(57)【要約】本発明は、患者における低毒性感染症を、真正感染症と偽陽性とを判別することによって検出する方法を提供する。本方法は、患者試料中の片利共生微生物（複数可）の存在または量を試験することを含み、特に、片利共生微生物は低毒性感染症の原因になり得るものである。片利共生微生物の試験を行うと、試料汚染が頻繁なせいで多数の偽陽性が検出されるので、これらの偽陽性と真正の慢性感染症とを判別するための試験も行われる。本発明によれば、試料からの核酸プロファイルを評価することによって、偽陽性が判別される。【選択図】図６
2018523492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における低毒性感染症の検出方法であって、
低毒性感染症の原因となる片利共生微生物が患者試料中に存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験することと、
前記試料由来のＲＮＡプロファイルを低毒性感染症を示すＲＮＡシグニチャについて評価して、偽陽性及び／または偽陰性と真正の低毒性感染症とを判別することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記患者が炎症状態の症状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症状態の症状が、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍、前立腺炎、前立腺癌から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が椎間板組織である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が慢性腰痛（ＣＬＢＰ）及び／または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
手術時に前記試料が採取される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料の一部にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種のうちの１種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料の少なくとも一部が消化され、ＤＮＡが単離される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記片利共生微生物のＤＮＡが増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料中の前記片利共生微生物（複数可）が、ＰＣＲ、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーションもしくはメタゲノム分析で検出または定量される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡシグニチャが、感染性臨床試料由来のＲＮＡプロファイル及び非感染性臨床試料由来のＲＮＡプロファイルでトレーニングされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記片利共生微生物の存在に対して試験結果が陽性（すなわち高含量）である臨床試料、及び前記片利共生微生物の存在に対して試験結果が陰性（すなわち低含量）である臨床試料由来のＲＮＡプロファイル用いて、ＲＮＡシグニチャをトレーニングする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記片利共生微生物が存在するかどうかが、定量的ＰＣＲまたはシークエンシング（培養、免疫化学法、分光法もしくはインサイチュ・ハイブリダイゼーションの少なくとも１つを用いたもの）から任意選択的に選択される少なくとも２つの検出方法により判別される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡシグニチャが、片利共生微生物及び非感染性細胞に感染した細胞培養からのＲＮＡプロファイルでトレーニングされたクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞培養がＮＰ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡシグニチャがマイクロＲＮＡシグニチャである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡシグニチャが、長いノンコーディングＲＮＡシグニチャであり、任意選択的にｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡまたはＴ−ＵＣＲの１つ以上を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡシグニチャが、小型ノンコーディングＲＮＡを含み、任意選択的にｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡの１つ以上を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡシグニチャがｍＲＮＡシグニチャである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が片利共生病原体にインビトロ感染する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２７】
慢性感染症をモデリングするため、前記細胞を少なくとも１週間インビトロ感染させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡシグニチャが、１００以下のＲＮＡ、または７５以下のＲＮＡ、または５０以下のＲＮＡ、または２５以下のＲＮＡ、または１０以下のＲＮＡ、または５以下のＲＮＡ、または４以下のＲＮＡの相対的発現を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡシグニチャが、２つまたは３つのＲＮＡの相対的発現を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡが、表２から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡが、表４、表５、または図８から選択されたｍｉＲＮＡである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡシグニチャが、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
手術時に陽性試料に対して局所抗生物質または消毒剤リンスが施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３６】
手術後に陽性試料に対して経口、ＩＶまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３７】
臨床組織試料中の片利共生微生物の低毒性感染症を検出する方法であって、前記方法が、
前記組織中のｍｉＲＮＡプロファイルを検出することと、
低毒性感染症を示すｍｉＲＮＡシグニチャに対して前記ｍｉＲＮＡプロファイルを評価することと
を含み、
前記ｍｉＲＮＡシグニチャは、少なくとも２つの検出方法で前記片利共生微生物の存在に対して陽性（すなわち高含量）である組織試料由来のｍｉＲＮＡプロファイル、及び前記少なくとも２つの方法で前記片利共生微生物の存在に対して陰性（すなわち低含量）である組織試料由来のｍｉＲＮＡプロファイルを用いてトレーニングされる、前記方法。
【請求項３８】
前記検出方法が、核酸増幅、ＤＮＡシークエンシング、微生物培養、免疫化学法、分光法及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出方法が定量的ＰＣＲ及び微生物培養である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡシグニチャが、１０以下のＲＮＡ、または５以下のＲＮＡ、または４以下のＲＮＡの相対的発現を含む、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＮＡシグニチャが、２つまたは３つのＲＮＡの相対的発現を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡが、表２から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＲＮＡが、表４または表５から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＲＮＡシグニチャが、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される炎症状態を有する、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が椎間板組織である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者が慢性腰痛（ＣＬＢＰ）及び／または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
手術時に前記試料が採取される、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料中にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を更に試験する、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種のうちの１種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記試料の一部が消化され、ＤＮＡが単離される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５８】
ＤＮＡが増幅される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記試料中の前記片利共生微生物（複数可）が、ＰＣＲ、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、及びメタゲノム分析の１つ以上で検出または定量される、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記試料中に前記片利共生病原体が存在するかどうかが他の技法では試験されない、請求項３７に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料中に前記片利共生病原体が存在するかどうかがＰＣＲ及び／または培養では試験されない、請求項３７に記載の方法。
【請求項６２】
手術時に陽性試料に対して局所抗生物質または消毒剤リンスが施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６４】
手術後に陽性試料に対して経口、ＩＶまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６５】
低毒性感染症の治療方法であって、低毒性感染症を有すると判定された患者に抗生物質を投与することを含み、前記低毒性感染症が、前記部位からの細胞中のＲＮＡシグニチャの存在によって検出され、前記ＲＮＡシグニチャが低毒性感染症を示す、前記方法。
【請求項６６】
前記患者において前記片利共生微生物が存在することが、任意選択的にＰＣＲ、培養、または顕微鏡検査のうちの１つ以上で、低毒性感染症の症状を呈する部位から採取された試料中に検出される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗生物質が局所的に前記部位に投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗生物質が全身的に投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＮＡシグニチャは、少なくとも２つの検出方法で前記片利共生微生物に対して陽性である組織試料由来のＲＮＡプロファイル、及び前記少なくとも２つの方法で前記片利共生微生物に対して陰性である組織試料由来のＲＮＡプロファイルを用いてトレーニングする、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出方法が、核酸増幅、ＤＮＡシークエンシング、微生物培養、免疫化学法、分光法及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションから選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記検出方法が定量的ＰＣＲ及び微生物培養である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＲＮＡシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＲＮＡシグニチャが、１０以下のＲＮＡ、または５以下のＲＮＡ、または４以下のＲＮＡの相対的発現を含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＲＮＡシグニチャが、２つまたは３つのＲＮＡの相対的発現を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＲＮＡが、表２から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＲＮＡが、表４または表５から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸シグニチャが、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７８】
前記患者が、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される炎症状態の症状を有する、請求項６５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記試料が椎間板組織である、請求項６５に記載の方法。
【請求項８１】
前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記患者が慢性腰痛（ＣＬＢＰ）及び／または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項７８〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
手術時に前記試料が採取される、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記試料中にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を更に試験する、請求項６５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種のうちの１種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項６５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記試料の一部が消化され、ＤＮＡが単離される、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記片利共生微生物のＤＮＡが増幅される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記試料中の前記片利共生微生物（複数可）が、ＰＣＲ、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、及びメタゲノム分析の１つ以上で検出または定量される、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
