(57)【要約】  本発明は、少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含む組成物であって、該ポリマーがナノ担体をさらに含み、該ナノ担体が薬物を含む、上記組成物に関する。さらに、疾患の治療での該組成物の使用および該組成物を製造するための方法もまた、本発明に包含される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含む組成物であって、該ポリマーがナノ担体をさらに含み、該ナノ担体が薬物を含む、上記組成物。
【請求項２】
前記ナノ担体が、前記少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーに共有結合または非共有結合している、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリマーが、生理的条件下で緩やかに膨潤する、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーが、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、ポリ(エチレン-酢酸ビニル)（PEVA）、トリグリセリド、多糖、およびタンパク質からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ担体が、血中への前記薬物の徐放を可能にする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノ担体が、ポリマーベースか、タンパク質ベースかまたは脂質ベースのナノ担体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ担体が、1000nm未満、好ましくは500nm未満、300nm未満、200nm未満、100nm未満または50nm未満の平均粒径を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ担体がヘパリンナノ複合体である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
前記薬物がタンパク質である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質が免疫調節タンパク質である、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫調節タンパク質がIFNベータである、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
疾患の治療での使用のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記疾患が自己免疫疾患である、請求項12に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項12または13に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
以下のステップ：
(a) ナノ担体中に薬物をカプセル封入するステップ；
(b) 少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含むポリマーマトリックスを作製するステップ；および
(c) ステップ(a)の該ナノ担体をステップ(b)の該ポリマーマトリックス中に組み込み、それにより組成物が形成されるステップ
を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含む組成物であって、該ポリマーがナノ担体をさらに含み、該ナノ担体が薬物を含む、上記組成物に関連する。さらに、疾患の治療での該組成物の使用および該組成物の製造方法もまた本発明に包含される。
【背景技術】
【０００２】
様々な疾患の治療に関して、低い薬物投与頻度、ならびに長時間の薬物の制御放出および持続放出が望まれる。生体適合性物質に基づく継続放出製剤が、当技術分野で周知である。これらの製剤は、多くの場合、活性成分をカプセル封入している、生分解性合成ポリマー（ポリ(乳酸)（PLA）、ポリ(グリコール酸)（PGA）など）、およびそれらのコポリマーの組み合わせから形成される固体微粒子またはナノ粒子を含有する。ポリマーがin vivoで加水分解される間、封入された薬物がゆっくりと放出され、残余のポリマー分解生成物は身体により完全に吸収される。
【０００３】
ポリマーベースの微粒子の次に、脂質ベースの微粒子（リポソーム）を含有する製剤もまた、頻繁に用いられる。リポソームは通常、少量の大きな頭部のリン脂質を用いて立体的に安定化されている、一層または最大でも数層の脂質二重層を有する、中程度の大きさの中身が詰まったリン脂質ベシクルからなる。薬物送達のために、リポソームは多くの場合、外側にポリエチレングリコール（PEG）の追加の層を含んで構築され、これにより、身体内でのさらに長い循環寿命が可能になる（Blume et al., 1990）。
【０００４】
ポリマー性微粒子または脂質ベースの微粒子ならびにそのような微粒子を含む医薬組成物を作製するための方法は、先行技術に広範囲に記載されている。例示として、以下の文献が本明細書中で言及される：
【０００５】
US6020004Aは、活性成分とポリマーとの混合物が連続的な相の中に分散され、得られた分散物が凍結されて、水および有機溶媒が、凍結乾燥により分散物から除去される、薬物を含有するポリマー性微粒子の作製方法を明らかにしている。
【０００６】
ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)および麻薬拮抗薬であるナルトレキソンを含む注射用微粒子を形成するための別の方法が、Wiseにより開示された（Wise, 1984）。
【０００７】
US2003031701Aには、以下のステップ：(1) 有機溶媒中に溶解されているポリマーおよび懸濁された不安定な薬物を含むポリマー溶液/薬物混合物を形成させるステップ；(2) ポリマー溶液/薬物混合物から溶媒を除去し、それにより固体のポリマー/薬物マトリックスを形成させるステップ；および(3) ポリマー/薬物マトリックスを機械的に圧縮し、それにより移植可能なポリマー/薬物マトリックス塊を形成させるステップを含む、移植可能なポリマー/薬物マトリックス塊を作製するための方法が記載されている。
国際公開第9742940号は、固体のポリマー/薬物マトリックスを含むポリマーベースの制御放出デバイスを作製するための方法に関する。
【０００８】
US6555156Bには、封入性（encasing）ポリマーの溶液中へと、かつ該封入性ポリマーの液体非溶媒中へと、結合した微粒子の分散液を噴霧することによる、封入型の結合微粒子の作製プロセスが記載されている。
【０００９】
US2003041602AおよびUS2004197413Aは、それぞれ、液体中への噴霧凍結による微粒子およびナノ粒子の形成方法およびスプレー乾燥液滴形成システムを明らかにしている。
【００１０】
US2005152980Aには、少なくとも1種の疎水性生物学的分解性ポリマーと、任意的な少なくとも1種の水溶性ポリマーとの混合物を含むマトリックス、マトリックス中に分布している製薬上活性な成分、およびマトリックス中に分布しているレシチンおよびリン脂質の群由来の追加の少なくとも1種の水不溶性界面活性物質からなる医薬用微粒子、ならびにそれらの調製のための三相乳化プロセスが記載されている。
生分解性ポリマー、水溶性ポリマー、および活性薬剤の混合物を含む微粒子が、US5869103AおよびUS2006141041Aに開示されている。
【００１１】
US4526938Aは、薬理学的に活性なポリペプチドおよび薬理学的もしくは獣医学的に許容される両親媒性非架橋型の直鎖、分岐鎖またはグラフトブロックコポリマーを含む医薬組成物を明らかにする。
US2002019336Aは、ムコ多糖、キャリアタンパク質、および薬物を含む持続薬物放出のための組成物に関する。
【００１２】
US2006210641Aは、任意により吸収性ポリマーコーティングを有する吸収性ポリマー微粒子上に固定された1種以上のペプチド、1種以上のタンパク質またはそれらの組み合わせの持続放出複合体に関する。
【００１３】
国際公開第9902135号A1には、本質的にタンパク質性である成分および天然、合成または半合成ポリマーを含むコア、ならびに生命体の細胞表面の受容体もしくは構成要素により認識されることができるか、または天然、合成もしくは半合成分子構造を認識できる、天然、合成または半合成分子からなる外側の層から構成される微粒子が記載されている。
【００１４】
US4774091Aには、注入により投与できるかまたは身体へと移植できる、活性成分および製薬上許容される生分解性担体から本質的になる、針様または棒様形状の固体持続放出調製物が記載されている。
【００１５】
US2004247683Aは、ストレプトマイシンなどの親水性カチオン性薬物を含有する生分解性ポリマーのナノ粒子、および好ましくは経口投与される、ナノ粒子を含有する医薬調製物に関する。
【００１６】
現行の製剤のすべてが、特に、ペプチドまたはタンパク質ベースの薬物の安定性、およびしたがって長時間放出に関する、一定の制限または欠点を有する。ペプチドまたはタンパク質ベースの薬物は、消化管で生じる急速な分解に起因して、非保護状態では経口投与することができない。加えて、ペプチドまたはタンパク質は、通常はin vivoで短い半減期を有し、それにより薬物または移植物の複数回の注入が必要となる。
【００１７】
タンパク質ベースの薬物であるインターフェロンベータ（IFN-β）に関しては、IFN-βの長時間放出を確実にし、したがって現在承認されている製品を用いた治療中に生じる障害を克服する市販の製剤は、未だに存在しない。
【００１８】
IFN-βは再発寛解型多発性硬化症（RRMS）および二次進行型MS（SPMS）の治療に対して承認されている（I.M.S.S. Group, 1993；Li et al., 2001b）。このサイトカインの作用様式は複雑であるが、その一部分は、その抗炎症活性および抗増殖活性により説明することができ、このことは、免疫系および血液脳関門に対する多面的な作用と相関する（Hohlfeld et al., 1997）。IFN-βは、インターフェロン-α/β受容体に結合し、JAK1およびTYK2を活性化する。転写因子STAT1およびSTAT2のチロシンリン酸化の誘導は、DNAとの相互作用により、約1,000種類の遺伝子の活性化または抑制をもたらす（Reder et al, 2014；Sadzak et al., 2008）。
【００１９】
RRMSは、少なくとも24時間にわたる増悪または再発と、それに続く、症状が改善するかまたは消失さえする寛解の期間により特徴付けられる（Goldenberg, 2012）。SPMSでは、症状が徐々に悪化する一次進行型MSが最初に診断されるが、時間と共に、患者はRRMSに典型的である再発を経験する（Goldenberg, 2012）。
【００２０】
現在では、IFN-βは、筋内（i.m.）注入または皮下（s.c.）注入のいずれかにより非経口投与される。IFN-β-1aを含有するAvonex(登録商標)は筋内注入され、成人に対して週1回30μgの用量を必要とする（EMA, 2011）。Rebif(登録商標)もまたIFN-β-1aを含有するが、この製品に関しては、推奨投与レジメンはs.c.注入による週3回の44μg投与である（EMA, 2014）。しかしながら、非経口投与は、注入により引き起こされる疼痛が、多くの場合に患者にとっての恐れおよび不快感を伴うので、問題が多いことが知られている。それゆえ、コンプライアンスが損なわれる場合があり、このことが、処方された薬物の薬効を制限し得る。s.c.注入は、補助なしで患者に対して行なうことが未だに最も多くの場合に容易である。しかしながら、市販の製品に関しては、i.m.投与製品の場合よりもより頻繁な注入を行なうことが妥協策である。さらに、IFN-β-1aの注入部位反応およびその他の副作用（白血球減少症および肝機能異常）の頻度は、s.c.注入後の方が高い。一方で、IFN-βを用いる治療での最も高い出現率を有する副作用であるインフルエンザ様症候群は、i.m.注入後の方がより多く現われる（Langer-Gould et al., 2004；Portaccio et al., 2009）。最も一般的な徴候は、投与後の軽度の発熱反応である。少なくとも週1回の注入を必要とする投与レジメンに起因して、頻繁な注入の不快感が、この非常に効果的な薬物のコンプライアンスを損ないかねない。
【００２１】
