(57)【要約】  本明細書では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６Ｐａｘ７、および／またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞を生成する方法および組成物を提供する。一部の場合では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を、１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に接触させることを含み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に接触させることは、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の発生を直接もたらす。また、発生した細胞を使用する方法も提供する。典型的には、化合物のうちの１つはＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１などのｗｎｔ経路活性化剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞を生成する方法であって、前記方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を提供することと、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に接触させることとを含み、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、前記１つの化合物、または前記２つもしくはそれ超の化合物と同時に前記接触させることが、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の発生を直接もたらす、方法。
【請求項２】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞が、筋芽細胞を形成する潜在性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を接触させることが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の発生を直接もたらす１つの化合物と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を接触させることが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の発生を直接もたらす２つまたはそれ超の化合物と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の１つの化合物の濃度を一定期間にわたって維持することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物前記２つまたはそれ超の化合物の濃度を一定期間にわたって維持することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の前記発生が核酸のトランスフェクションによって引き起こされない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞を他の細胞から単離された単一細胞としてプレーティングする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞を単層内で他の多能性幹細胞と共にプレーティングする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の前記発生が単一ステップで起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト多能性幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト多能性幹細胞が遺伝子改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト多能性幹細胞が遺伝的筋肉疾患または障害に関連する突然変異を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記多能性幹細胞が遺伝子疾患または障害を有する対象の表現型を矯正するために遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分がＰａｘ３／Ｐａｘ７／ＣＤ５６細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、前記１つの化合物、または前記２つもしくはそれ超の化合物と同時に最初に接触させてから２０日間よりも短い間に、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する５つより多くの細胞が前記多能性幹細胞から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記５つより多くの細胞が、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する１０個より多くの細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記２０日間よりも短い間が１５日間よりも短い間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分が衛星様細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分が衛星細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分が、少なくとも約１７０μｍ２の断面積を有する核を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ阻害剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ５阻害剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記２つまたはそれ超の化合物が血清またはアスコルビン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記２つまたはそれ超の化合物がウマ血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記２つまたはそれ超の化合物が、トランスフェリン、ＸＡＶ９３９、ＶＥＧＦ、ＳＢ４３１５４２、線維芽細胞増殖因子、ＢＩＸ０１２９４、ＩＧＦ−１、Ｎｏｇｇｉｎ、クレアチン、ＰＤ１６９３１６、ＳＭＯアンタゴニスト、および酪酸ナトリウムからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記２つまたはそれ超の化合物がＷｎｔ経路活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤を含む、請求項１、２４、２５、または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記２つまたはそれ超の化合物がＧＳＫ３β阻害剤を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１またはＡＺＤ１０８０である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に最初に接触させてから２０日間よりも短い間に、ＭｙｏＤ、ＭＹＯＧ、またはＭＹＦ５を発現する５つより多くの細胞が前記多能性幹細胞から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ヒト多能性幹細胞を、筋芽細胞を形成する能力を有する細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる方法であって、前記方法が、前記ヒト多能性幹細胞を２つまたはそれ超の化合物と接触させることを含み、前記２つまたはそれ超の化合物がＷｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む、方法。
【請求項３５】
筋芽細胞を形成する能力を有する前記細胞がＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｗｎｔ経路活性化剤がＧＳ３Ｋβ阻害剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｗｎｔ経路活性化剤が、両端を含めて０．１μＭ〜８μＭの濃度で存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＧＳ３Ｋβ阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１またはＡＺＤ１０８０である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ５阻害剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡ８３−０１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＧＦβ受容体阻害剤が、両端を含めて０．１μＭ〜１０μＭの濃度で存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ヒト多能性幹細胞の筋芽細胞を形成する能力を有する細胞への前記分化が単一ステップで起こる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヒト多能性幹細胞を、前記Ｗｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤と、Ｗｎｔ経路活性化剤対ＴＧＦ−β受容体阻害剤が少なくとも１：１の比で接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒト多能性幹細胞を、前記Ｗｎｔ経路活性化剤および前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤と、Ｗｎｔ経路活性化剤対ＴＧＦ−β受容体阻害剤が少なくとも３：２の比で接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触が１０日間またはそれ未満の間起こる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触が２０日間またはそれ未満の間起こる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物が増殖因子を含まない、請求項１から４８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＦＧＦ、ＩＧＦ、またはＨＧＦを含まない、請求項１から４８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＦＧＦ２を含まない、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記多能性幹細胞を増殖因子と接触させない、請求項１から５０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法によって生成された前記細胞が、ＭｙｏＤ、ＭＹＯＧ、およびＭＹＦ５からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現しない、請求項１から４６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
細胞選別を含まない、請求項１から５２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法によって発生した細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法によって発生した細胞の少なくとも約９０％がＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞を、細胞外マトリックスでコーティングした培養表面上で培養することをさらに含む、請求項１から５５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞外マトリックスがラミニンを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞外マトリックスがラミニン１１１、ラミニン２１１、およびラミニン５２１からなる群から選択される物質を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記コラーゲンがＩ型コラーゲンである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）阻害剤を含む、請求項１から６０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＬＲＲＫ２阻害剤がＬＲＲＫ２−ＩＮ−１である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む、請求項１から６０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、両端を含めて０．１μＭ〜１０μＭの濃度で存在する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記方法によって発生した細胞をさらに分化させて細胞集団を発生することができ、前記細胞集団の少なくとも５０％が筋芽細胞を含む、請求項１から６５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法によって発生した細胞をさらに分化させて細胞集団を発生することができ、前記細胞集団の少なくとも５０％が筋管を形成する、請求項１から６５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ＣＤ５６／Ｐａｘ３を発現する、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項６９】
ＣＤ５６／Ｐａｘ７を発現する、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項７０】
ＣＤ５６、Ｐａｘ３、およびＰａｘ７を発現する、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項７１】
Ｐａｘ３／Ｐａｘ７を発現する、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞へと分化する能力を有する、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで筋芽細胞へと分化する能力を有する、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項７４】
自然に存在しない、請求項１から６７のうちのいずれか一項に記載の方法を使用して生成した細胞。
【請求項７５】
（ａ）ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中で提供することと、
（ｂ）前記ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を、系列が決定したＨＬＡヌル細胞へと分化させることと
を含む方法。
【請求項７６】
前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞またはその誘導体を、それを必要とする対象内に導入する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を、前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞へと前記分化させることが単一ステップで行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞が骨格筋前駆細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞が、筋芽細胞を形成する能力を有する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞が衛星細胞または衛星様細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞がＰａｘ３、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ＭＦ２０、およびＣＤ５６のうちの少なくとも１つを発現する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
ＨＬＡをコードするゲノム座位が機能的ＨＬＡを生成しなくなり、それによってＨＬＡヌル多能性幹細胞を発生するように、多能性幹細胞を、ＨＬＡをコードする前記ゲノム座位を変更するように設計されているＣＲＩＳＰＲ酵素と接触させることを含む方法。
【請求項８３】
前記多能性幹細胞がヒトに由来する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞をＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞へと分化させることをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞が、筋芽細胞を形成する能力を有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な、ＨＬＡをコードする前記ゲノム座位の一部分を欠失させるために、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に２つまたはそれ超のガイドＲＮＡを導入する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な、ＨＬＡをコードする前記ゲノム座位の突然変異を生じるために、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に１種または複数種のガイドＲＮＡを導入する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な組換え事象を誘導するために、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に、１種または複数種のガイドＲＮＡおよび前記ＨＬＡまたは周辺ＨＬＡをコードするゲノム座位に対して類似性を有する鋳型ＤＮＡ分子を導入する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
ＨＬＡヌル多能性幹細胞のＰａｘ３およびＰａｘ７を発現する細胞への分化を促進する条件下で前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養し、それによってＰａｘ３およびＰａｘ７を発現するＨＬＡヌル細胞を生成することを含む方法。
【請求項９１】
前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養するための前記条件が、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を２つまたはそれ超の化合物と接触させて、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞のＰａｘ３およびＰａｘ７を発現する前記細胞への分化を促進することを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養するための前記条件がトランスフェクションの条件を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
筋肉欠乏を有する対象を処置する方法であって、
ａ）請求項１から６７、８４、８５、９０から９２のいずれか一項に記載の方法によって生成された細胞を得ることと、
ｂ）前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象内に導入することと
を含む方法。
【請求項９４】
前記筋肉欠乏が筋ジストロフィーによって引き起こされる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記筋肉欠乏がデュシェンヌ型筋ジストロフィーによって引き起こされる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記筋肉欠乏が悪液質によって引き起こされる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記筋肉欠乏が筋肉減少症によって引き起こされる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
請求項１から６７、８４、８５、または９０から９２のいずれか一項に記載の方法によって得られた細胞が、前記筋肉欠乏を有する前記対象に導入する前に足場上に移植する衛星様細胞である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象に導入した後、前記筋肉欠乏を有する前記対象が前記細胞に対して顕著な免疫応答を開始しない、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象に提供する前記細胞の用量が前記対象の前記疾患の重症度に基づく、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞の用量が、前記対象において筋肉量の増加を引き起こすために十分である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象に前記導入することが、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象の腕筋肉内に注射することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象に前記導入することが、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象の脚筋内に注射することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞の用量が、前記筋肉欠乏を有する前記対象の前記脚筋における筋肉量の増加を引き起こすために十分である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
前記多能性幹細胞が、前記筋肉欠乏を有する前記対象に由来する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記筋肉欠乏を有する前記対象に由来する前記多能性幹細胞が、前記筋肉欠乏に関連する表現型を逆転させるために遺伝子改変されている、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
（ａ）筋芽細胞を形成する潜在性を有する、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞と、
（ｂ）Ｗｎｔ経路活性化剤と、
（ｃ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤と
を含む細胞培養物。
【請求項１０８】
候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．請求項１から６７、８４、８５、または９０から９２のいずれか一項に記載の方法から発生させた１種または複数種の細胞であって、表現型を含む細胞を提供することと、
ｂ．前記方法によって発生した前記１種または複数種の細胞を前記候補薬剤と接触させることと、
ｃ．前記候補薬剤が前記表現型に対する効果を有するかどうかを検出することと
を含む方法。
【請求項１０９】
前記候補薬剤による前記表現型に対する前記効果が前記表現型の低下または逆転である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記候補薬剤による前記表現型に対する前記効果が前記表現型の増強である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記表現型が前記１種または複数種の細胞中の突然変異に関連している、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記１種または複数種の細胞が、筋肉欠乏を有する患者に由来する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記１種または複数種の細胞が、筋ジストロフィーを有する患者に由来する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
前記１種または複数種の細胞が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者に由来する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
前記１種または複数種の細胞が、悪液質または筋肉減少症によって引き起こされる筋肉欠乏を有する患者に由来する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１６】
前記１種または複数種の多能性幹細胞が、遺伝子疾患または障害を引き起こす、またはそれに関連付けられている突然変異を含むように遺伝子改変されている、請求項１０８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年４月２２日に出願された米国仮出願番号第６２／１５１，３５２号の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
背景
衛星細胞は、骨格筋細胞の前駆体である。成人の筋肉では、衛星細胞は一般に休止状態にあるが、疾患または傷害もしくは運動などの機械的歪みに応答して活性化し、筋形成を起こす場合がある。衛星細胞はまた、筋肉の通常の成長にも関与している。活性化すると衛星細胞は増殖することができる。さらに、これらの衛星細胞の一部は筋芽細胞へと分化することができ、これは融合して筋管および他の骨格筋構成成分を形成することができる。筋芽細胞はまた、既存の筋管と融合することによって既存の筋線維を増強させることもできる。
【背景技術】
【０００３】
筋肉の疾患および障害は、発達性及び変性性のいずれのものであっても、筋肉細胞の減退または死滅が原因の筋肉機能の徐々または急激な損失、ならびに発達疾患が原因の筋発生の減少を引き起こす場合がある。先天性筋疾患は、これらの特徴を提示する筋疾患の例である。筋肉損失はまた、老化、疾患の処置、またはいくつかの他の原因からも起こり得る。これらの種類の筋肉損失の例には、筋肉減少症および悪液質が含まれる。当技術分野において、様々な種類の筋肉損失の治療の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本開示は、疾患、障害、および老化を含む様々な原因に関連する筋肉損失の潜在的な治療に使用することができる、人工的に生成された衛星細胞、または衛星様細胞、ならびにそのような細胞を作製する方法を提供する。細胞はまた、衛星細胞に対して特定の効果を有する薬物を同定するためのスクリーニングにおいて使用することもできる。
【０００５】
