(57)【要約】１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドを含有する調製乳組成物。【選択図】図６
2018537997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドを含有する調製乳組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドが、ＢＣＭ−４、ＢＣＭ−５、ＢＣＭ−６、ＢＣＭ−７、ＢＣＭ−８、ＢＣＭ−９、ＢＣＭ−１０、ＢＣＭ−１１、ＢＣＭ−１２、ＢＣＭ−１３、ＢＣＭ−１４、ＢＣＭ−１５、ＢＣＭ−１６、ＢＣＭ−１７、ＢＣＭ−１８、ＢＣＭ−１９、ＢＣＭ−２０、ＢＣＭ−２１、ＢＣＭ−２２、ＢＣＭ−２３およびＢＣＭ−２４を含む群から選択される、前記組成物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の組成物であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドが、ＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７から選択される、前記組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であって、ＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７の両方を含む、前記組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドが、ＢＣＭ−４、ＢＣＭ−５、ＢＣＭ−６、ＢＣＭ−７、ＢＣＭ−８、ＢＣＭ−９、ＢＣＭ−１０、ＢＣＭ−１１、ＢＣＭ−１２、ＢＣＭ−１３、ＢＣＭ−１４、ＢＣＭ−１５、ＢＣＭ−１６、ＢＣＭ−１７、ＢＣＭ−１８、ＢＣＭ−１９、ＢＣＭ−２０、ＢＣＭ−２１、ＢＣＭ−２２、ＢＣＭ−２３およびＢＣＭ−２４のいずれか１つの構造的類似体を含む群から選択される、前記組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物であって、牛乳に由来するベータカゼインをさらに含み、該乳の総ベータカゼイン含有率が、少なくとも５０％ｗ／ｗ  Ａ２ベータカゼインを含む、前記組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、該乳の総ベータカゼイン含有率が、少なくとも９０％ｗ／ｗ  Ａ２ベータカゼインを含む、前記組成物。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載の組成物であって、該Ａ２ベータカゼインが、該ベータカゼインのアミノ酸配列の６７位においてプロリンを有する任意のベータカゼインである、前記組成物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物であって、該牛乳が、該ベータカゼインＡ２Ａ２遺伝子型を有することが知られている雌牛から得られる、前記組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドが、化学合成により調製される、前記組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドが、組み換えＤＮＡ技法を用いて調製される、前記組成物。
【請求項１２】
調製乳組成物を調製するための方法であって、成分混合物に１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドを添加する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドが、ＢＣＭ−４、ＢＣＭ−５、ＢＣＭ−６、ＢＣＭ−７、ＢＣＭ−８、ＢＣＭ−９、ＢＣＭ−１０、ＢＣＭ−１１、ＢＣＭ−１２、ＢＣＭ−１３、ＢＣＭ−１４、ＢＣＭ−１５、ＢＣＭ−１６、ＢＣＭ−１７、ＢＣＭ−１８、ＢＣＭ−１９、ＢＣＭ−２０、ＢＣＭ−２１、ＢＣＭ−２２、ＢＣＭ−２３およびＢＣＭ−２４を含む群から選択される、前記方法。
【請求項１４】
請求項１２または請求項１３に記載の方法であって、該１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドが、ＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７から選択される、前記方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の、幼児のための食品としての使用。
【請求項１６】
調製乳組成物の調製における１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト母乳の組成を綿密に模倣する調製乳組成物（infant formula composition）に関する。特に、本発明は、ベータカゼインタンパク質由来のヒトベータカゾモルフィンペプチドを含有する調製乳組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
少なくとも一生の最初の６ヵ月間、好ましくはさらに６〜１２ヵ月間の母乳栄養の幼児への利益は、十分に確立されている。ヒトの母乳は、幼児を感染症から保護することならびに糖尿病、肥満および喘息を含む健康問題の発生率を低減することが知られている。母乳で育てられた幼児の腸内細菌叢全体が、抗感染特性を提供し、免疫系の生後発達に関する重要な刺激因子であることは、広く受け入れられている。母乳は、一般に新生児に関する最高の栄養源であると考えられている。しかし、多くの母親が彼女らの乳児に母乳を与えることができないことも、周知であり、従って、乳児に与えるための調製乳（調乳（milk formula）としても知られている）の使用が、好まれ、ある場合には、唯一の選択肢である。
【０００３】
成熟したヒトの乳は、３〜５％の脂肪、０．８〜０．９％のタンパク質、６．９〜７．２％の炭水化物（ラクトースとして計算される）、および０．２％の無機成分を含有する。主なヒト乳タンパク質は、乳清およびカゼインである。これらのタンパク質のバランスが、急速かつ容易な消化を可能にする。乳清タンパク質の濃度は、泌乳初期から低下し、下がり続ける。これらの変化は、結果として泌乳初期における約９０：１０、成熟乳における６０：４０、そして泌乳後期における５０：５０の乳清／カゼイン比をもたらす。ヒト乳の主なタンパク質は、ウシベータカゼインに相同性のカゼイン、アルファラクトアルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリンＩｇＡ、リゾチーム、および血清アルブミンである。ヒト乳の必須アミノ酸パターンは、ヒト幼児に最適であることが分かっている必須アミノ酸パターンに非常によく似ている。
