(57)【要約】本特許出願は、概して、がんの処置、より詳細には、がんの処置のためのＩＬ−１２を発現する偽型レンチウイルスの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞標的化レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、前記粒子は、がんの処置で使用するための、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含み、前記組成物は、腫瘍内に投与される、組成物。
【請求項２】
前記ＩＬ−１２は単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）である、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項３】
前記ｓｃＩＬ−１２はｐ３５−Ｌ−ｐ４０を含む、請求項２に記載の使用組成物。
【請求項４】
前記ｓｃＩＬ−１２はｐ４０−Ｌ−ｐ３５を含む、請求項２に記載の使用組成物。
【請求項５】
前記レンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に選択的に結合する修飾アルファウイルスＥ２糖タンパク質を含む、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項６】
前記レンチウイルスベクター粒子は、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープを含む、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項７】
前記処置は、さらに、アジュバントを腫瘍内に投与することを含む、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項８】
前記アジュバントは、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性または水中油型のエマルジョン製剤である、請求項７に記載の使用組成物。
【請求項９】
前記レンチウイルスベクター粒子を含む組成物は、さらに、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性製剤を含む、請求項７に記載の使用組成物。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクター粒子は単回投与で投与される、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項１１】
前記レンチウイルスベクター粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイで測定されるように、最初の４８時間で約０．１μｇ〜１μｇ／１Ｅ１０ベクターゲノム産生というレベルのＩＬ−１２を産生する、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項１２】
前記処置は、さらに、制御性Ｔ細胞欠乏を含む、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項１３】
前記制御性Ｔ細胞欠乏は、シクロホスファミドまたは抗ＣＤ２５抗体の全身投与を含む、請求項１２に記載の使用組成物。
【請求項１４】
前記シクロホスファミドまたは抗ＣＤ２５抗体の全身投与は、前記レンチウイルスベクターを含む組成物の腫瘍内注入に先行する、請求項１３に記載の使用組成物。
【請求項１５】
前記処置は、さらに、腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子を投与することを含む、請求項１に記載の使用組成物。
【請求項１６】
（ａ）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含む、樹状細胞標的化レンチウイルスベクター粒子を含む第１組成物と；（ｂ）腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子を含む第２組成物とを含み、前記第１組成物を腫瘍内に投与し、前記第２組成物を異なる経路で投与する、被検体のがんを処置する方法で使用するための生成物。
【請求項１７】
前記第２組成物が皮内、皮下、または筋肉内に投与される、請求項１６に記載の生成物。
【請求項１８】
前記第１組成物と前記第２組成物が同時に投与される、請求項１６に記載の生成物。
【請求項１９】
前記第１組成物と前記第２組成物が逐次的に投与される、請求項１６に記載の生成物。
【請求項２０】
１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ＩＬ−２３をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子。
【請求項２１】
ａ．１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；
ｂ．ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子。
【請求項２２】
前記ＩＬ−１２が単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）である、請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２３】
前記ｓｃＩＬ−１２がｐ３５−Ｌ−ｐ４０を含む、請求項２２に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２４】
前記ｓｃＩＬ−１２はｐ４０−Ｌ−ｐ３５を含む、請求項２２に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２５】
前記レンチウイルスベクターゲノムが、さらに、抗原をコードする配列を含む、請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２６】
前記抗原が腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または真菌抗原である、請求項２５に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２７】
前記腫瘍関連抗原が、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、前立腺特異的膜抗原、ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＧＡＧＥ、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃｒｉｐｔｉｎ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、およびＣ−Ｒａｆ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＭ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、ＡｎｎｅｘｉｎＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｎｏｔｃｈ１−４、ｃ−Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞がん−５Ｔ４、ＳＭ２２−ａｌｐｈａ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転移ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ならびにｆｏｓ関連抗原１からなる群から選択される、請求項２６に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２８】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子を含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含む、被検体のがんを処置する方法。
【請求項２９】
腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクターを含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを同時に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる時点で逐次的に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる経路で投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に、同じ経路で投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記レンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与し、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に、異なる経路で、同時に投与する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２５に記載のレンチウイルスベクター粒子を含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含む、被検体のがんを処置する方法。
【請求項３８】
ＴＬＲ４アゴニストを腫瘍内に投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性または水中油型のエマルジョン製剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記レンチウイルスベクター粒子を含む組成物は、さらに、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性製剤を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記レンチウイルスベクター粒子を単回投与で投与する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記レンチウイルスベクター粒子は、低レベルのＩＬ−１２を産生する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記低レベルのＩＬ−１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの形質導入アッセイで測定されるように、最初の４８時間で約０．１μｇ〜１μｇ／１Ｅ１０ベクターゲノム産生である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記レンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
ヒトまたは動物の被検体の処置法で使用するための、請求項２１〜２７の何れか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。
【請求項４６】
請求項２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子とを含む、組成物。
【請求項４７】
請求項２５に記載のレンチウイルスベクター粒子と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、治療ワクチンまたは予防ワクチンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、概して、がんの処置、より詳細には、がんの処置のためのＩＬ−１２を発現する偽型レンチウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞は抗原を発現する。このような抗原の存在にも関わらず、腫瘍は、概して、病気の進行により明らかなように、容易に認識されて、宿主により削除されることはない。腫瘍を予防する免疫系の不能は、回避機構、能動的抑制、または最適以下の応答活性化が原因であり得る。
【０００３】
サイトカインは、自然免疫系および獲得免疫系の両方にとって欠かせない。サイトカインは、細胞性応答および体液性応答のバランスを変え、Ｂリンパ球のクラススイッチを変え、自然応答を修正し得る。
【０００４】
インターロイキン−１２は、免疫系に対し多数の生物学的効果を有するヘテロ二量体サイトカインである。インターロイキン−１２は、２つのサブユニット、ｐ３５およびｐ４０から構成され、これは両方とも、ＩＬ−１２、ｐ７０の活性化形態の分泌に必要である。インターロイキン−１２は、樹状細胞（ＤＣ）に作用し、成熟の亢進および抗原提示を引き起こし、腫瘍特異的抗原に対するＴ細胞応答を開始させ得る。それは、また、ＤＣによるＩＬ−１２の分泌を駆り立て、応答を増幅させるポジティブフィードバック機構を生み出す。いったん反応が開始されると、ＩＬ−１２は、免疫系を、Ｔｈ１サイトカインプロファイルに向けることにおいて基本的な役割を果たし、ＣＤ４＋Ｔ細胞にインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を分泌させ、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こす（例えば、Cancer Immunol Immunother (2014) 63:419-435を参照されたい）。しかしながら、ＩＬ−１２は、また、ＩＦＮ−γと組み合わさってＣＤ４＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生の必要条件となる、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含む他のサイトカインの分泌を招く、強力な炎症性サイトカインでもある（Sasiain, M. C., et al. (1998) Clinical and experimental immunology 114: 196-203）。さらに、ＩＬ−１２は、ＩＦＮγおよび他のサイトカインの誘導を介して、マクロファージおよび好酸球などの自然免疫細胞の活性化を促進し得る。この活性化は、次に、これらの細胞によるＩＬ−１２分泌と、自然応答および獲得応答の両方のさらなる増幅を引き起こす（Portielje, J. E., et al., (2003) Cancer Immunol Immunother 52: 133-144.）。しかしながら、高レベルのＩＬ−１２およびその結果のＩＦＮγは、また、ＩＬ−１０などの拮抗分子の誘導と、ＩＬ−１２の下流のシグナル分子、例えばＳＴＡＴ４などの欠乏に関連する（Portielje, J. E., et al. (2003) Clin Cancer Res 9: 76-83; Sacco, S., et al. (1997) Blood 90: 4473-4479; Leonard, J. P., et al. (1997) Blood 90: 2541-2548.）。
【０００５】
組換えＩＬ−１２の直接注入が、何匹かの白血病マウスモデルで示された（Masztalerz, A., et al., (2003) Cancer Immunol Immunother 52: 235-242; Zagozdzon, R., et al. (1998) Int J Cancer 77: 720-727; Tatsumi, T., et al. (2001) Cancer research 61: 7563-7567; Nastala, C. L., et al. (1994) J Immunol 153: 1697-1706; Dunussi-Joannopoulos, K., et al., (1999) Blood 94: 4263-4273.）。一方、このアプローチを利用した最初のヒト治験に、期待は持てなかった（Atkins, M. B., et al. (1997) Clin Cancer Res 3: 409-417;  Kang, W. K., et al. (2001) Human gene therapy 12: 671-684; Mazzolini, G., et al. (2005) J Clin Oncol 23: 999-1010; Dohnal, A. M., et al., (2007) Cytotherapy 9: 755-770.）。革新的な遺伝子療法戦略は、がんに対する予防免疫療法の開発を加速させ得る。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一態様は、ａ）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ｂ）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子を提供する。本明細書に記載するレンチウイルスベクター粒子のある実施形態では、ＩＬ−１２は単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）である。本明細書に記載のレンチウイルスベクターのある実施形態では、ｓｃＩＬ−１２はｐ３５−Ｌ−ｐ４０を含む。本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子のある実施形態では、ｓｃＩＬ−１２はｐ４０−Ｌ−ｐ３５を含む。本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子の他の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノムは、さらに、抗原をコードする配列を含む。これに関し、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または真菌抗原である。ある実施形態では、腫瘍関連抗原は、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、前立腺特異的膜抗原、ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＧＡＧＥ、Ｐｌｕ―１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃｒｉｐｔｉｎ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、およびＣ−Ｒａｆ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＭ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、ＡｎｎｅｘｉｎＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ���、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｎｏｔｃｈ１−４、ｃ−Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞がん腫−５Ｔ４、ＳＭ２２−ａｌｐｈａ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転移ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ならびにｆｏｓ関連抗原１からなる群から選択される。
【０００７】
本発明の別の態様は、被検体のがんを処置する方法であって、ａ）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ｂ）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含むレンチウイルスベクター粒子などの、本明細書に記載のレンチウイルスベクターを含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態では、前記方法は、さらに、腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクターを含む組成物を有効量で被検体に投与するステップを含む。ある実施形態では、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子および第２レンチウイルスベクターを、同時に投与する。別の実施形態では、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子と第２レンチウイルスベクターを、異なる時点で逐次的に投与する。他の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子と、第２レンチウイルスベクターを、異なる経路で投与する。別の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子と、第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に投与する。他の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子と、第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に、同じ経路で投与する。別の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子を、腫瘍内に投与する。一実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストを、本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子と一緒に腫瘍内に投与する。ある実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストを、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子と同じ組成物において、腫瘍内に投与する。他の実施形態では、ＴＲＬ４アゴニストを、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子と同時に腫瘍内に投与するが、別の組成物において投与する。ＴＬＲ４アゴニストを投与するこれらの実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、水性または水中油型のエマルジョン製剤中のグルコピラノシル脂質Ａとすることができる。ある実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与し、第２レンチウイルスベクターを異なる経路で異なる部位に同時に投与する。
【０００８】
本発明の別の態様は、被検体のがんを処置する方法であって、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子を含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含み、前記レンチウイルスベクターゲノムはさらに抗原をコードする配列を含む、方法を提供する。ある実施形態では、レンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与する。特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子を単回投与で投与する。別の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、低レベルのＩＬ−１２を産生する。これに関し、低レベルのＩＬ−１２とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの形質導入アッセイで測定されるように、最初の４８時間で約０．１μｇ〜１μｇ／１Ｅ１０ベクターゲノム産生である。
【０００９】
本発明の他の態様には、ヒトまたは動物の被検体の処置法で用いる、本明細書に記載のＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクター粒子が含まれる。
【００１０】
本発明の別の態様は、ａ）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ｂ）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む組成物を；腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子と組み合わせて提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、ａ）１）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；２）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子を含む第１組成物と；ｂ）腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子を含む第２組成物とを含む生成物を、第１組成物の腫瘍内投与と、第２組成物の異なる経路での投与により被検体のがんを処置する方法で用いるために、提供する。一実施形態では、第２組成物は、皮内、皮下、または筋肉内に投与する。別の実施形態では、第１組成物および第２組成物を同時に投与する。さらなる実施形態では、第１組成物と第２組成物を逐次的に投与する。
【００１２】
本発明の別の態様は、医薬的に許容される賦形剤と、ａ）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープ、および；ｂ）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子とを含み、前記レンチウイルスベクターゲノムはさらに抗原をコードした配列を含む、治療ワクチンまたは予防ワクチンを提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、被検体のがんを処置する方法であって、ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子を含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含み、前記レンチウイルスベクター粒子を含む組成物は腫瘍内に投与され、前記レンチウイルスベクター粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイで測定されるように、最初の４８時間で約０．１μｇ〜１μｇ／１Ｅ１０ベクターゲノムという低レベルのＩＬ１２を産生する、方法を提供する。ある実施形態では、処置は、さらに、制御性Ｔ細胞の欠乏を含む。これに関し、制御性Ｔ細胞の欠乏には、シクロホスファミドの全身投与か、または、制御Ｔ細胞を欠乏させる抗体などの薬剤を用いた処置が含まれ得る。このような抗体の例は、抗ＣＤ２５抗体である。ある実施形態では、シクロホスファミドまたは抗ＣＤ２５抗体の全身投与は、レンチウイルスベクターを含む組成物の腫瘍内注入に先立つ。
【００１４】
本明細書に記載するがんの処置方法はいずれも、シクロホスファミドまたは制御性Ｔ細胞を欠乏させる抗体（例えば、抗ＣＤ２５抗体）などの薬剤の全身投与などの制御Ｔ細胞欠乏と組み合わせることができる。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、ａ）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ｂ）ＩＬ−２３をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、ＶＰ０２／ＩＬ−１２とＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１の共送達が、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞応答を高めることを示す図である。図１Ｂは、ＶＰ０２／ＩＬ−１２とＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１の共送達が、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞応答を高めることを示す図である。
【図２】図２Ａは、ＶＰ０２／ＩＬ−１２とＶＰ０２／ｈＣＡＩＸの共送達が、抗ｈＣＡＩＸ  ＣＤ８  Ｔ細胞応答を高めることを示す図である。図２Ｂは、ＶＰ０２／ＩＬ−１２とＶＰ０２／ｈＣＡＩＸの共送達が、抗ｈＣＡＩＸ  ＣＤ８  Ｔ細胞応答を高めることを示す図である。
【図３】図３Ａは、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達が、レンチウイルスベクターＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１により誘導されるＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく高めることを示す図である。図３Ｂは、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達が、レンチウイルスベクターＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１により誘導されるＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく高めることを示す図である。
【図４Ａ】ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達が、レンチウイルスベクターＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１により誘導されるＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を著しく高めることを示す図である。
【図４Ｂ】ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達が、レンチウイルスベクターＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１により誘導されるＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を著しく高めることを示す図である。
【図５Ａ】低用量のＶＰ０２／ＩＬ−１２（１Ｅ９  ｖｇ用量）であっても、免疫原性用量のボーダーライン（１Ｅ９  ｖｇ）のＬＶ３０５との共投与は、ＣＤ８およびＣＤ４の応答を高めたことを示す図である。
【図５Ｂ】低用量のＶＰ０２／ＩＬ−１２（１Ｅ９  ｖｇ用量）であっても、免疫原性用量のボーダーライン（１Ｅ９  ｖｇ）のＬＶ３０５との共投与は、ＣＤ８およびＣＤ４の応答を高めたことを示す図である。
【図５Ｃ】低用量のＶＰ０２／ＩＬ−１２（１Ｅ９  ｖｇ用量）であっても、免疫原性用量のボーダーライン（１Ｅ９  ｖｇ）のＬＶ３０５との共投与は、ＣＤ８およびＣＤ４の応答を高めたことを示す図である。
【図５Ｄ】低用量のＶＰ０２／ＩＬ−１２（１Ｅ９  ｖｇ用量）であっても、免疫原性用量のボーダーライン（１Ｅ９  ｖｇ）のＬＶ３０５との共投与は、ＣＤ８およびＣＤ４の応答を高めたことを示す図である。
【図６】ＶＰ０２／ＩＬ１２の共投与は、高用量のＶＰ０２／ｈＣＡＩＸの治療活性を高めたが、差は有意でなかったことを示す図である。
【図７】図７Ａは、低用量のＬＶ３０５により媒介される抗腫瘍効果が、ＶＰ０２／ＩＬ−１２と混合することにより著しく高められたことを示す図である。図７Ｂは、抗腫瘍効果は、ＮＹ−ＥＳＯ−１−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の大きさと相関関係にあることを示す図である。
【図８】図８Ａは、ＶＰ０２／ＩＬ−２３が、初回免疫化後のＰＢＭＣにおいて、ＬＶ３０５誘導ＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく高めることができたことを示す図である。図８Ｂは、ＶＰ０２／ＩＬ−２３が、初回免疫化後のＰＢＭＣにおいて、ＬＶ３０５誘導ＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく高めることができたことを示す図である。
【図９】図９Ａは、Ｂ１６Ｆ１０足蹠マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図９Ａは腫瘍増殖曲線を示す。図９Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０足蹠マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図９Ｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶ７０３）と組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＬＶ７０４、ＶＰ０２ともいう）の両方の生存率曲線を示す。
【図１０】図１０Ａは、Ｂ１６Ｆ１０側腹部マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１０Ａは腫瘍増殖曲線を示す。図１０Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０側腹部マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１０Ｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶ７０３）と組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＬＶ７０４、ＶＰ０２ともいう）の両方の生存率曲線を示す。