移植は、投与頻度がより低い非経口用製剤を目指す好適な技術的アプローチに思える。ポリマーマトリックスの助けを借りて短い半減期を有するAPIの放出を制御することにより、多くの場合に即時放出製剤の欠点である薬物血中レベルの変動の克服を補助できる（Mank et al., 1991）。したがって、副作用は最小限になり得る（Kempe et al., 2012）。
【００２２】
しかしながら、移植は、線維症へと発達さえし得る投与部位での考えられる組織学的変化のような他の不利益を被る。低分子量ヘパリンは、腹膜、肝臓、および腎臓の線維症を防止することが実証されている（Abe et al., 2007；Li et al., 2015；Pecly et al., 2006）。化学的には、ヘパリンは負の電荷を担持するグリコサミノグリカンである。カルボキシル基および硫酸基により修飾されている、グルコサミン残基とグルクロン酸残基とが交互になっている二糖単位が、構造中にα-1,4結合により20〜200回反復している。その負の電荷に起因して、ヘパリンは、静電相互作用により、正に荷電した分子とのナノ複合体を形成することができる。この方法は、プロタミン-ヘパリンナノ複合体およびキトサン-ヘパリンナノ複合体の調製に関して確立されている（Alam et al., 2015；Boddohi et al., 2009；Liang et al., 2000；Liu et al, 2007）。
【００２３】
ポリマーであるエチレン酢酸ビニル、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)、またはトリグリセリドをはじめとする、多数の生分解性材料が、事前形成型移植物の構築のために用いられてきた（Funk et al., 2005；Sax et al, 2012；Zhou et al., 1998）。メチルセルロース（MC）は、その高度な生体適合性および非細胞接着特性が知られている（Tate et al., 2001）。MCは、逆熱ゲル化特性を示す。温度上昇により、周囲の溶媒との水素結合形成能の低下に起因して、より粘稠な構造となる（Li et al., 2001a；Sarkar et al., 1979）。さらに、塩濃度が、MCのゲル化挙動に影響を及ぼす。電解質量の増大は、水中でのMCの溶解度を低下させ、したがって、ゲル化温度を低下させる（Gupta et al., 2006）。Guptaらは、メチルプレドニゾロンのくも膜下腔送達のためにヒアルロナン（HA）をMCと混合することにより、現場形成型移植物を確立し、HAがまた、アニオン性塩として作用することによりMCのゲル化温度を低下させることも実証した（Gupta et al., 2006）。さらに、HAは、明らかな疎水性を有し、このことが、薬物送達システムへの水の浸透を減少させる場合があり（Spagnoli et al., 2005）、かつその抗炎症特性に起因して、創傷治癒および瘢痕形成に対する有益な作用を有する（Balazs et al., 1989；Sudha et al., 2014）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】US6020004A
【特許文献２】US2003031701A
【特許文献３】国際公開第9742940号
【特許文献４】US6555156B
【特許文献５】US2003041602A
【特許文献６】US2004197413A
【特許文献７】US2005152980A
【特許文献８】US5869103A
【特許文献９】US2006141041A
【特許文献１０】US4526938A
【特許文献１１】US2002019336A
【特許文献１２】US2006210641A
【特許文献１３】国際公開第9902135号A1
【特許文献１４】US4774091A
【特許文献１５】US2004247683A
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Blume et al. (1990), Liposomes for the sustained drug release in vivo, Biochimica et Biophysica Acta 1029 (1): 92-97.
【非特許文献２】Wise (1984), Biopolymeric Controlled Release Systems, Vol.1, Wise, ed., CRC Press Inc., Chapter 8.
【非特許文献３】I.M.S.S. Group (1993), Interferon beta-1b is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis I. Clinical results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Neurology 43(4), 655-655.
【非特許文献４】Li et al. (2001b), Randomized controlled trial of interferon-beta-1a in secondary progressive MS MRI results. Neurology 56(11), 1505-1513.
【非特許文献５】Hohlfeld (1997), Biotechnological agents for the immunotherapy of multiple sclerosis. Principles, problems and perspectives. Brain 120(Pt 5), 865-916.
【非特許文献６】Reder et al. (2014), How type I interferons work in multiple sclerosis and other diseases: some unexpected mechanisms. J Interferon Cytokine Res 34(8) 589-599.
【非特許文献７】Sadzak et al. (2008), Recruitment of Stat1 to chromatin is required for interferon-induced serine phosphorylation of Stat1 transactivation domain. Proc Natl Acad Sci U S A 105(26), 8944-8949.
【非特許文献８】Goldenberg (2012), Multiple sclerosis review. Pharmacy and Therapeutics 37(3), 175.
【非特許文献９】EMA (2011), European Public Assessment Report on Avonex (Interferon-beta-1a), EMA/354496/2011.
【非特許文献１０】EMA (2014), European Public Assessment Report on Rebif (Interferon-beta-1a), EMA/14511/2014.
【非特許文献１１】Langer-Gould et al. (2004), Strategies for managing the side effects of treatments for multiple sclerosis. Neurology 63(11 Suppl 5), S35-41.
【非特許文献１２】Portaccio et al. (2009), Improving compliance with interferon-βtherapy in patients with multiple sclerosis. CNS drugs 23(6), 453-462.
【非特許文献１３】Mank et al. (1991), Parenteral depot drug forms with a base of biodegradable polymers. Pharmazie 46(1), 9-18.
【非特許文献１４】Kempe et al. (2012), In situ forming implants - an attractive formulation principle for parenteral depot formulations. J Control Release 161(2), 668-679.
【非特許文献１５】Abe et al. (2007), Low molecular weight heparin prevents hepatic fibrogenesis caused by carbon tetrachloride in the rat. J Hepatol 46(2), 286-294.
【非特許文献１６】Li et al. (2015), Low molecular weight heparin (LMWH) improves peritoneal function and inhibits peritoneal fibrosis possibly through suppression of HIF-1alpha, VEGF and TGF-beta1. PLoS One 10(2).
【非特許文献１７】Pecly et al. (2006), Effects of low molecular weight heparin in obstructed kidneys: decrease of collagen, fibronectin and TGF-beta, and increase of chondroitin/dermatan sulfate proteoglycans and macrophage infiltration. Nephrol Dial Transplant 21(5), 1212-1222.
【非特許文献１８】Alam et al. (2015), Functionalized heparin-protamine based self-assembled nanocomplex for efficient anti-angiogenic therapy. J Control Release 197, 180-189.
【非特許文献１９】Boddohi S et al. (2009), Polysaccharide-based polyelectrolyte complex nanoparticles from chitosan, heparin, and hyaluronan. Biomacromolecules 10(6), 1402-1409.
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【非特許文献２１】Liu et al. (2007), Heparin/chitosan nanoparticle carriers prepared by polyelectrolyte complexation. J Biomed Mater Res A 83(3), 806-812.
【非特許文献２２】Funk et al. (2005), Safety and efficacy of ImplanonTM, a single-rod implantable contraceptive containing etonogestrel. I.U.S. Group. Contraception 71(5), 319-326.
【非特許文献２３】Sax et al. (2012), Release pathways of interferon alpha2a molecules from lipid twin screw extrudates revealed by single molecule fluorescence microscopy. J Control Release 162(2), 295-302.
【非特許文献２４】Zhou et al. (1998), Development of a multiple-drug delivery implant for intraocular management of proliferative vitreoretinopathy. Journal of Controlled Release 55(2), 281-295.
【非特許文献２５】Tate et al. (2001), Biocompatibility of methylcellulose-based constructs designed for intracerebral gelation following experimental traumatic brain injury. Biomaterials 22(10), 1113-1123.
【非特許文献２６】Li et al. (2001a), Gel network structure of methylcellulose in water. Langmuir 17(26), 8062-8068.
