(57)【要約】本開示はヒト化抗ヒトＣＣＲ７抗体及びそのような抗体を含む組成物を提供する。上記抗体及び組成物は、その腫瘍細胞がＣＣＲ受容体を発現するがんの処置において、炎症状態、組織又は臓器移植から生じる状態又は合併症、及び線維症から生じる又はこれに関連する状態又は合併症の処置において有用である。マウス抗体に由来するいくつかの抗体に関して実験結果を詳しく述べる。ｍａｂ７２９という内部の呼称を有するマウス抗体［ＣＤＲとして、ＶＨ１：ＧＬＴＦＲＤＦＡ；ＶＨ２：ＩＳＳＧＧＦＹＴ；ＶＨ３：ＶＲＲＡＹＲＹＤＧＴＧＤＹＳＡＬＤＹ；ＶＬ１：ＱＤＩＧＰＳ；ＶＬ２：ＡＴＳ；ＶＬ３：ＬＱＦＡＳＳＰＬＴを有する］は、さらにヒト化される（内部の呼称はｍＡＢ６５０＿Ｈ１Ｌ１）。上記抗体は、実験結果によって示される通り、ＣＣＲ７受容体内部移行を阻害する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、
ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号６を含み；
ＨＶＲ−Ｈ２  Ｈ１は配列番号１３を含み；
ＨＶＲ−Ｈ３  Ｈ１は配列番号１９を含み；
ＨＶＲ−Ｌ１  Ｈ１は配列番号２７を含み；
ＨＶＲ−Ｌ２  Ｈ１は配列番号３１を含み；及び
ＨＶＲ−Ｌ３  Ｈ１は配列番号３６を含み、
抗体が、
ａ）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２であるマウス抗ＣＣＲ７抗体のＫｄの１０倍を超えないＫｄにより定義される配列番号７６のアミノ酸配列を有する合成抗原に対する最小親和性；及び
ｂ）ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１から選択される少なくとも１つのＣＣＲ７−リガンドにより、ＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達とＣＣＲ７受容体内部移行のうちの少なくとも１つを阻害するための１００ｎＭ以下のＩＣ５０
のうちの少なくとも１つを有するヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項２】
抗体の重鎖可変ドメインが、ＨＦＲ１、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＦＲ２、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＦＲ３、ＨＶＲ−Ｈ３及びＨＦＲ４の順で作動可能に連結されている、ＨＦＲ１〜ＨＦＲ４の４つの重鎖フレームワーク領域及びＨＶＲ−Ｈ１〜ＨＶＲ−Ｈ３の３つの超可変領域を含み、抗体の軽鎖可変ドメインが、ＬＦＲ１、ＨＶＲ−Ｌ１、ＬＦＲ２、ＨＶＲ−Ｌ２、ＬＦＲ３、ＨＶＲ−Ｌ３及びＬＦＲ４の順で作動可能に連結されている、ＬＦＲ１〜ＬＦＲ４の４つの軽鎖フレームワーク領域及びＨＶＲ−Ｌ１〜ＨＶＲ−Ｌ３の３つの超可変領域を含み、ＨＦＲ１〜ＨＦＲ４の重鎖フレームワーク領域が：
ｉ）それぞれ配列番号４０、４３、４５及び４８；
ｉｉ）それぞれ配列番号４１、４４、４６及び４９；又は
ｉｉｉ）それぞれ配列番号４２、４４、４７及び４９
のアミノ酸配列を有し、ＬＦＲ１〜ＬＦＲ４の軽鎖フレームワーク領域が：
ｉｖ）それぞれ配列番号５０、５２、５５及び５８；又は
ｖ）それぞれ配列番号５１、５３、５６及び５９
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項３】
抗体の重鎖可変ドメインが配列番号６１、６２及び６３のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変ドメインが配列番号６４及び６５のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは抗体の重鎖可変ドメインが配列番号６１のアミノ酸配列を含み、好ましくは抗体の軽鎖可変ドメインが配列番号６４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項４】
抗体の重鎖可変ドメインが配列番号６１のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変ドメインが配列番号６４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項５】
抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４領域である重鎖定常領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項６】
抗体が：Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害及び食作用からなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を有する機能的Ｆｃ領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項７】
抗体がアロタイプＧ１ｍ１７，１の重鎖定常領域を含み、好ましくは前記重鎖定常領域がＥ３３３Ａ置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物。
【請求項９】
薬物として使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体、又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
がん、炎症状態、組織若しくは臓器移植から生じる状態若しくは合併症、又は線維症から生じる若しくはこれに関連する状態若しくは合併症の処置において使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体、又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
がんがその腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現しているがんであり、好ましくは前記がんが慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん、頭頸部扁平上皮癌及び結腸癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体、又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
炎症状態が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性気管支炎、気道平滑筋過形成、線維性肺疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳにおける炎症状態からなる群から選択される、又は組織若しくは臓器移植が腎臓、心臓、皮膚、及び肺移植のうちの１つ又は複数である、請求項１０に記載の使用のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体、又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
線維症が、肝線維症及び肝硬変、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体、又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗ＣＣＲ７抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、好ましくは、前記核酸分子は抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、前記コードヌクレオチド配列は宿主細胞における前記コードヌクレオチド配列の発現のための調節配列に作動可能に連結されている、前記核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、医学及び薬学の分野に関し、特に、腫瘍学で使用するための生物製剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現しているがんの処置に有用である抗ＣＣＲ７受容体抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＣモチーフ受容体７（以下「ＣＣＲ７」と呼ばれる）は、ＥＢＶ感染によりリンパ球選択的様式で発現されることが最初に見出された７回膜貫通型ドメインＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である（Ｂｉｒｋｅｎｂａｃｈら、１９９３年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２２０９〜２２２０頁）。後にＣＣＲ７はＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１に対する選択的ケモカイン受容体であることが見出された。生理的条件下では、ＣＣＲ７の発現は無処置Ｔ及びＢリンパ球並びに成熟樹状細胞に限定されており、その遊走、組織化、及び活性化を調節するのに役割を果たしている。
【０００３】
ＣＣＲ７活性は、慢性炎症状態（Ｍｏｓｃｈｏｖａｋｉｓら、２０１２年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１９４９〜５５頁）、アテローム性動脈硬化（Ｌｕｃｈｔｅｆｅｌｄら、２０１０年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：１６２１〜２８頁）、ＨＩＶ感染（Ｅｖａｎｓら、２０１２年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２３：１５１〜５７頁）及びがん（Ｂｅｎ−Ｂａｒｕｃｈ、２００９年、Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ３：３２８〜３３頁）を含む、多種多様な疾患状態に関係付けられてきた。
【０００４】
種々の研究により、ＣＣＲ７が、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉症、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん又は頭頸部扁平上皮癌及び結腸癌などのがん、並びにＢ細胞性慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、乳がん細胞並びに悪性乳房腫瘍を含む幅広い種類の腫瘍細胞で発現されていることが明らかにされている（国際公開第２００７／００３４２６号）。さらに、ＣＣＲ７は種々のがんのリンパ節転移に役割を果たしていることが明らかになってきている（Ｖｉｏｌａ  ａｎｄ  Ｌｕｓｔｅｒ、２００８年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．４８：１７１〜９７頁）。
【０００５】
ヒトＣＣＲ７に対する基準マウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ１９７、クローン＃１５０５０３）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている（ｗｗｗ．ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）。
【０００６】
国際公開第２００７／００３４２６号は、腫瘍細胞がＣＣＲ７を発現するがんの処置のためのＣＣＲ７に結合する抗体の使用を開示している。ＣＣＲ７発現腫瘍細胞に抗体が結合すると腫瘍細胞の遊走を阻害する並びに／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びアポトーシスの誘導のうちの１つ又は複数により腫瘍細胞を死滅させることが開示されている。
【０００７】
国際公開第２０１２／０４３５３３号は、線維症又はがんを処置するのに有用であるヒトＣＣＲ７に対する８つの異なるマウスモノクローナル抗体を開示している。しかし、これらの抗体で、細胞内Ｃａ２＋シグナル伝達を阻害するために７．４ｎＭ未満のＩＣ５０を有するものは１つもない。
【０００８】
国際公開第２０１４／１５１８３４号は、ヒトＣＣＲ７発現細胞で免疫されたＸｅｎｏｍｏｕｓ（商標）で産生された３つの異なるヒト抗ＣＣＲ７抗体、並びにマウス抗ヒトＣＣＲ７抗体及びそのキメラ化とヒト化を開示している。ヒト抗ＣＣＲ７抗体は、基準マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ１９７とは異なるヒトＣＣＲ７上のエピトープに結合する。この抗体は、炎症状態、がん性状態、並びに組織又は臓器移植から生じる状態及び合併症を処置するのに有用であることが開示されている。国際公開第２０１４／１５１８３４号は、マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体、その中でもその重鎖定常領域をそのヒト対応物で置き換えることによりキメラ化された遮断抗体ＭＡｂ２２の単離をさらに開示している。このキメラ化抗体はヒトＣＣＲ７に結合する能力を保持していた。このキメラ化抗体の軽鎖はさらに変更されて、キメラ化重鎖及びヒト化軽鎖を有する一連のＭＡｂ２２変異体を産生した。国際公開第２０１４／１５１８３４号は、たとえあるにしても、ヒト化軽鎖を有するこれらのＭＡｂ２２変異体のうちのどれがヒトＣＣＲ７に結合する能力を保持しているのかを開示していない。
【０００９】
しかし、ヒト治療において有用であるさらに別の及び改良された抗ＣＣＲ７抗体の必要性が当技術分野にはまだ存在する。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は配列：Ｇ−Ｆ／Ｌ−Ｔ／Ａ／Ｐ−Ｆ−Ｓ／Ｔ／Ｒ−Ｎ／Ｄ／Ｓ−Ｙ／Ｆ−Ａを含み；ＨＶＲ−Ｈ２  Ｈ１は配列：Ｉ−Ｓ−Ｓ／Ｄ−Ｇ／Ｒ−Ｇ−Ｓ／Ｔ／Ｆ−Ｙ／Ｈ／Ｆ−Ｔ／Ｐを含み；ＨＶＲ−Ｈ３  Ｈ１は配列：Ａ／Ｔ／Ｖ／Ｇ−Ｒ−Ｒ／Ａ−Ａ／Ｅ／Ｔ−Ｙ／Ｇ／Ｔ−Ｒ／Ｖ−Ｙ／Ｖ−Ｄ／＊−ＧＴＧ／＊−Ｅ／Ｖ／Ｄ／Ａ／Ｇ／＊−Ｎ／Ｓ／Ｄ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｄ−Ｍ／Ｌ／Ｆ−Ｙ／Ｓを含み；ＨＶＲ−Ｌ１  Ｈ１は配列：Ｑ／Ｓ−Ｄ／Ｓ−Ｉ／Ｌ／Ｖ−Ｇ／Ｓ／Ｌ−Ｄ／Ｓ／Ｐ／Ｇ／Ｎ−Ｓ／Ｎ−＊／Ｙ／ＤＧＫＴＹを含み；ＨＶＲ−Ｌ２  Ｈ１は配列：Ａ／Ｓ／Ｔ−Ｔ／Ｉ／Ｖ−Ｓを含み；及びＨＶＲ−Ｌ３  Ｈ１は配列：Ｌ／Ｗ／Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｆ／Ｇ／Ｗ−Ａ／Ｔ／Ｓ−Ｓ／Ｎ／Ｈ−Ｓ／Ｆ／Ｎ−Ｐ−Ｌ／Ｐ／Ｑ−Ｔを含み、「＊」はその位置にアミノ酸が存在することはできないことを示している、ヒト化抗ＣＣＲ抗体に関する。本発明の抗体は好ましくは、ａ）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２であるマウス抗ＣＣＲ７抗体のＫｄの１０倍を超えないＫｄにより定義される配列番号７６を有する合成抗原ＳＹＭ１８９９に対する最小親和性；及びｂ）ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１から選択される少なくとも１つのＣＣＲ７−リガンドにより、ＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達とＣＣＲ７受容体内部移行のうちの少なくとも１つを阻害するための１００ｎＭ以下のＩＣ５０のうちの少なくとも１つを有する。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号３〜１０のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号１１〜１６のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号１７〜２３のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号２４〜３０のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号３１〜３３のうちの１つを含み；及びＨＶＲ−Ｌ３が配列番号３４〜３９のうちの１つを含む、ヒト化抗ＣＣＲ７抗体である。本発明のヒト化抗ＣＣＲ７抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、それぞれが順番に（ｉ）配列番号３、１１、１７、２４、３２、及び３４；（ｉｉ）配列番号４、１２、１８、２５、３１、及び３５；（ｉｉｉ）配列番号５、１２、１８、２６、３１、及び３５；（ｉｖ）配列番号６、１３、１９、２７、３１、及び３６；（ｖ）配列番号７、１４、２０、２４、３１、及び３５；（ｖｉ）配列番号８、１５、２１、２８、３１及び３７；（ｖｉｉ）配列番号９、１６、２２、２９、３３及び３８；又は（ｖｉｉｉ）配列番号１０、１４、２３、３０、３１及び３９を含むのがさらに好ましい。
【００１２】
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、抗体の重鎖可変ドメインが、ＨＦＲ１、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＦＲ２、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＦＲ３、ＨＶＲ−Ｈ３及びＨＦＲ４の順で作動可能に連結されている、ＨＦＲ１〜ＨＦＲ４の４つの重鎖フレームワーク領域及びＨＶＲ−Ｈ１〜ＨＶＲ−Ｈ３の３つの超可変領域を含み、抗体の軽鎖可変ドメインが、ＬＦＲ１、ＨＶＲ−Ｌ１、ＬＦＲ２、ＨＶＲ−Ｌ２、ＬＦＲ３、ＨＶＲ−Ｌ３及びＬＦＲ４の順で作動可能に連結されている、ＬＦＲ１〜ＬＦＲ４の４つの軽鎖フレームワーク領域及びＨＶＲ−Ｌ１〜ＨＶＲ−Ｌ３の３つの超可変領域を含み、ＨＦＲ１〜ＨＦＲ４の重鎖フレームワーク領域が：ｉ）それぞれ配列番号４０、４３、４５及び４８（＝ＶＨ１由来のＦＲ）；ｉｉ）それぞれ配列番号４１、４４、４６及び４９（ＶＨ２由来のＦＲ）；又はｉｉｉ）それぞれ配列番号４２、４４、４７及び４９（＝ＶＨ３由来のＦＲ）のアミノ酸配列を有し、ＬＦＲ１〜ＬＦＲ４の軽鎖フレームワーク領域が：ｉｖ）それぞれ配列番号５０、５２、５５及び５８（＝ＶＬ１由来のＦＲ）；又はｖ）それぞれ配列番５１、５３、５６及び５９（＝ＶＬ２由来のＦＲ）のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗ＣＣＲ７抗体である。
【００１３】
再びさらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、抗体の重鎖可変ドメインが配列番号６１、６２及び６３（ＶＨ１、２又は３）のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変ドメインが配列番号６４及び６５（ＶＫ１又は２）のうちの少なくとも１つに少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、抗体の重鎖可変ドメインが配列番号６１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、抗体の軽鎖可変ドメインが配列番号６４のアミノ酸配列を含む、ヒト化抗ＣＣＲ７抗体である。
【００１４】
本発明の上の実施形態のうちのいずれかに従ったヒト化抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４領域である重鎖定常領域を含む。
【００１５】
本発明の上の実施形態のうちのいずれかに従ったヒト化抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害及び食作用からなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を有する機能的Ｆｃ領域を含む。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、本発明の上の実施形態のうちのいずれかに従ったヒト化抗ＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物に関する。
【００１７】
第３の態様では、本発明は薬物として使用するための：ａ）本発明の上の実施形態のうちのいずれか１つに従ったヒト化抗ＣＣＲ７抗体；又はｂ）そのような抗体を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
第４の態様では、本発明は、がん、炎症状態、組織若しくは臓器移植から生じる状態若しくは合併症、又は線維症から生じる若しくはこれに関連する状態若しくは合併症の処置において使用するための：ａ）本発明の上の実施形態のうちのいずれか１つに従ったヒト化抗ＣＣＲ７抗体；又はｂ）そのような抗体を含む医薬組成物に関する。処置では、がんはその腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現しているがんであるのが好ましく、がんは慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん、頭頸部扁平上皮癌及び結腸癌からなる群から選択されるのが好ましい。処置では、炎症状態は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性気管支炎、気道平滑筋過形成、線維性肺疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳにおける炎症状態からなる群から選択される、又は組織若しくは臓器移植が腎臓、心臓、皮膚、及び肺移植のうちの１つ又は複数であるのが好ましい。処置では、線維症は、肝線維症及び肝硬変、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症からなる群から選択されるのが好ましい。
【００１９】
第５の態様では、本発明は、好ましくは、核酸分子が抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、コードヌクレオチド配列が宿主細胞においてコードヌクレオチド配列の発現の調節配列に作動可能に連結されている、本発明の上の実施形態のうちのいずれか１つに従ったヒト化抗ＣＣＲ７抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００２０】
第６の態様では、本発明は第５の態様に従った核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）マウスｍＡｂ７２９及び（ｂ）ヒト化ｍＡｂ６５０（ｍＡｂ７２９のヒト化版）のエピトープマッピングを示す図である。両方の抗体が、ヒトＣＣＲ７のＮ終端に位置する同じ線形エピトープを認識する（Ｚ＝硫酸化Ｔｙｒ）。
