(57)【要約】  本発明は、ネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用に関する。本発明はさらに、ネコに曝露したヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用に関する。本発明はさらに、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質とを含む、組成物に関する。本発明の組成物は、ネコに効率的な免疫応答、特に抗体応答を誘導し、ネコアレルギーの治療および／または予防に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与し、前記組成物が、
（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子と、
（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質と
を含み、前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合している、使用。
【請求項２】
前記ネコのアレルゲン性の前記低減が、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中にＦｅｌ  ｄ１とＦｅｌ  ｄ１抗体で形成される免疫複合体を生成させることによってもたらされ、好ましくは、前記組成物の前記投与によって、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中に前記免疫複合体の前記生成が起こる、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項３】
前記ネコのアレルゲン性の前記低減が、前記ネコに曝露したヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の低減であり、ネコに曝露した前記ヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の前記低減が、（ｉ）前記ヒトに生じるアレルギー反応のレベルもしくは重症度の低減または（ｉｉ）前記ヒトの少なくとも１つのアレルギー症状の低減であり、好ましくは、前記ネコへの前記ヒトの前記曝露が、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙、好ましくは前記ネコの唾液への前記ヒトの曝露である、請求項１または請求項２に記載の組成物の使用。
【請求項４】
（ｉ）前記ヒトに生じるアレルギー反応のレベルもしくは重症度の前記低減または（ｉｉ）前記ヒトの前記少なくとも１つのアレルギー症状の前記低減が、皮膚プリック試験、鼻誘発試験または結膜誘発試験の陽性度の低下、好ましくは皮膚プリック試験の陽性度の低下によって表されるものであって、前記皮膚プリック試験、鼻誘発試験または結膜誘発試験、好ましくは前記皮膚プリック試験に、好ましくは、前記投与の前および後の前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙を、さらに好ましくは、前記投与の前および後の前記ネコの唾液を用いる、請求項３に記載の組成物の使用。
【請求項５】
前記ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＶＬＰポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなる改変ＶＬＰであり、前記改変ＶＬＰポリペプチドが、
（ａ）ＶＬＰポリペプチドと、
（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープと
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記ＶＬＰポリペプチドが、
（ｉ）ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは植物ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列または
（ｉｉ）変異アミノ酸配列
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列が、前記ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と前記ウイルスのコートタンパク質が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項６】
前記ＶＬＰがキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、
（ａ）ＣＭＶポリペプチドと
（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープと
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記ＣＭＶポリペプチドが、
（ｉｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または
（ｉｉ）変異アミノ酸配列
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と前記ＣＭＶのコートタンパク質が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
前記ＣＭＶポリペプチドが、
（ａ）配列番号１を含むか、好ましくはこれよりなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または
（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、
この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列が、配列番号３４を含むか、
この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列が、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む、
請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域が前記Ｔヘルパー細胞エピトープに置き換わっており、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域が、配列番号１のアミノ酸２〜１２に対応する、請求項６〜７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
前記Ｔｈ細胞エピトープがＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープが、配列番号５のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものであるか、
前記Ｔｈ細胞エピトープが破傷風毒素に由来するものであり、前記Ｔｈ細胞エピトープが、配列番号４のアミノ酸配列を有するもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである、
請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
前記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記アミノ酸配列が、配列番号１または配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記アミノ酸配列が配列番号３４を含み、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域が前記Ｔヘルパー細胞エピトープに置き換わっており、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置き換えられたＮ末端領域が、１１〜１３個の連続するアミノ酸、好ましくは１１個の連続するアミノ酸よりなり、さらに好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域が、配列番号１のアミノ酸２〜１２に対応する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含むＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質であり、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２が、１つのペプチド結合を介して直接融合しているか、一方の鎖のＮ末端と他方の鎖のＣ末端とを結合するスペーサーを介して融合している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、
（ａ）配列番号２０、
（ｂ）配列番号２５、
（ｃ）配列番号２６、
（ｄ）配列番号２７または
（ｅ）配列番号２９
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
ネコのアレルゲン性を低減する方法であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が、
（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子と、
（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質と
を含み、前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合しており、好ましくは、前記方法または前記組成物が、請求項１〜１３のいずれか１項で定められるものである、方法。
【請求項１５】
（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質と
を含み、
前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合しており、
前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、配列番号２５または配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記ＶＬＰが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、
（ａ）ＣＭＶポリペプチドと
（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープと
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用に関する。本発明はさらに、ネコに曝露したヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用に関する。本発明はさらに、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質とを含む、組成物に関する。本発明の組成物は、ネコに効率的な免疫応答、特に抗体応答を誘導し、ネコから出るＦｅｌ  ｄ１のアレルゲン性を低減するものであり、このため、ヒトにおけるネコアレルギーの治療および／または予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）は室内アレルゲンの重要な発生源の１つである（Ｌａｕ，Ｓ．ら（２０００）Ｌａｎｃｅｔ  ３５６，１３９２−１３９７）。実際、西洋諸国では約２５％の家庭にネコがみられ、その集団の大部分にネコに対するアレルギーが認められる。症状の重症度には、比較的軽度な鼻炎および結膜炎から、生命に危険を及ぼす可能性のある喘息の増悪まである。ネコの皮屑および皮に含まれる複数の異なる分子に感作された患者もいるが、主要なアレルゲンはＦｅｌ  ｄ１である。このアレルゲンの重要性を強調した研究は多数ある。実際、ネコアレルギー患者のうち、この強力なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体がみられる患者は８０％を超える（ｖａｎ  Ｒｅｅ，Ｒ．ら（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０４，１２２３−１２３０）。
【０００３】
Ｆｅｌ  ｄ１は、Ｎ結合炭水化物を１０〜２０％含有する３５〜３９ｋＤａの酸性糖タンパク質であり、ネコの皮、すなわち皮膚と体毛、唾液腺および涙腺のほか、肛門周囲腺にも存在する。Ｆｅｌ  ｄ１は、非共有結合した２つのヘテロ二量体によって形成されている。各ヘテロ二量体は、別個の遺伝子がコードする７０残基のペプチド（「鎖１」として知られる）１つと７８残基、８５残基、９０残基または９２残基のペプチド（「鎖２」として知られる）１つとよりなる（Ｄｕｆｆｏｒｔ，Ｏ．Ａ．ら（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８，３０１−３０９；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．ら；（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，９６９０−９６９４およびＧｒｉｆｆｉｔｈ，Ｉ．Ｊ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１３，２６３−２６８を参照されたい）。
【０００４】
現在、ネコアレルギー患者の治療は、粗ネコ皮屑抽出物またはＦｅｌ  ｄ１由来の短いペプチドの用量を漸増させて反復注射する脱感作療法によって実施されている。ＬｉｌｊａらおよびＨｅｄｌｉｎらは、ネコアレルギー患者に粗ネコ皮屑抽出物を投与する脱感作プログラムを開示している（Ｌｉｌｊａ，Ｑら（１９８９）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８３，３７−４４およびＨｅｄｌｉｎら（１９９１）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８７，９５５−９６４）。このプログラムは少なくとも２〜３年を要し、３年間治療を受けた患者でも依然として全身症状が認められた。脱感作にＦｅｌ  ｄ１由来の短いペプチドを用いても、ペプチド群とプラセボ群との間に有意差は認められていない（Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｗ．Ｌ．ら（２００２）Ｌａｎｃｅｔ  ３６０，４７−５３）。この短いペプチドは、患者に大量に（７５０μｇ）投与した場合にのみ効果が認められている（Ｎｏｒｍａｎ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５４，１６２３−１６２８）。
【０００５】
粗ネコ皮屑抽出物による治療でも短いペプチドによる治療でも、遅発型喘息反応などのアレルギー性副作用が報告されている。このため、いずれの脱感作プログラムでも、注射するアレルゲンに起因するアナフィラキシーショックが安全性に関する大きな懸念材料となっている。しかし、注射するアレルゲンの量を減らしてこのような作用を回避すれば、治療効果が低下したり、治療期間が長くなったりする。このため、ネコアレルギー治療の分野では、上記のものに代わる脱感作レジメン、ここでは特に、アレルギー症状を軽減することができるが、アレルギー性副反応は誘発しない脱感作レジメンの必要性が高い。ヒトのネコアレルギーに対処するためほかにも、ウイルス様粒子と共有結合させたＦｅｌ  ｄ１抗原を用いるヒトの能動免疫化が記載されている（国際公開第２００６／０９７５３０Ａ２号）。
【０００６】
別法として、ネコそのものを治療してネコから出るＦｅｌ  ｄ１の量を減少させることが提案されている（国際公開第２００７／１１３６３３Ａ２号）。しかし、これまで、成功例の報告どころかデータさえ得られていない。
【０００７】
したがって、ヒトのネコアレルギーに対処するのに効果的であることが示されている組成物および治療法が必要とされている。特に、ヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法において効果的な組成物および治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、本発明の組成物がネコのアレルゲン性、ここでは特に、ヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法において効果的であることを明らかにした。例えば、本発明者らは、本発明の組成物をネコに投与するとＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体およびＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＡ抗体が生成することを明らかにした。さらに、免疫感作したネコに内因性Ｆｅｌ  ｄ１とＩｇＡ抗体とよりなる免疫複合体が検出された。さらに、前記組成物で免疫感作した後に採取したネコの唾液抽出物では、ネコアレルギー患者の好塩基球の脱顆粒のレベルが、免疫感作前に前記ネコから採取した唾液抽出物と比較して最大２０％低下しており、この値はＦｅｌ  ｄ１濃度が１３分の１になったことに相当し、唾液中のアレルゲン性Ｆｅｌ  ｄ１が大幅に減少したことを示している。
【０００９】
この説明に束縛されるものではないが、本発明は、ネコにＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体およびＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＡ抗体を誘導し、これがＦｅｌ  ｄ１と結合し、ひいてはＦｅｌ  ｄ１のアレルゲン作用を低下させる、または中和することによって、ヒトのアレルギー反応の最初の介入点であると考えられるところに影響を及ぼす。有効量の本発明の組成物をネコに投与すると、Ｆｅｌ  ｄ１に対してのみならず、ＶＬＰ担体に対しても体液性免疫応答が誘導される。この抗体応答は主としてＩｇＧアイソタイプのものであると予想されるが、ほかにもＩｇＡが誘導される。最終的には、これらの抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体がアレルギー反応を防ぐ。免疫感作およびＦｅｌ  ｄ１特異的抗体の誘導後、免疫複合体、すなわち抗体−Ｆｅｌ  ｄ１複合体がｉｎ  ｓｉｔｕで形成され、環境中に分泌される。その結果、ヒトは、ネコが出す複合体型のＦｅｌ  ｄ１に曝露することになり、天然型（「反応型」）のＦｅｌ  ｄ１への曝露量は少なくなる。これは、２つの作用機序を介することによって効果を示す可能性が考えられる。１つ目が、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩによってＦｅｌ  ｄ１の関与を抑えること（古典的中和）によるものであり、２つ目が、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩとＩｇＧ／ＦｃγＲＩＩｂが同時に関与し、ＦｃεＲＩを介するシグナル伝達を脱活性化すること（負のシグナル伝達）によるものである。
【００１０】
したがって、第一の態様では、本発明は、通常かつ好ましくはヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与し、前記組成物が、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合している、使用を提供する。好ましくは、前記方法は、前記ネコのアレルゲン性を低減する非治療的方法である。さらなる実施形態では、前記ネコはアレルギーにも自己免疫疾患にも罹患しておらず、通常かつ好ましくは、前記ネコはＦｅｌ  ｄ１を原因とするアレルギーにも自己免疫疾患にも罹患していない。
【００１１】
好ましい実施形態では、通常かつ好ましくはヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中にＦｅｌ  ｄ１とＦｅｌ  ｄ１抗体とで形成される免疫複合体を生成させることによってもたらされ、好ましくは、前記組成物の前記投与によって、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中に前記免疫複合体の前記生成が起こる。
【００１２】
さらなる好ましい実施形態では、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチドと（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはこれよりなるものであり；前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列はＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。さらなる極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１を含むか、好ましくはこれよりなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり；この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列は配列番号３４を含むか；あるいは、この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列は、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む。
【００１３】
