(57)【要約】  バイオセンサーは、基質と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を含み、酵素は、標的分子の結合に応答して触媒不活性状態から触媒活性状態に切替え可能であるように操作されている。標的分子を検出する方法であって、酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼが、酵素が標的分子の結合に応答して触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替わった結果として、基質と反応して１つまたは複数の電子を生じさせる、方法を提供する。
2018518168.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および前記酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持する少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列を含むバイオセンサーであって、前記異種センサーアミノ酸配列が、標的分子に応答して前記酵素の前記アミノ酸配列を前記触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える、バイオセンサー。
【請求項２】
前記少なくとも１つの酵素アミノ酸配列および前記少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列が、単一の連続したアミノ酸配列に存在するか、またはその少なくとも一部分を形成する、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列が、前記少なくとも１つの酵素アミノ酸配列内の挿入物であり、それによって前記酵素アミノ酸配列の前記触媒不活性状態と前記触媒活性状態との切替えを促進する、請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記異種センサーアミノ酸配列が、前記標的分子に結合し、それによって前記酵素の前記アミノ酸配列を前記触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える、請求項１から３のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記異種センサーアミノ酸配列が、カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列またはそのフラグメントである、請求項１から４のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記カルシウム結合タンパク質がカルモジュリンである、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および前記酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含むバイオセンサーであって、標的分子に応答して前記酵素の前記アミノ酸配列を前記触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替えるバイオセンサー。
【請求項８】
前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列が、１つまたは複数のアミノ酸配列突然変異を含むように操作されている、請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる前記酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と、前記酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列とが、非共有結合によって相互作用する、請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列を置き換えることができる、前記酵素のさらに別のアミノ酸配列をさらに含む、請求項９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
置き換えが、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列を、基質と反応することができる前記酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と非共有結合によって組み合わせて機能性触媒活性酵素を形成することによって、前記酵素の触媒活性を回復させる、請求項１０に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列、および基質と反応することができる前記酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列が、標的分子に結合することによって相互作用することができるそれぞれの結合部分を含み、前記さらに別のアミノ酸配列による前記操作されたアミノ酸配列の前記置き換えを促進する、請求項１０または請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記酵素の前記操作されたアミノ酸配列、および基質と反応することができる前記酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列が、最初に相互作用するそれぞれの結合部分を含み、前記相互作用がその後、標的分子に結合した前記結合部分の一方または他方によって中断されて、前記さらに別のアミノ酸配列による前記操作されたアミノ酸配列の前記置き換えが促進される、請求項１０または請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列が、前記酵素の第１のフラグメント配列を表し、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列または前記さらに別のアミノ酸配列が、前記酵素の第２のフラグメント配列を表し、前記第１のフラグメント配列および前記第２のフラグメント配列が、非共有結合によって相互作用して、安定した酵素を再構成することができる、請求項７から１３のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
プロテアーゼ標的分子を検出するのに適しており、前記酵素の前記アミノ酸配列内に１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトを含み、場合によっては、前記アミノ酸配列が、前記プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含む、請求項７から１４のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
基質と反応することができる前記酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列、および前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列が、これらの間の結合の阻害剤のプロテアーゼ切断後に相互作用することができるそれぞれの結合部分を含む、請求項１５に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；標的分子に結合することができる結合部分；および前記標的分子の非存在下で前記結合部分と相互作用し、それによって前記酵素を阻害することができる少なくとも１つの酵素阻害剤を含むバイオセンサーであって、前記標的分子が、前記少なくとも１つの酵素阻害剤と前記結合部分との前記相互作用を解放し、それによって前記阻害剤による前記酵素の阻害を解放し、前記酵素の前記アミノ酸配列を前記触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替えることができるように配置されているバイオセンサー。
【請求項１８】
触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトによって前記酵素に連結またはカップリングした前記酵素の阻害剤；および第１の成分結合部分を含む第１の成分；前記第１の成分結合部分に結合することができる第２の成分結合部分；プロテアーゼアミノ酸配列；および標的分子に結合することができる別の第２の成分結合部分を含む第２の成分；ならびに前記標的分子の非存在下で前記第２の成分結合部分と相互作用することができる第３の成分結合部分を含む第３の成分を含み、前記標的分子が、前記第３の成分結合部分と前記第２の成分結合部分との結合を解離させて、前記第１の成分結合部分と前記第２の成分結合部分との相互作用を促進することによって、プロテアーゼが、前記プロテアーゼ切断サイトを切断して前記阻害剤による前記酵素の阻害を除去し、それによって前記酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えることができるように配置されている、請求項１７に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
前記プロテアーゼ切断サイトの近くに位置する、前記プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含む、請求項１８に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記第３の成分結合部分が、前記第２の成分結合部分の一方と相互作用することができる第１の部位、および前記標的分子の非存在下で前記第２の成分結合部分の他方と相互作用することができる第２の部位を含む、請求項１８または１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
前記第２の成分結合部分の前記他方による前記標的分子の結合が、前記第３の成分の前記第２の部位の結合を阻害する、請求項２０に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
前記酵素が、酸化還元酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ酵素である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
標的分子に応答性である異種センサーアミノ酸配列を含むグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素であって、前記標的分子の結合が前記酵素の触媒活性を調節するように働く、ＧＤＨ酵素。
【請求項２４】
前記異種センサーアミノ酸配列が、カルシウム結合タンパク質またはその機能性フラグメントのアミノ酸配列である、請求項２３に記載のＧＤＨ酵素。
【請求項２５】
酵素の触媒活性を阻止または低減するように働く阻害部分を含む酸化還元酵素であって、前記阻害部分が、１つまたは複数の分子の存在下で解離して前記酵素の触媒活性を活性化することができる、酸化還元酵素。
【請求項２６】
１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトを含み、プロテアーゼによる前記サイトの切断が、前記阻害部分を解離させて前記酵素の触媒活性を活性化し、場合によっては、前記プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含む、請求項２５に記載の酸化還元酵素。
【請求項２７】
さらなる分子上のそれぞれの結合部分と相互作用することができる結合部分を含み、前記結合部分間の相互作用が、前記阻害部分を解離させて前記酵素の触媒活性を活性化する、請求項２５または２６に記載の酸化還元酵素。
【請求項２８】
１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトを含み、前記さらなる分子が、プロテアーゼをさらに含み、前記結合部分間の相互作用が、前記プロテアーゼを前記サイトに接近させて前記サイトを切断し、前記阻害部分を解離させるように働く、請求項２７に記載の酸化還元酵素。
【請求項２９】
グルコースデヒドロゲナーゼ酵素である、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の酸化還元酵素。
【請求項３０】
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチドであって、前記酵素の第２のフラグメント配列を含むポリペプチドと非共有結合によって相互作用して、安定したＧＤＨ酵素を再構成することができるポリペプチド。
【請求項３１】
前記酵素の第２のフラグメント配列を含む前記ポリペプチドと、安定した触媒活性ＧＤＨ酵素を再構成することができる、請求項３０に記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチド。
【請求項３２】
前記再構成された安定したＧＤＨ酵素を触媒不活性にする１つまたは複数の突然変異を含む、請求項３０に記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチド。
【請求項３３】
前記酵素の第２のフラグメント配列を含む前記ポリペプチド内に含まれるそれぞれの結合部分と相互作用することができる結合部分を含み、前記結合部分間の前記相互作用が、前記再構成された安定したグルコースデヒドロゲナーゼ酵素の触媒活性を調節する、請求項３０から３２のいずれか一項に記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチド。
【請求項３４】
前記結合部分間の前記相互作用が、標的分子の結合によって調節される、請求項３３に記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチド。
【請求項３５】
前記それぞれの結合部分の相互作用を阻害する配列、および１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトをさらに含み、前記プロテアーゼによる切断により、前記結合部分間の相互作用が実現され、場合によっては、前記プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含む、請求項３３または３４に記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれかに記載のバイオセンサー、グルコースデヒドロゲナーゼ酵素、酸化還元酵素、またはグルコースデヒドロゲナーゼ酵素の第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを含む組成物またはキット。
【請求項３７】
基質分子をさらに含む、請求項３６に記載の組成物またはキット。
【請求項３８】
標的分子を検出する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載のバイオセンサー、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物を試料と接触させ、それによって前記試料中の前記標的分子の存在または非存在を判定するステップを含む方法。
【請求項３９】
哺乳動物においてパフォーマンス増強物質または違法薬物を検出するための、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
生物における疾患または状態の診断方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載のバイオセンサー、または請求項３６もしくは３７に記載の組成物を、前記生物から得られた生体試料と接触させ、それによって前記生体試料中の標的分子の存在または非存在を判定するステップを含み、前記標的分子の存在または非存在の判定により、前記疾患または前記状態の診断が容易になる、方法。
【請求項４１】
請求項１から２２のいずれか一項に記載のバイオセンサー、請求項２３もしくは２４に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の酸化還元酵素、または請求項３０から３５のいずれかに記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを含むセルまたはチャンバーを備える検出デバイス。
【請求項４２】
請求項１から２２のいずれか一項に記載のバイオセンサーもしくはその成分、請求項２３もしくは２４に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の酸化還元酵素、または請求項３０から３５のいずれかに記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列もしくは第２のフラグメント配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項４３】
請求項４２に記載の単離された核酸を含む遺伝的構築体。
【請求項４４】
請求項４３に記載の遺伝的構築体を含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質バイオセンサーもしくはその成分、請求項２３もしくは２４に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の酸化還元酵素、または請求項３０から３５のいずれかに記載のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列もしくは第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、請求項４４に記載の宿主細胞において前記組換えタンパク質バイオセンサーもしくはその成分、または前記ＧＤＨ酵素もしくは前記酸化還元酵素、またはＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列もしくは第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを産生させるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、バイオセンサーに関する。より詳細には、本発明は、電気化学バイオセンサーに関し、試料中の１つまたは複数の標的分子を検出するのに適している電気化学的に活性な酵素またはそのフラグメントに関する。バイオセンサー分子はまた、例えば人工細胞シグナリングネットワークの構築について、合成生物学の分野に関する場合がある。
【０００２】
背景
生体試料中の標的分子または分析物の検出は、健康および疾患の診断モニタリングにとって重要である。分析物の検出の重要な必要条件は、特に標的分子または分析物の、生体試料中の量または濃度が限られている場合、特異度および感度である。
【０００３】
典型的には、分析物に特異的に結合するモノクローナル抗体によって、特異度が与えられる。典型的には、特定の抗体に、または比較的低いレベルの分析物の検出を補助する二次抗体に結合する標識によって、感度が与えられる。このタイプの診断アプローチは周知となっており、酵素結合免疫吸着サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）形式で広く用いられるようになった。場合によっては、例えば、同じ反応を触媒するプロ酵素切断反応の生成物を用いることによって、酵素増幅が感度をより一層向上させ得る。そのような「自己触媒的な」酵素の一部の例として、トリプシノゲン、ペプシノゲン、または血液凝固第ＸＩＩ因子がある。しかしながら、特異度に関して、抗体は比較的高価であり、一部の分析物について、十分な特異度を持たせるのが困難な場合がある。ポリクローナル抗体も同じ欠点があり、大規模に生産して精製するのがより一層困難である。
【０００４】
予後目的または診断目的で、特定の標的分子および分析物を検出する現在の方法は、いくらかの制限を受け、これにより、臨床、術中、およびポイントオブケアの場面における広範囲の適用がかなり制限される。最も重要なことに、大多数の診断アッセイは、かなりのレベルの技術的専門知識、および一団の高価な、かつ特定の試薬（最も顕著にはモノクローナル抗体）、ならびに、専門のラボ環境以外では、滅多に利用可能でない精巧な生体医学的インフラを必要とする。例えば、ＥＬＩＳＡ（複雑な生体試料中の特定の分析物を検出するためのゴールドスタンダード）は、固体表面上での標的分析物の選択的捕捉に依存しており、これが今度は、標的分析物に特異的である第２の親和性試薬により検出される。ＥＬＩＳＡはまた、広範なインキュベーションステップおよび洗浄ステップを特徴としており、これらは一般に、時間を浪費し、標準化するのが困難であり、連続ステップの数によって頻繁に、様々な手順の全体にわたってかなりの変動が導入されるので、オペレーターおよびラボが定量的な比較をするのが困難となっている。
【０００５】
概要
本発明は、処置レジームと適合する短い時間スケールで、標的分子（例えば分析物）の存在または活性を容易に検出する、定量的な、比較的安価な、かつ容易に生産される分子バイオセンサーを開発する必要性に対応する。そのようなバイオセンサーは単独で、または複合的に適用されて、無関係な生理学的プロセスにおける遺伝的バックグラウンドおよび自然変異に関係なく、特異度が高く、かつ統計学的信頼が大きい分子表現型を確認かつ／または診断することができる。そのような分子バイオセンサーは、例えば標的分子または分析物が違法薬物またはパフォーマンス増強物質である、他の試験手順に用いられてもよい。
【０００６】
より詳細には、本発明は、診断結果を分析かつ伝達する電気デバイス、例えばポイントオブケアデバイスへの組込みに特に適した分子バイオセンサーを提供する。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、標的分子に対する特異度を有し、標的分子の検出に対して電気的応答をもたらすことができるバイオセンサー分子を提供することである。
【０００８】
広い一形態において、本発明は、基質と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素のアミノ酸配列を含むバイオセンサーであって、酵素は、標的分子の結合に応答して触媒不活性状態から触媒活性状態に切替え可能であるように操作されている、バイオセンサーに関する。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持する少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列を含むバイオセンサーであって、異種センサーアミノ酸配列は、標的分子に応答して酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える、バイオセンサーを提供する。ゆえに、異種センサーアミノ酸配列は、酵素の触媒活性を可逆的に調節する。異種センサーアミノ酸配列は、標的分子の存在下で解離し、それによって酵素を触媒的に活性化することができる。異種センサーアミノ酸配列は、酵素の触媒活性をアロステリックに調節することができる。
