(57)【要約】  本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための方法ならびに前記処置のための組成物およびキットに関する。一つの態様から、本発明は、癌のＩＧＦ−１Ｒ状態の決定のための第１の抗体と前記癌の処置のためのＡＤＣとして使用される第２の抗体の併用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を有する対象における癌の処置に使用するための組成物であって、
前記組成物が、下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である。］
またはその薬学的に許容可能な塩を含んでなり、
前記対象のＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態が、前記対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて決定されており、
前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
であることを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
前記第１および第２の抗体が、同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、
ｉ）配列番号７の配列の重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列；および／または配列番号８の配列の軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列を含んでなる抗体；あるいは
ｉｉ）配列番号１７の配列の重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列；および／または配列番号１８の配列の軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列を含んでなる抗体
である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体が、
ｉ）２０１４年９月１７日にＩ−４８９３番としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに提出されたハイブリドーマにより分泌される抗体８１０Ｄ１２ハイブリドーマ；または
ｉｉ）２０１４年９月１７日にＩ−４８９４番としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに提出されたハイブリドーマにより分泌される抗体８１６Ｃ１２
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
Ａｂが、ｉ）配列番号２１、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２４、２５および２６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−のエピトープと結合する抗体から選択される、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ａｂが、
ａ）配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２９、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号３０、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２９、２５および３２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；または
ｄ）配列番号２８、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２９、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ａｂが、
ａ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７もしくは５９と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の重鎖可変ドメインと；配列番号２９、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３４、３７および６０または配列番号３４、３７または６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の重鎖可変ドメインと；配列番号３４、３７および６０から選択される配列または配列番号３４、３７または６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Ａｂが、
ａ）配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６１または配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８もしくは６１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の重鎖と；
ｂ）配列番号３６、３８および６２または配列番号３６、３８もしくは６２と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の軽鎖と
を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Ａｂが、ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０、ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
薬物部分Ｄが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管新生薬、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬、キレート剤、鉄吸収刺激剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、アポトーシス刺激剤、チミジル酸阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロンアゴニスト、リボヌクレオシド三リン酸レダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体アンタゴニスト、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管新生阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、カンナビノイド受容体アゴニスト、ドーパミン受容体アゴニスト、顆粒球刺激因子アゴニスト、エリスロポエチン受容体アゴニスト、ソマトスタチン受容体アゴニスト、ＬＨＲＨアゴニスト、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、インターロイキン受容体アンタゴニスト、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成刺激剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ビンカアルカロイド、抗ホルモン剤もしくは免疫調節剤、または細胞傷害剤もしくは毒素の活性基準を満たす任意の他の薬物から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
薬物部分Ｄがオーリスタチン、ドロスタチン１０、またはそれらの誘導体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
薬物部分Ｄが下記式（ＩＩ）：
【化１】
2018537425.tif 000181
［式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
波線は、Ｌとの結合点を示す］
のものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｌが、下記式（ＩＩＩ）のリンカー：
【化２】
2018537425.tif 000182
［式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニルであり、
Ｗは、アミノ酸単位であり；ｗは、０〜５の間に含まれる整数であり；
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
【化３】
2018537425.tif 000183
であり；ｙは０または１であり；
アスタリスクは、Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、Ａｂとの結合点を示す］
である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体−薬物複合体が式：
【化４】
2018537425.tif 000184
2018537425.tif 000185
2018537425.tif 000186
2018537425.tif 000187
［式中、Ａｂは、ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０、またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体である］
を有するか、またはそれらの薬学上許容される塩である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ａ）ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、またはその任意の抗原結合フラグメント
からなる第１のＩＧＦ−１Ｒ；ならびに
ｂ）下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ      （Ｉ）
［式中、
Ａｂは、ｉ）配列番号２１、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２４、２５および２６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、下記式（ＩＩ）の薬物部分：
【化５】
2018537425.tif 000188
［式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
波線は、Ｌとの結合点を示し；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩
を少なくとも含んでなる、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置において使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための方法ならびに前記処置のための組成物およびキットに関する。一つの態様から、本発明は、癌のＩＧＦ−１Ｒ状態の決定のための第１の抗体と前記癌の処置のためのＡＤＣとして使用される第２の抗体の併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−ＩＲ（または時にはＩＧＦ１ＲもしくはＩＧＦ−ＩＲ）と呼称されるインスリン様成長因子Ｉ受容体は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有する受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは、分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。これは、ヘテロ四量体の受容体であり、その半分はそれぞれジスルフィド架橋によって連結しており、細胞外α−サブユニットおよび膜貫通β−サブユニットからなる。ＩＧＦ−ＩＲは、極めて高い親和性（Ｋｄ＃１ｎＭ）でＩＧＦ１およびＩＧＦ２と結合するが、同様にインスリンとも１００分の１〜１０００分の１の親和性で結合し得る。逆に、ＩＧＦは１００分の１の親和性でしかインスリン受容体と結合しないが、ＩＲは極めて高い親和性でインスリンと結合する。α−サブユニット上に存在するシステインに富む領域とβ−サブユニットのＣ末端部分にそれぞれ相同性の低い区域が関係しているが、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼドメインとＩＲのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の差異はリガンドの結合区域に存在するため、それはＩＧＦとインスリンのそれぞれに対するＩＧＦ−ＩＲとＩＲの相対的親和性の基となっている。β−サブユニットのＣ末端部分における差異は、２つの受容体のシグナル伝達経路における相違をもたらし、ＩＧＦ−ＩＲは細胞分裂促進作用、分化作用および抗アポトーシス作用を媒介し、一方、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用に関与する。
【０００３】
細胞質チロシンキナーゼタンパク質は、リガンドが受容体の細胞外ドメインに結合することによって活性化される。キナーゼの活性化は、次に、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＳｈｃおよびＧｒｂ１０を含む種々の細胞内基質の刺激に関与する。ＩＧＦ−ＩＲの２つの主要な基質はＩＲＳおよびＳｈｃであり、これらは下流で多くのエフェクターの活性化によって、ＩＧＦのこの受容体への結合に関連した増殖および分化作用の大部分を媒介する。従って、基質の利用度がＩＧＦ−ＩＲの活性化に関連した最終的な生物学的作用を決定し得る。ＩＲＳ−１が優勢である場合には、細胞は増殖し形質転換する傾向にある。Ｓｈｃが優勢である場合には、細胞は分化する傾向にある。アポトーシスに対する保護作用に主として関与する経路は、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路であると思われる。
【０００４】
発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ１０年で集中的な研究の対象となってきている。この関心は、ＩＧＦ−ＩＲが、その細胞分裂促進性および抗アポトーシス性に加えて、形質転換された表現型の確立と維持に必要であると思われるという事実の発見に従ったものである。実際に、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現または構成的活性化が、多様な細胞において、ウシ胎仔血清を含まない培地で補助に依存することなく細胞を増殖させ、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成させるということが十分に確認されている。成長因子の多数の受容体を含む、過剰発現した遺伝子の多様な産物が細胞を形質転換し得ることから、このこと自体は固有の特性ではない。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換において果たす主要な役割を明らかに立証した重要な発見は、ＩＧＦ−ＩＲをコードする遺伝子が不活性化されたＩＧＲ−ＩＲ−細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質などの、通常は細胞を形質転換することができる様々な物質、ＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したｒａｓ、またはこれら最後の２つの因子の組合せなどによる形質転換に全く不応であるということを立証している。
【０００５】
ＩＧＦ−ＩＲは、多様な腫瘍および腫瘍株において発現し、ＩＧＦは、それらのＩＧＦ−ＩＲへの結合を介して腫瘍増殖を増幅する。ＩＧＦ−ＩＲの発癌における役割を支持するその他の論拠は、受容体に対するマウスモノクローナル抗体を用いた、またはＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブを用いた研究から得られる。実際には、ＩＧＦ−ＩＲに対するマウスモノクローナル抗体は、多くの細胞株の培養増殖およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の増殖を阻害する。同様に、ＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブが腫瘍増殖を阻害し得ることが示されている。
【０００６】
多くのプロジェクトが、癌の処置のための裸のＩＧＦ−１Ｒ抗体の開発に着手している。しかしながら、現時点でこれらのプロジェクトに成功したものは無く、上市している抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は無い。
【０００７】
さらに、これらの抗体にＫＲＡＳ突然変異患者を治療できたものは無かったので、ＥＧＦＲとＩＧＦ−１Ｒの両方を標的とするために抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせた抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に関する一連の臨床試験は成功を見ていない。
【０００８】
結果として、ＩＧＦ−１Ｒは今や主要な標的とは見なされず、潜在的治療抗体の研究では、ＩＧＦ−１Ｒはもはや特に注目されるものとは考えられていない。
【０００９】
適切な診断または予後ツールとして使用することができる有価な抗体を開発するため従前の試みが報告されているが、これらのものに満足のいくものはない。
【００１０】
以下の例から明らかなように、本発明者らは、驚くことに、ＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍のスコア化に現在慣用されている市販の抗体は、それらが偽陽性および／または偽陰性を示すことから適切でないと思われることを実証した。この問題がおそらく、一部には、患者の不適切な選択のために、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた臨床試験の失敗をもたらした。
【００１１】
さらに、市販の抗体を用いて行われた最初の試験は、ＩＧＦ−１Ｒスコア化と標的化ＡＤＣ療法の抗腫瘍活性との間に矛盾を示した。
【００１２】
しかしながらやはり、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を作製するための努力は、裸の抗体、すなわち、それらの固有の特性により有用な抗体に焦点が当てられたことにも留意しなければならない。この意味で、ＩＧＦ−１Ｒは、ＩＧＦ−１Ｒは血管を含む正常な細胞によっても広く発現される標的として記載されているので、抗体−薬物複合体(antibody-drug-conjugate)（「ＡＤＣ」と呼称）などのＡＤＣの作出には好適とは言えない標的と考えられる。この意味で、より最近のＩＧＦ−１Ｒ抗体、すなわち、ＡＶＥ１６４２は、薬物で武装されていない裸の抗体として開発されていることに着目できる。それは現在開発中の他のＩＧＦ−１Ｒ抗体でも、また、臨床試験で成功しなかった総てのものでも同じである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、診断抗体としての第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体および治療抗体としての第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の、優先的にはＡＤＣとしての使用に基づく、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための新規な方法を提供することによりこの問題を改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、癌の処置のための方法であって、それを必要とする対象がＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を呈する場合に、その対象をＩＧＦ−１Ｒ標的療法で処置することを含んでなり、
前記対象のＩＧＦ−１Ｒ状態は、前記対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて決定されており、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
である方法に関し、
その処置は、下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩を用いて実現される。
【００１５】
本発明はまた、対象におけるＩＧＦ−１Ｒ（＋）癌を下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩で処置する方法であって、
処置前に、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた方法により前記対象の癌はＩＧＦ−１Ｒ（＋）であることが決定されており、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
である、方法にも関する。
【００１６】
もう一つの代替様式では、本発明は、対象において癌を診断および処置する方法に関し、その方法は、
ａ）前記対象の癌をＩＧＦ−１Ｒ（＋）として診断すること第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて診断すること、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
であり；および
ｂ）工程ａ）で診断された前記対象を下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩で処置することを含んでなる。
【００１７】
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を有する対象における癌の処置のため、または癌の処置に使用するための組成物であって、下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩を含んでなること、および
前記対象のＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態は前記対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて決定されており、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
であることを特徴とする組成物に関する。
【００１８】
本発明はまた、
Ａ）対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて対象のＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を決定する工程；および
Ｂ）前記対象がＩＧＦ−ＩＲ（＋）状態を呈する場合に、その患者に抗体−薬物複合体を投与する工程
を含んでなり、
・前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
であり；かつ
・前記抗体−薬物複合体は下記式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である、
対象におけるＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置において使用するための抗体−薬物複合体に関する。
【００１９】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、「抗体、またはその任意の抗原結合フラグメント」は、特にＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその任意のＩＧＦ−１Ｒ結合のフラグメントを呼称することを意図する。
【００２０】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、第１および第２の抗体は、同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合しない。
【００２１】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号７の配列、もしくは配列番号７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の重鎖可変ドメイン；および／または配列番号８の配列、もしくは配列番号８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体；あるいは
ｉｉ）配列番号１７の配列、もしくは配列番号１７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の重鎖可変ドメイン；および／または配列番号１８の配列、もしくは配列番号１８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体
である。
【００２２】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）２０１４年９月１７日にＩ−４８９３番としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに提出されたハイブリドーマにより分泌される抗体８１０Ｄ１２；または
ｉｉ）２０１４年９月１７日にＩ−４８９４番としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリに提出されたハイブリドーマにより分泌される抗体８１６Ｃ１２
である。
【００２３】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、Ａｂは、ｉ）配列番号２１、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２４、２５および２６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
【００２４】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、Ａｂは、
ａ）配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２９、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号３０、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２９、２５および３２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；または
ｄ）配列番号２８、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２９、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
である。
【００２５】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、Ａｂは、
ａ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７もしくは５９と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の重鎖可変ドメインと；配列番号２９、２５および３１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３４、３７および６０または配列番号３４、３７もしくは６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；あるいは
ｃ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７もしくは５９と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の重鎖可変ドメインと；配列番号３４、３７および６０または配列番号３４、３７もしくは６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
である。
【００２６】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、Ａｂは、
ａ）配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６１または配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８もしくは６１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の重鎖と；
ｂ）配列番号３６、３８および６２または配列番号３６、３８もしくたは６２と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列から選択される配列の軽鎖
を含んでなる。
【００２７】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、Ａｂは、ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０から選択される抗体、ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体である。
【００２８】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、薬物部分Ｄは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管新生薬、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬、キレート剤、鉄吸収刺激剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、アポトーシス刺激剤、チミジル酸阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロンアゴニスト、リボヌクレオシド三リン酸レダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体アンタゴニスト、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管新生阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、カンナビノイド受容体アゴニスト、ドーパミン受容体アゴニスト、顆粒球刺激因子アゴニスト、エリスロポエチン受容体アゴニスト、ソマトスタチン受容体アゴニスト、ＬＨＲＨアゴニスト、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、インターロイキン受容体アンタゴニスト、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成刺激剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ビンカアルカロイド、抗ホルモン剤または免疫調節剤または細胞傷害剤もしくは毒素の活性基準を満たす任意の他の薬物から選択される。
【００２９】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、薬物部分Ｄは、オーリスタチン、ドロスタチン１０(dolostatin 10)、またはそれらの誘導体である。
【００３０】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、薬物部分Ｄは、下記式（ＩＩ）：
【化１】
2018537425.tif 000002
［式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
波線は、Ｌとの結合点を示す］
のものである。
【００３１】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、Ｌは、下記式（ＩＩＩ）のリンカーであり、
【化２】
2018537425.tif 000003
式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニルであり、
Ｗは、アミノ酸単位であり；ｗは、０〜５の間に含まれる整数であり；
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
【化３】
2018537425.tif 000004
であり；ｙは０または１であり；
アスタリスクは、Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、Ａｂとの結合点を示す。
【００３２】
本明細書に記載の方法、組成物またはキットによれば、本抗体−薬物複合体は
【化４】
2018537425.tif 000005
2018537425.tif 000006
2018537425.tif 000007
2018537425.tif 000008
およびその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、Ａｂは、ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０から選択される抗体、またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体から選択される抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択される抗体である。
【００３３】
本発明はまた、ａ）
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、またはその任意の抗原結合フラグメント
からなる第１のＩＧＦ−１Ｒ；ならびに
ｂ）下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ｉ）配列番号２１、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２４、２５および２６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、下記式（ＩＩ）の薬物部分：
【化５】
2018537425.tif 000009
［式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
波線は、Ｌとの結合点を示し；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩
を少なくとも含んでなる、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置において使用するためのキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａ：ｒｈＩＧＦ１Ｒ  ＥＬＩＳＡにおいて第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１６Ｃ１２（Ａ）で得られたＯＤ値のグラフ。データフィッティングおよびＥＣ５０決定は、Ｐｒｉｓｍアプリケーションを用いて行った。
【図１Ｂ】図１Ｂ：ｒｈＩＧＦ１Ｒ  ＥＬＩＳＡにおいて第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１０Ｄ１０（Ｂ）で得られたＯＤ値のグラフ。データフィッティングおよびＥＣ５０決定は、Ｐｒｉｓｍアプリケーションを用いて行った。
【図２】図２Ａ〜２Ｄ：第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１６Ｃ１２（２Ａ）、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１０Ｄ１２（２Ｂ）、Ｇ１１抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ）（２Ｃ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（２Ｄ）によるパラフィン包埋腫瘍ＭＣＦ−７の認識の免疫組織化学（ＩＨＣ）パターン。
【図３】図３：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図４】図４Ａ〜４Ｄ：第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１６Ｃ１２（４Ａ）、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１０Ｄ１２（４Ｂ）、Ｇ１１抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ）（４Ｃ）またはＡＦ−３０５  （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（４Ｄ）によるパラフィン包埋腫瘍ＳＢＣ−５の免疫組織化学（ＩＨＣ）パターン。
【図５】図５：ＳＢＣ−５異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図６】図６Ａ〜６Ｃ：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体。図６Ａは、ＭＣＦ−７細胞株における力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図６Ｂは、ＭＣＦ−７細胞株におけるマウスおよびキメラ両方の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図６Ｃは、ＭＣＦ−７細胞株におけるキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＢｍａｘを表す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂ：トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞を用いたｈＩＧＦ−１Ｒ認識の評価。図７Ａは、ＩＧＦ−１Ｒ＋細胞株における１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図７Ｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ−細胞株におけるキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂ：トランスフェクト細胞を用いたＩＧＦ−１ＲとｈＩＲに対するＡｂの特異性の評価。図８Ａは、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株におけるマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。図８Ｂは、ＩＲ＋細胞株におけるキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ  Ｍａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、陽性対照として導入された。
【図９】図９：ＩＭ−９細胞株におけるマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ  Ｍａｂは、陽性対照として導入された。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃ：サルＩＧＦ−１Ｒの認識の評価。図１０Ａは、ＣＯＳ−７細胞株に対するキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図１０Ｂは、ＣＯＳ−７細胞株における、マウスおよびキメラ両方の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図１０Ｃは、ＮＩＨ  ３Ｔ３トランスフェクト(transfected)細胞ｈＩＧＦ−１Ｒ＋およびＣＯＳ−７細胞株の両方におけるキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。
【図１１】図１１：カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトされたマウス抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体の１１０００ＲＵ超で活性化したＣＭ５センサーチップを用いたＳＰＲ技術に基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００で得られたセンサーグラム。実験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、２５℃にて３０μｌ／分の流速で行った。図は、分析物の最初の注入の開始時にｘ軸上に、また、この最初の注入直前に定義されたベースラインによりｙ軸上に並べた４つの独立したセンサーグラムの重畳を示した。組換え可溶性ＩＧＦ１Ｒのヒトに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを菱形で示す。組換え可溶性ＩＧＦ１Ｒのカニクイザルに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを三角で示す。白い記号はブランクサイクル（ランニングバッファーの５回の注入）に相当し、黒い記号は漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２（５、１０、２０、４０および８０ｎＭ）の注入に相当する。
【図１２】図１２：ＩＧＦ１と比較した場合の受容体リン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の固有の効果の評価。
【図１３】図１３：マウス抗ｈＩＧＦ−１ＲによるＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害。
【図１４】図１４：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞表面シグナル強度は、３７℃での細胞インキュベーション後にダウンレギュレートされる。ＭＣＦ−７細胞を４℃または３７℃で４時間、１０μｇ／ｍｌのＡｂとともにインキュベートした。図は、ΔＭＦＩを表す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂ：抗体表面減衰。細胞表面結合抗体を３７℃で１０、２０、３０、６０および１２０分後に評価した。図１５Ａは、４℃で測定したシグナル強度と比較した残留ＩＧＦ−１Ｒ％を表す。図１５Ｂは、Ｐｒｉｍｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用い(usinf)、指数減衰フィッティングを用いた半減期計算を表す。
【図１６】図１６：抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂは内部移行される。細胞を１０μｇ／ｍｌのマウスＡｂとともに３７℃で０、３０または６０分間インキュベートした。細胞に透過処理を施し、または施さず、二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８とともにインキュベートした。膜は、シグナル強度ｗ／ｏ透過処理に相当する。全体は、細胞透過処理後のシグナル強度に相当し、細胞質は、内部移行したＡｂに相当する。各評価抗体の名称を各グラフの上に示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ：Ａｂ内部移行のイメージング。図１７Ａ：ｍ２０８Ｆ２とともに４℃で２０分間インキュベートし、インキュベーション前（Ｗ）、３７℃で１５分（Ｘ）、３０分（Ｙ）および６０分（Ｚ）洗浄したＭＣＦ−７細胞。細胞を固定し透過処理を施した。ｍ２０８Ｆ２  Ａｂは抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ４８８を用いて、Ｌａｍｐ−１はウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体を二次抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ５５５とともに用いて可視化した。
【図１７Ｂ】図１７Ｂ：Ａｂ内部移行のイメージング。図１７Ｂ：ＭＣＦ−７細胞を３７℃で３０分間抗ｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体とともにインキュベートし、上記のように染色した。共局在はＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在ハイリター(highliter)プラグインを用いて確認した。
【図１８】図１８：抗体分解におけるリソソーム経路の関与。
【図１９】図１９：酸性ｐＨは５種類のマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合能を低下させる。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄ：ｃ２０８Ｆ２  Ｍａｂの第１のヒト化型の結合特徴。ｈｚ２０８Ｆ２  ｍＡｂの結合特性をヒト細胞株ＭＣＦ−７（Ａ）、サル細胞株ＣＯＳ−７（Ｂ）およびヒトインスリン受容体を発現するトランスフェクトマウス細胞株（Ｃ）で評価した。マウスおよびキメラの両２０８Ｆ２  ｍＡｂの結合を並行して評価した。トランスフェクト(transefected)細胞株（Ｄ）でのｈＩＲの発現を確認するために抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用いた。
【図２１】図２１：ｈｚ２０８Ｆ２抗体表面減衰。
【図２２】図２２：両フローセルにて、流速３０μｌ／分でランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトした１２．０００ＲＵ前後のマウス抗ＴａｇＨｉｓモノクローナル抗体で活性化したＣＭ５センサーチップを用い、２５℃の温度でＳＰＲに基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置で得られたセンサーグラムの重畳。各センサーグラム（第１のものを三角で示し、第２のものを菱形で示す）は全サイクルに相当する。  １−第２のフローセルへの組換えｈ−ＩＧＦ１Ｒ（１０μｇ／ｍｌ）の溶液の１分間の注入  ２−第１のセンサーグラムでは：各９０秒で５回のランニングバッファーの注入。  第２のセンサーグラムでは：各９０秒で漸増濃度範囲での抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｃ２０８Ｆ２抗体溶液の５回の注入  ３−解離動態速度の決定のための３００秒の減衰  ４−１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーの４５秒の注入による表面の再生
