(57)【要約】本発明のさまざまな態様は、ポロキサマーコアと少なくとも1つのシクロデキストリンとを含む、ポリロタキサン、ならびに本発明のさまざまな態様のポリロタキサンを用いてニーマン・ピック病C型(NPC)を処置するための方法および画像化(例えば、MRI)するための方法に関する。2018532036.tif 000070
2018532036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
2018532036.tif 000061
を有する、
ポロキサマーコアと少なくとも1つのシクロデキストリンとを含む、ポリロタキサン、またはその塩:
式中、
各mおよびnは、独立して、0〜30の整数であり、ただしm + m' + n + n'が約4〜約30であることを条件とし;
CおよびC'は同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000062
式中、各L2は独立して、結合または(C1〜C6)アシルであり; 各G3は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く;各sは独立して、1〜6の整数であり;
Bは以下:
2018532036.tif 000063
を表し、これに対して末端キャップ基が(C1〜C6)ヒドロカルビレン基を介してBに共有結合しており、またはBは炭水化物、ポリペプチド、ポリカーボネート、ポリアミド、もしくはポリエステルポリマーを表し;
式中、R5はメチルであり; dは約1〜約800の整数であり; かつqは約6〜約800の整数であり;
Aは一般式(I)の大環状ホスト分子を表し:
2018532036.tif 000064
式中、
xは0〜8の整数であり; ZはOまたはNHであり;
各R1およびR2は独立して、水素、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基または下記式(IIIc)の基であり:
2018532036.tif 000065
式中、yは0〜10の整数であり; pは1〜10の整数であり; X2は(C1〜C6)アシル、短鎖ポリペプチド、短鎖炭水化物、ポリエステルまたはポリアミドを表し; X3およびX4は各々、独立して、-O-、-NH-、カルバミル基、ヘテロシクリル基、ジスルフィド(-S-S-)、アミドまたはエステルであり; かつR4はレポーター基であり、ただし少なくとも1つのR2基が式(IIIc)の基であることを条件とする。
【請求項２】
CおよびC'が同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000066
式中、各L2は独立して(C1〜C6)アシルである、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項３】
L2がC=Oである、請求項2に記載のポリロタキサン。
【請求項４】
各sが2である、請求項3に記載のポリロタキサン。
【請求項５】
各G3が独立して、コレステリル基、2,4,6-トリニトロフェニル基、シクロデキストリンラジカルまたはフルオレセインラジカルである、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項６】
Bが以下:
2018532036.tif 000067
を表し、これに対して末端キャップ基がカルバミル基、ヘテロシクリル基、ジスルフィド(-S-S-)、アミドまたはエステルを介してBに共有結合している、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項７】
R1が置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基であり、かつR2が式(IIIc)の基である、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項８】
xが1であり、かつzが0である、請求項7に記載のポリロタキサン。
【請求項９】
X2が(C1〜C6)アシルを表す、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項１０】
X2がC=Oである、請求項9に記載のポリロタキサン。
【請求項１１】
X3およびX4がそれぞれNHである、請求項10に記載のポリロタキサン。
【請求項１２】
m + m' + n + n'が約5〜約20である、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項１３】
Aがヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HPβCD)である、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項１４】
A'が4-スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン(SBEβCD)である、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項１５】
Aがヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであり、かつm + nが約2〜約10であり;A'が4-スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリンであり、かつm' + n'が約2〜約10である、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項１６】
レポーター基がキレート化部分である、請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項１７】
キレート化部分が、放射性核種を含む放射性核種キレート化部分である、請求項16に記載のポリロタキサン。
【請求項１８】
放射性核種キレート化部分が、常磁性核種を含む常磁性核種キレート化部分である、請求項17に記載のポリロタキサン。
【請求項１９】
キレート化部分がDOTAラジカルまたはDO3Aラジカルである、請求項18に記載のポリロタキサン。
【請求項２０】
ポリロタキサンが、
HPβCD/SBEβCD-F127 (ここでd = 200およびq = 65);
HPβCD/SBEβCD-F68 (ここでd = 151およびq = 29);
HPβCD/SBEβCD-L35 (ここでd = 22およびq = 16);
HPβCD/SBEβCD-L64 (ここでd = 26およびq = 30);または
HPβCD/SBEβCD-L81 (ここでd = 6.25およびq = 43)であり、
GPC分析によって決定された場合に約20,000 g/mol〜約50,000 g/molの重量平均分子量を有し;
HPβCDが式(I)の大環状ホストであり、
式中、各R1はHであり、ZはOであり、かつR2は式(IIIc)の基であり、ここでyは0であり; X2はC(O)Oであり; X3およびX4はそれぞれ-NH-であり; pは2であり; かつR4はDOTAであり; 
各sが2であり; 各L2 C(O); かつ各G3がコレステリル基を表す、下記式:
2018532036.tif 000068
の基CおよびC'はC(O)基を介して、各ポリロタキサンに対して変数dおよびqが上記のように定義される下記式:
2018532036.tif 000069
の基Bに共有結合している、
請求項1に記載のポリロタキサン。
【請求項２１】
約1〜約10個のHPβCD分子および約1〜約10個のSBEβCDを含む、請求項20に記載のポリロタキサン。
【請求項２２】
請求項1に記載のポリロタキサンおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項1に記載のポリロタキサンの治療有効量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、ニーマン・ピック病C型(NPC)を処置するための方法。
【請求項２４】
請求項1に記載のポリロタキサンの画像化に十分な量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、画像化のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年10月14日付で出願された米国特許仮出願第62/241,413号の恩典を主張するものであり、その全体が本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は国立衛生研究所によって付与された助成金GM087016の下での政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
治療剤および画像化造影剤は、高いクリアランスおよび/または高い毒性に起因する不利益を時に被る。例えば、β-シクロデキストリン(β-CD)およびその誘導体（ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP-β-CD)を含む）は、典型的には致死的疾患であるニーマン・ピック病C型(NPC)の処置において有用でありうることがいくつかの研究により示されているが、投与されるβ-CDまたはその誘導体の、高い投与量が必要とされる。というのは、血流中のそれらの持続性が短いからである(90%超は24時間以内に除去される)。画像化造影剤に関して、臨床的に用いられる造影剤の大部分は、高い常磁性、優れた緩和増強性および安定性を持ちうるが、身体からの迅速なクリアランスを受け、その結果、例えば血管造影増強のためには役に立たない。いくつかの例では、例えば、Gd3+の担体として用いられるナノ粒子プラットフォームは、他の臨床的に用いられる造影剤よりも良好な薬物動態を有するが、急性毒性および不十分な水接近性のような問題がある。それゆえ、例えば、NPCを処置するための治療剤、および本明細書において列挙された不利益を被らない画像化造影剤が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
【図面の簡単な説明】
【０００５】
これらの図は一般に、本書面において論じられるさまざまな態様を、限定としてではなく、例として説明する。
【０００６】
【図１】PR1、PR2、PR3およびPR5が、F127、F68、L35、L81 PLURONIC(プルロニック)(登録商標)コポリマーで調製されたポリロタキサンに対応する、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサンの1H NMRDスペクトルである。
【図２】7 T、25℃でのGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサンおよびDOTAREM(登録商標)の緩和率測定を示すプロットである。
【図３Ａ】ポリロタキサンの3D-MR画像である。A: DOTAREM。画像はBruker 7 Tで記録した。
【図３Ｂ】ポリロタキサンの3D-MR画像である。B: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127。画像はBruker 7 Tで記録した。
【図３Ｃ】ポリロタキサンの3D-MR画像である。C: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68。画像はBruker 7 Tで記録した。
【図３Ｄ】ポリロタキサンの3D-MR画像である。D: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35。画像はBruker 7 Tで記録した。
【図３Ｅ】ポリロタキサンの3D-MR画像である。E: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81。画像はBruker 7 Tで記録した。
【図４】Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサン造影剤の正規化強度のプロットである。
【図５】J774マクロファージ細胞とともにインキュベートされたGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサンに関する細胞生存率のプロットである。
【図６】J774マクロファージ細胞におけるポリロタキサンの細胞取り込みのプロットである。F127: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127, F68: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68, L35: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35, L64: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L64, L81: Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81。画像はBruker 7 Tで記録した。
【図７】異なるCD誘導体のポリロタキサン(PR)上への全タンパク質吸着のプロットである。
【図８】ポリロタキサンタンパク質コロナの平均(%)のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
これから、開示された主題のある種の態様を詳細に参照し、その例を添付の図面において部分的に示す。開示された主題を、列挙された特許請求の範囲とともに記述するが、例示された主題は特許請求の範囲を、開示された主題に限定するように意図されないことが理解されよう。
【０００８】
本発明のさまざまな態様の治療剤および画像化造影剤は、以下のスキーム1に示されるように、ポリロタキサンの「軸」上に「貫通された(threated)」1つまたは複数の大環状ホストを有するポリロタキサンとして知られる、超分子材料群に基づく。予期せぬことに、本明細書において記述されるポリロタキサン中に存在する大環状ホストの数が増加するにつれて、治療有効性を達成するために、または画像化の目的のために使用する必要があるポリロタキサンの用量は、場合によっては有意に、減少することが見出された。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、大環状ホストの数が増加するにつれて、本明細書において記述されるさまざまな態様のポリロタキサンがより「棒状」になり、結果として、ポリロタキサンの濃度依存性モル緩和能の有意な改善が観察されるものと考えられる。濃度依存性モル緩和能の改善は、いくつかの態様において、コントラストを増強し、それにより解剖学的形態でのさらに大きな識別を与えることができる有意に改善された造影剤であるポリロタキサンをもたらす。
【０００９】
ポリロタキサンは、ホストとゲスト間の疎水性相互作用を介して互換性のある寸法のポリマー鎖上に「貫通された」大環状ホスト分子であり、ポリマー鎖の末端は末端キャップ基でキャップされている。ポリロタキサンの略図をスキーム1に示す:
2018532036.tif 000003
またはその塩(例えば、薬学的に許容されるその塩)であり、
式中、CおよびC'は同じかまたは異なり、末端キャップ基を表し; Bは、末端キャップ基が共有結合している「互換性のある寸法のポリマー鎖」を表し; Aはポリマー鎖B上に「貫通された」大環状ホスト分子を表し; nは1〜100 (例えば、1〜75、1〜50、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数であり、ここでnはポリマー鎖B上に「貫通された」大環状ホスト分子Aの数を表す。
【００１０】
いくつかの態様において、大環状ホスト分子Aの全てが同じである。他の態様において、大環状ホスト分子Aの1つまたは複数が異なる。大環状ホスト分子Aの1つまたは複数が異なるポリロタキサンの略図を、スキームIAおよびIBに示す:
2018532036.tif 000004
式中、mおよびnは同じであってもまたは異なっていてもよく; nは0〜100 (例えば、1〜75、1〜50、0〜30、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数であり; mは0〜100 (例えば、1〜75、1〜50、0〜30、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数であり; かつ式中、mおよびnは、ポリマー鎖B上に「貫通された」大環状ホスト分子A'およびAの数をそれぞれ表す。それゆえ、大環状ホスト分子が異なる場合、それらは、nとmとの比によって決定されるさまざまなモル比で存在しうることが明らかである。いくつかの態様において、比は1:1を含めて、1:0〜0:1であることができる。AおよびA'の2つの特定の配向がスキームIAおよびIBに与えられているが、AおよびA'はスキームICに示される配向を含む全ての可能な配向でありうることが理解されるべきであり、式中、各mおよびnは同じであってもまたは異なっていてもよく:
2018532036.tif 000005
式中、m、m'、nおよびn'は同じであってもまたは異なっていてもよく; mは0〜100 (例えば、1〜75、1〜50、0〜30、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数であり; nは0〜100 (例えば、1〜75、1〜50、0〜30、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数であり; m'は0〜100 (例えば、1〜75、1〜50、0〜30、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数であり; n'は0〜100 (例えば、1〜75、1〜50、0〜30、1〜30、5〜15、5〜12、10〜30、10〜50、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18)の整数である。
【００１１】
いくつかの態様において、大環状ホスト分子(A)および(A')の配向は、本明細書における、スキームICに示される通りであることができ、ここでm、m'、nおよびn'はゼロ以外であり、かつ約85% (例えば、約65%〜約90%; 約75%〜約90%; または約80%〜約90%)の大環状ホスト分子が(A)nおよび(A)mの「尾−尾」配向を有し、かつ約15% (例えば、約10%〜約35%; 約10%〜約25%; または約10%〜約20%)の大環状ホスト分子が(A')n'および(A')m'の「頭−頭」配向を有する。
【００１２】
大環状ホスト分子(A)および(A)'は、大環状ホスト分子がホスト-ゲスト疎水性相互作用を介して互換性のある寸法のポリマー鎖上に「貫通され」うる限り、任意の適当な大環状ホスト分子であることができる。適当な大環状ホスト分子については、例えば、C.J. Collins et al., Biochemistry 52: 3242-3253 (2013)を参照されたく、この文献は本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。いくつかの態様において、大環状ホスト分子(A)および(A')は、シクロデキストリンであり得る。本明細書において用いられる場合、「シクロデキストリン」という用語は、それぞれα-、β-、またはγ-CDを生成させる、例えばα-1,4-結合により結合された6、7または8(+)-グルコピラノシド単位の環化(例えば、酵素的環化)によって生成される大環状オリゴ糖を広くいう。
【００１３】
シクロデキストリンは、疎水性内部空洞を有するトロイダルトポロジーを有する。β-CD、およびその誘導体は、可溶化剤、浸透性増大剤、および活性成分安定剤としての医薬産業および食品産業でのその用途のために注目を集めている。
【００１４】
いくつかの態様において、大環状ホスト分子(A)および(A')は、一般式(I)または(Ia)を有する:
2018532036.tif 000006
式中、各Zは独立してO (酸素)、NHまたはアジド基(-N3もしくは-N=N+=N-)であり; 各R1およびR2は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜20 (例えば、0〜5または0〜3)個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)ヒドロカルビル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビル基)であり; xは0〜8の整数である(例えば、0〜3、1〜8および1〜3; いくつかの態様においてxは0であることができる)。Zがアジド(-N3)基である場合、R2は存在しないことが理解されるべきである。いくつかの態様において、各R1およびR2は独立して、水素または薬物ラジカル、任意の適当なレポーター基ラジカル(例えば、画像化造影剤ラジカル、例えば放射性核種を含む放射性核種キレート化部分もしくは常磁性核種を含む常磁性核種キレート化部分; キレート化部分の例としては、DOTAおよびDO3Aラジカルが挙げられる)で置換された(C1〜C20)ヒドロカルビル基、またはそれらの組み合わせである。xが1であり、Zがアジド(-N3)基であり、各R1が水素であり、かつR2が存在しない場合には、大環状ホスト分子(A)または(A')はアジド-β-シクロデキストリンとして知られている。
【００１５】
他の態様において、式中、各Zは独立してO (酸素)、NHまたはアジド基(-N3もしくは-N=N+=N-)であり; 各R1およびR2は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)ヒドロカルビル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビル基)であり; xは1〜8 (例えば、1〜3)の整数である。Zがアジド(-N3)基である場合、R2は存在しないことが理解されるべきである。いくつかの態様において、各R1およびR2は独立して、水素または薬物ラジカル、画像化造影剤ラジカル(例えば、放射性核種を含む放射性核種キレート化部分もしくは常磁性核種を含む常磁性核種キレート化部分)で置換された(C1〜C20)ヒドロカルビル基またはそれらの組み合わせである。xが1であり、Zがアジド(-N3)基であり、各R1が水素であり、かつR2が存在しない場合には、大環状ホスト分子(A)または(A')はアジド-β-シクロデキストリンとして知られている。
【００１６】
いくつかの態様において、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C20)アルキル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)アルキル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)アルキル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)アルキル基)であり; xは1〜3の整数である。いくつかの態様において、各R1は置換(C1〜C20)アルキル基である。いくつかの態様において、(C1〜C20)アルキル基上の置換基は、スルホネート(-SO3-)基である。さらに他の態様において、R1は、ブチルスルホネート基(-CH2CH2CH2CH2SO3-)である。スルホネート(-SO3-)基およびブチルスルホネート(-CH2CH2CH2CH2SO3-)基は、ナトリウム(Na+)、カリウム(K+)およびリチウム(Li+)カチオンを含む、任意の適当な対イオンと結び付くことができる。モノカチオンが本明細書において列挙されていても、カルシウム(Ca2+)およびマグネシウム(Mg2+)ジカチオンを含む、ポリカチオンも本明細書において企図される。
【００１７】
いくつかの態様において、各Zが独立してOまたはNHである式(I)の化合物との関連で、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; xは1〜3の整数であり; R2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり、ただし少なくとも1つのR2は、1つのRが水素であり、かつもう1つが放射性核種キレート化部分で置換されたアリール基である基C(S)N(R)2で置換され、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、(C1〜C20)ヒドロカルビル基であることを条件とする。
【００１８】
いくつかの態様において、各R1は水素または下記式を有する基である:
2018532036.tif 000007
式中、yは0〜10の整数(例えば、1〜8、1〜5または1〜3の整数)であり、R3は水素または置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビル基である。
【００１９】
他の態様において、R1およびR2は各々、独立して、水素または式(II)の基であり、式中、R3は水素であり; ZはOであり; xは1〜3の整数であり; yは0〜3の整数である。
【００２０】
いくつかの態様において、式(I)の化合物は、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP-β-CD)である。HP-β-CDは、不活性薬剤成分としてFDAにより認可され、β-CDよりも室温で実質的に水溶性(水中で0.65 g/mL )であるため、ポリロタキサン合成の魅力的な前駆体である。水溶液中でのそのような溶解性によって、例えば、NPC疾患のモデルにおけるHP-β-CDの薬物動態および生体内分布を増強しうる、本明細書において記述されるものなどの、耐容性良好なポリロタキサンをデザインするための良好な候補になる。
【００２１】
