(57)【要約】  改善された特性を有するキモシンの変異体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、
（ａ）当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの特定の凝固活性の少なくとも７０％である、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有し；かつ
（ｂ）当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の５０％未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計に接続されたＲＰ−ＨＰＬＣによって行われる、
ことを特徴とする、単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項２】
親ポリペプチドが、配列番号４（ラクダキモシン）のポリペプチドと、少なくとも８０％、例えば、少なくとも例えば８５％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項３】
前記ポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの特定の凝固活性の、少なくとも７０％、例えば、少なくとも例えば７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％又は１５０％を有する、請求項１又は２に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項４】
前記ポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）の、５０％未満、例えば４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は６％未満を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項５】
前記ポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのＣ／Ｐ比の、少なくとも３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、１０００％、１２００％、１４００％又は１６００％のＣ／Ｐ比を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項６】
前記変異体が１又は複数のアミノ酸置換を含み、ここで、当該１又は複数の置換が、配列番号４のアミノ酸配列に関して次のように特定されている：Ｙ１１、Ｌ１３０、Ｓ１３２、Ｖ３２、Ｓ２２６、Ｒ２６６、Ｌ１２、Ｖ２２１、Ｓ２５５、Ｓ２７７、Ｌ２２２、Ｌ２５３、Ｍ１５７、Ｖ２６０、Ｓ２７１、Ｈ７６、Ｋ１９、Ｖ１８３、Ｓ１６４、Ｉ２６３、Ｖ５１、Ｔ２３９、Ｙ３０７、Ｒ６７、Ｇ２５１、Ｒ６１、Ｑ２８８、Ｅ８３、Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｓ１５４、Ｙ２１、Ｖ２０３、Ｌ１８０、Ｅ２９４、Ｇ２８９、Ｌ２１５、Ｄ１４４、Ｉ３０３、Ｌ１０５、Ｔ２８４、Ｙ１２７、Ｖ２４８、Ｋ３２１、Ｖ２０５、Ｅ２６２、Ｋ２３１、Ｒ３１６、Ｍ２５６、Ｄ１５８、Ｄ５９、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｒ２４２又はＩ９６、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項７】
前記変異体が１又は複数のアミノ酸置換を含み、ここで、当該１又は複数の置換が、配列番号４のアミノ酸配列に関して次のように特定されている：Ｙ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｖ３２Ｌ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２６６Ｖ、Ｌ１２Ｍ、Ｖ２２１Ｍ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２７７Ｎ、Ｌ２２２Ｉ、Ｌ２５３Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２６０Ｔ、Ｓ２７１Ｐ、Ｈ７６Ｑ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１８３Ｉ、Ｓ１６４Ｇ、Ｉ２６３Ｌ、Ｖ５１Ｌ、Ｔ２３９Ｓ、Ｙ３０７Ｆ、Ｒ６７Ｑ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ６１Ｑ、Ｑ２８８Ｅ、Ｅ８３Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｗ、Ｓ１５４Ａ、Ｙ２１Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｌ１８０Ｉ、Ｅ２９４Ｑ、Ｇ２８９Ｓ、Ｌ２１５Ｖ、Ｄ１４４Ｑ、Ｉ３０３Ｌ、Ｌ１０５Ｅ、Ｔ２８４Ｓ、Ｙ１２７Ｆ、Ｖ２４８Ｉ、Ｋ３２１Ｐ、Ｖ２０５Ｉ、Ｅ２６２Ｔ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ３１６Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｄ１５８Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｒ２４２Ｅ及び／又はＩ９６Ｌ、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項８】
前記変異体が、以下：
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ＋Ｌ２５３Ｉ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；  Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ又は
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ、
を含むリストから選択される置換の組み合わせを含み、ここで、各置換が、配列番号４のアミノ酸配列に関して特定されている、
請求項１から７のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）：配列番号４のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列中の１又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置：Ｙ１１、Ｌ１３０、Ｓ１３２、Ｖ３２、Ｓ２２６、Ｒ２６６、Ｌ１２、Ｖ２２１、Ｓ２５５、Ｓ２７７、Ｌ２２２、Ｌ２５３、Ｍ１５７、Ｖ２６０、Ｓ２７１、Ｈ７６、Ｋ１９、Ｖ１８３、Ｓ１６４、Ｉ２６３、Ｖ５１、Ｔ２３９、Ｙ３０７、Ｒ６７、Ｇ２５１、Ｒ６１、Ｑ２８８、Ｅ８３、Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｓ１５４、Ｙ２１、Ｖ２０３、Ｌ１８０、Ｅ２９４、Ｇ２８９、Ｌ２１５、Ｄ１４４、Ｉ３０３、Ｌ１０５、Ｔ２８４、Ｙ１２７、Ｖ２４８、Ｋ３２１、Ｖ２０５、Ｅ２６２、Ｋ２３１、Ｒ３１６、Ｍ２５６、Ｄ１５８、Ｄ５９、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｒ２４２及び／又はＩ９６、
のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換を含み、
（ｂ）：ステップ（ａ）の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含む、方法。
【請求項１０】
（ａ）前記変異体が、以下の置換：Ｙ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｖ３２Ｌ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２６６Ｖ、Ｌ１２Ｍ、Ｖ２２１Ｍ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２７７Ｎ、Ｌ２２２Ｉ、Ｌ２５３Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２６０Ｔ、Ｓ２７１Ｐ、Ｈ７６Ｑ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１８３Ｉ、Ｓ１６４Ｇ、Ｉ２６３Ｌ、Ｖ５１Ｌ、Ｔ２３９Ｓ、Ｙ３０７Ｆ、Ｒ６７Ｑ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ６１Ｑ、Ｑ２８８Ｅ、Ｅ８３Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｗ、Ｓ１５４Ａ、Ｙ２１Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｌ１８０Ｉ、Ｅ２９４Ｑ、Ｇ２８９Ｓ、Ｌ２１５Ｖ、Ｄ１４４Ｑ、Ｉ３０３Ｌ、Ｌ１０５Ｅ、Ｔ２８４Ｓ、Ｙ１２７Ｆ、Ｖ２４８Ｉ、Ｋ３２１Ｐ、Ｖ２０５Ｉ、Ｅ２６２Ｔ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ３１６Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｄ１５８Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｒ２４２Ｅ及び／又はＩ９６Ｌ、の１又は複数を含む、
請求項９に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法。
【請求項１１】
（ａ）前記変異体が、以下の置換の組み合わせの１又は複数を含み、かつ、各置換が、配列番号４のアミノ酸配列に関して次のように特定されている：
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ＋Ｌ２５３Ｉ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ；
Ｙ１１Ｉ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ又はＹ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ、
請求項９又は１０に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法。
【請求項１２】
食品又は飼料製品を製造するための方法であって、
請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分（複数）に添加し、並びに
食品又は飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記食品又は飼料製品が乳ベースの製品である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド（polypetide）変異体を含む、食品又は飼料製品。
【請求項１５】
チーズを製造するためのプロセスにおける、請求項１から８のいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【請求項１６】
パスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズ、を製造するためのプロセスにおける、請求項１５に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
【請求項１７】
チーズの苦味を低減するための、請求項１５又は１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、改善された特性を有するキモシンの変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
哺乳類の胃の凝乳酵素である、キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）及びペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
【０００３】
胃粘膜細胞で産生される場合、キモシン及びペプシンはそれぞれ、酵素的に不活性なプレ−プロキモシン及びプレ−ペプシノーゲンとして生じる。キモシンが分泌されると、Ｎ末端ペプチドフラグメントである、プレ−フラグメント（シグナルペプチド）が切断され、プロ−フラグメントを含むプロキモシンが得られる。プロキモシンは酵素の実質的に不活性な形態であるが、プロ−フラグメントの自己触媒除去により活性キモシンへと酸性条件下で活性化される。この活性化は、適切なｐＨ条件下で胃管腔においてイン・ビボで、又は酸性条件下でイン・ビトロで起こる。
【０００４】
ウシ、すなわちボス・タウラス（Bos taurus）の、プレ−プロキモシン、プロキモシン及びキモシンの構造的及び機能的特性は広く研究されてきた。ウシプレ−プロキモシン分子のプレ−部分は１６個のａａ残基を含み、対応するプロキモシンのプロ−部分は４２個のａａ残基の長さを有する。活性ウシキモシンは３２３ａａを含む。
【０００５】
キモシンは哺乳類種、例えばウシ、ラクダ、ヤギ（caprines）、バッファロー、ヒツジ、ブタ、ヒト、サル及びラットにおいて、天然に生成される。
【０００６】
ウシ及びラクダキモシンは長年にわたって酪農業界に市販されてきた。
【０００７】
凝乳酵素、例えばキモシン及びペプシンによる乳の酵素的凝固は、チーズの製造における最も重要な工程の１つである。酵素的な乳の凝固は、次の２相工程である：タンパク質分解酵素であるキモシン又はペプシンが、κ−カゼインを攻撃し、カゼインミセル構造の準安定状態をもたらす第１相、及び、続いて乳が凝固し、凝固物を形成する第２相（参考文献１）。κ−カゼインを切断することによって乳の凝固を促進することに加えて、キモシンは主にＬｅｕ１９２とＴｙｒ１９３との間でβ−カゼイン（β−カゼイン）を切断して、β（１９３−２０９）ペプチドの形成をもたらす。さらに、β（１９３−２０９）のタンパク質分解及び短い疎水性ペプチドの形成は、製品の望ましくない苦い風味をもたらし得る。
【０００８】
国際公開第０２／３６７５２Ａ２号（Chr.Hansen）は、ラクダキモシンの組換え生成を記載している。
国際公開第２０１３／１７４８４０Ａ１号（Chr.Hansen）は、ウシ及びラクダキモシンの突然変異体／変異体を記載している。
国際公開第２０１３／１６４４７９Ａ２号（ＤＳＭ）は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。
【０００９】
以下に列挙した参考文献は、本文脈において、キモシンの突然変異体を記載する参考文献として参照される：
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286。
【００１０】
上述の先行技術文献のいずれも、以下に記載するように、変異体が由来する親と比較して同様の凝固活性で、β−カゼイン切断頻度が低下したキモシン変異体を直接かつ明確に記載していない。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明によって解決されるべき問題は、実質的にその凝固効率を維持しながら、親ポリペプチドと比較した場合に、より低い低下したβ−カゼイン切断頻度を有する、キモシンの変異体を提供することである。
【００１２】
従って、本発明は、単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、
（ａ）当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの特定の凝固活性の少なくとも８０％である、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有し；かつ
（ｂ）当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の５０％未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計に接続された、ＲＰ−ＨＰＬＣによって行われる、
ことを特徴とする、単離されたキモシンポリペプチド変異体を提供する。
【００１３】