手術時に陽性試料に対して局所抗生物質が施される、請求項６５に記載の方法。
【請求項９３】
手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項９４】
手術後に陽性試料に対して経口、ＩＶまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１５年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１９６，５０８号の優先権の利益を主張するものであり、その全容は、本明細書において参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト身体は、その内部で数千もの微生物種が人体と絶えず相互作用している超個体である。２０１４年３月の時点で、Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅデータベースには、ヒト身体内に検出された細菌ゲノム（完成し且つ発行された２，７２３種、ならびに進行中の少なくとも１４，８６７種）が列挙されている。数々の研究によって、以前には未知であった数千もの微生物がヒト組織及び血液中に存在することが、明らかにされている。実際に、以前は無菌であると考えられていた環境において、多菌性及び慢性病原体が検出されるようになった。結果として、一連の身体及び神経の炎症性疾患は微生物叢組成のシフトに付随したものであると、昨今では考えられるようになっている。例えば、ヒト皮膚の常在菌であるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）などの片利共生細菌が、慢性腰痛及び椎間板疾患に関連する低毒性感染症をはじめとする低毒性感染症を引き起こす可能性のあることを示唆する証拠が存在している。
【０００３】
病原体によっては、（例えば、片利共生病原体）は、培養技術またはＰＣＲなどの分子技術で、生物学的組織において検出される可能性もあるが、診断目的に用いられる標準の条件下では、微生物の圧倒的大多数が培養不可能である。更に、疑わしい病原体が、或る宿主組織内に遍在する片利共生微生物である場合は試料の汚染が原因で、特に分子検出アッセイを用いたときに、偽陽性の存在率が許容できないほど高くなる。
【０００４】
本発明は、真正感染症と偽陽性とを判別することによって、信頼でき且つ費用効果的な医療ケアを支持することを含む、低毒性感染症（例えば、片利共生病原体による感染）を同定する方法を提供する。本発明は更に、椎間板疾患または慢性腰痛に付随する感染症を含む、低毒性感染症の治療方法を提供する。本発明の他の目的は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、患者試料中の片利共生病原体の存在を判別し、片利共生微生物による慢性感染症例と偽陽性症例とを判別する（例えば、感染症と片利共生微生物叢による試料汚染とを判別する）ことによって、低毒性感染症を同定する方法を提供するものである。これらの実施形態において本発明は、椎間板感染症などの低毒性感染症の診断に有用である。例えば、微生物学的な培養、ＤＮＡ分析、免疫化学法、及び顕微鏡検査のうちの１つ以上によって、片利共生微生物叢に対する試験結果が陽性であった試料を宿主細胞のＲＮＡシグニチャに対して評価し、（それにより低毒性感染症を確認して）偽陽性を除外する。続いて、外科医または治療医は、低毒性感染症に罹患していると同定された患者に対し、適切な治療薬を投与できる。
【０００６】
他の態様において、本発明は、（例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓによる）低毒性感染症に対して陽性（高感受性且つ特異性）である試料と低毒性感染症に対して陰性である試料とを判別するｍｉＲＮＡシグニチャを提供する。これらの試験を、分子アッセイ、微生物培養、及び試料の鏡検による分析と併用することによって、偽陽性を判別することもできるし、あるいは、一部の実施形態では、これらを独立に使用することによって陽性試料を同定することもできる。Ｐ．ａｃｎｅｓ感染症に関する例示的なｍｉＲＮＡスコアは、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐに対する相対的発現量をスコアすることによって算出できる。次式に基づく診断ｍｉＲＮＡスコア（ＤＭＳ）は、検証研究において精度が９５％に達し、陽性試料のスコアは−０．０１に等しいかまたはそれ未満であった。
ＤＭＳ＝１８．７１−１１．２４＊ｌｏｇ１０（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ）＋１０．４＊ｌｏｇ１０（ｍｉＲ−５７４−３ｐ）。
【０００７】
Ｐ．ａｃｎｅｓ（もしくは他の片利共生微生物）に対して陽性（すなわち高含量）である試料、及びＰ．ａｃｎｅｓに対して試験結果が陰性（すなわち低含量）である試料に由来するＲＮＡプロファイルから、他のＲＮＡシグニチャがトレーニングされる場合がある。例えば、定量的ＰＣＲ及び少なくとも１つの他の技法（微生物培養、免疫化学法または分光法など）による片利共生微生物の検出（または検出レベル）に基づいて、試料同士をビニングする場合もある。
【０００８】
さまざまな実施形態では、試料中の宿主細胞のコーディング及び／またはノンコーディングＲＮＡのプロファイルを診断試験で使用することによって、低毒性感染症と非感染試料との判別（また、更に一部の実施形態では偽陽性との判別）を行う。慢性低毒性感染症は、それらの低悪性度の感染症によって引き起こされる炎症反応は局所レベル且つ最小限のものにすぎないが、宿主組織のＲＮＡプロファイル（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡプロファイル）により判別できる。
【０００９】
本発明は、術後医療ケア導入時に外科試料に適用することも、あるいは術前治療導入時に生検試料に適用することも可能であるし、且つ／あるいは低毒性感染症の治療によって高侵襲性手技の必要性を減ずることも可能である。
【００１０】
別の態様において、本発明は、低毒性感染症の治療方法を提供する。さまざまな実施形態において、本方法は、全身的に投与される抗生物質で、または局所的に投与される抗生物質もしくは消毒剤で、低毒性感染症を治療することを含む。低毒性感染症は、本明細書中に記載されている方法に従って同定できる。
【００１１】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。    
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】変性椎間板疾患の説明図が提供されている。
【図２】患者の椎間板手術がスケジュールされ、且つ手術部位から椎間板試料が採取される、本発明の実施形態に関するフローチャートである。試料に対する診断試験（ＰＣＲアッセイなど）を実施することによって、試料中の片利共生病原体の存在もしくは不在の検出、または定量を行う。試料が片利共生病原体に対して陽性である場合は、ｍｉＲＮＡプロファイルの実行によって、偽陽性（汚染）と真正感染症とを判別する。低毒性感染症が確認された場合、患者にさらなる治療（例えば、経口、静脈もしくは椎間抗生物質、局所消毒剤治療、または更なる外科的治療）を薦める。
【図３】ヒト椎骨及び椎間板（ＩＶＤ）の概略図である。（ａ）腰椎の側面図である。（ｂ）ＡＦ薄板を部分的に除去し、前方角度から見たＩＶＤである。（ｃ）隣接する２つの脊椎と、典型的動作を示す座標系に介在するＩＶＤと、からなる脊髄部分である。
【図４】Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性及び陰性の椎間板組織内で、それぞれ異なる様式で発現したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ）の正規化発現量を示す。
【図５】基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性例及び陰性例について計算された、診断ｍｉＲＮＡスコア（ＤＭＳ）値を示す。Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性のカットオフＤＭＳ値は、−０．０１である（左パネル）。ＤＭＳ値のＲＯＣ分析は、Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の多い症例（培養及びリアルタイムＰＣＲ）と陰性例とを、ＤＭＳが強力に判別できることを示している（右パネル）。
【図６】基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性例及び陰性例の独立検証について計算されたＤＭＳ値を示す（左パネル）。ＤＭＳ値のＲＯＣ分析は、Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の多い症例（培養及びリアルタイムＰＣＲ）と陰性例とを、ＤＭＳが強力に判別できることを示している（右パネル）。
【図７】コアグラーゼ陰性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉに対して陽性の培養物を含む椎間板組織が、Ｐ．ａｃｎｅｓ陰性試料に特徴的なＤＭＳ値（ＤＭＳ＞−０．０１）を有することを示している。
【図８】Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の多い椎間板組織内で脱調節されたｍｉＲＮＡの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一態様において、本発明は、患者における低毒性感染症を、例えば、真正感染症と偽陽性及び偽陰性を含む非感染試料とを判別することによって検出する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、患者試料中の片利共生微生物（複数可）の存在または量を試験することを含む。片利共生微生物の試験を行うと、、試料汚染が頻繁なせいで多数の偽陽性が検出されるので、これらの偽陽性と真正の慢性感染症とを判別するための試験も行われる。本発明によれば、試料由来のＲＮＡプロファイル（コーディングＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡのいずれか）、例えばｍＲＮＡまたは小型ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ等）のプロファイルを評価することによって、偽陽性を判別する。本明細書に記載されているように、慢性低毒性感染症は、それらの低悪性度の感染症によって引き起こされる炎症反応は局所レベル且つ最小限のものにすぎないが、宿主組織／細胞のＲＮＡプロファイルにより判別できる。
【００１４】
本明細書において用いられている「低毒性感染症」という用語は、片利共生微生物に関連する慢性の低悪性度感染症である。例示的な片利共生微生物としては、宿主組織試料中に分子的に検出できる片利共生生物、または実験室の培養で特定できる片利共生生物のいずれかが挙げられ、限定されるものではないが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（Ｐ．ａｃｎｅｓ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、ｃｏａｇｕｌａｓｅ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種が挙げられる。一部の実施形態では、片利共生微生物は、培養するのが困難かまたは培養不可能である。一部の実施形態では、微生物は、バイオフィルム形成表現型を有する。
【００１５】
一部の実施形態において、本方法は、患者試料中のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を検出または定量することを含む。Ｐ．ａｃｎｅｓは、皮膚、口腔及び胃腸管ならびに尿生殖器官の正常常在微生物の一部を形成する、グラム陽性の耐気性嫌気性菌である。Ｐ．ａｃｎｅｓは、インプラント感染、椎間板炎、筋骨格病態（例えば、骨炎、骨髄炎、滑膜炎−ざ瘡（ａｃｎｅ）−膿疱症−骨化症−骨炎（ＳＡＰＨＯ）症候群）、サルコイドーシス、慢性前立腺炎及び前立腺癌をはじめとする多様な感染症ならびに病態に関連づけられている、日和見病原体でもある。
【００１６】
一部の実施形態において、本方法は、試料中の片利共生及び／または病原体微生物含量の、相対的もしくは絶対的に多いかどうかの判別等、試料の微生物叢組成を判別することを含む。試料の微生物叢組成は、例えば、ｒＲＮＡシークエンシング（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシング）によって判別できる。
【００１７】
低毒性感染症は、いくつかある慢性病態のいずれかを引き起こす原因または要因となりうる。本発明は、低毒性感染症の疑いがある任意の慢性病態に適用できる。ゆえに、一部の実施形態において、患者は、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の可能性のある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される病態を有する。患者は、ヒトまたは動物患者でありうる。概して、試料は、低毒性感染症の疑いがある、炎症もしくは損傷のある組織の外科試料または生検試料である。一部の実施形態において、試料は、コロニー形成され易い部位、または嫌気性片利共生細菌による感染に罹り易い部位から採取されたものである。
【００１８】
一部の実施形態において、患者は、構造上の椎間板損傷及び／または低毒性感染症と一致する、慢性腰痛を有する。一部の実施形態において、患者は、椎間板手術候補になりうると共に、椎間板手術のスケジュールを組まれる場合がある。低毒性感染症に罹患した患者は、適正な診断及び適切な治療を受けない限り、ＣＬＢＰを発症するリスクが高まる場合もあれば、且つ／あるいは「脊椎手術後疼痛症」になるおそれもある。例えば、椎間板手術を受ける患者のなかには、手術を必要とする急性症状を患う前に、ＣＬＢＰをも患うことになる患者もいる。また、椎間板手術を受けた患者で、フォローアップにおいてＣＬＢＰを発症する患者は、或る比率（約５〜１０％）に達しており、時には「脊椎手術後疼痛症」患者または「椎間板切除後症候群」と呼ばれることもある。これらの病態は、統計的に低毒性感染症に関連する。
【００１９】
