(57)【要約】本発明は、癌免疫療法、特に薬物耐性を克服できる低毒性の薬物の分野に関する。本発明は、ＴＲＡＩＬ腫瘍関連抗原およびＴリンパ球ＣＤ３の両方に結合する能力を有する新規二重特異性抗体に関する。本発明はさらに、二重特異性抗体と標識化剤とを含む組成物、および医薬組成物に関する。本発明はまた、腫瘍の治療における二重特異性抗体の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインであって、前記重鎖（ＶＨＡ）の可変ドメインは配列番号１によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有し、第１の特異性（Ａ）はＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗原に対してである、第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインと、
ｂ．第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインであって、前記軽鎖（ＶＬＢ）の可変ドメインは配列番号３によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有し、第２の特異性（Ｂ）はＴリンパ球ＣＤ３に対してである、第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインと、
ｃ．特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインであって、前記重鎖（ＶＨＢ）の可変ドメインは配列番号５によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインと、
ｄ．特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインであって、前記軽鎖（ＶＬＡ）の可変ドメインは配列番号７によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインと
を含み、
一本鎖二重特異性抗体のＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡの順序で連結し、各々のＶＨおよびＶＬドメインはペプチドリンカーにより連結し、ＶＨＡドメインとＶＬＢドメインとの間、およびＶＨＢドメインとＶＬＡドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）からなり、ＶＬＢドメインとＶＨＢドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、各々４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基の各々からなる３個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３からなる、
一本鎖二重特異性ダイアボディ。
【請求項２】
前記直接的な等価物が、前記可変ドメインと少なくとも９５％の全体の配列相同性／同一性を有する、請求項１に記載の一本鎖二重特異性抗体。
【請求項３】
配列番号１３によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、請求項１または２に記載の一本鎖二重特異性抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖二重特異性抗体と、標識化剤とを含む組成物。
【請求項５】
前記標識化剤が、放射性ヌクレオチドまたは蛍光ナノ粒子からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項７】
筋肉内、静脈内注射、皮下、または吸入投与経路用の請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物の効力を増強または低減させることができる、少なくとも１種のさらなる化合物と組み合わせて使用される、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍細胞に対するＴリンパ球の細胞傷害作用を再誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖二重特異性抗体と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１０】
腫瘍の治療に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖二重特異性抗体。
【請求項１１】
前記腫瘍が、黒色腫、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸腺癌、肝細胞癌および肺扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記治療が、少なくとも１種の抗腫瘍剤による以前の治療に対して耐性があるか、もしくは不耐容である患者に対してであるか、または抗腫瘍剤による治療が回避されなければならない患者に対してである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
前記治療が予防的または治療的である、請求項１１または１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌免疫療法、特に薬物耐性を克服できる薬物の分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＴリンパ球ＣＤ３の両方に結合する能力を有する新規二重特異性抗体に関する。
【０００３】
本発明はさらに、二重特異性抗体を含む医薬組成物および腫瘍の治療における二重特異性抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
悪性腫瘍はヒトの死および非常に大きな健康問題の最大の原因の１つである。最近の１０年において、科学者らは、前臨床研究において非常に良好な結果を有する多くの療法を開発してきたが、多くの場合、毒性または薬物耐性の発生に起因して、その後の臨床試験において不十分であるかまたは全く効果がないことがしばしばあった。腫瘍壊死因子スーパーファミリーの天然のサイトカインメンバーである、ＦａｓＬ、ＴＮＦαおよびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の発見は、それらのアポトーシスを誘導する能力のおかげで新たな癌療法の開発についての新たな可能性を開いた。スーパーファミリーの最初の２つのメンバーであるＦａｓＬおよびＴＮＦαは抗癌分子としての使用が考慮されている。
【０００５】
インビトロで腫瘍細胞の根絶を生じる最初の優れた結果の後、これらの２つの戦略を使用した治療は、前臨床モデルを使用してインビボで重大な副作用の発生を示した：ＴＮＦαの使用は強力な炎症反応を引き起こし、一方で組換え抗Ｆａｓアゴニスト抗体の使用は重篤な肝臓毒性の原因となった。
【０００６】
ＴＲＡＩＬは腫瘍プロアポトーシスリガンドであり、ＴＮＦαおよびＦａｓＬと対照的に、インビボ研究では、腫瘍細胞に対する特異性のために毒性が排除され、正常な細胞を保護する。
【０００７】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両方は、天然に、または特定の化学療法薬に反応してのいずれかで多くの腫瘍細胞において上方制御される。
【０００８】
臨床試験が、ＴＲＡＩＬの組換え型およびアゴニスト抗体などのＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト化合物で開始された。組換えＴＲＡＩＬは両方の受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２）を標的化する能力を有するので、より広い作用範囲を有する。
【０００９】
対照的に、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に対する抗体（マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕａｂ））またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する抗体（ドロジツマブ、コナツムマブ、レクサツムマブおよびティガツズマブ）は１つのみの受容体を認識できるので、それらは組換えＴＲＡＩＬと比較して狭い作用範囲を有するが、それらは、リガンドを隔離する役割を有するデコイ受容体ＴＲＡＩＬ−Ｒ３およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４によって隔離されず、機能的受容体へのＴＲＡＩＬ結合を阻止するという利点を有する。
【００１０】
これらの薬剤を試験した第Ｉ相臨床試験は有望であったが（患者の特定のサブセットに対する組換えタンパク質の投与は安全であり、部分的または完全に反応にしていくらかの抗腫瘍活性が実証された）、無作為化した第ＩＩ相臨床試験は抗癌活性を現さなかった。ほとんどの場合、腫瘍細胞による耐性の発生に起因して失敗した。
【００１１】
耐性を回避するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２アゴニスト化合物が、「ＴＲＡＩＬ感作剤」と呼ばれる薬物と併用して使用されている。いくつかの従来の化学療法剤（ドキソルビシン、カルボプラチンまたはシスプラチン、イリノテカン、ボルテゾミブなど）は良好な「ＴＲＡＩＬ感作剤」とみなされ、良好な前臨床結果を示したが、臨床試験においては期待を裏切った。
【００１２】
組換え技術の出現後、医学研究において二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）が急増した。これらの抗体は２つの異なる標的に同時に結合でき、この理由のためにそれらは２つの作用機構を１つの分子に付与することができ、活性を高めることができる。５０より多くの異なるＢｓＡｂフォーマットが操作された。ＢｓＡｂは、放射線イメージングもしくは放射線免疫療法において、または同じ細胞上の２つの異なる抗原もしくは２つの可溶性リガンドの二重標的化によって標的化前戦略と共に使用することができるが、最も頻繁な用途は免疫細胞を腫瘍細胞に再標的化することである。
【００１３】
特に、良好な結果が、（Ｔ細胞受容体）ＴＣＲとは関係ない方法で腫瘍細胞を溶解するためにＴ細胞を再標的化できる二重特異性抗体で得られた。これらの例は、ハイブリッドハイブリドーマ技術を用いて産生されたＩｇＧから作製されたカツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ  ｘ  ＣＤ３）、およびブリナツモマブ（ＣＤ１９  ｘ  ＣＤ３）、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）である。両方の分子は、腫瘍関連抗原およびＣＤ３、Ｔ細胞受容体の定常部分に結合する能力を有する。特にＢＩＴＥクラスのＢｓＡｂ、ブリナツモマブが２０１４年１２月にＦＤＡに承認された。ＢｉＴＥは２つの連結された一本鎖抗体断片（ＳｃＦｖ）から作製される。得られた構造は小型であり、腫瘍と免疫細胞との間で免疫細胞溶解シナプスを形成できる：この構造により、特に両方のアームがそれらの標的抗原と結合したときだけサブナノモル濃度のＢｉＴＥでＴ細胞の活性化が可能となる。
【００１４】
ＴＲＡＩＬを用いてＴ細胞の細胞傷害性装備を高める目的のために２つの二重特異性分子が開発されている。ｓＴＲＡＩＬおよびｓｃＦｖ、抗ＣＤ３または抗ＣＤ７によって構成される３つの融合タンパク質からなる各構築物を一緒にして、ＴＲＡＩＬの三量体を形成した。ｓＴＲＡＩＬより腫瘍細胞に対して細胞傷害性を生じるこれらの化合物で装備したＴ細胞にも関わらず、ｓｃＦｖ抗ＣＤ３または抗ＣＤ７の三量体はＴ細胞オフターゲットを活性化でき、サイトカインストームおよび正常細胞に対する毒性のような重大な副作用を引き起こす。この理由のために著者は、特定の解剖学的に拘束された領域に制限された腫瘍を治療するためだけのこれらの化合物の使用を提案している。１つの抗ＣＤ３結合部位のみを含有する二重特異性抗体の使用はこの問題を回避でき、このＢｓＡｂは全身治療のために使用され得る。なぜなら１つのみのＣＤ３の結合はＴ細胞活性化を達成するのに十分ではないからである。タンデムｓｃＦｖまたは一本鎖ダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）フォーマットにおいて二重特異性抗体を使用することにより、免疫細胞溶解シナプスが形成した場合のみ、およびそれにより腫瘍細胞上の抗原の結合後のみにＴ細胞は活性化される（非特許文献１）。
【００１５】
前立腺癌の分野において二重特異性ダイアボディによって媒介される免疫療法は、前立腺特異的膜抗原およびＣＤ３を標的とする二重特異性ダイアボディを用いて調査されている（非特許文献２）。
【００１６】
