(57)【要約】本技術は部分的に、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させ、拡大するための方法および組成物に関する。本明細書のある特定の態様では、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、ｉ）集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
【請求項２】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
【請求項３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
【請求項４】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記シグナル伝達阻害剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【請求項７】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【請求項８】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【請求項９】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【請求項１０】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、請求項１および６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、請求項１および６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記元になる上皮細胞集団が、分化上皮細胞を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および／または前静止上皮細胞を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記元になる上皮細胞集団が、分化系列決定上皮細胞を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記元になる上皮細胞集団および／または前記拡大された上皮細胞集団が、胚性幹細胞を含有しない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する１つまたは複数の分子を含む、請求項１および６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと相互作用する１つまたは複数の分子を含む、請求項１および６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、請求項１および６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、請求項２から５および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化９】
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［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項１および１０から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項１、２、３、および１０から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、請求項６から９および３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記拡大培養条件が、前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項１、６、８、および１０から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、請求項７、９、および４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを各々、マイクロモル未満の濃度で使用する、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記拡大培養条件が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項１、２、３、および１０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記拡大培養条件が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項１、２、３、および１０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記規定されたゼノフリー基本培地が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記規定されたゼノフリー基本培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、請求項１、２、３、および１０から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、請求項６から９および５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記拡大培養条件が、異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、３０回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、５０回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、８０回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、１００回またはこれを超える集団倍加が可能である、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記元になる上皮細胞集団が、基底上皮細胞を含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記元になる上皮細胞集団および／または前記拡大された上皮細胞集団が、１つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
連続的に増殖する上皮幹細胞、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団を選択するステップを含まない、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記元になる上皮細胞集団が、連続的に増殖する上皮幹細胞を含まず、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団に由来する細胞を含まない、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団。
【請求項６６】
遺伝子改変細胞を作製するための、請求項６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【請求項６７】
対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するための、請求項６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【請求項６８】
対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、請求項６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【請求項６９】
対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、請求項６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【請求項７０】
ｉ）培養された上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７１】
ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７２】
ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７３】
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７４】
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７５】
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７６】
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項７７】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する１つまたは複数の分子を含む、請求項７０および７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと相互作用する１つまたは複数の分子を含む、請求項７０および７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、請求項７０および７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、請求項７１、７２、または７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、請求項８０または８１に記載の組成物。
【請求項８３】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化１０】
2018532389.tif 000025
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、請求項８０から８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、請求項８０から８３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８６】
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項８５または８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項７０および７７から８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、請求項８９または９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、請求項８９から９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
前記１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、請求項８９から９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
前記１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
前記１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項７０、７１、７２、および７３から９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１００】
細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、請求項７３から７６および９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項７０、７３、７５、および７７から１０１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０３】
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、請求項７４、７６、および１０２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、請求項７２に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、請求項１０３または１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが各々、マイクロモル未満の濃度で存在する、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項７０、７１、７２、および７７から１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項７０、７１、７２、および７７から１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記規定されたゼノフリー基本培地が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記規定されたゼノフリー基本培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、請求項７０、７１、７２、および７７から１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、請求項７３から７６および１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、請求項７０から１１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
本特許出願は、２０１５年９月１１日に出願され、「ＥＸ  ＶＩＶＯ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬＳ」との名称であり、Ｃｈｅｎｇｋａｎｇ  Ｚｈａｎｇを発明者とし、管理番号ＰＰＧ−２００１−ＰＶ２として指定された米国仮特許出願第６２／２１７，４０６の利益を主張する。本特許出願はまた、２０１６年２月１２日に出願され、「ＥＸ  ＶＩＶＯ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬＳ」との名称であり、Ｃｈｅｎｇｋａｎｇ  Ｚｈａｎｇを発明者とし、管理番号ＰＰＧ−２００１−ＰＶ３として指定された米国仮特許出願第６２／２９４，８９６の利益を主張する。本特許出願はまた、２０１６年３月３１日に出願され、「ＥＸ  ＶＩＶＯ  ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬＳ」との名称であり、Ｃｈｅｎｇｋａｎｇ  Ｚｈａｎｇを発明者とし、管理番号ＰＰＧ−２００２−ＰＶとして指定された米国仮特許出願第６２／３１６，４３８の利益を主張する。前述の出願の内容全体は、全てのテキスト、表および図面を含め、全ての目的について、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年９月６日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＰＧ−２００２−ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１２，１３４バイトのサイズである。
【０００３】
本技術は部分的に、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させ、拡大するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
肺、腎臓、肝臓、膵臓、および皮膚などの臓器は、とりわけ、臓器特異的上皮細胞の存在により特徴付けることができる。上皮細胞は、このような各臓器の１つまたは複数の特異的機能により規定することができる。特異的機能は、例えば、肺におけるガス交換、腎臓における濾過、肝臓における解毒および抱合、膵島細胞におけるインスリンの産生、または皮膚による、環境内の危険な条件に対する保護を含みうる。変性または喪失した臓器構造は、容易に置き換えられないため、かつ１つの臓器の特化した細胞は一般に、別の臓器の機能を引き継ぐことができないため、このような臓器の疾患または変性は、消耗性または致死性であることが多い。
【０００５】
ある特定の種類の上皮細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける回復および／または再生が難しい場合があり、それらの体内の状況から取り出されると、維持が困難でありうる。ある特定の種類の上皮細胞（例えば、対象から採取された臓器特異的上皮細胞、多能性幹細胞および／または分化上皮細胞に由来する分化系列決定上皮細胞）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖および拡大が困難である場合があり、培養物中の寿命が非常に制限されることが典型的である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける上皮細胞について研究するには、ウイルスまたは細胞のがん遺伝子の挿入など、遺伝子操作の形態は、細胞が、数回を超える継代にわたり存続することを可能とするように要求されることが多い。しかし、これらの遺伝子操作は、これらの細胞が、正常上皮細胞に相似したり、正常上皮細胞と同様に機能したりできなくなるように、細胞の遺伝子バックグラウンドおよび生理学を変化させる。さらに、これらの遺伝子改変細胞は、動物への植込みのための候補細胞とはならない。
【０００６】
上皮細胞（例えば、対象から採取された細胞、幹細胞に由来する細胞）を、細胞の遺伝子変更を伴わずに、長期間培養および拡大する方法は、研究適用、オーダーメード医療適用、および移植を含む、様々な目的のために有用でありうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書のある特定の態様では、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、ｉ）集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、方法が提供される。
【０００８】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、方法も提供される。
【０００９】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、方法も提供される。
【００１０】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、方法も提供される。
【００１１】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、方法も提供される。
【００１２】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、方法も提供される。
【００１３】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップを含み、拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、方法も提供される。
【００１４】
本明細書のある特定の態様では、ｉ）培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物が提供される。
【００１５】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物も提供される。
【００１６】
本明細書のある特定の態様ではまた、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物も提供される。
【００１７】
本明細書のある特定の態様ではまた、規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物も提供される。
【００１８】
本明細書のある特定の態様ではまた、規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物も提供される。
【００１９】
本明細書のある特定の態様ではまた、規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物も提供される。
【００２０】
本明細書のある特定の態様ではまた、規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物も提供される。
【００２１】
以下の記載、実施例、特許請求の範囲、および図面では、ある特定の実施形態についてさらに記載する。
【００２２】
図面は、本技術のある特定の実施形態を例示するものであり、限定的なものではない。例示の明確さおよび容易さのために、図面は、原寸に比例しては作成せず、場合によって、特定の実施形態の理解を容易とするように、多様な態様を、誇張または拡大して示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、通常の培養培地中（すなわち、対照培養条件）における、前立腺上皮細胞の成長を示す。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。ＰＤ：集団倍加。
【００２４】
【図２】図２は、通常の培養培地中（すなわち、対照培養条件）における、気管支上皮細胞の成長を示す。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。ＰＤ：集団倍加。
【００２５】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺がん細胞株である、ＬＮＣａＰ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。ｎ．ｄ．：検出なし。ｐ：継代。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺がん細胞株である、ＬＮＣａＰ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。ｎ．ｄ．：検出なし。ｐ：継代。
【００２６】
【図４】図４は、上皮細胞内の上皮幹細胞マーカーであるＬＧＲ５の発現の欠如を示す。Ｌｇｒ５ポリクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ、ＬＳ−Ａ１２３５）を、１：５０の希釈率で使用した。ＴＰ６３モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２５２６８）を、１：５０の希釈率で使用した。ＤＡＰＩ：ＤＮＡ蛍光色素である、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【００２７】
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、気管支上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺がん細胞株である、ＬＮＣａＰ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ｎ．ｄ．：検出なし。ｐ：継代。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、気管支上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ｈＴＥＲＴ：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺がん細胞株である、ＬＮＣａＰ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ｎ．ｄ．：検出なし。ｐ：継代。
【００２８】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、前立腺上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を示す。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ｈＴＥＲＴ：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺がん細胞株である、ＬＮＣａＰ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ｊ２：３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ｎ．ｄ．：検出なし。ｐ：継代。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、前立腺上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を示す。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ｈＴＥＲＴ：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。ＬＮＣａＰ：ヒト前立腺がん細胞株である、ＬＮＣａＰ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ｊ２：３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ｎ．ｄ．：検出なし。ｐ：継代。
【００２９】
【図７】図７は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１の存在下における、ＫＳＦＭ中、通常の組織培養表面上の前立腺上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。
【００３０】
【図８】図８は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１の存在下における、ＫＳＦＭ中、通常の組織培養表面上の気管支上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。
【００３１】
【図９】図９は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の存在下における、ＫＳＦＭ中、通常の組織培養表面上の前立腺上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３２】
【図１０】図１０は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の存在下における、ＫＳＦＭ中、通常の組織培養表面上の気管支上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３３】
【図１１】図１１は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の存在下における、ＫＳＦＭ中、コラーゲンＩでコーティングされた組織培養表面上の前立腺上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３４】
【図１２】図１２は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の存在下における、ＫＳＦＭ中、コラーゲンＩでコーティングされた組織培養表面上の気管支上皮細胞のプレーティング効率を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３５】
【図１３】図１３は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の存在下における、ＫＳＦＭ中の継代後期の前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の細胞老化を示す。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３６】
【図１４】図１４は、前立腺上皮細胞の成長を示す。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＰｒＥＧＭ：Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３７】
【図１５】図１５は、気管支上皮細胞の成長を示す。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００３８】
【図１６】図１６は、多様な化合物（５μＭ：黒色バー；１μＭ：網目バー；および０．２μＭ：白色バー）の存在下における、前立腺上皮細胞の成長を示す。対照は、化合物を伴わないＫＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））である。
【００３９】
【図１７】図１７は、多様な化合物（５μＭ：黒色バー；１μＭ：網目バー；および０．２μＭ：白色バー）の存在下における、前立腺上皮細胞の成長を示す。対照は、化合物を伴わないＫＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））である。
【００４０】
【図１８】図１８は、ＫＳＦＭおよびＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙの存在下における、ヒト包皮角化細胞の成長を示す。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００４１】
【図１９】図１９は、ＫＳＦＭおよびＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙの存在下における、前立腺上皮細胞の成長を示す。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００４２】
【図２０】図２０は、ＫＳＦＭおよびＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙの存在下における、気管支上皮細胞の成長を示す。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００４３】
【図２１】図２１は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された多様な上皮細胞の継代早期および継代後期における、核型解析の結果を示す。左下パネルは、継代早期（ｐ３）におけるＨＦＫ細胞の代表的な中期染色体スプレッドを示す。右下パネルは、継代後期（ｐ１９）におけるＨＦＫ細胞の代表的な中期染色体スプレッドを示す。ＨＦＫ：ヒト包皮角化細胞。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。
【００４４】
【図２２】図２２は、多様な集団倍加における、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された包皮角化細胞内の平均相対テロメア長を示す。定量的ＰＣＲを使用して、相対テロメア長を、テロメアリピート（Ｔ）と単一のコピー遺伝子（Ｓ）との比（Ｔ／Ｓ比）として表す。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。
【００４５】
【図２３】図２３は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を伴うＫＳＦＭ中の、トランスジェニックの核局在化赤色蛍光タンパク質（ｎＲＦＰ）発現上皮細胞株の成長を示す。ＨＦＫ：ヒト包皮角化細胞。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ｎＲＦＰ：核局在化赤色蛍光タンパク質。
【００４６】
【図２４】図２４は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を伴うＫＳＦＭ中で成長させた、トランスジェニックの核局在化赤色蛍光タンパク質（ｎＲＦＰ）発現上皮細胞株についての画像を示す。ＨＦＫ：ヒト包皮角化細胞。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。ＰｒＥＣ：前立腺上皮細胞。ｎＲＦＰ：核局在化赤色蛍光タンパク質。
【００４７】
【図２５】図２５は、多様な化合物および条件の存在下における、ヒト包皮角化細胞の成長を示す。ＨＦＫ：ヒト包皮角化細胞。Ｍ＊：ＥＧＦ、ａＦＧＦ、Ａ８３−０１、およびＹ−２７６３２を加えた、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＣＤＢ−１５３培地（９０μＭのＣａＣｌ２を伴う）。ＥＧＦ：上皮成長因子。ａＦＧＦ：酸性線維芽細胞の成長因子。ＢＳＡ：脂肪酸非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）。ｒＨＡ：イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）。脂質ミックス：Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）。ＡｌｂｕＭＡＸ：ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１０２０−０３９）。
【００４８】
【図２６】図２６は、多様な化合物および条件の存在下における、ヒト気管支上皮細胞の成長を示す。ＨＢＥＣ：ヒト気管支上皮細胞。Ｍ＊：ＥＧＦ、ａＦＧＦ、Ａ８３−０１、およびＹ−２７６３２を加えた、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＣＤＢ−１５３培地（９０μＭのＣａＣｌ２を伴う）。ＥＧＦ：上皮成長因子。ａＦＧＦ：酸性線維芽細胞の成長因子。ＢＳＡ：脂肪酸非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）。ｒＨＡ：イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）。脂質ミックス：Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）。ＡｌｂｕＭＡＸ：ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１０２０−０３９）。
【００４９】
【図２７】図２７は、それらの発現レベルが、異なる継代の、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で成長させた上皮細胞内で、異なる継代の、ＫＳＦＭ中で成長させた上皮細胞と比較して、下方調節または上方調節される代表的な遺伝子のリストを示す。ｐ２におけるＫＳＦＭ中の遺伝子発現レベルを１とする。正の数は、上方調節の倍数を指し示し、負の数は、下方調節の倍数を指し示す。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ｐ２：継代２回目。ｐ６：継代６回目。ｐ１３：継代１３回目。ｐ２３：継代２３回目。
【００５０】
【図２８】図２８は、１ｍＭのＣａＣｌ２を添加した後（右側の画像）における、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を伴う（左側の画像）ＫＳＦＭ中で培養された上皮細胞の挙動の変化を示す。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００５１】
【図２９】図２９は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２ならびに異なるカルシウム濃度を伴うＫＳＦＭ中で培養された気管支上皮細胞についての、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜を隔てた電気抵抗を示す。Ａ：ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１。Ｙ：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２。ＫＳＦＭ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ＲＡ：ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）。
【００５２】
【図３０】図３０は、濃度を増大させるイソプロテレノールを補充した、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ）中で培養された、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）の成長を示す。
【００５３】
【図３１】図３１は、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）の、ブロンコスフェアへの分化を示す。上パネルは、低倍率（４Ｘ）で見た細胞を示し、下パネルは、高倍率（２０Ｘ）で見た細胞を示す。目視可能な管腔を伴う、大型のブロンコスフェアを、下パネルに示す。
【００５４】
【図３２ＡＢ】図３２Ａ〜図３２Ｄは、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）培養物中（図３２Ａ、図３２Ｂ）、およびヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）培養物中（図３２Ｃ、図３２Ｄ）、形成されるドーム様構造を示す。図３２Ａおよび図３２Ｃは、全ウェルについての肉眼的画像である。図３２Ｂおよび図３２Ｄは、ミニチュアドームの３Ｄ様構造を示す顕微鏡画像である。
【図３２ＣＤ】図３２Ａ〜図３２Ｄは、高濃度のＣａＣｌ２の存在下で、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）培養物中（図３２Ａ、図３２Ｂ）、およびヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）培養物中（図３２Ｃ、図３２Ｄ）、形成されるドーム様構造を示す。図３２Ａおよび図３２Ｃは、全ウェルについての肉眼的画像である。図３２Ｂおよび図３２Ｄは、ミニチュアドームの３Ｄ様構造を示す顕微鏡画像である。
【００５５】
【図３３】図３３は、高濃度ＣａＣｌ２の存在下で誘導される分化の後で、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）の間に形成されるタイトジャンクションを示す。細胞間タイトジャンクションの存在は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３３９１８８）へとコンジュゲートさせたモノクローナル抗体を使用する、タイトジャンクションタンパク質であるＺＯ−１についての免疫蛍光染色により明らかにされる。
【００５６】
【図３４】図３４は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中、高濃度ＣａＣｌ２の存在下における、気液界面分化で、経時的に、経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）を増大させる、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）を示す。液面下期を、グレーのボックスで指し示す。
【００５７】
【図３５】図３５は、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）がＡ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中、高濃度ＣａＣｌ２の存在下における、気液界面分化で、経時的に、表皮様構造を形成することを示す。層が、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層に相似する、多層構造が示される。
【００５８】
【図３６】図３６は、Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、およびイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中の、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）の、単一細胞によるクローニングを示す。
【００５９】
【図３７】図３７は、単一細胞に由来するヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）の後代について、細胞形状の異質性を示す。
【００６０】
【図３８】図３８は、Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、およびイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中で培養された、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）についての、単一細胞によるコロニー形成効率を示す。
【００６１】
【図３９ＡＢ】図３９Ａ〜図３９Ｄは、上皮細胞の培養を支援するのに、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）の代わりに使用しうることを示す。角化細胞（図３９Ａおよび図３９Ｂ）および気道上皮細胞（図３９Ｃおよび図３９Ｄ）を、コラーゲンでコーティングされた培養槽上の、Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、イソプロテレノール、およびＥＧＦを補充したＫＳＦＭ中、多様なｒＨＡ濃度またはＢＰＥ濃度で培養した。
【図３９ＣＤ】図３９Ａ〜図３９Ｄは、上皮細胞の培養を支援するのに、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）の代わりに使用しうることを示す。角化細胞（図３９Ａおよび図３９Ｂ）および気道上皮細胞（図３９Ｃおよび図３９Ｄ）を、コラーゲンでコーティングされた培養槽上の、Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、イソプロテレノール、およびＥＧＦを補充したＫＳＦＭ中、多様なｒＨＡ濃度またはＢＰＥ濃度で培養した。
【００６２】
【図４０】図４０は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、上皮細胞（すなわち、成体角化細胞）の拡大の延長を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）を用いて得たものと同様のレベルまで支援することを示す。Ａ＋Ｙ（ＢＰＥ）：Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、ＥＧＦ、イソプロテレノール、およびＢＰＥを補充したＫＳＦＭ。Ａ＋Ｙ（ｒＨＡ）：Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、ＥＧＦ、イソプロテレノール、およびｒＨＡを補充したＫＳＦＭ。Ａ＋Ｂ（ｒＨＡ）：Ａ８３−０１、ブレビスタチン、ＥＧＦ、イソプロテレノール、およびｒＨＡを補充したＫＳＦＭ。ＨＥＫａ：成体ヒト表皮角化細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｇｉｂｃｏ製）。
【００６３】
【図４１】図４１は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、上皮細胞（すなわち、気道上皮細胞）の拡大の延長を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）を用いて得たものと同様のレベルまで支援することを示す。Ａ＋Ｙ（ＢＰＥ）：Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、ＥＧＦ、イソプロテレノール、およびＢＰＥを補充したＫＳＦＭ。Ａ＋Ｙ（ｒＨＡ）：Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、ＥＧＦ、イソプロテレノール、およびｒＨＡを補充したＫＳＦＭ。Ａ＋Ｂ（ｒＨＡ）：Ａ８３−０１、ブレビスタチン、ＥＧＦ、イソプロテレノール、およびｒＨＡを補充したＫＳＦＭ。ＤＨＢＥ−ＣＦ：嚢胞性線維症患者に由来する罹患ヒト気管支上皮細胞（Ｌｏｎｚａ）。
【００６４】
【図４２】図４２は、多様な組合せの構成成分を補充したＫＳＦＭ中で培養された角化細胞の拡大を示す。ＥＧＦ：表皮成長因子。ＢＰＥ：ウシ脳下垂体抽出物。ｒＨＡ：イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン。ＩＳＯ：イソプロテレノール。Ａ８３−０１：ＡＬＫ５阻害剤。Ｙ−２７６３２：ＲＯＣＫ阻害剤。ブレビスタチン：ミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤。ＢＭＳ−４５３：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）に対するアンタゴニスト。誤差バーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００６５】
【図４３】図４３は、ＥＧＦ、イソプロテレノール、Ａ８３−０１、および組換えヒト血清アルブミンを補充したＫＳＦＭ中、用量を増大させるＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２の存在下で培養された角化細胞の拡大を示す。誤差バーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００６６】
【図４４】図４４は、ＥＧＦ、イソプロテレノール、Ａ８３−０１、および組換えヒト血清アルブミンを補充したＫＳＦＭ中、用量を増大させるミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤であるブレビスタチンの存在下で培養された角化細胞の拡大を示す。誤差バーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００６７】
【図４５】図４５は、ＥＧＦ、イソプロテレノール、Ａ８３−０１、および組換えヒト血清アルブミンを補充したＫＳＦＭ中、用量を増大させるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストであるＢＭＳ−４５３の存在下で培養された角化細胞の拡大を示す。誤差バーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００６８】
【図４６】図４６は、ＥＧＦ、イソプロテレノール、Ａ８３−０１、および組換えヒト血清アルブミンを補充したＫＳＦＭ中、用量を増大させるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストであるＢＭＳ−１９５６１４の存在下で培養された角化細胞の拡大を示す。誤差バーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００６９】
【図４７】図４７は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、新生包皮角化細胞の拡大の延長を支援することを示す。
【００７０】
【図４８】図４８は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、健常ドナーに由来する気管支上皮細胞の拡大の延長を支援することを示す。
【００７１】
【図４９】図４９は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、嚢胞性線維症ドナーに由来する気管支上皮細胞の拡大の延長を支援することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本明細書では、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法および培地組成物が提供される。上皮細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる上皮細胞）は、フィーダー細胞の集団と共培養され、かつ／またはフィーダー細胞に由来する馴化培地中で培養されることが多い。しかし、フィーダー細胞への依拠は、上皮細胞を、どこでどのように培養するのかを制限する場合があり、上皮細胞を培養する費用を、著明に増大させうる。フィーダー細胞の使用はまた、フィーダー細胞に由来する、未規定の生物学的因子により引き起こされる、細胞培養物のばらつきに起因して、問題点でもありうる。ばらつきは、一貫しない結果をもたらす可能性があり、これは、再現性の欠如に起因して、データの解釈を困難とする。フィーダー細胞また、望まれない作用物質（例えば、レトロウイルス、他の病原体、およびＮｅｕ５Ｇｃなど、免疫原性の非ヒトシアル酸）を、培養される上皮細胞へと導入する潜在的可能性も有する。このような培養条件は、例えば、移植など、ある特定の適用には望ましくない場合がある。
【００７３】
上皮細胞は、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を補充した培地中で培養することが典型的である。しかし、ある特定の場合、血清は、未規定のマイトジェンの供給源となる可能性があり、ロット間のばらつきが観察されることが多い。さらに、血清は、マイコプラズマおよびウイルスなど、感染作用物質で汚染されている可能性もある。したがって、血清は、培養培地の、未規定でばらつきのある構成成分となる可能性があり、血清の使用は、ある特定の培養された細胞のための、規定された栄養的要求およびホルモン的要求の解明を妨げる場合がある。
【００７４】
上皮細胞は、１つまたは複数の成長因子、および１つまたは複数の未規定の動物臓器抽出物を補充することが多い、無血清培地を伴う、フィーダー細胞フリー条件下で培養する場合がある。しかし、これらの条件下で培養された上皮細胞は典型的に、数回の継代後に、増殖を停止させ、寿命が非常に限定されており、一般に、ｅｘ  ｖｉｖｏでは、大量に拡大することができない。
【００７５】
本明細書では、フィーダー細胞またはフィーダー細胞由来の馴化培地を使用せず、ある特定の実施形態では、血清および／または未規定の動物臓器抽出物を使用せずに、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させ、拡大するための、方法および培地組成物が提供される。本明細書の、ある特定の実施形態ではまた、規定されたおよび／またはゼノフリーの細胞培養条件下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させ、拡大するための、方法および培地組成物も提供される。本明細書の、ある特定の実施形態ではまた、本明細書で提供される方法および組成物を使用して増殖させ、拡大した、上皮細胞の集団も提供される。
上皮細胞
【００７６】
本明細書では、ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させ、拡大するための方法および組成物が提供される。上皮細胞、または上皮は、中空の臓器を裏打ちする、細胞（単数又は複数）のほか、腺および体外表面を構成する、細胞も指すことが典型的である。上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞、または移行上皮細胞を含みうる。上皮細胞は、臓器および場所に応じて、単層に配列される場合もあり、または多層に配列される場合もある。
【００７７】
本明細書で記載される上皮細胞は、角化上皮細胞（ＫＥ）または非角化上皮細胞（ＮＫＥ）を含む場合がある。角化細胞は、皮膚、眼表面、口腔粘膜、食道、および子宮頸部などの解剖学的部位において見出される、扁平上皮を形成する。角化細胞は最終的に、防護障壁を形成することにより、環境および感染に対して保護する一助となる、平坦で、高度に角化した、非生存細胞へと分化する。角化上皮細胞の例は、皮膚角化細胞、眼上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
ＮＫＥ細胞は、乳房、前立腺、肝臓、気管、網膜、および消化管において見出されるような、身体の上皮を形成する。ＮＫＥ細胞は、例えば、吸収および／または分泌において機能する、機能的な生存細胞へと分化することが典型的である。これらの細胞は、扁平上皮細胞に特徴的な、高度に角化した構造を形成しないことが典型的である。
【００７９】
本明細書で記載される方法における使用のためのＮＫＥ細胞は、任意の種類または組織起源の細胞でありうる。ＮＫＥ細胞の例は、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵ベータ細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃部上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、脳下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞、および毛包細胞を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＮＫＥ細胞は、腸上皮細胞を含まない。
【００８０】
一部の実施形態では、上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。基底上皮細胞は一般に、重層上皮および多層上皮の最深層にある細胞である。基底上皮細胞は、その核が多列上皮内の基底層の近傍に位置する細胞でありうる。場合によって、基底上皮細胞は、分裂し（例えば、非対称細胞分裂または対称細胞分裂により）、他の基底細胞型および／または他の上皮細胞型（例えば、重層上皮、多層上皮、または多列上皮内の他の細胞型）をもたらしうる。一部の上皮内のある比率の基底上皮細胞は、一生にわたる自己再生能を有する場合があり、他の上皮細胞型および基底細胞をもたらすことが可能であり、時として、上皮幹細胞と考えられる。一生にわたる自己再生能を有し、上皮幹細胞と考えられる、基底上皮細胞の比率は、異なる組織間で変動する。
【００８１】
上皮細胞は、対象および／または細胞供給源から得ることができる。対象および／または細胞供給源から得られた細胞を、元になる上皮細胞集団と称することができる。元になる上皮細胞集団は、本明細書で記載される培養条件（例えば、拡大培養条件、フィーダー細胞フリーの拡大条件、ゼノフリーの拡大条件）による拡大のための、インプットの上皮細胞集団である。細胞供給源は、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの集団を含みうる。一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団を、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離する。一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）培養物から単離する。元になる上皮細胞集団は、対象から、様々な方式で得ることができる（例えば、生検、抜き取った毛髪の毛包、尿もしくは体腔液などの体液など、生体組織から採取するか、または循環から単離する）。対象は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長動物、およびヒトなど、任意の哺乳動物を含むがこれらに限定されない、任意の動物を含みうる。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、胚よりも長く、子宮環境内に懐胎され、出生後ヒトまたは出生後動物（例えば、新生ヒト、新生動物、成体ヒト、または成体動物）であることが多い、動物またはヒトである。対象は、胚ではないことが典型的である。対象は、時として、若年動物、若年ヒト、成体動物、または成体ヒトである。