いくつかの態様において、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; Zは-NH-であり; R2は、Rが水素または置換アリール(例えば、キレート化部分で置換されたアリール)である基C(S)N(R)2で置換された、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、(C1〜C20)ヒドロカルビル基である。
【００２２】
いくつかの態様において、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; Zは-NH-であり; R2は、Rが水素または置換アリール(例えば、キレート化部分で置換されたアリール)である基C(S)N(R)2で置換された、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; xは1である。
【００２３】
いくつかの態様において、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜20 (例えば、0〜5または0〜3)個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; Zは-NH-であり; R2は、Rが水素または置換アリール(例えば、キレート化部分で置換されたアリール)である基C(S)N(R)2で置換された、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜20 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; xは1である。
【００２４】
いくつかの態様において、式(I)または(Ia)の化合物の場合、各R2は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜20 (例えば、0〜5または0〜3)個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; Zは、Rが水素または置換アリール(例えば、キレート化部分で置換されたアリール)である基C(S)N(R)2で置換された、-NH-であり; xは1である。
【００２５】
他の態様において、各R1は水素であり; R2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; Zは-NH-であり; xは1である。さらに他の態様において、各R1は水素であり; Zは-NH-であり; xは1であり; R2は、Rが水素または置換アリール(例えば、キレート化部分で置換されたアリール)である基C(S)N(R)2で置換された、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、(C1〜C20)ヒドロカルビル基である。そのようなR2基の非限定的な例は、式(III)を有するものである:
2018532036.tif 000008
式中、pは1〜10 (例えば、1〜5または1〜3)の整数であり; R4はキレート化部分(例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)ラジカル)である。いくつかの態様において、式(III)を有する基は、式(IIIa)の基である:
2018532036.tif 000009
式中、pは1〜10 (例えば、1〜5または1〜3)の整数であり; R4はキレート化部分(例えば、DOTAラジカル)である。
【００２６】
他の態様において、式(I)または(Ia)の化合物において、R2は式(IIIb)を有する:
2018532036.tif 000010
式中、X1は、短鎖ポリペプチド(例えば、20個までのアミノ酸もしくは約5〜約20個のアミノ酸を有するポリペプチド)、短鎖炭水化物(例えば、20個までの単糖類単位もしくは約5〜約20個の単糖類単位を有する炭水化物)、ポリエステルまたはポリアミドを含む、適当なリンカーを表し; R4はキレート化部分(例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)ラジカル)である。
【００２７】
他の態様において、式(I)または(Ia)の化合物において、R2は式(IIIc)を有する:
2018532036.tif 000011
式中、yは0〜10の整数であり; pは1〜10の整数であり; X2は、(C1〜C6)アシル(例えば、C=O)、短鎖ポリペプチド(例えば、20個までのアミノ酸もしくは約5〜約20個のアミノ酸を有するポリペプチド)、短鎖炭水化物(例えば、20個までの単糖類単位もしくは約5〜約20個の単糖類単位を有する炭水化物)、ポリエステルまたはポリアミドを含む、適当なリンカーを表し; X3およびX4は各々、独立して、-O-、-NH-、カルバミル基(例えば、Rが本明細書において定義される、-OC(O)N(R)-)、ヘテロシクリル基、-S-S-、エステル(例えば、-C(O)O-)、またはアミド(Rが本明細書において定義される、C(O)N(R))であり; R4はキレート化部分(例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)ラジカル)である。
【００２８】
いくつかの態様において、大環状ホスト分子(A)または(A')がキレート化部分のラジカル(例えば、DOTAのラジカル)を含むR2基を含む場合、本明細書において記述されるポリロタキサンは、キレート化部分が、本明細書において定義されるように、放射性核種を含むとき、MRI造影剤として有用である。
【００２９】
本明細書において「軸」といわれることもあるポリマー鎖(B)は、ポリマー鎖が大環状ホスト分子を「貫通」することができ、かつホストとゲスト間の疎水性相互作用を介してポリマー鎖と相互作用することができる限り、任意の適当なポリマー鎖であることができる。適当なポリマー鎖については、例えば、C.J. Collins et al., Biochemistry 52: 3242-3253 (2013)を参照されたく、この文献は本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。いくつかの態様において、適当なポリマー鎖は、大環状ホスト分子が放出されるような、ある種の条件の下で(例えば、生理学的条件の下で、または酵素が、例えばNPC細胞において、末端キャップ基(CおよびC')を酵素的に除去する場合には酵素の存在下で)「軸」から「脱貫通される」。ポリマー鎖(B)は、互換性のある寸法のポリマー鎖である。適当なポリマー鎖(B)には、アミン末端ポリ(テトラヒドロフラン)およびアミン末端ポリ(エチレングリコール)に基づくものが含まれるが、これらに限定されることはない。例えば、Nakazono, K., et al., Macromolecules 43: 691-696 (2009)を参照されたく、この文献は本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。他の適当なポリマー鎖(B)には、炭水化物、ポリペプチド、ポリカーボネート、ポリアミド、およびポリエステルポリマーが含まれる。ポリマー鎖(B)は、カルバミル基、ヘテロシクリル基(例えば、1,2,3-トリアゾリル基)、ジスルフィド、アミド、エステルなどを含む、任意の適当な連結基によって末端キャップ基CおよびC'に(例えば、共有結合的に)結合することができる。
【００３０】
適当なポリマー鎖(B)には、場合によっては、本明細書において「ポロキサマーコア」といわれうるポリアルキレンオキシドポリマー鎖に基づくものも含まれるが、これらに限定されることはない。ポリアルキレンオキシド(例えば、ランダムコポリマー、ジブロックコポリマーまたはトリブロックコポリマー配置)ポリマー鎖(B)の例としては、下記式(IV)を有するものが挙げられる:
2018532036.tif 000012
式中、各R5は独立して、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)ヒドロカルビル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビル基)であり; dは約1〜約800 (例えば、約6〜約200; 約20〜約200; 約20〜約150; 約100〜約500; 約250〜約750; 約150〜約400; 約250〜約600または約300〜約700)の整数であり; qは約6〜約800 (例えば、約10〜約100; 約10〜約75; 約10〜約50; 約100〜約500; 約250〜約750; 約150〜約400; 約250〜約600または約300〜約700)の整数である。
【００３１】
いくつかの態様において、各R5は独立して、置換もしくは非置換(C1〜C20)アルキル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)アルキル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)アルキル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)アルキル基)である。いくつかの態様において、R5はメチルである。
【００３２】
いくつかの態様において、d + qは約10〜約800 (例えば、約100〜約500; 約250〜約750; 約150〜約400; 約250〜約600または約300〜約700)である。他の態様において、d + qは、ポリアルキレンオキシドポリマー鎖(B)の分子量が約2 kD〜約50 kD (例えば、約10 kD〜約35 kD、約10 kD〜約20 kD、約15 kD〜約25 kDまたは約15 kD〜約30 kD)であるようなものである。
【００３３】
ポリアルキレンオキシドポリマー鎖(B)の例としては、ポリ(エチレングリコール)-ポリ(プロピレングリコール)-ポリ(エチレングリコール) (PEG-PPG-PEG)トリブロックコポリマーのファミリー、PLURONIC (登録商標)界面活性剤のようなポロキサマーに基づくポリアルキレンオキシドポリマー鎖が挙げられる。PLURONIC (登録商標)界面活性剤それ自体は、その好ましい生体適合性および低い毒性のために、幅広い用途に恵まれている。PLURONIC (登録商標)界面活性剤の例としては、PLURONIC (登録商標)F127; PLURONIC (登録商標)F68; PLURONIC (登録商標)L35; PLURONIC (登録商標)L64; およびPLURONIC (登録商標)L81が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３４】
基CおよびC'は同じかまたは異なり、任意の適当な末端キャップ基を表す。適当な末端キャップ基については、例えば、C.J. Collins et al., Biochemistry 52: 3242-3253 (2013)を参照されたく、この文献は本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。末端キャップ基は、一般に、大環状ホスト分子(A)または(A')が、例えば十分な立体的かさ高さを提供することにより、ポリマー鎖(B)から「脱貫通」するのを防ぐように機能する。いくつかの態様において、末端キャップ基は、末端キャップ基を除去する適切な「引き金」が適用されるまで(例えば、生理学的条件の下で、または酵素が、例えばNPC細胞において、末端キャップ基(CおよびC')を酵素的に除去する場合には酵素の存在下で、大環状ホスト分子(A)または(A')がポリマー鎖(B)から「脱貫通」するのを防ぐ。
【００３５】
基CおよびC'は、適当な連結基を介してポリマー鎖に共有結合している。適当な末端キャップ基には、式(IV)の基が含まれるが、これらに限定されることはない:
2018532036.tif 000013
式中、L1は(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり; G1は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり; G2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C0〜C6)ヒドロカルビレン-(C6〜C50)ヒドロカルビル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン-(C6〜C50)ヒドロカルビル基)であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く; tは2〜5 (例えば、2)の整数である。いくつかの態様において、(C6〜C50)ヒドロカルビル基(例えば、(C6〜C30)ヒドロカルビル; (C6〜C20)ヒドロカルビルまたは(C6〜C15)ヒドロカルビル)は、置換または非置換であってよく、例えば、蛍光部分(例えば、フルオレセインもしくはフルオレセニルラジカル)、ステロイド(例えば、コレステロールもしくはコレステリルラジカル)、短鎖ポリペプチド、短鎖炭水化物またはアリール基(例えば、置換アリール基)であることができる。
【００３６】
他の態様において、L1は(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり; G1は、0〜5 (例えば、0〜3)個の-NH-基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり; G2は0〜5 (例えば、0〜3)個の-NH-基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C6〜C50)ヒドロカルビレン-(C1〜C6)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く; tは2〜5 (例えば、2)の整数である。
【００３７】
いくつかの態様において、L1は(C1〜C3)ヒドロカルビレン基であり; G1は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビレン基であり; G2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビレン-(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く; tは2〜5 (例えば、2)の整数である。
【００３８】
さらに他の態様において、L1は(C1〜C6)アシル(例えば、C=O)であり; G1は、0〜5 (例えば、0〜3)個の-NH-基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビレン基であり; G2は、0〜5 (例えば、0〜3)個の-NH-基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビレン-(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く; tは2〜5 (例えば、2)の整数である。
【００３９】
いくつかの例では、G1およびG2は一緒になって、下記式を有する基を形成する:
2018532036.tif 000014
式中、各L2は独立して、結合または(C1〜C6)アシル(例えば、C=O)であり; 各G3は、-O-、-NH-、および-S-(例えば、-O-)から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く;各sは独立して、1〜6 (例えば、2〜5または2〜3)の整数である。
【００４０】
他の例では、G1およびG2は一緒になって、下記式を有する基を形成する:
2018532036.tif 000015
式中、各L2は独立して、結合または(C1〜C6)アシル(例えば、C=O)であり; 各G3は、-O-、-NH-、および-S-(例えば、-O-)から選択される0〜5 (例えば、0〜3)個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く;各sは独立して、1〜6 (例えば、2〜5または2〜3)の整数である。
【００４１】
いくつかの態様において、基G3は置換もしくは非置換-O-(C6〜C50)アルキル基または置換もしくは非置換(C6〜C12)アリール基であり、ここで(C6〜C50)アルキル基および(C6〜C12)アリール基は立体的にかさ高い。他の態様において、基G3は置換もしくは非置換-O-(C6〜C50)アルキル基であり、ここで、いくつかの例では、(C6〜C50)アルキル基はコレステリル基:
2018532036.tif 000016
である。他の態様において、G3は置換フェニル基であり、ここでフェニル基は少なくとも2つの置換基(例えば、NO2)で置換されている。いくつかの態様において、置換フェニル基は、2,4,6-トリニトロフェニル基:
2018532036.tif 000017
のような三置換フェニル基である。
【００４２】
さらに他の態様において、基G3は、大環状ホスト分子(A)または(A')がポリマー鎖(B)から「脱貫通」するのを防ぐのに十分な立体的かさ高さを有するペプチドまたは炭水化物である。例えば、本明細書において記述されるペプチドもしくは炭水化物、または末端キャップ基のいずれかは、約2 nm〜約50 nm (例えば、約4 nm〜約10 nm; 約2 nm〜約15 nm; または約3 nm〜約12 nm)のその有効径によって定義される立体的かさ高さを有する。
【００４３】
さらに他の態様において、基G3は、蛍光部分(例えば、フルオレセインもしくはフルオレセニルラジカル)、ステロイド(例えば、コレステロールもしくはコレステリルラジカル)、短鎖ポリペプチド、短鎖炭水化物、アリール基(例えば、置換アリール基)またはα-もしくはβ-シクロデキストリンのような、シクロデキストリン基であることができる。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明のさまざまな態様のポリロタキサンは、式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)の化合物:
2018532036.tif 000018
またはそれらの組み合わせであり、式中、A、A'、B、C、C'、n、m、n'、およびm'は本明細書において定義される通りである。いくつかの例では、CおよびC'は同じかもしくは異なり、ポリロタキサンAおよびA'がポリマー鎖(B)から「脱貫通」するのを防ぐのに十分な立体的かさ高さを有するペプチドもしくは炭水化物を含み、またはC'およびC'は同じかもしくは異なり、下記式の基を含み:
2018532036.tif 000019
式中、各sは2であり、各L2は結合またはC=Oであり、かつ各G3は、コレステリル基、2,4,6-トリニトロフェニル基、または大環状ホスト分子(A)もしくは(A')がポリマー鎖(B)から「脱貫通」するのを防ぐのに十分な立体的かさ高さを有するペプチドもしくは炭水化物であり; Bは、下記式の「互換性のある寸法のポリマー鎖」を表し:
2018532036.tif 000020
式中、R5はメチルであり、dおよびqは本明細書において定義される通りであり、これに対して末端キャップ基が、(C1〜C6)アシル基のような、適当な(C1〜C6)ヒドロカルビレン基を含む任意の適当な連結基(例えば、本明細書においてL1)を介してポリマー鎖に共有結合しており; Aは一般式(I)または(Ia)の大環状ホスト分子を表し:
2018532036.tif 000021
式中、R1、R2、Z、およびxは本明細書において定義される通りであり、ここで大環状ホスト分子はポリマー鎖B上に「貫通され」; nは0〜30 (例えば、0〜20、0〜15、0〜12、2〜12または2〜18)の整数であり; mは0〜30 (例えば、0〜20、0〜15、0〜12、2〜12または2〜18)の整数であり、ここでmおよびnは、ポリマー鎖B上に「貫通された」、それぞれ、大環状ホスト分子A'およびAの数を表す。例えば、C.J. Collins et al., Biochemistry 52: 3242-3253 (2013)を参照されたく、この文献は本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。
【００４５】
いくつかの態様において、本発明のさまざまな態様のポリロタキサンはHPβCD/SBEβCD-F127; HPβCD/SBEβCD-F68; HPβCD/SBEβCD-L35; -HPβCD/SBEβCD-L64; またはHPβCD/SBEβCD-L81であり、ここでポリロタキサンは、GPC分析によって決定された場合に約20,000 g/mol〜約50,000 g/molの重量平均分子量を有する。いくつかの態様において、本発明のさまざまな態様のポリロタキサンは、約1〜約10個のHPβCD分子および約1〜約10個のSBEβCD-F68を含む。
【００４６】
当業者は、本明細書において記述される化合物(例えば、大環状ホスト分子(A)または(A'))がキラル中心を含むことを認識するであろう。本明細書において記述される化合物の全てのジアステレオマー、およびラセミ化合物が本明細書において企図される。
【００４７】
本発明のさまざまな態様のポリロタキサンは、ニーマン・ピックC型(NPC)病を処置するのに有用である。NPCは、脳、肝臓、脾臓、および肺細胞のリソソームにおける非エステル化コレステロールおよびスフィンゴ脂質の蓄積によって引き起こされるリソソーム蓄積障害疾患である。NPC細胞におけるコレステロールの異常な蓄積は、リソソームからのコレステロールの流出に必要とされる可溶性NPC2タンパク質または膜結合NPC1のいずれかをコードする遺伝子の突然変異に由来することが示されている。残念なことに、この典型的に致命性の疾患の処置選択肢は限られている。β-シクロデキストリン(β-CD)およびその誘導体（ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP-β-CD)を含む）が、リソソーム区画からの蓄積コレステロールの除去を行使できることがいくつかの研究によって示されている。いくつかのグループは、npc1-/-マウスへのHP-β-CDの皮下注射(4.0 mg/kg体重)が、それらの生存、肝臓病理、および神経病理の改善をもたらしたことを示している。これらの結果は有望であるが、HP-β-CDがヒトNPC1疾患において細胞からコレステロールをどのように可溶化するかは依然として不明である。さらに、投与されるHP-β-CDの高い投与量が必要とされる。というのは、そのかなりの水溶性および比較的低い分子量(およそ1460 g.mol-1)のために、血流中のそれらの持続性が短いからである(90%超は24時間以内に除去される)。
【００４８】
本発明のさまざまな態様のポリロタキサンは、長時間循環することができ、生体適合性であることができ、NPC細胞のような細胞からのコレステロール除去を実質的に増加させることができる。さらに、末端キャップ基の除去によって、それらは例えばHP-β-CDの、複数「コピー」をNPC細胞のリソソームに送達することができる。フィリピン染色を用いたNPC2-/-線維芽細胞における本発明のさまざまな態様のある種のポリロタキサンの分析により、それらが異常に蓄積されたコレステロールのこれらの細胞からの除去を促進することが明らかにされた。本明細書における実施例を参照されたい。
【００４９】
それゆえ、いくつかの態様において、本発明は、治療有効量の本発明のさまざまな態様の少なくとも1つのポリロタキサンまたは本発明のさまざまな態様の少なくとも1つのポリロタキサンを含む組成物(例えば、薬学的組成物)を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、NPCを処置するための方法を企図する。
【００５０】
他の態様において、本発明は、治療有効量の本発明のさまざまな態様の少なくとも1つのポリロタキサンまたは本発明のさまざまな態様の少なくとも1つのポリロタキサンを含む組成物(例えば、薬学的組成物)を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、動物の細胞からコレステロールを除去する方法を企図する。
【００５１】
いくつかの態様において、NPCを処置するための方法または動物の細胞からコレステロールを除去するための方法で用いるために企図されるポリロタキサンには、一般式:
2018532036.tif 000022
を有するポリロタキサンまたはその組み合わせまたはその塩が含まれるが、これらに限定されることはなく、式中、A、A'、B、C、C'、n、m、n'、およびm'は本明細書において定義される通りである。いくつかの態様において、nは0〜30の整数であり; mは0〜30の整数であり(例えば、nは1〜30の整数であり; かつmは1〜30の整数であり); CおよびC'は同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000023
式中、L1は、(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり、G1は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり、G2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン-(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く、tは2〜5の整数であり; Bは下記式のポリマー鎖を表し:
2018532036.tif 000024
式中、各R5は独立して、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり、dは約100〜約800の整数であり、かつqは約1〜約800の整数であり、ここでポリマー鎖および末端キャップ基は、(C1〜C6)アシル基のような、適当な(C1〜C20)ヒドロカルビル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)ヒドロカルビル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビル基)を含む、任意の適当な連結基を介して共有結合しており; 