ヒトＢ細胞リンパ腫成長に対するダイアボディの効果が非特許文献３によって研究された。Ｂ細胞上のヒトＣＤ１９およびＴＣＲ複合体のＣＤ３ε鎖に特異的なヘテロ二量体ダイアボディが、Ｂリンパ腫異種移植片を保有する免疫不全マウスにおいてインビトロおよびインビボの両方で腫瘍成長阻害に対する効果を調査するために使用された。
【００１７】
特許文献１は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）およびＴＲＡＩＬ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ５（ＤＲ５）を標的とする二重特異性抗体を記載しており、それらはアポトーシス誘導における使用を調査された。
【００１８】
多くの異なる腫瘍細胞において上方制御される抗原を認識する化合物を識別するための必要性および重要性が徐々に増している。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は非従来的な腫瘍関連抗原であると認識され得、実際に腫瘍上で受容体は上方制御され得るが、同じレベルの正常細胞においても存在し得る。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、発現レベルとは関係なく、正常細胞を保ち、腫瘍細胞を殺傷でき、正常細胞はＴＲＡＩＬ−Ｒ２によって誘導される殺傷に抵抗するための十分な機構を発生することに留意すべきである。この重要な特性に関わらず、腫瘍細胞はまた、ＴＲＡＩＬアゴニスト治療に対する抵抗を発生し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２０１４１６１８４５号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】ｄｅ  Ｂｒｕｙｎ  Ｍ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１、Ｓｅｐ  １；１７（１７）：５６２６−３７
【非特許文献２】Ｂｕｈｌｅｒ  Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００８、５７：４３−５２
【非特許文献３】Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６５：８８８−８９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、アゴニストＴＲＡＩＬ化合物として作用する腫瘍細胞を特異的に殺傷する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２アーム、および腫瘍細胞を溶解するために腫瘍細胞に対してＴ細胞を再標的化する抗ＣＤ３アームを有するＢｓＡｂの開発である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の基本的な問題は、関連する腫瘍病理学の治療のための医薬の製造を可能にするための、腫瘍細胞に特異的に結合でき、殺傷できる利用可能な化合物を作製することである。
【００２３】
この問題は、本明細書の説明、実施例および添付の特許請求の範囲に記載されている、それらの結合特異性および細胞傷害性能を有することができる二重特異性抗体の使用による本発明の発見によって解決される。
【００２４】
本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＴ細胞上で発現されたＣＤ３の両方に結合する能力を有するｓｃＤｂフォーマットの新規二重特異性抗体に関する。広範囲の腫瘍（黒色腫、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸腺癌、肝細胞癌および肺扁平上皮癌など）におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２を認識する同じ能力を有すること以外に、本明細書に提示される二重特異性抗体は、ＴＲＡＩＬアゴニストとしておよびＣＤ３を介してリンパ球細胞傷害を引き起こすことによっての両方で作用できる。
【００２５】
Ｔ細胞活性化は標的特異的であることが実証されている。本発明は、
ａ．第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記重鎖（ＶＨＡ）の可変ドメインは配列番号１によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有し、第１の特異性（Ａ）はＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対してである、第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片と、
ｂ．第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記軽鎖（ＶＬＢ）の可変ドメインは配列番号３によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有し、第２の特異性（Ｂ）はＴリンパ球ＣＤ３に対してである、第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片と、
ｃ．特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記重鎖（ＶＨＢ）の可変ドメインは配列番号５によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片と、
ｄ．特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記軽鎖（ＶＬＡ）の可変ドメインは配列番号７によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片と
を含み、
一本鎖多重抗原結合分子のＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡの順序で連結し、各々のＶＨおよびＶＬドメインはペプチドリンカーにより連結し、ＶＨＡドメインとＶＬＢドメインとの間、およびＶＨＢドメインとＶＬＡドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）からなり、ＶＬＢドメインとＶＨＢドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、各々４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基の各々からなる３個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３からなる、
一本鎖二重特異性ダイアボディまたはその断片に関連する。
【００２６】
本発明の詳細な説明にさらに記載されるように、二重特異性抗体は、ＴＲＡＩＬの潜在的抗腫瘍能力に耐性を回避する能力を付与する利点を有する。
【００２７】
実際に、ＢｓＡｂは２つのアームを有する：１つのアームはＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合し、可溶性ＴＲＡＩＬのプロアポトーシス潜在性を模倣し、抗ＣＤ３アームは腫瘍細胞に対してＴ細胞を再標的化し、腫瘍細胞を殺傷する。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、本発明による一本鎖二重特異性抗体分子またはその断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【００２９】
別の態様によれば、記載される本発明は、腫瘍細胞に対してＴリンパ球の細胞傷害作用を再誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、本明細書に開示される一本鎖二重特異性抗体と接触させる工程を含む、方法を提供する。
【００３０】
別の態様によれば、記載される本発明は、腫瘍の治療に使用するための、本発明による一本鎖二重特異性抗体またはその断片を提供する。
【００３１】
本発明の特性および利点は、以下に報告される詳細な説明、例示であり、非限定的目的のために与えられる実施例、および添付の図１〜７から明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図１は、実施例２および３に記載されるように、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合でき、腫瘍細胞に対してＴ細胞を効果的に再標的化できる二重特異性抗体を創出するように操作した二重特異性構築物フォーマットの図を示す。図１Ａ：タンデムｓｃＦｖ  ＢｓＡｂフォーマット：短いリンカーによって抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ（濃灰色）（ＴＲ６６またはｈＵＣＴＨ１に由来する）に結合した抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｓｃＦｖ（薄灰色）。
【図１Ｂ】二重特異性ｓｃＤｂフォーマット：抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２可変ドメインは構造の先端にあり、ミスマッチ対の形成を回避する２つの同一の５アミノ酸の短いリンカーによって抗ＣＤ３  ｓｃＦｖに結合している。
【図１Ｃ】二重特異性ｓｃＤｂ構築物の図。
【図２Ａ】図２は、実施例２および３に記載される、本発明による、ＢＩＴＥ様立体配座におけるＢｓＡｂ  １６ｅ２／ＴＲ６６と、ｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１により得られたものとの間のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルの結果の比較を示す。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＣＤ３を発現するかまたは発現しない細胞でＦＡＣＳによって結合能力を評価した。空ピーク：陰性対照；灰色ピーク：ｓｃＤｂプラス抗Ｔａｇおよび抗マウス抗体。図２Ａ：数日後にその結合能力を喪失し、凝集する傾向があるタンデムｓｃＦｖ  ＢｓＡｂ  １６ｅ２／ＴＲ６６のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。
【図２Ｂ】安定であり、凝集は２年後でも０．５％を超えなかったｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。
【図２Ｃ】抗ＣＤ３としてｈＵＣＴＨ１を使用して構築したタンデムｓｃＦｖフォーマットのサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。この構築物はＣＤ３を認識するが、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を認識できなかった。
【図２Ｄ】抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ドロジツマブとして、少数のアミノ酸のみ１６ｅ２から変化している１６ｅ２の誘導体、および抗ＣＤ３としてｈＵＣＴＨ１を使用して同様に構築したｓｃＤｂのサイズ排除クロマトグラフィープロファイル。この場合、構築物は数日間だけ作用し、生産収率は非常に低かった。
【図３Ａ−１】実施例３に記載されるｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１の機能的および生化学的分析。図３Ａ：ＣＤ３＋  ＪｕｒｋａｔおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２−＼ＣＤ３−  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８上で異なる受容体発現レベルを有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋黒色腫細胞株のパネルで実施したフローサイトメトリー分析。試験により、ＢｓＡｂの結合特異性を確認した：異なる細胞株上の受容体の発現後のｓｃＤｂ結合プロファイル（上段）。市販の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体またはＪｕｒｋａｔについてのＴＲ６６抗ＣＤ３抗体（下段）を対照として使用した。空ピーク：陰性対照；灰色のピーク：ｓｃＤｂプラス抗Ｔａｇおよび抗マウス抗体（上段）または市販の抗体プラス抗マウス抗体（下段）。
