(57)【要約】  本発明は、低密度顆粒球遺伝子または１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現に基づいて、自己免疫性または免疫介在性疾患に罹患している患者の抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する方法に関する。また、本発明を実施する検査キット、関連する治療方法、および治療に対する応答をモニタリングする方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象の応答を予測する方法であって、前記対象から得られた試料を分析して低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子のレベルを決定することを含み、ここで前記標的分子のレベルが参照レベルと比較して増加している場合は、前記対象が抗ＴＮＦ療法に対して好ましくない応答を示すと予測する、方法。
【請求項２】
前記ＬＤＧ遺伝子が、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、請求項２に記載のバイオマーカーの２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、または１３種のそれぞれの発現を示す標的分子のレベルを決定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記参照レベルが、自己免疫性または免疫介在性障害のない対象由来の試料に含まれる標的分子のレベルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、バイオマーカーＲＮＡＳＥ３、および任意にＲＮＡＳＥ２の発現を示す標的分子のレベルを決定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡＳＥ３のレベルの増加が、参照値に対して少なくとも０．７５倍、１倍または１．２倍またはそれ以上の差である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象の応答を予測する方法であって、前記対象から得られた試料を分析してＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することを含み、その標的分子のレベルが、自己免疫性または免疫介在性障害のない対象に由来する試料に含まれる標的分子のレベルと比較して増加している場合は、前記対象が抗ＴＮＦ療法に対して良好な応答を示すと予測する、方法。
【請求項８】
前記方法が、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される異なるバイオマーカーの発現を示す１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、または６種の標的分子のレベルを決定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象の応答を予測することを含む、請求項１に記載の方法であって、ここで前記方法が、前記対象から得られた試料を分析して、ｉ）ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群から選択されるバイオマーカーの発現を示す標的分子、およびｉｉ）ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することであって、ここで自己免疫性または免疫介在性障害のない対象に由来する試料に含まれる標的分子のレベルと比較して、ｉ）のレベルは実質的に増加せず、およびｉｉ）のレベルが増加している場合は、前記対象が抗ＴＮＦ療法に対して良好な応答を示すと予測する、方法。
【請求項１１】
前記方法が、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１Ｂ、およびＲＮＡＳＥ３のレベルを決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ｉ）抗ＴＮＦ療法に対する非応答を予測する遺伝子特性を与える、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３のそれぞれの発現を示す標的分子のレベルを決定すること、およびｉｉ）抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する遺伝子特性を与える、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂのそれぞれの発現を示す標的分子のレベルを決定することを含む、方法。
【請求項１３】
自己免疫性または免疫介在性障害が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、血管炎、若年性皮膚筋炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＴＮＦ療法が、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質またはＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、小分子ＴＮＦアンタゴニストおよび類似の天然または非天然分子、および／またはＴＮＦを阻害するそれらの組換えおよび／または改変された形態からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＴＮＦ療法が、インフリキシマブ（Remicade）、アダリムマブ（Humira）、セソリズマブペゴール（Cimzia）、およびゴリムマブ（Simponi）などのモノクローナル抗体；エタネルセプト（Enbrel）などの循環受容体融合タンパク質；およびキサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリンおよびブプロピオン）などの単純分子からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
試料が全血試料である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が好中球画分、好ましくは精製した好中球画分である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＴＮＦ療法に対する良好な応答が、疼痛、炎症、腫脹または硬直の緩和、運動機能の改善、疾患の進行抑制、寛解期間の延長を含む、請求項７および請求項７に従属する場合の請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
疾患が関節リウマチであり、良好な応答が、抗ＴＮＦ療法の開始後１２週におけるＤＡＳ２８の変化が０．８以上、好ましくは１以上、さらに好ましくは１．２以上であり、および／または、抗ＴＮＦ療法の開始後１２週におけるＤＡＳ２８が３．２以下である、請求項７および請求項７に従属する場合の請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＴＮＦ療法に対する不良な応答が、疼痛、炎症、腫脹または硬直の増進または無変化、運動機能の低下または無変化、疾患の進行または無変化、寛解期間の延長または無変化を含む、請求項１〜６のいずれか１項および請求項１〜６に従属する場合の請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
疾患が関節リウマチであり、不良な応答が、抗ＴＮＦ療法の開始後１２週におけるＤＡＳ２８の変化が１以下、１．２以下、または１５．５以下である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
標的分子が核酸であり、好ましくはｍＲＮＡである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ｍＲＮＡがトランスクリプトームである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標的分子のレベルを決定する方法が、ハイブリダイゼーション技術、定量的ＰＣＲおよびハイスループットシークエンシングからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的分子のレベルを決定する方法がハイスループットシークエンシングであり、例としてＳＡＧＥ(serial analysis of gene expression)およびＲＮＡ−ｓｅｑなどのタグを用いたシークエンシングからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、さらに試料からのｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡを得るための逆転写酵素を用いる工程、ｃＤＮＡ群の増幅、およびｃＤＮＡ群のシークエンシングから構成される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。このような方法には、ｍＲＮＡ群の断片化、ｍＲＮＡへのアダプターの結合、およびｃＤＮＡ群へのバーコードの付与がさらに含まれる。
【請求項２７】
前記方法が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、およびＳＯＬｉＤ（商標）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、複数の試料を同時的、逐次的、または個別的に分析することを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
表４に示した１組以上のプライマー対、および任意に１組以上の取扱説明書、少なくとも検査キットのプライマー対に関連したバイオマーカーに対する参照値または基準値を示した図表、および試薬、を含む検査キット。
【請求項３０】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療する方法であって、ここで対象の試料に含まれる低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子が、自己免疫性または免疫介在性障害を有しない対象の試料に含まれる標的分子のレベルと比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであって、前記方法が、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む、方法。