Aは一般式(I)または(Ia)の大環状ホスト分子を表し:
2018532036.tif 000025
式中、各ZはOまたは-N3であり、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; xは1〜3の整数であり; かつR2は、Zが-N3である場合に存在しないか、または-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基である。
【００５２】
いくつかの態様において、CおよびC'は同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000026
式中、各sは2であり、各L2は結合またはC=Oであり、かつ各G3はコレステリル基または2,4,6-トリニトロフェニル基であり;
Bは下記式の「互換性のある寸法のポリマー鎖」を表し:
2018532036.tif 000027
式中、R5はメチルであり、dおよびqは本明細書において定義される通りであり、これに対して末端キャップ基が、(C1〜C6)アシル基のような、適当な(C1〜C6)ヒドロカルビレン基を含む任意の適当な連結基(例えば、本明細書においてL1)を介してポリマー鎖に共有結合しており; 
Aは一般式(I)または(Ia)の大環状ホスト分子を表し:
2018532036.tif 000028
式中、各ZはOまたは-N3であり、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; xは1〜3の整数であり; かつR2は、Zが-N3である場合に存在しないか、または-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基である。
【００５３】
いくつかの態様において、xは1であり; ZはOであり; R2はHであり; かつR1はHである。
【００５４】
他の態様において、xは1であり; ZはOであり; R2は、置換または非置換(C1〜C6)アルキル基であり; かつR1は置換または非置換(C1〜C6)アルキル基である。いくつかの態様において、(C1〜C6)アルキル基は、-OHまたは-SO3-で置換されている。
【００５５】
さらに他の態様において、xは1であり; Zは-N3であり; R2は存在せず; かつR1はHである。
【００５６】
磁気共鳴画像法(MRI)は、身体内の解剖学的構造および特定の器官または組織の高分解能3次元(3D)医療画像作成のための強力なツールである。MRIは、電離放射線が存在しないこと、高いコントラスト、高い空間分解能および優れた深度プロファイリング能力のような利点を有する。MRIは、さまざまな神経疾患、心血管疾患および腫瘍性疾患の診断において広範な用途がある。MRI画像の質およびコントラストは、周囲の水プロトンの縦(T1)および横(T2)緩和率を変更することによって、関心対象の組織内の画像コントラストを高めるMRI造影剤の使用により改善することができる。造影剤は、T1緩和率を増加させ、陽性像コントラストを生成するガドリニウム(III)キレートのようなT1剤、またはT2緩和率を増加させ、陰性像コントラストを生成する超磁性酸化鉄ナノ粒子のようなT2剤のいずれかに分類することができる。
【００５７】
臨床的に用いられる造影剤の大部分、その高い常磁性、優れた緩和増強、および安定性のために好まれるGd3+キレートである。残念なことに、ほとんどの臨床的に認可された造影剤は、身体からの迅速なクリアランスを受け、効果的ではないコントラスト増強の弱点があり、ゆえに、血管造影増強には効果がない。したがって、造影剤のための担体として高分子、高分子集合体、およびナノ粒子を用いることは、それらの循環特性が長く、標的リガンドの使用による組織選択性の可能性のために魅力的である。そのような物質は、より良好な薬物動態を有するだけでなく、より高いGd3+負荷を有しうる可能性もある。デンドリマー、ポリマー、リポソーム、無機粒子、および超分子集合体のようなプラットフォームは、Gd3+の担体として用いられてきた; しかしながら、これらの担体の大部分は、急性毒性および粒子コア内のGd3+の局在化による水の接近不良のような問題に悩まされている。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明は、ポロキサマーコアと少なくとも1つの核種キレート化部分を含む少なくとも1つのシクロデキストリンとを含む、ポリロタキサンを企図する。本発明のさまざまな態様のポリロタキサンは、多価Gd3+担体として機能することができる。例えば、大環状ホスト分子(A)がキレート化部分(例えば、DOTAラジカル)を含むR2基を含む場合、本明細書において記述されるポリロタキサンは、キレート化部分が、本明細書において定義されるように、核種を含むとき、MRI造影剤として有用である。
【００５９】
それゆえ、いくつかの態様において、本発明は、本発明のさまざまな態様によるポリロタキサンの画像化に十分な量、または本発明のさまざまな態様によるポリロタキサンの画像化に十分な量を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、画像化のための方法を企図する。
【００６０】
いくつかの態様において、画像化のための方法において有用なポリロタキサンには、下記一般式：
2018532036.tif 000029
を有するポリロタキサンまたはその塩が含まれるが、これらに限定されることはなく、式中、
nは1〜30の整数であり;
CおよびC'は同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000030
式中、L1は、(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり、G1は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン基であり、G2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビレン-(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く、tは2〜5の整数であり;
Bは下記式のポリマー鎖を表し:
2018532036.tif 000031
式中、各R5は独立して、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり、dは約1〜約800の整数であり、かつqは約1〜約800の整数であり、ここでポリマー鎖および末端キャップ基は、(C1〜C6)アシル基のような、適当な(C1〜C20)ヒドロカルビル基(例えば、置換もしくは非置換(C1〜C12)ヒドロカルビル基; 置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基; または置換もしくは非置換(C1〜C3)ヒドロカルビル基)を含む、任意の適当な連結基を介して共有結合しており; 
Aは一般式(I)または(Ia)の大環状ホスト分子を表し:
2018532036.tif 000032
式中、各Zは独立してOまたはNHであり、各R1は独立して、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、水素または置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; xは1〜3の整数であり; R2は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C1〜C20)ヒドロカルビル基であり; ただし少なくとも1つのR2は、1つのRが水素であり、かつもう1つが放射性核種キレート化部分で置換されたアリール基である基C(S)N(R)2で置換された、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、(C1〜C20)ヒドロカルビル基であることを条件とする。
【００６１】
本発明の態様は、非水性条件の下で(例えば、ジエチルエーテル、ヘキサンなどのような、非極性溶媒の存在下で)、適当なポリマー鎖(B)を適当な大環状ホスト分子(A)および/または(A')と(例えば、不均一条件の下で)組み合わせ/接触させることによって本発明のさまざまな態様のロタキサンを作製する方法を企図する。いくつかの態様において、適当なポリマー鎖(B)ならびに適当な大環状ホスト分子(A)および/または(A')は、少なくとも1個(例えば、1〜30、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18個)の大環状ホスト分子がポリマー鎖上に貫通されるような、大環状ホスト分子(A)または(A')がポリマー鎖(B)上に「貫通される」のに十分な時間(例えば、48時間)接触される。ポリマー鎖上に「貫通された」少なくとも1個(例えば、1〜30、1〜20、1〜15、5〜15、3〜11、1〜12、2〜12または2〜18個)の大環状ホスト分子を含む、ポリマー鎖(B)の末端は、本明細書において記述されるキャップ方法または当技術分野において公知のものを用いて引き続き「キャップ」される。例えば、C.J. Collins et al., Biochemistry 52: 3242-3253 (2013)を参照されたく、この文献は本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み入れられる。
【００６２】
薬学的組成物
本発明のさまざまな態様では、本発明のさまざまな態様の1種または複数種の化合物と、1種または複数種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物もまた企図される。「薬学的組成物」は、対象(例えば、限定されるものではないが、哺乳動物のような、動物)への投与に適した化学的または生物学的組成物をいう。そのような組成物は、限定されるものではないが、口腔粘膜、皮膚、皮膚上、硬膜外、注入、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、脊髄内、髄腔内、静脈内、経口、非経口、肺、浣腸剤または坐剤による経直腸、皮下、真皮下、舌下、経皮、および経粘膜などといった、いくつかある経路の1つまたは複数による投与のために特別に製剤化されうる。加えて、投与は、カプセル剤、滴剤、フォーム剤、ゲル剤、ガム剤、注射剤、溶液剤、貼付剤、丸剤、多孔性小袋(porous pouch)、粉剤、錠剤、または他の適切な投与手段を使って行うことができる。
【００６３】
「薬学的賦形剤」または「薬学的に許容される賦形剤」は、時には液状の、担体を含み、その中に活性治療作用物質が調合される。一般に賦形剤は、製剤に、化学的および/または生物学的安定性ならびに放出特徴は与えうるが、薬理学的活性はなにも与えない。適当な製剤の例は、例えば、Remington, The Science And Practice of Pharmacy, 20th Edition, (Gennaro, A. R., Chief Editor), Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000において見出すことができ、この文献は参照によりその全体が組み入れられる。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」には、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤が含まれる。1つの態様において、担体は非経口投与に適している。あるいは、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下、または経口投与に適しうる。薬学的に許容される担体として、滅菌水溶液または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質のためのそのような媒質および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。従来の媒質または作用物質は、それらが活性化合物と不適合でない限り、本発明の薬学的組成物におけるその使用が考えられる。組成物には補助活性化合物も組み込むことができる。
【００６５】
薬学的組成物は製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でありうる。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール)、ならびにそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散系の場合は要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用などによって維持することができる。
【００６６】
多くの場合、組成物には等張化剤、例えば多糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが、好ましいであろう。注射用組成物の長時間にわたる吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどを組成物中に含めることによって引き起こすことができる。そのうえ、本明細書において記述される化合物は、持効性製剤中に、例えば遅放性ポリマーを含む組成物中に、調合することができる。活性化合物は、急速な放出から化合物を保護することになる担体を使って、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化送達システムなどといった放出制御製剤を使って、調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー(PLG)などの生分解性生体適合性ポリマーを使用しうる。そのような製剤を調製するための方法は当業者には数多く知られている。
【００６７】
本明細書では経口投与剤形も考えられる。本発明の薬学的組成物は、カプセル剤(硬または軟)、錠剤(フィルムコート錠、腸溶性錠または非コート錠)、散剤または顆粒剤(コート剤もしくは非コート剤)または液剤(溶液剤もしくは懸濁剤)として経口投与しうる。製剤は、都合がよいように、当技術分野において周知のどの方法で調製してもよい。本発明の薬学的組成物は、1種または複数種の適当な製造助剤または賦形剤、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、希釈剤、流動剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、着色剤、甘味料、香料、および薬学的に適合する担体を含みうる。
【００６８】
具陳する態様のそれぞれについて、当技術分野において公知のさまざまな剤形によって、化合物を投与することができる。当業者に公知の生物学的に許容される任意の剤形およびそれらの組み合わせが考えられる。そのような剤形の例には、咀嚼錠、速溶錠、発泡錠、再構成用散剤、エリキシル剤、液剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、多層錠剤、二層錠剤、カプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、硬ゼラチンカプセル剤、カプレット、口中錠、チュアブル口中錠、ビーズ剤、散剤、ガム剤、顆粒剤、粒剤、微粒子剤、分散性顆粒剤、カシェ剤、潅注液、坐剤、クリーム剤、外用剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、貼付剤、粒子吸入剤、インプラント、デポーインプラント、経口摂取剤(ingestibles)、注射剤(皮下、筋肉内、静脈内、および皮内注射剤を含む)、注入剤、およびそれらの組み合わせがあるが、それらに限定されることはない。
【００６９】
混合によって含めることができる他の化合物は、例えば医学的に不活性な成分(例えば固形および液状の希釈剤)、例えば錠剤またはカプセル剤用のラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、デンプンまたはリン酸カルシウム、軟カプセル剤用のオリーブ油またはオレイン酸エチル、および懸濁剤または乳剤用の水または植物油; シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムおよび/またはポリエチレングリコールなどの潤滑剤; コロイド状粘土などのゲル化剤; トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウムなどの増粘剤、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤; デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤; 発泡混合物; 染料; 甘味料; レシチン、ポリソルベートまたはラウリル硫酸などの湿潤剤; および他の治療的に許容される補助成分、例えばそのような製剤用の公知の添加剤である保水剤、保存剤、緩衝剤および酸化防止剤である。
【００７０】
経口投与用の分散液は、シロップ剤、乳剤、溶液剤、または懸濁剤であることができる。シロップ剤は、担体として、例えばサッカロースまたはサッカロースとグリセロールおよび/もしくはマンニトールおよび/もしくはソルビトールを含有することができる。懸濁剤および乳剤は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有することができる。
【００７１】
本発明のさまざまな態様による治療組成物中の活性化合物の量は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重、病歴、リスク因子、疾患に対する素因、投与経路、既存の処置レジメン(例えば他の薬物療法との考えうる相互作用)、および体重などといった因子に応じて変動しうる。投薬レジメンは最適な治療応答が得られるように調節しうる。例えば単回ボーラス投与を行ってもよいし、ある期間にわたって分割量を数回投与してもよいし、治療状況の要求に応じて、用量を比例的に増減してもよい。
【００７２】
本明細書において用いられる「投薬単位形(dosage unit form)」とは、処置される哺乳動物対照への単位投薬量として好適な物理的に離散した単位をいい、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された前もって決定された分量の活性化合物を必要な薬学的担体とともに含有する。本発明の投薬単位形の仕様は、活性化合物に特有の特徴および達成しようとする特定治療効果、ならびに個体における感受性の処置のためにそのような活性化合物を配合する技術に固有の制約によって決まり、それらに直接依存する。本発明の化合物またはその適当な薬学的組成物が有効である哺乳動物(例えばヒト)における状態の処置に治療的に使用する場合は、本発明の化合物を有効量で投与することができる。本発明に適した投薬量は、組成物、薬学的組成物、または本明細書において記述される他の任意の組成物でありうる。
【００７３】
具陳した態様のそれぞれについて、投薬量は、典型的には1日に1回、2回、または3回投与されるが、それより頻繁な投与間隔も可能である。投薬量は、毎日、2日ごと、3日ごと、4日ごと、5日ごと、6日ごと、および/または7日ごと(週に1回)に投与してもよい。ある態様では、投薬量を、最長30日(30日を含む)にわたって、好ましくは7〜10日にわたって、毎日投与しうる。別の態様において、投薬量を10日にわたって1日2回投与しうる。患者が慢性疾患または慢性状態の処置を必要とする場合は、徴候および/または症状が続く限り、投薬量を投与することができる。患者は「維持処置」を必要とすることもあり、その場合、患者は数ヶ月、数年または生存中はずっと投薬を受けていく。加えて、本発明の組成物は、症状の再発予防を達成するための組成物であってもよい。例えば投薬量は、リスクがある患者における症状の発生を防止するために、特に無症候性の患者に、1日に1回または2回投与しうる。
【００７４】
本明細書において記述される組成物は、次に挙げるどの経路でも投与しうる: 口腔粘膜、皮膚上、硬膜外、注入、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、脊髄内、髄腔内、静脈内、経口、非経口、肺、浣腸剤または坐剤による経直腸、皮下、真皮下、舌下、経皮、および経粘膜。好ましい投与経路は口腔粘膜、経口および静脈内である。投与は、局所的であることができ、その場合は、組成物が疾患(例えば炎症)の部位の近くに、限局的に、その部位に、その部位付近に、またはその部位の近傍に直接投与される。また、投与は全身性であることもでき、その場合は、組成物が患者に与えられ、広く体じゅうを通過し、その結果、疾患の部位に到達する。局所投与は、疾患を包含し、かつ/または疾患に冒されており、かつ/または疾患の徴候および/または症状が活動性であるか、疾患の徴候および/または症状が生じる可能性がある、細胞、組織、器官、および/または器官系に投与することができる。局所投与は、画像化(例えば、磁気共鳴画像法)を必要とする細胞、組織、器官、および/または器官系への投与であってもよい。
【００７５】
投与は局所効果を持つ外用であることができ、組成物はその作用が望まれる場所に直接塗布される。投与は経腸投与であることができ、その場合、所望の効果は全身性(非局所性)であって、組成物は消化管を通して与えられる。投与は非経口投与であることができ、その場合は、所望の効果は全身性であって、組成物は消化管以外の経路によって与えられる。
【００７６】
本明細書において用いられる「治療有効量」という用語は、組織系、動物またはヒトにおいて研究者、獣医、医師または他の臨床家が求めている生物学的または医学的応答(処置される疾患または障害の症状の緩和を含む)を引き出す、1種または複数種の本発明のさまざまな態様の化合物の量をいう。いくつかの態様において、治療有効量は、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益/リスク比で疾患または疾患の症状を処置しまたは緩和しうる量である。ただし、本明細書において記述される化合物および組成物の総1日量は、担当医が妥当な医学的判断の範囲内で決定しうると理解すべきである。どの特定患者についても、具体的な治療有効量レベルは、処置される状態およびその状態の重症度; 使用する具体的化合物の活性; 使用する具体的組成物; 患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事; 投与時間、投与経路、使用する具体的化合物の排泄速度; 処置の継続時間; 使用する具体的化合物と併用されるまたは同時に使用される薬物などといった、研究者、獣医、医師または他の臨床家に周知の因子を含む、さまざまな因子に依存するであろう。1種または複数種の本明細書において記述される化合物の投与中に生じるかも知れないあらゆる毒性または他の望ましくない副作用に照らして治療有効量を選択できることも理解される。
【００７７】
定義
本明細書において用いられる「約」という用語は、言明された値の、または言明された範囲の限界値の、例えば10%以内、5%以内、または1%以内の値または範囲の変動率を許容することができる。
【００７８】
本明細書において用いられる「実質的に」という用語は、「〜の大部分」、または主として、例えば少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.99%、または少なくとも約99.999%もしくはそれ以上の場合などをいう。
【００７９】
範囲の形式で表される値は、その範囲の限界値として明示的に具陳された数値だけでなく、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲も、各数値および部分範囲が明示的に具陳されたかのように、全て含まれるものと、柔軟に解釈されるべきである。例えば「約0.1%〜約5%」または「約0.1%〜5%」という範囲は、約0.1%〜約5%を含むだけではなく、表示した範囲内の個々の値(例えば1%、2%、3%、および4%)ならびに表示した範囲内の部分範囲(例えば0.1%〜0.5%、1.1%〜2.2%、3.3%〜4.4%)も含むと解釈すべきである。「約X〜Y」という言明は、別段の表示がある場合を除き、「約X〜約Y」と同じ意味を有する。同様に「約X、Y、または約Z」という言明は、別段の表示がある場合を除き、「約X、約Y、または約Z」と同じ意味を有する。
【００８０】
この文書において、「1つの(a)」、「1つの(an)」または「その(the)」という用語は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、1つまたは2つ以上を含むように用いられる。「または」という用語は、別段の表示がある場合を除き、非排他的な「または」をいうために用いられる。加えて、本明細書において用いられる表現法または用語法は、別段の定義がなければ、説明を目的としているに過ぎず、限定を目的としていないと理解すべきである。セクション見出しの使用はいずれも、本文書の解釈を助けることを意図しており、限定と解釈してはならない。さらに、セクション見出しに関連する情報は、その特定セクション内にもその特定セクション外にも見いだされうる。さらにまた、この文書において言及する刊行物、特許、および特許文書は、あたかも個別に参照により組み入れられたかのように、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。この文書と、そうして参照により組み入れられた文書との間に不一致があった場合、組み入れられた参考文献における使用法は、この文書の使用法を補うものと見なされるべきであり、両立しえない不一致については、この文書における使用法が優先される。
【００８１】