椎間板炎は、臨床的に明らかになるのがきわめて速やかな場合もあれば、適切な診断方法によってごく容易に診断される場合もあり、あるいは「低悪性度」の「くすぶり」感染症に一変する可能性もある。この感染症は、或る変性プロセスと判別するのが極端に困難な場合もあれば、また、脊髄の疼痛を引き起こすおそれもある。第１の症例では、明らかな局所症状及び全身症状を伴ういわゆる「化膿感染」に帰結することにもなりかねない。そのような「高悪性度」の感染症は、敗血症に進展することもしばしばであり、無処置のまま放置された場合は、敗血症ショックを起こすことさえある。第２の症例において、臨床的特徴は、全身性反応を伴わない局所的疼痛といったような、比較的軽度で且つ非特異的なものでありうる。そのような現象はまた、肩、殿部、及び膝関節の関節形成術後の人工関節周囲の感染症との関連において公知である。特に、罹患患者におけるそのような低悪性度の感染症、症状、及び愁訴は、典型的に感染に関連するものというよりも寧ろ、変性または機械的な脊髄の問題を伴うものに類する傾向がある。核脱水及び環状亀裂などの退行性変化が先在するＩＶＤの場合、健康なＩＶＤとは対照的に、低毒性感染症薬を使用した場合にコロニーを形成する傾向が強くなるので、このことが特に当てはまる。
【００２０】
ゆえに、一部の実施形態において、患者は、椎間板疾患を有する。例えば、試料は、手術中に採取される椎間板切除物でありうる。更に他の実施形態では、患者の椎間板手術をスケジュールし、手術に先立って試験用の細針生検試料を分離する。例示的な椎間板手術としては、椎間板ヘルニア修復手術、主腰椎固定手術、または主椎間板関節形成術が挙げられる。これらの実施形態において、本発明は、椎間板組織において１つ以上の片利共生病原体（例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓ）が存在するかどうか、及び／または低毒性感染症を示すＲＮＡシグニチャが存在するかどうかの分析を伴う。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、微生物の培養、または遺伝学的、免疫化学的もしくは分光学的分析による、椎間板組織試料中の片利共生病原体（複数可）（例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓ）の検出または定量を伴う。本発明は、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を評価して、プロファイルを、低毒性感染症を示すプロファイルまたは低毒性感染症を示さないプロファイルとして分類することを更に含む。一部の実施形態では、ＲＮＡプロファイルを独立に評価することによって（つまり、ＰＣＲ、培養または顕微鏡検査などの他の技法を使用することなしに）、低毒性感染症が存在するかどうかが判別される。
【００２２】
一部の実施形態では、種を好気的及び／もしくは嫌気的に培養し、且つ以後に生化学的及び分光的に（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）同定することを含む培養によって、片利共生微生物が存在するかどうかを評価する。例えば、組織試料を滅菌条件下で処理してから、（例えば、滅菌済の生理食塩水中で）均質化することによって処理することもできる。均質化技法としては、殺菌済の海砂を実験用乳鉢すなわちＳｔｏｍａｃｈｅｒ（Ｓｅｗａｒｄ，ＵＫ）に入れてすりつぶすことを含む、多様な技法を利用できる。均質化試料が好気性培養物及び嫌気性培養物の寒天表面上に接種される。例えば、好気性培養では、ヒツジ血液（ＣＢＡ製）７％をコロンビア血液寒天（Ｏｘｏｉｄ製）に添加して使用でき、嫌気性培養ではヒツジ血液７％及びビタミンＫ（ＷＣＨＡ製）をＷｉｌｋｉｎｓ  Ｃｈａｌｇｒｅｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｇａｒ（Ｈｉ  Ｍｅｄｉａ製）に添加して使用できる。接種されたＷＣＨＡプレートを、３７℃にて嫌気的に（窒素８０％、ＣＯ２１０％、及びＨ２１０％）、最小限１４日間インキュベートする。ＣＢＡプレートを、３７℃にて約７日間、好気的にインキュベートする。一部の実施形態では、均質化組織の一部分を、ブロス（例えば、ＶＬブロス（Ｍｅｒｃｋ製）１０ｍｌ）が入っている試験管に移し、その後、滅菌パラフィン油で覆って酸素の出入を防ぎ、３７℃にて約７日間インキュベートし、好気状態にて３７℃で最小限７日間ＷＣＨＡに接種する。微生物が増殖した徴候が現れたら、そのような管の中身を、ＣＢＡ及びＷＣＨＡに接種して、上記のようにインキュベートする。
【００２３】
得られた分離株をＷＣＨＡプレート（嫌気性雰囲気にて７日間のインキュベーション）、及びＣＢＡ（好気性雰囲気にて１日のインキュベーション）で継代培養することにより、今後の分析に備えて、別個のコロニーを得ることができる。分離株は、増殖特性、コロニー形態、グラム蛍光色素、及び試験カタラーゼにより特徴づけることができる。推定Ｐ．ａｃｎｅｓ分離株は、例えば、ＲａｐｉｄＩＤ  ＡＮＡ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ）または  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（商標）ＬＴ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ＋ソフトウェア＋バクテリアスペクトルライブラリ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐ）を使用した生化学的分析によって同定できる。
【００２４】
分子分析用の試料は、新鮮な組織試料としてもよいし、あるいは、例えばＦＦＰＥ試料としてまたは他の保存技術で保存することもできる。一部の実施形態では、試料を分子分析用に、手術後もしくは生検後約２４時間、または手術後もしくは生検後約４８時間、または約７２時間、または９６時間、保存あるいは処理する。
【００２５】
遺伝子分析に備えて、分析対象の試料から核酸（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を単離する。多量の軟骨（例えば、関節もしくは椎間板組織）が試料に含まれる一部の実施形態では、試料を、コラーゲナーゼ（例えば、コラーゲナーゼＡ）及び／またはプロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）あるいは細胞外基質の分解に有用な他の酵素で消化することによって処理する。
【００２６】
更に他の実施形態では、免疫化学法（例えば、免疫組織化学染色またはＥＬＩＳＡ）を使用して、片利共生生物のタンパク質エピトープを検出する場合がある。保存済または新鮮な組織試料に対して、免疫組織化学染色を行うことができる。例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓに対するモノクロナール抗体を使用でき、限定されるものではないが、細胞膜に結合したリポテイコ酸のエピトープに特異的な抗体（ＰＡＢ抗体）、及びリボソームに結合したトリガーファクタータンパク質のエピトープに特異的な抗体（ＴＩＧ抗体）が挙げられる。
【００２７】
陽性試料を同定する際には、組織試料の鏡検などの他の技法を使用することもできるし、適切な染色試薬（例えば、グラム染色もしくは蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））または対象となる片利共生微生物に特異的な他の免疫試薬を使用することもできる。一部の実施形態では、顕微鏡検査を使用して、細胞内の細菌を同定する。組織内のＰ．ａｃｎｅｓの明視化に関するＦＩＳＨの応用例は、Ａｌｅｘｅｙｅｖ  ＯＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７  Ｎｏｖ；４５（１１）：３７２１−８に記載されている。
【００２８】
一部の実施形態では、細胞内の細菌の核酸を含みうる椎間板（ＩＶＤ）組織から核酸を単離する。ＩＶＤは、脊髄の主要な運動関節であって、横断面内で腎臓の形に類する外観をしており、中央のゼラチン状髄核（ＮＰ）、このＮＰを円周方向に囲繞する膠原性線維輪（ＡＦ）、ならびにＡＦ及びＮＰを椎体から隔てている軟骨終板（ＣＥＰ）の、３つの異なる構造からなる（図３Ｂ及びＢ）。椎骨または骨の終板と称される、椎体のＩＶＤ側の境界部は、半多孔性の肥厚海綿骨の層から構成され、ＣＥＰと共に終板（ＥＰ）を形成している。ＩＶＤは、広範囲な細胞外基質（ＥＣＭ）からなり、このＥＣＭは、組織特異的な表現型を有する細胞によって維持されている。それらの占有率は、組織容量の０．５％未満である。
【００２９】
ＩＶＤの９９．５％は、細胞外基質で占められる。ＮＰ、ＡＦ及びＣＥＰは、基本的な生化学的成分が同じ、つまり、水、プロテオグリカン（ＰＧ）及びコラーゲンであるが、それらの相対的比率は異なる。ＩＶＤの主要ＰＧはアグリカンであり、アグリカンは、最高１００個のケラチン及びコンドロイチン硫酸が共有結合されているコアタンパク質からなる。これらは、強い負電荷を持つグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、水を吸収して、組織に対し（特に、高次に水和されたＮＰに対し）粘弾性挙動を与える。Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンは、総ＩＶＤコラーゲンのおよそ９０％を構成している。コラーゲン繊維は、ＮＰ内では不規則に配向され、ＡＦ内では、単方向的に整列配置された１０〜２５個の薄板に編成される。これらの薄板は、内側ゾーンではＮＰを囲繞し且つＣＥＰに付着する一方、外側ゾーンでは椎骨の終板に付着する（図３Ｂ）。ＩＶＤ内で最も含量の多い非構造タンパク質は、ＭＭＰ（マトリックス・メタロプロテイナーゼ）ならびにＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジン・モチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）の系統群である。これらは、亜鉛に依存するプロテイナーゼであり、ＥＣＭのほとんど全ての成分を開裂しうる。
【００３０】
ＩＶＤの細胞は、細胞外基質（「ＥＣＭ」）を合成し、維持する。これらの細胞によって、ＥＣＭの合成と分解のホメオスタシスが制御される。他の組織と比較して、広範なＥＣＭの維持を司る細胞が比較的少ないせいで、ＥＣＭタンパク質の代謝回転には数か年を要する結果となっている。ＮＰ及びＡＦ内では、脊索細胞（ＮＣ）、ＮＰ細胞及びＡＦ細胞の、３種類の主要な細胞が判別される。ＮＣは、胎生期脊索からの残存物であり、主たるＮＰを構成している。小児期初期に、ＮＣはＮＰ細胞で置き換えられる。ＡＦ細胞及びＮＰ細胞は、間葉起源のものであり、これら両細胞の遺伝子形質発現プロファイルによれば、ＡＦ細胞は線維細胞であり、ＮＰ細胞は軟骨細胞である。ＡＦ細胞はＩ型コラーゲンを、ＮＰ細胞はアグリカン及びＩＩ型コラーゲンを、主要な構造タンパク質として合成する。３つの細胞型のいずれもが維持している細胞周囲基質は、軟骨細胞のコンドロンに類するが、その組成は細胞間基質とは異なっている。
【００３１】
本発明の実施形態に従って、ＮＰの細胞から片利共生病原体を培養することも、あるいは遺伝学的分析用に核酸を単離することも、あるいはＮＰの細胞を細菌性抗原に対して評価することもある。
【００３２】
一部の実施形態では、炎症を起こした組織から採取された細胞において、片利共生病原体の存在が検出される。例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓが細胞内に存在することは、Ｐ．ａｃｎｅｓが宿主内に長期にわたって永続することを裏付けるものであり、結果として慢性炎症状態を引き起こしかねない。
【００３３】
一部の事例では、細菌培養を成就させようという試みが、諸々の理由から失敗する可能性がある。その典型的な理由としては、（１）整形外科関連のバイオフィルムによる感染が、多くの場合、培養陰性であること［Ａｃｈｅｒｍａｎｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．］「Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：ｆｒｏｍ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｔｏ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ．」Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２０１４；２７：４１９−４０］、（２）試料の採取に先立って抗菌治療を開始したこと、（３）生検では、十分な組織／コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）が産生されなかったこと、（４）病巣の末梢／非代表的区域から生検材料を採取したこと、（５）（結核、他の細胞内の病原体、及び特定の嫌気性細菌または真菌の症例によくあるように）特異的な感染体には培養培地が不適切であること、（６）ラボで検体を処理するまでの輸送条件が不適切で遅延が発生したこと、（７）ラボの条件下では（例えば、結核の）増殖率がきわめて低いこと、ならびに（８）微生物学的ラボ内では培養物が繁殖不能に見え、嫌気性菌を探すことに十分な時間をかけてインキュベートせずに、時期早尚に棄ててしまうことが挙げられる。そのほか、微生物学的診断（とりわけ、低悪性度の椎間板感染症は、しばしば嫌気性菌に起因するため）、この診断を確定するのに失敗した場合、さまざまな原因が考えられる。
【００３４】
一部の実施形態では、（培養の代わりに、もしくは培養に加えて）微生物核酸のハイブリダイゼーションまたは増幅により、片利共生病原体の存在もしくは濃度が定量される。例えば、検出アッセイとしては、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）エンドポイントＰＣＲ、マイクロアレイへの核酸ハイブリダイゼーションもしくは核酸シークエンシングが挙げられる。検出アッセイには、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの検出を含めることができる（一部の実施形態では、この検出を逆転写後に含める）。一部の実施形態では、試料を「ディープシークエンシング」に供して、絶対的または相対的に微生物の含量の多い試料を調製する。シークエンシング方式としては、パイロシークエンシング（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ナノポアシークエンシング、電子シークエンシング（Ｇｅｎａｐｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、及びＳａｎｇｅｒシークエンシングをはじめとするさまざまな種類のものが知られている。
【００３５】
これらの分子技術は、きわめて高感受性で且つ特異的であり、従来の微生物学的培養に関連した上述の問題の多くを被らずに済んでいる。しかしながら、これらの技法はきわめて高感受性であり、片利共生細菌が数多く遍在していることから、試料の汚染される可能性が常に懸念され、偽陽性の検査結果が許容不可能な比率になる可能性がある。しかも、Ｐ．ａｃｎｅｓのＤＮＡが、市販のＴａｑポリメラーゼ、及びＰＣＲ溶液を頻繁に汚染することも、明らかにされている。Ｌｕｐａｎ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．「Ｔｈｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」Ｒｏｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｅｔｔ  ２０１３；１８：８００７−１２を参照。
【００３６】
一部の実施形態では、分子検出アッセイを培養と共に実施する。分子アッセイでは、原因病原体を同定できるが、さまざまな抗菌薬に対する原因病原体に特異的な感受性または耐性に関するデータが必ずしも提供されるわけではないので、最適な治療法を開始するのに役立つ追加的な情報を培養により提供する場合がある。