【図２】ヒトＴ細胞リンパ腫細胞の遊走に対するリガンド結合（ａ：ＣＣＬ１９；ｂ：ＣＣＬ２１）のアゴニスト効果はマウス抗ＣＣＲ７ｍＡｂ７３０により阻害されている（ＩＣ５０：それぞれ１５ｎＭ及び６ｎＭ）ことを示すグラフである。
【図３】ＣＤＣアッセイで試験した場合、正常無処置ヒトＴ細胞は、リツキサン（ＲＴＸ；四角形）でもキャンパス（ＣＡＭＰ；円形）によっても、抗ヒトＣＣＲ７ｍＡｂ７２９−２Ａ（三角形）を用いた処置では死滅しないことを示すグラフである。ＩｇＧ２Ａ（ダイアモンド形）は負の対照として含まれた。
【図４】ＣＤＣアッセイ。ＣＤ２０抵抗性ＣＬＬ患者腫瘍細胞はマウス抗ヒトＣＣＲ７ｍＡｂ７２９−２Ａ（７２９−２Ａ；三角形）により死滅するが、負の対照ＩｇＧ２Ａ（ダイアモンド形）では死滅しないことを示すグラフである。
【図５】ヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ（１＊１＝ＨＣ１  ＬＣ１、２＊１＝ＨＣ２  ＬＣ１及び３．１＝ＨＣ３  ＬＣ１）及びキメラ抗ヒトＣＣＲ７ｍＡｂ（Ｆａｂマウス／Ｆｃヒト、０＊０＝ＨＣ０  ＬＣ０）は白血病性リンパ球の溶解を誘導したことを示すグラフである。正の対照：ｍＡｂアレムツズマブ（ＡＬＥＭ）及びリツキサン（ＲＴＸ）及び負の対照：ＩＧＧ１。ＡＤＣＣアッセイ（ｎ＝２）は、エフェクター細胞／標的細胞（ＣＬＬ細胞）比５対１（薄い灰色バー）及び１０対１（濃い灰色バー）を用いて実行された。
【図６】活性内部移行アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定した場合、ＣＣＬ１９の阻害はヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ６５０によるＣＣＲ７受容体内部移行を誘導したことを示すグラフである。ｍＡｂ６５０の濃度（μｇ／ｍｌ）は、ｙ軸上のＣＣＬ１９誘導ＣＣＲ７内部移行の阻害（％阻害）に対してｘ軸上にプロットされている。
【図７】確立したβアレスチン動員アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定した場合、ＣＣＬ１９の阻害はヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ６５０によるβアレスチン経路のＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達を誘導したことを示すグラフである。ｍＡｂ６５０の濃度（μｇ／ｍｌ）は、ｙ軸上のＣＣＬ１９誘導βアレスチン動員の阻害（％阻害）に対してｘ軸上にプロットされている。
【図８】確立したｃＡＭＰ二次メッセンジャー経路アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定した場合、ＣＣＬ１９の阻害はヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ６５０によるＣＣＲ７依存性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を誘導したことを示すグラフである。ｍＡｂ６５０の濃度（μｇ／ｍｌ）は、ｙ軸上のＣＣＬ１９誘導ＣＣＲ７  ｃＡＭＰ二次メッセンジャー経路の阻害（％阻害）に対してｘ軸上にプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
用語「抗体」はその最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、アンタゴニスト、中和抗体、完全長又は無傷のモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗ＣＣＲ７抗体組成物、ポリクローナル抗体、多価抗体、一本鎖抗ＣＣＲ７抗体を含む単一抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体、並びに、断片が所望の生物及び／又は免疫活性を示しさえすれば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む抗ＣＣＲ７抗体の断片（下参照）を網羅する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は本明細書では抗体と互換的に使用される。抗体はヒト及び／又はヒト化でも可能である。
【００２３】
用語「抗ＣＣＲ７抗体」又は「ＣＣＲ７に結合する抗体」とは、抗体がＣＣＲ７を標的にするのに診断薬及び／又は治療薬として有用であるのに十分な親和性でＣＣＲ７に結合することができる抗体のことである。無関係な非ＣＣＲ７タンパク質への抗ＣＣＲ７抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＡにより測定された場合、ＣＣＲ７への抗体の結合の約１０％未満であることが好ましい。ある特定の実施形態では、ＣＣＲ７に結合する抗体は、≦１ｍＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦、０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＣＲ７抗体は、異なる種由来のＣＣＲ７間で保存されているＣＣＲ７のエピトープに結合する。
【００２４】
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離された及び／又は回収された抗体である。その自然環境の汚染成分は抗体の治療的使用を妨げると考えられる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含むことがある。好ましい実施形態では、抗体は（１）ローリー法で決定した場合、９５重量％よりも多い抗体まで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用により少なくともＮ終端若しくは内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度にまで、又は（３）クーマシーブルー若しくは、好ましくは、銀染色を使用した還元若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないことになるので、組換え型細胞内のインサイチュでの抗体を含む。しかし、通常では、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００２５】
基本４鎖抗体単位は、２つの同一軽（Ｌ）鎖と２つの同一重（Ｈ）鎖で構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は５つの基本ヘテロ四量体単位とＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、したがって、１０の抗原結合部位を含有しており、分泌されたＩｇＡ抗体は重合化して２〜５つの基本４鎖単位とＪ鎖を含む多価集合体を形成することが可能である）。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般に１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結されており、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されている。それぞれのＨ及びＬ鎖は、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれのＨ鎖はＮ終端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いてα及びγ鎖ごとに３つの定常ドメイン（ＣＨ）をμ及びεアイソタイプでは４つのＣＨドメインを有する。それぞれのＬ鎖はＮ終端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いてそのもう一方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列され、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と整列されている。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインの間に境界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬが互いに対形成すると単一抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ、Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９９４年、ｐａｇｅ７１  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ６を参照されたい。
【００２６】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つのはっきりと異なるタイプのうちの１つに割り当てることが可能である。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスの又はアイソタイプに割り当てることが可能である。免疫グロブリンには５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと名付けられた重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的小さな違いに基づいてさらにサブクラスに分割され、例えば、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
【００２７】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重又は軽鎖のアミノ終端ドメインのことである。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることがある。これらのドメインは一般に抗体の最も変わりやすい部分であり抗原結合部位を含有する。
【００２８】
用語「可変」とは、可変ドメインのある特定のセグメントは抗体間で配列が大規模に異なるという事実のことである。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸全長にわたり一様に分布しているのではない。それどころか、Ｖ領域は、それぞれが９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極端に可変性の短い領域で分離された１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれが４つのＦＲを含み、３つの超可変領域により連結されたβシート立体配置を主に取り、この超可変領域はループを形成してβシート構造を連結する、及びいくつかの場合は、βシート構造の一部を形成する。それぞれの鎖中の超可変領域はＦＲによりすぐそばに結合され、もう一方の鎖由来の超可変領域と抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合させることに直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００２９】
「無傷の」抗体とは、抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは天然の配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でもよい。無傷の抗体は１つ又は複数のエフェクター機能を有するのが好ましい。
【００３０】
本明細書での目的のための「裸の抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことである。
【００３１】
「抗体断片」は無傷の抗体の一部、好ましくは、無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；リニア抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２頁［１９９５］）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体を含む。一実施形態では、抗体断片は無傷の抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持している。
【００３２】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び残余の「Ｆｃ」断片を生じ、その命名は容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は全Ｌ鎖の他にＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。それぞれのＦａｂ断片は抗原結合に関しては一価である、すなわち、Ｆａｂ断片は単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシン処理すると、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィドに連結されたＦａｂ断片におよそ相当し、それでも抗原と架橋結合することができる、単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ終端に追加の数個の残基を有することでＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では定常領域のシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を帯びているＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は最初は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学連結も知られている。
【００３３】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより結合されている両Ｈ鎖のカルボキシ終端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決定され、この領域はある特定タイプの細胞上で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分でもある。
【００３４】
「Ｆｖ」は完全抗原認識及び結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、緊密に非共有会合した１つの重と１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重と１つの軽鎖可変ドメインは、軽及び重鎖が２本鎖Ｆｖ種の構造に類似する「二量体」構造に会合することが可能であるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合することが可能である。
これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基を与え抗体に抗原結合特異性を授ける６つの超可変ループ（３つのループそれぞれがＨ及びＬ鎖由来である）が出てくる。しかし、単一可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも抗原を認識し結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性は低い。
【００３５】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、連結されて単一ポリペプチド鎖になるＶＨとＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインの間にさらに含むのが好ましい。ｓＦｖの概説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。
【００３６】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことであり、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある考えられる天然に存在する突然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の抗体に汚染されないで合成することができる点で有利である。修飾語句「モノクローナルの」は、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈するべきではない。例えば、本発明に有用なモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法により調製してもよいし、又は細菌性、真核動物又は植物細胞において組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）を使用して作成してもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８頁（１９９１）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７頁（１９９１）に記載されている技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００３７】
本明細書のモノクローナル抗体は、重及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又は相同であり、上記鎖（複数可）の残りが別の種由来の又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又は相同である「キメラ」抗体、並びに、所望の生物活性を示すのであればそのような抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５頁（１９８４）参照）。本明細書での目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿、等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化された」抗体を含む。
【００３８】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。その大部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域由来の残基（ドナー抗体）で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンの少数のフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体はレシピエント抗体にもドナー抗体にも見出せない残基を含むことがある。これらの改変は抗体性能をさらに洗練するために加えられる。一般に、ヒト化抗体は典型的には、超可変ループのすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに一致し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである２つの可変ドメインを含むことになる。ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細は、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９頁（１９８８）；ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６頁（１９９２）を参照されたい。以下のレビュー論文及びそこに引用される参考文献：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１：１０５〜１１５頁（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２３：１０３５〜１０３８頁（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５：４２８〜４３３頁（１９９４）も参照されたい。
【００３９】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」とは、本明細書で使用される場合、抗体可変ドメインのうち配列が高頻度可変性であり及び／又は抗原結合の原因となる構造的に規定されたループを形成する領域のことである。一般に、抗体は６つの超可変領域；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。いくつかの超可変領域描写が使用されており本明細書に包含されている。超可変領域は、一般に「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」由来のアミノ酸配列（例えば、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従って番号を付けた場合、ＶＬ中ではおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びにＶＨ中ではおよそ３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））；及び／又は「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式に従って番号付けをした場合、ＶＬ中では残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、並びにＶＨ中では２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）及び９５〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７））；及び／又は「超可変ループ」／ＣＤＲ由来のアミノ酸残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付け方式に従って番号付けをした場合、ＶＬ中では残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）及び１０５〜１２０（Ｌ３）、並びにＶＨ中では２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）及び１０５〜１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９〜２１２頁（１９９９）、Ｒｕｉｚ、Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９〜２２１頁（２０００））を含む。任意選択で、抗体は、Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、Ａ．及びＰｌｕｎｋｔｈｕｎ、Ａ．Ｊ．に従って番号付けした場合、以下の点ＶＬ中の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）及び１２３（Ｌ３）、並びにＶＨ中の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）及び１２３（Ｈ３）のうちの１つ又は複数に対称的挿入を有する（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７〜６７０頁（２００１））。本発明の抗体の超可変領域／ＣＤＲは好ましくは、ＩＭＧＴ番号付け方式に従って定義され番号付けされる。
