(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ切断治療に対する腫瘍の反応を、当該腫瘍からのサンプルを使用して評価するための方法に関する。当該方法においては、（ａ）腫瘍から採取された細胞から、細胞サンプルを準備し、（ｂ）細胞サンプルを、線量Ｄで特徴付けられるＤＮＡ切断治療に供し、（ｃ）細胞サンプルについて、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して観察時間ｔにおいて得られる核病巣の平均数（これらの平均数をそれぞれＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）と呼ぶ）を求め、ここで観察時間ｔは、ｔ＝０分（線量Ｄの照射前の状態であるｔ０）、および、吸収線量Ｄの照射後のｔ＝ｔ１，ｔ２，ｔ３およびｔ４から選択される少なくとも１つであり、（ｄ）ＤＮＡ切断治療に対するサンプルの反応を特徴付けることを可能とする少なくとも１つのパラメータまたはスコアを、少なくとも平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を使用して求める。ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達するまでの時間を表す固定値であり、ｔ３は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞の二本鎖切断（ＤＳＢ）の約２５％が修復される時間を表す固定値であり、ｔ２は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞の二本鎖切断（ＤＳＢ）の約５０％が修復される時間を表す固定値であり、ｔ１は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞内で、認識されたＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ切断治療に対する腫瘍の反応を、当該腫瘍からのサンプルを使用して（好ましくは生検材料により）評価するための方法であって、
（ａ）前記腫瘍から採取された細胞から、細胞サンプルを準備し、
（ｂ）前記細胞サンプルを、線量Ｄで特徴付けられるＤＮＡ切断治療に供し、
（ｃ）前記細胞サンプルについて、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して観察時間ｔにおいて得られる核病巣数の平均（これらの平均数をそれぞれＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）と呼ぶ）を求め、前記観察時間ｔは、ｔ＝０分（前記線量Ｄの照射前の状態であるｔ０）、および、前記吸収線量Ｄの照射後のｔ＝ｔ１，ｔ２，ｔ３，およびｔ４から選択される少なくとも１つであり、
（ｄ）前記ＤＮＡ切断治療に対する前記サンプルの反応を特徴付けることを可能とする少なくとも１つのパラメータまたはスコアを、少なくとも前記平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を使用して求める方法であって、
ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達するまでの時間を表す固定値であり、好適にはｔ３の６倍〜８倍の間で選択されるが、ただしこの場合は１２時間以上でなくてはならず、好ましくは１２時間〜４８時間であり、より優先的には約２４時間であり、
ｔ３は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞の二本鎖切断（ＤＳＢ）の約２５％が修復される時間を表す固定値であり、好適にはｔ２の３倍〜５倍の間から選択されるが、ただしこの場合は２．５時間以上６時間以下でなくてはならず、好ましくは３時間〜５時間であり、より優先的には約４時間であり、
ｔ２は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞のＤＳＢの約５０％が修復される時間を表す固定値であり、好適にはｔ１の５倍〜７倍の間から選択されるが、ただしこの場合は３５分以上９０分以下でなくてはならず、好ましくは４５分〜７５分であり、より優先的にほぼ約６０分であり、
ｔ１は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞内で認識されるＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値であり、好適には照射の中断から５分〜１５分の間から選択され、好ましくは７．５分〜１２．５分であり、より優先的には約１０分である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記ＤＮＡ切断治療が、電離放射線の照射であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、
前記腫瘍が、固形腫瘍または液性腫瘍であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１つに記載の方法において、
前記平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を、ｔ＝ｔ０，ｔ１，ｔ２，ｔ３およびｔ４において求めることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１つに記載の方法において、
ｎ回分の線量ｄに分割される線量Ｄの照射後の細胞生存率（ＳＦ（ｄ，Ｄ））と、パラメータＴＣＤ５０と、パラメータＴＣＤ９５と、パラメータＴＣＰと、腫瘍体積とからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを、前記ＤＮＡ切断治療に対する前記サンプルの反応のパラメータまたはスコアとして求めることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１つに記載の方法において、
前記パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数１】
2018523830.tif 000033
（式中、
Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
Ｎ（２Ｇｙ）は、線量２Ｇｙでの電離放射線照射によるＤＮＡ切断治療照射後のｔ４における生存細胞の数を表わし、前記線量が、好ましくは０.５Ｇｙ〜５Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、さらに優先的には２Ｇｙの電離放射線線量であり、
Ａは、１３０Ｇｙ〜１６０Ｇｙの整数定数または小数定数であり、
Ｂは、５Ｇｙ〜１５Ｇｙの整数定数または小数定数である。）
【請求項７】
請求項５または６に記載の方法において、
前記パラメータＴＣＤ９５が、線量Ｄでの前記ＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数２】
2018523830.tif 000034
（式中、Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、Ｎ（２Ｇｙ）は、線量２Ｇｙでの電離放射線照射によるＤＮＡ切断治療照射後のｔ４における生存細胞の数を表わし、前記線量が、好ましくは０.５Ｇｙ〜５Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、さらに優先的には２Ｇｙの電離放射線線量である。）
【請求項８】
請求項５または６に記載の方法において、
前記パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数３】
2018523830.tif 000035
（式中、ＮＨ２ＡＸ（２Ｇｙ，２４ｈ）は、ＤＮＡ切断治療の線量Ｄの後のｔ４におけるｐＨ２ＡＸ病巣の数を表わし、前記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙであり、θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、Ａは、１３０Ｇｙ〜１６０Ｇｙの整数定数（Ｇｙ）または小数定数（Ｇｙ）であり、Ｂは、５Ｇｙ〜１５Ｇｙの整数定数（Ｇｙ）または小数定数（Ｇｙ）である。）
【請求項９】
請求項５または８に記載の方法において、
前記パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数４】
