(57)【要約】本発明はバイオテクノロジーに関し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害除草剤への耐容性を付与するための新規の組み換えＤＮＡ分子及び遺伝子操作タンパク質を提供する。また本発明は、当該組み換えＤＮＡ分子を含有する、除草剤耐容性のトランスジェニック植物、種子、細胞、及び植物部分、ならびにこれらの使用方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２０からなる群から選択されるポリペプチド配列に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列に作用可能に連結した異種プロモーターを含む組み換えＤＮＡ分子であって、前記タンパク質が除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、前記組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記核酸配列が、配列番号２２〜６３からなる群から選択される、請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号１〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記異種プロモーターが植物細胞中で機能する、請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記核酸配列が、作用可能に連結したタンパク質を細胞内に局在化するように機能する標的配列をコードするＤＮＡ分子に作用可能に連結している、請求項４に記載の組み換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項７】
前記組み換えＤＮＡが、前記タンパク質を細胞内に局在化するように機能する標的配列をコードする作用可能に連結したＤＮＡ分子を含む、請求項６に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
前記タンパク質が前記細胞に除草剤耐容性を付与する、請求項７に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
トランスジェニック植物、種子、または細胞のゲノム中に存在する、請求項６に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項１０】
配列番号１〜２０から選択される全長のアミノ酸配列に対する少なくとも８５％の配列同一性を備える組み換えポリペプチドであって、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、前記組み換えポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
【請求項１２】
追加のトランスジェニック除草剤耐容性形質を備える、請求項１１に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
【請求項１３】
少なくとも１種のＰＰＯ除草剤への除草剤耐容性を備えるものとして定義される、請求項１１に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
【請求項１４】
請求項１１に記載の種子。
【請求項１５】
請求項１０に記載の組み換えポリペプチドを含む、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
【請求項１６】
植物、種子、細胞、または植物部分に除草剤耐容性を付与する方法であって、請求項１０に記載の組み換えポリペプチドを前記植物、種子、細胞、または植物部分において異種発現させることを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記植物、種子、細胞、または植物部分が、前記組み換えポリペプチドによって付与されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を備える、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記除草剤耐容性が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン−エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン−エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット−メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン−エチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に対するものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
植物の形質転換方法であって、
ａ）請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を植物細胞に導入するステップと、
ｂ）そこから前記組み換えＤＮＡ分子を含む植物を再生するステップと、を含む前記方法。
【請求項２０】
少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に耐容性である植物を選択するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記再生された植物を自らと、または第２の植物と交配させ、前記交配種から種子を収集するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
植物生長区域における雑草を防除する方法であって、請求項１１に記載のトランスジェニック植物または種子を含む植物生長区域を少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に接触させることを含み、前記トランスジェニック植物または種子が前記ＰＰＯ除草剤に耐容性であり、かつ雑草が前記植物生長区域において防除される、前記方法。
【請求項２３】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
ａ）ネイティブＥ．ＣｏｌｉのＰＰＯ酵素の遺伝子ノックアウトを有するＥ．ｃｏｌｉ株を、候補となる除草剤耐容性タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む細菌発現ベクターを用いて形質転換することと、
ｂ）前記形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、ヘムフリー細菌培地を用いて増殖させることであって、前記細菌培地を用いた増殖が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を同定する、前記増殖させることと、を含む前記方法。
【請求項２４】
除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
ａ）ネイティブＥ．ＣｏｌｉのＰＰＯ酵素の遺伝子ノックアウトを有するＥ．ｃｏｌｉ株を、組み換えタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む細菌発現ベクターを用いて形質転換することと、
ｂ）前記形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤を含有する細菌培地を用いて増殖させることであって、細菌の増殖が、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を同定する、前記増殖させることと、を含む前記方法。
【請求項２５】
除草剤耐容性遺伝子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を植物細胞において発現させることと、
ｂ）ＰＰＯ除草剤への除草剤耐容性を示す植物細胞を同定することと、を含む前記方法。
【請求項２６】
除草剤耐容性遺伝子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子をＨｅｍＧを欠いた細菌細胞において発現させることであって、前記細菌細胞が、ＰＰＯ除草剤の存在下のヘムフリー細菌培地中で増殖する、前記発現させることと、
ｂ）ＰＰＯ除草剤への耐容性を示す細菌細胞を同定することと、を含む前記方法。
【請求項２７】
ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤に耐容性の植物を生成する方法であって、
ａ）請求項１１に記載の植物を取得することと、
ｂ）前記トランスジェニック植物を、前記少なくとも１種の他の除草剤への耐容性を備えた第２の植物と交配させることと、
ｃ）ＰＰＯ除草剤及び前記少なくとも１種の他の除草剤への耐容性を備えた前記交配から得られた後代植物を選択することと、を含む前記方法。
【請求項２８】
除草剤耐容性雑草の発生を低減する方法であって、
ａ）作物生長環境において請求項１２に記載の植物を栽培することと、
ｂ）ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤を前記作物生長環境に施用することであって、前記作物植物が前記ＰＰＯ除草剤及び前記少なくとも１種の他の除草剤に耐容性である、施用することと、を含む前記方法。
【請求項２９】
前記ＰＰＯ除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン−エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン−エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット−メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン−エチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１種の他の除草剤が、ＡＣＣアーゼ阻害剤、ＡＬＳ阻害剤、ＥＰＳＰＳ阻害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成阻害剤、ＨＰＰＤ阻害剤、ＰＰＯ阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＣＣアーゼ阻害剤が、アリールオキシフェノキシプロピオネートまたはシクロヘキサンジオンであり、前記ＡＬＳ阻害剤が、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、またはトリアゾリノンであり、前記ＥＰＳＰＳ阻害剤が、グリホサートであり、前記合成オーキシンが、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、またはセミカルバゾンであり、前記光合成阻害剤が、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、またはウレアであり、前記グルタミン合成阻害剤が、グルホシネートであり、前記ＨＰＰＤ阻害剤が、イソオキサゾール、ピラゾロン、またはトリケトンであり、前記ＰＰＯ阻害剤が、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、またはピリミジンジオンであり、または前記長鎖脂肪酸阻害剤が、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、またはピラゾールである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／２００，４２８号の優先権の利益を主張し、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
６９．４ＫＢ（ＭＳ−ＷＩＮＤＯＷＳでの計測）の２０１６年７月２７日に作成されたＭＯＮＳ３８３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルに含まれた配列表は、電子申請により本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
背景
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを阻害する除草剤への耐容性をもたらす酵素をコードする、組み換えＤＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術
農業作物生産ではしばしば、バイオテクノロジーの方法を用いて作られたトランスジェニック形質が利用される。異種遺伝子（導入遺伝子としても知られる）は、トランスジェニック形質を生成するために植物に導入することができる。植物での導入遺伝子の発現により、植物に除草剤耐容性などの形質が付与される。トランスジェニック除草剤耐容性形質の例としては、グリホサート耐容性、グルホシネート耐容性、及びジカンバ耐容性が挙げられる。一般的に使用されている除草剤への耐性を有する雑草種の増加に伴い、新たな除草剤耐容性形質が当技術分野で必要とされている。特に目的となる除草剤としては、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤（ＰＰＯ除草剤と称される）が挙げられる。ＰＰＯ除草剤は様々な除草剤耐性雑草の防除を提供するため、これらの除草剤への耐容性を付与する形質は、１つ以上の他の除草剤耐容性（複数可）と組み合わせた栽培体系においてとりわけ有用になる。
【０００５】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、クロロフィル及びヘムの両生合成経路で機能し、プロトポルフィリノーゲンＩＸをプロトポルフィリンＩＸに変換する。プロトポルフィリンＩＸ生成の後、クロロフィル及びヘム生合成経路は異なる金属イオン（ヘムは鉄、クロロフィルはマグネシウム）を取り込んで分岐する。この経路のセグメントは原核生物及び真核生物にまたがって保存されており、原核生物及び真核生物にまたがって見いだされる多くのＰＰＯ酵素は比較的類似している。一部の原核生物（例えば、ラン藻類）はこの経路をクロロフィル及びヘム生成に使用し、一方他の原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）はこの経路をヘム生成に使用する。
【０００６】