【図１１】図１１Ａは、Ｐ８１５マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１１Ａは腫瘍増殖曲線を示す。図１１Ｂは、Ｐ８１５マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１１Ｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶ７０３）と組み込み欠損レンチウイルスベクターベクター（ＬＶ７０４、ＶＰ０２ともいう）の両方の生存率曲線を示す。
【図１２】図１２Ａは、ＣＴ２６側腹部マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１２Ａは腫瘍増殖曲線を示す。図１２Ｂは、ＣＴ２６側腹部マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１２Ｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶ７０３）と組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＬＶ７０４、ＶＰ０２ともいう）の両方の生存率曲線を示す。
【図１３】図１３Ａは、４Ｔ１マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１３Ａは腫瘍増殖曲線を示す。図１３Ｂは、４Ｔ１マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１３Ｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶ７０３）と組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＬＶ７０４、ＶＰ０２ともいう）の両方の生存率曲線を示す。
【図１４】図１４Ａは、Ａ２０マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１４Ａは腫瘍増殖曲線を示す。図１４Ｂは、Ａ２０マウス腫瘍モデルにおける、ＬＶ／ＩＬ−１２の腫瘍内注入の抗腫瘍効果を示す図である。図１４Ｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶ７０３）と組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＬＶ７０４、ＶＰ０２ともいう）の両方の生存率曲線を示す。
【図１５Ａ】ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加が、混ざり合ったｒＮＹ−ＥＳＯ−１＋ＧＬＡ−ＳＥと共投与し、尾基底部に皮下投与した場合に、ＮＹ−ＥＳＯ−１  Ａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の応答を著しく高めたことを示す図である。図１５Ａは、サイトカインポジティブＣＤ４  Ｔ細胞率を示す。
【図１５Ｂ】ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加が、混ざり合ったｒＮＹ−ＥＳＯ−１＋ＧＬＡ−ＳＥと共投与し、尾基底部に皮下投与した場合に、ＮＹ−ＥＳＯ−１  Ａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の応答を著しく高めたことを示す図である。図１５Ｂは、総ＩＦＮγ  ＣＤ４陽性Ｔ細胞率を示す。
【図１６】図１６Ａは、ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせた組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）を用いた実験において、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加がＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく増大させることを示す図である。図１６Ｂは、ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせた組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）を用いた実験において、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加がＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく増大させることを示す図である。図１６Ｃは、ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせた組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）を用いた実験において、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加がＣＤ４  Ｔ細胞応答を低減させることを示す図である。図１６Ｄは、ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせた組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）を用いた実験において、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加がＣＤ４  Ｔ細胞応答を低減させることを示す図である。
【図１７】図１７Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝８／群）の右足蹠に、１×１０６のＢ１６Ｆ１０メラノーマを接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左足蹠に１×１０６のメラノーマ細胞を接種した。次に、マウスを、組み込みＬＶ／ＩＬ−１２（ＬＶ７０３）またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔまたはコントロールベクター、ＩＴ±２００μｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体またはアイソタイプ・コントロール、ＩＰで免疫化した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。図１７Ａは個々の腫瘍成長である。図１７Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝８／群）の右足蹠に、１×１０６のＢ１６Ｆ１０メラノーマを接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左足蹠に１×１０６のメラノーマ細胞を接種した。次に、マウスを、組み込みＬＶ／ＩＬ−１２（ＬＶ７０３）またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔまたはコントロールベクター、ＩＴ±２００μｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体またはアイソタイプ・コントロール、ＩＰで免疫化した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。図１７Ｂは個々のアブスコパル腫瘍増殖である。図１７Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝８／群）の右足蹠に、１×１０６のＢ１６Ｆ１０メラノーマを接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左足蹠に１×１０６のメラノーマ細胞を接種した。次に、マウスを、組み込みＬＶ／ＩＬ−１２（ＬＶ７０３）またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔまたはコントロールベクター、ＩＴ±２００μｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体またはアイソタイプ・コントロール、ＩＰで免疫化した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。図１７Ｃは生存率である。
【図１８】図１８Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝８／群）の右側腹部に、１×１０５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左側腹部に１×１０５のメラノーマ細胞を接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔまたはコントロールベクター、ＩＴ±２００μｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体またはアイソタイプ・コントロール、ＩＰで免疫化した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。図１８Ａは個々の腫瘍増殖である。図１８Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝８／群）の右足蹠に、１×１０５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左足蹠に１×１０５のメラノーマ細胞を接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔまたはコントロールベクター、ＩＴ±２００μｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体またはアイソタイプ・コントロール、ＩＰで免疫化した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。図１８Ｂは個々のアブスコパル腫瘍増殖である。図１８Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（ｎ＝８／群）の右足蹠に、１×１０５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左足蹠に１×１０５のメラノーマ細胞を接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔまたはコントロールベクター、ＩＴ±２００μｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体またはアイソタイプ・コントロール、ＩＰで免疫化した。研究の終わりまで、抗体を一週間に一度投与した。図１８Ｃは生存率である。
【図１９】図１９Ａは、ＢＡＬＢ／ｃメスマウス（ｎ＝１０／群）の右第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはコントロールベクター、ＩＴ±ＧＬＡ、ＩＴ±２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはアイソタイプコントロール、ＩＰで免疫化した。第１のＧＬＡ用量は、腫瘍内投与前にＬＶ７０３／ＩＬ−１２と混合した、５μｇのＧＬＡ−ＡＦだった。続く腫瘍内ＧＬＡ用量は、５μｇのＧＬＡ−ＳＥで、週に一度投与した。図１９Ａは個々の原発腫瘍増殖である。図１９Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃメスマウス（ｎ＝１０／群）の右第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはコントロールベクター、ＩＴ±ＧＬＡ、ＩＴ±２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはアイソタイプコントロール、ＩＰで免疫化した。第１のＧＬＡ用量は、腫瘍内投与前にＬＶ７０３／ＩＬ−１２と混合した、５μｇのＧＬＡ−ＡＦだった。続く腫瘍内ＧＬＡ用量は、５μｇのＧＬＡ−ＳＥで、週に一度投与した。図１９Ｂは、追加アブスコパル腫瘍を有する動物における個々の原発腫瘍増殖である。図１９Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃメスマウス（ｎ＝１０／群）の右第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはコントロールベクター、ＩＴ±ＧＬＡ、ＩＴ±２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはアイソタイプコントロール、ＩＰで免疫化した。第１のＧＬＡ用量は、腫瘍内投与前にＬＶ７０３／ＩＬ−１２と混合した、５μｇのＧＬＡ−ＡＦだった。続く腫瘍内ＧＬＡ用量は、５μｇのＧＬＡ−ＳＥで、週に一度投与した。図１９Ｃは、個々のアブスコパル腫瘍増殖である。図１９Ｄは、ＢＡＬＢ／ｃメスマウス（ｎ＝１０／群）の右第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。７日目に、担腫瘍マウスの左第４乳房脂肪体内に、１×１０５の４Ｔ１乳がん細胞を同所性接種した。次に、マウスを、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２またはコントロールベクター、ＩＴ±ＧＬＡ、ＩＴ±２００μｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはアイソタイプコントロール、ＩＰで免疫化した。第１のＧＬＡ用量は、腫瘍内投与前にＬＶ７０３／ＩＬ−１２と混合した、５μｇのＧＬＡ−ＡＦだった。続く腫瘍内ＧＬＡ用量は、５μｇのＧＬＡ−ＳＥで、週に一度投与した。図１９Ｄは、生存率である。
【図２０】図２０Ａは、腫瘍内ＬＶ７０３／ＩＬ−１２で処置したマウスのＩＬ−１２の血漿レベルを示すグラフである。図２０Ｂは、腫瘍内ＬＶ７０３／ＩＬ−１２で処置したマウスのＩＦＮγの血漿レベルを示すグラフである。
【図２１】図２１Ａは、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２を脊髄内投与し、異なる細胞タイプが欠乏しているマウスにおける個々の腫瘍サイズ（Ｂ１６Ｆ１０側腹部モデル）のグラフである。（２１Ａ）：ＣＤ８  Ｔ細胞欠損。図２１Ｂは、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２を脊髄内投与し、異なる細胞タイプが欠乏しているマウスにおける個々の腫瘍サイズ（Ｂ１６Ｆ１０側腹部モデル）のグラフである。（２１Ｂ）：ＣＤ４  Ｔ細胞欠損。図２１Ｃは、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２を脊髄内投与し、異なる細胞タイプが欠乏しているマウスにおける個々の腫瘍サイズ（Ｂ１６Ｆ１０側腹部モデル）のグラフである。（２１Ｃ）：ＮＫ細胞欠損。図２１Ｄは、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２を脊髄内投与し、異なる細胞タイプが欠乏しているマウスにおける個々の腫瘍サイズ（Ｂ１６Ｆ１０側腹部モデル）のグラフである。（２１Ｄ）：ＣＤ８＋ＣＤ４欠損およびＣＤ８、ＣＤ４＋ＮＫの欠損。図２１Ｅは、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２を脊髄内投与し、異なる細胞タイプが欠乏しているマウスにおける個々の腫瘍サイズ（Ｂ１６Ｆ１０側腹部モデル）のグラフである。（２１Ｅ）：ＣＤ８＋ＮＫおよびＣＤ４＋ＮＫの欠損。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、ＩＬ−１２をコードするレンチウイルスベクターを投与することにより、がんを処置する方法および組成物を提供する。ある実施形態では、レンチウイルスベクターはＩＬ−１２を発現する、樹状細胞（ＤＣ）標的レンチウイルスベクターである。特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルスＥ２に由来するエンベロープ糖タンパク質変異体と、ＩＬ−１２をコードする配列を含むゲノムと、オプションとして他の組成物とを含む。糖タンパク質変異体は、基準シンドビスウイルス株であるＨＲと比較し、ヘパラン硫酸への結合の減少を示す。エンベロープ糖タンパク質は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進する。本明細書で用いる場合、感染を「促進する」とは、形質導入を促進すると同じであり、偽型レトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の標的細胞への受容体媒介性侵入の促進または増強において単独でまたは他の分子と共同して作用する、エンベロープ糖タンパク質の役割を意味する。
【００１８】
概して、レンチウイルスベクター粒子は、機能性ベクター粒子を生成するのに必要な成分を共にコードしている、１つまたは複数のプラスミドベクターおよび／または組み込みエレメントを含有する細胞株により産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、典型的には、複製能がなく、つまり、該粒子は、１回の感染のみ可能である。ほとんどの場合、産生細胞染色体に安定して組み込まれた多数のプラスミドベクターまたは個々の発現カセットが、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子成分を分離するために利用されるが、レンチウイルス成分の全てを有する単一プラスミドベクターを用いることも可能である。一例示では、パッケージング細胞株は、ＬＴＲ、ｃｉｓ作用性パッケージング配列、および対象配列を含む、ウイルスベクターゲノムを含有する１つまたは複数のプラスミド、ウイルスの酵素成分および構造成分（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）をコードする少なくとも１つのプラスミド、ならびにエンベロープ糖たんぱく質をコードする少なくとも１つのプラスミドを用いて遺伝子導入される。ある実施形態では、エンベロープタンパク質はアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質である。他の実施形態では、エンベロープタンパク質は、ゲノムに使用されるウイルスに対し異種なウイルスに由来する（例えば、エンベロープ糖タンパク質は、レンチウイルスベクター以外のウイルスに由来する）。ウイルス粒子は細胞膜から発芽し、それは、典型的には対象配列を含有する２つのＲＮＡゲノムを含むコアと、樹状細胞を標的にするアルボウイルスエンベロープなどのエンベロープ糖タンパク質とを含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である場合、糖タンパク質は、基準株ＨＲと比較して、ヘパラン硫酸への結合が低下するように操作されている。これは、通常、ＨＲ  Ｅ２糖タンパク質配列と比較し、少なくとも１つのアミノ酸変化が伴う。
【００１９】
理論に縛られることは望むものではないが、ウイルス粒子の細胞表面への結合はエンドサイトーシスを誘導し、ウイルスをエンドソームへ運び、膜融合を引き起こし、ウイルスコアのサイトゾルへの侵入を可能にすると考えられている。レンチウイルスベクター粒子の組み込みを利用するある実施形態では、産生物の逆転写およびその核への移行の後、ウイルスのゲノムは標的細胞ゲノムに組み込まれ、対象配列が標的細胞のゲノムに取り込まれる。しかしながら、挿入性変異誘発の確率を低下させ、指定抗原の一過性発現を促進するため、他の実施形態は、標的細胞ゲノムへ組み込まれないが、代わりに、対象配列をエピソームから発現させる、組み込み欠損レンチウイルスベクター粒子を利用する。いずれにせよ、その後、感染細胞は、対象配列、例えばＩＬ−１２と、オプションとして抗原および／または刺激性分子を発現する。抗原が含まれた場合、それは次に樹状細胞によりプロセシングされ、Ｔ細胞およびＢ細胞に提示され、抗原特異的免疫応答を生成することが可能である。上記の特定の経路は、樹状細胞が抗原特異的免疫応答を刺激することが可能である限り、必要ではない。
【００２０】
予防効果または治療効果をもたらすために、ウイルス粒子を被検体に投与することが可能である。対象配列の産生物は、典型的には、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）または他の形態のＩＬ−１２であり、該産生物には、疾患を引き起こす病原体かもしくは罹患細胞（例えば腫瘍細胞）の抗原、およびまたは、追加の免疫調節分子、例えばサイトカインも含まれ得る。樹状細胞の感染および産生物の発現に続いてＩＬ−１２が発現し、ＩＬ−１２に加えて抗原がベクターから発現する実施形態では、免疫応答が抗原に対しもたらされ、発現したＩＬ−１２産生物により増大する。免疫応答は、体液性または細胞性または両方であり得る。
【００２１】
Ａ．ウイルスベクターエンベロープ
本明細書に記載のウイルスベクターは、概して、異種ウイルス由来のエンベロープタンパク質で偽型化されている。ある実施形態では、ウイルスベクターは、ＶＳＶｇエンベロープ糖タンパク質で偽型化されている。他の実施形態では、ウイルスベクターは、異種ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−２）または他の異種レトロウイルス、例えばネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、もしくはマエディ／ビスナウイルスなどに由来するエンベロープ糖タンパク質で偽型化されている。
【００２２】
特定の実施形態では、本明細書に記載するウイルスベクターは、アルボウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質で偽型化されている。節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）は、蚊などの感染した節足動物ベクターにより、ヒト、ウマ、またはトリなどの宿主に伝染するウイルスである。アルボウイルスは、さらに、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含むウイルスの亜科に分類され、これらは正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムおよび糖タンパク質含有エンベロープを有する。例えば、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、およびウエストナイルウイルスがフラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科の構成要素である（Wang et al. J. Virol. 66, 4992 (1992)）。シンドビスウイルスのエンベロープには、２つの膜貫通糖タンパク質（Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)）：融合に関与すると考えられるＥ１と、細胞結合に関与すると考えられているＥ２が含まれる。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む他のレトロウイルスを、偽型化することが知られている。
【００２３】
上記で論じたように、アルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を使用して、レンチウイルス系ベクターゲノムを偽型化することが可能である。「偽型」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによりコードされる１つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書に記載するように、修飾し、変異させ、または操作することができる。
【００２４】
シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質二重層に取り込まれ、典型的には、２つの糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２の多数の複製を含む。各糖タンパク質は膜貫通領域を有し；Ｅ２は約３３残基細胞質ドメインを有するが、Ｅ１の細胞質尾部は非常に短い（約２残基）。Ｅ１とＥ２は両方とも、膜貫通領域かまたその近くに結合したパルミチン酸を有する。Ｅ２は、最初、前駆体タンパク質として合成され、フューリンまたは他のＣａ２＋依存性セリンプロテイナーゼにより切断されて、Ｅ２と、Ｅ３と呼ばれる小糖タンパク質になる。Ｅ２とＥ１をコードする配列の間に位置するのは、６Ｋと呼ばれるタンパク質をコードする配列である。Ｅ３および６Ｋは、それぞれ、Ｅ２糖タンパク質とＥ１糖タンパク質を膜に転位置させるように機能するシグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域には、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１をコードする配列が含まれる。本明細書で用いる場合、アルボウイルスウイルスの「エンベロープ」には、少なくともＥ２が含まれ、また、Ｅ１，６Ｋ、およびＥ３も含まれ得る。シンドビスウイルス、ＨＲ株のエンベロープ糖タンパク質の例示的配列は、国際公開第２０１１／０１１５８４号のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７と表される。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに見ることが可能である。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は受入番号ＧＱ２５２６７７で（とりわけＧｅｎＢａｎｋにおいて）、および、ＮＣＢＩのウイルス多様性データベースにおいて見出すことができ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号とウイルス多様性データベースはエンベロープ糖タンパク質配列の参照により組み込まれる）、そして、ベネズエラ馬脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする配列は受入番号ＮＰ０４０８２４に見出すことができる（エンベロープ糖タンパク質の配列の参照により組み込まれる）。
【００２５】
アルファウイルス、および特にシンドビスウイルスに対する樹状細胞上の細胞受容体が、これまで明確に特定されたことはなかったが、一つの受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮであると思われる（Klimstra et al., J Virol 77: 12022, 2003）。用語「付着」、「結合」、「標的化」等の使用は区別なく使用され、これらはシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分の間の相互作用の機構を示すことを意味するものではない。ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３（細胞接着分子３）−結合非インテグリン；ＣＤ２０９としても知られる）は、物質の迅速な結合およびエンドサイトーシスが可能なＣ型レクチン様受容体である（Geijtenbeek, T. B., et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004）、Ｅ２は、ＤＣ−ＳＩＧＮを介して、ウイルスに樹状細胞を標的化させるようである。本明細書に示すように、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない同質遺伝子細胞よりも、シンドビスウイルスＥ２で偽型化したウイルスベクター粒子により、より良好に（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍良好に）形質導入される。Ｅ２糖タンパク質がウイルス感染を促進する機序には、可能性としてはＤＣ−ＳＩＧＮへの直接結合、または立体構造もしくは一部の他の機構を変化させることを通して、ＤＣ−ＳＩＧＮが関与しているようである。実際の機序に関わらず、Ｅ２による標的化は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞、つまり、樹状細胞が優先される。
【００２６】
シンドビスウイルスも、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合するようである（Klimstra et al., J Virol 72: 7357, 1998; Burmes and Griffin, J Virol 72: 7349, 1998）。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカンが大部分の細胞型の表面に見られることから、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質の間の相互作用は低減させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させることにより、または、シンドビスウイルスエンベロープの、樹状細胞への結合を増大させる、例えば結合力を高めることにより、またはその両方により達成することが可能である。結果として、エンベロープがＤＣ−ＳＩＧＮに対し特異的であったとしても起こり得る、他の細胞型により発現され得る他の分子への非特異的な結合が減少し、特異性の改善は、所望の免疫応答を低下させ得る副作用または他の細胞型の標的外形質導入に関連する副作用などの、望ましくない副作用を避けるように機能し得る。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点の代わりに、またはそれに加えて、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質で偽型化したウイルス粒子は、ＶＳＶＧなどの糖タンパク質で偽型化されたウイルス粒子を超える、他の利点を提供し得る。このような利点の例としては、補体媒介性溶解の低下および／または神経細胞の標的化の減少が挙げられ、これらは両方とも、ＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルス粒子の投与に関連していると考えられる。
【００２７】
種々の例示では、レンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸への結合を減少または抑止した。つまり、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質を修飾して、ウイルスに、他の細胞タイプと比較して、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞を優先的に標的させることができる。他の研究のうち、構造研究および分子モデリングより得られた情報に基づき、エンベロープタンパク質、特にＥ２およびＥ１糖タンパク質の変異配列を、前記糖タンパク質がタンパク質としての機能を維持するが、所望の結合特異性、親和性、または結合レベルを有するように、設計および生成する。候補変異配列を糖タンパク質ごとに生成し、以下に記載の方法または当技術分野で既知の他の方法を用いてアッセイして、最も望ましい特徴を有するエンベロープ糖タンパク質を同定することができる。
【００２８】
シンドビスＥ２のある変異配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比較し少なくとも１つのアミノ酸変化を残基１６０で有する。残基１６０は除去されるか、または、グルタミン酸以外のアミノ酸に変更される。変更は、最も一般的には、少なくとも１つのアミノ酸の置換であるが、代わりに、１つまたは複数のアミノ酸の付加または除去の場合もある。好適には、任意の追加アミノ酸は少数であり、安全性を損なうことがある抗原エピトープ（例えば、ヘマグルチンタグ配列）を含まない。２つ以上の変更がある場合、それらは両方とも同じ種類（例えば、置換）か、または異なる種類（例えば置換と除去）とすることが可能である。多数の変更を、タンパク質配列において分散させるか、または、隣接して位置づけることが可能である。本発明で使用する例示的なＥ２糖タンパク質の変異体は、国際公開第２０１１０１１５８４号に記載されており、該変異体には、本明細書で提供する配列表のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜１５の何れかおよび本明細書に記載のその変異体が含まれる。
【００２９】
第１の例では、変異配列は、約残基５０〜約残基１８０の領域に少なくとも１つのアミノ酸変更を含む。この領域内には、ヘパラン硫酸への結合に関与するアミノ酸が存在する。Ｅ２の正味の正電荷を減少させることにより、ヘパラン硫酸との静電相互作用を低減させ、ヘパラン硫酸への結合を減少させることが可能である。この領域内の正荷電アミノ酸の候補としては、残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９、１５９のリシン、残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、１７２のアルギニンが挙げられる（Bear et al., Virology 347: 183-190, 2006）。これらのアミノ酸のうち少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸へのＥ２結合に直接関係する。正味の正電荷は、リシンもしくはアルギニンの除去、または、中性もしくは負荷電アミノ酸でのリシンもしくはアルギニンの置換により、減少させることが可能である。例えば、これらのリシンおよびアルギニンの１つまたは複数を、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えることができる。ある実施形態は、リシン７０、７６、または１５９の少なくとも１つの置換を有する。Ｅ２がＥ３を有するポリタンパク質として発現する場合、天然Ｅ３／Ｅ２切断部位に隣接して位置するリシンは維持される−つまり、認識配列および切断部位は不変である。あるいは、天然エンドペプチダーゼ切断部位配列が、異なるエンドペプチダーゼの認識配列で置換される。
