(57)【要約】本発明は、特に再発寛解型多発性硬化症を患っている患者において、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞内のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１ａ）の発現レベルを測定することにより、Ｔｒｅｇ耐性と呼ばれる、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の低下した応答性を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、自己免疫疾患または状態を患っている患者からのＴｒｅｇ耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞内のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）の発現レベルを測定することにより、機能性遺伝子発現プロファイルを作成するステップと、得られた遺伝子発現プロファイルを健常対照からのＴｒｅｇ感受性ＣＤ４＋Ｔ細胞からの発現プロファイルと比較するステップとを含む、自己免疫疾患または状態の検出のためのインビトロスクリーニング方法に関する。ＰＣＧ−１αまたはＴｒｅｇ耐性Ｔ細胞の上流制御因子ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１は、Ｔｒｅｇに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の低下した応答性の検出のためのスクリーニング系において使用され得る。
2018522573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞内のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）の発現レベルを測定することにより、Ｔｒｅｇ耐性と呼ばれる、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の低下した応答性を検出するための方法。
【請求項２】
前記ＰＧＣ−１αの発現レベルが活性化Ｔｒｅｇ感受性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＧＣ−１α発現レベルと比較され、前記活性化Ｔｒｅｇ感受性ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較された活性化Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞内のＰＧＣ−１αの下方制御がＴｒｅｇ耐性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＧＣ−１αの上方制御がＴｒｅｇ媒介性抑制に対するＴｒｅｇ感受性Ｔ細胞の応答性と相関する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔｒｅｇ耐性がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後の促進されたＩＬ−６産生、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔの増強されたリン酸化および／または増大されたＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）発現に関連する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞のＴｒｅｇ応答性が、ＩＦＮ−βを用いて活性化Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞内のＰＧＣ−１α発現を基準化することによって回復される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＧＣ−１αに加えてまたはその代わりに、Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞の上流制御因子ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１の発現レベルがＣＤ４＋Ｔ細胞内で決定され、かつＴｒｅｇ感受性Ｔ細胞と比較される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
自己免疫疾患または状態を検出するためのインビトロスクリーニング方法であって、自己免疫疾患または状態を患っている患者からのＴｒｅｇ耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞内のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）の発現レベルを測定することにより、機能性遺伝子発現プロファイルを作成するステップと、前記得られた遺伝子発現プロファイルを健常対照からのＴｒｅｇ感受性ＣＤ４＋Ｔ細胞からの発現プロファイルと比較するステップとを含むインビトロスクリーニング方法。
【請求項８】
前記機能性遺伝子発現プロファイルの作成が、
ａ．Ｔ細胞からＲＮＡを抽出および精製するステップと、
ｂ．ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを合成するステップと、
ｃ．ｃＤＮＡをマーカー分子で標識化し、かつ遺伝子チップにハイブリダイズするステップと、
ｄ．前記マーカー分子の強度を検出することにより、前記遺伝子チップを分析するステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＧＣ−１αに加えてまたはその代わりに、Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞の上流制御因子ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１の発現レベルがＣＤ４＋Ｔ細胞内で決定され、かつＴｒｅｇ感受性Ｔ細胞と比較される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の低下した応答性が請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって検出される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記自己免疫疾患または状態が関節リウマチ、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性炎症性腸疾患、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔｒｅｇ耐性と呼ばれる、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の低下した応答性を検出するためのスクリーニング系における、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）またはＴｒｅｇ耐性Ｔ細胞の上流制御因子ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１の使用。
【請求項１３】
自己免疫性患者から単離された活性化Ｔ細胞内のＰＣＧ−１α発現を上方制御するアゴニストを同定するための、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
自己免疫障害または状態の治療的処置プロセスを監視するための、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫応答を活発に抑制する能力が賦与される独特のＴ細胞系統を表す。Ｔｒｅｇは、健常者において全ての末梢Ｔ細胞の２％未満に相当する（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００１；１９３：１２８５−１２９４）。
【０００２】