【０００４】
調製乳の組成は、産後おおよそ１〜３ヵ月の時点のヒト母乳に基づくように設計されている。最も一般的に用いられる調製乳は、タンパク質源として牛乳からの精製された乳清およびカゼイン、脂肪源として植物油のブレンド、炭水化物源としてラクトース、ビタミン−無機物混合物、ならびに製造業者に応じた他の成分を含有する。加えて、一部の調製乳は、大豆を牛乳の代わりにタンパク質源として使用し、一部の調製乳は、他のタンパク質に対してアレルギーのある幼児のためにその構成アミノ酸へと加水分解されたタンパク質を使用している。ヒト母乳を除くと、調製乳は、（牛乳、ヤギ乳、または変更された組成の調製補完乳（ｆｏｌｌｏｗ−ｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｅ）とは対照的に）医学界が１歳未満の幼児に関して栄養的に許容可能であると考える唯一の他の乳製品である。
【０００５】
牛乳は、典型的には１リットルあたり約３０グラムのタンパク質を含む。カゼインは、そのタンパク質の最大の構成要素（８０％）を構成し、ベータカゼインは、そのカゼインの約３７％を構成する。過去２０年間に、カゼインタンパク質、特にベータカゼインがいくつかの健康障害に関与していることを示す一連の証拠が、増えてきている。
【０００６】
ベータカゼインファミリーは、いくつかのバリアントを含み、それは、通常Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ等として知られている。Ａ１ベータカゼインおよびＡ２ベータカゼインは、ほとんどのヒトの集団において消費される乳中の主なベータカゼインである。出願人および他の者は、以前に、乳および乳製品中のＡ１ベータカゼインの消費ならびにＩ型糖尿病（国際公開第１９９６／０１４５７７号）、冠動脈性心疾患（国際公開第１９９６／０３６２３９号）および神経障害（国際公開第２００２／０１９８３２号）を含む特定の健康状態の発生率の間の関連を決定している。さらに、出願人は、Ａ１ベータカゼインおよび腸炎症（国際公開第２０１４／１９３２４８号）、ラクトース不耐性（国際公開第２０１５／００５８０４号）、および高血糖値（国際公開第２０１５／０２６２４５号）の間の関連を示している。
【０００７】
Ａ１ベータカゼインは、Ａ２ベータカゼインと１個のアミノ酸により異なる。ヒスチジンアミノ酸が、Ａ１ベータカゼインの２０９アミノ酸配列の６７位に位置している一方、プロリンが、Ａ２ベータカゼインの同じ位置に位置している。しかし、この１個のアミノ酸の違いは、腸内でのベータカゼインの酵素消化に決定的に重要である。６７位におけるヒスチジンの存在は、ベータカゾモルフィン−７（ＢＣＭ−７）として知られる７アミノ酸を含むタンパク質断片が酵素消化で生成されることを可能にする。従って、ＢＣＭ−７は、Ａ１ベータカゼインの消化産物である。Ａ２ベータカゼインの場合、６７位はプロリンにより占められており、それは、その位置におけるアミノ酸結合の切断を妨げる。ＢＣＭ−７は、Ａ２ベータカゼインの消化産物ではない。
【０００８】
全てのベータカゼインは、そのベータカゼインが６７位においてプロリンを有するかまたはヒスチジンを有するかに基づいてＡ１型またはＡ２型として分類されることができる。従って、ベータカゼインのＡ１型は、Ａ１、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＨベータカゼインを含み、一方でベータカゼインのＡ２型は、Ａ２、Ａ３、Ｄ、ＥおよびＦベータカゼインを含む。従って、Ａ１型ベータカゼインは、消化の際にＢＣＭ−７を生成することができる。Ａ２型ベータカゼインは、ＢＣＭ−７を生成することができない。
【０００９】
ベータカゾモルフィン（ＢＣＭ）は、ベータカゼイン由来の生物学的に活性なオピオイドペプチドである。乳中に存在するプロテアーゼ酵素は、摂取の前および消化の間にベータカゼインからＢＣＭを遊離させることが知られている。ＢＣＭは、ペプチド鎖の長さにおいて異なり、例えばＢＣＭ−４は、４アミノ酸を含み、一方でＢＣＭ−７は、７アミノ酸を含む。全てのＢＣＭは、オピオイド活性を有するが異なる親和性を有するようである。一般に、ＢＣＭがより短いほど、オピオイド受容体に関する親和性はより強い。ウシＢＣＭは、ヒトＢＣＭに対して構造的に類似しているが、同一ではない。例えば、ウシおよびヒトＢＣＭ−７は、ペプチドの４および５位の２アミノ酸により異なる。これらの構造的な違いは、ＢＣＭ−７のオピオイド活性に影響を及ぼす。ウシＢＣＭは、ヒトＢＣＭよりも少なくとも１０倍強力である（すなわち、ミューオピオイド受容体に対するより大きい結合親和性を有する）ことが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第１９９６／０１４５７７号
【特許文献２】国際公開第１９９６／０３６２３９号
【特許文献３】国際公開第２００２／０１９８３２号
【特許文献４】国際公開第２０１４／１９３２４８号
【特許文献５】国際公開第２０１５／００５８０４号
【特許文献６】国際公開第２０１５／０２６２４５号
【発明の概要】
【００１１】
出願人は、ここで、ヒトＢＣＭ−７（ｈＢＣＭ−７）がウシＢＣＭ−７（ｂＢＣＭ−７）と比較して優先的な神経原性作用を示し、従ってｂＢＣＭ−７と比較して脳の成長および発達に対してプラスの作用を有することを見出している。従って、ヒトＢＣＭ−７および／またはヒトＢＣＭ−７に対するペプチド前駆体を含有する調製乳は、幼児の健康および発達に有益であろうことが、予想される。
【００１２】
従って、本発明は、ヒト母乳中に存在するペプチドの、調製乳組成物中への組み込みに基づく。これらのペプチドは、好ましくは（それらに限定されないが）ｈＢＣＭ−５、ｈＢＣＭ−７ならびにｈＢＣＭ−５およびｈＢＣＭ−７の前駆体であるペプチドである。関連する利益は、脳の成長および発達ならびに向上した免疫系の発達を含む。
【００１３】
従って、１種類以上のヒトベータカゾモルフィンもしくはそれらの生物学的前駆体を含有する調製乳組成物を提供すること、または少なくとも既存の組成物に対する有用な代替物を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
発明の概要
本発明の第１側面において、１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドを含有する調製乳組成物が、提供される。その１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドは、ＢＣＭ−４〜ＢＣＭ−２４のいずれであることもできるが、好ましくはＢＣＭ−５および／またはＢＣＭ−７である。
【００１５】
第２側面において、成分混合物に１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドを添加する工程を含む、調製乳組成物を調製するための方法が、提供される。
別の側面において、本発明の調製乳組成物の幼児のための食品としての使用が、提供される。
【００１６】
別の側面において、１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドの、調製乳組成物の調製における使用が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ウシＡ１ベータカゼイン、ウシＡ２ベータカゼインおよびヒトベータカゼインの部分的なアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＢＣＭ−７（ｈＢＣＭ−７）およびウシＢＣＭ−７（ｂＢＣＭ−７）の間の遺伝子発現（ＤＥＴ）および遺伝子プロモーターのメチル化レベル（ＤＭＴ）の対照的なパターンを描写するベン図ＡおよびＢを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、広範囲にわたる神経細胞分化を示す、生理食塩水対照で処理された胎児幹細胞を拡大した画像である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、広範囲にわたる神経細胞増殖を示す、１μＭモルヒネで処理された胎児幹細胞を拡大した画像である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｂＢＣＭ−７と比較してより高度な神経細胞分化を示す、１μＭ  ｈＢＣＭ−７で処理された胎児幹細胞を拡大した画像である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ｈＢＣＭ−７と比較してより少ない神経細胞分化を示す、１μＭ  ｂＢＣＭ−７で処理された胎児幹細胞を拡大した画像である。
【図４】図４は、ｈＢＣＭ−７、ｂＣＭ−７およびｂＢＣＭ−９に関するＧＳＨ：ＧＳＳＧ比を示す。
【図５】図５は、ｈＢＣＭ−７、ｂＣＭ−７およびｂＢＣＭ−９に関するＳＡＭ／ＳＡＨ比を示す。
【図６】図６は、ｈＢＣＭ−７、ｂＣＭ−７およびｂＢＣＭ−９に関するＣｐＧメチル化レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ヒトベータカゾモルフィン（ＢＣＭ）、特にＢＣＭ−５、ＢＣＭ−７および／または前駆体ペプチドを含有する調製乳組成物に関する。
用語“ベータカゾモルフィン”は、乳タンパク質ベータカゼインの消化に由来する任意のペプチドを意味する。
【００１９】
用語“調製乳”は、通常は粉末（水と混合される）または液体（追加の水を用いる、または用いない）からの哺乳瓶栄養補給（ｂｏｔｔｌｅ−ｆｅｅｄｉｎｇ）またはカップ栄養補給（ｃｕｐ−ｆｅｅｄｉｎｇ）のために調製された、乳児および１２月齢未満の幼児への栄養補給のために設計された製造食品を意味する。米国連邦食品・医薬品・化粧品法（ＦＦＤＣＡ）は、調製乳を“そのヒト乳の模倣またはヒト乳に関する完全もしくは部分的な代替物としての適切性の理由により、幼児のための食品としてのみの特別な食事使用のためのものであると主張されている、またはそう表現されている食品”と定義している。調製乳は、おおよそ産後１〜３ヵ月前後の時点のヒトの母乳に基づくように設計されている。最も一般的に用いられる調製乳は、タンパク質源としての精製された牛乳の乳清およびカゼイン、脂肪源としての植物油のブレンド、炭水化物源としてのラクトース、ビタミン−無機物混合物、ならびに製造業者に応じた他の成分を含有する。
【００２０】
用語“前駆体ペプチド”は、消化されて、もしくは他の方法で変換されて、もしくは分解されて別のペプチドになることができる、または別のペプチドの構造的類似体である任意のペプチドを意味する。典型的には、前駆体ペプチドのアミノ酸鎖は、１ヵ所以上で切断されてより少ないアミノ酸残基を有するペプチドを生成する。例えば、ＢＣＭ−９およびＢＣＭ−１１は、ＢＣＭ−５に関する前駆体ペプチドである。特定のペプチドの“構造的類似体”は、その特定のペプチドと同じ生物学的機能を有するがその特定のペプチドと異なる構造を有する任意のペプチドまたはペプチド模倣物を含む。
【００２１】
“粉ミルク”または“乾燥乳”とも呼ばれる用語“粉乳”は、蒸発して乾燥し、粉末として形成されている、または粉末を形成するように処理されている乳を意味する。
上記のように、ウシベータカゼインは、Ａ１ベータカゼインおよびＡ２ベータカゼインとして分類されることができる。これらの２種類のタンパク質は、ほとんどのヒトの集団において消費される乳中の主なベータカゼインである。Ａ１ベータカゼインは、Ａ２ベータカゼインと１個のアミノ酸により異なる。ヒスチジンアミノ酸が、Ａ１ベータカゼインの２０９アミノ酸配列の６７位に位置している一方、プロリンが、Ａ２ベータカゼインの同じ位置に位置している。しかし、この１個のアミノ酸の違いは、腸内でのベータカゼインの酵素消化に決定的に重要である。６７位におけるヒスチジンの存在は、ベータカゾモルフィン−７（ＢＣＭ−７）として知られる７アミノ酸を含むタンパク質断片が酵素消化で生成されることを可能にする。従って、ＢＣＭ−７は、Ａ１ベータカゼインの消化産物である。Ａ２ベータカゼインの場合、６７位は、プロリンにより占められており、それは、その位置におけるアミノ酸結合の切断を妨げる。従って、ＢＣＭ−７は、Ａ２ベータカゼインの消化産物ではない。
【００２２】
他のベータカゼインのバリアント、例えばＢベータカゼインおよびＣベータカゼインも、６７位においてヒスチジンを有し、他のバリアント、例えばＡ３、ＤおよびＥは、６７位においてプロリンを有する。しかし、これらのバリアントは、欧州起源の雌牛からの乳中に非常に低いレベルでしか存在しないか、または全く存在しない。従って、本発明の文脈において、用語“Ａ１ベータカゼイン”は、６７位においてヒスチジンを有する任意のベータカゼインを指し、用語“Ａ２ベータカゼイン”は、６７位においてプロリンを有する任意のベータカゼインを指す。
【００２３】
ＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７は、ＢＣＭの内でもより重要であると考えられている。それらは、オピエート受容体に関する最高の親和性を有し、従ってＢＣＭペプチドの内で最も研究されている。ヒト母乳中のＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７の存在が、研究されてきた(Jarmolowska et al., Peptides, 2007, 28, 1982-1986)。初乳において、ＢＣＭ−５（５倍高い）およびＢＣＭ−７（８倍高い）両方の、成熟乳におけるよりも有意に高い濃度が、見出された。ヒト母乳中に存在するＢＣＭ−５の量は、約５μｇ／Ｌ（初乳）〜約０．５μｇ／Ｌ（４ヵ月）の範囲であることが分かり、ＢＣＭ−７に関しては、約３μｇ／Ｌ（初乳）〜約０．３μｇ／Ｌ（４ヵ月）の範囲であることが分かった。初乳において、ＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７は、おおよそ１．６：１の比率で存在することが分かり、分娩から１ヵ月の時点で収集された乳中ではおおよそ２．５：１、分娩から４ヵ月の時点で収集された乳中ではおおよそ１．７：１であった。ＢＣＭは、プロリンに富むため、それらは、ほとんどのプロテアーゼによる攻撃に対して高度に耐性である。これは、ＢＣＭが未変化の形態で腸に到達し、腸粘膜に影響を及ぼすことができることを意味する。出生後の最初の１２日間における腸粘膜および免疫系の未成熟性は、この期間の間の腸の生体分子に対する透過性が高いことを意味する。ＢＣＭ−５およびＢＣＭ−７の初乳中の高いレベルは、それらが胃腸管に影響を及ぼし得るだけでなく、腸障壁を通過して全身循環に入った後に生物全体にも影響を及ぼし得ることを、示している。
【００２４】
図１を見れば理解できるように、ヒトベータカゼインは、ウシＡ１ベータカゼインまたはＡ２ベータカゼインのいずれとも同じではない。より詳細には、ＢＣＭ−７をコードしている配列は、種の間で異なる。従って、これらのペプチドは、差次的作用を有する。
【００２５】
出願人は、ウシＢＣＭおよびヒトＢＣＭの間の機能的な違いを研究しており、特定のヒトＢＣＭは、それらのウシの対応物と比較して重要である可能性のある有益な特徴を有することを、見出した。研究の結果は、調製乳の製造、特に幼児における腸の発達、脳の成長および発達、ならびに免疫系の発達のための調製乳におけるヒトＢＣＭの使用に関する重要な示唆を有する。
【００２６】
従って、本発明は、１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドまたはその前駆体ペプチドを含有する調製乳組成物を提供する。その１種類以上のヒトベータカゾモルフィンペプチドは、ＢＣＭ−４〜ＢＣＭ−２４のいずれ（すなわち、ＢＣＭ−４、ＢＣＭ−５、ＢＣＭ−６、ＢＣＭ−７、ＢＣＭ−８、ＢＣＭ−９、ＢＣＭ−１０、ＢＣＭ−１１、ＢＣＭ−１２、ＢＣＭ−１３、ＢＣＭ−１４、ＢＣＭ−１５、ＢＣＭ−１６、ＢＣＭ−１７、ＢＣＭ−１８、ＢＣＭ−１９、ＢＣＭ−２０、ＢＣＭ−２１、ＢＣＭ−２２、ＢＣＭ−２３、およびＢＣＭ−２４のいずれか１つ）であることもできるが、好ましくはＢＣＭ−５および／またはＢＣＭ−７である。前駆体ペプチドは、ＢＣＭ−４、ＢＣＭ−５、ＢＣＭ−６、ＢＣＭ−７、ＢＣＭ−８、ＢＣＭ−９、ＢＣＭ−１０、ＢＣＭ−１１、ＢＣＭ−１２、ＢＣＭ−１３、ＢＣＭ−１４、ＢＣＭ−１５、ＢＣＭ−１６、ＢＣＭ−１７、ＢＣＭ−１８、ＢＣＭ−１９、ＢＣＭ−２０、ＢＣＭ−２１、ＢＣＭ−２２、ＢＣＭ−２３、およびＢＣＭ−２４のいずれか１つの構造的類似体を含む群から選択されることができる。
【００２７】
本発明のある態様において、組成物は、牛乳に由来するベータカゼインをさらに含み、ここで、乳の総ベータカゼイン含有率は、少なくとも５０％ｗ／ｗ  Ａ２ベータカゼイン、好ましくは少なくとも９０％ｗ／ｗ  Ａ２ベータカゼイン、例えば少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％ｗ／ｗ  Ａ２ベータカゼインを含む。
【００２８】
ベータカゼインバリアントは、Ａ２ベータカゼインであることが好ましいが、Ａ２ベータカゼインは、任意のＡ２型ベータカゼインバリアント、すなわちベータカゼインアミノ酸配列の６７位においてプロリンを有するＡ２、Ａ３、Ｄ、ＥおよびＦベータカゼインのいずれであることもできることは、理解されるべきである。本発明のある態様において、牛乳は、ベータカゼインＡ２Ａ２遺伝子型を有することが知られている雌牛から得られる。
【００２９】
主に、または排他的にＡ２ベータカゼインであるベータカゼインを含む（すなわちＡ１ベータカゼインをほとんどまたは全く含有しない）乳は、まず雌牛をベータカゼイン遺伝子に関して遺伝子型決定し、それらの乳中でＡ２ベータカゼインを生成し他のベータカゼインを生成しない能力を有する雌牛（すなわちＡ２Ａ２対立遺伝子を有する雌牛）を同定し、そしてそれらの雌牛から乳を得ることにより、得られることができる。その方法論は、国際公開第１９９６／０３６２３９号において一般的に記載されており、動物遺伝子型決定、群れの形成ならびに牛乳の生産および供給の分野の当業者により認識および理解されているであろう。
【００３０】
本発明の調製乳中に組み込まれるべきヒトＢＣＭは、任意の既知の標準的技法により調製されることができる。これらの技法は、化学合成、組み換えＤＮＡ技法、およびヒト母乳からのペプチドの単離を含む。
【００３１】
実施例１において示されるように、両方が両方ともエクソルフィン（ｅｘｏｒｐｈｉｎｓ）として一般化されているにもかかわらず、ｂＢＣＭ−７およびｈＢＣＭ−７は、短期および長期遺伝子発現のパターンに対する対照的な作用を有する。
【００３２】
出願人は、ｈＢＣＭ−７およびｂＢＣＭ−７の影響下でのゲノムワイドな後成的変化を調べた。これらの２種類のペプチドおよびモルヒネにより誘導される機能的経路および遺伝子ネットワークの変化を調べるため、ＤＮＡメチル化ＭＢＤ−ｓｅｑおよびＤＮＡマイクロアレイデータが、収集された。対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞ならびに１μＭ  ｈＢＣＭ−７、ｂＢＣＭ−７またはモルヒネで４時間処理された細胞が、調べられた。モルヒネは、陽性オピオイド作用対照の役目を果たした。
【００３３】
全ゲノムＤＮＡのＭＢＤ−ｓｅｑは、０．１未満のＦＤＲにより定義される差次的にメチル化されたプロモーターの転写産物（ＤＭＴ）を明らかにした。マイクロアレイデータは、１．５以上の倍率変化および０．０５以下の生ｐ値（ｒａｗ  ｐ−ｖａｌｕｅ）により定義される差次的に発現された転写産物（ＤＥＴ）を明らかにし、それは、遺伝子領域および非コード領域の両方からの差次的にメチル化／転写された遺伝子を含んでいた。
【００３４】