一態様では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞を生成するための方法であって、前記方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を提供することと、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に接触させることとを含み、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、前記１つの化合物、または前記２つもしくはそれ超の化合物と同時に前記接触させることが、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の発生を直接もたらす、方法が提供される。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞が、筋芽細胞を形成する潜在性を有する。一部の実施液体では、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を接触させることが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の発生を直接もたらす１つの化合物と接触させることを含む。一部の実施液体では、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を接触させることが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の多能性幹細胞を、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の発生を直接もたらす２つまたはそれ超の化合物と接触させることを含む。一部の実施液体では、方法は、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の１つの化合物の濃度を一定期間にわたって維持することを含む。一部の実施液体では、方法は、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物前記２つまたはそれ超の化合物の濃度を一定期間にわたって維持することを含む。一部の場合には、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の前記発生が核酸のトランスフェクションによって引き起こされない。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞を他の細胞から単離された単一細胞としてプレーティングする。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞を単層内で他の多能性幹細胞と共にプレーティングする。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞の前記発生が単一ステップで起こる。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である。一部の実施液体では、前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である。一部の実施液体では、前記ヒト多能性幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である。一部の実施液体では、前記ヒト多能性幹細胞が遺伝子改変されている。一部の実施液体では、前記ヒト多能性幹細胞が遺伝的筋肉疾患または障害に関連する突然変異を含む。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞が遺伝子疾患または障害を有する対象の表現型を矯正するために遺伝子改変されている。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分がＰａｘ３／Ｐａｘ７／ＣＤ５６細胞である。一部の実施液体では、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、前記１つの化合物、または前記２つもしくはそれ超の化合物と同時に最初に���触させてから２０日間よりも短い間に、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する５つより多くの細胞が前記多能性幹細胞から生成される。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記５つより多くの細胞が、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する１０個より多くの細胞である。一部の実施液体では、前記２０日間よりも短い間が１５日間よりも短い間である。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分が衛星様細胞である。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分が衛星細胞である。一部の実施液体では、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する前記細胞の少なくとも一部分が、少なくとも約１７０μｍ２の断面積を有する核を有する。一部の実施液体では、前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む。一部の実施液体では、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ阻害剤である。一部の実施液体では、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ５阻害剤である。一部の実施液体では、前記２つまたはそれ超の化合物が血清またはアスコルビン酸を含む。一部の実施液体では、前記２つまたはそれ超の化合物がウマ血清を含む。一部の実施液体では、前記２つまたはそれ超の化合物が、トランスフェリン、ＸＡＶ９３９、ＶＥＧＦ、ＳＢ４３１５４２、線維芽細胞増殖因子、ＢＩＸ０１２９４、ＩＧＦ−１、Ｎｏｇｇｉｎ、クレアチン、ＰＤ１６９３１６、ＳＭＯアンタゴニスト、および酪酸ナトリウムからなる群から選択される化合物を含む。一部の実施液体では、前記２つまたはそれ超の化合物がＷｎｔ経路活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤を含む。一部の実施液体では、前記２つまたはそれ超の化合物がＧＳＫ３β阻害剤を含む。一部の実施液体では、前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１またはＡＺＤ１０８０である。一部の実施液体では、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の前記多能性幹細胞を、１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に最初に接触させてから２０日間よりも短い間に、ＭｙｏＤ、ＭＹＯＧ、またはＭＹＦ５を発現する５つより多くの細胞が前記多能性幹細胞から生成される。
【０００６】
別の態様では、ヒト多能性幹細胞を、筋芽細胞を形成する能力を有する細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させるための方法であって、前記方法が、前記ヒト多能性幹細胞を２つまたはそれ超の化合物と接触させることを含み、前記２つまたはそれ超の化合物がＷｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む、方法が提供される。一部の実施液体では、筋芽細胞を形成する能力を有する前記細胞がＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する。一部の実施液体では、前記Ｗｎｔ経路活性化剤がＧＳ３Ｋβ阻害剤である。一部の実施液体では、前記Ｗｎｔ経路活性化剤が、両端を含めて０．１μＭ〜８μＭの濃度で存在する。一部の実施液体では、前記ＧＳ３Ｋβ阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１またはＡＺＤ１０８０である。一部の実施液体では、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ５阻害剤である。一部の実施液体では、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＳＢ４３１５４２である。一部の実施液体では、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡ８３−０１である。一部の実施液体では、前記ＴＧＦβ受容体阻害剤が、両端を含めて０．１μＭ〜１０μＭの濃度で存在する。一部の実施液体では、ヒト多能性幹細胞の筋芽細胞を形成する能力を有する細胞への前記分化が単一ステップで起こる。一部の実施液体では、前記ヒト多能性幹細胞を、前記Ｗｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤と、Ｗｎｔ経路活性化剤対ＴＧＦ−β受容体阻害剤が少なくとも１：１の比で接触させる。一部の実施液体では、前記ヒト多能性幹細胞を、前記Ｗｎｔ経路活性化剤および前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤と、Ｗｎｔ経路活性化剤対ＴＧＦ−β受容体阻害剤が少なくとも３：２の比で接触させる。一部の実施液体では、前記接触が１０日間またはそれ未満の間起こる。一部の実施液体では、前記接触が２０日間またはそれ未満の間起こる。
【０００７】
上記実施液体のいずれかでは、前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物が増殖因子を含まない。上記実施液体のいずれかでは、前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＦＧＦ、ＩＧＦ、またはＨＧＦを含まない。上記実施液体のいずれかでは、前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＦＧＦ２を含まない。上記実施液体のいずれかでは、前記多能性幹細胞を増殖因子と接触させない。上記実施液体のいずれかでは、前記方法によって生成された前記細胞が、ＭｙｏＤ、ＭＹＯＧ、およびＭＹＦ５からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現しない。上記実施液体のいずれかでは、方法は、細胞選別を含まない。上記実施液体のいずれかでは、前記方法によって発生した細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する。上記実施液体のいずれかでは、前記方法によって発生した細胞の少なくとも約９０％がＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する。上記実施液体のいずれかでは、方法は、前記細胞を、細胞外マトリックスでコーティングした培養表面上で培養することをさらに含む。一部の実施液体では、前記細胞外マトリックスがラミニンを含む。一部の実施液体では、前記細胞外マトリックスがラミニン１１１、ラミニン２１１、およびラミニン５２１からなる群から選択される物質を含む。一部の実施液体では、前記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む。一部の実施液体では、前記コラーゲンがＩ型コラーゲンである。上記実施液体のいずれかでは、前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）阻害剤を含む。一部の実施液体では、前記ＬＲＲＫ２阻害剤がＬＲＲＫ２−ＩＮ−１である。上記実施液体のいずれかでは、前記１つの化合物または前記２つもしくはそれ超の化合物がＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む。一部の実施液体では、前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２である。一部の実施液体では、前記ＲＯＣＫ阻害剤が、両端を含めて０．１μＭ〜１０μＭの濃度で存在する。上記実施液体のいずれかでは、前記方法によって発生した細胞をさらに分化させて細胞集団を発生することができ、前記細胞集団の少なくとも５０％が筋芽細胞を含む。上記実施液体のいずれかでは、前記方法によって発生した細胞をさらに分化させて細胞集団を発生することができ、前記細胞集団の少なくとも５０％が筋管を形成する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のいずれかの方法によって作製される。別の態様では、本開示は、ＣＤ５６／Ｐａｘ３を発現する、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞を提供する。  別の態様では、本開示は、ＣＤ５６／Ｐａｘ７を発現する、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞。なお別の態様では、本開示は、ＣＤ５６、Ｐａｘ３、およびＰａｘ７を発現する、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞を提供する。なお別の態様では、本開示は、Ｐａｘ３／Ｐａｘ７を発現する、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞を提供する。別の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞へと分化する能力を有する、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞を提供する。別の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋芽細胞へと分化する能力を有する、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞を提供する。別の態様では、本開示は、自然に存在しない、上記実施形態のいずれかの方法を使用して生成した細胞を提供する。
【０００９】
別の態様では、（ａ）ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中で提供することと、（ｂ）前記ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を、系列が決定したＨＬＡヌル細胞へと分化させることとを含む方法が提供される。一部の実施液体では、前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞またはその誘導体を、それを必要とする対象内に導入する。一部の実施液体では、前記ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を、前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞へと前記分化させることが単一ステップで行われる。一部の実施液体では、前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞が骨格筋前駆細胞である。一部の実施液体では、前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞が、筋芽細胞を形成する能力を有する。一部の実施液体では、前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞が衛星細胞または衛星様細胞である。一部の実施液体では、  前記系列が決定したＨＬＡヌル細胞がＰａｘ３、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ＭＦ２０、およびＣＤ５６のうちの少なくとも１つを発現する。
【００１０】
なお別の態様では、ＨＬＡをコードするゲノム座位が機能的ＨＬＡを生成しなくなり、それによってＨＬＡヌル多能性幹細胞を発生するように、多能性幹細胞を、ＨＬＡをコードする前記ゲノム座位を変更するように設計されているＣＲＩＳＰＲ酵素と接触させることを含む方法が提供される。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞がヒトに由来する。一部の実施液体では、方法は、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞をＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞へと分化させることをさらに含む。一部の実施液体では、前記ＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞が、筋芽細胞を形成する能力を有する。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な、ＨＬＡをコードする前記ゲノム座位の一部分を欠失させるために、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に２つまたはそれ超のガイドＲＮＡを導入する。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な、ＨＬＡをコードする前記ゲノム座位の突然変異を生じるために、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に１種または複数種のガイドＲＮＡを導入する。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な組換え事象を誘導するために、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素に、１種または複数種のガイドＲＮＡおよび前記ＨＬＡまたは周辺ＨＬＡをコードするゲノム座位に対して類似性を有する鋳型ＤＮＡ分子を導入する。一部の実施液体では、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である。
【００１１】
別の態様では、ＨＬＡヌル多能性幹細胞のＰａｘ３およびＰａｘ７を発現する細胞への分化を促進する条件下で前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養し、それによってＰａｘ３およびＰａｘ７を発現するＨＬＡヌル細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施液体では、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養するための前記条件が、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を２つまたはそれ超の化合物と接触させて、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞のＰａｘ３およびＰａｘ７を発現する前記細胞への分化を促進することを含む。一部の実施液体では、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養するための前記条件がトランスフェクションの条件を含む。
【００１２】
別の態様では、筋肉欠乏を有する対象を処置する方法であって、ａ）上記実施形態の方法のいずれかによって生成された細胞を得ることと、ｂ）前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象内に導入することとを含む方法が提供される。一部の実施液体では、前記筋肉欠乏が筋ジストロフィーによって引き起こされる。一部の実施液体では、前記筋肉欠乏がデュシェンヌ型筋ジストロフィーによって引き起こされる。一部の実施液体では、前記筋肉欠乏が悪液質によって引き起こされる。一部の実施液体では、前記筋肉欠乏が筋肉減少症によって引き起こされる。一部の実施液体では、上記実施形態の方法のいずれかによって得られた細胞が、前記筋肉欠乏を有する前記対象に導入する前に足場上に移植する衛星様細胞である。一部の実施液体では、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象に導入した後、前記筋肉欠乏を有する前記対象が前記細胞に対して顕著な免疫応答を開始しない。一部の実施液体では、前記対象に提供する前記細胞の用量が前記対象の前記疾患の重症度に基づく。一部の実施液体では、前記細胞の用量が、前記対象において筋肉量の増加を引き起こすために十分である。一部の実施液体では、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象に前記導入することが、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象の腕筋肉内に注射することを含む。一部の実施液体では、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象に前記導入することが、前記細胞を、前記筋肉欠乏を有する前記対象の脚筋内に注射することを含む。一部の実施液体では、前記細胞の用量が、前記筋肉欠乏を有する前記対象の前記脚筋における筋肉量の増加を引き起こすために十分である。一部の実施液体では、前記多能性幹細胞が、前記筋肉欠乏を有する前記対象に由来する。一部の実施液体では、前記筋肉欠乏を有する前記対象に由来する前記多能性幹細胞が、前記筋肉欠乏に関連する表現型を逆転させるために遺伝子改変されている。
【００１３】
別の態様では、（ａ）筋芽細胞を形成する潜在性を有する、ＣＤ５６／Ｐａｘ３、ＣＤ５６／Ｐａｘ７、またはＰａｘ３／Ｐａｘ７を発現する細胞と、（ｂ）Ｗｎｔ経路活性化剤と、（ｃ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤とを含む細胞培養物が提供される。
【００１４】
別の態様では、候補薬剤をスクリーニングする方法であって、ａ．上記実施形態のいずれかの方法から発生させた１種または複数種の細胞であって、表現型を含む細胞を提供することと、ｂ．前記方法によって発生した前記１種または複数種の細胞を前記候補薬剤と接触させることと、ｃ．前記候補薬剤が前記表現型に対する効果を有するかどうかを検出することとを含む方法が提供される。一部の実施液体では、前記候補薬剤による前記表現型に対する前記効果が前記表現型の低下または逆転である。一部の実施液体では、前記候補薬剤による前記表現型に対する前記効果が前記表現型の増強である。一部の実施液体では、前記表現型が前記１種または複数種の細胞中の突然変異に関連している。一部の実施液体では、前記１種または複数種の細胞が、筋肉欠乏を有する患者に由来する。一部の実施液体では、前記１種または複数種の細胞が、筋ジストロフィーを有する患者に由来する。一部の実施液体では、前記１種または複数種の細胞が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者に由来する。一部の実施液体では、前記１種または複数種の細胞が、悪液質または筋肉減少症によって引き起こされる筋肉欠乏を有する患者に由来する。一部の実施液体では、前記１種または複数種の多能性幹細胞が、遺伝子疾患または障害を引き起こす、またはそれに関連付けられている突然変異を含むように遺伝子改変されている。
参照による組み込み
【００１５】
この明細書で指摘される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本発明の新規特長は、添付の請求項に詳細に示される。本発明の特長および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および付随図への参照によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本開示の実施形態に従って衛星細胞または衛星様細胞を発生させるおよび使用する方法を示す概要図である。
【００１８】
【図２】図２は、本開示の実施形態に従った、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞の分化過程への手法および使用の概要図である。
【００１９】
【図３】図３は、本開示の実施形態に従った、多能性幹細胞から筋管までの分化の４段階の説明図である。
【００２０】
【図４】図４は、本開示の実施形態に従った、１ステップ過程において衛星細胞または衛星様細胞へと分化する多能性幹細胞の説明図である。
【００２１】
【図５】図５は、本開示の実施形態に従った、ヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ００２）の分化用の分化培地中の血清構成成分の比較の説明図である。
【００２２】
【図６】図６は、本開示の実施形態に従った、ヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）の分化用の分化培地中の血清構成成分の比較の説明図である。
【００２３】
【図７】図７は、本開示の実施形態に従った、ヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０２０）の分化用の分化培地中の血清構成成分の比較の説明図である。
【００２４】
【図８】図８は、本開示の実施形態に従った、ＧＥＮ００２、ＧＥＮ０１９、およびＧＥＮ０２０ヒト胚性幹細胞株にわたる様々な分化培地中の血清構成成分における細胞計数の比較の説明図である。
【００２５】
【図９】図９は、本開示の実施形態に従った、様々な分化培地中の衛星細胞様マーカーを提示する細胞の説明図である。
【００２６】
【図１０】図１０は、本開示の実施形態に従った、３継代にわたる衛星細胞または衛星様細胞の増殖の説明図である。
【００２７】
【図１１Ａ】図１１Ａは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。図１１Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞のＰａｘ３発現の比較の説明図である。図１１Ｃは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞のＰａｘ７発現の比較の説明図である。
【図１１Ｂ】図１１Ａは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。図１１Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞のＰａｘ３発現の比較の説明図である。図１１Ｃは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞のＰａｘ７発現の比較の説明図である。
【図１１Ｃ】図１１Ａは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。図１１Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞のＰａｘ３発現の比較の説明図である。図１１Ｃは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させた細胞のＰａｘ７発現の比較の説明図である。
【００２８】
【図１２Ａ】図１２Ａは、本開示の実施形態に従って様々な細胞外マトリックス分子上で成長させた細胞におけるＰａｘ７発現の比較の説明図である。図１２Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な細胞外マトリックス分子上で成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａは、本開示の実施形態に従って様々な細胞外マトリックス分子上で成長させた細胞におけるＰａｘ７発現の比較の説明図である。図１２Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な細胞外マトリックス分子上で成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。
【００２９】
【図１３Ａ】図１３Ａは、本開示の実施形態に従って、ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１を用いてまたは用いずに成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。図１３Ｂは、本開示の実施形態に従って、ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１を用いてまたは用いずに成長させた細胞におけるＰａｘ３発現の比較の説明図である。
【図１３Ｂ】図１３Ａは、本開示の実施形態に従って、ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１を用いてまたは用いずに成長させた細胞の細胞計数の比較の説明図である。図１３Ｂは、本開示の実施形態に従って、ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１を用いてまたは用いずに成長させた細胞におけるＰａｘ３発現の比較の説明図である。
【００３０】
【図１４】図１４は、本開示の実施形態に従って、ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１を用いてまたは用いずに分化培地中で成長させたヒト胚細胞株（ＧＥＮ０１９およびＧＥＮ０６７）の比較の説明図である。
【００３１】
【図１５Ａ】図１５Ａは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）におけるＰａｘ３発現レベルの比較の説明図である。図１５Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。図１５Ｃは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１５）におけるＰａｘ３発現レベルの比較の説明図である。図１５Ｄは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１５）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。図１５Ｅは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０２）におけるＰａｘ３発現レベルの比較の説明図である。図１５Ｆは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０２）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。
