(57)【要約】  少なくとも1種のポリマーに特異的に結合する結合モジュールと、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールとを含むポリマー検出プローブが提供される。上記結合モジュールは、炭水化物結合モジュール（CBM）であり得る。上記レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質であり得る。少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーを含むパルプ製品又は紙製品に特異的に結合されたプローブを含む複合体が提供される。少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーと、それに結合された少なくとも1つのプローブとを含むパルプ製品又は紙製品が提供される。リグノセルロース用プローブを使用する方法が提供される。リグノセルロース系ポリマー又はその他の種類のポリマーを検出する方法が提供される。工業的処理のパルプ製品又は紙製品に対する有効性を判定する方法も提供される。パルプ製品又は紙製品の物理的特性を測定する方法が更に提供される。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合する結合モジュールa）と、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールb）とを含むリグノセルロース系ポリマー検出プローブ。
【請求項２】
前記リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、ポリペプチド型プローブを含む、請求項1に記載のプローブ。
【請求項３】
前記結合モジュールは、ポリペプチド型結合モジュールであり、かつ前記レポーターモジュールは、ポリペプチド型レポーターモジュールである、請求項2に記載のプローブ。
【請求項４】
前記ポリペプチド型結合モジュールは、前記ポリペプチド型レポーターモジュールへと直接的に融合されている、請求項3に記載のプローブ。
【請求項５】
前記ポリペプチド型結合モジュールは、前記ポリペプチド型レポーターへとリンカーポリペプチドを介して結合されている、請求項3に記載のプローブ。
【請求項６】
前記ポリペプチド型プローブは、配列番号2、6、8、10、及び12のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のプローブ。
【請求項７】
前記ポリペプチド型結合モジュールは、配列番号14、16、18、20、及び22のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリペプチド型レポーターモジュールは、配列番号24、26、28、及び30のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のプローブ。
【請求項８】
前記ポリペプチド型結合モジュールは、抗体又はそのフラグメントではない、請求項3に記載のプローブ。
【請求項９】
前記レポーターモジュールは、抗体又はそのフラグメントではない、請求項3に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記レポーターモジュールは、ポリペプチドではない、請求項1に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記レポーターモジュールは、蛍光性である、請求項1に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記レポーターモジュールは、約350 nmから約700 nmまでの蛍光励起ピーク（最大）を有する、請求項11に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記レポーターモジュールは、約400 nmから約750 nmまでの蛍光発光ピーク（最大）を有する、請求項11に記載のプローブ。
【請求項１４】
前記レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質を含む、請求項11に記載のプローブ。
【請求項１５】
前記蛍光性タンパク質は、紫外蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、シアン蛍光性タンパク質、緑色蛍光性タンパク質、黄色蛍光性タンパク質、橙色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、遠赤蛍光性タンパク質、近赤外蛍光性タンパク質、赤外蛍光性タンパク質、sapphire型蛍光性タンパク質、長ストークスシフト蛍光性タンパク質、切り替え可能な蛍光性タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項14に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記蛍光性タンパク質は、Sirius、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、mAmetrine、Cerulean、mCerulean3、SCFP3A、CyPet、mTurguoise、mTurquoise2、単量体Midoriishi-Cyan、Aquamarine、eCFP、TagCFP、mTFP1、AmCyan1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、単量体Azami Green、TurboGFP、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、eGFP、AcGFP1、ZGreen1、ZsYellow1、mBanana、EYFP、Topaz、Citrine、Venus、SYFP2、Ypet、IanRFP-deltaS83、mPapaya1、TagYFP、mOrange、mOrange2、単量体Kusabira-Orange、mKOk、mKO2、mTangerine、mNectarine、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、DsRed-Express2、DsRed-Express、tdTomato、DsRed-単量体、DsRed-単量体、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry、HcRed1、FusionRed、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、TagRFP675、iFP1.4、iRFP（iRFP713）、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720、iFP2.0、mIFP、mKeimaRed、LSS-mKate1、LSS-mKate2、LSSmOrange、mBeRFP、PA-GFP、PATag RFP、Dendra2、Timer、PAmCherry、Kaede（緑色）、Kaeda（赤色）、KikGR1（緑色）、KikGR1（赤色）、PS-CFP2、mEos2（緑色）、mEos2（赤色）、mEos3.2（緑色）、mEos3.2（赤色）、PSmOrange、Dropna、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項14に記載のプローブ。
【請求項１７】
前記結合モジュールは、CBM1、CBM2、CBM3、CBM3a、CBM4、CBM5、CBM6、CBM9、CBM10、CBM11、CBM12、CBM14、CBM15、CBM17、CBM18、CBM19、CBM20、CBM21、CBM25、CBM27、CBM28、CBM33、CBM48、CBM49を含む炭水化物結合モジュール（CBM）、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1に記載のプローブ。
【請求項１８】
前記結合モジュールは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キシラン、マンナン、又はそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する、請求項1に記載のプローブ。
【請求項１９】
前記結合モジュールは、結晶化されたセルロースに特異的に結合する、請求項1に記載のプローブ。
【請求項２０】
前記リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、各々のリグノセルロース系ポリマー検出プローブが、異なるリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合する複数のリグノセルロース系ポリマー検出プローブを含む、請求項1に記載のプローブ。
【請求項２１】
各々のリグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なるレポーターモジュールを含む、請求項20に記載のプローブ。
【請求項２２】
各々のレポーターモジュールは、異なる蛍光的特徴を有する、請求項20に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記レポーターモジュールは、eGFP、mCherry、mOrange2、及びeCFPの1種以上を含む、請求項20に記載のプローブ。
【請求項２４】
前記結合モジュールは、CBM3a、CBM4-1、CBM15、及びCBM27の1種以上を含む、請求項20に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、eGFP-CBM3a、mCherry-CBM4-1、mOrange2-CBM15、eCFP-CBM27、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なる波長で検出可能である、請求項1に記載のプローブ。
【請求項２７】
少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーを含むパルプ製品又は紙製品に特異的に結合された請求項1〜26のいずれか一項に記載のプローブを含む複合体。
【請求項２８】
少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーと、それに特異的に結合された請求項1〜26のいずれか一項に記載の少なくとも1つのプローブとを含むパルプ製品又は紙製品。
【請求項２９】
リグノセルロース系ポリマーを検出する方法であって、
請求項1〜26のいずれか一項に記載のプローブとバイオマス材料とを接触させることと、
前記レポーターモジュールと関連する特性を測定して、前記バイオマス材料中の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの有無を、前記プローブの前記少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーへの特異的な結合に基づいて判定することと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記測定される特性は、蛍光である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算すること、前記少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの種類を特定すること、又はその両方を更に含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記バイオマス材料は、木質バイオマス材料を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
前記木質バイオマス材料は、パルプ、完成紙料、紙、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記木質バイオマス生産物から少なくとも1つの手すき紙を形成することを更に含み、ここで前記測定は、該手すき紙において行われる、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記測定は、処理の前に、処理の間に、若しくは処理の後に、又はそれらの任意の組み合わせにおいて行われる、請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
前記処理は、酵素的処理、漂白、形態破壊、粉砕、若しくはPFI叩解、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記処理は、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、リグナーゼを含む少なくとも1種の酵素、又はそれらの任意の組み合わせによる酵素的処理を含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記バイオマス材料の少なくとも1つの処理を、測定された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて行うことを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３９】
前記測定されたリグノセルロース系ポリマーの量は、前記バイオマス生産物の少なくとも1つの物理的特性と負の相関又は正の相関を有する、請求項31に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも1種の物理的特性は、比破裂強さ、濾水速度、比引裂強さ、比引張強さ、若しくは内部結合強さ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも1種の酵素を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて供給することを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項４２】
ミル速度を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて調節することを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオマス材料の全含水量を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて調節することを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項４４】
前記プローブは、複数のプローブを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項４５】
パルプ製品又は紙製品に対する工業的処理の有効性を判定する方法であって、
請求項1〜26のいずれか一項に記載のリグノセルロース系ポリマー検出プローブとパルプ製品又は紙製品とを接触させることと、
前記プローブの前記パルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出することと、
前記パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算することと、
前記パルプ製品又は紙製品に対する工業的処理の有効性を、検出された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて判定することと、
を含む、方法。
【請求項４６】
前記工業的処理は、酵素的処理、化学的処理、若しくは物理的処理、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法は、工業的処理の前に、工業的処理の間に、若しくは工業的処理の後に、又はそれらの任意の組み合わせにおいて行われる、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
前記リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なる波長で検出可能である、請求項45に記載の方法。
【請求項４９】
パルプ製品又は紙製品の物理的特性を測定する方法であって、
請求項1〜26のいずれか一項に記載のリグノセルロース系ポリマー検出プローブとパルプ製品又は紙製品とを接触させることと、
前記プローブの前記パルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出することと、
前記パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算することと、
前記パルプ製品又は紙製品の少なくとも1つの物理的特性を、検出された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて測定することと、
を含む、方法。
【請求項５０】
前記少なくとも1種の物理的特性は、比破裂強さ、濾水速度、比引裂強さ、比引張強さ、若しくは内部結合強さ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも1種のポリマーに特異的に結合する結合モジュールa）と、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールb）とを含むポリマー検出プローブ。
【請求項５２】
前記ポリマー検出プローブは、ポリペプチド型プローブを含む、請求項51に記載のプローブ。
【請求項５３】
前記レポーターモジュールは、蛍光性である、請求項51に記載のプローブ。
【請求項５４】
前記レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質を含む、請求項53に記載のプローブ。
【請求項５５】
前記蛍光性タンパク質は、紫外蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、シアン蛍光性タンパク質、緑色蛍光性タンパク質、黄色蛍光性タンパク質、橙色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、遠赤蛍光性タンパク質、近赤外蛍光性タンパク質、赤外蛍光性タンパク質、sapphire型蛍光性タンパク質、長ストークスシフト蛍光性タンパク質、切り替え可能な蛍光性タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項54に記載のプローブ。
【請求項５６】
前記結合モジュールは、炭水化物結合モジュール（CBM）である、請求項51に記載のプローブ。
【請求項５７】
前記結合モジュールは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キシラン、マンナン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、キシログルカン、若しくはそれらの任意の組み合わせ、若しくはそれらの線状断片、若しくはそれらの分岐状断片、若しくはそれらのオリゴマー、若しくはそれらのモノマー及び／又はマクロマー、例えばグルコース、D-グルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、モノリグノール、p-クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、p-ヒドロキシフェニルフェニルプロパノイド、グアイアシルフェニルプロパノイド、若しくはシリンギルフェニルプロパノイド、又はそれらの組み合わせに特異的に結合する、請求項51に記載のプローブ。
【請求項５８】
前記結合モジュールは、糖タンパク質、炭水化物、又はその両方に特異的に結合し、特定の血液抗原、種類、型、又は亜型に特異的である、請求項51に記載のプローブ。
【請求項５９】
前記結合モジュールは、ポリアリールエーテルケトン（PAEK）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、パラアラミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、タンパク質、リン酸化タンパク質、修飾タンパク質、脂質、界面活性剤、レシチン、若しくは生物界面活性剤、又はそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する、請求項51に記載のプローブ。
【請求項６０】
前記ポリマー検出プローブは、各々のポリマー検出プローブが、異なるポリマーに特異的に結合する複数のポリマー検出プローブを含む、請求項51に記載のプローブ。
【請求項６１】
各々のポリマー検出プローブは、異なるレポーターモジュールを含む、請求項60に記載のプローブ。
【請求項６２】
各々のレポーターモジュールは、異なる蛍光的特徴を有する、請求項60に記載のプローブ。
【請求項６３】
前記ポリマー検出プローブは、異なる波長で検出可能である、請求項61に記載のプローブ。
【請求項６４】
少なくとも1種の表面可用性ポリマーを含む材料に特異的に結合された請求項51〜63のいずれか一項に記載のプローブを含む複合体。
【請求項６５】
ポリマーを検出する方法であって、
請求項51〜63のいずれか一項に記載のプローブと材料とを接触させることと、
前記レポーターモジュールと関連する特性を測定して、前記材料中の少なくとも1種のポリマーの有無を、前記プローブの前記少なくとも1種のポリマーへの特異的な結合に基づいて判定することと、
を含む、方法。
【請求項６６】
