(57)【要約】  B型肝炎ウイルス遺伝子発現の阻害のための組成物および方法が記載される。B型肝炎ウイルス遺伝子の発現を阻害するための RNA干渉（RN Ai）トリガーおよびRNAiトリガーコンジュゲートが記載される。任意の1つ以上のさらなる治療薬とともに1つ以上のHBV RNAiトリガーを含む医薬組成物もまた記載される。 記載されたHBV RNAiトリガーを、感染した肝臓にインビボで送達することにより、HBV遺伝子の発現が阻害され、治療が提供される。
2018523668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
B型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
a）MLP-(L-T)x（式中、
MLPはメリチン様ペプチドであり、
-L-Tは、-CO-C(CH3)=C(T)-COOHまたは-CO-C(T)=C(CH3)-COOHで表される構造を有し、ここで、Tは、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を持つ標的化リガンドを含み、
xは、MLPの集団の第一級アミンの数の80％超である）、
b）アンチセンス鎖とセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が表1Aに提示された任意のアンチセンス配列のヌクレオチド2〜18を含む第1のHBV RNAiトリガー、及び
c）アンチセンス鎖とセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が表1Aに提示された任意のアンチセンス配列のヌクレオチド2〜18を含む第2のHBV RNAiトリガー
とを含む、組成物。
【請求項２】
前記第1のHBV RNAiトリガーが、表1Bに提示された対応する任意のセンス配列のヌクレオチド2〜18を含有するセンス鎖を含み、前記センス鎖は、任意に標的化基に連結され；前記第2のHBV RNAiトリガーが、表1Bに提示された対応する任意のセンス配列のヌクレオチド2〜18を含有するセンス鎖を含み、前記センス鎖は、任意に標的化基に連結されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記第1のHBV RNAiトリガーが、TEG基を介してコレステリル基に共有結合したセンス鎖を含み、前記第2のHBV RNAiトリガーが、C6基を介してコレステリル基に共有結合したセンス鎖を含む、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記第1のHBV RNAiトリガーがAD01385を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第2のHBV RNAiトリガーがAD01386を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記第1のHBV RNAiトリガーがAD01385を含み、前記第2のHBV RNAiトリガーがAD01386を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記MLPが、配列ID番号650、配列ID番号644、配列ID番号654、配列ID番号694、配列ID番号700、配列ID番号701、配列ID番号751、又は配列ID番号755のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記MLPが、配列ID番号650のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
TがN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）を含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
-(L-T)が、
【化１】
2018523668.tif 000081
で表される構造を有する（式中、n＝１である）、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第1のHBV RNAiトリガーの少なくとも1つが修飾されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第1のHBV RNAiトリガーのアンチセンス鎖が、表1Aに提示されたいずれかの修飾された配列のヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第1のHBV RNAiトリガーのセンス鎖が、表1Bに提示されたいずれかの修飾された配列のヌクレオチド配列を含む、請求項11または12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第2のHBV RNAiトリガーの少なくとも1つのヌクレオチドが修飾されている、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第2のHBV RNAiトリガーのアンチセンス鎖が、表1Aに提示されたいずれかの修飾された配列のヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第1のHBV RNAiトリガーのセンス鎖が、表1Bに提示されたいずれかの修飾された配列のヌクレオチド配列を含む、請求項14または15に記載の組成物。
【請求項１７】
前記MLPが、前記HBV RNAiトリガーとは別のバイアルで提供される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬として許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１９】
医薬として許容可能な前記賦形剤がデキストランを含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
前記MLP、および／または前記第1のHBV RNAiトリガー、および／または前記第2のHBV RNAiトリガーが凍結乾燥されている、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２１】
a）アンチセンス鎖とセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表1Aに提示された任意のアンチセンス配列のヌクレオチド2〜18を含み、前記センス鎖が、表1Bに提示された対応する任意のセンス配列を含む第1のHBV RNAiトリガーと、
b）アンチセンス鎖とセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表1Aに提示された任意のアンチセンス配列のヌクレオチド2〜18を含み、前記センス鎖が、表1Bに提示された対応する任意のセンス配列を含む第2のHBV RNAiトリガー
とを含む組成物。
【請求項２２】
前記第1のHBV RNAiトリガーが、TEG基を通じてコレステリル基に共有結合したセンス鎖を含み、前記第2のHBV RNAiトリガーが、C6基を通じてコレステリル基に共有結合したセンス鎖を含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
アンチセンス鎖とセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表1Aに提示された任意の修飾されたアンチセンス配列のヌクレオチド2〜18を含むHBV RNAiトリガーを含む組成物。
【請求項２４】
前記センス鎖が、表1Bに提示された対応する任意の修飾されたセンス配列を含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
前記センス鎖がガラクトース三量体に共役している、請求項23または24に記載の組成物。
【請求項２６】
1つ以上の追加の治療薬をさらに含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２７】
患者においてB型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制する方法であって、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記MLP-(L-T)x、前記第1のHBV RNAiトリガー、前記第2のHBV RNAiトリガーを連続的に投与する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記第1のHBV RNAiトリガーと前記第2のHBV RNAiトリガーは一括して投与し、前記MLP-(L-T)xは連続的に投与する、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
HBV感染を治療する方法であって、その治療を必要とする患者に請求項1〜26のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３１】
HBV感染を治療するための、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組成物の利用。
【請求項３２】
HBV感染を治療するための薬を製造するための、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組成物の利用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
B型肝炎ウイルスは、正確な肝臓指向性の二本鎖DNA含有ウイルスである。DNAは遺伝材料だが、複製サイクルは、プレゲノムRNAをDNAにコピーする逆転写工程を含んでいる。B型肝炎ウイルスはヘパドナウイルスの一員に分類され、ヘパドナウイルス科のファミリーに属している。成人がB型肝炎ウイルスに初感染すると急性肝炎が起こり、臓器の炎症、発熱、黄疸、血液中の肝臓トランスアミナーゼ増加という症状を伴う。ウイルス感染を克服できない患者は長年にわたって慢性疾患の進行に苦しむことになり、肝硬変や肝臓がんになるリスクが増大する。B型肝炎ウイルスに感染した母親から新生児への周産期感染も慢性肝炎につながる。
【０００２】
ヌクレオカプシドは、肝細胞によって取り込まれると核に移動し、DNAが放出される。その場所でDNA鎖の合成が完了し、ギャップが修復されて3.2 kbの共有結合閉環状（ccc）スーパーコイルDNAが生じる。このcccDNAは、長さがそれぞれ3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb、0.7 kbである4つの主要なウイルスmRNAの転写のための鋳型として機能する。すべてのmRNAが5'-キャップ状態であり、3'末端がポリアデニル化されている。4つすべてのmRNAの間で3'末端に配列の重複がある。
【０００３】
3.5 kbのmRNAは、コアタンパク質とポリメラーゼを産生させるための鋳型として機能する。それに加え、その同じ転写産物がプレゲノム複製中間体として機能し、ウイルスのポリメラーゼがDNAへの逆転写を開始できるようにする。コアタンパク質はヌクレオカプシドの形成に必要とされる。それに加え、逐次的なプロセシング活動によっていくつかのコアタンパク質が分泌可能なe-抗原に変換される。血液中のe-抗原の量は肝臓内でのB型肝炎ウイルスの複製と相関しているため、疾患の進行を監視するための1つの重要な診断マーカーとして機能する。
【０００４】
2.4 kbと2.1 kbのmRNAは、ウイルスの大表面抗原、中表面抗原、小表面抗原を発現させるためのプレ-S1、プレ-S2、Sというオープンリーディングフレームを有する。s-抗原は、感染性の完全な粒子と関係している。それに加え、感染した患者の血液には、s-抗原のみに由来してゲノムDNAやポリメラーゼのない非感染性粒子も含まれている。これら粒子の機能は完全にはわかっていない。血液中に検出可能なs-抗原がまったくない状態が継続することが、B型肝炎ウイルス消失の信頼できる指標と見なされており、したがって治療の成功と見なされる。
【０００５】
0.7 kbのmRNAはXタンパク質をコードしている。この遺伝子産物はウイルス遺伝子の効率的な転写にとって重要であり、宿主での遺伝子発現に関するトランス活性化因子としても作用する。その因子の活性は、肝臓がんが進行する間の肝細胞の変化にとって重要であるように見える。
【０００６】
s-抗原、e-抗原又はウイルスDNAを血液中に6ヶ月超にわたって検出できる患者は慢性感染していると見なされる。逆転写酵素活性の阻害剤としてのヌクレオシド類似体が、多くの患者にとって治療の典型的な第一選択肢となる。ラミブジン、テノホビル、エンテカビルは、B型肝炎ウイルスの複製を抑制し、ときには検出できないレベルにする。肝機能の改善と肝臓の炎症の低下が、最も重要な利点である。しかしごく少数の患者だけが、治療の終了後に完全かつ継続的な寛解を達成する。さらに、B型肝炎ウイルスは、治療期間が長くなると薬剤耐性を発達させる。これは、B型肝炎とヒト免疫不全に同時に感染している患者にとって特に厳しい。どちらのウイルスもヌクレオシド類似体薬に感受性があり、耐性を同時に発達させる可能性がある。
【０００７】
治療の第二の選択肢はインターフェロン-αの投与である。この場合には、患者は6ヶ月の期間にわたって高用量のインターフェロン-αを投与される。アジア遺伝子型Bは奏効率が非常に低い。D型肝炎またはヒト免疫不全ウイルスにも同時に感染していると、インターフェロン-α療法が完全に無効になることが判明している。肝臓の損傷が激しく重い線維状態になっている患者には、インターフェロン-α療法は適切でない。
【０００８】
B型肝炎ウイルス治療の分野における顕著な進歩にもかかわらず、慢性感染患者でこのウイルスの遺伝子発現を選択的かつ効率的に沈黙させ、複製を阻止し、ウイルス負荷を低減させることのできる薬剤が依然として必要とされている。
【０００９】
総括
本明細書は、B型肝炎ウイルス（HBV）の発現を選択的かつ効率的に減らすことのできるHBV特異的RNA干渉（RNAi）トリガー分子（RNAi剤、RNAiトリガー、トリガーとも呼ぶ）、及びB型肝炎ウイルス遺伝子の発現、特にB型肝炎ウイルスの複製または発症に関連する遺伝子の発現を阻害するためのRNA干渉の介在における使用について記載される。それぞれのRNAiトリガーは、少なくともセンス鎖とアンチセンス鎖を含んでいる。センス鎖とアンチセンス鎖は、互いに、一部が相補的である、または実質的に相補的である、または完全に相補的であることが可能である。本明細書に記載したRNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖それぞれの長さは、16〜30ヌクレオチドにすることができる。いくつかの実施態様では、センス鎖とアンチセンス鎖は、長さが独立に17〜26ヌクレオチドである。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ長さにすること、または異なる長さにすることができる。本明細書に記載したRNAiトリガーは、HBVを発現する細胞に送達されると、生体内で1つ以上のHBV遺伝子の発現を抑制する。HBV RNAiトリガーで使用できるHBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の例は、表1Aと表1Bに提示されている。HBV RNAiトリガーデュープレックスの例は表2に提示されている。
【００１０】
HBV RNAiトリガーは、第1の配列を含むセンス鎖（パッセンジャー鎖）と、第2の配列を含むアンチセンス鎖（ガイド鎖）を含んでいる。いくつかの実施態様では、センス鎖は、B型肝炎ウイルスのmRNAの少なくとも一部と少なくとも90％一致したコア配列を含んでいる。アンチセンス鎖は、B型肝炎ウイルス遺伝子をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、相補性領域は長さが30ヌクレオチド未満である。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーデュープレックスの長さは約16〜30ヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーデュープレックスの長さは約15〜25ヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、デュープレックスの長さが約18、または19、または20、または21、または22、または23、または24ヌクレオチドである。配列の例は表1Aと表1Bに提示されている。
【００１１】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、標的化基をさらに含んでいる。標的化基は、HBV RNAiトリガーのセンス鎖またはアンチセンス鎖の3'末端または5'末端に連結させることができる。いくつかの実施態様では、標的化基は、センス鎖の3'末端または5'末端に連結される。いくつかの実施態様では、標的化基は、センス鎖の5'末端に連結される。いくつかの実施態様では、標的化基は、20個以上の炭素原子を有する疎水性基を含んでいる。いくつかの実施態様では、疎水性基は、コレステロール基またはコレステリル基を含んでいる。いくつかの実施態様では、標的化基は、ガラクトース三量体を含んでいる。
【００１２】
いくつかの実施態様では、標的化基は、リンカーを介してトリガーに連結される。適切なリンカーの非限定的な例に含まれるのは、-(CH2)n-（ただしnは1〜10であり、いくつかの実施態様ではn＝6、すなわち本明細書で用いるC6である）と、-(O-CH2-CH2) nまたは-(CH2-CH2-O) n（ただしnは1〜10であり、いくつかの実施態様ではn＝3、すなわちトリエチレングリコール（TEG）である）である。標的化基を有するリンカー、または標的化基のないリンカーを、表1Aと表1Bに開示されているセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の5'末端または3'末端に付着させることができる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、配列の異なる少なくとも2つのHBV RNAiトリガーの組み合わせを記述する。いくつかの実施態様では、その少なくとも2つ以上の異なるHBV RNAiトリガーは、それぞれが標的化基に連結される。いくつかの実施態様では、その少なくとも2つ以上の異なるHBV RNAiトリガーは、それぞれがコレステロール標的化基に連結される。いくつかの実施態様では、その少なくとも2つ以上の異なるHBV RNAiトリガーは、それぞれがガラクトース三量体標的化基に連結される。いくつかの実施態様では、2つの異なるトリガーを使用するとき、第1のトリガーはコレステロールに連結され、第2のトリガーはガラクトース三量体に連結される。いくつかの実施態様では、2つ以上のトリガーを使用するとき、その2つのトリガーは、同じリンカーまたは似たリンカーを用いてそれぞれの標的化基に連結される。いくつかの実施態様では、2つ以上のトリガーを使用するとき、その2つのトリガーは、異なるリンカーを用いてそれぞれの標的化基に連結される。いくつかの実施態様では、第1の標的化基はC6リンカーを介して第1のHBV RNAiトリガーに連結され、第2の標的化基はTEGリンカーを介して第2のHBV RNAiトリガーに連結される。いくつかの実施態様では、第1と第2の標的化基は、両方とも、コレステロール基またはコレステリル基を含むか、コレステロール基またはコレステリル基からなる。いくつかの実施態様では、第1と第2の標的化基は、両方とも、ガラクトース三量体またはガラクトース四量体を含むか、ガラクトース三量体またはガラクトース四量体からなる。異なるリンカーを用いると、トリガーの識別を改善することと、トリガーを定量的に分析することが可能になる。
【００１４】
いくつかの実施態様には、標的化基に共役したHBV RNAiトリガーを生体内で肝臓細胞に送達する組成物が記載されている。いくつかの実施態様では、標的化基は、ガラクトース三量体またはコレステロールである。
【００１５】
いくつかの実施態様には、HBV RNAiトリガーを生体内で肝臓細胞に送達する組成物として、a）アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）を標的とする可逆的にマスクされたメリチン様ペプチド（MLP）、すなわちMLP送達ペプチド（または単純に送達ペプチド）と、b）少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基（非限定的な例は、コレステロール基またはコレステリル基）に共役したHBV RNAiトリガー（RNA-共役体）を含む組成物が記載されている。MLP送達ペプチドとRNAiトリガー-共役体は別々に合成され、別々の容器で、または単一の容器で供給することができる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは送達ペプチドに共役されない。
【００１６】
いくつかの実施態様では、B型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制する組成物として、a）MLP-(L-T)x（ただし-L-Tは、-CO-C(CH3)=C(T)-COOHまたは-CO-C(T)=C(CH3)-COOHで表される構造を持ち、Tは、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する標的化リガンドを含み、xは、MLPの集団の第一級アミンの数の80％超である）と、b）表1Aに提示されている任意のアンチセンス配列のヌクレオチド2〜15、2〜19、1〜17、1〜21、1〜26のいずれかを含むアンチセンス鎖と、表1Bに提示されていてTEG基を介してコレステリル基に共有結合した対応する任意のセンス配列を含むセンス鎖を含む第1のHBV RNAiトリガーと、c）表1Aに提示されている任意のアンチセンス配列のヌクレオチド2〜15、2〜19、1〜17、1〜21、1〜26のいずれかを含むアンチセンス鎖と、表1Bに提示されていてC6基を介してコレステリル基に共有結合した対応する任意のセンス配列を含むセンス鎖を含む第2のHBV RNAiトリガーを含む組成物を記述する。いくつかの実施態様では、表1Bに提示されているセンス鎖ヌクレオチド配列は、5'または3'をChol-TEGまたはChol-C6で修飾することができる。
【００１７】
いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーの1つ以上と、場合によってはMLP送達ペプチドを、医薬として許容可能な基剤または希釈剤の中に入れて哺乳動物に投与する。いくつかの実施態様では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーと送達ペプチドを溶液の中で組み合わせた後に哺乳動物に投与する。いくつかの実施態様では、送達ペプチドとRNAiトリガーを別々の溶液で哺乳動物に同時に投与する。いくつかの実施態様では、送達ペプチドとRNAiトリガーを哺乳動物に順番に投与する。順番に投与するには、送達ペプチドを投与した後にRNAiトリガーを投与することができる。その代わりに、順番に投与するため、RNAiトリガーを投与した後に送達ペプチドを投与することができる。
【００１８】