免疫モジュレーターとして、Ｔｒｅｇは、他の免疫細胞の活性化を抑制し、抑制されたＴエフェクター細胞に制御特性を付与することにより、末梢免疫寛容の維持において重要な役割を果たす（非特許文献１；非特許文献２）。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の低下した応答性は、Ｔｒｅｇ耐性としても知られている。Ｔｒｅｇ耐性は、いくつかの炎症性および非炎症性自己免疫疾患において検出可能である。Ｔｒｅｇの抑制機能は活性化に依存するが、活性化されるとＴｒｅｇは他の免疫細胞を非特異的に抑制し、広範な全身性の免疫調節効果をもたらす（非特許文献３）。自己反応性Ｔ細胞の活性化は、生理的条件下で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって調節される（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。自然免疫応答および適応免疫応答を制御するその独特の機能のために、Ｔｒｅｇは免疫学研究における重要な主題となっている。従って、Ｔｒｅｇは、関節リウマチ、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性炎症性腸疾患、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡などのいくつかの自己免疫状態または疾患において主要な役割を果たす（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００３】
これらの疾患の中で、多発性硬化症（ＭＳ）は、不均一な自己免疫疾患として患者のごく一部が治療に反応するのみであるため、処置するのが困難である。新しい治療的処置は調査するのが困難であるが、近年、治療の成果が有意に（著しく）改善されている。これまで、ＴｒｅｇはＭＳ患者において機能的に低下していることが知られている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。この不均衡のために、自己反応性Ｔ細胞はＴｒｅｇによる抑制を免れ、血液脳関門を通って移動して中枢神経系を攻撃する（非特許文献１７）。サイトカインＩＬ−６は、増強されたＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化と、上方制御されたＩＬ−６Ｒ発現と、ポジティブフィードバックループにおいてそれ自体の促進された産生とを誘導することにより、主要な役割を果たす（非特許文献１８）。
【０００４】
ＰＰＡＲＧＣ１Ａは２型糖尿病の検出との関連でも知られており、特許文献１に従って白血球中のＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現レベルを測定することによって検出することができる。
【０００５】
しかしながら、現在のところ自己免疫患者において欠損ＴｒｅｇとＴｒｅｇ耐性Ｔ細胞とを区別することは不可能である。この区別は、両方のＴ細胞集団がその特定の活性化マーカーの発現またはそのサイトカインプロファイルの点で違いがないという事実によって複雑にされる（非特許文献１９；非特許文献２０）。これらの障壁により、低下したＴ細胞機能に関連し、かつＴ細胞−Ｔｒｅｇ相互作用の理解において重要な洞察を提供する分子の同定に対する需要が増大した（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許第１０２１４６４７４号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ２５（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｖｅｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００２，１９６．２５５−２６０
【非特許文献２】Ｓｔａｓｓｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ：ｔｗｏ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｌｐｈａ  ４  ｂｅｔａ  ７  ｏｒ  ａｌｐｈａ  ４  ｂｅｔａ  １  ｃｏｎｆｅｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｕｐｏｎ  ＣＤ４＋Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：１３０３−１３１１
【非特許文献３】Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９８，１８８：２８７−２９６
【非特許文献４】Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：１２８５−１９２４
【非特許文献５】Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１２．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：５３１−５６４
【非特許文献６】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ：ｈｏｗ  ｄｏ  ｔｈｅｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ？Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２１：１１０５−１１１１
【非特許文献７】Ｋｅｌｃｈｔｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ．Ａｒｔｈｒ  ｒｅｓ  ｔｈｅｒ，２００５，７：ｒ４０２−ｒ４１５
【非特許文献８】１４．Ｍｃｇｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０５，１７５：３０２５−３０３２  １５
【非特許文献９】Ｐｏｗｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ＣＤ４＋ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ．Ｂ−１７  ｓｃｉｄ  ｍｉｃｅ，１９９３，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１４６１−１４７１
【非特許文献１０】Ｂｅｌｋａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４２０：５０２−５０７
【非特許文献１１】Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ  ａｎｄ  Ｈａｆｌｅｒ，２００４ｂ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：２７３−２７６
【非特許文献１２】Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：６９７−７０６
【非特許文献１３】Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３５：３３４３−３３５２
【非特許文献１４】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，“Ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｔ（ｒｅｇｓ）ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ＩＬ−６−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ”，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：１７０ｒａ１１５
【非特許文献１５】Ｔｒｉｎｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  Ｔ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８：ｅ７７６３４
【非特許文献１６】Ｚｏｚｕｙｌａ  ａｎｄ  Ｓｉｅｎｄｌ，２００８．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．４：３８４−３９８
【非特許文献１７】Ｇｏｖｅｒｍａｎ，２００９．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：３９３−４０７
