(57)【要約】  配列番号１〜１０またはその変種もしくはパラログから選択される少なくとも１つの核酸配列の存在および／またはサイズが約１７５６６ｂｐの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられる、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）の株。ＩＭＩ５０４８５３によって例示されるこのような株は、特に植物の細胞内でコロニー形成できることから農業において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１０またはその変種もしくはパラログから選択される少なくとも１つの核酸配列の存在および／またはサイズが約１７５６６ｂｐの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられる、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）の株。
【請求項２】
配列番号１〜１０の少なくとも１つの核酸によって特徴付けられる、請求項１に記載の株。
【請求項３】
配列番号１〜１０の少なくとも３つの異なる核酸配列によって特徴付けられる、請求項１または２に記載の株。
【請求項４】
列番号１〜１０の少なくとも５つの異なる核酸配列によって特徴付けられる、請求項３に記載の株。
【請求項５】
列番号１〜１０の少なくとも８つの異なる核酸配列によって特徴付けられる、請求項４に記載の株。
【請求項６】
配列番号１〜１０の全ての核酸配列の存在によって特徴付けられる、請求項５に記載の株。
【請求項７】
サイズが約１７５６６ｂｐの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられる、請求項１に記載の株。
【請求項８】
前記プラスミドが制限酵素ＥｃｏＲＩによって２つの断片に制限され、前記断片が約１２および５．６ｋｂのサイズである、請求項８に記載の株。
【請求項９】
前記プラスミドが配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および／または配列番号６８を欠く、請求項７または８に記載の株。
【請求項１０】
ＩＭＩ５０４８５３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の株。
【請求項１１】
農業上許容される担体と組み合わされて請求項１〜１０のいずれか一項に記載の株を含んでなる、農業用組成物。
【請求項１２】
種子コーティングを含んでなる、請求項１１に記載の農業用組成物。
【請求項１３】
植物の窒素固定能を高める方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧｄの株、請求項１１または１２に記載の組成物を、前記Ｇｄが植物にコロニー形成するように前記植物またはその環境に投与するステップを含んでなる方法。
【請求項１４】
前記株が前記植物の成長培地、種子の表面、または前記植物の傷に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
種子であって、その上にコーティングを有し、前記コーティングが請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧｄの株を含んでなる、種子。
【請求項１６】
植物または種子であって、その中にコロニー形成した請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧｄの株を有する、植物または種子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の植物または種子の種子または子孫であって、前記種子中において細胞内に存在する請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧｄの株を有する、種子または子孫。
【請求項１８】
植物性産物を生産する方法であって、請求項１６に記載の植物を栽培し、かつそれから前記産物を得るステップを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物、特に窒素固定細菌グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）の新規株と、これらの微生物を含有する農業上許容される組成物を含む農業におけるそれらの使用とに関する。株は、植物細胞内でコロニー形成して特に効果的な窒素固定を引き起こすそれらの能力の観点から、農業において優れた実用性を有する。これらの株の同定およびその使用のモニタリングのためのキットは、同時係属中の出願の主題を形成する。
【背景技術】
【０００２】
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）は、Ｅｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ（２０１４）：１−１３で概説されるように、その窒素固定および植物成長促進活性について十分に試験されている。しかし、Ｇｄの特定の株は、植物種子および組織非依存性を示しながら、植物細胞内でそれら自体を確立できることから、植物の処理において特に有利であることが示されている（Ｃｏｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｎｔ（２００６）４２（１）。これらの特性は、一連の植物組織を移動するそれらの能力と組み合わされて、このような株が標的作物植物に恩恵をもたらすことをより良好に可能にする。
【０００３】
しかし、広範なＧｄの株が存在し、これらの有益な特性を有する株を容易に同定する手段を提供することは依然として可能でない。
【０００４】
さらに、バイオ肥料の重要な側面は、自然に優しい方法で化学肥料の代替物を農作物植物に提供することであった。しかし、農業者が成長条件を向上させるために、必要に応じていずれのレベルの窒素肥料を供給する必要があるかを決定できるように、圃場条件で進行中の処理の有効性を検証することは役立つであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願人らは、Ｇｄの特定の有利な株が、他のＧｄ種または植物種を含む他の種に見いだされていない、いくつかの固有の核酸配列を含むことを見いだした。これは、有益な株が容易に同定され得ることを意味し、関連する有益な株を同定するための圃場における処理のモニタリングおよびまた研究において、有用な信頼できる診断試験の提供をもたらす。
【０００６】
本発明に従って、配列番号１〜１０またはその変種もしくはパラログから選択される少なくとも１つの核酸配列の存在および／またはサイズが約１７５６６ｂｐの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられる、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）の株が提供される。
【０００７】
これらの固有の特徴を有する株は、植物細胞の細胞内コロニー形成において特に有効であり、有益な窒素固定をもたらすことが判明している。特に、本発明の染色の使用は、トウモロコシおよび小麦のような禾穀類などの作物において収穫量向上をもたらすことが判明している。代替的に、従来の窒素肥料の施用を低減してもなお同様の収穫量が達成され得る。
【０００８】
以下の（添付の表１に示される）配列番号１〜１０の配列は、特定の株ＩＭＩ５０４８５３に存在するが、他の利用可能な株のゲノム分析には出現しない。
【０００９】
配列番号１〜１０の変種は、高度に天然に存在する変種である対立遺伝子型を含む。それらは、基礎配列と例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、７５％、７９％、８１％、８４％、８７％、９０％、９３％、９５％、９６％または９８％同一である、高度の配列同一性を有する。これに関連して、同一性は、基本配列としての配列番号２または断片、特に下述される断片を使用したＢＬＡＳＴＰコンピュータプログラムを用いて判定され得る。ＢＬＡＳＴソフトウェアは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ（２０１５年７月２７日にアクセス可能）で公的に利用可能である。
【００１０】
しかし、特に、本発明の株は、配列番号１〜１０の少なくとも１つの核酸、適切には配列番号１〜１０の少なくとも３つの異なる核酸配列、例えば配列番号１〜１０の少なくとも５つまたは少なくとも８つの異なる核酸配列の存在により、特に配列番号１〜１０の全ての核酸配列の存在により特徴付けられる。
【００１１】
好ましい株はまた、サイズが約１７５６６ｂｐの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられ得る。プラスミドの存在、特にそのサイズは、プラスミドを欠くことが報告されている以前から知られているＧｄの株ＵＡＰ５５４１と異なる（Ｌｕｉｓ  Ｅ．Ｆｕｅｎｔｅｓ−Ｒａｍｉｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ２９（１９９９）１１７−１２８）。さらに、プラスミドのサイズは、単一のプラスミドを含有するＰＡＬ５株に関してこれまでに報告されているサイズよりも小さい（Ｇｉｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｙ  ２０１０，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｉｓｓｕｅ  ３，ｐｐ  ３０９−３１７  ｄｏｉ：１０．４０５６／ｓｉｇｓ．９７２２２１）。