前記測定される特性は、蛍光である、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも1種のポリマーの量を計算すること、前記少なくとも1種のポリマーの種類を特定すること、又はその両方を更に含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
前記材料は、血液試料を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６９】
前記血液試料の血液抗原、種類、型、及び亜型の少なくとも1つを特定することを更に含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
前記プローブは、複数のプローブを含む、請求項65に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリマーは、少なくとも1種の糖ポリマーである、請求項51〜63のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７２】
前記ポリマーは、少なくとも1種のオリゴ糖ポリマーである、請求項51〜63のいずれか一項に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2015年10月26日に出願された先行する米国仮特許出願第62/246,231号の米国特許法第119条（e）項に基づく利益を主張するものであり、この出願の全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、バイオマス中の特定のポリマー、例えば多糖等のリグノセルロース系ポリマーの検出、特性評価、及び定量に関し、さらに、例えば本明細書に記載される様々な使用のためのオリゴ糖等の任意のポリマーの検出に関する。
【０００３】
パルプ及び製紙の分野の産業では、それらの製品の価値を高めるために数々の物理的処理、化学的処理、及び生物学的処理に頼っている。処理には、例えば、所望の紙特性の発揮を助けるための繊維の機械的剪断（叩解）が挙げられる。現在では、そのような処理の成果を、パルプ特性及び紙特性を入念に分析することなく予測する実用的な方法は存在しない。そのような分析には、費用及び時間を費やすパイロット規模又は工業的規模の試験が必要とされる。
【０００４】
ポリマー検出及び繊維表面特性評価のための最近の方法としては、例えばX線光電子分光法（XPS）、走査型電子顕微鏡法（SEM）、飛行時間型二次イオン質量分析法（ToF-SIMS）、及びフーリエ変換赤外分光法（FTIR）が挙げられる。これらの技術には、特殊な機器、特別な専門知識、並びに冗長な操作及び解読が必要とされる。また、これらの技術では、セルロースとヘミセルロースとは区別されない。その他のアプローチは、色素、例えばアクリジンオレンジ及びフェナントレンの使用に基づくポリマーの間接的な検出について開発されている。それらのアプローチは、植物細胞の形態学の研究に使用することには成功しているが、極めて複雑な顕微鏡を使用し、定量的ではない。さらにその他の技術では、代表的な分子に対する抗体を使用してヘミセルロースが検出されている。しかしながら、そのような抗体は、高価であり、抗体製造のために使用された分子に似たポリマーの一部が検出されるに過ぎない。特定の抗体によって認識される正確なエピトープが見出されないか、又は該エピトープに到達することができないと、それらのポリマーは検出されないこととなる。抗体技術は、冗長なものであり、それには二次抗体の使用も必要とされる。
【０００５】
炭水化物結合モジュール（CBM）は、バイオマスポリマー検出に特化した一群の分子である。CBMは、様々な標的、例えば結晶性セルロース及びキシラン等の炭水化物の特異的な検出のために最適化されたタンパク質である。そのようなCBMのバイオマスへの結合を検出するために、そこにレポーター色素を結合させることができる。そのような技術には、顕微鏡法が必要とされる。しかしながら、これらの方法のいずれも、様々な処理のパルプ又は紙に対する影響を予測可能にする繊維表面のポリマーの迅速な特性評価に使用することには成功していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、バイオマス中のリグノセルロース系ポリマーを検出するためのより良い材料及び方法、並びに様々な用途における、一般的にはオリゴ糖等のポリマーの検出のためのより良い材料及び方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の特徴は、バイオマス中のリグノセルロース系ポリマーを、例えば時間的にも費用的にも効果的に検出及び測定するための材料及び方法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の特徴は、特定の処理を施す前に、その間に、及び／又はその後に、工業的処理のパルプ又は紙に対する有効性を判定するための材料及び方法を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる特徴は、パルプ製品又は紙製品の物理的特性を、間接的に該パルプ製品又は紙製品中のリグノセルロース系ポリマーの存在及び／又は含有量に基づいて測定するための材料及び方法を提供することである。
【００１０】
本発明の付加的な特徴は、バイオマス中の多数の異なるリグノセルロース系ポリマーの存在及び／又は量を、個別の又は一連の試験手順とは独立して、同時に測定するための材料及び方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる特徴は、1種以上のオリゴ糖等の任意のポリマーを検出するための材料及び方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる特徴及び利点は、以下の明細書で一部説明され、本明細書から一部明らかとなるか、又は本発明の実施により認識することができる。本発明の目的及び他の利点は、本明細書及び添付の特許請求の範囲において具体的に指摘された要素及び組み合わせを用いて実現及び達成される。
【００１３】
これらの利点及びその他の利点を達成するために、本発明の目的によれば、本明細書で具体化され、かつ広範に記載されるように、本発明は、部分的に、少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合する結合モジュールと、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールとを含むリグノセルロース系ポリマー検出プローブに関する。上記モジュールの一方又は両方は、ポリペプチドを含み得る。結合モジュールは、炭水化物結合モジュール（CBM）であり得る。上記レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質であり得る。上記プローブは、各々のプローブが特定のリグノセルロース系ポリマーに対して特異的であり、かつ各々のプローブが固有の蛍光スペクトルプロファイルを有する複数のプローブを含み得る。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーを含むパルプ製品又は紙製品に特異的に結合されたプローブを含む複合体に関する。
【００１５】
本発明はさらに、少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーと、それに特異的に結合された少なくとも1つのプローブとを含むパルプ製品又は紙製品に関する。
【００１６】
本発明はまた、リグノセルロース系ポリマーを検出する方法に関する。該方法は、プローブとバイオマス材料とを接触させることと、レポーターモジュールに関連する特性を測定して、バイオマス材料中の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの有無を判定することとを含み得る。
【００１７】
本発明はさらに、工業的処理のパルプ製品又は紙製品に対する有効性を判定する方法に関する。リグノセルロース系ポリマー検出プローブをパルプ製品又は紙製品と接触させ得る。プローブのパルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出し得る。パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算し得る。工業的処理のパルプ製品又は紙製品に対する有効性又は必要性を検出される少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて判定し得る。
【００１８】
本発明はまた、パルプ製品又は紙製品の物理的特性を測定する方法に関する。リグノセルロース系ポリマー検出プローブをパルプ製品又は紙製品と接触させ得る。プローブのパルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出し得る。パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を測定（例えば、計算）し得る。パルプ製品又は紙製品の少なくとも1種の物理的特性を検出される少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて測定し得る。
【００１９】
本発明はさらに、ポリマー検出プローブに関する。該プローブは、例えば、本明細書に記載されるリグノセルロース系ポリマー用プローブの1種以上の特性若しくは機能、重複している特性若しくは機能、又は異なる特性若しくは機能を有していてもよい。上記ポリマー検出プローブは、例えば、少なくとも1種のポリマー（例えば、オリゴ糖又はその他の糖ポリマー）に特異的に結合する結合モジュールと、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールとを含み得る。少なくとも1種の表面可用性ポリマーを含む材料に特異的に結合されたプローブを含む複合体が提供される。
【００２０】
本発明はまた、ポリマー（例えば、オリゴ糖又はその他の糖ポリマー）を検出する方法に関する。本発明のプローブを材料と接触させ得る。レポーターモジュールと関連する特性を測定することで、該材料中の少なくとも1種のポリマーの有無を、プローブの少なくとも1種のポリマーへの特異的な結合に基づいて判定することができる。検出又は非検出には、本明細書に記載される数多くの用途がある。
【００２１】
本明細書に開示される材料及び方法は、パルプ及び紙において使用される繊維の表面にある様々なリグノセルロース系ポリマー、例えばセルロース及びヘミセルロースの迅速かつ同時の検出を、融合タンパク質を使用して可能にしている。シグナルのパターンは、パルプ特性及び紙特性の様々な変化と相関し得る。該方法は、様々な処理の紙特性に対する影響の予測を可能にする。そのような予測は、所与の標的のための処理、適用量、及び／又はその他の条件、例えばより高い比破裂強さを有する紙、より高い濾水速度を有するパルプ、及び／又は漂白促進のための最適なキシラナーゼ濃度に導く条件の迅速かつ正確な選択を可能にする。該方法は、化学的処理、酵素的処理、又は物理的処理の最適な使用も同様に可能にする。該方法は、木質バイオマスを基礎とするあらゆる産業において使用することができる。
【００２２】
さらに、本発明には、多くの用途がある。繊維ポリマーの露出又は分布又は加水分解に対して影響を有する任意の関連の化学的処理、物理的処理、又は生物学的処理の、パルプ特性及び紙特性に対する効果を、測定又は予測することができる。例えば、パルプの叩解を最適化するための酵素の順序を決定又は予測することができる。漂白促進のためのキシラナーゼ処理を最適化することができる。バイオマスを加水分解するときのヘミセルロースの分解を監視することができる。精製されたセルロース系材料、例えばナノセルロース又はフィラメントのための製造条件は、本発明の方法を使用して、非晶質セルロース対結晶性セルロースの存在を監視することによって最適化することができる。
【００２３】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方が例示的及び説明的なものに過ぎず、請求項に記載の本発明を更に説明することを意図すると理解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のプローブを使用するポリマー検出の例の概略図である。
【図２】pet11A-eGFP（eGFPレポーターモジュール）の発現ベクターの概略図である。
【図３】pet11A-mCherry（mCherryレポーターモジュール）の発現ベクターの概略図である。
【図４】pet11A-mOrange2（mOrange2レポーターモジュール）の発現ベクターの概略図である。
【図５】pet11A-eCFP（eCFPレポーターモジュール）の発現ベクターの概略図である。
【図６】精製された蛍光タンパク質のSDS-PAGEの例である。矢印は、対象のタンパク質を強調している。
【図７】精製されたCBMのSDS-PAGEの例である。矢印は、対象のタンパク質を強調している。
【図８】549 nmでの励起後の、レポーターモジュール（eGFP及びmCherry）の発光スペクトル、並びにパルプ製手すき紙円板の発光スペクトルを示すグラフの例である。
【図９】488 nmの励起波長を使用する、蛍光性タンパク質（FP）（eGFP及びmCherryの発光スペクトル）、及びパルプ製手すき紙円板の発光スペクトルの例である。
【図１０】pET11A-eGFP-CBM3a発現ベクター（プローブ1）の概略図の例である。
【図１１】pET11A-mCherry-CBM4-1発現ベクター（プローブ2a）の概略図の例である。
【図１２】pET11A-mCherry-CBM17発現ベクター（プローブ2b）の概略図の例である。
【図１３】pET11A-mOrange2-CBM15発現ベクター（プローブ3）の概略図の例である。
【図１４】pET11A-eCFP-CBM27発現ベクター（プローブ4）の概略図の例である。
【図１５】プローブ1〜プローブ4のSDS-PAGE分析の例である。左から右に向かって、プローブ1、プローブ2a、プローブ2b（プローブ2aよりも高い非晶質セルロースに対する親和性を有するものはここでは使用しなかった）、プローブ3及びプローブ4。後ろから4つまでのゲルの左側には、同じゲル上で泳動されたタンパク質のサイズの推定を可能にする標準サイズのラダーが示されている。
【図１６】A〜Dは、それぞれプローブ1、プローブ2b、プローブ3、及びプローブ4についての、FP-CBMタンパク質の励起スペクトル（点線）及び発光スペクトル（実線）のグラフの例である。
【図１７】プローブ1を使用する、固相でのディプリーションアッセイからの結合飽和のグラフの例である。
【図１８】紙円板上でのプローブ結合実験を説明する概略図の例である。
【図１９】未処理のパルプ及びセルラーゼ処理されたパルプ（2つのレベルの叩解後）に結合されたレポーターモジュール（eGFP）単独の蛍光強度（FI）のグラフの例である。
【図２０】未処理のパルプ及びセルラーゼ処理されたパルプ（2つのレベルの叩解後）に結合されたプローブ1の蛍光強度のグラフの例である。
【図２１】パルプ1製手すき紙の表面上の結晶性セルロースの定量に対するPFI叩解の影響を示すグラフの例である。
【図２２】パルプ1製手すき紙の表面上の結晶性セルロースの定量に対するセルラーゼ処理の影響を示すグラフの例である。
【図２３】キシラナーゼ処理された手すき紙の表面上に結合されたプローブ1の定量（μg/mm2）を表すグラフの例である。
【図２４】2種の異なるプラントで製造されたPFI叩解された手すき紙の表面上の結晶性セルロースの定量（μg/mm2）を表すグラフの例である。
【図２５】A〜Dは、叩解エネルギー（PFI回転数）の関数としての、プローブ1を使用する結晶性セルロースの定量（μg/mm2）と、それぞれ比引裂強さ（mN m2/g）、比引張強さ（N m/g）、内部結合強さ（J/m2）、繊維平均長さ（mm）を含むパルプ2/紙の物理的特性との間の相関を表すグラフの例である。
【図２６】A〜Dは、叩解エネルギー（PFI回転数）の関数としての、プローブ1を使用する結晶性セルロースの定量（μg/mm2）と、それぞれ比引裂強さ（mN m2/g）、比引張強さ（N m/g）、内部結合強さ（J/m2）、繊維平均長さ（mm）を含むパルプ1/紙の物理的特性との間の相関を表すグラフの例である。
【図２７】それぞれUBKPR：未漂白のクラフトパルプ（パルプ2）、UBMP：未漂白の機械パルプ（パルプ5）、BMP：漂白された機械パルプ（パルプ6）、UBKP：未漂白のクラフトパルプ（パルプ3）、及びBKP：漂白されたクラフトパルプ（パルプ4）を含む5種の異なる紙円板の表面にあるキシランに結合されたプローブ3の蛍光強度を表すグラフの例である。
【図２８】未処理のパルプ4（BKP）紙及びキシラナーゼ処理されたパルプ4（BKP）紙の表面にあるキシランに結合されたプローブ3の蛍光強度を表すグラフの例である。
【図２９】2種の異なる紙円板、つまり未漂白のクラフトパルプ（パルプ3、UBKP）、及び漂白されたクラフトパルプ（パルプ4、BKP）の表面にあるマンナンに結合されたプローブ4（eCFP-CBM27）の蛍光強度を表すグラフの例である。
【図３０】マンナナーゼで処理された漂白されたクラフトパルプ（パルプ4、BKP）紙の表面にあるマンナンに結合されたプローブ4の蛍光強度を表すグラフの例である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、部分的に、少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合する結合モジュールa）と、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールb）とを含むリグノセルロース系ポリマー検出プローブに関する。任意の適切な結合モジュール及びレポーターモジュールを使用することができる。所与のプローブは、結合モジュール及びレポーターモジュールの数及び／又は種類に関して様々であってもよい。プローブは、単独の結合モジュールと単独のレポーターモジュールとを含んでもよい。プローブは、レポーターモジュールより多くの結合モジュール、結合モジュールより多くのレポーターモジュール、又は同数の結合モジュール及びレポーターモジュールを含んでもよい。プローブは、1個から3個までの、1個から5個までの、1個から10個までの、又はそれより多くの結合モジュール及び／又はレポーターモジュールを含んでもよい。各々の結合モジュールは、特定のリグノセルロース系ポリマー又は特定の部分集合のリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合することができる。
【００２６】
リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、少なくとも1つのポリペプチド型プローブを含むことができる。全て又は一部のプローブは、1種以上のポリペプチドから構築されていてもよい。ポリペプチドは、全体的又は部分的に修飾された20種の標準的アミノ酸を含むタンパク質を含むと理解される。1種以上の標準的アミノ酸に加えて、1種以上の非標準的アミノ酸を置き換えてもよく、又はそれらを使用することもできる。該ポリペプチドは、化学合成によって、又はin vitro若しくはin vivoのどちらかで分子生物学的発現系を使用して構築することができる。任意の適切な発現系、例えば原核性発現系、真核性発現系、プラスミドベースの発現系、染色体組込み型発現系、又はそれらの任意の組み合わせを使用することができる。修飾は、合成により、発現系における翻訳後修飾により、又はその両方により行うことができる。任意の適切な修飾、例えばリン酸化、スルホン化、フッ素化、アセチル化、炭水化物基の付加、脂質基の付加、核酸の付加、ポリヌクレオチドの付加、その他のアミノ酸の付加、その他のポリペプチドの付加、合成有機分子の付加、無機基の付加、又はそれらの任意の組み合わせを使用することができる。
【００２７】
結合モジュールは、ポリペプチド型結合モジュールであっても、又はそれを含んでもよい。レポーターモジュールは、ポリペプチド型レポーターモジュールであっても、又はそれを含んでもよい。ポリペプチド型結合モジュール及びポリペプチド型レポーターモジュールは、互いに直接的に又は間接的に連結されていてもよい。例えば、ポリペプチド型結合モジュールは、ポリペプチド型レポーターモジュールへと直接的に融合することができる。ポリペプチド型結合モジュールは、ポリペプチド型レポーターへと、共有結合により、例えばリンカーポリペプチドを介して連結されていてもよい。該リンカーは、任意の適切な長さ、例えば、少なくとも1個のアミノ酸、2個から約2000個までのアミノ酸（残基）、約5個から約1000個までのアミノ酸、約10個から約500個までのアミノ酸、約25個から約250個までのアミノ酸、約50個から約100個までのアミノ酸、又は2000個より多くのアミノ酸であってもよい。該リンカーは、ポリペプチド以外に、又はポリペプチドに加えて、分子、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、合成有機小分子、非天然ポリマー、金属、又はそれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、結合モジュール及びレポーターモジュールは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又はその両方を使用して架橋されていてもよい。結合モジュールとレポーターモジュールとの間の連結又は結合は、イオン性結合、水素結合、疎水性相互作用、親水性相互作用、溶媒排除相互作用、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。上記連結又は結合は、レポーターモジュールを結合モジュールにつなぎ留めるか、又はさもなくば安定的に結合させることを保証するために、少なくとも1個の共有結合を含み得る。