図２におけるベン図は、１μＭモルヒネ、ｂＢＣＭ−またはｈＢＣＭ−７で４時間処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞（ｎ＝５）におけるＤＥＴおよびＤＭＴのパターンにおける重複および対比を示す。遺伝子発現は、ゲノムワイドマイクロアレイにより分析されてＤＥＴのリストを生成した（図Ａ）。ＤＮＡメチル化は、ＭＢＤ−ｓｅｑにより分析されて、ＤＭＴのリストをもたらした（図Ｂ）。ＤＭＴおよびＤＥＴは、未処理対照と比較した処置群の１以上により引き起こされた重複する転写産物変化を図説するためにプロットされた。ＤＥＴに関して、Ｎ＝３；倍率変化≧１．５；生ｐ≦０．０５。ＤＭＴに関して、Ｎ＝５、ＦＤＲ＜０．１。
【００３５】
実施例２は、ｈＢＣＭ−７およびｂＢＣＭ−７の、神経細胞性幹細胞（ＮＳＣ）の成長および分化に対する対照的な作用を示し、ｂＢＣＭ−７は、モルヒネ対照に対してより比較可能であり、ｈＢＣＭ−７は、より高いレベルの細胞分化を示している。ｈＢＣＭ−７の投与は、ｂＢＣＭ−７を含む試験された他のオピオイドペプチドの投与が促進したよりも大きい程度までＮＳＣの神経発生を促進した。この作用は、ｈＢＣＭ−７が３ｄｐｐ（蒔いた後の日数）に開始して１日間投与された際に、最も明らかであった。
【００３６】
実施例３は、オピオイドペプチド（モルヒネ、ｂＢＣＭ−７、ｈＢＣＭ−７、およびｂＢＣＭ−９）の、３ｄｐｐにおける分化しているＮＳＣの細胞内チオールレベル（ＧＳＧ：ＧＳＳＨ比）への作用を示す。ｂＢＣＭ−７またはモルヒネの投与は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を有意に増大させ（図４）、ＳＡＭ／ＳＡＨ比を有意に低下させた（図５）。対照的に、これらの比率のいずれも、ｈＢＣＭ−７またはｂＢＣＭ−９により影響を受けなかった。全ての４種類のペプチドは、対照細胞におけるレベルと比較してＣｐＧメチル化を減少させる傾向があり、ｈＢＣＭ−７は、ｂＢＣＭ−９と比較可能であり、対照およびｂＢＣＭ−７の両方と顕著に異なっていた（図６）。酸化還元状態、ならびに抗酸化物質、例えばＧＳＨの細胞内レベルおよび供与体ＳＡＭレベルの形態でのメチル化能力は、ＮＳＣ分化のプロセスへの重要な寄与因子である。
【００３７】
ｈＢＣＭ−７および（Ａ２ベータカゼインに由来する）ｂＢＣＭ−９の間の機能的類似性は、ヒトＢＣＭが調製乳組成物中の成分として有益であるだけでなく、組成物の粉乳基剤が好ましくはＡ２ベータカゼイン（または任意のＡ２型のベータカゼイン）をその主な、または唯一のベータカゼイン構成要素として有する乳に由来するべきであることを、強く示すものである。相当量のＡ１ベータカゼイン（またはいずれかのＡ１型のベータカゼイン）を含有する乳に由来する粉乳は、避けられるべきである。
【００３８】
ｈＢＣＭ−７およびｂＢＣＭ−７の差次的作用の基礎となる機序は、不明であるが、ｂＢＣＭ−７がＮＳＣ上で発現しているμオピエート受容体に対してより強いアゴニスト活性を有し、酸化還元およびメチル化状態におけるより大きい変化を引き起こしている可能性がある。これらの差次的作用は、乳児期における人工栄養と比較して母乳栄養の健康上の利益に寄与する可能性もある。
【００３９】
本発明の調製乳組成物は、任意の既知の製造プロセスを用いて調製されることができる。１種類以上のヒトＢＣＭペプチドまたはその前駆体ペプチドは、プロセスにおける任意の適切な段階において添加されることができる。
【００４０】
粉末状調製乳は、任意の標準的な方法により、典型的には乾式ブレンドプロセスまたは湿式混合／噴霧乾燥プロセスを用いて製造されることができる。乾式ブレンドプロセスにおいて、成分は、脱水された粉末状形態であり、完全な調製乳製品に必要な多量および微量栄養素の均一なブレンドを達成するために一緒に混合される。次いで、ブレンドされた製品は、大きすぎる粒子および外来物質を除去するために篩を通過させられる。次いで、篩にかけられた製品は、貯蔵のために袋、トート（ｔｏｔｅｓ）または裏打ちされたファイバーボードのドラム（ｄｒｕｍｓ）に移される。ある場合には、粉末は、直接粉末包装ラインに移される。包装ラインにおいて、粉末は、粉末を缶充填ライン中に供給するフィラーホッパーに移される。充填された缶は、不活性ガスでフラッシュされ、シーム（ｓｅａｍｅｄ）され、ラベルを貼られ、コード化され（ｃｏｄｅｄ）、ボール箱中に詰め込まれる。
【００４１】
湿式ブレンド／噴霧乾燥プロセスにおいて、成分は、一緒にブレンドされ、均質化され、低温殺菌され、噴霧乾燥されて粉末状の製品を生成する。成分は、大きいバッチで水とブレンドされ、次いで低温殺菌のために熱交換器へとポンプで送られる。液体は、通常は均質化され、任意の熱感受性微量栄養素（例えばビタミン類、アミノ酸および脂肪酸）が、添加される。液体は、それを蒸発器に通すことにより濃縮されることができ、またはそれは、直接噴霧乾燥機にポンプで送られることができる。噴霧乾燥の後、製品は、粒径を増大させるためおよびその可溶性を向上させるために凝塊形成させられることができる。代替のプロセスにおいて、乳は、ドラム乾燥により乾燥させられることができ、ここで、乳は、加熱されたドラムの表面上に薄膜として適用される。次いで、乳の固体は、削ぎ落とされることができる。凍結乾燥も、用いられることができる。乳の乾燥法および熱処理は、それが処理される際に、粉乳の特性、例えばその冷水中での可溶性、その風味およびその充填密度を変化させる。完成した粉末は、篩を通され、次いで貯蔵のために袋、トートもしくはサイロに移され、または直接粉末包装ラインに移される。
【００４２】
本明細書における先行技術文献へのあらゆる参照は、そのような先行技術が広く知られている、またはその分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという自認と考えられるべきではない。
【００４３】
本明細書で用いられる際、単語“含む”、“含むこと”、および類似の単語は、排他的または包括的な意味で解釈されるべきではない。換言すると、それらは、“含んでいるが、それに限定されない”を意味することが、意図されている。
【００４４】
本発明は、以下の実施例への参照によりさらに記載される。特許請求される本発明が、これらの実施例により限定されることは決して意図されていないことは、理解されるであろう。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ｈＢＣＭ−７対ｂＢＣＭ−７の短期および長期遺伝子発現に対する対照的な作用。
材料