【００１２】
本発明の株のプラスミドはまた、制限酵素ＥｃｏＲＩによって２つの断片に制限され、それらの断片がそれぞれ約１２ｋｂおよび約５．６ｋｂのサイズであることを特徴とし得る。さらに、プラスミドは、以前にＰＡＬ５のプラスミド中に存在するとして同定されたいくつかの重要な配列を欠く。これらの配列は、添付の配列表中で配列番号６５、６６、６７、および６８として示される。したがって、これらの特定の配列の非存在は、本発明の株のさらなる特徴の特性決定を提供し得る。
【００１３】
本発明の株の特定の例は、２０１５年５月２２日にＣＡＢＩ（ＵＫ）に寄託されたＩＭＩ５０４８５３である、上記の請求項のいずれか１つに記載の株である。
【００１４】
この株のプラスミドのドットプロット分析は、ＧＥＰＡＲＤソフトウェアＶ１．３０（Ｋｒｕｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７；２３（８）：１０２６−８）を使用して、Ｐａｌ５  ＤＮＡ配列分析（Ｍ．Ｂｅｒｔａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００９）１０：４５０  ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−１０−４５０）からの小型プラスミド（ＮＣ＿０１０１２３；１６６１０ｂｐ）と比較して実施された。興味深いことに、２つのプラスミドのＤＮＡ配列を比較した際、プロットは生成されなかった。これは相同性が非常に低く、ソフトウェアによって構造類似性が確立できなかったことを示唆し、したがって、プラスミドが単一で固有のプラスミドであることが確認された。
【００１５】
農業で使用するために、本発明の株は農業用組成物に適切に配合される。
【００１６】
したがって、本発明のさらなる態様は、農業上許容される担体と組み合わされて上記の株を含んでなる農業用組成物を含んでなる。一般に、組成物中に存在する窒素固定細菌の濃度は、投与の方法、処理される植物または種子の種類、および使用されるＧｄの特定の株、ならびに必要な窒素固定強化のレベルなどの要素に応じて変動する。しかし、典型的に組成物は、１ミリリットルの組成物あたり１〜１×１０９個の細菌、例えば１ミリリットルの組成物あたり１０〜１０３個の細菌、例えば１ミリリットルの組成物あたり５０〜２００個の細菌、例えば１ミリリットルの組成物あたり１００個の細菌を含有する溶液を含んでなる。このような組成物は、例えば、光学濃度を調べることで容易に検出可能なレベルに細菌を培養し、次に溶液を相応に希釈することで得られてもよい。
【００１７】
Ｇｄは、組成物の唯一の活性成分であり得るか、またはそれは、Ｇｄと適合性であるという条件で殺虫剤、殺真菌剤または植物成長調節剤などの追加的な農薬活性成分と組み合わされ得る。
【００１８】
本発明の組成物は、適切には水などの溶媒を含んでなるが、必要に応じて植物油などの有機溶媒またはパラフィンもしくは灯油などの炭化水素が使用され得る。適切には、任意の有機溶剤は、大豆油、ヒマワリ油、キャノーラ油（アブラナ油）、綿実油、ヒマシ油、亜麻仁油またはパーム油またはこれらの混合物などの植物油である。
【００１９】
組成物は、増粘剤、分散剤、希釈剤、湿潤剤、固体担体などの当該技術分野で公知の添加剤または賦形剤をさらに含んでなってもよい。
【００２０】
特定の実施形態では、組成物は、多糖類もしくは農業上許容される界面活性剤またはこれらの組み合わせをさらに含んでなる。本出願人らは、同時係属中の英国特許出願に記載されているように、そのような成分が組成物の活性を増強し得ることを見いだした。適切な多糖類としては、植物、動物または微生物源に由来する親水コロイド多糖類が挙げられる。
【００２１】
特に、これらとしては、アラビアガム、ガティガム、カラヤガム、およびトラガカントガムなどの滲出ガム多糖類；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは微結晶セルロースなどのセルロース誘導体；例えば、コーンスターチ、タピオカデンプン、ジャガイモデンプン、米デンプン、小麦デンプン、およびα化デンプン、酸化デンプン、エチル化デンプン、デンプンデキストリンまたはマルトデキストリンなどのその修飾型を含むデンプンおよび誘導体；ペクチン；例えば、寒天、アルギン酸塩、カラゲナン、およびファセレラン（ｆｕｃｅｌｌａｒａｎ）などの海藻由来の多糖類；グアーガムおよびローカストビーンガムなどの種子ガム；キサンタンガム、ジェランガムなどの微生物発酵に由来する多糖類；およびキトサンなどの窒素含有多糖類；またはこれらの混合物が挙げられる。
【００２２】
特定の実施形態では、多糖類は、アラビアガム、ガティガム、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの滲出ガム多糖類である。多糖類の特定の例は、アラビアガムである。
【００２３】
組成物中に存在する多糖類の量は、投与方法、処理される植物または種子のタイプ、使用されるＧｄの特定の株、および必要な窒素固定強化のレベルなどの要素次第で変動し得る。これは、使用される特定の多糖類、処理される植物または種子のタイプ、使用される窒素固定細菌の特定の株、および投与方法などの様々な要素次第で変動する。しかしながら、典型的には、０．１〜１％ｗ／ｗ、例えば０．１〜０．５％ｗ／ｗ、例えば約０．３％ｗ／ｗの多糖類を含む組成物が使用される。
【００２４】
特定の実施形態では、組成物は、特に、例えばツイーン８０（登録商標）の商品名の下に販売されるものなどの非イオン性界面活性剤を含む界面活性剤または合成洗剤をさらに含んでなる。ツイーン８０は、非イオン性合成洗剤であり、７０％が脂肪酸オレイン酸から構成され、残りはリノレン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の組み合わせである。１％溶液のｐＨは、５．５〜７．２の範囲である。それは、物質を医療品および食品中で乳化および分散するために広く利用されている。それは、抗菌剤としての活性がわずかであるかまたは皆無である（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：１９８６），ｐ．２８９）。含まれる界面活性剤の量は、使用される特定の界面活性剤、処理される種子のタイプ、投与方法、処理される植物または種子のタイプ、および使用されるＧｄの特定の株、ならびに必要な窒素固定強化のレベルなどの様々な要素次第で変動する。しかし、典型的に、組成物は、０．０００５〜０．２％ｖ／ｖ、例えば０．０００５〜０．１５％ｖ／ｖ、例えば約０．００１％ｖ／ｖを含んでなる。
【００２５】
適切には、Ｇｄのための栄養素も組成物に含まれる。例としては、欧州特許第Ｂ−１４２２９９７号明細書に記載されるような３％ｗ／ｖスクロース溶液が挙げられる。
【００２６】
全体として、組成物の全ての成分が天然物であるため、本発明の処理の環境影響は少なく、組成物は比較的容易に規制要件を満たし得る。
【００２７】
特定の実施形態では、製剤は、上記のように特定の実施形態において種子コーティングとして適用される。特に、製剤は噴霧または浸漬のいずれかによって種子に塗布され、次に、種子は乾燥されて、その上にＧｄを含んでなる残留被膜が形成される。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、植物の窒素固定能を高める方法であって、上記のようなＧｄの株またはそれを含んでなる農業用組成物を、Ｇｄが植物にコロニー形成し、特に植物細胞に入るように（細胞内コロニー形成）植物またはその環境に投与するステップを含んでなる方法を提供する。
【００２９】
これは様々な方法で達成され得る。例えば、Ｇｄは、例えば欧州特許出願公開第Ａ−１７１４５４５号明細書に記載されるような方法を使用して、特に発芽時またはその後に植物の成長培地に投与され得る。この場合、例えば寒天などの成長培地への例えば１ミリリットルの接種材料あたり１〜１００個の細菌などの特に低レベルの投与が、例えば発芽時またはその直後、例えば７日後までに草に施用される。
【００３０】
代替的に、Ｇｄは、種子、特に種子の表面に、例えば発芽前浸漬中にまたは特定の実施形態では種子被コーティングとして塗布され得る。代替的に、１つまたは複数の組成物が、その上で種子を発芽させる成長培地に施用され得る。このような成長培地としては、その中に種子がまもなく播種されるかまたは播種された寒天ゲルのような人工培地ならびに土壌または堆肥が挙げられる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、Ｇｄは、成長植物、特に植物の傷に塗布される。この技術は、本出願人らの同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１５／０５２１７０号明細書に記載されている。この方法では、窒素固定細菌が成長植物の傷に投与される。傷は、偶発的または自然損傷の結果であり得、その上で追加的な窒素可用性が修復成長を促進し得る。しかしながら、特定の実施形態では、傷は、芝刈り（観賞用芝）、草刈り（サイレージおよび乾草作物）、家畜による摂食（牧草）または収穫などの活動によって引き起こされる損傷の結果である。したがって、窒素固定細菌の投与前に、特に芝刈り、草刈り、または収穫によって「損傷」を与える予備段階を実施し得る。窒素固定細菌は、適切には、植物に損傷が与えられてから例えば４８時間以内、例えば２４時間以内、例えば１０時間以内、適切には１〜２時間以内など、このような処理の実施から比較的短い時間内に塗布される。
