(57)【要約】  本発明は、放射線造影媒体を用いる処置(特に膵臓、胆嚢及び/又は胆管系を選択的に造影する処置)のための、造影後の膵炎のリスクを低下させるための組成物及び方法に関する。非限定的実施形態において、本発明は、(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を含む放射線造影媒体、並びに構成要素(ii)及び(iii)を含まない従来の放射線造影剤と比較して、その後の膵炎のリスクが低減された、膵臓及び関連構造の造影の実施におけるその使用を提供する。【選択図】  図１Ａ
2018524287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を、被験体における放射線造影に有効で、カルシニューリン阻害剤及び抗酸化剤を伴わずに投与される放射線造影剤と比較して造影後の膵炎のリスクを低下させる量で含む、放射線造影媒体。
【請求項２】
放射線造影剤が水溶性非イオン性放射線造影剤である、請求項１に記載の放射線造影媒体。
【請求項３】
カルシニューリン阻害剤がシクロスポリンである、請求項１に記載の放射線造影媒体。
【請求項４】
抗酸化剤がN-アセチルシステインである、請求項１に記載の放射線造影媒体。
【請求項５】
(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を含む請求項１に記載の放射線造影媒体を調製するためのキット。
【請求項６】
放射線造影剤が水溶性非イオン性放射線造影剤である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
カルシニューリン阻害剤がシクロスポリンである、請求項５又は６に記載のキット。
【請求項８】
抗酸化剤がN-アセチルシステインである、請求項５、６又は７に記載のキット。
【請求項９】
被験体における膵臓、胆嚢、及び/又は胆管系を放射線造影する方法であって、被験体の膵臓、胆嚢及び/又は胆管系に、有効量の(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を含む上記に示される放射線造影媒体を導入するステップを含む、前記方法。
【請求項１０】
放射線造影剤が水溶性非イオン性放射線造影剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カルシニューリン阻害剤がシクロスポリンである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗酸化剤がN-アセチルシステインである、請求項９、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
造影後の膵炎のリスクを低下させるために試験化合物を使用し得るか否かを決定する方法であって、(i) 炎症誘導性プロモーターに作動可能に連結された、検出可能なレポーターと融合したNFκBをコードする核酸が導入されている初代腺房細胞又は膵臓細胞株の細胞である細胞を提供するステップ；(ii) 細胞を放射線造影剤及び試験化合物に曝露し、NFκB-レポーターの量を決定するステップ；及び(iii) (ii)において決定されたNFκB-レポーターの量を、同等の条件下であるが試験化合物の不存在下で放射線造影剤に曝露された対照細胞中に存在するNFκB-レポーターの量と比較するステップを含み、ここで(ii)において決定されたNFκB-レポーターの量が、(iii)において決定されたNFκB-レポーターの量より少ない場合、造影後の膵炎のリスクを低下させるために試験化合物を使用し得る、前記方法。
【請求項１４】
造影後の膵炎のリスクを低下させるために試験化合物を使用し得るか否かを決定する方法であって、(i) 炎症誘導性プロモーターに作動可能に連結された、検出可能なレポーターと融合したNFATをコードする核酸が導入されている初代腺房細胞又は膵臓細胞株の細胞である細胞を提供するステップ；(ii) 細胞を放射線造影剤及び試験化合物に曝露し、NFAT-レポーターの量を決定するステップ；及び(iii) (ii)におけるNFAT-レポーターの量を、同等の条件下であるが試験化合物の不存在下で放射線造影剤に曝露された対照細胞中に存在するNFAT-レポーターの量と比較するステップを含み、ここで(ii)において決定されたNFAT-レポーターの量が、(iii)において決定されたNFAT-レポーターの量より少ない場合、造影後の膵炎のリスクを低下させるために試験化合物を使用し得る、前記方法。
【請求項１５】
炎症誘導性プロモーターに作動可能に連結された、検出可能なレポーターと融合したNFκBをコードする核酸が導入されている初代腺房細胞又は膵臓細胞株の細胞を含む、請求項１４に記載の方法において使用するためのアッセイ系。
【請求項１６】
炎症誘導性プロモーターに作動可能に連結された、検出可能なレポーターと融合したNFATをコードする核酸が導入されている初代腺房細胞又は膵臓細胞株の細胞を含む、請求項１４に記載の方法において使用するためのアッセイ系。
【請求項１７】
被験体の膵臓及び関連構造を造影する薬剤として、(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を、被験体における造影後の膵炎のリスクを低下させるような量で含む放射線造影媒体を使用するステップを含む、かかる処置を必要とする被験体における造影後の膵炎のリスクを低下させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年5月27日に出願された米国仮特許出願第62/167,143号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
助成金情報
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金No. DK093491、DK083327及びDK03002の下、政府支援により成された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
1. 序文
本発明は、膵臓及び関連構造の造影研究において使用するための、造影後の膵炎のリスクを低減する組成物、及び対応する使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2. 発明の背景
内視鏡的逆行性胆管膵管造影(ERCP)は、内視鏡が十二指腸まで挿入され、ファーター膨大部にカニューレが挿入される一般的な消化管処置である1。膵胆管系をX線写真上で可視化するため、カテーテルを通して放射線造影剤(RC)が注入される。ERCPは、米国において推定年間発生率が10万人当たり60〜75人実施される一般的な処置である2。これらは、一般的な胆管(CBD)に嵌入した胆石の除去及び様々な他の治療的介入のために不可欠である。しかし、最も一般的なERCPの医源性合併症は、膵臓の有痛性の炎症性障害である急性膵炎である。ERCP後膵炎(PEP)の頻度は1％〜15％にわたり、全平均3.5％を有する3、4。PEPは、膵管の静水圧と膵臓のRCへの曝露との合併に起因するものであった。高リスク状況で、膵管ステントの留置又は抗炎症薬インドメタシンの直腸投与が用いられていた5〜9。しかし、PEPを予防するために広く受け入れられている戦略(例えば、直腸インドメタシンによる前処理2)の効力には課題が残っていた3、4。PEP予防の探究は、これまで解明されていない、RCが、膵炎をもたらす膵臓傷害を誘導する根本的な機構を明らかにすることを要する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
3. 発明の要約
本発明は、放射線造影媒体を用いる処置(特に膵臓、胆嚢及び/又は胆管系を選択的に造影する処置)のための、造影後の膵炎のリスクを低下させるための組成物及び方法に関する。
【０００６】
非限定的実施形態において、本発明は、(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を含む放射線造影媒体を提供する。関連する非限定的実施形態において、前記放射線造影媒体は、構成要素(ii)及び(iii)を含まない従来の放射線造影剤と比較してその後の膵炎のリスクが低減された、膵臓及び関連構造の造影の実施において使用することができる。
【０００７】
特定の非限定的実施形態において、本発明の放射線造影媒体は、内視鏡的逆行性胆管膵管造影(ERCP)において用いることが可能であり、ここで上記放射線造影媒体は、ERCP後膵炎(PEP)のリスクを低下させる。
【０００８】
関連する非限定的実施形態において、放射線造影媒体は、膵臓及び関連構造の造影において、その後起こり得る任意の膵炎の程度を低下させるために使用することができる。
【０００９】
関連する非限定的実施形態において、放射線造影媒体は、胆管系に直接的に(例えば、胆膵管に)又は間接的に(例えば、静脈内投与を介して)導入することができる。
【００１０】
さらなる非限定的実施形態において、本発明は、腺房細胞株における炎症性の変化及び/又は傷害を測定するためのウイルス媒介レポーター系を用いる膵炎のin vitroアッセイのためのハイスループットスクリーン、並びにウイルスベクターを通してルシフェラーゼレポーターを受容するマウスにおける膵臓のNF-kBのin vivoアッセイ法を提供する。
【００１１】
さらなる非限定的実施形態において、本発明は、膵臓炎のモジュレーター、腺房細胞株における炎症性の変化及び/又は傷害を測定するためのウイルス媒介レポーター系を用いる膵炎のin vitroアッセイ、並びにウイルスベクターを通してルシフェラーゼレポーターを受容するマウスにおける膵臓のNFATのin vivoアッセイ法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】RC注入は、in vivoで膵炎を引き起こし、マウス膵臓腺房細胞中でCa2+シグナルを誘導する。(A) 灌流ポンプを用いた、遠位総胆管(矢印)へのRC注入の模式図(P、膵臓；D、十二指腸)。
【図１Ｂ】RC注入は、in vivoで膵炎を引き起こし、マウス膵臓腺房細胞中でCa2+シグナルを誘導する。(B) NS偽対照マウス及びRC注入(20μL/分で、100μl容量)マウスから得た膵頭部の代表的なHE切片。導管内RCと速度及び容量の増加との組み合わせは、より重大な組織学的重症度及びより高い血清アミラーゼレベルを誘導した(1条件当たりn=5匹動物)。*、NS偽処置に対してP<0.05。
【図１Ｃ】RC注入は、in vivoで膵炎を引き起こし、マウス膵臓腺房細胞中でCa2+シグナルを誘導する。(C) マウス膵臓腺房細胞を、特注の灌流チャンバーに搭載し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。
【図１Ｄ】RC注入は、in vivoで膵炎を引き起こし、マウス膵臓腺房細胞中でCa2+シグナルを誘導する。(D) ベースライン、Ca2+蛍光の初期上昇中、及びRCによる灌流中のピーク蛍光における、Ca2+色素Fluo-4AMをロードした腺房の位相差画像及び偽カラー画像。個々の腺房細胞は白色の点線で輪郭が示され、赤色の矢印は、Ca2+シグナルの、細胞の頂端領域から基底領域への進行を示す。
【図１Ｅ】RC注入は、in vivoで膵炎を引き起こし、マウス膵臓腺房細胞中でCa2+シグナルを誘導する。(E) 増加濃度のRCによるCa2+フラックスの全細胞トレーシングの総和。
【図１Ｆ】RC注入は、in vivoで膵炎を引き起こし、マウス膵臓腺房細胞中でCa2+シグナルを誘導する。(F) Ca2+シグナルの振幅及び曲線下面積の測定値。Ca2+を含む媒体の存在下又は不存在下で、腺房細胞にRC(25％)を灌流した(1条件当たりn=細胞20〜30個)。*、17％RCと比較してP<0.05。
【図２Ａ】イオヘキソール(Omnipaque 300)による注入後の組織学的サブスコア、及びイオパミドール(Isovue 300)も膵炎を誘導することの証拠。(A) 外科処置の24時間後に膵頭部のHE-染色片を回収した。膵炎の組織学的重症度は、浮腫、炎症性浸潤及び壊死の存在によって評価した(1群当たりn=5匹動物)。*、NS偽処置に対してP<0.05。
【図２Ｂ】イオヘキソール(Omnipaque 300)による注入後の組織学的サブスコア、及びイオパミドール(Isovue 300)も膵炎を誘導することの証拠。(B) NS偽処置マウス、イオパミドール注入マウス、及びイオヘキソール注入マウスから得た膵頭部の代表的なHE切片。
【図２Ｃ】イオヘキソール(Omnipaque 300)による注入後の組織学的サブスコア、及びイオパミドール(Isovue 300)も膵炎を誘導することの証拠。(C) 組織学的重症度。
【図２Ｄ】イオヘキソール(Omnipaque 300)による注入後の組織学的サブスコア、及びイオパミドール(Isovue 300)も膵炎を誘導することの証拠。(D) 血清アミラーゼレベル。
【図２Ｅ】イオヘキソール(Omnipaque 300)による注入後の組織学的サブスコア、及びイオパミドール(Isovue 300)も膵炎を誘導することの証拠。(E) 組織学的重症度。
【図２Ｆ】イオヘキソール(Omnipaque 300)による注入後の組織学的サブスコア、及びイオパミドール(Isovue 300)も膵炎を誘導することの証拠。(F) 血清IL-6を、外科処置の24時間後に測定した。(1群当たりn=5匹動物)。*、NS偽処置に対してP<0.05。
【図３Ａ】RCは、ヒト膵臓腺房細胞中ではCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導するが、非膵臓細胞株中では相当なCa2+シグナルを誘導することができない。(A) Fluo-4AMをロードしてRC(10〜50％)を灌流させたヒト腺房細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。
【図３Ｂ】RCは、ヒト膵臓腺房細胞中ではCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導するが、非膵臓細胞株中では相当なCa2+シグナルを誘導することができない。(B) 振幅及び曲線下面積の定量。(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。*、10％RCに対してP<0.05。
