(57)【要約】本発明は、生体外皮膚同等物、特に、動物の皮膚、好ましくは、哺乳類及び／又はヒトの皮膚の生体外皮膚同等物に関し、並びにその使用に関する。特に、本発明の主題は、実験用ツールとしての、並びに／又は美容化合物及び／若しくは皮膚科学的化合物を試験するための方法における皮膚同等物の使用である。本発明は、特に、薬理学、美容術、及び皮膚科学の分野で用いられ得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．線維芽細胞培地Ｍ１中で線維芽細胞を培養する工程；
ｂ．コラーゲンマトリクスに、工程ａで得られた線維芽細胞を播種する工程；
ｃ．前記コラーゲンマトリクスに播種された線維芽細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２中で培養し、前記マトリクス及び前記培養された線維芽細胞に代用真皮を形成させる工程；
ｄ．メラニン形成細胞を、メラニン形成細胞培地Ｍ３中で培養する工程；
ｅ．角化細胞を、角化細胞培地Ｍ４中で培養する工程；
ｆ．工程ｄで得られたメラニン形成細胞と工程ｅで得られた角化細胞とを混合する工程；
ｇ．工程ｃで得られた前記代用真皮を、工程ｆで得られた前記混合物とともに播種する工程；
ｈ．工程ｇで播種された前記代用真皮を、皮膚培地Ｍ５中で培養し、それによって代用皮膚を形成する工程
を含む方法によって得ることができる生体外皮膚同等物。
【請求項２】
前記培地Ｍ２が、アスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含む、請求項１に記載の皮膚同等物。
【請求項３】
前記培地Ｍ５が、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む、請求項１又は２に記載の皮膚同等物。
【請求項４】
前記培地Ｍ５が、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む、請求項３に記載の皮膚同等物。
【請求項５】
工程ｆのメラニン形成細胞と角化細胞との前記混合が、１／２０から１／１５のメラニン形成細胞／角化細胞比で行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の皮膚同等物。
【請求項６】
工程ｇの前記播種が、９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の皮膚同等物。
【請求項７】
工程ｂの前記播種が、前記コラーゲンマトリクスの表面積に対して２００００から５００００線維芽細胞／ｃｍ２の密度で行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載の皮膚同等物。
【請求項８】
工程ｃが、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない線維芽細胞培地Ｍ２１の存在下、１８から２８時間にわたる第一の培養工程、及びそれに続くアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２２の存在下、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の皮膚同等物。
【請求項９】
工程ｈが：
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない培地Ｍ５１の存在下、１８から２８時間にわたる第一の培養工程ｈ’、
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５２の存在下、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｈ’’、並びに
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中、少なくとも２日間にわたる第三の培養工程ｈ’’’
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の皮膚同等物。
【請求項１０】
実験用ツールとしての請求項１から９のいずれか一項に記載の皮膚同等物の使用。
【請求項１１】
前記皮膚同等物が、美容的剤及び／又は皮膚科学的剤のための試験方法に用いられる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記試験方法が：
−  前記皮膚同等物を少なくとも１つの剤と接触させる工程、及び
−  前記剤の効果又は効果の非存在を特定する工程
を含む、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外皮膚同等物、特に、動物の皮膚、好ましくは、哺乳類及び／又はヒトの皮膚の生体外皮膚同等物に関し、並びにその使用に関する。
【０００２】
本発明は、特に、薬理学、美容術、及び皮膚科学の分野で用いられ得る。
【０００３】
以下の記述において、角括弧（［］）内の参照番号は、テキストの最後に提示する参考文献のリストを参照することを意味する。
【背景技術】
【０００４】
皮膚は、非常に特定の層構造を含む非常に複雑な器官である。それは、以下の３つの主要部分：
−  最も薄く、表皮と称される表層部分、
−  より厚い中間部分で、表皮が付着されている真皮、及び
−  より深い層の皮下組織
を含む。
【０００５】
それは特に、外部媒体と、多くの哺乳類、特にヒトの内部媒体との間のバリアを提供する。この「バリア」機能のおかげで、皮膚は、生物にとっての保護を自然に提供し、一方同時に、前記生物と外部環境との間の繋がりも提供する。皮膚は、何らかの攻撃に対する最初の防御器官も成す。
【０００６】
皮膚は、多くの攻撃を受けるものであり、それらは、例えば、癌の原因となる炎症反応／細胞改変を引き起こし得るＵＶ線に伴う攻撃、熱傷、乱切など、例えば鈍器によるものなどの物理的攻撃、洗剤を例とする化学製品に例えば伴う化学的攻撃であり得る。このような様々な攻撃は、特に、皮膚の構造を改変すること、その色を変化させること、皮膚創傷の外観を引き起こすこと、及び／又は皮膚の「老化」をもたらすことを起こし得る皮膚障害を誘発し得る。
【０００７】
実際、外部攻撃は、構造の改変を引き起こす可能性があり、及び／又は皮膚の外観を変化させる可能性があり、特に、シワ、皮膚の乾燥、色素沈着の変化など、皮膚老化の徴候の外観を引き起こす可能性があることが知られている
【０００８】
さらに、ヒドロキノンなどの化学製品及び／又は分子が、高い用量で用いられた場合、強い色素脱失を誘発し得ること、瘢痕、ストレッチマーク、皮膚癌、又は全身合併症、体毛の発達を引き起こし得ること、並びに顎鬚の成長及び体臭の乱れを引き起こし得ることも知られている。
【０００９】
他の要素が皮膚の変化の原因となる場合もあり、例えば、遺伝的秩序（genetic order）のパラメータ、並びに／又は全身内分泌及び／若しくは自己免疫障害に伴うパラメータである。それらは、特に、白斑、メラニン増加症、無色性色素失調症、又は母斑などの色素異常を引き起こす病態であり得る。
【００１０】
いかなる製品も、商品化の前に、出現する可能性のある考え得る副作用について研究及び評価を行うことができ、及び／又は適切な医薬剤形／濃度を特定することができることが必要であり、重要である。
【００１１】
先行技術には、特に皮膚の生理機能を研究するために用いられ、並びに／又は化合物の活性及び／若しくはその考え得る副作用を特定するための化合物の試験に用いることができる皮膚「モデル」が存在する。
【００１２】
しかし、用いられる市販の皮膚「モデル」は、構造的な意味でも、及び疫学的な意味でも、脆弱な製品である。したがって、これらの製品は、特にその取扱い時における製品のいかなる断裂も回避するために、小サイズである場合が多い。
【００１３】
先行技術にはまた、例えば米国特許第５７５５８１４号の文書に記載のように、特に、細胞の培養、特に線維芽細胞、メラニン形成細胞と角化細胞との混合物の培養を含む代用皮膚を作製するためのシステム／方法も存在する。しかし、これらのシステム／方法では、生体内の皮膚と同一の構造を有する代用物を得ることはできない。加えて、これらの方法によって得られた代用物は、角質層中におけるケラチンの成熟異常に相当する皮膚の分化異常である不全角化を呈し得るか又は実際に呈し、したがって、皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失の治療に、皮膚モデルなどとしてこれらを用いることはできない。そして、代用皮膚を作製するための公知のシステム／方法は、特に、ウシ脳下垂体抽出物を例とする臨床使用に不適合である化合物を含む媒体を用いる。したがって、得られる同等の代用物は、特に、臨床的実践においても、又は皮膚モデルとしても用いられ得ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、先行技術のこれらの欠陥、欠点、及び障害を克服する皮膚同等物、特に、皮膚の主要な構成細胞を含み、化合物の皮膚に対する有効性／効果及び／又は考え得る副作用を評価するために用いることができる皮膚同等物を見出すことが実際に求められている。
【００１５】
また、「病態」皮膚を表す／再現することができ、特に、治療のための候補化合物の有効性及び／又は考え得る副作用を評価することを可能とする皮膚同等物を見出すことも、先行技術において実際に求められている。
【００１６】
加えて、特に、治療のための候補化合物の有効性及び／又は考え得る副作用についての信頼性が高く再現性のある結果を得ることを可能とする皮膚同等物を見出すことも、先行技術において実際に求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、具体的には、以下の：
ａ．線維芽細胞培地Ｍ１中で線維芽細胞を培養する工程；
ｂ．コラーゲンを含むマトリクスに、工程ａで得られた線維芽細胞を播種する工程；
ｃ．コラーゲンを含むマトリクスに播種された線維芽細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２中で培養し、マトリクス及び培養された線維芽細胞に代用真皮を形成させる工程；
ｄ．メラニン形成細胞を、メラニン形成細胞培地Ｍ３中で培養する工程；
ｅ．角化細胞を、角化細胞培地Ｍ４中で培養する工程；
ｆ．工程ｄで得られたメラニン形成細胞と工程ｅで得られた角化細胞とを混合する工程；
ｇ．工程ｃで得られた代用真皮を、工程ｆで得られた混合物とともに播種する工程；
ｈ．工程ｇで播種された代用真皮を、皮膚培地Ｍ５中で培養して、代用皮膚を形成する工程
を含む作製方法によって得ることができる皮膚同等物を提供することによって、この必要性を満たし、上述した先行技術の問題に対処することである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、「含む（comprise）」の用語は、一方では、「含む（include）」、「含有する」、又は「包含する」を、他方では、「から構成される」又は「から成る」を同等に意味し得る。