モルヒネは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られた（カタログ番号Ｍ８７７７、ミズーリ州セントルイス）。ＢＣＭ−７のヒトおよびウシ形態は、Ｎｅｏｐｅｐｔｉｄｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）により委託合成された。ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）（バージニア州マナサス）から購入された。
【００４６】
細胞は、１０ｍＬのＭｅｄｉａｔｅｃｈ（バージニア州マナサス）からのアルファ改変最小必須培地（α−ＭＥＭ）にやはりＭｅｄｉａｔｅｃｈからの１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾンおよびＨｙＣｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）からの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったものを含有する１０ｃｍ標準組織培養ディッシュ中で、３７℃、５％ＣＯ２において増殖性単層として増殖させられた。細胞（継代数４）は、１μＭ  ｈＢＣＭ−７、ｂＢＣＭ−７、モルヒネで４時間処理され、または対照として未処理のままにされた後、ＲＮＡまたはＤＮＡ抽出が行われた。この濃度は、１μＭがＥＡＡＴ３に媒介されるシステイン取り込みの最大限の阻害をもたらすことを示す以前の用量反応試験に基づいて選択された。
【００４７】
ＤＮＡメチル化の分析のための細胞培養からのＤＮＡは、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ（ニューヨーク州ファーミングデール）からのＦｉｔＡｍｐ（商標）血液および培養細胞ＤＮＡ抽出キットを用いて単離された。単離されたＤＮＡは、ＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ（デラウェア州ウィルミントン）分光光度計を用いて定量化された。ＲＮＡ転写の分析のための細胞培養からのＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）からのＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−４ＰＣＲキットを用いて単離された。単離されたＲＮＡは、ＤＮアーゼで処理された後、ＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いたＲＮＡ定量化が行われた。ゲノムＤＮＡは、Ｅａｓｙ  ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ１８００−０１；ニューヨーク州グランドアイランド）により、細胞株に関する適切なプロトコルを用いて試料から抽出された。
【００４８】
ＤＮＡメチル化の測定は、ＭｅｔｈｙｌＣａｐ−Ｓｅｑプロトコル(De Meyer et al., PLoS ONE. 2013;8, e59068)を用いて実施された。ＥｄｇｅＲ(Robinson et al., Bioinforma Oxf. Engl. 2010;26:139-40)が、条件の間の差次的ＭＢＤカバー度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を有する領域の検出のために用いられた。
【００４９】
マイクロアレイハイブリダイゼーションに関して、それぞれの試料からの５００ｎｇの総ＲＮＡが、蛍光色素（Ｃｙ３；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、低ＲＮＡ入力線形増幅標識キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）を製造業者のプロトコルに従って用いて標識された。蛍光標識されたｃＲＮＡの量および質が、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価された。製造業者の仕様書に従って、１．６ｍｇのＣｙ３標識されたｃＲＮＡが、Ａｇｉｌｅｎｔヒト全ゲノムオリゴマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）に対して１７時間ハイブリダイズさせられた後、洗浄および走査が行われた。データが、走査された画像から、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）を用いて抽出された。
【００５０】
対比較（例えばｈＢＣＭ−７［４時間］対ｂＢＣＭ−７［４時間］）が、（１．５以上の倍率変化、０．０５以下の生ｐにおいて）スチューデントのｔ検定を用いて実施され、差次的に発現された遺伝子のリストを生成した。
【００５１】
統計分析が、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）バージョン５．０１を用いて実施された。独立した手段に関するスチューデントのｔ検定が、未処理の対照および実験群の間の有意差に関して試験するために用いられた。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表された。多数のデータの群の間の比較が、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーのポストホック検定を用いて実施され、個々の群の間の違いを決定した。
【００５２】
方法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞が、１μＭ  ｈＢＣＭ−７およびｂＢＣＭ−７で処理された。ＲＮＡおよびＤＮＡが、４時間後に、処理を伴って、または伴わずに単離された。遺伝子発現における短期の変化を反映する転写変化（ＤＥＴ）が、マイクロアレイアプローチを用いて評価され、ＣｐＧメチル化（ＤＭＴ）状態を通して得られる遺伝子発現に対する長期の作用が、４５０，０００のＣｐＧ部位において分析された。両方のエンドポイントからの機能的関与（ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）が、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．０により評価され、ＫＥＧＧ経路分析が、ＤＮＡメチル化または転写レベルで有意に変化していた（ｐ＜０．０５、ＦＤＲ＜０．１）転写産物間の生物学的相互作用を同定するために実施された。結果が、図２において示されている。
【００５３】
実施例２：ｈＢＣＭ−７およびｂＢＣＭ−７の胎児幹細胞の神経発生に対する対照的な作用
