(57)【要約】【課題】  乳酸菌のコーティング方法、及び前記コーティング方法で製造された乳酸菌複合体に関する。【解決手段】  本出願は、（ａ）乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、前記乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ；（ｂ）前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップ；（ｃ）前記（ｂ）ステップの混合物をカルシウム含有溶液に添加してアルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップを備え、前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂とラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳは、前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に含まれることを特徴とする。【選択図】図１
2018537114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、前記乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ；
（ｂ）前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップ；及び
（ｃ）前記（ｂ）ステップの混合物をカルシウム含有溶液に添加してアルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップを備え、
前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂、及びラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳが、前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に含まれることを特徴とする、乳酸菌のコーティング方法。
【請求項２】
前記乳酸菌はラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）およびワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｓｐ．）からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項３】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項４】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ２４３）、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ１３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ１３３）、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ１３６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ１３６）、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ５５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ５５）、及びラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ５６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ５６）からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項５】
前記カゼイン含有培地は脱脂粉乳を含むことを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項６】
前記コーティング剤は、多孔性ポリマー、蛋白質および増粘多糖類からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項７】
前記（ｂ）ステップの溶液に、プレバイオティクスがさらに含まれることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項８】
前記アルギン酸溶液は、アルギン酸ナトリウムを２重量％〜４重量％で水溶化したものであり、アルギン酸溶液の重量とカゼインでコーティングされた乳酸菌の重量の比が１：１〜１０：１であることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項９】
前記（ｂ）ステップのラクトバチルス・プランタラムは、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ２４３）であることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項１０】
前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂及びラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳが内部に含まれたアルギン酸−カルシウムビーズを凍結乾燥するステップをさらに備える、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）ステップの溶液に凍結保護剤がさらに含まれることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌のコーティング方法。
【請求項１２】
カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ、およびアルギン酸−カルシウムビーズを含む、乳酸菌複合体。
【請求項１３】