【００３７】
一部の実施形態では、微生物培養、ＰＣＲ、顕微鏡検査、及びその他の技法を試料のコホートに対して使用して、片利共生病原体（例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓまたはその他）を同定し、且つＰ．ａｃｎｅｓ（または他の片利共生病原体）の高含量レベルに相関するコホートにおいてＲＮＡシグニチャを同定する。このＲＮＡシグニチャは、他の片利共生病原体検出方法の代替として、つまり、微生物培養、ＰＣＲまたは他の技法を実行する必要なしに、独立に他の試料に対して使用できる。
【００３８】
進行中の感染症の毒性が低いほど、感染症の診断は困難である。これらの、いわゆる低悪性度の感染が引き起こす炎症反応は、局所レベルでは有意に軽度で、全身レベルでは皆無またはごく最小限である。これは、次いで、撮像研究及びラボ試験がそのような感染を的確に診断する能力にマイナスの影響を与えるが、それに加えて、より重要なことには、そのような感染症が存在するかどうか及び患者の症状の原因に対する一次的な臨床的疑いを早々抑制しうる。例えば、ＭＲＩ（腰痛用に最もよく用いられていて、ＣＲを凌ぐ先進の診断撮像研究）では、椎間板感染症が、しばしば軽度で且つ非特異的であることにより特徴づけられる。感染した椎間板に隣接する椎骨終板において最もよく観察される変化は、多かれ少なかれ顕著な（タイプＩのモディック変化と同等な）骨髄浮腫であり、活性化された骨軟骨症など、よく起こるある特定の変性症状を伴うのが観察される場合もある。
【００３９】
一部の実施形態では、１６Ｓ及び／または２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ならびに特に１６Ｓの可変領域などの微生物のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子が、分子検出アッセイで検出される。例えば、身体部位における微生物コミュニティの複雑さを特徴評価するには、１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングを使用できる。１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングは、微生物分類群、例えば、種または高等な分類学的レベルの認識を促し、以前には未知であった微生物の事例では、一般分類（例えば、族、系統）を可能にする。メタゲノムホールゲノムショットガン（ＷＧＳ）シークエンシングは、微生物コミュニティ内に存在する機能及び経路に対する洞察を提供するものである。
【００４０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列には、両方の高度に保存された領域及び可変領域が含まれる。これらの可変領域（Ｖ１〜Ｖ９の、９とおりの数）を使用して、系統発生に従って生物分類を行うことによって、１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングが、試料中に存在する分類群を同定するうえでの一助となり、メタゲノムにおいて特に有用なものになる。これらの配列は、チップ技術、ＲＴ−ＰＣＲ、またはディープシークエンシングを使用して調べることができる。
【００４１】
一部の実施形態では、片利共生病原体の存在は、マイクロアレイなどのハイブリダイゼーションベースのアッセイで判別される。例えば、ＰｈｙｌｏＣｈｉｐ手法は、特に、相対的に含量の多い５０，０００超の個々の微生物分類群を同定し測定する、マイクロアレイベースの方法である。この手法は、全ての細菌ゲノム内に存在する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列全体を分析することによるものであるが、特定の微生物タイプに対するフィンガープリントを提供するという点では相違している。マイクロアレイベースのハイブリダイゼーション手法を使用すれば、低含量の重要な細菌の測定値よりも、微生物群落において圧倒的大多数を占めるメンバの測定値の方が優先されるのを確実に回避できる。
【００４２】
一部の実施形態において、検出アッセイは、Ｐ．ａｃｎｅｓなどの重要な片利共生物の型判定を可能にし、汚染の可能性を判別し、あるいは感染に対して効能がある可能性の高い有望な治療薬を同定する助けとなる。一部の実施形態において、本方法は、組織試料（例えば、椎間板組織）中、及び誘導済Ｐ．ａｃｎｅｓコロニー中の片利共生病原体菌株（例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓ）を、ＰＣＲまたは他の分子技術で型判定することを含む。Ｐ．ａｃｎｅｓが汚染の結果生じたものではない場合、両方における菌株は同じであるはずである。ゆえに、培養及びＰＣＲの両方で、高レベルの同じＰ．ａｃｎｅ菌株に対して陽性である症例は、格好の基準であると見なされ、且つマイクロＲＮＡプロファイリングに対して真陽性として表される。  
【００４３】
【表１】
2018523492.tif 000003
【００４４】
一部の実施形態では、分子検出アッセイでは、リアルタイムＰＣＲを使用して、検量線に基づいて、Ｐ．ａｃｎｅｓ（または他の片利共生病原体）遺伝子コピーの絶対的定量が行われる。
【００４５】
培養、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、顕微鏡検査または免疫化学法のうちの１つ以上で検出を行った際、１種以上の片利共生病原体が陽性となる場合、概して容認し難いほど偽陽性の比率が高い。その原因として最も可能性が高いのは、微生物叢による頻繁な試料汚染である。これらの偽陽性を判別するため、試料のＲＮＡプロファイルを、低悪性度または低毒性感染症を示すＲＮＡシグニチャ（例えば、ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡシグニチャ）が存在するかどうかについて評価する。例えば、試料中の宿主細胞からＲＮＡを単離することもできるし、（例えば）いくつかある利用可能なｍｉＲＮＡ検出プラットフォームのいずれかを介して、ｍｉＲＮＡが相対的に高含量かどうかを評価することもできる。これらには、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｅｘｉｑｏｎ、ＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙｓ（ＴＬＤＡ）Ｈｕｍａｎ  マイクロＲＮＡ  Ｐａｎｅｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＱＩＡＧＥＮ  ＳＹＢＲ（登録商標）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用したＧｒｅｅｎ色素でのｍｉＲＮＡのリアルタイムＰＣＲプロファイリング）、マイクロアレイベースのプラットフォーム（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＭｉＲＮＡ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡマイクロアレイ、Ｅｘｉｑｏｎ製ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）マイクロＲＮＡ  Ａｒｒａｙｓ）、次世代シークエンシングベースのプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製の小型ＲＮＡシークエンシング、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ製の小型ＲＮＡシークエンシング）、及びＦＦＰＥ組織におけるインサイチュマイクロＲＮＡハイブリダイゼーションが挙げられる。概して、ＲＮＡプロファイルは、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／またはシークエンシング技術で定量できる。
【００４６】
ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）シグニチャは、細菌種には関係なく低毒性感染症に相関する場合もあれば、あるいはＰ．ａｃｎｅｓ、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈ、Ｅ．ｃｏｌｉ、もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの細菌種または菌株に対して特異的である場合もある。一部の実施形態では、感染細胞及び非感染細胞由来のＲＮＡプロファイルを用いてクラシファイア・アルゴリズムをトレーニングすることによって、ＲＮＡシグニチャを特定する。細胞はインビトロ感染する場合もあれば、またはインビボ感染細胞（臨床試料から採取された感染細胞）である場合もある。一部の実施形態では、細胞は、Ｐ．ａｃｎｅｓの臨床分離株または他の片利共生病原体にインビトロ感染する。一部の実施形態では、感染培養物を少なくとも１日、少なくとも１週間または少なくとも２週間維持管理し、ＲＮＡプロファイルの判別に先立って、慢性感染を綿密にモデリングする。一連の片利共生病原体に感染した細胞を使用して、細菌に特異的なシグニチャ及び細菌に非特異的なシグニチャを作製できる。一部の実施形態では、ＮＰ細胞をインビトロで培養し、Ｐ．ａｃｎｅｓなどの片利共生病原体に感染させ、結果として得られたＲＮＡプロファイルを使用して、Ｐ．ａｃｎｅｓ感染細胞を非感染細胞と判別するクラシファイア・アルゴリズムをトレーニングする。Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性細胞とその対照であるＰ．ａｃｎｅｓ陰性細胞、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ陽性細胞とその対照であるコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ陰性細胞、ならびにＰ．ａｃｎｅｓ及びコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈ陽性細胞とその対照である両方に陰性の細胞を使用して、クラシファイアをトレーニングできる。
【００４７】
一部の実施形態では、感染細胞（例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓに感染したＮＰ細胞）、及び汚染された細胞を使用して、汚染に起因する真正の慢性感染症と急性「感染症」とを判別することによってＲＮＡシグニチャをトレーニングする。同様に、ＲＮＡシグニチャをトレーニングすることによって、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生生物などの生物を判別することができ、一部の実施形態では、グラム陽性細菌とその対照であるグラム陰性細菌、及び／または細菌種もしくは菌株を判別することができる。
【００４８】
一部の実施形態では、片利共生微生物のレベルに対して試験結果が陽性（すなわち高含量）の試料と、その対照である陰性（すなわち低含量）の試料とを使用して、ＲＮＡシグニチャをトレーニングする。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子技術（例えば、定量的ＰＣＲ）で、任意選択的に培養または顕微鏡検査で同様に、（例えば、コホート内の試料の少なくとも上位５０％、６０％、７０％、７５％、８０％もしくは９０％中の）片利共生微生物に対して陽性試料は高含量とされる。一部の実施形態では、陽性試料は、培養により、少なくとも約１０３ＣＦＵ／ｍＬ、または約１０４ＣＦＵ／ｍＬ超を生成する。定量的ＰＣＲなどの分子技術では、陰性試料は概して陰性であり、すなわち定量的には少なくとも下位１／４、下位２０％または下位１０％である。陰性試料は概して、培養または顕微鏡検査では実質的に陰性である。例えば、一部の実施形態では、陰性試料は、培養で、約１０３ＣＦＵ／ｍＬ未満、または約１０２ＣＦＵ／ｍＬ未満、または約１０ＣＦＵ／ｍＬ未満を生成する。これに関連して、培養方法には、実施例３に示すプロセスを使用できる。一部の実施形態では、陰性試料は、培養で確定されたＣＦＵ／ｍＬに関して下位１／４、または下位２０％、または下位１０％である。
【００４９】
一部の実施形態では、メタゲノム分析の結果を基に、つまり、ディープシークエンシングもしくはハイブリダイゼーションアレイで同定された微生物を絶対的または相対的に高含量で使用して、感染性の臨床試料由来のＲＮＡシグニチャをトレーニングする。
【００５０】
ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡシグニチャを判別または分類するための例示的な計算ツールとしては、主成分分析、単純ベイズ、サポートベクターマシン、近傍法、決定木、ロジスティック、人工ニューラルネットワーク、及びルールベースのスキーマが挙げられる。コンピュータシステムでは、判別アルゴリズムまたは「クラス予測」を使用することもできる。これらのアルゴリズムは、その全容が本明細書において参照により援用されているＲ．Ｓｉｍｏｎ、「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ」、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００３）８９，１５９９−１６０４に記載されている。クラシファイア・アルゴリズムは、教師付き、教師無し、または半教師付きでありうる。
【００５１】
一部の実施形態では、発現制御を含まない１フィーチャ、２フィーチャ、３フィーチャ、４フィーチャ、または５フィーチャ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）が、クラシファイアに使用される。一部の実施形態では、シグニチャを含めるため２〜約１００フィーチャ（ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）が、アルゴリズムに使用される。一部の実施形態では、シグニチャを含めるため２〜約５０フィーチャ、または２〜約３０フィーチャ、または２〜約２０フィーチャ、または２〜約１０フィーチャが、アルゴリズムに使用される。一部の実施形態において、クラシファイアは、５〜５０フィーチャ、または１０〜５０フィーチャ、または２０〜５０フィーチャに基づく。例示的なヒトのｍｉＲＮＡを、表２及び表８に示す。
【００５２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、高含量クラスの内在性の小型ノンコーディングＲＮＡ（１８〜２５ヌクレオチド長）を含む、遺伝子発現に重要な調節因子であり、ｍＲＮＡの分解を促進する能力またはタンパク翻訳を減衰する能力を有する。バイオインフォマティクス研究が推定したところによれば、マイクロＲＮＡは、全てのヒト遺伝子の５０％超を調節できると共に、各ｍｉＲＮＡは数百もの遺伝子標的を制御できる。ｍｉＲＮＡによっては、細胞に特異的な組織に特異的な及び／または開発ステージに特異的な様式にて発現するものもある一方、遍在して発現するものもある。検証済ｍｉＲＮＡの数は増加の一途をたどっており、最新版のウェブベースのデータベースであるｍｉＲＢａｓｅは、ヒトゲノム内の１８００前駆体、及び２３４２成熟配列に対して注釈付けしてある。ｍｉＲＮＡの大半が（注釈付きまたは予測された遺伝子から１ｋｂを超えて離間している）遺伝子間領域に位置することを示唆する、ｍｉＲＮＡのゲノム位置に関する注釈に基づいて、ほとんどのｍｉＲＮＡ遺伝子が自律転写ユニットとして転写されることが想定されている。ｍｉＲＮＡは、胚形成、器官形成、細胞分化、増殖、アポトーシスなどの多くの基本的な生物学的プロセスのマスター調節因子としての役目を果たすことができ、幹細胞系及び免疫系などの主要な生体系に対し影響を及ぼす。他の小型ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ）または長いノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、Ｔ−ＵＣＲ）は、本開示に従って低毒性感染症を検出するのに用いられる場合がある。