【図２３】図２３：漸増濃度範囲の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｃ２０８Ｆ２溶液で得られたセンサーグラムに対するブランクセンサーグラム（ＨＢＳ−ＥＰ＋の５回の注入）の減算に相当するセンサーグラムを灰色で示す。下記パラメーター：ｋｏｎ＝（１．２０６±０．０３６）×１０６Ｍ−１．ｓ−１、ｋｏｆｆ＝（７．８１±０．１８）×１０−５ｓ−１、Ｒｍａｘ＝３０７．６±０．３ＲＵを用いた１：１モデルに相当する理論的センサーグラムを細い黒線で示す。ｃ２０８Ｆ２の算出濃度をグラフに示す：最高濃度（２４ｎＭ）のみを定数と見なす）。
【図２４】図２４：解離定数は各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、ｐＭ単位で表される比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎ×１０１２に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【図２５】図２５：半減期は、各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、時間の単位で表される比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆ／３６００に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【図２６】図２６：３つの異なる化合物とカップリングされた抗ＩＧＦ−１Ｒの細胞傷害性。５種類のキメラ抗体、抗ＩＧＦ−１ＲをＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた。無関連抗体ｃ９Ｇ４もまた同じ化合物とカップリングさせた。
【図２７Ａ】図２７Ａ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（図２７Ａ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２７Ｂ】図２７Ｂ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２７Ｂ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２７Ｃ】図２７Ｃ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３（図２７Ｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２８Ａ】図２８Ａ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＡＤＣ対照（ｃ９Ｇ４−Ｅ１３およびｃ９Ｇ４−Ｇ−１３）と比較したｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（図２８Ａ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２８Ｂ】図２８Ｂ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＡＤＣ対照（ｃ９Ｇ４−Ｅ１３およびｃ９Ｇ４−Ｇ−１３）と比較したｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２８Ｂ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂ：酸性ｐＨは、ヒト化ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０２６／Ｌ０２４（Ａ）およびｈｚ２０８Ｆ２（Ｈ０７７／Ｌ０１８（Ｂ）の結合能を低下させる。
【図３０】図３０：正常細胞におけるｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３の細胞傷害性の評価。
【図３１】図３１：Ｇ−１３とカップリングされたｈｚ２０８Ｆ２のヒト化変異体の細胞傷害性。無関連抗体ｃ９Ｇ４もまた同じ化合物とカップリングさせた。
【図３２】図３２：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける２０８Ｆ２−Ｇ−１３とｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３のヒト化形態のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける１回の注射に比べて、４回注射したｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（３３Ａ）またはｈｚ２０８Ｆ２−４−Ｇ−１３（３３Ｂ）のいずれかのｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂ：ＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（３４Ａ）およびｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（３４Ｂ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｄ：カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトされた抗ポリヒスチジンマウスモノクローナル抗体の１２０００ＲＵ超で活性化したＣＭ５に捕捉された可溶型のｈ−ＩＧＦ１Ｒ（３０μｇ／ｍｌ）のキャプチャーに相当するセンサーグラム。この注入の後に、Ａｃ１として、ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋）（ＡおよびＣ）または５０μｇ／ｍｌの濃度で使用したＨｚ２０８Ｆ２−４（ＢおよびＣ）のいずれかを注入した。この注入の後、Ａｃ２として５０μｇ／ｍｌの濃度のＨｚ２０８Ｆ２−４（ＡおよびＢ）または５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ８１０Ｃ１２（ＣおよびＤ）を注入した。実験はＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００にて２５℃、流速１０μｌ／分で行った。
【図３６】図３６：Ａｃ１不含（白いバー）のまたはＡｃ１の存在下での（黒いバー）注入後２０秒におけるＡｃ２の結合レベル。
【図３７】図３７：２＋ＮＣＩ−Ｈ２１２２異種移植モデルにおけるＧ−１３化合物に結合された２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図３８】図３８：２０８Ｆ２−Ｇ−１３の注射前のＭＣＦ７腫瘍におけるＩＧＦ−１ＲおよびＫｉ６７染色レベル。
【図３９】図３９：２０８Ｆ２−Ｇ−１３の注入後のＭＣＦ７腫瘍におけるＩＧＦ−１ＲおよびＫｉ６７染色レベル。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、癌の処置のための方法であって、それを必要とする対象がＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を呈する場合に、その対象をＩＧＦ−１Ｒ標的療法で処置することを含んでなり、
前記対象のＩＧＦ−１Ｒ状態は、前記対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて決定されており、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
である方法に関し、
その処置は、下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩を用いて実現される。
【００３６】
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を有する対象における癌の処置のため、または癌の処置に使用するための組成物であって、下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩を含んでなること、および
前記対象のＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態は前記対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて決定されており、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
であることを特徴とする組成物に関する。
【００３７】
本発明はまた、
Ａ）対象の生体サンプルから第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いて対象のＩＧＦ−１Ｒ（＋）状態を決定する工程；および
Ｂ）前記対象がＩＧＦ−ＩＲ（＋）状態を呈する場合に、その患者に抗体−薬物複合体を投与する工程
を含んでなり、
・前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント
であり；かつ
・前記抗体−薬物複合体は下記式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
［式中、
Ａｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、薬物部分であり；かつ
ｎは、１〜１２である］
を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩である、
対象におけるＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置において使用するための抗体−薬物複合体に関する。
【００３８】
本発明はまた、
ａ）
ｉ）配列番号１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、もしくはその任意の抗原結合フラグメント；又は
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖とを含んでなる抗体、またはその任意の抗原結合フラグメント
からなる第１のＩＧＦ−１Ｒ；ならびに
ｂ）下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
（Ｉ）
［式中、
Ａｂは、ｉ）配列番号２１、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号２４、２５および２６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、下記式（ＩＩ）の薬物部分：
【化６】
2018537425.tif 000010
［式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
波線は、Ｌとの結合点を示し；かつ
ｎは、１〜１２である］
またはその薬学的に許容可能な塩
を少なくとも含んでなる、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置において使用するためのキットに関する。
【００３９】
Ｉ−定義
用語「抗体（単数）」、「抗体（複数）」、「ａｂ」、「Ａｂ」、「ＭＡｂ」または「免疫グロブリン」は、最も広義で互換的に使用され、それらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、単離された、操作された、または組換え型の抗体（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびまたその抗体フラグメントが含まれる。より詳しくは、このような分子は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼称されるより保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００４０】
本発明で使用する場合、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」という表現は、「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」と同様に解釈されるべきであり、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体を意味する。
【００４１】
用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団の個々の抗体は、わずかな量で存在し得る潜在的な自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられている。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一のクローンまたはハイブリドーマにより生産され得る。モノクローナル抗体はまた、組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学または化学合成により生産され得る。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。加えて、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。本明細書のモノクローナル抗体は、後述されるものなどのマウス、キメラ、およびヒト化抗体を含む。
【００４２】
用語「組換え抗体」は、生きた細胞内での組換えＤＮＡの発現から生じる抗体を意味する。本発明の組換え抗体は、当業者に周知の遺伝子組換えの実験法を用いて生物には見られないＤＮＡ配列を作出することにより得られる。
【００４３】
本発明によるＡＤＣの抗体の「抗原結合フラグメント」または「ＩＧＦ−ＩＲ結合フラグメント」とは、抗体の標的（一般に抗原とも呼称される）との結合能を保持するいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すことを意図する。一つの実施形態では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディ、またはポリ（アルキレン）グリコール、例えば、ポリ（エチレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼称されるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）などの化学修飾により、または本発明による抗体の特徴的ＣＤＲのうち少なくとも１つを有する前記フラグメントをリポソーム内に組み込むことによりその半減期が延長されている任意のフラグメントからなる群において選択される。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列から構成されるか、または含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および標的に対して十分な、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。より好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖の３つのＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と可変軽鎖の３つのＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から少なくとも構成されるか、または含んでなる。
【００４４】
「結合」または「結合する」などとは、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定な、抗原との複合体を形成することを意図する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍの平衡解離定数を特徴とし得る。２分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、および放射性標識アッセイなどが含まれる。疑念を避けるため、それは前記抗体が別の抗原と、低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながら、一つの実施形態として、前記抗体は前記抗原のみと結合する。
【００４５】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴによって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことを意図する。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼称される２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。
【００４６】
本明細書に相反する記載がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味するものと理解されるべきである。しかしながら、ＣＤＲはまたＫａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版)に従って定義することもできる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ここで、用語ＣＤＲ（単数または複数）は、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１以上もしくはさらには全体を示すために使用される。本出願の通読を簡単にするために、ＫａｂａｔによるＣＤＲは定義しない。しかしながら、ＩＭＧＴによるＣＤＲの定義を用いてＫａｂａｔによるＣＤＲを定義することは当業者には自明であろう。
【００４７】
用語５０％有効濃度（ＥＣ５０）は、ベースラインと明示されたある暴露時間後の最大値の間の中点の応答を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度に相当する。それは薬物の効力の尺度として慣用されている。従って、漸増用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が見られる化合物の濃度を表す。素量的用量反応曲線のＥＣ５０は、明示された暴露期間の後に集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。濃度尺度は一般に、比較的小さな濃度変化で急激に増加するシグモイド曲線を描く。これはベストフィットラインの導出により数学的に決定できる。
【００４８】
用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまたコンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成される。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴、および／または特定の変化特徴を有し得る。
【００４９】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性」または「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。同一性パーセンテージは、アミノ酸ヌクレオチドまたは残基が２配列間、好ましくは、２つの完全配列間で同一である位置の数を求め、その同一の位置の数をアラインメントウインドウの位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより計算される。例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ２配列」(Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing p
rotein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して；選択されるマトリックスは例えば、このプログラムにより提案される「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用することができ、比較する２配列間の同一性パーセンテージがこのプログラムにより直接計算される。参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列については、好ましい例として、参照配列、特定の修飾、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含むものが挙げられる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」という表現は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の、また、以下に定義される具体例の、生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。限定されない例として、下表１は、対応する修飾抗体の生物活性に有意な修飾をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。より好ましい実施形態では、ＣＤＲを含有する抗体の参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列内に含まれる非修飾ＣＤＲを少なくとも含む。
【００５０】
【表１】
2018537425.tif 000011
【００５１】
本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない核酸のフラグメントまたは領域を定義し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ＩＧＦ−１Ｒ療法の投与から利益を受けるであろう対象」および「ＩＧＦ−１Ｒ療法で処置され得る対象」などの句は、例えばＩＧＦ−１Ｒの検出のため（例えば、診断手順のため）のＩＧＦ−１Ｒ療法の投与から、および／またはＩＧＦ−１Ｒと結合するＩＧＦ−１Ｒ結合分子を用いた処置、すなわち癌などの疾患の軽減もしくは予防から利益を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。本明細書にさらに詳しく記載されるように、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、非複合体型で使用することができ、または例えば薬物、プロドラッグ、または同位体と複合体を形成することもできる。
【００５３】
「ＩＧＦ−１Ｒ発現癌」とは、ＩＧＦ−１Ｒを発現、過剰発現、または異常発現するいずれの癌も意味する。特定の実施形態では、それは前癌病変、異常な細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍を含んでなり、または「癌」は、ＩＧＦ−１Ｒを発現、過剰発現、もしくは異常発現する細胞を含んでなる。
【００５４】
疾病を「診断する」とは、本明細書で使用する場合、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する、またはＩＧＦ−１Ｒの発現により媒介される病的過剰増殖性腫瘍形成障害の存在を同定または検出する、疾患の進行を経過観察する、およびＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する障害の指標となる細胞またはサンプルを同定または検出する方法を意味する。
【００５５】
「予後」は、本明細書で使用する場合、疾患からの回復の見込みまたは疾患のあり得る発症もしくは転帰の予測を意味する。例えば、対象由来のサンプルがＩＧＦ−１Ｒ抗体による染色に関して陰性であれば、その対象の「予後」は、サンプルがＩＧＦ−１Ｒ染色に関して陽性である場合よりも良好である。サンプルは、以下のより詳説されるように、適当な尺度でＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関してスコア化され得る。
【００５６】
「生体サンプル」は、対象から採取可能ないずれのサンプルであってもよい。このようなサンプルは、本発明のバイオマーカーの発現レベルの決定を可能としなければならない。従って、サンプルの性質は腫瘍の性質に依存する。好ましい生体サンプルは、癌が液性腫瘍である場合には、血液サンプル、血漿サンプル、またはリンパサンプルなどのサンプルを含む。好ましい生体サンプルは、癌が固形腫瘍である場合には、生検サンプルまたは外科的切除療法から採取されたサンプルなどのサンプルを含む。好ましくは、生体サンプルは、血清、全血細胞などの体液、組織サンプルまたはヒト起源の生検である。サンプルは、例えば、生検組織を含み、これはＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する病的腫瘍形成障害の存在に関して好都合にアッセイすることができる。
【００５７】
「ＩＧＦ−１Ｒ状態」は、本発明の意味の範囲内で、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光活性化細胞選別ＦＡＣＳ、または当業者に公知の他の方法などの任意の方法によって測定されるＩＧＦ−１Ｒの発現レベルの決定に基づく、ＩＧＦ−１Ｒ陽性［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］またはＩＧＦ−１Ｒ陰性［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］種への腫瘍の分類に関する。
【００５８】
ＩＩ−第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体
本発明の実施形態において、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、
ｉ）配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；
ｉｉ）配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖と
を含んでなる。
【００５９】
第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号７の配列、または配列番号７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。
【００６０】
第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号８の配列、または配列番号８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。
【００６１】
前記実施形態によれば、８１０Ｄ１２と呼称される第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号７の配列もしくは最適なアラインメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなること；ならびに／または配列番号８の配列もしくは最適なアラインメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなることを特徴とする。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、
ｉ）配列番号１１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する重鎖と；
ｉｉ）配列番号１４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５の配列のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を有する軽鎖
を含んでなる。
【００６３】
第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号１７の配列、または配列番号１７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。
【００６４】
第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号１８の配列、または配列番号１８の配列と少なくとも９０％の相同性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。
【００６５】
前記実施形態によれば、８１０Ｄ１２ＴＰ呼称される第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号１７の配列もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなること；ならびに／または配列番号１８の配列もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を有する配列のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなることを特徴とする。
【００６６】
本発明の特定の態様は、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントがインスリン受容体（ＩＲ）と結合しないというものである。
【００６７】
別の実施形態では、本発明の第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、モノクローナル抗体からなる。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、組換え抗体からなる。
【００６９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、化学合成抗体からなる。
【００７０】
「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、（相反する明示がなければ）前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体のマウス、キメラおよびヒト化型である。
【００７１】
より明確にするために、下表２にＩＭＧＴに従って定義される抗体８１０Ｄ１２（表２ａ）および８１６Ｃ１２（表２ｂ）の配列を示す。
【００７２】
【表２】
2018537425.tif 000012
【００７３】
一つの実施形態では、本明細書においてモノクローナル抗体は、マウス、キメラおよびヒト化抗体を含む。
【００７４】
第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、仏国）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来してよく、前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞との融合により得られたものである。前記ハイブリドーマは、ｉ）２０１４年９月１７日に番号Ｉ−４８９３としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、仏国に寄託されたマウス起源のハイブリドーマ、またはｉｉ）２０１４年９月１７日に番号Ｉ−４８９４としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、仏国に寄託されたマウス起源のハイブリドーマから選択することができる。
【００７５】
前記ハイブリドーマＩ−４８９３により分泌される、本明細書で８１０Ｄ１２と呼称される第１のＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、本発明において明らかに使用可能である。
【００７６】
前記ハイブリドーマＩ−４８９４により分泌される、本明細書で８１６Ｃ１２と呼称される第１のＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、本発明において明らかに使用可能である。
【００７７】
別の実施形態では、前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、以下のヌクレオチド配列：
ｉ）重鎖可変ドメインとしての配列番号９および／または軽鎖可変ドメインとしての配列番号１０；
ｉｉ）重鎖可変ドメインとしての配列番号１９および／または軽鎖可変ドメインとしての配列番号２０
によりコードされ得る。
【００７８】
以下の表３に、抗体８１０Ｄ１２（表３ａ）および抗体８１６Ｃ１２（表３ｂ）に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
【００７９】
【表３】
2018537425.tif 000013
【００８０】
本発明の第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体のバイオマーカーとしての使用も開示される。本方法は、限定されるものではないが、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、膠芽腫、結腸癌(colon, cancer)、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、頭頸部癌またはＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する任意の他の癌により例示されるＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する種々の過剰増殖性腫瘍形成障害を検出または診断するために使用可能である。当業者により認識されるように、特定の障害に関連する抗体発現のレベルは、既存の病態の性質および／または重篤度によって異なる。
【００８１】
ＩＧＦ−１Ｒ状態の決定は、当業者に知られた、または当業者により現在使用されている任意の方法または技術によって行うことができる（一般に、ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルの決定に基づく）。しかしながら、いくつかの非限定例を以下に示す。
【００８２】
病期の決定は、潜在的予後値を含み、最適な療法を計画するための基準を与える。Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。例えば、固形腫瘍の処置選択は腫瘍の病期分類に基づき、通常、米国癌合同委員会(American Joint Committee on Cancer)（ＡＪＣＣ）からの腫瘍／結節／転移（ＴＮＭ）検査を用いて行われる。この検査および病期分類体系は患者において固形癌が診断された病期に関するいくつかの有価な情報を提供するが、それは不正確で不十分であることが一般に認識される。特に、それは腫瘍進行の最も早い病気を特定することができない。
【００８３】
ある実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて対象の腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒスコアを決定するための方法は、
（ａ）前記対象由来の生体サンプルを上記のような第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程；
（ｂ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）により、前記生体サンプル中のＩＧＦ−１Ｒに対する前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントの結合レベルを定量する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた定量レベルを２つのパラメーター、すなわち、染色の強度および陽性細胞のパーセンテージに基づく適当な尺度と比較することにより、前記腫瘍細胞をスコア化する工程
を含んでなり得る。
【００８４】
ある実施形態では、第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、組織サンプルが、ホルマリン固定、ホルモール置換固定、Ｇｌｙｃｏ−ｆｉｘｘ固定、パラフィン包埋および／または凍結されている場合に、ＩＧＦ−１Ｒ結合能を有する。
【００８５】
いずれの従来のハザード分析法をＩＧＦ−１Ｒの予後値を評価するために使用してもよい。代表的な分析方法としてはコックス回帰分析が含まれ、これは打ち切りがある場合の生存またはイベントまでの時間のデータのモデル化のためのセミパラメトリック法である(Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972)。例えば生命表またはカプラン・マイヤーなどの他の生存分析とは対照的に、コックスは、モデル内に予測因子変数（共変量）の包含を可能とする。慣例分析法、例えばコックスを用いて、原発腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ発現状と、疾患再発（無病生存期間、もしくは転移性疾患までの時間）または疾患による死亡までの時間（全生存期間）のいずれかの発生までの時間との相関に関する仮説を検証することが可能となり得る。コックス回帰分析は、コックス比例ハザード分析としても知られる。この方法は、患者の生存期間に対して腫瘍マーカーの予後値を検定するために標準的である。多変量様式で使用する場合、独立した予後値を有する個々の共変量、すなわち、最も有用なマーカーが同定され得るように、いくつかの共変量の効果が並行して検定される。陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語はまた、［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］または［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］として表すこともできる。
【００８６】
サンプルは、癌の診断または経過観察の際に「スコア化」され得る。その最も単純形態で、スコア化は、免疫組織化学によるサンプルの視覚的検査によって判断して明確な陰性または陽性であり得る。より定量的なスコア化は、染色強度とサンプル採取された染色（「陽性」）細胞の割合の２つのパラメーターを判断することを含む。
【００８７】
ある実施形態では、標準化を保証するために、サンプルを種々の尺度に対するＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関してスコア化してもよく、それらのほとんどは反応生成物の強度および陽性細胞のパーセンテージの評価に基づく(Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90)。
【００８８】
別の実施形態では、前記スコア化は、染色の強度および陽性細胞のパーセンテージに基づく適当な尺度を使用することを含んでなる。
【００８９】
第１の例として、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のＩＨＣ評価に関するＱｕｉｃｋ  Ａｌｌｒｅｄスコア化と同様に、サンプルは、反応性の強度および染色細胞の割合に関するスコアを合わせた０〜８の包括的尺度で、ＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関してスコア化され得る(Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481)。より詳しくは、反応性強度の第１の基準は０〜３の尺度でスコア化され、０は「反応性無し」に相当し、３は「強い反応性」に相当する。比例反応性の第２の基準は０〜５の尺度でスコア化され、０は「反応性無し」、５は「６７〜１００％の比例反応性」に相当する。次に、反応性の強度のスコアと比例反応性のスコアを足して、０〜８の合計スコアを出す。合計スコア０〜２は陰性と見なされ、合計スコア３〜８は陽性と見なされる。
【００９０】
この尺度によれば、本明細書で使用する腫瘍の陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、それぞれＡｌｌｒｅｄ尺度のスコア０〜２または３〜８に相当するＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを指す。
【００９１】
以下の表４は、ＩＨＣ結果をＡｌｌｒｅｄ法に従って解釈するための指針を示す。
【００９２】
【表４】
2018537425.tif 000014
【００９３】
本発明によれば、前記適当な尺度は、０〜８の尺度であり得、反応性無しは０点であり、６７〜１００％の割合の強い反応性は８点である。
【００９４】
言い換えれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて対象由来の腫瘍の状態を決定する方法が記載され、前記方法は、（ａ）対象由来の腫瘍をＡｌｌｒｅｄ尺度に従ってスコア化する工程；および（ｂ）Ａｌｌｒｅｄスコア３〜８で、その腫瘍の状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であることを決定する；または（ｃ）Ａｌｌｒｅｄスコア０〜２で、その腫瘍の状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であることを決定する工程を含んでなる。
【００９５】
本発明の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア３で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【００９６】
本発明の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア４で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【００９７】
本発明の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア５で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【００９８】
本発明の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア６で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【００９９】
本発明の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア７で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１００】
本発明の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア８で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０１】
本発明の別の特定の態様では、Ａｌｌｒｅｄスコア３〜８で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて対象における腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態を決定するための、本明細書に記載の別の特定の方法は、
（ａ）ＩＧＦ−１Ｒ腫瘍細胞を上記のようにスコア化する工程；および
（ｂ）スコア３〜８で腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であることを決定する工程；または
（ｃ）スコア０〜２で腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であることを決定する工程
を含んでなることを特徴とする。
【０１０３】
第２の例として、例えば、ＨＥＲ−２受容体のＩＨＣ評価のための従来のスコア化と同様に、染色の強度（優先的には、膜性染色）および染色を示す細胞の割合を統合して０〜３＋の複合尺度とするややより単純なスコア化法でサンプルをＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに関してスコア化してもよい。
【０１０４】
簡易尺度と呼称されるこの尺度では、０および１＋が陰性であり、２＋および３＋が陽性染色を表す。しかしながら、各陽性スコアはスコア０（陰性）に比べて有意に高い再発リスクおよび致死性疾患に関連付けられ得るので、スコア１＋〜３＋は陽性と見なされ得るが、陽性スコア間の強度の上昇はさらなるリスク減をもたらし得る。
【０１０５】
一般的に言えば、本明細書で使用する腫瘍の陰性または陽性「ＩＧＦ−１Ｒ状態」という用語は、簡易尺度のそれぞれスコア０〜１＋または２＋〜３＋に相当するＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを意味する。浸潤性腫瘍の完全な周辺の膜性反応性のみを考慮すべきであり、しばしば「金網」の外観になぞらえられる。現行の指針の下では、ＩＧＦ−１Ｒに関してボーダーライン（スコア２＋または３＋）としてスコア化されたサンプルは、さらなる評価を受けることが要される。非限定例として、対照が予想通りでなく、アーチファクトがほとんどのサンプルに伴い、サンプルが正常乳管（内部対照）の強い膜性陽性を有し、過度の抗原賦活が示唆される場合には、ＩＨＣ分析は拒絶され、繰り返されるか、またはＦＩＳＨもしくは他の任意の方法により試験されるべきである。
【０１０６】
より明確にするために、以下の表５にこれらのパラメーターをまとめる。
【０１０７】
【表５】
2018537425.tif 000015
【０１０８】
適当な尺度は０〜３＋の尺度であり得、ここで、腫瘍細胞の膜性反応性無しはスコア０とされ、１０％を超える腫瘍細胞の強い完全反応性はスコア３＋とされる。
【０１０９】
より詳しくは、上記のように、前記適当な尺度は、０〜３の尺度であり、ここで、腫瘍細胞の膜性反応性無しはスコア０；１０％を超える腫瘍細胞でのかろうじて認識できる膜性反応性はスコア１＋；１０％を超える腫瘍細胞での弱い〜中等度の完全膜性反応性はスコア２＋；および１０％を超える腫瘍細胞での強い完全反応性はスコア３＋とされる。
【０１１０】
言い換えれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて対象由来の腫瘍の状態を決定する方法が記載され、前記方法は、（ａ）対象由来の腫瘍を上記のような簡易尺度に従ってスコアする工程；および（ｂ）スコア２＋または３＋で、その腫瘍の状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であることを決定する工程し；または（ｃ）スコア０または１＋で、その腫瘍の状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であることを決定する工程を含んでなる。
【０１１１】
本発明の特定の態様では、スコア２＋で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１１２】
本発明の特定の態様では、スコア３＋で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１１３】
本発明の別の特定の態様では、スコア２＋または３＋で、腫瘍は［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］である。