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号４のポリペプチド（ラクダキモシン）と少なくとも８０％、例えば、少なくとも例えば８５％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有する、親ポリペプチドに由来し得る。
【００１４】
関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの特定の凝固活性の、少なくとも７０％、例えば、少なくとも例えば７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％又は１５０％を有する。
【００１５】
さらに関連する態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、好ましくは、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの非特異的タンパク質分解活性（Ｐ）の、少なくとも５０％未満、例えば４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は６％未満を有する。
【００１６】
さらなる関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのＣ／Ｐ比の、少なくとも３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、１０００％、１２００％、１４００％又は１６００％のＣ／Ｐ比を有する。
【００１７】
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよく、ここで、当該１又は複数の置換、欠失又は挿入は、配列番号４のアミノ酸配列に関して次のように特定されている：Ｙ１１、Ｌ１３０、Ｓ１３２、Ｖ３２、Ｓ２２６、Ｒ２６６、Ｌ１２、Ｖ２２１、Ｓ２５５、Ｓ２７７、Ｌ２２２、Ｌ２５３、Ｍ１５７、Ｖ２６０、Ｓ２７１、Ｈ７６、Ｋ１９、Ｖ１８３、Ｓ１６４、Ｉ２６３、Ｖ５１、Ｔ２３９、Ｙ３０７、Ｒ６７、Ｇ２５１、Ｒ６１、Ｑ２８８、Ｅ８３、Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｓ１５４、Ｙ２１、Ｖ２０３、Ｌ１８０、Ｅ２９４、Ｇ２８９、Ｌ２１５、Ｄ１４４、Ｉ３０３、Ｌ１０５、Ｔ２８４、Ｙ１２７、Ｖ２４８、Ｋ３２１、Ｖ２０５、Ｅ２６２、Ｋ２３１、Ｒ３１６、Ｍ２５６、Ｄ１５８、Ｄ５９、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｒ２４２又はＩ９６、そしてより具体的には、例えばＹ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｖ３２Ｌ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２６６Ｖ、Ｌ１２Ｍ、Ｖ２２１Ｍ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２７７Ｎ、Ｌ２２２Ｉ、Ｌ２５３Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２６０Ｔ、Ｓ２７１Ｐ、Ｈ７６Ｑ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１８３Ｉ、Ｓ１６４Ｇ、Ｉ２６３Ｌ、Ｖ５１Ｌ、Ｔ２３９Ｓ、Ｙ３０７Ｆ、Ｒ６７Ｑ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ６１Ｑ、Ｑ２８８Ｅ、Ｅ８３Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｗ、Ｓ１５４Ａ、Ｙ２１Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｌ１８０Ｉ、Ｅ２９４Ｑ、Ｇ２８９Ｓ、Ｌ２１５Ｖ、Ｄ１４４Ｑ、Ｉ３０３Ｌ、Ｌ１０５Ｅ、Ｔ２８４Ｓ、Ｙ１２７Ｆ、Ｖ２４８Ｉ、Ｋ３２１Ｐ、Ｖ２０５Ｉ、Ｅ２６２Ｔ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ３１６Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｄ１５８Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｒ２４２Ｅ及び／又はＩ９６Ｌ。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体の作製方法、単離されたキモシンポリペプチド変異体を使用する食品又は飼料製品の製造方法、これら変異体を含む食品及び飼料製品、並びに、食品及び飼料製品を製造するための当該変異体の使用、を提供する。
【００１９】
関連する代替態様において、本発明は、減少した単離されたキモシンポリペプチドを作製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）：配列番号４のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列中の１又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置：
配列番号４におけるＹ１１、Ｌ１３０、Ｓ１３２、Ｖ３２、Ｓ２２６、Ｒ２６６、Ｌ１２、Ｖ２２１、Ｓ２５５、Ｓ２７７、Ｌ２２２、Ｌ２５３、Ｍ１５７、Ｖ２６０、Ｓ２７１、Ｈ７６、Ｋ１９、Ｖ１８３、Ｓ１６４、Ｉ２６３、Ｖ５１、Ｔ２３９、Ｙ３０７、Ｒ６７、Ｇ２５１、Ｒ６１、Ｑ２８８、Ｅ８３、Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｓ１５４、Ｙ２１、Ｖ２０３、Ｌ１８０、Ｅ２９４、Ｇ２８９、Ｌ２１５、Ｄ１４４、Ｉ３０３、Ｌ１０５、Ｔ２８４、Ｙ１２７、Ｖ２４８、Ｋ３２１、Ｖ２０５、Ｅ２６２、Ｋ２３１、Ｒ３１６、Ｍ２５６、Ｄ１５８、Ｄ５９、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｒ２４２又はＩ９６、のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含み；
（ｂ）：ステップ（ａ）の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含む、方法に関する。
【００２０】
上記方法によって生成された、単離されたキモシンは、以下の置換：
Ｙ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｖ３２Ｌ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２６６Ｖ、Ｌ１２Ｍ、Ｖ２２１Ｍ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２７７Ｎ、Ｌ２２２Ｉ、Ｌ２５３Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２６０Ｔ、Ｓ２７１Ｐ、Ｈ７６Ｑ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１８３Ｉ、Ｓ１６４Ｇ、Ｉ２６３Ｌ、Ｖ５１Ｌ、Ｔ２３９Ｓ、Ｙ３０７Ｆ、Ｒ６７Ｑ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ６１Ｑ、Ｑ２８８Ｅ、Ｅ８３Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｗ、Ｓ１５４Ａ、Ｙ２１Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｌ１８０Ｉ、Ｅ２９４Ｑ、Ｇ２８９Ｓ、Ｌ２１５Ｖ、Ｄ１４４Ｑ、Ｉ３０３Ｌ、Ｌ１０５Ｅ、Ｔ２８４Ｓ、Ｙ１２７Ｆ、Ｖ２４８Ｉ、Ｋ３２１Ｐ、Ｖ２０５Ｉ、Ｅ２６２Ｔ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ３１６Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｄ１５８Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｒ２４２Ｅ及び／又はＩ９６Ｌ、の１又は複数を含んでもよい。
【００２１】
関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体、及び上記方法によって生成された変異体は、置換の組み合わせを含んでもよく、かつ、各置換は、配列番号４のアミノ酸配列に関して次のように特定されている：
I96+G163+V221; R67+H76+S132+V248+S271; R67+L130+M157; V136+V221+L222+S226; S132+R254+V259+Y307; V32+I96+S277; L130+M142+I200+V259+E294; L130+S132+V32; L130+G163+Y307;R61+L166+T239; L130+T239+S277+L295; D98+H146+V203+I263+S271; S132+V221+S255+S273+V317; H76+L222+G251;H76+K231+G244; Y127+S132+D158;V221+V248+L253+L295;V32+R61+H146; V32+E294+R316+V317; H76+I96+D158; D98+M157+V183; S226+G244+I263+G289;G70+L130+Y268; D59+V248+L222+V248; R67+G70+H146+Q188+S226; S74+H76+M142+M157+G163; R61+S226+T239+V248+G251;V32+L130+R145+L222+D279; D59+L222+G251+E83+Q162; D59+L222+G251+F17+Y21; D59+L222+G251+H76+S164;D59+L222+G251+K62+M165;D59+L222+G251+Q162+V155;D59+L222+G251+S273+L166;D59+L222+G251+Y268+V198;D59+L222+G251+S273+F66;D59+L222+G251+M165+L166;D59+L222+G251+H76+M165;D59+L222+G251+F17+S273; D59+L222+G251+L166+I45; D59+L222+G251+L180+T284; D59+L222+G251+V32+L12+T284; D59+L222+G251+Y21+L166; D59+L222+G251+V155+E262+V32; D59+L222+G251+L105+S164; D59+L222+G251+Y21+L215+L105; D59+L222+G251+I96+T177+K321; D59+L222+G251+F17+T284+V203; D59+L222+G251+V32+K321+V260; D59+L222+G251+V198+V32+E83; D59+L222+G251+I96+V203+V309;
D59+L222+G251+Y268+L215+V32; D59+L222+G251+H76+L105+V260; D59+L222+G251+Y21+H76+Y268; D59+L222+G251+S164+R266+I96; D59+L222+G251+H181+F66+V32; D59+L222+G251+H181+R266+D267; D59+L222+G251+Y268+L12+D267; D59+L222+G251+L166+E262+T177; D59+L222+G251+F66+Q288+I96; D59+L222+G251+V203+R266+F223; D59+L222+G251+I303+S154+V260; D59+L222+G251+Y21+T284+I96; D59+L222+G251+Q288+K19+T177; D59+L222+G251+K62+Y268+K19; L12+Y21+D59+H76+M165+V198+L222+G251+Q288; L12+Y21+D59+H76+M165+L222+G251+S273; L12+D59+H76+M165+V198+L222+G251+S273+K321; L12+D59+H76+S154+M165+V203+L222+G251+V309; L12+D59+H76Q+D98+L222; L12+K19+V32+D59+H76+D144+M165+L222+G251; L12+Y21+D59+H76+M165+V203+L222+G251+E262; L12+V51+H76+M165+G251; L12+D59+F66+H76+M165+L180+L222+G251+V309; L12+D59+H76+S154+M165+L222+G251+Q288; L12+D59+H76+D98+M165+L222+G251+E262+Q288;  L12+V51+D59+H76+L166+L222+G251; L12+D59+H76+D144+M165+V203+L222; L12+D59+144+M165+L166+L222+G251; L12+K19+D59+H76+S154+M165+V198+L222+G251; L12+H76+D98+M165+L222+G251; L12+V32+D59+H76+M165+L180+V198+L222+G251; L12+D59+H76+S154+M165+S273; L12+V51+D59+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W; L12+V32+H76+M165+L222+E262;L12+N50+D59+H76+M165+G251+E262; V51+D59+H76+M165+L180+L222+G251+E262; L12+D59+H76+M165+G251+Q288+V309+K321; L12+N50+D59+V203+L222+G251; L12+D59+H76+L180+L222+G251+K321; L12+Y21+D59+M165+L222+K321; D59+H76+M165+L166+V198+L222; L12+K19+N50+D59+H76+M165+L222+Q288;  L12+Y21+N50+D59+F66+H76+D144+M165+L222+G251; H76+S132+S164+L222+N249+G251; Y21+D59+H76+S164+L166+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+R242+S273+V309; D59+H76+L130+L166+L222+N249+G251+S273;