【００８２】
一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団を、対象に由来する試料から単離する。試料は、対象またはその一部から単離されるかまたは得られる、任意の検体を含みうる。検体の非限定的な例は、限定されるものではないが、血液もしくは血液生成物（例えば、血清、血漿など）、臍帯血、骨髄、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹腔、乳管、耳、関節鏡）、生検試料もしくは組織生検、口腔スワブ、腹腔穿刺試料、女性生殖管洗液、尿、糞便、痰、唾液、鼻腔粘液、前立腺液、洗浄物、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、乳房液、硬組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、または卵巣）など、またはそれらの組合せを含む、対象に由来する体液または組織を含む。血液という用語は、全血液、血液生成物、または従来規定されている血清、血漿、軟膜など、血液の任意の画分を包含する。血漿は、抗凝固剤で処理された血液の遠心分離から生じる、全血液の画分を指す。血清は、血液試料を凝固させた後に残存する、流体の水様部分を指す。一部の実施形態では、胎児細胞を、母体試料（例えば、母体血液、羊水）から単離する。
【００８３】
一部の実施形態では、上皮細胞は、正常細胞、健常細胞（例えば、罹患していない細胞）を含みうる。一部の実施形態では、上皮細胞は、遺伝子変更されていない細胞を含みうる。一部の実施形態では、上皮細胞は、罹患したおよび／または遺伝子変更されたものを含みうる。罹患上皮細胞は、疾患を引き起こす突然変異を保有する対象に由来する細胞（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子内の遺伝子突然変異を伴う上皮細胞）を含みうる。罹患上皮細胞は、新形成、過形成、悪性腫瘍、または良性腫瘍由来などの異常な組織に由来する細胞を含みうる。ある特定の実施形態では、罹患上皮細胞は、腫瘍細胞ではない細胞を含みうる。ある特定の実施形態では、罹患上皮細胞は、対象の循環（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））から単離された細胞を含みうる。ある特定の実施形態では、罹患上皮細胞は、例えば、尿、精液、便（糞便）などの身体試料から単離された細胞を含みうる。
【００８４】
一部の実施形態では、上皮細胞は、初代細胞を含む。一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団は、初代細胞を含む。初代上皮細胞は、生検、抜き取った毛髪の毛包、便試料、尿、精液、もしくは体腔液などの体液などの身体試料など、生体組織から直接採取されるか、または循環から単離される。ある特定の場合には、初代細胞は、継代されていない。ある特定の場合には、初代細胞は、１回継代されている。初代細胞を、分化組織から単離することができる（例えば、多様な臓器の上皮から単離する）。初代細胞は、例えば、組織消化を介して、新規に単離され、プレーティングされていることが典型的である。初代細胞は、凍結させ、次いで、後に融解させても、させなくてもよい。加えて、初代細胞が単離される組織も、加工の直前に、凍結または他の何らかの方式で保存しても、しなくてもよい。細胞を、１回を超えて継代した後ではもはや、細胞は、初代細胞ではないことが典型的である。１回またはこれを超えて継代され、継代の直後に凍結させた細胞もまた、融解させた場合に、初代細胞とは考えられない。ある特定の実施形態では、上皮細胞は、初期には、初代細胞であるが、本明細書で記載される方法の使用を介して、継代の後、非初代細胞となる。一部の実施形態では、細胞を、分化組織から単離した後で、かつ、元になる上皮細胞集団を、本明細書で記載される培養条件（例えば、本明細書で記載される拡大培養条件）と接触させる前に、元になる上皮細胞集団の細胞を、細胞培養物中で維持するかまたは増殖させる。
【００８５】
一部の実施形態では、上皮細胞は、確立された細胞株、形質転換細胞、あらかじめ凍結させた回収物に由来する融解細胞などに由来する細胞などの非初代細胞を含む。ある特定の実施形態では、上皮細胞は、二次細胞を含む。一部の実施形態では、上皮細胞は、確立された細胞株に由来する細胞を含まない。
【００８６】
一部の実施形態では、培養組成物は、同じ組織または同じ組織コンパートメントに由来する、異種上皮細胞の集団（例えば、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、上皮先駆細胞、分化系列決定上皮細胞、トランジット増幅上皮細胞、分化途上上皮細胞、分化上皮細胞、および最終分化上皮細胞など、細胞型および／または分化状態の混合物を含む）を含む。一部の実施形態では、培養組成物は、同じ組織または同じ組織コンパートメントに由来する、同種上皮細胞の集団（例えば、細胞型および／または分化状態の混合物を含まない）を含む。一部の実施形態では、同種上皮細胞の集団は、同じ細胞型のものであり、かつ／または同じ分化状態で存在する、少なくとも約９０％の上皮細胞を含む。例えば、同種上皮細胞の集団は、同じ細胞型のものであり、かつ／または同じ分化状態で存在する、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の上皮細胞を含みうる。一部の実施形態では、同種上皮細胞の集団は、同じ細胞型のものであり、かつ／または同じ分化状態で存在する、約１００％の上皮細胞を含む。一部の実施形態では、上皮細胞は、同種基底上皮細胞の集団である。一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団は、異種の場合もあり、同種の場合もある。一部の実施形態では、拡大された上皮細胞集団は、異種の場合もあり、同種の場合もある。
【００８７】
一部の実施形態では、上皮細胞を、上皮細胞の集団内に含まれるか、または存在しない、細胞型および／または分化状態により特徴付ける。一部の実施形態では、このような細胞の特徴付けは、元になる上皮細胞集団に適用可能でありうる。一部の実施形態では、このような細胞の特徴付けは、拡大された上皮細胞集団に適用可能でありうる。一部の実施形態では、このような細胞の特徴付けは、元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団に適用可能でありうる。一部の実施形態では、特定の細胞型および／または分化状態を含む上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態のものである、少なくとも約５０％の上皮細胞を含む。一部の実施形態では、特定の細胞型および／または分化状態を含む上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態のものである、少なくとも約９０％の上皮細胞を含む。例えば、特定の細胞型および／または分化状態を含む上皮細胞は、特定の型および／または分化状態のものである、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の上皮細胞を含みうる。一般に、特定の細胞型および／または分化状態を含まない上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態のものである、約１０％未満の細胞を含む。例えば、特定の細胞型および／または分化状態を含まない上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態のものである、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の細胞を含みうる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、培養組成物または集団は、本明細書の以下では、「多数細胞」と称する、特定の種類の上皮細胞から本質的になる。このような培養組成物は、本明細書の以下では、「少数細胞」と称する、少量の、１つまたは複数の、他の種類の上皮細胞を含みうる。少数細胞は典型的に、多数細胞と同じ組織に由来するかまたはこれらから導出され、多数細胞と同じ組織コンパートメントに由来するかまたはこれらから導出されることが多い。多数細胞は、組成物中の全細胞の、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、または８０％を超える場合があり、組成物中の全細胞の、約９０％またはこれを超えることが多く、時として、組成物または集団中の全細胞の、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはこれを超える。
【００８９】
一部の実施形態では、培養組成物は、Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、およびＧ０期など、老化および静止を含む、異なる細胞周期にある異種上皮細胞の集団を含む。一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団は、Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、およびＧ０期など、老化および静止を含む、異なる細胞周期にある異種上皮細胞の集団を含む。一部の実施形態では、拡大された上皮細胞集団は、Ｍ期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、およびＧ０期など、老化および静止を含む、異なる細胞周期にある異種上皮細胞の集団を含む。特定の細胞周期にある上皮細胞は、集団の１％〜１００％を構成しうる。
【００９０】
一部の実施形態では、上皮細胞は、１つまたは複数の分化段階にある細胞を含む。一部の実施形態では、このような分化段階を、元になる上皮細胞集団について記載することができる。一部の実施形態では、このような分化段階を、拡大された上皮細胞集団について記載することができる。一部の実施形態では、このような分化段階を、元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団について記載することができる。例えば、上皮細胞（または上皮細胞の集団）は、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、分化系列限定上皮前駆細胞、上皮先駆細胞、分化系列決定上皮細胞、トランジット増幅上皮細胞、増殖上皮細胞、分化途上上皮細胞、分化上皮細胞、静止上皮細胞、前静止上皮細胞、非増殖上皮細胞、および最終分化上皮細胞（例えば、組織および臓器内で見出される細胞）を含みうる。上皮細胞はまた、多能性幹細胞（胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から分化させた、および／またはそれに由来する分化系列決定上皮細胞を含みうる。
【００９１】
一部の実施形態では、上皮細胞は、分化上皮細胞を含む。分化上皮細胞は、分裂しうるが、無際限の自己再生のための能力を有さないことが典型的である。一部の実施形態では、分化上皮細胞は、複数の組織型へと分化する能力を獲得しない。本明細書で記載される条件下で培養される分化上皮細胞は一般に、未分化細胞（例えば、幹細胞（胚性または成体）、前駆細胞、先駆細胞）より分化が大きく、最終分化細胞より分化が小さい。分化上皮細胞は一般に、幹細胞（胚性または成体）、前駆細胞、または先駆細胞を含まない。ある特定の場合には、分化上皮細胞を、「組織特異的」および／または「分化系列決定」上皮細胞と称することができる。ある特定の場合には、分化上皮細胞は、組織特異的および／または分化系列決定上皮細胞を含みうる。一部の実施形態では、分化上皮細胞は、静止上皮細胞を含む。一部の実施形態では、分化上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、上皮細胞は、静止細胞または前静止細胞を含む。静止細胞は一般に、非増殖細胞（すなわち、非周期細胞、細胞周期から離脱した細胞、静止細胞）であり、可逆的成長停止として特徴付けることができる。ある特定の条件下では、静止細胞を、増殖するように誘導することができる。静止細胞は、細胞周期のＧ０期に存在するとして特徴付けることができる。増殖するように誘導された静止細胞を、前静止細胞と称することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、上皮細胞は、臓器特異的上皮細胞を含む。時として、臓器特異的上皮細胞を、組織特異的上皮細胞と称する。一部の実施形態では、臓器特異的上皮細胞は、所与の臓器内の、より特異的な細胞型へと分化しうるが、一般に、他の種類の臓器の細胞へと分化する能力を有さないか、または獲得しない。臓器特異的上皮細胞は一般に、未分化細胞（例えば、幹細胞（胚性または成体））より分化が大きく、最終分化細胞より分化が小さい。臓器特異的上皮細胞は一般に、胚性幹細胞を含まない。臓器特異的上皮細胞は、成体幹細胞（例えば、成体上皮幹細胞）を含む場合もあり、これらを含まない場合もあり、臓器特異的上皮細胞は、前駆細胞または先駆細胞を含む場合もあり、これらを含まない場合もある。
【００９４】
一部の実施形態では、上皮細胞は、分化系列決定上皮細胞を含む。一部の実施形態では、上皮細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞から分化させた、分化系列決定上皮細胞を含みうる。分化系列決定上皮細胞は、分裂しうるが、無際限の自己再生のための能力を有さないことが典型的である。一部の実施形態では、分化系列決定上皮細胞は、所与の細胞分化系列（例えば、呼吸器、消化器、または外皮分化系列）内の多様な細胞型へと分化しうるが、一般に、異なる細胞分化系列の細胞へと分化する能力を有さないか、または獲得しない（例えば、外皮分化系列決定上皮細胞は一般に、血液細胞へと分化しない）。分化系列決定上皮細胞は一般に、未分化の多能性幹細胞より分化が大きく、最終分化細胞より分化が小さい。分化系列決定上皮細胞は一般に、多能性幹細胞（胚性または人工多能性）を含まない。一部の実施形態では、分化系列決定上皮細胞は、前駆細胞または先駆細胞を含む。一部の実施形態では、分化系列決定上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、上皮細胞は、最終分化上皮細胞を含まない。最終分化上皮細胞は一般に、分裂せず、特定の機能に傾倒している。最終分化上皮細胞は一般に、細胞周期からの決定的な離脱により特徴付けられ、増殖するよう誘導できないことが典型的である。一部の実施形態では、上皮細胞は、最終分化胃上皮細胞、最終分化腸上皮細胞、および／または最終分化膵上皮細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、有糸分裂後細胞を含まない。有糸分裂後細胞は一般に、細胞分裂が不可能であるか、またはもはや細胞分裂ができない。一部の実施形態では、上皮細胞は、老化細胞を含まない。
【００９６】
一部の実施形態では、上皮細胞は、胚性幹細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、胚性幹細胞から分化させる、かつ／またはそれに由来する。一部の実施形態では、上皮細胞は、胚性幹細胞に由来しない。一般に、胚性幹細胞は、無際限の再生または自己再生する能力を有する未分化細胞である。胚性幹細胞は、時として、多能性（すなわち、成体生物の多くのまたは全ての細胞型へと分化しうる）であると考えられ、時として、全能性（すなわち、胎盤組織を含む、全ての細胞型へと分化しうる）であると考えられる。一部の実施形態では、上皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させる、かつ／またはそれに由来する。一部の実施形態では、上皮細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来しない。一般に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、成体細胞から直接作出されうる多能性幹細胞の種類である。一部の実施形態では、上皮細胞は、多能性細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、全能性細胞を含まない。
【００９７】
一部の実施形態では、上皮細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞は、分化細胞、臓器特異的細胞、または分化系列決定細胞より分化が小さく、胚性幹細胞より分化が大きいことが典型的である。成体幹細胞は、幹細胞、未分化幹細胞、先駆細胞、および／または前駆細胞と称しうるが、成体幹細胞は、胚から単離されないので、胚性幹細胞とは考えられない。成体上皮幹細胞は、上皮幹細胞、未分化上皮幹細胞、上皮先駆細胞、および／または上皮前駆細胞と称することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、上皮細胞は、成体幹細胞または成体幹細胞に由来する細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、上皮幹細胞または上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、多能性上皮幹細胞または多能性上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、前駆細胞または前駆細胞に由来する細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、先駆細胞または先駆細胞に由来する細胞を含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、連続的に増殖する（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する）上皮幹細胞（例えば、腸陰窩細胞；Ｌｇｒ５＋細胞）、または連続的に増殖する上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。一部の実施形態では、元になる細胞、または元になる細胞が採取される組織は、連続的に増殖する上皮幹細胞（例えば、腸陰窩細胞；Ｌｇｒ５＋細胞）を含まず、本明細書の方法は、このような細胞型を選択するステップを含まない場合がある。例えば、一部の実施形態では、方法は、連続的に増殖する上皮幹細胞を選択するステップ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団（すなわち、採取する前に、対象において連続的に増殖する上皮幹細胞の集団）を選択するステップを含まない。一部の実施形態では、上皮細胞は、オルガノイドを形成する能力を獲得しない。一部の実施形態では、上皮細胞は、初期に単離およびプレーティングするときに、完全な未分化細胞ではない。
【００９９】
一部の実施形態では、上皮細胞は、細胞が、１つもしくは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有するのか、かつ／または測定可能レベルのある特定のマーカーを有さないか、もしくは低レベルのこれらを有するのかにより特徴付けることができる。一部の実施形態では、このようなマーカーによる特徴付けは、元になる上皮細胞集団に適用可能でありうる。一部の実施形態では、このようなマーカーによる特徴付けは、拡大された上皮細胞集団に適用可能でありうる。一部の実施形態では、このようなマーカーによる特徴付けは、元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団に適用可能でありうる。
【０１００】
ある特定の場合には、マーカーの発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）のレベルを決定する。ｍＲＮＡ発現のレベルは、ｍＲＮＡ発現を検出および測定するのに適する任意の方法を使用して決定することができる。例えば、発現レベルは、定量的逆転写ＰＣＲにより、Ｃｔｇｅｎｅ値［ここで、Ｃｔｇｅｎｅは、定量的ＰＣＲ反応の蛍光シグナルが、規定された（例えば、検出可能な）閾値を超えるのに要求される周期数である］に従い決定することができる。一般に、Ｃｔｇｅｎｅが３５より高い場合、マーカーの発現は、非存在と考えられる。Ｃｔｇｅｎｅが、３５未満かつ３０より大きいまたはこれに等しい場合、マーカーの発現レベルは、低いと考えられる。Ｃｔｇｅｎｅが、２９未満かつ２２より大きいまたはこれに等しい場合、マーカーの発現レベルは、中等または中程度と考えられる。Ｃｔｇｅｎｅが、２２未満である場合、マーカーの発現レベルは、高いと考えられる。
【０１０１】
一部の実施形態では、上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態と典型的に関連するマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態と典型的に関連するマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さない。一部の実施形態では、上皮細胞は、特定の細胞型および／または分化状態と典型的に関連しないマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、未分化幹細胞と典型的に関連しないマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、基底上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、分化上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、気道上皮細胞および／または角化細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。場合によって、中程度レベル〜高レベルのマーカーも存在しうる。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、多能性幹細胞、最終分化上皮細胞、老化細胞、胃上皮細胞、腸上皮細胞、膵上皮細胞、線維芽細胞、および／または腸杯細胞など、ある特定の細胞型と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、細胞接着および／またはストレス応答と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、臓器特異的上皮細胞は、測定可能レベルの、他の臓器に由来する細胞型と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。例えば、気道上皮細胞は、測定可能レベルの、胃上皮細胞、腸上皮細胞、膵上皮細胞、線維芽細胞、および／または腸杯細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さない、または低レベルのこれらを有する場合がある。
【０１０３】
一部の実施形態では、上皮細胞は、例えば、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、およびＴＰ６３など、基底上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、例えば、ＫＲＴ４、ＫＲＴ６、およびＫＲＴ８など、分化上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、例えば、ＨＥＹ２、ＮＧＦＲ、およびＢＭＰ７など、気道上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、例えば、ＺＦＰ４２など、角化細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、例えば、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＧ１、ＩＤ１、ＭＡＰ２Ｋ６、ＩＧＦＢＰ３、およびＩＧＦＢＰ５など、１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有する。場合によって、中程度レベル〜高レベルのこのようなマーカーも存在しうる。
【０１０４】
一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＬＧＲ５など、上皮幹細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２など、多能性幹細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢ、およびＳＦＴＰＤなど、最終分化上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＬＢ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、およびＳＯＤ２など、細胞老化と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、接着分子である、ＦＮ１およびＴＨＢＳ１など、細胞接着と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、中間径フィラメントタンパク質であるビメンチン（ＶＩＭ）など、細胞フィラメントと典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３など、胃上皮細胞、腸上皮細胞、または膵上皮細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＺＥＢ１およびＺＥＢ２など、線維芽細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。一部の実施形態では、上皮細胞は、測定可能レベルの、例えば、ＫＲＴ２０など、腸杯細胞と典型的に関連する１つまたは複数のマーカー（例えば、細胞表面マーカー、ｍＲＮＡ、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー）を有さないか、または低レベルのこれらを有する。
細胞培養物
【０１０５】
本明細書では、細胞を培養するための方法および組成物が提供される。特に、本明細書では、拡大培養条件が提供される。細胞培養物または培養物は、細胞の、人工的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境内の維持、または細胞の、外部のｅｘ  ｖｉｖｏ環境（すなわち、生物の体外）内の維持を指すことが典型的であり、個々の細胞および組織の培養を含みうる。本明細書で記載される、ある特定の細胞培養系は、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境でありうる。一部の実施形態では、初代細胞を単離する。一部の実施形態では、初代細胞を、単回の針生検を使用して単離することができる。一部の実施形態では、初代細胞を、組織生検を使用して単離することができる。一部の実施形態では、初代細胞を、抜き取った毛髪から単離することができる。一部の実施形態では、初代細胞を、尿または体腔液などの体液から単離することができる。一部の実施形態では、初代細胞を、対象の循環から単離することができる。
【０１０６】
単離の後、細胞材料を、洗浄することができる（例えば、生理食塩液および／またはＰＢＳ液で）。組織マトリックスからの細胞の解離を促進するように、細胞材料を、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、および／またはトリプシンなどの酵素溶液で処理することができる。例えば、ディスパーゼを使用して、上皮を、根底にある組織から解離することができる。次いで、無傷の上皮を、例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼで処理することができる。このような消化ステップは、解離された細胞および組織マトリックスを含有するスラリーを結果としてもたらすことが多い。次いで、スラリーを、残りのスラリーから細胞を分離するのに十分な力で遠心分離することができる。次いで、細胞ペレットを取り出し、緩衝液および／または生理食塩液および／または細胞培養培地で洗浄することができる。遠心分離および洗浄は、任意の回数反復することができる。次いで、最終的な洗浄の後、細胞を、任意の適切な細胞培養培地で洗浄することができる。ある特定の場合には、単離時に、細胞が根底にある組織から十分に分離されている場合（例えば、循環から、または針生検を使用して単離された細胞の場合）、消化および洗浄ステップは、実施しなくてもよい。一部の実施形態では、腫瘍細胞などの細胞を、対象の循環から単離することができる。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞を、ある特定の種類の腫瘍細胞上で特異的に発現する細胞マーカーに従い単離することができる（例えば、参照により組み込まれる、Lu.  J.ら、Int'l.  J.  Cancer、１２６巻（３号）：６６９〜６８３頁（２０１０年）；およびYu,  M.ら、J.  Cell  Biol.、１９２巻（３号）：３７３〜３８２頁（２０１１年）を参照されたい）。細胞は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒなど、電子細胞カウンターを使用してカウントしてもよく、そうしなくてもよく、血球計を使用して、手作業でカウントしてもよい。
【０１０７】
細胞播種密度は、ある特定の所望の培養条件に従い調整することができる。例えば、１ｃｍ２当たりの細胞約１×１０３〜約１×１０５個の初期播種密度を使用することができる。一部の実施形態では、１ｃｍ２当たりの細胞約１×１０５個の初期播種密度を使用することができる。ある特定の場合には、細胞１×１０６個を、７５ｃｍ２の培養フラスコ内で培養することができる。細胞密度は、必要に応じて、任意の継代において変更することができる。
【０１０８】
細胞は、細胞インキュベーター内、約３７℃、標準大気圧で培養することができる。インキュベーター雰囲気は、加湿することができ、空気中に約３〜１０％の二酸化炭素を含有しうる。場合によって、インキュベーター雰囲気は、約０．１〜３０％の酸素を含有しうる。温度、圧力、および二酸化炭素、および酸素濃度は、必要に応じて変更することができる。培養培地のｐＨは、約７．１〜約７．６、または約７．１〜約７．４、または約７．１〜約７．３の範囲でありうる。
【０１０９】
細胞培養培地は、１〜２日ごと、または、必要に応じて、これを超える頻度もしくはこれ未満の頻度で置き換えることができる。細胞が、培養槽内でコンフルエンスに接近したら、継代することができる。細胞の継代は、細胞を分割するか、または分け、細胞の一部を、新たな培養槽または培養環境へと移すことである。細胞培養表面に接着する細胞は、剥離を要求しうる。接着細胞を、培養槽の表面から剥離させる方法は、周知であり、トリプシンなどの酵素の使用を含みうる。
【０１１０】
単回の継代は、細胞を１回分割するか、または手作業で１回分け、より少数の細胞を、新たな容器または環境へと移すことを指す。継代する場合、細胞が付着および成長することを可能とする、任意の比に細胞を分割することができる。例えば、単回の継代では、細胞を、１：２の比、１：３の比、１：４の比、１：５の比などに分割することができる。一部の実施形態では、細胞を、少なくとも約１回〜少なくとも約３００回継代する。例えば、細胞を、少なくとも約２回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、２００回、または３００回継代することができる。一部の実施形態では、細胞を、少なくとも約１５回継代する。一部の実施形態では、細胞を、少なくとも約２５回継代する。
【０１１１】
細胞の成長は一般に、１つの母細胞が、２つの娘細胞へと分裂するような細胞分裂を指す。細胞の成長を、細胞の拡大と称することができる。本明細書における細胞の成長は一般に、細胞の実際のサイズ（例えば、直径、容量）の増大を指さない。細胞の成長の刺激は、経時的に、細胞集団（例えば、細胞集団倍加）をプロットすることにより評価することができる。成長曲線が急な細胞集団は一般に、曲線が急でない細胞集団より急速に成長すると考えられる。例えば、成長曲線を、同じ細胞型の間の多様な処置について比較することもでき、成長曲線を、同じ条件で異なる細胞型について比較することもできる。
【０１１２】
細胞の集団を拡大することは、集団倍加として表すことができる。細胞の集団倍加は、細胞の数が倍加するように、培養物中の細胞が分裂する場合に生じる。場合によって、細胞をカウントして、細胞の集団が倍加したのか、三倍加したのか、または他のいくつかの倍数分だけ多数倍加したのかを決定する。集団倍加の回数は、細胞培養物を継代する回数と等しくない場合がある。例えば、細胞を継代し、さらなる培養のために、細胞を１：３の比に分割することは、細胞集団の三倍加と等しくない場合がある。集団倍加（ＰＤ）を計算するために使用されうる式を、方程式Ａ：
ｎ＝３．３２×（ｌｏｇ  Ｙ−ｌｏｇ  ｌ）＋Ｘ  方程式Ａ
［式中、ｎ＝採取または継代する場合の、細胞培養物の最終的なＰＤ数、Ｙ＝採取または継代時における細胞収量、ｌ＝細胞培養を始めるための接種物として使用される細胞数、およびＸ＝継代培養を開始するのに使用される、元になる細胞培養物のＰＤ数］
に提示する。
【０１１３】
細胞の集団は、ある特定の期間にわたり、ある特定の回数倍加しうる。一部の実施形態では、細胞の集団は、ある特定の期間にわたり、少なくとも約１回〜少なくとも約５００回倍加することが可能であるか、または倍加する。例えば、細胞の集団は、少なくとも約２回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、１１０回、１２０回、１３０回、１４０回、１５０回、１６０回、１７０回、１８０回、１９０回、２００回、２５０回、３００回、３５０回、４００回、４５０回、または５００回倍加することが可能であるか、または倍加しうる。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも２０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも５０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも６０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも７０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも８０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも９０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１００回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１２０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１５０回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも２００回倍加することが可能であるか、または倍加する。一部の実施形態では、細胞の集団を、約１日間〜約５００日間の期間にわたり、ある特定の回数倍加するか、または倍加することが可能である。例えば、細胞の集団は、約２日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間、１００日間、１１０日間、１２０日間、１３０日間、１４０日間、１５０日間、１６０日間、１７０日間、１８０日間、１９０日間、２００日間、２５０日間、３００日間、３５０日間、４００日間、４５０日間、または５００日間の期間にわたり、ある特定の回数倍加しうるか、または倍加することが可能である。一部の実施形態では、細胞の集団を、約５０日間の期間にわたり、ある特定の回数倍加するか、または倍加することが可能である。一部の実施形態では、細胞の集団を、約１００日間の期間にわたり、ある特定の回数倍加するか、または倍加することが可能である。一部の実施形態では、細胞の集団を、約１５０日間の期間にわたり、ある特定の回数倍加するか、または倍加することが可能である。一部の実施形態では、細胞の集団を、約２００日間の期間にわたり、ある特定の回数倍加するか、または倍加することが可能である。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書の方法は、細胞の集団を拡大するステップを含む。細胞の集団を拡大するステップを、細胞の集団を増殖させるステップと称することができる。細胞の集団を拡大するステップは、細胞数の増大の倍数として表すことができる。増大の倍数を、集団倍加の関数として計算するのに使用されうる式を、方程式Ｂ：
Ｆ＝２ｎ  方程式Ｂ
［式中、Ｆ＝ｎ回の集団倍加後における、細胞数の増大の倍数］
に提示する。例えば、１回の集団倍加の後で、細胞の数は２倍に増大し、２回の集団倍加の後で、細胞の数は４（２２＝４）倍に増大し、３回の集団倍加の後で、細胞の数は８（２３＝８）倍に増大するなど。よって、２０回の集団倍加の後で、細胞の数は１００万倍（２２０＝１，０４８，５７６）を超えて増大し、３０回の集団倍加の後で、細胞の数は１０億倍（２３０＝１，０７３，７４１，８２４）を超えて増大し、４０回の集団倍加の後で、細胞の数は１兆倍（２４０＝１，０９９，５１１，６２７，７７６）を超えて増大するなど。一部の実施形態では、細胞の集団を、少なくとも約２倍〜少なくとも約１兆倍に拡大するか、または拡大することが可能である。例えば、細胞の集団は、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１００万倍、１０億倍、または１兆倍に拡大することができる。特定の拡大倍数は、例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、１００日間、またはこれを超えるなど、培養におけるある特定の期間にわたり生じうる。
【０１１５】
細胞は、連続的に増殖させるか、または連続的に培養することができる。連続増殖または連続培養は、細胞が、それらの健常性を維持するのに、継代および未使用の培地の添加を要求するように、細胞培養容器内で、コンフルエンスに達するか、または接近する、細胞の連続的分裂を指す。連続的に増殖させた細胞または連続的に培養された細胞は、不死化細胞と同様または同じ特色を有しうる。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも約５回の継代〜少なくとも約３００回の継代にわたり、成長および分裂を持続する。例えば、細胞は、少なくとも約１０回の継代、２０回の継代、３０回の継代、４０回の継代、５０回の継代、６０回の継代、７０回の継代、８０回の継代、９０回の継代、１００回の継代、２００回の継代、または３００回の継代にわたり、成長および分裂を持続しうる。
【０１１６】
一部の実施形態では、上皮細胞は、初期の回収およびプレーティング時には、異種上皮細胞の集団であり、１回または複数の継代の後で、同種上皮細胞の集団となる。例えば、異種上皮細胞の集団は、２回の継代の後、３回の継代の後、４回の継代の後、５回の継代の後、１０回の継代の後、２０回の継代の後、３０回の継代の後、４０回の継代の後、５０回の継代の後、または１００回もしくはこれを超える回数の継代の後に、同種上皮細胞の集団となりうる。
【０１１７】
一部の実施形態では、上皮細胞を、初期の回収およびプレーティング時に、上皮細胞の集団内に含まれるか、または存在しない、細胞型および／または分化状態により特徴付ける。一部の実施形態では、上皮細胞を、１回または複数の継代の後で、上皮細胞の集団内に含まれるか、または存在しない、細胞型および／または分化状態により特徴付ける。例えば、上皮細胞は、２回の継代の後、３回の継代の後、４回の継代の後、５回の継代の後、１０回の継代の後、２０回の継代の後、３０回の継代の後、４０回の継代の後、５０回の継代の後、または１００回もしくはこれを超える回数の継代の後で、上皮細胞の集団内に含まれるか、または存在しない、細胞型および／または分化状態により特徴付けることができる。一部の実施形態では、上皮細胞を、元になる上皮細胞集団内に含まれる細胞型および／または分化状態により特徴付ける。一部の実施形態では、上皮細胞を、拡大された上皮細胞集団内に含まれる細胞型および／または分化状態により特徴付ける。
【０１１８】
一部の実施形態では、細胞は、拡大、連続増殖、または連続培養時に、分化を経ない。例えば、細胞は、拡大、連続増殖、または連続培養時に、最終分化細胞または他の細胞型へと分化しない場合がある。一部の実施形態では、特定の臓器または分化系列の細胞は、異なる臓器または分化系列の細胞へと分化しない。例えば、気道上皮細胞は、拡大、連続増殖、または連続培養時に、線維芽細胞、腸上皮細胞、腸杯細胞、胃上皮細胞、または膵上皮細胞へと分化しない場合がある。一部の実施形態では、細胞は、拡大、連続増殖、または連続培養時に、ある程度の分化を経る。例えば、分化系列決定上皮細胞は、拡大、連続増殖、または連続培養時に、所与の分化系列内の細胞型へと分化することが可能であり、かつ／または臓器特異的上皮細胞は、所与の臓器内の他の細胞型へと分化することが可能である。
【０１１９】
一部の実施形態では、ある特定の比率の上皮細胞は、細胞が細胞周期を外れ、分裂を停止させたＧ０の静止期であってよく、静止状態および老化状態の両方を含む。ある特定の比率の上皮細胞は、細胞がサイズを増大させ、ＤＮＡ合成の準備ができたＧ１期にありうる。ある特定の比率の上皮細胞は、ＤＮＡの複製が生じるＳ期にありうる。ある特定の比率の上皮細胞は、細胞が成長を持続し、Ｍ（有糸分裂）期に入り、分裂する準備ができたＧ２期にありうる。ある特定の比率の上皮細胞は、Ｍ（有糸分裂）期にあり、細胞分裂を完結させうる。
【０１２０】
一部の実施形態では、細胞を、テロメア長により特徴付ける。一部の実施形態では、元になる上皮細胞集団内の細胞を、テロメア長により特徴付ける。一部の実施形態では、拡大された上皮細胞集団内の細胞を、テロメア長により特徴付ける。テロメア長は、細胞が分裂するにつれて短くなることが典型的である。細胞は通常、テロメアの平均長がある特定の長さ、例えば、４ｋｂへと短縮されると、分裂を停止させうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される培地中および／または培養条件下で培養される細胞の平均テロメア長は、約１０ｋｂ未満の長さまで短縮される場合があり、細胞は、分裂を持続しうる。例えば、本明細書で記載される培地中および／または培養条件下で培養される細胞の平均テロメア長は、約９ｋｂ、８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、または１ｋｂ未満の長さまで短縮される場合があり、細胞は、分裂を持続しうる。平均テロメア長は、時として、平均値テロメア長または中央値テロメア長として表される。平均テロメア長は、テロメア長を決定するのに適する任意の方法を使用して決定することができ、細胞型により変動しうる。一部の実施形態では、平均テロメア長を、単一のコピー遺伝子の存在度に対する、テロメアリピートの相対存在度として決定する。
【０１２１】
一部の実施形態では、細胞の核型を変更せずに、ある特定の数の継代の間、細胞を拡大するか、連続的に増殖させるか、または連続的に培養する。例えば、細胞の核型の変更は、染色体もしくはその部分の重複もしくは欠失、および／または１つの染色体の一部から別の染色体への転座を含みうる。核型を、ある特定の数の継代の後における細胞の集団についてアッセイし、これを、継代前における、同じ起源の細胞の集団と比較することができる。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも約５回の継代〜少なくとも約３００回の継代の後で、核型を変更していない。例えば、細胞は、少なくとも約１０回の継代、２０回の継代、３０回の継代、４０回の継代、５０回の継代、６０回の継代、７０回の継代、８０回の継代、９０回の継代、１００回の継代、２００回の継代、または３００回の継代の後で、核型を変更していない可能性がある。ある特定の場合には、ある特定の数の継代の後で、核型を変更しなかった細胞を、条件的不死化細胞と称することができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、本明細書の方法は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の使用を含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、細胞外マトリックスの使用を含まない。ＥＣＭは、ある特定の多糖、水、エラスチン、ならびに、例えば、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチン、およびラミニンなど、ある特定の糖タンパク質を含有しうる。ＥＣＭ産生細胞を培養し、任意選択で、上皮細胞をプレーティングする前に、これらの細胞を除去することにより、ＥＣＭを作出することができる。ＥＣＭ産生細胞の例は、コラーゲンおよびプロテオグリカンを産生する軟骨細胞；ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質性プロコラーゲン、およびフィブロネクチンを産生する線維芽細胞；ならびにコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、およびＶ型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、およびテネイシンＣを産生する結腸筋線維芽細胞を含む。ＥＣＭはまた、商業的に提供されてもよい。市販の細胞外マトリックスの例は、細胞外マトリックスタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、およびＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ｚ３７８６６６）などの合成細胞外マトリックス材料を含む。ある特定の場合には、細胞外マトリックス材料の混合物を使用することができる。細胞外マトリックスは、同種（本質的に単一の構成成分を含む）または異種（複数の構成成分を含む）でありうる。異種細胞外マトリックスは一般に、例えば、複数の糖タンパク質および成長因子を含む、ＥＣＭ構成成分の混合物を含む。異種細胞外マトリックスの例は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））を含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、異種細胞外マトリックスの使用を含まない。細胞外マトリックスは、規定されている（全てまたは実質的に全ての構成成分およびそれらの量が公知である）、または未規定（全てまたは実質的に全ての構成成分およびそれらの量が公知でない）でありうる。未規定の細胞外マトリックスの例は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））を含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、未規定の細胞外マトリックスの使用を含まない。
【０１２３】
一部の実施形態では、細胞を、コーティングを含む容器内で培養する。例えば、細胞を、１つまたは複数の接合因子を含有する培養槽の表面へとプレーティングすることができる。一部の実施形態では、細胞を、接合因子を伴わない培養槽の表面へとプレーティングする。接合因子を使用する実施形態では、培養容器を、コラーゲン、フィブロネクチン、およびそれらの天然または合成の断片などであるがこれらに限定されない、天然、組換え、または合成の、接合因子（単数または複数）またはそのペプチド断片であらかじめコーティングすることができる。一部の実施形態では、培養槽を、コラーゲンであらかじめコーティングする。一部の実施形態では、培養槽を、基底膜マトリックスであらかじめコーティングする。一部の実施形態では、培養槽を、同種および／または規定された細胞外マトリックスであらかじめコーティングする。
【０１２４】
細胞は、培養工程を通して、１つまたは複数の機能的特徴を維持しうる。一部の実施形態では、機能的特徴は、生来の機能的特徴でありうる。生来の機能的特徴は一般に、所与の細胞型がその天然環境（例えば、細胞を培養するために抽出される前における、対象の体内の細胞）にあるときに保有する形質を含む。生来の機能的特徴の例は、気道上皮細胞におけるガス交換能、肝上皮細胞における解毒能、腎上皮細胞における濾過能、ならびに膵島細胞におけるインスリン生成および／またはグルコース応答性を含む。一部の実施形態では、細胞は、培養工程を通して、１つまたは複数の機能的特徴を維持しない。
【０１２５】
時として、培養物中の細胞の特徴を、培養物中の細胞の集団全体について決定する。例えば、平均テロメア長、倍加時間、成長速度、分裂速度、遺伝子レベルまたはマーカーレベルなどの特徴を、例えば、培養物中の細胞の集団について決定する。特徴は、集団内の細胞を代表することが多いが、培養物中の特定の細胞についての特徴は、変動する場合もある。例えば、培養物中の細胞の集団が、４ｋｂの平均テロメア長を呈示する場合、集団内の細胞の一部は、４ｋｂのテロメア長を有する場合があり、細胞の一部は、４ｋｂを超えるテロメア長を有する場合があり、細胞の一部は、４ｋｂ未満のテロメア長を有する場合がある。細胞の集団が高レベルの特定の遺伝子またはマーカーを発現するものとして特徴付けられる別の例では、一部の実施形態では、集団内の全ての細胞が、特定の遺伝子またはマーカーを高レベルで発現し、ある特定の実施形態では、集団内の細胞の一部（例えば、細胞の少なくとも７５％）が、特定の遺伝子またはマーカーを高レベルで発現し、細胞の小さな部分が、特定の遺伝子を、中程度のレベル、低レベル、または検出不能なレベルで発現する。細胞の集団が、特定の遺伝子またはマーカーを発現しないか、低レベルで発現するものとして特徴付けられる別の例では、一部の実施形態では、集団内の細胞が、特定の遺伝子またはマーカーを、検出可能なレベルで発現せず、ある特定の実施形態では、集団内の細胞の一部（例えば、細胞の１０％未満）が、特定の遺伝子またはマーカーを、検出可能なレベルで発現する。
【０１２６】
時として、培養物中の細胞の特徴（例えば、集団倍加、マーカー発現）を、対照培養条件下で培養された細胞について観察される同じ特徴と比較する。対照培養条件下で培養された細胞について観察される特徴を比較する場合、同じ供給源に由来する、等量または実質的に等量の細胞を、ある特定の培養条件へおよび対照培養条件へと添加することが多い。対照培養条件は、同じ基本培地（例えば、無血清基本培地）、および１つまたは複数の薬剤（例えば、ＴＧＦ−ベータ阻害剤の１つまたは複数（例えば、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）、ＲＯＣＫ阻害剤、ミオシンＩＩ阻害剤、ＰＡＫ阻害剤）の１つまたは複数を除いたさらなる構成成分を含みうる。一部の実施形態では、細胞培養条件は、対照培養条件下で培養された細胞について観察される同じ特徴と比較して、培養物中の細胞の１つまたは複数の特徴（例えば、集団倍加、マーカー発現）を達成するのに必要な、ある特定の構成成分から本質的になる。細胞培養条件が、ある特定の構成成分から本質的になる場合、対照培養条件と比較して、培養物中の細胞の１つまたは複数の特徴（例えば、集団倍加、マーカー発現）に対して著明な効果を誘導体、さらなる構成成分または特色も含むことができる。このようなさらなる構成成分または特色を、非必須構成成分と称することができ、塩、ビタミン、アミノ酸、ある特定の成長因子、脂肪酸など、典型的な細胞培養構成成分を含みうる。
フィーダー細胞
【０１２７】
細胞は、フィーダー細胞を伴ってまたは伴わずに培養することができる。一般に、フィーダー細胞は、ある特定の細胞培養系のために、他の細胞型と共に共培養される細胞である。フィーダー細胞は典型的に、非増殖細胞であり、時として、増殖を阻害するように処理され、生きた、代謝的に活性な状態で維持されることが多い。例えば、フィーダー細胞は、ガンマ線照射で照射する、かつ／またはマイトマイシンＣで処理することができ、これらにより、フィーダー細胞を、代謝的に活性な状態に維持しながら、細胞分裂を停止させることができる。
【０１２８】
フィーダー細胞は、任意の哺乳動物に由来することが可能であり、フィーダー細胞の動物供給源は、培養される細胞と同じ動物供給源である必要がない。例えば、フィーダー細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長動物、およびヒトのフィーダー細胞でありうるがこれらに限定されない。フィーダー細胞の種類は、脾臓細胞、マクロファージ、胸腺細胞、および／または線維芽細胞を含みうる。フィーダー細胞の種類は、それらが支援する、同じ細胞型でありうる。フィーダー細胞の種類は、それらが支援する、同じ細胞型でない場合もある。Ｊ２細胞は、ある特定の細胞培養系のためのフィーダー細胞として使用され、確立されたＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞株に由来するマウス線維芽細胞のサブクローンである。
【０１２９】
一部の実施形態では、細胞を、フィーダー細胞の非存在下で培養する。一部の実施形態では、細胞を、フィーダー細胞により馴化された培地中で培養しない（すなわち、馴化培地中で培養しない）。一部の実施形態では、細胞を、分画フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の粒子状画分および／もしくは可溶性画分の存在下で培養しない。上記の培養条件（すなわち、フィーダー細胞の非存在下で培養する；馴化培地中で培養しない；分画フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の粒子状画分および／もしくは可溶性画分の存在下で培養しない）のいずれか１つのまたは全てを、フィーダー細胞フリー条件またはフィーダーフリー条件と称することができる。本明細書で提供される拡大培養条件は典型的に、フィーダー細胞フリー培養条件である。
培地および細胞培養物の組成
【０１３０】
細胞は、細胞培養培地の存在下で培養することが典型的である。本明細書で提供される拡大培養条件は典型的に、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、例えば、無血清培地；血清含有培地；低血清培地；タンパク質非含有培地；化学的に規定された培地；タンパク質非含有で、化学的に規定された培地；ペプチド非含有、タンパク質非含有で、化学的に規定された培地；動物タンパク質非含有培地；ゼノフリー培地など、任意の種類の培地を含みうる。細胞培養培地は典型的に、水性ベースの培地であり、例えば、ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０培地、ＲＰＭＩ  １６４０、イーグル基礎培地（ＥＢＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＫＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、前立腺上皮成長培地（ＰｒＥＧＭ；Ｌｏｎｚａ）、ＣＨＯ細胞培養培地、ＰＥＲ．Ｃ６培地、２９３培地、ハイブリドーマ培地など、およびそれらの組合せなど、市販および／または古典的な培地のいずれかを含みうる。