【００３０】
Ｅ２のある変異体も、また、樹状細胞への結合に正の影響を与えるように修飾する。基準ＨＲ配列の残基１６０に見られるグルタミン酸の変更が、樹状細胞への結合を改善し得る（Gardner et al., J Virol 74, 11849, 2000参照）。残基１６０の除去または残基１６０の置換などの変更が、ある変異体に見られる。特定の変異体では、非荷電アミノ酸がＧｌｕに置換されており、他の変異体では、非酸性アミノ酸がＧｌｕに置換されている。典型的には、Ｇｌｕ１６０は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸１つで置換されている。
【００３１】
他の変異体は、２つ以上のアミノ酸変更を含む。典型的には、これらの変異体において、変更の１つはＧｌｕ１６０であり、残りの変更は、残基約５０〜約１８０にわたる領域内での、リシンおよびアルギニンの１つまたは複数の変更である。ある変異体は、Ｇｌｕ１６０の非酸性塩基への変更または除去、および、非塩基性アミノ酸を用いた、リシン７０、リシン７６、またはリシン１５９の１つまたは複数の変更を含む。いくつかの特異的変異体は、Ｇｌｕ１６０をＧｌｙへ、Ｌｙｓ７０をＧｌｕへ、Ｌｙｓ１５９をＧｌｕへと；Ｇｌｕ１６０をＧｌｙへ、Ｌｙｓ７０、７６、および１５９をＧｌｕへと；Ｇｌｕ１６０の除去ならびにＬｙｓ７０および１５９をＧｌｕへと；Ｇｌｕ１６０の除去ならびにＬｙｓ７０、７６、および１５９をＧｌｕへとを含む。
【００３２】
ある例では、Ｅ２タンパク質が、少なくともＥ３との融合において、または、リーダー配列との融合において、ポリタンパク質として最初に発現する。リーダー配列がＥ３であるか、または別の配列であるかに関わらず、ウイルスエンベロープのＥ２は、Ｅ３または他のリーダー配列を含むべきではない。言い換えると、Ｅ２は、好適には、Ｅ３／Ｅ２融合タンパク質（例えば、ＳＶＧｍｕと呼ばれるＥ３／Ｅ２融合タンパク質）ではない。ある実施形態では、Ｅ２は、Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現する。シンドビスウイルスは、ポリタンパク質の一部としてＥ２を天然に発現し、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋ、および６Ｋ／Ｅ１の接合領域は、エンドペプチダーゼにより認識および切断される配列を有する。通常、Ｅ３／Ｅ２接合は、フューリンまたはフューリン様セリンエンドペプチダーゼにより、残基６５と６６の間で切断される。フューリンは、２つのアミノ酸により分離されているアルギニン残基対に対し特異性を有する。フューリンによるＥ３／Ｅ２切断を維持するためには、残基６２〜６６（ＲＳＫＲＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）は、２つのアミノ酸で分離されている２つのアルギニン残基と、セリン残基とを維持しなければならない。あるいは、異なる切断配列を、Ｅ３／Ｅ２フューリン切断配列または他の切断配列のいずれかの代わりに用いることが可能である。認識部位および切断部位は、限定するわけではないが、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン、パパイン、カルパイン）、メタロエンドペプチダーゼ（例えば、コラゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを含む、エンドペプチダーゼに対して取り込まれ得る。これらの酵素に対する認識および切断部位配列は、周知である。
【００３３】
すでに言及したもの以外のＥ２のアミノ酸を変更することもできる。概して、変異Ｅ２配列は、基準Ｅ２配列に対して少なくとも８０％の配列アミノ酸同一性を有するか、または、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有し得る。変異糖タンパク質は、Ｅ２を含むエンベロープを有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力などの、生物学的機能を示すべきである。実験により、ウイルス構築、細胞表面への結合、および感染という種々の面において重要な役割を有すると見られるエンベロープ糖タンパク質の領域が特定されている。変異体を作成する場合、以下の情報をガイドラインとして使用することが可能である。Ｅ２の細胞質尾部―約残基４０８〜４１５―は、ウイルス構築にとって重要である（West et al. J Virol 80: 4458-4468, 2006; 8）。他の領域は、二次構造の形成に関与し（約残基３３〜５３）；輸送およびタンパク質の安定性に関与する（約残基８６〜１１９）（Navaratmarajah et al., J Virol 363: 124-147, 2007;）。変異体は、膜を貫通する領域、約残基３７０〜３８０の疎水性特徴を維持し得る。変異体は、Ｎ−結合型糖鎖付加部位残基ＮＩＴ（残基１９６〜１９８）およびＮＦＴ（残基３１８〜３２０）の一方または両方を維持し得、パルミトイル化される部位（Ｃ−３９６、Ｃ４１６、およびＣ４１７）の１つまたは複数を維持し得る（Strauss and Strauss Microbiol Rev 58, 491-562, 1994; pp. 499-509）。一方で、Ｅ２の多くの領域を、有害事象なしに変更することができる。例えば、Ｅ２の多くの異なる場所におけるトランスポゾンの挿入は、なお、生存可能なウイルスをもたらした（Navaratmarajah, ibid）。
【００３４】
ある実施形態では、Ｅ３、６Ｋ、またはＥ１タンパク質にタグペプチドを取り込んでよい。いくつかの目的のためにＥ２にタグを取り込んでよいが、タグは、ヒト患者への投与のための生成物での使用には望ましくない。タグペプチドは短配列であるが（例えば、５〜３０アミノ酸）、これを使用して、ウイルス粒子におけるエンベロープ発現およびその存在の検出を容易にすることが可能である。検出の目的上、タグ配列は、典型的には、抗体または化学物質により検出可能であろう。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製を容易にすることである。タグの結合パートナーを含有する基質を使用して、ウイルスを吸着することが可能である。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグを移動させる部分を用いた処理により達成されるか、または、タグ配列が切断配列と結合している場合は、適切なエンドペプチダーゼを用いた処理が、好都合なことにウイルスの遊離を可能にする（例えば、ＱｉａＧＥＮ（登録商標）カタログ、第Ｘａ因子プロテアーゼ系を参照されたい）。タグペプチドの除去は、概して、動物被検体におけるウイルス粒子の使用の安全性の目的上、望ましい。タグを除去されない場合、タグに対する免疫応答が起こり得る。
【００３５】
適切なタグとしては、数ある中でも、限定するわけではないが、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）（米国特許第４７０３００４号明細書）（これに対する抗体は商業的に利用可能である）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）（米国特許第４５６９７９４号明細書）、チオレドキシン、ＨＡ（ヘマグルチニン）−タグが挙げられる。ポリ（Ｈｉｓ）は、結合金属イオン、例えば、ニッケルまたはコバルトを含有する親和性培地に吸着され、低ｐＨ媒体で溶出され得る。
【００３６】
ウイルス粒子を評価して、樹状細胞を標的にする、ウイルスに取り込まれたエンベロープ糖タンパク質の特異性を決定することができる。例えば、骨髄細胞の混合群を、被検体から得て、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することが可能である。あるいは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する、または発現しない同質遺伝子細胞株を得て使用することも可能である。組換えウイルスを、骨髄細胞の混合群または同質遺伝子細胞株に投与し、ウイルスに取り込まれたレポーター遺伝子の発現を、培養細胞中でアッセイすることが可能である。ある実施形態は、限界希釈分析を利用する場合があり、この分析では、細胞の混合群を別々の部分に分割し、それを次に、ウイルス量を減少させながら別々にインキュベーションする（例えば、各部分で、２分の１、５分の１、１０分の１のウイルス）。一部の実施形態では、混合細胞群中の感染細胞の少なくとも約５０％、より好適には少なくとも約６０％、７０％、８０％、または９０％、さらにより好適には少なくとも約９５％が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。ある実施形態では、感染樹状細胞と感染非樹状細胞（または、非ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞）の比は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１００００：１、またはそれ以上である。限界希釈では、より優れた選択性は、典型的には、インプットウイルスの希釈が高いほど（つまり、少量であるほど）、見られる。
【００３７】
偽型ウイルス粒子の活性は、種々の技法の何れかにより決定することが可能である。例えば、感染効率（ＩＵ、感染単位）を測定する好適な方法は、ウイルス粒子を細胞に投与し、ベクターゲノムにコードされた産生物の発現を測定することによる。アッセイすることが可能な任意の産生物が使用され得る。１つの好都合な種類の産生物は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質である。ＧＦＰおよびアッセイは、実施例で例示する。使用することが可能な他の産生物としては、細胞表面上に発現されるタンパク質（例えば、抗体結合による検出）、および酵素等が挙げられる。ＩＬ−１２の検出には、ＩＬ−１２検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）または生物学的機能アッセイ（例えば、実施例１参照）を使用することが可能である。産生物が抗原を含み、細胞が樹状細胞である場合、感染性／活性は、抗原特異的免疫応答を測定することにより評価することが可能である。さらに、哺乳動物で副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的にする能力は、また、例えば、以下に記載するように、細胞培養において直接テストすることも可能である。
【００３８】
ウイルス粒子を調製し、それらの選択性および／または標的細胞膜の透過を容易にするそれらの能力についてテストすることが可能である。未修飾糖タンパク質を有するエンベロープを有するウイルス粒子を、比較のための対照として使用することが可能である。簡潔に述べると、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞を、標準的な感染アッセイを使用してウイルスに感染させる。特定の時間後、例えば感染の４８時間後に、細胞を採取し、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージを、例えば、フローサイトメトリーにより求めることが可能である。選択性は、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージを計算することにより、点数化することが可能である。同様に、変異エンベロープ糖タンパク質のウイルス力価に対する影響は、変異エンベロープを含むウイルスに感染した細胞のパーセンテージを、対応する野生型（未修飾）エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスに感染した細胞のパーセンテージで除算することにより、定量化することが可能である。特に適切な変異体が、選択性および感染力価の最良の組み合わせを有するだろう。いったん変異体を選択したら、ウイルス濃度アッセイを実行して、これらのウイルスが活性を損なうことなく濃縮可能であることを確認することができる。ウイルス上清を採取し、超遠心分離法により濃縮する。ウイルス力価は、ウイルス原液の限界希釈と、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞の感染によって、上記のように、ウイルスにより発現される産生物の発現を測定して、求めることが可能である。
【００３９】
標的細胞へのレンチウイルスベクター粒子の侵入は、別の種類の活性評価である。ＨＩＶ−１ウイルス透過を測定するために、ＢｌａＭ−Ｖｐｒ（β−ラクタマーゼＶｐｒ）融合タンパク質が利用されており；ＢｌａＭと、Ｅ１またはＥ２／Ｅ１融合タンパク質などのシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質の融合を使用して、標的細胞への融合および透過を促進する際のエンベロープタンパク質の有効性を評価することが可能である。ウイルス粒子は、例えば、ウイルス性エレメント、ＢｌａＭ−Ｖｐｒ、および対象の変異エンベロープ（および、適切な場合は、親和性分子）を含む１つまたは複数のベクターを用いたパッケージング細胞の一過性遺伝子導入により、調製することができる。結果として生じるウイルスを使用して、遊離結合阻害物質（例えば、抗体など）の存在下でも不在下でも、標的分子（または親和性分子）が特異的に結合する分子を発現する細胞を感染させることが可能である。次に、細胞は、ＣＯ２非依存培地で洗浄され、ＣＣＦ２染料（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が充填され得る。室温でインキュベーションして、切断反応を完了させた後、細胞をパラホルムアルデヒドにより固定し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡で解析することが可能である。青い細胞の存在は、ウイルスの細胞質への透過を示し；ブロッキング抗体が加えられる場合、青い細胞がより少ないことが予期される（Cavrois et al. Nat Biotechnol 20:  1151-1154, 2002;）。
【００４０】
透過が低ｐＨに依存するか否かを調べるため、所望のｐＨ依存性を有するエンベロープ糖タンパク質を特定するため、ＮＨ４ＣｌまたはｐＨを変化させる他の化合物を、感染ステップ時に加えることが可能である（ＮＨ４Ｃｌは、エンドソームの酸性区画を中性化するだろう）。ＮＨ４Ｃｌの場合、青い細胞の消失は、ウイルスの透過が低ｐＨ依存性であることを示すだろう。加えて、活性がｐＨ依存性であることを確認するため、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンＡ１、モネンシン、ニゲリシン等のリソソーム薬剤をインキュベーション緩衝液に加えることができる。これらの薬剤はエンドソーム区画内のｐＨを上昇させる（例えば、Drose and Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997）。これらの薬剤の阻害効果は、ウイルスの融合および侵入に対するｐＨの役割を明らかにしよう。異なる融合性分子を提示するウイルス間の異なる侵入動態学を比較し、特定の適用に最も適切なものを選択することができる。
【００４１】
ＰＣＲ系侵入アッセイを利用して、逆転写を監視し、ウイルス侵入動態の指標として、ウイルスＤＮＡ合成動態を測定することが可能である。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含むウイルス粒子を、２９３Ｔ細胞、ＤＣ、またはエンベロープタンパク質分子に対し適切な結合パートナー（受容体）を発現するように操作された、もしくはそれを天然に発現する任意の他の細胞などの標的細胞と共にインキュベーションする。即時に、または、（感染を発生させるための）時間増分後に、非結合のウイルスを除去し、一定分量の細胞をウイルス核酸について分析する。ＤＮＡをこれらの一定分量から抽出し、概して半定量的アッセイでの、ＬＴＲ特異的プライマーで予備刺激される増幅分析に供する。ＬＴＲ特異的ＤＮＡ産生物の出現は、ウイルスの侵入の成功を示す。
【００４２】
Ｂ．レンチウイルスベクターゲノム
ウイルスベクター粒子にはゲノムが含まれ、該ゲノムは、ＩＬ−１２、例えばｓｃＩＬ−１２などをコードする配列と、任意選択的に、１つまたは複数の他の対象配列が含まれる。ゲノムがウイルス粒子にパッケージングされるのを可能にする配列、および標的細胞の形質導入後の対象配列の発現を促進する配列などの他の配列も、含まれ得る。ゲノムは、Pfeifer and Verma（Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001;）に記載されているような、ヒト遺伝子療法用途向けに特定されているものを含む、多くの適切で利用可能なレンチウイルスゲノム系ベクターの何れかに由来し得る。簡潔にするため、ゲノムは、また、「ウイルスベクターゲノム」または「ベクターゲノム」ともいう。
【００４３】
1．骨格
適切なレンチウイルスベクターゲノムとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ／ビスナウイルスに基づくものが挙げられる。レンチウイルスの望ましい特徴は、レンチウイルスが、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得ることであり、標的細胞が分裂している（または、標的細胞を刺激して分裂させる）必要はない。概して、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は異なるウイルスに基づき、その結果、結果として生じるウイルスベクター粒子は偽型化される。ベクターゲノムの安全性特徴は、好適に取り込まれる。安全性特徴には、自己不活化ＬＴＲおよび組み込み欠損ゲノム／粒子が含まれる。例示的なベクターは国際公開第２０１１／０１１５８４号に記載されており、そのようなベクターを、ＩＬ−１２、他の免疫賦活性分子、サイトカイン、および対象抗原などの対象配列の発現のために、本発明の実施形態において用いることができる。
【００４４】
一部の例示的な実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ−１ゲノムまたはＳＩＶゲノムなどのレンチウイルスゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの５´ＬＴＲおよび３´ＬＴＲからの配列を含み得、特に、レンチウイルスの５´ＬＴＲからのＲ配列およびＵ５配列、ならびに、レンチウイルスの不活性化または自己不活化３´ＬＴＲを含み得る。ＬＴＲ配列は、任意の種の任意のレンチウイルスからのＬＴＲ配列とすることができる。例えば、それは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶからのＬＴＲ配列とすることができる。典型的には、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ  ＬＴＲ配列である。
【００４５】
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活化の３´ＬＴＲを含み得る（Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998;）。自己不活化ベクターは、概して、３´長末端反復（ＬＴＲ）からのエンハンサー配列およびプロモーター配列に欠失を有し、これは、ベクター組み込み時に５´ＬＴＲに複製される。一例では、３´ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、ＴＡＴＡ  ｂｏｘ、Ｓｐ１、およびＮＦ−κＢ部位に欠失を含有する。自己不活化３´ＬＴＲの結果として、侵入および逆転写の後に生成されるプロウイルスは、不活性化５´ＬＴＲを含むだろう。論拠は、ベクターゲノムの可動化のリスクと、近くの細胞性プロモーターに対するＬＴＲの影響を低減させることにより、安全性が高められることである。自己不活化３´ＬＴＲは、当技術分野で任意の既知の方法によって構築することができる。
【００４６】
任意選択的に、レンチウイルスの５´ＬＴＲのＵ３配列を、異種プロモーター配列などの、ウイルス構築物中のプロモーター配列と置換することができる。これは、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価を高め得る。エンハンサー配列を含んでもよい。パッケージング細胞株中のウイルス性ＲＮＡゲノムの発現を高める任意のエンハンサー／プロモーターの組み合わせを使用することができる。一例では、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列を使用する（米国特許第５３８５８３９号明細書および同第５１６８０６２号明細書、）。
【００４７】
ある実施形態では、レンチウイルスベクターゲノムを、組み込み不全となるように構築することにより、挿入性変異誘発のリスクを最小化させる。非組み込み／組み込み欠損ベクターゲノムを生成するために、種々のアプローチが探究され得る。これらのアプローチは、不活性化インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素成分に変異を組み込むことを必要とする。ベクターゲノム自体を修飾して、例えば、一方または両方の付着部位を変異もしくは除去することにより、または、除去もしくは修飾により、３´ＬＴＲ近位ポリプリン配列（ＰＰＴ）を非機能性にすることにより、組み込みを妨げることが可能である。加えて、非遺伝的アプローチも利用可能であり；これには、インテグラーゼの１つまたは複数の機能を阻害する薬理学的薬剤が含まれる。アプローチは、互いに排他的ではなく、つまり、２つ以上のアプローチを一度に使用することが可能である。例えば、インテグラーゼと付着部位の両方を非機能化するか、インテグラーゼとＰＰＴ部位を非機能化するか、付着部位とＰＰＴ部位を非機能化するか、または、これらすべてを非機能化することが可能である。
【００４８】
上記のように、１つのアプローチは、非機能性インテグラーゼを作成し、使用することである。インテグラーゼは、ウイルス二重鎖平滑末端ＤＮＡを切断することと、その末端を、染色体標的部位の二本鎖の５´リン酸に結合させることに関与する。インテグラーゼは３つの機能ドメイン：亜鉛結合モチーフ（ＨＨＣＣ）を含有するＮ−末端ドメインと、触媒コアおよび保存されたＤＤ３５Ｅモチーフ（ＨＩＶ−１中のＤ６４、Ｄ１１６、Ｅ１５２）を含有する中央ドメインコアと、ＤＮＡ結合特性を有するＣ−末端ドメインとを有する。インテグラーゼに導入される点変異は、通常の機能を阻害するのに十分である。多くのインテグラーゼ変異が構築され、特徴付けされている（Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia、ユニバーシティー・カレッジ・オブ・ロンドンに提出された学位論文、April 2009, pp, 82-97; Engelman et al. J Virol 69:2729 1995; Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1121, 2006;参照）。インテグラーゼタンパク質をコードする配列を、除去または変異させて、好ましくは逆転写酵素活性または核標的化を著しく損なうことなく、タンパク質を不活性化し、それにより、プロウイルスの標的細胞ゲノムへの組み込みのみを防ぐことが可能である。許容される変異は、インテグラーゼの触媒作用、鎖転移、ａｔｔ部位への結合、宿主染色体ＤＮＡへの結合、および他の機能を低減させ得る。例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶインテグラーゼの残基３５における単一のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換は、完全に、ウイルスのＤＮＡ組み込みを消失させる。インテグラーゼの除去は、概して、Ｃ−末端ドメインに限定されるだろう。残基２３５〜２８８でのコード配列の除去は、有用な非機能性インテグラーゼをもたらす（Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995）。さらなる例として、変異、例えば、Ａｓｐ６４（残基ナンバーはＨＩＶ−１に対し与えられ、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスに由来するインテグラーゼに対応する残基番号は、当業者により容易に決定され得る）（例えば、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ）、Ａｓｐ１１６（例えば、Ｄ１１６Ｎ）、Ａｓｎ１２０（例えば、Ｎ１２０Ｋ）、Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８（例えば、Ｑ１４８Ａ）、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５９、Ｔｒｐ２３５（例えば、Ｗ２３５Ｅ）、Ｌｙｓ２６４（例えば、Ｋ２６４Ｒ）、Ｌｙｓ２６６（例えば、Ｋ２６６Ｒ）、Ｌｙｓ２７３（例えば、Ｋ２７３Ｒ）を生成することができる。他の変異を構築し、組み込み、導入遺伝子の発現、および、任意の他の所望のパラメータについてテストすることが可能である。これらの機能についてのアッセイは周知である。変異は、部位特異的変異誘発および核酸配列の化学的合成を含む、種々の技法の何れかにより生成することが可能である。インテグラーゼ内に１つの変異を作成することができるか、または、これらの変異の２つ以上が存在し得る。例えば、インテグラーゼは、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸などで変異を有し得る。
【００４９】
あるいは、または、インテグラーゼ変異の使用と組み合わせて、Ｕ３およびＵ５の付着部位（ａｔｔ）も変異させることが可能である。インテグラーゼはこれらの部位に結合し、３´末端ジヌクレオチドがベクターゲノムの両末端で切断される。ＣＡジヌクレオチドが、陥凹３´末端に位置し；そのＣＡがプロセシングに必要とされ、そのヌクレオチドの変異が宿主染色体への組み込みをブロックする。ＣＡジヌクレオチドのＡは、組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両末端での変異は、最良の結果をもたらすだろう（Brown et al J Virol 73:9011 (1999)）。一例示では、各末端のＣＡをＴＧに変える。他の例示では、各末端のＣＡを、一方の末端ではＴＧに、もう一方の末端ではＧＴに変える。他の例示では、各末端のＣＡを除去し；他の例示では、各末端のＣＡのＡを除去する。
【００５０】
組み込みは、また、３´ＬＴＲの近位に位置するポリプリン配列（ＰＰＴ）の変異または除去により阻害することも可能である（国際公開第２００９／０７６５２４号；）。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成用のプライマー結合部位として機能し得る、約１５ヌクレオチドのポリプリン配列である。この場合、ＰＰＴの変異または除去は、逆転写プロセスを標的とする。機序にとらわれることを望むものではないが、ＰＰＴを変異または除去することにより、直鎖ＤＮＡの産生が著しく減少し、実質的には、１−ＬＴＲ  ＤＮＡ環のみが産生される。組み込みは、直鎖二重鎖ＤＮＡベクターゲノムを必要とし、それなしでは、組み込みは実質的に消去される。上記で述べたように、ＰＰＴは、変異または除去により非機能化させることが可能である。典型的には、約１５ｎｔのＰＰＴ全体を除去するが、一部の実施形態では、それより短い１４ｎｔ、１３ｎｔ、１２ｎｔ、１１ｎｔ、１０ｎｔ、９ｎｔ、８ｎｔ、７ｎｔ、６ｎｔ、５ｎｔ、４ｎｔ、３ｎｔ、２ｎｔを除去する場合もある。変異が形成される場合、典型的には、特にＰＰＴの５´半分に多数の変異が形成されるが（McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003）、最初の４塩基中の単一変異および二重変異も依然として転写を低下させる。ＰＰＴの３´末端に形成された変異は、概して、より劇的な効果を有する（Powell and Levin J Virol 70: 5288, 1996）。
【００５１】
ベクターゲノムを非組み込み型にするこれらの異なるアプローチは、一つずつ、または組み合わせて用いることが可能である。冗長化機序によるフェイルセーフベクターを構築するために、２つ以上のアプローチの使用を用いることができる。したがって、ＰＰＴの変異もしくは除去を、ａｔｔ部位の変異もしくは除去と、もしくはインテグラーゼの変異と組み合わせることが可能であるか、または、ＰＰＴの変異もしくは除去を、ａｔｔ部位の変異もしくは除去およびインテグラーゼの変異の両方と組み合わせることが可能である。同様に、ａｔｔ部位の変異または除去とインテグラーゼの変異は、互いに、または、ＰＰＴの変異もしくは除去と組み合わせることができる。
【００５２】
２．調節エレメント
本明細書に論じるように、ウイルスベクターゲノムは、ＩＬ−１２をコードする配列と、任意選択的に、標的細胞において発現することが望ましい、１つまたは複数の他の対象核酸とを含む。簡潔にするため、用語「対象配列」（ＳＯＩ）は、ＩＬ−１２を、ある実施形態では、１つまたは複数の他の対象配列（例えば、１つもしくは複数の他の免疫賦活性分子、サイトカイン、または１つもしくは複数の抗原）を意味するために使用する。典型的には、対象配列は、５´ＬＴＲ配列と３´ＬＴＲ配列の間に位置する。さらに、ＩＬ−１２と、任意の他の対象配列をコードする配列は、好適には、特定の方法で対象配列の発現を調節する他の遺伝エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列と機能的関係にある。ある例では、有用な転写調節配列は、時間的にも空間的にも、活性に関して高度に調節されるものである。成分の発現の調節に使用することができる発現制御エレメントは、当技術分野で既知であり、限定するわけではないが、誘導性プロモーター、恒常的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節エレメントが挙げられる。
【００５３】
対象配列および他の任意の発現可能な配列は、典型的には、内部プロモーター／エンハンサー調節配列と機能的関係にある。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルスベクター構築物の５´ＬＴＲ配列と３´ＬＴＲ配列の間に位置するものであり、対象配列に動作可能に結合している。内部プロモーター／エンハンサーは、機能的関係にある遺伝子の発現を増大させることが知られている任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせであり得る。「機能的関係」および「動作可能に結合している」は、限定するわけではないが、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子と接触すると対象配列が発現するように、配列が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに対して正しい位置および方向にあることを意味する。
【００５４】
内部プロモーター／エンハンサーの選択は、対象配列の所望の発現パターンおよび既知のプロモーター／エンハンサーの特異的特性に基づく。したがって、内部プロモーターは、恒常的に活性である場合もある。使用することができる恒常的プロモーターの非限定的例としては、ユビキチンのためのプロモーター（米国特許第５５１０４７４号明細書；国際公開第９８／３２８６９号）、ＣＭＶ（Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984；米国特許第５１６８０６２号明細書）、β−アクチン（Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835）、およびｐｇｋプロモーター（例えば、Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417；およびDobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637参照）が挙げられる。
【００５５】
あるいは、プロモーターは組織特異的プロモーターであり得る。一部の好適な実施形態では、プロモーターは標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＴＬＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ−３、ＤＥＣ−２０５、ＤＣＩＲ２、マンノース受容体、Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＭＨＣクラスＩＩを含む、樹状細胞により発現される任意の産生物に由来し得る。さらに、プロモーターは、対象配列の誘導性発現を可能にするように選択することができる。テトラサイクリン応答システム、ｌａｃオペレーター−リプレッサーシステム、ならびに、ヒートショック、金属イオン、例えばメタロチオネインプロモーター、インターフェロン、ハイポキシア、ステロイド、例えばプロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター、放射線、例えばＶＥＧＦプロモーターを含む、様々な環境の変化または生理的変化に応答するプロモーターを含む、誘導性発現のためのいくつかのシステムが当技術分野において既知である。対象遺伝子の所望の発現を得るためにプロモーターの組合せを使用することもできる。当業者は、生物または対象の標的細胞での遺伝子の所望の発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができよう。
