薬物濃度、保存温度、凍結乾燥および添加剤の影響
パクリタキセルは、乳癌、肺癌および卵巣癌などの固形腫瘍のための最も有効な化学療法薬の1つである。パクリタキセルは、その溶解度(0.35-0.7μg/mL)を改善し、クレモフォールELのような有害な溶媒の使用を避けるために、ナノ粒子製剤、アブラキサン(登録商標)として製剤されている。次世代のアブラキサンが報告されている：Cynviloq(登録商標)は、ナノ粒子を安定化するために生物学的ポリマーではなく化学ポリマーを使用する高分子ミセルパクリタキセル製剤である。本発明は、次世代アブラキサン(登録商標)の創製のためにCynviloq(登録商標)化学ポリマーよりもむしろリン脂質の使用を提供する。
【０１６６】
パクリタキセルをローディングされ、リン脂質でコーティングされたナノ粒子製剤の薬物ローディングおよび物理的安定性における脂質組成の影響を、凍結乾燥の前後で評価した。ナノ粒子を、マイクロ流動化-溶媒蒸発法および薄膜蒸着法により製造した。製剤パラメータは、リン脂質の種類、リン脂質脂肪酸鎖長、リン脂質とリゾリン脂質組み合わせの比率、および薬物−リン脂質の比率を含んだ。マイクロ流動化圧力およびマイクロ流動化サイクル数などのプロセスパラメータを研究し、薬物ローディング、粒子サイズおよび物理的安定性へのそれらの影響を評価した。
【０１６７】
異なるリン脂質比を用いて製造されたナノ粒子の短期安定性評価は、粒子サイズが約200nmである場合に、80％以上のパクリタキセルローディングを達成するのに最適なリン脂質-リゾリン脂質比として、4：1を実証した。リン脂質脂肪酸の炭素鎖長が長くなるにつれて、ナノ粒子のサイズは増加したが、マイクロ流動化圧力またはサイクル数の変化に伴う薬物ローディングにとって有意な傾向は観察されなかった。製剤の安定性を、凍結乾燥の前後で、異なる温度にて評価した。凍結乾燥における安定性のためのリン脂質組成、薬物-脂質比、プロセスパラメータ、および添加剤の最適化は、貯蔵中のサイズ、電荷および粒子の完全性を維持する物理的に安定したパクリタキセルをローディングされ、リン脂質でコーティングされたナノ粒子製剤をもたらした。
【０１６８】
リン脂質でコーティングされ、パクリタキセルをローディングされたナノ粒子は、リン脂質、リゾリン脂質、およびコレステロールなどの生分解性および生体適合性成分からなった。リン脂質でコーティングされたナノ粒子中に含まれるパクリタキセルローディングの程度およびこれらのナノ粒子の安定性は、(i)リン脂質の性質、種類および濃度；(ii)製造方法；および(iii)薬物-脂質比によって決定される薬物-脂質相互作用；に依存すると決定された。
【０１６９】
以下に、凍結乾燥前後のリン脂質でコーティングされ、PTXをローディングされたNPの粒子サイズ、薬物ローディングおよび物理的安定性に影響を与える因子の最適化について説明する。
【０１７０】
2つの方法でパクリタキセル-リン脂質ナノ粒子(PTX-NP)を調製した：マイクロ流動化-溶媒蒸発法および薄膜水和法。
【０１７１】
方法1：マイクロ流動化-溶媒蒸発法
LV1低容量マイクロフルイダイザー(Microfluidizer)(登録商標)プロセッサを用いるマイクロ流動化によって、パクリタキセル-リン脂質ナノ粒子(PTX-NP)を製造した。パクリタキセルおよびリン脂質を含む有機溶媒を水相に添加し、エマルションをマイクロフルイダイザーに通してナノエマルションを得た。溶媒をナノエマルションから回転蒸発により除去して、パクリタキセルのナノ懸濁液を得た。
【０１７２】
方法2：薄膜水和法
エタノール中にパクリタキセルおよびリン脂質を溶解して、リン脂質膜を製造した。得られる濾過されていない製剤の視覚的測定、顕微鏡的測定、サイズ測定、およびローディング効率測定のために、乾燥薄膜を水で水和させた。
【０１７３】
NPサイズ測定
Zetasizer Nano-ZSを用いて粒子サイズおよび粒子サイズ測定(the particle size and the particle size measurements)を行い、サンプルのZav流体力学的直径を累積分析によって決定した。直径10mmの細胞において、動的レーザー光散乱(固定波長633nm、25℃にて173°He-Neレーザー)を用いる光子相関分光法(PCS)により、粒子サイズおよび強度による粒子サイズ分布を測定した。
【０１７４】
マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)および薄膜水和法(方法2)によって製造されたリン脂質(PL)およびリゾリン脂質(リゾ-PL)の組み合わせ製剤
リン脂質で安定化されたパクリタキセルナノ粒子(PTX-NP)を製造するために、異なる鎖長および著しい相転移温度差を有する2つの異なるPLおよびリゾ-PLを組み合わせて使用した。研究に用いた脂質の分子構造を図2に示す。PL(PC-12−PC-20)およびリゾ-PL(リゾ-PC-12−リゾ-PC-20)の物理的性質を上記の表1に示す。
【０１７５】
パクリタキセル用の安定した脂質でコーティングされたナノ粒子製剤を開発するために、PLおよびリゾ-PLの一連の組み合わせを研究した。
【０１７６】
図11に示すように、薄膜水和法は、一般に、マイクロ流動化-溶媒蒸発法よりも高いローディング(90％まで)の粒子を生成した。PLまたはリゾ-PL単独ではいずれの方法でも、約200nmのサイズのより小さい粒子を生成しなかった。
【０１７７】
図11は、マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)および薄膜水和法(方法2)によって製造された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子(LM-101)について、パクリタキセルローディング(％)を比較する。
【０１７８】