2018523830.tif 000036
（式中、ＮＨ２ＡＸ（２Ｇｙ，２４ｈ）は、ＤＮＡ切断治療の線量Ｄの後のｔ４におけるｐＨ２ＡＸ病巣の数を表わし、上記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙであり、θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、βは、腫瘍組織タイプについての線形二次モデルのパラメータ（単位：Ｇｙ−２）を表わす。）
【請求項１０】
請求項５から９のいずれか１つに記載の方法において、
前記パラメータＴＣＰが、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
ＴＣＰ（Ｄ）＝ｅ−Ｎ（Ｄ）
（式中、Ｎは、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数であり、前記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙである。）
【請求項１１】
請求項５から１０のいずれか１つに記載の方法において、
前記パラメータＴＣＰが、ＤＮＡ切断治療線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数５】
2018523830.tif 000037
（式中、ＮＨ２ＡＸ（ｄ，２４ｈ）は、ＤＮＡ切断治療の線量ｄの後の時間ｔ４において生存する細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣を表わし、前記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙである。）
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法において、
ｎ回の線量ｄに分割される線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍細胞の生存が、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数６】
2018523830.tif 000038
（式中、ＮＨ２ＡＸは、照射後２４時間における、生存する腫瘍細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄは、線量（Ｄｙ）であり、
ｄは分割照射１回あたりの線量（Ｇｙ）であり、
ｎは分割の回数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）である。）
【請求項１３】
請求項５から１２のいずれか１つに記載の方法において、
ｎ回の分割線量ｄに分割される線量Ｄ照射後における前記生存率の比例関係が、放射線治療の前後での撮像により収集される信号の強度比を使用して定義され、好ましくは次式に従い定義される方法。
【数７】
2018523830.tif 000039
（式中、
Ｉｆは、治療の終了時の治療対象体積における信号強度であり、
Ｉｉは、治療前の治療対象体積における信号強度であり、
Ｃは、比例定数である。）
【請求項１４】
請求項５から１３のいずれか１つに記載の方法において、
線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍体積（当該体積はパラメータＶ（Ｄ）により表わされる）は、腫瘍細胞の生存により定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数８】
2018523830.tif 000040
（式中、
Ｎは、線量Ｄでの照射後の生存細胞の数であり、
Ｖ０は、初期腫瘍体積であり、
ＳＦ（Ｄ）は、線量Ｄにおける細胞生存率であり、
ａは、ＤＮＡ切断数あたりの体積変動定数であり、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量（Ｇｙ）である。）
【請求項１５】
請求項５から１４のいずれか１つに記載の方法において、
線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍体積（当該体積はパラメータＶ（Ｄ）により表わされる）は、腫瘍細胞の生存により定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数９】
2018523830.tif 000041
（式中、
Ｎは、線量Ｄでの照射後の生存細胞の数であり、
Ｖ０は、初期腫瘍体積であり、
Ｎ（Ｄ）は、線量Ｄにおける生存細胞の数であり、
ａは、ＤＮＡ切断数あたりの体積変動定数であり、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量（Ｇｙ）である。）
【請求項１６】
請求項５から１５のいずれか１つに記載の方法において、
ｎ回の線量ｄに分割される線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍体積が、前記ＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される方法。
【数１０】
2018523830.tif 000042
（式中、
Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
ｎ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される分割照射の回数であり、
ａは、切断数あたりの体積変動定数であり、
βは、腫瘍組織タイプについての線形二次モデルのパラメータ（単位はＧｙ−２）を表わす。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用放射線治療の分野に関し、より具体的には放射線治療検査方法の分野に関する。本発明は、細胞的、組織的および臨床的な放射線感受性予測方法に関する。この予測方法は、複数の細胞パラメータと酵素パラメータとを決定および相互検証すること、ならびに、腫瘍の反応に適用される基準に基づく方法である。より具体的には、本発明は、ＤＮＡ切断放射線治療に対する腫瘍の感受性を特性付けするための予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非外科的抗癌治療は、概して、癌細胞の細胞死を誘発することを目的としている。これらの治療のほとんどは、ＤＮＡ切断を誘発し、その後、癌細胞のアポトーシスを誘発する。このことは、特に、電離放射線を使用した腫瘍治療（放射線治療）にあてはまる。しかし、そのような抗腫瘍治療に対する腫瘍の反応を予測する方法はほとんど存在せず、また、その信頼性は、臨床現場において抗腫瘍治療の戦略を方向付けるのに十分なものではない。（放射線治療については“Radiation Biology, A Handbook for Teachers and Students”, IAEA, 2010年, p. 107/108を参照。）
電離放射線に対する組織の感受性の問題は、ＤＮＡ損傷修復メカニズムの問題から切り離すことができないことが知られている。実際、細胞レベルでは、電離放射線はある種の化学結合を切断して、（特に過酸化によって）遊離基や、ＤＮＡ損傷の原因となるその他の反応種を発生させる。内因性攻撃または外因性攻撃（例えば、電離放射線および遊離基）によってＤＮＡが傷つけられると、受けたエネルギーに応じて各種のＤＮＡ損傷（具体的には、塩基損傷、一本鎖切断、および二本鎖切断（ＤＳＢ））が引き起こされ得る。非修復ＤＳＢは、細胞死および毒性に関連し、より具体的には、放射線感受性に関連する。修復が不十分なＤＳＢは、ゲノムの不安定さ、突然変異を促進する現象、および癌の素因に関連する。身体は、それぞれの種類のＤＮＡ損傷について、特定の修復システムを備えている。ＤＳＢに関しては、哺乳類は２つの主要な修復方法を備えている。すなわち、縫合修復（鎖の連結）および組換修復（相同鎖または非相同鎖の挿入）である。このことは、正常組織か腫瘍組織かという組織の種類には関係なくあてはまる。
【０００３】