前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部は、前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、及び前記ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳが含まれることを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【請求項１４】
プレバイオティクス、凍結保護剤からなる群より選択されるいずれか一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【請求項１５】
前記コーティング剤は、多孔性ポリマー、蛋白質および増粘多糖類からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【請求項１６】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）およびワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｓｐ．）からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【請求項１７】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【請求項１８】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ２４３）、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ１３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ１３３）、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ１３６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ１３６）、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ５５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ５５）、及びラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ５６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ５６）からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【請求項１９】
前記ラクトバチルス・プランタラムは、ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ２４３）であることを特徴とする、請求項１２に記載の乳酸菌複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、乳酸菌のコーティング方法及びその方法で製造された乳酸菌複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）は哺乳類の腸内に生息して雑菌による異常発酵を防止し、整腸剤にも用いる重要な細菌である。例えば、ブルガリア乳酸菌（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）は最も古くから知られている乳酸菌であり、ヨーグルトの製造に使用され、チーズや発酵バターの製造時のスターターとしても用いられる。また、好気性乳酸菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）は人及び全哺乳類とその他の動物の腸に存在し、バターや牛乳の製造や腸自家中毒の治療に利用される。また、ラクティス乳酸球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）はＤＬ−乳酸を生成し、常に牛乳の中に存在してバターやチーズの製造に使用され、酪農用の乳酸菌として最も重要な菌である。
【０００３】
前述したように有用な乳酸菌は腸に定着して腸管運動の活性化、有害菌の抑制、ビタミンおよび免疫増強物質の促進、及びアトピー皮膚の緩和などの様々な生理活性効果を発揮する。しかし、前記生理学的効果を発揮するためには、既存のヨーグルトなどの食品による摂取量より非常に多量の乳酸菌を摂取しなければならない。したがって、乳酸菌のみを分離して粉末やカプセル型で簡単に食べられる方法が普及している。
【０００４】
しかし、乳酸菌を粉末やカプセル型で製造すると、長期的な流通過程中または体内に胃酸や胆汁酸により死滅する乳酸菌が多く、乳酸菌本来の生理活性機能の発揮ができなくなる場合が多い。したがって、最近では、これらの欠点を克服するために、各種のコーティング剤を使用して乳酸菌をコーティングする方法として澱粉、ゼラチン、アルギン酸、セルロース、硬化油、各種乳化剤などをコーティング物質で使用し巨大カプセル又は５０μｍ以上の微細カプセルを製造することや、機能性不飽和脂肪酸を必要以上の高濃度で含有させてカプセル化し使用期間内で品質を維持する方法が開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、懸濁／乳化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）及び押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）方法で乳酸菌をコーティングし、流通安定性と腸内生存率が著しく高められた乳酸菌のコーティング方法を開発して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記の課題を解決するため本発明の一実施態様は、
（ａ）乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、前記乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ；
（ｂ）前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップ；及び