PLおよびリゾ-PLの組み合わせでは、いずれの方法によっても約200nmの、より小さいサイズの粒子が生成された(図12)。
【０１７９】
図12は、マイクロ流動化-溶媒蒸発法(方法1)および薄膜水和法(方法2)によって製造された本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子(LM-101)について、粒子サイズ(nm)を比較する。
【０１８０】
PCおよびリゾ-PCにおける炭素鎖長のスクリーニングならびにPTXローディングの再水和温度
方法2によるPC：リゾPC組み合わせにおけるパクリタキセルの封入効率を、図13に示す。PC-10およびリゾ-PC-10の組み合わせは、一般的に、パクリタキセルの最高ローディングをもたらした。
【０１８１】
図13は、薄膜水和法(方法2)によって製造されたPC炭素鎖長(6-22)の関数としての、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子について、パクリタキセルローディング(％)を比較する。
【０１８２】
約90％であるパクリタキセルの最高封入効率は、再水和のための水温40℃の水で得られた(図14)。
【０１８３】
図14は、薄膜水和法(方法2)により製造されたナノ粒子について、再水和温度の関数として、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子のパクリタキセルローディング(％)を比較する。
【０１８４】
凍結乾燥によるナノ粒子の安定化のための凍結保護剤の種類と量のスクリーニング
単一の凍結保護剤としてのスクロース、マンニトール、PVPおよびトレハロースの保護能力を、異なる量で評価した。図15に示すように、5〜20％の量のトレハロースが、凍結乾燥で粒子を安定化するのに最良であることが分かった。トレハロースは、凍結乾燥による粒子の成長を阻害するための凍結保護剤としての最良の賦形剤であった。
【０１８５】
図15は、薄膜水和法によって製造された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子(LM-101)について、凍結乾燥前および再構成後に、凍結乾燥剤および凍結乾燥剤の量の関数として、粒子サイズを比較する。
【０１８６】
5〜10％のトレハロースを含む製剤は、再構成後室温にて4時間安定であった(図16)。
【０１８７】
図16は、薄膜水和法によって製造された、本発明の代表的なリン脂質でコーティングされた治療薬(パクリタキセル)ナノ粒子である、PCでコーティングされたパクリタキセルナノ粒子(LM-101)について、pH 5.5の3.2 mMヒスチジン緩衝液による再構成後の時間(t=0および4時間)の関数として、粒子サイズを比較する。
【０１８８】
本明細書で使用される用語「約」および「実質的に」は、用語の対象から10％未満の変動を示す。
【０１８９】
以下の実施例は、本発明を限定するものではなく例示する目的で提供される。
実施例
【実施例１】
【０１９０】
マイクロ流動化-溶媒蒸発法による代表的なパクリタキセルナノ粒子の製造
PTX-リン脂質NPを、LV1低容量マイクロフルイダイザー(登録商標)プロセッサ(Microfluidics、Massachusetts、US)でのマイクロ流動化によって調製した。PTXおよびリン脂質を含有する有機溶媒(エタノール：クロロホルム(9：1))を水相(脱イオン水、DI)に添加し、エマルションをマイクロフルイダイザーに通してナノエマルションを得た。溶媒をナノエマルションから回転蒸発により除去して、水相中のリン脂質でコーティングされたPTXナノ微粒子のナノ懸濁液を得た。
【０１９１】
有機相および水性相を一緒に混合することによって、ナノ粒子を製造した。有機相は、エタノール：クロロホルム(9：1)溶媒0.16mlに溶解した、40mgの12：0 PC(DLPC)1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(Avanti Polar Lipids、Inc.、Alabama、US)、10mgの12：0 リゾPC 1-ラウロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(Avanti Polar Lipids、Inc.、Alabama、US)および10mgのパクリタキセル(パクリタキセルは、Tecoland Corporation、Irvine、CAから入手した(DMF No. 11909))からなる。水相は1.84mlの脱イオン水からなる。有機相と水相を、ホモジナイザー(VWR(登録商標)200ホモジナイザー)を用いて1分間混合して、マイクロサイズの粒子またはマイクロエマルションを得た。LV1マイクロフルイダイザーを用いて、マイクロサイズの粒子をさらに分解してナノ粒子を形成させた。製剤は、20,000psiのプロセス圧力でマイクロフルイダイザーの12回の通過を通して押し出された。次いで、直ちに製剤を以下の条件で回転蒸発に付した(水浴温度=40℃、冷却装置温度=5℃、真空=25mmHg、回転=280rpm、フラスコサイズ=250ml)。全ての溶媒が除去され、さらなる気泡がフラスコ内で観察されなくなるまで、蒸発を続けた。製剤を、DI水を用いて、最終体積10mlになるように希釈した。
【０１９２】