【請求項３１】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療する方法であって、ここで対象の試料に含まれるバイオマーカーの発現を示す標的分子が増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものである、請求項２〜６のいずれか１項、および請求項２〜６のいずれか１項に従属する場合の請求項１０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療する方法であって、ここで対象の試料に含まれる、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群より選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子が、自己免疫性または免疫介在性障害を有しない対象の試料に含まれる標的分子のレベルと比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであって、前記方法が、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む、方法。
【請求項３３】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療する方法であって、ここでｉ）対象の試料に含まれる低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれる、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群より選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであって、前記方法が、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載された方法であって、ここでｉ）対象の試料に含まれる、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３のそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれる、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂのそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであって、前記方法が、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む、方法。
【請求項３５】
抗ＴＮＦ療法に対する自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療する方法であって、ここでｉ）対象の試料に含まれる低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれる、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群より選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないことが事前に決定（あるいは推定）されたものであって、前記方法が、抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法を対象に実施することを含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載された方法であって、ここでｉ）対象の試料に含まれる、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３のそれぞれの発現を示す標的分子が参照レベルと比較して増加していないこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれる、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂのそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであって、前記方法が、抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法を対象に実施することを含む、方法。
【請求項３７】
治療に対する応答をモニタリングする方法であって、前記方法は、自己免疫性または免疫介在性障害の活動性を決定することを含み、ここで対象が請求項７〜９のいずれか１項および請求項７〜９のいずれか１項に従属する場合の請求項１０〜２９のいずれか１項に記載の抗ＴＮＦ療法に対して良好な応答を有することが事前に予測されたものであって、ここで患者は、抗ＴＮＦ療法が実施されている、方法。
【請求項３８】
対象のための治療計画を選択する方法であって、前記対象から得られた試料を分析することを含み、ここで前記方法は、前記対象が、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗ＴＮＦ療法に対する応答者または非応答者であるかどうかを予測することを含み、ここで第１の側面による標的分子のレベル増加は、前記対象が抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法から利益を受けることを示し、ここで第２の側面による標的分子のレベル増加は、前記対象が抗ＴＮＦ療法から利益を受けることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性または免疫介在性疾患に罹患している患者の抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、英国の５０万人以上の成人の障害および生活の質の低下をもたらす全身性炎症性疾患である。また、若年死の原因ともなっている。関節リウマチは、関節の滑液を攻撃し、関節包の炎症および肥厚の原因となる。罹患した関節は圧痛、発熱、腫れを生じ、関節のこわばりによって運動が制限される。最も一般的に罹患するのは、手、足、頚椎の関節であるが、肩や膝のような大きな関節が影響を受ける場合もある。眼、心臓、肺、皮膚などの他の多くの臓器もこの病気の影響を受ける可能性がある。現在、関節リウマチは遺伝的要因と環境的要因の組み合わせの結果であると考えられている。
【０００３】
本疾患は異なる起原によるものであり、薬物療法に対する反応は罹患者によって大きく異なる。慢性疾患に進行する可能性のある患者の識別精度を上げるため、２０１０年に米国リウマチ学会（ＡＣＲ）と欧州リウマチ連盟（ＥＵＬＡＲ）の関節リウマチ分類基準が導入された。その分類基準は、関節浸潤、リウマチ因子（ＲＦ）およびＡＣＰＡ（抗シトルリン化タンパク質抗体）を含む血清学的パラメータ、急性期炎症反応性物質、および罹病期間を含む基準に基づいて、０〜１０点の値で評価される。
【０００４】
点数が６点以上だと、関節リウマチと診断されるべき患者であると明確に分類される。関節の破壊が起こる以前の早期に診断するためには、血清学および自己免疫に関する診断が重要な役割を果たす。
【０００５】
関節リウマチの寛解を評価する方法は多くある。２８関節の疾患活動性指数（ＤＡＳ２８）は、関節リウマチの疾患活動の指標および治療に対する応答として広く使用されている。 ＤＡＳ２８を用いて、罹患者の疾患活動を分類することができる。
【０００６】
関節リウマチの治療は、痛みや腫れを最小限に抑え、骨の変形を防ぎ、日常的な機能を維持することを目指している。最前線の関節リウマチの治療方法には、メトトレキサートなどの疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）が含まれる。 多くの患者がＤＭＡＲＤｓに良好に反応する一方、かなりの割合（約３０％）で疾患の適切な制御に達することができない。
【０００７】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎、腹膜炎、難治性喘息などの自己免疫性および免疫介在性疾患に関連する臨床上の問題と関係する。通常のＤＭＡＲＤに応答しない患者には、抗ＴＮＦ製剤などの生物学的なＤＭＡＲＤを処方されることがある。生物学的製剤は高価であり、英国では疾患活動度が最も高い患者（ＤＡＳ２８＞５．１）のみに処方される。同様に、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎などの他の炎症性関節炎を有する患者に対して抗ＴＮＦ療法による治療を行うためには、第一選択薬に応答せず、かつ疾患活動度が高いことが示される必要がある。残念ながら、抗ＴＮＦ療法を受けている患者の約４０％が十分な反応を達成または維持することができず、適切な療法が見出されるまで一連の代替的な生物学的ＤＭＡＲＤを用いて試行錯誤する必要が生じている。薬剤耐性患者において適切な疾患制御がこのように遅延することは、関節に深刻かつ不可逆的な損傷をもたらし、貴重な医療資源を浪費する。例えば、現在、抗ＴＮＦ療法による１年間の治療費は、患者１人当たり約１２，０００ポンドであり、したがって、医療および福祉システムにとって相当な負担となっている。
【０００８】
これらの理由から、ある患者の抗ＴＮＦ療法に対する反応の見込みを予測できることが望まれる。
【０００９】
Sekiguchi ら(Rheumatology 2008 47:780-788)には、関節リウマチの治療において、抗ＴＮＦ生物学的製剤であるインフリキシマブに応答を示す患者とそうでない患者で発現が異なる遺伝子として、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２およびＩＦＩＴ１が同定されたことが記載されている。
【００１０】
WO2008/132176には、ＩＦＩ４４およびＬＹ６Ｅを含むバイオマーカーの発現量が増加した患者が生物学的製剤に対する良い応答を示すことを用いて患者を分類する、関節リウマチを治療するための抗ＴＮＦ療法に対する患者の応答を評価する方法が記載されている。この評価方法は、患者の滑液に対して行われる。
【００１１】
US2009/0142769には、ＣＸＣＬ１０、Ｃ１ｏｒｆ２９、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩ４４、ＰＲＫＲ、 ＯＡＳ３、ＧＢＰ１、ＩＲＦ１、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＣＸＣ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＩ１０、ＰＳＭＢ８、ＧＰＲ１０５、ＣＤ６４、ＦＣＧＲ１Ａ、ＩＬ−１ｒａ、ＴＮＲＳＦ１Ｂから選択される少なくとも１種のインターフェロン誘導遺伝子の発現を検出することによる、関節リウマチなどの疾患を有し、抗ＴＮＦ療法に応答する患者を識別する方法が記載されている。また著者らは、ＩＦＮβ／α比が高いことが抗ＴＮＦ療法に対する良好な応答の指標となることも示している。
【００１２】
WO2012/066536には、抗ＴＮＦ療法に応答する患者または応答しない患者の識別方法が記載されている。バイオマーカーには、良好な反応を示すものとしてＩＦＩＴ１およびＩＦＩ４４の発現が含まれる。
【００１３】
抗ＴＮＦ療法に応答する患者の識別は有用であるが、それらの方法は、抗ＴＮＦ療法に対して良い応答を示す患者を識別することはできるかもしれない。しかし、そういった方法は、抗ＴＮＦ療法に応答する可能性のない患者をより良く識別できるかという点で改善が必要であることが分かる。
【発明の概要】
【００１４】