Y21+D59+S164+L222+R242+G251+S273+V309; K19+Y21+D59+H76+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+R242+G251; H76+S164+L166+L222+S226+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y21+H76+S164+L222+R242+G251+S273; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; H76+S164+L222+N249+G251+S273+V309; K19+D59+H76+S164+L222+N249+S273; Y21+D59+H76+S164+L222+S226+G251+S273+V309; H76+S164+L166+L222+R242+G251+S273; D59+H76+I96+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S164+L166+L222+G251+S273+V309; D59+S132+S164+L222+R242+N249+G251+S273; H76+I96+S164+G251+S273+V309; D59+H76+L130+S164+G251+V309; K19+D59+S164+L166+L222+S226+G251+S273; D59+H76+I96+S132+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+I96+S164+L166+L222+G251+S273; K19+D59+H76+L130+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+S132+L222+G251+S273+V309; H76+L130+L222+S226+G251+S273; K19+Y21+D59+H76+L130+S164+L222+S273; Y21+D59+H76+I96+S164+L222+N249+G251+S273; K19+D59+H76+S164+R242+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+S226+R242; D59+H76+I96+S132+S164+L166+L222+G251+S273; D59+H76+S132+S164+L166+S273; Y21+D59+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S132+S164+L222+R242+G251+S273; D59+H76+S164+L166+L222+N249+G251+S273+V309; D59+H76+I96+S164+L222+S226+G251+S273+V309; K19+D59+H76+L166+L222+R242+G251+S273; Y21+D59+H76+I96+L222+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+N249+G251+S273; L130+S164+L222+S273; K19+Y21+H76+S164+L222+G251+S273; Y21+D59+H76+L130+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+S226+R242+G251+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; K19+D59+I96+S164+G251;
K19+I96+S164+L166+L222+R242; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; D59+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+D59+E83+I96+L222+G251+I263; Y11+K19+D59+S164+L222+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+G251+L253; K19+I96+S164+L222+N249+G251+L253; K19+I96+L222+R242+L253; K19+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253; D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; K19+I96+S164+L166+L222+N249+I263; D59+I96+L166+L222+R242+G251; K19+D59+E83+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+E83+I96+S164+L222+N249; K19+E83+I96+S164+L222+R242+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; K19+I96+S164+L222+R242+I263; Y11+D59+I96+S164+L222+G251+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+I263; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+G251; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+I263; K19+I96+S164+R242+L253; K19+D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+L253+I263; Y11+K19+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+L253; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; K19+E83+I96+S164+L222+R242+N249+G251+L253; I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253+I263; Y11+I96+S164+L222+R242+N249+L253+I263; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253;
I96+S164+L222+R242+G251+S274; H76+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+G251;  V32+N100+N291; V221+N100+N291; D290+N100+N291; V136+N100+N291; E240+N100+N291; R242+N100+N291; G289+N100+N291; N292+N100+N291; L295+N100+N291; V136+N100+N291; D290+N100+N291; F119+N100+N291; Q280+N100+N291; F282+N100+N291; R254+N100+N291; R242+N100+N291; V203+N100+N291; N249+N100+N291; H56+N100+N291; S74+N100+N291; A131+N100+N291; Y190+N100+N291; I297+N100+N291; H76+N100+N291; S273+N100+N291; K19+N100+N291; D59+N100+N291; L222+N100+N291; V309+N100+N291; I96+N100+N291; Y21+N100+N291; L130+N100+N291; S132+N100+N291; S226+N100+N291; G251+N100+N291; Y243+N100+N291; S273+N100+N291;  R242+Q280+N100+N291; R242+N252+N100+N291; N252+Q280+N100+N291; Y243+Q280+N100+N291; Y243+N252+N100+N291; R254+Q280+N100+N291; S273+Q280+N100+N291; R242+G251+N100+N291; R242+G251+Q280+N100+N291; R242+S273+Q280+N100+N291; N252+S273+Q280+N100+N291; G251+S273+Q280+N100+N291; R242+R254+Q280+N100+N291; R242+R254+S273+Q280+N100+N291; Y243+R254+S273+N100+N291;  V223+N252+N291; E290+N252+N291; A117+N252+N291; I136+N252+N291; Q242+N252+N291; Q278+N252+N291; S289+N252+N291; Q294+N252+N291; D249+N252+N291; D251+N252+N291; G244+N252+N291; Q56+N252+N291; L32+N252+N291; K71+N252+N291; P72+N252+N291; Q83+N252+N291; V113+N252+N291; E133+N252+N291; Y134+N252+N291; K71+N252+N291;  Y11+N100+N291;; Y11+D290+N100+N291; L12+N100+N291; D13+N100+N291; D13+N100+N291;  R67+N100+L130+M157+V248+N291; N100+L130+S132+M157+K231; R67+I96+L130+M157+L222+M256; R67+L130+S132+M157+R242+V248; R67+N100+M157+R242+M256; R67+G70+M157+R242+V248; V32+R67+M157+L222+R242; Y11+R67+M157+V248+M256; R67+V136+M157+L222+V248; L130+M157+V248+M256+N291; R67+I96+L130+M157+K231+R242; V32+R67+L130+M157+L222+K231; L130+V136+M157+L222+N292; R67+G70+M157+L222+N291; V32+R67+L130+K231+N292; Y11+R67+N100+L130+V136+M157; R67+L130+L222+R242+M256; R67+M157+L222+V248+N292;
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Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+I96+L166+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; Y11+K19+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251、例えば:
I96L+G163E+V221M;
R67Q+H76Q+S132A+V248I+S271P;
R67Q+L130I+M157L;
V136I+V221M+L222I+S226T;
S132A+R254S+V259I+Y307F;
V32L+I96L+S277N;
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q;
L130I+G163E+Y307F;
R61S+L166V+T239S;
L130I+T239S+S277N+L295K;
L130I+S132A+V32L;
D98V+H146R+V203A+I263L+S271P;
S132A+V221M+S255Y+S273Y+V317L;
H76Q+L222I+G251W;
H76Q+K231N+G244D;
Y127F+S132A+D158S;
V221M+V248I+L253I+L295K;
V32L+R61Q+H146R;
V32L+E294Q+R316L+V317L;
H76Q+I96L+D158S;
D98V+M157L+V183I;
S226T+G244D+I263L+G289S;
G70D+L130I+Y268F;
D59N+V248I+L222I+V248I;
R67Q+G70N+H146R+Q188E+S226T;
S74F+H76Q+M142I+M157L+G163E;
R61Q+S226T+T239S+V248I+G251W;
V32L+L130I+R145Q+L222I+D279E;
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S;
D59N+L222I+G251W+F17Y+Y21S;
D59N+L222I+G251D+H76Q+S164G;
D59N+L222I+G251D+K62Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+Q162S+V155F;
D59N+L222I+G251D+S273Y+L166V;
D59N+L222I+G251D+Y268F+V198I;
D59N+L222I+G251D+S273Y+F66Y;  
D59N+L222I+G251D+M165E+L166V;
D59N+L222I+G251D+H76Q+M165E;  
D59N+L222I+G251D+F17Y+S273Y;  
D59N+L222I+G251D+L166V+I45V;  
D59N+L222I+G251W+L180I+T284S;  
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L166V;  
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L;  
D59N+L222I+G251D+L105E+S164G;  
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E;  
D59N+L222I+G251D+I96L+T177S+K321P;  
D59N+L222I+G251D+F17Y+T284S+V203A;
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T;
D59N+L222I+G251D+V198I+V32L+E83S;
D59N+L222I+G251D+I96L+V203A+V309I;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L215V+V32L;
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+H76Q+Y268F;
D59N+L222I+G251D+S164G+R266V+I96L;
D59N+L222I+G251D+H181N+F66Y+V32L;
D59N+L222I+G251D+H181N+R266I+D267Q;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L12M+D267Q;
D59N+L222I+G251D+L166V+E262T+T177S;
D59N+L222I+G251D+F66Y+Q288E+I96L;
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A;
D59N+L222I+G251D+I303L+S154A+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+T284S+I96L;
D59N+L222I+G251D+Q288E+K19T+T177S;
D59N+L222I+G251D+K62Q+Y268F+K19T
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+Q288E;  
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+L222I+G251W+S273Y;  
L12M+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+S273Y+K321P;  
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I;
L12M+D59N+H76Q+D98V+L222I;  
L12M+K19T+V32L+D59N+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D;  
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L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D;  
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R67Q+I96L+M157L+L222I+K231N; R67Q+M157L+L222I+K231N+V248I; R67Q+L130I+M157L+R242E+M256L+N292H; R67Q+L222I+K231N+V248I; R67Q+S132A+L222I+K231N+R242E+V248I;  Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D; Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D。
【００２２】
代替態様は、食品又は飼料製品を製造するための方法であって、
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分（複数）に添加し、並びに