使用されたリン脂質はすべて研究用グレードであった：1,2-ジドデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン( DLPC)；1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)；1,2-diパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)；1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)；1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DAPC)；1-ドデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(リゾ-LPC)；1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(リゾ-MPC)；1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(LPC)、1-エイコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(リゾ-EPC)を、Avanti Polar Lipids、Inc.(Alabama、US)から購入した。コレステロールを、Sigma(St. Louis、MO)から入手した。HPLCグレードの水およびエタノールを、Fisher Scientific(Fair Lawn、NJ)から購入した。HPLCグレードのクロロホルムを、Acros Organics(Morris Plains、NJ)から購入した。その他の化学薬品および試薬はすべて分析グレードであり、さらに精製または特性評価することなく使用された。
【実施例２】
【０１９３】
薄膜水和法による代表的なパクリタキセルナノ粒子の製造
エタノール中にPTXおよびリン脂質を溶解して、リン脂質膜を製造した。得られる濾過されていない製剤の視覚的測定、顕微鏡的測定、サイズ測定、およびローディング効率測定のために、乾燥薄膜を水で水和させた。
【０１９４】
有機相は、10mlのエタノールに溶解した、40mgの12：0 PC(DLPC)1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(Avanti Polar Lipids、Inc.、Alabama、US)、10mgの12：0 リゾPC 1-ラウロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(Avanti Polar Lipids、Inc.、Alabama、US)および10mgのパクリタキセル(パクリタキセルは、Tecoland Corporation、Irvine、CAから入手した(DMF No. 11909))からなる。水相は10mlの脱イオン水からなる。2つの相を250mlのエバポレーターフラスコ中で混合する。この溶液を、以下の条件で回転蒸発器を用いて完全に蒸発させる：水浴温度=28℃、圧力<2mm Hg、冷却装置温度=5℃、真空=25mmHg、回転速度=280rpm、フラスコ上に薄膜が形成されるまで。次いで、水浴温度を60℃に上昇させ、残留エタノールをさらに1時間蒸発させて除去する。次いで、60℃に加熱した10mlの脱イオン水をフラスコに加え、マグネチックスターラーを用いて30分間連続的に撹拌して、薄膜を再水和させる。
【実施例３】
【０１９５】
代表的なパクリタキセルナノ粒子のサイズおよびゼータ電位測定
Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments Ltd、Worcestershire、UK)を用いて粒子サイズおよび粒子サイズ測定(the particle size and the particle size measurements)を行い、サンプルのZav流体力学的直径を累積分析によって決定した。直径10mmの細胞において、動的レーザー光散乱(固定波長633 nmの4 mW He-Neレーザー、25℃にて173°の後方散乱)を用いる光子相関分光法(PCS)により、粒子サイズおよび強度による粒子サイズ分布を測定した。キュムラント平均としても知られる粒子サイズのZavは、高調波強度の平均粒径として定義される。すべての測定を6回ずつ行った。水中でのNPのゼータ電位(表面電荷)測定は、Zetasizer Nano-ZSを用いる測定期間の自動モードで、折り畳まれた毛細血管細胞を用いる粒子の電気泳動移動度に基づいて行われた。Smoluchowskiモデル(レーザードップラーマイクロ電気泳動、He-Neレーザー633nm、25℃にて)を用いるレーザー散乱法により、測定を行った。すべての測定を6回ずつ行った。
【０１９６】
本発明の好ましい実施態様を図示および説明してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができることが理解されよう。
【０１９７】
排他的な財産または特権が主張される本発明の実施態様は、以下のように定義される。
【図１】
2018527289.tif 000007
【図２】
2018527289.tif 000008
【図３】
2018527289.tif 000009
【図４】
2018527289.tif 000010
【図５】
2018527289.tif 000011
【図６】
2018527289.tif 000012
【図７】
2018527289.tif 000013
【図８】
2018527289.tif 000014
【図９】
2018527289.tif 000015
【図１０Ａ】
2018527289.tif 000016
【図１０Ｂ】
2018527289.tif 000017
【図１０Ｃ】
2018527289.tif 000018
【図１１】
2018527289.tif 000019
【図１２】
2018527289.tif 000020
【図１３】
2018527289.tif 000021
【図１４】
2018527289.tif 000022
【図１５】
2018527289.tif 000023
【図１６】
2018527289.tif 000024
【国際調査報告】
2018527289.tif 000025
2018527289.tif 000026