【００５３】
結果として、多様なヒト癌、ならびに心血管、尿、及び他の器官系統の病理において、ｍｉＲＮＡ調節解除の特異的なパターンが同定されている。ウイルス感染と比較して、細菌性病原体に対するｍｉＲＮＡの応答は、さほど探究されてこなかった。
【００５４】
一部の実施形態では、２〜約１０００のレベルのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）が、患者試料から単離されたＲＮＡにおいて検出される。例えば、約２〜約５００、もしくは２〜約３００、もしくは２〜約２００、もしくは２〜約１００、もしくは２〜１０のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが検出される。一部の実施形態では、少なくとも５０のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが検出される。これらの実施形態または他の実施形態では、５００以下、３００以下もしくは１００以下、もしくは１０以下のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが検出される。一部の実施形態では、２〜約５または２〜約１０のｍｉＲＮＡが個々に検出され、対照と比較して相対的に含量の多いことが判別される。例えば、ｍｉＲＮＡシグニチャは、表２、表４、表５中のｍｉＲＮＡ用ｍｉＲＮＡプロファイル、または図２もしくは図８のヒトｍｉＲＮＡに基づいて、トレーニングできる。
【００５５】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９７−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐのｍｉＲＮＡのうちの２つ以上が、患者試料（例えば、椎間板組織）中に検出される。一部の実施形態では、（例えば、椎間板組織中に）ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐが検出される。ＲＮＵ３８Ｂ及び／またはＲＮＵ４８などの１つ以上の対照遺伝子の発現に対して相対的に、発現を定量できる。出発材料、試料採取、ＲＮＡの調製及び品質、ならびに逆転写（ＲＴ）効率の量のばらつきを制御するため、対照ＲＮＡを選択する場合もある。内在性コントロール遺伝子に対する正規化は、潜在的ＲＮＡ入力またはＲＴ効率バイアスを補正するための的確な方法である。他の潜在的対照としては、ＡＣＴＢ（ベータアクチン）及びＧＡＰＤＨ４などのハウスキーピング遺伝子が挙げられる。一部の実施形態において内在性対照は、有益な組織タイプ及び細胞タイプ全体にわたって比較的一定で且つきわめて高含量の、遺伝子発現を実証している。一部の実施形態では、コホート内の陽性及び陰性試料中のｍｉＲＮＡフィーチャに対する相対的な発現量に基づいてｍｉＲＮＡスコアを確定し、そのスコアによって個々の陽性及び陰性試料が判別される。Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性の椎間板組織試料とＰ．ａｃｎｅｓ陰性の椎間板組織試料とを判別するための例示的な診断ｍｉＲＮＡスコア（ＤＭＳ）は、ＤＭＳ＝１８．７１−１１．２４＊ｌｏｇ１０（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ）＋１０．４＊ｌｏｇ１０（ｍｉＲ−５７４−３ｐ）であり、カットオフは０．０〜−０．４もしくは０．０〜−０．３、または０．０〜−０．２の範囲内に設定される（Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性はカットオフと等しいかまたはそれ未満）。例えば、一部の実施形態では、カットオフが−０．０１に設定される。一部の実施形態では、このスコアを、微生物培養、及び／またはＰＣＲ（もしくは他の分子アッセイ）の代わりに使用する場合もある。一部の実施形態では、例えば、ＰＣＲまたは他の分子アッセイで同定された偽陽性を同定する目的に、スコアが使用される。
【００５６】
本明細書において記述されている診断試験で、低毒性感染症が確認された場合、患者に治療を受けるように奨める。低毒性感染症が確認されない場合（分子分析の際、培養で偽陽性が検出された場合を含む）、患者に慢性感染の治療を奨めない。
【００５７】
特に、手術に先立って生検を用いたときに試料が低毒性感染症に対して陽性であった場合、手術時に局所抗生物質または消毒リンスを施される場合がある。代わりに、手術に先立って、経口、静脈または局所抗生物質レジメンが投与される場合もある。
【００５８】
手術中に試料が単離され、低毒性感染症に対して試験結果が陽性であった場合、経口、静脈または椎間抗生物質レジメンが、術後の数日間、数週間もしくは数か月間にわたって投与される場合がある。
【００５９】
一部の実施形態では、生検試料に基づいて、患者を低毒性感染症に罹患していると診断することがある。その場合、患者は抗生物質レジメンを投与され、背下部の疼痛が減じられるかまたは疼痛が消失すれば、椎間板切除もしくは他の侵襲的手技などの手術が回避され、例えば、低侵襲性の手技の方が優先されることがある。
【００６０】
一部の実施形態では、定常の椎間板手術（椎間板切除術）中に得られた組織試料で、陽性の検査結果が得られた場合、任意選択的に、利用可能であれば感受性試験、及び綿密な臨床検査、ならびに撮像フォローアップ（ＭＲＩ）に従って、抗生物質治療を行う。患者が、微小椎間板切除術後に、腰痛の持続または増悪で苦しんでいて、進行性の椎間板腔炎症の徴候さえ呈している可能性がある場合、治療専門医は、感染症及び背部痛の両方を治療するため、完全な椎間板切除術及び椎間関節固定術を適応とすることがある。患者が抗生物質治療を受けて改善が見られた場合、一定期間の経過後にその抗生物質を中断して、以後の臨床的及び撮像フォローアップを行う。
【００６１】
一部の実施形態では、予定された手術に先立って、経皮的生検で採取された組織試料で陽性の検査結果を得て、予定された手技に先立って標的化抗生物質の前処理を実行できる。そのような治療下、臨床的改善の可能性に応じて、予定していた手術を低侵襲性手技または保存療法に変更することも可能である。手術中には、罹患している感染症が低悪性度であることを認識したうえで、感染症が寛解する確率及び良好な臨床転帰が得られる確率を高めようという試みから、局所消毒剤または抗生物質が使用される場合もある。
【００６２】
以下、本発明の実施形態について、下記の実施例を通して説明する。
【実施例】
【００６３】
米国では、毎年、およそ８００，０００例もの患者が、難治性神経根（神経障害性）の疼痛を軽減するため、椎間板手術を受けている。この手技は、神経の炎症を引き起こす椎間板の一部の除去を伴う。これら個人の大多数が潜在的に変形性椎間板疾患（すなわち、患者に慢性腰痛、椎間板ヘルニア、坐骨神経痛及び他の病気に罹り易くなる素因を与える病態）を有することから、我々の社会において障害及び羅病が有意な率に達し、一方、これらの手術のうち約２５％は、患者を健康な状態に復帰させることが不可能となっている。
【００６４】
変形性椎間板疾患の原因はしばしば特発性であり、椎間板手術を受けた患者の亜集団が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのほか、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに起因する可能性のある低毒性感染に罹患しているという証拠が強まっている。低毒性感染は、数例の変性椎間板の原因または悪化因子、且つ／あるいは椎間板手術の２５％が、患者をウェルネス状態に復帰させるのに失敗する要因であると考えられている。低毒性感染症は、免疫系を免れる感染症であり、慢性変性病態の一因となる可能性がある。
【００６５】
実施例１．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のインビトロ・プロファイリング
（１）天然椎間板組織の３つの試料から誘導されたＮＰ細胞は、Ｐ．ａｃｎｅｓ（ＰＡ）（顔面座瘡から誘導されたＡＴＣＣ  ６９１９）を介して、または感染した椎間板組織から直接に誘導されたＰＡを介して、他の細菌種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感染する。
（２）さまざまな時点で、細菌細胞内の発生をサイトカイン応答、及びＤＡＰＩ蛍光色素で評価する。
（３）細胞内空間内の細菌によって誘発されたマイクロＲＮＡプロファイルを同定する。第１のプロファイル（プロファイル１ａ）は、全ての細菌種に共通のプロファイルであり、第２のプロファイル（プロファイル１ｂ）は、組織試料内の汚染検出用のＰ．ａｃｎｅｓまたはＥ．ｃｏｌｉなどに特異的なプロファイルである。
（４）ＮＰ細胞培養物の感染後のさまざまな時点において、マイクロＲＮＡプロファイル（プロファイル１ａ、及びプロファイル１ｂ）を同定する。急性感染症のモデルとして、試料固定に先立って起こる汚染（例えば、インビトロ汚染信号）を示すプロファイルを同定する際には、３０〜６０分用いる場合がある。慢性感染症をモデリングして、慢性感染症を示すプロファイルを同定する場合には、長期（例えば、１日間、７日間、及び２１日間）にわたるインキュベーションが用いられる。
【００６６】
Ｅｘｉｑｏｎ製マイクロＲＮＡ  ＨｕｍａｎパネルＶ３．０を使用して、グローバルマイクロＲＮＡの発現プロファイリング（マイクロＲＮＡ×７５４例）を実行する。
【００６７】
実施例２．ｍｉＲＮＡの新鮮な椎間板組織のプロファイリング
（１）チェコ共和国において約５００例の登録患者が椎間板手術を受け、手術時点、ならびに６週間、６か月間及び１２か月間のフォローアップで、臨床データが収集される。
（２）各組織試料は、以下の３つの部分に分けられる。
１．細菌ＤＮＡ事象のＤＮＡ精製、及びｑＰＣＲ評価用。メタゲノム手法用に、ＤＮＡを抽出直後に−８０℃で貯蔵する。
２．マイクロＲＮＡプロファイルのＲＮＡ精製及びｑＰＣＲ評価用。安定化溶液（ＲＮＡlａｔｅｒ）を用い、ＲＮＡを採取する。
３．微生物評価用に、室温にて組織をできるだけ早急に微生物学部門に移送する。今後の研究に備えて、血漿及び尿もまた採取し、−８０℃で貯蔵する。
（３）試料１をＤＮＡ精製に使用し、全ての試料においてＰ．ａｃｎｅｓのＤＮＡをｑＰＣＲにより定量する。加えて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉなどの他の細菌種を定量できる。
（４）培養及びｑＰＣＲの両方で陽性である試料については、多重ＰＣＲ及び／またはシークエンシングで、コロニー及び椎間板組織中のＰＡ菌株を同定する。汚染を排除するために、同じ菌株を同定する必要がある。培養及びｑＰＣＲで、同じ菌株に対して陽性の試料はマイクロＲＮＡプロファイリングに対して基準陽性であると見なされる。
（５）培養で陰性、及びｑＰＣＲ（例えば、ＰＡ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）で陰性（あるいは、陰性試料が存在しない場合、低レベルの陽性）の試料は、マイクロＲＮＡプロファイリングに対して基準陰性であると見なされる。
（６）ＰＡ陽性×２０例、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ陽性×１０例、及び陰性×３０例を、マイクロＲＮＡプロファイリング用に使用する。
（７）椎間板組織における細菌の発生に関連する共通のマイクロＲＮＡプロファイルを、ＰＡ×２０例及びＳｔａｐｈ×１０例とその対照である陰性試料×３０例に由来するマイクロＲＮＡプロファイルと比較することによって同定する。ＰＡ＋の２０例及びＳｔａｐｈ＋の１０例と、その対照である陰性試料とを、別個に比較することによって、細菌に特異的なプロファイルを特定する。
（８）インビトロマイクロＲＮＡシグニチャとインビボマイクロＲＮＡシグニチャとの比較を行う。
【００６８】
実施例３．コホート全体における陽性の相互検証
試料５００例中、培養ではＮ例の陽性患者、ｑＰＣＲではＮ１例の陽性患者が存在し、同定されたマイクロＲＮＡシグニチャに基づいて診断アルゴリズムが開発され、ｍｉＲＮＡシグニチャにより患者Ｎ３例が陽性とされるであろう。
【００６９】
共通のｍｉＲＮＡシグニチャに対して陽性の症例において、ＰＡに特異的でＳｔａｐｈにも特異的なｍｉＲＮＡシグニチャを評価する。Ｎ３は共通のシグニチャに対して陽性になる。Ｎ４はＰＡに特異的なｍｉＲＮＡシグニチャに対して陽性になり、Ｎ５はＳｔａｐｈに特異的なｍｉＲＮＡシグニチャに対して陽性となり、両方のｍｉＲＮＡシグニチャに対してＮ６が陰性となる。このＮ６をメタゲノム分析にかける。
【００７０】
予期される観察としては、ＣＬＢＰの既往歴があるために手術を受けた患者において真陽性の頻度が高くなること、ならびに腰椎術後疼痛を有する患者において及び（６か月目及び１２か月目に臨床転帰が評価された後）特にＣＬＢＰに患うであろう患者において真陽性の頻度が高くなることが挙げられる。
【００７１】
実施例４．診断マイクロＲＮＡスコア（ＤＭＳ）の確定
患者コホート、及び基準Ｐ．ａｃｎｅｓ試料の定義
平均年齢４４±１３歳の患者３２６例（男性１８６例、及び女性１４０例）が、前向き研究に登録した。臨床的に明らかな術後椎間板炎を発症した患者はいなかった。ゴールドスタンダードの定量的な細菌培養を行ってＰ．ａｃｎｅｓ数を算出し、リアルタイムＰＣＲを行って、椎間板組織検体内のゲノム数を検出した。細菌培養及びリアルタイムＰＣＲに用いられた手技については、「方法」の節で詳述する。培養では１３０例（４０％）がＰ．ａｃｎｅｓ陽性であった。Ｐ．ａｃｎｅｓ計数は１００〜９０００ＣＦＵ／ｍｌの範囲に及び、その中央値は４００ＣＦＵ／ｍｌであった。リアルタイムＰＣＲで、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムは、９８例（３０％）において検出不可能であった。Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性２２８例の椎間板組織内のＰ．ａｃｎｅｓゲノムの数は２〜４５３１の範囲に及び、その中央値は２５６ゲノム／総ＤＮＡ５００ｎｇであった。培養（≧１０３ＣＦＵ／ｍｌ、７５パーセンタイル）及びリアルタイムＰＣＲ（ＤＮＡ５００ｎｇ中、ゲノム５００例以上、７５パーセンタイル）の両方で、Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の多いことによって特徴づけられる椎間板組織試料が、基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性例（Ｎ＝４５、１４％）と見なされた。他方、細菌培養及びリアルタイムＰＣＲの両方で陰性の試料は、基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陰性例（Ｎ＝７２．２２％）として使用された。これらのＰ．ａｃｎｅｓ基準症例は、３相バイオマーカー研究において、グローバルマイクロＲＮＡの発現プロファイリング、診断マイクロＲＮＡの同定、ならびに診断マイクロＲＮＡスコア（ＤＭＳ）の検証及び開発に使用された。