【００２８】
ポリペプチド型プローブは、例えば配列番号2、6、8、10、及び12のいずれか1つのアミノ酸配列、又はそれらの組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよく、それらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1、5、7、9、及び11の核酸配列によってコードされている。ポリペプチド型結合モジュールは、例えば配列番号14、16、18、20、及び22のいずれか1つのアミノ酸配列であっても、又はそれらを含んでもよく、それらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号13、15、17、19、及び21の核酸配列によってコードされている。ポリペプチド型レポーターモジュールは、例えば配列番号24、26、28、及び30のいずれか1つのアミノ酸配列であっても、又はそれらを含んでもよく、それらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号23、25、27、及び29の核酸配列によってコードされている。ヒスチジンタグ配列は、例えば、精製法がニッケルカラムを使用しないのであれば、プローブのための配列、結合モジュールのための配列、及び／又はレポーターモジュールのための配列から省いてもよい。
【００２９】
本発明のプローブは、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチドとは独立して、それらを含むことなく、又はそれらを使用することなく機能し得ることから有利である。ポリペプチド型の結合モジュールもレポーターモジュールも、抗体又はそのフラグメントを必要としないか、又はそれらを含まない。ポリペプチド型の結合モジュールとレポーターモジュールのどちらかは、抗体又はそのフラグメントであるか、又はそれらを含んでもよい。ポリペプチド型の結合モジュールとレポーターモジュールの両者が、抗体又はそのフラグメントであるか、又はそれらを含んでもよい。結合モジュールが抗体又はその抗原結合フラグメントではなくても、それでも該結合モジュールは、抗体の特異性をもって標的に結合することができる。結合モジュールのそのリグノセルロース系の標的への結合は、抗体のその抗原への結合と類似の条件下で、又はそれとは異なる条件下で生じ得る。結合は、結合モジュールのその1種以上の所望の標的への特異的な結合を増大させるとともに、結合モジュールの非標的への非特異的な結合を減少させるか、最小化させるか、又は妨げる任意の適切な条件下で行われ得る。結合は、1種以上の追加の要因の存在によって、例えばプローブ濃度、イオン、例えばカルシウムイオン、イオン強度、pH、及び／又は温度等によって補助され得る。結合モジュール及びレポーターモジュールの両方ともが、任意の種類のポリペプチドであっても、若しくはそれを含んでもよく、結合モジュール及びレポーターモジュールのどちらも、任意の種類のポリペプチドでなくても、若しくはそれを含んでいなくてもよく、又は結合モジュール及びレポーターモジュールの一方だけが、任意の種類のポリペプチドであっても、若しくはそれを含んでもよい。結合モジュール及び／又はレポーターモジュールは、ポリペプチドの代わりに、又はそれに加えて、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、合成有機基、及び／又は無機基であっても、又はそれらを含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチド、多糖、脂肪酸、エステル、ステロール、及び／又は非天然ポリマーを使用することができる。結合モジュール及び／又はレポーターモジュール、及び／又はプローブのその他の部分は、任意の適切な種類又は数の分子、例えば本明細書に記載される分子を含んでもよい。
【００３０】
任意の適切なレポーターモジュール又はレポーターモジュールの組み合わせは、本発明のプローブ及び方法において使用することができる。例えば、レポーターモジュールは、全体的に又は部分的に、蛍光性であってもよい。レポーターモジュールは、任意の適切な蛍光励起スペクトル及び蛍光発光スペクトルを有してもよい。レポーターモジュールは、固有の励起スペクトル及び／又は最大励起ピークを有してもよい。例えば、レポーターモジュールは、例えば、300 nmより低い、約300 nmから約750 nmまでの、約350 nmから約700nmまでの、約400 nmから約650 nmまでの、約350 nmから約400 nmまでの、約400nmから約450 nmまでの、約450 nmから約500 nmまでの、約500 nmから約550nmまでの、約550 nmから約600 nmまでの、約600 nmから約650 nmまでの、約650nmから約700 nmまでの、700 nmより高い、又は任意のその間の範囲（例えば、1 nm〜3 nm、5 nm、10 nm、又は25 nmの範囲）若しくは値の蛍光励起ピーク（最大）を有してもよい。レポーターモジュールは、固有の発光スペクトル（±1 nm、又は±3 nm、又は±5 nm）及び／又は最大発光ピーク（±1 nm、又は±3 nm、又は±5 nm）を有してもよい。例えば、レポーターモジュールは、350 nm未満の、約350 nmから約800nmまでの、約400 nmから約750 nmまでの、約450 nmから約700 nmまでの、約350nmから約400 nmまでの、約400 nmから約450 nmまでの、約450 nmから約500nmまでの、約500 nmから約550 nmまでの、約550 nmから約600 nmまでの、約600nmから約650 nmまでの、約650 nmから約700 nmまでの、約700 nmから約750nmまでの、750 nmより高い、又は任意のその間の範囲（例えば、1 nm〜3 nm、5 nm、10 nm、又は25 nmの範囲）若しくは値の蛍光発光ピーク（最大）を有してもよい。
【００３１】
上記レポーターモジュールは、任意の数又は種類の蛍光性部分を含んでもよい。例えば、蛍光性部分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、小有機分子、金属、配位錯体、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。例えば、レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質、又は蛍光性タンパク質の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。該蛍光性タンパク質は、紫外蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、シアン蛍光性タンパク質、緑色蛍光性タンパク質、黄色蛍光性タンパク質、橙色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、遠赤蛍光性タンパク質、近赤外蛍光性タンパク質、赤外蛍光性タンパク質、sapphire型蛍光性タンパク質、長ストークスシフト蛍光性タンパク質、切り替え可能な蛍光性タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。該蛍光性タンパク質は、例えば、Sirius、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、mAmetrine、Cerulean、mCerulean3、SCFP3A、CyPet、mTurguoise、mTurquoise2、単量体Midoriishi-Cyan、Aquamarine、eCFP、TagCFP、mTFP1、AmCyan1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、単量体Azami Green、TurboGFP、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、eGFP、AcGFP1、ZGreen1、ZsYellow1、mBanana、EYFP、Topaz、Citrine、Venus、SYFP2、Ypet、IanRFP-deltaS83、mPapaya1、TagYFP、mOrange、mOrange2、単量体Kusabira-Orange、mKOk、mKO2、mTangerine、mNectarine、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、DsRed-Express2、DsRed-Express、tdTomato、DsRed-単量体、DsRed-単量体、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry、HcRed1、FusionRed、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、TagRFP675、iFP1.4、iRFP（iRFP713）、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720、iFP2.0、mIFP、mKeimaRed、LSS-mKate1、LSS-mKate2、LSSmOrange、mBeRFP、PA-GFP、PATag RFP、Dendra2、Timer、PAmCherry、Kaede（緑色）、Kaeda（赤色）、KikGR1（緑色）、KikGR1（赤色）、PS-CFP2、mEos2（緑色）、mEos2（赤色）、mEos3.2（緑色）、mEos3.2（赤色）、PSmOrange、Dropna、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。蛍光性レポーターモジュール以外のレポーターモジュールを、蛍光性レポーターモジュールに加えて、又はそれに代えて使用することができる。例えば、抗体、抗体フラグメント、放射性同位体、色素、合成有機分子、燐光性分子、酵素等、又はそれらの任意の組み合わせを使用することができる。Knox P.J. (2012) Methods in Enzymology, volume 510, 233-245（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるレポーターモジュールを使用することができる。結合モジュール、例えばCBMの到達可能な第一級アミンは、テトラフルオロフェニル（tetrafluorophenyl）エステル部を含む反応性色素（Invitrogen社）を使用して標識することができる。
【００３２】
任意の適切な結合モジュール又は結合モジュールの組み合わせを、本発明のプローブ及び方法において使用することができる。例えば、該結合モジュールは、CBM1、CBM2、CBM3、CBM3a、CBM4、CBM5、CBM6、CBM7、CBM8、CBM9、CBM10、CBM11、CBM12、CBM13、CBM14、CBM15、CBM16、CBM17、CBM18、CBM19、CBM20、CBM21、CBM22、CBM23、CBM24、CBM25、CBM26、CBM27、CBM28、CBM29、CBM30、CBM31、CBM32、CBM33、CBM34、CBM35、CBM36、CBM37、CBM38、CBM39、CBM40、CBM41、CBM42、CBM43、CBM44、CBM45、CBM46、CBM47、CBM48、CBM49、CBM50、CBM51、CBM52、CBM53、CBM54、CBM55、CBM56、CBM57、CBM58、CBM59、CBM60、CBM61、CBM62、CBM63、CBM64、CBM65、CBM66、CBM67、CBM68、CBM69、CBM70、CBM71を含む炭水化物結合モジュール（CBM）、若しくはそれらのファミリーの一員、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。結合特異性は、特定のCBMファミリー又は特定のCBMファミリーの一員、例えば、CBM1（セルロース）、CBM2（セルロース）、CBM3（結晶性セルロース）、CBM4（非晶質セルロース）、CBM5（キチン）、CBM6（セロオリゴ糖、ラミナリン、キシロオリゴ糖、β1,4結合とβ1,3結合との混合型のグルカン）、CBM8（セルロース）、CBM9（結晶性セルロース）、CBM10（セルロース）、CBM11（セルロース）、CBM12（キチン）、CBM13（セルロース、キシラン、マンノース）、CBM14（キチン）、CBM15（キシラン及びキシロオリゴ糖）、CBM16（セルロース及びグルコマンナン）、CBM17（非晶質セルロース）、CBM18（キチン）、CBM19（キチン）、CBM20（デンプン）、CBM21（グリコーゲン）、CBM22（β-1,3/β-1,4の混合型のグルカン）、CBM23（マンナン）、CBM24（α-1,3-グルカン）、CBM25（α-グルコオリゴ糖及び顆粒デンプン）、CBM26（デンプン）、CBM27（β-1,4-マンノオリゴ糖、カロブガラクトマンナン及びコンニャクグルコマンナン、マンナン）、CBM28（非晶質セルロース、セロオリゴ糖、及びβ-（1,3）（1,4）-グルカン）、CBM29（マンナン及びグルコマンナン）、CBM30（セルロース）、CBM31（β-1,3-キシラン）、CBM32（ガラクトース、ラクトース、ポリガラクツロン酸、及びβ-D-ガラクトシル-1,4-β-D-N-アセチルグルコサミン）、CBM33（キチン）、CBM34（顆粒デンプン）、CBM35（キシラン、マンナン、及びβ-ガラクタン）、CBM36（キシラン及びキシロオリゴ糖）、CBM37（キシラン、キチン、微結晶性セルロース、及びリン酸膨潤セルロース）、CBM38（イヌリン）、CBM39（β-1,3-グルカン、リポ多糖、及びリポテイコ酸）、CBM48（グリコーゲン）、CBM40（シアル酸）、CBM41（α-グルカン、アミロース、アミロペクチン、及びプルラン）、CBM42（アラビノフラノース及びアラビノキシラン）、CBM43（β-1,3-グルカン）、CBM44（セルロース及びキシログルカン）、CBM45（デンプン）、CBM46（セルロース）、CBM47（フコース）、CBM48（グリコーゲン）、CBM49（結晶性セルロース）、CBM50（キチン及びキトペンタオース）、CBM51（ガラクトース及びA/B血液型抗原）、CBM52（β-1,3-グルカン）、CBM53（デンプン）、CBM54（キシラン）、CBM55（キチン）、CBM56（β-1,3-グルカン）、CBM58（マルトヘプタオース）、CBM59（マンナン、キシラン、及びセルロース）、CBM60（キシラン）、CBM61（β-1,4-ガラクタン）、CBM62（ガラクトース、キシログルカン、アラビノガラクタン、及びガラクトマンナン）、CBM63（セルロース）、CBM64（セルロース）、CBM65（キシログルカン）、CBM66（フルクタン）、CBM67（L-ラムノース）、CBM68（マルトトリオース及びマルトテトラオース）、CBM69（デンプン）、CBM70（ヒアルロナン）、CBM71（ラクトース及びβ-D-ガラクトシル-1,4-β-D-N-アセチルグルコサミン）、又はそれらの任意の組み合わせの結合特異性であっても、又はそれらを含んでもよい。例えばBoraston et al., Biochem J., 382: 769-781 (2004)、Shoseyov et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2):283-295 (2006)、又はChristiansen et al., FEBS Journal,276:5006-5029 (2009)に記載される任意の適切な炭水化物結合モジュールを使用することができる。CBM又はその他の結合モジュールは、炭水化物、その他の種類のポリマー、又は非ポリマー化合物のいずれかの任意の所望の標的に結合するように、合成により又は遺伝子的に発生させるか又はさもなくば生成させることができる。例えばファージディスプレイ等の技術を使用することができる。例えば、ポリマー、例えばポリアリールエーテルケトン（PAEK）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene）、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、パラアラミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、タンパク質、リン酸化タンパク質、修飾タンパク質、脂質、界面活性剤、レシチン、若しくは生物界面活性剤、又はそれらの任意の組み合わせに結合するCBMを製造することができる。該CBMを、抗体によって置き換えることができ、かつその検出法は、抗体向けに作られてもよい。例えば、Knox P.J. (2012) Methods in Enzymology, volume 510, 233-245（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照のこと。
【００３３】
結合モジュールは、任意の所望のポリマー（例えば、リグノセルロース系ポリマー若しくはそれらの組み合わせ、又は任意のオリゴ糖）に特異的に結合することができる。例えば、上記結合モジュールは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キシラン、マンナン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、キシログルカン、若しくはそれらの任意の組み合わせ、若しくはそれらの線状断片、若しくはそれらの分岐状断片、若しくはそれらのオリゴマー（例えば、オリゴ糖）、若しくはそれらのモノマー及び／又はマクロマー、例えばグルコース、D-グルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、モノリグノール、p-クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、p-ヒドロキシフェニルフェニルプロパノイド、グアイアシルフェニルプロパノイド、シリンギルフェニルプロパノイド、又はそれらの組み合わせに特異的に結合し得る。結合モジュールは、非晶質又は結晶性のリグノセルロース系ポリマーに結合することができる。結合モジュールは、特定のリグノセルロース系ポリマーの非晶質形及び結晶性形の両方を認識することができ、又はその一方に対して、若しくはもう一方に対して特異的であってもよい。例えば、該結合モジュールは、結晶化されたセルロースに特異的に結合することができる（非晶質セルロースには特異的に結合することができない）。結合モジュールは、非晶質セルロースに特異的に結合することができる（結晶化されたセルロースには特異的に結合することができない）。
【００３４】
リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、各々のリグノセルロース系ポリマー検出プローブが、異なるリグノセルロース系ポリマーに単独で又は本質的に単独で結合する複数のリグノセルロース系ポリマー検出プローブを含むことができる。該複数のプローブは、任意の数又は種類のプローブを含んでいてもよい。例えば、複数のプローブには、少なくとも2個のプローブ、少なくとも3個のプローブ、少なくとも4個のプローブ、少なくとも5個のプローブ、少なくとも10個のプローブ、2個から20個までのプローブ、2個から10個までのプローブ、又は2個から4個までのプローブが含まれ得る。複数のプローブは、予備配合された組成物として提供することもでき、又は個々のプローブの別個の貯蔵液から混ぜ合わせることもできる。組成物中の各々のプローブの濃度、例えば重量パーセントは、該組成物の全重量に対してプローブの種類の間で同一又は異なってもよい。例えば、4つの異なる種類のプローブを含む組成物中でのプローブの重量比は、1:1:1:1であってもよく、又は幾つかのその他の比率であってもよい。プローブの相対量、比率、及び／又は濃度は、特定のバイオマスのリグノセルロース系ポリマーのプロファイルに基づき調節することができる。
【００３５】
プローブ組成物は、様々なその他の成分、例えば1種以上の安定化剤、1種以上の保存剤、1種以上の乳化剤、1種以上の増粘剤、1種以上の希釈剤、又はそれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【００３６】
各々のリグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なるレポーターモジュールを含むことができる。例えば、各々のレポーターモジュールは、異なる（又は固有の）蛍光的特徴を有することができる。蛍光性レポーターモジュールの任意の組み合わせ、例えばeGFP、mCherry、mOrange2、及びeCFPの1種以上を使用することができる。結合モジュールの任意の組み合わせ、例えばCMB3a、CMB4-1、CMB15、及びCMB27の1種以上を使用することができる。複数のプローブは、各々の結合モジュールが、固有のレポーターモジュールと対を成すように、そしてその逆となるように提供され得る。例えば、リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、eGFP-CBM3a、mCherry-CBM4-1、mOrange2-CBM15、eCFP-CBM27、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００３７】
本発明のリグノセルロース系ポリマー検出プローブ又は任意のポリマー検出プローブは、異なる波長（±0.5 nm、±1 nm、3 nm、±5 nm）で検出可能である。このように、種々のプローブを別々に又は順次に使用するのではなく、種々のプローブの組み合わせを、同時に使用して測定することができる。
【００３８】