【非特許文献１８】Ｔｒｉｎｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  Ｔ−ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８：ｅ７７６３４
【非特許文献１９】Ｆｅｒｒａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａｌｔｅｒｅｄ  ＩＬ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＳＬＡＭ）−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０）１６０：１５１４−１５２１
【非特許文献２０】Ｖｌａｄｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｓＩＬ−６Ｒ  ｇｐ８０）ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０：８６−８９
【非特許文献２１】Ｈａｖｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．［Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅ］．Ｄｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎｉｓｔ  ５６：４３２−４４５
【非特許文献２２】Ｋａｔｓａｖｏｓ  ａｎｄ  Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕｌｉ，２０１３．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ａｎ  Ｕｐ−ｔｏ−Ｄａｔｅ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１３：３４０５０８
【非特許文献２３】Ｗｅｉｎｅｒ，２００９．Ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｈｏｗ  ｄｏ  ｗｅ  ｃｕｒｅ  ａ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ？Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６５：２３９−２４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の低下した応答性の検出と、Ｔｒｅｇ耐性に関連する炎症性および非炎症性自己免疫状態または疾患の検出とを可能にする新規の改善された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、本方法と、それで利用される本発明に従う生物学的マーカー分子とによって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。
【００１０】
本発明は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞内のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）またはＴｒｅｇ耐性Ｔ細胞の他の上流制御因子の発現レベルを測定することにより、Ｔｒｅｇ耐性と呼ばれる、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の低下した応答性を検出するための方法に関する。
【００１１】
本発明は、単離されたヒトまたは動物細胞または細胞培養物におけるＴｒｅｇ耐性の検出を可能にする生体分子を同定することを目的とする。本発明者らにより、Ｔｒｅｇ耐性は、増大されたＩＬ−６受容体発現、促進されたＩＬ−６産生および増強されたＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔのリン酸化によって引き起こされることが実証される。自己免疫疾患を患っている患者からＴｒｅｇ耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能性遺伝子発現プロファイルを作成して、Ｔｒｅｇ耐性に関連する潜在的なバイオマーカーを同定した。Ｔｒｅｇ活性化Ｔ細胞の発現プロファイル、その増殖能力およびサイトカイン産生は、自己免疫疾患を患っている患者と健常者の活性化Ｔ細胞との間で違いがない。本明細書中で同定されるバイオマーカーは、Ｔｒｅｇ耐性に関連し、かつ所与の処置の治療の成功を監視するための診断ツールを提供する。結果として、自己免疫疾患は、副作用の低減をもたらす特定の分子に取り組むことによって個別化することができ、それにより治療の効率および成功が高まる。本明細書中で同定されるバイオマーカーは、増強されたＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化と、上方制御されたＩＬ−６Ｒ発現と、ポジティブフィードバックループにおいてそれ自体の促進された産生とを誘導することにより、主要な役割を果たすＩＬ−６経路と密接な関係がある。
【００１２】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）は、本発明者らによってさらに調査された、Ｔｒｅｇ耐性の検出のための、従ってＴｒｅｇ耐性に関連する自己免疫状態または疾患の検出のためのバイオマーカーの全ての基準を満たす１つの候補である。活性化Ｔ細胞内のＰＧＣ−１αの発現プロファイルを比較する研究において、多発性硬化症（ＭＳ）患者を健常者と比較した。従って、ＭＳ患者からのエフェクターＴ細胞は、健常者からのＴ細胞と比べて大きく低減された発現レベルを示す。機能性生物情報学的分析を適用して、ＭＳおよび他の自己免疫状態に特異的ないくつかの他のバイオマーカー（これらは全てＴ細胞機能およびＴｒｅｇ耐性と密接な関係がある）を同定した。ＰＧＣ−１αと同様に、Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞の他の上流制御因子ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１も健常者のＴｒｅｇ感受性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞内で活性化時に有意に上方制御されるが、自己免疫患者の活性化Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞内では下方制御され、これにより、Ｔｒｅｇ耐性および／または自己免疫障害の検出のための適切な候補とされる。
【００１３】
Ｔｒｅｇに対するＴ細胞の感受性はＰＧＣ−１α発現レベルと相関するため、ＰＧＣ−１αの発現は、ＩＬ−６に応答してかつ自己免疫患者の活性化Ｔ細胞において下方制御され、発現レベルはＴｒｅｇ耐性と相関する。ＰＧＣ−１αは自己免疫患者において下方制御されるため、治療は、Ｔｒｅｇ機能に対する感受性を改善するために活性化Ｔ細胞内のＰＧＣ−１αの上方制御を対象とし得る。
【００１４】
本発明者らは、ＰＧＣ−１αの下方制御がＩＬ−６によって直接誘導可能であり、それにより新しい治療戦略の開発のための有望なアプローチを提供することをさらに見出した。ＩＬ−６は、免疫応答において重要な機能を有すると共に、いくつかの自己免疫疾患の発症および維持にも寄与する多面的なサイトカインであることが知られている（Ｍａｌｐａｓｓ，２０１３；Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｆｉｎｏｔｔｏ，２００１）。ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化はＩＬ−６の合成によって促進され、これは関節炎およびＭＳ患者のＴ細胞において見出され、これらの細胞をＴｒｅｇの調節に対して非感受性にする。
【００１５】
治療アプローチの一部として、自己免疫患者の活性化Ｔ細胞内のＰＧＣ−１α発現を上方制御することができるアゴニストを同定することができる。本発明において、ＭＳ患者から単離されたＴ細胞においてＰＧＣ−１α発現の上方制御を誘導するために、これらのＴ細胞内でのＩＦＮ−βの効果が実証された。ＰＧＣ−１α発現レベルは、ＩＦＮ−β処置においてほぼ基準化することが可能であり、ＰＧＣ−１αは治療的処置プロセスを監視するためのマーカーとしても適していることが実証される。さらに、ＰＧＣ−１α発現の誘導がＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化を防止し、その後、ＩＬ−６の存在下でもＴｒｅｇ媒介性抑制に対するその感受性を回復させることが見出された。さらに、ＩＦＮ−β処置は、Ｔ細胞機能の回復に関連するＰＧＣ−１αの基準化された発現プロファイルを誘導し、ＰＧＣ−１αがＴｒｅｇによる抑制の伝達における主要制御因子であることを実証した。