【図１５Ｂ】同上
【図１５Ｃ】同上
【図１５Ｄ】同上
【図１５Ｅ】同上
【図１５Ｆ】同上
【００３２】
【図１６Ａ】図１６Ａは、本開示の実施形態に従って様々なキナーゼ阻害剤の存在下で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。図１６Ｂは、本開示の実施形態に従って様々なキナーゼ阻害剤の存在下で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１５）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａは、本開示の実施形態に従って様々なキナーゼ阻害剤の存在下で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。図１６Ｂは、本開示の実施形態に従って様々なキナーゼ阻害剤の存在下で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１５）におけるＰａｘ７発現レベルの比較の説明図である。
【００３３】
【図１７Ａ】図１７Ａは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）の、細胞数（左パネル）およびＰａｘ３陽性細胞の数（右パネル）の比較の説明図である。図１７Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）における、Ｐａｘ３陽性細胞の百分率（左パネル）およびＰａｘ３の発現レベル（右パネル）の比較の説明図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）の、細胞数（左パネル）およびＰａｘ３陽性細胞の数（右パネル）の比較の説明図である。図１７Ｂは、本開示の実施形態に従って様々な分化培地中で成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９）における、Ｐａｘ３陽性細胞の百分率（左パネル）およびＰａｘ３の発現レベル（右パネル）の比較の説明図である。
【００３４】
【図１８】図１８は、本開示の実施形態に従って、ＲＯＣＫ阻害剤を用いてまたは用いずに成長させたヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１９およびＧＥＮ０６７）の細胞計数の比較の説明図である。
【００３５】
【図１９】図１９は、本開示の実施形態に従ってマウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）と共培養した衛星様細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ筋管形成の説明図である。
【００３６】
【図２０】図２０は、本開示の実施形態に従った、ヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１５）からのＨＬＡクラスＩ上の目的の領域の一例の説明図である。
【００３７】
【図２１】図２１は、本開示の実施形態に従って設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって標的とされるヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮ０１５）のＨＬＡ−Ａエクソン６の領域の一例の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
Ａ．全体
本開示は、多能性幹細胞を、衛星細胞に似ており、筋芽細胞ならびに他の筋肉細胞および筋線維を生じさせる潜在性を有し得る筋肉系列細胞である衛星様細胞へと分化させるためのユニークな方法を特長とする。本方法は、一般に、多能性幹細胞を、衛星様細胞への細胞の分化を媒介する１つまたは複数の化合物と接触させることを含む。本方法は多くの場合は１ステップ過程を含み、したがって高効率である傾向にある。一部の例では、１ステップ過程は、ヒト多能性幹細胞を２つの化合物（たとえば、Ｗｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤）を含む分化培地と接触させることを含み、これにより、多くの場合はＰａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６などの衛星細胞に関連する遺伝子の制御によって、多能性幹細胞が筋肉分化経路に入るようにし、衛星様細胞の生成がもたらす。本方法はまた、特に開始多能性幹細胞の数と比較した場合に、衛星様細胞を高収率で生成し得るという意味でも、高効率であり得る。
【００３９】
臨床的に、衛星様細胞は、筋変性疾患を有する患者、またはこれらだけには限定されないが遺伝子障害、散在性疾患、悪液質、筋挫傷、筋傷害、筋萎縮を含む様々な原因から生じる障害を有する患者、ならびに筋肉減少症および一般的な老化過程などの、患者の処置を含むいくつかの設定において非常に有用であり得る。本明細書中で提供する衛星様細胞は、そのような患者の細胞治療、特に、患者の天然に存在する衛星細胞を補充または補足する治療において使用し得る。そのような細胞治療では、衛星様細胞を筋肉部位などの患者内の部位に注射してよく、これらは続いて患者内で後期の筋肉細胞（たとえば筋芽細胞）を形成し得る。筋芽細胞は、互いにまたは患者の天然に存在する筋芽細胞のいずれかと融合し、患者の身体内で筋管および機能性骨格筋組織を形成し得る。その結果、患者は、筋力の改善を含む、筋緊張または筋機能の改善を経験し得る。一部の例では、美容上、運動上、または他の目的のために筋緊張または筋機能の強化を求める対象は、本開示中に提供する方法および組成物から利益を受け得る。
【００４０】
一部の例では、本方法は、対象を遺伝子改変細胞に由来する衛星様細胞（またはさらには直接遺伝子改変した衛星様細胞）で処置することを含み得る。たとえば、分化細胞を、遺伝子疾患（たとえば、ハンチントン病、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなど）を有する対象から単離することができる。次いで、分化細胞を多能性幹細胞となる（たとえば誘導多能性幹細胞となる）条件に供し得る。多能性幹細胞は、疾患状態を救出または改善するために遺伝子改変または変更し得る。次いで、これらの遺伝子改変した多能性細胞を衛星細胞または衛星様細胞へと分化させてよく、疾患または障害の影響を低下させるために、これらを対象内に移植する。これらの細胞は、異なる対象に由来する細胞よりも、対象において免疫応答を引き起こす可能性が低い場合がある。
【００４１】
別の例では、衛星細胞または衛星様細胞を、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）コード領域（単数または複数）を不活化するように改変されたヒト多能性幹細胞から分化させて、ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を生成させ得る。次いで、ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞をＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞へと分化させてよく、これを細胞治療に使用することができる。これらの細胞は、対象による免疫応答を完全にまたは部分的に回避でき得るため、特に有益であり得る。
【００４２】
本明細書中で提供する衛星様細胞（遺伝子改変または未改変の多能性幹細胞に由来する細胞を含む）はまた、薬物スクリーニングアッセイ、特に筋肉異常を寛解させるための薬剤を同定するためのアッセイにおいて使用することもできる。細胞はまた、疾患モデリングおよび他の種類の疾患研究にも有用であり得る。一部の例では、衛星細胞または衛星様細胞を、ヒトにおいて遺伝子疾患を引き起こす、同一または実質的に類似の突然変異を有するように遺伝子改変したヒト多能性幹細胞から分化させ得る。次いで、そのような衛星細胞または衛星様細胞を、突然変異の効果を逆転または低下させる薬剤についてスクリーニングし得る。これらの細胞は、疾患もしくは障害を研究するため、または薬物スクリーニングを行うために、さらに筋芽細胞および筋管へと分化させることができる。
Ｂ．一般方法
【００４３】
本開示は、他の衛星細胞もしくは衛星様細胞を生じさせる、または骨格筋細胞へと分化して機能的骨格筋を形成する能力を有する衛星細胞または衛星様細胞を、生成、培養、および保存するための方法および組成物を提供する。本開示は、衛星細胞または衛星様細胞から分化した細胞（たとえば、筋芽細胞、筋管）、それらの調製、およびそれらの保存をさらに記載する。
【００４４】
分化過程の全体的な概要を図１に示す。諸ステップは、任意の順序で、多能性幹細胞、たとえば胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞を得ること（１００）を含み得る。一部の場合では、誘導多能性幹細胞を患者からの分化細胞から得る。一部の場合では、多能性幹細胞（たとえば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）を遺伝子改変する。これらのステップはまた、多能性幹細胞を１つまたは複数の化合物と接触させて、細胞を（たとえば化学分化によって）衛星細胞または衛星様細胞へと分化させること（１１０）、衛星細胞または衛星様細胞を同定すること（１２０）、および任意選択で細胞を保存すること（１３０）も含み得る。これらのステップの間に、細胞を培養または拡大することを含む、細胞を維持するためのステップを散在させてもよい。さらに、細胞の保存は、過程中の多くのステップの後に行うことができる。さらに、図１には、衛星細胞または衛星様細胞の同定（１２０）の後に精製ステップが任意選択で含まれていてもよい。一部の場合では、本明細書中に開示する方法は、特定の表現型を有する細胞を残りの細胞集団から分別することを含むステップなどの、１つまたは複数の精製ステップを含む。一部の場合では、本明細書中に開示する方法は精製ステップを含まない。一部の場合では、本方法は、細胞を分別することを含まない。
【００４５】
一部の場合では、衛星細胞または衛星様細胞を、それらが筋肉系列中のさらなる分化細胞、たとえば筋芽細胞または筋管を生じることを可能にする条件に供する。特に、衛星細胞または衛星様細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞および筋管へと分化させ得る（１５０）。他の場合では、衛星細胞または衛星様細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで分化させ得る。
【００４６】
衛星様細胞は、治療剤または他の使用（１４０）などの多くの状況において使用することができる。これらの使用の例には、細胞治療、発達の研究、疾患モデリング、および薬物スクリーニングキャンペーンが含まれる。細胞治療の一部の例では、衛星細胞または衛星様細胞を対象（たとえば患者）内に移植してよく、次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋芽細胞および筋管などの他の筋肉系列細胞へと分化させ得る（１６０）。移植細胞をまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖して、さらなる衛星細胞または衛星様細胞を生じさせてもよい。移植細胞（または、筋芽細胞などのそれらに由来する細胞）をｉｎ  ｖｉｖｏで宿主筋芽細胞と融合して、移植細胞（または移植由来の細胞）および宿主細胞の両方からの核も含むハイブリッド筋管を形成し得る。一部の場合では、移植した衛星細胞もしくは衛星様細胞（またはそれらに由来する細胞）は、因子を分泌することまたは機械的支持を提供することによってなど、他の様式で筋成長を促進し得る。一部の場合では、移植細胞またはそれらから分泌された因子は、炎症反応を軽減することによって筋肉を保護し得る。一部の場合では、移植細胞は、異なる対象から得た細胞から生じた細胞である。一部の場合では、対象は、元々は対象から得た細胞試料に由来する移植細胞を受ける。一部の場合では、対象から得た細胞試料は、誘導多能性幹細胞を形成するように誘導した分化細胞（たとえば、線維芽細胞、血液細胞）を含む。誘導多能性幹細胞は、たとえば表現型を矯正するために遺伝子改変し得る。
【００４７】
一部の場合では、衛星細胞または衛星様細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞および／または筋管へと分化させる。次いで、筋芽細胞および／または筋管を、細胞治療として（たとえば、細胞を対象内に導入することによって）、薬物スクリーニングアッセイのプラットフォームとして、または他の目的のために使用し得る。
【００４８】
別の例では、衛星細胞または衛星様細胞を、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）コード領域（単数または複数）を不活化するように改変されたヒト多能性幹細胞から分化させて、ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を生成させ得る。次いで、ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞をＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る。ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞は、より分化していない細胞（たとえば、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、筋肉系列に制限された前駆細胞）から化学分化によって、衛星細胞もしくは衛星様細胞に関連する遺伝子マーカーの強制発現によって、または当技術分野で公知の任意の他の分化過程によって生成させ得る。強制発現は、タンパク質をコードする発現ベクターの細胞内への導入、組換えウイルスを用いた細胞の形質導入、目的の外来性の精製ポリペプチドの細胞内への導入、目的のポリペプチドをコードする外来性の精製ｍＲＮＡの細胞内への導入、細胞と目的のマーカー（たとえば、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、もしくはＣＤ５６）の発現を誘導する天然に存在しない試薬との接触、または目的のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導するための任意の他の生物学的、化学的、もしくは物理的過程によって達成することができる。
【００４９】
図２は、ＨＬＡヌル多能性幹細胞をＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞へと分化させる一部の基本的なステップを例示する。これらのステップは、多能性幹細胞、たとえば胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞を得ること（２００）、少なくとも１つのＨＬＡ座位を無能化すること（２１０）、細胞を、たとえば化学分化によって、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、またはＣＤ５６などのポリペプチドを発現する細胞へと分化させること（２２０）、衛星細胞または衛星様細胞を同定すること（２３０）、および任意選択で細胞を保存すること（２４０）を含み得る。これらのステップの間に、細胞を培養または拡大することを含む、細胞を維持するためのステップを散在させてもよい。さらに、細胞の保存は、過程中の多くのステップの後に行うことができる。さらに、図２には、衛星細胞または衛星様細胞の同定（２３０）の後に精製ステップが任意選択で含まれていてもよい。一部の場合では、本明細書中に開示する方法は、特定の表現型を有する細胞を残りの細胞集団から分別することを含むステップなどの、１つまたは複数の精製ステップを含む。一部の場合では、本明細書中に開示する方法は精製ステップを含まず、一部の場合では、本方法は、細胞を分別することを含まない。一部の場合では、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞を、それらが筋肉系列中のさらなる分化細胞、たとえば筋芽細胞または筋管を生じることを可能にする条件に供する。特に、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させて筋芽細胞および筋管を形成し得る（２６０）。一部の例では、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞を対象（たとえば患者）内に移植してよく、次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋芽細胞および筋管などの筋肉系列細胞へと分化させ得る（２７０）。移植細胞をまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖して、さらなる衛星細胞または衛星様細胞を生じさせてもよい。さらに、移植したＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞は、対象からの免疫応答（２８０）を回避し得る。移植したＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで宿主筋芽細胞と融合した後に宿主ＨＬＡ抗原を表示することによって、ナチュラルキラー細胞応答を回避し得る。一部の場合では、衛星細胞または衛星様細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞および／または筋管へと分化させる。次いで、筋芽細胞および／または筋管を、細胞治療として（たとえば、細胞を対象内に導入することによって）、薬物スクリーニングアッセイのプラットフォームとして、または他の目的のために使用し得る。
【００５０】
他の例では、衛星細胞または衛星様細胞は、遺伝子疾患もしくは障害に関連する突然変異を保有すると同定された、胚性幹細胞などの疾患に特異的な多能性幹細胞、または、（ａ）遺伝子突然変異を有する対象から得た、もしくは（ｂ）遺伝子突然変異を保有するように遺伝子変更されたいずれかの誘導多能性幹細胞から分化させ得る。次いで、これらの疾患に特異的な幹細胞を疾患に特異的な衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る。疾患に特異的な衛星細胞または衛星様細胞は薬物スクリーニングおよび他の臨床応用に使用し得る。
ＩＩ．細胞の調製
Ａ．多能性幹細胞、多分化能幹細胞、および衛星細胞または衛星様細胞へと分化する能力を有する他の細胞
【００５１】
一部の場合では、衛星細胞または衛星様細胞は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、または系列が決定した細胞（筋肉系列が決定した細胞など）の分化によって生成される。多能性幹細胞は、一般に、３つすべての胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の細胞へと分化する能力を有している一方で、多分化能幹細胞は、複数の細胞型へと発達することができるが多能性幹細胞よりも制限されている。多能性幹細胞には様々な供給源が存在するが、一般に、多能性幹細胞は胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞に由来する。多分化能幹細胞は、新生児臍帯血、または出生後組織から単離した細胞を含む様々な供給源に由来し得る。一例では、本明細書中で提供する方法は、間葉多分化能幹細胞または筋肉系列に制限された前駆細胞を衛星細胞へと分化させるために使用し得る。
【００５２】
衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る細胞の例は、好ましくはヒト対象からのものであるが、非ヒト対象、たとえば非ヒト哺乳動物に由来することもできる。非ヒト哺乳動物の例には、これらだけには限定されないが、非ヒト霊長類（たとえば、類人猿、サル、ゴリラ）、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはウサギが含まれる。
【００５３】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、受精後約４〜５日目の胚盤胞の内部細胞塊から単離してよく、多能性および自己複製の両方によって特徴付けられている。したがって、ＥＳＣは未分化状態で無限に増殖させることができる。ＥＳＣはまた、無期限で培養物中にて増殖させた、以前に単離した細胞から得ることもできる。ＥＳＣは、遺伝子型が男性または女性の胚盤胞から得ることができる。ＥＳＣは、単為生殖を使用して未受精の卵子から得てもよい。さらなる例では、ＥＳＣは、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の使用によって得てもよい、またはＳＣＮＴを受けた細胞の子孫であってもよい。
【００５４】
ＥＳＣは様々な疾患状態を有する対象から収集し得る。細胞は、有害な健康状態のない胚から収集することができる。他の場合では、胚は、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）によって、疾患または障害、たとえば、筋ジストロフィー、ハンチントン病、メロシン欠乏１Ａ、ネマリン筋疾患、および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの筋変性疾患を発生する危険性が増加していると同定され得る。筋ジストロフィーの例には、ベッカー型、先天性、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨ）、筋緊張性（ＩおよびＩＩ型）、眼咽頭型、遠位型、筋緊張性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、およびエメリ−ドレフュス型筋ジストロフィーが含まれる。デュシェンヌ型およびベッカー型の筋ジストロフィーは第Ｘ染色体に位置する遺伝子の突然変異によって引き起こされ、主に男性が患うが、女性も重篤な症状を有する場合がある。さらに、ほとんどの種類の筋ジストロフィーが多系統障害であり、心臓、胃腸管系、神経系、内分泌腺、眼、および脳を含む身体系において徴候を有する。
【００５５】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は様々な細胞型から誘導し得る。適切な細胞集団の例には、これらだけには限定されないが、線維芽細胞、骨髄由来単核細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、末梢血単核球、血液細胞、末梢血リンパ球、マクロファージ、ケラチノサイト、口腔ケラチノサイト、毛嚢真皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、滑膜細胞、腎細胞、皮膚上皮細胞、または骨芽細胞が含まれる。
【００５６】
また、誘導多能性幹細胞は、多くの異なる種類の組織、たとえば、骨髄、皮膚（たとえば、真皮、表皮）、筋肉、脂肪組織、末梢血、包皮、骨格筋、または平滑筋に起源することもできる。細胞はまた、これらだけには限定されないが、臍帯組織（たとえば、臍帯、臍帯血、臍帯血管）、羊膜、胎盤、または他の様々な新生児組織（たとえば、骨髄液、筋肉、脂肪組織、末梢血、皮膚、骨格筋など）を含む新生児組織に由来することもできる。
【００５７】
誘導多能性幹細胞、多分化能細胞、または系列が決定した細胞は、男性または女性である対象に由来し得る。細胞は、帝王切開分娩を含む出生から死亡までの期間の間に対象から収集された、新生児または出生後の組織に由来し得る。一部の場合では、誘導多能性幹細胞は、早期老化を経験している対象を含む高齢の対象に由来する。一部の場合には、組織は、＞１０分齢、＞１時間齢、＞１日齢、＞１か月齢、＞２か月齢、＞６か月齢、＞１歳、＞２歳、＞５歳、＞１０歳、＞１５歳、＞１８歳、＞２５歳、＞３５歳、＞４５歳、＞５５歳、＞６０歳、＞６５歳、＞７０歳、＞７５歳、＞８０歳、＜８０歳、＜７０歳、＜６０歳、＜５０歳、＜４０歳、＜３０歳、＜２０歳または＜１０歳である対象に由来してもよい。対象は新生児であり得る。一部の場合では、対象は小児または成人である。一部の例では、組織は、２、５、１０、または２０時間齢のヒトからのものである。別の例では、組織は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月または１２か月の年齢のヒトに由来する。一部の場合には、組織は、１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、１８歳、２０歳、２１歳、２３歳、２４歳、２５歳、２８歳、２９歳、３１歳、３３歳、３４歳、３５歳、３７歳、３８歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４７歳、５１歳、５５歳、６１歳、６３歳、６５歳、７０歳、７７歳または８５歳の年齢のヒトに由来する。
【００５８】
ｉＰＳＣ、多分化能細胞、または系列が決定した細胞は、本明細書中に記載の対象または患者のうちの任意のものを含む、様々な疾患状態を有する対象から収集し得る、またはそれらに由来し得る。細胞は、有害な健康状態のない対象から収集することができる。他の場合では、対象は、疾患または障害を有する、または有する危険性がある。一部の場合では、対象は、本明細書中に記載の筋肉欠乏性疾患（たとえば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー）または筋肉の消耗もしくは萎縮などの、筋変性疾患または障害を有する、または有する危険性がある。一部の場合では、対象は、遺伝子疾患または障害を有する、または有する危険性があり、そのような場合では、本明細書中で提供する方法を使用して、疾患または障害を処置または寛解させ得る。対象はまた、他の疾患または障害、たとえば、心血管疾患、眼疾患（たとえば黄斑変性症）、聴覚疾患（たとえば聴覚消失）、糖尿病、認知障害、統合失調症、鬱病、双極性障害、認知症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、骨粗鬆症、肝臓疾患、腎臓疾患、自己免疫疾患、関節炎、または増殖性障害（たとえばがん）などの慢性の健康状態も有し得る。特定の場合では、対象は、自身が将来使用するため（たとえば自己治療）、または、処置もしくは治療などのために使用する細胞を必要とし得る別の対象が使用するため（たとえば同種治療）の細胞を提供する。一部の場合では、ドナーおよびレシピエントは免疫組織学的に適合性がある、またはＨＬＡが一致する。
【００５９】
ｉＰＳＣは、分化細胞を多能性へと戻す調節によって得ることができる。さらに、ｉＰＳＣは単一細胞または細胞集団を含む試料から得ることができる。集団は均質または不均質であり得る。細胞は、ヒト細胞試料、たとえば生検または血液試料中に見つかる細胞集団であり得る。多くの場合、細胞は体細胞である。細胞は細胞株であり得る。一部の場合では、細胞は、他の細胞と融合した細胞に由来する。一部の場合では、細胞は、他の細胞と融合した細胞に由来しない。一部の場合では、細胞は、他の細胞と人工的に融合した細胞に由来しない。
【００６０】
ｉＰＳＣの生成は、ポリペプチド、特に、胚性幹細胞の自己複製および／または多能性の維持または制御において役割を果たすタンパク質の発現を強制することによって達成できる。そのようなタンパク質の例は、すべて胚性幹細胞中で高度に発現されるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、およびｃ−Ｍｙｃ転写因子である。さらに、一部の例では、ｉＰＳＣ細胞は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、もしくはＬ−ｍｙｃ、またはがんを引き起こすタンパク質を使用せずに調製する。強制発現には、目的のポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞内に導入すること、組換えウイルスを用いた細胞の形質導入、目的の外来性の精製ポリペプチドを細胞内に導入すること、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡを細胞内に導入すること、細胞を、目的のポリペプチドをコードする内在遺伝子（たとえば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、もしくはｃ−Ｍｙｃ）の発現を誘導する天然に存在しない試薬と接触させること、または、目的のポリペプチドをコードする遺伝子（たとえば、内在遺伝子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、もしくはｃ−Ｍｙｃ）の発現を誘導するための任意の他の生物学的、化学的、もしくは物理学的手段が含まれ得る。さらなる例では、ｉＰＳＣは、多能性を誘導するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）方法または遺伝子ノックダウン方法を使用して生成することができる。ｉＰＳＣの生成はまた、多能性および中胚葉などの分化細胞を形成する能力のマーカーの発現をもたらす他の方法によっても達成し得る。
【００６１】