【００１９】
本発明において、本発明の方法に従って得られた代用真皮は、生体内の真皮の特徴を再現する完全な組織であり、すなわち、タンパク質型の高分子、特にコラーゲン線維、グリコサミノグリカン線維、タンパク質、及び機能性線維芽細胞を含む。
【００２０】
本発明において、皮膚同等物は、代用皮膚とも称され、及び真皮同等物は、代用真皮とも称される。
【００２１】
本発明において、方法に従って得られた皮膚同等物は、有利には、生体内の皮膚の特徴を再現する完全な組織であり、すなわち、組織学的に正常である基底層、有棘層、顆粒層、及び角質層を再現する角化細胞、並びに基底メラニン形成細胞を含み、機能性線維芽細胞を含有する代用真皮と機能性基底層を介して接触している角化多重層表皮（keratinized pluristratified epithelium）を含む。
【００２２】
有利には、皮膚同等物は、代用物の細胞によって分泌されるタンパク質混合物から特に成り、それによって、生体内の皮膚の特徴を再現する真皮−表皮接合部を形成する基底層を含む。
【００２３】
本発明では、皮膚同等物を得ることを可能とする方法で用いることができる線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び角化細胞は、当業者に公知のあらゆる線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び角化細胞であってよい。それらは、例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ［フランス国立微生物カルチャーコレクション］（ＣＮＣＭ）由来のものを例とする細胞バンクから入手した線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらはまた、市販の線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよく、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＣｅｌｌｎＴｅｃ社、又はＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）社、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｓ．ａ．ｒ．ｌ．社から販売されている細胞である。それらはまた、動物、好ましくは、哺乳類から、及び／又はヒトから予め単離された生物サンプルから単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞は、１つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞は、前記患者への前記代用皮膚の移植片の目的で、個体、好ましくは、哺乳類及び／又はヒトからの１つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離されてよい。それらは、独立して、個体に対して自家性又は異種性である線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００２４】
線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞は、例えば、コーカサス人種、アジア人種、若しくはアフリカ人種の皮膚由来、様々な解剖学的部位、例えばヒトの背中、顔、胸部、手の甲、手のひら由来の１つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離されてよい。
【００２５】
それらは、独立して、好ましくはヒトからの皮膚生検組織から独立して単離された線維
芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらは、例えば、健康な皮膚又は少なくとも１つの病態を有する皮膚から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらは、例えば、加齢シミ（日光黒子（actinic lentigo））、肝斑、白斑、母斑、メラノーマ、色素性乾皮症を有する皮膚から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらはまた、遺伝性の病態を有する哺乳類から得られた皮膚生検組織から、例えば、早老症、拘束性皮膚症、表皮水疱症、又は魚鱗癬に罹患しているヒトから得られた皮膚生検組織から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。それらはまた、薬理学的治療下にある哺乳類から得られた皮膚生検組織から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよく、例えば、それらは、白血病に対する治療下にあるヒトの、又はざ瘡若しくは若年性ざ瘡の治療を例とする皮膚科学的治療下にあるヒトの生検組織から単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００２６】
それらはまた、例えば、レトロウィルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって独立して遺伝子改変された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。それらは、例えば、独立して、少なくとも１つのタンパク質、例えば、ＶＩＩ型コラーゲン、ケラチン５、１４、カタラーゼ、及びＳＩＲＴ６から選択されるタンパク質を過剰発現し、並びに／又は少なくとも１つのタンパク質、例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術を介して、例えば、ＶＩＩ型コラーゲン、ＨＩＦ１、又はＣＣＮ３を過小発現する線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらは、例えば、Pendaries V et al., JID 2012［１］；Petek LM et al. Mol ther 2010［２］に記載のように独立して遺伝子改変された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらは、例えば、独立して遺伝子改変されていても、又はされていなくてもよい線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよく、例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４０４８の参照番号で識別されるＫｅｒ−ＣＴ細胞、又はＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４００５の参照番号で識別されるＴｅｌＣＯＦＳ０２ＭＡ細胞である。
【００２７】
それらはまた、ＨａＣａＴ角化細胞株又はＷＳ１線維芽細胞株を例とする細胞株由来の線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００２８】
それらはまた、成体幹細胞から、例えば前記成体幹細胞を維持することによって誘導された多能性幹細胞から、並びに／又は例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、若しくはｃ−Ｍｙｃ遺伝子の導入、及び続いてのレチノイン酸及び／若しくはＢＭＰ−４を例とする因子カクテルによる細胞株への分化を介して誘導された多能性幹細胞から独立して得られた線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。それらはまた、アルギニン末端ポリアミドアミンナノ粒子を例とするナノ粒子の使用に基づく非ウィルス技術によって誘導された成体幹細胞及び／又は多能性幹細胞であってもよい。当業者であれば、自身の一般的知識により、方法及び／又は細胞を選択することができる。それらは、例えば、Kogut et al. Methods Mol Biol 2014［３］、Ohta et al., Methods Mol
Biol, 2013［４］、及び／又はRevilla et al., J Tissue Eng Regen Med, 2015［５］に記載される方法によって得られた線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００２９】
本発明において、「線維芽細胞培地Ｍ１」の用語は、線維芽細胞の培養に適する当業者に公知のいかなる培地をも意味することを意図している。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むＧｉｂｃｏ社から販売されているダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）、又はＣｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から販売されているＦｉｂｒｏｌｉｆｅ培地であっ
てよい。
【００３０】
【表１−１】
2018510643.tif 000003
【表１−２】
2018510643.tif 000004
【００３１】
本発明において、培地Ｍ１は、添加剤、特に、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）も含んでよい。
【００３２】
本発明において、培地Ｍ１は、例えば、培地の総重量に対して、５重量％から１５重量％、７．５から１２．５重量％、１０重量％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでよい。
【００３３】
本発明において、培地Ｍ１は、少なくとも１つの抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物を含んでよい。これは、例えば、当業者に公知の、及び／又は市販されているいかなる抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物であってもよい。それは、例えば、アンホテリシンＢ、ケトコナゾール、及びこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗真菌性化合物であってよい。それは、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、及びこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗菌性化合物であってよい。
【００３４】
本発明において、培地Ｍ１は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、１重量％の抗真菌剤を含んでよい。