【００５６】
ウイルスゲノムは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩの応答プロモーターを含み得る。このプロモーターは対象配列に動作可能に結合することができ、また、終止配列に結合することもできる。さらに、２つ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩのプロモーターが組み込まれてよい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩのプロモーターは当業者に周知である。例えば、Paule and White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)に、適切な範囲のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩのプロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩに下流のＲＮＡコード配列の転写を指示し得る、任意の合成されたまたは操作されたＤＮＡ断片を含む。さらに、ウイルスベクターゲノムの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩ）のプロモーターまたは複数のプロモーターは、誘導性であり得る。任意の適切な誘導性のＰｏｌＩＩまたはＩＩＩのプロモーターは、本明細書に記載される方法で使用することが可能である。特に適切なＰｏｌＩＩまたはＩＩＩのプロモーターには、Ohkawa and Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000)およびMeissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001)において提供されるテトラサイクリン応答プロモーターが含まれる。
【００５７】
内部エンハンサーは、対象遺伝子の発現を増大させるために、ウイルス構築物に存在してもよい。例えば、ＣＭＶエンハンサー（Boshart et al. Cell, 41:521, 1985;）を使用することができる。ＨＩＶ、ＣＭＶなどのウイルスゲノムおよび哺乳類ゲノム中の多数のエンハンサーが特定され、特徴付けされている（ＧｅｎＢａｎｋ参照）。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者は所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができよう。
【００５８】
ウイルスベクターゲノムは、通常、標的細胞によって認識され、対象配列、ウイルス成分、および本明細書で論じる他の配列に動作可能に結合しているプロモーターを含有するだろう。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、転写を生じさせる核酸配列により形成される発現制御エレメントである。プロモーターは誘導的、恒常的、時間活性的、または組織特異的であり得る。誘導性プロモーターの活性は生物性または非生物性要因の存在または不在によって誘導される。誘導性プロモーターが動作可能に結合している遺伝子の発現は、生物の発生、その製造のある段階で、または特定の組織でオンオフされ得るので、誘導性プロモーターは遺伝子工学で有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは、化学的調節プロモーターおよび物理的調節プロモーターとして分類され得る。典型的な化学調節プロモーターとしては、限定するわけではないが、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答プロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）系プロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）系プロモーター、蛾エクダイソン受容体系プロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子系プロモーター）、および病因関連プロモーター（例えば、アラビドプシスおよびトウモロコシ病原体関連（ＰＲ）タンパク質系プロモーター）が挙げられる。典型的な物理的調節プロモーターとしては、限定するわけではないが、温度調節プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）および光調節プロモーター（例えば、ダイズＳＳＵプロモーター）が挙げられる。他の例示的なプロモーターは別の場所、例えば、２００９年５月１８日にアクセスしたＰａｔｅｎｔ  Ｌｅｎｓ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅの「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」に記載されている。
【００５９】
当業者は特定の状況に基づいて適切なプロモーターを選択することができよう。プロモーターを発現予定の遺伝子に動作可能に結合させる方法と同様に、多くの異なるプロモーターが当技術分野において周知である。パッケージング細胞および標的細胞での発現を管理するために、天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの両方を使用することができる。しかしながら、異種プロモーターは概して天然プロモーターと比較してより多い転写および所望のタンパク質のより高い収率をもたらすため、異種プロモーターが好適である。
【００６０】
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。プロモーターは、標的細胞と適合性があることを条件に、例えば、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーター、または天然の配列と通常結合しているプロモーターとすることができる。一実施形態において、プロモーターは、ウイルス発現系において天然に存在するウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、ＣＤ１１ｃプロモーターであり得る。
【００６１】
転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、典型的には、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常約１０〜３００塩基対長のｃｉｓ作用性ＤＮＡエレメントである。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−胎児タンパク質、およびインスリン）から、ならびに真核生物細胞ウイルスからの多くのエンハンサー配列が知られている。例としては、複製起点の後期側上のＳＶ４０エンハンサー（塩基対１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対して５´位置または３´位置で、ベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターの５´部位に位置する。
【００６２】
発現ベクターは、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含み得る。これらの配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５´非翻訳領域に、時には３´非翻訳領域にしばしば見出され、当技術分野では周知である。
【００６３】
ウイルスベクターゲノムは、追加の遺伝的エレメントを含有することもできる。構築物に含まれ得るエレメントの種類は、決して限定されず、特定の結果を達成するように選択され得る。例えば、標的細胞内でのウイルスゲノムの核移行を促進するシグナルが含まれ得る。そのようなシグナルの例はＨＩＶ−１  ｃＰＰＴ／ＣＴＳシグナル（ＤＮＡフラップ）である。さらに、標的細胞内のプロウイルス組み込み部位の特徴付けを容易にするエレメントが含まれ得る。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列が構築物に含まれ得る。例えば、ニワトリβ−グロビンからのインスレーター配列もまた、ウイルスゲノム構築物に含まれ得る。このエレメントは、メチル化およびヘテロクロマチン化効果に起因する、標的細胞に組み込まれたプロウイルスのサイレンシングの機会を低下させる。加えて、インスレーターは、内部エンハンサー、プロモーター、および外因性遺伝子を、染色体上の組み込み部位の周りのＤＮＡからの正または負の位置効果から遮蔽することができる。加えて、ベクターゲノムは、対象遺伝子の発現を高めるように設計された１つまたは複数の遺伝エレメントを含有し得る。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント（ＷＲＥ）を、構築物中に配置してよい（Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190,）。
【００６４】
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージングまたは産生細胞株に遺伝子導入され得る、プラスミド形態で構築される。プラスミドは、概して、細菌でのプラスミド複製に有用な配列を含む。このようなプラスミドは、当技術分野で周知である。加えて、原核生物の複製起点を含むベクターは、また、その発現が薬物抵抗性などの検出可能なまたは選択可能なマーカーを付与する遺伝子を含み得る。典型的な細菌薬物抵抗性産生物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するものである。
【００６５】
本明細書に記載する成分を１つまたは複数含有するプラスミドは、当該技術分野で周知の標準技法を用いて、容易に構築される。プラスミドに正しいヌクレオチド配列が構築されていることを確認するための分析では、プラスミドは大腸菌で複製され、精製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され得るか、またはそのＤＮＡ配列は従来法で決定され得る。
【００６６】
哺乳類細胞での一過性発現のために構築されたベクターもまた、使用することができる。一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製を蓄積し、転じて、その発現ベクター中の抗原特異的ポリヌクレオチドによりコードされる高レベルのポリペプチドを合成するように、宿主細胞中で高効率に複製することができる発現ベクターの使用を伴う。Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22を参照されたい。ポリペプチドの発現への適応に適切な他のベクターおよび方法は当該技術分野で周知であり、特定の状況に容易に適合される。
【００６７】
本明細書において提供する教示を用いて、当業者は、特定の発現システムの有効性が、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによりパッケージング細胞に遺伝子導入し、適切な技法を用いて発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体からの蛍光を測定することによりテストされ得ることを理解しよう。適切なレポーター遺伝子は、当該技術分野において周知である。
【００６８】
３．対象配列の種類
本明細書に記載するレトロウイルスベクターは、ＩＬ−１２をコードし、任意選択的に、限定するわけではないが、免疫賦活性分子、サイトカイン、ケモカイン、対象抗原、チェックポイント阻害剤等の他の対象配列をコードする。
【００６９】
ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野で既知であり、公的なデータベースにおいて利用可能である。当業者には容易に理解されようが、ＩＬ−１２は、免疫系に対し多数の生物学的効果を有するヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ−１２は、２つのサブユニット、ｐ３５およびｐ４０から構成され、これは両方とも、ＩＬ−１２、ｐ７０の活性化形態の分泌に必要である。一実施形態では、ＩＬ−１２配列（発現カセット）は、ＩＬ−１２ポリペプチドの発現を指示するポリヌクレオチドを含む。既知のＩＬ−１２分子の変異体および誘導体を含む任意のＩＬ−１２ポリペプチドを用いることも可能であり、ここで、その変異体および誘導体はＩＬ−１２活性を保持する。ＩＬ−１２の活性は、当技術分野で既知のアッセイ（例えば、実施例１に記載するような）を用いて測定することが可能である。一実施形態では、ＩＬ−１２はヒトＩＬ−１２である。別の実施形態では、ＩＬ−１２はマウスＩＬ−１２である。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、単一転写物から多数の導入遺伝子の発現を可能にするＩＲＥＳ配列により分離された、ＩＬ−１２サブユニット、ｐ３５およびｐ４０の両方の配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）をコードする。これに関し、単鎖融合タンパク質は、何れの向きでもＩＬ−１２サブユニットをコードし得、ある実施形態では、ｐ３５−Ｌ−ｐ４０またはｐ４０−Ｌ−ｐ３５など、２つのサブユニットの間にリンカーを含み得る。「リンカー」は、約２〜約１５０個のアミノ酸のリンカーなど、他のペプチドまたはポリペプチドを連結または結合するペプチドである。種々のリンカーの何れも当技術分野で既知であり、本明細書で用いることが可能である（例えば、Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct;65(10):1357-69を参照されたい）。ある実施形態では、リンカーはエラスチンリンカーである。
【００７０】
他の対象配列も、本明細書に記載のウイルスベクターに含まれ得る。したがって、この点について、対象配列は決して限定されず、当業者が標的細胞に転写および発現させることを望む任意の核酸が含まれる。産生物は、タンパク質または核酸とすることが可能である。対象配列は、タンパク質か、または、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補的二重鎖ＲＮＡ、もしくはメッセージＲＮＡに対し相補的なＲＮＡを含む核酸分子をコードすることが可能であり、メッセージＲＮＡへのこの相補的な（アンチセンス）ＲＮＡの結合は、翻訳されてタンパク質を合成するというメッセーＲＮＡの能力をブロックする。一部の例では、対象配列は、免疫応答が望まれる抗原をコードすることが可能である。特に、腫瘍抗原およびＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、マラリア、または結核などの病原体からの感染症抗原が望ましい。
【００７１】
ある場合では、対象配列は、分子の発現を下方調節する、対象の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子とすることが可能である。例えば、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをコードする遺伝子を用いて、樹状細胞の活性または成熟を阻害するものを含む、細胞内の負の調節因子の発現を下方調節することが可能である。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡは、当技術分野で周知である（Fire et al., Nature 391:806, 1998；また、“The RNA Interference Resource” of Applied Biosystems, Trang et al., Oncogene Suppl 2:S52, 2008; Taganov, K., et al. 2007. Immunity 26:133-137; Dahlberg, J. E. and E. Lund. 2007. Sci. STKE 387:pe25；Tiemann and Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2009も参照されたい）。あるいは、対象配列は、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補的二重鎖ＲＮＡ、または約２０リボヌクレオチド長よりも大きいアンチセンスＲＮＡをコードすることが可能である。当業者であれば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現し得ること、あるいは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから転写される、非コードＲＮＡの成分であり得ることを理解しよう。
【００７２】
さらに、対象配列は、ＩＬ−１２をコードする配列を含み、さらに、２つ以上の産生物をコードする配列を含むことができる。一部の構成では、送達される配列は、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ、もしくは少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡ分子をコードする多数の遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせを含むことが可能である。例えば、送達される配列は、ＩＬ−１２と、免疫応答が望まれる１つまたは複数の抗原をコードする、１つまたは複数の遺伝子とを含むことが可能である。１つまたは複数の抗原は、単一の疾患または障害と関連し得るか、または多数の疾患および／または障害と関連し得る。一部の例では、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、免疫応答が望まれる抗原をコードする遺伝子とともに含まれ得、その組み合わせにより、免疫応答を誘導し、所望の方向および規模に調節することが可能である。したがって、ある実施形態では、ベクターは、ＩＬ−１２をコードする配列、抗原をコードする配列、および免疫調節タンパク質をコードする配列を含み得る。産生物は、コード配列が１つのプロモーターと機能的関係にある、初期融合産生物として産生され得る。あるいは、産生物は、別々にコードされてもよく、各コード配列は、プロモーターと機能的関係にある。プロモーターは、同一でも、または異なっていてもよい。
【００７３】
別の場所で記載するように、ある実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、ＩＬ−１２をコードする配列と、疾患または障害と関連する１つまたは複数の抗原をコードする対象配列とを含む。疾患または障害と関連する任意の抗原を、本明細書に記載のウイルス粒子を用いて樹状細胞に送達することが可能である。疾患または障害と関連する抗原は、特定されている。多くの疾患および障害と関連する抗原は、当技術分野で周知である。抗原は、疾患または障害と関連することが事前に知られているか、または、当技術分野で既知の任意の方法により特定することができる。例えば、患者が患っているある種のがんに対する抗原、例えば、腫瘍関連抗原は、既知であるか、または、当技術分野で既知の種々の方法の何れかにより、腫瘍自体から特定され得る。
【００７４】
腫瘍関連抗原は、例えば、腎細胞がん、前立腺がん、黒色腫、および乳がんを含む、種々のがんに関して知られている。一部の乳がんでは、例えば、Ｈｅｒ−２受容体が、がん細胞の表面に過剰発現される。例示的な腫瘍抗原としては、限定するわけではないが、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、前立腺特異的膜抗原、ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＧＡＧＥ、Ｐｌｕ―１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃｒｉｐｔｉｎ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、およびＣ−Ｒａｆ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＭ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、ＡｎｎｅｘｉｎＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｎｏｔｃｈ１−４、ｃ−Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞がん−５Ｔ４、ＳＭ２２−ａｌｐｈａ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転移ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ��、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ならびにｆｏｓ関連抗原１が挙げられる。多数の腫瘍関連抗原が検討されてきた（例えば、"Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994；"A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001,.を参照されたい）。
【００７５】
抗原は、感染症、例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどと関連付けられる抗原とすることも可能である。抗原は、例えば、ｇｐ１２０であり得る（Klimstra, W. B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K. A., et al. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A. P., et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356,）。他の例示的抗原としては、限定するわけではないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｎｅｆ、およびｒｅｖが挙げられる（Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. et al. 1998. Viral Immunol 11(4): 167-181,）。
【００７６】
ウイルス抗原の例としては、限定するわけではないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（例えば、Ｂ型肝炎コアもしくは表面抗原、またはＣ型肝炎ウイルスＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コア、もしくは非構造的タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質）、免疫不全ウイルスポリペプチド（例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、Ａ型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはヌクレオタンパク質）、白血病ウイルスポリペプチド、マルバーグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられる。
【００７７】
細菌抗原の例としては、限定するわけではないが、アクチノミセスポリペプチド、バシルスポリペプチド、バクテロイドポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド（例えば、Ｂ．ブルグドルフェリＯｓｐＡ）、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノサイトファーガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリアポリペプチド、コキシエラポリペプチド、ダーマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリアポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド（例えば、Ｈ．インフルエンザ型ｂ外膜タンパク質）、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、Ｌ型バクテリアポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロカリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、スタフィロコッカスポリペプチド、ストレプトコッカスポリペプチド（例えば、Ｓ．ピロゲンＭタンパク質）トレポネマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド（例えば、Ｙ．ペスティスＦ１）およびＶ抗原が挙げられる。
【００７８】
真菌抗原の例としては、限定するわけではないが、アブシジアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バシジオボラスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コッキジオイドポリペプチド、コニジオボラスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィラロフォラポリペプチド、プロトテカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フハイカビポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシジウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロハイファポリペプチドが挙げられる。
【００７９】
プロトゾア寄生虫抗原の例としては、限定するわけではないが、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エンタモエバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンジアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノセマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチド（例えば、Ｐ．熱帯性サーカムスポロゾイト（ＰｆＣＳＰ）、種虫表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）、および輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドが挙げられる。
【００８０】
蠕虫寄生抗原の例としては、限定するわけではないが、アカントケイロネマポリペプチド、ネコ円虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、住血線虫ポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、カピラリアポリペプチド、大口腸線虫ポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ジクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィムポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボツリウムポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイドポリペプチド、ヘモンカスポリペプチド、ラゴキラスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、血色食道虫ポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイドポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリクリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびバンクロフト糸状虫ポリペプチドが挙げられる。
【００８１】
外部寄生虫抗原の例としては、限定するわけではないが、ノミ；カタダニおよびヒメダニを含むマダニ；ユスリカ、蚊、スナバエ、ブヨ、ウシアブ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ病を引き起こすハエ、ヌカカなどのハエ；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびにトコジラミおよびサシガメなどのナンキンムシからのポリペプチド（保護抗原およびアレルゲンを含む）が挙げられる
【００８２】
いったん抗原が特定および選択されると、所望の抗原をコードする配列が特定される。好適には、配列はｃＤＮＡを含む。次に、配列を、当技術分野で既知の標準的な方法論を用いて、ウイルスベクターゲノムにクローン化する。
【００８３】
ある形態では、ベクターは免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列を含有する。例示的な免疫調節分子には、種々のサイトカインの何れかが含まれる。本明細書で用いる場合、「サイトカイン」とは、ある細胞集団より放出される、別の細胞上で細胞内メディエーターとして作用するタンパク質の総称を意味する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものとしては、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミュラー管抑制因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β等のトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロンα、βおよびγなどのインターフェロン；マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；並びに顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１；ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β）；ならびに、ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書で用いる場合に予期される他の免疫調節分子としては、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬剤誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）等が挙げられる。ある実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、典型的には、樹状細胞内でコード配列の発現を指示する１つまたは複数の制御性エレメントの制御下にある。
【００８４】
ある実施形態では、本明細書に記載するＩＬ−１２を発現するベクターによりコードされる免疫調節分子は、チェックポイント阻害剤分子である。免疫チェックポイントとは、自己寛容を維持し、免疫応答の持続および規模を調節するのに重要な、免疫系の種々の阻害経路を意味する。腫瘍は、ある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主要なメカニズムとして使用する（例えば、Pardoll, 2012 Nature 12:252; Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1を参照のこと）。本開示は、免疫チェックポイント阻害剤をコードするベクターを提供する。免疫チェックポイント阻害剤としては、統計学的に有意な方法で、免疫系の阻害経路をブロックまたは阻害する任意の薬剤が挙げられる。かかる阻害剤としては、免疫チェックポイント受容体に結合してこれをブロックもしくは阻害する、抗体もしくはその抗原結合断片か、または、免疫チェックポイント受容体リガンドに結合してこれをブロックもしくは阻害する抗体が挙げられ得る。ブロッキングまたは阻害のために標的化され得る、例示的な免疫チェックポイント分子としては、限定するわけではないが、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、ＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞の全てに発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５ともいう）、ならびにＣＧＥＮ−１５０４９が挙げられるが。免疫チェックポイント阻害剤としては、抗体もしくはその抗原結合断片、または、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０およびＣＧＥＮ−１５０４９の１つまたは複数に結合してこれらの活性をブロックまたは阻害する、他の結合タンパク質が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、以下の抗体またはその抗原結合断片：トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＫ−３４７５（ペムブロリズマブ；ＰＤ−１遮断剤）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ−０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ；抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、およびヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤）の何れかが挙げられる。