誘導多能性幹細胞、多分化能細胞、または系列が決定した細胞は、非胚性組織からのもの、たとえば胚期より後の発達段階にあるものであり得る。他の場合では、細胞は胚に由来し得る。一部の場合では、細胞は、胎児段階より後の発達段階の組織からのものであり得る。他の場合では、細胞は胎児に由来し得る。
【００６２】
多能性幹細胞（たとえば、ＥＳＣ、誘導多能性幹細胞）、多分化能細胞、または系列が決定した細胞は、好ましくはヒト対象からのものであるが、非ヒト対象、たとえば非ヒト哺乳動物に由来することもできる。非ヒト哺乳動物の例には、これらだけには限定されないが、非ヒト霊長類（たとえば、類人猿、サル、ゴリラ）、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはウサギが含まれる。
【００６３】
細胞集団には分化細胞および未分化細胞の両方が含まれ得る。一部の場合では、集団は主に分化細胞を含有する。他の場合では、集団は主に未分化細胞、たとえば未分化の幹細胞を含有する。一部の例では、集団内の未分化細胞を、多能性または多分化能となるように誘導し得る。一部の場合では、細胞集団内の分化細胞を、多能性または多分化能となるように誘導する。
【００６４】
さらなる例では、細胞集団には未分化の幹細胞またはナイーブ幹細胞が含まれ得る。一部の場合では、未分化の幹細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびＴｅｒｔのうちの少なくとも４つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも１つの遺伝子、または０個の遺伝子のＤＮＡメチル化またはヒストン修飾が原因で、ヘテロクロマチン形成の後成的失活化修飾を受けていない幹細胞である。そのような遺伝子、たとえば、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、またはＳｏｘ２の活性化、または発現は、ヒト多能性幹細胞がヒト出生後組織中に存在する未分化の幹細胞から誘導される場合に起こり得る。
【００６５】
候補の多分化能または多能性幹細胞コロニーを同定するための形態学的特徴には、これらだけには限定されないが、周辺細胞と比較してより円形の、より小さな細胞の大きさ、および高い核対細胞質の比が含まれる。候補誘導細胞の大きさは、約５μｍ〜約１０μｍ、約５μｍ〜約１５μｍ、約５μｍ〜約３０μｍ、約１０μｍ〜約３０μｍ、または約２０μｍ〜約３０μｍであり得る。一部の例では、高い核対細胞質の比は、約１．５：１〜約１０：１、たとえば、約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約７：１、約８：１、約９．５：１、または約１０：１であり得る。一部の場合では、誘導細胞のクローンは、ＥＳ細胞と比較して平らな形態学を示す。たとえば、末梢血細胞に由来する候補誘導細胞、またはフィーダーを含まない培地中で培養した細胞に由来する候補誘導細胞は、周辺細胞と比較して平らな形態学を示し得る。誘導細胞クローンを同定するための別の形態学的特徴は、親細胞間（たとえば線維芽細胞間）の空間内での小さな単層コロニーの形成である。
【００６６】
候補の多分化能または多能性幹細胞を同定するための遺伝子発現特徴には、これらだけには限定されないが、多能性マーカーの発現（たとえば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０）、普遍的遺伝子発現プロファイルの特徴付け（たとえば、Ｐｌｕｒｉｔｅｓｔ、Ｍｕｌｌｅｒら、２０１１年）、および追加のナイーブｈＥＳＣマーカーの発現が含まれる。誘導多能性幹細胞も、胚性幹細胞と同様、自己複製する能力を有するため、そのような細胞は、無期限で培養物中にて増殖させた、以前に単離した細胞から得ることもできる。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ酵素による多能性または多分化能幹細胞の遺伝子改変
【００６７】
多能性幹細胞（たとえば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ）または多分化能幹細胞を遺伝子改変することができ、それによって生成された細胞を単離し、培養し、所望の遺伝子型を有する分化細胞を生成するために使用することができる。そのような改変には、多能性幹細胞を、（ａ）ＲＮＡ分子と相互作用するヌクレアーゼ酵素（たとえば、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列酵素（ＣＲＩＳＰＲ）、および（ｂ）ＲＮＡ分子と接触させることによって、多能性幹細胞（または他の細胞型）のゲノム座位を変更することを含むことができる。そのようなＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、またはキメラｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「ガイドＲＮＡ」、または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる）を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、これらのＲＮＡ分子の領域と同一または高度に同一であるゲノム中の部位で、ニックまたは二重鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ酵素の例には、これらだけには限定されないが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃｓｎ４、またはＣａｓ１０が含まれる。特に好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は二重鎖切断を生じるＣａｓ９である。
【００６８】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、二重鎖切断の不完全な修復が原因でゲノム中に突然変異を誘導することができる。２つの末端が相同的な鋳型を必要とせずにライゲーションされる非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）は、遺伝子産物を非機能的にする挿入／欠失突然変異をもたらす場合がある。二本鎖の切断はまた、二重鎖切断が切断部位近くの配列と第２のＤＮＡ分子上の類似または同一の配列との組換えを誘導する、相同性に管理された修復過程によって解決することもできる。相同性に管理された修復過程は、配列をゲノム内に組み込むために使用することができる。ゲノム内への配列の組込みを使用して、目的の遺伝子を中断することができる。相同性に管理された修復を使用して、遺伝子の切断または欠失をもたらす鋳型分子との組換えを誘導することができる。たとえば、介在配列なしで遺伝子の５’および３’非翻訳領域をコードするゲノム領域からなる鋳型分子が提供されている場合、生じる組換え産物は遺伝子のコード配列をどれも欠いているであろう。
Ｃ．多能性または多分化能幹細胞におけるＨＬＡ系の遺伝子改変
【００６９】
ＨＬＡ系は、小さなポリペプチド断片を免疫細胞に提示するポリペプチドをコードする、第６染色体上の遺伝子座位からなる。クラスＩ  ＨＬＡポリペプチドは、健康な細胞によって生成されるポリペプチドなどの、細胞内からのポリペプチドを提示するが、細胞内にある、ウイルスなどの外来源に由来するポリペプチドも提示する。クラスＩ  ＨＬＡポリペプチドは、ＣＤ８を発現するＴ細胞と相互作用し、免疫応答を誘導することができる。クラスＩＩ  ＨＬＡポリペプチドは、細胞外の供給源に由来する短いポリペプチドを提示する。抗原にクラスＩＩ  ＨＬＡポリペプチドを提示する一部の細胞には、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ−リンパ球が含まれる。
【００７０】
ＨＬＡ系の構成成分をコードする遺伝子座位は可変性が高い。それぞれの個体は、その細胞中に同じ対立遺伝子の組合せを有するが、これらの対立遺伝子は人ごとに異なる場合がある。異なるＨＬＡ対立遺伝子の組合せを有する人から組織または臓器移植を受ける人は、移植片拒絶の危険性が高い。したがって、ＨＬＡ座位は、移植前に最も一般的に型付けされる遺伝子座位のうちの１つである。
【００７１】
処置する対象以外の供給源に由来する幹細胞を使用した処置は、拒絶の危険性を低下させるＨＬＡ座位を有する細胞の使用によって改善することができる。幹細胞は、そのＨＬＡ座位で遺伝子型決定し、対象と一致させて、移植片拒絶の危険性を低下させることができる。たとえば、幹細胞またはそれに由来する分化細胞を対象（たとえば、自己対象、ＨＬＡが一致する対象）内に移植して、疾患または状態を処置することができる。
【００７２】
好ましい一例では、本明細書中に開示する方法は、移植片拒絶の危険性を低下させるために、ＨＬＡ座位の一部分を発現しない細胞を生成することを含む。ＨＬＡ座位または複数のＨＬＡ座位は、遺伝子改変戦略、組換えなどを含む当技術分野で公知の任意の方法によって、除去または失活させ得る。一部の場合では、多能性幹細胞を、ＨＬＡをコードするゲノム座位を、それらが機能的ＨＬＡを生成しなくなるよう変更するように設計されたＣＲＩＳＰＲ酵素と接触させることによって、ＨＬＡヌル多能性幹細胞を生じさせることができる。ＨＬＡ座位は、Ｃａｓ９をＣＲＩＳＰＥＲ酵素として使用することで非機能的にすることができる。
【００７３】
ＨＬＡ座位を非機能的にする突然変異を誘導するために、Ｃａｓ９に１種または複数種のｇＲＮＡを導入することができる。あるいは、ＨＬＡ座位の欠失を誘導するために、Ｃａｓ９に２つまたはそれ超のｇＲＮＡを導入することができる。一例では、多能性幹細胞が機能的ＨＬＡを生成しなくなるために十分な組換え事象を誘導するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素であるＣａｓ９に、１種または複数種のガイドＲＮＡおよびＨＬＡまたは周辺ＨＬＡをコードするゲノム座位に対して類似性を有する鋳型ＤＮＡ分子を導入し得る。
【００７４】
組換え事象を誘導するために、Ｃａｓ９に１種または複数種のｇＲＮＡおよび１種または複数種の鋳型核酸を導入することができる。そのような組換え事象はＨＬＡ座位の欠失をもたらす場合がある。組換え事象はまた、ＨＬＡ座位が機能的ＨＬＡポリペプチドを生成できなくなるように、ＨＬＡ座位の一部分を欠失させることによるＨＬＡ座位の無能化ももたらし得る。欠失の大きさは、大きさが変動し得る。一部の例では、欠失領域（単数または複数）は小さくてよい。小さな欠失の例には、早期ストップコドンを生じる欠失、転写物の分解を誘導する欠失、または非機能的ポリペプチドを生じる欠失が含まれる。他の例では、１種または複数種の必須エクソンを欠失させることができる。他の例では、遺伝子全体を欠失させることができる。
【００７５】
さらなる例では、複数のＨＬＡ座位を含有する領域を欠失させることができる。したがって、欠失の範囲は、概して＞５ｂｐ、＞１０ｂｐ、＞２０ｂｐ、＞５０ｂｐ、＞１００ｂｐ、＞５００ｂｐ、＞１ｋｂｐ、＞５ｋｂｐ、＞１０ｋｂｐ、＞２０ｋｂｐ、＞５０ｋｂｐ、＞１００ｋｂｐ、＞５００ｋｂｐ、＞１Ｍｂｐ、＞２Ｍｂｐ、または＞３Ｍｂｐであってよい。あるいは、そのような組換え事象は、ＨＬＡ座位内への配列の組込みをもたらし、それを非機能的（ＨＬＡヌル）にする場合がある。そのような突然変異、欠失、または挿入は、プロモーター、転写因子、またはＨＬＡ座位の発現もしくは機能に影響を与える他のゲノム座位を標的とすることができる。
【００７６】
ＨＬＡヌル多能性幹細胞は、「ヒト化」マウスモデル（「Ｈｕ−マウス」）において試験することができる。Ｈｕ−マウスは、ヒト胎児胸腺組織および同質遺伝子ＣＤ３４＋胎児肝臓細胞を免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内に組合せ移植することによって、機能的ヒト免疫系を示す（Ｌａｎ，Ｐ．、Ｔｏｎｏｍｕｒａ，Ｎ．、Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ａ．、Ｗａｎｇ，Ｓ．、およびＹａｎｇ，Ｙ．（２００６年）。Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｔｈｙｍｕｓ／ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ。Ｂｌｏｏｄ、１０８巻（２号）、４８７〜９２頁）。ＨＬＡヌル多能性幹細胞は一般に、ＨＬＡ−多能性幹細胞と比較して、マウスによって拒否される可能性が低下している。免疫系の回避の成功は、ＨＬＡヌル奇形腫の検出によって実証することができる。
Ｄ．疾患を保有する突然変異を導入するための遺伝子改変
【００７７】
遺伝子疾患を引き起こすことが公知である突然変異を健康な幹細胞株に導入することができる。たとえば、フレームシフト突然変異を引き起こす、または他の様式で遺伝子を非機能的にするために、ジストロフィン遺伝子もしくはジストロフィン遺伝子の一部分、または１つもしくは複数のエクソンを欠失させ得る。突然変異は、男性または女性の幹細胞株において、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。生じる改変した幹細胞株を、衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ、さらに筋芽細胞または筋管へと分化させることができる。これらの衛星細胞、衛星様細胞、筋芽細胞、または筋管は、導入した突然変異（単数または複数）によって引き起こされる疾患関連の表現型を示し得る。遺伝的に改変していない幹細胞株は、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および疾患研究において特に有用であり得る同質遺伝子対照として役割を果たし得る。
Ｅ．疾患を引き起こす突然変異を救出するための遺伝子改変
【００７８】
多能性幹細胞、多分化能幹細胞、または他の種類の幹細胞を遺伝子改変し、次いで、本明細書中で提供する方法において使用し得る。一部の場合では、疾患または障害を引き起こす遺伝子突然変異または複数の突然変異を保有する、幹細胞株などの幹細胞を遺伝子改変して、突然変異を矯正し、それによって対象が経験する疾患または障害を軽減させることができる。遺伝子改変は当技術分野で公知の任意の方法によって達成し得る。
【００７９】
一部の例では、細胞（たとえば、血液細胞、皮膚細胞）を、対象の筋組織に影響を与える遺伝子疾患または障害（たとえば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症など）を有する対象から得る。次いで、細胞を、それらが多能性幹細胞または多分化能幹細胞となることを可能にする条件に供し得る。たとえば、細胞は脱分化を受け、誘導多能性幹細胞、特に誘導多能性幹細胞株となり得る。多能性幹細胞（または細胞株）を遺伝子改変して突然変異を矯正し得る。たとえば、対象はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子中に１種または複数種の突然変異を有する場合があり、対象に由来する幹細胞を遺伝子改変して、そのような突然変異またはそのような突然変異の一部分を矯正し得る。改変した多能性幹細胞は、本明細書中に記載の方法を使用して衛星様細胞または衛星細胞へと分化させ得る。次いで、障害の一部の側面を処置または寛解させるために、改変した衛星様細胞または衛星細胞を、遺伝子疾患または障害を有する対象内に導入し得る。
ＩＩＩ．多能性幹細胞の培養
【００８０】
多能性幹細胞を生じさせたまたは得た後、多能性幹細胞（たとえば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ）を拡大することができる。たとえば、多能性幹細胞は任意の適切な培地中で培養および拡大し得る。多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下で培養することができる。たとえば、細胞は、ネズミまたはヒトの胚性線維芽細胞（たとえば、照射したまたはマイトマイシンで処置した胚性線維芽細胞）の層またはカーペット上で培養し得る。多能性幹細胞は、フィーダーを含まない培地中で培養することができる。そのような培地は、精製した構成成分を公知の量で加える、定義された内容物を有し得る。そのような培地は、他の細胞の存在下で馴化した培地などの、完全に定義されていない内容物を有していてよく、この場合、そのような細胞は除去するが、それらに由来するポリペプチドおよび他の分子が培地中に残っている。
【００８１】
多能性幹細胞は、組織培養グレードのプラスチック上に直接プレーティングおよび培養することができる。あるいは、細胞は、コーティングした基質、たとえば、フィブロネクチン、ゼラチン、ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、細胞外マトリックス、コラーゲン、またはラミニン、およびそれらの組合せでコーティングした基質上にプレーティングおよび培養することができる。プレートをコーティングするために使用する物質の濃度は、約５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、もしくは２００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌ、または適切な他の濃度であってよい。一部の場合では、多能性幹細胞を細胞外マトリックスでコーティングした基質上で成長させることは、衛星様細胞集団への分化の効率を増加させ得る。一部の場合では、未処理のペトリ皿を使用し得る。一部の場合では、多能性幹細胞は、以下の物質のうちの１つまたは複数でコーティングしたプレート上で成長させ得る：コラーゲン、たとえば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＸ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、またはＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン。一部の例では、多能性幹細胞は、ラミニン、たとえば、ラミニン−１１１、ラミニン−２１１、ラミニン−１２１、ラミニン−２２１、ラミニン−３３２／ラミニン−３Ａ３２、ラミニン−３Ｂ３２、ラミニン−３１１／ラミニン−３Ａ１１、ラミニン−３２１／ラミニン−３Ａ２１、ラミニン−４１１、ラミニン−４２１、ラミニン−５１１、ラミニン−５２１、ラミニン−２１３、ラミニン−４２３、ラミニン−５２２、ラミニン−５２３、またはそれらの組合せでコーティングしたプレート上で成長させ得る。一部の場合では、多能性幹細胞は、コラーゲン−Ｉ、ラミニン−１１１、ラミニン−２１１、またはラミニン−５２１でコーティングしたプレート上で成長させる。
【００８２】
適切な細胞培養容器には、たとえば、３５ｍｍ、６０ｍｍ、１００ｍｍ、および１５０ｍｍの細胞培養皿、６ウェル、１２ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルの細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、および他の大きさが等価な細胞培養容器が含まれる。
【００８３】
多能性幹細胞は、アポトーシスを低下させるために、ｒｈｏ、またはｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で維持し得る。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞を酵素処理などの過酷な処理に供する場合に特に有用であり得る。たとえば、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、水溶性）、Ｙ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、水溶性）、またはファスジル（ＨＡ１０７７、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の添加を使用して、本開示の多能性幹細胞を培養し得る。一部の場合では、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、Ｙ−２７６３２、またはファスジルの濃度は、約１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、または２０μＭである。
【００８４】
多能性幹細胞は、特定の血清構成成分を添加した培地中で培養し得る。一部の実施形態では、血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清アルブミン、ウマ血清、ＰＬＴ−Ｍａｘヒト血小板抽出物、ウシ血清アルブミン、またはノックアウト血清交換である。血清構成成分の混合物、たとえば、ＦＢＳとウマ血清、ノックアウト血清交換とウシ血清アルブミン、ＦＢＳとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との混合物もまた、使用し得る。
【００８５】
多能性幹細胞を培養するために使用し得る一部の代表的な培地には、これらだけには限定されないが、霊長類ＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ、日本）、ＴｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（商標）、ｈＥＳＦ９、ＭＣ−ＥＳ、胚性幹細胞（ＥＳ）培地、ＭＥＦ馴化ＥＳ（ＭＣ−ＥＳ）、Ｍ２培養培地（Ｇｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓにより製造）、または１０％のＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれる。
【００８６】
ｈＥＳＦ９は、ヘパリンならびに４つのタンパク質構成成分、すなわちインスリン、トランスフェリン、オレイン酸とコンジュゲートしたアルブミン、および線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したｈＥＳＦ基本培地を含み得る。さらに、ＥＳ培地は、４０％のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、４０％のＦ１２培地、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含み得る。
【００８７】
ＭＳ−ＥＳ培地は以下のように調製し得る。ＥＳ培地を、マイトマイシンＣで処置したネズミ胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で２０〜２４時間馴化し、回収し、０．４５μＭフィルターを通して濾過し、約０．１ｍＭのＢ−メルカプトエタノール、約１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２、および任意選択で約１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加した。一部の場合では、マイトマイシンＣで処置したＭＥＦの代わりに照射したＭＥＦを使用する。他の場合では、ＭＥＦの代わりにＳＴＯ（ＡＴＣＣ）マウス細胞株またはヒト繊維芽細胞を使用する。
【００８８】
一部の場合では、多能性幹細胞を低密度でプレーティング（または培養）してよく、これは、細胞を約１：８〜約１：３、たとえば、約１：８、約１：６、約１：５、約１：４、または約１：３で分割することによって達成し得る。細胞を約１０３個の細胞／ｃｍ２〜約１０４個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし得る。一部の例では、細胞を、約１．５ｘ１０３細胞／ｃｍ２〜約１０４細胞／ｃｍ２；約２ｘ１０３細胞／ｃｍ２〜約１０４細胞／ｃｍ２；約３ｘ１０３細胞／ｃｍ２、約１０４細胞／ｃｍ２約４ｘ１０３細胞／ｃｍ２〜約１０４細胞／ｃｍ２；または約１０３細胞／ｃｍ２〜約９ｘ１０３細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし得る。一部の実施形態では、細胞を、１０４細胞／ｃｍ２、例えば、約１．２５ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜約３ｘ１０４細胞／ｃｍ２を超える密度でプレーティングし得る。
【００８９】
多能性幹細胞は、維持培養培地中、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター（たとえば大気中酸素レベル下）中で培養し得る。あるいは、多能性幹細胞は、維持培養培地中、３７℃、５％のＣＯ２、５％のＯ２インキュベーター（たとえば低酸素の条件下）中で、好ましくは毎日または隔日の培地交換を用いて培養し得る。一部の実施形態では、未分化の幹細胞から誘導した多能性幹細胞を培養および成長させるために、細胞を、５〜７日毎に、本明細書中に記載の添加剤を含有する培養培地中、マウス胚性線維芽細胞で覆ったプラスチック培養皿またはｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングしたプラスチック培養皿上で継代培養することが好ましい。誘導細胞のための維持培養培地の例には、任意かつすべての完全ＥＳ細胞培地（たとえばＭＣ−ＥＳ）が含まれる。維持培養培地にはｂ−ＦＧＦまたはＦＧＦ２を添加し得る。一部の場合では、維持培養培地に、他の因子、たとえば、ＩＧＦ−ＩＩ、アクチビンＡ、または本明細書中に記載の他の増殖因子を添加する。たとえばＢｅｎｄａｌｌら、（２００７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３０：４４８巻（７１５７号）：１０１５〜２１頁を参照されたい。一部の実施形態では、誘導細胞を、約１４日間〜約４０日間の間、たとえば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８日間、または約１４日間〜約４０日間のうちの他の期間の間、培養および観察した後、形態学的特徴に基づいて候補の多分化能または多能性幹細胞のコロニーを同定および選択する。
【００９０】
一部の場合では、多能性幹細胞を約１日間、２日間、３日間、４．５日間、５日間、６．５日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、または任意の他の日数の間、培養してよく、その後、本明細書中に記載の分化方法に供する。他の場合では、細胞を１２日間より長く、たとえば、約１２日間〜約２０日間、約１２日間〜約３０日間、または約１２日間〜約４０日間の間、培養し得る。一部の場合では、細胞を無期限に培養し得る。一部の場合では、細胞のアリコートを凍結し、のちに凍結したアリコートから培養物を再開することができる。
【００９１】
多能性幹細胞は、分化の前に複数回（たとえば、１回より多く、５回より多く、または１０回より多く）継代培養し得る。継代培養は、細胞のアリコートを新鮮な培地に入れることによって達成することができる。そのようなアリコートは、細胞の一部分、たとえば、細胞の２分の１、細胞の３分の１、細胞の４分の１、細胞の１０分の１、またはさらには単一細胞であってよい。そのようなアリコートは、細胞の凍結ストックからのものであってよい。単一細胞から培養物を開始するためには、多くの場合は細胞を解離させることが必要である。細胞を解離させる１つの手段は、プロテアーゼ（たとえば、トリプシン、キモトリプシンなど）を用いた処理によるものである。
【００９２】
分化の前に、培養した多能性幹細胞を単一細胞へと解離することができる。この解離は、これらをトリプシンまたはキモトリプシンなどのプロテアーゼと共にインキュベートすることによって達成することができる。一部の場合では、分化の前に培養した多能性幹細胞を単一細胞へと解離しない。
【００９３】
一部の場合には、多能性幹細胞を、約１２℃、１４℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３６℃、３７℃、３８℃、４０℃、４２℃または４４℃の温度で培養し得る。一部の場合には、多能性幹細胞を、約＜１％、＜２％、＜３％、＜４％、＜５％、＜６％、＜７％、＜８％、＜９％または＜１０％のＣＯ２および約＜１％、＜２％、＜３％、＜４％、＜５％、＜６％、＜７％、＜８％、＜９％、＜１０％または＜２０％のＯ２で培養し得る。
ＩＶ．分化過程
Ａ．概要
【００９４】
分化過程中、あまり特殊化されていない細胞が、より特殊化された細胞型となる。分化は、細胞の大きさ、形状、および／または機能的能力などの、細胞の態様に影響を与え得る。これらの変化は、遺伝子発現の制御された改変が大きな原因である。分化の一例では、多能性幹細胞は衛星細胞または衛星様細胞へと分化する。次いで、分化した衛星細胞または衛星様細胞を、衛星細胞または衛星様細胞を特徴付けるいくつかの特性（たとえば、形態学的、遺伝子発現）についてスクリーニングする。次いで、これらのスクリーニング基準を満たす分化した衛星細胞または衛星様細胞をサブクローニングおよび拡大し得る。図３は、本開示の実施形態に従った多能性幹細胞から筋管までの分化の４段階の説明図である。図３のパネル３１０は、免疫蛍光染色によって検出された、多能性のマーカーであるＮａｎｏｇを発現する多能性幹細胞を示す。さらに、図３のパネル３２０は、多能性幹細胞を、Ｐａｘ３／Ｐａｘ７を発現する衛星細胞または衛星様細胞へと化学的に分化させた、分化の第１段階を示す。図３パネル３３０は、衛星細胞または衛星様細胞を筋芽細胞へと分化させ、これらを筋芽細胞マーカーであるＭｙｏＤについて免疫蛍光染色した、分化の第２段階を示す。さらに、図３のパネル３４０は、筋芽細胞が一緒に結合して、筋管形成のマーカーであるジストロフィンの免疫蛍光染色によって検出される筋管を形成する、分化の第３段階を示す。