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものである。さらに、極めて好ましくは、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含むＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質であり、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２は、１つのペプチド結合を介して直接融合しているか、一方の鎖のＮ末端と他方の鎖のＣ末端とを結合するスペーサーを介して結合している。極めて好ましくは、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号２０；（ｂ）配列番号２５；（ｃ）配列番号２６；（ｄ）配列番号２７；または（ｅ）配列番号２９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、通常かつ好ましくはヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する方法であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合している、方法を提供する。好ましくは、前記方法は、前記ネコのアレルゲン性を低減する非治療的方法である。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合しており、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、配列番号２５または配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＶＬＰがキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、（ａ）ＣＭＶポリペプチドと（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはこれよりなるものであり；前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものである、組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、ネコに投与する組成物として製剤化され、ネコが出すＦｅｌ  ｄ１のアレルゲン性を低減する、免疫原性組成物を提供する。本発明の組成物により、ネコに接触または接近したときにネコアレルギーの症状を示す傾向のあるヒトに対するネコのアレルゲン性が少なくなる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与し、前記組成物が、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合しており、前記ネコの前記低減されるアレルゲン性が、ヒトに対する前記ネコの低減されるアレルゲン性である、使用を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ネコのアレルゲン性を低減する方法に使用する組成物であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与し、前記組成物が、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合しており、前記ネコの前記低減されるアレルゲン性が、ヒトに対する前記ネコの低減されるアレルゲン性である、組成物を提供する。
【００１９】
この記載を進めるに従って、本発明のさらなる態様および実施形態が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｐＥＴ−ＣＭＶｗｔプラスミドマップである。関連する遺伝子および制限酵素部位の相対的位置が示されている。
【図２Ａ】精製ＣＭＶｗｔ  ＶＬＰの動的光散乱を示す図である。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、イギリス）を用いて粒子の大きさを検出した。
【図２Ｂ】精製ＣＭＶｗｔ  ＶＬＰの電子顕微鏡解析を示す図である。ＶＬＰの形態解析にはＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ社、東京、日本）を用いた。
【図３】精製ＣＭＶ由来ＶＬＰの質量分光分析を示す図である。Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ社、ドイツ）でマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。質量の決定にはタンパク質分子質量（ＭＭ）校正標準品ＩＩ（２２．３〜６６．５ｋＤａ；Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ社）を用いた。
【図３Ａ】ＣＭＶ野生型（「ｗｔ」）；理論ＭＭ＝２４０６９；実測ＭＭ＝２４０５８
【図３Ｂ】ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ；理論ＭＭ＝２４１６１（１番目のＭｅｔを含まない）；実測ＭＭ＝２４１６０
【図３Ｃ】ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０；理論ＭＭ＝２４４８３（１番目のＭｅｔを含まない）；実測ＭＭ＝２４４７７
【図４Ａ】精製ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰの動的光散乱を示す図である。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、イギリス）を用いて粒子の大きさを検出した。
【図４Ｂ】精製ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰの電子顕微鏡解析を示す図である。ＶＬＰの形態解析にはＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ社、東京、日本）を用いた。
【図５Ａ】精製ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ  ＶＬＰの動的光散乱を示す図である。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、イギリス）を用いて粒子の大きさを検出した。
【図５Ｂ】精製ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ  ＶＬＰの電子顕微鏡解析を示す図である。ＶＬＰの形態解析にはＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ社、東京、日本）を用いた。
【図６Ａ】ＰｒｅｐＥａｓｅキット（ＵＳＢ）を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞からのＦ１２Ｈ６ＧＧＣタンパク質の発現および精製のＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析を示す図である。Ｍ−タンパク質サイズマーカー；Ｓ−可溶性タンパク質画分；Ｐ−細胞残屑；Ｆ−Ｎｉ−ＩＤＡカラムのフロースルー（未結合タンパク質）；Ｗ１、Ｗ２−洗浄画分（２×２ｍｌの１×ＬＥＷ緩衝液）；Ｗ３、Ｗ４−洗浄画分（２×２ｍｌの１×ＬＥＷ＋１０ｍＭイミダゾール）；Ｅ１、Ｅ２−溶出画分（２×１．５ｍｌのＥ緩衝液、２５０ｍＭイミダゾール）。
【図６Ｂ】精製Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの質量分光分析を示す図である。算出したＦ１２Ｈ６ＧＧＣの平均質量は２００８９．８Ｄａに相当する。実測質量２０１０５．３はＭｅｔスルホキシドを１つ有するＦ１２Ｈ６ＧＧＣに相当する。
【図６Ｃ】ＦＧ１２ＧＧＣＧ精製のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。（Ａ）ｓ−超音波処理後の上清；ＡｍＳ−５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４後に溶解した沈殿物。ＤＥＡＥカラム法で得た各種画分：ＦＴ−フロースルー、Ａ４−Ａ７−漸増ＮａＣｌ勾配によって溶離した画分、（Ｂ）次いで実施したＭｏｎｏＱカラムおよびＢｕｔｙｌ  ＨＰカラムによる精製。
【図７】Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するサンドイッチＥＬＩＳＡ法に天然Ｆｅｌ  ｄ１に対するｍＡｂを用いたものを示す図である。ｍＡｂｓは、Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣおよび天然Ｆｅｌ  ｄ１を同じように十分に認識する。
【図８Ａ】天然Ｆｅｌ  ｄ１の好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）を示す図である。
【図８Ｂ】Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）を示す図である。Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと天然Ｆｅｌ  ｄ１は、ネコアレルギー患者の血液中のＣＣＲ３＋好塩基球上のＣＤ６３のアップレギュレーションによって示される好塩基球の活性化を同レベルで誘導する。
【図９】第０日および第１４日にＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ  ＶＬＰ（Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰまたはＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰ）または単にＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと混合したＣＭＶ−ＶＬＰ（ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰまたはＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰ）を１０μｇ投与したマウスの抗体応答を示す図である。第０日、第１４日および第２１日に血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより天然Ｆｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体に対して分析した。Ｎ＝３。
【図１０Ａ】Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰをアジュバントとともに用いて、または単独で用いて免疫感作したネコのＦｅｌ  ｄ１およびＣＭＶに対するＩｇＧ抗体価を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いて免疫感作ネコの血清中のＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１０Ａ）およびＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１０Ｂ）を検出した。
【図１０Ｂ】Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰをアジュバントとともに用いて、または単独で用いて免疫感作したネコのＦｅｌ  ｄ１およびＣＭＶに対するＩｇＧ抗体価を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いて免疫感作ネコの血清中のＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１０Ａ）およびＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１０Ｂ）を検出した。
【図１１Ａ】ネコの唾液抽出物中の抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体および抗ＣＭＶ抗体の測定結果を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いてＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ａ）、Ｆｅｌ  ｄ１−特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｂ）、ＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ｃ）およびＣＭＶ特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｄ）を検出した。
【図１１Ｂ】ネコの唾液抽出物中の抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体および抗ＣＭＶ抗体の測定結果を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いてＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ａ）、Ｆｅｌ  ｄ１−特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｂ）、ＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ｃ）およびＣＭＶ特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｄ）を検出した。
【図１１Ｃ】ネコの唾液抽出物中の抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体および抗ＣＭＶ抗体の測定結果を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いてＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ａ）、Ｆｅｌ  ｄ１−特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｂ）、ＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ｃ）およびＣＭＶ特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｄ）を検出した。
【図１１Ｄ】ネコの唾液抽出物中の抗Ｆｅｌ  ｄ１抗体および抗ＣＭＶ抗体の測定結果を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いてＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ａ）、Ｆｅｌ  ｄ１−特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｂ）、ＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ｃ）およびＣＭＶ特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｄ）を検出した。
【図１２】免疫感作ネコの唾液中の内因性Ｆｅｌ  ｄ１とＩｇＡ抗体とからなる免疫複合体の検出を示す図である。
【図１３Ａ】第０日および第８５日の唾液試料を用いた好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）から、Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰで免疫感作することによりネコ６個体のうち５個体に脱顆粒の減少がみられることがわかる（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
【図１３Ｂ】第０日および第８５日の唾液試料を用いた好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）から、Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰで免疫感作することによりネコ６個体のうち５個体に脱顆粒の減少がみられることがわかる（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
【図１４】Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰで免疫感作する前と後に得たネコ体毛抽出物を用いた皮膚プリック試験で得られた膨疹サイズ（面積、ｍｍ２）の比較を示す図である。１：８０および１：２４３（１：２４０）に希釈したネコ体毛抽出物に関するデータを平均＋／−標準誤差で示す。免疫感作前と免疫感作後の体毛抽出物の膨疹サイズを比較した計１６件の皮膚プリック試験が成功を収め、これを解析に供した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
【００２２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」という用語は、非複製性または非感染性のウイルス粒子、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、あるいはウイルス粒子に類似した非複製性または非感染性の、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造、好ましくはウイルスのキャプシドを指す。本明細書で使用される「非複製性」という用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを指す。本明細書で使用される「非感染性」という用語は、宿主細胞に侵入することができないことを指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスのゲノムまたはゲノム機能が全部または一部欠けているため、非複製性かつ非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、そのゲノムとは異なる核酸を含有し得る。組換えにより作製したウイルス様粒子には通常、宿主細胞由来のＲＮＡが含まれている。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドよりなるウイルスキャプシドである。ウイルス様粒子は通常、タンパク質サブユニットをウイルス様粒子１個当たり通常６０個、１２０個、１８０個、２４０個、３００個、３６０個または３６０個超含むウイルスコートタンパク質よりなる高分子集合体である。通常かつ好ましくは、上記のサブユニットの相互作用によって、固有の反復構造を有するウイルスキャプシド構造またはウイルスキャプシド様構造が形成される。ウイルス様粒子の特徴の１つは、そのサブユニットが高秩序に反復して配置されていることである。
【００２３】
ＣＭＶのウイルス様粒子：「ＣＭＶのウイルス様粒子」またはＣＭＶ  ＶＬＰという用語は、少なくとも１つのＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくは実質的にこれよりなるか、好ましくはこれよりなるウイルス様粒子を指す。好ましくは、ＣＭＶのウイルス様粒子は、前記ＣＭＶポリペプチドをキャプシド構造の主要なタンパク質成分、さらにより好ましくは唯一のタンパク質として含む。通常かつ好ましくは、ＣＭＶのウイルス様粒子は、ＣＭＶのキャプシドの構造と類似したものである。ＣＭＶのウイルス様粒子は、非複製性かつ／または非感染性であり、少なくともＣＭＶの複製機構をコードする１つまたは複数の遺伝子を欠き、通常ほかにも、宿主へのウイルスの結合または侵入を担う１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を欠く。この定義には、上記の１つまたは複数の遺伝子が存在するものの不活性であるウイルス様粒子も含まれる。ＣＭＶのウイルス様粒子を非複製性かつ／または非感染性にする好ましい方法には、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理などの物理的不活化または化学的不活化によるものがある。好ましくは、ＣＭＶのＶＬＰは、ＣＭＶの複製機構をコードする１つまたは複数の遺伝子を欠き、ほかにも、宿主へのウイルスの結合または侵入を担う１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を欠く。さらにより好ましくは、非複製性かつ／または非感染性のウイルス様粒子は、組み換え遺伝子技術によって得られるものである。組換えによって作製される本発明によるＣＭＶのウイルス様粒子は通常かつ好ましくは、ウイルスゲノムを含まない。２つ以上の種のポリペプチドを含むウイルス様粒子は多くの場合、モザイクＶＬＰと呼ばれ、このようなウイルスも本発明に包含される。したがって、一実施形態では、本発明によるウイルス様粒子は、少なくとも１つの異なる種のポリペプチドを含み、前記種のポリペプチドのうち少なくとも１つはＣＭＶポリペプチドである。好ましくは、ＣＭＶのＶＬＰは、通常ＶＬＰ１個当たり１８０個のコートタンパク質サブユニットを含む、ＣＭＶコートタンパク質よりなる高分子集合体である。通常かつ好ましくは、本明細書で使用されるのＣＭＶのＶＬＰは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなる少なくとも１つのＣＭＶポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列はＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００２４】
ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合（アミド結合としても知られる）によって直線状に結合したアミノ酸モノマーよりなるポリマーを指す。ポリペプチドという用語は、アミノ酸よりなる連続した鎖を指し、特定の長さの産物を指すわけではない。したがって、ポリペプチドの定義にはペプチドおよびタンパク質が含まれる。
【００２５】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド：本明細書で使用される「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド」という用語は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質のアミノ酸配列または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるポリペプチドであって、変異させるアミノ酸配列がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列、すなわち前記ＣＭＶのコートタンパク質が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す、ポリペプチドを指す。通常かつ好ましくは、ＣＭＶポリペプチドは、発現時に自己集合によりＣＭＶのウイルス様粒子を形成することが可能なものである。