第１の側面において、本発明は自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象の抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する方法を提供する。この方法は、対象から得られた試料を分析し、低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子のレベルを決定することを含み、その標的分子のレベルがベースライン値と比較しより高い場合は、対象が抗ＴＮＦ療法に対して不良な応答を示すと予測する。
【００１５】
ＬＤＧ遺伝子は、ＬＤＧ細胞により特異的に発現する遺伝子であってもよい。それは、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群から選択される１種以上の遺伝子であってもよい。
【００１６】
第２の側面において、本発明は、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象の抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する方法を提供する。この方法は、対象から得られた試料を分析し、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することを含み、その標的分子のレベルがベースライン値と比較しより高い場合は、対象が抗ＴＮＦ療法に対して良好な応答を示すと予測する。
【００１７】
一実施形態において、この第２の側面は、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することをさらに含んでもよい。
【００１８】
第３の側面において、本発明は、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象の抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する方法を提供する。この方法は、対象から得られた試料を分析し、ｉ）低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子と、ｉｉ）ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される１つ以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することを含み、ｉ）のレベルがベースライン値と比較して実質的に高くはなく、かつｉｉ）のレベルがベースライン値と比較してより高い場合は、対象が抗ＴＮＦ療法に対して良好な応答を示すと予測する。
【００１９】
本発明の実施形態を、添付図面を参照して以下にさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、Ingenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ）分析の結果を示したものである。ＩＰＡによって、（Ａ）ＴＮＦｉに応答する患者においてインターフェロンによるシグナル伝達系が治療開始前に有意に上方制御され、（Ｂ）ＴＮＦｉに応答する患者において、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）制御遺伝子が下方制御され、したがって、逆にＴＮＦｉ非応答の患者においては上方制御されることが予測された。＊＝上方制御、§＝下方制御、灰色＝変化なし。
【図２】図２は、関節リウマチ患者由来の末梢血好中球で実施された試験をグラフで示したものである。最初のコホート試験において、ＴＮＦｉに応答する患者と非応答の患者との間で発現レベルに有意に差が認められた（ｅｄｇｅＲ  ＦＤＲ＜０．０５）１０種のＩＦＮ関連遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の発現レベル（１００万読み取りあたり、１，０００塩基長あたりの転写量の読取り値（ＲＰＫＭ））。応答は、０週目から１２週目までのＤＡＳ２８の減少度として測定した。ＤＡＳ２８が１．２以上減少した場合を応答として分類した。
【図３】図３は、最初のコホート試験のＲＰＫＭ発現レベルをグラフで示したものである。最初のコホート試験からのＴＮＦｉに対する「良好な」応答の患者および非応答の患者における１０種のＩＦＮ関連遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の発現レベル（ＲＰＫＭ）。応答は、ＥＵＬＡＲ判定基準における良好な応答、および非応答を使用し、０週目から１２週目までのＤＡＳ２８の減少度として測定した。
【図４】図４は、検証試験をグラフで示したものである。検証コホート試験におけるＴＮＦｉに対する「良好な」応答の患者、および非応答の患者における１０種のＩＦＮ関連遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の発現レベル（ｑＰＣＲ  ＭＮＥ）。応答は、ＥＵＬＡＲ判定基準における良好な応答、および非応答を使用し、０週目から１２週目までのＤＡＳ２８の減少度として測定した。
【図５】図５は、検証コホート試験において、ＤＭＡＲＤ未投与の患者の発現レベルをグラフで示したものである。検証コホート試験における、ＤＭＡＲＤ未投与の患者における１０種のＩＦＮ関連遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の発現レベル（ｑＰＣＲ  ＭＮＥ）。応答は、ＥＵＬＡＲ判定基準における良好な応答、および非応答を使用し、０週目から１２週目までのＤＡＳ２８の減少度として測定した。
【図６】図６は、予測因子となる遺伝子の良い組み合わせを同定するために、１０種のＩＦＮ調節遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の段階的回帰分析を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、抗ＴＮＦ療法に応答しない対象を予測する遺伝子発現特性の同定および検証に基づいている。具体的には、末梢血好中球のトランスクリプトーム解析（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を用いることで、低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子群の発現が、関節リウマチなどの自己免疫性または免疫介在性障害を持つ対象への抗ＴＮＦ治療に対する応答と関連している。本発明はさらに、抗ＴＮＦ療法に対する良好な応答に関連するインターフェロン関連遺伝子のさらなる発現特性の同定に基づいている。これら２つの遺伝子発現特性は互いに排他的であり、したがって、自己免疫性または免疫介在性障害における抗ＴＮＦ療法に対する応答の予測に、高い感度および特異性を提供する。
【００２２】
したがって、本発明は、好ましくは対象が抗ＴＮＦ療法を開始する前に、抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測する臨床試験の可能性を提供する。このような検査により、患者は抗ＴＮＦ療法に応答する可能性があるかどうかを臨床医に伝え、患者が応答しそうにないと予測される場合に臨床医は代替療法を開始することができる。これは、現在の「試行錯誤」的手法に頼らず、早期に適切な治療法による処置を目指すことによって患者に利益をもたらす。したがって、このような試験の結果、最大の効果が達成されるであろう疾患の初期段階の患者に対して抗ＴＮＦ治療を選択することができ、結果としてより費用効率の高い使い方でこれらの製剤を利用できる可能性がある。
【００２３】
本明細書に記載のバイオマーカーのいくつかは、抗ＴＮＦ療法に対する良好な応答と関連するものとして過去に明らかにされている。本発明は、非応答を識別することができることが特徴であるため、そのような非応答の患者に代替治療を提供することが可能であり、非応答ではない（したがって中程度または良好な応答の）患者に対しては抗ＴＮＦ療法を提供することができる。「良好な」応答を示す患者のみが識別され、利益を得ることができる中程度の応答を示す患者を特定できない以前の予測方法と比較し、非応答を識別することにより、中程度の応答および良好な応答を示す患者の両方が、抗ＴＮＦ療法に適していると識別される。したがって、本発明の結果、より選択されやすく、費用効率の良い方法として抗ＴＮＦ療法が利用される。
【００２４】
本発明は、好ましくない応答を示すものとして先行技術では予測されることのなかったバイオマーカーと、さらに良好な応答を示すバイオマーカーを用いて、抗ＴＮＦ療法に対する応答の予測のために改良された方法を提供する。
【００２５】
患者（patient）および対象（subject）という用語は、本明細書中で互換的に使用され、抗ＴＮＦ療法に対して応答するかどうかを判定することが望ましい個人を指す。そのような個人は、自己免疫性または免疫介在性障害を有するか、または有している可能性があり、またはそれらを発症する傾向がある。
【００２６】
本明細書で使用されるバイオマーカーとは、ある過程、事象または状態に対して生物学的に誘導された指標である。バイオマーカーは、臨床スクリーニングなどの診断法、予後評価、治療結果のモニタリング、特定の治療処置に最も応答する可能性のある患者の識別、医薬品のスクリーニングおよび開発に用いることができる。バイオマーカーは、抗ＴＮＦ療法に対して応答する患者と非応答の患者との間で、発現に差異のある遺伝子であり得る。バイオマーカー遺伝子の発現（転写および付随的な翻訳）は、本明細書において標的分子と呼ばれる遺伝子の発現産物を測定して決定することができる。本明細書において、２つ以上のバイオマーカーの組み合わせは、抗ＴＮＦ療法に対する応答の有無と相関する群または遺伝子特性と呼ぶことができる。
【００２７】
本明細書で定義される自己免疫性または免疫介在性障害は、限定されないが、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ベーチェット症候群、炎症性腸疾患、血管炎、若年性皮膚筋炎、強皮症、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬および全身性エリテマトーデスを含むことができる。
【００２８】
抗ＴＮＦ療法とは、例えばＴＮＦに対する細胞表面受容体との相互作用を阻害すること、ＴＮＦタンパク質産生を阻害すること、ＴＮＦ遺伝子発現を阻害すること、細胞からのＴＮＦ分泌を阻害すること、ＴＮＦ受容体のシグナル伝達を阻害すること、または対象のＴＮＦ活性を低下させる他の方法によって、ＴＮＦ活性を好ましくは直接阻害する治療法である。抗ＴＮＦ療法はＴＮＦ阻害（ＴＮＦｉ）療法とも呼ばれる。抗ＴＮＦ治療薬は、ＴＮＦ阻害剤またはＴＮＦアンタゴニストと呼ばれ、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質またはＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、小分子ＴＮＦアンタゴニストおよび類似の天然または非天然分子、および／または前述のようにＴＮＦを阻害し、特に異常なＢ細胞活性を排除する組換えおよび／または改変された形態を含むことができる。抗ＴＮＦ療法には、インフリキシマブ（Remicade）、アダリムマブ（Humira）、セソリズマブペゴール（Cimzia）、およびゴリムマブ（Simponi）などのモノクローナル抗体や、エタネルセプト（Enbrel）などの循環受容体融合タンパク質を含み、また、機能的等価物、バイオシミラーまたはそれら医薬品の意図された複製、およびキサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリンおよびブプロピオン）などの単純分子も含まれる。