本明細書において記述される方法において、段階は、時間的順序または作業順序が明示的に具陳されている場合を除き、本発明の原理から逸脱することなく任意の順番で実行することができる。さらにまた、指定された段階は、明示的な請求項の文言が、それらは別々に実行されると具陳していない限り、同時に実行することもできる。例えば、Xを行うという請求項の段階と、Yを行うという請求項の段階とは、単一の作業内で同時に行うことができ、その結果生じるプロセスは前記請求項の字義どおりの範囲内に包含されるであろう。
【００８２】
本明細書において用いられる場合、「ヒドロカルビル」という用語は、直鎖、分枝、または環状炭化水素から誘導される官能基をいい、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、またはその任意の組み合わせであることができる。ヒドロカルビル基は、1〜50個の炭素原子(C1〜C50)、10〜30個の炭素原子(C10〜C30)、12〜18個の炭素原子(C12〜C18)、1〜約20個の炭素原子(C1〜C20)、1〜10個の炭素原子(C1〜C10)、1〜8個の炭素原子(C1〜C8)、1〜5個の炭素原子(C1〜C5)または、いくつかの態様において、1〜3個の炭素原子(C1〜C3)を有することができる。
【００８３】
本明細書において用いられる場合、「ヒドロカルビレン」という用語は、アルキレン(例えば、-CH2-および-CH2CH2-)、アルケニレン(例えば、-CH=CH-および-CH=CH-CH3、ここで、適用可能であれば、二重結合の幾何学的配置は、E-、Z-またはE-およびZ-の混合物でありうる)、アルキニレン(例えば、-C≡C-および-C≡C-CH3)、アリーレン(例えばフェニレン)、シクロアルキレン(例えば、シクロペンチレン(cylcopentylene)およびシクロヘキシレン)、二価アシル(例えば、-C(=O)-および-CH2C(=O)-CH2)、またはそれらの組み合わせのような、直鎖、分枝、または環状炭化水素から誘導される二価官能基を広くいう。ヒドロカルビレン基は、本明細書において定義されるように、置換されていなくてもまたは置換されていてもよい。
【００８４】
ヒドロカルビル基は置換されていてもまたは置換されていなくてもよい。本明細書において用いられる「置換(された)」という用語は、本明細書において定義する有機基または分子であって、そこに含まれている1つまたは複数の水素原子が1つまたは複数の非水素原子で置き換えられているものをいう。本明細書において用いられる「官能基」または「置換基」という用語は、分子上または有機基上の、置換することができる基または置換されている基をいう。「置換基」は有機基であることもできる。置換基または官能基の例としては、ハロゲン(例えばF、Cl、Br、およびI); ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ(カルボニル)基、カルボン酸、カルボン酸塩、およびカルボン酸エステルを含むカルボキシル基などの基における酸素原子; チオール基、アルキルスルフィド基およびアリールスルフィド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホンアミド基などの基における硫黄原子; アミン、ヒドロキシルアミン、ニトリル、ニトロ基、N-オキシド、ヒドラジド、アジド、およびエナミンなどの基における窒素原子; ならびに他のさまざまな基における他のヘテロ原子が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００８５】
本明細書において用いられる「有機基」という用語は、限定されるものではないが、任意の炭素含有官能基をいう。例えば、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ(カルボニル)基、カルボン酸、カルボン酸塩、およびカルボン酸エステルを含むカルボキシル基などの酸素含有基; アルキルスルフィド基およびアリールスルフィド基などの硫黄含有基; ならびに他のヘテロ原子含有基。有機基の非限定的な例としては、OR、OOR、OC(O)N(R)(R')、CN、CF3、OCF3、R、C(O)、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、N(R)(R')、SR、SOR、SO2R、SO2N(R)(R')、SO3R、C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)CH2C(O)R、C(S)R、C(O)OR、OC(O)R、C(O)N(R)(R')、OC(O)N(R)(R')、C(S)N(R)(R')、(CH2)0〜2N(R)C(O)R'、(CH2)0〜2N(R)N(R)(R')、N(R)N(R)C(O)R'、N(R)N(R)C(O)OR'、N(R)N(R)CON(R)(R')、N(R)SO2R'、N(R)SO2N(R)(R')、N(R)C(O)OR'、N(R)C(O)R'、N(R)C(S)R'、N(R)C(O)N(R)(R')、N(R)C(S)N(R)(R')、N(COR)COR'、N(OR)R'、C(=NH)N(R)(R')、C(O)N(OR)R'、またはC(=NOR)Rが挙げられ; 式中、各RおよびR'は、独立して、水素(他の炭素原子を含む例では)または炭素に基づく部分(例えば、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール)であることができ、かつ炭素に基づく部分はそれ自体がさらに置換されることができる。
【００８６】
有機基は同様に、例えば、放射性核種または常磁性核種をキレート化できる、限定されるものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、トリエチレンテトラミン(TETA)、1,4,7-トリアザシクロノナン-三酢酸(NOTA)などのような、本明細書において「核種キレート化部分」ともいわれる、キレート化部分を含む。核種の例としては、In-111、Y-90、F-18、P-32、Sc-47、Cu-62、Cu-64、Cu-67、Ga-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Zr-89、Tc-99m、Pd-109、Ag-111、In-111、I-123、I-125、I-131、Sm-153、Gd-155、Gd-157、Th-161、Lu-177、Re-186、Re-188、Pt-197、Pb-212、Bi-212、Bi-213、Ra-223、Ac-225、As-72、As-77、At-211、Au-198、Au-199、Bi-212、Br-75、Br-76B、C-11、Co-55Co、Dy-166、Er-169、F-18、Fe-52、Fe-59、Ga-67、Ga-68、Gd-154-158、Ho-166、I-120、I-121、I-124、In-110、In-111、M194、Lu-177、Mn-51、Mn-52、Mo-99、N-13、O-15、P-32、P-33、Pb-211、Pb-212、Pd-109、Pm-149、Pr-142、Pr-143、Rb-82、Re-189、Rh-105、Sc-47、Se-75、Sr-83、Sr-89、Th-161、Tc-94、Tc-99、Y-86、Y-90およびZr-89が挙げられるが、これらに限定されることはない。常磁性核種の例としては、Gd3+、Mn2+、およびFe3+が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００８７】
置換された炭素(または他の)原子に結合できる置換基Jの非限定的な例としては、F、Cl、Br、I、OR、OC(O)N(R')2、CN、NO、NO2、ONO2、アジド、CF3、OCF3、R'、O (オキソ)、S (チオノ)、C(O)、S(O)、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、N(R)2、SR、SOR、SO2R'、SO2N(R)2、SO3R、C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)CH2C(O)R、C(S)R、C(O)OR、OC(O)R、C(O)N(R)2、OC(O)N(R)2、C(S)N(R)2、(CH2)0-2N(R)C(O)R、(CH2)0-2N(R)N(R)2、N(R)N(R)C(O)R、N(R)N(R)C(O)OR、N(R)N(R)CON(R)2、N(R)SO2R、N(R)SO2N(R)2、N(R)C(O)OR、N(R)C(O)R、N(R)C(S)R、N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2、N(COR)COR、N(OR)R、C(=NH)N(R)2、C(O)N(OR)R、またはC(=NOR)Rが挙げられ、式中、Rは水素もしくは炭素に基づく部分であることができ、かつ炭素に基づく部分はそれ自体がさらに置換されることができ; 例えば、式中、Rは水素、アルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはヘテロアリールアルキルであることができ、任意のアルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはヘテロアリールアルキルまたはRは独立してJで一置換もしくは多置換されていてもよく; または式中、窒素原子に結合したもしくは隣接する窒素原子に結合した2つのR基は、窒素原子と一緒になってヘテロシクリルを形成することができ、これはJで一置換もしくは独立して多置換されていてもよい。
【００８８】
本明細書において用いられる「アルキル」および「アルキレン」という用語は、1〜50個の炭素原子、10〜30個の炭素原子、12〜18個の炭素原子、1〜約20個の炭素原子、1〜10個の炭素、1〜8個の炭素原子、1〜5個の炭素原子または、いくつかの態様において、1〜3個の炭素原子を有する置換または非置換直鎖および分枝アルキルおよびアルキレン基ならびにシクロアルキルおよびシクロアルキレン基をいう。直鎖アルキル基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル基のような1〜8個の炭素原子を有するものが挙げられる。分枝アルキル基の例としては、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、2,2-ジメチルプロピル、およびイソステアリル基が挙げられるが、これらに限定されることはない。本明細書において用いられる場合、「アルキル」および「アルキレン」という用語は、n-アルキルおよびn-アルキレン; イソアルキルおよびイソアルキレン; ならびにアンテイソアルキルおよびアンテイソアルキレン基も、アルキルおよびアルキレンの他の分枝鎖形態も包含する。
【００８９】
本明細書において用いられる「アルケニル」および「アルケニレン」という用語は、2つの炭素原子の間に少なくとも1つの二重結合が存在することを除いて、本明細書において定義される置換または非置換直鎖および分枝鎖および環状アルキルおよびアルキレン基をいう。したがって、アルケニルおよびアルケニレン基は、2〜50個の炭素原子、または2〜約20個の炭素原子、または2〜12個の炭素または、いくつかの態様において、2〜8個の炭素原子を有する。アルケニル基の例としては、とりわけビニル、-CH=CH(CH3)、-CH=C(CH3)2、-C(CH3)=CH2、-C(CH3)=CH(CH3)、-C(CH2CH3)=CH2、シクロヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニル、ブタジエニル、ペンタジエニルおよびヘキサジエニルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００９０】
本明細書において用いられる「アルキニル」および「アルキニレン」という用語は、2つの炭素原子の間に少なくとも1つの三重結合が存在することを除いて、置換または非置換直鎖および分枝鎖アルキルおよびアルキレン基をいう。したがって、アルキニルおよびアルキニレン基は、2〜50個の炭素原子、2〜約20個の炭素原子、または2〜12個の炭素または、いくつかの態様において、2〜8個の炭素原子を有する。例としては、とりわけ-C≡CH、-C≡C(CH3)、-C≡C(CH2CH3)、-CH2C≡CH、-CH2C≡C(CH3)、および-CH2C≡C(CH2CH3)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００９１】
本明細書において用いられる「アシル」という用語は、カルボニル部分を含有する基であって、カルボニル炭素原子を介して結合している基をいう。カルボニル炭素原子はまた、アルキル、アリール、アラルキル シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル基などの一部でありうる別の炭素原子に結合している。カルボニル炭素原子が水素に結合している特別な例では、この基は、本明細書において定義されるアシル基の1つ、「ホルミル」基である。アシル基は、カルボニル基に結合した0個から約12〜20または12〜50個までのさらなる炭素原子を含むことができる。アシル基は、本明細書における意味の範囲内で二重結合または三重結合を含むことができる。アクリロイル基はアシル基の一例である。アシル基はまた、ヘテロ原子(例えば、-O-、-NH-、および-S-)を含むことができる。ニコチノイル基(ピリジル-3-カルボニル)は、本明細書における意味の範囲内でアシル基の一例である。他の例としては、アセチル、ベンゾイル、フェニルアセチル、ピリジルアセチル、シンナモイル、およびアクリロイル基などが挙げられる。カルボニル炭素原子に結合している炭素原子を含有する基がハロゲンを含有する場合、その基は「ハロアシル」基と呼ばれる。一例はトリフルオロアセチル基である。
【００９２】
本明細書において用いられる「アリール」および「アリーレン」という用語は、環の中にヘテロ原子を含有しない置換または非置換環状芳香族炭化水素をいう。したがってアリール基には、フェニル、アズレニル、ヘプタレニル、ビフェニル、インダセニル、フルオレニル、フェナントレニル、トリフェニレニル、ピレニル、ナフタセニル、クリセニル、ビフェニレニル、アントラセニル、およびナフチル基が含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、アリールおよびアリーレン基は、基の環部分の中に約6〜約14個の炭素を含有する。代表的な置換アリール基は、一置換されていてもあるいは、限定されるものではないが、2-置換、3-置換、4-置換、5-置換もしくは6-置換フェニルまたは2〜8置換ナフチル基のような、二以上置換されていてもよい。
【００９３】
本明細書において用いられる「ヘテロシクリル」という用語は、3個またはそれ以上の環員を含有し、そのうちの1つまたは複数が、限定されるものではないが、N、O、およびSのようなヘテロ原子である、置換または非置換芳香環および非芳香環化合物をいう。したがって、ヘテロシクリルは、シクロヘテロアルキルもしくはヘテロアリールであるか、または多環式であるなら、それらの任意の組み合わせであることができる。いくつかの態様において、ヘテロシクリル基は3〜約20個の環員を含み、一方、他のそのような基は3〜約15個の環員を有する。C2-ヘテロシクリルと指定されるヘテロシクリル基は、2個の炭素原子と3個のヘテロ原子とを有する5員環、2個の炭素原子と4個のヘテロ原子とを有する6員環などであることができる。同様に、C4-ヘテロシクリルは、1個のヘテロ原子を有する5員環、2個のヘテロ原子を有する6員環などであることができる。炭素原子の数にヘテロ原子の数を加えた数は、環原子の総数に等しい。ヘテロシクリル環は1つまたは複数の二重結合を含むこともできる。ヘテロアリール環はヘテロシクリル基の1つの態様である。「ヘテロシクリル基」という語句は、縮合芳香族および非芳香族基を含むものを含む縮合環種を含む。ヘテロシクリル基の例としては、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、テトラジニル、キノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル(例えば、1,2,4-トリアゾリル)、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリルなどが挙げられる。ヘテロシクリル基の例としては、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、キヌクリジニルなども挙げられる。
【００９４】
本明細書において用いられる「アルコキシ」という用語は、本明細書において定義されるように、シクロアルキル基を含む、アルキル基に結合した酸素原子をいう。直鎖アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。分枝アルコキシの例としては、イソプロポキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、イソペンチルオキシ、イソヘキシルオキシなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。環状アルコキシの例としては、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。アルコキシ基は、酸素原子に結合した1から約12〜20または約12〜40個までの炭素原子を含むことができ、二重または三重結合をさらに含むことができ、ヘテロ原子も含むことができる。例えば、アリルオキシ基は、本明細書における意味の範囲内でアルコキシ基である。メトキシエトキシ基も本明細書における意味の範囲内でアルコキシ基であり、ある構造の隣接する2つの原子がメチレンジオキシ基で置換されている場合には、そのメチレンジオキシ基もそうである。
【００９５】
本明細書において用いられる「ハロ」、「ハロゲン」または「ハライド」基という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。
【００９６】
本明細書において用いられる「ハロアルキル」基という用語は、モノ-ハロアルキル基、全てのハロ原子が同じであってもまたは異なっていてもよいポリ-ハロアルキル基、およびペル-ハロアルキル基を含み、ここで全ての水素原子はフルオロのような、ハロゲン原子によって置き換えられている。ハロアルキルの例としては、トリフルオロメチル、1,1-ジクロロエチル、1,2-ジクロロエチル、1,3-ジブロモ-3,3-ジフルオロプロピル、パーフルオロブチル、-CF(CH3)2などが挙げられる。
【００９７】
本明細書において用いられる場合、「塩」および「薬学的に許容される塩」という用語は、親化合物がその酸または塩基の塩を作製することによって修飾されている開示される化合物の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例としては、アミンのような塩基性基の無機または有機酸塩; およびカルボン酸のような酸性基のアルカリまたは有機塩が挙げられるが、これらに限定されることはない。薬学的に許容される塩には、例えば、無毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の慣用の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような慣用の無毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、および硝酸のような無機酸から誘導されるもの; ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、およびイセチオン酸などのような有機酸から調製される塩が含まれる。
【００９８】
薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物から、慣用の化学的方法によって合成することができる。いくつかの例では、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中で、またはその2種の混合物中で反応させることによって調製することができる; 一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適当な塩のリストは、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985において見出され、この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００９９】
本発明は、実例として供与される以下の実施例を参照することによって、よりよく理解することができる。本発明は、本明細書において与えられる実施例に限定されない。
【０１００】
材料
PLURONIC (登録商標)トリブロックコポリマーF127 (EO 200, PO 65)、F68 (EO 153, PO 29)、L35 (EO 22, PO 16,)、L64 (EO 26, PO 30)、およびL81 (EO 6, PO 43)は、Sigma Aldrichから購入し、使用前に真空下でベンゼンから共沸蒸留によって乾燥した。2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、カルボニルジイミダゾール(CDI)、トリエチルアミン(TEA)、トリス(2-アミノエチル)アミン(TAEA)もSigma-Aldrichから購入し、直接使用した。水中10% w/vの2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)溶液を、Cleveland, OHのResearch Organicsから入手し、受け取ったまま使用した。全ての溶媒は、使用前に適切な乾燥剤から蒸留した。透析セルロース膜はSpectrum Labs Inc.から入手し、使用前に少なくとも30分間脱イオン水に浸漬した。NANOpure Ultrapure水システムから超純水(抵抗率約18.0 MΩ/cm-1)を生成した。
【０１０１】
紫外可視分光法
タングステンおよび重水素ランプを備えたHP8453 UV-Vis分光光度計を用いて記録した吸収スペクトルを測定して、例えば、本発明のさまざまな態様のポリロタキサンのTNBS末端キャップ反応の有効性を確認した。試料を水に溶解し(1 mg/mL)、スペクトルを20℃で記録した。
【０１０２】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間, MALDI-TOF
MALDI-MSスペクトルは、4000 Series Explorer v3.5ソフトウェアを有するApplied Biosystems/MDS Sciex 4800 MALDI-TOF/TOF Analyzerにて線形モードで6000および6500レーザショットのレーザ出力を用い陽イオン反射体モードで1500〜35000 Daの質量範囲で得られた。マトリックスには、以前に記述されたプロトコルを用い、いくらかの変更を加えて作製された新たに調製したイオン液体マトリックス(ILM)が含まれていた。手短に言えば、2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノン一水和物(THAP)および1,1,3,3-テトラメチルグアニジン(TMG)をメタノール中1:2のモル比で混合した。次いで、溶液を40℃で15分間超音波処理した。SpeedVac中20℃で3時間の遠心蒸発によるメタノールの除去後、ILMを終夜50 μm Hgの真空下に放置した。次いで、最終的なILM溶液を、マトリックスとして用いるためにDMF中に90 mg/mLの濃度で調製した。ポリロタキサン試料をDMF中3 mg/mLで調製し、次いでMALDI-MS分析のために1:80のポリロタキサン:ILM比で混合した。次いで、ポリロタキサン:ILM混合物0.6 μLを、鏡面研磨されたステンレス鋼MALDI標的上に付着させ、分析前に終夜大気圧下20℃で乾燥させた。
【０１０３】
原子間力顕微鏡法
ポリロタキサン粒子のトポロジー(サイズ、高さ)は、Nanoscope IIIaコントローラを備えたMultimode AFM (Veeco Instruments, USA)、10 nmまたはそれ未満のコーティングされていないプローブチップ(NSC15/A1BS, MikroMasch, USA)、および40 N/mのばね定数を有するカンチレバーを用いてタッピングモード原子間力顕微鏡法により22℃の空気中で決定した。典型的な測定においては、ポリロタキサン試料(水中1.0×10-9 mg/mL) 7.0 μLを雲母表面上に、プローブ超音波処理および水分除去による洗浄の後、1,1,1,2-テトラフルオロエタンガスを含有するTechSprayダスタを用いて付着させた。
【０１０４】
高性能および超性能液体クロマトグラフィー, HPLC/UPLC
ESA Corona検出器と連結されたAgilent Series 1200 HPLCを、本発明のさまざまな態様のポリロタキサンの抜け(dethreading)研究のために利用した。このアッセイ法では、クロマトグラム中のシクロデキストリンピークを積分し、ポリロタキサン開裂から得られたHP-β-CDの濃度を、2つの異なる緩衝液(pH 7.4およびpH 5.5)のうちの1つにより37℃で処理したポリロタキサン溶液の水溶液のアリコット1 mLに対する標準曲線との比較により決定した。ポリロタキサンの水溶液(2.0 mg/mL)を、注入前に0.2 μmのセルロース膜フィルタに通してろ過した。較正曲線は、水に溶解した異なる濃度のHP-β-CD標準物質を分析することによって構築された。分離は、Agilent逆相Zorbax Eclipse XDB-フェニルカラム(2.1 mm×150 mm, 粒径5 μm)にて50℃で行われた。移動相組成は、0.25 mL/分の流速での勾配溶出における水(A)およびアセトニトリル(B)の混合液であった。水/アセトニトリル混合物の組成は、次の通りであった: 0〜9分、水(100%)、9〜11分、水/アセトニトリル(40/60, v/v)、11〜12分、水/アセトニトリル(29/71, v/v)、および12〜25分、水(100%)。Thermo LTQ Velos質量分析計に連結されたThermo Accela UPLCシステム(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用い試料中の遊離シクロデキストリンの割合を決定するための独立した測定としてUPLC-MS分析を行った。研究室で作製した親水性相互作用カラム(2.1×30 mm, ポリアクリルアミドでコーティングした700 nmの非孔質シリカ粒子)を固定相として用いた。カラムオーブンの温度は25℃に維持した。HP-β-CDのストック溶液は、較正標準物質として水中0.05〜2 mg/mLの範囲内の異なる濃度で調製した。