【００１６】
Ｔｒｅｇ耐性の検出は、好ましくは、ＰＧＣ−１αまたは同定された他のバイオマーカー分子ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１のいずれかの発現レベルと、活性化Ｔｒｅｇ感受性ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれのバイオマーカーの発現レベルとを比較することによって実行され、ここで、活性化Ｔｒｅｇ感受性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞と比較した活性化Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞内のＰＧＣ−１αまたは他の言及されたバイオマーカーのいずれかの下方制御はＴｒｅｇ耐性を示す。本発明に従う方法において、ＰＧＣ−１αまたは他のバイオマーカーのいずれかの上方制御は、Ｔｒｅｇ感受性ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ媒介性抑制に対する応答性と相関がある。ＰＧＣ−１αの下方制御は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後の促進されたＩＬ−６産生、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔの増強されたリン酸化および／または増大されたＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）発現に関連するため、Ｔｒｅｇ耐性のさらなる調節が可能である。
【００１７】
また、本発明は、炎症疾患または自己免疫状態の検出のためのインビトロスクリーニング方法にも関し、本方法は、自己免疫疾患または状態を患っている患者からのＴｒｅｇ耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞内のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ＰＧＣ−１α）の発現レベルを測定することにより、機能性遺伝子発現プロファイルを作成するステップと、得られた遺伝子発現プロファイルを健常対照からのＴｒｅｇ感受性ＣＤ４＋Ｔ細胞からの発現プロファイルと比較するステップとを含む。特に、本発明のスクリーニング方法は、ＭＳ患者の活性化Ｔ細胞における発現プロファイルを健常者の発現プロファイルと比較したときに、多発性硬化症などのいくつかの自己免疫疾患の早期検出を可能にする。また、本発明のスクリーニング方法は、Ｔｒｅｇ耐性に関連する同様の自己免疫疾患または状態、例えば、関節リウマチ、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、自己免疫性炎症性腸疾患、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡などの検出のためにも使用可能であることも認められる。さらに実証されるように、Ｔ細胞機能の改善はＰＧＣ−１α発現の基準化と相関があり、Ｔｒｅｇ活性の回復は、多発性硬化症または他の言及された自己免疫障害のいずれかなどの自己免疫障害の処置のための有望な治療的アプローチであることが示される。Ｔｒｅｇ耐性の影響を受けたＴ細胞からＴｒｅｇ感受性の影響を受けたＴ細胞への移行は、ＰＧＣ−１α、またはＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＥＳＲＲＡ、ＬＰＩＮ１などの他のバイオマーカー分子のいずれかの発現レベルと相関がある。加えて、ＩＬ−６発現レベルは、ＰＧＣ−１αが下方制御されたＭＳ患者からの活性化Ｔ細胞内で有意に増大する。他方で、健常者の活性化Ｔ細胞内において、ＩＬ−６Ｒ発現は有意に低減され、ＰＧＣ−１αは上方制御される。上述のように、活性化ＭＳ  Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１αの下方制御は、増強されたＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化およびＴｒｅｇ媒介性抑制に対するＴ細胞の無応答性に関連している。他方で、ＰＧＣ−１α発現の誘導は、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化を防止し、その後、ＩＬ−６の存在下でもＴｒｅｇ媒介性抑制に対するその感受性を回復させるのに十分であった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】機能性遺伝子チップ分析により、ＨＣのＴｒｅｇ感受性Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ耐性ＭＳ  Ｔ細胞の１６の上流制御因子が同定された。
【図２】ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＭＳ  Ｔ細胞のＴｒｅｇ耐性と関係がある潜在的な分子としてＰＧＣ−１αが同定される。
【図３】ＩＬ−６は活性化Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１αの下方制御を誘導し、それによりＴｒｅｇ耐性を媒介する。
【図４】共培養におけるＰＰＡＲαアゴニストの存在はＰＧＣ−１αの上方制御を誘導し、それによりＩＬ−６の存在下でもＴ細胞の感受性を回復させる。
【図５】ＭＳ患者からのＴ細胞のＴｒｅｇ耐性はＩＦＮ−β治療後に改善され、ＰＧＣ−１αの上方制御と相関がある。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の実施例は、本発明をより詳細に実証するであろう。
【実施例】
【００２０】
ＭＳ患者からのＴｒｅｇ耐性ＣＤ４＋Ｔ細胞の先進的遺伝子プロファイリング
Ｔ細胞活性化プロセスは転写的に制御されるため、本発明者らは、ＭＳ  Ｔ細胞のＴｒｅｇ耐性が遺伝子発現プロファイルにおける特定の転写変化によって反映されると仮定した。従って、本発明者らは、Ｔｒｅｇ感受性ＨＣ（健常対照）ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ耐性ＭＳ  ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ刺激応答性遺伝子の発現プロファイルを分析した（図１Ａ）。多数の３，５１２の刺激応答遺伝子をＭＳにおいて同定し、刺激時に発現の変化を有するＨＣ  Ｔ細胞における２，４７２の遺伝子を同定した（図１Ｂ）。続いて、異なって制御されるこれらの遺伝子を表すデータセットを用いて上流制御因子の先進的生物情報学的分析を実施した。目的は、本明細書により、ＭＳ患者またはＨＣのＴ細胞において特異的に活性化または阻害される上流制御因子を決定することであった（図１Ｃ）。さらに、上流制御因子のグループをさらに縮小するために、ストリンジェンシーの高い分子およびＩＬ−６／ｃ−Ａｋｔシグナル伝達経路と機能的に関連がある分子を示した（図１Ｄ）。これらのパラメータは、標的上流制御因子のグループを、Ｔｒｅｇ耐性に機能的に関与するはずである１６遺伝子に縮小した。
【００２１】
ＰＧＣ−１αは刺激時にＨＣのＴＣにおいて強力に上方制御されるが、ＭＳ  Ｔ細胞では下方制御される