複数の原核生物及び真核生物から除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（「ｉＰＰＯ」）が単離されている。構造に基づくと、次に挙げる、少なくとも３種の異なるＰＰＯ酵素のサブクラスが存在すると考えられている：ＨｅｍＹ（Ｈａｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｄｅｒｓｔｅｄｔ，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｈｅｍＥＨＹ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ，ｗｈｉｃｈ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｐｒｏｔｏｈｅｍｅ  ＩＸ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４（２４）：８０８１−８０９３（１９９２））、ＨｅｍＧ（Ｓａｓａｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｈｅｍ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１３：２９７−３０３（１９７９））、及びＨｅｍＪ（Ｂｏｙｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７７（１４）：４７９５−４８０１（２０１１））。本発明は、ＨｅｍＧファミリーのメンバーである新規の組み換えｉＰＰＯを提供する。２０年にわたる研究及びこれまでに同定されたｉＰＰＯの数にもかかわらず、組み換えｉＰＰＯを含むトランスジェニック作物植物はまだ商品化されていない。強力な雑草防除プラットフォームは、部分的には、除草剤耐容性形質パッケージの継続的な開発に依存している。そのため、ｉＰＰＯを同定し利用してトランスジェニック作物形質を創生することは農業の進歩を意味する。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、配列番号１〜２０から選択されるポリペプチド配列に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に連結した異種プロモーターを含む組み換えＤＮＡ分子であって、当該ポリペプチドが除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、組み換えＤＮＡ分子を提供する。ある特定の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号１〜２０の中から選択されるポリペプチドに対し、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する。一部の実施形態では、核酸配列が配列番号２２〜６３からなる群から選択される組み換えＤＮＡ分子が提供される。特定の実施形態では、当該組み換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。そのため、本発明により、配列番号１〜２０の中から選択される全長のアミノ酸配列に対する少なくとも８５％の配列同一性を備える組み換えポリペプチドであって、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、組み換えポリペプチドが提供される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、異種プロモーター、例えば植物細胞中で機能するプロモーターは、本発明のポリペプチド配列、例えば配列番号１〜２０から選択されるポリペプチド配列に対し、少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列に、作用可能に連結しており、当該ポリペプチドは除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する。得られたこのようなＤＮＡ分子は、当該ポリペプチドを細胞内に局在化するように機能する標的配列をさらに含むことができる。
【０００９】
一態様において、本発明は、本発明の組み換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡコンストラクトを提供する。一実施形態では、このようなＤＮＡコンストラクトは、本発明の核酸配列への作用可能な連結において、当該ポリペプチドを細胞内に局在化するように機能する標的配列を含む。当該ＤＮＡ分子は、トランスジェニック植物、種子、または細胞のゲノム中に存在し得る。ある特定の実施形態では、当該ポリペプチドは、細胞、植物、種子、または植物部分に除草剤耐容性を付与する。
【００１０】
本発明の別の態様では、本発明の組み換えＤＮＡ分子または本発明の組み換えポリペプチドを含むトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分が提供される。そのため、当該トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤への除草剤耐容性を備え、すなわちそれを示す。一部の実施形態では、当該トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、追加のトランスジェニック除草剤耐容性形質を備える。
【００１１】
本発明の別の態様では、植物、種子、細胞、または植物部分に除草剤耐容性を付与する方法であって、当該植物、種子、細胞、または植物部分において本発明の組み換えポリペプチドを異種発現させることを含む、方法が提供される。当該方法における一部の実施形態では、当該植物、種子、細胞、または植物部分は、当該組み換えポリペプチドによって付与されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を備える。一部の実施形態では、当該除草剤耐容性は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン−エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン−エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット−メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン−エチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に対するものである。
【００１２】
本発明の別の態様は、植物の形質転換方法であって、ａ）本発明の組み換えＤＮＡ分子を植物細胞に導入するステップと、ｂ）そこから当該組み換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を再生するステップと、を含む方法に関する。当該方法は、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に耐容性である植物を選択するステップをさらに含む。また、当該方法は、再生された植物を自らと、または第２の植物と交配させ、この交配種から種子を収集するステップもさらに含むことができる。
【００１３】
本発明のまた別の態様では、植物生長区域における雑草を防除する方法であって、トランスジェニック植物または種子を含む植物生長区域を少なくとも１種のＰＰＯ除草剤に接触させることを含み、トランスジェニック植物または種子が当該ＰＰＯ除草剤に耐容性であり、かつ雑草が植物生長区域において防除される、方法が提供される。
【００１４】
また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、ａ）ネイティブＥ．ＣｏｌｉのＰＰＯ酵素の遺伝子ノックアウトを有するＥ．ｃｏｌｉ株を、候補となる除草剤耐容性タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む細菌発現ベクターを用いて形質転換することと、ｂ）当該形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、ヘムフリー細菌培地を用いて増殖させることであって、当該細菌培地を用いた増殖が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を同定する、増殖させることと、を含む方法も提供される。
【００１５】
本発明により、さらに、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、ａ）ネイティブＥ．ＣｏｌｉのＰＰＯ酵素の遺伝子ノックアウトを有するＥ．ｃｏｌｉ株を、組み換えタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を含む細菌発現ベクターを用いて形質転換することと、ｂ）当該形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤を含有する細菌培地を用いて増殖させることであって、細菌の増殖が、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を同定する、増殖させることと、を含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様は、除草剤耐容性遺伝子についてスクリーニングする方法であって、ａ）本発明の組み換えＤＮＡ分子を植物細胞において発現させることと、ｂ）ＰＰＯ除草剤への耐容性を示す植物細胞を同定することと、を含む方法に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、除草剤耐容性遺伝子についてスクリーニングする方法であって、ａ）本発明の組み換えＤＮＡ分子をＨｅｍＧを欠いた細菌細胞において発現させることであって、当該細菌細胞が、ＰＰＯ除草剤の存在下のヘムフリー細菌培地中で増殖する、発現させることと、ｂ）ＰＰＯ除草剤への耐容性を示す細菌細胞を同定することと、を含む方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤に耐容性の植物を生成する方法であって、ａ）本発明の組み換えＤＮＡ分子を含む植物を取得することと、ｂ）トランスジェニック植物を、当該少なくとも１種の他の除草剤への耐容性を備えた第２の植物と交配させることと、ｃ）ＰＰＯ除草剤及び当該少なくとも１種の他の除草剤への耐容性を備えた当該交配種から得られた後代植物を選択することと、を含む方法を提供し、本発明の別の態様である。
【００１９】
また、本発明は、別の態様において、除草剤耐容性雑草の発生を低減する方法であって、ａ）作物生長環境において、例えば本発明のＤＮＡ分子を含むことにより、ＰＰＯ除草剤への耐容性を備え、かつ少なくとも１種の他の除草剤への耐容性を備える、本発明の植物を栽培することと、ｂ）ＰＰＯ除草剤及び少なくとも１種の他の除草剤を当該作物生長環境に施用することであって、当該作物植物が当該ＰＰＯ除草剤及び当該少なくとも１種の他の除草剤に耐容性である、施用することと、を含む方法も提供する。当該方法のある特定の実施形態では、当該ＰＰＯ除草剤は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン−エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン−エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット−メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン−エチル、サフルフェナシル、及びＳ−３１００からなる群から選択される。当該方法における一部の実施形態では、当該少なくとも１種の他の除草剤は、ＡＣＣアーゼ阻害剤、ＡＬＳ阻害剤、ＥＰＳＰＳ阻害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成阻害剤、ＨＰＰＤ阻害剤、ＰＰＯ阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＡＣＣアーゼ阻害剤は、アリールオキシフェノキシプロピオネートまたはシクロヘキサンジオンであり、ＡＬＳ阻害剤は、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、またはトリアゾリノンであり、ＥＰＳＰＳ阻害剤は、グリホサートであり、合成オーキシンは、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、またはセミカルバゾンであり、光合成阻害剤は、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、またはウレアであり、グルタミン合成阻害剤は、グルホシネートであり、ＨＰＰＤ阻害剤は、イソオキサゾール、ピラゾロン、またはトリケトンであり、ＰＰＯ阻害剤は、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、またはピリミジンジオンであり、または長鎖脂肪酸阻害剤は、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、またはピラゾールである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｈ＿Ｎ９０、Ｈ＿Ｎ２０、Ｈ＿Ｎ６０、Ｈ＿Ｎ１０、Ｈ＿Ｎ３０、Ｈ＿Ｎ４０、Ｈ＿Ｎ５０、Ｈ＿Ｎ７０、Ｈ＿Ｎ１００、及びＨ＿Ｎ１１０タンパク質配列（配列番号１〜１０）を整列化した図であり、下にコンセンサス位置が示されている。
【図２】ＰＰＯ除草剤を用いたＰＰＯ細菌スクリーニング系のアッセイ結果を示す図であり、試験ｉＰＰＯを含有するＥ．ｃｏｌｉの増殖が８時間時点で測定されている。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｈ＿Ｎ９０のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号２は、Ｈ＿Ｎ２０のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号３は、Ｈ＿Ｎ６０のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号４は、Ｈ＿Ｎ１０のアミノ酸配列であり、これはＥ．ｃｏｌｉ野生型ＨｅｍＧプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０２１４９８１９９）である。
【００２５】
配列番号５は、Ｈ＿Ｎ３０のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号６は、Ｈ＿Ｎ４０のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号７は、Ｈ＿Ｎ５０のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号８は、Ｈ＿Ｎ７０のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号９は、Ｈ＿Ｎ１００のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１０は、Ｈ＿Ｎ１１０のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１１〜配列番号１７は、それぞれ配列番号１、２、４、５、６、７、９に対応する開始メチオニンを欠いたアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１８及び配列番号１９は、配列番号１１のアミノ酸変異体である。
【００３３】
配列番号２０は、配列番号１７のアミノ酸変異体である。
【００３４】
配列番号２１は、ＷＨのアミノ酸配列であり、これはＡｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ（ヒユモドキ）からの野生型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼである。
【００３５】
配列番号２２〜配列番号３１は、それぞれ配列番号１〜配列番号１０をコードするヌクレオチド配列であり、Ｅ．ｃｏｌｉの発現用にコドン最適化されている。
【００３６】
配列番号３２〜配列番号４１は、それぞれ配列番号１〜配列番号１０をコードするヌクレオチド配列であり、双子葉類の発現用にコドン最適化されている。
【００３７】
配列番号４２〜配列番号４８は、それぞれ配列番号１１〜配列番号１７をコードするヌクレオチド配列であり、双子葉類の発現用にコドン最適化されている。
【００３８】