【図３Ｃ】RCは、ヒト膵臓腺房細胞中ではCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導するが、非膵臓細胞株中では相当なCa2+シグナルを誘導することができない。(C) ヒト腺房細胞にAd-NFAT-ルシフェラーゼを感染させ、増加濃度のRCで刺激した。RC(25％)誘導性NFAT-ルシフェラーゼ活性は、細胞内Ca2+キレート剤BAPTAによって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図３Ｄ】RCは、ヒト膵臓腺房細胞中ではCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導するが、非膵臓細胞株中では相当なCa2+シグナルを誘導することができない。(D) Fluo-4AMをロードしてRC(25〜75％)を灌流させたHEK293細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。これらのグラフ中、実験の終了部分(細胞のCa2+を可動させる能力を確認するためにカルバコール(1mM)を灌流させる)が示される(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。
【図３Ｅ】RCは、ヒト膵臓腺房細胞中ではCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導するが、非膵臓細胞株中では相当なCa2+シグナルを誘導することができない。(E) Fluo-4AMをロードしてRC(25〜75％)を灌流させたCOS7細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。これらのグラフ中、実験の終了部分(細胞のCa2+を可動させる能力を確認するためにカルバコール(1mM)を灌流させる)が示される(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。
【図４Ａ】RCは、Ca2+可動化及びIP3Rを介して腺房細胞カルシニューリン活性化を誘導する。(A) マウス腺房細胞にAd-NFAT-ルシフェラーゼを感染させ、異なる期間、RC(25％RC)で刺激した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図４Ｂ】RCは、Ca2+可動化及びIP3Rを介して腺房細胞カルシニューリン活性化を誘導する。(B) マウス腺房細胞にAd-NFAT-ルシフェラーゼを感染させ、増加濃度のRCで5時間刺激した。(n=3)。対照に対して、*、P<0.05。
【図４Ｃ】RCは、Ca2+可動化及びIP3Rを介して腺房細胞カルシニューリン活性化を誘導する。(C) RC(9％)誘導性NFAT-ルシフェラーゼ活性は、カルシニューリン阻害剤FK506(24μM)及びシクロスポリン(CsA；16μM)による30分間の前処理により予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図４Ｄ】RCは、Ca2+可動化及びIP3Rを介して腺房細胞カルシニューリン活性化を誘導する。(D) RC(9％)誘導性NFAT-ルシフェラーゼ活性は、IP3R阻害剤2-APB(100μM)又は細胞内Ca2+キレート剤BAPTA-AM(64μM)による30分間の前処理により予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図５】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でカルシニューリン活性化を誘導する。AR42J細胞にAd-NFAT-ルシフェラーゼを感染させ、異なる濃度のRCイオパミドールで刺激した(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図６Ａ−１】カルシニューリンは、RCに起因する腺房細胞NF-κB(カッパ軽鎖エンハンサーBの核因子)の活性化を誘導するために必要且つ十分である。(A) 20％RC又は異なる濃度のRCで15分間又は30分間刺激し、リン酸化IκBα又はp65についてプローブされた初代マウス腺房細胞から得られたウエスタンブロット。各ブロットについて、デンシトメトリーが下に示される。
【図６Ａ−２】図６Ａ−１の続きである。
【図６Ｂ】カルシニューリンは、RCに起因する腺房細胞NF-κB(カッパ軽鎖エンハンサーBの核因子)の活性化を誘導するために必要且つ十分である。(B)腺房分化AR42J細胞に、Ad-NF-κBルシフェラーゼを一晩感染させ、その後増加濃度のRCと共に6時間インキュベートした。AR42J細胞をRC(25％)に異なる時間曝露し(実線)、次いでバッファーで洗浄し(点線)、合計6時間インキュベートした。
【図６Ｃ】カルシニューリンは、RCに起因する腺房細胞NF-κB(カッパ軽鎖エンハンサーBの核因子)の活性化を誘導するために必要且つ十分である。(C) NF-κBルシフェラーゼ活性は、AR42J細胞中で、U73122(5μM)、2-APB(100μM)及びBAPTA(64μM)による前処理により予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図６Ｄ】カルシニューリンは、RCに起因する腺房細胞NF-κB(カッパ軽鎖エンハンサーBの核因子)の活性化を誘導するために必要且つ十分である。(D) NF-κBルシフェラーゼ活性は、AR42J細胞中でFK506(24μM)、及びCsA(16μM)による前処理により予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図６Ｅ】カルシニューリンは、RCに起因する腺房細胞NF-κB(カッパ軽鎖エンハンサーBの核因子)の活性化を誘導するために必要且つ十分である。(E) AR42J細胞に、構成的に活性な形態の触媒カルシニューリンAサブユニット(Ad-ΔCn)を有する増加力価のアデノウイルスを感染させ、又はAd-EGFP(陰性対照)を感染させた。NFAT-ルシフェラーゼ活性及びNF-κB-ルシフェラーゼ活性を測定した。4x105感染単位(IFU)を上回る量のAd-EGFPは、ルシフェラーゼレベルを増加させることができなかった。AR42J細胞中のNFAT-ルシフェラーゼ活性とNF-κB-ルシフェラーゼ活性間の相関関係(R2=0.9185；P = 0.0002)。(n=3)。*、Ad-EGFP単独に対してP<0.05。
【図７Ａ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(A) Fluo-4AMをロードしてRC(イオヘキソール；10〜25％)を灌流させたAR42J細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。
【図７Ｂ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(B) 振幅及び曲線下面積の定量。*、10％RCに対してP<0.05。
【図７Ｃ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(C) RC(25％)誘導性腺房細胞Ca2+シグナルは、PLC阻害剤U73122(5μM)及びIP3R阻害剤2-APB(100μM)によって予防された(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。
【図７Ｄ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(D) 振幅及び曲線下面積の定量。#、RC単独に対してP<0.05。
【図７Ｅ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(E) AR42J細胞にAd-NFAT-ルシフェラーゼを感染させ、増加濃度のRCで刺激した。
【図７Ｆ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(F) RC(6％)誘導性NFAT-ルシフェラーゼ活性は、カルシニューリン阻害剤FK506(24μM)による前処理によって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図７Ｇ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(G) RC(6％)誘導性NFAT-ルシフェラーゼ活性は、CsA(16μM)による前処理によって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図７Ｈ】RCは、AR4fu2J細胞中でCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導する。(H) RC(6％)誘導性NFAT-ルシフェラーゼ活性は、U73122(5μM)、2-APB(100μM)又は細胞内Ca2+キレート剤BAPTA(64μM)による前処理によって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図８Ａ】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でNF-κB活性化も誘導し、RC誘導性NF-κB活性化は、高浸透圧条件、酸化ストレス、又は非エステル化脂肪酸の遊離によっては誘発されない。(A) AR42J細胞にAd-NF-κBルシフェラーゼを感染させ、異なる濃度のイオパミドールで刺激した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図８Ｂ】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でNF-κB活性化も誘導し、RC誘導性NF-κB活性化は、高浸透圧条件、酸化ストレス、又は非エステル化脂肪酸の遊離によっては誘発されない。(B) イオヘキソールの計算浸透圧(製品挿入に由来する)は、凍結融解浸透圧計で浸透圧を測定することによって確認した(R2=0.9832)。
【図８Ｃ】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でNF-κB活性化も誘導し、RC誘導性NF-κB活性化は、高浸透圧条件、酸化ストレス、又は非エステル化脂肪酸の遊離によっては誘発されない。(C) AR42J細胞に、Ad-NF-kBルシフェラーゼを感染させ、増加オスモル濃度のイオヘキソール又はマンニトール(対照)に曝露した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図８Ｄ】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でNF-κB活性化も誘導し、RC誘導性NF-κB活性化は、高浸透圧条件、酸化ストレス、又は非エステル化脂肪酸の遊離によっては誘発されない。(D) マウスに、全濃度の放射線造影剤の浸透圧を模倣する濃度のマンニトール(672 mOsmol)を注入した。膵臓組織切片を、注入の24時間後に評価した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図８Ｅ】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でNF-κB活性化も誘導し、RC誘導性NF-κB活性化は、高浸透圧条件、酸化ストレス、又は非エステル化脂肪酸の遊離によっては誘発されない。(E) ROSスカベンジャーのN-アセチルシステイン(NAC；2〜8mM)の存在下又は不存在下でRC(16％)により刺激したAR42J細胞から、NF-kB-ルシフェラーゼを測定した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図８Ｆ】RCイオパミドール(Isovue-300)は、AR42J細胞中でNF-κB活性化も誘導し、RC誘導性NF-κB活性化は、高浸透圧条件、酸化ストレス、又は非エステル化脂肪酸の遊離によっては誘発されない。(F) リパーゼ阻害剤オルリスタット(50〜100μM)の存在下又は不存在下でRC(16％)により刺激したAR42J細胞から、NF-kB-ルシフェラーゼを測定した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図９Ａ】RCは、Ca2+/カルシニューリン-依存経路を通じて腺房細胞壊死を引き起こす。(A) 腺房細胞を増加濃度のRCで6時間処置し、ヨウ化プロピジウムの取り込みを測定した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図９Ｂ】RCは、Ca2+/カルシニューリン-依存経路を通じて腺房細胞壊死を引き起こす。(B) RC(12％)誘導性腺房細胞傷害(6時間インキュベーション)は、U73122(5μM)、2-APB(100μM)、又はBAPTA(64μM)によって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図９Ｃ】RCは、Ca2+/カルシニューリン-依存経路を通じて腺房細胞壊死を引き起こす。(C) RC(12％)誘導性腺房細胞傷害(6時間インキュベーション)は、NF-κB阻害剤IKK-2(20μM)によって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図９Ｄ】RCは、Ca2+/カルシニューリン-依存経路を通じて腺房細胞壊死を引き起こす。(D) カルシニューリンの阻害(FK506；24μM、CsA；16μM)(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図９Ｅ】RCは、Ca2+/カルシニューリン-依存経路を通じて腺房細胞壊死を引き起こす。(E) 調節カルシニューリンAβサブユニット(CnAβ)の遺伝子欠失。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図９Ｆ】RCは、Ca2+/カルシニューリン-依存経路を通じて腺房細胞壊死を引き起こす。(F) ATPレベルを、RC(12％)で3.5時間±FK506で処置した腺房細胞から測定した。(n=3)。*、対照に対してP<0.05。
【図１０Ａ】AR42J細胞におけるRC誘導性細胞壊死はカルシニューリン依存性である。PEPモデルから得られた組織学的サブスコア。(A) RC(12％)誘導性腺房細胞壊死は、FK506(24μM)又はCsA(16μM)によって予防された。(n=3)。*、#、それぞれ対照又はRC単独に対してP<0.05。