Ｔｒｅｇ耐性およびＩＬ−６シグナル伝達に関連することが予測される分子がそれ自体差別的に制御されるかどうかを調査するために、本発明者らは、ＭＳ患者およびＨＣからのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞において同定された上流制御因子のｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。特に、インシリコで予測された分子ＨＮＦ４Ａ、ＨｄａｃおよびＰＰＡＲＧＣ１Ａ（図２Ａ）は、その上流制御因子についての生物情報学的分析により予測されるように、実際にそれ自体制御されるが、ＩＲＦ８、ＦＧＦ１９およびＲＯＲＡのｍＲＮＡ発現は変化しなかった。ＰＰＡＲＧＣ１Ａにおいて最も大きい違いが見出され、さらなる分析により、ＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現は活性化時にＨＣのＴｒｅｇ感受性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞において有意に上方制御されるが、ＭＳ患者の活性化Ｔｒｅｇ耐性Ｔ細胞では下方制御されることが明らかにされた（図２Ｂ、左側）。興味深いことに、ＭＳ患者およびＨＣにおける休止Ｔ細胞の相対的発現は同程度に発現されるため、差別的な制御は活性化状態に直接依存する（図２Ｂ、右側）。ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ１α）または省略形ＰＧＣ−１αは、エネルギー代謝に関与する遺伝子を制御する転写コアクチベータとして知られており、外部シグナルの主要インテグレータであることが示唆された（Ａｕｓｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ，２０１２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＰＧＣ−１α発現は、ＰＫＢ／ｃ−ＡｋｔおよびＩＬ−６シグナル伝達に関係し（Ｈａｎｄｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｏｍａｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、この分子がＭＳ患者の機能障害性Ｔ細胞のための有望な候補を表すという生物情報学予測をさらに実証する。
【００２２】
ＩＬ−６は活性化Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１αの上方制御を妨害する
ＰＧＣ−１αの制御およびＴｒｅｇ耐性におけるＩＬ−６シグナル伝達の役割をさらに調査するために、本発明者らは、ＩＬ−６の存在または非存在下においてＨＣからのＴｒｅｇ感受性Ｔ細胞を単独でまたはＴｒｅｇと一緒に刺激した。実際に、抑制因子共培養物におけるＩＬ−６の補給は、ＴｒｅｇによるＴ細胞の効率的な調節を防止した（図３Ａ）。同時に、外因性ＩＬ−６の添加は活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＰＧＣ−１αの上方制御を防止し、さらに活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞内のＰＧＣ−１α発現を下方制御した（図３Ａ）。これらはいずれも、これらのＴ細胞におけるＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔのリン酸化の増強に関連する（図３Ｂ）。さもなければ、抗ＩＬ−６ＲｍＡｂまたはｃ−Ａｋｔ阻害薬ＶＩＩＩはＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔのリン酸化を阻害し（図３Ｃ）、従ってＩＬ−６誘導性Ｔｒｅｇ耐性を回復させた。これらの結果は、ＰＧＣ−１α発現がＴｒｅｇ耐性と厳密に関連し、その制御がＩＬ−６により調節されることを示す。
【００２３】
Ｔ細胞内のＰＧＣ−１αの上方制御はＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ活性化を防止し、Ｔｒｅｇ媒介性抑制に対するその応答性と厳密に相関がある
Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１α上方制御がＴｒｅｇ媒介性抑制に対するその感受性と正の相関があるという本発明者らの仮説を評価するために、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α（ＰＰＡＲα）のアゴニストおよびアンタゴニストを使用した。ＰＰＡＲαの活性化は、ＰＧＣ−１αに媒介されるミトコンドリア新生に必要である（Ｆｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＰＰＡＲαアゴニストの存在はＰＧＣ−１α発現を増強し、同時にＴ細胞内のＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化を低減した。ＰＰＡＲαアンタゴニストによるインキュベーションは、期待される反対の結果をもたらし（図４ＡおよびＢ）、毒性を誘導しなかった（補足図４）。Ｔｒｅｇ媒介性抑制に対するＴ細胞の感受性におけるＰＧＣ−１α調節の機能的結果を調査するために、古典的な抑制因子アッセイにおいて修飾因子を使用した。Ｔｒｅｇの非存在下において、ＰＰＡＲα修飾因子は、両方とも（アゴニストもアンタゴニストも）Ｔ細胞増殖に有意に影響を与えなかった。しかしながら、アゴニストの添加は、外因性ＩＬ−６の存在下でも共培養物中のＴｒｅｇ媒介性抑制を回復させた（図４Ｃ）。さもなければ、Ｔｒｅｇ耐性は、ＰＰＡＲαアンタゴニストの投与により単独で誘導され得る（図４Ｄ）。これは、Ｔｒｅｇ媒介性抑制に対するその感受性のためにＴ細胞におけるＰＧＣ−１α上方制御が重要であることを実証する。
【００２４】
ＩＦＮ−β治療はＭＳ患者のＴ細胞においてＰＧＣ−１α発現を基準化し、Ｔｒｅｇ応答性を回復させる
ＩＦＮ−βは再発寛解型ＭＳの処置における１つの標準的治療であるが、ＩＦＮ−βがその効果を発揮するメカニズムは完全には理解されていない（Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本発明者らは、ＩＦＮ−β治療がＴｒｅｇ調節に関してもＭＳ患者のＴ細胞機能を回復させるかどうかを分析した。ここで、ＩＦＮ−βによる４か月間の処置は、Ｔｒｅｇ媒介性抑制に対する末梢Ｔ細胞の感受性をほぼＨＣからのＴ細胞のレベルまで改善することが見出された（図５Ａ）。これは、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化の低減（図５Ｂ）およびＩＬ−６Ｒ発現の低下（図５Ｃ）と相関がある抑制に対する感受性を回復させた。ＰＧＣ−１αの基準化と相関があるＴ細胞応答性を回復させるかどうかを決定するために、ＩＦＮ−β治療を用いてまたは用いずに、ＭＳ患者のＴ細胞においてＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現を分析した。ＰＧＣ−１αは、治療を受けていないＭＳ患者において活性化後に強力に下方制御された（図５Ｄ）が、ＩＦＮ−β処置を経験した患者において、ＨＣからの活性化Ｔ細胞における発現に匹敵するＰＧＣ−１αの有意な上方制御が見出された。これは、治療の成功を予測するための診断ツールとしてのＰＧＣ−１αの可能性を実証する。
【００２５】
本明細書で提示されるデータは、ＰＧＣ−１αが適切なバイオマーカー分子であり、Ｔ細胞特異的であり、Ｔｒｅｇに対するＴ細胞感受性と直接相関があることを実証する。ＰＧＣ−１αの発現はＭＳ患者の活性化Ｔ細胞内のＩＬ−６に応答して下方制御され、低レベルのＰＧＣ−１αはＴｒｅｇ耐性と相関がある。治療で誘導されるＰＧＣ−１αの上方制御は、Ｔｒｅｇ機能に対するその感受性の耐性のために使用することができる。従って、末梢Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１α発現の下方制御はＴｒｅｇ耐性を示し、Ｔｒｅｇ耐性関連の自己免疫状態または障害の同定を可能にする。また、ＰＧＣ−１α下方制御がＩＬ−６により直接誘導可能であり、新しい治療戦略の開発を可能にすることも実証される。他方で、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔのリン酸化は同族プロモーターへのＰＧＣ−１αの補充を防止し、糖尿病患者において糖新生および脂肪酸酸化を促進するその能力が損なわれる。アゴニストによるＰＧＣ−１αの上方制御は、他方でＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔのリン酸化を制限し、ＩＬ−６の存在下でもＴ細胞感受性をもたらした。ＩＦＮ−βは、ＩＬ−６経路を介するシグナル伝達を弱めることにより、ＭＳ患者における自己侵襲的なＴ細胞の免疫調節を有意に改善し、従って、Ｔｒｅｇ媒介性の抑制に対するその感受性が回復される。Ｔ細胞機能の改善は、ＰＧＣ−１α発現のほぼ健常者のレベルへの基準化と相関があり、ＰＧＣ−１αが治療的アプローチを監視するための適切なマーカーであることが実証される。
【００２６】