本発明はまた、少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーを含むパルプ製品又は紙製品に結合された任意のプローブ又はそれらの組み合わせを含む複合体に関する。本発明はまた、少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーと、それに結合された少なくとも1つのプローブとを含むパルプ製品又は紙製品に関する。該パルプは、任意の等級のパルプであってもよく、かつ紙又はその他のバイオマス生産物の任意の製造段階のパルプであってもよい。パルプは、完成紙料を含んでもよい。パルプは、白水を含んでもよい。パルプは、製品廃棄物、例えば製紙スラッジであっても、又はそれを含んでもよい。パルプは、化学パルプ、機械パルプ、熱機械パルプ、若しくは化学（熱）機械パルプ、又はクラフトパルプであってもよい。パルプは、堅木、軟木、若しくはその両方の種類由来のパルプであってもよく、又はテキスタイル繊維、農作物パルプ等を含んでいてもよい。パルプは、漂白されていてもよく、予備漂白されていてもよく、又は未漂白であってもよい。パルプは、叩解されていてもよく、又は未叩解であってもよい。上記紙製品は、中間紙製品、試験に有用な紙製品試料、又は完成紙製品であってもよい。紙製品は、例えば印刷可能又はインク付け可能な紙シート、板紙構造物用のシート、ティッシュペーパー、衛生用及びパーソナルケア用シート、又はライナー材料等であってもよい。
【００３９】
本発明はまた、リグノセルロース系ポリマー検出プローブ又は任意のポリマー検出プローブを使用する様々な方法に関する。該方法は、任意の数又は種類のプローブ、例えば単一のプローブ又は複数のプローブを使用することができる。本発明は、リグノセルロース系ポリマー又は任意のポリマーを検出する方法に関する。プローブをバイオマス材料と接触させ得る。このことは、プローブをバイオマス材料（例えば、パルプ製品又は紙製品）に導入することによって、プローブをバイオマス材料に添加することによって、プローブをバイオマス材料と混合することによって、又はさもなくばプローブをバイオマス材料と混ぜ合わせることによって達成することができる。接触は、その特異的な標的のリグノセルロース系ポリマー又は任意のポリマーが存在するのであれば、プローブの結合を含むことがあり、及び／又はプローブの結合をもたらすことがある。レポーターモジュールと関連する特性を測定することで、該バイオマス材料中の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの有無を判定することができる。例えば、測定される特性は、蛍光であっても、又はそれを含んでもよい。該方法はまた、少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算すること、少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの種類を特定すること、又はその両方を含むことができる。
【００４０】
測定されるバイオマス材料は、任意の適切なバイオマス材料であっても、又はそれを含んでもよい。該バイオマス材料は、原材料、部分的に処理された材料、又は完成製品であってもよい。該バイオマス材料は、木質バイオマス材料であっても、又はそれを含んでもよい。木質バイオマス材料は、パルプ、完成紙料、白水、紙、紙製品、製紙スラッジ、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。該方法は、木質バイオマス生産物から少なくとも1つの手すき紙を形成することを含むことができ、ここで測定は、該手すき紙において行われる。
【００４１】
測定は、バイオマス材料の処理の前に、処理の間に、及び／又は処理の後に、又はそれらの任意の組み合わせにおいて行うことができる。処理は、例えば、酵素的処理、漂白、形態破壊（amorphogenesis）、粉砕、若しくはPFI叩解、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。処理は、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、リグナーゼを含む少なくとも1種の酵素、又はそれらの任意の組み合わせによる酵素的処理であっても、又はそれを含んでもよい。上記方法は、バイオマス材料の少なくとも1つの処理を、測定された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて行うことであっても、又はそれを含んでもよい。測定されたリグノセルロース系ポリマーの量は、バイオマス生産物の少なくとも1つの物理的特性と負の相関又は正の相関を有していてもよい。少なくとも1種の物理的特性は、例えば、比破裂強さ、濾水速度、比引裂強さ、比引張強さ、内部結合強さ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該少なくとも1種の物理的特性には、例えば、密度、弾性率、剪断弾性率、ヤング率、ポアソン比、降伏応力、終局応力、繊維長さ、伸び等を挙げることができる。
【００４２】
測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方を使用することで、バイオマス材料に施される処理の量又は種類を決定することができる。例えば、上記方法は、少なくとも1種の酵素を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて供給することを含むことができる。例えば、結晶性セルロースの量が比較的低ければ、より多くの量のセルラーゼを添加することができる。リグニンの量が多ければ、例えば、漂白剤の量を増加させることができる。測定された多量のキシランは、例えばパルプに添加されるキシラナーゼの量を増加させることによって対処することができる。予備漂白のためには、例えば、高いマンナン含有量の測定値は、パルプに添加されるマンナーゼの量を増加させることによって対処することができる。上記方法は、ミル速度を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて調節することを含むことができる。例えば、結晶性セルロースの量が比較的低ければ、叩解の強度（例えば、rpm数でのミル速度）を増加させることができる。上記方法は、バイオマス材料の全含水量を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて調節することを含むことができる。例えば、結晶性セルロースの量が比較的高く、かつ非晶質セルロースの量が比較的低ければ、水をパルプに添加することができる。このように、該方法を使用することで、パルプ又はその1種以上の成分の濃度を調節することができる。
【００４３】
本発明はさらに、工業的処理のパルプ製品又は紙製品に対する有効性を判定する方法に関する。リグノセルロース系ポリマー検出プローブを、パルプ製品又は紙製品と接触又は付着させることができる。プローブのパルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出することができる。パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を測定（例えば、計算）することができる。工業的処理のパルプ製品又は紙製品に対する有効性を、検出された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて判定することができる。任意の適切な工業的処理の有効性を測定することができる。工業的処理は、例えば、酵素的処理、化学的処理、物理的処理、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。上記方法は、工業的処理の前に、工業的処理の間に、工業的処理の後に、又はそれらの任意の組み合わせにおいて行うことができる。ポリマー検出プローブは、上記方法の一部として異なる波長で検出可能である。該方法は、紙廃棄物、例えば製紙スラッジに対して行うことができ、かつ工業的処理は、紙廃棄物への処理を含み得る。
【００４４】
本発明はまた、パルプ製品又は紙製品の物理的特性を測定する方法に関する。リグノセルロース系ポリマー検出プローブをパルプ製品又は紙製品と接触させることができる。プローブのパルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出することができる。パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算することができる。パルプ製品又は紙製品の該少なくとも1種の物理的特性は、検出された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて測定することができる。少なくとも1種の物理的特性は、例えば、比破裂強さ、濾水速度、比引裂強さ、比引張強さ、若しくは内部結合強さ、又はそれらの任意の組み合わせであっても、又はそれらを含んでもよい。該少なくとも1種の物理的特性は、例えば、密度、弾性率、剪断弾性率、ヤング率、ポアソン比、降伏応力、終局応力、繊維長さ、伸び等であっても、又はそれらを含んでいてもよい。
【００４５】
本発明のプローブ及び方法は、パルプ処理及び紙加工以外の用途に利用可能である。例えば、該プローブ及び方法は、環境コンプライアンス及び／又は環境モニタリングのために使用することができる。上記プローブ及び方法は、例えば、食品産業において、食物生産の様々な段階の間に存在する炭水化物の種類及び／又は量を追跡し、引き続き食物略奪（food spoliation：食品損傷）又はその他の状態若しくは特性を検知するために使用することができる。該プローブ及び方法は、任意の材料中の微生物又はその他の細胞型の存在及び／又は量を追跡するために使用することができる。該プローブ及び方法は、糖タンパク質等の細胞マーカー、例えば血液型、癌、又は病原体に特有の細胞マーカーを検出するために使用することができる。該プローブ及び方法は、医療関係で、例えば組織学において使用することができる。本発明のプローブ及び方法は、工業生産、食物生産／試験、農業用途、プラスチック、医学、診断、微生物学、バイオマス／生物燃料、及び／又は産油／石油試験等の任意の関連分野に利用可能である。
【００４６】
ポリマー検出プローブは一般に、本発明により提供される。該プローブは、例えば、本明細書に記載されるリグノセルロース系ポリマー用プローブの1種以上の特性若しくは機能、重複している特性若しくは機能、又は異なる特性若しくは機能を有してもよい。ポリマー検出プローブは、例えば、少なくとも1種のポリマーに特異的に結合する結合モジュールa）と、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールb）とを含むことができる。ポリマー検出プローブは、例えば、ポリペプチド型プローブであっても、又はそれを含んでもよい。レポーターモジュールは、例えば、蛍光性であってもよい。レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質であっても、又はそれを含んでもよい。結合モジュールは、炭水化物結合モジュール（CBM）であってもよい。結合モジュールは、例えば、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キシラン、マンナン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、キシログルカン、若しくはそれらの任意の組み合わせ、若しくはそれらの線状断片、若しくはそれらの分岐状断片、若しくはそれらのオリゴマー、若しくはそれらのモノマー及び／又はマクロマー、例えばグルコース、D-グルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、モノリグノール、p-クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、p-ヒドロキシフェニルフェニルプロパノイド、グアイアシルフェニルプロパノイド、若しくはシリンギルフェニルプロパノイド、又はそれらの組み合わせに特異的に結合することができる。結合モジュールは、例えば、糖タンパク質、炭水化物、又はその両方に特異的に結合することができ、特定の血液抗原、種類、型、又は亜型に特異的である。
【００４７】
結合モジュールは、任意の特定のポリマー（例えば、オリゴ糖、又はその他の糖ポリマー若しくはその他のポリマー）に特異的に結合することができる。該ポリマーは、天然産生ポリマー又は合成ポリマーであってもよい。結合モジュールは、例えば、ポリアリールエーテルケトン（PAEK）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、パラアラミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、タンパク質、リン酸化タンパク質、修飾タンパク質、脂質、レシチン、界面活性剤、若しくは生物界面活性剤、又はそれらの任意の組み合わせ、又はこれらのポリマーの1種以上を含む若しくは含有する材料に特異的に結合することができる。ポリマー検出プローブは、各々のポリマー検出プローブが、異なるポリマーに特異的に結合する複数のポリマー検出プローブを含むことができる。各々のポリマー検出プローブは、異なるレポーターモジュールを含むことができる。各々のレポーターモジュールは、異なる蛍光的特徴を有することができる。ポリマー検出プローブは、異なる波長（±0.2 nm、±0.5 nm、±1 nm、±3 nm、±5 nm）で検出可能である。少なくとも1種の表面可用性ポリマーを含む材料に特異的に結合されたプローブを含む複合体が提供される。リグノセルロース系ポリマー用プローブを（本明細書に記載されるように）設計及び使用する様式は、一般に、任意のポリマーのためのより幅広い本発明のポリマー用プローブへと、該プローブに特異的に結合するそのポリマーの検出のために同様に利用することができる。
【００４８】
ポリマー（例えば、先に記載された種類及び特定のポリマー）を検出する方法が提供される。本発明のプローブを材料と接触させ得る。レポーターモジュールと関連する特性を測定することで、該材料中の少なくとも1種のポリマーの有無を、プローブの少なくとも1種のポリマーへの特異的な結合に基づいて判定し得る。測定される特性は、例えば、蛍光であってもよい。上記方法は、少なくとも1種のポリマーの量を計算すること、少なくとも1種のポリマーの種類を特定すること、又はその両方を含むことができる。上記材料は、生物学的試料、例えば癌生検試料、細胞、組織試料、微生物学的試料、又は血液試料であっても、又はそれらを含んでもよい。癌の有無、及び／又は癌の種類の個性は、例えば癌細胞表面マーカー、例えば糖タンパク質に特異的な結合モジュールを使用することによって判定することができる。有用微生物若しくは病原性微生物の有無、及び／又はウイルス若しくは細菌等の微生物の個性（identity）は、例えば微生物細胞表面マーカー、例えば細胞壁多糖又は細胞表面糖タンパク質に特異的な結合モジュールを使用することによって判定することができる。血液試料の血液抗原、種類、型、又は亜型のうちの少なくとも1つを特定することができる。例えば、A、B、AB及びOの種類を、ABO血液型系において区別することができる。D抗原等のRh抗原を、Rh血液型系において検出して、血液試料がRh陽性であるか、又はRh陰性であるかを判定することができる。複数のプローブ、例えば異なる種類のプローブを該方法で使用することができる。このように、血液試料のABO型及びRh因子の個性を、例えば、同時に判定することができる。
【００４９】
本発明の例示を意図する以下の実施例によって、本発明を更に明確にする。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、本発明の有用性及び既存の技術を上回るその驚くべき利点を裏付けている。様々な蛍光性タンパク質に融合されたCBMの使用に基づく予測法を編み出した。分子生物学技術及び構築物を使用して、4種の異なる融合タンパク質を作製した。これらの「プローブ」の各々は、特異的結合モジュール（CBM部）及びレポーターモジュール（蛍光性タンパク質）から構築されている。各々のプローブは、異なる波長で蛍光を発し、こうして該結合モジュールによって特異的に結合されるポリマーの明白な検出が可能となる。図1は、プローブを使用するポリマー検出の概略図である。
【００５１】
プローブの製造及び特性評価の後に、それらのプローブは、関連のポリマーに特異的に結合すると実証され、そしてそのようなポリマーの表面可用性の変化に応答して結合が変化する。したがって、これらのプローブは、本発明がその変化の検出を可能にし、かつ該プローブによって生成されたシグナルが業界標準法で独立して測定されたパルプ及び紙の特性と相関し得ることを裏付けている。該方法は、ポリマーの露出に依存する特性に対する任意の工業的処理の影響を予測するために使用することができる。これらの実施例によって実証されるように、本発明はまた、リグノセルロース系バイオマスを必要とする任意の方法に関する任意の段階で表面ポリマーを監視するために使用することもできる。
【００５２】
表1は、CBM、結合標的、及び関連する蛍光体を列挙している。発光波長は、数ナノメートルだけ離れており、こうして、その他のプローブと混合された場合であっても個々のプローブの検出が可能となる（スペクトル分解）。
【００５３】
【表１】
2018537692.tif 000003
【００５４】
プローブ1は、例えば結晶性セルロースを検出し（CBM3a-eGFP）、507 nmで蛍光を発する。プローブ2aは、例えば非晶質セルロースを検出し（CBM4-1-mCherry）、610 nmで蛍光を発する。プローブ2b（CBM17-mCherry）も非晶質セルロースを検出するが、プローブ2aと比べてより高い親和性を有する。mOrange2に融合されたCBM15は、キシランを検出し（プローブ3）、565 nmで可視化可能である。プローブ4は、eCFPに融合されたCBM27を含み、477 nmで発光する。上記プローブの発光極大は分離されており、プローブがここに記載される他のものと混ざった場合であっても検出可能である。
【００５５】
実施例1
この実施例は、本発明によるレポーターモジュール（蛍光性タンパク質）の製造を実証している。4種のレポーターモジュール（eCFP、eGFP、mCherry、及びmOrange2）を、pET11ベクター中にクローニングし、そして原核性の系において発現させた。図2〜図5は、pET11ベクター中にクローニングされたそれぞれのレポーターモジュール（蛍光性タンパク質）の遺伝子地図を示している。レポーターモジュールに関する核酸配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号23〜配列番号30に示されている。これらのベクター構築物は、クローニングされた遺伝子からの結合モジュールをレポーターモジュールで標識するために使用される。単独の蛍光性タンパク質（レポーターモジュール）を使用することで、パルプポリマーへのバックグラウンド（非特異的）結合が測定される。
【００５６】
タンパク質は、以下の方法論を使用して精製した。選択された発現プラスミド（レポーターモジュール、結合モジュール、又は完全なプローブ）を有するE.コリBL21（DE3）GOLD pLysS細胞（ThermoFisher Scientific社）を、100 μg/mlのアンピシリンを含有するルリア−ベルタニブロス中、37℃で増殖させた。組換えタンパク質発現の誘導は、対数中期細胞（0.6〜0.8のO.D.600 nm）に500 μMのIPTG（ThermoFisherScientific社）を添加し、引き続き25℃で18時間にわたりインキュベートすることによって行われた。その後に細胞を回収し、-80℃に保った。解凍された細胞ペレットを、300 mMのNaCl、2 mMのイミダゾール及び1mMのPMSFを含有する50 mMのNaPO4（pH 8）中で再懸濁し、次いで6サイクルの60秒間の200 Wでの超音波処理（Branson Ultrasonics Corporation社）を使用して溶解させた。溶解物の澄明化は、30分間にわたる4℃での10000 gでの遠心分離によって達成された。
【００５７】
次いで、対象のタンパク質を、300 mMのNaCl及び10 mMのイミダゾールを含有する50 mMのNaPO4（pH 8.0）バッファー中で平衡化されたHisPrep FF 16/10カラム（GE Healthcare Life Sciences社）を介したアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。カラム容量の10倍のバッファーで洗浄した後に、所望のタンパク質が、300 mMのNaClを含有する50 mMのNaPO4（pH 8.0）バッファー中のカラム容量の10倍のイミダゾールの勾配（10 mMから100 mM）に従って溶出された。最後の精製工程は、その均一な純度（purity）を確実なものにするために、SUPERDEX 200 HR 16/50カラム（GE Healthcare LifeSciences社）を介して300 mMのNaClを含有する50 mMのTris-HCl（pH7.5）バッファー中で実施した。次いで、精製されたプローブを、20 mMのNaCl及び5 mMのCaCl2を含有する20のTris-HCl（pH 7.5）バッファー中、4℃で透析し、10 k MACROSEP Advance遠心濾過デバイス（Pall Corporation社）を使用して濃縮した。濃縮されたタンパク質溶液を、瞬間凍結を使用して-80℃で貯蔵した。タンパク質純度は、SDS-PAGEによって確認した。タンパク質の量は、ブラッドフォード法によって定量した。
【００５８】
