(57)【要約】本発明は、画像誘導手術および光線力学的治療に有用である新しい化合物について記載している。特に、罹患組織上に発現する受容体を標的化するリガンドを使用して化合物ががんなどの罹患組織に送達され、これに続いて受容体媒介性エンドサイトーシスが生じた後、化合物は核またはミトコンドリアを標的とし、がん細胞ならびに他の障害に対して有効な活性を提供することができる。これに使用するための方法および組成物が記載されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化４４】
2018537402.tif 000056
を有する、光線力学的治療用化合物または薬学的に許容されるその塩、またはその同位体（式中、
Ｌはアミノ酸であり、
Ｌ’は、薬物動態特性を改善するリンカーであり、
Ｌ”は、細胞小器官を標的とする光線力学的治療用（ＰＤＴ）薬剤を放出する放出可能なリンカーであり、
Ｘは細胞小器官標的化薬剤であり、
Ｙは光線力学的治療剤である）。
【請求項２】
Ｙが、
【化４５】
2018537402.tif 000057
【化４６】
2018537402.tif 000058
【化４７】
2018537402.tif 000059
【化４８】
2018537402.tif 000060
【化４９】
2018537402.tif 000061
【化５０】
2018537402.tif 000062
【化５１】
2018537402.tif 000063
【化５２】
2018537402.tif 000064
【化５３】
2018537402.tif 000065
【化５４】
2018537402.tif 000066
【化５５】
2018537402.tif 000067
【化５６】
2018537402.tif 000068
【化５７】
2018537402.tif 000069
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙが、可視スペクトルにおいて吸収極大および発光極大を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｙが、約６８０ｎｍ〜約８００ｎｍの吸収極大および発光極大を有する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙが高い吸光係数（εｍａｘ）を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｙが、約５０，０００〜約１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１の範囲内のεｍａｘを有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙが高い一重項酸素量子収率（ΦΔ）を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式：
【化５８】
2018537402.tif 000070
【化５９】
2018537402.tif 000071
【化６０】
2018537402.tif 000072
【化６１】
2018537402.tif 000073
【化６２】
2018537402.tif 000074
【化６３】
2018537402.tif 000075
【化６４】
2018537402.tif 000076
【化６５】
2018537402.tif 000077
【化６６】
2018537402.tif 000078
【化６７】
2018537402.tif 000079
【化６８】
2018537402.tif 000080
【化６９】
2018537402.tif 000081
【化７０】
2018537402.tif 000082
【化７１】
2018537402.tif 000083
【化７２】
2018537402.tif 000084
【化７３】
2018537402.tif 000085
【化７４】
2018537402.tif 000086
を有する、請求項１に記載の化合物、およびそのカリウム、ナトリウム、またはアンモニウム塩。
【請求項９】
組織細胞中でのその分布後、蛍光を発するように作られている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
近赤外線波長の励起光に曝すことによって、蛍光を発するように作られている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
葉酸受容体に対する葉酸の結合親和性と同様である、前記葉酸受容体標的に対する結合親和性を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
腫瘍細胞への標的化に高度に選択的である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｌが、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、オルニチン、システイン、セリン、アルギニン、ならびにその異性体および誘導体からなる群から選択される、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、アルファアミノ酸、ホモアミノ酸、およびベータアミノ酸からなる群から選択される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記アミノ酸が、単一またはジペプチド結合を介して、プテロイルリガンドにコンジュゲートする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｌ’が、ポリエーテル、スルホン酸、グリカン、アミノ酸またはその誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ポリエーテルが、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびポリオキシエチレンからなる群から選択される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記スルホン酸およびその誘導体が、
【化７５】
2018537402.tif 000087
からなる群から選択される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
前記グリカンおよびその誘導体が、
【化７６】
2018537402.tif 000088
からなる群から選択される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２１】
前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、天然に存在するアミノ酸またはアミノ酸誘導体からなる群から選択される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２２】
前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、アルファアミノ酸、ホモアミノ酸、ベータアミノ酸、正に荷電したアミノ酸、負に荷電したアミノ酸、およびその誘導体からなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
正電荷側鎖を含む前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、アルギニン、リシン、オルニチン、ヒスチジンおよびその誘導体からなる群から選択される、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
負電荷側鎖基を含む前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、アスパラギン酸、グルタミン酸、その異性体または誘導体である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２５】
前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が硫黄含有側鎖基を含む、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２６】
硫黄含有側鎖基を含む前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体がシステインである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項２７】
前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、カルコゲンを含有する側鎖基を含む、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２８】
カルコゲンを含有する側鎖基を含む前記アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、セレノシステインである、請求項３１に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｌ”が、放出可能なリンカーまたは放出不可能なリンカーおよびその誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３０】
放出可能なリンカーおよびその誘導体が、
【化７７】
2018537402.tif 000089
【化７８】
2018537402.tif 000090
からなる群から選択される、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｘが、罹患細胞内の細胞小器官を標的化する細胞小器官標的化薬剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３２】
前記細胞小器官標的化薬剤が、前記ＰＤＴ薬剤を前記罹患細胞のミトコンドリアに標的化する、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
前記ミトコンドリアを標的とするＰＤＴ薬剤が、
【化７９】
2018537402.tif 000091
【化８０】
2018537402.tif 000092
【化８１】
2018537402.tif 000093
【化８２】
2018537402.tif 000094
【化８３】
2018537402.tif 000095
【化８４】
2018537402.tif 000096
【化８５】
2018537402.tif 000097
からなる群から選択される、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
前記細胞小器官標的化薬剤が、前記ＰＤＴ薬剤を前記罹患細胞の核に標的化する、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３５】
前記核を標的とするＰＤＴ薬剤が、
【化８６】
2018537402.tif 000098
【化８７】
2018537402.tif 000099
【化８８】
2018537402.tif 000100
【化８９】
2018537402.tif 000101
【化９０】
2018537402.tif 000102
からなる群から選択される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
請求項１に記載の化合物および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物。
【請求項３７】
葉酸受容体を発現する生物学的組織に対して光線力学的治療を実施する方法であって、
（ａ）前記生物学的組織を請求項１に記載の組成物と接触させることと、
（ｂ）前記組成物中の前記化合物が、前記生物学的標的内に分布し、非標的組織から排除される時間を与えることと、
（ｃ）前記化合物により吸収可能な波長の励起光で前記組織を照射することと
を含み、前記組成物が反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成し、これによって、罹患細胞の細胞死およびネクローシスを誘発し、前記生物学的組織を破壊する、方法。
【請求項３８】
前記組織が対象内にあり、前記対象が動物またはヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物学的組織が、前記受容体を過剰発現する疾患を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記罹患細胞が、悪性細胞、腫瘍関連マクロファージ、および骨髄由来のサプレッサー細胞からなる群から選択される葉酸受容体発現細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が、がん、神経変性疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、骨疾患、環境疾患、および皮膚疾患からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記組織が葉酸受容体を発現するがんまたはリンパ節である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記がんが、卵巣がん、肺がん、子宮内膜がん、子宮がん、乳がん、腎臓がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、下垂体がん、甲状腺がん、子宮頸がん、中皮腫がん、脳がん、頭頸部がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、および食道がんからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記がんが卵巣がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記がんが肺がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記がんが子宮内膜がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんが子宮がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記がんが乳がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記がんが腎臓がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記がんが子宮頸がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記組織またはリンパ節が、葉酸受容体を発現する腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍組織である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記励起光が近赤外線の波長光である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記励起光波長が、約６００〜約１０００ナノメートルの範囲内である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記励起光波長が、約６７０〜約８５０ナノメートルの範囲内である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１に記載の化合物を含むキット。
【請求項５６】
前記疾患が、がん、神経変性疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、および皮膚疾患からなる群から選択される、請求項に記載のキット。
【請求項５７】
請求項１に記載の化合物の誘導体をさらに含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
化合物９、化合物１１ａ、化合物１１ｂ、化合物１２ｂ、化合物１３、化合物１４、化合物１５、化合物２６、化合物２７、化合物４１、化合物５８ａ、化合物５９ａ、化合物６０ａ、化合物６４、化合物６５ａ、化合物６５ｃ、化合物７６ａ、化合物７６ｃ、化合物８８ａ、化合物８９、化合物９２ａ、化合物９９、化合物１００、化合物１０４、化合物１１２ａ、化合物１１２ｂ、化合物１１６、および化合物１１７からなる群から選択される化合物。
【請求項５９】
【化９１】
2018537402.tif 000103
【化９２】
2018537402.tif 000104
【化９３】
2018537402.tif 000105
【化９４】
2018537402.tif 000106
【化９５】
2018537402.tif 000107
【化９６】
2018537402.tif 000108
【化９７】
2018537402.tif 000109
【化９８】
2018537402.tif 000110
【化９９】
2018537402.tif 000111
からなる群から選択される化合物。
【請求項６０】
葉酸受容体を発現する生物学的組織に対して光線力学的治療を実施する方法であって、
（ａ）前記生物学的組織を請求項５９に記載の化合物と接触させることと、
（ｂ）前記組成物中の前記化合物が前記生物学的標的内に分布するための時間を与えることと、
（ｃ）前記化合物により吸収可能な波長の励起光で前記組織を照射することと
を含み、前記組成物が反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成し、これによって、罹患細胞の細胞死およびネクローシスを誘発し、前記生物学的組織を破壊する、方法。
【請求項６１】
固形がんを処置する方法であって、請求項７２に記載の化合物を含む組成物を固形腫瘍に投与し、前記化合物が前記腫瘍に分布して、前記固形がんの細胞死、細胞減少または他の作用処理が生じたら、前記化合物を照射することを含む、方法。
【請求項６２】
前記腫瘍が、前記組成物の投与前、投与後、または投与と同時に切除される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記罹患組織が、ＯＴＬ３８（葉酸受容体を標的とするＮＩＲ色素）の援助下で視覚化され、ＯＴＬ３８が、構造：
【化１００】
2018537402.tif 000112
またはそのラセミ混合物を有する［式中、
Ｘは、
【化１０１】
2018537402.tif 000113
またはそのラセミ混合物からなる群から選択され、
Ｙは、式：
【化１０２】
2018537402.tif 000114
（式中、
Ｒ１は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から選択され、
Ｒ２は、独立して、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から選択される）で表される］
、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記生物学的組織が対象内にあり、前記対象が動物またはヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記生物学的組織が、前記受容体を過剰発現する疾患を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患が、葉酸受容体を発現する細胞内にあり、悪性細胞、炎症細胞、および微生物細胞からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患が、がん、炎症性疾患、免疫学的疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、神経変性疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、感染症、骨疾患、環境疾患、および皮膚疾患からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記組織が、葉酸受容体を発現するがんまたはリンパ節である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記がんが、卵巣がん、肺がん、子宮内膜がん、子宮がん、乳がん、腎臓がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、下垂体がん、甲状腺がん、子宮頸がん、中皮腫がん、脳がん、頭頸部がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、および食道がんなどからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記がんが卵巣がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記がんが肺がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記がんが子宮内膜がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記がんが子宮がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記がんが乳がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記がんが腎臓がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記がんが子宮頸がんである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記組織またはリンパ節が、葉酸受容体を発現する腫瘍関連マクロファージを有する腫瘍組織である、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１５年９月９日に出願された米国仮特許出願６２／２１６，１５７号に関連し、その優先利益を主張し、その内容は、本明細書に、その全体が本開示に対して参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明の開示は、葉酸受容体を発現するがん細胞などの罹患細胞、腫瘍関連のマクロファージを処置する方法、ならびにこれに使用するための組成物および化合物に関する。本開示は、腫瘍の処置のために、標的化された光線力学的治療用（ＰＤＴ）薬剤を利用する方法を提供する。ＰＤＴ薬剤は、ミトコンドリアまたは核のいずれかを標的化するよう修飾し、次いで、葉酸受容体など、病原／罹患細胞中で過剰発現する受容体を標的化する、葉酸またはフォレートなどのリガンドとコンジュゲートして、水溶性、薬物動態特性、およびバイオアベイラビリティーなどを改善するのに適切なリンカーを介して化合物の特異性および検出性を増加させ、罹患細胞内にＰＤＴ薬剤を放出し、これによって細胞内でミトコンドリアまたは核へと導き、排出ポンプ［例えば、ＡＴＰ結合カセットファミリー（ＡＢＣトランスポーター）］による薬物耐性が生じることを防ぐなどすることができる。その使用を含む、コンジュゲート化合物を使用した処置の方法が企図される。
【背景技術】
【０００３】
がんのための処置は、最も一般的に手術、放射線療法、ホルモン投与、および／または化学療法を含む。残念なことに、これらの治療法のいずれもが転移性疾患に対して高度に有効ではない。さらに、患者が多くの場合これらの治療法を拒否するのに十分な欠点をそれぞれが有している。
【０００４】
悪性疾患の外科切除は、がんに対する第１次処置のために最も一般的で、有効な治療的介入の１つを構成する。すべての検出可能な悪性病変の切除は、すべてのがん患者の約５０％において疾患の検出可能な再発を生じず、推定寿命を延ばし、またはがんの再発が見られる患者に対して罹患率を減少させることができる。驚くことではないが、より定量的な腫瘍縮小を達成するための手術法は現在、より重大な審査を受けている。
【０００５】
がんの最適な外科的除去のためには、外科医が全がん組織およびリンパ節の位置を特定し、隣接する構造および器官の残留する機能を有意に傷つけることなく、がんと結節の両方を除去することが可能なことが重要である。４０％を超えるがん患者において、がんの組織を特定することができなかった、または特定された場合でも、切除に適していなかったといういずれかの理由で、外科的切除によっても、切除後でさえ一部のがん細胞が患者内に依然として残ることが予測される。これら「切除を逃れた」悪性細胞は、これらが特定され、除去されない限り、疾患再発またはさらには死亡の重大な危険性をもたらす。前立腺がんにおいて、原発性腫瘍は前立腺の除去により処置することができる。しかし、ラジカル前立腺切除（前立腺の完全な除去）は重大な弱点があり、泌尿器制御の損失およびインポテンスをもたらし得る。