神経細胞性幹細胞の培養
以前に分離および凍結された神経細胞性幹細胞培養物が、適切に解凍、維持および培養された。細胞懸濁液は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、抗生物質／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ニューヨーク州グランドアイランド）、０．６％グルコース、２５μｇ／ｍｌインスリン、２０ｎＭプロゲステロン、６０μＭプトレッシン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（全てＳｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスからのもの）、１００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組み換え内皮増殖因子（ＥＧＦ；ＲｏｃｈｅまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、イリノイ州シカゴ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク州レイクプラシッド）で構成される定義された培地（ＤＦ１２）中で増殖させられた。細胞は、自由に浮動する凝集体（神経幹細胞塊）として増殖し、３〜４日ごとに機械的解離により継代された。最低４回の継代の後、細胞は、１５μｇ／ｍｌポリＬ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコートされた８ウェルガラススライドチャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、イリノイ州ネーパーヴィル）上に１８，０００細胞／ｃｍ２の密度で蒔かれた。培養物は、ＤＦ１２およびＥＧＦまたはＥＧＦ＋ｂＦＧＦ中で３日間維持され、次いでより長い培養期間の間成長因子を含まないＤＦ１２に切り替えられた。免疫細胞化学的研究が、３〜１０ｄｐｐの間の異なる時点において実施された。オピオイドペプチドの作用を分析するため、細胞は、１０μＭの濃度のモルヒネ、ヒトｈＢＣＭ−７、ウシｂＢＣＭ−７、およびｂＢＣＭ−９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、カリフォルニア州サニーベール）で処理された。ペプチドは、滅菌水中で再構成され、３７℃で１日または３日間インキュベートされた。平行するウェルが、試験ペプチドを含まないＤＦ１２中で維持された（未処理群）。免疫細胞化学的分析が、処理後１、３、または１０日の時点で実施された。
【００５４】
間接的免疫細胞化学
細胞は、４％パラホルムアルデヒドにより２０分間固定され、エタノール−酢酸溶液（１９：１）で２０℃において２０分間透過処理され、１０％ウシ胎児血清でブロッキングされ、一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートされた。姉妹（ｓｉｓｔｅｒ）培養物は、陰性対照の役目を果たし、それぞれの場合に一次抗体を含めずにインキュベーションされたことを除いて同様に処理された。免疫蛍光が、全ての抗原の検出のために用いられた。モノクローナル抗ネスチン（クローンＲａｔ  ４０１；１：２００）は、発生研究ハイブリドーマバンク（アイオワ大学、アイオワ州アイオワシティ）から得られた。ポリクローナル抗グリア原線維酸性タンパク質（１：５００）は、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ（グロストラップ、デンマーク）から購入された。モノクローナル抗βチューブリンイソ型ＩＩＩ（１：２０００）およびポリクローナル抗βチューブリンイソ型ＩＩＩ（１：２０００）は、Ｃｏｖａｎｃｅ（カリフォルニア州リッチモンド）から購入された。ポリクローナル抗Ｏ１（１：５）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナサス）から購入されたハイブリドーマから得られた。モノクローナル抗ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；１：５０）は、Ｄａｋｏ（ハイ・ウィカム、英国）から得られ、モノクローナル抗神経細胞核（ＮｅｕＮ）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（カリフォルニア州テメキュラ）から得られた。神経抗原の単一標識のために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５６８またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）から購入された。
【００５５】
細胞増殖およびアポトーシスの評価
増殖している細胞を同定するため、１００μＭのＢｒｄＵ（チミジンの類似体）が、細胞の固定の２４時間前に添加された。エタノール酢酸溶液（１９：１）による透過処理の後、細胞は、ＤＮＡを変性させるために２Ｎ  ＨＣｌで４℃において３０分間処理された。ＢｒｄＵに対する一次モノクローナル抗体（１：２０；Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）が、室温において１時間添加され、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出された。この方法は、過去２４時間においてそれらのＤＮＡを複製した細胞の同定を可能にした。アポトーシス細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州）を用いて、断片化した濃縮された青く染色された核として可視化され、蛍光顕微鏡下で計数された(Lopez-Toledano M.A. and Shelanski M.L., 2004 Neurogenic effect of beta-amyloid peptide in the development of neural stem cells. J Neurosci. 24(23):5439-44)。結果が、図３Ａ〜３Ｄにおいて示されている。
【００５６】
実施例３：細胞ＧＳＨ：ＧＳＳＨ比ならびに酵素活性およびメチル化において反映されるＤＮＡメチル化活性により示される、ｈＢＣＭ−７およびＡ２ベータカゼイン由来のｂＢＣＭ−９の間で示される細胞応答に対する効果比較
細胞内チオール代謝産物の単離