【図３Ａ−２】実施例３に記載されるｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１の機能的および生化学的分析。図３Ａ：ＣＤ３＋  ＪｕｒｋａｔおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２−＼ＣＤ３−  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８上で異なる受容体発現レベルを有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋黒色腫細胞株のパネルで実施したフローサイトメトリー分析。試験により、ＢｓＡｂの結合特異性を確認した：異なる細胞株上の受容体の発現後のｓｃＤｂ結合プロファイル（上段）。市販の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体またはＪｕｒｋａｔについてのＴＲ６６抗ＣＤ３抗体（下段）を対照として使用した。空ピーク：陰性対照；灰色のピーク：ｓｃＤｂプラス抗Ｔａｇおよび抗マウス抗体（上段）または市販の抗体プラス抗マウス抗体（下段）。
【図３Ａ−３】実施例３に記載されるｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１の機能的および生化学的分析。図３Ａ：ＣＤ３＋  ＪｕｒｋａｔおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２−＼ＣＤ３−  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８上で異なる受容体発現レベルを有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋黒色腫細胞株のパネルで実施したフローサイトメトリー分析。試験により、ＢｓＡｂの結合特異性を確認した：異なる細胞株上の受容体の発現後のｓｃＤｂ結合プロファイル（上段）。市販の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体またはＪｕｒｋａｔについてのＴＲ６６抗ＣＤ３抗体（下段）を対照として使用した。空ピーク：陰性対照；灰色のピーク：ｓｃＤｂプラス抗Ｔａｇおよび抗マウス抗体（上段）または市販の抗体プラス抗マウス抗体（下段）。
【図３Ａ−４】実施例３に記載されるｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１の機能的および生化学的分析。図３Ａ：ＣＤ３＋  ＪｕｒｋａｔおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２−＼ＣＤ３−  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８上で異なる受容体発現レベルを有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋黒色腫細胞株のパネルで実施したフローサイトメトリー分析。試験により、ＢｓＡｂの結合特異性を確認した：異なる細胞株上の受容体の発現後のｓｃＤｂ結合プロファイル（上段）。市販の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体またはＪｕｒｋａｔについてのＴＲ６６抗ＣＤ３抗体（下段）を対照として使用した。空ピーク：陰性対照；灰色のピーク：ｓｃＤｂプラス抗Ｔａｇおよび抗マウス抗体（上段）または市販の抗体プラス抗マウス抗体（下段）。
【図３Ａ−５】実施例３に記載されるｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１の機能的および生化学的分析。図３Ａ：ＣＤ３＋  ＪｕｒｋａｔおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２−＼ＣＤ３−  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８上で異なる受容体発現レベルを有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋黒色腫細胞株のパネルで実施したフローサイトメトリー分析。試験により、ＢｓＡｂの結合特異性を確認した：異なる細胞株上の受容体の発現後のｓｃＤｂ結合プロファイル（上段）。市販の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体またはＪｕｒｋａｔについてのＴＲ６６抗ＣＤ３抗体（下段）を対照として使用した。空ピーク：陰性対照；灰色のピーク：ｓｃＤｂプラス抗Ｔａｇおよび抗マウス抗体（上段）または市販の抗体プラス抗マウス抗体（下段）。
【図３Ｂ】Ｂｉａｃｏｒｅ分析（リアルタイムで２つのタンパク質間の動力学的相互作用を追跡することを可能にする表面プラズモン共鳴に基づいた方法）。左のパネル：ｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１は、ＣＭ５チップに固定したＴＲＡＩＬ−Ｒ２組換えタンパク質に急速に結合し、それから急速に分離したことを実証した。平衡（ＫＤ）での解離定数は１４８ｎｍｏｌｅ／Ｌであり、４００ｎｍのｓｃＤｂから開始して２５ｎＭまでの５つの異なる濃度を使用して算出した。右のパネル：競合研究を示すＢＩＡｃｏｒｅからのセンサーグラム。黒色の矢印において１μＭのｓＴＲＡＩＬを注入してチップに存在する全ての受容体を飽和させた；灰色の矢印において４００ｎＭのｓｃＤｂ１６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１を注入した。飽和受容体上のｓｃＤｂの結合は観察されず、２つの化合物が同じ結合部位に競合していることが明らかになった。
【図３Ｃ】ＳＤＳページおよびウェスタンブロット分析により、ｓｃＤｂの質量は約５４ｋＤａであることが明らかになった。
【図３Ｄ】図３Ｃにおいて得られたデータを確認するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。
【図４Ａ】図４は細胞障害性である。図４Ａは、Ｍ６４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の低発現およびｓＴＲＡＩＬ抵抗）およびＭ１５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の高発現およびｓＴＲＡＩＬ感知）黒色腫細胞株上での二重特異性ｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１の細胞障害性。異なるＥ：Ｔ比および濃度を使用してｓｃＤｂ細胞障害性を評価した。ＳｃＤｂを、細胞障害性実験においてＦ２希釈物と共に１０：１から開始して０．１５：１までのＥ：Ｔ比で１、０．５および０．１μｇ／ｍｌにて使用して最適なｓｃＤｂ用量およびＥ：Ｔ比を決定した。実験により、最適なＥ：Ｔ比は５：１であることが示され、本発明者らは、未処理腫瘍細胞上での細胞傷害性の不在および０．５μｇ／ｍｌの濃度にてｓｃＤｂの活性は実施例３に記載されるようにプラトーに達することを観察した。
【図４Ｂ】グラフは、処理結果の再現性を試験するために実施した９つの異なる成長阻害アッセイを示した。ＰＢＬの異なるバッチ（健康なドナーに由来する）を各実験において使用した。０．５μｇ／ｍｌのｓｃＤｂプラスＰＢＬ（５：１のＥ：Ｔ比）によるＭ６４、Ｍ４１およびＭ１５の処理は全ての実験において同様の結果を与えた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、予想されるように処理に反応しなかった。
【図４Ｃ】抗体依存性ＰＢＬ媒介性成長阻害を、０．５μｇ／ｍｌの濃度および５：１のＥ：Ｔ比を使用していくつかの癌細胞株について実施した。細胞を４８または９６時間の処理に曝露した。処理は、全ての試験した腫瘍ＴＲＡＩＬ−Ｒ２陽性細胞株での増殖阻害を誘導し；毒性はＴＲＡＩＬ−Ｒ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞および正常ＴＲＡＩＬ−Ｒ２高発現ＨＥＫ２９３細胞で観察されなかった。
【図４Ｄ】抗体依存性ＰＢＬ媒介性成長阻害を、０．５μｇ／ｍｌの濃度のｓｃＤｂおよび５：１のＥ：Ｔ比を使用していくつかの癌細胞株について実施した。細胞を４８または９６時間処理に曝露した。処理は全ての試験した腫瘍ＴＲＡＩＬ−Ｒ２陽性細胞株での増殖阻害を誘導した。
【図４Ｅ】カルセイン−ＡＭ放出アッセイ。腫瘍細胞にカルセイン−ＡＭを負荷し、細胞に一旦入れて、エステル化し、蛍光にした。細胞をｓｃＤｂで再誘導して、４および１６時間処理して、Ｔ細胞毒性を測定した。グラフは溶解細胞のパーセンテージを示す。４時間後、約４５〜５０％のＴＲＡＩＬ−Ｒ２高発現Ｍ１５およびＭ４１を溶解し、さらに、低発現Ｍ６４について、処理細胞の変動は対照と比較して有意ではなかった。１６時間後、１００％の処理細胞、Ｍ６４もまた、処理の結果として溶解した。溶解はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において観察されなかった。グラフは平均±ＳＤを表す、ｎ＝５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５Ａ】図５はアゴニスト活性である。図５Ａは多量体化したｓｃＤｂを表す図である：抗タグＭＡｂはそれらを二量体化するｓｃＤｂに存在するタグに結合できる。抗マウスＭＡｂを抗タグ／ｓｃＤｂコンジュゲートに加えることにより、二量体化でき、ＢｓＡｂの四量体化を誘導できる。
【図５Ｂ】ｓＴＲＡＩＬ感受性Ｍ１５細胞に対するｓｃＤｂのアゴニストプロアポトーシス活性。Ｍ１５細胞をいくつかの用量のｓｃＤｂのみまたは図５Ａの記載に従って二量体化または四量体化した等しい用量のｓｃＤｂで処理した。細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを使用した処理の２４時間後に評価した。等しいｓｃＤｂ濃度でｓＴＲＡＩＬを陽性対照のように使用した。結果を陰性対照のパーセンテージとして表した。
【図５Ｃ】ＴＲＡＩＬに対して異なる感受性を有する黒色腫細胞でのｓｃＤｂのアゴニストプロアポトーシス活性。ｓＴＲＡＩＬ感受性Ｍ１５、半抵抗性Ｍ４１および抵抗性Ｍ６４を、０．５μｇ／ｍｌのｓｃＤｂのみまたは抗タグおよび抗マウスストラテジーで多量体化したｓｃＤｂで２４時間処理した（Ｃ）。可溶性ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を受容体媒介性アポトーシス誘導の陽性対照のように使用した。
【図５Ｄ】ビオチン−ストレプトアビジン結合によるｓｃＤｂの四量体化を表す図である。ＳｃＤｂを、ビオチンＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）を使用してインビトロでビオチン化し、ストレプトアビジンとインキュベートした。四量体ｓｃＤｂをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【図５Ｅ】ｓＴＲＡＩＬ感受性Ｍ１５細胞に対するストレプトアビジン四量体化ｓｃＤｂのアゴニストプロアポトーシス活性。Ｍ１５細胞を、０．５または０．０５μｇ／ｍｌの四量体化ｓｃＤｂで処理した。細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを使用した処理の２４時間後に評価した。結果を陰性対照のパーセンテージとして表した。
【図６Ａ】図６はＳｃＤｂ媒介性Ｔ細胞活性化分析である。図６Ａ：実施例３に記載されるように、新たに単離したＴ細胞を、濃度Ｅ：Ｔ＝５：１で、３つの異なる黒色腫細胞株上で０．５μｇ／ｍｌのｓｃＤｂと共にまたはそれを含まずにインキュベートした。ＣＤ２５およびＣＤ６９の発現。ＣＤ６９およびＣＤ２５の細胞表面発現、再誘導したＴ細胞上の活性化関連マーカーを、共培養を開始してから２４時間後、フローサイトメトリー分析によって測定した。グラフは、各マーカーについての全Ｔ細胞集団と比較した陽性細胞のパーセンテージを表す。腫瘍細胞を含まないＴ細胞をインキュベートしてＴ細胞自己活性化を測定した。結果は、健康なドナー由来のＴ細胞の３つの異なるバッチで実施した３つの異なるアッセイの平均±ＳＤを表す。
【図６Ｂ】実施例３に記載されるように、新たに単離したＴ細胞を、濃度Ｅ：Ｔ＝５：１で、Ｍ１５腫瘍細胞株上で０．０１〜０．５μｇ／ｍｌの滴定濃度のｓｃＤｂと共にまたはそれを含まずにインキュベートした。ＣＤ４およびＣＤ８再誘導Ｔ細胞上のＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＰＤ−１およびＣＤ６９の発現。ＣＤ１３７、ＰＤ−１、ＣＤ６９およびＣＤ２５、再誘導Ｔ細胞上の活性化関連マーカーの細胞表面発現を、共培養を開始してから１６時間後にフローサイトメトリー分析によって測定した。グラフは、各マーカーについて全ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団と比較した陽性細胞のパーセンテージを表す。腫瘍細胞を含まないＴ細胞をインキュベートしてＴ細胞自己活性化を測定した。