【００７２】
基準試料（陽性４５例、陰性７２例）を更に、それらのＰ．ａｃｎｅｓの状態に比例するように、ディスカバリーセット、トレーニングセット及び検証セットに更に分けた。Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の少ない陽性例において、汚染ベースの偽陽性のリスクが大きいという理由から、検証コホートにおいてリアルタイムＰＣＲではＰ．ａｃｎｅｓ含量の少ない試料（＜１０３ＣＦＵ／ｍｌ）及び／またはさまざまなゲノム計数の試料（Ｎ＝４４）を、新規に開発されたＤＭＳの実装によって評価されるよう対象に含めた（標準の方法では結果が得られないため）。研究の対象となったコホートにおける患者背景を、表３に要約してある。これらの患者１６１症例のほか、別の１０症例（コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（ＣｏＮＳ）に対して陽性の椎間板培養例）も、特異性対照群として、本研究の検証部分に含めた。
【表２】
2018523492.tif 000004
【００７３】
発見フェーズ−Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性及び陰性試料中で脱調節されたｍｉＲＮＡ
Ｅｘｉｑｏｎ製リアルタイムＰＣＲベースの技術を使用して、基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性の椎間板組織の１２例及びＰ．ａｃｎｅｓ陰性試料×１２例において、マイクロＲＮＡの７５４例の発現プロファイリングを遂行した。１群中の平均Ｃｔ（閾値サイクル）が３５未満であるｍｉＲＮＡのみを、統計的評価の対象とした。マイクロＲＮＡの発現量をＲＮＵ３８Ｂに対して正規化した。「方法」の節に記載されているように、Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性及び陰性の椎間板組織試料中、マイクロＲＮＡ×２０例がそれぞれ異なった様式で発現した（表４に要約されている）。
【表３】
2018523492.tif 000005
【００７４】
トレーニングフェーズ−診断マイクロＲＮＡスコア（ＤＭＳ）の検証、及び確定
本方法に記載されているように、我々は、個別マイクロＲＮＡの発現アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２つの基準遺伝子用アッセイを使用して、発見フェーズからの１６候補ｍｉＲＮＡ、ならびに３５椎間板組織試料中のＲＮＵ３８Ｂ及びＲＮＵ４８（基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性１５例、及び基準陰性２０例）の発現量を特定した。マイクロＲＮＡの発現量を、２つの基準遺伝子（ＲＮＵ３８Ｂ、及びＲＮＵ４８）の平均値に対して相対的に定量した。全ての試料が、Ｃｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）＜３４且つ／またはＣｔ（ＲＮＵ４８）＜３１で、品質管理に合格した。Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性及び陰性の椎間板組織試料において、発現量が有意に異なることが確認されたマイクロＲＮＡは５つ存在し、それらのうち２つは、多重仮説検定に対しＰ値を調整した後でさえも依然として有意であった（表５、図４）。
【表４】
2018523492.tif 000006
【００７５】
診断マイクロＲＮＡスコア（ＤＭＳ）（式１）を確定するため、２つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５４７−３ｐ）を使用した。カットオフ値−０．０１は、ＲＯＣ分析に適用した場合に、基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性例と陰性例とを最も正確に判別できる値として同定された（図５、ＡＵＣ＝０．９８３３）。
【００７６】
ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５４７−３ｐ発現量は、以下の２つの基準遺伝子（ＲＮＵ３８Ｂ、及びＲＮＵ４８）の平均値に対して相対的に表される。
ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ＝２−（Ｃｔ（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ）−平均（Ｃｔ（ＲＮＵ４８）、及びＣｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）））
ｍｉＲ−５７４−３ｐ＝２−（Ｃｔ（ｍｉＲ−５７４−３ｐ）−平均（Ｃｔ（ＲＮＵ４８）、及びＣｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）））
式１：
ＤＭＳ＝１８．７１−１１．２４＊ｌｏｇ１０（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ）＋１０．４＊ｌｏｇ１０（ｍｉＲ−５７４−３ｐ）
【００７７】
図５に示すように、ＤＭＳ値のＲＯＣ分析は、Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の多い症例（培養及びリアルタイムＰＣＲ）と陰性例とを強力に判別できることを示す。
【００７８】
検証フェーズ−Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の少ない陽性症例におけるＤＭＳの独立検証、及びＤＭＳの使用（標準の方法では結果が得られない場合）
個々のマイクロＲＮＡの発現アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び基準遺伝子に対するアッセイを使用してｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの発現量を定量し、トレーニングフェーズと同様にＤＭＳ、ＲＮＵ３８Ｂ及びＲＮＵ４８を構成した。独立した５８例（基準Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性１８例、基準陰性４０例）におけるＤＭＳの適用によって、その分析性能が高度であることが確認され、試料の分類精度が９５％に達し、従ってＰ．ａｃｎｅｓの状態に比例していることが明らかにされた（表６及び表７、図６）。しかも、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（ＣｏＮＳ）陽性培養による椎間板組織試料の１０例はＤＭＳ陰性であり、Ｐ．ａｃｎｅｓに対するＤＭＳの特異性を示しているか、あるいは少なくとも、ＤＭＳが椎間板組織内で二番目に最も頻繁に観察された微生物（ＣｏＮＳ）の存在による影響を受けないことを示している（図７）。
【００７９】
標準の診断方法（培養、及びリアルタイムＰＣＲ）にＤＭＳを追加したことにより、培養で、Ｐ．ａｃｎｅｓ含量の少ない陽性として評価された椎間板試料のほぼ６０％、及びリアルタイムＰＣＲによるさまざまなゲノム計数は、偽陽性であることが明らかにとなっている（表６）。
【表５】
2018523492.tif 000007
【００８０】
［試料ＩＤ４−陽性］
Ｃｔ（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ）＝２５．０２；Ｃｔ（ｍｉＲ−５７４−３ｐ）＝３１．３５；Ｃｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）＝３１．５８；Ｃｔ（ＲＮＵ４８）＝２８．７６
品質管理：Ｃｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）＜３４且つＣｔ（ＲＮＵ４８）＜３１の場合、ＲＮＡ試料は有効である。
ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ＝２−（２５．０２−（２８．７６+３１．５８）/２）＝３５．５０６２
ｍｉＲ−５７４−３ｐ＝２−（３１．３５−（２８．７６+３１．５８）/２）＝０．４４１４
ＤＭＳ（ｉｄ４）＝１８．７１〜１１．２４＊ｌｏｇ１０（３５．５０６２）＋１０．４＊ｌｏｇ１０（０．４４１４）＝−２．４１
ＤＭＳ（ｉｄ４）＝−２．４１＜ＤＭＳ（（陽性カットオフ）＝−０．０１の場合、試料はＰ．ａｃｎｅｓ陽性である。
［試料ＩＤ３０−陰性］
Ｃｔ（ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ）＝２６．４９；Ｃｔ（ｍｉＲ−５７４−３ｐ）＝３１．７３；Ｃｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）＝３２．４３；Ｃｔ（ＲＮＵ４８）＝３０．０７
品質管理：Ｃｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）＜３４且つＣｔ（ＲＮＵ４８）＜３１の場合、ＲＮＡ試料は有効である。
ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ＝２−（２６．４９−（３０．０７＋３２．４３）／２）＝２７．０９５９
ｍｉＲ−５７４−３ｐ＝２−（３１．７３−（３０．０７+３２．４３）/２）＝０．７１７０
ＤＭＳ（ｉｄ３０）＝１８．７１〜１１．２４＊ｌｏｇ１０（２７．０９５９）＋１０．４＊ｌｏｇ１０（０．７１７０）＝１．１
ＤＭＳ（ｉｄ３０）＝１．１＞ＤＭＳ（（陽性カットオフ）＝−０．０１の場合、試料はＰ．ａｃｎｅｓ陰性である。
【００８１】
表６に示すように、３９例中の２３例（５９％）が、培養ではＰ．ａｃｎｅｓ含量の少ない陽性であったのに対し、ＤＭＳの実装ではＰ．ａｃｎｅｓ陰性として評価された。
【００８２】
５例中の４例（８０％）は、リアルタイムＰＣＲで強陽性であったのに対し、培養では陰性であり、ＤＭＳでは陰性として評価された。一方、ＤＭＳでは５例中の１例（２０％）が陽性であった。
【００８３】
潜在的な臨床的意義
臨床上の決定を行う目的で、Ｐ．ａｃｎｅｓに感染した椎間板を使用し、その診断（細菌の培養及び／またはリアルタイムＰＣＲ）に標準の方法を適用すれば、１／３を超える患者が、潜在的に有害な抗生物質治療を感染することなしに受けることとなる。多大な時間を必要とし、且つかなり汚染され易い標準の診断技法は、これを、分析性能を有するＤＭＳで完全に置き換えることができ得る。それによって、脊髄疾患患者におけるこれらの不必要な有害処置を防ぐための解決策が得られる。
【００８４】
方法
患者：
組み入れ基準としては、感覚欠損有りもしくは無しの腰椎または腰仙部神経根障害で、相関する腰椎または仙骨神経根の分布において対応する臨床的に意義ある運動障害を伴うもの（撮像基準を参照）、あるいは保守的な手段では治り難い神経根痛（坐骨神経痛または大腿骨痛）を伴うもの、下肢伸展挙上陽性試験、皮膚分節感覚欠損、筋緊張運動障害及び／または深部腱反射低下などの身体検査所見に合致すること、最新式磁気共鳴映像方法によるもしくはコンピュータ断層装置による腰仙脊髄の撮像に、臨床的に罹患した神経根及び身体的検査と相関する分布にて遊離髄核隔離または椎間板ヘルニア／突起が示されることが含まれていた。除外基準としては、共存感染もしくは免疫無防備状態、手術以前の月におけるコルチコステロイドまたは抗生物質の使用、トラウマ、未知の放射線量、炎症性関節炎、または他のリウマチ性疾患の診断が含まれていた。収集された疫学データ及び臨床データは、性別、年齢、椎間板疾患部、ヘルニアの種類、既往の脊髄手術の有病率、硬膜外ステロイド注射、術後椎間板炎の発症に関するものであった。書面によるインフォームド・コンセントが、各患者から得られた。本研究は、施設内審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。
【００８５】
術中試料の採取
ポビドンヨードの３組調製物を手術部位にこすり付けて、標準の滅菌技術を使用してドレープした。全ての症例において皮膚切開前に標準の周術期抗生物質を投与した。セファゾリンが、ほとんどの症例において投与される標準の抗生物質であった。ペニシリンアレルギーのある患者では、バンコマイシンまたはクリンダマイシンのいずれかが投与された。皮膚切開の対象となる厳密な位置を術中Ｘ線透視で案内し、後部正中アプローチを用いて鋭的剥離及び電気焼灼を行った。自家保定牽引子（カスパル型）が配置された後、手術用顕微鏡の下で、Ｐｅｎｆｉｅｌｄ解剖器具及びＫｅｒｒｉｓｏｎ骨鉗子を用い、必要に応じて黄色靱帯を切除した。横断神経根を穏やかに収縮させて、椎間板ヘルニアを露出させ、環状欠損部の近くの椎間板腔において髄核の残存疎性断片と共に摘出した。全ての組織試料を、汚染を最小限に抑える方法で取り扱い、密閉した滅菌済の試料カップ内で保持した後、標識化の対象として現場に渡し、実験室に移送した。実験室で、椎間板組織試料が更に分析された。我々は、摘出標本からできるだけ多くの材料を得ようと試みたので、試料サイズを精密には測定せず、３×３×５〜１０×５×５ｍｍと概測した。処理前に試料を凍結せず、手術後２〜４時間以内に培養が確立された。
【００８６】
微生物の培養
個別包装された滅菌済のガンマ線照射メス、及び滅菌済のガンマ線照射ペトリ皿を使用して、新鮮な椎間板組織試料をより小さな断片に切断した。これらの断片のうちの１つを２ｍｌのＤＮＡ非含有の微量遠心分離管に入れて、Ｐ．ａｃｎｅｓのＤＮＡ分析処理を行うまで−８０℃で貯蔵した。クラス２の生物学的安全キャビネット内で、滅菌乳棒、及び無菌石英砂（粒径：０．１〜０．５ｍｍ；Ｐｅｎｔａ，Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）を入れた乳鉢、ならびに無菌状態の生理食塩水を用いて、組織の処理及び均質化を行った。均質化された組織試料を、７％ヒツジ血液及びビタミンＫを補給したＷｉｌｋｉｎｓ  Ｃｈａｌｇｒｅｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｇａｒ（Ｈｉ  Ｍｅｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａ）に接種した。接種されたプレートを、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｒｕｓｋｉｎｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＫ）内で、３７℃にて好気的に（窒素８０％、ＣＯ２１０％、及びＨ２１０％）１４日間インキュベートし、細菌の増殖を評価した。試料中の細菌の量は、ホモジネート１ｍｌ中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）として表された。Ｒａｐｉｄ  ＡＮＡ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｍｅｌ，ＵＳＡ）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（商標）ＬＴＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｓｙｓｔｅｍ＋ソフトウェア＋バクテリアスペクトルライブラリ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐ．）で、生化学的に細菌を同定した。
【００８７】
ＤＮＡの単離