【００４０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４１】
「遮断」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害する又は低下させる抗体である。好ましい遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物活性を実質的に又は完全に阻害する。
【００４２】
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチドの機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００４３】
「種依存性抗体」、例えば、哺乳動物抗ヒトＩｇＥ抗体は、第１の哺乳動物種由来の抗原に対して、第２の哺乳動物種由来のその抗原の相同体に対するよりも強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体はヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種由来の抗原の相同体に対して、ヒト抗原に対するその結合親和性の少なくとも約５０分の１、又は少なくとも約５００分の１、又は少なくとも約１０００分の１である結合親和性を有する。種依存性抗体は上記の種々のタイプの抗体のいずれであることも可能であるが、好ましくは、ヒト化又はヒト抗体である。
【００４４】
「結合親和性」とは一般に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の合計の強さのことである。別の方法で示されていなければ、本明細書で使用されるように、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１対１相互作用を反映する内在的結合親和性のことである。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に解離定数（Ｋｄ）により表すことが可能である。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することが可能である。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくり結合しすぐに解離する傾向があり、高親和性抗体は一般にもっと速く抗原に結合しもっと長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野では公知であり、そのうちのいずれでも本発明の目的のために使用することが可能である。特定の説明的実施形態が以下に記載されている。
【００４５】
「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、固定化抗原ＣＭ５チップを約１０〜５０応答単位（ＲＵ）用いて２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定可能である。手短に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）をＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を用いて、供給業者の説明書に従って活性化する。抗原は、５μｌ／分の流速での注射前に１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、おおよそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。抗原の注射に続いて、１Ｍのエタノールアミンを注射して未反応基を遮断する。動態測定では、抗体又はＦａｂの２倍連続希釈（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を２５℃、おおよそ２５μｌ／分の流速で０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離センサーグラムの同時フィッティングにより単純な１対１対応ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．２版）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。例えば、Ｃｈｅｎ、Ｙ．ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５〜８８１頁を参照されたい。上の表面プラズモン共鳴アッセイによりオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超えた場合、スターレッドキュベット付のストップフロー装備分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光光度計で測定される漸増濃度の抗原の存在下で、ｐＨ７．２、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ、放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ通過幅）の増減を測定する蛍光消失技法を使用することによりオンレートを決定することが可能である。
【００４６】
本発明に従った「オンレート」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、上記のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する上記の同じ表面プラズモン共鳴技法でも決定することが可能である。
【００４７】
目的の抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチドＣＣＲ７抗原標的「に結合する」抗体は、抗体が抗原を発現している細胞又は組織を標的にするのに治療薬として有用であり、他のタンパク質とは著しく交差反応しないほど十分な親和性で抗原に結合する抗体である。そのような実施形態では、「非標的」タンパク質への抗体の結合の程度は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定される場合、特定の標的タンパク質への抗体の結合の約１０％未満になる。標的分子への抗体の結合に関して、用語「特異的結合」又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」若しくは「に特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定できるほど異なっている結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を持たない類似の構造の分子である対照分子の結合と比べて、分子の結合を判定することにより測定することが可能である。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非標識標的に類似している対照分子との競合により判定することが可能である。この場合、プローブへの標識標的の結合が過剰な非標識標的により競合的に阻害される場合には特異的結合が示される。本明細書で使用される用語「特異的結合」又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」若しくは「に特異的である」とは、少なくとも約１０−４Ｍ、代わりに少なくとも約１０−５Ｍ、代わりに少なくとも約１０−６Ｍ、代わりに少なくとも約１０−７Ｍ、代わりに少なくとも約１０−８Ｍ、代わりに少なくとも約１０−９Ｍ、代わりに少なくとも約１０−１０Ｍ、代わりに少なくとも約１０−１１Ｍ、代わりに少なくとも約１０−１２Ｍ、又はそれよりも大きい標的に対するＫｄ（上記の通りに決定してもよい）を有する分子により示すことが可能である。一実施形態では、用語「特異的結合」とは、分子が特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド上のエピトープに結合し、他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープにも実質的に結合しない結合のことである。
【００４８】
用語「エピトープ」とは、分子のうち、抗原結合タンパク質、例えば、抗体が結合する部分のことである。上記用語は、抗体などの抗原結合タンパク質に又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意の決定基を含む。エピトープは近接していても非近接でも可能である（例えば、ポリペプチド内で、ポリペプチド配列中では互いに近接していないが、分子という状況内では抗原結合タンパク質と結合しているアミノ酸残基）。ある特定の実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質を生み出すのに使用されるエピトープに類似している三次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を生み出すのに使用されるそのエピトープに見出されるアミノ酸残基を１つも又は一部しか含まないという点で、擬態性であってもよい。きわめて多くの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例では、核酸などの他の種類の分子上に存在していることがある。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニル又は硫酸基などの分子の化学的に活性な表面基を含んでもよいし、特定の三次元構造的特徴及び／又は特定の電荷特徴を有していてもよい。一般に、特定の標的抗原に特異的である抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中で標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【００４９】
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然の配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因しうる生物活性のことであり、抗体アイソタイプにより変化する。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；並びにＢ細胞活性化を含む。
【００５０】
本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ終端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化することがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０位からそのカルボキシル終端まで伸びると定義されている。Ｆｃ領域のＣ終端リシン（ＥＵ番号付け方式に従えば残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することにより、取り除かれることがある。したがって、無傷の抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が取り除かれた抗体集団、Ｋ４４７残基が取り除かれていない抗体集団、及びＫ４４７残基のある抗体とＫ４４７残基のない抗体の混合物を有する抗体集団を含むことがある。
【００５１】
「機能的Ｆｃ領域」は天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例となる「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節、等を含む。そのようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合する必要があり、例えば、本明細書の定義で開示される種々のアッセイを使用して評価することが可能である。
【００５２】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域並びにその天然に存在する変異体を含む。
【００５３】
「変異Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変、好ましくは１つ又は複数のアミノ酸置換（複数可）のため、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。変異Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するのが好ましく、例えば、天然配列Ｆｃ領域に又は親ポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５アミノ酸置換を有する。本明細書の変異Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域と及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、非常に好ましくは、それと少なくとも約９０％相同性、さらに好ましくは、それと少なくとも約９５％相同性を有する。
【００５４】
「抗体依存性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合している分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合しそれに続いて細胞毒で標的細胞を死滅させることを可能にする細胞傷害性の形態のことである。抗体は細胞傷害性細胞を「武装させ」、そのような死滅には絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２頁（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は米国特許第５８２１３３７号に記載されるアッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代わりに又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６頁（１９９８）に開示されるモデルなどの動物モデルで、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価してもよい。
【００５５】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合する受容体（ガンマ受容体）であり、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的にスプライシングされた形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害化受容体」）を含み、これらの受容体は主にその細胞質ドメインが異なる類似するアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害化モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（概説Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４頁（１９９７）参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜４９２頁（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４頁（１９９４）；ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１頁（１９９５）で概説されている。将来同定されることになるＦｃＲを含む他のＦｃＲは、本明細書の用語「ＦｃＲ」により包含されている。上記用語は母系性ＩｇＧの胎児への移行の原因である新生児受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７頁（１９７６）及びＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９頁（１９９４））。
【００５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株で、又は変異Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類でアッセイすることが可能である。国際公開第２０００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ）はＦｃＲへの結合が改良された又は減少した抗体変異体を記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４頁（２００１）も参照されたい。
【００５７】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ又は複数のＦｃＲを発現しエフェクター機能を遂行する白血球である。細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現しＡＤＣＣエフェクター機能を遂行するのが好ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含み；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は天然の供給源から、例えば、血液から単離することができる。
【００５８】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解のことである。古典的補体経路の活性化は、その同族抗原に結合している抗体（適切なサブクラスの）への補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を評価するため、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３頁（１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイを実施してもよい。変化したＦｃ領域アミノ酸配列（変異Ｆｃ領域を有する抗体）及び増加した又は減少したＣ１ｑ結合能力を有する抗体変異体は、例えば、米国特許第６１９４５５１号及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記載されている。例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４頁（２０００）も参照されたい。Ｃ１ｑ結合を増加させ、それによってＣＤＣ活性を増加させる１つのそのような置換はＥ３３３Ａ置換であり、この置換は本発明の抗体において都合よく適用することが可能である。
【００５９】
用語「Ｆｃ領域を含む抗体」とはＦｃ領域を含む抗体のことである。Ｆｃ領域のＣ終端リシン（ＥＵ番号付け方式に従えば残基４４７）は、例えば、抗体の精製中に又は抗体をコードする核酸の組換え操作により取り除かれることがある。したがって、本発明に従ったＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、Ｋ４４７すべてが取り除かれている抗体、又はＫ４４７残基のある抗体とない抗体の混合物を含むことが可能である。
【００６０】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカル整列アルゴリズムを使用して２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の整列により判定することが可能である。長さが類似する配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適に整列させるグローバル整列アルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列させ、長さがかなり異なる配列は、好ましくは、ローカル整列アルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列させる。次に、配列は、少なくともある特定の最小パーセントの配列同一性（下で定義されている）を共有する場合（例えば、デフォルトパラメータを使用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列された場合）「実質的に同一である」又は「実質的に類似している」と呼ばれることもある。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバル整列アルゴリズムを使用してその全長（完全長）にわたり２つの配列を整列させる、マッチの数を最大にしてギャップの数を最小にする。グローバル整列は、長さが類似する２つの配列の場合に配列同一性を判定するのに使用するのが適切である。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメータが使用され、ギャップクリエーションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａ及びタンパク質ではデフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９頁）。配列整列及びパーセント配列同一性を表すスコアーは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、１０．３版、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１〜３７５２頁  ＵＳＡより入手可能などのコンピュータプログラムを使用して、又は上記のＧＡＰについてと同じパラメータを使用してＥｍｂｏｓｓＷＩＮ２．１０．０版においてプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して、又はデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」についてと「ｗａｔｅｒ」についての両方で及びタンパク質についてとＤＮＡ整列についての両方で、デフォルトギャップオープニングペナルティは１０．０及びデフォルトギャップエクステンションペナルティは０．５；デフォルトスコアリングマトリックスはタンパク質ではＢｌｏｓｕｍ６２及びＤＮＡではＤＮＡＦｕｌｌ）を使用して決定してもよい。全長がかなり異なる配列の場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する整列などのローカル整列が好ましい。代わりに、パーセント類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、等などのアルゴリズムを使用して、公開データベースを検索することにより判定してもよい。