レポーターモジュールの製造に成功し、それらをアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（図6）。製造の収率は、培養物1 L当たりにタンパク質約25 mgであった。図6は、精製された蛍光性タンパク質のSDS-PAGEであり、矢印は、対象のタンパク質を強調している。表2は、精製されたレポーターモジュール（ここでは、蛍光性タンパク質）の特性を示している。
【００５９】
【表２】
2018537692.tif 000004
【００６０】
実施例2
この実施例は、本発明による結合モジュール（CBM）の製造を実証している。5種のCBM遺伝子（CBM3a、CBM4-1、CBM15、CBM17、及びCBM27）を、pET11ベクター中にクローニングし、そして原核性の系において発現させた。それらのCBMを製造し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した（図7）。CBMの製造の収率は、培養物1 L当たりにタンパク質約10 mgであった。図7は、精製されたCBMのSDS-PAGEであり、矢印は、対象のタンパク質を強調している。表3は、精製された結合モジュール（ここでは、CBM）の特性を示している。
【００６１】
【表３】
2018537692.tif 000005
【００６２】
実施例3
この実施例は、本発明によるレポーターモジュールによる蛍光発光を実証している。パルプ及びレポーターモジュール（eGFP、mCherry、及びmOrange2）の発光スペクトルを測定した。スペクトルは、23℃で取得し、そしてタンパク質は、20 mMのNaCl及び5 mMのCaCl2を含有する20 mMのTris-HCl（pH7.5）バッファー中で希釈した。図8及び図9におけるスペクトルは、励起波長（488 nm対549 nm）に応じて、蛍光強度（FI）の変化（eGFP対mCherry）が、パルプの自家蛍光又はその他のプローブとは独立して測定され得ることを示している。図8は、レポーターモジュール（eGFP及びmCherry）の発光スペクトル、及び549 nmでの励起後のパルプ製手すき紙円板の発光スペクトルを示している。この励起波長では、mCherryの蛍光は、その他の基材のシグナルを凌駕している。図9は、488 nmの励起波長を使用する、蛍光性タンパク質（FP）（eGFP及びmCherry）、及びパルプ製手すき紙円板の発光スペクトルを示している。この励起波長では、パルプ及びmCherryの蛍光は、eGFPよりも大幅に弱い。
【００６３】
実施例4
この実施例は、完全なプローブ（結合モジュール−レポーターモジュール）の製造を実証している。レポーターモジュール及び結合モジュールの製造のために使用された遺伝子を融合させて、該プローブを作製した。図10〜図14は、pET11ベクター、及び融合配列を対象に含めた遺伝子地図を示している。得られた分子（プローブ）は、N末端にレポーターモジュールを含み、それに結合モジュールが続いている。図10は、pET11A-eGFP-CBM3a発現ベクター（プローブ1）のベクター及び地図を示している。図11は、pET11A-mCherry-CBM4-1発現ベクター（プローブ2a）のベクター及び地図を示している。図12は、pET11A-mCherry-CBM17発現ベクター（プローブ2b）のベクター及び地図を示している。図13は、pET11A-mOrange2-CBM15発現ベクター（プローブ3）のベクター及び地図を示している。図14は、pET11A-eCFP-CBM27発現ベクター（プローブ4）のベクター及び地図を示している。プローブ1に関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1及び配列番号2として列挙している配列中に含まれる。プローブ1中のリンカー（eGFPとCBM3aとを結合する）に関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3及び配列番号4として列挙している配列中に含まれる。プローブ2aに関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5及び配列番号6として列挙している配列中に含まれる。プローブ2bに関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号7及び配列番号8として列挙している配列中に含まれる。プローブ3に関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9及び配列番号10として列挙している配列中に含まれる。プローブ4に関するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号11及び配列番号12として列挙している配列中に含まれる。新しい分子（プローブ）は、N末端のレポーターモジュール（蛍光性タンパク質）で始まり、それに適切な結合モジュール（CBM）が続いている。レポーターモジュールを結合モジュールに連結する配列は、連結配列が配列番号4（トロンビン開裂部位を含む）によりコードされる配列番号3であるプローブ1を除き、グリシンから構成されている。
【００６４】
プローブをコードするベクターを、E.コリBL21-Gold（DE3）pLysSコンピテント細胞中で形質転換させた。形質転換された細胞を、アンピシリン（100μg/mL）を有するLBアガー上で選択した。プローブのベクターを有するE.コリ細胞を、アンピシリン（100 μg/mL）を含有するルリア−ベルタニ（LB）ブロス中、27℃で対数中期（A600nm=0.5）まで培養した。組換えタンパク質発現を、0.5 mMのIPTGの添加により誘導し、更に27℃で16時間にわたりインキュベートした（200 rpmの振盪）。誘導された細胞を、4000 gで4℃において30分間にわたり遠心分離し、ペレットを-80℃で貯蔵した。細胞を、50 mMのリン酸ナトリウムバッファー（pH 8.0）中で懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞破壊片を、15000 rpmでの15分間にわたる遠心分離によって除去した。6xHigタグが付いたタンパク質を、未変性条件下でNi-NTAニッケルアフィニティー樹脂（Qiagen社）を使用して製造業者の仕様書に従ってpH 8で溶出のためにイミダゾールを用いて精製した。2回目の通過を利用して、タンパク質調製物の純度を高めた。塩及びイミダゾールを除去するために、精製されたプローブを、20 mMのTris-HCl（pH7.5）、20 mMのNaCl、及び5mMのCaCl2を含有するバッファー中、4℃で24時間にわたり透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して測定した。
【００６５】
図15は、各々のプローブのSDS PAGE分析を示している。矢印は、プローブの融合タンパク質の位置を示している。各々のプローブのサイズは、そのアミノ酸残基含有量を基礎として予想されたサイズに相当する。後ろから4つまでのゲルの左側には、同じゲル上で泳動されたタンパク質のサイズの推定を可能にする標準サイズのラダーが示されている。表4は、精製されたプローブ（レポーターモジュール−結合モジュール）の特性を示している。
【００６６】
【表４】
2018537692.tif 000006
【００６７】
実施例5
この実施例は、本発明による製造後のプローブの分光的特性評価を実証している。レポーターモジュールの結合モジュールへの融合が本来の折り畳みを妨げないことを確認するために、分光分析を実施した。スペクトルは、23℃で取得し、そしてタンパク質は、20 mMのNaCl及び5 mMのCaCl2を含有する20 mMのTris-HCl（pH7.5）バッファー中で希釈した。プローブ1、プローブ2b、プローブ3、及びプローブ4について記録された吸収スペクトル及び発光スペクトルは、図16のA〜図16のDに示されている。それらのスペクトルは、文献で報告されるスペクトルと同等であり、レポーターモジュールが結合モジュールの存在によって影響されないことを強く示唆している。図16のA〜図16のDにおいて、蛍光性タンパク質（FP）−CBMタンパク質について、励起スペクトルは、点線として示されており、発光スペクトルは、実線として示されている。これらの結果は、レポーターモジュール（蛍光性タンパク質）が、細菌からのそれらの回収後に適切に折り畳まれ、かつ結合モジュールが近いと、そのレポーター能力に大きな影響を及ぼさないことを強く指摘している。
【００６８】
実施例6
この実施例は、本発明によるモデル化合物へのプローブの結合を実証している。固相でのディプリーションアッセイを、プローブ1及び基材としてのAVICEL又はWHATMANペーパーを用いて実施した。AVICELは、FMC Corporation社から入手可能な結晶性セルロース製の市販の基材である。WHATMANペーパーは、GE Healthcare Life Sciences社から入手可能な非晶質セルロース製濾紙である。図17は、プローブ1のAVICELへの結合飽和が明らかな固相でのディプリーションアッセイの結果を示している。
【００６９】
プローブ1のAVICELに対する親和性（Ka）を、固相でのディプリーションアッセイの改変版を使用して測定することで、レポーターモジュール（eGFP）と結合モジュール（CBM3a）との融合が折り畳みに悪影響を及ぼさず、ひいてはCBM3aのAVICELに対する親和性に悪影響を及ぼさないことを確認した。図17は、プローブ1がAVICELに対して8 μMの親和性定数（Ka）、つまり結晶性セルロースのための市販の構築物について報告される値（7.7 μM）と同様の値を有することを示している。この結果は、レポーターモジュール（eGFP）が近いにもかかわらず、プローブ1の結合モジュール（CBM3a）が適切に折り畳まれ、プローブ1が結晶性セルロースへと高い親和性で結合することを確証する。
【００７０】
20 mMのNaCl及び5 mMのCaCl2を含有する20 mMのTris-HCl（pH 7.5）バッファー中にeGFP-CBM3a（100 μg/ウェル）を有する様々なセルロース支持材の、23℃で1時間のインキュベート後のeGFP-CBM3aのAVICEL（黒塗りの丸）及びWHATMANペーパー（白抜きの丸）への結合等温線。親和性定数（Ka）は、[P結合]=NoKa[P遊離]/(1+Ka[P遊離])の非線形回帰から計算した。この実施例においては、Kaは、AVICELの場合は8 μMと等しく、WHATMANペーパーの場合は0.083と等しい。
【００７１】
実施例7
実施例7は、以下の実施例で使用される典型的なプローブ結合実験のためのパラメーターを示している。材料及び溶液は、濾過されたバッファー（20 mMのTris-HCl（pH 7.5）+20 mMのNaCl+5mMのCaCl2；室温で1時間にわたる振盪）、バッファー中6%のミルク（生乳）（1.2 gのミルクを20 mlのバッファー中に溶解させる；室温で100 gで2分間にわたり遠心分離する）、バッファー中3%のミルク（生乳）、バッファー中のTWEEN（0.05%）、黒色のマイクロプレートの底部へと光沢のある面を下にしてのり付けされたパルプ由来の手すき紙（紙円板：3 mmの直径）を含んでいた。蛍光の取得は、終点及び面スキャニング3×3 500 μm、励起波長（レポーターモジュールに依存）（9 mm）／発光波長（レポーターモジュールに依存）（9 mm）、ゲイン50、75、及び100、並びに上方（4.5 mm）検出を含んでいた。反応容量は、200 μlであった。蛍光性（融合）プローブ（又は繊維ポリマー）処理法のFPTMプロトコルは、Knox P.J. (2012) Methods in Enzymology, volume 510, 233-245（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるプロトコルと一致するものであった。同様の手順は、Ding et al. (2006) BioTechniques 41, 435-443に記載されており、該文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【００７２】
未処理の紙円板の蛍光を測定した。手すき紙を、200 μlのミルク（3%）中で、ゆっくりと振盪させながら室温で1時間インキュベートした。3回（200 μl）の5分間の洗浄を、バッファーを用いて振盪させながら室温で実施した。ブロッキングされた紙円板の蛍光を測定した。200 μlのプローブ／ミルク（3%）を添加し、ゆっくりと振盪させながら室温で1時間にわたりインキュベートした。上清を分離し、全蛍光を測定した。バッファーを用いた3回（200 μl）の5分間の洗浄を、振盪させながら室温で実施した。残留蛍光を測定した。3回（200 μl）の5分間の洗浄を、TWEEN（0.05%）を用いて振盪させながら室温で実施した。残留蛍光を測定した。黒色の96ウェルのマイクロプレート（Costar、カタログ番号3631）を使用した。SYNERGY Mxプログラムを実行した（BioTek Instruments, Inc.社、バーモント州、ウィヌースキー）。
【００７３】
図18は、紙円板上でのプローブ結合実験を説明する概略図である。以下の実施例で使用される様々なパルプを、表5に記載する（NA：取得不可；「*」=CRMLで測定されたパルプ化学組成（重量%））。使用されたパルプは、北米の製紙プラントからのものであった。
【００７４】
表5：種々のパルプの化学組成及び取得可能な特性
【表５】
2018537692.tif 000007
【００７５】
実施例8
この実施例は、本発明による、紙表面での市販の「結合−レポーター」プローブからの蛍光と、レポーターモジュール単独からの蛍光との比較を実証している。パルプ1の小さい円板（約0.5 mg）の表面上の結晶性セルロースの特異的な検出は、市販のeGFP-CBM3a（NZYTech company社）の結合によって達成された。小さい円板上でのレポーターモジュールの結合によりもたらされる非特異的シグナルを、レポーターモジュール単独と一緒にインキュベートした後に測定した。そのアッセイは、96ウェルのマイクロプレート中で実施した。過剰のプローブ1（又はレポーターモジュールGFP）を、Tween 20（0.05%）を使用する洗浄によって除去した。
【００７６】
レポーターモジュール（単独で又はプローブの構成要素として）からの蛍光を、511 nmの波長（励起波長488 nm）でSYNERGY Mxマイクロプレートリーダー（BioTek Instruments,Inc.社）を使用して測定した。蛍光強度は、ここでは叩解強度及びセルラーゼ処理に対して表される。図19は、未処理のパルプ及びセルラーゼ処理されたパルプ（2つのレベルの叩解後）に結合されたレポーターモジュール（eGFP）単独の蛍光強度を示している。レポーターモジュール単独で得られた非特異的な蛍光シグナルは、プローブ1と比較して非常に低かった。
【００７７】
図20は、未処理のパルプ及びセルラーゼ処理されたパルプ（2つのレベルの叩解後）に結合されたプローブ1の蛍光強度を示している。図20は、セルラーゼ処理された手すき紙の表面でのプローブ1を使用する結晶性セルロースの検出を示している。古パルプのセルラーゼ酵素処理は、全ての叩解レベルにおいて、未処理のパルプと比較して蛍光シグナルを高めており、このことはパルプのセルラーゼ処理が、追加の結晶性セルロース領域を露出させたことを示している。したがって、本発明のプローブ1を使用すると、セルラーゼ処理のパルプに対する影響を、パルプ及び紙の古典的試験を一切用いることなく検出することができる。
【００７８】
実施例9
この実施例は、本発明による叩解及びセルラーゼ処理後の表面結晶性セルロースの変化の検出を実証している。該方法は、手すき紙の表面上でのCBM3a-eGFP（プローブ1）による結晶性セルロースの認識と関連する蛍光強度を基礎とするものである。規格化されたプローブ1の蛍光曲線を用いることで、測定された蛍光強度を量（μg）へと変換することができ、その量は次いで、手すき紙の表面積（mm2）で除算される。その結果（μg/mm2）は、手すき紙の表面上での結晶性セルロースの定量を可能にする。
【００７９】
パルプ1製手すき紙の表面上での結晶性セルロースの定量は、約0.5 mgの小さい円板上で実施した。坪量60 g/m2の手すき紙を、事前に処理された（0.05%のセルラーゼ、1時間、50℃、pH 7）パルプ1及び未処理のパルプ1から製造した。パルプ1製手すき紙の表面上での結晶性セルロースの特異的な検出は、24ウェルのマイクロプレート中でプローブ1（250 μg/ml、1時間、室温、pH 7.4）を用いて達成された（Gourlay et al., 2012）。3回の洗浄工程後に、緑色の残留蛍光が、511 nm（励起波長：488 nm）でSynergyMxマイクロプレートリーダー（Bioteck）を使用して測定された。蛍光強度の平均を取って、PFI回転数（図21）又はセルラーゼ処理（図22）に対して百分率として表した。
【００８０】
図21は、パルプ1製手すき紙の表面上の結晶性セルロースの定量に対するPFI叩解の影響を示している。未叩解の蛍光強度及び相応のCSF値を、基準点（100%）として定めた。図21は、パルプ1製手すき紙の表面でのプローブ1が付いた結晶性セルロースの量を示すものとされる残留蛍光が、PFI回転数の1500から6000への増加に伴い、2.7%から28.6%にまで増大したことを示している。この減少は線形ではなく、パルプの水和の度合いの指標であるCSFの減少（87.9 mlから71.1mlまで）と相関した。したがって、PFI叩解と関連している形態破壊過程（パルプの水膨潤）は、明らかにパルプ1製手すき紙の表面での記録された結晶性セルロースの脱結晶化又は消失の原因である。
【００８１】
図22は、パルプ1製手すき紙の表面上の結晶性セルロースの定量に対するセルラーゼ処理の影響を示している。0回転、3000回転、及び4500回転での未処理の蛍光強度を、基準値（100%）として定めた。図22は、全てのセルラーゼ処理が、eGFPが付いた結晶性セルロースの検出を高めたことを示している。これらの結果は、酵素が、未処理の手すき紙と比較してパルプ1製手すき紙の表面にてこれまで埋もれていた結晶性セルロースを露出することを指摘している。
【００８２】
記録された最も大きな増大は、叩解無しでセルラーゼC6によりパルプ1を処理した場合であった。セルラーゼC1処理及びセルラーゼC2処理は、未叩解のパルプ1及び3000回転で叩解されたパルプ1において（未処理に対して）、その他の酵素試料と比較して最も小さい結晶性セルロースの増大をもたらした。しかしながら、セルラーゼ試料C1、C2、及びC3で処理されたパルプ1におけるより強力な叩解（4500回転）の使用は、結晶性セルロースの増大をもたらす。これらの観察は、叩解後に微細繊維が生ずるため、該繊維の表面に結晶性セルロースの露出が増えるということで説明することができる。これらの結果は、パルプ1のセルラーゼ処理に続いて機械的処理により、より多量の結晶性セルロースが露出されることを示唆している。全てのその他の酵素に反して、叩解は、C4処理された手すき紙に影響を及ぼさなかった。
【００８３】
実施例10
この実施例は、本発明による叩解及びキシラナーゼ処理後の表面結晶性セルロースの変化の有無の予測を実証している。キシラナーゼによるキシランポリマーの消化は、結晶性セルロースを露出させることができ、未処理のコントロールと比べて、手すき紙表面上での結晶性セルロースの検出を高めることができる。プローブ1を使用して、キシラナーゼ処理後の紙の表面にある結晶性セルロースの変化を検出した。図23は、プラント2からの0回転、3000回転、及び4500回転のPFI回転で叩解された手すき紙をキシラナーゼ処理したものの表面上に結合されたプローブ1の定量（μg/mm2）を示している。パルプ2を、手すき紙の製造のために使用した。励起波長は、488 nmであった。ここで使用されたキシラナーゼ処理は、検出された蛍光に大きな影響を及ぼさなかった。ここで測定された結晶性セルロースの量は、使用されたキシラナーゼ調製物が、セルロース繊維表面に影響を及ぼさなかったことを示唆している。この結果は、キシラナーゼ処理後の紙の物理的特性及び繊維の形態学の分析と完全に一致している。プローブ1のFPTMの結果は、従来のTAPPI法のために必要とされる時間よりもかなり短い時間においてキシラナーゼの影響の不存在を明らかにしており、こうして速く高いスループットのプロトコルを可能にする。
【００８４】
実施例11
この実施例は、本発明による叩解後の結晶性セルロースの検出を実証している。2種の異なるパルプを用いるプローブ1の検出と紙の物理的特性との間の相関が明らかにされた。2種のパルプ（パルプ1及びパルプ2）を叩解し、そしてプローブ1によって分析し、かつ標準的なTAPPI法によって分析した。手すき紙円板（60 g/m2）上での結晶性セルロースの測定は、その紙円板を250μg/mlのプローブ1と一緒にインキュベートすることによって実施した。プローブ1の蛍光を、叩解（様々なエネルギーレベル）後の手すき紙の表面上での結晶性セルロースの認識のために使用した。規格化された曲線を用いることで、測定された蛍光強度を結晶性セルロースの量（μg）へと変換し、その量を次いで、手すき紙の表面積（mm2）で除算する。その結果（μg/mm2）は、手すき紙の表面上での結晶性セルロースの定量を可能にする。
【００８５】
図24は、PFI叩解された手すき紙（パルプ1（プラント1、左のバー）対パルプ2（プラント2、右のバー））の表面上での結晶性セルロースの定量（μg/mm2）を示している。これらのFPTMの結果は、パルプの叩解がセルロースを部分的に脱結晶化させるという考えを支持している。パルプ2製手すき紙の場合に、少なくとも3回の脱結晶化事象（又は工程）が観察される（0回転〜2000回転のPFI回転、3000回転〜4500回転のPFI回転、及び6000回転のPFI回転において）。この効果は、3000回転より高い回転を使用する場合ほどは明確ではない。