【００１０】
適切には、少なくとも１つの酵素アミノ酸配列および前記少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列は、単一の連続したアミノ酸配列に存在するか、またはその少なくとも一部分を形成する。
【００１１】
特定の実施形態において、前記少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列は、前記少なくとも１つの酵素アミノ酸配列内の挿入物であり、それによって酵素アミノ酸配列の前記触媒不活性状態と前記触媒活性状態との切替えを促進する。
【００１２】
適切には、異種センサーアミノ酸配列は、前記標的分子に結合し、それによって酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える。
【００１３】
一実施形態において、異種センサーアミノ酸配列は、カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列またはそのフラグメントである。特定の実施形態において、カルシウム結合タンパク質はカルモジュリンである。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含むバイオセンサーであって、標的分子に応答して酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替えるバイオセンサーを提供する。
【００１５】
適切には、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸配列突然変異を含むように操作されている。適切には、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と、酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列とは、非共有結合によって相互作用する。一実施形態において、この態様のバイオセンサーは、酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列を置き換えることができる、前記酵素のさらに別のアミノ酸配列を含む。典型的には、この置き換えは、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列を、基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と非共有結合によって組み合わせることで、機能性触媒活性酵素を形成することによって、酵素の触媒活性を回復させる。広い実施形態において、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列、および基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列は、例えば標的分子に結合することによって相互作用することができるそれぞれの結合部分を含み、前記さらに別のアミノ酸配列による操作されたアミノ酸配列の置き換えを促進する。
【００１６】
したがって、第２の態様の特定の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；第１の結合部分；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含む第１の成分；ならびに前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列および第２の結合部分を含む第２の成分を含むバイオセンサーであって、前記第１の結合部分と前記第２の結合部分との相互作用が、第２の成分の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の成分の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えを促進し、それによって第１の成分の酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【００１７】
別の広い実施形態において、前記酵素の前記操作されたアミノ酸配列、および基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列は、最初に相互作用するそれぞれの結合部分を含み、相互作用はその後、標的分子に結合した結合部分の一方または他方によって中断される。相互作用のこの中断により、前記さらに別のアミノ酸配列による操作されたアミノ酸配列の置き換えが促進される。
【００１８】
したがって、第２の態様の別の特定の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；第１の結合部分；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含む第１の成分；ならびに前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列および第２の結合部分を含む第２の成分を含むバイオセンサーであって；第１の結合部分または第２の結合部分に結合することができる標的分子によって、前記第１の結合部分と前記第２の結合部分との相互作用が解放されて、第２の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えが促進され、それによって第１の成分の酵素が触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替わるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【００１９】
別の広い実施形態において、第２の態様のバイオセンサーは、プロテアーゼ標的分子を検出するのに適しているので、典型的には、１つまたは複数、例えば２つまたは３つのプロテアーゼ切断サイトを含む。好ましくは、１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトは、操作されたアミノ酸配列を置き換えることができる、酵素の前記さらに別のアミノ酸配列に位置している。前記さらに別のアミノ酸配列は、プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含んでもよく、この配列は、プロテアーゼ切断サイトの近くに位置してもよい。
【００２０】
好ましくは、基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列、および酵素の前記さらに別のアミノ酸配列は、これらの間の結合の阻害剤のプロテアーゼ切断後に相互作用することができるそれぞれの結合部分を含む。この相互作用は、前記さらに別のアミノ酸配列による操作されたアミノ酸配列の置き換えを促進する。
【００２１】
したがって、第２の態様のさらに別の特定の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；第１の結合部分；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含む第１の成分；ならびに前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列、およびプロテアーゼ切断サイトによって阻害剤に連結または接続されている第２の結合部分を含む第２の成分を含むバイオセンサーであって、阻害剤が、第１の結合部分と第２の結合部分との相互作用を阻止または阻害し；前記阻害剤が、前記プロテアーゼ切断サイトを切断するプロテアーゼ標的分子によって解放されて、第１の結合部分と第２の結合部分との相互作用を促進して、第２の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えを促進し、それによって第１の成分の酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【００２２】
特定の実施形態において、阻害剤は、第１の結合部分と実質的に同じ分子である。
【００２３】
第３の態様において、本発明は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；標的分子に結合することができる結合部分；および標的分子の非存在下で結合部分と相互作用し、それによって酵素を阻害することができる少なくとも１つの酵素阻害剤を含むバイオセンサーであって、標的分子が、前記少なくとも１つの酵素阻害剤と結合部分との相互作用を解放し、それによって阻害剤による酵素の阻害を解放し、酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替えることができるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【００２４】
第３の態様の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；プロテアーゼ切断サイトによって酵素に連結またはカップリングした前記酵素の阻害剤；および第１の成分結合部分を含む第１の成分；第１の成分結合部分に結合することができる第２の成分結合部分；プロテアーゼアミノ酸配列；および標的分子に結合することができる別の第２の成分結合部分を含む第２の成分；ならびに標的分子の非存在下で前記第２の成分結合部分と相互作用することができる第３の成分結合部分を含む第３の成分を含むバイオセンサーであって、前記標的分子が、第３の成分結合部分と前記第２の成分結合部分との結合を解離させて、前記第１の成分結合部分と前記第２の成分結合部分との相互作用を促進することによって、プロテアーゼが、プロテアーゼ切断サイトを切断して阻害剤による酵素の阻害を除去し、それによって、酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えることができるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【００２５】
先の態様の全てにおいて、酵素は、酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ酵素であってよい。
【００２６】
本発明はさらに、標的分子に応答性である異種センサーアミノ酸配列を含む酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素であって、標的分子の結合が酵素の触媒活性を調節するように働く、酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を提供する。
【００２７】
本発明はまた、酵素の触媒活性を阻止または低減するように働く阻害部分を含む酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素であって、阻害部分が１つまたは複数の分子の存在下で解離して酵素の触媒活性を活性化し得る、酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を提供する。本発明はさらに、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチドであって、前記酵素の第２のフラグメント配列を含むポリペプチドと非共有結合によって相互作用して、安定したＧＤＨ酵素を再構成することができる、ポリペプチドを提供する。本発明の別の態様は、上述の態様のいずれかのバイオセンサー、酸化還元酵素、ＧＤＨ酵素、またはＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを含む組成物またはキットを提供する。組成物またはキットはさらに、基質分子を含んでよい。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、標的分子を検出する方法であって、上述の態様のいずれかのバイオセンサー、酸化還元酵素もしくはＧＤＨ酵素、またはＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを試料と接触させ、それによって試料中の標的分子の存在または非存在を判定するステップを含む、方法を提供する。
【００２９】
本発明のなおさらなる態様は、生物における疾患または状態の診断方法であって、上述の態様のいずれかのバイオセンサー、酸化還元酵素もしくはＧＤＨ酵素、またはＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを、生物から得られた生体試料と接触させ、それによって生体試料中の標的分子の存在または非存在を判定するステップを含み、標的分子の存在または非存在の判定により、疾患または状態の診断が容易になる、方法を提供する。
【００３０】
生物として、植物、ならびに魚類、鳥類、および哺乳動物、例えばヒトを含めた動物が挙げられ得る。
【００３１】
本発明のなおさらに別の態様は、上述の態様のいずれかのバイオセンサー、酸化還元酵素もしくはＧＤＨ酵素、またはＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを含むセルまたはチャンバーを備える検出デバイスを提供する。
【００３２】
適切には、試料は、セルまたはチャンバー中に導入され、それによって、標的分子の検出が容易にされ得る。
【００３３】
ある特定の実施形態において、検出デバイスは、標的分子の存在を示す電気化学的シグナル、音響シグナル、および／または光シグナルを提供することができる。
【００３４】
検出デバイスはさらに、
プロセッサー；および
プロセッサーにカップリングされたメモリーであって、プロセッサーによって実行された場合に、
診断試験結果を分析して、疾患または状態の診断を実現すること
を含む１セットの機能を実行するコンピュータ可読プログラムコードコンポーネントを備えるメモリー
を備えることによって、疾患診断を、診断標的結果から提供することができる。
【００３５】
検出デバイスはさらに、
プロセッサー；および
プロセッサーにカップリングされたメモリーであって、プロセッサーによって実行された場合に、
診断結果を受信デバイスに伝えることと；
場合によっては、疾患または状態の診断を、当該受信デバイス、または別の受信デバイスから受けることと
を含む１セットの機能を実行するコンピュータ可読プログラムコードコンポーネントを備えるメモリー
を備えることによって、診断試験結果を通信することを実現することができる。
【００３６】
本発明の関連した態様は、上述の態様のいずれかのバイオセンサーもしくはその成分、または本発明の酸化還元酵素もしくはＧＤＨ酵素、または本発明のＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列もしくは第２のフラグメント配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００３７】
本発明の別の関連した態様は、上述の態様の単離された核酸を含む遺伝的構築体を提供する。
【００３８】
本発明のさらに関連した態様は、上述の態様の遺伝的構築体を含む宿主細胞を提供する。
【００３９】
なおさらに関連した態様は、組換えタンパク質バイオセンサーもしくはその成分、または本発明の酸化還元酵素もしくはＧＤＨ酵素、またはＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列もしくは第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、前記方法は、先の態様の宿主細胞において組換えタンパク質バイオセンサーまたはその成分を産生させるステップを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１。アシネトバクター・カルコアセチカス（A. calcoaceticus）ＰＱＱ−ＧＤＨの構造およびカルモジュリン挿入サイトの同定。（Ａ）ＰＱＱおよびグルコースを有する複合体中の酵素のリボン描写。ＰＱＱ補因子を、ボールおよび棒の描写で示す一方、グルコースを、原子色（atomic color）で色付けている。結合したＣａ２＋を、空間を埋める物体として示している。βシートを、それぞれの数字で標示し、シート３のβ鎖を、文字によって標示している。鎖３Ａおよび鎖３Ｂを青色で色付けており、グルコースの配位に関与する活性サイト残基を、ボールおよび棒で示す。触媒的Ｈｉｓ１４４を、赤色で色付けている。（Ｂ）鎖Ａおよび鎖Ｂを接続しているループを示すＧＤＨの側面図である。構造は、Ａのように示し、かつ色付けている。
【図２】図２。Ｃａ２＋の濃度が異なるＰＱＱ−ＧＤＨ−ＣａＭ活性の分光測定分析。（Ａ）０．６ｍＭ電子メディエーターフェナジンメトサルフェートの存在下での、６０μＭ電子受容色素ジクロロフェノールインドフェノールの吸収の時間分解変化を、２０ｍＭグルコースおよび１ｎＭ  ＧＤＨ−ＣａＭの存在下で、６００ｎｍにて測定した。（Ｂ）Ａと同様であるが、３ｎＭ  ＧＤＨ−ＣａＭを用いて、濃度を増大させたＣａＣｌ２に曝した。（Ｃ）電気化学系におけるセンサーとしてのＧＤＨ−ＣａＭキメラの性能。主なプロット；Ｃａ２＋濃度の増大に対するＧＤＨ−ＣａＭクロノアンペロメトリック電極の応答。＋０．４Ｖにて５秒後に測定された電流対Ａｇ埋込み参照ストリップ（ＧＤＨ−ＣａＭが３００ｎＭで、ＰＭＳメディエーターが３ｍＭで、グルコースが５０ｍＭで存在）。挿入画のプロット；電流対＋０．４Ｖでの分極後の時間対Ａｇ埋込み参照ストリップ（２つの典型的なカルシウム濃度（０μＭおよび１００μＭ）にて）。（Ｄ）２０ｍＭグルコースおよび１．１ｍＭの特異的Ｃａ２＋キレーターＢＡＰＴＡの存在下での、３ｎＭ  ＧＤＨ−ＣａＭの観察された初期反応速度のプロット。実験は、（Ｂ）のように実行した。塗り潰された三角形は、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で滴定が実行された実験を示す。
【図３−１】図３。（Ａ）プロテアーゼ切断可能リンカーを介して、Abe K, et al. (2013)によって記載される阻害ペプチドＮＳＴＨＨＨＨＦＡＴＩＷ（配列番号５１）と連結した、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ。アッセイにおいて、０．３ｍＭ電子メディエーターフェナジンメトサルフェートの存在下での、１０μＭ電子受容色素ジクロロフェノールインドフェノールの吸収を、２０ｍＭグルコース、５０ｕＭ  ＣａＣｌ２、および２ｎＭ  ＧＤＨ−ＡＩの存在下で、６００ｎＭにて測定した。１０ｕＭ  ＴＶＭＶプロテアーゼを用いた。（Ｂ）ファージディスプレイによって同定された阻害ペプチドＳＨＤＩＨＹＭと、トロンビン切断可能リンカーを介して連結した、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ。アッセイにおいて、６０μＭジクロロフェノールインドフェノール、０．６ｍＭフェナジンメトサルフェート、２０ｍＭグルコース、５０ｕＭ  ＣａＣｌ２、５ｎＭ  ＧＤＨ−ＡＩ、および２０Ｕトロンビンを用いて、活性は（Ａ）のように測定した。（Ｃ）ＴＶＭＶ切断可能リンカーを介して阻害抗体フラグメントのＣ末端に融合されたピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼに基づくバイオセンサーの概略図。（Ｄ）異なる抗体ドメインを有するいくつかのバイオセンサーの活性分析。活性は（Ｂ）のように測定した。（Ｅ）２つの成分受容体構造の概略図であり、分析物媒介性スカフォールディング（scaffolding）相互作用による自動阻害ＧＤＨであるならば、プロテアーゼの活性または自己阻害バージョンを接近させる。（Ｆ）Ｅにおいて表される２つの成分受容体のラパマイシン媒介性活性化。このアッセイにおいて、１ｎＭ  ＧＤＨ−ＶＨ−ＦＫＢＰ１２、１５ｎＭ  ＦＲＢ−ＴＶＭＶを、１００ｎＭラパマイシンの存在下、および非存在下で、６０μＭジクロロフェノールインドフェノール、０．６ｍＭフェナジンメトサルフェート、５０ｕＭ  ＣａＣｌ２と、９０分間インキュベートした。２０ｍＭグルコースを加えた後に、６００ｎＭでの吸収をモニターした。（Ｇ）自動阻害ＧＤＨに基づく２つの可逆的成分バイオセンサー構造の概略図。この構造において、阻害ドメインは、リガンドペプチド、例えばカルモジュリン結合ペプチド、またはアフィニティークランプリガンドペプチドに融合されている。系の第２の成分は、結合ドメイン、例えばカルモジュリンまたはアフィニティークランプ結合ペプチドによって示す。リガンドによる双方の分子のスカフォールディングが、ＡＩのＧＤＨとの「タグ争い（tag of war）」相互作用をもたらし、その結合ドメインと融合したペプチドが、酵素の活性化をもたらす。（Ｈ）ＧＤＨのＡＩ形態に基づくバイオセンサー構造の概略図であり、ＧＤＨとＡＩと間のリンカーがリガンド結合ドメインを含有し、これは、リガンド結合後に立体構造変化を経験する。これにより、ＧＤＨの活性サイトからＡＩが取り除かれる。
【図３−２】（前記の通り。）
【図３−３】（前記の通り。）
【図４】図４。ＧＤＨ酵素分割サイトを利用して、電気化学バイオセンサーを作製する。反応条件は、１５ｎＭ  ＧＤＨ−ＦＲＢ、ＴＶＭＶサイトを有する１０ｎＭ  ＧＤＨ−ＦＫＢＰ、１ｍＭラパマイシン、１ｍＭ  ＴＶＭＶ、および１００ｍＭ  ＣａＣｌ２であった。
【図５−１】図５。分割ＧＤＨ酵素を含む電気化学バイオセンサーであり、操作された酵素不活化突然変異ドメイン（赤色）の、対応する活性ドメイン（緑色）による置き換えにより、ラパマイシンの検出が可能となる。（Ａ）結合部分は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰであり、ラパマイシンに結合する。典型的には、ＦＲＢは、ＦＫＢＰに結合して、ラパマイシンと結合する。反応条件は、１５ｎＭ  ＧＤＨ−ＦＲＢ、１０ｎＭ  ＧＤＨ−ＦＫＢＰ（ＴＶＭＶによってプレ切断されている）、１００μＭ  ＣａＣｌ２＋／−２０％血清であった。（Ｂ）免疫抑制薬物ＦＫ５０６（タクロリムス）の検出用の２つの成分系。バイオセンサー結合部分は、ＧＤＨの一方の活性成分に融合されたカルシニュリンＡ／Ｂヘテロダイマー、およびもう一方に融合されたＦＫＢＰを含む。右のプロットは、ラパマイシンおよびシクロスポリンＡの存在下または非存在下での、ＦＫ５０６によるセンサーの滴定を示す。（Ｃ）免疫抑制薬物シクロスポリンＡの検出用の２つの成分系。センサーは、ＧＤＨの一方の活性成分に融合されたカルシニュリンＡ／Ｂヘテロダイマー、およびもう一方に融合されたペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼで構成される。
【図５−２】（前記の通り。）
【図５−３】（前記の通り。）