凍結した組織試料（湿潤重量の中央値：１３０ｍｇ、範囲：２０〜１８０ｍｇ）を解凍し、新たに開封した滅菌済の針、メス及びピンセット一組を使って小型断片に切断して、滅菌済の２ｍｌ微量遠心分離管に移した。５００μｌのＡＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）（Ｑｉａｇｅｎ）を溶解した溶液中に、組織試料の小断片を更に懸濁させて、サーモミキサーの中で５６℃、６５０ｒｐｍで一晩消化させた。一連の並列処理済の試料のそれぞれに対し滅菌水入りの管をラボ汚染対照として使用し、組織の消化からＤＮＡ単離、リアルタイムＰＣＲ分析までを、全ラボプロセスに従って行った。ＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、メーカーの指示書に記載されているとおりに、ＤＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ，ＵＳＡ）を使用し、あるいはＤＮＡ濃度が５ｎｇ／μｌ未満の試料用に蛍光色素及びＱｕｂｉｔ  ３．０蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）使用して、ＤＮＡの濃度を分光測定で測定した。
【００８８】
リアルタイムＰＣＲによるＰ．ａｃｎｅｓの定量
前述のリアルタイムＰＣＲアッセイを、Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１３１−ｂｐ領域を増幅するために以下のプライマーを使用して実施した：：フォワードプライマー５’−ＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡ−３’（配列番号１）、リバースプライマー５’−ＴＴＣＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＡ−３’（配列番号２）及びＴａｑＭａｎプローブ５’−ＡＧＣＧＴＴＧＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２０）。ＰＣＲ反応混合物１５-μｌ中には、ＤＮＡ試料６,７５μｌ、各プライマー５ｐｍｏｌ、及びＴａｑＭａｎプローブ２ｐｍｏｌ、ならびに１Ｘ  ＴａｑＭａｎ遺伝子発現Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）が含有されていた。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を、熱サイクリングプロファイル（５０℃で２分間、９５℃で１０分間、ならびに９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の５０サイクル）にて使用した。合成されたＰ．ａｃｎｅｓアンプリコン（１３１ｂｐ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）の６とおりの濃縮物（１０〜１０６コピー）の複製５つを用いて作成された内部標準曲線で、試料中のＰ．ａｃｎｅｓゲノム当量を推定した。上述のラボ汚染対照、及びＰＣＲ陰性対照を、全てのそれぞれのＰＣＲ反応に含めた。試料ごとにアッセイを２回ずつ行い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コピーの平均数を計算した。ラボ汚染を排除するため、ラボ汚染対照において検出された１６Ｓ  ｒＲＮＡ数を、組織試料中のコピー数から減算した。Ｐ．ａｃｎｅｓ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡオペロン（３コピー／細胞）のコピーの既知数を使用して、各試料中の細菌ゲノムの数を最終的に計算し、椎間板組織試料から抽出された総ＤＮＡ５００ｎｇ中の細菌ゲノム数として表した。標本品質及び核酸抽出、ならびに阻害増幅プロセスの評価を可能にするため、ヒトのβグロビン遺伝子を内部対照として含めた。
【００８９】
ＲＮＡの単離
凍結した組織試料を解凍し（湿潤重量の中央値：１００ｍｇ、範囲：２０〜１４５ｍｇ）、滅菌済の針、メス及びピンセット一組を使って小型断片に切断し、滅菌済の２ｍｌ微量遠心分離管に移した。５００μｌのＡＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）（Ｑｉａｇｅｎ）を溶解した溶液中に、組織試料の小断片を更に懸濁させて、５６℃にて６５０ｒｐｍで一晩消化させた。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、メーカーの指示書に記載されているとおりに、マイクロＲＮＡ及び他の小型ＲＮＡを含めた総ＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ，ＵＳＡ）を使用し、あるいはＲＮＡ濃度を５ｎｇ／μｌ未満の試料用に蛍光色素、及びＱｕｂｉｔ  ３．０蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡの濃度を分光測定で測定した。
【００９０】
マイクロＲＮＡの発現プロファイリング
ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅａｄｙ-ｔｏ-Ｕｓｅ  ＰＣＲ  Ｐａｎｅｌｓ（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ｍｉＲＮＡの発現プロファイリングを実行した。データ正規化用に、２枚１組のカード（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ＋ＩＩ、Ｖ４．Ｍ）を使用して、ヒトｍｉＲＮＡ×７５２例及び内在性コントロール×６例を定量できるようにした。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及び総ＲＮＡ１００ｎｇを使用し、標準のプロトコールに従って、第一鎖ｃＤＮＡの合成を実行した。その後、ＥｘｉＬＥＮＴ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス、及びマイクロＲＮＡに特異的なＰＣＲ増幅プライマーを使用して、リアルタイムＰＣＲ増幅を行い、且つＬＮＡ（商標）（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて最適化した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、最終的な測定を実行した。
【００９１】
個々のマイクロＲＮＡの発現分析
ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従い、遺伝子に特異的なプライマーを使用して、総ＲＮＡから相補性ＤＮＡを合成した。逆転写酵素反応を行うため、ＲＮＡ試料１０ｎｇ、５０ｎＭのステムループＲＴプライマー、ＲＴ緩衝液×１、各ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素３．３３Ｕμｌ−１、及びＲＮａｓｅ阻害剤０．２５Ｕμｌ−１（いずれも、ＴａｑＭａｎ  マイクロＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔより、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。反応混合物（１０μｌ）を、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、続いて４℃にて保持した（Ｔ１００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実行した。ＰＣＲ反応混合物２０-μｌ中には、ＲＴ製品１．３３μｌ、１×ＴａｑＭａｎ（ＮｏＵｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びプライマー１μｌ、ならびにＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙキットのプローブミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）が含まれていた。反応物を９６ウェルの光学プレートで９５℃にて１０分間インキュベートし、続いて、９５℃にて１５秒間、及び６０℃にて１分間のインキュベートを４０サイクル行った。使用したマイクロＲＮＡアッセイはｍｉＲ−５７４−３ｐ（ＩＤ：００２３４９）、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ（ＩＤ：００２１１２）、ｍｉＲ−４９７−５ｐ（ＩＤ：００１０４３）、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ（ＩＤ：０００５８７）、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ（ＩＤ：０００４３６）、ｍｉＲ−１９５−５ｐ（ＩＤ：０００４９４）、ｍｉＲ−２８−５ｐ（ＩＤ：０００４１１）、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ（ＩＤ：０００４１６）、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ（ＩＤ：００１０９７）、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ（ＩＤ：００２３１６）、ｍｉＲ−１４０−３ｐ（ＩＤ：００２２３４）、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（ＩＤ：００２１９８）、ｍｉＲ−４２３−５ｐ（ＩＤ：００２３４０）、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（ＩＤ：０００４４９）、ｍｉＲ−２８−３ｐ（ＩＤ：００２４４６）、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ（ＩＤ：００２１５８）である。基準遺伝子の定量には、ＲＮＵ３８Ｂ（ＩＤ：００１００４）及びＲＮＵ４８（ＩＤ：００１００６）の、２とおりのアッセイを使用した。
【００９２】
データ分析
閾値サイクルデータを、ＳＤＳ  ２．０．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で計算した。個々のマイクロＲＮＡリアルタイムＰＣＲ反応をいずれも３回ずつ実行した。測定された全てのｍｉＲＮＡの平均発現量を、グローバルマイクロＲＮＡの発現プロファイリングではＲＮＵ３８Ｂを使用し、個々のマイクロＲＮＡの測定においてはＲＮＵ３８ＢとＲＮＵ４８との平均を用いて正規化した。続いて、発現量を２−ΔＣｔ方法により分析した。Ｅｘｉｑｏｎ製ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  ＰＣＲ  Ｐａｎｅｌに付属している６種の可能な遺伝子による標準ｇｅｎｅＮｏｒｍアルゴリズム及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒアルゴリズムを併用して、ＲＮＵ３８Ｂ（ＳＮＯＲＤ３８Ｂ）を内在性対照として選択した。１群中の平均Ｃｔ（閾値サイクル）が３５未満であるｍｉＲＮＡのみを、統計的評価の対象とした。Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性例及びＰ．ａｃｎｅｓ陰性例中、分析されたｍｉＲＮＡのレベル間の統計的差異をノンパラメトリックのマン・ホイットニー検定で評価し、多重仮説検定用にＢｅｎｊａｍｉｍｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を施した。個々のマイクロＲＮＡの発現量を、２つの基準遺伝子（ＲＮＵ３８Ｂ、及びＲＮＵ４８）の平均値に対して相対的に定量した。Ｃｔ（ＲＮＵ３８Ｂ）＞３４且つ／あるいはＣｔ（ＲＮＵ４８）＞３１に該当する試料を、本研究から除外した。診断マイクロＲＮＡスコア（ＤＭＳ）式を、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐ発現量の線型組み合わせに基づいて作成した。ＲＯＣ分析を通して、Ｐ．ａｃｎｅｓ陽性例とＰ．ａｃｎｅｓ陰性例とを判別するための最適なカットオフ値を得た。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して計算を行った。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。 
【００９３】
【表６】
2018523492.tif 000008
2018523492.tif 000009
2018523492.tif 000010
2018523492.tif 000011
2018523492.tif 000012
2018523492.tif 000013
【００９４】
【表７】
2018523492.tif 000014
2018523492.tif 000015
【図１】
2018523492.tif 000016
【図２】
2018523492.tif 000017
【図３】
2018523492.tif 000018
【図４】
2018523492.tif 000019
【図５】
2018523492.tif 000020
【図６】
2018523492.tif 000021
【図７】
2018523492.tif 000022
【図８−１】
2018523492.tif 000023
【図８−２】
2018523492.tif 000024
【図８−３】
2018523492.tif 000025
【図８−４】
2018523492.tif 000026
【配列表】
2018523492000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月8日(2016.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における低毒性感染症の検出方法であって、
低毒性感染症の原因となる片利共生微生物が患者試料中に存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験することと、
前記試料由来の宿主細胞ＲＮＡプロファイルを特定することと、
前記ＲＮＡプロファイルを低毒性感染症を示すＲＮＡシグニチャについて評価して、偽陽性及び／または偽陰性と真正の低毒性感染症とを判別することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記患者が炎症状態の症状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症状態の症状が、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍、前立腺炎、前立腺癌から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が椎間板組織である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が慢性腰痛（ＣＬＢＰ）及び／または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