【００８５】
検出可能な産生物、たいていはタンパク質をコードする配列を含めることで、所望の産生物を発現する細胞の特定を可能にすることができる。例えば、蛍光マーカータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、（例えば、抗原をコードする）対象配列と共に構築物内に組み込まれる。他の例では、そのタンパク質は抗体によって検出可能であり得るか、または、そのタンパク質は基質に作用して検出可能な産生物を生じる酵素であり得るか、または遺伝子導入もしくは形質導入された標的細胞の選択を可能にする、例えば、ハイグロマイシン耐性などの薬物耐性を付与する産生物であり得る。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または、真核細胞での使用に適切な他の毒素、例えば、当技術分野において既知のものの中でもネオマイシン、メトトレキサート、ブラストサイジンに対する耐性を付与するタンパク質か、または栄養要求性欠損を補完するタンパク質か、または培地に与えていない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする。選択可能マーカーは、任意選択的に、別個のプラスミドに存在し、共遺伝子導入により導入され得る。
【００８６】
標的細胞中の多数の対象配列の発現、または、パッケージング細胞内で所望のウイルスの産生に必要なアクセサリータンパク質の発現に必要なエレメント（例えば、対象配列、エンベロープ分子、ＤＣ成熟因子）のうち２つ以上を含む、１つまたは複数の多シストロン性発現単位を使用することができる。多シストロン性ベクターの使用は、必要とされる核酸分子の総数を減らし、したがって、多数のベクターゲノムからの協調発現に関連する可能性のある困難が回避される。多シストロン性ベクターでは、発現予定の種々のエレメントが１つまたは複数のプロモーター（および必要に応じて他の発現制御エレメント）に動作可能に結合している。いくつかの構成では、多シストロン性ベクターは、対象配列、レポーター産生物をコードする配列、およびウイルス配列を含む。対象配列は、ＩＬ−１２を含むが、任意選択的に抗原もコードし、ある特定の実施形態では、追加の免疫賦活性分子、チェックポイント阻害剤、または他のサイトカインを含むことも可能である。時には、多シストロン性ベクターは、ＩＬ−１２をコードする遺伝子、抗原、別の免疫賦活性分子をコードする遺伝子、およびウイルスエレメントを含む。
【００８７】
多シストロン性発現ベクターで発現する各成分は、同一プロモーターからの種々のタンパク質の別々の発現を可能にするために、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントまたはウイルス性２Ａエレメントによって分離させることができる。ＩＲＥＳエレメントおよび２Ａエレメントは当技術分野において既知である（米国特許第４９３７１９０号明細書；de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626,）。一実施形態では、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）（Szymczaket al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594,）由来の２Ａ様配列に結合したフューリン切断部位配列（ＲＡＫＲ）をコードするオリゴヌクレオチド（Fanget al. 2005. Nat. Biotech 23: 584-590,）を使用して、多シストロン性ベクターの遺伝子エレメントを分離させる。特定の多シストロン性ベクターの効力は、標準的なプロトコルを使用して遺伝子のそれぞれの発現を検出することにより容易にテストすることができる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、多数の対象配列（例えば、ＩＬ−１２および１つもしくは複数の対象抗原、ならびにまたは、１つもしくは複数の追加免疫賦活性分子、ならびにまたはチェックポイント阻害剤等）が、標的細胞での発現のために企図されるが、各ベクターが１つまたは複数の対象配列を発現する、多数のベクターを使用することが可能である。特定の一実施形態では、１つのレトロウイルスベクターがＩＬ−１２を発現し、これを、本質的には、アジュバントベクターとして、任意の１つまたは複数の他のベクターと組み合わせて使用することが可能である。これに関し、１つのレトロウイルスベクターがＩＬ−１２を発現し、別のレトロウイルスベクターが、免疫応答が望まれる１つまたは複数の対象抗原を発現し得る。別の実施形態では、ＩＬ−１２を発現する１つのレトロウイルスベクターを、１つもしくは複数の抗原および／または１つもしくは複数の追加の免疫賦活性分子および／またはチェックポイント阻害剤を発現する別のレトロウイルスベクターと共に使用するために、生成することが可能である。したがって、多数の対象配列を企図する場合は、それらを、同一のまたは別のベクター上に提供することができる。
【００８９】
特定の例示では、ウイルス性ベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列；ＨＩＶの５´ＬＴＲ由来のＲ配列およびＵ５配列；パッケージング配列（ψ）、ＨＩＶ−１のフラップシグナル；内部エンハンサー；内部プロモーター；対象遺伝子；ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント；ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列；エンハンサー配列の欠失を有するＵ３エレメント；ニワトリβ−グロビンインシュレーター；ならびにＨＩＶの３´ＬＴＲのＲ配列およびＵ５配列を含む。いくつかの例示では、ベクターゲノムは完全なレンチウイルスの５´ＬＴＲと自己不活化３´ＬＴＲを含む（Iwakuma et al. Virology 15: 120, 1999,）。
【００９０】
限定するわけではないが、例えば、Sambrook et al.（1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.）, Coffin et al.（Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)）および"RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定という標準的技法を含む、当技術分野において既知の任意の適切な遺伝子工学技術を用いて、ベクターゲノムの構築を達成することが可能である。
【００９１】
Ｃ．ウイルス粒子の産生
本技術分野において既知である種々の方法のいずれかを使用して、そのゲノムがウイルスベクターゲノムのＲＮＡ複製を含む、感染性レンチウイルス粒子を産生することができる。ある方法では、ウイルスベクターゲノムを、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングするために必要な成分のすべてを含有するパッケージング細胞株に導入する。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、１つまたは複数の対象配列に加えて、ウイルス成分をコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでもよい。しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子は、通常、除去され、パッケージング細胞株において別々に提供される。
【００９２】
概して、レンチウイルスベクター粒子は、粒子を生成するのに必要な成分を含有する１つまたは複数のプラスミドベクターにより遺伝子導入される細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、典型的には、複製可能ではなく、つまり、該粒子は、１回の感染のみ可能である。ほとんどの場合、複数のプラスミドベクターを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子成分を分離し、主に、そうでなければ複製可能なウイルスを生成し得る組み換え事象の機会を減少させる。しかしながら、所望であれば、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。複数のプラスミドベクターを用いるシステムの一例として、細胞株は、ＬＴＲ、ｃｉｓ作用性パッケージング配列、および多くの場合、異種プロモーターに動作可能に結合している対象配列を含む、ウイルスベクターゲノムを含有する少なくとも１つのプラスミド（つまり、ベクターゲノムプラスミド）と、ウイルス酵素的および構造的成分をコードする少なくとも１つのプラスミド（すなわち、ＧａｇおよびＰｏｌ等の成分をコードする、パッケージングプラスミド）と、アルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つのエンベローププラスミドとで遺伝子導入される。追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載し、本技術分野において既知であるようなＲｅｖ発現プラスミドを使用して、レトロウイルス粒子産生を強化することが可能である。ウイルス粒子は、細胞膜から発芽し、対象配列を含有するゲノムを含むコアと、樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である場合、糖タンパク質を操作して、基準株ＨＲと比較して、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。
【００９３】
本発明のプラスミドベクターによるパッケージング細胞の遺伝子導入は、周知の方法によって達成することが可能であり、使用する方法は、決して限定されない。いくつかの非ウイルス送達システムが、当技術分野で既知であり、例えば、エレクトロポレーション、リポソームを含む脂質系送達システム、「裸の」ＤＮＡの送達、およびポリシクロデキストリン化合物を使用する送達、例えば、Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ  ＡＧ（2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs,）に記載されるものが含まれる。典型的には、陽イオン性脂質または塩処理方法が用いられる。例えば、Graham et al. (1973. Virol. 52: 456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76）を参照されたい。リン酸カルシウム沈殿方法がほとんどの場合使用される。しかしながら、核微量注入および細菌原形質融合を含む、ベクターを細胞に導入するための他の方法を使用してもよい。
【００９４】
パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムＲＮＡをレンチウイルスベクター粒子にパッケージングするためにトランスで必要な、ウイルス調節および構造的タンパク質を含む成分を提供する。パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的レンチウイルスベクター粒子を産生することが可能な、任意の細胞株とすることができる。一部の適切なパッケージング細胞株としては、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  Ｘ）、２９３Ｔ、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＬ  ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３０）細胞が挙げられる。パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。そのようなパッケージング細胞株は、例えば、米国特許第６２１８１８１号明細書に記載されている。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムとともに、１つまたは複数の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸分子を用いて、一時的に遺伝子導入することができる。結果として生じるウイルス粒子を採取し、標的細胞の感染に使用する。エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子は、通常、ｐｃＤＮＡ３などの発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州）にクローン化される。真核細胞発現ベクターは、当技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手できる。次に、２９３Ｔ細胞などのパッケージング細胞に、対象配列（例えば、ＩＬ−１２、任意選択的に１つまたは複数の抗原、追加のサイトカイン）をコードするウイルスベクターゲノムと、ウイルスパッキング成分をコードする少なくとも１つのプラスミドと、標的分子の発現のためのベクターとで、共遺伝子導入する。エンベロープは、パッケージング細胞の膜上に発現し、ウイルスベクターに取り込まれる。
【００９５】
１つのシナリオでは、本明細書に記載するように、Ｅ２などのシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を調製するために、１つまたは複数のベクターを用いてポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入する。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープを含む、ウイルスの種々の成分をコードするポリヌクレオチド配列、対象配列（例えば、ＩＬ−１２、および任意選択的に、１つもしくは複数の抗原、または他の対象配列）、ならびにパッケージング細胞によって提供されないウイルスを産生するために必要な任意の成分を含有することが可能である。
【００９６】
さらに他のシナリオでは、ＩＬ−１２をコードするウイルスベクターゲノム、および１つまたは複数の追加のベクターを用いてパッケージング細胞に共遺伝子導入する。例えば、ＩＬ−１２（および、任意選択的に、１つまたは複数の追加の対象配列）をコードするウイルスベクターに加えて、第２のベクターは、好適には、修飾した（変異体とも呼ばれる）シンドビスウイルスエンベロープをコードする遺伝子を担持する。一部の状況では、ＩＬ−１２をコードするウイルスベクターゲノムは、非限定例として、ケモカイン、サイトカイン、ＤＣ成熟因子、または免疫チェックポイント機序を調節する因子を含む、追加の選択した免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。他の状況では、選択した免疫調節因子をコードするポリヌクレオチド配列は、ＩＬ−１２をコードするウイルスベクターおよび１つまたは複数の追加ベクターと共にパッケージング細胞に共遺伝子導入される、第３のベクターに含有される。
【００９７】
一部のまたは任意の実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子は、ＳＡＭＨＤ１阻害剤を含む。ある実施形態では、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、Ｖｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質である。ある実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子は、Ｖｐｘタンパク質またはその変異体を含む（例えば、国際公開第２０１３／１４９１６７号を参照されたい）。一部のまたは任意の実施形態では、変異体は、ＳＡＭＨＤ１を阻害する機能を保持する。
【００９８】
シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、４つのＮ−連結グリカン（Ｅ２タンパク質上の２つと、Ｅ１タンパク質上の２つ）を含有する。哺乳動物細胞において、マンノシダーゼＩ阻害剤の不在下で産生されるウイルスの２つのＮ−グリカンは、高マンノース構造を有し（１つは、Ｅ２  Ｎ−連結グリカンであり、１つは、Ｅ１  Ｎ−連結グリカンである）、一方、残りの２つは、複合体構造を有する。２つの複合体構造のＮ−グリカンは、エンベロープタンパク質の表面に露出しており、一方、２つの高マンノース構造のＮ−グリカンは、エンベロープタンパク質の三量体の中心に埋没している。複合体Ｎ−連結グリカンを有するシンドビスウイルス粒子は、それほど複雑ではない、高度にマンノシル化された糖タンパク質を有する粒子ほど効率的にＤＣ−ＳＩＧＮに結合することはない。
【００９９】
ある実施形態では、ウイルス粒子を、キフネンシンなどのマンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で哺乳動物細胞において産生する（例えば、国際公開第２０１３／１４９１６７号を参照されたい）。したがって、一部のまたは任意の実施形態では、ウイルスパッケージング細胞を、マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で培養する。一部のまたは任意の実施形態では、マンノシダーゼＩ阻害剤はキフネシンである。一部の実施形態では、キフネンシンは、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、または約０．２５μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの濃度で培地に存在する。
【０１００】
偽型レンチウイルスベクター粒子がシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質およびＶｐｘタンパク質を含む、一部のまたは任意の実施形態において、レンチウイルス粒子を、マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で産生する。一部の実施形態において、マンノシダーゼ阻害剤は、デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＮＪ）である。好適な実施形態では、マンノシダーゼ阻害剤はキフネシンである。一部の実施形態では、ＤＭＮＪは、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約９００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約８００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約７００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約６００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、または約２００μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌの濃度で培地に存在する。
【０１０１】
一部のまたは任意の実施形態では、マンノシダーゼＩ阻害剤（例えば、キフネンシン）の存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子は、エンベロープ糖タンパク質（例えば、シンドビスウイルスＥ２）を含み、Ｎ−連結グリカンの少なくとも６０％は、マンノース５（Ｍａｎ５）、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、および／またはＭａｎ９の構造を含む。一部の実施形態では、Ｎ−連結グリカンの少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、および／またはＭａｎ９＋の構造を含む。
【０１０２】
１つのシナリオでは、本明細書に記載するように、Ｅ２などのシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を用いて偽型化したレンチウイルスベクター粒子の調製のために、１つまたは複数のベクターを使用して、ポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、高度にマンノシル化されている。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子はまた、Ｖｐｘタンパク質またはその変異体を含む。さらに他の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、高度にマンノシル化されており、Ｖｐｘタンパク質またはその変異体を含む。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープを含むウイルスの種々の成分、対象配列（典型的には、抗原をコードする）、およびパッケージング細胞によって提供されないウイルスの産生に必要な任意の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含有することが可能である。
【０１０３】
ウイルスエンベロープタンパク質のグリコシル化プロファイルは、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定することができる。例えば、グリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅＦ）で処理された、または処理されないままのウイルス糖タンパク質についてのゲルシフトアッセイを、比較することができる。他の方法としては、グリカンをウイルス糖タンパク質から切断し、ＨＰＬＣおよび質量分光分析法によって成分を分離および特定することが挙げられる。
【０１０４】
ウイルスの産生は、本明細書に記載するように測定され、容量あたりのＩＵとして表現される。ＩＵは、感染単位、あるいは形質導入単位（ＴＵ）であり；ＩＵおよびＴＵは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的測定値として区別なく使用することができる。本明細書に記載するように、ゲノムは、容易に測定可能な産生物を発現することができるウイルスを産生する。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質が好適である。レンチウイルスベクターは、典型的には、非取り込みである。次に、ウイルスを標的細胞に投与し、フローサイトメトリーなどにより、ＧＦＰを発現する標的細胞の数を求める。次に、力価を計算する。力価は、可能な限り高いことが望ましいが、細胞上清の少なくとも１×１０５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０６ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも１×１０７ＩＵ／ｍＬである（あらゆる濃縮前）。あるいは、力価は、同じ細胞においてＶＳＶ−Ｇエンベロープを用いて偽型化した同じレンチウイルスベクターの力価の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％である。
【０１０５】
Ｄ．ウイルスの送達
ウイルスは、ウイルスが、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドおよび任意の他の対象ポリヌクレオチドの送達が望まれる、標的樹状細胞（ＤＣ）と接触するのを可能にする任意の方法で、標的細胞に送達することができる。時には、適切な量のウイルスが、例えば、身体への注入を通して、ヒトまたは他の動物に直接（ｉｎ  ｖｉｖｏで）導入されよう。適切な動物としては、限定するわけではないが、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、または他のトリが挙げられる。ウイルス粒子および本明細書に開示する他の治療剤は、静脈内、皮内、皮下、結節内、腹腔内、または粘膜等のいくつかの経路によって注入することができる。ウイルスは、米国特許第７２４１２７５号明細書、同第７１１５１０８号明細書、同第７１０８６７９号明細書、同第，０８３５９９号明細書、同第７０８３５９２号明細書、同第７０４７０７０号明細書、同第６９７１９９９号明細書、同第６８０８５０６号明細書、同第６７８０１７１号明細書、同第６７７６７７６号明細書、同第６６８９１１８号明細書、同第６６７０３４９号明細書、同第６５６９１４３号明細書、同第６４９４８６５号明細書、同第５９９７５０１号明細書、同第５８４８９９１号明細書、同第５３２８４８３号明細書、同第５２７９５５２号明細書、同第４８８６４９９号明細書に開示されるデバイスなどの皮下注入デバイスを用いて送達することができる。特定の一実施形態では、ウイルスを腫瘍内に送達する。標的細胞を含む器官に直接など、他の注入場所も適切である。例えば、リンパ節内注入、脾臓内注入、または骨髄内注入を使用して、ウイルスをリンパ節、脾臓、および骨髄にそれぞれ送達してもよい。特定の状況および標的細胞の性質に応じて、例えば、吸入、または上皮組織、例えば、眼、口、または皮膚の上皮組織との直接接触を含む、他の手段を通して導入を行うことが可能である。
【０１０６】
本明細書の別の場所で記載するように、多数の対象配列が標的細胞での発現向けに企図されるある実施形態では、対象配列は、同一のベクターから発現するか、または、別のベクターで提供することができる。これに関し、多数のベクターの投与が企図される。ある実施形態では、各ベクターを同じ経路で投与する。他の実施形態では、各ベクターを、異なる経路で、異なる時間に投与し得る。一実施形態では、各ベクターを、同じ経路だが、異なる用量で、異なる時間に投与する。さらなる実施形態では、各ベクターを、同じ経路かつ同じ時間に、同じまたは異なる部位に、同じ用量または異なる用量で投与する。別の実施形態では、各ベクターを、同じ経路かつ同じ時間に投与するが、各ベクターは異なる用量で提供する。
【０１０７】
一例として、ＩＬ−１２を発現するベクターを、対象抗原を発現する別のベクターと同時に、腫瘍内に投与することができる。追加の例では、ＩＬ−１２を発現するベクターを、１つまたは複数の対象抗原と、任意選択に、１つまたは複数の追加の対象配列とを発現する別のベクターと同時に、腫瘍内に投与することができる。さらなる実施形態では、ＩＬ−１２および１つまたは複数の対象抗原を発現するベクターを、腫瘍内に投与する。追加の実施形態では、ＩＬ−１２を発現するベクターを腫瘍内に投与し、１つまたは複数の対象抗原を発現する別のベクターを、異なる腫瘍の腫瘍内か、または、異なる部位に、異なる経路（例えば、皮下、皮内、もしくは筋肉内）を介して、別の部位に同時に投与する。他の実施形態では、ＩＬ−１２を発現するベクターを腫瘍内に投与し、１つまたは複数の対象抗原を発現する別のベクターを、ＩＬ−１２を発現するベクターの前後で、同じ部位または異なる部位に、投与することができる。これに関し、２つのベクターを、異なる部位に、異なる用量を用いて投与することができる。ＩＬ−１２を発現するベクター、ならびに、１つまたは複数の抗原を発現し、および／または、他の対象配列を含む別のベクターを同時に投与するある実施形態では、別のベクターを含む組成物を、単一の投与用量に混ぜることが好都合な場合がある。
【０１０８】
あるいは、標的細胞を、例えば、培養プレートにおいて、提供し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスと接触させる。標的細胞は、典型的には、健康な被検体または治療を必要とするもしくは抗原に対する免疫応答を刺激することが望ましい被検体から得た樹状細胞を含む細胞群である。被検体から細胞を得る方法は、当該技術分野で周知であり、静脈切開術、外科的切開、および生検が挙げられる。ヒトＤＣは、また、ＣＤ３４α＋ヒト造血前駆細胞を得ること、および他の場所に記載するようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養方法を使用することによって生成することができる（例えば、Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)）。
【０１０９】
ウイルスを培地に懸濁し、培養プレート、管、または他の容器のウェルに添加してよい。ウイルスを含有する培地は、細胞を蒔く前か、または細胞を蒔いた後に添加してもよい。細胞は、典型的には、適量の培地においてインキュベートして、生存能を与え、宿主細胞の形質導入が起きるように、培地中のウイルスの適切な濃度を可能する。細胞は、好適には、ウイルスを細胞に感染させるのに十分な時間、ウイルスでインキュベートする。好適には、細胞は、少なくとも１時間、少なくとも５時間、または少なくとも１０時間、ウイルスでインキュベートする。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達の両方において、所望の標的細胞に感染させるのに十分な数を含有するウイルス粒子のアリコートを使用することができる。標的細胞を培養する場合、ウイルス粒子の濃度は、概して、少なくとも１ＩＵ／μＬ、より好ましくは、少なくとも１０ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも３００ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０４ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０５ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０６ＩＵ／μＬ、またはさらにより好適には、少なくとも１×１０７ＩＵ／μＬである。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルスの感染後、標的細胞をヒトまたは他の動物に導入（または再導入）することが可能である。細胞は、皮内、皮下、または末梢血流に導入することが可能である。動物に導入する細胞は、好適には、有害な免疫応答を回避するため、その動物に由来する細胞である。類似する免疫背景を有するドナーに由来する細胞も使用することができる。使用することができる他の細胞としては、有害な免疫応答を回避するように設計されたものが挙げられる。
【０１１２】
標的細胞は、例えば、対象の配列または遺伝子の組み込み、転写、および／または発現、組み込まれる遺伝子の複製の数、ならびに組み込み位置に関して分析することができる。そのような分析は、任意の時間に行うことができ、当該技術分野で既知の任意の方法によって行うことができる。
【０１１３】
ウイルスまたはウイルス感染した樹状細胞が投与される被検体を、感染細胞の場所、ウイルス送達されたポリヌクレオチドまたは対象遺伝子の発現、免疫応答の刺激について分析し、当該技術分野で既知の任意の方法によって、疾患または障害に関連する症状を監視することができる。
【０１１４】
上記に開示する細胞を感染させる方法は、細胞の個別の特異的な特性に依存しない。結果として、それらは、種々の動物種に容易に拡大される。いくつかの例では、ウイルス粒子を、ヒトまたはヒト樹状細胞に送達し、他の例では、ウイルス粒子を、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、またはマウス、またはトリなどの動物に送達する。本明細書で論じるように、ウイルスベクターゲノムを偽型化して、それに、広範な宿主範囲ならびに標的細胞特異性を付与する。当業者は、特定の動物種において対象配列の望ましい発現を達成するための、適切な内部プロモーターおよび他のエレメントにも気付くであろう。したがって、当業者は、任意の種からの樹状細胞に感染させる方法を修正することができよう。
【０１１５】
Ｅ．治療的および予防的投与
標的細胞は、本明細書に記載する、疾患または障害の予防または治療のためのレンチウイルスベクター粒子、特に、患者においてＩＬ−１２に影響される免疫応答を誘導することが有益となるものに感染させることができる。特定の実施形態では、樹状細胞を、本明細書に記載する疾患または障害の予防または治療のためのレンチウイルスベクター粒子、特に、患者における免疫応答の活性化が有益となるものに感染させることができる。そのような多くの疾患が周知である。例えば、本発明の方法による治療または予防の影響を受けやすい疾患または障害としては、限定するわけではないが、がん、自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、および寄生虫感染を含む感染が挙げられる。１つの方法では、対象配列を樹状細胞に送達するため、疾患は、本明細書に記載するウイルス粒子によって処置され、対象配列の発現が、ＩＬ−１２および任意選択的に疾患特異的抗原を産生し、細胞免疫応答および体液性免疫応答の刺激をもたらす。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２を、免疫応答が望まれるが、通常は樹状細胞で発現しない、１つまたは複数の抗原をコードする対象配列と共に、発現させる。抗原は、樹状細胞により発現および提示される。ウイルスベクターゲノムは、追加の免疫賦活性分子またはチェックポイント阻害剤などの他の免疫調節分子をさらにコードしてよい。