【０１１４】
別の実施形態では、対象においてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態を決定するための方法は、
（ａ）前記対象由来のＩＧＦ−１Ｒ腫瘍細胞を前記の方法に従ってスコア化する工程；および
（ｂ）スコア２＋または３＋で、腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（＋）］であると決定する工程；または
（ｃ）スコア０または１＋で、腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態が［ＩＧＦ−１Ｒ（−）］であると決定する工程
を含んでなり得る。
【０１１５】
一般に、検査またはアッセイの結果は、多様な形式のいずれかで提供することができる。これらの結果は定量的に提供することができる。例えば、検査報告は、特定のポリペプチドが検出されたかどうかのみを、おそらくはまた検出限界の表示とともに示すことができる。結果は半定量的として提示してもよい。例えば、様々な範囲を定義してもよく、それらの範囲は、ある程度の量的情報を与えるあるスコアに割り当てることがきる（例えば、使用する尺度に応じて０〜３＋または０〜８）。このようなスコアは、種々の因子、例えば、ＩＧＦ−１Ｒが検出される細胞の数、シグナルの強度（ＧＦ−１ＲまたはＩＧＦ−１Ｒ保持細胞の発現レベルを示し得る）などを反映し得る。これらの結果は、例えば、ＩＧＦ−１Ｒが検出される細胞のパーセンテージとして、タンパク質濃度としてなど、定量的に提示されてもよい。
【０１１６】
当業者により認識されるように、検査により提供される出力のタイプは、その検査の技術的限界およびそのポリペプチドの検出に関連する生物学的重要性に応じて異なる。例えば、特定のポリペプチドの場合、純粋に質的な出力（例えば、そのポリペプチドが特定の検出レベルで検出されるかどうか）は有意な情報を提供する。他の場合、より定量的な出力（例えば、サンプル中のポリペプチドの発現レベルの比が、通常レベルに対して検定される）が必要である。
【０１１７】
本発明の別の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ状態の決定は、ＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする療法の投与に応答したＩＧＦ−１Ｒ発現のモニタリングのために行い得る。このようなモニタリングは、前記療法がＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションおよび／または分解を標的とする場合に極めて有用であり得る。
【０１１８】
また、腫瘍形成性障害がＩＧＦ−１Ｒ標的療法による処置に感受性があるかどうかを決定するための方法を記載することも本発明の目的であり、前記方法は、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて対象の腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態を上記の方法に従って決定する工程、および
（ｂ）腫瘍細胞のＩＧＦ−１Ｒ状態がＩＧＦ−１Ｒ（＋）であれば、前記腫瘍形成性障害はＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする抗体薬による処置に感受性があることを決定する工程
を含んでなる。
【０１１９】
特に、細胞表面のＧＦ−１Ｒ発現のモニタリングは、臨床試験および「個別化」療法の際の処置の有効性を評価するための重要なツールとなり得る。
【０１２０】
ＩＧＦ−１Ｒレベルの上昇または低下は、ＩＧＦ−１Ｒに関連する癌の進展の指標となる。よって、ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞の数の増加または種々の組織もしくは細胞に存在するＩＧＦ−１Ｒの濃度の変化を測定することにより、ＩＧＦ−１Ｒに関連する悪性腫瘍を改善することを目的とした特定の治療計画が有効であるかどうかを決定することが可能である。
【０１２１】
また、本発明のもう一つの目的は、前記障害に罹患している対象においてＩＧＦ−１Ｒに関連する腫瘍形成性障害を緩和するように計画された治療計画の有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて決定するための方法であり、前記方法は、
（ａ）第１の生体サンプルにおいて上記のようなＩＧＦ−１Ｒの第１の発現レベルを決定する工程、前記第１の生体サンプルは、前記処置の第１の時点に相当する；
（ｂ）第２の生体サンプルにおいて上記のようなＩＧＦ−１Ｒの第２の発現レベルを決定する工程、前記第２の生体サンプルは、前記処置のその後の第２の時点に相当する；
（ｃ）工程（ａ）で得られた前記第１の発現レベルと工程（ｂ）で得られた前記第２の発現レベルの比を計算する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の比が１より大きい場合に前記治療計画の有効性が高いと決定する；または工程（ｃ）の比が１以下の場合に前記治療計画の有効性が低いと決定する工程
を含んでなる。
【０１２２】
好ましい実施形態では、前記障害に罹患している対象においてＩＧＦ−１Ｒに関連する腫瘍形成性障害を緩和するように計画された前記治療計画は、前記対象へのＩＧＦ−１Ｒ経路を標的とする療法の投与を含む。
【０１２３】
また、ＩＧＦ−１Ｒの発現に関連する腫瘍形成性障害のイメージングのｉｎ  ｖｉｖｏ法を提供することも本発明の目的である。このような方法は、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで限局する、ならびにそれらの浸潤性を経過観察するために有用である。同様に、本方法は、ＩＧＦ−１Ｒ介在性癌と従前に診断された患者において進行および／または処置に対する応答を経過観察するためにも有用である。
【０１２４】
一つの実施形態は、対象においてＩＧＦ−１Ｒ発現腫瘍細胞の位置を検出するための方法であり、前記方法は、
ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメントを前記対象に投与する工程；および
ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を検出する工程
を含んでなり、
前記結合は腫瘍細胞の存在を示す。
【０１２５】
発現腫瘍の存在の検出については、当業者に公知の多くの技術が使用できる。しかしながらやはり、好ましい手段はＩＨＣおよびＦＡＣＳである。
【０１２６】
ＩＩＩ−抗体薬物複合体（ＡＤＣ）
ＩＩＩ．１−第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ａｂ）
ある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、組換え抗体からなる。
【０１２７】
別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、化学的に合成された抗体からなる。
【０１２８】
本出願のある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのエピトープは、優先的には、ヒトＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤとも呼称される）に位置する。
【０１２９】
特定の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ、またはその任意の抗原結合フラグメントは、１０×１０−１０〜１×１０−１０の間、より優先的には８×１０−１０〜２×１０−１０の間に含まれるＥＣ５０でＩＧＦ−１Ｒと結合し得る。
【０１３０】
好ましい実施形態として、本発明で決定されたＥＣ５０は、ヒト腫瘍細胞上に露出しているＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤに結合する抗体の効力を特徴付ける。ＥＣ５０パラメーターは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定される。ＥＣ５０パラメーターは、ヒト腫瘍細胞上で発現されるヒトＩＧＦ−１Ｒに対して最大結合の５０％が得られる抗体濃度を表す。各ＥＣ５０値は、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量反応曲線の中点として計算された。このパラメーターは生理学的／病理学的状態を代表するように選択された。
【０１３１】
ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関する競合は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれの方法または技術によっても決定可能である。「ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関して競合する」とは、少なくとも２０％、優先的には少なくとも５０％、より優先的には少なくとも７０％の競合を意味する。
【０１３２】
同じエピトープへの結合の決定は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれの方法または技術によっても決定可能である。「ＩＧＦ−Ｒの同じエピトープに結合する」とは、少なくとも２０％、優先的には少なくとも５０％、より優先的には少なくとも７０％に競合を意味する。
【０１３３】
上述のように、一般的知識に反して、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ結合後に高い内部移行能を示す特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体に着目する。本明細書で使用する場合、「内部移行される」または「内部移行された」抗体（これらの２つの表現は同様である）は、哺乳動物細胞上のＩＧＦ−１Ｒに結合した際に細胞により取り込まれる（それが入ることを意味する）ものである。このような抗体はＡＤＣの一部として着目され、従って、それは連結された細胞傷害剤を標的癌細胞にアドレスする、または向ける。ひと度、内部移行されると、細胞傷害剤は癌細胞死を誘導する。
【０１３４】
驚くことに、本発明による第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは総てＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関しては同じ配列を示し、他の３つのＣＤＲは異なる。この所見は、抗体の結合特異性に関して、ＣＤＲ−Ｈ３が最も重要であり、エピトープの認識に最も関連があると記載されている一般的知識の一部であるので、一貫性があると思われる。
【０１３５】
ＡＤＣ療法で成功するための重要な鍵は、標的抗原の特異性と抗原−抗体複合体の癌細胞への内部移行であると思われる。明らかに内部移行しない抗原は内部移行する抗原よりも細胞傷害性薬剤送達効果が低い。内部移行プロセスは抗原によって異なり、抗体により影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。
【０１３６】
ＡＤＣでは、細胞傷害剤が細胞傷害活性を付与し、使用する抗体が癌細胞に対する特異性、ならびに細胞傷害剤を適正にアドレスするよう細胞内に入れるためのベクターを担う。従って、ＡＤＣを改善するために、抗体は標的癌細胞への高い内部移行能を示し得る。抗体により媒介される内部移行の効率は、標的とされるエピトープによって有意に異なる。強力な内部移行性ＩＧＦ−１Ｒ抗体の選択には、ＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションだけではなく、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞への内部移行後を研究する様々な実験データが必要である。
【０１３７】
ある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの内部移行は、免疫蛍光もしくはＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）（本出願の下記に例示される通り）または内部移行機構に特異的な当業者に公知の任意の方法もしくはプロセスによって評価することができる。好ましい実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、ＩＧＦ−１Ｒとの結合後に少なくとも３０％、優先的には５０％、より優先的には８０％の内部移行を誘導し得る。
【０１３８】
複合体ＩＧＦ−１Ｒ／第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、前記ＩＧＦ−１ＲのＥＣＤへの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合の後に内部移行され、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒ量の減少が誘導される。この減少は、非限定例としてのウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫蛍光などの当業者に公知のいずれかの方法によって定量することができる。
【０１３９】
一つの実施形態では、このように内部移行を反映するこの減少は、好ましくはＦＡＣＳにより測定可能であり、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂとの４時間のインキュベーション後に、４℃で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）と３７℃で測定されたＭＦＩの間の差またはΔとして表すことができる。
【０１４０】
非限定例として、このΔは、ｉ）第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂとの４時間のインキュベーション後の乳癌細胞ＭＣＦ７と、ｉｉ）Ａｌｅｘａ４８８で標識された二次抗体を用い、非処理細胞および第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ体で処理した細胞で得られたＭＦＩに基づいて決定される。このパラメーターは、下記式：Δ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）で算出される通りに定義される。
【０１４１】
ＭＦＩは細胞表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒに比例するので、このＭＦＩ間の差異は、ＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを反映する。
【０１４２】
有利な態様において、本抗体は、ＭＣＦ−７上でΔ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）を惹起する少なくとも２８０、好ましくは少なくとも４００の抗体からなる。
【０１４３】
より詳細には、上述のΔは下記の方法に従って測定することができ、それは例示的な非限定例と見なされるべきである：
ａ）対象とする腫瘍細胞を低温（４℃）または温かい（３７℃）完全培養培地中、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂで処理し、インキュベートすること；
ｂ）工程ａ）の処理細胞および並行して非処理細胞を二次抗体で処理すること；
ｃ）本発明の抗体と結合し得る二次標的抗体で処理した細胞および非処理の細胞のＭＦＩを測定すること（表面に存在するＩＧＦ−１Ｒの量を代表する）；および
ｄ）Δを非処理細胞で得られたＭＦＩからの、処理細胞で得られたＭＦＩの減算として計算すること。
【０１４４】
このΔＭＦＩから、内部移行パーセンテージを
１００×（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）／ＭＦＩ４℃
として求めることができる。
【０１４５】
ＡＤＣの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、好ましくは、ＭＣＦ７に対して、５０％〜９９％、７０％〜９０％、優先的には７５％〜８７％の間に含まれる内部移行パーセンテージである。
【０１４６】
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ特定の利点は、それらの内部移行速度によるものである。
【０１４７】
ＡＤＣの場合、使用する抗体は急速な、好ましくは、抗体の投与から２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、いっそうより好ましくは６時間以内の内部移行速度を示すことが望ましいと一般に知られている。
【０１４８】
本発明では、細胞表面結合抗体減少または細胞表面抗体減衰とも呼称される内部移行速度は、ｔ１／２（半減期）として表され、ΔＭＦＩの５０％の低下を得るために必要な時間に相当する（この態様は、下記の例に関して明確に理解される）。
【０１４９】
特定の利点は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、５〜２５分の間、優先的には１０〜２０分の間に含まれるｔ１／２を有する。
【０１５０】
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号２２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号２３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２５の配列のＣＤＲ−Ｌ２を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなり得る。
【０１５１】
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号２１、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、２５および２６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなり得る。
【０１５２】
ある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号２１、２２および２３の配列、または配列番号２１、２２もしくは２３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる３つの重鎖ＣＤＲと；配列番号２４、２５および２６の配列、または配列番号２４、２５もしくは２６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなるか、またはからなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなり得る。
【０１５３】
別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号２１、２２および２３の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲと；配列番号２４、２５および２６の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１５４】
特定の態様によれば、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、インスリン受容体（ＩＲ）と結合しない。この態様は、本明細書に記載の抗体は、インスリン代謝を意味する、ＩＲに対する負の影響を持たないので注目される。
【０１５５】
別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのさらに別の有利な態様は、ヒトＩＧＦ−１ＲにだけでなくサルＩＧＦ−１Ｒにも、より詳しくは、カニクイザルＩＧＦ−１Ｒにも結合し得る。この態様もまた、それが臨床試験に必要とされる毒性評価を容易にするので注目される。
【０１５６】
さらに別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、モノクローナル抗体からなる。
【０１５７】
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、好ましくは、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、仏国）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来し、前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞の融合により得られたものである。
【０１５８】
前記マウスハイブリドーマは、それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所  仏国に寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６およびＩ−４７７４から選択され得る。
【０１５９】
特定の態様では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、ｉ）それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所  仏国に寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６もしくはＩ−４７７４により産生される抗体、またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じ、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択される。
【０１６０】
ある実施形態では、本発明の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂはマウス抗体からなり、従って、ｍ［抗体の名称］と呼称される。
【０１６１】
ある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂはキメラ抗体からなり、従って、ｃ［抗体の名称］と呼称される。
【０１６２】
ある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂはヒト化抗体からなり、従って、ｈｚ［抗体の名称］と呼称される。
【０１６３】
疑念を避けるため、以下の明細書において、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」および「［抗体の名称］という表現は同等であり、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体または前記「［抗体の名称］」のマウス型、キメラ型およびヒト化型を含む（相反する記載がない限り）。必要であれば、接頭辞ｍ−（マウス）、ｃ−（キメラ）またはｈｚ−（ヒト化）が使用される。
【０１６４】
より明確にするために、以下の表６ａに好ましい第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂに関してＩＭＧＴに従って定義されるＣＤＲ配列を示す。同じ特徴を示す他の任意の抗体も本発明の汎ＩＡに含まれ得る。
【０１６５】
【表６】
2018537425.tif 000016
【０１６６】
上記のような６つのＣＤＲのいずれの組合せも本発明の一部と見なされるべきであることは当業者には自明であろう。
【０１６７】
この表６ａから見て取ることができるように、本明細書に記載の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは総て、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関して同じ配列を有し、この特性は上記のように特に注目される。
【０１６８】
所与の態様では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、マウス（ｍ）抗体である。
【０１６９】
別の態様では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、キメラ（ｃ）抗体である。
【０１７０】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を前記の所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【０１７１】
キメラ抗体は、組換え遺伝子の技術を使用することにより製造され得る。例えば、キメラ抗体は、プロモーターおよび非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列および異種、好ましくは、ヒトの抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより製造することができる。１つのこのような組換え遺伝子によりコードされている本発明によるＡＤＣのキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。
【０１７２】
より明確にするために、以下の表６ｂに、キメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の種々の変異体に関するＶＨおよびＶＬ（可変ドメインおよび全長）の配列の非限定例を示す。
【０１７３】
【表７】
2018537425.tif 000017
さらに別の態様では、第２のＩＧＦ−１Ｒ  抗体Ａｂは、ヒト化抗体である。
【０１７４】
「ヒト化抗体」は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（ＦＲと呼称される）の一部を、結合親和性を保持するように改変することができる。
【０１７５】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的および／もいくは治療的処置を含む方法におけるそれらの使用に好ましい。ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２１６、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている例えば、「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術もまた当業者に公知である。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
【０１７６】
本発明の特定の実施形態として、限定されるものではないが、ｈｚ２０８Ｆ２からなる第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂが本明細書に記載される。このようなヒト化は、本発明の他の抗体部分にも当てはまり得る。
【０１７７】
ある実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、
ｉ）それぞれ配列番号２７、２２および２３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、
ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号８６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号８８）に由来するＦＲ４と
を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。
好ましい実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、
ｉ）それぞれ配列番号２９、２５および３１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、
ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号８７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号８９）に由来するＦＲ４
を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなる。
【０１７８】
限定されるものではないが、本発明の好ましい実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、
ａ）それぞれ配列番号２７、２２および２３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号８６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号８８）に由来するＦＲ４を有する重鎖と；
ｂ）それぞれ配列番号２９、２５および３１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号８７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号８９）に由来するＦＲ４を有する軽鎖と
を含んでなる。
【０１７９】
別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、
ａ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９から選択される配列、または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７もしくは５９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと；配列番号２９、２５および３１の配列３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３４、３７および６０から選択される配列または配列番号３４、３７もしくは６０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号２７、２２および２３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９から選択される配列、または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５もしくは５７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと；配列番号３４、３７および６０から選択される配列、または配列番号３４、３７もしくは６０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１８０】
別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、
ａ）配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５および５７から選択される配列、または配列番号３３、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５もしくは５７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３４の配列、または配列番号３４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３３、４１、４５および５５から選択される配列、または配列番号３３、４１、４５もしくは５５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３７の配列、または配列番号３７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５９の配列、または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６０の配列、または配列番号６０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体
から選択される。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、
ａ）配列番号３５の配列、または配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｂ）配列番号３５の配列、または配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３８の配列、または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｃ）配列番号４０の配列、または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｄ）配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｅ）配列番号４２の配列、または配列番号４２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３８の配列、または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｆ）配列番号４４の配列、または配列番号４４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｇ）配列番号４６の配列、または配列番号４６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｈ）配列番号４６の配列、または配列番号４６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３８の配列、または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｉ）配列番号４８の配列、または配列番号４８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｊ）配列番号５０の配列、または配列番号５０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｋ）配列番号５２の配列、または配列番号５２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｌ）配列番号５４の配列、または配列番号５４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｍ）配列番号５６の配列、または配列番号５６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｎ）配列番号５６の配列、または配列番号５６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３８の配列、または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｏ）配列番号５８の配列、または配列番号５８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；および
ｐ）配列番号６１の配列、または配列番号６１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６２の配列、または配列番号６２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体
から選択される抗体である。
【０１８２】
言い換えれば、本発明は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂが
ａ）配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６１から選択される配列、または配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８もしくは６１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖と；
ｂ）配列番号３６、３８および６２から選択される配列、または配列番号３６、３８および６２と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖と
を含んでなる抗体である、方法に関する。
【０１８３】
より明確にするために、以下の表６ｃに、ヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２の種々の変異体に関するＶＨおよびＶＬ（可変ドメインおよび全長）の配列の非限定例を示す。
【０１８４】
【表８】
2018537425.tif 000018
2018537425.tif 000019
【０１８５】
ＩＩＩ−２−薬物（Ｄ）
薬物部分Ｄは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管新生薬、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬、キレート剤、鉄吸収刺激剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、アポトーシス刺激剤、チミジル酸阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロンアゴニスト、リボヌクレオシド三リン酸レダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体アンタゴニスト、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管新生阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、カンナビノイド受容体アゴニスト、ドーパミン受容体アゴニスト、顆粒球刺激因子アゴニスト、エリスロポエチン受容体アゴニスト、ソマトスタチン受容体アゴニスト、ＬＨＲＨアゴニスト、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、インターロイキン受容体アンタゴニスト、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成刺激剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ビンカアルカロイド、抗ホルモン剤または免疫調節剤または細胞傷害剤もしくは毒素の活性基準を満たす任意の他の薬(dolostatin 10)、またはそれらの誘導体である。
【０１８６】
好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物に従う薬物部分は、下記式（ＩＩ）を有し、
【化７】
2018537425.tif 000020
式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリル（例えば、チアゾール−２−イル）であり、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、メチル）、特に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、メチル）であり、
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり、かつ、
波線は、Ｌとの結合点を示す。
【０１８７】
本発明において「アルキル」とは、直鎖または分岐型の飽和炭化水素鎖を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシル基が挙げられる。
【０１８８】
本発明において「（Ｃｘ−Ｃｙ）アルキル」は、ｘ〜ｙ個の炭素原子を含んでなる上記に定義されるようなアルキル鎖を意味する。よって、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖である。
【０１８９】
（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、有利には（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、好ましくは(preferably)  （Ｃ１−Ｃ２）アルキルである。
【０１９０】
本発明の化合物のうち、一つの特に好適なクラスの薬物部分は、Ｒ２がＣＯＯＨ基を表す式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
【０１９１】
別の特に好適なクラスの部分は、Ｒ２がチアゾール（特に、チアゾール−２−イル基）である式（ＩＩ）の部分に相当する。
【０１９２】
別のクラスの特に好適な部分は、Ｒ２がＣＯＯＭｅである式（ＩＩ）の部分に相当する。
【０１９３】
本発明の一つの特定の実施形態によれば、Ｒ２は、より詳しくは、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅまたはチアゾール−２−イル基である。
【０１９４】
第１の好ましい実施形態によれば、Ｒ２はＣＯＯＨである。
【０１９５】
第２の好ましい実施形態によれば、Ｒ２はＣＯＯＭｅである。
【０１９６】
Ｒ３は、特に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、有利にはメチル基を表す。
【０１９７】
ｍは、１〜８の間、特に１〜６の間、有利には１〜４の間に含まれる整数であり、好ましくは、１または２である。
【０１９８】
好ましい実施形態では、Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基であり、かつ、ｍは１または２である。
【０１９９】
本発明の薬物部分のうち、一つの特に好適なクラスの薬物部分は、Ｒ９がメチル基または水素である式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
【０２００】
好ましい実施形態では、
Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基であり、Ｒ９はメチル基であり、かつ、ｍは１または２であるか、または
Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基であり、Ｒ９は水素であり、かつ、ｍは１または２である。
【０２０１】
好ましい実施形態によれば、ＮＲ９基は、フェニル環上の、（ＣＨ２）ｍ基に対してパラ位に位置する。
【０２０２】
有利には、薬物部分は、以下の部分の中から選択される。
【化８】
2018537425.tif 000021
2018537425.tif 000022
（式ＤＨ）の薬物の製造：
本薬物は以下の合成スキームに記載される一般法を用い、場合により、必要であれば、文献に記載されている、または当業者に周知の、または実施例のその実験の部に記載される任意の標準操作により補って製造することができる。
【化９】
2018537425.tif 000023
スキーム１は、薬物を製造するために使用することができる第１の一般法を示す。上記の一般式において、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２およびＲ３は式ＩＩに関して従前に定義されたものなどであり、Ｒ４は、
【化１０】
2018537425.tif 000024
を表し、Ｒ４ａは、場合により保護形態の、従前に定義されたものなどのＲ４基を表し、かつ、Ｇは保護基である。
【０２０３】
第１の工程は、そのアミン官能基で保護基Ｇにより保護された化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）の縮合からなる。Ｘは、塩素などの脱離基を表し得る。この場合、第１の工程は、酸塩化物とアミンの間の反応からなる。この反応は、当業者に周知の方法および技術を用いて行うことができる。一つの特に好適な方法では、これら２つの実体は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの溶媒中、有機または無機塩基、例えば、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ピリジン、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３の存在下で反応される。Ｘはまたヒドロキシル（ＯＨ）であってもよい。この場合、第１の工程は、カルボン酸（ＩＩ）とアミン（ＩＩＩ）の間の縮合反応である。この反応は、当業者に周知の方法および技術に従って行うことができる。一つの特に好適な方法では、これら２つの実体は、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンなどのカップリング剤、第三級アミン（ジイソプロピルエチルアミンなど）の存在下で反応される。別の特に好適な方法では、これら２つの実体は、−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、第三級アミン（トリエチルアミンなど）の存在下で反応される。別の特に好適な方法は、これら２つの実体を−１５℃〜１００℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、第三級アミン（ジイソプロピルエチルアミンなど）の存在下で反応させることからなる。
【０２０４】
当業者に周知の技術(<< Protective Groups in Organic Synthesis >>, T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006および<< Protecting Groups >>, P.J. Kocienski, Thieme Verlag, 1994)を用いたこの中間体の脱保護の後、上記の方法および技術に従って化合物（ＩＶ）を化合物（Ｖ）と縮合させて、脱保護工程の後に化合物（ＶＩ）を得ることができる。次に、この化合物は、中間体（ＶＩＩ）との縮合および任意選択の脱保護の後に薬物の形成に至り得る。化合物（ＶＩ）はまた、Ｒ’３がＲ３の前駆体、特に、保護基によって保護されたＲ３基である化合物（ＶＩＩ’）とカップリングさせることもできる。カップリングとその後の基Ｒ’３の脱保護によるＲ３の取得は、従前に記載したものと同じ手順に従って行うことができる。
【化１１】
2018537425.tif 000025
スキーム２は、薬物を製造するために使用することができる第２の一般法を示す。上記の一般式において、Ｇは保護基であり、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４ａは従前に定義されたものなどであり、かつ、Ｒ４ｂは、
【化１２】
2018537425.tif 000026
を表す。
【０２０５】