食品又は飼料製品、例えば乳ベースの製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法に関し、
並びに、任意により具体的には、チーズ、例えばパスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズを製造するための方法、に関する。
【００２３】
従って、本発明は、本明細書に記載のキモシンポリペプチド（polypetide）変異体を含む、食品又は飼料製品に関する。
【００２４】
本発明のポリペプチド変異体はまた、チーズ及び、例えばヨーグルトのような他の乳製品における苦味を低減するために使用され得る。
【００２５】
チーズ熟成において、キモシンは、β−カゼインを主にＬｅｕ１９２とＴｙｒ１９３との間で切断する（参考文献２、３）。得られたペプチドβ（１９３−２０９）は、プロテアーゼによって、苦味がある短い疎水性ペプチドへとさらに分解されることになる（参考文献４）。乳製品用途における苦味は最も頻繁に望ましくない特徴とみなされるので、より低いβ−カゼイン切断頻度を有するキモシン変異体を開発することが望ましい。
【００２６】
異なる変異体の知的設計及び比較分析に基づいて、本発明者らは、多くのアミノ酸位置を同定し、このアミノ酸位置は、これらの位置の１又は複数における変異体を作製することによって、より低いβ−カゼイン切断頻度を有する改善されたキモシン変異体を得ることができるという意味で、本明細書において重要である。
【００２７】
変異体又は突然変異を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドの番号付けで行われる。明確化のために、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号４に対応する。
【００２８】
当該技術分野で知られているように、異なる哺乳動物種から得られた異なる天然野生型キモシンポリペプチド配列（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット）は、比較的高い配列類似性／同一性を有している。
【００２９】
図１において、これは、本明細書で関連する異なるキモシン配列のアラインメントによって例示される。この比較的近い配列関係を考慮して、異なる天然野生型キモシンの３Ｄ構造も比較的類似していると考えられる。
【００３０】
本文脈において、天然に得られた野生型キモシン（例えばウシキモシン又はラクダキモシン）は、本明細書において親ポリペプチドの一例、すなわち、本発明の変異体キモシンポリペプチドを生成するために改変が成される親ポリペプチドであり得る。
【００３１】
理論に制限されることなく、本明細書で議論されたキモシンに関連するアミノ酸位置は、任意の本明細書に関連する目的のキモシン酵素（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットなどのキモシン）において一般的に重要であり、それは、これらの位置の１又は複数における変異体を作製することによって、一般的に改善されたキモシン変異体（例えば改善されたウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラットキモシン変異体）を得ることができるという意味で、重要であると考えられる。
【００３２】
本明細書で議論されるように、目的の親キモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書における配列番号２の公知の成熟ヒトコブラクダ（Camelius dromedarius）キモシン配列が本明細書で使用される。それを本明細書では代わりにラクダキモシンと呼ぶことができる。当該配列はまた、本明細書の図１に示される。
【００３３】
本文脈において、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する親キモシンポリペプチド（例えばヒツジ又はラット由来）は、本明細書に記載したアミノ酸位置のいずれかにおける変異体を作製することによって改善されるために、例えばウシ又はラクダキモシンに関して、本明細書において十分な構造として見ることができると考えられる。
【００３４】
本発明の実施形態を以下に説明する。
【００３５】
定義
本明細書において関連する用語の全ての定義は、本明細書で関連する技術的文脈に関して当業者により理解されることになるものに従う。
【００３６】
用語「β−切断」又は「β−カゼインの切断」は、β−カゼインの任意の酵素的切断を意味する。例えばＬｅｕ１９２とＴｙｒ１９３との間での切断は、β（１９３−２０９）ペプチドの形成をもたらす。一態様において、β−切断は、スキムミルクをキモシン変異体ポリペプチド又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られた、β（１９３−２０９）ペプチドを定量化することによって決定され、ここで、定量化は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計に接続されたＲＰ−ＨＰＬＣによって行われる。β−カゼイン切断を決定する好ましい方法の全詳細は、実施例に記載される。
【００３７】
用語「キモシン」は、ＥＣ３．４．２３．４クラスの酵素に関する。キモシンは高い特異性を有し、カゼインのκ−鎖における単一１０４−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−｜−Ｍｅｔ−Ａｌａ−１０８結合の切断によって、主に乳を凝固させる。副活性（side-activity）として、キモシンはまた、β−カゼインを主にＬｅｕ１９２とＴｙｒ１９３との間で切断する（参考文献２、３）。得られたペプチドβ（１９３−２０９）は、プロテアーゼによって、苦味がある短い疎水性ペプチドへとさらに分解されることになる（参考文献４）。当該技術分野で使用されるキモシンの代替名は、レンニンである。
【００３８】
用語「キモシン活性」は、本文脈において当業者によって理解される、キモシン酵素のキモシン活性に関する。当業者は、本明細書において関連するキモシン活性の決定方法を知っている。
【００３９】
用語「特定の凝固活性」は、キモシンポリペプチドの乳凝固活性を説明し、当該技術分野でよく知られているアッセイに従って決定することができる。ＩＭＣＵ／ｍｇタンパク質の単位で特定の凝固活性を決定するための好ましい方法は、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法（ＩＤＦ法）であり、それは、乳凝固活性が、乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定され、そして試料の凝固時間が、既知の凝乳活性、及びＩＤＦ標準１１０Ｂによる試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較される、ステップを含む。試料及び参照標準は、同一の化学的及び物理的条件下で測定される。ＩＤＦ法の全詳細は実施例に記載される。
【００４０】
当該技術分野において知られているように、本明細書で関連するいわゆるＣ／Ｐ比は、特定の凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって決定される。当該技術分野において知られているように、より高いＣ／Ｐ比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。
【００４１】
用語「単離された変異体」は、人間の行為によって改変された変異体を意味する。一態様において、当該変異体は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定されるように、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、及び少なくとも９０％純粋である。
【００４２】
本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドの番号付けで行われる。配列表において、本願に以下の配列が提供される：
配列番号１は、ウシプレ−プロキモシン（prochmyosin）の完全なポリペプチド配列を表す；
配列番号２は、ラクダプレ−プロキモシンの完全なポリペプチド配列を表す；
配列番号３は、成熟ウシキモシンのポリペプチド配列を表す；
配列番号４は、成熟ラクダキモシンのポリペプチド配列を表す。
【００４３】
換言すれば、配列番号３及び４は、それぞれ配列番号１及び２のアミノ酸５９〜３８１に対応する。本明細書で同定された特定の置換の全ては、成熟キモシン配列の位置に関連して、すなわち配列番号３又は４のアミノ酸の番号付けに関連して、同定されている。その位置が配列番号１又は２のアミノ酸の番号付けに関連して同定される限りにおいて、配列番号３又は４における位置を同定するために５８残基を減算しなければならず、逆もまた同様である。
【００４４】
用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの後の、その最終形態のペプチドを意味する。本文脈において、本明細書で関連する成熟キモシンポリペプチドは活性キモシンポリペプチド配列、すなわちプレ−部分及び／又はプロ−部分の配列を有さないものとして見られる。本明細書で関連する成熟ポリペプチドの例は、例えば、配列番号１のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１である、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチド、あるいは、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドである。
【００４５】
用語「親」、「親ポリペプチド」又は「キモシン活性を有する親ポリペプチド」は、本発明の酵素変異体を生成するために改変が成されるポリペプチドを意味する。この親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。本発明の好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号４のポリペプチド（ラクダキモシン）と、少なくとも８０％、例えば、少なくとも例えば８５％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【００４６】
用語「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間での関連性に関する。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、Trends Genet.16:276-277）に実装されるような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman及びWunsch、1970、J.Mol.Biol.48:443-453）、好ましくはバージョン３．０．０以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００４７】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、上記参照）に実装されるような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman及びWunsch、1970、上記参照）、好ましくはバージョン３．０．０以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。
【００４８】
用語「変異体」は、改変、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を、１又は複数の（いくつかの）位置に含む、キモシン活性を有するペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の、異なるアミノ酸での置き換えを意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；そして挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。アミノ酸は天然又は非天然アミノ酸であってもよく、例として、例えばＤ−アラニンの、例えば特にＤ−異性体（又はＤ−型）による置換が、理論的に可能であり得る。
【００４９】
用語「野生型」ペプチドとは、天然に存在するヌクレオチド配列又はペプチド配列、すなわち、人間の行為による標的化された突然変異に供されていないヌクレオチド配列又はペプチド配列をいう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本明細書で関連する異なるキモシン配列のアラインメント。示された「Bos_bovis_chymosin_B」は本明細書における配列番号１のウシキモシンであり、示された「ヒトコブラクダ（Camelus_dromedarius）」は本明細書における配列番号２のラクダキモシンである。本明細書に記載された参照配列として配列番号１のウシキモシンを用いると、例えば、ウシキモシンが位置１０に「Ｖ」を有し、かつラクダキモシンが同じ位置１０に「Ａ」を有することがわかる。また、例えば、ウシ／ラット（Rat）は位置３５２に「Ｑ」を有し、かつラクダ／フタコブラクダ（C._bactrianus）は同じ位置３５２に「Ｅ」を有することもわかる。図１に示されたキモシン配列に関連して、ヒツジ（Sheep）はウシ配列番号１と９４．５％の配列同一性を有し；フタコブラクダ（C._bactrianus）は、ウシ配列番号１と８３．２％の配列同一性を有し；ヒトコブラクダ（Camelus_dromedarius）（配列番号２のラクダキモシン）は、はウシ配列番号１と８４％の配列同一性を有し；ブタ（Pig）はウシ配列番号１と８０．３％の配列同一性を有し、そしてラットはウシ配列番号１と７１．９％の配列同一性を有する。本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン−すなわち配列番号１のアミノ酸位置５９〜３８１）と、例えばヒツジ、フタコブラクダ（C._bactrianus）、ラクダ、ブタ又はラットキモシンの成熟ポリペプチド配列との、本明細書で関連する配列同一性パーセンテージは、上述の配列同一性パーセンテージに比較的類似している。
【図２】紫で示された、結合したβ−カゼインのモデルを有するラクダキモシン（ＰＤＢ：４ＡＡ９）の３Ｄ構造。β−カゼインは、残基１９２と１９３との間の切断可能な結合でキモシン基質の結合溝に配置されている。ラクダキモシン残基Ｖ３２、Ｌ１３０、及びＳ１３２は緑色で強調されている。
【図３】紫で示された、結合したβ−カゼインのモデルを有するラクダキモシン（ＰＤＢ：４ＡＡ９）の３Ｄ構造。β−カゼインは、残基１９２と１９３との間の切断可能な結合でキモシン基質の結合溝に配置されている。ラクダキモシン残基Ｖ３２、Ｌ１３０、及びＳ１３２は緑色で強調されている。
【図４】ラクダキモシンの３Ｄ構造（ＰＤＢ：４ＡＡ９）。ラクダキモシン残基Ｖ３２及びＬ１２は、緑色で強調されている。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
上記で論じたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号２として開示された公知のラクダキモシン配列が使用される。
【００５２】
別のキモシンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に開示されたポリペプチドとアラインされ、そしてアラインメントに基づいて、配列番号１に開示されたポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、本明細書の実施例１に記載のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて決定される。
上記のよく知られたコンピュータープログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
【００５３】
本明細書の図１には、アラインメントの一例が示されている。
単なる一例として、図１において、例えば、本明細書で使用されるウシ参照配列番号１は位置５０に「Ｇ」を有し、かつ「ヒトコブラクダ（Camelus_dromedarius）」（本明細書の配列番号２）はこの位置５０に「Ａ」を有することがわかる。
【００５４】