【０００６】
別の治療的介入は、単独で、または組み合わせた治療用レジメンの一部としての放射線療法を含む。しかし、放射線療法は、第２の種類のがんの出現の危険性を増加させる可能性がある。例えば、放射線療法を使用した前立腺がんの処置は、結腸および膀胱がんの危険性を増加させる可能性がある。侵襲性または転移性がんの処置は、多くの場合症状緩和のためのホルモン療法および／または化学療法に限定される。ホルモンによる処置は、ホルモン応答性がんの寛解を誘発するが、腫瘍寛解の寿命は限定され、投与される薬物に関連する肝臓損傷を含めた重大な毒性、心血管疾患、体重増加、および骨粗鬆症を伴う。
【０００７】
化学療法はまた寿命を延ばすこともできるが、このような抗有糸分裂性薬物の副作用は多くの場合これらの利益を上回る。大部分のがん治療法は現在細胞障害性薬物での処置を含むが、この薬物は、投与の際に、区別なしに実質的に身体のすべての細胞に分布し、悪性細胞と正常細胞の両方に対して同様に損傷を起こす。このような従来の化学療法は、急速に分割する細胞を死滅させるように主に設計されているため、これら化学療法は増殖性の正常細胞をも破壊して、オフターゲット毒性をもたらすが、これらの毒性には、骨髄抑制、粘膜炎、脱毛症、悪心／嘔吐、貧血、末梢神経障害、および疲労などが含まれ得る。明らかに、正常細胞に対する付随的な損害を回避した、病的細胞を選択的に標的とすることができる細胞傷害性治療法であれば、がんの処置において重大な進歩となるであろう。したがって、より安全で、がんのより強力な処置法に対する重大な必要性が存在する。
【０００８】
画像誘導手術は、取り囲んでいる健康な組織を傷つけることなく、外科医が悪性組織をより正確に特定し、除去するのを助ける、新興の技術である。画像誘導手術の分野における特有の難題の１つが、がん組織に対して特異的であり、感受性があり、腫瘍の同定を助けるように腫瘍内に選択的に蓄積する造影剤（プローブ）の開発である。これは、通常の技術では容易に特定することができない潜在性病変に特に当てはまる。ＦＤＡは、ある特定のがんに対する画像誘導手術における使用のための非標的近赤外線（ＮＩＲ）−色素であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を認可したが、この色素には、腫瘍組織の同定において、感受性および特異性に関する重大な制限があることが判明した。
【０００９】
腫瘍同定の改善に対する必要性がきっかけとなり、ある特定の本発明者らは、葉酸受容体陽性がんに対する画像誘導腫瘍手術で使用するための新規の高親和性葉酸受容体（ＦＲ）を標的とするＮＩＲプローブ（ＯＴＬ３８）を以前開発した。ＯＴＬ３８は、ラットおよびイヌにおいて毒性を伴うことなく、合成および貯蔵中に高度に安定しており、小規模生産からＧＭＰ製造における合成の容易さを実証し、原発性および転移性がん細胞の両方に対して、培養中のおよび動物モデルにおけるＦＲ陽性がん細胞に対して高度に特異的である。これらの成功的臨床前データに基づき、ＯＴＬ３８は、卵巣がんおよび肺がんに対して、２０１４年１月、オランダ、ライデンにおいて治験第１ａ相に入り、ＵＳＡ内の６つの異なる場所で、治験第ＩＩ相に入った。この研究では、ＯＴＬ３８なしの場合と比べて、約５倍多くの悪性病変がＯＴＬ３８の援助下で除去された。さらに、切除した蛍光病変のすべてが病理により悪性と確認された。ＯＴＬ３８誘導による切除法の使用により、腫瘍細胞の約９５％を除去することができる。したがって、このようながんの残りの５％をできるだけ排除するように、治療法を発見または改善する必要がある。
【００１０】
本発明の一部は、画像誘導手術後またはその間に使用することができるＯＴＬ３８（葉酸を標的とするＮＩＲ色素）と葉酸を標的とする治療剤のカクテルを使用した新規の手法を特定することである。しかし、この手法の１つの欠点は、ＯＴＬ３８および葉酸を標的とする治療剤の両方が同じ葉酸受容体に対して競合することになり、受容体に対してより高い親和性を有する化合物がこの機能を支配することである。例えば、ＯＴＬ３８が、葉酸を標的とする治療剤と比較してより低い親和性を有する場合、腫瘍中に蛍光があまり存在しないことになり、外科医は、裸眼と比較して５倍多くの腫瘍を切除することができなくなり得る。他方では、提示された造影剤が受容体に対してより高い親和性を有する場合、治療剤は、所望の治療結果をもたらすことに恐らく効果はなくなる。したがって、２つの化合物間の正しい比率を発見するか、またはＯＴＬ３８にマッチするよう葉酸を標的とする治療剤の薬物動態特性を調節することが必要となる。あるいは、ＯＴＬ３８と治療剤とを区別するよう、葉酸を標的とする治療剤の薬物動態特性を調節する代わりに、画像誘導手術のためのＯＴＬ３８の投与と、処置のための、葉酸を標的とする治療剤の投与の間の時間を変えることができる。さらなる代替法では、画像誘導手術と治療剤の両方の目的を発揮することができる治療様式であれば、理想的な状況である。
【００１１】
光線力学的治療（ＰＤＴ）は、画像誘導手術と治療の両方に使用できる新しい革新的技術である。これは、光増感剤（ＰＳ）を特定の種類の光源と組み合わせて使用する治療モダリティである。適当な量のＰＳが照射された場合、光線力学的反応が生じ、反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。これらのＲＯＳは、罹患細胞、例えば、悪性細胞、炎症細胞、および微生物細胞の細胞死およびネクローシスを誘発する。ＰＤＴを使用して、がんから加齢黄斑変性および抗生剤耐性感染症までの範囲の疾患を処置する。
【００１２】
光増感剤が特定の光波長に曝露されると、これが光からフォトン（エネルギー）を吸収することによって、基底状態（一重項状態）から励起状態（三重項状態）へと活性化する。次いでこれは、３つの方式：非放射性減衰を介して、フォトンを発光することによって、および／またはエネルギーを移すことによって、緩和してその基底状態になる。フォトンを発光する検出可能な結果は蛍光をもたらす。エネルギーの転換は、ＲＯＳの生成を引き起こし、これが最終的に光毒性をもたらす。しかし、これらの２つのプロセス（蛍光および光毒性）間の比率は使用するＰＳの種類に依存する。したがって、正しいバランスを有する正しいＰＳを発見することが、画像誘導手術に対する、ならびに手術中または手術後の治療に対する完璧な候補として、ＰＤＴにおいてＰＳを使用するために重要となる。
【００１３】
生成されるＲＯＳの種類に基づき、生じ得る２つの種類の光線力学的反応物が存在する。タイプＩのＰＤＴ：最初に、活性化した増感剤は、細胞膜または分子などの基質と直接反応し、電子を抽出して、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）を形成することによって、または電子もしくは水素原子を移動して、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ＊）および／もしくは過酸化物ラジカル（ＯＯＨ＊）を形成することによって、フリーラジカルを生成する。次いで、これらのラジカルは、酸素と相互作用して、酸素化した生成物（１Ｏ２）を生成する。
【００１４】
タイプＩＩのＰＤＴ：活性化した増感剤は、そのエネルギーを直接酸素に移して、一重項酸素（１Ｏ２）を形成することができ、この一重項酸素は高度に反応性の酸素種である。これらの種は様々な基質を酸化させる。
【００１５】
ＰＳが活性化した後、タイプＩとタイプＩＩのＰＤＴ反応物が生じ得るが、これらのプロセスの比率は、使用するＰＳのタイプ、基質濃度、組織内に存在する酸素の量、および基質または組織中に局在するＰＳ分子の数に依存する。
【００１６】
したがって、罹患細胞に対してだけでなく、罹患細胞内の適当な区画にＰＳを選択的に標的化して、疾患を排除することができる革新的な技術を開発することに対する未だ満たされていない医学的需要が存在する。さらに、ＰＳは、従来の非標的ＰＤＴ薬剤が提示する弱点を克服するはずである。例えば、このような分子は、高い潜在能力、高い特異性、より高い水溶性、副作用が伴わない、または最小限（特に皮膚毒性）の副作用で、正常細胞に対して低い毒性を有するべきである。
【００１７】
正常組織中の葉酸受容体（ＦＲ）の限定された分布および様々な疾患細胞内のより高い受容体発現レベルに基づき、葉酸（ＦＡ）は、依然として、ＦＲ＋がん細胞、活性化したマクロファージ、および腫瘍関連マクロファージへの治療剤および造影剤の選択的送達に対して興味深いおよび高親和性のリガンドである。今日までに、ＦＲの４つのアイソフォームが特定されている（ＦＲ−α、ＦＲ−β、ＦＲ−γ、およびＦＲ−δ）が、ＦＲ−αおよびＦＲ−βだけが、診断用および治療用の用途において使用するのに十分な数で発現される。上皮由来のがんにおいて過剰発現されるＦＲ−αは、肺、卵巣、腎臓、乳房、骨髄、および脳などのがんにおいて高レベルで発見される。対照的に、ＦＲ−βは、炎症性疾患状態に関連する活性化したマクロファージおよび腫瘍関連マクロファージには発現するが、静止または安静時マクロファージには発現しない。重要なことに、大部分の細胞は、葉酸コンジュゲートを輸送できない、還元された葉酸担体またはプロトンカップリングした葉酸トランスポーターを介してこれらが必要とするＦＡ（ビタミンＢ９）を蓄積する。特定のタイプの細胞上でのこのＦＲ受容体の選択的過剰発現により、葉酸を標的とする９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎ  ＳＰＥＣＴ造影剤、１９Ｆ  ＰＥＴ造影剤ならびにＮＩＲ光学造影剤（ＯＴＬ３８）は、臨床におけるＦＲ＋がんおよび炎症状態の検出用に開発された。さらに、葉酸を標的とする化学療法剤もまた評価されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本開示は、罹患細胞上で過剰発現された受容体を標的化するリガンドに適切なリンカーを介してコンジュゲートされる光線力学的治療剤を合成するための方法を提供する。治療剤は、腫瘍および他の悪性病変の処置のための光線力学的治療のために使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、葉酸またはプテロイルリガンド、アミノ酸、リンカー、ＰＤＴ薬剤が罹患細胞の内側に入った時点でＰＤＴ薬剤を誘導するための細胞小器官標的化部分、および光線力学的治療剤を含む化合物またはその塩誘導体に関する。本発明の薬剤は、より良いＰＫ特性、および高いＰＤＴ効力と共に高い水溶性を有する。放出可能なリンカーは、細胞小器官を標的とするＰＤＴ薬剤を罹患細胞内側に放出し、これにより、細胞小器官を標的とするＰＤＴ薬剤は、特定の細胞小器官に移動することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、連結基は、ポリエーテル化合物、スルホン酸、グリカン、アミノ酸、異性体、誘導体、またはそのラセミ混合物であってよい。ある特定の実施形態では、放出可能なリンカーは、ジスルフィド結合、旺盛な感受性のある基、酵素に感受性のある基などを含有する。他の態様では、細胞小器官標的化薬剤はミトコンドリアまたは核標的化薬剤である。さらに別の態様では、光線力学的治療剤は、Ｂｐｈｅｉｄ−ａコンジュゲートおよびビスダインコンジュゲートからなる群から選択することができる。
【００１９】
一部の態様では、本開示は、光線力学的治療剤を標的化薬剤で修飾する方法であって、標的化薬剤が核またはミトコンドリアを標的化することができる方法を提供する。本発明の化合物は、がんの処置において特に有用となり得ることが観察されている。特に好ましい本発明の化合物として、これらに限定されないが、化合物９、化合物１１ａ、化合物１１ｂ、化合物１２ｂ、化合物１３、化合物１４、化合物１５、化合物２６、化合物２７、化合物４１、化合物５８ａ、化合物５９ａ、化合物６０ａ、化合物６４、化合物６５ａ、化合物６５ｃ、化合物７６ａ、化合物７６ｃ、化合物８８ａ、化合物８９、化合物９２ａ、化合物９９、化合物１００、化合物１０４、化合物１１２ａ、化合物１１２ｂ、化合物１１６、および化合物１１７が挙げられる。このような化合物は、単独でまたは他の治療法と組み合わせて使用することができる。実際に、ＢＰｈｅｉｄ−ａよりも良いＥＣ５０値を有する本明細書に記載の任意の化合物は、本発明に対する治療用、診断用または研究用化合物として有用となり得る。上述の化合物を作製するための方法および組成物は、本明細書で以下の実施例において詳述されている。
【００２０】
本開示の一部の態様では、連結基はアミノ酸である。他の態様では、連結基はポリエーテル、スルホン酸およびその誘導体、グリカンおよびその誘導体、またはアミノ酸およびその誘導体である。
【００２１】
追加の態様では、本開示は、葉酸リガンドに連結基をコンジュゲートする方法であって、連結基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）である方法を提供する。
【００２２】
本開示は、プテロイルリガンドに連結基をコンジュゲートするための方法であって、連結基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）である方法を提供する。
【００２３】
追加の態様では、本開示は、葉酸リガンドで連結基をコンジュゲートする方法であって、連結基がスルホン酸またはジスルフィド化合物である方法を提供する。
【００２４】
本開示は、プテロイルリガンドに連結基をコンジュゲートするための方法であって、連結基がスルホン酸またはジスルフィド化合物である方法を提供する。
【００２５】
一部の態様では、本開示は、光線力学的治療剤にアミノ酸をコンジュゲートするための方法であって、アミノ酸がチロシン、セリン、テロニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、システイン、セレノシステイン、その異性体または誘導体であり、光線力学的治療剤へのコンジュゲーションがジスルフィド結合を介する方法を提供する。
【００２６】
本開示は、標的化薬剤にアミノ酸をコンジュゲートするための方法であって、アミノ酸が、チロシン、セリン、テロニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、システイン、セレノシステイン、その異性体または誘導体であり、標的化薬剤へのコンジュゲーションがアミン結合を介する方法を提供する。
【００２７】
一部の態様では、本開示は、標的化薬剤にアミノ酸をコンジュゲートするための方法であって、アミノ酸が、チロシン、セリン、テロニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、システイン、セレノシステイン、その異性体または誘導体であり、標的化薬剤へのコンジュゲーションがジスルフィド結合を介する方法を提供する。
【００２８】
追加の態様では、化合物は、標的受容体を発現する腫瘍細胞への標的化に高度に選択的である。
【００２９】
一部の態様では、本開示は、約５００ｎｍ〜約９００ｎｍの間の吸収極大および発光極大を有するＰＤＴ薬剤へのアミノ酸連結基のコンジュゲーションに関する。他の態様では、アミノ酸連結基は、約６００ｎｍ〜約８００ｎｍの間の吸収および発光極大を有するＰＤＴ薬剤へコンジュゲートされる。
【００３０】
特定の実施形態では、本開示は、がん、法医学的用途、鉱物用途、歯、ゲル染色、ＤＮＡ配列、神経染色、またはプラスチック手術のための光線力学治療、光化学治療、光線照射治療、光線治療のための、葉酸を標的とする細胞小器官を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの使用に関する。
【００３１】
ある特定の態様では、本開示は、腫瘍標的治療に使用される化合物であって、研究、診断用、または治療用の目的のために使用することができる化合物に関する。他の実施形態では、本開示は、光線力学的治療化合物および薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、または塩を含む組成物を提供する。
【００３２】
他の態様では、本開示は、以下からなる群から選択される式を有する化合物に関する：
【００３３】
【化１】
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【００３４】
【化２】
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【００３５】
【化３】
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【００３６】
【化４】
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【００３７】
【化５】
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【００３８】
【化６】
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【００３９】
【化７】
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【００４０】
【化８】
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【００４１】
【化９】
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【００４２】
【化１０】
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【００４３】
【化１１】
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【００４４】
【化１２】
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【００４５】
【化１３】
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【００４６】
【化１４】
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【００４７】
【化１５】
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【００４８】
【化１６】
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【００４９】
【化１７】
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【００５０】
【化１８】
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【００５１】
【化１９】
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【００５２】
【化２０】
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【００５３】
【化２１】
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【００５４】
【化２２】
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【００５５】
【化２３】
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【００５６】
【化２４】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１−１】図１は、非標的ＰＤＴ薬剤の構造を表している（５、６、７はすでに認可され、２および４は治験を受けている）。
【図１−２】図１は、非標的ＰＤＴ薬剤の構造を表している（５、６、７はすでに認可され、２および４は治験を受けている）。
【図１−３】図１は、非標的ＰＤＴ薬剤の構造を表している（５、６、７はすでに認可され、２および４は治験を受けている）。
【００５８】
【図２】図２は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している［ヒト子宮頸がん細胞株である、ＨｅＬａ（ＨｅＬａは、多数の葉酸受容体を有する）細胞株の誘導体である］。ＤＭＳＯ中に溶解した遊離薬物を、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００５９】
【図３】図３は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に、半身（上の列）および全身（下の列）の蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌのＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）を注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００６０】
【図４−１】図４Ａは、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量のＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）の作用を表している。リン酸緩衝生理食塩水中の５０ｎｍｏｌのＢＰｈｅｉｄ−ａ、ＰＢＳ（薬物担体）の注射から３時間後、４５ｍｍ３腫瘍を有するマウスを、レーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で、３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。
【００６１】
【図４−２】図４Ｂは、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対するＰＢＳ（薬物担体または対照）の作用を表している。ＰＢＳの注射から３時間後、６５ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。
【００６２】
【図５−１】図５は、ミトコンドリアを標的化するように修飾されたＢＰｈｅｉｄ−ａの構造を表す。ミトコンドリアを標的化するよう正に荷電した分子。
【図５−２】同上
【図５−３】同上
【図５−４】同上
【図５−５】同上
【図５−６】同上
【図５−７】同上
【図５−８】同上
【図５−９】同上
【００６３】
【図６−１】図６は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。ＤＭＳＯ中に溶解した遊離薬物を、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【図６−２】図６は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。ＤＭＳＯ中に溶解した遊離薬物を、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００６４】
【図７】図７は、閾値を調節した後の、白色光画像上に、半身（上の列）および全身（下の列）の蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの（１４）を注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウスに、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００６５】
【図８】図８は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の（１４）の作用を表している。５０ｎｍｏｌの１４の注射から３時間後、５３ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。
【００６６】
【図９−１】図９は、核を標的とするＰＤＴ薬剤の構造を表している。
【図９−２】同上
【図９−３】同上
【図９−４】同上
【図９−５】同上
【００６７】
【図１０】図１０は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。ＤＭＳＯ中に溶解した遊離薬物を、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００６８】
【図１１−１】図１１は、基剤薬物を生成する異なる機序を有する、放出可能なリンカーを有する葉酸を標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの構造を表している。
【図１１−２】同上
【図１１−３】同上
【００６９】
【図１２】図１２は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００７０】