【０１１６】
典型的な用途では、ウイルス粒子は、標的細胞に、ＩＬ−１２をコードする配列を送達し、ある特定の実施形態では、同一のベクターまたは別のベクターにより発現される１つまたは複数の抗原と共に、ＩＬ−１２をコードする配列を送達する。送達は、樹状細胞をウイルスとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることにより達成され得、感染した樹状細胞が患者に提供される。他の時は、送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞を感染させるために、ウイルスを被検体に送達することにより達成することが可能である。次に、樹状細胞は、ＩＬ−１２を産生することにより、ＩＬ−１２により誘導される他の生物学的活性のうち、ＣＤ８  Ｔ細胞の誘導、Ｂ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の増加、ならびにＴＨ１応答の誘導を含む、ＩＬ−１２に対する細胞応答を引き起こす。ある実施形態では、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターを腫瘍内投与することにより、他の生物学的活性のうち、Ｔｈ１応答の誘導を引き起こし、治療的抗腫瘍活性を提供する。ある実施形態では、１つまたは複数の抗原を発現するベクターと共に、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターを腫瘍内投与することは、また、患者において抗原特異的Ｔ細胞またはＢ細胞を刺激して、発現抗原に対する細胞性および体液性の免疫応答を誘導する。このようにして、疾患または障害を患っている患者を、所望の特異性を有する免疫細胞を生成することにより処置する。
【０１１７】
ある実施形態では、ＩＬ−１２を発現するベクターを、腫瘍内に投与することができる。本開示は、予想外なことに、低レベルのＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターの腫瘍内投与が、テストした多数のモデルにおいて治療的に有効であったことを示す。特に、実験は、本明細書に記載する、低レベルのＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターの単回腫瘍内注入でさえ、治療的に有効であることを示した。当技術分野の他の研究では、エレクトロポレーションを用いたＩＬ−１２の多数回の注入を必要とし、かつ、より高レベルのＩＬ−１２を必要とする。例えば、ある研究では、エレクトロポレーションを用いたＩＬ−１２プラスミドの腫瘍内注入を、１日目、５日目、および８日目の３回の注入で行い、場合により、７週目に第２コースを行った（例えば、臨床治験ＮＣＴ０１４４０８１６を参照されたい）。別の研究では、被検体は、２８日サイクルで、１日目と８日目の２回の処置日からなる処置サイクルを、最大６サイクル受けることもある。これらの研究では、患者はｐＩＬ−１２の腫瘍内注入を受け、続いて、即時に、腫瘍細胞内にプラスミドＤＮＡのエレクトロポレーションを引き起こす腫瘍部位周辺での放電を行った（例えば、ＮＣＴ０１５７９３１８を参照されたい）。
【０１１８】
本発明は、予想外なことに、本明細書に記載するレンチウイルスベクターの注入により腫瘍に局部的に生じる非常に低いレベルのＩＬ−１２発現が、治療的に有効であったことを示す。これに関し、ＩＬ−１２発現のレベルは、最適な培養条件下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づくと、最初の４８時間で、約０．５ミクログラム産生／１Ｅ１０ベクターゲノムより少なかった。ＩＬ−１２は、実施例１および実施例６に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏの形質導入アッセイを用いて測定することが可能である。例えば、０日目に、１Ｅ６の適切な標的細胞（例えば、レンチウイルスベクター粒子を、修正シンドビスＥ２糖タンパク質を用いて偽型化した２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞など）を、６ウェルプレートの適切な培養培地２ｍＬ中に蒔く。１日目に、細胞に８．５Ｅ９ベクターゲノムを用いて形質導入する。形質導入を、概して、６００μＬの培地において実行し、次に、０．９ｍＬの培地を６時間後に加える。３日目（形質導入の４８時間後）に、上清を０．４５μｍフィルタに通して濾過し、ＩＬ−１２を、標準ＥＬＩＳＡを使用して（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｋｉｔ  Ｍ１２７０などの商業的に利用可能なキットを使用して）測定した。
【０１１９】
したがって、本発明の特定の一実施形態では、ＩＬ−１２を発現する本明細書に記載のウイルスベクターを、がんの処置のために、腫瘍内に投与し、ある特定の実施形態では、単回注入で腫瘍内に投与する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２を発現する本明細書に記載のレンチウイルスベクターの腫瘍内注入が、低レベルのＩＬ−１２を産生する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２を発現する本明細書に記載のレンチウイルスベクターの単回腫瘍内注入を用い、これにより低レベルのＩＬ−１２を産生する。本明細書に記載のレンチウイルスベクターの腫瘍内注入、ある実施形態では単回注入により産生されるＩＬ−１２のレベルは、概して、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより測定されるように、最初の４８時間で約０．０５マイクログラム産生相当から、最初の４８時間で約５マイクログラム産生の範囲に及ぶ。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルスベクターの単回腫瘍内注入により産生されるＩＬ−１２のレベルは、最初の約４８時間で約０．１マイクログラム産生相当から、最初の４８時間で約１マイクログラム産生の範囲に及ぶ。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターの単回腫瘍内注入により産生されるＩＬ−１２のレベルは、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより測定されるように、最初の４８時間で、約０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または約５．０μｇのＩＬ１２産生からの範囲に及ぶ。本明細書に記載の特定の用量のレンチウイルスベクターにより産生されるＩＬ−１２の量は、最適な培養条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を使用して測定することが可能である。
【０１２０】
特定の実施形態では、単回腫瘍内注入に使用する、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターは、組み込みベクターである。別の実施形態では、単回腫瘍内注入に使用する、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターは、非組み込みベクターである。
【０１２１】
一実施形態では、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターを、制御性Ｔ細胞除去剤、例えば、シクロホスファミド、抗ＣＴＬＡ４、または制御性Ｔ細胞マーカーに特異的に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ２５抗体；このような抗体としては、ダクリズマブが挙げられる）などと共に、腫瘍内に投与する。これに関し、このような制御性Ｔ細胞欠乏剤は、本明細書に記載するＬＶ−ＩＬ１２の腫瘍内投与の前に、投与と同時に、投与の後に、投与することができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的レンチウイルスベクターを、制御性Ｔ細胞を欠乏させる薬剤、例えば、シクロホスファミド、抗ＣＴＬＡ４、または、制御性Ｔ細胞欠乏抗体もしくは薬剤の全身投与と同時に、腫瘍内に投与する。ある特定の実施形態では、低用量のシクロホスファミドをメトロノミックレジメンを使用して投与する。ある特定の実施形態では、シクロホスファミドを経口投与する。
【０１２２】
ヒトの制御性Ｔ細胞を欠乏させるための種々の方法が存在し、評価されており、本明細書に記載のＬＶ／ＩＬ１２ベクターおよび方法は、これらの方法の何れかと共に使用することが可能である。当業者に理解されるように、そのような１つの方法は、ＣＤ４４＋ＣＤ１３７＋制御性Ｔ細胞の欠乏である（例えば、Immunotherapy 2012 May; 4(5): 483-485を参照されたい）。
【０１２３】
別の実施形態では、ＩＬ−１２を発現する本明細書のウイルスベクターを、対象抗原を発現する第２ベクターと同時に投与する。追加の例では、ＩＬ−１２を発現するベクターを、１つまたは複数の対象抗原と、任意選択的に、１つまたは複数の追加の対象配列を発現する別のベクターと同時に、腫瘍内に投与することができる。さらなる実施形態では、ＩＬ−１２と１つまたは複数の対象抗原を発現するベクターを、腫瘍内に投与する。追加の実施形態では、ＩＬ−１２を発現するベクターを腫瘍内に投与し、１つまたは複数の対象抗原を発現する別のベクターを、異なる腫瘍の腫瘍内か、または、異なる部位に、異なる経路（例えば、皮下、皮内、もしくは筋肉内）を介して、別の部位に同時に投与する。他の実施形態では、ＩＬ−１２を発現するベクターを、腫瘍内に投与し、１つまたは複数の対象抗原を発現する別のベクターを、ＩＬ−１２を発現するベクターの前後で、同じ部位または異なる部位に、投与することができる。これに関し、２つのベクターを、異なる部位に、異なる用量を用いて投与することができる。ＩＬ−１２を発現するベクター、ならびに、１つまたは複数の抗原を発現し、および／または、他の対象配列を含む別のベクターを同時に投与するある特定の実施形態では、別のベクターを含む組成物を、単一の投与用量に混ぜることが好都合な場合がある。
【０１２４】
ウイルス感染の後、対象配列（例えば、ＩＬ−１２をコードし、任意選択的に１つまたは複数の抗原をコードする）が、標的樹状細胞により発現される。ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる場合、次に、例えば注入により標的樹状細胞を患者に戻し、そこで標的樹状細胞は、所望の抗原に対し免疫応答を生成することが可能な免疫細胞と相互作用する。好適な実施形態では、組換えウイルスを患者に注入し、そこでウイルスは、標的樹状細胞にｉｎ  ｓｉｔｕで形質導入を生じさせる。次に、樹状細胞はＩＬ−１２と、任意選択的に、処置すべき疾患または障害と関連する特定の抗原を発現し、患者は、その疾患または障害に対し効果的な免疫応答を開始することができる。
【０１２５】
ウイルスベクターゲノムは、２つ以上の抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有し得、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される多数の抗原に対する免疫応答を生成する。一部の実施形態では、抗原は、単一の疾患または障害に関する。他の実施形態では、抗原は多数の疾患または障害に関する。
【０１２６】
ウイルスの一部では、ＤＣの成熟を活性化および／または刺激するＤＣ成熟因子を、対象配列と共に送達する。代わりに、ＤＣは、ウイルス送達前に、送達と同時に、送達後に、ＤＣ成熟因子の送達により活性化する。ＤＣ成熟因子は、ウイルス投与とは別に提供され得る。
【０１２７】
本明細書に記載するように、１つもしくは複数の免疫調節分子および／またはＤＣ成熟因子は、ウイルスゲノムに含有される１つまたは複数の配列によりコードされ、ウイルスが樹状細胞に感染した後に発現することが可能である。免疫調節分子をコードする配列は、また、パッケージング細胞株において、ＩＬ−１２と、任意選択的に１つまたは複数の抗原とをコードするウイルスベクターと共に共遺伝子導入される別のベクターにおいて、提供することが可能である。
【０１２８】
本明細書に記載の方法は、患者の養子免疫療法に用いることが可能である。ＩＬ−１２と、ある特定の実施形態では所望の抗原とをコードするポリヌクレオチドを得て、組み換えウイルスにパッケージングする。標的樹状細胞を患者から得て、ＩＬ−１２と、任意選択的に所望の抗原とをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスにより、形質導入する。次に、樹状細胞を患者に戻す。
【０１２９】
ウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｖｏで注入することができ、そこでウイルス粒子はＤＣに感染し、ＩＬ−１２と、任意選択的に、抗原または他の免疫賦活性分子をコードする配列とを送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも３×１０６ＩＵであり、少なくとも１×１０７ＩＵ、少なくとも３×１０７ＩＵ、少なくとも１×１０８ＩＵ、少なくとも３×１０８ＩＵ、少なくとも１×１０９ＩＵ、または少なくとも３×１０９ＩＵとすることが可能である。選択した間隔で、レシピエントのリンパ器官からのＤＣを使用して、例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのマーカーの発現を観察することにより、発現を測定することができる。核酸モニタリング技法および逆転写酵素（ＲＴ）の活性の測定を使用して、ウイルス粒子の体内分布を解析することも可能である。レンチウイルスベクター粒子で処置したレシピエントの末梢血単核細胞、リンパ節、脾臓、または、悪性もしくは標的の病原体感染組織からのＴ細胞を、抗原刺激に対する応答の規模および持続力より測定することができる。ＤＣ以外の組織細胞、例えば上皮性細胞およびリンパ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達の特異的について解析することができる。
【０１３０】
ワクチンは、しばしば、アジュバントを含む。ある実施形態では、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターを、他のワクチンと共に、アジュバントとして使用することができる。
【０１３１】
本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子を、アジュバントと共に投与することもできる。アジュバントを、組み換えウイルス粒子の前にまたは組み換えウイルス粒子の後に、組み換えウイルス粒子と一緒に投与することができる。ウイルス粒子と一緒に投与する場合、所望のアジュバントは、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス膜を崩壊するなど、ウイルス粒子の完全性を著しく崩壊させることはない。
【０１３２】
種々のアジュバントをウイルスと組み合わせて使用して、誘導される免疫応答をさらに増大させることが可能である。ある特定の例示的なアジュバントとしては、アルム、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（ＧＢ  ２２２０２１１を参照されたい）が挙げられる。ＱＳ２１は、南米に見られるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されるトリテルペングリコシドまたはサポニンである（Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995)；米国特許第５０５７５４０号明細書を参照されたい）。他のアジュバントは、モノホスホリル脂質Ａなどの免疫刺激剤と任意選択的に組み合わせた、水中油型エマルジョン（例えば、スクアレンまたはピーナッツ油）である（Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)を参照されたい）。別のアジュバントはＣｐＧである（Bioworld Today, Nov. 15, 1998）。あるいは、Ａβをアジュバントと結合させることが可能である。例えば、Ａβのリポペプチド版は、Ｂ型肝炎抗原ワクチン接種に関して記載されるように、パルミチン酸または他の脂質をＡβのＮ末端に直接結合させることによって調製することが可能である（Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)）。しかしながら、そのような結合は、それに対する免疫応答の性質に影響するように、Ａβの構造を実質的に変更してはならない。アジュバントは、活性成分を有する治療組成物の成分として投与することが可能であるか、または治療薬の投与前に、投与と同時に、または投与後に個別に投与することができる。
【０１３３】
アジュバントの一部類は、アルミニウム塩（アラム）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどである。このようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリマーまたは単量体アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシンなどの、他の特異的な免疫刺激剤の有無に関わらず使用することが可能である。別の部類のアジュバントは、水中油型エマルジョン製剤である。そのようなアジュバントは、他の特異的な免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ＡＩ−Ｄ−イソグル−Ｌ−アラ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド（商標）または他の細菌細胞壁成分の有無に関わらず使用することができる。水中油型エマルジョンとしては、（ａ）モデル１１０Ｙミクロフリューダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ニュートン、マサチューセッツ州）などのミクロフリューダイザを使用してサブミクロン粒子に製剤する、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％スパン８５を含有する（任意により様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）ＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）（ｂ）サブミクロン乳剤にするためにミクロフリューダイザにかけた、または、より大きい粒子サイズの乳剤を作製するためにボルテックスにかけた１０％スクワラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）よりなる群からの１つ以上の細菌細胞璧成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。別の分類の好適なアジュバントは、サポニンアジュバント、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ（マサチューセッツ州ウースター）、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどそれから生成される粒子である。他のアジュバントとしては、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。他のアジュバントとしては、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインが挙げられる。
【０１３４】
本明細書で組成物とともに使用することが可能な別のアジュバントは、化学式（Ｉ）によって特定される：
【０１３５】
【化１】
2018537432.tif 000002
【０１３６】
式中、部分Ａ１と部分Ａ２は、水素、ホスフェート、およびリン酸塩からなる群より独立して選択される。ナトリウムとカリウムはリン酸塩の例示的な対イオンである。部分Ｒ１、部分Ｒ２、部分Ｒ３、部分Ｒ４、部分Ｒ５および部分Ｒ６は、Ｃ３〜Ｃ２３で表される３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビル基から独立して選択される。明確にするために付け加えると、部分が多数の構成物を有する特定の群「から独立して選択される」場合、第１の部分に選ばれた構成物は第２の部分に選ばれる構成物の選択に決して影響を与えることも制限を与えることもないことが理解されるべきであると説明されよう。部分Ｒ１、部分Ｒ３、部分Ｒ５および部分Ｒ６が結合する炭素原子は非対称であり、したがって、Ｒ立体化学かＳ立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態では、それらの炭素原子の全てがＲ立体化学の配置にある一方、別の実施形態ではそれらの炭素原子の全てがＳ立体化学の配置にある。
【０１３７】
「ヒドロカルビル」は完全に水素と炭素から形成される化学部分であって、その炭素原子の配置が直鎖型または分岐型、非環状または環状であり得、そして、隣接する炭素原子の間の結合は完全に単結合であり得、すなわち、飽和ヒドロカルビルをもたらすか、または、任意の２つの隣接する炭素原子の間に二重結合または三重結合が存在し得、すなわち、不飽和型ヒドロカルビルをもたらし、そして、そのヒドロカルビル基の炭素原子数が３と２４炭素原子の間である、化学部分を指す。ヒドロカルビルはアルキルであり得、その場合、代表的な直鎖アルキルには、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどを含む、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが含まれ；一方、分岐アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、などが含まれる。代表的な飽和型環状ヒドロカルビルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、などが含まれ；一方、不飽和型環状ヒドロカルビルにはシクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが含まれる。不飽和型ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合または三重結合を含有する（そのヒドロカルビルが非環状である場合、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」といい、そのヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合、それぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルという）。代表的な直鎖および分岐アルケニルにはエチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２、３−ジメチル−２−ブテニルなどが含まれ、代表的な直鎖および分岐アルキニルにはアセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが含まれる。
【０１３８】
式（Ｉ）のアジュバントは当技術分野において既知の合成方法、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第２００９／０３５５２８号および国際公開第２００９／０３５５２８号に開示される合成方法によって得ることができる。アジュバントのうちのある特定の物は商業的に入手することもできる。好適なアジュバントは、アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社のカタログで特定される製品番号６９９８００であり、以下のＥ１０と併せてＥ１を参照されたい。
【０１３９】
本発明の種々の実施形態では、アジュバントは式（Ｉ）の化学構造を有するが、部分Ａ１、部分Ａ２、部分Ｒ１、部分Ｒ２、部分Ｒ３、部分Ｒ４、部分Ｒ５および部分Ｒ６は、これらの部分についてこれまでに提供された選択肢からなる部分集合から選択され、これらの部分集合はＥ１、Ｅ２などにより以下で特定される。
【０１４０】
Ｅ１：Ａ１はホスフェートまたはリン酸塩であり、Ａ２は水素である。
【０１４１】
Ｅ２：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ３〜Ｃ２１ アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ５〜Ｃ２３ヒドロカルビルである。
【０１４２】
Ｅ３：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ５〜Ｃ１７アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ７〜Ｃ１９ヒドロカルビルである。
【０１４３】
Ｅ４：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ７〜Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ１７ヒドロカルビルである。
【０１４４】
Ｅ５：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ９〜Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１１〜Ｃ１５ヒドロカルビルである。
【０１４５】
Ｅ６：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ９〜Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１１〜Ｃ１７ヒドロカルビルである。
【０１４６】
Ｅ７：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ７〜Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ１５ヒドロカルビルである。
【０１４７】
Ｅ８：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０ヒドロカルビルである。
【０１４８】
Ｅ９：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１３ヒドロカルビルである。
【０１４９】
Ｅ１０：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４はトリデシルである。
【０１５０】
ある特定の選択肢では、Ｅ２〜Ｅ１０のそれぞれが実施形態Ｅ１と組み合わされる、および／または、Ｅ２〜Ｅ９のヒドロカルビル基がアルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。
【０１５１】
式（Ｉ）のアジュバントは、それぞれ以下に論じるように、任意選択的に共アジュバントと共に医薬組成物に製剤化され得る。これに関して、ＧＬＡアジュバントの水性製剤（ＡＦ）および安定エマルジョン製剤（ＳＥ）などの製剤を提供する米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号明細書を参照するが、これらの製剤は式（Ｉ）のアジュバントのいずれにも用いることができる。
【０１５２】
アジュバントは、単一組成物として本発明のウイルスと共に投与するか、または、本発明の組み換えウイルスの投与前に、投与と同時に、投与後に、投与することが可能である。ある特定の実施形態では、免疫原がアジュバントに含まれる。免疫原とアジュバントをパッケージングし、同じバイアルで供給するか、または、別のバイアルにパッケージングし、使用前に混合することが可能である。免疫原とアジュバントは、典型的には、意図する治療用途を示すラベルとともに、パッケージングされる。免疫原およびアジュバントが別々にパッケージングされる場合、パッケージングは、典型的には、使用前に混合するための説明書を含む。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される種でのアジュバントの有用性に左右され、ヒトにおいては、医薬的に許容されるアジュバントは、認可されたものであるか、または関連の規制機関によってヒトへの投与が承認されたものである。例えば、完全フロインドアジュバントは、ヒト投与に適切ではない。アラム、ＭＰＬ、およびＱＳ２１が好適である。任意選択的に、アラムとＭＰＬ、アラムとＱＳ２１、ＭＰＬとＱＳ２１、およびアラム、ＱＳ２１とＭＰＬなど、２つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することが可能である。また、不完全フロインドのアジュバントは、任意選択的に、アラム、ＱＳ２１、およびＭＰＬ、ならびにそれらのすべての組み合わせと組み合わせて使用することが可能である（Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)）。
【０１５３】
本明細書に記載のレトロウイルスベクターを含む組成物は、１つまたは複数の他の治療剤の投与と同時に、投与の前に、または投与の後に投与することもできる。
【０１５４】
このような併用治療には、本明細書に記載のウイルスベクターと、１つまたは複数の追加の活性剤を含有する単一の医薬投与製剤を投与することと、本発明のウイルスベクターを含む組成物と各活性剤をそれぞれ別個の医薬投与製剤で投与することが含まれ得る。例えば、ウイルスベクターを含む組成物と、他の活性剤を、錠剤またはカプセルなどの単一の経腸性（例えば、経口）投与組成物中で一緒に患者に投与するか、または、各薬剤を個別の経腸的（例えば、経口）投与製剤で投与することが可能である。同様に、ウイルスベクターを含む組成物と、他の活性剤を、食塩水または他の生理学的に許容される溶液などにおける、単一の非経口的（例えば、既知であり、本明細書に記載されている、皮下、皮内、結節内、腫瘍内または筋肉内などの非経口経路のいずれか）投与組成物において一緒に患者に投与することが可能であるか、または、各製剤を、個別の非経口的投与剤形において投与する。本明細書に記載する併用治療は、同じ経路で投与するか、または、異なる経路を使用して投与することができる。別個の投与製剤を使用する場合、ウイルスベクターを含む組成物と、１つまたは複数の追加の活性剤は、実質的に同じ時刻に、つまり同時に、または、別々にずらした時刻に、つまり逐次的に、任意の順番で投与することが可能であり；併用治療には、これらのレジメンが全て含まれることが理解される。
【０１５５】
したがって、ある特定の実施形態では、１つまたは複数の他の治療剤（例えば、他の抗がん剤または他の緩和もしくは補助治療）と組み合わせた、本開示のウイルスベクターを含む組成物の投与も企図される。ある特定の実施形態では、このような治療剤は、本明細書に記載する特定のがんの標準処置として、当技術分野で許容され得る。企図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、放射線治療薬、または他の活性剤および補助剤が挙げられる。
【０１５６】
一実施形態では、本発明のウイルスベクターを含む組成物を、１つまたは複数の化学療法剤を含む１つまたは複数のがん治療剤と組み合わせて投与する。チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；エチレンイミンとアルトレートアミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチローロメラミンを含むメチルアメラミン；クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メソトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デホファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルホルミチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テニュアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）；クロランブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メソトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類縁体；ビンブラスチン、トラスツズマブ、ドセタキセル、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ、イバンドロネート、ＣＰＴ−１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチロミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニリュウキン ジフチトックス）、エスペラマイシン、カペシタビン、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤として、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケトキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（ファレストン）を含む抗エストロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュウプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン、ならびに上記いずれかの医薬的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。さらなるがん治療剤には、ソラフェニブと、アファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ホスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブおよびスニチニブなどの他のプロテインキナーゼ阻害剤；シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムスならびに他のｍＴＯＲ阻害剤が挙げられる。