【非特許文献２７】Sarkar (1979), Thermal gelation properties of methyl and hydroxypropyl methylcellulose. Journal of Applied Polymer Science 24(4), 1073-1087.
【非特許文献２８】Gupta et al. (2006), Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials 27(11), 2370-2379.
【非特許文献２９】Spagnoli et al. (2005), Hyaluronan conformations on surfaces: effect of surface charge and hydrophobicity. Carbohydrate research 340(5), 929-941.
【非特許文献３０】Balazs et al. (1989), Clinical uses of hyaluronan. The biology of hyaluronan 265, 285.
【非特許文献３１】Sudha et al. (2014), Beneficial effects of hyaluronic acid. Adv Food Nutr Res 72, 137-176.
【発明の概要】
【００２６】
多数の生分解性材料およびタンパク質ベースの薬物の制御放出のための事前形成型移植物の作製方法が公知であるが、現在承認されている製品を用いる治療で生じる障害を解決する、改善された製剤に対する強い需要がある。
【００２７】
本発明の基礎となる技術的課題は、上記の需要を満たすための手段および方法の提供と考えることができる。技術的課題は、特許請求の範囲および本明細書中に下記で特徴付けられる実施形態により解決される。
【００２８】
本発明は、少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含む組成物であって、該ポリマーがナノ担体をさらに含み、該ナノ担体が薬物を含む、上記組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】移植物のための前駆体材料の調製に用いられる凍結乾燥プログラムを示す図である。作動時間は89時間であった。温度（黒色線、●）は、一次乾燥を可能にするために−50℃まで低下させ、二次乾燥の間に＋15℃まで徐々に上昇させた。真空圧（点線、■）は、一次乾燥中の凝華を確実にするために、0.006mbarとした。
【図２】トリプシノーゲン［0.01mg/mL、点線］、種々のDOLで調製されたトリプシノーゲン-ATTO 647N複合体［0.5、短破線；1、長破線；3、黒色線］のSEC図である。分析は、Micro Bio-SpinTM 6クロマトグラフィーカラムを通した遠心分離により未結合色素を除去した後に行なった。標識された複合体の保持時間は、生来型タンパク質と比較して増大した。DOL3の適用は、用いられたタンパク質のうちの90％超を標識するのに十分であった。
【図３】DLSにより決定されるトリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体（灰色線）およびIFN-β-ヘパリンナノ複合体（黒色線）の粒径分布を示す図である。トリプシノーゲン複合体は、測定前に50倍に希釈した。IFN-βナノ粒子は、十分なシグナルを読み取るために、未希釈で測定した。
【図４】電子顕微鏡観察によるナノ複合体の可視化を示す図である。ナノ複合体の形状およびサイズを、走査型電子顕微鏡観察（SEM、A）および透過型電子顕微鏡観察（TEM、B、C）を用いて可視化した。
【図５】PAGEルーラー（レーン1）、1μg IFN-β-1a（レーン2）、再加水分解（re-hydrolyzed）IFN-β-1a-ヘパリンナノ複合体（レーン3）、1μgトリプシノーゲン（レーン4）、再加水分解トリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体（レーン5）、および対照として1μgヘパリン（レーン6、バンドは観察されなかった）のSDS-PAGEを示す図である。ナノ複合体に関して、1μgのタンパク質（IFN-βまたはトリプシノーゲン）を含有する量をアプライした。処理されたタンパク質に関して、分解または凝集は観察されなかった。
【図６】12日間にわたる、マウスで観測された蛍光シグナルの合計放射効率を示す図である。蛍光標識された移植物（■）は、ブランク移植物（●）を用いて処置された動物と比較して、すべての測定時点で上昇したシグナルを示した。実験は3回反復で行なわれた。説明的エラーバーのためにS.D.が用いられている。
【図７】実験開始から0時間、72時間、168時間および245時間後での、ブランクおよび蛍光標識移植物についてのin vitroおよびin vivo実験の蛍光イメージングを示す図である。in vitro実験では（第1列および第3列）、2％[w/v]の濃度を有するアガロースゲルを、皮下脂肪組織を模倣するために、10％[v/v]グリセロールを含有するPBS pH7.4中に調製した。in vivo実験では（第2列および第4列）、色素標識を行なったかまたは行なっていない移植物を、頸部領域に注入した。
【図８】種々の濃度を有するアガロースゲルを用いるIVISの較正を示す図である。
【図９】ROIとして尾部領域で取得された移植物およびATTO-トリプシノーゲン懸濁物についての薬物動態プロファイルを示す図である。濃度は、較正から算出した。
【図１０】移植物に関するin vitroおよびin vivo放出画分の比較を示す図である。in vitro放出は、2％アガロースを用いて行なった。in vivoで放出された画分は、Nelson-Wagner法を用いて算出した。
【図１１】累積吸収率および溶解割合（％）のIVIVCモデル線形回帰プロットを示す図である。灰色領域は95％の信頼水準を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
用語「生体適合性」（biocompatible）とは、悪性応答（例えば、炎症応答または免疫系による急性拒絶）を引き起こすことなく、生存被験体へと挿入または注入できるポリマー性物質に関する。生体組織と高度に適合性である物質に対して、ある程度の免疫応答が予期されるべきであることは、当業者には明らかである。しかしながら、当該免疫応答は、好ましくは、著明でないであろう。物質の生体適合性を評価する方法は当業者に周知であり、LD50試験および/または毒性評価の生化学的方法、すなわち、DNA合成、タンパク質合成、およびATP活性ならびに細胞培養毒性アッセイ、すなわち、物質への曝露後の細胞死の測定が挙げられる。
【００３１】
用語「生分解性」（biodegradable）とは、物質を形成する高分子のモル質量を減少させることによる、生物学的活性による分解を受け易いポリマー性物質に関する。in vivoでは、ポリマー性物質は加水分解され、ポリマー分解生成物は、時間をかけて身体により完全に吸収される。ポリマーの分解は、ポリマーの分子量およびモノマーサブユニットの立体規則性をはじめとする数種類の因子に依存して、数日間、数週間、数ヵ月間、または数年間の単位の半減期を有して、様々な速度で生じ得る。好ましくは、本発明に従う生分解性ポリマーの半減期は、約1週間、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間または約8週間である。より好ましくは、半減期は約2週間である。
【００３２】
本明細書中で参照される「約」とは、±20％、±10％、±5％、±4％、±3％、±2％または±1％の範囲内であるいずれかの変動を含む、本明細書中で言及されるいずれかの具体的な値（例えば、示される半減期）を指す。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、用語「ポリマー」とは、反復するサブユニット（いわゆるモノマー）から構成される高分子を意味する。ポリマーは、典型的な合成プラスチック（例えば、ポリスチレン）であり得るが、天然バイオポリマー（DNAおよびタンパク質など）もまた含まれる。天然に存在するポリマーおよび合成ポリマーは、モノマーの重合を介して生成される。重合プロセスの基礎となる化学反応は、モノマーの性質およびポリマー性構造中のモノマー間で形成される結合に依存する。ポリマー性構造を生じるであろう好適な化学反応は、当業者に周知である。大きな分子量に起因して、ポリマーは通常、特殊かつ固有の物性を有し、これには、靭性、粘弾性、ならびにガラスおよび半結晶構造（結晶でなく）を形成する傾向が含まれる。好ましくは、本発明に従うポリマーは、約50〜100,000個のモノマーサブユニット、約100〜50,000個のモノマーサブユニット、約500〜25,000個のモノマーサブユニットまたは約1,000〜約10,000個のモノマーサブユニットを含む。本発明に従うポリマーは、好ましくは、生理的条件下で緩やかに膨潤する。「生理的条件下で緩やかに膨潤する」とは、本明細書中で意味する場合、生体適合性かつ生分解性であるポリマーが、in vivoでは緩慢に加水分解され、それにより、薬物を含むナノ担体を緩やかに放出することを示す。ポリマー加水分解としては、水との反応により、影響を受け易い分子の基が切断されることが挙げられる。ポリマー加水分解は、酸、塩基または酵素により触媒され得る。ポリマーの加水分解および分解は、ポリマーの分子量およびモノマーサブユニットの立体規則性をはじめとする数種類の因子に依存して、数日間、数週間、数ヵ月間、または数年間の単位の半減期を有して、様々な速度で生じ得る。
【００３４】
生体適合性かつ生分解性のポリマーは、好ましくは、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、ポリ(エチレン-酢酸ビニル)（PEVA）、トリグリセリド、多糖（ヒアルロン酸、セルロースエステルおよびデンプンなど）、タンパク質（ゼラチン、およびヒトまたはウシ血清アルブミン（HASまたはBSA）など）、およびそれらのコポリマーからなる群より選択される。より好ましくは、生体適合性かつ生分解性のポリマーは、多糖を含む。最も好ましくは、生体適合性かつ生分解性のポリマーは、メチルセルロースおよび/またはヒアルロナンを含む。