【図１３】図１３は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの６５ａを注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００７１】
【図１４】図１４は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の６５ａの作用を表している。５０ｎｍｏｌの６５ａを注射した３時間後、５３ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（１３週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００７２】
【図１５−１】図１５Ａは、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する２５ｎｍｏｌの用量の６５ａの作用を表している。２５ｎｍｏｌの６５ａを注射した３時間後、２８ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（４週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００７３】
【図１５−２】図１５Ｂは、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の６５ｃの作用を表している。５０ｎｍｏｌの６５ｃを注射した３時間後、３７ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（３日間）再発することなく、完全に治癒した。
【００７４】
【図１６−１】図１６は、異なる溶解性リンカーとの、葉酸を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの構造を表している。
【図１６−２】同上
【図１６−３】同上
【００７５】
【図１７】図１７は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００７６】
【図１８】図１８は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの７６ａおよび７６ｃを注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００７７】
【図１９】図１９は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の７６ａの作用を表している。５０ｎｍｏｌの７６ａを注射した３時間後、２６ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（３週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００７８】
【図２０】図２０は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の７６ｂの作用を表している。５０ｎｍｏｌの７６ｂを注射した３時間後、２６ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（３週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００７９】
【図２１】図２１は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の７６ｃの作用を表している。７６ｃを注射した３時間後、２８ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（４週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００８０】
【図２２−１】図２２は、異なる溶解性リンカーとの、葉酸を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したビスダインコンジュゲートの構造を表している。
【図２２−２】同上
【図２２−３】同上
【００８１】
【図２３】図２３は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００８２】
【図２４−１】図２４は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの８０または８６を注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝６４０ｎｍ、ｅｍ＝７２０ｎｍ、曝露時間＝１秒）。
【図２４−２】図２４は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの８０または８６を注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝６４０ｎｍ、ｅｍ＝７２０ｎｍ、曝露時間＝１秒）。
【００８３】
【図２５−１】図２５は、がん細胞内側で正に荷電したＰＤＴ類似体を生成するための、葉酸を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの構造を表している。
【図２５−２】同上
【図２５−３】同上
【図２５−４】同上
【００８４】
【図２６】図２６は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００８５】
【図２７】図２７は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に、時間依存性全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの８９ａを注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および８９ａの投与の２時間後、異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００８６】
【図２８】図２８は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の８９の作用を表している。８９を注射した３時間後、２６ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（４週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００８７】
【図２９】図２９は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の９２の作用を表している。９２を注射した３時間後、２６ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（４週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００８８】
【図３０−１】図３０は、がん細胞の内側に双性イオンＰＤＴ類似体を生成するための葉酸を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したＢＰｈｉｅｄ−ａコンジュゲートの構造を表している。
【図３０−２】同上
【００８９】
【図３１】図３１は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した、生存度を使用して細胞生存を定量化した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００９０】
【図３２】図３２は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの１００を注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００９１】
【図３３】図３３は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の９９の作用を表している。９９を注射した３時間後、６１ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（２週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００９２】
【図３４】図３４は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する５０ｎｍｏｌの用量の１００の作用を表している。１００を注射した３時間後、１２２ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。腫瘍は、モニタリングした時間の間（２週間）再発することなく、完全に治癒した。
【００９３】
【図３５−１】図３５は、がん細胞の内側にアニオン性ＰＤＴ（負に荷電した）類似体を生成するための葉酸を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したＢＰｈｅｉｄ−ａおよびビスダインコンジュゲートの構造を表している。
【図３５−２】同上
【図３５−３】同上
【図３５−４】同上
【００９４】
【図３６】図３６は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存度を測定した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【００９５】
【図３７】図３７は、閾値を調節した後の、白色光画像の上に全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの１０４を注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および異なる時間間隔でのＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【００９６】
【図３８】図３８は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する１０４の作用を表している。５０ｎｍｏｌの１０４を注射した３時間後、８１ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。
【００９７】
【図３９】図３９は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する１０４の作用を表している。２５ｎｍｏｌの１０４を注射した３時間後、２３ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリングし（画像を撮った）、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。
【００９８】
【図４０−１】図４０は、がん細胞内でアニオン性ＰＤＴ（負に荷電した）化合物を生成するための、葉酸を標的とする放出可能なジスルフィドにより連結したＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの構造を表している。
【図４０−２】同上
【図４０−３】同上
【００９９】
【図４１】図４１は、ＫＢ細胞の生存に対する薬物濃度の作用を表している（ＨｅＬａ細胞株の誘導体、およびＨｅＬａ細胞はヒト子宮頸がん細胞株である）。葉酸塩不含ＲＰＭＩ中に溶解された葉酸薬物コンジュゲートを、示された濃度で、葉酸塩不含ＲＰＭＩ培地内のＫＢ細胞に加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地と置き換えた（薬物を含まない）。次いで、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した、生存度を使用して細胞生存を定量化した。誤差棒はｓ．ｄ．を表している（ｎ＝３）。
【０１００】
【図４２】図４２は閾値を調節した後の、白色光上に、全身蛍光画像を重ね合わせたものを表している。１０ｎｍｏｌの１１２ａを注射された、ＫＢ腫瘍を保持するマウス、および１１２ａの投与の２時間後のＩＶＩＳ撮影装置による画像である（ｅｘ＝７４５ｎｍ、ｅｍ＝ＩＣＧ、曝露時間＝１秒）。
【０１０１】
【図４３】図４３は、皮下ＫＢ腫瘍の増殖に対する１１７の作用を表している。２５ｎｍｏｌの１１７を注射した３時間後、２０ｍｍ３腫瘍を有するマウスをレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍の増殖をモニタリング（画像を撮った）し、キャリパを使用して腫瘍容積を測定した。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
本発明は、より良いＰＫ特性と共に高い水溶性を有し、葉酸受容体（ＦＲ）陽性がん、腫瘍関連マクロファージ、および骨髄由来のサプレッサー細胞に対して、細胞培養物と動物モデルの両方において高いＰＤＴ効力を有する、特定の葉酸を標的とする細胞小器官（ミトコンドリアまたは核）を標的とするＰＤＴ薬剤を対象とする。これらの化合物は、健康な組織に対して毒性がないか、または毒性が最小限であり、検出可能な副作用がない。さらに、これらの分子は高い蛍光を有し、投与の１時間以内に腫瘍内に局在する。他の組織にはいかなる蛍光も観察されず、腫瘍とバックグラウンドとの非常に高い比率（シグナル対ノイズ）をもたらす。したがって、これらの分子は、画像化ＦＲ陽性疾患、画像誘導手術、および光線力学的治療に使用することができる。
【０１０３】
手術は、すべての固形腫瘍、例えば、前立腺、卵巣、肺、乳房、結腸、および膵臓がんなどに対して最も良い治療法の１つである。手術は米国において固形腫瘍を有する患者の５０％において有効である一方、化学療法および放射線療法は単独で、すべてのがん患者の５％未満において有効である。毎年７００，０００人を超える患者が米国内でがん手術を受け、手術患者の４０％が５年以内に局所領域の疾患を再発している。最近十年にわたるオンコロジー分野の主要な進歩にもかかわらず、本分野において克服すべき重大なハードルが依然として存在する。例えば、切除縁陰性の原発性腫瘍の完全な切除、転移性がん細胞を宿すリンパ節の除去および衛星疾患の同定を達成することは依然として困難である。これら３つのケースにおいて改善を達成することは、疾患クリアランスを改善するだけでなく、手術後の化学療法および照射に関する判定の手引きとなる。
【０１０４】
画像誘導手術に加えて、本発明は、ＰＤＴに有効な特定のＰＳ分子を提供する。オンコロジーにおける使用のための３つの主要な機序が存在し、これを用いてＰＤＴは腫瘍の破壊に貢献する。第１に、ＰＤＴにより生成されるＲＯＳは悪性細胞を直接破壊することができる。第２に、ＰＤＴはまた腫瘍関連の血管系を損傷することができ、これによって腫瘍への血流を阻害し、腫瘍梗塞をもたらす。最後に、ＰＤＴは、免疫細胞を腫瘍細胞に方向付けし直し、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化することができる。疾患の長期治癒をもたらすために、すべての３つの機序の組合せが働いて、疾患の長期治癒をもたらし得る。
【０１０５】
したがって、細胞内局在化における使用に適したものにするように、正確なＰＤＴ特性を有する有用なＰＳの設計および／または開発が重要となる。ＰＳは、蛍光と光毒性の良好な比率、タイプＩ  ＲＯＳの生成とタイプＩＩ  ＲＯＳの生成の良好な比率、罹患細胞に対する高い選択性および特異性、ならびに罹患細胞内のミトコンドリアまたは核などの正しい細胞内局在化を有するべきである。さらに、小規模と大規模の両方での合成の容易さ、合成および貯蔵中の安定性、低コストでの出発材料の入手の可能性、水溶性、非毒性の他の組織を除いた罹患細胞の効率的減退、長期安全性もまたＰＳを設計する前に考慮すべき重要な因子および特色である。
【０１０６】
青色光は、最も効率悪く組織を介して浸透するのに対して赤色のおよび赤外線は、より深い浸透を生じる（１〜１．５ｃｍ）。６００と１２００ｎｍとの間の光の波長は、多くの場合、組織の光学的窓と呼ばれる。しかし、より長い波長は光線力学的反応を開始するのに十分なエネルギーを有さないため、約８００ｎｍまでの光のみが一重項酸素（１Ｏ２）を生成するのに十分なエネルギーを有する。したがって、７００〜８００ｎｍの間のＰＳ励起波長は、組織に対する光学的窓に適合し、ならびに光線力学的反応を開始するのに適当な波長を有するので、好ましい。
【０１０７】
光源の選択は、ＰＳの吸収（蛍光励起および作用スペクトル）、疾患（病変の位置、サイズ、接近しやすいかどうか、および組織の特徴）、コスト、およびサイズに基づかなくてはならない。ＰＤＴの臨床効果は、複雑な線量測定：全光線量、光曝露時間、光送達モード（単一対分画されたもの、またはメトロノミックさえにも）およびフルエンス率に依存することになる。
【０１０８】
レーザーと白熱光源の両方がＰＤＴに使用され、同様の有効性が示されている。大きなおよび非効率な励起ダイレーザーと比較して、ダイオードレーザーはより小さく、対費用効果がより高く、組込みが簡単である。ダイオードレーザーはまた、より長い稼働寿命と共に、自動化された線量測定および較正の特色を有する。発光ダイオード（ＬＥＤ）は比較的狭いスペクトルの帯域幅および高いフルエンス率を有する代替の光源である。レーザーは、拡散する先端を有するファイバーにカップリングして、最小限に侵襲的な方法で腫瘍を処置することができる。内側が強く光散乱する物質で覆われ、器官に適合するように形成されたインフレータブルバルーンもまた市販されている。したがって、画像誘導手法の下で、体内の深い箇所の固形器官内に光源をインプラントすることは完全に可能である。
【０１０９】
ＰＳ、光源、および処置パラメーターの最適な組合せの選択はＰＤＴを成功させる上で重大である。生成される光傷害および細胞毒性の範囲もまた多因子性であり、ＰＳのタイプ、その細胞外（生体分布）および細胞内（細胞小器官）の局在化、投与される全用量、全光曝露（エネルギーおよび時間の量）、光フルエンス率、酸素の入手の可能性、ならびに薬物投与と光曝露の間の時間に依存する。
【０１１０】
オンコロジーにおいて、理想的ＰＳは、以下を含むいくつかの特徴を有すべできある：公知の化学組成を有する純粋な形態で利用可能であること、高い一重項酸素量子収率（ΦΔ）、高い吸光係数（εｍａｘ＝５０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１）を有する可視スペクトル（７００〜８００ｎｍ）のＮＩＲ領域での強い吸収、低い光脱色、光増感剤とその代謝物の両方に対する、腫瘍組織内での有効な蓄積および低い暗色毒性の所有、循環中のおよび組織液中での安定性および溶解度、注射または他の方法を介した疾患組織部位への容易な送達、ならびに処置完了の際に身体から簡単に排泄されなければならないこと、およびヒトが使用するために必要とされる大量生産に対して合成が簡単に拡張可能でなければならないこと。
【０１１１】
幅広いアレイの光増感剤が文献において報告され、これらの大部分は、ポルフィリン、クロロフィル、および色素（大半が近赤外線の色素）のクラスに属する。ポルフィリンおよびクロロフィルは、長い波長（７５０〜８５０ｎｍ）でのより高い吸収、高い単一酸素量子収率、低い光脱色、および自然の蛍光を有し、よって、ポルフィリンベースのＰＳは画像誘導治療に対して完璧な候補である。
【０１１２】
臨床で使用するためのいくつかの光増感剤、例えば、フォトフリン、ビスダイン、ホスカン、Ａｌｌｕｍｅｒａ、レブラン、Ｍｅｔｖｉｘ、Ｈｅｘｖｉｘ、Ｃｙｓｖｉｅｗ、およびＬａｓｅｒｐｈｙｒｉｎなどが市販されている。少数の光増感剤、例えば、Ｔｏｏｋａｄ、Ａｎｔｒｉｎ、Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ、Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓ、Ｐｈｏｔｒｅｘ、Ｌｕｍａｃａｎ、Ｃｅｖｉｒａ、Ｖｉｓｏｎａｃ、ＢＦ−２００、ＡＬＡ、Ａｍｐｈｉｎｅｘ、およびＡｚａｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｓなどが、治験または臨床前開発の様々な段階において見出されている。
【０１１３】
ＰＤＴの有効性にもかかわらず、旧来の非標的光増感剤は多くの弱点を有する。これらの非標的光増感剤は高度に疎水性であり、非常に難水溶性である。したがって、配合剤、例えば、クレモホア、ｔｗｅｅｎ２０などを患者への投与前に使用する。しかし、これらの配合剤はヒトに対して毒性を持つことが周知である。さらに、投与可能な製剤に製剤化した後でも、ＰＳは、より長いリードタイムにより、腫瘍または罹患部位へと局在するのに２４時間超かかる。さらに、難水溶性のため、腫瘍または罹患組織中での薬物のバイオアベイラビリティーは非常に低く、薬物の有効性を低くしている。これまで利用可能なＰＳは、その非標的性質により、高度に非特異的であり、健康な組織内に蓄積する。さらに、肝臓などの内臓に対して暗色毒性を回避することは可能であるが（医師は疾患組織を光で照らすため）、皮膚取込みにおける光毒性は十分確立されている（長期の日光感受性）。したがって、旧来のＰＤＴを受ける患者は、光への曝露、太陽光からの光までも回避し、長期の期間暗くした環境に留まらなくてはならない。他方では、ＰＳの健康な組織への蓄積はＰＤＴに関係しない毒性をもたらし、ならびに正常細胞に対する免疫応答の活性化により激しい副作用を引き起こす。したがって、罹患細胞に対して特異的であり、これを標的とする新しいＰＳ薬剤に対する必要性が存在する。
【０１１４】
本発明者らは、５つの市販のＰＳを評価し、これらが、水不溶性であり、がん細胞においてあまり有効でなく、ヌードマウスにおいて非常に高い皮膚取込みを有し、腫瘍異種移植片を持つマウスの腫瘍内に蓄積するのに２４時間超かかり、非常に低い蛍光を有し（恐らく、腫瘍内のＰＳ分子蓄積の欠如により）、マウス上の腫瘍異種移植片から排除できないことが判明した。したがって、腫瘍細胞内の腫瘍組織および／または細胞小器官を標的化することによる、改善された腫瘍標的化手法に対する必要性が存在する。
【０１１５】
細胞内のＰＳ局在化の位置（細胞内の区画、例えば、ミトコンドリアまたは核など）または細胞小器官を標的とするＰＳはまた、ＰＤＴ中のＰＳに対する重要な特徴でもある。薬物送達における２つの最も重要な細胞小器官はミトコンドリアおよび核である。ミトコンドリアは細胞の発電所であり、アポトーシスおよび細胞死の主要制御因子である。核は遺伝物質を保有し、細胞の主要な生物学的活性を制御する。
【０１１６】
治療手段においてミトコンドリアを標的化することは、これらの細胞小器官を標的化することにより細胞の代謝活性の停止をもたらすことができるため、ＰＤＴにおける主要因子として認識されている。ミトコンドリアは、化学的エネルギーの供給源として使用されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の細胞の供給の大部分を生成する。ミトコンドリアはまた非常に高い酸素含有量を有する。酸化的リン酸化および代謝に加えて、ミトコンドリアは、細胞死、新生物、細胞分化、先天免疫系、酸素および低酸素感知、およびカルシウム代謝において中心的役割を果たす。
【０１１７】
ＰＳをミトコンドリアに送達するいくつかの方式が存在する。第１はミトコンドリア内に選択的に蓄積するＰＳを開発することである。第２は、ミトコンドリア内で標的に選択的に結合する分子にＰＳをコンジュゲートすることである。第３には、膜電位を使用し、ＰＳを正電荷分子にコンジュゲートすることが可能であり、こうしてＰＳは、ミトコンドリア内側の大きな負の電位によりミトコンドリアへと動かされる。
【０１１８】
親油性カチオンおよびミトコンドリアを標的とするペプチドは両方とも、薬物および生理活性分子がミトコンドリアを標的化するよう開発された。親油性カチオン、例えば、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）誘導体などは、大きなミトコンドリアの膜電位によりｉｎ  ｖｉｖｏで動かされたミトコンドリアにより急速におよび広範囲にわたり取り込まれる。これらの戦略の使用は、ミトコンドリア内で標的とされた化合物のより高い濃度をもたらすことができ、これによって、効力を増加させ、使用される化合物の用量を減少させることを可能にし、不活化、排出または有毒性副作用をもたらす可能性のあるミトコンドリア外の代謝を最小限に抑える。さらに、この手法はまた、様々な理由のため（例えば疎水性）ミトコンドリアによる取込みが不十分な分子をｉｎ  ｖｉｖｏでミトコンドリアへと誘導することを可能にする。しかし、親油性カチオンおよびミトコンドリアを標的とするペプチドの使用の主要な制限は、これらが器官特異的ではなく、化合物が一般的に高いミトコンドリア含有量を有する組織内に優先的に蓄積し、オフターゲット毒性をもたらすことである。
【０１１９】