【００２９】
応答を予測することとは、対象における治療効果の見込みを判定することを意味する。予測とは、典型的には、関連する治療を開始する前に行われる評価を意味するが、対象が代替的な治療を受けている間に特定の治療に対して起こりうる応答を予測する事とも理解される。本発明の範囲内において、治療に対する応答を予測するとは、抗ＴＮＦ療法に対して継続的に応答するかどうかを評価することも含まれる。従って、応答の予測には、抗ＴＮＦ療法を実施中に起こりうる応答を判定することが含まれる。
【００３０】
試料は、生検試料のような組織試料や、体液試料を含む群から選択したものでよい。体液試料は血液試料であってもよい。血液試料は末梢血試料であってもよい。それは全血試料またはその細胞抽出物であってもよい。それは血液試料の白血球画分または好中球画分であってもよい。さらなる実施形態では、試料は精製された好中球画分である。
【００３１】
本明細書において、標的分子のレベルとは、試料中の標的分子の量の尺度を指す。そのレベルは、特定のバイオマーカー（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）が特異的に発現していることを示す、一種類の標的分子の測定に基づくことができる。また、そのレベルは、特定のバイオマーカー（すなわち、２つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質）が特異的に発現していることを示す２種類以上の標的分子の複合的な測定に基づくことができる。標的分子のレベルは、標的分子の量（例えば、濃度（ｍｇ／ｖｏｌ試料）またはＲＰＫＭ）の直接測定として表すことができる。
【００３２】
高いレベルとは、自己免疫性または免疫介在性障害を有さない対象における同じ標的分子（対照試料）のレベルと比較して、標的分子のレベル（すなわち、量）が増加していることを意味する。高いレベルには、対照と比較して統計的に有意な増加が含まれる。自己免疫性または免疫介在性障害を有さない対象におけるバイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルは、参照値またはベースライン値と呼ぶことができる。
【００３３】
検査中の患者試料に存在する標的分子の量を、対照試料に存在する標的分子の量を表す参照値と比較することによって、遺伝子発現を表す標的分子のレベルの高さを評価することができる。
【００３４】
本明細書において、標的分子またはバイオマーカーの発現が「同じ」レベルであるとは、試料のバイオマーカーの発現が参照値またはベースライン値と同一であることを示す。本明細書において、標的分子またはバイオマーカーの発現が「同様の」レベルであるとは、試料のバイオマーカーの発現が参照値またはベースライン値と同一ではないが、それらの間の差異が統計的に有意でない、すなわち、それらのレベルが同等の量であることを示す。
【００３５】
参照値またはベースライン値を決定するのに適した対照試料は、自己免疫性または免疫介在性障害を持たない個人から得られたものでよい。それは、検査対象である特定の自己免疫性または免疫介在性障害を持たない、またはより好ましくは、どのような自己免疫性または免疫介在性障害も持たない個人であってよい。対照試料は、検査中の患者に年齢を合わせてもよい。参照値またはベースライン値は、適切な個人から得られ、複数の分析のために一般的な参照値として使用することができる。
【００３６】
抗ＴＮＦ療法における良好な応答とは、特に限定されないが、疼痛、炎症、腫脹または硬直の緩和、運動機能の改善、疾患の進行抑制、寛解期間の延長、機能の改善、生活の質の改善が含まれる。関節リウマチにおける良好な応答とは、骨損傷の進行抑制も含まれる。関節リウマチにおける良好な応答とは、抗ＴＮＦ療法の開始後１２週において、対象のＤＡＳ２８の変化が０．８以上、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上となる場合と定義することができる。良好な応答とは、さらに、抗ＴＮＦ療法の開始後１２週において、ＤＡＳ２８が３．２以下となった場合と定義することもできる。
【００３７】
抗ＴＮＦ療法における不良な応答とは、特に限定されないが、疼痛、炎症、腫脹または硬直の増進または無変化、運動機能の低下または無変化、疾患の進行または無変化、寛解期間の延長または無変化、機能の改善不良、生活の質の改善不良が含まれる。関節リウマチにおける不良な応答とは、骨損傷の進行あるいは無変化も含まれる。関節リウマチにおける不良な応答とは、抗ＴＮＦ療法の開始後１２週において、対象のＤＡＳ２８の変化が１以下、１．２以下、または１．５以下となる場合と定義することができる。
【００３８】
疾患の活動性には、例えば、寛解、進行または疾患の重篤度が含まれる。疾患の活動性を判定する方法は、当技術分野において利用可能であり、一実施形態において利用することができる。例えば関節リウマチの場合、２８関節の疾患活動性指数（ＤＡＳ２８）を含む多くの方法を利用することができる。このことから、罹患者の疾患活動性は以下のように分類することができる：
【表１】
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【００３９】
関節リウマチの寛解をモニタリングする他の方法には、ＡＣＲ−ＥＵＬＡＲの暫定定義、簡易疾患活動指数（Simplified Disease Activity Index ＝ＳＤＡＩ）および臨床疾患活動指数（Clinical Disease Activity Index ＝ＣＤＡＩ）が含まれる。他の疾患の評価方法には、ＰｓＡＲＣ（乾癬性関節炎）、ＰＡＳＩ（乾癬）、ＢＡＳＤＡＩ（強直性脊椎炎）が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される標的分子は、バイオマーカータンパク質およびバイオマーカータンパク質をコードする核酸を含む群から選択することができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。一実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。本明細書中の標的分子として参照されるものには、１種の生物学的分子（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはタンパク質）、それら生物学的分子の２種以上の組み合わせ、または同じバイオマーカーの発現を示す全ての指標物質が含まれる。
【００４１】
結合パートナーは、相補的核酸、アプタマー、受容体、抗体または抗体フラグメントを含む群から選択することができる。特異的結合パートナーとは、標的分子ではない分子との非特異的結合と区別できるように、標的分子の少なくとも１つに結合することができる結合パートナーを意味する。例として、適切な区別は、その結合度合いにおいて区別が可能な差異に基づくことができる。
【００４２】
本発明は、調査する複数のバイオマーカーの合算によって生じる増加度の分析を提供する。分析は、比較的簡単な手段を用いて行うことができ、また、より複雑なアルゴリズムを用いて行うこともできる。本発明の手段において、標的分子の発現に関連する結果の分析に使用することができる周知かつ自由に利用可能なソフトウェアの例は、以下の段落に記載する。よい結果を達成する分析を行う好ましい手段により、本発明のさらに有用な側面および実施形態が生みだされる。
【００４３】
ＬＤＧ遺伝子とは、ＬＤＧ細胞が特異的に発現する遺伝子を意味する。ＬＤＧ遺伝子は、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群から選択することができる。
【００４４】
インターフェロン関連遺伝子とは、インターフェロンのシグナル伝達経路に含まれる発現産物をコードする遺伝子を意味する。ここで、インターフェロン関連遺伝子は、ＣＭＰＫ２、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩ６、ＩＦＩＴ１Ｂ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群から選択することができる。
本開示の目的のために、以下のタンパク質の名称が使用される：
【００４５】
ＡＺＵ１は、アズロフィル顆粒球抗菌タンパク質であり、カチオン性抗菌タンパク質またはヘパリン結合タンパク質としても知られているアズロシジンをコードする遺伝子である。
【００４６】
ＢＰＩは、転写因子殺菌性／浸透性増強タンパク質をコードする遺伝子である。
【００４７】
ＣＥＡＣＡＭ８は、ＣＤ６６ｂ（表面抗原分類６６ｂ）としても知られている癌胎児性抗原関連細胞接着分子８（ＣＥＡＣＡＭ８）をコードする遺伝子である。
【００４８】
ＣＲＩＳＰ３は、高システイン分泌タンパク質３をコードする遺伝子である。
【００４９】
ＣＴＳＧは、カテプシンＧをコードする遺伝子であり、ＣＧおよびＣＡＴＧとしても知られている。
【００５０】
ＤＥＦＡ４は、ディフェンシンをコードする遺伝子のアルファ４（ＤＥＦＡ４）であり、好中球ディフェンシン４またはＨＮＰ４としても知られている。
【００５１】
ＥＬＡＮＥは、好中球エラスターゼＧＥ、ＮＥ、ＨＬＥ、ＨＮＥ、ＥＬＡ２、ＳＣＮ１、ＰＭＮ−Ｅとしても知られているエラスターゼをコードする遺伝子である。
【００５２】
ＬＣＮ２は、癌遺伝子２４ｐ３または好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）としても知られているリポカリン−２（ＬＣＮ２）をコードする遺伝子である。
【００５３】
ＬＴＦは、ラクトトランスフェリンをコードする遺伝子であり、ＨＬＦ２、 ＧＩＧ１２、ＨＥＬ１１０ともよばれている。
【００５４】
ＭＭＰ８は、好中球コラゲナーゼ、ＰＭＮＬコラゲナーゼ（ＭＮＬ−ＣＬ）としても知られているマトリクスメタロプロテイナーゼ−８をコードする遺伝子である。
【００５５】
ＭＰＯはミエロペルオキシダーゼをコードする遺伝子である。
【００５６】
ＲＮＡＳＥ２は、ＲＮａｓｅ  Ａファミリー２をコードする遺伝子（肝臓、好酸球由来神経毒）である。これは、ＲＮＳ２、ＥＤＮ、好酸球由来神経毒、リボヌクレアーゼＵＳ、リボヌクレアーゼ２、ＲＮａｓｅ  ＵｐＩ−２、ＥＣ３．１．２７．５、非分泌リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡＦ３およびＲＡＦ３としても知られている。
【００５７】
ＲＮＡＳＥ３は、ＲＮＳ３、ＥＣＰ、好酸球カチオン性タンパク質、リボヌクレアーゼ３、ＲＮａｓｅ３、細胞傷害性リボヌクレアーゼ、ＥＣ３．１．２７．５、ＥＣ３．１．２７、ＥＣ３．１．２７とも呼ばれる、リボヌクレアーゼ，ＲＮａｓｅＡファミリー３をコードする遺伝子である。
【００５８】