【００３５】
本発明において、培地Ｍ１は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、１重量％の抗生物質を含んでよい。
【００３６】
本発明において、培地Ｍ１及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００３７】
「臨床グレード」の用語は、本発明において、構成成分又は培地が、ある分野における臨床的な使用に適するとして該当機関から認可されたものであることを意味する。有利には、本発明において、培地が臨床グレードである場合、それは、ウシ脳下垂体抽出物を含まない。
【００３８】
本発明において、線維芽細胞培養工程ａは、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００３９】
本発明において、工程ａの線維芽細胞培養時間は、５から２１日間、５から１５日間、又は８から１５日間を含んでよい。
【００４０】
本発明において、工程ａの線維芽細胞培養時間は、５％から１０％のＣＯ２を含む制御雰囲気下、例えば、少なくとも５％のＣＯ２を含む雰囲気下で行われてよい。
【００４１】
本発明において、線維芽細胞培養工程ａは、３０から４０℃、３２から４０℃、又は３７℃に等しい温度、及び少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下のインキュベーター中で行われてよい。
【００４２】
本発明において、線維芽細胞培養工程ａは、当業者に公知である適切ないかなる培養容器中で行われてもよい。それは、ペトリ皿、又は容量が２５、７５、若しくは１７５ｃｍ２である培養フラスコであってもよい。
【００４３】
本発明において、工程ａに従う培養によって得られた線維芽細胞は、培養容器中、コンフルエントである細胞の層を形成してよい。例えば、線維芽細胞は、７０％から１００％コンフルエントであってよく、好ましくは、１００％コンフルエントである。
【００４４】
本発明において、工程ａに従う培養が、所望に応じてコンフルエントであってもよい細胞の層に相当する場合、方法はさらに：
−  培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程ａ’、
−  トリプシン処理によって細胞を剥離する工程ａ’’、及び
−  沈澱を行う工程ａ’’’、
も含んでよい。
【００４５】
本発明では、工程ａ’において、培地の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地を吸引すること、又は培地を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【００４６】
本発明では、工程ａ’において、細胞のリンスは、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよく、例えば、リンス溶液中での細胞の浸漬、散布、又はインキュベーションによる。
【００４７】
本発明において、「リンス溶液」の用語は、当業者に公知である細胞をリンスするためのいかなる溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、７．２から７．４を含むｐＨのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）緩衝溶液であってよい。
【００４８】
【表２】
2018510643.tif 000005
【００４９】
それは、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってもよい。
【００５０】
本発明では、工程ａ’において、リンス溶液の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、リンス溶液を吸引すること、又はリンス溶液を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【００５１】
本発明において、トリプシン処理工程ａ’’は、トリプシンを含む緩衝溶液（ＢＳ）に細胞を浸漬し、続いて、酵素反応を停止するために、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって行われてよい。
【００５２】
本発明において、緩衝溶液（ＢＳ）は、トリプシン処理法に用いることができる当業者に公知であるいかなる緩衝溶液であってもよい。それは、例えば、それぞれＧｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってもよい。
【００５３】
本発明において、緩衝溶液（ＢＳ）に添加されるトリプシンの量は、総重量に対して０．０１重量％から０．０５重量％であってよい。
【００５４】
本発明において、緩衝溶液（ＢＳ）にＦＣＳを添加する前のトリプシンを含む緩衝溶液中でのインキュベーション時間は、２から１０分間であってよい。
【００５５】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）に添加されるＦＣＳの量は、総体積に対して５体積％から２０体積％を含んでよい。
【００５６】
本発明において、沈澱工程ａ’’’は、当業者に公知であるいかなる方法で行われても
よい。それは、例えば、沈降、又は８００から１４００回転毎分、例えば１２００回転毎分に等しい速度での遠心分離であってよい。
【００５７】
本発明において、遠心分離工程ａ’’’は、４から１０分間、例えば５分間に等しい時間にわたって行われてよい。
【００５８】
本発明において、遠心分離工程ａ’’’は、当業者に公知であるいかなる装置で行われてもよい。それは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社又はＪｏｕａｎ社から販売されている回転式遠心分離機であってもよい。
【００５９】
本発明において、「コラーゲンを含むマトリクス」の用語は、細胞を播種することができる当業者に公知であるコラーゲンを含むいずれのマトリクスをも意味することを意図している。それは、例えば、Bell et al., 1979［６］に記載されるように、好ましくは線維芽細胞のいかなる優先的な組織化も起こさない、弛緩状態の（non-taut）Ｉ型コラーゲンゲルに相当するコラーゲンマトリクスであってよい。それは、例えば、２５から５００ｃｍ２の表面積であるＩ型コラーゲンが好ましいコラーゲンの密度／濃度を有するマトリクスであってよい。それは、例えば、市販のコラーゲンを含むマトリクスであってよく、例えば、それは、Ｉｎｔｅｇｒａ社から販売されているコラーゲンを含むマトリクスであってもよい。
【００６０】
有利には、コラーゲンを含むマトリクスは、真皮再生マトリクス（dermal regeneration matrix）であってよい。真皮再生マトリクスは、特に、それぞれＩｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社及びＭｅｄＳｋｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｄｒ．  Ｓｕｗｅｌａｃｋ  ＡＧ社からＩｎｔｅｇｒａ（登録商標）及びＭａｔｒｉｄｅｒｍ（登録商標）の商品名で販売されているマトリックスから選択されてよい。有利には、及びコラーゲンを含む他のマトリックスとは対照的に、上記で述べたものなどの真皮再生マトリクスは、既にモデル化されており、それによって、皮膚同等物の構築が促進される。
【００６１】
１つの実施形態では、コラーゲンを含むマトリクスは、架橋されたコラーゲン、及び少なくとも１つのグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン−６−硫酸を含むマトリクスであってよい。それは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されているＩｎｔｅｇｒａマトリクス（登録商標）及び／又はBoyce ST et al., 1988［７］の文書に記載される方法に従って得られたマトリクスであってもよい。
【００６２】
別の実施形態では、コラーゲンを含むマトリクスは、未変性構造コラーゲン及びエラスチンの線維を含むマトリクスであってもよい。「未変性構造コラーゲンの線維」の用語は、特に、化学的に架橋されていない線維を意味することを意図している。マトリクスは、例えば、ＭｅｄＳｋｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｄｒ．  Ｓｕｗｅｌａｃｋ  ＡＧ社から販売されているＭａｔｒｉｄｅｒｍマトリクス、及び／又はHafemann et al., Burns 1999［８］の文書に記載の方法に従って得られたマトリクスであってもよい。
【００６３】
本発明において、コラーゲンを含むマトリクスの厚さは、線維芽細胞を播種する前は、１．０から３．０ｍｍ（両端値を含む）であってよい。１つの特定の実施形態では、コラーゲンを含むマトリクスの厚さは、線維芽細胞を播種する前は、厳密に１．０ｍｍ超であってよい。
【００６４】
本発明において、工程ｂの播種は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、線維芽細胞を含む培地のマトリクス上への散布による、マトリクス上で細胞をサブ培養することによる堆積による、細胞を懸濁状態で含む培地の注ぎ入れによ
る、又は例えばWonhye Lee et al. “Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication.” Biomaterials, 2009, March; 30(8):1587-95［７］に記載のような３Ｄプリンティングによる適用であってもよい。
【００６５】
本発明において、工程ａが、工程ａ’’を含む場合、本発明の方法は、播種工程ｂの前に、遠心分離した細胞の培地Ｍ１中での再懸濁の工程ｂ１を含んでよい。
【００６６】
本発明において、コラーゲンマトリクスの工程ｂの播種は、コラーゲンを含むマトリクスの表面積に対して、２００００から５００００線維芽細胞／ｃｍ２、好ましくは、３００００線維芽細胞／ｃｍ２の密度で行われてよい。１つの特定の実施形態では、線維芽細胞密度は、コラーゲンを含むマトリクスに対して、厳密に５００００線維芽細胞／ｃｍ２未満であってよい。
【００６７】
本発明において、線維芽細胞培地Ｍ２は、線維芽細胞の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地であってもよい。それは、例えば、市販の培地であってもよく、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）であってもよい。
【００６８】
本発明において、培地Ｍ１はまた、添加剤、特に、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでもよい。