【００３５】
好ましくは、本発明に従って用いられるべきポリマーは、65℃未満、好ましくは約40℃〜60℃、好ましくは約45℃〜55℃、好ましくは約50℃のガラス転移温度（すなわち、ポリマーがガラスを形成する傾向を有する温度）を有するであろう。本発明に従う生体適合性かつ生分解性のポリマーとしてのタンパク質の場合、ポリマーは、好ましくは、約25℃〜100℃、好ましくは約25℃〜80℃、好ましくは約25℃〜60℃、好ましくは約40℃〜80℃、より好ましくは約40℃〜60℃のガラス転移温度を有するであろう。さらなる詳細は、特にBSAに関して、Brownsey et al., 2003に見出すことができる。
【００３６】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の数種類の投与経路により、生物体に投与することができる。例えば、組成物は、筋内（i.m.）もしくは皮下（s.c.）注入により投与されるか、または身体内の様々な部位で生物体へと移植することができる。好ましくは、本発明の組成物は、事前形成型移植物へと加工され、生物体へと皮下的に（s.c.）投与される。好ましくは、該生物体は動物であり、より好ましくは、ヒト、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、ネコまたはげっ歯類などの哺乳動物である。最も好ましくは、生物体はヒトである。
【００３７】
用語「ナノ担体」（nanocarrier）とは、ポリマー、タンパク質および/または脂質の構造的配置を意味する。好ましくは、そのようなナノ担体は粒子であり、好ましくは、ゲル様、リポソーム様、ミセル様または固体粒子である。化合物（1種類または複数種類）の性質およびナノ担体を形成するために用いられる方法に依存して、ナノ担体が、ゲル様、リポソーム様、ミセル様または固体粒子を形成するか否かが決定されるであろうことは、当業者には理解されるであろう。好適な方法および好適な化合物は、当業者に周知である。
【００３８】
本発明のポリマーベースのナノ担体は、以下の方法からなる群より好ましくは選択される当技術分野で公知の方法により作製することができる：沈殿、乳化重合、界面縮合、凍結乾燥、超臨界流体加工技術、および液滴形成。ナノ担体の固化は、好ましくは、凍結、乾燥または凍結乾燥により行なわれる。通常用いられるポリマーとしては、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、ポリ(エチレン-酢酸ビニル)（PEVA）、トリグリセリド、多糖およびタンパク質が挙げられる。好ましくは、ポリマーベースのナノ担体はヘパリンを含む。
【００３９】
本発明の脂質ベースのナノ担体は、好ましくは、本質的にリン脂質からなる。薬物溶液の脂質ベースの粒子へのカプセル封入は、以下の方法をはじめとする当技術分野で公知の方法により行なうことができる：高圧ホモジナイゼーション、マイクロエマルジョン形成、乳化-溶媒蒸発（沈殿）、溶媒注入（または溶媒置換）、相反転、および超音波処理。リポソームを調製するために通常用いられるリン脂質としては、マトリックス脂質（DPPCまたはDSPCなど）、in vivoでのより長い循環のためのPEG化脂質（DSPE-PEG2000など）、脂質二重層不安定化脂質（リゾレシチンなど）または孔形成性光活性化脂質および部位特異的標的化のための抗体および/もしくはペプチドなどのリガンドとのコンジュゲート化のための官能化脂質（マレイミド-DSPE-PEG2000など）が挙げられる。
【００４０】
ナノ担体のサイズは、典型的には、約5〜約2,000nm、好ましくは10〜約1,000nm、好ましくは約50〜約500nmの範囲である。本発明のナノ担体の粒径および/または形状は、当技術分野で公知の方法、例えば、動的光散乱および電子顕微鏡観察により決定することができる。
【００４１】
好ましくは、本発明のナノ担体は、本発明に従う生体適合性かつ生分解性のポリマーにより形成される生体適合性かつ生分解性のポリマー性マトリックスへと組み込まれる。ナノ担体は、好ましくは、少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーに共有結合または非共有結合している。非共有結合および共有結合は、当技術分野で公知である。非共有結合の例としては、静電相互作用、ファンデルワールス力、疎水性作用、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用および抗体-抗原相互作用が挙げられる。共有結合は、化学的結合である。ナノ担体の結合は、つまり、可逆的であるか、または不可逆的であり得る。可逆的に結合しているナノ担体は、例えば、生理的環境の変化により、例えば、pH、イオン強度などの変化により、ポリマーから放出される。不可逆的に結合しているナノ担体は、ポリマーに接着し、ポリマーが分解されればポリマー性マトリックスから放出されることとなるであろう。あるいは、不可逆的に結合しているナノ担体は、例えば、ナノ担体とポリマーとの共有結合の酵素的切断により放出されることができる。
【００４２】
典型的には、ナノ担体は、組成物全体のうちの約1％〜90％、より好ましくは約10％〜80％、約20％〜70％、約30％〜60％または約40％〜50％（重量/重量）を構成し得る。
【００４３】
用語「薬物」とは、本発明に従えば、in vivoでの治療的特性、予防的特性または診断的特性を保有する、薬剤、またはその製薬上許容される塩を意味する。本明細書中で用いる場合、薬物との用語は、限定するものではないが、免疫グロブリン様タンパク質、抗体、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、ヌクレアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、インスリン、酵素、腫瘍抑制因子、ホルモン、抗原、増殖因子、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（アンチセンス分子など）をはじめとするいずれかの種類の薬物を含み得る。さらに、薬物は、限定するものではないが、免疫系の調節、抗癌活性、抗細菌活性、抗ウイルス活性および抗真菌活性をはじめとするいずれかの種類の活性を示す場合がある。好ましくは、薬物は、好ましくは免疫調節剤として機能するペプチドまたはタンパク質ベースの薬物である。
【００４４】
より好ましくは、本発明に従って用いられる薬物は、インターフェロンベータ（IFNベータ）である。IFNベータ（IFN-β）は、インターフェロンの群に属する。インターフェロン（IFN）は、ウイルス、細菌、寄生生物、および腫瘍細胞などの数種類の病原体の存在に応答して、宿主細胞により産生および放出されるシグナル伝達タンパク質である。IFNは、サイトカインとして知られるタンパク質の大きなクラスに属する。サイトカインは、病原体を撲滅するために免疫系を始動させるために細胞間で用いられる重要な情報伝達分子である。20種類を超える異なるIFN遺伝子およびタンパク質が、ヒトをはじめとする動物で特定されている。IFNは、それを通してシグナル伝達を行なう受容体の種類に依存して、I型、II型およびIII型の3種類のカテゴリーに分類することができる。
【００４５】
I型インターフェロンは、IFNAR1鎖およびIFNAR2鎖からなるIFN-α/β受容体（IFNAR）として知られる特異的な細胞表面受容体複合体に結合する（De Weerd et al., 2007）。IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κおよびIFN-ωがI型インターフェロンに属する（Liu et al., 2005）。I型インターフェロンは、典型的には、ウイルス感染に応答して線維芽細胞および単球により産生される。IFN-αは、B型肝炎およびC型肝炎感染の治療に有益であることが示されており、IFN-βは多発性硬化症の治療に強い効果を示した（Cohen, et al., 2001）。
【００４６】
II型インターフェロンは、IFNGR1鎖およびIFNGR2鎖からなるIFNGRに結合する。ヒトで最もよく知られているII型インターフェロンはIFN-γである（Cohen et al., 2001）。IFN-γは、生来的な免疫応答の一部分としてナチュラルキラー（NK）細胞およびナチュラルキラーT（NKT）細胞により主に産生され、抗原特異的免疫が形成されると、CD4 Th1およびCD8細胞傷害性Tリンパ球（CTL）エフェクターT細胞により産生される（Schoenborn et al., 2007）。免疫系でのIFN-γの重要性は、ウイルス複製を直接的に阻害するその能力に起因し、最も重要なことにはその免疫刺激作用および免疫調節作用に起因する。
【００４７】
III型インターフェロンは、IL10R2およびIFNLR1からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。このファミリーのメンバーは、インターフェロンラムダ（IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3）として知られる。III型インターフェロンは異なる受容体を介してシグナル伝達するが、I型インターフェロンと、類似はするが完全には重複しない応答を惹起する。特に、IFN-λは、ロタウイルス感染を制御するのに非常に有効であることが示されているが、インフルエンザウイルスなどの他のウイルスのクリアランスは、I型インターフェロンであるIFN-αおよびIFN-βに主に依存している（Hermant et al., 2014）。
【００４８】
IFNベータおよび特に変異体IFN-ベータ-1aは、多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療で現在最も重要なインターフェロンである。IFN-β-1aを含む承認された医薬組成物としては、AvoneX(登録商標)（Biogen社）およびRebif(登録商標)（EMD Serono社）が挙げられる。AvoneX(登録商標)（Biogen社）。再発性多発性硬化症の治療のためには、AvoneX(登録商標)は好ましくは筋内注入され、成人に対して週1回の30μg用量を必要とする（EMA, 2011）。Rebif(登録商標)もまたIFN-β-1aを含有するが、この製品に関しては、推奨される投与レジメンはs.c.注入による週3回の44μg投与である（EMA, 2014）。