【００３２】
細菌の送達は、特に組成物の形態の適切な製剤を傷領域に塗布することで達成される。組成物は、液体、ゲル、ペーストの形態であり得、それは直接もしくは希釈形態で塗布され得、またはそれは使用前に水などの液体に溶解される粉末もしくは顆粒組成物などの固体組成物の形態であり得る。固体組成物中では、細菌は、通常、水の添加によって戻せる乾燥形態、例えば凍結乾燥形態で使用される。しかし、本株の乾燥耐性は、凍結乾燥が必要でないことを意味し得る。
【００３３】
特定の実施形態では、組成物は、植物上に噴霧するのに適した形態であり、したがって液体または固体形態、特に液体形態であり得る希釈用濃縮物を含んでなるか、またはそれは、直接噴霧され得る希釈水性組成物を含んでなってもよい。
【００３４】
任意の特定の例で投与される窒素固定細菌の量は、処理される種子または植物タイプ、使用される窒素固定細菌の特定の株、要求される発芽増大のレベルおよび投与方法などの要素次第で変動する。しかし、典型的に、種子または例えば成長培地などのそれらの環境には、１ミリリットルの接種材料あたり１〜１×１０９個の細菌、例えば１ミリリットルの接種材料あたり１〜１００個の細菌、例えば１ミリリットルの接種材料あたり１０〜８０個の細菌、例えば１ミリリットルの接種材料あたり５０個の細菌を含有する溶液が接種される。このような溶液は、例えば、光学濃度を調べることで容易に検出可能なレベルに細菌を培養し、次に溶液を相応に希釈することで得られてもよい。
【００３５】
特定の実施形態では、Ｇｄは、本出願人らの同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１５／０５２１７１号明細書に記載されるように、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と一緒にまたはそれとの組み合わせで投与される。本出願人らは、そのような株がＧｄの活性を増強し得ることを見いだした。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の適切な株としては、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・グロリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、特にテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）の株である。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｇｄと別々にまたは混和材中で投与される。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｇｄとの密接混和材中にあり得るか、またはそれは共培養もしくは混合培養形態で投与され得る。
【００３６】
適切な植物としては、マメ科植物および非マメ科作物ならびに観賞植物が挙げられる。非マメ科植物は、好ましくはイネ科（イネ［イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）］、小麦［コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）］、およびトウモロコシ［トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）］を含む）から選択される。非マメ科植物は、また、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トマト、ジャガイモ、およびタバコを含む）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）／アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（キャベツ、カブ、アブラナ、およびモデル植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を含む）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）（綿を含む）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）／キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（ヒマワリおよびレタスを含む）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）（キャッサバを含む）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（甜菜を含む）などから選択されるものであり得る。マメ科植物は、好ましくはマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（大豆、クローバー、アルファルファ、エンドウマメ、および他の豆を含む）から選択される。処理される種子は、単子葉植物または双子葉植物でであり得るが、特に草、米、小麦、大麦、ソルガム、キビ、オート麦、ライ麦、およびトウモロコシなどの単子葉植物である。特に、本発明の方法に従って処理される種子は、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）などの草である。
【００３７】
上に列挙される他の作物がＧｄを使用して、上記のように非最適ｐＨ条件下における生存を容易にし得る。
【００３８】
上記のように接種されると、本発明のＧｄは植物細胞にコロニー形成し、植物内で共生的に機能して窒素固定を強化する。
【００３９】
したがって、本発明のさらなる態様は、上記のようにＧｄの株によってコロニー形成されている植物または種子を提供する。特に、Ｇｄは、生きた植物細胞内に位置する。
【００４０】
本出願人らは、細胞内Ｇｄが世代間で引き継がれ、したがって本発明の種子および植物から得られた種子および他の子孫も細胞内Ｇｄを含んでなることを見いだした。このような種子または子孫は、本発明のなおさらなる態様を形成する。
【００４１】
窒素固定を強化することにより、植物は、より迅速なまたは改善された成長特性および／または改善された収穫量などの強化された特性を示し得る。さらなる態様では、本発明は、植物性産物を生産する方法であって、上記のようにＧｄでコロニー形成された植物を栽培し、かつそれから産物を得るステップを含んでなる方法を提供する。
【００４２】
さらに、本出願人らは、窒素固定細菌によってコロニー形成された特定の植物、特に細胞内でコロニー形成された植物が、成長促進または収穫量特性を示すだけでなく、このような細胞内細菌を有しない植物と比較して増加したクロロフィルレベルも示すことを指摘している。この特性を特に実証すると思われ植物は、牧草、観賞用または芝草を含む草である。高いクロロフィルレベルはより良好な緑色の着色を生じ、それは観賞植物に関連して非常に望ましいことから、このような植物に関連して特に有利である。
【００４３】
したがって、さらなる態様では、本発明は、上記のようなＧｄを含んでなる草を栽培するステップを含んでなる、草の中のクロロフィルを増加させる方法を提供する。
【００４４】
草としては、例えば、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）、ネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）、イタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｓｉｃｕｍ）などのロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）種；アグロステス・カステラナ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｓｔｅｌｌａｎａ）、コロニアルベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）、ハイコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）などのコヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種；オオウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ）、ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ）、ハードフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）などのウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）種；スズメノカタビラ（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）およびオオスズメノカタビラ（Ｐｏａ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ）、サワスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ）などのイチゴツナギ属（Ｐｏａ）種；ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）などのギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）種；ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ビロードシバ（Ｚｏｙｓｉａ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）、またはエメラルド・ゾイシヤ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｚｏｙｓｉａ）などのシバ属（Ｚｏｙｓｉａ）種；セントオーガスチングラス（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ）、ヤギュウシバ（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）またはキクユグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎｕｍ）などの牧草、観賞用、芝生または装飾用草などの草が挙げられる。しかし、一般に、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）種および／またはウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）種が多くの観賞用草または芝草の基礎を形成する。
【００４５】
Ｇｄは、上述の技術のいずれかを用いて草に投与され得るが、特に草の種子にまたは草刈り後にできる草の傷にコーティングとして塗布され得る。
【００４６】
本発明による株は、サンプル中における、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つの核酸配列の存在を判定するための手段を含んでなる診断キットの使用により、同定および／またはモニタリングされ得る。
【００４７】
上で考察されるように、配列番号１〜１０は、Ｇｄの好ましい亜種または株に出現する固有で新規の配列に相当する。したがって、それらは、これらの有益な株を同定する手段を提供する。さらに、それらは、植物種と交差反応しないプライマーを用いた検出を受け入れやすいことが判明している。
【００４８】
さらに、株は宿主植物細胞内で細胞内にコロニー形成し得るため、それらは植物全体にわたり効果的に移動できる。本発明のキットは、発芽後の若齢段階におけるＧｄによるコロニー形成の評価を提供し、その効率をチェックするために使用され得る。これにより、農業者はコロニー形成の存在および程度、ならびに必要に応じてどの程度の化学肥料を施用する必要があるかについての「情報に基づく決定」を下せるようになる。この追加の安全保障レベルは、自然および農作物に優しい肥料をＧｄの形態で使用しているときでさえ、作物が良く管理されているという「保証」を農業者に提供する。
【００４９】
特定の実施形態では、キットは、配列番号１〜１０の前記核酸配列の例えば１０個まで、例えば５個まで、または３個までなど、配列番号１〜１０の核酸配列の１つまたは複数の存在を判定する手段を含んでなってもよい。このようにして、検出された株が有益な株と同様のまたは実質的に同様の株であることを確実にする、信頼できる診断キットが提供される。同様の株は、例えば変異の結果として、配列の１つまたは複数が異なる場合でさえも検出されるであろう。
【００５０】
好ましい株はプラスミドを含有するようであり、したがって、例えば市販のプラスミド単離キットを用いた単離によるプラスミド検出が有益な株の同定のさらなる確認を提供し得る。特に、同定された任意のプラスミドは、サイズが例えば約１７５６６ｂｐなどの２７４５５ｂｐ未満であるべきである。プラスミドの存在、特にそのサイズは、プラスミドを欠いていると報告されている以前から知られているＧｄの株ＵＡＰ５５４１と異なる（Ｌｕｉｓ  Ｅ．Ｆｕｅｎｔｅｓ−Ｒａｍｉｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ２９（１９９９）１１７−１２８）。さらに、プラスミドのサイズは、単一のプラスミドを含有するＰＡＬ５株に関してこれまでに報告されているサイズよりも小さい。
【００５１】
このプラスミドは、特にＥｃｏＲＩ制限酵素の手段によって切断されて、約１２ｋｂおよび約５．６ｋｂの２つの断片を生じ得る。
【００５２】
診断キットは、例えばＧｄ種に特徴的な２つまたは３つの核酸配列など、Ｇｄ種に特徴的な少なくとも１つの核酸配列の存在を判定するための手段をさらに含んでなってもよい。このようにして、キットは、サンプル中にいくらかのＧｄが存在することの確認を提供し、したがって試験の正確性を裏付ける。サンプルがＧｄを含有することが知られている場合、この判定における陽性結果は、試験が効果的に実行されたことを確認する「対照」として機能する。適切な特異的株は、一般にＧｄ種に見いだされる配列であるが、他の種には見いだされず、特に他の微生物種または少なくともいくつかの植物、特にＧｄ処理の標的にされ得る植物には見いだされない。
【００５３】
このような配列の特定の例は、下の表２に配列番号１１〜１３として示される。特に、Ｇｄ種を検出するために使用されるこれらの核酸配列は、植物種と交差反応することなく、一連の作物に存在するＧｄ種の検出に修正可能であることが判明している。
【００５４】
さらに、キットは、本発明の株に見いだされない配列を検出するための手段を含んでなり、陰性対照を提供し得る。このような配列の例は、配列番号６５〜６８として示される。さらなる実施形態では、キットは、植物ＤＮＡから普遍的に増幅する葉緑体特異的核酸など、植物特異的核酸配列の存在を検出するための手段を含んでなる。このような手段は、Ｇｄ不在下であってさえも検出可能なシグナルを生じるため、このような手段の組み入れは、キットが植物種内のＧｄ検出に関連して使用される場合に対照として機能する。このシグナルが出なければ、Ｇｄが存在しないのでなく、試験の失敗が示唆される。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販される特定の葉緑体プライマーセットである。Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘとしての製品は、Ｄｅｍｅｓｕｒｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ４：１２９−１３１の開示に基づく。
【００５５】
核酸配列の存在を検出するための手段は、当技術分野で理解されるように様々な形態を取り得る。
【００５６】
核酸が発現される遺伝子である場合、キットは、発現されるタンパク質を検出するための手段を含んでなってもよい。このような手段は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ技術などのタンパク質に特異的な抗体を利用してタンパク質を固定化および／または検出する免疫化学分析；またはウエスタンブロット法などの免疫電気泳動法などの特異的タンパク質試験を含み得る。
【００５７】
しかし、特定の好ましい実施形態では、本発明のキットは、特異的核酸自体を検出するための手段を含んでなる。
【００５８】
特に、核酸は、核酸のハプテン化形態に対して生じさせた抗体を用いる、核酸結合アッセイおよび免疫測定法を含む利用可能な技術のいずれかを用いて検出され得る。しかし、特定の実施形態では、検出は核酸増幅反応を伴い、したがって、特にキットは、検出されるそのまたは各核酸配列を標的化する１つもしくは複数の増幅プライマーを含んでなる。
【００５９】
当業者に理解されるように、増幅反応を用いて配列の検出を実施する場合、配列全体を増幅する必要はなく、例えば、少なくとも１０塩基対および適切には少なくとも５０塩基対の断片などの配列全体の特徴的な断片が増幅される。したがって、増幅され得る配列のサイズは、１０〜３０７０塩基対、適切には２０〜２０００塩基対、例えば５０〜５００塩基対、例えば１００〜３００塩基対の範囲内であり得る。断片のサイズは、使用される検出反応の性質に左右されるが、それは生成物が配列番号１〜１０または上で定義されるような変異型に特徴的であり、したがって他の配列、特に植物配列に存在しないことを確実にするのに十分であるべきである。２つ以上の配列が増幅される場合、サイズに基づく分離または融点分析などの技術を使用した検出中、それらが容易に区別され得るように、それらは異なるサイズであるように選択され得る。
【００６０】
必要に応じて、キットは、核酸増幅反応を実施するのに必要な１つまたは複数の追加的な試薬をさらに含んでなってもよい。したがって、それは、当該技術分野で理解されるように、ポリメラーゼなどの酵素、マグネシウム塩またはマンガン塩などの塩、緩衝液、およびヌクレオチドを含み得る。
【００６１】
キットは、必要に応じて、増幅産物を検出するための手段を含み得る。このような手段としては、染料またはプローブ、特にプライマーを仲介する標的配列に結合する標識されたプローブが挙げられる。代替的に、プライマー自体を標識して検出を容易にし得る。
【００６２】