【００８６】
図25のA〜図25のDは、叩解エネルギー（PFI回転数）の関数としての、プローブ1を使用する結晶性セルロースの定量（μg/mm2）と、パルプ2／紙の物理的特性との間の相関を示している。図25のAは、比引裂強さ（mN m2/g）を示し、図25のBは、比引張強さ（N m/g）を示し、図25のCは、内部結合強さ（J/m2）を示し、かつ図25のDは、繊維平均長さ（mm）を示す。図25のA〜Dは、プローブ1のシグナルと、パルプ2製手すき紙についての相応の紙の物理的特性との間の相関を示している。比引張強さ及び内部結合強さに関して逆相関が観察される（図25のB及び図25のC）。それに対し、比引裂強さは、結晶性セルロースの定量と直接相関している（図25のA）。これらの相関は、TAPPIによるパルプ及び紙の分析と比べて非常に短時間（1時間対数日）で、様々な叩解処理が最終的な紙特性に及ぼす影響を予測するために使用することができる。内部結合及び繊維長さは、3000回転を超える叩解によって、同様の条件下では安定化される比引裂強さ及び比引張強さとは異なって更に変化した。
【００８７】
パルプ1の処理後に検出された特性の変化及び結晶性セルロースは、図26のA〜図26のDに示されている。叩解エネルギー（PFI回転数）の関数としての、プローブ1を使用する結晶性セルロースの定量（μg/mm2）と、パルプ1／紙の物理的特性との間に相関が示されている。図26のAは、比引裂強さ（mN m2/g）を示し、図26のBは、比引張強さ（N m/g）を示し、図26のCは、内部結合強さ（J/m2）を示し、かつ図26のDは、繊維平均長さ（mm）を示す。プローブ1により検出されるセルロースの量は、1500回転と関連する値を除き、一般的に叩解エネルギーの増大に伴って減少する。この特定の値を除き、全てのパネルは、パルプ2で観察される（図25のA及び図25のB）のと同じ相関を示唆している。両方のパルプの異なるリグニン含有量が相関全体に影響しないように思われた。比引裂強さについては正の相関であり、内部結合及び比引張強さについては逆数相関であった。
【００８８】
監視される4つの特性は、叩解が3000回転を超えて高められた場合には変化を続けた。このように、上記方法を異なるパルプに適用すると、高い叩解エネルギーでは相関に微妙な変化がもたらされることがある。ここで研究された物理的特性及びパルプとは無関係に、叩解の結晶性セルロースに対する影響は、最小限の繊維の分解後に（すなわち、処理が1500回転を超えたときに）観察された。3000回転を超える叩解の影響は、表面にある結晶性セルロースの変化ともはや関連していない（その結晶性セルロースは、更なる叩解によって変化しない）。したがって、パルプ／紙の物理的特性を改善及び発展させるためには、叩解強度は、パルプの結晶性マトリックスを最小限にしか分解しないことが望ましい。
【００８９】
それらの結果は、上記方法が、所与の一式の特性のための叩解条件を決定するときに考慮に入れることができる診断指標であることを裏付けている。その単純さ及び高い感度は、一式の物理的特性のために使用される最良の叩解条件の速く効率的な診断を可能にする。それらの結果は、上記方法を使用することで、引裂強さ、引張強さ、及び内部結合強さに関するパルプ及び紙の特性への処理の影響を、それらの特性の手すき紙での実際の測定を実施することなく予測することができることを示している。
【００９０】
実施例12
この実施例は、本発明による紙円板の表面上でのキシランの検出を実証している。パルプ5（未漂白の機械パルプ）、パルプ6（漂白された機械パルプ）、パルプ3（未漂白のクラフトパルプ）、パルプ4（漂白されたクラフトパルプ）、及びパルプ2（未漂白のクラフトパルプ）を、この実施例で使用した（先に表5で記載した）。アッセイは、各々のウェルに小さい手すき紙円板（60 g/m2）を収容する96ウェルのマイクロプレート中で実施した。種々のパルプからできたそのような円板の表面上でのキシランの特異的な検出は、プローブ3（CBM15-mOrange2）の結合によって達成された。蛍光強度は、該紙円板を200 μlのプローブ3の溶液と一緒にインキュベートした後に測定された。過剰のプローブ3並びに同じ付加物の任意のその他の部分への非特異的な結合は、TWEEN 20溶液（0.05%）で3回洗浄することによって除去した。結合されたプローブ3からの蛍光強度は、569 nmの波長（励起波長549 nm）でSYNERGY Mxマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【００９１】
図27は、5種の異なる紙円板（UBKPR  未漂白のクラフトパルプ（パルプ2）、UBMP  未漂白の機械パルプ（パルプ5）、BMP  漂白された機械パルプ（パルプ6）、UBKP  未漂白のクラフトパルプ（パルプ3）、及びBKP  漂白されたクラフトパルプ（パルプ4））の表面にあるキシランに結合されたプローブ3の蛍光強度を示している。これらの結果は、プローブ3が、その他の紙円板と比べて、BKP由来の円板に対してより高い結合親和性を有することを示している。これらの結果は、該紙円板の表面上のリグニン含有量によるものであるかもしれない。クラフトパルプ法において、セルロース及びヘミセルロースを覆う結合物質であるリグニンを溶解するために、化学薬品及び熱が使用される。未漂白の化学パルプのリグニン含有量は、約3%〜5%であり、漂白法により、残りのリグニンの事実上全てが除去され、0%の全含有量に向かう。機械パルプ法は、ほとんどの木質成分を維持するので、リグニン含有量は木材の含有量と同様である（20%〜28%）。最低量のリグニンを含有する漂白されたクラフト紙は、その他の紙円板よりも大幅に効率的に上記プローブによって検出された。これは、漂白された繊維の表面上でのキシランの露出の増加が原因であり得る。この分析は、プローブ3が紙円板の表面上のキシランを検出し、そのプローブが種々のパルプからできた紙の表面の間を判別し得ることを示している。
【００９２】
実施例13
この実施例は、本発明による酵素処理後のキシラン除去の検出を実証している。またキシランを検出する能力を、キシラン含有量が繊維表面で変化したパルプについて試験した。プローブ3のキシランへの結合を明白に実証するために、紙円板（漂白されたクラフトパルプ（BKP）製）を、検出アッセイの前に市販のキシラナーゼで処理した。キシラナーゼは、2種の用量で使用した（紙円板につき0.1 U及び紙円板につき0.4 U）。結果は、図28に示されている。図28は、未処理のパルプ4（BKP）紙及びキシラナーゼ処理されたパルプ4（BKP）紙の表面にあるキシランに結合されたプローブ3の蛍光強度を示している。処理時間は、x軸上に示されている。未処理とは、キシラナーゼ処理をしていないパルプ4の紙円板を示す。「O/N」は、室温においてキシラナーゼで一晩処理された紙を示している。プローブ3の結合は、キシラナーゼ処理後にほぼ80%だけ減少し、それは上記方法が、繊維表面にあるポリマーの変化を検出することを立証している。
【００９３】
実施例14
この実施例は、本発明による紙円板の表面上でのマンナンの検出を実証している。高い含有量のマンナン（及びクラフトパルプ法の間のセルロース繊維の表面上での再堆積）は、漂白法を妨げることがある。したがって、キシラナーゼに加えてマンナナーゼが予備漂白のために使用される。マンナナーゼ処理を最適化するために、予備漂白の前後にマンナン含有量を測定することが有用である。
【００９４】
2種の異なる等級のパルプ（パルプ3：未漂白のクラフトパルプ（UBKP）及びパルプ4：漂白されたクラフトパルプ（BKP））を、それらのマンナン含有量に関して調査した。アッセイは、各々のウェルに小さい手すき紙円板（60 g/m2）を収容する96ウェルのマイクロプレート中で実施した。種々のパルプからできたそのような円板の表面上でのマンナンの特異的な検出は、プローブ4とも呼ばれるeCFP-CBM27タンパク質融合物の結合によって達成された。蛍光強度は、該紙円板を200 μlのプローブ4の溶液と一緒にインキュベートした後に測定された。過剰のプローブ4及び同じ付加物の任意のその他の部分への非特異的な結合は、TWEEN 20溶液（0.05%）で3回洗浄することによって除去した。結合されたプローブ4からの蛍光強度は、477 nmの波長（励起波長434 nm）でSYNERGY Mxマイクロプレートリーダーを使用して測定した。結合されたプローブの蛍光強度は、図29に表されている。
【００９５】
図29は、2種の異なる紙円板、つまり未漂白のクラフトパルプ（パルプ3、UBKP）、及び漂白されたクラフトパルプ（パルプ4、BKP）の表面にあるマンナンに結合されたプローブ4（eCFP-CBM27）の蛍光強度を示している。これらの結果は、プローブ4が、パルプ3（UBKP）の紙円板と比べて、パルプ4（BKP）由来の円板に対してより高い結合親和性を有することを示している。これらの結果は、ヘミセルロースの再堆積と、パルプ4（BKP）の紙円板の表面上のリグニン含有量とによるものであるかもしれない。クラフトパルプ法において、セルロース及びヘミセルロースを覆う結合物質であるリグニンを溶解するために、化学薬品及び熱が使用される。こうして、リグニン含有量は、3%〜5%からほぼゼロまで下がる。こうして、漂白されたクラフト紙（最低量のリグニンを含有する）中のマンナンは、その他の紙円板よりも大幅に効率的に上記プローブによって検出された。この結果は、漂白された繊維の表面上でのマンナンの露出の増加を反映している。
【００９６】
実施例15
この実施例は、本発明による酵素処理後のマンナン除去の検出を実証している。繊維の表面にあるマンナンを検出する能力を試験した。プローブ4のマンナンへの結合を明白に示すために、紙円板（漂白されたクラフトパルプ（パルプ4、BKP）製）を、検出アッセイの前に市販のマンナナーゼ（MEGAZYME社のE-BMANN）酵素で処理した。結果は、図30に示されている。図30は、マンナナーゼで処理された漂白されたクラフトパルプ（パルプ4、BKP）紙の表面にあるマンナンに結合されたプローブ4の蛍光強度を示している。プローブ4の結合は、マンナナーゼでの1時間の処理後に、ほぼ44%だけ減少した。これらの結果は、上記方法が、繊維表面にあるポリマーの変化を検出することを明らかに裏付けている。
【００９７】
本発明は以下の態様／実施形態／特徴を任意の順序及び／又は任意の組み合わせで包含する：
1.  少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合する結合モジュールa）と、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールb）とを含むリグノセルロース系ポリマー検出プローブ。
2.  リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、ポリペプチド型プローブを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
3.  結合モジュールは、ポリペプチド型結合モジュールであり、かつレポーターモジュールは、ポリペプチド型レポーターモジュールである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
4.  ポリペプチド型結合モジュールは、ポリペプチド型レポーターモジュールへと直接的に融合されている、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
5.  ポリペプチド型結合モジュールは、ポリペプチド型レポーターへとリンカーポリペプチドを介して結合されている、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
6.  ポリペプチド型プローブは、配列番号2、6、8、10、及び12のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
7.  ポリペプチド型結合モジュールは、配列番号14、16、18、20、及び22のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、かつポリペプチド型レポーターモジュールは、配列番号24、26、28、及び30のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
8.  ポリペプチド型結合モジュールは、抗体又はそのフラグメントではない、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
9.  レポーターモジュールは、抗体又はそのフラグメントではない、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
10.  レポーターモジュールは、ポリペプチドではない、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
11.  レポーターモジュールは、蛍光性である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
12.  レポーターモジュールは、約350 nmから約700 nmまでの蛍光励起ピーク（最大）を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
13.  レポーターモジュールは、約400 nmから約750 nmまでの蛍光発光ピーク（最大）を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
14.  レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
15.  蛍光性タンパク質は、紫外蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、シアン蛍光性タンパク質、緑色蛍光性タンパク質、黄色蛍光性タンパク質、橙色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、遠赤蛍光性タンパク質、近赤外蛍光性タンパク質、赤外蛍光性タンパク質、sapphire型蛍光性タンパク質、長ストークスシフト蛍光性タンパク質、切り替え可能な蛍光性タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
16.  蛍光性タンパク質は、Sirius、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、mAmetrine、Cerulean、mCerulean3、SCFP3A、CyPet、mTurguoise、mTurquoise2、単量体Midoriishi-Cyan、Aquamarine、eCFP、TagCFP、mTFP1、AmCyan1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、単量体Azami Green、TurboGFP、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、eGFP、AcGFP1、ZGreen1、ZsYellow1、mBanana、EYFP、Topaz、Citrine、Venus、SYFP2、Ypet、IanRFP-deltaS83、mPapaya1、TagYFP、mOrange、mOrange2、単量体Kusabira-Orange、mKOk、mKO2、mTangerine、mNectarine、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、DsRed-Express2、DsRed-Express、tdTomato、DsRed-単量体、DsRed-単量体、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry、HcRed1、FusionRed、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、TagRFP675、iFP1.4、iRFP（iRFP713）、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP720、iFP2.0、mIFP、mKeimaRed、LSS-mKate1、LSS-mKate2、LSSmOrange、mBeRFP、PA-GFP、PATag RFP、Dendra2、Timer、PAmCherry、Kaede（緑色）、Kaeda（赤色）、KikGR1（緑色）、KikGR1（赤色）、PS-CFP2、mEos2（緑色）、mEos2（赤色）、mEos3.2（緑色）、mEos3.2（赤色）、PSmOrange、Dropna、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
17.  結合モジュールは、CBM1、CBM2、CBM3、CBM3a、CBM4、CBM5、CBM6、CBM9、CBM10、CBM11、CBM12、CBM14、CBM15、CBM17、CBM18、CBM19、CBM20、CBM21、CBM25、CBM27、CBM28、CBM33、CBM48、CBM49を含む炭水化物結合モジュール（CBM）、又はそれらの任意の組み合わせである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
18.  結合モジュールは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キシラン、マンナン、又はそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
19.  結合モジュールは、結晶化されたセルロースに特異的に結合する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
20.  リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、各々のリグノセルロース系ポリマー検出プローブが、異なるリグノセルロース系ポリマーに特異的に結合する複数のリグノセルロース系ポリマー検出プローブを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
21.  各々のリグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なるレポーターモジュールを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
22.  各々のレポーターモジュールは、異なる蛍光的特徴を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
23.  レポーターモジュールは、eGFP、mCherry、mOrange2、及びeCFPの1種以上を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
24.  結合モジュールは、CBM3a、CBM4-1、CBM15、及びCBM27の1種以上を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
25.  リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、eGFP-CBM3a、mCherry-CBM4-1、mOrange2-CBM15、eCFP-CBM27、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
26.  リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なる波長で検出可能である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
27.  少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーを含むパルプ製品又は紙製品に特異的に結合された任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブを含む複合体。
28.  少なくとも1種の表面可用性リグノセルロース系ポリマーと、それに特異的に結合された任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の少なくとも1つのプローブとを含むパルプ製品又は紙製品。
29.  リグノセルロース系ポリマーを検出する方法であって、
任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のいずれか1つのプローブとバイオマス材料とを接触させることと、
レポーターモジュールと関連する特性を測定して、バイオマス材料中の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの有無を、プローブの少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーへの特異的な結合に基づいて判定することと、
を含む、方法。
30.  測定される特性は、蛍光である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
31.  少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算すること、少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの種類を特定すること、又はその両方を更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
32.  バイオマス材料は、木質バイオマス材料を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