【図７Ａ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＩＬ−２（図７Ａ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｂ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＩＬ−４（図７Ｂ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｃ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＩＬ−６（図７Ｃ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｄ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＩＬ−１０（図７Ｄ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｅ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＴＮＦα（図７Ｅ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｆ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＩＦＮγ（図７Ｆ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｇ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＧＭ−ＣＳＦ（図７Ｇ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【図７Ｈ】図７は、実施例３に記載されるように、ｓｃＤｂ再誘導Ｔ細胞のサイトカイン（ｃｋ）放出プロファイルである。Ｔ細胞と、ｓｃＤｂとまたはｓｃＤｂを含まずにインキュベートした腫瘍細胞の培地を４日間毎日採取した：ＩＬ−８（図７Ｈ）の量を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用して測定した。二連のウェルの平均値を各グラフに表す。各点はｓｃＤｂによる処理後に生じたｃｋのレベルを表し、Ｔ細胞を腫瘍細胞のみとインキュベートしたとき、Ｔ細胞はＴ細胞サイトカイン基礎産生から差し引いた。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＴ細胞上で発現されるＣＤ３の両方に結合する能力を有するｓｃＤｂフォーマットにおける新規二重特異性抗体に関する。
【００３４】
多くの療法が癌免疫療法の分野において開発されているが、それらは必ずしも有効ではないか、または良好な結果を示さない。
【００３５】
実際に、ほとんどの場合、疾患の予備的緩和または安定化の後、腫瘍は再発し、この事実は特に腫瘍細胞における薬物耐性の発生に起因する。近年、化学療法と併用した標的化療法が、化学療法のみよりも転帰を改善することが示されている。特に、免疫療法において有用な手段である、療法の新規クラスである二重特異性抗体が現れた。二重特異性抗体は免疫細胞を腫瘍細胞に再標的化するように作用してそれらを殺傷する。
【００３６】
本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＴ細胞上に存在するＣＤ３に結合できる二重特異性抗体に関する。
【００３７】
異なる構築物である抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／抗ＣＤ３の中で、１つのみが良好な生化学的特性および生物活性を示した。異なる方法を使用して、本発明者らは、ＢｓＡｂが、腫瘍細胞とリンパ球との間で免疫細胞溶解（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｌｉｔｉｃ）シナプスを形成できることを実証した。シナプスの形成後、本発明者らは、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ−１およびＣＤ２５の上方制御によるＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）活性化ならびにオフターゲットの毒性を有さずに炎症性サイトカインの産生を観察できた。シナプスの形成および活性化後、Ｔ細胞は、乳癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌および肺癌のような、非常に異なる悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞を溶解できた。正常細胞で行った同じ実験はＴ細胞活性化を示さず、細胞傷害性事象は生じなかった。
【００３８】
したがって、本発明は、
ａ．第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記重鎖（ＶＨＡ）の可変ドメインは配列番号１によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有し、第１の特異性（Ａ）はＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗原に対してである、第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片と、
ｂ．第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記軽鎖（ＶＬＢ）の可変ドメインは配列番号３によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有し、第２の特異性（Ｂ）はＴリンパ球ＣＤ３に対してである、第２の特異性（Ｂ）を免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片と、
ｃ．特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記重鎖（ＶＨＢ）の可変ドメインは配列番号５によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインまたはその断片と、
ｄ．特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片であって、前記軽鎖（ＶＬＡ）の可変ドメインは配列番号７によるアミノ酸配列またはその直接的な等価物を有する、特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインまたはその断片と
を含み、
一本鎖多重抗原結合分子のＶＨおよびＶＬドメインはＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡの順序で連結し、各々のＶＨおよびＶＬドメインはペプチドリンカーにより連結し、ＶＨＡドメインとＶＬＢドメインとの間、およびＶＨＢドメインとＶＬＡドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）からなり、ＶＬＢドメインとＶＨＢドメインとの間のペプチドリンカーは、各々４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）３の各々からなる３個のリンカー配列からなる、一本鎖二重特異性ダイアボディまたはその断片を記載している。
【００３９】
ＢｓＡｂは、黒色腫、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸腺癌、肝細胞癌および肺扁平上皮癌などの異なる腫瘍細胞に対して活性であり、ＴＲＡＩＬの潜在的抗腫瘍能力に耐性を回避する能力を付与する。
【００４０】
ＳｃＤｂフォーマットはダイアボディ（Ｄｂ）フォーマットに由来する。抗ＣＤ３部分を有するＤｂフォーマットにおけるＢｓＡｂは、前立腺特異的膜抗原との結合により前立腺癌細胞株（Ｂｕｈｌｅｒ  Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００８、５７：４３−５２）およびＣＤ１９との結合によりＢ細胞リンパ腫（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６５：８８８−８９５）を含む腫瘍を溶解するためにＴ細胞を効果的に再標的化することができることが実証された。
【００４１】
インビトロでの有望な結果にも関わらず、Ｄｂｓは、インビボ安定性の低下および機能的ヘテロ二量体と共に不活性ホモ二量体の存在などの、それらの使用の制限という顕著な欠点に出くわした。これらの問題は、同種可変ドメイン間の、より効果的な対合を可能にし、２つの抗体ドメインを融合し、一本鎖ダイアボディを生じる、２つのポリペプチド鎖を連結する約１５ａａの別のペプチドリンカーを導入することによって克服された。
【００４２】
本発明において、
本明細書に使用される場合、「特異性」という用語は、特定の配列またはドメインを認識する能力を指し、さらに、その配列またはドメインに結合する能力を指し、
一本鎖二重特異性抗体（ｓｃＢｓＡｂ）という用語は、２つのアーム：ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合し、可溶性ＴＲＡＩＬのアポトーシス促進可能性を模倣する抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２アーム、および腫瘍細胞に対してＴ細胞を再標的化し、腫瘍細胞を殺傷する抗ＣＤ３アームを有する多重抗原結合分子を指す。本発明によるＢｓＡｂはｓｃＤｂであり、
本明細書に使用される場合、「その断片」という用語は、対応する抗体に対して、より小さいサイズを有する一本鎖抗体断片を指す。本発明による一本鎖二重特異性抗体またはその断片はｓｃＤＢフォーマットであり、それは、有益には、他の二重特異性抗体フォーマットと比較して、より小型の形態を有し、免疫細胞溶解シナプスの形成を可能にする。ＢｉＴＥ様フォーマットにおいて組織化／構築された同じ抗体可変ドメインは機能的ではない。
【００４３】
実施例３に記載され、図２に示される結果は、ＢＩＴＥ様フォーマットであるタンデムｓｃＦｖ  ＢｓＡｂ  １６ｅ２／ＴＲ６６が、２日後のみにその結合する能力を喪失することを示す。いかなる理論にも束縛されないが、これは、サイズ排除クロマトグラフィープロファイルによって実証されるように凝集する傾向を有する構造の不安定性に起因し得る。
【００４４】
対照的に、ダイアボディフォーマットである、本発明によるｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１は、驚くべきことに安定であり、凝集体は２年後でも０．５％を超えなかった（図２Ｂ）。ＢｓＡｂをタンデムｓｃＦｖフォーマットに変換することを除いて同じ可変領域（１６ｅ２およびｈＵＣＴＨ１）を使用すると、構築物がＴＲＡＩＬ−Ｒ２だけでなく、ＣＤ３も決して認識しないことが示され得る（図２Ｃ）。本発明者らはまた、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２として、少数のアミノ酸のみ１６ｅ２とは異なる１６ｅ２の誘導体であるドロジツマブおよび抗ＣＤ３としてｈＵＣＴＨ１を使用してｓｃＤｂを構築した。この場合も同様に、構築物は数日間だけ作用する。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は一本鎖二重特異性抗体またはその断片を提供し、前記直接的な等価物は前記可変ドメインと少なくとも９５％の全体の配列相同性／同一性を有する。
【００４６】
本発明によるＶＨおよびＶＬ可変ドメインの直接的な等価物は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の全体の配列類似性または相同性を有する。好ましい発明において、一本鎖二重特異性抗体またはその断片は配列番号１３によるアミノ酸配列を有し、「ｓｃＤｂ１６ｅ２／ｈＵＣＨＴ１」またはその直接的な等価物とも称される。本発明によるＢｓＡｂもまた、例えば図１Ｃに表され、それは、ＶＨおよびＶＬドメインが連結している配列の一例を報告している。
【００４７】
一態様において、本発明によるＢｓＡｂの例は以下の配列である：
ＶＨＡドメイン、続いて４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）からなるリンカー配列、ＶＬＢドメイン、続いて配列番号１５に対応する、各々４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基の各々（（ＧＧＧＧＳ）３）からなる３個のリンカー配列、続いてＶＨＢドメイン、続いて４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）からなるリンカー配列およびＶＬＡドメイン。
【００４８】
さらなる態様では、本発明によるＢｓＡｂの例は、以下の配列でリンカーおよびドメインを有する：配列番号２２、配列番号２、配列番号１０、配列番号４、配列番号１１、配列番号６、配列番号１２、配列番号８、末端リンカーＧＣＧＧＣＣＧＣ。
【００４９】
リンカー配列はクローニング目的のための制限酵素部位を含んでもよいが、当業者は、このような制限酵素部位が研究者の必要性に応じて修飾されてもよいこと、およびリンカー配列は特定の制限部位に制限されないことを容易に理解できる。
【００５０】
