(57)【要約】本発明は、（ａ）マスキングペプチド；（ｂ）１つ以上の抗原特異的標的化ドメイン；（ｃ）細胞外スペーサードメイン；（ｄ）膜貫通ドメイン；（ｅ）少なくとも１つの共刺激ドメイン；及び（ｆ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、マスクされたキメラ抗原受容体に関する。ｍＣＡＲは、マスキングペプチドの切断時に活性化される。2018518972.tif 000030
2018518972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．マスキングペプチドと；
ｂ．抗原特異的標的化ドメインと；
ｃ．膜貫通ドメインと；
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメインと；
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、マスクされたキメラ抗原受容体（ｍＣＡＲ）であって、
前記抗原特異的標的化ドメインは、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む、
前記ｍＣＡＲ。
【請求項２】
細胞外スペーサードメインをさらに含む、請求項１に記載のｍＣＡＲ。
【請求項３】
前記マスキングペプチドが、前記抗原特異的標的化ドメインに特異的に結合するマスク、及び切断部位を含む、請求項１に記載のｍＣＡＲ。
【請求項４】
前記マスク及び前記切断部位が、リンカーによって連結されている、請求項３に記載のｍＣＡＲ。
【請求項５】
前記マスキングペプチドが、リンカーによって前記ｃＡＲに連結されている、請求項１に記載のｍＣＡＲ。
【請求項６】
マスクされている場合には不活性であり、切断されている場合には活性である、請求項１に記載のｍＣＡＲ。
【請求項７】
前記切断部位が、プロテアーゼ特異的切断部位である、請求項３に記載のｍＣＡＲ。
【請求項８】
非切断状態におけるマスクされたｍＣＡＲが、マスク−リンカー−切断部位−抗原特異的標的化ドメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインという、Ｎ末端からＣ末端までの構造配置を含む、請求項５に記載のｍＣＡＲ。
【請求項９】
非切断状態におけるマスクされたｍＣＡＲが、マスク−リンカー−切断部位−抗原特異的標的化ドメイン−細胞外スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインという、Ｎ末端からＣ末端までの構造配置を含む、請求項５に記載のｍＣＡＲ。
【請求項１０】
前記細胞外スペーサードメインが、抗体またはその機能的等価物、断片、もしくは誘導体のＦｃ断片、抗体またはその機能的等価物、断片、もしくは誘導体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項２に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ及びＣＨ２領域、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ及びＣＨ２領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１０に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ８α、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１２に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上からのシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、及びそれらの組み合わせの１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
前記抗原特異的標的化ドメインが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、及びそれらの組み合わせに特異的な抗原からなる群から選択される抗原を標的とする、請求項１に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
癌に特異的な前記抗原が、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエキストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１６に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、ラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦベータ１、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１６に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１６に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−１β、ＣＤ３、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１６に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項２１】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン−１−ホスファート、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１６に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、インフルエンザＡ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、請求項１６に記載のマスクされたキメラ抗原受容体。
【請求項２３】
前記抗原特異的標的化ドメインがＥＧＦＲを標的とする、請求項１に記載のｍＣＡＲ。
【請求項２４】
表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に記載の配列を含む、請求項１に記載のｍＣＡＲ。
【請求項２５】
請求項１に記載のマスクされたキメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２８】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
【請求項２９】
ＲＮＡウイルスである、請求項２８に記載のウイルス。
【請求項３０】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、請求項２８に記載のウイルス。
【請求項３１】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子改変細胞。
【請求項３２】
Ｔ細胞である、請求項３１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３３】
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項３２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３４】
ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項３１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３５】
以下の工程を含む、マスクされたキメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞の産生方法：
１つ以上のＴ細胞を請求項２７に記載のベクターでトランスフェクトする工程；及び
該１つ以上のＴ細胞を、前記抗原特異的標的化ドメインによって標的とされる抗原を発現する細胞、または前記ｍＣＡＲのＡＳＴＤに特異的な組換え抗原で刺激する工程であって、これにより前記Ｔ細胞が増殖して、一定量のＴ細胞を産生する、工程。
【請求項３６】
請求項１に記載の組成物を提供する工程；及び
疾患を治療するように、治療的有効量の該組成物を対象に投与する工程
を含む、それを必要とする対象における疾患の治療方法であって、
前記抗原特異的標的化ドメインが該疾患と関連している、前記方法。
【請求項３７】
前記疾患が癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が、肺癌、乳癌、腎癌、または神経芽細胞腫である、請求項３６または３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた契約番号ＣＡ１７０８２０、ＥＢ０１７２０６、及びＣＡ１３２６８１の下での政府支援に基づいて達成されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、活性化可能なキメラ抗原受容体、及びそれを用いた遺伝子改変細胞に関する。活性化可能なｍＣＡＲは、マスクされている場合には不活性であり、マスクされていない場合には活性である。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書中の全ての出版物は、個々の出版物または特許出願それぞれが、明確かつ個々に参考文献に組み込まれると示されたかのように同じ程度に、参考文献に組み込まれる。以下の記載は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書中で提供されたあらゆる情報が、先行技術であるかまたは現在請求されている発明に関連することを認めない、または明確または暗に言及されたあらゆる出版物が先行技術であることを認めない。
【０００４】
Ｔ細胞、特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作されたＴ細胞の養子移入は、癌免疫療法における有望なアプローチとして浮上している。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に認識する細胞外単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びに細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインからなる合成受容体である。自然発生するＴ細胞受容体とは異なり、ＣＡＲは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって課される制限なく、それらの標的抗原を直接認識することができ、高レベルの細胞死滅活性を潜在的に仲介することができる。
【０００５】
ＣＡＲ改変Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法は、Ｂ細胞特異的受容体ＣＤ１９の標的化を介したＢ細胞悪性腫瘍の多くの臨床試験において顕著な成功を示している。これは、固形腫瘍の治療に対するＣＡＲ−Ｔ技術の拡大における大きな関心へのきっかけとなり、いくつかの現在進行中の臨床試験が、そのような治療法の試験を目的としている。しかしながら、この移り変わりの１つの困難な局面は、腫瘍細胞に制限される理想的な固形腫瘍抗原の同定である。多数の固形腫瘍抗原が同定されているが、それらのほとんどは、正常組織中でも低レベルで発現される。健常細胞中のこの低レベルの抗原発現は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化をもたらし、「オンターゲットオフ腫瘍（on-target off-tumor）」毒性につながり得る。例えば、ある患者におけるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入は、肺組織中のＨＥＲ２の発現により致命的な炎症性サイトカインの放出を引き起こした。理想的な腫瘍抗原を同定する困難さを考慮すると、望ましくないオンターゲットオフ腫瘍効果を改善する１つの戦略は、ＣＡＲ構造における腫瘍選択性メカニズムを操作して、腫瘍微小環境中の標的抗原と正常組織中の標的抗原の間のより良い差別化を可能とすることである。
【０００６】
Ｔ細胞免疫療法は、黒色腫、Ｂ細胞リンパ腫、及び他の癌を有する患者の長期治癒をもたらし得る強力な治療である。１つの一般的な方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために、Ｔ細胞をエクスビボで遺伝子改変することであり、これにより、ＭＨＣ提示を必要とせずに標的抗原を認識することができる。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は、非常に高レベルの抗腫瘍活性を生じる可能性を有するが、オフターゲット細胞死滅の増加を示すこともある。従って、当該技術分野では、そのような副作用を最小限にする必要がある。本明細書で記載されるのは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のオフターゲット細胞死滅を減少させる組成物である。
【発明の概要】
【０００７】
以下の実施形態及びそれらの態様は、システム、組成物、及び方法に関連付けて説明及び例示するが、それらは例示であり、範囲を限定しないものと意図される。
【０００８】
キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、非常に高レベルの抗腫瘍活性を生じる可能性を有するが、オフターゲット細胞死滅の増加を示すこともある。そのような副作用を最小限にするため、ＣＡＲの標的、広範囲の腫瘍で高発現される腫瘍関連抗原である上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）にＣＡＲが結合する能力を遮断するＮ末端マスキングペプチドを含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を設計した。マスキングペプチドは、例えば、腫瘍微小環境において一般的に活性なプロテアーゼによって切断されうるため、ｍＣＡＲは、腫瘍部位でそれらの標的抗原のみを認識することができる。
【０００９】
本明細書で提供されるのは、マスクされたキメラ抗原受容体（ｍＣＡＲ）を含む組成物であり、ＣＡＲは、マスクされている場合には不活性であり、マスクが切断された場合には活性である。ある実施形態において、ｍＣＡＲは、表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。本明細書に記載されるように、マスキングペプチドは、ｍＣＡＲ中の抗原特異的標的化ドメインがその標的に早期結合することを防ぐマスク、プロテアーゼの基質であってもよい切断部位、マスクを切断部位に接続するリンカー配列、及び切断部位をＣＡＲに連結するリンカー配列を含む。
【００１０】
ある実施形態において、Ｎ末端からＣ末端までのｍＣＡＲの構造配置は、マスクが切断されていない場合、マスク−リンカー−切断部位−リンカー−ＣＡＲである。ある実施形態において、Ｎ末端からＣ末端までのｍＣＡＲの構造配置は、マスクが切断されている場合、リンカー−ＣＡＲである。
【００１１】
ある実施形態において、Ｎ末端からＣ末端までのｍＣＡＲの構造配置は、マスクが切断されていない場合、マスク−リンカー−切断部位−リンカー−抗原特異的標的化ドメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。さらなる配列は、例えば、ｍＣＡＲにさらに柔軟性及び安定性をもたらすように、各ドメイン間に存在してもよい。
【００１２】
ある実施形態において、Ｎ末端からＣ末端までのｍＣＡＲの構造配置は、マスクが切断されていない場合、マスク−リンカー−切断部位−リンカー−抗原特異的標的化ドメイン−細胞外スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。さらなる配列は、例えば、ｍＣＡＲにさらに柔軟性及び安定性をもたらすように、各ドメイン間に存在してもよい。
【００１３】
ある実施形態において、ＥＧＦＲに特異的なｍＣＡＲは、マスキングペプチドを含み、マスキングペプチド中のマスクは、
2018518972.tif 000003
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。別の実施形態において、Ｈｅｒ２に特異的なｍＣＡＲは、マスキングペプチドを含み、マスキングペプチド中のマスクは、
2018518972.tif 000004
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。さらなる実施形態において、ＧＤ２ガングリオシドに特異的なｍＣＡＲは、マスキングペプチドを含み、マスキングペプチド中のマスクは、
2018518972.tif 000005
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列、または
2018518972.tif 000006
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。さらなる実施形態において、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）に特異的なｍＣＡＲは、マスキングペプチドを含み、マスキングペプチド中のマスクは、ＬＳＴＡＦＡＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列、または
2018518972.tif 000007
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。
【００１４】
ある実施形態において、ｍＣＡＲは、マスキングペプチドを含み、マスキングペプチド中の切断部位は、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。
【００１５】
ある実施形態において、ｍＣＡＲは、（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、阻害する抗原特異的標的化ドメインを含む。ある実施形態において、ＥＧＦＲインヒビターは、
2018518972.tif 000008
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である可変軽鎖配列、及び
2018518972.tif 000009
に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である可変重鎖配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ｍＣＡＲは、表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す配列に少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、または８０％同一である配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。
【００１７】
また、本明細書で提供されるのは、マスクされたキメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞の産生方法である。本方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のマスクされたキメラ抗原受容体をコードするベクターでトランスフェクトすること、及び１つ以上のＴ細胞を、抗原特異的標的化ドメインによって標的とされる抗原を発現する細胞、もしくはｍＣＡＲのＡＳＴＤに特異的な組換え抗原、またはそれらの組み合わせで刺激することを含む。いくつかの実施形態において、トランスフェクトされた細胞の刺激は、一定量のＴ細胞を産生するようにＴ細胞増殖をもたらす。
【００１８】
また、本明細書で提供されるのは、対象における疾患の症状を治療する、阻害する、減少する、または対象における疾患の進行を遅らせる／減少する方法である。本方法は、本明細書に記載のｍＣＡＲを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。ある実施形態において、組成物中のｍＣＡＲは、表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す配列を含む。ある実施形態において、ｍＣＡＲは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。ある実施形態において、疾患は、ＥＧＦＲを阻害することによって治療可能な任意の疾患である。ある実施形態において、疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、黒色腫、神経膠芽腫、膵臓癌、卵巣癌のいずれか１つ以上である。ある実施形態において、ｍＣＡＲは、ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合し、癌は、神経芽細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌、骨肉腫、または軟部組織肉腫である。一実施形態において、ｍＣＡＲは、ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合し、癌は、神経芽細胞腫である。さらなる実施形態において、ｍＣＡＲは、炭酸脱水酵素９に特異的に結合し、癌は、腎細胞癌、表在性膀胱癌、または浸潤性尿路上皮癌である。一実施形態において、ｍＣＡＲは、炭酸脱水酵素９に特異的に結合し、癌は、腎細胞癌である。
【００１９】