また、結果は、Ｔ細胞機能の調節不全に関係する分子を発見するために先進的生物情報学的分析が有益であるという強力な証拠も提供する。活性化ＭＳ  Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１αの下方制御は、増強されたＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化およびＴｒｅｇ媒介性抑制に対するＴ細胞の無応答性と関係がある。他方で、ＰＧＣ−１α発現の誘導は、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化を防止し、その後、ＩＬ−６の存在下でもＴｒｅｇ媒介性抑制に対するその感受性を回復させるのに十分であった。さらに、ＩＦＮ−β処置は、Ｔ細胞機能の回復に関連するＰＧＣ−１αの基準化された発現プロファイルを誘導し、ＰＧＣ−１αがＴｒｅｇによる抑制の伝達における主要制御因子であることが実証された。
【００２７】
方法
患者および健常対照
再発寛解コースの８５人の患者（ＲＲＭＳ、年齢１８〜６４歳）および臨床的に単離された症候の４人の患者（ＣＩＳ、年齢２２〜５３歳）（全て多発性硬化症の改訂されたＭｃＤｏｎａｌｄ診断基準を満たす）を本研究に含めた。３１人の患者を少なくとも４カ月間にわたりＩＦＮ−βで処置した。５８人の患者は、分析の時点の６か月前に前処置または免疫抑制薬を受けておらず、臨床的に安定していた。健常対照からのＰＢＭＣは、対照としての役割を果たした。血液採取後の１２時間以内にＰＢＭＣを単離し、インビトロ実験において直接使用した。血液は、ＰＢＭＣ濃縮前に室温に保持した。ヘルシンキ宣言で表示された原理および倫理委員会に承認されたプロトコルに従って、患者は本研究に参加する前に書面による同意書を提供した。
【００２８】
マイクロアレイ解析
製造業者の説明書に従ってＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ，ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉキットおよびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｔ細胞から全ＲＮＡを抽出および精製した。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＲＮＡの完全性を検証した。Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１００ｎｇの全ＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。次に、ｃＤＮＡを断片化し、遺伝子チップＷＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇおよびコントロールキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてビオチン化した。ビオチン化ｃＤＮＡ断片を遺伝子チップＨｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｒｒａｙ  ２．０にハイブリダイズし、次にマイクロアレイを洗浄し、遺伝子チップＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で染色した。次に、遺伝子チップＳｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて遺伝子チップを分析した。Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）からのＲｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｖｅｒａｇｅ法（ＲＭＡ）を用いて、ハイブリダイゼーション強度に対応する蛍光シグナルを基準化した。本発明者らは、ポリクローナル刺激により、３個体の培地において２倍を超える変化である転写の相違を示す遺伝子プローブを選別した（ウェルチのｔ検定：Ｐ＜０．０５）。次に、差別的に発現された遺伝子を表すデータベースをＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）に適用した。Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓにおいて機能および転写制御の予測のために活性化ｚスコアを用いた。ｚスコアは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅに収集された実験的に観察された転写変化事象から得られる統合情報を用いて、各経路に属する遺伝子プローブにおける発現プロファイルから計算される。フィッシャーの正確確率検定を用いて各経路の有意性を評価した（Ｐ≦０．０５）。２よりも下（阻害）または上（活性化）のｚスコアは有意であると考えられる。
【００２９】
培地および抗体
Ｘ−ＶＩＶＯ−１５（Ｌｏｎｚａ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）においてヒト細胞を培養した。以下の抗体：抗ヒトＣＤ３（ＳＫ７）、抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、抗ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ヒトＣＤ８（ＳＫ１）、抗ヒトＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、抗ヒトＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、抗ヒトＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）（全てＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのもの）、抗ヒトＣＤ８（ＢＷ１３５／８０，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ（登録商標）ビオチン化ヒトインターロイキン−６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてフローサイトメトリー分析を実施した。７−ＡＡＤおよびｅＦｌｕｏｒ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてフローサイトメトリー分析中の細胞生存率を決定した。妨害実験について、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ＩＵ／ｍｌ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）と共に、抗ＩＬ−６Ｒに対する中和抗体（トシリズマブ）、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ  ＶＩＩＩ阻害薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＰＰＡＲＡアンタゴニスト（ＧＷ６４７１，Ｔｏｃｒｉｓ，０．０５μΜ）またはＰＰＡＲＡアゴニスト（ＧＷ７６４６，Ｔｏｃｒｉｓ，０．０１μΜ）を培養物に補充した。
【００３０】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ選別
ＰＢＭＣまたはＴ細胞の表面染色のために、表示される抗体を４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。染色した細胞を、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＬＳＲＩＩにおいて測定した。リン酸化ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ（抗Ａｋｔ、ｐＳ４７３、ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ）を検出するために、細胞を３７℃で固定し（ＢＤ  ＣｙｔｏｆｉｘＴＭ緩衝液）、透過処理を行い（ＢＤＴＭＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ緩衝液）、ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ染色緩衝液で２回洗浄し、製造業者の説明書に従って表示される抗体に対して染色した。
【００３１】
Ｔ細胞サブセットの単離