【図６−１】図６。アミラーゼを検出するための、分割ＧＤＨ酵素を含む電気化学バイオセンサー。結合部分は、アミラーゼに結合する、ＶＨＨ１およびＶＨＨ２と呼ばれるラクダ科ＶＨＨ抗体である。反応条件は、２０ｎＭ  ＧＤＨ−ＶＨＨ１（ＰＤＢ：１ＫＸＶ由来）、１５ｎＭ  ＧＤＨ−ＶＨＨ２（ＰＤＢ：１ＢＶＮ由来）（ＴＶＭＶによってプレ切断されている）、および１００ｕＭ  ＣａＣｌ２であった。（Ｂ）アミラーゼバイオセンサーのクロノアンペロメトリック分析。  試料調製および反応条件は、以下の通りであった：ＡＭＹ−２  ＰＱＱ／ＴＶＭＶ混合物の調製：ＡＭＹ−２  ＰＱＱおよびＴＶＭＶ（５０μＭ  ＡＭＹ−２の２０μＬおよび５０μＭ  ＴＶＭＶの２０μＬ）のそれぞれ１アリコートを解凍した。ＴＶＭＶの４μＬを、ＡＭＹ−２  ＰＱＱの２０μＬと混合した（最終濃度８．３ｕＭ  ＴＶＭＶおよび４１．６μＭ  ＡＭＹ−２  ＰＱＱ）。これは、使用前に室温にて３．００時間保存した。バッファー：０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、４．２ｍＭ  ＫＣｌ、２．２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２。（Ａ）２５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＭＷ００３４／１、ｍｗ  １４７．０１）：５０μＭ  ＣａＣｌ２、バッファー中２．２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２：２５ｍＭ  ＣａＣｌ２の２０μＬ＋９．９８ｍＬバッファー。ＡＭＹ−１：１アリコート（２０μＬ、５０μＭ）を、使用直前に解凍した。（Ｂ）５００ｎＭ  ＡＭＹ−１：５０ｕＭ  ＡＭＹ−１の５μＬ＋（Ａ）の４９５μＬ。（Ｃ）４１６ｎＭ  ＡＭＹ−２  ＰＱＱ（８３ｎＭ  ＴＶＭＶ）：ＡＭＹ−２ＰＱＱ／ＴＶＭＶ混合物の５μＬ＋（Ａ）の４９５μＬ。ヒト唾液アルファアミラーゼ（ＭＷ００２２／１）：Ｓｉｇｍａ、Ａ１０３１、ロットＳＬＢＫ８７０８Ｖ由来。ＣｏｆＡは、試料が９％タンパク質であり、活性が８５２Ｕ／ｍｇであるとしている。アルファアミラーゼの分子量が５０ｋＤａであるとすれば、０．５５ｍｇ／ｍＬの固体は、１．０ｕＭアルファアミラーゼを含有する。２．４６ｕＭアルファアミラーゼ：０．７７６ｍＬ（Ａ）中０．００１０４ｇ（これは、使用直前に調製した）。１２３０ｎＭアルファアミラーゼ：２．４６μＭアミラーゼの０．５ｍＬ＋（Ａ）の０．５ｍＬ。１２３ｎＭアルファアミラーゼ：１２３０ｎＭアミラーゼの０．１ｍＬ＋（Ａ）の０．９ｍＬ。
【図６−２】（前記の通り。）
【図７】図７。操作された酵素不活化突然変異ドメイン（赤色）の過剰の添加による、自発的ＧＤＨ酵素再構成の引下げ。
【図８−１】図８。（Ａ）プロテアーゼ標的分子を検出するための電気化学バイオセンサー。Ｓ＝スカフォールディングドメイン結合部分：例えばＳＨ２ドメイン、ＰＤＺなど。Ｌ＝スカフォールディングドメインに結合するリガンドペプチド。プロテアーゼ標的分子の切断サイトが、中間体ＳとＬの間に位置しているので、切断により、活性ＧＤＨドメインにカップリングされたＬは、Ｓに結合して、対応する活性ＧＤＨドメイン（緑色）による、操作された酵素不活化突然変異ドメイン（赤色）の置き換えを促進することができる。（Ｂ）異なる濃度のトロンビン（上から下へ、０．０１３Ｕ／ｍｌ；０．１３Ｕ／ｍｌ；１．３Ｕ／ｍｌと進む）による、トロンビンセンサーの活性化。アッセイにおいて、０．６ｍＭ電子メディエーターフェナジンメトサルフェートの存在下での６０μＭ電子受容色素ジクロロフェノールインドフェノールの吸収を、２０ｍＭグルコース、５０μＭ  ＣａＣｌ２、１０ｎＭ  ＧＤＨ−Ｓ−Ｌ、および１５ｎＭ不活性ＧＤＨ−Ｌの存在下で、６００ｎｍにて測定した。（Ｃ）高親和性トロンビン結合ペプチドおよびトロンビン切断サイトを有するトロンビンセンサー。活性を、（Ｂ）のように測定したが、トロンビン濃度は、０．０００１３Ｕ／ｍｌ；０．００１３Ｕ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ；１６ｐＭ）；０．０１３Ｕ／ｍｌ（５ｎｇ／ｍｌ）；０．１３Ｕ／ｍｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）；１．３Ｕ／ｍｌ（５００ｎｇ／ｍｌ）であった。（Ｄ）２セットの高親和性トロンビン切断サイトを有するトロンビンセンサー。活性を、（Ｂ）のように測定したが、トロンビン濃度は、０．００１３Ｕ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ；１０ｐＭ）；０．０１３Ｕ／ｍｌ（５ｎｇ／ｍｌ）；０．１３Ｕ／ｍｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）；１．３Ｕ／ｍｌ（５００ｎｇ／ｍｌ）であった。（Ｅ）第Ｘａ因子の異なる濃度での、第Ｘａ因子センサーの活性。活性を、（Ｂ）のように測定したが、トロンビン濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ；０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌであった。（Ｆ）Ｅと同様であるが、３つの第Ｘａ因子切断サイトを含有するセンサーによった。活性を、（Ｂ）のように測定したが、トロンビン濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ；０．０１μｇ／ｍｌ；０．１μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；７μｇ／ｍｌであった。
【図８−２】（前記の通り。）
【図９】図９。違法薬物検出用の電気化学バイオセンサー。この実施形態において、標的分子は、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）である。結合部分は、カルモジュリン結合ペプチドにコンジュゲートしたＴＨＣである。
【図１０】図１０。違法薬物検出用の電気化学バイオセンサー。この実施形態において、標的分子は、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）である。結合部分は、ＴＨＣ抗体に競合的に結合するペプチドである。
【図１１】図１１。違法薬物検出用の電気化学バイオセンサー。この実施形態において、標的分子は、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）である。結合部分は、抗ＴＨＣ抗体に、そしてスカフォールディングドメインに競合的に結合するペプチドである。第３の成分は、プロテアーゼおよびスカフォールディングドメイン、例えばＳＨ２またはＰＤＺに融合されたＴＨＣ抗体を含む。
【図１２】図１２。電気化学バイオセンサーによって発生した電流の検出用の基本的な電子デバイスの概略図。
【図１３】図１３。ＧＤＨの代わりにＣａｍ−ＧＤＨバイオセンサーを含有するように再操作された市販のグルコースモニターの例。センサーは、ヒト唾液中のＣａ２＋の存在によって活性化した。
【図１４−１】図１４。電気化学バイオセンサーおよびその成分のアミノ酸配列（配列番号２〜１０、５３、５４）。ＧＤＨアミノ酸配列は二重下線が引かれており、結合部分アミノ酸配列は斜字であり、ＴＶＭＶ切断サイト（ＥＴＶＲＦＱＳ；配列番号１１）は太字である。ＧＤＨ突然変異体、ＧＤＨフラグメント、結合部分、プロテアーゼ切断サイトおよびプロテアーゼ結合サイト、ならびに阻害ペプチド（配列番号１２〜４９、５１、５２、および５５）のアミノ酸配列。
【図１４−２】（前記の通り。）
【図１４−３】（前記の通り。）
【図１４−４】（前記の通り。）
【図１４−５】（前記の通り。）
【図１４−６】（前記の通り。）
【図１４−７】（前記の通り。）
【図１４−８】（前記の通り。）
【図１４−９】（前記の通り。）
【図１４−１０】（前記の通り。）
【図１４−１１】（前記の通り。）
【００４１】
詳細な記載
本発明は、標的分子に応答して１つまたは複数の電子を生じさせ、または発生させることができるバイオセンサーを提供する。適切には、バイオセンサーは、触媒「不活性」状態と触媒「活性」状態との間で切替え可能である酵素または酵素フラグメントを含み、それによって、基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせる。ゆえに、本明細書中で提供されるのはまた、本明細書中に記載されるバイオセンサーの特徴を有する酵素および酵素フラグメントである。より詳細には、酵素または酵素フラグメントは、触媒「不活性」状態と触媒「活性」状態との切替えを可能にするように操作された酸化還元酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である。特定の一形態において、ＧＤＨ分子は、異種挿入物を有し、これが、標的分子に結合し、それによって立体構造が変化して酵素が活性化し得る。特定の別の形態において、ＧＤＨ分子は、活性部位、および操作された突然変異部位を含む「分割酵素」構築体であることで、バイオセンサーの１つまたは複数の結合部分による標的分子の結合により、操作された突然変異部位は、別の活性部位によって置き換えられて、それによって、ＧＤＨ酵素活性を再構成する。本明細書中で開示されるバイオセンサー分子は、分子診断において有効であり得、「標的分子」は、診断価値があり、または重要な、分析物または他の分子である。しかしながら、本明細書中に開示されるバイオセンサーの別の用途は、合成生物学における、多成分人工細胞シグナリングネットワークを構築する用途であってもよい。
【００４２】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、単数の不定冠詞であると解釈されるべきではなく、そうでなければ、不定冠詞が言及する１つ超または単一の対象よりも多いことを除外すると解釈されるべきでもないことが理解されよう。例えば、「１つの（ａ）」分子は、１つの分子、１つもしくは複数の分子、または複数の分子を含む。
【００４３】
文脈上別段の解釈を要する場合を除き、本明細書中で用いられる語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、明示される整数または整数の群の包含を意味し、他のあらゆる整数または整数の群の除外ではないことが理解されよう。
【００４４】
本発明の目的で、「単離された」とは、その本来の状態から取り出された、またはその他の場合には人の操作を受けた物質（例えば分子）を意味する。単離された物質は、その本来の状態で通常それに付随する成分を、実質的に、または本質的に含まなくてもよいし、人工的な状態においてその本来の状態で通常それに付随する成分と一緒にあるように操作されてもよい。単離されたタンパク質および核酸は、本来の形態であっても、化学的合成形態であっても、組換え形態であってもよい。
【００４５】
「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーを意味する。アミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよく、当該技術において十分に理解されているＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である。
【００４６】
「ペプチド」は、５０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００４７】
「ポリペプチド」は、５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００４８】
「酵素」は、１つまたは複数の基質分子に対する触媒活性を有するタンパク質である。適切には、酵素は、基質分子に対する触媒活性を示し、それによって、１つまたは複数の電子を生じさせることができる。一部の実施形態において、酵素は酸化還元酵素である。特定の一実施形態において、酵素はグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であり、基質分子はグルコースである。ゆえに、触媒活性は、実施例１に従って測定され得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性であってもよい。グルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＱＱ−ＧＤＨであってもＦＡＤ−ＧＤＨであってもよい。好ましくは、ＧＤＨはＰＱＱ−ＧＤＨである。別の実施形態において、酵素はグルコースオキシダーゼであり、基質はグルコースである。別の実施形態において、酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）であり、基質分子はジヒドロ葉酸である。別の実施形態において、酵素は乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）であり、基質分子は乳酸である。
【００４９】
本明細書中で一般に用いられる「触媒活性」および「触媒活性状態」は、酵素またはそのフラグメントもしくは部位によって示され、または達成され得る酵素活性の絶対量または相対量を指し得る。典型的には、酵素は、それが、基質分子に対して特異的な酵素活性を示して、適切な反応条件下で、１つまたは複数の電子を生じさせることができるならば、触媒活性である、または触媒活性状態にある。本明細書中で一般に用いられる「触媒不活性」および「触媒不活性状態」は、適切な反応条件下で、基質分子に向けた特異的な酵素活性を実質的に示すことができない酵素、そのフラグメントまたは部位を指し得る。典型的には、生じる電子は、対応する触媒活性酵素によって生じる電子と比較して、実質的により少なく、または完全に非存在となるであろう。
【００５０】
第１の態様、本発明は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持する少なくとも１つの異種修飾子アミノ酸配列を含むバイオセンサー分子であって、異種修飾子アミノ酸配列が、標的分子に応答して酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える、バイオセンサー分子を提供する。
【００５１】
適切には、少なくとも１つの酵素アミノ酸配列および前記少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列は、単一の連続したアミノ酸配列に存在するか、またはその少なくとも一部分を形成する。
【００５２】
特定の実施形態において、前記少なくとも１つの異種センサーアミノ酸配列は、前記少なくとも１つの酵素アミノ酸配列内の挿入物であり、それによって酵素アミノ酸配列の前記触媒不活性状態と前記触媒活性状態との切替えを促進する。この文脈において、「挿入物」とは、前記少なくとも１つの酵素アミノ酸配列に対して異種であり、前記少なくとも１つの酵素アミノ酸配列のそれぞれの部位、サブ配列、またはフラグメントの間に位置し、これらに連続しているアミノ酸配列を意味する。
【００５３】
適切には、異種センサーアミノ酸配列は、前記標的分子に結合し、それによって酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える。好ましくは、異種センサーアミノ酸配列による標的分子の結合により、立体構造が変化して、酵素のアミノ酸配列の触媒不活性状態から前記触媒活性状態への切替えをもたらし、またはこれを促進する。
【００５４】
一実施形態において、異種センサーアミノ酸配列は、カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列またはそのフラグメントである。この実施形態によれば、標的分子はカルシウムである、またはカルシウムを含む。特定の実施形態において、カルシウム結合タンパク質はカルモジュリンである。
【００５５】
酵素は、基質分子と反応し、それによって、１つまたは複数の電子を生じさせることができる任意の酵素であってよい。好ましくは、酵素は、酸化還元酵素、例えばＧＤＨ、ＬＤＨ、またはＤＨＦＲである。これらの実施形態に従えば、基質分子は、それぞれグルコース、乳酸、またはジヒドロ葉酸である。酵素がＧＤＨである場合、酵素はＦＡＤ−ＧＤＨであってもＰＱＱ−ＧＤＨであってもよい。ＰＱＱ−ＧＤＨは好ましくは、配列番号１またはその変異体の配列を含む。
【００５６】
したがって、本発明はさらに、標的分子に応答性である異種センサーアミノ酸配列を含む酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素であって、標的分子の結合が酵素の触媒活性を調節するように働く、酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を提供する。
【００５７】
標的分子は、本明細書中に記載される任意の標的分子であってよく、したがって、前記標的分子に応答する異種センサーアミノ酸配列は、本明細書中に記載される前記標的分子に対する任意の結合部分であってよく、当該結合部分は、酵素内に含まれる場合、標的分子との相互作用に依存する酵素の触媒活性を解放可能に調節する能力を有する。ゆえに、異種センサーアミノ酸配列は、酵素の触媒活性を可逆的に調節する。異種センサーアミノ酸配列は、標的分子の存在下で解離し、それによって酵素を触媒的に活性化することができる。異種センサーアミノ酸配列は、酵素の触媒活性をアロステリックに調節することができる。異種センサーアミノ酸配列は、標的分子、例えばペプチドまたはタンパク質の結合と同時に構造が再配列される、１つまたは複数のドメイン（例えば１つまたは２つのドメイン）を含んでよい。あるいは、異種センサーアミノ酸配列は、構造化されていない配列、または展開された配列を示してよく、これらは、標的分子、例えばペプチドまたはタンパク質の結合と同時に構造が再配列される。構造再配列により、１つまたは複数の折り畳まれたタンパク質ドメインが生じ得る。異種センサーアミノ酸配列は、以下に記載されるように、結合部分であってよい。異種センサーアミノ酸配列は、以下に記載されるように、アフィニティークランプであってよい。異種センサーアミノ酸配列は好ましくは、カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列またはその機能性フラグメントである。カルシウム結合タンパク質は、カルモジュリンまたはその機能性カルシウム結合フラグメントであってよい。
【００５８】
異種センサーアミノ酸配列は、典型的には、酵素のアミノ酸配列内の挿入物として提供される。挿入は、前記挿入に耐える、酵素のアミノ酸配列中の位置になされ、立体的な衝突が、酵素の安定した折畳みを妨げることはない。リンカー配列が、挿入物と酵素の配列との間に加えられて、挿入の耐容性が補助されてよい。典型的には、挿入により、異種センサーアミノ酸配列は、典型的には酵素の活性サイトにて、酵素の立体構造変化を誘導することによって、触媒活性を可逆的に阻害することができる。異種センサーアミノ酸配列は典型的に、標的分子の存在下で、立体構造が変化することで、酵素に対するその阻害効果を解放し、触媒活性を回復させる。挿入は、先に記載されるように、異種センサーアミノ酸配列に機能的に耐える酵素の構造において、ループ領域またはターン領域に位置してよい。
【００５９】
先に記載されるバイオセンサーおよび酵素の特定の一実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼ、例えばピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）、例えばアシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）ＰＱＱ−ＧＤＨが、アロステリック受容体ドメインを用いて、標的分子結合に応答して触媒活性を制御するように操作されてよい。本発明者らは、アシネトバクター・カルコアセチカス（A. calcoaceticus）ＰＱＱ−ＧＤＨ（ＰＤＢ：１ＣＱ１）の高分解能構造を、酵素の活性中心近くの考えられるサイトについて分析した。このサイトは、立体構造変化を活性中心に伝えるほど十分に近い一方で、異種センサーアミノ酸配列の挿入に耐えるであろう。βシート３の鎖Ａと鎖Ｂを接続するループが、この挿入に適したサイトとして提唱される。鎖Ａの始まりは、Ｈｉｓ１４４を保有しており、これは、グルコースＯ１原子からプロトンを抽出する一般塩基として作用する。Ｈｉｓ１４４は、触媒にとって重要であるので、鎖Ａおよび鎖Ｂの分離によって導入されるねじれ（torsion）を介して転位すると、ＧＤＨ触媒活性が変更される。
【００６０】
一実施形態において、バイオセンサーは、鎖３Ａと鎖３Ｂを接続するループ中に挿入されるカルモジュリンのカルシウム結合ドメインを含み、その結果、このドメインによるカルシウムの結合が、実質的な立体構造変化を引き起こす。特定の実施形態において、バイオセンサーは、キメラタンパク質であり、マウスＣａＭの残基１２〜６７が、ＰＱＱ−ＧＤＨの残基１５３と残基１５５との間に挿入される。また、構造的な緊張（tension）および衝突を引き下げるために、接合サイト中、カルモジュリンのＮ末端にＧＳＧＳリンカーを、カルモジュリンアミノ酸配列のＣ末端にＧｌｙリンカーを、導入した。Ｃａ２＋イオンの非存在下で、バイオセンサーは実質的に、酵素活性を示さない。Ｃａ２＋イオンを加えると、バイオセンサーの用量依存性の活性化が生じる一方、異種カルモジュリン挿入物を欠くＰＱＱ−ＧＤＨに対する効果は、限られたものでしかない。
【００６１】
これらの実施形態の非限定的な例を、図１〜図３に示す。本明細書中に記載される任意の異種センサーアミノ酸配列が、先に記載されるように、ＰＱＱ−ＧＤＨの鎖３Ａと鎖３Ｂを接続するループに相当するＧＤＨ酵素のループ領域もしくはターン領域に、または前記酵素の残基１５３〜１５５（配列番号１の残基１５３〜１５５）に相当する領域中に導入されてもよい。当業者であれば、構造分析および配列アラインメントから、他の酵素における対応する位置を同定することができる。対応する位置は典型的に、先に記載されるように、酵素の触媒活性を可逆的に阻害するように挿入された異種センサーアミノ酸配列を収容する位置である。挿入は、配列番号１のＨｉｓ１４４に相当する触媒残基を転位（dislocate）してよい。
【００６２】
本発明はさらに、配列番号１の残基１５３と残基１５５との間またはその変異体に挿入された異種センサーアミノ酸配列を含むＧＤＨ酵素を提供する。そのような酵素は、配列番号１３（残基１〜１５３）またはその変異体、異種センサーアミノ酸配列、および配列番号１５（残基１５５〜４５４）またはその変異体の配列を、順に含んでよい。配列番号１、１３、および１５の変異体が、以下でさらに記載される。先の配列は、先に記載されるように、リンカー配列によって、挿入された異種センサーアミノ酸配列に耐え得るように、分離され得る。本発明はさらに、先に記載されるように、配列番号５３またはその変異体を含む、ＰＱＱ−ＧＤＨおよびマウスＣａＭに基づくカルシウムバイオセンサーを提供する。
【００６３】
本発明はさらに、標的分子に応答性である異種センサーアミノ酸配列を含む酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を操作する方法であって、標的分子の結合が、酵素の触媒活性を調節するように働く、方法を提供する。当該方法は、異種センサーアミノ酸配列の挿入に耐えることができる、酵素中の適切な位置を選択するステップと、前記異種センサーアミノ酸配列を酵素中に挿入するステップとを含み、標的分子に応答する酵素は、酵素の触媒活性を調節する（典型的には活性化する）ように操作される。