変異体の命名法
本発明の変異体を説明する際に、以下に記載した命名法が参照を容易にするために適用される。認められたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字のアミノ酸の略号が使用される。
以下、この「命名法」セクションで論じた特定の変異体は、本明細書で関連する本発明の変異体でなくてもよく、すなわち、この「命名法」セクションは単に、本明細書で関連する使用された命名法それ自体を説明する。上記に示したように、本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟キモシンポリペプチド配列におけるアミノ酸の位置に基づいている。
【００５５】
置換
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのアラニンによるスレオニンの論理的置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」として指定される。複数の突然変異は、追加の印（「＋」）により分離され、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」はそれぞれ、位置２０５及び４１１での、アルギニン（Ｒ）によるグリシン（Ｇ）の、及びフェニルアラニン（Ｆ）によるセリン（Ｓ）の置換を表す。置換、例えば指定された「２２６Ａ」は、位置２２６でのアラニンによる親アミノ酸（例えばＴ、Ｑ、Ｓ又は別の親アミノ酸）の置換を意味する。同様に、指定された「Ａ２２６」又は「Ａ２２６Ｘ」の置換は、位置２２６におけるアラニンの、別の不特定のアミノ酸による置換を意味する。
【００５６】
欠失
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、＊。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」として指定される。複数の欠失は、追加の印（「＋」）により分離され、例えば、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」となる。
【００５７】
挿入
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と指定される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；など］と指定される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」として示される。
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基（複数）は、挿入されたアミノ酸残基（複数）の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって、番号付けされる。したがって、上記例において、配列は次の通りである：
【００５８】
【表１】
2018525974.tif 000002
【００５９】
複数の改変
複数の改変を含む変異体は、追加の印（「＋」）によって分離され、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０及び１９５でのアルギニン及びグリシンについての、チロシン及びグルタミン酸の置換を表す。
【００６０】
異なる置換
異なる置換が１つの位置に導入され得る場合、その異なる置換はコンマによって分離され、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ，Ｅ」は、位置１７０でのチロシン又はグルタミン酸による、アルギニンの置換を表す。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」又は「Ｙ１６７Ｇ，Ａ＋Ｒ１７０Ｇ，Ａ」は、以下の変異体を指定する：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【００６１】
好ましい変異体：
以下の実施例に概説したように、本発明者らは、少なくともその凝固活性を維持しながら、対応する親ポリペプチドよりも低い頻度でβ−カゼインを切断する、多くの好ましいキモシンポリペプチド変異体を作製した。
【００６２】
β−カゼイン切断頻度が低減された好ましい変異体：
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの特定の凝固活性の少なくとも８０％である、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を有し、配列番号４によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの特定の凝固活性の、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９７％である、特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を含む。
【００６３】
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号４のポリペプチド（ラクダキモシン）と少なくとも８０％、例えば、少なくとも例えば８０％、８５％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する、親ポリペプチドに由来し得る。
【００６４】
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含んでもよく、ここで、当該１又は複数の置換、欠失又は挿入は、配列番号４のアミノ酸配列に関して次のように特定されている：Ｙ１１、Ｌ１３０、Ｓ１３２、Ｖ３２、Ｓ２２６、Ｒ２６６、Ｌ１２、Ｖ２２１、Ｓ２５５、Ｓ２７７、Ｌ２２２、Ｌ２５３、Ｍ１５７、Ｖ２６０、Ｓ２７１、Ｈ７６、Ｋ１９、Ｖ１８３、Ｓ１６４、Ｉ２６３、Ｖ５１、Ｔ２３９、Ｙ３０７、Ｒ６７、Ｇ２５１、Ｒ６１、Ｑ２８８、Ｅ８３、Ｄ５９、Ｖ３０９、Ｓ２７３、Ｇ２５１、Ｓ１５４、Ｙ２１、Ｖ２０３、Ｌ１８０、Ｅ２９４、Ｇ２８９、Ｌ２１５、Ｄ１４４、Ｉ３０３、Ｌ１０５、Ｔ２８４、Ｙ１２７、Ｖ２４８、Ｋ３２１、Ｖ２０５、Ｅ２６２、Ｋ２３１、Ｒ３１６、Ｍ２５６、Ｄ１５８、Ｄ５９、Ｎ２４９、Ｌ１６６、Ｒ２４２又はＩ９６例えばＹ１１Ｉ、Ｙ１１Ｖ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｖ３２Ｌ、Ｓ２２６Ｔ、Ｒ２６６Ｖ、Ｌ１２Ｍ、Ｖ２２１Ｍ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２７７Ｎ、Ｌ２２２Ｉ、Ｌ２５３Ｉ、Ｍ１５７Ｌ、Ｖ２６０Ｔ、Ｓ２７１Ｐ、Ｈ７６Ｑ、Ｋ１９Ｔ、Ｖ１８３Ｉ、Ｓ１６４Ｇ、Ｉ２６３Ｌ、Ｖ５１Ｌ、Ｔ２３９Ｓ、Ｙ３０７Ｆ、Ｒ６７Ｑ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ６１Ｑ、Ｑ２８８Ｅ、Ｅ８３Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｖ３０９Ｉ、Ｓ２７３Ｙ、Ｇ２５１Ｗ、Ｓ１５４Ａ、Ｙ２１Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｌ１８０Ｉ、Ｅ２９４Ｑ、Ｇ２８９Ｓ、Ｌ２１５Ｖ、Ｄ１４４Ｑ、Ｉ３０３Ｌ、Ｌ１０５Ｅ、Ｔ２８４Ｓ、Ｙ１２７Ｆ、Ｖ２４８Ｉ、Ｋ３２１Ｐ、Ｖ２０５Ｉ、Ｅ２６２Ｔ、Ｋ２３１Ｎ、Ｒ３１６Ｌ、Ｍ２５６Ｌ、Ｄ１５８Ｓ、Ｄ５９Ｎ、Ｎ２４９Ｅ、Ｌ１６６Ｖ、Ｒ２４２Ｅ及び／又はＩ９６Ｌ。
【００６５】
関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、置換の組み合わせを含んでもよく、ここで当該置換の組み合わせは、以下を含むリスト：
Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ１６６＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９＋Ｇ２５１；
Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２＋Ｇ２５１；  Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ１６６＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９＋Ｇ２５１＋Ｌ２５３；  Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ１６６＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９＋Ｇ２５１；  Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９＋Ｇ２５１；  Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ１６６＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９＋Ｇ２５１；  Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９；  Ｙ１１＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ１６６＋Ｒ２４２＋Ｇ２５１；  Ｙ１１＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２；  Ｙ１１＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋Ｌ２２２＋Ｒ２４２＋Ｇ２５１又はＹ１１Ｉ＋Ｋ１９＋Ｄ５９＋Ｉ９６＋Ｓ１６４＋  ＋Ｒ２４２＋Ｎ２４９＋Ｇ２５１例えば
Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；
Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；  Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ＋Ｌ２５３Ｉ；  Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；  Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；  Ｙ１１Ｖ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；  Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ；  Ｙ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ１６６Ｖ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ；  Ｙ１１Ｉ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ；  Ｙ１１Ｉ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ又はＹ１１Ｉ＋Ｋ１９Ｔ＋Ｄ５９Ｎ＋Ｉ９６Ｌ＋Ｓ１６４Ｇ＋Ｌ２２２Ｉ＋Ｒ２４２Ｅ＋Ｎ２４９Ｅ＋Ｇ２５１Ｄ、
から選択され、ここで、各置換は、配列番号４のアミノ酸配列に関して特定されている。
【００６６】
関連態様において、変異体は、キモシン活性を有する親ポリペプチドと比較して、１又は複数の特定の位置における改変を含んでもよく、ここで、当該改変は、以下の位置１１、１３０、１３２、３２、２２６、２６６、１２、２２１、２５５、２７７、２２２、２５３、１５７、２６０、２７１、７６、１９、１８３、１６４、２６３、５１、２３９、３０７、６７、２５１、６１、２８８、８３、５９、３０９、２７３、２５１、１５４、２１、２０３、１８０、２９４、２８９、２１５、１４４、３０３、１０５、２８４、１２７、２４８、３２１、２０５、２６２、２３１、３１６、２５６、１５８、５９、２４９、１６６、２４２又は９６、のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含んでおり、ここで、親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと親ポリペプチドとのアラインメントによって決定され、そして親ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置５９〜アミノ酸位置３８１である、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと、少なくとも６５％の配列同一性を有し、ここで、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、対応する親ポリペプチドよりも低い頻度でβ−カゼインを切断する。
【００６７】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも例えば８５％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。
【００６８】
好ましくは、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は変異体であり、ここで、当該変異体は、変異体が由来する親ペプチドと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を有する。
【００６９】
より好ましくは、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は変異体であり、ここで、当該変異体は、以下、
−本明細書における配列番号１の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性；並びに
−本明細書における配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性、
を有する。
【００７０】
上記で論じたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号２として開示された公知のラクダキモシン配列の成熟ペプチドが、本明細書で使用される。
【００７１】
上記で論じたように、例えば本明細書で論じられたコンピューター配列アラインメントプログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド（例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど）の本明細書で関連するアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
【００７２】
用語「親ポリペプチドが配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する」とは、本明細書で関連するその変異体を作製するために使用される親キモシンポリペプチドの配列に基づく制限に関連するものとして見られる。
【００７３】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは、親ポリペプチドは配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する。親ポリペプチドは配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましいであろう。
【００７４】
本文脈において当業者によって理解されるように、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、例えばすでに、例えば対応する野生型キモシンの、変異体であり得る。
換言すれば、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求される位置以外の位置において、改変（例えば置換）を含み得る。
【００７５】
本明細書の図１に示されたキモシン配列に関して、ヒツジはウシ配列番号１と９４．５％の配列同一性を有し；フタコブラクダ（C._bactrianus）（ラクダ）はウシ配列番号１と８３．２％の配列同一性を有し；ブタはウシ配列番号１と８０．３％の配列同一性を有し、そしてラットはウシ配列番号１と７１．９％の配列同一性を有する。