【図１０Ｂ】AR42J細胞におけるRC誘導性細胞壊死はカルシニューリン依存性である。PEPモデルから得られた組織学的サブスコア。(B) RC注入の24時間後に、膵頭部のHE-染色片を、薬理学的(FK506；1mg/kg)カルシニューリン阻害の存在下又は不在下で回収した。膵炎の組織学的重症度は、浮腫、炎症性浸潤及び壊死の存在によって評価した(1群当たりn=5匹動物)。*、NS偽処置に対してP<0.05。
【図１０Ｃ】AR42J細胞におけるRC誘導性細胞壊死はカルシニューリン依存性である。PEPモデルから得られた組織学的サブスコア。(C) RC注入の24時間後に、膵頭部のHE-染色片を、野生型マウス(WT)をCnAβノックアウトマウスと比較することによって回収した。膵炎の組織学的重症度は、浮腫、炎症性浸潤及び壊死の存在によって評価した(1群当たりn=5匹動物)。*、NS偽処置に対してP<0.05。
【図１１Ａ】PEPはカルシニューリン依存性である。(A) RCの注入に対する、FK506(1mg/kg)の投与の模式図。
【図１１Ｂ】PEPはカルシニューリン依存性である。(B) 膵頭部から得られた代表的なH&E片。
【図１１Ｃ】PEPはカルシニューリン依存性である。(C) 全体的重症度スコア(左)、及び血清アミラーゼ測定値(右)(1群当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれNS偽処置及びRC単独と比較してP<0.05。
【図１１Ｄ】PEPはカルシニューリン依存性である。(D) AAV6-NF-κBルシフェラーゼの導管内注入を受けたマウスの膵臓由来の生物発光。36時間にわたる膵臓NF-κB-生物発光シグナルの定量(1群当たりn=3匹動物)。
【図１１Ｅ】PEPはカルシニューリン依存性である。(F) 膵頭部からのIL-6、GADD45B、及びIL-1βの遺伝子発現(n=3)。*、#、それぞれNS偽処置及びRC単独と比較してP<0.05。
【図１１Ｆ】PEPはカルシニューリン依存性である。(F) 膵頭部から得られた代表的なH&E片。全体的重症度スコア(左)、及び血清アミラーゼ測定値(右)(1群当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれNS偽処置及びRC単独と比較してP<0.05。
【図１２Ａ】RC誘導性膵炎中のFK506前処理は、NSAID前処理と同程度に有効である。(A) RCの注入後のインドメタシン(7mg/kg；IP)の投与の模式図。
【図１２Ｂ】RC誘導性膵炎中のFK506前処理は、NSAID前処理と同程度に有効である。(B) RC±インドメタシン後の全体的重症度スコア。*、#、それぞれNS偽処置及びRC単独と比較してP<0.05。
【図１２Ｃ】RC誘導性膵炎中のFK506前処理は、NSAID前処理と同程度に有効である。(C) RC±インドメタシン後のサブスコア。*、NS偽処置と比較してP<0.05。
【図１３Ａ】PEP誘導後に投与されるFK506は、膵臓炎を低下させる。(A) RCの注入後のFK506(1mg/kg)の投与の模式図。
【図１３Ｂ】PEP誘導後に投与されるFK506は、膵臓炎を低下させる。(B) RC±FK506後に膵頭部から得られた代表的なHE切片。
【図１３Ｃ】PEP誘導後に投与されるFK506は、膵臓炎を低下させる。(C) RC±FK506後の全体的重症度スコア(左)及びサブスコア(右)。
【図１３Ｄ】PEP誘導後に投与されるFK506は、膵臓炎を低下させる。(D) RC注入±FK506の24時間後に測定した血清アミラーゼ(左)及びIL-6(右)。(1群当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれNS偽処置及びRC単独と比較してP<0.05。
【図１４Ａ】RC誘導性腺房細胞Ca2+シグナルは、カルシニューリンによって調節されない。(A) Fluo-4AMをロードしてRC(25〜50％)を灌流させたマウス初代腺房細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。振幅及び曲線下面積の定量は、右側に示される(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。
【図１４Ｂ】RC誘導性腺房細胞Ca2+シグナルは、カルシニューリンによって調節されない。(B) Fluo-4AMをロードしてRC(25〜50％)を灌流させたヒト初代腺房細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。振幅及び曲線下面積の定量は、右側に示される(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。
【図１４Ｃ】RC誘導性腺房細胞Ca2+シグナルは、カルシニューリンによって調節されない。(C) Fluo-4AMをロードしてRC(25〜50％)を灌流させたAR42J細胞から得られた全細胞トレーシングの総和。振幅及び曲線下面積の定量は、右側に示される(1条件当たりn=20〜30個の細胞)。
【図１５】仮説図。RC曝露は、腺房細胞に：(1) PLCの活性化；(2) IP3R誘導性Ca2+放出をもたらすIP3の生成；(3) カルシニューリンの下流活性化；(4) NF-κBの核への移行、その後生じる(5) 腺房細胞傷害及び膵炎を引き起こす。阻害スキームは、赤色で示される。PIP2、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート；DAG、ジアシルグリセロール。
【図１６Ａ】マウスにおいて、Cre-lox組換えを用いる腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを予防する。(A) Ela-CreERT2マウスとCnB1f/fマウスとの交雑により誘導される腺房細胞Cnノックアウト系(CnΔ/Δ)、その後のタモキシフェン投与。
【図１６Ｂ】マウスにおいて、Cre-lox組換えを用いる腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを予防する。(B) 偽手術モデル化条件、導管処置(DM)モデル化条件、及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件から得られた膵頭部の代表的なHE切片と、組織学的重症度スコアリング。
【図１６Ｃ】マウスにおいて、Cre-lox組換えを用いる腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを予防する。(C) 画像閾値(左側)、及びMPO染色(右側)によって評価された浮腫。
【図１７Ａ】Ela-CreERT2/CnB1f/f遺伝子型及びCnB1欠失の確認。(A) loxP部位を含むCnB1ノックインアレルの模式図。赤色の矢印は、それぞれ575bp及び289bpの5’loxP部位PCR産物及び3’loxP部位PCR産物を生成するために設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを示す。青色の矢印は、2803bpのCnB1全長領域を示す。
【図１７Ｂ】Ela-CreERT2/CnB1f/f遺伝子型及びCnB1欠失の確認。(B) Ela-CreERT2トランスジーンの模式図。赤色の矢印は、それぞれ575bp及び289bpの5’loxP部位PCR産物及び3’loxP部位PCR産物を生成するために設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを示す。青色の矢印は、2803bpのCnB1全長領域を示す。
【図１７Ｃ】Ela-CreERT2/CnB1f/f遺伝子型及びCnB1欠失の確認。(C) loxP部位及びEla-CreERT2トランスジーンの存在を確認するために得られた予想サイズのPCR産物を示すアガロースゲル。
【図１７Ｄ】Ela-CreERT2/CnB1f/f遺伝子型及びCnB1欠失の確認。(D) loxP部位を含むCnB1遺伝子の図示。赤色の矢印は、168bpの断片を生じるCnB1Δ/Δを同定するために設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを示す。
【図１７Ｅ】Ela-CreERT2/CnB1f/f遺伝子型及びCnB1欠失の確認。(E) 膵臓におけるCnB1欠失を確認するPCR産物を示す2パーセントアガロースゲル。
【図１７Ｆ】Ela-CreERT2/CnB1f/f遺伝子型及びCnB1欠失の確認。(F) NFATルシフェラーゼ活性は、放射線造影剤(RC)に応答して、CnB1Δ/Δ由来の腺房細胞中では著しく減少するが、CnB1f/f対照由来の腺房細胞中では減少しない。*、#、陰性対照及び陽性対照それぞれに対してP<0.05。
【図１８Ａ】タモキシフェン誘導性Ela-CreERT2/CnB1f/fマウスにおける腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを定義する膵臓損傷成分を予防する。(A) 全体的な膵臓及び隣接器官(十二指腸(D)及び脾臓(Sp)を含む)の画像。白色の点線は、盲検組織学的評価のために使用した、十二指腸の隣の膵臓領域を囲んでいる。
【図１８Ｂ】タモキシフェン誘導性Ela-CreERT2/CnB1f/fマウスにおける腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを定義する膵臓損傷成分を予防する。(B) 偽手術モデル化条件、導管処置(DM)モデル化条件、及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件の膵頭部から得られた浮腫スコアリング。*、#、それぞれフロックスアウトされていない(non-floxed out)対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１８Ｃ】タモキシフェン誘導性Ela-CreERT2/CnB1f/fマウスにおける腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを定義する膵臓損傷成分を予防する。(C) 偽手術モデル化条件、導管処置(DM)モデル化条件、及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件の膵頭部から得られた炎症スコアリング。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１８Ｄ】タモキシフェン誘導性Ela-CreERT2/CnB1f/fマウスにおける腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを定義する膵臓損傷成分を予防する。(D) 偽手術モデル化条件、導管処置(DM)モデル化条件、及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件の膵頭部から得られた壊死スコアリング。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１８Ｅ】タモキシフェン誘導性Ela-CreERT2/CnB1f/fマウスにおける腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを定義する膵臓損傷成分を予防する。(E) IHC-染色組織切片から得られたMPOスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１９Ａ】マウスにおいて、腺房細胞特異的Cn欠失は、胆汁酸浸出膵炎を予防する。(A) (左側)代表的なHE切片、(右側)全体的な組織学的重症度。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１９Ｂ】マウスにおいて、腺房細胞特異的Cn欠失は、胆汁酸浸出膵炎を予防する。(B) 浮腫の組織学的サブスコアリング(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１９Ｃ】マウスにおいて、腺房細胞特異的Cn欠失は、胆汁酸浸出膵炎を予防する。(C) 炎症の組織学的サブスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図１９Ｄ】マウスにおいて、腺房細胞特異的Cn欠失は、胆汁酸浸出膵炎を予防する。(D) 壊死の組織学的サブスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれフロックスアウトされていない対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図２０Ａ】マウスにおいて、AAV6-Ela-iCreの導管内注入を用いた腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを予防する。(A) CnB1f/fマウス系統におけるAAV6-Ela-iCre(腺房細胞特異的)又はAAV6-CMV-ZsGreen(AAV6対照)の導管内注入の模式図。
【図２０Ｂ】マウスにおいて、AAV6-Ela-iCreの導管内注入を用いた腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを予防する。(B) 偽対照及びPEP条件から得られた代表的なHE切片と、組織学的重症度スコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図２０Ｃ】マウスにおいて、AAV6-Ela-iCreの導管内注入を用いた腺房細胞特異的Cn欠失は、PEPを予防する。(C) 浮腫及びMPO。(1条件当たりn=5匹動物)。
【図２１Ａ】新規なAAV6-Ela-iCre構築物の導管内注入は、膵臓腺房細胞を標的とし、PEPを予防する。(A) AAV6-Ela-iCreプラスミドの模式図。
【図２１Ｂ】新規なAAV6-Ela-iCre構築物の導管内注入は、膵臓腺房細胞を標的とし、PEPを予防する。(B) Lox-Stop-Lox tdTomato赤色レポーターマウスに、ウイルスカーゴ送達の特異性を試験するため、AAV6-Ela-iCreを注入した。赤色蛍光は膵臓中では観察されたが、隣接器官(例えば小腸(SI)、肝臓(L)、及び脾臓(Sp))からは除外された。組織切片中、白色の点線は、膵臓(左)を十二指腸(右)から分離している。