【０１０５】
ポリロタキサンの細胞培養レスキュー研究
本発明のさまざまな態様の他のポリロタキサンのうちでも、適切な組織培養モデルにおけるHP-β-CD:PLURONIC (登録商標)ポリロタキサンの治療可能性を評価するために、ヒトNPC2欠損線維芽細胞(npc2-/-)を増殖させ、ポリロタキサンで処理した。各化合物をDMSOに可溶化し、線維芽細胞培地(MEM/15% FBS/pen/strep)中で、25 μMの遊離HP-β-CDの等価物を生じる濃度および0.001%の最終DMSO濃度に希釈した。古い培地を細胞から除去し、各ポリロタキサン試料を含有する培地を添加した後に、処理後30分、1.0時間、3.0時間、および6.0時間の時点で細胞を固定した。次いで、固定された細胞を0.05 mg.ml-1のフィリピン(Filipin)で染色し、続いてスライド調製を行った。コレステロール蓄積の低減を、細胞内のフィリピン染色の画像化によって定性的に、および全細胞領域に対するフィリピン染色面積の判定によって定量的にモニターした。結果は、対照の未処理細胞と比べて表され、平均±SE (n=3)として表される。
【０１０６】
実施例1
HP-β-CD:ポロキサマーポリロタキサンの合成は、スキーム2に示される順序によって行ったが、式中、d、q、nは本明細書において定義される通りであり、A、B、C、およびC'は示されている通りである。
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【０１０７】
α, ω-ビス-トリス(2-アミノエチル)アミンPLURONIC (登録商標)トリブロックコポリマー(TAEA-PLURONIC (登録商標))の調製
TAEA-PLURONIC (登録商標)誘導体の典型的な合成手順を以下に記述する。乾燥したPLURONIC (登録商標)コポリマー(0.400 mmol)を乾燥CH2Cl2 30 mLに溶解した。トリエチルアミン(1.5当量)を氷浴上で30分かけてゆっくりと加えた。混合物を20℃までゆっくりと加温し、その後、過剰のCDI(20.0 mmol)を加えた。次いでこの混合物を窒素下、20℃で24時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。生成物をエーテル500 ml中で沈殿させ、固体PLURONIC (登録商標) (F127およびF68)の場合にはろ過した。粗生成物をエーテルで洗浄し、ろ過し、真空乾燥して、70〜98%の白色粉末のα, ω-ビス-カルボニルイミダゾールPLURONIC (登録商標)トリブロックコポリマーを得た。液体PLURONIC (登録商標) (L35、L64、L81)の場合、生成物を遠心分離(8000 rpm, 5 min, 20℃)によって洗浄した。粗CDI活性化PLURONIC (登録商標)中間体(3.53 g; 0.276 mmol)をトリス(2-アミノエチル)アミン(13.8 mmol)の添加前に乾燥CH2Cl2 30 mLに溶解した。次に混合物を20℃の乾燥N2下で24時間撹拌した。生成物をエーテル300 mL中で沈殿させ、遠心分離(液体PLURONIC (登録商標))またはろ過(固体PLURONIC (登録商標))のいずれかによりジエチルエーテルで3回洗浄した。最終生成物を50 μm Hg真空下で72時間乾燥させて、白色粉末または黄色液体のα,ω-ビス-トリス(2-アミノエチル)アミンPLURONIC (登録商標)中間体(PLURONIC (登録商標)-TAEA)を得た。1H NMR (D2O):δ=1.00ppm(m,PPGのCH3)、2.60〜2.80 ppm (m, 16H, TAEAのCH2)、3.54〜3.65 ppm (m, PEGおよびPPGのCH2、PPGのCH)。
【０１０８】
TNBS末端キャップポリロタキサンの調製
一般的プロトコル
乾燥したPLURONIC (登録商標)-TAEA (0.04 mmol)および2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(すなわち、CD:PPG単位の比=1:2)をヘキサン15 mLに溶解(または懸濁)し、混合物を3分間ボルテックスした後に、2時間激しく撹拌した。その後、PLURONIC (登録商標)コポリマーの貫通効率を改善するために、30℃で30分間の浴超音波処理、続いて5分間のプローブ超音波処理(Model W-350, 50 w, 1/2インチ プローブ)を行った。次いで、混合物を20℃で48時間撹拌し、ロッキングプレート上でさらに24時間振盪した後に、ヘキサンを除去し、水を加えてスラリー溶液を作製し、これに2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸溶液(水中10% w/v, 0.24 mmol)およびNaHCO3, (0.24 mmol)を加えた。混合物を20℃で24時間撹拌し、次いでロッキングプレート上でさらに24時間混合して、生成物を凝集させ沈殿させた。粗生成物をメタノール10 mLに2回溶解し、ジエチルエーテル500 mlの添加によって生成物を沈殿させることにより、未反応の試薬および解きほぐされたシクロデキストリンを除去した。脱イオン水中で8日間3,500〜14,000 MWCOの再生セルロース膜を用いた透析によって生成物を精製し、凍結乾燥により乾燥させて、ポリロタキサンの黄橙色粉末を生成させた。1H NMR (DMSO-d6): δ = 8.7 pm (s, 8H, フェニルのメタH)、5.0 ppm (b, CDのC1-H)、4.0 ppm (t, 4H, フェニルC-NH) 3.5〜3.8 ppm (m, CDのC3,5,6-H)、2.6〜2.8 ppm (m, 16H, TAEAのCH2) 1.0 ppm (d, PPGのCH3)。
【０１０９】
実施例2
トリス(2-アミノチル)アミン修飾ポロキサマーの調製は、Li and coworkers. Li, J. et al., Advanced Materials 18: 2969-2974 (2006)によって報告された方法のわずかな変更によって達成された。有機溶媒を貫通反応について評価した。100 mgのPLURONIC (登録商標) F127-TAEAおよびHP-β-CDを2:1のPPG:CD比で溶解するために、いくつかの溶媒(3 mL)を用いた。濁った溶液を順次浴に入れ、プローブ超音波処理し、続いて20℃で48時間撹拌した。低沸点溶媒(例えば、DCM、メタノール、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびヘキサン)を減圧下で除去して、白色の擬ポリロタキサン中間体を得た。その後、NaHCO3の存在下で過剰の2,4,6-トリニトロベンゼンスルホネート(TNBS)スラリー溶液を添加し、24時間20℃で橙色の粘性溶液を撹拌して、末端キャップされたポリロタキサンを生成し、これを溶媒洗浄および透析によって精製した。水、DMSO、およびDMFのような高沸点溶媒中でのロタキサン化反応の場合、TNBS末端キャッピング試薬を直接加え、続いて洗浄および透析精製手順を行った。ポリロタキサンの反応収率および対応するPLURONIC (登録商標) PPGブロックの被覆率に対する溶媒タイプの影響の概要を以下の表1に示す。
【０１１０】
（表１）HP-β-CD:PLURONIC (登録商標) F127の収率に及ぼす溶媒効果
2018532036.tif 000034
TNBS (0.046 mmol, 0.14 mL)の添加および24時間20℃での撹拌の前に20℃で48時間、溶媒(3 mL)中で撹拌された、PLURONIC (登録商標) F127 (Mn 12600, 100 mg)、HP-β-CD (Mw 1460, 0.34 g, 1 CD/2 PO単位)。aε: 誘電率、b 貫通されたHP-β-CD単位の数、c HP-β-CDのC1-HプロトンおよびPPGのメチルプロトンの比(1 CD/2 PPG単位と仮定)に基づき、1H NMR積分によって決定された。
【０１１１】
HP-β-CD C1-H (5.05 ppm)およびPPG CH3 (1.0 ppm)シグナルの積分強度を比較することによって、PLURONIC (登録商標)軸上に「貫通された」シクロデキストリンの数を決定するために1H NMR分光分析を用いた。CD単位当たり2つのPPG単位が含まれているという仮定に基づいて被覆率を計算した。本発明者らのデータは、ヘキサンおよびジエチルエーテルのような非極性溶媒が、生成物NMRスペクトルにおいてHP-β-CDの兆候をほとんどまたは全く示さない水、D2O、メタノール、DMSO、またはDMFよりも高い貫通効率を促進することを示す。これらの知見から、極性溶媒が極性シクロデキストリンを駆動して環状体の「広い」面と「狭い」面との間の水素結合相互作用によって凝集し、それによりPLURONIC (登録商標)鎖の包含を可能にする疎水性トンネルを形成させるものと推測することができる。さらに、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、非極性溶媒は、それらの親油性PPGブロックを溶媒和することによってPLURONIC (登録商標)コポリマーの自己会合を妨げるようである。ヘキサン溶液中でPLURONIC (登録商標)F127上にHP-β-CDを貫通することによって得られたポリロタキサン構造が、1HNMRによって確認された。およそ1.0 ppmのプロトンピークがコポリマー上のPPGメチル基に割り当てられ、一方で3〜3.5 ppm領域のプロトンシグナルはPEGのメチレン単位(CH2)およびいくつかのHP-β-CDプロトンに起因する。4.5〜5.0 ppmの領域に表示される幅広いシグナルは、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン修飾のOH-8プロトンと同様に、HP-β-CD C1-Hプロトンに割り当てられる。芳香族TNBプロトンシグナルは、7〜8 ppmの領域においてさらに低磁場で観察することができる。PPGブロック上に貫通されたHP-β-CD単位の平均数は、C1-H、OH-8 HP-β-CDピークおよびPPG/CH3ダブレットに起因する1H NMRシグナルの相対強度から推定された。
【０１１２】
HP-β-CDとF127 PLURONIC (登録商標)軸との間のロタキサン化反応をさらに確認するために、二次元NOESY 1H NMRスペクトルを収集した。HP-β-CDの内部C3,5-Hプロトンは、PPGメチル基との空間相関を示す。この結果は、β-CD-ポリマー複合体の以前の報告と一致し、HP-β-CD分子がF127 PLURONIC (登録商標)鎖上に貫通されたことを示唆している。さらに、末端キャップ反応が有効であったことを証明するために、HP-β-CD:F127 PLURONIC (登録商標)ポリロタキサンおよび遊離TNBSの水溶液(0.5 mg/mL)に対してUV-可視分光法を実施した。ポリロタキサン複合体(約345 nm, 422 nm)の吸収極大は、未反応のTNBS前駆体のそれとは完全に異なる。この知見によって、対応するHP-β-CD:F127 PLURONIC (登録商標)擬ポリロタキサンが完全に末端キャップされたことが確認される。
【０１１３】
ヘキサン中で同じ反応条件を実施して、他のポロキサマー(異なるPEGおよびPPGブロック長を有する、PLURONIC (登録商標)コポリマーF68、L35、L64、L81)に基づくポリロタキサンを調製した。これらの場合、0.04 mmolを他のポロキサマー全てに用い、貫通反応のためにヘキサン15 mLに溶解した。
【０１１４】
表2は、PPGブロックで可能な最大理論被覆率と比べて被覆率に及ぼすPPGブロックサイズの効果を要約している。見て分かるように、貫通効率はポロキサマー軸の親水性-親油性バランス(HLB)に反比例し、PLURONIC (登録商標)L81およびPLURONIC (登録商標)L64で高い被覆率が観察される。これらの知見は、疎水性PPGブロックと自己会合型HP-β-CDモノマーの疎水性空洞との相互作用を促進することにより、非極性溶媒がロタキサン化反応に有利に働くという本発明者らの仮説と一致する。PLURONIC (登録商標)F127は、おそらくPPGコアに隣接する大きなPEGブロックによって、この傾向の例外であり、したがって、シクロデキストリン空洞とPEGブロックとの間の弱い疎水性相互作用によってロタキサン化反応が抑制される。
【０１１５】
（表２）ポリロタキサンの分子量および純度
2018532036.tif 000035
【０１１６】
表2および本明細書の他の箇所において、表記nHP.XXXは、ポロキサマー「軸」上に「貫通された」HP-β-CD分子の数nをいい、ここでXXXはポロキサマー「軸」のタイプを示す。
【０１１７】
貫通効率は、推定される1 HP-β-CD:2 PO単位の比に基づいて計算された。nCDは、1H NMR積分によって決定されたPLURONIC (登録商標)コア上に貫通されたHP-β-CD分子の数をいう。遊離CD値(w/v)は、HP-β-CDを標準物質として用いたUPLCクロマトグラフィーによって決定された。ポリロタキサン生成物の平均的サイズおよび高さは、最終生成物のAFM像から決定された。HLB: 親水性-親油性バランス、CAC:臨界凝集濃度、ここでこの値は、P.Laibinis et al., J. Coll. Interface. Sci. 1991, 142, 74から出典されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１８】
HP-β-CD:ポロキサマーポリロタキサンのMALDI-TOF MS分析
スキーム2に示される順序によって形成されたポリロタキサン生成物のモル質量の分布を決定するために、MALDI-TOF質量分析を用いた。
【０１１９】
NMR分光法およびSECクロマトグラフィーは、ポリロタキサンの特徴付けに利用される最も一般的な方法であるが、MALDI-TOFを用いたポリジメチルシロキサン:シクロデキストリンポリロタキサン組成および分子量の分析を用いることもできる。1:80のポリロタキサン:THAP/TMG混合物(メタノール中1:2の比)を有する、HP-β-CD:PLURONIC (登録商標)F127ポリロタキサンについて最初に評価されたILMマトリックス組成物は、最良のシグナル対ノイズ比を生成することが分かった。ポリロタキサンのNMRスペクトルは、異なる程度のHP-β-CD貫通(nCD)に対応するピークの範囲を示す。ピーク強度は、シグナルがもはやベースラインから識別できなくなるまで、ポリロタキサンのm/z値の増加とともに減少することが見出された。全てのポリロタキサンについて、観察されたm/z値はTNB末端キャップポロキサマー鎖の合計 + 1460 x nCDに相当した。興味深いことに、このスペクトルは、HP-β-CDモノマーのモル質量に対応する1460 Daだけ異なる質量の段階的増加を明らかにする。さらに、最も強いイオンピークファミリーは、表2に要約されるようにNMRによって計算された値と一致したが、スペクトルプロファイルは、ポリロタキサン生成物が多分散化合物であることを示す(MALDI-TOFスペクトルは支援情報において見ることができる)。
【０１２０】
ポリロタキサンのAFM画像化
タッピングモードAFMを用いて、凝集した100% HP-β-CDポリロタキサンの微細構造が観察された。全てのポリロタキサンは、異なるサイズの大きな球状凝集体として現れ、47〜80 nmに及ぶ平均直径および0.5〜2 nmに及ぶ高さを有する。これらのデータは、おそらくロタキサン化ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン間の側方水素結合相互作用に起因して、ポリロタキサン分子が球状集合体にクラスタ化することを示している。低い貫通効率と柔軟な非貫通PEG末端との組み合わせによって、Zhangらが報告したようにPEGコロナに囲まれた球状粒子への疎水性PPG-HP-β-CDドメインの凝集が促進される。これらの粒子の球状の外観は、それらが腎臓ろ過による血液からのその迅速なクリアランスを避けることによって、インビボで魅力的な長期循環特性を保有しうることを示唆している。
【０１２１】
実施例3
ポリロタキサン曝露に対するNPC2-/-線維芽細胞応答
HP-β-CDとポロキサマーに基づくポリロタキサンとの非共有結合によって、これらのポリマーに、例えば酵素的活性化のため、末端キャップ基の除去時にポリマー軸からシクロデキストリン単位を容易に脱貫通する能力が付与される。いくつかの酵素活性化スキームが最近評価されているが、NPC細胞については報告されていない。リソソームからのコレステロールの可溶化および流出を促進するためにNPC細胞内での活性化の際にHP-β-CDを放出するポリロタキサンを調べるために、中性(pH 7.4)および酸性エンドソーム区画(pH 5.5)に対する応答の模倣体として、異なるpHの緩衝液に曝露されたHP-β-CD:ポロキサマーポリロタキサン複合体の末端キャップ切断反応および脱貫通反応速度を調べた。PBS緩衝液, pH 7.4またはクエン酸緩衝液, pH 5.5のいずれかに37℃で曝露されたF127に基づくポリロタキサン(07HP.F127, 2 mg/mL)のHPLC分析から、HP-β-CD:PLURONIC(登録商標)F127ポリロタキサンが軽度に酸性および中性のpH条件の両方に対して安定であることが明らかにされた。この結果は、エンドサイトーシス前の生理的条件下でのポリロタキサン粒子の安定性という点で有望であったが、酸性の後期エンドソーム/リソソーム内のポリロタキサン担体からの末端キャップ切断は、これらの条件下では遅くなることが示唆された。しかしながら、驚くべきことに、異常に貯蔵されたコレステロールの相当なプールを有するnpc2-/-線維芽細胞のポリロタキサンによる処理は、フィリピン染色の相当かつ迅速な減少をもたらし、これらの細胞内のコレステロール低減の定性的指標となった。これらの細胞におけるフィリピン染色の時間依存性評価は、25 μM遊離HP-β-CDによって産生されるコレステロール低減の程度に類似したレベル、すなわち、未処理対照の60〜80%までの全てのポリロタキサン化合物に対するコレステロール蓄積の低減のさらなる証拠となった。
【０１２２】
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、この知見は、npc2-/-細胞内でポリロタキサンが内在化かつ脱貫通され、それによって遊離HP-β-CDを放出し、これが今度は、異常に貯蔵されたコレステロールを移動させうることを示唆している。これらの知見に基づいて、TNB基は、細胞内で起こる酵素反応または還元反応のいずれかによってポリロタキサンから切断されると考えられる。数多くのヒト組織に存在するニトロレダクターゼ酵素によってニトロベンゼン基質が還元されることを示す重要な多数のデータが存在する。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、これらの知見、および芳香族ニトロ化合物の逐次的な還元機構に基づいて、ポリロタキサンのカルバミル結合トリニトロベンゼン末端キャップは、シクロデキストリンがポリマー軸を滑り落ちることを可能にする立体的に小さいアミン置換基に還元されるものと推測することができる。代替的な説明は、末端キャップをポリロタキサン骨格に結合させるカルバメート結合が、チロシナーゼ加水分解の基質として働き、したがって末端キャップ除去および後続のポリロタキサン脱貫通を誘発しうるというものである。
【０１２３】
実施例4
ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンおよびポロキサマー(例えば、PEG-PPG-PEGのようなトリブロックコポリマー)から構築されたポリロタキサンに基づくGd3+磁気共鳴(MR)造影剤が本明細書において記述される。下記式を有する、ポリロタキサン(PRTx)末端キャップへの開裂可能なカルバメート結合を保有したβ-CDに基づくポリロタキサンのファミリーが合成された:
2018532036.tif 000036
式中、d、q、n、およびAは、本明細書において定義される通りである。
【０１２４】
これらの化合物は、表3および4に示されるように、5〜15コピーのβ-シクロデキストリン(β-CD) (n = 5〜15)または3〜11コピーの2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP-β-CD) (n = 3〜11)のいずれかで貫通されたポロキサマー(例えば、PEG-PPG-PEGのようなトリブロックコポリマー)を有する。
【０１２５】
（表３）
2018532036.tif 000037
【０１２６】
（表４）
2018532036.tif 000038
【０１２７】
下記式の化合物も合成された:
2018532036.tif 000039
式中、Cholはコレステリル基をいい; d、q、およびnは本明細書において定義される通りであり; かつ
2018532036.tif 000040
である。
【０１２８】
そのような化合物は、化合物がDOTAによってキレート化された1つまたは複数の核種(Rad)を含む場合、本明細書において「PRTx-DOTA」および「PRTx-DOTA(Rad)」といわれることもある。
【０１２９】
HP-β-CDによるポロキサマーのPPGブロックの包含は、ビス-カルバミルコレステロール末端キャップを介してCD単位を保持するポリロタキサンを構築するために利用された。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書において記述されるポリロタキサンは、長期循環特性を付与することによってその薬物動態を大きく高めることができる柔軟な棒状形態を有するようである。HP-β-CDはポロキサマーのPPGブロックと包接複合体を形成することが知られているので、この性質を利用して、カルバメート結合を介して結合したコレステロール末端キャップを担持するポリロタキサン(HP-β-CD:F127-Chol)を構築した。
【０１３０】
1H NMR、2D核オーバーハウザー効果分光法、およびマトリックス支援レーザ脱離/イオン化質量分析法(MALDI-MS)による分析から、ポリロタキサンが35 kDaの分子量およびおよそ46%のPPGブロック被覆率を有する、15コピーのHP-β-CDを保持することが示された。ポリロタキサンを、逆相高圧液体クロマトグラフィーおよび親水性相互作用液体クロマトグラフィーにより遊離HP-β-CD混入の存在についても分析した; これらの技法のどちらでも、10%以下の遊離HP-β-CDが示された。次いで、HP-β-CD:F127-Cholを、CDI活性化カップリングを介して過剰のオリゴ(エチレングリコール)で修飾して、材料の水溶性を増加させた。最後に、これをチオカルバメート結合によりDOTA-Bn-NCSにコンジュゲートさせ、次いでGd3+と錯体化させて、およそ14個のDOTA(Gd3+)部分が結合した最終PRTx-DOTA(Gd3+)を得た。試料のAFM像によって、調製されたポリロタキサンが、30〜40 nmのAFM範囲の長さを有する棒状形態を有することが示された。3〜7 nm未満の寸法を有する粒子は、糸球体壁の有効孔径が8 nm前後であることから、血流からの迅速なクリアランスを受けることが知られている。それゆえ、Gd3+:DOTA-β-CD:ポロキサマーPRTxは、流れ整列およびPEG-DOTAグラフト化によるおよそ4.6 nmへの有効なPRTx棒径の拡大に起因してモノマーGd3+:DOTA-β-CD対照よりも血液からのクリアランス速度がはるかに遅いものと予測された。
【０１３１】
次いで、合成された材料をマウスモデルで評価して、それらのコントラスト増強能力を決定した。MRIデータから、PRTx-DOTA(Gd3+)が30分もの間、心臓において2倍の増強比(ER)を有したことが明らかである。それとは逆に、対照β-CD-DOTA(Gd3+)のERは、30分の期間にわたって1.5から1に低下した。さらに、MRIデータから、対照β-CD-DOTA(Gd3+)で観察されたものは30分の期間にわたって1.9から1.1に急低下したのに対し、PRTx-DOTA(Gd3+)により腎臓において観察されたERは30分の期間にわたって2から1.6に低下したことも示され、対照の急速な腎臓ろ過を示すものであった。対照と比較して30分で心臓におけるPRTx-DOTA(Gd3+)の優れたMRコントラストから、ポリロタキサンの改善された薬物動態がさらに確認された。β-CD構築体の分子量および寸法の増大によって、Gd3+:DOTAによる修飾後EPR効果により腎臓ろ過速度が低減され、HP-β-CDモノマー対照と比べて、ポリロタキサン骨格に対するマウスでの循環半減期および増強比が実質的に長くなる。さらに、ポリロタキサンは膀胱を通過して除去され、急性毒性は観察されなかった。ニーマン・ピック病C2-/-型線維芽細胞を親β-CD:ポロキサマーPRTx化合物に曝露すると(すなわち、DOTA活性化およびGd3+負荷の前に)、カルバミル末端キャップされたポリロタキサン構造は、β-CD単位がPRTx末端キャップのpHまたは酵素誘発除去のいずれかを介してポリマー骨格から遊離されるLE/LY区画に輸送されるまで、血清補充培地中で無傷のままであることが明らかである。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、これらの知見は、PRTxが完全な種として排出されうることを示唆する。さらに、これらの結果を総合すると、PRTx-DOTA(Gd3+)は急性毒性の欠如および長期循環性のために血管増強のための潜在的な薬剤でありうることが示唆される。