【００６９】
本発明において、培地Ｍ２は、培地の総重量に対して、５から１５重量％、７．５重量％から１２．５重量％、又は１０重量％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでもよい。
【００７０】
本発明において、培地Ｍ２は、少なくとも１つの抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物を含んでよい。それは、例えば、当業者に公知である及び／又は市販されているいかなる抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物であってもよい。それは、例えば、アンホテリシンＢ、ケトコナゾール、又はこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗真菌性化合物であってもよい。それは、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、及びこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗菌性化合物であってもよい。
【００７１】
本発明において、培地Ｍ２は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、又は１重量％の抗真菌剤を含んでよい。
【００７２】
本発明において、培地Ｍ２は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、又は１重量％に等しい量の抗生物質を含んでよい。
【００７３】
本発明において、培地Ｍ２はまた、アスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含んでもよい。例えば、培地Ｍ２は、２０から６０ｍｇ・ｍＬ−１、例えば、３０から５５ｍｇ・ｍＬ−１、又は５０ｍｇ・ｍＬ−１に等しい濃度で、アスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含んでよい。
【００７４】
有利には、アスコルビン酸により、特に、線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激することによって、コラーゲンを含むマトリクスのリモデリングを促進することが可能となる。
【００７５】
本発明において、培地Ｍ２及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００７６】
本発明において、線維芽細胞培養工程ｃは、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００７７】
本発明において、工程ｃの線維芽細胞培養時間は、５から１２日間、又は７から１０日間であってよい。
【００７８】
本発明において、線維芽細胞培養工程ｃは、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【００７９】
本発明において、コラーゲンを含むマトリクスに播種された線維芽細胞の培養工程ｃは：
−  アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない線維芽細胞培地Ｍ２１の存在下、１８から２８日間にわたる第一の培養工程ｃ’、及び
−  アスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含む線維芽細胞培地Ｍ２２の存在下、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｃ’’
を含んでよい。
【００８０】
この実施形態において、線維芽細胞培地Ｍ２１は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない上記で定める通りの培地Ｍ２に相当する。本発明において、培地Ｍ２１及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００８１】
この実施形態において、線維芽細胞培地Ｍ２２は、アスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含む上記で定める通りの培地Ｍ２に相当する。本発明において、培地Ｍ２２及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００８２】
本発明において、培養工程ｃ’は、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００８３】
本発明において、工程ｃ’の培養時間は、１９から２７時間、例えば２４時間であってよい。
【００８４】
本発明において、培養工程ｃ’’は、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００８５】
本発明において、工程ｃ’’の培養時間は、５から１２日間、又は７日間に等しくてよい。
【００８６】
本発明者らはまた、有利には、工程ｃで得られたマトリクス及び培養線維芽細胞が、代用真皮に相当する構造を形成することも実証した。
【００８７】
有利には、培養工程ｃ’は、接着及び線維芽細胞によるマトリクスのコロニー形成の工程に相当し、工程ｃ’’により、有利には、代用真皮を形成するための線維芽細胞を含むマトリクスのリモデリングが可能となる。特に、それぞれ培地Ｍ２１及びＭ２２を用いることによる連続する工程ｃ’及びｃ’’により、有利には、線維芽細胞が増殖せず、コラーゲンを含むマトリクスにコロニー形成する代用真皮の形成が可能となり、同時に、有利には、線維芽細胞自体によるコラーゲン産生も可能となり、したがって、真皮のリモデリングが可能となる。
【００８８】
言い換えると、工程ｃ後に得られた製品は、有利には、代用真皮として用いることがで
きる。特に、この製品は、線維芽細胞が誘導され得る真皮のすべての物理化学的特性を含む。
【００８９】
本発明において、メラニン形成細胞培養工程ｄは、当業者に公知である適切ないかなる培養容器中で行われてもよい。それは、ペトリ皿、又は容量が２５から７５ｃｍ２、２５、７５、１２５ｃｍ２である培養フラスコであってもよい。
【００９０】
本発明において、メラニン形成細胞培地Ｍ３は、メラニン形成細胞の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地であってもよい。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社から「Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍ２」、「ＭＢＭ」の参照名で販売されている市販の培地、又は以下の表３に示されるように、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているＭＣＤＢ１５３培地であってよい。
【００９１】
【表３−１】
2018510643.tif 000006
【表３−２】
2018510643.tif 000007
【００９２】
それはまた、改変された市販の培地であってもよく、例えば、チロシン、メチオニン、又はこれらの混合物を例とする補助アミノ酸、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を例とするさらなる無機塩も含むＭＣＤＢ１５３培地であってもよい。
【００９３】
本発明において、培地Ｍ３はさらに、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、インスリン、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）、ヒドロコルチゾン、ウマ血清、ウシ血清、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＳＣＦ、又はこれらのいずれかの混合物から選択される少なくとも１つの添加剤も含んでよい。
【００９４】
本発明において、培地Ｍ３は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５から５重量％、又は１重量％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）を含んでよい。
【００９５】
本発明において、培地Ｍ３は、１．２５から１．６０μＭ、１．４０から１．５５μＭ、又は１．４５μＭのヒドロコルチゾン濃度を含んでよい。
【００９６】
本発明において、培地Ｍ３は、１００から１６０μｇ・ｍＬ−１、１１０から１５０μｇ・ｍＬ−１、又は１４０μｇ・ｍＬ−１に等しいウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）濃度を含んでよい。
【００９７】
本発明において、培地Ｍ３は、１５から２５μｇ・ｍＬ−１、又は２０μｇ・ｍＬ−１に等しいインスリン濃度を含んでよい。
【００９８】
本発明において、培地Ｍ３は、０．０１から０．２μｇ・ｍＬ−１、０．０１から０．１μｇ・ｍＬ−１、又は０．０１μｇ・ｍＬ−１に等しいＧＭ−ＣＳＦ濃度を含んでよい。
【００９９】
本発明において、培地Ｍ３は、０．００４から０．２μｇ・ｍＬ−１、０．０１から０．１５μｇ・ｍＬ−１、又は０．０５μｇ・ｍＬ−１に等しいＳＣＦ濃度を含んでよい。
【０１００】
本発明において、培地Ｍ３は、０．１から１０ｎｇ・ｍＬ−１、０．５から５ｎｇ・ｍＬ−１、０．８から２ｎｇ・ｍＬ−１、又は１ｎｇ・ｍＬ−１に等しいｂＦＧＦ濃度を含んでよい。
【０１０１】
本発明において、培地Ｍ３は、培地の総重量に対して、１重量％から５重量％、２重量％から４重量％、若しくは３重量％のウマ又はウシ血清を含んでよい。
【０１０２】
本発明において、培地Ｍ３及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【０１０３】
本発明において、メラニン形成細胞培養工程ｄは、３０から４０℃、例えば３７℃に等しい温度を例とする周囲温度で行われてよい。
【０１０４】
本発明において、工程ｄの培養時間は、１５から２８日間であってよい。
【０１０５】
本発明において、工程ｄのメラニン形成細胞培養は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１０６】
本発明において、工程ｄに従う培養によって得られたメラニン形成細胞は、培養容器中、コンフルエントである細胞層を形成してよい。例えば、メラニン形成細胞は、５０％から１００％コンフルエントの細胞層を形成してよい。
【０１０７】
本発明によると、工程ｄに従う培養が、所望に応じてコンフルエントであってもよい細胞層に相当する場合、方法はさらに：
−  培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程ｄ’、