【図２１Ｃ】新規なAAV6-Ela-iCre構築物の導管内注入は、膵臓腺房細胞を標的とし、PEPを予防する。(C) 偽手術モデル化条件及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件の膵頭部から得られた浮腫スコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２１Ｄ】新規なAAV6-Ela-iCre構築物の導管内注入は、膵臓腺房細胞を標的とし、PEPを予防する。(D) 偽手術モデル化条件及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件の膵頭部から得られた炎症スコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２１Ｅ】新規なAAV6-Ela-iCre構築物の導管内注入は、膵臓腺房細胞を標的とし、PEPを予防する。(E) 偽手術モデル化条件及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件の膵頭部から得られた壊死スコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２１Ｆ】新規なAAV6-Ela-iCre構築物の導管内注入は、膵臓腺房細胞を標的とし、PEPを予防する。(F) MPOスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２２Ａ】放射線造影剤注入に伴うCn阻害剤の導管内(ID)投与は、PEPを予防する。(A) 偽手術モデル化条件、導管処置(DM)モデル化条件、及びERCP後膵炎(PEP)モデル化条件から得られた代表的なHE切片。Cn阻害剤FK506(1μM)又はCsA(10μM)を、放射線造影剤溶液と共に膵管内に送達した。
【図２２Ｂ】放射線造影剤注入に伴うCn阻害剤の導管内(ID)投与は、PEPを予防する。(B) 組織学的重症度スコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ対照偽処置及び各陽性対照に対してP<0.05。
【図２３Ａ】Cn阻害剤の導管内注入は、PEPを定義する膵臓損傷成分を低下させる。(A) 浮腫の組織学的サブスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２３Ｂ】Cn阻害剤の導管内注入は、PEPを定義する膵臓損傷成分を低下させる。(B) 炎症の組織学的サブスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２３Ｃ】Cn阻害剤の導管内注入は、PEPを定義する膵臓損傷成分を低下させる。(C) 壊死の組織学的サブスコアリング。(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【図２３Ｄ】Cn阻害剤の導管内注入は、PEPを定義する膵臓損傷成分を低下させる。(D) PEP誘導の6時間後の血清アミラーゼ(1条件当たりn=5匹動物)。*、#、それぞれ陰性対照及び陽性対照に対してP<0.05。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
5. 詳細な説明
説明の明確性のため、限定のためではなく、詳細な説明は以下の副節に分けられる：
(a) 放射線造影剤；
(b) カルシニューリン阻害剤；
(c) 抗酸化剤；
(d) 放射線造影媒体組成物及びキット；
(e) 処置方法；及び
(f) アッセイ系。
【００１４】
本発明による使用のための放射線造影媒体は、以下の3つの因子：(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を含む。
【００１５】
5.1 放射線造影剤
本発明による使用のための放射線造影媒体は、1つの構成要素として、放射線造影剤を含む。放射線造影剤は、X線ベースの造影技術(例えば、限定するものではないが、コンピュータ化断層撮影及びX線撮影)において、体内構造の可視性を高める組成物である。特定の非限定的例として、本発明の放射線造影媒体において使用するための放射線造影剤は、内視鏡的逆行性胆道膵管造影法(「ERCP」)における造影に適した薬剤である。
【００１６】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤の量は、造影研究における造影の促進に有効な量である。
【００１７】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤は水溶性である。
【００１８】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤は非イオン性である。
【００１９】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤は、非イオン性モノマー、例えば、低浸透圧造影剤、例えば、限定するものではないが、イオパミドール(Isovue(登録商標))、イオヘキソール(Omnipaque(登録商標))、イオベルソール(Optiray(商標))、イオプロミド(Ultravist(登録商標))、イオキシラン(Oxilan(登録商標))、又はイオペントール(Imagopaque)である。
【００２０】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤は、非イオン性ダイマー、例えば、低浸透圧造影剤(例えば、限定するものではないが、イオトロラン(Iotrol)又はイオジキサノール(Visipaque(商標))である。
【００２１】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤は、イオン性放射線造影剤である。
【００２２】
本発明の非限定的実施形態において、放射線造影剤は、ヨウ化放射線造影剤である。
【００２３】
5.2 カルシニューリン阻害剤
本発明の放射線造影媒体の第2成分は、カルシニューリンの作用を直接的に又は間接的に阻害することができる1種以上のカルシニューリン阻害剤である。具体的な非限定的実施形態において、阻害されるカルシニューリンはヒトカルシニューリンである。
【００２４】
本発明の非限定的実施形態において、本発明の放射線造影媒体中に存在するカルシニューリン阻害剤の量は、抗酸化剤と共に、被験体における膵炎のリスクの低減に有効である。
【００２５】
本発明の非限定的実施形態において、本発明の放射線造影媒体中に存在するカルシニューリン阻害剤の量は、抗酸化剤と共に、被験体におけるERCP後膵炎のリスクの低減に有効である。
【００２６】
本発明の非限定的実施形態において、存在するカルシニューリン阻害剤の量は、膵臓内で、放射線造影剤媒介性のNF-κB(カッパ軽鎖エンハンサーBの核因子)活性及び/又はNFAT活性の増加を、腺房細胞培養物中で少なくとも約20パーセント又は少なくとも約30パーセント低下させる局所濃度を生じる。
【００２７】
特定の非限定的実施形態において、カルシニューリン阻害剤はシクロスポリンAである。
【００２８】
特定の非限定的実施形態において、カルシニューリン阻害剤はFK506(タクロリムス)である。
【００２９】
本発明の非限定的実施形態において、カルシニューリン阻害剤がシクロスポリンAである場合、本発明の放射線造影媒体中に含まれるシクロスポリンAの量は、少なくとも5μM、若しくは少なくとも10μM、若しくは少なくとも16μM、又は約10μM、若しくは約16μM、又は約5μM〜10μM、若しくは約5〜20μM、若しくは約10〜20μM、及び/又は20μM以下若しくは30μM以下の局所濃度を生じる量であり得る。
【００３０】
本発明の非限定的実施形態において、カルシニューリン阻害剤がFK506である場合、本発明の放射線造影媒体中に含まれるFK506の量は、少なくとも10μM、若しくは少なくとも20μM、若しくは少なくとも30μM、又は約20μM、若しくは約24μM、又は約10〜40μM、若しくは約20〜30μM、及び/又は30μM以下若しくは40μM以下の局所濃度を生じる量であり得る。
【００３１】
5.3 抗酸化剤
本発明の放射線造影媒体の第3の成分は、抗酸化剤である。
【００３２】
本発明の特定の非限定的実施形態において、抗酸化剤は、N-アセチルシステインである。
【００３３】
本発明の特定の非限定的実施形態において、抗酸化剤は、亜セレン酸ナトリウムである。
【００３４】
本発明の特定の非限定的実施形態において、抗酸化剤は、ビタミンEである。
【００３５】
本発明の特定の非限定的実施形態において、抗酸化剤は、ベータ-カロテンである。
【００３６】
本発明の非限定的実施形態において、本発明の放射線造影媒体中に存在する抗酸化剤の量は、カルシニューリン阻害剤と共に、被験体における膵炎のリスクの低減において有効である。
【００３７】
本発明の非限定的実施形態において、本発明の放射線造影媒体中に存在する抗酸化剤の量は、カルシニューリン阻害剤と共に、被験体におけるERCP後膵炎のリスクの低下に有効である。
【００３８】
本発明の非限定的実施形態において、抗酸化剤がN-アセチルシステインである場合、本発明の放射線造影媒体中に含まれるN-アセチルシステインの量は、少なくとも約2mM、又は約1〜3mMであり得る。
【００３９】
5.4 放射線造影媒体の組成物及びキット
非限定的実施形態において、本発明は、以下の3つの構成要素：(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を、被験体における放射線造影に有効で、カルシニューリン阻害剤及び抗酸化剤を伴わずに投与される放射線造影剤と比較して造影後の膵炎のリスクを低下させる量で含む、本発明による使用のための放射線造影媒体を提供する。好適な放射線造影剤、カルシニューリン阻害剤及び抗酸化剤成分の非限定的な例は、上の節に示される。
【００４０】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、本発明の放射線造影媒体を含み、生理学的に好適な溶媒(例えば水)をさらに含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、1種以上の製剤(例えば、限定するものではないが、バッファー及び/又は保存剤)をさらに含み得る。
【００４１】
特定の非限定的実施形態において、放射線造影剤の市販製剤にカルシニューリン阻害剤及び/又は抗酸化剤を添加してもよい。
【００４２】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、使用前に組み合わせることができる、治療量の(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び/又は(iii) 抗酸化剤を含むキットを提供する。
【００４３】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、別々に、又は副組み合わせで治療対象の被験体に投与し得る、治療量の(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び/又は(iii) 抗酸化剤を含むキットを提供する。
【００４４】
5.5 処置方法
本発明によれば、本発明による放射線造影媒体は、造影処置において、従来の造影媒体を用いて造影処置が行われた対照被験体におけるリスクと比較して処置後膵炎のリスクを低下させるため、従来の造影媒体の代わりに使用することができる。例えば、対照被験体は、治療される被験体と類似の臨床プロファイルを有し得る。
【００４５】
非限定的実施形態において、本発明は、被験体における膵臓、胆嚢、及び/又は胆管系を放射線造影する方法であって、カルシニューリン阻害剤を伴わず且つ抗酸化剤を伴わずに放射線造影剤を受容する被験体と比較して、被験体が造影後の膵炎を発症するリスクが低下し得るという利点を有する、被験体の膵臓、胆嚢及び/又は胆管系に、(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を含む上記に示される放射線造影媒体を導入するステップを含む、上記方法を提供する。
【００４６】
非限定的実施形態において、被験体は、ヒト被験体であってもよいし、又は非ヒト被験体(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はウサギ)であってもよい。
【００４７】
非限定的実施形態において、本発明による放射線造影媒体は、従来の造影媒体を用いて造影処置が行われた対照被験体におけるERCP後膵炎のリスクと比較してERCP後膵炎のリスクを低下させるため、ERCP処置における従来の媒体の代わりに使用することができる。
【００４８】
例えば、限定するものではないが、被験体は、被験体が、新たな又は悪化した腹部疼痛及び血清アミラーゼの増加(例えば、処置の24時間後超に測定された、正常と見なされる上限値の少なくとも2倍又は少なくとも3倍のレベルまでの増加)を示す場合、膵炎に罹患していると見なされ得る。
【００４９】
本発明から特に利益を受け得る被験体は、処置後膵炎を発症するリスクを有する被験体、例えば、限定するものではないが、以下の特徴：オディ括約筋機能障害、若年齢、女性、及び/又は膵炎の既往歴、及び/又は、造影処置中、カニューレ挿入が困難な場合、膵管に対して複数の注入物がある場合、以前に切開された括約筋切開若しくは膵臓括約筋切開が存在する場合、の1つ以上を有する患者である。
【００５０】
本発明の放射線造影媒体は、造影処置の前又は最中に被験体に投与することができる。本発明の放射線造影媒体は、注射若しくは注入又は局所点滴によって投与することができる。例えば、限定するものではないが、本発明の放射線造影媒体は、胆膵管又は静脈内を介して投与することができる。患者における組み合わせを達成するため、放射線造影媒体の3つの成分の任意の組み合わせ又は全てを、一緒に又は別々に投与することができる。
【００５１】