配列番号４９〜配列番号５２は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２のヌクレオチド変異体である。
【００３９】
配列番号５０、５１、及び５３は、配列番号１８、１９、及び２０をコードするヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号５４〜配列番号６３は、それぞれ配列番号１〜配列番号１０をコードするヌクレオチド配列であり、単子葉類の発現用にコドン最適化されている。
【００４１】
詳細な説明
以下の説明及び定義は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針とするために、提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来的な使用法に従って理解するものとする。
【００４２】
本発明は、新規の、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｉＰＰＯ）をコードする組み換えＤＮＡ分子及びタンパク質を提供する。例えば本発明は、一実施形態において、細胞及び植物において発現させるための微生物由来のｉＰＰＯをコードするベクター及び発現カセットを提供する。また、ＰＰＯ除草剤に耐容性の細胞及び植物を生成する方法も提供される。本発明はさらに、ｉＰＰＯを取得及び改良するためのタンパク質工学及び生物情報学ツールを使用するための方法及び組成物を提供する。
【００４３】
特定の態様において、本発明は組み換えＤＮＡ分子及びタンパク質を提供する。本明細書で使用される「組み換え」という用語は、遺伝子操作の結果物であり、そのため通常天然には見いだされないと考えられる非天然のＤＮＡ、タンパク質、細胞、種子、または生物を指す。「組み換えＤＮＡ分子」とは、天然に存在せず、そのためヒトによる介入の結果であるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、例えば、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子である。組み換えＤＮＡ分子の例に、本明細書で提供される、異種の調節エレメントまたは他のエレメント（例えば、異種プロモーター）に作用可能に連結した除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするＤＮＡ分子がある。「組み換えタンパク質」は、天然に存在せず、そのためヒトによる介入の結果であるアミノ酸配列（例えば、遺伝子操作されたタンパク質またはキメラタンパク質）を含むタンパク質である。組み換え細胞、種子、または生物とは、組み換えＤＮＡ分子を含み、そのため植物の形質転換の結果として生成されたトランスジェニックＤＮＡ、例えばトランスジェニック細胞、種子、植物、または植物部分、を含む細胞、種子、または生物である。
【００４４】
本明細書で使用される「遺伝子操作」という用語は、通常天然には見いだされないと考えられ、そのためヒトによる介入の適用が必要となる、非天然のＤＮＡ、タンパク質、または生物を作成することを指す。遺伝子操作は、分子生物学、タンパク質生化学、細菌形質転換、及び植物形質転換などのバイオテクノロジー技法の１つ以上を用いて、実験室で考案され作成された、遺伝子操作ＤＮＡ、タンパク質、または生物を生成するために使用することができる。例えば、遺伝子操作は、遺伝子クローニング、ＤＮＡライゲーション、及びＤＮＡ合成などの分子生物学技法のうちの１つ以上を用いて、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子を含むキメラ遺伝子を作成するために使用することができる。キメラ遺伝子は、作用可能に連結した２つ以上の異種ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子発現エレメントに作用可能に連結したタンパク質コード配列、例えば、輸送ペプチドコード配列または異種プロモーター、からなることができる。遺伝子操作は、部位特異的変異誘発を用いたタンパク質設計、ならびにランダム変異誘発及びＤＮＡシャッフリングを用いた定向進化などの、タンパク質工学技法のうちの１つ以上を用いて自らのポリペプチド配列が作成された遺伝子操作タンパク質を作成するために、使用することができる。遺伝子操作タンパク質は、野生型タンパク質のコード配列との比較で１つ以上の欠失、挿入、または置換を有することができ、各欠失、挿入、または置換は、１つ以上のアミノ酸からなることができる。別の実施形態では、遺伝子操作タンパク質は、輸送ペプチドに作用可能に連結した酵素などの、作用可能に連結した２つの異種ペプチドからなることができる。
【００４５】
本明細書で使用される「除草剤不感受性」とは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）が、１種以上のＰＰＯ除草剤（複数可）の存在下で、自らの酵素活性の少なくとも一部を維持する能力を意味する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば酵素アッセイにより測定することができる。酵素アッセイでは、１種以上のＰＰＯ除草剤（複数可）の存在下で、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ産物生成量またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ基質消費量を、蛍光、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または質量分析（ＭＳ）を介して測定する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性を測定するアッセイの別の例に、本明細書に記載の増殖アッセイなどの細菌アッセイがある。この細菌アッセイにより、組み換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの発現を、これをしなければＰＰＯ活性を欠いている細菌細胞に行い、このノックアウト表現型に対する組み換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの補完能力を測定する。除草剤不感受性は、特定の除草剤への完全なまたは部分的な不感受性とすることができ、そして特定のＰＰＯ除草剤への耐容性パーセント（％）または不感受性として表現することができる。本明細書で使用される「除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」または「ｉＰＰＯ」とは、１種以上のＰＰＯ除草剤（複数可）の存在下での除草剤不感受性を示す。
【００４６】
本明細書で使用される「ｈｅｍＧノックアウト株」とは、ヘムフリー増殖培地上で増殖が不可能な程度に、または機能的ＨｅｍＧを含む他のアイソジェニック系統との比較でヘム不在下の増殖が検出可能に損なわれるようにＨｅｍＧ活性を欠いた、生物または生物の細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を意味する。例えばＥ．ｃｏｌｉのｈｅｍＧノックアウト株は、当技術分野の知識を考慮して、例えばＥ．ｃｏｌｉのｈｅｍＧ配列（Ｅｃｏｇｅｎｅ受託番号ＥＧ１１４８５、Ｓａｓａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍＧ  ｇｅｎｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２”Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９：１１５５−１１６１，１９９３）を考慮して、調製することができる。
【００４７】
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、植物形質転換法などのヒトの介入により、人工的に生物のゲノムに組み込まれたＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される「トランスジェニック」という用語は導入遺伝子を含むことを意味し、例えば「トランスジェニック植物」とは、そのゲノム中に導入遺伝子を含む植物を指し、「トランスジェニック形質」とは、植物ゲノムに組み込まれた導入遺伝子の存在により伝達または付与される特徴または表現型を指す。このようなゲノム改変のため、トランスジェニック植物は関連する野生型植物とは明確に異なる植物であり、トランスジェニック形質は、関連野生型植物には天然に見いだされない形質である。本発明のトランスジェニック植物は、本明細書により提供される組み換えＤＮＡ分子及び遺伝子操作タンパク質を含む。
【００４８】
本明細書で使用される「異種」という用語は、異なる供与源に由来し、よって通常天然には関連しない２つ以上のアイテム間の関係を指す。例えば、タンパク質コード組み換えＤＮＡ分子は、作用可能に連結したプロモーターに対し、このような組み合わせが通常天然には見いだされない場合は、当該プロモーターに対し異種である。加えて、特定の組み換えＤＮＡ分子は、自らが挿入された細胞、種子、または生物に対し、この挿入がこれら特定の細胞、種子、または生物において天然には生じないと考えられる場合、これらに対し異種であり得る。
【００４９】
本明細書で使用される「単離」という用語は、分子を、天然状態では典型的に関連している他の分子から、少なくとも部分的に分離することを指す。一実施形態において、「単離」という用語は、ＤＮＡ分子が天然状態では通常隣接している核酸から分離することを指す。例えば、ある細菌中に天然に存在するタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、当該タンパク質をコードする当該ＤＮＡ分子が天然に見いだされる細菌のＤＮＡ内にない場合には、単離ＤＮＡ分子であると考えられる。したがって、例えば組み換えＤＮＡまたは植物形質転換技法の結果として、天然には関連しないと考えられる１つ以上の他のＤＮＡ分子（複数可）に融合または作用可能に連結したＤＮＡ分子は、本明細書では単離しているとみなされる。このような分子は、宿主細胞の染色体に統合されている場合であっても、他のＤＮＡ分子と共に核酸溶液中に存在する場合であっても、単離しているとみなされる。
【００５０】
本明細書で使用される「タンパク質コードＤＮＡ分子」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を指す。「タンパク質コード配列」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。「配列」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の連続した配置を意味する。タンパク質コード配列の境界は、５’末端にある翻訳開始コドン及び３’末端にある翻訳停止コドンによって決定することができる。タンパク質コード分子は、タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。本明細書で使用される「導入遺伝子発現」、「導入遺伝子を発現する」、「タンパク質発現」、及び「タンパク質を発現する」とは、ＤＮＡ分子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写し、ｍＲＮＡを最終的にはタンパク質にフォールディングされるポリペプチド鎖に翻訳するプロセスを通じた、タンパク質の生成を意味する。タンパク質コードＤＮＡ分子は、組み換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞においてタンパク質を発現するために使用するＤＮＡコンストラクト中の異種プロモーターに、作用可能に連結され得る。本明細書で使用される「作用可能に連結した」とは、２つのＤＮＡ分子の一方が他方の機能に影響を及ぼし得るような様式で連結していることを意味する。作用可能に連結したＤＮＡ分子は、単一の近接する分子の一部であってもよく、また隣接していてもしていなくてもよい。例えば、プロモーターが、ＤＮＡコンストラクト中のタンパク質コードＤＮＡ分子と作用可能に連結している場合において、これら２つのＤＮＡ分子は、プロモーターが導入遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるように配置されている。
【００５１】
本明細書で使用される「ＤＮＡコンストラクト」とは、２つ以上の異種のＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは導入遺伝子発現に有用であり、これはベクター及びプラスミドに含まれ得る。ＤＮＡコンストラクトは、形質転換（異種ＤＮＡを宿主細胞に導入すること）の目的でベクターで使用してトランスジェニック植物及び細胞を生成することができ、そのためトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分の色素体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに含めることもできる。本明細書で使用される「ベクター」とは、細菌または植物形質転換の目的で使用され得る任意の組み換えＤＮＡ分子を意味する。配列表に記載される組み換えＤＮＡ分子は、例えば、コンストラクトの一部としてベクターに挿入することができ、この組み換えＤＮＡ分子を有するコンストラクトは、植物において、組み換えＤＮＡ分子によりコードされる遺伝子操作タンパク質の発現に影響を及ぼすように機能する遺伝子発現エレメントに対し、作用可能に連結している。組み換えＤＮＡコンストラクト及び植物形質転換ベクターを作製及び使用するための、ＤＮＡ分子の操作に有用な一般的方法は、当技術分野において周知であり、例えば、ＭＲ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）ＩＳＢＮ：９７８−１−９３６１１３−４２−２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２０１２）を含めた手引き書及び実験マニュアルに詳細に記載されている。ＤＮＡコンストラクトまたはＤＮＡコンストラクトを含むベクターの構成成分には、転写可能なＤＮＡ配列に作用可能に連結した１つ以上の遺伝子発現エレメントが含まれ、例えば以下のようなものである：作用可能に連結したＤＮＡを発現させるためのプロモーター、作用可能に連結したタンパク質コードＤＮＡ分子、及び作用可能に連結した３’非翻訳領域（ＵＴＲ）。本発明の実施に有用な遺伝子発現エレメントとしては、限定するものではないが、以下のタイプのエレメントのうちの１つ以上が挙げられる：プロモーター、５’ＵＴＲ、エンハンサー、リーダー、ｃｉｓ作用性エレメント、イントロン、標的配列、３’ＵＴＲ、及び１つ以上の選択可能なマーカー導入遺伝子。
【００５２】
本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明により提供されるタンパク質コードＤＮＡ分子に作用可能に連結し、それにより組み換えタンパク質分子の発現を駆動するプロモーターを含むことができる。本発明の実施に有用なプロモーターとしては、細胞において作用可能に連結したポリヌクレオチドの発現のために機能するもの、例えば細菌プロモーターまたは植物プロモーターが挙げられる。植物プロモーターは様々でありかつ当技術分野において周知であり、例えば、誘導性、ウイルス性、合成型、常在型、時間的制御型、空間的制御型、及び／または空間時間的制御型のものが挙げられる。
【００５３】