【００４９】
好ましくは、ナノ担体は、薬物の安定性を増大させる。より好ましくは、ナノ担体は、ペプチドまたはタンパク質ベースの薬物の安定性を増大させ、最も好ましくは、ナノ担体はインターフェロンベータの安定性を増大させる。タンパク質の安定性の決定は、当技術分野で公知の方法により、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により決定することができる。
好ましくは、薬物は、本明細書中の他の箇所に記載される通りに、ナノ担体中にカプセル封入される。
【００５０】
ナノ担体中への薬物のカプセル封入は、共有結合または非共有結合により生じさせることができる。さらに、ナノ担体と薬物とは、可逆的または不可逆的に連結させることができる。好ましくは、連結は、非共有的な可逆的連結である。そのような非共有的な可逆的結合は当技術分野で公知であり、例示的な静電相互作用、ファンデルワールス力、疎水性作用、ナノ担体ストレプトアビジン-ビオチン相互作用および抗体-抗原相互作用が挙げられる。
好ましくは、薬物は、タンパク質ベースの薬物を、好適なナノ担体、好ましくはヘパリンと混合することによりカプセル封入される。
【００５１】
さらに、本発明に従うナノ担体は、血中への薬物の徐放を可能にする。薬物の「徐放」とは、本明細書中で意味する場合、活性薬剤が、長期間にわたって所望のプロファイルに従って放出される、放出形態または剤型を指す。徐放プロファイルとしては、例えば、持続放出、長時間放出、パルス状放出、および遅延放出プロファイルが挙げられる。即時放出組成物とは異なり、徐放組成物は、所定のプロファイルに従う長時間にわたる被験体への薬剤の送達を可能にする。そのような放出速度は、長時間にわたって薬剤の治療上有効なレベルを提供することができ、それにより、従来の急速放出剤型と比較して、より長時間の薬理的または診断的応答をもたらすことができる。徐放組成物はさらに、不適切な即時放出速度に伴う副作用を最小限にし、正確な投与を最適化することができる。種々の疾患の治療で、特に多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療に対して、徐放製剤は、多くの場合に、従来の短時間作用型製剤よりも非常に好ましい。特に、徐放とは、24時間後に50％未満の薬物が、好ましくは40％未満、より好ましくは30％未満の薬物が放出されていることを示す場合がある。あるいは、徐放とは、48時間後に、50％未満の活性薬剤または活性薬剤画分が、好ましくは40％未満、より好ましくは30％未満、さらにより好ましくは20％未満の活性薬剤または活性薬剤画分が放出されていることを示す場合がある。あるいは、徐放とは、72時間後に、50％未満の活性薬剤または活性薬剤画分が、好ましくは40％未満、より好ましくは30％未満、さらにより好ましくは20％未満の活性薬剤または活性薬剤画分が放出されていることを示す場合がある。
【００５２】
用語「血中への薬物の放出」とは、薬物が全身に投与されることになり、すなわち、薬物を含む組成物は、好ましくは全身性投与を意図されていることを意味することが、当業者により理解されるであろう。薬物が投与部位で直接的にその作用を発揮することとなる局所投与とは対照的に、全身性投与では、薬物が循環系に入り、それにより全身が影響を受ける。好ましくは、全身性投与が意図される組成物は、その個々の構成成分への解離を可能とする。より好ましくは、ナノ担体および薬物は、非共有的に連結し、血流に入れば個々の構成成分へと解離する。最も好ましくは、全身性投与が意図される組成物は、ヘパリンナノ複合体を含む。
【００５３】
有利なことに、本発明の基礎となる研究によれば、薬物送達のための2種類の異なるマトリックスを含む組成物が、放出特性を改善することが見出されている。特に、薬物の安定性が保護され、放出は長期にわたり、かつよりよく制御されることができる。第1のマトリックス（すなわち、ポリマー）は、例えば筋肉への注入または移植時に、注入/移植に応答した即時反応からナノ担体を保護する。さらに、第1のマトリックスは、ナノ担体のおかげで未だに保護された不活性な状態にある薬物を、調節可能な徐放動態を伴って放出する。該ポリマーからの放出時には、ナノ担体が血中または他の組織中に侵入し、ここで、薬物が、ナノ担体から、調節可能な徐放動態を伴って、再び放出される。本発明の組成物中の二重マトリックスシステムのおかげで、薬物に関する最終的な放出動態が2種類の個別に調節可能な動態パラメータに依存するので、薬物に関する放出動態は、よりよく調節することができる。さらに、薬物およびナノ担体は、ポリマー（すなわち、第2の保護層）により、注入または移植時に即時反応から効果的に保護される。
【００５４】
上記の説明および用語の定義は、本明細書全体を通して適用される。さらに、下記では、本発明に従う組成物の典型的な実施形態が列挙される。
本発明に従う組成物の好ましい実施形態では、前記ナノ担体は、少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーに共有結合または非共有結合している。
本発明に従う組成物のさらなる好ましい実施形態では、前記生体適合性かつ生分解性のポリマーは、生理的条件下で緩やかに膨潤する。
【００５５】
本発明に従う組成物の更なる好ましい実施形態では、前記生体適合性かつ生分解性のポリマーは、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、ポリ(エチレン-酢酸ビニル)（PEVA）、トリグリセリド、多糖およびタンパク質からなる群より選択される。より好ましくは、生体適合性かつ生分解性のポリマーは多糖を含む。最も好ましくは、生体適合性かつ生分解性のポリマーは、メチルセルロースおよび/またはヒアルロナンを含む。
【００５６】
本発明に従う組成物の更なる好ましい実施形態では、前記ナノ担体は、血中への薬物の徐放を可能にする。
本発明に従う組成物の更なる好ましい実施形態では、前記ナノ担体は、ポリマーベースか、タンパク質ベースか、または脂質ベースのナノ担体である。
【００５７】
本発明に従う組成物の更なる好ましい実施形態では、前記ナノ担体は、1000nm未満、好ましくは500nm未満、300nm未満、200nm未満、100nm未満または50nm未満の平均サイズを有する。
本発明に従う組成物の更なる好ましい実施形態では、前記ナノ担体は、ヘパリンナノ複合体である。
本発明に従う組成物の更なる好ましい実施形態では、前記薬物はタンパク質である。
本発明はまた、疾患の治療での使用のための本発明の組成物も提供することが理解されるであろう。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、用語「疾患の治療」とは、疾患もしくはそれに伴う少なくとも1種の症状を改善または治癒させることを意味する。つまり、疾患もしくはそれに伴う少なくとも1種の症状の改善または治癒が生じる場合、治療は有効であると見なされることになる。治療はすべての被験体で有効ではない場合があることが理解されるであろう。しかしながら、本発明に従えば、治療は、治療対象である被験体のうちの少なくとも統計学的に有意な部分で有効であることが予測される。有効に治療することができる被験体のうちの統計学的に有意な部分をどのように決定するかは、当業者には周知である。ある部分が統計学的に有意であるか否かは、種々の周知の統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マンホイットニー検定などを用いて、当業者によりさらなる面倒なく決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、本発明により予測される確率は、有効な治療の知見が、所与のコホートまたは集団の被験体のうちの、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％に対して正しいであろうことを可能にする。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、前記疾患は、自己免疫疾患である。
本明細書中で用いる場合、用語「自己免疫疾患」とは、身体内に正常に存在する物質および組織に対する、身体の異常な免疫応答により生起される疾患をいう。自己免疫は、生物全体に影響する場合があり、特定の器官に限定される場合があり、または異なる位置にある特定の組織を含む場合がある。自己免疫疾患の診断は、個体の症状、身体検査からの所見、および実験室検査からの結果に基づく。自己免疫疾患に対する典型的な検査は、当技術分野で公知であり、血液検査、尿検査、スワブ、診断的検査、実験室検査、および病理検査が挙げられる。しかしながら、一部の自己免疫疾患は、特に疾患の早期ステージでは、診断が困難な場合がある。自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス（SLE）、サルコイドーシス、強皮症、関節リウマチ、1型糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、および多発性硬化症が挙げられる。
【００６０】
本発明の更なる好ましい実施形態では、前記自己免疫疾患は、多発性硬化症（MS）である。
多発性硬化症（MS）は、中枢神経系に影響を及ぼす最も一般的な自己免疫疾患である。MSは、脳および脊髄中の神経細胞の絶縁性被覆が損傷される脱髄疾患である。この損傷は、神経系の一部分の通信する能力を傷害し、それにより、身体的、知能的、およびときには精神病的な問題をはじめとする広範囲の徴候および症状を生じさせる（Compston et al., 2008）。MSは数種類の形態を採り、分離された発作として生じる（再発型MS）か、または時間をかけて形成される（進行型MS）、新規の症状を含む。発作と発作の間には、症状は完全に消失する場合がある。しかしながら、疾患が進行するにつれ、永続的な神経学的問題が現われる場合がある（Reingold, 1996）。