本発明の放射線造影媒体の使用に加えて、膵炎のリスクをさらに低下させるため、及び/又は膵炎による損傷をさらに制限するため、以下の手段の1つ以上を採り得る：(i) 1種以上の膵臓酵素(セクレチン)阻害薬(例えば、アトロピン、カルシトニン、ソマトスタチン、グルカゴン及び/又はフルロウラシル)による処置；(ii) 1種以上のプロテアーゼ阻害薬(例えば、アプロチニン、ガベキサート、メシレート、カモステート、及び/又はホスホリパーゼA2)による処置；(iii) 1種以上の抗炎症剤(例えば、非ステロイド性抗炎症薬(例えば、インドメタシン)、アロプリノール、プロスタグランジン阻害剤、血小板活性化因子アンタゴニスト、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、又はレキシパント(Lexipant))による処置；(iv) ニトログリセリン、ニフェジピン、又はリドカインによるオディ括約筋圧の低下；(v) 抗生物質による処置；(vi) 膵管内ステント留置；及び/又は(vii) 抗代謝産物(例えば5-フルロウラシル)による処置。
【００５２】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、被験体の膵臓及び関連構造を造影する薬剤として、(i) 放射線造影剤；(ii) カルシニューリン阻害剤；及び(iii) 抗酸化剤を被験体における造影後の膵炎のリスクを低下させるような量で含む放射線造影媒体(本明細書に記載)を使用するステップを含む、かかる処置を必要とする被験体における造影後の膵炎のリスクを低下させる方法を提供する。
【００５３】
5.6 アッセイ系
特定の非限定的実施形態において、本発明は、造影後の膵炎のリスクを低下させる薬剤を同定するために使用することができるアッセイ系を提供する。アッセイ系は、in vitroアッセイであってもよいし、in vivoアッセイであってもよい。
【００５４】
特定の非限定的実施形態において、アッセイは、レポーター遺伝子と融合したNF-κB又はNFAT(例えばNF-κBルシフェラーゼ又はNFAT-ルシフェラーゼ)を、発現可能な形態で(例えば、IL-4プロモーターなどの炎症誘導性プロモーターに作動可能に連結されて)コードする核酸が導入されている初代腺房細胞又は膵臓細胞株の細胞を含むin vitroアッセイである。例えば、前記核酸は、ネイキッドDNAとして、又はウイルスベクター(例えば、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター)を介して導入することができる。膵臓細胞株が使用される場合、腺房細胞型の表現型を促進する条件下で培養することができる。このような培養系の特定の例は、以下の第6節の実施例に示され、その特徴は、参照によりこの詳細な説明に組み込まれる。
【００５５】
従って、非限定的実施形態において、本発明は、造影後の膵炎のリスクを低下させるために試験化合物を使用することができるか否かを決定する方法であって、以下のステップ：(i) 炎症誘導性プロモーターに作動可能に連結された、検出可能なレポーターと融合したNFκB又は検出可能なレポーターと融合したNFATをコードする核酸が導入されている初代腺房細胞又は膵臓細胞株の細胞である細胞を提供するステップ；(ii) 上記細胞を放射線造影剤及び試験化合物に曝露し、NFκB-レポーター又はNFAT-レポーターの量をそれぞれ決定するステップ；及び(iii) (ii)において決定されたNFκB-レポーター又はNFAT-レポーターの量を、同等の条件下であるが試験化合物の不存在下で放射線造影剤に曝露された対照細胞中に存在するNFκB-レポーター又はNFAT-レポーターの量と比較するステップを含み、ここで(ii)において決定されたNFκB-レポーター又はNFAT-レポーターの量が、(iii)において決定されたNFκB-レポーター又はNFAT-レポーターの量より少ない場合、造影後の膵炎のリスクを低下させるために試験化合物を使用することができる、上記方法を提供する。
【００５６】
非限定的実施形態において、本発明は、上記のNFκB又はNFAT-レポーター構築物を、例えば、膵臓への直接注入を介してin vivoで動物の膵臓細胞に導入するin vivoアッセイを提供する。特定の非限定的例は、融合構築物をin vivoで膵臓細胞に導入するために使用し得るプロモーターに作動可能に連結された、NFκB-ルシフェラーゼ融合物をコードする核酸を有するAAVベクターである。第6節の実施例を参照されたい。In vivoアッセイは、in vitroアッセイと同様に、試験化合物が放射線造影剤誘導性のNFκB-レポーター又はNFAT-レポーターの増加を低下させる能力を評価するために使用することができる。
【００５７】
特定の非限定的実施形態において、本発明は、試験化合物を、in vivoで動物の膵臓細胞に(例えば膵臓内への直接注入を介して)導入するin vivoアッセイ、並びに、試験化合物が造影後の膵炎のリスク又はそのマーカー(例えば、限定するものではないが、放射線造影剤誘導性の血清アミラーゼの増加；全体的な組織学的重症度、例えば、限定するものではないが、浮腫、炎症性浸潤及び壊死；並びに/又はミエロペルオキシダーゼ(MPO)の増加)を低下させる能力を評価するために使用し得る類似のin vitroアッセイを提供する。
【実施例】
【００５８】
6. 実施例：実施例：放射線造影剤曝露は、カルシウム及びカルシニューリンを誘発することによって膵臓のNF-κβ及び膵炎を誘導する
【００５９】
6.1. 材料及び方法
試薬及び動物
RCは、主として、低浸透圧(672mOsm/kg水)、非イオン性、ヨウ化(300mg/ヨウ素/ml)造影媒体として分類されるイオヘキソール(Omnipaque 300；GE Healthcare；Princeton、NJ)を指す。本研究から得られる主要な知見を確認するため、第2のRCであるイオパミドール(Isovue 300；Bracco Diagnostics；Monroe Township、NJ)(イオヘキソールと同じカテゴリー内)を使用し、その使用は本文中に明記される。NFAT-ルシフェラーゼ(Qiagen；Valencia, CA)、NF-κBルシフェラーゼ(Vector Biolabs；Philadelphia PA)、及び構成的に活性なカルシニューリン(ΔCn)のアデノウイルスを、先に記載されたとおりに構築した10〜12。他の全ての試薬は、別段に特定されない限り、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。体重22〜28gの雄のSwiss websterマウス(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)に標準的な実験食を食べさせ、水は自由に摂取させた。CnAβ-/-マウスは、B6129J/F1系統のマウスであった13。週齢、性別及び系統が一致する対照マウスを、野生型(WT)対照として使用した。全ての動物実験は、ピッツバーグ大学動物実験委員会によって認可されたプロトコルを使用して実施した。
【００６０】
マウスにおける導管内RC注入
CBD及び膵管への逆行性注入の処置は、以前に報告されている14。手短に言えば、Swiss websterマウスを、イソフルランで麻酔した。中線切開を行って腹腔を明らかにした。十二指腸を裏返してその遠位側を明らかにし、結紮によりその場に保持した。十二指腸の腸間膜反対側を通して30Gの針を挿入し、CBDにカニューレ挿入した。注入剤の十二指腸管腔への逆流を防止してカニューレをその場に保持するため、遠位CBD(十二指腸の近く)に小ブルドック鉗子を適用した。肝臓への注入を防止することによって流れを膵管に向けるため、近位CBD(肝臓の近く)にはさらに大きなブルドック鉗子を適用した。総容量50〜100μlのイオヘキソール、イオパミドール、又は正常生理食塩水(NS)を、P33灌流ポンプ(Harvard Apparatus, Holliston, MA)を用いて1分当たり10〜20μlで5分間注入した。注入完了後、ブルドック鉗子を外した。外側の腹部創傷を、7mm創傷クリップを用いて閉じ、手術の直後にブプレノルフィン(0.075mg/kg)の単回注射を投与した。マウスは、ヒーティングパッド上で処置後30分間回復させた。手術後、これらのマウスに食物及び水を自由に摂取させた。
【００６１】
マウス腺房及びヒト腺房由来の細胞Ca2+シグナルの検出及び分析
腺房細胞に、高親和性Ca2+-検出色素Fluo-4AM(Kd=300nM；Invitrogen)を室温でロードした。酸洗浄ガラスカバースリップ上に腺房細胞をプレーティングし、その後灌流チャンバーに取り付けた。その後すぐに、HEPESバッファー中で希釈した異なる濃度のRC(17〜50％)により、これらを室温で刺激した。各実験の最後にカルバコール(1mM)を投与し、細胞がインタクトであり、細胞内Ca2+貯蔵を可動化することができたことを確認した。Zeiss LSM710レーザー走査共焦点顕微鏡を、20X、開口数1.4の対物レンズを用いて使用した。色素を488nmの波長で励起させ、>515nmの発光シグナルを2秒毎に収集した。個々の腺房細胞由来の蛍光を記録した。ImageJソフトウェア(NIH, Bethesda, MD)を用いて記録の分析を行い、各領域中の長時間にわたる平均蛍光をグラフ化した。
【００６２】
NFAT-ルシフェラーゼ活性アッセイ
先に記載された手順に従って、腺房細胞にAd-NFAT-ルシフェラーゼを感染させた10、15、16。この構築物は、9つのタンデムなNFAT結合部位を含有するIL-4プロモーターの下流に配置されたルシフェラーゼ遺伝子を含む10。腺房細胞を、刺激の前にNFAT駆動ルシフェラーゼアデノウイルスと共に1.5時間インキュベートした。記載される阻害剤は全て、RCによる刺激の前に30分間添加した。ルシフェラーゼアッセイ系を用いて、NFAT-ルシフェラーゼを測定した。手短に言えば、細胞を、1,000rpmで5分間スピンさせ、PBSで洗浄し、レポーター溶解5Xバッファー(Promega, #E397A, Madison, WI)を用いて溶解させた。サンプルをボルテックスし、12,000gで2分間スピンした。上清をプレーティングし、Synergy H1プレートリーダー(BioTek, Winooski, VT)を用いて発光を測定し、全タンパク質に対して正規化した。
【００６３】
NF-κB-ルシフェラーゼ活性アッセイ
AR42J細胞を、デキサメタゾン(100nM)を48〜72時間投与することによって腺房表現型へと分化させた17。AR42J細胞に、先に記載された方法を用いて、刺激の16時間前にAd-NF-κBルシフェラーゼを感染させた12。DMEM/F12培地による洗浄後、腺房細胞を48ウェルプレートに均等に分配し、37℃で30分間インキュベートした。これらを、異なる濃度のRCと共に、異なる時間でインキュベートした。市販のルシフェラーゼアッセイ(Promega, Madison, WI)を用いて、NF-κBルシフェラーゼを測定した。手短に言えば、細胞を、1,000rpmで5分間スピンし、PBSで洗浄し、レポーター溶解5Xバッファー(Promega, カタログno. E397A)を用いて溶解した。サンプルをボルテックスし、12,000xgで2分間スピンした。上清をプレーティングし、Synergy H1プレートリーダー(BioTek, Winooski, VT)を用いて発光を測定し、全DNAに対して正規化した。
【００６４】
In vivoにおける膵臓NF-κB生物発光の造影
AAV6-NF-κBルシフェラーゼレポーターを構築し、HEK293細胞中で増殖させ、先に記載されたとおりに精製した18〜20、39。容量100μlのウイルス(1012 GCP/ml)を、上記の及び最近刊行されたRC注入技術21、39と同じ技術を用いて、10μl/分の速度で膵胆管内に注入した。手術から5週間の回復後、マウスは、FK506処置と共に、又はFK506処置を伴わずにPEP誘導を受けた。手術後の異なる時点(2〜36時間にわたる)で、造影の開始15分前に、最初にルシフェリン(150μg/体重g)の皮下注射を首筋に投与することによって生物発光シグナルを得た。マウスをイソフルランで短時間麻酔し、生物発光造影チャンバー(IVIS spectrum imager；Perkin Elmer, Waltham, MA)中で、3〜10分間仰臥位に配置した。平均ピクセル強度を目的の膵臓領域から測定した(上腹部中)。各マウスから得られたロータイムポイント(raw time point)を、ゼロ時点におけるその個々のベースライン強度に対して正規化した。
【００６５】
膵臓組織調製、組織学的評価、及び血清アミラーゼ
膵臓、十二指腸及び脾臓を、4％パラホルムアルデヒド中で室温にて24時間固定した。パラフィン包理切片をヘマトキシリン及びエオシン(HE)で染色し、10個の別視野にわたり(10 separate field)20X対物レンズを用いて盲検様式で評価した。Wildi et al67に記載されているとおり、膵臓組織を、浮腫、炎症性浸潤及び壊死について評価した。全血サンプルを、4℃にて1,500xgで5分間遠心分離した。先に記載されたとおり68、Phadebas kit(Amersham Pharmacia, Rochester NY)を用いて血清アミラーゼを測定した。
【００６６】
Ca2+造影用のマウス膵腺房の調製
膵臓腺房細胞集団を、先に記載されたとおりに26、69、わずかに改変を加えて単離した。手短に言えば、膵臓を除去し、その後20mM HEPES(pH7.4)、95mM NaCl、4.7mM KCl、0.6mM MgCl2、1.3mM CaCl2=、10mMグルコース及び2mMグルタミン、さらに1％BSA、1X MEM非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、200単位/ml 4型コラゲナーゼ(Worthington, Freehold, NJ)、及び1mg/mlダイズトリプシン阻害剤を含むバッファー中で5分間ミンチした。この組織を90rpmで振盪しながら37℃で30分間インキュベートした。消化物を15mL円錐管に移し、コラゲナーゼ非含有バッファーで洗浄した。懸濁液を15〜20秒激しく振盪し、細胞をより小さなクラスターに分離した。
【００６７】
ホスホ-IκBα及びp65移行のウエスタンブロット