ＣＭＰＫ２は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ２、チミジル酸キナーゼファミリーＬＰＳ誘導性メンバー、チミジン一リン酸キナーゼ２またはＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ２、ミトコンドリアＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ、ＥＣ２．７．４．１４、ＥＣ２．７．４．６、ＵＭＰ−ＣＭＰＫ２、ＴＭＰＫ２、およびＴＹＫｉとも呼ばれる、シチジン一リン酸（ＵＭＰ−ＣＭＰ）キナーゼ２をコードする遺伝子である。
【００５９】
ＩＦＦＩ４４Ｌは、インターフェロン誘導タンパク質４４−様をコードする遺伝子であり、Ｃ１ｏｒｆ２９、第１染色体オープンリーディングフレーム２９、およびＧＳ３６８６とも呼ばれている。
【００６０】
ＩＦＩ６は、Ｇ１Ｐ３、インターフェロン誘導タンパク質６−１６、ＩＦＩ−６−１６、ＩＦＩ６１６、ＦＡＭ１４Ｃおよび６−１６とも呼ばれる、インターフェロン，α−誘導性タンパク質６をコードする遺伝子である。
【００６１】
ＩＦＩＴ１Ｂは、テトラトリコペプチド反復配列−１様タンパク質を持つインターフェロン誘導タンパク質、ＩＦＩＴ１Ｌ、およびＢＡ１４９Ｉ２３．６とも呼ばれる、テトラトリコペプチド反復配列１Ｂを持つインターフェロン誘導タンパク質をコードする遺伝子である。
【００６２】
ＬＹ６Ｅは、リンパ球Ｅ、ＲＩＧＥ、ＳＣＡ２、レチノイン酸誘導遺伝子Ｅタンパク質、レチノイン酸誘導遺伝子Ｅ、胸腺共通抗原１、幹細胞抗原２、Ｌｙ−６Ｅ、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１、リンパ球抗原６Ｅ，９８０４、およびＴＳＡ１とも呼ばれる、リンパ球抗原６複合体をコードする遺伝子である。
【００６３】
ＯＡＳ１は、ＯＩＡＳ、２−５−オリゴアデニル酸シンセターゼ１、（２−５）オリゴ（Ａ）シンターゼ１、２−５Ａシンターゼ１、Ｐ４６／Ｐ４２ＯＡＳ、Ｅ１８／Ｅ１６、２−５オリゴアデニル酸シンセターゼ１Ｐ４８アイソフォーム、２−５オリゴアデニル酸シンセターゼ１Ｐ５２アイソフォーム、２，５−オリゴアデニル酸シンセターゼ１（４０−４６ＫＤ）、２，５−オリゴアデニル酸シンセターゼ１，４０／４６ｋＤａ、２−５−オリゴイソアデニル酸シンセターゼ１、２−５−オリゴアデニル酸シンターゼ１、（２−５）オリゴ（Ａ）シンセターゼ１、２，５−オリゴＡシンセターゼ１、２−５Ａシンセターゼ１、ＥＣ２．７．７．８４、ＥＣ２．７．７、ＩＦＩ−４、およびＯＩＡＳＩとも呼ばれる、２’−５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ１をコードする遺伝子である。
【００６４】
ＯＡＳ２は２’−５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ２をコードする遺伝子で、２−５−オリゴアデニル酸シンセターゼ２、２−５−オリゴアデニル酸シンセターゼ２（６９−７１ＫＤ）、（２−５）オリゴ（Ａ）シンターゼ２、Ｐ６９  ＯＡＳ／Ｐ７１  ＯＡＳ、Ｐ６９ＯＡＳ／Ｐ７１ＯＡＳ、２−５Ａシンターゼ２、ＥＣ２．７．７．８４およびＥＣ２．７．７とも呼ばれる。
【００６５】
ＯＡＳ３は２’−５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ３をコードする遺伝子で、（２−５）オリゴ（Ａ）シンターゼ３、２−５Ａシンターゼ３、Ｐ１００  ＯＡＳ、Ｐ１００ＯＡＳ、２−５−オリゴアデニル酸シンセターゼ３（１００ＫＤ）、２−５オリゴアデニル酸シンセターゼＰ１００、２−５オリゴアデニル酸シンターゼ３、（２−５）オリゴ（Ａ）シンセターゼ３、２−５Ａシンセターゼ３、ＥＣ２．７．７．８４、ＥＣ２．７．７、およびＰ１００とも呼ばれる。
【００６６】
ＲＳＡＤ２はラジカルＳ−アデノシルメチオニンドメイン含有２（Radical S-Adenosyl Methionine Domain Containing 2）をコードする遺伝子で、ビペリン、インターフェロン誘導性小胞体関連ウイルス阻害タンパク質（Virus Inhibitory Protein, Endoplasmic Reticulum-Associated, Interferon-Inducible）、サイトメガロウイルス誘導性遺伝子５タンパク質、Ｃｉｇ５、ラジカルＳ−アデノシルメチオニンドメイン含有タンパク質２、２５１０００４Ｌ０１Ｒｉｋ、Ｃｉｇ３３、およびＶｉｇ１とも呼ばれる。
【００６７】
ＵＳＰ１８はユビキチン特異的ペプチダーゼ１８をコードする遺伝子で、ＩＳＧ４３、ＩＳＧ１５−特異的プロセシングプロテアーゼ、ユビキチン特異的プロテアーゼ１８、４３ＫＤａ  ＩＳＧ１５特異的プロテアーゼ、Ｕｂｌチオエステラーゼ１８、ＨＵＢＰ４３、ＵＢＰ４３、Ｕｂｌカルボキシル末端ヒドロラーゼ１８、Ｕｂｌチオールエステラーゼ１８、ＥＣ３．１．２．１５およびＥＣ３．４．１９とも呼ばれる。
【００６８】
本発明の第１の側面は、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群から選択される、それぞれ異なるバイオマーカーの発現を示す１種以上の標的分子を利用することができる。本発明の第１の側面は、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群から選択される異なるバイオマーカーの発現を示す２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、または１３種の標的分子を利用することができる。
【００６９】
一実施形態において、本発明の第１の側面は、ＲＮＡＳＥ３の発現を示す標的分子を利用することができる。
【００７０】
一実施形態において、本発明の第１の側面は、ＲＮＡＳＥ２の発現を示す標的分子を利用することができる。
【００７１】
一実施形態において、本発明の第１の側面は、それぞれ異なるバイオマーカーの発現を示す２種以上の標的分子を利用することができ、バイオマーカーはＲＮＡＳＥ３およびＲＮＡＳＥ２である。
【００７２】
したがって、本発明は抗ＴＮＦ療法に応答しない、または応答し得る対象を特定する遺伝子発現特性を決定する。一実施形態において、遺伝子発現特性は少なくとも２種の遺伝子、特にＲＮＡＳＥ３およびＲＮＡＳＥ２の上方制御によって特徴付けられる。
【００７３】
本発明の第２の側面は、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群から選択される、異なるバイオマーカーの発現を示す１種以上の標的分子を利用することができる。本発明の第２の側面は、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群から選択される、異なるバイオマーカーの発現を示す２種以上、３種以上、または４種の標的分子を利用することができる。
【００７４】
一実施形態において、本発明の第２の側面は、ＣＭＰＫ２の発現を示す標的分子を利用することができる。
【００７５】
一実施形態において、本発明の第２の側面は、ＩＦＩ６の発現を示す標的分子を利用することができる。
【００７６】
一実施形態において、本発明の第２の側面は、ＲＳＡＤ２の発現を示す標的分子を利用することができる。
【００７７】
一実施形態において、本発明の第２の側面は、ＵＳＰ１８の発現を示す標的分子を利用することができる。
【００７８】
一実施形態において、本発明の第２の側面は、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８である異なるバイオマーカーの発現を示す４種以上の標的分子を利用することができる。
【００７９】
さらに、第２の側面は、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、およびＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される異なるバイオマーカーの発現を示す１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、または６種の標的分子のレベルを決定することを含む。
【００８０】
本発明の第３の側面は、良好な応答に関連するバイオマーカー、および不良な応答に関連するバイオマーカーの発現を示す標的分子のレベルを決定することを含む複合的手法を提供する。第３の側面は、本明細書で定義される本発明の第１および第２の側面のいずれかの側面、または本発明の第１および第２の側面の実施形態を任意に組み合わせたものを含むことができる。一実施形態において、第３の側面のバイオマーカーは、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１Ｂ、およびＲＮＡＳＥ３を含む。したがって、本発明は抗ＴＮＦ療法に応答しない、または応答し得る対象を特定する遺伝子発現特性を同定する。一実施形態において、遺伝子発現特性は少なくとも４種の遺伝子、特にＣＭＰＫ２、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１Ｂ、およびＲＮＡＳＥ３の上方制御によって特徴付けられる。
【００８１】
第３の側面の一実施形態において、本発明は以下の標的分子のレベルを決定する：ｉ）抗ＴＮＦ療法に対する非応答が予測される遺伝子特性を与える、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３のそれぞれの発現を示す標的分子、および、ｉｉ）抗ＴＮＦ療法に対する応答が予測される遺伝子特性を与える、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３およびＩＦＩＴ１Ｂのそれぞれの発現を示す標的分子。
【００８２】
一実施形態において、本発明は抗ＴＮＦ療法に対する対象の応答を予測する方法を提供する。その療法は、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質またはＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、小分子ＴＮＦアンタゴニスト、天然または非天然由来のＴＮＦアンタゴニスト、および／または前述のようにＴＮＦを阻害する組換えおよび／または改変された形態を含む群から選択される。一実施形態において、抗ＴＮＦ療法は、インフリキシマブ（Remicade）、アダリムマブ（Humira）、セソリズマブペゴール（Cimzia）、およびゴリムマブ（Simponi）などのモノクローナル抗体、エタネルセプト（Enbrel）などの循環受容体融合タンパク質、機能的等価物、バイオシミラーまたはそれら医薬品の意図された複製、およびキサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリンおよびブプロピオン）などの単純分子からなる群から選択することができる。好ましい実施形態において、抗ＴＮＦ療法は、モノクローナル抗体、好ましくはアダリムマブまたはエタネルセプト、またはそのバイオシミラーである。
【００８３】