Ｂ．多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞への化学分化
【００９５】
多能性幹細胞を衛星細胞または衛星様細胞へと分化させるために、多能性幹細胞は、凍結ストックまたは成長中の培養物から得られ得る。これらの多能性幹細胞は、基本培地中、衛星細胞または衛星様細胞への分化を誘導する化合物の存在下、１ステップ過程で培養することができ、これは、複数回の培地変更を含んでいてもいなくてもよい。一部の場合では、多能性幹細胞は、基本培地中、衛星細胞または衛星様細胞への分化を誘導する化合物の存在下、様々な化合物の継続的な添加を含む過程など、複数ステップ過程で培養する。一般に、分化を誘導するために１種または複数種の化合物をそれに加えた基本培地は、「分化培地」と呼び得る。
ｉ．分化培地の構成成分
【００９６】
化学分化過程において使用し得る分化培地の例には、基本培地、Ｗｎｔ活性化剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む培地が含まれ得る。一部の場合では、分化培地には、ＲＯＣＫ阻害剤、血清構成成分、またはそれらの組合せが含まれ得る。一部の場合では、分化培地にはＬＲＲＫ２阻害剤が含まれ得る。多くの場合、本明細書中で提供する分化培地は増殖因子を含まない。
【００９７】
分化培地の例において使用される基本培地は変動する場合があるが、一般に栄養素が豊満な培地を含む。使用し得る基本培地の例は、ＭＣＤＢ１２０、骨格筋細胞基本培地（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌにより製造）、ＳｋＢＭ基本培地（ＳｋＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｏｎｚａにより製造）、ＳｋＢＭ−２基本培地（ＳｋＢＭ−２  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｏｎｚａにより製造）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ「ＡＰＥＬ培地」（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより製造）、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２である。
【００９８】
さらに、ＲＯＣＫ阻害剤が分化培地中に存在し得る。ＲＯＣＫ阻害剤は低細胞密度でのアポトーシスを低下させ得る。一部の場合では、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、Ｙ−２７６３２、またはファスジルなどのＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭまたはそれより多くである。一部の場合では、ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞から衛星様細胞への分化過程の間、連続的に存在する。一部の場合では、ＲＯＣＫ阻害剤は、源を発する多能性幹細胞から衛星様細胞への分化過程の実質的な部分の間（たとえば、１日間より長く、２日間より長く、３日間より長く、４日間より長く、５日間より長く、１０日間より長く、または１５日間より長く）存在する。
【００９９】
基本培地は、上述した培地、または上述したものに類似の培地を、追加の血清様構成成分と共にさらに含み得る。そのような血清様構成成分には、ＢＳＡ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン、フェツイン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ウマ血清、ノックアウト交換血清、デキサメタゾン、またはそれらの組合せを含めることができる。
【０１００】
ＢＳＡは、一部の例では、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％または最大で約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％の最終濃度で存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＢＳＡと接触させることができる。
【０１０１】
ＦＧＦ（または他の増殖因子）は、一部の例では、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、３．５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、４．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌまたは２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で存在し得る。一部の場合には、ＦＧＦは、最大で約０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、３．５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、４．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌまたは２５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＦＧＦと接触させることができる。
【０１０２】
インスリンは、一部の例では、少なくとも約２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間インスリンと接触させることができる。
【０１０３】
一部の場合では、分化培地は、実質的に成長因子を含まない、または任意の増殖因子が存在しない（たとえば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＦＧＦ２、インスリンなどを含まない）。一部の場合では、分化培地は実質的に無血清の（「ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ」）、または非ヒト生物に由来する構成成分が実質的に存在しない。一部の場合では、分化培地は成長因子も含まず、異種物質もない。
【０１０４】
フェツインは、一部の例では、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの最終濃度で存在し得る。ＥＧＦを、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、および２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間フェツインと接触させることができる。
【０１０５】
ウマ血清は、一部の例では、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％の最終濃度で存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ウマ血清と接触させることができる。
【０１０６】
ノックアウト交換血清は、一部の例では、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％の最終濃度で存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ノックアウト交換血清と接触させることができる。
【０１０７】
デキサメタゾンは、一部の例では、約０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ、例えば、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌの最終濃度で存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間デキサメタゾンと接触させることができる。
【０１０８】
基本培地、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤および／または血清構成成分に加えて、分化培地には、多能性幹細胞（または多分化能幹細胞などの他の種類の幹細胞）の衛星細胞または衛星様細胞への分化に寄与する化合物が含まれ得る。特に、Ｗｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤（単独または組み合わせて）と曝露させる多能性幹細胞（または他の種類の幹細胞）は、衛星細胞または衛星様細胞へと分化し得る。さらに、この方法を使用して生成される衛星細胞または衛星様細胞は、筋芽細胞を形成する能力を有し得る。
【０１０９】
一部の場合では、多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞への分化のための分化培地中に存在する化合物はＷｎｔ経路活性化剤である。そのような活性化剤には、ＣＨＩＲ９９０２１、ＱＳ１１、ＩＱ１、バルプロ酸（ＶＰＡ）、またはデオキシコール酸（ＤＣＡ）を含めることができる。特に、Ｗｎｔ経路活性化剤の使用は、ＧＳＫ阻害剤（たとえばＧＳＫ３−β阻害剤）として作用し得る。
【０１１０】
Ｗｎｔ経路活性化剤ＣＨＩＲ９９０２１は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間Ｗｎｔ経路活性化剤ＣＨＩＲ９９０２１と接触させることができる。
【０１１１】
Ｗｎｔ経路活性化剤ＡＺＤ１０８０は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の例では、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＡＺＤ１０８０と接触させることができる。
【０１１２】
Ｗｎｔ経路活性化剤ＱＳ１１は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＱＳ１１と接触させることができる。
【０１１３】
Ｗｎｔ経路活性化剤ＩＱ１は、一部の例では、約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌあるいはより高い範囲の濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＩＱ１と接触させることができる。
【０１１４】
ＶＰＡは、一部の例では、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＶＰＡと接触させることができる。
【０１１５】
Ｗｎｔ経路活性化剤ＤＣＡは、一部の例では、約０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭまたは１００μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＤＣＡと接触させることができる。
【０１１６】
一部の場合では、ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、単独で、またはＷｎｔ経路活性化剤などの別の化学薬品と組み合わせて、分化培地中に存在する。ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、一般に、ＴＧＦ−β受容体シグナル伝達経路の少なくとも一部分を阻害する能力を有する。一部の場合では、ＴＧＦ−β受容体阻害剤はＩ型ＴＧＦ−β受容体シグナル伝達経路の少なくとも一部分を阻害し得る。一部の場合では、ＴＧＦ−β受容体阻害剤はＩＩ型ＴＧＦ−β受容体シグナル伝達経路を阻害し得る。ＴＧＦ−β受容体阻害剤の例には、Ａｌｋ５阻害剤（単数または複数）、ＳＢ４３１５４２、およびＡ８３−０１を含めることができる。特に、ＴＧＦ−β受容体阻害剤の使用は、Ａｌｋ５阻害剤などのＡｌｋ阻害剤として作用し得る。
【０１１７】
ＴＧＦ−β受容体阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤）は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＴＧＦ−β受容体阻害剤（例えば、Ａｌｋ５阻害剤）と接触させることができる。
【０１１８】
ＳＢ４３１５４２は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＳＢ４３１５４２と接触させることができる。
【０１１９】
Ａ８３−０１は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間Ａ８３−０１と接触させることができる。
【０１２０】
Ｗｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤の存在に加えて、シグナル伝達分子がさらに存在し得る。そのようなシグナル伝達分子には、トランスフェリン、アスコルビン酸、ＸＡＶ９３９、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＢＩＸ０１２９４、ＩＧＦ−１、ｎｏｇｇｉｎ、クレアチン、ＰＤ１６９３１６、ＳＭＯアンタゴニスト（単数または複数）、ウマ血清、または酪酸ナトリウムを含めることができる。
【０１２１】
トランスフェリンは、一部の例では、約１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、２１０μｇ／ｍＬ、２３０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、２７０μｇ／ｍＬまたは３００μｇ／ｍＬあるいはより高い濃度で細胞培養物中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間トランスフェリンと接触させることができる。
【０１２２】
アスコルビン酸は、一部の例では、約１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、７０μＭ、９０μＭ、１１０μＭ、１３０μＭ、１５０μＭ、１７０μＭ、１９０μＭ、２１０μＭ、２３０μＭ、２５０μＭ、２７０μＭまたは２９０μＭ、３１０μＭ、３３０μＭ、３５０μＭ、３７０μＭまたは４００μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間アスコルビン酸と接触させることができる。
【０１２３】
ＸＡＶ９３９は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＸＡＶ９３９と接触させることができる。
【０１２４】
ＶＥＧＦは、一部の例では、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＶＥＧＦと接触させることができる。
【０１２５】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーメンバー（例えば、ＦＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３など）は、一部の例では、約１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌまたは５００ｎｇ／ｍｌあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。細胞を、一部の例では、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＦＧＦと接触させることができる。
【０１２６】
ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４）は、一部の例では、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。細胞を、一部の例では、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＢＩＸ０１２９４と接触させることができる。
【０１２７】
ＩＧＦ−１は、一部の例では、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で分化培地中に存在し得る。細胞を、一部の例では、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＦＧＦと接触させることができる。
【０１２８】
ｎｏｇｇｉｎは、一部の例では、１０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１７０ｎｇ／ｍｌまたは１９０ｎｇ／ｍｌ、２１０ｎｇ／ｍｌ、２３０ｎｇ／ｍｌまたは２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で分化培地中に存在し得る。細胞を、一部の例では、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ｎｏｇｇｉｎと接触させることができる。
【０１２９】
クレアチンは、一部の例では、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭまたはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。細胞を、一部の場合には、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間クレアチンと接触させることができる。
【０１３０】
ＰＤ１６９３１６は、一部の例では、約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭの濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＰＤ１６９３１６と接触させることができる。
【０１３１】
ＳＭＯアンタゴニストは、一部の例では、約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ  ０．５μＭ、０．７μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ＳＭＯアンタゴニストと接触させることができる。
【０１３２】
ウマ血清は、一部の例では、約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％あるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間ウマ血清と接触させることができる。
【０１３３】
酪酸ナトリウムは、一部の例では、約０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、７０μＭ、９０μＭ、１１０μＭ、１３０μＭ、１５０μＭ、１７０μＭ、１９０μＭ、２１０μＭ、２３０μＭ、２５０μＭ、２７０μＭまたは２９０μＭ、３１０μＭ、３３０μＭ、３５０μＭ、３７０μＭまたは４００μＭあるいはより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日より長く、８日より長くまたは９日より長くの間酪酸ナトリウムと接触させることができる。
【０１３４】
一部の場合には、Ａｌｋ５阻害剤は、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンを含むことができ、これは、一部の例では、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１２．５μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭまたは５０μＭあるいはより高い濃度で存在し得る。１つの特定の実施形態では、Ａｌｋ５阻害剤２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンの濃度は、２μＭまたは約２μＭである。
【０１３５】
一部の場合では、多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞への分化のための分化培地中に存在する化合物はロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）阻害剤である。そのような阻害剤には、これらだけには限定されないが、ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１、ＣＺＣ５４２５２、ＧＳＫ２５７８２１５Ａ、ＧＮＥ−０８７７、ＧＮＥ−７９１５、ＧＮＥ−９６０５、およびＰＦ０６４４７４７５を含めることができる。
【０１３６】
一部の例では、ＬＲＲＫ２阻害剤は、ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１である。ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１は、約１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭまたは１００μＭより高い濃度で分化培地中に存在し得る。一部の場合には、細胞を、１日より長く、２日より長く、３日より長く、４日より長く、５日より長く、６日より長く、７日、８日より長くまたは９日より長くの間ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１と接触させることができる。
ｉｉ．多能性幹細胞の分化培地への曝露
【０１３７】
多能性幹細胞（または他の種類の幹細胞）を１種または複数種の分化培地と接触させることによって、多能性幹細胞（または他の種類の幹細胞）を衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る。本明細書中で提供する方法には、単一の薬剤、または同時に提供する薬剤の単一の組合せが分化経路を始動させる、多能性幹細胞（または他の幹細胞）を分化させる１ステップ方法が含まれる。一部の場合では、本方法は、多能性幹細胞が核酸を発現するように、核酸を多能性幹細胞内に導入すること（たとえば、トランスフェクション、形質導入、ウイルス形質導入、電気穿孔（eletroporation）などによる）を含み得る。一部の場合では、本方法は、核酸が細胞によって発現され、多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞への分化を引き起こすまたはそれに寄与するように、核酸を多能性幹細胞内に導入することを含まない、または核酸を多能性幹細胞内にトランスフェクトすることを含まない、または核酸を多能性幹細胞内に電気穿孔することを含まない、または核酸を多能性幹細胞内に形質導入すること（たとえばウイルスベクターによる）を含まない。一部の場合では、本方法は、筋原タンパク質を多能性幹細胞に導入することを含む。一部の場合では、本方法は、筋原タンパク質を多能性幹細胞に導入することを含まない。
【０１３８】
図４は、多能性幹細胞を衛星細胞または衛星様細胞へと分化させる例を例示する。多能性幹細胞（４１０）は、本明細書中に記載のように、または当技術分野で公知の任意の方法によって、たとえば単一細胞として適切な培養培地中にプレーティングすることによって、プレーティングおよび培養することができる。一部の場合では、多能性幹細胞を単一ステップで分化培地（４２０）と接触させ、それによって多能性幹細胞の衛星細胞もしくは衛星様細胞への分化を引き起こす、または他の様式で衛星細胞または衛星様細胞を生じる。
【０１３９】
一般に、単一ステップの接触は、多能性幹細胞を、細胞に提供する単一の分化培地と、一度に、または連続的かつ経時的に接触させることを含み得る（たとえば培地変更による）。一部の場合では、単一ステップの接触は、多能性幹細胞を、細胞に提供する単一の分化培地と、様々な濃度で経時的に接触させることを含み得る（たとえば、分化培地の濃度の変更を含む培地変更）。一部の実施形態では、単一の分化培地中に存在する構成成分は、多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞（たとえば、天然に存在する衛星細胞の特徴に類似した、機能的、構造的、形態学的、または発現マーカーの特徴を有する細胞）への分化を引き起こすために十分である。一部の実施形態では、単一の分化培地中に存在する構成成分は、衛星細胞または衛星様細胞を多能性幹細胞から生じさせるために十分である。一部の場合では、単一の分化培地中に存在する構成成分は、細胞が構成成分に連続的に曝露されている場合に（たとえば１回または複数回の培地変更による）、多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞への分化を引き起こすために十分である。一部の場合では、多能性幹細胞を単一の分化培地と接触させることは、細胞を分化培地と連続的に接触させることを含む。他の場合では、多能性幹細胞を単一の分化培地と接触させることは、細胞を分化培地と散発的または連続的に接触させることを含む。
【０１４０】
一部の場合では、本明細書中で提供する培地内の構成成分または構成成分の組は、１種または複数種の多能性幹細胞からの衛星細胞または衛星様細胞の発生を直接引き起こす能力を有し得る。たとえば、一部の場合では、Ｗｎｔ経路活性化剤およびＴＧＦ−β受容体阻害剤は、一緒になって、追加の分化剤の添加なしで多能性幹細胞からの衛星細胞または衛星様細胞の発生を引き起こす能力を有し得る。
【０１４１】
一部の場合では、接触は、多能性幹細胞を２つまたはそれ超の異なる分化培地と接触させることを含む。２つまたはそれ超の異なる分化培地は異なる構成成分を含み得る。一部の場合では、２つまたはそれ超の異なる分化培地は、２つもしくはそれ超、３つもしくはそれ超、４つもしくはそれ超、５つもしくはそれ超、６つもしくはそれ超、７つもしくはそれ超、８つもしくはそれ超、９つもしくはそれ超、または１０個もしくはそれ超の異なる分化培地である。
【０１４２】
一部の場合には、多能性幹細胞を、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも２１日または少なくとも２８日の間１つまたはそれ超の分化培地（培地交換ありまたはなしで）と接触または曝露させ得る。一部の場合には、多能性幹細胞を、最大で１日、最大で２日、最大で３日、最大で４日、最大で５日、最大で６日、最大で７日、最大で８日、最大で９日、最大で１０日、最大で１１日、最大で１２日、最大で１３日、最大で１４日、最大で２１日または最大で２８日の間１つまたはそれ超の分化培地（培地交換ありまたはなしで）と接触させ得る。一部の場合には、多能性幹細胞を、約１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、２１日、２８日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日または７０日の間分化培地と接触または曝露させる。
【０１４３】
１種または複数種の多能性幹細胞は、分化培地の化合物によって同時に接触され得る、たとえば、重複するタイムフレーム中に２つまたはそれ超の化合物を多能性幹細胞に投与する。たとえば、多能性幹細胞を１〜３日目に１つの化合物と接触させ、２〜５日目に第２の化合物と接触させ得る。一部の場合では、１種または複数種の多能性幹細胞は、分化培地の化合物によって同時に接触され得る。たとえば、多能性幹細胞を同じタイムフレーム中に２つの化合物と接触させ得る（たとえば、１〜３日目に２つの化合物と接触させる）。一部の場合では、多能性幹細胞を分化培地の２つまたはそれ超の化合物と連続的または順次に接触させる。たとえば、多能性幹細胞を１〜３日目に１つの化合物と接触させ、４〜６日目に第２の化合物と接触させ得る。
【０１４４】
分化培地の構成成分は単一ステップで添加することができる。培地の構成成分は順次添加することができる。さらに、分化培地の構成成分は同時に添加することができる。分化培地の構成成分はまた、細胞を１つの構成成分と一定期間接触させた後、第２の構成成分を施用することによって、重複した様式で添加することもできる。培地の構成成分はまた、個々にまたは混合物中で細胞に添加することができる。これらの添加は、単一の培地組成への曝露が原因で分化が起こるように、過程全体にわたって培地の組成を変更せずに行うことができる。
【０１４５】
本明細書中で言及するように、分化培地（単数または複数）は時間とともに変更または交換し得る。一部の場合では、分化培地を変更、追加、または置き換える。多くの場合、これらの培地交換の全体にわたって、分化培地の組成は多能性幹細胞から衛星細胞または衛星様細胞への分化の全体にわたって安定して保たれる。一部の場合では、分化培地の組成を変動させる。培地変更は、定期的に、たとえば、６時間毎、１２時間毎、毎日、隔日、３日毎、４日毎、または５日毎に行うことができる。一部の場合では、分化培地（単数または複数）は、多能性幹細胞を衛星細胞または衛星様細胞へと分化させる過程中に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１５回変更する。培地はまた、ケモスタット培養などのように、連続的に添加および除去することもできる。
【０１４６】