1％ピルビン酸ナトリウム及び1％BSAを加えたF12/DMEM培地中2mg/mlコラゲナーゼを用いてマウス膵腺房を単離した。3回洗浄後、0.1％BSAを加えたF12/DMEM培地中で腺房細胞を培養した。細胞をRCで処理し、異なる時点で回収した。細胞を1X PBSで洗浄し、1X SDSサンプルバッファー中で溶解した。p65の核移行を検証するため、NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction kit (Thermo Scientific, Rockford, IL)を用いて核画分及び細胞質画分を抽出した。40マイクログラムのタンパク質を、4〜20％勾配のPAGEゲル上に流した。抗体は全て、Cell Signaling (Beverly, MA)から購入した。IκBαのSer32におけるリン酸化を、ホスホ-IκBα-特異的抗体(#2859)を用いるウェスタンブロットによって検証した。ローディング対照として、アクチン(#4967)を使用した。p65のブロットは、Cell Signalingの抗体(#4764)を用いて、核画分及び細胞質画分上で行った。GAPDH(#2118)及びヒストン3(#9715)を、細胞質マーカー及び核マーカーとしてそれぞれ使用した。Image Jソフトウェア(NIH)を用いてデンシトメトリーを行った。
【００６８】
細胞壊死アッセイ
RC添加の前に、腺房細胞を、50μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)を含む48ウェルプレート中で30分間インキュベートした。6時間までの時間経過にわたって、536nm励起波長及び617nm発光波長で蛍光を測定した。0.5％トリトン-X100による細胞溶解後に測定された蛍光を使用して、結果を全DNAに対して正規化した。
【００６９】
ATPレベル測定
単離後、膵臓腺房細胞を、DMEM/F12培地(48ウェルプレートで0.5mL/ウェル)中で37℃の水浴で培養し、RC±FK506で処置した。指定時点で細胞を回収し、100μlの溶解バッファー(100mM Tris pH7.75、4mM EDTA)中で溶解した。ENLITENルシフェラーゼ/ルシフェリン試薬(Promega, カタログno. FF2021)を用いて、20μlアリコートの腺房細胞溶解物からATPレベルを測定した。
【００７０】
全膵臓からのRNA抽出及びリアルタイムPCR
4℃にて40mgの組織を2mlのTRIzol試薬(Life Technologies; Grand Island NY)中でホモジナイズし、直ぐに液体窒素中でフラッシュ凍結することによって、膵頭部由来の全RNAを得た。サンプルを氷上で解凍し、4℃にて12,000xgで10分間遠心分離した。上清を200μlのクロロホルムで希釈し、4℃にて12,000xgで15分間遠心分離した。上側の水相を0.5mlのイソプロパノールで処理し、4℃にて10,000xgで10分間遠心分離した。150μlの75％エタノールでペレットを再懸濁し、4℃にて7,500xgで5分間遠心分離した。このペレットを空気乾燥させ、100μlのヌクレアーゼ非含有水中で溶解した。全RNAサンプルを使用し、iScript Advanced cDNA合成キット(Bio Rad；Hercules, CA)を用いてcDNAを作製した。
【００７１】
サイトカインIL-6及びIL-1β、並びに細胞増殖停止及びDNA損傷誘導遺伝子GADD45Bの相対発現を決定するため、定量的リアルタイムPCR(rtPCR)を実施した。それぞれのプライマー対並びにGAPDH対照を、プライムPCR-PreAMP SYBR Greenアッセイ(Bio Rad；ユニークアッセイID # qMmuCEP0054186、qMmuCID0005641、qMmuCEP0039581)の部分として得た。SsoAdvanced Universal Supermix SYBR Green system(Bio Rad)を用いて、20μl容量の反応液中でrtPCR反応を実施した。この反応液は、1X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix、300nMフォワードプライマー、300nMリバースプライマー及び100ng cDNAを含有していた。rtPCR条件は、Bio Rad CFX96 Touch thermocycler(Bio Rad)上で、95℃で10秒間及び60℃で30秒間を35サイクルであった。mRNAの発現の結果を18S rRNAの発現に対して正規化し、それぞれの対照群の発現レベルと比較して表す。
【００７２】
統計的分析
データは、別段に記載されない限り、平均±標準偏差として表した。不対T検定を用いて統計的有意性を決定し、P値≦0.05と定義した。
【００７３】
6.2. 結果
マウスにおいて、RCの導管内注入は膵臓傷害を誘導する
マウスのPEPモデルは、「方法」に詳述されるとおり、CBDの十二指腸経由のカニューレ挿入を行うことによって発症させた(図1A)。近位CBDをクランプし、これにより肝臓への逆流を妨げることによって注入物を膵管に向けた。
【００７４】
浮腫、炎症性浸潤及び壊死の存在によって評価される膵炎の組織学的重症度は、外科処置の24時間後に膵頭部から評価した(図1B及び図2A)。処置の6時間後に血清アミラーゼを測定した。
【００７５】
臨床的報告は、ERCP後膵炎が、膵臓への圧力及び造影剤曝露の組み合わせに起因することを示唆していた3。現在入手可能な造影剤圧送ポンプは、マウスの胆膵管に必要とされる十分に低い速度(10〜20μl/分)で注入することができなかったため、注入の速度及び容量を変えることによって圧力変化を模倣した。
【００７６】
正常生理食塩水(NS)注入の速度及び容量を2倍にすると、組織学的重症度は33％増加したが(P<0.05)、血清アミラーゼの上昇は引き起こさず、膵炎が閾値レベルに達していなかったことを示していた。しかし、NSをRCに置き換えると、組織学的重症度に付加的な影響を及ぼし、導管内NS-偽対照を59％上回る増加をもたらす(P<0.05)と考えられる。血清アミラーゼは少なくとも50％増加し、複数の実験バッチ間で1.5倍〜3.5倍の増加にわたった。これらの知見に基づけば、圧力増加及びRC曝露はいずれも、PEPモデルの傷害に寄与している。
【００７７】
酸性造影剤は、ラットにおける膵炎の重症度に介在することが示されている22。しかし、マウスにおいては、RCを10mM HEPESで緩衝し、pHを6に固定した場合、pH7の場合と比較して膵炎の重症度の増大は生じなかった。大部分の実験は、ERCPにおいて一般的に使用されるRCであるイオヘキソール(Omnipaque 300)23を用いて実施した。しかし、この知見は、別の低浸透圧性、非イオン性ヨウ化RCであるイオパミドール(Isovue 300)を用いた場合と同様であった(図2B〜2F)。
【００７８】
RCは、マウス膵臓腺房細胞中で高振幅Ca2+シグナルを誘導する
RC曝露はPEPの主要原因であり、このため、単離膵臓細胞中で、RCがex vivoで膵炎を開始する機構について試験した。導管細胞は膵管及び小導管を裏打ちするが、膵臓の85％超は、膵臓腺房細胞で構成されている24。膵炎は腺房細胞中で始まり、大半の実験モデルにおいて、最も早期の重要な因子の1つは、大振幅の、ピークプラトー(すなわち持続的)Ca2+シグナルの誘導である25〜27。RCが腺房細胞Ca2+シグナルを誘導するか否かを試験するため、腺房として分類される5〜15個の初代腺房細胞の小クラスターを新たに単離した。これらに、高親和性Ca2+色素Fluo-4AMをロードし、タイムラプス共焦点造影を用いて灌流チャンバー中で造影した(図1C〜1F)。ERCP中、慎重にRCを膵管に注入する専用の膵管造影法を用いた場合でも、発明者らは、相当量の膵液希釈液から、腺房管腔が10％〜50％のRC濃度に曝露されていると推定した。この理由から、腺房には上記のRCの希釈液が灌流していた。
【００７９】
濃度17％〜20％のRCは、100秒以内に低振幅Ca2+トランジェントを引き起こし、直ぐにベースラインに戻った。RCを25％まで増加させ、その後33％まで増加させるとピークプラトーCa2+波が生じ、このCa2+波は大部分の細胞で頂端から基底領域にまで伝播した。これらのシグナルは、高振幅(ベースラインの400％超)、その後の持続的プラトーを特徴としていた。Ca2+シグナルは、Ca2+非含有媒体においても同様に開始し、RCが、最初に細胞内貯蔵からCa2+放出を誘発することを示していた。
【００８０】
これらの実験の全ての5分後に、細胞がCa2+を可動させる能力を確認するための、ムスカリンアゴニストであるカルバコール(1mM)による灌流を行った。RCは、死体ドナーから得られた生ヒト腺房細胞中でも、Ca2+シグナル及びカルシニューリン活性化を誘導した(図3A〜3C)。膵臓腺房細胞中に見られるロバストなCa2+シグナルは、HEK293細胞株又はCOS7細胞株中で観察されず、腺房細胞に対するRC誘導性Ca2+シグナルの一定レベルの選択性を示している(図3D〜3E)。
【００８１】
RCは、腺房細胞のカルシニューリン活性化を誘導する
RCはCa2+シグナルを誘導するため、本実施例は、カルシニューリン(膵炎における推定Ca2+標的)が活性化されたか否かについて試験した。カルシニューリン活性化について試験するため、IL-4プロモーター由来の9つのタンデムNFAT結合モチーフからなるアデノウイルスNFAT(活性化T細胞の核因子)-ルシフェラーゼを使用した10。細胞質におけるNFATのカルシニューリン脱リン酸化は核への移行を引き起こし、これによりルシフェラーゼを駆動する。
【００８２】
初代腺房細胞中で、RCは、NFAT-ルシフェラーゼの濃度依存性の増加を引き起こしたが、カルシニューリン阻害剤であるFK506(24μM)及びシクロスポリン(CsA；16μM)がRCによる上昇を大きく妨げたことから、この増加はカルシニューリン活性化に起因するものであった(図4)。RCによるカルシニューリン活性化は、2-APB(100μM)がルシフェラーゼ上昇を47％低下させた(P<0.05)ため、イノシトール1,4,5-トリスホスフェート受容体(IP3R)活性化に部分的に依存していた。しかし、カルシニューリンの活性化は、BAPTA-AM(64μM)により完全に低下した。RCイオパミドールはまた、NFAT活性化を濃度依存様式で誘導した(図5)。これらのデータは、RCが、腺房細胞中で、細胞質Ca2+の上昇を通してカルシニューリン活性化を誘導することを示す。
【００８３】
RCは、Ca2+/カルシニューリン依存経路を通してNF-κB活性化を引き起こす
膵炎における炎症の主要調節因子は、幾つかの炎症遺伝子(例えば、IL-6、Spi2a、TGF-β、及びIL-1β)28〜31を誘導することができる転写因子NF-κBである。初代腺房細胞中で、増加濃度のRCは、IκBαのセリン32におけるリン酸化(早期分解シグナル32)及びp65の核移行を誘導した(図6A)。RCがレポーター系においてNF-κBを誘導するか否かを決定するため、本発明者らは、一晩の感染及びその後6〜8時間のRC投与を必要とするアデノウイルスNF-κBルシフェラーゼを使用した12。このアッセイのための長期間の培養において初代腺房細胞を使用することには制限があるため、本発明者らは、デキサメタゾン(100nM)で48〜72時間プライミングされると腺房細胞表現型を誘導するAR42J膵臓細胞株17に変更した。RCは、この細胞株中でも、また初代腺房細胞中でもCa2+シグナルを誘導し、カルシニューリンを活性化した(図7)。RCは、NF-κBルシフェラーゼの濃度及び時間依存性の増加を引き起こした(図6B)。ERCP中の曝露条件をより密接に模倣するRCの短時間曝露(すなわち25％RCを10分間投与、その後洗浄)でも、ベースラインを上回るNF-κBルシフェラーゼの5倍の増加をもたらした。しかし、統計的に有意な増加は、60、90、及び120分で観察され、それぞれ、ベースラインを上回る58、59、及び112倍の増加をもたらした(P<0.05)。RCイオパミドールはまた、NF-κB活性化を濃度依存様式で誘導した(図8A)。
【００８４】
RCによるNF-κB活性化は、ホスホリパーゼC(PLC)、IP3R、及び細胞質Ca2+に依存していたが、これは、これらの各阻害剤であるU73122(5μM)、2-APB(100μM)、及びBAPTA(64μM；図6C)によってルシフェラーゼレベルが低下したためである。主な知見は、カルシニューリン阻害剤FK506(24μM)及びCsA(16μM)が、NF-κBを、それぞれ73％及び79％低下させたということであった(P<0.05；図6D)。総合すると、RCは、Ca2+-及びカルシニューリン-依存経路を通してNF-κB活性化を引き起こす。
【００８５】
使用したイオヘキソールの製剤(Omnipaque 300)は、全濃度で672mOsm/kgの浸透圧を有し、このため、Omnipaque 300は低浸透圧造影媒体に分類される23(表1)。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
様々なランダム化対照研究の異分析は、臨床的PEPの誘導における低浸透圧RC間又は高浸透圧RC間の有意差を示すことはできなかった33。それにも関わらず、マンニトールを使用して、浸透圧がNF-κB活性化に及ぼす寄与(存在する場合)について試験した(図8B〜8C)。RCは、350mOsm/LでNF-κBの300倍の上昇を誘導したが、等モル濃度のマンニトールは、増加を引き起こすことができなかった。RC腎症の媒介における酸化ストレスの役割について、矛盾するデータが存在する34、35。しかし、腺房細胞株中では、反応性酸素種(ROS)スカベンジャーであるN-アセチルシステイン(NAC；2〜12mM)による前処理は、NF-κB活性化に影響を及ぼさなかった(図5D)。最近の報告に基づいて考慮すべき別の因子36、37は、RCが、ERCP中に、膵臓分泌物中のリパーゼに対する曝露によって毒性の非エステル化脂肪酸へと遊離する可能性があるトリグリセリド脂質エマルションを含み得るか否かである(図8E)。しかし、RCの製造者は、任意のエマルション剤の添加について否定した。さらに、リパーゼ阻害剤であるオルリスタットによる前処理は、RCによるNF-κBの活性化を有意に低下させなかった。この結果は、RC誘導性NF-κB活性化が、浸透圧、酸化ストレス、又は脂肪酸毒性とは無関係であることを示す。
【００８８】
カルシニューリン活性化は、腺房細胞のNF-κB活性化を誘導するために十分である
カルシニューリンがNF-κB活性化を誘導するのに十分であるか否かを決定するため、AR42J細胞に、構成的に活性なカルシニューリン(自己阻害ドメインを含まない切断触媒カルシニューリンAサブユニット)を含むアデノウイルス11(Ad-ΔCn；図6E)を感染させた。
【００８９】