適切な核増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの熱循環を利用する反応；ならびに核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの等温増幅反応；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）；ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）およびローリングサークル増幅；３ＳＲ；分枝増幅（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（２００１）６  Ｎｏ２，ｐ１４１−１５０によって記載されるような）；リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＴｗｉｓｔＤｘから入手できる）などが挙げられる特定の実施形態では、核酸増幅は、ＰＣＲであり、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）であり得、コロニー形成の程度に関する情報を提供し得る。
【００６３】
代替の実施形態では、増幅はＬＡＭＰ反応である。ＬＡＭＰアッセイは、標的配列の６つの異なる領域を標的とするように設計された、少なくとも４つ、適切には６つのプライマーを利用する。２つの外部プライマー（Ｆ３およびＢ３）と２つの内部プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）が常に存在する。任意選択的に、さらに２つのループプライマー（ＦＬｏｏｐおよびＢＬｏｏｐ）がある。ループプライマーの使用は、通常、増幅時間を短縮し、アッセイの特異性を増加させる。ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーは、鋳型配列のＦ２ｃ領域に相補的なＦ２と、鋳型のＦ１領域と同一であるＦ１ｃとからなる。問題のないＬＡＭＰプライマー設計を保証するために、Ｆ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、およびＢ３プライマーでは５５〜６５℃、ＦＬｏｏｐおよびＢＬｏｏｐでは≧６５℃を所与とするプライマーの融解温度（Ｔｍ）；プライマー配列中の５０〜６０％のＧＣ含量；二次構造の形成の欠如および各プライマー末端における安定性；最後にプライマー領域間の距離の４つの主な特徴が検討されなくてはならない。適切なＬＡＭＰプライマーセットの例は以下で開示される。
【００６４】
増幅反応産物の存在は、任意の利用可能な技術を用いて判定され得る。したがって、それらは、アガロースゲル電気泳動など、生成物がサイズおよび／または電荷に基づいてゲル上で分離され検出される技術を含み得る。代替的に、それらは、例えば挿入染料または標識されたプローブまたはプライマーを使用して原位置で検出され得る。多様なシグナル伝達および検出システムを用いた増幅産物の検出が知られている。これらのシステムの多くは「リアルタイム」で操作され得、増幅の進行につれてその進捗をモニタリングできるようにし、生成物を定量化できるようにする。多くのこのようなシステムは、標識、特に蛍光標識を使用するが、それは、増幅システムで使用されるプライマーおよびプローブなどの要素に結合し、シグナル伝達の基礎として蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）に依存する。このような蛍光エネルギー移動の特定の形態は、シグナル生成のための蛍光共鳴エネルギー移動またはフォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。
【００６５】
商業的に使用されるこのようなプロセスの主な例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロセスであり、その中では、蛍光エネルギー供与体分子またはレポーターを含んでなる第１の標識と、蛍光エネルギー受容体分子またはクエンチャーを含んでなる第２の標識との両方を保有する、二重標識プローブがＰＣＲシステムに含まれる。プローブに結合すると、これらの分子は、供与体分子からの蛍光シグナルが受容体によって消光されるように相互作用する。しかし、増幅反応中、プローブは標的配列に結合し、ポリメラーゼがＰＣＲで使用されるプライマーを伸長するにつれて消化される。プローブの消化は供与体分子と受容体分子との分離をもたらし、それらはもはや相互作用しなくなる。このようにして、受容体の消光効果が排除され、したがって分子からの発光が変化する。この発光の変化をモニタリングし、増幅反応の進行に関連付けることができる。
【００６６】
２つ以上の核酸配列が検出される場合、キットは、例えばプライマーの個々のセットなど、複数の別々の増幅反応を実施するのに十分な構成要素を含んでなってもよい。しかし、好ましくは、キットは、多重反応を実施するように設定され、そこでは複数の標的が単一反応において検出され得る。ゲル電気泳動を用いて検出が行なわれる場合、プライマーは、それらがアガロースゲル上でまたはＤＮＡ挿入色素などのシグナル伝達試薬を用いた融点分析によって容易に分離および同定され得るように、各増幅産物が顕著に異なるサイズまたは電荷を有するように適切に選択される。
【００６７】
代替的に、検出システムが標識を含む場合、例えば、プライマーまたはプローブ上に提供される任意の標識が、例えば、放出シグナルの波長に基づいて、および／または生成物が異なる融点またはアニーリング温度を有するという事実に基づいて、他のプライマーセットと異なる区別可能なシグナルを提供し、それは、生成物の融点分析を実施することによって区別され得る。
【００６８】
特にＰＣＲ増幅のための適切な増幅プライマーは、それらが生じる生成物のおよそのサイズと共に下の表３に示されるものから選択される。
【００６９】
【表１】
2018522559.tif 000002
【００７０】
配列番号１４〜３３によって表されるプライマーセットは、有益なＧｄの株のための有用な株特異的プライマーとして機能することが判明している一方、配列番号３４〜３９で表されるプライマーセットは、有用なＧｄ種特異的プライマーとして機能する。
【００７１】
このキットは、植物細胞に細胞内コロニー形成できるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）株のサンプル中における存在を判定する方法で使用され得、前記方法は、前記サンプル中で、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つの核酸配列を検出するステップを含んでなる。
【００７２】
適切には１０個まで、例えば５個まで、例えば約３個までの配列番号１〜１０の前記核酸配列が検出される。
【００７３】
方法は、上記のように、配列番号１１〜１３の核酸配列のようなＧｄ種に特徴的な少なくとも１つの核酸を検出するステップをさらに含んでなってもよい。この場合にも、必要に応じて２つ以上のこのような種特異的核酸配列が検出され得る。
【００７４】
さらに、方法は、検査中の特定のＧｄコロニー形成植物の特徴であり得るか、または反応の対照として葉緑体特異的核酸配列などの植物に普遍的に存在し得る植物特異的核酸配列を検出するステップをさらに含んでなってもよい。
【００７５】
様々な検出方法が、上記のような方法、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅反応を含んでなる方法で使用され得る。
【００７６】
適切なプライマーは上記の通りである。
【００７７】
本発明の方法において使用され得るサンプルは、Ｇｄの株を含有するか、または含有することが疑われる任意のサンプルであり得る。これとしては、所望のＧｄの株を含有し得る培養物または研究サンプルが挙げられる。代替的に、それらは、例えば機械的、化学的または超音波手段を用いて細胞溶解を引き起こすことにより、それから核酸が放出される、葉、茎または根のサンプルを含む植物サンプルを含んでなってもよい。特に、サンプルは、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）株が以前に適用された植物からのものである。このようにして、Ｇｄによる植物の問題のないコロニー形成が確認され得る。
【００７８】
典型的には、このような試験は実験室で実施されるが、可動式ＰＣＲ装置などの適切な装置が利用可能な場合、または側方流動装置上で実施され得るＥＬＩＳＡなどの技術を使用する特定のタンパク質標的における標的の検出が用いられる場合、例えば圃場条件における移動試験が実施され得る。
【００７９】
ここで、次のように説明される添付図面を参照して、例として本発明を具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】表３のプライマーセットＡ〜Ｈ（図１Ａでそれぞれレーン４、５、６、７、８、９、１２、および１３に示される）、および図１Ｂでそれぞれレーン４、５、９、１２、および１３に示される表３のＩ〜Ｍを含む、株または種特異的であるように設計された範囲からのＰＣＲ産物を示すゲルである。