上記知見に基づき、本発明者らは、ミトコンドリア内の標的に選択的に結合する分子にコンジュゲートすることによって、または正に荷電した分子にコンジュゲートすることによって（ミトコンドリアの負の電位を利用することによって）ミトコンドリアを標的とするＰＳのライブラリーを設計および開発した。本発明者らは、臨床において現在利用可能なＰＳと比較した場合、本発明のミトコンドリアを標的とするＰＳの大部分が、非常に活性があることを発見した。本明細書で特定されたＰＳ分子は、培養中のがん細胞を（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）減退させることができる。しかし、ＰＳ分子は腫瘍特異的ではなく、健康な組織から排除されるのに長い時間がかかった。この弱い腫瘍特異性は、薬物が腫瘍細胞を標的としない性質であることによる。さらに、高度に疎水性である化合物の性質は、難水溶性および弱い薬物動態特性をもたらし、よって、腫瘍細胞に対して化合物の弱いバイオアベイラビリティーを設定することになる。したがって、ミトコンドリアを標的化した薬剤で修飾された光増感剤は、罹患組織を標的化しなければならない。薬剤をミトコンドリアに送達する別の問題は、これらが高度に不透過性の内膜であることである。
【０１２０】
ミトコンドリアとは異なり、核を取り囲む膜、すなわち核膜（ＮＥ）は、核の細孔複合体を介して生体分子を輸送することを可能にする。したがって、小さな薬物分子は、核に入り、ＤＮＡ損傷および細胞周期停止を潜在的に引き起こすことができる。したがって、本発明者らはまた、ＤＮＡ染色薬剤、ＤＮＡアルキル化剤などにコンジュゲートすることによって、核を標的とするＰＳのライブラリーを設計および開発した。ＤＮＡを標的とするＰＳは活性があり、培養中のがん細胞を死滅させることができたが、この場合も同様に、動物モデル（腫瘍を保持するマウス）においてあまり活性がなかった。溶解度が低いことおよび腫瘍をうまく標的化できないことが、動物モデルにおける低い効力に対する理由となり得る。
【０１２１】
一般的に、細胞小器官を標的とする治療は、標的治療としてのＰＤＴを改善する可能性を有するが、この技術で克服すべき問題があと少し存在する。意図した標的に実際に到達する薬物の濃度の低さ、意図した組織に対する特異性の低さ、健康な組織からのクリアランスの遅さ、信号とバックグラウンドとの比率の低さ、健康な組織内での非特異的取込みによる有害作用、投与される物質への免疫応答、難水溶性、および循環中の急速な分解は、ＰＤＴにＰＳが使用できるようになる前に克服すべきいくつかのハードルである。光線力学的治療が有用となるためには、これらの弱点を克服することが重要である。
【０１２２】
したがって、光線力学的治療コンジュゲートの調製において、いくつかの基準を考慮した。合成および化学的安定性の容易さは主要な化学的特質であった。スペクトル特性、例えば、吸収および発光スペクトルならびに量子収率などが考慮された。いくつかの生物学的特性、例えば、細胞研究における結合親和性、腫瘍を持つマウスを使用した全身動物画像化、および生体分布などが評価された。生体分布に対して具体的には、１回の口腔内分布から２時間後の死んだマウス、生きているマウスの画像化および用量段階的増大を含むいくつかの態様が考慮された。最後に、最大耐性用量（ＭＴＤ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、および一般的な臨床的病理分析を含む安全性に関する材料が検討された。
【０１２３】
本発明の開示は、赤外線の範囲内で安定した蛍光であり、標的とする組織内に深く浸透して、葉酸受容体を発現する組織領域内の腫瘍を根絶する光線力学的治療コンジュゲートを提供する。より具体的には、プテロイルコンジュゲートは、連結基およびアミノ酸を介して標的化薬剤で修飾された光線力学的薬剤に連結している。さらにより具体的には、連結基がアミノ酸である場合、リンカーが放出可能であることを発見した。
【０１２４】
アミノ酸は、カルボン酸官能基に連結したアミン官能基、および各アミノ酸に特異的である側鎖を含むと定義される。アルファアミノ酸は、一般式Ｒ５ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（α−アミノ酸）（式中、Ｒ５は、Ｈまたは任意の公知のアミノ酸側鎖からなる群から選択される）の任意の化合物である。
【０１２５】
ベータアミノ酸は、ベータ炭素において連結したアミン官能基およびアルファ炭素において連結したカルボン酸官能基を含むと定義される。ベータホモアミノ酸は、ベータ炭素において連結しているアミン官能基、アルファ炭素において連結しているカルボン酸官能基およびアルファ炭素またはベータ炭素のいずれかにおいて開始する側鎖（この側鎖は別のアミノ酸に結合している）を含むと定義される。
【０１２６】
天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのグループに分けることができる：（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、および（４）中性非極性アミノ酸。これらの様々なグループの中の代表的なアミノ酸として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：（１）酸性（負に荷電した）アミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸など；（２）塩基性（正に荷電した）アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンなど；（３）中性極性アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンなど；ならびに（４）中性非極性（疎水性）アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンなど。
【０１２７】
天然に存在するアミノ酸配列内のアミノ酸に対して保存された置換は、天然に存在するアミノ酸が属するグループの他のメンバーから選択することができる。例えば、アミノ酸の脂肪族側鎖基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである。天然に存在するアミノ酸バリンの保存された置換として、グリシン、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンの使用が挙げられる。
【０１２８】
アミノ酸の脂肪族−ヒドロキシル側鎖基はセリンおよびトレオニンである。アミノ酸のアミド含有側鎖基はアスパラギンおよびグルタミンである。アミノ酸の芳香族側鎖基はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。アミノ酸の塩基性側鎖基はリシン、アルギニン、およびヒスチジンである。アミノ酸が有する硫黄含有側鎖基はシステインおよびメチオニンである。天然の保存的アミノ酸置換の例は、ロイシンに対するバリン、トレオニンに対するセリン、チロシンに対するフェニルアラニン、アルギニンに対するリシン、メチオニンに対するシステイン、およびグルタミンに対するアスパラギンである。
【０１２９】
好ましい実施形態では、このような光線力学的治療コンジュゲートは、組織内の腫瘍細胞を特異的に標的化し、腫瘍細胞の治療的破壊をもたらすことが本明細書で示されている。したがって、本開示の化合物は、より経済的な画像化技術をもたらす。さらに、従来の画像化化合物と比較して、より低い用量の本開示の化合物は、体内への異物の投与に付随して生じる毒性および他の副作用を最小限に抑えるという追加の利点が存在する。
【０１３０】
さらに、このような光線力学的治療コンジュゲートの使用は、切除縁陰性を得るための、ならびに転移性がん細胞を宿すリンパ節の正確な同定および除去、および衛星疾患の同定のための原発性腫瘍のより正確なおよびより有効な切除をもたらすことになる。これらの利点のそれぞれは、処置を受けている患者に対するより良い臨床成績と正に相関する。
【０１３１】
化合物は、蛍光媒介性分子トモグラフィー画像化システム、例えば、深い組織において近赤外線蛍光活性化を検出するように設計されているものなどと共に使用することができる。化合物は、分子および組織特異性を提供し、高い蛍光対比、より明るい蛍光シグナルを生成し、バックグラウンド自己蛍光を減少させて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの罹患組織（例えば、がん）の改善された早期発見および分子標的評価を可能にする。化合物は、深い組織の三次元の画像化、標的手術、および生物学的試料中の標的細胞型の量を定量化するための方法に使用することができる。
【０１３２】
化合物
【０１３３】
一態様では、本開示は、式、式（Ｉ）：
【０１３４】
【化２５】
2018537402.tif 000027
【０１３５】
を含む化合物または薬学的に許容されるその塩、もしくはその同位体（式中、
【０１３６】
Ｌはアミノ酸であり、
【０１３７】
Ｌ’は薬物動態学的（ＰＫ）特性を改善するリンカーであり、
【０１３８】
Ｌ”は、細胞小器官を標的とする光線力学的治療用（ＰＤＴ）薬剤を放出する放出可能なリンカーであり、
【０１３９】
Ｘは細胞小器官標的化薬剤であり、
【０１４０】
Ｙは光線力学的治療剤である）
に関する。
【０１４１】
このようなアミノ酸の非限定的例として、システイン、メチオニン、トレオニン、セリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン、またはその誘導体を挙げることができる。
【０１４２】
具体的な好ましい実施形態では、本明細書で開示されている化合物は、化合物を特定の細胞または組織タイプを標的化するのに有効であり、その標的とする細胞または組織の画像化を可能にするリガンドを含む。リガンドはプテロイル部分または葉酸部分のいずれかであることが好ましく、リガンドはプテロイル部分であることがより好ましい。しかし、当業者は、一部の他のリガンドを使用して、化合物を目的の、特定の細胞表面タンパク質または受容体タンパク質に標的化することができることが企図される。具体的なおよび好ましい実施形態では、リガンドはプテロイルを含む：
【化２６】
2018537402.tif 000028
【０１４３】
化合物の合成
【０１４４】
本明細書で開示されている化合物は、文献において知られている従来の方法を使用して作製することができる。例えば、光線力学的治療薬剤化合物をこれまでに報告された通りに合成した。
【０１４５】
しかし、具体的な好ましい実施形態では、本発明の開示は、本明細書中に記載されている化合物（すなわち、式Ｉの化合物）を生成するためのより効率的な合成法を提供する。例えば、本発明の化合物は、以下のスキーム１〜１２のそれぞれにおいて概説されている一般スキームに従い調製することができる。
基剤薬物の合成
【化２７】
2018537402.tif 000029
【０１４６】
スキーム１は、現在治験を受けている非標的ＰＤＴ薬剤を生成するためにこれまでに使用された合成スキームを例示している。一実施形態では、バクテリオクロロフィル−ａ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｐｈｙｌｌ−ａ）は、メタノールとアルゴン下で１４時間反応させて、Ｂｐｈｅｉｄ−ａ（生成物（１））を生成する。Ｂｐｈｅｉｄ−ａをトリフルオロ酢酸とアルゴン下で反応させて、化合物（２）を生成する。化合物（２）をタウリンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と１２時間反応させて、化合物（３）および（４）を生成する。化合物（５）、（６）および（７）は市販のものである。
【０１４７】
しかし、注目すべきことは、これら市販のＰＤＴは一般的に水不溶性が不十分であり、がん細胞に有効ではなく、ヌードマウスにおける皮膚取込みが非常に高く、これらのマウス腫瘍モデル内への蓄積は長時間かかる一方で、非常に低い蛍光および弱い脱離を示すことである。したがって本発明者らは、修飾されたＢｐｈｅｉｄ化合物を調製することによって、これらの弱点を克服しようとした。
選択された、修飾Ｂｐｈｅｉｄ−ａ化合物の合成
【化２８】
2018537402.tif 000030
【０１４８】
スキーム２は、修飾されたＢｐｈｅｉｄ−ａ化合物を生成するために使用した合成スキームを例示している。一実施形態では、化合物（１）を、ヒドラジンおよびジメチルホルムアミドと、アルゴン下、２３℃で３時間反応させる。生成した化合物（２４）を、ヨウ化メチルおよびクロロホルムとアルゴン下、２３℃で４日間反応させて、化合物（２６）を生成する。別の実施形態では、化合物（２）をヒドラジンおよびジメチルホルムアミドと、アルゴン下、２３℃で３時間反応させる。生成した化合物（２５）を、アルゴン下、２３℃で４日間、ヨウ化メチルおよびクロロホルムと反応させて、化合物（２７）を生成する。
【０１４９】
【化２９】
2018537402.tif 000031
【０１５０】
スキーム３は、修飾されたＢｐｈｅｉｄ−ａ化合物を生成するために使用した別の実施形態の合成スキームを例示している。一実施形態では、化合物（３２）を、硫酸ジメチル、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏと、６５℃で、２時間反応させる。生成した化合物（３３）を、Ｈ２／Ｐｄ、ＤＣＭと、２３℃で、４時間反応させて、化合物（３４）を生成する。化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（３４）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（９）を生成する。別の実施形態では、化合物（２）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（３４）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（１０）を生成する。
【化３０】
2018537402.tif 000032
【０１５１】
スキーム４は、修飾されたＢｐｈｅｉｄ−ａ化合物を生成するために使用した別の実施形態の合成スキームを例示している。一実施形態では、化合物（３２）を、（ｉ）Ｐｈ３Ｐ（＋）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ／ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させる。生成した化合物（３５）を、化合物（３２）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（３６）を生成する。化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（３６）を、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させる。生成した化合物（１３ａ）を、ＮＨ２ＮＨ２、ＤＭＦと、アルゴン下、２３℃で、３時間反応させて、化合物（１４ａ）を生成する。別の実施形態では、化合物（２）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（３６）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させる。生成した化合物（１３ｂ）を、ＮＨ２ＮＨ２、ＤＭＦと、アルゴン下、２３℃で、３時間反応させて、化合物（１４ｂ）を生成する。
【化３１】
2018537402.tif 000033
【０１５２】
スキーム５は、修飾されたＢｐｈｅｉｄ−ａ化合物を生成するために使用した合成スキームの別の実施形態を例示している。一実施形態では、化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間；（ｉｉ）ＮＨ２−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させる。生成した化合物（３７）を、（ｉ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間；（ｉｉ）グルコサミン、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間；（ｉｉｉ）ＴＦＡと、２３℃で、１時間反応させて、化合物（１９ａ）を生成する。別の実施形態では化合物（２）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間；（ｉｉ）ＮＨ２−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させる。生成した化合物（３８）を、（ｉ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間；（ｉｉ）グルコサミン、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間；（ｉｉｉ）ＴＦＡと、２３℃で、１時間反応させて、化合物（１９ｂ）を生成する。
【０１５３】
本発明は、核を特異的に標的化するＰＤＴ薬剤の生成に関する。
（ａ）選択された、核を標的とするＰＤＴ薬剤の合成
【化３２】
2018537402.tif 000034
【０１５４】
スキーム６は、核を標的とするＰＤＴ薬剤を生成するために使用したある実施形態の合成スキームを例示している。一実施形態では、化合物（３２）を（ｉ）ベンダムスチン／ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間、（ｉｉ）３２、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させる。生成した化合物（５０）を、Ｈ２／Ｐｄ、ＤＣＭと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（５１）を生成する。化合物（１）を、ｉ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間、（ｉｉ）５１、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間；（ｉｉｉ）ＴＦＡと、２３℃で、１時間反応させて、化合物（４２ａ）を生成する。別の実施形態では化合物（２）を、ｉ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間、（ｉｉ）５１、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間；（ｉｉｉ）ＴＦＡと、２３℃で、１時間反応させて、化合物（４２ｂ）を生成する。
【化３３】
2018537402.tif 000035
【０１５５】
スキーム７は、核を標的とするＰＤＴ薬剤を生成するために使用した合成スキームの実施形態を例示している。一実施形態では、化合物（３２）を、４−アミノ−４−デオキシプテロイン酸（Ｒ＝Ｈ）／ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で１５分間反応させる。生成した化合物（５２）を、ＴＦＡと２３℃で１時間反応させて、化合物（５４）を生成する。
【０１５６】
別の実施形態では、化合物（３２）を、Ｎ１０−メチル−４−アミノ−４−デオキシプテロイン酸（Ｒ＝ＣＨ３）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で１５分間反応させる。生成した化合物（５３）を、ＴＦＡと２３℃で１時間反応させて、化合物（５５）を生成する。
【０１５７】
一実施形態では化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（５４）を、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（４３ａ）を生成する。別の実施形態では、化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（５４）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（４３ｂ）を生成する。
【０１５８】
一実施形態では化合物（２）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで化合物（５４）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（４４ａ）を生成する。別の実施形態では、化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、１５分間反応させ、次いで、化合物（５４）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（４４ｂ）を生成する。
【化３４】
2018537402.tif 000036
【０１５９】
スキーム８は、核を標的とするＰＤＴ薬剤を生成するために使用した合成スキームの実施形態を例示している。一実施形態では、化合物（３２）を、３−（４−ボロノフェニル）−プロパン酸／ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で１５分間反応させ、次いで、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で２時間反応させる。生成した化合物（５６）を、Ｈ２／Ｐｄ、ＤＣＭと、２３℃で２時間反応させて、化合物（５７）を生成する。化合物（１）を、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で１５分間反応させ、次いで化合物（５７）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（４９ａ）を生成する。
【０１６０】
別の実施形態では化合物（２）は、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で１５分間反応させ、次いで化合物（５７）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦと、２３℃で、２時間反応させて、化合物（４９ｂ）を生成する。
【化３５】
2018537402.tif 000037
【化３６】
2018537402.tif 000038
【化３７】
2018537402.tif 000039
【０１６１】
使用の方法
【０１６２】
本発明の化合物は光線力学的治療に使用される。本明細書で使用されている「光線力学的治療（ＰＤＴ、光化学療法）」という用語は、光増感剤（ＰＤＴ薬剤、光線力学的治療剤）および光増感剤を励起させることができる光線の存在により病変にダメージを与え、破壊する治療を指す。光増感剤が投与され、これに続いて光線が照射されるＰＤＴにおいて細胞は反応性酸素種（ＲＯＳ）によりダメージを受ける。光線力学的治療では、熱は生じず、局所的処置が可能となる。したがって、タンパク質の熱変性は生じないので、標的部位および標的部位を取り囲んでいる組織は壊死せず、標的部位のみに確実にダメージを与えることができる。光増感剤を使用することなくレーザービームなどの光線のみが使用される場合、レーザービームが照射された部位において熱は生じ得ない。したがって、取り囲んでいる組織にダメージを与えることはできない。したがって、本発明の光線力学的治療を使用する方法もまた、光増感剤を使用しないレーザーのみの照射のための方法または装置と比較して、優れた作用を有する。
【０１６３】
具体的な実施形態では、本開示は、最小限に侵襲性の手順を使用して、組織内の腫瘍を特異的におよび高い感度で根絶および／または切除するために使用することができる、本明細書で開示されている（例えば、式Ｉ、Ｉ（ａ）、Ｉ（ｂ）、Ｉ（ｃ）、および／またはＩ（ｄ）の）化合物の少なくとも１つを組み込む方法に関する。このように、本開示の化合物は、葉酸受容体を発現し、受容体を過剰発現する疾患を有する生物学的組織の任意の障害の処置において有用であり得る。一部の実施形態では、疾患は、がん、神経変性疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、骨疾患、皮膚疾患、および環境疾患からなる群から選択される。本発明の化合物はがんの処置に対して特に有用である。
【０１６４】
本発明の開示された化合物および方法は、任意の数のがんまたは腫瘍または両方を処置するための、標的組織または腫瘍の画像化に使用することができる。開示された化合物は、これらに限定されないが、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、膵臓がん、腸間膜がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、白血病（有毛細胞白血病および慢性骨髄性白血病を含む）、乳がん、黒色腫、悪性黒色腫、腎臓胞癌、結腸直腸癌、結腸がん、進行した結腸直腸の癌の肝臓の転移、リンパ腫（腺のリンパ腫を含む）、悪性リンパ腫、カポジ肉腫、非黒色腫皮膚がん（扁平上皮癌および基底細胞癌を含む）、血管腫多発性骨髄腫、およびグリア細胞腫を含む、深組織腫瘍の光線力学的処置における使用に適合している。開示された化合物は、これらに限定されないが、固形腫瘍、皮膚腫瘍および固形乳房腫瘍の増殖を含めた、いくつかのタイプの哺乳動物の腫瘍の処置に適合している。