【００６４】
本発明はさらに、触媒活性状態にあると基質分子と反応することができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含むバイオセンサー分子であって、バイオセンサーが、標的分子に応答して酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える、バイオセンサー分子を提供する。前記酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列および少なくとも１つの他の（操作された）アミノ酸配列は、非共有結合によって相互作用してよく、操作されたアミノ酸配列は、電気化学バイオセンサーの文脈において以下でさらに記載される、さらに別のアミノ酸配列によって置き換えられている。
【００６５】
本発明の好ましい態様は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含むバイオセンサー分子であって、バイオセンサーが、標的分子に応答して酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替える、バイオセンサー分子を提供する。
【００６６】
適切には、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸配列突然変異を含むように操作されている。適切には、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と、酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列とは、非共有結合によって相互作用する。
【００６７】
ある実施形態において、これらは、酵素のそれぞれのアミノ酸配列であり、これらの一方が、１つまたは複数のアミノ酸配列突然変異を含むように操作され、それによって、基質分子と反応する酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列を阻害、阻止、または別の方法で抑制する。適切には、この「操作された突然変異体」は、基質分子と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と非共有結合によって会合し、それによって、酵素活性を阻害、阻止、あるいは抑制するように働く。好ましい実施形態において、酵素のそれぞれのアミノ酸配列は、単一の連続したアミノ酸配列として発現され、あるいは生成され、これがその後、プロテアーゼによって切断され、それによって、操作された突然変異体と、基質分子と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列との非共有結合による会合が可能になる。
【００６８】
ゆえに、酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列は、典型的には、前記酵素の第１のフラグメント配列を表し、第１のフラグメント配列は、前記酵素の第２のフラグメント配列を表す前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列または前記さらに別のアミノ酸配列と非共有結合によって相互作用して、安定した酵素を再構成することができる。第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列は、酵素の完全な配列を一緒に構成しても、触媒ドメインを含む前記酵素の安定した形態を提供するのに十分な、酵素の配列を一緒に構成してもよい。
【００６９】
再構成された酵素は、安定した非触媒活性酵素であり得、第１のフラグメント配列は、酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列を示す。あるいは、再構成された酵素は、安定した触媒活性酵素であり得、第１のフラグメント配列は、酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列を置き換えることができる、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列を示す。本明細書中に記載される安定した酵素は、前記非共有結合によって相互作用するアミノ酸配列が、可溶性の酵素複合体を形成する、酵素である。非共有結合によって相互作用するアミノ酸配列はさらに、別の置き換えアミノ酸配列によって可逆的に切り離されて、代替の安定した酵素を形成し得る。
【００７０】
ＧＤＨに関する実施形態において、酵素のそれぞれのアミノ酸配列は、配列番号１３またはその変異体、および配列番号１５またはその変異体の配列であってよい。「操作された突然変異体」は、典型的には、Ｈ１４４突然変異、ならびにＱ７６およびＤ１４３の１つまたは複数に対する突然変異を含む。突然変異は、酵素の触媒活性を低減し、または無効にするように選択される。好ましくは、Ｈ１４４、Ｑ７６、およびＤ１４３がそれぞれ、突然変異している。これらの残基はそれぞれ、アラニンに突然変異してもよいし、触媒活性を低減し、または無効にする、アラニンの代替の突然変異が形成されてもよい。操作された突然変異体は、配列番号１４またはその変異体の配列を含んでよく、これもまた、酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列と非共有結合によって会合する場合、触媒不活性酵素を生じる。変異体は、本明細書中に記載されるように、配列番号１４において、７６、１４３、および１４４位にて、代替の突然変異を含んでよい。
【００７１】
結果として生じる、操作された突然変異体は好ましくは、細菌、例えば大腸菌（E. coli）中で、エピトープタグタンパク質として発現されて、親和性クロマトグラフィーによって精製される。
【００７２】
ある実施形態において、プロテアーゼ切断サイトは、ＴＶＭＶ切断サイト、例えばＥＴＶＲＦＱＳ（配列番号１１）またはその機能性変異体である。プロテアーゼ切断サイトは、代わりに、トロンビン切断サイト、例えば配列番号３３またはその機能性変異体であっても、第Ｘａ因子サイト、例えば配列番号３４もしくは３５、またはそれらの機能性変異体であってもよい。
【００７３】
一実施形態において、この態様のバイオセンサーは、酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列を置き換えることができる、前記酵素のさらに別のアミノ酸配列を含む。典型的には、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列は、操作された突然変異体のアミノ酸配列に実質的に相当するが、１つまたは複数のアミノ酸配列突然変異を欠いているアミノ酸配列を含む。典型的には、この置き換えは、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列を、基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列と非共有結合によって組み合わせて機能性触媒活性酵素を形成することによって、酵素の触媒活性を回復させる。
【００７４】
そのような実施形態の非限定的な例を、図４〜図９に示す。特に図７に関して、モル過剰の操作された突然変異体が提供されてよく、これは、標的分子結合の非存在下で、酵素の触媒活性の自発的置き換えを低減し、または除去することが理解されよう。これによって「バックグラウンドノイズ」が抑制されるので、バイオセンサーの感度が向上する。
【００７５】
広い実施形態において、前記酵素の前記さらに別のアミノ酸配列、および基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列は、例えば標的分子に結合することによって相互作用することができるそれぞれの結合部分を含み、操作されたアミノ酸配列の前記さらに別のアミノ酸配列による置き換えを促進する。
【００７６】
関連する態様において、本発明はさらに、酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチドを提供し、これは、前記酵素の第２のフラグメント配列を含むポリペプチドと非共有結合によって相互作用して、安定した酵素を再構成することができる。第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列は、先に記載されるように、酵素の完全な配列を一緒に構成しても、その触媒ドメインを含む前記酵素の安定した形態を提供するのに十分な、酵素の配列を一緒に構成してもよい。
【００７７】
第１のフラグメント配列を含むポリペプチドは、安定した触媒活性酵素を再構成することが可能であり得、前記ポリペプチドは、前記酵素の第２のフラグメント配列を含む。この実施形態において、前記酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチドは、酵素を触媒不活性状態で維持するように操作されている、前記酵素の対応するフラグメント配列を、安定した酵素複合体から解離させて、触媒活性を回復させることができる。第１のフラグメント配列を含むポリペプチドは代わりに、先で定義される、前記ポリペプチドを含む安定した酵素を触媒不活性にする１つまたは複数の突然変異を含んでよい。そのようなポリペプチド（操作されたポリペプチドとも記載される）はまた、前記安定した酵素複合体から解離させて、触媒活性を回復させることもできる。
【００７８】
また、提供されるのは、先に記載されるように操作されている第１のフラグメント配列、そしてまた、前記第２のフラグメント配列の双方を、連続したポリペプチドの一部分として含む酸化還元酵素、好ましくはＧＤＨ酵素であり、第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列は、１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトによって分離されており、プロテアーゼ活性により、操作されたフラグメント配列が解離することができ、触媒活性を回復させることができる第１のフラグメント配列がその後、第２のフラグメント配列と非共有結合によって会合して、安定した触媒活性酵素を形成することができるようになる。
【００７９】
先に記載されるポリペプチドは、前記酵素の第２のフラグメント配列を含む対応ポリペプチド上のそれぞれの結合部分と相互作用することができる結合部分を含んでよく、結合部分間の相互作用は、再構成された安定したグルコースデヒドロゲナーゼ酵素の触媒活性を調節する。結合部分間の相互作用は、標的分子の結合によって調節され得る。結合部分および対応する標的分子は、本明細書中に記載されるいずれかから選択されてよい。
【００８０】
先に記載されるポリペプチドはさらに、それぞれの結合部分の相互作用を阻害する配列、および１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトを含んでよく、プロテアーゼによる切断により、結合部分間の相互作用が実現される。ポリペプチドは、プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含んでよい。プロテアーゼ切断サイト、ならびにプロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列は、本明細書中に記載されるいずれかから選択されてよい。
【００８１】
特定の実施形態において、先に記載される第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列は、先に記載されるように、ＰＱＱ−ＧＤＨの鎖３Ａと鎖３Ｂを接続するループに相当する、ＧＤＨ酵素のループ領域もしくはターン領域における、または前記酵素の残基１５３〜１５５（配列番号１の残基１５３〜１５５）に相当する領域における、ＧＤＨ酵素の切断によって得ることができる。当業者であれば、構造分析および配列アラインメントから、他の酵素における対応する位置を同定することができる。対応する位置は、典型的には、安定した酵素を再構成することができる、前記酵素の機能性フラグメントの生成を可能にする位置である。
【００８２】
この態様において、本発明はさらに、安定した酵素を再構成することができる第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列を提供するように、酸化還元酵素、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を操作する方法を提供する。当該方法は、酵素が切断されて、前記第１のフラグメント配列および前記第２のフラグメント配列を提供し得る、酵素中の適切な位置を選択するステップを含む。当該方法は典型的に、前記配列の１つの中に、前記配列から再構成された安定した酵素を触媒不活性にする突然変異を導入するステップをさらに含む。当該方法は、１つまたは複数の結合部分を、安定した触媒活性酵素を再構成する配列を含むポリペプチドの、非共有結合による会合を補助する前記配列に加えるステップをさらに含んでもよい。
【００８３】
本発明はさらに、配列番号１３またはその変異体を含むＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、先に記載されるように、安定した触媒活性ＧＤＨ酵素を再構成することができるポリペプチドであってよい。本発明はさらに、配列番号１４またはその変異体を含むＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、先に記載されるように、前記ポリペプチドを含む安定した酵素を触媒不活性にするように操作されてよい。配列番号１４の変異体は、先に記載されるように、Ｈ１４４、Ｑ７６、およびＤ１４３の１つまたは複数、好ましくは全てに、アラニンの代替の不活性突然変異を含んでよい。配列番号１３または１４の変異体は、前記ポリペプチド中に含まれる場合、安定したＧＤＨ酵素を、配列番号１５を含むポリペプチドと一緒に再構成することができる配列であってよい。
【００８４】
本発明はさらに、配列番号１５またはその変異体を含むＧＤＨ酵素の第２のフラグメント配列を含むポリペプチドを提供する。配列番号１５の変異体は、先に記載されるように、前記ポリペプチド中に含まれる場合、安定したＧＤＨ酵素を、配列番号１３または配列番号１４を含むポリペプチドと一緒に再構成することができる配列であってよい。
【００８５】
配列番号１３もしくはその変異体、配列番号１４もしくはその変異体、または配列番号１５もしくはその変異体を含む先のポリペプチドはさらに、本明細書中に記載されるいずれかから選択される１つまたは複数の結合部分を含んでよい。典型的には、結合部分は、前記ポリペプチドにおいて、配列番号１３もしくは配列番号１４またはその変異体の配列のＣ末端に、そして配列番号１５またはその変異体の配列のＮ末端に提供される。結合部分を含むそのようなポリペプチドの典型的な例が、配列番号２、４、７、９によって提供される。本発明はさらに、本明細書中に記載されるように、配列番号２、４、７、および９のいずれかの変異体を包含する。
【００８６】
１つまたは複数、例えば１つ、２つ、または３つのプロテアーゼ切断サイトによって分離される２つの同族の（それぞれの）結合部分をさらに含む、配列番号１３またはその変異体を含むポリペプチドも提供される。ポリペプチドは、プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含んでもよい。同族の結合部分は、プロテアーゼの非存在下で相互作用し、この相互作用はその後、プロテアーゼの切断によって中断されて、配列番号１５またはその変異体を含むさらなるポリペプチド上で、保持された結合部分が、それぞれの結合部分へ結合し、それによって触媒活性ＧＤＨ酵素を再構成することができる。同族の結合部分、プロテアーゼ切断サイト、ならびに結合および／または切断効率を増強する配列は、本明細書中で記載されるいずれかから選択され得る。先のポリペプチドの典型的な例が、配列番号４０、４２、４４、４６、および４８によって提供される。本発明はさらに、本明細書中に記載されるように、配列番号４０、４２、４４、４６、および４８のいずれかの変異体を包含する。
【００８７】
また、提供されるのは、配列番号１４またはその変異体の配列、そしてさらに配列番号１５またはその変異体の配列を含むＧＤＨ酵素であり、１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトが、前記配列間に位置しており、プロテアーゼによる切断が、前記酵素から、配列番号１４の配列を含むポリペプチドを解離させることができるようになる。ＧＤＨ酵素はさらに、配列番号１３またはその変異体を含むＧＤＨ酵素の第１のフラグメント配列を含むポリペプチド上に、場合によっては標的分子の存在下で、それぞれの結合部分と相互作用することができる結合部分を含んでよく、結合部分間の相互作用により、安定したＧＤＨ酵素の再構成が可能になる。そのようなＧＤＨ酵素の典型的な例が、配列番号３、６、９、４１、４３、４５、４７、および４９によって提供される。本発明はさらに、本明細書中に記載されるように、配列番号３、６、９、４１、４３、４５、４７、および４９のいずれかの変異体を包含する。
【００８８】
先のポリペプチドおよび酵素は、本明細書中に記載されるように、バイオセンサーに備えられてもよい。あるいは、本明細書中に記載される、一緒に相互作用して標的分子を検出するポリペプチドおよび酵素の適切な組合せ、ならびに、典型的な例において、バイオセンサーは、任意のインビトロの状況で、一緒に提供されてよく、標的分子の検出が可能となる。ポリペプチドおよび酵素は、標的分子の検出用の溶液中に一緒に提供されてよい。一般に本明細書中で用いられる「結合部分」（単数または複数）は、互いに、または１つもしくは複数の他の標的分子を認識かつ／または結合することができる１つもしくは複数の分子、または生物的もしくは化学的な成分もしくは実体を指す。結合部分は、タンパク質、核酸（例えば一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ）、糖、オリゴ糖、多糖、もしくは他の炭水化物、脂質、またはこれらの任意の組合せ、例えば糖タンパク質、ＰＮＡ構築体など、あるいはその分子成分であってよい。単なる例であるが、結合部分は、以下であってよく、または以下を含んでよい：（ｉ）同族の増殖因子、サイトカイン、ホルモン（例えばインスリン）、神経伝達物質などの標的分子の結合に応答性の受容体のリガンド結合ドメインのアミノ酸配列；（ｉｉ）イオンもしくは代謝物質などの標的分子の結合が可能な、またはこの結合に応答性のイオンもしくは代謝物質トランスポーター（例えばＣａ２＋結合タンパク質、例えばカルモジュリンもしくはカルシニュリン、またはグルコーストランスポーター）のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＤＮＡ標的分子の亜鉛依存性結合に応答性の亜鉛フィンガーアミノ酸配列；（ｉｖ）ＤＮＡ標的分子の結合に応答性のヘリックス−ループ−ヘリックスアミノ酸配列；（ｖ）ホスホイノシチド標的分子の結合に応答性のプレクストリン相同ドメインアミノ酸配列；（ｖｉ）シグナリングタンパク質に応答性のＳｒｃ相同２−ドメインまたはＳｒｃ相同３−ドメインのアミノ酸配列；（ｖｉｉ）抗体標的分子の結合に応答性の抗原のアミノ酸配列；あるいは（ｖｉｉｉ）リン酸化可能な、またはリン酸化された標的分子の結合に応答性のプロテインキナーゼまたはホスファターゼのアミノ酸配列；（ｉｘ）ユビキチン結合ドメイン；（ｘ）ラパマイシン結合ＦＫＢＰおよびＦＲＢドメインなどの小分子、薬物、または抗生物質に結合するタンパク質またはタンパク質ドメイン；（ｘｉ）例えばＤＮＡまたはＲＮＡがアミノ酸配列または他のタンパク質−核酸相互作用にカップリングまたは架橋する場合、核酸標的分子に結合する一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ構築体；ならびに／あるいは（ｘｉｉ）アフィニティークランプ、例えばＰＤＺ−ＦＨ３ドメイン融合；その修飾されたバージョンまたは操作されたバージョンを含むがこれらに限定されない。
【００８９】
本発明で使用する特定の結合部分は、配列番号５、１６〜１９、３６、３７、５２、および５５、ならびにそれらの変異体によって提供される。変異体は典型的に、関連するそれぞれの結合部分についての機能的結合変異体である。
【００９０】
また、結合部分は、例えば結合剤、例えばビオチン、アビジン、エピトープタグ、レクチン、炭水化物、脂質（但しこれらに限定されない）で修飾されても、化学的に誘導体化されてもよいことが理解されよう。
【００９１】
一部の実施形態において、それぞれの部分は、直接結合しても、相互作用しても、複合体を形成してもよい。第１の結合部分および第２の結合部分は、直接結合、または相互作用し得る分子を含んでよい。したがって、標的分子と結合部分との直接的な結合相互作用は、適切には、第１の分子成分および第２の分子成分の共局在化を促進する。
【００９２】
他の実施形態において、それぞれの結合部分は、標的分子と結合する、相互作用する、または複合体を形成することができる。典型的には、それぞれの結合部分は、同じ標的分子と結合する、相互作用する、または複合体を形成することができる。また、「同じ」標的分子は、それぞれの異なる部分、サブユニット、ドメイン、リガンド、またはエピトープを有し得、これらが、それぞれの結合部分によって結合され、それによって共局在化して、プロテアーゼ活性を活性化し得ることが理解されよう。
【００９３】
標的分子は、任意のリガンド、分析物、小有機分子、エピトープ、ドメイン、フラグメント、サブユニット、部分、またはそれらの組合せ、例えば抗体および抗体フラグメント、抗原、酵素、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ならびに糖タンパク質を含めたタンパク質；脂質；リン脂質；単糖、二糖、および多糖を含めた炭水化物；核酸；核タンパク質；または他の任意の分子もしくは分析物であってよい。これらとして、薬物および他の医薬が挙げられ、抗生物質；禁止物質；違法薬物、または中毒性の薬物；薬物設計およびスクリーニングにおける化学療法剤および鉛化合物；生体試料中に典型的に見出される分子および分析物、例えばバイオマーカー、腫瘍および他の抗原；受容体；転写因子を含めたＤＮＡ結合タンパク質；ホルモン；神経伝達物質；増殖因子；サイトカイン；受容体；代謝酵素；シグナリング分子；核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ；膜脂質および他の細胞成分；ウイルス、細菌、原生動物、菌類、および虫のタンパク質を含めた病原体由来分子；脂質；炭水化物；ならびに核酸が挙げられるが、これらに限定されない。先に記載されるように、「同じ」標的分子は、異なるそれぞれの結合部分によって結合され得ることが理解されよう。
【００９４】
一実施形態において、結合部分は、標的分子に直接結合、もしく相互作用する、または結合することができる、少なくとも任意のタンパク質のフラグメント、またはタンパク質フラグメント、またはドメインのアミノ酸配列を含む。結合部分は、標的分子に結合する結合部位、ドメイン、または領域を作出するまたは含むように適切に操作され得るタンパク質、例えばペプチド、抗体、抗体フラグメント、または他の任意のタンパク質スカフォールド（例えば、Binz et al., 2005 Nature Biotechnology, 23, 1257-68.で概説されている）であっても、これを含んでもよい。