抗ＣＤ２５ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを単離し、以前に記載されたように（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により汚染ＣＤ８＋、ＣＤ１４＋およびＣＤ１９＋細胞を欠乏させた。純度は常に８０％を超え、標準的な抑制因子アッセイにおいてＴｒｅｇ機能性が保証された。製造業者の説明書に従ってｐａｎＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、非接触（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ）ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離を実施した。いくつかの実験について、ＰＢＭＣは、対応するＤｙｎａｂｅａｄｓ（１ビーズ／細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＤ３またはＣＤ２５を欠乏させた。
【００３２】
サイトカイン分析
ＨＣまたはＭＳ患者からのＴｒｅｇ欠乏ＰＢＭＣをＴｒｅｇ（１：１比）の存在または非存在下で培養し、抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ−３）で刺激した。製造業者の説明書に従って、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による刺激の７２時間後に上清中のサイトカインを測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（Ｓｔａｔｃｏｎ）により分析した。
【００３３】
抑制因子アッセイ
Ｔｒｅｇ欠乏ＰＢＭＣ（１０５細胞）を０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ−３）で刺激し、種々のＴｒｅｇ比（Ｔｒｅｇ：Ｔ細胞  １：１〜１：６４）の存在または非存在下で培養した（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに１６時間の３７ｋＢｑ／ウェルの３Ｈ−Ｔｄｒの添加により培養の３日目にＴ細胞増殖を決定した。抗ＩＬ−６Ｒに対する中和ｍＡｂ（３０ｎｇ／ｍｌ；トシリズマブ；Ｒｏａｃｔｅｒｍａ；Ｒｏｃｈｅ）を培養物に補充することにより、またはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ＩＵ／ｍｌ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充して、いくつかの実験を実施した。ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ  ＶＩＩＩ阻害薬（０．１μΜ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、アイソザイム選択性、Ａｋｔ１／２）を個々のアッセイに添加した。ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ＩＵ／ｍｌ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）と共に、ＰＰＡＲＡアンタゴニスト（ＧＷ６４７１，Ｔｏｃｒｉｓ，０．０５μΜ）またはＰＰＡＲＡアゴニスト（ＧＷ７６４６，Ｔｏｃｒｉｓ，０．０１μΜ）を培養物に補充することにより、いくつかの実験を実施した。増殖性Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析のために、温かいＰＢＳ中でＴｒｅｇ欠乏ＰＢＭＣを洗浄し、１μΜのＣＦＳＥにより染色し、その後、Ｔｒｅｇ（１：１比）と共に、またはＴｒｅｇ（１：１比）を伴わずに共培養し、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。死細胞の除外後３日目に増殖を評価した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において分析を実施し、ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて評価した。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の説明書に従ってＲｎｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２ｘ１０６細胞からＲＮＡを抽出した。Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）による逆転写によってｃＤＮＡを生成し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ，７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）およびＱｕａｎｔｉＦＡＳＴ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により増幅した。相対的なＩＬ−６  ｍＲＮＡ（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｑｉａｇｅｎ）発現レベルをＥＦ１−αまたはβ−Ａｃｔｉｎに基準化した。相対的なＰＰＡＲＧＣ１α、ＩＲＦ８、ＦＧＦ１９、ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ  ｍＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）により分析し、発現レベルをβ−ＡＣＴに基準化した。
【００３５】
統計分析
結果は、平均プラス／マイナスＳＥＭを表す。対応なしのＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いてＨＣに対して統計的有意性を決定した。０．０５未満のｐ値を有意とみなし、対応する図面に表示した。いくつかの実験では、ボンフェローニ補正を使用して多重比較の問題を相殺した：ｐ＊＝ｐ×ｎ。
【００３６】
図面の凡例
図１：機能性遺伝子チップ分析により、ＨＣのＴｒｅｇ感受性Ｔ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ耐性ＭＳ  Ｔ細胞の１６の上流制御因子が同定された
Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ分析のために使用される実験計画の概略的な概観。Ｂ）ＨＣおよびＭＳのＴ細胞内で異なって発現され、統計的に２倍の変化を示す刺激応答遺伝子のＶｏｌｃａｎｏプロット。Ｃ）活性化Ｔ細胞の経路分析。上側パネル：ＭＳ、ＨＣまたは両方の活性化Ｔ細胞において活性化されることが予測される上流制御因子の数。下側パネル：ＭＳ患者、ＨＣまたは両方の活性化Ｔ細胞において阻害されることが予測される上流制御因子の数。Ｄ）統計的に＋１または−１を超えて（ｚスコアにおいて）有意である上流制御因子をＩＬ−６／ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔシグナル伝達経路との関係に関して検査した（Ａ：制御因子はＩＬ−６／Ａｋｔの産生／活性を増大させる；Ｂ：制御因子はＩＬ−６／Ａｋｔの産生／活性を低下させる；Ｃ：制御因子の活性／発現がＩＬ６／Ａｋｔにより増大される、Ｄ：制御因子の活性／発現がＩＬ−６／Ａｋｔにより低下される、およびＥ：情報なし）。
【００３７】
図２：ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＭＳ  Ｔ細胞のＴｒｅｇ耐性と関係がある潜在的な分子としてＰＧＣ−１αが同定される