【０１６５】
開示された化合物の用量は、これらに限定されないが、選択された光線力学的治療化合物、治療用プロトコルの性質、個々の対象、および熟練した医師の判断などの因子に応じて当業者により最適化することができる。
【０１６６】
したがって、開示診断法において、罹患組織（および結合した、または取り込まれた、標的化構造体）は励起光に「曝露される」（例えば、外科的に作り出された開口により、または内部の位置への光の内視鏡的送達により）。開示された方法は、対象の体内の部位、例えば、自然の体腔または外科的に作り出された開口内などに位置する罹患組織のｉｎ  ｖｉｖｏでの検出に特に適合しており、ここで、罹患組織は、本開示の化合物の取込みにより強調される領域の生体検査または手術的切除の手順を促進させるための「平面図」の形である（すなわち、ヒトの眼にさらされる）。腫瘍組織の正確な位置および／または表面積が本開示の化合物の取込みにより容易に判定されるので、本開示の化合物を利用する本方法は、光線力学的治療剤およびレーザー光源（手術中、および画像化に対しては、低いエネルギーを使用することができる）を使用して切除されることになる塊の正確な輪郭、サイズなどをリアルタイムで「見る」ことが必要な外科医にとって価値のあるガイドを提供する。手術後、残留する腫瘍細胞は、高エネルギーを使用するレーザー光源により減退させることができる。
【０１６７】
したがって、具体的な実施形態では、本発明の開示は、高い溶解度およびより良いＰＫ特性を有する、罹患部を標的とする細胞小器官を標的とするＰＤＴ薬剤を、画像誘導手術、これに続く光線力学的処置に使用することができることを伴う。
【０１６８】
同様の方式で、本開示の化合物を使用して、標的細胞型の少なくとも１つの細胞への化合物の結合を可能にする時間および条件下で、生物学的試料を、このような化合物に接触させることによって生物学的試料中の標的細胞型を特定する。次いで、結合した化合物は、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して内在化され、罹患細胞のエンドソームにおいて細胞小器官を標的とするＰＤＴ薬剤を放出する。次いで、ＰＤＴ薬剤に付加した、誘導された分子に応じて、細胞小器官を標的とするＰＤＴ薬剤は罹患細胞のミトコンドリアまたは核のいずれかに運ばれることになる。この場合、最も好ましくは、標的とする罹患細胞タイプは、腫瘍細胞、または腫瘍細胞が拡散したリンパ節、または腫瘍関連マクロファージ、または骨髄由来のサプレッサー細胞である。
【０１６９】
実際に、当業者は、本開示の化合物を、単独でまたは標的化する、検出可能な部分のカクテルの一部として投与し、これらの化合物および標的化部分の、調査中の部位に存在し得る任意の標的化組織への結合および／またはこれによる取込みを可能とし、次いで光源の供給を提供する。典型的には、本開示の化合物および任意の追加の標的化部分は、本開示の蛍光化合物ならびに任意の追加の蛍光構造体の、標的組織による取込みを可能にするような時間および組成で手術前に投与されることになる。
【０１７０】
当業者は、それぞれが標的部位に特異的に結合する、逐次的に投与される蛍光性標的化構造体の組合せを考案することができる。本開示方法の実施に使用される異なる標的化構造体のすべてから同時蛍光を励起させるために利用しなければならない異なる光源の数を最小限に抑えるために、このようなカクテルにおいて標的組織を特定するために使用される蛍光性標的化構造体のすべてが、本開示の化合物のものと同じ波長帯内または同じ波長で蛍光を発する蛍光体（例えば、本開示の化合物における近赤外線の波長の光に対して感度の高い蛍光性のもの）を含むことが好ましい。しかし、本開示の化合物以外の追加の標的化部分が、本開示の蛍光化合物からの光と異なる色での（すなわち、異なる波長を有する）光の照射に応答して蛍光を発し得ることが企図される。本開示の化合物から生じる蛍光と、追加の標的化化合物の蛍光の色の差異は、罹患組織の位置およびサイズの判定において観測者を助けることができる。一部の例では、罹患組織と正常組織との対比がさらに増強されて、標的組織の位置およびサイズの判定において観測者をさらに助けるように、正常組織を標的化するように標的化された標的化構造体、および罹患組織を標的化する本開示の化合物に蛍光体を含めることが望ましい場合がある。本開示の化合物に加えて、このような追加の蛍光体および標的化薬剤を使用することによって、正常組織から生じる任意の自然蛍光が、身体部分の正常組織を標的とする補助的な標的化構造体中の蛍光体（複数可）から生じる蛍光で覆い隠されるという利点が得られる。正常組織および標的組織から生じる蛍光色の差異が大きいほど、観測者が標的組織の輪郭およびサイズを視覚化することがより容易になる。例えば、本開示の化合物から赤外光を生成する蛍光体を含む蛍光性標的化構造体を標的組織（すなわち、異常な組織）を標的化し、緑色光を生成する蛍光体を健康な組織に標的化することによって、観測者が標的組織を正常組織から区別するのを助ける。当業者は、明確な視覚的色の対比を提示する蛍光体の組合せを容易に選択することができる。
【０１７１】
特に有用な組合せとは、本発明のＰＤＴを、ＯＴＬ３８を使用した画像誘導手術と組み合わせて使用することである。ＯＴＬ３８の使用のための方法および組成物は、参照により本明細書に組み込まれている、例えば、米国特許第９，０６１，０５７号において開示されている。
【０１７２】
本開示方法の実施に使用されるスペクトル光は、標的化構造体または標的化構造体内に含有される、生物学的適合性のある蛍光性部分の優勢な励起波長に対応する少なくとも１つの波長を含有するように選択される。一般的に、本開示方法の実施に使用される励起光は、約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍの近赤外線の波長帯における少なくとも１つの励起波長の光を含む。
【０１７３】
しかし、異なる波長で蛍光を発する標的化リガンドの組合せが本開示の実施に使用される場合、励起光のスペクトルは、使用した蛍光体のそれぞれに対して少なくとも１つの励起波長を得るのに十分な程度に広くなければならない。例えば、罹患組織から正常組織を区別するために異なる色の蛍光体が選択された場合、光（複数可）の励起スペクトルは、正常組織および標的組織を標的とする蛍光体に対する励起波長を含むことが特に有益である。
【０１７４】
本明細書に記述されているように、本開示の化合物は、本開示の化合物の一部であるプテロイルまたは葉酸リガンドにより、葉酸受容体を特異的に標的とする。追加の標的化部分が使用される実施形態では、このような追加の標的化部分の標的化構造体は、目的の標的組織、例えば、標的組織内の疾患または異常な状態を特徴付けている細胞上または細胞内に含有された抗原または他の表面フィーチャーに特異的に結合するおよび／またはこれらにより取り込まれるように選択される。他の診断用アッセイの場合のように、標的化構造体が標的組織に、または疾患もしくは異常な状態に関連する抗原に選択的に結合するか、またはこれらにより取り込まれることが望ましい。しかし、標的組織を表す蛍光画像が、視野において健康な組織または構造から生じる任意の蛍光とは異なるように明確に視覚化され得るように、標的組織内の抗原の濃度または標的組織に対する標的化構造体の親和性が視野内の健康な組織に対する親和性よりも十分に大きい限り、健康な組織または細胞構造に結合するまたはこれらにより取り込まれるリガンド部分を含有する標的化構造体を本開示方法の実施において使用することができる。
【０１７５】
例えば、結腸がんは多くの場合がん胎児性の抗原（ＣＥＡ）の存在を特徴とするが、この抗原はまた健康な個体内のある特定の組織に関連する。しかし、がんの結腸組織中のＣＥＡの濃度は多くの場合健康な組織に見出されるものより大きく、よって、抗ＣＥＡ抗体は、本開示の実施においてリガンド部分として使用することができる。別の例では、デオキシグルコースは、健康な組織によって、異なる程度に取り込まれ、利用されるが、健康な組織中でのその代謝は、ある特定の公知の器官、例えば心臓などを除いて、腫瘍中より実質的に低い。したがって、体内での公知のパターンのデオキシグルコース消費は、デオキシグルコースの予想外に高い取込みが腫瘍細胞の存在を示唆する、これらの領域内での判定を助けるために使用することができる。
【０１７６】
本開示方法により検出される疾患または異常な状態は、特異結合リガンドが公知である、公知の標的組織の存在を特徴とする任意のタイプであることができる。例えば、様々な心臓状態は、壊死性もしくは虚血性組織の生成または特異結合リガンドが公知である動脈硬化組織の生成を特徴とする。別の例証的な例として、乳がんは、モノクローナル抗体、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、またはＨＥＲ２／ｎｅｕで特定されるがん組織の生成を特徴とする。標的組織は、多くの標的化構造体が細胞膜を浸透するため、結合リガンドが公知である表面抗原、または細胞内マーカー（すなわち抗原）のいずれかを生成する細胞を特徴とすることができることが企図される。本開示方法を使用して特定できる代表的な病態として、異なるタイプの腫瘍など、様々な状態が挙げられる。本明細書で使用される場合「異常な」組織として、前癌状態、壊死性または虚血性組織、および結合組織疾患に関連する組織、および自己免疫障害などが挙げられる。さらに、本開示方法を使用する診断または検査に対して適切な標的組織のタイプの例として、心臓、乳房、卵巣、子宮、肺、内皮、血管系、消化管、結腸直腸、前立腺組織、内分泌性組織など、ならびにこれらの任意の２つまたはそれよりも多い組合せが挙げられる。
【０１７７】
単なる例として、一部の一般的な悪性腫瘍に対する抗原およびこれらが一般的に見出される身体の位置が当業者には公知であり、抗体などの標的化リガンド、またはこれらの抗原に対するもの、または正に抗原が受容体であるリガンドが当技術分野で公知である。例えば、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）は、結腸、乳房および肺由来の腫瘍に一般的に見出される；ＰＳＡ（前立腺特異的抗原、または時には前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と呼ばれる）は前立腺がんに対して特異的である；ＣＡ−１２５は卵巣がん起源の腫瘍に一般的に見出される、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ−１、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕは乳がん腫瘍に一般的に見出され、アルファ−フェトタンパク質は、精巣がんと肝臓がん腫瘍の両方に見出される、ベータ−ヒト絨毛膜のゴナドトロピンは精巣がんおよび絨毛癌に見出され、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体の両方はまた子宮がん腫瘍に見出され、上皮成長因子受容体は膀胱がん由来の腫瘍に一般的に見出される。他の腫瘍特異的リガンドおよびマーカーが当業者には周知である。好ましい実施形態では、本開示は、葉酸またはプテロイル部分を利用して、前立腺がん細胞に対する色素の標的化のために、葉酸受容体およびＰＭＳＡ標的部分を標的化する。
【０１７８】
これらの一般的に公知の腫瘍マーカーのいずれかは、本明細書中に記載されている色素を使用して（プテロイル部分を、これらのマーカーを特異的に標的とする部分と交換することによって）標的することができ、または代わりに、これらのマーカーは、本開示の化合物を使用して標的にされている葉酸受容体に加えて、およびこれと組み合わせて標的にすることができることが企図される。これまで論じたように、いくつかのマーカーがより明るく、明確に腫瘍を視覚化するよう標的化されている診断用カクテルとしての役割を発揮するように、所与の腫瘍上のいくつかの異なるマーカーに対して標的化部分を有することは特に有利となり得る。
【０１７９】
化合物に加えて、このようなカクテル中の標的化部分は、タンパク質またはポリペプチド、例えば、抗体、または生物活性のあるその断片、好ましくはモノクローナル抗体などを含むことができる。本開示方法の実施に使用される補助的な蛍光性標的化構造体（複数可）はまた、蛍光体でタグを付けたポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよく、これらを含んでもよい。「抗体」という用語は、本開示において使用される場合、インタクトな分子、ならびにエピトープの決定因子に結合可能なその機能的断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどを含む。これらの断片を作製する方法は当技術分野で公知である。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年を参照されたい）。本開示で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原性決定因子を意味する。エピトープの決定因子は、通常、分子の化学的に活性のある表面グルーピング、例えば、アミノ酸または糖側鎖などからなり、通常、特定の三次元構造的特徴、ならびに特定の電荷特徴を有する。
【０１８０】
抗体に加えて、カクテルは、蛍光性標的化構造体に付加しているリガンド部分が、受容体に特異的に結合し、および／または腫瘍細胞により優先的に取り込まれる多くの生物学的に適合性のある化合物から選択され、本開示の標的化構造体においてリガンド部分として使用することができる化合物を含むことができる。腫瘍細胞により優先的に「取り込まれる」化合物は、表面または核内受容体（例えば、ホルモン受容体）、細孔、細胞脂質二重層内の親水性の「窓」などを介して細胞に入ることができる。
【０１８１】
腫瘍を標的化するこのクラスの化合物の例は、ソマトスタチン、ソマトスタチン受容体−結合ペプチド、デオキシグルコース、メチオニンなどである。特に有用なソマトスタチン受容体−結合ペプチドは、オクトレオチド（Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−トリプトフィル−Ｌ−リシル−Ｌ−トレオニル−Ｎ−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）プロピル］−−Ｌ−システインアミド環式（２→７）−ジスルフィド）、ランレオチド、オクトレオチドの経口製剤、Ｐ８２９、Ｐ５８７、などとして公知の長時間作用性の、ソマトスタチンのオクタペプチド類似体である。ソマトスタチン−結合ペプチドは、米国特許第５，８７１，７１１号に開示され、還元条件下、これらのカルボキシル末端アミノ酸を介してこのようなペプチドを共有結合によりラジオアイソトープに連結するための方法は、米国特許第５，８４３，４０１号に開示されており、これら両方が、これらの全体において、参照により本明細書に組み込まれている。当業者は、ラジオアイソトープの代わりに本開示の蛍光性部分を使用することにより、蛍光感受性ソマトスタチン受容体−結合ペプチドの調製に対するこのような教示に容易に適応することができる。
【０１８２】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン受容体−結合ペプチドは、病態が神経内分泌性または内分泌性腫瘍である場合、標的化構造体内の腫瘍−標的化リガンド部分としての使用に特に有効である。本開示方法を使用して診断することができる神経内分泌性腫瘍の例として、腺腫（ＧＨを産生およびＴＳＨを産生）、島細胞腫瘍、カルチノイド、未分化神経内分泌癌、小細胞および非小細胞肺がん、神経内分泌性および／または中間体細胞癌、卵巣、子宮頸部、子宮内膜、乳房、腎臓、喉頭、副鼻腔、および唾液腺の神経内分泌性腫瘍、髄膜腫、よく区別されたグリア由来の腫瘍、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、神経節性神経腫（芽細胞腫）、傍神経節腫、甲状腺細胞における乳頭状、卵胞および髄様癌、メルケル細胞癌、および黒色腫、ならびに肉芽腫およびリンパ腫が挙げられる。これら腫瘍細胞は、ソマトスタチン受容体を有することが公知であり、本開示の蛍光性標的化構造体における腫瘍−標的化リガンドとして、ソマトスタチンまたはソマトスタチン受容体結合ペプチドを使用して標的とすることができる。
【０１８３】
ＶＩＰ受容体シンチグラフィーで使用される血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）（Ｉ．  Ｖｉｒｇｏｌｉｎｉ、Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、２７巻（１０号）：７９３〜８００頁、１９９７年）もまた、小さな主要な腺癌、肝臓転移および消化管のある特定の内分泌性腫瘍の診断のための本開示方法において有用である。
【０１８４】
腫瘍により優先的に取り込まれる腫瘍−標的化リガンドの別の分子の例はデオキシグルコースであり、これは様々な異なるタイプの腫瘍により優先的に取り込まれることが公知である。デオキシグルコースを腫瘍−標的化リガンドとして使用して検出することができる腫瘍のタイプの例として、黒色腫、結腸直腸および膵臓の腫瘍、リンパ腫（ＨＤおよびＮＨＬの両方）、頭頸部腫瘍、骨髄腫、卵巣、乳房、および脳のがん（高異型および下垂体腺腫）、肉腫（等級依存性）、肝癌、精巣がん、甲状腺（等級依存性）小細胞肺がん、膀胱および子宮がんなどが挙げられる。
【０１８５】
本開示のカクテルに使用することができるまた他の腫瘍−標的化化合物として、１−アミノ−シクロブタン−１−カルボン酸およびＬ−メチオニンが挙げられる。Ｌ−メチオニンは、タンパク質合成に必要な必須アミノ酸である。悪性細胞がメチオニン代謝を変化させ、外部のメチオニン供給源を必要とすることは公知である。
【０１８６】
腫瘍受容体への特異性を用いて結合し、および／または腫瘍細胞により優先的に取り込まれる生物学的に適合性のある腫瘍−標的化化合物の追加の例として、哺乳動物のホルモン、特に性ホルモン、神経伝達物質、および腫瘍細胞により優先的に取り込まれる、互いのコミュニケーションのために腫瘍細胞により発現される化合物、例えばクローン内の移動または反転などの染色体収差から生じる新規の分泌タンパク質構造体などが挙げられる。
【０１８７】
性ホルモン、細胞成長ホルモン、サイトカイン、内分泌性ホルモン、エリスロポエチンなどを含むホルモンもまた腫瘍標的化部分としての役目を果たす。当技術分野で公知であるように、いくつかの腫瘍タイプは、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲンなどのホルモン、例えば、テストステロンなどに対して受容体を発現する。このようなホルモンは、例えば、特定の受容体を介して腫瘍細胞に優先的に取り込まれる。
【０１８８】
本開示方法の実施に使用される標的化構造体および補助的な標的化構造体は、当業者に公知の任意の経路、例えば、局所的、関節内、大槽内、眼内、側脳室内、髄腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、気管内、膣内など、ならびにこれらの任意の２つまたはそれよりも多い任意の組合せにより投与することができる。
【０１８９】
投与に対する最も適切な経路は、処置すべき病態、または診断すべき疑わしい状態、または腫瘍の位置に応じて異なる。例えば、炎症状態および様々な腫瘍の処置に対して、励起光により照射されるよう身体部分に直接注射することによる投与（例えば、膣内）を含めた局所的投与は、標的化構造体（例えば、蛍光でタグを付けた抗体）を、その全身投与に伴うこともある合併症の危険性なしに、高濃度で投与することができるという利点を提供する。
【０１９０】
本開示の化合物ならびに本開示の化合物を含む診断用カクテルに使用される任意の追加の標的化構造体は、診断に対して「有効量」で投与される。有効量とは、対象において調査中の身体部分に位置する任意の標的組織の直接可視化を助けるために必要な標的化構造体の量である。本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の哺乳動物、例えば、飼いならしたペット、家畜、または動物園の動物などを含むことが企図されているが、好ましくはヒトである。診断で使用するのに有効な量は、当然、調査する身体部分のサイズおよび位置、標的組織に対する標的化構造体の親和性、標的組織のタイプ、ならびに投与経路に依存する。標的化構造体の局所的投与は典型的に、任意の全身投与モードより少ない用量が必要とされるが、ただし、標的化構造体の局所的濃度は、場合によっては、局所的投与の後、全身投与により安全に達成し得る濃度より高くなり得る。
【０１９１】
個々の対象は、症状の重症度に幅広いバリエーションを提示することもあり、各標的化構造体は、標的に対する標的化構造体の親和性、身体内プロセスによる標的化構造体のクリアランス速度、その中に含有された蛍光体の特性などを含むその独特な診断の特徴を有するので、熟練した医師は、因子を重み付けし、用量を適宜変化させることになる。
【０１９２】
本開示の化合物ならびにこれらの化合物を含むカクテルは、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の方法に従い滅菌注射用懸濁液として製剤化することができる。滅菌注射用調製物はまた、注射可能な滅菌溶液または無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の懸濁液、例えば、１，４−ブタンジオール（１−４，  ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）中溶液であってもよい。滅菌の、不揮発性油は溶媒または懸濁媒として慣例的に利用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、天然に存在する植物油、例えば、ゴマ油、ヤシ油、ピーナッツ油、綿実油など、または合成脂肪性ビヒクル、例えば、オレイン酸エチルなどを含む任意の無菌性不揮発性油を利用することができる。緩衝液、保存剤、抗酸化剤などを必要に応じて組み込むことができ、または、代わりに、これらが製剤を構成することもできる。
【０１９３】
その趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示において様々な変更を行うことができ、したがって、本開示は、明細書において具体的に開示されたものに加えて実施形態を包含するが、ただし、添付の特許請求の範囲に示されているもののみを包含することは当業者には明らかであろう。
【０１９４】
以下に続く実施例は、単に本開示の特定の実施形態を例示する目的だけで提供され、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書中で論じたように、開示された化合物および方法の特定のフィーチャーは、これらが提供する操作性または利点に対して必要とされない様々な方式で修飾することができる。例えば、化合物は、化合物が利用される特定の使用に応じて、様々なアミノ酸およびアミノ酸誘導体ならびに標的化リガンドを組み込むことができる。当業者であれば、このような変化形は、添付の特許請求の範囲内に包含されることを認識する。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例において、標的とされる、新規の罹患組織ならびに光線力学的治療（ＰＤＴ）用の細胞小器官を標的とする光増感剤（ＰＳ）の合成が説明され、これらの化合物の合成が記されている。
【０１９６】
以下の実施例において、ＫＢ細胞を使用して、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を判定する。これらのアッセイにおいて、ＫＢ細胞は、７０％コンフルエンスまで増殖させ、濃度を次第に上げたＰＳと共に２時間振動させた。洗浄して未結合のコンジュゲートを除去した後、細胞をレーザービーム（２５ウェルに対して、６ｍＷ／ｃｍ２、１２Ｊ／ｃｍ２および曝露直径＝６ｃｍ）に３２分間曝露し、新鮮な培地内で、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを使用して、放出されたＡＴＰの生物発光の定量化により細胞生存度を測定した。小分子薬物はｉｎ  ｖｉｖｏで、＜２時間で排除される（非標的組織から）ことが判明し、これは薬物へのより長い曝露が非生理学的結果をもたらし得ることを示唆しているため、上述の２時間の曝露が選択された。
【０１９７】
以下の実施例において、提示されたデータはＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０は半数効果濃度であり、その最大作用の５０％が観察される化合物の濃度を表す。本発明者らは、ＥＣ５０値が低いほど、活性は高い。ＥＣ５０＜５０ｎＭの化合物は活性があり、ＥＣ５０＜１０ｎＭを高活性と考える。