また、本明細書で提供されるのは、対象における肺癌の症状を治療する、阻害する、減少する、または対象における肺癌の進行を遅らせる／減少する方法である。方法は、本明細書に記載のｍＣＡＲを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。ある実施形態において、組成物中のｍＣＡＲは、表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す配列を含む、当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。ある実施形態において、ｍＣＡＲは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。
【００２０】
例示の実施形態は、参照図面に示される。本明細書に開示される実施形態及び図面は、限定することではなく説明に役立つものとして考慮されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本発明の実施形態に従う、抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ構築物のマスクされていない形態、マスクされた形態、及びＮＳＵＢ形態の概略図を示す。（ａ）腫瘍選択性を改善するための、マスクされたＣＡＲの理論的設計の概略図である。プロテアーゼの存在を伴う腫瘍微小環境では、マスキングペプチドは切断され、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の遮断されていた抗原結合部位が露出される。
【図１Ｂ】本発明の実施形態に従う、抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ構築物のマスクされていない形態、マスクされた形態、及びＮＳＵＢ形態の概略図を示す。（ｂ）種々の抗ＥＧＦＲ  ｍＣＡＲ構築物の概略図である。ｓｃＦｖ配列は、モノクローナル抗体セツキシマブに由来した。ｓｃＦｖを、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインとインフレームで融合し、その後、ＣＤ２８／４１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと融合した後、レトロウイルスベクターにクローン化し、マスクされていないＣＡＲを得た。マスキングペプチド、及びプロテアーゼ感受性リンカーを、マスクされていないＣＡＲ中のｓｃＦｖの上流に挿入し、マスクされたｍＣＡＲ構築物を生成した。マスキングペプチド、及び切断不可能なＧＳリンカーを、マスクされていないＣＡＲ中のｓｃＦｖの上流に挿入し、ＮＳＵＢ（無プロテアーゼ基質配列）ＣＡＲ構築物を得た。
【図２】本発明の実施形態に従う、ＥＧＦＲタンパク質への抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞の結合能力を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＥＧＦＲ  ＣＡＲまたはマスクＥＧＦＲ  ＣＡＲをそれぞれコードするレンチベクターで形質導入した。ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ細胞を組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃで染色した後、二次抗体（黒色）としてヤギ抗ヒトＦｃ抗体、またはバックグラウンド（灰色）のみとして第２抗体で染色した。
【図３】本発明の実施形態に従う、対応する標的細胞Ｋ５６２−ＥＧＦＲまたはＫ５６２−ＣＤ１９細胞との共培養によるＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞の活性化を示す。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ、マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲ、またはＣＤ１９  ＣＡＲをそれぞれコードするレンチベクターで形質導入した。ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞をそれらの標的細胞と共培養した。ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞の活性化は、ＧＦＰ発現に従って評価した。マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲの活性化は減少したが、プロテアーゼｕＰＡ（５０ｎＭ）の切断後に一部回復することができる。
【図４】本発明の実施形態に従う、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１との共培養によるＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞の活性化を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのプロテアーゼの内因性分泌は、マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲを部分的に活性化することができる一方、ｕＰＡ（５０ｎＭ）処理は、活性化シグナルを強化することができる。
【図５】本発明の実施形態に従う、マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞の活性化を回復するためのｕＰＡ濃度の滴定を示す。より高濃度のｕＰＡによる処理は、標的Ｋ５６２−ＥＧＦＲ細胞での刺激後にそのＧＦＰ発現によって評価して、より活性化されたマスクＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター集団をもたらす。
【図６】本発明の実施形態に従う、ヒトＴ細胞中での種々のＣＡＲの発現、及び標的抗原ＥＧＦＲへのそれらの結合能力を示す。ヒトＰＢＭＣは、マスクされていない抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ、マスクされた抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ、及びＮＳＵＢ抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで活性化、形質導入し、エクスビボで１０日間拡大した。（ａ）３つの群のＣＡＲ−Ｔ細胞を、ビオチン化タンパク質Ｌで染色した後、ＡＰＣ複合化ストレプトアビジンで染色し、細胞表面上のＣＡＲ発現を検出した。（ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を、組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質と共にインキュベーションした後、ＰＥ複合化ヤギ抗ヒトＦｃ抗体で染色し、ＣＡＲのそれらの標的抗原であるヒトＥＧＦＲへの結合能力を評価した。
【図７】本発明の実施形態に従う、プロテアーゼ処理後の種々のＣＡＲの標的抗原ＥＧＦＲへの結合を示す。マスクされていない抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、マスクされた抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、及びＮＳＵＢ抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、濃度を増加させた（０ｎＭ、１００ｎＭ、及び４００ｎＭ）ｕＰＡで処理した後、組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ）、及びヤギ抗ヒトＦｃ抗体で染色し、プロテアーゼ処理の、抗原に結合するＣＡＲに対する効果を評価した。
【図８Ａ】本発明の実施形態に従う、異なる標的細胞で刺激した種々のＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す。（ａ）活性化及びエクスビボ拡大の１０日後に、マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞、及びＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇインヒビターと共に、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＥＧＦＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、またはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞と６時間共培養した。未刺激ＣＡＲ−Ｔ細胞を陰性対照として使用し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激したＣＡＲ−Ｔ細胞を陽性対照として使用した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生は、細胞内染色によって測定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を各パネルに示す。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞をゲートし、総ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるそれらの割合を各散布図で示す。
【図８Ｂ】本発明の実施形態に従う、異なる標的細胞で刺激した種々のＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す。（ｂ）要約統計を棒グラフで示した（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、チューキーの多重比較による一元配置分散分析）。
【図９】本発明の実施形態に従う、インビトロでの異なる標的細胞株に対する種々のＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞、及びＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を異なる標的細胞株と共培養した。（ａ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を、１：１、３：１、または１０：１のエフェクター対標的比でＫ５６２−ＥＧＦＲ細胞と４時間共培養し、Ｋ５６２−ＥＧＦＲに対する細胞傷害性を測定し、図に示した。（ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を、１：１、３：１、または１０：１のエフェクター対標的比でＮＣＩ−Ｈ２９２細胞と１８時間共培養し、細胞傷害性を測定した。（ｃ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を、１：１、２．５：１、５：１、または１０：１エフェクター対標的比でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と１８時間共培養し、細胞傷害性を測定した。
【図１０】本発明の実施形態に従う、ヒト肺癌異種移植モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示す。（ａ）インビボＣＡＲ−Ｔ治療プロトコルの概略図である。０日目に、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞をＮＳＧマウスの右脇腹に注入した。マウスを４つの群（ｎ＝８、各群）に無作為化し、１３日目及び２６日目に４００万個のマスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞、またはＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した；形質導入されていないＴ細胞は、対照として含めた。腫瘍サイズは、キャリパーによって毎週２回測定した。（ｂ）各群の腫瘍成長曲線は、平均±ＳＥＭとして示した（ｎｓ、有意ではない；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。（ｃ）マウス生存曲線は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いて算出した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書に引用される全ての参照物は、完全に明記されるかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、当業者に本出願において使用される用語の多くの一般的な指針を提供する。
【００２３】
当業者には、本発明の実践において使用され得る、本明細書に記載されるものと類似または同等などの多くの方法及び材料が認識されるであろう。実際に、本発明は、記載の方法及び材料には全く限定されない。本発明の目的に対して、以下の用語が下記に定義される。
【００２４】
本明細書に記載の発明は、活性化可能なまたはマスクされた（ｍＣＡＲ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。キメラ抗原受容体は、免疫特異性を遺伝子改変細胞に移植する改変受容体である。マスキングペプチドは、ＣＡＲ上の各抗原結合部位に固有であり、例えば、ＣＡＲをマスキングペプチドに連結するリンカーを切断することによって活性化されるまで、ＣＡＲを不活性にする。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「マスキングペプチド」（ＭＰ）は、ＭＰが非切断状態である場合、ＣＡＲのＡＳＴＤの標的細胞上の抗原への結合を阻害するペプチドを指す。ＭＰは、切断可能なリンカー部分を介してＣＡＲに連結される。ＭＰは、ＣＡＲが標的細胞上の抗原に結合するのを防ぐマスク（ペプチド）、及び切断部位を含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、マスキングペプチド、及び切断部位を分離し、マスキングペプチド（ＭＰ）は、マスク−リンカー−切断部位の構造を有する。切断部位は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸を含む。マスクは、５〜５０アミノ酸の長さであってもよい。切断状態では、ＭＰは、ＣＡＲの標的細胞上の抗原への結合に干渉しない。いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端まで非切断状態における、マスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）の構造配置は、ＭＰ−Ｌ−ＡＳＴＤ−ＥＳＤ−ＴＭ−ＣＳＤ−ＩＳＤである。いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端まで非切断状態における、ｍＣＡＲの構造配置は、ＭＰ−Ｌ−ＡＳＴＤ−ＴＭ−ＣＳＤ−ＩＳＤである。種々の実施形態において、マスキングペプチドは、各ＡＳＴＤに固有である。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「抗原特異的標的化ドメイン」（ＡＳＴＤ）は、特定の抗原を標的とするＣＡＲのドメイン／領域を指す。ｍＣＡＲは、１つ以上のＡＳＴＤを含み得る。ＡＳＴＤは、細胞外であり、抗体またはその機能的等価物またはその断片またはその誘導体を含み得る。標的化ドメイン／領域は、各々が標的抗原に特異的である、完全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含み得る。当業者が理解するように、いくつかの実施形態において、高親和性を有する所与の抗原に結合する任意の分子は、ＡＳＴＤ、例えば、結合サイトカイン（サイトカイン受容体を有する細胞の認識をもたらす）、アフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質／ペプチドリガンド、ペプチド、及び免疫応答として使用することができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせなどのＴ細胞）に移植する改変受容体を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られる。ＣＡＲは、１つ以上の抗原特異的標的化ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲが２つの異なる抗原を標的とする場合、抗原特異的標的化ドメインは、直列に配列され、リンカー配列によって分離されてもよい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「共刺激ドメイン」（ＣＳＤ）は、メモリー細胞の増殖、生存、および／または発生を増強するＣＡＲの部分を指す。ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのいずれか１つ以上の共刺激ドメインを含む。（例えば、他のタンパク質由来の）他の共刺激ドメインが、当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「細胞外スペーサードメイン」（ＥＳＤ）は、抗原特異的標的化ドメインと膜貫通ドメインとの間の親水性領域を指す。いくつかの実施形態において、本発明のｍＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含んでもよく、または含まなくてもよい。細胞外スペーサードメインは、抗体のＦｃ断片、またはその断片もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその断片もしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」（ＩＳＤ）または「細胞質ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示する、ＣＡＲの部分を指す。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例としては、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、並びにＣＤ２、ＣＤ５、及びＣＤ２８などのＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「リンカー」（Ｌ）または「リンカードメイン」または「リンカー領域」は、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、及びＣＡＲをマスキングペプチドに連結する約１〜１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシン及びセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にすることが望ましい場合、より長いリンカーが使用され得る。リンカーは、切断可能であってもよく、または切断可能でなくてもよい。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、マスキングペプチドをＣＡＲに連結する。切断可能なリンカーの例としては、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはそれらの機能的等価物、及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーには、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルス（Ｐ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）配列、ゾセア・アシグナウイルス（Ｔ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ、変異体、及び機能的等価物が挙げられる。他の実施形態において、リンカー配列は、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間に切断をもたらす、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（２Ａ）―Ｐｒｏ（２Ｂ）モチーフ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を含み得る。他のリンカーが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ）は、細胞膜を横断するＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせの膜貫通領域である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞関連疾患」は、Ｂ細胞免疫不全、自己免疫性疾患、および／またはＢ細胞と関連している過剰／無制御細胞増殖（リンパ腫および／または白血病を含む）を含む。本発明のｍＣＡＲが治療手段として使用され得る、そのような疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、反応性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、尋常性天疱瘡、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性甲状腺疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、プレＢ急性リンパ芽球性白血病、全身性エリテマトーデス、分類不能型免疫不全、慢性リンパ性白血病、選択的ＩｇＡ欠乏および／またはＩｇＧサブクラス欠乏と関連している疾患、Ｂ細胞系リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、胸腺腫を伴う免疫不全、一過性低ガンマグロブリン血症および／または高ＩｇＭ症候群、並びにＥＢＶ媒介性リンパ増殖性疾患などのウイルス媒介性Ｂ細胞疾患、及びＢ細胞が病態生理に関与する慢性感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「有益な結果」には、疾患状態の重症度を緩和するか、または軽減する、疾患状態が悪化するのを防ぐ、疾患状態を治癒する、疾患状態を発症するのを防ぐ、患者が疾患状態を発症する機会を低減する、及び患者の寿命もしくは寿命の予想値を伸ばすことが含まれ得るが、これらには全く限定されない。