電離放射線に対する組織の感受性は、各臓器または個々人によって大きく変動することも知られている。FertilおよびMalaiseにより、「内在性放射線感受性」が概念化された（“Inherent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy”, Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621-629 (1981年); "Intrinsic radiosensitivity of human cell lines is correlated with radioresponsiveness of human tumors: Analysis of 101 published survival curves", Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11, p. 1699-1707 (1985年))。したがって、放射線治療の作用と副作用とについてのさまざまな研究により、特に高い放射線抵抗性を示す人が存在する一方で、放射線感受性を示す人も存在し、また、その放射線感受性は、臨床的に認識されるが重視するほどではない副作用のレベルから、致命的作用までの範囲にわたり得ることがわかっている。放射線感受性が極端に高い稀なケースは、遺伝的起源であることが実証されたようであるが、そのようなケースを別にしても、放射線感受性は、概して、遺伝的素因に端を発するものであると考えられている。つまり、放射線感受性は、個人に特有のものである。
【０００４】
同様に、腫瘍は、広い放射線感受性のスペクトルを示し、このスペクトルは個人と組織の種類との両方に依存する。例えば、リンパ腫は、概して、肉腫よりも放射性感受性が高く、このことは原則としては個人の遺伝的状況には無関係である。よって、腫瘍については、「個人的因子」が「組織の」因子により打ち消されることがある。抗癌治療のメリットとリスクとの割合を評価するためには、腫瘍の増殖を抑止するために必要な最小限の累積線量を判定可能な予測試験方法を利用できることが望ましいと言える。この問題は、第一に、高電離線量を背景とした放射線治療において生じる。しかし、この問題は、この他にも、放射線治療に使用される線量と同等の高電離線量への暴露についても生じる傾向にある。
【０００５】
医師は、多くの臨床的基準を使用して、抗癌治療後の腫瘍の反応を定量化している。これらの基準のほとんどは、治療後の腫瘍体積の減少（または局所制御）、またはこの体積を減少させる放射線量に関係している。しかし、これらの基準のなかに共感性のものはない。
【０００６】
ＴＣＤ５０基準およびＴＣＤ９５基準（腫瘍制御線量基準）は、それぞれ、腫瘍の５０％制御および９５％制御を達成するための線量を表す。これらの基準は、標準的治療により所定の腫瘍についての標準化が可能であった１９８０年代に頻繁に使用されたが、医療機関等ごとに広範囲にわたる多様な線量を使用して各種方法で治療される癌疾病についてはもはや有効ではない。
【０００７】
腫瘍制御確率（ＴＣＰ基準）によって、腫瘍制御の確率を理論的に予測できる。この基準は、インビトロで照射を受けた腫瘍細胞のクローン原生生存を考慮した放射線生物学的研究に基づく。数学的には、ＴＣＰは線形二次モデルに基づく。
【０００８】
【数１】
2018523830.tif 000002
【０００９】
（式中、αおよびβは線形二次モデルパラメータであり、γは細胞増殖定数であり、Ｔは日々の治療時間である。）
固形腫瘍における反応評価基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、放射線治療後の固形腫瘍の進行を説明するために現在最も広く利用されている基準の１つである。この基準は、国際協力プロジェクトにより２０００年２月に発行され、２００９年に改訂された（Eisenhauer、外、“New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1)”, European J Cancer 45 (1009), p.228-247）。この基準は、以下のように、腫瘍の最大径の合計の減少に基づいている。
・完全反応（Complete Response；CR）：腫瘍の完全消滅
・部分的反応（Partial Response；PR）：腫瘍の最大径の合計の少なくとも３０％の減少
・安定的疾患（Stable Disease；SD）：注目すべき変化は無し
・進行的疾患（Progressive Disease；PD）：腫瘍の最大径の合計の少なくとも２０％の増加
さらに、臨床医は、２つの撮像基準、具体的には、放射線治療後の信号強度の変化に関係する基準を使用している。この信号強度は、一般には、ペットスキャン（PetScan）または造影剤注入ＭＲＩにより測定される。腫瘍中の生存細胞を含む部分ではまだ血管新生が起こるので、この部分のみが信号を発信する。このため、信号強度と生存細胞の数とを相関させることができる。さらに、チョイ基準（Choi、外、2007年、“Correlation of Computed Tomography and Positron Emission Tomography in Patients With Metastatic Gastrointestinal Stromal Tumor Treated at a Single Institution With Imatinib Mesylate: Proposal of New Computed Tomography Response Criteria”J Clin Oncol 25.1753-1759）によれば、腫瘍体積と信号強度とを相関させることができる。
【００１０】
また、当業者には、腫瘍を説明するための細胞パラメータが知られている。
【００１１】
細胞パラメータの１つとして、細胞の生存がある。１９５６年、PuckおよびMarcusにより、インビトロのコロニー試験を利用して放射線感受性を定量化することが提案された。具体的には、既知の数の照射済み細胞の接種後に、放射線照射では増殖が抑止されなかった細胞が形成するコロニー（５〜６世代後の増殖性生存細胞の巨視的クラスター）の数の測定値が、インビトロで照射された細胞の生存率を評価するための基準番号となる。生存曲線は、線量（Ｘ軸）−生存（対数Ｙ軸）関係をさまざまな線量（各線量は概ね一回照射による）での一連の試験によって片対数グラフに表わすことにより規定される。これらの曲線は、次の線形二次モデルを利用して説明される。
【００１２】
ＳＦ（Ｄ）＝ｅｘｐ（−αＤ−βＤ２）
（式中、αおよびβは、調整パラメータである。）
この式は、単回照射に有効である。しかし、分割照射、すなわち、合計線量Ｄがｎ回分の分割線量ｄに分割されることを考慮すると、上記式から次式が得られる。
【００１３】
Ｄ＝ｎ×ｄ
Ｓｄ（ｄ）＝ｅｘｐ（−αｄ−βｄ２）
この線量での照射がｎ回繰り返されて、合計線量Ｄに到達する。
【００１４】
ＳＦ（Ｄ，ｄ）＝ＳＦ（ｄ）ｎ＝ｅｘｐ（−αｄ−βｄ２）ｎ
＝ｅｘｐ（−ｎαｄ−ｎβｄ２）
＝ｅｘｐ（−αＤ−βｄＤ）
分割線量の場合、生存は次式を用いて説明される。
【００１５】
ＳＦ（ｄ，Ｄ）＝ｅｘｐ（−αＤ−βｄＤ）
（式中、ｄは分割照射１回あたりの線量（Ｇｙ）である。）
単回照射の生存曲線、および合計線量Ｄをｎ回分の分割線量ｄに分割した照射の生存曲線を、図１にＡおよびＢとしてそれぞれ示す。
【００１６】
図１からわかるように、合計治療線量が同じ場合、単回照射は、分割照射よりも大きな細胞損傷を誘発する。この種の分割は、腫瘍に対する治療の有効性を低下させはするが、放射線治療の副作用を低減することができる。
【００１７】
サイバーナイフやトモセラピーといったより高度な治療技術は、健康な組織を傷つけることなく、１分割回あたりにより大きい線量を腫瘍に送達することができるので、治療をより効果的なものにする。
【００１８】
２Ｇｙでの生存率（ＳＦ２）は、腫瘍の放射線感受性の予測のためによく利用される。１９８１年、FertilおよびMalaiseによって、ＴＣＤ９５とＳＦ２との間に次式のような線形関係があることが発見された（上記に引用の文献を参照）。
【００１９】
ＴＣＤ９５＝１４２.８×ＳＦ２＋８.５７
複数の研究チームが、ＳＦ２を上記のさまざまな臨床的腫瘍反応基準に相関させようと試みている。しかし、これらの試みは、予測試験の開発のための概括的で比較的簡便なモデルの作成には至っていない。
【００２０】
別のパラメータとして、生存細胞の数がある。放射線照射後の生存細胞の数は、腫瘍制御と体積減少とを定義するために使用される定量化可能パラメータである。生存細胞の数は、細胞の生存と腫瘍内の初期細胞の数Ｎ０とに直接的に相関される。
【００２１】
Ｎ＝Ｎ０ＳＦ（ｄ，Ｄ）