【００２６】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）：本明細書で使用される「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）」という用語は、天然に存在するキュウリモザイクウイルスのコートタンパク質を指す。キュウリモザイクウイルスは宿主の範囲が極めて広いため、多数の様々な株および分離株が知られており、前記株および分離株のコートタンパク質の配列が既に決定されており、したがって当業者に公知である。前記ＣＭＶのコートタンパク質（ＣＰ）の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔまたはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／などの既知のデータベースに記載されており、そこから検索することが可能である。欧州特許出願公開第１４１８９８９７．３号に例が記載されている。ＣＭＶコートタンパク質のさらなる例は配列１〜３で記載されるものである。注目すべきは、上記の株および分離株は、コートタンパク質のＮ末端を含めた様々なタンパク質ドメインにおいてコートタンパク質配列が極めて類似していることである。具体的には、配列全体が完全に決定されたＣＭＶ分離株の９８．１％は、そのコートタンパク質配列の最初の２８個のアミノ酸の中での配列同一性が互いに８５％を上回り、さらには、配列全体が完全に決定されたＣＭＶ分離株の７９．５％は、そのコートタンパク質配列の最初の２８個のアミノ酸の中での配列同一性が互いに９０％を上回る。
【００２７】
通常かつ好ましくは、本発明に使用するＣＭＶのコートタンパク質は、発現時に自己集合によりＣＭＶのウイルス様粒子を形成することが可能なものである。好ましくは、本発明に使用するＣＭＶのコートタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現時に自己集合によりＣＭＶのウイルス様粒子を形成することが可能なものである。
【００２８】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」という用語は、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくは実質的にこれよりなるか、好ましくはこれよりなるよう改変されたＣＭＶのＶＬＰであって、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶポリペプチドとＴヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはこれよりなるものである、ＣＭＶのＶＬＰを指す。通常かつ好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、（ｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端に融合しているか、（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＣ末端に融合しているか、（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドの連続するアミノ酸の領域と置き換わっており、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置き換えられた連続するアミノ酸の領域とＴヘルパー細胞エピトープとの間の配列同一性が少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であるか、（ｉｖ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置き換わっており、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置き換えられたＮ末端領域が５〜１５個の連続するアミノ酸よりなるものである。好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置き換わっており、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置き換えられたＮ末端領域が５〜１５個の連続するアミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続するアミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続するアミノ酸、最も好ましくは１１個、１２個または１３個の連続するアミノ酸よりなるものである。好ましくは、本発明の前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、ＣＭＶの組換え改変ＶＬＰである。
【００２９】
改変ＣＭＶポリペプチド：本明細書で使用される「改変ＣＭＶポリペプチド」という用語は、本明細書で定義される通りに、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶポリペプチドとＴヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはこれよりなるよう改変されたＣＭＶポリペプチドを指す。通常、改変ＣＭＶポリペプチドは、発現時に自己集合によりＣＭＶのウイルス様粒子を形成することが可能なものである。好ましくは、改変ＣＭＶポリペプチドは、組換え改変ＣＭＶポリペプチドであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現時に自己集合によりＣＭＶのウイルス様粒子を形成することが可能なものである。
【００３０】
ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域：本明細書で使用される「ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域」という用語は、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端、特にＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端、または前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端の２番目のアミノ酸から始まる、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端の領域を指す。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドまたは前記コートタンパク質がＮ末端メチオニンを含む場合、実用的観点から言えば、メチオニンをコードする開始コドンは通常削除してＴｈ細胞エピトープのＮ末端に付加する。さらに好ましくは、クローン化目的には任意選択で、開始メチオニンとＴｈ細胞エピトープとの間に追加のアミノ酸を１個、２個または３個、好ましくはアミノ酸を１個挿入し得る。本明細書で使用される「ＣＭＶポリペプチドまたはＣＭＶコートタンパク質の変異アミノ酸配列のＮ末端領域」という用語は、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端、または前記変異アミノ酸配列がＮ末端メチオニン残基を含む場合、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端の２番目のアミノ酸から始まる、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端の領域を指す。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドまたは前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、実用的観点から言えば、メチオニンをコードする開始コドンは通常削除してＴｈ細胞エピトープのＮ末端に付加する。さらに好ましくは、クローン化目的には任意選択で、開始メチオニンとＴｈ細胞エピトープとの間に追加のアミノ酸を１個、２個または３個、好ましくはアミノ酸を１個挿入し得る。
【００３１】
組換えポリペプチド：本発明において「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術の段階を少なくとも１つ含む工程によって得られるポリペプチドを指す。通常かつ好ましくは、組換えポリペプチドは原核発現系で産生されるものである。当業者には、組換えによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核発現系に発現し産生されるポリペプチドがＮ末端メチオニン残基を含み得ることは明らかである。Ｎ末端メチオニン残基は通常、発現宿主内で組換えポリペプチドが成熟する過程で組換えポリペプチドから切断される。しかし、Ｎ末端メチオニンの切断が不完全なものになることがある。このため、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基の有無以外は同一であるポリペプチドの混合物を含み得る。通常かつ好ましくは、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する組換えポリペプチドを１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満含む。
【００３２】
組換えＣＭＶポリペプチド：「組換えＣＭＶポリペプチド」という用語は、上の定義と同じく組換えＤＮＡ技術の段階を少なくとも１つ含む工程によって得られる、ＣＭＶポリペプチドを指す。通常かつ好ましくは、組換えＣＭＶポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する組換えＣＭＶポリペプチドを１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満含む。したがって、本発明の組換えウイルス様粒子は、Ｎ末端メチオニン残基の有無以外は同一である組換えポリペプチドを含み得る。
【００３３】
組換え改変ＣＭＶポリペプチド：「組換え改変ＣＭＶポリペプチド」という用語は、上の定義と同じく組換えＤＮＡ技術の段階を少なくとも１つ含む工程によって得られる、改変ＣＭＶポリペプチドを指す。通常かつ好ましくは、組換え改変ＣＭＶポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する組換え改変ＣＭＶポリペプチドを１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満含む。したがって、本発明の組換えウイルス様粒子は、Ｎ末端メチオニン残基の有無以外は同一である組換えポリペプチドを含み得る。
【００３４】
組換えウイルス様粒子：本発明において「組換えウイルス様粒子」という用語は、組換えＤＮＡ技術の段階を少なくとも１つ含む工程によって得られるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。通常かつ好ましくは、組換えウイルス様粒子は、少なくとも１つの組換えポリペプチド、好ましくは組換えＣＭＶポリペプチドまたは組換え改変ＣＭＶポリペプチドを含む。最も好ましくは、組換えウイルス様粒子は、組換えＣＭＶポリペプチドまたは組換え改変ＣＭＶポリペプチドから構成されるか、これよりなるものである。したがって、本発明において、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列に関して本発明の組換えＶＬＰを定義する場合、その本発明の組換えＶＬＰの範囲には、前記Ｎ末端メチオニン残基のない前記特定のアミノ酸配列によって形成されるＶＬＰのみならず、通常、本明細書に記載したように少量ではあるが、前記Ｎ末端メチオニンを有する前記特定のアミノ酸配列によって形成されるＶＬＰも含まれる。さらに、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列に関して本発明の組換えＶＬＰを定義する場合、依然として前記Ｎ末端メチオニン残基を含むアミノ酸配列を含むＶＬＰおよびＮ末端メチオニン残基を欠くアミノ酸配列を含むＶＬＰの両方が含まれるのは、本発明の範囲内のことである。
【００３５】
変異アミノ酸配列：「変異アミノ酸配列」という用語は、変異させるアミノ酸配列内に所定の変異のセットを導入することによって得られるアミノ酸配列を指す。本発明において、変異させる前記アミノ酸配列は、通常かつ好ましくはＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である。したがって、変異アミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なり、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列は少なくとも９０％の配列同一性を示す。通常かつ好ましくは、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。好ましくは、前記変異アミノ酸配列と前記変異させる配列は、最大１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸残基に相違があり、さらに好ましくは、前記相違は挿入、欠失およびアミノ酸置換から選択される。好ましくは、変異アミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも１個のアミノ酸に相違があり、好ましくは、前記相違はアミノ酸置換である。
【００３６】
残基．．．に対応する位置：あるアミノ酸配列上での別のアミノ酸配列の所与の残基に対応する位置は、配列アライメントによって、通常かつ好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを最も好ましくは標準設定で用いることによって、特定することができる。通常の好ましい標準設定は以下の通りである：予測閾値：１０；ワードサイズ：３；検索範囲内での最大マッチ：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、伸長１；組成調節：条件付き組成スコアマトリックス調節。
【００３７】
配列同一性：２つの所与のアミノ酸配列の配列同一性は、両配列のアライメントに基づいて決定される。配列同一性を決定するアルゴリズムは当業者に利用可能なものである。好ましくは、公的に入手可能なコンピュータ相同性検索プログラム、例えば「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）または「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）などを用いて、ここでは好ましくは、ＮＣＢＩのホームページｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムを提供時の初期設定で用いて、２つのアミノ酸配列の配列同一性を決定する。通常の好ましい標準設定は以下の通りである：予測閾値：１０；ワードサイズ：３；検索範囲内での最大マッチ：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、伸長１；組成調節：条件付き組成スコアマトリックス調節。
【００３８】
アミノ酸置換：「アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸配列中の所与のアミノ酸残基を化学構造が異なる任意の別のアミノ酸残基で、好ましくは別のタンパク質構成アミノ酸残基で置換することを指す。したがって、アミノ酸の挿入または欠失とは対照的に、アミノ酸置換によって前記アミノ酸配列のアミノ酸の総数が変化することはない。本発明において極めて好ましいのは、変異させる前記アミノ酸配列のアミノ酸残基をリジン残基またはシステイン残基で置換することである。
【００３９】
エピトープ：エピトープという用語は、抗原、好ましくはポリペプチドの連続部分または非連続部分を指し、前記部分には、抗体またはＭＨＣ分子との関連でＴ細胞受容体が特異的に結合し得る。抗体に関して言えば、特異的結合には非特異的結合は含まれないが、交差反応性は必ずしもそうではない。エピトープは通常、その抗原性部位に固有の空間的配置で５〜２０個のアミノ酸を含む。
【００４０】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ：本明細書で使用される「Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ」という用語は、ヘルパーＴｈ細胞による認識が可能なエピトープを指す。別の好ましい実施形態では、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは普遍的Ｔヘルパー細胞エピトープである。
【００４１】
普遍的Ｔｈ細胞エピトープ：本明細書で使用される「普遍的Ｔｈ細胞エピトープ」という用語は、少なくとも１種類、好ましくは２種類以上のＭＨＣクラスＩＩ分子が結合可能なＴｈ細胞エピトープを指す。あるペプチド配列が普遍的Ｔｈ細胞エピトープであるかどうかを判定する最も単純な方法は、そのペプチドが個々のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する能力を測定することである。この能力は、ペプチドが既知のＴｈ細胞エピトープペプチドと競合してＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する能力によって測定され得る。ＨＬＡ−ＤＲ分子の選択については、例えばＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１に代表的なものが記載されている。Ｔｈ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子に対する親和性は、少なくとも１０−５Ｍであるべきである。あるいは、Ｔｈ細胞エピトープの「普遍性」を測定する方法として上記のものより単調で時間がかかるが適切な方法に、ある集団に免疫感作を実施し、１か月後にＩＦＡの形で製剤化したＴｈ細胞エピトープを含有するタンパク質で追加免疫したとき、測定可能なＴ細胞応答がみられる割合が高い（３０％超）ことを示すというものがある。Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  Ｐら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２には、様々な個人にみられるＭＨＣクラスＩＩ分子の代表的なものがまとめて収載されている。したがって、本明細書で使用される「普遍的Ｔｈ細胞エピトープ」という用語は、好ましくは、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  Ｐら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２に記載されているように、選択した個人の集団に免疫感作を実施し（１か月後にＩＦＡの形で製剤化したＴｈ細胞エピトープを含有するタンパク質で）追加免疫したとき、その集団の３０％超に測定可能なＴ細胞応答が生じる、Ｔｈ細胞エピトープを指す。また、さらに好ましくは、本明細書で使用される「普遍的Ｔｈ細胞エピトープ」という用語は、好ましくは、（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１およびこれに引用されている参考文献に記載されている）ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ３、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲ５２ａ、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される、好ましくはＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらにより好ましくは少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子と少なくとも５００ｎＭの親和性で結合することが可能なＴｈ細胞エピトープを指し；前記親和性を評価する好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ  Ａら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５−４０に記載されているものである。さらにより好ましくは、本明細書で使用される「普遍的Ｔｈ細胞エピトープ」という用語は、（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１およびこれに引用されている参考文献に記載されている）ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも��つ、さらにより好ましくは少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子と少なくとも５００ｎＭの親和性で結合することが可能なＴｈ細胞エピトープを指し；前記親和性を評価する好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ  Ａら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５−４０に記載されているものである。
【００４２】
普遍的Ｔｈ細胞エピトープについては、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  Ｐら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２、Ｃａｌｖｏ−Ｃａｌｌｅ  ＪＭら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５９：１３６２−１３７３およびＶａｌｍｏｒｉ  Ｄら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４９：７１７−７２１などに記載されており、当業者に公知である。
【００４３】