B型肝炎ウイルスRNAiトリガーの利用により、HBV感染に付随する疾患／異常を治療および／または予防する方法が提供される。記載したHBV RNAiトリガーは、RNA干渉を通じてB型肝炎ウイルスの複製および／または病因に必要な1つ以上の遺伝子の発現を抑制する。HBV RNAiは特に、細胞、または組織、または哺乳動物において、ウイルスのポリメラーゼ、および／またはコアタンパク質、および／または表面抗原、および／またはe-抗原、および／またはXタンパク質の抑制を開始させる。HBV RNAiトリガーは、B型肝炎ウイルス感染症の治療に用いることができる。HBV RNAiトリガーは、B型肝炎ウイルス感染に付随する慢性肝臓疾患／異常、炎症、線維状態、増殖性異常（がんなど）の治療または予防に用いることもできる。いくつかの実施態様では、配列は長さが少なくとも13個の連続ヌクレオチドである。このような方法は、HBV RNAiトリガーをHBVに感染したヒトまたは動物に投与することを含んでいる。さらに、HBV RNAiトリガーを生体内で肝臓細胞に送達するための組成物を記述する。
【００１９】
いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーは、場合によっては、1つ以上の追加の（すなわち第2、第3などの）治療薬と組み合わされる。第2の治療薬として、別のHBV RNAiトリガー（例えば、HBVゲノム内の異なる配列を標的とするHBV RNAiトリガー）が可能である。追加の治療薬として、小分子薬、および／または抗体、および／または抗体断片、および／またはワクチンも可能である。1つ以上の追加の薬を組み合わせた、または組み合わせないHBV RNAiトリガーを1つ以上の賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。
【００２０】
1つ以上のHBV RNAiトリガーを含む医薬組成物は、局所的治療を望むか全身治療を望むかに応じ、多数のやり方で投与することができる。投与の非限定的な例として、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、（例えば埋め込んだ装置を通じた）皮下投与、柔組織内投与が可能である。
【００２１】
記載したHBV RNAiトリガーおよび／または組成物は、HBV感染によって起こるHBVの感染症または疾患または異常を治療する方法で使用することができる。そのような方法は、本明細書に記載したHBV RNAiトリガーを対象（例えばヒト対象または動物対象）に投与することを含んでいる。
【００２２】
特に断わらない限り、本明細書で用いるあらゆる科学技術用語は、本発明の属する当業者が一般に理解しているのと同じ意味を持つ。本発明を実施したり試験したりするのに本明細書に記載したのと同様または同等の方法と材料を使用できるが、適切な方法と材料を以下に記述する。本明細書で言及するあらゆる刊行物、特許出願、特許、他の参考文献は、引用によってその全体が組み込まれている。係争が生じた場合、定義を含めて本明細書が優先する。それに加え、材料、方法、実施例は単なる例示であり、本発明を制限する意図はない。
【００２３】
さらなる目的、特徴、利点は、添付の図面と組み合わせたときに以下の詳細な説明から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、HBV RNAiトリガーの標的化基と連結基を表わす化学構造である。
【００２５】
【図２】図2は、HBV RNAiトリガーの標的化基と連結基を表わす化学構造である。
【００２６】
【図３】図3は、可逆的に修飾されたMLP送達ペプチドとRNAiトリガー-コレステロール共役体を用いて治療した霊長類における（A）血液尿窒素（BUN）のレベルと（B）クレアチニンのレベルを示すグラフである。
【００２７】
【図４】図4は、可逆的に修飾されたMLP送達ペプチドとRNAiトリガー-コレステロール共役体を用いて治療した霊長類における（A）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）のレベルと（B）アラニントランスアミナーゼ（ALT）のレベルを示すグラフである。
【００２８】
【図５】図5は、3 mg/kgのMLP送達ペプチドに加え、（A）1.5 mg/kgのAD01385、または1.5 mg/kgのAD01386を投与するか、（B）1.5 mg/kgのAD01385＋1.5 mg/kgのAD01386を同時に投与した後のpHBVマウスにおける血清HBV DNAを示すグラフである。
【００２９】
【図６】図6は、（A）2 mg/kgのMLP送達ペプチド、1 mg/kgのAD0009、1 mg/kgのAD0010、または（B）2 mg/kgのMLP送達ペプチド、1 mg/kgのAD01386、1 mg/kgのAD01385を同時に投与した後のチンパンジー95A010における血清HBsAgを示すグラフである。
【００３０】
【図７】図7は、（A）AM02312-AS、（B）AM02315-AS、（C）AM02312-AS＋AM02315-ASのHPLCクロマトグラフである。
【００３１】
【図８】図8は、（A）AM02316-SS（TEG）、（B）AM02319-SS（TEG）、（C）AM02320-SS（C6）のHPLCクロマトグラフである。
【００３２】
【図９】図9は、（A）AM02323-SS（C6）、（B）AM02320-SS（C6）＋AM02323-SS（C6）、（C）AM02319-SS（TEG）＋AM02316-SS（TEG）のHPLCクロマトグラフである。
【００３３】
【図１０】図10は、（A）AM02320-SS（C6）＋AM02319（TEG）、（B）AM02323-SS（C6）＋AM02316-SS（TEG）、（C）AM02320-SS（C6）／AM02312-AS＋AM02323-SS（C6）／AM02315-ASのHPLCクロマトグラフである。
【００３４】
【図１１】図11は、（A）AM02316-SS（TEG）／AM02312-AS＋AM02319-SS（TEG）／AM02315-AS、（B）AM02320-SS（C6）／AM02312-AS＋AM02319-SS（TEG）／AM02315-AS、（C）AM02316-SS（TEG）＋AM02312-AS＋AM02323-SS（C6）／AM02315-ASのHPLCクロマトグラフである。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書に記載するのは、B型肝炎ウイルスの発現を抑制するためのRNAiトリガー（本明細書ではHBV RNAiトリガーと呼ぶ）である。それぞれのHBV RNAiトリガーは、センス鎖とアンチセンス鎖を含んでいる。センス鎖とアンチセンス鎖は、互いに、一部が相補的である、または実質的に相補的である、または完全に相補的である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載したRNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、独立に、16〜30ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、本明細書に記載したRNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、独立に、17〜26ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、本明細書に記載したRNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、独立に、17、または18、または19、または20、または21、または22、または23、または24、または25、または26ヌクレオチドである。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ長さにすること、または異なる長さにすることができる。いくつかの実施態様では、センス鎖は長さが約19ヌクレオチドであるのに対し、アンチセンス鎖は長さが約21ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、センス鎖は長さが約21ヌクレオチドであるのに対し、アンチセンス鎖は長さが約23ヌクレオチドである。別の実施態様では、センス鎖とアンチセンス鎖の長さは、独立に、17〜21ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方とも、長さがそれぞれ21〜26ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方とも長さが26ヌクレオチドである。HBV RNAiトリガー分子を形成するのに用いるヌクレオチド配列の例は、表1Aと表1Bに提示されている。
【００３６】
HBV RNAiトリガーはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、そのそれぞれの鎖が、長さ16〜23ヌクレオベースのコア配列を含んでいる。アンチセンス鎖のコア配列は、HBV mRNAに存在するあるヌクレオチド配列（「標的配列」と呼ぶことがある）と100％（完全に）相補的であるか、少なくとも90％（実質的に）相補的である。センス鎖のコア配列は、アンチセンス鎖の中のある配列と100％（完全に）相補的であるか、少なくとも90％（実質的に）相補的であるため、HBV mRNAに存在するあるヌクレオチド配列（標的配列）と完全に一致するか、少なくとも90％一致する。センス鎖のコア配列は、対応するアンチセンス鎖のコア配列と同じ長さにすること、または異なる長さにすることができる。いくつかの実施態様では、アンチセンス鎖のコア配列は、長さが16、または17、または18、または19、または20、または21、または22、または23ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、センス鎖のコア配列は、長さが16、または17、または18、または19、または20、または21、または22、または23ヌクレオチドである。
【００３７】
HBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖は、典型的にはアニールしてデュープレックス（二本鎖）を形成する。相補的デュープレックス領域では、センス鎖のコア配列は、アンチセンス鎖のコア配列と少なくとも90％相補的であるか、100％相補的である。いくつかの実施態様では、センス鎖のコア配列は、アンチセンス鎖のコア配列の対応する16、または17、または18、または19、または20、または21ヌクレオチドの配列と少なくとも90％、または100％相補的である、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21ヌクレオチドからなる配列を含んでいる（すなわちHBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖のコア配列は、少なくとも90％の塩基が対を形成する、または100％の塩基が対を形成する少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21ヌクレオチドからなる領域を有する）。
【００３８】
RNAiトリガーに含まれる非限定的な例は、短い干渉性RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、ダイサー（dicer）基質（例えばアメリカ合衆国特許第8,084,599号、第8,349,809号、第8,513,207号）である。本明細書に記載したRNAiトリガーは、HBV遺伝子を発現する細胞に送達されると、RNA干渉（RNAi）という生物学的プロセスを通じて生体内で1つ以上のHBV遺伝子の発現を抑制またはノックダウンする。
【００３９】
本明細書で用いる「配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオベース（核酸塩基）、および／またはヌクレオチド、および／またはヌクレオシドの連なりまたは順番を意味し、ヌクレオチドの標準的命名法で用いる文字列と、本明細書に記載した修飾されたヌクレオチドのための鍵で記述する。
【００４０】
センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、場合によっては、独立に、コア配列の3'末端に、または5'末端に、または3'末端と5'末端の両方に、追加の1個、または2個、または3個、または4個、または5個、または6個のヌクレオチド（伸長部）を含んでいる。アンチセンス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合には、HBV mRNAの対応する配列と相補的であってもなくてもよい。センス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合には、HBV mRNAの対応する配列と相補的であってもなくてもよい。アンチセンス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合には、対応するセンス鎖に存在する場合の追加のヌクレオチドと相補的であってもなくてもよい。
【００４１】
本明細書では、伸長部分は、センス鎖のコア配列および／またはアンチセンス鎖のコア配列の5'末端および／または3'末端に位置する1個、または2個、または3個、または4個、または5個、または6個のヌクレオチドを含んでいる。センス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖のヌクレオチド（コア配列ヌクレオチドまたは伸長ヌクレオチド）と相補的であってもなくてもよい。逆に、アンチセンス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖のヌクレオチド（コア配列ヌクレオチドまたは伸長ヌクレオチド）と相補的であってもなくてもよい。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が3'伸長部と5'伸長部を含んでいる。いくつかの実施態様では、一方の鎖の1つ以上の3'伸長ヌクレオチドが、他方の鎖の1つ以上の5'伸長ヌクレオチドと塩基対を形成する。別の実施態様では、一方の鎖の1つ以上の3'伸長ヌクレオチドが、他方の鎖の1つ以上の5'伸長ヌクレオチドと塩基対を形成しない。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、3'伸長部を有するアンチセンス鎖と、5'伸長部を有するセンス鎖を持っている。
【００４２】
本明細書に記載したHBV RNAiトリガーは、アンチセンス鎖をセンス鎖とアニールさせることによって形成される。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーのアンチセンス鎖は、表1Aの任意の配列のヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーのアンチセンス鎖は、表1Aの任意の配列のヌクレオチド配列1〜17、2〜15、2〜17、1〜18、2〜18、1〜19、2〜19、1〜20、2〜20、1〜21、2〜21、1〜22、2〜22、1〜23、2〜23、1〜24、2〜24、1〜25、2〜25、1〜26、2〜26のいずれかを含む。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーのセンス鎖は、表1Bの任意の配列のヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーのセンス鎖は、表1Bの任意の配列のヌクレオチド配列1〜18、1〜19、1〜20、1〜21、1〜22、1〜23、1〜24、1〜25、1〜26、2〜19、2〜20、2〜21、2〜22、2〜23、2〜24、2〜25、2〜26、3〜20、3〜21、3〜22、3〜23、3〜24、3〜25、3〜26、4〜21、4〜22、4〜23、4〜24、4〜25、4〜26、5〜22、5〜23、5〜24、5〜25、5〜26、6〜23、6〜24、6〜25、6〜26、7〜24、7〜25、7〜26、8〜25、8〜26のいずれかを含む。
【００４３】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載したHBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖は、同数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載したHBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーのセンス鎖の5'末端とアンチセンス鎖の3'末端が平滑末端を形成している。RNAiトリガーのセンス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端が平滑末端を形成している。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーの両方の末端が平滑末端を形成している。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーのどちらの末端も平滑末端ではない。本明細書では、平滑末端は、2本のアニールされた鎖の末端ヌクレオチドが相補的である（相補的な塩基対を形成する）二本鎖トリガー分子の末端を意味する。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーのセンス鎖の5'末端とアンチセンス鎖の3'末端がほどけた末端を形成する。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーのセンス鎖の3'末端とアンチセンス鎖の5'末端がほどけた末端を形成する。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーの両方の末端がほどけた末端を形成する。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーのどちらの末端もほどけた末端ではない。本明細書では、ほどけた末端は、2本のアニールされた鎖の末端ヌクレオチドが対を形成する（すなわちオーバーハングを形成しない）が相補的ではない（すなわち非相補的な対を形成する）二本鎖RNAiトリガー分子の末端を意味する。本明細書では、オーバーハングは、二本鎖RNAiトリガー分子の1本の鎖の末端に位置する1つ以上の不対ヌクレオチドの伸長部である。不対ヌクレオチドはセンス鎖上にあってもアンチセンス鎖上にあってもよく、3'オーバーハングまたは5'オーバーハングを生じさせる。いくつかの実施態様では、RNAiトリガー分子は、平滑末端とほどけた末端を含むか、平滑末端と5'オーバーハング末端を含むか、平滑末端と3'オーバーハング末端を含むか、ほどけた末端と5'オーバーハング末端を含むか、ほどけた末端と3'オーバーハング末端を含むか、2つの5'オーバーハング末端を含むか、2つの3'オーバーハング末端を含むか、5'オーバーハング末端と3'オーバーハング末端を含むか、2つのほどけた末端を含むか、2つの平滑末端を含む。
【００４４】
ヌクレオチドの塩基（すなわちヌクレオベース）は、あらゆる核酸の構成成分である複素環のピリミジン化合物またはプリン化合物であり、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）、ウラシル（U）を含んでいる。本明細書では、「G」、「g」、「C」、「c」、「A」、「a」、「U」、「u」、「T」のそれぞれは、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、チミジンを含むヌクレオベース、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体を表わす。本明細書では、「ヌクレオチド」という用語に、修飾されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド模倣体、非塩基部位、代理置換部分を含めることができる。
【００４５】
本明細書では、「修飾されたヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（2'-ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレオチドの少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または100％が修飾されている。修飾されたヌクレオチドの非限定的な例には、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、非塩基ヌクレオチド（本明細書ではXまたはAbで表わす）、2'修飾ヌクレオチド、3'→3'連結（逆転）ヌクレオチド（本明細書ではinvdN、invN、invn、invXで表わす）、非天然の塩基を含むヌクレオチド、架橋したヌクレオチド、ペプチド核酸、2',3'-セコヌクレオチド模倣体（ロックされていないヌクレオベース類似体であり、本明細書ではNUNAまたはNUNAで表わす）、ロックされたヌクレオチド（本明細書ではNLNAまたはNLNAで表わす）、3'-O-メトキシ（2'ヌクレオチド間連結）ヌクレオチド（本明細書では3'-OMenで表わす）、2'-F-アラビノヌクレオチド（本明細書ではNfANAまたはNfANAで表わす）、モルホリノヌクレオチド、ホスホン酸ビニルデオキシリボヌクレオチド（本明細書ではvpdNで表わす）、ホスホン酸ビニルヌクレオチド（本明細書ではvpNで表わす）が含まれる。2'修飾ヌクレオチド（すなわち、5員糖環の2'位にヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）の非限定的な例には、2'-O-メチルヌクレオチド（本明細書では、ヌクレオチド配列の中の小文字「n」で表わす）、2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチド（本明細書ではNfで表わすが、本明細書で2'-フルオロヌクレオチドとも表記する）、2'-デオキシヌクレオチド（本明細書ではdNで表わす）、2'-メトキシエチル（2'-O-2-メトキシエチル）ヌクレオチド（本明細書ではNMまたは2'-MOEで表わす）、2'-アミノヌクレオチド、2'-アルキルヌクレオチドが含まれる。所与の化合物のあらゆる位置が一様に修飾される必要はない。逆に、単一のHBV RNAiトリガーに2つ以上の修飾を組み込むこと、それどころかそのHBV RNAiトリガーの単一のヌクレオチドに2つ以上の修飾を組み込むことさえできる。HBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖は、本分野で知られている方法で合成および／または修飾することができる。1つのヌクレオチドの修飾は、別のヌクレオチドの修飾とは独立である。
【００４６】
修飾されたヌクレオチドには、修飾されたヌクレオベースを有するヌクレオチドも含まれる。修飾されたヌクレオベースの非限定的な例には、合成されたヌクレオベース、天然のヌクレオベース、5置換されたピリミジン、6-アザピリミジン、N-2置換プリン、N-6置換プリン、O-6置換プリンが含まれ、その中には2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンとグアニンの6-メチルとそれ以外のアルキルの誘導体、アデニンとグアニンの2-プロピルとそれ以外のアルキルの誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、6-アゾチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-ハログアニン、8-アミノアデニン、8-アミノグアニン、8-チオールアデニン、8-チオールグアニン、8-チオアルキルアデニン、8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルアデニン、8-ヒドロキシルグアニン、他の8置換されたアデニンとグアニン、5-ハロウラシルと5-ハロシトシン（特に、5-ブロモウラシルと5-ブロモシトシン、5-トリフルオロメチルウラシルと5-トリフルオロメチルシトシン、他の5置換されたウラシルとシトシン）、7-メチルグアニンと7-メチルアデニン、8-アザグアニンと8-アザアデニン、7-デアザグアニンと7-デアザアデニン、3-デアザグアニンと3-デアザアデニンが含まれる。