【００６１】
上記の整列プログラムのうちのいずれかを使用して２つのアミノ酸配列を整列させた後は、所与のアミノ酸配列Ｂ（代わりに所与のアミノ酸配列Ｂにとっての、との、又はに対するある特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして表すことが可能である）にとっての、との、又はに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性は以下の通り：１００掛ける割合Ｘ／Ｙ、Ｘは配列整列プログラムによるＡとＢのそのプログラム整列での同一マッチとしてスコアー化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である、に計算される。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＢにとってのＡの％アミノ酸配列同一性はＡにとってのＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことは認識されている。
【００６２】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、本明細書では、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる人工の核酸分子を意味すると理解されている。したがって、用語「核酸構築物」は天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は天然に存在する核酸分子（の部分）を含んでいてもよい。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、そのような配列に適合する宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現を引き起こすことができるヌクレオチド配列のことである。これらの発現ベクターは典型的には、少なくとも適切な転写調節配列及び任意選択で３’転写終結シグナルを含む。発現エンハンサーエレメントなどの、発現を引き起こすのに必要な又は役立つ追加の因子も存在していてよい。発現ベクターは適切な宿主細胞内に導入され、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物においてコード配列の発現を引き起こすことができる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物での複製に適している。
【００６３】
本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置しており、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位並びに転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含むがこれらに限定されない他の任意のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写の量を直接的に又は間接的に調節するようにふるまう当業者には公知であるヌクレオチドの他の任意の配列の存在により構造的に同定される核酸断片のことである。「構成的」プロモーターとは、大半の生理及び発生条件下、大半の組織で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、例えば、化学誘導剤の適用により生理的に又は発生的に調節されるプロモーターである。
【００６４】
本明細書で使用されるように、用語「作動可能に連結された」とは機能的関係でのポリヌクレオチドエレメントの連結のことである。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合「作動可能に連結されている」。例えば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には近接しており、２つのタンパク質コード領域を結合させることが必要な場合、近接していてリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００６５】
発明の詳細な説明
本発明の抗ＣＣＲ７抗体
第１の態様では、本発明はＣＣＲ７に結合する抗原結合タンパク質を提供する。ＣＣＲ７に結合する本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、例えば、抗ＣＣＲ７抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体変異タンパク質、及び抗体変異体を含む、本明細書で上に定義される最も広い意味での抗ＣＣＲ７抗体である。本発明の抗ＣＣＲ抗体は、好ましくは、単離された抗体である。本発明の抗ＣＣＲ抗体は、霊長類ＣＣＲ７に結合するのが好ましく、ヒトＣＣＲ７に結合するのがさらに好ましい。ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列はジェンバンク：ＥＡＷ６０６６９．１で入手可能である（配列番号７５）。この配列のアミノ酸１〜２４は、発現中に切断される膜移行シグナルペプチドを含む。ヒトＣＣＲ７のアミノ酸２５〜５９はＮ終端細胞外ドメインを構成し、このドメインはＹ３２位及びＹ４１位に硫酸化チロシン残基を含む。種々の対立遺伝子変異体は、ジェンバンク：ＥＡＷ６０６６９．１の配列と比べて１つ又は複数のアミノ酸置換を有するヒトＣＣＲ７で知られている。本発明での「ヒトＣＣＲ７」は、少なくとも変異体が細胞外ドメイン及びＣＣＲ７の機能を有する限り、これらの対立遺伝子変異体を含む。
【００６６】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は好ましくは、ＣＣＲ７、好ましくはヒトＣＣＲ７のＮ終端細胞外ドメインに特異的に結合する。本発明の抗体は、好ましくは、Ｚが硫酸化チロシンであり、ｘが任意のアミノ酸であることが可能であり、Ｆが疎水性アミノ酸で置き換えることが可能である、アミン酸配列「ＺｘＬＦＥ」を含む又はからなるエピトープに特異的に結合する。したがって、本発明の抗体は好ましくは、ヒトＣＣＲ７のＮ終端細胞外ドメイン中の４１〜４５位にアミノ酸配列「ＺＴＬＦＥ」を含む又はからなるエピトープに特異的に結合する。抗体は、好ましくは、ヒトＣＣＲ７に特異的である。
【００６７】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、ヒトＣＣＲ７に対して又は「ＺＴＬＦＥ」エピトープを含む合成抗原に対して、好ましくは本明細書の実施例に記載される合成抗原ＳＹＭ１８９９に対して最小親和性を有する。したがって、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、２×１０−９Ｍ、１．８×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ若しくは１×１０−１１Ｍ又はそれよりも低いＫｄを有するのが好ましい。代わりに、抗体の最小親和性は、同じアッセイにおいて試験されるときは、基準抗ＣＣＲ７抗体のＫｄを参照することにより定義される。したがって、好ましくは、本発明の抗ＣＣＲ７抗体はヒトＣＣＲ７に対して又は「ＺＴＬＦＥ」エピトープを含む合成抗原（好ましくは、本明細書の実施例に記載される合成抗原ＳＹＭ１８９９）に対して、抗原に対する基準抗ＣＣＲ７抗体のＫｄの１０、５、２、１．５、１．２、１．１又は１．０５倍以下であるＫｄを有し、基準抗ＣＣＲ７抗体はマウス抗ＣＣＲ７抗体であり、その重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１であり、その軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号２である。基準のＫｄの１０倍以下であるＫｄを有する抗体は、基準抗体の親和性の１０分の１以上である親和性を有する抗体であることは本明細書では理解されている。したがって、基準抗体が１×１０−９ＭのＫｄを有する場合、問題の抗体は１×１０−８Ｍ又はそれよりも低いＫｄを有する。
【００６８】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、ヒトＣＣＲ７に又は「ＺＴＬＦＥ」エピトープを含む合成抗原（好ましくは、本明細書の実施例に記載される合成抗原ＳＹＭ１８９９；配列番号７６）に、最大のｋｏｆｆ速度定数で結合する。したがって、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、１×１０−３、１×１０−４若しくは１×１０−５ｓ−１又はそれよりも低いｋｏｆｆ速度定数を有するのが好ましい。代わりに、抗体の最大のｋｏｆｆ速度定数は、同じアッセイにおいて試験されるときは、基準抗ＣＣＲ７抗体のｋｏｆｆ速度定数を参照することにより定義される。したがって、好ましくは、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、ヒトＣＣＲ７に又は「ＺＴＬＦＥ」エピトープを含む合成抗原（好ましくは、本明細書の実施例に記載される合成抗原ＳＹＭ１８９９）に、抗原に対する基準抗ＣＣＲ７抗体のｋｏｆｆ速度定数の１０、５、２、１．５、１．２、１．１又は１．０５倍以下であるｋｏｆｆ速度定数で結合し、基準抗ＣＣＲ７抗体はマウス抗ＣＣＲ７抗体であり、その重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１であり、その軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号２である。
【００６９】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１から選択される少なくとも１つのＣＣＲ７リガンドによりＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達及び／又はＣＣＲ７受容体内部移行を阻害する中和抗体である。抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、例えば、本明細書の実施例に記載されるアッセイにおいて決定することができるように、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１から選択される少なくとも１つのＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達及び／又はＣＣＲ７受容体内部移行の阻害について、１５０、１００、８０、５０、３０、２５、２０、１５、１０、５又は３ｎＭ以下であるＩＣ５０を有する。代わりに、抗体の最大ＩＣ５０は同じアッセイにおいて試験されるときは、基準抗ＣＣＲ７抗体のＩＣ５０を参照することにより定義される。したがって、好ましくは、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、基準抗ＣＣＲ７抗体のＩＣ５０の１０、５、２、１．５、１．２、１．１又は１．０５倍以下であるＩＣ５０を有し、基準抗ＣＣＲ７抗体はマウス抗ＣＣＲ７抗体であり、その重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１であり、その軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号２である。
【００７０】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、例えば、本明細書の実施例に記載されるアッセイにおいて決定することができるように、実質的なアゴニスト効果なしで、さらに好ましくは検出可能なアゴニスト効果なしで、上記のＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達ＣＣＲ７を阻害する。
【００７１】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、
ＨＶＲ−Ｈ１は配列：Ｇ−Ｆ／Ｌ−Ｔ／Ａ／Ｐ−Ｆ−Ｓ／Ｔ／Ｒ−Ｎ／Ｄ／Ｓ−Ｙ／Ｆ−Ａを含み；
ＨＶＲ−Ｈ２  Ｈ１は配列：Ｉ−Ｓ−Ｓ／Ｄ−Ｇ／Ｒ−Ｇ−Ｓ／Ｔ／Ｆ−Ｙ／Ｈ／Ｆ−Ｔ／Ｐを含み；
ＨＶＲ−Ｈ３  Ｈ１は配列：Ａ／Ｔ／Ｖ／Ｇ−Ｒ−Ｒ／Ａ−Ａ／Ｅ／Ｔ−Ｙ／Ｇ／Ｔ−Ｒ／Ｖ−Ｙ／Ｖ−Ｄ／＊−ＧＴＧ／＊−Ｅ／Ｖ／Ｄ／Ａ／Ｇ／＊−Ｎ／Ｓ／Ｄ／Ｔ−Ａ／Ｓ／Ｄ−Ｍ／Ｌ／Ｆ−Ｙ／Ｓを含み；
ＨＶＲ−Ｌ１  Ｈ１は配列：Ｑ／Ｓ−Ｄ／Ｓ−Ｉ／Ｌ／Ｖ−Ｇ／Ｓ／Ｌ−Ｄ／Ｓ／Ｐ／Ｇ／Ｎ−Ｓ／Ｎ−＊／Ｙ／ＤＧＫＴＹを含み；
ＨＶＲ−Ｌ２  Ｈ１は配列：Ａ／Ｓ／Ｔ−Ｔ／Ｉ／Ｖ−Ｓを含み；
ＨＶＲ−Ｌ３  Ｈ１は配列：Ｌ／Ｗ／Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｆ／Ｇ／Ｗ−Ａ／Ｔ／Ｓ−Ｓ／Ｎ／Ｈ−Ｓ／Ｆ／Ｎ−Ｐ−Ｌ／Ｐ／Ｑ−Ｔを含み、「＊」はその位置にアミノ酸が存在できないことを示す。
【００７２】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号３〜１０のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号１１〜１６のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号１７〜２３のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号２４〜３０のうちの１つを含み；ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号３１〜３３のうちの１つを含み；及びＨＶＲ−Ｌ３が配列番号３４〜３９のうちの１つを含む抗体であるのがさらに好ましい。
【００７３】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、それぞれが、順番に、（ｉ）配列番号３、１１、１７、２４、３２、及び３４；（ｉｉ）配列番号４、１２、１８、２５、３１、及び３５；（ｉｉｉ）配列番号５、１２、１８、２６、３１、及び３５；（ｉｖ）配列番号６、１３、１９、２７、３１、及び３６；（ｖ）配列番号７、１４、２０、２４、３１、及び３５；（ｖｉ）配列番号８、１５、２１、２８、３１及び３７；（ｖｉｉ）配列番号９、１６、２２、２９、３３及び３８；又は（ｖｉｉｉ）配列番号１０、１４、２３、３０、３１及び３９を含むのが最も好ましい。
【００７４】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体はマウス抗体又はキメラ、例えば、マウス−ヒト抗体でも可能である。しかし、好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本発明に従ったヒト化抗体は、好ましくは、抗体が投与される対象において抗体に対する免疫原性応答をほとんど又はまったく誘発しない。例えば、本発明に従ったヒト化抗体は、宿主対象において、例えば、配列番号１及び２の配列を含む最初のマウス抗体と比べて、かなり減少したレベルでヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を誘発する及び／又は誘発すると予想される。ヒト化抗体は、最小のヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を誘発する若しくは誘発しない及び／又はこれを誘発する若しくは誘発しないと予想されるのが好ましい。本発明の抗体は、臨床的に許容できるレベルである又はそれよりも低い抗マウス抗体応答を誘発するのが最も好ましい。
【００７５】
非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当技術分野では公知である。例えば、ヒト化抗体は、１つ又は複数のアミノ酸残基を非ヒトである供給源から導入させることが可能である。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、この残基は典型的には「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的には、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６頁）の方法に従って実施することが可能である。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインよりかなり少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの超可変領域残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体由来の類似する部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【００７６】
ヒト化抗体を作成するのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽でも重でも、抗原性を減少させるのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次に、齧歯類の配列に最も近いヒト配列はヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして受け入れられる（Ｓｉｍｓら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１頁）。別の方法は、軽又は重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２６２３頁）。
【００７７】
抗体が抗原に対する高親和性及び他の都合の良い生物学的特性を保持したままヒト化されるのはさらに重要である。この目標を達成するため、１つの方法に従って、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析のプロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の高可能性な三次元立体構造を図示し表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これらの表示を検査すれば、候補免疫グロブリン配列の機能化での残基の可能性のある役割を分析すること、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基を分析することが可能になる。この方法で、ＦＲ残基は、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性などの所望の抗体特徴が達成されるように、レシピエント及び移入配列から選択し組み合わせることが可能である。一般に、超可変領域残基は抗原結合に影響を与えることに直接及び最も実質的に関与している。
【００７８】
本発明の好ましいヒト化抗体を作成するのに使用される好ましいヒト可変ドメインフレームワーク領域の選択では、軽でも重でも、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して７２９抗体のマウスＶＨドメインとの比較のためにヒトＩｇＧ配列のオンラインデータベースを検索した。候補ヒト可変ドメインは上位２００ＢＬＡＳＴ結果から選択された。これらの候補は、重要なフレームワーク残基を維持しているフレームワーク相同性及びキャノニカルループ構造の組合せに基づいて３候補まで絞り込まれた。
【００７９】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、抗体の重鎖可変ドメインがＨＦＲ１、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＦＲ２、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＦＲ３、ＨＶＲ−Ｈ３及びＨＦＲ４の順に作動可能に連結されている４つの重鎖フレームワーク領域、ＨＦＲ１〜ＨＦＲ４、及び３つの超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１〜ＨＶＲ−Ｈ３を含み、抗体の軽鎖可変ドメインがＬＦＲ１、ＨＶＲ−Ｌ１、ＬＦＲ２、ＨＶＲ−Ｌ２、ＬＦＲ３、ＨＶＲ−Ｌ３及びＬＦＲ４の順に作動可能に連結されている４つの軽鎖フレームワーク領域、ＬＦＲ１〜ＬＦＲ４、及び３つの超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１〜ＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体である。本発明の抗体中の重鎖フレームワーク領域ＨＦＲ１〜ＨＦＲ４は：ｉ）それぞれ配列番号４０、４３、４５及び４８（すなわち、ＶＨ１由来のＦＲ）；ｉｉ）それぞれ配列番号４１、４４、４６及び４９（すなわち、ＶＨ２由来のＦＲ）；又はｉｉｉ）それぞれ配列番号４２、４４、４７及び４９（すなわち、ＶＨ３由来のＦＲ）のアミノ酸配列を有するのが好ましい。本発明の抗体中の軽鎖フレームワーク領域ＬＦＲ１〜ＬＦＲ４は：ｉｖ）それぞれ配列番号５０、５２、５５及び５８（すなわち、ＶＬ１由来のＦＲ）；又はｖ）それぞれ配列番号５１、５３、５６及び５９（すなわち、ＶＬ２由来のＦＲ）のアミノ酸配列を有するのが好ましい。
【００８０】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体では、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号６１、６２及び６３（ＶＨ１、２又は３）のうちの少なくとも１つに少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むのが好ましく、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号６１に少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むのがさらに好ましい。
【００８１】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体では、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号６４及び６５（ＶＫ１又は２）のうちの少なくとも１つに少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むのが好ましく、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号６４に少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むのがさらに好ましい。