本発明の一実施形態において、本明細書で提供されるＤＮＡコンストラクトは、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド分子をコードする異種核酸に作用可能に連結した標的配列を含み、これにより標的配列は、このポリペプチド分子の細胞内局在化を促進する。標的配列は、シグナル配列、標的ペプチド、局在化配列、及び輸送ペプチドとして当技術分野で知られている。標的配列の例に、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）、ミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）、または葉緑体及びミトコンドリア二重標的ペプチドがある。タンパク質の細胞内局在化を促進することにより、標的配列は組み換えタンパク質の蓄積を増大させ、当該タンパク質をタンパク質分解から保護し、かつ／または除草剤耐容性のレベルを強化し、これにより、除草剤施用後のトランスジェニック細胞、種子、または生物の損傷レベルを低減することができる。
【００５４】
本発明に関連して使用することができるＣＴＰ及び他の標的分子は当技術分野において公知であり、以下に限定するものではないが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２１０：４３７−４４２，１９８７）、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ  ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８３：６８７３−６８７７，１９８６）、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０：４９−６０，１９９２、ＰＣＴ  ＷＯ９７／４１２２８）、ミトコンドリアのプレ配列（例えば、Ｓｉｌｖａ  Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０：７６９−７８０，１９９６）、及びエンドウのグルタチオンレダクターゼシグナル配列（Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８：１６７−１７５，１９９５、ＰＣＴ  ＷＯ９７／４１２２８）が挙げられる。
【００５５】
本発明の組み換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡ操作に有用な配列（例えば、制限酵素認識部位または組み換えに基づくクローニング部位）、植物に好ましい配列（例えば、植物コドン使用またはＫｏｚａｋコンセンサス配列）、またはＤＮＡコンストラクト設計に有用な配列（例えば、スペーサーまたはリンカー配列）を提供することが望ましい場合に、当技術分野で公知の方法により、完全にまたは部分的に、合成及び修飾することができる。本発明には、本明細書で提供される組み換えＤＮＡ分子またはポリペプチド配列のいずれかに対し、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、及び少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する組み換えＤＮＡ分子及び遺伝子操作タンパク質が含まれる。本明細書で使用される「配列同一性パーセント」または「配列同一性％」という用語は、試験（「サブジェクト」）配列（またはその相補鎖）と比較した参照（「クエリー」）配列（またはその相補鎖）の、これら２つの配列が最適に整列された（比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０％未満となる適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、欠失、またはギャップを伴う）場合における、直鎖状ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中の同一なヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。比較ウィンドウを整列するための配列の最適な整列化は当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのホモロジー整列化アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似法の研究などのツールにより、ならびに、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の配列分析ソフトウェアパッケージの一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、ＭＥＧＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５）、及びＭＵＳＣＬＥ（バージョン３．６）（Ｅｄｇａｒ，“ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（５）：１７９２−７（２００４））などのコンピューターによるこれらのアルゴリズムの実行により、例えばデフォルトのパラメーターを用いて、行うことができる。試験配列及び参照配列の整列セグメントに関する「同一性率（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、整列された参照配列セグメント部分において、すなわち参照配列全体または参照配列の定義された小部分において、２つの整列配列が共有する同一な構成成分の数を構成成分の総数で割ったものである。配列同一性パーセントは、同一性率に１００を掛けたものとして表される。１つ以上の配列の比較は、全長配列���たはその一部に対してでも、より長い配列に対してでもよい。
【００５６】
遺伝子操作タンパク質の生成は、野生型タンパク質を変化させて（すなわち、修飾して）、修飾された特徴（複数可）、例えば、中でも、葉緑体またはミトコンドリアに対する標的化のような特定の細胞局在化パターン、または有用なタンパク質の特徴の新規組み合わせ（例えば、改変されたＶｍａｘ、Ｋｍ、Ｋｉ、ＩＣ５０）、基質特異性、阻害剤／除草剤特異性、基質選択性、細胞中の他の構成成分（例えばパートナータンパク質または膜）と相互作用する能力、及びタンパク質の安定性、を有する新規のタンパク質を生成することにより、行われ得る。修飾は、タンパク質における特定のアミノ酸位置で行うことができ、天然には（すなわち、野生型タンパク質では）その位置で見いだされるアミノ酸を別のアミノ酸で置換することであり得る。したがって、本発明で提供される遺伝子操作タンパク質は、天然に見いだされる同様のタンパク質と比較して１つ以上の改変タンパク質の特徴を有する新規のタンパク質を提供する。本発明の一実施形態において、遺伝子操作タンパク質は、改変タンパク質の特徴、例えば同様の野生型タンパク質と比較して１種以上の除草剤への感受性低下をもたらす特徴、または、当該遺伝子操作タンパク質を発現するトランスジェニック植物に１種以上の除草剤への除草剤耐容性を付与するための改良された能力をもたらす特徴を有する。一実施形態において、本発明は、遺伝子操作タンパク質と、それをコードする組み換えＤＮＡ分子であって、表１から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、配列番号１〜２０を含むがこれに限定されない本明細書で提供される遺伝子操作タンパク質配列のいずれかに対し、少なくとも約７０％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約８５％の配列同一性、約９０％の配列同一性、約９５％の配列同一性、約９６％の配列同一性、約９７％の配列同一性、約９８％の配列同一性、及び約９９％の配列同一性を有する、組み換えＤＮＡ分子とを提供する。アミノ酸の突然変異は、タンパク質中の単一のアミノ酸置換として、または１つ以上の他の突然変異（複数可）との組み合わせで、例えば、１つ以上の他のアミノ酸置換（複数可）、欠失、または付加との組み合わせで、行われ得る。突然変異は、当業者に知られている任意の方法により行うことができる。
表１：アミノ酸置換
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【００５７】
本明細書で使用される「野生型」とは、天然に存在する、類似しているが同一ではないバージョンを意味する。「野生型ＤＮＡ分子」または「野生型タンパク質」は、当該ＤＮＡ分子またはタンパク質の天然に存在するバージョン、すなわち、天然に既に存在する当該ＤＮＡ分子またはタンパク質のバージョンである。本発明により提供される遺伝子操作タンパク質との比較に有用な野生型タンパク質の例に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼがある。「野生型植物」とは、トランスジェニック植物と同じタイプの非トランスジェニック植物であり、そのため、除草剤耐容性形質を備えるトランスジェニック植物とは遺伝的に異なる。トランスジェニックトウモロコシ植物との比較に有用な野生型植物の例に、非トランスジェニックＬＨ２４４トウモロコシ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１７３）及び０１ＤＫＤ２近交系トウモロコシ（Ｉ２９４２１３）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５９）がある。トランスジェニックダイズ植物についての例示的な比較系統としては、非トランスジェニックＡ３５５５ダイズ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２０７）が考えられ、トランスジェニックワタ植物についての例示的な比較系統としては、非トランスジェニックＣｏｋｅｒ１３０（Ｐｌａｎｔ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ８９００２５２）が考えられる。
【００５８】
トランスジェニック植物及び除草剤
本発明の一態様には、本発明により提供される組み換えＤＮＡ分子及び遺伝子操作タンパク質を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック種子が含まれる。当該組み換えＤＮＡ分子及び遺伝子操作タンパク質を含むこれらの細胞、組織、植物、及び種子は、１種以上のＰＰＯ除草剤（複数可）への除草剤耐容性、及び任意選択により１種以上の追加の除草剤（複数可）への耐容性を示す。
【００５９】
本発明での使用に好適な宿主植物細胞の形質転換方法には、ＤＮＡを細胞に導入することができる（例えば、組み換えＤＮＡコンストラクトを安定的に植物染色体に統合させる）ほぼ全ての方法が含まれ、形質転換方法は当技術分野において周知である。組み換えＤＮＡコンストラクトを植物に導入するための、例示的でありかつ広く利用されている方法はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系であり、これは当業者によく知られている。組み換えＤＮＡコンストラクトを植物に導入するための、別の例示的な方法は、部位特異的統合の方法による所定の部位の植物ゲノムへの組み換えＤＮＡコンストラクト挿入である。部位特異的統合は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、遺伝子操作もしくはネイティブなメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）により、遂行することができる。トランスジェニック植物は、植物細胞培養の方法により、形質転換植物細胞から再生することができる。導入遺伝子に対してホモ接合性（すなわち、導入遺伝子の２つの対立形質コピー）であるトランスジェニック植物は、単一の導入遺伝子対立形質を自らと共に含有するトランスジェニック植物、例えばＲ０植物を自家受粉（同系交配）させてＲ１種子を生成させることにより、取得することができる。生成したＲ１種子の４分の１が当該導入遺伝子にホモ接合性となる。発芽Ｒ１種子から生育した植物は、ＳＮＰアッセイ、ＤＮＡシークエンシング、または熱による増幅アッセイを用いて接合状態を試験することができる。接合状態アッセイと呼ばれるこの試験により、ヘテロ接合体とホモ接合体との区別が可能になる。
【００６０】
本発明で使用される「ＰＰＯ阻害除草剤」または「ＰＰＯ除草剤」とは、プロトポルフィリノーゲンＩＸの脱水素を触媒して、ヘム及びクロロフィルの前駆体であるプロトポルフィリンＩＸを形成する、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）の酵素活性を標的とし阻害する、化学物質である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの阻害により反応性酸素種が形成され、結果として細胞膜の破壊、最終的には感受性を有する細胞の死がもたらされる。ＰＰＯ除草剤は当技術分野において周知であり、市販されている。ＰＰＯ除草剤の例としては、以下に限定するものではないが、ジフェニルエーテル（例えば、アシフルオルフェン、その塩及びエステル、アクロニフェン、ビフェノックス、その塩及びエステル、エトキシフェン、その塩及びエステル、フルオロニトロフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、クロメトキシフェン、フルオログリコフェン、その塩及びエステル、ラクトフェン、その塩及びエステル、オキシフルオルフェン、ならびにホメサフェン、その塩及びエステル）、チアジアゾール（例えば、フルチアセット−メチル及びチジアジミン）、ピリミジンジオンまたはフェニルウラシル（例えば、ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、エチル［３−２−クロロ−４−フルオロ−５−（１−メチル−６−トリフルオロメチル−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−３−イル）フェノキシ］−２−ピリジルオキシ］アセテート（ＣＡＳ登録番号３５３２９２−３１−６及び本明細書での呼称はＳ−３１００）、フルプロパシル、サフルフェナシル、及びチアフェナシル）、フェニルピラゾール（例えば、フルアゾラート、ピラフルフェン及びピラフルフェン−エチル）、オキサジアゾール（例えば、オキサジアルギル及びオキサジアゾン）、トリアゾリノン（例えば、アザフェニジン、ベンカルバゾン、カルフェントラゾン、その塩及びエステル、及びスルフェントラゾン）、オキサゾリジンジオン（例えば、ペントキサゾン）、Ｎ−フェニルフタルイミド（例えば、シニドン−エチル、フルミクロラック、フルミクロラック−ペンチル、及びフルミオキサジン）、ベンゾオキサジノン誘導体（例えば、１，５−ジメチル−６−チオキソ−３−（２，２，７−トリフルオロ−３，４−ジヒドロ−３−オキソ−４−プロパ−２−イニル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−６−イル）−１，３，５−トリアジナン−２，４−ジオン）、フルフェンピル及びフルフェンピル−エチル、ピラクロニル、ならびにプロフルアゾールが挙げられる。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及び本発明による細胞、種子、植物、及び植物部分は、１種以上のＰＰＯ除草剤（複数可）への除草剤耐容性を示す。
【００６１】