【００４７】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーの1つ以上のヌクレオチドが非標準的な連結または骨格（すなわち修飾されたヌクレオシド間連結または修飾されたヌクレオシド間骨格）によって連結される。いくつかの実施態様では、修飾されたヌクレオシド間連結は、非リン酸含有共有結合性ヌクレオシド間連結である。修飾されたヌクレオシド間連結または修飾されたヌクレオシド間骨格の非限定的な例には、ホスホロチオエート、5'-ホスホロチオエート基（本明細書ではヌクレオチドの前に小文字「s」を付けてsN、sn、sNf、sdNと表わす）、キラルホスホロチオエート、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートと他のアルキルホスホネート（3'-アルキレンホスフェートとキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（3'-アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートが含まれる）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルホリノ連結、通常の3'-5'連結を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'連結類似体、極性が逆転していてヌクレオシド単位の隣接したペアの連結が3'-5'→5'-3'または2'-5'→5'-2'であるものが含まれる。別の実施態様では、修飾されたヌクレオシド間連結または修飾されたヌクレオシド間骨格は、リン原子を欠いている。リン原子が欠けた修飾されたヌクレオシド間連結の非限定的な例には、短鎖アルキル糖間連結または短鎖シクロアルキル糖間連結、混合ヘテロ原子糖間連結、アルキル糖間連結またはシクロアルキル糖間連結、1つ以上の短鎖ヘテロ原子糖間連結または短鎖複素環糖間連結が含まれる。いくつかの実施態様では、修飾されたヌクレオシド間骨格の非限定的な例に、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格；ホルムアセチル骨格とチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格とメチレンチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ骨格とメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート骨格とスルホンアミド骨格、アミド骨格；N、O、S、CH2構成部分を混合して有する他のものが含まれる。
【００４８】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、1つ以上の修飾されたヌクレオチドと、1つ以上の修飾されたヌクレオシド間連結を含んでいる。いくつかの実施態様では、2'が修飾されたヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシド間連結と組み合わせる。例えばいくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーのセンス鎖が、1個、または2個、または3個、または4個のホスホロチオエート連結を含むことができる；または、HBV RNAiトリガーのアンチセンス鎖が、1個、または2個、または3個、または4個のホスホロチオエート連結を含むことができる；または、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が、独立に、1個、または2個、または3個、または4個のホスホロチオエート連結を含むことができる。
【００４９】
いくつかの実施態様では、化学的に修飾されたHBV RNAiトリガーは、2本の鎖を有するデュープレックスを含み、その鎖の一方または両方を化学的に修飾することができ、それぞれの鎖は約17個〜約29個のヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを含みつつ、細胞または再構成されたインビトロ系の内部でRNAiが機能する能力を維持している。HBV RNAiトリガーは修飾することができ、その場合の化学的修飾は、1つ以上（例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、修飾されたヌクレオチドを、そのHBV RNAiトリガーの中に存在するヌクレオチドの全数のある割合で含んでいる。そのためHBV RNAiトリガーは、一般に、約5％〜100％のヌクレオチド位置（例えば約5％、または10％、または15％、または20％、または25％、または30％、または35％、または40％、または45％、または50％、または55％、または60％、または65％、または70％、または75％、または80％、または85％、または90％、または95％、または100％のヌクレオチド位置）に修飾されたヌクレオチドを含むことができる。所与のHBV RNAiトリガーに存在する修飾されたヌクレオチドの実際の割合は、そのHBV RNAiトリガーに存在するヌクレオチドの全数に依存する。パーセント修飾は、センス鎖、またはアンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの全数を基準にすることができる。それに加え、所与のHBV RNAiトリガーに存在する修飾されたヌクレオチドの実際の割合は、そのHBV RNAiトリガーに存在するプリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドの全数にも依存する可能性がある。例えばHBV RNAiトリガーに存在する全ピリミジンヌクレオチドおよび／または全プリンヌクレオチドが修飾される。
【００５０】
代表的なHBV RNAiトリガーは、表2に示したデュープレックスID番号によって表される。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、本明細書に提示した任意のデュープレックスID番号からなる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、本明細書に提示した任意のデュープレックスID番号を含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、本明細書に提示した任意のデュープレックスID番号のセンス鎖とアンチセンス鎖の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、本明細書に提示した任意のデュープレックスID番号のセンス鎖とアンチセンス鎖の配列と、そのセンス鎖とアンチセンス鎖に共有結合した標的化基および／または連結基を含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、本明細書に提示した任意のデュープレックスID番号のセンス鎖とアンチセンス鎖の修飾されたヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、本明細書に提示した任意のデュープレックスID番号のセンス鎖とアンチセンス鎖の修飾されたヌクレオチド配列と、そのセンス鎖とアンチセンス鎖に共有結合した標的化基および／または連結基を含んでいる。
【００５１】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、標的化基、および／または連結基、および／または送達ポリマー、および／または送達ビヒクル、および／または他の非ヌクレオチド基を含むか、これらに共役している。標的化基、および／または連結基、および／または送達ポリマー、および／または送達ビヒクル、および／または他の非ヌクレオチド基は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の3'末端および／または5'末端に共有結合させることができる。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、センス鎖の3'末端および／または5'末端に連結した標的化基、または連結基、または送達ポリマー、または送達ビヒクル、または他の非ヌクレオチド基を含んでいる。いくつかの実施態様では、標的化基、または連結基、または送達ポリマー、または送達ビヒクル、または他の非ヌクレオチド基は、HBV RNAiトリガーのセンス鎖の5'末端に連結している。いくつかの実施態様では、標的化基、または連結基、または送達ポリマー、または送達ビヒクル、または他の非ヌクレオチド基は、リンカー／連結基を介してトリガーに直接または間接に連結している。いくつかの実施態様では、標的化基、および／または連結基、および／または送達ポリマー、および／または送達ビヒクル、および／または他の非ヌクレオチド基は、不安定な、または開裂可能な、または可逆的な結合またはリンカーを介してHBV RNAiトリガーのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に連結している。
【００５２】
標的化基は、その標的化基が付着しているRNAiトリガーまたは共役体の薬物動態特性または生体分布特性を向上させて、その共役体の細胞特異的分布または組織特異的分布と細胞特異的取り込みを改善することができる。いくつかの場合には、細胞または細胞受容体へに標的化基を結合させてエンドサイトーシスを開始させることができる。標的化基は、1価、または2価、または3価、または4価であること、またはより大きな価数を持つことができる。代表的な標的化基の非限定的な例には、細胞表面分子への親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、細胞表面分子への親和性を有する抗体模倣体が含まれる。
【００５３】
修飾されていないHBV RNAiトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列は表1Aと表1Bに提示されている。HBV RNAiトリガーを形成するとき、表1Aと表1Bに掲載されている修飾されていない配列のそれぞれに含まれる各ヌクレオチドとして、修飾されていないヌクレオチドが可能である。修飾されていないヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とセンス鎖の非限定的な例も表1Aと表1Bに提示されている。表1Aと表1Bでは、以下の表記を用いて修飾されたヌクレオチドを示す：N＝2'-OH（修飾されていない）リボヌクレオチド（fまたはdのない大文字）；n＝2'-O-メチル（2'-OMe）ヌクレオチド；Nf＝2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチド（2'-フルオロ修飾ヌクレオチドとも呼ぶ）；dN＝2'-デオキシヌクレオチド（デオキシヌクレオチド）；NUNA＝2',3'-セコヌクレオチド模倣体（ロックされていないヌクレオベース類似体）；NM＝2'-メトキシエチルヌクレオチド（2'-MOEとしても示す）；(invdN)＝3'-3'連結（逆転）デオキシリボヌクレオチド（3'-3'連結ヌクレオチド）；(invAb)＝3'-3'連結（逆転）非塩基ヌクレオチド（(invX)としても示す）；x＝非塩基部位；s＝ホスホロチオエート連結ヌクレオチド；p＝ホスフェート；vp＝ホスホン酸ビニル含有ヌクレオチド。
【００５４】
【表１−１】
2018523668.tif 000003
【表１−２】
2018523668.tif 000004
【表１−３】
2018523668.tif 000005
【表１−４】
2018523668.tif 000006
【表１−５】
2018523668.tif 000007
【表１−６】
2018523668.tif 000008
【表１−７】
2018523668.tif 000009
【表１−８】
2018523668.tif 000010
【表１−９】
2018523668.tif 000011
【表１−１０】
2018523668.tif 000012
【表１−１１】
2018523668.tif 000013
【００５５】
【表２−１】
2018523668.tif 000014
【表２−２】
2018523668.tif 000015
【表２−３】
2018523668.tif 000016
【表２−４】
2018523668.tif 000017
【表２−５】
2018523668.tif 000018
【表２−６】
2018523668.tif 000019
【表２−７】
2018523668.tif 000020
【表２−８】
2018523668.tif 000021
【表２−９】
2018523668.tif 000022
【表２−１０】
2018523668.tif 000023
【表２−１１】
2018523668.tif 000024
【表２−１２】
2018523668.tif 000025
【００５６】
【表３−１】
2018523668.tif 000026
【表３−２】
2018523668.tif 000027
【表３−３】
2018523668.tif 000028
【表３−４】
2018523668.tif 000029
【表３−５】
2018523668.tif 000030
【表３−６】
2018523668.tif 000031
【表３−７】
2018523668.tif 000032
【表３−８】
2018523668.tif 000033
【００５７】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、塩、混合塩、遊離酸のいずれかとして調製または提供される。
【００５８】
表1Aと表1Bに示されているように、標的化基と連結基の非限定的な例には、 (Chol-TEG)、(Chol-C6)、(Chol-ALNY)、(NH2-C6)、(C6-SS-Alk-Me)、(Alk-SS-C6)、(C11-PEG3-NAG3)、(NAG13)、(NAG25)、(Toc)、及び(TEG-ビオチン)が含まれる。いくつかの実施態様では、表1Bに掲載されていて3'または5'の標的化基または連結基を含むHBV RNAiトリガーのセンス鎖のどれも、3'または5'の標的化基または連結基を含んでいなくてもよく、異なる3'または5'の標的化基または連結基を含んでいてもよい。
【００５９】
表1Bに掲載されているRNAiトリガーに連結する標的化基と連結基の構造を以下に示すとともに、図1と図2に示す（RNAiトリガーはRNAまたはトリガーで示す）。
【００６０】
【化１】
2018523668.tif 000034
(CHOL-TEG)-RNA、n＝1〜10、いくつかの実施態様ではn＝2。
【００６１】
【化２】
2018523668.tif 000035
(NH2-C)n-RNA、n＝1〜10、いくつかの実施態様ではn＝6（C6）。
【００６２】
【化３】
2018523668.tif 000036
RNA-(C6-SS-Alk-Me)または(Me-Alk-SS-C6)-RNA；（n＝1〜10）、いくつかの実施態様ではn＝4。
【００６３】
【化４】
2018523668.tif 000037
(TEG-ビオチン)
【００６４】
【化５】
2018523668.tif 000038
(C11-PEG3-NAG3)-トリガー
【００６５】
【化６】
2018523668.tif 000039
(NAG13)-トリガー
【００６６】
【化７】
2018523668.tif 000040
(NAG25)-トリガー
【００６７】
生体内送達
【００６８】
本明細書には、HBV RNAiトリガーを哺乳動物の肝臓細胞に生体内で送達する方法が記載されている。いくつかの実施態様では、送達ビヒクルを用いることができる。送達ビヒクルは、細胞へのRNAi剤の送達を改善する化合物である。送達ビヒクルの非限定的な例として、ポリマー（両親媒性ポリマー、膜活性化ポリマーなど）、ペプチド（メリチン、メリチン様ペプチドなど）、可逆的に修飾されたポリマーまたはペプチド、脂質が可能である。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、ガラクトース誘導体を含む標的リガンドに連結される。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、ガラクトース三量体を含むかガラクトース三量体からなる標的リガンドに連結される。いくつかの実施態様には、小さな送達ペプチドと、ミツバチの毒ペプチドに由来するMLPと、1つ以上の独立な標的化なHBV RNAiトリガーを含むHBV RNAiトリガー送達系が記載されている。
【００６９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載したRNAiトリガーは、ガラクトース三量体に連結される。本明細書では、ガラクトース三量体という用語に、ガラクトースと、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性がガラクトースの親和性と等しいかより大きいガラクトースの誘導体の両方が含まれる。ガラクトース三量体は、3つまたは4つのガラクトース誘導体を含み、そのそれぞれがC-1炭素を通じて中央分岐点に連結している。いくつかの実施態様では、ガラクトース誘導体は、リンカーまたはスペーサを介して中央分岐点に連結している。いくつかの実施態様では、リンカーまたはスペーサは、可撓性のある親水性スペーサであり（アメリカ合衆国特許第5,885,968号；Biessen他、J. Med. Chem. 1995年、第39巻、1538〜1546ページ）、非限定的な例としてPEGスペーサがある。いくつかの実施態様では、PEGスペーサはPEG3スペーサである。分岐点として、3〜4個のガラクトース誘導体が付着できて、さらにその分岐点がRNAi剤に付着できる任意の小分子が可能である。RNAi剤への分岐点の付着は、リンカーまたはスペーサを通じて起こることができる。いくつかの実施態様では、リンカーまたはスペーサは、可撓性のある親水性スペーサを含んでいる（PEGスペーサがその非限定的な例）。いくつかの実施態様では、PEGスペーサはPEG3スペーサである（3エチレン単位）。別の実施態様では、PEGスペーサは1〜20個のエチレン単位を有する（PEG1〜PEG20）。いくつかの実施態様では、ガラクトース誘導体は、N-アセチルガラクトサミン（GalNAcまたはNAG）を含んでいる。アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する他の糖類誘導体の選択は、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチル-ガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミンを含むリストからなすことができる。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されてきており（例えばIobst, S.T.とDrickamer, K. J.B.C. 1996年、第271巻、6686ページを参照のこと）、その親和性は本分野で周知かつ一般に使用されている方法を利用して容易に決定される。3つの末端ガラクトース誘導体を有するガラクトース三量体に関する本分野で一般的な他の用語には、3分枝型ガラクトース、3価ガラクトースが含まれる。ガラクトース三量体に関する本分野で一般的な他の用語には、ガラクトースクラスターが含まれる。3分枝型ガラクトース誘導体クラスターは、2分枝型ガラクトース誘導体構造または単分枝型ガラクトース誘導体構造よりも大きな親和性でASGPrに結合する（BaenzigerとFiete、1980年、Cell、第22巻、611〜620ページ；Connolly他、1982年、J. Biol. Chem.、第257巻、939〜945ページ）。
【００７０】
いくつかの実施態様には、
MLP-(L-M)x＋N-T
を含む組成物が記載されている。ただし、NはHBV RNAiトリガーであり、Tは標的化基（コレステロールなど、20個以上の炭素原子を有する疎水性基が含まれる）であり、MLPは本明細書に記載したメリチン様ペプチドであり、マスキング剤Mは、生理学的に不安定な可逆的連結Lを通じてMLPに共有結合した本明細書に記載のASGPrリガンドを含んでいる。本明細書では、MLP-(L-M)xは、MLP送達ペプチドまたは送達ペプチドである。Lの開裂によってMLP上の修飾されていないアミンが復元される。いくつかの実施態様では、オプションの基Yが、MLPのアミノ末端、またはカルボキシル末端、またはシステインに連結される。Yは、存在する場合には、ASGPrリガンド、ポリエチレングリコール（PEG）、ASGPrリガンド-PEGのいずれかを含むことができる。xは1よりも大きい整数である。MLPは、修飾されていない状態では膜活性である。しかし送達ペプチドMLP-(L-M)xは膜活性ではない。Mを付着させることによるMLP第一級アミンの可逆的修飾により、MLPの膜活性が可逆的に抑制または不活性化される。十分な割合のMLP第一級アミンを修飾してこのポリマーの膜活性を抑制し、肝細胞を標的とする。いくつかの実施態様では、xを、あらゆるマスキング剤の不在下でのMLP上の第一級アミンの量によって求めると、MLP上の第一級アミンの数の80％超、または90％超、または95％超の値を持つ。より具体的には、xは、MLP上の第一級アミンの80％超かつ100％までの値を持つ。MLPは、典型的には3〜5個の第一級アミンを含むことに注意されたい（アミノ末端（修飾されていない場合）と、典型的には2〜4個のリシン残基を含む）。したがってアミンの割合の変更には、MLP集団の中のMLPアミンの割合の変更が反映されることを意味する。MLP集団は、当業者にとって重要であると考えられる所定のサンプルサイズの中のMLP集団（例えば容器、用量、製造されたバッチの中の集団）を意味する。いくつかの実施態様では、MLP集団は、製造されたバッチの中のMLPプールである。可逆的連結Lが開裂すると、修飾されていないアミンが復元され、そのことによってMLPが修飾されていない膜活性状態に戻る。いくつかの実施態様では、可逆的連結は、pH不安定性連結、例えば二置換されたマレアメート連結である。MLP-(L-M)x、すなわちASGPrを標的とする可逆的にマスクされた膜活性ポリマー（送達ペプチド）と、T-N、すなわちポリヌクレオチド-共役体は、別々に合成または製造される。TもNも、MLP、L、Mに直接または間接に共有結合していない。マスクされたポリマーまたはマスクされていないポリマーとのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド-共役体の静電的会合または疎水性会合は、生体内でポリヌクレオチドを肝臓に送達するのに必要とされない。マスクされたポリマーとポリヌクレオチド-共役体は、同じ容器で、または別々の容器で供給することができる。これらは、組み合わせた後に投与すること、または同時に投与すること、または順番に投与することができる。