【００３５】
「癌」及び「癌性」とは、典型的には、制御されていない細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指すか、または述べる。癌の例としては、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌、並びにアンドロゲン依存性前立腺癌及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むがこれらに限定されない前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「状態」、「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、「疾患」、及び「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ）」は、疾患細胞が、例えば、疾患細胞上の特異抗原に対する抗体を発現する本発明のＣＡＲによって標的とされ得る、生理学的状態を含む。標的とされ得る抗原の例としては、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、並びに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。例示の実施形態において、標的とされる抗原は、ＥＧＦＲである。
【００３７】
「エフェクター機能」は、分化した細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変細胞」、「再配向細胞」、「遺伝子改変細胞」、または「改変細胞」は、本発明のｍＣＡＲを発現する細胞を指す。遺伝子改変細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性胚性幹細胞、または胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子改変細胞は、本発明のｍＣＡＲを発現し、ｍＣＡＲは、活性化可能であり、標的細胞の表面上で発現される抗原のいずれかを標的にし得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、貪食細胞、形質細胞、及びＴ細胞が含まれるが、これらに限定されない、哺乳類免疫系の細胞を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、先天免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、後天（適応）免疫、自己免疫、および／または過活動免疫が含まれるが、これらに限定されない、免疫を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「哺乳類」は、限定されることなく、ヒト及び非ヒト霊長動物、例えば、チンパンジー及び他の類人猿並びにサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜動物；イヌ及びネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット、モルモットなどの齧歯動物を含む実験動物を含む、哺乳綱の任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。このため、成体及び新生児／仔の対象、並びに胎児／仔は、雄性または雌性にかかわらず、本用語の範囲内に含まれることが意図される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、および／またはｔＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「裸のＤＮＡ」は、発現に適切な配向で好適な発現ベクター内にクローン化されたＣＡＲをコードするＤＮＡを指す。使用され得るウイルスベクターには、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドベクター、および／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾンシステム）、またはインテグラーゼ系のベクターシステムが含まれるが、これらに限定されない。本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る他のベクターが、当業者に明白である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「単鎖可変断片」、「単鎖抗体可変断片」、または「ｓｃＦｖ」抗体は、リンカーペプチドで結合された重鎖及び軽鎖のみの可変領域を含む、抗体の形態を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、一疾患に関与し、本発明の遺伝子改変細胞（遺伝子改変Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、及び胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない）によって標的とされ得る細胞を指す。他の標的細胞が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００４６】
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は、相互交換可能であり、本明細書において同義的に使用される。例としては、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「治療剤」は、例えば、疾患を、治療する、阻害する、防ぐ、その影響を軽減する、その重症度を低減する、発症の可能性を低減する、その進行を緩徐にする、および／またはそれを治癒するために使用される薬剤を指す。治療剤によって標的とされる疾患には、限定されないが、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫が含まれ、種々の免疫細胞上で発現される抗原、並びに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「形質導入」は、ウイルスベクターを使用した、外来核酸の細胞内への導入を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、組換えＤＮＡ技術を使用した、外来核酸の細胞内への導入を指す。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡ配列の、宿主細胞への導入を意味し、その導入遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素などの望ましい物質を産生させるように、宿主細胞にその導入遺伝子または配列を発現させるようにする。導入遺伝子または配列はまた、「クローン化された」または「外来」遺伝子または配列と呼ばれてもよく、細胞の遺伝子機構によって使用される、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、または他の配列などの制御性または調節配列を含み得る。遺伝子または配列は、非機能性配列または機能不明の配列を含み得る。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受容しかつ発現する宿主細胞は、「形質転換され」ており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、その宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含む、任意の源に由来し得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「治療」及び「治療する」は、そこで対象が、治療が最終的に不成功であったとしても、標的とされる病態を防ぐか、または鈍化（緩和）させる、病態を防ぐ、有益な結果を探究するか、または得る、あるいは個体のその状態を発症する可能性を低下させることを目的とした、治療的処置及び予防的もしくは予防手段の両方を指す。治療を必要とする対象には、既にその状態を有している対象、並びにその状態を有し易い対象、またはその状態が防がれるべき対象が含まれる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、全ての腫瘍細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」は、媒介物であって、これにより、宿主を形質転換しかつ導入配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するように、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され得る、媒介物を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれる。
【００５３】
キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、非常に高レベルの抗腫瘍活性を生じる可能性を有するが、オフターゲット細胞死滅の増加を示すこともある。そのような副作用を最小限にするため、本発明者らは、ＣＡＲがその標的に時期尚早に結合する能力を遮断するＮ末端マスキングペプチドを有するＣＡＲを記載する。
【００５４】
本明細書で記載されるのは、１つ以上の抗原に特異的なキメラ抗原受容体、及びマスキングペプチドを含む、マスクされた／活性化可能なキメラ抗原受容体（ｍＣＡＲ）である。マスキングペプチドは、ＣＡＲ上の抗原特異的結合領域が標的細胞上の抗原に早期結合するのを遮断する。一般的な実施形態において、本発明は、ｍＣＡＲ、ｍＣＡＲをコードする核酸配列、ｍＣＡＲをコードする核酸を含むベクター、ｍＣＡＲをコードする核酸配列を含むウイルス、ｍＣＡＲを発現し、治療剤としてｍＣＡＲを用いた宿主細胞（遺伝子改変細胞など）に関する。本発明のｍＣＡＲは、細胞中で発現され、次いで、少なくとも１つの抗原特異的標的化ドメイン、例えば、抗原と相互作用する少なくとも１つの分子の存在に応答して増殖し得るように構築される。特に、抗原と抗原結合ドメインとの間の相互作用は、ｍＣＡＲを発現する細胞の増殖を促進する。他の因子（例えば、微小環境中のサイトカイン、結合の親和性、調節性細胞の存在など）もまた、ｍＣＡＲを発現する細胞の増殖を促進し得る。
【００５５】
本明細書に記載のｍＣＡＲは、単一のポリペプチド鎖として合成され得、マスキングペプチド、１つ以上の抗原特異的標的化ドメイン、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。この実施形態において、マスキングペプチドは、抗原特異的標的化ドメインのＮ末端にあり、直列に配列され、リンカーペプチドによって分離される。抗原特異的標的化ドメインは、膜貫通ドメインに連結される細胞外スペーサードメインに連結される。膜貫通ドメインは、共刺激ドメインに連結される。共刺激ドメインは、Ｃ末端の細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。２つ以上の共刺激ドメインが使用される場合、複数の共刺激ドメインは、そのＮ末端で膜貫通ドメイン、及びそのＣ末端で細胞内シグナル伝達ドメインと直列に配列され得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｉ型膜貫通タンパク質としてｍＣＡＲを細胞表面に方向付けるＮ末端シグナル配列をさらに含み得る。抗原特異的標的化ドメインは、細胞外に面していてもよく、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質内であってもよい。
【００５６】
図１は、本発明のマスクされたキメラ抗原受容体の概略図を示す。
【００５７】
マスキングペプチド
マスキングペプチドは、マスク及び切断部位を含む。種々の実施形態において、マスキングペプチドは、ＣＡＲ中の各抗原特異的標的化ドメインに特異的である。例えば、標的抗原に特異的な各ｓｃＦｖは、固有のマスキングペプチド配列を有する。マスク及び切断部位は、リンカーによって連結される。マスクは、ＣＡＲの抗原特異的標的化ドメインに特異的／固有であり、マスキングペプチドを切断部位で切断することによってｍＣＡＲが活性化されるまで、ＣＡＲの標的細胞上の抗原への結合を遮断する。マスクされたＣＡＲの例示の実施形態は、表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に記載される。
【００５８】
マスキングペプチドは、５〜５０アミノ酸の長さであってもよい。種々の実施形態において、（マスク、リンカー、及び切断部位を含む）マスキングペプチドは、２〜５、５〜１０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２５、１５〜２０、１５〜２５、２０〜２５、２０〜３０、２５〜３０、２５〜３５、３０〜３５、３５〜４０、３５〜４５、４０〜４５、または４５〜５０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、マスキングペプチドは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さである。ある実施形態において、マスキングペプチド中のマスクは、ＣＡＲの各抗原特異的標的化ドメインに特異的である。いくつかの実施形態において、マスクは、２〜５、５〜１０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２５アミノ酸の長さであり得る。
【００５９】
例示の実施形態において、ｍＣＡＲにおけるＡＳＴＤは、ＥＧＦＲに特異的であり、マスクは、配列
2018518972.tif 000010
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。別の例示の実施形態において、ｍＣＡＲにおけるＡＳＴＤは、ＥＧＦＲに特異的であり、マスクは、配列
2018518972.tif 000011
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。別の例示の実施形態において、ｍＣＡＲにおけるＡＳＴＤは、Ｈｅｒ２に特異的であり、マスクは、配列
2018518972.tif 000012
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。さらなる例示の実施形態において、ＣＡＲにおけるＡＳＴＤは、ＧＤ２ガングリオシドに特異的であり、マスクは、配列
2018518972.tif 000013
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。さらなる例示の実施形態において、ＣＡＲにおけるＡＳＴＤは、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）に特異的であり、マスクは、配列
2018518972.tif 000014
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。
【００６０】
マスキングペプチド中のマスクをスクリーニングする方法は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、コンビナトリアルアプローチを使用して、マスクされたペプチドを設計する。コンビナトリアルアプローチは、公知のマスク（例えば、抗体または他の抗原結合ドメインに結合することが示されているペプチド）を公知の抗原結合ドメイン（例えば、単鎖抗体、または他のタンパク質結合ドメイン）と組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、デノボスクリーニングアプローチを使用して、既存のＣＡＲ中の抗原特異的結合ドメインをマスクするそれらの能力について、例えば、細菌ディスプレイペプチドライブラリー中のペプチドをスクリーニングすることによって、マスクされたペプチドを設計する。適当なマスキング部分は、種々の公知の技術のいずれかを用いて同定される。例えば、ペプチドマスキング部分は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００９／００６２１４２号に記載の方法を用いて同定され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細菌ディスプレイスクリーニングにより、例えば、マスキングペプチドライブラリーは、ＯｍｐＸなどの細菌膜タンパク質への融合によって細胞表面上に表示される。形質転換された細胞を、ＣＡＲの抗原結合ドメインに対応するフルオロフォア標識抗体でインキュベーションし、結合細胞は、蛍光活性化細胞選別によって単離される。結合細胞を増幅し、選択処理を数ラウンド繰り返した。選択されたクローンのシークエンシングによって、候補のマスキングペプチド配列を同定する。他のスクリーニング法には、Ｂａｒｂａｓ，Ｃａｒｌｏｓ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００４に教示されているようなファージディスプレイ；Ｗｉｌｓｏｎ、Ｄａｖｉｄ  Ｓ．、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ．Ｋｅｅｆｅ  ａｎｄ  Ｊａｃｋ  Ｗ．Ｓｚｏｓｔａｋ．“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９８．７（２００１）：３７５０−３７５５に教示されているようなｍＲＮＡディスプレイ；及びＢｏｄｅｒ，Ｅｒｉｃ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｋ．Ｄａｎｅ  Ｗｉｔｔｒｕｐ．“Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５．６（１９９７）：５５３−５５７に教示されているような酵母ディスプレイが含まれる。
【００６１】
種々の実施形態において、切断部位は、プロテアーゼ、例えば、対象における治療部位で標的抗原と共局在するプロテアーゼに対する基質を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、マスキングペプチド中の切断部位は、２〜５、５〜１０、５〜１５、１０〜１５、５、８、１０、１２、または１５アミノ酸の長さである。例示の実施形態において、切断部位は、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になり、ｕＰＡプロテアーゼに特異的である。別の例示の実施形態において、切断部位は、配列
2018518972.tif 000015
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になり、ｕＰＡプロテアーゼに特異的である。本明細書に記載のｍＣＡＲと共に使用するのに適当である好適な切断部位を選択する方法は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、切断部位は、ｕＰＡ、ＭＴ−ＳＰｌ、レグマインなどのプロテアーゼに対する基質である。いくつかの実施形態において、切断部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などのプロテアーゼに対する基質である。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断可能なリンカー配列の例としては、プロテアーゼＭＭＰ−１基質
2018518972.tif 000016
、ＭＭＰ−２、および／またはＭＭＰ−９基質
2018518972.tif 000017
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
切断部位の望ましい特徴には、対象に対する非毒性、対象における全身循環中の安定性、循環プロテアーゼ（トロンビン、プラスミンなど）への非感受性、対象における治療を意図する部位で活性であることが含まれるが、これらに限定されない。適当な基質は、種々の公知の技術のいずれかを用いて同定される。例えば、ペプチド基質は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第７，６６６，８１７号に記載の方法を用いて同定され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。（Ｂｏｕｌｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｒａｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０６．３（２０１０）：３３９−４６も参照されたい）。
【００６３】
例示の実施形態において、マスクと切断部位との間のリンカーは、配列
2018518972.tif 000018