【０１３２】
実施例5
β-CD:Pluronicポリロタキサン(PR)化合物のライブラリは、ポリマー貫通および末端キャッピング反応を開始する前に、4-スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン(SBE-β-CD)を固体状態で所望の第2のβ-CD誘導体と、これら2種類のβ-CD粉末の高度な粉砕により徹底的に混合することによって調製された。この手順によって生成された擬ポリロタキサン中間体は、スキーム3に描かれるように、コレステロールクロロホルメートで末端キャップされて、対応するPR生成物を生成した。1H NMR分析を用いて、HP-β-CD C1-H (5.05 ppm)およびPPG CH3 (1.0 ppm)シグナルの積分強度を比較することにより、Pluronic軸上に貫通されたβ-CD単位の数を決定した。SBE-β-CDを含有する化合物の場合、1.7 ppmの位置のスルホブチルCH2部分の広いピークを用いて、組み入れられたSBE-β-CD単位の数を決定した。CD単位当たり2つのPPG単位が含まれているという仮定に基づいて被覆率を計算した。β-CD、HP-β-CD、Me-β-CD、およびアジド-β-CD単独からまたは混合β-CD種として得られたPluronic L81 PRに対応する試料の各コポリマー上に貫通された総β-CD単位の推定数およびβ-CD被覆率を表5に示す。
2018532036.tif 000041
スキーム3. β-CD/SBE-β-CD混合PR誘導体のために利用された合成経路
【０１３３】
（表５）
2018532036.tif 000042
【０１３４】
次に、1H NMR分析生成物によって推定されたPRの分子量を、溶出液としてDMSOを用いたGPC-MALS/RIの結果と比較した(表5)。GPC分析によって決定された分子量は、GPCクロマトグラム中の非常に高いMWピークの出現に基づいてDMSO中で自己集合するように見えるβ-CD/PRを除いて、NMRから計算された値と概ね一致する。
【０１３５】
混合ロタキサン化反応におけるβ-CD競合の役割を評価するために、SBE-β-CDと混合されたβ-CD、HP-β-CD、Me-β-CD、またはアジド-β-CDを含有する二成分混合物を、0% SBE-β-CDで開始して異なるモル比で調製した。Pluronic L81コポリマーが混合物中の両方のβ-CDホストに容易に接近できるように、β-CDの固体混合物をヘキサン中に懸濁させた。反応フィード中のSBE-β-CDのパーセントモル比に対して各β-CD対のパーセント貫通効率をプロットすると、非荷電β-CD誘導体の貫通効率はほぼ一定のままであるが、ポリマー軸上に貫通されたSBE-β-CDの量は、フィード比の増加とともに増加する。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、β-CD誘導体の構造的修飾が本明細書において記述されるβ-CD誘導体の全体で大きく変化しうるので、CD捕捉ヘキサン溶媒は、他の、より極性の低い非イオン性β-CD誘導体の空洞よりもポリマー鎖のPEG末端によって、SBE-β-CD空洞からより容易に移動されるものと考えられる。
【０１３６】
FTIRを用いてPR化合物を分析した; これらのスペクトルを、純粋なβ-CDモノマー前駆体およびPluronic L81前駆体のスペクトルと比較した。コレステロール末端キャップカーバメートに対応するピークは1672 cm-1の位置に現れ、カーバメート結合におけるカルボニル基のC-O-CおよびC-N-C伸縮振動は、PRの全てで、それぞれ1109 cm-1および1230 cm-1の位置に現れる。3100〜3500 cm-1の広い吸収は、CDヒドロキシル伸縮振動に対応する。アジド伸縮モードに対応して、アジド-β-CD:Pluronic L81 PRおよびアジド-β-CD/SBE-β-CD:Pluronic L81 PR化合物においても2103 cm-1の位置に強いピークが観察され、これらの反応から単離されたPRは、有意なアジド-β-CD含量を有することを示唆するものであった。
【０１３７】
広角X線散乱(WAXS)を用いて、PR生成物構造をさらに特徴付けた。固有のピークが2θ = 20°付近に観測される; このピークは、対応する純粋なβ-CDまたはPluronic L81に見られるものとは異なる。非晶質HP-β-CD、Me-β-CD、SBE-β-CD、およびβ-CD試料は、12.04°、14.36°、18.24°および21.76°の位置にピークを示す。総合すると、これらのデータは、文献のなかで以前に報告されたチャネル様構造と同様に、本研究において生成された全てのβ-CD PRのチャネル型結晶構造の存在を示唆している。
【０１３８】
β-CD単位内のPluronic含有は、示差走査熱量測定(DSC)分析によってさらに支持された。純粋なβ-CD (アジド-β-CDを除く)および未修飾Pluronic L81ポリマーのDSCサーモグラムは、有意な吸熱転移を生じていない。これは、第1の加熱段階中のβ-CD微結晶粉末の不規則化によるものであり、融解転移を有しない非晶質固体を生成する可能性が高い。アジド-β-CDの場合、140℃でのピークはN2放出に起因しうる。一方、PRの場合には明確な吸熱転移が観察される。これは、高温で融解する微結晶ドメインへの、最も近い隣接PR種の棒状セグメントの凝集に対応する。全てのSBE-β-CDに基づくPRに対応するエンタルピー交換は、単一CDおよび混合PR材料のそれよりも小さいようである。SBE-β-CDスルホネート基によって引き起こされる電荷反発は、これらの巨大分子が秩序構造にまとまるのを妨げる可能性がある。
【０１３９】
PR熱安定性も、熱重量分析(TGA)によって評価した。アジド-β-CDおよびSBE-β-CDを除いて、純粋なβ-CDは、単一の熱分解事象を有していた。アジド-β-CDは、アジド基の分解およびCDからのN2(g)の損失を示す、440℃での急激な重量損失を伴う異なるプロファイルを生じる。SBE-β-CDについて見られる複数の重量損失は、β-CD修飾の脱水、放出および/またはクラッキング(例えば、H2O、SO2およびブタンスルトンの損失)プロセスによる可能性が高い。
【０１４０】
PRサーモグラムは、熱分解プロセスにおいて2つまたはそれ以上の段階を示した。第1段階は、対応するシクロデキストリンの熱分解に起因し、第2段階はPluronic L81コポリマー分解に関連する。明らかに、包接ポリマー複合体の重量損失は、遊離β-CDの重量損失よりも遅く、PPGブロックに結合したβ-CDはモノマーCD種よりもβ-CDの熱安定性を高めることを示唆している。さらに、PR分解の第2相の間のPluronic L81の分解温度は、遊離ポリマーのそれに比べて増加する。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、これらの所見から、CD空洞内にPPG鎖を含めることにより、PPG-β-CD壁衝突による熱誘導ポリマーセグメント振動を減衰させることにより、コポリマーの熱安定性を高めることができるものと推測することができる。これらの知見、すなわち、β-CD種およびPluronic L81トリブロックコポリマーの両方の熱安定性がロタキサン化の際に増加することは、ポリマーが疎水性β-CD空洞内に含まれることを示唆している。
【０１４１】
陰性染色TEM顕微鏡法を用いて、PR分散体の微細構造が観察される。調製された全てのPRのモデルとして選択した、HP-β-CD:Pluronic L81 PRおよびHP-β-CD/SBE-β-CD:Pluronic L81 PRについてTEM顕微鏡写真を得た。どちらの化合物も自己凝集を示し、球状粒子を生成する。HP-β-CD:Pluronic L81 PRは直径10〜88 nmを有するナノ粒子を生じたが、同じ条件の下で、HP-β-CD/SBE-β-CD:Pluronic L81 PRは、直径が6〜12 nmであった、より規則的で小さな粒子に凝集した。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、これら2つの試料の間に見られる正味の差異はスルホン化されたCD間の静電荷反発によって説明することができ、それによってHP-β-CD/SBE-β-CD:Pluronic L81 PRの場合にはPRのより広範な凝集を防ぐことができる。
【０１４２】
HP-β-CD PRの溶解性がニーマン・ピック病C型細胞におけるスクリーニング研究を可能とするのに十分に改善されているかどうかを試験するために実験を行った。PR複合体中のSBE-β-CD単位によって導入された負電荷は、それらの凝集を低減させ、それらの水溶性を改善すると考えられる。この仮定を試験するために、HP-β-CD/SBE-β-CD混合物から得られた試料をナノピュア水に溶解し、溶液の見かけをモニターした。PR構造中のSBE-β-CDの量を増加させると、特にSBE-β-CDモル比が25%以上の試料の場合には、その水溶性が著しく改善されることが分かった。CDに基づくPRは、それらの棒状構造の凝集のために一般に水に不溶性であることは周知である。高度に水溶性の材料であるSBE-β-CDの組み入れは、混合PR生成物の、弱い分子間相互作用および改善された水溶性をもたらす。
【０１４３】
SBE-β-CDの組み入れはPR溶解性を有意に増加させるので、ニーマン・ピック病C型疾患のインビトロモデルにおいて混合β-CD組成を有するPRも生物学的に活性であるかどうかを決定するために実験を行った。異常な蓄積部位からコレステロールを移動させる能力を調べるため、ニーマン・ピックC1欠損(npc1-/-)線維芽細胞に、増加していくSBE-β-CD割合を保有するPRを投与した。0%、30%、50%、60%、または100%のSBE-β-CDフィード比で生成された各PRファミリーメンバーを、25 μMの総β-CD濃度で投与し、対照としての25 μM SBE-β-CDまたはHP-β-CDモノマーの投与と比較した。これらの実験において、コレステロール移動の明らかな差異が、細胞に添加された全薬物濃度ではなくPR剤(β-CDプロドラッグの一種)に起因しうるように、10コピーのβ-CDを保有する各PR構築体をβ-CDモノマー対照に対するよりも10倍低いモル濃度で投与されるような、等価なβ-CD濃度で比較を行った。
【０１４４】
処理から6時間後のコレステロール移動の分析によって、これらのPRファミリーメンバーがコレステロール移動アッセイ法においてその各モノマーとほぼ同等に働くことが明らかにされた。HP-β-CDおよびSBE-β-CDモノマーは、npc1-/-線維芽細胞における平均フィリピン染色を、6時間後の未処理対照レベルのおよそ75%まで減少させた。100% HP-β-CDおよび100% SBE-β-CDから構成されるPRは、等価に働き、各々が対照のおよそ78%までフィリピン染色を減少させた。30:70のSBE-β-CD:HP-β-CD比を保有するPRは、未処理群およそ65%まで蛍光を減少させた。50:50または60:40のSBE-β-CD:HP-β-CD薬物負荷を保有するPRは、効果が低く、蛍光をそれぞれ86%および83%までに減少させた。低いSBE-β-CD比の組み入れ(例えば、30%)が、より高いSBE-β-CD割合を有するPRまたはβ-CDモノマーと比べてコレステロール流出を有意に改善できるかどうかを決定するために、より広いPR濃度のスクリーニングが必要であろう。DMSO対照実験は、フィリピン染色に及ぼすDMSO処理の効果を示さなかった。これらの実験は、混合貫通反応から生成されたPRがインビトロでそれらのコレステロール移動活性を保持することを明らかに示す。
【０１４５】
要約すると、これらの実験は、異種戦略を用いた混合β-CDに基づくPRの構築のための効率的な合成方法となる。ロタキサン化反応中のβ-CDモノマー間の競合は、隣接するSBE-β-CD単位間の静電反発力と、さまざまなβ-CD誘導体の分子間水素結合能と、異種貫通反応の間に用いられる有機溶媒中でのそれらの相対溶解度とのバランスによって決まる可能性が高い。ポリマーコア上での混合CDの貫通につながる、ロタキサン化反応中のβ-CDの協調的貫通プロセスが推測される。SBE-β-CDのロタキサン化は、フィード中のそのモル比の増加に応じて増加した。興味深いことに、PR生成物中のSBE-β-CD単位の存在のために、PRの水溶性が有意に改善された。PR骨格内へのSBE-β-CDの組み入れは、モノマーβ-CD対照と比べて異常に貯蔵されたコレステロールを移動させる能力に有意に影響を与えない。定義されたアジド単位を有する水溶性PRの合成は、改善されたニーマン・ピック病C型治療用物質のためのいっそう容易に投与されかつ保持される形態のβ-CD誘導体を含めて、多種多様の用途に対する制御された直交後修飾の可能性を開きうる。
【０１４６】
実施例6
HP-β-CDおよびSBE-β-CDに基づくポリロタキサンの合成造影剤(Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PR)
ポリロタキサン造影剤を合成するために使用する概略的アプローチをスキーム4に示す。
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【０１４７】
最初に、HP-β-CD/SBE-β-CDの1ファミリー:Pluronic(登録商標)ポリロタキサンの合成を、以前に報告された異種条件下で、以前に報告した手順にしたがって実施した。F-127、F-68、L-35、L-64、L-81を含む5つのPluronic(登録商標)コポリマーを、各コポリマーのサイズとポリエチレンオキシド(PEG)ブロックおよびポリプロピレンオキシド(PPG)ブロックに基づいて考慮した。SBE-β-CDとHP-β-CDをよく粉砕して細かい粉末混合物にし、この2つのシクロデキストリンを、SBE-β-CDの固体状態でのモル比30%でよく混合して化合物を調製し、ヘキサンを溶剤として用いてポリマー貫通反応と末端キャッピング反応を開始させた。この手順によって発生させた擬ポリロタキサン中間体を、カルバメートリンカーを介してコレステロールクロロホルメートで末端キャップし、対応するポリロタキサン生成物を生成した。1H NMR分光分析を使って、2つのシクロデキストリン、すなわちHP-β-CD C1-H(4.5〜5.0 ppm)とHP-β-CD(1.6 ppm)と、Pluronic(登録商標)シグナルのPPG CH3(1.0 ppm)の積分強度を比較することによって、Pluronic(登録商標)の軸に貫通させたシクロデキストリンの数を定量化した。1つのCD分子が自身のキャビティに2つのPPG単位を含むことができるという仮定に基づいて被覆率を計算した。およそ1.0 ppmでのプロトンピークをコポリマーのPPGメチル基に割り当て、3〜3.5 ppm領域のプロトンシグナルはPEGのメチレン単位(CH2)とHP-β-CDプロトンに帰属させた。4.5〜5.0 ppmの領域で表示される幅広いシグナルは、シクロデキストリンのC1-Hプロトンによるものとする。この領域におけるピークの広がりは、Pluronic(登録商標)コポリマーがシクロデキストリンでうまく貫通されていることを示している。表6は、各Pluronic(登録商標)軸が保持しているCDの数、被覆率、ならびにこの分子中に含まれるSBE-β-CDの%量をまとめたものである。貫通効率は、ポリマーのPPG単位/PEG単位比が高くなるにつれて改善する傾向がある。これはL-35、L-64およびL-81で見ることができ、PPG/PEG比はそれぞれ0.72、1.2、7.2である。ポリロタキサン中のシクロデキストリンの割合は、ポリロタキサン全体を通じて、SBE-β-CD範囲40〜50%に制御されているように思われる。次いで、HP-β-CD/SBE-β-CD：Pluronic(登録商標)PR中間体をCDIで活性化して、余った1,8-ジアミノ-3,6-オキソ-オクタンで修飾してHP-β-CD/SBE-β-CDの水溶性を高め、アミン官能基を組み込んで化学的抱合をさらに促進させた。最後に、DADO-HP-β-CD/SBE-β-CD-PR中間体をDO3A-Bn-SCNとカップリングさせ、次にGdCl3で処理してGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PRを得た。別個に添付したDO3Aキレート化剤を1H NMRによって測定した(表6)。
【０１４８】
(表６)Gd3+ HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサン造影剤のCD数および被覆の要約
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a 1H NMRにより測定した。b PPGメチルプロトンで正規化したDOTAのフェニルプロトンのNMR積分を用いて推定した。
【０１４９】
この化合物の分子量は、1H NMR分析、GPC-MALS/RIによって推定し、DMSOを溶出液として用いた分析用超遠心分離分析(AUC)を比較に用いた(表7)。
【０１５０】
(表７)Gd3+-DOTA-HP-β-CD/SBE-β-CDポリロタキサンの平均分子量
2018532036.tif 000045
a PPGメチルプロトンで正規化したDOTAのフェニルプロトンのNMR積分を用いて推定した。b ICP-MS分析。
【０１５１】
GPC分析によって求めた相対分子量は、NMRから計算された値と概ね一致し、AUC値は、ほとんどの化合物で、NMRから計算されたAUC値よりも低い。これは、溶解性の問題を回避するために遠心分離試料調製法を使用したことによって説明することができる。ポリロタキサンは多分散性が非常に高いため、AUC分析で使用が考慮される上清には低分子量のポリロタキサン分子が含有されていると考えられる。表7に、ICP-MS分析で評価した試料中のGd含有量の重量百分率を示す。これらの値が比較的低いのは、おそらく数日にわたり水のpHを7に維持することを必要とする透析精製中にGdが減少することによるものと思われる。試料の物理的特性をDLS分析で特性決定した(表8)。
【０１５２】
(表８)流体力学的直径およびζ電位Gd3+-DOTA-HP-β-CD/SBE-β-CDポリロタキサン
2018532036.tif 000046
【０１５３】
水に溶解した各ポリロタキサンの流体力学的直径は116〜140 nmの範囲にあるが、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127およびGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L64はこれに該当せず、この2つの化合物は凝集したと思われる。DLSデータはまた、本発明者らの過去の研究で以前に観察されたようにこれらの化合物が広範囲に多分散性を有することを明らかにした。ζ電位測定値は、SBE-β-CDのスルホネートが負に帯電していることにより、ポリロタキサン造影剤がわずかに負に帯電し、それが化合物の水溶性を大幅に改善したことを示している。
【０１５４】
Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PRのモル緩和度
プロトン核磁気緩和分散法(1H NMRD)を用いて、ポリロタキサン造影剤のT1緩和度を測定した。この造影法は、ある一定範囲の磁場強度にわたって核スピン格子定数1/T1を測定することを通じて物質の分子動力学を収集するために通常使用される非破壊低磁場磁気法である。Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L64を除いて、全ての化合物について30℃でプロファイルを得た。プロファイルは0.24 mTから0.97 Tまでの磁場の30個の値をカバーした。ただしGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L64は、非重水素化水に溶解した。結果を図1に示している。このプロファイルは、全ての化合物について、20 MHzから40 MHzへのわずかな増加が見られることを示している。30 MHz付近のr1の曲線のこの平坦化は、この領域周辺でプロファイルのNMRD最大値を示すデンドリマーなどの高分子造影剤の特徴である。DOTAREM(登録商標)やProhance(登録商標)などのGd(III)キレートモノマーの1H NMRDプロファイルは、同じ領域においていかなる増加も最大値も示さない。Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68 (12.2 mM-1s-1, 40 MHz)とGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35 (6.7 mM-1s-1, 40 MHz)について、最も低い緩和度と最も高い緩和度が観察された。これらの値は、デンドリマーの値に比べて相対的に低い。これは、高い柔軟性、すなわちポリロタキサン構築体のポリマー軸を中心としてCDが自由に回転したり平行移動したりすることによって説明することができる。この自由な回転と平行移動が、長い滞留時間TMを誘発する。一般に、巨大分子の緩和度を高める観点から、滞留時間を適度に短くすべきである。さらに、これらの柔軟性に富んだ構造体の回転時間TRは、デンドリマーなどのリジッドなナノ粒子と比べた場合は短いと予想され、その結果、緩和性が低くなると予想される。これに対してデンドリマーはコンパクトな構造を有しており、それが等方的回転動的制限を課し、それによりΓRを増大させる。MR造影特性を評価するには、別個の高磁場(1.5 Tまたは臨床場、3 T)でのポリロタキサン造影剤の緩和度の測定が必要である。
【０１５５】
23℃で7 T (261 MHz)のBruker BioSpecスキャナを使用して、0.05〜1.0 mMの範囲でポリロタキサン造影剤の水溶液に対して緩和度の固定電界測定も行った。緩和度r1とr2は、Gd濃度の関数としてそれぞれ縦方向(1/T1)、横方向(1/T2)緩和時間をプロットすることによって決定した。図2に示すように、各ポリロタキサン造影剤のr1とr2はDOTAREM(登録商標)のr1とr2よりも高く(表9)、このことは、各ポリロタキサン造影剤の化合物が高分子MRI造影剤特性を有することを示している。
【０１５６】
(表９)Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサンおよびDOTAREM(登録商標)のモル緩和度
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【０１５７】
高磁場のポリロタキサン化合物についてこれらの高い緩和度が得られる原因は、回転揺動時間TR1が伸びることにおそらく求めることができる。この場合、TR1が伸びる効果は、この巨大分子全体の動きと側鎖の内部運動の両方の組み合わせであり、Lipariと共同研究者が実証したように、この2つの要素の組みあわせが緩和速度(relaxation rate)に影響を及ぼす。さらに、ポリロタキサンは水溶性が低いことが知られており、ポリロタキサンの凝集は緩和度の増加に深刻な影響を及ぼす恐れがある。この現象は、Elhabiriらによって最近発見された。この手法でGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127およびGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35について得られた値が1H NMRDで得られた値に比べて高いことは、おそらく、測定が行われた磁場がそれだけ高いからであると思われる。Wood and Bologhグループは、TMがより短い複合体に高磁場を適用すると、高い緩和度が得られると報告している。Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68およびGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81の緩和度r1およびr2は、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35およびGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L64の緩和度よりも大きい。これは、これらの化合物のPEGブロックのサイズによって部分的に説明することができる。Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127とGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68のPEGブロックが大きいこと(エチレンオキシド単位がそれぞれ200と152)が、水分子が粒子内部のGdキレートにアクセスするのを促進する役割を果たすと考えられる。Kodjimaらは、ペグ化デンドリマーの緩和度に対してPEGのサイズが同じ効果を及ぼすことを観察している。Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81の場合は、貫通被覆率が高いこと(90%)が、おそらく棒状形態の構造をこの分子に付与し、その構造がポリマー軸に沿ったCDのある程度の自由度を制限し、分子の揺動率を低下させ、結果として緩和時間が短縮されると考えられる。
【０１５８】
いくつかの態様では、本明細書において記述されるさまざまな態様のポリロタキサンのモル緩和度(7 Tおよび25℃にて脱イオン水で測定した1/T1および/または1/T2)は濃度依存性であり、約5〜約200 mM-1s-1であった(例えば、約5 mM-1s-1から約50 mM-1s-1、約25m M-1s-1から約35mM-1s-1、約50 mM-1s-1から、約100 mM-1s-1、または約50 mM-1s-1から約150 mM-1s-1である)。
【０１５９】
Gd(III)ポリロタキサンのインビトロMR造影