好ましい実施形態では、本開示は、配列番号１３のアミノ酸配列、および配列番号２１のヌクレオチド配列を有するＢｓＡｂを提供する。
【００５１】
本発明の第２の態様では、本発明はさらに、本発明による一本鎖二重特異性抗体分子またはその断片と、標識化剤とを含む組成物を提供する。
【００５２】
好ましい態様では、本発明による組成物は、放射性ヌクレオチド、蛍光ナノ粒子からなる群から選択される標識化剤、または本発明によるＢｓＡｂを多量体化できる任意の方法（ビオチンタグまたはロイシンジッパーなど）を含む。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、本発明による一本鎖二重特異性抗体分子またはその断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【００５４】
本発明による医薬組成物は、局所、筋肉内、静脈内注射、皮下、または他の投与経路用である。
【００５５】
提供される医薬組成物は、その効果を増強または低減できる少なくとも１種のさらなる化合物と組み合わせて使用されてもよい。本発明による医薬組成物の効果を増強または低減できる化合物の例としては、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）の群に含まれるＴＲＡＩＬ増感剤、ＨＤＡＣ阻害剤（例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸）、ＣＤＫ阻害剤（例えばフラボピリドール）、ＥＲ阻害剤（例えばタモキシフェン）、Ｂｃｌ−２阻害剤（例えばＡＢＴ−７３７）、Ｓｍａｃ模倣剤（例えばＬＢＷ２４２）、カルボプラチンまたはシスプラチン、イリノテカン、ボルテゾミブが挙げられる。
【００５６】
別の態様によれば、記載される本発明は、腫瘍細胞に対してＴリンパ球の細胞傷害作用を再誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、本明細書に開示される一本鎖二重特異性抗体と接触させる工程を含む、方法を提供する。別の態様によれば、記載される本発明は、腫瘍の治療に使用するための、本発明による一本鎖二重特異性抗体またはその断片を提供する。
【００５７】
好ましい態様では、本発明による一本鎖二重特異性抗体またはその断片は腫瘍の治療に使用するためであり、前記腫瘍は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸腺癌、肝細胞癌および肺扁平上皮癌からなる群から選択される。
【００５８】
有益には、本発明によるＳｃＤｂは、異なる器官ならびに異なるステージおよびグレードに由来する全てのＴＲＡＩＬ−Ｒ２陽性腫瘍の治療に使用され得る。
【００５９】
好ましい態様では、本発明による一本鎖二重特異性抗体またはその断片は、少なくとも１種の抗腫瘍剤による以前の治療に対して耐性があるか、もしくは不耐容であるか、または抗腫瘍剤による治療が回避されなければならない患者の治療に使用するためでもある。このことは、他の治療に対して耐性があるか、または耐性になる、これらの患者を治療するさらなる機会を与える。さらに、本発明による一本鎖二重特異性抗体またはその断片は、予防的または治療的処置のためである。
【００６０】
本発明の目的に関して、各々の一本鎖二重特異性抗体ドメインまたはリンカーは以下のように対応する配列番号を有する：
配列番号１は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのアミノ酸配列：ＶＨＡ  １６Ｅ２（クラスＩＧＨＶ  ３−２０＊０１）に対応し；
配列番号２は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのヌクレオチド配列：ＶＨＡに対応し；
配列番号３は、免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列；ＶＬＢ（ｈＵＣＴＨ１）に対応し；
配列番号４は、免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのヌクレオチド配列：ＶＬＢに対応し；
配列番号５は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのアミノ酸配列：ＶＨＢ（ｈＵＣＴＨ１）に対応し；
配列番号６は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのヌクレオチド配列：ＶＨＢに対応し；
配列番号７は、免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列：１６Ｅ２のＶＬＡ（クラスＩＧＬＶ３−１９＊０１）に対応し；
配列番号８は、免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのヌクレオチド配列：ＶＬＡに対応し；
配列番号９（ＶＨＡドメインの前に来る配列、Ｓｆｉ  Ｉ制限部位）
配列番号１０（ＶＨＡドメインとＶＬＢドメインとの間のリンカー、Ａｇｅ  Ｉ制限部位）
配列番号１１（ＶＬＢドメインとＶＨＢドメインとの間のリンカー、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー）
配列番号１２（ＶＨＢドメインとＶＬＡドメインとの間のリンカー、Ｘｂａ  Ｉ制限部位）
末端リンカーの配列：ＧＣＧＧＣＣＧＣ（末端リンカー、ＶＬＡドメイン後、Ｎｏｔ  Ｉ制限部位）
配列番号１３は、一本鎖二重特異性抗体ｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１のアミノ酸配列に対応し、
配列番号１４は、ベクター内にｓｃＤｂをクローニングするために使用される上流配列を有する一本鎖二重特異性抗体ｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１のヌクレオチド配列に対応し、
配列番号１５は、ＶＬＢドメインとＶＨＢドメインとの間の代替リンカーのアミノ酸配列に対応し、
配列番号１６は、ＨｉｓおよびＭｙｃタグを有する一本鎖二重特異性抗体のアミノ酸配列に対応し、
配列番号１７は、ファージディスプレイで単離されたクローン７抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＳｃＦｖのアミノ酸配列に対応し、
配列番号１８は、ファージディスプレイで単離されたクローン８抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＳｃＦｖのアミノ酸配列に対応し、
配列番号１９は、ファージディスプレイで単離されたクローン４４抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＳｃＦｖのアミノ酸配列に対応し、
配列番号２０は、ファージディスプレイで単離されたクローン５６抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＳｃＦｖのアミノ酸配列に対応し、
配列番号２１は、一本鎖二重特異性抗体ｓｃＤｂ  １６ｅ２／ｈＵＣＴＨ１（ＢｓＡｂ）のヌクレオチド配列に対応し、
配列番号２２は、（ＧＧＧＧＳ）リンカーのヌクレオチド配列に対応する。
【００６１】
本明細書上記に説明されている本発明の種々の実施形態および態様ならびに添付の特許請求の範囲における請求項は以下の実施例の実験により支持されることが見出される。
【実施例】
【００６２】
ここで上記の説明と共に以下の実施例を参照して本発明のいくつかの実施形態を例示する。
【００６３】
細胞株
Ｍ４１、Ｍ１５およびＭ６４ヒト黒色腫細胞を使用した。Ｍ１５、Ｍ６４およびＭ４１は、異なるＴＲＡＩＬ−Ｒ２発現およびｓＴＲＡＩＬ処理に対する感受性を有する細胞である：特に、Ｍ１５はｓＴＲＡＩＬ感受性および高発現であり；Ｍ４１は部分的にｓＴＲＡＩＬ感受性および高発現であり、一方でＭ６４は低発現で耐性がある。
【００６４】
ＨｅＬａ（頸部上皮腺癌）、Ａ４３１（扁平上皮癌）、ＳＫＯＶ３、Ａ２７７４、Ａ２７８０およびＮＬ３５０７  ＩＮＴ−Ｏｖ−１１（上皮性卵巣癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＴ−３（トリプルネガティブ乳癌）、ＬｎＣＡＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３（前立腺癌）、ＣａＣｏ２（結腸直腸腺癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＳｋＭｅｓ（肺扁平上皮癌）、ＨＥＫ−２９３（正常胚腎臓）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴリンパ球の不死化株）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（トリプルネガティブ乳癌、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ネガティブ細胞株）、ＳＵ−ＤＨＬ−４（リンパ腫）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＭＤ）から購入した。ＩＮＴ−Ｏｖ−１１（上皮性卵巣癌）は本発明者らのグループによって開発された。
【００６５】
ｍＡｂを産生するハイブリドーマ、抗ｍｙｃタグｍＡｂ  ９Ｅ１０（ＣＲＬ−１７２９）はＡＴＣＣから購入した。
【００６６】
細菌株
大腸菌株。ＴＧ１｛ｓｕｐＥｔｈｉ−１（（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｈｓｄ（５［Ｆ’  ｔｒａＤ３６＋ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑ  ｌａｃＺ（Ｍ１５）］｝を抗体ファージディスプレイパニングのために使用し、ＨＢ２１５１｛ｎａｌｒ  ｔｈｉ−１  ａｒａ  ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ［Ｆ’  ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃｉｑ  ｌａｃＺ（Ｍ１５）］｝を二重特異性抗体の可溶性産生のために使用した。
【００６７】
実施例１
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する一本鎖抗体断片（一本鎖可変断片ｓｃＦｖ）の単離
３サイクルの濃縮を実施して、以下に記載されるようにＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するｓｃＦｖを単離した。溶出ファージの力価は各サイクル後に徐々に増加し、産生したファージの結合をファージＥＬＩＳＡにおいて試験し、濃縮後のファージに由来する、濃縮した７６８個の無作為に採取したコロニーと共に比例的に増加させ、天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ２に特異的な単一のクローンファージＥＬＩＳＡおよび４個のクローンにおいて試験し、単離し、シークエンスし、特性付けした。４個のｓｃＦｖを可溶性形態で産生し、その結果、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋細胞に特異的に結合できた。
【００６８】
材料および方法：
抗体ファージディスプレイ
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するＳｃＦｖを、ファージディスプレイ抗体技術を使用して単離した。予め作製したヒトＳｃＦｖファージディスプレイライブラリー（所有）を使用し、３ラウンドの選択を実施した。天然のＴＲＡＩＬ−Ｒ２での選択のために、６×１０６個のリンパ腫ＳＵ−ＤＨＬ−４受容体陽性細胞を溶解した。溶解物に含有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と以前にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて捕捉した。磁性ビーズを用いて捕らえたＴＲＡＩＬ−Ｒ２を、１時間撹拌しながらＭＰＢＳ（ミルク４％＋ＰＢＳ）中でインキュベートし、その後、ファージライブラリーを加え、室温にて２時間撹拌しながらインキュベートし、第１、第２および第３サイクルの濃縮においてそれぞれ２０、１５および１０回、ＰＢＳＴ（ＰＢＳおよびＴｗｅｅｎ  ０．１％）で洗浄した。洗浄工程後、受容体に特異的な抗体断片を示したファージをビーズに付着させたままにし、２×ＴＹ培地中で０．４〜０．５のＯ．Ｄ．にて増殖させた２ｍｌのＴＧ１大腸菌を感染させるために使用した。感染した細菌を、四角のプレートディッシュ（１００×１５ｍｍ）において２ｘＴＹＥ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンに播種し、３０℃にてＯ／Ｎ（一晩）増殖させた。コロニーを計数し、ＰＣＲによってスクリーニングし、プレートを擦った。連続ラウンドのためのファージを産生するために、５０μｌの擦った細菌を、１％のグルコースおよびアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌの２ｘＴＹ培地中に接種した。Ｏ．Ｄ．が０．４〜０．５に到達したら、細菌を、３７℃にて３０分間、恒温槽中で、５×１０５ｐｆｕのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に感染させた。次いで細菌を遠心分離し、グルコースを含まない同じ培地中で再懸濁し、３０℃にてＯ／Ｎ増殖させた。ファージをＰＥＧで沈殿させ、ＰＢＳ中に再懸濁し、連続ラウンドの選択のためにそれらを使用する前に滴定した。第３ラウンドの後、ファージをＦＡＣＳ中で試験してＴＲＡＩＬ−Ｒ２結合能力を評価した。濃縮後に得られた単一コロニーを用いて、単一ファージＥＬＩＳＡを実施した。