を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になり、マスキングペプチドをＣＡＲに連結するリンカーは、配列ＧＳＳＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を含む、または当該配列からなる、または当該配列から本質的になる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結された場合のＣＡＲの解離定数（Ｋｄ）が、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結されない場合のＣＡＲのＫｄより少なくとも２０倍以上であるように、マスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）が、ＣＡＲが対象中の治療部位で標的抗原に結合する能力を減少させる。いくつかの実施形態において、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結された場合のＣＡＲの解離定数（Ｋｄ）が、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結されない場合のＣＡＲのＫｄより少なくとも１００倍以上であるように、マスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）は、ＣＡＲが対象中の治療部位で標的抗原に結合する能力を減少させる。いくつかの実施形態において、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結された場合のＣＡＲの解離定数（Ｋｄ）が、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結されない場合のＣＡＲのＫｄより少なくとも１０００倍以上であるように、マスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）は、ＣＡＲが対象中の治療部位で標的抗原に結合する能力を減少させる。いくつかの実施形態において、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結された場合のＣＡＲの解離定数（Ｋｄ）が、標的抗原に向かうマスキングペプチドに連結されない場合のＣＡＲのＫｄより少なくとも１０００倍以上であるように、マスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）は、ＣＡＲが対象中の治療部位で標的抗原に結合する能力を減少させる。例示の実施形態において、ＥＧＦＲに向かうマスキングペプチドに連結された場合のＥＧＦＲ特異的ＣＡＲの解離定数（Ｋｄ）が、抗原に向かうマスキングペプチドに連結されない場合のＥＧＦＲ特異的ＣＡＲのＫｄより２０、５０、１００、１００、または１０，０００倍以上の少なくともいずれかであるように、マスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）は、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲが対象中の治療部位でＥＧＦＲに結合する能力を減少させる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、標的抗原の存在下で、例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２００９／０２５８４６号及び同第ＷＯ２０１０／０８１１７３号に記載のアッセイなどの標的置換アッセイを用いて、インビトロでアッセイした場合に、マスキングペプチドは、切断部位が切断されていない場合に、切断部位が切断される場合と比べて、ＣＡＲが標的抗原に結合する能力を、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％減少させる。例示の実施形態において、ＥＧＦＲの存在下で、表１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に記載のマスキングペプチドは、表１に示す切断部位（ＬＳＧＲＳＤＮＨ）が切断されていない場合に、切断部位が切断されている場合と比べて、ＥＧＦＴ特異的ＣＡＲがＥＧＦＲに結合する能力を、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％減少させる。
【００６６】
キメラ抗原受容体の抗原特異的標的化ドメイン
本発明のｍＣＡＲは、１つ以上の抗原を標的とし得る。ｍＣＡＲのＡＳＴＤによって標的とされる抗原は、単一疾患細胞（癌性Ｂ細胞など）上の抗原、または各々が疾患に寄与する別々の細胞上で発現される抗原であり得る。ｍＣＡＲによって標的とされる抗原は、疾患に直接的または間接的に関与する抗原である。ｍＣＡＲのＡＳＴＤを含む抗体は、選択肢の任意の抗原に特異的であり得る。抗原に特異的な抗体は、抗体のＦａｂ断片または抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００６７】
例えば、図１は、ＥＧＦＲに特異的な、及び、マスキングペプチド及び切断可能なリンカーを含むｍＣＡＲを描写する本発明の実施形態を示す。当業者によく知られている方法を使用して、マスキングペプチドは、ＡＳＴＤ（ｓｃＦｖなど）の上流に（すなわち、Ｎ末端に）クローン化される。さらに、抗原に特異的なｓｃＦｖは、以下に記載される遺伝子改変細胞によって標的とされ得る細胞上で標的抗原が発現される限り、ＣＤ２８ＴＭ−４１ＢＢＣＳＤ−ＣＤ３ゼータＩＳＤドメインの上流に（すなわち、Ｎ末端に）クローン化され得る。別の実施形態において、抗原に特異的なｓｃＦｖは、以下に記載される遺伝子改変細胞によって標的とされ得る細胞上で標的抗原が発現される限り、ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ８ＴＭ−ＣＤ２８ＣＳＤ−４１ＢＢＣＳＤ−ＣＤ３ゼータＩＳＤ（図１）ドメインの上流に（すなわち、Ｎ末端に）クローン化され得る。そのような技術が文献において完全に説明される。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｐｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、並びにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌における研究書）。
【００６８】
一実施形態において、抗原特異的標的化ドメインは、抗原特異性を与えるのにＶＨドメイン単独で十分である場合（「単一ドメイン抗体」）、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、並びにＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃ）Ｉｇドメインを有する完全長ＩｇＧ重鎖（標的抗原に特異的）を含む。完全長ＩｇＧ重鎖は、適切な膜貫通ドメインを介して、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。ある実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００６９】
別の実施形態において、ｍＣＡＲの各抗原特異的標的化ドメインは、１つ以上の単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。２つ以上のｓｃＦＶが、ｍＣＡＲ中に存在する場合、各ｓｃＦＶは、異なる標的抗原に特異的である。ｓｃＦｖは、その中で１つの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）のＣ末端がポリペプチドリンカーを介して、他方（それぞれ、ＶＬまたはＶＨ）のＮ末端につながれており、ｓｃＦｖは、抗原の結合または結合の特異性を著しく破壊することなく発達してきた。（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｔａｃ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ．１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９４９１、Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．１９９０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８６１５）。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に結合する。これらのｓｃＦｖは、自然抗体の重鎖及び軽鎖中にある定常領域（Ｆｃ）を欠く。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、少なくとも２つの異なる抗原に特異的であり、直列に配列され、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。任意の実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合領域と膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００７０】
別の態様において、各ｓｃＦｖ断片は、重鎖の定常ドメインの全て、または一部に融合され得る。得られた抗原特異的標的化ドメインは、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。任意の実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００７１】
さらなる実施形態において、ｍＣＡＲの１つ以上の抗原特異的標的化ドメインは、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））単鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ−ｓｃＦＶを含むｍＣＡＲにおいて、抗原に特異的な２つのｓｃＦｖは、直列ｓｃＦｖをもたらす２つのＶＨ及び２つのＶＬ領域をもつ単一ペプチド鎖を生成することによって、一緒に連結される。（Ｘｉｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ−Ｙｉ；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ；Ｓｈｉ，ＸＢ；Ｄｅｎａｒｄｏ，ＧＬ；Ｄｅｎａｒｄｏ，ＳＪ（２００６）．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＭＵＣ−１  ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉ−ｓｃＦｖ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １９（８）：３５９−３６７））。１つ以上の抗原特異的標的化ドメインｍＣＡＲは、２つの抗原のそれぞれに特異的な２つのｓｃＦｖを発現することになる。得られた抗原特異的標的化ドメインは、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。任意の実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００７２】
さらなる実施形態において、ｍＣＡＲの各抗原特異的標的化ドメインは、ダイアボディを含む。ダイアボディにおいて、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒に折り重なるには短すぎるリンカーペプチドを用いて作製され、ｓｃＦｖを二量体化させる。さらにより短いリンカー（１つまたは２つのアミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディまたはトリボディの形成をもたらす。テトラボディもまた使用され得る。
【００７３】
本発明のｍＣＡＲを作製するために、抗原特異的標的化ドメインは、単一のタンパク質分子上で共有結合的または非共有結合的のいずれかで互いに結合される。オリゴまたはポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジまたは膜ヒンジ領域は、これらのドメインを互いに結合するために使用され得る。
【００７４】
マスクされたキメラ抗原受容体の共刺激ドメイン
本発明のｍＣＡＲはまた、共刺激ドメインを含む。このドメインは、細胞増殖、細胞生存、及びメモリー細胞の発生を増強し得る。本発明のｍＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上の共刺激ドメインを含む。他のタンパク質由来の共刺激ドメインがまた、本発明のＣＡＲとともに使用され得る。さらなる共刺激ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。ｍＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは直列に配列され、任意にリンカーによって分離され得る。
【００７５】
マスクされたキメラ抗原受容体の細胞外スペーサードメイン
本発明のｍＣＡＲは、細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このドメインは、適切なタンパク質フォールディングを促進する。細胞外スペーサードメインは、抗原特異的標的化ドメイン及び膜貫通ドメインに付着される親水性領域を含む。細胞外スペーサードメインには、抗体のＦｃ断片、またはその断片もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその断片もしくはその誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例としては、ＣＤ８αヒンジ、Ｇｌｙ３などのポリペプチドから作製される人工スペーサー、またはＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４など）のＣＨ１、ＣＨ３ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ及びＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、または（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ及びＣＨ２、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞外スペーサードメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７６】
マスクされたキメラ抗原受容体の膜貫通ドメイン
本発明のｍＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に由来する膜貫通配列を含み得る。本発明のｍＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列を含み得る。本発明のｍＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。さらなる膜貫通ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７７】
マスクされたキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン
本発明のｍＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。このドメインは、細胞質内であってもよく、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示し得る。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、並びにＣＤ２、ＣＤ５、及びＣＤ２８などのＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞内シグナル伝達ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７８】
ｍＣＡＲにおけるリンカー
いくつかの実施形態において、本発明のｍＣＡＲの２つ以上の成分は、１つ以上のリンカーによって分離される。いくつかの実施形態において、マスキングペプチド（マスク及び切断部位）の成分は、リンカー配列によって分離される。いくつかの実施形態において、マスキングペプチドは、リンカー配列によってＣＡＲに連結される。リンカーは、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約１〜１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域である。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、５〜１２アミノ酸の長さ、５〜１５アミノ酸の長さ、または５〜２０アミノ酸の長さであり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシン及びセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。例えば、１００アミノ酸よりも長い、より長いリンカーが、本発明の代替の実施形態に関連して使用されてもよく、例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために選択され得る。本発明において使用され得るリンカーの例としては、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
上述のように、本発明のｍＣＡＲは、単一ポリペプチド鎖として合成され得る。ある実施形態において、切断されていないｍＣＡＲをコードする単一ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、マスク−リンカー−切断部位−リンカー−抗原特異的標的化ドメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインの構造配置を有する。さらなる配列は、例えば、ｍＣＡＲにさらに柔軟性及び安定性をもたらすように、各ドメイン間に存在してもよい。
【００８０】
ある実施形態において、切断されていないｍＣＡＲをコードする単一ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、マスク−リンカー−切断部位−リンカー−抗原特異的標的化ドメイン−細胞外スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインの構造配置を有する。さらなる配列は、例えば、ｍＣＡＲにさらに柔軟性及び安定性をもたらすように、各ドメイン間に存在してもよい。
【００８１】
キメラ抗原受容体の抗原特異的標的化ドメインの標的
いくつかの実施形態において、ｍＣＡＲの抗原特異的標的化ドメインは、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、またはそれらの組み合わせに特異的な抗原を標的とする。本発明のｍＣＡＲによって標的とされ得る抗原の例としては、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、並びに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のｍＣＡＲは、発現細胞のエフェクター機能を両標的抗原のいずれかに向け直すことが可能であり得る。構築物のこの特徴は、例えば、遺伝的に不安定なＢ細胞系悪性腫瘍を、単一の抗原特異性を使用して標的とする際の、抗原消失エスケープ変異体の問題を克服し得る。
【００８２】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る癌に特異的な抗原には、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。癌に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００８３】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る炎症性疾患に特異的な抗原には、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、ラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦベータ１、ＴＮＦ−α、またはＶＥＧＦ−Ａのうちのいずれか１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００８４】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る神経障害に特異的な抗原には、βアミロイドまたはＭＡＢＴ５１０２Ａのいずれか１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。神経障害に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００８５】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る糖尿病に特異的な抗原には、Ｌ−１βまたはＣＤ３のいずれか１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。糖尿病または他の代謝障害に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００８６】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る心血管系疾患に特異的な抗原には、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、及びスフィンゴシン−１−ホスファートのうちのいずれか１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。心血管系疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００８７】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る感染性疾患に特異的な抗原には、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、及びＴＮＦ−αのうちのいずれか１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。感染性疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００８８】