第１の工程で、そのアミン官能基において保護基Ｇによって保護された化合物（ＩＸ）が化合物（ＶＩ）と縮合される。Ｘは、脱離基、例えば塩素を表し得る。この場合、第１の工程は、酸塩化物とアミンの間の反応からなる。この反応は、当業者に周知の方法および技術を用いて行うことができる。一つの特に好適な方法では、これら２つの実体は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの溶媒中、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ピリジン、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３などの有機または無機塩基の存在下で反応される。Ｘはまたヒドロキシルを表してもよい。この場合、第１の工程は、カルボン酸（ＩＸ）とアミン（ＶＩ）の間の縮合反応である。この反応は、当業者に周知の方法および技術に従って行うことができる。一つの特に好適な方法では、これら２つの実体は、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン、第三級アミン（ジイソプロピルエチルアミンなど）の存在下で反応される。別の特に好適な方法では、これら２つの実体は、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、第三級アミン（トリエチルアミンなど）の存在下で反応される。
【０２０６】
当業者に周知の技術を用いたこの中間体の脱保護の後、得られた化合物（ＶＩＩＩ）は、Ｒ４Ｙとの反応後に薬物となり得る。この場合、Ｙは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＳＯ２ＣＨ３、ＯＳＯ２ＣＦ３またはＯ−トシルなどの脱離基である。この反応は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性無水溶媒中、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３などの有機または無機塩基の存在下で行われる。別の特に好適な方法では、化合物（ＶＩＩＩ）は、Ｒ４ｂがＲ４の前駆体に相当する式Ｒ４ｂ−ＣＨＯのアルデヒドと反応される。この場合、この反応は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度、酢酸などの酸の付加により制御できるｐＨで、任意選択のチタンイソプロポキシド（ＩＶ）の存在下、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨなどの極性溶媒中、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３などの還元剤の存在下での還元的アミノ化である。
【０２０７】
上記合成スキームにおいて、薬物は、例えば、当業者に周知の方法を用いた鹸化などの付加的反応工程後に別の薬物となり得、それにより、エステル（ＣＯＯＭｅ）を表すＲ２基はカルボン酸（ＣＯＯＨ）を表すＲ２基に変化する。
【０２０８】
少なくとも１つの塩基官能基を含有する薬物を酸付加塩の状態で単離することが臨まれる場合には、これは、その薬物の遊離塩基（少なくとも１つの塩基官能基を含有する）を、好ましくは等量の、好適な酸で処理することにより可能である。好適な酸は特にトリフルオロ酢酸であり得る。
【０２０９】
ＩＩＩ．３−リンカー（Ｌ）
「リンカー」、「リンカー単位」、「Ｌ」または「連結」は、本発明において、共有結合を含んでなる化学部分または抗体を少なくとも１つの薬物に共有結合させる原子の鎖を意味する。
【０２１０】
リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、細胞傷害性薬剤とアドレス指定系のコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。他の架橋試薬は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ロックフォード、Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）であり得る。
【０２１１】
リンカーは、「切断不能」であってもまたは「切断可能」であってもよい。
【０２１２】
好ましい実施形態では、リンカーは、細胞内での薬物の放出を助ける「切断可能リンカー」からなる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用可能である。リンカーは、好ましい実施形態では、リンカーの切断が細胞内環境において抗体から薬物を放出するように、細胞内条件下で切断可能である。
【０２１３】
例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断因子により切断可能である。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（限定されるものではないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む）により切断されるペプチジルリンカーであり得る。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２つの連続するアミノ酸もしくは少なくとも３つの連続するアミノ酸を含んでなるか、または少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断因子はカテプシンＢおよびＤおよびプラスミンを含むことができ、これらは総て、ジペプチド薬誘導体を加水分解して標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが知られている。例えば、癌組織で発現の高いチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断可能なペプチジルリンカーが使用可能である（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含んでなる、またはそのものであるリンカー）。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＰｈｅ−Ｌｙｓを含んでなる、またはそのものである。薬物の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの１つの利点は、薬物がコンジュゲートされた場合には一般に減弱され、かつ、その複合体の血清安定性が一般に高いことである。
【０２１４】
他の実施形態では、切断可能なリンカーはｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。一般に、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、またはケタールなど）が使用できる。このようなリンカーは、血中などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して薬物と結合されているチオエーテル）である。
【０２１５】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を用いて形成可能なものが含まれる。
【０２１６】
特定の好ましい実施形態では、リンカー単位は、下記一般式：
−（Ｔ）ａ−（Ｗ）ｗ−（Ｙ）ｙ−
を有してよく、式中、
Ｔは、延伸単位であり；
ａは、０または１であり；
Ｗは、アミノ酸単位であり；
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり；
Ｙは、スペーサー単位であり；
ｙは、０、１または２である。
【０２１７】
延伸単位（Ｔ）は、存在する場合に第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａを、存在する場合にアミノ酸単位（Ｗ）と、または存在する場合にスペーサー単位と、または直接的に薬物と連結する。天然にまたは化学的操作を介して第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ上に存在し得る有用な官能基としては、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、糖鎖のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれる。好適な官能基はスルフヒドリルおよびアミノである。スルフヒドリル基は、存在する場合、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの分子内ジスルフィド結合の還元により作製することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのリシン部分のアミノ基と２−イミノチオランまたは他のスルフヒドリル生成試薬との反応により生成することもできる。特定の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、１以上のリシンを有するように操作される。より好ましくは、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、１以上のシステインを有するように操作することができる（ＴｈｉｏＭａｂｓ参照）。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、延伸単位は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの硫黄原子と結合を形成する。硫黄原子は、還元型の抗体のスルフヒドリル（−ＳＨ）基に由来し得る。
【０２１９】
他のある特定の実施形態では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と延伸単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ抗体に連結される。
【０２２０】
他の特定の実施形態では、延伸部の反応性基は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａのアミノ基に反応し得る反応性部位を含む。このアミノ基は、アルギニンまたはリシンのものであり得る。好適なアミン反応性部位としては、限定されるものではないが、活性化エステル（例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル）、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。
【０２２１】
さらに別の態様では、延伸部の反応性官能基は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ上に存在し得る修飾糖鎖基に反応性のある反応性部位を含む。特定の実施形態では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、糖鎖部分を提供するように酵素的にグリコシル化されているか、または天然にグリコシル化されている。糖鎖は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で温和に酸化されてもよく、結果として得られる酸化糖鎖のカルボニル単位は、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、カルボン酸ヒドラジン、またはアリールヒドラジドなどの官能基を含む延伸部と縮合させることができる。
【０２２２】
特定の実施形態によれば、延伸単位は下記式：
【化１３】
2018537425.tif 000027
を有し、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル（前記シクロアルキルまたはアルキル部分は、マレイミド部分の窒素原子に連結される）であり、
アステリスクは、存在する場合にアミノ酸単位との、存在する場合にスペーサー単位との、または薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂとの結合点を示す。
【０２２３】
「（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル」は、本発明において、４〜１０個の炭素原子を有する炭化水素環を意味し、限定されるものではないが、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどが含まれる。
【０２２４】
Ｌ２は、有利には、下記式のペンチル−カルボニルなどの（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル：
【化１４】
2018537425.tif 000028
であり得、式中、
アステリスクは、存在する場合にアミノ酸単位、存在する場合にスペーサー単位、または薬物Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す。
【０２２５】
存在する場合にアミノ酸単位（Ｗ）は、存在する場合に延伸単位（Ｔ）を、またはそうでなければ、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂを、スペーサー単位が存在する場合にはスペーサー単位（Ｙ）に、もしくはスペーサー単位が存在しない場合には薬物に連結する。
【０２２６】
上述のように、（Ｗ）ｗは存在しないか（ｗ＝０）、またはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドもしくはドデカペプチド単位であり得、ここで、ペプチドを形成するアミノ酸は互いに異なり得る。
【０２２７】
よって、（Ｗ）ｗは、下記式：（Ｗ１）ｗ１（Ｗ２）ｗ２（Ｗ３）ｗ３（Ｗ４）ｗ４（Ｗ５）ｗ５により表すことができ、式中、各Ｗ１〜Ｗ５は互いに独立にアミノ酸単位を表し、各ｗ１〜ｗ５は０または１である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸単位（Ｗ）ｗは、天然に存在するものなどのアミノ酸残基、ならびにシトルリンなどの希少アミノ酸および非天然アミノ酸類似体を含んでなり得る。
【０２２９】
アミノ酸単位（Ｗ）ｗのアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アセチルまたはホルミルで保護されたまたは保護されていないリシン、アルギニン、トシルまたはニトロ基で保護されたまたは保護されていないアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチン、およびシトルリンが挙げられる。例示的アミノ酸リンカー成分としては、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチド、特に、ジペプチドまたはトリペプチドが挙げられる。
【０２３０】
例示的ジペプチドとしては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが挙げられる。
【０２３１】
例示的トリペプチドとしては、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓが挙げられる。
【０２３２】
例示的テトラペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号９３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号９４）が挙げられる。
【０２３３】
例示的ペンタペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号９５）が挙げられる。
【０２３４】
特定の実施形態によれば、（Ｗ）ｗは、Ｖａｌ−Ｃｉｔなどのジペプチド（すなわち、ｗ＝２）であり得、またはリンカーはアミノ酸単位を欠いている（ｗ＝０）。リンカーがアミノ酸単位を欠く場合、好ましくは、それはスペーサー単位も欠く。
【０２３５】
好ましい実施形態によれば、ｗ＝０（すなわち、（Ｗ）ｗは一重結合である）またはｗ＝２（すなわち、（Ｗ）ｗはジペプチドである）および従って、（Ｗ）ｗは
【化１５】
2018537425.tif 000029
から選択することができ、特に、Ｖａｌ−Ｃｉｔであり、式中、
アステリスクは、存在する場合にスペーサー単位との、または薬物Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、Ｌ２との結合点を示す。
【０２３６】
アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。
【０２３７】
リンカーのアミノ酸単位は、限定されるものではないが、腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素により酵素的に切断されて薬物を遊離し得る。
【０２３８】
アミノ酸単位は、特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に関するその選択性において設計および最適化することができる。好適な単位は、その切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、ならびにプラスミンにより触媒されるものである。
【０２３９】
存在する場合にスペーサー単位（Ｙ）は、存在する場合にアミノ酸単位を、または存在する場合に延伸単位を、またはそうでなければ、抗体を薬物に連結する。スペーサー単位は、自壊的および非自壊的の２つの一般的タイプのものである。非自壊的スペーサー単位は、抗体−薬物複合体からのアミノ酸単位の酵素的切断後にそのスペーサー単位の一部または全部が薬物に結合して残るものである。非自壊的スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が挙げられる。薬物を遊離させるためには、非依存的加水分解反応がグリシン−薬物単位の結合を切断するように標的細胞内で起こるべきである。
【０２４０】
特定の実施形態では、非自壊的スペーサー単位（Ｙ）はＧｌｙである。
【０２４１】
あるいは、自壊的スペーサー単位を含有する抗体−薬物複合体は、独立した加水分解工程の必要なく薬物を遊離することができる。これらの実施形態では、（Ｙ）は、ｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）基の窒素原子を介して（Ｗ）ｗに連結され、かつ、エステル基、炭酸基、カルバミン酸基またはエーテル基を介して薬物に直接接続されたＰＡＢ単位の残基である。
【０２４２】
自壊的スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールの残基などのＰＡＢ基と電気的に等価な芳香族化合物が挙げられる。スペーサーは、アミド結合の加水分解時に容易に環化を受けるもの、例えば、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド、適宜置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミドが使用可能である。
【０２４３】
別の実施形態では、スペーサー単位は、分岐型のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは付加的薬物を組み込むために使用可能である。
【０２４４】
特定の実施形態では、スペーサー単位（Ｙ）はＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは
【化１６】
2018537425.tif 000030
（ＰＡＢ単位の酸素は、カルボニルに連結されている）であり、かつ、ｙ＝１またはリンカーはスペーサー単位を欠いている（ｙ＝０）。
【０２４５】
特定の実施形態では、リンカーは下記式（ＩＩＩ）：
【化１７】
2018537425.tif 000031
を有し、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル（これらの部分のカルボニルは、存在する場合、（Ｗ）ｗに連結されている）であり、
Ｗは、アミノ酸単位を表し、ここで、ｗは、０〜５の間に含まれる整数を表し、
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
【化１８】
2018537425.tif 000032
（ＰＡＢ単位の酸素は、カルボニルに連結されている）であり、かつ、ｙは０または１であり（好ましくは、ｗが０である場合、ｙは０であり、ｗが１〜５の間に含まれる場合、ｙは０または１である）、
アステリスクは、薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂとの結合点を示す。
【０２４６】
有利には、Ｌ２は、下記式のペンチル−カルボニルなどの（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル：
【化１９】
2018537425.tif 000033
であり、式中、
アステリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し；かつ
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す。
【化２０】
2018537425.tif 000034
から選択され、式中、
アステリスクは、薬物Ｄとの結合点を示し、かつ、波線は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂとの結合点を示す。
【０２４７】
ＩＩＩ．４−抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）
好ましい実施形態では、本発明の方法または組成物において使用される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、例えば、限定されるものではないが、ｉ）第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の薬物の求核基との反応、またはｉｉ）薬物の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの求核基との反応など、当業者に公知のいずれの方法によって作製されてもよい。
【０２４８】
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ上の求核基としては、限定されるものではないが、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基（例えば、リシン）、側鎖チオール基、および第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂがグリコシル化されている場合には糖のヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられる。
【０２４９】
薬物上の求核基としては、限定されるものではないが、アミン、チオール、およびヒドロキシル基、好ましくは、アミン基が挙げられる。
【０２５０】
アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができ、限定されるものではないが、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハリド；アルキルおよびベンジルハリド、例えば、ハロアセトアミド；アルデヒド；ケトン；カルボキシル；およびマレイミド基が挙げられる。抗体は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有してもよい。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は理論上２つの反応性チオール求核部分を形成する。当業者に公知の任意の反応を介して抗体に付加的求核基を導入することができる。非限定例として、反応性チオール基は、１以上のシステイン残基を導入することにより第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂに導入され得る。
【０２５１】
ＡＤＣはまた、リンカー試薬上の求核置換基と反応し得る求電子部分を導入するための第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの修飾によっても作製され得る。グリコシル化抗体の糖を酸化してアルデヒドまたはケトン基を形成させてもよく、これはリンカー試薬または薬物のアミン基と反応し得る。生じたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成し得るか、または還元されて安定なアミン結合を形成し得る。一つの実施形態では、グリコシル化された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの糖鎖部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応はタンパク質中に、薬物上の適当な基と反応し得るカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じ得る。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、その結果、最初のアミノ酸に代わってアルデヒドの生成をもたらし得る。
【０２５２】
好ましい実施形態では、ＡＤＣは、薬物−リンカー部分の形成とその後の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの求核基（例えば、システイン部分のＳＨ基）と薬物−リンカー部分の求電子基（例えば、マレイミド）との間のカップリングにより作製される。
【０２５３】
１．薬物−リンカー
薬物−リンカー部分は、
リンカーと薬物、
リンカーの合成が完了する前のリンカーの一部と薬物、
薬物の合成が完了する前のリンカーと薬物の一部もしくは前駆体、または
リンカーおよび薬物の合成が完了する前のリンカーの一部と薬物の一部もしくは前駆体
をカップリングすることにより作製され得る。
【０２５４】
カップリング反応は、求核基と求電子基の間の当業者に周知の反応である。
【０２５５】
求核基は特に、アミン、チオールまたはヒドロキシル基であり得る。好ましい実施形態では、求核基は第一級または第二級アミン基である。
【０２５６】
求電子基は、場合により活性化形態のカルボン酸基（ＣＯＯＨ）、または活性化された炭酸エステル部分であり得る。
【０２５７】
カルボン酸の「活性化形態」とは、ＣＯＯＨ官能基のＯＨ部分が、アミド結合を形成して化合物ＬＧ−Ｈを遊離するために活性化カルボン酸基とアミノ基のカップリングを可能とする活性化脱離基（ＬＧ）で置換されている、カルボン酸を意味する。活性化形態は、活性化エステル、活性化アミド、無水物またはアシルハリド、例えば、塩化アシルであり得る。活性化エステルとしては、カルボン酸基とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの反応により形成される誘導体が含まれる。
【０２５８】
「活性化炭酸エステル」は、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ部分を含んでなる炭酸エステルを意味し、ここで、ＯＲは、カルバミン酸部分を形成して化合物ＲＯＨを遊離するために活性化炭酸エステルとアミノ基のカップリングを可能とする良好な脱離基を表す。活性化炭酸エステルのＲ基としては、限定されるものではないが、ｐ−ニトロ−フェニル、ペンタフルオロフェニル、２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イルおよびベンジル基、好ましくはｐ−ニトロ−フェニルおよびペンタフルオロフェニル基が挙げられる。
【０２５９】
リンカーが下記式（ＩＩＩ）：
【化２１】
2018537425.tif 000035
を有する場合、薬物−リンカー部分は下記式（ＩＶ）：
【化２２】
2018537425.tif 000036
を有し、薬物−リンカー部分の合成の最終工程は一般に、下記式（Ｖ）：
【化２３】
2018537425.tif 000037
（式中、Ｌ２は従前に定義された通りであり、ＬＧは、脱離基、特に、ハリド、例えば、クロリドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドに由来する基を表す）
の化合物と下記式（ＶＩ）：
Ｈ−（Ｗ）ｗ−（Ｙ）ｙ−Ｄ    （ＶＩ）
（式中、ｙ＝１およびＹ＝ＰＡＢ−カルボニル）
の化合物の間のカップリングであり、式（ＶＩ）の化合物は、薬物（ＤＨ）と下記式（ＶＩＩ）の化合物、好ましくはその保護形態：
Ｇ−（Ｗ）ｗ−ＰＡＢ−ＣＯ−ＯＲ    （ＶＩＩ）
（式中、Ｗおよびｗは従前に定義された通りであり、Ｒは、「活性化炭酸エステル」の定義に定義された通りであり、かつ、Ｇは、Ｈまたは保護基である）
の間のカップリングにより作製され得る。
【０２６０】
式（ＶＩＩ）の化合物が保護形態である場合、脱保護の最終工程が必要である。
【０２６１】
ｙ＝０である場合、化合物（ＶＩ）は式Ｈ−（Ｗ）ｗ−Ｄを有し、式中、（Ｗ）ｗおよびＤはアミノ酸単位から構成される。結果として、化合物（ＶＩ）はこの場合、当業者に周知の従来のペプチド合成方法により作製され得る。
【０２６２】
２．Ａｂ−リンカー−薬物
本発明に従うある実施形態は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ上に存在するシステインと薬物−リンカー部分の求電子基、好ましくは、薬物−リンカー部分上に存在するマレイミド部分との間のカップリングからなる。
【０２６３】
マレイミド−システインのカップリングは、当業者に周知の方法により行うことができる。
【０２６４】
一般に、抗体は、たとえあるとしても、薬物部分に連結可能な多くの遊離の反応性システインチオール基を含まない。抗体中のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在し、部分的または完全な還元条件下でジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤を用いて還元しなければならない。ＡＤＣの負荷量（薬物／抗体比）は、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）または抗体に対するリンカー試薬のモル過剰率の制限、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度の制限、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する部分的還元条件または限定還元条件を含む、いくつかの異なる方法で制御可能である。
【０２６５】
ヒトＩｇＧのジスルフィド結合構造は、今日、よく確立されている（Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23に総説）。実際に、４つのヒトＩｇＧサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のジスルフィド結合構造に関して、多くの類似性といつくかの相違がある。総てのＩｇＧサブクラスが常に１２の鎖内ジスルフィド架橋と、重鎖と軽鎖の間で形成されるそれらの鎖内ジスルフィド結合内に存在する相違を含む。各鎖内ジスルフィド結合は、個々のＩｇＧドメイン、すなわち、可変（ＶＬおよびＶＨ）および定常（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）ドメインに関連する。２本の重鎖はそれらのヒンジ領域で様々な数：ＩｇＧ１およびＩｇＧ４では２つ、ＩｇＧ２では４つ、ＩｇＧ３では１１のジスルフィド架橋により連結されている。ＩｇＧ１の重鎖と軽鎖は軽鎖の最後のシステイン残基と重鎖の５番目の残基の間のジスルフィド結合により接続されているが、他のサブクラスＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４では、軽鎖は、軽鎖の最後のシステイン残基とＶＨドメインとＣＨ１ドメインの境界に存在する、重鎖の３番目のシステイン残基の間のジスルフィド結合により重鎖に連結されている。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらの古典的構造以外のジスルフィド結合構造が記載されている（Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23に総説）。鎖内ジスルフィド結合は溶媒露出性が高く、結果として、各ドメイン内で逆平行β−シート構造に埋もれて溶媒に曝されていない鎖内ジスルフィド結合よりもはるかに反応性が高い。これらの理由で、抗体のアイソタイプによらず、カップリングは、軽い還元の後に露出した鎖内システイン残基で起こる。従って、各鎖内ジスルフィド架橋は、理論上、２つのコンジュゲーション部位を形成し得る。
【０２６６】
付加的な求核基は、リシンと２−イミノチオラン（トロート試薬）との反応によるアミンのチオールへの変換を介して抗体に導入することができる。反応性チオール基はまた、１、２、３、４、またはそれを越えるシステイン残基を操作すること（例えば、１以上の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異型抗体を作製すること）によって抗体（またはそのフラグメント）に導入してもよい。ＵＳ７５２１５４１は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体の操作を教示している。
【０２６７】
システインアミノ酸は、抗体中の、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない反応性部位で操作し得る（Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729;ＵＳ７５２１５４１；ＵＳ７７２３４８５；ＷＯ２００９／０５２２４９)。操作されたシステインチオールは、マレイミドまたはα−ハロアミドなどのチオール反応性求電子基を有する本発明のリンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応させて、システイン操作抗体と薬物部分を有するＡＤＣを形成することができる。従って、薬物部分の位置は設計、制御可能であり、既知である。操作されたシステインチオール基は一般に高収率でチオール反応性リンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応するので、薬物負荷量は制御可能である。重鎖または軽鎖上の単一部位における置換によるシステインアミノ酸の導入のためのＩｇＧ抗体の操作から、対称な抗体上に２つの新たなシステインが得られる。ほぼ均質なコンジュゲーション産物ＡＤＣで、２に近い薬物負荷量が達成できる。
【０２６８】
抗体の２以上の求核基または求電子基が薬物−リンカー中間体、またはリンカー試薬、次いで薬物部分試薬と反応する場合、得られる産物は、抗体と結合した一定の分布、例えば、１、２、３などの薬物部分を持ったＡＤＣ化合物の混合物である。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法で、混合物中の化合物を薬物負荷値によって分離することができる。単一薬物負荷値（ｐ）を有するＡＤＣの調製物は単離可能であるが、薬物部分はリンカーを介して抗体の異なる部位に結合されていることがあるので、これらの単一薬物負荷値のＡＤＣはなお異質な混合物であり得る。
【０２６９】
一部のＡＤＣでは、薬物比は抗体上の結合部位の数によって制限を受け得る。高い薬物負荷、例えば、薬物比＞５は、特定のＡＤＣの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の低下を招く場合がある。一般には、コンジュゲーション反応では、理論的最大値より少ない薬物部分が抗体にコンジュゲートされる。
【０２７０】
薬物負荷量はまた薬物−抗体比（ＤＡＲ）とも呼称され、細胞結合剤当たりの薬物の平均数である。
【０２７１】
抗体ＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜８薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、および８つの薬物部分が抗体と共有結合される。
【０２７２】
抗体ＩｇＧ２アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜１２薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２の薬物部分が抗体と共有結合される。
【０２７３】
ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８または１〜１２の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
【０２７４】
コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製における抗体当たりの薬物の平均数は、ＵＶ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および電気泳動などの従来の手段によって特徴付けることができる。
【０２７５】
非限定実施形態として、本明細書では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号３６、３８または６２配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８または６１の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される少なくとも１つのシステインとカップリングされる。
【０２７６】
非限定実施形態として、本明細書では、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号３６、３８または６２の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列３５、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６１の重鎖では、２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される２、３または４つのシステインとカップリングされる。
【０２７７】
別の例はリシンカップリングからなる。抗体は、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬と反応しない、例えば、多数のリシン残基を含み得る。最も反応性の高いリシン基だけがアミン反応性リンカー試薬と反応し得る。また、最も反応性の高いシステインチオール基だけがチオール反応性リンカー試薬と反応し得る。
【０２７８】
本発明の化合物がリシンと結合される場合、薬物負荷量は細胞抗体当たり１〜８０薬物（Ｄ）の範囲であり得るが、上限は４０、２０、１０または８が好ましいものであり得る。ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８０、１〜４０、１〜２０、１〜１０または１〜８の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
【０２７９】
本発明による式（Ｉ）のＡＤＣは、薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。
【０２８０】
本発明において、「薬学的に許容可能な」とは、一般に、安全、非毒性で、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではなく、かつ、獣医学的使用ならびにヒト医薬的使用に許容可能な医薬組成物の作製に使用できるものを意味する。
【０２８１】
化合物の「薬学的に許容可能な塩」とは、本明細書で定義されるように薬学的に許容可能であり、かつ、親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。
【０２８２】
薬学的に許容可能な塩は特に、
（１）塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および類似の酸などの薬的に許容可能な無機酸を伴って形成される、または酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ステアリン酸、乳酸および類似の酸などの薬学的に許容可能な有機酸を伴って形成される、薬学的に許容可能な酸の付加塩；ならびに
（２）親化合物中に存在する酸プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたはアルミニウムイオンのいずれかにより置換されている；またはリシン、アルギニンおよび類似のものなどの薬学的に許容可能な有機塩基；もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムおよび類似のものなどの薬学的に許容可能な無機塩基とともに配位している場合に形成される薬学的に許容可能な塩基の付加塩
を含んでなる。
【０２８３】
これらの塩は、塩基または酸官能基を含有する本発明の化合物および対応する酸または塩基から、従来の化学法を用いて作製することができる。
【０２８４】
Ｖ−処置
本発明はまた、必要とする人への有効量の上記に定義されるような式（Ｉ）の化合物の投与を含んでなる癌を処置するための方法にも関する。
【０２８５】
癌は好ましくは、それらの表面でタンパク質ＩＧＦ−１Ｒの全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含むＩＧＦ−１Ｒ発現癌から選択することができる。
【０２８６】
より詳しくは、前記癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、神経鞘腫、神経芽腫、口腔扁平上皮癌、中皮腫、平滑筋肉腫および任意の薬物耐性現象または癌である。
【０２８７】
本発明による方法は、患者における癌、特に、薬物耐性または難治性癌を処置するために有用である。いくつかの実施形態では、患者は、難治性または薬物耐性癌を有し、ここで、患者は、化学療法薬による少なくとも１回の事前処置に奏効していない。
【０２８８】
疑念を避けるため、薬物耐性または難治性癌とは、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌、すなわち元々ＩＧＦ−１Ｒを発現する耐性癌だけなく、元々は抗ＩＧＦ−１Ｒを発現または過剰発現しないが、それらがひと度従前の処置に対して耐性となった場合にＩＧＦ−１Ｒを発現する癌もそうであると理解されるべきである。
【０２８９】
処置され得る他の特定のタイプの癌としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、およびその他の癌、細胞増殖性障害および腫瘍の難治性または薬物耐性形態が挙げられる。
【０２９０】
本発明のもう一つの目的は、本明細書に記載のようなＡＤＣを含んでなる医薬組成物である。
【０２９１】
より詳しくは、本発明は、本発明のＡＤＣを少なくとも賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルとともに含んでなる医薬組成物に関する。
【０２９２】
本明細書において、「薬学的に許容可能なビヒクル」または「賦形剤」は、二次反応を誘発せずに医薬組成物中に入り、かつ、例えば、１または複数の有効化合物の投与の助長、体内でのその寿命および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大またはその保存の改善を可能とする化合物または化合物の組合せを表すものとする。これらの薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤は周知であり、選択された１または複数の有効化合物の性質および投与様式の関数として当業者により適合される。
【０２９３】
有効成分は、従来の医薬担体との混合物として単位投与形で動物またはヒトに投与することができる。好適な単位投与形は、経口経路を介する形態および非経口経路（皮下、皮内、筋肉内または静脈内）を介する投与形態を含んでなる。
【０２９４】
経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチン硬または軟カプセル）または顆粒の使用が可能である。これらの組成物では、本発明の有効成分は、アルゴン流中でデンプン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカなどの１以上の不活性希釈剤と混合する。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの１以上の滑沢剤、着色剤、コーティング剤（コーティング錠）またはワニスも含んでなり得る。
【０２９５】
非経口投与用の無菌組成物は、好ましくは、水性または非水性溶液、懸濁液またはエマルションであり得る。溶媒またはビヒクルとして、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、特に、オリーブ油、注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルまたは他の好適な有機溶媒の使用が可能である。これらの組成物は、アジュバント、特に、湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤および安定剤も含有してよい。滅菌は、例えば、除菌濾過、組成物への滅菌剤の配合、照射または加熱によるなどのいくつかの方法で行うことができる。それらはまた、使用時に無菌水または他の任意の注射用無菌媒体に溶かすことができる固体無菌組成物の形態で調製することもできる。
【０２９６】
好ましくは、これらのＡＤＣは、全身経路により、特に、静脈内経路により、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路により、または経口経路により投与される。より好ましい様式では、本発明によるＡＤＣを含んでなる組成物は、連続的に数回投与される。
【０２９７】
本発明は、従って、また、少なくともｉ）本発明による抗体−薬物複合体、および／または本発明による医薬組成物と、ｉｉ）前記抗体−薬物複合体および／または医薬組成物が分配されているシリンジまたはバイアルまたはアンプルとを含んでなるキットにも関する。
【０２９８】
それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する忍容性および示される二次的作用など、患者に適合された処置の確立において一般に考慮される基準に従って決定することができる。
【０２９９】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および凡例が以下に表される図面とともに本明細書の続きで明らかとなる。
【実施例】
【０３００】
実施例１：第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体の作製および選択
Ｍａｂ  ８１６Ｃ１２および８１０Ｄ１２を以下のように作製し、選択した。
【０３０１】
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、１０μｇの組換えヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３９１−ＧＲ）をフロイントのアジュバントとともに皮下注射することにより免疫した。免疫は２週間隔で３回繰り返した。４回目の注射はアジュバントの存在下で腹腔内注射により行った。
【０３０２】
３日後、ＰＥＧ５０％を用いて脾臓細胞をＳＰ２ＯＡｇ１４骨髄腫細胞と融合させた。１４日のＨＡＴ代謝選択の後、ハイブリドーマ上清を、ヒトＭＣＦ７乳癌細胞を用いてＦＡＣＳにより試験した。ＭＣＦ７結合抗体のみを維持した。
【０３０３】