【００９５】
特定の一実施形態において、結合部分はそれぞれ、アフィニティークランプのアミノ酸配列である、またはこれを含む。アフィニティークランプは、好ましくは、認識ドメイン、場合によっては、エンハンサードメインを含む。認識ドメインは、典型的には、例えば先の（ｉ）〜（ｉｘ）に記載される、１つまたは複数の標的分子に結合することができる。認識ドメインとして、ホスホチロシン結合（例えば、ＳＨ２、ＰＴＢ）に関係するドメイン、ホスホセリン結合（例えば、ＵＩＭ、ＧＡＴ、ＣＵＥ、ＢＴＢ／ＰＯＺ、ＶＨＳ、ＵＢＡ、ＲＩＮＧ、ＨＥＣＴ、ＷＷ、１４−３−３、Ｐｏｌｏ−ボックス）、ホスホトレオニン結合（例えば、ＦＨＡ、ＷＷ、Ｐｏｌｏ−ボックス）、プロリンリッチ領域結合（例えば、ＥＶＨ１、ＳＨ３、ＧＹＦ）、アセチル化リジン結合（例えばＢｒｏｍｏ）、メチル化リジン結合（例えば、Ｃｈｒｏｍｏ、ＰＨＤ）、アポトーシス（例えば、ＢＩＲ、ＴＲＡＦ、ＤＥＤ、Ｄｅａｔｈ、ＣＡＲＤ、ＢＨ）、細胞骨格調節（例えば、ＡＤＦ、ＧＥＬ、ＤＨ、ＣＨ、ＦＨ２）、ユビキチン結合ドメイン、またはその修飾されたバージョンもしくは操作されたバージョン、あるいは他の細胞機能（例えば、ＥＨ、ＣＣ、ＶＨＬ、ＴＵＤＯＲ、ＰＵＦリピート、ＰＡＳ、ＭＨ１、ＬＲＲ１、ＩＱ、ＨＥＡＴ、ＧＲＩＰ、ＴＵＢＢＹ、ＳＮＡＲＥ、ＴＰＲ、ＴＩＲ、ＳＴＡＲＴ、ＳＯＣＳボックス、ＳＡＭ、ＲＧＳ、ＰＤＺ、ＰＢ１、ＬＩＭ、Ｆ−ボックス、ＥＮＴＨ、ＥＦ−Ｈａｎｄ、ＳＨＡＤＯＷ、ＡＲＭ、ＡＮＫ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９６】
エンハンサードメインは典型的に、標的分子の少なくとも１つに対する結合親和性を増大させ、または増強する。一部の実施形態において、親和性は、認識ドメイン単独の親和性と比較して、少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍増大し得る。アフィニティークランプはさらに、認識ドメインとエンハンサードメインを接続するリンカーを含んでよい。
【００９７】
特定の一実施形態において、アフィニティークランプは、ＰＤＺドメインの少なくとも一部位またはフラグメントを含む認識ドメイン、およびフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの少なくとも一部位またはフラグメントを含むエンハンサードメインを含む。ＰＤＺドメインは、ヒトＥｒｂｉｎタンパク質に由来してよい。Ｅｒｂｉｎ−ＰＤＺ（ｅＰＤＺ）は、標的分子、例えばｐ１２０関連カテニンのＣ末端（例えば、口蓋心臓顔面症候群（ＡＲＶＣＦ）において欠失するδ−カテニンおよびＡｒｍａｄｉｌｌｏ反復遺伝子）に結合する。好ましくは、アフィニティークレームのこの実施形態はさらに、ヒトフィブロネクチンの第１０のタイプＩＩＩ（ＦＮ３）ドメインをエンハンサードメインとして含む。
【００９８】
一部の実施形態において、アフィニティークランプは、１つまたは複数のコネクターアミノ酸配列を含んでよい。例えば、コネクターアミノ酸配列は、プロテアーゼアミノ酸配列（例えば、プロテアーゼアミノ酸配列を含む）をＥｒｂｉｎ−ＰＤＺドメインに、Ｅｒｂｉｎ−ＰＤＺドメインをＦＮ３ドメインに、および／またはＦＮ３ドメインを阻害剤に接続してよい。
【００９９】
また、本発明に従って用いられ得る、アフィニティークランプの構造および機能の、そして特定のアフィニティークランプのより詳細な説明のために、国際公開第２００９／０６２１７０号パンフレット、Zhuang & Liu, 2011, Comput. Theoret. Chem. 963 448、Huang et al, 2009, J. Mol. Biol. 392 1221、Huang et al., 2008, PNAS (USA) 105 6578、およびKoide1,*and Huang Methods Enzymol. 2013; 523: 285-302が参照される。本発明に用いられ得るアフィニティークランプの例が、配列番号５２として提供される。
【０１００】
別の実施形態において、結合部分は、抗体標的分子に結合し得る、または抗体標的分子によって結合され得る１つまたは複数のエピトープを含む。
【０１０１】
別の実施形態において、結合部分は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、組換え抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ’２フラグメント、ダイアボディ、ならびに単鎖抗体フラグメント（例えばｓｃＶ）を含めた（但しこれらに限定されない）抗体または抗体フラグメントであっても、これを含んでもよい。適切には、第１の結合部分および第２の結合部分は、それぞれが、標的分子に結合する抗体または抗体フラグメントであっても、これを含んでもよい。非限定的な例を、図２Ｃに概略的に示す。
【０１０２】
さらに別の特定の実施形態において、結合部分は、抗体結合分子であっても、これを含んでもよく、抗体は、標的分子に対して特異度を有する。抗体結合分子は好ましくは、プロテインＡのアミノ酸配列、またはそのフラグメント（例えばＺＺドメイン）であり、抗体のＦｃ部位に結合する。
【０１０３】
したがって、この態様の特定の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；第１の結合部分；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含む第１の成分；ならびに前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列および第２の結合部分を含む第２の成分を含むバイオセンサーであって、前記第１の結合部分と前記第２の結合部分との相互作用が、第２の成分の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の成分の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えを促進し、それによって第１の成分の酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【０１０４】
用語「第１の」、「第２の」、および「第３の」は、バイオセンサーのそれぞれの、別々の、または不連続な分子成分および／または結合部分の文脈で用いられる一方、これらは、逆にされ得ないあらゆる特定の、任意でない順序または名称に関するものではないことが理解されよう。したがって、本明細書中で開示される第１の成分、第２の成分、および／または第３の成分の構造および機能特性はそれぞれ、第３の成分、第２の成分、および／または第１の成分のものであってよい。同様に、本明細書中で開示される第１の結合部分および第２の結合部分の構造および機能特性はそれぞれ、第２の結合部分および第１の結合部分のものであってよい。また、バイオセンサーはさらに、１つまたは複数の、明示されていない他の分子成分を含んでよいことも理解されよう。
【０１０５】
この文脈では、「成分」または「分子成分」は、バイオセンサーの別々の一部分、部位または成分を形成する不連続な分子である。典型的な実施形態において、各分子成分は、単一の連続したアミノ酸配列（すなわち融合タンパク質）である、またはこれを含む。多くの実施形態において、第１の成分および第２の成分は、それぞれの結合部分によって媒介される「結合事象」の文脈で非共有結合によって結合、カップリング、相互作用、または会合し得ることが明らかであろう一方、それらは、バイオセンサーを形成する不連続な分子のままである。
【０１０６】
一部の実施形態において、標的分子は、酵素、例えば□アミラーゼである。そのような実施形態において、第１の結合部分および第２の結合部分はそれぞれ、ラクダ科抗体ＶＨＨ１およびＶＨＨ２である。
【０１０７】
一部の実施形態において、標的分子は、小有機分子、例えばラパマイシンである。そのような実施形態において、第１の結合部分および第２の結合部分はそれぞれ、ＦＫＢＰおよびＦＲＢである。この一般的な実施形態の特定の形態の非限定的な例を、一般に、図５Ａおよび図６に示す。
【０１０８】
一部の実施形態において、標的分子は、小有機分子、例えばＦＫ５０６である。そのような実施形態において、第１の結合部分および第２の結合部分はそれぞれ、図５Ｂに示すようなＦＫＢＰおよびカルシニュリンＡ／Ｂ複合体である。
【０１０９】
一部の実施形態において、標的分子は、小有機分子、例えばシクロスポリンである。そのような実施形態において、第１の結合部分および第２の結合部分はそれぞれ、図５Ｃに示すようなペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡおよびカルシニュリンＡ／Ｂ複合体である。
【０１１０】
別の広い実施形態において、前記酵素の前記操作されたアミノ酸配列、および基質分子と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列は、最初に相互作用するそれぞれの結合部分を含み、相互作用はその後、標的分子に結合した結合部分の一方または他方によって中断される。相互作用のこの中断により、前記さらに別のアミノ酸配列による操作されたアミノ酸配列の置き換えが促進される。
【０１１１】
したがって、第２の態様の別の特定の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；第１の結合部分；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含む第１の成分；ならびに前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列および第２の結合部分を含む第２の成分を含むバイオセンサーであって、第１の結合部分または第２の結合部分に結合することができる標的分子によって、前記第１の結合部分と前記第２の結合部分との相互作用が解放されて、第２の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えが促進され、それによって第１の成分の酵素が触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替わるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【０１１２】
好ましくは、バイオセンサーはさらに、第１の結合部分および第２の結合部分と最初に相互作用して、前記第１の結合部分と前記第２の結合部分との相互作用を解放可能に維持する交差結合剤を含む。適切には、交差結合剤は、第２の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えを促進するように、標的分子によって第１の結合部分および／または第２の結合部分から置換可能である。
【０１１３】
一部の実施形態において、標的分子は、違法薬物、例えばＴＨＣである。そのような実施形態において、結合部分は、ＴＨＣカルモジュリン結合ペプチド結合体、または代わりに、カルモジュリン結合ペプチドに融合された抗ＴＨＣ抗体のＴＨＣ結合サイトに競合的に結合するペプチドである。この実施形態に従えば、架橋結合剤は、アミノ酸配列ＧＶＭＰＲＥＥＴＤＳＫＴＡＳＰＷＫＳＡＲＬＭＶＨＴＶＡＴＦＮＳＩＫＥＬＮＥＲＷＲＳＬＱＱＬＡ（配列番号１３）を含む、またはこれからなるカルモジュリン結合ペプチドである。
【０１１４】
そのような実施形態の非限定的な例を、図９に示す。
【０１１５】
別の広い実施形態において、第２の態様のバイオセンサーは、プロテアーゼ標的分子を検出するのに適している。好ましくは、基質と反応することができる酵素の前記少なくとも１つのアミノ酸配列、および酵素の前記さらに別のアミノ酸配列は、これらの間の結合の阻害剤のプロテアーゼ切断後に相互作用することができるそれぞれの結合部分を含む。この相互作用は、前記さらに別のアミノ酸配列による操作されたアミノ酸配列の置き換えを促進する。
【０１１６】
したがって、第２の態様のさらに別の特定の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；第１の結合部分；および酵素を触媒不活性状態で解放可能に維持するように操作されている、前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列を含む第１の成分；ならびに前記酵素の少なくとも１つの他のアミノ酸配列、およびプロテアーゼ切断サイトによって阻害剤に連結または接続されている第２の結合部分を含む第２の成分を含むバイオセンサーであって、阻害剤が、第１の結合部分と第２の結合部分との相互作用を阻止または阻害し；前記阻害剤が、前記プロテアーゼ切断サイトを切断するプロテアーゼ標的分子によって解放されて、第１の結合部分と第２の結合部分との相互作用を促進して、第２の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列による第１の分子の前記少なくとも１つの他のアミノ酸配列の置き換えを促進し、それによって第１の成分の酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【０１１７】
「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解する、または別の方法で切断する能力を示す、または示すことができるタンパク質である。同様の用語として「プロテアーゼ」および「ペプチダーゼ」が挙げられる。プロテアーゼとして、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、およびエンドペプチダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼは、天然に存在するプロテアーゼの精製された形態であっても、合成（例えば組換え合成）形態であってもよいし、天然に存在するプロテアーゼの１つまたは複数のフラグメントまたはドメインを含み、場合によっては、１つまたは複数の所望の特性、活性、または特性を所有するようにさらに修飾されている、操作された、または修飾されたプロテアーゼであってもよい。
【０１１８】
標的プロテアーゼは、プロテアーゼ切断サイトが公知である任意のプロテアーゼであってよい。適切には、標的プロテアーゼは、細菌、植物、および動物を含めた生物から入手可能な生体試料において検出可能である。動物として、ヒトおよび他の哺乳動物が挙げられ得る。標的プロテアーゼの非限定な例として、血液凝固物中に含まれるプロテアーゼ、例えばトロンビン、プラスミン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）；および他のプロテアーゼ、例えばカリクレイン（例えばカリクレインＩＩＩ、Ｐ−３０、または前立腺特異的抗原）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、創傷および潰瘍内に含まれる；例えばＭＭＰ７およびＭＭＰ９）、アダマライシン、セラリシン、アスタシン、およびメトジンシンスーパーファミリーの他のプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンＧ、ペプシン、およびカルボキシペプチダーゼＡ、ならびに病原性ウイルスのプロテアーゼ、例えば、ＨＩＶプロテアーゼ、Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ＮＳ３プロテアーゼ、およびデング熱ウイルスプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
この実施形態の非限定的な例を、図８に示す。
【０１２０】
第３の態様において、本発明は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；標的分子に結合することができる結合部分；および標的分子の非存在下で結合部分と相互作用し、それによって酵素を阻害することができる少なくとも１つの酵素阻害剤を含むバイオセンサー分子であって、標的分子が、前記少なくとも１つの酵素阻害剤と結合部分との相互作用を解放し、それによって阻害剤による酵素の阻害を解放して、酵素のアミノ酸配列を触媒不活性状態から前記触媒活性状態に切り替えることができるように配置されているバイオセンサー分子を提供する。
【０１２１】
酵素、基質分子、標的分子、および／または結合部分は、本明細書中で先に記載される任意の酵素、基質分子、標的分子、および／または結合部分であってよい。
【０１２２】
この態様の特定の特徴は、結合部分が、存在するならば、標的分子に結合、またはこれと相互作用し得ることである。好ましい初期状態において、結合部分は、酵素阻害剤、または酵素阻害剤に連結した分子（例えばアミノ酸配列）と解放可能に相互作用し、またはこれに結合する。これにより、酵素阻害剤による酵素阻害が促進される。その後、存在するならば、標的分子は、酵素阻害剤と、またはこれに連結した分子と競合し、それによって酵素阻害剤を結合部分から解放して、その結果、酵素阻害を解放し、それによって酵素を触媒活性状態に切り替える。
【０１２３】
酵素阻害剤は、基質分子と反応して１つまたは複数の電子を提供する酵素の能力を阻止、阻害、阻止または抑制することができるあらゆる分子であってよい。
【０１２４】
第３の態様の実施形態は、触媒活性状態にあると基質分子と反応して１つまたは複数の電子を生じさせることができる酵素の少なくとも１つのアミノ酸配列；プロテアーゼ切断サイトによって酵素に連結またはカップリングした前記酵素の阻害剤；および第１の成分結合部分を含む第１の成分；第１の成分結合部分に結合することができる第２の成分結合部分；プロテアーゼアミノ酸配列；および標的分子に結合することができる別の第２の成分結合部分を含む第２の成分；ならびに標的分子の非存在下で前記第２の成分結合部分と相互作用することができる第３の成分結合部分を含む第３の成分を含むバイオセンサーであって、前記標的分子が、第３の成分結合部分と前記第２の成分結合部分との結合を解離させて、前記第１の成分結合部分と前記第２の成分結合部分との相互作用を促進することによって、プロテアーゼが、プロテアーゼ切断サイトを切断して阻害剤による酵素の阻害を除去し、それによって酵素を触媒不活性状態から触媒活性状態に切り替えることができるように配置されているバイオセンサーを提供する。
【０１２５】
酵素、基質分子、標的分子、および／または結合部分は、本明細書中で先に記載される任意の酵素、基質分子、標的分子、および／または結合部分であってよい。
【０１２６】
この実施形態の特定の特徴は、第１の成分のプロテアーゼ切断サイトが、第２の成分のプロテアーゼアミノ酸配列によって切断可能であることである。好ましくは、第３の成分結合部分は、第１の部位および第２の部位を含み、第１の部位は最初に、前記第２の成分結合部分に解放可能に結合、またはこれと相互作用し得、第２の部位は最初に、標的分子の非存在下で、前記別の第２の成分結合部分に解放可能に結合、またはこれと相互作用し得る。存在するならば、標的分子は、第３の成分の第２の部位を、前記別の第２の成分結合部分から解離させ得る。これにより、第３の成分の第１の部位の、前記第２の成分結合部分との相互作用、またはこれへの結合からの解放が促進される。これにより、第１の成分結合部分の、前記第２の成分結合部分への結合、またはこれとの相互作用が促進され、それによって、第１の成分および第２の成分が共局在化して、第２の成分のプロテアーゼアミノ酸配列を、第１の成分のプロテアーゼ切断サイトに接近させる。プロテアーゼはその後、プロテアーゼ切断サイトを切断し、それによって酵素を酵素阻害剤から解放して、その結果、酵素阻害を解放し、それによって酵素を触媒活性状態に切り替え得る。
【０１２７】
関連する態様において、本発明はさらに、酵素の触媒活性を阻止または低減するように働く阻害部分を含む酸化還元酵素、好ましくはＧＤＨ酵素であって、阻害部分が１つまたは複数の分子の存在下で解離して、酵素の触媒活性を活性化し得る、酸化還元酵素、好ましくはＧＤＨ酵素を提供する。阻害部分はまた、本明細書中で酵素阻害剤として記載され、酵素の触媒活性を阻止または低減することができる任意の分子であってよく、これは、解離して触媒活性を活性化することができる。
【０１２８】
阻害部分は、活性サイトの触媒性アミノ酸残基に置き換わり得る。阻害部分は、活性サイトへの基質のアクセスを立体的に阻止し得る。阻害部分は好ましくは、抗体もしくは抗体フラグメント、または阻害ペプチドである。阻害部分は、酵素のＮ末端またはＣ末端に、酵素のＮ末端またはＣ末端を含むように位置してもよく、酵素のアミノ酸配列の内部に位置してもよい。酵素は、酵素の触媒活性を阻止または低減する阻害部分（例えば阻害ペプチド）の能力を増大させる１つまたは複数の突然変異を含んでよく、この増大は、例えば、前記領域により強く結合または固定し、それによって触媒活性を阻止または低減するような、酵素内の領域に対する阻害ペプチドの親和性を増大させることによってなされる。
【０１２９】
ＧＤＨ酵素に関する実施形態において、阻害部分は、酵素のＣ末端に位置する抗体もしくは抗体フラグメント、または阻害ペプチドであってよい。ＧＤＨ酵素は、配列番号１またはその変異体の配列を含んでよい。阻害部分は、配列番号２０〜２４、５１、または５５、またはそれらの変異体のいずれかの配列を含んでよく、これは典型的に、前記ＧＤＨ酵素のＣ末端領域内に、例えばＣ末端に、またはその近くに加えられる。
【０１３０】
ＧＤＨ酵素は、先に記載されるように、阻害部分の結合を補助するアミノ酸突然変異を含む突然変異酵素である場合、典型的には、配列番号１の３４０〜３４４位（配列番号１の本来のＰＱＱ−ＧＤＨ酵素において、ＥＭＴＹ１）に相当する１つまたは複数の位置に、そのような突然変異を含み、これは、酵素のＣ末端に位置する阻害部分の阻害活性を増強することができる。変異体は好ましくは、配列番号１の３４３位にチロシン残基を保持する。変異体は、３４０から３４２および３４４位の１つまたは複数に突然変異を含んでよく、これは、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を導入する。変異体は、配列番号１の３４０〜３４４位に相当する位置に、配列ＳＳＳＹＳ（配列番号５１）またはその変異体を含んでよい。突然変異酵素は、配列番号３１またはその変異体の配列を含んでよい。先に記載される突然変異ＧＤＨ酵素（例えば、配列番号３１またはその変異体の配列を含むＧＨＤ酵素）に加えられ得る阻害部分の典型的な例として、配列番号２５〜３０またはその変異体が挙げられる。これらの阻害部分は典型的に、先に記載されるように、酵素のＣ末端に含まれる。阻害部分を組み込んでいる突然変異ＧＤＨ酵素（自己阻害酵素）の典型的な例が、配列番号３１から３３および５４によって示されている。本発明は、配列番号３１から３３および５４またはそれらの変異体のいずれかの配列を含む自己阻害突然変異ＧＤＨ酵素を提供する。
【０１３１】