手術時に前記試料が採取される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料の一部にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種のうちの１種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料の少なくとも一部が消化され、且つＤＮＡが単離される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記片利共生微生物のＤＮＡが増幅される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料中の前記片利共生微生物（複数可）が、ＰＣＲ、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーションもしくはメタゲノム分析で検出または定量される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡシグニチャが、感染性臨床試料由来のＲＮＡプロファイル及び非感染性臨床試料由来のＲＮＡプロファイルでトレーニングされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記片利共生微生物の存在に対して試験結果が陽性（すなわち高含量）である臨床試料、及び前記片利共生微生物の存在に対して試験結果が陰性（すなわち低含量）である臨床試料由来のＲＮＡプロファイル用いて、ＲＮＡシグニチャをトレーニングする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記片利共生微生物が存在するかどうかが、定量的ＰＣＲまたはシークエンシング（培養、免疫化学法、分光法もしくはインサイチュ・ハイブリダイゼーションの少なくとも１つを用いたもの）から任意選択的に選択される少なくとも２つの検出方法により判別される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡシグニチャが、片利共生微生物及び非感染性細胞に感染した細胞培養からのＲＮＡプロファイルでトレーニングされたクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞培養がＮＰ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡシグニチャがマイクロＲＮＡシグニチャである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡシグニチャが、長いノンコーディングＲＮＡシグニチャであり、任意選択的にｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡまたはＴ−ＵＣＲの１つ以上を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡシグニチャが、小型ノンコーディングＲＮＡを含み、任意選択的にｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡの１つ以上を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡシグニチャがｍＲＮＡシグニチャである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が片利共生病原体にインビトロ感染する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２７】
慢性感染症をモデリングするため、前記細胞を少なくとも１週間インビトロ感染させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡシグニチャが、１００以下のＲＮＡ、または７５以下のＲＮＡ、または５０以下のＲＮＡ、または２５以下のＲＮＡ、または１０以下のＲＮＡ、または５以下のＲＮＡ、または４以下のＲＮＡの相対的発現を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡシグニチャが、２つまたは３つのＲＮＡの相対的発現を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡが、表２から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡが、表４、表５、または図８から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡシグニチャが、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
手術時に陽性試料に対して局所抗生物質または消毒剤リンスが施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項３６】
手術後に陽性試料に対して経口、ＩＶまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３７】
臨床組織試料中の片利共生微生物の低毒性感染症を検出する方法であって、前記方法が、
前記宿主組織中のｍｉＲＮＡプロファイルを検出することと、
低毒性感染症を示すｍｉＲＮＡシグニチャに対して前記ｍｉＲＮＡプロファイルを評価することと
を含み、
前記ｍｉＲＮＡシグニチャは、少なくとも２つの検出方法で前記片利共生微生物の存在に対して陽性（すなわち高含量）である組織試料由来のｍｉＲＮＡプロファイル、及び前記少なくとも２つの方法で前記片利共生微生物の存在に対して陰性（すなわち低含量）である組織試料由来のｍｉＲＮＡプロファイルを用いてトレーニングされる、前記方法。
【請求項３８】
前記検出方法が、核酸増幅、ＤＮＡシークエンシング、微生物培養、免疫化学法、分光法及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出方法が定量的ＰＣＲ及び微生物培養である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡシグニチャが、１０以下のＲＮＡ、または５以下のＲＮＡ、または４以下のＲＮＡの相対的発現を含む、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＮＡシグニチャが、２つまたは３つのＲＮＡの相対的発現を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡが、表２から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＲＮＡが、表４または表５から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＲＮＡシグニチャが、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される炎症状態を有する、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が椎間板組織である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者が慢性腰痛（ＣＬＢＰ）及び／または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
手術時に前記試料が採取される、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料中にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を更に試験する、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種のうちの１種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記試料の一部が消化され、且つＤＮＡが単離される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５８】
ＤＮＡが増幅される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記試料中の前記片利共生微生物（複数可）が、ＰＣＲ、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、及びメタゲノム分析の１つ以上で検出または定量される、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記試料中に前記片利共生病原体が存在するかどうかが他の技法では試験されない、請求項３７に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料中に前記片利共生病原体が存在するかどうかがＰＣＲ及び／または培養では試験されない、請求項３７に記載の方法。
【請求項６２】
手術時に陽性試料に対して局所抗生物質または消毒剤リンスが施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６４】
手術後に陽性試料に対して経口、ＩＶまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６５】
低毒性感染症の治療方法であって、低毒性感染症を有すると判定された患者に抗生物質を投与することを含み、前記低毒性感染症が、低毒性感染症の徴候を呈する部位からの細胞中の宿主細胞ＲＮＡシグニチャの存在によって検出され、前記ＲＮＡシグニチャが低毒性感染症を示す、前記方法。
【請求項６６】
前記患者において前記片利共生微生物が存在することが、任意選択的にＰＣＲ、培養、または顕微鏡検査のうちの１つ以上で、低毒性感染症の症状を呈する部位から採取された試料中に検出される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗生物質が局所的に前記部位に投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗生物質が全身的に投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＮＡシグニチャは、少なくとも２つの検出方法で前記片利共生微生物に対して陽性である組織試料由来のＲＮＡプロファイル、及び前記少なくとも２つの方法で前記片利共生微生物に対して陰性である組織試料由来のＲＮＡプロファイルを用いて、トレーニングする、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出方法が、核酸増幅、ＤＮＡシークエンシング、微生物培養、免疫化学法、分光法及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションから選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記検出方法が定量的ＰＣＲ及び微生物培養である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＲＮＡシグニチャが、教師付き、教師無し、または半教師付きクラシファイア・アルゴリズムを使用する、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＲＮＡシグニチャが、１０以下のＲＮＡ、または５以下のＲＮＡ、または４以下のＲＮＡの相対的発現を含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＲＮＡシグニチャが、２つまたは３つのＲＮＡの相対的発現を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＲＮＡが、表２から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＲＮＡが、表４または表５から選択されるｍｉＲＮＡである、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸シグニチャが、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ及びｍｉＲ−５７４−３ｐの一方または両方の相対的発現量を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７８】
前記患者が、慢性腰痛（ＣＬＢＰ）、関節もしくは軟骨の炎症、インプラントもしくは補綴に付随する炎症、心内膜炎、感染の疑いのある静脈ポートシステム、または胃潰瘍から選択される炎症状態の症状を有する、請求項６５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記試料が軟骨、または好気性環境からの組織もしくは細胞を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記試料が椎間板組織である、請求項６５に記載の方法。
【請求項８１】
前記患者は椎間板手術がスケジュールされている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記椎間板手術が、椎間板ヘルニアの修復、主腰椎固定手術、または主椎間板の関節形成術である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記患者が慢性腰痛（ＣＬＢＰ）及び／または脊椎手術後疼痛症の既往歴を有する、請求項７８〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記患者が偽関節症の既往歴を有する、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
手術時に前記試料が採取される、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
手術に先立って前記試料が生検で採取される、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記試料中にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅが存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を更に試験する、請求項６５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種のうちの１種以上が存在するかどうかまたは前記試料中の濃度を試験する、請求項６５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記試料の一部が消化され、ＤＮＡが単離される、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記片利共生微生物のＤＮＡが増幅される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記試料中の前記片利共生微生物（類）が、ＰＣＲ、培養、免疫化学法、分光法、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、及びメタゲノム分析の１つ以上で検出または定量される、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
手術時に陽性試料に対して局所抗生物質が塗布される、請求項６５に記載の方法。
【請求項９３】
手術に先立って陽性試料に対して経口または局所抗生物質レジメンが投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項９４】
手術後に陽性試料に対して経口、ＩＶまたは椎間抗生物質レジメンが投与される、請求項６５に記載の方法  
【国際調査報告】
2018523492.tif 000027
2018523492.tif 000028