33.  木質バイオマス材料は、パルプ、完成紙料、紙、又はそれらの任意の組み合わせである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
34.  木質バイオマス生産物から少なくとも1つの手すき紙を形成することを更に含み、ここで測定は、該手すき紙において行われる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
35.  測定は、処理の前に、処理の間に、若しくは処理の後に、又はそれらの任意の組み合わせにおいて行われる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
36.  処理は、酵素的処理、漂白、形態破壊、粉砕、若しくはPFI叩解、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
37.  処理は、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、リグナーゼを含む少なくとも1種の酵素、又はそれらの任意の組み合わせによる酵素的処理を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
38.  バイオマス材料の少なくとも1つの処理を、測定された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて行うことを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
39.  測定されたリグノセルロース系ポリマーの量は、バイオマス生産物の少なくとも1つの物理的特性と負の相関又は正の相関を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
40.  少なくとも1種の物理的特性は、比破裂強さ、濾水速度、比引裂強さ、比引張強さ、若しくは内部結合強さ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
41.  少なくとも1種の酵素を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて供給することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
42.  ミル速度を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて調節することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
43.  バイオマス材料の全含水量を、測定されたリグノセルロース系ポリマーの量、測定されたリグノセルロース系ポリマーの種類、又はその両方に基づいて調節することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
44.  プローブは、複数のプローブを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
45.  パルプ製品又は紙製品に対する工業的処理の有効性を判定する方法であって、
任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のいずれか1つのリグノセルロース系ポリマー検出プローブとパルプ製品又は紙製品とを接触させることと、
プローブのパルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出することと、
パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算することと、
パルプ製品又は紙製品に対する工業的処理の有効性を、検出された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて判定することと、
を含む、方法。
46.  工業的処理は、酵素的処理、化学的処理、若しくは物理的処理、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
47.  方法は、工業的処理の前に、工業的処理の間に、若しくは工業的処理の後に、又はそれらの任意の組み合わせにおいて行われる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
48.  リグノセルロース系ポリマー検出プローブは、異なる波長で検出可能である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
49.  パルプ製品又は紙製品の物理的特性を測定する方法であって、
任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のリグノセルロース系ポリマー検出プローブとパルプ製品又は紙製品とを接触させることと、
プローブのパルプ製品又は紙製品への特異的な結合を検出することと、
パルプ製品又は紙製品の表面上の少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量を計算することと、
パルプ製品又は紙製品の少なくとも1つの物理的特性を、検出された少なくとも1種のリグノセルロース系ポリマーの量に基づいて測定することと、
を含む、方法。
50.  少なくとも1種の物理的特性は、比破裂強さ、濾水速度、比引裂強さ、比引張強さ、若しくは内部結合強さ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
51.  少なくとも1種のポリマーに特異的に結合する結合モジュールa）と、分光学的に検出可能であるレポーターモジュールb）とを含むポリマー検出プローブ。
52.  ポリマー検出プローブは、ポリペプチド型プローブを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
53.  レポーターモジュールは、蛍光性である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
54.  レポーターモジュールは、蛍光性タンパク質を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
55.  蛍光性タンパク質は、紫外蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、シアン蛍光性タンパク質、緑色蛍光性タンパク質、黄色蛍光性タンパク質、橙色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、遠赤蛍光性タンパク質、近赤外蛍光性タンパク質、赤外蛍光性タンパク質、sapphire型蛍光性タンパク質、長ストークスシフト蛍光性タンパク質、切り替え可能な蛍光性タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
56.  結合モジュールは、炭水化物結合モジュール（CBM）である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
57.  結合モジュールは、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キシラン、マンナン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、キシログルカン、若しくはそれらの任意の組み合わせ、若しくはそれらの線状断片、若しくはそれらの分岐状断片、若しくはそれらのオリゴマー、若しくはそれらのモノマー及び／又はマクロマー、例えばグルコース、D-グルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、モノリグノール、p-クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、p-ヒドロキシフェニルフェニルプロパノイド、グアイアシルフェニルプロパノイド、若しくはシリンギルフェニルプロパノイド、又はそれらの組み合わせに特異的に結合する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
58.  結合モジュールは、糖タンパク質、炭水化物、又はその両方に特異的に結合し、特定の血液抗原、種類、型、又は亜型に特異的である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
59.  結合モジュールは、ポリアリールエーテルケトン（PAEK）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、パラアラミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、タンパク質、リン酸化タンパク質、修飾タンパク質、脂質、界面活性剤、レシチン、若しくは生物界面活性剤、又はそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
60.  ポリマー検出プローブは、各々のポリマー検出プローブが、異なるポリマーに特異的に結合する複数のポリマー検出プローブを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
61.  各々のポリマー検出プローブは、異なるレポーターモジュールを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
62.  各々のレポーターモジュールは、異なる蛍光的特徴を有する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
63.  ポリマー検出プローブは、異なる波長で検出可能である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
64.  少なくとも1種の表面可用性ポリマーを含む材料に特異的に結合された任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブを含む複合体。
65.  ポリマーを検出する方法であって、
任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブと材料とを接触させることと、
レポーターモジュールと関連する特性を測定して、材料中の少なくとも1種のポリマーの有無を、プローブの少なくとも1種のポリマーへの特異的な結合に基づいて判定することと、
を含む、方法。
66.  測定される特性は、蛍光である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
67.  少なくとも1種のポリマーの量を計算すること、少なくとも1種のポリマーの種類を特定すること、又はその両方を更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
68.  材料は、血液試料を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
69.  血液試料の血液抗原、種類、型、及び亜型の少なくとも1つを特定することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
70.  プローブは、複数のプローブを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
71.  上記ポリマーは、少なくとも1種の糖ポリマーである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
72.  上記ポリマーは、少なくとも1種のオリゴ糖ポリマーである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のプローブ。
【００９８】
本発明は文及び／又は段落に記載される上記及び／又は下記のこれらの様々な特徴又は実施形態の任意の組み合わせを包含し得る。本明細書に開示される特徴の任意の組み合わせが本発明の一部であるとみなされ、組み合わせることができる特徴に関しては何ら限定を意図しない。
【００９９】
以下の参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
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【０１００】
出願人らはこの開示における全ての引用文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値と好ましい下限値とのリストのいずれかとして与えられる場合、これは範囲が別々に開示されているかに関わらず、任意の範囲上限又は好ましい値と任意の範囲下限又は好ましい値との任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示するものと理解される。数値の範囲が本明細書で言及されている場合、特に指定のない限り、範囲はその端点、並びに範囲内の全ての整数及び端数を含むことが意図される。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に言及された特定の値に限定されることは意図されない。
【０１０１】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から当業者にとって明らかであろう。本明細書及び本実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲及びその均等物により示されることが意図される。
【０１０２】
配列表
eGFP-CBM3a（プローブ1）についての配列番号1（核酸）。下線が引かれた文字は、eGFPをCBM3aに連結するトロンビン開裂部位を表す。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAAAGTTCCGGTCTGGTGCCGCGTGGTAGCACACCGGTATCAGGCAATTTGAAGGTTGAATTCTACAACAGCAATCCTTCAGATACTACTAACTCAATCAATCCTCAGTTCAAGGTTACTAATACCGGAAGCAGTGCAATTGATTTGTCCAAACTCACATTGAGATATTATTATACAGTAGACGGACAGAAAGATCAGACCTTCTGGTGTGACCATGCTGCAATAATCGGCAGTAACGGCAGCTACAACGGAATTACTTCAAATGTAAAAGGAACATTTGTAAAAATGAGTTCCTCAACAAATAACGCAGACACCTACCTTGAAATTAGCTTTACAGGCGGAACTCTTGAACCGGGTGCACATGTTCAGATACAAGGTAGATTTGCAAAGAATGACTGGAGTAACTATACACAGTCAAATGACTACTCATTCAAGTCTGCTTCACAGTTTGTTGAATGGGATCAGGTAACAGCATACTTGAACGGTGTTCTTGTATGGGGTAAAGAATAA
【０１０３】
eGFP-CBM3a（プローブ1）についての配列番号2（アミノ酸）。下線が引かれた文字は、eGFPをCBM3aに連結するトロンビン開裂部位を表す。
MGHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSSGLVPRGSTPVSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKE
【０１０４】
プローブ1のリンカーについての配列番号3。
AGTTCCGGTCTGGTGCCGCGTGGTAGC
【０１０５】
プローブ1のリンカーについての配列番号4（アミノ酸）。
SSGLVPRGS
【０１０６】
mCherry-CBM4-1（プローブ2a）についての配列番号5（核酸）。下線が引かれた文字は、mCherryをCBM4-1に連結するグリシンを表す。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGTGCGTCGCCGATCGGGGAGGGAACGTTCGACGACGGGCCCGAGGGGTGGGTCGCGTACGGCACCGACGGCCCCCTCGACACGAGCACGGGCGCGCTGTGCGTCGCCGTGCCGGCCGGCTCCGCGCAGTACGGCGTCGGCGTCGTGCTCAACGGCGTCGCGATCGAGGAAGGGACCACCTACACGCTCCGGTACACCGCGACGGCCTCGACCGACGTCACCGTGCGGGCGCTCGTCGGGCAGAACGGCGCCCCCTACGGCACCGTGCTCGACACGAGCCCGGCCCTGACGTCCGAGCCGCGGCAGGTGACCGAGACGTTCACGGCCTCGGCGACGTACCCCGCGACACCCGCCGCCGACGACCCCGAGGGGCAGATCGCCTTCCAGCTCGGCGGGTTCAGCGCCGACGCGTGGACGTTCTGCCTCGACGACGTCGCGCTCGACTCCGAGGTCGAGCTCTAA
【０１０７】
mCherry-CBM4-1（プローブ2a）についての配列番号6（アミノ酸）。下線が引かれた文字は、mCherryをCBM4-1に連結するグリシンを表す。
MGHHHHHHGVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKGASPIGEGTFDDGPEGWVAYGTDGPLDTSTGALCVAVPAGSAQYGVGVVLNGVAIEEGTTYTLRYTATASTDVTVRALVGQNGAPYGTVLDTSPALTSEPRQVTETFTASATYPATPAADDPEGQIAFQLGGFSADAWTFCLDDVALDSEVEL
【０１０８】
mCherry-CBM17（プローブ2b）についての配列番号7（核酸）。下線が引かれた文字は、mCherryをCBM17に連結するグリシンコドンを表す。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGTTTATGGGCAGATAATGAATTAACCACTTCAGGTCAATATGTACGTGCTCGTATTAAGGGAGCTTATTATGCTACACCAGTTGATCCTGTAACAAACCAACCAACAGCACCGAAAGACTTTTCTTCAGGCTTTTGGGACTTTAATGACGGTACTACACAAGGTTTTGGTGTAAATCCAGATAGTCCAATAACTGCTATTAATGTTGAAAATGCTAACAATGCTTTAAAAATCAGCAATCTTAATAGTAAGGGTAGTAATGATTTATCTGAAGGAAACTTTTGGGCCAATGTCCGCATTTCAGCTGATATCTGGGGACAAAGTATAAATATATATGGAGACACAAAACTAACAATGGATGTTATAGCTCCAACACCTGTAAATGTATCAATCGCAGCTATCCCACAAAGTAGTACTCACGGTTGGGGAAATCCTACAAGAGCTATACGTGTTTGGACAAACAACTTTGTAGCACAAACTGATGGAACCTATAAAGCAACTTTGACCATTTCTACAAACGATAGTCCAAATTTCAATACTATAGCTACAGATGCTGCTGATAGTGTAGTAACAAATATGATTCTATTTGTTGGTTCAAATTCAGATAATATTTCTTTAGACAATATAAAGTTTACTAAATAAGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAA
【０１０９】
mCherry-CBM17（プローブ2b）についての配列番号8（アミノ酸）。下線が引かれた文字は、mCherryをCBM17に連結するグリシンコドンを表す。
MGHHHHHHGVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKGLWADNELTTSGQYVRARIKGAYYATPVDPVTNQPTAPKDFSSGFWDFNDGTTQGFGVNPDSPITAINVENANNALKISNLNSKGSNDLSEGNFWANVRISADIWGQSINIYGDTKLTMDVIAPTPVNVSIAAIPQSSTHGWGNPTRAIRVWTNNFVAQTDGTYKATLTISTNDSPNFNTIATDAADSVVTNMILFVGSNSDNISLDNIKFTK
【０１１０】
mOrange2-CBM15（プローブ3）についての配列番号9（核酸）。下線が引かれた文字は、mOrange2をCBM15に連結するグリシンコドンを表す。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCATTTCACCTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTCAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTACGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGTGCCCTGAAGGGCAAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTCCGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACATCGTCGACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGTGTCGCTGCCAGCGAGGGCAATGTTGTTATAGAGGTGGACATGGCAAATGGCTGGAGAGGCAACGCATCAGGCAGTACCAGCCATTCCGGTATTACCTACAGTGCCGATGGCGTTACCTTTGCCGCACTGGGCGATGGCGTGGGCGCTGTTTTTGATATTGCCCGACCAACCACACTGGAAGATGCTGTGATAGCAATGGTTGTTAATGTCAGCGCTGAATTTAAGGCCAGTGAAGCCAACTTGCAGATATTTGCCCAGTTAAAAGAAGACTGGTCAAAGGGCGAATGGGATTGTCTGGCGGCCAGCAGCGAACTCACTGCGGATACTGACCTAACCCTGACCTGCACCATTGATGAAGACGACGATAAATTCAACCAAACGGCGCGCGATGTGCAAGTCGGTATCCAGGCCAAGGGAACACCCGCCGGAACTATCACCATTAAAAGCGTCACCATTACACTCGCACAGGAAGCCTATTCAGCCAATTAA