【００７６】
本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号１の成熟ポリペプチド（ウシキモシン−すなわち配列番号１のアミノ酸位置５９〜３８１）と、例えば成熟ヒツジ、フタコブラクダ（C._bactrianus）、ラクダ、ブタ又はラットキモシンとの、本明細書で関連する配列同一性パーセンテージは、上述の配列同一性パーセンテージと比較的類似している。
【００７７】
好ましくは、本明細書に記載の単離されたウシキモシンポリペプチド変異体は変異体であり、ここで、当該変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのβ−カゼイン切断頻度と比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性を有する。
【００７８】
上記で論じたように、本明細書の実施例において、親ポリペプチドとして配列番号２（ラクダキモシン）のポリペプチドを用いて変異体が作製された。そのような変異体は、本明細書において、ラクダキモシン変異体と称され得る。
【００７９】
本文脈において当業者によって理解されるように、単離されたキモシン変異体は、上記で与えられた以外のアミノ酸位置における改変（例えば置換）を含み得る。
例として、配列番号２の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して、例えば５〜１０の改変（例えば置換）を有するラクダキモシン変異体は、依然として、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。
【００８０】
単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して３０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して２０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して１０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して５未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合がある。
【００８１】
本文脈において当業者によって理解されるように、上記の用語「単離された変異体ポリペプチドが配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する」とは、本明細書に記載の単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号２の公知の野生型ラクダキモシン配列と１００％同一であるポリペプチド配列を有するものではないことに関する。
【００８２】
好ましい実施形態は、改変が、本明細書で請求された位置のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、単離されたラクダキモシンポリペプチド変異体に関する。
【００８３】
少なくとも１つの改変が置換であることが好ましい場合があり、すなわち、本明細書で関連する好ましい実施形態は、改変が、本明細書で請求された位置のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸位置における置換を含んでいる、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
【００８４】
キモシン活性を有する好ましい親ポリペプチド：
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）及び／又は配列番号２（ラクダキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００８５】
単なる一例として、本明細書で好適な関連する親ポリペプチドは、例えばウシキモシンＡであり得る。当該技術分野において知られているように、ウシキモシンＡは、本明細書における配列番号１のウシキモシンＢと比較して、１個のアミノ酸の差異のみを有し得る。
【００８６】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは  親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する。親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。
【００８７】
本文脈において当業者によって理解されるように、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、例えばすでに、例えば対応する野生型キモシンの変異体であり得る。
【００８８】
例として、配列番号１の成熟野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば５〜１０の改変（例えば置換）を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
【００８９】
換言すると、一般的には、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求された位置以外の位置における改変（例えば置換）を含み得る。
【００９０】
本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号２の成熟ポリペプチド（ラクダ）と少なくとも９０％の配列同一性を有する親ポリペプチドは、依然として、配列番号１（ウシ）に基づく配列同一性要件の範囲内である。すなわち、それは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
【００９１】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、さらにより好ましくは親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性を有する。親ポリペプチドは、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。
【００９２】
本文脈において当業者によって理解されるように、単離されたキモシン変異体は、上記で与えられた以外のアミノ酸位置における改変（例えば置換）を含み得る。
例として、配列番号１の野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば５〜１０の改変（例えば置換）を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
【００９３】
単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して３０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して２０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して１０未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号１（ウシキモシン）の成熟ポリペプチドと比較して５未満のアミノ酸改変（例えば置換）を含むことが好ましい場合がある。
【００９４】
配列番号２のラクダキモシンポリペプチドは、配列番号１のウシポリペプチド（すなわち、プレ及びプロ配列を含む、位置１〜３８１の完全な配列番号１）と、８４％の配列同一性を有する。
【００９５】
単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法
上記で論じた通り、当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を日常的に生成及び精製し得る。
換言すれば、当業者が、本明細書で関連する目的のキモシン活性を有する親ポリペプチド（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット由来）を保有したならば、そのような目的の親キモシンの変異体を作製することは、当業者にとって日常的な作業である。
【００９６】
キモシン（変異体又は親）を生成及び単離するための好適な方法の例は、例えば国際公開第０２／３６７５２Ａ２号（Chr.Hansen）に記載されたような、よく知られた、例えば真菌組み換え発現／生成に基づく技法によるものであり得る。
【００９７】
キモシン活性を有する親ポリペプチドにおける１又は複数の位置で、改変を行うことも、当業者にとって日常的な作業であり、ここで、当該改変は、少なくとも１つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含んでいる。
当業者に知られているように、これは例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発、及び組み換え発現／生成に基づく技法によって行われ得る。
【００９８】
本明細書で関連する親ポリペプチド（例えばラクダ又はウシ野生型キモシン）及び／又は本明細書で関連する変異体が、キモシン活性を有するか否かを決定することはまた、当業者にとって日常的な作業である。当該技術分野において知られているように、キモシン特異性は、いわゆるＣ／Ｐ比によって決定することができ、この比は特定の凝固活性（Ｃ）をタンパク質分解活性（Ｐ）で割ることによって決定される。
当該技術分野において知られているように、より高いＣ／Ｐ比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。
【００９９】
また、当該技術分野において知られているように、β−カゼイン切断及びβ−カゼイン（β（１９３−２０９）を含む）形成は、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて決定され得る。
【０１００】
乳ベースの製品を製造するための方法
上記で論じたように、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、当該技術に従って、例えば目的の乳ベースの製品（例えばチーズ製品）を製造するために、使用され得る。
【０１０１】
上記で論じたように、本発明の一態様は、食品又は飼料製品を製造するための方法であって、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分（複数）に添加し、並びに、食品又は飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、を含む、方法に関する。
【０１０２】
好ましくは、前記食品又は飼料製品は乳ベースの製品であり、ここで、当該方法は、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、乳に添加し、並びに乳ベースの製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、を含む。
【０１０３】
例えば、本発明のキモシンポリペプチド変異体は、乳の発酵後に、乳ベースの製品に添加され得る。一態様において、本発明のキモシンポリペプチド変異体は、チーズの製造方法の一部として、発酵乳製品の凝固のために添加される。
【０１０４】
前記乳は、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳であり得る。
【０１０５】
前記乳ベースの製品は、例えば発酵乳製品、例えばクワルク（quark）又はチーズであり得る。
【０１０６】
食品及び飼料製品
本発明はまた、本発明のキモシンポリペプチド変異体、又は本発明の方法に従って得ることができるキモシンポリペプチド変異体を含む、食品及び飼料製品を提供する。前記食品及び飼料製品は、好ましくは発酵食品、例えばチーズ及びクワルクを含む発酵乳製品である。
【０１０７】
さらに関連する態様において、本発明は、食品又は飼料製品を製造するための方法であって、本発明に係る単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を添加すること、を含む、方法に関する。好ましくは、前記食品又は飼料製品は乳ベースの製品である。
【０１０８】
本発明のキモシンポリペプチド変異体はまた、チーズを製造するためのプロセスにおいて、例えばチーズの苦味を低減するために、使用され得る。
【実施例】
【０１０９】
実施例
実施例１：キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアラインメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、ＥＢＩ（ＥＢＩ、ツール、複数の配列アラインメント、CLUSTALW”、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）によって提供され、Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21)、2947-2948に記載された、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いてアラインした。
【０１１０】
複数の配列アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷ２設定は、タンパク質重量マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ、ＧＡＰ  ｏｐｅｎ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ＝  ０．０５、ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝８、Ｎｏ  Ｅｎｄ  Ｇａｐｓ、ＩＴＥＲＡＴＩＯＮ＝ｎｏｎｅ、ＮＵＭＩＴＥＲ＝１、ＣＬＵＳＴＥＲＩＮＧ＝ＮＪ、であった。
【０１１１】
参照配列として、ウシキモシンＢプレプロキモシンを使用し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ００７９４−配列番号１として本明細書に開示される）、ここで、Ｎ−末端メチオニンは番号１を有し（ＭＲＣＬ……）、そしてＣ−末端イソロイシン（タンパク質配列中…ＬＡＫＡＩ）は番号３８１を有する。
【０１１２】
実施例２：キモシン変異体の設計
キモシン変異体を異なる戦略を用いて設計した。
【０１１３】
ラクダキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号２の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンに言及される。配列番号２のラクダキモシンは、そのラクダキモシン変異体を作製するために使用される、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドとして見られる。
【０１１４】
ウシキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号１のポリペプチドを含むウシキモシンに言及される。配列番号１のウシキモシンは、そのウシキモシン変異体を作製するために使用される、関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドとして見られる。
【０１１５】
ラクダキモシンの変異体１〜２６９及び３６７〜４６１は、ウシキモシンＢと比較して２５％以上の同一性を有する多くの組の公知のアスパラギン酸プロテアーゼ配列の、アラインメントに基づいて設計された。一般に、変異は、種間で高レベルのアミノ酸変異を有する領域に導入されたが、保存された領域は変更されなかった。アミノ酸置換は、β−カゼイン切断に対して有益な効果を示す可能性が高い変化を同定するために、系統学的、構造的及び実験的情報に基づいて選択された。複数の変異を各変異体構築物に導入して、種々の置換の間の共変動の影響を最小限にするために、各単一突然変異が複数の変異体構築物に存在することを確実にした。実験データの機械学習及び統計分析を使用して、キモシン変異体の測定された凝固性能に対するアミノ酸置換の相対的寄与を決定した（参考文献１４、１５）。
【０１１６】