【００６９】
単一クローンファージＥＬＩＳＡ
第３ラウンドの選択後、ファージ感染させた細菌を２ｘＴＹＥ＋アンピシリンプレートに播種した。単一クローンファージの産生を、ディープ９６ウェルプレートの各ウェルにおいて上記のように実施した。各ウェルの上清の結合能力を試験するために、単一ファージＥｌｉｓａを実施した。抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃にてＯ／Ｎコーティングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％およびＰＢＳによる３回の洗浄後、０．５μｇのＳＵ−ＤＨＬ−４溶解物を室温にて１時間インキュベートした。特異的クローンの存在が抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体と共に明らかになった。
【００７０】
抗体断片可溶性発現
可溶性二重特異性抗体または抗体断片を大腸菌において産生した。コンピテントＨＢ２１５１大腸菌を新たに形質転換し、２ｘＴＹＥに播種し、３７℃にてＯ／Ｎ増殖させた。１つの単一コロニーを接種し、２ｘＴＹ（０．１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）培地中で３７℃にて一晩増殖させた。翌日、培養物を０．１のＯＤから開始する新たな培地に接種し、培養物が０．８〜０．９のＯＤに到達するまで細菌を増殖させた。培養物を遠心分離し、使い果たした培地を、可溶性タンパク質の誘導に特有の新たな培地（２ｘＴＹ＋０．１％のグルコース＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン＋１ｍＭのＩＰＴＧ）に交換した。効果的な可溶性タンパク質発現を可能にするために、細菌を各タンパク質について最適な温度（２５〜３０℃）にてＯ／Ｎインキュベートした。翌日、細菌を遠心分離によって採取し、撹拌しながら４℃にて１時間、１ｍＭのＥＤＴＡおよび２０％のスクロースを含有する２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を使用する浸透圧衝撃処理プロトコルを実施して、二重特異性抗体または抗体断片を含有するペリプラズムタンパク質を抽出した。
【００７１】
ペリプラズム調製物を、ニッケルまたはＬプロテインクロマトグラフィーカラムと共にＩＭＡＣプロトコルを使用して精製した。
【００７２】
実施例２
二重特異性抗体の構築
本発明者らは、実施例１に記載される４個の単離した抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｓｃＦｖの可変ドメインを使用し、それらを、以下に記載される２つのマウス抗ＣＤ３ハイブリドーマ（ＴＲ６６およびＯＫＴ３）のうちの１つの可変ドメインと結合して、タンデムＳｃＦｖフォーマット（配列番号１７、１８、１９および２０）において二重特異性抗体を構築した。二重特異性抗体の構造は２つのＳｃＦｖである、第１の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２および第２の抗ＣＤ３によって構成され、それらは、構造に剛性を与え、異なる特異性の可変ドメインのミスマッチ対を可能にしない短いＧＧＧＧＳリンカーによって結合された（図１Ａ）。タンデムＳｃＦｖフォーマットとしてＴＲ６６  ｓｃＦｖと対合する、これらのクローンのうちの１つであるクローン８（配列番号１８）は最適な結合能力を示した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の異なる発現のＮＨＬ、ＨｅＬａおよび黒色腫細胞株でのＦＡＣＳによってＢｓＡｂは、その一価結合にも関わらず、完全なＩｇＧ二価陽性対照と類似した良好な反応性を実証する。不幸にも、ＢｓＡｂは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実証されるように、恐らく凝集体の存在に起因する時間の間、不十分な安定性を実証した。より安定なクローンを見つけるために、本発明者らは、クローン８をランダム変異導入し、変異したｓｃＦｖのプールを、ＴＲ６６  ｓｃＦｖを含有するベクター内にクローニングした。単一クローンＥＬＩＳＡを実施して、陽性細胞に対して良好に結合するクローンを単離した。９０個のクローンのうち、２つのＣ２およびＣ３は良好な結合および特異性を与える。それらの配列は、それらが、フレームワークにおいてそれぞれ２および１点突然変異を有することを実証する。より正確には、Ｃ２において、ＶＨのフレームワーク１において１アミノ酸変化およびフレームワーク２において１アミノ酸変化が存在し、Ｃ３において、ＶＬのフレームワーク１において１アミノ酸変化が存在する。安定性はいずれの場合も本発明者らの目的のためにまだ十分ではなかった。
【００７３】
並行して、本発明者らは、ＢｉＴＥ様ＢｓＡｂフォーマットにおいてライブラリーの直接的な選択を開始することを決定した：異なる種類のリンカーはｓｃＦｖ断片の結合および特性に影響を及ぼし得、ｓｃＦｖは、ＢｓＡｂとして構築された場合、異なる性質を有し得る。断片のプールを天然ｓｃＦｖライブラリーの第２のパニング後に得、それらから本発明者らは上記のクローンを選択し、ＴＲ６６のｓｃＦｖを含有するベクター内にクローニングした。また、十分に特性付けられた抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２クローン１６ｅ２を含有する構築物を、陽性対照として使用するために生成し、産生した。得られたライブラリーを一時的に加熱して、アンフォールディングを誘導し、凝集を促進した。冷却後、ファージディスプレイ抗体断片は可逆的にアンフォールドし、それによりそうしないものに対して濃縮した。２ラウンドの選択後、９０個のクローンのうち６個が、黒色腫細胞でＥＬＩＳＡにおいて陽性であり、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現しない細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）株で陰性であると見出した。これらの６個のクローンをＦＡＣＳによってさらに分析し、それらのうちの３個が両方のアームに良好に結合することが実証された。また、１６ｅ２  ｓｃＦｖを含有するクローンはＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＣＤ３に特異的に結合できるが、他の６個のクローンと同様に、それは特異性を少なくとも１週間維持し、その後、結合はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実証されるように恐らく凝集体の存在に起因して喪失した（図２Ａ）。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
材料および方法：
Ｂｉｔｅ様フォーマット構築物における二重特異性抗体
本発明者らの目的のために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する単離した一本鎖Ｆｖ断片を、フレキシブルなＧＧＧＧＳリンカーによって抗ＣＤ３  ｓｃＦｖに結合した。使用した抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは２つのマウスハイブリドーマＴＲ６６およびＯＫＴ３に由来した。抗体遺伝子を、二重特異性カセット遺伝子の後にエキサヒスチジン（ｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）およびＭｙｃタグの両方を含むｐＩＴ２ベクター内にクローニングした。二重特異性抗体をＨＢ２１５１大腸菌において発現させ、実施例１に記載されるように精製した。
【００７６】
第２のパニング抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に由来する増幅ＶｈおよびＶｌ
天然ＴＲＡＩＬ−Ｒ２での２回のパニングサイクル後に誘導されたファージからのプラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。ＶｈおよびＪｋ生殖細胞系列の全てに特異的なプライマーのプールを使用して、ｓｃＦｖをＰＣＲによって増幅させ、プライマーによってＴＲ６６  ｓｃＦｖを含むｐＩＴ２ベクター内にクローニングし、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位をコードして、二重特異性抗体ライブラリーを生成した。このライブラリーを、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の市販の抗体を使用して磁性ビーズに固定した天然ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対してスクリーニングした。
【００７７】
組換え抗体：ＦＡＣＳの結合特異性
全ての実験において、２×１０５個の細胞を、４℃にて３０分間、１％の飽和ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で一次抗体とインキュベートした。抗ヒスチジンタグ抗体および標識した抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ特異的）Ａｌｅｘａ４８８を使用してＢｓＡｂを検出した。ハイブリドーマに由来するマウス抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびマウスＴＲ６６  ｍＡｂを陽性対照のように使用した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して蛍光標識を測定した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ）を使用してデータ分析を実施した。
【００７８】
実施例３
新規フォーマット
ＢｉＴＥ様フォーマットの安定性の欠如により、本発明者らは異なるフォーマットの二重特異性抗体を構築することを動機付けされた。免疫細胞溶解シナプスに必要なＴ細胞および腫瘍細胞の隣接を可能にする小型のフォーマットは一本鎖二重特異性ダイアボディ（ｓｃＤｂ）である。二重特異性ダイアボディフォーマット（図１Ｂ）は、ＶＨドメインのＣ末端が、ＶＨおよびＶＬの鎖内対合を制限するために短い剛性リンカーを使用して別の特異性のＶＬドメインのＮ末端に結合している２つのｓｃＦｖによって構成される。ｓｃＤｂフォーマットにおいて、２つの鎖間の別のリンカー（ＧＧＧＧＳ）３は構造を安定化させる。本発明者らは、単離した抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｓｃＦｖ、１６ｅ２またはドロジツマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の全ての可変ドメインの配列および抗ＣＤ３特異性に対するヒト化抗体ＵＣＴＨ１（ｈＵＣＴＨ１）を有するｓｃＤｂを構築した。ｈＵＣＴＨ１のｓｃＦｖを多くのＢｓＡｂ構築物において使用し、１６ｅ２と結合させてｓｃＤｂを形成して使用した場合、安定であることを実証した。
【００７９】
構築物を、ＩＰＴＧによる誘導後、細菌ＨＢ２１５１ペリプラズムにおいてｓｃＤｂの分泌を可能にするｐＩＴ２プラスミド内にクローニングした。産生したＢｓＡｂは、Ｃ末端において、ｃ−ｍｙｃおよびエキサヒスチジンタグをそれぞれコードする２つの配列を有する。Ｈｉｓタグを挿入し、ＩＭＡＣプロトコルを使用してＢｓＡｂ精製を可能にした。二重特異性タンデムｓｃＦｖまたはｓｃＤｂフォーマットの全て異なって産生した構築物の中で、本発明者らは、低い産生量、結合の欠如および／または凝集の存在は、１６ｅ２およびｈＵＣＴＨ１と共に構築されたｓｃＤｂを除いて安定な試薬を有する可能性をなくすことに気付いた。
【００８０】
全ての構築物は１６ｅ２×ｈＵＣＴＨ１  ｓｃＤｂと比較して非常に低い産生量であった。標準産生物の産生量は約５０〜１００μｇ／Ｌであり、ｓｃＤｂについては約１〜２ｍｇ／Ｌである。産生量の差が偶然によらないようにするために、約２０の異なる産生の試みを実施し、結果は同等であった。
【００８１】