次に、対象とする抗体を限界希釈によりクローニングした。クローニング８日後に、上清を、ＭＣＦ７細胞を用いてＦＡＣＳにより一度選択した。各ハイブリドーマにつき３つの陽性クローンを維持した。分泌された抗体のアイソタイプを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ：５３００−０５）からのＳＢＡクロノタイピングシステム−ＨＲＰキットを用いて決定した。最後に、１つのクローンを拡大培養し、凍結させた。
【０３０４】
次に、８１６Ｃ１２および８１０Ｄ１２のさらなる特性決定を、ｒｈＩＧＦ−１ＲまたはｒｍＩＧＦ−１ＲまたはｒｈＩＲ  ＥＬＩＳＡなどのハイブリドーマ上清を用いて行った。総ての直接的ＥＬＩＳＡにおいて、対象とするタンパク質を各ウェルの底部に固定した（１μｇ／ｍｌ）。飽和後、ハイブリドーマ上清をウェルに加えた。１時間のインキュベーション期間と洗浄工程の後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識ポリクローナル抗体の溶液を検出のために使用した後、ＴＭＢ基質を加えた。反応を１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液で停止させた後、分光光度計を用い、４５０ｎｍの波長でＯＤを読み取った。データを表７に示す。
【０３０５】
【表９】
2018537425.tif 000038
【０３０６】
ｒｈＩＧＦ−１Ｒコーティング上での第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の用量反応曲線を、８１６Ｃ１２に関しては図１に、８１０Ｄ１２に関しては図１Ｂに示す。ＥＣ５０の値は、Ｐｒｉｓｍアプリケーションを用いて決定した。
【０３０７】
データは、８１６Ｃ１２抗体はｒｈ  ＩＧＦ−１ＲのみをＥＣ５０  ０．４１ｎＭで認識し、８１０Ｄ１２抗体はｒｈ  ＩＧＦ−１ＲのみをＥＣ５０  ０．５１ｎＭで認識することを示した。それらは両方とも、マウス型のＩＧＦ−１ＲともヒトＩＲとも結合しない。
【０３０８】
実施例２：病期分類と本発明の第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体の相関およびＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＩＧＦ−１Ｒを標的とするＡＤＣの活性の評価
腫瘍のグレード分類を薬理学と相関させるために、腫瘍がグレード分類され（第２．１節）、次いで、内部移行されることが知られるＩＧＦ−１Ｒを標的とする第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体部分とオーリスタチンからなる薬物部とを含んでなるＡＤＣを用いて、ＭＣＦ−７異種移植モデルに対するｉｎ  ｖｉｖｏ試験が行われた（第２．２節）。
【０３０９】
２．１：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫組織化学的検出
ＭＣＦ−７異種移植片由来の組織切片を脱パラフィンし、再水和し、９８℃で４０分間、熱誘導エピトープ賦活化のために、９８℃に予温した沸騰浴中、標的賦活化バッファー(Target Retrieval Buffer)１Ｘ（Ｄａｋｏ  Ｓ１６９９）に入れ、次いで、さらに２０分間、標的賦活化バッファーに煎れた。トリスバッファー生理食塩水−０．０５％ツィーン２０（ＴＢＳ−Ｔ）（Ｄａｋｏ  Ｓ３００６）中で３回洗浄した後、  内因性ペルオキシダーゼ活性を、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ  Ｋ４００７）を用いて５分間遮断した。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロッキング試薬（Ｕｌｔｒａ  Ｖ  ｂｌｏｃｋ−ＴＡ−１２５ＵＢ−ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）で５分間インキュベートした後、８１６Ｃ１２モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）または陰性対照としてのマウスＩｇＧ１／κ（５μｇ／ｍｌ、Ｘ０９３１、Ｄａｋｏ）のいずれかとともに室温で１時間インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｄａｋｏ）とともに３０分間インキュベートした。ジアミノベンジジンを褐色反応生成物の発生のために使用した（Ｄａｋｏ  Ｋ３４６８）。これらのスライドを２分間ヘマトキシリンに浸漬して対比染色した（Ｄａｋｏ  Ｓ３３０９）。
【０３１０】
第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体８１６Ｃ１２および８１０Ｄ１２は、ＭＣＦ−７の細胞膜を差次的に染色する。このＩＨＣ手順では、この褐色反応生成物を細胞膜の陽性染色と相関させ、褐色反応生成物の不在を陰性染色および細胞膜の非可視化と相関させる。膜性アルゴリズムを使用すると、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の染色のスコア化は３＋であった（８１６Ｃ１２は図２Ａおよび８１０Ｄ１２は図２Ｂ）。Ｇ１１抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いると、同じ腫瘍の切片はスコア２＋とされた（それぞれ図２Ｃおよび２Ｄ）。
【０３１１】
２．２：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
第２の(seconf)ＩＧＦ−１Ｒ部分を含んでなる抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＭＣＦ−７異種移植モデルで評価した。
【０３１２】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注射前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
【０３１３】
ＭＣＦ−７細胞移植の２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を６個体ずつの群に分けた。抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、４日ごとの６回注射のサイクル（Ｑ４ｄ４）の腹腔内注射によって接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【０３１４】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣの注射は、グレードｇ３＋の腫瘍では予想通りに腫瘍成長を有意に阻害し、さらには完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえしたが（図３）、グレード２＋の腫瘍についてはそうではなかった。
【０３１５】
実施例３：病期分類と本発明の第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体との相関およびＳＢＣ−５異種移植モデルにおけるＩＧＦ−１Ｒを標的とするＡＤＣの活性の評価
腫瘍のグレード分類を薬理学と相関させるために、腫瘍がグレード分類され（第３．１節）、次いで、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体部分とオーリスタチンからなる薬物部とを含んでなるＡＤＣを用いて、ＳＢＣ−５異種移植モデルに対するｉｎ  ｖｉｖｏ試験が行われた（第３．２節）。
【０３１６】
３．１  ＳＢＣ−５異種移植モデルにおけるＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫組織化学的検出
ＩＧＦ−１Ｒのレベルを、以下の実施例２の第２．１節に記載される同じプロトコールを用いて分析した。
【０３１７】
ＩＧＦ−１Ｒを８１６Ｃ１２および８１０Ｄ１２で検出した場合には、低レベルが検出された（１＋）（８１６Ｃ１２は図４Ａおよび８１０Ｄ１２は４Ｂ）。ＩＧＦ−１ＲをＧ１１抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ）またはＡＦ−３０５（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で検出した場合には、同じ腫瘍由来の切片がスコア３＋とされた（それぞれ図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０３１８】
３．２：ＳＢＣ−５異種移植モデルにおける抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣをＳＢＣ−５異種移植モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。
【０３１９】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＳＢＣ−５細胞を７週齢の無胸腺マウスに皮下注射した。細胞移植の１２日後、腫瘍が１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を６個体ずつの群に分けた。抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣを、４日ごとの６回注射のサイクル（Ｑ４ｄ６）の腹腔内注射によって接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【０３２０】
ＳＢＣ−５腫瘍細胞の腫瘍進行は、グレード１＋の腫瘍では予想通りに、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体を含んでなる抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＤＣの注射により影響を受けなかったが（図５）、グレード３＋の腫瘍についてはそうではなかった。
【０３２１】
実施例４：ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤに対するマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの作製
ヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）で３回皮下免疫した。代わりに、一部の動物にＩＧＦ−１Ｒのマウス細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）１０μｇで３回の追加免疫を行った。初回の免疫はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。次の免疫では、フロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。融合３日前に、免疫マウスに１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質で追加免疫を行った。次に、脾細胞およびリンパ球をそれぞれ脾臓の灌流および近位リンパ節の細断により調製し、５個体の免疫マウスのうち１個体（総てのマウスの血清力価測定の後に選択）から採取し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合させた。融合プロトコールはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。次に、融合細胞に対してＨＡＴ選択を行う。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングとして、ハイブリドーマの上清を、ヒト乳房ＭＣＦ７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）および／または細胞表面にサルＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル腎臓ＳＶ４０形質転換）を用いたＦＡＣＳ分析によって、ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対して生成したＭａｂの分泌に関して評価した。より厳密には、フローサイトメトリーによる選択のために、１０５細胞（ＭＣＦ７またはＣＯＳ７のいずれか）を９６ウェルプレートの各ウェルの１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）で１／５００°希釈したＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄後、各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌでヨウ化プロピジウムを加えた後に、ＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により細胞を分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート二次抗体ともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を各実験で使用した（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）。蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を算出するために少なくとも５０００細胞を評価した。
【０３２２】
加えて、内部移行する第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのみを選択するために内部移行アッセイを行った。このアッセイでは、ＭＣＦ７腫瘍細胞株を試験前にフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％のＦＡＣＳを含むＲＭＰＩ  １６４０中で３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、１００μｌの細胞懸濁液を４．１０５細胞／ｍｌで、９６マルチウェルプレートのフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、細胞を５０μｌのハイブリドーマ上清または対照抗体溶液（１μｇ／ｍｌの陽性対照およびアイソタイプ対照）のいずれかに再懸濁させた。４℃で２０分のインキュベーション時間の後、細胞を２０００ｒｐｍで２分遠心分離し、冷（４℃）または温（３７℃）いずれかの完全培養培地に再懸濁させた。次に、細胞を３７℃または４℃のいずれかで２時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞集団でのＦＡＣＳ分析を行った。
【０３２３】
ＦＡＣＳ分析の後、（ｉ）１つのハイブリドーマ上清とともに、４℃でインキュベートした細胞の表面上で検出された蛍光シグナルと、３７℃でインキュベートした細胞で得られたものとの差異と、（ｉｉ）細胞表面上に残留するＩＧＦ１Ｒのパーセンテージの、２つのパラメーターを決定した。
【０３２４】
残留ｈＩＧＦ  １Ｒのパーセンテージは、下記のように算出される：％残留ＩＧＦ−１Ｒ＝（ＭＦＩＡｂ  ３７℃／ＭＦＩＡｂ  ４℃）×１００。
【０３２５】
加えて、組換えヒト（ｈＩＧＦ−１Ｒ）およびマウス（ｍＩＧＦ−１Ｒ）タンパク質、ならびに組換えヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）タンパク質への第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合を検討するために、３種類のＥＬＩＳＡを行った（クローニング前または後のいずれか）。ｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒおよび／またはｒｍ−ＩＧＦ−１Ｒへの結合を示し、ｒｈＩＲには結合しない抗体を分泌するハイブリドーマを保持した。簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を４℃にて一晩、ＰＢＳ中０．６μｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）または１μｇ／ｍｌのｒｍＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）または１μｇ／ｍｌのｒｈＩＲタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４４−ＩＲ／ＣＦ）のいずれか１００μｌ／ウェルでコーティングした。次に、これらのプレートを３７℃にて２時間、０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）でブロッキングした。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出したところで、各ウェルに１００μｌの各上清希釈液（無希釈ハイブリドーマ上清も上清連続希釈液も）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１００μｌセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％ツィーン２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中１／５０００希釈で３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加える。室温で１０分のインキュベーション時間後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの光学密度を測定する。
【０３２６】
対象とする第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ抗体を分泌するハイブリドーマを拡大培養し、限界希釈によりクローニングした。アイソタイプ分類を行ったところで、各コードの１クローンを拡大培養し、凍結させた。さらなる特性決定のため、対象とする各第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂをＣｅｌｌＬｉｎｅ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産系で生産した。
【０３２７】
結合特異性ＦＡＣＳ分析に取り組むためのさらなるアッセイを、ＩＭ９細胞（ヒトＩＲ発現Ｂリンパ芽球）ならびにｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞に対して行った。
【０３２８】
選択された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂに対応するデータは総て表８にまとめられ、５つの選択された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂがＭＣＦ−７乳癌細胞またはトランスフェクト細胞のいずれかで発現された天然ヒトＩＧＦ−１Ｒを強く認識することを示した。それらの抗体はまたＣＯＳ−７細胞でサルＩＧＦ−１Ｒも認識する。これらの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは、ＩＭ９細胞で発現の高いヒトインスリン受容体とは交差反応しない。これらの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂはＥＬＩＳＡプレートに直接コーティングされた場合のｒｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤタンパク質をあまり認識しないことを述べておかなければならない。
【０３２９】
【表１０】
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【０３３０】
実施例５：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合
５つのマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂをキメラ化した。マウスおよびキメラ両方の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合特性をヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）にて漸増抗体濃度を用い、ＦＡＣＳ分析により評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃にてＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともに２０分間インキュベートした。次に、それらの細胞を３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。各抗体で得られたシグナル強度の最大値をＢｍａｘと呼び、蛍光強度の平均（ＭＦＩ）で表した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。  
【０３３１】
各マウスまたはキメラ型の第２の(seconf)ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの力価測定曲線は、生成した総ての抗体が典型的な飽和特性で天然ＩＧＦ−１Ｒ型を認識できることを示した（図６Ａ）。第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのランク付けを行い、マウスおよびキメラ型の両Ａｂの結合特性を比較するために、各化合物の結合ＥＣ５０を、非直線回帰分析を用いて決定した。各マウスＡｂとその対応するキメラ型のＥＣ５０の比較は、これら２つの形態が同じ結合特性を示し、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのキメラ化がＩＧＦ−１Ｒ認識に影響を及ぼさなかったことを示した（図６Ｂ−Ｃ）。キメラ抗体のＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表９にまとめた。
【０３３２】
【表１１】
2018537425.tif 000040
【０３３３】
実施例６：ＩＧＦ−１ＲもしくはＩＲトランスフェクト細胞または有意なレベルのＩＲを発現するＩＭ９細胞のいずれかを使用することによる第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの特異性の確認
生成された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂのＩＧＦ−１ＲとＩＲに対する特異性を確認するために、ｈＩＧＦ−１ＲまたはｈＩＲのいずれかを発現する安定なトランスフェクト体を、ＦＡＣＳ分析により評価した。簡単に述べれば、漸増濃度のキメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、細胞とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３３４】
ｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞株（図７Ａ）と非トランスフェクト細胞（図７Ｂ）で得られた力価測定曲線から、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するキメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合特異性が確認された。ＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表１０にまとめた。
【０３３５】
【表１２】
2018537425.tif 000041
【０３３６】
ｈＩＲへのマウスおよびキメラ両方の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合の不在を確認するために、ヒトＩＲ（ｈＩＲ）を発現する安定な細胞株を用いた。マウスおよびキメラ両方の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂによるヒト細胞表面ｈＩＲの認識は、ＦＡＣＳ分析により行った。漸増濃度のマウスまたはキメラいずれかのＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃にて２０分間、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株上でインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を陽性対照として用いた。マウスおよびキメラ９Ｇ４抗体を無関連抗体として導入した。
【０３３７】
トランスフェクト細胞の細胞表面での高レベルのｈＩＲ発現は、市販の抗ｈＩＲ抗体ＧＲＯ５を用いて確認した（図８Ａおよび８Ｂ）。高濃度のマウス（図８Ａ）またはキメラ（図８Ｂ）いずれかの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂを用いても、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞の細胞表面での結合は見られなかった。これらの結果は、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのマウス型もキメラ型もｈＩＲを認識しなかったことを示した。
【０３３８】
ｈＩＧＦ−１ＲとＩＲの認識のこの特異性はまた、ｈＩＲを発現するＢリンパ腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いたＦＡＣＳ分析によっても示された（図９）。このＦＡＣＳ分析では、プロトコールは上記のものと同じであり、抗ヒト二次Ａｂの交差反応性を避けるためにマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂを用いた（ＩＭ９細胞はそれらの細胞表面にヒトＩｇを発現する）。図９に示す結果は、ここでも、ＧＲＯ５抗ｈＩＲ抗体を用いた場合にも予想されたシグナルが見られたが、評価したマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂにこの細胞株上で有意な結合シグナルを示したものはなかったことを示した。
【０３３９】
実施例７：ＦＡＣＳ分析およびＢｉａｃｏｒｅ分析によるサル天然ＩＧＦ−１Ｒへの第２の(Seond)ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合
規制毒性試験の第１の前提条件の１つは、選択された化合物を評価するために適切な動物種を見つけることである。本明細書に記載の抗体系列はマウスＩＧＦ−１Ｒを認識できないので、毒性評価に最も可能性のある種は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。
【０３４０】
サルＩＧＦ−１Ｒに対する第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合を評価するために、マウスおよびキメラ両方の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合をまず、漸増抗体濃度を用い、ＣＯＳ−７細胞株でＦＡＣＳ分析により評価した。細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％、ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂとともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、最後にＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認される生細胞に対する第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合をすぐに評価した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３４１】
ＣＯＳ−７サル細胞株で得られた力価測定曲線は、総ての第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂがサル細胞株の表面で発現されたＩＧＦ−１Ｒを特異的に認識したことを示した（図５Ａ）。マウスおよびキメラの各第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂに関するＥＣ５０の決定は、これらの２形態はサルＩＧＦ−１Ｒに対するそれらの結合特性に関して十分同等であったことを示した（図１０Ｂ）。これらの結果は、生成された総ての第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂがサルＩＧＦ−１Ｒを認識したことを示した。
【０３４２】
ヒトとサルのＩＧＦ−１Ｒに対するキメラ抗体認識の大きさを確認するために、ＣＯＳ−７細胞とトランスフェクトＩＧＦ−１Ｒ細胞での結合ＥＣ５０の比較を行った。図１０Ｃに示される結果は、総ての第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂによるヒトおよびサルＩＧＦ−１Ｒの同等の認識を示した。
【０３４３】
別の種類のサルにおける認識を確認するために、細胞をＩＧＦ−１Ｒ型カニクイザルでトランスフェクトして可溶性サルＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤを作製し、ｈＩＧＦ−１ＲまたはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒのいずれかに対するその結合特性を比較するためにキメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の１つ（ｃ２０８Ｆ２）を用いてＢｉａｃｏｒｅ試験を行った。
【０３４４】
認識試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置にて、抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体（ＨｉｓキャプチャーキットＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号２８−９９５０−５６）により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。アミンキット化学を用い、１１０００ＲＵを越える抗体をカルボキシメチルデキストラン(carboxymethyldextan)マトリックスに化学的にグラフトした。これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。マカク属ＩＧＦ−１Ｒと比較してｈＩＧＦ−１Ｒに対する２０８Ｆ２第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体のキメラ型（ｃ２０８Ｆ２）の結合の速度パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
【０３４５】
ヒト（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）またはカニクイザル（自家作製）のうち１つのいずれかの配列に基づく、２本のα鎖と、付加的なＣ末端１０Ｈｉｓタグとともに発現される２本のβ鎖の細胞外ドメインから構成されるＩＧＦ１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型の溶液を、１６０ＲＵ前後の抗原を捕捉するために定義された希釈で第２のフローセルに１分注入した。捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲のｃ２０８Ｆ２を注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを通した。
【０３４６】
次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーを３０秒間注入して表面を再生した。
【０３４７】
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ−１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する（図１１）。
【０３４８】
各ＩＧＦ１Ｒ分子（ヒトまたはカニクイザル）に関して、漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。動態速度は独立に（各ＩＧＦ−１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の２つの動態速度）または一般に（ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の同じ動態速度）評価する。フィッティングの質は、０．０５ＲＵ未満のＣｈｉ２／Ｒｍａｘ比により評価した。
【０３４９】
各ＩＧＦ−１Ｒに関して個別に定義された結合の動態速度（表１１参照）は近く、同じ動態速度を有する両センサーグラムのフィッティングは良好な質である。
【０３５０】
ｃ２０８Ｆ２抗体は、組換えヒトＩＧＦ−１ＲとカニクイザルＩＧＦ−１Ｒを約０．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）で同様に認識する。この研究で(in tis study)定義された親和性は、１６０ＲＵ前後の捕捉ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒレベルに関しての抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。
【０３５１】
【表１３】
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【０３５２】
実施例８：ＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する生成された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの固有の効果
抗体がチロシンキナーゼ受容体と結合した際に促進作用を誘導し得ることはよく知られている。本発明者らはこのようなアゴニスト抗体を選択したくはなかったので、キメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂを用いてｈＩＧＦ−１Ｒリン酸化の評価を検討した。
【０３５３】
この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、ＩＧＦ−１（１００ｎＭ）または供試する第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂのいずれかを３７℃で１０分間加えた（１０μｇ／ｍｌ）。培地を排出し、細胞を４℃にて９０分間、１０ｍトリスＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中で崩壊させた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
【０３５４】
図１２に記載される結果は、ＩＧＦ−１と比較した場合の３回の独立した実験のキメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体に応答したｐＩＧＦ−１Ｒの％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．を表す。示されたように、ＭＣＦ−７細胞が１０μｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂとともにインキュベートされた場合に、ｈＩＧＦ−１Ｒの有意なリン酸化は検出されなかったか、または低い（＜１０％）リン酸化しか検出されなかった。
【０３５５】
実施例９：マウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂによる、ＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害
選択された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの特性決定を行うために、ＩＧＦ１により誘導されたリン酸化を阻害するそれらの能力を検討した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、細胞をマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体とともに５分間インキュベートした後、３７℃で２分間ＩＧＦ−１を添加した。培地を排出し、細胞を４℃で９０分間、１０ｍＭトリスＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中で崩壊させた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
【０３５６】
総ての第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ＡｂがＩＧＦ−１に応答してｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を強く阻害した（８０％を越える低下）（図８）。ＩＧＦ１により誘導されたｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の最良の阻害剤は、ｍ２０８Ｆ２、ｍ２１２Ａ１１およびｍ２１４Ｆ８  Ｍａｂである。
【０３５７】
実施例１０：ＦＡＣＳ分析による生成された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒの内部移行の研究
ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのキメラ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間の後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩとの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図１４および表１２に示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂの内部移行パーセンテージは、１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出され、表１２に示した。
【０３５８】
【表１４】
2018537425.tif 000043
【０３５９】
サルＩＧＦ−１Ｒも認識した第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体がこの受容体を内部移行することができたかどうかを決定するために、同じ内部移行試験を行った。表１３にまとめた結果は、総ての供試抗体がサルＩＧＦ−１Ｒの内部移行を媒介できたことを示した。
【０３６０】
【表１５】
2018537425.tif 000044
【０３６１】
細胞表面結合抗体減少の動態をさらに評価した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに播種し、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのマウスとともにインキュベートした。次に、３７℃にて１０、２０、３０、６０または１２０分間、培地中で細胞を洗浄して結合してない抗体を除去した。各時点で、細胞を遠心分離した後、氷上にて二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８で表面標識して、細胞表面に残留する抗体の量を決定した。各マウスＡｂおよび各時点の蛍光強度を４℃でのシグナル（残留ＩＧＦ−１Ｒ％）により正規化し、指数減衰に当てはめて半減期（ｔ１／２）を求めた。ｔ１／２は、シグナルの５０％の低下を得るために必要な時間と考えた。図１５に示されるように、総てのマウスＡｂの表面レベルは最初の３０分で急速に低下し、低下は６０分のインキュベーション後にほぼ最大となった（図１５Ａ）。算出された半減期はマウスＡｂに応じて１０〜１８分の間に含まれた（図１５Ｂ）。
【０３６２】
細胞表面シグナルの低下が第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの内部移行によるものであって、受容体の脱落によるものではなかったことを確認するために、細胞を３７℃で０、３０および６０分間、マウスＡｂとともにインキュベートした（図１６）。次に、細胞結合抗体（ｗ／ｏ透過処理）および細胞表面結合＋内部移行した第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ（透過処理有り）に相当する全抗体シグナルを決定するために、細胞を固定し、透過処理を施すか、または施さなかった。内部移行した第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ（細胞質）の量は次のように決定した：透過処理後のＭＦＩ−ＭＦＩ  ｗ／ｏ透過処理。この試験は、細胞表面に結合した第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの減少は細胞質Ａｂの増加によるものであることを示し、Ａｂが内部移行したことが実証された（図１６）。加えて、透過処理後のシグナル（全体）の低下により示されるように、Ａｂの分解は１時間のインキュベーション後に始まった。
【０３６３】
実施例１１：共焦点分析による生成した第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒの内部移行の研究
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの内部移行をさらに確認するため、細胞輸送後の抗体の細胞下分布を評価するために共焦点顕微鏡観察を行った。細胞を抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂ  ３７℃とともにインキュベートし、固定し、透過処理を施した。従って、細胞を、二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８をウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体（二次抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ５５５を用いて可視化した）を用いて染色した。３７℃でのインキュベーション前に、マウス２０８Ｆ２  ＡｂはＭＣＦ−７細胞の膜上に局在した（図１７Ａ）。ＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在ハイリター(highliter)プラグインを用いてリソソームマーカーｌａｍｐ−１との共局在は見られなかった。細胞表面結合抗体は、３７℃で１５分のインキュベーション後に劇的に減少した。細胞表面結合抗体の減少と同時に、細胞内抗体が小胞に検出された。ｌａｍｐ−１との共局在はまれにしか見られなかった。３０分のインキュベーション後に、細胞表面結合抗体はほとんど検出されなかった。しかしながら、リソソームでのＡｂの共局在は増加した。１時間のインキュベーション後には、細胞内Ａｂ染色ならびにｌａｍｐ−１との共局在数は低下した。細胞表面結合抗体のこの動態およびその細胞内蓄積は、ＦＡＣＳによる抗体表面減衰尺度の動態と相関していた。加えて、ＦＡＣＳ試験ですでに記載したように、マウスＡｂの分解は、共焦点顕微鏡によれば、１時間のインキュベーション後に始まった。
【０３６４】
他の総ての第２のＩＧＦ−１Ｒマウス抗体Ａｂの内部移行およびそれらのＬａｍｐ−１との共局在もまた評価した（図１７Ｂ）。３７℃で３０分のインキュベーション後に、細胞内抗体が検出され、ｌａｍｐ−１との共局在が見られ、このことは選択された総ての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がリソソームに効果的に内部移行されたことを示す。
【０３６５】
実施例１２：リソソーム阻害剤バフィロマイシンＡ１を用いた第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの阻害
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂがリソソームに到達してそこで分解される(antibodies reached the lysosome were they are degraded)ことを確認するために、細胞をリソソーム機能の強力な阻害剤であるバフィロマイシンＡ１で処理したか、または非処理とした。次に、細胞を４℃で１０μｇ／ｍｌの供試Ａｂとともにインキュベートし、洗浄し、３７℃で２時間インキュベートした。内部移行したＡｂは細胞透過処理後に二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８  Ａｂを用いて検出された。バフィロマイシンＡ１の添加は細胞内Ａｂの分解を防ぎ（図１８）、このことはＡｂが効果的に内部移行され、リソソームで分解されたことを示す。
【０３６６】
実施例１３：第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂ−ＩＧＦ−１Ｒ結合に対するｐＨの影響
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂはそれらの内部移行能に基づいて選択され、リソソームコンパートメントに入る前に初期エンドソームと共局在することが上記で示されたので、対象とするアプローチは、Ａｂ／ｈＩＧＦ−１Ｒ結合の安定性がｐＨ環境によって調節された抗体、優先的には、ｐＨ環境が酸性となった場合にＩＧＦ−１Ｒから優先的に解離される抗体を選択することからなった。実際に、初期エンドソームとリソソームの間の主要な違いはそれらの管腔ｐＨであり、エンドソームコンパートメントではｐＨはおよそ６であり、リソソームコンパートメントではｐＨは約４．５である。
【０３６７】
リガンド結合（ＩＧＦ１）後にひと度、内部移行されると、ｈＩＧＦ−１Ｒは再循環経路を介して細胞表面に戻ることがよく知られている。
【０３６８】
特定の理論に関連付けるものではないが、本明細書に記載される仮説は、酸性ｐＨで早期にそれらの標的からより放出されやすい抗体はおそらく膜への標的再循環に有利であり、結果として、ＡＤＣアプローチのより良い候補と考えられるはずであるというものである。
【０３６９】
生成された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂにこのような特性を示すものがあるか、また、この特性が細胞傷害活性と相関するかどうかを検討するために、ＭＣＦ−７細胞株でのマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合を、種々のｐＨのバッファー中で行った。漸増濃度のマウスｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、死細胞が染色されるヨウ化プロピジウムを用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。図１９に示されるように、選択された総てのマウスの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂは酸性ｐＨでより低い結合能を示した。