本発明の方法は、本明細書で定義される範囲の患者試料を使用することができる。一実施形態において、本発明は末梢血試料を利用してよい。一実施形態において、本発明は白血球画分、好ましくは好中球画分を使用してよい。このような血液の細胞画分は、当技術分野で知られた入手可能な方法、例えば、遠心分離を行った後、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ）中に再懸濁する方法を用いて調製してよい。全血試料から好中球画分を抽出する適切な方法は、Polymorphprep（Axis Shield）、FIcoll-Paque（GE Healthcare）またはEasySepヒト好中球濃縮キット（StemCell）でよい。一実施形態において、本発明の方法は、対象の血液試料から白血球画分を抽出することを含む。一実施形態において、本発明の方法は、対象の血液試料から好中球画分を抽出することを含む。本発明者らは、対象からの白血球試料に対するバイオマーカー発現分析を実施することで、対象の抗ＴＮＦ療法に対する応答または非応答の分類を改良できることを見出した。したがって、試料から細胞画分（例えば、白血球または好中球）を抽出する工程を含む本発明の方法は、好ましい実施形態を示すことができる。本発明の方法は対象から試料を得る工程を含んでもよい。
【００８４】
本発明の方法は好ましくはin vitroで実施するが、当然のことだが、本発明の方法はin vivoで実施してもよい。
【００８５】
標的分子のレベルは、標的分子の結合パートナーを用いて分析することができる。結合パートナーは標的分子に特異的であってよい。本発明の文脈において、標的分子に特異的な結合パートナーは、標的分子でない分子との非特異な結合と区別できるように、標的分子の少なくとも１つに結合することができる。例として、適切な区別は、その結合度合いにおいて区別が可能な差異に基づく事ができる。
【００８６】
タンパク質標的に関しては、遺伝子発現時に産生される転写物の翻訳によって産生する前駆体または変異体を含むことができる。したがって、タンパク質が翻訳時と成熟形態との間で修飾を受ける場合、その前駆体および／または成熟タンパク質は適切な標的分子として使用することができる。上記のように、タンパク質標的分子を患者試料中に保存し、その検出を容易にする技術は当業者に周知である。タンパク質標的は、患者試料の細胞中に見られるか、または細胞から分泌または放出されてもよい。
【００８７】
標的分子がタンパク質である本発明の実施形態では、結合パートナーを用いて対象から得られた試料中のタンパク質のレベルを決定することができる。適切な結合パートナーは、アプタマー、受容体、および抗体または抗体フラグメントからなる群から選択することができる。試料中のタンパク質のレベルを決定するための適切な方法は、当技術分野において利用可能である。例えば、本発明の方法または装置の特定の実施形態において、結合パートナーは抗体または抗体フラグメントであり、標的分子の検出は免疫学的方法を利用する。本発明の方法または装置の特定の実施形態において、免疫学的方法はサンドイッチＥＬＩＳＡなどの変種を含む酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や放射免疫測定（ＲＩＡ）でよく、他の実施形態では、免疫学的方法は側方流動装置を利用してもよい。他の適切な技術は、ルミネックスまたはプロテオミクス多重反応モニタリング、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）や化学ルミネッセンスなどの複合検定が含まれる。
【００８８】
特定の実施形態において、例えば、蛍光体、発色基質または発色酵素などのレポーター部分を使用して結合パートナーを標識することができる。本発明がレポーター部分を使用することが望ましい場合、レポーター部分は結合パートナーに直接結合してもよい。このような実施形態の例には、標識抗体を利用するものが含まれる。あるいは、レポーター部分は結合パートナーと相互作用するレポーター分子に結合してもよい。そのような実施形態の例には、ビオチン／アビジン複合体によってレポーター部分に間接的に結合した抗体を利用するものが含まれる。
【００８９】
標的分子が核酸である実施形態では、結合パートナーは、例えばマイクロアレイやチップに用いるような相補的な核酸およびアプタマーでよい。試料中の核酸標的分子のレベルを決定する方法は、当技術分野において利用可能である。一実施形態において、遺伝子発現を示すのに適した標的分子は、翻訳されタンパク質を生成するＲＮＡ転写産物を含んでもよい。一般的に、この種のｍＲＮＡは患者試料内に見出される。特に、患者試料中の白血球、例えば好中球のトランスクリプトームは、抗ＴＮＦ療法に対する非応答者および／または良好な応答者を判定する感度および特異性に優れたバイオマーカー特性を提供することが見出されており、ｍＲＮＡ、特にトランスクリプトームは好ましい実施形態を示すことができる。標的分子としてｍＲＮＡを使用することには、ｍＲＮＡを検出する方法（定量的ｒｔＰＣＲなど）が、タンパク質を検出する方法（ＥＬＩＳＡなど）よりも安価になる傾向があるという利点がある。核酸は、一般にそれらに対応するタンパク質より高い安定性を示し、核酸を回収し増幅するための試料調製は、一般にタンパク質の場合よりも簡単である。したがってｍＲＮＡ分析は比較的容易に複合化できるので、高性能分析が可能である。
【００９０】
必要に応じてｍＲＮＡを収集、精製、増幅する技術は当業者に周知である。一実施形態において、本発明は、バイオマーカーの発現を測定するためにトランスクリプトーム解析を利用することができる。例えばトランスクリプトーム解析などによって、試料中のＲＮＡのレベルを決定するのに適当な技術には、ハイブリダイゼーション技術、例えば核酸ライブラリーへの結合を検出する技術、定量的ＰＣＲ、およびＳＡＧＥ（serial analysis of  gene expression）やＲＮＡ−ｓｅｑのようなタグを用いたシークエンシングを含むハイスループットシークエンシングが含まれる。
【００９１】
上記の例は非限定的であり、本発明の方法は、必要な標的分子の存在またはレベルの増加を検出できる任意の適切な検出法を利用することができる。当然のことだが、適切な検出法は、検出される標的分子の性質および／または使用される患者試料の性質を参照して決定することができる。
【００９２】
複数の試料は、同時、逐次的または個別に処理することができる。複数の試料は、例えば高性能の処理方法などを用いて同時に処理することができる。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態を表す方法は、試料からのｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡを得るための逆転写酵素を用いる工程、ｃＤＮＡ群の増幅、およびｃＤＮＡ群のシークエンシングから構成される。このような方法には、ｍＲＮＡ群の断片化、ｍＲＮＡへのアダプターの結合、ｃＤＮＡ群へのバーコードの付与がさらに含まれる。
【００９４】
本発明において有用なハイスループットシークエンシングを実施するための既知の方法には、Illumina HiSeq（商標）、Ion Torrent（商標）、およびSOLiD（商標）が含まれる。
【００９５】
核酸標的分子の発現レベルは、一般的には、１００万読み取りあたり、１０００塩基長あたりの読取り値（Reads per kilobase of exon model per million mapped reads、ＲＰＫＭ）として表し、（マッピングされた読取り数×１０００塩基長×１００万のマッピングされた読取り数）／（転写物の長さ×総読取り数）として計算する。
【００９６】
本発明が核酸標的分子のレベルを決定するために定量的ＰＣＲに基づく方法を使用する場合、本発明は、表４に示した１組以上のプライマー対を含む検査キットを提供することができる。さらに任意に、検査キットは１組以上の取扱説明書、少なくとも検査キットのプライマー対に関連したバイオマーカーに対する参照値またはベースライン値を示した図表、および試薬を含むことができる。
【００９７】
患者試料中の標的分子の量または濃度を測定すれば、その情報を抗ＴＮＦ療法に対する応答予測の評価基準として使用し、さらに患者に対する適切な治療方針を示すのに利用することができる。評価は定性的でも定量的でもよい。
【００９８】
バイオマーカーの増加レベルは、ベースライン値あるいは参照値レベルと比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、あるいはそれ以上が含まれる。一実施形態において、増加レベルはベースライン値または参照値に対して１倍以上の差になってよく、例えば１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１０．５倍、１１倍、１１．５倍、１２倍、１２．５倍、１５倍、２０倍、またはそれらの間の任意の範囲の倍数差になる。一実施形態において、高レベルはベースライン値に対して１倍〜１５倍の差であり、例えばベースライン値に対して１．５倍〜１２倍の差である。さらなる実施形態では、高レベルはベースライン値に対して１〜７倍の差である。当然のことだが、レベルの増加度は、同じバイオマーカーでも使用される標的分子によって異なってもよい。核酸およびタンパク質標的分子が任意の特定のバイオマーカーに使用される場合、レベルの増加度は、個別の標的分子について表現してもよく、または標的分子の合計または平均として表現してもよい。
【００９９】
例えば、本発明の方法は、ＲＮＡＳＥ３の発現を示す標的分子が０．７５倍、１倍、１．２倍または１．５倍またはそれ以上増加するかどうかを判定してもよく、および／またはＲＮＡＳＥ２が０．７５倍、１倍または１．２倍またはそれ以上増加するかどうかを判定してもよい。これらの標的分子の１種以上が上記の値だけ増加したと判定された場合、対象は抗ＴＮＦ療法に対する非応答者として分類され、他の治療法を受けるべきである。
【０１００】
上記に加えて、あるいは上記の代わりに、本発明の方法は、ＣＭＰＫ２の発現を示す標的分子が１倍、１．５倍、１．７５倍または２倍以上増加するかどうかを判定してもよく、および／また、ＩＦＩ６の発現を示す標的分子が１倍、１．５倍、１．７５倍または２倍以上増加するかどうかを判定してもよく、および／また、ＲＳＡＤ２の発現を示す標的分子が１倍、１．５倍、１．７５倍または２倍以上増加するかどうかを判定してもよく、および／また、ＵＳＰ１８の発現を示す標的分子が１倍、１．５倍、１．７５倍または２倍以上増加するかどうかを判定してもよい。これらの標的分子の１種以上が上記の値だけ増加したと判定された場合、対象は抗ＴＮＦ療法に対する応答者として分類され、抗ＴＮＦ療法を受けるべきである。
【０１０１】
本発明は、バイオマーカーまたは複数のバイオマーカーの合計に対するレベル値の増加度に基づいて、定量的な出力値を与えることができる。一方、本発明は起こりうる応答に基づく定性的な出力値を与えることができ、例えば、はい／いいえ、増加、非増加、応答／非応答、ＥＵＬＡＲの評価基準に基づいた良い／中程度／低い、などがある。２種以上の標的分子のレベルを決定した場合、同じ標的分子の参照値の複合評価と比較することで、複合評価を決定することができる。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明の方法または装置は、患者の生理学的測定値を調査することをさらに含んでもよい。
【０１０３】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、対象の試料に含まれる低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法を対象に実施することを含む。