【００８２】
本発明の特に好ましい抗ＣＣＲ７抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（すなわち、ＶＨ１可変ドメイン）及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（すなわち、ＶＫ１可変ドメイン）を含む。
【００８３】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体のアミノ酸配列改変（複数可）が想定されている。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改良するのが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体コード核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような改変は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はこれへの挿入、及び／又はこれの置換を含む。最終構築物が所望の特徴を有するのであれば、最終構築物を達成するために欠失、挿入、及び置換のいかなる組合せでも行われる。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置を変えるなどの、アンタゴニストの翻訳後工程を変更してもよい。
【００８４】
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から１００又はそれよりも多い残基を含有するポリペプチドまでに及ぶアミノ−及び／又はカルボキシ−終端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。終端挿入の例は、Ｎ終端メチオニル残基を有するアンタゴニスト又は細胞傷害性ポリペプチドに融合されたアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、酵素のアンタゴニストのＮ−又はＣ終端への融合物、又はアンタゴニストの血清半減期を増加させるポリペプチドを含む。
【００８５】
別のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体はアンタゴニスト分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基で置き換えられている。抗体アンタゴニストの置換変異誘発のための最も大きな目的の部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ変化も想定されている。
【００８６】
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体はアンタゴニストの最初のグリコシル化パターンを変更する。変更するとは、アンタゴニスト中に見出される１つ若しくは複数の炭水化物部分を欠失する、及び／又はアンタゴニスト中には存在しない１つ若しくは複数のグリコシル化部位を加えることを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は典型的には、Ｎ連結又はＯ連結である。Ｎ連結とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合のことである。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンはアスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在すると潜在的なグリコシル化部位を生み出す。Ｏ連結グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに単糖又は単糖誘導体Ｎアセチルガラクトサミン、ガラクトース、若しくはキシロースのうちの１つが結合することであるが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンを使用してもよい。抗体にグリコシル化部位を加えることは、抗体が上記トリペプチド配列のうちの１つ又は複数を含有する（Ｎ連結グリコシル化部位のために）ようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく成し遂げられる。最初の抗体の配列に１つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加する、又はこれらの残基で置換することにより変更を加えてもよい（Ｏ連結グリコシル化部位のために）。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当技術分野で公知の種々の方法により調製される。これらの方法は、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合に）又はオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及び以前調製された変異体若しくはアンタゴニストの非変異版のカセット変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は軽鎖及び／又は重鎖抗体定常領域を含む。当技術分野で公知のいかなる抗体定常領域でも使用することが可能である。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ−又はラムダ−タイプの軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ−又はラムダ−タイプの軽鎖定常領域が可能である。重鎖定常領域は、例えば、アルファ−、デルタ−、エプシロン−、ガンマ−、又はミュータイプの重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ−、デルタ−、エプシロン−、ガンマ−、又はミュータイプの重鎖定常領域が可能である。したがって、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、いかなるアイソタイプでも、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域を含む定常領域を有することが可能である。一実施形態では、軽又は重鎖定常領域は天然に存在する定常領域の断片、誘導体、変異体、又は変異タンパク質である。目的の抗体から異なるサブクラス又はアイソタイプの抗体を導き出すための技法、すなわち、サブクラススイッチングは公知である。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体から導き出してもよく、逆の場合も同様である。そのような技法により、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体のアイソタイプ又はサブクラスとは異なる抗体アイソタイプ又はサブクラスに関連する生物学的特性も示す新しい抗体の調製が可能になる。組換えＤＮＡ技法を用いてもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化されたＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡをそのような手順で用いてもよい。Ｌａｎｔｔｏら（２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．１７８：３０３〜１６頁）も参照されたい。したがって、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、例えば、本明細書で開示され所望のアイソタイプを有する可変ドメイン配列のうちの１つ又は複数を含む抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）、並びにそのＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片を含む。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、ＩｇＧ４抗体に異種性をもたらすことが可能なＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するためにＢｌｏｏｍら（１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７頁）に記載されるヒンジ領域中に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）を導入するのも望ましいことがある。
【００８８】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、好ましくは、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害及び食作用からなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を有する機能的Ｆｃ領域を含む。
【００８９】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、エフェクター機能を改良するために、例えば、抗体のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを増強するように、改変することが可能である。これは、抗体のＦｃ領域に１つ又は複数のアミノ酸置換を導入することにより達成可能である。本発明の抗体のＦｃ領域での好ましい置換は、例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４頁（２０００）に記載されているなどの、Ｃ１ｑ結合を増加させ、それによって、ＣＤＣ活性を増加させる置換である。Ｃ１ｑ結合を増加させるＦｃ領域での好ましい置換はＥ３３３Ａ置換である。
【００９０】
糖タンパク質、例えば、抗体のアミノ酸骨格に付加されているグリコシル基はいくつかの単糖又は単糖誘導体により形成され、異なる哺乳動物又は組織由来の細胞で産生される同じ抗体で異なることがある組成物を生じる。さらに、グリコシル基の異なる組成が抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する際の効力に影響を与えることがあり得ることが明らかにされている。したがって、異なる供給源由来の抗体のグリコシル化のパターンを研究することによりそうした特性を改良することが可能である。そのようなアプローチの例はＮｉｗａら（２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４（６）：２１２７〜３３頁）である。
【００９１】
代わりに又はさらに、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、それによってこの領域での鎖内ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして産生されるホモ二量体抗体は、改良された内部移行能力並びに／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎら（１９９２年、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１〜１１９５頁）ａｎｄ  Ｓｈｏｐｅｓ、（１９９２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８〜２９２２頁）を参照されたい。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら（１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０〜２５６５頁）に記載されるヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製してもよい。代わりに、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作することが可能であり、それによって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９８９年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９〜２３０頁）を参照されたい。抗体の血清半減期を増加させるためには、例えば、米国特許第５７３９２７７号に記載されている通りに、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に組み込んでもよい。本明細書で使用されるように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープのことである。
【００９２】
本発明の好ましい抗ＣＣＲ７抗体は、ヒトアロタイプＧｌｍ１７，１の重鎖定常領域を含み（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）ＭＡｂｓ  １巻  ４号、１〜７頁参照）、この重鎖定常領域は配列番号７９のアミノ酸配列を含む。本発明の抗体中のヒトアロタイプＧｌｍ１７，１の重鎖定常領域はＥ３３３Ａ置換を含むのがさらに好ましく、この重鎖定常領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む。
【００９３】
がんの細胞毒性化学療法又は放射線療法は、その療法が悪性細胞に対して選択性ではないために感受性正常細胞への毒性から生じる重篤な生命を危うくすることもある副作用により制限される。これらの問題を回避する１つの戦略は、治療薬を本発明の抗ＣＣＲ７抗体などの抗体と連結することである。これにより、リガンド標的治療法への悪性細胞の曝露が増え、正常細胞の曝露が減る。Ａｌｌｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２：７５０〜７６３頁（２００２）を参照されたい。治療薬は免疫抑制剤、すなわち、本明細書で処置されている哺乳動物の免疫系を抑制する又は遮蔽するように作用する物質が可能である。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原発現を下方調節する若しくは抑制する、又はＭＨＣ抗原を遮蔽する物質を含むと考えられる。治療薬は、細胞傷害剤、すなわち、細胞の機能を阻害する若しくは妨げる及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質でも可能である。上記用語は、放射性同位元素、化学療法薬、すなわち、がんの処置に有用な化学化合物、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素、又はその断片を含むことが意図されている。治療薬は、サイトカイン、ホルモン、成長因子、壊死因子、すなわち、細胞間介在物質として又は同じ細胞集団においてさえ別の細胞に作用する１つの細胞集団により放出されるタンパク質又はペプチドでも可能である。本明細書で使用されるように、用語サイトカインは、天然の供給源由来の又は組換え細胞培養物由来のタンパク質及びペプチド並びに天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。治療薬は、親薬物と比べて腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く酵素的に活性化される又はもっと活性な親形態に変換されることができる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体形態のことであるプロドラッグでも可能である。
【００９４】
抗体と１つ又は複数の小分子毒素のコンジュゲート
本発明の一好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＣＲ７抗体は１つ又は複数の毒素分子にコンジュゲートされている。使用することが可能である酵素的に活性な毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ディアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰ１、ＰＡＰ１１、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン類を含む。
【００９５】
本発明は、核酸分解活性を備えた化合物（例えば、リボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は細胞構造又はオルガネラを損傷し、したがって、細胞を死滅する又は細胞の活力を減じることができる他の化合物にコンジュゲートされた抗体をさらに想定している。
【００９６】
本発明の抗体は、プロドラッグを活性な抗がん薬に変換するプロドラッグ活性化剤にコンジュゲートされていてもよい。そのようなコンジュゲートの薬剤成分は、プロドラッグをそのもっと活性な細胞傷害形態に変換するような方法でプロドラッグに作用することができるいかなる薬剤でも含む。
【００９７】
代わりに、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗ＣＣＲ７抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築することが可能である（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜６０８頁参照）。
【００９８】
抗体と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは種々の二機能性タンパク質カップリング剤又はリンカーを使用して作ってもよい。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能リンカー」でもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーを使用してもよい。代わりに、抗体及び細胞傷害性薬剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技法又はペプチド合成により作ってもよい。
【００９９】
本発明の抗体の産生及び精製
本発明の抗ＣＣＲ７抗体はいくつかの従来の技法のいずれによっても調製することが可能である。本発明の抗ＣＣＲ７抗体は通常、当技術分野で公知であるいかなる技法でも使用して、組換え発現系で産生される。例えば、Ｓｈｕｋｌａ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｍｅｓ（２０１０年、「Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（５）：２５３〜２６１頁）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい。当技術分野で公知であるいかなる発現系でも使用して、本発明の組換えポリペプチドを作ることが可能である。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。
【０１００】
一態様では、したがって、本発明は、本発明の抗ＣＣＲ７抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。１つのヌクレオチド配列は本発明の抗ＣＣＲ７抗体の軽鎖の少なくとも可変ドメインを含むポリペプチドをコードし、別のヌクレオチド配列は本発明の抗ＣＣＲ７抗体の重鎖の少なくとも可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。好ましい核酸分子は、本発明の抗体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、例えば、プロモーター及びシグナル配列などの発現調節配列に作動可能に連結されている発現ベクターである。本発明の抗ＣＣＲ７抗体ポリペプチドの発現のための好ましいシグナル配列は、例えば、重鎖シグナルペプチド：ＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳ（配列番号７７）及び軽鎖シグナルペプチド：ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣ（配列番号７８）を含む。
【０１０１】
別の態様では、本発明はこのセクションの上記核酸分子を含む細胞に関する。細胞は好ましくは、単離された細胞又は培養された細胞である。用いてもよい宿主細胞には、原核、酵母又は高等真核細胞がある。原核生物はグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌を含む。高等真核細胞は昆虫細胞及び哺乳動物起源の確立した細胞株を含む。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞株、及びにＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１より記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ由来のＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株を含む。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主を用いて使用するための適切なクローニング及び発現ベクターはＰｏｕｗｅｌｓら．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５年）により記載されている。
【０１０２】
形質転換された細胞はポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することが可能である。したがって、一態様では、本発明は、本発明の抗ＣＣＲ７抗体を産生するための方法であって、ポリペプチドの発現に、及び、任意選択でポリペプチドを回収するのに貢献する条件下で、本明細書で定義される少なくとも１つの発現ベクターを含む細胞を培養するステップを含む方法に関する。
【０１０３】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は、例えば、ラクダ由来単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体断片に基づいて独特のアフィニティー精製溶液を提供するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）リガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｅｉｆｌｅｒら、２０１４年．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｔｐｒ．１９５８を参照）を含む、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｌｏｗら、２００７年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、８４８：４８〜６３頁；Ｓｈｕｋｌａら、２００７年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、８４８：２８〜３９頁を参照）を含む、従来のタンパク質精製手順により回収することが可能である。本明細書で使用するために想定されているポリペプチドは、汚染内在性物質が実質的にないかなり均一な組換え抗ＣＣＲ７抗体ペプチドを含む。