【０１１１】
mOrange2-CBM15（プローブ3）についての配列番号10（アミノ酸）。下線が引かれた文字は、mOrange2をCBM15に連結するグリシンコドンを表す。
MGHHHHHHGVSKGEENNMAIIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPHFTYGSKAYVKHPADIPDYFKLSFPEGFKWERVMNYEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGKIKMRLKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPVQLPGAYIVDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKGVAASEGNVVIEVDMANGWRGNASGSTSHSGITYSADGVTFAALGDGVGAVFDIARPTTLEDAVIAMVVNVSAEFKASEANLQIFAQLKEDWSKGEWDCLAASSELTADTDLTLTCTIDEDDDKFNQTARDVQVGIQAKGTPAGTITIKSVTITLAQEAYSAN
【０１１２】
eCFP-CBM27（プローブ4）についての配列番号11（核酸）。下線が引かれた文字は、eCFPをCBM27に連結するグリシンコドンを表す。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGTAACGAAGCACGGTACGTGCTCGCAGAGGAAGTTGATTTTTCCTCTCCAGAAGAGGTGAAAAACTGGTGGAACAGCGGAACCTGGCAGGCAGAGTTCGGGTCACCTGACATTGAATGGAACGGTGAGGTGGGAAATGGAGCACTGCAGCTGAACGTGAAACTGCCCGGAAAGAGCGACTGGGAAGAAGTGAGAGTAGCAAGGAAGTTCGAAAGACTCTCAGAATGTGAGATCCTCGAGTACGACATCTACATTCCAAACGTCGAGGGACTCAAGGGAAGGTTGAGGCCGTACGCGGTTCTGAACCCCGGCTGGGTGAAGATAGGCCTCGACATGAACAACGCGAACGTGGAAAGTGCGGAGATCATCACTTTCGGCGGAAAAGAGTACAGAAGATTCCATGTAAGAATTGAGTTCGACAGAACAGCGGGGGTGAAAGAACTTCACATAGGAGTTGTCGGTGATCATCTGAGGTACGATGGACCGATTTTCATCGATAATGTGAGACTTTATAAAAGAACAGGAGGTATGTAA
【０１１３】
eCFP-CBM27（プローブ4）についての配列番号12（アミノ酸）。下線が引かれた文字は、eCFPをCBM27に連結するグリシンコドンを表す。
MGHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGNEARYVLAEEVDFSSPEEVKNWWNSGTWQAEFGSPDIEWNGEVGNGALQLNVKLPGKSDWEEVRVARKFERLSECEILEYDIYIPNVEGLKGRLRPYAVLNPGWVKIGLDMNNANVESAEIITFGGKEYRRFHVRIEFDRTAGVKELHIGVVGDHLRYDGPIFIDNVRLYKRTGGM
【０１１４】
CBM3aについての配列番号13（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTACACCGACCAAGGGAGCAACACCAACAAATACAGCTACGCCGACAAAATCAGCTACGGCTACGCCCACCAGGCCATCGGTACCGACAAACACACCGACAAACACACCGGCAAATACACCGGTATCAGGCAATTTGAAGGTTGAATTCTACAACAGCAATCCTTCAGATACTACTAACTCAATCAATCCTCAGTTCAAGGTTACTAATACCGGAAGCAGTGCAATTGATTTGTCCAAACTCACATTGAGATATTATTATACAGTAGACGGACAGAAAGATCAGACCTTCTGGTGTGACCATGCTGCAATAATCGGCAGTAACGGCAGCTACAACGGAATTACTTCAAATGTAAAAGGAACATTTGTAAAAATGAGTTCCTCAACAAATAACGCAGACACCTACCTTGAAATTAGCTTTACAGGCGGAACTCTTGAACCGGGTGCACATGTTCAGATACAAGGTAGATTTGCAAAGAATGACTGGAGTAACTATACACAGTCAAATGACTACTCATTCAAGTCTGCTTCACAGTTTGTTGAATGGGATCAGGTAACAGCATACTTGAACGGTGTTCTTGTATGGGGTAAAGAATAA
【０１１５】
CBM3aについての配列番号14（アミノ酸）。
MGHHHHHHGTPTKGATPTNTATPTKSATATPTRPSVPTNTPTNTPANTPVSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKE
【０１１６】
CBM4-1についての配列番号15（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGCGTCGCCGATCGGGGAGGGAACGTTCGACGACGGGCCCGAGGGGTGGGTCGCGTACGGCACCGACGGCCCCCTCGACACGAGCACGGGCGCGCTGTGCGTCGCCGTGCCGGCCGGCTCCGCGCAGTACGGCGTCGGCGTCGTGCTCAACGGCGTCGCGATCGAGGAAGGGACCACCTACACGCTCCGGTACACCGCGACGGCCTCGACCGACGTCACCGTGCGGGCGCTCGTCGGGCAGAACGGCGCCCCCTACGGCACCGTGCTCGACACGAGCCCGGCCCTGACGTCCGAGCCGCGGCAGGTGACCGAGACGTTCACGGCCTCGGCGACGTACCCCGCGACACCCGCCGCCGACGACCCCGAGGGGCAGATCGCCTTCCAGCTCGGCGGGTTCAGCGCCGACGCGTGGACGTTCTGCCTCGACGACGTCGCGCTCGACTCCGAGGTCGAGCTCTAA
【０１１７】
CBM4-1についての配列番号16（アミノ酸）。
MGHHHHHHGASPIGEGTFDDGPEGWVAYGTDGPLDTSTGALCVAVPAGSAQYGVGVVLNGVAIEEGTTYTLRYTATASTDVTVRALVGQNGAPYGTVLDTSPALTSEPRQVTETFTASATYPATPAADDPEGQIAFQLGGFSADAWTFCLDDVALDSEVEL
【０１１８】
CBM17についての配列番号17（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTTTATGGGCAGATAATGAATTAACCACTTCAGGTCAATATGTACGTGCTCGTATTAAGGGAGCTTATTATGCTACACCAGTTGATCCTGTAACAAACCAACCAACAGCACCGAAAGACTTTTCTTCAGGCTTTTGGGACTTTAATGACGGTACTACACAAGGTTTTGGTGTAAATCCAGATAGTCCAATAACTGCTATTAATGTTGAAAATGCTAACAATGCTTTAAAAATCAGCAATCTTAATAGTAAGGGTAGTAATGATTTATCTGAAGGAAACTTTTGGGCCAATGTCCGCATTTCAGCTGATATCTGGGGACAAAGTATAAATATATATGGAGACACAAAACTAACAATGGATGTTATAGCTCCAACACCTGTAAATGTATCAATCGCAGCTATCCCACAAAGTAGTACTCACGGTTGGGGAAATCCTACAAGAGCTATACGTGTTTGGACAAACAACTTTGTAGCACAAACTGATGGAACCTATAAAGCAACTTTGACCATTTCTACAAACGATAGTCCAAATTTCAATACTATAGCTACAGATGCTGCTGATAGTGTAGTAACAAATATGATTCTATTTGTTGGTTCAAATTCAGATAATATTTCTTTAGACAATATAAAGTTTACTAAATAA
【０１１９】
CBM17についての配列番号18（アミノ酸）。
MGHHHHHHGLWADNELTTSGQYVRARIKGAYYATPVDPVTNQPTAPKDFSSGFWDFNDGTTQGFGVNPDSPITAINVENANNALKISNLNSKGSNDLSEGNFWANVRISADIWGQSINIYGDTKLTMDVIAPTPVNVSIAAIPQSSTHGWGNPTRAIRVWTNNFVAQTDGTYKATLTISTNDSPNFNTIATDAADSVVTNMILFVGSNSDNISLDNIKFTK
【０１２０】
CBM15についての配列番号19（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTCGCTGCCAGCGAGGGCAATGTTGTTATAGAGGTGGACATGGCAAATGGCTGGAGAGGCAACGCATCAGGCAGTACCAGCCATTCCGGTATTACCTACAGTGCCGATGGCGTTACCTTTGCCGCACTGGGCGATGGCGTGGGCGCTGTTTTTGATATTGCCCGACCAACCACACTGGAAGATGCTGTGATAGCAATGGTTGTTAATGTCAGCGCTGAATTTAAGGCCAGTGAAGCCAACTTGCAGATATTTGCCCAGTTAAAAGAAGACTGGTCAAAGGGCGAATGGGATTGTCTGGCGGCCAGCAGCGAACTCACTGCGGATACTGACCTAACCCTGACCTGCACCATTGATGAAGACGACGATAAATTCAACCAAACGGCGCGCGATGTACAAGTCGGTATCCAGGCCAAGGGAACACCCGCCGGAACTATCACCATTAAAAGCGTCACCATTACACTCGCACAGGAAGCCTATTCAGCCAATTAA
【０１２１】
CBM15についての配列番号20（アミノ酸）。
MGHHHHHHGVAASEGNVVIEVDMANGWRGNASGSTSHSGITYSADGVTFAALGDGVGAVFDIARPTTLEDAVIAMVVNVSAEFKASEANLQIFAQLKEDWSKGEWDCLAASSELTADTDLTLTCTIDEDDDKFNQTARDVQVGIQAKGTPAGTITIKSVTITLAQEAYSAN
【０１２２】
CBM27についての配列番号21（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTAACGAAGCACGGTACGTGCTCGCAGAGGAAGTTGATTTTTCCTCTCCAGAAGAGGTGAAAAACTGGTGGAACAGCGGAACCTGGCAGGCAGAGTTCGGGTCACCTGACATTGAATGGAACGGTGAGGTGGGAAATGGAGCACTGCAGCTGAACGTGAAACTGCCCGGAAAGAGCGACTGGGAAGAAGTGAGAGTAGCAAGGAAGTTCGAAAGACTCTCAGAATGTGAGATCCTCGAGTACGACATCTACATTCCAAACGTCGAGGGACTCAAGGGAAGGTTGAGGCCGTACGCGGTTCTGAACCCCGGCTGGGTGAAGATAGGCCTCGACATGAACAACGCGAACGTGGAAAGTGCGGAGATCATCACTTTCGGCGGAAAAGAGTACAGAAGATTCCATGTAAGAATTGAGTTCGACAGAACAGCGGGGGTGAAAGAACTTCACATAGGAGTTGTCGGTGATCATCTGAGGTACGATGGACCGATTTTCATCGATAATGTGAGACTTTATAAAAGAACAGGAGGTATGTAA
【０１２３】
CBM27についての配列番号22（アミノ酸）。
MGHHHHHHGNEARYVLAEEVDFSSPEEVKNWWNSGTWQAEFGSPDIEWNGEVGNGALQLNVKLPGKSDWEEVRVARKFERLSECEILEYDIYIPNVEGLKGRLRPYAVLNPGWVKIGLDMNNANVESAEIITFGGKEYRRFHVRIEFDRTAGVKELHIGVVGDHLRYDGPIFIDNVRLYKRTGGM
【０１２４】
eGFPについての配列番号23（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
【０１２５】
eGFPについての配列番号24（アミノ酸）。
MGHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
【０１２６】
mCherryについての配列番号25（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
【０１２７】
mCherryについての配列番号26（アミノ酸）。
MGHHHHHHGVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
【０１２８】
mOrange2についての配列番号27（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCATTTCACCTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTCAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTACGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGTGCCCTGAAGGGCAAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTCCGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACATCGTCGACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
【０１２９】
mOrange2についての配列番号28（アミノ酸）。
MGHHHHHHGVSKGEENNMAIIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPHFTYGSKAYVKHPADIPDYFKLSFPEGFKWERVMNYEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGKIKMRLKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPVQLPGAYIVDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
【０１３０】
eCFPについての配列番号29（核酸）。
ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
【０１３１】
eCFPについての配列番号30（アミノ酸）。
MGHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK 
【符号の説明】
【０１３２】
図1
Reportermodule  レポーターモジュール
Bindingmodule  結合モジュール
Polymers  ポリマー
図2
His-tag  His-タグ
図3
His-tag  His-タグ
図4
His-tag  His-タグ
図5
His-tag  His-タグ
図8
FluorescenceIntensity  蛍光強度
Paperdisc  紙円板
Wavelength  波長
図9
FluorescenceIntensity  蛍光強度
Paperdisc  紙円板
Wavelength  波長
図10
His-tag  His-タグ
Thrombinsite  トロンビン部位
図11
His-tag  His-タグ
図12
His-tag  His-タグ
図13
His-tag  His-タグ
図14
His-tag  His-タグ
図15
Probe  プローブ
図16
Abs  吸光度
Wavelength  波長
FluorescenceIntensity  蛍光強度
図17
Bound  結合された
cellulose  セルロース
Free  遊離の
図18
RefinedPaper  叩解された紙
PhysicalProperties  物理的特性
PaperDisc  紙円板
図19
Revolution(#)  回転（数）
図20
FI  蛍光強度
Probe  プローブ
Revolution(#)  回転（数）
図21
ResidualFluorescence  残留蛍光
ResidualCSF  残留CSF
Revolutions(#)  回転（数）
図22
FluorescenceIncrease  蛍光増加
Cellulases  セルラーゼ
Revolution  回転
Revolutions  回転
図23
Untreated  未処理
Xylanase  キシラナーゼ
PFIRevolutions  PFI回転
図24
Crystallinecellulose  結晶性セルロース
PFIRevolutions (#)  PFI回転（数）
図25
Tearindex  比引裂強さ
Tensileindex  比引張強さ
Internalbond strength  内部結合強さ
Fibersmean length  繊維平均長さ
PFIRevolutions (#)  PFI回転（数）
Crystallinecellulose  結晶性セルロース
図26
Tearindex  比引裂強さ
Tensileindex  比引張強さ
Internalbond strength  内部結合強さ
Fibersmean length  繊維平均長さ
PFIRevolutions (#)  PFI回転（数）
Crystallinecellulose  結晶性セルロース
図27
Fluorescence Itensity（正：Fluorescence Intensity）  蛍光強度
Pulps  パルプ
図28
Fluorescenceintensity  蛍光強度
Untreated  未処理
図29
FluorescenceIntensity  蛍光強度
Pulps  パルプ
図30
FluorescenceIntensity  蛍光強度
Untreated  未処理
1hrTreatment  1時間の処理
O/NTreatment  O/N処理
【図１】
2018537692.tif 000008
【図２】
2018537692.tif 000009
【図３】
2018537692.tif 000010
【図４】
2018537692.tif 000011
【図５】
2018537692.tif 000012
【図６】
2018537692.tif 000013
【図７】
2018537692.tif 000014
【図８】
2018537692.tif 000015
【図９】
2018537692.tif 000016
【図１０】
2018537692.tif 000017
【図１１】
2018537692.tif 000018
【図１２】
2018537692.tif 000019
【図１３】
2018537692.tif 000020
【図１４】
2018537692.tif 000021
【図１５】
2018537692.tif 000022
【図１６】
2018537692.tif 000023
【図１７】
2018537692.tif 000024
【図１８】
2018537692.tif 000025
【図１９】
2018537692.tif 000026
【図２０】
2018537692.tif 000027
【図２１】
2018537692.tif 000028
【図２２】
2018537692.tif 000029
【図２３】
2018537692.tif 000030
【図２４】
2018537692.tif 000031
【図２５】
2018537692.tif 000032
【図２６】
2018537692.tif 000033
【図２７】
2018537692.tif 000034
【図２８】
2018537692.tif 000035
【図２９】
2018537692.tif 000036
【図３０】
2018537692.tif 000037
【配列表】
2018537692000001.app
【国際調査報告】
2018537692.tif 000038
2018537692.tif 000039