【００７１】
いくつかの実施態様では、ASGPrを標的とする可逆的にマスクされたMLPは、第一級アミンとASGPrリガンド含有マスキング剤の反応によって可逆的に修飾されたMLPを含んでいる。アミンは、修飾基の開裂によってアミンが復元される場合に可逆的に修飾される。本明細書に開示したマスキング剤を用いたMLPの可逆的修飾により、MLPの膜活性が抑制される。可逆的にマスクされたMLPは、マスクされた状態では、膜破壊活性を示さない。いくつかの実施態様では、MLP上のアミンの80％超、または90％超が可逆的に修飾されている。
【００７２】
MLPは、本明細書では、ミツバチの体内で自然に発生する毒ペプチドであるメリチンに由来する、約23〜約32個のアミノ酸を含む小さな両親媒性膜活性ペプチドである。自然に発生するメリチンは26個のアミノ酸を含み、アミノ末端では疎水性が優勢であり、カルボキシ末端では親水性（カチオン性）が優勢である。いくつかの実施態様では、MLPは生物源または合成物から単離される。合成ポリマーは、「人手による」化学的プロセスによって調製または製造され、自然に生じる生物プロセスによっては生まれない。本明細書では、MLPに、MLPファミリーの自然に発生するミツバチ毒ペプチドが包含される。その毒ペプチドを見いだせるのは、例えばApis florea、Apis mellifera、Apis cerana、Apis dorsata、Vespula maculifrons、Vespa magnified、Vespa velutina、Polistes属のHQL-2001種、Polistes hebraeusという種の毒の中である。本明細書では、MLPに、自然に発生するMLPとアミノ酸配列が同じか似た合成ペプチドも包含される。具体的には、MLPのアミノ酸配列に、表3に示した配列が包含される。メリチンに固有の大きな膜活性を保持しているアミノ酸に加え、1〜8個のアミノ酸をこのペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加することができる。具体的には、システイン残基をアミノ末端またはカルボキシ末端に付加することができる。表3のリストはすべてを網羅したものではなく、他の保存されたアミノ酸置換を容易に思いつく。合成MLPは、自然に発生するL-アミノ酸または鏡像異性体D-アミノ酸（インベルソ）を含むことができる。MLPのアミノ酸配列は、逆転させることもできる（レトロ）。レトロMLPは、L-アミノ酸またはD-アミノ酸を持つことができる（レトロインベルソ）。2つのMLPを共有結合させてMLP二量体を形成することもできる。MLPは、マスキング剤以外に、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付着して組織標的化を増進したり生体内循環を容易にしたりする修飾基を持つことができる。しかし本明細書では、MLPに、互いに共有結合したり、別の1つのポリマーまたは足場と共有結合したりしている2つ以上のMLPを含む鎖またはポリマーは含まれない。
【００７３】
いくつかの実施態様では、メリチン様ペプチド（MLP）は、Apis florea（コミツバチまたはヒメミツバチ）のメリチン、Apis mellifera（セイヨウミツバチまたは大きいミツバチ）のメリチン、Apis dorsata（オオミツバチ）のメリチン、Apis cerana（トウヨウミツバチ）のメリチン、またはこれらの誘導体（アミノ酸置換を含む）を含んでいる。いくつかの実施態様では、MLPは、Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-
Xaa15-Leu-Xaa17-Xaa18-Trp-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26という配列を含んでいる。式中、
Xaa1は、ロイシン、D-ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、トリプトファン、バリン、アラニン、ジメチルグリシン、グリシン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はシステインであり、
Xaa2は、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン又はバリンであり、
Xaa3は、グリシン、ロイシン又はバリンであり、
Xaa5は、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン又はバリンであり、
Xaa7は、リシン、セリン、アスパラギン、アラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Xaa10は、アラニン、トレオニン又はロイシンであり、
Xaa11は、トレオニン又はシステインであり、
Xaa12は、グリシン、ロイシン又はトリプトファン、
Xaa15は、トレオニン又はアラニンであり、
Xaa17は、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン又はバリンであり、
Xaa18は、セリン又はシステインであり、
Xaa20は、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン又はバリン、
Xaa21は、リシン又はアラニンであり、
Xaa22は、アスパラギン又はアルギニンであり、
Xaa23は、リシン又はアラニンであり、
Xaa24は、アルギニン又はリシンであり、
Xaa25は、リシン、アラニン又はグルタミンであり、
Xaa26は任意であり、存在する場合には、グルタミン、システイン、グルタミン-NH2又はシステイン-NH2であり、
Xaa21、Xaa23、Xaa25のうちの少なくとも2つはリシンである。
【００７４】
いくつかの実施態様では、MLPは、Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-
Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26という配列を含んでいる。ただし
Xaa1は、ロイシン、D-ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシンのいずれかであり、
Xaa2は、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、バリンのいずれかであり、
Xaa3は、グリシン、ロイシン、バリンのいずれかであり、
Xaa5は、イソロイシン、バリン、ロイシン、ノルロイシンのいずれかであり、
Xaa7は、リシン、セリン、アスパラギン、アラニン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかであり、
Xaa10は、アラニン、トレオニン、ロイシンのいずれかであり、
Xaa11は、トレオンまたはシステインであり、
Xaa12は、グリシン、ロイシン、又はトリプトファンのであり、
Xaa15は、トレオニンまたはアラニンであり、
Xaa17は、イソロイシン、ロイシン、又はノルロイシンであり、
Xaa20は、イソロイシン、ロイシン、又はノルロイシンであり、
Xaa22は、アスパラギンまたはアルギニンであり、
Xaa26は、グルタミンまたはシステインである。
【００７５】
いくつかの実施態様では、MLPは、Xaa1-Xaa2-Gly-Ala-Xaa5-Leu-Lys-Val-Leu-Ala-Xaa11-
Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26という配列を含んでいる。ただし、
Xaa1、Xaa2、Xaa5、Xaa17、Xaa20は、独立に、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシンのいずれかであり、
Xaa11は、トレオンまたはシステインであり、
Xaa22は、アスパラギンまたはアルギニンであり、
Xaa26は、グルタミンまたはシステインである。
【００７６】
【表４−１】
2018523668.tif 000041
【表４−２】
2018523668.tif 000042
【表４−３】
2018523668.tif 000043
【００７７】
いくつかの実施態様では、ASGPrリガンド含有マスキング剤は、電荷が中性であり、二置換された無水マレイン酸アミン反応基に連結されたASGPrリガンドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ASGPrリガンドは、ASGPrに対し、ガラクトース（ガラクトース誘導体）に対するのと同じかそれよりも大きな親和性を有する。ガラクトース誘導体の非限定的な例には、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、ラクトース、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、N-イソ-ブタノイル-ガラクトサミンが含まれる。
【００７８】
いくつかの実施態様では、マスキング剤は、
【化８】
2018523668.tif 000044
によって表される構造を持つ中性の親水性二置換アルキルマレイン酸無水物を含んでいる（式中、R1は、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）リガンドを含み、アルキルの非限定的な例として、メチル（-CH3）、エチル（-CH2CH3）、プロピル（-CH2CH2CH3）であってもよい）。置換されたアルキルマレイン酸無水物の一例は、2-プロピオン性-3-アルキルマレイン酸無水物誘導体からなる。中性の親水性2-プロピオン性-3-アルキルマレイン酸無水物誘導体は、中性の親水性基を、2-プロピオン性-3-アルキルマレイン酸無水物γ-カルボキシル基：
【化９】
2018523668.tif 000045
を介して2-プロピオン性-3-アルキルマレイン酸無水物に付着させることによって形成される。式中、R1は中性ASGPrリガンドを含み、n＝0または1である。いくつかの実施態様では、ASGPrリガンドは、短いPEGリンカーを介して無水物に連結される。
【００７９】
いくつかの実施態様では、ガラクトースリガンドは、以下の構造：
【化１０】
2018523668.tif 000046
によって表されるPEGリンカーを通じて無水物に連結される。ただしnは1〜19の整数である。
【００８０】
アミンと環式無水物の反応によってアミド酸が形成される。
【００８１】
【化１１】
2018523668.tif 000047
【００８２】
アミド酸の開裂によるアミンと無水物の形成はpH依存性であり、酸性pHで大いに加速される。
【００８３】
膜活性ポリアミンは、過剰なマスキング剤の存在下でマスキング剤と共役させることができる。過剰なマスキング剤を共役した送達ペプチドから除去した後にその送達ペプチドを投与することができる。
【００８４】
ASGPrリガンド
【００８５】
標的化部分または標的化基は、その標的化部分または標的化基が付着した共役体の薬物動態特性または生体分布特性を向上させ、その共役体の細胞特異的分布と細胞特異的取り込みを改善する。生体内で分子を肝細胞の表面に発現したアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）に結合させることを通じて肝細胞に向かわせるのにガラクトース誘導体が用いられてきた。本明細書では、ASGPrリガンドは、ASGPrに対してガラクトース（ガラクトース誘導体）に対するのと同じかそれよりも大きな親和性を有するガラクトース誘導体を含んでいる。ASGPrは、ASGPrリガンドが結合することで、肝細胞へと細胞特異的に向かうことと肝細胞へのエンドサイトーシスが容易になる。ASGPrリガンドの選択は、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチル-ガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミンを含むグループからなすことができる（Iobst, S.T.とDrickamer, K.、J. B.C. 1996年、第271巻、6686ページ）。ASGPrリガンドは、単量体（例えば単一のガラクトサミンを有する）または多量体（例えば多数のガラクトサミンを有する）が可能である。いくつかの実施態様では、MLPはASGPrリガンドマスキング剤をペプチド上の80％以上または90％以上の第一級アミンに付着させることによって可逆的にマスクされる。
【００８６】
RNAiトリガー-疎水性基共役体
【００８７】
疎水性基（コレステロール基やコレステリル基など）へのHBV RNAiトリガーの共役と、RNAiトリガー共役体とMLP送達ペプチドの同時投与により、HBV RNAiトリガーが生体内で肝臓細胞、特に肝細胞に効率的、機能的に送達されることを見いだした。いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは疎水性基に共有結合で共役している。トリガーは、反応基Aを含むように合成または修飾することができる。標的化基も反応基Bを含むように合成または修飾することができる。反応基AとBは、本分野で知られている方法を利用して共有結合を通じて連結させることができるように選択される。疎水性基は、HBV RNAiトリガーの3'末端または5'末端に連結させることができる。いくつかの実施態様では、疎水性基は、RNAiトリガーのセンス鎖またはアンチセンス鎖に連結される。いくつかの実施態様では、疎水性基は、RNAiトリガーのセンス鎖に連結される。
【００８８】
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチド標的化部分として有用な疎水性基の選択は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基（そのそれぞれは、直線状、分岐式、環式のいずれでもよい）、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール、ステロイド、ステロイド誘導体からなるグループからなすことができる。疎水性標的化部分は、典型的には、炭素原子と水素原子だけを含む炭化水素である。いくつかの実施態様では、疎水性基の非限定的な例として、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、コレアミドが可能である。送達ペプチドを同時に投与しないと、HBV RNAiトリガーに疎水性標的化基を付着させてもそのHBV RNAiトリガーが生体内で効率的、機能的に送達されることはない。siRNA-コレステロール共役体がsiRNA（siRNA-コレステロール）を追加の送達ビヒクルなしに生体内で肝臓細胞に送達することが別の研究者によって報告されているが、高濃度のsiRNAが必要とされるため、送達効率は低い。本明細書に記載した送達ペプチドと組み合わせると、RNAiトリガーの送達が大きく改善される。HBV RNAiトリガー-コレステロールと送達ペプチドを用意することにより、HBV RNAiトリガーの効率が約100倍大きくなる。いくつかの実施態様では、標的化基をRNAiトリガーのセンス鎖またはアンチセンス鎖に連結させる。疎水性を維持する置換またはヘテロ原子（例えばフッ素）が許される。疎水性標的化基は、本分野で知られている方法を利用してHBV RNAiトリガーの3'末端または5'末端に付着させることができる。2つの鎖を有するHBV RNAiトリガーに関しては、疎水性基をいずれかの鎖に付着させることができる。
【００８９】
疎水性基は、その化学部分が水を回避することを定性的に示している。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向がある。疎水性基は、脂肪、油、脂質、非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力をほとんど持たないか、まったく持たない。二（2）個以上の炭素原子を含む炭化水素、いくつかの置換された炭化水素、コレステロール、コレステロール誘導体が、疎水性基と疎水性化合物の例である。疎水性基は、典型的には、炭素原子と水素原子だけを含む炭化水素である。いくつかの実施態様では、疎水性を維持していて例えばフッ素を含む非極性置換または非極性へテロ原子が許容される。この用語には、脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基（そのそれぞれは、直線状、分岐式、環式が可能である）が含まれる。疎水性基という用語には、ステロール、ステロイド、コレステロール、ステロイド誘導体、コレステロール誘導体も含まれる。本明細書では、コレステリル基は、コレステロールまたはコレステロール誘導体を含む化合物を意味する。
【００９０】
本明細書では、膜活性ペプチドは、生物の膜に対して以下に示す効果の1つ以上を誘導できる、表面活性のある両親媒性ペプチドである。その効果とは、非膜透過性分子が細胞の中に入ったり膜を横断したりできるようにする膜の変化または破壊、膜への孔形成、膜の分裂、膜の破壊または溶解である。本明細書では、膜または細胞膜は、脂質二重層を含んでいる。膜の変化または破壊は、赤血球細胞溶解（溶血）アッセイ、リポソーム漏出アッセイ、リポソーム融合アッセイ、細胞融合アッセイ、細胞溶解アッセイ、エンドソーム放出アッセイのうちの少なくとも1つのアッセイにおけるペプチドの活性によって機能的に定義することができる。細胞膜の溶解を引き起こすことのできる膜活性ペプチドは、膜溶解性ペプチドとも呼ばれる。形質膜上でエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすペプチドは、エンドソーム溶解性であると見なされる。細胞膜に対する膜活性ペプチドの効果は一過性である可能性がある。膜活性ペプチドは膜に対する親和性を持っていて、二層構造の変性または変形を引き起こす。
【００９１】
ポリヌクレオチドまたは核酸またはポリ核酸という用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する専門用語である。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。モノマー単位が120個未満のポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ばれることがしばしばある。天然の核酸はデオキシリボース骨格またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成のポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されたポリヌクレオチドであり、同じか似た塩基を含んでいるが、天然のリボース骨格またはデオキシリボース-リン酸骨格とは異なるタイプの骨格を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、本分野で知られている任意の技術を利用して合成することができる。本分野で知られているポリヌクレオチド骨格には、PNA（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノや、天然の核酸のリン酸骨格の他のバリアントが含まれる。塩基にはプリンとピリミジンが含まれ、そこにはさらに、天然の化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシンと、天然の類似体が含まれる。プリンとピリミジンの合成誘導体の非限定的な例には、ヌクレオチドに新たな反応基（アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、アルキルハロゲン化物などだが、これらに限定されない）を配置する修飾が含まれる。塩基という用語には、DNAとRNAの既知の任意の塩基類似体が包含される。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチドや、これらの適切な任意の組み合わせを含むことができる。ポリヌクレオチドはインビトロで重合させることができ、組み換えであってもよく、キメラ配列やこれらの基の誘導体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、5'末端に、または3'末端に、または5'末端と3'末端の両方に末端キャップ基を含むことができる。キャップ基の非限定的な例として、逆転したデオキシ非塩基基、逆転したデオキシチミジン、チミジン、3'グリセリル修飾が可能である。
【００９２】
RNA干渉（RNAi）トリガーは、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導して配列特異的なやり方で導入遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物の翻訳を低下させる、または抑制することのできる分子である。2つの主要なHBV RNAiトリガーは、小さい（または短い）干渉RNA（siRNA）とマイクロRNA（miRNA）である。HBV RNAiトリガーの選択は、siRNA、マイクロRNA（miRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、RNA干渉を誘導できるRNAをコードしている発現カセットを含むグループからなすことができる。RNAiトリガーは、典型的には15〜50個の塩基対を含む二本鎖構造を含んでいる。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーは、17〜26個の塩基対を含み細胞内で発現した標的遺伝子またはRNAのコード配列と同じかほぼ同じ（部分的に相補的）ヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含んでいる。RNAiトリガーは、ジヌクレオチド3'オーバーハングを持つことができる。RNAiトリガーは、2つのアニールされたポリヌクレオチドで構成すること、またはヘアピン構造を形成する単一のポリヌクレオチドで構成することができる。RNAiトリガーは、センス領域とアンチセンス領域を含んでいる。いくつかの実施態様では、RNAiトリガーは、2つのオリゴヌクレオチド断片から組み立てられる。そのとき一方の断片はそのRNAiトリガーのアンチセンス領域のヌクレオチド配列を含み、第2の断片はそのRNAiトリガーのセンス領域のヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、センス鎖はリンカー分子（ポリヌクレオチドリンカーや非ヌクレオチドリンカーなど）を介してアンチセンス鎖に接続される。マイクロRNA（miRNA）は、長さが約22個のヌクレオチドからなる小さい非コードRNA遺伝子産物であり、そのmRNA標的の破壊または転写抑制を指揮する。miRNAと標的mRNAの間の相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳が抑制される。相補性が広範囲にわたる場合、標的mRNAが開裂する。miRNAの場合、複合体は、一般にmiRNAとほんの一部しか相同性を共有していないmRNAの3'UTRに通常位置する標的部位に結合する。「種領域」（miRNAの5'末端における約七（7）個の連続したヌクレオチドからなり、対応する標的と完全な塩基対を形成する伸長部）が、miRNAの特異性において鍵となる役割を果たす。mRNAにRISC/miRNA複合体が結合することで、タンパク質翻訳、またはmRNAの開裂と分解を抑制することができる。最近のデータは、mRNAの開裂が優先的に起こるのは、miRNAとその標的の全長にわたって完全な相同性が存在している場合であり、種領域でだけ完全な塩基対形成を示す場合ではないことを示している（Pillai他、2007年）。