（ｃ）前記（ｂ）ステップの混合物をカルシウム含有溶液に添加してアルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップを備え、前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂及びラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳは前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に含まれることを特徴とする、乳酸菌のコーティング方法を提供する。
【０００７】
また、本出願の他の態様は、前記製造方法で製造してコーティングされた乳酸菌複合体を提供する。前記乳酸菌複合体は、アルギン酸−カルシウムビーズ、カゼインでコーティングされた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ、コーティング剤、および食用油脂を含むことができる。
【０００８】
以下、本出願の態様について詳細に説明する。
（ａ）乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ
前記乳酸菌は酸を生成し弱酸性条件でも増殖できる乳酸菌であり、これらに限定されないが、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｓｐ．）のいずれか一つであることを特徴とする。具体的には、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）のいずれか一つであり、より具体的には、韓国特許登録番号第１１７８２１７号に記載のラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ２４３）、韓国特許登録番号第１４８６９９９号に記載のラクトバチルス・プランタラムＣＪ１３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ１３３）、韓国特許登録番号第１０７５５５８号に記載のラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ１３６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ１３６）、韓国特許登録番号第１２５５０５０号に記載のラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ５５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ５５）及び韓国特許登録番号第１０７５５５７号に記載のラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ５６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ５６）のいずれか一つ以上である。
【０００９】
前記菌株は、韓国の生命工学研究院遺伝子銀行に寄託され、当業者が生命工学研究院遺伝子銀行から容易に入手できる菌株である。
【００１０】
前記カゼイン含有培地には、例えば、脱脂粉乳が含まれた培地などがある。前記カゼインは増殖中の乳酸菌の代謝産物である有機酸などにより等電点（ｐＨ４．６）に達して自然に凝集して粒子化し、粒子化過程で微生物を同時に捕集してカゼイン−菌マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）を形成して乳酸菌をコーティングする。カゼインが含まれた脱脂粉乳の含量は、全培地組成物の１００重量を基準に、０．００５重量％〜０．２重量％である。具体的には０．０１重量％〜０．１重量％であり、最も具体的には０．０２重量％〜０．０５重量％である。脱脂粉乳の含量が全培地組成物の１００重量％を基準に０．２重量％以上である場合には凝集したカゼイン量が多すぎて集菌後に懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）効率が低下し、０．００５重量％以下の場合にはカゼイン量が少なくてカゼイン−菌マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）の形成が難しくコーティング効率が減少する恐れがある。カゼインの含量は脱脂粉乳の２０重量％〜３０重量％である。
【００１１】
（ｂ）前記（ａ）ステップでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップ
（ｂ）ステップは懸濁および／または乳化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）ステップであり、前記（ａ）ステップにおいて生成したカゼインでコーティングされた乳酸菌を遠心分離などの方法により集菌した後、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及びアルギン酸を含む溶液と混合する。
【００１２】
前記コーティング剤は乳酸菌を外部環境から保護する目的で使用され、具体的には多孔性ポリマー、蛋白質および増粘多糖類からなる群より選択されるいずれか一つ以上である。前記コーティング剤は、乳酸菌の重量を基準に６重量％〜６１重量％、具体的には１０重量％〜５０重量％の範囲で含まれる。
【００１３】
前記多孔性ポリマーは多孔性の粒子基材であり、外部水分及び空気の流入を遮断する役割をする。前記多孔性ポリマーは具体的に、これらに限定されないが、マルトデキストリン、キトサン、デンプン、ポリエチレングリコール、トリアチン及びグリセリンのいずれか一つ以上であり、具体的にはマルトデキストリンを含む。
【００１４】
前記多孔性ポリマーは、乳酸菌の重量を基準に５重量％〜５０重量％であり、具体的に１０重量％〜３０重量％であり、より具体的に１４重量％〜１６重量％である。
【００１５】
前記タンパク質は空隙を埋める役割をする。前記タンパク質は具体的に、これに限定されないが、脱脂粉乳、乳清たんぱく及び大豆タンパク質のいずれか一つ以上であり、具体的には脱脂粉乳または乳清たんぱくである。
【００１６】
前記タンパク質は、乳酸菌の重量を基準に１重量％〜１０重量％であり、具体的に２重量％〜８重量％であり、より具体的には３重量％〜７重量％である。