本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされ得る標的抗原のさらなる例には、特異的なまたは増幅された様式で癌細胞上に見出される表面タンパク質（例えば、Ｂ細胞リンパ腫におけるＩＬ−１４受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ４０、種々の癌腫におけるルイスＹ及びＣＥＡ抗原、乳癌及び結腸直腸癌におけるＴａｇ７２抗原、肺癌におけるＥＧＦ−Ｒ、ヒト乳癌及び卵巣癌においてしばしば増幅されている葉酸結合タンパク質及びＨＥＲ−２タンパク質）、またはウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０及びｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス由来のエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂ及び他のエンベロープ糖タンパク質、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのオンコウイルス由来のエンベロープタンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＣＡＲの他の潜在的標的は、リガンドがＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質である場合、ＣＤ４、並びに他のウイルス受容体、例えば、ヒトライノウイルスの受容体であるＩＣＡＭ、及びポリオウイルスの関連受容体分子を含む。
【００８９】
本発明のｍＣＡＲのさらなる標的は、Ｂ細胞関連疾患に関与する抗原を含む。本発明のｍＣＡＲのなおさらなる標的が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００９０】
遺伝子改変細胞
本発明は、本明細書に記載のｍＣＡＲを含み及びそれを安定して発現する遺伝子改変細胞も提供する。遺伝子改変細胞によって発現されるｍＣＡＲは、マスキングペプチド、少なくとも１つの抗原特異的標的化ドメイン、任意の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ｍＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端シグナル配列も含み得る。
【００９１】
遺伝子改変細胞は、本明細書に記載のｍＣＡＲを発現する。一実施形態において、抗原特異的標的化ドメインは、標的特異的抗体またはそれらの機能的等価物もしくは断片もしくは誘導体を含む。抗原特異的抗体は、抗体のＦａｂ断片または抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００９２】
本発明のｍＣＡＲを含みかつ発現し得る遺伝子改変細胞には、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、遺伝子改変細胞は、自家細胞である。例として、本発明の個々のＴ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ４−／ＣＤ８＋、ＣＤ４−／ＣＤ８−、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−及びＣＤ４−／ＣＤ８＋細胞の混合群、または単一クローンの一群であり得る。本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞とインビトロで共培養された場合、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び他のＴ細胞エフェクターサイトカインを産生し得る。本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原特異的標的細胞とインビトロで共培養された場合、その標的細胞を溶解し得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー細胞、ＣＤ６２Ｌ−エフェクターメモリー細胞、またはそれらの組み合わせうちのいずれか１つ以上であり得る。（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９  ２１（２）２２４−２３２）。
【００９３】
遺伝子改変細胞は、本明細書に記載のｍＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞に安定してトランスフェクトすることによって産生され得る。ウイルスベクターは一般的に異種遺伝子を細胞（例えば、Ｔ細胞）に運ぶために使用される。遺伝子改変細胞を生成するために使用され得るウイルスベクターの例としては、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾンシステム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
種々の方法は、本発明のｍＣＡＲを発現する安定したトランスフェクタントを生成する。一実施形態において、細胞に安定してトランスフェクトし及び細胞を再配向する方法は、裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによるものである。裸のＤＮＡを使用することによって、再配向細胞を生成するために必要とされる時間は、著しく減少され得る。本発明のｍＣＡＲをコードする裸のＤＮＡを使用して細胞を遺伝子改変するためのさらなる方法には、（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、および／または陽イオンポリマーを使用する）化学形質転換法、非化学形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、光学形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー、および／またはハイドロダイナミックデリバリー）、および／または粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃を使用するインペールフェクションおよび／またはマグネトフェクション）が含まれるが、これらに限定されない。単一の統合された非再配列ベクター及びｍＣＡＲの発現の存在を示すトランスフェクトされた細胞は、エクスビボで拡大され得る。一実施形態において、エクスビボでの拡大のために選択された細胞は、ＣＤ８＋であり、抗原特異的標的細胞を特異的に認識しかつ溶解する能力を示す。
【００９５】
ウイルス形質導入法もまた、本発明のｍＣＡＲを発現する再配向細胞を生成するために使用され得る。本発明のｍＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞を生成するために使用され得る細胞型には、治療に関連した成果をもたらすことができるＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
適切な条件下での抗原によるＴ細胞の刺激は、細胞の増殖（拡大）および／またはＩＬ−２の産生をもたらす。本発明のｍＣＡＲを含む細胞は、１つ以上の抗原の、ｍＣＡＲの抗原特異的標的化ドメインへの結合に応答して、数を拡大する。本発明はまた、ｍＣＡＲを発現する細胞を作製しかつ拡大させる方法を提供する。方法は、ｍＣＡＲを発現するベクターを細胞にトランスフェクトするか、または形質導入することと、該細胞を、受容体に対する標的抗原、組換え標的抗原、または抗体を発現する細胞で刺激することとを含み、前記細胞は、Ｔ細胞を作製しかつ拡大させるように増殖する。ある実施形態において、細胞は、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または多能性胚性／誘導性幹細胞のうちのいずれか１つ以上であり得る。
【００９７】
治療方法
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象において、本明細書に記載のｍＣＡＲによって標的とされる抗原と関連している疾患の治療方法である。方法は、本明細書に記載のｍＣＡＲを含む組成物を提供すること、及び対象における抗原と関連している疾患を治療するように、有効量の組成物を投与することを含む。
【００９８】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象における癌を治療する、阻害する、癌の進行を遅らせる、および／または癌の転移を防止する方法である。方法は、本明細書に記載のｍＣＡＲを含む組成物を提供すること、及び対象における癌を治療する、阻害する、癌の進行を遅らせる、および／または癌の転移を防止するように、有効量の組成物を投与することを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、組成物は、ｍＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ｍＣＡＲを含むタンパク質、またはｍＣＡＲを含む遺伝子改変細胞を含む。別の実施形態において、組成物の遺伝子改変細胞は、治療に関連した成果をもたらすことができるＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または多能性胚性／誘導性幹細胞であり、それらは本発明のｍＣＡＲを発現する。本発明の組成物は、単独で、または既存の療法と併せて投与され得る。他の療法が併せて使用される場合、本発明の組成物は、他の既存の療法と同時に、または連続して投与され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、それを必要とする対象における癌を治療する、阻害する、癌の進行を遅らせる、および／または癌の転移を防止することは、既存の療法と併せて本明細書に記載のｍＣＡＲを含む組成物の有効量を投与することを含む。種々の実施形態において、ｍＣＡＲを含む組成物は、既存の療法と連続して、または同時に投与され得る。既存の癌治療の例としては、積極的監視、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（外部照射、定位放射線手術（ガンマナイフ）、及び分割定位放射線療法（ＦＳＲ）など）、局所療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
化学治療剤の例としては、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロランブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
種々の実施形態において、本明細書に記載のｍＣＡＲを含む組成物の有効量は、約０．０１〜０．０５μｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１μｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５μｇ／ｋｇ／日、０．５〜５μｇ／ｋｇ／日、５〜１０μｇ／ｋｇ／日、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日、２０〜５０μｇ／ｋｇ／日、５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、１００〜１５０μｇ／ｋｇ／日、１５０〜２００μｇ／ｋｇ／日、２００〜２５０μｇ／ｋｇ／日、２５０〜３００μｇ／ｋｇ／日、３００〜３５０μｇ／ｋｇ／日、３５０〜４００μｇ／ｋｇ／日、４００〜５００μｇ／ｋｇ／日、５００〜６００μｇ／ｋｇ／日、６００〜７００μｇ／ｋｇ／日、７００〜８００μｇ／ｋｇ／日、８００〜９００μｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００μｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５−０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ／日、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ／日、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ／日、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、またはそれらの組み合わせのいずれか１つ以上である。本明細書に記載のｍＣＡＲの有効量の代表的投与量は、既知の治療化合物が使用されている製造者による推奨範囲、及びインビトロ応答または動物モデルでの応答によって当業者に示されたような推奨範囲であってもよい。このような投与量は、通常、関連生物活性を失うことなく、約１桁の範囲内の濃度または量まで減らすことができる。実際の投与量は、医師の判断、患者の状態、及び、例えば、当該培養細胞または生検悪性腫瘍などの組織培養された生体組織試料のインビトロ応答性、または適切な動物モデルで観察された応答に基づく治療方法の有効性に依存し得る。種々の実施形態において、本明細書に記載のｍＣＡＲを含む本発明の組成物は、１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはそれ以上投与して、対象に有効量のｍＣＡＲを投与してもよい。ここで、有効量は、本明細書に記載のうちのいずれか１つ以上の用量である。
【０１０３】
医薬組成物
種々の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤及び治療的有効量の本明細書に記載のｍＣＡＲを含む、医薬組成物を提供する。組成物中のｍＣＡＲは、ｍＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ｍＣＡＲを含むタンパク質、またはｍＣＡＲを含む遺伝子改変細胞のいずれか１つ以上であり得る。「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全、非毒性、及び望ましい医薬組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用、並びにヒトへの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
【０１０４】
種々の実施形態において、本発明に従う医薬組成物は、任意の投与経路を介する送達用に製剤化され得る。「投与経路」とは、エアロゾル、経鼻、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、経粘膜、経皮、非経口、埋め込み型ポンプ、連続注入、局所適用、カプセル、および／または注射が含まれるが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の投与経路を指し得る。
【０１０５】
本発明に従う医薬組成物はまた、任意の薬学的に許容される担体を含有してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ある組織、臓器、または身体の部分から、別の組織、臓器、または身体の部分へと関心対象の化合物を運ぶか、または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または媒介物を指す。例えば、担体は、液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル封入材料、またはそれらの組み合わせであり得る。担体の各成分は、それが製剤の他の成分と適合性がなければならないという点で、「薬学的に許容され」なければならない。それはまた、その治療的利益を過度に上回る、毒性、過敏、アレルギー反応、免疫原性、または任意の他の合併症の危険性を有してはならないという意味で、それが接触し得る任意の組織または臓器と接触する使用に適していなければならない。
【０１０６】
本発明に従う医薬組成物はまた、経口投与用にカプセルに封入されるか、錠剤化されるか、または乳剤もしくはシロップに調製されてもよい。薬学的に許容される固形もしくは液体担体が、組成物を増強するか、または安定させるために、または組成物の調製を促進するために添加され得る。液体担体には、シロップ、落花生油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、及び水が含まれる。固形担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンが含まれる。担体にはまた、単独で、または蝋とともに、モノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリンなどの持続放出材料も含まれる。
【０１０７】
医薬調製物は、必要に応じて、錠剤形成のための製粉、混合、造粒、及び加圧；または硬性ゼラチンカプセル形成のための製粉、混合、及び充填を伴う薬学の従来の技術に従って作製される。液体担体を使用する場合、調製物は、シロップ、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性懸濁液の形態である。そのような液体製剤は、直接経口投与または軟性ゼラチンカプセル内に充填されて投与されてもよい。
【０１０８】
本発明に従う医薬組成物は、治療的有効量で送達され得る。正確な治療的有効量は、所与の対象における治療の有効性の観点において最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療化合物の特性（活性度、薬物動態、薬力学、及び生物学的利用能を含む）、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患タイプ及び段階、全身健康状態、所与の投薬量に対する応答性、及び薬物療法のタイプを含む）、製剤物中の薬学的に許容される担体（複数可）の性質、並びに投与経路が含まれるが、これらに限定されない、種々の要因に応じて異なる。臨床及び薬理学分野の技術者は、通例の実験方法を通して、例えば、化合物の投与に対する対象の反応を監視し、それに応じて投薬量を調整することによって治療的有効量を決定することができる。さらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【実施例】
【０１０９】
特許請求される本発明をより良く例示するために以下の実施例が提供され、本発明の範囲を限定するとは解釈されない。特定の材料が言及される範囲に関して、それは単に例示の目的であり、本発明を限定するとは意図されない。当業者は、独創的な能力を行使させることなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。
【０１１０】
実施例１
実験方法
細胞株構築：Ｋ５６２−ＥＧＦＲ細胞株は、ＶＳＶｇ偽型レンチベクターによるＫ５６２細胞の安定した形質導入によって生成された。ヒトＥＧＦＲのｃＤＮＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を増幅し、レンチウイルスプラスミドＦＵＷにクローン化し、ＦＵＷ−ＥＧＦＲを生成した。その後、レンチベクターを生成し、使用して、Ｋ５６２細胞を形質導入した。形質導入された細胞をＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＥＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、選別して、Ｋ５６２細胞を発現するＥＧＦＲの集団を得た。Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞株は、同様の方法を用いて生成した。
【０１１１】
プラスミド構築：レンチウイルスベクターｐＣＣＷ−ＥＧＦＲ  ＣＡＲは、ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ配列、ＣＤ２８膜貫通ドメイン−４１ＢＢ−ＣＤ３ｚ共刺激ドメイン、及びバックボーンｐＣＣＷベクターのギブソンアセンブリによって構築された。プラスミドｐＣＣＷ−マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲはｐＣＣＷ−ＥＧＦＲ  ＣＡＲに基づいて構築し、ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ領域のＮ末端において、マスキングペプチドと、ＧＳリンカーを隣に伴うプロテアーゼ基質配列と
2018518972.tif 000019
を発現するように最適化されたＤＮＡ配列を追加した。マスクペプチドには、下線をつけ；基質領域には、点線の下線をつけている。
【０１１２】
レンチベクター産生：レンチベクターは、標準のリン酸カルシウム沈殿プロトコルを用いて、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって調製された。６−ｃｍ組織培養皿で培養した２９３Ｔ細胞は、２．５μｇのエンベローププラスミドＶＳＶＧ、及びパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、及びｐＲＳＶ−Ｒｅｖと共に、５μｇのレンチウイルスバックボーンプラスミドｐＣＣＷ−ＥＧＦＲ  ＣＡＲ、またはｐＣＣＷ−マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後にウイルス上清を採取し、０．４５−μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介して濾過した。
【０１１３】
細胞株のレンチベクター形質導入：ＪｕｒｋａｔまたはＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞（１Ｅ５／ウェル）を２４ウェル培養皿に播種し、２，５００ｒｐｍ、２５℃で９０分間、採取したてのウイルス上清（２ｍｌ／ウェル）をスピン感染させた。その後、上清を新鮮な培養培地と交換し、５％のＣＯ２で３７℃にて３日間インキュベーションした。ＣＡＲの発現は、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１１４】