また、１６ｅ２×ｈＵＣＴＨ１  ＴａＳｃＦｖは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に特異的に結合できなかったこと（図２Ｃ）、およびドロジツマブ×ｈＵＣＴＨ１  ｓｃＤｂのような他の構築物（図２Ｄ）または１６ｅ２×ＴＲ６６  ＴａＳｃＦｖ（図２Ａ）が、産生直後の特異性で両方に結合できたが、１〜３日の保存後、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２またはＣＤ３結合能力をそれぞれ損失したことも観察することができ、この結合の損失の原因を調べ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＵＰＥＲＯＳＥ  １２  １０／３００）（分離範囲：３００Ｋｄ〜１０Ｋｄ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アッセイを実施し、精製の１６時間後に発生した１６Ｅ２×ＴＲ６６  ＴａＳｃＦｖの凝集を観察した。１６Ｅ２×ｈＵＣＴＨ１  ｓｃＤｂフォーマットは凝集傾向のない他の構築物と比較して優れており、２年の保存後でも両方の特異性、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＣＤ３に対する結合親和性を維持した（図２Ｂ）。
【００８２】
一本鎖ダイアボディ特性付け
精製したｓｃＤｂを４〜１２％のＳＤＳゲルでの電気泳動によって試験し、エキサヒスチジニル（ｅｘａｈｙｓｔｉｄｉｎｉｌ）エピトープに特異的なＭＡｂ抗Ｈｉｓを使用して、Ｃｏｍａｓｓｉｅブルーで染色したか、またはニトロセルロース膜でのブロッティング後に染色した。検出したバンドは正確な分子量であり、他のバンドは観察されなかった（図３Ｃ）。ＳＵＰＥＲＯＳＥ  １２  １０／３００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー分析により、精製後のｓｃＤｂの純度は９７％超であることが示された。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ試験により、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋黒色腫細胞およびＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するｓｃＤｂの特異的結合が実証された。両方の特異性についてＭＤＡ−ＭＢ−４６８の完全に陰性細胞に対する結合は観察されなかった（図３Ａ）。
【００８３】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢｓＡｂのＴＲＡＩＬ−Ｒ２の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して表面プラズモン共鳴によって測定した。チップに固定した組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用して分析を実施した。実験データに基づいて、結合および解離曲線を算出し、動力学的評価により、１．４８×１０７ｎＭの算出された親和定数（ＫＤ）が得られた（図３Ｂ、左のパネル）。
【００８４】
ｓｃＤｂ抗ＴＲＡＩＬ−アームのｓＴＲＡＩＬとの結合競合を評価するために、組換え受容体をチップに固定し、１μＭの可溶性ＴＲＡＩＬで飽和させた。分析により、同じ結合部位に対して強力な競合が示された。なぜなら、ｓＴＲＡＩＬ飽和ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するＢｓＡｂ結合は観察されないからである（図３Ｂ、右のパネル）。この理由のために、本発明者らは、ｓｃＤｂがアゴニスト様式でｓＴＲＡＩＬのように作用できるかどうかを調べた。
【００８５】
ＳｃＤｂアゴニスト活性
ＴＲＡＩＬＲ２アゴニスト活性をより深く特性付けるために、本発明者らは、単量体形態または異なる方法で多量体化したｓｃＤｂを使用した。本発明者らが使用した第１の方法は、９Ｅ１０モノクローナル抗体によって与えられたＭｙｃタグの認識の可能性を利用した：この抗体はｍｙｃタグを認識でき、ｓｃＤｂの二量体化を可能にし、Ｆｃ特異的抗マウス抗体とインキュベートする場合、それは９Ｅ１０のＦｃに結合でき、ｓｃＤｂの人工四量体形態を有することができる。第２の方法は、ストレプトアビジンのビオチン四量体化特性を利用する：ｓｃＤｂをビオチン化し、ストレプトアビジンとインキュベートした。四量体化したｓｃＤｂを、ＳＥＣを用いて単離し、細胞を処理するために使用した。Ｍ１５、Ｍ６４およびＭ４１は、異なるＴＲＡＩＬ−Ｒ２発現およびｓＴＲＡＩＬ処理に対する感受性を有する細胞である：特にＭ１５はｓＴＲＡＩＬ感受性および高発現である；Ｍ４１は部分的にｓＴＲＡＩＬ感受性および高発現であり、Ｍ６４は低発現で耐性がある。ｓｃＤｂを多量体化するために使用した全ての方法はアゴニスト効果を示唆しており、特にビオチン−ストレプトアビジン戦略で多量体化したｓｃＤｂは最適なアゴニスト活性を実証する。
【００８６】
ｓｃＤｂによる細胞傷害性の誘導
腫瘍細胞に対して増殖阻害または細胞傷害性を誘導する二重特異性抗体の能力を、
健康なドナーから単離した、活性化または非活性化ＰＢＬを腫瘍細胞に対して再誘導することによって調べた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現するＭ１５、Ｍ４１およびＭ６４黒色腫細胞株、Ａ２７７４、Ａ２７８０、ＳＫＯＶ３、ＮＬ３５０７およびＡ４３１卵巣癌細胞株、Ａ４３１扁平上皮癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＴ−３トリプルネガティブ乳癌細胞株、ＬｎＣａｐ、ＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞株、ＣａＣＯ２結腸直腸腺癌細胞株、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞株およびＳｋＭｅｓ肺扁平上皮癌細胞株を標的細胞として使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２陰性細胞株を使用して、オフターゲットの細胞傷害性の不在を試験した；正常な腎臓不死化細胞株であるＨＥＫ−２９３を使用して、正常細胞に対する毒性を排除した。増殖阻害についてＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏまたは直接的なＴ細胞の細胞傷害性についてカルセインＡＭ放出アッセイを使用してｓｃＤｂの効果を測定した。異なる濃度のＢｓＡｂ（０．０１μｇ／ｍｌに到達するまで１：２希釈で１μｇ／ｍｌから開始する）、異なるエフェクター対標的比（２０：１〜１．２５：１）および活性化または非活性化ＰＢＬを使用して最初の実験を実施した。
【００８７】
０．５μｇ／ｍｌの濃度および５：１のＥ：Ｔ比を使用して最適な結果を得た。ｓｃＤｂは、使用した全ての腫瘍細胞株に対して良好な効果を示す。Ｍ６４およびＭ１５に関するデータを図４Ａに報告する。
【００８８】
１０人の異なる健常ドナーの末梢血から抽出したＰＢＬを使用した結果の再現性を試験するためにこれらの条件を使用して他の実験を実施した。異なるドナーに由来するＰＢＭＣの異なる細胞傷害性力に起因する歪みを回避するために、腫瘍細胞の処理前に、ＰＢＭＣ基礎活性化状態をＦＡＣＳによって評価した。ＣＤ６９およびＣＤ２５マーカーが非常に多い場合、ＰＢＭＣはちょうど活性化しているとみなし、処理に使用しなかった。黒色腫細胞株で、ｓｃＤｂおよびＰＢＭＣによる処理は同じ結果を繰り返した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８においてオフターゲット細胞傷害性は観察されなかった。さらに、各群において算出した非常に低い標準偏差により、処理が再現可能であり、異なるＰＢＬプールによる影響を受けないことが示された（図４Ｂ）。
【００８９】
二重特異性抗体の反応性をさらに特性付けるために、異なる癌細胞株上のＴＲＡＩＬ−Ｒ２受容体の存在を評価した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の表面発現を、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｍＡｂを使用してＦＡＣＳによって分析した。この分析から、本発明者らは、ＩＮＴ−Ｏｖ−１１、Ａ２７７４、Ａ２７８０、ＳＫＯＶ３、ＮＬ３５０７卵巣癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＴ−３トリプルネガティブ乳癌細胞株、ＬｎＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞株、ＣａＣＯ２結腸直腸腺癌細胞株、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞株、ＳｋＭｅｓ肺扁平上皮癌細胞株、Ａ４３１扁平上皮癌細胞株はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現することを見出し、標的細胞として使用した。ＨＥＫ−２９３、正常な腎臓不死化細胞株は非常に高いレベルのＴＲＡＩＬ−Ｒ２を示し、正常細胞に対する毒性を排除するために使用した。
【００９０】
０．５μｇ／ｍｌのｓｃＤｂによるＰＢＬ（５：１のＥ：Ｔ比）の再標的化後、本発明者らは、ＢｓＡｂが使用した全ての細胞株について標的細胞増殖阻害を誘導できることを観察した。処理したＨＥＫ−２９３に対して細胞傷害性は観察されなかった（図４Ｃ〜４Ｄ）。
【００９１】
カルセインＡＭ放出
直接的なＴ細胞の細胞傷害性を調べるために、５１Ｃｒ放出と同等の方法である、カルセインＡＭ（カルセイン−アセトキシメチルジアセチルエステル）放出を使用した（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓら、１９９４およびＲｏｄｅｎら、１９９９）。腫瘍標的細胞数および密度に対するカルセイン−ＡＭ濃度を、１〜１０μＭの濃度範囲で細胞をインキュベートすることによって決定し、最大と自然放出との間の最適な分離を評価した（データは示さず）。ｓｃＤｂによる処理は良好な結果を示し、黒色腫細胞Ｍ１５、Ｍ６４およびＭ４１を溶解するためにＴ細胞を再標的化することができた。Ｔ細胞を再標的化することにより、腫瘍細胞に損傷を与えることができ、カルセインは培地中に放出した。４時間後、細胞傷害性はＴＲＡＩＬ−Ｒ２高発現Ｍ１５およびＭ４１について約５０％であり、低発現Ｍ６４について約３０％であった。１６時間後、細胞傷害性は全ての処理した細胞株について１００％に達した。直接的な細胞傷害性はＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２陰性細胞株において観察されなかった（図４Ｅ）。
【００９２】
Ｔ細胞活性化
細胞傷害性の機構を調査するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２陽性および陰性腫瘍ならびに正常細胞との同時インキュベーション後、活性化のＰＢＭＣ状態を分析した。Ｔ細胞上で発現したＣＤ６９およびＣＤ２５活性化マーカーはＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋細胞とのインキュベーション後にＰＢＭＣに存在し、ｓｃＤｂの存在下でのみ増加した。対照的に、２つのマーカーの上方制御はｓｃＤｂの非存在下またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＭＤＡ−ＭＢ−４６８もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２高発現ＨＥＫ−２９３正常細胞との同時培養後に存在しなかった（図６Ａ）。Ｍ１５細胞株を処理して実施した実験により、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＣＤ６９およびＰＤ−１の用量依存的発現が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団の両方において誘導されたことが明らかになった（図６Ｂ）。腫瘍細胞に対するｓｃＤｂ媒介性再標的化後、Ｔ細胞活性化が、培地中に放出されたサイトカインの濃度の増加によってさらに実証された。特に、図７は、これらのサイトカイン産生の増加が、２４時間における産生のピークでｓｃＤｂの存在下でのみ特異的に誘導したことを示す。２４時間の上清に対するサイトカイン産生は４８時間後に減少し、７２時間後に同様に戻った。４回全てにおいて、ｓｃＤｂ処理培地において測定したサイトカインは、ＰＢＭＣのみで処理した細胞の培地中で産生されたサイトカインより多い。陰性ＴＲＡＩＬ−Ｒ２または正常細胞を使用するとサイトカイン産生は観察されなかった。
【００９３】
材料および方法
ＢＩＡｃｏｒｅ
ＢｓＡｂ抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２アームの結合を、研究グレードのＣＭ５センサーチップ（