【００９３】
HBV RNAiトリガーは、化学的に修飾することができる。そのような化学的修飾の非限定的な例に含まれるのは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、逆転したデオキシ非塩基残基組み込みである。これらの化学的修飾は、さまざまなポリヌクレオチドコンストラクトで用いるとき、細胞内でポリヌクレオチド活性を維持すると同時に、これら化合物の血清安定性を増大させることが示されている。化学的に修飾されたRNAiトリガーは、ヒトでインターフェロン活性を増大させる可能性を最小にすることもできる。
【００９４】
相補性という用語は、ポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチド配列と伝統的なワトソン-クリック方式によって、または他の非伝統的な方式によって水素結合を形成する能力を意味する。ポリヌクレオチド分子に関し、あるポリヌクレオチド分子が対応する標的（エフェクタ結合部位）または相補的配列と結合する自由エネルギーは、そのポリヌクレオチドの重要な機能（例えば酵素によるmRNAの開裂または翻訳の抑制）が進行することを可能にするのに十分である。核酸分子が結合する自由エネルギーを求める方法は本分野で周知である（Frier他 1986年、Turner他 1987年）。パーセント相補性は、第1のポリヌクレオチド分子の連続した鎖のうちで第2のポリヌクレオチド配列と水素結合を形成すること（例えばワトソン-クリック型塩基対形成）が可能な塩基の割合を示す（例えば10個のうちの5個、6個、7個、8個、9個、10個、すなわち50％、60％、70％、80％、90％、100％の相補性）。完全な相補性は、ポリヌクレオチド配列の連続した鎖の中のすべての塩基が第2のポリヌクレオチド配列の中の同数の連続した塩基と水素結合することを意味する。
【００９５】
遺伝子発現を抑制する、下方調節する、ノックダウンするとは、その遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはそのRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質、タンパク質サブユニットのレベルを測定したとき、その遺伝子の発現が、阻止機能のあるポリヌクレオチド-共役体の不在下で観察されたよりも低下していることを意味する。いくつかの実施態様では、記載した組成物によって送達されたポリヌクレオチドを用いた遺伝子発現の抑制、下方調節、ノックダウンにより、対照である不活性な核酸、またはスクランブル配列を有する核酸、または不活性にするミスマッチの存在下で観察されるレベル、またはマスクされたポリマーへのポリヌクレオチドの共役の不在下で観察されるレベルよりも低くなる。
【００９６】
生体内投与
【００９７】
薬物学と毒物学では、投与経路は、薬、流体、毒や、それ以外の物質を身体と接触させる経路である。一般に、哺乳動物を治療するための薬や核酸を投与する方法は本分野で周知であり、記載した組成物の投与に適用できる。いくつかの実施態様では、記載した組成物は、適切な任意の経路（非限定的な例として非経口経路がある）を通じ、その経路に適するようにした調製物として投与することができる。したがっていくつかの実施態様では、記載した組成物は、注射によって、例えば静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射によって投与することができる。いくつかの実施態様では、医薬として許容可能な基剤または賦形剤を含む医薬組成物を記載する。
【００９８】
投与の非経口経路に含まれるのは、注射器と針、またはカテーテルを用いた血管内（静脈内、動脈内）注射、筋肉内注射、柔組織内注射、皮内注射、皮下注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、硬膜下腔内注射、硬膜下注射、硬膜外注射、リンパ管内注射である。本明細書では、血管内は、体内の組織または臓器につながっていて血管と呼ばれる管構造の中を意味する。管構造の空洞の中を体液が身体の部分へと流れていったり、身体の部分から流れてきたりする。体液の例には、血液、脳脊髄液（CSF）、リンパ液、胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、小動脈、毛細血管、小静脈、洞様毛細血管、静脈、リンパ管、胆管、唾液腺またはそれ以外の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、血管（動脈や静脈など）を通じた送達が含まれる。血液循環系は、医薬を全身に広げる。
【００９９】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガー-標的化基共役体は、送達ペプチドと同時に投与される。同時に投与するとは、HBV RNAiトリガーと送達ペプチドを、その両方が同時に哺乳動物の中に存在するようにその哺乳動物に投与することを意味する。HBV RNAiトリガー-標的化基共役体と送達ペプチドは、同時に投与すること、または逐次的に送達することができる。同時投与のためには、その両者を混合した後に投与することができる。逐次投与のためには、HBV RNAiトリガー-標的化基共役体または送達ペプチドを最初に投与することができる。
【０１００】
医薬組成物
【０１０１】
いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーの少なくとも1つを、HBV発現の低下または抑制からの恩恵があると考えられる対象を治療するための医薬組成物の調製に用いる。その医薬組成物は、細胞、組織、臓器のいずれかにおけるHBVの発現抑制に有用である。いくつかの実施態様では、記載した医薬組成物は、HBV発現の低下または抑制からの恩恵があると考えられる疾患または異常を持つ対象を治療するのに用いられる。
【０１０２】
本明細書で用いる医薬組成物または薬は、記載したHBV RNAiトリガーの少なくとも1つを薬学的に有効な量含むとともに、1つ以上の医薬として許容可能な賦形剤を含んでいる。医薬として許容可能な賦形剤（賦形剤）は、安全性の評価が適切になされていて薬送達系に意図的に含まれるようにした活性医薬成分（API、治療用製品、例えばRNAiトリガー）以外の物質である。賦形剤は、想定する用量では、治療効果を及ぼさないか、及ぼすとは想定されていない。賦形剤は、a）製造中に薬送達系の処理を助ける、および／またはb）APIの安定性、生体利用性、患者の受容性を保護、サポート、増進する、および／またはc）製品の同定を助ける、および／またはd）保管中または使用中にAPIの全体的な安全性、有効性、送達の他のあらゆる属性を増進するという作用を持つことができる。医薬として許容可能な賦形剤は、不活性な物質であってもなくてもよい。
【０１０３】
賦形剤の非限定的な例には、吸収増進剤、抗接着剤、抗発泡剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、基剤、被覆剤、着色剤、送達増進剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香料、流動促進剤、湿潤剤、潤滑剤、油、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩類、溶媒、糖類、懸濁剤、持続放出マトリックス、甘味剤、増粘剤、等張剤、ビヒクル、撥水剤、湿潤剤が含まれる。
【０１０４】
医薬組成物は、医薬組成物に一般に見いだされる他の追加成分を含むことができる。そのような追加成分の非限定的な例には、かゆみ止め、収斂剤、局所麻酔剤、抗炎症剤（例えば抗ヒスタミン、ジフェンヒドラミンなど）が含まれる。本明細書に規定したRNAiトリガーを発現する、または含む細胞、組織、単離された臓器を「医薬組成物」として用いることも考えられる。
【０１０５】
本明細書では、「薬学的に有効な量」、「治療に有効な量」、あるいは単に「有効量」は、想定する薬学的結果、治療結果、予防効果を生み出すRNAiトリガーの量を意味する。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーは、1つ以上の追加の治療薬または治療剤と組み合わされる。治療薬または治療剤の非限定的な例には、第2のHBV RNAiトリガーかそれ以外のRNAi剤、小分子薬、抗体、抗体断片、ワクチンが含まれる。
【０１０７】
記載したHBV RNAiトリガーと、本明細書に開示したHBV RNAiトリガーを含む医薬組成物は、キット、容器、パック、ディスペンサーいずれかの中に収容すること、または含めることができる。HBV RNAiトリガーと、そのHBV RNAiトリガーを含む医薬組成物は、あらかじめ充填した注射器またはバイアルの中に収容することができる。
【０１０８】
治療法
【０１０９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載したHBV RNAiトリガーは、HBVに感染した対象を治療するのに用いられる。いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーは、HBVに感染した対象の少なくとも1つの症状を治療するのに用いられる。その対象は、記載したRNAiトリガーのうちのどれか1つ以上を、治療に有効な量投与される。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、HBVに感染した対象の臨床症状を治療または管理するのに用いられる。その対象には、1つ以上のHBV RNAiトリガー、または本明細書に記載したHBV RNAiトリガーを含む組成物が、治療に有効な量で投与される。いくつかの実施態様では、治療法は、本明細書に記載したHBV RNAiトリガー分子を含む組成物を治療すべき対象に投与することを含んでいる。
【０１１１】
本明細書では、遺伝子の発現を「沈黙させる」、「低下させる」、「抑制する」「下方調節する」、「ノックダウンする」という用語は、HBV遺伝子に関して用いる場合、そのHBV遺伝子の転写がなされる細胞、細胞群、組織の中でその遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはmRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質、タンパク質サブユニットのレベルによって測定されるその遺伝子の発現が、記載したHBV RNAiトリガーを用いて細胞、細胞群、組織を治療するときには、そのような治療がなされていない第2の細胞、細胞群、組織と比べて、またはHBV RNAiトリガーを投与する前の同じ細胞、細胞群、組織と比べて低下することを意味する。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーを投与された対象におけるHBV遺伝子の遺伝子発現レベルおよび／またはmRNAのレベルは、そのHBV RNAiトリガーを投与される前の対象、またはHBV RNAiトリガーを投与されていない対象と比べて少なくとも約5％、または約10％、または約15％、または約20％、または約25％、または約30％、または約35％、または約40％、または約45％、または約50％、または約55％、または約60％、または約65％、または約70％、または約75％、または約80％、または約85％、または約90％、または約95％、または約98％低下する。対象における遺伝子発現レベルおよび／またはmRNAのレベルは、その対象の細胞、および／または細胞群、および／または組織において低下する可能性がある。いくつかの実施態様では、記載したHBV RNAiトリガーを投与された対象におけるHBVのタンパク質レベルは、そのHBV RNAiトリガーを投与される前の対象、またはHBV RNAiトリガーを投与されていない対象と比べて少なくとも約5％、または約10％、または約15％、または約20％、または約25％、または約30％、または約35％、または約40％、または約45％、または約50％、または約55％、または約60％、または約65％、または約70％、または約75％、または約80％、または約85％、または約90％、または約95％、または約98％低下する。対象におけるタンパク質レベルは、その対象の細胞、および／または細胞群、および／または組織、および／または血液、および／またはそれ以外の体液で低下する可能性がある。遺伝子発現、またはmRNA、またはタンパク質のレベルの低下は、本分野で知られている任意の方法で評価することができる。HBV mRNAのレベルおよび／またはタンパク質のレベルの低下または減少は、本明細書ではまとめてHBVの低下または減少、またはHBVの発現の抑制または減少と呼ぶ。
【０１１３】
「細胞内に導入する」は、RNAiトリガーに関して用いる場合、そのRNAiトリガーを細胞内に機能可能に送達することを意味する。機能可能な送達とは、RNAiトリガーが細胞に送達されて予想される生物活性（例えば遺伝子発現の配列特異的抑制）を持つことを意味する。
【０１１４】
投与経路は、RNAiトリガーを身体と接触させる経路である。一般に、対象を治療するために薬と核酸を投与する方法は本分野において周知であり、本明細書に記載した組成物の投与に適用することができる。本明細書に記載した化合物は、適切な任意の経路を通じ、その特定の経路に適するようにした調製物の中に入れて投与することができる。したがって本明細書に記載した化合物は、例えば静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射によって投与することができる。
【０１１５】
実施例
【０１１６】
実施例1  MLPの合成
すべてのMLPを、本分野で標準的なペプチド合成技術を利用して作製した。適切なMLPとして、あらゆるL-アミノ酸、あらゆるD-アミノ酸（インベルソ）が可能である。L系であるかD系であるかに関係なく、MLP配列は逆転させることができる（レトロ）。
【０１１７】
実施例2  MLPのアミノ末端修飾
CKLK-MLP（20 mg/ml）とTCEP-HCl（28.7 mg/ml、100 mM）とMES-Na（21.7 mg/ml、100 mM）の溶液をdH2Oの中に調製した。20 mlのシンチレーションバイアルの中で、CKLK-MLP（0.030ミリモル、5 ml）を1.7モル当量のTCEP-HCl（0.051ミリモル、0.51 ml）と反応させ、室温で30分間撹拌し続けた。次に、最終濃度が10 mg/ml MLPかつ20 mM MES-Naとなる量のMES-Na（2 ml）と水（1.88 ml）を添加した。pHを調べ、pH 6.5〜7に調節した。NAG-PEG2-Br（100 mg/ml）の溶液をdH2Oの中に調製した。NAG-PEG2-Br（4.75当量、0.142ミリモル、0.61 ml）を添加し、溶液を室温で48時間撹拌し続けた。
【０１１８】
あるいは20 mlのシンチレーションバイアルの中で、Cys-MLP（0.006ミリモル、1 ml）を1.7モル当量のTCEP-HCl（0.010ミリモル、100μl）と反応させ、室温で30分間撹拌し続けた。最終濃度が10 mg/ml MLPかつ20 mM MES-Naとなる量のMES-Na（400μl）と水（390μl）を添加した。pHを調べ、pH 6.5〜7に調節した。NAG-PEG8-マレイミド（100 mg/ml）の溶液をdH2Oの中に調製した。NAG-PEG8-マレイミド（2当量、0.012ミリモル、110μl）を添加し、溶液を室温で48時間撹拌し続けた。
【０１１９】
Luna 10μC18 100Å21.2×250 mmカラムでサンプルを精製した。緩衝液A：H2O 0.1％TFAと緩衝液B：MeCN、10％イソプロピルアルコール、0.1％TFA。流速は15 ml/分、20分間で35％Aから62.5％Bへ。
【０１２０】
他のアミノ末端修飾は、同様の手段を利用して実現した。カルボキシル末端修飾を実施し、カルボキシル末端にシステインを有するMLPをアミノ末端にシステインを有するMLPで置換した。
【０１２１】
修飾されたCys-MLPまたはMLP-Cysで用いる化合物：
【化１２】
2018523668.tif 000048
PEGマレイミド - 式II
nは1〜120の整数である（PEGの分子量は約5 kDaまで）
【化１３】
2018523668.tif 000049
NAG-PEGマレイミド - 式I
【化１４】
2018523668.tif 000050
N-NAG-PEGブロモアセチミド
【０１２２】
本分野で典型的な方法を利用したペプチド合成の間に、アミノ末端またはカルボキシル末端に、末端システイン残基ではなく、アセチル、ジメチル、ステアロイル、ミリストイル、PEGという修飾を有するペプチドを樹脂表面に作製した。
【０１２３】
実施例3  マスキング剤の合成
【０１２４】
A。pH不安定性マスキング剤：立体安定剤CDM-PEGと標的化基CDM-NAG（N-アセチルガラクトサミン）の合成。CDM（300 mg、0.16ミリモル）を50 mlの塩化メチレンに溶かした溶液に塩化オキサリル（2 g、10重量当量）とジメチルホルムアミド（5μl）を添加した。一晩反応させた後、過剰な塩化オキサリルと塩化メチレンをロータリーエバポレーションによって除去すると、CDM酸塩化物が得られた。この酸塩化物を1 mlの塩化メチレンに溶かした。この溶液に、CDM-PEGのためのポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子量550）、またはCDM-NAG のための(アミノエトキシ)エトキシ-2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド（すなわちアミノビスエトキシ-エチルNAG）を1.1モル当量と、ピリジン（200μl、1.5当量）を含む10 mlの塩化メチレンを添加した。次にこの溶液を1.5時間撹拌した。次に溶媒を除去し、得られた固形物を5 mlの水に溶かし、0.1％TFA水／アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCを利用して精製した。
【０１２５】
【化１５】
2018523668.tif 000051
CDM
【０１２６】
【化１６】
2018523668.tif 000052
一般的な二置換無水マレイン酸マスキング剤
R1は中性ASGPrリガンドを含む。いくつかの実施態様では、このマスキング剤は帯電していない。
【０１２７】
【化１７】
2018523668.tif 000053
CDM-PEG
Rはメチルまたはエチルであり、nは2〜100の整数である。いくつかの実施態様では、PEGは5〜20個のエチレン単位を含んでいる（nは5〜20の整数）。いくつかの実施態様では、PEGは10〜14個のエチレン単位を含んでいる（nは10〜14の整数）。PEGは長さを変えることができ、平均長は5〜20個または10〜14個のエチレン単位である。あるいはPEGは、単分散状態、均一状態、離散状態にすることができ、例えば正確に11個または13個のエチレン単位を有する。
【０１２８】
【化１８】
2018523668.tif 000054
CDM-NAG - 式I
nは1〜10の整数である。上に示したように、PEGスペーサは無水物基とASGPrリガンドの間に位置させることができる。いくつかの実施態様では、PEGスペーサは1〜10個のエチレン単位を含んでいる。
【０１２９】
あるいはアルキルスペーサを無水物とN-アセチルガラクトサミンの間に用いることができる。
【化１９】
2018523668.tif 000055
CDM-NAG（アルキルスペーサ）
nは0〜6の整数である。
【０１３０】
他のスペーサまたはリンカーを無水物とN-アセチルガラクトサミンの間に用いることができる。いくつかの実施態様では、親水性のスペーサまたはリンカーを用いる。いくつかの実施態様では、中性のスペーサまたはリンカーを用いる。
【０１３１】
実施例4  MLPの可逆的修飾／マスキング
【０１３２】
A。無水マレイン酸系マスキング剤を用いた修飾。修飾の前に、5x mgの二置換無水マレイン酸マスキング剤（例えばCDM-NAG）を氷酢酸の0.1％水溶液から凍結乾燥させた。乾燥させた二置換無水マレイン酸マスキング剤に、x mgのMLPを0.2x mlの等張グルコースに溶かした溶液と、10x mgの無HEPES塩基を添加した。無水物を完全に溶解させてからこの溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした後、動物に投与した。二置換無水マレイン酸マスキング剤とペプチドの反応によって
【化２０】
2018523668.tif 000056
が生じた。ここにRはMLPであり、R1はASGPrリガンド（例えばNAG）を含んでいる。無水物とポリマーアミンの間の反応で生じた無水カルボキシルは、電荷が予想の約1/20である（Rozema他、Bioconjugate Chemistry、2003年）。したがってこの膜活性ポリマーは、負電荷が大きいポリアニオンに変換されるのではなく、うまく中性化されている。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、マスクされたMLP（MLP-(CDM-NAG)）は、125 mgのMLP、500 mgのデキストラン1K、3.18 mgの炭酸ナトリウム、588 mgの炭酸水素ナトリウムを5 mlの水の中に含む溶液の中に存在していた。いくつかの実施態様では、MLP-(CDM-NAG)は凍結乾燥された。
【０１３４】
B。プロテアーゼで開裂可能なマスキング剤を用いた修飾。NAGを含有していてプロテアーゼで開裂可能な基質のアミン反応性炭酸p-ニトロフェニル誘導体またはアミン反応性炭酸N-ヒドロキシスクシンイミド誘導体を2〜6x mg添加することにより、1x mgのペプチドと10x mgのHEPES塩基を、ペプチドが1〜10 mg/mlの状態でマスクした。次にこの溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１３５】
実施例5  HBV RNAiトリガー-標的化分子共役体
【０１３６】
（1）アルキル基へのRNAiトリガーの共役。Glen Research社（ヴァージニア州、アメリカ合衆国）からの5'-カルボキシ修飾剤C10アミダイトを用いてRNAiトリガーの5'-C10-NHSエステル修飾センス鎖（NHSC10-RNAiトリガー、またはCOC9-RNAiトリガー）を調製した。固体支持体にまだ付着している活性化されたRNAを、下記の表4に掲載した親油性アミンと共役させるのに用いた。100 mgのセンス鎖CPG（量は60マイクロモル/g、0.6マイクロモルのRNA）を、Sigma Aldrich Chemie GmbH社（タウフキルヒェン、ドイツ国）またはFluka社（Sigma Aldrich社、ブーフス、スイス国）から取得した0.25ミリモルの対応するアミンと混合した。
【０１３７】
【表５】
2018523668.tif 000057
【０１３８】
この混合物を40℃で18時間振盪した。RNAを固体支持体から分離させ、水酸化アンモニウム水溶液（NH3、33％）を45℃で一晩用いて保護を外した。TEA×3HFを65℃で3.5時間用いて2'-保護基を除去した。粗オリゴリボヌクレオチドをRP-HPLCによって精製した（Resource RPC 3 ml、緩衝液：A：水中の100 mM TEAA、B：95％CH3CNの中の100 mM TEAA、勾配： 15 CVの中で3％Bから70％Bへ。ただし番号7は例外であり、15 CVの中で3％Bから100％Bへという勾配）。