変異体２７１〜３６６を、ウシキモシン（ＰＤＢコード：４ＡＡ８）及びラクダキモシン（ＰＤＢコード：４ＡＡ９）の詳細な構造分析に基づいて設計した。変異を、それぞれのアミノ酸側鎖の化学的性質、及びカゼイン基質結合又は一般的酵素特性のいずれかに対するその予想される影響に基づいて選択した。変異体２７１〜３４６におけるアミノ酸置換の大部分は、基質結合溝内に又はそれに構造的に近接しているいずれかの配列位置で、あるいは結合したカゼイン基質と接触する二次構造要素で、作製された。さらに、変化は、これらの領域の電荷プロファイルを変更する、タンパク質表面上の位置で成され（参考文献５）、それゆえ、酵素性能に影響を及ぼすことが予想される。変異体３４７〜３６６は、ウシ及びラクダキモシンにおけるＮ−末端配列の異なる構造配座に基づいて作製された。アミノ酸置換は、ラクダキモシンのＮ−末端と相互作用する基質結合溝内の位置で成された。
【０１１７】
実施例３：キモシン変異体酵素材料の調製
全てのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、真菌発現ベクター、例えばｐＧＡＭｐＲ−Ｃにクローニングした（国際公開第０２／３６７５２Ａ２号に記載）
【０１１８】
ベクターを大腸菌（E.coli）に形質転換し、プラスミドＤＮＡを当業者に既知の標準的な分子生物学プロトコルを用いて精製した。
変異体プラスミドを個々に、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）株に形質転換し、タンパク質を本質的に国際公開第０２／３６７５２Ａ２号に記載のように産生し、標準的なクロマトグラフィー技法を用いて精製した。
【０１１９】
当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体−例えば本明細書に記載のウシ及びラクダキモシン変異体を、生成及び精製することができる。
【０１２０】
実施例４：特定のキモシン活性の決定
４．１  乳凝固活性の決定
乳凝固活性を、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法（ＩＤＦ法）である、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定した。
乳凝固活性を、０．５ｇ／Ｌ（ｐＨ≒６．５）の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪乳粉末から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定する。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつＩＤＦ標準１１０Ｂによって当該試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料及び参照標準を、同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体試料を、８４ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５．５を用いて約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調整した。その後、２００μｌの酵素調製物を、一定の攪拌下で３２℃±１℃の一定温度を維持することができる水浴中に配置した、ガラス試験管中の１０ｍｌの予熱した乳（３２℃）に加えた。あるいは、２０μＬの酵素調製物を、上記のように１ｍＬの予熱した乳に加えた。
レンネットの総凝乳活性（強度）を、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌで計算した：
ＩＭＣＵ／ｍｌでの強度＝Ｓ標準  ｘ  Ｔ標準  ｘ  Ｄ試料
Ｄ標準  ｘ  Ｔ試料
Ｓ標準：レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
Ｔ標準：標準希釈について得られた秒での凝固時間
Ｄ試料：試料についての希釈係数
Ｄ標準：標準についての希釈係数
Ｔ試料：酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間
【０１２１】
ライブラリ１、３、４及び６変異体、並びに構造設計による変異体の凝固活性決定のために、μＩＭＣＵ法を、ＲＥＭＣＡＴ法の代わりに使用した。ＲＥＭＣＡＴと比較して、μＩＭＣＵアッセイにおけるキモシン変異体の凝集時間を、ＵＶ／ＶＩＳプレートリーダーで８００ｎｍにおける９６−ウェルマイクロタイタープレートでのＯＤ測定によって決定した。既知の凝固強度を有する参照標準の種々の希釈の標準曲線を、各プレートに対して記録した。８４ｍＭの酢酸緩衝液、０．１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐＨ５．５）により酵素を希釈することによって、試料を調製した。３２℃での反応を、４％（ｗ／ｗ）低温、低脂肪乳粉末及び７．５％（ｗ／ｗ）塩化カルシウム（ｐＨ≒６．５）を含有する標準乳基質の２５０μＬを、２５μＬの酵素試料に添加することによって、開始した。国際凝乳単位（ＩＭＣＵ）／ｍｌでのキモシン変異体の乳凝固活性を、標準曲線に対する試料の凝集時間に基づいて決定した。
【０１２２】
４．２  総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用し、提供者の支持に従って決定した。
【０１２３】
４．３  特定の凝固活性の計算
特定の凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｇ総タンパク質）を、凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を総タンパク質含有量（ｍｇ総タンパク質／ｍｌ）で割ることによって決定した。
【０１２４】
実施例５：β−カゼイン切断の決定
β−カゼイン加水分解活性の決定
乳タンパク質のキモシン媒介タンパク質分解を、ｐＨ４．６で抽出した水溶性ペプチドのプロファイルを決定することによって特徴づけた。９６ウェルプレートで作製された無培養（culture free）チーズモデルを研究に使用した。簡潔には、グルコノ−デルタ−ラクトン（ＧＤＬ）及び塩化カルシウムを添加した、Ｏｌｌｉｎｇｅｇａｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋからの７５０μｌのスキムミルクを、９６ディープウェルプレートのウェルに等分した。乳へのＧＤＬの添加から１０分後に、キモシンの変異体をプレートの個々のウェルに添加して、０．０５ＩＭＣＵ／ｍｌの最終活性とした。形成した凝塊を、ピペットチップで凝塊を十分に攪拌することによって、レンネットの添加から３０分後に切断した；各ウェルに新しいチップを使用した。その後、プレートをさらに６０分間放置した後、２５００ｇで１０分間プレートを遠心分離することによって、カード及びホエーを分離した。乳を、レンネッティング（renneting）、切断及び離水（syneresis）の間、３０℃に保った。最後に、ホエーをプレートからデカントし、プレートに残ったレンネットカードのペレットを４日間室温で保存した。各ウェルに０．５Ｍのクエン酸三ナトリウムの５００μｌを添加し、プレートを３７℃で２４時間穏やかに振とうすることによって、ペプチドを抽出した。次に、ここで完全に溶解したレンネットカードを、４．４〜４．５の最終ｐＨまで塩酸を添加することによって沈殿させた。プレートを遠心分離機でスピンダウンし、ｐＨ４．５可溶性ペプチドのさらなる分析のために上清を回収した。
【０１２５】
ｐＨ４．５可溶性ペプチドのプロファイルを、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計に接続したＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定した。質量分析計（Ｇ６５４０Ａ  Ｑ−ＴＯＦ、Agilent Technologies A/S、サンタクララ、カリフォルニア、ＵＳＡ）に接続された、液体クロマトグラフィーシステム（Agilent 1290 infinity、Agilent Technologies A/S、サンタクララ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を用いて、分析を行った。ＬＣシステムにおけるカラムは、Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＳ−Ｃ１８ｍ、２．７μｍ、１００ｘ２．１ｍｍ（Supelco、Sigma-Aldrich、セントルイス、ＵＳＡ）であった。移動相は、溶離液Ａ（水中の０．１％ギ酸）、及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：水中の０．１％ギ酸、９：１）からなる。２％Ｂでのカラムの平衡化後、１０μＬの試料容量を注入した。溶離液Ｂを１５カラム容量にわたって２％から５０％まで増加させることによって生成した勾配溶離によって、ペプチドを分離した。流速は０．４４ｍＬ／分であった。２１４ｎｍでのＵＶ吸光度を連続的に測定することにより、ペプチドを検出した。１００〜２０００ｍ／ｚのＭＳスキャンを実行することによって、質量スペクトルを収集した。各スキャンからの２つの最も強いイオンに対して、ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。分析された全ての試料の等量からなる混合試料を調製し、この試料を各１２試料について分析した。ＭＳデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ．ｄフォーマットから、ＭＳＣｏｎｖｅｒｔ  ｖｅｒ．３．０．６６１８を用いて．ｍｚｍｌファイルに変換した。全てのさらなるデータ分析はＲ３．１．３を用いて行った。ペプチドを、Ｒパッケージ「ＭＳＧＦｐｌｕｓ」バージョン１．０５を用いてＭＳ／ＭＳスペクトルから同定した。ペプチド同定のための検索データベースは、ウシの乳タンパク質：αｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトペルオキシダーゼ及びラクトフェリン、に限定された。セリンのリン酸化及びメチオニンの酸化が、可変修飾として含まれた。Ｒパッケージ「ｘｃｍｓ」ｖ．１．４２．０を、Ｓｍｉｔｈら（２００６）に従って試料セットにおける試料にわたってピークを検出及びグループ化するために使用した。Ｍａｓｓｉｆｑｕａｎｔ法をピーク検出のために使用し、ピークのグループ化は密度法に基づいて行った。同一性は、β−カゼイン１９３−２０９を含む同定されたペプチドの定量的表をもたらす、グループ化されたピークに割り当てられた。
【０１２６】
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析
統計的機械学習アプローチ及びＰＣＡに基づく分析を用いて、位置１９２／１９３でのβ−カゼインの切断に対する、マルチ置換ライブラリ１〜３、４及び６の変異体に存在する全ての単一突然変異の影響を決定した。
【０１２７】
結果
マルチ置換ライブラリ１
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシンの変異体を生成し、上記のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２の成熟ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。
【０１２８】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１２９】
【表２−１】
2018525974.tif 000003
【表２−２】
2018525974.tif 000004
【表２−３】
2018525974.tif 000005
【０１３０】
表１には、位置１９２／１９３でのβ−カゼインの切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての酵素変異体は、実験において０．０５ＩＭＣＵ／ｍＬの正規化された濃度で使用されたため、低いβ−カゼイン切断は、低い一般的酵素活性よりもむしろ、β−カゼイン１９２／１９３を超えるκ−カゼイン１０４／１０５の切断についてのそれぞれの変異体の高い特異性を示す。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の半分以下を有する変異体は、太字で強調されている（変異体９、１６、２６、３９、４７、５１、６０、６８、７８、８４、９５）。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異のパターンと比較して、突然変異Ｖ３２Ｌ、Ｌ１３０Ｉ、及びＳ１３２Ａが過剰に出現している。突然変異Ｖ３２Ｌを有する６つの変異体のうち４つ、突然変異Ｌ１３０Ｉを有する６つの変異体のうち４つ、及び突然変異Ｓ１３２Ａを有する５つの変異体のうち３つが、野生型ラクダキモシンの５０％と等しいかそれ未満のβ−カゼイン１９２／１９３切断を示している。
【０１３１】
ラクダキモシンの三次元構造において、位置Ｖ３２は基質ペプチド配列のＰ１残基と相互作用しており（図２）、一方で、位置Ｌ１３０及びＳ１３２はそれぞれ、Ｐ５´（Ｌ１３０）並びにＰ２´及びＰ６´（Ｓ１３２）と相互作用している（図３；参考文献５〜１０）。キモシン基質結合部位における３つの位置の配置は、突然変異Ｖ３２Ｌ、Ｌ１３０Ｉ、及びＳ１３２Ａが、より低いβ−カゼイン１９２／１９３切断を引き起こし、したがって、κ−及びβ−カゼインとの直接的な相互作用によって、一定の凝固強度でβ−カゼインフラグメントβ（１９３−２０９）のより低い生成を引き起こすことを示唆している。変異体セットを通して最も低いβ−カゼイン１９２／１９３切断を示している、変異体９５は、突然変異Ｖ３２Ｌ及びＬ１３０Ｉの両方を含んでいる。これは、カゼイン基質特異性に対する突然変異の影響の加法性を示唆している。
【０１３２】
マルチ置換ライブラリ２
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、ＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定した。
【０１３３】
【表３−１】
2018525974.tif 000006
【表３−２】
2018525974.tif 000007
【０１３４】
表２には、位置１９２／１９３でのβ−カゼインの切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての酵素変異体は、実験において０．０５ＩＭＣＵ／ｍＬの正規化された濃度で使用されたため、低いβ−カゼイン切断は、低い一般的酵素活性よりもむしろ、β−カゼイン１９２／１９３切断を超えるκ−カゼイン１０４／１０５の切断についてのそれぞれの変異体の高い特異性を示す。
【０１３５】
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の２５％未満を有する変異体は、太字で強調されている（変異体１１０、１１２、１２２、１２５、１３２）。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異のパターンと比較して、突然変異Ｖ３２Ｌが過剰に出現している。突然変異Ｖ３２Ｌを有する６つの変異体のうち５つが、野生型ラクダキモシンの２５％と等しいかそれ未満のβ−カゼイン１９２／１９３切断を示している。これらの結果は、先の変異体セットの所見及び結論を支持する。
【０１３６】
マルチ置換ライブラリ３
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の第３のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１３７】
【表４】
2018525974.tif 000008
【０１３８】
表３には、位置１９２／１９３でのβ−カゼインの切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての酵素変異体は、実験において０．０５ＩＭＣＵ／ｍＬの正規化された濃度で使用されたため、低いβ−カゼイン切断は、低い一般的酵素活性よりもむしろ、β−カゼイン１９２／１９３を超えるκ−カゼイン１０４／１０５の切断についてのそれぞれの変異体の高い特異性を示す。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の１０％未満を有する変異体は、太字で強調されている（変異体１５０、１６１、１６５）。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異パターンと比較して、突然変異Ｖ３２Ｌが過剰に出現している。突然変異Ｖ３２Ｌを有する３つ全ての変異体が、野生型ラクダキモシンの１０％未満のβ−カゼイン１９２／１９３切断を示している。