分子レベルについては、従来技術では、放射線治療の有効性の予測を目的とした、Ｈ２ＡＸまたはｐＨ２ＡＸマーカーを使用した分析が報告されている。例えば、Mahrhofer、外、（“Radiation induced DNA damage and damage repair in human tumour and fibroblast cell lines assessed by histone HAX phosphorylation”, Int J Oncol Biol Phys, 2006年，64(2): p. 573-80）により、５つの癌株について、ｐＨ２ＡＸマーカーと、２Ｇｙにおけるクローン原生生存（ＳＦ２）により定義される腫瘍放射線感受性との間には、相関がないことが示された。しかし、この研究は、実際のｐＨ２ＡＸ病巣の数（結果の標準化）を考慮しておらず、ＳＦ２のみに基づいている。同様に、Kock、外、（“Residual yH2AX foci predict local tumour control after radiotherapy”, Radiotherapy and Oncology, 2013年, 108. p. 434-9）は、標準化されたｐＨ２ＡＸ病巣の数とＴＣＤ５０との間の相関に基づいたモデルを提案している。しかし、この研究は異種移植片について行われたものであり、腫瘍の生理学的現実を反映するものではない。
【００２２】
欧州特許出願公開第２４４６３１０号明細書（Helmholtz Zentrum Muenchen）には、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化型（ガンマ−Ｈ２ＡＸまたはｇ−Ｈ２ＡＸとして知られる）の存在下でのＤＮＡ二本鎖切断の修復が記載されている。
【００２３】
米国特許出願公開第２００８／２３４９４６号明細書および第２０１２／０４１９０８号明細書（University of South Florida、外）には、健康な細胞ではなく、癌細胞の放射線感受性を予測する方法が記載されており、さらには、この方法が、機能試験ではなく、ゲノムデータに基づくことが記載されている。
【００２４】
国際公開第２０１４／１５４８５４号（Montpellier University Hospital Center）には、少なくとも１つの放射線感受性バイオマーカーを使用して、対象の放射線感受性を予測する方法が記載されている。この方法は、ＤＮＡ損傷と修復とに直接的に関連するマーカーを検出するものではない。さらに、この方法は、プロテオミクスデータに基づくものである。さらに、この特許出願には、放射線生物学的データと組織反応の重症度との定量的関係については記載されていない。
【００２５】
国際公開第２０１３／１８７９７３（University of California）には、対照群との関係で、細胞および／または対象の放射線感受性を判定するためのシステムおよび方法が記載されている。より具体的には、この方法は、生物学的試料に照射を行うことと、抗ｐＨ２ＡＸ、抗ＭＲＥ１１および抗ＡＴＭを含む一群のマーカーから選択した１つまたは複数の検出マーカーを使用して、血液サンプルから、赤血球細胞、リンパ球または一次細胞内に放射線照射により誘発された病巣を検出および定量化すること、とを備える。２時間よりも短い時間内での各照射後観察時点において、照射により誘発された病巣を定量化することにより、その修復動態を判定でき、この修復動態が対象の放射線感受性と実験的に相関される。しかし、リンパ球種細胞の核は小さいので、リンパ球種細胞の病巣の分析は非常に困難である。さらに、この方法では、医師が、患者の治療について決定を行うことはできない。
【００２６】
国際公開第２０１０／８８６５０号（University of Texas）には、特定の放射線治療に感受性または耐性がある癌細胞を識別するための方法および組成物が記載されている。よって、この方法と組成物は、あらゆる放射線治療に適用できるわけではない。
【００２７】
国際公開第２０１０／１０９３５７号には、患者ごとの特定のマーカーによる、正常組織の合併症の確率および腫瘍制御の確率の最適化に基づいた、適用可能放射線治療プロトコルを立案するための方法と装置が記載されている。正常組織に関連するマーカーの値には、インビトロ試験結果、タンパク質質量分析徴候、患者のこれまでの医療履歴および記録データが含まれる。インビトロ試験値は、細胞起源、プロテオミクス起源、および遺伝的起源であってよく、例としては、細胞の各種計数、ＨＢ、ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＴＮＦアルファ、フェリチン、トランスフェリン、ＬＤＨ、ＩＬ−６、ヘプシジン、クレアチニン、グルコース、ＨｂＡ１ｃ、およびテロマー長さがあるが、これらに限定されない。患者のこれまでの医療履歴および記録からの標識には、これまでの腹部外科手術、ホルモン薬剤または抗凝固剤、糖尿病、年齢、および各種切除に関連するバイオマーカーのような腫瘍成長関連測定値が含まれる。しかし、個人の放射線感受性は考慮されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本願出願人は、従来技術が上記のように広範囲に及ぶのにもかかわらず、上記特許文献には、抗癌治療の有効性を定量的に評価するのに適した、ＤＮＡ切断治療に対する腫瘍の感受性を定量化する方法であって、いかなる患者にも使用可能で、ＤＳＢを誘発し易いあらゆる治療、特にあらゆる種類の電離放射線にも使用可能な方法は記載されていないことに注目した。腫瘍感受性の予測方法の提供、および、使用される臨床的パラメータに関わらない腫瘍制御の予測という問題には、実効的な解決手段がいまだ無い。本発明は、ＤＮＡ切断治療に対する腫瘍の感受性を予測する新規な方法を提案することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
発明の主題
本発明者らは、線量Ｄおよび分割線量ｄにおける細胞の生存と、ｐＨ２ＡＸ病巣の数との間に以下のような相関関係を見出した。
【００３０】
【数２】
2018523830.tif 000003
【００３１】
（式中、
ＮＨ２ＡＸは、照射後２４時間における、生存する腫瘍細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄは線量（Ｇｙ）であり、ｄは分割照射１回あたりの線量（Ｇｙ）であり、ｎは分割の回数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）であり、
ここで、θおよびβは小数または整数の調整パラメータであり、計算値の端数を、小数点以下有効２桁に、より好ましくは小数点以下有効３桁に、さらに好ましくは小数点以下有効４桁に算術的に丸めることに対応する小数の調整パラメータであることが好ましい。
【００３２】
これに基づき、発明者らは、臨床的パラメータと、ある種の分子パラメータおよび／または細胞パラメータとの間の相関関係を見出した。
パラメータＴＣＤ９５について
１）生存細胞の数によれば、次式が成り立つ。
【００３３】
【数３】
2018523830.tif 000004
【００３４】
（式中、
Ａは、１３０Ｇｙ〜１６０Ｇｙの整数定数または小数定数であり、
Ｂは、５Ｇｙ〜１５Ｇｙの整数定数または小数定数である。）
好ましくは、パラメータＴＣＤ９５は、次式により求められる。
【００３５】
【数４】
2018523830.tif 000005
【００３６】
２）ｐＨ２ＡＸ病巣の数（この数をＮＨ２ＡＸとする）によれば、次式が成り立つ。
【００３７】
【数５】
2018523830.tif 000006
【００３８】
（式中、
Ａは、１３０Ｇｙ〜１６０Ｇｙの整数定数または小数定数であり、
Ｂは、５Ｇｙ〜１５Ｇｙの整数定数または小数定数である。）
好ましくは、パラメータＴＣＤ９５は、次式により求められる。
【００３９】
【数６】
2018523830.tif 000007
【００４０】
（ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
パラメータＴＣＰについて
１）線量Ｄでの治療後の生存細胞の数によれば、次式が成り立つ。
【００４１】
ＴＣＰ（Ｄ）＝ｅ−Ｎ（Ｄ）
（ここで、この相関関係は、以下の既知の相関関係（ZainerおよびMinerbo, "Tumour control probability: a formulation applicable to any temporal protocol of dose delivery", Phys Med Biol. 2000年2月；45(2):279-93）から推論される。）
【００４２】
【数７】
2018523830.tif 000008
【００４３】
２）ｐＨ２ＡＸ病巣の数（この数をＮＨ２ＡＸとする）によれば、次式が成り立つ。
【００４４】
【数８】
2018523830.tif 000009
【００４５】
（ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