【０１３９】
RNA一本鎖からRNAiトリガーを生成させるため、同じモル量の互いに相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖をアニーリング緩衝液（20 mMのリン酸ナトリウム、pH 6.8；100 mMの塩化ナトリウム）の中で混合し、3分間80℃に加熱し、3〜4時間かけて室温まで冷却した。因子VIIのmRNAに向かうRNAiトリガーをゲル電気泳動によって特徴づけた。
【０１４０】
（2）コレステロールへのHBV RNAiトリガーの共役 - 本分野で標準的な方法を利用してHBV RNAiトリガー-コレステロール共役体を合成した。コレステロールは、トリガーのセンス鎖またはアンチセンス鎖の5'末端または3'末端に付着させることができる。いくつかの実施態様では、付着は、トリガーのセンス鎖の5'末端に対してなされる。トリガー-コレステロールは、トリガーを合成した後に、本分野で標準的な方法を利用し、反応基（例えばチオール、アミン、カルボキシル）を含むRNA鎖を用いて作製することもできる。
【０１４１】
実施例6  HBV RNAiトリガーの生体内投与と肝細胞への送達
RNAiトリガーとマスクされたMLPを上記のようにして合成した。6〜8週齢のマウス（株C57BL/6またはICR、それぞれ約18〜20 g）をHarlan Sprague Dawley社（インディアナポリス、イリノイ州）から取得した。注入の前にマウスを少なくとも2日間飼育した。食餌は、Harlan Teklad Rodent Diet（Harlan社、マディソン、ウィスコンシン州）を自由に摂取させた。マウスの尾の静脈に0.2 mlの送達ペプチド溶液と0.2 mlのRNAiトリガー共役体を注入した。送達ペプチドとRNAiトリガーを同時に注入するため、修飾されたペプチドにRNAiトリガー-共役体を添加した後に注入し、全量を注入した。組成物は生理的条件下では可溶性であり、凝集しなかった。溶液を輸液によって尾の静脈に注入した。他の血管（例えば後眼窩注入）への注入は、同じように有効であることが予想される。
【０１４２】
指示された配列を有するMLPを上記のようにしてCDM-NAG（5x）で可逆的に修飾した。次に、指示された量のMLPを、指示された量のApoB RNAiトリガー-コレステロール共役体と同時に注入した。ApoBのレベルに対する効果を上記のようにして求めた。
【０１４３】
【表６−１】
2018523668.tif 000058
【表６−２】
2018523668.tif 000059
【０１４４】
実施例7  HBV RNAiトリガーをMLP送達ペプチドとともに送達した後の生体内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の低減
【０１４５】
A）pHBVモデルマウス：-42日目に、6〜8週齢のメスNOD.CB17-Prkdscid/NcrCrl（NOD-SCID）マウスに、ハイドロダイナミック法で尾の静脈に注射すること（Yang PL他、「ハイドロダイナミック法によるウイルスDNAの注射：急性B型肝炎ウイルス感染のマウスモデル」、PNAS USA 2002年、第99巻：13825〜13830ページ）によってMC-HBV1.3を一過性に生体トランスフェクトした。MC-HBV1.3はプラスミドに由来するミニサークルであり、HBV1.3.32トランスジェニックマウスと同じ末端冗長ヒトB型肝炎ウイルス配列HBV1.3を含んでいる（GenBank登録#V01460）（Guidotti LG他、「トランスジェニックマウスにおける高レベルのB型肝炎ウイルス複製」、J Virol 1995年、第69巻、6158〜6169ページ）。10μgのMC-HBV1.3を全体積がマウスの体重の10％のリンゲル溶液に入れて尾の静脈からマウスに注入し、慢性HBV感染のpHBVモデルを作製した。この溶液の注入は、以前に報告されている（Zhang G他、「裸のプラスミドDNAを尾の静脈から注入した後の肝細胞における高レベルの外来遺伝子発現」、Human Gene Therapy 1999年、第10巻、1735〜1737ページ）ようにして、27ゲージの針を通じて5〜7秒で実施した。トランスフェクションの3週間後である-21日目、血清中のB型肝炎表面抗原（HBsAg）の発現レベルをELISAによって測定し、マウスを平均HBsAg発現レベルに従ってグループ分けした。
【０１４６】
B）HBV RNAiトリガー：
コレステロール-C6-RNAiトリガーの構造：
【化２１】
2018523668.tif 000060
【０１４７】
AD00009とAD00010を合成し、精製し、ハイブリダイズさせ（センス鎖とアンチセンス鎖）、1：1のモル比で組み合わせた。組み合わせたそのRNAiトリガーをその後の全手続きで使用した。
【０１４８】
B型肝炎ウイルスRNAiトリガーは、アメリカ合衆国特許出願公開第2013-0005793号（アメリカ合衆国特許第8,809,293号）に記載されており、その内容は参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１４９】
C）MLP送達ペプチド：250 mMのHEPES緩衝化水溶液の中でCDM-NAGをMLP（配列ID番号650（G1L MLP、L系））に5：1（w/w）の比で室温にて添加し、30分間インキュベートすると、MLP送達ペプチドが得られた。4M NaOHを用いてこの反応混合物のpHを9.0に調節した。2,4,6-トリニトロベンゼン-スルホン酸を用いて反応の程度を調べ、95％超であると判断した。MLP送達ペプチドを10 mM炭酸水素塩緩衝液（pH 9.0）の中でタンジェンシャルフローによって精製し、そこに10％デキストラン（w/w）を添加した。精製した最終材料を凍結乾燥させた。
【０１５０】
D）HBV RNAiトリガー送達組成物の形成：凍結乾燥させた5 mgのMLP送達ペプチドを1 mlの水に再懸濁させた。次に、MLP送達ペプチドをHBV RNAiトリガーと1：1の比（w/w）（約5.49：1のモル比）で組み合わせた。等張グルコースを必要に応じて添加し、1回ごとの注入体積を200μlにした。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーは、0.069 g/lのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物と0.071 g/lのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物も含んでいる溶液中で26 g/lの濃度であった。
【０１５２】
いくつかの実施態様では、注入した4.8 mlの溶液は、25.0 g/lのHBV RNAiトリガーと、25.0 g/lのMLP-(CDM-NAG)と、0.066 g/lのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物と、0.068 g/lのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物と、0.1 g/lのデキストラン1Kと、0.318 g/lの炭酸ナトリウムと、0.588 g/lの炭酸水素ナトリウムを含んでいた。
【０１５３】
E）RNAiトリガーの送達：1日目、各マウスの尾の静脈を通じ、2、4、8 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガー、または等張グルコース、または8 mg/kgのMLP送達ペプチドを含む200μlを1回だけ静脈内投与した。
【０１５４】
F）分析： MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーの投与、または等張グルコースの投与、またはMLP送達ペプチドだけの投与の前と後のさまざまな時点で、血清HBsAg、または血清HBV DNA、または肝臓HBV RNAを測定した。HBVの発現レベルは、等張グルコースを注入した対照マウスに規格化した。
【０１５５】
i）血清回収：マウスを2〜3％イソフランで麻酔し、血液サンプルを下顎下領域から回収して血清分離管（Sarstedt AG&Co.社、ニュムブレヒト、ドイツ国）に入れた。血液を周囲温度で20分間放置して凝固させた。血清分離管を8,000×gで3分間遠心分離して血清を分離し、4℃で保管した。
【０１５６】
ii）血清B型肝炎表面抗原（HBsAg）のレベル：血清を回収し、5％無脂粉乳を含むPBSの中で10〜2000倍に希釈した。その無脂乳溶液の中に希釈した二次HBsAg基準を、10μgのHBsAg 発現プラスミドpRc/CMV-HBs（Aldevron社、ファルゴ、ノースダコタ州）をトランスフェクトしてあったICRマウス（Harlan Sprague Dawley社）の血清から調製した。HBsAgのレベルは、GS HBsAg EIA 3.0キット（BioRad Laboratories, Inc.社、レッドモンド、ワシントン州）を製造者が記載しているようにして用いて求めた。組み換えHBsAgタンパク質のaywサブタイプをやはりPBS中の無脂乳に希釈して一次標準として用いた（Aldevron社）。
【０１５７】
処理なしに関するMC-HBV1.3の発現の低下を明らかにするため、各マウスのHBsAg発現を、等張グルコースを注入した対照群のマウスに規格化した。最初に、ある時点での各マウスのHBsAgのレベルをそのマウスにおける処理前（-1日目）の発現レベルで割り算し、「処理前レベルに規格化した」発現の比を求めた。次に、個々のマウスについて「処理前レベルに規格化した」比を、等張グルコース対照群の全マウスの「処理前レベルに規格化した」比の平均値で割り算することによって特定の時点での発現を対照群に規格化した。
【０１５８】
iii）血清HBV DNAのレベル：1つの群のマウスからの同体積の血清をプールして最終体積を100μlにした。QIAmp MinElute Virus Spin Kit（Qiagen社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）を製造者の指示に従って用いてDNAを血清サンプルから単離した。無菌0.9％生理食塩水を各サンプルに添加して最終体積を200μlにした。緩衝液とプロテアーゼを入れた試験管に血清サンプルを添加した。少量のDNAを単離しやすくするためキャリアRNAを添加した。1 ngのpHCR/UbC-SEAPプラスミドDNA（Wooddell CI他、「成体マウスにおける最適化したsiRNA発現コンストラクトからの長期RNA干渉」、Biochem Biophys Res Commun（2005年）第334巻、117〜127ページ）を回復対照として添加した。56℃で15分間インキュベートした後、エタノールを用いて核酸をライセートから沈殿させ、全溶液をカラムに適用した。洗浄後、サンプルを体積50μlの緩衝液AVEの中に溶離させた。
【０１５９】
pHBVマウスモデル血清から単離されたDNAに含まれるHBVゲノムのコピー数をqPCRによって求めた。S遺伝子内でHBVゲノムの短い区画（GenBank登録番号#V01460塩基353〜777）をコードしているプラスミドpSEAP-HBV353-777を用いて6 log標準曲線を作成した。pHCR/UbC-SEAPの検出に基づき、DNAの回復が平均値から2標準偏差未満であるサンプルを除外した。TaqMan化学に基づいていてfluor/ZEN/IBFQを有するプライマーとプローブを用いた。
HBVプライマー：
5'-GCCGGACCTGCATGACTA-3'（配列ID番号 740）及び
5'-GGTACAGCAACAGGAGGGATACATA-3'（配列ID番号 741）
HBVプローブ：6-カルボキシフルオレセイン（FAM）で標識したレポータ：
5'-FAM/CTGCTCAAGGAACCTC-3'（配列ID番号 742）
hHCR（HCR/UbC-SEAP）プライマー：
5'-CATGCCACCTCCAACATCCACTC-3'（配列ID番号 743）
5'-GGCATAGCCACTTACTGACGACTC-3'（配列ID番号 744）
hHCRプローブ：
5'-FAM/TTGTCCTGGC/ZEN/GTGGTTTAGGTAGTGTGA/IBFQ-3'（配列ID番号 745）
【０１６０】
7500 FastまたはStepOne Plus Real-Time PCRシステム（Life Technologies社）でqPCRアッセイを実施した。血清中のHBV DNAを評価するため、プールした群血清サンプルから2回の精製工程でDNAを単離した。HBV DNAと回復対照プラスミドの定量を3回繰り返して実施したqPCR反応によって求めた。各反応にはHBCとpHCR/UbC-SEAPを定量するためのプローブが含まれていた。
【０１６１】
iv）HBV RNAの分析：さまざまな時点でマウスを安楽死させ、肝臓を切除して12 mlのTRI試薬RT（Molecular Research Center, Inc.社、シンシナチ、オハイオ州）を収容した50 mlの円錐管に入れた。全RNAを、製造者が推奨するようにして単離した。簡単に述べると、Bio-Gen PRO200組織ホモジェナイザー（Pro Scientific, Inc.社、オックスフォード、コネティカット州）を約30秒間用いてTRI試薬の中の肝臓をホモジェネートにした。1 mlのホモジェネートを0.2 mlのクロロホルムに添加し、混合し、遠心分離によって相を分離した。0.1 mlの水相を取り出し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、遠心分離した。得られたペレットを75％エタノールで洗浄し、0.4〜0.6 mlの無ヌクレアーゼ水の中に再懸濁させた。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Life Technologies社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）を用いて全RNA（50〜500 ng）を逆転写した。次にcDNAを1：50に希釈した後、HBVを検出するため、順プライマー5'-GCCGGACCTGCATGACTA-3'（配列ID番号746）と、逆プライマー5'-GGTACAGCAACAGGAGGGATACATA-3'（配列ID番号747）と、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）で標識したレポータ5'-CTGCTCAAGGAACCTC-3'（配列ID番号748）を用いた5'エキソヌクレアーゼ化学を利用してマルチプレックスRT-qPCRを実施した。
【０１６２】
RT-qPCRプローブは、発現がほとんど検出不能なレベルである遺伝子X転写産物を除くすべてのHBV RNAに結合する。そのためこのプローブで全HBV RNAを測定した。HBV、マウスのβ-アクチン、Gene Expression Master Mix（Life Technologies社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）の遺伝子発現アッセイを利用した。相対的定量の比較CT法（Livak KJ他、「リアルタイム定量PCRと2(-デルタデルタC(T)を利用した相対的遺伝子発現の分析)」、Method. Methods、2001年、第25巻、402〜408ページ）を利用して遺伝子発現データを分析した。
【０１６３】
各マウスからの全RNAを逆転写してcDNAを得た。そのcDNAをデュープリケートqPCR反応によって調べ、HBV全RNAと、内在性対照であるマウスβ-アクチンmRNAを同じ反応で測定した。
ΔΔCT＝(CT標的-CT対照)サンプル-(CT標的-CT対照)基準
相対的発現＝2-ΔΔCT
個別の相対的発現＝反復測定の幾何平均
範囲の下端及び範囲の上端は、2-平均ΔΔCT+標準偏差ΔCT及び2-平均ΔΔCT-標準偏差ΔCTを指す。
【０１６４】
v）組織内のRNAiトリガーの定量： HBV RNAiトリガーであるAD00009とAD00010のための全ガイド鎖、全完全長ガイド鎖、5'-ホスホリル化完全長ガイド鎖の肝臓におけるレベルをさまざまな時点で蛍光PNAプローブハイブリダイゼーションとHPLCアニオン交換クロマトグラフィによって測定した。ガイド鎖は内在性細胞質CLP1キナーゼによって5'-ホスホリル化される（Weizer S他、「ヒトRNAキナーゼhCLp1は3'トランスファーRNAエキソンと短い干渉RNAに対して活性である」、Nature 2007年、第447巻、222〜227ページ）。ガイド鎖にハイブリダイズした蛍光標識付き配列特異的ペプチド核酸（PNA）プローブを、均質化した肝臓組織に添加した。プローブ-ガイド鎖ハイブリッドをHPLCアニオン交換クロマトグラフィによって分析すると、電荷に基づいてガイド鎖が分離された。
【０１６５】
組織を回収し、ただちに液体窒素の中で凍結させた。凍結中に組織サンプルを粉砕した。25 mgまでの凍結粉末を、50μg/mlのプロテイナーゼKを含む1 mlの希釈Affymetrix Lysis Solution（1部のAffymetrix Lysis Solutionと、2部の無ヌクレアーゼ水）に溶解させた。サンプルをマイクロ・スティック超音波処理装置で超音波処理し、65℃で30分間インキュベートした。サンプルをさらに希釈する必要がある場合、ハイブリダイゼーション工程の前に、上記のように希釈したAffymetrix Lysis Solutionを用いてそれを実施した。RNAiトリガー標準の段階希釈物も希釈したLysis Solutionの中に調製した。
RNAiトリガー標準：RD74
センス        (NH2C6)CfuGfuAfgGfcAfuAfaAfuUfgGfuAf(invdT)（配列ID番号 749）
アンチセンス  pdTAfcCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgdTsdT       （配列ID番号 750）
RNAiトリガー標準：RD77
センス        (NH2C6)AfcCfuCfuGfcCfuAfaUfcAfuCfuAf(invdT)（配列ID番号 751）
アンチセンス  pdTAfgAfuGfaUfuAfgGfcAfgAfgGfudTsdT       （配列ID番号 752）
n＝2'-O-メチル、Nf＝2'-フルオロ、dN＝デオキシリボース、inv＝逆転した、s＝ホスホロチオエート結合。
【０１６６】
10μlの3M KClを100μlの組織サンプル溶液に添加することによってSDSを標準とサンプルから沈殿させた。氷の上で10分間インキュベートした後、サンプルを2,700×gで15分間遠心分離した。上清でRNAiトリガーの定量を実施した。
【０１６７】
各HBV RNAiトリガーのアンチセンス鎖に結合させるため、2つのエチレングリコールリンカー（OO＝PEG2；PNA Bio社、サウザンド・オークス、カリフォルニア州）を介してPNA鎖に付着させたN末端の蛍光Atto 425標識を含む配列特異的ペプチド核酸（PNA）プローブを設計した。
ペプチド核酸（PNA）プローブ
AD00009用  Atto425-OO-CTGTAGGCATAAATT（配列ID番号 753）
AD00010用  Atto425-OO-ACCTCTGCCTAATCA（配列ID番号 754）
【０１６８】
96ウエル円錐底プレートの中で、希釈した55μlの血清サンプルに、143μlの無ヌクレアーゼ水と、11μlの200 mMトリス-HCl（pH 8）と、11μlの1μM AD9またはAD10 PNAプローブ溶液を添加した。このプレートを密封し、サーマルサイクラーの中で95℃にて15分間インキュベートした。サーマルサイクラーの温度を54℃に下げてサンプルをさらに15分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルをHPLC分析のためにオートサンプラーに装填するまで4℃で保管した。
【０１６９】
LC-20ATポンプと、SIL-20ACオートサンプラーと、RF-10Axl蛍光検出器と、CTO-20Acカラムオーブン（Shimadzu Scientific Instruments社、コロンビア、メリーランド州）を備えたShimadzu HPLCシステムを用いてHPLC分析を実施した。ハイブリダイゼーション工程からの96ウエルのプレートをオートサンプラーに装着した。4×50 mmガードカラム（#DXSP4016；Fisher Scientific社、ピッツバーグ、ペンシルヴェニア州）を取り付けたDNAPac PA-100 4×250 mm分析カラム（#DX043010；Fisher Scientific社、ピッツバーグ、ペンシルヴェニア州）への注入体積を100μlにした。分析は、流速を1 ml/分、カラムオーブンの温度を50℃にして実施した。移動相A（10 mMトリス-HCl（pH 7）、100 mM NaCl、30％（v/v）アセトニトリル）と移動相B（10 mMトリス-HCl（pH 7）、900 mM NaCl、30％（v/v）アセトニトリル）を利用した勾配溶離。
【０１７０】
蛍光検出では、励起波長を436 nm、発光波長を484 nmにし、中間ゲインを4に設定した。12点外部標準較正曲線を用いて7〜10分の間に溶離した分析物の濃度を計算した。較正曲線は、PNAがハイブリダイズした完全長ホスホリル化RNAiトリガーであるRD74とRD77を用いて作成した。
【０１７１】
【表７】
2018523668.tif 000061
【０１７２】
iv）臨床化学検査：COBAS Integra 400（Roche Diagnostics社、インディアナポリス、インディアナ州）化学分析装置を製造者の指示に従って用いてマウス血清中の臨床化学マーカーを測定した。
【０１７３】
G）生体内でのB型肝炎ウイルス（HBV）ノックダウン：
【０１７４】
HBV DNA：最大のHBV DNAノックダウンは、8 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスで8日目と15日目に起こった。血清中の全HBV DNAは、それぞれ1/294と1/345に低下した。29日目、マウス血清中のHBV DNAは、処理していない対照マウスの1/13.5に留まっていた。全HBV DNAは、4 mg/kgと2 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスでは8日目にそれぞれ1/91.8と1/6.5に低下した。
【０１７５】
血清中のHBsAg：最大ノックダウンは、8 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスで8日目と15日目に起こった。血清中のHBsAgは、それぞれ1/270と1/139に低下した。29日目、血清中のHBsAgは、処理していない対照マウスの1/7.3であった。血清中のHBsAgは、4 mg/kgと2 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスでは8日目にそれぞれ1/71.4と1/5.4に低下した。
【０１７６】
8 mg/kgを1回だけ投与した効果の持続期間は少なくとも28日間であった。HBsAgとHBV DNAは、22日目の間は95％超低下していた。（HBV RNAiトリガーなしで）MLP送達ペプチドを注入したマウスからの血清中のHBV DNAとHBsAgのレベルは、等張グルコースを1回だけ注入したマウスにおけるレベルと同等に留まった（表7）。
【０１７７】