【００１７】
前記増粘多糖類は、多孔質ポリマー、タンパク質などと共に使用した時に、多孔質ポリマー、たんぱく質などを安定化する役割をする。コーティング剤を安定化する役割もする。前記増粘多糖類は具体的に、これらに限定されないが、ゼラチン、ペクチン、グアーガム、寒天、キサンタンガム、および、ゲランガムのいずれか一つ以上であり、具体的にはキサンタンガムまたは、ゲランガムである。
【００１８】
前記増粘多糖類は、乳酸菌の重量を基準に０．００１重量％〜１重量％であり、具体的に０．００５重量％〜０．５重量％であり、より具体的には０．００８重量％〜０．１重量％である。
【００１９】
前記アルギン酸を含む溶液は、アルギネート、例えば、アルギン酸ナトリウムを２重量％〜４重量％の濃度で水溶化したものである。アルギン酸含有溶液の重量とカゼインでコーティングされた乳酸菌の重量の割合は１：１〜１０：１、具体的には１：１〜８：１であり、最も具体的には１：１〜４：１である。
【００２０】
前記食用油脂はヤシ油、パーム油などの飽和脂肪であり、一実施形態で固体状態の食用油脂を使用することができる。
【００２１】
前記食用油脂は（ａ）食用油か９０℃〜１１０℃の温度で加熱して溶解させるステップ；及び（ｂ）前記加熱された食用油脂を４０℃〜６０℃の範囲で冷却するステップ；を備えた方法で製造する。より具体的に、食用飽和脂肪に加水して１００℃で加熱溶解させた後、５０℃に冷却して製造することができ、乳酸菌の重量を基準に食用油を１：０．００５〜１：０．１の割合で混合するか、溶液の重量を基準に０．２重量％の大豆レシチンを添加した後、加水してホモジナイザーを使用して乳化して約１０重量％の乳化液を製造して添加することができ、５０℃に冷却して乳酸菌の重量を基準に１：０．０５〜１：１の割合で混合する。
【００２２】
前記ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）は粘性のある多糖類であり、腸内生存率の向上と腸内定着性の向上に役立つ特徴がある。
【００２３】
前記ラクトバチルス・プランタラムは、一実施形態においてラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＣＪＬＰ２４３）である。
【００２４】
前記ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳは、（ａ）培養培地にグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を１重量％〜５重量％を添加するステップ；（ｂ）ラクトバチルス・プランタラムを２５℃〜４０℃の温度で前記培地に培養するステップ、当該培地内のグルコース濃度が０．０１重量％以下になるまで培養するステップ；及び（ｃ）得られた培養物を遠心分離で上澄み液のみ分離するステップを備える方法で製造する。
【００２５】
必要に応じて、前記（ｃ）ステップの後、前記分離された上澄み液を３倍〜４倍に濃縮するステップをさらに備えるか、前記（ｂ）ステップの後で得られた培養液に固形分を基準に７〜１０倍重量のデキストリンを混合し、前記混合物を乾燥して粉末化するステップをさらに備える。具体的に、ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）培地にグルコースを３重量％添加した培養液を滅菌後に前記ラクトバチルス・プランタラム、最も具体的にラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３を３０℃でグルコースが完全に消費されるまで培養した後、遠心分離して得られた除菌濾過液を濃縮液または粉末化して使用することができる。
【００２６】
前記ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳは、残ったグルコースの濃度が０．０１重量％以下、ブリックス（Ｂｒｉｘ）が７〜８の範囲であり、３倍〜４倍の濃縮液の形態で使用するか、培養液の固形分重量を基準に７倍〜１０倍のデキストリンを混合して乾燥と粉末化して使用する。
【００２７】
前記ＥＰＳの添加量は、乳酸菌の重量を基準に１重量％〜５０重量％である。
前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップは、これらの各成分を同時に添加するか、あるいは順次に添加するか、時間差を置いて混合する。具体的には、カゼインでコーティングされた乳酸菌とコーティング剤を先に混合し、前記混合物に水を添加して水性混合物を得て、前記水性混合物にアルギン酸含有溶液を追加して混合する。他の実施形態では、カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、およびアルギン酸含有溶液を同時に添加して混合するか、カゼインでコーティングされた乳酸菌とアルギン酸含有溶液を最初に混合し、その後コーティング剤を追加する。
【００２８】
その後、カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、およびアルギン酸含有溶液を含む水性混合物に、食用油脂とＥＰＳを添加して、前記水性混合物を懸濁および／または乳化させることができる。
【００２９】
前記（ｂ）ステップの混合時に、プレバイオティクスを任意に追加することができる。具体的に、乳酸菌とコーティング剤を混合する時にプレバイオティクスを追加して混合することができる。前記プレバイオティクスは乳酸菌の餌の役割をする。前記プレバイオティクスは、これらに限定されないが、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マルチトール、ラクチトール、及びイヌリンから選択されたいずれか一つ以上であり、具体的にはフラクトオリゴ糖またはイヌリンである。
【００３０】
前記プレバイオティクスは、乳酸菌の重量を基準に０．１重量％〜５重量％である。
また、前記（ｂ）ステップの混合時に、凍結保護剤を任意に追加することができる。
前記凍結保護剤は、凍結乾燥のせいで乳酸菌が損傷または死滅することを防止する役割をする。前記凍結保護剤は、これらに限定されないが、例えば、デキストリン、ショ糖、グリセロール、マンニトール、およびトレハロースのいずれか一つ以上であり、具体的にはトレハロースのみを含ませるか、トレハロースに加えて他の凍結保護剤を含ませる。