【０１３１】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、血清含有培地である。血清は、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清、ヤギ血清、またはヒト血清を含みうる。一般に、血清は、培地の、約１％〜約３０％の間の容量で存在する。場合によって、血清は、培地の、約０．１％〜約３０％の間の容量で存在する。一部の実施形態では、培地は、血清代替物を含有する。
【０１３２】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、無血清培地である。無血清培地は一般に、いかなる動物血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清、ヤギ血清、またはヒト血清）も含有しないが、血清アルブミン（例えば、血液から精製された）、成長因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物、および／または接合因子など、ある特定の動物由来の生成物は含有しうる。一部の実施形態では、無血清細胞培養培地は、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＫＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を含む。ＫＳＦＭは、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）を含みうる。ＫＳＦＭ基礎培地の代表的な処方は、例えば、米国特許第６６９２９６１号において記載されている。
【０１３３】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、規定された無血清培地である。規定された無血清培地を、時として、化学的に規定された無血清培地と称し、一般に、既知の濃度で存在する、同定された構成成分を含み、一般に、動物臓器抽出物（例えば、脳下垂体抽出物）、または他の未規定の動物由来の生成物（例えば、非定量化量の血清アルブミン（例えば、血液から精製された）、成長因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物、および／または接合因子）など、未規定の構成成分を含まない。規定された培地は、アミノ酸、ビタミン、無機酸、無機塩、アルカリ性のケイ酸塩、プリン、ピリミジン、ポリアミン、アルファ−ケト酸、有機硫黄化合物、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、抗酸化剤、およびエネルギー供給源（例えば、グルコース）の１つまたは複数を含有する、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、またはＲＰＭＩ  １６４０などの基礎培地を含むことが可能であり、組換えアルブミン、組換え成長因子、化学的に規定された脂質、組換えインスリンおよび／または亜鉛、組換えトランスフェリンまたは鉄、セレニウム、ならびに抗酸化性チオール（例えば、２−メルカプトエタノールまたは１−チオグリセロール）の１つまたは複数を補充することができる。組換えアルブミンおよび／または成長因子は、例えば、イネまたはＥ．ｃｏｌｉなどの非動物供給源に由来する場合があり、ある特定の場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の機能の一部を再現しうる、ポリマーであるポリビニルアルコールなどの合成化学物質を、規定された培地へと添加する。一部の実施形態では、規定された無血清培地は、ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍ７４０３）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、型番０１−０５９−１）、ＭＣＤＢ  １０５培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍ６３９５）、ＭＣＤＢ  １１０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍ６５２０）、ＭＣＤＢ  １３１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍ８５３７）、ＭＣＤＢ  ２０１培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍ６６７０）、およびそれらの改変バージョンから選択することができる。一部の実施形態では、規定された無血清培地は、ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍ７４０３）である。一部の実施形態では、規定された無血清培地は、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＣＤＢ  １５３培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、型番０１−０５９−１）である。一部の実施形態では、規定された無血清細胞培養培地は、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＫＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、ゼノフリー無血清培地である。ゼノフリーは一般に、培養される細胞の元になる動物以外の動物を元とする構成成分を有さないことを意味する。例えば、ヒト細胞を培養する場合、ゼノフリー培養物は、非ヒト動物起源の構成成分を有さない。一部の実施形態では、細胞培養培地は、規定されたゼノフリー無血清培地である。規定されたゼノフリー無血清培地を、時として、化学的に規定されたゼノフリー無血清培地と称し、一般に、既知の濃度で存在する、同定された構成成分を含み、一般に、動物臓器抽出物（例えば、脳下垂体抽出物）、または他の未規定の動物由来の生成物（例えば、血清アルブミン（例えば、血液から精製された）、成長因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物、および／または接合因子）など、未規定の構成成分を含まない。規定されたゼノフリー無血清培地は、例えば、組換えアルブミン、組換え成長因子、組換えインスリン、および／もしくは組換えトランスフェリンなどの、脂質ならびに／または動物供給源（例えば、非ヒト供給源）に由来する組換えタンパク質を含んでも含まなくてもよい。組換えタンパク質は、例えば、植物（例えば、イネ）または細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの非動物供給源に由来する場合があり、ある特定の場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の機能の一部を再現しうる合成化学物質（例えば、ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール））を、規定された培地へと添加する。一部の実施形態では、規定された無血清培地は、例えば、ＸＦ−ＫＯＳＲ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、市販のゼノフリー血清代替物を含みうる。一部の実施形態では、規定された無血清培地は、例えば、ｍＴｅＳＲ２（商標）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０（商標）もしくはＸ−Ｖｉｖｏ  １５（商標）（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＨＥＳｃＧＲＯ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）など、市販のゼノフリー基本培地を含みうる。一部の実施形態では、ゼノフリー無血清細胞培養培地は、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＫＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を含む。
【０１３５】
さらなる成分を、本明細書の細胞培養培地へと添加することができる。例えば、このようなさらなる成分は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、無機酸、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ヘパリン、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸、メタバナジウム酸アンモニウム、モリブデン酸、ケイ酸塩、アルカリ性のケイ酸塩（例えば、ナトリウムメタシリケート）、プリン、ピリミジン、ポリアミン、アルファ−ケト酸、有機硫黄化合物、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、抗酸化剤、チオクト酸、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チミジン、およびトランスフェリンを含みうる。ある特定の場合には、インスリンおよび／またはトランスフェリンは、クエン酸第二鉄または硫酸第一鉄キレートで置きかえることができる。アミノ酸は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンを含みうる。ビタミンは、例えば、ビオチン、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋２−パントテネート、Ｄ−パントテナン酸、葉酸、ｉ−イノシトール、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、およびビタミンＢ１２を含みうる。無機塩は、例えば、カルシウム塩（例えば、ＣａＣＩ２）、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＫＣＩ、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４）、マンガン塩（例えば、ＭｎＣｌ２）、酢酸ナトリウム、ＮａＣＩ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ならびにセレニウム、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、および亜鉛を含む、ある特定の微量元素のイオンを含みうる。これらの微量元素は、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮＨ４ＶＯ３、ＮｉＳＯ４、ＳｎＣＩ、およびＺｎＳＯなどの塩の形態を含む、様々な形態で提供することができる。さらなる成分は、例えば、ヘパリン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる、少なくとも１つの薬剤、少なくとも１つの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０４１４１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０９９１９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ１４２１０）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ６１ＣＶ５）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ３ＭＩ８６）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｂ９ＥＧＶ５）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：ＱＯＰ６Ｎ６）、エピレグリン（ＥＲＧ）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：０１４９４４）、ベータセルリン（ＢＣ）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８６ＵＦ５）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ２０８０９）、コラーゲン、およびヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ１４４８７）を含みうる。
【０１３６】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、カルシウムを含む。一部の実施形態では、カルシウムは、約２ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、２ｍＭを下回る濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、約１ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、１ｍＭを下回る濃度で存在する。例えば、カルシウムは、２ｍＭを下回る、１ｍＭを下回る、９００μＭを下回る、８００μＭを下回る、７００μＭを下回る、６００μＭを下回る、５００μＭを下回る、４００μＭを下回る、３００μＭを下回る、２００μＭを下回る、１００μＭを下回る、９０μＭを下回る、８０μＭを下回る、７０μＭを下回る、６０μＭを下回る、５０μＭを下回る、４０μＭを下回る、３０μＭを下回る、２０μＭを下回る、または１０μＭを下回る濃度で存在しうる。一部の実施形態では、カルシウムは、５００μＭを下回る濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、３００μＭを下回る濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、１００μＭを下回る濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、２０μＭを下回る濃度で存在する。一部の実施形態では、カルシウムは、約９０μＭの濃度で存在する。
【０１３７】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、アルブミン（例えば、血清アルブミン）を含む。アルブミンは、脊椎動物の血液中で一般に豊富なタンパク質である。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。アルブミンは、精製することもでき（例えば、ヒト血清またはウシ血清から）、例えば、植物（例えば、イネ）、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内などで、組換えにより生成することもできる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、イネにおいて生成された、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数の脂質を含む。脂質は一般に、油、脂肪、蝋、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫ）、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、プレノール脂質などを指し、脂質の混合物（例えば、化学的に規定された脂質混合物）を含みうる。一部の実施形態では、脂質は、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−アルファ−トコフェロール酢酸エステル、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ  ８０）、ＴＷＥＥＮ  ２０、肝油脂肪酸（メチルエステル）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｄ−α−トコフェロール酢酸エステルから選択することができる。一部の実施形態では、脂質は、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の１つまたは複数を含みうる。一部の実施形態では、脂質ミックスは、市販の脂質ミックス（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）；Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ５１４６）；Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ０２８８））でありうる。一部の実施形態では、脂質ミックスは、市販のアルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１０２０−０３９））により供給される脂質の混合物を含みうる。
【０１３９】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数のマイトジェン性成長因子を含む。例えば、マイトジェン性成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、および／または角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含みうる。一部の実施形態では、培地は、マイトジェン性成長因子を含まない。
【０１４０】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数のマイトジェン性補充物質を含む。例えば、マイトジェン性補充物質は、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）、ＧＥＭ２１  ＮＥＵＲＯＰＬＥＸ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、およびＮ２  ＮＥＵＲＯＰＬＥＸ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含みうる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、マイトジェン性補充物質を含まない。
【０１４１】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤を含む。例えば、細胞培養培地は、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト（例えば、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト）を含みうる。ベータ−アドレナリン作動性アゴニスト（例えば、ベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト）は一般に、ベータアドレナリン受容体（例えば、ベータ−１アドレナリン作動性受容体、ベータ−２アドレナリン作動性受容体、ベータ−３アドレナリン作動性受容体）を活性化させる、交感神経様作用剤のクラスである。ベータアドレナリン受容体の活性化は、アデニル酸シクラーゼを活性化させ、これは、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の活性化をもたらす。ベータ−アドレナリン作動性アゴニスト（例えば、ベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト）は、例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、ドブタミン、キサモテロール、サルブタモール（ＡＬＢＵＴＥＲＯＬ）、レボサルブタモール（ＬＥＶＡＬＢＵＴＥＲＯＬ）、フェノテロール、フォルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、イソエタリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブタミン、ベフノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメンタン、ブロキサテロール、シマテロール、シラゾリン、デノパミン、ドペキサミン、エチレフリン、ヘキソプレナリン、ヒゲナミン、イソクスプリン、マブテロール、メトキシフェナミン、ニリドリン、オキシフェドリン、プレナルテロール、ラクトパミン、レプロテロール、リミテロール、トレトキノール、ツロブテロール、ジルパテロール、およびジンテロールを含みうる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、イソプロテレノールを含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、イソプロテレノールを、約０．５μＭ〜約２０μＭの間の濃度で含む。例えば、イソプロテレノールは、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．２５μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、または約１５μＭの濃度で存在しうる。
【０１４２】
細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる他の薬剤は、細胞内ｃＡＭＰレベルの直接的な上昇を誘導する薬剤（例えば、ジブチリルｃＡＭＰ）、細胞内Ｇタンパク質との相互作用により、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こす薬剤（例えば、コレラ毒素およびフォルスコリン）、およびｃＡＭＰホスホジエステラーゼの活性を阻害することにより、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こす薬剤（例えば、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）およびテオフィリン）を含みうる。
【０１４３】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、以下：Ｗｎｔアゴニスト、ベータ−カテニンアゴニスト、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチン酸アミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８阻害剤、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＢＺ、ＤＡＰＴ、インターロイキン６（ＩＬ６）、またはエフリンＡ５（ＥｆｎＡ５）の１つまたは複数を含まない。
【０１４４】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数の阻害剤を含む。阻害剤は、例えば、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）、１つまたは複数のｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）、および１つまたは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、１つまたは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）を含みうる。このような阻害剤のクラスについては、下でさらに詳細に論じる。阻害剤は、低分子阻害剤（例えば、有機低分子）、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、天然または修飾基質、酵素、受容体、ペプチド模倣体、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーなど、およびこれらの構造的または機能的模倣体の形態でありうる。阻害剤は、競合的に、非競合的に、不競合的に、または混合型阻害により作用しうる。例えば、ある特定の実施形態では、阻害剤は、標的キナーゼ（例えば、タンパク質キナーゼ）のＡＴＰ結合ポケットの競合的阻害剤でありうる。一部の実施形態では、阻害剤は、１つまたは複数の受容体の活性を破壊する。一部の実施形態では、阻害剤は、１つまたは複数の受容体−リガンド間相互作用を破壊する。一部の実施形態では、阻害剤は、その標的に結合し、その活性を低減しうる。一部の実施形態では、阻害剤は、その標的に結合し、その活性を、対照と比較して、約１０％またはこれを超えて低減しうる。例えば、阻害剤は、その標的に結合し、その活性を、対照と比較して、約２０％もしくはこれを超えて、３０％もしくはこれを超えて、４０％もしくはこれを超えて、５０％もしくはこれを超えて、６０％もしくはこれを超えて、７０％もしくはこれを超えて、８０％もしくはこれを超えて、９０％もしくはこれを超えて、９５％もしくはこれを超えて、または９９％もしくはこれを超えて低減しうる。阻害は、例えば、細胞アッセイを使用して評価することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、阻害剤は、キナーゼ阻害剤（例えば、タンパク質キナーゼ阻害剤）である。その標的の生物学的または生化学的機能を阻害するキナーゼ阻害剤の有効性は、ＩＣ５０値として表すことができる。ＩＣ５０は一般に、キナーゼを５０％阻害するのに、どのくらいの特定の阻害剤が要求されるのかを指し示す。一部の実施形態では、阻害剤は、１０００ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、５００ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、４００ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、３００ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、２００ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、１００ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、５０ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、２０ｎＭと等しいかもしくはこれ未満、または１０ｎＭと等しいかもしくはこれ未満のＩＣ５０値を有する。
【０１４６】
一部の実施形態では、阻害剤は、１つまたは複数の細胞の活性、機能、または特徴に、直接的または間接的に影響を及ぼしうる。例えば、阻害剤は、培養される細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素の発現を、例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路の阻害を介して誘導しうる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、培養される細胞内の、テロメラーゼ逆転写酵素の発現を活性化させる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、培養される細胞内の、テロメラーゼ逆転写酵素の発現を活性化させる。ある特定の実施形態では、Ａ８３−０１は、培養される細胞内の、テロメラーゼ逆転写酵素の発現を活性化させる。別の例では、阻害剤は、培養される細胞内の細胞骨格構造を、例えば、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）、および／またはミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））の阻害を介してモジュレートしうる。細胞骨格構造のモジュレーションは、例えば、アクチンによるマイクロフィラメント、チューブリンによる微小管、および中間径フィラメントを含む、細胞骨格構造の任意の態様の改変、これらに対する破壊、もしくはこれらの変化；または分子モーター、架橋剤、キャッピングタンパク質、および核化促進因子など、任意の関連タンパク質との相互作用を含みうる。ある特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、培養される細胞内の細胞骨格構造をモジュレートする。ある特定の実施形態では、Ｙ−２７６３２は、培養される細胞内の細胞骨格構造をモジュレートする。ある特定の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、培養される細胞内の細胞骨格構造をモジュレートする。ある特定の実施形態では、ＩＰＡ３は、培養される細胞内の細胞骨格構造をモジュレートする。ある特定の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）は、培養される細胞内の細胞骨格構造をモジュレートする。ある特定の実施形態では、ブレビスタチンは、培養される細胞内の細胞骨格構造をモジュレートする。
ＴＧＦ−ベータ阻害剤
【０１４７】
一部の実施形態では、本明細書の方法は、培養される上皮細胞内の、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害するステップを含む。ＴＧＦ−ベータシグナル伝達は、様々な細胞型における、増殖、細胞の分化、および他の機能を制御し、ある特定の細胞型における、細胞周期の制御、免疫系の調節、および発生で役割を果たしうる。ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の阻害は、任意のＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路、ならびに／またはＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック、およびＶｇ−１などのリガンド；Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体、ＩＩ型ＴＧＦ−ベータ受容体、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ８などの受容体；ならびにＲ−ＳＭＡＤ、および他のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）などの下流のエフェクターを含む、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーの阻害を含みうる。
【０１４８】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体の活性を阻害する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を阻害する。一部の実施形態では、Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体を阻害する。Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ８の１つまたは複数を含みうる。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ受容体は、ＡＬＫ５である。
【０１４９】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＳＭＡＤタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体、および１つまたは複数のＴＧＦ−ベータリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体、および１つまたは複数のＳＭＡＤタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を破壊する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−ＳＭＡＤ間相互作用を破壊する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、ＴＧＦ−ベータ受容体のリン酸化または自己リン酸化を遮断する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体の脱リン酸化を促進する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＳＭＡＤタンパク質のリン酸化を遮断する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＳＭＡＤタンパク質の脱リン酸化を促進する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体のユビキチン媒介性分解を促進する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、１つまたは複数のＳＭＡＤタンパク質のユビキチン媒介性分解を促進する。一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、ＳＭＡＤの核移行、ＳＭＡＤの核シャッフリング、ＳＭＡＤの、共活性化因子との相互作用などに影響を及ぼす。ある特定の場合には、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を、ＳＭＡＤレポーターアッセイにより測定することができる。
【０１５０】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）は、ＡＬＫ５阻害剤でありうる。ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５、または１つもしくは複数のＡＬＫ５リガンド、あるいはこれらの両方に結合しうる。ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５、または１つもしくは複数の下流のＳＭＡＤタンパク質、あるいはこれらの両方に結合しうる。ＡＬＫ５阻害剤は、１つまたは複数のＡＬＫ５−リガンド間相互作用を破壊する場合もあり、１つまたは複数のＡＬＫ５−ＳＭＡＤ間相互作用を破壊する場合もある。一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＭＡＤ２のリン酸化を遮断する。
【０１５１】
ＡＬＫ５阻害剤は、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含みうる。一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＴＰ類似体である。一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、式Ａ：
【化１】
2018532389.tif 000003
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール（hetercycloaryl）、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
置換アルキル基、置換アルコキシ基、置換アルカノイル基、置換アルコキシカルボニル基、置換シクロアルキル基、置換アリール基、置換シクロアリール基、置換複素環基、または置換ヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む。
【０１５２】
ＡＬＫ５阻害剤は、例えば、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ＧＷ７８８３８８（４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド）、ＲｅｐＳｏｘ（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、およびＳＢ  ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）を含みうる。一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、Ａ８３−０１である。
アルブミン
【０１５３】
一部の実施形態では、本明細書の培養条件は、１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む。規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、例えば、アルブミンタンパク質、アルブミンタンパク質の機能的断片、アルブミンタンパク質と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質、アルブミンの１つまたは複数の機能的形質を有するタンパク質、アルブミンの対立遺伝子変異体、貯蔵アルブミン、アルブミノイド、オボアルブミン、および血中輸送タンパク質を含みうる。血中輸送タンパク質は一般に、例えば、ホルモン、塩、胆汁塩、脂肪酸（例えば、遊離脂肪酸）、カルシウム、ナトリウム、カリウム、イオン、トランスフェリン、ヘマチン、トリプトファン、ビリルビン（例えば、非抱合ビリルビン）、サイロキシン（Ｔ４）、ビタミン、およびある特定の薬物など、可溶性が低い分子および元素のための担体として、血液（例えば、血清、血漿）中で機能する。血中輸送タンパク質は、例えば、血清アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合性タンパク質、およびアファミンを含みうる。規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は一般に、未規定の臓器抽出物および他の未規定の混合物を除外する。
【０１５４】
一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、血清アルブミンを含む。血清アルブミンは、肝臓内で生成される分泌タンパク質であり、一般に、血中で豊富に見出される。血清アルブミンは典型的に、血液容量を調節し（例えば、血液の膠質浸透圧（すなわち、コロイド浸透圧）を維持することにより）、一般に、例えば、脂溶性ホルモン、胆汁塩、非抱合ビリルビン、遊離脂肪酸、カルシウム、イオン、トランスフェリン、ヘマチン、トリプトファン、およびある特定の薬物（例えば、ワルファリン、フェノブタゾン、クロフィブレート、フェニトインなど）など、水溶性が低い分子および元素の担体として働きうる。ある特定の場合には、血清アルブミンは、抗酸化剤および／または抗凝固剤として作用することが可能であり、血漿ｐＨ緩衝液として働きうる。
【０１５５】
一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、ヒト血清アルブミンを含む。一部の実施形態では、ヒト血清アルブミンは、以下のアミノ酸配列：
【化２】
2018532389.tif 000004
を含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、ヒト血清アルブミンは、以下のアミノ酸配列：
【化３】
2018532389.tif 000005
を含む。
【０１５７】
全長ヒト血清アルブミンは一般に、成熟全長ヒト血清アルブミンタンパク質、またはこのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。成熟全長ヒト血清アルブミンタンパク質は、約５８５アミノ酸（Ｎ末端のプロ配列およびプレプロ配列を除去した後）であり、配列番号２として提供される。プレプロヒト血清アルブミンの配列（Ｎ末端のプロおよびプレプロ配列を除去する前）は、６０９アミノ酸であり、配列番号１として提供される。ある特定の個々の残基の同定は、対立遺伝子分岐に起因して、配列番号１および２に提示される同定から変動する場合がある。対立遺伝子変異は、例えば、配列番号２における位置と比べて番号付けされた、残基４１０におけるＲからＣ；残基４６６におけるＫからＥ；残基４７９におけるＥからＫ；残基４９４におけるＤからＮ；残基５０１におけるＥからＫ；残基５０５におけるＥからＫ；残基５３３におけるＶからＭ；残基５３６におけるＫからＥ；残基５４１におけるＫからＥ；残基５５０におけるＤからＡまたはＤからＧ；残基５６０におけるＫからＥ；残基５６３におけるＤからＮ；残基５６５におけるＥからＫ；残基５７０におけるＥからＫ；残基５７３におけるＫからＥ；残基５７４におけるＫからＥ；残基５７２〜５８５におけるＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号３）からＰＴＭＲＩＲＥＲＫ（配列番号４）；および残基５７５〜５８５におけるＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号５）からＴＣＣＣＫＳＳＣＬＲＬＩＴＳＨＬＫＡＳＱ  ＰＴＭＲＩＲＥＲＫ（配列番号６）を含みうる。
【０１５８】
一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンを含む。例えば、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と、約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％またはこれを超えて同一なアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンを含みうる。
【０１５９】
一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、組換えにより生成されたアルブミンを含む。例えば、アルブミンは、植物（例えば、イネ）、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、組換えにより生成することができる。一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）を含む。一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、規定されたゼノフリーの血清代替構成成分は、アルブミンタンパク質の機能的断片を含む。機能的断片は一般に、例えば、血液容量を調節する、および／またはキャリアタンパク質として働く能力など、全長アルブミンの１つまたは複数の機能を保持する。場合によって、機能的断片は、全長アルブミンの機能レベルの、少なくとも約５０％のレベルで機能を果たす。場合によって、機能的断片は、全長アルブミンの機能レベルの、少なくとも約７５％のレベルで機能を果たす。場合によって、機能的断片は、全長アルブミンの機能レベルの、少なくとも約９０％のレベルで機能を果たす。場合によって、機能的断片は、全長アルブミンの機能レベルの、少なくとも約９５％のレベルで機能を果たす。アルブミンの機能レベルは例えば、例えばアルブミン結合アッセイ（例えば、アルブミンの、有色色素のアニオン形態（例えば、メチルオレンジ、ＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）−安息香酸）、ブロムクレゾールグリーンなど）への結合）；疎水性化合物の結合およびその後の可溶化；アルブミンの、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合；ならびに他のリガンド−アルブミン結合アッセイ（例えば、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８４７６０８１号に記載されている部位特異的蛍光プローブを使用する）など、アルブミンに適する任意の機能アッセイを使用して評価することができる。
レチノイン酸シグナル伝達阻害剤
【０１６１】
一部の実施形態では、本明細書の培養条件は、レチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤を含む。レチノイン酸は、主に、脊索動物における成長および発生に要求される、ビタミンＡの機能を媒介する、ビタミンＡ（レチノール）の代謝物である。レチノイン酸シグナル伝達は一般に、早期胚発生時に機能し、胚の後方部分の発生を導く、細胞間シグナル伝達分子として働くことにより、胚の前方／後方軸に沿った位置を決定する一助となる。
【０１６２】
レチノイン酸は一般に、レチノイン酸応答エレメント（ＲＡＲＥ）と呼ばれる領域内のレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合する、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）に結合することにより作用する。レチノイン酸リガンドの、ＲＡＲへの結合は、ＲＡＲのコンフォメーションを変更し、これは、近傍の遺伝子（Ｈｏｘ遺伝子および他のいくつかの標的遺伝子を含む）の転写を誘導または抑制する他のタンパク質の結合に影響を及ぼす。レチノイン酸受容体は、様々な細胞型の分化を制御する、異なる遺伝子のセットの転写を媒介することが可能であり、したがって、調節される標的遺伝子は典型的に、標的細胞に依存する。一部の細胞では、標的遺伝子の１つは、レチノイン酸受容体自体の遺伝子（哺乳動物では、ＲＡＲ−ベータ）であり、これにより応答が増幅される。レチノイン酸レベルの制御は、レチノイン酸の合成および分解を制御する、一連のタンパク質により維持される。
【０１６３】
一部の実施形態では、本明細書の培養条件は、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む。ＲＡＲアンタゴニストは、ＲＡＲαアンタゴニスト、ＲＡＲβアンタゴニスト、および／またはＲＡＲγアンタゴニストを含むことが可能であり、ＲＡＲアンタゴニストは、汎ＲＡＲアンタゴニストを含みうる。ＲＡＲアンタゴニストの非限定的な例は、ＢＭＳ−４５３、ＢＭＳ−１９５６１４、ＢＭＳ  ４９３、ＡＧＮ  １９３１０９−ｄ７、ＡＧＮ  １９３１０９、ＡＧＮ  １９４３１０、ＡＧＮ  １９４４３１、ＡＧＮ  １９４３０１、ＣＤ  ２６６５、ＥＲ  ５０８９１、ＬＥ  １３５、およびＭＭ  １１２５３を含む。一部の実施形態では、本明細書の培養条件は、さらなる機構（例えば、レチノイン酸の産生および／または代謝に影響を及ぼすことによる）として、レチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達阻害剤（例えば、受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト）を、マイクロモル未満の濃度で使用する。例えば、レチノイン酸シグナル伝達阻害剤は、１マイクロモルを下回る、１００ナノモルを下回る、または１０ナノモルを下回る濃度で使用することができる。
ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤
【０１６５】
一部の実施形態では、本明細書の方法は、培養される上皮細胞内の、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害するステップを含む。セリン／トレオニンｐ２１活性化キナーゼのファミリーである、ＰＡＫタンパク質は、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、およびＰＡＫ４を含み、一般に、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーを、細胞骨格の再編成および核内のシグナル伝達と連関させるように機能する。これらのタンパク質は、Ｃｄｃ４２およびＲａｃの標的であり、多様な生物学的活性において機能しうる。ＰＡＫ１は、例えば、細胞の運動および形状を調節しうる。一部の実施形態では、本明細書の方法は、培養される上皮細胞内の、ＰＡＫ１の活性を阻害するステップを含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、ＰＡＫ１タンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、１つまたは複数のＰＡＫ１活性化因子（例えば、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ）に結合する。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、ＰＡＫ１の、１つまたは複数の下流のエフェクターに結合する。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、ＰＡＫ１タンパク質、および１つまたは複数のＰＡＫ１活性化因子（例えば、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ）に結合する。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、１つまたは複数のＰＡＫ１−活性化因子間相互作用を破壊する。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、１つまたは複数のＰＡＫ１−エフェクター間相互作用を破壊する。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、自己調節性機構をターゲティングし、ＰＡＫ１の不活性コンフォメーションを促進する。
【０１６７】
ＰＡＫ１阻害剤は、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含みうる。ＰＡＫ１阻害剤は、例えば、ＩＰＡ３（１，１’−ジチオジ−２−ナフトール（naphthtol））、ＡＧ−１４７８（Ｎ−（３−クロロフェニル）−６，７−ジメトキシ−４−キナゾリンアミン（quinazolinanine））、ＦＲＡＸ５９７（６−［２−クロロ−４−（１，３−チアゾール−５−イル）フェニル］−８−エチル−２−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）アニリノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）、ＦＲＡＸ４８６（６−（２，４−ジクロロフェニル）−８−エチル−２−［［３−フルオロ−４−（１−ピペラジニル）フェニル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン）、およびＰＦ−３７５８３０９（（Ｓ）−Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）−１−フェニルエチル）−６，６−ジメチル−３−（（２−メチルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）−４，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−５（１Ｈ）−カルボキサミド）を含みうる。一部の実施形態では、ＰＡＫ１阻害剤は、ＩＰＡ３である。
ミオシンＩＩ阻害剤
【０１６８】
一部の実施形態では、本明細書の方法は、培養される上皮細胞内の、ミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））の活性を阻害するステップを含む。ミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））は、ＡＴＰ依存性モータータンパク質ファミリーのメンバーであり、筋収縮および他の運動過程（例えば、アクチンベースの運動）において役割を果たす。非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）は、アクチン架橋および収縮特性を有し、その軽鎖および重鎖のリン酸化により調節されるアクチン結合性タンパク質である。その位置が、収束性シグナル伝達経路の下流にあるため、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）は、細胞接着、細胞遊走、および組織構築の制御に関与する。高等真核生物では、非筋ミオシンＩＩは、Ｓｅｒ１９／Ｔｈｒ１８における、その調節的軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化により活性化する。ＭＬＣのリン酸化は、アクトミオシン収縮装置のアセンブリーおよびその収縮性の両方を制御する。２つの群の酵素が一般に、ＭＬＣのリン酸化を制御する。一方の群は、ＭＬＣをリン酸化するキナーゼ（ＭＬＣキナーゼ）を含み、活性を促進し、他方の群は、ＭＬＣを脱リン酸化するホスファターゼであり、活性を阻害する。いくつかのキナーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｓｅｒ１９／Ｔｈｒ１８で、ＭＬＣをリン酸化することが可能であり、場合によって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても可能である。これらは、例えば、ＭＬＣＫ、ＲＯＣＫ、ＰＡＫ（ｐ２１活性化キナーゼ）、シトロンキナーゼ、ＩＬＫ（インテグリン結合型キナーゼ）、ＭＲＣＫ（筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ関連ｃｄｃ４２結合性キナーゼ）、およびＤＡＰＫ（ＺＩＰＫを含む、細胞死関連タンパク質キナーゼ）を含む。平滑筋細胞および非筋細胞内に存在する、主要なミオシンホスファターゼは、３つのサブユニット：１３０ｋＤａの大型サブユニット（ミオシンホスファターゼターゲティングサブユニットＭＹＰＴ１と称する（また、Ｍ１３０／１３３、Ｍ１１０、またはＭＢＳとも呼ばれる））、３８ｋＤａの触媒性サブユニット（１型タンパク質ホスファターゼのδアイソフォーム、ＰＰ１ｃ）、および２０ｋＤａの小型サブユニットを含む。Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、ＭＹＰＴ１を阻害し、ＭＬＣを直接リン酸化することにより、ミオシンＩＩを活性化させうる。ＰＡＫ１は、非定型的なタンパク質キナーゼＣ（ａＰＫＣζ）のリン酸化により、ミオシンＩＩを活性化させうる。
【０１６９】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）を含む。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシンＩＩタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシンヘッド構造に結合する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシン−ＡＤＰ−Ｐｉ複合体に結合する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ活性を破壊する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシンＩＩへの結合について、ＡＴＰと競合する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシン亜断片１への結合について、ヌクレオチドと競合する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシンＩＩ−アクチン間結合を破壊する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ミオシンヘッドの、アクチンおよび／または基質との相互作用を破壊する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ＡＴＰ誘導性アクトミオシン解離を破壊する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ホスフェートの放出過程に干渉する。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、堅固なアクトミオシン架橋を阻止する。