肝臓内のHBV RNA：最大ノックダウンは、8 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスで8日目に起こった。肝臓内の全HBV RNAは、平均して1/12.5に低下した。29日目、肝臓内の全HBV RNAは、処理していない対照マウスの平均の1/3.4であった。全HBV RNAは、4 mg/kgと2 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスでは8日目にそれぞれ1/5.8と1/1.6に低下した（表7）。
【０１７８】
組織内のRNAiトリガーの定量：8 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーをpHBVモデルマウスに注入すると、8日目に肝細胞の細胞質に約80 ng/gのHBV RNAiトリガーが得られた。これは、それぞれ約40 ng/gの完全長AD00009ガイド鎖と完全長AD00010ガイド鎖が5'ホスホリル化されたことの証拠となる。8日目に得られた薬物動態効果は、全HBV RNAが93％ノックダウンされたことと、血清中のHBsAgとHBV DNAが99％超低下したことであった。22日目、肝臓内のほぼすべてのガイド鎖が5'ホスホリル化されていて、完全長であった（表7）。
【０１７９】
臨床化学検査：肝臓と腎臓の機能を-1日目（注入前）と2日目（注入してから24時間後）評価した。臨床化学検査でMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーに関係する変化はなく、MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーの投与からも、MLP送達ペプチド単独投与からも、毒性の証拠はまったくなかった。
【０１８０】
【表８】
2018523668.tif 000062
【０１８１】
実施例8チンパンジーにおける慢性HBV感染でのRNAiの抗ウイルス効率。HBV遺伝子型Bが慢性感染した1匹のチンパンジー（チンパンジー4x0139；遺伝子型B；ウイルス量は約7×109GE/ml、51.3〜51.5 kg）にMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガー（AD00009とAD00010）を静脈内輸液によって与えた。本試験の前2年間のこの動物のウイルスHBV DNA力価は、4×109〜1.3×1010ゲノム当量/ml（この研究のベースライン値）の範囲であった。血液サンプルを健診時（-7日目）に採取し、投与の直前（1日目）にも再び採取し、ベースラインサンプルとして用いた。健診には、物理的検査、CBC、全血化学が含まれていた。2 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガー（5 mg/mlのMLP送達ペプチドを20.6 ml）を1日目に静脈内プッシュによって3分間かけて投与した。3 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガー（5 mg/mlのMLP送達ペプチドを30.9 ml）を15日目に静脈内プッシュによって3分間かけて投与した。血液サンプルを4日目、8日目、11日目、15日目、22日目、29日目、36日目、43日目、57日目、64日目、71日目、78日目、85日目に取得した。肝臓生検サンプルは、健診時、29日目、57日目の3回取得した。動物は、すべての手続きで鎮静させた。採血と投与のための鎮静は、運動抑制剤としてTelazol（商標）（2 mg/kg）とキサラジン（100 mg）を筋肉内投与することによって実現した。手続きの終了時にヨヒンビンをキサラジンの拮抗剤として用いる。
【０１８２】
血清と肝臓のHBV DNAのアッセイ。コア領域とX領域を標的とするTaqManアッセイを利用して血清サンプルと肝臓生検サンプルでHBV DNAのレベルを求めた（ベースライン、29日目、57日目）。両方のアッセイで全ゲノムが検出されるはずである。Qiagen QiaAmp DNA Mini Kit（カタログ番号51304）を製造者のプロトコルに従って用いて100μlの血清または肝臓組織ホモジェネートからDNAを精製した。HBVコア遺伝子に対して設計したプライマーとプローブを用い、TaqMan 技術を利用してDNAサンプルをリアルタイムPCRによって分析した。
順プライマー、HBVコアF  5' CGAGGCAGGTCCCCTAGAAG 3'（配列ID番号 755）
逆プライマー、HBVコアR  5' TGCGACGCGGYGATTG 3'（配列ID番号 756）
プローブ、HBVコアプローブ  5' 6-FAM/AGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG-6-TAM 3'（配列ID番号 757）
HBV X遺伝子に対するプライマーとプローブを用いて肝臓のDNAとRNAも分析した。
順プライマー、HBV X   F-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTG（配列ID番号 758）
逆プライマー、HBV X   R-AGTCCAAGAGTYCTCTTATGYAAGACCTT（配列ID番号 759）
プローブ、HBV X  5' 6-FAM/CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGC-6-TAM 3'（配列ID番号 760）
【０１８３】
各TaqManアッセイについてHBV DNAインサートを含むプラスミドを用いて10 GEから100万GEまでの範囲で標準曲線を作成した。TaqManアッセイではABI 7500配列検出装置を用いてサンプルを分析した。そのとき用いたサイクルパラメータは、50℃で2分間／95℃で10分間／95℃で15秒間を45サイクル／60℃で1分間である。
【０１８４】
肝臓HBV DNAのレベルは、29日目にベースラインレベルの1/2.4（コア領域PCRアッセイ）と1/2.7（X領域PCRアッセイ）に低下した。
【０１８５】
血清HBV DNAのレベルは、最初の投与後に急激に低下し、4日目までに1/17に低下した。レベルは8日目〜15日目に上昇し、ベースラインの1/18.8から1/6.7になった。15日目に2回目の投与を実施した後、ウイルスDNAの低下が観察され、22日目にベースラインの1/35.9に達した。
【０１８６】
血清中のHBsAgとHBeAgの分析。BioRad社からのELISAキット（GS HBsAg EIA 3.0）を用いてHBsAgのレベルを求めた。表面抗原の定量結果は、ODを既知の表面抗原標準と比較することによって求めた。HBeAgの定量結果は、DiaSorin社からのELISAキット（ETI-EBK Plus）を用いてすべての血清で求めた。
【０１８７】
HBsAgのレベルは顕著に低下し、824μg/mlというベースラインのレベルから29日目に151μg/mlまで下低下した。数値は、ARC 520を最初に投与してから4日目までに顕著に低下していた（ベースラインの値と比べて18％低下）。数値は15日目まで低下を続けてベースラインの53％（1/2.1）になり、29日目に81％（1/5.2）という最大の低下に達した。
【０１８８】
血清中のHBeAgのレベルはベースラインが136 ng/mlであり、ARCを最初に注入してから4日目までに12.5 ng/ml（1/10.9）に低下した。レベルは15日目に46 ng/ml（ベースラインの1/2.9）まで上昇した。2回目の注入の後、レベルは22日目に再び28 ng/mlまで低下した。
【０１８９】
サイトカインとケモカインのRT-PCR分析。ISG15、CXCL11（I-TAC）、CXCL10（IP-10）、CXCL9（Mig）、インターフェロンγ（IFNγ）、GAPDHを定量RT-PCRによって求めた。簡単に述べると、肝臓に由来する200 ngの全細胞RNAを、ABI Assays-on-Demand（商標）からのプライマーおよびプローブとABI 7500 TaqMan配列分析装置（Applied Biosystems社／Ambion社、オースチン、テキサス州）を用いてqRT-PCRアッセイによって分析した。RNA UltraSense（商標）One-Step Quantitative RT-PCR System（Invitrogen Corporation社、カールスバッド、カリフォルニア州）からの試薬を用いてqRT-PCRを実施した。そのときのサイクル設定は、48℃、30分間；95℃、10分間；95℃、15秒間；60℃、1分間で、最後の2つを45サイクルであった。肝臓生検サンプルをただちにRNAlater（登録商標）安定化試薬の中に入れ、製造者が記載しているようにして処理し、全細胞RNAに対してRNA-Bee（Tel-Test, Inc.社、フレンズウッド、テキサス州）を用いてRNAを抽出した。これら遺伝子の実質的な誘導は見られなかった。
【０１９０】
サイトカインとケモカインのLuminex分析。39プレックス・サイトカイン／ケモカインキット（Millipore社；ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いるxMAP（複数分析物プラットフォーム）システムでLuminex 100を用いてサイトカインとケモカインのモニタリングを実施した。各サイトカインのための標準の希釈物を各アッセイで評価した。各サイトカインのための標準を各試行で評価して定量結果を得た。Luminex法を利用して血清サンプル中の以下のサイトカイン／ケモカインを評価した：EGF、エオタキシン、FGF-2、Flt-3リガンド、フラクタルカイン（CX3CL1）、G-CSF、GM-CSF、GRO、IFNα2、IFNγ、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17、IL-lα、IL-1β、IL-1受容体アンタゴニスト、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL- 7、IL-8、IL-9、IL-10、MCP-1（CCL2）、MCP-3（CCL7）、MDC（CCL22）、ΜΙΡ-1α（CCL3）、MIP-1β（CCL4）、sCD40L、sIL-2受容体アンタゴニスト、TGFα、TNFα、ΤΝΡβ、VEGF。肝臓転写産物と同様、治療中にケモカインとサイトカインの実質的な変化は観察されなかった。
【０１９１】
臨床症状  Unicel DxC 600分析装置（Beckman Coulter, Inc.社とDiagnostic Chemicals Ltd社、オックスフォード、コネティカット州、アメリカ合衆国）を用いて血液化学検査を実施した。全血化学検査では、以下の測定値が得られた：Na、K、Cl、Ca、CO2、Phos、ALT、AST、GGT、LDH、直接ビリルビン、全ビリルビン、Alk Phos、BUN、クレアチン、クレアチンキナーゼ、グルコース、全タンパク質、アルブミン、コレステロール、トリグリセド。同じコロニーからの感染していないマウスの値を用いて正常な範囲を確立した。肝臓生検サンプルを標準的な手続きによって麻酔した動物から採取した。生検材料をただちに分割して組織病理学のためと、DNAとRNAを分析するための分画にした。組織病理学検査のための切片を、10％ホルマリンを含むPBSの中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。DNA分析のための分画を瞬間凍結させた。RNA分析のための分画は、RNAlater（登録商標）安定化試薬の中に入れた。
【０１９２】
肝臓の免疫化学染色。肝臓生検サンプルを緩衝化ホルマリンの中で固定し、パラフィン包埋し、4ミクロンに切断した。スライドをEZ-DeWax（BioGenex社；HK 585-5K）2xの中で5分間脱パラフィン化した後、水で洗浄した。抗原の賦活化を、マイクロ波圧力調理器に入れたクエン酸塩緩衝液（抗原賦活化溶液；BioGenex社；HK 086-9K）の中で、1000ワットにて15分間と、300ワットにて15分間実施した。冷却したスライドを水とPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ抑制剤、ユニバーサルブロック、アビジンを順番に用いて処理した（すべての試薬がPierce 36000 Immunohisto Peroxidase Detectiion Kitからのものである）。スライドのインキュベーションを、ビオチンブロックを含むユニバーサルブロックの中に希釈した一次抗体とともに室温で1時間、ビオチニル化したヤギ抗マウスIgGとともに0.5時間、アビジン-ビオチン複合体（ABC）とともに0.5時間の順番で実施した。Immpact Nova Redペルオキシダーゼ基質（Vector社、SK-4805；バーリンゲーム、カリフォルニア州）を用いてスライドを現像し、Mayers（Lillieの）ヘマトキシリン（DAKO社、S3309）で対比染色し、脱水し、非水性装着媒体（Vector社、VectaMount；H-5000）に装着した。バキュロウイルスの中で発現した精製コア粒子からウサギ抗HBVコアを調製した。
【０１９３】
大半の肝細胞はHBVコア抗原に対して陽性であり、細胞質が強く染色され、核はいくらか染色された。染色の低下が29日目に起こり、それはかなり顕著であった。
【０１９４】
実施例9MLP送達ペプチドを用いてHBV RNAiトリガーを送達した後のトランスジェニックマウスモデルにおける生体内B型肝炎ウイルス（HBV）の減少
【０１９５】
A）トランスジェニックHBVモデルマウス：トランスジェニックHBV1.3.32マウスは、マウス染色体DNAに組み込まれたayw株（GenBank登録番号V01460）の末端重複1.3-ゲノム長ヒトHBVゲノムの単一のコピーを含んでいる。これらマウスの肝臓で高レベルのHBV複製が起こる（Guidotti LG他、「トランスジェニックマウスにおける高レベルのB型肝炎ウイルス複製」、J Virol 1995年、第69巻、6158〜6169ページ）。
【０１９６】
離乳時の血清中のHBeAgのレベルに基づいて研究のためのマウスを選択した。HBeAgの平均レベルが各群で同じになるようにマウスをグループ分けした。スチューデントのt検定を利用して、対照siLuc群に対してどの群の間にも有意な差がないようにした。
【０１９７】
MLP送達ペプチドHBV RNAiトリガー送達組成物（MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガー）を上記のようにして調製した。AD00009、AD00010、RNAiトリガー標準RD74、RNAiトリガー標準RD77を上記のようにして調製した。
siLuc（ホタルルシフェラーゼRNAiトリガー）
センス鎖        Chol-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)（配列ID番号 761）
アンチセンス鎖  UfsCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfaAfgdTsdT        （配列ID番号 762）
【０１９８】
B）HBV RNAiトリガーの送達：1日目、メスのHBV1.3.32マウス（月齢1.8〜7.7）の後眼窩静脈叢に、3 mg/kgまたは6 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを20 gの体重に対して200μlの割合で一回だけ静脈内注入した。対照マウスには、等張グルコース、または6 mg/kgのMLP送達ペプチド＋siLucを注入した。
【０１９９】
血清の回収：マウスに50％CO2で短時間麻酔し、ヘパリン処理したNatelsonマイクロ血液回収管（#02-668-10、Fisher Scientific社、ピッツバーグ、ペンシルヴェニア州）を用いて血液サンプルを後眼窩叢から回収した。血液を、回収中に60〜120分間にわたって周囲温度にしておいたマイクロ遠心分離管に移した。次にサンプルを14,000 rpmで10分間遠心分離して血清を分離し、それを-20℃で保管した。
【０２００】
C）HBcAgノックダウン：MLP送達ペプチドを媒介としてHBV RNAiトリガーを送達した後の肝細胞の細胞質の中のHBVコア抗原（HBcAg）の分布を、肝臓切片の免疫組織化学染色によって定量評価した。細胞質HBcAgの存在は、そのタンパク質が活発に発現していることを示す。組織サンプルを10％亜鉛緩衝化ホルマリンの中で固定し、パラフィンの中に包埋し、切断し（3μm）、ヘマトキシリンで染色した（Chisari FV他、「B型肝炎ウイルスの大きなエンベロープポリペプチドの発現がトランスジェニックマウスでB型肝炎表面抗原の分泌を抑制する」、J Virol 1986年、第60巻、880〜887ページ）。HBcAgの細胞内分布を、標識したアビジン-ビオチン検出手続きによって評価した（Guidotti LG他、「B型肝炎ウイルスの核キャプシド粒子はトランスジェニックマウスで肝細胞の核膜を横断しない」、J Virol 1994年、第68巻、5469〜5475ページ）。PBS（pH 7.4）の中のパラフィン包埋切片を3％過酸化水素で37℃にて10分間処理した後、PBSで洗浄した。その切片を正常なヤギ血清で室温にて30分間ブロックした後、ウサギ抗HBcAg（DAKO North America, Inc.社、カーピンテリア、カリフォルニア州）一次抗血清を1：100に希釈して37℃にて60分間にわたって適用した。PBSで洗浄した後、ビオチンが共役したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG F(ab9)2（Sigma-Aldrich Co. LLC.社、セントルイス、ミズーリ州）からなる二次抗血清を1：100に希釈して37℃にて30分間にわたって適用した。抗体で被覆したスライドをPBSで洗浄し、ストレプトマイシン-セイヨウワサビのペルオキシダーゼ共役体（ExtrAvidin；Sigma-Aldrich Co. LLC.社、セントルイス、ミズーリ州）を1：600に希釈して用いて37℃にて30分間にわたって処理し、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC；Shandon-Lipshaw社、ピッツバーグ、ペンシルヴェニア州）で染色し、Mayerのヘマトキシリンで対比染色した後、装着した。肝細胞内のHBcAgのレベルと分布を目視で評価した。6 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを注入してから15日目と29日目に細胞質HBcAgは核HBcAgと比べて大きく低下していた。これは、HBcAgの発現がノックダウンされたことを示している。
【０２０１】
【表９】
2018523668.tif 000063
【０２０２】
D）HBeAgノックダウン：MLP送達ペプチドを媒介としたHBV RNAiトリガーの送達がHBV e抗原（HBeAg）に及ぼす効果をELISAによって調べた。マウスからの血清回収を、注入前である-1日目、注入してから6時間後、3日目、8日目、15日目、22日目、29日目に実施した。2μlのマウス血清を用い、HBe酵素固定免疫吸着アッセイ（ELISA）を製造者（Epitope Diagnostics社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が記載しているようにして利用してHBeAgの分析を実施した。抗原のレベルは、アッセイの直線範囲で求めた。各マウスの各時点におけるHBeAgのレベルは、投与前である-1日目のレベルに規格化した。MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理した群を、等張グルコース群またはsiLuc群と別々に比較した。対応のあるt検定を利用して3日目から8日目までのHBeAgの発現の変化を評価した。
【０２０３】
HBeAgのレベルは、両方の用量レベルで3日目に85〜88％低下しており（1/7〜1/8）、8日目には約71〜73％低下していた。HBeAgは、6 mg/kgのメリチン送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスでは29日目に約66％低下した状態に留まった。これらトランスジェニックマウスは、腎臓でHBeAgを産生することが知られている。腎臓から出て循環しているHBeAgのレベルは不明である。
【０２０４】
【表１０】
2018523668.tif 000064
【０２０５】
【表１１】
2018523668.tif 000065
【０２０６】
E）HBV RNAノックダウン：HBVは、長さが3.5キロ塩基（kb）（2種類）、2.4 kb、2.1 kb（2種類）、0.7 kbの少なくとも6つのmRNA種を産生する。3.5 kbである一方のmRNAはHBeAgをコードしている。HBeAgは分泌されるタンパク質である。3.5 kbである他方のmRNAはプレゲノムRNA（pgRNA）であり、翻訳されてコアタンパク質（HBcAg）とポリメラーゼを産生する。pgRNAは逆転写されてビリオンDNAを生み出す。HBcAgタンパク質モノマーは組み合わされて、ビリオンDNAを取り囲むキャプシドを形成する。2.4 kbと2.1 kbのmRNAは、S抗原（HBsAg）とも呼ばれるエンベロープ（S）タンパク質をコードしている。HBsAgタンパク質は、ウイルスキャプシドの周囲にエンベロープを形成する（トランスジェニックHBC1.3.32マウスはこのタンパク質に対する抗体を産生するため、HBsAgは測定されなかった）。0.7 kbのmRNAはXタンパク質をコードしていて、通常はトランスジェニックマウスでは検出できない。
【０２０７】
マウスを安楽死させた後、肝臓組織を液体窒素の中で凍結させ、-70℃で保管した後に全RNAを抽出した。RNAを単離し、HBV転写産物のレベルを、ノーザンブロッティングと定量リアルタイムPCR（RT-qPCR）により、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に対して評価し、定量した。
【０２０８】
ノーザン分析  10μgの全細胞RNAを用いてRNA（ノーザン）フィルタハイブリダイゼーション分析を実施した。フィルタを32Pで標識したHBV（ayw株）ゲノムDNAで調べてHBV配列を検出し、マウスのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のcDNAで調べ、内部対照として用いるGAPDH転写産物を検出した。ノーザンブロットで3.5 kbのHBV RNAバンドと2.1 kbのRNAバンドに対応する放射性ハイブリダイゼーション信号を、同じマウスからのGAPDH mRNAバンドに対応する信号に規格化した。各マウスからの2.1 kbのHBV RNA：GAPDHの比を、等張グルコースを注入した4匹のマウスとMLP送達ペプチド＋siLucで処理した4匹のマウスからなる組み合わせ対照群におけるこの比の平均値で割り算し、2.1 kbのHBV RNAにおける処理特異的変化を求めた。3.5 kbのHBV RNAも同じ方法で分析した。どちらの場合にも誤差はこの比の標準偏差として示してある。統計的有意さは、スチューデントの両側t検定によって求めた。肝臓組織からの全細胞RNAのRNAフィルタハイブリダイゼーション（ノーザンブロット）分析からの結果を表11に示す。MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを用いた処理によって肝臓内のウイルスRNA含量が低下した。等張グルコースまたはMLP送達ペプチド＋siLucを投与されたマウスの肝臓におけるウイルスRNAのレベルに対する効果は観察されなかった。
【０２０９】
【表１２】
2018523668.tif 000066
【０２１０】
【表１３】
2018523668.tif 000067