除草剤は、雑草を防除する一方法として、本発明により提供される植物及び種子を含む植物生長区域に施用することができる。本発明により提供される植物及び種子は除草剤耐容性を備え、そのため１種以上のＰＰＯ除草剤の施用に対し耐容性である。除草剤の施用は、商業的推奨比率（ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｒａｔｅ）（１Ｘ）またはこの任意の分数または倍数、例えば商業的推奨比率の２倍（２Ｘ）、とすることができる。除草剤の比率は、除草剤及び製剤に応じて、ポンド酸当量／エーカー（ｌｂ  ａｅ／ａｃｒｅ）またはグラム酸当量／ヘクタール（ｇ  ａｅ／ｈａ）またはポンド活性成分／エーカー（ｌｂ  ａｉ／エーカー）またはグラム活性成分／ヘクタール（ｇ  ａｉ／ｈａ）として表現することができる。除草剤の施用は、少なくとも１種のＰＰＯ除草剤を含む。植物生長区域は、除草剤施用の時点で雑草植物を含んでも含まなくてもよい。区域内の雑草防除に使用するためのＰＰＯ除草剤（複数可）の除草剤的有効用量は、生長期にわたりラベル比率（複数可）の約０．１Ｘ〜約３０Ｘの範囲からなることができる。いくつかの例示的なＰＰＯ除草剤の１Ｘラベル比率を表２に示す。１エーカーは２．４７１０５ヘクタールに相当し、１ポンドは４５３．５９２グラムに相当する。除草剤比率は、ヤード・ポンド法とメートル法との間で以下のように変換することができる：（ｌｂ  ａｉ／ａｃ）×１．１２＝（ｋｇ  ａｉ／ｈａ）及び（ｋｇ  ａｉ／ｈａ）×０．８９＝（ｌｂ  ａｉ／ａｃ）。
表２：例示的なＰＰＯ除草剤
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【００６２】
除草剤の施用は、複数のＰＰＯ除草剤のうち１種、２種、もしくは組み合わせ、または任意の他の適合性除草剤を、経時的に混合してもタンク混合してもよい。生長期にわたり、様々な双子葉雑草、単子葉雑草、または両方の防除を行うために、本発明のトランスジェニック植物を含む区域に対し、１種の除草剤または２種以上の除草剤（組み合わせまたは単独で）の複数回施用を使用してもよく、例えば、２回施用（例えば、植え付け前の施用及び発芽後の施用、または発芽前の施用及び発芽後の施用）、または３回施用（例えば、植え付け前の施用、発芽前の施用、及び発芽後の施用、または発芽前の施用及び発芽後の２回施用）を行うことができる。
【００６３】
本明細書で使用される「耐容性」または「除草剤耐容性」とは、除草剤の施用時の毒性効果に耐える植物、種子、または細胞の能力を意味する。除草剤耐容性作物は生長を継続することができ、施用化学物質の存在による影響を受けない、または影響を最小限にとどめる。本明細書で使用される「除草剤耐容性形質」とは、野生型植物と比較して改良された除草剤耐容を植物に付与するトランスジェニック形質である。本発明の除草剤耐容性形質で生成され得る想定植物としては、例えば、中でも、ダイズ（例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、コーン（トウモロコシ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐ．）、及びキャノーラなどの作物植物を含めた任意の植物が挙げられ得る。
【００６４】
本発明のトランスジェニック植物、後代、種子、植物細胞、及び植物部分は、１種以上の追加の形質を含有してもよい。追加の形質は、本発明により提供される組み換えＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を含有する植物を、１種以上の追加の形質（複数可）を含有する別の植物と交配させることにより、導入することができる。本明細書で使用される「交配」とは、後代植物を生成するために２つの個別の植物を交配することを意味する。したがって、２つの植物を交配させて各植物からの望ましい形質を含有する後代を生成することができる。本明細書で使用される「後代」とは、親植物の任意の世代の子孫を意味し、トランスジェニック後代は、本発明により提供されかつ少なくとも１つの親植物から受け継がれるＤＮＡコンストラクトを含む。追加の形質（複数可）の導入も、この追加のトランスジェニック形質（複数可）のためのＤＮＡコンストラクトを、本発明により提供される組み換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡコンストラクトで（例えば、植物形質転換に使用される同じベクターの一部として存在する全てのＤＮＡコンストラクトで）同時形質転換することにより、または追加の形質（複数可）を本明細書で提供されるＤＮＡコンストラクトを含むトランスジェニック植物に挿入するかまたはその逆により（例えば、トランスジェニック植物または植物細胞に対し、植物形質転換またはゲノム編集のいずれかの方法を用いて）、行うことができる。このような追加の形質としては、以下に限定するものではないが、昆虫耐性の増加、水使用効率の増加、収率性能の上昇、乾燥耐性の増加、種子の質の上昇、栄養の質の改良、ハイブリッド種子生成、及び除草剤耐容性（当該形質が野生型植物に対し計測される）が挙げられる。例示的な追加の除草剤耐容性形質としては、１種以上の除草剤、例えば、中でも、ＡＣＣアーゼ阻害剤（例えば、アリールオキシフェノキシプロピオネート及びシクロヘキサンジオン）、ＡＬＳ阻害剤（例えば、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、及びトリアゾリノン）、ＥＰＳＰＳ阻害剤（例えば、グリホサート）、合成オーキシン（例えば、フェノキシ、安息香酸、カルボン酸、セミカルバゾン）、光合成阻害剤（例えば、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、及びウレア）、グルタミン合成阻害剤（例えば、グルホシネート）、ＨＰＰＤ阻害剤（例えば、イソオキサゾール、ピラゾロン、及びトリケトン）、ＰＰＯ阻害剤（例えば、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、及びピリミジンジオン）、及び長鎖脂肪酸阻害剤（例えば、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、及びピラゾール）、へのトランスジェニックまたは非トランスジェニック耐容性が挙げられ得る。例示的な昆虫耐性形質としては、中でも、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、及びＨｏｍｏｐｔｅｒａ各目のうちの１つ以上の昆虫メンバーに対する耐性が挙げられ得る。このような追加の形質は当業者によく知られており、例えば、このようなトランスジェニック形質のリストが米国農務省（ＵＳＤＡ）の動植物検疫局（ＡＰＨＩＳ）により提供されている。
【００６５】
発現コンストラクトなどの本発明のポリヌクレオチドで形質転換された細胞は、このような細胞をトランスジェニック植物に再生させる前または後の当該ポリヌクレオチドまたはそのコードされた酵素活性の存在のために選択され得る。したがって、このようなポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物は、例えば、当該ポリヌクレオチドまたはコードされた酵素活性を含む、かつ／または別のアイソジェニック対照植物との比較で改変された形質を示すトランスジェニック植物を同定することにより、選択され得る。このような形質は、例えば、ＰＰＯ除草剤への耐容性であり得る。
【００６６】
本発明により提供されるトランスジェニック形質を含有するトランスジェニック植物及び後代は、当技術分野において公知である任意の交配方法を用いて使用することができる。２種以上のトランスジェニック形質を備える植物系統において、これらのトランスジェニック形質は、独立して分離していても連結していてもよく、３種以上の形質を備える植物系統においては両方の組み合わせであってもよい。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も栄養繁殖であるために考慮されている。異なる形質及び作物に使用される交配方法の説明は、当業者によく知られている。特定の植物または種子における導入遺伝子（複数可）の存在を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。このようなアッセイとしては、例えば、分子生物学的アッセイ（例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ、及びＤＮＡシークエンシング）、生化学的アッセイ（例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）による、または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出）、植物部分アッセイ（例えば、葉または根のアッセイ）が挙げられ、また、全植物の表現型の分析によっても行われる。
【００６７】
植物遺伝子型へのトランスジェニック形質の遺伝子移入は、戻し交配転換のプロセスの結果として達成される。トランスジェニック形質が遺伝子移入された植物遺伝子型は、戻し交配変換遺伝子型、系統、近交系、または交雑系と呼ぶことができる。同様に、望ましいトランスジェニック形質を欠いた植物遺伝子型は、未変換遺伝子型、系統、近交系、または交雑系と呼ぶことができる。
【００６８】
本発明を詳細に説明してきたが、付属の請求項で定義される本発明の範囲を逸脱することなく変更、変形形態、及び同等の実施形態が可能であることは明らかなものとなる。さらに、本開示における実施例は非限定的な例として提供されることを理解されたい。
【実施例】
【００６９】
本発明の実施形態を実証するために、以下の実施例が含まれている。当業者は、次の実施例に開示されている技法が、発明者によって発見された、本発明の実施で十分に機能するための技法を代表するものであり、したがってこの技法が本発明を実施するための好ましい様式を構成するものとみなされ得ることを、理解するはずである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことが可能であり、それでも依然として本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果が得られ得ることも理解するはずである。より具体的には、化学的かつ生理学的に関連するある特定の薬剤は、本明細書に記載の薬剤に置き換えられ得、同じまたは同様の結果が達成され得ることが明白となろう。当業者に対して明白な、このような同様の代用及び変更は全て、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内にあるものとみなされる。
【００７０】
実施例１：微生物プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの発見
生物情報学的方法及び新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ細菌スクリーニング系を用いて、微生物配列データベースから新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを同定した。微生物配列データベースの生物情報学的分析のための開始配列として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨｅｍＧ（配列番号４）の配列を使用した。生物情報学的分析により、多様な細菌供与源からＨｅｍＧ  ＰＰＯファミリーの３３種の新規の推定プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼが同定された。系統樹マッピングを使用してこれらの推定ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をコードする配列を比較し、これらが比較的多様であることを見いだした。系統樹上の個々のユニークなクラスターメンバーの表示により、この３３種からなる群からさらなる分析用に１０種を選択した。
【００７１】
この選択した１０種のＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のコード配列を、野生型ＤＮＡ配列に見いだされるいかなるレアなコドンも排除するようＥ．ｃｏｌｉ発現用に最適化した。次に、１０種のＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のＥ．ｃｏｌｉ最適化コード配列を細菌発現ベクターにクローニングした。ヒユモドキ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）に天然に見いだされる除草剤感受性ＰＰＯ酵素を、ＰＰＯ機能及び除草剤感受性の両方についての対照として使用するために、細菌発現ベクターにクローニングした（「ＷＨ」と称し、配列番号２１として示す、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ５２３２６、Ｐａｔｚｏｌｄｔ，ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｃｏｄｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ．１０３（３３）：１２３２９−１２３３４（２００６））。ヒユモドキＰＰＯ酵素は、ＨｅｍＧファミリーメンバーではない。Ｅ．ｃｏｌｉに天然に見いだされるＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素を、ＰＰＯ活性の対照として及び除草剤感受性のアッセイに使用するため細菌発現ベクターにクローニングした（Ｈ＿Ｎ１０と称し、配列番号４として示す）。
【００７２】
組み換えタンパク質のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を試験し、そうすることで機能的ＰＰＯ酵素であることを確認するために、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ細菌スクリーニング系を作成した。このスクリーニング系では、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＰＯ酵素（配列番号４）遺伝子ノックアウトを含有するＥ．ｃｏｌｉ株に機能的レスキューアッセイを使用した。利用したｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株がヘムフリー細菌培地（例えば、ＬＢ培地）上で示す増殖は非常に最小限だったが、遊離ヘムを補充した場合、または活性組み換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをＥ．ｃｏｌｉに発現させた場合には増殖が回復した。したがって、タンパク質のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を迅速かつ容易にアッセイするために、ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株を組み換えタンパク質発現で使用することができた。
【００７３】
ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株を、１０種の推定ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素、及びヒユモドキＰＰＯ酵素をコードする遺伝子を含有する細菌発現ベクターで形質転換した。次に細菌を、ヘムフリー細菌培地であるＬＢ培地プレート上に縞状に並べた。組み換えＰＰＯ酵素の発現によりＥ．ｃｏｌｉの増殖がレスキューされ、ＬＢプレート上での増殖がもたらされた。形質転換ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株がＬＢプレート上で増殖したことにより、タンパク質配列がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとして機能したことが示された。このアッセイにおいて、１０種のＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素（配列番号１〜１０）及びヒユモドキＰＰＯ酵素（配列番号２１）は、形質転換ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の増殖を回復することができたため、よってこれらのＰＰＯ活性が確認された。ＰＰＯ酵素のタンパク質配列を整列化したものをコンセンサス位置と共に図１に示す。このアッセイを使用して、多数の新規タンパク質または遺伝子操作タンパク質をスクリーニングしてプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性の確認及び測定を行うことができる。
【００７４】
実施例２：プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤不感受性
除草剤細菌スクリーニング系を用いて、ＰＰＯ除草剤に耐性である新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを同定した。このスクリーニング系は、ＰＰＯ除草剤に感受性でないプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを同定するために、ＰＰＯ除草剤を含むＬＢ液体培地におけるｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の増殖アッセイを使用した。
【００７５】
ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株を、確認されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を含有する細菌発現ベクターで形質転換し、ＬＢ液体培地中で培養した。３つの種々のＰＰＯ化学サブクラスを代表する５種の種々のＰＰＯ除草剤（アシフルオルフェン（１ｍＭ）、フルミオキサジン（０．５ｍＭ）、ラクトフェン（０．５ｍＭ）、ホメサフェン（１ｍＭ）、及びＳ−３１００（１００μＭ））のうちの１種の精製結晶形態を、培地に添加した。組み換えタンパク質を発現させ、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖速度を測定した。これら種々の変異体の増殖曲線（ＯＤ６００）を、ＰＰＯ除草剤の存在下及び非存在下で、０時間〜２４時間の選択された時点において測定した。ＰＰＯ除草剤存在下でＬＢ培地中の形質転換ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株が増殖したことにより、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に使用した遺伝子が除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｉＰＰＯ）をコードすることが示された。
【００７６】
新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをこのアッセイで使用して、ＰＰＯ除草剤への不感受性を試験した。配列番号１〜配列番号１０として示される１０種のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは全て、ＰＰＯ除草剤の存在下でＬＢ培地中のｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株に正常な増殖速度を付与することが見いだされ、これにより、これらのタンパク質が除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｉＰＰＯ）であることが示された（図２）。ヒユモドキＰＰＯ（配列番号２１）を発現するｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株は５種全ての除草剤に感受性であり、これにより、当該アッセイが、各除草剤について感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとを区別できることが確認された。このアッセイを用いて、多数の新規タンパク質または遺伝子操作タンパク質をスクリーニングして、ＰＰＯ除草剤（複数可）の存在下でのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を確認することができる。
【００７７】
実施例３：プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）酵素アッセイ
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素的キャラクタリゼーションを行って、各ＰＰＯ酵素基質の結合親和性（Ｋｍ）及びＰＰＯ除草剤への感受性（ＩＣ５０）を測定した。ヒユモドキ、ダイズ、及びトウモロコシからの野生型植物ＰＰＯ酵素を使用して、微生物ＨｅｍＧプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（配列番号１〜配列番号１０として示される）との比較を行った。
【００７８】
黄化させた子葉（ダイズ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、黄化させた葉／子葉鞘（トウモロコシ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、及び広げた先端葉（ヒユモドキ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔａ）から、概してＧｒｏｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．により説明される手順（“Ｔｈｅ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ（Ｋｉｘｏｒ（ＴＭ））ｉｓ  ａ  Ｎｅｗ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＸ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５８（１）：１−９（２０１０））により、白色体及び葉緑体を調製した。ダイズ（Ａ３５５５）及びトウモロコシ（ＬＨ２４４）の種子を、水の入ったビーカー中の２枚の湿った発芽紙（Ａｎｃｈｏｒ  Ｐａｐｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）の間に挟み、８〜１０日の連続暗期で置いた。ヒユモドキ植物を温室で３０日間生育した。組織を収集し、湿ったペーパータオルの間に挟み、乳鉢及び乳棒を用いて液体窒素中で細かい粉末になるまで粉砕した。均質化緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ塩化マグネシウム、及び２ｇ／リットルウシ血清アルブミン）を凍った粉末に４：１（ｍｌ均質化緩衝液：ｇ新鮮重組織）で添加し、激しく攪拌し、予め湿らせた４層のＭｉｒａｃｌｏｔｈ（商標）（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過した。濾過液を９２９９ｇで５分間遠心処理した。沈渣を均質化緩衝液に再懸濁させ、１５０ｇで２分間遠心処理した。上清溶液を４０００ｇで１５分間遠心処理した。全遠心処理ステップを４℃で実施した。沈渣（インタクトなプラスミド画分）を１５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２０％（ｖ／ｖ）グリセリンに再懸濁させ、−８０℃でアリコートにして保管した。プラスミド調製物中の総タンパク質量を、ウシ血清アルブミンを基準として、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＭＭ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ，“Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２：２４８−２５４（１９７６））により測定した。
【００７９】
選択したＰＰＯ酵素を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｅｍＧノックアウト細胞株において発現させた。終夜培養物からの細菌細胞を使用して２０ｍｌの新鮮培地に接種した。これらの培養物を２０℃でおよそ４８時間増殖させ、高密度培養物にした。遠心処理により細菌細胞を収集し、酵素アッセイを実施するまで細胞沈渣を−８０℃で保管した。凍った細菌沈渣を抽出懸濁液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ＆１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁させ、超音波処理（Ｓｏｎｉｃｓ  ＶｉｂｒａＣｅｌｌ（商標），Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ  ＵＳＡ）にかけ、氷浴中で３０秒を３サイクル、サイクル間に１分の休止期間をおいて行った。破砕細胞を２００ｇで４℃にて２分間遠心処理し、上清溶液を抽出懸濁液で希釈した後、ＰＰＯ酵素アッセイに使用した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法により、ウシ血清アルブミンを基準として総タンパク質量を測定した。
【００８０】
ＪＭ  Ｊａｃｏｂｓ及びＮＪ  Ｊａｃｏｂｓによる説明（“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（１９９９）８．５．１−８．５．１３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の通りに、市販のプロトポルフィリンをナトリウム水銀アマルガムで還元することにより、プロトポルフィリノーゲンＩＸ（プロトゲン）を合成した。プロトポルフィリン（Ｐｒｏｔｏ）を２０％エタノール中０．０１Ｎの水酸化カリウムに添加し、溶解するまで暗中で攪拌した（約４０分）。Ｏリングを収容するねじ蓋を有する２ｍｌポリプロピレンバイアルに体積０．８ｍｌを入れ、約１ｇ（スパチュラチップ１杯分、油除去）のナトリウム水銀アマルガム（製品番号４５１９０８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，油浸下で保管）を添加した。直ちにチューブに蓋をし、ボルテックスミキサーで激しく攪拌し、約３０秒ごとに蓋を緩めることによりベントし、溶液がＵＶ光下で赤色に蛍光発光しなくなるまでこれを行った（約５分）。反応バイアルをアルゴンでフラッシュし、軽く遠心処理して、残存するナトリウムアマルガムをペレットにした。上清溶液を直ちに０．１Ｍ  ＤＴＴ及び０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の溶液で１：１（ｖ／ｖ）希釈し、バイアルをアルゴンでフラッシュした。得られた溶液をより少量のアリコートに分割して０．５ｍｌポリプロピレン蓋付きチューブに入れ、アリコートを添加した直後にチューブをアルゴンでフラッシュした。蓋付きチューブをアルミホイルで覆い、−８０℃で保管した。酵素アッセイ用にプロトゲンアリコートを解凍し、氷上で覆った状態で保管し、同日に使用した。調製物中のプロトゲン濃度を、出発材料におけるＰｒｏｔｏ濃度から、蛍光ＨＰＬＣにより測定される最終プロトゲン溶液におけるＰｒｏｔｏ濃度（典型的には出発材料の約１％）を減算する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，“Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｌｔａ−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｏｎ  Ｄｕｃｋｗｅｅｄ（Ｌｅｍｎａ  ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ  Ｈｅｇｅｌｍ．）”Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｐｈｙｓ．４８：２１４−２２１（１９９４）により説明される方法）ことにより算出した（いずれのサンプルにも顕著な不純物がないものと想定）。これらの条件下で調整し保管したプロトゲンは、少なくとも６ヶ月間安定であった。
【００８１】
植物プラスミド抽出調製物及び細菌抽出調製物におけるＰＰＯ活性を、概してＧｒｏｓｓｍａｎｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）による説明の通りに測定した。１０マイクロリットルの、植物プラスミド抽出物（総タンパク質量４０μｇ）または細菌抽出物（種々の細菌抽出物について総タンパク質量１６〜３５μｇ）のいずれかを、アッセイ緩衝液（１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０８５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０）に添加した。Ｓ−３１００（「ＳＹＮ−５２３」としても知られる。例えば米国特許公開第ＵＳ２０１０００６２９４１Ａ１号）を、アセトン中で調製した１００Ｘストック溶液からの２マイクロリットル体積として添加した。分析グレードＳ−３１００は、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された。全アッセイを、１％（ｖ／ｖ）アセトンの最終濃度で実行した。抽出物（プラスミドまたは細菌のもの）、緩衝液、及びＳ−３１００を３０℃（植物抽出物）または３７℃（細菌抽出物）で５分間インキュベートしてから２マイクロリットルのプロトゲンを添加し、当該アッセイを開始した。全アッセイを、９６ウェル黒色ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中で２００マイクロリットルの最終体積で行った。プロトゲンを全てのウェルに添加後（ＩＣ５０測定については３μＭ、Ｋｍ測定については可変）、プレートを３０℃（植物抽出物）または３７℃（細菌抽出物）でインキュベートしてからデータ収集を開始した。３０℃（植物抽出物）または３７℃（細菌抽出物）における経時的な蛍光を、励起波長及び発光波長をそれぞれ４０５ｍｍ及び６３０ｍｍにして、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において測定した。熱失活した（１００℃で５分）抽出物をアッセイ混合物に添加することにより、アッセイブランクを実行した。
【００８２】
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの基質（プロトポルフィリノーゲン）結合親和性をＫｍとして測定した。評価対象の各ＰＰＯについての見かけ上のＫｍ値を、ＳｏｆｔＰｒｏ（登録商標）動力学ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて直角双曲線の曲線適合を用いて算出した。ＰＰＯ除草剤Ｓ−３１００への酵素活性感受性を、防除活性の５０％阻害をもたらす濃度（ＩＣ５０）として測定した。評価対象の各ＰＰＯに対するＳ−３１００のＩＣ５０値を、Ｓ−３１００濃度対ＰＰＯ活性の片対数プロットから図式的に求めた。
【００８３】