−  トリプシン処理によって細胞を剥離する工程ｄ’’、及び
−  沈澱工程ｄ’’’、
も含んでよい。
【０１０８】
本発明において、工程ｄ’では、培地の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地を吸引すること、又は培地を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１０９】
本発明において、工程ｄ’では、細胞のリンスは、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよく、例えば、リンス溶液中での細胞の散布又は浸漬であってもよい。
【０１１０】
本発明において、「メラニン形成細胞リンス溶液」の用語は、当業者に公知であるいかなるメラニン形成細胞リンス溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、上記の表２に記載の溶液を例とするＨＢＳＳ緩衝溶液、又は７．２から７．４を含むｐＨのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。それはまた、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってもよい。
【０１１１】
本発明において、工程ｄ’では、リンス溶液の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、リンス溶液を吸引すること、又はリンス溶液を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１１２】
本発明によると、トリプシン処理工程ｄ’’は、トリプシンを含む緩衝溶液（ＢＳ）に細胞を浸漬し、続いて、酵素反応を停止するために、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって行われてよい。
【０１１３】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）は、上記で定める通りの緩衝溶液であってよい。
【０１１４】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）に添加されるトリプシンの量は、総重量に対して、０．０１重量％から０．０５重量％であってよい。
【０１１５】
本発明によると、ＦＣＳを緩衝溶液に添加する前のトリプシンインキュベーション時間は、２から５分間であってよい。
【０１１６】
本発明において、溶液（ＢＳ）に添加されるＦＣＳの量は、総体積に対して５体積％から２０体積％を含んでよい。
【０１１７】
本発明によると、沈澱工程ｄ’’’は、沈降によって、遠心分離によって、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、８００から１２００回転毎分の速度での遠心分離であってもよい。
【０１１８】
本発明において、遠心分離工程ｄ’’’は、５から１０分間にわたって行われてよい。
【０１１９】
本発明において、遠心分離工程ｄ’’’は、当業者に公知であるいかなる装置で行われてもよい。それは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社又はＪｏｕａｎ社から販売されている回転式遠心分離機であってもよい。
【０１２０】
本発明において、遠心分離工程ｄ’’’により、細胞を培地から分離するために、細胞を沈降させることができる。当業者であれば、一般的知識により、培地中の細胞を沈降させることができる公知のいずれかの技術を用いて遠心分離工程ｄ’’’を適合／改変させる方法を認識しているであろう。
【０１２１】
本発明において、角化細胞培養工程ｅは、当業者に公知である適切ないかなる培養容器中で行われてもよい。それは、ペトリ皿、又は容量が２５から７５ｃｍ２、２５、７５、若しくは１２５ｃｍ２である培養フラスコであってもよい。
【０１２２】
本発明において、角化細胞培地Ｍ４は、角化細胞の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地であってもよい。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から販売されているＫＳＦＭ培地、Ｌｏｎｚａ社若しくはＰｒｏｖｉｔｒｏ社から販売されているＫＧＭ、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えば
グルコースの混合物を特に含むＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているＭＣＤＢ１５３培地であってよい。それはまた、改変された市販の培地であってもよく、例えば、０．１００から０．１１０Ｍ／ｌ、例えば０．１０４Ｍ／ｌの塩化ナトリウム濃度、２から３×１０−２Ｍ／ｌ、例えば２．２９×１０−２Ｍ／ｌのＨｅｐｅｓ濃度、１．１０×１０−２Ｍ／ｌから１．２５×１０−２Ｍ／ｌ、例えば１．１９×１０−２Ｍ／ｌの炭酸水素ナトリウム濃度を含み、並びに未改変ＭＣＤＢ１５３培地の濃度の２倍であるアルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、及びコリンの濃度を含むＭＣＤＢ１５３培地であってもよい。
【０１２３】
本発明において、培地Ｍ４は、増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、インスリン、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）、ヒドロコルチゾン、又はこれらのいずれかの混合物から選択される添加剤も含んでよい。有利には、培地Ｍ４は、臨床グレードの添加剤を含んでよい。それらは、例えば、増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）、ヒドロコルチゾン、又はこれらのいずれかの混合物から選択される添加剤であってよい。
【０１２４】
本発明において、培地Ｍ４は、例えば、培地の総重量に対して、０．５重量％から５重量％、０．７５から３重量％、又は１重量％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）を含んでよい。
【０１２５】
本発明において、培地Ｍ４は、１．２５から１．６０μＭ、１．４０から１．５５μＭ、又は１．４５μＭのヒドロコルチゾン濃度を含んでよい。
【０１２６】
本発明において、培地Ｍ４は、５０から９０μｇ・ｍＬ−１、６０から８０μｇ・ｍＬ−１、又は７０μｇ・ｍＬ−１のウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）濃度を含んでよい。
【０１２７】
本発明において、培地Ｍ４は、３から８μｇ・ｍＬ−１、例えば５μｇ・ｍＬ−１に等しいインスリン濃度を含んでよい。
【０１２８】
本発明において、培地Ｍ４は、５から１５ｎｇ・ｍＬ−１、６．５から１３ｎｇ・ｍＬ−１、又は１０ｎｇ・ｍＬ−１に等しい上皮増殖因子（ＥＧＦ）濃度を含んでよい。
【０１２９】
本発明において、培地Ｍ４及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【０１３０】
本発明において、角化細胞培養工程ｅは、２５から３９℃、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１３１】
本発明において、工程ｅの培養時間は、１５から２８日間を含んでよい。
【０１３２】
本発明において、工程ｅの角化細胞培養は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１３３】
本発明において、工程ｅに従う培養によって得られた角化細胞は、培養容器中にて細胞の単層を形成し得る。それは、例えば、培養容器中、コンフルエントに近い、例えば、５０％から８０％コンフルエントである細胞の単層であってよい。
【０１３４】
本発明において、工程ｅに従う培養が、コンフルエントに近い、好ましくは、５０％から８０％コンフルエントである細胞の単層に相当する場合、方法はさらに：
−  培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程ｅ’、
−  トリプシン処理によって細胞を剥離する工程ｅ’’、及び
−  遠心分離工程ｅ’’’、
も含んでよい。
【０１３５】
本発明において、工程ｅ’では、培地の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地を吸引すること、又は培地を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１３６】
本発明において、工程ｅ’では、細胞のリンスは、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよく、例えば、角化細胞リンス溶液中での細胞の浸漬、散布、又はインキュベーションによる方法であってもよい。
【０１３７】
本発明において、「角化細胞リンス溶液」の用語は、当業者に公知であるいかなる角化細胞リンス溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、７．２から７．４を含むｐＨのＰＢＳ緩衝溶液又は例えば上記の表２に記載のようなＨＢＳＳ緩衝溶液であってよい。それはまた、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってよい。
【０１３８】
本発明において、工程ｅ’では、角化細胞リンス溶液の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、角化細胞リンス溶液を吸引すること、又は角化細胞リンス溶液を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１３９】
本発明において、トリプシン処理工程ｅ’’は、トリプシンを含む溶液（Ｓ）に細胞を浸漬し、続いて、酵素反応を停止するために、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって行われてよい。
【０１４０】
本発明において、溶液（Ｓ）に添加されるトリプシンの量は、溶液の総重量に対して、０．０１％から０．０５％を含んでよい。
【０１４１】
本発明において、ＦＣＳを培地に添加する前のトリプシンインキュベーション時間は、５から１０分間を含んでよい。
【０１４２】
本発明において、溶液（Ｓ）に添加されるＦＣＳの量は、溶液の総重量に対して５重量％から２０重量％を含んでよい。
【０１４３】
本発明において、遠心分離工程ｅ’’’は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、８００から１２００回転毎分の速度での遠心分離であってもよい。