【図２】（１）Ａｂｉｌｉｔｙ変種ＯＳＲ、（２）Ｅｘｔｒｏｖｅｒｔ変種ＯＳＲ、（３）Ｖａｌｅｎｃｉａ変種イネ、（４）Ｗｉｌｌｏｗ変種小麦、（５）Ａｂｅｒｇｌｙｎ変種草、（６）Ｄｉｃｋｅｎｓ変種草、（７）トウモロコシ、（８）キノア、（９）Ｃｏｌｕｍｂｉａ変種シロイヌナズナ、（１０）Ｃｈａｐｅａｕｘ変種大麦、（１１）Ｔｗｙｓｔａｒ変種草、（１２）Ｊ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｗｉｃｋｅｔ変種草、（１３）ジャガイモ、および（１４）トマトの１００ｎｇとの反応物の接種に続く、プライマーセットＥを用いたＰＣＲ産物を示すゲルである。レーン（１５）は、Ｇｄに由来する１０ｎｇのゲノムＤＮＡから生成されたアンプリコンを含有し、（１６）はいかなる鋳型ＰＣＲ対照も含有せず、ゲルの各末端の分子量マーカーはハイパーラダー１ｋｂプラス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）である。
【図３】（１）１ｎｇ、（２）１００ピコグラム、（３）１０ピコグラム、（４）１ピコグラム、（５）１００フェムトグラム、（６）１０フェムトグラム、および（７）皆無の添加されたＧｄ由来ゲノムＤＮＡと同時接種されたＯＳＲ  Ａｂｉｌｉｔｙ変種からの１００ｎｇのＤＮＡを含有する反応物における、プライマーセットＢを用いた感度ＰＣＲを示すゲルである。レーン（８）は、鋳型なしの対照サンプルであり、ゲルの各末端の分子量マーカーはハイパーラダー１ｋｂプラス（Ｂｉｏｌｉｎｅ）である。
【図４】（Ａ）Ｇｅｎｉｅ  ＩＩリアルタイム装置および本発明を具現するプライマーセットを用いた、蛍光灯によるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の正の増幅を示すグラフである。正のＤＮＡ増幅は蛍光シグナルによって検出され、（Ｂ）ＬＡＭＰによる増幅に続くグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）サンプルのアニール曲線；反応はアニール分析にかけられ、ｄｓＤＮＡが再アニールする温度は蛍光のバーストとして検出される。
【図５】ＧＤ  ＤＮＡ含有サンプルの連続希釈を用いて実施した場合における、本発明による配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施されたＱＰＣＲ実験の代表的な結果を示すグラフであり、下で定義されるように、（Ａ）は、配列番号５８および５９についてＰ５と命名されたプライマーセットの結果を示し、（Ｂ）は、配列番号６０および６１についてＰ８と命名されたプライマーセットの結果を示し、（Ｃ）は、配列番号６２および６３についてＰ１７と命名されたプライマーセットの結果を示す。
【図６】ＧＤ  ＤＮＡおよび植物ゲノムのＤＮＡを含有するサンプルの連続希釈を用いて実施した場合における、本発明による配列を増幅するように設計されたプライマーを使用して実施されたＱＰＣＲ実験の代表的な結果を示すグラフであり、（Ａ）は、小麦ＤＮＡの存在下におけるＰ５と命名されたプライマーセットの結果を示し、（Ｂ）は、全てのサンプルについて（Ａ）の生成物の融解ピークグラフ（すなわち、小麦ゲノムおよび妥当な対照の存在下におけるＧｄの希釈）を示し、（Ｃ）は、（Ａ）からの対照の融解ピークグラフを示し、Ｇｄ  ＤＮＡのみを含んでなる陽性対照はシグナルを生じ、植物ＤＮＡのみを含んでなる陰性対照およびＱＰＣＲ陰性サンプルのみを含んでなる陰性対照（ＮＴＣ−転写なし対照）は、いずれもシグナルを生じず、（Ｄ）は、トウモロコシＤＮＡの存在下で以下に定義されるＰ１７と称されるプライマーセットについての結果を示し、（Ｅ）は、試験した全てのサンプルについて（Ｄ）の生成物の融解ピークグラフ（すなわち、トウモロコシゲノムおよび妥当な対照の存在下におけるＧｄの希釈）を示し、（Ｆ）は、（Ｄ）からの対照の融解ピークグラフを示し、Ｇｄ  ＤＮＡのみを含んでなる陽性対照はシグナルを生じ、植物ＤＮＡのみを含んでなる陰性対照およびＱＰＣＲ陰性サンプルのみを含んでなる陰性対照（ＮＴＣ−転写なし対照）は、いずれもシグナルを生じなかった。
【図７】特定のＧＤ株（ＩＭＩ５０４８５３）から抽出されたプラスミドＤＮＡを示す、分離された１％アガロースゲルを示す。
【図８】ＥｃｏＲＩによる、Ｇｄの株（ＩＭＩ５０４８５３）由来のプラスミドＤＮＡの分離された１％アガロースゲル制限消化産物を示す。制限断片は、１ｋｂハイパーラダー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）との並列で試験される場合、１）約１２Ｋｂおよび２）約５．６Ｋｂとして言及され、そこではサイズ比較のためにラダーの最も近い断片が強調表示される。
【図９】圃場実験中に得られた小麦苗からＧｄを検出するためのＰＣＲ増幅から得られたアガロースゲルを示す。
【図１０】対照と比較した、本発明によるＧｄで処理された小麦のクロロフィル指数を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
しかし、本発明を実施するために特定の詳細が必要でないことは当業者に明らかであろう。以下の本発明の特定の実施形態の説明は、例証および説明の目的で提示される。それらは、網羅的であることまたは開示される精密な形態に本発明を限定することは意図されない。上記の教示を鑑みて、多数の修正形態および変更形態が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実用的応用を最適に説明するために提示されて説明され、それによって当業者らが、検討される特定用途に適するように様々な修正を加えて、本発明および様々な実施形態を最適に利用できるようにする。
【実施例】
【００８２】
実施例１
固有の配列の同定
特に有益な植物コロニー形成特性を有することが判明した継代ＵＡＰ５５４１由来のＧｄ株であるＩＭＩ５０４８５３を単離し、完全ゲノム配列決定した。標準的な方法を用いて、基準株の公的に入手可能なゲノム（ＰＡＬ５；ＪＧＩによる配列決定、米国（Ｇｅｎｂａｎｋ配列登録ＣＰ００１１８９））との比較を行った。
【００８３】
驚くべきことに、ゲノムには多数の相違が認められ、特にＩＭＩ５０４８５３のゲノムに存在するがＰＡＬ５に存在しない、いくつかの遺伝子が同定された。
【００８４】
これらの遺伝子の多くは、関連機能と共にアノテートされた。アノテーション付きの固有の遺伝子は、ＮＣＢＩのウェブベースＢＬＡＳＴツール（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、これまでに配列決定された全てのゲノムにわたる一意性についてさらに調べた。
【００８５】
ＢＬＡＳＴ結果の解析により、いかなるゲノムにも存在しない２０個の固有の遺伝子にリストが絞られた。これらの固有の遺伝子は、ＩＭＩ５０４８５３に「株特異的」なようであった。
【００８６】
また、５つのセットがＧｄ種に特有であることが判明し、以下では「種特異的」と称される（すなわち、ＩＭＩ５０４８５３、Ｐａ１５、および他のＧｄ株に存在するが、他種に存在しない）。
【００８７】
したがって、これらの配列の相違は株を特徴付けるようであり、ＩＭＩ５０４８５３および類似株のための診断キットを設計するために使用され得る。
【００８８】
実施例２
ＰＣＲ検証
ゲノムの解析で同定された配列に基づいて、２５種のプライマーセットの組を設計した。ＩＭＩ５０４８５３およびＰＡＬ５のゲノムＤＮＡを用いて従来のＰＣＲ反応を実施することで、これらの２５個のプライマーセット（２０個は系統特異的に設計され、５個は種特異的に設計された）の特異性を最初に試験した。ＩＭＩ５０４８５３の結果は図１に示される。結果は、３つの異なるコレクション（ＡＴＣＣ４９０３７、ＤＳＭ５６０１、およびＬＭＧ７６０３）から得られたＰＡＬ５由来の１６個の株特異的プライマーセットがＩＭＩ５０４８５３を描写することを示した。しかし、４つの推定上の株特異的プライマーセットは、少なくとも１つのＰＡＬ５と交差反応し、したがって株特異的研究から除去された。
【００８９】
５つの種特異的プライマーは全て予測されたように反応した。
【００９０】
さらに、上記の方法を用いて、１つは最初にＩｎｄｉａ（ＩＭＩ５０２３９８）から、もう１つはＭａｕｒｉｔｉｕｓ（ＩＭＩ５０２３９９）から単離されたＧｄの２つの別の株に対して、ならびにＵＡＰ５５４１株の復活させた２００１年の培養物（−８０℃でグリセロール中に保存）に対して株および種特異的プライマー試験を行った。種特異的プライマーセットの１つがより高い分子量のバンドを生じたため、データは、１６個の株特異的プライマーおよび４個の種特異的プライマーセットと一致した。これは驚くべき結果であった。
【００９１】
細菌ブロス培養液の連続希釈を使用して、２５個のプライマーセット（２０個の株特異的および５個の種特異的）の全ての検出感度を調べた。これらのセットのうちの２４個のセットが（１〜１０個の細菌細胞を要する）非常に高レベルの検出をもたらしたことが判明した。
【００９２】