【００６１】
再発寛解型多発性硬化症（RRMS）は、神経学的機能を悪化させる、明確に定義された発作により特徴付けられる。これらの発作、いわゆる再発は、少なくとも24時間の時間にわたって現われ、典型的にはその後に部分的または完全な回復期間が続き（寛解）、その間には、症状が部分的または完全に改善され、疾患の明らかな進行はない（Goldenberg, 2012）。RRMSは、診断時に最も一般的な疾患経過である。約85％の人々が、最初にRRMSとして診断され、それと比較して10〜15％が進行型の疾患とされる。SPMS（二次進行型多発性硬化症）は、当初には再発寛解型の疾患経過（RRMS）を有していた人々に生じる。言い換えれば、SPMSは、多数の個体に関して疾患の2番目の相として起こる。当初にはRRMSと診断されている85％の人々のうち、大部分は、最終的にSPMSに移行し、このことは、再発および寛解が経験される一定期間後に、疾患が、再発を伴うかまたは伴わずに、より絶え間なく進行し始めるであろうことを意味する。
【００６２】
本発明はまた、前記組成物の製造のための方法も提供することが理解されるであろう。特に、以下のステップ：
(a) ナノ担体中に薬物をカプセル封入するステップ；
(b) 少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含むポリマーマトリックスを作製するステップ；および
(c) ステップ(a)のナノ担体をステップ(b)のポリマー性マトリックス中に組み込み、それにより組成物が形成されるステップ
を含む、前記組成物を製造するための方法が提供される。
【００６３】
本明細書中で用いる場合、用語「薬物をカプセル封入するステップ」とは、ポリマーベースか、ペプチドベースか、または脂質ベースのナノ担体中への薬物のいずれかの種類の捕捉または取り込みを意味する。薬物をカプセル封入するための方法は当技術分野で公知であり、限定するものではないが、沈殿、乳化重合、界面縮合、凍結乾燥、超臨界流体加工技術、および共液滴形成（co-acervation）が挙げられる。
【００６４】
好ましくは、薬物は、タンパク質ベースの薬物を好適なナノ担体、好ましくはヘパリンと混合することによりカプセル封入される。好ましくは、混合物は、完全な沈殿を誘導するために少なくとも1時間インキュベートされる。より好ましくは、混合物は、約20℃の温度、および任意により約550rpmの回転で、少なくとも1時間インキュベートされる。薬物をカプセル封入するナノ担体のさらなる固化は、好ましくは、凍結乾燥により行なわれる。
【００６５】
ナノ担体中への薬物のカプセル封入は、共有結合または非共有結合により行なうことができる。さらに、ナノ担体と薬物とは、可逆的または不可逆的に連結させることができる。好ましくは、連結は非共有的な可逆的連結である。そのような非共有的な可逆的結合は当技術分野で公知であり、例示的な静電相互作用、ファンデルワールス力、疎水性作用、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用および抗体-抗原相互作用が挙げられる。
【００６６】
好ましくは、ナノ担体中への薬物のカプセル封入は、薬物の安定化をもたらす。薬物、特にタンパク質ベースの薬物の安定性の決定は、当技術分野で公知の方法により、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により決定することができる。
【００６７】
原則として、ナノ担体は、本明細書中の他の箇所に記載される通りに製造することができる。ナノ担体の製造のためのより詳細な予測される方法はまた、US2003041602A、US2004197413A、US6020004A、US6555156B、国際公開第9742940号、Blume et al. 1990およびWise, 1984にも記載されている。本発明に従う特定の好ましい技術は、下記の添付の実施例に開示されている。
【００６８】
用語「少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含むポリマーマトリックスを作製するステップ」とは、生体適合性かつ生分解性のポリマーのポリマーマトリックスの確立を意味する。少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーを含むポリマーマトリックスは、当技術分野で公知の方法により作製され、限定するものではないが、沈殿、乳化重合、界面縮合、凍結乾燥、超臨界流体加工技術、および共液滴形成が挙げられる。
【００６９】
好ましくは、少なくとも1種の生体適合性かつ生分解性のポリマーは、ポリラクチド（PLA）、ポリグリコリド（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、ポリ(エチレン-酢酸ビニル)（PEVA）、トリグリセリド、多糖およびタンパク質からなる群より選択される。より好ましくは、生体適合性かつ生分解性のポリマーは多糖を含む。最も好ましくは、生体適合性かつ生分解性のポリマーは、メチルセルロース（MC）および/またはヒアルロナン（HA）を含む。好ましくは、MC（1％[w/v]）およびHA（1％[m/v]）の溶液をpH7.4のPBS中に調製し、非常に粘稠なポリマー性マトリックスを得る。
【００７０】
本明細書中で用いる場合、用語「組み込むこと」とは、ナノ担体をポリマー性マトリックスに連結させる方法を意味する。ナノ担体とポリマー性マトリックスとの連結は、共有結合または非共有結合により生じさせることができる。さらに、ナノ担体とポリマー性マトリックスとは、可逆的または不可逆的に連結させることができる。好ましくは、連結は、非共有的な可逆的連結である。そのような非共有的な可逆的結合は当技術分野で公知であり、例示的に静電相互作用、ファンデルワールス力、疎水性作用、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用および抗体-抗原相互作用が挙げられる。共有結合は、原子間の電子対の共有により特徴付けられる。共有結合は当技術分野で公知であり、σ結合、π結合、金属間結合、アゴスチック相互作用（agostic interaction）、屈曲結合、および三中心二電子結合が挙げられる。
【００７１】
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、それらの全体的な開示内容および本明細書中で具体的に言及されている開示内容に関して、参照により本明細書中に組み入れられる。参考文献の完全な引用情報は、本明細書中の他の箇所に見出されるはずである。
【実施例】
【００７２】
本発明は、以下の実施例により単に例示される。該実施例は、いずれにせよ、本発明の範囲を限定するように解釈されるものではない。
［実施例1：トリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体の調製］
ナノ複合体の調製のために、トリプシノーゲンを、5mg/mLの濃度で精製水中に溶解させた。50mg/mLの濃度を有するヘパリン水溶液を、一度に加えた。体積比としては、10部のトリプシノーゲン溶液に対して1部のヘパリン溶液が選択され、したがって重量比は1：1に等しくなった。完全な沈殿を誘導するために、混合物を20℃、550rpmで1時間インキュベートした。
【００７３】
インターフェロン-β-1a-ヘパリンナノ複合体の調製：
モデル化合物であるトリプシノーゲンについて記載された方法を、IFN-β粒子の調製に変換した。タンパク質溶液の濃度を変化させて、IFN-βの低いアベイラビリティーのために、0.1mg/mLとなるように選択した。その後、ヘパリン溶液（50mg/mL）を加えた。この場合、両方の化合物の重量比を維持することにより、体積比は500部のIFN-βに対して1部のヘパリン溶液へと変更された。インキュベーションは、トリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体について記載された通りに行なった。
【００７４】
［実施例2：サイズ排除クロマトグラフィーによる最適な色素：タンパク質比の決定およびATTO 647N-タンパク質複合体の定量化］
SEC分析に関して、トリプシノーゲンについて0.025〜0.6mg/mLの範囲で線形較正を行なった。保持時間は9分であることが見出された。結合反応に関する最適条件の決定のためのDOLの変動について、図1は上昇比率を図示する。色素-タンパク質複合体は、保持時間の増大（10分）により決定できる。プロットにより、DOL 0.5または1は、ATTO 647NのNHSエステルへの定量的なトリプシノーゲンの結合には不十分であったことが明らかである。DOL 3では、添加トリプシノーゲンの1％未満が未標識のまま残った。したがって、蛍光標識IFN-βの調製のために、DOL 3を用いた。以前の研究から、過剰な未結合色素はMicro Bio-SpinTM 6クロマトグラフィーカラムを通した遠心分離により除去できることが示されている（Sax et al., 2012）。in vivoおよびin vitroイメージング実験を参照すると、したがって、蛍光シグナルの流束（flux）は、その生体内分布に起因する移植物マトリックスからの標識化ナノ複合体の拡散に相関し得る。
【００７５】
タンパク質と色素とのカップリング反応後に、複合体の量を、647nmで分光法により決定した。この波長は、色素の分析に対して推奨されている波長である。較正は、4〜70μmol/L ATTO 647N-NHSエステルの範囲内で直線的であった。標識化手順および精製カラムを通したろ過後に取得された溶液を、100倍に希釈して、測定した。DOL 3では、78.37±4.87％の添加色素がタンパク質トリプシノーゲンに結合した。SEC実験の結果を考慮すると、90％超の添加タンパク質がその標識化された形態で回収されたようである。
【００７６】
サイズ排除クロマトグラフィーによるトリプシノーゲンの定量：