先に記載される酸化還元（例えばＧＤＨ）酵素は、典型的には、１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトを含み、プロテアーゼによる前記サイトの切断が、阻害部分を解離させて酵素の触媒活性を活性化する。酵素は、プロテアーゼの結合および／または切断効率を増強する配列をさらに含んでもよい。
【０１３２】
酸化還元酵素は、さらなる分子上のそれぞれの結合部分と相互作用することができる結合部分を含んでよく、結合部分間の相互作用が、阻害部分を解離させて酵素の触媒活性を活性化する。そのような酸化還元酵素は、１つまたは複数のプロテアーゼ切断サイトをさらに含んでよく、このさらなる分子は、プロテアーゼをさらに含み、結合部分間の相互作用が、プロテアーゼを前記サイトに接近させて前記サイトを切断し、阻害部分を解離させるように働く。結合部分およびプロテアーゼ切断サイトは、本明細書中に記載されるもののいずれかから選択され得る。
【０１３３】
プロテアーゼ切断によって活性化される自己阻害ＧＤＨ酵素の例を、図３Ａ〜図３Ｅに示す。
【０１３４】
本発明はさらに、自己阻害酸化還元（例えばＧＤＨ）酵素を操作する方法であって、前記酵素に融合された場合に、触媒活性を阻止または低減することができる阻害部分についてスクリーニングするステップを含み、阻害部分が、標的分子の存在下で解離して触媒活性を再構成することができる、方法を提供する。阻害部分は、酵素の配列のＮ末端またはＣ末端に組み込まれてよい。ＧＤＨ酵素に関する実施形態において、阻害部分は好ましくは、酵素のＣ末端に提供され、例えばＣ末端に融合される。ＧＨＤ酵素は、配列番号１もしくは配列番号３１、またはそのいずれかの変異体の配列を含んでよい。推定の阻害部分は、ファージディスプレイによって同定され得る。スクリーニングは、インビトロ活性アッセイで実行されてよい。適切なアッセイが、本明細書中の実施例に記載されている。
【０１３５】
プロテアーゼアミノ酸配列は、プロテアーゼのアミノ酸配列全体であってもよいし、プロテアーゼのタンパク質分解活性フラグメントのアミノ酸配列またはサブ配列であってもよい。
【０１３６】
一部の実施形態において、プロテアーゼは自己阻害プロテアーゼであってよい。
【０１３７】
好ましい一実施形態において、プロテアーゼはエンドペプチダーゼである。
【０１３８】
一部の実施形態において、プロテアーゼは、ウイルスゲノムに由来する、またはウイルスゲノムによってコードされる。典型的には、そのようなプロテアーゼは、ウイルス、例えばピコルナウイルス目（Picornavirales）、ニドウイルス目（Nidovirales）、ヘルペスウイルス目（Herpesvirales）、レトロウイルス科（Retrovirus）、およびアデノウイルス科（Adenovirus）（但しこれらに限定されない）のライフサイクルの一部として必要とされるポリタンパク質の発現およびタンパク質分解プロセシング、ならびに／または他の事象に依存する。プロテアーゼの特定の例として：ポティウイルス科（Potyviridae）プロテアーゼ、例えばタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、タバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶ）、サトウキビモザイクウイルス（ＳＭＶ）その他のＮＩａプロテアーゼ；フラビウイルス科（Flaviviridae）プロテアーゼ、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プロテアーゼ；ピコルナウイルス科（Picornaviridae）プロテアーゼ、例えばＥＶ７１、ノロウイルスなどの３Ｃプロテアーゼ、ヒトライノウイルス、コクサッキーウイルスＢ４などの２Ａプロテアーゼ、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）などのリーダープロテアーゼ；コロナウイルス科（Coronaviridae）プロテアーゼ、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＩＢＶ−ＣｏＶの３Ｃ様プロテアーゼ、およびヘルペスウイルスプロテアーゼ、例えばＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＨＣＭＶ、およびＭＣＭＶプロテアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
好ましくは、ウイルスゲノムは、植物ウイルスのものである。
【０１４０】
より好ましくは、植物ウイルスは、ポティウイルス属（Potyvirus）である。
【０１４１】
特に好ましい実施形態において、プロテアーゼは、ポティウイルス属（Potyvirus）プロテアーゼ、例えばＴＥＶ、ＴＶＭＶ、またはＳＭＶのＮＩａプロテアーゼである。
【０１４２】
代替の実施形態において、プロテアーゼは、フラビウイルス属（Flavivirus）、例えばＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼである。
【０１４３】
他の実施形態において、プロテアーゼは、ＳＵＭＯ関連プロテアーゼであり、これには、ユビキチン（Ｕｂ）プロテアーゼ、ＮＥＤＤ８プロテアーゼ、およびＡｔｇ  ８プロテアーゼが挙げられる［２１］。これらのプロテアーゼは、それぞれの認識ドメイン（例えばＳＵＭＯ）との、プロテアーゼ抵抗リンカーを介した融合によって、自己阻害形態に変換される。
【０１４４】
特定の一実施形態において、第２の成分結合部分は、スカフォールディングタンパク質、ドメイン、またはそのフラグメントである。非限定的な例として、ＰＤＺドメイン、ＳＨ２もしくはＳＨ３ドメイン、またはそのフラグメントが挙げられる。先に記載されるように、好ましくは、第３の成分結合部分は、第１の部位および第２の部位含み、第１の部位は最初に、前記第２の成分結合部分に解放可能に結合、またはこれと相互作用し得、第２の部位は最初に、標的分子の非存在下で、前記別の第２の成分結合部分に解放可能に結合、またはこれと相互作用し得る。第１の部位は、スカフォールディングタンパク質、ドメイン、またはそのフラグメントに結合するリガンド（例えばペプチド）であってよい。
【０１４５】
第３の成分の第２の部位は、第１の部位にコンジュゲートされた、標的分子の結合サイトもしくは標的分子またはその類似体に競合的に結合するペプチドであってよい。
【０１４６】
これらの実施形態の非限定的な例を、図１０および図１１に示す。
【０１４７】
本明細書中に記載されるバイオセンサー、およびその分子成分は、例えば、当該技術においてよく理解されているキメラタンパク質または融合タンパク質の形態の、連続したアミノ酸配列である、またはこれを含んでよいと理解されよう。場合によっては、それぞれのアミノ酸配列（例えば、結合部分、酵素アミノ酸配列、プロテアーゼアミノ酸配列など）は、スペーサーまたはリンカー（例えばアミノ酸、アミノ酸配列、ヌクレオチド、ヌクレオチド配列、または他の分子）によって、特徴または活性、例えば標的分子の認識、結合、および酵素活性または阻害（但しこれらに限定されない）を最適化するように連結または接続された、不連続の、または別々のアミノ酸配列であってよい。酵素アミノ酸配列、操作された突然変異、リンカー、プロテアーゼ切断サイト、および結合部分を含めたアミノ酸配列の非限定的な例を、図１４および配列番号１〜５５に示す。
【０１４８】
また、本発明は、本明細書中に記載される実施形態の変異体であるバイオセンサー分子、または本明細書中に開示される構成プロテアーゼ、センサー、および／もしくは阻害アミノ酸配列の変異体を含むバイオセンサー分子を含むことが理解されよう。典型的には、そのような変異体は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列のいずれか、例えば配列番号１〜５５またはその部位との配列同一性が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。単なる例であるが、機能の明らかな変化も実質的な変化もない保存的アミノ酸変異がもたらされてよい。例えば、保存的アミノ酸置換は、電荷、親水性、疎水性、側鎖「バルク」、二次構造および／もしくは三次構造（例えばヘリシティ）、標的分子結合、プロテアーゼ活性、ならびに／またはプロテアーゼ阻害活性が、実質的には不変であるか、あるいはバイオセンサーの機能を明らかに、または実質的に損なわない程度に変更される場合、許容され得る。本発明の変異体（本明細書中に記載される操作された非活性突然変異体以外）は、機能的であるように選択されるので、先に記載されるバイオセンサーの適切なさらなる成分と一緒に提供された場合に、触媒活性、またはそのような触媒活性を再構成する能力を保持、または実質的に保持する。本明細書中に記載される、非共有結合によって会合するアミノ酸配列の変異体（例えば第１のフラグメント配列および第２のフラグメント配列）は、それらのそれぞれの結合パートナー配列と組み合わせて提供される場合、安定した酵素を再構成する能力を保持するように選択される。
【０１４９】
用語「配列同一性」は、本明細書中で、最も広い意味で、比較ウィンドウの全体にわたって配列が同一である程度を考慮する標準的なアルゴリズムを用いて、適切なアラインメントを考慮した正確なアミノ酸マッチ数を含むように用いられる。配列同一性は、例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389によって開示されるようなプログラムのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴファミリーなどのコンピュータアルゴリズムを用いて判定され得る。配列分析の詳細な考察が、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995-1999)のUnit 19.3において見出され得る。
【０１５０】
タンパク質フラグメントは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、好ましくは最大８０％、８５％、より好ましくは最大９０％、または最大９５〜９９％を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質フラグメントは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば配列番号１〜５５の最大５、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、２２０、２３０、２５０、２８０、３００、３３０、３５０、４００、または４５０個のアミノ酸を含んでよい。
【０１５１】
先の記載から理解されるように、本明細書中に記載されるバイオセンサーは、１つまたは複数の標的分子への結合、標的分子との相互作用、または別の方法による標的分子の検出に応じて、基質分子と反応することによって、電子を生じさせる。この文脈において、基質分子と「反応する」、基質分子との「反応」または「反応すること」は、酵素によって基質分子を１つまたは複数の生成物分子に変換することを意味し、基質分子あたり１つまたは複数の電子の正味の生産または全体としての生産を伴う。したがって、バイオセンサーは、電子ドナーとして作用し、これによって、反応によって生じた電子は、直接、または電子シャトル、例えば以下に限られないがフェナジンメトサルフェートまたはフェロシアン化カリウムを介して流れ、それによって、アノードとして作用し得る。アノードとカソードとの間の電位の、結果として生じる変化が、電子検出器で検出される。そのような構成の非限定的な一例を、図１２に示す。
【０１５２】
本発明のさらなる態様は、本明細書中に開示される１つまたは複数のバイオセンサーを、１つまたは複数の基質分子と組み合わせて含むキットまたは組成物を提供する。
【０１５３】
さらなる態様において、本発明は、標的分子を検出する方法であって、上述の態様の組成物を試料と接触させ、それによって試料中の標的分子の存在または非存在を判定するステップを含む、方法を提供する。
【０１５４】
適切には、試料は生体試料である。生体試料として、臓器試料、組織試料、細胞試料、流体試料、または他の、生物もしくは生物の成分から入手可能である、得られる、誘導可能である、またはこれに由来する任意の試料が挙げられ得る。生体試料は、発酵培地、原料、または食品、例えば、限定されないが、乳製品を含んでよい。
【０１５５】
特定の実施形態において、生体試料は、哺乳動物、好ましくはヒトから入手可能である。一例として、生体試料は、流体試料、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、涙液、汗、脳脊髄液、または羊水、組織試料、例えば組織生検または臓器生検であってもよいし、細胞試料、例えば赤血球、リンパ球、腫瘍細胞、または皮膚細胞を含む試料であってもよいが、これらに限定されない。生体試料の特定のタイプは、病理試料である。
【０１５６】
適切には、バイオセンサーの酵素活性は実質的に、試料の成分（例えば、血清タンパク質、代謝物質、細胞、細胞残渣および細胞成分、天然に存在するプロテアーゼ阻害剤など）によって阻害されない。
【０１５７】
一実施形態において、バイオセンサーおよび／または使用方法は、例えば違法な中毒薬物（例えば、カンナビノイド、アンフェタミン、コカイン、ヘロインなど）の使用を検出するための、かつ／またはスポーツにおけるパフォーマンス増強物質および／もしくはパフォーマンス増強物質の検出を回避するために典型的に用いられるマスキング剤を検出するための薬物試験に適用可能であり得る。これは、パフォーマンスを増強させるために違法な「ドーピング」を受けた可能性があるヒトおよび／または他の哺乳動物、例えば競走馬およびグレイハウンドにおける、禁止されているパフォーマンス増強物質の検出に適用可能であり得る。
【０１５８】
別の特定の実施形態において、バイオセンサーおよび／または使用方法は、哺乳動物、例えばヒトの疾患または状態の診断用である。
【０１５９】
したがって、本発明の好ましい態様は、ヒトにおける疾患または状態の診断方法であって、上述の態様の組成物をヒトから得られた生体試料と接触させ、それによって生体試料中の標的分子の存在または非存在を判定するステップを含み、標的分子の存在または非存在の判定により、疾患または状態の診断が容易になる、方法を提供する。
【０１６０】
疾患または状態は、標的分子の検出により診断が補助される場合、いかなるものであってもよい。標的分子または分析物の非限定的な例として、血液凝固因子、例えば先に記載される、ＰＳＡを含めたカリクレイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ウイルスプロテアーゼおよび細菌プロテアーゼ、抗体、グルコース、トリグリセリド、リポタンパク質、コレステロール、腫瘍抗原、リンパ球抗原、自己抗原および自己抗体、薬物、塩、クレアチニン、血清タンパク質または血漿タンパク質、殺虫剤、尿酸、ヒト代謝および動物代謝の生成物および中間体、ならびに金属が挙げられる。
【０１６１】
本発明のこの好ましい態様は、「ポイントオブケア」法として実行されるように適合され得、これによって、疾患または状態の診断のために、標的分子の存在または非存在の判定が、患者の所在地にて発生してから、その所在地にて分析されても、遠隔地に伝えられてもよい。
【０１６２】
本発明のなおさらに別の態様は、上述の態様のいずれかのバイオセンサーを含むセルまたはチャンバーを備える検出デバイスを提供する。
【０１６３】
適切には、試料は、セルまたはチャンバー中に導入され、それによって、標的分子の検出が容易にされ得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態において、検出デバイスは、標的分子の存在を示す電気化学的シグナル、音響シグナル、および／または光シグナルを提供することができる。
【０１６５】
検出デバイスはさらに、
プロセッサー；および
プロセッサーにカップリングされたメモリーであって、プロセッサーによって実行された場合に、
診断試験結果を分析して、疾患または状態の診断を実現すること
を含む１セットの機能を実行するコンピュータ可読プログラムコードコンポーネントを備えるメモリー
を備えることによって、疾患診断を、診断標的結果から提供することができる。
【０１６６】
検出デバイスはさらに、
プロセッサー；および
プロセッサーにカップリングされたメモリーであって、プロセッサーによって実行された場合に、
診断結果を受信デバイスに伝えることと；
場合によっては、疾患または状態の診断を、当該受信デバイス、または別の受信デバイスから受けることと
を含む１セットの機能を実行するコンピュータ可読プログラムコードコンポーネントを備えるメモリー
を備えることによって、診断試験結果を通信することを実現することができる。
【０１６７】
本発明の診断態様はまた、１つまたは複数の異なる標的分子を検出することができる１つまたは複数の異なるバイオセンサーを含むキットの形態であってもよい。この点に関して、キットは、複数の異なる標的分子を検出することができる、異なるバイオセンサーのアレイを含んでよい。キットはさらに、本明細書中に先に記載されるように、１つまたは複数の増幅分子（amplifier molecule）、不活化分子、および／または標識基質を含んでよい。キットはまた、さらなる構成要素を含んでよく、試薬、例えばバッファーおよび希釈剤、反応容器、および使用説明書が挙げられる。
【０１６８】
本発明のさらなる態様は、本明細書中に先で定義されるように、本発明のバイオセンサーのアミノ酸配列、またはその変異体をコードする単離された核酸を提供する。
【０１６９】
本明細書中で用いられる用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ならびにｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、およびゲノムＤＮＡを含めたＤＮＡを示す。
【０１７０】
「ポリヌクレオチド」は、８０個以上の連続したヌクレオチドを有する核酸である一方、「オリゴヌクレオチド」は、８０個未満の連続したヌクレオチドを有する。「プライマー」は通常、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくは１５〜５０個の連続したヌクレオチドを有し、これは、相補的核酸「鋳型」にアニールして、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）の作用によって、鋳型に依存して伸長することができる。「プローブ」は、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってよく、適切には、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングにおいて相補的配列を検出する目的で標識されている。
【０１７１】
本発明はまた、単離された核酸の変異体および／またはフラグメントを提供する。変異体は、本明細書中で開示される任意のヌクレオチド配列とのヌクレオチド配列同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるヌクレオチド配列を含んでよい。他の実施形態において、核酸変異体は、本明細書中で開示される任意のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。
【０１７２】
フラグメントは、本明細書中で開示される任意のヌクレオチド配列中に存在する連続したヌクレオチドの最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５〜９９％を含んでも、これからなってもよい。
【０１７３】
フラグメントは、本明細書中で開示される任意のヌクレオチド配列中に存在する最大２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１３５０、または１３００個の連続したヌクレオチドを含んでも、これからなってもよい。
【０１７４】
本発明はまた、１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列に動作可能に連結された、本明細書中に開示される１つまたは複数の単離された核酸、その変異体またはフラグメントを含む「遺伝的構築体」を提供する。
【０１７５】
本明細書中で一般に用いられる「遺伝的構築体」は、本明細書中に開示される単離された核酸を組み込み、かつ／またはその使用を促進する、人工的に作製された核酸である。
【０１７６】
特定の実施形態において、そのような構築体は、前記単離された核酸の組換え操作、増殖、増幅、相同組換え、および／または発現に有用であり得る。
【０１７７】
本明細書中で用いられる、組換えタンパク質の発現に用いられる遺伝的構築体は、「発現構築体」と称され、発現されることになる単離された核酸は、発現ベクター中で、１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列に動作可能に連結され、または動作可能に接続される。
【０１７８】
「発現ベクター」は、自己複製する染色体外ベクター、例えばプラスミドであっても、宿主ゲノム中に統合するベクターであってもよい。
【０１７９】
この文脈において、１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列は、調節ヌクレオチド配列である。
【０１８０】
「動作可能に連結された」または「動作可能に接続された」が意味するのは、前記調節ヌクレオチド配列が、発現されることになる核酸に対して、核酸の発現を開始し、調節し、または別の方法で制御するように位置を定められていることである。
【０１８１】
調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に用いられる宿主細胞にとって適切であろう。適切な発現ベクターおよび適切な調節配列の多数のタイプが、当該技術において、種々の宿主細胞について公知である。
【０１８２】
１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列として、以下に限定されないが、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合サイト、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、スプライスドナー／アクセプター配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得る。
【０１８３】
当該技術において公知の構成プロモーターまたは誘導性プロモーターが用いられてよく、例えば、ナイシン誘導性プロモーター、テトラサイクリン抑制性プロモーター、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、酸誘導性プロモーター、および／または金属誘導性プロモーターが挙げられる。
【０１８４】
一実施形態において、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、形質転換細菌（例えば、ｂｌａ、ｋａｎＲ、ｅｒｍＢ、およびｔｅｔＲ）、または形質転換哺乳動物細胞（例えば、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、およびピューロマイシン抵抗性）の選択に有用である。