本願発明者らは、以下のことに注目した。本発明により決定されるこれらのパラメータＴＣＤ９５およびＴＣＰにより得られる予測説明は、実際に、従来の方法で得られるものよりも正確である。その一方、ＤＮＡ切断治療に対する腫瘍の感受性を線量Ｄおよび分割線量ｄにおける細胞生存率の評価または腫瘍体積により特徴付けすれば、細胞パラメータおよび／または分子パラメータに基づく予測説明を大幅に向上させることができる。この実施形態は、また、以下の利点を有する。
【００４６】
・ｐＨ２ＡＸ病巣の数に基づき、ＳＦ（ｄ，Ｄ）を容易に求めることができる。
【００４７】
・幾何学的要素である体積は、医師が従来技術に従って腫瘍の状態と進行を説明するために使用する他のすべての基準（例えば，上記のＲＥＣＩＳＴ基準）と相関させることができる。
線量Ｄにおける細胞生存率について
発明者らは、また、２４時間後のｐＨ２ＡＸ病巣の数と細胞の生存の間に相関関係があることを見出した。２Ｇｙの線量については、細胞の生存は次式のとおりである。
【００４８】
【数９】
2018523830.tif 000010
【００４９】
または、線量Ｄおよび分割線量ｄについては、次式のとおりである。
【００５０】
【数１０】
2018523830.tif 000011
【００５１】
（式中、
ＮＨ２ＡＸは、照射後２４時間における、生存する腫瘍細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄは線量（Ｇｙ）であり、ｄは分割照射１回あたりの線量（Ｇｙ）であり、ｎは分割の回数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
腫瘍体積について
１）生存によれば、次式が成り立つ。
【００５２】
【数１１】
2018523830.tif 000012
【００５３】
（ここで、Ｖ（Ｄ）は、線量Ｄにおいて生存する腫瘍の体積を表わす。）
２）生存細胞の数によれば、次式が成り立つ。
【００５４】
【数１２】
2018523830.tif 000013
【００５５】
３）ｐＨ２ＡＸ病巣の数によれば、次式が成り立つ。
【００５６】
【数１３】
2018523830.tif 000014
【００５７】
腫瘍体積に関連するこれらの式において、
Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量であり、
ｎ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される分割照射の回数であり、
ａは、切断数あたりの体積変動定数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
さらに、（ｎ回の分割線量ｄに分割される）線量Ｄにおけるこの生存率は、次式に従い、放射線治療の前後での撮像により収集される信号の強度比に比例する。
【００５８】
【数１４】
2018523830.tif 000015
【００５９】
（式中、
Ｉｆは、治療の終了時の治療対象体積における信号強度であり、
Ｉｉは、治療前の治療対象体積における信号強度であり、
Ｃは、比例定数である。）
本発明におけるこれらの相関関係のすべてを、電離放射線線量について利用できる。一実施形態では、線量ｄは放射線治療の分割１回あたりの線量（典型的には２Ｇｙ）であり、線量Ｄは放射線治療において照射される合計線量である。
【００６０】
したがって、本発明は、ＤＮＡ切断治療に対する腫瘍の反応を、当該腫瘍の細胞のサンプルを使用して（好ましくは生検材料により）評価するための方法に関する。本発明の方法では、
（ａ）上記腫瘍から採取した細胞から、細胞サンプルを準備し、
（ｂ）上記細胞サンプルを、線量Ｄで特徴付けられるＤＮＡ切断治療に供し、
（ｃ）上記細胞サンプルについて、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して観察時間ｔにおいて得られる核病巣数の平均数（これらの平均数をそれぞれＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）と呼ぶ）を求め、ここで、上記観察時間ｔは、ｔ＝０分（上記線量Ｄの照射前の状態であるｔ０）、および、上記吸収線量Ｄの照射後のｔ＝ｔ１，ｔ２，ｔ３，およびｔ４から選択される少なくとも１つであり、
（ｄ）上記ＤＮＡ切断治療に対する上記サンプルの反応を特徴付けることを可能とする少なくとも１つのパラメータまたはスコアを、少なくとも上記平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を使用して求める。
【００６１】
この方法においては、
ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達するまでの時間を表す固定値であり、好適にはｔ３の６倍〜８倍の間で選択されるが、ただしこの場合は１２時間以上でなくてはならず、好ましくは１２時間〜４８時間であり、より優先的には約２４時間であり、
ｔ３は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞の二本鎖切断（ＤＳＢ）の約２５％が修復される時間を表す固定値であり、好適にはｔ２の３倍〜５倍の間から選択されるが、ただしこの場合は２．５時間以上６時間以下でなくてはならず、好ましくは３時間〜５時間であり、より優先的には約４時間であり、
ｔ２は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞のＤＳＢの約５０％が修復される時間を表す固定値であり、好適にはｔ１の５倍〜７倍の間から選択されるが、ただしこの場合は３５分以上９０分以下でなくてはならず、好ましくは４５分〜７５分であり、より優先的には約６０分であり、
ｔ１は、その経過後に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞内で認識されるＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値であり、好適には照射の中断から５分〜１５分の間から選択され、好ましくは７．５分〜１２．５分であり、より優先的には約１０分である。
【００６２】
上記ＤＮＡ切断治療は、電離放射線の照射である。
【００６３】
上記腫瘍は、固形腫瘍であってもよく、液性腫瘍であってもよい。
【００６４】
本発明の方法の一実施形態では、平均数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）を、ｔ＝ｔ０，ｔ１，ｔ２，ｔ３およびｔ４において求める。
【００６５】
別の実施形態では、ｎ回の線量ｄに分割される線量Ｄの照射後の細胞生存率（ＳＦ（ｄ，Ｄ））と、パラメータＴＣＤ５０と、パラメータＴＣＤ９５と、パラメータＴＣＰと、腫瘍体積とからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを、ＤＮＡ切断治療に対する上記サンプルの反応のパラメータまたはスコアとして求める。
【００６６】
上記ＤＮＡ切断治療が電離放射線の照射である場合、好適には、パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される。
【００６７】
【数１５】
2018523830.tif 000016
【００６８】
（式中、
Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
Ｎ（２Ｇｙ）は、線量２Ｇｙでの電離放射線照射によるＤＮＡ切断治療照射後のｔ４における生存細胞の数を表わし、上記線量が、好ましくは０.５Ｇｙ〜５Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、さらに優先的には２Ｇｙの電離放射線線量であり、
Ａは、１３０Ｇｙ〜１６０Ｇｙの整数定数または小数定数であり、
Ｂは、５Ｇｙ〜１５Ｇｙの整数定数または小数定数である。）
上記ＤＮＡ切断治療が電離放射線の照射である場合、好適には、パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される。
【００６９】
【数１６】
2018523830.tif 000017
【００７０】
（式中、Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
Ｎ（２Ｇｙ）は、線量２Ｇｙでの電離放射線照射によるＤＮＡ切断治療照射後のｔ４における生存細胞の数を表わし、上記線量が、好ましくは０.５Ｇｙ〜５Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、さらに優先的には２Ｇｙの電離放射線線量である。）
上記ＤＮＡ切断治療が電離放射線の照射である場合、好適には、パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される。