【０１４４】
本発明において、遠心分離工程ｅ’’’は、５から１０分間にわたって行われてよい。
【０１４５】
本発明において、遠心分離工程ｅ’’’は、当業者に公知であるいかなる装置を用いて行われてもよい。それは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社又はＪｏｕａｎ社から販売されている回転式遠心分離機であってもよい。
【０１４６】
本発明において、工程ｄで得られたメラニン形成細胞を工程ｅで得られた角化細胞と混合する工程ｆは、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地中、撹拌下での細胞の混合であってもよい。
【０１４７】
本発明において、工程ｆのメラニン形成細胞と角化細胞との混合は、１／２０から１／１５、又は１／１９に等しい数基準でのメラニン形成細胞／角化細胞比で行われてよい。
【０１４８】
有利には、本発明者らは、驚くべきことに、メラニン形成細胞と角化細胞との混合を、１／２０から１／１５、好ましくは１／１９に等しいメラニン形成細胞／角化細胞比で行った場合、得られる代用皮膚又は皮膚同等物が、生体内の皮膚と同一の構造的／生物学的特性を有することを実証した。
【０１４９】
１つの好ましい実施形態では、工程ｆのメラニン形成細胞と角化細胞との混合は、１／２０から１／１５、又は１／１９に等しい数基準でのメラニン形成細胞／角化細胞比で行われ、コラーゲンを含むマトリクスは、上記で定める通りの真皮再生マトリクスである。
【０１５０】
本発明において、工程ｇの代用真皮への播種は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、工程ｆで得られたメラニン形成細胞と角化細胞との混合物を含む培地の散布による、代用真皮上で細胞をサブ培養することでの堆積による、工程ｆで得られたメラニン形成細胞と角化細胞との混合物細胞を含む培地の滴下による、又は例えばWonhye Lee et al. “Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication.” Biomaterials, 2009, Mar; 30(8):1587-95［９］に記載のような３Ｄプリンティングによる適用であってもよい。
【０１５１】
本発明において、工程ｇの代用真皮への播種は、有利には、９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行われてよい。本発明者らは、実際、驚くべきことに、工程ｇの播種を９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行った場合、得られる代用皮膚又は皮膚同等物が、正常皮膚と同一の構造的／生物学的特性を有することを実証した。
【０１５２】
１つの好ましい実施形態では、工程ｇの代用真皮への播種は、９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行われ、コラーゲンを含むマトリクスは、上記で定める通りの真皮再生マトリクスである。
【０１５３】
本発明において、「皮膚培地Ｍ５」の用語は、皮膚の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地をも意味することを意図している。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、改変グリーン培地（modified Green medium）であってよく、すなわち、２／３のダルベッコ／フォークト改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）；１／３のハムＦ１２培地を含み、及び１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでおり、これは、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むＧｉｂｃｏ社から販売されている注文生産の混合物である。それはまた、改変グリーン培地、すなわち、コレラ毒素及びトリヨードチロニン（triodothyronine）を含まないグリーン培地、又は１０％のＦＣＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）とＭＣＤＢ１５３培地との混合物、又は１０％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ／ｄｅｒｍａｌｉｆｅ角化細胞培地であってよく、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、及びＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから販売されている。
【０１５４】
本発明において、培地Ｍ５は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩若しくはそれらの誘導体、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩若しくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物から選択される添加剤もさらに含んでよい。
【０１５５】
本発明において、培地Ｍ５は、例えば、４０から６０ｍｇ・Ｌ−１、４５から５５ｍｇ
・Ｌ−１、又は５０ｍｇ・Ｌ−１のヒアルロン酸塩又はヒアルロン酸を含んでよい。
【０１５６】
有利には、培地Ｍ５が、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩及び／又はそれらの誘導体を含む場合、それは、ウシ脳下垂体抽出物を含まない。
【０１５７】
本発明において、培地Ｍ５は、例えば、４０から６０ｍｇ・Ｌ−１、４５から５５ｍｇ・Ｌ−１、又は５０ｍｇ・Ｌ−１のアスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含んでよい。
【０１５８】
本発明において、皮膚培養工程ｈは、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１５９】
本発明において、工程ｈの皮膚培養時間は、６から２１日間、例えば８から１５日間であってよい。
【０１６０】
本発明において、工程ｈの皮膚培養は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１６１】
本発明によると、工程ｈの皮膚培養は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度、及び少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１６２】
本発明において、培地Ｍ５及び／又はその各構成成分は、臨床グレードのものであってよい。
【０１６３】
本発明において、工程ｈは：
−  ヒアルロン酸及びヒアルロン酸塩を、又はアスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない培地Ｍ５１の存在下、少なくとも６時間、好ましくは、６から２４時間にわたる第一の培養工程ｈ’、
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５２の存在下、０から７日間、好ましくは、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｈ’’、並びに
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中、少なくとも２日間にわたる第三の培養工程ｈ’’’
を含んでよい。
【０１６４】
代用皮膚培地Ｍ５１は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない上記で定める通りの培地Ｍ５に相当する。
【０１６５】
本発明において、培地Ｍ５１及び／又はその各構成成分は、臨床グレードのものであってよい。
【０１６６】
代用皮膚又は皮膚同等物培地Ｍ５２は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含み、同時に、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含まない上記で定める通りの培地Ｍ５に相当する。
【０１６７】
本発明において、培地Ｍ５２は、臨床グレードの培地であってよい。
【０１６８】
代用皮膚又は皮膚同等物培地Ｍ５３は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含み、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む上記で定める通りの培地Ｍ５に相当する。
【０１６９】
本発明において、培地Ｍ５３は、臨床グレードの培地であってよい。
【０１７０】
本発明において、培養工程ｈ’は、工程ｇで得られた播種された代用真皮を、培地Ｍ５１中に堆積されることによって行われてよい。
【０１７１】
本発明において、培養工程ｈ’は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１７２】
本発明において、培養工程ｈ’の継続時間は、６から２４時間、例えば８から２４時間、又は１２から１８時間であってよい。
【０１７３】
本発明において、皮膚培養工程ｈ’は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１７４】
有利には、本発明者らは、工程ｈ’により、メラニン形成細胞及び角化細胞の代用真皮上での接着を促進することが可能となることを実証した。
【０１７５】
本発明において、培養工程ｈ’’は、工程ｈ’で得られた播種された代用真皮を、培地Ｍ５２中に堆積されることによって、又は工程ｈ’で得られた播種された代用真皮を、培地Ｍ５２中に浸漬若しくは液浸（submersion）することで行われてよい。
【０１７６】
本発明において、培養工程ｈ’’は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１７７】
本発明において、培養工程ｈ’’の継続時間は、０から７日間、好ましくは、２から７日間を含んでよい。
【０１７８】
本発明において、皮膚培養工程ｈ’’は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１７９】
本発明において、培養工程ｈ’’’は、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮の培地Ｍ５２での堆積、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮の培地Ｍ５２への浸漬、又は工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮の、前記代用物が気液界面まで前記培地中に浸漬されるか若しくは前記培地の液面からちょうど出るように浸漬される浸漬によって行われてよい。