【０３７０】
ＭＣＦ−７細胞株でのヒト化型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合を、種々のｐＨのバッファー中で行った。漸増濃度のヒト化ｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞にヒト化された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体Ａｂの結合がなされ、これを、死細胞が染色されるヨウ化プロピジウムを用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。図２９に示されるように、ヒト化された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体は酸性ｐＨでより低い結合能を示した。
【０３７１】
実施例１４：２０８Ｆ２  Ｍａｂのヒト化型の評価
１４．１  ヒト化型ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０２６／Ｌ０２４（ＶＨ３／ＶＬ３または変異体  ３とも呼称することがある）の結合および内部移行の評価
ｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂのヒト化型の結合をＭＣＦ−７、ＣＯＳ−７およびＮＩＨ  ３Ｔ３  ＩＲ＋細胞株で評価した。漸増濃度のｍ２０８Ｆ２、ｃ２０８Ｆ２またはｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３ＶＬ３を各細胞株に４℃で２０分間加えた。次に、細胞を洗浄し、供試ｍＡｂの結合を、対応する二次抗体を用いて可視化した。トランスフェクト細胞株上でのヒトＩＲの発現を確認するために、市販の抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用い、その認識特性を例示した（図２０Ｄ）。
【０３７２】
ＭＣＦ−７細胞（図２０Ａ）またはサルＣＯＳ−７細胞（図２０Ｂ）でヒト化型とマウス型またはキメラ型のいずれかと比較したところ、供試したこれら３つの型に近似した特性が示された。ヒト化のプロセスは抗体の認識特異性を変更せず、これはヒトインスリン受容体に対する交差反応性の不在という点でマウス型およびキメラ型に完全に匹敵している（図２０Ｃ）。
【０３７３】
ヒト細胞株ＭＣＦ−７およびサル細胞株ＣＯＳ−７に対する２０８Ｆ２の第１のヒト化型の算出ＥＣ５０は、ｍＡｂ  ２０８Ｆ２のマウス型またはキメラ型のいずれで決定されたものとも同等であった。
【０３７４】
ｍＡｂ  ｈｚ２０８Ｆ２  ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０２６／Ｌ０２４の内部移行能をフローサイトメトリーにより評価した。ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌの抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間の後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図２１および表１４ａに示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出され、表１４ａに示す。よって、ヒト化ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０２６／Ｌ０２４（下表ではＶＨ３／ＶＬ３と呼称）は、対応するマウスおよびキメラ２０８Ｆ２抗体で測定されたものと同等の結合および内部移行特性を有していた。
【０３７５】
【表１６】
2018537425.tif 000045
【０３７６】
１４．２  その後のｈｚ２０８Ｆ２ヒト化型の結合の評価
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体２０８Ｆ２がヒト化され、１６のヒト化変異体（１２．１に記載の第１の形態を含む）の結合特性を評価した。ヒト化変異体の結合特性をヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株およびサル細胞株Ｃｏｓ−７で漸増抗体濃度を用い、ＦＡＣＳ分析により評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃で２０分間、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともにインキュベートした。次に、それらを３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３７７】
ヒト化変異体のＥＣ５０は、総てのヒト化変異体がヒトおよびサルの両細胞株で同等の結合特性を示したことを示した。
【０３７８】
ヒト化抗体のＥＣ５０を表１４ｂにまとめた。
【０３７９】
【表１７】
2018537425.tif 000046
【０３８０】
１４．３  別のｈｚ２０８Ｆ２ヒト化型の内部移行の評価
ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのヒト化抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量をＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間の後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩとの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを表１４ｃに示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出した。ヒト化された第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０７７／Ｌ０１８は、ＩＧＦ−１Ｒの有意な(sifgnifiant)内部移行を誘導し得る。
【０３８１】
【表１８】
2018537425.tif 000047
【０３８２】
実施例１５：可溶性組換えヒトＩＧＦ１Ｒに対する２０８Ｆ２抗体の５つのキメラ抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｃ２０８Ｆ２、ｃ２１３Ｂ１０、ｃ２１２Ａ１１、ｃ２１４Ｆ８およびｃ２１９Ｄ６）およびヒト化型（Ｈ０２６／Ｌ０２４）の結合の解離定数（ＫＤ）の定義
組換え可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の結合の解離定数（ＫＤ）は、解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）の間の比により定義した。動態試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置にて、マウス抗Ｔａｇ  Ｈｉｓモノクローナル(monoclobnal)抗体により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。１２０００ＲＵ前後の抗体を、アミンキット化学を用いてカルボキシメチルデキストラン(carboxymethyldextan)マトリックスに化学的にグラフトする。
【０３８３】
これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。
【０３８４】
その２つのＣ末端１０ヒスチジンタグにより捕捉された可溶性組換えヒトＩＧＦ１Ｒへの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合の動態パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
【０３８５】
１−２本のα鎖と付加的Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグとともに発現される２本β鎖の細胞外ドメインのヒトＩＧＦ−１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）の溶液を第２のフローセルに１０μｇ／ｍｌの濃度で１分間注入した。本試験で実現した２４サイクルのそれぞれにおいて平均５８７ＲＵ（標準偏差２４ＲＵ）の可溶性受容体が捕捉された。
【０３８６】
２−この捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲の、６種類の抗体のうちの１つを注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを５分間通した。
【０３８７】
３−次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５のバッファーを４５秒間注入して表面を再生した。
【０３８８】
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する。
【０３８９】
各ＩＧＦ−１Ｒに関して、漸増濃度範囲の１つの抗体の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した（図２２参照）。
【０３９０】
得られたセンサーグラムを、１：１モデルでのＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアにより分析した。
【０３９１】
各抗体について、２つの異なる濃度範囲、すなわち、各第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体について実施した最初の２回の試験では４０、２０、１０、５および２．５ｎＭおよびあとの２回の試験では２４、１２、６、３および１．５ｎＭを用いて４回の試験を行った。
【０３９２】
本試験で供試した６つの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体について、試験データは、より高い濃度が定数と定義された場合に有意なｋｏｆｆ値を有する１：１モデルによく適合し、他の４つの濃度が計算される（図２３参照）。
【０３９３】
比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される解離定数（ＫＤ）および比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆとして算出されるそれらの複合体の半減期を図２４および２５に示す。これらは各第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体について行った４回の独立した試験の平均に相当する。エラーバーは値の標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【０３９４】
解離定数は１０〜１００ｐＭの範囲である。ｃ２０８Ｆ２抗体は、ｈ−ＩＧＦ−１Ｒに対してより弱い親和性（より高い解離定数値）を示し（ＫＤ  ７５ｐＭ前後）、そのヒト化型は少なくともキメラ型と同等に良好である（ＫＤ  ６０ｐＭ前後）。他の４つの第２のＩＧＦ−１Ｒキメラ抗体は、ｈＩＧＦ１−Ｒに対して全く同等の親和性を示す（ＫＤ  ３０ｐＭ前後）。この親和性の違いは主として解離速度または結果としての複合体の半減期に関連している。２０８Ｆ２では、キメラ型およびヒト化型の第２のＩＧＦ−１Ｒの場合、複合体の半減期は２〜３時間の間である。他の４つの第２のＩＧＦ−１Ｒキメラ抗体では、平均半減期は７．０〜９．４時間の間である。
【０３９５】
これらの極めて緩慢な解離速度は、それらの両Ｆａｂアームにより２つの隣接するｈ−ＩＧＦ−１Ｒ分子に同時に結合できる抗体の二価構造に明らかに関連している。この場合、捕捉されたＩＧＦ−１Ｒ分子のレベルは解離速度に影響を持ち得る。本試験で定義された親和性は、捕捉された６００ＲＵ前後のｈ−ＩＧＦ−１Ｒのレベルに対する抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。上記に示されるデータ（表１１）と実施例１３に示される値の間に見られるＫＤの３倍の違いは、ｈＩＧＦ−１Ｒの捕捉レベルの違い（実施例７では６００ＲＵと１６０ＲＵ）に関連している。
【０３９６】
実施例１６：本発明の薬物の合成
以下の実施例では下記の略号を使用する。
ａｑ．      水性
ｅｅ        鏡像体過剰率
ｅｑｕｉｖ  当量
ＥＳＩ    エレクトロスプレーイオン化
ＬＣ／ＭＳ  液体クロマトグラフィーと質量分析の組み合わせ
ＨＰＬＣ    高速液体クロマトグラフィー
ＮＭＲ      核磁気共鳴
ｓａｔ．    飽和
ＵＶ        紫外線
【０３９７】
参照化合物１
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド、ビストリフルオロ酢酸
【化２４】
2018537425.tif 000048
【０３９８】
化合物１Ａ：（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−５−フェニル−３−プロパノイル−１，３−オキサゾリジン−２−オン
【化２５】
2018537425.tif 000049
（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン（５．８ｇ、３２．７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１２０ｍＬ）に溶かした。この混合物を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（１４．４ｍＬ）を滴下した。−７８℃で３０分間振盪した後、塩化プロパノイル（５．７ｍＬ）を加えた。−７８℃で３０分間、次いで、周囲温度で一晩振盪を続けた。この反応混合物を濃縮した後、２００ｍＬの水に再溶解させた。溶液のｐＨを重炭酸ナトリウム飽和水溶液で７に調整した。この水相を１００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、６．８ｇ（８９％）の化合物１Ａを黄色油状物の形態で得た。
【０３９９】
化合物１Ｂ：（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−３−［（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化２６】
2018537425.tif 000050
化合物１Ａ（１７．６ｇ、７５．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中でジクロロメタン（ＤＣＭ、２８６ｍＬ）に溶かした。この溶液を氷浴で冷却した。トリエチルアミン（ＴＥＡ、１２．１ｍＬ、１．１５当量）およびＢｕ２ＢＯＴｆ（７８．３ｍＬ、１．０４当量）を、反応混合物の温度を２℃より低く保持しながら滴下した。０℃で４５分間振盪を続け、その後、この反応物を−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（４２ｍＬ）中、（２Ｓ）−２−ホルミルピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．５ｇ、４２．６６ｍｍｏｌ、０．５７当量）の溶液を滴下した。−７８℃で２時間、次いで０℃で１時間、最後に周囲温度で１時間振盪を続けた。この反応物を７２ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．２〜７．４）および２１４ｍＬのメタノールで中和し、０℃に冷却した。メタノール中３０％過酸化水素の溶液（２５７ｍＬ）を、温度を１０℃より低く維持しながら滴下した。０℃で１時間振盪を続けた。この反応物を１４２ｍＬの水で中和した後、減圧下で濃縮した。得られた水溶液を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を、シリカカラムにてＥｔＯＡｃおよび石油エーテルの混合物（ＥｔＯＡｃ：ＰＥ＝１：８）を用いて精製し、１３．１６ｇ（４０％）の化合物１Ｂを無色の油状物の形態で得た。
【０４００】
化合物１Ｃ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］ピロリジン−２−イル］−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸
【化２７】
2018537425.tif 000051
化合物１Ｂ（１３．１６ｇ、３０．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を過酸化水素（水中３０％、１５．７ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（４６０ｍＬ）に溶かした後、氷浴で冷却した。水酸化リチウム水溶液（０．４ｍｏｌ／Ｌ、１５２．１ｍＬ）を、反応温度を４℃より低く保持しながら滴下した。この反応混合物を０℃で２．５時間振盪した。Ｎａ２ＳＯ３水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、１６７．３ｍＬ）を、温度を０℃に保持しながら滴下した。この反応混合物を周囲温度で１４時間振盪した後、１５０ｍＬの冷重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、５０ｍＬのＤＣＭで３回洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍ  ＫＨＳＯ４水溶液で２〜３に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、７．３１ｇ（８８％）の化合物１Ｃを無色の油状物の形態で得た。
【０４０１】
化合物１Ｄ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］ピロリジン−２−イル］−３−メトキシ−２−メチルプロパン酸
【化２８】
2018537425.tif 000052
化合物１Ｃ（７．３１ｇ、２６．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ヨードメタン（２５．３ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（１３５ｍＬ）に溶かした。この反応媒体を氷浴で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、４．２８ｇ）を少量ずつ加えた。この反応物を０℃で３日、振盪下で放置した後、１００ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、５０ｍＬのエーテルで３回洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍ  ＫＨＳＯ４水溶液で３に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３（水中５％）で１回、ＮａＣｌ飽和溶液で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、５．５ｇ（７２％）の化合物１Ｄを無色の油状物の形態で得た。
【０４０２】
化合物１Ｅ：Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−２−フェニルアセトアミド
【化２９】
2018537425.tif 000053
２−フェニル酢酸（１６．２ｇ、１１８．９９ｍｍｏｌ、１．００当量）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１３０ｍＬ）に溶かした後、−１０℃に冷却した。ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ、１９．２ｍＬ）、メトキシ（メチル）アミン塩酸塩（１２．９２ｇ、１３３．２０ｍｍｏｌ、１．１２当量）およびトリエチルアミン（３３．６ｍＬ）を加えた。この反応混合物を−１０℃で３０分、次いで、周囲温度で２．５時間振盪した。次に、これを１リットルのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で２回、４００ｍＬの水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３）を用いて精製し、２０．２ｇ（９５％）の化合物１Ｅを黄色油状物の形態で得た。
【０４０３】
化合物１Ｆ：２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−オン
【化３０】
2018537425.tif 000054
テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ、２７．２ｍＬ）を不活性雰囲気中、ＴＨＦ  ３００ｍＬに溶かした後、−７８℃に冷却し、その後、ｎ−ＢｕＬｉ（６７．６ｍＬ、２．５Ｍ）を滴下した。２−ブロモ−１，３−チアゾール（１５．２ｍＬ）を滴下し、−７８℃で３０分振盪を続けた。ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かした化合物１Ｅ（２５ｇ、１３９．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下した。−７８℃で３０分間、次いで、−１０℃で２時間振盪を続けた。この反応物を５００ｍＬのＫＨＳＯ４（飽和）で中和した後、１リットルのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、４００ｍＬの水で２回および７００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：１０）を用いて精製し、２５ｇ（８８％）の化合物１Ｆを黄色油状物の形態で得た。
【０４０４】
化合物１Ｇ：（１Ｒ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−オール
【化３１】
2018537425.tif 000055
不活性雰囲気中、（＋）−Ｂ−クロロジイソピノカンフェイルボラン(chlorodiisopinocampheylborane)（（＋）−Ｉｐｃ２ＢＣｌ、１１０．８ｍＬ）に、エーテル（３００ｍＬ）中、化合物１Ｆ（１５ｇ、７３．８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を滴下した。この反応混合物を０℃で２４時間振盪した後、ＮａＯＨ（水中１０％）とＨ２Ｏ２（水中３０％）の（１：１）混合物３００ｍＬで中和し、最後に５００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、３００ｍＬのＫ２ＣＯ３（飽和）で２回および５００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２０から１：２）を用いて精製し、６．３ｇ（４２％）の化合物１Ｇを白色固体の形態で得た。
【０４０５】
化合物１Ｈ：２−［（１Ｓ）−１−アジド−２−フェニルエチル］−１，３−チアゾール
【化３２】
2018537425.tif 000056
化合物１Ｇ（６ｇ、２９．２３ｍｍｏｌ、１．００当量）を、不活性雰囲気中、トリフェニルホスフィン（１３ｇ、４９．５６ｍｍｏｌ、１．７０当量）の存在下でＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ、７．６ｍＬ）、次いで、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ、１１ｍＬ）を滴下した後、冷却浴を外し、溶液を振盪下、周囲温度で４８時間放置した。この媒体を減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３０）を用いて精製し、８ｇの部分的に精製された化合物１Ｈを黄色油状物の形態で得た。化合物１Ｈはそのまま次の工程で使用した。
【０４０６】
化合物１Ｉ：Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバミンｔｅｒｔ−ブチル酸
【化３３】
2018537425.tif 000057
化合物１Ｈ（６．５ｇ、２８．２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、トリフェニルホスフィン（６．５ｇ、３３．９ｍｍｏｌ、１．２０当量）の存在下でＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かし、２時間５０℃に加熱した。次に、アンモニア（７０ｍＬ）を加え、３時間加熱を続けた。この反応物を冷却し、５００ｍＬの水で中和した後、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌで２回抽出した、水相を合わせ、水酸化ナトリウム溶液（水中１０％）を加えることによりｐＨ８〜９とした後、５００ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４．８ｇ（８３％）の（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−アミンを黄色油状物の形態で得た。次に、この化合物を、それが精製可能となるように、Ｂｏｃ基（（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル）で保護した。これを不活性雰囲気中、１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。２０ｍＬの１，４−ジオキサンに希釈した（Ｂｏｃ）２Ｏ（１０．２６ｇ、４７．０１ｍｍｏｌ、２．００当量）を滴下した。冷却浴を外し、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、３００ｍＬの水で中和し、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：２０、ｅｅ＝９３％）を用いて精製した。次に、これをヘキサン／アセトン混合物（約５〜１０／１、１ｇ／１０ｍＬ）中で再結晶させ、６ｇ（８４％）の化合物１Ｉを白色固体の形態で得た（ｅｅ＞９９％）。
【０４０７】
化合物１Ｊ：（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−カルボンｔｅｒｔ−ブチル
【化３４】
2018537425.tif 000058
化合物１Ｉ（３ｇ、９．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、１０ｍＬのＤＣＭに溶かした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮し、２．０ｇ（６４％）の（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−アミン；トリフルオロ酢酸を黄色油状物の形態で得た。この中間体を２０ｍＬのＤＣＭに再溶解させ、その後、化合物１Ｄ（１．８ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、１．０５当量）、ＤＥＰＣ（１．１ｇ、６．７５ｍｍｏｌ、１．１３当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１．６４ｇ、１２．７１ｍｍｏｌ、２．１３当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３）を用いて精製し、２．３ｇ（８１％）の化合物１Ｊを淡黄色固体の形態で得た。
【０４０８】
化合物１Ｋ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］−３−［（２Ｓ）−ピロリジン−２−イル］プロパンアミド；トリフルオロ酢酸
【化３５】
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化合物１Ｊ（２．２５ｇ、４．７５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、１０ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮し、２．１８ｇ（９４％）の化合物１Ｋを黄色油状物の形態で得た。
【０４０９】
化合物１Ｌ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−（ベンジルアミノ）−３−メチルペンタン酸
【化３６】
2018537425.tif 000060
２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（３７５ｍＬ）に、（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸（９８．４ｇ、７５０ｍｍｏｌ、１．００当量）を周囲温度で少量ずつ加えた。ベンズアルデヒド（７９．７ｇ、７５１．０２ｍｍｏｌ、１．００当量）を手早く加え、得られた溶液を３０分振盪した。水素化ホウ素ナトリウム（１０．９ｇ、２８８．１７ｍｍｏｌ、０．３８当量）を、温度を５〜１５℃の間に保持しながら少量ずつ加えた。周囲温度で４時間振盪を続けた。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈した後、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回洗浄した。水溶液のｐＨを２Ｎ塩酸溶液で７に調整した。生じた沈澱を濾取し、１４９．２ｇ（９０％）の化合物１Ｌを白色固体の形態で得た。
【０４１０】
化合物１Ｍ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタン酸
【化３７】
2018537425.tif 000061
化合物１Ｌ（２５ｇ、１１２．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ホルムアルデヒド（水中３６．５％、２２．３ｇ）の存在下でギ酸（３１．２ｇ）に溶かした。溶液を９０℃で３時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を２５０ｍＬのアセトン中で摩砕した後、濃縮した。この摩砕／蒸発操作を、５００ｍＬのアセトンを用いて２回繰り返し、２１．６ｇ（８１％）の化合物１Ｍを白色固体の形態で得た。
【０４１１】
化合物１Ｎ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタン−１−オール
【化３８】
2018537425.tif 000062
ＬｉＡｌＨ４（０．３６ｇ）を不活性雰囲気中、０℃で１０ｍＬのＴＨＦに懸濁させた。化合物１Ｍ（１．５ｇ、６．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）を、温度を０〜１０℃の間に保持しながら少量ずつ加えた。この反応混合物を６５℃で２時間振盪した後、再び０℃に冷却し、その後、３６０μｌの水、１ｍＬの１５％水酸化ナトリウムおよび３６０μｌの水を順次加えて中和した。沈澱したアルミニウム塩を濾去した。濾液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：５０）を用いて精製し、８２０ｍｇ（５８％）の化合物１Ｎを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４１２】
化合物１Ｏ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタノール
【化３９】
2018537425.tif 000063
塩化オキサリル（０．４ｍＬ）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶かした。溶液を−７０℃に冷却し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）の溶液を１５分間滴下した。この反応混合物を３０分振盪し、その後、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、化合物１Ｎ（８２０ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を１５分間滴下した。この反応混合物をさらに３０分、低温で振盪した後、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）をゆっくり加えた。この反応混合物を−５０℃で１時間振盪した後、冷却浴を外し、温度を常温に戻しながら、反応物を２５ｍＬの水で中和した。この溶液を３０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２００）を用いて精製し、０．４２ｇ（５２％）の化合物１Ｏを黄色油状物の形態で得た。
【０４１３】
化合物１Ｐ：（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ベンジル−１，１ジメトキシ−Ｎ，３−ジメチルペンタン−２−アミン
【化４０】
2018537425.tif 000064
化合物１Ｏ（４．７ｇ、２１．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を０℃で２０ｍＬのメタノールに溶かした。濃硫酸（４．３ｍＬ）を滴下し、０℃で３０分間振盪を続けた。オルトギ酸トリメチル（２１．４ｍＬ）を加え、冷却浴を外し、反応媒体を周囲温度で３時間、振盪下で放置した。この反応媒体を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１００ｍＬの１０％Ｎａ２ＣＯ３および２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで順次洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．４ｇ（６０％）の化合物１Ｐを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４１４】
化合物１Ｑ：［［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）エテニル］オキシ］（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラン
【化４１】
2018537425.tif 000065
ジイソプロピルアミン（２０ｇ、１８６．７１ｍｍｏｌ、１．０８当量）を不活性雰囲気中、１７０ｍＬのＴＨＦに溶かし、−７８℃に冷却した。ｎＢｕＬｉ（２．４Ｍ、７８．８ｍＬ）を滴下し、溶液を低温で３０分振盪し（ＬＤＡ−リチウムジイソプロピルアミドを得るため）、その後、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０ｇ、１７２．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。この反応混合物を−７８℃で２０分振盪した後、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ、２５．８ｍＬ）および３５ｍＬのＴＨＦ中、ｔｅｒｔブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＤＭＳＣｌ、２８ｇ、１８５．８０ｍｍｏｌ、１．０８当量）の溶液を加えた。低温でさらに２０分間振盪を続けた後、冷却浴を外した。この溶液を減圧下で濃縮した。残渣を１００ｍＬの水に再溶解させ、１００ｍＬのＰＥで３回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を蒸留により精製し、１６．６ｇ（８３％）の化合物１Ｑを無色の油状物の形態で得た。
【０４１５】
化合物１Ｒ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４２】
2018537425.tif 000066
化合物１Ｐ（２．０ｇ、７．５４ｍｍｏｌ、１．００当量）および化合物１Ｑ（２．６ｇ、１１．２８ｍｍｏｌ、１．５０当量）を不活性雰囲気中、３３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を０℃に冷却した。ＤＭＦ（１．２ｇ）を７．５ｍＬのＤＣＭ中、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（２．１ｇ）の溶液とともに滴下した。０℃で２４時間振盪を続けた。この反応媒体を３０ｍＬの炭酸ナトリウム（１０％）で１回および５０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００）を用いて精製し、１．８２ｇ（９１％）の化合物１Ｒを黄色油状物の形態で得た。
【０４１６】
化合物１Ｓ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタン酸塩酸塩
【化４３】
2018537425.tif 000067
化合物１Ｒ（２．４ｇ、６．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、Ｐｄ／Ｃ（０．１２ｇ）および濃塩酸（０．６３ｍＬ）の存在下で３５ｍＬのエタノールに溶かした。窒素雰囲気を水素雰囲気に置き換え、反応媒体を周囲温度で１８時間、振盪下で放置した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を５０ｍＬのヘキサン中で摩砕し、上清を取り出し、減圧下で乾燥させた後、１．６６ｇ（８２％）の化合物１Ｓを白色固体の形態で得た。
【０４１７】
化合物１Ｔ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ(mthoxy)−５−  メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４４】
2018537425.tif 000068
（２Ｓ）−２−［［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ］−３−メチルブタン酸（１５ｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＩＥＡ（３８．３ｍＬ）およびブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ、３２．３ｇ）の存在下で３００ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を周囲温度で３０分振盪した後、化合物１Ｓ（１５．９９ｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０７当量）を加えた。この反応媒体を２時間振盪した後、濃縮した。残渣をアセトニトリル（ＡＣＮ）と水の混合物（４０分で３０：７０から１００：０）を用いて逆相（Ｃ１８）で精製し、１７ｇ（５８％）の化合物１Ｔを無色の油状物の形態で得た。
【０４１８】
化合物１Ｕ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４５】
2018537425.tif 000069
化合物１Ｔ（７６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、Ｐｄ／Ｃ（０．０５ｇ）の存在下で１０ｍＬのエタノールに溶かした。窒素雰囲気を水素雰囲気に置き換え、この反応物を周囲温度で２時間振盪した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６４ｍｇの化合物１Ｕを無色の油状物の形態で得た。
【０４１９】
化合物１Ｖ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノエート
【化４６】
2018537425.tif 000070
化合物１Ｕ（１８．１９ｇ、５０．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）を重炭酸ナトリウム（１２．７８ｇ、１５２ｍｍｏｌ、３．００当量）およびクロロギ酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ、１９．６９ｇ、７６ｍｍｏｌ、１．５０当量）の存在下で４００ｍＬの１，４−ジオキサン／水混合物（１：１）に溶かした後、周囲温度で２時間振盪した。次に、この反応媒体を５００ｍＬの水で希釈し、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、２００ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４０ｇの部分的に精製された化合物１Ｖを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４２０】
化合物１Ｗ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸
【化４７】
2018537425.tif 000071
化合物１Ｖ（４０ｇ、６８．８８ｍｍｏｌ、１．００当量）を中性雰囲気中、６００ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（３００ｍＬ）を加えた。この溶液を周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：１０）を用いて精製し、２３．６ｇ（６５％）の化合物１Ｗを無色の油状物の形態で得た。
【０４２１】
化合物１Ｘ：Ｎ−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル
【化４８】
2018537425.tif 000072
化合物１Ｗ（２．５３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ、１．０８当量）を化合物１Ｋ（２．１８ｇ、４．４７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＥＰＣ（８７５ｍｇ、５．３７ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（１．２５ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、２．１６当量）の存在下で２０ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、５０ｍＬの飽和ＫＨＳＯ４および１００ｍＬの水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：２００から１：４０）を用いて精製し、２．８ｇ（７１％）の化合物１Ｘを淡黄色固体の形態で得た。
【０４２２】
化合物１Ｙ：（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［（３Ｒ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
【化４９】
2018537425.tif 000073
化合物１Ｘ（２．８ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）をピペリジン（３ｍＬ）の存在下でアセトニトリル（ＡＣＮ、１２ｍＬ）に溶かし、周囲温度で１８時間、振盪下で放置した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、１００ｍＬのＤＣＭで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：１００から１：４０）を用いて精製し、１．２ｇ（５７％）の化合物１Ｙを黄色固体の形態で得た。
【０４２３】
化合物１ＺＡ：（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化５０】
2018537425.tif 000074
（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］−３−メチルブタン酸（６３ｇ、２８９．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ヨードメタン（１８１ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（１０００ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、水素化ナトリウム（１１６ｇ、４．８３ｍｏｌ、１６．６７当量）を少量ずつ加えた。この反応混合物を０℃で１．５時間振盪した後、冷却浴を外し、１８時間振盪を続けた。この反応物を２００ｍＬの水で中和した後、減圧下で濃縮した。残った水相を４リットルの水で希釈し、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで１回洗浄し、そのｐＨを１Ｎ塩酸溶液で３〜４の間に調整した。得られた混合物を１．２ＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、６０ｇ（８９％）の化合物１ＺＡを黄色油状物の形態で得た。
【０４２４】
化合物１ＺＢ：ベンジル（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタノエート
【化５１】
2018537425.tif 000075
化合物１ＺＡ（４７ｇ、２０３．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＬｉ２ＣＯ３（１５．８ｇ、２１３．８３ｍｍｏｌ、１．０５当量）の存在下でＤＭＦ（６００ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、臭化ベンジル（ＢｎＢｒ  ５７．９ｇ、３３８．５３ｍｍｏｌ、１．６７当量）を滴下した。この反応混合物を一晩振盪下で放置した後、４００ｍＬの水で中和し、濾過した。得られた溶液を５００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：２０）を用いて精製し、２２．５ｇ（３４％）の化合物１ＺＢを黄色油状物の形態で得た。
【０４２５】
化合物１ＺＣ：（２Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタン酸ベンジル塩酸塩
【化５２】
2018537425.tif 000076
化合物１ＺＢ（２２．５ｇ、７０．００ｍｍｏｌ、１．００当量）を１５０ｍＬのＤＣＭに溶かした。気体塩酸をバブリングさせた。この反応物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮し、１７ｇ（９４％）の化合物１ＺＣを黄色固体の形態で得た。
【０４２６】
化合物１ＺＤ：Ｎ−（３，３−ジエトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５３】
2018537425.tif 000077