３種の植物供与源（ヒユモドキ、ダイズ、またはトウモロコシ）からのＰＰＯ酵素及び微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素（配列番号１〜配列番号１０）についてのＫｍは０．３ｕＭ〜２．０ｕＭの範囲であり、類似していることが見いだされた。試験した３種の植物ＰＰＯ酵素は、それぞれＩＣ５０値が０．００９、０．００４、及び０．００３ｕＭであり、Ｓ−３１００に感受性であった。これに対し、細菌供与源からのＰＰＯ酵素（配列番号１〜配列番号１０）は、ＩＣ５０値が１００ｕＭ超であり、Ｓ−３１００に不感受性であった。データを表３に示す。
表３．植物または微生物の供与源から精製した酵素のＰＰＯ酵素活性
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【００８４】
実施例４：プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素最適化
タンパク質最適化を使用して、新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素特性を改良または変更した。１つ以上のタンパク質工学の方法を使用して酵素を最適化する。タンパク質工学手法の非限定的な例としては、アラニンスキャニング変異導入、相同性スキャニング変異導入、Ｐｒｏ／Ｇｌｙスキャニング変異導入、領域のスワップまたは変異導入、及びこれらの様々な技法の組み合わせが挙げられる（Ｍ  Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍ  Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（４）：３７１−３７５（２００１）、Ｂ  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇ  ａｎｄ  ＶＧＨ  Ｅｉｊｓｉｎｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３（４）：３３３−３３７（２００２）、及びＷｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９７（１６）：８９５０−８９５４（２０００）を参照）。遺伝子操作プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を合成し、細菌発現ベクターにクローニングする。このベクターは、実施例１に記載の初期高スループット細菌レスキュースクリーニングのため、ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の形質転換に使用する。ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株をレスキューする遺伝子操作プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼについては、実施例２に記載の細菌増殖アッセイを用いて、１種以上のＰＰＯ除草剤（複数可）への感受性をスクリーニングする。代替方法として、ＰＰＯ除草剤を含む、及び含まない培地に形質転換ｈｅｍＧノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株を蒔く。ＰＰＯ除草剤への耐容性を示す遺伝子操作変異体を細菌発現系において発現させ、実施例３に記載の連続的蛍光定量アッセイにより精製されたタンパク質を用いて詳細な生化学的キャラクタリゼーションを行う。植物形質転換ベクターへのクローニング、植物形質転換、及び植物体への試験のために、ＰＰＯ除草剤に不感受性の遺伝子操作変異体を選択する。
【００８５】
実施例５：トウモロコシにおけるＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の発現及び試験
微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をトランスジェニックトウモロコシ植物において発現させ、このトランスジェニック植物のＰＰＯ除草剤耐容性を分析した。配列番号１〜２０として示される微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの１つをコードする組み換えＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを構築した。ＰＰＯ酵素をコードするＤＮＡ配列には、５’末端にメチオニンのコドンが含まれ得、これは開始コドンとして一般に知られるが、あるいはこのコドンを除去して、輸送ペプチド配列がコード配列の５’末端に作用可能に連結するように促すことができる。アミノ末端にメチオニンを含有するＰＰＯ酵素タンパク質配列の例は、配列番号１〜１０として提供される。アミノ末端にメチオニンを含まないＰＰＯ酵素タンパク質配列の例は、配列番号１１〜２０として提供される。植物形質転換のため、推定ＰＰＯ酵素をコードするヌクレオチド配列を双子葉類または単子葉類の発現用にコドン最適化した。表４に、タンパク質に対応する配列番号及び形質転換ベクターにおける微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のヌクレオチド配列を示す。
表４．ＰＰＯ変異体に対応する配列番号
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【００８６】
ＨｅｍＧ  ＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現させるために、２つの異なるプロモーター＋リーダー＋イントロンの組み合わせ、２つの異なる標的ペプチド（ＴＰ）配列、及び２つの異なる３’ＵＴＲ配列を用いて４種の植物形質転換ベクターを作成した。植物形質転換コンストラクトは、注釈付きコンストラクト１、６、１１、及び１６であった。トウモロコシ植物体試験のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、未熟なトウモロコシ（ＬＨ２４４）胚を形質転換した。
【００８７】
ＨｅｍＧ  ＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）をコードする遺伝子を含有する植物形質転換コンストラクト６及び１６を用いて、トランスジェニックトウモロコシ植物を生成した。Ｒ０植物から葉のサンプルを収集し、ＰＣＲによりスクリーニングして当該植物ゲノムに挿入した導入遺伝子のコピー数を求めた。単一のコピーを含有する植物（シングルコピー）に同系交配及び異系交配を行って、今後の試験用にそれぞれＲ１及びＦ１種子を生じさせた。複数のコピーを含む植物（マルチコピー）に対し、以下のように噴霧を行った。（１）およそＶ５生長段階に５ｇ／ｈａのＳ−３１００、次におよそＶ７生長段階に１０ｇ／ｈａのＳ−３１００、施用合計として１５ｇ／ｈａのＳ−３１００、または（２）およそＶ５生長段階に１０ｇ／ｈａのＳ−３１００。損傷の平均パーセンテージを、０〜１００の尺度で０が損傷なし、１００が完全な作物の枯死として、各バッチにつき最終処理から７日後に評価した。噴霧を行った非トランスジェニックＬＨ２４４トウモロコシを対照として使用したが、これは合計１５ｇ／ｈａのＳ−３１００で処理した場合（処理１）に平均４３．３％の損傷を示し、合計１０ｇ／ｈａのＳ−３１００で処理した場合（処理２）に平均２６．７％の損傷を示した。ＨｅｍＧＨ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、当該対照植物よりも性能が優れており、合計１５ｇ／ｈａのＳ−３１００で処理した場合（処理１）に平均２８．９％の損傷、合計１０ｇ／ｈａのＳ−３１００で処理した場合（処理２）に平均２４．２％の損傷であった。データを表５に示す。
表５：トランスジェニックトウモロコシの除草剤耐容性Ｉ
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【００８８】
ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１）、Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）、Ｈ＿Ｎ６０（配列番号３）、Ｈ＿Ｎ１１０（配列番号１０）、及びＨ＿Ｎ４０（配列番号６）をコードする遺伝子を含有する、それぞれ植物形質転換コンストラクト６、２０、２１、２２、及び２３を用いて、トランスジェニックトウモロコシ植物を生成した。これら５種のコンストラクトは、同じプロモーター＋リーダー＋イントロンの組み合わせ、２種の異なる標的ペプチド（ＴＰ）配列、及び同じ３’ＵＴＲ配列を有した。葉のサンプルをＲ０植物から採取し、ＰＣＲにより分析して導入遺伝子のコピー数を求めた。コンストラクト当たり最大１２のユニークな事象のためのシングルコピー植物をポットに移植し、同系交配及び異系交配を行って、今後の試験用にそれぞれＲ１及びＦ１種子を生じさせた。マルチコピー植物及び余分なシングルコピー植物に対し、およそＶ５生長段階に４０グラム／ｈａのＳ−３１００を噴霧し、処理から７日後に損傷評定を行った。各ＰＰＯ酵素を発現する全植物の損傷平均パーセント（％）及び耐容性が高い（１０％損傷未満）とみなされた植物の数を記録した。各植物は、ユニークなシングルコピーまたはマルチコピーの形質転換体である。Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、全体の平均損傷が３９．５％であり、試験を行った１３９の植物から３１の耐容性が高い植物を生成した。Ｈ＿Ｎ６０（配列番号３）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、全体の平均損傷が５５．８％であり、試験を行った８６の植物から１９の耐容性が高い植物を生成した。Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、全体の平均損傷が３１．４％と最も低く、試験を行った９９の植物から４４の耐容性が高い植物を生成した。Ｈ＿Ｎ４０（配列番号６）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、全体の平均損傷が４７．０％であり、試験を行った９８の植物から５３の耐容性が高い植物を生成し、最も高い割合で耐容性が高い植物を生成した。Ｈ＿Ｎ１１０（配列番号１０）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、平均損傷は４３．０％であったが、いかなる耐容性が高い植物も生成しなかった。データを表６に示す。
表６：トランスジェニックトウモロコシの除草剤耐容性ＩＩ
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【００８９】
Ｒ０トランスジェニックトウモロコシのデータにより実証されたことは、５種の微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１）、Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）、Ｈ＿Ｎ６０（配列番号３）、Ｈ＿Ｎ４０（配列番号６）、及びＨ＿Ｎ１１０（配列番号１０）が、トランスジェニック植物において発現させた場合に損傷率の低減をもたらし、よって作物にＰＰＯ除草剤への耐容性を付与したことである。
【００９０】
２つのコンストラクト構成のうちの１つにおいて、Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するシングルコピーＲ０植物の異系交配から生成したトランスジェニックＦ１植物の除草剤耐容性を、温室で試験した。当該植物に対し、Ｖ３生長段階に４０グラム／ｈａのＳ−３１００で処理し、処理から７日後に損傷評定を行った。コンストラクト６構成においてＨ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物では、１８事象のうち１３事象で耐容性の高い植物（１０％以下の損傷）がもたらされたが、コンストラクト１６構成ではどの事象でも耐容性の高い植物がもたらされなかった。
【００９１】
２つのコンストラクト構成（コンストラクト６及び１６）のうちの１つにおいて、Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するシングルコピーＲ０植物の異系交配から生成したトランスジェニックＦ１植物の除草剤耐容性を、野外で試験した。このＦ１集団は分離集団（５０％ヘミ接合５０％欠損）であり、損傷評定の前にトランスジェニック植物の選択を行わなかった。トランスジェニック植物から非トランスジェニック植物を識別することは困難であるため、このような集団に対する全体の平均損傷評定は、均質なトランスジェニック集団よりも高くなることが予想される。トライアルは２箇所の場所で行い、コンストラクト当たり２回の反復試験及び３通りの処理を行った。非トランスジェニック植物を陰性対照として使用した。除草剤施用処理は、以下の通りである：処理１は、Ｖ２、次にＶ４、次にＶ８で０．０３６ｌｂ  ａｉ／エーカーのＳ−３１００を施用、処理２は、Ｖ２、次にＶ４、次にＶ８で０．０７２ｌｂ  ａｉ／エーカーのＳ−３１００を施用、処理３は、Ｖ２、次にＶ４、次にＶ８で０．１４４ｌｂ  ａｉ／エーカーのＳ−３１００を施用。作物損傷パーセント評定を、処理から５〜７日後のＶ２生長段階（ＣＩＰＶ２）及びＶ４生長段階（ＣＩＰＶ４）で評価した（エラーＶ２及びエラーＶ４は最小有意差（ＬＳＤ）の半分である）。両方の場所における作物損傷評定を合わせた。全ての非トランスジェニック植物及びコンストラクト１６を用いて事象を生じさせた植物は、３通りの処理のそれぞれについて、Ｖ２及びＶ４両方における除草剤施用後に９４．６から９９．５％の間の損傷を示した。コンストラクト６を用いて事象を生じさせた植物は、Ｖ２の除草剤施用後に３０％〜５０％の損傷を示すにとどまり、Ｖ４の除草剤施用後には損傷を示さなかった。データを表７に示す。
表７．Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を含有するＦ１トウモロコシの野外トライアルにおける有効性
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【００９２】
Ｆ１トランスジェニックトウモロコシの温室及び野外のデータにより実証されたことは、微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）が、トランスジェニック植物において発現させた場合に損傷率の低減をもたらし、よって作物にＰＰＯ除草剤への耐容性を付与したことである。
【００９３】
実施例６：ダイズ植物におけるＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の発現及び試験
微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をトランスジェニックダイズ植物において発現させ、このトランスジェニック植物のＰＰＯ除草剤耐容性を分析した。Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４及び配列番号１３）、Ｈ＿Ｎ２０（配列番号１２）、Ｈ＿Ｎ３０（配列番号１４）、Ｈ＿Ｎ４０（配列番号１５）、Ｈ＿Ｎ５０（配列番号１６）、Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１１、１８、１９）、及びＨ＿Ｎ１００（配列番号１７、２０）として示される微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素のうちの１つをコードする組み換えＤＮＡ分子を含む、植物形質転換ベクターを構築した。
【００９４】