【０１８０】
本発明において、「前記培地の液面からちょうど出る」の用語は、培地中への代用物の浸漬が、その上部を浸漬することなくその高さ全体にわたって代用物を覆うように行われることを意味することを意図している。
【０１８１】
本発明において、培養工程ｈ’’’は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１８２】
本発明において、培養工程ｈ’’’の継続時間は、２から７日間、好ましくは、７日間を含んでよい。
【０１８３】
本発明において、皮膚培養工程ｈ’’’は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１８４】
有利には、本発明者らは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びア
スコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中に、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮を浸漬させることにより、真皮−表皮接合部の形成を促進することが可能となり、したがって、播種された代用真皮の細胞のより良好な極性化が得られることを実証した。
【０１８５】
有利には、本発明者らはまた、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮を培地の気液界面まで、又は培地の液面からちょうど出るように、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中に浸漬させることにより、表皮の分化が可能となり、したがって、代用皮膚又は同等物上での角質層の形成が促進されることも実証した。
【０１８６】
有利には、本発明者らはまた、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮を培地の気液界面まで、又は培地の液面からちょうど出るように、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中に浸漬させることにより、基底層の細胞の高い増殖能、並びに生体内の皮膚で見られる勾配に類似する表皮の分化の増加に伴う増殖能の減少勾配を維持することが可能となることも実証した。
【０１８７】
有利には、本発明者らはまた、培地Ｍ５がヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む場合、このことにより、驚くべきことに、生体内の皮膚と同一の構造で前記皮膚を形成する層のすべてを含む代用皮膚又は同等物の品質を改善することが可能となることも実証した。
【０１８８】
有利には、本発明者らは、この方法により、有利には、その構成層のすべてを含む代用皮膚又は同等物を得ることが可能となることを実証した。したがって、本発明の方法に従って得られる代用皮膚は、先行技術で知られる代用皮膚とは対照的に、天然の皮膚に類似の特性を有する。
【０１８９】
有利には、本発明者らはまた、この方法により、先行技術で知られているよりも非常に大きいサイズの代用真皮及び／又は代用皮膚又は同等物を得ることが可能となることも実証した。特に、この方法により、有利には、１から２５ｃｍ２、例えば、５から２５ｃｍ２の表面積を有する代用真皮及び／又は代用皮膚又は同等物を得ることが可能となる。
【０１９０】
本発明者らはまた、有利には、この方法により、最小増幅能（minimum amplification capacity）が６である代用真皮若しくは同等物、及び／又は皮膚同等物若しくは代用物を得ることが可能となることも実証した。
【０１９１】
加えて、本発明者らはまた、有利には、この方法により、その取扱い時に前記同等物のいかなる断裂／物理的変化をも回避することが有利には可能となる粘弾性を伴って取扱うことができる真皮同等物及び／又は皮膚同等物を得ることが可能となることも実証した。
【０１９２】
有利には、本発明者らは、皮膚同等物が、表皮メラニン沈着ユニット（epidermal melanization unit）を形成する基底層のレベルにメラニン形成細胞を含むことを実証した。
【０１９３】
有利には、上述した方法によって得ることができる皮膚同等物は、有利には、メラニン形成細胞の存在によって、構成的な色素沈着を呈する。
【０１９４】
本発明の別の主題は、本発明に従う皮膚同等物の実験用ツールとしての使用である。
【０１９５】
本発明において、「実験用ツール」の用語は、例えば皮膚同等物の生体外試験での使用
を意味することを意図している。それらは、例えば、皮膚同等物に対する生理機能、構造、色素沈着剤、光防護剤、又は酸化防止剤を例とする剤（agent）の評価についての研究を目的とする試験であってよい。
【０１９６】
本発明において、及び上記で述べたように、同等物中に存在する角化細胞、メラニン形成細胞、及び線維芽細胞は、独立して、異なる組織／生検組織／細胞培養物から得られてよく、したがって、皮膚同等物は、有利には、病態の代表物であってもよく、及び／又は病理的若しくは非病理的細胞の群の、同等物中に存在する他の細胞の群に対する影響の研究を可能とするものであってもよい。例えば、得られる皮膚同等物は、若年性ざ瘡、白斑、肝斑、老人性黒子、又は強皮症を例とする皮膚病態の代表物及び／又はモデルであってよい。加えて、有利には、得られる皮膚同等物は、カルシノーマ若しくはメラノーマ型の皮膚のモデルを例とする病態皮膚を代表するものであるか、又はモデルであってよい。
【０１９７】
したがって、本発明の別の主題は、少なくとも１つの候補剤を評価するためのプロセスにおける皮膚同等物の使用である。
【０１９８】
本発明において、候補剤は、候補化合物及び／又は外部因子である。
【０１９９】
本発明によると、代用皮膚は、当業者に公知であり、及び皮膚に関しての化合物の評価に適している候補化合物評価のためのいかなるプロセスに用いられてもよい。例えば、皮膚同等物は、米国特許出願公開第２００４／００１５１４９号の文書、米国特許第５８８２２４８号の文書、米国特許出願公開第２００８／００９７６０７号の文書、又は欧州特許第２７８１１９１号の文書に記載されている方法に用いられてよい。
【０２００】
使用時、「皮膚同等物」の用語は、上記で述べたように、皮膚同等物及び／又は代用皮膚を意味することを意図している。
【０２０１】
それは、当業者に公知であるいかなる化学的及び／又は生物学的化合物に関していてもよい。それは、例えば、当業者に公知である化合物、並びに／又は市販の化合物、並びに／又は化学合成又は植物、細菌、及び／若しくは酵母物質からの抽出によって得られた化合物に関していてよい。それは、例えば、美容化合物又は有効成分、例えば、International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbookに記載されている美容化合物又は有効成分に関していてよい。それはまた、医薬及び／又は皮膚科学的化合物、例えば、Merck Index及び／又はOrange Bookに記載されているいずれの化合物であってもよい。
【０２０２】
本発明において、「外部因子」の用語は、例えば、紫外（ＵＶ）放射線、赤外（ＩＲ）放射線、低酸素、過酸素、汚れ空気、例えば高濃度の二酸化炭素及び／若しくは一酸化窒素を有する汚れ空気、並びに／又は汚染された空気、例えば都市の空気を意味することを意図している。
【０２０３】
本発明において、評価プロセスは、候補化合物をスクリーニングするプロセスであってもよい。
【０２０４】
評価プロセスは：
−  皮膚同等物を少なくとも１つの剤と接触させる段階、及び
−  前記剤の効果の存在又は効果の非存在を特定する段階
を含んでよい。
【０２０５】
本発明において、接触させる段階は、当業者に公知であるいかなるプロセスで行われてもよい。それは、例えば、前記剤を含む溶液中への皮膚同等物の浸漬による、当業者に公
知である適切ないずれかの手段による、皮膚同等物の表面の一部及び／又は全体への直接の適用であってよい。当業者であれば、自身の一般的知識により、候補化合物に応じて皮膚同等物と接触させる段階を適合させる方法を認識している。
【０２０６】
本発明において、効果を特定する工程は、当業者に公知であるいかなる方法及び／又は手段で行われてもよい。それは、例えば、皮膚同等物を、剤と接触させていないコントロール皮膚同等物と比較することであってよい。それは、例えば、皮膚同等物の巨視的外観の目視観察、又はメラニン、ＤＮＡに対する損傷、若しくは表皮分化の特定のための、所望に応じて予め染色若しくは免疫組織化学法が施されてよい皮膚同等物の光学顕微鏡による観察であってもよい。それはまた、剤で処理された又は処理されていない同等物の抽出物のプロテオーム解析又はトランスクリプトーム解析であってもよい。
【０２０７】
有利には、代用皮膚は、先行技術で知られるよりも非常に大きいサイズであり、それによって、特に、１つの同じ同等物に対する剤の評価を同時に行うことができる。
【０２０８】
有利には、真皮同等物は、線維芽細胞が分布している少なくとも１つのＩ型コラーゲンマトリクスを含む。それはまた、特にＩＶ型コラーゲンであるコラーゲン、ラミニン、又はグリコサミノグリカンなどの分子を例とするその他の細胞外マトリクス構成成分も含有してよい。
【０２０９】
その他の利点は、当業者であれば、説明のために与えられ、添付の図面によって示される以下の例を読むことで、さらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は、代用皮膚／同等物を得るための工程の図を示す。
【図２】図２は、皮膚（図２Ａ）、及び播種する細胞の比を変化させた方法に従って得られた代用皮膚／同等物（図２Ｂ及び２Ｃ）の光学顕微鏡写真を示す。
【図３】図３Ａは、工程ｃで得られた代用真皮の、線維芽細胞を染色した後の光学顕微鏡による写真である。図３Ｂは、小サイズ、すなわち０．５ｃｍ２の得られた代用皮膚の写真である。図３Ｃは、中サイズ、すなわち２５ｃｍ２の得られた代用皮膚の写真である。
【図４】図４は、１３．３の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞播種細胞比による方法に従って得られた皮膚同等物の光学顕微鏡写真（図４Ａ及びＢ）；基底位置（basal position）のメラニン形成細胞の免疫組織化学的標識（図４Ｃ、明色領域）、並びにＩＶ型コラーゲン（図４Ｄ（２））及びｐ６３増殖マーカー（図４Ｄ（１））を標識した基底層の生成を示す。
【実施例】
【０２１１】
例１：代用皮膚の作製の例
本例において、用いた細胞は、過去に患者に対して行った乳房形成術から採取した皮膚生検組織から得た。
【０２１２】