【００７１】
【数１７】
2018523830.tif 000018
【００７２】
（式中、ＮＨ２ＡＸ（２Ｇｙ，２４ｈ）は、ＤＮＡ切断治療の線量Ｄの後のｔ４におけるｐＨ２ＡＸ病巣の数を表わし、上記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙであり、θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、Ａは、１３０Ｇｙ〜１６０Ｇｙの整数定数（Ｇｙ）または小数定数（Ｇｙ）であり、Ｂは、５Ｇｙ〜１５Ｇｙの整数定数（Ｇｙ）または小数定数（Ｇｙ）である。）
同じ場合において、パラメータＴＣＤ９５が、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義されてもよい。
【００７３】
【数１８】
2018523830.tif 000019
【００７４】
（式中、ＮＨ２ＡＸ（２Ｇｙ，２４ｈ）は、ＤＮＡ切断治療の線量Ｄの後のｔ４におけるｐＨ２ＡＸ病巣の数を表わし、上記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙであり、θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
同じ場合において、パラメータＴＣＰが、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義されてもよい。
【００７５】
ＴＣＰ（Ｄ）＝ｅ−Ｎ（Ｄ）
（式中、Ｎは、ＤＮＡ切断治療線量Ｄの後に生存する細胞の数であり、上記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙである。）
同じ場合において、パラメータＴＣＰが、ＤＮＡ切断治療線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義されてもよい。
【００７６】
【数１９】
2018523830.tif 000020
【００７７】
（式中、ＮＨ２ＡＸ（ｄ，２４ｈ）は、ＤＮＡ切断治療線量ｄの後の時間ｔ４において生存する細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣の数を表わし、上記線量は、好ましくは電離放射線線量２Ｇｙであり、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
一実施形態では、ｎ回の線量ｄに分割される線量ＤでのＤＮＡ切断治療後に生存する腫瘍細胞が、好ましくは次の関係式により定義される。
【００７８】
【数２０】
2018523830.tif 000021
【００７９】
（式中、ＮＨ２ＡＸは、照射後２４時間における、生存する腫瘍細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄは線量（Ｇｙ）であり、ｄは分割照射１回あたりの線量（Ｇｙ）であり、ｎは分割の回数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）である。）
ｎ回の分割線量ｄに分割される線量Ｄの照射後における上記細胞生存率の比例関係が、放射線治療の前後での撮像により収集される信号の強度比を使用して、次式に従って定義される。
【００８０】
【数２１】
2018523830.tif 000022
【００８１】
（式中、
Ｉｆは、治療の終了時の治療対象体積における信号強度であり、
Ｉｉは、治療前の治療対象体積における信号強度であり、
Ｃは、比例定数である。）
好適な一実施形態では、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍体積（当該体積はパラメータＶ（Ｄ）により表わされる）は、腫瘍細胞の生存を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される。
【００８２】
【数２２】
2018523830.tif 000023
【００８３】
（式中、
Ｎは、線量Ｄでの照射後の生存細胞の数であり、
Ｖ０は、初期腫瘍体積であり、
ＳＦ（Ｄ）は、線量Ｄにおける細胞生存率であり、
ａは、ＤＮＡ切断数あたりの体積変動定数であり、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量（Ｇｙ）である。）
好適な別の実施形態では、線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍体積（当該体積はパラメータＶ（Ｄ）により表わされる）は、腫瘍細胞の生存を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される。
【００８４】
【数２３】
2018523830.tif 000024
【００８５】
（式中、
Ｎは、線量Ｄでの照射後の生存細胞の数であり、
Ｖ０は、初期腫瘍体積であり、
Ｎ（Ｄ）は、線量Ｄにおける生存細胞の数であり、
ａは、ＤＮＡ切断数あたりの体積変動定数であり、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量（Ｇｙ）である。）
別の実施形態では、ｎ回分の線量ｄに分割される線量ＤでのＤＮＡ切断治療後の腫瘍体積が、ＤＮＡ切断治療後に生存する細胞のｐＨ２ＡＸ病巣の数を使用して定義され、好ましくは次の関係式により定義される。
【００８６】
【数２４】
2018523830.tif 000025
【００８７】
（式中、
Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量であり、
ｎ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される分割照射の回数であり、
ａは、切断数あたりの体積変動定数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１には、単回照射後の細胞生存の変動（Ａを参照）と、および合計線量Ｄをｎ回の分割線量ｄに分割した照射についての細胞生存の変動（線Ｂを参照）とを示す。図１は、合計治療線量が同じ場合、細胞レベルにおいては、単回照射は分割照射よりもはるかに致命的であることを示している。この種の分割は、腫瘍レベルでは治療の有効性を低下させはするが、放射線治療に関連する副作用の低減を可能にする。
【図２】図２は、２Ｇｙでの単回照射における細胞生存率（ＳＦ２（％））の変動を表す。同細胞生存率は、吸収線量２Ｇｙの照射後修復時間（２４時間）後に、１細胞あたりに獲得されたｐＨ２ＡＸ病巣の数に応じて表される。各点は、線量２Ｇｙでの細胞生存の変動に対応している。この細胞生存は、１細胞株につき吸収線量２Ｇｙの照射後修復時間（２４時間）後の、１細胞あたりに獲得されたｐＨ２ＡＸ病巣の数に応じて表される。図２中の点線は、吸収線量２Ｇｙでの照射後修復時間（２４時間）後に、ＳＦ２（％）を１細胞あたりに獲得されたｐＨ２ＡＸ病巣の数と相関させる、本発明によるシミュレーションを表す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
本発明の範囲では、ＤＮＡ切断治療が、その線量Ｄで定量化される。このＤＮＡ切断治療が電離放射線照射（放射線治療）である場合、線量Ｄはこの電離放射線の吸収線量（一般的には、Ｇｙで表される）に相当する。
【００９０】
ヒトである患者に適した複数の代替的実施形態を包含する一実施形態について、以下に説明する。
試験の準備
細胞サンプルの採取および細胞サンプルの操作の前に、（例えば、細胞学的分析研究施設に所属する）各オペレータは、患者のＨＩＶまたはＣ型肝炎への感染の可能性について（典型的には、医師から）通知を受ける。これにより、オペレータが、採取中、操作中、および細胞培養の管理中に、適度に高められた生物学的安全対策を取ることができる。
【００９１】
作業者は、患者から腫瘍サンプルを採取する。この細胞サンプルを、２０％ウシ胎児血清を添加した無菌ＤＭＥＭ培地に配置する。サンプルは、すぐに専門の実験室に移す。ここで、サンプルを３８時間を超える時間、室温に置いたままにしてはならない。
【００９２】
サンプルとして採取された組織は、以下の工程により、単離および／または増幅される。
【００９３】