【０１０４】
本発明の抗体を含む組成物
他の態様では、本発明は、対象に投与するための、本発明の抗ＣＣＲ７抗体、すなわち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体、若しくはその抗原結合断片、又はその医薬誘導体若しくはプロドラッグを、薬学的に許容される担体、アジュバンド、若しくは溶媒と一緒に含む医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、それを必要とする対象に有効量の組成物を投与することにより本明細書の下に記載される処置の方法で使用することが可能である。本明細書で使用される用語「対象」とは、哺乳動物として分類されるすべての動物のことであり、霊長類及びヒトを含むがこれらに限定されない。対象は好ましくは任意の年齢又は人種の男性又は女性ヒトである。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」とは、医薬品投与と適合するありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌抗真菌剤、等張吸収遅延剤、及び同類の物を含むことが意図されている（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅら  ｅｄｓ．７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍを参照）。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野では周知である。いかなる従来の媒体又は薬剤でも活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物中でのその使用が想定されている。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなどの）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；サクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、亜鉛タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０６】
本発明の抗体は同じ製剤中にあってもよく、異なる製剤で投与されてもよい。投与は同時でも逐次でも可能であり、どちらの順番でも効果的であることがある。
【０１０７】
補助活性化合物も本発明の医薬組成物中に組み込むことが可能である。したがって、特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、処置中の特定の適応症のために必要に応じて１つを超える活性化合物、好ましくは、互いに悪い影響を与えない相補的活性を有する化合物を含有してもよい。例えば、化学療法薬、サイトカイン、鎮痛剤、又は免疫調節薬、例えば、免疫抑制薬若しくは免疫賦活薬をさらに供給するのが望ましいこともある。そのような他の活性薬剤の有効量は、とりわけ、医薬組成物中に存在する本発明の抗体の量、疾病若しくは障害又は処置のタイプ、等に依拠する。
【０１０８】
実施形態では、本発明の抗体は、留置剤及びマイクロカプセル化送達システム、例えば、リポソームを含む、放出制御製剤などの、身体からの急速な排除に対して上記化合物を保護する担体と一緒に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することが可能である。そのような製剤の調製のための方法は当業者には明らかである。標的にされたリポソームを含む、リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用することが可能である。これらは、例えば、米国特許第４５２２８１１号、国際公開第２０１０／０９５９４０号に記載される、当業者に公知の方法に従って調製することが可能である。
【０１０９】
本発明の抗体（又はその断片）の投与経路は、経口でも、非経口でも、吸入によっても、局所的でも可能である。本明細書で使用される用語「非経口の」は、
静脈内、動脈内、リンパ内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣投与を含む。静脈内形態の非経口投与が好ましい。「全身投与」とは、経口、静脈内、腹腔内及び筋肉内投与を意味する。治療又は予防効果に必要な抗体の量は、当然のことながら、選択される抗体、処置中の状態の性質及び重症度並びに患者によって変化する。さらに、抗体は、例えば、抗体の減少用量でパルス注入により適切に投与してもよい。投与は注射により与えられるのが好ましく、一部、投与が短時間又は慢性かどうかに応じて、静脈内又は皮下注射が最も好ましい。
【０１１０】
したがって、特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、適切な単位用量形態での無菌溶液、懸濁液又は凍結乾燥製剤などの非経口投与に適した形態でもよい。注射可能な使用に適した医薬組成物は、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体は生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。あらゆる場合に、組成物は無菌でなければならず、容易な注射器使用可能性が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、薬学的に許容されるポリオール様グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、及びその適切な混合物を含有する溶剤又は分散媒が可能である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散の場合には必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することが可能である。微生物の作用の予防は、種々の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、並びに同類の物により達成することが可能である。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。
【０１１１】
注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによりもたらすことが可能である。
【０１１２】
無菌注射溶液は、活性化合物（例えば、ポリペプチド又は抗体）を必要な量で適切な溶剤に、適宜、上に列挙されている成分のうちの１つ又は組合せと共に取込み、続いて濾過無菌化することにより調製することが可能である。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上に列挙されている成分から必要な他の成分を含有する無菌溶媒中に活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより活性成分とその既に無菌濾過されている溶液からの任意の追加の望ましい成分の粉末が得られる。
【０１１３】
特定の実施形態では、上記医薬組成物は静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）を介して投与される。充填剤、緩衝剤又は界面活性剤などの適切な賦形剤を使用することが可能である。当技術分野では周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｅｄ．Ａｌｌｅｎ、Ｌ．Ｖ．２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）を含む種々の出典にさらに詳細に記載されているように、言及された製剤は、非経口投与組成物を調製するための標準法を使用して調製される。
【０１１４】
容易な投与及び投与量の均一性のために、医薬組成物、すなわち、非経口組成物を単位剤形で処方するのが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、対象が処置を受けるための単位投与量として適した物理的に別々の単位のことであり；それぞれの単位は必要な医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算され予め決められた量の活性化合物（本発明の抗体）を含有する。本発明の単位剤形の規格は、活性化合物の独特の特徴及び達成されることになる特定の治療効果及び個体の処置のためのそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限により規定され、これに直接依拠している。
【０１１５】
一般に、本発明の抗体の効果的投与量は、選択される化合物の相対的効力、処置中の障害の重症度及び患者の体重に依拠することになる。しかし、活性化合物は典型的には、１日に１回又は複数回、例えば、１日に１、２、３又は４回投与され、典型的な全１日量は０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、最も好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【０１１６】
患者への抗体の投与は別として、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を想定している。国際特許第９６／０７３２１号は、細胞内抗体を産生するための遺伝子治療の使用に関する。
【０１１７】
医薬組成物は、投与の説明書と一緒に容器、パック、又はディスペンサーに含めることが可能である。
【０１１８】
本発明の抗体及び医薬組成物を他の薬物と一緒に使用して併用療法を提供してもよい。他の薬物は同じ組成物の一部を形成しても、同時間又は異なる時間での投与のために別々の組成物として提供してもよい。
【０１１９】
本発明の抗体の使用
本発明の抗体及び医薬組成物は広範囲の疾患、状態、及び適応症の処置に有用になる。処置することが可能な疾患のタイプの例は、がん状態、炎症状態、組織又は臓器移植から生じる状態及び合併症、並びに線維症から生じる又はこれに関連する状態及び合併症を含む。
【０１２０】
本発明の抗体及び医薬組成物はがんに関連する障害又は疾病を処置するために、特に前記がんがＣＣＲ７受容体を発現している腫瘍細胞を特徴とするがんを処置するために、より詳細にはＣＣＲ７受容体を発現している腫瘍細胞を死滅させる又はこのアポトーシスを誘導するために適切に使用することが可能である。その腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現し、本発明に従った処置に感受性である説明的で非限定的がんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん又は頭頸部の扁平上皮癌及び結腸癌を含む。好ましい実施形態では、本発明に従った処置に感受性であるがんは、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん又は頭頸部の扁平上皮癌及び結腸癌を含む。非常に好ましい実施形態では、本発明に従った処置に感受性であるがんは、濾胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化及び骨髄異形成症候群の急性転化を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、本発明に従って処置されるがんはＣＬＬ及びＭＣＬを含む。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は本明細書に記載される医学的状態の他の処置、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗ホルモン薬、種々の症状に対する治療薬、例えば、鎮痛剤、利尿薬、抗利尿剤、抗ウイルス剤、抗生物質、サイトカイン、栄養補助剤、貧血治療薬、血液凝固治療薬、骨治療薬、精神医学及び心理的治療薬、並びに同類のものを含む、化学療法、放射線療法、免疫療法、又は手術法と組み合わせてもよい。
【０１２２】
自家骨髄又は幹細胞移植をもたらすために抗ＣＣＲ７抗体を用いた処置の後で上記患者から骨髄又は末梢血幹細胞を収穫してもよい。
【０１２３】
本発明の抗体の投与に先立って、がん性Ｂ細胞の表面でのＣＣＲ７又は他の標的タンパク質の発現を上方調節するために患者をサイトカインで処置するのも有用なことがある。サイトカインは、免疫エフェクター機能を刺激するために枯渇性抗体又は放射標識抗体の投与と同時に又はこれに先立って又はこの後に投与してもよい。
【０１２４】
一実施形態では、化学療法レジメンは本明細書に開示される治療を補完するのに使用してもよく、上記放射標識抗体の投与と同時に又はいかなる順でも逐次施してもよい。化学療法レジメンは、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン（ヒドロキシルダウノルビシンとも呼ばれる）、ビンクリスチン（オンコビンとも呼ばれる）及びプレドニゾン）、ＩＣＥ（イダルビシン、シタラビン及びエトポシド）、ミトザントロン（Ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、シタラビン、ＤＶＰ（ダウノルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン）、ＡＴＲＡ（すべてのトランス型レチノイン酸）、イダルビシン、ホエルツァー化学療法レジメン、ラ化学療法レジメン、ＡＢＶＤ（ブレオマイシン、ダカルバジン、ドキソルビシン及びビンクリスチン）、ＣＥＯＰ（シクロホスファミド、エピルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン）、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン）、ＦＬＡＧ＆ＩＤＡ（フルダラビン、シタラビン、フィルガストリム及びイダルビシン）、（それに続くＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）処置と一緒に又はなしで）、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン及びデキサメタゾン）、Ｍ＆Ｐ（メルファラン及びプレドニゾン）、Ｃ（シクロホスファミド）毎週、ＡＢＣＭ（アドリアマイシン、ブレオマイシン、シクロホスファミド及びマイトマイシン−Ｃ）、ＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）及びＤＨＡＰ（デキサメタゾン、シタラビン及びシスプラチン）からなる群から選択してもよい。好ましい化学療法レジメンはＣＨＯＰである。
【０１２５】
したがって、別の態様では、本開示は、がん、詳細にはその腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するがんを処置するための方法であって、上記処置を必要とする対象に治療有効量の本発明の抗体、すなわち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。特定の実施形態では、上記がんはＣＣＲ７受容体を発現している腫瘍細胞を特徴とするがんである。本発明に従って処置される説明的非限定的がんは、ＣＬＬ、ＭＣＬ、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん又は頭頸部の扁平上皮癌及び結腸癌を含む。好ましい実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、乳がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、胃がん又は頭頸部の扁平上皮癌及び結腸癌を含む。非常に好ましい実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、濾胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化及び骨髄異形成症候群の急性転化を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、本発明に従って処置されるがんはＣＬＬ及びＭＣＬを含む。
【０１２６】
他の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現している腫瘍細胞を死滅させるための又はそのアポトーシスを誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、上記細胞を本発明の抗体、すなわち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体、又はその抗原結合断片に接触させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、上記腫瘍細胞は、ＣＬＬ及びＭＣＬ細胞などの、ＣＣＲ７受容体を発現している腫瘍細胞である。
【０１２７】
「ＣＣＲ７ポリペプチドを発現している腫瘍細胞の成長を阻害する」抗体又は「成長阻害」抗体とは、適切なポリペプチドを発現している又は過剰発現しているがん細胞の測定可能な成長阻害をもたらす抗体のことである。ＣＣＲ７ポリペプチドはがん細胞の表面で発現される膜貫通型ポリペプチドである。好ましい成長阻害抗ＣＣＲ７抗体は、適切な対照、典型的には試験されている抗体で処置されない腫瘍細胞である対照と比べて、ＣＣＲ７発現腫瘍細胞の成長を２０％よりも多く、好ましくは約２０％〜約５０％、さらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％〜約１００％）阻害する。一実施形態では、成長阻害は、細胞培養物中約０．１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することが可能であり、成長阻害は抗体に腫瘍細胞を曝露して１〜１０日後に判定される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の成長阻害は、ＣＣＲ７を発現している腫瘍細胞についての欧州特許第２４７４５５７号に記載されているなどの種々の方法で判定することが可能である。約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗ＣＣＲ７抗体の投与により、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内に、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍サイズ又は腫瘍細胞増殖が減少する場合は、抗体はｉｎ  ｖｉｖｏで成長阻害性である。
【０１２８】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞縮み、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成により判定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。細胞は通常、ＣＣＲ７ポリペプチドを過剰発現する細胞である。細胞は腫瘍細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好塩基球、好酸球、好中球、単球、血小板又は赤血球などの造血細胞であるのが好ましい。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するための種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転位はアネキシン結合により測定可能であり；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダリングを通じて評価可能であり、核／クロマチン凝縮はＤＮＡ断片化と共に低二倍体の細胞のいかなる増加によっても評価可能である。アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて未処置の細胞と比べてアネキシン結合の誘導が約２〜５０倍が好ましく、約５〜５０倍が好ましく、最も好ましくは約１０〜５０倍になる抗体である。
【０１２９】
「細胞死を誘導する」抗体は、生細胞を生育不能にさせる抗体である。上記細胞はＣＣＲ７ポリペプチドを発現する細胞であり、ＣＣＲ７ポリペプチドを特異的に発現する又は過剰発現する細胞型である。細胞は特定の細胞型のがん性細胞でも正常細胞でもよい。ＣＣＲ７ポリペプチドは、がん細胞の表面で発現される膜貫通型ポリペプチドでも、又はがん細胞により産生され分泌されるポリペプチドでもよい。細胞はがん細胞、例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞でもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により誘導される細胞死を区別するため、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で決定してもよい。したがって、細胞死についてのアッセイは熱不活化血清を使用して（すなわち、補体の非存在下で）及び免疫エフェクター細胞の非存在下で実施してもよい。抗体が細胞死を誘導できるかどうかを判定するため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１〜１１頁（１９９５）を参照）又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜統合性の消失を非処置細胞と比べて評価することが可能である。好ましい細胞死誘導抗体はＢＴ４７４細胞でＰＩ取込みアッセイにおいてＰＩ取込みを誘導する抗体である。
【０１３０】
ＣＣＲ７受容体を発現しており本発明の方法での処置に感受性の腫瘍細胞に関する情報、抗体、投与レジメン及び投与量はすでに言及済みである。特定の実施形態では、ＣＣＲ７受容体を発現しており上記方法での処置に感受性の腫瘍細胞はＣＬＬ又はＭＣＬ細胞である。
【０１３１】