【０１７０】
ミオシンＩＩ阻害剤（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）は、１つまたは複数の低分子ミオシンＩＩ阻害剤（例えば、低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）を含みうる。ミオシンＩＩ阻害剤は、例えば、ブレビスタチン（（±）−１，２，３，３ａ−テトラヒドロ−３ａ−ヒドロキシ−６−メチル−１−フェニル−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］キノリン−４−オン）、およびその類似体（例えば、パラ−ニトロブレビスタチン、（Ｓ）−ニトロ−ブレビスタチン、Ｓ−（−）−７−デスメチル−８−ニトロブレビスタチンなど）、ＢＴＳ（Ｎ−ベンジル−ｐ−トルエンスルホンアミド）、およびＢＤＭ（２，３−ブタンジオンモノオキシム）を含みうる。一部の実施形態では、ミオシンＩＩ阻害剤は、ブレビスタチンである。
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）阻害剤
【０１７１】
一部の実施形態では、本明細書の方法は、培養される上皮細胞内の、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）の活性を阻害するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、培養される上皮細胞内の、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）の活性を阻害するステップを含まない。Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）は、Ｒｈｏキナーゼ、Ｒａｃ１キナーゼ、およびＣｄｃ４２キナーゼを含む、タンパク質のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼファミリーに属する。Ｒｈｏのエフェクター分子は、ＲｈｏのＧＴＰ結合形態に結合するセリン／トレオニンキナーゼである、ＲＯＣＫである。セリン／トレオニンキナーゼに特徴的な保存的モチーフを含む、ＲＯＣＫの触媒性のキナーゼドメインは、Ｎ末端に見出される。ＲＯＣＫタンパク質はまた、Ｒｈｏ結合性ドメイン（ＲＢＤ）を含む、中央部のコイルドコイルドメインも有する。Ｃ末端は、内部システインリッチドメインを伴う、プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを含有する。コイルドコイルドメインは、他のアルファヘリックスタンパク質と相互作用すると考えられる。コイルドコイルドメイン内に位置するＲＢＤは、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣを含む、活性化Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼと相互作用する。ＰＨドメインは、アラキドン酸およびスフィンゴシルホスホリルコリンなどの脂質メディエーターと相互作用し、タンパク質の局在化において役割を果たすと考えられる。ＰＨドメインおよびＲＢＤの、キナーゼドメインとの相互作用は、自己阻害性ループを結果としてもたらす。加えて、キナーゼドメインは、ＲＯＣＫ活性の負の調節因子である、ＲｈｏＥへの結合にも関与する。
【０１７２】
ＲＯＣＫファミリーは、ＲＯＣＫ１（ＲＯＫ−ベータまたはｐ１６０ＲＯＣＫとしてもまた公知）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫ−アルファとしてもまた公知）を含む。ＲＯＣＫ１は、約１３５４アミノ酸の長さであり、ＲＯＣＫ２は、約１３８８アミノ酸の長さである。ヒトＲＯＣＫ１およびヒトＲＯＣＫ２のアミノ酸配列は、それぞれ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）受託番号：Ｑ１３４６４および０７５１１６に見出すことができる。ヒトＲＯＣＫ１およびヒトＲＯＣＫ２のヌクレオチド配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００５４０６．２およびＮＭ＿００４８５０に見出すことができる。様々な動物に由来するＲＯＣＫ１タンパク質およびＲＯＣＫ２タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースにいずれにおいても見出すことができる。
【０１７３】
両方のＲＯＣＫアイソフォームは、組織内で遍在的に発現するが、それらは、一部の組織内で異なる強度を呈示する。例えば、ＲＯＣＫ２が、脳および骨格筋においてより多く見られるのに対し、ＲＯＣＫ１は、肝臓、精巣、および腎臓においてより豊富である。いずれのアイソフォームも、血管平滑筋および心臓において発現する。静止状態では、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２のいずれも、主に、細胞質ゾルにあるが、Ｒｈｏが活性化すると、膜へと移行する。Ｒｈｏ依存性のＲＯＣＫ活性化は、高度に細胞型依存性であり、ＲＯＣＫ活性は、収縮性の変化、細胞透過性、遊走、増殖からアポトーシスまでを含む、いくつかの異なる機構により調節される。いくつかのＲＯＣＫ基質が同定されている（例えば、それらの全てが参照により組み込まれる、HuおよびLee、Expert  Opin.  Ther.  Targets、９巻：７１５〜７３６頁（２００５年）；Loirandら、Cir.  Res.、９８巻：３２２〜３３４頁（２００６年）；ならびにRientoおよびRidley、Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Bioi.、４巻：４４６〜４５６頁（２００３年）を参照されたい）。場合によって、ＲＯＣＫは、ＧＴＰ結合Ｒｈｏの結合を介して活性化した後で、ＬＩＭキナーゼおよびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）ホスファターゼをリン酸化する。
【０１７４】
Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）の活性の阻害は、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２の少なくとも１つの、活性の低減、機能の低減、または発現の低減を含みうる。活性、機能、または発現は、完全に抑制することもでき（すなわち、活性、機能、または発現なし）、活性、機能または発現を、処置細胞において、非処置細胞と対比して低下させることもできる。一部の実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）の活性の阻害は、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２が、活性化しないか、またはその活性が、非処置細胞と比較して低減されるように、ＲＯＣＫ１経路および／またはＲＯＣＫ２経路の上流のエフェクター、例えば、ＧＴＰ結合Ｒｈｏの遮断を伴う。他の上流のエフェクターは、インテグリン、ＴＧＦ−ベータおよびＥＧＦＲを含むがこれらに限定されない成長因子受容体、カドヘリン、Ｇタンパク質共役受容体などを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）の活性の阻害は、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２が、いかなるシグナルも伝搬できないか、または非処置細胞と比較して低減されたシグナルだけを伝搬しうるように、活性化ＲＯＣＫ１および／または活性化ＲＯＣＫ２の、下流のエフェクター分子の活性、機能、または発現の遮断を伴う。下流のエフェクターは、ビメンチン、ＬＩＭＫ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ＮＨＥＩ、コフィリンなどを含むがこれらに限定されない。
【０１７５】
一部の実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ）の活性の阻害は、１つまたは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、１つまたは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）の使用を含みうる。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）は、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）を含みうる。分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）の例は、例えば、それらの各々が市販されている、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）、ＳＲ  ３６７７（Ｎ−［２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−カルボキサミド二塩酸塩）、チアゾビビン（Ｎ−ベンジル−［２−（ピリミジン−４−イル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド）、ＨＡ１１００塩酸塩（１−［（１，２−ジヒドロ−１−オキソ−５−イソキノリニル）スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン塩酸塩）、ＨＡ１０７７（塩酸ファスジル）、およびＧＳＫ−４２９２８６（４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−メチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジンカルボキサミド）を含む。さらなる低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）は、例えば、それらの全ての内容が参照により組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ０３／０５９９１３号、同第ＷＯ０３／０６４３９７号、同第ＷＯ０５／００３１０１号、同第ＷＯ０４／１１２７１９号、同第ＷＯ０３／０６２２２５号、および同第ＷＯ０３／０６２２２７号において記載されており、米国特許第７，２１７，７２２号および同第７，１９９，１４７号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２２０３５７号、同第２００６／０２４１１２７号、同第２００５／０１８２０４０号、および同第２００５／０１９７３２８号において記載されている、低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む。
後続の環境
【０１７６】
一部の実施形態では、一定の長さの時間の後、細胞を上で記載した培養条件から取り出し、後続の環境に置くことができる。後続の環境では、上で記載した構成成分のいずれかが、非存在でありうる。一部の実施形態では、後続の環境では、上記で記載した１つまたは複数の阻害剤は、非存在である。例えば、後続の環境では、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤）、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＡＫ１阻害剤、ミオシンＩＩ阻害剤（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）、およびレチノイン酸シグナル伝達阻害剤の１つまたは複数は、非存在でありうる。
【０１７７】
後続の環境は、細胞の分化を促進する環境でありうる。後続の環境は、細胞が由来する元の臓器または組織と、同様または同一のｉｎ  ｖｉｖｏ環境（例えば、自家インプラント）でありうる。後続の環境は、細胞が由来した元の臓器または組織の、ある特定の生化学的特性または生理学的特性に酷似する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境またはｅｘ  ｖｉｖｏ環境でありうる。後続の環境は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで分化を促進することが公知の因子を細胞培養物へと添加したような、合成環境でありうる。例えば、カルシウムまたはさらなるカルシウムを、細胞培養物へと添加して、分化を促進することができる。一部の実施形態では、細胞培養培地中のカルシウム濃度を、少なくとも約１ｍＭとして、分化を促進するように、カルシウムを添加することができる。例えば、細胞培養培地中のカルシウム濃度は、少なくとも約１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、または２．０ｍＭでありうる。一部の実施形態では、細胞培養培地中のカルシウム濃度を、約１．５ｍＭとして、分化を促進するように、カルシウムを細胞培養物へと添加する。
【０１７８】
一部の実施形態では、細胞が由来した元の臓器または組織の細胞への、細胞の分化を刺激するのに特異的な後続の環境に、細胞を置く。一部の実施形態では、細胞を、透過膜の一方の側へと播種することができる。一部の実施形態では、透過膜の一方の側で培養された細胞は、空気へと曝露されうる一方で、透過膜の他方の側から栄養物を受け取るので、このような培養を、気液界面と称することができる。場合によって、細胞は、気液界面分化時に、経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大をもたらす。一部の実施形態では、細胞を、後続の環境において、天然または合成の三次元細胞培養表面内または三次元細胞培養表面上へと播種することができる。三次元表面の非限定的な例は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングされた培養表面である。一部の実施形態では、細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）または他のハイドロゲル中に包埋することができる。他の三次元培養環境は、例えば、ハイドロゲルなど、任意の立体形状にある、コラーゲンゲルおよび／または合成生体ポリマー材料を含む表面を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、上皮細胞は、培養物中で、タイトジャンクションを形成する。タイトジャンクションは一般に、流体に対して、不透過性または実質的に不透過性の障壁を形成するように共に接合される、細胞膜の部分である。タイトジャンクションの形成は、例えば、タイトジャンクションタンパク質（例えば、ＺＯ−１）の免疫蛍光染色により視覚化することができる。一部の実施形態では、上皮細胞を、培養物中で、タイトジャンクションを形成するように誘導することができる。例えば、上皮細胞を、ある特定のカルシウム濃度へと曝露された場合に、タイトジャンクションを形成するように誘導することができる。一部の実施形態では、上皮細胞を、約１ｍＭまたはこれを超えるカルシウム濃度へと曝露された場合に、タイトジャンクションを形成するように誘導することができる。例えば、上皮細胞を、約１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、またはこれを超えるカルシウム濃度へと曝露された場合に、タイトジャンクションを形成するように誘導することができる。一部の実施形態では、上皮細胞を、約１．５ｍＭのカルシウム濃度へと曝露された場合に、タイトジャンクションを形成するように誘導することができる。
【０１８０】
一部の実施形態では、上皮細胞は、培養物中で、ドーム構造またはドーム様構造を形成する。ドームは一般に、培養物中で分極した上皮に固有の、多細胞ヘミシスト構造であり、経上皮溶質輸送に関して、分化上皮と機能的に同等でありうる。ドームは、細胞コンフルエンスの間に、小エリア内で、散在的に生じ、しばしば、機能的な上皮単層の、初期の分化過程の顕徴となりうる。ある特定の場合には、ドームの形成は、タイトジャンクションタンパク質の発現、不透過性基層の形成、および根底にある支持体への細胞の接着の減衰（例えば、細胞層と、根底にある支持体との間における、液体の蓄積の結果として）の１つまたは複数を含みうる。ドームの形成は、例えば、形状的に分極した細胞のための、経上皮輸送系の発生時に生じうる（例えば、Suら（２００７年）、J.  Biol.  Chem.、２８２巻（１３号）：９８８３〜９８９４頁を参照されたい）。一部の実施形態では、上皮細胞を、培養物中で、ドーム構造またはドーム様構造を形成するように誘導することができる。例えば、上皮細胞を、ある特定のカルシウム濃度へと曝露された場合に、ドーム構造またはドーム様構造を形成するように誘導することができる。一部の実施形態では、上皮細胞を、約１ｍＭまたはこれを超えるカルシウム濃度へと曝露された場合に、ドーム構造またはドーム様構造を形成するように誘導することができる。例えば、上皮細胞を、約１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、またはこれを超えるカルシウム濃度へと曝露された場合に、ドーム構造またはドーム様構造を形成するように誘導することができる。一部の実施形態では、上皮細胞を、約１．５ｍＭのカルシウム濃度へと曝露された場合に、ドーム構造またはドーム様構造を形成するように誘導することができる。
【０１８１】
一部の実施形態では、細胞を、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ＲＯＣＫを阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ＰＡＫ１を阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））を阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、レチノイン酸シグナル伝達を阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびＲＯＣＫを阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびＰＡＫ１を阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））を阻害しない、後続の環境に置く。一部の実施形態では、細胞を、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびレチノイン酸シグナル伝達を阻害しない、後続の環境に置く。
【０１８２】
一部の実施形態では、細胞は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ＲＯＣＫを阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ＰＡＫ１を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、レチノイン酸シグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびＲＯＣＫを阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびＰＡＫ１を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびミオシンＩＩ（例えば、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ））を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。一部の実施形態では、細胞は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達およびレチノイン酸シグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する。
拡大された細胞の使用
【０１８３】
ある特定の実施形態では、拡大された上皮細胞集団は、例えば、生体分子の作製（例えば、タンパク質の発現）、診断法（例えば、異常な上皮細胞を同定すること）および／または治療法（例えば、候補治療剤のスクリーニング；細胞療法（例えば、細胞療法のための遺伝子改変細胞））など、ある特定の生物医学的使用および検査室における使用のために使用することができる。場合によって、拡大された上皮細胞集団は、自家適用（例えば、自家インプラント）のために使用することができ、ある特定の場合、拡大された上皮細胞集団は、非自家適用（例えば、薬物スクリーニング）のために使用することができる。場合によって、拡大された上皮細胞集団は、回収、および／または単離、および／また貯蔵できる（例えば、細胞バンクのために）。
【０１８４】
一例では、拡大された上皮細胞集団は、タンパク質の発現、ウイルス／ワクチンの作製などのために使用することができる。場合によって、拡大された上皮細胞集団は、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）を発現するように遺伝子改変することができる。場合によって、上皮細胞または細胞群は、遺伝子改変し、次いで、本明細書で記載される拡大条件を使用して拡大することができる。細胞のこのような遺伝子改変は一般に、細胞の拡大を増大させるように意図された改変とはならない。そうではなく、細胞のこのような遺伝子改変は、例えば、特定のタンパク質をコードする導入遺伝子（例えば、疾患修飾導入遺伝子）を挿入するようにデザインされる。導入遺伝子によって発現されるタンパク質は、逸失または欠損するタンパク質の機能的なバージョンとして作用する場合もあり、遺伝子または他のタンパク質の抑制因子または阻害剤として作用する場合もある。次いで、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生するように、特定のタンパク質を発現する細胞を、例えば、対象への自家インプラントなどの後続の環境に置くことができる。
【０１８５】
別の例では、拡大された上皮細胞集団は、異常な上皮細胞または罹患上皮細胞の存在を顕徴とする状態を有する対象のための候補処置を同定するのに有用でありうる。このような状態は、例えば、新形成、過形成、および悪性腫瘍、または良性腫瘍を含みうる。場合によって、対象から得られた異常な上皮細胞を、本明細書で記載される拡大条件のいずれかに従い拡大して、異常な上皮細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ集団を作製することができる。例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を、対象の循環から単離することができ、本明細書の拡大条件を利用して、例えば、細胞の、機能的、表現型的、および／または遺伝子的特徴付けなど、さらなる解析のために十分な数の細胞を得ることができる。
【０１８６】
別の例では、拡大された上皮細胞集団は、対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するために有用でありうる。例えば、拡大された上皮細胞集団は、応答プロファイルを作出するためにアッセイすることができる。応答プロファイルは、特定の処置が、例えば、正常な上皮細胞または異常な上皮細胞において、所望の応答をもたらす可能性を指し示しうる、１つまたは複数のデータ点のコレクションであることが典型的である。治療剤に対する応答は、例えば、細胞死（例えば、壊死、毒性、アポトーシスなどによる）、および／または細胞の成長速度の低減を含みうる。治療剤に対する応答について評価する方法は、例えば、用量反応曲線、細胞生存曲線、治療指数などを決定するステップを含む。例えば、鼻腔上皮細胞または気管上皮細胞を、ＣＦＴＲ遺伝子内に突然変異を保有する対象から単離することができ、本明細書の拡大条件を利用して、例えば、薬物および／または抗体など、治療剤に対する応答プロファイルを作出するためのアッセイなど、さらなる解析のために十分な数の細胞を得ることができる。
【０１８７】
別の例では、拡大された上皮細胞集団は、対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するために有用でありうる。例えば、少なくとも１つの異常な上皮細胞候補は、本明細書で記載される拡大条件のいずれかに従い拡大することができる。細胞を拡大したら、例えば、細胞についての、原発組織プロファイルを決定して（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現についてのアッセイ、組織学的査定、免疫組織化学染色により）、推定原発組織を決定することができる。細胞の少なくとも１つの特色を、同じ原発組織に由来する、正常上皮細胞の同じ特色と比較することができる。比較されうる細胞の特色は、例えば、細胞の成長特徴、コロニーの形成、プロテオームプロファイル、代謝プロファイル、およびゲノムプロファイルを含む。異常な上皮細胞候補および正常上皮細胞において検出される差違は、異常な上皮細胞候補が、正常上皮細胞と比較して異常であることを指し示しうる。
【０１８８】
別の例では、拡大された上皮細胞集団は、対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするために有用でありうる。疾患の進行のモニタリングは一般に、対象における異常な状態を定期的に点検して、異常な状態が進行しつつある（増悪しつつある）のか、退縮しつつある（改善しつつある）のか、静的状態を維持している（検出可能な変化がない）のかを決定することを意味する。対象に由来する、拡大された上皮細胞は、進行または退縮の多様なマーカーについてアッセイすることができる。疾患の進行のモニタリングはまた、１つまたは複数の処置の有効性のモニタリングを含みうる。
【実施例】
【０１８９】
下に明示する例は、ある特定の実施形態を例示するものであり、本技術を限定するものではない。
（実施例１）
材料および方法
【０１９０】
そうでないことが注記される場合を除き、本実施例で明示される材料および方法を使用して、実施例２〜１０で記載される細胞培養アッセイおよび他のアッセイを実施した。
細胞の培養および集団倍加の決定
【０１９１】
実施例２〜５および図１〜１７に指し示される培養培地を使用して、上皮細胞（前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞）を、組織培養槽内の生存細胞３，０００〜１０，０００個／ｃｍ２でプレーティングし、５％のＣＯ２を伴う３７℃でインキュベートした。培地は、２または３日間ごとに交換した。それらが約７０〜９０％コンフルエントのときに、標準的なトリプシン化法を使用して、細胞を継代培養した。製造元の指示書に従い、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭＱＡＸ１０００）を使用して、総細胞数を決定した。
【０１９２】
これらのアッセイのために使用される細胞および培地は、あらかじめ選定されたｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １−５３（ＥＧＦ  １−５３；０．２ｎｇ／ｍＬで使用される）、およびＢｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ；３０μｇ／ｍＬで使用される）と共に供給される、ＰｒＥＣ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−２５５５）；Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−２５４０）；ＬＮＣａｐ  Ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ−０７３）；ＰｒＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＰｒＥＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ａｎｄ  ＰｒＥＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−３１６６）；およびＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  １７００５−０４２）を含んだ。細胞培養材料は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｃｅｌｌｗａｒｅ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ、Ｔ−２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６４８４）を含んだ。
【０１９３】
集団倍加（ＰＤ）を計算するために使用される式を、方程式Ａ：
ｎ＝３．３２×（ｌｏｇ  Ｙ−ｌｏｇ  ｌ）＋Ｘ  方程式Ａ
［式中、ｎ＝所与の継代培養の終了時における最終的なＰＤ数、Ｙ＝採取時における細胞収量、ｌ＝継代培養を始めるための接種物として使用される細胞数、およびＸ＝定量化する継代培養を開始するのに使用される接種物の倍加レベル］
に提示する。
【０１９４】
研究で使用されるある特定の化学物質の原液は、ＤＭＳＯ中で、１０ｍＭへと溶解させることにより調製した。化学物質の原液は、実施例２〜５に記載し、図１〜１７に示す通り、細胞培養を開始する時点から、培養培地へと、所望の最終濃度まで添加した。使用されるある特定の化合物を、下の表１に列挙する。
【表１】
2018532389.tif 000006
【０１９５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
製造元の指示書に従い、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２１８３−５５５）、およびＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２１８３０１８Ａ）を使用して、全ＲＮＡを調製した。供給元により提供されるプロトコールに従い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ（商標）１−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３９２９３８）を使用して、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現を決定するために、１００ナノグラムの全ＲＮＡを使用した。使用されるｈＴＥＲＴプライマーおよびＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブは、以下の通り：フォワードプライマー：５’−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号７）、リバースプライマー：５’−ＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号８）、およびＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ：５’−ＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号９）であった。
（実施例２）
従来の細胞培養培地（すなわち、対照培養条件）中の上皮細胞の成長
【０１９６】
本実施例では、前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）および気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、従来の細胞培養培地（すなわち、対照培養条件）中で成長させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおける上皮細胞の成長のある特定の特性を実証した。
【０１９７】
前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を、前立腺上皮細胞を培養するために一般に使用される、２種類の通常の培養培地の１つ：あらかじめ選定されたｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １−５３（ＥＧＦ  １−５３；０．２ｎｇ／ｍＬで使用される）、およびＢｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ；３０μｇ／ｍＬで使用される））と共に供給される１）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＰｒＥＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ａｎｄ  ＰｒＥＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｌｏｎｚａ  ＣＣ−３１６６））、または２）ＫＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  １７００５−０４２）の中で培養した。各継代における細胞の集団倍加を計算し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした（図１、上パネル）。いずれの培地型でも、前立腺上皮細胞は、老化に入る前に、集団倍加１０〜２０回だけの限定的な細胞複製を示した。ＫＳＦＭ中で培養された前立腺上皮細胞は、集団倍加１８回目で、細胞老化に特徴的な形状を呈示した（ＰＤ  １８；図１、下パネル）。
【０１９８】
気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、ＫＳＦＭ中で培養した。各継代における細胞の集団倍加を計算し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした（図２、上パネル）。気管支上皮細胞は、細胞老化に入る前に、１１回だけの集団倍加の間活性の複製を示した。ＫＳＦＭ中で培養された気管支上皮細胞は、集団倍加１１回目で、細胞老化に特徴的な形状を呈示した（ＰＤ  １１；図２、下パネル）。
【０１９９】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を、異なる継代における、気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞内の定量的リアルタイムＰＣＲにより検討した。染色体の末端は、テロメアと呼ばれる、染色体を異常な癒着または切断（分解）から保護する、反復的なＤＮＡ構造のセグメントから構成されている。正常上皮細胞では、テロメアは、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の発現の欠如のために、細胞が分裂するにつれて、徐々に短くなることが典型的である。テロメラーゼは一般に、幹細胞において活性であり、無制限に成長および分裂する、大半のがん細胞において異常に活性である。ｈＴＥＲＴ発現のレベルを、ｈＴＥＲＴ発現についての陽性対照として使用した、ヒト前立腺がん細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ−０７３）である、ＬＮＣａＰ細胞と比較した。気管支上皮細胞は、継代早期（ｐ３）または継代後期（ｐ５）において、ｈＴＥＲＴを発現させなかった。継代早期（ｐ２）における前立腺上皮細胞は、極めて低レベルのｈＴＥＲＴを発現させたが、継代３回目で急速に減衰し、継代５回目までに検出されなくなった（図３Ａおよび図３Ｂ）。これらの知見は、ＰｒＥＣおよびＨＢＥＣのいずれも、正常上皮細胞であることを確認した。
【０２００】
ある特定の細胞マーカーの発現を、培養された前立腺上皮細胞内で検討した。これらの細胞は、免疫蛍光染色により検討される通り、上皮幹細胞マーカーであるＬｇｒ５を発現させなかった（図４、下パネル）。代わりに、全ての細胞は、ＴＰ６３発現について陽性に染色された（図４、中パネル）。転写因子である、ＴＰ６３遺伝子は、基底上皮細胞のマーカーであり、一般に、上皮組織の正常な機能に要求される。ＤＡＰＩ染色を使用して、細胞核を視覚化した（図４、上パネル）。Ｌｇｒ５ポリクローナル抗体（抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＳ−Ａ１２３５）を、１：５０の希釈率で使用した。抗ＴＰ６３モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２５２６８）を、１：５０の希釈率で使用した。
【０２０１】
したがって、上記の実験は、従来の細胞培養培地（すなわち、対照培養条件）中で培養された上皮細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、限定的な増殖能、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の極めて低いまたは検出されない発現を有し、上皮幹細胞に典型的なタンパク質マーカーを発現しない（すなわち、上皮幹細胞マーカーであるＬＧＲ５を発現しない）ことを実証した。
（実施例３）
ＡＬＫ５阻害剤の存在下における、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現
【０２０２】
本実施例では、上皮細胞中のｈＴＥＲＴ発現を、ＡＬＫ５阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）、またはこれらの両方の存在下で評価した。ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現は、気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞内の定量的リアルタイムＰＣＲにより検討した。細胞を、ＫＳＦＭ中の異なる継代において、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、もしくはＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２、またはこれらの両方の阻害剤で処理した。下で記載される通り、Ａ８３−０１は、上皮細胞中のｈＴＥＲＴ発現を迅速に誘導し、持続させた。
【０２０３】
図５Ａおよび図５Ｂに示す通り、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ中の継代早期（ｐ３）および継代後期（ｐ５）のいずれにおいても、ｈＴＥＲＴを発現させなかった。ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１は、継代早期（ｐ３）において、気管支上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を頑健に誘導し、継代後期（ｐ６）において、測定可能なｈＴＥＲＴ発現を持続させた。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、継代早期（ｐ３）において、気管支上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現をわずかに誘導したが、継代後期（ｐ６）には検出不能となった。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の存在下では、ｈＴＥＲＴ発現は、気管支上皮細胞内で誘導され、継代後期（ｐ６）において持続した。
【０２０４】
図６Ａおよび図６Ｂに示す通り、継代早期（ｐ２）における前立腺上皮細胞は、低レベルのｈＴＥＲＴを発現させたが、これは、継代３回目において、迅速に減衰し、継代５回目において、検出不能となった。ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１は、継代早期（ｐ２）において、前立腺上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を迅速に誘導し、継代後期（ｐ５）において、測定可能なｈＴＥＲＴ発現を持続させた。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、継代早期（ｐ２）において、前立腺上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現を誘導したが、継代後期（ｐ５）には検出不能となった。Ａ８３−１０およびＹ−２７６３２の両方の存在下では、ｈＴＥＲＴ発現は、継代早期（ｐ２）の前立腺上皮細胞内で、著明に誘導され、継代後期（ｐ５）においてもなお、高レベルで持続した。ｈＴＥＲＴ発現のこのレベルは、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞（Ｊ２）と共に共培養された前立腺上皮細胞内のｈＴＥＲＴ発現のレベルと同等であった。
（実施例４）
上皮細胞のプレーティング効率
【０２０５】
本実施例では、上皮細胞のプレーティング効率、すなわち、細胞培養表面に効率的に付着し、コロニーへと分裂および成長を持続する細胞の数を、多様な条件下で検討した。
【０２０６】
図７に示す通り、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１は、通常の組織培養表面（すなわち、コーティングされていない）上、ＫＳＦＭ中における、前立腺上皮細胞のプレーティング効率に干渉した。ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１の存在下で、大半の前立腺上皮細胞は、３日後においてもなお、通常の組織培養表面への付着に失敗した。しかし、付着した少数の細胞は、増殖を持続した。細胞を継代した８日目までに、大半の細胞は、活発に分裂する細胞に特徴的な形状を呈示した。
【０２０７】
図８に示す通り、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１は、通常の組織培養表面（すなわち、コーティングされていない）上、ＫＳＦＭ中における、気管支上皮細胞のプレーティング効率に干渉した。ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１の存在下で、大半の気管支上皮細胞は、３日後においてもなお、通常の組織培養表面への付着に失敗した。しかし、付着した少数の細胞は、増殖を持続した。大半の細胞は、７日目に、活発に分裂する細胞に特徴的な形状を呈示した。
【０２０８】
図９に示す通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、ＫＳＦＭ中で、Ａ８３−０１により引き起こされる、前立腺上皮細胞のプレーティング効率の低下を改善した。多くの前立腺上皮細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の存在下では、プレーティング後２日目において、通常の組織培養表面に付着した。細胞は、増殖を持続し、大半の細胞は、７日目に、活発に分裂する細胞に特徴的な形状を呈示した。
【０２０９】
図１０に示す通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、ＫＳＦＭ中で、Ａ８３−０１により引き起こされる、気管支上皮細胞のプレーティング効率の低下を改善した。多くの気管支上皮細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の存在下では、プレーティング後２日目において、通常の組織培養表面に付着した。細胞は、増殖を持続し、大半の細胞は、７日目に、活発に分裂する細胞に特徴的な形状を呈示した。
【０２１０】
図１１に示す通り、コラーゲンＩでコーティングされた組織培養表面の使用は、ＫＳＦＭ中、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の存在下における前立腺上皮細胞のプレーティング効率を劇的に増大させた。大半の細胞は、プレーティング後１日目において、表面に効率的に付着し、迅速に増殖した。細胞を継代した５日目までに、大半の細胞は、活発に分裂する細胞に特徴的な形状を呈示した。
【０２１１】
図１２に示す通り、コラーゲンＩでコーティングされた組織培養表面の使用は、ＫＳＦＭ中、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の存在下における気管支上皮細胞のプレーティング効率を劇的に増大させた。大半の細胞は、プレーティング後１日目において、表面に効率的に付着し、迅速に増殖した。細胞を継代した６日目までに、大半の細胞は、活発に分裂する細胞に特徴的な形状を呈示した。
（実施例５）
ＡＬＫ５阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および他の化合物を含む化合物の、上皮細胞の増殖に対する効果
【０２１２】
本実施例では、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の増殖を、ＡＬＫ５阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
【０２１３】
前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ中、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の存在下で成長させた。図１３に示す通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２の連続使用にもかかわらず、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞のいずれも、継代後期において、老化に入った。８日目または９日目までに、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の後期継代物は、平坦で肥大した細胞形など、細胞老化に特徴的な形状を呈示した。したがって、単独で使用した場合、Ｙ−２７６３２は、前立腺上皮細胞または気管支上皮細胞の増殖を促進しなかった。
【０２１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおけるさらなる成長条件の効果について検討するために、前立腺上皮細胞を、ＫＳＦＭまたはＰｒＥＧＭ中、培地単独、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２、またはこれらの両方（コラーゲンを伴うかまたは伴わない）の存在下で成長させた。図１４に示す通り、前立腺上皮細胞は、ＰｒＥＧＭまたはＫＳＦＭ中、１０〜２０回の集団倍加の後、老化に入った。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、前立腺上皮細胞の総集団倍加をわずかに増大させたが、細胞はやはり、ＰＤ２０を超えた直後に、老化に入った。Ａ８３−０１もまた、総集団倍加を増大させたが、Ａ８３−０１は、通常の組織培養表面上のプレーティング効率に干渉しうる（実施例４を参照されたい）ので、細胞数の増大は緩徐である。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の、ＫＳＦＭへの添加は、前立腺上皮細胞の総集団倍加を、通常の組織培養槽およびコラーゲンでコーティングされた組織培養槽のいずれにおいても、はるかに迅速なペースで、著明に増大させた。したがって、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１と、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２とを、組み合わせて使用したところ、前立腺上皮細胞の総集団倍加は、著明に増大した。
【０２１５】
上記の実験と同様に、気管支上皮細胞を、ＫＳＦＭ中、培地単独、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２、またはこれらの両方（コラーゲンを伴うかまたは伴わない）の存在下で成長させた。図１５に示す通り、気管支上皮細胞は、ＫＳＦＭ中、１１回の集団倍加の後、老化に入った。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、気管支上皮細胞の総集団倍加をわずかに増大させたが、細胞はやはり、ＰＤ１３を超えた直後に、老化に入った。Ａ８３−０１もまた、総集団倍加を増大させたが、Ａ８３−０１は、通常の組織培養表面上のプレーティング効率に干渉しうる（実施例４を参照されたい）ので、細胞数の増大は緩徐である。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方の、ＫＳＦＭへの添加は、気管支上皮細胞の総集団倍加を、通常の組織培養表面およびコラーゲンでコーティングされた組織培養表面のいずれにおいても、はるかに迅速なペースで、著明に増大させたが、これらの後者は、なお迅速なペースを示した。したがって、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１と、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２とを、組み合わせて使用したところ、気管支上皮細胞の総集団倍加は、著明に増大した。
【０２１６】
別の実験では、継代後期の前立腺上皮細胞を、多様な濃度（すなわち、５μＭ：黒色バー；１μＭ：網目バー；および０．２μＭ：白色バー）で試験した、図１６に指し示す個々の化合物を加えたＫＳＦＭ中で培養した。化合物を添加しない対照実験では、５日後に、最小限の細胞数の増大が見られた。Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、ＧＳＫ  ４２９２８６、およびチアゾビビンなどの、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）は、総細胞数のわずかな増大をもたらす。これに対し、Ａ８３−０１、ＳＢ  ４３１５４２、ＧＷ  ７８８３８８、およびＲｅｐＳｏｘなどのＡＬＫ５阻害剤は、５日後に、総細胞数の顕著な増大を結果としてもたらした。ＰＡＫ１阻害剤であるＩＰＡ−３も、ミオシンＩＩ阻害剤（すなわち、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）であるブレビスタチンも、細胞増殖の増大を結果としてもたらさず、ＩＰＡ−３は、被験最高濃度（５μＭ）で、ほぼ完全な細胞死を引き起こした。したがって、単独で使用した場合、ＡＬＫ５阻害剤は、ＫＳＦＭ中の継代後期における前立腺上皮細胞の増殖を著明に増大させ、単独で使用した場合、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）は、増殖をわずかに増大させ、単独で使用した場合、ＰＡＫ１阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤（すなわち、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）は、増殖を増大させなかった。
【０２１７】
さらなる実験では、継代後期の前立腺上皮細胞を、多様な濃度（５μＭ：黒色バー；１μＭ：網目バー；および０．２μＭ：白色バー）で試験した、図１７に指し示す個々の化合物を加えたＫＳＦＭ、またはＡ８３−０１を補充したＫＳＦＭ中で培養した。ＫＳＦＭに阻害剤を添加しない対照実験では、５日後に、最小限の細胞数の増大が見られた。Ａ８３−０１は、継代後期における前立腺上皮細胞の増殖を、著明に増大させたが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２は、細胞の増殖のわずかな増大をもたらす。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の両方を使用したところ、これらは、前立腺上皮細胞の増殖を相乗的に増大させた。このような相乗効果はまた、ＳＲ  ３６７７、ＧＳＫ  ４２９２８６、およびチアゾビビンなど、他のＲｈｏキナーゼ阻害剤についても観察された。ＰＡＫ１阻害剤であるＩＰＡ−３、およびミオシンＩＩ阻害剤（すなわち、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）であるブレビスタチンもまた、ＫＳＦＭ中で、Ａ８３−０１と一緒に使用した場合、前立腺上皮細胞の増殖を、相乗的に増大させた。これに対し、ＧＷ  ７８８３８８、ＳＢ  ４３１５４２、またはＲｅｐＳｏｘなど、他のＡＬＫ５阻害剤を、Ａ８３−０１と一緒に使用した場合、前立腺上皮細胞の増殖のさらなる増大は、ほとんど見られなかった。したがって、細胞骨格の完全性をモジュレートする、いくつかのクラスの阻害剤は、Ａ８３−０１と一緒に使用した場合、ＫＳＦＭ中の、継代後期における前立腺細胞の増殖を、相乗的に増大させた。上で記載した通り、これらは、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、ＧＳＫ  ４２９２８６、およびチアゾビビンなどの、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）；ＰＡＫ１阻害剤であるＩＰＡ−３；ならびにミオシンＩＩ阻害剤（すなわち、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤）であるブレビスタチンを含む。
（実施例６）
ＡＬＫ５阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および他の化合物を含む化合物の、上皮細胞の増殖に対する効果、ならびに他の特性についてのさらなる研究
【０２１８】
本実施例では、包皮角化細胞、前立腺上皮細胞、および気管支上皮細胞の増殖を、ＡＬＫ５阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
【０２１９】
包皮角化細胞（図１８）、前立腺上皮細胞（図１９）、および気管支上皮細胞（図２０）を、コラーゲンでコーティングされた培養槽上の、ＫＳＦＭ単独、または１μＭのＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１および５μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ中で培養した。各継代における細胞の集団倍加を評価し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした（図１８、１９、および２０）。ＫＳＦＭでは、上皮細胞は、１０〜２０回だけの集団倍加の間、限定的な細胞複製を示した後、成長を停止させた。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を伴うＫＳＦＭ中では、上皮細胞は、さらに４０〜６０回の集団倍加の間、増殖を持続した。したがって、包皮角化細胞、前立腺上皮細胞、および気管支上皮細胞の集団倍加は、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）であるＹ−２７６３２を、共に使用した場合に、著明に増大したことから、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２は共に、培養物中の多様な上皮細胞の寿命を著明に延長することを示す。
【０２２０】
さらなる調査では、上皮細胞の成長を、ベータ−アドレナリン作動性アゴニスト（すなわち、ベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト）の存在下で評価した。ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、濃度を増大させるイソプロテレノール（細胞質ゾルのｃＡＭＰレベルを上昇させるベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト）を補充した、１μＭのＡ８３−０１および５μＭのＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養した。６日後に、細胞数をカウントして、対照と比べた細胞の成長を計算した。図３０に示す通り、イソプロテレノールは、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中の、上皮細胞の成長をさらに増大させた。