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）のためのHPLCシステムは、LCオーガナイザー（Chromaster, VWR Hitachi, VWR International）、5310カラムオーブン、5450屈折率検出器、5260自動サンプラーおよび5160インテリジェントポンプから構成されていた。固定相としては、Biosep SEC-s3000カラム（Phenomenex Inc., Aschaffenburg, Germany）を用いた。移動相は、pH値6.8のリン酸緩衝生理食塩液（PBS）から構成された。流速は1mL/分に設定され；観測波長は280nmに設定された。30μLの注入体積を用いた。較正は、0.025〜0.6mg/mLの範囲で行なった。
【００７７】
ATTO 647N NHSエステルに対するトリプシノーゲンまたはインターフェロン-βのカップリング反応：
光安定性蛍光色素であるATTO 647Nを用いてタンパク質を標識化するために、5mg/mLの色素NHSエステルの濃度を有するジメチルスルホキシド溶液を調製した。化合物IFN-β（0.1mg/mL）またはトリプシノーゲン（5mg/mL）の溶液を、PBSおよび重炭酸ナトリウム溶液を含有するpH8.3の標識化バッファー中に調製した。最適な標識化手順を決定する目的で、モデル化合物であるトリプシノーゲンを用いて、種々の色素：タンパク質比（DOL）を試験した。したがって、色素およびタンパク質溶液を混合し、反応管中で20℃および550rpmにて1時間インキュベートした（Thermomixer Comfort, Eppendorf AG, Hamburg, Germany）。結果として、未結合色素を、バッファー交換後にMicro Bio-SpinTM 6クロマトグラフィーカラムを通して1,000rcfで4分間ろ過することにより除去した。この方法は、未結合色素を除去するために好適であることが報告されている（Sax et al., 2012）。
【００７８】
最適な色素：タンパク質比の決定：
トリプシノーゲンに関して、IFN-βを用いて行なわれる標識化反応へと最適条件を移行させるために、DOLを変化させた。したがって、1：1、1：2、および1：3（タンパク質：色素）のモル比を分析した。存在し得る未標識化タンパク質を測定するために、Micro Bio-SpinTM 6クロマトグラフィーカラムを通したろ過後に、SEC分析を行なった。
【００７９】
ATTO 647N-タンパク質複合体の定量化：
ろ過による精製後の色素-タンパク質複合体の定量化に分光法を用いた。したがって、100μLのサンプルまたは標準溶液（PBS pH8.3中の未処理ATTO 647N-NHSエステル）を、ピペットで96ウェルプレートに加え、マイクロプレートリーダーInfinite M200（Tecan Group Ltdl, Crailsheim, Germany）を用いて647nmで測定を行なった。較正は、5.4×10-9〜7×10-8mol/mLの範囲で行なった。
【００８０】
［実施例3：動的光散乱によるナノ複合体の特性決定］
トリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体の粒径は152.6±4.8nmであった。PDIにより示される粒径分布は狭く（0.228±0.079）、非経口投与に対する取得されたナノ複合体の好適性を示した。さらに、水溶液中での安定性は、−53.2±2.3mVのゼータ電位により確認された。
【００８１】
IFN-β-ヘパリンナノ複合体の特性は、粒径に関して137.5±3.7nmであると決定された（図3を参照されたい）。粒径分布は比較的広く、PDIで0.470±0.024であった。ゼータ電位は、−27.4±4.1mVであると測定された。沈殿法の確立に先立って行なわれた実験により、沈殿プロセスに対する浸透圧およびpH条件の影響に起因して、調製プロセスの間に添加される賦形剤およびイオンの強い影響が明らかになった。2種類の反対に荷電した高分子電解質の複合体化および沈殿は、それらのクーロン力によるものであると考えられる。分子の親水性部分は、複合体化反応中に中和される。したがって、疎水性が増大し、水中でのそれらの溶解度を低下させる（Boddohi et al., 2009; Tsuchida et al., 1972）。それゆえ、水性媒体の組成のいかなる変更も、疎水性結合、水素結合、および静電力などの分子間力の変化として現れる。用いられたIFN-β-1aは、供給業者によれば、塩化ナトリウム（100mN）、クエン酸ナトリウム（10mM）、およびスクロース（10mM）を含有する溶液から凍結乾燥された。結果として、媒体組成の変化に起因して、沈殿様式が変化し、このことが、より広い粒径分布を有する粒子を生じさせた。しかしながら、平均直径はトリプシノーゲン-ヘパリン複合体に関して見られたものと同等の範囲であったので、沈殿法の原理は、IFN-β-ヘパリンナノ複合体の作製にも当てはまり得る。CHO細胞から取得されたIFN-βの異なる処理は、この問題を克服する助けとなり得る。例えば、タンパク質を抽出の直後に沈殿させることができ、または、静電力にあまり影響しない他の安定化剤を凍結乾燥に用いることができるであろう。
【００８２】
粒径、粒径分布および正味の電荷を決定するために、173°の角度での後方散乱検出器を装着したZetasizer Nano ZS（Malvern Instruments GmbH, Malvern, UK）を用いた。正味の電荷についての指標としてのゼータ電位は、Malvernディップセルでのマイクロ電気泳動法を用いて分析した。トリプシノーゲンに基づくナノ複合体は、測定前に10倍希釈し、IFN-β-1aに基づくナノ粒子は未希釈で測定した。
【００８３】
［実施例4：沈殿収率の決定］
確立された調製法の収率を、その比較的高い入手可能性を理由として、トリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体について決定した。未沈殿ヘパリンおよびトリプシノーゲンを遠心分離および再分散により除去した後、沈殿収率を重量分析により測定し、21±4.2％であることが見出された。この値は、一見すると低いように見える可能性があるが、20,800rcfでの遠心分離が100nmより小さな粒子を上清から分離するためにはまだ十分ではない可能性があることを考慮しなければならない。10〜25％の範囲の沈殿収率が、他のヘパリンベースの複合体化プロセスについても報告された（Boddohi et al., 2009）。さらに、遠心分離および再分散のサイクルを繰り返すことによる精製は、有害な添加剤または安定化剤は用いられていないという事実を理由として、調製される製剤には必要ではない。さらに、未沈殿ヘパリンが特定の作用部位では抗炎症剤および抗線維化剤として作用する場合がある。したがって、移植物の調製に関して、添加したAPIの量の損失がないことが、決定された沈殿収率にかかわらず、明らかであろう。
【００８４】
沈殿したトリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体の量を、重量分析により評価した。したがって、沈殿により得られた1mLのナノ粒子懸濁液を、20,800rcf、4℃で30分間遠心分離した。ピペットを用いて上清を除去し、ペレットを250μLの精製水中に再懸濁した。50μLの粒子懸濁液をアルミ皿上で80℃で2時間乾燥した後、量を決定し、沈殿のために元々添加された化合物に対する割合（％）として表わした。
【００８５】
［実施例5：電子顕微鏡観察によるナノ複合体の可視化］
トリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体の粒径および形状を決定するために、SEMおよびTEMを用いた。TEMにより撮影された写真は、DLSにより測定されたサイズを確認した。形状は、粒子のうちの一部については球状に見えたが、不規則な形状を有する一部の粒子もまた検出された。SEMによる観察により、DLSの結果に完全には適合しない、無視できない量の、より小さな粒子が明らかになった。粒子のうちの一部の不規則な形状は、粒径の算出のために用いられるレイリー散乱（Raleigh Scattering）に基づくアルゴリズムの評価を妨げる可能性がある（Tscharnuter et al., 2000）。それでもなお、200nmを超える形状を有するナノ複合体は観察されなかった。したがって、達成されたナノ担体の非経口投与は、重大な問題になるものではないと考えることができる。
【００８６】
ナノ複合体の形状およびサイズは、透過型電子顕微鏡観察（TEM）および走査型電子顕微鏡観察（SEM）を用いて可視化された。TEMの場合には、20μLの水性懸濁液を、コーティングされた銅グリッド上に移した。染色は、リンタングステン酸溶液（2％[w/v]）を用いる処理により実行した。Gatanモジュール782（ES 500W）を装着した透過型電子顕微鏡モデルCM 12（Philips, Amsterdam, The Netherlands）を用いた。
【００８７】
SEM分析に関しては、20μLのアリコートをピペットでSEMサンプルホルダーに加え、24時間乾燥させた。その後、Agarスパッタコーター（Agar Scientific, Essex, UK）を用いて金のスパッタリングを行なった。用いた装置は、Hitachi S4500顕微鏡システム（Hitachi, Tokyo, Japan）であった。
【００８８】
［実施例6：ナノ複合体を含有する移植物の作製］
凍結乾燥および圧縮により、事前形成型移植物を、直径2mm、長さ8mm、重量約20mgに調製した。MCおよびHAを含有するマトリックスの組成物では、ポリマーの優れた膨潤特性に起因する長時間のAPI放出と組み合わされた、良好な安全性プロファイルが確認される。現場形成型移植物は、多くの場合、デポー系の形成中にAPIの多量放出を示す（Kempe et al., 2012）。さらに、多くの場合、N-メチル-2-ピロリドンまたはエタノールなどの有機溶媒は無視することができないが、投与には毒性作用が伴う場合がある（Leira et al., 1992；Malek et al., 1997）。開発された事前形成型移植物は、十分確立され、かつ生体適合性の賦形剤により構成された。サイズの精密な制御はまた、移植用シリンジを用いる投与も可能にする。針は相当に大きいが、切開による投与と比較して有益であると考えられる。投与前のさらなる調製は必要なく、このことは、現場形成型システムと比較して別の利点を示す。最終的な製品は固体投与剤型であるので、最終的な製剤設計中に水が含まれないことにより、凝集または変性などのタンパク質の不安定性を防止し易い。