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ２０００を使用して表面プラズモン共鳴によって評価した。組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）非相関タンパク質を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）との標準的なアミンカップリングプロトコルを使用してＣＭ５センサーチップの２つの異なるレーンに固定した。ＢｓＡｂを３０μＬ／分の流速で３分間注入した。動態分析を４００〜２５ｎＭの範囲の濃度のｓｃＤｂで実施した。初期ベースラインの回復を各注入後に検証した。得られたデータを、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ−結合モデルを仮定するＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．２（グローバルフィッティング）によって分析した。
【００９４】
生化学的特性付けおよび完全性
サイズおよび均一性を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティングおよび質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）によって分析した。
【００９５】
潜在的二量体化を、ＳＵＰＥＲＯＳＥ  １２  １０／３００（分離範囲：３００Ｋｄ〜１０Ｋｄ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【００９６】
ＰＢＬの単離
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離標準プロトコル（Ｆｉｃｏｌｌ  ｐｌｕｓ  ｈｙｓｔｏｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって健康なドナーの軟膜から単離した。単離したＰＢＭＣをＲＰＭＩ  １６４０完全培地中に再懸濁し、細胞数を１×１０６／ｍｌに調整した。フラスコを、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃にて３０分間、横にして置き、単球を付着させた。上清に存在するＰＢＬを除去し、別のフラスコに入れた。ＰＢＬを、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、ＩＬ−２およびＰＨＡを使用して４日間活性化した。
【００９７】
腫瘍／正常細胞増殖阻害および細胞傷害性アッセイ
再誘導したＴ細胞増殖阻害を、ＰＢＬおよび一組の異なるＴＲＡＩＬ−Ｒ２＋細胞株を使用してＭＴＴアッセイによって評価した。１．２×１０４個の細胞を、適切な培地を含む９６ウェル平底プレートの各ウェルに播種し、ＯＮインキュベートし、それらを付着させた。０．５μｇ／ｍｌのｓｃＤｂを加え、細胞を１時間インキュベートし、その後、ＰＢＬを加えた（Ｅ：Ｔ比：５：１）。陰性対照：未処理の細胞として、ｓｃＤｂのみとインキュベートした細胞またはＰＢＬのみとインキュベートした細胞を使用した。４８または９６時間後、上清を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄してＰＢＬを除去した。各ウェルに、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ塩を含有する１００μｌの新たな培地を加えた。３時間後、上清を捨て、１５０μｌのＭＴＴ溶媒（イソプロパノール＋４ｍＭ  ＨＣｌ＋０．１％  ＮＰ４０）を使用して、形成したホルマザン塩を再懸濁した。Ｂｉｏｒａｄ−５５０マイクロプレートリーダーを使用して５９０ｎｍ（６２０ｎｍの参照フィルター）における吸光度を読み取った。
【００９８】
再誘導したＴ細胞の細胞傷害性を、カルセインＡＭ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ）放出アッセイによって分析した。１０６個の標的細胞を、１５μＭのカルセイン−ＡＭを含有する１ｍｌの完全培地中に再懸濁し、３７℃にて３０分インキュベートし、新たな培地で３回洗浄した。１０４個の細胞を、増殖阻害アッセイのために使用した同じ処理後（各々について３連）に９６ウェル丸底プレートに播種した。６個の複製ウェルを自然放出の測定のために使用し、最大放出について６であった（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する培地中の標的細胞）。４時間後、プレートを１５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、放出された蛍光カルセインを含有する上清を黒壁の９６ウェルプレートに移した。４８５／５３５ｎｍの励起／発光波長でＵｌｔｒａマルチプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ／Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）によって蛍光強度を測定した。
【００９９】
Ｔ細胞活性化
活性化マーカー評価
ＴＲＡＩｌ−Ｒ２＋黒色腫（Ｍ１５、Ｍ４１およびＭ６４）ならびにＨｅｋ−２９３正常細胞およびＴＲＡＩｌ−Ｒ２−ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を標的細胞として使用し、ウェル当たり３．５×１０４個の細胞密度で４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内のＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。１２時間後、０．５μｇ／ｍｌのｓｃＤｂを加え、１時間インキュベートして、腫瘍細胞に存在するＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合させた。新たに単離したヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、５：１のエフェクター対標的比でｓｃＤｂ処理／未処理標的細胞に加えた。３７℃、５％ＣＯ２にて１６時間のインキュベーション後、上清に含まれたＴ細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、抗ヒトＣＤ１３７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、抗ヒトＰＤ−１  ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ヒトＣＤ２５（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、氷上で３０分間、異なる蛍光色素で標識した。ＰＢＳ＋ＦＣＳ  １％で３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでフローサイトメトリーによって分析した。
【０１００】
サイトカイン放出の決定（Ｂｉｏｐｌｅｘ）
分泌したＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ、およびＩＬ−２の量を決定するために、上清を、ｓｃＤｂプラスＴ細胞による腫瘍細胞の処理の開始後、４日間毎日回収した。上清を、製造業者のプロトコルに従ってＢｉｏ−ｐｌｅｘ  ＰｒｏＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ２７−Ｐｌｅｘ、グループＩ（ＢＩＯＲＡＤ）を使用してサイトカイン分泌について分析した。試料の吸収を測定し、得られた値を使用して、製造業者によって提供される標準的なシリーズについて得られた値に従って試料中のサイトカインの濃度を算出した。
【０１０１】
上記の説明および上記の実施例から、本発明に従って記載され、得られる生成物によって達成される利点が明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ａ−４】
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【図３Ａ−５】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月27日(2018.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインであって、前記重鎖（ＶＨＡ）の可変ドメインは配列番号１によるアミノ酸配列を有し、第１の特異性（Ａ）はＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗原に対してである、第１の特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインと、
ｂ．第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインであって、前記軽鎖（ＶＬＢ）の可変ドメインは配列番号３によるアミノ酸配列を有し、第２の特異性（Ｂ）はＴリンパ球ＣＤ３に対してである、第２の特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインと、
ｃ．特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインであって、前記重鎖（ＶＨＢ）の可変ドメインは配列番号５によるアミノ酸配列を有する、特異性（Ｂ）を有する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変ドメインと、
ｄ．特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインであって、前記軽鎖（ＶＬＡ）の可変ドメインは配列番号７によるアミノ酸配列を有する、特異性（Ａ）を有する免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインと
を含み、
一本鎖二重特異性抗体のＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡの順序で連結し、各々のＶＨおよびＶＬドメインはペプチドリンカーにより連結し、ＶＨＡドメインとＶＬＢドメインとの間、およびＶＨＢドメインとＶＬＡドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）からなり、ＶＬＢドメインとＶＨＢドメインとの間の前記ペプチドリンカーは、各々４個のグリシンアミノ酸残基および１個のセリンアミノ酸残基からなる３個のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３からなる、
一本鎖二重特異性ダイアボディ。
【請求項２】
配列番号１３によるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の一本鎖二重特異性抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の一本鎖二重特異性抗体と、標識化剤とを含む組成物。
【請求項４】
前記標識化剤が、放射性ヌクレオチドまたは蛍光ナノ粒子からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の一本鎖二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項６】
筋肉内、静脈内注射、皮下、または吸入投与経路用の請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物の効力を増強または低減させることができる、少なくとも１種のさらなる化合物と組み合わせて使用される、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍細胞に対するＴリンパ球の細胞傷害作用を再誘導する方法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１または２に記載の一本鎖二重特異性抗体と接触させる工程を含む、方法。
【請求項９】
腫瘍の治療用の医薬の製造のための請求項１または２に記載の一本鎖二重特異性抗体の使用。
【請求項１０】
前記腫瘍が、黒色腫、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸腺癌、肝細胞癌および肺扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記治療が、少なくとも１種の抗腫瘍剤による以前の治療に対して耐性があるか、もしくは不耐容である患者に対してであるか、または抗腫瘍剤による治療が回避されなければならない患者に対してである、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記治療が予防的または治療的である、請求項１０または１１に記載の使用。
【国際調査報告】
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