【０１０４】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、対象の試料に含まれる、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる群から選択されるバイオマーカーの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法を対象に実施することを含む。
【０１０５】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、対象の試料に含まれ、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、およびＵＳＰ１８からなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子が、自己免疫性あるいは免疫介在性障害を有しない対象から得た試料に含まれる標的分子のレベルと比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む。
【０１０６】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、ｉ）対象の試料に含まれる低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれ、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、またはＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む。
【０１０７】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、ｉ）対象の試料に含まれ、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３のそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれ、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、またはＩＦＩＴ１Ｂのそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法を対象に実施することを含む。
【０１０８】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、ｉ）対象の試料に含まれる低密度顆粒球（ＬＤＧ）遺伝子の発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれ、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、またはＩＦＩＴ１Ｂからなる群から選択される１種以上のインターフェロン調節バイオマーカーの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法を対象に実施することを含む。
【０１０９】
さらなる実施形態において、自己免疫性または免疫介在性障害を有する対象を治療するための方法を提示するものであって、ｉ）対象の試料に含まれ、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３のそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加していないこと、およびｉｉ）対象の試料に含まれ、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ６、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８、ＩＦＦＩ４４Ｌ、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、またはＩＦＩＴ１Ｂのそれぞれの発現を示す標的分子が参照値と比較して増加したことが事前に決定（あるいは推定）されたものであり、前記方法は、抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法を対象に実施することを含む。
【０１１０】
本明細書で定義される対象を治療する方法において、事前に標的分子のレベルを決定することは、第１、第２、第３の側面、および実施形態のいずれかで定義したものと同様であることが想定される。
【０１１１】
一実施形態において、治療への応答をモニタリングするために自己免疫性または免疫介在性障害の活動性を決定することを含む方法を提示するものであり、ここで、前期対象が、抗ＴＮＦ療法に対して良好な応答を示す可能性があることが事前に予測され、またここで患者は抗ＴＮＦ療法が実施されたものである。そのような方法において、事前に標的分子のレベルを決定して実施された抗ＴＮＦ療法に対する応答を予測することは、第１、第２、第３の側面、および実施形態のいずれかで定義したものと同様であることが想定される。
【０１１２】
さらに、本発明は、対象の治療計画を選択する方法を提示することができるものであって、対象から得られた試料の分析を含み、ここで前記方法は、対象が本発明の第１、第２または第３の側面のいずれかによって、抗ＴＮＦ療法に対する応答者または非応答者であるかどうかを予測することを含み、ここで第１の側面による標的分子のレベル増加は、対象が抗ＴＮＦ療法に代わる治療方法から利益を受けることを示し、ここで第２の側面による標的分子のレベル増加は、対象が抗ＴＮＦ療法から利益を受けることを示す。
【０１１３】
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載される方法で使用するための検査キットを提供する。そのような検査キットは、標的分子に結合することができる結合パートナーを含むことができる。標的分子がタンパク質の場合、このような結合パートナーはタンパク質に特異的に結合する抗体を含んでもよい。標的分子が核酸の場合、結合パートナーは標的分子に相補的な核酸を含んでもよい。標的分子がタンパク質の場合、検査キットは標的分子に特異的な抗体または抗体フラグメントを含んでもよい。また、試料中の任意の標的分子のレベルを測定するため、検査キットには一組の取扱説明書と対照試料の参照値を含んでもよい。
【０１１４】
本発明の側面の実施形態は、必要な変更を加えて本発明の他の側面に適用されることが想定される。
【０１１５】
特許請求の範囲および／または明細書において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、それは「１つ（ｏｎｅ）」を意味してもよい。また、それは「１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」、および「１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味と同様である。
【０１１６】
表１〜表５および図面を参照し、限定されることのない例として本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１１７】
患者および実験方法
（倫理的声明）
本研究は、リバプール大学健康管理研究倫理委員会（Committee on Research Ethics for healthy controls＝CORE）およびNorth West 3 (Liverpool East)関節リウマチ患者研究倫理委員会によって許可された。すべての参加者からは書面にてインフォームドコンセントを得た。
【０１１８】
（患者）
最初の試験では、２０人の関節リウマチ患者および６人の対照群となる健常者を募集した。関節リウマチのＡＣＲ基準（参考文献１）を満たした全ての患者は、生物学的製剤を投与されたことがなく、ＴＮＦｉによる治療を受けようとしていた。試験の募集範囲は以下のとおりであった。１８歳〜８０歳、メトトレキサート（ＭＴＸ）を含む少なくとも２種の疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）による治療効果が不良、英国の関節リウマチの生物学的治療を規定するＮＩＣＥガイドラインにおいて疾患活動性あり（ＤＡＳ２８＞５．１）。検証試験では、同じ基準を満たす３２人の関節リウマチ患者（１６人のＤＭＡＲＤ未投与患者および１６人のＴＮＦｉ治療前患者）を募集した。それぞれのコホート試験における治療前後（０週と１２週）の臨床的特徴を表１〜表３に示した。１２週目に治療に対する応答を２つの方法で測定した。第一の方法では、ＤＡＳ２８の低下量が１．２を超える場合（ＢＳＲ基準）を「応答」、その逆を「非応答」と定義し、第二の方法では、以下に示したＥＵＬＡＲ基準（参考文献１）による判定表から、応答を「良好」、「中程度」、「なし」と定義した。
【表２】
2018537100.tif 000003
【０１１９】
（好中球の単離）
最初の試験において、治療開始前（０週目）の関節リウマチ患者または健常対照群から、血液（２０ｍｌ）をリチウム−ヘパリン採血管に採取した。Polymorphprep（Axis Shield）を用いて好中球を単離し、低浸透圧破壊によって夾雑赤血球を除去した。好中球はHEPES（Gibco）を加えたRPMI1640培養液へ再懸濁し、濃度が５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製した。検証試験では、２０ｍｌの全血をHetaSep溶液（StemCell）に１：５（HetaSep：全血）となるように混合し、血漿／赤血球界面が全体積の約５０％になるまで３７℃・３０分間静置した。白血球が濃縮された血漿層を注意深く採取し、４倍量の推奨培養液（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まないＰＢＳ、２％ＦＢＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄した。細胞は２００ｇで１０分間遠心分離し、４倍量の推奨培養液に再懸濁した。洗浄した白血球はFicoll-Paque（GE Healthcare）へ１：１となるように重層し、５００ｇで３０分間遠心分離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の層を除去し、顆粒球の沈殿を推奨培養液に再懸濁し、５００ｇで３分間遠心分離し、推奨培養液に濃度が５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように再懸濁した。EasySepヒト好中球濃縮キット（StemCell）を製造者の指示通りに使用し、顆粒球の沈殿から高純度好中球を単離した。その方法を簡潔に述べると、細胞表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６およびグリコフォリンＡに結合するモノクローナル抗体（デキストランに対して二重特異性を持つ）から構成される４量体抗体複合体を含むEasySep（登録商標）好中球濃縮混合溶液を、１ｍｌの有核細胞溶液あたり５０μｌ加え、氷上で１０分間静置した。１ｍｌの有核細胞溶液あたり１００μｌのEasySepデキストラン被覆ナノ粒子ビーズを添加し、氷上でさらに１０分間静置した。細胞／抗体／ビーズ溶液は、全容量が２．５ｍｌになるように推奨培養液で希釈し、EasySep磁石に室温で５分間静置した。ビーズに結合しなかった好中球溶液を採集し、さらにEasySep磁石に５分間静置した。ビーズに結合しなかった高純度の好中球溶液を短時間遠心分離し、２５ｍＭのHEPESを加えたRPMI1640培養液へ５×１０６／ｍｌの濃度になるように再懸濁した。