フローサイトメトリー：ＣＡＲ発現を検出するため、ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ細胞を、４％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（洗浄緩衝液）で２回洗浄し、２μｇ／ｍｌの組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４℃にて３０分間染色し、２回洗浄した後、Ｒ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で４℃にて３０分間染色した。細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ミルテニーバイオテク社のフローサイトメーターを用いて蛍光を評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによりデータを分析した。
【０１１５】
マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲのタンパク質分解活性化：マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲのプロテアーゼ媒介活性化は、１ｅ５  マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を、ＰＢＳ中で異なる濃度のプロテアーゼｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で室温にて１時間インキュベーションすることで達成された。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、さらなる実験で使用した。
【０１１６】
標的細胞とのＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞の共培養：１ｅ５  ＥＧＦＲ  ＣＡＲ／マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を、２００μｌのＣ１０培地中の丸底９６ウェルプレートにおいて、２ｅ５  標的細胞Ｋ５６２−ＥＧＦＲまたはＭＤＡ−ＭＢ−２３１と一緒に播種した。ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞をＫ５６２−ＣＤ１９細胞と一緒に共培養した。細胞混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。フローサイトメーターによりＧＦＰ蛍光を分析した。
【０１１７】
以下の表１に示す配列を有する抗ＥＧＦＲ  ｍＣＡＲは、本発明者らによって作製された。
（表１）マスクは太字で、切断部位には下線をつけている（“Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，  Ｌ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５，２０７ｒａ１４４（２０１３））。
2018518972.tif 000020
【０１１８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗ＥＧＦＲ  ｍＣＡＲで形質導入し、抗ＥＧＦＲ  ｍＣＡＲのＥＧＦＲタンパク質への結合能力を分析した。図２に示すように、ｒｈＥＧＦＲへの結合能力は、親抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲと比べてマスクＥＧＦＲ  ＣＡＲで大きく減少したが、プロテアーゼｕＰＡの切断後に回復することができた。
【０１１９】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を抗ＥＧＦＲ  ｍＣＡＲで形質導入し、抗ＥＧＦＲ  ｍＣＡＲの活性化（これによる、レポーター細胞中のＧＦＰ発現）を分析した。図３に示すように、マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲの活性化は、親抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲと比べて減少し、プロテアーゼｕＰＡの切断後に一部回復した。
【０１２０】
図４に示すように、内因性プロテアーゼを分泌する乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の存在下で、マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲは、一部活性化され、ｕＰＡによる処理は、活性化をさらに増強することができる。
【０１２１】
図５に示すように、より高濃度のｕＰＡによる処理は、マスクＥＧＦＲ  ＣＡＲをより活性化させる。
【０１２２】
実施例２
コンビナトリアル設計及びデノボスクリーニングを用いて、マスクされたＨＥＲ特異的ＣＡＲ
コンビナトリアル設計：マスクされたＨｅｒ２標的化ＣＡＲは、トラスツズマブ結合ペプチドである
2018518972.tif 000021
（Ｊｉａｎｇ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｃａｎ  ｍｉｍｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ＨＥＲ−２．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，４６５６−４６６２（２００５））を、腫瘍特異的切断配列であるＬＳＧＲＳＤＮＨ（Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，Ｌ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５，２０７ｒａ１４４（２０１３）に連結することによって生成された。この切断可能なマスクを、トラスツズマブ抗体に由来した単鎖抗体ＣＡＲのＮ末端に融合した（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８３，５５６３−５５７４（２００９））。Ｈｅｒ２＋標的細胞と共培養したＴ細胞レポーター株を用いて、これらのＣＡＲのオンターゲット及びオフターゲット活性について試験した。
【０１２３】
デノボスクリーニング：マスキングペプチドは、トラスツズマブベースのＨｅｒ２特異的ＣＡＲ（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８３，５５６３−５５７４（２００９））に結合するそれらの能力に基づいて、細菌ディスプレイペプチドライブラリー＿ＥＮＲＥＦ＿４から選択した（Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｃｈｏｈｎ，Ａ．，Ｂｅｓｓｅｔｔｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｏｕｌｗａｒｅ，Ｋ．Ｔ．＆  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ｓ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯｍｐＸ  ｙｉｅｌｄｓ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５，８２５−８３６（２００６））。Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲを安定して発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株に対する陽性選択に続いて、ベースのＪｕｒｋａｔ細胞株に対する陰性選択を行った。単離されたクローンの配列を決定し、切断可能なリンカーによって、固有のペプチドをＨｅｒ２  ＣＡＲのＮ末端にクローニングした。マスキングＣＡＲは、腫瘍特異的プロテアーゼの存在下ではＨｅｒ２＋標的細胞に対する活性、及びプロテアーゼの不在化では活性の欠如によって選択された。
【０１２４】
実施例３
腫瘍特異的活性化のための、マスクされたキメラ抗原受容体（ｍＣＡＲ）
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、多くの上皮腫瘍においてその広範な過剰発現、及びＥＧＦＲ発現と臨床成果の間の逆相関により、癌治療における魅力的な標的である。小分子インヒビター及びＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体の開発を通じて多大な成功が収められているが、皮膚、腎臓、及び胃腸系で、これらの健常組織中のＥＧＦＲ発現の結果として、治療毒性が観察される。例えば、ヒトＥＧＦＲに対するヒトマウスキメラモノクローナル抗体であるセツキシマブは、結腸癌及び頭頸部癌における使用が承認されているが、皮膚の発疹及び下痢は、上皮組織における内因性ＥＧＦＲ発現がもたらす最も一般的な副作用である。セツキシマブの治療指数を改善する１つの方法は、健常環境中では無反応のままであるが、腫瘍関連プロテアーゼによって腫瘍中で活性化される抗体ベースのプロドラッグであるプロボディの開発である。
【０１２５】
ここで、セツキシマブ由来のプロボディからの配列を用いて、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲを構築した。このマスクされたＣＡＲ（ｍＣＡＲ）は、抗体結合部位がＥＧＦＲを遮断することが可能なＮ末端マスキングペプチドと、腫瘍関連プロテアーゼに敏感なリンカーを含有する。この設計により、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、健常組織中で抗原に遭遇すると不活性のままであるが、タンパク質分解切断を介して抗原結合部位を露出することによって腫瘍微小環境中で活性化することができ、それにより腫瘍細胞を認識し、殺傷することができる。
【０１２６】
実験方法
プラスミドの構築。マスクされていないＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター（ＲＶ−ｕｍＣＡＲ）は、ＭＰ７１レトロウイルスベクターに基づいて構築された（Ｅｎｇｅｌｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４：１１５５−１１６８）。ＲＶ−ｕｍＣＡＲベクターは、５’末端〜３’末端までのフレームで以下の成分：ＭＰ７１レトロウイルスバックボーン、ＮｏｔＩ部位、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ軽鎖可変領域、ＧＳリンカー、ＣＤ８α分子の抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ重鎖可変領域、ヒンジ、及び膜貫通領域、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の細胞質ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及びＥｃｏＲＩ部位からなった。
【０１２７】
マスクされていないＣＡＲ中の抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ部分は、セツキシマブのアミノ酸配列に由来した。ｓｃＦｖの対応するＤＮＡ配列は、オンラインコドン最適化ツールを用いて、ヒト細胞中でのその最適発現のためにコドン最適化され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。マスクされていないＥＧＦＲ  ＣＡＲ配列は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からのギブソンアセンブリクローニングキットを用いて、全ての断片のギブソンアセンブリによって生成された後、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩを介してＭＰ７１バックボーンベクターに連結した。ギブソンアセンブリで使用したプライマーは、フォワードプライマー（ＮｏｔＩ）
2018518972.tif 000022
リバースプライマー（ＥｃｏＲＩ）
2018518972.tif 000023
である。大文字は、制限酵素消化の標的配列を表す。
【０１２８】
マスクされたＣＡＲ構築物、及びＮＳＵＢ  ＥＧＦＲ  ＣＡＲ構築物は、マスクされていないＥＧＦＲ  ＣＡＲ構築物に基づいてクローニングした。マスキングペプチド（下線をつけている）と、ＧＳリンカーを隣に伴うプロテアーゼ基質配列（点線の下線をつけている）と（アミノ酸配列：
2018518972.tif 000024
）をコードするＤＮＡ配列を、既報（Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，ＬＲ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：２０７ｒａ１４４）に由来したように、コドン最適化した後、マスクされていないＣＡＲ構築物におけるｓｃＦｖ領域のＮ末端にクローニングした。ＮＳＵＢ  ＣＡＲ構築物では、プロテアーゼ基質配列は、ＧＳリンカー配列（点線の下線をつけている）によって置き換えて
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、マスクされていないＣＡＲ構築物のＮ末端にクローニングした。
【０１２９】
テナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧＡＬＶ）をコードするエンベローププラスミド（ｐＧＡＬＶ）は、以下の工程によって構築された。ＧＡＬＶのｃＤＮＡは、ＰＧ１３細胞株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（Ｇｈａｎｉ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＲＤ１１４−ａｎｄ  ＧＡＬＶ−ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０：９６６−９７４）。クローニングに使用したプライマーは、フォワードプライマー（ＥｃｏＲＩ）
2018518972.tif 000026
、及びリバースプライマー（ＥｃｏＲＩ）
2018518972.tif 000027
である。その後、得られたＰＣＲ断片は、ＥｃｏＲＩ部位を介してＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）由来のｐＨＣＭＶプラスミドバックボーンにクローニングした。
【０１３０】
ヒトＥＧＦＲをコードするレンチウイルスベクター（ＦＵＷ−ＥＧＦＲ）は、ＳａｌＩ及びＸｂａＩを介して、ＰＣＲ増幅されたヒトＥＧＦＲのｃＤＮＡをｐＥＮＴＲプラスミドに挿入することによって生成された後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からのゲートウェイクローニングキットを用いたＬＲ反応を介して、ＥＧＦＲ遺伝子をレンチウイルスベクターＦＵＷにクローニングした。クローニングに使用したプライマーは、フォワードプライマー（ＳａｌＩ）
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、及びリバースプライマー（ＸｂａＩ）
2018518972.tif 000029
である。
【０１３１】
細胞株及び培養培地。細胞株Ｋ５６２、２９３Ｔ、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＡＴＣＣから入手した。肺癌株ＮＣＩ−Ｈ２９２は、Ｄｒ．Ｉｔｅ  Ｌａｉｒｄ−Ｏｆｆｒｉｎｇａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）によって親切に提供された。Ｋ５６２−ＥＧＦＲ細胞株は、レンチウイルスベクターＦＵＷ−ＥＧＦＲによる親Ｋ５６２細胞の形質導入によって生成された。形質導入Ｋ５６２細胞を抗ヒトＥＧＦＲ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色し、選別して、Ｋ５６２細胞を過剰発現するＥＧＦＲの集団を得た。
【０１３２】
Ｋ５６２及びＫ５６２−ＥＧＦＲ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地からなるＲ１０培地中で維持した。２９３Ｔ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地からなるＤ１０培地中で培養した。上記の細胞培養培地及び添加物は全て、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から購入した。ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）、１％のＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、及び０．２％のＮ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で培養した。
【０１３３】
レトロウイルスベクター産生。レトロウイルスベクターは、標準のリン酸カルシウム沈殿プロトコルを用いて、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって調製された。１５−ｃｍ組織培養皿で培養した２９３Ｔ細胞は、ｇａｇ−ｐｏｌをコードする１８．７５μｇのエンベローププラスミドｐＧＡＬＶと３０μｇのパッケージングプラスミドと共に、３７．５μｇのレトロウイルスバックボーンプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間及び７２時間後にウイルス上清を採取し、使用前に０．４５−μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を介して濾過した。
【０１３４】
Ｔ細胞伝達及び拡大。凍結したヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）から入手した。ＰＢＭＣをＴＣＭ中で解凍し、一晩静置した。レトロウイルス形質導入前、５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体、及び１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−７及びＩＬ−１５と培養することによって、ＰＢＭＣを２日間活性化させた（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）。形質導入では、採取したてのレトロウイルス上清は、２０００×ｇ、３２℃で２時間遠心分離することによって、１５μｇのレトロネクチン／ウェル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で被覆した非組織培養処理１２ウェルプレート上にスピンロードした。ベクターのスピンローディングは、新鮮なウイルス上清で１回繰り返した（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，ＪＮ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：６８９−７０２）。活性化ＰＢＭＣは、新鮮なＴＣＭに１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−７及びＩＬ−１５を補完した５×１０５／ｍｌの濃度で再懸濁し、ベクターをロードしたプレートに添加した。プレートを１０００×ｇ、３２℃で１０分間スピンし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。同じ形質導入手順を翌日も繰り返した。エクスビボ拡大中、培養培地を補充し、細胞密度を２日毎に５×１０５／ｍｌに調整した。この試験では、実験及び臨床プロトコルでより広範に使用されているＩＬ−２の代わりに、サイトカインＩＬ−７及びＩＬ−１５の組み合わせをＣＡＲ−Ｔ細胞のエクスビボ拡大に使用したことに注意すべきである。ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下で培養された遺伝子改変Ｔ細胞が、ＮＳＧマウスにおける移植の改善をもたらしたと報告されたため、このサイトカイン条件を選択した（Ｃｉｅｒｉ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＩＬ−７  ａｎｄ  ＩＬ−１５  ｉｎｓｔｒｕｃｔ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎａｉｖｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２１：５７３−５８４；Ａｌｃａｎｔａｒ−Ｏｒｏｚｃｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＳＧ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：３１０−３２０）。
【０１３５】