あらゆる場合に、言い回し「治療有効量」とは、既に定義されているがんを処置するのに効果的な量を意味し；上記量は所望の応答をもたらす、又は、例えば、転移の症状若しくは徴候若しくは原発腫瘍進行、サイズ、若しくは成長を寛解するのに十分な量であることが可能である。特定の対象に対する治療有効量は、処置を受けている状態、対象の健康全般、投与の方法、経路、及び用量並びに副作用の重症度などの要因に応じて変化することがある。効果は定量化の少なくとも約１０％の変化をもたらすのが好ましく、少なくとも２０％、３０％、５０％、７０％、又は９０％でも、又はそれよりも多いのが好ましい。組み合わせた場合、治療有効量は成分の組合せに比例し、効果は個々の成分単独に限定されない。治療有効量は症状を典型的には少なくとも約１０％；通常は少なくとも約２０％；好ましくは少なくとも約３０％；又はさらに好ましくは少なくとも約５０％調節する。代わりに、遊走の調節とは、種々の細胞型の遊走又は輸送が影響を受けることを意味する。そうしたことにより、例えば、影響を受けている細胞の数の統計的に有意で数量化できる変化が生じる。これは、時期又は標的領域内で引き付けられている標的細胞の数の減少のことがある。原発腫瘍進行、サイズ、播種又は成長の速度をモニターしてもよい。
【０１３２】
抗ＣＣＲ７抗体及びそのような抗体を含む本発明の組成物を使用して、炎症状態並びに組織又は臓器移植から生じる状態及び合併症を処置することも可能である。
【０１３３】
ＣＣＲ７活性は、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関係付けられる。クローン病は、腸の細菌叢に対する過度に活性なＴＨ１媒介免疫応答を反映すると考えられている慢性衰弱性炎症性腸疾患である。クローン病の病変は腸のどこにでも、時に胃腸管の他の場所に現われることがある。一方、潰瘍性大腸炎病変は通常、結腸に現われる。その病変の性質も異なっているが、その疾患は臨床的に区別するのが時に困難なほど十分に類似している。例えば、米国特許第６５５８６６１号を参照されたい。本明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、ＩＢＤ患者を処置し、及び／又はＩＢＤの１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１３４】
ＣＣＲ７活性の阻害は組織又は臓器移植拒絶と関係付けられてきた（Ｌｏら、２５  ２０１１年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９１：７０〜７７頁；Ｌｉｕら、２０１１年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１：６１１〜２３頁；Ｙｕｌｉｎｇら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８：１４０１〜１２頁）。本明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、組織又は臓器移植レシピエント、例えば、腎臓、心臓、皮膚、若しくは肺移植レシピエントを処置し、及び／又は移植手術の１つ若しくは複数の合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１３５】
ＣＣＲ７活性は喘息、アレルギー性気管支炎、気管支平滑筋過形成、及び線維性肺疾患と関係付けられてきた（Ｇｏｍｐｅｒｔｓら、２００７年、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．８２：４４９〜５６；Ｋａｗａｋａｍｉら、２０１２年、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５７５：２４〜３２頁；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、２００９年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３９：１６８４〜９２頁）。明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、喘息、アレルギー性気管支炎、気管支平滑筋過形成、若しくは線維性肺疾患を抱えた患者を処置し、及び／又はこれらの疾患の１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１３６】
ＣＣＲ７活性は関節リウマチと関係付けられてきた（Ｍｏｓｃｈｏｖａｋｉｓら、２０１２年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１９４９〜５５頁）。明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、関節リウマチを抱えた患者を処置し、及び／又は関節リウマチの１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１３７】
ＣＣＲ７活性は多発性硬化症と関係付けられてきた（Ａｕｎｇら、２０１０年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２２６：１５８〜６４頁）。明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、多発性硬化症を抱えた患者を処置し、及び／又は多発性硬化症の１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１３８】
ＣＣＲ７活性は乾癬と関係付けられてきた（Ｆａｎら、２００８年、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  Ｌｅｐｒｏｌ．７４（５）：５５０頁；Ｂｏｓｅら、２０１３年、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１８３（２）：４１３〜４２１頁）。明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、乾癬を抱えた患者を処置し、及び／又は乾癬の１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１３９】
ＣＣＲ７活性はアテローム性動脈硬化症と関係付けられてきた（Ｌｕｃｈｔｅｆｅｌｄら、２０１０年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０  １２２：１６２１〜２８頁）。明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、アテローム性動脈硬化症を抱えた患者を処置し、及び／又はアテローム性動脈硬化症の１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１４０】
ＣＣＲ７活性はＨＩＶ感染と関係付けられてきた（Ｅｖａｎｓら、２０１２年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２３：１５１〜５７頁）。明細書に記載される抗体及び組成物を使用して、ＡＩＤＳを有する患者を含む、ＨＩＶに感染した患者、又はＨＩＶに罹患する若しくはＡＩＤＳを発症するリスクのある患者を処置し、及び／又はＨＩＶ若しくはＡＩＤＳの１つ若しくは複数の症状若しくは合併症を減少する、予防する、若しくは取り除くことが可能である。
【０１４１】
本発明の抗ＣＣＲ７抗体及びそのような抗体を含む組成物は、線維症、好ましくは組織線維症の治療のためにさらに使用することが可能である。組織線維症の例は、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、胃腸管線維症及び他の線維症疾患からなる群から選択される線維症を含む。肝線維症の例は、肝硬変、虚血性再灌流、肝臓移植後障害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される肝線維症を含む。肝硬変に関しては、アルコールによる誘導、薬物による誘導、及び化学誘導による誘導からなる群から選択される少なくとも１つにより引き起こされる肝硬変が挙げられる。腎線維症の例は、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚炎、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択される腎線維症を含む。肺線維症の例は、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞外傷（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、肺高血圧症、及び新生児気管支肺異形成症からなる群から選択される肺線維症を含む。皮膚線維症の例は、強皮症、ケロイド瘢痕、乾癬、肥厚性瘢痕、及び偽性強皮症（ｐｓｅｕｄｏ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される皮膚線維症を含む。心血管線維症の例は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心臓移植、及び心筋線維症からなる群から選択される心血管線維症を含む。胃腸管線維症の例は、コラーゲン大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成（ｃｒｙｐｔ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着手術後傷跡からなる群から選択される胃腸管線維症を含む。線維症は、骨関連線維性疾患から生じる状態を有することがあり、リウマチ様パンヌス形成のこともある。
【０１４２】
上に記載される上記治療法のいずれもそのような治療を必要とする、例えば、哺乳動物、好ましくは、霊長類、最も好ましくはヒトを含む、いかなる対象に適用してもよい。
【０１４３】
本文書では及びその特許請求の範囲では、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用は非限定的な意味で使用されて、この語に続く項目が含まれるが、具体的に言及していない項目は排除されないことを意味する。さらに、不定冠詞「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」による要素への言及は、文脈がその要素のうちの１つ及び１つだけが存在することを明白に要求していなければ、その要素のうちの１つよりも多くが存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１４４】
本明細書に引用されるすべての特許及び文献参照はこれにより参照によってその全体を組み込む。
【０１４５】
以下の実施例は説明目的でのみ提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１  マウス抗ＣＣＲ７ｍＡｂの産生
正常マウス（すなわち、マウス免疫系を備えたマウス）を、ヒトＣＣＲ７  Ｎ終端細胞外ドメイン由来のアミノ酸配列を含む又は発現している抗原で免疫化した。マウスモノクローナル抗体は標準ハイブリドーマ技術を使用して得た。
【０１４７】
ＣＣＲ７  Ｎ終端ドメインのＹ４１での硫酸化を欠く抗原を使用する最初の試みにより、ＣＣＬ１９−又はＣＣＬ２１−依存性ＣＣＲ７シグナル伝達を中和できない抗体が産生された。Ｙ４１の硫酸化を含む抗原での免疫化により、ＣＣＬ１９−又はＣＣＬ２１−依存性ＣＣＲ７シグナル伝達を中和することができる一連のマウスモノクローナル抗体が産生された。８つの選択されたマウス抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体について、配列が決定された。これら８つのモノクローナル抗体の超可変領域のアミノ酸配列は表１に収載されている。
【０１４８】
７２９マウス抗体の重及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１及び２に与えられている。
【表１】
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2018522568.tif 000003
【０１４９】
実施例２  マウス抗ＣＣＲ７ｍＡｂの評価
２．１  エピトープマッピング
モノクローナル抗体のエピトープマッピング（図１）は、以前公表されたプロトコルに従って実施された（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら、１９９６年  Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ、１：８７〜９６頁；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、２００７年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、２０：２８３〜９９年）。手短に言えば、それぞれのペプチドへの抗体の結合はＥＬＩＳＡベースのＰＥＰＳＣＡＮで試験される。ペプチドアレイは、例えば、遮断液（ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎ中４％ウマ血清、５％卵白アルブミン（ｗ／ｖ））に希釈した１ｍｇ／ｍｌからなる一次抗体液と一緒にインキュベートする。洗浄後、ペプチドは、２５℃で１時間、１０００倍希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと一緒にインキュベートする。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ  ２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び０．０５Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ４中０．００６％Ｈ２Ｏ２）を添加した。室温での１時間インキュベーション後、発色現像を測定した。発色現像は電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラと画像処理システムで定量化した。
【０１５０】
２．２  抗ＣＣＲ７ｍＡｂはＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達を阻害する
得られた抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体（表２）は、確立した標準βアレスチン動員アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、２０１３年、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．１８（５）：５９９〜６０９頁）により決定した場合、ヒトＣＣＲ７過剰発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１媒介細胞内シグナル伝達を阻害する。
【表２】
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【０１５１】
２．３  抗ＣＣＲ７ｍＡｂは細胞遊走を阻害する
マウスｍＡｂ７３０は、リガンドＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１により誘導されて内因的にヒトＣＣＲ７受容体を発現している、ヒトＴ細胞リンパ腫細胞の遊走（走化性）を阻害し、ＩＣ５０はそれぞれ１５ｎＭ及び６ｎＭである（図２）。
【０１５２】
細胞遊走アッセイは、８μｍポアサイズのインサート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたトランスウェルダブルチャンバーを使用して実施した。下のチャンバーは、０．５％のＢＳＡを補充したＨａｍＦ１２培養液に希釈したリガンド（ＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１）を含有した。ＣＣＲ７内因性発現細胞（Ｔ細胞リンパ腫（ＨｕＴ−７８）は抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体と一緒に前インキュベートし、インサート内に置かれ、チャンバーアセンブリー（ｃｈａｍｂｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を３７℃でインキュベートした。下のチャンバーの膜横断遊走細胞の量は、細胞溶解後、ＤＮＡ染色により決定した（ＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ、ＵＫ）。
【０１５３】
２．４  抗ＣＣＲ７ｍＡｂはアゴニスト効果なしでＣＣＲ７シグナル伝達を遮断する
高濃度（２６７ｎＭ）で試験すると、確立した標準βアレスチン動員アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、２０１３年、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．１８（５）：５９９〜６０９頁）により決定した場合、ｍＡｂ７２９及び７３０を含む上の表２に収載されるマウス抗ヒトＣＣＲ７結合モノクローナル抗体はどれも、ヒトＣＣＲ７過剰発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において検出可能な細胞内アゴニスト効果を誘導しなかった（データは示してない）。ＩｇＧ２ａは負の対照として使用され、ＣＣＲ７に対する天然リガンドであるＣＣＬ２１は正の対照として使用された。
【０１５４】
２．５  親和性測定
２．５．１  Ｂｉａｃｏｒｅ親和性測定
同定されたモノクローナル抗体の親和性は、標準条件下Ｂｉａｃｏｒｅ測定により決定された。モノクローナル抗体は適切なセンサー表面に固定化され、ヒトＣＣＲ７のＮ終端由来の残基１９〜４９を含む硫酸化抗原ＳＹＭ１８９９（（ｐｙｒｏＧｌｕ）ＤＥＶＴＤＤＺＩＧＤＮＴＴＶＤＺＴＬＦＥＳＬＣＳＫＫＤＶＲＮＫ；配列番号７６）；Ｚは硫酸化されたチロシンを示す）の溶液をセンサー表面に通した。ＳＹＭ１８９９に対するマウスｍＡｂ７２９の得られた親和性値（Ｋｄ）は０．７ｎＭであった。
【０１５５】
２．５．２  フローサイトメトリー親和性測定
ヒトＣＣＲ７発現ＣＨＯ細胞（１０６細胞／ｍｌ）は４℃で２４時間、３倍希釈系列（範囲２０ｎＭ〜０．１１ｐＭ）でマウスｍＡｂ７２６〜７３５と一緒に前インキュベートされた。結合抗体の量は、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された二次マウス特異的抗体を用いて染色し、続いてフローサイトメトリーにより検出することにより決定された。ＥＣ５０値（表３）は、Ｓ字結合曲線から最小及び最大プラトー値の５０％で決定された。
【表３】
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【０１５６】
２．６  抗ＣＣＲ７ｍＡｂは正常細胞上では安全である
ＣＤＣアッセイでは、正常無処置ヒトＴ細胞（図３）は、効果的な濃度（範囲３３〜０．５ｎＭ）での抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体ｍＡｂ７２９−２Ａを用いた処置に対して安全である。ＣＤＣアッセイはＣｕｅｓｔａ−Ｍａｔｅｏｓら．（２０１５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２６２−０１５−１６７０−ｚ）により記載された通りに実施した。
【０１５７】
２．７  抗ＣＣＲ７ｍＡｂはＣＤ２０抵抗性ＣＬＬ患者腫瘍細胞を死滅させる
細胞分裂阻害薬及び抗ＣＤ２０モノクローナル抗体療法に無応答であり抗ＣＤ２０療法抵抗性だと見なされている患者由来のＣＤ２０抵抗性ＣＬＬ腫瘍Ｂ細胞は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいてｍＡｂ７２９−２Ａ（ＩＣ５０  ０．１５ｎＭ）により十分に死滅する（図４）。ＣＤＣアッセイはＣｕｅｓｔａ−Ｍａｔｅｏｓら．（２０１５年、上記）により記載される通りに実施した。
【０１５８】
実施例３．  ヒト化
３．１  ヒト化Ａｂの設計及び構築
マウスモノクローナル抗体抗ヒトＣＣＲ７  ＭＡｂ７２９がヒト化のために選択された。ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ由来の抗体番号付け方式を使用して、ｍＡｂ７２９中でＣＤＲが同定された（上の表１参照）。これら２つの番号付け方式は、マウス抗体の異なる残基をＣＤＲに属すると同定し、組合せＩＭＧＴ／Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ配列はＣＤＲループ立体構造の最適保持のために使用された。本明細書で使用されるマウスｍＡｂ７２９のヒト化変異体のコードはｍＡｂ６５０である。
【０１５９】
マウス重鎖では、最も近いヒト生殖系列遺伝子Ｖ領域はホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＩＧＨＶ３−２１（配列番号７３）である。マウス軽鎖では、最も近いヒト生殖系列遺伝子Ｖ領域はホモサピエンスＩＧＫＶ１−３９（配列番号７４）である。
【０１６０】
重鎖のヒト化のために、ヒトＩｇＧ配列のオンラインデータベースが、マウスＶＨドメインとの比較のためにＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して検索され、候補ヒト可変ドメインが上位２００ＢＬＡＳＴ結果から選択された。これらの候補は、重要なフレームワーク残基を維持するフレームワーク相同性と基準ループ構造の組合せに基づいて３候補に絞り込まれ、それぞれＣＡＧ１７６１６（配列番号６７）、ＡＡＬ６７５１０（配列番号６８）及びＡＣＳ９６２２６（配列番号６９）であった。マウス抗ヒトＣＣＲ７  ＭＡｂ７２９  ＶＨのＣＤＲをこれらの受容体フレームワークに移植すると、ヒト化変異体ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３になり、それぞれ配列番号６１、６２及び６３に描かれるヒト化重鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する。表４は、ＩＭＧＴ番号付けに従った３つのヒト化重鎖可変ドメイン中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を収載している。
【表４】
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【０１６１】
軽鎖のヒト化のため、ヒトＩｇＧ配列のオンラインデータベースが、マウスＶＬドメインとの比較のためにＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して検索され、候補ヒト可変ドメインが上位２００ＢＬＡＳＴ結果から選択された。これらの候補は、重要なフレームワーク残基を維持するフレームワーク相同性と基準ループ構造の組合せに基づいて３候補に絞り込まれ、それぞれＡＢＩ７４０６６（配列番号７０）、ＡＢＡ２６１２２（配列番号７１）及びＡＢＵ９０６５３（配列番号７２）であった。マウス抗ヒトＣＣＲ７  ＭＡｂ７２９  ＶＨのＣＤＲをこれらの受容体フレームワークに移植すると、ヒト化変異体ＶＫ１、ＶＫ２及びＶＫ３になり、それぞれ配列番号６４、６５及び６６のヒト化軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する。表５は、ＩＭＧＴ番号付けに従った３つのヒト化軽鎖可変ドメイン中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を収載している。