ダイズにおいては、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、切除胚（Ａ３５５５）を形質転換コンストラクト１及び１１で形質転換した。形質転換コンストラクト１及び１１は、同じプロモーター＋リーダー＋イントロンの組み合わせ、同じ３’ＵＴＲ配列、同じ微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯのＨ＿Ｎ１０（配列番号４）を有したが、標的ペプチド（ＴＰ）配列は相違していた。再生したＲ０トランスジェニック苗を温室で生育した。コンストラクト１１から生成される２０のシングルコピーＲ０ダイズ事象を代表し、かつ微生物ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現する植物に、２１０ｇ／ｈａのフルミオキサジン（Ｖａｌｏｒ（登録商標）、Ｖａｌｅｎｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ  ＣＡ）を噴霧した。十分に発育した３枚の三出葉を有するＶ３発育段階に当該除草剤を噴霧し、損傷評定を処理から８日後に評価した。耐容性が高い（１５％以下の損傷）とみなされた植物のパーセンテージを記録した。２１０ｇ／ｈａのフルミオキサジン施用後、非トランスジェニックダイズ対照植物は平均損傷が３０％であり、耐容性の高い植物は存在しなかった。微生物ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するダイズ植物は、平均損傷評定が２２％であり、試験した植物の９％が当該除草剤への耐容性が高かった。
【００９５】
コンストラクト１１から生成される１０のマルチコピーＲ０ダイズ事象を代表し、微生物ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現する植物に、５ｇ／ｈａのＳ−３１００を噴霧した。十分に発育した３枚の三出葉を有するＶ３発育段階に当該除草剤を噴霧し、損傷評定を処理から８日後に行った。耐容性が高い（２５％以下の損傷）とみなされた植物のパーセンテージを記録した。Ｓ−３１００（５ｇ／ｈａ）の施用後、非トランスジェニックダイズ対照植物は平均損傷が６０％であり、耐容性の高い植物は存在しなかった。微生物ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するダイズ植物は、平均損傷評定が４７％であり、試験した植物の３０％が当該除草剤への耐容性が高かった。
【００９６】
温室のシングルコピートランスジェニックＲ１ダイズ植物に、以下の３通りの除草剤施用率のうちの１つにて噴霧した：処理１は、Ｖ４、次にＲ１で５グラム  ａｉ／ｈａのＳ−３１００を施用、処理２は、Ｖ４、次にＲ１で１０グラム  ａｉ／ｈａのＳ−３１００を施用、処理３は、Ｖ４、次にＲ１で３０グラム  ａｉ／ｈａのＳ−３１００を施用。Ｖ２における作物損傷パーセント（ＣＩＰＶ２）評定を処理から１０日後に評価した。非トランスジェニック植物は平均損傷評定が８９％〜１００％であり、Ｒ１生長段階における評定に使用することができなかった。コンストラクト１から生成し、かつ微生物ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現する植物は、損傷評定が３％〜１５．７％の範囲だった。データを表８に示す。
表８：温室におけるＲ１ダイズのＳ−３１００有効性スクリーニング
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【００９７】
高スループット植物形質転換及びスクリーニング方法を使用して、トランスジェニック植物における多数のコンストラクトの除草剤耐容性を、早期の形質転換苗の組織で評価した。これにより、コンストラクト構成及びＰＰＯ酵素をより速く大量にスクリーニングすることが可能になった。
【００９８】
７種の微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号１３）、Ｈ＿Ｎ２０（配列番号１２）、Ｈ＿Ｎ３０（配列番号１４）、Ｈ＿Ｎ４０（配列番号１５）、Ｈ＿Ｎ５０（配列番号１６）、Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１１、１８、１９）、及びＨ＿Ｎ１００（配列番号１７、２０）をコードする遺伝子を３７種の異なる標的ペプチドに作用可能に連結させ、ベース植物形質転換ベクターにクローニングした。これにより、遺伝子発現に同じプロモーター及び３’ＵＴＲエレメントを用いて７種の異なるＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素と３７種の異なる標的ペプチドとの並列比較が可能になった。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、これらの植物形質転換コンストラクトをダイズの切除胚（生殖質Ａ３５５５）の形質転換に使用した。４００個の外植片を各コンストラクトに接種し、その結果コンストラクト当たり１２個の容器になった。無菌のＰＰＯ除草剤溶液を除草剤耐容性試験に使用した。除草剤溶液は、クロップオイル濃縮液（５．０ｍＬ）及び４９５ｍＬの脱イオン水中０．３ｇのＳ−３１００からなった。これを０．４５ミクロンのＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ（商標）組織培養フィルターユニット及び無界面活性剤セルロースアセテートメンブレンフィルターユニット（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）で濾過した。得られた無菌溶液を適用前に振とうした。
【００９９】
形質転換後５週間時に、コンストラクト当たり１２個の植物容器のうち４個の容器に、無菌のＰＰＯ除草剤溶液を２回噴霧した。次に、処理した苗を容器に密閉し、各日噴霧後に少なくとも１５時間の光曝露を４日間受けさせた。Ｓ−３１００施用後の４日目の終わりに、処理した苗を撮影し、緑色呈色（緑色呈色は、光退色した組織との比較で健康な光合成植物組織を表す）対ダメージの視覚的尺度によりスコア化した。スコア値は、０が低い耐容性、高ダメージ、低い緑色呈色、１がいくらかの耐容性、平均的ダメージ、中程度の緑色呈色、２が良好な耐容性、低ダメージ、高い緑色呈色であった。各コンストラクトのスコアを表９に提示する。ｎ．ｄ．は、分析が行われなかったことを示す。当該結果は、この高スループットスクリーニングにおいて、複数のコンストラクトがＰＰＯ除草剤への耐容性をもたらしたことを示す。
表９．除草剤耐容性についての高スループットダイズスクリーニング：呈色スコア
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【０１００】
当技術分野で公知の標準的方法を用いて、スコアが２のコンストラクトに対応する、噴霧を行っていない容器の苗を、形質転換後およそ７週間時に移植し、Ｒ０植物として生育した。０及び１の耐容性がないスコアに対応する苗も生育し、陰性対照にした。Ｒ０植物を長日苗条件下（８０°Ｆで１８時間明期、次に７４°Ｆで６時間暗期）でおよそ４週間、温室で生育した。１１週時に、上述のものと同じ除草剤溶液（０．３ｇのＳ−３１００）を２回、Ｒ０植物に噴霧した。処理から７日後に除草剤損傷評定を収集した。
【０１０１】
１１週時におけるＲ０植物への除草剤耐容性施用の結果は、５週間時における高スループットスクリーニングで観察された低いパーセントの損傷評定スコアを裏付けるものだった。３０％以上の損傷評定は、非トランスジェニックダイズの損傷評定に相当する。いくつかのコンストラクトは、除草剤施用に対する非常に良好な耐容性を示した点で際立っていた。例えば、ＴＰ１においてＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１１）を用いた場合はわずか３％の損傷、ＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ３０（配列番号１４）またはＨ＿Ｎ４０（配列番号１５）を用いた場合はわずか５％の損傷、ＴＰ２０においてＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１１）を用いた場合はわずか５％の損傷だった。これに対し、ＴＰ３２においてＰＰＯ  Ｈ＿Ｎ９０（配列番号１１）を用いた場合は５０％の損傷スコアだった。データを表１０に示す。ｎ．ｄ．は、分析が行われなかったことを示す。
表１０．Ｒ０トランスジェニックダイズの除草剤耐容性：パーセント損傷スコア
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【０１０２】
ダイズにおける植物形質転換コンストラクトをさらに評価するため、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる植物形質転換ベクター及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、切除胚（Ａ３５５５）を形質転換する。再生したＲ０トランスジェニック苗を温室で生育し、複数の群に分割する。これらの群に対し、群ごとに１種以上のＰＰＯ除草剤を噴霧して除草剤耐容性を評価する。例えば、およそＶ２〜Ｖ４生長段階のＲ０トランスジェニック植物に対し、ラクトフェンを１１０ｇ  ａｉ／ｈａ（０．０９ｌｂ  ａｉ／エーカー）または２２０ｇ  ａｉ／ｈａ（０．１９ｌｂ  ａｉ／エーカー）の比率で噴霧する。処理から１〜１４日後に植物の損傷を評価し、損傷スコアを記録する。トランスジェニックＤＮＡ挿入のシングルコピーを有するトランスジェニック植物を同定するために葉のサンプルを使用し、シングルコピーのみを含有し、かつ除草剤噴霧試験にパスするＲ０植物を同系交配してＲ１種子を生成する。
【０１０３】
Ｒ１植物を温室で生育し、複数の群に分割する。これらの群に対し、群ごとに１種以上のＰＰＯ除草剤を噴霧して除草剤耐容性を評価する。例えば、ＰＰＯ除草剤のラクトフェンを、発芽前に、及び／またはＶ２〜Ｖ６生長段階に、２００ｇ  ａｉ／ｈａ（０．１９ｌｂ  ａｉ／エーカー）の比率で施用する。処理から１〜１４日後に植物の損傷を評価し、損傷スコアを記録する。噴霧を行わないトランスジェニック植物を、噴霧を行わない野生型植物との表現型比較のために使用する。
【０１０４】
ホモ接合型トランスジェニックＲ１植物を同系交配し種子を収集することにより、Ｒ２植物を生じさせる。１箇所以上の野外の場所または温室アッセイでＲ２植物を評価する。除草剤処理を施用し、除草剤施用から１〜１４日後にプロットまたは植物の作物損傷を０〜１００の尺度（０が損傷なし、１００が完全な作物の枯死）で評定する。
【０１０５】
実施例７：リーフディスクアッセイ
組み換えＰＰＯ酵素を発現するトランスジェニック植物における除草剤耐容性を迅速にかつ最小限のダメージで評価するために、リーフディスクアッセイを使用した。コーン及びダイズ植物から、幼若な完全に緑色の葉の組織をサンプル採取した。使い捨てのプランジャー付き生検パンチ（Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）Ｍｉｌｔｅｘ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ｙｏｒｋ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて、葉のサンプルから直径４ｍｍのリーフディスクを５枚切り取り、これらのリーフディスクを蓋付き２４ウェルポリスチレンプレート中の１ｍｌのインキュベート溶液（１ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５、１％  ｗ／ｖショ糖、１％（ｖ／ｖ）アセトン）に入れた。除草剤耐容性分析のため、このインキュベート溶液にＳ−３１００を添加し、最終濃度を１マイクロモルにした。真空濾過を適用し、リーフディスクのプレートを室温（２３〜２４℃）、１日の連続暗期でインキュベートし、次に天井の蛍光及び白熱電球（５２０ｕＥ）の下で２６〜２７℃で、１日（ダイズ）または２日（コーン）の連続明期でインキュベートした。次に、リーフディスクの損傷を、０（最も低い損傷）〜４（最も高い損傷）の尺度で視覚的にスコア化した。スコアが低いほどＰＰＯ除草剤への耐容性が良好であることを示す。
【０１０６】
コンストラクト６を用いた、かつＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物からのリーフディスクは、平均リーフディスクスコア０．４に基づく顕著な除草剤耐容性を示した。この結果は、コンストラクト６で形質転換し、かつＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現する完全植物において観察されたＰＰＯ除草剤耐容性と一致するものであった。コンストラクト１及びコンストラクト１１を用いた、かつＰＰＯ酵素Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４）を発現するトランスジェニックダイズ植物からのリーフディスクにより、コンストラクト１による植物が損傷評定ゼロで顕著な除草剤耐容性であるのに対し、コンストラクト１１による植物は損傷評定１．６、非トランスジェニック植物は損傷評定２．６であることが示された。
【０１０７】
実施例８：ワタにおけるＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素の発現及び試験
微生物ＨｅｍＧ  ＰＰＯ酵素をトランスジェニックワタ植物において発現させ、このトランスジェニック植物のＰＰＯ除草剤耐容性を分析する。ワタにおいては、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、これらのベクターで切除胚（Ｃｏｋｅｒ１３０）を形質転換した。再生したＲ０トランスジェニック苗を温室で生育し、複数の群に分割する。これらの群は、ＰＰＯ除草剤（群当たり１種のＰＰＯ除草剤）を噴霧して耐容性を評価するために使用する。例えば、およそ本葉２〜４枚の生長段階のＲ０トランスジェニック苗に対し、ラクトフェンを１１０ｇ  ａｉ／ｈａ（０．０９ｌｂ  ａｉ／エーカー）または２２０ｇ  ａｉ／ｈａ（０．１９ｌｂ  ａｉ／エーカー）の比率で噴霧する。処理から１〜１４日後に植物の損傷を評価し、損傷スコアを記録する。葉のサンプルを使用して、トランスジェニック挿入のシングルコピーを有するトランスジェニック植物を同定する。シングルコピーのみを含有し、かつ除草剤噴霧試験にパスするＲ０植物を同系交配してＲ１種子を生成する。
【０１０８】
Ｒ１植物を温室で生育し、複数の群に分割する。これらの群に対し、群ごとに１種以上のＰＰＯ除草剤を噴霧して除草剤耐容性を評価する。例えば、ＰＰＯ除草剤のラクトフェンを、発芽前に、及び／または本葉２枚から初花の段階に、２００ｇ  ａｉ／ｈａ（０．１９ｌｂ  ａｉ／エーカー）（１Ｘ）の比率で施用する。処理から１〜１４日後に植物の損傷を評価し、損傷スコアを記録する。噴霧を行わないトランスジェニック植物を、噴霧を行わない野生型植物との表現型比較のために使用する。
【０１０９】
ホモ接合型トランスジェニックＲ１植物を同系交配し種子を収集することにより、Ｒ２植物を生じさせる。１箇所以上の野外の場所または温室アッセイでＲ２植物を評価する。除草剤処理を施用し、除草剤施用から１〜１４日後にプロットまたは植物の作物損傷を０〜１００の尺度（０が損傷なし、１００が完全な作物の枯死）で評定する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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