アジュバント：本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質または宿主内で沈着物を形成させる物質であって、本発明のワクチンおよび医薬組成物とそれぞれ組み合わせとき免疫応答をさらに一層増強し得る物質を指す。好ましいアジュバントには、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウムおよび改変ムラミルジペプチドがある。さらに好ましいアジュバントには、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールのほか、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などのヒトアジュバントがある。このようなアジュバントも当該技術分野で周知である。本発明の組成物とともに投与することができるアジュバントとしてはさらに、特に限定されないが、モノホスホリルリピド免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４およびビロソームアジュバント技術が挙げられる。アジュバントはほかにも、上記の物質の混合物を含み得る。ウイルス様粒子は一般に、アジュバントとして記載されている。しかし、本願において使用される「アジュバント」という用語は、本発明のウイルス様粒子ではないアジュバントを指す。「アジュバント」はむしろ、本発明の組成物、ワクチンまたは医薬組成物の別の異なる成分に関連するものである。
【００４４】
有効量：本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的効果をもたらすのに必要なまたは十分な量を指す。有効量の組成物あるいは医薬組成物は、この選択する結果が得られる量となり、そのような量は、当業者には慣例的なこととして決定され得る。好ましくは、本明細書で使用される「有効量」という用語は、通常かつ好ましくはヒトに対するネコのアレルゲン性を低減する効果を得るのに必要なまたは十分な量を指す。好ましくは、本明細書で使用される「有効量」という用語は、ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは、本明細書に記載されるようにネコの唾液中にＦｅｌ  ｄ１とＦｅｌ  ｄ１抗体とで形成される免疫複合体を生じさせる効果を得るのに必要なまたは十分な量を指す。有効量は、投与する特定の組成物および対象の大きさに応じて異なるものとなり得る。当業者であれば、過度の実験を必要とせずに本発明の特定の組成物の有効量を実験により決定することができる。
【００４５】
治療：本明細書で使用される「治療」、「治療する」、「治療される」または「治療すること」という用語は、予防法および／または治療法を指す。一実施形態では、「治療」、「治療する」、「治療される」または「治療すること」という用語は、治療的処置を指す。別の実施形態では、「治療」、「治療する」、「治療される」または「治療すること」という用語は、予防的処置を指す。
【００４６】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質：本明細書で使用される「Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質」という用語は、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含むか、あるいはこれよりなるタンパク質を指す。好ましくは、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２は共有結合している。好ましい一実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して結合している。別の好ましい実施形態では、鎖１と鎖２は、直接またはスペーサーを介して融合しており、この場合、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質はスペーサーをさらに含むか、あるいはこれよりなるものである。好ましくは、本明細書で定義されるＦｅｌ  ｄ１タンパク質は、合計最大３００個、さらにより好ましくは最大２００個のアミノ酸よりなる。通常かつ好ましくは、本発明によるＦｅｌ  ｄ１タンパク質は、天然Ｆｅｌ  ｄ１、内因性のＦｅｌ  ｄ１または本発明の実施例７〜９に従って作製される組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質のいずれかと特異的に結合する抗体の産生をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することが可能である。
【００４７】
Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１：本明細書で使用される「Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１」という用語は、配列番号３０またはその相同配列のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれよりなるポリペプチドを指す。本明細書で使用される「配列番号３０の相同配列」という用語は、配列番号３０と８０％超、より好ましくは９０％超、さらにより好ましくは９５％超の同一性を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される「Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１」という用語はほかにも、特に限定されないが、本明細書で定義されるＦｅｌ  ｄ１の鎖１の少なくとも１つのグリコシル化を含めた少なくとも１つの翻訳後修飾を含むポリペプチドを指すべきである。好ましくは、本明細書で定義されるＦｅｌ  ｄ１の鎖１は、合計最大１３０個、さらにより好ましくは最大１００個のアミノ酸よりなる。
【００４８】
Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２：本明細書で使用される「Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２」という用語は、配列番号３１、配列番号３２もしくは配列番号３３またはその相同配列のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれよりなるポリペプチドを指す。本明細書で使用される「配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３の相同配列」という用語は、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３を８０％超、より好ましくは９０％超、さらにより好ましくは９５％超の同一性を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される「Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２」という用語は、特に限定されないが、本明細書で定義されるＦｅｌ  ｄ１の鎖２の少なくとも１つのグリコシル化を含めた少なくとも１つの翻訳後修飾を含むポリペプチドを指すべきである。好ましくは、本明細書で定義されるＦｅｌ  ｄ１の鎖２は、合計最大１５０個、さらにより好ましくは最大１３０個、さらにより好ましくは最大１００個のアミノ酸よりなる。
【００４９】
免疫複合体：本明細書で使用される「免疫複合体」という用語は、抗体とそのコグネイト／特異的抗原の結合から形成される複合体を指す。好ましくは、本明細書で使用される「免疫複合体」という用語は、抗体とそのコグネイト／特異的抗原の非共有結合から形成される複合体を指す。より好ましくは、本明細書で使用される「免疫複合体」という用語は、Ｆｅｌ  ｄ１抗体とＦｅｌ  ｄ１の結合、好ましくは非共有結合から形成される複合体を指す。
【００５０】
第一の結合部位：本明細書で使用される「第一の結合部位」という語句は、ウイルス様粒子と天然に存在するか、ウイルス様粒子に人工的に付加された要素であって、第二の結合部位が結合し得る要素を指す。第一の結合部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、リヌクレオチド、天然もしくは合成のポリマー、二次代謝産物もしくは化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）または化学的に反応性の基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基などあるいはその組合せである。第一の結合部位となる化学的に反応性の基の好ましい実施形態は、アミノ酸残基、好ましくはリジン残基のアミノ基である。第一の結合部位は通常、ＶＬＰの表面、好ましくは外表面に位置している。第一の結合部位は、好ましくはＶＬＰの外表面に複数のものが通常、反復的配置で存在する。好ましい実施形態では、第一の結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介してＶＬＰに結合している。さらなる好ましい実施形態では、第一の結合部位は、ＶＬＰと天然に存在するものである。あるいは好ましい実施形態では、第一の結合部位は、ＶＬＰに人工的に付加したものである。極めて好ましい実施形態では、前記第一の結合部位は、前記ＶＬＰポリペプチドのアミノ酸配列のリジン残基のアミノ基である。
【００５１】
第二の結合部位：本明細書で使用される「第二の結合部位」という語句は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と天然に存在するか、同タンパク質に人工的に付加した要素であって、第一の結合部位が結合し得る要素を指す。Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の第二の結合部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然もしくは合成のポリマー、二次代謝産物もしくは化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）または化学的に反応性の基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基などあるいはその組合せである。第二の結合部位となる化学的に反応性の基の好ましい実施形態は、スルフィドリル基、好ましくはアミノ酸システインのスルフィドリル基、最も好ましくはシステイン残基のスルフィドリルである。したがって、「少なくとも１つの第二の結合部位を有する抗原」または「少なくとも１つの第二の結合部位を有するＦｅｌ  ｄ１タンパク質」という用語は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と少なくとも１つの第二の結合部位とを含む構築物を指す。しかし、特にＦｅｌ  ｄ１タンパク質内に天然に存在しない第二の結合部位に関しては、そのような構築物は、通常かつ好ましくは「リンカー」をさらに含む。別の好ましい実施形態では、第二の結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介してＦｅｌ  ｄ１タンパク質と結合している。さらなる実施形態では、第二の結合部位は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質内に天然に存在するものである。別のさらなる好ましい実施形態では、第二の結合部位は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質にリンカーを介して人工的に付加したものであり、前記リンカーは、システインを含むか、あるいはこれよりなるものである。好ましくは、リンカーはペプチド結合によってＦｅｌ  ｄ１タンパク質と融合している。
【００５２】
結合している：本明細書で使用される「結合している」または「結合」という用語は、少なくとも１つの第一の結合部位と少なくとも１つの第二の結合部位が互いに連結するのに考え得るあらゆる方法、好ましくは化学的相互作用を指す。化学的相互作用としては、共有相互作用および非共有相互作用が挙げられる。典型的な非共有相互作用の例にはイオン性相互作用、疎水性相互作用または水素結合があり、一方、共有相互作用は、例を挙げれば、共有結合、例えばエステル結合、エーテル結合、リン酸エステル結合、炭素−リン結合、チオエーテル結合などの炭素−硫黄またはイミド結合などに基づくものである。特定の好ましい実施形態では、第一の結合部位と第二の結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つの非ペプチド結合を介して、さらにより好ましくはもっぱら非ペプチド結合（１つまたは複数）を介して結合している。ただし、本明細書で使用される「結合している」という用語は、少なくとも１つの第一の結合部位と少なくとも１つの第二の結合部位が直接結合していることのみならず、これに代えて好ましくは、少なくとも１つの第一の結合部位と少なくとも１つの第二の結合部位が、中間分子（１つまたは複数）を介して、ここでは、通常かつ好ましくは少なくとも１つ、好ましくは１つのヘテロ二官能性架橋剤を用いることによって、間接的に結合していることを指すものとする。他の好ましい実施形態では、第一の結合部位と第二の結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介して、さらにより好ましくはもっぱらペプチド結合（１つまたは複数）を介して結合している。
【００５３】
リンカー：本明細書で使用される「リンカー」は、第二の結合部位とＦｅｌ  ｄ１タンパク質とを結合させるか、あるいは既に第二の結合部位を含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものである。好ましくは、本明細書で使用される「リンカー」は、第二の結合部位を、通常かつ好ましくは（必ずというわけではないが）１個のアミノ酸残基、好ましくはシステイン残基として既に含むものである。好ましいリンカーは、アミノ酸リンカー、すなわち、少なくとも１個のアミノ酸残基を含むリンカーである。アミノ酸リンカーという用語は、そのようなリンカーがもっぱらアミノ酸残基よりなるものであることを意味するわけではない。しかし、もっぱらアミノ酸残基よりなるリンカーは本発明の好ましい実施形態の１つである。リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは、当該技術分野で公知の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、あらゆるＬ−アミノ酸もしくはあらゆるＤアミノ酸またはその混合物から構成されるものである。本発明によるリンカーのさらなる好ましい実施形態は、スルフィドリル基またはシステイン残基を含む分子であり、したがって、このような分子も本発明に包含される。リンカーとＦｅｌ  ｄ１タンパク質との結合は、好ましくは少なくとも１つの共有結合によるもの、より好ましくは少なくとも１つのペプチド結合によるものである。
【００５４】
したがって、第一の態様では、本発明は、ネコのアレルゲン性を低減する方法への組成物の使用であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与し、前記組成物が、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合している、使用を提供する。好ましくは、前記方法は、前記ネコのアレルゲン性を低減する非治療的方法である。さらなる好ましい実施形態では、前記ネコはアレルギーにも自己免疫疾患にも罹患しておらず、好ましくは、前記ネコはＦｅｌ  ｄ１を原因とするアレルギーにも自己免疫疾患にも罹患していない。
【００５５】
好ましい実施形態では、通常かつ好ましくはヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中にＦｅｌ  ｄ１とＦｅｌ  ｄ１抗体で形成される免疫複合体を生成させることによってもたらされ、好ましくは、前記組成物の前記投与によって、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中に前記免疫複合体の前記生成が起こる。
【００５６】
前記ネコへの本発明の組成物の投与によって起こる、ヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の低減はさらに、実施例に記載されるように、ネコアレルギー患者の好塩基球の脱顆粒によって判定され得る。したがって、好ましい実施形態では、ヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、前記ネコが出すＦｅｌ  ｄ１のアレルゲン性の低減であり、好ましくは、前記ネコが出すＦｅｌ  ｄ１のアレルゲン性の前記低減は、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中のＦｅｌ  ｄ１のアレルゲン性の低減である。
【００５７】
好ましい実施形態では、ネコへの前記有効量の組成物の前記投与は、ネコへの前記有効量の組成物の反復投与を含み、前記反復投与は、２週間、３週間、４週間、８週間、１２週間の間隔で実施され、好ましくは、前記反復投与は、ネコへの前記有効量の組成物の２回、３回、４回または５回の投与を含む。
【００５８】
さらなる好ましい実施形態では、前記反復投与は、３週間または４週間の間隔で実施される３回の投与である。通常かつ好ましくは、ネコへの前記有効量の組成物の前記投与はさらに、ネコへの前記有効量の組成物の単回投与を含み、前記単回投与は、前記反復投与の最後の投与から６か月後、９か月後、１２か月後、１５か月後または１８か月後、好ましくは１２か月後に実施される。
【００５９】
前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙の中、好ましくは前記ネコの唾液中の前記アレルギー活性のあるＦｅｌ  ｄ１の前記低減は通常、前記反復投与の最後の投与から少なくとも１か月後〜３か月後の間にみられる。
【００６０】
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、前記ネコに曝露したヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の低減である。さらなる極めて好ましい実施形態では、ネコに曝露した前記ヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、（ｉ）前記ヒトに生じるアレルギー反応のレベルもしくは重症度の低減または（ｉｉ）前記ヒトの少なくとも１つのアレルギー症状の低減であり；好ましくは、前記ネコへの前記ヒトの前記曝露は、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙、好ましくは前記ネコの唾液への前記ヒトの曝露である。
【００６１】
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、前記ネコに曝露したヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の低減であり、ネコに曝露した前記ヒトに対する前記ネコのアレルゲン性の前記低減は、（ｉ）前記ヒトに生じるアレルギー反応のレベルもしくは重症度の低減または（ｉｉ）前記ヒトの少なくとも１つのアレルギー症状の低減であり；好ましくは、前記ネコへの前記ヒトの前記曝露は、前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙、好ましくは前記ネコの唾液への前記ヒトの曝露である。好ましくは、（ｉ）前記ヒトに生じるアレルギー反応のレベルもしくは重症度の前記低減または（ｉｉ）前記ヒトの前記少なくとも１つのアレルギー症状の前記低減は、症状スコア試験、皮膚プリック試験、鼻誘発試験または結膜誘発試験の陽性度の低下、好ましくは症状スコア試験または皮膚プリック試験の陽性度の低下によって表されるものであり、前記皮膚プリック試験、鼻誘発試験または結膜誘発試験、好ましくは前記症状スコア試験または前記皮膚プリック試験には、好ましくは、前記投与の前および後の前記ネコの唾液、体毛、皮膚または涙を、さらに好ましくは、前記投与の前および後の前記ネコの唾液を用いる。アレルギーおよびアレルギー症状は症状スコア試験、皮膚プリック試験、鼻誘発試験、結膜誘発試験または気管支誘発試験を用いて評価し得ることが当業者には公知である。これらの手順、質問票および検査は当業者に周知である。本明細書で症状スコア試験、皮膚プリック試験、鼻誘発試験、結膜誘発試験と関連して、特に症状スコア試験または皮膚プリック試験と関連して使用される「陽性度の低下」という用語は、（ｉ）前記ネコの唾液、体毛、皮膚もしくは涙、好ましくは前記ネコの唾液に曝露したときに前記ヒトに生じるアレルギー反応のレベルもしくは重症度の軽減もしくは低減または（ｉｉ）前記ネコに曝露したとき、好ましくは前記ネコの唾液、体毛、皮膚もしくは涙、好ましくは前記ネコの唾液に曝露したとき、より好ましくは前記ネコの唾液に曝露したときの前記ヒトの少なくとも１つのアレルギー症状の軽減もしくは低減を指す。
【００６２】
一実施形態では、前記ウイルス様粒子は、前記ネコに対して非病原性のウイルスに由来するものである。好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、植物ウイルスまたはバクテリオファージに由来するものであり、好ましくは、前記バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージに由来するものであり、さらに好ましくは、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージまたは植物ウイルスに由来するものであり、またさらに好ましくは、前記ＶＬＰは植物ウイルスに由来するものである。別の好ましい実施形態では、前記ＶＬＰは組換えＶＬＰであり、好ましくは、前記組換えＶＬＰは植物ウイルスに由来するものである。別の好ましい実施形態では、前記ＶＬＰはキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＶＬＰである。別の好ましい実施形態では、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰであり、好ましくは、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージの組換えＶＬＰである。別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子である。別の好ましい実施形態では、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰではなく、好ましくは、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージの組換えＶＬＰではない。別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子はＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子ではない。