【表５】
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【０１６２】
最初のＶＫ３変異体はＮ連結グリコシル化モチーフ（ＮＸＳ／Ｔ、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）を含有していた。このＮ連結グリコシル化モチーフは７２位のアスパラギン残基をセリン残基に変更することにより取り除かれた。アスパラギンはマウスＶＬ中のこの位置の残基であるセリンに変異された。一部のヒト抗体もこの位置にセリンを含有している。ＶＫ３変異体中のこのＮ連結グリコシル化モチーフ以外に、その他のヒト化変異体の配列中に存在しているさらなるＮ連結グリコシル化モチーフは見つからなかった。
【０１６３】
実施例４．  ヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂの評価
４．１  免疫原ＳＹＭ１８９９への結合
免疫原ＳＹＭ１８９９への抗体６５０変異体の結合を評価するＥＬＩＳＡでは、硫酸化ペプチドはヒトＣＣＲ７のＮ終端（残基１９〜４９；配列番号７６）に由来していた。１００ｎｇ／ウェルのＳＹＭ１８９９はコーティング緩衝液中で９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定化した。コーティング緩衝液は取り除き、２００μｌ／ウェルの遮断液（３％ｗ／ｖセミスキムミルク粉末、ＰＢＳ）を添加し、室温で２時間撹拌した。プレートはＰＢＳ−Ｔ（０．００１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）で６回洗浄した。抗体６５０変異体はＰＢＳ中１μｇ／ｍｌまで希釈し、ＰＢＳ中連続１対１希釈を濃度０．００７８μｇ／ｍｌまで行った。それぞれの抗体希釈液の３通りのウェル当たり１００μｌを、ＰＢＳの負の対照に加えてプレートに添加し、撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。プレートはＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した。１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＨＲＰ（Ｆｃ特異的）（ＰＢＳ中１対６００００）を添加し、プレートは撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。プレートはＰＢＳ−Ｔで６回、ＰＢＳ中１回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を添加し３７℃で１０分間インキュベートした。ウェル当たり５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを添加し、プレートは直ちにＢｉｏｌｉｓｅプレート読取り装置上４５０ｎｍで読み取った。
【表６】
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【０１６４】
ｍＡｂ６５０のヒト化は成功し、いくつかの潜在的候補変異体が同定された。ＬＣ３軽鎖変異体を含む３つの抗体６５０変異体はすべてＳＹＭ１８９９には十分に結合せず、Ｋｄは１００よりも高かった。
【０１６５】
ＨＣ１  ＬＣ１は１．７８の最も良いＫｄを生じ、驚くべきことに、２．１４のＫｄを有するキメラＨＣ０  ＬＣ０よりもはるかに良くＳＹＭ１８９９と結合する唯一の構築物であった。
【０１６６】
４．２  抗体６５０変異体１−１、２−１及び３−１はＣＬＬ細胞においてＡＤＣＣを媒介する
同じ軽鎖変異体を含む３つのヒト化抗ヒトＣＣＲ７  ＩｇＧ１ｍＡｂ（ＬＣ１、すなわち、重鎖＊軽鎖：１＊１＝ＨＣ１  ＬＣ１；２＊１＝ＨＣ２  ＬＣ１；及び３．１＝ＨＣ３  ＬＣ１）及びキメラ抗ヒトＣＣＲ７ｍＡｂ（Ｆａｂマウス／Ｆｃヒト：０＊０＝ＨＣ０  ＬＣ０）は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ（ｎ＝２）により決定した場合、慢性リンパ性白血病患者由来の悪性Ｔ細胞の５０〜６０％を死滅させた（図５）。アレムツズマブ（ＡＬＥＭ）及びリツキサン（ＲＴＸ）は正の対照として使用し、ｍＡｂ  ＩＧＧ１は負の対照として使用した。ＡＤＣＣアッセイはＳｏｍｏｖｉｌｌａ−Ｃｒｅｓｐｏら（２０１３年、Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．＆Ｏｎｃｏｌ．６：８９頁）により記載されている通りに実施した。
【０１６７】
４．３  ヒト化抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ６５０はＣＣＲ７受容体内部移行を阻害する
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ６５０−Ｈ１Ｌ１のアンタゴニスト活性は、本質的には下記の通り、確立した活性内部移行アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定された場合、ＣＣＬ１９誘導ＣＣＲ７受容体内部移行の阻害により実証される（ＩＣ５０  ０．４１５５μｇ／ｍｌ＝２．８ｎＭ；試験された範囲：２６７〜０．０１４ｎＭ）（図６）。
【０１６８】
活性内部移行アッセイ設計：ＧＰＣＲエンドサイトーシス
ＥＦＣ技術を使用して、ＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘ社は受容体内部移行を研究するためのいくつかの方法を開発した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）活性化ＧＰＣＲ内部移行アッセイはアレスチン媒介ＧＰＣＲ内部移行の定量的測定を提供し、生細胞中の細胞膜由来の非標識アレスチン結合ＧＰＣＲの動きをモニターすることを可能にする。
【０１６９】
アンタゴニスト決定では、細胞はアンタゴニストと一緒に前インキュベートされ、続いてＥＣ８０濃度でアゴニストチャレンジを行った。試料ストックの中間希釈を実施してアッセイ緩衝液中５×試料を作成した。５μＬの５×試料を細胞に添加し、３７℃又は室温で３０分間インキュベートした。溶媒濃度は１％であった。アッセイ緩衝液中６×ＥＣ８０アゴニストを５μｌ、細胞に添加し、３７℃若しくは室温で９０若しくは１８０分間（ＥＡ−アレスチン／ＥＡ−エンドソーム）又は３７℃で１６時間（ＥＡ−膜）インキュベートした。
【０１７０】
シグナル検出
アッセイシグナルは、１２．５又は１５μＬ（５０％ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬カクテルの単回添加、続いて室温で１時間のインキュベーションを通じて発生させた。化学発光シグナル検出のためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置を用いて、シグナル発生に続いてマイクロプレートを読み取った。
【０１７１】
データ解析
複合活性はＣＢＩＳデータ解析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を使用して解析した。アンタゴニストモードアッセイでは、パーセント阻害は以下の式：％阻害＝１００％×（１−（試験試料の平均ＲＬＵ−溶媒対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ−溶媒対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算した。
【０１７２】
４．３  ヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ６５０はβアレスチン経路のＣＣＲ７依存性細胞内シグナル伝達を阻害する
ＣＣＲ７のＣＣＬ１９誘導細胞内シグナル伝達は、本質的には下記の通り、確立したβアレスチン動員アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定された場合、ｍＡｂ６５０−Ｈ１Ｌ１、マウスｍＡｂ７２９のヒト化版により効果的に阻害される（ＩＣ５０  ９．５６２２μｇ／ｍｌ＝６３．７ｎＭ；試験された範囲：２６７〜０．０１４ｎＭ）（図７）。
アレスチン経路
【０１７３】
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）βアレスチンアッセイは、機能的リポーターとしてβガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を用いた酵素断片補完（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＥＦＣ）と呼ばれるＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘ社が開発した技術を使用して同種非画像化アッセイフォーマットにおいてＧＰＣＲの活性化をモニターする。
【０１７４】
アッセイ設計
アンタゴニスト調節フォーマット：アンタゴニスト決定では、細胞はアンタゴニストと一緒に前インキュベートされ、続いてＥＣ８０濃度でアゴニストチャレンジを行った。試料ストックの中間希釈を実施してアッセイ緩衝液中５×試料を作成した。５μＬの５×試料を細胞に添加し、３７℃又は室温で３０分間インキュベートした。溶媒濃度は１％であった。アッセイ緩衝液中６×ＥＣ８０アゴニストを５μｌ、細胞に添加し、３７℃又は室温で９０又は１８０分間インキュベートした。
【０１７５】
シグナル検出
アッセイシグナルは、１２．５又は１５μＬ（５０％ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬カクテルの単回添加、続いて室温で１時間のインキュベーションを通じて発生させた。化学発光シグナル検出のためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置を用いて、シグナル発生に続いてマイクロプレートを読み取った。
【０１７６】
データ解析
複合活性はＣＢＩＳデータ解析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を使用して解析した。アンタゴニストモードアッセイでは、パーセント阻害は以下の式：％阻害＝１００％×（１−（試験試料の平均ＲＬＵ−溶媒対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ−溶媒対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算した。
【０１７７】
４．４  ヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ６５０はＣＣＲ７依存性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を阻害する
ｍＡｂ６５０−Ｈ１Ｌ１は、本質的には下記の通り、確立したｃＡＭＰ二次メッセンジャー経路アッセイ（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定された場合、ＣＣＬ１９誘導ＣＣＲ７依存性細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を阻害する（ＩＣ５０  １．６０９μｇ／ｍｌ＝１０．７ｎＭ；試験された範囲：２６７〜０．０１４ｎＭ）（図８）。
【０１７８】
ｃＡＭＰ二次メッセンジャー経路
ＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘ社は、ｃＡＭＰを通じて内因的にシグナルを送るタグされていないＧＰＣＲを安定的に発現している細胞株のパネルを開発していた。Ｈｉｔ  Ｈｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイは、機能的エンドポイントとしてβガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を用いた酵素断片補完（ＥＦＣ）と呼ばれるＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘ社が開発した技術を使用して同種非画像化アッセイフォーマットにおいてＧｉ及びＧｓ二次メッセンジャーシグナル伝達を介してＧＰＣＲの活性化をモニターする。
【０１７９】
アッセイ設計：ＧＰＣＲ  ｃＡＭＰ調節
インバースアゴニストフォーマット
インバースアゴニスト決定では、細胞はＥＣ２０フォルスコリンの存在下で試料と一緒に前インキュベートした。培養液は細胞から吸引し、１５μＬの２対１ＨＢＳＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ：ｃＡＭＰ  ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えた。試料ストックの中間希釈を実施して、４×ＥＣ２０フォルスコリンを含有するアッセイ緩衝液中４×試料を作成した。４．５μＬの４×試料を細胞に添加し、３７℃又は室温で３０又は６０分間インキュベートした。最終アッセイ溶媒濃度は１％であった。
【０１８０】
シグナル検出
適切な複合インキュベーション後、アッセイシグナルは、２０μＬのｃＡＭＰ  ＸＳ＋ＥＤ／ＣＬ溶解カクテルと一緒の１時間のインキュベーション、続いて２０μＬのｃＡＭＰ  ＸＳ＋ＥＡ試薬と一緒の室温で３時間のインキュベーションを通じて発生させた。化学発光シグナル検出のためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置を用いて、シグナル発生に続いてマイクロプレートを読み取った。
【０１８１】
データ解析
複合活性はＣＢＩＳデータ解析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を使用して解析した。Ｇｉインバースアゴニストモードアッセイでは、パーセント活性は以下の式：％インバースアゴニスト活性＝１００％×（（試験試料の平均ＲＬＵ−ＥＣ２０フォルスコリンの平均ＲＬＵ）／（フォルスコリン正の対照の平均ＲＬＵ−ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算する。
【０１８２】
実施例５．  ヒト化抗ＣＣＲ７抗体のアロタイプ転換及びＣＤＣ増強されたＦｃ突然変異体
５．１  アロタイプ転換されＣＤＣ増強された突然変異体の設計
ヒト化抗ＣＣＲ７ｍＡｂ６５０変異体１−１、２−１及び３−１の最初のアロタイプ（コードについては上記４．２参照）は十分に強いＣＤＣエフェクター機能を生じなかった。したがって、３つの変異体１−１、２−１及び３−１のアロタイプはヒトアロタイプＧ１ｍ１７，１に転換されて変異体１１−１７、２１−１７、３１−１７を与え、それぞれが配列番号７９に描かれている重鎖定常領域を有していた。ＣＤＣエフェクター機能をさらに増強するため、これら３つの変異体の重鎖定常領域はＥ３３３Ａ置換（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４頁により記載されている）を導入することによりさらに改変されて、変異体１１−ＡＥ、２１−ＡＥ、３１−ＡＥを与え、それぞれが配列番号８０に描かれている重鎖定常領域を有していた。さらに、１１−１７抗体の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３（ＣＤＲ３）アミノ酸配列を配列番号８１のアミノ酸配列に変更することにより、対照抗体「１１−ｘ」を構築し、この抗体はＣＣＲ７を認識し結合する能力を完全に消失させた。抗体は５００ｍｌ培養液体積中ＣＨＯ細胞において一過性に発現され、精製され下記のさらなる試験のために、「０−０」とも呼ばれるキメラＨＣ０  ＬＣ０抗体（上参照）と共に使用された。
【０１８３】
５．２  アロタイプ転換されＣＤＣ増強された突然変異体ヒト化抗体ＣＣＲ７抗体の性能
次に、抗体１１−１７、２１−１７、３１−１７、１１−ＡＥ、２１−ＡＥ、３１−ＡＥ、１１−ｘ及びキメラＡｂ  ０−０の性能を種々のアッセイで試験した。
【０１８４】
１．膜発現されるＣＣＲ７への抗体の結合は、３つの異なる慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）試料上で及び３つの異なるＴ細胞前リンパ球性白血病（ＴＰＬＬ）試料上でのフローサイトメトリーによる蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により決定された（データは示していない）。適切な対照（ヒトアイソタイプ対照）は、比ＭＦＩ（試料）／ＭＦＩ（対照）から得られる陽性細胞のパーセント及び／又は相対的蛍光強度中央値（ＲＭＦＩ）を容易に計算するために含めた。ＣＬＬ試料上では、抗体１１−ＡＥ、１１−１７、３１−１７、３１−ＡＥが最も性能がよくキメラ０−０抗体よりも性能が優れてさえいた。ＴＰＬＬ試料上では、抗体１１−ＡＥ及び１１−１７が最も性能がよかった。抗体１１−ＡＥ、１１−１７、３１−１７、３１−ＡＥは２人の健康なドナー（ＨＤ）から得たＴ細胞では類似のＦＡＣＳプロファイルを示したが、これらの抗体は好中球、単球又はＮＫ細胞には結合しなかった（データは示していない）。
【０１８５】
２．抗体は、３つの異なるＣＬＬ試料及び１つのＴＰＬＬ試料上での補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介するその能力について試験された（データは示していない）。ＣＤＣアッセイは本質的にＣｕｅｓｔａ−Ｍａｔｅｏｓら．（２０１５年、上記）により記載される通りに実施した。抗体１１−１７、１１−ＡＥ及び３１−ＡＥは、試料番号１及び番号３の新たに単離されたＣＬＬ細胞においてＣＤＣを媒介するのに最も良い応答を示した。抗体１１−１７及び１１−ＡＥは、試料番号２のＣＬＬ細胞上でＣＤＣを媒介するのに応答を示した。抗体１１−１７、１１−ＡＥ、２１−ＡＥ及び３１−ＡＥは、試料番号１のＴＰＬＬ細胞上でＣＤＣを媒介するのに応答を示した。
【０１８６】
ＦＡＣＳプロファイル及びＣＤＣの媒介における抗体の性能に関する上記結果に基づいて、抗体１１−ＡＥ、１１−１７、３１−１７及び３１−ＡＥがさらに試験するために選択された。
【０１８７】
３．４つの選択された抗体のうち、１１−ＡＥ及び１１−１７は４番目のＣＬＬ試料上で最もよいＣＤＣプロファイルを示した（データは示していない）。
【０１８８】
４．４つの選択された抗体はＡＤＣＣを媒介するその能力についてさらに試験した。ＡＤＣＣアッセイは以下の通りに実施した。
【０１８９】
Ａ）標的細胞：患者由来の単離されたＰＢＭＣ又は悪性細胞は、培養液（ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ）のみと一緒に、又は最終濃度１０μｇ／ｍｌで試験される抗体の存在下で培養液と一緒に３７℃で３０分間インキュベートされた。使用する試料に応じて、アイソタイプ対照（ＩＣ）及び／又は抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）及び／又は抗ＣＤ２０（リツキシマブ）及び／又は抗ＣＣＲ７抗体が試験された。未結合抗体は、２ｍｌのＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡを添加し１８００ｒｐｍで２分間細胞を回転させることにより２度洗い流した。
【０１９０】
Ｂ）エフェクター細胞：ヒト又はマウスＰＢＬは、フィコール密度勾配遠心分離により得た。ＮＫ細胞及び単球の割合は、ＣＤ１６−ＰＥ及びＣＤ１４−ＡＰＣに対する抗体を使用して上記のＦＡＣＳにより決定した。
【０１９１】
Ｃ）標的細胞とエフェクター細胞を識別するため、ＰＢＬはカルセイン−ＵＶ細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコルに従って標識した。手短に言えば、１μＬの５ｍＭ細胞トラッカー溶液をＰＢＳ中それぞれｍＬの細胞懸濁液に添加し（１×１０６細胞／ｍＬ）、最終作業濃度５μＭとした。試料は、光から保護しつつ３７℃で２０分間インキュベートした。次に、最初の染色体積の５倍の培養液を細胞に添加し５分間インキュベートし（このステップは溶液中に残るいかなる遊離の色素を取り除く）、細胞は１８００ｒｐｍで２分間遠心分離によりペレット化した。
【０１９２】
Ｄ）標的細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中１０４細胞／ウェルで９６ウェル丸底プレートに蒔かれた。次に、カルセイン−ＵＶ標識ＰＢＬを、異なるエフェクター対標的比（Ｅ対Ｔ）でエフェクター細胞として（細胞溶解のエフェクターとして）使用した。４時間のインキュベーション後、標的細胞はいくつかの特異的マーカーで染色され、細胞生存率は７ＡＡＤ染色により決定された。それぞれの試料はフローサイトメトリーで分析された。ＡＤＣＣにより死滅した標的細胞のパーセントは：％溶解＝１００×（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）により決定された。ＥＲ、ＳＲ、及びＭＲは実験的、自然な及び最大細胞死を表す。データは媒体対照に正規化された。
【０１９３】
４つの選択された抗体はすべて、２つの異なるＣＬＬ試料上で単離されたＰＢＬを使用してＡＤＣＣを媒介するのにアレムツズマブ及びリツキシマブよりも性能がよかった（データは示していない）。
【０１９４】
５．４つの選択された抗体はすべて、アレムツズマブ抵抗性ＣＬＬ試料上で単離されたＰＢＬを使用してＡＤＣＣを媒介することができた（データは示していない）。
【０１９５】
６．フローサイトメトリー親和性プロファイル（ＦＣＡＰ）は、４つの選択された抗体がすべてＣＬＬ及びＴＰＬＬ細胞上で類似する結合プロファイルを有するが、１１重鎖組合せを有する抗体は３１重鎖組合せを有する抗体よりもわずかに高い親和性を有していることを示した（データは示していない）。
【０１９６】
７．ＣＬＬとＴＰＬＬ試料の両方で、４つの選択された抗体はすべてＣＣＬ１９への遊走を遮断するが、抗体３１−ＡＥはＣＣＬ２１への遊走を遮断するのに有効性がわずかに低い（データは示していない）。
【０１９７】
表７は上記結果の概要を提示しており、個々のアロタイプ転換されＣＤＣ増強された突然変異体ヒト化抗ＣＣＲ７抗体変異体は上記アッセイにおけるその相対的性能に従ってランク付けされている。１１−ｘは、ＦＡＣＳにより分析した場合、膜発現されたＣＣＲ７へのいかなる結合も示さず、ＣＤＣもＡＤＣＣも媒介しなかった。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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