多能性幹細胞は分化培地に連続的に曝露させることができる。多能性幹細胞は、分化培地に一定期間曝露させた後、維持培地に戻すことができる。さらに、分化は、特定の期間（たとえば、３日間、５日間、７日間、１０日間、もしくは１５日間）の間、または所定の遺伝子もしくは形態学的マーカーが検出されるまで続けることができる。
ｉｉｉ．分化培地を使用して衛星細胞および衛星様細胞を生成する方法の収率、効率、および他の有益な特長
【０１４７】
本明細書中で提供する方法は、高い衛星細胞または衛星様細胞の収率をもたらし得る、および／または高い効率を有し得る。たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の複数の多能性幹細胞を、本明細書中に記載の分化培地を使用して分化させた場合、前記複数の多能性幹細胞から分化させた細胞の４０％を超えるものがＰａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現し得る一部の場合には、前記複数の多能性幹細胞から分化させた細胞の２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものが、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７および／またはＣＤ５６を発現し得る。一部の場合には、前記複数の多能性幹細胞から分化させた細胞の２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものが、筋芽細胞に分化することができる。一部の場合には、前記複数の多能性幹細胞から分化させた細胞の２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものが、機能的な筋芽細胞に分化することができる。
【０１４８】
一部の場合では、本明細書中で提供する方法を行うことによって衛星細胞または衛星様細胞を複数の多能性幹細胞から発生させるための時間（または期間）は、数日から数週間の単位であり得る。一部の場合には、多能性幹細胞から衛星細胞または衛星様細胞までの期間は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日または約２０日であり得る。期間は、分化を開始した（たとえば多能性幹細胞を分化培地中にプレーティングした）時点から、多能性幹細胞の大多数が衛星細胞または衛星様細胞へと分化した時点、たとえば、培養物中の多能性幹細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が衛星細胞または衛星様細胞へと分化した時点までとして計算し得る。
【０１４９】
一部の場合には、本明細書において提供される方法を実施することによる多能性幹細胞の筋芽細胞への分化の期間は、数日〜数週間の単位であり得る。例えば、本明細書において提供される方法を実施することによる多能性幹細胞の筋芽細胞への分化の期間は、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日または約３０日であり得る。期間は、分化を開始した（たとえば多能性幹細胞を分化培地中にプレーティングした）時点から、多能性幹細胞の大多数が筋芽細胞へと分化した時点、たとえば、培養物中の多能性幹細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が筋芽細胞へと分化した時点までとして計算し得る。
【０１５０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中で提供する多能性幹細胞を、１つの化合物、または２つもしくはそれ超の化合物と同時に接触させてよく、それによって、前記ヒト多能性幹細胞を、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６（たとえば、Ｐａｘ３／ＣＤ５６、Ｐａｘ７／ＣＤ５６、Ｐａｘ３／Ｐａｘ７／ＣＤ５６）を発現する細胞へと分化させる。特に、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現する細胞は、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現する５つより多くの細胞が、特定の期間（たとえば９日間）内に前記多能性幹細胞から発生するような収率で、筋芽細胞を形成する潜在性を有し得る。したがって、多能性幹細胞を培養物中の集団として成長させた場合、培養物は、多能性幹細胞の最初の数に対して少なくとも５：１の比でＰａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現する細胞を生成し得る。一部の場合には、比は、少なくとも２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、２０：１、５０：１または１００：１である。一部の場合には、この比は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７０または１００日内で達成される。
【０１５１】
本明細書中で提供する方法は、高い純度で衛星細胞または衛星様細胞を多能性幹細胞から発生し得る。純度とは、培養物中の全細胞の、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６陽性の百分率（％）または割合をいい得る。純度は分化のそれぞれの段階で評価してよく、たとえば、衛星細胞もしくは衛星様細胞の純度、筋芽細胞の純度および／または筋管の純度を評価することができる。一部の場合には、本明細書において提供されるとおりの分化方法を実施した後の培養物における衛星細胞もしくは衛星様細胞の純度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。一部の場合には、本明細書において提供されるとおりの分化方法を実施した後の培養物における筋芽細胞の純度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。一部の場合には、本明細書において提供されるとおりの分化方法を実施した後の培養物における筋管の純度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。一部の場合には、純度は、１つまたは複数の精製または濃縮ステップ、例えば、１つまたは複数のソーティングステップ（例えば、フローサイトメトリー）を最初に実施することなく得られる。一部の場合には、複数の衛星細胞もしくは衛星様細胞、筋芽細胞または筋管の純度は、１つまたは複数の精製または濃縮ステップ、例えば、１つまたは複数のソーティングステップ（例えば、フローサイトメトリー）を実施することなく少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【０１５２】
一部の場合では、本開示の分化方法を行った後の細胞集団は、神経細胞または神経前駆細胞を実質的に含まない。例えば、本明細書において提供されるとおりの分化方法を実施した後の細胞の集団は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下の神経細胞または神経前駆細胞を含む。
【０１５３】
分化後、衛星細胞または衛星様細胞は、記載した基本培地のうちの任意のものなどの、筋形成培養に適切な任意の培地中で維持することができる。衛星様細胞は、分化を誘導するために使用した化合物を含有する培地中で維持することができる。生じる衛星細胞または衛星様細胞は直接使用することができる。生じる衛星細胞または衛星様細胞は、さらなる倍加、２回の倍加、３回の倍加、４回の倍加、５回の倍加、もしくは６回の倍加、８回の倍加、１０回の倍加、１２回の倍加、１４回の倍加、１６回の倍加、１８回の倍加、２０回の倍加、２２回の倍加、２４回の倍加、２６回の倍加、２８回の倍加、または３０回の倍加のために、培養物中で拡大することができる。
Ｃ．ＨＬＡヌル多能性幹細胞の衛星細胞または衛星様細胞への分化
【０１５４】
本明細書中に記載のＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞は、より分化していない細胞（たとえば、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、筋肉系列に制限された前駆細胞）から化学分化によって、衛星細胞もしくは衛星様細胞に関連する遺伝子マーカーの強制発現によって、または当技術分野で公知の任意の他の分化過程によって生成させ得る。強制発現は、タンパク質をコードする発現ベクターの細胞内への導入、組換えウイルスを用いた細胞の形質導入、目的の外来性の精製ポリペプチドの細胞内への導入、目的のポリペプチドをコードする外来性の精製ｍＲＮＡの細胞内への導入、細胞と目的のマーカー（たとえば、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、もしくはＣＤ５６）の発現を誘導する試薬（たとえば天然に存在しない試薬）との接触、または目的のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導するための任意の他の生物学的、化学的、もしくは物理的過程によって達成することができる。
【０１５５】
一部の例では、ＨＬＡヌル多能性幹細胞を、本明細書中に記載の化学分化方法によって分化させることができる。さらに、ＨＬＡヌル多能性幹細胞を、トランスフェクションを含む培養条件下で衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る。
【０１５６】
ＨＬＡヌル多能性幹細胞は、ＨＬＡヌル多能性幹細胞のＰａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現する細胞への分化を促進する条件下で培養してよく、それによって、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現するＨＬＡヌル細胞が生成される。特に、ＨＬＡヌル多能性幹細胞を培養する条件は、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞を、前記ＨＬＡヌル多能性幹細胞のＰａｘ３、Ｐａｘ７、および／またはＣＤ５６を発現する前記細胞への分化を促進する化合物と接触させることを含み得る。
【０１５７】
たとえば、ＨＬＡヌル多能性幹細胞をＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞へと分化させ得る。ＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞は、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ＭＦ２０、およびＣＤ５６のうちの少なくとも１つを発現し得る。ＨＬＡヌル骨格筋前駆細胞は筋芽細胞を形成する能力を有し得る。さらに、ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞を、特定の組織の前駆体を形成する能力を有するＨＬＡヌル細胞へと分化させ得る。例には、ＨＬＡヌル多能性幹細胞を間葉組織または筋肉系列に特異的な前駆体へと分化させることが含まれ得る。次いで、特定の組織または分化細胞を、それを必要とする対象に提供し得る。さらに、ＨＬＡヌルのヒト多能性幹細胞の分化は、単一ステップで起こる分化の方法を使用して分化させ得る。
【０１５８】
ＨＬＡヌル多能性幹細胞は、分化を誘導するために外来ポリペプチドで処理することができる。たとえば、ｉ）前記細胞を筋原性因子タンパク質で処理すること、ｉｉ）前記細胞において前記筋原性因子の発現を誘導すること、またはｉｉｉ）前記細胞に筋原性因子を発現する能力を有する遺伝子を導入することによって、筋原性因子を幹細胞に提供することができる。一実施形態では、筋原性因子を、細胞に筋原性因子を発現する能力を有する核酸を導入することによって提供する。一実施形態では、筋原性因子はＭｙｏＤをコードする核酸である。
【０１５９】
さらに、ＨＬＡヌル多能性幹細胞は、最初に、アクチビンＡを用いた処理などの間葉系幹細胞への分化を促進する条件下で培養することによって、衛星細胞または衛星様細胞へと分化させる。これらの細胞を選別してＰＤＧＦＲα陽性細胞について高度に濃縮された集団を得ることができ、次いで、これを塩化リチウムで処理して衛星細胞または衛星様細胞への分化を誘導することができる。
Ｖ．衛星様細胞の特長および衛星様特長の検出
【０１６０】
本明細書中で使用する用語「衛星様細胞」とは、天然に存在する衛星細胞（たとえば、ヒトなどの生物内の衛星細胞）に関連する構造的または機能的特長を保有しているが、衛星様細胞を天然に存在する衛星細胞から区別する少なくとも１つの構造的または機能的特長も保有している、任意の細胞をいう。好ましい実施形態では、衛星様細胞は、（ａ）幹細胞、好ましくは多能性幹細胞などのより分化していない細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した細胞、または（ｂ）衛星様細胞の増殖から生じた細胞などの、衛星様細胞に由来する細胞である。本明細書中で使用する用語「衛星細胞」とは、天然に存在する衛星細胞または筋衛星細胞によって示される構造的および機能的特長を保有しており、それを区別する少なくとも１つの構造的または機能的特長を保有していてもいなくてもよい細胞をいう。
【０１６１】
本明細書中で提供する衛星様細胞は天然に存在する衛星細胞と共通の特長を保有しており、天然に存在する衛星細胞において見つかるもとのとは異なる特徴も保有している。本明細書中で提供する衛星様細胞は、ＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルで特異的マーカーを発現する。一部の場合では、マーカーは以下のマーカーのうちの１つまたは複数である：Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、あるいはＣＤ５６（白血球抗原もしくはＬｅｕ−１９、または膜結合神経細胞接着分子もしくはＮ−ＣＡＭとも呼ぶことができる）。一部の場合では、マーカーには、筋細胞核因子（ＭＮＦ）またはｃ−ｍｅｔ原癌遺伝子（肝細胞増殖因子ＨＧＦの受容体が含まれる）。好ましい実施形態では、衛星様細胞はＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６を発現する。一部の実施形態では、部分的に分化した衛星様細胞は、これらのマーカーのサブセットのみ、たとえばＣＤ５６を単独で発現し得る。一部の場合では、衛星様細胞は顕著なレベルのＣＳＰＧ４を発現しない。一部の場合では、衛星様細胞は、顕著なレベルの筋原性調節因子（ＭＲＦ）、たとえば、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ミオゲニン、またはＭＲＦ４などを発現しない。天然に存在する成人衛星細胞はＰａｘ７を発現する一方で、Ｐａｘ３は主に天然に存在する胚性衛星細胞のマーカーである。
【０１６２】
衛星様細胞マーカーは当技術分野で公知の任意の方法によって検出し得る。マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシング、またはｍＲＮＡ転写物のｃＤＮＡ補体のシーケンシングによってなど、ｍＲＮＡ転写物の検出によってアッセイすることができる。ＲＮＡマーカーの普遍的発現（または複数のマーカーの発現）は、マイクロアレイおよびシーケンシング（たとえば、サンガーシーケンシング、高スループットシーケンシング、次世代シーケンシング、超並列高スループットシーケンシングなど）を含む、当技術分野で公知の任意の技法によって検出することができる。タンパク質マーカーの発現は、免疫蛍光、遺伝子融合産物の生成（たとえば、Ｐａｘ７−ＧＦＰレポーター構築物）、放射標識、免疫沈降、ウエスタンブロット、または当技術分野で公知の任意の他の方法によってアッセイすることができる。プロテオミクス技法（たとえばタンパク質アレイ）もまた、衛星様細胞に関連するタンパク質マーカーを検出するために使用し得る。マーカーの発現は、その活性がマーカーによって制御されている遺伝子の活性化または抑圧を検出することによってなど、マーカーの発現の下流効果をアッセイすることによって間接的に推測することができる。
【０１６３】
衛星細胞または衛星様細胞は、その形態学によって同定することができる。衛星様または衛星細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、または上皮細胞と比較して高い核対細胞質の体積比を有し得る。衛星細胞または衛星様細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、または上皮細胞と比較して、いくつかのオルガネラ（たとえば、リボソーム、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ複合体）を有し得る。衛星様細胞は、約１７０μｍ２の断面積の核を有し得る。衛星細胞または衛星様細胞は、筋核と比べて大量の核ヘテロクロマチンを有し得る。活性化された衛星細胞または衛星様細胞は、増加したカベオラ数、細胞質オルガネラ、および休止状態の衛星細胞または衛星様細胞と比較して減少したレベルのヘテロクロマチンを有し得る。衛星様細胞または衛星細胞は、筋芽細胞と比較してそれほど細長くなく、それほど紡錘体の形状ではない。
【０１６４】
一般に、本明細書中で提供する衛星細胞または衛星様細胞は、筋芽細胞、特に融合して筋管を形成することができる筋芽細胞を形成する能力を有する。この能力は、筋芽細胞または筋管への分化を実証することによってなど、機能的に検出することができる。分化は培養物中で行うことができる。分化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえば、衛星細胞または衛星様細胞を適切な動物対象内に注射し、その分化を追跡することによって行うことができる。
【０１６５】
ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞では、ＨＬＡ遺伝子産物が存在しないことは、免疫蛍光、ウエスタンブロット、または任意の公知の方法によって実証することができる。一部の場合では、ＨＬＡ遺伝子の存在または非存在は、当技術分野で公知の方法、たとえばＰＣＲを使用して評価することができる。
ＶＩ．衛星細胞または衛星様細胞の筋芽細胞および筋管への分化
【０１６６】
衛星細胞または衛星様細胞は筋芽細胞および機能性筋管へと分化する能力を有し得る。衛星細胞または衛星様細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋芽細胞および筋管へとさらに分化させることができる。このことは、衛星細胞または衛星様細胞を、心臓毒で処置したｈｕ−マウスまたはそれを必要とする適切なヒトレシピエントなどの、適切な対象に投与することによって達成できる。たとえば、それを必要とするヒトレシピエントは筋変性疾患または障害を有する対象であり得る。
【０１６７】
一部の例では、衛星細胞または衛星様細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋芽細胞および筋管へとさらに分化させることができる。そのような分化は、ＩＧＦ−１またはＴＧＦ−βなどの増殖因子の施用によって起こり得る。そのような分化は、ＢＩＸ０１２９４またはＳＢ４３１５４２などの小分子の施用によって起こり得る。
ＶＩＩ．適用
【０１６８】
本明細書中で提供する衛星細胞または衛星様細胞（ＨＬＡヌル多能性幹細胞に由来するＨＬＡヌルの衛星細胞および衛星様細胞を含む）は、細胞を筋変性疾患または障害を有する患者などの対象内に導入することを含む、細胞治療などの多種多様な臨床適用において使用し得る。本明細書中で提供する細胞はまた、薬物スクリーニングならびに正常な発達および生理学ならびに疾患の研究においても有用であり得る。
Ａ．対象
【０１６９】
本明細書中で提供する衛星様および衛星細胞は、多種多様な対象の症状を処置または寛解させるために使用することができる。本明細書中で提供する細胞および方法から一般に利益を受け得る対象は、筋機能、筋緊張、または筋生理学に影響を与える筋疾患または障害を有する対象である。一部の場合では、対象は遺伝子疾患（たとえば、ハンチントン病、筋ジストロフィー）を有し得る。一部の場合では、対象は後天性障害（たとえば不活動によって引き起こされる筋萎縮）を有し得る。さらに、筋ジストロフィーを有する対象は、心臓、胃腸管系、神経系、内分泌腺、眼、および脳を含む身体系において徴候を有する多系統障害を有し得る。処置を必要とする対象には、筋挫傷または傷害を被った者を含めることができる。筋傷害は、運動などの活動中のスリップまたは転倒などの、外傷事象の結果であり得る。
【０１７０】
処置を必要とする対象にはまた、悪液質または消耗症候群の結果として起こり得る筋萎縮を含む、筋萎縮または消耗を経験している者も含まれ得る。悪液質には筋萎縮、体重減少、疲労、脱力感、および顕著な体重減少が伴い得る。本明細書中で提供する処置方法は、これらの症状のうちの一部、特に筋萎縮および脱力感の逆転を助ける場合がある。悪液質を有する対象には、がん、後天性免疫不全症候群（syndrom）（ＡＩＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、鬱血性心不全、結核、家族性アミロイド多発性神経障害、ガドリニウム中毒、水銀中毒（肢端疼痛症）、およびホルモン欠乏症を有する患者が含まれ得る。
【０１７１】
一部の場合では、処置を必要とする対象は、筋肉減少症、または筋肉の量もしくは老化過程に関連する機能の損失を有する患者である。本明細書中で提供する処置は、筋肉減少症、または筋肉の量もしくは機能の損失の逆転または改善を助け得、一部の場合では、本明細書中で提供する処置は、筋肉減少症（sacropenia）、または筋肉の量もしくは機能の損失が時間と共に悪化することの予防を助ける。
【０１７２】
開示した組成物および方法から利益を受け得る対象には、筋肉量損失の危険性にある対象などの、予防的処置を望む対象が含まれる。そのような対象には、化学療法などの、筋肉量を低下させる可能性がある処置レジメンを受けようとしている者が含まれ得る。そのような対象にはまた、意識喪失または固定ギプスの装着などが原因で、筋肉量を低下させるために十分な期間の間、不動または部分的に不動であった対象も含めることができる。対象の例には、筋組織を損傷または再接続した手術を最近受けた者が含まれ得る。対象の例にはまた、特定の筋肉を欠いて生まれた者または筋肉移植を必要とするものも含まれ得る。対象はまた、美容上の理由または運動上の性能を改善するために筋肉の量もしくは機能の改善を追求する対象であってもよい。
【０１７３】
衛星細胞もしくは衛星様細胞移植を必要とする対象には、男性または女性が含まれ得る。そのような対象は、＞１０分齢、＞１時間齢、＞１日齢、＞１か月齢、＞２か月齢、＞６か月齢、＞１歳、＞２歳、＞５歳、＞１０歳、＞１５歳、＞１８歳、＞２５歳、＞３５歳、＞４５歳、＞５５歳、＞６５歳、＞８０歳、＜８０歳、＜７０歳、＜６０歳、＜５０歳、＜４０歳、＜３０歳、＜２０歳または＜１０歳を含み得る年齢の範囲であり得る。対象は新生児であり得る。一部の場合では、対象は小児または成人である。一部の例では、組織は、２、５、１０または２０時間齢のヒトからのものである。一部の例では、組織は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月または１２か月齢のヒトからのものである。一部の場合には、組織は、１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、１８歳、２０歳、２１歳、２３歳、２４歳、２５歳、２８歳、２９歳、３１歳、３３歳、３４歳、３５歳、３７歳、３８歳、４０歳、４１歳、４２歳、４３歳、４４歳、４７歳、５１歳、５５歳、６１歳、６３歳、６５歳、７０歳、７７歳または８５歳のヒトからのものである。対象は、異なる人種群または遺伝子的に混合された集団を含む、異なる遺伝子的背景を有し得る。
Ｂ．細胞治療
【０１７４】
衛星細胞または衛星様細胞は、疾患または障害（たとえば遺伝的欠陥）、特に筋肉機能に影響を与える疾患または障害を有する対象を処置するための治療として使用し得る。治療は、疾患の原因の処置および／または疾患もしくは状態の影響の処置を目的としたものであってよい。衛星細胞または衛星様細胞は、対象の傷害部位もしくはその近くに移植し得る、または、細胞が傷害部位へと遊走する、もしくはホーミングすることを可能にする様式で、細胞を対象に導入することができる。たとえば、細胞は、細胞を目的の部位へとシャトルするように設計された、マイクロカプセルなどの材料中に封入し得る。一部の例では、移植した細胞は、損傷、疾患、または傷害の細胞を有利に置き換え、対象の全体的な状態の改善を可能にし得る。一部の例では、移植した細胞は組織の発生または修復を刺激し得る。
【０１７５】
代表的な例では、筋変性疾患または他の筋障害（たとえば筋傷害）を有する対象を、本明細書中に記載の方法において多能性幹細胞に由来する衛星細胞または衛星様細胞で処置する。特に、多能性幹細胞は、多能性幹細胞を、多能性幹細胞を衛星細胞または衛星様細胞へと分化させる薬剤または複数の薬剤と接触させることによって分化させてよく、これを対象に移植する。多能性幹細胞に由来する衛星細胞または衛星様細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで筋芽細胞を形成する能力を有し得る。一部の例では、衛星細胞または衛星様細胞は、それを必要とする対象に導入し得る。衛星細胞または衛星様細胞は、筋変性疾患または障害を有する対象の筋肉内に導入し得る。一部の場合では、筋芽細胞、筋管、または遺伝子改変の衛星もしくは衛星様細胞などの衛星細胞または衛星様細胞に由来する細胞を対象内に導入する。
【０１７６】
一部の例では、遺伝子改変した衛星細胞、または遺伝子を変更した細胞に由来する衛星細胞（遺伝子改変した多能性幹細胞など）を対象内に導入する。一部の例では、誘導多能性幹細胞株は、遺伝子突然変異によって引き起こされる筋ジストロフィーなどの、筋肉欠乏性の疾患または障害を有する患者から発生させ得る。突然変異を誘導多能性幹細胞中で矯正してもよく、次いでこれを、本開示に従って衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る。次いで、筋肉機能を回復、改善、または増強させるために、矯正突然変異を有する衛星様細胞または衛星細胞を患者内に移植し得る。
【０１７７】
一部の具体的な例では、誘導多能性幹細胞（または誘導多能性幹細胞株）は、筋ジストロフィー（たとえばデュシェンヌ型筋ジストロフィー）を引き起こす突然変異を有する患者から発生させ得る。突然変異は、当技術分野で公知の遺伝子改変技法を使用して誘導多能性幹細胞中で矯正し得る。遺伝子改変誘導多能性幹細胞は、本開示に従って衛星細胞または衛星様細胞へと分化させ得る。衛星細胞または衛星様細胞は患者内に移植してよく、ここでこれらは、機能的な非突然変異させたタンパク質を生成して、筋肉機能を回復または増強させ得る。
【０１７８】
筋ジストロフィー（たとえばデュシェンヌ型筋ジストロフィー）などの筋変性疾患の処置は、筋肉損失を回復させる能力を有する衛星細胞または衛星様細胞を、疾患または損傷した筋肉内に注射することによって、達成することができる。衛星細胞または衛星様細胞は筋芽細胞を生成して既存の筋管と融合し得る。筋管は近接する細胞質を有するため、移植した衛星細胞または衛星様細胞に由来する筋芽細胞によって生成されたジストロフィンが筋管の全体にわたって見つかる場合があり、内因性の異常を補い得る。十分な量の特定の遺伝子産物を欠くことによって引き起こされる任意の状態、疾患、または障害を矯正または改善するために、同様の手順を行い得る。
【０１７９】
衛星細胞または衛星様細胞を、広範囲の疾患および障害を患っている対象に移植し得る。神経および／または神経筋の疾患または障害を患っている対象が、衛星細胞治療から特に利益を受ける可能性がある。一部の手法では、分化細胞を筋肉部位に移植して、神経筋の状態、たとえば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどを処置し得る。開示した衛星様細胞および衛星細胞によって処置または寛解させ得る筋疾患または障害は、遺伝子疾患もしくは障害であり得るか、または非遺伝的な原因を有し得る。一部の場合では、疾患または障害は慢性であり、他の場合では、疾患または障害は急性または亜急性であり、さらに他の場合では、疾患または障害は再発性の疾患または障害である。開示した細胞によって処置または寛解させ得る例示的な疾患または障害には、遺伝子疾患および非遺伝子疾患が含まれ得る。例示的な疾患または障害には、筋ジストロフィー、ハンチントン病、メロシン欠乏１Ａ、ネマリン筋疾患、および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）が含まれ得る。開示した細胞によって処置または改善し得る筋ジストロフィーの例には、ベッカー型、先天性、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨ）、筋緊張性（ＩおよびＩＩ型）、眼咽頭型、遠位型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、およびエメリ−ドレフュス型筋ジストロフィーが含まれる。デュシェンヌ型およびベッカー型の筋ジストロフィーは第Ｘ染色体に位置する遺伝子の突然変異によって引き起こされ、主に男性が患うが、女性も重篤な症状を有する場合がある。開示した方法および組成物によって処置または寛解させ得る追加の疾患または障害には、悪液質、散在性疾患、筋肉減少症、筋消耗、筋萎縮、筋挫傷、筋傷害、多発性硬化症、パーキンソン病、または老化に関連する筋消耗が含まれ得る。