【００３１】
前記凍結保護剤は、乳酸菌の重量を基準に５重量％〜５０重量％であり、具体的に１０重量％〜３０重量％であり、より具体的には１４重量％〜１６重量％である。
【００３２】
前記凍結保護剤は、凍結乾燥前の任意のステップで添加することができるが、具体的には、乳酸菌とコーティング剤の混合時に凍結保護剤を追加して混合する。この時、コーティング剤および凍結保護剤の重量合；とカゼインコーティングされた乳酸菌の重量；の比が０．１：１〜５：１になるように混合した方が良い。
【００３３】
（ｃ）前記（ｂ）ステップの混合物をカルシウム含有溶液に添加して、カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂及びラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳを内部に含むアルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップ
前記（ｃ）ステップは、押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）ステップであり、懸濁および／または乳化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）されてコーティングされた乳酸菌とアルギン酸含有混合物をカルシウム含有溶液と反応させると、アルギン酸−カルシウム架橋結合によるマトリックスの形成のためカルシウム含有溶液内で乳酸菌がビーズ内部に捕集され、このとき、（ｂ）ステップで混合されたコーティング剤、ＥＰＳ、食用油脂などがビーズ内に同時に捕集される。
【００３４】
前記アルギン酸−カルシウム反応によるビーズ粒子の製造は常温条件（例えば、２５℃）で行い、他の物理的なストレスが少ないため生菌の生存率に悪影響が少ない。また、押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）方式を利用したアルギン酸−カルシウムビーズ粒子の形成は、ｐＨ依存性の放出特性があり、胃酸のような酸性では分解されず、腸内環境の中性で徐々に分解される特性があって、乳酸菌の腸内生存率の向上に大きく役立つ。
【００３５】
前記アルギン酸−カルシウムビーズを形成する（ｃ）ステップは、
（１）前記（ｂ）ステップの混合物を２５℃〜３５℃に維持するステップ；
（２）１００ｍＭ〜１Ｍのカルシウムイオン溶液を攪拌するステップ；及び
（３）前記（ｂ）ステップの混合物を加圧条件で前記攪拌されたカルシウムイオン溶液に点滴してアルギン酸−カルシウムビーズ含有溶液を製造するステップを備える。
【００３６】
前記アルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップは、（４）前記アルギン酸−カルシウムビーズ含有溶液を４℃〜２０℃の温度で３０分〜６０分間放置するステップをさらに備えることができる。
【００３７】
前記（ｃ）ステップは、懸濁および／または乳化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）された（ｂ）ステップの混合物を２５℃〜３５℃の温度で維持する。カルシウムイオン溶液の濃度は０．１Ｍ〜１Ｍであり、具体的に例えば１００ｍＭの乳酸カルシウム溶液をガラスビーカーに入れて撹拌する。前記乳化（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）および／または懸濁された前記（ｂ）ステップの混合物は、例えば１０ｍＬ注射針形態の押出または微細ノズルによる噴射工程を経てカルシウムイオン溶液槽で直接反応させ、カルシウムイオン溶液槽は攪拌を維持して個々の反応の粒子が互いに固まることを防止する。１０ｍＬ注射器に前記（ｂ）ステップの混合物を充填した後、圧力を加えてカルシウムイオン溶液ビーカーに直接点滴してビーズを形成することができる。ビーズ形成が終わったらビーズを含む溶液槽を、更に４℃〜２０℃の条件で３０分〜６０分間放置して熟成することができる。前記熟成過程を経て粒子組織の緻密性が高められる。
【００３８】
注射針形態の押出方式である場合には２０〜１００メッシュ（ｍｅｓｈ）の篩に、微細噴射ノズルを用いた噴射工程の方式である場合には１００〜２００メッシュの篩にかけてビーズを得て、蒸留水で２回洗浄して残ったカルシウム溶液を除去した後にビーズを得た。
【００３９】
（ｄ）前記（ｃ）ステップで製造された乳酸菌を含むアルキン酸−カルシウムビーズを凍結乾燥するステップ
前記（ｃ）ステップの後、必要に応じて（ｄ）ステップをさらに備えることができる。（ｄ）ステップは凍結乾燥するステップであり、前記（ｃ）ステップ後に製造された乳酸菌を含むアルギン酸−カルシウムビーズを凍結乾燥トレイ（Ｔｒａｙ）に移し、急速凍結条件である−４０℃〜−７０℃の温度で１２時間ないし２４時間前後で維持した後、凍結乾燥機で解凍しながら水分を除去する。
【００４０】
本出願の他の実施態様では、前記のいずれか一つの方法で製造されたコーティングされた乳酸菌複合体を提供する。
【００４１】
乳酸菌複合体は、アルギン酸−カルシウムビーズ、カゼインでコーティングされた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳ、コーティング剤、および食用油脂を含む。前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に前記カゼインでコーティングされた乳酸菌及び前記ラクトバチルス・プランタラムのＥＰＳを含むことができる。または、乳酸菌複合体は、アルギン酸−カルシウムビーズ及び前記アルギン酸カルシウムビーズ内のカゼインでコーティングされた乳酸菌と乳酸菌のＥＰＳを含み、食用油脂、コーティング剤、プレバイオティクス及び凍結保護剤のいずれか一つ以上をさらに含むことができる。具体的には、食用油脂及びコーティング剤を前記のアルギン酸カルシウムビーズ内に含ませる。乳酸菌複合体は乳酸菌をカゼインコーティングしアルギン酸−カルシウムビーズ内で包接させることで、従来の乳酸菌に比べて保管安定性と腸内生存率が大幅に改善される。前記乳酸菌複合体は、固体、具体的には粉末の形態であり、より具体的には凍結乾燥粉末の形態である。
【００４２】