【００６３】
好ましい実施形態では、前記ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＶＬＰポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなる改変ＶＬＰであり、前記改変ＶＬＰポリペプチドは、（ａ）ＶＬＰポリペプチドと（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記ＶＬＰポリペプチドは、（ｉ）ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは植物ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列は、前記ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と前記ウイルスのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００６４】
好ましい実施形態では、前記ＶＬＰはキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチドと（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、好ましくはこれよりなるものであり；前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列はＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００６５】
好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものである。別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させるアミノ酸配列はＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。通常かつ好ましくは、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列は、少なくとも１個、最大１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個のアミノ酸残基に相違があり、好ましくは、これらの相違は、（ｉ）挿入、（ｉｉ）欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸置換および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組合せから選択される。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号１を含むか、好ましくはこれよりなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列もしくは（ｂ）配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させる前記アミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められる前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１を含むか、好ましくはこれよりなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または（ｂ）配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものである。
【００６８】
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号３４を含む、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列もしくは（ｂ）配列番号３４と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させる前記アミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められる前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００６９】
さらなる好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号３４を含む、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または（ｂ）配列番号３４と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものである。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、
（ｉ）（ａ）配列番号１を含むか、好ましくはこれよりなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または（ｂ）配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列が配列番号３４を含むか；この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列が、配列番号３４と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む；あるいは
（ｉｉ）変異アミノ酸配列
を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、変異させる前記アミノ酸配列が、この請求項の（ｉ）で定められる前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と変異させる前記アミノ酸配列が少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１を含むか、好ましくはこれよりなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列または（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、；この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列は配列番号３４を含むか；この請求項の（ａ）または（ｂ）で定められる前記アミノ配列は、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域が前記Ｔヘルパー細胞エピトープに置き換わっている。別の好ましい実施形態では、前記置き換えられたＮ末端領域のアミノ酸の数が、前記Ｔヘルパー細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。
【００７３】
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域が前記Ｔヘルパー細胞エピトープに置き換わっており、前記置き換えられたＮ末端領域のアミノ酸の数が、前記Ｔヘルパー細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。通常かつ好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置き換えられたＮ末端領域は、５〜１５個の連続するアミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続するアミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続するアミノ酸よりなる。
【００７４】
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に対応する。
【００７５】
別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは普遍的Ｔヘルパー細胞エピトープである。別の好ましい実施形態では、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは最大２０個のアミノ酸よりなる。
【００７６】
極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列である。さらなる極めて関連のある実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号５のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号５のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、前記Ｔヘルパー細胞エピトープはヒトワクチンに由来するものである。極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは破傷風毒素に由来するものである。さらなる極めて関連のある実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号４のアミノ酸配列を有するもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは破傷風毒素に由来するものであり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号４のアミノ酸配列を有するもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。
【００７８】
極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号５のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである；あるいは、前記Ｔｈ細胞エピトープは破傷風毒素に由来するものであり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号４のアミノ酸配列を有するもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。
【００７９】
極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドはＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり、前記アミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれよりなるものであり；前記アミノ配列は配列番号３４を含み、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域は前記Ｔヘルパー細胞エピトープに置き換わっており、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置き換えられたＮ末端領域は、１１〜１３個の連続するアミノ酸、好ましくは１１個の連続するアミノ酸よりなり、さらに好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に対応する。
【００８０】
別の極めて好ましい実施形態では、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【００８１】
極めて好ましい実施形態では、前記第一の結合部位と前記第二の結合部位は、少なくとも１つの共有非ペプチド結合を介して結合している。別の極めて好ましい実施形態では、前記第一の結合部位は、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含むか、好ましくは、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基である。さらなる極めて好ましい実施形態では、前記第二の結合部位は、スルフィドリル基、好ましくはシステインのスルフィドリル基を含むか、好ましくは、スルフィドリル基、好ましくはシステインのスルフィドリル基である。
【００８２】
極めて好ましい実施形態では、少なくとも１つの第一の結合部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも１つの第二の結合部位は、スルフィドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフィドリル基またはＦｅｌ  ｄ１タンパク質と化学的に結合されたスフヒドリル（ｓｕｆｈｙｄｒｙｌ）基である。さらなる好ましい実施形態では、前記第二の結合部位のうち唯１つの結合部位が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合を介して前記第一の結合部位と結合することにより、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と前記改変ウイルス様粒子との単一で一様な結合を生じさせており、前記第一の結合部位と結合する前記唯１つの第二の結合部位はスルフィドリル基であり、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と前記改変ウイルス様粒子は前記結合を介して相互作用して、規則正しく反復する抗原の配置、すなわち、規則正しく反復するＦｅｌ  ｄ１タンパク質の配置を形成する。
【００８３】
本発明の好ましい一実施形態では、化学架橋によって、通常かつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤の使用によって、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとを結合させる。好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、改変ＶＬＰの好ましい第一の結合部位、好ましくはアミノ基、より好ましくはリジン残基（１つまたは複数）のアミノ基と反応することができる官能基と、好ましい第二の結合部位、すなわち、好ましくはＦｅｌ  ｄ１タンパク質に本来備わっているか、これに人工的に付加し、任意選択で還元により反応に利用できるようにしたシステイン（１つまたは複数）残基のスルフィドリル基と反応することができる、さらなる官能基とを含む。複数のヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野で公知である。このようなものとしては、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ  ＳＶＳＢ、ＳＩＡのほか、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手可能であり、アミノ基に対して反応性の官能基１つとスルフィドリル基に対して反応性の官能基１つとを有するその他の架橋剤が挙げられる。上に挙げた架橋剤はいずれも、アミノ基との反応後にアミド結合を形成させ、スルフィドリル基とのチオエーテル結合を形成させるものである。本発明の実施に適した別の種類の架橋剤は、カップリング時にＦｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することを特徴とするものである。この種類に属する好ましい架橋剤としては、例えばＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ社）が挙げられる。
【００８４】
上記の好ましい方法に従いヘテロ二官能性架橋剤を使用してＦｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとを結合させることによって、配向性をもたせてＦｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとをカップリングすることができる。Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとを結合させる方法としてほかにも、カルボジイミドＥＤＣおよびＮＨＳを用いてＦｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとを架橋する方法が挙げられる。最初に、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質を例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはイミノチオランと反応させてチオラート化してもよい。次いで、必要に応じて脱保護した後、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質を以下のように改変ＶＬＰとカップリングする。余剰のチオレーション試薬を分離した後、システイン反応性部分を含むためシステイン残基に対して反応性の少なくとも１つまたは複数の官能基を示す上記のようなヘテロ二官能性架橋剤で予め活性化し、チオラート化Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が反応することが可能になった改変ＶＬＰと、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質とを反応させる。任意選択で、反応混合物中に少量の還元剤を含ませる。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えば改変ＶＬＰのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性の官能基を有するグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ社）をはじめとする既知のホモ二官能性架橋剤を用いて、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と改変ＶＬＰとを結合させる。
【００８５】
本発明の極めて好ましい実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に付加したシステイン残基またはＦｅｌ  ｄ１タンパク質内にある天然のシステイン残基を介して改変ウイルス様粒子のリジン残基と結合している。好ましい実施形態では、本発明の組成物はさらにリンカーを含み、前記リンカーは、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質と前記第二の結合部位とを結合させており、好ましくは、前記リンカーは、前記第二の結合部位を含むか、あるいはこれよりなるものである。
【００８６】
別の極めて好ましい実施形態では、前記組成物はさらにリンカーを含み、前記リンカーは、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質のＣ末端に融合している。極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質はＦｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含み、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１は、少なくとも１つの共有結合によってＦｅｌ  ｄ１の鎖２と結合している。
【００８７】
極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含むＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質であり、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２は、１つのペプチド結合を介して直接融合しているか、一方の鎖のＮ末端と他方の鎖のＣ末端とを結合するスペーサーを介して融合している。Ｆｅｌ  ｄ１の組換え融合タンパク質が既にいくつか記載されている（Ｖａｉｌｅｓ  ＬＤら，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）１１０：７５７−７６２；Ｇｒoｎｌｕｎｄ  Ｈら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００３）２７８：４０１４４−４０１５１；Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｎら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００９）２０６：１９４１−１９５５；ＷＯ２００６／０９７５３０）。さらなる好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含むＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質であり、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２は、そのＣ末端と前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１のＮ末端で、１つのペプチド結合を介して直接融合しているか、スペーサーを介して融合しており、前記スペーサーは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列よりなり、好ましくは、前記スペーサーは、１０〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列よりなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記スペーサーはアミノ酸残基が１５個のアミノ酸配列よりなり、好ましくは、前記スペーサーは配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