さらに、社内で抽出されたＤＮＡを使用して、これらの２５個のプライマーをいくつかの標的植物種および変種との交差反応性について調べた。プライマーは、以下の植物種から抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲ反応で試験した：トウモロコシ、小麦（Ｗｉｌｌｏｗ変種）、キノア、イネ（Ｖａｌｅｎｃｉａ変種）、大麦（Ｃｈａｐｅａｕｘ変種）、ジャガイモ、シロイヌナズナ属（Ｃｏｌｕｍｂｉａ変種）、アブラナ（ＡｂｉｌｉｔｙおよびＥｘｔｒｏｖｅｒｔ変種）、および草（Ａｂｅｒｇｌｙｎ、Ｄｉｃｋｅｎｓ、ＪＰｒｅｍｉｅｒＷｉｃｋｅｔ、およびＴｗｙｓｔａｒ変種）。植物組織から核酸を単離する方法は、葉材料の機械的浸軟と、それに続く修正ＣＴＡＢ抽出とを伴った（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，１９８７  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．，１９：１１−１５）。簡潔に述べると、ＳＤＳおよびＣＴＡＢを使用して細胞膜を破壊し、その内容物を放出させ、プロテイナーゼＫおよびβ−メルカプトエタノールを使用して細胞タンパク質を分解または変性させた。抽出緩衝液はまた、植物ポリフェノールを除去するためのＰＶＰＰ、金属イオンをキレート化するためのＥＤＴＡ、核酸構造を可溶化するための塩化ナトリウム、および緩衝液ｐＨを安定化させるためのトリスＨＣｌも含有した。ＲＮアーゼＡ処理を用いてＲＮＡ分子を分解した。クロロホルム：イソアミル混合物（２４：１）を使用した不溶性細胞残骸の除去に続いて、酢酸ナトリウムを使用してエタノール中でデオキシ核酸を沈殿させ、希釈エタノールを使用して洗浄し、分子等級の水に再懸濁した。
【００９３】
例示的な結果を図２に示す。
【００９４】
同時に、前述の植物ゲノム１００ｎｇを含むＰＣＲ反応物と、１ｎｇから開始して６倍段階希釈されたＧｄからのゲノムＤＮＡとを同時接種することにより、プライマーの感度を試験した。ＰＣＲシステムの感度は、植物ゲノムの存在によって一般に影響を受けないことが判明し、日常的検出は、最低１ピコグラムのＧｄＤＮＡから確立された。
【００９５】
例示的な結果を図３に示す。結果は、２０個の株特異的プライマーセットのうちの１７個、および５個の種特異的セットのうちの３個が、試験された植物ゲノムと交差反応しないか、または少数と交差反応するが、異なるサイズおよび区別可能なサイズのＤＮＡ産物を産生することを示唆した。
【００９６】
株特異的プライマーセットのうちの１０個のみが（１）高い特異性を有し、（２）高感度を有し、（３）植物ＤＮＡとの交差反応を生じなかった。これらをプライマーセットＡ〜Ｊとして表３に示す。同様に、選択された種特異的プライマーセットのうちの３つのみが特異的かつ使用に十分に高感度であることが見いだされ、これらはそれぞれ表３にプライマーセットＫ〜Ｍとして示される。さらに、これらのプライマーを使用して得られた生成物のサイズが表３に示され、図１Ａおよび１Ｂに示される。したがって、これらのプライマーに基づく方法およびキットは、圃場状況において有益なＧｄを同定するのに特に有用である。
【００９７】
実施例３
ＬＡＭＰアッセイ
配列番号６、７、および９の領域を増幅するように一連のＬＡＭＰプライマーを設計し、下の表４に次のように示す。
【００９８】
【表２】
2018522559.tif 000003
【００９９】
配列番号４０〜４５は上記配列番号６を増幅するように設計し、配列番号４６〜５１は配列番号７を増幅するように設計し、配列番号５２〜５７は配列番号９を増幅するように設計した。
【０１００】
これらのプライマーは、修正ＣＴＡＢ法を用いて液体培養で増殖させた細菌から単離された、純粋なＧｄ  ＤＮＡを含んでなるサンプルについてのＬＡＭＰアッセイにおいて得られ、試験された。
【０１０１】
さらに、一連の植物病原菌および真菌由来のＤＮＡを、プライマーセットによるＬＡＭＰにおける増幅について試験した。これらは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、フルクトバチルス属（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、一連のフィトプラズマ、およびフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からの種を含む様々な真菌を含んだ。
【０１０２】
リアルタイムＬＡＭＰをＧｅｎｉｅ  ＩＩ装置（ＯｐｔｉＧｅｎｅ）上で実施して、１５μｌの等温マスター混合物ＩＳＯ−００１（ＯｐｔｉＧｅｎｅ）と、各２００ｎＭの外部プライマー（Ｆ３およびＢ３）と、各２μＭの内部プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）と、１μＭのループプライマー（ＦＬｏｏｐおよびＢＬｏｏｐ）とを含有する２４μｌの反応混合物に１μｌのサンプルを添加した。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応は、６３℃で３０分間の等温増幅からなった。生成物のアニーリング温度を評価するため、次に蛍光モニタリングをしながら、反応物を９５〜６８℃（０．０５℃／ｓ）の緩慢なアニーリング工程に供した。
【０１０３】
水からなる陰性反応対照も使用した。
【０１０４】
ＬＡＭＰで試験した３組のプライマーのうち、配列番号９に特異的な第３のプライマーセットは、８９．２℃におけるアニーリングで９．５分間内に増幅をもたらした（図４Ａを参照されたい）。配列番号６に特異的なプライマーセットは、およそ８８°Ｃにおけるアニーリングで陽性対照を１１分間前後で増幅し、配列番号７に特異的なプライマーセットは最も遅く、９０°Ｃ前後でのアニーリング温度で陽性対照を２３分間前後で増幅した。
【０１０５】
陽性Ｇｄ増幅をもたらすプライマーのセットは、全て細菌特異的であり、それらが試験された以外のいかなる細菌ＤＮＡおよび真菌ＤＮＡからも増幅しなかった。したがって、それらは全てＧｄ細菌の検出に使用されるプライマーセットとして適切である。
【０１０６】
実施例４
ＬＡＭＰを用いた植物サンプル上でのＧｄの検出
汚染された種子から迅速に抽出されたＤＮＡ上でプライマーを確認するために一連の実験を設定し、トマトおよび小麦の２つの植物種の種子の表面にＧｄ  ＤＮＡをスパイクした。次に、鋼製ビーズおよびＴＥ緩衝液を含有するプラスチック管にサンプルを入れて２分間激しく振盪する、２分間ＤＮＡ抽出技術でサンプルを処理した。次に、配列番号５２〜５７を含んでなるプライマーセットを使用して、２マイクロリットルの溶液を実施例４に記載されるようなＬＡＭＰ反応に入れて、これらのサンプルからのＧｄ  ＤＮＡの増幅を試験した。
【０１０７】
結果は、これらのアッセイを行ったとき、Ｇｄ  ＤＮＡが植物ＤＮＡのバックグラウンドに対して検出可能であることを示した。
【０１０８】
Ｇｄのための陰性任意サンプルがＬＡＭＰ増幅をサポートする（すなわち、それらがＬＡＭＰ反応の阻害剤を含まない）ことを確かめるために、宿主植物からＤＮＡを増幅する遺伝子シトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）プライマー（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９１：１４８−１５４．）を偽陰性のための対照として全てのサンプル上で使用した。
【０１０９】
実施例５
ＱＰＣＲ測定
一連のＱＰＣＲ反応をＧｄ（ＩＭＩ５０４８５３）由来の既知量のＤＮＡを含んでなるサンプル上で実施し、トウモロコシ、大麦、および小麦ゲノムＤＮＡを含む一連の作物種由来のサンプル上でも実施した。
【０１１０】
ＱＰＣＲ反応混合物は、１反応あたり２０μＬの容量に調製した。Ｇｄ  ＤＮＡ単独の場合、これらは、１０μＬのｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２Ｘ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、各１μＬの順方向プライマーおよび逆方向プライマー（１０μモルの最終濃度）、７μＬのＳＤＷ（滅菌蒸留水）、および必要な濃度の１μＬのＤＮＡ鋳型からなった。
【０１１１】
この場合に使用されたプライマーは、表５に示される通りであった。
【０１１２】
【表３】
2018522559.tif 000004
【０１１３】
配列番号５８および５９で表わされるプライマーセット（Ｐ５と命名される）は、配列番号３の１４９塩基対領域を増幅することを目的とし、配列番号６０および６１で表わされるプライマーセット１（Ｐ８と命名される）は、上記の配列番号６の１０４塩基対領域を増幅するように設計し、配列番号６２および６３で表わされるプライマー対（Ｐ１７と命名される）は、上記の配列番号１０の１３０塩基対領域を増幅するように設計した。
【０１１４】
熱サイクルは、Ｂｉｏ−ｒａｄからのＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ検出システムを用いて実施した。初期変性は９５℃で３分間実施し、増幅は、９５℃で５秒間の変性と、それに続く３０秒間の６０℃の４０サイクルとを用いて実施した（プレート読み取りは各増幅を提示した）。
【０１１５】
全てのプライマーセットは、３回の増幅反復試験の平均Ｃｑ値を示す表６に記載されるように、定量的には図５によって示されるように、良好な効率でＧｄ  ＤＮＡを増幅した。百分率効率は、式、％Ｅ＝［１０（−１／勾配）］−１×１００を用いて計算した。
【０１１６】
【表４】
2018522559.tif 000005
【０１１７】
交差反応性が存在するか否かを判定するために、ゲノム植物ＤＮＡの存在下で定量的増幅を実施した。いくつかの植物種との交差反応性がある一方、プライマー対Ｐ５は小麦および大麦ゲノムとの交差反応性を示さず、Ｐ８は小麦およびトウモロコシとの交差反応性を示さず、Ｐ１７は小麦およびトウモロコシのゲノムとの交差反応性を示さないことが分かり、これらを作物種のＧｄを検出するための潜在的に適切なプライマーセットにする。
【０１１８】