ポリロタキサン試料のシグナル増強特性を評価するために、Gdの濃度を引き上げながら、試料の水溶液のT1強調スピンエコーMR画像を記録した。DOTAREM(登録商標)画像と純水画像も同じ条件で得た。全てのGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサンについて高いポジティブコントラスト強化が観察され、スポットの輝度は、Gd濃度が上昇するにつれて、DOTAREM(登録商標)から得られたスポットと比べて高まった。しかし、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127およびGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35の最低濃度からシグナルの輝度が観察される。これらの結果は、調製された試料がDOTAREM(登録商標)と同等またはそれを上回るコントラスト画像を有することを示した。
【０１６０】
Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PRのインビボMRIコントラスト増強
ポリロタキサンのMRコントラスト強調と循環動態を調べるために、7T Bruker小型動物スキャナによって、静脈内注射後のBalb/Cマウスの3D T1強調MR画像を、注射前、注射10分後、20分後、35分後、50分後、60分後に取得した。ポリロタキサンによる組織コントラスト強調は、各ポリロタキサン造影剤の貫通効率、分子量、サイズおよび表面電荷に依存してさまざまな運命をたどる。図3A〜3Eは、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L64を除く全てのポリロタキサン造影剤から得られた最大強度投影画像を示したものであるが、心臓、肝臓、腎臓については15分後、膀胱については35分後に大部分のポリロタキサン造影剤でコントラスト強調が大きくなることを示している。総じて、心臓と循環器系においては、コントラスト強度は時間の経過に伴い漸進的に減少するが、腎クリアランス後の膀胱において大幅に増加する。予想通り、DOTAREM(登録商標)は20分以内に完全に排出された。これは、小さな造影剤で見られる典型的な傾向である。
【０１６１】
意外なことに、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127は、他のポリロタキサンと比較して低いコントラスト強調を示した。これは、貫通率が低く(31%)、そのため大きなPEGブロックとPluronic F127のPPGブロックのほぼ半分が露出することによると思われる。一見したところ、コロナを形成しているPEGブロックに沿って数少ないGd(III)キレートに疎水性PPGブロックが巻き付き、それが、Gd(III)キレートが水にアクセスするのを妨げている。Kojimaらは、PEG化されたデンドリマーの緩和度と強調を低下させるうえで、PEGブロック(PEG5k)が、短いPEG2kに比べて強い作用を及ぼすことを観察している71。逆に、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35やGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81などの高貫通ポリロタキサン造影剤は強調が最も高く、これはおそらくは貫通効率が高いことによるものであり、それが、循環中に棒状形態を付与し、その結果、高貫通ポリロタキサン造影剤がマクロファージによる取り込みを回避し、より長く循環することになると考えられる。
【０１６２】
コントラスト強調を定量化するために、2D T1強調スキャンから得た心臓、肝臓および腎臓の断面画像に慎重に関心領域(ROI)を描き、その領域についてコントラストノイズ比(CNR)を計算した。これらすべての組織においてコントラスト強調は軽微であった(図4)。心臓においては、全てのポリロタキサンで意味のあるシグナル強調が観察され、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81で最も顕著な増加が見られた。これらのポリロタキサンは、DOTAREM(登録商標)およびGd3+-HP-β-CD/SBE-βCD-F127よりも長く循環にとどまるように思われる。これらの所見は、前者のポリロタキサンの貫通効率と高分子量によって説明することができる。腎臓のプロファイルは、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127およびGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81が蓄積を示し、組織の中により長くとどまるという点で異なるように見える。肝臓では、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81が高レベルの蓄積を示し、持続性を実証したが、それを除くその他のポリロタキサンの組織内におけるプレゼンスは低レベルから中レベルである。実際、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L35とGd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F68は、時間が経過するにつれて肝臓に蓄積し、後者の場合、コントラスト強度は25%増加し、前者は注射から70分後には10%であった。Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-F127のSNRは、DOTAREM(登録商標)の値よりも下に位置している。
【０１６３】
インビトロでの細胞毒性
Gd-ポリロタキサンの生体適合性を評価するために、J774マクロファージ細胞に対するMTSアッセイ法を用いて、それらの細胞生存率を評価した。図5に示す結果を、試料なしで培養した細胞の対照試料に対して正規化した。全体として、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PRは、Gd濃度0.1 mMで細胞増殖に対して中程度の影響を及ぼしており、そのことは、このポリロタキサン造影剤の忍容性が妥当なものであり、インビボ実験で安全であることを示している。この濃度では、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-L81以外の全てのポリロタキサンの細胞生存率は70〜83%である。PEGがGdに基づく高分子造影剤の細胞毒性を低下させることが示されており、こうした細胞生存率は、L81 Pluronicコポリマーが保持するPEGブロックが非常に小さいことに原因を求めることができるかもしれない。
【０１６４】
細胞取り込み試験
ポリロタキサンのような巨大分子構築体はインビボで自然免疫系(単球、マクロファージ、樹状細胞)を誘発することが考えられるため、MR画像化モダリティを用いてマクロファージによるポリロタキサン造影剤の取り込みを評価した。さらに、がん、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、糖尿病およびその他のヒトの疾患におけるマクロファージを撮像するうえでこれらの物質の生物学的特性を有利に活用することができる。マクロファージは宿主防御系にいて重要な役割を果たし、ほとんどのナノ物質が不遇な運命をたどることにつながることが知られている。同様に、マクロファージの過剰発現は、組織調節やがんにおける血管新生76〜78、動脈プラークの破裂、さらには脳卒中に至る病変の不安定化、炎症性疾患など多くの疾患に伴って発生する。MR造影は、腫瘍の成長とがん治療をモニターする、心臓血管疾患におけるリスクを予測する、腫瘍または病変部位でマクロファージ蓄積を使って糖尿病の進行を視覚化する、などの目的で使用されている。これらの報告に基づいて、ポリロタキサン造影剤におけるJ774マクロファージの細胞取り込みを評価した。化合物を0.1 mM Gdの最終濃度でJ774細胞と37℃で12時間、無血清培地中でインキュベートし、MR造影のために溶解した。300 μLのエッペンドルフチューブに含まれている溶解細胞のT1値およびT2値を7Tで反復回復法を用いて測定し、スピン-格子の逆数(1/T1)とスピン-スピン緩和時間の逆数(1/T2)を評価した。図6に示すように、Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PRで処理したマクロファージでは緩和時間が短縮されたのに対し、DOTAREM(登録商標)は、試料で処理されなかった対照細胞に比べてエンドサイトーシスを示さなかった。ポリロタキサンは、受容体介在経路を介してエンドサイトーシスを改善する標的化能力を付与されていないので、観察されたポリロタキサンの高い取り込み率は非特異的であり、おそらく細胞膜内におけるエンド・キャップ・コレステロールの区分がポリロタキサンの内在化に有利に作用することに起因すると思われる。この仮定は、親油性を有さないDOTAREM(登録商標)では取り込みが少ないことによって支持される。これらの結果は、ポリロタキサン造影剤が、いくつかのマクロファージ関連疾患のインビボ造影と診断にとって魅力的であることを示唆している。
【０１６５】
ポリロタキサンタンパク質ハードコロナプロテオミクス分析
本実施例に記述されているポリロタキサンの電荷および表面化学は、Pluronic L81コアでの分子種の混合物としてβ-CD誘導体を組み込むことによって評価した。さまざまなCD誘導体の取り込みがCD誘導体の生物学的性能にどのような影響を及ぼすかを確認することで、物理化学的局面全体の重要性についての洞察が得られ、特定の標的条件の候補選択にあたって参考となる情報が得られる。この目的のために、異なるβ-CD誘導体を含有する4つの異なるポリロタキサンを開発し、特性を評価した。すなわち、β-CD、HP-β-CD、メチル化βシクロデキストリン(Me-β-CD)、およびHP-β-CDとスルホブチルエーテルβシクロデキストリン(SBE-β-CD)の混合物に基づくポリロタキサン(表10)である。
【０１６６】
(表１０)プロテオミクス分析のためのポリロタキサンのCDの数および被覆の要約
2018532036.tif 000048
【０１６７】
SBE-β-CDをPR骨格に組み込むと静電反発力が導入される。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、ポリロタキサン上のスルホネート基がPRの挙動や血液成分との相互作用を劇的に変化させる電位を有すると予想される。他方、HP-β-CDはポリロタキサンの表面に過度のヒドロキシル基を提供し、そのヒドロキシル基が、より多くの水素結合相互作用を誘発すると思われる。他方、Me-β-CDを導入した場合は、当然これらの水素結合相互作用を低減すると思われる。
【０１６８】
PR骨格によって運ばれるCD誘導体の変化は、PRハードコロナを構成するタンパク質の量と同一性に差を生じさせた。吸着されたタンパク質の総量は、ポリロタキサンに組み込まれたCD全体を通じて大きなばらつきがあり、そのため、図7に示したようにその表面化学も大きく変動した。未修飾β-CDが最も大量の表面タンパク質を蓄積した。これは、水素結合主鎖がリジッドであり、CDリム上に反応性表面アルコールが存在していたことによるものと思われる。おそらくは同じような理由から、HP-β-CD PRの平均タンパク質吸着が2番目に高かった。未修飾β-CD PRに比べてHP-β-CDが相対的に減少しているのは、HP修飾に由来するブラシ様の遮蔽、または反応性アルコールが必ずしも定期的に供給されないことによって媒介されていると考えられる。Me-β-CDと混合貫通PRは、非常に異なる表面化学を呈するにもかかわらず、ほぼ同量のタンパク質を取り込んだ。Me-β-CDにおける吸着の減少は、表面アルコールのキャッピングによるものであると考えられる。また、荷電したCDの取り込みも、なんらかのメカニズム、例えば反発力の増加、あるいは疎水性相互作用の減少によって、吸着を低減させるように思われる。これらの違いの背後にあるメカニズムを明確に特定するには、さらに慎重な検討が必要である。
【０１６９】
ある種のポリロタキサン構造がある特定の経路内で特異的に相互作用を生じるかどうかを識別するために、コロナごとに、そこに存在するタンパク質をそれぞれのファミリーに分類した。タンパク質群を比較すると、この場合もやはりCDの変動が、優先的に付着するタンパク質ファミリーの変化につながった(図7)。そのタンパク質ファミリー全体を通じて、ポリロタキサンに吸着したリポタンパク質の割合が高かった。リポタンパク質含量が最も低いコロナは、未修飾β-CDに基づくポリロタキサンであった。このファミリーでは、コロナ全体に占める割合はおよそ30%であった。未修飾CDが組み込まれたことが、他のタンパク質ファミリーの動員を促進し、リポタンパク質ダイソプソニンが占める割合を減少させるように思われる。さらに、このポリロタキサンファミリーを構成する全てのポリロタキサンがほぼ同じような割合でリポタンパク質を吸着していることから、これらのタンパク質との関連は、特定のCD化学ではなく、PRコアまたは末端キャップによって変化するように思われる。リポタンパク質は、血流を通してコレステロール、コレステロールエステル、脂肪酸などを運ぶことが知られており、したがって、ポリロタキサンコレステロール末端キャップと関連しやすいと思われる。特に、β-CD PRとHP-β-CD PRは、同種のポリロタキサンより、大幅に大きな免疫グロブリン付着を達成する。これは、侵入してくる細菌に存在する表面とリジッドな糖主鎖とが似ているため1,4-グルコース構造が抗体として認識されることによるものと思われる。これは、これらの物質が、身体からのより迅速なクリアランスを受けやすいことを示しているとも考えられる。HP-β-CD PRは、グループの中で血清アルブミンの分画が最も大きく、アルブミン含有率はおよそ20%であるが、すべてのPRがこのタンパク質をある程度吸着した。この場合もやはり、この関連は、末端キャップのアルブミン疎水性ポケットとの関連によって説明することができる。
【０１７０】
HP-β-CD PRでは、CD表面に未修飾アルコールが存在するにもかかわらず、補体吸着レベルの著しい低下も呈し、補体C3は、他のアーキテクチャに比べてコロナのおよそ2%しか占めていなかった。これと対照的に、Me-β-CD PRは、アルコール表面化学が減少したにもかかわらず、最も多くの補体タンパク質を動員していた。このことは、共有結合修飾以外の吸着機構が存在することを含意している。4つの骨格はいずれも、凝固経路タンパク質の付着をほとんど示さない。これには、血漿ではなくフィブリノーゲンが枯渇したヒト血清を使用したことも関係していると思われる。
【０１７１】
PRごとにコロナで最も豊富なタンパク質を示した表を図8に示す。未修飾β-CDとHP-β-CDPRのコロナで最も豊富なタンパク質は血清アルブミンである。表面にアルブミンが占める割合がこのように増加したため、これらのアーキテクチャの循環時間が他の構造に比べて長くなる可能性がある。いずれの場合も、2番目に豊富なタンパク質は免疫グロブリンκであり、アルブミンと免疫グロブリンによって占められるコロナの割合が高いことを反映している。どちらのアーキテクチャも、上位20のタンパク質に含まれる数多くのリポタンパク質を有している。さらに、いずれのポリロタキサンコロナも、セロトランスフェリンとアポリポタンパクE (ApoE)を有しており、それによって血液脳関門(BBB)を通過する可能性が高まる。
【０１７２】
Me-β-CDとSBE-β-CD PR混合物は、最も豊富なタンパク質の上位3つが共通しており、それぞれのコロナの約45.2%と約41.5%をそれぞれ構成している。これらのタンパク質は、補体C3、アポリポタンパク質E、血清アルブミンである。興味深いことは、反応性表面アルコールのキャッピングにもかかわらず、補体C3が比較的豊富である。このこともやはり、共有結合への代替メカニズムが存在することを示唆している。補体C3によってタンパク質コロナの優勢な部分が占められることにより、補体経路媒介過敏反応がもたらされる可能性がある。ME-β-CDのアポリポタンパク質Eと混合貫通ポリロタキサンの割合がそれぞれ16.9%と12.2%と高く、そのことからすると、これらのアーキテクチャがBBBを通過する可能性がそれだけ高くなると思われる。これらのアーキテクチャにおいてコロナのような大きな部分が共通しているという事実は、それぞれが運ぶCDにおける物理化学的違いを考えると興味深い。
【０１７３】
全体として、PRファミリーのメンバーは全て、最も豊富な上位20のうち10のタンパク質が共通している。これらのタンパク質の中には、補体C3、血清アルブミン、3つの免疫グロブリン、4つのリポタンパク質がある。他のタンパク質の多くは複数のアーキテクチャと重複しているが、4つのコロナ全てに存在するわけではない。PRの各ペアは13から15の特徴的なタンパク質が共通している。このことは、CD特性が違ってもPRインキュベーションに対する血清タンパク質応答がほぼ同じであることを示している。したがって、総じて、PR構造間の類似性(ポリマー構造、末端キャップ化学、および形状)は、タンパク質の動員においてCD特性よりもより大きな役割を果たしていると考えられる。
【０１７４】
ポリロタキサン表面の組成と化学が、ハードコロナ上の血清タンパク質の結合を制御するのはもちろんである。しかし、コロナの中のタンパク質の実際の種類は、非常に似ていると考えられる。したがって、このことは、ポリロタキサン構造全体が、ほとんどの場合、それらの表面への同じようなタンパク質の動員を促進するだけの類似性を有している可能性があることを示している。
【０１７５】
要約すると、5つのガドリニウムHP-β-CD/SBE-β-CDに基づくポリロタキサン造影剤を合成し、特性分析し、これらの化合物全体を通じて、貫通CDの相対的な割合を40〜50% SBE-β-CDの範囲内に制御した。DLSの結果は、ポリロタキサンが多分散性を有しており、サイズが110 nmから290 nmの範囲であることを示唆している。ζ電位測定値は、SBE-β-CDのスルホン酸塩が負に荷電しており、そのためポリロタキサンがわずかに負に荷電していることを示している。この負の荷電は、ポリロタキサンの水溶性の有意な改善に寄与する。23℃での核磁気緩和分散(1H NMRD)とモル緩和測定は、全てのポリロタキサンが、市販のDOTAREM(登録商標)(Gd-DOTA)に比べてスピン-スピン緩和(T1)率とスピン-格子緩和(T2)率が高いことを示している。マクロファージ細胞生存率と取り込みの試験から、これらの全ての高分子造影剤の毒性が低く細胞取り込み率が高いことが実証されている一方、DOTAREM(登録商標)は、ほとんど細胞取り込みを示さなかった。Gd-HP-β-CD/SBE-β-CD-PR生理食塩水溶液とともに0.05 mmol Gd/体重kgの用量でガドリウムを静脈注射したBalb/cマウスから7Tで取得したインビボT1強調画像は、DOTAREM(登録商標)に比べ、全てのポリロタキサンでコントラスト強度の増加と、血液プールでの循環時間の延長が見られた。マクロファージ取り込み分析は、これらの高分子造影剤が、がんなどのいくつかのマクロファージ関連疾患のインビボ造影および診断にとって魅力的であることを明らかにしている。さらに、ポリロタキサンのプロテオミクス解析は、ポリロタキサンの表面の組成と化学がそれぞれのポリロタキサンのハードコロナの血清タンパク質の結合を制御し、それぞれのポリロタキサンの構造全体が、同じようなタンパク質のポリロタキサン表面への動員を促進するのに十分に類似していると考えられることを示している。
【０１７６】
材料
PluronicトリブロックコポリマーF127 (EO 200, PO 65, MW = 12600)、F68 (EO 153, PO 29, MW = 8350)、L35 (EO 22, PO 16, Mw = 1900)、L64 (EO 26, PO 30, MW = 2900)、およびL81 (EO 6, PO 43, MW = 2800)をSigma-Aldrichから購入し、使用前に真空下でベンゼンから共沸蒸留によって乾燥した。6.8の平均置換度を有する2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、カルボニルジイミダゾール(CDI)、トリエチルアミン(TEA)、トリス(2-アミノエチル)アミン(TAEA)、クロロギ酸コレステリルもSigma-Aldrichから購入し、直接使用した。4-スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン(SBE-β-CDまたはCaptisol)を平均SBE置換度6.0〜7.1でCydex Pharmaceuticals (Lawrence, KS)から得て、同様にさらに精製することなく使用した。Macrocyclics (Dallas, TX)からS-2-(4-イソチオシアナトベンジル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン四酢酸(p-SCN-Bn-DOTA)を得た。全ての溶媒は試薬等級であり、商業的供給元から購入し、CaH2で乾燥し、ろ過し、減圧で蒸留し、使用前にアルゴン下で貯蔵した。セルロース透析膜をSpectrum Labsから入手し、使用前に脱イオン水に少なくとも30分間浸漬した。NANOpure Ultrapure水系を用いて超高純度H2O (抵抗率およそ18.0 MΩ/cm-1)を生成した。
【０１７７】
ビス-コレステロール-末端キャップHP-β-CD/SBE-β- CD Pluronicポリロタキサン(HP-β-CD/SBE-β-CD-PR)の合成
ポリロタキサンの合成の前に、全てのPluronicコポリマーを修飾してα,ω-ビス-トリス(2-アミノエチル)アミンPluronicを得た。次いで、ポリロタキサンの合成を、先に記述された異種シクロデキストリンスレッディング(threading)手順にしたがいわずかな変更を加えて行った。典型的には、各乾燥α,ω-ビス-トリス(2-アミノエチル)アミンPluronicトリブロックコポリマー2 gをヘキサン70 mL中に懸濁させ、溶液が均質に見えるまで撹拌する前に、約5分間、浴超音波処理によって分散させた。HP-β-CDおよびSBE-β-CDを、各タイプのPluronicについてCD:PO単位=1:2の比を用いて30%のSBE-β-CDのモル比で混合し、30分間微粉砕した。粉末シクロデキストリン混合物をポリマー懸濁液に添加し、その後2時間激しく撹拌した。次に、混合物を20℃で1時間浴超音波処理し、続いてPluronicコポリマーの分散を改善するために10分間のプローブ超音波処理(モデルW-350, 50 W, 1/2インチ プローブ)を行った。混合物を20℃で72時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去し、得られた材料を、クロロギ酸コレステリル(12当量)を添加する前に、乾燥CH2Cl2 40〜60 mLに再溶解した。反応混合物を20℃で24時間撹拌し、濃縮し、次いでジエチルエーテル(700 mL)中で沈殿させた。未反応の試薬および貫通されていないシクロデキストリンを除去するために、粗生成物をCH3OH (300 mL)に溶解し、ジエチルエーテル500 mL中で沈殿させ、次いでろ過した。最後に、生成物を、最初にDMSO中で12,000〜14,000および6,000〜8,000 MWCOの再生セルロース膜を用いた連続透析によって精製し、白色のHP-β-CD/SBE-β-CD-PR-Chl粉末を生成させる凍結乾燥の前に5日間、脱イオン水と徐々に交換した。1H NMR (500 MHz, Cryoプローブ, DMSO-d6): δ = 6.92 ppm (S, H-NCOカルバメート)、5.25 ppm (t, 1H, Chl-エチレンH)、4.5〜5.0 ppm (b, CDのC1-H)、4.5 ppm (b, HP-β-CDのOHプロピル)、3.5〜3.8 ppm (m, CDのC3,5,6-H)、3.5 ppm (m, PEG-CH2)、2.6〜2.8 ppm (m, 16H, TAEAのCH2)、1.6 ppm (b, (CH2)-SO3-)、1.2 ppm (d, CH3-HP-β-CD)、1.0 ppm (d, PPGのCH3)、0.8〜0.6 ppm (m, Chl-CH3)。
【０１７８】
1,8-ジアミノ-3,6-ジオキソオクタン修飾ポリロタキサン(DADO-HP-β-CD/SBE-β-CD-PR)の合成
前段階からの乾燥ポリロタキサン(200 mg)をDMSO 20 mLに溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌した。この混合物に、TEA (1.5当量のOH基)を加え、反応物を30分間撹拌した後、過剰の1,1'-カルボニルジイミダゾールを加え、24時間撹拌した。次に、過剰の1,8-ジアミノ-3,6-ジオキソオクタンを溶液にゆっくりと加え、混合物を20℃で24時間撹拌した。生成物をDMSOおよび脱イオン水中で12,000〜14,000および6,000〜8,000 MWCOの再生セルロース膜を用いて3日間透析することによって精製し、次いで凍結乾燥により凍結乾燥して1,8-ジアミノ-3,6-ジオキソオクタン修飾ポリロタキサン(DADO-HP-β-CD/SBE-β-CD-PR)の白色粉末を生成させた。1H NMR (500 MHz, Cryoプローブ, DMSO-d6): δ = 6.92 ppm (S, H-NCOカルバメート)、5.25 ppm (t, 1H, Chl-エチレンH)、4.5〜5.0 ppm (b, CDのC1-H)、4.5 ppm (b, HP-β-CDのOHプロピル)、3.5〜3.8 ppm (m, CDのC3,5,6-H)、3.5 ppm (m, PEG-CH2)、2.6〜2.8 ppm (m, 16H, TAEAのCH2)、1.8 ppm (b, DADOのNH2)、1.6 ppm (b, (CH2)-SO3-)、1.2 ppm (d, CH3-HP-β-CD)、1.0 ppm (d, PPGのCH3)、0.8〜0.6 ppm (m, Chl-CH3)。