【００８８】
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１とＦｅｌ  ｄ１の鎖２とを含むＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質であり、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１は、そのＣ末端と前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２のＮ末端とで、１つのペプチド結合を介して直接融合しているか、スペーサーを介して融合しており、前記スペーサーは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列よりなり、好ましくは、前記スペーサーは、１０〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列よりなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記スペーサーはアミノ酸残基が１５個のアミノ酸配列よりなり、好ましくは、前記スペーサーは配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
【００８９】
別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１は配列番号３０の配列またはその相同配列を含み、前記相同配列は、配列番号３０と８０％超、好ましくは９０％超またはさらにより好ましくは９５％超の同一性を有する。好ましくは、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖１は配列番号３０の配列またはその相同配列を含み、前記相同配列は、配列番号３０と９０％超またはさらにより好ましくは９５％超の同一性を有する。
【００９０】
別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２は、配列番号３１、配列番号３２もしくは配列番号３３の配列またはその相同配列を含み、前記相同配列は、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３と８０％超、好ましくは９０％超、さらにより好ましくは９５％超の同一性を有する。さらに好ましくは、前記Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２は、配列番号３１、配列番号３２もしくは配列番号３３の配列またはその相同配列を含み、前記相同配列は、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３と９０％超、さらにより好ましくは９５％超の同一性を有する。
【００９１】
極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号２０；（ｂ）配列番号２５；（ｃ）配列番号２６；（ｄ）配列番号２７；または（ｅ）配列番号２９から選択されるアミノ酸配列を含む。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである。
【００９２】
別の態様では、本発明は、ネコのアレルゲン性を低減する方法であって、前記ネコに有効量の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合している、方法を提供する。好ましくは、前記方法は、前記ネコのアレルゲン性を低減する非治療的方法であり；好ましくは、前記方法または前記組成物はさらに、本明細書に記載される通りに定義されるものである。
【００９３】
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの第一の結合部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；（ｉｉ）少なくとも１つの第二の結合部位を有する少なくとも１つのＦｅｌ  ｄ１タンパク質を含み；前記ウイルス様粒子と前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、前記少なくとも１つの第一の結合部位と前記少なくとも１つの第二の結合部位を介して結合しており、前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が、配列番号２５または配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ＶＬＰがキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、実質的にこれよりなるか、あるいはこれよりなるものであり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、（ａ）ＣＭＶポリペプチドと（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはこれよりなるものであり；前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むもの、好ましくは同アミノ酸配列よりなるものである、組成物を提供する。
【００９４】
（実施例）
実施例１
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の単離およびクローン化
ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、米国）を製造業者の指示通りに用いて、ＣＭＶを感染させたユリの葉から全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成にはＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社、フェンロー、オランダ）を用いた。ＣＭＶ  ＣＰ遺伝子の増幅には、ＧｅｎＢａｎｋのＣＭＶ配列を解析して以下のプライマー配列を選択した：ＣＭｃｐＦ（ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴ）（配列番号８）およびＣＭｃｐＲ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡ）（配列番号９）；ＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を施した。対応するＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ヴィリニュス、リトアニア）にクローン化した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞をクローン化およびプラスミド増幅の宿主として用いた。ＰＣＲエラーを含んだクローンが選択されるのを回避するため、ＢｉｇＤｙｅサイクルシーケンシングキットおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カールスバッド、米国）を用いて、ＣＰ遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンをいくつかシーケンシングした。シーケンシング後、配列番号１のＣＭＶコートタンパク質をコードする配列エラーのないＣＭＶ  ＣＰ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１０）をｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、サンディエゴ、米国）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローン化し、発現プラスミドｐＥＴ−ＣＭＶｗｔ（図１）を得た。
【００９５】
実施例２
ＣＭＶのＶＬＰが得られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での配列番号１のＣＰの発現
ＣＭＶ  ＶＬＰを得るため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、米国）をＣＭＶ  ＣＰ遺伝子含有プラスミドｐＥＴ−ＣＭＶｗｔで形質転換した。標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を回転式振盪機（２００ｒｅｖ／ｍｉｎ；Ｉｎｆｏｒｓ社、ボットミンゲン、スイス）上でカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２×ＴＹ培地中、ＯＤ６００が０．８〜１．０になるまで３０℃で増殖させた。次いで、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧで細胞を誘導し、培地に５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。回転式振盪機上、インキュベーションを２０℃で１８時間継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離により収集し、−２０℃で凍結させた。氷上で解凍した後、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭホウ酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノールを含有する緩衝液（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）に細胞を懸濁させ、超音波処理により破壊した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により不溶性タンパク質および細胞残屑を除去した。清澄化した溶解物中の可溶性ＣＭＶ  ＣＰタンパク質を＋４℃で一晩、飽和硫酸アンモニウム（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いてペレット化した。沈殿したタンパク質を同じ緩衝液Ａ（メルカプトエタノールは含まない）中、＋４℃で４時間可溶化させた。低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）により不溶性タンパク質を除去した。スクロース勾配（メルカプトエタノールを含まず、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した緩衝液Ａ中２０〜６０％のスクロース）を用いた超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社、パロアルト、米国；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により、可溶性ＣＭＶ  ＣＰ含有タンパク質溶液を細胞タンパク質から分離した。勾配を勾配の底から始めて６つの画分に分け、その画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（データ不掲載）。組換えＣＭＶ  ＣＰが含まれる２番と３番の画分を合わせて２００体積の緩衝液（５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）に対して透析し、スクロースおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除去した。透析後、ＣＭＶ  ＣＰ溶液を０．２μフォルターでろ過することにより滅菌した。次いで、無菌条件下、Ｔｙｐｅ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国）を用いて２０％スクロースの「クッション」で超遠心分離（５００００ｒｐｍ、４時間、＋５℃）することによりＣＭＶ  ＣＰを濃縮した。ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を製造業者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ユージーン、米国）通りに用いて精製ＣＭＶｗｔの濃度を推定した。濃縮ＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、緩衝液（ｐＨ９．０）中、＋４℃で保管した。１２．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＶＬＰの発現および精製に関与する全段階をモニターした。
【００９６】
ＣＭＶコートタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で良好に発現させることが可能であり、得られた相当部分が可溶性画分に含まれ得る。さらに、このタンパク質は、スクロース勾配解析（図２Ａ）、動的光散乱法および電子顕微鏡解析（図２Ｂ）からわかるように、同じ大きさのＶＬＰの形で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞抽出物中に直接みられる。
【００９７】
実施例３
破傷風トキソイドエピトープを含む改変ＣＭＶコートタンパク質（ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０）のクローン化
配列番号１のＣＭＶ  ＣＰのＮ末端部分の本来のアミノ酸を破傷風トキソイドエピトープのコード配列に置き換えるため、ＰＣＲ増幅および変異誘発にｐＥＴ−ＣＭＶｗｔプラスミドを用いた。ＣＭＶｗｔ遺伝子内に位置するＳａｌＩ部位（図１）を対応するＰＣＲ産物のクローン化に用いた。
【００９８】
ＣＭＶｗｔ遺伝子に破傷風トキソイドエピトープのコード配列を導入するため、２段階のＰＣＲ変異誘発を用いた。第一段階の増幅には以下のプライマーを用いた：ｐＥＴ−２２０（ＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号１１）−ポリリンカーから上流、増幅される領域にＢｇｌＩＩ部位が含まれる）およびＣＭＶ−ｔｔ８３−１Ｒ（ＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴ）（配列番号１２）。第二ラウンドには、第一の増幅で得たＰＣＲ産物を１：５０に希釈し、プライマーｐＥＴ−２２０（配列番号１１）およびＣＭＶ−ｔｔ８３Ｓａｌ−Ｒ２（ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＧ）（配列番号１３）を用いて再増幅した。得られたＰＣＲ産物（配列番号６のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０をコードする配列番号１４のｃＤＮＡ）をｐＥＴ−ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａＬＩ部位にサブクローン化した。シーケンシングにより正確なクローンを確認し、ｐＥＴ−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と命名した。
【００９９】
実施例４
ＣＭＶの改変ＶＬＰが得られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の発現
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰを得るため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、米国）をＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０遺伝子含有プラスミドｐＥＴ−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０で形質転換した。標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を回転式振盪機（２００ｒｅｖ／ｍｉｎ；Ｉｎｆｏｒｓ社、ボットミンゲン、スイス）上でカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２×ＴＹ培地中、ＯＤ６００が０．８〜１．０になるまで３０℃で増殖させた。次いで、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧで細胞を誘導し、培地に５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。回転式振盪機上、インキュベーションを２０℃で１８時間継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離により収集し、−２０℃で凍結させた。氷上で解凍した後、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭホウ酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノールを含有する緩衝液（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）に細胞を懸濁させ、超音波処理により破壊した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により不溶性タンパク質および細胞残屑を除去した。清澄化した溶解物中の可溶性ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０タンパク質を＋４℃で一晩、飽和硫酸アンモニウム（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いてペレット化した。沈殿したタンパク質を緩衝液Ａ（メルカプトエタノールは含まない）中、＋４℃で４時間可溶化させた。低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）により不溶性タンパク質を除去した。スクロース勾配（メルカプトエタノールを含まず、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した緩衝液Ａ中２０〜６０％のスクロース）を用いた超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社、パロアルト、米国；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により、可溶性ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０含有タンパク質溶液を細胞タンパク質から分離した。勾配を勾配の底から始めて６つの画分に分けた。組換えＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０が含まれる画分を合わせて２００体積の５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）に対して透析し、スクロースおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除去した。透析後、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０溶液を０．２μフィルターでろ過することにより滅菌した。次いで、無菌条件下、Ｔｙｐｅ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社、パロアルト、米国）を用いて２０％スクロースの「クッション」で超遠心分離（５００００ｒｐｍ、４時間、＋５℃）することによりＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０を濃縮した。ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を製造業者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ユージーン、米国）通りに用いて精製ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の濃度を推定した。濃縮ＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭホウ酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、緩衝液（ｐＨ９．０）中、＋４℃で保管した。１２．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＶＬＰの発現および精製に関与する全段階をモニターした。ＣＭＶ  ＶＬＰ中に破傷風トキソイドエピトープが存在することを明らかにするため、精製ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰの質量分光分析を用いた。図３Ｃに示されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞でタンパク質が合成される際にみられるよう���１番目のメチオニンが除去されると、得られた主要ピークはタンパク質の理論的分子質量に対応したものとなる。動的光散乱法および電子顕微鏡法では、ＣＭＶｗｔ  ＶＬＰに類似した同じ大きさの粒子形態が確認された（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０１００】
実施例５
ＰＡＤＲＥエピトープを含む改変ＣＭＶコートタンパク質（ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ）のクローン化
ＣＭＶｗｔ遺伝子にＰＡＤＲＥエピトープのコード配列を導入するため、ｐＥＴ−ＣＭＶｗｔプラスミドを増幅およびサブクローニングの鋳型に用いてＰＣＲ変異誘発を実施した（実施例２および３も参照されたい）。増幅には以下のプライマーを用いた：ｐＥＴ−２２０（配列番号１１）およびＣＭＶ−ｐａｄｒＳａｌ−Ｒ（ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴ）（配列番号１５）。得られたＰＣＲ産物（配列番号７のＣＭＶ−Ｎｐａｄｒをコードする配列番号１６のｃＤＮＡ）を再びｐＥＴ−ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位にサブクローン化した。シーケンシングにより正確なクローンを確認し、ｐＥＴ−ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒと命名した。