乳酸菌複合体の各成分の詳細な説明は、前記乳酸菌コーティング方法の態様で説明したのでその記載を省略する。
【発明の効果】
【００４３】
本出願者らは、懸濁および／または乳化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）及び押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）方法で乳酸菌複合体を製造して乳酸菌を多重保護することで、乳酸菌の流通安定性と腸内生存率を高めた。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本出願の一実施態様に係る乳酸菌複合体の製造過程をフロー−チャート（ｆｌｏｗ−ｃｈａｒｔ）で示した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本出願に関して実施例を挙げて詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の例示に過ぎなく、本発明の内容はこれに限定されない。
【００４６】
実施例１：乳酸菌含有複合体の製造
ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３菌株を０．０２重量％の脱脂粉乳が含まれたＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に３７℃で１８時間〜２４時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、カゼインでコーティングされた乳酸菌のみ回収した。
【００４７】
その後、トレハロース（菌体の重量を基準に１５重量％前後）、マルトデキストリン（菌体の重量を基準に１５重量％前後）、脱脂粉乳（菌体の重量を基準に４重量％前後）、キサンタンガム（菌体重量を基準に０．０１重量％前後）及びプラクトオリゴ糖（菌体の重量を基準に２重量％）を混合して、凍結保護剤、コーティング剤、およびプレバイオティクス含有溶液を製造し、この溶液を加水及び水溶化して滅菌した。得られた乳酸菌と前記凍結保護剤、コーティング剤、およびプレバイオティクス含有溶液を混合して懸濁させた。
【００４８】
その後、アルギン酸ナトリウムを２重量％に水溶化してアルギン酸溶液を製造した。前記凍結保護剤、コーティング剤、およびプレバイオティクス含有溶液に混合された乳酸菌と、前記製造されたアルギン酸溶液の重量を、乳酸菌の重量を基準に１：４の割合で混合した。
【００４９】
パーム油などの飽和脂肪固形分を加水し１００℃で加熱溶解した後、溶液の重量を基準に０．２重量％の大豆レシチンを添加しホモジナイザーを使用して乳化して約１０重量％の乳剤を製造し、５０℃に冷却して乳化の最終工程で乳酸菌の重量を基準に１：０．５の割合でＥＰＳと共に後添した。前記ＥＰＳは、ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）培地にｇｌｕｃｏｓｅを３重量％添加した培養液を滅菌した後に微生物としてラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３菌株を３０℃で培地内のグルコース濃度が０．０１重量％以下になるまで培養した後、遠心分離によって得られた除菌濾過液を濃縮液形態または粉末化したものである。濃縮液形態または培養液の固形分は、濃縮液形態または培養液の固形分を基準に７〜１０倍のデキストリンを混合し乾燥と粉末化して使用した。前記ＥＰＳの濃縮液または粉末は、菌体の重量を基準に１：０．２の濃度で懸濁して添加した。前記懸濁された乳酸菌含有混合物を適切な粘度で維持させるため、コーティング前に３０℃で維持した。１００ｍＭの乳酸カルシウム溶液をガラスビーカーに入れて攪拌条件を維持した。１０ｍＬ注射器に乳酸菌含有混合物を充填した後に圧力を加えて乳酸カルシウム溶液ビーカーに直接点滴してビーズを形成した。ビーズ形成が終わったら、ビーズを含む溶液槽を４℃の条件で冷却し、３０分間放置した。１００ｍｅｓｈサイズの篩にかけてビーズを回収し、蒸留水で２回洗浄してビーズを得た。得られた粒子は凍結乾燥トレイに移し、急速凍結条件（−４０℃以下）で１２時間〜２４時間前後を維持した後、凍結乾燥機で解凍しながら水分を除去し、アルギン酸−カルシウムビーズ内乳酸菌が捕獲された乳酸菌複合体の乾燥粉末を得た。
【００５０】
比較例１：乳酸菌凍結乾燥体の製造
ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３菌株をＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に３７℃で１８時間〜２４時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、乳酸菌のみ回収した。トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）（菌体の重量を基準に１５重量％前後）を加水及び水溶化して滅菌した。乳酸菌と前記凍結保護剤を混合して懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。前記乳酸菌を遠心分離器で集菌した。回収した乳酸菌は凍結乾燥トレイ（Ｔｒａｙ）に移し、急速凍結条件（−４０℃以下）で１２時間〜２４時間前後を維持した後、凍結乾燥機で解凍しながら水分を除去した。
【００５１】
すなわち、比較例１は実施例１に比べて、カゼインが含まれた培地で培養するステップ、コーティング剤およびプレバイオティクスを混合するステップ、アルギン酸溶液を混合するステップ、食用油脂を混合するステップ、及びＥＰＳを混合するステップとアルギン酸カルシウムビーズを形成するステップが省略された。
【００５２】
比較例２：カゼインでコーティングされた乳酸菌（コーティング処理）の凍結乾燥体を製造
ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３菌株を０．０２重量％の脱脂粉乳が含まれたＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に３７℃で１８時間〜２４時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、カゼインでコーティングされた乳酸菌のみ回収した。