【００８９】
ナノ複合体の固化は、凍結乾燥により確実にされた。したがって、非常に粘稠なゲルマトリックスを、in vivoでの長時間放出を伴う移植物を開発するために用いた。それゆえ、MC（1％[w/v]）およびHA（1％[m/v]）の溶液を、PBS pH7.4中に調製した。1個の移植に対して十分な材料を達成するために、1バイアル当たり1gの各成分を加えた。添加されるタンパク質の量は、市販の製品の投与量に鑑みて選択された。本研究で開発された移植物は、s.c.投与が意図されるので、Rebif(登録商標)を参考として用いた。投与量は、週3回の44μgを含む。本発明者らの研究で確立された移植物製剤の予備的in vivo実験により、蛍光シグナルはマウスで2週間測定できることが示された。それゆえ、算出される用量は、44μg×週3回×2週間の持続期間となる。ヒトに対しては、したがって、264μg/移植物が、適切であると考えられるであろう。重量の相違（ヒトで約75kgとマウス20g）に起因して、調整される用量は70ng/マウスとなるであろう。しかしながら、タンパク質1個当たりの色素分子数は低いことが報告されている（約1〜3個）（Sax et al., 2012）。したがって、本研究に関しては、ATTO 647N-NHSに関して1×10-8molを1バイアル当たりに添加した。3分子のATTO 647N-NHSエステルがタンパク質1分子当たりに結合していると仮定して、80ngのトリプシノーゲンが移植物1個当たりに組み込まれた。溶液を、Christ Epsilon 2-4 LSC装置（Martin Christ Gefriertocknungsanlagen GmbH, Osterode, Germany）を用いて89時間凍結乾燥させた。用いたプログラムを、図1に図示する。その後、凍結乾燥物を円柱形状に圧縮することにより、移植物を取得した。したがって、この目的のために特別に設計および構築された手動の移植物プレスを用いた。
【００９０】
［実施例7：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質安定性の決定］
ヘパリンとの沈殿によるタンパク質の処理および水性媒体中でのインキュベーションステップは、タンパク質構造の分解を誘導する場合がある。したがって、未処理の化合物IFN-βおよびトリプシノーゲンを、それらの対応するヘパリン含有ナノ複合体と比較するために、SDS-PAGEを行なった。図5は、IFN-βおよびトリプシノーゲンが、同等の分子量により特徴付けられることを図示している（レーン2および4を参照されたい）。ヘパリンとの沈殿は、これらの製剤のいずれでも二量体画分の形成を引き起こさなかった（レーン3および5を参照されたい）。タンパク質の凝集または分解は、追加のバンドにより認識されたであろうが、PBS pH8.0中での加水分解でさえも、安定性の問題を生じさせなかった。したがって、タンパク質の構造は、調製プロセス全体を通して得られ、このことは、調製プロセスの好適さを強調する。凝集物の形成は、多くの場合に、タンパク質の持続放出製剤の製造中の障害として説明され、これは調製された製剤を用いて解決された（Morlock et al., 1997；Sinha et al., 2003）。多糖としてのヘパリンは、クマシーブルー染色後には可視化されなかった。
【００９１】
沈殿プロセスは、タンパク質にとってはストレスの多い条件を意味する。水性媒体中での振盪および多糖ヘパリンとの相互作用は、凝集を引き起こす場合がある。この作用を排除するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行なった。したがって、100μLのIFN-βおよびトリプシノーゲンのヘパリンナノ複合体を、4℃で15分間20,800で遠心分離した。ペレットを、50μLのPBS pH8.0中で加水分解した。2μg IFN-βまたはトリプシノーゲンを10μLの水溶液中に含有する溶液を、10μLのSchaeggerバッファーを用いて希釈し、5分間処理した。対照として、未処理のIFN-β、トリプシノーゲン、およびヘパリン（最終濃度：20μL中の2μg、Schaeggerバッファーを含む）をアプライした。タンパク質サイズを検出するために、第1レーンにPAGEルーラーをアプライした。電気泳動を、標準的な条件下で行なった。
【００９２】
［実施例8：SJLマウスでの薬物動態］
IVISを用いて蛍光強度を追跡することにより、12日間にわたる長期間の放出が確認された。この期間後でさえ、色素を含有しない移植物と比較して、蛍光はまだ上昇していた（図6を参照されたい）。したがって、マトリックス材料の選択は、新規な革新的薬物送達システムの開発に向けて大きな可能性を示した。さらに、ブランク移植物（記載されたマトリックス中にトリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体を含有するが、色素は含まない）を保持する動物で観察された蛍光シグナルにより、製剤に対する炎症応答が排除された。マウスは、観察期間中に感染またはストレスのいかなる兆候も示さなかった。したがって、製剤化は問題になるものではないと考えることができる。しかしながら、2週間の期間は、患者に対する投与へと移植物を推進させるにはまだ十分ではない可能性がある。それでもなお、製剤化プロセスは、多数のパラメータによって調節可能である。それゆえ、直径または長さを増加させることによって移植物の寸法を拡大することにより、マトリックスおよび拡散経路を増加させることができ、これにより、滞留時間を延長することができる。特別に設計された移植物プレスはまた、硬度の調節もまた可能にする。結果として、事前形成型移植物の重量は、寸法を変更する必要なしに、容易に増加させることができる。このことは、マトリックス材料中の孔径が低下する結果として、放出時間を向上させることができるであろう。
【００９３】
in vivoイメージング分析を、IVIS(登録商標)技術により行なった。IVIS(登録商標) Lumina Spectrum装置（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）は、生物発光および蛍光シグナルの観察を可能にし、このシグナルを、Living Imageソフトウェア（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）を用いて評価した。したがって、移植物を、頸部領域での最小限の侵襲的切開により、雌性SJLマウスに皮下的に投与した。トリプシノーゲン-ATTO 647N-ヘパリンナノ複合体を含有する移植物を、色素を含まないMC/HAマトリックス中にトリプシノーゲン-ヘパリンナノ複合体を含有する対応する製剤と比較した。この対照は、移植プロセスに起因する刺激（irritation）により引き起こされる蛍光の評価を可能にし、製剤に対する考えられる炎症応答を評価することを補助する。各実験について、3匹のマウスを試験した。11日間にわたって、選択された時点でマウスを麻酔し、蛍光シグナルの流束（flux）を決定した。したがって、700nmの発光波長および640nmの励起波長を用いた。
【００９４】
［実施例9：in vivo-in vitro相関］
皮下組織の放出特性を、2％[w/v]アガロースゲル由来のin vitro実験を実行することによりシミュレーションした。ゲルは、10％[v/v]グリセロールを含有するPBS pH7.4を用いて調製した。50mLの体積の混合物を、ペトリ皿に注いだ。すべての移植物は、上記の通りに作製し、この放出区画の中央に配置した。IVIS(登録商標)技術により、薬物放出をモニタリングした。
【００９５】
移植物は、参照として機能するためにATTO 647Nの非存在下で調製した。蛍光強度を、所定の時点で測定した。図7は、0時間、72時間、168時間および245時間後の、in vivo実験およびin vitro実験のイメージング結果を示す。これらの画像の蛍光強度を定量化するために、合計放射効率を、IVISソフトウェアを用いて蛍光強度について測定した。
【００９６】
s.c.注入をマウス背部の頸部領域に行なったので、背部領域で検出されたシグナルは、皮下組織および血流中での蛍光を含み得る。したがって、尾部領域の蛍光強度を、血漿濃度と相関比較するために対象領域（ROI）として設定した。血漿濃度は、図9にプロットされた較正曲線を用いることにより、蛍光強度から算出した。移植物およびATTO-トリプシノーゲン懸濁物について決定されたcmax値（ピーク血漿濃度）は、それぞれ0.306ng/mLおよび0.656ng/mLであった。
【００９７】
移植物については9時間、懸濁物については6時間のtmax値（cmaxに達するまでの時間）が観察された。移植物実験の血漿濃度の変動は、注入部位での移植物の徐放により説明できることに留意すべきである。
【００９８】
in vitroとin vivoで放出された薬物の関係を確かめるために、吸収された画分を、Nelson-Wagner法（J. G. Wagner et al., 1963）および線形台形則を用いるデコンボリューションにより、血漿濃度プロファイルから決定した。消失速度（kel＝0.068時間-1）が、最小二乗回帰分析により曲線の線形部分の勾配から得られた（G. Schliecker et al., 2003）。つまり、図10は、in vivoで吸収された薬物の割合（％）およびin vitroで放出された薬物量を時間に対して表わす。in vitroでのサンプリング時間を、対応するin vivoでの時点に対してLevyプロットでプロットした（図11）。図11は、in vitroおよびin vivoでの放出プロファイルの良好な相関（R2＝0.94）を示唆する。
【００９９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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