【０１０１】
実施例６
ＣＭＶの改変ＶＬＰが得られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＣＭＶ−Ｎｐａｄｒの発現
ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒの発現および精製の手順はＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の場合と実質的に同じであり、実施例４に記載されている。ＣＭＶ  ＶＬＰ中にＰＡＤＲＥエピトープが存在することを明らかにするため、精製ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ  ＶＬＰの質量分光分析を用いた。図３Ｂに示されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞でタンパク質が合成される際にみられるように１番目のメチオニンが除去されると、得られた主要ピークはタンパク質の理論的分子質量に対応したものとなる。動的光散乱法および電子顕微鏡解析では、同じ大きさの粒子形態が確認された（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【０１０２】
実施例７
Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質のクローン化
アミノ酸１５個の配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１７）を介してＦｅｌ  ｄ１の鎖２のＮ末端に融合したＦｅｌ  ｄ１の鎖１からなり、Ｆｅｌ  ｄ１の鎖２のＣ末端にＨＨＨＨＨＨＧＧＣ配列（配列番号１８）が組み込まれて融合したＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質（名称Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣ）を、オリゴヌクレオチドを対象とする指向性遺伝子合成により作製した。対応するオリゴヌクレオチド配列は配列番号１９の配列を有し、Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣのタンパク質配列は配列番号２０の配列を有する：
ＭＥＩＣＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥＮＡＬＳＶＬＤＫＩＹＴＳＰＬＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＮＧＮＥＬＬＬＤＬＳＬＴＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣＹＶＥＮＧＬＩＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴＩＳＳＳＫＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＶＥＤＬＫＬＮＴＬＧＲＨＨＨＨＨＨＧＧＣ
【０１０３】
遺伝子を合成した後、同遺伝子をそのヘルパープラスミドから切り取り、プラスミドｐＥＴ４２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、米国）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にインフレームでサブクローン化して発現ベクターｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを得た。
【０１０４】
プラスミドｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを鋳型に用いたＰＣＲ変異誘発により、Ｃ末端に追加のグリシン残基を有するＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質（名称Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣＧ）、ヘキサ−ヒスチジン配列のないＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質（名称Ｆ１２ＧＧＣ）またはヘキサ−ヒスチジンはないがＣ末端に追加のグリシン残基を有するＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質（名称Ｆ１２ＧＧＣＧ）を作製した。上記の融合タンパク質を作製するのにＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである：
Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣＧは、順方向プライマーをＦｅｌ  ＢｇｌＦ（配列番号２１）とし、逆方向プライマーをＦｅｌ６Ｈ−ｃｇＲ（配列番号２２）とした。
Ｆ１２ＧＧＣは、順方向プライマーをＦｅｌ＿ＢｇｌＦ（配列番号２１）とし、逆方向プライマーをＦｅｌｄ−ｄＨＲ（配列番号２３）とした。
Ｆ１２ＧＧＣＧは、順方向プライマーをＦｅｌ＿ＢｇｌＦ（配列番号２１）とし、逆方向プライマーをＦｅｌｄ−ｄＨ−ｃｇＲ（配列番号２４）とした。
【０１０５】
全ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで切断し、ベクターｐＥＴ４２−Ｆ１２６ＨＧＧＣの同じ切出し部位に再びサブクローン化した。プラスミドＤＮＡを単離した後、ＢｉｇＤｙｅサイクルシーケンシングキットおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カールスバッド、米国）を用いて、導入された変化を確認した。得られた発現ベクターをｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣＧ、ｐＥＴ４２−Ｆ１２ＧＧＣおよびｐＥＴ４２−Ｆ１２ＧＧＣＧと命名した。これらは、対応するＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣＧ（配列番号２５）、Ｆ１２ＧＧＣ（配列番号２６）およびＦ１２ＧＧＣＧ（配列番号２７）をコードする。
【０１０６】
ＭＥＩＣＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥＮＡＬＳＶＬＤＫＩＹＴＳＰＬＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＮＧＮＥＬＬＬＤＬＳＬＴＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣＹＶＥＮＧＬＩＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴＩＳＳＳＫＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＶＥＤＬＫＬＮＴＬＧＲＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ（配列番号２５）
【０１０７】
ＭＥＩＣＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥＮＡＬＳＶＬＤＫＩＹＴＳＰＬＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＮＧＮＥＬＬＬＤＬＳＬＴＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣＹＶＥＮＧＬＩＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴＩＳＳＳＫＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＶＥＤＬＫＬＮＴＬＧＲＧＧＣ（配列番号２６）
【０１０８】
ＭＥＩＣＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥＮＡＬＳＶＬＤＫＩＹＴＳＰＬＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＮＧＮＥＬＬＬＤＬＳＬＴＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣＹＶＥＮＧＬＩＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴＩＳＳＳＫＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＶＥＤＬＫＬＮＴＬＧＲＧＧＣＧ（配列番号２７）
【０１０９】
ヘキサ−ヒスチジン配列は金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にするものであり、ＧＧＣまたはＧＧＣＧ（配列番号２８）を含むＣ末端配列はＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質とＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒとのカップリングを可能にするものである。
【０１１０】
実施例８
Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質の発現および精製。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質の発現。Ｆｅｌ  ｄ１発現ベクターｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣ、ｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣＧ、ｐＥＴ４２−Ｆ１２ＧＧＣおよびｐＥＴ４２−Ｆ１２ＧＧＣＧを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、米国）に形質転換した。標的タンパク質のレベルが最も高いクローンを選択し、のちの実験に使用した。各種の組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質の発現を以下のように実施した。発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養物を回転式振盪機（２００ｒｅｖ／ｍｉｎ；Ｉｎｆｏｒｓ社、ボットミンゲン、スイス）上でカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２×ＴＹ培地中、ＯＤ６００が０．８〜１．０になるまで３０℃で増殖させた。次いで、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによりＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質遺伝子の発現を誘導した。培地に５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した。回転式振盪機上、インキュベーションを２０℃で１８時間継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離により収集し、精製まで−２０℃で凍結させた。
【０１１１】
ヘキサ−ヒスチジンタグ化Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質の精製。融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣおよびＦ１２Ｈ６ＧＧＣＧの精製には、ＵＳＢ  ＰｒｅｐＥａｓｅ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ハイウィカム、イギリス）を製造業者の指示通りに用いた。氷上で解凍した後、５ｍＭ  ＤＴＴを含有する１×ＬＥＷ緩衝液に培養物１００ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（約０．７５ｇ）を懸濁させ、次いで、超音波処理により破壊した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により不溶性タンパク質および細胞残屑を除去した。清澄化した溶解物をＮｉ−ＩＤＡカラムにかけ、同じ緩衝液（ＤＴＴは含まない）で２回洗浄し、１×Ｅ緩衝液を含有する２×１．５ｍｌのイミダゾールで溶離させた。Ｆｅｌ  ｄ１が含まれる画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより特定し（図６Ａ）、２００体積の緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に対して２回透析した。透析後、ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ユージーン、米国）通りに用いて、または２８０ｎｍでのＵＶ分光光度測定により、タンパク質濃度を推定した。質量分光分析（図６Ｂ）および抗Ｈｉｓ−タグ抗体を用いたウエスタンブロット（Ｎｏｖａｇｅｎ社、カタログ番号Ｎｏ．７１８４０−３；データ不掲載）により精製タンパク質のアイデンティティを確認した。
【０１１２】
ヘキサ−ヒスチジンタグのないＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質の精製。融合タンパク質Ｆ１２ＧＧＣおよびＦＧ１２ＧＧＣＧの精製には、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた。ＩＰＴＧで誘導した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３グラムを溶解緩衝液ＬＢ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ）２０ｍｌ中で超音波処理により破壊した。超音波処理後、溶液を１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を収集した。硫酸アンモニウムを３０％の飽和に達するまで常時攪拌しながら加えた後、ＲＴで５分間インキュベートした。遠心分離後、回収した上清に固体の硫酸アンモニウムを５０％の飽和まで加えた。遠心分離後、タンパク質ペレットを収集し、ＬＢ  ２ｍｌに溶かし、ＬＢで平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で余剰の塩を除去した。脱塩したタンパク質の溶出液をＬＢで平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭＣａｐｔｏ（商標）ＤＥＡＥカラムにかけた。ＮａＣｌ勾配を漸増させて、結合したＦ１２ＧＧＣまたはＦＧ１２ＧＧＣＧを溶離させた。Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質が含まれる画分を収集しプールした。得られた溶液を４体積の２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴで希釈し、ＬＢ中、ＭｏｎｏＱ５／５０ＧＬカラムにかけ、ＮａＣｌ勾配を漸増させながら溶離させた。Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質が含まれる画分を収集しプールした。５Ｍ  ＮａＣｌを２．５Ｍの濃度に達するまで加え、その溶液にＤＴＴを加えて５ｍＭの濃度を維持した。次いで、Ｆｅｌ  ｄ１含有溶液を２．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ中、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＨＰカラムにかけ、ＮａＣｌ濃度を連続的に低下させて溶離させた。Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質が含まれる画分を収集しプールした。クーマシー染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにより全精製段階をモニターした（図６Ｃ）。組換えＦｅｌ  ｄ１に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより精製タンパク質のアイデンティティを確認した（データ不掲載）。
【０１１３】
実施例９
組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質（１つまたは複数）の信頼性
各Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質はＦｅｌ  ｄ１特異的モノクローナル抗体によって同じように認識される。Ｉｎｄｏｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カーディフ、イギリス）製のサンドイッチＥＬＩＳＡ  Ｆｅｌ  ｄ１  ＥＬＩＳＡキット（６Ｆ９／３Ｅ４）を用いて、Ｆｅｌ  ｄ１特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）との結合をＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと天然Ｆｅｌ  ｄ１（ｎＦｅｌ  ｄ１）とで比較した。この目的に向けて、Ｎｕｎｃ  ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、抗Ｆｅｌ  ｄ１  ｍＡｂ  ６Ｆ９（１μｇ／ｍｌ）でコートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２時間、室温（ＲＴ）でブロックした。天然Ｆｅｌ  ｄ１およびＦ１２Ｈ６ＧＧＣ（１μｇ／ｍｌ）を１：３に連続希釈し、ＲＴで２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ビオチン化抗Ｆｅｌ  ｄ１  ｍＡｂ  ３Ｅ４（１μｇ／ｍｌ）を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。検出には西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いた。この目的に向けて、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いで、プレートにストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社、１：１０００希釈）をＲＴで３０分間添加した。ＯＰＤ基質溶液および停止液の５％Ｈ２ＳＯ４を用いて検出を実施した。ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡでは、天然Ｆｅｌ  ｄ１とＦ１２Ｈ６ＧＧＣは同等の力価を示したことから、両者がＦｅｌ  ｄ１特異的ｍＡｂによって同じように認識されたことがわかり、これにより組換えＦｅｌ  ｄ１  Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの信頼性が裏付けられた（図７）。
【０１１５】
組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質はネコアレルギー患者の全血中の好塩基球を活性化する。ネコアレルギー患者の血液には、表面にＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＥ抗体を有する好塩基球が含まれており、アレルゲンに曝露すると、このＩｇＥ抗体がＦｃεＲＩを架橋し脱顆粒を引き起こす。組換えＦｅｌ  ｄ１が脱顆粒を引き起こすことが可能であるかどうかを調べるため、Ｆｅｌ  ｄ１アレルギー患者から全血を採取し、Ｂuｈｌｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＢａｓｏｐｈｉｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔキット（Ｆｌｏｗ  Ｃａｓｔ（登録商標）、ＦＫ  ＣＣＲ）で組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣとともに用いた。このアッセイは、ＣＣＲ３＋好塩基球上にある唯一の脱顆粒マーカーＣＤ６３のアップレギュレーションを測定するものである。簡潔に述べれば、刺激緩衝液１００μｌとＥＤＴＡ処理した全血５０μｌとを混合した。さらに、天然Ｆｅｌ  ｄ１または組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの各種希釈物５０μｌを加えた。このアッセイではほかにも、ＦｃεＲＩに対するｍＡｂと非特異的活性化因子（ｆＭＬＰ）とを含む陽性対照溶液を試験した。ＰＥで標識した抗ＣＣＲ３  ＡｂとＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ６３  Ａｂとを含有する染色色素（１試料当たり２０μｌ）を加え、３７℃で２５分間インキュベートした。次いで、溶解緩衝液を加えて赤血球を溶解させた。１０分間インキュベートした後、試料を５００×ｇで５分間遠心分離し、洗浄緩衝液（２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ）で洗浄した。２回目の遠心分離段階の後、細胞ペレットを洗浄緩衝液２００μｌに懸濁させ、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いて捕捉した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアで試料を解析した。ＣＣＲ３＋好塩基球上のＣＤ６３発現の割合を解析した。
【０１１６】
組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質はネコアレルギー患者の好塩基球の脱顆粒を容易に誘発することがわかった。さらに、天然Ｆｅｌ  ｄ１と比較しても同等レベルの脱顆粒がみられたことから、組換えにより作製したＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質の信頼性が示された（図８Ａ／図８Ｂ）。
【０１１７】
実施例１０
Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−ＶＬＰとのカップリング