【００５３】
その後、トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）（菌体の重量を基準に１５重量％前後）、マルトデキストリン（菌体の重量を基準に１５重量％前後）、脱脂粉乳（菌体の重量を基準に４重量％前後）及びキサンタンガム（菌体重量を基準に０．０１重量％前後）を混合して凍結保護剤とコーティング剤含有溶液を製造し、この溶液を加水及び水溶化して滅菌した。回収した乳酸菌と前記凍結保護剤及びコーティング剤含有溶液を混合して懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。前記乳酸菌を遠心分離器で集菌した。回収した乳酸菌は凍結乾燥トレイ（ｔｒａｙ）に移し、急速凍結条件（−４０℃以下）で１２時間〜２４時間前後で維持した後、凍結乾燥機で解凍しながら水分を除去した。
【００５４】
すなわち、比較例２は実施例１に比べて、プレバイオティクスを混合するステップ、アルギン酸溶液を混合するステップ、食用油脂とＥＰＳを混合するステップ及びアルギン酸カルシウムビーズを形成するステップが省略された。
【００５５】
比較例３：アルギン酸−カルシウムビーズ内にカゼインでコーティングされた乳酸菌含有複合体（コーティング剤、食用油脂とプレバイオティクス処理、ＥＰＳ未処理）の凍結乾燥体を製造
ラクトバチルス・プランタラムＣＪＬＰ２４３菌株を０．０２重量％の脱脂粉乳が含まれたＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に３７℃で１８時間〜２４時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、カゼインでコーティングされた乳酸菌のみ回収した。
【００５６】
その後、トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）（菌体の重量を基準に１５重量％前後）、マルトデキストリン（菌体の重量を基準に１５重量％前後）、脱脂粉乳（菌体の重量を基準に４重量％前後）、キサンタンガム（菌体重量を基準に０．０１重量％前後）及びフラクトオリゴ糖（菌体の重量を基準に２重量％）を混合してプレバイオティクス、凍結保護剤およびコーティング剤含有溶液を製造し、この溶液を加水および水溶化して滅菌した。
【００５７】
乳酸菌と前記凍結保護剤およびコーティング剤含有溶液を混合して懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。その後、アルギン酸ナトリウムを２重量％で水溶化してアルギン酸溶液を製造した。前記アルギン酸溶液を乳酸菌の重量を基準に１：４の割合で混合した。パーム油などの飽和脂肪固形分を加水して１００℃で加熱溶解した後に溶液重量を基準に０．２重量％の大豆レシチンを添加しホモジナイザーを使用して乳化し約１０重量％の乳化液を製造し、５０℃に冷却して乳化の最終工程で乳酸菌の重量を基準に１：０．５の割合で後添した。前記懸濁された乳酸菌含有液を適切な粘度で維持させるため３０℃を維持した。１００ｍＭの乳酸カルシウム溶液をガラスビーカーに入れて攪拌条件を維持した。１０ｍＬ注射器に乳酸菌含有液を充填した後に圧力を加えて乳酸カルシウム溶液ビーカーに直接点滴してビーズを形成した。ビーズ形成が終わったらビーズを含む溶液槽を４℃の条件に冷却し３０分間放置した。１００ｍｅｓｈサイズの篩にかけてビーズを回収し、蒸留水で２回洗浄してビーズを得た。得られた粒子は凍結乾燥トレイに移し、急速凍結条件（−４０℃以下）で１２時間〜２４時間前後を維持した後、凍結乾燥機で解凍して水分を除去した。
【００５８】
すなわち、比較例３は実施例１に比べて、ＥＰＳを混合するステップが省略された。
前記製造された実施例１と比較例１ないし３の乳酸菌または乳酸菌複合体に対して、下記の方法で腸内生存率、流通保存性を評価し、その結果を下記表１ないし４に示した。
【００５９】
実験例１：腸内生存率の評価
乳酸菌は摂取後、消化器官を経て様々な要因によって死滅する環境にさらされる。最も重要な原因としては、胃から分泌される胃酸による死滅と十二指腸から分泌される胆汁酸による死滅を挙げることができる。具体的に、胃酸の強酸は菌に直接作用して死滅を誘導し、胆汁酸は様々な消化酵素（主に脂肪分解酵素による）や、浸透圧のストレスで菌の死滅を誘導する。胃／胆汁酸による生菌の生存率の評価方法の一つである簡易モデルとして、仮想の胃／胆汁経路実験法（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｓｔｏｍａｃｈ  Ｄｕｏｄｅｎｕｍ  Ｐａｓｓａｇｅ、（ＳＳＤＰ））（ＭＧ  Ｖｉｚｏｓｏ  Ｐｉｎｔｏ、ＣＭＡＰ  Ｆｒａｎｚ、Ｕ．  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ、ａｎｄ  ＷＨ  Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ、  “Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆａｅｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１０９、ｎｏ．３、ｐｐ．２０５−２１４、２００６）が提案された。ＳＳＤＰの主な試験法は、一定濃度の生菌や生菌粉末を酸性条件下（ｐＨ  ３．０、飲食物を摂取した胃のｐＨ条件）のＭＲＳ培地で１時間静置培養し、さらに胆汁酸条件（人工胆汁液、Ｏｘｇａｌｌ／ｓａｌｔｓ）で２時間静置培養して、菌の生存率を１時間単位でチェックする方法である。ＳＳＤＰ試験法は、前記胃−胆汁条件を連続的に適用するため、菌の生存は個別に適用するよりも過酷な条件であるが、実際の人体の消化器環境に似ている。特に、脱水および粉末製剤化された乳酸菌の場合、菌体が活性化されない状態であるためＳＳＤＰ試験の過酷な環境でもっと脆弱であるが、粉末形態の乳酸菌を最終的に摂取する評価モデルとしてもっと適切な方法であると考えられる。
【００６０】