NFAT-ルシフェラーゼ活性は、1x105機能的ウイルス感染単位(IFU)を上回るAd-ΔCnによる感染後に最大であった。さらにより高い力価のAd-EGFP(陰性対照)は、NFAT-ルシフェラーゼを誘導することができなかった。興味深いことに、Ad-ΔCnによるNF-κBの活性化には濃度依存性の増加があった。これらのデータは、腺房細胞株において、カルシニューリン活性化がNF-κBを誘導するのに十分であることを示す。
【００９０】
RCは、Ca2+/カルシニューリン依存経路を通して腺房細胞壊死を引き起こす
単離初代腺房細胞におけるヨウ化プロピジウム(PI)取り込みは、in vivoにおける膵炎中の腺房傷害及び壊死のサロゲートである。6時間のRC曝露は、PLC、IP3RCa2+放出、及び細胞質Ca2+上昇に依存する(これらの各阻害剤又はキレート剤に基づく)、PI取り込みの濃度依存性の増加をもたらした(図9)。同様の結果は、AR42J腺房細胞株中で観察された(図10A)。さらに、RCは、いずれも濃度依存様式でATPレベルの枯渇を引き起こした(図9F)。しかし、FK506はATP枯渇を予防することはできず、in vitroでは、カルシニューリンが、ATP枯渇をもたらすミトコンドリア病変に必要ではないことを示していた。
【００９１】
IKK-2によるNF-κB移行の阻害は、カルシニューリン阻害剤と同様に、PI取り込みを大きく妨げた(図9C〜9D)。カルシニューリンのストレス応答性サブユニットは、カルシニューリンAのベータアイソフォーム(CnAβ)である13。CnAβノックアウトマウスから単離された腺房細胞は、RCに起因するPI取り込みを予防した(図9E)。総合すると、データは、RCが、Ca2+/カルシニューリン及びNF-κB-依存経路を介して腺房細胞壊死を誘導することを示す。
【００９２】
マウスにおいて、薬理学的及び遺伝子的なカルシニューリン阻害は、RC誘導性膵炎を軽減する
本実施例は、マウスにおいてカルシニューリンがPEPを媒介するか否かについてもin vivoで試験した(図11)。マウスにおいてカルシニューリンを最大に阻害した先のレジメン16、38に基づいて、FK506(1mg/kg)の腹腔内注射を、導管内RC注入の1時間前に投与し、その後、外科処置の2.5時間後、5.5時間後及び12時間後に投与した。外科処置の24時間後に測定された、膵炎後の膵臓の組織学的重症度は予防され、血清アミラーゼはNS偽条件のレベルまで低下した(図11A〜11C及び図10B〜10C；P<0.05)。この効果は、PEPに対して一般的に投与されるNSAID、インドメタシンの治療的投与と同程度にロバストであった(図12)。
【００９３】
膵臓NF-κBのライブの動的造影は、方法39に詳述されるとおり、AAV6-NF-κBルシフェラーゼを膵管内に注入することによる、マウス膵臓中へのNF-κBルシフェラーゼの新規なAAV6-媒介遺伝子送達を通して達成された。導管内に正常生理食塩水を受容した偽手術マウスと比較すると、RC注入マウスは、手術の4時間後、膵臓領域中にNF-κBルシフェラーゼの13倍のピークを有していた(図11D)。FK506処置は、NF-κBを著しく鈍らせた。さらに、IL-6、GADD45B、及びIL-1βの発現は、RC曝露中にアップレギュレートされた(図11E)。FK506による前処理は、IL-6及びGADD45Bの遺伝子発現の有意な低下、並びにIL-1βの発現の低下傾向を生じさせた。この結果は、カルシニューリンを、in vivoで、NF-κB炎症性シグナルの誘導に関係させる。同様に、CnAβノックアウトマウスはPEPの組織学的重症度を低下させたが、血清アミラーゼレベルは、野生型マウスと比較して変化しなかった(図11F)。重要なことに、PEP誘導後のカルシニューリン阻害剤の治療的投与もまた、RC誘導性膵炎を予防した(図13)。全体的に、上記の結果は、マウスにおいて、カルシニューリンが膵臓NF-κB及びPEPのメディエーターであることを示す。カルシニューリンはCa2+の標的であるが、Ca2+ホメオスタシスを媒介する脱リン酸化タンパク質によってCa2+を調節することもできる40。しかし、初代腺房細胞中で、カルシニューリン阻害はRC誘導性の異常Ca2+シグナルに影響を与えなかった(図14)。
【００９４】
6.3. 考察
本研究は、膵臓傷害の文脈を用いた、RC曝露が、異常なCa2+シグナル及び活性化カルシニューリンを誘導することによってNF-κBの活性化を引き起こし、上皮損傷及び器官損傷をもたらすことの最初の証明である(図15)。
【００９５】
マウスにおけるPEPの新たなモデルを開発した。より大型の動物(例えばイヌ)における先のモデルでは、内視鏡的胆膵管カニューレ挿入を用いていた41、42。より小型の動物におけるより最近のモデルでは、開腹手術を行って経十二指腸的アクセスを達成することによってRCを注入した22、43。マウスにおける本in vivo研究の主な利点は、カルシニューリンノックアウトの使用と併せて、カルシニューリンの薬理学的阻害を補完できることであった。
【００９６】
本データは、PEPが、膵管圧とRC曝露との組み合わせから生じることを示すが、これは、それぞれがPEPの転帰を相加的に悪化させるためである。この知見は、ERCP処置中に、膵管ステントを挿入して導管圧を軽減することにより、また最小必要量のRCのみを注入することによってPEPが緩和され得ることを示す臨床データと一致する5〜7、9。
【００９７】
本実施例は、RC曝露が膵臓及び主要な柔組織細胞である膵臓腺房細胞に与える影響に注目した。RCは、血行動態不安定を誘導することによって高リスク患者において急性腎臓傷害を引き起こすことが知られており、恐らくは反応性酸素種(ROS)の生成34、44及びNF-κBの核移行35を通して、腎臓細胞に直接的な毒性作用を及ぼす。腺房細胞株において、N-アセチルシステインはNF-κBに影響を与えなかった。結果は、RCが、細胞型に応じて特異な効果を有することを示す。RCは、腎臓細胞株中でNF-κBの活性化を引き起こすことは示されたが、活性化の機構は同定されなかった45、46。本研究は、RCが異常なCa2+シグナル及びカルシニューリン活性化を介してNF-κB活性化を引き起こすことの最初の証明である(図15)。In vivoにおける膵臓NF-κBシグナルは、AAV媒介導管内遺伝子送達を通してNF-κBルシフェラーゼを送達することにより、ライブで、動的様式で造影された。この新たな技術は、NF-κBルシフェラーゼレポーターを全体的に発現するトランスジェニックマウス本来の隣接器官中のルシフェラーゼ発現に由来するノイズを受けることなく、膵臓のシグナルに主に注目することを可能とした47。
【００９８】
Ca2+トランジエントは、マウス腺房細胞及びヒト腺房細胞の両方において、RC曝露の直後(1〜2分以内)に出現した。さらに、Ca2+シグナルの形は、大部分の細胞において、腺房細胞傷害及び膵炎に先行し25、26、48〜53且つカルシニューリン活性化に有利な54、特徴的な病的シグナルである高振幅ピークプラトーを模倣していた。最近の報告は、イオベルソール(本発明者らが使用したイオヘキソール及びイオパミドールと類似のRC)による長時間(4時間)のインキュベーションが、NRK-52E腎臓細胞株中でベースライン細胞質Ca2+レベルのゆっくりとした包括的な増加を引き起こしたことを示した55。これは、RCが電位依存性Ca2+チャネルを誘発し、又は細胞膜Na+/Ca2+交換輸送体(NCX)の逆転を引き起こし、Ca2+流入に有利となったことを示唆していた。この知見は、ラットにおいてCa2+チャネル遮断薬がRC誘導性急性腎臓傷害を改善したという先の報告によって裏付けられた56。しかし、RC誘導性膵臓傷害の文脈において、NCXは、膵臓腺房細胞の機能的成分であるとは考えられない25、57。従って、RCによる腺房細胞Ca2+シグナルは、NRK-52E細胞株において報告された弱いCa2+シグナル、又は本発明者らが試験した非膵臓細胞株に由来する弱いCa2+シグナルとは区別されるものであった。
【００９９】
膵炎におけるCa2+の推定標的(MPTP及びキナーゼを含む)の中でも、Ca2+-活性化セリン/トレオニンホスファターゼであるカルシニューリンが、腺房傷害及び膵臓炎の重要なメディエーターであることが示唆されている16、38、53、58、59。カルシニューリンは、触媒Aサブユニット(CnA)及び調節Bサブユニット(CnB)によって形成される二量体である60〜62。CnAは3つのアイソフォーム(アルファ、ベータ及びガンマ)を有し、CnBは2つのアイソフォーム(B1及びB2)を有する。カルシニューリンは、身体の大部分の細胞において高く保存され且つユビキタスであるが、そのアイソフォームには差次的分布がある。膵臓腺房細胞は、主にCnAβ及びCnB1を発現する59。カルシニューリンは、異常なCa2+と類似の事象、例えば腺房内プロテアーゼ活性化58、NF-κB53、63及び細胞傷害59を媒介することが示された。In vivoで、カルシニューリンは、セルレイン過刺激38及び胆汁酸浸出16による膵炎を媒介した。
【０１００】
適切に保存されたRCにおけるヨウ素解離は最小限であり、腎臓細胞へのナトリウムヨウ素投与だけでは細胞傷害を引き起こさない35、65ことから、分子ヨウ素が細胞に直接影響を及ぼした、又は(例えば、ナトリウムヨウ素輸送体を介して64)細胞に侵入した可能性は低い。カルシニューリン阻害剤はT細胞を阻害する66ため、免疫抑制剤として臨床的に使用される。しかし、本実施例は、in vivoで腺房細胞中のカルシニューリンが腺房病変を引き起こすこと、また腺房カルシニューリン自体が膵炎に寄与し得ることを示す。本研究は、PEPの予防におけるカルシニューリン阻害剤の役割を試験するための臨床試験を行うための前臨床的契機を提供する。より広義には、本研究は、任意の器官又は細胞型において、RCが異常なCa2+シグナルを通してNF-κB及び細胞壊死を誘導すること、また中心的なCa2+メディエーターがカルシニューリンであることの最初の証明でもある。
【０１０１】
7. 実施例：膵臓腺房細胞カルシニューリンの標的化阻害は、ERCP後膵炎を予防するための新たな戦略である
7.1. 材料及び方法
内視鏡的逆行性胆管膵管造影(ERCP)は一般的な消化管処置であり、1％〜15％の急性膵炎のリスクを与える70。ERCP後膵炎(PEP)を予防するために広く受け入れられている戦略、例えば直腸インドメタシン8による前処理の効力には最近、課題が生じている71、72。PEP予防の探究には、PEPを開始する中心的機構を明らかにすることが必要である。初代マウス及びヒト膵臓腺房細胞の単離から得られたPEPのex vivoサロゲートモデルを用いて、本発明者らは最近、ERCP中に使用される一般的な放射線造影剤が、カルシウム活性化ホスファターゼであるカルシニューリン(Cn)の活性化を通して腺房細胞の炎症性シグナル伝達及び傷害を誘導することを示した73。マウスにおけるPEPのin vivoモデルにおいて、本発明者らは、グローバルCnノックアウトマウス(CnAβ欠損)又はCn阻害剤FK506若しくはシクロスポリンA(CsA)の頻繁な予防的投与によるCnの全身性阻害がPEPを予防したことを見出した。Cnはユビキタスに発現しているため、重大な未解決の問題は、in vivoにおいて、腺房細胞Cnの遮断自体がPEPを予防するのに十分であるか否かである。
【０１０２】
試薬及び動物
試薬は全て、別段に特定されない限り、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。CnB1のloxP隣接(「フロックス(floxed)」)アレルを有するマウス(CnB1f/f；C57BL/6系統と戻し交雑)は、Gerald Crabtree博士74からの親切な贈り物であり、Ela-CreERT2トランスジェニック系統は、Craig Logsdon博士75からの親切な贈り物であった。Lox-Stop-Lox tdTomato赤色レポーターマウスはJackson研究所76から得た。雄及び雌両方の遺伝子組み換えマウスを、in vivo研究に同等に使用した。体重25gの8〜10週齢の野生型の雄及び雌のSwiss websterマウスを使用して、FK506及びCsAの導管内投与の効力を評価した。全マウスを、22℃にて、12時間の明暗サイクルで飼育し、標準的な実験食で維持して食物及び水は自由に摂取させた。全ての動物実験は、ピッツバーグ大学動物実験委員会によって認可されたプロトコルを用いて実施した。
【０１０３】
条件付き膵臓腺房特異的CnB1ノックアウトの生成
CnB1f/fマウスをEla-CreERT2マウスと交雑し、ホモ接合Ela-CreERT2/CnB1f/f系統を作製した。膵臓腺房細胞中でCnB1を欠失させるため(CnB1Δ/Δ)、CreERT2/CnB1f/fマウスは、累積用量の5〜6mgタモキシフェンを、毎日又は1日おきに総期間5〜6日間で腹腔内に受容した。PEPは、最後のタモキシフェン注射(図16A)の一週間後に誘導された。Ela-CreERT2の挿入がないCnB1f/f系統を対照として供した。これらの対照もタモキシフェンを受容した。
【０１０４】
CnB1Δ/Δの遺伝子型決定
記載されたとおり77、新たに単離したマウスの膵臓組織及び肝臓組織からゲノムDNAを調製した。手短に言えば、上記の組織を氷上でミンチし、プロテイナーゼKを含む塩化ナトリウムトリス-EDTA(STE)バッファー中でホモジナイズした。ホモジネートを、断続的にボルテックスしながら55℃で3時間インキュベートした。プロテイナーゼKの不活性化後、ホモジネートを4℃で遠心分離し、ゲノムDNAを含む上清をイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したゲノムDNAを4℃でペレット化し、70％エタノールで洗浄し、空気乾燥させて、PCR反応のために200μLの1xトリス-EDTAバッファーに溶解した。予測アンプリコンの位置及び大きさの模式図は、図17に提供される。プライマー配列は以下のとおりである。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
予想されたとおり、CnB1Δ/Δ膵臓組織からは168bpの断片が増幅されたが、肝臓組織中ではごくわずかであった(図17D〜17E)。168bpの断片は、AAV6-Ela-iCreが注入されたCnB1f/fマウスの膵臓組織からも増幅された。PCRのアニーリング温度は61℃であり、テンプレート量は、全ゲノムDNAの100pgであった。PCR産物を2％アガロースゲル上で分離し、造影した。168bpのDNAバンドを切り出し、精製し、配列決定した。全配列をNCBIデータベースにアラインし、CnB1欠失、及び各構成成分(例えばエラスターゼプロモーター、Cre、ERT2)がインフレームであることを確認するため、手動で検証した。