【０２２１】
核局在化赤色蛍光タンパク質（ｎＲＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを使用して、多様な上皮細胞（すなわち、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）、前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）、およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ））のための、安定的なトランスジェニック細胞株を確立した。このようなトランスジェニック細胞株（例えば、図２４に示す）は、ｎＲＦＰレポーター遺伝子を遍在的に発現させ、標準的な抗生剤選択により選択される。ＨＦＫ／ｎＲＦＰ細胞、ＰｒＥＣ／ｎＲＦＰ細胞、およびＨＢＥＣ／ｎＲＦＰ細胞を、図２３に示す通り、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を伴うＫＳＦＭ中で、長期間培養した。
【０２２２】
Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された多様な上皮細胞の核型を、継代早期および継代後期において評価した。具体的には、中期における染色体のスプレッディングを使用して、継代３回目（１３．５回の集団倍加）および継代１９回目（６２．０回の集団倍加）におけるヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）；継代４回目（１１．１回の集団倍加）および継代１６回目（４５．１回の集団倍加）におけるヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）；ならびに継代３回目（１３．５回の集団倍加）および継代１３回目（４１．１回の集団倍加）における前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）に対する核型解析を実施した。核型解析の結果を、図２１に提示する。細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２の存在下の長期培養後において、肉眼的な核型異常を伴わない、４６の正常な染色体を示した。図２１の左下パネルは、継代早期（ｐ３）における、ＨＦＫ細胞の、代表的な中期染色体スプレッドを示し、図２１の右下パネルは、継代後期（ｐ１９）における、ＨＦＫ細胞の、代表的な中期染色体スプレッドを示す。
【０２２３】
平均テロメア長を、ＫＳＦＭ単独、またはＡ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で、数回の集団倍加にわたり培養された細胞について評価した。具体的には、定量的ＰＣＲアッセイを使用して、ＫＳＦＭ単独、またはＡ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された包皮角化細胞内の平均テロメア長を決定し、Ｔ／Ｓ比（Ｔ：テロメア；Ｓ：単一のコピー遺伝子）として、図２２に表す。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された包皮角化細胞内のテロメアの平均長は、培養物の集団倍加が増大するにつれて、着実に減少した。
【０２２４】
ある特定の遺伝子の発現を、ＫＳＦＭ単独、またはＡ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された上皮細胞について、多様な継代において評価した。図２７は、それらの発現レベルが、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で、下方調節または上方調節される代表的な遺伝子のリストを提供する。全ＲＮＡは、ＫＳＦＭ単独、またはＡ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された包皮角化細胞から、異なる継代において抽出した。遺伝子発現レベルは、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ、ＰＡＨＳ−０５０Ｚ）を使用する定量的ＰＣＲにより解析した。ストレス応答および老化に関与する、いくつかの遺伝子（すなわち、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＬＢ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、およびＳＯＤ２）は、細胞が、ＫＳＦＭ中、６回目の継代において、老化に入ると、発現の増大を示したが、これらの遺伝子の発現は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中では抑制された。同様に、接着分子の遺伝子（ＦＮ１、ＴＨＢＳ１）および中間径フィラメントタンパク質（ＶＩＭ）の遺伝子も、細胞が、ＫＳＦＭ中、６回目の継代において、老化に入ると、発現の増大を示したが、これらの遺伝子の発現は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中では抑制された。ある特定の遺伝子である、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＧ１、ＩＤ１、ＭＡＰ２Ｋ６、ＩＧＦＢＰ３、およびＩＧＦＢＰ５の発現は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中、とりわけ、継代後期において、著明に上方調節された。したがって、時として細胞の老化と関連する、少数の遺伝子（ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＧ１、ＩＤ１、ＭＡＰ２Ｋ６、ＩＧＦＢＰ３、およびＩＧＦＢＰ５など）は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された継代後期の上皮細胞集団内で、発現の増大を示した。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された、継代後期の正常上皮細胞内で観察される正常核型およびより短いテロメアと一緒に、これは、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で拡大された正常上皮細胞は、それらが、元になる上皮細胞集団とは異なるような特色を獲得したが、異常な細胞へは形質転換されなかったことを指し示す。
【０２２５】
培養培地中のカルシウム含量の、細胞挙動に対する効果を、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された上皮細胞について評価した。ヒト気管支上皮細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ（９０μＭのＣａＣｌ２を伴う）中で成長させた。これらの細胞は、培養槽全体に分散し（図２８、左パネル）、それらが互いと近接する場合であってもなお、細胞間接続を形成する細胞は、ほとんど見られなかった。Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭへの、高濃度（１ｍＭ）のＣａＣｌ２の添加は、気管支上皮細胞を、緊密なクラスターへと凝集させた（図２８、右パネル）。パッチの中心部の細胞は、堆積する傾向があり、個々の細胞の間の境界部は一般に、識別不能であった。ある特定の場合には、クラスター間の異常な伸長部が形成された。
【０２２６】
さらなる調査では、培養培地中のカルシウム含量の、細胞間ジャンクションに対する効果を、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で培養された気管支上皮細胞について評価した。細胞間ジャンクションを、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）により測定される、傍細胞イオン流に従い評価した。図２９（上パネル）に示す通り、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中に、高濃度（１ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下で、ＴＥＥＲを増大させることにより示される通り、気管支上皮細胞は、傍細胞イオン流を最小化させる、緊密な細胞間ジャンクションを確立した。逆に、気管支上皮細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中に、低濃度（９０μＭ）のＣａＣｌ２下では、緊密な細胞間ジャンクションを確立できなかった。気管支上皮細胞を、多孔性膜による支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、膜を培養培地で覆い７日間維持した（液面下期；図２９の上パネル内のグレーのボックス）。８日目に、培地を、膜の頂端側から除去し、細胞を、空気へと曝露して、さらなる分化を誘導した。さらに、図２９（下パネル）に示す通り、気管支上皮細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中に、高濃度（１ｍＭ）のＣａＣｌ２存在下で、経時的に経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大を確立した。気管支上皮細胞を、多孔性膜による支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、２４日間維持したところ、膜は、培養持続期間、培養培地で覆われた。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、培養期間を通して、高レベルにとどまった。図２９（下パネル）内の各トレースは、１つの多孔性膜を隔てたＴＥＥＲの測定値を示す。
（実施例７）
上皮細胞を増殖させるための、規定された培地組成物の同定
【０２２７】
ウシ脳下垂体抽出物は、ＫＳＦＭ中および多くの無血清細胞培養培地中で、マイトジェン性補充物質として使用する。そのマイトジェン活性に加えて、ＢＰＥは、様々な、未規定のタンパク質、脂質、およびホルモンを含有する。上皮細胞の増殖が可能な、１つまたは複数の、規定された培地組成物を同定するために、さらなる培養培地組成物について試験した。具体的には、上皮細胞を、ＡＬＫ５阻害剤およびＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわち、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤）を含有する、様々な規定された培地組成物中で増殖させ、これらの細胞集団の成長について評価した。規定された培地組成物は、Ｍ＊（ＭＣＤＢ−１５３（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；型番０１−０５９−１；この製剤は、ワールドワイドウェブアドレス：bioind.com/page_16682、および下の表２Ｂにおいて見出すことができる）＋上皮成長因子（ＥＧＦ）＋酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）＋Ａ８３−０１＋Ｙ−２７６３２）；脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、Ａ８８０６）；イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ；Ｓｉｇｍａ、Ａ９７３１）；脂質ミックス（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ；Ｇｉｂｃｏ、１１９０５−０３１）；およびＡＬＢＵＭＡＸ  Ｉ  Ｌｉｐｉｄ−Ｒｉｃｈ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１０２０−０３９）から選択される１つまたは複数の構成成分を含んだ。ＭＣＤＢ−１５３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ７４０３）、およびＭｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＣＤＢ−１５３（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；型番０１−０５９−１）中のある特定の構成成分、ならびにそれらの濃度を、下の表２Ａおよび２Ｂに提示する。脂質ミックスは、エチルアルコールおよび下の表３に列挙される構成成分を含む。ＡＬＢＵＭＡＸは、ＢＳＡ、ならびにＢＳＡ  １ｇ当たり約０．５〜２．２ｍｇの間ずつの、以下の脂肪酸：アルファ−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびパルミチン酸を含む。
【表２Ａ−１】
2018532389.tif 000007
【表２Ａ−２】
2018532389.tif 000008
【表２Ｂ−１】
2018532389.tif 000009
【表２Ｂ−２】
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【表３】
2018532389.tif 000011
【０２２８】
ＨＦＫ細胞およびＨＢＥＣ細胞は、Ｍ＊；Ｍ＊＋ＡＬＢＵＭＡＸ（１０００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、３１．３μｇ／ｍＬ、および１５．６μｇ／ｍＬで）；Ｍ＊＋ＢＳＡ＋脂質ミックス（１：５０の希釈率、１：１００の希釈率、１：２００の希釈率、１：４００の希釈率、１：８００の希釈率、１：１６００の希釈率、および１：３２００の希釈率で）；またはＭ＊＋ｒＨＡ＋脂質ミックス（１：５０の希釈率、１：１００の希釈率、１：２００の希釈率、１：４００の希釈率、１：８００の希釈率、１：１６００の希釈率、および１：３２００の希釈率で）中で成長させた。細胞集団の成長を評価し、結果を、細胞数の増大倍数として、ＨＦＫ細胞については図２５に、ＨＢＥＣ細胞については図２６に提示する。結果は、アルブミンおよび脂質混合物を使用して、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）の補充を必要とせずに、上皮細胞の増殖を支援しうることを示す。
（実施例８）
上皮細胞の遺伝子発現プロファイル
【０２２９】
本実施例では、遺伝子発現プロファイルを、多様な無血清培地条件下で成長させた上皮細胞について記載する。
【０２３０】
全ＲＮＡは、継代２および６回目におけるＫＳＦＭ、または継代２、１３、および２３回目において、Ａ８３−０１（１μＭ）およびＹ−２７６３２（５μＭ）を加えたＫＳＦＭ中で培養されたヒト包皮角化細胞；ならびに継代２および８回目において、Ａ８３−０１（１μＭ）およびＹ−２７６３２（５μＭ）を加えたＫＳＦＭ中で培養された気道上皮細胞から抽出した。気道上皮細胞のための細胞培養培地はまた、イソプロテレノール（３μＭ）も含んだ。遺伝子発現レベルは、カスタマイズしたＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ヒト小腸組織またはヒト肺組織に由来する全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、対照として含めた。アクチンＢの遺伝子発現レベルと比べた遺伝子発現レベルは、２（ＣｔａｃｔｉｎＢ−Ｃｔｇｅｎｅ）［式中、ＣｔａｃｔｉｎＢまたはＣｔｇｅｎｅは、定量的ＰＣＲ反応の蛍光シグナルが、規定された閾値を超えるのに要求される周期の数である］を使用して計算した。ＣｔａｃｔｉｎＢは一般に、約１８であった。Ｃｔｇｅｎｅが３５より高い場合、遺伝子の発現レベルは、検出不能（ＮＤ）と考えられた。Ｃｔｇｅｎｅが、３５未満かつ３０より大きいまたはこれに等しい場合、遺伝子の発現レベルは、低いと考えられた。Ｃｔｇｅｎｅが、２９未満かつ２２より大きいまたはこれに等しい場合、遺伝子の発現レベルは、中等または中程度と考えられた。Ｃｔｇｅｎｅが、２２未満であった場合、遺伝子の発現レベルは、高いと考えられた。
【０２３１】
下の表４に示す通り、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で成長させた上皮細胞は、高レベルの、基底上皮細胞（ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、およびＴＰ６３）内で典型的に発現する遺伝子を発現させた。これらの細胞はまた、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２など、ある特定の多能性幹細胞マーカーの発現も欠き、中程度レベルのＫＬＦ４を発現させた。細胞はまた、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢ、およびＳＦＴＰＤを含む、最終分化上皮細胞内で典型的に発現する遺伝子も発現させないか、または非常に低レベルのこれらを発現させた。ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３を含む、胃上皮細胞、腸上皮細胞、または膵上皮細胞内で高度に発現する遺伝子のいずれも、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中で成長させた細胞内で検出されなかった。
【表４−１】
2018532389.tif 000012
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
2018532389.tif 000016
（実施例９）
培養物中の上皮細胞の特徴付け
【０２３２】
本実施例では、ある特定の特徴を、多様な、フィーダーフリーで無血清の培地条件下で成長させた上皮細胞について記載する。
【０２３３】
気管支上皮細胞の、ブロンコスフェアへの分化
１μＭのＡ８３−０１および５μＭのＹ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中で培養された、継代２回目のヒト気管支上皮細胞を、ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ条件から取り出し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中に、単一細胞として包埋し、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｂ−ＡＬＩ（商標）ａｉｒ−ｌｉｑｕｉｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｍｅｄｉｕｍ（高カルシウムの分化培地、Ｌｏｎｚａ）中で、１４日間培養した。図３１は、ブロンコスフェアへと分化した気管支上皮細胞を示す。図３１の上パネルは、低倍率（４Ｘ）で見た細胞を示し、図３１の下パネルは、高倍率（２０Ｘ）で見た細胞を示す。目視可能な管腔を伴う、大型のブロンコスフェアを、図３１の下パネルに示す。
高カルシウム濃度への曝露後における、上皮細胞の特徴付け
【０２３４】
角化細胞および気管支上皮細胞培養物中では、高濃度のＣａＣｌ２の存在下において、ドーム様構造が形成された。具体的には、１μＭのＡ８３−０１および５μＭのＹ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）で培養された、継代後期のヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）および継代後期のヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）を、６ウェルプレート内で、コンフルエンスに到達させた。細胞を、ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ条件下にとどめ、ＣａＣｌ２濃度を、１．５ｍＭへと上昇させて、上皮細胞の分化を誘導した。７〜１０日後に、多くのドーム様構造が形成されたが、これらを、図３２Ａ〜図３２Ｄに示す。
【０２３５】
高濃度のＣａＣｌ２への曝露の後で、タイトジャンクションの形成が、角化細胞の間で観察された。具体的には、１μＭのＡ８３−０１および５μＭのＹ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）で培養された、継代後期のヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）を、コンフルエンスに到達させた。細胞を、ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ条件下にとどめ、ＣａＣｌ２濃度を、１．５ｍＭへと上昇させて、分化を誘導した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３３９１８８）へとコンジュゲートさせたモノクローナル抗体を使用する、タイトジャンクションタンパク質であるＺＯ−１についての免疫蛍光染色により、細胞間タイトジャンクションの存在が明らかにされたが、これを、図３３に示す。
【０２３６】
角化細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中、高濃度（１．５ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下における、気液界面分化で、経時的に、経膜電気抵抗（ＴＥＥＲ）の増大を確立した。具体的には、１μＭのＡ８３−０１および５μＭのＹ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）であらかじめ培養されたヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）を、多孔性膜による支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、１４日間維持した。１日目（液面下期；図３４内のグレーのボックス）は、細胞を、培養培地（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙおよび１．５ｍＭのＣａＣｌ２）で覆い、残りの日数は、空気へと曝露した。図３４に示す通り、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、培養期間を通して、非常に高レベルに達した。
【０２３７】
角化細胞は、Ａ８３−０１およびＹ−２７６３２を加えたＫＳＦＭ中、高濃度（１．５ｍＭ）のＣａＣｌ２の存在下における、気液界面分化で、経時的に、表皮様構造を形成した。具体的には、１μＭのＡ８３−０１および５μＭのＹ−２７６３２を補充したＫＳＦＭ（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙ）中、低ＣａＣｌ２（９０μＭ）であらかじめ培養されたヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）を、多孔性膜による支持体（ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４７４）上にプレーティングし、１４日間維持した。１日目は、細胞を、培養培地（ＫＳＦＭ＋Ａ＋Ｙおよび１．５ｍＭのＣａＣｌ２）で覆い、残りの日数は、空気へと曝露した。実験の終了時（すなわち、１４日目）に、培養物を、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン内に包埋し、その構造を明らかにするように、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）のために切片化した。図３５に示す通り、細胞は、層が、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層に相似する、多層構造へと分化していた。
上皮細胞培養物のさらなる特徴付け
【０２３８】
角化細胞の単一細胞によるクローニングおよび拡大について検討した。具体的には、継代後期における単一のヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）（１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、および３μＭのイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中であらかじめ培養された）を、コラーゲンＩでコーティングされた３８４ウェルプレートへとプレーティングし、１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、および３μＭのイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中で培養した。１０日間にわたり、細胞は、１０００個を超える細胞へと分裂し、図３６に示す通り、コロニーを形成した。
【０２３９】
単一細胞に由来する角化細胞の後代について、細胞形状の異質性を観察した。具体的には、上で記載し、図３６に示した、単一細胞由来のコロニーを、Ｔ−２５フラスコ内、１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、および３μＭのイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中で、さらに拡大した。細胞形状（例えば、細胞サイズ）の異質性が観察されたが、これを、図３７に示す。有糸分裂細胞は、特徴的な丸い形状、明るいハローおよび暗い中心部の位相バンド（凝縮した染色体を指し示す）により同定した。
【０２４０】
単一細胞によるコロニー形成効率を、Ａ８３−０１、Ｙ−２７６３２、およびイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中で培養された、ある特定の上皮細胞型について検討した。具体的には、１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、および３μＭのイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中であらかじめ培養された、継代後期のヒト包皮角化細胞（ＨＦＫ）およびヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を、コラーゲンでコーティングされた３８４ウェルプレートへと、ウェル１つ当たりの細胞１個で播種し、１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、および３μＭのイソプロテレノールを加えたＫＳＦＭ中で、１０日間成長させた。１０日目に、各ウェル内の細胞の数を決定した。２０個未満の細胞を有する、２１〜１００個の細胞を有する、１０１〜５００個の細胞を有する、または５００個を超える細胞を有するウェル（すなわち、コロニー）の数を集計およびプロットし、結果を、図３８に提示する。
異なる培地条件下で培養された上皮細胞の拡大
【０２４１】
異なる培養培地中の拡大に対する、それらの潜在的可能性について査定するため、異なる組織に由来する上皮細胞を培養した。細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｇｉｂｃｏ（ＨＦＫｎおよびＨＥＫａ）、またはＬｏｎｚａ（ＨＭＥＣ、ＰｒＥＣ、ＨＢＥＣ、ＳＡＥＣ、およびＤＨＢＥ−ＣＦ）から得た。拡大倍数は、式Ｆ＝２ｎ［式中、Ｆ＝ｎ回の集団倍加後における、拡大の倍数］を使用して計算し、結果を、下の表５に提示する。
【表５−１】
2018532389.tif 000017
【表５−２】
2018532389.tif 000018
（実施例１０）
アルブミンの存在下で培養した上皮細胞
【０２４２】
本実施例では、上皮細胞の拡大を、アルブミン、ならびにＡＬＫ５阻害剤、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、非筋ミオシンＩＩ阻害剤、および他の化合物の１つまたは複数の存在下で評価した。
【０２４３】
角化細胞および気道上皮細胞を、コラーゲンでコーティングされた培養槽上の、１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、３μＭのイソプロテレノール、および０．５ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子（ＥＧＦ）を補充したＫＳＦＭ中で培養した。異なる濃度の組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ；イネにおいて発現させたものであり、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する）またはウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）を、それらの成長促進効果について試験した。結果を、図３９Ａ〜図３９Ｄに提示するが、これらは、上皮細胞の培養を支援するのに、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）の代わりに使用しうることを示す。
【０２４４】
別の実験では、角化細胞および気道上皮細胞を、多様な条件下で、５回を超える連続継代の間培養し、細胞培養物の集団倍加を計算した。条件は、１）Ａ＋Ｙ（ＢＰＥ）：１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、３μＭのイソプロテレノール、０．５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および３０μｇ／ｍＬのＢＰＥを補充したＫＳＦＭ；２）Ａ＋Ｙ（ｒＨＡ）：１μＭのＡ８３−０１、５μＭのＹ−２７６３２、３μＭのイソプロテレノール、０．５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および１００μｇ／ｍＬのｒＨＡ（イネにおいて発現させた）を補充したＫＳＦＭ；ならびに３）Ａ＋Ｂ（ｒＨＡ）：１μＭのＡ８３−０１、２μＭのブレビスタチン、３μＭのイソプロテレノール、０．５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および１００μｇ／ｍＬのｒＨＡ（イネにおいて発現させた）を補充したＫＳＦＭを含んだ。結果を、図４０および図４１に提示するが、これらは、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、上皮細胞の拡大の延長を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）と同様のレベルまで支援することを示す。
【０２４５】
別の実験では、角化細胞を、多様な組合せの構成成分を補充したＫＳＦＭ中で培養した。構成成分は、０．５ｎｇ／ｍＬで使用される、表皮成長因子（ＥＧＦ）；３０μｇ／ｍＬで使用される、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）；１００μｇ／ｍＬで使用される、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）；３μＭで使用される、イソプロテレノール（ＩＳＯ）；１μＭで使用される、ＡＬＫ５阻害剤（Ａ８３−０１）；５μＭで使用される、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）；２μＭで使用される、ミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤（ブレビスタチン）；１００ｎＭで使用される、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）に対するアンタゴニストであるＢＭＳ−４５３を含んだ。結果を、図４２に提示するが、これらは、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、ＡＬＫ５阻害剤であるＡ８３−０１、ＥＧＦ、およびイソプロテレノールの存在下で、上皮細胞の拡大の延長を、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）と同様のレベルまで支援することを示す。さらに、この効果は、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）またはミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤（ブレビスタチン）に依存しなかった。また、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストであるＢＭＳ−４５３が、Ａ８３−０１、ＥＧＦ、およびイソプロテレノール中、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）の存在下で培養された角化細胞の増殖をさらに増大させたことも観察された。
【０２４６】
別の実験では、角化細胞を、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、イソプロテレノール（３μＭ）、Ａ８３−０１（１μＭ）、および組換えヒト血清アルブミン（イネにおいて発現させた；１００μｇ／ｍＬ）を補充したＫＳＦＭ中、用量を増大させるＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）またはミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤（ブレビスタチン）の存在下で培養した。結果を、図４３および図４４に提示する。これらの条件下では、Ｙ−２７６３２またはブレビスタチンの存在下で、細胞の成長速度の有意な増大は観察されなかった。
【０２４７】
別の実験では、角化細胞を、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、イソプロテレノール（３μＭ）、Ａ８３−０１（１μＭ）、および組換えヒト血清アルブミン（イネにおいて発現させた；１００μｇ／ｍＬ）を補充したＫＳＦＭ中、用量を増大させる（１０ｎＭ〜２μＭの間で）、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストであるＢＭＳ−４５３、またはレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストであるＢＭＳ−１９５６１４の存在下で培養した。結果を、図４５および図４６に提示する。いずれのアンタゴニストも、マイクロモル未満の用量で、細胞の成長速度をさらに増強することが可能であった。
【０２４８】
別の実験では、新生包皮角化細胞、健常ドナーに由来する気管支上皮細胞、および嚢胞性線維症ドナーに由来する気管支上皮細胞の各々を、１μＭのＡ８３−０１、０．５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、３μＭのイソプロテレノール、１００μｇ／ｍＬのｒＨＡ、および５０ｎＭのＢＭＳ−４５３を補充したＫＳＦＭ中で培養および継代した。細胞培養物の集団倍加を計算した。結果を、図４７、図４８、および図４９に提示するが、これらは、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）が、上皮細胞の拡大の延長を支援することを示す。
（実施例１１）
実施形態の例
【０２４９】
下に明示する例は、ある特定の実施形態を例示するものであり、本技術を限定するものではない。
【０２５０】
Ａ１．ｅｘ  ｖｉｖｏで分化上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、分化上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、分化上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０２５１】
Ａ１．１  ｅｘ  ｖｉｖｏで前静止上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、前静止上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、前静止上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０２５２】
Ａ１．２  ｅｘ  ｖｉｖｏで分化系列決定上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、分化系列決定上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、分化系列決定上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０２５３】
Ａ２．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）フィーダー細胞フリーの条件下で、上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと；
ｃ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害するステップと
を含む方法。
【０２５４】
Ａ２．１  上皮細胞が、分化上皮細胞を含む、実施形態Ａ２による方法。
【０２５５】
Ａ２．２  上皮細胞が、前静止上皮細胞を含む、実施形態Ａ２による方法。
【０２５６】
Ａ２．３  上皮細胞が、分化系列決定上皮細胞を含む、実施形態Ａ２による方法。
【０２５７】
Ａ３．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと；
ｃ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のミオシンＩＩの活性を阻害するステップと
を含む方法。
【０２５８】
Ａ３．１  上皮細胞が、分化上皮細胞を含む、実施形態Ａ３による方法。
【０２５９】
Ａ３．２  上皮細胞が、前静止上皮細胞を含む、実施形態Ａ３による方法。
【０２６０】
Ａ３．３  上皮細胞が、分化系列決定上皮細胞を含む、実施形態Ａ３による方法。
【０２６１】
Ａ３．４  ミオシンＩＩが、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ａ３〜Ａ３．３のいずれか１つによる方法。
【０２６２】
Ａ４．（ａ）で培養するステップを、血清含有培地の存在下で実施する、実施形態Ａ２〜Ａ３．４のいずれか１つによる方法。
【０２６３】
Ａ４．１  （ａ）で培養するステップを、無血清培地の存在下で実施する、実施形態Ａ２〜Ａ３．４のいずれか１つによる方法。
【０２６４】
Ａ５．ｅｘ  ｖｉｖｏで分化上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）フィーダー細胞フリーの条件下で、分化上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）分化上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと；
ｃ）分化上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む方法。
【０２６５】
Ａ５．１  ｅｘ  ｖｉｖｏで前静止上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）フィーダー細胞フリーの条件下で、前静止上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）前静止上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと；
ｃ）前静止上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む方法。
【０２６６】
Ａ５．２  ｅｘ  ｖｉｖｏで分化系列決定上皮細胞を増殖させるための方法であって、
ａ）フィーダー細胞フリーの条件下で、分化系列決定上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）分化系列決定上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと；
ｃ）分化系列決定上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む方法。
【０２６７】
Ａ５．３  （ｂ）で、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害する、実施形態Ａ５、Ａ５．１、またはＡ５．２による方法。
【０２６８】
Ａ５．４  （ａ）と（ｂ）とを、同時に実施するか；または（ａ）と、（ｂ）と、（ｃ）とを、同時に実施する、実施形態Ａ１〜Ａ５．３のいずれか１つによる方法。
【０２６９】
Ａ５．５  （ａ）の前に、上皮細胞を凍結および融解させる、実施形態Ａ１〜Ａ５．４のいずれか１つによる方法。
【０２７０】
Ａ６．（ｂ）で、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体の活性を阻害する、実施形態Ａ１〜Ａ５．５のいずれか１つによる方法。
【０２７１】
Ａ７．（ｂ）で、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を阻害する、実施形態Ａ６による方法。
【０２７２】
Ａ８．１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体が、Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体を含む、実施形態Ａ６またはＡ７による方法。
【０２７３】
Ａ９．Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体が、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ８から選択される、実施形態Ａ８による方法。
【０２７４】
Ａ１０．１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体が、ＡＬＫ５を含む、実施形態Ａ８による方法。
【０２７５】
Ａ１１．ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップが、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤の使用を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つによる方法。
【０２７６】
Ａ１２．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ受容体、または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータリガンド、あるいはこれらの両方に結合する、実施形態Ａ１１による方法。
【０２７７】
Ａ１３．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を破壊する、実施形態Ａ１１またはＡ１２による方法。
【０２７８】
Ａ１４．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、組換えタンパク質を含まない、実施形態Ａ１１、Ａ１２、またはＡ１３による方法。
【０２７９】
Ａ１５．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、またはＧｒｅｍｌｉｎを含まない、実施形態Ａ１１〜Ａ１４のいずれか１つによる方法。
【０２８０】
Ａ１６．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ａ１１〜Ａ１５のいずれか１つによる方法。
【０２８１】
Ａ１７．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ａ１６による方法。
【０２８２】
Ａ１８．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、実施形態Ａ１７による方法。
【０２８３】
Ａ１９．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化４】
2018532389.tif 000019
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、実施形態Ａ１６〜Ａ１８のいずれか１つによる方法。
【０２８４】
Ａ２０．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、実施形態Ａ１６〜Ａ１９のいずれか１つによる方法。
【０２８５】
Ａ２１．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１を含む、実施形態Ａ２０による方法。
【０２８６】
Ａ２２．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５、または１つもしくは複数のＡＬＫ５リガンド、あるいはこれらの両方に結合する、実施形態Ａ１６〜Ａ２１のいずれか１つによる方法。
【０２８７】
Ａ２３．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５−リガンド間相互作用を破壊する、実施形態Ａ１６〜Ａ２２のいずれか１つによる方法。
【０２８８】
Ａ２４．上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれか１つによる方法。
【０２８９】
Ａ２４．１  上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つによる方法。
【０２９０】
Ａ２４．２  ａ）上皮細胞内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させるステップと；
ｂ）上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップと
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４．１のいずれか１つによる方法。
【０２９１】
Ａ２５．（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＲｈｏキナーゼ、および／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４．２のいずれか１つによる方法。
【０２９２】
Ａ２６．Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼが、Ｒｈｏキナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）およびＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）から選択される、実施形態Ａ２５による方法。
【０２９３】
Ａ２７．Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害するステップが、１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤の使用を含む、実施形態Ａ２５またはＡ２６による方法。
【０２９４】
Ａ２８．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つもしくは複数の低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、実施形態Ａ２７による方法。
【０２９５】
Ａ２９．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ａ２８による方法。
【０２９６】
Ａ３０．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２を含む、実施形態Ａ２９による方法。
【０２９７】
Ａ３０．１  （ａ）で培養中に、上皮細胞内のＲｈｏキナーゼ、および／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害するステップを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つによる方法。
【０２９８】
Ａ３１．（ａ）で培養中に、上皮細胞内のｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３０．１のいずれか１つによる方法。
【０２９９】
Ａ３２．ＰＡＫが、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、およびＰＡＫ４から選択される、実施形態Ａ３１による方法。
【０３００】
Ａ３３．ＰＡＫが、ＰＡＫ１である、実施形態Ａ３２による方法。
【０３０１】
Ａ３４．ＰＡＫ１の活性を阻害するステップが、１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤の使用を含む、実施形態Ａ３３による方法。
【０３０２】
Ａ３５．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、実施形態Ａ３４による方法。
【０３０３】
Ａ３６．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ａ３５による方法。
【０３０４】
Ａ３７．（ａ）で培養中に、上皮細胞内のミオシンＩＩの活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つによる方法。
【０３０５】
Ａ３７．１  ミオシンＩＩが、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ａ３７による方法。
【０３０６】
Ａ３７．２  ミオシンＩＩの活性を阻害するステップが、１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤の使用を含む、実施形態Ａ３７またはＡ３７．１による方法。
【０３０７】
Ａ３７．３  １つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の低分子ミオシンＩＩ阻害剤を含む、実施形態Ａ３７．２による方法。
【０３０８】
Ａ３７．４．１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、ブレビスタチンを含む、実施形態Ａ３７．２またはＡ３７．３による方法。
【０３０９】
Ａ３８．（ａ）で培養中に、上皮細胞内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３７．４のいずれか１つによる方法。
【０３１０】
Ａ３９．細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させるステップが、１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、および／または１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用を含む、実施形態Ａ３８による方法。
【０３１１】
Ａ３９．１  １つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、および／または１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ａ３９による方法。
【０３１２】
Ａ４０．上皮細胞が（ａ）の前に対象から得られる、実施形態Ａ１〜Ａ３９．１のいずれか１つによる方法。
【０３１３】
Ａ４０．１  対象が、哺乳動物である、実施形態Ａ４０による方法。
【０３１４】
Ａ４０．２  対象が、ヒトである、実施形態Ａ４０による方法。
【０３１５】
Ａ４０．３  上皮細胞が、対象の組織に由来する、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．２のいずれか１つによる方法。
【０３１６】
Ａ４０．４  上皮細胞が、対象の分化組織に由来する、実施形態Ａ４０．３による方法。
【０３１７】
Ａ４０．５  上皮細胞が、対象の循環細胞に由来する、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．２のいずれか１つによる方法。
【０３１８】
Ａ４１．上皮細胞が、対象に由来する初代細胞を含む、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．５のいずれか１つによる方法。
【０３１９】
Ａ４２．上皮細胞が、対象に由来する初代細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ４０．５のいずれか１つによる方法。
【０３２０】
Ａ４３．上皮細胞が、対象に由来する腫瘍細胞を含む、実施形態Ａ４０〜Ａ４２のいずれか１つによる方法。
【０３２１】
Ａ４４．対象に由来する上皮細胞が、扁平細胞、円柱細胞、腺腫様細胞、および移行上皮細胞から選択される、実施形態Ａ４１〜Ａ４３のいずれか１つによる方法。
【０３２２】
Ａ４４．１  対象に由来する上皮細胞が、扁平細胞、円柱細胞、腺腫様細胞、および移行上皮細胞の１つまたは複数を含む、実施形態Ａ４１〜Ａ４３のいずれか１つによる方法。
【０３２３】
Ａ４５．対象に由来する上皮細胞が、角化上皮細胞を含む、実施形態Ａ４１〜Ａ４４．１のいずれか１つによる方法。
【０３２４】
Ａ４５．１  角化上皮細胞が、皮膚角化細胞、眼上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態Ａ４５による方法。
【０３２５】
Ａ４６．対象に由来する上皮細胞が、非角化上皮細胞を含む、実施形態Ａ４１〜Ａ４４のいずれか１つによる方法。
【０３２６】
Ａ４７．非角化上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態Ａ４６による方法。
【０３２７】
Ａ４８．非角化上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵ベータ細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃部上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、脳下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞、および毛包細胞から選択される、実施形態Ａ４６またはＡ４７による方法。
【０３２８】
Ａ４８．１  上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つによる方法。
【０３２９】
Ａ４８．２  上皮細胞が、腸上皮細胞ではない、実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれか１つによる方法。
【０３３０】
Ａ４９．（ａ）で培養するステップを、無血清培地の存在下で実施する、実施形態Ａ１〜Ａ４８．２のいずれか１つによる方法。
【０３３１】
Ａ４９．１  無血清培地が、規定された無血清培地である、実施形態Ａ４９による方法。
【０３３２】