【０２１１】
RT-qPCR分析。逆転写工程の後、定量PCR（RT-qPCR）を利用してHBV1.3.32マウスの肝臓RNAのGAPDHとHBV 3.5 kb転写産物のレベルを測定した。DNアーゼIで処理した後、TaqMan逆転写試薬（Life Technologies社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）を用いたcDNA合成で1μgのRNAを使用し、次いでSYBR GreenとApplied Biosystems 7300リアルタイムPCRシステムを用いてqPCRによる定量を実施した。サーマルサイクリングは、95℃で10分間という最初の変性工程の後、40サイクルの変性（95℃で15秒間）とアニーリング／伸長（60℃で1分間）で構成した。相対的なHBV 3.5 kb RNA発現のレベルは、マウスGAPDH RNAに規格化した比較CT（ΔCT）法を利用して推定した。使用したPCRプライマーは、それぞれ、5'-GCCCCTATCCTATCAACACTTCCGG-3'（配列ID番号763）（HBV 3.5 kb RNAセンスプライマー、位置2,311〜2,335）、5'-TTCGTCTGCGAGGCGAGGG A-3'（配列ID番号764）（HBV 3.5 kb RNAアンチセンスプライマー、位置2,401〜2,382）、5'-TCTGGAAAGCTGTGGCGTG-3'（配列ID番号765）（マウスGAPDHセンスプライマー）、5'-CCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'（配列ID番号766）（マウスGAPDHアンチセンスプライマー）であった。
【０２１２】
【表１４】
2018523668.tif 000068
【０２１３】
F）HBV DNA複製中間体のノックダウン：マウスを安楽死させた後、肝臓組織を液体窒素の中で凍結させ、-70℃で保管した後に全RNAを抽出した。DNAを肝臓から単離し、HBV複製中間体を評価し、サザンブロッティングによってトランスジーンに対する相対量を定量した。32Pで標識したHBV（ayw株）ゲノムDNAを用い、HindIIIで消化させた20μgの全細胞DNAのサザンブロット分析を実施した。HBV複製中間体の相対レベル、弛緩型環状DNA（HBV RC DNA）、一本鎖DNA（HBV SS DNA）を、ホスホイメージャで定量した後に同じマウスのHBVトランスジーン（HBVトランスジーンDNA）のレベルに規格化した。各マウスからのHBV RC DNAとHBV SS DNAを組み合わせた信号：HBV Tg DNAの信号を、等張グルコースを注入した4匹のマウスとMLP送達ペプチドとsiLucを同時に投与した4匹のマウスからなる組み合わせ対照群におけるこの比の平均値で割り算し、複製中間体における処理特異的変化を求めた。サザンブロット分析は、MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したすべての群でHBV複製中間体のレベルが低下したことを示していた（表14〜表16）。HBV DNA複製中間体は、6 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを1回だけ注入した後に4週間にわたって大きく抑制された状態に留まっていた。複製中間体は、1週間後と2週間後には98〜99％低下していて（1/64〜1/74）、4週間後には97％低下していた（1/29）。
【０２１４】
【表１５】
2018523668.tif 000069
【０２１５】
【表１６】
2018523668.tif 000070
【０２１６】
G）肝臓内のHBV RNAiトリガーの定量：MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーで処理したマウスの肝臓にあるHBV RNAiトリガーのガイド鎖の量を、上記の蛍光ペプチド核酸（PNA）プローブとのハイブリダイゼーションによって定量した。PNA-ハイブリダイゼーション法により、組織の重量当たりのガイド鎖の全量を、AD00009とAD00010の代謝産物（総計、全完全長、5'ホスホリル化完全長、非ホスホリル化完全長）を含めて定量することが可能になった。完全長5'ホスホリル化ガイド鎖の存在は、RNAiトリガーが標的細胞の細胞質に効率的に送達されたことを示していた。
【０２１７】
【表１７】
2018523668.tif 000071
【０２１８】
H）臨床化学検査：臨床化学検査とサイトカイン評価のための血清を、各マウスから、注入する-1日前と、注入してから6時間後と48時間後に回収した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、血液尿窒素（BUN）、クレアチニンの臨床化学分析を、COBAS Untegra 400（Roche Diagnostics社、インディアナポリス、インディアナ州）化学分析装置を製造者の指示に従って用いて実施しした。各アッセイでは、検査に応じて2〜23μlの血清が必要であった。一元配置分散分析により、マウスのすべての群からの臨床化学検査の結果を注入前と注入後で比較した。ボンフェローニの多重比較検定を利用して個々の群の値を注入前と注入後で比較した。注入の48時間後にALT、AST、BUN、クレアチニンは増加しなかった（図3〜図4）。マウスの25種類のサイトカインからなるパネルを、MILLIPLEX MAPマウスサイトカイン／ケモカイン磁性ビーズパネル - Premixed 25 Plex - 免疫学マルチプレックスアッセイ（カタログ番号MCYTOMAG-70K-PMX、EMD Millipore Corporation社、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いて評価した。25種類のサイトカインとは、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)、インターフェロンγ（IFN-γ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-lβ）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-12サブユニットp40（IL-12p40）、インターロイキン-12サブユニットp70（IL-12p70）、インターロイキン-13（IL-13）、インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-17（IL-17）、インターフェロンγ誘導タンパク質-10 （IP-10）、ケラチノサイト由来サイトカイン（KC）、単球化学誘引タンパク質-1（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質-1α（ΜΙΡ-1α）、マクロファージ炎症性タンパク質-1β（MIP-1β）、マクロファージ炎症性タンパク質-2（MIP2）、ランテス（活性化で調節され、正常 T細胞が発現・分泌する：RANTES）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）である。いくつかのサイトカインがこの取り扱い手続きによって上昇したが、MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーでの処理とは関係していないように見えた。
【０２１９】
すべての群で注入してから6時間後のIL-6のレベルを評価した。上昇は、3 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを注入されたマウスでより大きく、6 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを注入されたマウスで最大であり、正常値（170 pg/mlまで）の上限の8倍であった。IL-6のレベルは、注入してから48時間後の3日目までに正常に戻った。
【０２２０】
6時間後の時点でKCのレベルを評価すると、正常値の上限（103 pg/ml）の40倍までであったが、この上昇はすべての処理群で同様であった。
【０２２１】
IP-10のレベルは、6時間後の時点で2倍未満であり、いくつかのサンプルでは48時間後の時点で2倍未満であった。しかし上昇は等張グルコース対照群でも見られた。
【０２２２】
MIP2は、マウスの血清では通常は検出できないが、注入後の主に6時間の時点ですべての群においてレベルが上昇した。
【０２２３】
G-CSFのレベルはわずかに上昇して注入後6時間の時点で平均で3〜4倍になったが、群の平均値は正常範囲に留まっていた。
【０２２４】
TNF-αとMCP-1は、6時間後の時点ですべての群で上昇していたが、正常値の上限よりも十分に下の位置に留まった。
【０２２５】
6 mg/kgのMLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを注入した12匹のマウスのうちの1匹は、6時間後の時点で、IL-7のレベルが正常値の上限よりも約3倍大きかった（80 pg/ml）。
【０２２６】
肝臓または腎臓の毒性の評価から、有害な効果は最少であることがわかった。肝臓または腎臓のための臨床化学マーカーは、注入前と比べて増加しなかった。いくつかのサイトカインの上昇が投与前に観察され、少数のサイトカインが取り扱い手続きによって上昇したが、MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーでの処理とは関係していないように見えた。
【０２２７】
実施例10  HBV RNAiトリガーをMLP送達ペプチドとともに送達した後の生体内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の減少
【０２２８】
pHBVモデルマウス：-28日目に、6〜8週齢のメスNOD.CB17-Prkdscid/NcrCrl（NOD-SCID）マウスに、記載したハイドロダイナミック法で尾の静脈から注入することによりMC-HBV1.3を一過性にトランスフェクトした。
【０２２９】
MLP送達ペプチド：CDM-NAGを250 mM HEPES緩衝化水溶液中のMLP（配列ID番号650（G1L MLP、L系））に5：1（w/w）の比で室温にて添加し、30分間インキュベートすると、MLP送達ペプチドが得られた。4M NaOHを用いてこの反応混合物をpH 9.0に調節した。2,4,6-トリニトロベンゼン-スルホン酸を用いて反応の程度を調べ、95％超であると判断した。MLP送達ペプチドを10 mM炭酸水素塩緩衝液（pH 9.0）の中でタンジェンシャルフローによって精製し、そこに10％デキストラン（w/w）を添加した。精製した最終材料を凍結乾燥させた。
【０２３０】
HBV RNAiトリガー送達組成物の調製：凍結乾燥させた5 mgのMLP送達ペプチドを1 mlの水に再懸濁させた。次に、MLP送達ペプチドをHBV RNAiトリガー（AD01385またはAD01386）とさまざまな用量レベルで組み合わせた。
【０２３１】
RNAiトリガーの送達：1日目に、各マウスの尾の静脈を通じ、MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを含む生理食塩水を20 gの体重につき200μlの割合で一回だけ静脈内投与した。
【０２３２】
分析：MLP送達ペプチド＋HBV RNAiトリガーを投与する前と投与した後のさまざまな時点で血清HBsAgと血清HBV DNAを測定した。ある時点での各マウスの血清中のHBsAgのレベルをそのマウスにおける処理前のレベルで割り算し、「処理前レベルに規格化した」血清中のHBsAgの比を求めた。ある時点における各群の血清中のHBV DNAのレベルもその群における処理前のレベルで割り算し、「処理前レベルに規格化した」血清中のHBV DNAの比を求めた。次に、処理なしに関するMC-HBV1.3またはpHBV1.3の発現の低下を明らかにするため、ある時点における個々のマウスの「処理前に規格化した」比を同じ時点における生理食塩水対照群の全マウスの「処理前レベルに規格化した」比の平均値で割り算し、血清中の「処理前と対照のレベルに規格化した」HBsAgまたはHBV DNAの比を得た。
【０２３３】
血清回収：マウスを2〜3％イソフランで麻酔し、血液サンプルを下顎下領域から回収して血清分離管（Sarstedt AG&Co.社、ニュムブレヒト、ドイツ国）に入れた。血液を周囲温度で20分間放置して凝固させた。血清分離管を8,000×gで3分間遠心分離して血清を分離し、4℃で保管した。
【０２３４】
血清中のB型肝炎表面抗原（HBsAg）とHBV DNAのレベルを上記のようにして測定した。
【０２３５】
【表１８】
2018523668.tif 000072
【０２３６】
【表１９】
2018523668.tif 000073
【０２３７】
【表２０】
2018523668.tif 000074
【０２３８】
【表２１】
2018523668.tif 000075
【０２３９】
結果は図5にも示してあり、8日目にほぼ2桁ノックダウンされたことを示している。
【０２４０】
実施例11  HBV RNAiトリガーをMLP送達ペプチドとともに送達した後の慢性HBV感染チンパンジーにおけるB型肝炎ウイルス（HBV）ウイルスタンパク質HBsAgの低下
【０２４１】
チンパンジー：動物95A010は、生誕時にHBVに曝露した19歳で体重66 kgのメスのチンパンジー（生年月日1995年7月8日）である。研究の開始時にはこのチンパンジーはHBeAg陰性かつ抗HBe陽性であり、HBV RNA力価が血清1ml当たり3.7×103コピーであった。
【０２４２】
HBV RNAiトリガー送達組成物の調製：MLP送達ペプチドのバイアル1は、殺菌した10 mlのガラス製バイアルの中に凍結乾燥させたMLP-(CDM-NAG)を125 mgの量で含んでいた。活性医薬成分（API）のバイアル2は、殺菌した10 mlのガラス製バイアルの中に5.3 mlのリン酸緩衝液中の液体として全RNAiトリガー1 ml当たりAD0009とAD0010の同モル混合物を26 mgの割合で含んでいた。バイアル2から4.8 mlの液体をバイアル1に添加し、かき混ぜて溶解させた。得られた溶液は、5 mlの中の活性医薬成分に関し、1つのバイアルにつき125 mgの量を25 mg/mlの公称濃度で含んでいた。指示された用量の十分な数のバイアルを対で用意した。2 mg/kgのMLP送達ペプチド＋1 mg/kgのAD01385＋1 mg/kgのAD01386を投与するため、リン酸緩衝液の中にAD01385とAD01386を同じモル数で含む26 mg/mlの溶液を用いてバイアル1のMLP送達ペプチドを可溶化した。
【０２４３】
RNAiトリガーの送達  チンパンジー95A010に2 mg/kgのMLP送達ペプチド（MLP送達ペプチドとして調製）＋1 mg/kgのAD0009＋1 mg/kgのAD0010を、MLP送達ペプチドに関して輸液速度10 mg/分で輸液した。HBsAgのレベルがARC-520で処理した後にベースラインに戻ってから、チンパンジーに2 mg/kgのMLP送達ペプチド＋1 mg/kgのAD01385＋1 mg/kgのAD01386を輸液した。
【０２４４】
血清中のB型肝炎表面抗原（HBsAg）のレベル：血清を回収し、5％無脂粉乳を含むPBSの中で104〜105倍に希釈した。それ以外はアッセイを上に記載したようにして実施した。
【０２４５】
データ：15日目のHBsAgのレベルは、1 mg/kgのAD0009＋AD0010を注入した後には50％低下しており、1 mg/kgのAD01385＋AD01386を注入した後には81％低下していた。どちらの場合も2 mg/kgのMLP送達ペプチドを用いた（図6）。
【０２４６】
【表２２】
2018523668.tif 000076
【０２４７】
【表２３】
2018523668.tif 000077
【０２４８】
実施例12  生体内でのB型肝炎ウイルス（HBV）の減少
【０２４９】
pHBVモデルマウス：-35日目、6〜8週齢のメスNOD.CB17-Prkdscid/NcrCrl（NOD-SCID）マウスに、ハイドロダイナミック法で尾の静脈に注射すること（Yang PL他、「ハイドロダイナミック法によるウイルスDNAの注射：急性B型肝炎ウイルス感染のマウスモデル」、PNAS USA 2002年、第99巻：13825〜13830ページ）によってMC-HBV1.3を一過性に生体トランスフェクトした。MC-HBV1.3はプラスミドに由来するミニサークルであり、HBV1.3.32トランスジェニックマウスと同じ末端冗長ヒトB型肝炎ウイルス配列HBV1.3を含んでいる（GenBank登録#V01460）（Guidotti LG他、「トランスジェニックマウスにおける高レベルのB型肝炎ウイルス複製」、J Virol 1995年、第69巻、6158〜6169ページ）。5μgのMC-HBV1.3を全体積がマウスの体重の10％のリンゲル溶液に入れて尾の静脈からマウスに注入し、慢性HBV感染のpHBVモデルを作製した。この溶液の注入は、以前に報告されている（Zhang G他、「裸のプラスミドDNAを尾の静脈から注入した後の肝細胞における高レベルの外来遺伝子発現」、Human Gene Therapy 1999年、第10巻、1735〜1737ページ）ようにして、27ゲージの針を通じて5〜7秒で実施した。トランスフェクションの4週間後である-7日目、血清中のB型肝炎表面抗原（HBsAg）の発現レベルをELISAによって測定し、マウスを平均HBsAg発現レベルに従ってグループ分けした。
【０２５０】
RNAiトリガーの送達。1日目、各マウスにHBV RNAiトリガーまたは通常の生理食塩水を含む200μlを1回だけ皮下投与した。皮膚と筋肉の間で注入する（すなわち皮下注射の）ための典型的な部位は、首と肩の領域の上方のたるんだ皮膚の中だが、軽く皺になっている他の部位も利用することができる。
【０２５１】
分析：HBV RNAiトリガーまたは通常の生理食塩水の投与前と投与後のさまざまな時点で、血清HBsAg、または血清HBV DNA、または肝臓HBV RNAを測定した。HBVの発現レベルは、通常の生理食塩水を注入した対照マウスに規格化した。
【０２５２】
i）血清の回収：マウスを2〜3％イソフランで麻酔し、血液サンプルを下顎下領域から回収して血清分離管（Sarstedt AG&Co.社、ニュムブレヒト、ドイツ国）に入れた。血液を周囲温度で20分間放置して凝固させた。血清分離管を8,000×gで3分間遠心分離して血清を分離し、4℃で保管した。
【０２５３】
ii）血清B型肝炎表面抗原（HBsAg）のレベル：血清を回収し、5％無脂粉乳を含むPBSの中で10〜2000倍に希釈した。無脂粉乳溶液に希釈した二次HBsAg基準を、10μgのHBsAg 発現プラスミドpRc/CMV-HBs（Aldevron社、ファルゴ、ノースダコタ州）をトランスフェクトされていたICRマウス（Harlan Sprague Dawley社）の血清から調製した。HBsAgのレベルは、GS HBsAg EIA 3.0キット（BioRad Laboratories, Inc.社、レッドモンド、ワシントン州）を製造者が記載しているようにして用いて求めた。やはりPBS中の無脂粉乳に希釈した組み換えHBsAgタンパク質aywサブタイプを一次標準として用いた（Aldevron社）。
【０２５４】
処理なしに関するMC-HBV1.3の発現の低下を明らかにするため、各マウスのHBsAg発現を、等張グルコースを注入した対照群のマウスに規格化した。最初に、ある時点での各マウスのHBsAgのレベルをそのマウスにおける処理前（-1日目）の発現レベルで割り算し、「処理前レベルに規格化した」発現の比を求めた。次に、個々のマウスについて「処理前レベルに規格化した」比を、等張グルコース対照群のすべてのマウスの平均「処理前レベルに規格化した」比で割り算することによって特定の時点での発現を対照群に規格化した。
【０２５５】
【表２４−１】
2018523668.tif 000078
【表２４−２】
2018523668.tif 000079
【０２５６】
実施例13  HBV RNAiトリガーのクロマトグラフィ分析。臨床開発には、薬製品中の活性医薬成分（API）を定量することが必要とされる。薬製品が2つのAPIの混合物（例えばAD1385とAD1386）であるとき、定量には分析による明確な分離が必要とされる。オリゴヌクレオチドAPIに関しては、同じ長さのオリゴヌクレオチドの組成が似ているという理由で分析による明確な分離は難しい。AD1385とAD1386の混合物のセンス鎖をクロマトグラフィで容易に分離できるようにするため、コレステロールとオリゴヌクレオチドの間に6個の炭素（C6）を含むリンカーを一方の鎖に組み込み、トリエチレンオキシド（TEG）リンカーを他方の鎖で用いた。これらリンカーは異なる疎水性を有するため、クロマトグラフィによる分離が可能になる。RNAiトリガーのセンス鎖は、Thermo Scientific DNAPac PA-200カラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィによって分離される。そのとき、（10 mM NaHCO3（pH 11.3）／50 mM NaBr／45％ACN）：（10 mM NaHC O3（pH 11.3）／650 mM NaBr／45％ACN）の70：30混合物から100％の650 mM NaBr溶液へという勾配を用いた（図24〜図28参照）。センス鎖のピークを分析して解像度（Rs）を求めた。解像度は、
Rs＝(tR2-tR1)／((0.5×w1＋w2))  （1）
として計算される。ここにtR2とtR1は2本の鎖の保持時間であり、w1とw2はベースラインにおけるピーク幅である。Rsが2よりも大きい場合にピークは分離されると考えられる。C6リンカーとTEGリンカーの順列が異なるセンス鎖の混合物は、以下の解像度：
TEG：TEGの解像度Rs＝0.44（分離されない）
C6：C6の解像度Rs＝0.15（分離されない）
C6：TEGの解像度Rs＝2.7（分離される）
を持つことが計算される。同じコレステロール標的化基リンカー（両方がC6、または両方がTEG）を有するRNAiトリガーセンス鎖は分離されなかった。逆に、TEGリンカーとC6リンカーはクロマトグラフィによってよく分離されるため、これら2つの混合物からTEGリンカーとC6リンカーを有するセンス鎖の濃度を求めることができた。表24と図7〜図11に示した結果から、2つのHBV RNAiトリガーは、2つの異なるリンカーによって連結されているときによく分離されることがわかる。
【０２５７】
いくつかの実施態様では、HBV RNAiトリガーであるAD1385とAD1386を組み合わせてHBV感染を治療するための治療用RNAiを形成する。
【０２５８】
【表２５】
2018523668.tif 000080
【図１】
2018523668.tif 000082
【図２】
2018523668.tif 000083
【図３】
2018523668.tif 000084
【図４】
2018523668.tif 000085
【図５】
2018523668.tif 000086
【図６】
2018523668.tif 000087
【図７】
2018523668.tif 000088
【図８】
2018523668.tif 000089
【図９】
2018523668.tif 000090
【図１０】
2018523668.tif 000091
【図１１】
2018523668.tif 000092
【配列表】
2018523668000001.app
【国際調査報告】
2018523668.tif 000093
2018523668.tif 000094
2018523668.tif 000095