ＭＳ患者（赤色）またはＨＣ（黒色）からのＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を未刺激のままにするか、またはプレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂにより活性化した。ＦＧＦ１９、ＨＮＦ４Ａ、Ｈｄａｃ、ＲＯＲＡ、ＩＲＦ８およびＰＰＡＲＧＣ  ｍＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより検出した。ハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチンを使用した。４回の独立した実験が、四分位範囲、ＨＣ  Ｔ細胞に対するｐ値と共に中央値として示される。Ｂ）ＭＳ患者（赤色）もしくはＨＣ（黒色）からの全Ｔ細胞（左側パネル）またはＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋のいずれかのＴ細胞（右側パネル）を未刺激のままにするか、またはプレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂにより活性化した。ＰＰＡＲＧＣ１Ａ  ｍＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより検出した。β−アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。６〜１１回の独立した実験が、四分位範囲、ＨＣ  Ｔ細胞に対するｐ値と共に中央値として示される。左側：休止Ｔ細胞に基準化された活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現レベルが示される。右側：ハウスキーピング遺伝子β−アクチンに基準化された休止ＣＤ３＋Ｔ細胞内のＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現レベルが示される。
【００３８】
図３：ＩＬ−６は活性化Ｔ細胞におけるＰＧＣ−１αの下方制御を誘導し、それによりＴｒｅｇ耐性を媒介する
Ａ）上側パネル：ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇをＩＬ−６の存在下（灰色）または非存在下（黒色）で共培養し、抗ＣＤ３ｍＡｂにより刺激した。３日目に３Ｈ−Ｔｄｒの取込みにより増殖を決定し、３回の測定の平均±ＳＥＭで示した。４回の独立した実験の１つが示される。下側パネル：ＩＬ−６と共に（灰色）またはＩＬ−６を伴わずに（黒色）ＨＣからのＰＢＭＣを２４時間培養し、徹底的に洗浄し、およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。細胞を未刺激のままにするか、またはプレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂにより４時間活性化した。休止Ｔ細胞に基準化された活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣ）における（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ）ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡの発現レベルが示される。β−アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。バーは、４回の実験の平均、ＩＬ−６を伴わないＴＣに対するｐ値を表す。Ｂ）ＩＬ−６と共に（黒色）またはＩＬ−６を伴わずに（灰色）、２４時間の培養後にＣＤ３＋Ｔ細胞内でフローサイトメトリーによりＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化を分析した。Ｃ）ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化のフローサイトメトリーによる決定。ＩＬ−６の存在下（灰色）または非存在下（黒色）、またはＩＬ−６およびＩＬ−６ＲｍＡｂの存在下（灰色、白色ストライプ）で、ＨＣからのＴ細胞を２４時間インキュベートした。Ｔ細胞内のｐＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示される（５回の独立した実験の１つの代表的な結果）。Ｄ）ＩＬ−６の存在下（灰色）またはＩＬ−６およびＶＩＩＩ阻害薬の存在下（ストライプ、０．０１、０．１および１μＭ）でＨＣからのＰＢＭＣを２４時間培養した。ＣＤ３＋Ｔ細胞内でフローサイトメトリーによりＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化を分析した。１つの代表的な実験の標準偏差を含む、ＭＦＩ値の算術平均が示される（ｎ＝６）。
【００３９】
図４：共培養におけるＰＰＡＲαアゴニストの存在はＰＧＣ−１αの上方制御を誘導し、それによりＩＬ−６の存在下でもＴ細胞の感受性を回復させる
Ａ）ＨＣからのＰＢＭＣを培地（黒色）、ＰＰＡＲαアンタゴニスト（青色）またはＰＰＡＲαアゴニスト（緑色）と共に２４時間培養し、徹底的に洗浄し、活性化Ｔ細胞内のＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより検出した。β−アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。バーは、３回の異なる実験のＰＧＣ−１α発現の平均を表す。Ｂ）培地（黒色）、ＰＰＡＲαアゴニスト（緑色）またはＰＰＡＲαアンタゴニスト（青色）と共に２４時間の培養後にＣＤ３＋Ｔ細胞内でＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化をフローサイトメトリーにより分析した。４回の独立した実験の１つの代表が示される。Ｃ）ＩＬ−６の存在下（灰色）または非存在下（黒色）、またはＩＬ−６およびＰＰＡＲαアゴニストの存在下（緑色）でＴ細胞およびＴｒｅｇを共培養し、抗ＣＤ３ｍＡｂにより刺激した。３日目に３Ｈ−Ｔｄｒの取込みにより増殖を決定し、３回の測定の平均±ＳＥＭで示した。３回の独立した実験の１つが示される。Ｄ）ＰＰＡＲαアンタゴニストの存在下（青色）または非存在下（黒色）でＴ細胞およびＴｒｅｇを共培養し、抗ＣＤ３ｍＡｂにより刺激した。３日目に３Ｈ−Ｔｄｒの取込みにより増殖を決定し、３回の測定の平均±ＳＥＭで示した。３回の独立した実験の１つが示される。
【００４０】
図５：ＭＳ患者からのＴ細胞のＴｒｅｇ耐性はＩＦＮ−β治療後に改善され、ＰＧＣ−１αの上方制御と相関がある
Ａ）治療を受けていないＭＳ患者（黒色）、ＩＦＮ−β処置されたＭＳ患者（青色）またはＨＣ（白色）からのＴｒｅｇ欠乏ＰＢＭＣを同種異系Ｔｒｅｇと共に共培養し、抗ＣＤ３ｍＡｂにより刺激した。３日目に３Ｈ−Ｔｄｒの取込みによりＴ細胞の増殖を決定した。ボックスプロットは、ＰＢＭＣ単独の増殖に基準化されたＴｒｅｇ（１：１比）の存在下における抑制の割合を中央値として、四分位範囲（ｎ＝１５）、ＨＣまたは治療を受けていないＭＳの抑制に対するＰ値と共に示し、ファミリーワイズエラー率を回避するためにボンフェローニ補正を使用し、（ｐ＊）で示した。Ｂ）治療を受けていないＭＳ患者（赤色）、ＩＦＮ−β処置したＭＳ患者（青色）またはＨＣ（黒色）からのＣＤ３＋Ｔ細胞内でＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化をフローサイトメトリーにより決定した。灰色のヒストグラムはＭＳのアイソタイプ対照を示す。下側パネルは、６回の異なる実験のＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔリン酸化のＭＦＩ、ＭＳのＭＦＩに対するｐ値を示す。Ｃ）ＨＣ（黒色）、治療を受けていないＭＳ患者（赤色）、またはＩＦＮ−β処置されたＭＳ患者（青色）からのＰＢＭＣ内のＩＬ−６Ｒ発現をフローサイトメトリーにより決定した。ボックスプロットは、６人の独立したドナーのＣＤ３＋Ｔ細胞内のＩＬ−６Ｒ＋細胞の割合を示し、治療を受けていないＭＳまたはＨＣのＩＬ−６Ｒ発現に対するｐ値が示される。Ｄ）治療を受けていないＭＳ患者、ＩＦＮ−β処置したＭＳ患者、またはＨＣからのＣＤ３＋Ｔ細胞を未刺激のままにするか、またはプレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂにより４時間活性化した。活性化Ｔ細胞内のＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより検出した。β−アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。６回の独立した実験は中央値として四分位範囲（ｎ＝６）と共に示され、ＨＣまたは治療を受けていないＭＳのＴＣの発現レベルに対するｐ値が示され、ファミリーワイズエラー率を回避するためにボンフェローニ補正を使用し、ｐ＊で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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