Ａ４９．２  無血清培地が、ゼノフリー無血清培地である、実施形態Ａ４９による方法。
【０３３３】
Ａ４９．３  無血清培地が、規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態Ａ４９による方法。
【０３３４】
Ａ５０．無血清培地が、カルシウムを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ４９．３のいずれか１つによる方法。
【０３３５】
Ａ５１．無血清培地が、１ｍＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０による方法。
【０３３６】
Ａ５２．無血清培地が、５００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０による方法。
【０３３７】
Ａ５３．無血清培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０による方法。
【０３３８】
Ａ５３．１  無血清培地が、約９０μＭの濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５３による方法。
【０３３９】
Ａ５４．無血清培地が、２０μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ａ５０による方法。
【０３４０】
Ａ５４．１  無血清培地が、緩衝液と、無機酸、塩、アルカリ性のケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、アルファ−ケト酸、有機硫黄化合物、およびグルコースから選択される１つまたは複数の構成成分とを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つによる方法。
【０３４１】
Ａ５４．２  １つまたは複数の塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態Ａ５４．１による方法。
【０３４２】
Ａ５４．３  １つまたは複数のアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態Ａ５４．１またはＡ５４．２による方法。
【０３４３】
Ａ５４．４  緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、実施形態Ａ５４．１〜Ａ５４．３のいずれか１つによる方法。
【０３４４】
Ａ５４．５  無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４．４のいずれか１つによる方法。
【０３４５】
Ａ５４．６  アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態Ａ５４．５による方法。
【０３４６】
Ａ５４．７  無血清培地が、１つまたは複数の脂質を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４．６のいずれか１つによる方法。
【０３４７】
Ａ５４．８  １つまたは複数の脂質が、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−アルファ−トコフェロール酢酸エステル、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、およびポリソルベート８０から選択される、実施形態Ａ５４．７による方法。
【０３４８】
Ａ５４．９  １つまたは複数の脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態Ａ５４．８による方法。
【０３４９】
Ａ５５．１つまたは複数のマイトジェン性成長因子の使用を含む、実施形態Ａ１〜Ａ５４．９のいずれか１つによる方法。
【０３５０】
Ａ５６．１つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦを含む、実施形態Ａ５５による方法。
【０３５１】
Ａ５６．１  １つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＦＧＦを含む、実施形態Ａ５５による方法。
【０３５２】
Ａ５６．２  １つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ａ５５による方法。
【０３５３】
Ａ５６．３  ＦＧＦが、酸性ＦＧＦを含む、実施形態Ａ５６．１またはＡ５６．２による方法。
【０３５４】
Ａ５７．マイトジェン性成長因子の使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５４．９のいずれか１つによる方法。
【０３５５】
Ａ５８．１つまたは複数のマイトジェン性補充物質の使用を含む、実施形態Ａ１〜Ａ５７のいずれか１つによる方法。
【０３５６】
Ａ５９．１つまたは複数のマイトジェン性補充物質が、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）を含む、実施形態Ａ５８による方法。
【０３５７】
Ａ５９．１  マイトジェン性補充物質の使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５７のいずれか１つによる方法。
【０３５８】
Ａ６０．Ｗｎｔアゴニストまたはベータ−カテニンアゴニストの使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ５９．１のいずれか１つによる方法。
【０３５９】
Ａ６０．１  ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチン酸アミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８阻害剤、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＢＺおよびＤＡＰＴから選択される構成成分の１つまたは複数の使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ６０のいずれか１つによる方法。
【０３６０】
Ａ６１．細胞外マトリックスの使用を含まない、実施形態Ａ１〜Ａ６０．１のいずれか１つによる方法。
【０３６１】
Ａ６２．（ａ）で培養するステップを、コーティングを含む容器内で実施する、実施形態Ａ１〜Ａ６０．１のいずれか１つによる方法。
【０３６２】
Ａ６３．コーティングが、コラーゲンを含む、実施形態Ａ６２による方法。
【０３６３】
Ａ６４．コーティングが、基底膜マトリックスを含む、実施形態Ａ６２による方法。
【０３６４】
Ａ６５．（ａ）で培養するステップが、上皮細胞を拡大することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ６４のいずれか１つによる方法。
【０３６５】
Ａ６６．上皮細胞を、少なくとも約２倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３６６】
Ａ６７．上皮細胞を、少なくとも約５倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３６７】
Ａ６８．上皮細胞を、少なくとも約１０倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３６８】
Ａ６９．上皮細胞を、少なくとも約１５倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３６９】
Ａ７０．上皮細胞を、少なくとも約２０倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７０】
Ａ７０．１  上皮細胞を、少なくとも約１００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７１】
Ａ７０．２  上皮細胞を、少なくとも約１，０００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７２】
Ａ７０．３  上皮細胞を、少なくとも約１０，０００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７３】
Ａ７０．４  上皮細胞を、少なくとも約１００，０００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７４】
Ａ７０．５  上皮細胞を、少なくとも約１００万倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７５】
Ａ７０．６  上皮細胞を、少なくとも約１０億倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７６】
Ａ７０．７  上皮細胞を、少なくとも約１兆倍に拡大する、実施形態Ａ６５による方法。
【０３７７】
Ａ７１．上皮細胞を、約４日間培養する、実施形態Ａ６５〜Ａ７０．７のいずれか１つによる方法。
【０３７８】
Ａ７２．上皮細胞を、約５日間培養する、実施形態Ａ６５〜Ａ７０．７のいずれか１つによる方法。
【０３７９】
Ａ７３．上皮細胞を、連続的に増殖させる、実施形態Ａ１〜Ａ７２のいずれか１つによる方法。
【０３８０】
Ａ７４．上皮細胞を、少なくとも１５回継代するステップを含む、実施形態Ａ１〜Ａ７３のいずれか１つによる方法。
【０３８１】
Ａ７５．上皮細胞を、少なくとも２５回継代するステップを含む、実施形態Ａ１〜Ａ７３のいずれか１つによる方法。
【０３８２】
Ａ７６．上皮細胞の集団が、ある期間にわたり倍加する、実施形態Ａ１〜Ａ７５のいずれか１つによる方法。
【０３８３】
Ａ７７．上皮細胞集団が、少なくとも２０回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３８４】
Ａ７８．上皮細胞集団が、少なくとも５０回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３８５】
Ａ７８．１  上皮細胞集団が、少なくとも８０回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３８６】
Ａ７９．上皮細胞集団が、少なくとも１００回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３８７】
Ａ８０．上皮細胞集団が、少なくとも１２０回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３８８】
Ａ８１．上皮細胞集団が、少なくとも１５０回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３８９】
Ａ８２．上皮細胞集団が、少なくとも２００回倍加する、実施形態Ａ７６による方法。
【０３９０】
Ａ８３．ある期間が、約５０日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つによる方法。
【０３９１】
Ａ８４．ある期間が、約１００日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つによる方法。
【０３９２】
Ａ８５．ある期間が、約１５０日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つによる方法。
【０３９３】
Ａ８６．ある期間が、約２００日間である、実施形態Ａ７６〜Ａ８２のいずれか１つによる方法。
【０３９４】
Ａ８７．（ｂ）の間、上皮細胞が、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持する、実施形態Ａ１〜Ａ８６のいずれか１つによる方法。
【０３９５】
Ａ８８．（ｂ）の間、上皮細胞が、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持しない、実施形態Ａ１〜Ａ８６のいずれか１つによる方法。
【０３９６】
Ａ８９．（ｂ）の後で、上皮細胞を、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置く、実施形態Ａ１〜Ａ８８のいずれか１つによる方法。
【０３９７】
Ａ９０．ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置いた後で、上皮細胞が、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する、実施形態Ａ８９による方法。
【０３９８】
Ａ９１．上皮細胞を誘導して、複数の組織型へと分化させうる、実施形態Ａ１〜Ａ９０のいずれか１つによる方法。
【０３９９】
Ａ９１．１  上皮細胞が、複数の組織型へと分化する能力を獲得しない、実施形態Ａ１〜Ａ９０のいずれか１つによる方法。
【０４００】
Ａ９２．上皮細胞が、オルガノイドを形成する能力を獲得しない、実施形態Ａ１〜Ａ９１．１のいずれか１つによる方法。
【０４０１】
Ａ９３．上皮細胞が、胚性幹細胞に由来しない、実施形態Ａ１〜Ａ９２のいずれか１つによる方法。
【０４０２】
Ａ９３．１  上皮細胞が、連続的に増殖する上皮幹細胞に由来しない、実施形態Ａ１〜Ａ９３のいずれか１つによる方法。
【０４０３】
Ａ９３．２  上皮細胞が、静止上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態Ａ１〜Ａ９３．１のいずれか１つによる方法。
【０４０４】
Ａ９３．３  連続的に増殖する上皮幹細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ９３．２のいずれか１つによる方法。
【０４０５】
Ａ９３．４  腸陰窩細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ９３．３のいずれか１つによる方法。
【０４０６】
Ａ９３．５  ＬＧＲ５＋細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ａ１〜Ａ９３．４のいずれか１つによる方法。
【０４０７】
Ａ９４．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、連続的に増殖する上皮幹細胞、または連続的に増殖する上皮幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９３．５のいずれか１つによる方法。
【０４０８】
Ａ９４．１  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、多能性幹細胞、または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４のいずれか１つによる方法。
【０４０９】
Ａ９４．２  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、最終分化上皮細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．１のいずれか１つによる方法。
【０４１０】
Ａ９４．３  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および／または膵上皮細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．２のいずれか１つによる方法。
【０４１１】
Ａ９４．４  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．３のいずれか１つによる方法。
【０４１２】
Ａ９４．５  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、ＬＧＲ５＋細胞を含まない、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．４のいずれか１つによる方法。
【０４１３】
Ａ９５．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、同種上皮細胞の集団である、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．５のいずれか１つによる方法。
【０４１４】
Ａ９５．１  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、同種基底上皮細胞の集団である、実施形態Ａ４０〜Ａ９５のいずれか１つによる方法。
【０４１５】
Ａ９５．２  対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、異種上皮細胞の集団である、実施形態Ａ４０〜Ａ９４．５のいずれか１つによる方法。
【０４１６】
Ａ９６．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、最終分化細胞より分化が小さく、胚性幹細胞または成体幹細胞より分化が大きい、実施形態Ａ４０〜Ａ９５．２のいずれか１つによる方法。
【０４１７】
Ａ９７．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、１つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態Ａ４０〜Ａ９６のいずれか１つによる方法。
【０４１８】
Ａ９８．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、およびＴＰ６３の１つまたは複数を発現する、実施形態Ａ４０〜Ａ９７のいずれか１つによる方法。
【０４１９】
Ａ９９．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、１つまたは複数の上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ９８のいずれか１つによる方法。
【０４２０】
Ａ１００．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、Ｌｇｒ５を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ９９のいずれか１つによる方法。
【０４２１】
Ａ１０１．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、１つまたは複数の多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１００のいずれか１つによる方法。
【０４２２】
Ａ１０２．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２の１つまたは複数を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０１のいずれか１つによる方法。
【０４２３】
Ａ１０３．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、１つまたは複数の最終分化上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０２のいずれか１つによる方法。
【０４２４】
Ａ１０４．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢ、およびＳＦＴＰＤの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０３のいずれか１つによる方法。
【０４２５】
Ａ１０５．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、１つもしくは複数の胃上皮細胞マーカー、１つもしくは複数の腸上皮細胞マーカー、および／または１つもしくは複数の膵上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０４のいずれか１つによる方法。
【０４２６】
Ａ１０６．対象から得られた上皮細胞、および／または培養物中の上皮細胞が、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３の１つまたは複数を発現しない、実施形態Ａ４０〜Ａ１０５のいずれか１つによる方法。
【０４２７】
Ａ１０７．ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０６のいずれか１つによる方法。
【０４２８】
Ａ１０８．ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１０７のいずれか１つによる方法。
【０４２９】
Ａ１０９．実施形態Ａ１〜Ａ１０８のいずれか１つによる方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団。
【０４３０】
Ａ１１０．遺伝子改変細胞を作製するための、実施形態Ａ１０９による、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０４３１】
Ａ１１１．対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するための、実施形態Ａ１０９による、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０４３２】
Ａ１１２．対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、実施形態Ａ１０９による、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０４３３】
Ａ１１３．対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、実施形態Ａ１０９による、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
【０４３４】
Ｂ１．フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、分化上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む無血清培地。
【０４３５】
Ｂ１．１  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、前静止上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む無血清培地。
【０４３６】
Ｂ１．２  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、分化系列決定上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む無血清培地。
【０４３７】
Ｂ１．３  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、分化上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤からなる低分子阻害剤を含む無血清培地。
【０４３８】
Ｂ１．４  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、前静止上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤からなる低分子阻害剤を含む無血清培地。
【０４３９】
Ｂ１．５  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、分化系列決定上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤からなる低分子阻害剤を含む無血清培地。
【０４４０】
Ｂ１．６  規定された無血清細胞培養培地である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．５のいずれか１つによる無血清細胞培養培地。
【０４４１】
Ｂ１．７  ゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．５のいずれか１つによる無血清細胞培養培地。
【０４４２】
Ｂ１．８  規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．５のいずれか１つによる無血清細胞培養培地。
【０４４３】
Ｂ２．フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、ならびに１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤を含む培地。
【０４４４】
Ｂ２．１  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＰＡＫ１阻害剤からなる低分子阻害剤を含む培地。
【０４４５】
Ｂ３．フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、ならびに１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤を含む培地。
【０４４６】
Ｂ３．１  ミオシンＩＩが、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｂ３による細胞培養培地。
【０４４７】
Ｂ３．２  フィーダー細胞フリー条件下のｅｘ  ｖｉｖｏで、上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤からなる低分子阻害剤を含む培地。
【０４４８】
Ｂ３．３  ミオシンＩＩが、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｂ３．２による細胞培養培地。
【０４４９】
Ｂ４．上皮細胞が、分化上皮細胞を含む、実施形態Ｂ２〜Ｂ３．３のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５０】
Ｂ４．１  上皮細胞が、前静止上皮細胞を含む、実施形態Ｂ２〜Ｂ３．３のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５１】
Ｂ４．２  上皮細胞が、分化系列決定上皮細胞を含む、実施形態Ｂ２〜Ｂ３．３のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５２】
Ｂ５．血清含有培地である、実施形態Ｂ２〜Ｂ４のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５３】
Ｂ５．１  無血清培地である、実施形態Ｂ２〜Ｂ４のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５４】
Ｂ５．２  規定された無血清培地である、実施形態Ｂ５．１による細胞培養培地。
【０４５５】
Ｂ５．３  ゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｂ５．１による細胞培養培地。
【０４５６】
Ｂ５．４  規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｂ５．１による細胞培養培地。
【０４５７】
Ｂ６．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ受容体、または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータリガンド、あるいはこれらの両方に結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ５．３のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５８】
Ｂ７．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を破壊する、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４５９】
Ｂ８．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、組換えタンパク質を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４６０】
Ｂ９．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、またはＧｒｅｍｌｉｎを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ８のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４６１】
Ｂ１０．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４６２】
Ｂ１１．１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤が、１つまたは複数のＩ型ＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤を含む、実施形態Ｂ１０による細胞培養培地。
【０４６３】
Ｂ１２．１つまたは複数のＩ型ＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤が、ＡＬＫ１阻害剤、ＡＬＫ２阻害剤、ＡＬＫ３阻害剤、ＡＬＫ４阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＡＬＫ６阻害剤、ＡＬＫ７阻害剤、およびＡＬＫ８阻害剤から選択される、実施形態Ｂ１１による細胞培養培地。
【０４６４】
Ｂ１３．１つまたは複数のＩ型ＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｂ１２による細胞培養培地。
【０４６５】
Ｂ１４．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｂ１３による細胞培養培地。
【０４６６】
Ｂ１５．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、実施形態Ｂ１５による細胞培養培地。
【０４６７】
Ｂ１６．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化５】
2018532389.tif 000020
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、実施形態Ｂ１４またはＢ１５による細胞培養培地。
【０４６８】
Ｂ１７．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、実施形態Ｂ１４、Ｂ１５、またはＢ１６による細胞培養培地。
【０４６９】
Ｂ１８．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１を含む、実施形態Ｂ１７による細胞培養培地。
【０４７０】
Ｂ１９．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５、または１つもしくは複数のＡＬＫ５リガンド、あるいはこれらの両方に結合する、実施形態Ｂ１３〜Ｂ１８のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４７１】
Ｂ２０．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５−リガンド間相互作用を破壊する、実施形態Ｂ１３〜Ｂ１９のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４７２】
Ｂ２１．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４７３】
Ｂ２２．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏキナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、実施形態Ｂ２１による細胞培養培地。
【０４７４】
Ｂ２３．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つもしくは複数の低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、実施形態Ｂ２１またはＢ２２による細胞培養培地。
【０４７５】
Ｂ２４．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｂ２３による細胞培養培地。
【０４７６】
Ｂ２５．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２を含む、実施形態Ｂ１４による細胞培養培地。
【０４７７】
Ｂ２５．１  Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４７８】
Ｂ２６．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５．１のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４７９】
Ｂ２７．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、実施形態Ｂ２６による細胞培養培地。
【０４８０】
Ｂ２８．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｂ２７による細胞培養培地。
【０４８１】
Ｂ２９．１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４８２】
Ｂ２９．１  １つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｂ２９による細胞培養培地。
【０４８３】
Ｂ３０．１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の低分子ミオシンＩＩ阻害剤を含む、実施形態Ｂ２９またはＢ２９．１による細胞培養培地。
【０４８４】
Ｂ３０．１  １つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｂ３０による細胞培養培地。
【０４８５】
Ｂ３１．１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、および／または１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３０．１のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４８６】
Ｂ３１．１  １つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、および／または１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｂ３１による細胞培養培地。
【０４８７】
Ｂ３２．上皮細胞が、対象に由来する、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１．１のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４８８】
Ｂ３２．１  上皮細胞が、対象の組織に由来する、実施形態Ｂ３２による細胞培養培地。
【０４８９】
Ｂ３２．２  上皮細胞が、対象の分化組織に由来する、実施形態Ｂ３２．１による細胞培養培地。
【０４９０】
Ｂ３２．３  上皮細胞が、初代細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３２．２のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９１】
Ｂ３３．上皮細胞が、初代細胞を含まない、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３２．２のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９２】
Ｂ３４．上皮細胞が、腫瘍細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３３のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９３】
Ｂ３５．対象に由来する上皮細胞が、扁平細胞、円柱細胞、腺腫様細胞、および移行上皮細胞から選択される、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３４のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９４】
Ｂ３５．１  対象に由来する上皮細胞が、扁平細胞、円柱細胞、腺腫様細胞、および移行上皮細胞の１つまたは複数を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３４のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９５】
Ｂ３６．対象に由来する上皮細胞が、角化上皮細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３５．１のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９６】
Ｂ３６．１  角化上皮細胞が、皮膚角化細胞、眼上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態Ｂ３６による細胞培養培地。
【０４９７】
Ｂ３７．対象に由来する上皮細胞が、非角化上皮細胞を含む、実施形態Ｂ３２〜Ｂ３５のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０４９８】
Ｂ３８．非角化上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態Ｂ３７による細胞培養培地。
【０４９９】
Ｂ３９．非角化上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵ベータ細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃部上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、脳下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞、および毛包細胞から選択される、実施形態Ｂ３７またはＢ３８による細胞培養培地。
【０５００】
Ｂ３９．１  上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５０１】
Ｂ３９．２  上皮細胞が、腸上皮細胞ではない、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５０２】
Ｂ４０．カルシウムを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３９．２のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５０３】
Ｂ４１．カルシウムが、１ｍＭを下回る濃度で存在する、実施形態Ｂ４０による細胞培養培地。
【０５０４】
Ｂ４２．カルシウムが、５００μＭを下回る濃度で存在する、実施形態Ｂ４０による細胞培養培地。
【０５０５】
Ｂ４３．カルシウムが、１００μＭを下回る濃度で存在する、実施形態Ｂ４０による細胞培養培地。
【０５０６】
Ｂ４３．１  カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｂ４３による細胞培養培地。
【０５０７】
Ｂ４４．カルシウムが、２０μＭを下回る濃度で存在する、実施形態Ｂ４０による細胞培養培地。
【０５０８】
Ｂ４４．１  緩衝液と、無機酸、塩、アルカリ性のケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、アルファ−ケト酸、有機硫黄化合物、およびグルコースから選択される１つまたは複数の構成成分とを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５０９】
Ｂ４４．２  １つまたは複数の塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態Ｂ４４．１による細胞培養培地。
【０５１０】
Ｂ４４．３  １つまたは複数のアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態Ｂ４４．１またはＢ４４．２による細胞培養培地。
【０５１１】
Ｂ４４．４  緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、実施形態Ｂ４４．１〜Ｂ４４．３のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５１２】
Ｂ４４．５  アルブミンを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．４のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５１３】
Ｂ４４．６  アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態Ｂ４４．５による細胞培養培地。
【０５１４】
Ｂ４４．７  １つまたは複数の脂質を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．６のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５１５】
Ｂ４４．８  １つまたは複数の脂質が、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−アルファ−トコフェロール酢酸エステル、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、およびポリソルベート８０から選択される、実施形態Ｂ４４．７による細胞培養培地。
【０５１６】
Ｂ４４．９  １つまたは複数の脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態Ｂ４４．８による細胞培養培地。
【０５１７】
Ｂ４５．１つまたは複数のマイトジェン性成長因子を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．９のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５１８】
Ｂ４６．１つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦを含む、実施形態Ｂ４５による細胞培養培地。
【０５１９】
Ｂ４６．１  １つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＦＧＦを含む、実施形態Ｂ４５による細胞培養培地。
【０５２０】
Ｂ４６．２  １つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｂ４５による細胞培養培地。
【０５２１】
Ｂ４６．３  ＦＧＦが、酸性ＦＧＦを含む、実施形態Ｂ４６．１またはＢ４６．２による細胞培養培地。
【０５２２】
Ｂ４７．マイトジェン性成長因子を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４４．９のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５２３】
Ｂ４８．１つまたは複数のマイトジェン性補充物質を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４７のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５２４】
Ｂ４９．１つまたは複数のマイトジェン性補充物質が、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）を含む、実施形態Ｂ４８による細胞培養培地。
【０５２５】
Ｂ４９．１  マイトジェン性補充物質を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４７のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５２６】
Ｂ５０．Ｗｎｔアゴニストまたはベータ−カテニンアゴニストを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ４９．１のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５２７】
Ｂ５０．１  ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチン酸アミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８阻害剤、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＢＺおよびＤＡＰＴから選択される構成成分の１つまたは複数を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ５０のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５２８】
Ｂ５１．細胞外マトリックスを含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ５０．１のいずれか１つによる細胞培養培地。
【０５２９】
Ｃ１．ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、分化上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、分化上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団。
【０５３０】
Ｃ１．１  ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、前静止上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、前静止上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団。
【０５３１】
Ｃ１．２  ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、分化系列決定上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、分化系列決定上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団。
【０５３２】
Ｃ２．ａ）フィーダー細胞フリーの条件下で、上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと；
ｃ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団。
【０５３３】
Ｃ２．１  分化上皮細胞を含む、実施形態Ｃ２による上皮細胞。
【０５３４】
Ｃ２．２  前静止上皮細胞を含む、実施形態Ｃ２による上皮細胞。
【０５３５】
Ｃ２．３  分化系列決定上皮細胞を含む、実施形態Ｃ２による上皮細胞。
【０５３６】
Ｃ３．ａ）無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で、上皮細胞を培養するステップと；
ｂ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップと；
ｃ）（ａ）で培養中に、上皮細胞内のミオシンＩＩの活性を阻害するステップと
を含む方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた上皮細胞の集団。
【０５３７】
Ｃ３．１  分化上皮細胞を含む、実施形態Ｃ３による上皮細胞。
【０５３８】
Ｃ３．２  前静止上皮細胞を含む、実施形態Ｃ３による上皮細胞。
【０５３９】
Ｃ３．３  分化系列決定上皮細胞を含む、実施形態Ｃ３による上皮細胞。
【０５４０】
Ｃ３．４  ミオシンＩＩが、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｃ３〜Ｃ３．３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５４１】
Ｃ４．（ａ）で培養するステップを、血清含有培地の存在下で実施する、実施形態Ｃ２〜Ｃ３．４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５４２】
Ｃ５．（ａ）で培養するステップを、無血清培地の存在下で実施する、実施形態Ｃ２〜Ｃ３．４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５４３】
Ｃ５．１  （ａ）と（ｂ）とを、同時に実施するか；または（ａ）と、（ｂ）と、（ｃ）とを、同時に実施する、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５４４】
Ｃ５．２  （ａ）の前に、上皮細胞を凍結および融解させる、実施形態Ｃ１〜Ｃ５．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５４５】
Ｃ６．（ｂ）で、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体の活性を阻害する、実施形態Ｃ１〜Ｃ５．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５４６】
Ｃ７．（ｂ）で、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を阻害する、実施形態Ｃ６による上皮細胞。
【０５４７】
Ｃ８．１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体が、Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体を含む、実施形態Ｃ６またはＣ７による上皮細胞。
【０５４８】
Ｃ９．Ｉ型ＴＧＦ−ベータ受容体が、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ８から選択される、実施形態Ｃ８による上皮細胞。
【０５４９】
Ｃ１０．１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体が、ＡＬＫ５を含む、実施形態Ｃ８による上皮細胞。
【０５５０】
Ｃ１１．ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害するステップが、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤の使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５５１】
Ｃ１２．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ受容体、または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータリガンド、あるいはこれらの両方に結合する、実施形態Ｃ１１による上皮細胞。
【０５５２】
Ｃ１３．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータ受容体−リガンド間相互作用を破壊する、実施形態Ｃ１１またはＣ１２による上皮細胞。
【０５５３】
Ｃ１４．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、組換えタンパク質を含まない、実施形態Ｃ１１、Ｃ１２、またはＣ１３による上皮細胞。
【０５５４】
Ｃ１５．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、またはＧｒｅｍｌｉｎを含まない、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５５５】
Ｃ１６．１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｃ１１〜Ｃ１５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５５６】
Ｃ１７．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｃ１６による上皮細胞。
【０５５７】
Ｃ１８．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、実施形態Ｃ１７による上皮細胞。
【０５５８】
Ｃ１９．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化６】
2018532389.tif 000021
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、実施形態Ｃ１６〜Ｃ１８のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５５９】
Ｃ２０．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、実施形態Ｃ１６〜Ｃ１９のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５６０】
Ｃ２１．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１を含む、実施形態Ｃ２０による上皮細胞。
【０５６１】
Ｃ２２．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５、または１つもしくは複数のＡＬＫ５リガンド、あるいはこれらの両方に結合する、実施形態Ｃ１６〜Ｃ２１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５６２】
Ｃ２３．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５−リガンド間相互作用を破壊する、実施形態Ｃ１６〜Ｃ２２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５６３】
Ｃ２４．方法が、テロメラーゼを活性化させるステップ、および／または上皮細胞内の細胞骨格構造をモジュレートするステップを含む、実施形態Ｃ１６〜Ｃ２３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５６４】
Ｃ２５．方法が、（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＲｈｏキナーゼ、および／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５６５】
Ｃ２６．Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼが、Ｒｈｏキナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）およびＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）から選択される、実施形態Ｃ２５による上皮細胞。
【０５６６】