この変異体セットからの１つの変異体のみ（変異体１７６）が、野生型ラクダキモシンと比較して５０％を超えるβ−カゼイン１９２／１９３切断を示している。これはまた、突然変異Ｌ１２Ｍを欠いているこのセットからの唯一の変異体である。
【０１３９】
位置Ｌ１２は、酵素の基質結合溝に結合しているラクダキモシンのＮ−末端の近くの配列ストレッチに位置している（図４）。ラクダキモシンにおいて、Ｎ−末端配列は、基質が結合していない時に、酵素の基質結合溝をブロックしていることが記載されている（参考文献５）。カゼイン基質分子は、活性部位に結合するためにこのＮ−末端配列を置き換える必要があり、続いて切断される。酵素のこの不活性形態を安定化しているキモシンにおける突然変異は、結果として基質結合を減少させ、したがって、カゼイン切断特異性に影響を与え得る。本発明者らは、この作用のモードを突然変異Ｌ１２Ｍに結論付けた。ラクダキモシンの三次元構造において、位置Ｌ１２及びＶ３２は互いに直接接触している。β−カゼイン結合に対するその直接的な影響に加えて、Ｖ３２Ｌが同様に酵素の不活性形態を安定化し得る。両方の突然変異を含む変異体（１５０、１６１、１６５）は、このセットの全ての変異体の中で最も低いβ−カゼイン１９２／１９３切断を示したので、カゼイン基質特異性に対するそれらの影響は加法的であると思われる。
【０１４０】
マルチ置換ライブラリ１〜３の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ１〜３のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表４に示す。
【０１４１】
【表５】
2018525974.tif 000009
【０１４２】
得られた結果に基づいて、表４に示された突然変異がβ−カゼイン１９２／１９３切断を減少させ、上述の突然変異Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｖ３２Ｌ、及びＬ１２Ｍが突然変異の中で最も強い影響を有すると結論付けられる（表４に太字で強調されている）。表４に示された突然変異は、β−カゼインのＣ−末端フラグメント、β（１９３−２０９）のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
【０１４３】
マルチ置換ライブラリ４
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２の成熟ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ  Ｍ）が参照として含まれる。
【０１４４】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１４５】
【表６】
2018525974.tif 000010
【０１４６】
表５には、β−カゼイン１９２／１９３の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して、４４％〜９３％減少したタンパク質分解活性を明らかにしている。
【０１４７】
マルチ置換ライブラリ４の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ４変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を表６に示す。
【０１４８】
【表７】
2018525974.tif 000011
【０１４９】
得られた結果に基づいて、表６に示された突然変異がβ−カゼイン１９２／１９３切断を減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのＣ−末端フラグメント、β（１９３−２０９）のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
【０１５０】
マルチ置換ライブラリ５
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２の成熟ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ  Ｍ）が参照として含まれる。
【０１５１】
凝固活性をＲＥＭＣＡＴ法を用いて決定した。
【０１５２】
【表８】
2018525974.tif 000012
【０１５３】
表７には、β−カゼイン１９２／１９３の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。４７個の変異体のうち、４６個が野生型ラクダキモシンと比較して、１６％〜８３％減少したタンパク質分解活性を明らかにしている。
【０１５４】
マルチ置換ライブラリ５の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ５変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表８に示す。
【０１５５】
【表９】
2018525974.tif 000013
【０１５６】
得られた結果に基づいて、表８に示された突然変異がβ−カゼイン１９２／１９３切断を減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのＣ−末端フラグメント、β（１９３−２０９）のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
【０１５７】
ラクダキモシンにおける構造に基づく変異
ラクダキモシン（配列番号２）の変異体を、タンパク質構造分析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した（表９）。突然変異Ｎ１００Ｑ及びＮ２９１Ｑを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）の両方のＮ−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
【０１５８】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１５９】
【表１０】
2018525974.tif 000014
【０１６０】
表９に示された結果に基づいて、突然変異Ｋ１９Ｔ、Ｙ２１Ｓ、Ｖ３２Ｌ、Ｄ５９Ｎ、Ｈ７６Ｑ、Ｉ９６Ｌ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｙ１９０Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２２６Ｔ、Ｄ２９０Ｅ、Ｄ２９０Ｌ、Ｒ２４２Ｅ、Ｒ２４２Ｑ、Ｙ２４３Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ２５４Ｓ、Ｓ２７３Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅ、Ｇ２８９Ｓ、及びＶ３０９Ｉが、β−カゼイン１９２／１９３の切断を１０％超減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのＣ−末端フラグメント、β（１９３−２０９）のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
【０１６１】
表９に示された減少したβ−カゼイン１９２／１９３の切断を有する２４個の変異体のうち１０個が、基質結合溝内に又はその構造的近接に突然変異（Ｖ３２Ｌ、Ｈ７６Ｑ、Ｌ１３０Ｉ、Ｓ１３２Ａ、Ｙ１９０Ａ、Ｌ２２２Ｉ、Ｓ２２６Ｔ、Ｇ２８９Ｓ、Ｄ２９０Ｅ、Ｄ２９０Ｌ）を有し（図５）、β−カゼイン結合に対するそれらの突然変異の直接的な影響を示唆している。
【０１６２】
表９に示された減少したβ−カゼイン１９２／１９３の切断を有する２４個の変異体のうち９個が、図６に見られるように結合溝に近接して位置するタンパク質表面上の明確な領域に、突然変異（Ｒ２４２Ｅ、Ｒ２４２Ｑ、Ｙ２４３Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｒ２５４Ｓ、Ｓ２７３Ｄ、Ｓ２７３Ｙ、Ｑ２８０Ｅ、Ｆ２８２Ｅ）を有する。この領域は、位置Ｐ１０〜Ｐ４（参考文献１０）においてその正に荷電した配列Ａｒｇ９６〜Ｈｉｓ１０２（参考文献５、１６〜１８）と相互作用することによって、κ−カゼイン基質の結合を支持することが示唆されている。導入された突然変異は、タンパク質表面上のこの領域の正味の電荷を減少させることによって、それらの相互作用を強化し得る。κ−カゼインの結合の増加は最終的に、他の基質、例えばβ−カゼインの結合及び加水分解を阻害することになる。結果は、この領域における単一アミノ酸置換がＣ／Ｐを有意に増加させることができることを示す。
【０１６３】
ラクダキモシンにおける負電荷の組み合わせ
ラクダキモシン（配列番号２）のより多くの変異体を、上記の表面領域（Ｒ２４２Ｅ、Ｙ２４３Ｅ、Ｇ２５１Ｄ、Ｎ２５２Ｄ、Ｒ２５４Ｅ、Ｓ２７３Ｄ、Ｑ２８０Ｅ）に、負電荷を導入する突然変異の組み合わせにより作製した。突然変異Ｎ１００Ｑ及びＮ２９１Ｑを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）の両方のＮ−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た（表１０）。
【０１６４】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１６５】
【表１１】
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【０１６６】
表１０に示された全ての変異体が、非グリコシル化ラクダキモシンと比較して、減少したβ−カゼイン切断を明らかにしている。キモシン構造上の領域と相互作用するＰ１０−Ｐ４に負電荷を導入することによるβ−カゼイン切断の阻害は、それぞれの突然変異の組み合わせによってさらに増強され得ると結論付けられる。
【０１６７】
ウシキモシンにおける構造に基づく変異
ウシキモシン（配列番号１）の変異体を、タンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した（表１１）。突然変異Ｎ２５２Ｑ及びＮ２９１Ｑを、これらの変異体及び参照ウシキモシン（ＢｏｖＵＧｌｙ）の両方のＮ−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
【０１６８】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１６９】
【表１２】
2018525974.tif 000016
【０１７０】
Ｉ１３６Ｖを除いて、全ての突然変異が、表１１に示された変異体においてβ−カゼイン１９２／１９３の切断の増加を引き起こした。特に、置換Ｉ１３６Ｖ、Ｑ２４２Ｒ、Ｄ２５１Ｇ、Ｓ２８９Ｇ、及びＥ２９０Ｄは、ウシキモシンのβ−カゼイン切断を増加させたが、減少したβ−カゼイン切断が、ラクダキモシンにおけるそれぞれの逆突然変異Ｖ１３６Ｉ、Ｒ２４２Ｑ、Ｇ２５１Ｄ、Ｇ２８９Ｓ、及びＤ２９０Ｅによって観察された（表９）。同様の影響が位置３２に見られる。Ｖ３２Ｌはラクダキモシンのβ−カゼイン切断の減少を引き起こしたが、Ｖに構造的に類似したβ分岐疎水性アミノ酸である、ＩへのＬ３２の突然変異は、ウシキモシンのβ−カゼイン切断の増加をもたらした。これは、これらのアミノ酸変化が種を超えて、キモシン特異性に同様の効果を発揮することを実証している。
【０１７１】
ラクダキモシンＮ−末端の変異
ラクダキモシン（配列番号２）の変異体を、基質結合溝内のＮ−末端配列Ｙ１１−Ｄ１３の分子相互作用のタンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した（表１２）。突然変異Ｎ１００Ｑ及びＮ２９１Ｑを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン（ＣａｍＵＧｌｙ）の両方のＮ−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
【０１７２】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１７３】
【表１３】
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【０１７４】
ラクダキモシン構造の分析は、Ｎ−末端配列Ｙ１１−Ｄ１３、並びにＹ１１の潜在的な相互作用パートナーである位置Ｄ２９０における変異を導いた（図７）。カゼイン基質は、結合溝内に結合するためにＮ−末端キモシン配列と競合するので、結合溝とモチーフＹ１１−Ｄ１３との相互作用を変化させるアミノ酸置換は、種々のカゼイン基質に対する酵素活性に、したがって、β−カゼイン１９２／１９３の切断に、影響を与えることが期待される。それぞれの変異体３４７〜３６６の結果は、β−カゼイン切断の強い変異を示す（表１２）。特に、変異体３５３及び３５５は、いずれも突然変異Ｄ２９０Ｅを有し、β−カゼイン切断の減少を明らかにしている。
【０１７５】
マルチ置換ライブラリ６
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２の成熟ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ  Ｍ）が参照として含まれる。
【０１７６】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１７７】
【表１４】
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【０１７８】
表１３には、β−カゼイン１９２／１９３の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。５０個全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して、１９％〜９７％減少したタンパク質分解活性を明らかにしている。
【０１７９】
マルチ置換ライブラリ６の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ６変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表１４に示す。
【０１８０】
【表１５】
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【０１８１】
得られた結果に基づいて、表１４に示された突然変異がβ−カゼイン１９２／１９３切断を減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのＣ−末端フラグメント、β（１９３−２０９）のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
【０１８２】
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン（配列番号２の成熟ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ  Ｍ）が参照として含まれる。
【０１８３】
凝固活性は、μＩＭＣＵ法を用いて決定した。
【０１８４】
【表１６】
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【０１８５】
表１５には、β−カゼイン１９２／１９３の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。４５個全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して減少したタンパク質分解活性を示す。
【０１８６】
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【図１】
2018525974.tif 000021
【図２】
2018525974.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【配列表】
2018525974000001.app
【国際調査報告】
2018525974.tif 000025
2018525974.tif 000026
2018525974.tif 000027