【０１８５】
発現に適した宿主細胞は、原核生物でも真核生物でもよく、例えば、大腸菌（Escherichia coli）（例えばＤＨ５α）を含めた細菌細胞；酵母細胞、例えば出芽酵母（S. cerivisiae）もしくはメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）；昆虫細胞、例えばバキュロウイルス発現系に利用されるＳＦ９細胞；または種々の哺乳動物もしくは他の動物宿主細胞のいずれか、例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、もしくは２９３細胞であるが、これらに限定されない。
【０１８６】
適切な宿主細胞中への発現構築体の導入が、以下に限定されないが、当該技術において周知であるエレクトロポーレーション、ヒートショック、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポソームベースのトランスフェクション（例えば、リポフェクチン、リポフェクトアミン（lipofectamine））、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、または微粒子砲撃を含む技術によってなされてよい。
【０１８７】
組換えバイオセンサー分子の精製は、当該技術において公知の任意の方法によって実行され得る。好ましい実施形態において、組換えバイオセンサー分子は、融合パートナー（好ましくはＣ末端Ｈｉｓタグ）を含み、これは、適切な親和性マトリックスによる精製を可能にし、この親和性マトリックスは、Ｈｉｓタグの場合、ニッケルマトリックスまたは樹脂であろう。
【０１８８】
本発明が容易に理解され、実用的に実行され得るように、本発明の実施形態を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１８９】
実施例１
アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼに基づく電気化学バイオセンサーの操作
過去３０年にわたって、バイオセンサーは、ヘルスケアに用いられる複雑かつ高価な分析機器の実用的な代替物となった［１］。いくつかの現在用いられている検出技術のうち、そのような光学センサー、音響センサー、圧電電気化学センサーが、その単純さ、特異度、および高い性能により、顕著に大きな位置を占めている［２］。電気化学血液グルコースセンサーは、最も商業的に成功したバイオセンサーであり、バイオセンサー市場のほぼ９０％を占めている［３］。これらのセンサーの成功は、設計の単純さ、および製造の容易さと併せて、その高い選択性および感度に起因する。センサーは、組換えグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼによるグルコース酸化の電流測定モニタリングに基づいている［４］。ここで、乾燥した分析チャンバーを試料で満たして、酵素反応を高い電流密度で始める。また、グルコースセンサーの第３世代は、酸素および電子輸送メディエーターから独立しており、系のドリフトは起こりにくくなっている［５］。設計の単純さおよびロバスト性により、使い捨てグルコース検知電極を０．１ドル未満で製造することが可能である［６］。注目すべきことに、この技術的かつ商業的成功は、ポイントオブケア診断法の臨床的要求および商業的可能性にもかかわらず、他の電気化学バイオセンサーに追いつかれていない。これは、分析物が、高い（４〜１０ｍＭ）濃度で存在し、またエネルギー源を、選択的な、物理的に安定し、高度に向上した電気化学受容体に提供する、グルコース検知の特有の特徴によって、少なくとも部分的に説明され得る。
【０１９０】
材料および方法
キメラ遺伝子構築、ならびにタンパク質の発現および精製
ＧＤＨ−ＣａＭキメラタンパク質の構築体を、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）法によって、メーカーの説明書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）に従って生じさせて、ＰＥＴ２８ａベクター中にクローニングした。アセンブリー用の遺伝子フラグメントを、ＰＣＲによって、またはＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＧｂｌｃｏｋ遺伝子合成によって、作製した。タンパク質の発現および精製は、Olsthoorn & Duine１９に記載されていた。ＰＱＱを１：１．５の比率で加えることによって、精製ＧＤＨ−ＣａＭを再構成した。ＧＤＨとＰＱＱとの再構成についてのこの比率は、本明細書中に記載するＰＱＱ−ＧＤＨ酵素を用いた他の全ての実験にも用いた。
【０１９１】
シクロスポリンセンサーのタンパク質を、以前に記載される（http://www.pnas.org/content/99/21/13522）ように精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ精製の後、プールした酵素含有画分にＥＤＴＡを補って、５ｍＭの最終濃度にし、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．０および５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファーに対して１０時間透析した。その後、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．０のみを含有するバッファーに対して試料を透析することによって、ＥＤＴＡを除去した。
【０１９２】
ＧＤＨ酵素活性の分析
Yu et al.２０によって記載されるように、ＧＤＨ酵素アッセイを実行した。簡潔に、１．５ｍＬのアッセイ系は、２０ｍＭグルコース、０．６ｍＭフェナジンメトサルフェート、０．０６ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノール、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、ならびに対応する濃度のＣａＣｌ２および酵素からなった。６００ｎｍでの２，６−ジクロロフェノールの吸光度の低下をモニタリングすることによって、酵素アッセイを２５℃にて実行した。
【０１９３】
ＧＤＨ−Ｃａｍ活性の電気化学分析
ＤｒｏｐＳｅｎｓ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｃｒｅｅｎ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｏｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（Ｃａｔ＃ＤＲＰ−Ｃ２２０ＢＴ）にインターフェースで連結したＤｉｇｙ−Ｉｖｙ  ＤＹ２１１６Ｂ  ３−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｍｉｎｉ−ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔを用いて、クロノアンペロメトリック測定を実行した。スキャンの間に電極を９８℃のｍｉｌｌｉＱ水で洗浄して、結合した活性酵素が存在しないことを確実にした。反応物は：３００ｎＭ  ＧＤＨ−ＣａＭ、３ｍＭ  ＰＭＳメディエーター、５０ｍＭグルコースを、ｐＨ７．６  ＰＢＳの５０μｌの総容量中に含有した。反応は、４０ｍＭグルコースを加えて、室温にて１分間インキュベートしてから、電極表面上にピペッティングすることで始めた。クロノアンペロメトリーを、スクリーン印刷電極上の埋込み銀ストリップに対して、＋０．４Ｖにて５秒間実行し、データを、一般に、カルシウム濃度に対する５秒の時点での電流として報告した（図２Ｃ）。
【０１９４】
結果
発明者らは、グルコースバイオセンサーにおいてなされた技術的進歩により、グルコースに構造的に関連していない分析物に対するバイオセンサーの設計を探究することができると推測した。この目的を達成するために、発明者らは、バイオセンサー設計の出発点として、直接電子輸送することができるアシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）を選択した［７］［８］。しかしながら、発明者らは、酵素の基質特異性を修飾しようと試みたのではなく、触媒活性をリガンド依存的に制御するアロステリック受容体ドメインを、酵素に与えることを所望した。これを達成するために、発明者らは、立体構造変化を活性中心に伝えるのに十分近く、そして同時に、受容体ドメインの挿入に耐えるのに十分遠い、活性中心近くの、可能性があるサイトについて、アシネトバクター・カルコアセチカス（A. calcoaceticus）ＰＱＱ−ＧＤＨ（ＰＤＢ：１ＣＱ１）の高分解能構造を分析した。
【０１９５】
下線を引いたＮ末端リーダー配列を含むＰＱＱ−ＧＤＨアミノ酸配列を、配列番号５０で示す。Ｎ末端リーダー配列を切断した、成熟ＰＱＱ−ＧＤＨアミノ酸配列を、配列番号１で示す：
【０１９６】
シグナル配列の切断前のタンパク質配列（配列番号５０）：
【０１９７】
【化１】
2018518168.tif 000003
【０１９８】
成熟タンパク質（配列番号１）
【０１９９】
【化２】
2018518168.tif 000004
【０２００】
通常、残基ナンバリングは、成熟タンパク質（配列番号１）についてである。配列番号５０のアミノ酸２５〜４７８は、成熟タンパク質の残基１〜４５４である。
【０２０１】
発明者らは、βシート３の鎖Ａと鎖Ｂを接続するループを選択した（図１Ａ、図１Ｂ）。鎖Ａの始まりは、グルコースＯ１原子からプロトンを抽出する一般的な塩基として作用するＨｉｓ１４４を保有する［９］。Ｈｉｓ１４４は触媒にとって重大であるので、発明者らは、鎖Ａと鎖Ｂの分離によって導入されるねじれを介した転位が、ＧＤＨの触媒活性を変えるであろうと推測した。発明者らは、リガンド結合があれば大きな立体構造変化を経験することが知られている、鎖３Ａと鎖３Ｂを接続するループ中へのタンパク質ドメインの組込みによって、この着想を試験することに決めた（図１Ｂ）。
【０２０２】
ループは、構造体、およびホモダイマー中の第２のサブユニットから外方を向いており、立体衝突の可能性を引き下げている。挿入ドメインとして、発明者らは、カルモジュリン（ＣａＭ）を選択した。これは、１７ｋＤａのタンパク質であり、カルシウムシグナルの伝達において、真核生物中のタンパク質を標的とする主要な役割を果たす［１０］。ＣａＭの４本のＥＦハンドへのＣａ２＋の結合により、ＣａＭの２つのローブのそれぞれの中にペプチド結合ポケットを開放する大きな立体構造変化が生じる。ＣａＭのこの特徴は、蛍光タンパク質のスペクトル変更もしくはＦＲＥＴ強度に、またはｂ−ラクタマーゼの活性に基づいた、遺伝的にコード可能なＣａ２＋センサーの構築に、繰り返し利用されてきた［１１］［１２］。ＧＤＨおよびＣａＭの双方について入手可能な構造情報に基づいて［１０］、発明者らは、マウスＣａＭの残基１２〜６７が、ＰＱＱ−ＧＤＨの残基１５３と残基１５５との間に挿入されているキメラタンパク質を設計した。構造的な緊張および衝突を引き下げるために、発明者らはまた、接合サイトにおいて、カルモジュリンのＮ末端にＧＳＧＳリンカーを、そしてカルモジュリンのＣ末端にＧｌｙリンカーを導入した。結果として生じたタンパク質は、大腸菌（E. coli）において、組換え形態で、周辺可塑的に（periplastically）産生し、これをＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーによって均一に精製した。次に発明者らは、確立された比色アッセイを用いて、ＧＤＨ−ＣａＭキメラタンパク質の活性を分析した［１３］。図２においてみられるように、Ｃａ２＋イオンの非存在下で、ＣａＭ−ＧＤＨは、酵素活性を実質的に示さなかった。ＣａＣｌ２を加えると、キメラタンパク質は、用量依存的に活性化した一方で、野生型酵素では、効果が限られたものでしかなかった。Ｃａ２＋キレーターＥＤＴＡを加えると、酵素が基底状態に戻った（図２Ａ）ので、活性化は可逆的であった。選択した実験条件下でのシグナル変化は、３０倍であった。Ｃａ２＋滴定データの分析により、Ｃａ２＋濃度に対する非線形応答が明らかとなり、これは、ＣａＭについて以前に記載されており、協働のＣａ２＋結合を反映している［１４］。
【０２０３】
データの適合は、開発したセンサーのＣａ２＋親和性が６００ｎＭであり、４００から５００ｎＭの間で最も大きなシグナル変化を示すことを実証した。６００ｎＭのＫｄは、細胞内環境内でのイオン化に対するＣａＭの親和性を反映する一方、このイオンの細胞外濃度はより一層高い。体液、例えば血液、尿、および唾液は、１から２ｍＭのＣａ２＋濃度を特徴とする［１５］。これらのパラメーターを迅速に評価する能力は、クリニックにおいて重要である。というのも、標準的な濃度からの逸脱が、多くの場合、慢性的な病理学的状態、例えば内分泌障害、骨粗鬆症、およびがん、または急性的な状態、例えば敗血症および急性腎不全を反映するからである［１５］。したがって、イオン化カルシウムに関する迅速かつ正確な試験は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断にとって、非常に有益であろう。概ね、Ｃａ２＋濃度がセンサーの応答範囲内に入るまで生体試料を単純に希釈することができるが、これはＰＯＣ用途の魅力をかなり引き下げるであろう。その代わりとして、発明者らは、Ｃａ２＋濃度を緩衝して、その遊離濃度をセンサー応答範囲内に導くことができるかを試験した。この目的を達成するために、発明者らは、十分に特徴付けられたＣａ２＋キレーター１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の存在下で実験を繰り返した。試料に１．１ｍＭ  ＢＡＰＴＡを加えることで、センサーの応答の最適条件を、血液試料中の生理学的Ｃａ２＋濃度の範囲内にシフトさせることができた（図２Ｃ）。また、Ｍｇ２＋の存在が、Ｃａ２＋バイオセンサーの応答に影響を及ぼすかも試験した。図２Ｃに示す結果は、Ｃａ２＋によるキメラＧＤＨの活性化が、Ｍｇ２＋の存在によって影響されないことを実証した。この結果は、開発したＧＤＨ−Ｃａｍキメラタンパク質が、ＰＯＣバイオセンサーの構築に適しているという考えを支持している。
【０２０４】
安価なグルコメーターストリップの開発を可能にする特徴は、脱水および再水和後に活性を保持するＧＤＨの能力であった。発明者らは、乾燥および再水和後に活性を保持する、発明者らのキメラタンパク質の能力を試験して、キメラタンパク質は、野生型ＧＤＨに類似して、再水和後にその活性を保持していることを確認した。開発したバイオセンサーの有用性を、分析用途および診断用途についてさらに分析するために、標準的なグルコメーターに基づいてＣａ２＋メーターを作製することを試みた。この目的を達成するために、発明者らは、標準的なＡｋｋｕ−Ｃｈｅｋ電極を酵素混合物から剥ぎ取って、これを、ＧＤＨ−Ｃａｍキメラタンパク質、グルコース、およびＰＭＳメディエーターの混合物と置き換えた。発明者らは、検知電極が、ヒト唾液中に存在するＣａ２＋イオンによって活性化され、バイオセンサーによって発生する電流が、標準的なグルコメーターを用いて検出され得ることを実証した（図１３）。
【０２０５】
次に図４〜図９および図１５（配列番号２〜１０）を参照して、操作した「死んだ」、または触媒不活性のＧＤＨ酵素の実施形態を示す。元々の着想は、ＧＤＨを２つの部位またはフラグメントに分割することであった：第１の部位またはフラグメントは、ＧＤＨ（１〜１５３ＡＡ）である；第２の部位またはフラグメントは、ＧＤＨ（１５５〜４５４ＡＡ）である。その後、標的分子を検出するために、結合部分を各部位にカップリングさせてよい。例えば、ラパマイシンセンサーについて、発明者らは、ＦＲＢをＧＤＨ（１〜１５３ＡＡ）に、ＦＫＢＰをＧＤＨ（１５４〜４５４ＡＡ）に付着させた。
【０２０６】
しかしながら、大腸菌（E. coli）から、タンパク質ＧＤＨ（１〜１５３ＡＡ）−ＦＲＢしか精製することができず、ＦＫＢＰ−ＧＤＨ（１５４〜４５４ＡＡ）を精製できなかった。したがって、異なるアプローチをとって、大腸菌（E. coli）から精製され得る構築体：ＧＤＨ（１〜１５３ＡＡ、Ｑ７６Ａ、Ｄ１４３Ａ、Ｈ１４４Ａ）−ＴＶＭＶ切断サイト−ＦＫＢＰ−ＧＤＨ（１５５〜４５４ＡＡ）を産生した。
【０２０７】
ＧＤＨのＨ１４４は、ＧＤＨの重要な触媒残基である。最初の実験データに基づいて、三重突然変異（Ｑ７６Ａ、Ｄ１４３Ａ、Ｈ１４４Ａ）のみが、このＧＤＨ変異体を不活性にした。ＴＶＭＶによる切断後、ＦＫＢＰ−ＧＤＨ（１５４〜４５４ＡＡ）が、ラパマイシンへのＦＲＢおよびＦＫＢＰの結合により、触媒活性ＧＤＨ全体の再構成に利用可能となった。
【０２０８】
また、発明者らは、たとえＧＤＨを２つの部分に分割したとしてもなお、それら自体で再構成させることができる。自己再構成のための親和性（Ｋｄ）は、およそ５０〜１００ｎＭである。したがって、現在のアッセイ条件について、発明者らは、１００ｎＭよりも低いＧＤＨの２つの部分の濃度を準備して、自己再構成の程度を低くする（低い活性バックグラウンドとなる）。別のアプローチは、高い過剰ＧＤＨ（１〜１５３ＡＡ、Ｑ７６Ａ、Ｄ１４３Ａ、Ｈ１４４Ａ）によるアッセイを実行して、ＧＤＨ（１〜１５３ＡＡ）−ＦＲＢの、ＦＫＢＰ−ＧＤＨ（１５５〜４５４ＡＡ）との自己再構成を阻止するものである。
【０２０９】
要約すれば、発明者らはここで、Ｃａ２＋ゲート（gated）電気化学センサーの成功した構造誘導性エンジニアリングの第１の例を示す。発明者らのアプローチは、触媒サイトの修飾または補欠分子族（prosthetic group）の修飾を用いた特異性エンジニアリング（specificity engineering）について報告されているアプローチ［８］［１６］を変更したものである。その代わりとして、発明者らは、触媒中心に近く、そして大きな、自律的に折り畳まれたタンパク質ドメインの挿入に耐性のあるＧＤＨ分子の中央において、挿入サイトを同定した。ドメイン挿入戦略は、以前に、人工アロステリック調節酵素を作製するようないくつかの場合に用いられて成功してきた［１７］［１８］が、電気化学的活性酵素にこれまで適用されてこなかった。記載したアプローチは、バイオセンサーの操作モードを変えるものであり、触媒速度はもはや、グルコース濃度によって制限されず、選択した分析物によってゲーティングされる。ＧＤＨの高いターンオーバー速度は、他のタイプのセンサーのエンジニアリングにとって非常に魅力的なシャーシとなる。次に、ＧＤＨ内の同定した挿入サイトを、他の検知ドメインの挿入に利用することができる。このプロセスは大部分が経験的なものであり、かなりの量の最適化を伴う一方、入手可能なデータによれば、一旦タンパク質中の挿入サイトが同定されると、複数のドメインの挿入に利用され得ることが示唆されている［１２］。ＧＤＨベースのグルコースセンサーの遍在的使用、ならびに測定デバイスのエンドポイントおよび継続の利用可能性を考えると、発明者らのアプローチは、臨床実施へのＣａ２＋センサーの導入のための迅速な経路の見込みがある。
【０２１０】
発明者らはまた、選択された分析物に曝されると活性酵素を形成する、不活性に操作されたＧＤＨフラグメントに基づく、包括的なバイオセンサー構造を開発した。発明者らは、リガンド認識を取り替えることによって、タンパク質、小分子、および酵素活性に対する合成電気化学受容体を構築することができることを実証した。
【０２１１】
分割ＧＤＨに基づく２つの成分受容体構造
以前に報告したカルモジュリン−ＧＤＨバイオセンサーＣａ２＋バイオセンサーの特性分析は、ＧＤＨが、合成電気化学受容体の構築に優れた構築ブロックであることを発明者らに悟らせた。高い物理的安定性が、非常に高い触媒速度（１秒あたり３８６０Ｋｃａｔ）と組み合わされることで、電子デバイスとの直接連結に理想的なアクチュエータとなる。βシート３の鎖Ａと鎖Ｂを接続するループが、大きなドメインの挿入に耐えることができたという観察に発明者らは喚起されて、酵素がこの位置にて分割されて、２つの成分再構成系（図４）を構築するのに用いられ得るかを試験した。この目的を達成するために、発明者らは、酵素のＮ末端部分およびＣ末端の部位をＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインと融合させて、大腸菌（E. coli）中で発現させることで、ラパマイシンの存在下で複合体を形成した。ＦＲＢ−ＧＤＨ１〜１５３が産生されて、均一に精製することができた一方、ＦＫＢＰ−ＧＤＨ１５５〜４５４は封入体を形成して、可溶性の形態で産生され得なかった。これは、分割がタンパク質の疎水性コアを曝すという事実を考えると、必ずしも驚くことではない。分割されたタンパク質は一般に、損なわれた完全性および安定性が、インビボでシャペロン系によってある程度補償され得るために、インビトロよりもインビボではるかに良好に機能する。
【０２１２】
しかしながら、発明者らには、ＧＤＨのＮ末端フラグメントが物理的に安定しており、かつ明らかに自律的に折り畳まれるという事実が励みになった。したがって、発明者らは、Ｃ末端フラグメントが溶液中で安定し得るならば、発明者らの元々の計画を続行することができるであろうと推測した。この目的を達成するために、発明者らは、鎖Ａと鎖Ｂを接続するループ中にＴＶＭＶ切断サイトを有し、かつＣ末端上にＦＫＢＰドメインを有するＧＤＨの変異体を構築した。発明者らはまた、活性サイト中の触媒的に重要な残基Ｇｌｎ７６、Ａｓｐ１４３、およびＨｉｓ１４４を、Ａｌａに突然変異させて、融合タンパク質を触媒的に死なせた。
【０２１３】
結果として生じたタンパク質は、組換えにより、可溶性の形態で産生され、予想されるように、検出可能な触媒活性は示されなかった。融合タンパク質を、ラパマイシンの存在下または非存在下で、精製ＦＲＢ−ＧＤＨ１〜１５３と混合した場合、非常にわずかな活性しか回復されなかった。その後、発明者らは、ＧＤＨのＮフラグメントとＣフラグメントを接続するループを含有するプロテアーゼ切断サイトを消化して、再構成実験を繰り返した。以前の事例におけるように、非常にわずかなＧＤＨ活性しか回復されなかった。しかしながら、系がラパマイシンに曝されると、ＧＤＨ活性の迅速かつ用量依存的な回復が観察され、このことは、ＧＤＨの不活化Ｎ末端フラグメントが、ＦＲＢ融合ＧＤＨ１〜１５３フラグメント（図４および図５Ａ）によって解離したことを示している。発明者らは、ラパマイシンとの反応を、濃度を増大させて滴定して、観察された速度を二次方程式に適合させた。得られた値１１ｎＭは、Banaszynski et al (J Am Chem Soc 2005, 127: 4715-21)によって以前に公開された値１２ｎＭとかなり一致した。重要なことに、反応は特異的であった。というのも、過剰の関連免疫抑制化合物、例えばＦＫ５０６およびシクロスポリンが、バイオセンサーを、評価可能な程度に活性化しなかったからである。
【０２１４】
開発したバイオセンサー構造の包括的性質の試験。
次に、発明者らは、開発した構造が十分に包括的であり、かつ他のバイオマーカーに拡張することができるかの試験を設定した。ラパマイシン（シロリムス）は、開発したバイオセンサーと交差反応しないシクロスポリンおよびＦＫ５０６（タクロリムス）と一緒に、大環状免疫抑制剤のクラスに属するので、発明者らは、類似したバイオセンサーを、これらの薬物について同様に開発することができないかと考えた。発明者らは加えて、免疫抑制剤が非常に狭い治療ウィンドウを有し、現在、それに関するポイントオブケア試験が存在しないという事実によって、動機付けされた。