【０１５７】
別の実施形態では、本明細書のウイルスベクター組成物を、別の免疫賦活性剤と組み合わせて投与する。このような免疫賦活性剤としては、限定するわけではないが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−γおよび抗ＣＤ４０抗体、または副刺激経路（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２７など）に結合し、これを活性化する他の抗体が挙げられる。
【０１５８】
一実施形態では、本明細書のウイルスベクター組成物は、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。免疫チェックポイントとは、自己寛容を維持し、免疫応答の持続および規模を調節するのに重要な、免疫系の種々の阻害経路を意味する。腫瘍は、ある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主要なメカニズムとして使用する（例えば、Pardoll, 2012 Nature 12:252; Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1を参照）。本開示は、抗原を有さないＧＬＡ組成物と組み合わせて投与可能な免疫チェックポイント阻害剤を提供する。かかる併用療法は連携して、抗がん免疫応答を強化する。ある特定のウイルスもまた、免疫チェックポイント経路を利用するメカニズムを発達させている。したがって、ある特定の実施形態では、このような併用治療を、抗ウイルス免疫応答を強化するために使用することができる。
【０１５９】
免疫チェックポイント阻害剤としては、統計的に有意な方法で免疫系の阻害経路をブロックまたは阻害する任意の薬剤が挙げられる。かかる阻害剤としては、小分子阻害剤が含まれ得、免疫チェックポイント受容体に結合してこれをブロックもしくは阻害する、抗体もしくはその抗原結合断片か、または、免疫チェックポイント受容体リガンドに結合してこれをブロックもしくは阻害する抗体が含まれ得る。ブロッキングまたは阻害のために標的化され得る、例示的な免疫チェックポイント分子としては、限定するわけではないが、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、ＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞の全てに発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５ともいう）、ならびにＣＧＥＮ−１５０４９が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、抗体、もしくはその抗原結合断片、または、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０およびＣＧＥＮ−１５０４９の１つまたは複数に結合し、これらの活性をブロックもしくは阻害する、他の結合タンパク質が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４ブロッキング抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１ブロッカー）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ−０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、およびヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤）が挙げられる。
【０１６０】
さらなる実施形態では、本明細書のウイルスベクター組成物を、他のＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストと組み合わせて投与する。このようなアゴニストは、ペプチドグリカン、ポリＩ：Ｃ、ＣｐＧ、３Ｍ００３、フラジェリン、ならびに真核細胞リボソーム伸長および開始因子４ａのリーシュマニア相同体（ＬｅＩＦ）から選択することができる。
【０１６１】
追加の実施形態では、本明細書のウイルスベクター組成物を、サイトカインと組み合わせて投与する。「サイトカイン」とは、ある細胞集団より放出される、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質の総称を意味する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものとしては、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミュラー管抑制因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロンα、βおよびγなどのインターフェロン；マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；限定するわけではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７を含むＩＬ−１からＩＬ−３６などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ；ならびに、ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書で使用する場合、サイトカインという用語には、天然源または組換え細胞培養からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【０１６２】
ある実施形態では、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物は、エンドソームの酸性化を妨げ、かつ、促進された細胞増殖および栄養素の枯渇から生き延びるために腫瘍細胞が引き起こす自食作用を阻害する、リソソーム作用剤であるクロロキンと組み合わせて投与することができる。より一般的には、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物は、自食作用阻害剤、放射線増感剤または化学物質増感剤として作用する、クロロキン、ミソニダゾール、メトロニダゾール、およびチラパザミンなどのハイポキシック・サイトトキシンのような治療剤と組み合わせて投与することができる。これに関して、このような、クロロキンまたは他の放射線もしくは化学物質増感剤、または自食作用阻害剤とウイルスベクターの組合せは、他のがん治療剤または放射線治療とさらに組み合わせて使用することが可能である。
【０１６３】
別の実施形態では、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物は、「免疫原性細胞死」と呼ばれる、腫瘍細胞の死滅と同時の免疫反応活性化を引き起こすことが知られている、シクロホスファミド、ドキソルビシン、オキサリプラチン、およびミトキサントロンなどの低分子薬物と組み合わせて投与することができる。さらに、腫瘍細胞の免疫原性を強化することが知られている、パツピロン（エポチロンＢ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）標的化モノクローナル抗体７Ａ７．２７、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタットおよびエンチノスタット）、ｎ３−多価不飽和脂肪酸のドコサヘキサエノン酸、さらにプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、シコニン（紫根の主成分）、ならびにＴＶｅｃ（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ））などの腫瘍溶解性ウイルスなどの薬物との組合せ。他の実施形態では、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物を、局所的または全身的に投与し得る、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、デシタビン、５−アザ−２’−デオキシシチジン）などのエピジェネティック治療薬と組み合わせて投与することができる。
【０１６４】
別の実施形態では、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物を、ＤＣによる腫瘍のＡＤＣＣ取込みを増加させる１つまたは複数の抗体と組み合わせて投与することができる。したがって、本発明は、抗原提示細胞による腫瘍細胞またはその断片の摂取、続く免疫系への腫瘍抗原の提示を誘起または強化する任意の分子と、ウイルスベクターを含む組成物とを組み合わせることを企図する。こうした分子には、受容体結合（Ｆｃまたはマンノース受容体）を誘導し、抗体、抗体様分子、多特異的多価分子およびポリマーなどを抗原提示細胞に輸送する薬剤が含まれる。このような分子は、ウイルスベクターを含む組成物と共に腫瘍内に投与するか、または異なる経路により投与してもよい。例えば、本明細書に記載するウイルスベクターを含む組成物を、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、カンパス、パニツムマブ、オファツムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、アド−トラスツズマブエムタンシン、オビヌツズマブ、抗ＨＥＲ１、抗ＨＥＲ２、または抗ＨＥＲ３抗体（例えば、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＭＭ−１１１、ＭＭ−１５１、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ８８８）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ニモツズマブ、ＡＢＴ−８０６）、または他の類似抗体の腫瘍内注入と共に、腫瘍内に投与することができる。Ｆｃ受容体、および細胞内取込みを誘導し得る他の受容体と係合可能な任意の多価足場、例えば、Ｆｃ断片または受容体と係合可能なポリマーに連結している標的に結合可能なペプチドおよび／またはタンパク質を、本明細書に記載する併用治療に使用することができる。
【０１６５】
ある実施形態では、ウイルスベクターとこのような抗体との組合せは、副刺激シグナルを促進する（例えば、阻害経路をブロックすることにより）抗体、例えば抗ＣＴＬＡ−４などか、または副刺激経路を活性化する抗体、例えば抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２８、抗ＩＣＯＳ、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ２７抗体などと、さらに組み合わせることができる。
【０１６６】
ウイルスベクターを含む組成物を、単独で、または放射線療法、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法もしくは他のがん治療剤、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法などの他の既知のがん処置と組み合わせて投与することができる。組成物は、また、抗生物質と組み合わせて投与することができる。
【０１６７】
本開示は、ＩＬ−１２を発現するＤＣ標的化レンチウイルスベクターを、任意選択的に、抗原を発現する他のレンチウイルスベクターと組み合わせて、または、他の治療剤と組み合わせて投与することにより、がんを処置する方法を提供する。特異的ながんの例としては、限定するわけではないが、肺がん、大腸がん、乳がん、精巣がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、結腸直腸がんがん、および前立腺がんが挙げられる。追加のがんも当業者には周知であり、それには、限定するわけではないが、白血病、リンパ腫、子宮頸がん、神経膠腫腫瘍、腺がん、肉腫、軟部組織肉腫、および皮膚がんが挙げられる。例示的ながんとしては、限定するわけではないが、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳およびＣＮＳのがん（例えば、神経膠腫腫瘍）、子宮頸がん、絨毛がん、結腸および直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん；子宮内膜がん、食道がん；眼がん；頭頸部のがん；胃がん；上皮内新生物；腎臓がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫、口腔がん（例えば、唇、下、口、および咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん、腎臓がん、呼吸器系のがん；肉腫、皮膚がん；胃がん、精巣がん、甲状腺がん；子宮がん、泌尿器系のがん、ならびに、他の細胞種および肉腫が挙げられる。がんとしては、また、当技術分野で周知の、哺乳動物における腫瘍および悪性疾患も挙げられる。一実施形態では、本開示は、ＩＬ１２を発現するＤＣ標的化レンチウイルスベクターの腫瘍内注入によるがんを処置する方法を提供し、一部の実施形態では、単回腫瘍内注入である。本明細書において、ＤＣ標的化ＩＬ１２発現レンチウイルスベクターを用いた腫瘍内注入には、注入可能腫瘍を有する任意のがんを企図する。
【０１６８】
Ｆ．医薬組成物およびキット
本明細書では、本明細書で提供するウイルスと１つまたは複数の成分とを含有する医薬組成物およびキットも企図する。医薬組成物には、本明細書で提供するウイルスベクター粒子と医薬担体が含まれ得る。キットには、本明細書で提供する医薬組成物および／または組み合わせ、ならびに、取扱い説明書、化合物を被検体に投与するためのデバイス、および、被検体に化合物を投与するためのデバイスなどの、１つまたは複数の構成要素が含まれ得る。
【０１６９】
本明細書で提供するのは、本明細書で提供するウイルス粒子を含有する医薬組成物と、適切な医薬担体である。本明細書で提供する医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、水性、または凍結乾燥形態とすることが可能である。適切な医薬担体の例は、当技術分野で既知である。このような担体および／または添加剤は、従来の方法により製剤化することが可能であり、被検体に適切な用量で投与することが可能である。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート剤などの安定化剤は、組成物が体内で分解されるのを防ぐことが可能である。
【０１７０】
本明細書で提供するウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージングすることが可能である。キットには、任意選択的に、取扱説明書、デバイス、および追加の試薬などの１つまたは複数の構成要素と、本方法を実行するための、管、容器、およびシリンジなどの構成要素とが含まれ得る。例示的なキットには、本明細書で提供するウイルスが含まれ得、任意選択的に、取扱説明書、被検体のウイルスを検出するためのデバイス、被検体へウイルスを投与するためのデバイス、および、被検体に化合物を投与するためのデバイスが含まれ得る。
【０１７１】
対象遺伝子（典型的には抗原）をコードするポリヌクレオチドを含むキットも、本明細書で企図する。キットには、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも１つのプラスミドと、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターが含まれ得る。一部のキットには、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクター、および、少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターが含有されよう。
【０１７２】
対象配列（典型的には抗原）をコードするウイルスベクターと、任意選択的に、ＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列とを含むキットも、本明細書で企図する。一部のキットでは、キットには、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも１つのプラスミドと、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターが含まれる。
【０１７３】
キットには、また、指示書が含有され得る。指示書には、典型的には、ウイルスと、任意選択的にキットに含まれる他の成分と、ウイルスを投与するための、被検体の適切な状態、適切な投薬量、および適切な投与方法を決定する方法を含む、投与方法とについて記載した具体的な表現が含まれる。指示書には、また、処置期間において、被検体をモニタリングするためのガイダンスが含まれ得る。
【０１７４】
本明細書で提供するキットは、また、ウイルスを被検体に投与するためのデバイスが含まれ得る。薬物またはワクチンを投与するための、当技術分野で既知の種々のデバイスの何れかが、本明細書で提供するキットに含まれ得る。例示的なデバイスとしては、限定するわけではないが、皮下注入針、静脈内注入針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および点眼器などの液体散布器が挙げられる。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスと適合性があろう；例えば、高圧注入デバイスなどの無針注入デバイスは、高圧注入に損傷を受けないウイルスとともにキットに含まれ得るが、典型的には、高圧注入により損傷を受けるウイルスとともにキットに含まれることはない。
【０１７５】
本明細書で提供するキットには、ＤＣ活性化剤または刺激剤などの化合物を被検体に投与するためのデバイスも含まれ得る。被検体に薬物を投与するための、当技術分野で既知の種々のデバイスの何れかが、本明細書で提供するキットに含まれ得る。例示的なデバイスとしては、皮下注入針、静脈内注入針、カテーテル、無針注入デバイスが挙げられ、限定するわけではないが、皮下注入針、静脈内注入針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および点眼器などの液体散布器が挙げられる。典型的には、キットの化合物を投与するためのデバイスは、化合物を投与する所望の方法に適合するだろう。
【０１７６】
以下は、本明細書で企図する、レンチウイルスベクターの実施形態のいくつかと、使用法である。
【０１７７】
実施形態１は、樹状細胞標的化レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、前記粒子は、がんの処置で使用するための、ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含み、前記組成物は、腫瘍内に投与される、組成物である。
【０１７８】
実施形態２は、前記ＩＬ−１２は単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）である、実施形態１に記載の使用組成物である。
【０１７９】
実施形態３は、前記ｓｃＩＬ−１２はｐ３５−Ｌ−ｐ４０を含む、実施形態２に記載の使用組成物である。
【０１８０】
実施形態４は、前記ｓｃＩＬ−１２はｐ４０−Ｌ−ｐ３５を含む、実施形態２に記載の使用組成物である。
【０１８１】
実施形態５は、前記レンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に選択的に結合する修飾アルファウイルスＥ２糖タンパク質を含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８２】
実施形態６は、前記レンチウイルスベクター粒子は、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープを含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８３】
実施形態７は、前記処置は、さらに、アジュバントを腫瘍内に投与することを含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８４】
実施形態８は、前記アジュバントは、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性または水中油型のエマルジョン製剤である、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８５】
実施形態９は、前記レンチウイルスベクター粒子を含む組成物は、さらに、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性製剤を含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８６】
実施形態１０は、前記レンチウイルスベクター粒子は単回投与で投与される、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８７】
実施形態１１は、前記レンチウイルスベクター粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイで測定されるように、最初の４８時間で約０．１μｇ〜１μｇ／１Ｅ１０ベクターゲノム産生というレベルのＩＬ−１２を産生する、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８８】
実施形態１２は、前記処置は、さらに、制御性Ｔ細胞欠乏を含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１８９】
実施形態１３は、前記制御性Ｔ細胞欠乏は、シクロホスファミドまたは抗ＣＤ２５抗体の全身投与を含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１９０】
実施形態１４は、前記シクロホスファミドまたは抗ＣＤ２５抗体の全身投与は、前記レンチウイルスベクターを含む組成物の腫瘍内注入に先行する、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１９１】
実施形態１５は、前記処置は、さらに、腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子を投与することを含む、前記実施形態の何れかに記載の使用組成物である。
【０１９２】
実施形態１６は、（ａ）ＩＬ−１２をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含む、樹状細胞標的化レンチウイルスベクター粒子を含む第１組成物と；（ｂ）腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子を含む第２組成物とを含み、前記第１組成物を腫瘍内に投与し、前記第２組成物を異なる経路で投与する、被検体のがんを処置する方法で使用するための生成物である。
【０１９３】
実施形態１７は、前記第２組成物が皮内、皮下、または筋肉内に投与される、実施形態１６に記載の生成物である。
【０１９４】
実施形態１８は、前記第１組成物と前記第２組成物が同時に投与される、実施形態１６〜１７の何れかに記載の生成物である。
【０１９５】
実施形態１９は、前記第１組成物と前記第２組成物が逐次的に投与される、実施形態１６〜１８の何れかに記載の生成物である。
【０１９６】
実施形態２０は、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ＩＬ−２３をコードする配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子である。
【０１９７】
実施形態２１は、ａ）１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも８０％の同一性を有し、１６０Ｘが欠けているかもしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のそれの変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３を有する融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと；ｂ）ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、レンチウイルスベクター粒子である。
【０１９８】
実施形態２２は、前記ＩＬ−１２が単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）である、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０１９９】
実施形態２３は、前記ｓｃＩＬ−１２がｐ３５−Ｌ−ｐ４０を含む、実施形態２１〜２２の何れか一つに記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０２００】
実施形態２４は、前記ｓｃＩＬ−１２はｐ４０−Ｌ−ｐ３５を含む、実施形態２１〜２３の何れか一つに記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０２０１】
実施形態２５は、前記レンチウイルスベクターゲノムが、さらに、抗原をコードする配列を含む、実施形態２１〜２４の何れか一つに記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０２０２】
実施形態２６は、前記抗原が腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または真菌抗原である、実施形態２１〜２５の何れか一つに記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０２０３】
実施形態２７は、前記腫瘍関連抗原が、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、前立腺特異的膜抗原、ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＧＡＧＥ、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃｒｉｐｔｉｎ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、およびＣ−Ｒａｆ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＭ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、ＡｎｎｅｘｉｎＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｎｏｔｃｈ１−４、ｃ−Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞がん−５Ｔ４、ＳＭ２２−ａｌｐｈａ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転移ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ならびにｆｏｓ関連抗原１からなる群から選択される、実施形態２６に記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０２０４】
実施形態２８は、本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子の何れかを含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含む、被検体のがんを処置する方法である。
【０２０５】
実施形態２９は、腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクターを含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップをさらに含む、実施形態２８に記載の方法である。
【０２０６】
実施形態３０は、実施形態２１を発現する前記レンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを同時に投与する、実施形態２８〜２９に記載の方法である。
【０２０７】
実施形態３１は、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる時点で逐次的に投与する、実施形態２８〜２９の何れか一つに記載の方法である。
【０２０８】
実施形態３２は、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる経路で投与する、実施形態２９に記載の方法である。
【０２０９】
実施形態３３は、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に投与する、実施形態２９に記載の方法である。
【０２１０】
実施形態３４は、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に、同じ経路で投与する、実施形態２９に記載の方法である。
【０２１１】
実施形態３５は、前記レンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与する、実施形態２８に記載の方法である。
【０２１２】
実施形態３６は、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与し、前記第２レンチウイルスベクターを、異なる部位に、異なる経路で、同時に投与する、実施形態２９に記載の方法である。
【０２１３】
実施形態３７は、実施形態２５に記載のレンチウイルスベクター粒子を含む組成物を、有効量で被検体に投与するステップを含む、被検体のがんを処置する方法である。
【０２１４】
実施形態３８は、ＴＬＲ４アゴニストを腫瘍内に投与するステップをさらに含む、実施形態２８に記載の方法である。
【０２１５】
実施形態３９は、前記ＴＬＲ４アゴニストは、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性または水中油型のエマルジョン製剤である、実施形態３８に記載の方法である。
【０２１６】
実施形態４０は、前記レンチウイルスベクター粒子を含む組成物は、さらに、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）の水性製剤を含む、実施形態３５に記載の方法である。
【０２１７】
実施形態４１は、前記レンチウイルスベクター粒子を単回投与で投与する、本明細書に記載の方法の何れか一つである。
【０２１８】
実施形態４２は、前記レンチウイルスベクター粒子は、低レベルのＩＬ−１２を産生する、本明細書に記載の方法の何れか一つである。
【０２１９】
実施形態４３は、前記低レベルのＩＬ−１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの形質導入アッセイで測定されるように、最初の４８時間で約０．１μｇ〜１μｇ／１Ｅ１０ベクターゲノム産生である、本明細書に記載の方法の何れか一つである。
【０２２０】
実施形態４４は、前記レンチウイルスベクター粒子を腫瘍内に投与する、本明細書に記載の方法の何れか一つである。
【０２２１】
実施形態４５は、ヒトまたは動物の被検体の処置法で使用するための、実施形態２１〜２７の何れか一つに記載のレンチウイルスベクター粒子である。
【０２２２】
実施形態４６は、実施形態２１に記載のレンチウイルスベクター粒子と、腫瘍抗原をコードする第２レンチウイルスベクター粒子とを含む、組成物である。
【０２２３】
実施形態４７は、実施形態２５に記載のレンチウイルスベクター粒子と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、治療ワクチンまたは予防ワクチンである。
【０２２４】
以下の例は、例示のために提供するものであり、限定のためではない。
【実施例】
【０２２５】
（実施例１）
ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターの操作