【０１０７】
NFAT-ルシフェラーゼ活性アッセイ
先に記載されたとおり16、単離膵臓腺房細胞にNFAT-ルシフェラーゼアデノウイルスを感染させた。手短に言えば、細胞を、NFAT-ルシフェラーゼアデノウイルス(力価、2 x 109 IFU)と共に30分間インキュベートし、その後、これらを放射線造影剤に約6時間曝露した。刺激後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、1X 溶解バッファー(Promega, #E397A, Madison, WI)で溶解し、4℃にて12,000gで5分間遠心分離した。ルシフェラーゼアッセイ系(Promega, #E1483)を用いてSynergy H1プレートリーダー(BioTek、Winooski、VT)中で上清から発光を測定し、BCA法(Thermo Scientific, Rockford, IL)により決定された全タンパク質を用いてデータを正規化した。
【０１０８】
アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)6構築物
先に記載されたとおり19、39、pEla-iCre又はpCMV-ZsGreenをpAAV-MCSプラスミド(Cell Biolab #VPK-410；San Diego, CA)中にクローニングすることによってAAV6プラスミドを作製した。一旦クローン化した後、AAV6プラスミドを、2つのヘルパープラスミド：(1) 血清型6のrep遺伝子及びcap遺伝子を有するパッケージングプラスミドであるpAAV-RepCap (Applied Viromics；cat #0912-06；Fremont, CA)；及び(2) ヘルパー遺伝子を有するプラスミドであるpHelper (Applied Viromics；cat# 0913；Fremont, CA)と共に、HEK293細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、50mM Tris、150mM NaCl及び2mM MgCl2を含む溶解バッファーに懸濁した。
【０１０９】
In vivo投与のためのAAV6の精製
先に記載されたとおりに21、39、AAV6を精製した。手短に言えば、トランスフェクトしたHEK293細胞を3回凍結/融解してAAV6ウイルスを放出させた。細胞溶解物をベンゾナーゼ(0.05単位)で37℃にて30分処理し、その後1％デオキシコール酸ナトリウムで37℃にて30分処理した。溶解物を、2500xgで10分スピンし、上清を回収した。40％ポリエチレングリコール(PEG-800)と2.5M塩化ナトリウムの1：4混合物を用いて、AAV6を0℃で2時間沈殿させた。溶液を2500xgで30分スピンし、PEGペレットを回収した。ペレットをHEPESバッファー(50mM)に再懸濁し、等容量の100％クロロホルムで処理し、2500xgで10分スピンし、30分空気乾燥させた。50％硫酸アンモニウム及び40％PEG-800を用いて二相分配を行い、2500xgで15分スピンした。硫酸アンモニウム相を回収し、10kDa分子量カットオフSlide-A-Lyser Dialysis Cassette (Thermo Scientific #66810)を用いて4時間透析した。透析を16時間、2回繰り返した。50kDa遠心分離フィルターユニット(Millipore #UFC905024, Billerica, MA)を用いてAAVを濃縮し、-80℃で保存した。QuickTiter AAV定量キット(Cell Biolabs #VPK-145, San Diego, CA)を使用してウイルス濃度を測定した。
【０１１０】
AAV6のCnB1f/fマウスへの膵管注入
AAV6の逆行性膵管注入のための外科処置は、先に記載されたとおりであった73。手短に言えば、100μlの精製AAV6(力価2X1012PFU)を、P33蠕動シリンジポンプ(Harvard Apparatus, Holliston, MA)を用いて、10μl/分の速度で10分間胆膵管に注入した。外科的麻酔は、イソフルラン及び酸素を吸入させることによって達成した。手術の直後に、鎮痛剤ブプレノルフィン(0.075mg/kg)の単回注射を投与した。マウスをヒーティングパッド上で30分間回復させ、PEPの誘導前に、食物及び水を自由に摂取させて4〜6週間飼育した。AAV6注入の効力を確認するため、Lox-Stop-Lox tdTomato赤色レポーターマウスを使用した。上記のとおり、100マイクロリットルの精製AAV6 Ela-iCre(力価2X1012 PFU)を膵管に注入した。手術の5週間後、蛍光解剖用顕微鏡を用いて、腹部器官と一体として膵臓組織を造影し、さらに切開した。
【０１１１】
ERCP後膵炎の誘導
先に記載されたとおりにPEPを誘導した73。手短に言えば、100μlのイオヘキソール(Omnipaque, GE Healthcare, Princeton, NJ)を、20μl/分の速度で5分間胆膵管に逆行性注入した。導管操作(DM)群に由来するマウスは、10μl/分の低速で5分間、50μlの正常生理食塩水の膵管中への逆行性注入を受けた。マウスは、PEP誘導の24時間後に、CO2吸入及び頸椎脱臼によって安楽死させた。偽群に由来するマウスは、開腹手術のみを受けた。
【０１１２】
血清アミラーゼ測定
血液は、PEP誘導の6時間後、眼窩後方出血により回収した。血清は、4℃にて1,500xgで10分間遠心分離することによって調製した。血清アミラーゼは、製造者の指示に従ってPhadebas キット(Amersham Pharmacia, Rochester, NY)を用いて測定した。
【０１１３】
膵臓組織病理学及び造影分析
解剖学的方向を維持するため、膵臓、十二指腸及び脾臓を一体として1つのカセット中に配置した(図18A)。組織を、室温で24時間4％パラホルムアルデヒド中に固定した。パラフィン包理切片を、ヘマトキシリン及びエオシン(HE)で染色した。200Xに拡大した、十二指腸に近位であることにより同定した膵頭部から系統的に選択された10個の視野を盲検様式で評価した。評価スコアは、記載されたとおり5、浮腫、炎症性浸潤及び壊死に対して同等の重み(0〜3)を与えた。浮腫指数は、ImageJ software(NIH, Bethesda, MD)を用いて強度閾値化を行うことによってさらに客観的に線引きした。分析のため、各スライドに由来する少なくとも5つの画像を選択した。各画像を、同じ色閾値に設定した。柔組織中の標識化された領域を浮腫として示し、それらの表面領域を全柔組織領域のパーセントとして計算した。
【０１１４】
免疫組織化学
Leica Bond-Max全自動IHC及びISH染色システム(Leica, Buffalo Grove, IL)を半自動様式で用いて、パラフィン包理組織切片からミエロペルオキシダーゼ(MPO)の免疫組織化学(IHC)を行った。MPOのIHC用の製品は全て、Leica社から購入した(一次抗体を含む)。スライドをBondシステムに搭載し、以下のとおりにプログラムを設定した：Bond脱ワックス溶液(AR9222)を使用する脱パラフィン化、アルコールによる脱水、MPO(PA0491)一次抗体と共に15分間インキュベート、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)-リンカーを含むBondポリマー精製検出キット(DS9800)と共にインキュベート、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするための過酸化水素ブロック、ビオチン非含有系。3,3’-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド水和物(DAB)、及びヘマトキシリン対比染色。次のステップへ進む前に、Bond Wash Solution(AR9590)又は蒸留水のいずれかを用いてスライドを自動的に洗浄した。陽性対照組織及び陰性対照組織を用いた抗体の系統的最適化後、MPO用の理想的な条件が、MPO BRTU(即時使用可能Bond(Bond Ready to Use))溶液、前処理必要なし、15分間の抗体インキュベーション時間、8分間の一次インキュベーション後時間、及び8分間のDABインキュベーション時間であることが見出された。50Xに拡大した、膵頭部から系統的に選択された5個の視野を盲検様式で評価した。0〜3のスコアを使用して、各視野中の褐色の程度を評価した。
【０１１５】
統計的分析
データは、平均±SEMとして表した。GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA)を用いて統計的分析を行った。比較は、不対T検定を用いて行った。P値≦0.05を有意と見なした。
【０１１６】
7.2. 結果
腺房細胞中でCnを選択的に欠失させるため、重要な調節サブユニットB1(CnB1)にフロックス(floxed)アレルを含むマウス系統を、完全長腺房特異的ラット膵臓エラスターゼプロモーターによって駆動されるタモキシフェン誘導性Cre系統と交雑した75(図16A及び図17)。正常生理食塩水の低圧導管内注入(導管操作(DM)と命名)により誘導されたPEPの軽症モデルでも、腺房細胞特異的CnB1欠損マウス(CnB1Δ/Δ；図16B)に、組織学的損傷のほぼ完全な低下が生じた。さらに、(速度及び容量を2倍にすることによる)より高圧での放射線造影剤の注入によってPEPを模倣する傷害のより重症なモデルにおいて、CnB1Δ/Δマウスでは、組織学的損傷が著しく低下(偽手術陰性対照群のレベルまで75％低下)した。浮腫、炎症性浸潤(MPO染色により付加的に試験した)、及び壊死を含む全組織学的スコアの各パラメータは減少した(図16C及び図18)。これらの知見は、in vivoで腺房細胞CnがPEPを媒介することを示す。PEPの軽症及び中程度のモデルに加えて、腺房細胞特異的Cn欠失は、胆汁酸であるタウロコール酸塩の注入によって誘導された、急性膵炎の異なるモデルも予防した(図19)。この知見は、膵臓傷害の媒介における腺房細胞Cnの広範な重要性を示した。
【０１１７】
腺房細胞Cnノックアウトの繁殖戦略は、より短い、独立して構築されたラット膵臓エラスターゼプロモーター79によって駆動される増強型Cre(iCre)78を有するアデノ随伴ウイルス血清型6ベクター(AAV6)を作製することによって補完された(図20A及び図21A)。血清型の中でも、AAV6が、AAV8と共に、最も高い腺房細胞への感染効率を提供する39、80。腺房細胞を標的とする原理の証明として、AAV6-Ela-iCreは、Lox-Stop-Lox tdTomato赤色レポーターマウス中で腺房細胞蛍光を誘導した(図21B)。CnB1f/fマウスの膵臓へのAAV6-Ela-iCreの導管内注入は、CnB1の腺房細胞特異的欠失をもたらし、導管内処置からの回復の際、PEPにより誘導された膵臓傷害は、対照レベルまで90％低下した(図20B〜20C及び図21C〜21F)。
【０１１８】
PEP誘導の前後の、複数回用量のCn阻害剤の投与によるCnの全身性阻害はPEPを予防することが先に示されている73。しかし、2つの遺伝子Cn欠失モデルを用いた、in vivoで腺房細胞CnがPEPに必要とされるという本知見は、本発明者らが、単回急性用量のCn阻害剤を放射線造影剤注入と共に投与することによって腺房細胞Cn活性を選択的に標的化することが、PEPを緩和し得るか否か調査することを促した。この特有の、少量の薬物のコンパートメント化送達法は、阻害剤の毒性プロファイルをさらに除去する。FK506(1μM)及びCsA(10μM)は、それぞれ、即時使用可能イオヘキソール製剤中で容易に溶解した。導管内FK506又はCsA療法は、DMによって見られる軽症の組織学的損傷には影響を与えなかったが、この介入は、PEPの中程度のモデルの重症度を、偽レベルまでそれぞれ61及び37％低下させた(図22A〜22B及び図23A〜23C)。注入の6時間後にPEPによって見られる血清アミラーゼ上昇も低下した(図23D)。
【０１１９】
7.3. 考察
要約すると、in vivoで腺房細胞Cnを欠失させるための2つの補完的な遺伝子的アプローチを用いて、またマウスにおけるPEPの2つの重症モデル並びに膵炎の胆汁注入モデルにおいて、本発明者らは、PEP及び膵炎が、腺房細胞Cn欠失によって大きく予防され得ることを示す。これらの有意な知見の翻訳的な帰結は、in vivoで腺房細胞Cnを標的とするCn阻害剤の導管内送達はまた、PEPを低下させることが示されたことである。これらの新たな知見は、Cn阻害剤の慢性投与及び全身性投与が膵炎及び膵臓線維症に罹患しやすくさせる可能性があったが81、82、膵臓に対する急性及び標的化送達が膵炎を予防するというパラドックスを調整する。この研究は、PEPを予防するためのCn阻害剤を含む新規なERCP注入製剤の効力を試験するための臨床試験を開始する契機を提供する。
【０１２０】
8. 参考文献
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2018524287.tif 000006
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2018524287.tif 000013
2018524287.tif 000014
【０１２１】
様々な参考文献が本明細書に引用され、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2018524287.tif 000015
【図１Ｂ】
2018524287.tif 000016
【図１Ｃ】
2018524287.tif 000017
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2018524287.tif 000026
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ】
2018524287.tif 000039
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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