ある実施形態では、細胞サンプル（典型的には生検材料）を、受領後すぐに、増幅可能な細胞株の形に株化する。非常に好ましくは、株化は、フローサイトメトリーによる選択的培養か、または、選択的培地の使用によって、ウイルス性または化学的形質転換剤を使用せずに、腫瘍の種類に応じた公知の補助的転形可能手順に従って行われる。(Kroenig、外、“Cell type specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity”Oncotarget. 2015年1月，20;6(2):1302-14; Hristozova、外、“A simple multicolor flow cytometry protocol for detection and molecular characterization of circulating tumor cells in epithelial cancers”Cytometry A. 2012年6月;81(6):489-95. doi: 10.1002/cyto.a.22041. Epub 2012年3月21日; Wang、外、“Identification and characterization of cells with cancer stem cell properties in human primary lung cancer cell lines”PLoS One. 2013;8(3):2013年3月4日)。細胞の数が十分になったら（１〜３週間）、細胞をペトリ皿内のカバーガラス上に接種する。医療用照射装置を使用して、認可線量測定法に従い、吸収線量Ｄ（例えば２Ｇｙ）でこれらのカバーガラスの一部を照射する。その他の部分には照射を行わない。この部分は、自然状態（吸収線量は０Ｇｙ）を表わす。
【００９４】
例えば、照射は、３Ｇｙ  ｍｉｎ−１の吸収線量率で６ＭＶの光子を送出する医療用加速装置を使用して実施できる。照射後、および、後述する修復時間を経るために、細胞は培養インキュベーター内で３７℃に維持される。
【００９５】
照射済みの細胞について、放射線誘発状態に対応する特徴を、複数の修復時間（照射後修復時間）の後に獲得する。少なくとも２点、さらに優先的には少なくとも３点、具体的には、ｔ１、ｔ２、ｔ３およびｔ４を獲得する。上記の特徴は、ｐＨ２ＡＸマーカーに対応する病巣により表される。
【００９６】
次いで、カバーガラス上の細胞を固定し、溶解し、ハイブリダイズする。次のような公知の手順（引用のBodgiらの刊行物を参照）を使用できる。具体的には、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中、室温で１５分間、細胞を固定し、さらに、２０ｍＭのｐＨ７．４のヘペス緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤（ＣＡＳ  Ｎｏ．９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製））で３分間透過化処理した。その後、染色に先立ち、カバーガラスを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、頭文字を取ってＰＢＳとして知られる）中で洗浄した。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、頭文字のＢＳＡまたはフラクションＶとして知られる（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を添加したＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで洗浄を行った。一次抗体である抗ｐＨ２ＡＸは、１：８００の濃度で使用した。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。核を標識するために、カバーガラスをＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTMで処理した。ＤＡＰＩでの着色は、間接的に、フェーズＧ１にある細胞（核のＤＡＰＩ着色が均一）の個数、フェーズＳにある細胞（核が多数のｐＨ２ＡＸ病巣を有する）の個数、および、フェーズＧ２にある細胞（核のＤＡＰＩ着色が不均一）の個数、および中期（染色体が見える）にある細胞の個数の判定も可能にする。
【００９７】
免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）により、上記カバーガラスから結果を得る。読取りは、直接的（典型的には、各点につき、Ｇ０／Ｇ１にある細胞少なくとも５０個の病巣をカウントする）であってもよく、専用の画像解析ソフトウェアを使用して行ってもよく、または、自動化顕微鏡で行ってもよい。自動化ソフトウェアまたは顕微鏡法は、手動測定により較正されることが好ましい。
【００９８】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、最大で３回の個別の一連の試験（照射）を行い、規定の時間について各病巣数の平均を計算する。
生物学的・臨床的パラメータの判定
全般および使用マーカー
本発明は、とりわけ、ｐＨ２ＡＸマーカーについて得られた、非照射（自然状態）細胞および照射済み（放射線誘発状態）細胞のデータの利用を基本とする。本発明の方法は、修復時間に応じてこのマーカーを使用して行う標識の動態研究に基づくものである。つまり、放射線照射の中断からの規定の時間間隔後にサンプルを標識し、サンプルの免疫蛍光を調査する。例えば、好適にはｔ０、ｔ１（好ましくは１０分）、ｔ２（好ましくは１時間）、ｔ３（好ましくは４時間）、およびｔ４（好ましくは２４時間）に位置する５つの点で表される完全動態曲線を測定可能である。ここで、ｔ０は照射前の状態（自然状態）に相当する。
【００９９】
しかし、出願人は、ある特定の点（ある特定の修復時間に対応する）はその他の点よりも重要であること、および、予測的ではない点も存在することを認識するに至った。任意の時間に所定のパラメータを適切に選択することで、測定の回数を減らすことができ、よって、本方法の予測性能を低減させることなく、診断費用全体が削減できる。
【０１００】
サンプル採取がｎ＝３（ガウスタイプの「標準誤差ＳＥ」ではない）であれば、各マーカーを使用しての各点と各線量の平均は、平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」と呼ばれる）を使用して計算される。
【０１０１】
（ｉ）  ｐＨ２ＡＸは、ヒストンＨ２ＡＸのＸ変異体のセリン４３９におけるリン酸化型を指し、本願出願人の知見によれば、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）の数を標識する。ＤＳＢは、主要かつ信頼できる修復方法、すなわち、縫合により認識される。実質的に、ｐＨ２ＡＸマーカーは、もっぱら核病巣の形をとって核状であり、病巣の個数と大きさのみが分析される。
【０１０２】
ＤＡＰＩ（当業者には公知のＤＮＡマーカー）を使用した対比染色により、核内局在を位置づける核の位置を特定することができる。
生物学的パラメータ
以下のように、定義付けおよび決定を行う。
・ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）：ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して、観察時間ｔ０（非照射）または放射線照射（吸収線量：２Ｇｙ）後の観察時間ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４において、得られる核病巣の平均個数。ここで、パラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）の決定は本発明の方法の範囲において必須である。
予測的評価
これは、測定した生物学的データを使用して、臨床的パラメータおよび放射線治療的パラメータを予測することを目的とする。複数の診断レベルが提案される。
【０１０３】
Ａ）スコアの数学的値または数式から直接的に導出される定量的診断
これは、測定した生物学的データを使用して、臨床的パラメータおよび放射線治療的パラメータを予測することを目的とする。複数の診断レベルが提案される。
・パラメータＴＣＤ９５
【０１０４】
【数２５】
2018523830.tif 000026
【０１０５】
・パラメータＴＣＰ
【０１０６】
【数２６】
2018523830.tif 000027
【０１０７】
・線量Ｄおよび分割線量ｄにおける細胞生存率
【０１０８】
【数２７】
2018523830.tif 000028
【０１０９】
（式中、
ＮＨ２ＡＸは、照射後２４時間における、生存する腫瘍細胞中のｐＨ２ＡＸ病巣の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄは線量（Ｇｙ）であり、ｄは分割照射１回あたりの線量（Ｇｙ）であり、ｎは分割の回数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