レンチウイルスベクターに、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞を標的させる、修飾シンドビスＥ２エンベロープ糖タンパク質で偽型化したレンチウイルスベクター（例えば、米国特許第８１８７８７２号明細書および同第８３２３６６２号明細書を参照されたい）を操作して、マウスＩＬ−１２（本明細書では、ＶＰ０２／ＩＬ−１２という）を発現させた。ＩＬ−１２は、サブユニット、ｐ３５およびｐ４０に結合した２つのジスルフィドからなる。２つの異なる構築物を、エラスチンリンカーにより連結している両サブユニットを用いて、ただし異なる向きで調製した：ｐ３５−エラスチン−ｐ４０およびｐ４０−エラスチン−ｐ３５（ｐ３５−Ｌ−ｐ４０；ｐ４０−Ｌ−ｐ３５）。最初の実験により、ｐ４０−Ｌ−ｐ３５ベクターがより多くの量のＩＬ−１２を産生することが示された。機能バイオアッセイでは、２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞にＶＰ０２／ＩＬ−１２候補を形質導入し、培養上清を採取した。マウス脾細胞を、上清とともにインキュベーションした。１〜４８時間の経時変化実験において、脾臓培養上清を採取し、分泌ＩＦＮγについて解析した。結果は、ＶＰ０２／ＩＬ−１２候補の両方が機能性ＩＬ−１２を産生することを示した。しかしながら、ｐ４０−Ｌ−ｐ３５候補を、継続研究のために選択した。
【０２２６】
さらなる実験を実行して、ベクターにより産生されるＩＬ−１２の量を定量化した。実験は以下の通りだった：
【０２２７】
・０日目：培地２．５ｍＬを有する６ウェルに、１ｅ６／ウェルで２９３Ｔ−ＤＣＳＩＧＮ細胞を播種
【０２２８】
・１日目：翌日、ＶＰ０２−ｍＩＬ１２（ｐ３５−ｐ４０）およびＶＰ０２−ｍＩＬ１２（ｐ４０−ｐ３５）を遺伝子導入：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用）遺伝子導入のポジティブコントロールとして、ＶＰ０２−ＧＦＰプラスミドを含む。
・１．５μｇのプラスミドを、２５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地に添加
・４．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を加え、混合し、ＲＴで３０分インキュベーションする
・播種細胞に直接添加
【０２２９】
・１日目：ベクターを形質導入、１０μＬ濃縮／ウェル
・ＶＰ０２−ｍＩＬ１２（ｐ３５−エラスチン−ｐ４０）−非組み込み、３．１ｅ１１ゲノム／ｍＬ
・ＶＰ０２−ｍＩＬ１２（ｐ４０−エラスチン−ｐ３５）−非組み込み、５．９ｅ１１ゲノム／ｍＬ
・ＶＰ０２−ＧＦＰ−非組み込み、１．９ｅ１１ゲノム／ｍＬ
【０２３０】
・２日目：培地を新鮮な１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭと交換する、１Ｘ  ＰＢＳ洗浄を含む
【０２３１】
・４日目：上清を採取し４５μＭに通して濾過し、ＥＬＩＳＡまで−８０℃で保存
【０２３２】
ＩＬ−１２は、全ての上清で検出された。プラスミド遺伝子導入は、予想通り、ベクター遺伝子導入よりはるかに高いレベルを有した。ｐ４０−Ｌ−ｐ３５ベクターは、逆向きよりも多いＩＬ−１２を産生した。これらの結果を下の表に示す。
【０２３３】
【表１】
2018537432.tif 000003
【０２３４】
（実施例２）
腫瘍抗原を発現するレンチウイルスベクターと共送達したＶＰ０２／ＩＬ−１２が、腫瘍抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を強化
この実験は、腫瘍抗原を発現するＶＰ０２と、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達が、抗腫瘍抗原ＣＤ８  Ｔ細胞応答を高めることを示す。
【０２３５】
２つの実験を実行して、ＶＰ０２レンチウイルスベクターから発現される腫瘍関連抗原の発現と組み合わさって、ＶＰ０２／ＩＬ−１２レンチウイルスベクターから生成されるＩＬ−１２が存在することが、マウスの抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の応答を高め得るか否かを評価した。
【０２３６】
Ｃ５７／ＢＬ／６またはＢ６Ｄ２／Ｆ１のメスマウスを、尾基底部の皮下で、表１のＶＰ０２／ＩＬ−１２およびＶＰ０２／腫瘍抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＣＡＩＸ）を用いて免疫化した。脾臓のＴ細胞応答を、免疫化の１３日後に、ＣＤ８反応ペプチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激した後に、細胞内サイトカイン染色により、測定した。
【０２３７】
【表２】
2018537432.tif 000004
【０２３８】
図１および図２に示すように、ＮＹ−ＥＳＯ−１（図１）またはｈＣＡＩＸ（図２）を発現するＶＰ０２と共に共送達したＶＰ０２／ＩＬ−１２は、抗原特異的ＣＤ８応答を高めた。
【０２３９】
追加の実験を実行し、ＶＰ０２／ＩＬ−１２により提供される増強をさらに評価した。図３に示すように、ＶＰ０２／ＩＬ−１２とＬＶ３０５（ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するＶＰ０２）の共投与は、ベクターゲノムを比較的高用量（１Ｅ１０ベクターゲノム）で投与した場合、Ａｇ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を高める。しかしながら、この高用量ｖ．ｇ．でさえ、ＩＬ−１２の全発現はまだ極めて低い（例えば、最適な培養条件下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づくと、最初の４８時間で〜０．５マイクログラム未満産生）ことに留意されたい。特に、本実験の１Ｅ９ｖｇで生成される抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原特異的免疫応答は、実質的には検出不能だが、この基本的に検出不能な免疫応答は、予想外にも、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達により著しく高められたことに留意されたい（図３Ｂ）。ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共送達は、また、ＣＤ４応答も高める（図４Ａおよび４Ｂ参照）。
【０２４０】
さらに低用量のＶＰ０２／ＩＬ−１２（１Ｅ９ｖｇ用量）とボーダーラインの免疫原性用量のＬＶ３０５（１Ｅ９ｖｇ）の共投与は、ＣＤ８とＣＤ４の応答を高めた（図５Ａ〜５Ｄ参照）。
【０２４１】
（実施例３）
ＶＰ０２／ＩＬ１２の共投与が、高用量のＶＰ０２／ＨＣＡＩＸの治療活性を強化
この実施例は、腫瘍クローンを発現するＢＣ．１２ｈＣＡＩＸでチャレンジしたマウスに対する、ＶＰ０２／ＩＬ−１２とＶＰ０２／ｈＣＡＩＸの治療効果をテストするために行った実験について記載する。
【０２４２】
マウスの右側腹部の皮下に、ｈＣＡＩＸを発現するＢＣ．１２腫瘍細胞を注入した。治療を８日目に投与した。腫瘍サイズを２〜３日ごとに記録した。基礎的な実験プロトコルを、下の表２および表３に示す。
【０２４３】
【表３−１】
2018537432.tif 000005
【表３−２】
2018537432.tif 000006
【０２４４】
【表４】
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【０２４５】
図６に示すように、ＶＰ０２／ＩＬ１２の共投与は、高用量のＶＰ０２／ｈＣＡＩＸの治療活性を高めたが、差は有意ではなかった。同様に、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共投与は、中用量のＶＰ０２／ｈＣＡＩＸの治療活性を高めたが、差は有意ではなかった。
【０２４６】
（実施例４）
ＶＰ０２／ＩＬ１２の共投与が、低用量のＶＰ０２／ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＬＶ３０５）の治療活性を強化
この実験は、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の共投与が、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する免疫原性用量未満のＶＰ０２（ＬＶ３０５）の治療活性を高めたことを示す。
【０２４７】
この実験では、方法は以下の通りだった：０日目：１．５×１０５のＣＩＮ．２３細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈内にチャレンジ。３日目：ＶＰ０２／ＮＹＥＳＯ１±ＶＰ０２／ｍＩＬ１２を用いて、尾基底部で免疫化。１８日目：リンパ細胞を腫瘍から単離し、脾臓をフローサイトメトリーを介して解析した。
【０２４８】
図７Ａに示すように、低用量のＬＶ３０５により媒介される抗腫瘍効果は、ＶＰ０２／ＩＬ１２と混合することにより著しく高められ、抗腫瘍効力は、ＮＹＥＳＯ１−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の大きさと相関関係にあった（図７Ｂ）。
【０２４９】
実施例１〜４の概要および結果：ＶＰ０２／ＩＬ１２を使用して、抗腫瘍効力の強化を含め、ＶＰ０２に基づく免疫療法に対するＣＤ８とＣＤ４の応答を高めることが可能である。ＣＤ８応答に対する影響は、典型的には、ＬＶ３０５用量の３〜５倍の増加と同等で、ＣＤ４応答の強化については、最大１０倍＋用量と同等である。ＶＰ０２免疫療法（例えば、ＬＶ３０５）がより弱い応答レベルを誘導する場合、ＶＰ０２／ＩＬ１２が、典型的には、最も効果的である。ＬＶ３０５については、本明細書に記載するマウスモデルでは、このような応答は、典型的には、１Ｅ９〜１Ｅ１０ｖｇ用量範囲で誘導される。ＶＰ０２／ＩＬ１２の効果は、低用量で用いた場合、より低い。特に、１Ｅ１０ｖｇ未満の用量のＩＬ−１２が、ＣＤ８応答について免疫強化効果を引き起こすのは、ほんの時たまだった。ＶＰ０２／ＩＬ１２は、典型的には、ＶＰ０２／Ａｇと同じ（またはより高い）用量で用いた場合に効果的であり、これは、ＶＰ０２／ＩＬ１２が、免疫応答が望まれる腫瘍抗原として同一ベクターから効果的に発現され得ることを示唆する。
【０２５０】
（実施例５）
他のサイトカインを発現するＶＰ０２の投与
【０２５１】
ＶＰ０２から発現する７個の異なるサイトカインの一連を、腫瘍特異的抗原特異的免疫応答を高める機能についてテストした。
【０２５２】
テストしたサイトカインは、ＶＰ０２／ＩＬ−１５、ＶＰ０２／ＩＬ−１８、ＶＰ０２／ＩＬ−２１、ＶＰ０２／ＩＬ−２３、ＶＰ０２／ＩＬ−１β、ＶＰ０２／ＩＬ−ＴＮＦ、ＶＰ０２／ＩＬ−ＩＦＮγだった。ＢＡＬＢ／ｃマウスを２度、３週間空けて、３つの投薬量レベルのＬＶ３０５（高（ｈｉ）、中（ｍｅｄ）、低（ｌｏ））と、一定用量のＶＰ０２／ＩＬ−Ｘ（ｈｉ）で免疫化した。１４日目に、Ｔ細胞応答を、末梢血において予備刺激後に測定した（中用量のみ）。追加免疫後３３日目に、リンパ細胞を、ＩＣＳとフローサイトメトリーによる解析のために脾臓から単離した。
【０２５３】
テストしたサイトカインのうち、ＶＰ０２／ＩＬ−２３は、予備刺激後のＰＢＭＣにおいて、ＬＶ３０５誘導ＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく高めることができた（図８参照）。
【０２５４】
（実施例６）
ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターの単回腫瘍内投与が、テストした６匹のマウス腫瘍モデルのうち６匹で、著しい抗腫瘍効果をもたらした
この実施例は、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターの腫瘍内注入が、テストした６匹のマウス腫瘍モデルのうち６匹において、著しく効果的だったことを示す。
【０２５５】
腫瘍内ＬＶ／ＩＬ−１２投与を、以下で概説する方法を使用して、６匹の異なるマウス腫瘍モデルにおいてテストした。
【０２５６】
方法
０日目：マウスに腫瘍細胞を接種する。７日目：マウスを、修飾シンドビスエンベロープで偽型化した、ＩＬ−１２を発現するＬＶ（ＬＶ７０３−組み込み型：７０４−組み込み欠損型、ＶＰ０２ともいう）または修飾シンドビスエンベロープの代わりにＶＳＶＧで偽型化したＬＶ／ＩＬ−１２（組み込み欠損）を用いて免疫化する。腫瘍が＞１００ｍｍ２（足蹠）または＞２００ｍｍ２（側腹部）に達した際に、マウスを殺処分した。
【０２５７】
マウスを、腫瘍増殖と生存について、６週間＋の間、監視した。
【０２５８】
図９〜１４に示すように、ＬＶ／ＩＬ−１２は、テストした腫瘍モデルの６匹全てにおいて、処置動物での腫瘍増殖を低減させ、生存率を上げるのに非常に効果的だった。７０３／ｍＩＬ−１２レンチウイルスベクター、修飾シンドビスＥ２糖タンパク質で偽型化した組み込みレンチウイルスベクターは、全ての腫瘍モデルにおいて最良の抗腫瘍効果を達成した。７０３ベクターほど有効ではないが、組み込み欠損ベクター（７０４／ｍＩＬ―１２（ＶＰ０２／ＩＬ−１２ともいう）およびＶＳＶＧ／ｍＩＬ−１２）も、腫瘍増殖を遅らせ、生存率を上げるのに効果的だった。
【０２５９】
追加の実験を実行して、上記の腫瘍内注入実験で使用する、ベクターにより形質導入した２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞から得られた上清におけるＩＬ−１２レベルを求めた。組み込み型ベクターおよび非組み込み型ベクターの両方を、ネビラピンの存在下または不在下で、形質導入の４８時間後のＩＬ−１２の産生についてテストした。特に、０日目に、１Ｅ６の２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、６ウェルプレートのｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＭＥＭ２ｍＬに蒔いた。１日目に、細胞に、ネビラピンの不在下および存在下で、８．５Ｅ９のベクターゲノムを用いて形質導入した。形質導入は、６００μＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＭＥＭ±ネビラピン中で実行し、次に、０．９ｍＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＭＥＭ±ネビラピンを６時間後に添加した。３日目（形質導入の４８時間後）に、上清を０．４５μｍフィルタに通して濾過した。標準ＥＬＩＳＡを、商業的に入手可能なキットＲ＆Ｄ  ｋｉｔ  Ｍ１２７０）を使用して実行した。結果を下の表に示す。括弧内の数は、ネビラピンの存在下で測定したＩＬ−１２を示す。
【０２６０】
【表５】
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【０２６１】
比較研究は行っていないが、より短い期間でより高いレベルのＩＬ−１２を発現する急性ウイルス科に基づいたベクターと比較し、より長い期間にわたる比較的低い発現は、上記の実験で観察される驚くべき有効性の一因となり得、また、安全性プロファイルにとっても有利であった。さらに、エレクトロポレーションまたは他の両種指向性ウイルスによる任意の腫瘍細胞への無作為の注入とは対照的に、ＩＬ−１２を生理学的に産生すると最もよく知られた細胞である樹状細胞でのＩＬ１２の発現を特異的に標的化することは、予想外に効果的な抗腫瘍応答の一因となり得る。
【０２６２】
（実施例７）
抗ＣＴＬＡ−４抗体および／またはＧＬＡ−ＡＦと組み合わせた、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターの単回腫瘍内投与が、テストした３匹のマウス腫瘍モデルのうち３匹で、著しい抗腫瘍効果をもたらした
【０２６３】
この実施例は、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／またはＧＬＡ−ＡＦ／ＳＥと組み合わせた、ＩＬ−１２を発現するレンチウイルスベクターの単回腫瘍内注入が、テストした３匹のマウス腫瘍モデルのうち３匹で、著しく効果的だったことを示す。
【０２６４】
抗ＣＴＬＡ−４抗体および／またはＧＬＡ−ＡＦ／ＳＥと組み合わせた、腫瘍内ＬＶ／ＩＬ−１２投与を、以下で概説する方法を使用して、３匹の異なるマウス腫瘍モデルにおいてテストした。
【０２６５】
方法
０日目；マウスに腫瘍細胞を接種する（右側）。７日目：マウスに腫瘍細胞を接種する（左側）。マウスを、抗ＣＴＬＡ−４またはＧＬＡを含んでまたは含まないで、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２（マウス毎に調製した、７０３−組み込み型；１．３Ｅ１０ゲノム；５．４ｎｇのｒＩＬ１２）またはＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔ（マウス毎に調製した、７０３−組み込み型；活性を除去するために突然変異させた逆転写酵素；９．８Ｅ９ゲノム；５．４ｎｇのｒＩＬ１２）を用いて免疫化する。抗ＣＴＬＡ−４を、研究の終わりまで、一週間に一度投与した。ＧＬＡを受けたマウスでは、第１のＧＬＡ投与量（７日目に与えられた）はＧＬＡ−ＡＦで、ベクターと混合し、その後腫瘍内に投与した。次のＧＬＡ投与量はＧＬＡ−ＳＥで、研究の終わりまで、一週間に一度投与した。腫瘍が＞１００ｍｍ２（足蹠）または＞２００ｍｍ２（側腹部）に達した際に、マウスを殺処分した。
【０２６６】
マウスを、腫瘍増殖と生存率について、６週間＋の間、監視した。
【０２６７】
図１７〜２９に示すように、７０３／ＩＬ−１２のみが、テストした腫瘍モデルの３匹全てにおいて、処置動物における腫瘍増殖を低減させ、生存率を上げるのに非常に効果的で、実施例６に示す結果を確証させた。この治療的利点は、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２／ＲＴｍｕｔを用いて処置したマウスにおける腫瘍増殖が、非処置腫瘍担持マウスと類似していたことから、無傷の逆転写酵素を有するベクター粒子の存在により引き起こされた。テストした各腫瘍モデルにおける追加の観察について、以下のように詳述する。
【０２６８】
Ｂ１６足蹠モデルでは（図１７）、原発腫瘍（右側）におけるＬＶ７０３／ＩＬ−１２の腫瘍内投与が、未処置の遠位部位（左側）において腫瘍増殖を著しく遅らせたが、これはアブスコパル効果として知られる現象である。抗ＣＴＬＡ−４抗体の追加は、さらに、原発腫瘍の増殖を遅らせたが、遠位腫瘍ではなかった。
【０２６９】
Ｂ１６側腹部モデルでは（図１８）、原発腫瘍におけるＬＶ７０３／ＩＬ−１２の腫瘍内投与が、未処置の遠位部位において腫瘍増殖を著しく遅らせた。抗ＣＴＬＡ−４抗体の追加は、原発腫瘍の増殖をさらに遅らせることはなかったが（おそらく、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２のみが、ほぼすべての腫瘍増殖を抑制するのに成功したため）、遠位腫瘍の増殖はさらに遅らせた（図１８Ｂ参照）。このモデルでは、ＬＶ７０３／ＩＬ−１２の単回腫瘍内注入が、原発腫瘍の退縮を引き起こし、未処置の二次腫瘍の増殖を遅らせた。腫瘍が退縮したマウスは、第２腫瘍チャレンジに拒絶反応を示さなかったが、これは、免疫記憶の次善生成を示唆する。
【０２７０】
４Ｔ１乳房腫瘍モデルでは（図１９）、上記のように、原発腫瘍におけるＬＶ７０３／ＩＬ−１２の腫瘍内投与が、原発腫瘍の増殖を著しく遅らせた。ＧＬＡ−ＳＥの追加の腫瘍内投与が、原発腫瘍の増殖をさらに遅らせた（図１９Ａ）。原発腫瘍におけるＬＶ７０３／ＩＬ−１２＋ＧＬＡ−ＳＥの腫瘍内投与も、未処置の遠位部位において腫瘍増殖の遅れをもたらした（図１９Ｃ）。ＬＶ７０３／ＩＬ−１２＋ＧＬＡ−ＳＥへの抗ＣＴＬＡ−４抗体の追加は、原発腫瘍の増殖も遠位腫瘍の増殖もさらに遅らせることはなかった（おそらく、４Ｔ１が攻撃的な浸潤性腫瘍モデルであり、動物は、肺への腫瘍の広がりによる窒息で死亡したためである；図１９Ｂおよび１９Ｃ参照；）。動物の生存率を、表４に要約する。
【０２７１】
【表６】
2018537432.tif 000009
【０２７２】
したがって、上記の実施例は、免疫療法の恩恵を受けるがんおよび他の疾患の処置のための、ＬＶ／ＩＬ−１２のみまたはチェックポイント阻害剤および／もしくはＴＬＲ４アゴニストと組み合わせたＬＶ／ＩＬ−１２の使用を裏付ける。
【０２７３】
（実施例８）
組み換えタンパク質およびＧＬＡ／ＳＥと共に共投与した場合、ＶＰ０２／ＩＬ−１２は、抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を著しく増大させた
この実施例の実験は、ＶＰ０２／ＩＬ−１２と、組み換えタンパク質＋ＧＬＡ／ＳＥ、合成脂質Ａ  ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとの共投与の免疫原性を評価するために行った。
【０２７４】
Ｂ６Ｄ２／Ｆ１メスマウスを、ＧＬＡ／ＳＥを含んでまたは含まないで、ＶＰ０２／ＩＬ−１２および組み換えＮＹ−ＥＳＯ−１（ｒＮＹ−ＥＳＯ−１）を尾基底部に皮下注射して免疫化した（表５参照）。ＣＤ４およびＣＤ８の反応ペプチドを用いたｅｘ  ｖｉｖｏでの再刺激後の、ＩＣＳによる免疫化の７日後に、膵臓Ｔ細胞応答を測定した。
【０２７５】
【表７】
2018537432.tif 000010
【０２７６】
結果を図１５に示す。予想通り、ＧＬＡ−ＳＥを有する組換えタンパク質が、ＴＨ１  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導した。図１５Ａは、サイトカイン陽性ＣＤ４  Ｔ細胞率を示し、図１５Ｂは、総ＩＦＮγ  ＣＤ４陽性Ｔ細胞率を示す。結果は、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加が、ｒＮＹ−ＥＳＯ−１＋ＧＬＡ−ＳＥと一緒に混ぜて、尾基底部に皮下に共投与した場合に、ＮＹ−ＥＳＯ−１  Ａｇ−特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を著しく増大させたことを示す。
【０２７７】
ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせて組み換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）を使用する別の実験では、ＶＰ０２／ＩＬ−１２の添加が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を著しく増大させたが（図１６Ａおよび１６Ｂ）、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は低減させた（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。
【０２７８】
ＣＤ４応答レベルの低下または少なくとも上昇の欠如は、ＶＰ０２／ＩＬ１２での、ＶＰ０２発現抗原に対する応答の高まりで見られる効果と比較し、目立つ。可能性のある説明は、抗原発現ＶＰ０２は、抗ＣＤ４応答だけを誘導するわけではない一方、組み換えタンパク質抗原を有するＧＬＡは、著しいＣＤ４レベルを誘導するということである。そのため、ＩＬ１２の添加は、ＣＤ４誘導に追加の刺激を提供することができない。
【０２７９】
（実施例９）
腫瘍内ＬＶ／ＩＬ−１２で処置したマウスの血液中でＩＬ−１２およびＩＦＮγが検出された
本実施例における実験は、ＬＶ／ＩＬ１２の腫瘍内注入後の、ＩＬ−１２およびＩＦＮγの血漿レベルおよび動態学を評価するために行った。
【０２８０】
マウス（６メス／群）に、１×１０５のＢ１６腫瘍細胞を接種した。腫瘍が触知できるようになった際に（７日目）、マウスをＬＶ７０３／ｍＩＬ１２を用いて、ＩＴで免疫化した。０日目（プレブリード）、１日目、３日目、６日目、８日目、１２日目、１５日目、１７日目、および２０日目に採血して、血漿中に存在するＩＬ−１２とＩＦＮγの量を測定した。腫瘍増殖を、１週間で２〜３回監視した。腫瘍領域が２００ｍｍ２（側腹部）を超えた際に、マウスを殺処分した。図２０に示すように、腫瘍内にＬＶ７０３／ｍＩＬ１２を注入したマウスの血液では、ＩＬ−１２とＩＦＮγの増加が検出された。
【０２８１】
（実施例１０）
腫瘍内ＬＶ／ＩＬ−１２で処置したマウスにおける細胞欠乏研究
どの細胞が、腫瘍内ＬＶ／ＩＬ−１２で処置したマウスにおいて抗腫瘍効果を担うかを調べるために、本実施例での実験を行った。
【０２８２】
方法
マウス（１０〜２０メス／群）に、１×１０５のＢ１６腫瘍細胞を接種した。抗体（２００μｇ）を有する特異的な免疫細胞サブセットの欠乏を４日目に開始し、１週間に二度続けた。腫瘍が触知できるようになった際に（７日目）、マウスをＬＶ７０３／ｍＩＬ１２を用いて、ＩＴで免疫化した。腫瘍増殖を、１週間で２〜３回監視した。腫瘍領域が２００ｍｍ２（側腹部）を超えた際に、マウスを殺処分した。
【０２８３】
図２１に示すように、先の実験で確認されたように、ＬＶ７０３／ＩＬ１２の単回腫瘍内注入が、腫瘍の退縮を引き起こした。単一免疫細胞サブセットの欠乏は、ｉ．ｔ．ＬＶ／ＩＬ１２により誘導される抗腫瘍効果を阻害しなかった。特に、図２１Ａおよび２１Ｂを参照されたい。加えて、ＣＤ４およびＮＫ細胞の両方の欠乏は、ｉ．ｔ．ＬＶ／ＩＬ１２により誘導される抗腫瘍効果を阻害しなかった。ＣＤ８  Ｔ細胞の欠乏は、ｉ．ｔ．ＬＶ７０３／ＩＬ１２を注入したマウスにおける抗腫瘍制御を媒介するには、これらの細胞は必要ではあるが、十分ではないことを示した。（例えば、ＣＤ８細胞のみの欠乏は抗腫瘍効果を阻害しないが、ＣＤ４細胞、ＮＫ細胞、または両方の欠乏と組み合わさった場合、腫瘍制御は阻害された、図２１を参照されたい）。
【０２８４】
この実験の９８日目に、残った全部で４１匹のマウスのうち、８匹のマウスには腫瘍があり；３３匹のマウスには腫瘍がなく、ＬＶ／ＩＬ１２を用いた腫瘍内処置の予想外の効果がさらに確認された。
【０２８５】
興味深いことに、ＬＶ／ＩＬ１２を腫瘍内注入し、ＣＤ４  Ｔ細胞を欠乏させたマウスでは、重度の白斑が観察された（図２１Ｂおよび２１Ｅ参照）。この結果は、ＣＤ８  Ｔ細胞が存在する場合にのみ観察され、これは、ｉ．ｔ．ＬＶ７０３／ＩＬ−１２が、メラノサイトを標的化するエフェクターＣＤ８  Ｔ細胞のサブセットを少なくとも生成し、毛皮の色の脱色素（白斑）を引き起こしたことを示唆する。白斑は、メラノーマ特異的抗腫瘍効果の強い誘導の結果として、一般に観察される自己免疫性疾患の発症である。さらに、白斑は、ＣＤ４  Ｔ細胞が欠乏した、ｉ．ｔ．ＬＶ７０３／ＩＬ−１２処置マウスでのみ観察され、制御性Ｔ細胞の除去は、さらに、ｉ．ｔ．ＬＶ７０３／ＩＬ−１２療法を改善し得る。
【０２８６】
要約すると、ＬＶ／ｍＩＬ１２の局所的（腫瘍内）投与は、全身性ＣＤ８  Ｔ細胞媒介抗腫瘍応答を促進させる（冷たい腫瘍を熱くする）。理論に縛られることを望むものではないが、免疫記憶の最適な発達のために、制御性Ｔ細胞は、欠乏させる必要がある場合がある。
【０２８７】
（実施例１１）
腫瘍内ＬＶ／ＩＬ−１２で処置したマウスにおける、制御性Ｔ細胞欠乏研究
【０２８８】
制御性Ｔ細胞欠乏と腫瘍内ＩＬ−１２投与の組み合わせの治療的効果を調べるために、実験を行った。
【０２８９】
方法
マウス（１０〜２０メス／群）に、１×１０５のＢ１６腫瘍細胞を接種した。低用量シクロホスファミド、抗ＣＤ２５もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体（２００μｇ）、または、ジフテリア毒素を用いた制御性Ｔ細胞の欠乏（以下参照）を４日目に開始し、１週間に二度続けた。腫瘍が触知できるようになった際に（７日目）、マウを、ＬＶ７０３／ｍＩＬ１２を用いて、腫瘍内で免疫化した。腫瘍増殖を、１週間で２〜３回監視した。腫瘍領域が２００ｍｍ２（側腹部）を超えた際に、マウスを殺処分する。
【０２９０】
制御性Ｔ細胞も、遺伝子導入マウス（例えば、ＤＥＲＥＧまたはＦｏｘｐ３．ＬｕｃｉＤＴＲマウス）を使用して、欠乏させた。これらのマウスは、Ｆｏｘｐ３プロモーターの制御下で、ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）導入遺伝子を担持することにより、任意の時点でのジフテリア毒素の投与による制御性Ｔ細胞の特異的欠乏が可能である（例えば、Li et al., Eur J Immunol 2010, 40: 3325-3335を参照されたい）。
【０２９１】
理論に縛られることを望むものではないが、制御性Ｔ細胞の欠乏は、さらに、ｉ．ｔ．ＬＶ７０３／ＩＬ−１２療法を改善する。免疫記憶細胞を測定して、制御性Ｔ細胞欠乏治療を受けていない群と比較した、免疫記憶表現型細胞の増加を確認することができる。さらなる実験を、腫瘍が退縮したマウスに再チャレンジして、治療が再チャレンジ後の腫瘍増殖を阻害するのに十分か否かを確認するために行った。
【０２９２】
配列表に開示する配列は、国際公開第２０１１０１１５８４号でも提供される：
【表８】
2018537432.tif 000011
【０２９３】
本明細書および添付の請求項において、文脈上明らかに別の指示をしている場合を除き、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は複数の当該抗原を含み、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」または「細胞（ｔｈｅ  ｃｅｌｌ）」への言及は、１つまたは複数の細胞および当業者にとって既知その同等物（例えば複数の細胞）等への言及を含む。同様に、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、複数の当該化合物または組成物を含み、文脈上明らかに別の指示をしている場合を除き、それぞれ、１つまたは複数の化合物または組成物を指す。ある方法のステップが記載または特許請求され、そのステップが特定の順序で生じるように記載されている場合、第１のステップが第２のステップより「先」（すなわち、前）に生じる（または実行される）という記載は、第２のステップが第１のステップの「後」に生じる（または実行される）と述べるように書き換えられた場合、同じ意味を有する。数字または数値範囲に言及する際の「約」という用語は、言及している数字または数値範囲が実験上のばらつきの範囲内（または統計的実験誤差の範囲内）の近似値であることを意味し、したがって、数字または数値範囲は、記載されている数字または数値範囲の１％〜１５％の間で変動し得る。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の関連用語）は、他のある実施形態、例えば、本明細書に記載の物質組成、組成物、方法、またはプロセス等の実施形態が、記載されている特性「からなる」、または「本質的になる」ことがあり得ることを除外することは意図されていない。
【０２９４】
上記の種々の実施形態を組み合わせることにより、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照され、および／または出願データシートに列記されているすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許文献、および受入番号により言及される配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様を、必要に応じて、種々の特許、出願、および文献の概念を利用するように修正して、さらなる実施形態を提供することが可能である。
【０２９５】
上記の詳細な説明を鑑みて、これらのおよび他の変更を実施形態に加えることができる。概して、下記の請求項において使用する用語は、請求項を、本明細書および請求項で開示する特定の実施形態に限定するものと解釈するのでなく、当該請求項の権利対象と等価な全範囲にわたって可能なすべての実施形態を含めるものと解釈すべきである。したがって、請求項は本開示に制限されない。
【図１】
2018537432.tif 000012
【図２】
2018537432.tif 000013
【図３Ａ】
2018537432.tif 000014
【図３Ｂ】
2018537432.tif 000015
【図４Ａ】
2018537432.tif 000016
【図４Ｂ】
2018537432.tif 000017
【図５Ａ】
2018537432.tif 000018
【図５Ｂ】
2018537432.tif 000019
【図５Ｃ】
2018537432.tif 000020
【図５Ｄ】
2018537432.tif 000021
【図６】
2018537432.tif 000022
【図７】
2018537432.tif 000023
【図８】
2018537432.tif 000024
【図９】
2018537432.tif 000025
【図１０】
2018537432.tif 000026
【図１１】
2018537432.tif 000027
【図１２】
2018537432.tif 000028
【図１３】
2018537432.tif 000029
【図１４】
2018537432.tif 000030
【図１５Ａ】
2018537432.tif 000031
【図１５Ｂ】
2018537432.tif 000032
【図１６−１】
2018537432.tif 000033
【図１６−２】
2018537432.tif 000034
【図１７】
2018537432.tif 000035
【図１８】
2018537432.tif 000036
【図１９−１】
2018537432.tif 000037
【図１９−２】
2018537432.tif 000038
【図２０】
2018537432.tif 000039
【図２１−１】
2018537432.tif 000040
【図２１−２】
2018537432.tif 000041
【図２１−３】
2018537432.tif 000042
【配列表】
2018537432000001.app
【国際調査報告】
2018537432.tif 000043
2018537432.tif 000044
2018537432.tif 000045
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