生検組織の採取は、形成外科医が行い、生検組織は、生理食塩水を含有する滅菌チューブに入れた。
【０２１３】
細胞は、以下のようにして生検組織から単離した。
【０２１４】
１．表皮細胞単離
ａ．生検組織を滅菌ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）でリンスする。
ｂ．生物学技術者が外科用メスを用いて脂肪組織を除去する。
ｃ．３７℃まで予備加熱したトリプシン−ＥＤＴＡと共に、３から２４時間インキュベ
ートする。
ｄ．照射処理ＦＣＳ（トリプシン阻害剤）で中和する。
ｅ．表皮を除去し、高増殖（ｐ６３陽性）細胞が見られる基底層を外科用メスでこすり取る。
ｆ．ろ過、１２００回転毎分での遠心分離、並びに、以下の表４に示す化合物を含むが、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及び塩化コリンの濃度を２倍とし、ＮａＣｌ濃度を０．１０４Ｍ／ｌに低下させ、Ｈｅｐｅｓを２．２９×１０−２Ｍ／ｌに低下させ、及びＮａＨＣＯ３を１．１９×１０−２Ｍ／ｌに低下させ、培地のｐＨを７．４に調節し、及び角化細胞のための抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン１％）を含む改変＊ＭＣＤＢ１５３培地中への１ｃｍ２あたり１０００００細胞でのペレットの播種を行う。
【０２１５】
メラニン形成細胞については、ろ過、１２００回転毎分での遠心分離、並びに、以下の表４に示す化合物を含み、さらに５．８８ｇの炭酸水素ナトリウム／５ｌ、０．２７２ｇのチロシン／５ｌ、及び０．１５７ｇのＬ−メチオニン／５ｌを含み、培地のｐＨを７．４に調節した改変ＭＣＤＢ１５３培地中への１ｃｍ２あたり１０００００細胞でのペレットの播種を行う。
【０２１６】
【表４−１】
2018510643.tif 000008
【表４−２】
2018510643.tif 000009
【０２１７】
ｇ．３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートする。
ｈ．およそ１週間後、差別的トリプシン処理（differential trypsinization）＝０．０２５％  トリプシン及び０．０．１Ｍ  ＥＤＴＡでのトリプシン処理（メラニン形成細胞を剥離するために１〜２分間、角化細胞を剥離するために１０分間）を行う。メラニン形成細胞が先に剥離するために、培養物を精製することができる。
照射処理ＦＣＳでの中和、１２００回転毎分での遠心分離、及び同じ媒体での増幅のためのペレットの播種を行う。
ｉ．３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートする。
【０２１８】
２．線維芽細胞の単離
ａ．真皮部分をＨＢＳＳでリンスする。
ｂ．１％  コラゲナーゼと共に、３７℃で、真皮の種類に応じて最大３時間にわたって真皮をインキュベートする。
ｃ．照射処理ＦＣＳで中和する。
ｄ．４０μｍの細胞ふるいでのろ過、ＧＲ  ２０２２遠心分離機による１２００回転毎
分での５分間の遠心分離、並びに１０％  照射処理ＦＣＳ、及び１％でペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中への２４時間の１ｃｍ２あたり１０００００細胞でのペレットの播種を行う。
ｅ．Ｊｏｕａｎ  ＩＧ  １５０インキュベーター中、３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートする。
【０２１９】
３．代用皮膚の作製
ａ．０．０２５％  トリプシン及び０．０．１Ｍ  ＥＤＴＡで１０分間線維芽細胞をトリプシン処理し、続いて照射処理ＦＣＳで中和し、ＧＲ  ２０２２遠心分離機により１２００回転毎分で５分間遠心分離し、予めハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３回リンスした滅菌コラーゲン由来の真皮マトリクス、すなわち、Ｉｎｔｅｇｒａ  ｍａｔｒｉｘ（登録商標）上の１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭに、注文生産のステンレス鋼インキュベーターチャンバー中、１ｃｍ２あたり３００００線維芽細胞の割合で播種する。
ｂ．３７℃、５％  ＣＯ２での２４時間の培養後、インキュベーションチャンバーをマトリクスから取り除いた。
ｃ．播種したマトリクスを、１０％の照射処理ＦＣＳ、並びに１％でペニシリン及びストレプトマイシン、並びに５０ｍｇ／ｍＬ  アスコルビン酸を含むＤＭＥＭ中、３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートした。
ｄ．角化細胞及びメラニン形成細胞のトリプシン処理を、０．０２５％  トリプシン及び０．０．１Ｍ  ＥＤＴＡで、メラニン形成細胞培養皿からのメラニン形成細胞の剥離のために１から２分間、続いて角化細胞培養皿からの角化細胞の剥離のために１０分間行う。メラニン形成細胞が最初に剥離し、それによって、培養物を精製することができる。照射処理ＦＣＳでの中和、及び遠心分離、及びインキュベーションチャンバー中での、１９角化細胞あたり１メラニン形成細胞を含有する混合物の１ｃｍ２あたり４０００００細胞での播種を行う。
ｅ．２４時間接着させる。
ｆ．改変グリーン培地：５０ｍｇ／ｍｌでヒアルロン酸を含むＤＭＥＭ／ハムＦ１２／１０％  ＦＣＳで７日間液浸させる。
ｇ．改変グリーン培地：１０％  ＦＣＳ、５０ｍｇ／ｍｌでのヒアルロン酸及び５０ｍｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、並びに抗生物質、すなわち１％  ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／ハムＦ１２で７日間界面培養する。
【０２２０】
図１は、代用皮膚を得るための工程の図を示す。
【０２２１】
本例において、得られた２つの皮膚同等物は、それぞれ、１３．３の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を有していた。１３．３の比の場合、線維芽細胞、及び角化細胞／メラニン形成細胞混合物の堆積工程の過程において、播種した細胞の量は、それぞれ、線維芽細胞は１５０００、メラニン形成細胞は１００００、角化細胞は１９００００であった。
【０２２２】
代用物／同等物が得られると、それを、４％  ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、次に４μｍのセクションを切り出し、続いて皮膚の様々な層の標識のために、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。光学顕微鏡での観察を×４０の倍率で行った。顕微鏡をＣＣＤカメラ（ニコン、ソフトウェア  ＮＩＳ  ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｒ）と連結させたため、観察結果の写真を撮影した。図２Ｂは、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を１３．３とした場合の方法に従って得られた代用皮膚の光学顕微鏡写真を示す。図２Ｃは、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を６．７とした場合の方法に従って得られた代用皮膚の光学顕微鏡写真を示し、図２Ａは、正常皮膚生検組織の光学顕微鏡写真を示す。図４Ａ及び４Ｂも、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を１３．３とした場合の方法に従って得られた皮膚同等物の光学顕微鏡写真を示す。
【０２２３】
さらに、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を１３．３とした場合の方法によって得られた同等物、及び生体内皮膚の免疫組織化学的標識を、同等物中でのメラニン形成細胞の存在、特にＩＶ型コラーゲンを含む基底層の生成（図４Ｄ（２））、基底層中における細胞の増殖能（図４Ｄ（１））、及びメラニン形成細胞の存在（図４Ｃ）を識別する目的で、Salducci, M., Andre, N., Guere, C., Martin, M., Fitoussi, R., Vie,
K., and Cario-Andre, M. (2014). Factors secreted by irradiated aged fibroblasts
induce solar lentigo in pigmented reconstructed epidermis. Pigment Cell Melanoma Res. 27, 502-504［１２］又はSimon, D., Daubos, A., Pain, C., Fitoussi, R., Vie, K., Taieb, A., de Benetti, L., and Cario-Andre, M. (2013). Exposure to acute electromagnetic radiation of mobile phone exposure range alters transiently skin homeostasis of a model of pigmented reconstructed epidermis. Int. J. Cosmet. Sci. 35, 27-34［１３］に記載の方法に従って行った。図４Ｅ及び４Ｆは、基底位置のメラニン形成細胞の免疫組織化学的標識後（図６Ｅ、明色領域）、ＩＶ型コラーゲンの標識後（図４Ｆ（２））、及びｐ６３増殖マーカーの標識後（図４Ｆ（１））の生体内皮膚の光学顕微鏡写真を示す。図４Ｃ及び４Ｄにおいて、生体内皮膚の場合のように（図４Ｅ及び４Ｆ）存在する細胞が高増殖性であるレベルにＩＶ型コラーゲンが存在することによって実証されるように、本発明に従う皮膚同等物がメラニン形成細胞及び基底層を含むことが明白に見られる。
【０２２４】
これらの写真に示されるように、方法によって得られる代用皮膚／同等物は、生体内皮膚と同一の構造を有している。
【０２２５】
参考文献のリスト
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of pigmented reconstructed epidermis. Int. J. Cosmet. Sci. 35, 27-34
【図１】
2018510643.tif 000010
【図２】
2018510643.tif 000011
【図３】
2018510643.tif 000012
【図４】
2018510643.tif 000013
【国際調査報告】
2018510643.tif 000014
2018510643.tif 000015
2018510643.tif 000016
2018510643.tif 000017