【０１９８】
以下の実施例では、ヌードマウスにおいてＫＢ腫瘍細胞異種移植片を使用して化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を判定する。これらの研究では、ＫＢ細胞を皮下移植し、腫瘍の増殖をモニタリングした。時間依存性全身画像化に対して、１回腫瘍が２５０〜３５０ｍｍ３になったら、尾静脈を介して化合物を注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化を使用して、腫瘍内ＰＳの蓄積をモニタリングした（４８時間にわたり）。さらに、腫瘍が約５０ｍｍ３まで増殖したら、尾静脈を介して化合物を注射した。化合物の注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍容積の減少をモニタリングすることによって、ＢＰｈｅｉｄ−ａのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を評価した。
【０１９９】
（実施例１）
【０２００】
本発明の実施例では、本発明者らは、現在治験を受けている市販の非標的ＰＤＴ薬剤または同様の薬剤の臨床前評価を実施した。研究の目的は２つあった。第１に、目的は、がん細胞内の市販の光増感剤の光線力学的治療効果を評価することであり、第２に腫瘍異種移植片マウスモデルにおけるがん細胞内の市販の光増感剤の光線力学的治療効果を評価することであった。
【０２０１】
Ｔｏｏｋａｄおよびその類似体の合成
【０２０２】
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  Ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓの水性ペースト（１５０ｇ）をメタノール（２．２Ｌ）中に懸濁させ、暗所で１４時間撹拌しながら、緑色の懸濁液を介してアルゴンをバブリングした。焼結ガラス漏斗を介して懸濁液を濾過し、濾液がほとんど無色になるまで残渣をメタノールで洗浄した。濾液を回転式エバポレーター上で蒸発させ、高真空下で乾燥させて、濃緑色の固体として粗原料バクテリオクロロフィル−ａ（８）を得た。
【０２０３】
以前のステップで得た粗原料バクテリオクロロフィル−ａ（８）をＴＦＡ（１２０ｍＬ、水中８０％）中に懸濁させた。反応混合物を介してアルゴンを１０分間バブリングし、内容物を暗所で１時間撹拌した。反応混合物を水の中に注ぎ入れ（４００ｍＬ）、クロロホルム（３×３００ｍＬ）を使用して抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残渣をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、激しく撹拌しながら、ヘキサン（８００ｍＬ）に注入した。沈殿した暗褐色の固体を濾過し、高真空下で乾燥させて、バクテリオフェオフォルビド−ａ（ＢＰｈｅｉｄ−ａ）（１）を得た。
【０２０４】
アルゴンで１０分間バブリングしたクロロホルム（６０ｍＬ）を、激しく撹拌しながら、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（７８４ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ、６当量）とアスコルビン酸ナトリウム（７００ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ、６当量）の混合物に加え、これに続いて、脱気したメタノール（３６０ｍＬ）を加えた。別のフラスコ内で、ＢＰｈｅｉｄ−ａ（３６０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、１当量）を脱気したクロロホルム（１００ｍＬ）に溶解し、上記溶液をゆっくりと２分間で加えた。反応物内容物をアルゴンで１０分間バブリングし、暗所で、２３℃で１５時間撹拌した。完了したら、セライトを介して反応混合物を濾過し、濃縮した。生成した暗褐色−紫色の固体をメタノール／クロロホルム（２０／１００ｍＬ）に再溶解し、セライトを介して濾過し、濃縮した。ナトリウム（０．４％）アスコルビン酸塩処理したシリカおよびジクロロメタン中０〜１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーで、粗原料の固体を精製して、化合物２（Ｔｏｏｋａｄ）を形成した。
【０２０５】
タウリン（３２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（１ｍＬ）に溶解し、水性ＨＣｌを使用してｐＨを８．２に調節した。水を蒸発させ、高真空下で固体を乾燥させた。この固体に、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ−ａ（化合物（３））（２０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（３ｍＬ）を加え、溶液を介してアルゴンを２分間バブリングした。反応混合物を６０℃で６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで精製して、暗褐色の固体として化合物３を得た。
【０２０６】
Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ−ａ（３）（５０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７．５ｍＬ）に溶解し、溶液を介してアルゴンを２分間バブリングした。別のフラスコ内で、タウリン（７０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（２．１７ｍＬ）に溶解し、水性ＨＣｌを使用してｐＨを８．２に調節した。この溶液を上記溶液に加えた。反応混合物を介して、アルゴンをもう５分間バブリングし、内容物を４０℃で５時間撹拌した。回転式エバポレーターを４０℃で使用して、水を反応混合物から除去し、内容物を４０℃で４０時間撹拌した。反応混合物を濾過し、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで精製して、暗褐色の固体として溶解性ｔｏｏｋａｄ（４）を得た。
【０２０７】
化合物１〜５をＫＢ細胞上で試験して、これらの効力を判定した。図２は、細胞生存に対するこれらの薬物濃度の作用を示す。
【表１】
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【０２０８】
非標的ＰＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を判定するため、実施例の冒頭で以下に記載されているようにＫＢ細胞を使用した。
【０２０９】
試験したすべての非標的ＰＳのＥＣ５０値は、これらの薬剤はがん細胞中で活性がなく、したがってＰＤＴに対して適切ではないことを示している。この活性の欠如に対して、例えば、難水溶性、弱い細胞浸透性、およびがん細胞内の非効率な細胞小器官局在化を含むいくつかの理由が存在し得る。
【０２１０】
Ｐｄキレート化化合物（３および４）は、非キレート化分子（１および２）と比較した場合活性が低いこともまた認められた。さらに、化合物４は化合物１と比較した場合、活性が低い。この活性の損失は、求核剤による５員環（ケトン基およびメチルエステルを有する）の開口に起因し得る。
【０２１１】
これらの非標的ＰＳのがん細胞に対する特異性を確証するため、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩にＢＰｈｅｉｄ−ａを注射した。ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化を使用して、腫瘍内のＰＳの蓄積についてマウスをモニタリングした。時間依存性全身画像は、マウスの皮膚へのＢＰｈｅｉｄ−ａの非特異的取込みを示した。さらに、皮膚から排除するのに長い時間がかった。ＢＰｈｅｉｄ−ａは、腫瘍内に蓄積するのに約２４時間かかり、腫瘍内の蛍光は、非常に低く、これは、腫瘍組織に実際に到達したＢＰｈｅｉｄ−ａ分子が非常に少ないことを示している。ＢＰｈｅｉｄ−ａ分子が利用可能でないことは、様々な理由に起因し得るが、この理由として、例えば、薬物の難水溶性、弱い細胞浸透、低いバイオアベイラビリティー、薬物が腫瘍に十分な数の分子を提供しないこと、およびがん細胞内の非効率な細胞小器官局在化が挙げられる。
【０２１２】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌのＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）での処置の開始前に、約５０ｍｍ３まで増殖させた。５０ｎｍｏｌのＢＰｈｅｉｄ−ａの注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。ＢＰｈｅｉｄ−ａのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を、腫瘍容積の減少をモニタリングすることにより評価した。ＢＰｈｅｉｄ−ａで処置したＫＢ腫瘍は、＜１週間の倍化時間で増殖し、２週間の処置期間の終わりまでに＞６００ｍｍ３に到達し、マウスは、大きな腫瘍容積により３週で安楽死させなければならない。他方では、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）処理したマウス腫瘍は、腫瘍潰瘍による安楽死以前に３週間で６００ｍｍ３超まで増殖した。これは、未処置の対照マウスと比較した場合、腫瘍に対するＢＰｈｅｉｄ−ａからの一部の作用が存在したことを示す。
【０２１３】
これらの研究から、本発明者らは従来の非標的ＰＤＴ薬剤は、せいぜい非効率なＰＤＴ分子でしかないと結論づけた。これらは高度に水に不溶性であり、細胞培養物の中で低い効力を有するようにみえる。さらに、これらは高度に非特異的であり、同時に皮膚における高い取込みと、低い腫瘍対バックグラウンド比の両方を有する。これらの従来のおよび認可されたＰＤＴ分子は、腫瘍内に局在するのに２４時間またはそれよりも長くかかり、局在した場合、腫瘍中の薬物分子の低濃度のみを提示し、動物モデルにおいて非常に低い効力を有するようにみえる。さらに、これらの分子の使用は腫瘍中の低濃度のＰＤＴ薬剤により妨害され、これは、腫瘍画像化または画像誘導手術における使用に十分な蛍光を生成することができない非常に低レベルの蛍光が存在することを意味する。
【０２１４】
（実施例２）
ミトコンドリアを標的とする修飾されたＰＤＴ薬剤の前臨床評価
【０２１５】
この実施例では、目的は、親油性のカチオン性分子またはカチオン性ペプチドまたはミトコンドリア内の標的に選択的に結合する分子をコンジュゲートすることにより、ミトコンドリアを標的化するようにＢＰｈｅｉｄ−ａを修飾すること；がん細胞内でミトコンドリアを標的化する、修飾されたＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体の光線力学的治療効果を評価すること；ならびに腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中で最も活性のある分子に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することである。
（ａ）選択された、修飾されたＢｐｈｅｉｄ−ａ類似体の合成
【０２１６】
ヒドラジン（１０．２ｕＬ、０．３３ｍｍｏｌ、１０当量）を、ジメチルホルムアミド（３．３ｍＬ）中のＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）（２０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、１当量）またはｔｏｏｋａｄ（２）の溶液に加えた。反応混合物をアルゴンで５分間脱気し、アルゴン下、２３℃で３時間撹拌した。Ｃ１８カラムを使用して分取ＨＰＬＣにより反応物を精製して、暗褐色の固体として化合物（２４）または（２５）を得た。
【０２１７】
ジイソプロピルエチルアミン（１３．５ｕＬ、０．０７８ｍｍｏｌ）およびＣＨ３Ｉ（５０ｕＬ）を、脱気したＣＨＣｌ３（３ｍＬ）に溶解した化合物（２４）（５ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ）または（２５）の溶液に加えた。混合物を２３℃で４日間撹拌した。反応混合物を、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで精製して、暗褐色の固体として化合物（２６）を得た。
【０２１８】
硫酸ジメチル（０．５２ｍＬ、５．５７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（８ｍＬ）および水（５ｍＬ）中の化合物（３２）（４００ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１．５ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。懸濁液を２３℃で１時間撹拌した。完了したら、反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×７０ｍＬ）を使用して抽出した。有機物を水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮して、淡黄色の油状物として化合物（３３）を得た。
【０２１９】
木炭担持パラジウム（８０ｍｇ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物（３３）（２５０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応の内容物を水素バルーン大気下で４時間撹拌した。完了したら、セライトを介して反応混合物を濾過し、濃縮して、透明な油状物として化合物（３４）を得た。
【０２２０】
ＤＩＰＥＡ（２１ｕＬ、０．１２３ｍｍｏｌ、３当量）を脱気したＤＭＦ（２ｍＬ）中のＢＰｈｅｉｄ−ａ（２５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１当量）およびＨＡＴＵ（１５．５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加え、内容物をアルゴン下、２３℃で１５分間撹拌した。この時間の後、脱気したＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の５−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１−オキソペンタン−２−アミニウムメチルスルフェート（３５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１当量）溶液を反応容器に導入した。反応混合物を２３℃でもう１時間撹拌した。０．５ｍＬの水の添加によりカップリング試薬を破壊し、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応物を精製して、暗褐色の固体として化合物（１６）を得た。
【０２２１】
ジイソプロピルエチルアミン（１４６ｕＬ、０．８４２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３．５ｍＬ）中の化合物（３２）（１４０ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１２８ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）および（２−カルボキシエチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（１２１ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応の内容物を２３℃で１時間撹拌した。完了したら、反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）を使用して抽出した。有機物を水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮して、透明な高粘度の油状物として化合物（３５）を得た。
【０２２２】
木炭担持パラジウム（５０ｍｇ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物（３３）（１００ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応の内容物を水素バルーン大気下で２４時間撹拌した。完了したら、セライトを介して反応混合物を濾過し、濃縮し、ＨＰＬＣを使用して精製し、化合物（３６）を得た。
【０２２３】
ＤＩＰＥＡ（２１ｕＬ、０．１２３ｍｍｏｌ、３当量）を、脱気したＤＭＦ（２ｍＬ）中のＢＰｈｅｉｄ−ａ（２５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１当量）およびＨＡＴＵ（１５．５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加え、内容物をアルゴン下、２３℃で１５分間撹拌した。この時間の後、脱気したＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の（Ｓ）−（３−（（５−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−３−オキソプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（３０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を反応容器に導入した。反応混合物を２３℃でもう１時間撹拌した。０．５ｍＬの水の添加によりカップリング試薬を破壊し、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応物を精製して、暗褐色の固体として化合物１３ａを得た。
【０２２４】
ヒドラジン（３．１ｕＬ、０．１０ｍｍｏｌ、５当量）を、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中の化合物１３（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加えた。反応混合物をアルゴンで５分間脱気し、アルゴン下、２３℃で１時間撹拌した。Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応物を精製して、暗褐色の固体として化合物１４ａを得た。
【０２２５】
ジイソプロピルエチルアミン（１２０ｕＬ、０．６９７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１３．９ｍＬ）中のＢｐｈｅｉｄ−ａ（８５ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６３．５ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。アルゴンを混合物に５分間十分にバブリングし、暗所で２０分間撹拌した（溶液Ａ）。別のフラスコ内で、（Ｓ）−３−アミノ−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（３４ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解して、透明な溶液（溶液Ｂ）を形成した。カニューレを介して、溶液Ｂを溶液Ａに加え、内容物を１時間撹拌した。完了したら、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応混合物を精製して、化合物（３７）を得た。
【０２２６】
ジイソプロピルエチルアミン（３８ｕＬ、０．２１４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（７．１ｍＬ）中の化合物（３７）（５７ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２７．２ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物にアルゴンを５分間十分にバブリングし、暗所で１５分間撹拌した（溶液Ａ）。別のフラスコ内で、Ｄ−（α）−グルコサミン．ＨＣｌ（１５．４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．５ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２５ｕＬ、０．１４３ｍｍｏｌ）を加えた（溶液Ｂ）。カニューレを介して溶液Ｂを溶液Ａに加え、内容物を１時間撹拌した。完了したら、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応混合物を精製した。
【０２２７】
精製した生成物（５０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を脱気したＴＦＡ（３ｍＬ）に溶解し、アルゴン下、２３℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで粗残渣を精製して、暗褐色の固体として化合物（１９ａ）を得た。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表２】
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【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａ分子の効力を判定するため、実施例の冒頭で以下に記載されているようにＫＢ細胞を使用した。ＥＣ５０値としてデータを報告する。
【０２２９】
親油性カチオン性分子、またはカチオン性ペプチド、または糖などのミトコンドリア内の標的に選択的に結合する分子にコンジュゲートすることによるミトコンドリアの標的化薬剤でのＢＰｈｅｉｄ−ａの修飾は、ＢＰｈｅｉｄ−ａと比較して非常に活性のある化合物の発見につながった。特に、１４と２６の両方は、低いナノモル範囲（それぞれ３．７ｎＭおよび８．４ｎＭ）において活性を有し、がん細胞を死滅させることにおいて高活性であった。加えて、化合物９、１１ｂ、１２ｂ、１３、および１６もまたがん細胞を有効に減退させるのに有効であった。これらの活性化合物の大部分は、第四級アンモニウム［−Ｎ（＋）（ＣＨ３）３］またはヒドラジド［−ＮＨ−Ｎ（＋）（ＣＨ３）３］またはトリフェニルホスフィン［−Ｐ（＋）Ｐｈ３］としてカチオン性の電荷を有する。
【０２３０】
疎水性分子は、親水性分子より活性があることに本発明者らも気づき、例えば、化合物９、１２ｂ、および１３は、１１ａおよび１２ａと比較してより疎水性であった。化合物１１ａおよび１２ａは確かに遊離カルボン酸基を有するが、化合物９、１２ｂ、および１３において、これらの酸基は、ｔｅｒｔ−ブチル基、疎水性保護基で保護されている。したがって、１１ａおよび１２ａは、９、１２ｂ、および１３より親水性である。特定の理論または作用機序に制約されることなく、血漿およびミトコンドリア内膜を介した親油性カチオンの運動により疎水性カチオンがより活性がある可能性はある。これは、膜通過に対して活性化エネルギーを有効に低下させる大きな疎水性表面積およびカチオンの大きなイオン半径の結果である。ネルンスト方程式は、約６０ｍＶの膜電位ごとに１０倍増加し、ミトコンドリア内でこれらの数百倍の取込みをもたらす、親油性カチオンの膜電位依存性の取込みについて十分に説明している。
【０２３１】
Ｐｄキレート化した化合物は、これらの非キレート化同等物（例えば９対１０および２６対２７および３０対３１）よりも活性が低いことを、本発明者らは観察した。これは、Ｐｄ金属によるフリーラジカル形成のクエンチに起因し得る。
【０２３２】
最後に、化合物２６を除いて、求核剤での５員環（ケトン基およびメチルエステルを有する）の開口は、活性の損失をもたらすか、またはＰＤＴ薬剤の効力を減少させる。
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
【０２３３】
がん細胞に対する、本発明のミトコンドリアを標的とするＰＳの特異性を確証するために、化合物１４（がん細胞中で最も活性のある化合物）を、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用して蛍光画像化により腫瘍蓄積をモニタリングした。時間依存性全身画像は、マウスの皮膚および腎臓における化合物１４の非特異性の取込みを示す。腎臓内の蛍光はまた、腎臓を介した薬物のクリアランスが原因であり得る。これらのデータから、ミトコンドリアを標的化するようにＢＰｈｅｉｄ−ａを修飾することにより、細胞培養物中で高い活性のデータが得られたが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのデータは細胞培養物データほど有望ではなかったようにみえる。