【０１８０】
衛星細胞もしくは衛星様細胞、またはそれに由来する細胞を患者内に配置して、疾患または障害を処置し得る。たとえば、衛星細胞または衛星様細胞は、骨格筋内への直接注射を使用して移植し得る。それに加えてまたはその代わりに、衛星細胞または衛星様細胞は、足場を使用して、足場なしの方法を使用して、または他の移植装置を使用して、対象内に移植し得る。足場は当技術分野で公知の任意の材料から作られていてよい。一部の場合では、足場は、生分解性足場、吸収性足場、または他の種類の足場である。一部の場合では、足場はマトリックス（たとえば、生分解性マトリックス、吸収性マトリックス）を含む。一部の場合では、衛星細胞もしくは衛星様細胞、またはそれに由来する細胞を、移植前にマイクロカプセル内にカプセル封入する。一部の場合では、マイクロカプセルは、細胞を目的の位置に向けることを可能にするホーミング特長を保有し得る。
【０１８１】
骨格筋前駆細胞などの衛星細胞または衛星様細胞は、対象の身体全体にわたっていくつかの位置で注射し得る。たとえば、衛星細胞または衛星様細胞は、筋肉形成に近づく位置、たとえば、烏口腕筋、上腕二頭筋、および上腕筋などの腕の筋肉、前脛骨筋などの脚筋、長母趾伸筋、指伸筋、ならびに第三腓骨筋、または他の筋肉位置で注射し得る。
【０１８２】
対象に処置を投与する回数は変動し得る。対象内への分化細胞の導入は一度だけの事象であり得るが、特定の状況では、そのような処置は限定された期間の間のみ改善を誘発する場合があり、継続した一連の反復処置を必要とする。他の状況では、効果が観察されるまでに細胞の複数投与が必要であり得る。正確なプロトコールは、疾患または状態、疾患の段階、処置する個々の対象のパラメータに依存する。
【０１８３】
一部の例では、細胞は、以下の経路のうちの任意のものを介して対象に導入し得る：非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、腹腔内、または脊髄液内。特に、細胞を対象の骨格筋内に直接注射することによって、細胞を対象に導入し得る。
【０１８４】
衛星細胞または衛星様細胞の移植中、同じ期間の間に対象に薬物を与え得る。たとえば、衛星様細胞の移植の前、その間、もしくはそれに続いて、またはそれらの組合せで、薬物を投与し得る。対象に投与し得る薬物の例には、対象に対する疾患もしくは傷害を処置する薬物、免疫抑制薬、非免疫抑制薬（no  immunosuppressant  drug）、またはそれらの組合せが含まれる。例示的な免疫抑制薬には、シクロスポリンもしくはタクロリムスなどのカルシニュリン阻害剤、シロリムスもしくはエベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ミコフェノール酸モフェチルもしくはアザチオプリンなどのプリン合成阻害剤もしくはプリン類似体、またはプレドニゾンなどのステロイドが含まれる。
【０１８５】
衛星細胞および衛星様細胞は、シリンジなどの様々な器具を使用して投与することができる。衛星細胞および衛星様細胞はまた、食塩水、リン酸緩衝食塩水、または血清などの緩衝液と共に注射することもできる。衛星細胞および衛星様細胞は、バンコマイシンまたはレボフロキサシンなどの抗生物質と共に投与し得る。
【０１８６】
対象に移植し得る衛星細胞または衛星様細胞の用量は、対象の疾患または傷害、対象の疾患または傷害の進行、および対象の疾患または傷害の重篤度の度合に基づいて異なり得る。さらに、対象に提供する処置の回数は変動し得る。単一処置を対象に投与し得るか、または複数の処置を対象に与え得る。一部の場合では、対象を、本明細書中で提供する細胞で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５回またはそれより多くの回数、処置し得る。一部の場合では、対象は、１年間の間に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０回より少なく、処置し得る。処置自体もまた、衛星細胞または衛星様細胞を提供する部位の数が変動し得る。例では、衛星細胞または衛星様細胞の移植の単一処置には、衛星細胞または衛星様細胞の直接骨格筋注射するために１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、もしくは１００カ所、またはそれより多くの注射部位が含まれ得る。一部の場合には、単一用量の細胞は、約１０１、約５０、約１０２、約５ｘ１０２、約１０３、約５ｘ１０３、約１０４、約５ｘ１０４、１０５、約５ｘ１０５、約１０６、約５ｘ１０６、約１０７、約５ｘ１０７、約１０８、約５ｘ１０８、約１０９、約５ｘ１０９、約１０１０、約５ｘ１０１０、約１０１１、約５ｘ１０１１またはより多くの細胞を含む。一部の場合には、単一用量の細胞は、最大で１０２、最大で５ｘ１０２、最大で１０３、最大で５ｘ１０３、最大で１０４、最大で５ｘ１０４、最大で１０５、最大で５ｘ１０５、最大で１０６、最大で５ｘ１０６、最大で１０７、最大で５ｘ１０７、最大で１０８、最大で５ｘ１０８、最大で１０９、最大で５ｘ１０９、最大で１０１０、最大で５ｘ１０１０、最大で１０１１または最大で５ｘ１０１１細胞を含む。
【０１８７】
衛星細胞または衛星様細胞が患者に提供された後、衛星細胞または衛星様細胞は対象の筋芽細胞と融合してよく、融合筋肉細胞成分を形成し得る。処置の結果には、筋肉の回復、筋肉分解の停止、筋肉分解の遅延、ジストロフィン産生などの対象の疾患もしくは傷害に関連する因子の改善、またはそれらの組合せが含まれ得る。
【０１８８】
対象の疾患または傷害に関連する因子の改善は、筋肉回復または筋肉機能の試験に関連し得る。筋肉回復の度合は、筋肉量、力に対する抵抗によって測定した筋力、刺激に応答した収縮の量および電気ショックなどの刺激に応答した収縮の強度、所定の課題の時間的な性能、または筋肉に基づく試験の他の例などの、特定の筋肉性状の１種または複数種の試験によって評価し得る。
【０１８９】
筋肉の回復は、特定の筋肉性状の改善の量または度合に基づいて評価することができる。特に、筋肉性状（例えば、筋肉量、筋力など）は、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍または３００倍あるいはそれより多く改善し得る。一部の場合には、筋肉性状は、＞１％、＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％、＞１００％またはそれより多く改善し得る。より特定の場合には、筋力は、＞１％、＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％、＞１００％、＞２００％またはそれより多く改善する。筋肉性状の改善は、ある特定の期間内、例えば、衛星様細胞もしくは衛星細胞の導入の時点から約１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、２週間、３週間、４週間、１か月、６週間、２か月、１０週間、３か月、３．５か月、４か月、４．５か月、５か月、５．５か月、６か月、６．５か月、７か月、７．５か月、８か月、８．５か月、９か月、９．５か月、１０か月、１０．５か月、１１か月、１１．５か月、１２か月、１．５年または２年あるいはそれより長い期間以内に起こり得る。例えば、一部の場合には、筋肉性状（例えば、筋肉量、筋力など）の改善は、１か月以内に＞１％、１か月以内に＞５％、１か月以内に＞１０％、１か月以内に＞１５％、１か月以内に＞２０％、１か月以内に＞２５％、１か月以内に＞５０％、１か月以内に＞６０％、１か月以内に＞７０％、１か月以内に＞７５％、１か月以内に＞８０％、１か月以内に＞９０％、１か月以内に＞９５％、１か月以内に＞９９％、１か月以内に＞１００％、１か月以内に＞２００％、１か月以内に＞２５０％、１か月以内に＞３００％、１か月以内に＞４００％、１か月以内に＞５００％または１か月以内にさらに高い百分率であり得る。
【０１９０】
一部の場合では、衛星細胞または衛星様細胞を用いた処置は、一定期間内の筋変性の停止または遅延をもたらすことができる。一部の場合には、筋変性の速度を、細胞による処置の１か月以内に約＞１％、１か月以内に＞５％、１か月以内に＞１０％、１か月以内に＞１５％、１か月以内に＞２０％、１か月以内に＞２５％、１か月以内に＞５０％、１か月以内に＞６０％、１か月以内に＞７０％、１か月以内に＞７５％、１か月以内に＞８０％、１か月以内に＞９０％、１か月以内に＞９５％、１か月以内に＞９９％、１か月以内に＞１００％、１か月以内に＞２００％、１か月以内に＞２５０％、１か月以内に＞３００％、１か月以内に＞４００％、１か月以内に＞５００％または１か月以内にさらに高い百分率だけ遅延させることができる。追加的に、筋変性は、衛星様細胞もしくは衛星細胞を使用した細胞療法に基づいて完全に停止させることができる。筋変性は、ある特定の期間内、例えば、衛星様細胞もしくは衛星細胞の導入の時点から約１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、２週間、３週間、４週間、１か月、６週間、２か月、１０週間、３か月、３．５か月、４か月、４．５か月、５か月、５．５か月、６か月、６．５か月、７か月、７．５か月、８か月、８．５か月、９か月、９．５か月、１０か月、１０．５か月、１１か月、１１．５か月、１２か月、１．５歳または２歳あるいはそれより長い期間以内に完全に停止させられ得る。
Ｃ．薬物スクリーニング
【０１９１】
細胞治療における使用に加えて、衛星細胞または衛星様細胞は、薬物スクリーニングのプラットフォームとして役割を果たすために使用し得る。特に、細胞形態学、マーカー発現、増殖、または分化などの衛星細胞または衛星様細胞の表現型に対する効果を試験するために薬物のアッセイを行い得る。一部の場合では、表現型は筋肉機能に関連している。本明細書中で提供する細胞はまた、そのような遺伝子疾患または障害についての薬物スクリーニング、疾患モデリング、および疾患研究にも有用であり得る。
【０１９２】
一例では、試験する細胞は、健康な多能性幹細胞から化学的に分化させた健康な衛星細胞または衛星様細胞である。別の例では、試験する細胞は、疾患多能性幹細胞から分化させた疾患衛星細胞または衛星様細胞である。疾患多能性幹細胞には、筋ジストロフィーなどの神経筋遺伝子疾患等の遺伝子疾患に関連する特定の遺伝子突然変異を有する多能性幹細胞が含まれ得る。一部の場合では、疾患多能性幹細胞は、筋変性疾患に関連する遺伝子突然変異を保有する対象に由来する。一部の場合では、疾患多能性幹細胞は、筋肉遺伝子疾患を引き起こす、またはそれに関連する突然変異を保有するように遺伝子操作されている。突然変異は、対象（たとえばヒト対象）が保有する突然変異と同一であり得る、またはそのような突然変異に実質的に類似であり得る。疾患衛星細胞または衛星様細胞は、薬物のアッセイを行うため、疾患筋芽細胞もしくは筋管の表現型を試験するため、疾患の影響を細胞および組織レベルで特徴付けるため、または他の評価を行うために、筋芽細胞または筋管へとさらに分化させ得る。疾患の影響の特徴付けには、筋芽細胞もしくは筋管の機能および形態学、筋芽細胞もしくは筋管のマーカー発現、筋芽細胞および筋管の増殖および分化、筋管の長さ、筋管の直径、筋管の枝分かれ、融合指数、または筋管あたりの核の数が含まれ得る。
【０１９３】
一部の場合では、疾患を引き起こす突然変異または複数の突然変異を保有する胚性幹細胞株は、突然変異を矯正するために遺伝子改変することができる。本明細書中で提供する方法を使用して、疾患を引き起こす突然変異を保有する胚性幹細胞および／または改変した矯正した胚性幹細胞を衛星様もしくは衛星細胞（または細胞株）へと分化させ得る。遺伝子改変した細胞株は疾患を患った細胞株に対する同質遺伝子対照として役割を果たす場合があり、これは、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および疾患研究において特に有用であり得る。
【０１９４】
別の例では、衛星細胞もしくは衛星様細胞の増殖の増加をもたらす、または筋芽細胞への分化の増殖もしくは増強をもたらす薬物を同定するために、衛星細胞または衛星様細胞に対する薬物のアッセイを行う。これらの効果は、増殖細胞を同定するためのＥｄＵアッセイまたはＫｉ６７の免疫蛍光染色、細胞計数、筋芽細胞（myobalst）を同定するためのＭｙｏＤまたはデスミンの免疫蛍光染色などの、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。そのような薬物は、患者の内在性衛星細胞をブーストおよび活性化させ、筋肉の量もしくは機能の増加をもたらすために有用であり得る。
【０１９５】
別の例では、試験する細胞は、ＨＬＡヌル多能性幹細胞から分化させた健康な衛星細胞または衛星様細胞である。別の例では、試験する細胞は、筋ジストロフィーなどの神経筋遺伝子疾患などの遺伝子疾患に関連する特定の遺伝子突然変異を有するＨＬＡヌル多能性幹細胞が含まれ得る疾患ＨＬＡヌル多能性幹細胞である。
【０１９６】
開示した衛星および衛星様細胞を使用した薬物スクリーニングアッセイおよび疾患モデリングアッセイを、多種多様な疾患および障害、特に遺伝子疾患または障害について設計し得る。例示的な疾患または障害には、これらだけには限定されないが、ハンチントン病、メロシン欠乏１Ａ、ネマリン筋疾患、および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ならびに筋ジストロフィーが含まれる。筋ジストロフィーの例には、ベッカー型、先天性、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨ）、筋緊張性（ＩおよびＩＩ型）、眼咽頭型、遠位型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、およびエメリ−ドレフュス型筋ジストロフィーが含まれる。デュシェンヌ型およびベッカー型の筋ジストロフィーは第Ｘ染色体に位置する遺伝子の突然変異によって引き起こされ、主に男性が患うが、女性も重篤な症状を有する場合がある。さらに、ほとんどの種類の筋ジストロフィーが多系統障害であり、心臓、胃腸管系、神経系、内分泌腺、眼、および脳を含む身体系において徴候を有する。
Ｄ．移植片拒絶の回避
【０１９７】
他の適用では、移植細胞の拒絶を制限するために、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞を使用して骨格筋前駆細胞を移植し得る。特に、ナチュラルキラー細胞によるＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞の排除を回避するために、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞を対象に移植し、対象の筋芽細胞と融合させて対象のＨＬＡプロファイルを得てもよい。
【０１９８】
ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞を、それを必要とする対象に提供する場合、ＨＬＡの特徴付けの欠如が、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞が免疫細胞と相互作用することを可能にし、それによって、免疫細胞の未認識の細胞に対する有害反応が回避される。このようにして、それを必要とする対象は、それを必要とする前記対象内への前記衛星細胞または衛星様細胞の前記導入の後に、前記衛星細胞または衛星様細胞に対する顕著な免疫拒絶を開始しない。
【０１９９】
例では、ＨＬＡヌル衛星細胞または衛星様細胞の移植は、免疫抑制薬を服用する必要性を低下または排除し得る。免疫抑制薬の例には、シクロスポリンもしくはタクロリムスなどのカルシニュリン阻害剤、シロリムスもしくはエベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ミコフェノール酸モフェチルもしくはアザチオプリンなどのプリン合成阻害剤もしくはプリン類似体、またはプレドニゾンなどのステロイドが含まれる。
ＶＩＩＩ．細胞の保存
【０２００】
細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、ＨＬＡヌル多能性幹細胞、化学的に分化させた衛星細胞もしくは衛星様細胞、およびＨＬＡヌル多能性幹細胞から分化させたＨＬＡヌル衛星細胞もしくは衛星様細胞、または本明細書中に記載の他の細胞を保存し得る。したがって、過程中の任意の時点からの細胞または材料を、過程改変の将来の完成での使用のために保存し得る。
【０２０１】
保存方法は、本明細書中に記載の方法、たとえば凍結保存培地の使用を含む任意の方法であり得る。一部の例示的な凍結保存培地には、１〜１５％のＤＭＳＯ、グリセロール、高濃度のトレハロースなどの炭水化物、高濃度の血清またはアルブミンが含まれる。細胞は、好ましくは−７０℃未満の温度まで制御された冷却速度で凍結し、液体窒素保存容器中で保存する。本明細書中に記載の方法によって発生させた細胞の他の適切な凍結保存培地および凍結保存／解凍の方法は、ガラス化、カプセル封入、適切な試薬を用いた４℃での安定化、または適切な凍結保存培地で表面を覆った接着細胞である。
ＩＸ．一部の定義
【０２０２】
別段に指定しない限りは、本明細書中で使用する用語「または（ｏｒ）」とは非排他的な「または」をいい、たとえば、「ＡまたはＢ」には、「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、および「ＡおよびＢ」が含まれる。
【０２０３】
数値または数値範囲に言及する際に本明細書中で使用する用語「約」とは、言及した数値または数値範囲は実験のばらつき内（または統計的実験誤差内）の近似であり、したがって、数値または数値範囲が、たとえば記述した数値または数値範囲の１％から１５％の間で変動し得ることを意味する。例では、用語「約」とは記述した数値または値の±１０％をいう。
【０２０４】
本明細書中で使用する用語「処置する」、「寛解させる」、「処置」、および「処置すること」は互換的に使用される。これらの用語は、これらだけには限定されないが、治療上の利益および／または予防的利益を含む有益または所望の結果を得るための手法をいう。治療上の利益とは、処置する根底にある障害の根絶または寛解を意味する。患者が根底にある障害を依然として患っている可能性があるにもかかわらず、患者において改善が観察されるように根底にある障害に関連する生理的症状のうちの１種または複数種の根絶または寛解されることでもまた、治療上の利益が達成される。予防的利益では、この疾患の診断がなされていないかもしれない場合でも、衛星細胞または衛星様細胞を、特定の疾患を発生する危険性にある患者、または疾患の生理的症状のうちの１つもしくは複数を報告している患者に投与し得る。
【実施例】
【０２０５】
Ｘ．実施例
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されたが、そのような実施形態は例としてだけ提供されていることは当業者に明らかになる。本発明が明細書の中で提供される具体例によって制限されることは、意図されていない。本発明は前記の明細書を参照して記載されたが、本明細書の実施形態の記載および図示は限定する意味で解釈されるためのものではない。本発明を逸脱しない範囲で、当業者は今では多くの変異形、変更および代替を思いつく。さらに、本発明の全ての態様が、様々な条件および変数に依存する、本明細書に示される具体的な描写、構成または相対的な割合に限定されるとは限らないことを理解すべきである。記載される本発明の実施形態への様々な代替物を本発明の実施で用いることができることを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物はそれに含まれることを意図する。
（実施例１）
筋原性誘導条件のスクリーニング。
【０２０６】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、フィーダーを含まずに、コラーゲンＩをコーティングした表面上で、市販のＭ２培養培地（Ｇｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓにより製造）を使用して、標準のプロトコールに従って拡大した。この方法では、それぞれの継代で培養物を単一細胞へと解離する。それぞれの細胞株のバッチを、Ｍ２培地＋１０％のＤＭＳＯ中で、標準のプロトコールに従って凍結した。それぞれのバッチを、生存度、形態学、無菌性、核型、ＤＮＡフィンガープリント、多能性マーカー発現（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０）、およびＰｌｕｒｉｔｅｓｔ（Ｍｕｌｌｅｒら、２０１１年）について品質管理の試験を行った。
【０２０７】
市販の細胞株ＧＥＮＥＡ０１７およびＧＥＮＥＡ０２０を使用して筋原性誘導培養条件のスクリーニングを行った。基本培養培地は、製造者の指示に従って骨格筋細胞成長培地サプリメントミックス（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌにより製造）を骨格筋細胞基本培地（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌにより製造）に加えて、ＭＣＤＢ１２０（米国特許第５，１４３，８４２号）に類似の培地を生成することによって調製し、これにＲｈｏ関連キナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ）も加えた。細胞を、コラーゲンＩ（１００μｇ／ｍＬ）、ｈフィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）、ｍラミニン（５μｇ／ｍＬ）、またはｈフィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）とｍラミニン（５μｇ／ｍＬ）とでコーティングした、３８４ウェルのオプティカルボトムマイクロタイタープレート中で培養した。
【０２０８】
筋原性誘導培養条件をスクリーニングするために、細胞株を単一細胞へと解離し、２０μＬの基本培養培地中、８×１０３個の細胞／ｃｍ２の密度で、３８４ウェルプレートにプレーティングした。表１の化合物を、２つずつの組合せ（合計３７８個の組合せ）で、３８４ディープウェルプレート中に２×最終濃度で基本培養培地に加えた。２０μＬのこの化合物を添加した培地を培養細胞に加えて、細胞を、化合物をその最終濃度で含有する４０μＬの培養培地中で培養した。細胞を３７℃、５％のＣＯ２、および５％のＯ２で９日間培養した。スクリーニングする化合物の濃度をその最終濃度で維持しながら、培地を隔日で行った。
【０２０９】
培養期間の終わりに、細胞を４％のホルマリン溶液で固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫蛍光染色し、ハイコンテントイメージングによって分析した。基本培地のみで成長させた細胞はいずれも、衛星細胞マーカーについて染色を示さなかった。スクリーニングした３７８個の条件のうち、３４個は細胞に対して毒性が高かった。４個の条件は、ＣＤ５６について陽性であるが、Ｐａｘ３およびＰａｘ７の両方について陰性である細胞をもたらした。試験した条件のうちの１５個では、５０％を超える細胞が衛星細胞の特徴ならびにＣＤ５６、Ｐａｘ３、およびＰａｘ７について陽性染色を示す結果となった。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は観察されず、これは、衛星細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
【表１】
2018518943.tif 000002
（実施例２）
筋原性条件は血清、増殖因子、または特定の基本培地に強く依存していない。
【０２１０】
衛星細胞を、ＧＥＮＥＡ００２、ＧＥＮＥＡ０１９、およびＧＥＮＥＡ０２０から、実施例１に記載のように、ＣＨＩＲ９９０２１およびＡｌｋ５阻害剤を使用して、基本培地の組成を変動させて調製した。骨格筋細胞成長培地サプリメントの構成成分はそれらの最終濃度（たとえば、５０μｇ／ｍＬのウシフェツイン、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０μｇ／ｍＬのインスリン、および０．４μｇ／ｍＬのデキサメタゾン）に保ち、表２に列挙した基本培地および血清を２つずつ組み合わせて混合した。Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６の陽性衛星様細胞がすべての条件下で得られた。たとえば、図５、６、および７は、分化を誘導するための化合物で処理した細胞株ＧＥＮＥＡ００２、ＧＥＮＥＡ０１９、およびＧＥＮＥＡ０２０を示し、それぞれの培地中の、衛星様細胞のマーカーＰａｘ７およびＰａｘ３を発現する細胞の百分率を示す。しかし、細胞生存度は血清またはアルブミンの非存在下で乏しかった。たとえば、図８は、様々な血清構成成分を有する様々な分化培地中で成長させたＧＥＮＥＡ００２、ＧＥＮＥＡ０１９、およびＧＥＮＥＡ０２０を示す。細胞密度は使用した培地および血清構成成分に依存しており、これは、分化が様々な条件にわたって頑強であり、培地の影響は主に細胞生存度に対してであることを示している。すべての細胞株にわたる陽性細胞、細胞の拡大、および頑健性の割合は様々であった。ＰｒｏｍｏｃｅｌｌおよびＬｏｎｚａ１基本培地はいずれもＭＣＤＢ１２０に基づいているため、性能は非常に類似していた。ウマ血清がすべての細胞株について最も一貫して分化を支持していると考えられる。
【表２】
2018518943.tif 000003
【０２１１】
次に、ＣＨＩＲ９９０２１およびＡｌｋ５阻害剤を添加したＭＣＤＢ１２０様基本培地であるが、骨格筋細胞成長培地サプリメントの構成成分（５０μｇ／ｍｌのウシフェツイン、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、および０．４μｇ／ｍｌのデキサメタゾン）のうちの１つを除外した、または５％のウマ血清の場合は１．５％のＡｌｂｕｍａｘ（ウシ血清アルブミン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより製造）で置き換えたもの中でＧＥＮＥＡ０１９を分化させることによって、骨格筋細胞成長培地サプリメントの構成成分に対する依存性を試験した。さらに、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について陽性の衛星様細胞がそれぞれの条件下で得られ、これは、どの単一の増殖因子も筋原性誘導に必要でないことを実証している。たとえば、図９は、様々な血清構成成分を含有する培養条件下でＰａｘ３、Ｐａｘ７、またはＣＤ５６を発現する細胞の百分率を示す。分化はすべての条件にわたって概して同様であり、１つの血清構成成分が分化に重大であることを示している。
（実施例３）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびトランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１２】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびトランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびトランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
【表３】
2018518943.tif 000004