Ｃ２７．Ｒｈｏキナーゼおよび／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害するステップが、１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤の使用を含む、実施形態Ｃ２５またはＣ２６による上皮細胞。
【０５６７】
Ｃ２８．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む、実施形態Ｃ２７による上皮細胞。
【０５６８】
Ｃ２９．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｃ２８による上皮細胞。
【０５６９】
Ｃ３０．１つもしくは複数のＲｈｏキナーゼ阻害剤、および／または１つもしくは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２を含む、実施形態Ｃ２９による上皮細胞。
【０５７０】
Ｃ３０．１  方法が、（ａ）で培養中に、上皮細胞内のＲｈｏキナーゼ、および／またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼの活性を阻害するステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ２４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５７１】
Ｃ３１．方法が、（ａ）で培養中に、上皮細胞内のｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３０．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５７２】
Ｃ３２．ＰＡＫが、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、およびＰＡＫ４から選択される、実施形態Ｃ３１による上皮細胞。
【０５７３】
Ｃ３３．ＰＡＫが、ＰＡＫ１である、実施形態Ｃ３２による上皮細胞。
【０５７４】
Ｃ３４．ＰＡＫ１の活性を阻害するステップが、１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤の使用を含む、実施形態Ｃ３３による上皮細胞。
【０５７５】
Ｃ３５．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、実施形態Ｃ３４による上皮細胞。
【０５７６】
Ｃ３６．１つまたは複数のＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｃ３５による上皮細胞。
【０５７７】
Ｃ３７．方法が、（ａ）で培養中に、上皮細胞内のミオシンＩＩの活性を阻害するステップをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３６のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５７８】
Ｃ３７．１  ミオシンＩＩが、非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）である、実施形態Ｃ３７による上皮細胞。
【０５７９】
Ｃ３７．２  ミオシンＩＩの活性を阻害するステップが、１つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤の使用を含む、実施形態Ｃ３７またはＣ３７．１による上皮細胞。
【０５８０】
Ｃ３７．３  １つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の低分子ミオシンＩＩ阻害剤を含む、実施形態Ｃ３７．２による上皮細胞。
【０５８１】
Ｃ３７．４  １つまたは複数のミオシンＩＩ阻害剤が、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｃ３７．２またはＣ３７．３による上皮細胞。
【０５８２】
Ｃ３８．方法が、（ａ）で培養中に、上皮細胞内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ３７．４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５８３】
Ｃ３９．細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させるステップが、１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、および／または１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストの使用を含む、実施形態Ｃ３８による上皮細胞。
【０５８４】
Ｃ３９．１  １つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性アゴニスト、および／または１つもしくは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｃ３９による上皮細胞。
【０５８５】
Ｃ４０．（ａ）の前に対象から得られる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４０のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５８６】
Ｃ４０．１  対象が、哺乳動物である、実施形態Ｃ４０による上皮細胞。
【０５８７】
Ｃ４０．２  対象が、ヒトである、実施形態Ｃ４０による上皮細胞。
【０５８８】
Ｃ４０．３  対象の組織に由来する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５８９】
Ｃ４０．４  対象の分化組織に由来する、実施形態Ｃ４０．３による上皮細胞。
【０５９０】
Ｃ４０．５  対象の循環細胞に由来する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９１】
Ｃ４１．対象に由来する初代細胞を含む、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９２】
Ｃ４２．対象に由来する初代細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４０．５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９３】
Ｃ４３．対象に由来する腫瘍細胞を含む、実施形態Ｃ４０〜Ｃ４２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９４】
Ｃ４４．対象に由来する上皮細胞が、扁平細胞、円柱細胞、腺腫様細胞、および移行上皮細胞から選択される、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９５】
Ｃ４４．１  対象に由来する上皮細胞が、扁平細胞、円柱細胞、腺腫様細胞、および移行上皮細胞の１つまたは複数を含む、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９６】
Ｃ４５．対象に由来する上皮細胞が、角化上皮細胞を含む、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４４．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９７】
Ｃ４５．１  角化上皮細胞が、皮膚角化細胞、眼上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態Ｃ４５による上皮細胞。
【０５９８】
Ｃ４６．対象に由来する上皮細胞が、非角化上皮細胞を含む、実施形態Ｃ４１〜Ｃ４４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０５９９】
Ｃ４７．非角化上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態Ｃ４６による上皮細胞。
【０６００】
Ｃ４８．非角化上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵ベータ細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃部上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、脳下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞、および毛包細胞から選択される、実施形態Ｃ４６またはＣ４７による上皮細胞。
【０６０１】
Ｃ４８．１  基底上皮細胞を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６０２】
Ｃ４８．２  腸上皮細胞ではない、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６０３】
Ｃ４９．（ａ）で培養するステップを、無血清培地の存在下で実施する、実施形態Ｃ１〜Ｃ４８．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６０４】
Ｃ４９．１  無血清培地が、規定された無血清培地である、実施形態Ｃ４９による上皮細胞。
【０６０５】
Ｃ４９．２  無血清培地が、ゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｃ４９による上皮細胞。
【０６０６】
Ｃ４９．３  無血清培地が、規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態Ｃ４９による上皮細胞。
【０６０７】
Ｃ５０．無血清培地が、カルシウムを含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ４９．３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６０８】
Ｃ５１．無血清培地が、１ｍＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０による上皮細胞。
【０６０９】
Ｃ５２．無血清培地が、５００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０による上皮細胞。
【０６１０】
Ｃ５３．無血清培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０による上皮細胞。
【０６１１】
Ｃ５３．１  無血清培地が、約９０μＭの濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５３による上皮細胞。
【０６１２】
Ｃ５４．無血清培地が、２０μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｃ５０による上皮細胞。
【０６１３】
Ｃ５４．１  無血清培地が、緩衝液と、無機酸、塩、アルカリ性のケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、アルファ−ケト酸、有機硫黄化合物、およびグルコースの１つまたは複数とを含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ５４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６１４】
Ｃ５４．２  １つまたは複数の塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態Ｃ５４．１による上皮細胞。
【０６１５】
Ｃ５４．３  １つまたは複数のアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態Ｃ５４．１またはＣ５４．２による上皮細胞。
【０６１６】
Ｃ５４．４  緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、実施形態Ｃ５４．１〜Ｃ５４．３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６１７】
Ｃ５４．５  無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ５４．４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６１８】
Ｃ５４．６  アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態Ｃ５４．５による上皮細胞。
【０６１９】
Ｃ５４．７  無血清培地が、１つまたは複数の脂質を含む、実施形態Ｃ４９〜Ｃ５４．６のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６２０】
Ｃ５４．８  １つまたは複数の脂質が、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−アルファ−トコフェロール酢酸エステル、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、およびポリソルベート８０から選択される、実施形態Ｃ５４．７による上皮細胞。
【０６２１】
Ｃ５４．９  １つまたは複数の脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態Ｃ５４．８による上皮細胞。
【０６２２】
Ｃ５５．方法が、１つまたは複数のマイトジェン性成長因子の使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６２３】
Ｃ５６．１つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦを含む、実施形態Ｃ５５による上皮細胞。
【０６２４】
Ｃ５６．１  １つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＦＧＦを含む、実施形態Ｃ５５による上皮細胞。
【０６２５】
Ｃ５６．２  １つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｃ５５による上皮細胞。
【０６２６】
Ｃ５６．３  ＦＧＦが、酸性ＦＧＦを含む、実施形態Ｃ５６．１またはＣ５６．２による上皮細胞。
【０６２７】
Ｃ５７．方法が、マイトジェン性成長因子の使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５４．９のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６２８】
Ｃ５８．方法が、１つまたは複数のマイトジェン性補充物質の使用を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ５７のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６２９】
Ｃ５９．１つまたは複数のマイトジェン性補充物質が、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）を含む、実施形態Ｃ５８による上皮細胞。
【０６３０】
Ｃ５９．１  方法が、マイトジェン性補充物質の使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５７のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６３１】
Ｃ６０．方法が、Ｗｎｔアゴニストまたはベータ−カテニンアゴニストの使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ５９．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６３２】
Ｃ６０．１  方法が、ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ、ＥＧＦ、ニコチン酸アミド、ＦＧＦ１０、ガストリン、ｐ３８阻害剤、ＳＢ２０２１９０、ＤＨＴ、ｎｏｔｃｈ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＢＺおよびＤＡＰＴから選択される構成成分の１つまたは複数の使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６３３】
Ｃ６１．方法が、細胞外マトリックスの使用を含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６３４】
Ｃ６２．（ａ）で培養するステップを、コーティングを含む容器内で実施する、実施形態Ｃ１〜Ｃ６０．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６３５】
Ｃ６３．コーティングが、コラーゲンを含む、実施形態Ｃ６２による上皮細胞。
【０６３６】
Ｃ６４．コーティングが、基底膜マトリックスを含む、実施形態Ｃ６２による上皮細胞。
【０６３７】
Ｃ６５．（ａ）で培養するステップが、上皮細胞を拡大することを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ６４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６３８】
Ｃ６６．少なくとも約２倍に拡大する、実施形態Ｃ６５による上皮細胞。
【０６３９】
Ｃ６７．少なくとも約５倍に拡大する、実施形態Ｃ６５による上皮細胞。
【０６４０】
Ｃ６８．少なくとも約１０倍に拡大する、実施形態Ｃ６５による上皮細胞。
【０６４１】
Ｃ６９．少なくとも約１５倍に拡大する、実施形態Ｃ６５による上皮細胞。
【０６４２】
Ｃ７０．少なくとも約２０倍に拡大する、実施形態Ｃ６５による上皮細胞。
【０６４３】
Ｃ７０．１  少なくとも約１００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６４４】
Ｃ７０．２  少なくとも約１，０００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６４５】
Ｃ７０．３  少なくとも約１０，０００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６４６】
Ｃ７０．４  少なくとも約１００，０００倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６４７】
Ｃ７０．５  少なくとも約１００万倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６４８】
Ｃ７０．６  少なくとも約１０億倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６４９】
Ｃ７０．７  少なくとも約１兆倍に拡大する、実施形態Ａ６５による上皮細胞。
【０６５０】
Ｃ７１．約４日間培養する、実施形態Ｃ６５〜Ｃ７０．７のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６５１】
Ｃ７２．約５日間培養する、実施形態Ｃ６５〜Ｃ７０．７のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６５２】
Ｃ７３．連続的に増殖させる、実施形態Ｃ１〜Ｃ７２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６５３】
Ｃ７４．方法が、上皮細胞を、少なくとも１５回継代するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６５４】
Ｃ７５．方法が、上皮細胞を、少なくとも２５回継代するステップを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６５５】
Ｃ７６．上皮細胞の集団が、ある期間にわたり倍加する、実施形態Ｃ１〜Ｃ７５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６５６】
Ｃ７７．上皮細胞集団が、少なくとも２０回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６５７】
Ｃ７８．上皮細胞集団が、少なくとも５０回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６５８】
Ｃ７８．１  上皮細胞集団が、少なくとも８０回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６５９】
Ｃ７９．上皮細胞集団が、少なくとも１００回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６６０】
Ｃ８０．上皮細胞集団が、少なくとも１２０回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６６１】
Ｃ８１．上皮細胞集団が、少なくとも１５０回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６６２】
Ｃ８２．上皮細胞集団が、少なくとも２００回倍加する、実施形態Ｃ７６による上皮細胞。
【０６６３】
Ｃ８３．ある期間が、約５０日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６６４】
Ｃ８４．ある期間が、約１００日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６６５】
Ｃ８５．ある期間が、約１５０日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６６６】
Ｃ８６．ある期間が、約２００日間である、実施形態Ｃ７６〜Ｃ８２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６６７】
Ｃ８７．（ｂ）の間、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持する、実施形態Ｃ１〜Ｃ８６のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６６８】
Ｃ８８．（ｂ）の間、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ８６のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６６９】
Ｃ８９．（ｂ）の後で、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置かれる、実施形態Ｃ１〜Ｃ８８のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７０】
Ｃ９０．ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害しない細胞培養環境に置かれた後で、１つまたは複数の生来の機能的特徴を維持または再獲得する、実施形態Ｃ８９による上皮細胞。
【０６７１】
Ｃ９１．複数の組織型へと分化するように、誘導されうる、実施形態Ｃ１〜Ｃ９０のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７２】
Ｃ９１．１  複数の組織型へと分化する能力を獲得しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９０のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７３】
Ｃ９２．オルガノイドを形成する能力を獲得しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９１．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７４】
Ｃ９３．胚性幹細胞に由来しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７５】
Ｃ９３．１  連続的に増殖する上皮幹細胞に由来しない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７６】
Ｃ９３．２  静止上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７７】
Ｃ９３．３  方法が、連続的に増殖する上皮幹細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７８】
Ｃ９３．４  方法が、腸陰窩細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６７９】
Ｃ９３．５  方法が、ＬＧＲ５＋細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ｃ１〜Ｃ９３．４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８０】
Ｃ９４．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、連続的に増殖する上皮幹細胞、または連続的に増殖する上皮幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９３．５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８１】
Ｃ９４．１  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、多能性幹細胞、または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８２】
Ｃ９４．２  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、最終分化上皮細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８３】
Ｃ９４．３  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および／または膵上皮細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８４】
Ｃ９４．４  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８５】
Ｃ９４．５  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、ＬＧＲ５＋細胞を含まない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８６】
Ｃ９５．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、同種上皮細胞の集団である、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８７】
Ｃ９５．１  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、同種基底上皮細胞の集団である、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８８】
Ｃ９５．２  対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、異種上皮細胞の集団である、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９４．５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６８９】
Ｃ９６．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、最終分化細胞より分化が小さく、胚性幹細胞または成体幹細胞より分化が大きい、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９５．２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９０】
Ｃ９７．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、１つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９６のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９１】
Ｃ９８．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、およびＴＰ６３の１つまたは複数を発現する、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９７のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９２】
Ｃ９９．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、１つまたは複数の上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９８のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９３】
Ｃ１００．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、Ｌｇｒ５を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ９９のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９４】
Ｃ１０１．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、１つまたは複数の多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１００のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９５】
Ｃ１０２．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２の１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０１のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９６】
Ｃ１０３．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、１つまたは複数の最終分化上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０２のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９７】
Ｃ１０４．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢ、およびＳＦＴＰＤの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０３のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９８】
Ｃ１０５．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、１つもしくは複数の胃上皮細胞マーカー、１つもしくは複数の腸上皮細胞マーカー、および／または１つもしくは複数の膵上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０４のいずれか１つによる上皮細胞。
【０６９９】
Ｃ１０６．対象、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞の集団から得られる細胞が、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３の１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｃ４０〜Ｃ１０５のいずれか１つによる上皮細胞。
【０７００】
Ｃ１０７．遺伝子改変細胞を作製するための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つによる上皮細胞の使用。
【０７０１】
Ｃ１０８．対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つによる上皮細胞の使用。
【０７０２】
Ｃ１０９．対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つによる上皮細胞の使用。
【０７０３】
Ｃ１１０．対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０６のいずれか１つによる上皮細胞の使用。
【０７０４】
Ｄ１．規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む細胞培養組成物。
【０７０５】
Ｄ２．規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤からなる細胞培養組成物。
【０７０６】
Ｄ３．規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、およびベータ−アドレナリン作動性アゴニストまたはベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む細胞培養組成物。
【０７０７】
Ｄ４．規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、およびベータ−アドレナリン作動性アゴニストまたはベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストからなる細胞培養組成物。
【０７０８】
Ｄ５．ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む細胞培養組成物。
【０７０９】
Ｄ６．ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤からなる細胞培養組成物。
【０７１０】
Ｄ７．ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、およびベータ−アドレナリン作動性アゴニストまたはベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む細胞培養組成物。
【０７１１】
Ｄ８．ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、およびベータ−アドレナリン作動性アゴニストまたはベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストからなる細胞培養組成物。
【０７１２】
Ｄ９．規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む細胞培養組成物。
【０７１３】
Ｄ１０．規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤からなる細胞培養組成物。
【０７１４】
Ｄ１１．規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、およびベータ−アドレナリン作動性アゴニストまたはベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む細胞培養組成物。
【０７１５】
Ｄ１２．規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、ＥＧＦ、ＦＧＦ、アルブミン、ＴＧＦ−ベータ阻害剤またはＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、およびベータ−アドレナリン作動性アゴニストまたはベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストからなる細胞培養組成物。
【０７１６】
Ｅ１．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、フィーダー細胞フリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
拡大培養条件が、集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；
元になる上皮細胞集団が、拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；
元になる上皮細胞集団が、薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、
方法。
【０７１７】
Ｅ１．１  ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、無血清でフィーダー細胞フリーの条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
拡大培養条件が、集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する薬剤を含み；
元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および／または前静止上皮細胞を含む、
方法。
【０７１８】
Ｅ１．２  集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する薬剤が、第１の薬剤であり、
拡大培養条件が、集団内の細胞骨格構造をモジュレートする第２の薬剤をさらに含み、
対照培養条件が、第１の薬剤および第２の薬剤を含まない、
実施形態Ｅ１による方法。
【０７１９】
Ｅ１．３  拡大培養条件が、集団内の細胞骨格構造をモジュレートする薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１．１による方法。
【０７２０】
Ｅ２．元になる上皮細胞集団を、分化組織から単離するステップを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１．３のいずれか１つによる方法。
【０７２１】
Ｅ３．細胞を分化組織から単離した後で、かつ、元になる上皮細胞集団をフィーダー細胞フリーの拡大培養条件と接触させる前に、細胞培養物中の、元になる上皮細胞集団の細胞を、維持または増殖させるステップを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ２のいずれか１つによる方法。
【０７２２】
Ｅ４．元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団が、胚性幹細胞を含有しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つによる方法。
【０７２３】
Ｅ５．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、１つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つによる方法。
【０７２４】
Ｅ６．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ５、およびＴＰ６３の１つまたは複数を発現する、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つによる方法。
【０７２５】
Ｅ７．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、１つまたは複数の上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つによる方法。
【０７２６】
Ｅ８．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、Ｌｇｒ５を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つによる方法。
【０７２７】
Ｅ９．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、１つまたは複数の多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つによる方法。
【０７２８】
Ｅ１０．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、ＬＩＮ２８Ａ、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２の１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１つによる方法。
【０７２９】
Ｅ１１．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、１つまたは複数の最終分化上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか１つによる方法。
【０７３０】
Ｅ１２．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、ＣＦＴＲ、ＦＯＸＪ１、ＩＶＬ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ２０、ＬＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＦＴＰＢ、およびＳＦＴＰＤの１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つによる方法。
【０７３１】
Ｅ１３．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、１つもしくは複数の胃上皮細胞マーカー、１つもしくは複数の腸上皮細胞マーカー、および／または１つもしくは複数の膵上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つによる方法。
【０７３２】
Ｅ１４．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、ＣＤ３４、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＨＨ、ＫＩＴ、ＬＧＲ５、ＰＤＸ１、およびＰＲＯＭ１／ＣＤ１３３の１つまたは複数を発現しない、実施形態Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか１つによる方法。
【０７３３】
Ｅ１５．元になる上皮細胞集団、または
拡大された上皮細胞集団、または
元になる上皮細胞集団および拡大された上皮細胞集団
が、静止上皮細胞および／または前静止上皮細胞含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つによる方法。
【０７３４】
Ｅ１６．集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つによる方法。
【０７３５】
Ｅ１７．１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｅ１６による方法。
【０７３６】
Ｅ１８．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｅ１７による方法。
【０７３７】
Ｅ１９．１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、実施形態Ｅ１７による方法。
【０７３８】
Ｅ２０．細胞骨格構造をモジュレートする薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つによる方法。
【０７３９】
Ｅ２１．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、実施形態Ｅ２０による方法。
【０７４０】
Ｅ２２．Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、実施形態Ｅ２０またはＥ２１による方法。
【０７４１】
Ｅ２３．１つまたは複数のＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｅ２２による方法。
【０７４２】
Ｅ２４．ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、実施形態Ｅ２０〜Ｅ２３のいずれか１つによる方法。
【０７４３】
Ｅ２５．ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、実施形態Ｅ２４による方法。
【０７４４】
Ｅ２６．１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｅ２５による方法。
【０７４５】
Ｅ２７．ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｅ２０〜Ｅ２６のいずれか１つによる方法。
【０７４６】
Ｅ２８．１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｅ２７による方法。
【０７４７】
Ｅ２９．１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｅ２８による方法。
【０７４８】
Ｅ３０．拡大培養条件が、集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか１つによる方法。
【０７４９】
Ｅ３１．細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、実施形態Ｅ３０による方法。
【０７５０】
Ｅ３２．１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｅ３１による方法。
【０７５１】
Ｅ３３．拡大培養条件が、無血清培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１つによる方法。
【０７５２】
Ｅ３４．拡大培養条件が、規定された無血清培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか１つによる方法。
【０７５３】
Ｅ３５．拡大培養条件が、ゼノフリー培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３４のいずれか１つによる方法。
【０７５４】
Ｅ３６．拡大培養条件が、規定されたゼノフリー培養条件である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３５のいずれか１つによる方法。
【０７５５】
Ｅ３７．拡大培養条件が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１つによる方法。
【０７５６】
Ｅ３８．カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｅ３７による方法。
【０７５７】
Ｅ３９．拡大培養条件が、１つまたは複数のマイトジェン性成長因子を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３８のいずれか１つによる方法。
【０７５８】
Ｅ４０．１つまたは複数のマイトジェン性成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｅ３９による方法。
【０７５９】
Ｅ４１．拡大培養条件が、細胞外マトリックスを含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか１つによる方法。
【０７６０】
Ｅ４２．元になる上皮細胞集団が、拡大培養条件下で培養すると、３０回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つによる方法。
【０７６１】
Ｅ４３．元になる上皮細胞集団が、拡大培養条件下で培養すると、５０回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つによる方法。
【０７６２】
Ｅ４４．元になる上皮細胞集団が、拡大培養条件下で培養すると、８０回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つによる方法。
【０７６３】
Ｅ４５．元になる上皮細胞集団が、拡大培養条件下で培養すると、１００回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか１つによる方法。
【０７６４】
Ｅ４６．元になる上皮細胞集団内で、連続的に増殖する上皮幹細胞を選択するステップを含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つによる方法。
【０７６５】
Ｅ４７．元になる上皮細胞集団が、連続的に増殖する上皮幹細胞を含まない、実施形態Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つによる方法。
【０７６６】
Ｅ４８．ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ４７のいずれか１つによる方法。
【０７６７】
Ｅ４９．ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ４８のいずれか１つによる方法。
【０７６８】
Ｅ５０．実施形態Ｅ１〜Ｅ４９のいずれか１つによる方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団。
【０７６９】
Ｅ５１．遺伝子改変細胞を作製するための、実施形態Ｅ５０によるｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０７７０】
Ｅ５２．対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するための、実施形態Ｅ５０によるｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０７７１】
Ｅ５３．対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、実施形態Ｅ５０によるｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０７７２】
Ｅ５４．対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、実施形態Ｅ５０によるｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０７７３】
Ｆ１．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
【０７７４】
Ｆ１．１  ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
【０７７５】
Ｆ１．２  ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
【０７７６】
Ｆ１．３  前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記シグナル伝達阻害剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１．１またはＦ１．２に記載の方法。
【０７７７】
Ｆ１．４  前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１．１またはＦ１．２に記載の方法。
【０７７８】
Ｆ２．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【０７７９】
Ｆ３．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【０７８０】
Ｆ４．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【０７８１】
Ｆ５．ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
【０７８２】
Ｆ６．前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１およびＦ２からＦ５のいずれか１つに記載の方法。
【０７８３】
Ｆ６．１  前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１およびＦ２からＦ５のいずれか１つに記載の方法。
【０７８４】
Ｆ７．前記元になる上皮細胞集団が、分化上皮細胞を含む、実施形態Ｆ１からＦ６．１のいずれか１つに記載の方法。
【０７８５】
Ｆ７．１  前記元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および／または前静止上皮細胞を含む、実施形態Ｆ１からＦ６．１のいずれか１つに記載の方法。
【０７８６】
Ｆ７．２  前記元になる上皮細胞集団が、分化系列決定上皮細胞を含む、実施形態Ｆ１からＦ６．１のいずれか１つに記載の方法。
【０７８７】
Ｆ８．前記元になる上皮細胞集団および／または前記拡大された上皮細胞集団が、胚性幹細胞を含有しない、実施形態Ｆ１からＦ７．２のいずれか１つに記載の方法。
【０７８８】
Ｆ９．テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する１つまたは複数の分子を含む、実施形態Ｆ１およびＦ２からＦ８のいずれか１つに記載の方法。
【０７８９】
Ｆ９．１  テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと相互作用する１つまたは複数の分子を含む、実施形態Ｆ１およびＦ２からＦ８のいずれか１つに記載の方法。
【０７９０】
Ｆ９．２  テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、実施形態Ｆ１およびＦ２からＦ８のいずれか１つに記載の方法。
【０７９１】
Ｆ１０．前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｆ１．１からＦ１．４およびＦ９．２のいずれか１つに記載の方法。
【０７９２】
Ｆ１１．前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｆ１０に記載の方法。
【０７９３】
Ｆ１１．１  前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、実施形態Ｆ１０またはＦ１１に記載の方法。
【０７９４】
Ｆ１１．２  前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化７】
2018532389.tif 000022
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、実施形態Ｆ１０からＦ１１．１のいずれか１つに記載の方法。
【０７９５】
Ｆ１２．前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、実施形態Ｆ１０またはＦ１１．２に記載の方法。
【０７９６】