【０２３４】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌの化合物（１４）での処置の開始前に、約５０ｍｍ３まで増殖させた。５０ｎｍｏｌの化合物（１４）の注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの１４の効力を、腫瘍容積の減少をモニタリングすることにより評価した。１４で処置したＫＢ腫瘍は、＜１週間の倍化時間で増大し、２週間の処置期間の終わりまでに約５００ｍｍ３に到達した。このｉｎ  ｖｉｖｏでの効力の欠如は、弱い溶解度、弱いＰＫ特性、および分子の腫瘍標的化がないことに起因し得る。
（実施例３）
核を標的とするＰＤＴ薬剤の前臨床評価
【０２３５】
本実施例の目的は、がん細胞内で核を標的とする修飾されたＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体の光線力学的治療効果を評価するため、ならびに腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中で最も活性のある分子に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価するために、ＤＮＡ結合剤、ＤＮＡアルキル化剤などにコンジュゲートすることによって、核を標的化するようＢＰｈｅｉｄ−ａを修飾することであった。
【０２３６】
ジイソプロピルエチルアミン（１２０ｕＬ、０．６９１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＮ１０−メチル−４−アミノ−４−デオキシプテロイン酸（７５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に加え、２３℃で１５分間撹拌した（溶液Ａ）。別のフラスコ内で、化合物（３２−ａ）（４７ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１２０ｕＬ、０．６９１ｍｍｏｌ）を加えた（溶液Ｂ）。カニューレを介して、溶液Ｂを溶液Ａに加え、内容物を１時間撹拌した。完了したら、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応混合物を精製した。ＤＭＦ（３．５ｍＬ）中の（２−カルボキシエチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（１２１ｍｇ、０．３３７ｍｍｏｌ）。反応の内容物を２３℃で１時間撹拌した。完了したら、反応混合物をエーテル（５００ｍＬ）に加え、沈殿した固体を濾過し、高真空下で乾燥させて、高粘度の油状物として化合物（５３）を得た。
【０２３７】
化合物（５３）（１００ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（６ｍＬ）に溶解し、アルゴン下、２３℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで粗残渣を精製して、黄色の固体として化合物（５５）を得た。
【０２３８】
ジイソプロピルエチルアミン（３０ｕＬ、０．１７５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５．８ｍＬ）中のＢｐｈｅｉｄ−ａ（３５．６ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２２．１ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）の溶液に加え、２３℃で１５分間撹拌した（溶液Ａ）。別のフラスコ内で、化合物（５５）（２４ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（３０ｕＬ、０．１７５ｍｍｏｌ）を加えた（溶液Ｂ）。カニューレを介して、溶液Ｂを溶液Ａに加え、内容物を１時間撹拌した。完了したら、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応混合物を精製して、化合物（４４）を得た。
【表３】
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【０２３９】
核を標的とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効力を判定するために、ＫＢ細胞は実施例セクションの冒頭で以下に示されている通りであり、ＥＣ５０値によりデータが報告された。
【０２４０】
核を標的とする薬剤でＢＰｈｅｉｄ−ａを修飾することにより、ＢＰｈｅｉｄ−ａと比較して活性のあるＰＳの発見に至った。本発明者らが合成した化合物の中で、化合物４１は最も活性がある。このＢＰｈｅｉｄ−ａ分子を、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤のクラスに属する化学療法薬物で修飾する。このＤＮＡアルキル化剤（メルファラン）は、イミダゾール環の第７の窒素原子と反応できる２つのアルキル塩素基を有し、これによって、ＤＮＡ合成および細胞増殖を阻害する。
５．葉酸を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの前臨床評価。グループＡ：放出可能なリンカー部分のバリエーション（異なる放出機序を介した遊離薬物の放出）
【０２４１】
本実施例の目的は、異なる条件下で、異なる放出可能な機序を有する様々な放出可能なリンカーを介して、葉酸（葉酸、ビタミンＢ９）にコンジュゲートすることにより、ＢＰｈｅｉｄ−ａを葉酸受容体陽性腫瘍細胞に標的化し、がん細胞における光線力学的治療効果を評価し、腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中で最も活性のある分子に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することであった。
【０２４２】
合成
【化３８】
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以下の合成スキームを使用した：
１．Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−クロロトリチル樹脂（７００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１０ｍＬ）で膨潤させ、これに続いてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０ｍＬ）で膨潤させた。
２．ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）中の２０％ピペリジン溶液を樹脂に加え、アルゴンを毎回１０分間バブリングした。
３．樹脂を、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で毎回５分間洗浄した。
４．Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、遊離アミンの形成を判定した。
５．ＤＭＦ（８ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＳＯ３Ｈ）−ＯＨ（５００ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４９０ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（４４８ｕＬ、２．５８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングした。
６．樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で毎回５分間洗浄した。
７．Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、カップリング効率を判定した。
８．ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）中の２０％ピペリジン溶液を樹脂に加え、アルゴンを毎回１０分間バブリングした。
９．樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で毎回５分間洗浄した。
１０．Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、遊離アミンの形成を判定した。
１１．ＤＭＦ（８ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−（α−ＯｔＢｕ）−ＯＨ（６２５ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５５９ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６．０当量）の溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングした。
１２．樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で毎回５分間洗浄した。
１３．Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、カップリング効率を判定した。
１４．ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）中の２０％ピペリジンの溶液に樹脂を加え、アルゴンを毎回１０分間バブリングした。
１５．樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で毎回５分間洗浄した。
１６．Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、遊離のアミンの形成を判定した。
１７．ＤＭＦ（８ｍＬ）中のＰｔｅ＿１０Ｎ−ＴＦＡ−ＯＨ（６００ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）ＨＡＴＵ（５５９ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６．０当量）の溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングした。
１８．樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびイソプロパノール（３×１０ｍＬ）で毎回５分間洗浄した。
１９．Ｋａｉｓｅｒ試験を実施して、カップリング効率を判定した。
２０．樹脂をＤＣＭ（１０ｍＬ）で膨潤させた。
２１．トリフルオロ酢酸ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）：ＥＤＴカクテル（９２．５：２．５：２．５：２．５）（３×１０ｍＬ×３０分）を使用して、最終化合物を樹脂から切断し、撹拌下でカクテル洗浄物をエーテル（３００ｍＬ）に滴下添加して、淡黄色の沈殿物を得た。
２２．沈殿した固体を濾過し、エーテル（５×５０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で乾燥させて、オフホワイト色の固体として所望の化合物（７０）を得た。
【化３９】
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【０２４３】
ＣＨ３ＣＮ（３０．０ｍＬ）中のメトキシカルボニルスルフェニルクロリド（３．１ｍＬ、３４．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＣＨ３ＣＮ（１．０ｍＬ）中の２−メルカプトエタノール（２．４ｍＬ、３４．２５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を−１０℃で３０分間撹拌した。ＣＨ３ＣＮ（１８．０ｍＬ）中の２−チオピリジン（３．４６ｇ、３１．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、反応混合物を加え、２時間還流させた。次いで、反応混合物を１０℃で１時間撹拌し、濾過した。固体をＣＨ３ＣＮで洗浄し、減圧下、室温で乾燥させて、無色の固体として、純粋な生成物（７２）を生成した（４．０ｇ、５７．５％）。
【０２４４】
ＣＨ３ＣＮ（３５ｍＬ）中の２−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）エタノール（２．０、８．９４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１．５８ｇ、１１．７１ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（１．２５ｍＬ、８．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ジホスゲン（０．７２ｍＬ、５．９８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃に加熱し、２４時間撹拌した。固体を濾過し、ＣＨ３ＣＮで洗浄し、減圧下、室温で乾燥させて、ペールホワイト色の固体として純粋な生成物（７３）を生成した（３．４８ｇ、９５．７％）。
【０２４５】
ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の２−［ベンゾトリアゾール−１−イル−（オキシカルボニルオキシ）−エチルジスルファニル］−ピリジン塩酸塩（６８５ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６００ｕＬ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ヒドラジンを加えた。反応混合物を０℃で１５分、および室温で３０分撹拌した。沈殿物を濾過した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中２％ＭｅＯＨ）を使用して粗製の化合物を精製して、無色の油状物として生成物（７４）を生成した（３７１ｍｇ、９３．４％）。
【０２４６】
ジイソプロピルエチルアミン（２９ｕＬ、０．１６３ｍｍｏｌ、２．４当量）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＢＰｈｅｉｄ−ａ（化合物２）（４０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、１当量）およびＨＡＴＵ（３０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に加えた。アルゴンを５分間反応混合物に十分にバブリングし、暗所で２０分間撹拌した（溶液Ａ）。別のフラスコ内で、化合物７４をＤＭＦに溶解して、透明な溶液（溶液Ｂ）を形成した。カニューレを介して、溶液Ｂを溶液Ａに加え、内容物を１時間撹拌した。完了したら、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応混合物を精製して、化合物（７５ａ）を得た。
【化４０】
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【０２４７】
ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中の化合物（７５ａ）（８．５ｍｇ、０．０１０４ｍｍｏｌ、１当量）および化合物（７０）（１８．３ｍｇ、０．０２０４８ｍｍｏｌ、２当量）の溶液に、アルゴンで脱気を行い、アルゴン下、２３℃で７時間撹拌した。反応混合物を、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで精製して、暗褐色の固体として化合物（６５ａ）を得た。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表６】
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【０２４８】
葉酸およびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を判定するため、実施例セクションの冒頭で以下に記載されているようにＫＢ細胞を使用した。ＥＣ５０値としてデータを報告する。
【０２４９】
ＥＣ５０は、半数効果濃度であり、その最大作用の５０％が観察されている化合物濃度を表す。ＥＣ５０値が低いほど、活性は高い。本発明者らは、ＥＣ５０＜５０ｎＭを有する化合物は活性があり、ＥＣ５０＜１０ｎＭを有する化合物を高活性と考える。
【０２５０】
葉酸を標的とする放出可能な修飾されたＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート、特に６４、６５ａおよび６５ｃは、培養中のがん細胞に対して高活性であった。これは、薬物コンジュゲートの溶解度がより高いため、より多くの薬物が細胞内に入ることが原因であり得る。さらに、薬物コンジュゲートはここで葉酸受容体媒介性エンドサイトーシスを介して内在化し、エンドソーム内で薬物を放出する。放出された薬物分子は、必要な細胞小器官へと運ばれた可能性がある。
（ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
（ｉ）時間依存性全身画像化
【０２５１】
葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａのがん細胞に対する特異性を確証するため、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に化合物６５ａを注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化により腫瘍蓄積をモニタリングした。時間依存性全身画像は、葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａは、薬物投与の１時間以内に腫瘍に局在し、その蛍光特性を失うことなく２４時間にわたり腫瘍中に留まったことを示唆している。化合物６５ａは、ＦＲ陽性腫瘍に対して高度に特異的であり、蛍光は他の組織には観察されず、腫瘍とバックグラウンドとの高い比率をもたらした。さらに、化合物６５ａを有する腫瘍は、葉酸を標的とする放出不可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ）より高度に蛍光性があり、５９ａよりも多数の６５ａ分子が腫瘍に到達したことを示している。これら薬物動態特性の増加は、５９ａと比較して６５ａがより高い溶解度を有することが原因であり得る。さらに、がん細胞内の葉酸コンジュゲートの放出は、遊離受容体のリサイクル速度を増加させることができる。より具体的には、がん細胞内でのミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａの放出はＢＰｈｅｉｄ−ａのミトコンドリア局在化を増加させることができるという可能性がある。
（ｉｉ）ＦＲ陽性ＫＢ腫瘍を持つマウスに対する、葉酸を標的とする放出不可能な−ＢＰｈｉｅｄ−ａの作用
【０２５２】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌまたは２５ｎｍｏｌの化合物６５ａまたは６５ｃでの処置の開始前に、約５０ｍｍ３まで増殖させた。薬物注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を、腫瘍容積の減少をモニタリングすることにより評価した。両方の化合物がＫＢ腫瘍の増殖を阻害した。６５ａまたは６５ｃで処置したマウスは、両用量（５０および２５ｎｍｏｌ）において腫瘍退縮を示し、これは研究期間が終わるまで持続した。化合物６５ａおよび６５ｃに対して提示されたデータは、これらが抗腫瘍治療剤として有望な臨床用候補であることを示している。
【０２５３】
（実施例６）
葉酸を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの前臨床評価。グループＢ：薬物のバイオアベイラビリティーを改善するための水溶性リンカー部分の変化形
【０２５４】
本実施例の目的は、水溶性リンカーを有する放出可能なリンカーを介して葉酸（葉酸、ビタミンＢ９）にコンジュゲートすることによってＢＰｈｅｉｄ−ａを葉酸受容体陽性腫瘍細胞に標的化し、がん細胞における光線力学的治療効果を評価し、腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中の最も活性のある分子に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することである。
（ａ）合成
【０２５５】
すべての化合物は、実施例ｖにおいて６５ａに対して記載されている同様の方法および手順を使用して合成した。
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表７】
2018537402.tif 000047
【０２５６】
葉酸およびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を判定するため、実施例セクションの冒頭で以下に記載されているようにＫＢ細胞を使用した。ＥＣ５０値を使用してデータを報告する。
【０２５７】
すべての化合物は、ＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）と比較して高活性である。化合物６５ａ、６５ｃ、７６ａおよび７６ｃはがん細胞に対して極めて強力であった。これらの稀な活性は、増強した水溶性、細胞内での薬物の放出、葉酸媒介性エンドサイトーシス、およびミトコンドリアの局在化に起因し得る。
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
【０２５８】
葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａのがん細胞に対する特異性を確証するために、化合物７６ａおよび７６ｃを、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化で腫瘍蓄積をモニタリングした（６５ａ〜ｃから得た同様の研究に対するデータは実施例ｖに含まれた）。時間依存性全身画像は、葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａが、薬物投与の１時間以内に主に腫瘍内に局在し、その蛍光特性を失うことなく２４時間にわたり腫瘍中に留まったことを示唆している。化合物７６ａおよび７６ｃはＦＲ陽性腫瘍に対して高度に特異的であり、他の組織内には蛍光は観察されなかった。したがってこれらの化合物は腫瘍とバックグラウンドとの有用なおよび高い蛍光比率を生成する。さらに、腫瘍は、葉酸を標的とする放出不可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ）よりもより高度に蛍光性であり、５９ａより多数の７６ａおよび７６ｃ分子が腫瘍内に存在したことを示している。両方の分子は、同様の数の親水性官能基および同様の溶解度特性を有するので、活性における差異は、がん組織内のミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａの放出に起因し得る。
【０２５９】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下に移植し、５０ｎｍｏｌの７６ａ〜ｃでの処置の開始前に、約５０ｍｍ３まで増殖させた（６５ａ〜ｃから得た同様の研究に対するデータは実施例ｖに含まれていた）。薬物注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍容積の減少をモニタリングすることによって、コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を評価した。すべての３つの化合物がＫＢ腫瘍の増殖を阻害した。しかし、７６ｃで処置したマウスは、より長い時間にわたる腫瘍退縮を示し、良好な臨床的候補として有望であることを示していることに注目すべきである。さらに、Ｐｄ−キレート化コンジュゲート７６ｂは、依然として有効ではあるが、７６ａおよび７６ｃと比較してマウスにおける活性が低い。
【０２６０】
（実施例７）