３，３−ジエトキシプロパン−１−アミン（６ｇ、４０．７６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＥＡ（４．４５ｇ、４３．９８ｍｍｏｌ、１．０８当量）の存在下で１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。２０ｍＬの１，４−ジオキサンに希釈した（Ｂｏｃ）２Ｏ（９．６ｇ、４３．９９ｍｍｏｌ、１．０８当量）を滴下した。この溶液を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した後、１０ｍＬの水で中和した。ｐＨをＨＣｌ（１％）で５に調整した。この溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、８．２１ｇ（８１％）の化合物１ＺＤを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４２７】
化合物１ＺＥ：Ｎ−（３−オキソプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５４】
2018537425.tif 000078
化合物１ＺＤ（８．２０ｇ、３３．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を１８．７５ｍＬの酢酸に溶かし、周囲温度で一晩、振盪下で放置した。次に、この反応媒体を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、３０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、５ｇ（８７％）の化合物１ＺＥを暗赤色油状物の形態で得た。
【０４２８】
化合物１ＺＦ：（２Ｓ）−２−［（３−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］プロピル）（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化５５】
2018537425.tif 000079
化合物１ＺＥ（２．４ｇ、１３．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（３．５６ｇ、１３．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＤＩＥＡ（９．１６ｍＬ、４．００当量）の存在下で５０ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で３０分振盪した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．８７ｇ、２７．７０ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。一晩振盪を続けた後、反応物を１００ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：４）を用いて部分的に精製した。得られた粗生成物をＰｄ／Ｃ（１．２ｇ）の存在下で２０ｍＬのメタノールに再溶解させ、常温および常圧で２０分間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、２００ｍｇ（５％）の化合物１ＺＦを白色固体の形態で得た。
【０４２９】
化合物１ＺＧ：Ｎ−（３−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］チル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバモイル］−２−メチルプロピル］（メチル）アミノ］プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５６】
2018537425.tif 000080
化合物１Ｙ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＦ（２６．２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．２０当量）、ＤＩＥＡ（３７．７ｍＬ）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４３．３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．５０当量）の存在下で２ｍＬのＤＭＦに溶かした。この反応物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、１０ｍＬの水で希釈し、５ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、１００ｍｇの化合物１ＺＧを部分的に精製された無色の油状物の形態で得た。
【０４３０】
化合物１ＺＧ（９０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を中性雰囲気中、２ｍＬのＤＣＭに溶かし、この溶液を氷浴で冷却した。ＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、この反応物を周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％のＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；７分で１８％から３１％ＡＣＮへ、次いで、２分で３１％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１を２５％（２３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４３１】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３カラム、３μｍ、４．６×１００ｍｍ；３５℃；１ｍＬ／分、水中３０％から６０％ＡＣＮへ（６分で２０ｍＭ酢酸アンモニウム）；ＥＳＩ（Ｃ４４Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８２７．５３）ｍ／ｚ：８２９（ＭＨ＋）、５．８４分（９３．７％、２５４ｎｍ）。
1H NMR(300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.22 - 4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.74 (m, 58H)。
【０４３２】
参照化合物２
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−アミノピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド、トリフルオロ酢酸
【化５７】
2018537425.tif 000081
【０４３３】
化合物２Ａ：（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５８】
2018537425.tif 000082
化合物１Ｄ（２．５ｇ、８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）および（１Ｓ，２Ｒ）−２−アミノ−１−フェニルプロパン−１−オール（１．３１５ｇ、８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．３９ｍＬ）およびＴＥＡ（１．８２ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で４時間振盪した。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．６ｇ（９８％）の化合物２Ａを黄色固体の形態で得た。
【０４３４】
化合物２Ｂ：（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパンアミド２，２，２−トリフルオロアセテート
【化５９】
2018537425.tif 000083
化合物２Ａ（２．７ｇ、６．４２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加え、この溶液を０℃で２時間振盪した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、４．４ｇの化合物２Ｂを黄色油状物の形態で得た。
【０４３５】
化合物２Ｃ：（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル
【化６０】
2018537425.tif 000084
化合物２Ｂ（４．４ｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１．００当量）および１Ｗ（５．３１ｇ、１０．１２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４５ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．６２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（８．４ｍＬ）を滴下した。この反応混合物(The reation mixture)を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、圧力下で(under pressure)濃縮し、３．３ｇ（３９％）の化合物２Ｃを黄色固体の形態で得た。
【０４３６】
化合物２Ｄ：（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
【化６１】
2018537425.tif 000085
化合物２Ｃ（３００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＡＣＮ（２ｍＬ）およびピペリジン（０．５ｍＬ）に溶かした。この溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で蒸発乾固した。残渣をシリカカラムにてＤＣＭとＭｅＯＨの混合物（１：１００）を用いて精製し、１５０ｍｇ（６８％）の化合物２Ｄを白色固体の形態で得た。
【０４３７】
化合物２Ｅ：２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）イソニコチン酸メチル
【化６２】
2018537425.tif 000086
２−アミノピリジン−４−カルボン酸メチル（２ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ、１．００当量）をｔｅｒｔ−ブタノール（２０ｍＬ）に溶かし、その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４．０２ｇ、１８．４２ｍｍｏｌ、１．４０当量）を加えた。この反応混合物を６０℃で一晩振盪した後、この反応を１Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）の添加により停止させた。固体を濾別し、５０ｍＬのＥｔＯＨで洗浄した後、真空乾燥させ、２．５ｇ（７５％）の化合物２Ｅを白色固体の形態で得た。
【０４３８】
化合物２Ｆ：（４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６３】
2018537425.tif 000087
化合物２Ｅ（２．５ｇ、９．９１ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＣａＣｌ２（１．６５ｇ）をＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＮａＢＨ４（１．１３ｇ、２９．８７ｍｍｏｌ、３．０１当量）を徐々に加えた。この溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、この反応を水（５０ｍＬ）の添加により停止させた。この混合物を２０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、２０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２．０ｇ（９０％）の化合物２Ｆを無色の固体の形態で得た。
【０４３９】
化合物２Ｇ：（４−ホルミルピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６４】
2018537425.tif 000088
化合物２Ｆ（２．５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＥ（２５ｍＬ）に溶かした後、１９．４ｇ（２２３．１４ｍｍｏｌ、２０．０２当量）のＭｎＯ２を加えた。この混合物を７０℃で一晩、振盪下で放置した後、固体を濾去した。濾液を蒸発乾固させ、１．４ｇ（５７％）の化合物２Ｇを白色固体の形態で得た。
【０４４０】
化合物２Ｈ：（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化６５】
2018537425.tif 000089
化合物２Ｇ（２．３ｇ、１０．３５ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（２．９３ｇ、１１．３７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＩＥＡ（５．３９ｇ、４１．７１ｍｍｏｌ、４．０３当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（４．３９ｇ、２０．７１ｍｍｏｌ、２．００当量）の存在下で２５ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で６時間振盪した後、６０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で中和し、２０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、２０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１５）を用いて精製し、２．７ｇ（６１％）の化合物２Ｈを白色固体の形態で得た。
【０４４１】
化合物２Ｉ：（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化６６】
2018537425.tif 000090
化合物２Ｈ（５００ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）の存在下で１０ｍＬのＡｃＯＥｔおよび２ｍＬのメタノールに溶かし、周囲温度および大気圧で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、２５４ｍｇ（６４％）の化合物２Ｉを無色の固体の形態で得た。
【０４４２】
化合物２Ｊ：（４−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−３，６−ジイソプロピル−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６７】
2018537425.tif 000091
化合物２Ｊは、ＤＭＦ（３ｍＬ）中、アミン２Ｄ（８５．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．５０当量）、酸２Ｉ（３１．７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＨＡＴＵ（４２．９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（３６．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、３．０２当量）から、化合物１ＺＧと同様にして製造された。蒸発乾固の後、１００ｍｇの粗生成物を白色固体の形態で得た。
【０４４３】
化合物２Ｊ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を２ｍＬのＤＣＭおよび１ｍＬのＴＦＡに溶かした。この反応物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物２を６％（６．３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４４４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．８ｍＬ／分、６分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮへ）；ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７３Ｎ７Ｏ７、正確な質量８２３．５６）ｍ／ｚ：８２４．５（ＭＨ＋）および４１２．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、３．２１分（９９．２％、２１０ｎｍ）
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.81 - 7.79 (m, 1H); 7.39 - 7.29 (m, 5H); 6.61 - 6.59 (m, 2H); 4.84 - 4.52 (m, 1H); 4.32 - 4.02 (m, 1H); 3.90 - 2.98 (m, 10H); 2.90 - 2.78 (m, 1H); 2.55 - 0.81 (m, 39H)。
【０４４５】
参照化合物３
（（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル、トリフルオロ酢酸
【化６８】
2018537425.tif 000092
【０４４６】
化合物３Ａ：（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−（（（Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６９】
2018537425.tif 000093
化合物１Ｄ（３ｇ、１０．４４ｍｍｏｌ、１．００当量）および（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロパン酸メチル（２．２５ｇ、１２．５５ｍｍｏｌ、１．２０当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．６７ｍＬ、１．０５当量）およびＴＥＡ（３．６４ｍＬ、２．５０当量）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、１００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、１００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、圧力下で(under pressure)濃縮し、４ｇ（８５％）の化合物３Ａを無色の油状物の形態で得た。
【０４４７】
化合物３Ｂ：２（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチルの，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化７０】
2018537425.tif 000094
化合物３Ａ（５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を、不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かした。ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加え、溶液を２時間振盪した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、８ｇの化合物３Ｂを黄色油状物の形態で得た。
【０４４８】
化合物３Ｃ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化７１】
2018537425.tif 000095
化合物３Ｂ（８．０３ｇ、１７．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）および１Ｗ（９．１ｇ、１７．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（２．８ｍＬ）およびＤＩＥＡ（１２ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、５ｇ（３４％）の化合物３Ｃを黄色固体の形態で得た。
【０４４９】
化合物３Ｄ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化７２】
2018537425.tif 000096
化合物３Ｃ（５．５ｇ、６．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ、２．６１ｇ、９．９８ｍｍｏｌ、１．５５当量）の溶液に溶かした。この溶液を周囲温度で２時間振盪した後、１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせた後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．３ｇ（８１％）の化合物３Ｄを黄色固体の形態で得た。
【０４５０】
化合物３Ｅ：（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタン酸ベンジル
【化７３】
2018537425.tif 000097
ピリジン−４−カルバルデヒド（１ｇ、９．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（２．９ｇ、１１．２５ｍｍｏｌ、１．２１当量）およびチタンイソプロポキシド（ＩＶ）（４．１９ｍＬ、１．４０当量）の存在下で１０ｍＬの１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）に溶かした。この混合物を周囲温度で３０分間振盪した後、２．７７ｇのＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１３．０７ｍｍｏｌ、１．４０当量）を加えた。この反応媒体を振盪下で一晩放置した後、１００ｍＬの水で中和し、この混合物を５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾固させた。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２０）を用いて精製し、１．３ｇ（４５％）の化合物３Ｅを無色の油状物の形態で得た。
【０４５１】
化合物３Ｆ：（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタン酸
【化７４】
2018537425.tif 000098
化合物３Ｅ（８００ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（３００ｍｇ）の存在下で３０ｍＬのＡｃＯＥｔに溶かし、周囲温度および大気圧下で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＤＣＭとＭｅＯＨの混合物（１００：１から５：１）を用いて精製し、１００ｍｇ（１８％）の化合物３Ｆを白色固体の形態で得た。
【０４５２】
化合物３Ｄ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）および３Ｆ（２６．３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５０当量）を３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、０．０１８ｍＬのＤＥＰＣおよび０．０３９２ｍＬのＤＩＥＡを加えた。この反応物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応媒体を減圧下で濃縮し、残基（７０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％のＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物３を２７％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４５３】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮ）；ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３６．５）ｍ／ｚ：８３７．５（ＭＨ＋）および４１９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２（１００％））、７．０４分（９０．０％、２１０ｎｍ）
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.76 - 8.74 (m, 2H); 8.53 - 8.48 (m, 0.4H, NHCO 不完全交換); 8.29 - 8.15 (m, 0.8H, NHCO 不完全交換); 8.01 (s, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 4.88 - 4.68 (m, 3H); 4.31 - 4.07 (m, 2H); 3.94 - 2.90 (m, 18H); 2.55 - 0.86 (m, 38H)。
【０４５４】
参照化合物４
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、トリフルオロ酢酸
【化７５】
2018537425.tif 000099
化合物３（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）およびピペリジン（２．５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を振盪下で一晩放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、２０ｍｇ（２０％）の化合物４を白色固体の形態で得た。
【０４５５】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮへ）；ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７０Ｎ６Ｏ８、正確な質量８２２．５）ｍ／ｚ：８２３．５（ＭＨ＋）および４１２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．８４分（８９．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.79 - 8.78 (m, 2H); 8.09 (m, 2H); 7.30 - 7.21 (m, 5H); 4.80 - 4.80 (m, 1H), 4.36 - 0.87 (m, 58H)。
【０４５６】
参照化合物６
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−  フェニルプロパン酸メチル、ビストリフルオロ酢酸
【化７６】
2018537425.tif 000100
【０４５７】
化合物６Ａ：（２Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［（２Ｓ）−１−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−［（３−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］プロピル）（メチル）アミノ］−３−メチルブタンアミド］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル］ピロリジン−２−イル］（メトキシ）メチル］プロパンアミド］−３−フェニルプロパン酸メチル
【化７７】
2018537425.tif 000101
化合物３Ｄ（１５７．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．００当量）を０℃で不活性雰囲気中、カルボン酸１ＺＦ（７８．７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＥＰＣ（４６μｌ）およびＤＩＥＡ（１２４μｌ）の存在下で３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応混合物を低温で２時間振盪した後、冷却浴を外し、４時間振盪を続けた。次に、これを減圧下で濃縮し、２００ｍｇの化合物６Ａを粗黄色油状物の形態で得た。これをそのまま次の工程で使用した。
【０４５８】
化合物６Ａ（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、０℃で、２ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（１ｍＬ）を滴下し、冷却浴を外した。この反応混合物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、６０ｍｇ（２工程の収率２６％）の化合物６を白色固体の形態で得た
【０４５９】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．１％Ｈ３ＰＯ４）中３０から８０％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ４３Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８０２．５６）ｍ／ｚ：８０４（ＭＨ＋）；１１．５０分（９１．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.52 (d, 0.3H, NHCO 不完全交換); 8.25 (d, 0.5H, NHCO 不完全交換); 7.30 - 7.22 (m, 5H); 4.9 - 4.6 (m, 3H); 4.2 - 4.0 (m, 1H); 4.0 - 0.86 (m, 61H)。
【０４６０】
参照化合物７
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、ビストリフルオロ酢酸
【化７８】
2018537425.tif 000102
化合物６（７０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（２．５ｍＬ）とピペリジン（５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：で緩衝させた０．０５％ＦＡ水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；ＵＶ  Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、１４．６ｍｇ（２１％）の化合物７を白色固体の形態で得た。
【０４６１】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；１．５ｍＬ／分、４０℃、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中０から８０％メタノール；ＥＳＩ（Ｃ４２Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量７８８．５４）ｍ／ｚ：７９０（ＭＨ＋）、５．７１分（９６．８３％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.42 (d, 0.3H, NHCO 不完全交換); 8.15 (d, 0.2H, NHCO 不完全交換); 7.31 - 7.21 (m, 5H); 4.9 - 4.6 (m, 3H); 4.25 - 4.0 (m, 1H); 4.0 - 0.86 (m, 59H)。
【０４６２】
化合物  １１
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド、トリフルオロ酢酸
【化７９】
2018537425.tif 000103
【０４６３】
化合物１１Ａ：Ｎ−［４−（２−ヒドロキシエチル）フェニル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８０】
2018537425.tif 000104
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２−（４−アミノフェニル）エタノール（１０ｇ、７２．９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１６．７ｇ、７７ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加え、この反応物を周囲温度で一晩撹拌した。この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水（２００ｍＬ）、次いで、ＨＣｌ  １Ｍ（１００ｍＬ）、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、次いで、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、減圧下で蒸発乾固させた。粗生成物をヘプタン（１５０ｍＬ）で２回摩砕し、真空下で乾燥させ、化合物１１Ａを白色固体として得た（１４．７ｇ、８４％）。
【０４６４】
化合物１１Ｂ：Ｎ−［４−（２−オキソエチル）フェニル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８１】
2018537425.tif 000105
化合物１１Ａ（２．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を２５ｍＬのＤＣＭに溶かした後、−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（１０ｍＬ）中デス・マーチン・ペルヨージナン溶液（ＤＭＰ、６．７１ｇ、１５．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下した。冷却浴を外し、周囲温度で１時間振盪を続けた。この反応物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液とＮａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液の５０／５０混合物６０ｍＬで中和した。得られた溶液を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、ＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １／１５）で精製し、１．０ｇ（４０％）の化合物１１Ｂを淡黄色固体の形態で得た。
【０４６５】
化合物１１Ｃ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸ベンジル
【化８２】
2018537425.tif 000106
化合物１ＺＣ（３．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＩＥＡ（６．４ｇ、４９．７ｍｍｏｌ、４．０当量）、アルデヒド１１Ｂ（２．９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．２３ｇ、４９．７ｍｍｏｌ、２．０当量）の存在下でＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、６０ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和した。得られた溶液を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、ＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １：２０）で精製し、３．７ｇ（６８％）の化合物１１Ｃを黄色油状物の形態で得た。
【０４６６】
化合物１１Ｄ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化８３】
2018537425.tif 000107
化合物１１Ｃ（２ｇ、４．５ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ（２ｇ）の存在下で１０ｍＬのメタノールに溶かし、常温および常圧で２時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１．２ｇ（７５％）の化合物１１Ｄを黄色油状物の形態で得た。
【０４６７】
化合物１１Ｅ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化８４】
2018537425.tif 000108
化合物１１Ｄ（１．２ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶かした。反応媒体を氷浴で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、５４９ｍｇ、１３．７ｍｍｏｌ、４．０当量）を少量ずつ加えた後、ヨードメタン（４．９ｇ、３４ｍｍｏｌ、１０当量）を加えた。この反応物を周囲温度で(at ambient teperature)一晩、振盪下で放置した後、水で中和し、１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで６〜７に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、８００ｍｇ（６４％）の化合物１１Ｅを黄色固体の形態で得た。
【０４６８】
化合物１１Ｆ：Ｎ−［４−（２−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバモイル］−２−メチルプロピル］（メチル）アミノ］エチル）フェニル］−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８５】
2018537425.tif 000109
化合物１１Ｆは、アミン１Ｙ（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）および酸１１Ｅ（７０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１．０当量）から、化合物６Ａと同様にして製造された。シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １：１）での精製後、１００ｍｇ（５２％）の目的生成物を淡黄色固体の形態で得た。
【０４６９】
化合物１１は、中間体１１Ｆ（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）から、化合物１と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１１を３９％（３９．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４７０】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中５０から９５％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ５０Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量９０３．５７）ｍ／ｚ：９０４．５（ＭＨ＋）、７．５３分（９３．６８％、２５４ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.84 (d, 0.5H, NHCO 不完全交換); 8.7 - 8.5 (m, 0.9H, NHCO 不完全交換); 7.76 - 7.73 (m, 1H); 7.55 - 7.4 (m, 1H); 7.28 - 7.22 (m, 7H); 7.08 - 7.05 (m, 2H); 5.51 - 5.72 (m, 1H); 4.9 - 4.80 (m, 2H); 4.3 - 0.7 (m, 60H)。
【０４７１】
化合物１２
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル、トリフルオロ酢酸
【化８６】
2018537425.tif 000110
化合物１の合成の最終段階と同様にして、化合物１２をアミン３Ｄ（１１８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および酸１１Ｅ（８２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から２段階で製造した。最終残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１２を７％（１３．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４７２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０から９５％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ４９Ｈ７８Ｎ６Ｏ８、正確な質量８７８．５９）ｍ／ｚ：８７９．７（ＭＨ＋）、１０．０７分（９０．６％、２５４ｎｍ）。
1H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.40 (se, 2H); 7.38 - 7.22 (m, 7H); 4.95 - 4.7 (m, 3H); 4.2 - 4.0 (m, 1H); 3.9 - 0.86 (m, 62H)。
【０４７３】
化合物１３
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、トリフルオロ酢酸
【化８７】
2018537425.tif 000111
化合物１３は、化合物１２（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）から、化合物７と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１３を２０％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４７４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；１．５ｍＬ／分、４０℃、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０から９５％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７６Ｎ６Ｏ８、正確な質量８６４．５７）ｍ／ｚ：８６５．６（ＭＨ＋）、６．０５分（９０．９％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.32 - 7.19 (m, 9H); 4.9 - 4.65 (m, 3H); 4.2 - 4.0 (m, 1H); 3.9 - 0.86 (m, 59H)。
【０４７５】
化合物１４
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド、トリフルオロ酢酸
【化８８】
2018537425.tif 000112
【０４７６】
化合物１４Ａ：（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８９】
2018537425.tif 000113
（３−アミノフェニル）メタノール（３ｇ、２４．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＨＦ（６０ｍＬ）に溶かし、その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６．３８ｇ、２９．２３ｍｍｏｌ、１．２０当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、この反応物を２００ｍＬの水を加えて希釈した。生成物を１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した後、有機相を再び合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、粗生成物（１３．８５ｇの化合物１４Ａ）を黄色油状物の形態で得た。
【０４７７】
化合物１４Ｂ：（３−ホルミルフェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化９０】
2018537425.tif 000114
化合物１４Ａ（１３．８ｇ、６１．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＥ（４００ｍＬ）に溶かした後、ＭｎＯ２（５４ｇ、６２１．１４ｍｍｏｌ、１０．０５当量）を加えた。この混合物を周囲温度で３日間、振盪下で放置し、その後、これらの固体を濾去した。濾液を蒸発乾固させ、残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：３０）を用いて精製し、３ｇ（２２％）の化合物１４Ｂを白色固体の形態で得た。
【０４７８】
化合物１４Ｃ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化９１】
2018537425.tif 000115
化合物１４Ｂ（１ｇ、４．５２ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（１．１６ｇ、４．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＥＡ（３ｍＬ）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１．９２ｇ、９．０６ｍｍｏｌ、２．０１当量）の存在下で２０ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、１００ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：５０）を用いて精製し、１．９ｇ（９９％）の化合物１４Ｃを白色固体の形態で得た。
【０４７９】
化合物１４Ｄ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化９２】
2018537425.tif 000116
化合物１４Ｃ（１ｇ、２．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（４００ｍｇ）の存在下で３０ｍＬのＡｃＯＥｔおよび４ｍＬのメタノールに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６８０ｍｇ（８６％）の化合物１４Ｄを白色固体の形態で得た。
【０４８０】
化合物１４Ｅ：（３−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−３，６−ジイソプロピル−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化９３】