表面免疫染色及びフローサイトメトリー。細胞表面上のＥＧＦＲ  ＣＡＲ発現を検出するため、タンパク質Ｌまたは組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ）のいずれかで細胞を染色した。ＦＡＣＳ染色前、１×１０６個の細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（４％ウシ血清アルブミン画分Ｖを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。タンパク質Ｌ染色では、細胞を０．５μｇのビオチン化タンパク質Ｌ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で４℃、３０分間染色した（Ｚｈｅｎｇ，ＺＬ，ｅｔ  ａｌ（２０１２）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：２９）。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液中の０．１μｇのＡＰＣ複合化ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で４℃にて１０分間インキュベーションし、３回洗浄した。ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ染色では、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中の２μｇ／ｍｌの組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で４℃にて３０分間染色し、２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液中のヤギ抗ヒトＩｇＧの（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のＰＥ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片で４℃にて３０分間染色した。細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ミルテニーバイオテク社のフローサイトメーターを用いて蛍光を評価し、全てのＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【０１３６】
マスクされたＥＧＦＲ  ＣＡＲのタンパク質分解活性化。マスクされたＥＧＦＲ  ＣＡＲのプロテアーゼ媒介活性化は、１×１０６個のマスクされたＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で異なる濃度のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子プロテアーゼ（ｕＰＡ、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で室温にて１時間インキュベーションすることで達成された。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後の結合及び染色実験に使用した。
【０１３７】
細胞内サイトカイン染色。Ｔ細胞（１×１０６）を、９６ウェル丸底プレート中のＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で標的細胞と１：１の比で６時間、３７℃、５％ＣＯ２で共培養した。ＰＥ−Ｃｙ５．５−抗ＣＤ３抗体、ＡＰＣ−Ｃｙ７−抗ＣＤ４抗体、パシフィックブルーＣＤ８抗体、及びＰＥ抗ＩＦＮ−γを免疫染色に使用した。全ての抗体をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍの固定／透過処理キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞膜を透過処理し、製造者の指示に従って細胞内染色を行った。
【０１３８】
特異的細胞溶解アッセイ。標的細胞Ｋ５６２−ＥＧＦＲの溶解は、陰性対照細胞Ｋ５６２の生存に対する標的細胞Ｋ５６２−ＥＧＦＲの生存を比較することによって測定した。この方法は、前述されている（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，ＪＮ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：６８９−７０２）。１．５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で５μＭ蛍光色素ＣＭＴＭＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有するＲ１０培地でＫ５６２細胞を懸濁することによって標識した。細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした後、２回洗浄し、新鮮なＲ１０培地中に懸濁した。１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で５μＭ蛍光色素ＣＦＳＥを有するＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡでＫ５６２−ＥＧＦＲ細胞を懸濁することによって標識した。細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、同じ容量のＦＢＳを細胞懸濁液に添加した後、室温で２分間インキュベーションした。次に、細胞を２回洗浄し、新鮮なＲ１０培地中に懸濁した。同数のＫ５６２及びＫ５６２−ＥＧＦＲ細胞（各々、５×１０４個）を、エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞による培養ごとに同じウェルで組み合わせた。共培養は、以下のエフェクター対標的比：１：１、３：１、及び１０：１の３通りで丸底９６ウェルプレート中にセットアップした。培養を３７℃で４時間インキュベーションした後、製造者の指示（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って７−ＡＡＤ標識した。フローサイトメトリー分析を行い、残りの生きた（７−ＡＡＤ−陰性）標的細胞を定量化した。共培養ごとに、Ｋ５６２−ＥＧＦＲの生存率は、生きたＫ５６２−ＥＧＦＲの割合を生きたＫ５６２細胞の割合で割ることによって決定された。エフェクター細胞が無い標的と陰性対照細胞のみを含有するウェルでは、Ｋ５６２−ＥＧＦＲの割合の、Ｋ５６２細胞の割合に対する比を算出し、使用して、開始細胞数、及び自発的な細胞死の変動を補正した。細胞傷害性を３通りで決定し、平均±ＳＥＭで提示した。
【０１３９】
ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞では、特異的細胞溶解は、以下の相違点で、上記のように決定した。標的細胞は、ＣＦＳＥで標識した。標的細胞（５×１０４）をエフェクター細胞で１８時間３７℃にて培養した。標的細胞の生存率は、エフェクターを有する生きた標的細胞数をエフェクターが無い生きた標的細胞数で割ることによって決定した。
【０１４０】
非小細胞肺癌異種移植マウスモデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果。動物実験は、ＵＳＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された動物プロトコルに従って実施された。６〜８週齢の雌のＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２Ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｓｚ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ）をこの試験で使用した。０日目に、ＲＰＭＩ培地中で１：１に希釈した総量１５０μＬのマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）中で懸濁した６×１０６個のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、各ＮＳＧマウスの右脇腹に注入した。平均の腫瘍サイズが１２日目に１２０ｍｍ３に到達すると、腫瘍サイズに基づいて全てのマウスを無作為化し、４群（ｎ＝８）に割り当てた。１３日目及び２６日目に、それぞれ、尾静脈注射を介して静脈内投与した１５０μＬ  ＰＢＳ中の４００万個のＣＡＲ−Ｔ細胞でマウスを処理した。ドナーに適合させた形質導入されていないＴ細胞を添加することで、ＣＡＲ発現を全てのＣＡＲ群で３０％に正規化した。腫瘍成長を毎週２回モニタリングした。腫瘍サイズをキャリパーによって測定し、以下の式、Ｌ×Ｗ×Ｈ／２で算出した。明らかな体重減少、腫瘍の潰瘍形成、または１０００ｍｍ３を超える腫瘍サイズを示した場合には、マウスを安楽死させた。
【０１４１】
統計分析。グラフパッドプリズムバージョン５．０１で統計分析を行った。チューキーの多重比較による一元配置分散分析を行って、インビトロアッセイにおける異なる群間の差異を評価した。反復測定（シダックの多重比較法）による一元配置分散分析を用いて、腫瘍成長曲線を分析した。マウス生存曲線は、カプランマイヤー分析（ボンフェローニ補正によるログ・ランク検定）によって評価した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意と見なした。所見の有意性は、ｎｓ＝有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１として定義した。
【０１４２】
マスクされたＣＡＲの設計及び生成
所望のＣＡＲ機能について４−１ＢＢエンドドメインの公知の抗アポトーシス効果とＣＤ２８エンドドメインの効果的な細胞傷害性を考えると（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ，ｅｔ  ａｌ（２０１５）．Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １４：４９９−５０９；Ｒｉｃｅ，ＪＪ，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯｍｐＸ  ｙｉｅｌｄｓ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：８２５−８３６）、種々の形態の第三世代のＣＡＲ分子標的化ヒトＥＧＦＲが、この試験で構築された（図１ａ、ｂ）。これらのＣＡＲは、モノクローナル抗体セツキシマブに由来した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８αヒンジ、及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ  Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインからなった。
【０１４３】
ｍＣＡＲでは、セツキシマブのプロボディからのアミノ酸配列を用いて、切断可能なリンカー配列と共にマスキングペプチドをｓｃＦｖドメインの上流に導入した（Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，ＬＲ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：２０７ｒａ１４４）。マスキングペプチドは、細菌ディスプレイによって選択し、セツキシマブの抗原認識ドメインに結合した（Ｒｉｃｅ，ＪＪ，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯｍｐＸ  ｙｉｅｌｄｓ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：８２５−８３６）ため、ＥＧＦＲに結合するその能力を遮断した。リンカー配列は、それら全てが多くのヒト腫瘍の腫瘍微小環境において上方制御される（Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，ＬＲ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：２０７ｒａ１４４）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ）、及びレグマインを含む複数の腫瘍関連プロテアーゼに対するその応答性について、ペプチド基質の細胞ライブラリー（ＣＬｉＰＳ）（Ｂｏｕｌｗａｒｅ，ＫＴ，ａｎｄ  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，ＰＳ（２００６）．Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（ＣＬｉＰＳ）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：７５８３−７５８８）を用いた選択によって決定された。マスキングペプチド及びリンカー配列が無い従来のマスクされていないＣＡＲは、対照として構築された。同じマスキングペプチドを含有するが、プロテアーゼ切断に敏感なリンカーが欠如している対照ＣＡＲ構築物も生成し、それをＮＳＵＢ（無プロテアーゼ基質配列）ＣＡＲと名付けた。ＮＳＵＢ  ＣＡＲは、切断不可能なＧＳに富むリンカーを代わりに有する。これらのＣＡＲを全て、ヒトＴ細胞に送達するためにレトロウイルスベクターにクローニングした。
【０１４４】
この新規のｍＣＡＲのエンジニアリングは、安全スイッチの統合に基づいており、その結果、１）ＣＡＲ結合部位は、マスキングペプチドによって遮断され、全身循環または正常組織環境において静止したＣＡＲ−Ｔ細胞が得られるが、２）マスキングペプチドは、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍に合流すると、腫瘍環境において局所的に活性なプロテアーゼによって切断されるため、ＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化し、腫瘍部位で標的抗原を認識することができる。
【０１４５】
ｍＣＡＲの組換えＥＧＦＲへの結合減衰
様々に設計されたＣＡＲの機能的発現を試験するため、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によって刺激した後に、マスクされていない形態、マスクされた形態、またはＮＳＵＢ形態の抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。タンパク質Ｌ染色プロトコルを用いて、ＣＡＲ発現を検出し（Ｚｈｅｎｇ，ＺＬ，ｅｔ  ａｌ（２０１２）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：２９）、形質導入８日後にフローサイトメトリーによって分析した。ＣＡＲの同様なレベルの表面発現（おおよそ３０〜３５％のＣＡＲ陽性Ｔ細胞、図２ａ）が、３つ全ての形態のＥＧＦＲ  ＣＡＲで検出され、Ｔ細胞培養条件下で同様に拡大することが観察された。
【０１４６】
異なるＣＡＲ構築物のそれらの標的抗原ＥＧＦＲへの結合能力を評価するため、Ｆｃと融合した組換えヒトＥＧＦＲ（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃと呼ぶ）でＣＡＲ−Ｔ細胞をインキュベーションした後、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体で染色した。約３５％のマスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞はＥＧＦＲへの結合を示した（タンパク質Ｌによって検出されたＣＡＲ陽性細胞の割合に非常に良く対応していた）が、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞及びＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、３％及び０．４％のみの結合がそれぞれ検出されたように、標的抗原への結合の劇的な減少が示された（図２ｂ）。このため、マスキングペプチドは、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原認識能力を効果的に遮断することができた。
【０１４７】
ｍＣＡＲ抗原結合は、タンパク質分解によって回復する
プロテアーゼ感受性リンカーが切断されて、結合部位を露出させ、ＣＡＲ結合を回復することができたかどうか検討するため、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ｒｈＥＧＦＲでインキュベーションする前に、種々のヒト癌腫において活性な一般的なプロテアーゼである種々の濃度のｕＰＡで処理した（Ｕｌｉｓｓｅ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ（２００９）．Ｔｈｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：３２−７１）。予想した通り、マスクされていないＣＡＲまたはＮＳＵＢ  ＣＡＲの結合能力は、ｕＰＡ処理の存在下または不在下において著しく異ならなかった（図３、上及び下パネル）。しかしながら、マスクされたＣＡＲのＥＧＦＲへの結合は、ｕＰＡ処理の際にプロテアーゼ感受性リンカーのタンパク質分解切断によって大きく回復した。マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞のそのようなプロテアーゼ媒介性結合活性化は、用量依存性であることが判明した；ｒｈＥＧＦＲに結合することができたマスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞の割合は、ｕＰＡ処理無しの６％から、１００ｎＭ及び４００ｎＭのプロテアーゼでは、それぞれ２３％及び２９％に増加した（図３、中央パネル）。
【０１４８】
マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞の活性は、プロテアーゼの不在下で遮断されたが、プロテアーゼ分泌腫瘍細胞によるインビトロ刺激時に活性化された
マスキングペプチドが、マスクされたＣＡＲ及びＮＳＵＢ  ＣＡＲのＥＧＦＲへの結合を減少させたことを考慮すると、マスキングペプチドは、プロテアーゼの不在下でＥＧＦＲ＋細胞に向けたＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化を防ぐことができたと仮定した。この仮説を試験するため、ヒト野生型ＥＧＦＲを安定して過剰発現するための標的細胞株であるＫ５６２−ＥＧＦＲを生成した。親Ｋ５６２株は、ＥＧＦＲを発現せず（Ｇｈｏｓｈ，Ｇ，ｅｔ  ａｌ（２０１０）．Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２６：４２４−４３１）、及び、非常に低レベルのｕＰＡを発現する（Ａｎｔｏｎｙａｋ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：２５３−２５９）ヒト慢性骨髄性白血病細胞株である。２つの以前に研究された癌細胞株である乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び肺癌株ＮＣＩ−Ｈ２９２も使用した。これらは両方とも、野生型ＥＧＦＲの高い表面発現（Ｓｕｂｉｋ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，ＣＫ５／６，ＥＧＦＲ，Ｋｉ−６７  ａｎｄ  ＡＲ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（Ａｕｃｋｌ）４：３５−４１；Ｒａｂｅｎ，Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：７９５−８０５）、及びｕＰＡとマトリプターゼなどの腫瘍関連プロテアーゼの高い内因性分泌（Ｘｉｎｇ，ＲＨ，ａｎｄ  Ｒａｂｂａｎｉ，ＳＡ（１９９９）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（ｕＰＡ）ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：４４３−４５０；Ｍａ，Ｚ，ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＥＲＫ／ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：３３８７−３３���６；Ｌｉｕ，Ｇ，ｅｔ  ａｌ（１９９５）．Ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ，ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＰＡＩ−１  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｕｍ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６０：５０１−５０６）を有する。マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的活性化が、プロテアーゼ活性環境において達成できたかどうか試験するため、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＫ５６２、Ｋ５６２−ＥＧＦＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、またはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞と共培養した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、細胞内サイトカイン染色を介して前炎症性サイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生するそれらの能力によって測定した（図４ａ、ｂ）。
【０１４９】