葉酸を標的とする放出可能なビスダインコンジュゲートの前臨床評価。グループＣ：薬物のバイオアベイラビリティーを改善するための水溶性リンカー部分の変化形
【０２６１】
本実施例の目的は、水溶性のリンカーを有する放出可能なリンカーを介して、葉酸（葉酸、ビタミンＢ９）にコンジュゲートすることにより、ビスダインを葉酸受容体陽性腫瘍細胞に標的化し、がん細胞における光線力学的治療効果を評価し、腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中で最も活性のある分子に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することである。
ａ）合成
実施例Ｖにおいて６５ａに対して記載されているものと同様の方法および手順を使用して、すべての化合物を合成した。
ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表８】
2018537402.tif 000048
【０２６２】
葉酸およびミトコンドリアを標的とするビスダインコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を判定するため、実施例セクションの冒頭で以下に記載されているようにＫＢ細胞を使用した。ＥＣ５０値によりデータを報告する。これらのデータは、３つのコンジュゲート８１、８５、および８７はがん細胞において活性がないことを示した。
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
（８０）および（８６）を用いた、ＦＲ陽性ＫＢ腫瘍異種移植片の時間依存性全身画像化
【０２６３】
葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なビスダインのがん細胞に対する特異性を確証するために、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に化合物８０および８６を注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化により化合物の腫瘍蓄積をモニタリングした。時間依存性全身画像は、薬物投与の１時間以内に主に腫瘍内に両方のコンジュゲートが局在したことを示唆している。しかし、腫瘍中の蛍光は、葉酸−ＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ、６５ａ、７６ａおよび７６ｃ）より少なかった。これは、ＢＰｈｅｉｄ−ａとビスダインの間の光学特性の差異に起因し得る。本発明者らはまた、８０と８６とがマウスの眼に蓄積することに気が付いた。ビスダインは眼に蓄積する傾向にあると文献に十分記録されている。
【０２６４】
（実施例８）
葉酸を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの前臨床評価。グループＤ：がん細胞内でのカチオン性ＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体（正に荷電したＰＤＴ薬剤）の放出。
本実施例の目的は、細胞内でカチオン性ＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体を最終的に放出する、水溶性リンカーを有する放出可能なリンカーを介して、葉酸（葉酸、ビタミンＢ９）にコンジュゲートすることによって、ＢＰｈｅｉｄ−ａを葉酸受容体陽性腫瘍細胞に標的化することであった。第２の目的は、腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中で最も活性のある分子に対してがん細胞での光線力学的治療効果を評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏで全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することであった。
【化４１】
2018537402.tif 000049
【０２６５】
合成：すべての化合物は、実施例５において６５ａに対して記載されているものと同様の方法および手順を使用して合成した。
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表９】
2018537402.tif 000050
【０２６６】
葉酸およびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏの効力を判定するために、ＫＢ細胞を実施例セクションの冒頭で以下に記載されているように使用し、ＥＣ５０値を使用してデータを報告した。
【０２６７】
大部分の化合物は、非標的ＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）と比較して活性がある。化合物６５ａおよび８９ａは、このグループの中で極めて強力であり、８８ａおよび９２ａはまた、活性分子として考えることができる。
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
【０２６８】
葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａのがん細胞に対する特異性を確証するために、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に化合物８９ａを注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化により腫瘍蓄積をモニタリングした。２時間の時間点での全身画像は、葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａ（８９ａ）が主に腫瘍中に局在したことを示唆している。化合物８９ａは、ＦＲ陽性腫瘍に対して高度に特異的であり、蛍光が他の組織に観察されて、腫瘍とバックグラウンドとの高い比率をもたらした。さらに、腫瘍は、葉酸を標的とする放出不可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ）（および非標的ＢＰｈｅｉｄ−ａおよびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａ）よりも高度に蛍光性である。高い溶解度および分子放出により、ここで差異が生じた可能性がある。
【０２６９】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を、雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌの８９ａまたは９２ａでの処置の開始前に、約５０ｍｍ３まで増殖させた。薬物注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を、腫瘍容積の減少をモニタリングすることにより評価した。両化合物は腫瘍を完全に減少させ、より長い時間腫瘍退縮を示し、良好な臨床的候補として有望であることを示した。
【０２７０】
（実施例９）
葉酸を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａの前臨床評価  グループＥ：がん細胞内での双性イオンＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体（中性に荷電したＰＤＴ薬剤）の放出
本実施例の目的は、細胞内で中性に荷電したＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体を最終的に放出する、水溶性のリンカーを有する放出可能なリンカーを介して、葉酸（葉酸、ビタミンＢ９）にコンジュゲートすることにより、ＢＰｈｅｉｄ−ａを葉酸受容体陽性腫瘍細胞に標的化することである。第２の目的は、がん細胞中の光線力学的治療効果を評価し、細胞培養物中の最も活性のある分子に対して、腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することである。
【化４２】
2018537402.tif 000051
【０２７１】
（ａ）合成
【０２７２】
ＤＩＰＥＡ（２１ｕＬ、０．１２３ｍｍｏｌ、３当量）を、脱気したＤＭＦ（２ｍＬ）中のＢＰｈｅｉｄ−ａ（２５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１当量）およびＨＡＴＵ（１５．５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加え、内容物を、アルゴン下、２３℃で１５分間撹拌した。この後、脱気したＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の５−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１−オキソペンタン−２−アミニウムメチルスルフェート（３５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を反応容器に導入した。反応混合物を２３℃でもう１時間撹拌した。０．５ｍＬの水の添加によりカップリング試薬を破壊し、反応物を、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで精製して、暗褐色の固体として化合物（１６）を得た。
【０２７３】
化合物（１６）（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を、水（６ｍＬ）中の脱気した８０％ＴＦＡに溶解し、アルゴン下、２３℃で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗残渣を、Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで精製して、暗褐色の固体として、化合物（１８）を得た。
【０２７４】
ジイソプロピルエチルアミン（２９ｕＬ、０．１６３ｍｍｏｌ、２．４当量）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＢＰｈｅｉｄ−ａ（化合物２）（４０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、１当量）およびＨＡＴＵ（３０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に加えた。アルゴンを５分間反応混合物に十分にバブリングし、暗所で２０分間撹拌した（溶液Ａ）。別のフラスコ内で、２−（フェニルジスルファニル）エチルヒドラジンカルボキシレートをＤＭＦに溶解して、透明な溶液を形成した（溶液Ｂ）。カニューレを介して、溶液Ｂを溶液Ａに加え、内容物を１時間撹拌した。Ｃ１８カラムを使用する分取ＨＰＬＣで反応混合物を精製して、化合物（４）を得た。
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表１０】
2018537402.tif 000052
【０２７５】
葉酸をおよびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏの効力を判定するため、実施例セクションの冒頭で以下に示されている方法に従いＫＢ細胞を使用した。ＥＣ５０値によりデータを報告する。
【０２７６】
本発明者らが試験した３つの化合物は、非標的ＢＰｈｅｉｄ−ａ（１）と比較して活性がある。化合物９９および１００はグループの中で極めて強力である。
【０２７７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究：
（ｉ）（１００）を用いた、ＦＲ陽性ＫＢ腫瘍異種移植片の時間依存性全身画像化
【０２７８】
葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａのがん細胞に対する特異性を確証するために、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に化合物１００を注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化により腫瘍蓄積をモニタリングした。時間依存性全身画像は、１時間以内に葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａ（１００）が主に腫瘍内に局在したことを示唆している。化合物１００は、ＦＲ陽性腫瘍に対して高度に特異的であり、他の組織では蛍光は観察されず、腫瘍とバックグラウンドとの高い比率をもたらした。さらに、腫瘍は、葉酸を標的とする放出不可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ）（および非標的ＢＰｈｅｉｄ−ａおよびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａ）よりも高度に蛍光性がある。より高い溶解度および分子放出がここでの差異を説明し得る。
【０２７９】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌの９９または１００での処置の開始前に、約１００ｍｍ３まで増殖させた。薬物注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を、腫瘍容積の減少をモニタリングすることにより評価した。両化合物は、腫瘍を完全に治癒させ、２週間腫瘍退縮を示した。
【０２８０】
（実施例１０）
葉酸を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲートの前臨床評価。グループＦ：がん細胞内での、アニオン性修飾されたＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体（負に荷電した）の放出
【０２８１】
本実施例の目的は、細胞内で負電荷のＢＰｈｅｉｄ−ａ類似体を最終的に放出する水溶性リンカーを有する放出可能なリンカーを介して葉酸（葉酸、ビタミンＢ９）をコンジュゲートすることにより、ＢＰｈｅｉｄ−ａを葉酸受容体陽性腫瘍細胞に標的化することであった。第２の目的は、がん細胞中の光線力学的治療効果を評価し、腫瘍異種移植片を持つマウスにおいて、細胞培養物中で最も活性のある分子に対してｉｎ  ｖｉｖｏでの全身画像化能力およびＰＤＴ効力を評価することであった。
【化４３】
2018537402.tif 000053
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表１１】
2018537402.tif 000054
【０２８２】
葉酸およびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を判定するため、実施例セクションの冒頭で以下に示されているＫＢ細胞およびデータを、ＥＣ５０値により報告する。
【０２８３】
化合物６４および１０４の両方ががん細胞を活発に死滅させた。
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
（ｉ）全身画像化
【０２８４】
葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａのがん細胞に対する特異性を確証するため、化合物１０４を、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化により腫瘍蓄積をモニタリングした。時間依存性全身画像は、１時間以内に、葉酸およびミトコンドリアを標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａ（１０４）が主に腫瘍中に局在したことを示唆している。化合物１０４は、ＦＲ陽性腫瘍に対して高度に特異的であり、他の組織において蛍光は観察されなかった。したがって、化合物１０４は、腫瘍とバックグラウンドとの高い比率をもたらすのに有用である。さらに、腫瘍は葉酸を標的とする放出不可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ）（および非標的ＢＰｈｅｉｄ−ａおよびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａ）よりも高度に蛍光性である。より高い溶解度および分子放出が、この差異を説明し得る。
【０２８５】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌの１０４での処置の開始前に、約２０ｍｍ３まで増殖させた（化合物６４に対する同様のデータが以前の実施例において報告されている）。薬物注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍容積の減少をモニタリングすることで、コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を評価した。化合物６４および１０４は、腫瘍を完全に治癒させることができ、２週間腫瘍退縮を示した。両化合物とも臨床用候補と考えられる。
（実施例１１）
葉酸を標的とする放出可能なＢＰｈｉｅｄ−ａの前臨床評価  グループＧ：混合型
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【表１２】
2018537402.tif 000055
【０２８６】
葉酸および核を標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を判定するため、実施例セクションの冒頭で以下に記載されているＫＢ細胞およびデータを、ＥＣ５０値により上記に報告する。
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
（ｉ）全身画像化
【０２８７】
葉酸および核を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａのがん細胞に対する特異性を確証するため、化合物１１２ａを、ＫＢ腫瘍を持つヌードマウスの肩に注射し、ＩＶＩＳ撮影装置を使用する蛍光画像化により腫瘍蓄積をモニタリングした。全身画像は、葉酸および核を標的とする放出可能なＢＰｈｅｉｄ−ａ（１１２ａ）が主に腫瘍中に局在したことを示唆している。化合物１１２ａはＦＲ陽性腫瘍に対して高度に特異的であり、他の組織には蛍光は存在しなかった。したがってこの化合物は、腫瘍とバックグラウンドとの高い比率を生じる。さらに、腫瘍は、葉酸を標的とする放出不可能なＢＰｈｅｉｄ−ａコンジュゲート（５９ａ）（および非標的ＢＰｈｅｉｄ−ａおよびミトコンドリアを標的とするＢＰｈｅｉｄ−ａ）より高度に蛍光性である。より高い溶解度および分子放出が、ここでの差異をもたらした可能性がある。
【０２８８】
葉酸受容体を過剰発現したＫＢ細胞を雌のヌードマウスに皮下移植し、５０ｎｍｏｌの１１７での処置の開始前に、約２０ｍｍ３まで増殖させた。薬物注射の３時間後、腫瘍をレーザービーム（７５ｍＷ／ｃｍ２、１３７Ｊ／ｃｍ２、曝露直径＝７．５〜８ｍｍ）で３８分間処置した。腫瘍容積の減少をモニタリングすることによって、コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏで効力を評価した。化合物１１７は、腫瘍を完全に治癒させることができ、３週間腫瘍退縮を示した。
【図１−１】
2018537402.tif 000115
【図１−２】
2018537402.tif 000116
【図１−３】
2018537402.tif 000117
【図２】
2018537402.tif 000118
【図３】
2018537402.tif 000119
【図４−１】
2018537402.tif 000120
【図４−２】
2018537402.tif 000121
【図５−１】
2018537402.tif 000122
【図５−２】
2018537402.tif 000123
【図５−３】
2018537402.tif 000124
【図５−４】
2018537402.tif 000125
【図５−５】
2018537402.tif 000126
【図５−６】
2018537402.tif 000127
【図５−７】
2018537402.tif 000128
【図５−８】
2018537402.tif 000129
【図５−９】
2018537402.tif 000130
【図６−１】
2018537402.tif 000131
【図６−２】
2018537402.tif 000132
【図７】
2018537402.tif 000133
【図８】
2018537402.tif 000134
【図９Ａ】
2018537402.tif 000135
【図９Ｂ】
2018537402.tif 000136
【図９Ｃ】
2018537402.tif 000137
【図９Ｄ】
2018537402.tif 000138
【図９Ｅ】
2018537402.tif 000139
【図９Ｆ】
2018537402.tif 000140
【図９Ｇ】
2018537402.tif 000141
【図９Ｈ】
2018537402.tif 000142
【図９Ｉ】
2018537402.tif 000143
【図９Ｊ】
2018537402.tif 000144
【図１０】
2018537402.tif 000145
【図１１Ａ】
2018537402.tif 000146
【図１１Ｂ】
2018537402.tif 000147
【図１１Ｃ】
2018537402.tif 000148
【図１１Ｄ】
2018537402.tif 000149
【図１１Ｅ】
2018537402.tif 000150
【図１１Ｆ】
2018537402.tif 000151
【図１２】
2018537402.tif 000152
【図１３】
2018537402.tif 000153
【図１４】
2018537402.tif 000154
【図１５−１】
2018537402.tif 000155
【図１５−２】
2018537402.tif 000156
【図１６Ａ】
2018537402.tif 000157
【図１６Ｂ】
2018537402.tif 000158
【図１６Ｃ】
2018537402.tif 000159
【図１６Ｄ】
2018537402.tif 000160
【図１６Ｅ】
2018537402.tif 000161
【図１７】
2018537402.tif 000162
【図１８】
2018537402.tif 000163
【図１９】
2018537402.tif 000164
【図２０】
2018537402.tif 000165
【図２１】
2018537402.tif 000166
【図２２Ａ】
2018537402.tif 000167
【図２２Ｂ】
2018537402.tif 000168
【図２２Ｃ】
2018537402.tif 000169
【図２２Ｄ】
2018537402.tif 000170
【図２２Ｅ】
2018537402.tif 000171
【図２２Ｆ】
2018537402.tif 000172
【図２２Ｇ】
2018537402.tif 000173
【図２２Ｈ】
2018537402.tif 000174
【図２３】
2018537402.tif 000175
【図２４−１】
2018537402.tif 000176
【図２４−２】
2018537402.tif 000177
【図２５Ａ】
2018537402.tif 000178
【図２５Ｂ】
2018537402.tif 000179
【図２５Ｃ】
2018537402.tif 000180
【図２５Ｄ】
2018537402.tif 000181
【図２５Ｅ】
2018537402.tif 000182
【図２５Ｆ】
2018537402.tif 000183
【図２５Ｇ】
2018537402.tif 000184
【図２５Ｈ】
2018537402.tif 000185
【図２５Ｉ】
2018537402.tif 000186
【図２５Ｊ】
2018537402.tif 000187
【図２５Ｋ】
2018537402.tif 000188
【図２６】
2018537402.tif 000189
【図２７】
2018537402.tif 000190
【図２８】
2018537402.tif 000191
【図２９】
2018537402.tif 000192
【図３０Ａ】
2018537402.tif 000193
【図３０Ｂ】
2018537402.tif 000194
【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３５Ｈ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４０Ｇ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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