【０１７９】
p-SCN-Bn-DOTA修飾ポリロタキサン(DOTA-HP-β-CD/SBE-βCD-PR)の合成
前段階からのHP-β-CD/SBE-β-CD-PR (150 mg)をDMSO 5 mLに溶解し、Ar下で撹拌した。この混合物に、p-SCN-Bn-DOTA (50 mg, 0.073 mmol)を加え、20℃で24時間撹拌した。反応を停止させ、生成物を透析により精製して、DMSO、続いて水中で12,000〜14,000および6,000〜8,000 MWCOの再生セルロース膜を用い未反応のいかなる試薬も除去した後に、p-SCN-Bn-DOTA修飾ポリロタキサン(DOTA-HP-β-CD/SBE-βCD-PR)の粉末試料を生成させる凍結乾燥を行った。1H NMR (500 MHz, Cryoプローブ, DMSO-d6): δ = 13 ppm (Ben-NH-尿素)、9.5 ppm (尿素-NH-) 7.5〜7.0 ppm (d, 4H-Ar-DOTA)、6.92 ppm (S, H-NCOカルバメート)、5.25 ppm (t, 1H, Chl-エチレンH)、4.5〜5.0 ppm (b, CDのC1-H)、4.5 ppm (b, HP-β-CDのOHプロピル)、3.5〜3.8 ppm (m, CDのC3,5,6-H)、3.5 ppm (m, PEG-CH2)、2.6〜2.8 ppm (m, 16H, TAEAのCH2)、1.8 ppm (b, DADOのNH2)、1.6 ppm (b, (CH2)-SO3-)、1.2 ppm (d, CH3-HP-β-CD)、1.0 ppm (d, PPGのCH3)、0.8〜0.6 ppm (m, Chl-CH3)。
【０１８０】
ポリロタキサンガドリニウム錯体(Gd3+-HP-β-CD/SBE-β-CD-PR)の調製
ガドリニウム錯体化を次のように行った: GdCl3.6H2O (2当量の1つのDOTA)をH2O (5 mL)に溶解し、H2O (10 mL)に予め溶解されたDOTA-HP-β-CD/SBE-βCD-PR試料と混合し、NaOHおよびHCl溶液を用いて溶液のpHを5.5〜6.50前後に維持した。反応混合物を50℃で48時間撹拌し、生成物をMWCO (6.0〜8.0 kD)を有する膜を用い水(pH 7)に対して3日間透析した。非キレート化ガドリニウムを除去するために、試料をSephadex G 25カラムに通し、キシレノールオレンジを用いて微量の遊離Gd(III)イオンを検出した。透析後のポリロタキサン試料溶液中ではキシレノールオレンジを用いて色の変化(黄色からピンク色または紫色)が観察されないはずである。2つの波長(435および578 nm)での吸光度を推定するために、UV可視装置(CARY 50 Bio UV-Visible Spectrophotometer)を利用した。試料の水溶液50 μLおよび色素の酢酸塩緩衝液500 μLのピンク色および紫色により、遊離Gdの存在が示唆された。回収された画分を凍結乾燥して最終生成物を得た。
【０１８１】
核磁気共鳴, NMR
1H NMRスペクトルは、CryoProbeを備えたBruker AV-III-500-HDを用いて収集した。DMSO重水素化溶媒1 mLに溶解された各ポリロタキサンおよそ15 mgを用いて、別段の指示がない限り溶媒としてDMSO-d6を用い25℃でスペクトルを記録した。
【０１８２】
ゲル浸透クロマトグラフィー
ポリロタキサン造影剤の絶対質量は、RIおよび光散乱検出を使い流速0.1 mL/分で溶出液としてDMSOを用いて、Shodex SB-803-HQカラムを備えたAgilent Technologies 1200シリーズクロマトグラフから得た。Pullulan (MW 12,000 kD)、および3種のデキストラン(MW 11,600; 48,600; および667,800 kD)を標準物質として用いた。試料をDMSO (2 mg/mL)に溶解し、150分間溶出させた。
【０１８３】
分析的超遠心分離分析
AUC (Becman Coulter optimer-XL1)技法を用いて、ポリロタキサン分子の分子量を決定した。速度沈降法を50000 rpmの速度で20時間行った。試料を1 mg/mLの濃度でDMSOに溶解し、7.15 cmのセルに導入した。参照セルは純粋なDMSOで満たした。
【０１８４】
誘導結合プラズマ質量分析法
ICP-MS (Quadrapole ICP-MS (Agilent Technologies 7500am, West Lafayette, IN)を利用して、ポリロタキサン中のガドリニウム含量を分析した。試料を2%硝酸(TraceMetal Grade, Fisher Scientific)で消化し、標準添加法を用いてガドリニウム、1 mg/mLの2% HNO3 Certiprep ME1標準溶液(SPX CertiPrep, Metuchen, NJ)から希釈し、MicroMist Nebulizer(Glass Expansion 4 Barlow’s Landing Rdを備えた温度制御スプレイチャンバに導入した。
【０１８５】
Gd3+-HP-β-CD/SBE-βCD-PRの流体力学的直径および表面ゼータ電位の測定
材料のサイズ、サイズ分布およびゼータ電位を、粒径分析器(Zetasizer Nano S, Malvern Instruments Ltd.)を用いて20℃、散乱角90°の動的光散乱によって評価した。少なくとも3回の測定を行い、各試料に対しゼータ電位およびサイズ決定について平均した。
【０１８６】
1H NMRD
全ての試料の縦緩和速度曲線は、0.010〜40 MHzのプロトンラーモア周波数範囲に対応する0.24 mTから0.97 Tまでの磁場の30の値を網羅する従来のFFC法にしたがいStelar SPINMASTER 1T高速フィールドサイクリング(FFC)緩和計(Stelar Mede, Pavia, Italy)を用いて非重水素水中およそ0.5 mMの水溶液にて得た。30℃で標準プレ偏光(PP/S)および非偏光(NP/S)取得シーケンスを用いた。試料は、1H核の核磁化が飽和に達するまで、高磁場Bpol (25 MHz)で分極された。次に磁場を検出磁場Bacq (16 MHz)に切り替え、磁化を90°パルスで測定し、その後に時間依存減衰曲線の取得を行った。
【０１８７】
緩和測定
Bruker Biospin MRI GmbH容積コイル, 86 mm IDを備えた7 T Bruker BioSpecスキャナ(Bindley Bioscience Center, West Lafayette, IN) 47/30を用い、23℃にて300 MHzで作動させて、造影剤およびJ774マクロファージ細胞の縦方向および横方向の緩和速度を測定した（RES300 1H 112/086 QNS TO AD）。ポリロタキサン試料を脱イオン水に溶解し、0.05、0.10、0.30、0.50、0.80、および1.0 mMのGd含量の濃度有する5つの溶液(300 μL)を調製した。細胞取り込み実験の場合、溶解したマクロファージ細胞を300 μLのエッペンドルフに移入した。T1およびT2値は、それぞれインバージョンリカバリーシーケンスおよびマルチスライスマルチエコー(MSME)シーケンスを用いて測定された。試料の溶液から得られた画像ごとに、最小二乗曲線を適合させることによって非線形磁化回帰方程式、T1の場合：
2018532036.tif 000049
、およびT2の場合：
2018532036.tif 000050
を得る。使用されるパラメータは以下の通りである。r1: 反復時間、TE = 50.72、100、350、750、1250、2500、3500、および5000 ms、エコー時間、TE = 22.22 ms、FOV = 10×10 mm2、マトリックス = 128×128、スライス厚さ = 1.0 mm、取得数 = 1。r2 : TR = 2000 ms、TE = 15、30、45、60、75、90、105 ms、FOV = 20×20 mm2、マトリックス = 128×128、スライス厚さ = 1 mm、取得数 = 1。r1およびr2値は、同じROIを用いて、それぞれ、Gd濃度に対する1/T1および1/T2のプロットの線の傾きにより決定された。
【０１８８】
インビトロMRI画像化
緩和性試験の間に先に分析されたポリロタキサン試料の溶液のMR画像、およびマクロファージ細胞を、同じ器具であるBruker Biospin MRI GmbH容積コイル, 86 mm IDを備えた7 T Bruker BioSpecスキャナ(Bindley Bioscience Center, West Lafayette, IN) 47/30を用い、300 MHzで作動させて取得した。T1強調(T1w)スピンエコー画像を、以下のパラメータの下で集めた: TR/TE = 100/4 ms、FOV = 58 x58 mm2、マトリックス = 256 x 256、スライス厚さ = 2 mm、FA = 90°、取得数 = 1。得られた画像をImageJで処理した。
【０１８９】
インビボMR画像化
動物
ポリロタキサン造影剤のインビボ研究は、Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC)によって承認されたプロトコル(1112000342)にしたがい7〜9週齢の雌性BALBcマウス(各20 g)で行った。マウス(n = 3)を、SomnoSuite器具により100% 酸素と混合したイソフルラン(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)で麻酔した。誘導条件は2.5% イソフルランで250 mL/分の酸素に固定し、マウスを250 mL/分の酸素、1.8% イソフルランでスキャナに固定した。マウスの温度は水加熱浴床システムにより維持され、呼吸速度はマウスの下に挿入されたエアパッドを備えたSAシステムによりモニターされた。
【０１９０】
方法
300 MHzで作動する、Bruker Biospin MRI GmbH容積コイル, 86 mm IDを備え、冠状面像を収集するためにParaVisionソフトウェアにインターフェースで接続された7 T Bruker BioSpecスキャナ(Bindley Bioscience Center, West Lafayette, IN) 47/30でスキャンするために、高分解能T1強調3D勾配エコーシーケンスを実行した。次いでマウスの尾静脈に0.05 mmol/kg体重で試料の生理食塩水200 μLを静脈内注射した後、以下のパラメータの下で同じ高分解能T1強調3Dシーケンスにより異なる5時点で注射後画像を取得した: TR/TE = 15/3.0 ms、FOV = 80×30×30 mm3、マトリックス = 384×192×32、スライス厚さ = 30 mm スライスギャップなし、FA = 20°、取得数 = 3、分解能 = 0.20×0.15×0.90 mm3。同様に、以下のパラメータの下で異なる血管に富む器官を明らかにするために、異なる時点で2D T1強調横断画像を取得した: TR/TE = 500/1.5 ms、FOV = 50×50 mm2、マトリックス = 256×256、スライス厚さ = 2 mm、FA = 30°、取得数 = 2、分解能 = 0.20×0.20 mm2、スライスギャップ = 1.0 mmあり。
【０１９１】
画像分析
組織シグナル強度の変化を定量化するために、関心領域(ROI)を2D T1強調スキャンから得られた異なる器官の画像に描き、ParaVisionソフトウェアを用いて平均強度を評価した。以下の方程式:
2018532036.tif 000051
を用い、組織についてのコントラスト対ノイズ比(CNR)を計算した。
【０１９２】
ここでMSIは平均シグナル強度を表し、StDは標準偏差を示す。
【０１９３】
細胞生存率
J774細胞においてPRによる毒性の可能性を調べるために、MTSアッセイ法を用い細胞生存試験を行った。細胞生存率をPRの量に応じて測定した。細胞を、37℃、5% CO2、および95% 相対湿度で10% FBSを補充した完全DMEM培地中で培養した。細胞を10,000細胞/ウェルの密度で96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に播種した。24時間後、培地を、増加しているPR濃度を含有する無血清培地と交換し、細胞をMTS試薬(15 μL)の添加前に24時間インキュベートし、2時間インキュベートした。次に、マイクロプレートリーダー(SpectraMax Plus 384プレートリーダー)を用い492 nmの波長で吸光度を測定した。PRなしの培地で培養された対照細胞に対する細胞生存率(%)は、
[A]試験/[A]対照 × 100 (%)
として計算され、ここで[A]試験はPRを有するウェルの吸光度であり、[A]対照は対照ウェル(未処理細胞)の吸光度である。全ての細胞毒性値を三つ組で測定し、平均した。
【０１９４】
細胞取り込み試験
化合物の細胞内部移行を決定するためにMRIスキャニングを用いた。この方法は、カチオン性と考えられないまたはヌクレオチドと複合体化していない試料の細胞取り込みを研究するのに最適である。これを行うため、J774マクロファージ細胞株を用いて、24ウェルプレートに1ウェル当たり100,000細胞をプレーティングし、実験の前に24時間にインキュベートすることによって、複合体の取り込みを研究した。PR化合物を無血清培地中37℃で12時間、終濃度0.1 mMで細胞とともにインキュベートした。12時間後、使用済みの培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、溶解させた。次いで、これらの細胞を収集し、Bruker 7T Biospect小型動物スキャナ(Bindley Bioscience Center, West Lafayette, IN)での逆スピンエコースキャニングを用いて分析した。緩和T1およびT2値は、ポリロタキサン溶液のインビトロ画像化に利用されたものと同様のスキャニング条件を用いて、300 μLのプラスチック容器に含まれた細胞から記録した試料画像より収集した。
【０１９５】
タンパク質ハードコロナプロテオミクス
正常ヒト血清はComplement Technology, Inc (Tyler, TX)から購入し、使用直前に融解した。PR (100 μg)をPBSに取り、10分間超音波処理した後に、未希釈のヒト血清(1:1 v/v)とともに37℃で1時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、試料を4000×gで10分間遠心分離し、PRペレットを冷PBS 150 μLで4回洗浄した。3つの別々のインキュベーションを各PRファミリーメンバーについて行った。
【０１９６】
トリプシンペプチドは、ナノLCシステム(1100 Series LC , Agilent Technologies, Santa Clara, CA)にて分離された。ペプチドを濃縮のためAgilent 300SB-C18濃縮カラム(5×0.3 mm, 5 μm)に負荷し、濃縮カラムを5分後にナノ流路に切り替えた。ペプチドを、AgilentのC18逆相ZORBAX 300SB-C18分析カラム(0.75 μm × 150 mm, 3.5 um)で分離した。カラムをNew Objectiveの発光チップに接続し、高分解能ハイブリッドイオントラップ質量分析計LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific)のナノエレクトロスプレーイオン化(ESI)源に連結した。アセトニトリル/0.1%ギ酸(移動相B)直線勾配を用いて、カラムからペプチドを溶出させた。最初の5分間、カラムを95% H2O/0.1% ギ酸(移動相A)で平衡化し、続いて0.3 ul/分にて65分間で5% B〜40% Bの直線勾配、その後さらに10分間で40% B〜100% Bの直線勾配を行った。カラムを100%のACN/0.1% FAで洗浄し、次の試料を注入する前に95%のH2O/0.1% FAで平衡化した(全方法時間 = 95分)。キャリーオーバーを避けるために、ブランク注入を試料間で行った。LTQ-オービトラップ質量分析計は、各完全MSスキャン(30,000分解能)に続いて8つのMS/MSスキャンが続き、ここで8つの最も豊富な分子イオンが35%の正規化された衝突エネルギーを用い衝突誘起解離(CID)により選択され断片化された、データ依存性ポジティブ捕捉モードで操作された。データベースの検索は、MaxQuant for LFQ (Label Free Quantitation、LFQ)を用いて行われた。ヒト(SwissProt)注釈付きデータベースを検索に用いた。マスコットデータベース(Mascot Database)の検索結果を用いて初期スペクトルカウンティングを行った。
【０１９７】
使用した用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられ、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特徴またはその一部のいずれかの等価物を排除する意図はなく、主張された本発明の範囲内でさまざまな変更が可能であるものと認識される。したがって、本発明は、好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書において開示された概念の変更および変形は、当業者に依りうること、ならびにそのような変更および変形は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられるものと理解されるべきである。
【０１９８】
本発明は以下の態様を提供し、その番号付けは、重要度を指定するものと解釈されるべきではない。
【０１９９】
態様１は、以下に関する：
一般式：
2018532036.tif 000052
を有する、
ポロキサマーコアと少なくとも1つのシクロデキストリンとを含む、ポリロタキサン、またはその塩:
式中、
各mおよびnは、独立して、0〜30の整数であり、ただしm + m' + n + n'が約4〜約30であることを条件とし;
CおよびC'は同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000053
式中、各L2は独立して、結合または(C1〜C6)アシルであり; 各G3は、-O-、-NH-、および-S-から選択される0〜5個の基が割り込んでいる、置換もしくは非置換(C6〜C50)ヒドロカルビル基であり、ここで(C6〜C50)ヒドロカルビル基は立体的にかさ高く;各sは独立して、1〜6の整数であり;
Bは以下:
2018532036.tif 000054
を表し、これに対して末端キャップ基が(C1〜C6)ヒドロカルビレン基を介してBに共有結合しており、またはBは炭水化物、ポリペプチド、ポリカーボネート、ポリアミド、もしくはポリエステルポリマーを表し;
式中、R5はメチルであり; dは約1〜約800の整数であり; かつqは約6〜約800の整数であり; 
Aは一般式(I)の大環状ホスト分子を表し:
2018532036.tif 000055
式中、
xは0〜8の整数であり; ZはOまたはNHであり;
各R1およびR2は独立して、水素、置換もしくは非置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基または下記式(IIIc)の基であり:
2018532036.tif 000056
式中、yは0〜10の整数であり; pは1〜10の整数であり; X2は(C1〜C6)アシル、短鎖ポリペプチド、短鎖炭水化物、ポリエステルまたはポリアミドを表し; X3およびX4は各々、独立して、-O-、-NH-、カルバミル基、ヘテロシクリル基、ジスルフィド(-S-S-)、アミドまたはエステルであり; かつR4はレポーター基であり、ただし少なくとも1つのR2基が式(IIIc)の基であることを条件とする。
【０２００】
態様２は、
CおよびC'が同じかまたは異なり、下記式の末端キャップ基を表し:
2018532036.tif 000057
式中、各L2は独立して(C1〜C6)アシルである、態様1のポリロタキサンに関する。
【０２０１】
態様３は、
L2がC=Oである、態様1〜2のポリロタキサンに関する。
【０２０２】
態様４は、
各sが2である、態様1〜3のポリロタキサンに関する。
【０２０３】
態様５は、
各G3が独立して、コレステリル基、2,4,6-トリニトロフェニル基、シクロデキストリンラジカルまたはフルオレセインラジカルである、態様1〜4のポリロタキサンに関する。
【０２０４】
態様６は、
Bが以下:
2018532036.tif 000058
を表し、これに対して末端キャップ基がカルバミル基、ヘテロシクリル基、ジスルフィド(-S-S-)、アミドまたはエステルを介してBに共有結合している、態様1〜5のポリロタキサンに関する。
【０２０５】
態様７は、
R1が置換(C1〜C6)ヒドロカルビル基であり、かつR2が式(IIIc)の基である、態様1〜6のポリロタキサンに関する。
【０２０６】
態様８は、
xが1であり、かつzが0である、態様1〜7のポリロタキサンに関する。
【０２０７】
態様９は、
X2が(C1〜C6)アシルを表す、態様1〜8のポリロタキサンに関する。
【０２０８】
態様１０は、
X2がC=Oである、態様1〜9のポリロタキサンに関する。
【０２０９】
態様１１は、
X3およびX4がそれぞれNHである、態様1〜10のポリロタキサンに関する。
【０２１０】
態様１２は、
m + m' + n + n'が約5〜約20である、態様1〜11のポリロタキサンに関する。
【０２１１】
態様１３は、
Aがヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HPβCD)である、態様1〜12のポリロタキサンに関する。
【０２１２】
態様１４は、
A'が4-スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン(SBEβCD)である、態様1〜13のポリロタキサンに関する。
【０２１３】
態様１５は、
Aがヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであり、かつm + nが約2〜約10であり;A'が4-スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリンであり、かつm' + n'が約2〜約10である、態様1〜14のポリロタキサンに関する。
【０２１４】
態様１６は、
レポーター基がキレート化部分である、態様1〜15のポリロタキサンに関する。
【０２１５】
態様１７は、
キレート化部分が、放射性核種を含む放射性核種キレート化部分である、態様16のポリロタキサンに関する。
【０２１６】
態様１８は、
放射性核種キレート化部分が、常磁性核種を含む常磁性核種キレート化部分である、態様17のポリロタキサンに関する。
【０２１７】
態様１９は、
キレート化部分がDOTAラジカルまたはDO3Aラジカルである、態様18のポリロタキサンに関する。
【０２１８】
態様２０は、
ポリロタキサンが、
HPβCD/SBEβCD-F127 (ここでd = 200およびq = 65);
HPβCD/SBEβCD-F68 (ここでd = 151およびq = 29);
HPβCD/SBEβCD-L35 (ここでd = 22およびq = 16);
HPβCD/SBEβCD-L64 (ここでd = 26およびq = 30);または
HPβCD/SBEβCD-L81 (ここでd = 6.25およびq = 43)であり、
GPC分析によって決定された場合に約20,000 g/mol〜約50,000 g/molの重量平均分子量を有し;
HPβCDが式(I)の大環状ホストであり、
式中、各R1はHであり、ZはOであり、かつR2は式(IIIc)の基であり、ここでyは0であり; X2はC(O)Oであり; X3およびX4はそれぞれ-NH-であり; pは2であり; かつR4はDOTAであり; 
各sが2であり; 各L2 C(O); かつ各G3がコレステリル基を表す、下記式:
2018532036.tif 000059
の基CおよびC'はC(O)基を介して、各ポリロタキサンに対して変数dおよびqが上記のように定義される下記式:
2018532036.tif 000060
の基Bに共有結合している、
態様1のポリロタキサンに関する。
【０２１９】
態様２１は、
約1〜約10個のHPβCD分子および約1〜約10個のSBEβCDを含む、態様20のポリロタキサンに関する。
【０２２０】
態様２２は、
態様1〜21のポリロタキサンおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物に関する。
【０２２１】
態様２３は、
態様1〜21のポリロタキサンまたは態様22の薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、ニーマン・ピック病C型(NPC)を処置するための方法に関する。
【０２２２】
態様２４は、
態様1〜21のポリロタキサンまたは態様22の薬学的組成物の画像化に十分な量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、画像化のための方法に関する。
【図１】
2018532036.tif 000071
【図２】
2018532036.tif 000072
【図３Ａ】
2018532036.tif 000073
【図３Ｂ】
2018532036.tif 000074
【図３Ｃ】
2018532036.tif 000075
【図３Ｄ】
2018532036.tif 000076
【図３Ｅ】
2018532036.tif 000077
【図４】
2018532036.tif 000078
【図５】
2018532036.tif 000079
【図６】
2018532036.tif 000080
【図７】
2018532036.tif 000081
【図８】
2018532036.tif 000082
【国際調査報告】
2018532036.tif 000083