プライマーの効率および頑強性が植物ゲノムＤＮＡの存在下で維持されることを確実にするために、上記のＱＰＣＲの実施例を繰り返したが、この場合、組成を変化させ、６μＬのＳＤＷ（滅菌蒸留水）を１μＬの妥当なＧｄ希釈ＤＮＡ鋳型および１μＬの植物ゲノムＤＮＡ鋳型と一緒に使用した。例えば、Ｇｄ  ＤＮＡ（９２ｎｇ／μｌ）を小麦ＤＮＡ（７０．６ｎｇ／μｌ）またはトウモロコシＤＮＡ（１１１ｎｇ／μｌ）のいずれかと共に、１０−１から１０−７まで連続希釈し、増幅反応を上記のように実施した。
【０１１９】
代表的な結果を図６（Ａ）および（Ｃ）および表７に示す。
【０１２０】
【表５】
2018522559.tif 000006
【０１２１】
プライマーは植物ゲノムの存在下で効率を維持し、したがって検出キットの基礎を形成し得る。
【０１２２】
結果は、増幅後の融解分析を実施することで確認し、変成曲線（融解曲線）分析は、６０℃から９５℃まで０．５℃増分５秒／ステップで実施し、各増分後にプレート読み取りが続いた。
【０１２３】
結果の代表的な例を図６（Ｂ）および６（Ｅ）に示す。植物のゲノムＤＮＡのない、増幅されたＧｄ  ＤＮＡの明確な融解曲線が視覚化される。
【０１２４】
実施例６
プラスミド検出
Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（カタログ番号６９１０４）を用いて、Ｇｄ（ＩＭＩ５０４８５３）からのプラスミドＤＮＡ抽出を実施した。５ｍｌおよび１０ｍｌの４８時間細菌培養物を使用した低コピー数プラスミド抽出プロトコルが続いた。抽出したプラスミドは、１ｋｂのハイラダープラスが側面に位置する１％アガロースゲル上で泳動し（図７）、Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）を用いて画像化した。
【０１２５】
プラスミドＤＮＡと並んで、Ｇｄ（ＩＭＩ５０４８５３）のゲノムＤＮＡもレーン１に含まれた。図７に示される結果は、サイズが約１７．５Ｋｂの単一のプラスミドの存在を示唆し、これは、ＰＡＬ５に見いだされるプラスミドについて以前に報告されたものよりも小さい。
【０１２６】
プラスミドＤＮＡを配列決定し、Ｐｒｉｍｅｒ３を用いてプライマーを設計し（Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｉｍｅｒ３−ｎｅｗ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（１５）：ｅ１１５；Ｋｏｒｅｓｓａａｒ  ａｎｄ  Ｒｅｍｍ（２００７）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ３  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３（１０）：１２８９−９１）、線形シーケンスデータの開始点および終了点をカバーした（Ｐ＿Ｅｎｄ＿Ｆｗ−ＣＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＴＡ（配列番号６４）。このプライマー（配列番号６４）を使用してＳａｎｇａｒ配列決定を実施し、配列データを整列させてプラスミド配列が完全であることを確認した。
【０１２７】
その天然形態のプラスミドＤＮＡは環状であり、二次および三次構造を形成し得るため、これはアガロースゲルを使用するサイズ測定の精度に影響を及ぼし得る。結果を確認し、またプラスミドＤＮＡの配列決定も検証するために、ＮＥＢｃｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃ２．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ＮＥＢｃｕｔｔｅｒ２／）を用いてプラスミドの制限地図を調べた。制限消化は、プラスミドを直線化して単一の立体配座構造のみを提供する。また、制限酵素の選択は配列を調べた後に行われ、したがってプラスミド配列も検証できるようになる。ＩＭＩ５０４８５３プラスミドＤＮＡの場合、ＮＥＢ−ｃｕｔｔｅｒは、制限酵素ＥｃｏＲＩがプラスミドＤＮＡを  ３８６４〜９４６１ｂｐおよび９４６２〜３８６３ｂｐで消化して、５５９８ｂｐおよび１１９６８ｂｐのＤＮＡ断片を生じることを示した。いずれのサイズも実験室で利用可能な１Ｋｂハイパーラダープラス（Ｂｉｏｌｉｎｅカタログ番号ＢＩＯ−３３０６９）を使用して調べ得、標準ラダーの最大検出サイズの制限が取り除かれる。
【０１２８】
したがって、ＩＭＩ５０４８５３プラスミドでは、供給業者のプロトコルに従って二重カッターＥｃｏＲＩ（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１０８１９３６０）を使用して制限消化を実施した。制限消化後、バンドが分離するまで生成物を１％アガロースゲル上で泳動し、Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）を用いて画像化した。ＩＭＩ５０４８５３プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで制限した場合、予測されるサイズのＤＮＡの２つの断片（１．〜１２Ｋｂおよび２．〜５．６Ｋｂ）を生じた（図８）。
【０１２９】
これにより、サイズと配列との両方で配列決定データが検証された。それは、本発明の株の同定に使用されるキットとの関連で同定試験または検証的試験をさらに提供し得る。
【０１３０】
実施例７
ＩＭＩ５０４８５３の活性の例証
小麦（栽培種品Ｍｕｌｉｋａ）用いた圃場試験を設計し、バイオ肥料としてのＧｄ（ＩＭＩ５０４８５３）を試験した。Ｇｄ処理および対照（未処理）の２つの試験区にそれぞれ栽植した。発芽後、成長１０〜１２日目の幼若小麦苗を試料採取し、ＤＮＡ配列番号７に相当するプライマーＧ（配列番号２６および２７）を使用して、Ｇｄ存在について試験した。それぞれの陰性および陽性対照と共に１％アガロースゲル上でＰＣＲを分離すると、Ｇｄの存在が検出され（図９）、実環境下において、設計されたキットが良好に機能することが確認された。
【０１３１】
ＳＰＡＤメーターを用いたクロロフィル含有量、すなわち「緑色度」の測定は、全ての植物の健康状態および作物収穫量に相関することが示されている。ＳＰＡＤを用いて、成長段階３５および６１での作物をクロロフィル含有量について調べ、対照区画と比較して、Ｇｄ処理区画で統計的に有意（Ｐ＝０．００１）に見いだされた（図１０）。興味深いことに、ＳＰＡＤは、未処理対照と比較して、本発明のＧｄで処理した区画から得られた小麦からのクロロフィル含有量の有意な増加を示した（図１０）。これは、診断キットを使用して細菌存在が確認されたＧｄ処理区画がより健康な植物をもたらし、潜在的により高い収穫量をもたらすことを示唆する。小麦圃場試験からのデータは、バイオ肥料としてのＧｄの有効性を示唆する。
【０１３２】
実施例８
ＩＭＩ５０４８５３の使用の収穫量利益
未処理のおよび約１０５〜１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度のＩＭＩ５０４８５３を含んでなる配合物で処理された茎葉飼料トウモロコシ種子を２つの異なる場所に播種し、それぞれの特定の品種、地域、および土壌窒素利用可能性について、０〜１７５Ｋｇ／ｈａの範囲で、推奨される窒素肥料の割合を変えて施肥した。収穫量の結果は、収穫量のペナルティを受けない、４０〜９５％の窒素肥料の全体的な潜在的減少を示した。Ｎレベル全体にわたる平均収穫量利益は、７％〜２１％の収穫量の増加をもたらした。したがって、完全推奨Ｎ肥料率では、ＩＭＩ５０４８５３処理作物は、トウモロコシにおいて１トン／ｈａまでの収穫量利益を提供し得る。
【０１３３】
別の試験では、未処理のまたは約１０５〜１０７ｃｆｕ／ｍｌ１の濃度のＩＭＩ５０４８５３を含む処方物で処理した春小麦種子を春に播種した。作物は、品種、地域、および土壌窒素利用可能性に基づいて、０〜１２５Ｋｇ／ｈａ−１の推奨窒素肥料率の様々な割合で施肥した。全ての肥料レベルにわたって、ＩＭＩ５０４８５３処理作物は１５％の平均収量増加を示したが、皆無の窒素肥料および完全窒素肥料では、この増加はそれぞれ２０％および１０％であった。結果は、ＩＭＩ５０４８５３処理作物では、Ｎ施肥量を最大８５％まで減らしてもなお、完全施肥作物と同じ収穫量を達成することが可能であることを示唆する。
【０１３４】
【表６】
2018522559.tif 000007
【０１３５】
【表７】
2018522559.tif 000008
【０１３６】
【表８】
2018522559.tif 000009
【０１３７】
【表９】
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【０１３８】
【表１０】
2018522559.tif 000011
【０１３９】
【表１１】
2018522559.tif 000012
【０１４０】
【表１２】
2018522559.tif 000013
【０１４１】
【表１３】
2018522559.tif 000014
【０１４２】
【表１４】
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【０１４３】
【表１５】
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【０１４４】
【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2018522559.tif 000033
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