神経細胞性幹細胞培養物が、実施例２において記載されたように、幹細胞特異的増殖培地中でコンフルエンスまで増殖させられ、次いで示された薬物と共に特定の時間の間インキュベートされた。培地が、吸引され、細胞が、１ｍＬの氷冷ＨＢＳＳで２回洗浄された。次いで、ＨＢＳＳが、吸引され、０．６ｍＬの氷冷ｄＨ２Ｏが、細胞に添加され、細胞が、フラスコ／ディッシュから剥がされた。細胞懸濁液は、氷上で１５秒間超音波処理され、１００μＬの超音波処理物が、タンパク質含有量を決定するために用いられた。残りの溶解物は、微量遠心分離チューブに、等しい体積の０．４Ｎ過塩素酸と共に入れられ、氷上で５分間インキュベートされた。試料は、１０，０００ｇで遠心分離され、上清は、新しい微量遠心分離チューブに移された。次いで、１００μＬの試料が、円錐状の微量オートサンプラーバイアルに入れられ、オートサンプラーの冷却トレイ中で４℃で維持された。最後に、１０μＬのこの試料が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム中に注入された。
【００５７】
細胞内チオールのＨＰＬＣ測定
以下の代謝産物の濃度が、測定された：システイン（ＣＹＳ）、シスチン（ＣＹＳ２）、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、ホモシスチン（ＨＣＹ２）、メチオニン（ＭＥＴ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、およびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）。酸化還元およびメチル化経路の代謝産物が、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８分析カラム（３×１５０ｍｍ；３．５μｍ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（４．６×１２．５ｍｍ；５μｍ）ガードカラムを用いて分離された。２種類の移動相が、用いられた。移動相Ａは、０％アセトニトリル、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．４ｍＭ  １−オクタンスルホン酸を含んでおり、リン酸でｐＨ２．６５に調節された。移動相Ｂは、５０％アセトニトリルであった。流速は、最初は０．６ｍＬ／分に設定され、以下のような段階勾配が、用いられた：０〜９分  ０％Ｂ、９〜１９分  ５０％Ｂ、１９〜３０分  ５０％Ｂ。次いで、カラムは、次の運転の前に５％Ｂで１２分間平衡化された。カラム温度は、２７℃で維持された。電気化学検出器は、ＢＤＤ分析セルモデル５０４０を備えたＥＳＡ  ＣｏｕｌＡｒｒａｙであり、作動電位は、１５００ｍＶに設定された。試料濃度は、標準較正曲線およびＥＳＡソフトウェアを用いてそれぞれの代謝産物に関するピーク面積から決定され、次いでタンパク質濃度に関して標準化された。一部の試料は、必要に応じて移動相中で希釈され、または５０μｌまでの試料が、チオール濃度が標準曲線の範囲内であることを確実にするために注入された。
【００５８】
ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡが、培養細胞から、全体的なＤＮＡのメチル化を測定するために単離された。ＤＮＡは、回収された細胞から、ＦｉｔＡｍｐ血液および培養細胞ＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ、ニューヨーク州ファーミングデール）を用いて単離された。単離されたＤＮＡは、ＲＮＡ分解酵素を用いた処理によりあらゆる混入しているＲＮＡを取り除かれ、ＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化された。
【００５９】
全体的なＤＮＡメチル化の測定
全体的なＤＮＡメチル化の分析が、ＭｅｔｈｙｌＦｌａｓｈメチル化ＤＮＡ定量化キットを製造業者の説明書（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）に従って用いて実施された。簡潔には、１００ｎｇの混入物のない（ｃｌｅａｎ）ゲノムＤＮＡが、用いられ、ＤＮＡメチル化が、５−メチルシトシンモノクローナル抗体を酵素結合免疫吸着アッセイ様反応において用いて定量化された。メチル化されたＤＮＡのレベルは、マイクロプレートリーダー上のそれぞれのウェルの４５０ｎｍにおける光学密度に基づいて計算された。結果は、キットの０％〜１００％の範囲のメチル化された標準を用いて用意された標準曲線に対して標準化された。
【００６０】
データ分析
結果は、３通りまたは４通りで行われた独立した実験からのそれぞれの抗体に関する陽性細胞の直接計数の平均±平均の標準誤差として表されている。示されている場合、データは、適切な対照群と比較して標準化された。それぞれの培養物において、２５の予め決定された視野が、共焦点顕微鏡下で計数された。陽性細胞の数は、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色による同じ領域中の細胞の総数に関して補正された。統計分析が、適宜ボンフェローニのポストホック検定またはスチューデントのｔ検定による分散分析を用いて実施された。違いは、ｐ＜０．０５において有意であると考えられた。全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて実施された。結果が、図４〜６において示されている。
【００６１】
本発明は、例として記載されてきたが、特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなく変更および修正が行われることができることは、理解されるべきである。さらに、特定の特徴に対して既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、あたかも本明細書において具体的に言及されたかのように組み込まれる。
【図１】
2018537997.tif 000003
【図２】
2018537997.tif 000004
【図３Ａ】
2018537997.tif 000005
【図３Ｂ】
2018537997.tif 000006
【図３Ｃ】
2018537997.tif 000007
【図３Ｄ】
2018537997.tif 000008
【図４】
2018537997.tif 000009
【図５】
2018537997.tif 000010
【図６】
2018537997.tif 000011
【国際調査報告】
2018537997.tif 000012
2018537997.tif 000013
2018537997.tif 000014