【０２１５】
発明者らは、カルシニュリンＡおよびカルシニュリンＢならびにペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＤＢ：１ＭＦ８）とのシクロスポリンの、そしてカルシニュリンＡおよびカルシニュリンＢならびにＦＫＢＰ（ＰＤＢ：１ＴＣＯ）との複合体におけるＦＫ５０６の、入手可能な共結晶構造を分析した。複合体のトポロジーにより、発明者らは、複合体アセンブリーがリガンドによって誘導された場合に、分子に近づくと予想されるＧＤＨフラグメントの融合タンパク質を設計することができた。融合タンパク質は、組換えおよび精製形態で産生された（表１）。非同族の薬物が高い濃度で存在した場合でさえ、開発したバイオセンサーは、同族の薬物に用量依存的に応答し（図５Ｂおよび図５Ｃ）、検出可能な交差反応性を示さなかった。これらの結果は、開発したバイオセンサー構造は、公知の標的を有する生体異物の検出に迅速に採用され得ることを実証した。
【０２１６】
次のステップにおいて、発明者らは、開発したバイオセンサー構造が、タンパク質バイオマーカーの検出に適用することができるかの試験を所望した。第１の例として、発明者らは、ヒトストレスバイオマーカーとして一般的に用いられている唾液αアミラーゼを選択した。発明者らは、アルファアミラーゼの入手可能な結晶構造を分析して、ＶＨＨドメイン（ＰＤＢ：１ＫＸＱ、１ＫＸＴ、１ＫＸＶ、および１ＢＶＮ）に結合したブタα−アミラーゼの３つの結晶構造を同定した。ヒトアルファアミラーゼおよびブタアルファアミラーゼは、９７％の配列同一性であるので、発明者らは、ＶＨＨドメインが、ヒト唾液α−アミラーゼを認識することができるであろうと予想した。構造分析に基づいて、発明者らは、ＰＤＢ：１ＫＸＶおよびＰＤＢ：１ＢＶＮから抽出したＶＨＨドメインが、ヒト唾液アルファアミラーゼに非競合的に結合するであろうと仮定した。したがって、発明者らは、ＧＤＨ１〜１５３−ＶＨＨ１ＫＸＶを有する融合タンパク質、およびＶＨＨ１ＢＶＮが挿入されたＧＤＨ不活性突然変異体を構築して、これらを組換え形態で産生させた。ヒト唾液アルファアミラーゼを、双方の組換えタンパク質の混合物に加えると、ＧＤＨ活性は、用量依存的に増大し、濃度が高くなるにつれ減少した。このことは、１つの融合タンパク質のみが結合したアルファアミラーゼ複合体の形成を反映している。これらの結果は、開発した検知構造を、タンパク質バイオマーカーの検出に用いることができたことを実証している（図６）。
【０２１７】
最後に、発明者らは、開発したセンサー構造を、化学物質ではなく酵素活性を測定するのに用いることができるかの確立を所望した。試験例として、発明者らは、地球上で最も大きなクラスのタンパク質を構成するプロテアーゼを選択した。プロテアーゼ活性を、フラグメントからのＧＤＨの再構成に繋げるために、発明者らは、ＳＨ３ドメインの自己阻害バージョンを作製した。この中で、ＳＨ３ドメイン結合ペプチドは、プロテアーゼ消化可能リンカーを介してＳＨ３ドメインに連結していた（図８）。この構成において、ＳＨ３ドメインは、ドメインおよびそのリガンドを接続するリンカーが無傷である限り、外部ＳＨ３ドメイン結合ペプチドの結合から保護されている。発明者らは、自己阻害ＳＨ３モジュールを、ＧＤＨ１〜１５３のＣ末端に融合させた一方、ＳＨ３ペプチドを、不活性完全長ＧＤＨ中に挿入して、プロテアーゼ切断サイトをＮ末端にした。この設計において、発明者らは、ＳＨ３ドメインとそのリガンドとの間に、そして同様に、ＧＤＨ１〜１５３の不活性Ｎ末端とＳＨ３結合ペプチドとの間に、第Ｘａ因子切断サイトを入れた。組換え形態で産生された構築体の溶液を一緒に混合した場合、少しのＧＤＨ活性しか検出することができず、このことは、ＳＨ３ペプチドが、酵素の再構成を駆動することができなかったことを示唆している。しかしながら、第Ｘａ因子を加えると、ＧＤＨ活性が時間依存的に増大し、このことは、自己阻害ペプチドのタンパク質分解除去により、ＳＨ３ペプチドのトランス結合、および活性複合体の再構成が可能になることを示している。プロテアーゼバイオセンサーの普遍的な性質を実証するために、発明者らは、第Ｘａ因子切断サイトを、トロンビンの切断サイトと置き換えた。発明者らは、トロンビン切断サイトおよびトロンビンプロテアーゼを用いた同じ実験を繰り返して、プロテアーゼの存在下でのバイオセンサーのロバストな活性化を観察した。
【０２１８】
プロテアーゼバイオセンサーの応答速度を、免疫抑制剤およびアミラーゼの応答速度と比較して、発明者らは、前者が有意により遅く活性化されたことに気づいた。発明者らは、これが、リンカー消化の比較的遅い速度をもたらすトロンビンの低いＫｍに起因していると推測した。発明者らは、生産性の低いプロテアーゼ：ペプチド複合体の完全な解離を引き下げることによって、リンカー中への追加のトロンビン結合モチーフ「ＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬ」（配列番号３９）の導入が、切断反応全体を加速するであろうと推測した。実際に、トロンビン基質配列および追加の結合モチーフの２コピーの組込みにより、バイオセンサーの応答速度および感度が双方とも増大した（図８Ｃ）。同様に、第Ｘａ因子のバイオセンサーの場合、ＳＨ３とＳＨ３結合ドメインを接続するリンカー中に２つのさらなる切断サイトを導入すると、感度および応答速度は増大した（図８Ｅおよび図８Ｆ）。
【０２１９】
開発したバイオセンサーの、検知電極の構築についての安定性の分析。
ＧＤＨベースのグルコースモニターの圧倒的成功は、電極上のバイオセンサーの脱水、およびその周囲温度での長期保存を可能にする酵素の高い安定性に、少なくとも部分的に起因する。ＧＤＨの操作されたバージョンが、機能的な形態で乾燥かつ再水和され得るかを試験するために、発明者らは、乾燥したラパマイシンバイオセンサーを、異なる温度で最大４時間、インキュベートした。データは、最大４０度まで活性が失われなかったこと、そして最大５０度まで活性の極わずかな低下しか観察されなかったことを示している。発明者らはまた、室温にて最大１４日までラパマイシンバイオセンサーを乾燥させたままにしても、活性の検出可能な変化がなかったことから、当該センサーは検知電極の構築に適していることが示される。次に、発明者らは、市販のポテンショスタットを用いたクロノアンペロメトリック測定において、バイオセンサーの性能を試験した。ＤｒｏｐＳｅｎｓ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｃｒｅｅｎ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｏｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（Ｃａｔ＃ＤＲＰ−Ｃ２２０ＢＴ）にインターフェースで連結したＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧＳＴＡＴ２０４  ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ（Ｅｃｏ  Ｃｈｅｍｉｅ）を用いて、クロノアンペロメトリック測定を実行した。各測定に未使用のセンサーを用いた。反応物は：２２．５ｎＭ  ＡＭＹ−１、１８．７ｎＭ  ＡＭＹ−２  ＰＱＱ、３．７ｎＭ  ＴＶＭＶ、１．０ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、５０ｍＭグルコース、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｕＭ  ＣａＣｌ２、および０、２、４、６、８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、６００、８００、または１０００ｎＭヒト唾液アルファアミラーゼを、ｐＨ７．４  ＰＢＳの４５μｌの総容量中に含有した。反応は、１ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェートおよび５０ｍＭグルコースを加えて、室温にて３０秒間インキュベートしてから、電極表面上にピペッティングすることで始めた。１８０秒の待機時間後、クロノアンペロメトリーを、スクリーン印刷電極上の埋込み銀ストリップに対して、＋０．４Ｖにて５秒間実行し、データを、一般に、アミラーゼ濃度に対する５秒の時点での電流として報告した。
【０２２０】
自己阻害ＧＤＨ酵素の操作
発明者らはさらに、ＧＤＨ酵素を操作して、酵素の触媒活性酵素を自己阻害する阻害部分を含めた。これをその後、プロテアーゼによって酵素から切断して、活性を再構成することができる。プロテアーゼ切断事象はまた、標的分子の存在に応答して、バイオセンサーの異なる成分間の結合相互作用に結び付き得る。このタイプの自己阻害酵素を、図３Ａ〜図３Ｅに、酵素の活性化および標的分子の検出を示すデータと一緒に示している。また、突然変異をＧＤＨ酵素に行うと、活性サイトへの阻害ペプチドのアンカリングが向上し、これらの突然変異における活性の阻害をもたらす阻害ペプチドをさらに同定した。結果として生じた自己阻害ＧＤＨモジュールは、プロテアーゼ活性検出用の包括的なプラットフォームを提供し、それによれば、バイオセンサーの特異度は、プロテアーゼ切断サイトを、それぞれのプロテアーゼについての認識サイトと置き換えることによって、変えることができる。
【０２２１】
自己阻害（ＡＩ）ＧＤＨモジュールが利用可能なことで、様々な受容体構造、例えば２つの成分受容体の構築が可能となり、それによれば、ＡＩ−ＧＤＨモジュールを、リガンドとの相互作用によりスカフォールディングされた、動作可能に接続された結合ドメインの作用によって、プロテアーゼに接近させる（図３Ｅ）。これを、開発したＡＩ−ＧＤＨモジュールに基づいて構築したラパマイシン受容体によって例示する。さらに、同じＡＩ−ＧＤＨユニットを、図３Ｇに例示する可逆的受容体構造に一体化することができる。さらに、リガンド結合と同時に立体構造変化を経験する分析物結合ドメインを、ＧＤＨをＡＩと接続するリンカー中に統合することによって、ＡＩ−ＧＤＨモジュールの可逆的な分析物媒介性活性化を達成することができる（図３Ｈ）。また、先の実験の一部に用いた阻害部分を、インビトロスクリーニングアッセイによって同定した。より詳細には、独立した機能性タンパク質ドメイン（例えばリポーター酵素、対応する活性サイト特異的結合剤、および分析物特異的結合受容体）由来の自己阻害ＧＤＨモジュールを、９６ウェルプレートにおいて培地スループットアッセイを用いて、大腸菌（E. coli）細胞培養物の上澄み中で直接操作することができる。この目的を達成するために、推定の活性サイト特異的結合剤のＤＮＡライブラリー（ファージディスプレイまたは関連するスクリーニング、および選択手順によって以前に同定したもの）を最初に、分析物特異的受容体として作用するフレキシブルリンカーおよびＴＶＭＶの切断サイトによって分離されているリポーター酵素ＧＤＨのＣ末端に挿入する。結果として生じた融合タンパク質を、カナマイシン耐性を付与するｐＥＴ−２８ベクターのバックボーン内で、ペリプラズム発現用のＩＰＴＧ誘導性プロモーターおよびＰｅｌＢリーダーペプチドの制御下でクローニングする。大腸菌（E. coli）ＢＬ２１  ＲＩＬ中への形質転換後、カナマイシンの存在下で、細胞をアガープレート上にプレーティングして、３７℃にて一晩増殖させる。翌日、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを補った２００μＬ  ＬＢ培地に、個々のコロニーを植菌して、３７℃にて５〜６時間増殖させる。その後、推定の自己阻害ＧＤＨモジュールの発現を、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導して、１８℃にて２４時間発現させたままにする。自己阻害ＧＤＨモジュールについてアッセイするために、細胞を４，５００ｇにて１０分間遠心分離することによって、細胞培養物の上澄みを単離する一方、結果として生じた上澄み（４５μＬ）を、ＴＶＭＶプロテアーゼ（１ｍｇ／ｍＬプロテアーゼを５μＬ）の存在下、および非存在下で１時間インキュベートして、ＧＤＨ活性を、ｐＨ７．０にて１００μＭ  ＣａＣｌ２および２０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４で緩衝した６００ｎＭ  ２−６−ジクロロフェニル−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、６００ｎＭフェナジンメトサルフェート（ＰＳＦ）、６０ｎＭ  ＰＱＱ、および２０ｍＭグルコースを用いて、測定した。６２０ｎＭでの吸光度の低下を測定することによって、反応をモニターする。
【０２２２】
このアッセイは、推定の阻害部分を処理することができる培地−スループットインビトロスクリーニングを実現する。
【０２２３】
結論
専門施設から活動場所、例えばベッドサイドまたは農場まで、診断法および解析論を移すことで、利益が個人および社会全体の双方に及ぶと予想される。利益のうち、知られているのは、意思決定、エンドユーザーの関与、およびコスト引下げである。現在まで、電気化学バイオセンサー、例えばグルコースモニターしか、広範囲にわたる展開について、性能およびコストベンチマークを満たしていない。グルコースモニターの成功は、状態の性質、エネルギー源として同時に機能する分析物の存在量、およびバイオセンサーの注目すべき安定性に関係する。
【０２２４】
本明細書で、発明者らは、原理的バイオセンサーＧＤＨを包括的なバイオセンサー構造に再操作することによって、高度に進んだグルコメーター技術を構築する。酵素の注目すべき生物物理学的安定性を利用することによって、発明者らはそれを、２つの成分シグナリング系に変換する。個々の成分は、活性もなければ、リアセンブルすることもできない。これは、自発的な活性化の阻害剤として、ならびに活性がある半分の酵素の正確な折畳みおよび安定性を確実にするシャペロン因子として機能する、不活性フラグメントを有する分割酵素を作製することによって達成される。これにより、開発した構造は、インビトロ用途についての有用性を制限する下位の生物物理学的特性を多くの場合有する他の分割酵素系から区別される。
【０２２５】
開発した系の活性化は、不活性Ｎ末端フラグメントの、その活性形態との濃度駆動置き換えをもたらすフラグメントの分析物媒介性スカフォールディングを通して達成される。活性化の動態は、驚くべきことに、迅速であると思われ、このことは、Ｎ末端およびＣ末端複合体の高いオフ速度（off rate）を示している。実践的にはこれは、系の迅速な応答速度で変換するので、ポイントオブケア用途に適している。発明者らは、開発した基本構造を用いて、小分子、タンパク質、およびプロテアーゼ活性に対する広範なバイオセンサーを構築した。センサーは、優れた応答速度、感度、および選択性を実証した。このことは、系が偽りなくモジュール式であること、そして結合ドメインが見出され得る実質的にあらゆる分析物に採用され得ることを確認した。概ね、系は、半合成系に拡張され、小分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに他のタイプの生物製剤、合成ポリマー、および翻訳後修飾によって媒介される会合事象を検出するのに用いられ得る。
【０２２６】
これは、潜在的に重要な意味合いがある。というのも、インターネットが可能にするパーソナル電子デバイスの遍在的存在により、パーソナルモバイル的な分析用途および診断用途の着想が長く支持されてきたからである。しかしながら、これまでの標準的な分析技術の小型化は、モバイルデバイス上で容易に管理されるほど十分に小さく、安価、かつポータブルなバイオセンシング用途を供給することができなかった。本明細書で提示されるアプローチにより、潜在的にあらゆる分析物用のグルコースモニタリングのために開発された、安価かつポータブルな技術を潜在的に採用することができる。ＧＤＨの高い触媒速度および結果として生じる電子流は、分子認識事象の検出を単純化して、電極の小型化および多重化を潜在的に可能にする。
【０２２７】
【表１】
2018518168.tif 000005
【０２２８】
本明細書の全体を通して、その意図は、本発明を任意の一実施形態または特徴の特定の集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することであった。種々の変更および修飾が、記載され、例示される実施形態に対して、本発明から逸脱することなくなされてよい。
【０２２９】
本明細書において言及される各特許文献および科学文献、コンピュータープログラム、ならびにアルゴリズムの開示は、その全体が参照によって組み込まれる。
【０２３０】
参考文献
[1]  A. Turner, Trends Biotechnol.2013, 31, 119-20.
[2]  N. J. Ronkainen, H. B. Halsall, W. R. Heineman, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1747-63.
[3]  S. D. Psoma, P. D. van der Wal, O. Frey, N. F. de Rooij, A. P. F. Turner, Biosens. Bioelectron. 2010, 26, 1582-7.
[4]  E.-H. Yoo, S.-Y. Lee, Sensors (Basel). 2010, 10, 4558-76.
[5]  V. Scognamiglio, Biosens. Bioelectron. 2013, 47, 12-25.
[6]  J. Hu, X.-E. Zhang, J. Diabetes Sci. Technol. 2011, 5, 1294-9.
[7]  A. Oubrie, Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics 2003, 1647, 143-151.
[8]  S. Igarashi, J. Okuda, K. Ikebukuro, K. Sode, Arch. Biochem. Biophys. 2004, 428, 52-63.
[9]   a Oubrie, H. J. Rozeboom, K. H. Kalk, J. a Duine, B. W. Dijkstra, J. Mol. Biol. 1999, 289, 319-33.
[10]  P. Kursula, Amino Acids 2014, 46, 2295-304.
[11]  V. Perez Koldenkova, T. Nagai, Biochim. Biophys. Acta 2013, 1833, 1787-97.
[12]  G. E. Meister, N. S. Joshi, Chembiochem2013, 14, 1460-7.
[13]  K. Abe, W. Yoshida, K. Terada, Y. Yagi-Ishii, S. Ferri, K. Ikebukuro, K. Sode, Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 23244-56.
[14]  N. V Valeyev, D. G. Bates, P. Heslop-Harrison, I. Postlethwaite, N. V Kotov, BMC Syst. Biol. 2008, 2, 48.
[15]  W. G. Robertson, R. W. Marshall, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1981, 15, 85-125.
[16]  E. Katz, A. Riklin, V. Heleg-shabtai, I. Willner, A. F. Bu, 1999, 385, 45-58.
[17]  G. Guntas, T. J. Mansell, J. R. Kim, M. Ostermeier, Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102, 11224-11229.
[18]  A. V Karginov, F. Ding, P. Kota, N. V Dokholyan, K. M. Hahn, Nat. Biotechnol. 2010, 28, 743-7. 
[19]  Olsthoorn & Duine, Arch. Biochem. Biophys. 1996, 336, 42-48
[20]  Yu et al., Engineering in Life Sciences. 2012, 12, 574-582
[21]  Frey & Gorlich, J. Chromatography A. 2014 1337, 95-105
【図１】
2018518168.tif 000006
【図２】
2018518168.tif 000007
【図３−１】
2018518168.tif 000008
【図３−２】
2018518168.tif 000009
【図３−３】
2018518168.tif 000010
【図４】
2018518168.tif 000011
【図５−１】
2018518168.tif 000012
【図５−２】
2018518168.tif 000013
【図５−３】
2018518168.tif 000014
【図６−１】
2018518168.tif 000015
【図６−２】
2018518168.tif 000016
【図７】
2018518168.tif 000017
【図８−１】
2018518168.tif 000018
【図８−２】
2018518168.tif 000019
【図９】
2018518168.tif 000020
【図１０】
2018518168.tif 000021
【図１１】
2018518168.tif 000022
【図１２】
2018518168.tif 000023
【図１３】
2018518168.tif 000024
【図１４−１】
2018518168.tif 000025
【図１４−２】
2018518168.tif 000026
【図１４−３】
2018518168.tif 000027
【図１４−４】
2018518168.tif 000028
【図１４−５】
2018518168.tif 000029
【図１４−６】
2018518168.tif 000030
【図１４−７】
2018518168.tif 000031
【図１４−８】
2018518168.tif 000032
【図１４−９】
2018518168.tif 000033
【図１４−１０】
2018518168.tif 000034
【図１４−１１】
2018518168.tif 000035
【国際調査報告】
2018518168.tif 000036
2018518168.tif 000037
2018518168.tif 000038
2018518168.tif 000039
2018518168.tif 000040
2018518168.tif 000041