Ｋ５６２細胞による刺激の不在下、またはＫ５６２細胞による刺激で、ＣＡＲ−Ｔ細胞群は全て、バックグラウンドレベルのＩＦＮ−γ分泌を示した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の刺激時に、それらは全て、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞について同レベルのＩＦＮ−γ分泌を示した（約２０％）。予想した通り、マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞は、異なる標的細胞株と共培養した場合に、同様の範囲の割合（Ｋ５６２−ＥＧＦＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２９２について、それぞれ、１５．４％、１７．８％、１９．３％）で応答した。これに対し、全ての試験群のＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞と比べてサイトカイン応答不全を示した（Ｋ５６２−ＥＧＦＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２９２について、それぞれ、１％、５％、６％）。さらに、マスクされたＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のうちで、僅か約０．９％のＣＤ８＋細胞が、Ｋ５６２−ＥＧＦＲ細胞による刺激に応答して、ＩＦＮ−γを分泌することができ、これは、ＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ群のものと有意に異ならなかった。このため、この知見は、以前の結合データと一致しており、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化が、マスクされた群及びＮＳＵＢ群の両方についてマスキングペプチドによって大きく無効化されたことが確認された。しかしながら、ＥＧＦＲを発現し、腫瘍関連プロテアーゼを産生するＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞による刺激時に、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化レベル（ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋について、それぞれ、１６％及び１７．２％）は、マスクされていない群のものと同様のレベルに大きく回復した。まとめると、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞機能が、プロテアーゼ活性化環境では選択的に活性化できたが、プロテアーゼヌル環境では著しく無効化できたことが、これらのデータにより示された。
【０１５０】
上記の標的細胞株に向けた全ての群のＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性効果を試験するために特異的細胞溶解アッセイも行った。ＩＦＮ−γアッセイと同様に、マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｋ５６２−ＥＧＦＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む全ての標的細胞を溶解したが、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｈ２９２及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のみを高いエフェクター対標的比で溶解し、Ｋ５６２−ＥＧＦＲ細胞に向けた殺傷活性を示さなかった（図５ａ〜ｃ）。
【０１５１】
マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞は、マスクされていない細胞のものと同等のインビボ抗腫瘍効果を示した
インビトロでの腫瘍細胞に応答した、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性及び機能性が示されたため、インビボでのそれらの抗腫瘍反応性を次に調査しようとした。種々のＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価するため、ＮＳＧマウスにおける皮下ヒト肺癌異種移植モデルを利用した（図６ａ）。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（６×１０６）をＮＳＧマウスの右脇腹に注入した。平均の腫瘍サイズが、腫瘍接種後１２日目に約１２０ｍｍ３に到達すると、全ての担腫瘍マウスを腫瘍サイズランク一致コホート（ｎ＝８／処置群）に無作為化し、ＣＡＲ−Ｔ処置を開始した。１３日目及び２６日目に静脈注射を通じてマウスを４００万個のＣＡＲ−Ｔ細胞で処置し、腫瘍成長をモニタリングした。全ての処置群の動物は、腫瘍進行を示した。形質導入されていない対照Ｔ細胞群と比較して、ＮＳＵＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入は、腫瘍成長を遅らせる効果が無かった（図６ｂ）。しかしながら、形質導入されていないＴ細胞を受けたマウスと比べて、マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞またはマスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、腫瘍成長阻害をもたらした（マスクされていないもののＰ＝０．０２９４、マスクされたもののＰ＝０．０４０４、一元配置分散分析）。その結果、マスクされていないＣＡＲ−Ｔ細胞及びマスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞は両方ともマウスの生存を著しく改善した（図６ｃ、マスクされていないもののＰ＝０．０００６、マスクされたもののＰ＝０．００３６、ログ・ランク検定）。マスクされていない群及びマスクされた群は、生存期間中央値が４２日の形質導入していない群及びＮＳＵＢ群と比べて、それぞれ、第一処置後に５０．５日及び４９日の生存期間中央値を有した（図６ｃ）。
【０１５２】
「オンターゲットオフ腫瘍」毒性は、固形腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ療法の並進適用（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の深刻な限界である。これは、通常、正常組織における標的抗原の低レベルの発現によって引き起こされる。標的抗原に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の感度が高いため、オンターゲット毒性は、従来の抗体療法と比べてＣＡＲベース細胞療法で特に深刻になり得る。従って、種々の腫瘍において過剰発現されるが、他の組織においても広く発現されるＥＧＦＲ及びＨＥＲ２などの標的抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞に対する「創薬が困難な」標的として一般的に考えられる。
【０１５３】
ここで、ｓｃＦｖドメインにおける抗原認識部位を遮断するために、切断可能なマスキングペプチドの導入を介してＣＡＲ分子をｍＣＡＲにリエンジニアリングすることによってこの限界を克服できることを示す。親のマスクされていない抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と同様に、マスクされた抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＥＧＦＲを過剰発現する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２に向けて同様のサイトカイン産生及び細胞死滅活性を示したことが分かった。重要なのは、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞は、プロテアーゼをほとんどまたは全く分泌しないＥＧＦＲを過剰発現する細胞に向けた反応性を著しく減少させた。ＮＳＧマウスで確立されたヒト肺癌異種移植モデルでは、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍成長をインビボで阻害する親ＣＡＲ−Ｔ細胞と同様に有効であることが実証された。
【０１５４】
ＣＡＲ操作されたＴ細胞の腫瘍組織選択性を改善するためのエンジニアリング設計を調査するいくつかの取り組みがすでになされている（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，ＣＡ，ｅｔ  ａｌ（２０１６）．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２２：２６−３６）。１つの洗練された戦略は、正常細胞ではなく腫瘍の選択的認識を達成するための２つのＣＡＲによる二重標的化を利用する。２つの異なる抗原を標的にする２つのＣＡＲを発現するＴ細胞は、完全なＴ細胞活性化を制御するための論理ゲートとして作用することが実証された。一例では、１つのＣＡＲによる１つの抗原標的の認識が、準最適なＴ細胞活性化のみを誘発できる一方、２つ目の抗原による２つ目のＣＡＲの活性化は、さらなる共刺激シグナルを提供できるように、２つの減衰ＣＡＲを設計した。このため、両方のＣＡＲの活性化は、両方の抗原を発現する腫瘍組織に対する抗腫瘍免疫応答を誘発する全潜在能力を有するＴ細胞を同時にもたらした（Ｋｌｏｓｓ，ＣＣ，ｅｔ  ａｌ（２０１３）．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：７１−７５）。あるいは、同じ群は、２つの機能的に異なるＣＡＲ、１つは抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）及び別の活性ＣＡＲ（ａＣＡＲ）を同じＴ細胞に導入した。そのような二重ＣＡＲ−Ｔ細胞が、両方の抗原を発現する正常組織環境に遭遇すると、ｉＣＡＲにより引き起こされた抑制性シグナルは、Ｔ細胞シグナル伝達を支配し、Ｔ細胞応答を先制して抑制する。しかしながら、ｉＣＡＲ抗原ではなくａＣＡＲのみのアベイラビリティを持つ腫瘍環境にトラフィックすると、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗腫瘍免疫を引き起こすように完全に活性化することができる。３５我々のｍＣＡＲ法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍特異性を増強するための条件付きで活性なＣＡＲを生成するためのもう１つの戦略を提供する。
【０１５５】
オンターゲットオフ腫瘍毒性を最小限にする別の方法は、腫瘍組織中の抗原標的と正常組織中ものをより良く区別するためにＣＡＲ分子の親和性を調整することを伴う。低親和性の抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖに由来したＣＡＲは、腫瘍細胞を選択的に標的にする一方、標的抗原の低発現により正常組織に危害を加えないことができることが、最近の研究により示されている（Ｌｉｕ，Ｘ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｔｕｎｅｄ  ＥｒｂＢ２  ｏｒ  ＥＧＦＲ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５：３５９６−３６０７；Ｃａｒｕｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｔｕｎｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＣＡＲ  ｔｏ  ＥＧＦＲ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｍｉｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗｈｉｌｅ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５：３５０５−３５１８；Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ  ａｂｏｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：７６４７−７６５３）。このアプローチは、効果的かつ安全なＣＡＲの設計に適用できるが、腫瘍抗原密度が比較的低い腫瘍細胞の集団を認識することができない潜在的な欠点も有する。このため、異質レベルの抗原発現を有する腫瘍では、これらのＣＡＲ操作された細胞は、高い抗原発現腫瘍細胞を排除することができるが、抗原発現が低い腫瘍を見逃しやすい。親和性が調整された設計とは異なり、ｍＣＡＲは、現在利用可能な高親和性抗体から得ることができ、ｍＣＡＲの選択性は、空間的に制御された受容体活性化から生じる。プロテアーゼ豊富な腫瘍微小環境においてのみ、マスクされたＣＡＲ−Ｔ細胞は、周囲における標的に反応するようになり、下流の細胞傷害性応答を引き起こす。
【０１５６】
要するに、本発明者らの研究は、マスクされたＣＡＲプラットフォームのさらなる調査及び開発の出発点を提供している。しかしながら、腫瘍関連プロテアーゼを有するまたは有さない標的細胞間のインビトロ選択性、及び動物試験における抗腫瘍反応性を増強したことが観察されたが、ヒトにおけるｍＣＡＲ構築物の安全性及び有効性は、非ヒト霊長類またはフェーズＩパイロット試験を伴う前臨床試験におけるさらなる評価及び検査を必要としている。本発明のＣＡＲは、マウスＥＧＦＲと最小の交差反応性を有するセツキシマブに由来するため、マウスモデルにおける正常組織に対するマスクされた抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の反応性を評価することが難しい。また、この試験では、ＣＡＲ−Ｔは、特に、固形腫瘍において、典型的には、ほとんど満足できない程度の抗腫瘍効果しか有さない単剤として投与した。臨床の場では、ＣＡＲ−Ｔ療法及び化学療法の両方、または免疫チェックポイントインヒビターを含む併用療法を使用して、治療効果を高めることができた。さらに、我々のｍＣＡＲ設計で使用したプロテアーゼ切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境において局所的に活性な複数のプロテアーゼに敏感であるが、正常組織中のプロテアーゼ、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、及びＫＬＫ５には敏感ではないことが以前にテスト済みである。２０しかしながら、正常プロテアーゼのさらにより広範囲の評価が、ヒトにおける臨床試験前には望ましい。
【０１５７】
ＥＧＦＲは、多くの種類のヒト癌腫において調節不全であるため、この試験は、異なる種類の癌に標的にすることが可能なＣＡＲの設計に向かう経路を提供する。このマスクされたＣＡＲ戦略は、さもなければ「創薬可能な」腫瘍抗原が欠けている癌へのＣＡＲ−Ｔ細胞の適用性の拡大に役立ち得る。また、当該戦略は、ＣＡＲ−Ｔ療法が、「オンターゲットオフ腫瘍」副作用が耐え難く、命に関わることが示された炭酸脱水酵素ＩＸ、またはＨＥＲ２などの腫瘍抗原を標的にすることを潜在的に可能にする（Ｍｏｒｇａｎ，ＲＡ，ｅｔ  ａｌ（２０１０）．Ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｉｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ＥＲＢＢ２．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：８４３−８５１；Ｌａｍｅｒｓ，ＣＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＣＡＩＸ  ＣＡＲ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１：９０４−９１２）。
【０１５８】
上述の種々の方法及び技術は、本出願を実施する多くの方法を提供する。勿論、記載した全ての目的または利点が必ずしも本明細書に記載のいずれかの特定の実施形態により達成できるわけではないことは理解されたい。従って、例えば、当業者であれば、方法により、本明細書で教示されたまたは示唆された他の目的または利点を達成することを必ずしも必要とせずに、本明細書で教示の１つの利点または一群の利点を達成または最適化するように行うことができることが理解するであろう。種々の選択肢が本明細書で述べられている。いくつかの好ましい実施形態では、特に、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴が含まれる一方で、他の実施形態では、特に、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴が除外され、また一方で、他の実施形態では、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴を包含することにより特定の特徴が弱められていることを理解されたい。
【０１５９】
さらに、当業者であれば、異なる実施形態からの種々の特徴の適用性についても理解できるであろう。同様に、上記で考察した種々の要素、特徴、及びステップ、並びに、それぞれのこのような要素、特徴またはステップに対する他の既知の均等物の種々の組み合わせが当業者により採用され、本明細書に記載の原理による方法が実行できる。種々の要素、特徴、及びステップの内で、多様な実施形態において、いくつかが特に包含され、また、他のものが特に除外されることがあるであろう。
【０１６０】
本出願がある特定の実施形態及び実施例に照らして開示されてきたが、当業者であれば、本出願の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて他の代替の実施形態および／または用途、並びにその変形物及び均等物に展開できることを理解するであろう。
【０１６１】
本出願の好ましい実施形態は、本明細書に記載されており、これには、本発明者らに既知の、本出願を実行するための最良の形態が含まれる。これらの好ましい実施形態に対する変更は、前出の記載を読めば当業者には明らかになるであろう。当業者であれば、必要に応じてこのような変更を採用して、本明細書で具体的に記載の方法とは別の方法で本出願を実施できることは考慮されている。従って、本出願の多くの実施形態は、適用法で認められている本明細書に添付の請求項に記載の主題の全ての変形物及び均等物を含む。さらに、本明細書で特に指示がない限り、またはさもなければ文脈と明確に矛盾することがない限り、その全ての可能な変形における上述の要素のいずれかの組み合わせは、本出願に包含される。
【０１６２】
本明細書で参照された全ての特許、特許出願、特許出願公報、及び、論文、本、仕様書、出版物、文書、および／または種々資料などの他の資料は、上述の資料、本文書と一致しない、または矛盾する上述の資料のいずれか、または、本文書と関連する現時点のまたは以後の時点の請求項の最も広範な範囲に関して限定する作用をする可能性のある上述の資料のいずれかに関連するいずれかの審査履歴を除いて、その参照によりその全体が本出願において本明細書に援用される。例えば、組み込まれた資料に関連するいずれかの説明、定義、および／または用語の使用と本文書に関連するそれらとの間に何らかの不一致または矛盾が存在する場合は、本文書中の説明、定義、および／または用語の使用が優先されるものとする。
【０１６３】
本明細書で開示の出願の実施形態は、本出願の実施形態の原理の例示となるものであることを理解されたい。採用可能な他の変形は、本出願の範囲内に入る可能性がある。従って、例えば、限定するものではないが、本出願の実施形態の別の構成を、本明細書の教示に従って利用可能である。従って、本出願の実施形態は、図示及び記載された通りの形態に正確に限定されるものではない。
【０１６４】
本発明の種々の実施形態は、発明の詳細な説明で上述されている。これらの記述は、上記の実施形態を直接説明するが、当業者は、本明細書に示され、説明される特定の実施形態の修正および／または変形を考えてもよいことを理解されたい。本記述の範囲内である任意のそのような修正または変形は、同様にその中に含まれることが意図される。具体的に言及されない限り、本明細書及び特許請求の範囲の単語及び語句は、通常の、及び当出願分野における当業者に慣用的な意味において使用されることが、発明者の意図である。
【０１６５】
特許申請書提出時において、出願人に既知である本発明の種々の実施形態の前述の説明は、提案されており、例示及び説明の目的を意図している。本説明は、包括的であるか、または本発明を開示される正確な形式に限定することを意図せず、多くの修正及び変形が、上記の教示の観点から可能である。記載の本実施形態は、本発明の原理及びその実用的な用途の説明、並びに他の当業者が種々の実施形態において、及び企図される特定の使用に適した種々の修正を伴って本発明を利用できるようにするのに役立つ。従って、本発明は、本発明を実行するために開示される特定の実施形態に限定されないことが意図される。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態が示され説明されたが、本明細書の教示に基づいて、本発明及びそのより広範な態様から逸脱することなく変更及び修正がなされ得るため、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲内であるそのような全ての変化及び修正の範囲内を包含することが当業者にとって明白である。
【図１Ａ】
2018518972.tif 000031
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
2018518972.tif 000034
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018518972.tif 000038
【図８Ａ】
2018518972.tif 000039
【図８Ｂ】
2018518972.tif 000040
【図９】
2018518972.tif 000041
【図１０】
2018518972.tif 000042
【配列表】
2018518972000001.app
【国際調査報告】
2018518972.tif 000043
2018518972.tif 000044