実験群の試料をＳａｌｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒに１：１００の倍率で希釈して滅菌バッグに入れた後に均質化した。菌体量に合わせてＳａｌｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒで連続希釈したサンプルをＭＲＳアガー培地に（Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）に塗抹した。プレート（Ｐｌａｔｅ）を回収し、３７℃の好気条件で２４時間静置培養して計数した（初期菌数Ｄａｔａ）。
【００６１】
蒸留水にＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈを５５ｇ／ｌの濃度で攪拌して完全に溶解させ、攪拌（Ｓｔｉｒｒｉｎｇ）条件で５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３．０に調整した後、滅菌（１２１℃、１５分）した酸性ＭＲＳ培地を製造した。酸性ＭＲＳ培地５０ｍｌを滅菌Ｆｌａｓｋに分注し、１／１００当量の試料を投入した後、十分振って溶解させた（サンプルを溶解させた時点の正確な時間をチェックする）。３７℃、８０ｒｐｍの条件で振とう培養した。１時間後、１ｍｌを取り、Ｓａｌｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒで連続希釈したサンプルをＭＲＳアガープレート（Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）に塗抹した。プレート（Ｐｌａｔｅ）を回収し、３７℃好気条件で２４時間静置培養し係数した（１時間Ｄａｔａ）。
【００６２】
１０重量％Ｏｘｇａｌｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：蒸留水にＯｘｇａｌｌ（Ｄｉｆｃｏ）を１０重量％の濃度で溶解した後、滅菌（１２１℃、１５分）して１０重量％Ｏｘｇａｌｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを製造した。試料を取った直後に、１０重量％Ｏｘｇａｌｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２０ｍｌをフラスコ（Ｆｌａｓｋ）に添加し、続いて８５ｍｌの人工胆汁液Ｂｕｆｆｅｒを添加し、十分振り混ぜた。前記人工胆汁液ｂｕｆｆｅｒは蒸留水にＮａＨＣＯ３（６．４ｇ／ｌ）、ＫＣｌ（０．２３９ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（１．２８ｇ／ｌ）の濃度で溶解して、５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した後に滅菌（１２１℃、１５分）して製造した。３７℃、８０ｒｐｍの条件で振とう培養した。その後、２時間にわたって１時間単位で試料を取って、Ｂｕｆｆｅｒで連続希釈したサンプルをＭＲＳアガープレート（Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）に塗抹した。プレート（Ｐｌａｔｅ）を回収し、３７℃好気条件で２４時間静置培養し計数した（２時間、３時間Ｄａｔａ）。
【表１】
2018537114.tif 000003
【表２】
2018537114.tif 000004
【００６３】
前記表１は、実験結果の対数であり、表２は実験結果の実測値である。比較例１は胃酸で約４．３ｌｏｇ、胆汁酸で約１．１ｌｏｇ程度の減少幅を示した。比較例２は胃酸で安定であったが、胆汁酸で約２．３ｌｏｇ程度減少した。比較例３の適用条件は、胃酸／胆汁酸条件下で０．４ｌｏｇの減少幅を示し、比較例２に比べて約２ｌｏｇ（１００倍）程度の生存率が高まった。実施例１の適用条件で比較例３に比べても０．１ｌｏｇ以上の生存率が高まった。
【００６４】
２．流通保存性の評価（５０℃で７２時間放置）
凍結乾燥化された乳酸菌原末は温度と保存期間の経過につれて活性が徐々に減少する。 活性の影響要因として一般的に、温度、酸素、水分などが挙げられる。主に凍結乾燥化された乳酸菌原末は吸湿性が非常に強く、保存初期に多くの含量が減少する。流通保存性を高めるために包装材に脱酸素剤を適用するなど除湿のために様々な方法があるが、最終的には、乳酸菌原末自体のコーティング程度により保存期間に大差がある。したがって、原料特性に起因した吸湿性を緩和するために、グルコースとデキストリンなどの賦形剤を原末の重量を基準に１倍〜１０倍の範囲で混合して保存する。本実験では、マルトデキストリンと無水結晶ブドウ糖が１：１の割合で混合された賦形剤を原末１：混合賦形剤３の割合で混合して保存した。保存期間中の空気透過性を排除するためアルミパウチに個別包装して５０℃で３日間保存し、短期の過酷条件における生存率を分析した。
【００６５】
凍結乾燥粉末化した比較例１、比較例２、比較例３と実施例１の試料をアルミパウチ包装に所定量ずつ入れて、個々の包装を密封した。試料は、それぞれ５０℃のインキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で７２時間放置した。７２時間後、実験群の試料をＳａｌｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒに１：１００の倍率で希釈して滅菌バッグに入れて均質化した。Ｓａｌｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒで連続希釈したサンプルをＭＲＳアガープレート（Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）に塗抹した。プレート（Ｐｌａｔｅ）を回収し、３７℃好気条件で２４時間静置培養し計数した。
【表３】
2018537114.tif 000005
【表４】
2018537114.tif 000006
【００６６】
短期の過酷条件を適用した前後における菌の活性を比較測定した。前記表３は、実験結果の対数であり、表４は実験結果の実測値である。比較例２は約２ｌｏｇの活性減少が観測された。比較例３は、約０．９ｌｏｇ幅で生存率が高まった。実施例１は、０．６ｌｏｇのレベルに生存率がさらに高まった。
【図１】
2018537114.tif 000007
【国際調査報告】
2018537114.tif 000008
2018537114.tif 000009
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