さらに、（ｎ回の分割線量ｄに分割される）線量Ｄにおけるこの生存率は、次式に従い、放射線治療の前後での撮像により収集される信号の強度比に比例する。
【０１１０】
【数２８】
2018523830.tif 000029
【０１１１】
（式中、
Ｉｆは、治療の終了時の治療対象体積における信号強度であり、
Ｉｉは、治療前の治療対象体積における信号強度であり、
Ｃは、比例定数であり、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。）
・腫瘍体積
【０１１２】
【数２９】
2018523830.tif 000030
【０１１３】
腫瘍体積に関連するこれらの式において、
Ｎ０は、初期腫瘍細胞の数を表し、
θは、細胞耐性（単位：二本鎖切断の数）を表し、
Ｄ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される線量であり、
ｎ５０は、腫瘍体積の５０％減少が観察される分割照射の回数であり、
ａは、切断数あたりの体積変動定数であり、
βは、腫瘍組織種類に対する線形二次モデルのパラメータ（Ｇｙ−２）を表わし、
ここで、θおよびβは、上記のとおりの調整パラメータである。
【０１１４】
Ｂ）より定性的な診断（定量的診断の影響を受ける一方、医師が知る臨床的データが考慮される）
分析レベルと方法
第１の実施形態では、アルゴリズムにおいて得られた値ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）のすべてまたは一部が使用され、上記ＤＮＡ切断治療の線量Ｄに対するサンプルの反応を特徴付けるのに適したパラメータまたはスコアが得られる。
【０１１５】
第２の実施形態では、いくつかの値はどのスコアについても予測的ではないという観察結果が考慮される。これは、例えば、点ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ３）の場合である。この理由により、求めた値ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）のうち、点ｔ０、ｔ１、ｔ２、およびｔ４だけを使用する限定的分析を想定することができる。
実施例：ｐＨ２ＡＸ病巣の数によって２Ｇｙにおける生存率を求めるのに適した本発明の式の実証
表１に示す細胞株を、所望の細胞数を得られるまで、供給会社（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）の推奨に従って増幅した。十分な数の細胞を得たのち（概ね１〜３週間後）、本発明の方法で第１の実験を実施した。細胞をペトリ皿内のカバーガラス上に接種した。医療用照射装置を使用して、認可線量測定法に従い、２Ｇｙの吸収線量Ｄで、これらのカバーガラスに照射を行った。
【０１１６】
照射は、３Ｇｙ  ｍｉｎ−１の吸収線量率で６ＭＶの光子を送出する医療用加速装置を使用して実施した。吸収線量２Ｇｙでの照射の後、細胞を培養インキュベーター内で３７℃で保存した。照射後の修復時間２４時間の後、つまり、照射の中断から２４時間（ｔ４）において、サンプルを標識した。そして、照射後修復時間２４時間の後に、ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数を求めた（表１参照）。
【０１１７】
その後、照射を受けた細胞を、カバーガラス上で固定し、溶解し、ハイブリダイズした。これらの細胞を、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中で、室温で１５分間固定し、さらに、２０ｍＭのｐＨ７．４のヘペス緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤（ＣＡＳ  Ｎｏ．９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製））で３分間透過化処理した。その後、染色に先立ち、カバーガラスを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、頭文字を取ってＰＢＳとして知られる）中で洗浄した。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、頭文字のＢＳＡまたはフラクションＶとして知られる（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を添加したＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで洗浄を行った。一次抗体である抗ｐＨ２ＡＸは、１：８００の濃度で使用した。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。
【０１１８】
これらのカバーガラスを免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）にセットし、結果（ｐＨ２ＡＸマーカーを使用して得られた核病巣の平均数）を得た。読取りは、各点につき、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントすることにより直接的に、または、専用の画像解析ソフトウェア（imageJ）を使用して行った。
【０１１９】
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、３回の個別の一連の試験を行った。吸収線量２Ｇｙでの照射後の修復時間２４時間後の各病巣数の平均と平均値の標準誤差（「ＳＥＭ」またはσ）を計算した。計算値を表１に示す。
【０１２０】
付着性細胞株を使用した線量２Ｇｙでのクローン原生生存実験を行うことにより、ＳＦ２（％）を実験により得た。これらの実験は、当業者には公知の４段階手順に従い実施した。
【０１２１】
１）組織培養フラスコ内での細胞単層の処理
２）単純細胞懸濁液の調整、および、ペトリ皿内への適切な数の細胞の接種
３）線量Ｄ＝２Ｇｙでの細胞への照射
４）適切なインキュベーション時間（細胞株によって１〜３週間の範囲で変動する可能性がある）の後のコロニーの固定・着色。生存細胞の数は、生存％として表わされる。
【０１２２】
複数の腫瘍細胞株について、吸収線量２Ｇｙでの照射後修復時間２４時間後のｐＨ２ＡＸ病巣の数、および、２Ｇｙで得られた生存率を、以下の表１に示す。
【０１２３】
【表１】
2018523830.tif 000031
【０１２４】
表１に示したデータにより、次式のパラメータβおよび１／θを求めることができた。
【０１２５】
【数３０】
2018523830.tif 000032
【０１２６】
２Ｇｙでの細胞生存率（ＳＦ２（％））の変動を図２に示す。同細胞生存率は、吸収線量２Ｇｙの照射後修復時間（２４時間）後に、１細胞あたりに獲得されたｐＨ２ＡＸ病巣の数（表１のデータ）によって表される。各点は、線量２Ｇｙでの細胞生存の変動に対応している。この細胞生存は、１細胞株につき吸収線量２Ｇｙの照射後修復時間（２４時間）後の、１細胞あたりに獲得されたｐＨ２ＡＸ病巣の数によって表される。図２中の点線は、吸収線量２Ｇｙでの照射後修復時間（２４時間）後に、ＳＦ２（％）を１細胞あたりに獲得されたｐＨ２ＡＸ病巣の数と相関させるシミュレーションを表す。
【０１２７】
これらの腫瘍細胞株の生存率をシミュレーションし、βおよび１／θの関数として表わした。
【０１２８】
ＳＦ２＝ｅｘｐ（−０．０６１９×ＮＨ２ＡＸ（２４ｈ）−０．１１１）  （式中、Ｒ＝０.８２、β＝０.１１１／４＝０.０２７７、および、１／θ＝０.０６１９  である。）
ＳＦ２の式を使ってβおよび１／θの値を計算することにより、さまざまな腫瘍の放射線感受性を説明する一貫性のある結果（これらの２つの数値は、実際に、ほとんどがグループＩＩである腫瘍について期待されるβおよび１／θの平均値に相当する）を得られる。
【図１】
2018523830.tif 000043
【図２】
2018523830.tif 000044
【国際調査報告】
2018523830.tif 000045
2018523830.tif 000046
2018523830.tif 000047
2018523830.tif 000048
2018523830.tif 000049
2018523830.tif 000050
2018523830.tif 000051
2018523830.tif 000052
2018523830.tif 000053
2018523830.tif 000054