【０１２０】
（ＲＮＡの単離）
少なくとも１０７の細胞からトリゾール−クロロホルム（Invitrogen）を用いてＲＮＡを単離し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、ＤＮＡ分解工程を含むRNeasyキット（Qiagen）を用いて精製した。総ＲＮＡ濃度および保存性（RNA Integrity＝ＲＩＮ）は、Agilent 2100 Bioanalyser RNA Nano chipを用いて評価した。ＲＮＡ保存性（ＲＩＮ）は、本試験の手順において常に７．０以上であることが分かった。
【０１２１】
（ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーの作成およびシークエンシング）
poly-Aを用いた選択によって、全ＲＮＡからｍＲＮＡを濃縮した。標準的なIllumina社の手法を用いて、５０塩基対の単一末端読取ライブラリー（single-end read libraries）を作製した。その方法を簡潔に述べると、ｍＲＮＡを断片化し、逆転写し、シークエンシングプライマーと試料バーコードを結合し、大きさを選択し、ＰＣＲで増幅した。ライブラリーはIllumina HiSeq 2000でシークエンシングを行った。
【０１２２】
（読取配列の解読（マッピング）と遺伝子情報の付加（アノテーション））
読取配列は、TopHat v2.0.4（参考文献２）を使用し、-max-multihits１設定でヒトゲノム（ｈｇ１９）に対応付けした。読取り数はHTSeq v0.5（参考文献３）を用いて計算し、遺伝子の発現量（ＲＰＫＭ）（参考文献４）はCufflinks v2.0.2（参考文献２）を用いて計算した。真の陽性に対して偽陽性を含む可能性を最小限に抑えるため、測定データにおける発現量の最小閾値を０．３ＲＰＫＭ以上と設定した（参考文献５〜参考文献７）。
【０１２３】
（生物学的情報解析）
IPA（Ingenuity（登録商標）Systems、www.ingenuity.com）を用いて生物学的情報解析を行った。その結果、標準パスウェイのIPAライブラリーから、測定データにおいて最も顕著に表れた経路を特定した。
【０１２４】
（定量ＰＣＲ分析）
ｃＤＮＡは、Superscript III First Strand cDNA Synthesis kit (Invitrogen)を使用し、全ての試料でＲＮＡ濃度を等しくし、全てのＲＮＡから製造業者の指示通りに合成した。リアルタイムＰＣＲ分析は、QuantiTect SYBR Green ＰＣＲキット（Qiagen）を製造者の指示通りに使用して行った。分析はRoche 480 LightCyclerを用い、９６穴プレートに反応液を２０μｌ使用して行った。標的遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子であるＢ２Ｍに対する平均標準化発現量（Mean Normalised Expression）を用いて定量した（参考文献８）。プライマー配列を表４に示す。
【０１２５】
（統計分析）
ＲＮＡ−Ｓｅｑの発現レベルデータの統計分析は、edgeR v3.0.8（参考文献９）を用い、５％の偽陽性率（ＦＤＲ）で行った。二項ロジスティック回帰および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）法を２３種類のバイオマーカー遺伝子それぞれについて実施し、次いでＴＮＦｉに対する応答を予測する最適な群を見つけるため、データ全体について同様の方法を実施した。
【０１２６】
試験結果
（ＴＮＦｉ療法に対する応答者および非応答者で発現レベルが有意に異なる遺伝子の分析）
最初のコホート試験からＴＮＦｉ応答者および非応答者で有意に異なる発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＝ＤＥ）レベルを持つ遺伝子を同定するために、ＲＮＡ−Ｓｅｑ測定データに対するｅｄｇｅＲ分析を行い、試験開始０週と１２週のＤＡＳ２８の変化に基づいて、患者を応答者または非応答者として分類した。ＤＡＳ２８の減少度が１．２未満の場合は、ＴＮＦｉに対して非応答であると分類した。ＦＤＲが０．０５未満であることを適用し、各患者群においてＴＮＦｉを開始する前に有意にＤＥレベルにある４７種の遺伝子を同定した（表５）。これらの遺伝子のうち、１１種の遺伝子が応答者で高いレベルにあり、３６種の遺伝子が非応答者で高いレベルにあった。
【０１２７】
有意なＤＥ遺伝子のIngenuity（IPA）解析によって、ＴＮＦｉ応答者において最も活性化する系がインターフェロンのシグナル伝達系であると判明した（ｐ＝０．０００１、図１Ａ）（参考文献１０）。また、ＩＰＡは、ＴＮＦｉ応答者においてインターフェロンが上流調節因子として作用すると予測した（ＩＦＮＡ２  ｐ＝２．４９×１０−２９、ｚ−スコア＝６．５９４；  ＩＦＮＧ  ｐ＝６．２２×１０−２６、ｚ−スコア＝５．１９６）。ＴＮＦｉ応答者において有意にＤＥレベルにあった１１種の遺伝子のうち、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１Ｂ、ＩＦＩ６、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８からなる１０種の遺伝子がＩＦＮによって調節されると予測された。
【０１２８】
また、ＩＰＡは、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）がＴＮＦｉ応答者において遺伝子発現を負に調節すると予測し、これは逆にＧ−ＣＳＦがＴＮＦｉ非応答者において遺伝子発現を正に調節していることを意味する（ｐ＝１．４×１０−６、ｚ‐スコア＝−２．６０９、図１Ｂ）。発明者らは、ＩＰＡが予測することの出来たこの遺伝子が、全身性エリテマトーデス患者において以前に同定された低密度顆粒球（ＬＤＧｓ、未成熟好中球）の発現特性に極めて類似していることを見出した（参考文献１１）。ＴＮＦｉ非応答者において、ｅｄｇｅＲ分析で有意にＤＥとして同定された４７種の遺伝子のうち、ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３からなる１３種の遺伝子は、関節リウマチ患者の好中球で発現するＬＤＧ遺伝子に直接関係付けられた。
【０１２９】
ＴＮＦｉ応答者と非応答者との間で有意にＤＥであった１０種のＩＦＮ調節遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の発現レベルを図２に示す。ＤＡＳ２８の減少度が１．２を超えた場合を応答と分類している。図３において、１０種のＩＦＮ調節遺伝子および１３種のＬＤＧ遺伝子の発現レベルを、ＥＵＬＡＲ基準（参考文献１）で応答が「良好」あるいは「なし」となった患者に対してのみ示す。前述したように、本文脈におけるＥＵＬＡＲ基準の「良好な」応答とは、ＤＡＳ２８の減少度が１．２を超え、かつ試験終了時のＤＡＳ２８が３．２以下である場合に分類される。
【０１３０】
（関節リウマチ患者の別のコホート試験における、ＩＦＮ遺伝子およびＬＤＧ遺伝子の発現特性の検証）
ＴＮＦｉ応答者および非応答者におけるＩＦＮおよびＬＤＧ遺伝子の発現レベルを検証するため、２組の検証コホート試験の患者を募集し、１６人の早期関節炎（ＤＭＡＲＤ未処置の患者）および１６人の生物学的製剤未処置（ＴＮＦｉ未処置）患者を募集した。高純度の末梢血好中球からＲＮＡを抽出し、１０種のＩＦＮ調節遺伝子および１３種のＬＤＧ標識遺伝子の発現レベルをｑＰＣＲで測定した（平均標準化発現量（Ｍｅａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＝ＭＮＥ）を用い、Ｂ２Ｍハウスキーピング遺伝子で標準化）。
【０１３１】
検証コホート試験におけるＩＦＮおよびＬＤＧ遺伝子の発現レベルは、ＴＮＦｉ応答者および非応答者において、最初のコホート試験と同じ発現特性に従った（図４）。しかし、発現レベルとＤＭＡＲＤｓに対する応答との関連性はなく（図５）、これらのバイオマーカー遺伝子がＴＮＦｉに対する応答に特異的であることが確認された。
【０１３２】
（ＴＮＦｉに対する応答を予測するバイオマーカー遺伝子の統計分析）
２３種類のバイオマーカー遺伝子それぞれについて、二項ロジスティック回帰およびＲＯＣ・ＡＵＣ法で統計分析を行い、次いで、予測に最適な群を見つけるためデータ全体について同様の方法を実施した。分析結果を表６に示す。予測因子の良好な組み合わせを発見するため、２３種類の遺伝子の逐次的回帰分析を行った結果、予測因子となる遺伝子の最適な組み合わせとして、ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１ＢおよびＲＮＡＳＥ３（図６）を特定した。
【表３】
2018537100.tif 000004
【０１３３】
（考察）
本研究は、関節リウマチ患者の末梢血好中球における２３種の遺伝子の発現が、ＴＮＦｉ（最初の生物学的製剤）に対する応答を予測できることを実証している。１０種の遺伝子（ＣＭＰＫ２、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１Ｂ、ＩＦＩ６、ＬＹ６Ｅ、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＲＳＡＤ２、ＵＳＰ１８）を含むＩＦＮ調節遺伝子の発現を示す発現特性は、ＴＮＦｉに対する応答を予測する。また、成熟好中球によるＬＤＧ遺伝子（ＡＺＵ１、ＢＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＤＥＦＡ４、ＥＬＡＮＥ、ＬＣＮ２、ＬＴＦ、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３）の発現は、ＴＮＦｉに対する非応答を予測する。これら２つの遺伝子発現特性は互いに排他的であるため、関節リウマチにおいてＴＮＦｉに対する応答を予測する高い感度および特異性を持つバイオマーカーの群を構成する。
(表)
【表４】
2018537100.tif 000005
【表５】
2018537100.tif 000006
【表６】
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【表７】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表９】
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【０１３４】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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