以下のように、ヘテロ二官能性化学架橋剤のスクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート］（ＳＭＰＨ）を用いてＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣをＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ  ＶＬＰと共有結合させた。
【０１１８】
ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）中で保管したウイルス様粒子ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒの緩衝液を、３０％スクロースを含有する２０ｍＭ  リン酸Ｎａおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡと交換した。ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ  ＶＬＰまたはＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰの溶液を７．５倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤ＳＭＰＨとＲＴで６０分間反応させた。３０％スクロースを含有する２０ｍＭリン酸Ｎａおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ中、未反応のＳＭＰＨをＰＤ１０カラムで除去した。
【０１１９】
Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを１０倍モル過剰のＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で処理した。誘導体化されたＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰを１倍または２倍モル過剰の組換えＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと２３℃で３時間反応させた。クーマシーブルーで染色した還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス‐トリスゲル）によりカップリング反応を解析した。化学結合反応後、質量が約４４．５ｋＤａおよび６９ｋＤａのタンパク質のバンドが見られた（データ不掲載）。これらのバンドはそれぞれ、Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣ（２０ｋＤａ）と共有結合したＣＭＶコートタンパク質（２４．５ｋＤａ）および（４９ｋＤａの）１つのＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと共有結合した２つのＣＭＶコートタンパク質分子に対応し、Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ  ＶＬＰが形成されたことを示している。同じように、配列番号２５のＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質など別のＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質もＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰと共有結合した。
【０１２０】
実施例１１
Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ  ＶＬＰに対するマウスの免疫応答
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス３個体からなるグループを実施例１０に記載した通りに調製したＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰまたは単にＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと混合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰで免疫感作した。両組成物には同じ量のＦｅｌ  ｄ１融合タンパク質が含まれている。１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇの各組成物を調製し、第０日および第１４日に１５０μｌの体積で静脈内に注射した。第０日（免疫前）、第１４日および第２１日、マウスから採血し、ＥＬＩＳＡにより血清を天然のＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体に対して分析した。
【０１２１】
ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、ＰＢＳに溶かした濃度１μｇ／ｍｌの天然Ｆｅｌ  ｄ１（Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でコートした。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプレートをブロックした。ＯＤ５０を検出するため血清の段階希釈を実施した。ＯＤ５０は、最大ＯＤ値の半分に達する希釈度の逆数を表す。ホースラディッシュディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰＯ）で直接標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を用いてＦｅｌ  ｄ１に特異的なＩｇＧ抗体を検出した。７分間インキュベートした後、５％硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を加えることにより停止させた呈色反応として、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）の変換をＨＲＰＯにより４５０ｎｍで測定した。
【０１２２】
単回感作後のみマウスにＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体が検出された（第１４日）。２回目の注射により応答をブーストした。Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ  ＶＬＰは、混合組成物と比較してＦｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体の誘導を有意に増大させ、Ｆｅｌ  ｄ１融合タンパク質とＶＬＰとの化学的結合の免疫増強効果が示された（図９）。
【０１２３】
実施例１２
Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ  ＶＬＰに対するネコの免疫応答
標的生物種でのＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰの免疫原性および効果を検討するため、アジュバントを加えて（サポニン基質１５μｇ；ｎ＝３）、またはアジュバントを加えずに（ｎ＝３）ＰＢＳで製剤化したＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰ  １００μｇで雌ネコ（ヨーロピアンショートヘア種）を筋肉内経路（後肢）で３回（２１日の間隔で）免疫感作した。
【０１２４】
免疫感作前ならびに第２２日、第４３日、第５８日、第７１日および第８５日に血液を採取した。凝固および遠心分離の後、アッセイまで血清試料を凍結保存した。口腔内に滅菌スワブを挿入することにより、ネコから唾液試料を採取した。これは免疫感作前ならびに第６４日および第８５日に実施した。
【０１２５】
Ａ．免疫感作ネコの（ｉ）Ｆｅｌ  ｄ１キャリアおよび（ｉｉ）ＣＭＶキャリアに対するＩｇＧ抗体の測定。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて免疫感作ネコの血清中の（ｉ）Ｆｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体および（ｉｉ）ＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体を検出した。簡潔に述べれば：
【０１２６】
ｉ）ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレートにＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの天然Ｆｅｌ  ｄ１（Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を一晩加え、次いで洗浄し、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）に溶かした２％ＢＳＡでブロックした。洗浄後、連続希釈したネコ血清をプレートに加えた。さらに洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識したヤギ抗ネコＩｇＧ抗体をプレートに加えた。最後の洗浄段階の後、Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を加え、７分後、５％硫酸で反応を停止させた。ＨＲＰＯによるＯＰＤの変換を４５０ｎｍで測定した。最大ＯＤ値の半分に達する希釈度の逆数であるＯＤ５０で力価を報告する。
【０１２７】
免疫感作前、有意な抗Ｆｅｌ  ｄ１  ＩｇＧは認められなかった。単回感作後第２２日、Ｆｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧが検出された。第２２日の２回目の免疫感作後、応答がさらに増大し、第４３日に実施した３回目の注射後も高レベルに維持された。その後、抗体価が徐々に低下した。Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰをアジュバントと組み合わせて投与したネコでもほぼ同じ結果が得られた（図１０Ａ）。
【０１２８】
ｉｉ）ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレートに０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）中１μｇ／ｍｌのキュウリモザイクウイルス様粒子（ＣＭＶｗｔ）を一晩加えた。洗浄後、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）に溶かした２％ＢＳＡでプレートをブロックした。洗浄後、連続希釈したネコ血清をプレートに加えた。さらに洗浄した後、ＨＲＰＯで標識したヤギ抗ネコＩｇＧ抗体をプレートに加えた。最後の洗浄段階の後、ＯＰＤを加え、７分後、５％硫酸で反応を停止させた。ＨＲＰＯによるＯＰＤの変換を４５０ｎｍで測定した。最大ＯＤ値の半分に達する希釈度の逆数であるＯＤ５０で力価を報告する。
【０１２９】
免疫感作前、有意な抗ＣＭＶ  ＩｇＧは認められなかった。単回感作後第２２日、ＣＭＶ特異的ＩｇＧが検出された。第２２日の２回目の免疫感作後、応答がさらに増大し、第４３日に実施した３回目の注射後も高レベルに維持された。その後、抗体価が徐々に低下した。Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰをアジュバントと組み合わせて投与したネコでもほぼ同じ結果が得られた（図１０Ｂ）。
【０１３０】
Ｂ．免疫感作ネコから採取した唾液中のＦｅｌ  ｄ１特異的抗体およびＣＭＶ−ＶＬＰ特異的抗体の測定。綿棒（唾液採取に使用したもの）にＰＢＳＴ  １ｍｌをピペットで垂らし、回転ミキサーで５０ｒｐｍにて３０分間、ＲＴでインキュベートした。５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに篩（セルストレーナー、ＢＤ＃３５２３５０）を用い、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、綿棒から液体を分離した。フロースルーを採取し、ＥＬＩＳＡに用いた。
【０１３１】
抗Ｆｅｌ  ｄ１  ＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体の検出には、間接ＥＬＩＳＡ法を用いた。簡潔に述べれば、ＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレートにＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの天然Ｆｅｌ  ｄ１を４℃で一晩加え、次いで洗浄し、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）に溶かした２％ＢＳＡでブロックした。洗浄後、（１：３に）連続希釈した唾液抽出物をプレートに加え、次いで洗浄した。ＩｇＧ抗体の検出にＨＲＰＯで標識したヤギ抗ネコＩｇＧ抗体を加えた。あるいは、ＩｇＡ抗体の検出にＨＲＰＯで標識したヤギ抗ネコＩｇＡ抗体をプレートに加えた。最後の洗浄段階の後、ＯＰＤを加え、７分後、５％硫酸で反応を停止させた。ＨＲＰＯによるＯＰＤの変換を４５０ｎｍで測定した。
【０１３２】
唾液中のＣＭＶ特異的抗体も、組換えにより発現させたＣＭＶｗｔ  ＶＬＰでコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて同様に測定した。
【０１３３】
免疫感作後、Ｆｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ａ）は、第６４日に５個体、第８５日に全６個体で各個体の免疫感作前のベースラインを上回るレベルで測定された。Ｆｅｌ  ｄ１特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｂ）は、第６４日に５個体、第８５日に５個体で各個体の免疫感作前のベースラインを上回るレベルで測定された。ＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体（図１１Ｃ）は、第６４日に５個体、第８５日に５個体で免疫感作前のベースラインを上回るレベルで測定された。ＣＭＶ特異的ＩｇＡ抗体（図１１Ｄ）は、第６４日に全６個体、第８５日に全６個体で測定された。
【０１３４】
Ｃ．免疫感作ネコから採取した唾液中の内因性Ｆｅｌ  ｄ１と抗Ｆｅｌ  ｄ１  ＩｇＡ抗体とからなる免疫複合体の測定。３種類の重複しないＦｅｌ  ｄ１エピトープに特異的な３種類の異なるｍＡｂ（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）の混合物をＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コートした。プレートを洗浄し、ＲＴで２時間ブロックした（２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）。未希釈の唾液抽出物および連続希釈（１：３）した唾液抽出物をプレートに加えた。内因性Ｆｅｌ  ｄ１とＩｇＡ抗体とを含む免疫複合体をＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製のヤギ抗ネコＩｇＡ  Ａｂ−ＨＲＰＯで検出した。最後の洗浄段階の後、ＯＰＤを加え、７分後、５％硫酸で反応を停止させた。ＨＲＰＯによるＯＰＤの変換を４５０ｎｍで測定した。
【０１３５】
第６４日または第８５日、全個体に内因性Ｆｅｌ  ｄ１とＩｇＡ抗体とからなる免疫複合体が免疫感作前のベースラインを上回るレベルで検出された（図１２）。
【０１３６】
実施例１３
Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰ免疫感作ネコの唾液試料はネコアレルギー患者の好塩基球脱顆粒の減少を示す
実施例９に記載した好塩基球活性化試験を用いて、Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰで免疫感作することによって唾液Ｆｅｌ  ｄ１を介する好塩基球脱顆粒を阻害することが可能であるかどうかを明らかにした。この目的に向けて、免疫感作前および免疫感作後のネコから唾液試料を採取し、実施例１２に記載した通りに抽出した。陽性対照の抗ＦｃεＲＩ  ｍＡｂ５０μｌまたは免疫感作前および免疫感作後のネコの唾液試料５０μｌを用いて、好塩基球活性化試験を実施した。
【０１３７】
簡潔に述べれば、刺激緩衝液１００μｌとＥＤＴＡ処理した全血５０μｌとを混合した。さらに、免疫感作前および免疫感作後（第８５日）のネコの唾液試料５０μｌまたは陽性対照のＦｃεＲＩに対するｍＡｂを加えた。ＰＥで標識した抗ＣＣＲ３  ＡｂとＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ６３  Ａｂとを含有する染色色素（１試料当たり２０μｌ）を加え、３７℃で２５分間インキュベートした。次いで、溶解緩衝液を加えて赤血球を溶解させた。１０分間インキュベートした後、試料を５００×ｇで５分間遠心分離し、洗浄緩衝液（２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ）で洗浄した。２回目の遠心分離段階の後、細胞ペレットを洗浄緩衝液２００μｌに懸濁させ、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いて捕捉した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアで試料を解析した。ＣＣＲ３＋好塩基球上のＣＤ６３発現の割合を解析した。
【０１３８】
第８５日の免疫感作後に６個体から採取した唾液抽出物のうち５個体のものは、免疫感作前の唾液抽出物と比較して脱顆粒レベルが最大２０％低下していた（図１３）。前記好塩基球活性化試験および前記ネコアレルギー患者に天然Ｆｅｌ  ｄ１を用いて作成した力価測定曲線に外挿すると、２０％の脱顆粒減少は、Ｆｅｌ  ｄ１濃度が１３分の１になったことに相当する。このことから、唾液中のアレルゲン性Ｆｅｌ  ｄ１が大幅に減少したことがわかる。
【０１３９】
実施例１４
ネコアレルギー被験者を対象とした臨床試験によって評価したネコ免疫感作の効果
ネコアレルギーヒト被験者を対象とする漸増皮膚プリック試験を用いて、ネコをＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰで免疫感作する前と後に得たネコ体毛抽出物のアレルゲン性を比較した。
【０１４０】
ネコ体毛抽出物の調製
雌ネコ（ヨーロピアンショートヘア種）３個体にＦｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰ（実施例１０に記載した通りに調製した配列番号２５を含むもの）１００ｕｇを第１日、第２２日、第４３日および第２５６日の４回皮下投与して免疫感作した。第１日の免疫感作前および第３１２日の４回目の免疫感作後、ブラッシングによりネコの体毛試料を採取した。採取した体毛試料を調製まで凍結保存した。
【０１４１】
体毛抽出物を調製するため、体毛０．０３ｇを抽出バイアル（１．５ｍｌのチューブ）に移し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水１ｍｌを同バイアルに加えた。抽出チューブを設定温度２３℃のサーモシェーカー内に置き、５５０ｒｐｍで１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、抽出チューブを卓上エッペンドルフ遠心機に移し、ＲＴ、１６．０００×ｇで１０分間回転させた。上清を清潔な１．５ｍｌのチューブに移し、解析まで凍結保存した。
【０１４２】
皮膚プリック試験
凍結したネコ体毛抽出物（０：５ｍｌのエッペンドルフのチューブに入れた溶液７５μｌ）を使用直前に解凍し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で３倍段階希釈した。
【０１４３】
掌側前腕の左側でネコ体毛抽出物による従来の皮膚プリック試験を用いて、ネコアレルギー被験者のアレルギー状態が陽性であることを確認した。
【０１４４】
患者スクリーニングおよびネコ体毛抽出物の評価に用いた皮膚プリック試験を簡潔に説明する。試験に適した前腕掌側の皮膚領域を選択した。州の薬局が提供する消毒用アルコールを用いて、皮膚を清潔で乾燥し、脂肪もクリーム類も化粧品類も付着していない状態にした。湿疹または炎症のみられる皮膚領域は避けた。皮膚用マーカーを用いてプリック部位に印および番号を付した。肘領域および手関節は避けた。相互汚染を避けるため、２つのアレルゲン抽出物間の垂直方向および水平方向の距離を少なくとも２ｃｍとした。２０μｌのＧｉｌｓｏｎピペットを用いて、皮膚のしかるべき位置にネコ体毛溶液の液滴（１０μｌ）を置いた。次いで、液滴の中に皮膚穿刺針を通してアレルゲンを真皮内に刺入した。約１秒間圧力を加え、いずれの加圧もある力が同じになるようにした。１５分後、皮膚用マーカーを用いて各膨疹の輪郭を線で囲んだ。これらの線は、膨疹のどの部分も横断したり覆ったりしないよう、その周囲の赤くなった皮膚に引いた。膨疹周囲の赤くなった皮膚の部分が輪郭部分の内側に一切入らないようにした。膨疹に透明な粘着テープを貼り、次いで、それを紙に貼って消えない記録として残すことにより、囲んだ印のコピーを取った。膨疹サイズの面積（ｍｍ２）を算出した。
【０１４５】
患者が来院するごとに、１個体のネコの体毛抽出物を希釈したものを試験した。免疫感作前に採取したネコ体毛抽出物を右腕で試験し、免疫感作後に採取した体毛のネコ体毛溶液を左腕で試験した。
【０１４６】
結果
単施設非盲検臨床試験にネコアレルギー患者７例（年齢１８〜６５歳、男女）を組み入れた。免疫感作前と免疫感作後の体毛抽出物を比較した（可能な２１件のうち）１６件の皮膚プリック試験で膨疹サイズの比較に成功を収めた。
【０１４７】
上記の１６例の皮膚プリック試験で得た平均膨疹サイズの解析から、免疫感作ネコから得た体毛抽出物の方が、免疫感作前に採取したものよりも膨疹サイズが小さくなっているのがわかる（図１４）。このデータから、Ｆｅｌ  ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０  ＶＬＰで免疫感作した後にネコ体毛抽出物のアレルゲン性が低下したことが示唆される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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