Ｆ１３．前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、実施形態Ｆ１からＦ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０７９７】
Ｆ１４．前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、実施形態Ｆ１３に記載の方法。
【０７９８】
Ｆ１５．前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、実施形態Ｆ１３またはＦ１４に記載の方法。
【０７９９】
Ｆ１６．前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１およびＦ６からＦ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０８００】
Ｆ１７．細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、実施形態Ｆ１６に記載の方法。
【０８０１】
Ｆ１８．前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、実施形態Ｆ１７に記載の方法。
【０８０２】
Ｆ１９．前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、実施形態Ｆ１７またはＦ１８に記載の方法。
【０８０３】
Ｆ２０．前記１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｆ１９に記載の方法。
【０８０４】
Ｆ２１．前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、実施形態Ｆ１７からＦ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０８０５】
Ｆ２２．前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、実施形態Ｆ２１に記載の方法。
【０８０６】
Ｆ２３．前記１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｆ２２に記載の方法。
【０８０７】
Ｆ２４．前記ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｆ１７からＦ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０８０８】
Ｆ２５．前記１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｆ２４に記載の方法。
【０８０９】
Ｆ２６．前記１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｆ２５に記載の方法。
【０８１０】
Ｆ２７．前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１、Ｆ１．１、Ｆ１．２、およびＦ６からＦ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０８１１】
Ｆ２８．細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、実施形態Ｆ２からＦ５およびＦ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０８１２】
Ｆ２９．前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｆ２８に記載の方法。
【０８１３】
Ｆ３０．前記拡大培養条件が、前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、およびＦ６からＦ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０８１４】
Ｆ３１．レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、実施形態Ｆ３、Ｆ５、およびＦ３０のいずれか１つに記載の方法。
【０８１５】
Ｆ３１．１  前記１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、実施形態Ｆ１．２に記載の方法。
【０８１６】
Ｆ３２．前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、実施形態Ｆ３１またはＦ３１．１に記載の方法。
【０８１７】
Ｆ３２．１  前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを各々、マイクロモル未満の濃度で使用する、実施形態Ｆ３１からＦ３２のいずれか１つに記載の方法。
【０８１８】
Ｆ３３．前記拡大培養条件が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｆ１、Ｆ１．１、Ｆ１．２、およびＦ６からＦ３２．１のいずれか１つに記載の方法。
【０８１９】
Ｆ３３．１  前記拡大培養条件が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｆ１、Ｆ１．１、Ｆ１．２、およびＦ６からＦ３２．１のいずれか１つに記載の方法。
【０８２０】
Ｆ３４．前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｆ３３．１に記載の方法。
【０８２１】
Ｆ３５．前記規定されたゼノフリー基本培地が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｆ２からＦ５のいずれか１つに記載の方法。
【０８２２】
Ｆ３５．１  前記規定されたゼノフリー基本培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｆ２からＦ５のいずれか１つに記載の方法。
【０８２３】
Ｆ３６．前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｆ３５．１に記載の方法。
【０８２４】
Ｆ３７．前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、実施形態Ｆ１、Ｆ１．１、Ｆ１．２、およびＦ６からＦ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０８２５】
Ｆ３８．１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｆ２からＦ５およびＦ３７のいずれか１つに記載の方法。
【０８２６】
Ｆ３９．前記拡大培養条件が、異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、実施形態Ｆ１からＦ３８のいずれか１つに記載の方法。
【０８２７】
Ｆ４０．前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、３０回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１からＦ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０８２８】
Ｆ４１．前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、５０回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１からＦ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０８２９】
Ｆ４２．前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、８０回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１からＦ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０８３０】
Ｆ４３．前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、１００回またはこれを超える集団倍加が可能である、実施形態Ｆ１からＦ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０８３１】
Ｆ４４．前記元になる上皮細胞集団が、基底上皮細胞を含む、実施形態Ｆ１からＦ４３のいずれか１つに記載の方法。
【０８３２】
Ｆ４５．前記元になる上皮細胞集団および／または前記拡大された上皮細胞集団が、１つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態Ｆ１からＦ４４のいずれか１つに記載の方法。
【０８３３】
Ｆ４６．連続的に増殖する上皮幹細胞、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団を選択するステップを含まない、実施形態Ｆ１からＦ４５のいずれか１つに記載の方法。
【０８３４】
Ｆ４７．前記元になる上皮細胞集団が、連続的に増殖する上皮幹細胞を含まず、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団に由来する細胞を含まない、実施形態Ｆ１からＦ４６のいずれか１つに記載の方法。
【０８３５】
Ｆ４８．ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、実施形態Ｆ１からＦ４７のいずれか１つに記載の方法。
【０８３６】
Ｆ４９．  ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、実施形態Ｆ１からＦ４８のいずれか１つに記載の方法。
【０８３７】
Ｆ５０．実施形態Ｆ１からＦ４９のいずれか１つに記載の方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団。
【０８３８】
Ｆ５１．遺伝子改変細胞を作製するための、実施形態Ｆ５０に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０８３９】
Ｆ５２．対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するための、実施形態Ｆ５０に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０８４０】
Ｆ５３．対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、実施形態Ｆ５０に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０８４１】
Ｆ５４．対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、実施形態Ｆ５０に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
【０８４２】
Ｇ１．ｉ）培養された上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４３】
Ｇ１．１  ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４４】
Ｇ１．２  ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４５】
Ｇ２．規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４６】
Ｇ３．規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４７】
Ｇ４．規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４８】
Ｇ５．規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【０８４９】
Ｇ６．テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する１つまたは複数の分子を含む、実施形態Ｇ１およびＧ２からＧ５のいずれか１つに記載の組成物。
【０８５０】
Ｇ６．１  テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと相互作用する１つまたは複数の分子を含む、実施形態Ｇ１およびＧ２からＧ５のいずれか１つに記載の組成物。
【０８５１】
Ｇ６．２  テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、実施形態Ｇ１およびＧ２からＧ５のいずれか１つに記載の組成物。
【０８５２】
Ｇ７．前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｇ１．１、Ｇ１．２、またはＧ６．２に記載の組成物。
【０８５３】
Ｇ８．前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、実施形態Ｇ７に記載の組成物。
【０８５４】
Ｇ８．１  前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、実施形態Ｇ７またはＧ８に記載の組成物。
【０８５５】
Ｇ８．２  前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化８】
2018532389.tif 000023
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、実施形態Ｇ７からＧ８．１のいずれか１つに記載の組成物。
【０８５６】
Ｇ９．前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、実施形態Ｇ７からＧ８．２のいずれか１つに記載の組成物。
【０８５７】
Ｇ１０．前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、実施形態Ｇ１からＧ９のいずれか１つに記載の組成物。
【０８５８】
Ｇ１１．前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、実施形態Ｇ１０に記載の組成物。
【０８５９】
Ｇ１２．前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、実施形態Ｇ１０またはＧ１１に記載の組成物。
【０８６０】
Ｇ１３．前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｇ１およびＧ６からＧ１２のいずれか１つに記載の組成物。
【０８６１】
Ｇ１４．細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、実施形態Ｇ１３に記載の組成物。
【０８６２】
Ｇ１５．前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、実施形態Ｇ１４に記載の組成物。
【０８６３】
Ｇ１６．前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、実施形態Ｇ１４またはＧ１５に記載の組成物。
【０８６４】
Ｇ１７．前記１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、実施形態Ｇ１６に記載の組成物。
【０８６５】
Ｇ１８．前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、実施形態Ｇ１４からＧ１７のいずれか１つに記載の組成物。
【０８６６】
Ｇ１９．前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、実施形態Ｇ１８に記載の組成物。
【０８６７】
Ｇ２０．前記１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、実施形態Ｇ１９に記載の組成物。
【０８６８】
Ｇ２１．前記ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｇ１４からＧ２０のいずれか１つに記載の組成物。
【０８６９】
Ｇ２２．前記１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、実施形態Ｇ２１に記載の組成物。
【０８７０】
Ｇ２３．前記１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、実施形態Ｇ２２に記載の組成物。
【０８７１】
Ｇ２４．前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｇ１、Ｇ１．１、Ｇ１．２、およびＧ６からＧ２３のいずれか１つに記載の組成物。
【０８７２】
Ｇ２５．細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、実施形態Ｇ２からＧ５およびＧ２４のいずれか１つに記載の組成物。
【０８７３】
Ｇ２６．前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態Ｇ２５に記載の組成物。
【０８７４】
Ｇ２７．レチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、実施形態Ｇ１、Ｇ２、Ｇ４、およびＧ６からＧ２６のいずれか１つに記載の組成物。
【０８７５】
Ｇ２８．レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、実施形態Ｇ３、Ｇ５、およびＧ２７のいずれか１つに記載の組成物。
【０８７６】
Ｇ２８．１  前記１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、実施形態Ｇ１．２に記載の組成物。
【０８７７】
Ｇ２９．前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、実施形態Ｇ２８またはＧ２８．１に記載の組成物。
【０８７８】
Ｇ２９．１  前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが各々、マイクロモル未満の濃度で存在する、実施形態Ｇ２８からＧ２９のいずれか１つに記載の組成物。
【０８７９】
Ｇ３０．３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｇ１、Ｇ１．１、Ｇ１．２、およびＧ６からＧ２９．１のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８０】
Ｇ３０．１  １００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｇ１、Ｇ１．１、Ｇ１．２、およびＧ６からＧ２９．１のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８１】
Ｇ３１．前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｇ３０．１に記載の組成物。
【０８８２】
Ｇ３２．前記規定されたゼノフリー基本培地が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｇ２からＧ５のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８３】
Ｇ３２．１  前記規定されたゼノフリー基本培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、実施形態Ｇ２からＧ５のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８４】
Ｇ３３．前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、実施形態Ｇ３２．１に記載の組成物。
【０８８５】
Ｇ３４．前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、実施形態Ｇ１、Ｇ１．１、Ｇ１．２、およびＧ６からＧ３３のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８６】
Ｇ３５．１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、実施形態Ｇ２からＧ５およびＧ３４のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８７】
Ｇ３６．異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、実施形態Ｇ１からＧ３５のいずれか１つに記載の組成物。
【０８８８】
本明細書で参照される各特許、特許出願、刊行物、および文献の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物、および文献の引用は、前出のいずれかが、関連する先行技術であることの容認でも、これらの刊行物または文献の内容または日付についてのいかなる容認を構成するわけでもない。それらの引用は、関係のある開示の探索を指し示すものではない。文献の日付または内容についての全ての言明は、入手可能な情報に基づくものであり、それらの正確さまたは正しさについての容認ではない。
【０８８９】
前出には、本技術の基本的態様から逸脱することなく、改変を施すことができる。本技術は、１つまたは複数の具体的な実施形態に関して、実質的な詳細さで記載されており、当業者は、本出願で具体的に開示される実施形態には、変化を施すことができるが、これらの改変および改善は、依然として本技術の範囲および主旨内にあることを認識する。
【０８９０】
本明細書で例示的に記載される本技術は、本明細書で具体的に開示されていない、任意の要素の非存在下でも、適切に実施することができる。したがって、例えば、「〜を含むこと」、「〜から本質的になること」、および「〜からなること」という用語のいずれも、本明細書のそれぞれの場合では、他の２つの用語の一方で置き換えることができる。用いられる用語および表現は、記載の用語として使用されており、限定の用語としては使用されておらず、このような用語および表現の使用は、示され、記載された特色またはその部分の任意の同等物を除外せず、特許請求される本技術の範囲内で、多様な改変が可能である。「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」という用語は、要素の１つまたは１つを超える要素のいずれが記載されるか文脈上明らかでない限りにおいて、それが修飾する要素の１つまたは複数を指す場合がある（例えば、「ある試薬」は、１つまたは複数の試薬を意味しうる）。本明細書で使用される「約」という用語は、基礎となるパラメータの１０％以内（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）の値を指し、値の連なりの始端における「約」という用語の使用は、値の各々を修飾する（すなわち、「約１、２、および３」は、約１、約２、および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの間の重量を含みうる。さらに、本明細書で値の列挙（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、または８６％）について記載する場合、列挙は、その全ての中間値および小数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本技術について、代表的な実施形態および任意選択の特色により具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書で開示される概念の改変および変更を施すことができ、このような改変および変更は、本技術の範囲内にあると考えられることを理解されたい。
【０８９１】
本技術のある特定の実施形態については、以下の特許請求の範囲に示す。
【図１】
2018532389.tif 000026
【図２】
2018532389.tif 000027
【図３Ａ】
2018532389.tif 000028
【図３Ｂ】
2018532389.tif 000029
【図４】
2018532389.tif 000030
【図５Ａ】
2018532389.tif 000031
【図５Ｂ】
2018532389.tif 000032
【図６Ａ】
2018532389.tif 000033
【図６Ｂ】
2018532389.tif 000034
【図７】
2018532389.tif 000035
【図８】
2018532389.tif 000036
【図９】
2018532389.tif 000037
【図１０】
2018532389.tif 000038
【図１１】
2018532389.tif 000039
【図１２】
2018532389.tif 000040
【図１３】
2018532389.tif 000041
【図１４】
2018532389.tif 000042
【図１５】
2018532389.tif 000043
【図１６】
2018532389.tif 000044
【図１７】
2018532389.tif 000045
【図１８】
2018532389.tif 000046
【図１９】
2018532389.tif 000047
【図２０】
2018532389.tif 000048
【図２１】
2018532389.tif 000049
【図２２】
2018532389.tif 000050
【図２３】
2018532389.tif 000051
【図２４】
2018532389.tif 000052
【図２５】
2018532389.tif 000053
【図２６】
2018532389.tif 000054
【図２７】
2018532389.tif 000055
【図２８】
2018532389.tif 000056
【図２９】
2018532389.tif 000057
【図３０】
2018532389.tif 000058
【図３１】
2018532389.tif 000059
【図３２Ａ】
2018532389.tif 000060
【図３２Ｂ】
2018532389.tif 000061
【図３２Ｃ】
2018532389.tif 000062
【図３２Ｄ】
2018532389.tif 000063
【図３３】
2018532389.tif 000064
【図３４】
2018532389.tif 000065
【図３５】
2018532389.tif 000066
【図３６】
2018532389.tif 000067
【図３７】
2018532389.tif 000068
【図３８】
2018532389.tif 000069
【図３９ＡＢ】
2018532389.tif 000070
【図３９ＣＤ】
2018532389.tif 000071
【図４０】
2018532389.tif 000072
【図４１】
2018532389.tif 000073
【図４２】
2018532389.tif 000074
【図４３】
2018532389.tif 000075
【図４４】
2018532389.tif 000076
【図４５】
2018532389.tif 000077
【図４６】
2018532389.tif 000078
【図４７】
2018532389.tif 000079
【図４８】
2018532389.tif 000080
【図４９】
2018532389.tif 000081
【配列表】
2018532389000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月10日(2018.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分であって、アルブミンまたは配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む血清代替構成成分を含む、
方法。
【請求項２】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、アルブミンまたは配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記元になる上皮細胞集団が、分化上皮細胞、静止上皮細胞、前静止上皮細胞、分化系列決定上皮細胞、基底上皮細胞、および上皮前駆細胞のうちの１つまたは複数を含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミンを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ１）阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ミオシンＩＩ阻害剤が、ブレビスタチンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記拡大培養条件が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記拡大培養条件が、前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記拡大培養条件が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記拡大培養条件が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団。
【請求項２６】
ａ）遺伝子改変細胞の作製；
ｂ）対象のための１つまたは複数の候補処置の同定；
ｃ）対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞の同定；または
ｄ）対象における疾患の進行または疾患の処置のモニタリング、
における使用のための、請求項２５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を含む組成物。
【請求項２７】
ｉ）培養された上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分であって、アルブミンまたは配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
【請求項２８】
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストをさらに含む、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
１つまたは複数の成長因子を含む、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
以下の記載、実施例、特許請求の範囲、および図面では、ある特定の実施形態についてさらに記載する。
例えば、本発明の実施形態において、以下の項目が提供される。
（項目１）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
（項目２）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
（項目３）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、
方法。
（項目４）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記シグナル伝達阻害剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、項目２または３に記載の方法。
（項目６）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
（項目７）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
（項目８）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
（項目９）
ｅｘ  ｖｉｖｏで上皮細胞を増殖させるための方法であって、
分化組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、元になる上皮細胞集団の細胞の数を、規定された、ゼノフリーでフィーダーフリーの拡大培養条件下で拡大し、これにより、拡大された上皮細胞集団を発生させるステップ
を含み、
前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー基本培地；前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる細胞培養組成物中で上皮細胞を培養することを含む、
方法。
（項目１０）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、項目１および６から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、２５回またはこれを超える集団倍加が可能であり；前記元になる上皮細胞集団が、前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含まない対照培養条件下で培養すると、２０回を超えない集団倍加が可能である、項目１および６から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記元になる上皮細胞集団が、分化上皮細胞を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記元になる上皮細胞集団が、静止上皮細胞および／または前静止上皮細胞を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記元になる上皮細胞集団が、分化系列決定上皮細胞を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記元になる上皮細胞集団および／または前記拡大された上皮細胞集団が、胚性幹細胞を含有しない、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する１つまたは複数の分子を含む、項目１および６から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと相互作用する１つまたは複数の分子を含む、項目１および６から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、項目１および６から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、項目２から５および１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化９】
2018532389.tif 000082
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、項目１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、項目１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目１および１０から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、項目２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、項目２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記拡大培養条件が、前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目１、２、３、および１０から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、項目６から９および３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記拡大培養条件が、前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目１、６、８、および１０から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、項目７、９、および４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、項目３に記載の方法。
（項目４４）
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを各々、マイクロモル未満の濃度で使用する、項目４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記拡大培養条件が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目１、２、３、および１０から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記拡大培養条件が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目１、２、３、および１０から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記規定されたゼノフリー基本培地が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目６から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記規定されたゼノフリー基本培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目６から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、項目１、２、３、および１０から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、項目６から９および５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記拡大培養条件が、異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、項目１から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、３０回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、５０回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、８０回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記元になる上皮細胞集団が、前記拡大培養条件下で培養すると、１００回またはこれを超える集団倍加が可能である、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記元になる上皮細胞集団が、基底上皮細胞を含む、項目１から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記元になる上皮細胞集団および／または前記拡大された上皮細胞集団が、１つまたは複数の基底上皮細胞マーカーを発現する、項目１から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
連続的に増殖する上皮幹細胞、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団を選択するステップを含まない、項目１から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記元になる上皮細胞集団が、連続的に増殖する上皮幹細胞を含まず、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に増殖する上皮幹細胞の集団に由来する細胞を含まない、項目１から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を単離するステップをさらに含む、項目１から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団を、細胞バンクで貯蔵するステップをさらに含む、項目１から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
項目１から６４のいずれか一項に記載の方法により作製される、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団。
（項目６６）
遺伝子改変細胞を作製するための、項目６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目６７）
対象のための１つまたは複数の候補処置を同定するための、項目６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目６８）
対象における１つまたは複数の異常な上皮細胞を同定するための、項目６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目６９）
対象における疾患の進行または疾患の処置をモニタリングするための、項目６５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した上皮細胞の集団の使用。
（項目７０）
ｉ）培養された上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７１）
ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、およびｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７２）
ｉ）１つまたは複数の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤からなるシグナル伝達阻害剤、ならびにｉｉ）１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分を含む、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７３）
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７４）
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤から本質的になる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７５）
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；および前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７６）
規定されたゼノフリー基本培地；培養される上皮細胞の集団内のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または前記集団内の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤；１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分；１つまたは複数の成長因子；前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤；および前記集団内のレチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤からなる、規定されたゼノフリー細胞培養組成物。
（項目７７）
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用する１つまたは複数の分子を含む、項目７０および７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７８）
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記薬剤が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達経路内のタンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと相互作用する１つまたは複数の分子を含む、項目７０および７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７９）
テロメラーゼ逆転写酵素を活性化させ、かつ／または形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤を含む、項目７０および７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８０）
前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータシグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤を含む、項目７１、７２、または７９に記載の組成物。
（項目８１）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＡＬＫ５阻害剤を含む、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、１つまたは複数のＡＴＰ類似体を含む、項目８０または８１に記載の組成物。
（項目８３）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の少なくとも１つが、式Ａ：
【化１０】
2018532389.tif 000083
［式中、
Ｘ、Ｙ、およびＺは独立に、Ｎ、Ｃ、およびＯから選択され；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
ｎは、０または１であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール、−リンカー−（Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ１０シクロアリール）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９複素環）、−リンカー−（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）、−リンカー−（置換Ｃ５〜Ｃ９ヘテロシクロアリール）から選択され；
前記置換アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、シクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環、またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである］
の構造を含む、項目８０から８２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８４）
前記１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３−０１、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、およびＳＢ  ４３１５４２から選択される、項目８０から８３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８５）
前記１つまたは複数の規定されたゼノフリーの血清代替構成成分が、アルブミン、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する機能的に同等なタンパク質を含む、項目７０から８４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８６）
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、項目８５に記載の組成物。
（項目８７）
前記アルブミンが、イネにおいて発現させた組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である、項目８５または８６に記載の組成物。
（項目８８）
前記集団内の細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目７０および７７から８７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８９）
細胞骨格構造をモジュレートする１つまたは複数の薬剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤、およびミオシンＩＩ阻害剤の１つまたは複数を含む、項目８８に記載の組成物。
（項目９０）
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ  １）阻害剤およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ  ２）阻害剤から選択される、項目８９に記載の組成物。
（項目９１）
前記Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、項目８９または９０に記載の組成物。
（項目９２）
前記１つまたは複数の低分子Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ＳＲ  ３６７７、チアゾビビン、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ−４２９２８６から選択される、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、ＰＡＫ１阻害剤、ＰＡＫ２阻害剤、ＰＡＫ３阻害剤、およびＰＡＫ４阻害剤から選択される、項目８９から９２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９４）
前記ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤を含む、項目９３に記載の組成物。
（項目９５）
前記１つまたは複数の低分子ＰＡＫ１阻害剤が、ＩＰＡ３を含む、項目９４に記載の組成物。
（項目９６）
前記ミオシンＩＩ阻害剤が、１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、項目８９から９５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９７）
前記１つまたは複数の非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤を含む、項目９６に記載の組成物。
（項目９８）
前記１つまたは複数の低分子非筋ミオシンＩＩ（ＮＭ  ＩＩ）阻害剤が、ブレビスタチンを含む、項目９７に記載の組成物。
（項目９９）
前記集団内の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目７０、７１、７２、および７３から９８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１００）
細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、項目７３から７６および９９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０１）
前記１つまたは複数のベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニストが、イソプロテレノールを含む、項目１００に記載の組成物。
（項目１０２）
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する１つまたは複数の薬剤をさらに含む、項目７０、７３、７５、および７７から１０１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０３）
レチノイン酸シグナル伝達を阻害する前記１つまたは複数の薬剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、項目７４、７６、および１０２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０４）
前記１つまたは複数のレチノイン酸シグナル伝達阻害剤が、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストを含む、項目７２に記載の組成物。
（項目１０５）
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが、ＢＭＳ−４５３およびＢＭＳ−１９５６１４の１つまたは複数を含む、項目１０３または１０４に記載の組成物。
（項目１０６）
前記１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストが各々、マイクロモル未満の濃度で存在する、項目１０３から１０５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０７）
３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目７０、７１、７２、および７７から１０６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０８）
１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目７０、７１、７２、および７７から１０６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０９）
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、項目１０８に記載の組成物。
（項目１１０）
前記規定されたゼノフリー基本培地が、３００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１１）
前記規定されたゼノフリー基本培地が、１００μＭを下回る濃度でカルシウムを含む、項目７３から７６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１２）
前記カルシウムが、約９０μＭの濃度で存在する、項目１１１に記載の組成物。
（項目１１３）
前記拡大培養条件が、１つまたは複数の成長因子を含む、項目７０、７１、７２、および７７から１１２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１４）
１つまたは複数の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、またはＥＧＦおよびＦＧＦを含む、項目７３から７６および１１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１５）
異種構成成分を含む細胞外マトリックスを含まない、項目７０から１１４のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2018532389.tif 000084
2018532389.tif 000085
2018532389.tif 000086
2018532389.tif 000087
2018532389.tif 000088