（実施例４）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびアスコルビン酸（２００μｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１３】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびアスコルビン酸（２００μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびアスコルビン酸（２００μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例５）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＸＡＶ９３９（２．５μＭ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１４】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＸＡＶ９３９（２．５μＭ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＸＡＶ９３９（２．５μＭ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例６）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１５】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例７）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１６】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例８）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＳＢ４３１５４２（２μＭ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１７】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＳＢ４３１５４２（２μＭ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＳＢ４３１５４２（２μＭ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例９）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１８】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１０）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＢＩＸ０１２９４（１μＭ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２１９】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＢＩＸ０１２９４（１μＭ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＢＩＸ０１２９４（１μＭ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１１）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２０】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１２）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２１】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１３）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびクレアチン（１ｍＭ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２２】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびクレアチン（１ｍＭ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびクレアチン（１ｍＭ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１４）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＰＤ１６９３１６（１５０μｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２３】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＰＤ１６９３１６（１５０μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＰＤ１６９３１６（１５０μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１５）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＳＭＯアンタゴニスト（１５０μｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２４】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＳＭＯアンタゴニスト（１５０μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＳＭＯアンタゴニスト（１５０μｇ／ｍＬ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１６）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびウマ血清（５％）トランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２５】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびウマ血清（５％）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびウマ血清（５％）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１７）
寄与する構成成分としてＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）および酪酸ナトリウム（２５０μＭ）を使用した、多能性幹細胞からの衛星細胞の調製。
【０２２６】
ｈＰＳＣの培養物を、実施例１に記載のように、分化を誘導するためにＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）および酪酸ナトリウム（２５０μＭ）を添加した基本培地中で成長させた。分化させた細胞を固定し、衛星細胞マーカーＰａｘ３、Ｐａｘ７、およびＣＤ５６について免疫染色した。基本培地単独中で培養した細胞では陽性細胞は観察されなかったが、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）および酪酸ナトリウム（２５０μＭ）を添加した基本培地中で培養したものは、５０％超の細胞が前記マーカーについて陽性染色という結果となった。これらの衛星様細胞は試験したすべての細胞外マトリックスにおいて生成されたが、ｈフィブロネクチンが最も高いレベルの衛星様細胞を生じた。細胞を筋芽細胞マーカーＭｙｏＤについてさらに染色したが、陽性細胞は同定されず、これは、細胞が筋芽細胞へとさらに分化しなかったことを示している。
（実施例１８）
様々な細胞株からの筋芽細胞が融合して混合筋管を形成する。
【０２２７】
１つの細胞株からの多能性幹細胞を筋芽細胞へと分化させ、培養皿にプレーティングし、緑色蛍光ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒナノ結晶、たとえばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から入手したもので標識する。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒは細胞によって取り込まれ、継続中の細胞分裂によって希釈されてしまうまで、受動的に存在したままとなる。別の細胞株からの多能性幹細胞を筋芽細胞へと分化させ、赤色蛍光ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒナノ結晶で標識した後に、それらを解離させ、それらを最初の筋芽細胞に加える。筋管形成はＧｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌの筋管培地を使用して誘導する。約１週間培養した後、細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２４２色素で対比染色する。ハイコンテントイメージングを使用して混合（緑色および赤色蛍光）筋管を検出および定量する。
（実施例１９）
衛星細胞または衛星様細胞の増殖。
【０２２８】
さらに、図１０は、本開示の実施形態に従った、３継代にわたる衛星細胞または衛星様細胞の増殖の説明図である。Ｐａｘ３陽性細胞の割合は３継代にわたってほぼ一定に保たれる一方で、のちの継代ではより多くのＰａｘ７陽性細胞が見つかる。図１０に見られるように、細胞の大多数が増殖していると考えられる（Ｋｉ６７陽性）。
（実施例２０）
無血清の（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）、成長因子なしの衛星細胞の調製。
【０２２９】
無血清の条件における衛星様細胞の発生を試験した。以下の培地を使用して、衛星様細胞をヒト胚性幹細胞株（ＧＥＮＥＡ０１９）から調製した。
【０２３０】
１）対照培地：骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加。
【０２３１】
２）ＭＣＤＢｃ：ＭＣＤＢ１２０（２ｇ／Ｌ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加。
【０２３２】
３）ＭＣＤＢ  ＦＡ：ＭＣＤＢ１２０（２ｇ／Ｌ）、ウマ血清、フェツイン、ＥＧＦ、またはＦＧＦなし、ヒトアルブミン（２．５％）、オレイン酸（１００ｎｇ）、リノール酸（１００ｎｇ）、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加。
【０２３３】
４）ＭＣＤＢ  ＦＡ  ＩＴＳ：ＭＣＤＢ  ＦＡ（番号３）と同じ、さらにインスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ、１００×）を含む。
【０２３４】
ＭＣＤＢ  ＦＡは無血清で、成長因子を含まない配合物であり、ＭＣＤＢ  ＦＡ  ＩＴＳは無血清の配合物である。３日間の筋原性誘導後に細胞を固定し、核（細胞計数）ならびにＰａｘ３およびＰａｘ７について染色した。図１１Ａ〜１１Ｃは、細胞計数の増加（図１１Ａ）、ならびにＰａｘ３（図１１Ｂ）およびＰａｘ７（図１１Ｃ）の発現の増加を含む、試験したすべての培地における筋原細胞の頑強な誘導を示している。
（実施例２１）
ラミニン上での筋原性誘導は衛星様細胞集団に影響を与える。
【０２３５】
ＧＥＮＥＡ０１９ヒト胚細胞を、骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加したもの中、細胞外マトリックス分子コラーゲンＩ、ラミニン１１１、ラミニン２１１、およびラミニン５２１でコーティングした組織培養プレート上にプレーティングした。９日後、細胞を固定し、ＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）およびＰａｘ７について染色した。ラミニン、特にラミニン５２１は、細胞増殖を促進し（図１２Ｂ）、Ｐａｘ７陽性である衛星様細胞部分集団を好むこと（図１２Ａ）が見出された。
（実施例２２）
ＬＲＲＫ２／ＤＣＬＫ阻害剤を使用した衛星細胞の調製の改善。
【０２３６】
ＧＥＮＥＡ０１９ヒト胚性幹細胞を、骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加、ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１を含む（１μＭ）または含まないもの中にプレーティングした。９日後、細胞を固定し、ＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）およびＰａｘ３について染色した。ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１の添加は、細胞増殖を促進し（図１３Ａ）、Ｐａｘ３の発現を増加させた（図１３Ｂ）。
【０２３７】
同じ実験を、ＧＥＮＥＡ０１９およびＧＥＮＥＡ０６７ヒト胚性幹細胞株を使用して繰り返した。細胞集団を位相差顕微鏡観察によって観察した。図１４に見られるように、ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１の添加はより純粋な細胞集団をもたらし、汚染細胞として観察される、大きな細胞質を有する平らな細胞が抑制された。
（実施例２３）
ＬＲＲＫ２／ＤＣＬＫ阻害剤を使用した衛星細胞の調製の改善。
【０２３８】
ＧＥＮＥＡ００２、ＧＥＮＥＡ０１５、およびＧＥＮＥＡ０１９ヒト胚性幹細胞株を、コラーゲンＩをコーティングした培養皿上、以下の培養培地中でプレーティングした。
【０２３９】
１）ＭＣＤＢｃ：ＭＣＤＢ１２０（２ｇ／Ｌ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加。
【０２４０】
２）ＭＣＤＢ  Ｍｉｎ：ＭＣＤＢ１２０（２ｇ／Ｌ）、ウマ血清、フェツイン、ＥＧＦ、またはＦＧＦなし、ヒトアルブミン（２．５％）、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加。
【０２４１】
３）ＭＣＤＢ  Ｍｉｎ  ＦＡ：ＭＣＤＢ１２０（２ｇ／Ｌ）基本培地、ウマ血清、フェツイン、ＥＧＦ、またはＦＧＦなし、ヒトアルブミン（２．５％）、オレイン酸（１００ｎｇ）、リノール酸（１００ｎｇ）、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加。
【０２４２】
４）ＭＣＤＢ  ＦＡ  ＩＴＳ：ＭＣＤＢ  ＦＡと同じ、インスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ、１００×）を含む。
【０２４３】
対照化合物、５μｍのＴＨＩ（２−アセチル−４（５）−（１，２，３，４−テトラヒドロキシブチル）イミダゾール）、または５ｎｇ／ＬのＦＧＦ２を任意選択で培地に加えた。ＬＲＲＫ２阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１（１μＭ）を任意選択でＭＣＤＢ  ＭｉｎＦＡ培地に加えた。４日後に細胞を固定し、ＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、Ｐａｘ３、およびＰａｘ７について染色した。図１５Ａ〜Ｆに見られるように、ＴＨＩもＦＧＦ２も、Ｐａｘ３／７陽性細胞の細胞増殖または収率を増強しなかった。しかし、驚くべきことに、ＬＲＲＫ２阻害剤ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１はＰａｘ３陽性およびＰａｘ７陽性細胞の割合の強力な増加をもたらした。
【０２４４】
同じ実験を、ＧＥＮＥＡ０１５およびＧＥＮＥＡ０１９ヒト胚性幹細胞を用いて、骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加したもの中で繰り返した。ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１に加えて、様々な他のキナーゼ阻害剤を１０ｎＭ〜１μＭの用量範囲で試験した。４日後に細胞を固定し、ＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）およびＰａｘ７について染色した。図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、ＬＲＲＫ２（ＬＲＫＫ２）阻害剤であるＬＲＲＫ２−ＩＮ−１は用量依存的な様式でＰａｘ７陽性細胞の形成を強力に促進したが、他のキナーゼ阻害剤はそうではなかった。
（実施例２４）
筋原性誘導はＷｎｔ活性化／ＧＳＫ３ｂ阻害に依存する。
【０２４５】
ＧＥＮＥＡ０１９ヒト胚性幹細胞を、骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清（５％）に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）、ならびにＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）、ＡＺＤ１０８０（１μＭ）、ＩＷＰ−Ｌ６（１μＭ）、Ｄ４４７６（１μＭ）、およびＡＴ１３１４８（１μＭ）を含む一連のＷｎｔ経路モジュレーターを添加したもの中にプレーティングした。９日間培養した後、細胞を固定し、ＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）およびＰａｘ３について染色した。図１７Ａおよび１７Ｂに見られるように、Ｗｎｔ調節の非存在下では筋原性誘導は観察されなかった。ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤ではＣＨＩＲ９９０２１およびＡＺＤ１０８０はいずれも筋原性誘導を促進し、Ｐａｘ３陽性細胞をもたらした。ＩＷＰ−Ｌ６によるＷｎｔ−シグナル伝達の遮断は筋原性誘導を遮断した。他の間接的なＷｎｔ経路活性化剤は筋原性誘導をもたらさなかった。
（実施例２５）
Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害は分化過程全体にわたって重要である。
【０２４６】
ＧＥＮＥＡ０１９およびＧＥＮＥＡ０６７ヒト胚性幹細胞を、骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加したもの中、コラーゲンＩをコーティングしたプレート上にプレーティングした。細胞を、同じ培地中で隔日に培地を変更して、またはプレーティングの１日後のいずれかにさらに分化させ、細胞が付着した後、細胞を同じ培養培地であるがＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含まないものに変更して維持した。驚くべきことに、連続的なＲＯＣＫ阻害なしの細胞は分化中に高度に不均一な細胞集団を形成し、成長が顕著に遅れており（図１８、「−ＲＯＣＫ」は、細胞が付着した後にＹ−２７６３２を除去したことを示す）、これは、筋原性誘導中においてＲＯＣＫ阻害にはより特異的な役割が存在することを示唆している。
（実施例２６）
衛星様細胞とマウス筋芽細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ融合。
【０２４７】
ＧＥＮＥＡ０１９ヒト胚性幹細胞を、骨格筋細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）と骨格筋細胞成長サプリメント（Ｌｏｎｚａ）およびウマ血清に、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、およびＡｌｋ５阻害剤（２μＭ）を添加したもの中、コラーゲンＩをコーティングしたプレート上にプレーティングした。細胞を９日後に継代し、Ｇｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓ筋芽細胞培地（Ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓ）中に再プレーティングした。７日後、細胞を収集し、不死化マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞と一緒に、１：１で、全細胞密度６０，０００個の細胞／ｃｍ２で再プレーティングした。翌日、培養培地をＧｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓ筋管培地（Ｍｙｏｔｕｂｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓ）またはＤＭＥＭ低グルコース＋２％のウマ血清のいずれかに変更した。さらに２日後、細胞を固定し、ＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、ファーストＭＨＣ、およびラミンＡ／Ｃについて染色した。細胞を共焦点蛍光顕微鏡観察によって分析した。図１９に示すように、筋管内のマウスラミンＡ／Ｃ陰性核を有するヒトラミンＡ／Ｃ陽性核の存在は、幹細胞由来のＧＥＮＥＡ０１９筋芽細胞が別の筋芽細胞集団と融合する潜在性を実証していた。
（実施例２７）
ＨＬＡクラスＩ  遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の選択。
【０２４８】
染色体６ｐ２１．３上に位置するＨＬＡスーパー座位はヒトゲノムの多型性の頻度が最も高く、複数のＨＬＡクラスＩ  対立遺伝子を標的とするｇＲＮＡの一般的なセットの作製を困難にし、ＨＬＡ領域のゲノム編集の主な障壁となっている。６ｐ２１．３領域はまた、多能性の維持に重大であるＰＯＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ４としても知られる）を含むいくつかの必須遺伝子を含むため、その完全に切除するのも問題である。あるいは、より高い特異性のｇＲＮＡがそれぞれの標的遺伝子に対して個々に発生し得る。理想的には、１種または複数種のＨＬＡ群に対してホモ接合性である細胞株をゲノム編集に使用することができる。
【０２４９】
分化プロトコール（Ｇｅｎｅａ  Ｂｉｏｃｅｌｌｓ骨格筋分化キット（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用）に一度供した「良好な品質の」骨格筋を生成するその効率に基づいて、一群の胚性幹細胞株をゲノム編集について選択した。選択された系統をシーケンシングによるＨＬＡクラスＩ型決定に送った。シーケンシングは、型（対立遺伝子群）、亜型（特異的ＨＬＡタンパク質）、および同義ヌクレオチド置換に関する情報を提供する。３つのヒト胚細胞株のＨＬＡクラスＩプロファイルを表４に示し、それぞれの対立遺伝子の特定の配列はＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースで評価することができる。
【表４】
2018518943.tif 000005
【０２５０】
「目的の領域」は、最初に所定の細胞株のすべてのＨＬＡクラスＩ遺伝子をアラインメントし、３つすべてのＨＬＡクラスＩ（Ａ、Ｂ、およびＣ）対立遺伝子間の相同性の領域を見つけることによって定義した。多型性のほかに、クラスＩのメンバー間には高い度合の配列相同性が存在する。一例として、ヒト胚細胞株ＧＥＮＥＡ０１５のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃの両方の対立遺伝子の配列をアラインメントした（図２０）。２０個のヌクレオチドより長いすべてのエクソン相同領域を、Ｃａｓ９のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、または他のゲノム編集酵素の存在について調査した。
【０２５１】
図２０に示すように、配列「ｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｇｃｇｇａｇａｔｃａｃａｃｔｇａｃｃｔｇｇｃａｇｃｇｇｇａｔｇｇ」は、４３個のヌクレオチドの長さであり、すべてのＧＥＮＥＡ０１５ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の共通配列である。この領域中のＰＡＭ配列の検索により、６つの明確な潜在的な標的が戻され、それに対するｇＲＮＡを合成した。それぞれのｇＲＮＡは固有の特異性（Ｈｓｕら、２０１３年の特異性スコアによる）および効率（Ｄｏｅｎｃｈら、２０１４年の活性スコアによる）（表５を参照）を有しており、一般的な法則として、いずれの指数でも値が高ければ高いほどガイドの品質が良好である。図２１に示すように、標的配列はＨＬＡ−Ａのエクソン６に位置する。
【表５】
2018518943.tif 000006
（実施例２８）
ヒト胚性幹細胞株におけるＨＬＡ座位のノックアウト。
【０２５２】
たとえば実施例２７に実証するように適切なＨＬＡ標的配列が同定された後、ｇＲＮＡを合成し、ＲＮＡガイドのＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素と組み合わせて、核酸の形態またはタンパク質として細胞に送達することができる。送達は多くの異なる方法（たとえば、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、塩化カルシウム、ヌクレオフェクション、電気穿孔、プロテオフェクション）によって行うことができる。ＣＤ４または蛍光タンパク質などの表面タンパク質の発現の誘導は、酵素の受け取りに成功した細胞の同定およびさらなる選別を補助し得る。あるいは、細胞と適切な抗生物質と共にインキュベートすることによって陽性細胞の選択を可能にするために、抗生物質耐性カセットを導入することができる。
【０２５３】
選別／選択された細胞を一緒にプールし、拡大する。拡大後、プールした細胞の試料をＴ７エンドヌクレアーゼＩ（またはＳＵＲＶＥＹＯＲ）に供して編集効率を確認する。手短に述べると、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的領域をＰＣＲによって増幅する。単位複製配列を精製し、変性させ、アニーリングさせ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩの存在下でインキュベートする。不完全一致ＤＮＡのアニーリングによって発生したヘテロ二重鎖はエンドヌクレアーゼによって切断される。反応を停止させ、生成物を精製し、２％のアガロースゲルによって分離する。ゲル中に見えるバンドの数を遺伝子改変の百分率の推定として使用することができる。
【０２５４】
編集が見つかったらすぐに、細胞をクローン希釈でプレーティングし、クローンを拡大した後、プールした細胞について上述したものと同じ過程に供するが、代案として、増幅した標的を改変のプロファイリングのためにシーケンシングまたは高解像度融解（ＨＲＭ）に直接供することができる。編集について陽性であることが判明したクローンを内部品質管理に供する（多能性、比較ゲノムハイブリダイゼーション、マイコプラズマ）。最終的に、編集細胞の選択されたクローンをＨＬＡ型決定に再度提出する、および／またはその全ゲノムを配列決定する。ＨＬＡ−ＫＯ細胞株の衛星様細胞および筋管を発生する能力は確認されている。ＨＬＡ抗原が存在しないことは、衛星細胞、筋芽細胞、および筋管段階において確認されている。
【０２５５】
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されたが、そのような実施形態は例としてだけ提供されていることは当業者に明らかになる。本明細書の実施形態の記載および図示は限定する意味で解釈されるためのものではない。本発明を逸脱しない範囲で、当業者は今では多くの変異形、変更および代替を思いつく。さらに、本発明の全ての態様が、様々な条件および変数に依存する、本明細書に示される具体的な描写、構成または相対的な割合に限定されるとは限らないことを理解すべきである。本明細書に記載される本発明の実施形態への様々な代替物を本発明の実施で用いることができることを理解すべきである。本開示には、当業者が理解するであろう、本明細書中の例の実施形態に対するすべての変更、置換、変形、変更、および改変が包含される。以下の請求項が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物はそれに含まれることを意図する。
【図１】
2018518943.tif 000007
【図２】
2018518943.tif 000008
【図３】
2018518943.tif 000009
【図４】
2018518943.tif 000010
【図５】
2018518943.tif 000011
【図６】
2018518943.tif 000012
【図７】
2018518943.tif 000013
【図８】
2018518943.tif 000014
【図９】
2018518943.tif 000015
【図１０】
2018518943.tif 000016
【図１１Ａ】
2018518943.tif 000017
【図１１Ｂ】
2018518943.tif 000018
【図１１Ｃ】
2018518943.tif 000019
【図１２Ａ】
2018518943.tif 000020
【図１２Ｂ】
2018518943.tif 000021
【図１３Ａ】
2018518943.tif 000022
【図１３Ｂ】
2018518943.tif 000023
【図１４】
2018518943.tif 000024
【図１５Ａ】
2018518943.tif 000025
【図１５Ｂ】
2018518943.tif 000026
【図１５Ｃ】
2018518943.tif 000027
【図１５Ｄ】
2018518943.tif 000028
【図１５Ｅ】
2018518943.tif 000029
【図１５Ｆ】
2018518943.tif 000030
【図１６Ａ】
2018518943.tif 000031
【図１６Ｂ】
2018518943.tif 000032
【図１７Ａ】
2018518943.tif 000033
【図１７Ｂ】
2018518943.tif 000034
【図１８】
2018518943.tif 000035
【図１９】
2018518943.tif 000036
【図２０】
2018518943.tif 000037
【図２１】
2018518943.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月9日(2018.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018518943000001.app
【国際調査報告】
2018518943.tif 000039
2018518943.tif 000040
2018518943.tif 000041
2018518943.tif 000042
2018518943.tif 000043