2018537425.tif 000117
化合物１４Ｅは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（１０２．２７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０５３ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０４６ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１）を用いて精製し、１００ｍｇ（６７％）の化合物１４Ｅを淡黄色固体の形態で得た。
【０４８１】
化合物１４は、中間体１４Ｅ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器(Detecctor)２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１４を１０％（１０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４８２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；４０℃；１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０％から９５％ＭｅＯＨ）；ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８７５．５）ｍ／ｚ：８７６．５（ＭＨ＋）および４３８．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１１．３５分（９５．６％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.92 - 8.86 (m, 0.4H, NH 不完全交換); 8.70 - 8.54 (m, 0.6H, NH 不完全交換); 7.88 - 7.78 (m, 1H); 7.60 - 7.50 (m, 1H); 7.45 - 6.97 (m, 9H); 5.80 - 5.65 (m, 1H); 4.85 - 4.70 (m, 1H); 4.40 - 0.80 (m, 56H)。
【０４８３】
化合物１５
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル、トリフルオロ酢酸
【化９４】
2018537425.tif 000118
【０４８４】
化合物１５Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化９５】
2018537425.tif 000119
化合物１５Ａは、ＤＣＭ（５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（２００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（２１２．６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．１１０３ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．１５７ｍＬ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１）を用いて精製し、２００ｍｇ（６７％）の化合物１５Ａを黄色固体の形態で得た。
【０４８５】
化合物１５：化合物１５は、中間体１５Ａ（２００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ＵＶ検出器  ２５４５  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１５を１９％（３８．６ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４８６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨ）；ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８５０．５）ｍ／ｚ：８５１．５（ＭＨ＋）および４２６．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．６１分（９１．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.53 - 7.42 (m, 1H); 7.35 - 7.18 (m, 8H); 4.88 - 4.79 (m, 2H); 4.42 - 4.00 (m, 3H); 3.93 - 2.71 (m, 22H); 2.61 - 0.81 (m, 33H)。
【０４８７】
化合物  ２０
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−不フェニル(phnyl)−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド、トリフルオロ酢酸
【化９６】
2018537425.tif 000120
化合物２０は、アミン１ＺＣおよび対応するアルデヒドから化合物１と同様にして製造された。
【０４８８】
化合物２０の製造に関与する４−ニトロベンズアルデヒドは市販品であった。
【０４８９】
化合物２０の合成は、ニトロ基を還元することにより完了した。これは次のように行った：（２Ｓ）−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−［［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］カルバモイル］−１−メトキシ−２−メチルエチル］ピロリジン−１−イル］−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチル−２−［（２Ｓ）−３−メチル−２−［メチル［（４−ニトロフェニル）メチル］アミノ］ブタンアミド］ブタンアミド（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）を１５ｍＬのエタノールに溶かした。二水和塩化スズ（ＩＩ）（３１７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、３０当量）を加え、この溶液を振盪下、周囲温度で３日間放置した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、化合物２０を粗状態で得た（純度：９３．２％；量：２１．６ｍｇ）。
【０４９０】
化合物は、分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、対応するＴＦＡ塩を白色固体の形態で得た。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.6 - 7.5 (m, 1H); 7.4 - 7.15 (m, 5H); 7.1 - 7.05 (m, 2H); 6.73 - 6.70 (m, 2H); 5.8 - 5.55 (m, 1H); 5.0 - 4.7 (m, 2H); 4.25 - 4.05 (m, 1H); 4.0 - 0.8 (m, 54H). LC/MS/UV ESI: (C48H73N7O7S, exact mass 875.53) m/z 876 (MH+), 439 [75 %, (M.2H+)/2]; UV: RT = 4.83 min (96.8 %, 254 nm)。1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.6 - 7.5 (m, 1H); 7.4 - 7.1 (m, 7H); 6.76 - 6.72 (m, 2H); 5.8 - 5.55 (m, 1H); 4.9 - 4.65 (m, 2H); 4.25 - 4.05 (m, 1H); 4.0 - 0.8 (m, 54H)。
【０４９１】
化合物２９
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、トリフルオロ酢酸
【化９７】
2018537425.tif 000121
化合物１５（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）とピペリジンの混合物（２．５ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、２０ｍｇ（２０％）の化合物２９を白色固体の形態で得た。
【０４９２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；４０℃；１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０％から９５％ＭｅＯＨ）；ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３６．５４）ｍ／ｚ：８３７．５（ＭＨ＋）および４１９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１０．６１分（９２．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.38 - 7.15 (m, 6H); 7.00 - 6.99 (m, 3H); 4.85 - 4.68 (m, 2H); 4.37 - 3.38 (m, 11H); 3.31 - 2.70 (m, 8H); 2.60 - 0.82 (m, 35H)。
【０４９３】
化合物６１
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
【化９８】
2018537425.tif 000122
【０４９４】
化合物６１Ａ：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン二塩酸塩
【化９９】
2018537425.tif 000123
化合物１１Ｄ（９６２ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をプロパン−２−オール中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）１０ｍｌに溶かし、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた黄色固体をＥｔ２Ｏ（２×１０ｍｌ）で摩砕した。生成物を真空下で乾燥させ、化合物６１Ａを黄色固体として得た（３２２ｍｇ、４７％）。
【０４９５】
化合物６１：カルボン酸６１Ａ（７３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびアミン１Ｙ（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かした。ＤＩＥＡ（１５８μｌ、０．９０ｍｍｏｌ、４当量）およびＤＥＣＰ（ＤＥＰＣとも呼称）（５１μｌ、０．３４ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、この反応物を室温で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳによる分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物６１を淡黄色固体として得た（８３ｍｇ、４０％）。
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ (回転異性体の存在), 8.86 (d, 0.5H, NHCO); 8.65 (d, 0.5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0.5H, チアゾール), 7.78 (d, 0.5H, チアゾール), 7.65 (d, 0.5H, チアゾール), 7.63 (d, 0.5H, チアゾール), 7.32 - 7.12  (m, 5H), 6.83 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.45 (d, J=8.3 Hz, 2H), 5.56 - 5.49 (m, 0.5 H), 5.42 - 5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.46 (m, 2H), 4.01 - 0.66 (m, 57H)。
【０４９６】
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ；３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．３１分（９６．５％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＥＳＩ＋）８９０．５５５８（２％、ＭＨ＋、Ｃ４９Ｈ７６Ｎ７Ｏ６Ｓ理論値８９０．５５７２）、４４５．７８３４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４９Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ理論値４４５．７８２３）。
【０４９７】
化合物６２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル
【化１００】
2018537425.tif 000124
化合物６２は、カルボン酸６１Ａ（６９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、アミン３Ｄ（１３５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＩＥＡ（７５μｌ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＥＣＰ（４９μｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）を用い、化合物６１と同様にして製造された。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物６２を帯黄色固体として得た（８２ｍｇ、４５％）。
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ (回転異性体の存在), 8.50 (d, J=8.3, 0.5H, NHCO); 8.27 (d, J=8.0, 0.5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27 - 7.13  (m, 5H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.44 (m, 3H), 4.01 - 3.72 (m, 1.5H), 3.66 (s, 1.5H, CO2Me), 3.63 (s, 1.5H, CO2Me), 3.57 - 0.65 (m, 55.5H)。
【０４９８】
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ；３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．２９分（９５．３％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＥＳＩ＋）８６５．５８００（２％、ＭＨ＋、Ｃ４８Ｈ７７Ｎ６Ｏ８理論値８６５．５７９７）、４３３．２９３７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４８Ｈ７８Ｎ６Ｏ８理論値４３３．２９３５）。
【０４９９】
化合物６３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１０１】
2018537425.tif 000125
化合物６２（２３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を水（１ｍｌ）とアセトニトリル（１ｍｌ）の混合物に溶かした。ピペリジン（０．７５ｍｌ）を加え、この混合物を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐカラム  Ｃ１８  ＯＢＤ、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；移動相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１０分で２０％から４０％ＭｅＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；検出器  ＵＶ  Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物６３を白色固体として得た（１４ｍｇ、６６％）。
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ (回転異性体の存在), 12.7 (s(br), 1H, CO2H), 9.58 (m(br), 1H); 9.04 - 8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0.6H, NHCO), 8.15 (d, 0.4H, NHCO), 7.27 - 7.13  (m, 5H), 7.13 - 6.99 (m(br), 2H), 6.90 - 6.64 (s(br), 2H), 4.77 - 3.40 (m, 10H), 3.34 - 2.75 (m, 20H), 2.34 - 1.94 (m, 4H), 1.90 - 0.7 (m, 25H)。
【０５００】
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ；３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮへ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．２４分  （１００％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＥＳＩ＋）８５１．５６４１（６％、ＭＨ＋、Ｃ４７Ｈ７５Ｎ６Ｏ８理論値８５１．５６４１）、４２６．２８５４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４７Ｈ７６Ｎ６Ｏ８理論値４２６．２８５７）。
【０５０１】
実施例１７：薬物の抗増殖活性
方法：
細胞培養    Ａ５４９（非小細胞肺癌−ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳腺癌−ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）細胞をそれぞれ、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）および１０％ＦＣＳを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＣＦ７（乳管癌−ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）細胞およびＳＮ−１２Ｃ（腎臓癌−ＡＴＣＣ）細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＣＦ７細胞の場合にはフェノールレッド不含）で維持した。総ての培地にファンギゾン（１．２５μｇ／ｍＬ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／１００μｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を３７℃のインキュベーターにて、５％ＣＯ２および９５％大気湿度の標準条件下で培養した。
【０５０２】
４つの腫瘍細胞株での抗増殖活性    選択された薬物を、４細胞株の包括的パネルでＡＴＰｌｉｔｅ増殖アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｌｌｅｂｏｎ  ｓｕｒ  Ｙｖｅｔｔｅ、フランス）を用い、それらの抗増殖活性に関して調べた。０日目に、細胞を９６ウェルプレートに、細胞が７２時間の薬物処理期間に対数細胞増殖期に留まることを保証する濃度で播種した（Ａ５４９では１０３細胞／ウェル、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＮ１２Ｃでは２．１０３）。２４時間のインキュベーション期間の後、総ての細胞を供試化合物の希釈系で処理した（１％ＤＭＳＯ中１０倍溶液１１μＬ−６ウェル／条件）。チップ上への化合物の接着を避けるため、２つの連続する希釈の間でチップを交換した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。４日目に、細胞の生存率を、生細胞により放出されるＡＴＰを定量することにより評価した。生細胞の数を溶媒処理細胞の数と比較して分析した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＣＡ、ＵＳＡ）により提供されているアルゴリズムを用いて実行される曲線フィッティング分析（シグモイド用量反応、可変ヒル勾配係数を用いる非線形回帰モデル）で決定した。
【０５０３】
結果：
種々の薬物：
上記の方法に従いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株でのそれらの抗増殖活性を決定するために種々の薬物を試験した。測定された活性はＥＣ５０＜０．１μＭの値を示した。
【０５０４】
上記で例示した薬物の中から選択された少数の下記の例は、それらの十分に顕著な抗増殖活性を示す：
実施例１２：ＥＣ５０＝５．８０×１０−１０Ｍ；実施例１３：ＥＣ５０＝７．９５×１０−８Ｍ；実施例１５：ＥＣ５０＝１．７０×１０−１０Ｍ；実施例２７：ＥＣ５０＝１．２０×１０−１０Ｍ。
【０５０５】
種々の細胞株：
化合物１５を、上記の方法に従い種々の細胞株（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＳＮ１２Ｃ）で試験した。測定された活性は、総ての供試細胞株でＥＣ５０＜０．１μＭの値を示した。
【０５０６】
【表１９】
2018537425.tif 000126
【０５０７】
比較例：
以下の比較例でフェニル環上での置換（アミノ対カルボキシル）を検討したところ、アミノ置換基を含んでなる本発明による薬物の抗増殖活性の向上が示された。
【０５０８】
【表２０】
2018537425.tif 000127
【０５０９】
実施例１８：薬物−リンカー部分の合成
化合物Ｅ−１１
（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）（メチル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１０２】
2018537425.tif 000128
【０５１０】
化合物Ｅ−１１−１：（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸メチル塩酸塩
【化１０３】
2018537425.tif 000129
塩化アセチル（１０ｍＬ）を、０℃で撹拌しながらＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）に滴下した。２０分後、Ｌ−シトルリン（１０ｇ、５７ｍｍｏｌ、１．００当量）を加え、この混合物を一晩還流下で加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、１５ｇ（１１６％）の化合物Ｅ−１１−１を白色固体として得た。この生成物をそれ以上乾燥させずに次の工程で使用した。
【０５１１】
化合物Ｅ−１１−２：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸メチル
【化１０４】
2018537425.tif 000130
化合物Ｅ−１１−１（１３ｇ、５７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で不活性雰囲気下、ＤＭＦ（１４０ｍＬ）に溶かした。ＤＩＥＡ（３０ｍＬ、１７３ｍｍｏｌ、３．０当量）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ−１０．５９ｇ、６９．１ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＢｏｃ−Ｌ−バリンヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ−１８．１ｇ、５７．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩振盪した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を水（１００ｍＬ）に溶かし、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）で２回抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１８．８ｇ（８４％）の化合物Ｅ−１１−２を白色固体として得た。
【０５１２】
化合物Ｅ−１１−３：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸
【化１０５】
2018537425.tif 000131
化合物Ｅ−１１−２（１８．８ｇ、４８．４ｍｍｏｌ、１当量）を０℃でＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶かした。ＮａＯＨ  １Ｍ溶液（７２ｍＬ、７２ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、この混合物を室温で２時間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、残った水溶液をＨＣｌ  １Ｍで酸性化した。水相を蒸発乾固させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１８ｇ（９９％）の化合物Ｅ−１１−３を白色固体として得た。
【０５１３】
化合物Ｅ−１１−４：（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１０６】
2018537425.tif 000132
化合物Ｅ−１１−３（５ｇ、１３．４ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＣＭ（６５ｍｌ）と乾燥ＭｅＯＨ（３５ｍｌ）の混合物に溶かした。（４−アミノフェニル）メタノール（１．８１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ−６．６０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を暗所で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、５．２ｇ（７３％）の化合物Ｅ−１１−４を灰白色固体として得た。
【０５１４】
化合物Ｅ−１１−５：（（Ｓ）−３−メチル−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１０７】
2018537425.tif 000133
化合物Ｅ−１１−４（１．１ｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１当量）を不活性雰囲気下、周囲温度で乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かした。炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．４０ｇ、４．５９ｍｍｏｌ、２当量）、次いで、ＤＩＥＡ（６００μｌ、３．４４ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、得られた黄色溶液を一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１．２７ｇ（８４％）の化合物Ｅ−１１−５を灰白色固体として得た。
【０５１５】
化合物Ｅ−１１−６：４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）（メチル）カルバミン酸メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１０８】
2018537425.tif 000134
カーボネートＥ−１１−５（１１４ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、１．２当量）およびアニリン１１Ｆ（１５０ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かした。ＨＯＢｔ（３８ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＥＡ（５４μＬ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を週末にわたって室温で撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣を、ＤＣＭで溶出するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により再精製した。選択された画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１１−６を白色固体として得た（８９ｍｇ、３９％）。
【０５１６】
化合物Ｅ−１１：
【化１０９】
2018537425.tif 000135
化合物Ｅ−１１−６（２１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（０．２５ｍＬ）に溶かし、ＴＦＡ（４０μＬ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、その後、ＬＣ−ＭＳ分析は出発材料の完全な消費を示した。この混合物を短時間冷却（液体窒素浴）すると同時にＤＭＦ（０．５ｍＬ）、次いで、ＤＩＥＡ（１００μＬ）を加えてＴＦＡを中和した。その後、冷却浴を外し、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物を室温で４８時間撹拌し、生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１１を白色固体として得た（１１ｍｇ、５４％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１５２４．８２８２（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７９Ｈ１１５Ｎ１３ＮａＯ１４Ｓ理論値１５２４．８２９９）、７５１．９２８３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７９Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１４Ｓ理論値７５１．９２７６）。
【０５１７】
化合物Ｅ−１２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１１０】
2018537425.tif 000136
【０５１８】
化合物Ｅ−１２−１：（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１１１】
2018537425.tif 000137
化合物Ｅ−１１−４（６７０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で不活性雰囲気下、乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）に溶かした。炭酸ビス（ペルフルオロフェニル）（９９１ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ、２当量）、次いで、ＤＩＥＡ（３２９μｌ、１．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、得られた無色の溶液を室温で３０分間撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、８３６ｍｇ（９６％）の化合物Ｅ−１２−１を灰白色固体として得た。
【０５１９】
化合物Ｅ−１２−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１１２】
2018537425.tif 000138
アニリン１２（１６５ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ、１．０当量）を０℃で不活性雰囲気下、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かした。カーボネートＥ−１２−１（１９４ｍｇ、０．２８２ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＯＢｔ（５１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＥＡ（６６μＬ、０．３７５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を室温で８時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ１２−７を白色固体として得た（２４７ｍｇ、７７％）。
【０５２０】
化合物Ｅ−１２−３：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）  カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１１３】
2018537425.tif 000139
化合物Ｅ−１２−２（５．６ｍｇ、４．０４μｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（１００μＬ）に溶かした。５分後、２ｍｌの水を加え、この混合物を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１２−３を灰白色固体として得た（５．６ｍｇ、９８％）。
【０５２１】
化合物Ｅ−１２：
【化１１４】
2018537425.tif 000140
化合物Ｅ−１２−３（５．６ｍｇ、４μｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（５μＬ、７当量）、次いで、６−（２,５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．５ｍｇ、８μｍｏｌ、２当量）を加えた。この混合物を室温で６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより反応を管理した後、２００μｌの水を加え、得られた溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１２を白色固体として得た（４．６ｍｇ、７０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）７３９．４３８９（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７８Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１６理論値７３９．４３８９）。
【０５２２】
化合物Ｅ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１１５】
2018537425.tif 000141
【０５２３】
化合物Ｅ−１３−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン
【化１１６】
2018537425.tif 000142
化合物Ｅ−１２−２（１８５ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を室温で水（５ｍＬ）とアセトニトリル（５ｍＬ）の混合物に溶かした。ピペリジン（３．６７ｍＬ、３００当量）を加え、この混合物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をＥｔ２Ｏ（６０ｍＬ）で摩砕した。この固体をＥｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で２回すすぎ、真空下で乾燥させ、化合物Ｅ−１３−１を灰白色固体として得た（１７５ｍｇ、９５％）。
【０５２４】
化合物Ｅ−１３−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１１７】
2018537425.tif 000143
化合物Ｅ−１３−１（１７５ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（１ｍＬ）およびアセトニトリル（１ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１３−２を灰白色固体として得た（１８０ｍｇ、８７％）。
【０５２５】
化合物Ｅ−１３：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）  ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン，２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１１８】
2018537425.tif 000144
化合物Ｅ−１３−２（８０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）とＤＭＦ（０．４ｍＬ）の混合物に溶かした。ＤＩＥＡ（５０μＬ、０．２８９ｍｍｏｌ、５当量）、次いで、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３６ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。この混合物を室温で３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより反応を管理した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１３を白色固体として得た（３２ｍｇ、３５％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ−）１４６１．８３３６（１００％、（Ｍ−Ｈ）−、Ｃ７７Ｈ１１３Ｎ１２Ｏ１６理論値１４６１．８４０３）。ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１４６３．８５６５（２％、ＭＨ＋、Ｃ７７Ｈ１１５Ｎ１２Ｏ１６理論値１４６３．８５４９）、７３２．４３１７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７７Ｈ１１６Ｎ１２Ｏ１６理論値７３２．４３１１）。
【０５２６】
化合物Ｅ−１５
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１１９】
2018537425.tif 000145
【０５２７】
化合物Ｅ−１５−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１２０】
2018537425.tif 000146
化合物Ｅ−１５−１は、ＤＭＦ（２ｍＬ）中、カーボネートＥ−１１−５（２８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）、アニリン１５（４２ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、０．５当量）、およびＤＩＥＡ（１５μＬ、０．０８７ｍｍｏｌ、２当量）を用い、化合物Ｅ−１１−６と同じ方法に従って製造された。化合物Ｅ−１５−１を白色固体として単離した（８．２ｍｇ、１３％）。
【０５２８】
化合物Ｅ−１５−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１２１】
2018537425.tif 000147
化合物Ｅ−１５−１（８．２ｍｇ、５．５８μｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（１ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１５−８を白色固体として得た（７．６ｍｇ、９９％）。
【０５２９】
化合物Ｅ−１５：
【化１２２】
2018537425.tif 000148
化合物Ｅ−１５は、アセトニトリル（０．５ｍＬ）中、アミンＥ−１５−２（７．６ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、１当量）、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ、５当量）を用い、化合物Ｅ−１２と同じ方法に従って製造された。化合物Ｅ−１５を白色固体として単離した（４．２ｍｇ、４８％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１４７１．８１６９（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７６Ｈ１１２Ｎ１２ＮａＯ１６理論値１４７１．８２１１）、７２５．４２２３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７６Ｈ１１４Ｎ１２Ｏ１６理論値７２５．４２３２）、４８３．９４８２（１０％、（ＭＨ３）３＋、Ｃ７６Ｈ１１５Ｎ１２Ｏ１６理論値４８３．９５１３）。
【０５３０】
化合物Ｆ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１２３】
2018537425.tif 000149
【０５３１】
化合物Ｆ−１３−１：Ｎ−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１２４】
2018537425.tif 000150
化合物１１Ｃ（２５０ｍｇ、０．５６７ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かした後、ＮａＨ（鉱油中６０％懸濁液、６８ｍｇ、１．７０２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この混合物を５分間撹拌した後、ヨードメタン（１０６μＬ、１．７０２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この反応物を室温で２時間撹拌した後、水で急冷し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とで分離した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、化合物Ｆ−１３−１を黄色油状物として得（２５０ｍｇ、９７％）、これをそれ以上精製せずに用いた。
【０５３２】
化合物Ｆ−１３−２：Ｎ−メチル−Ｎ−（４−（メチルアミノ）フェネチル）−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１２５】
2018537425.tif 000151
Ｂｏｃ保護アニリンＦ−１３−１（２５０ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶かした後、ｉＰｒＯＨ中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）１ｍＬを加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。得られた黄色油状物をＥｔ２Ｏで摩砕し、化合物Ｆ−１３−２を黄色固体として得た（２０２ｍｇ、９４％）。
【０５３３】
化合物Ｆ−１３−３：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１２６】
2018537425.tif 000152
酸Ｅ−１１−３（１９０ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶かした後、ＤＩＥＡ（１１８μＬ、０．６７７ｍｍｏｌ、２当量）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ−２６４ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、１．５当量）およびアニリンＦ−１３−２（１２０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−３を白色固体として得た（１４０ｍｇ、４５％）。
【０５３４】
化合物Ｆ−１３−４：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
【化１２７】
2018537425.tif 000153
化合物Ｆ−１３−３（１１６ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ１０％（３０ｍｇ）の存在下でＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶かし、周囲温度および大気圧下で２時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１１０ｍｇ（９９％）の化合物Ｆ−１３−４をベージュの固体として得た。
【０５３５】
化合物Ｆ−１３−５：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１２８】
2018537425.tif 000154
アミン３Ｄ（８９ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ、１当量）および酸Ｆ−１３−４（１４５ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かし、ＰｙＢＯＰ（１０９ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（７３μＬ、０．４２０ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌し、溶媒を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃと水とで分離し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−５を白色固体として得た（１４０ｍｇ、７３％）。
【０５３６】
化合物Ｆ−１３−６：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１２９】
2018537425.tif 000155
化合物Ｆ−１３−５（１４０ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ、１当量）を水（４ｍＬ）、アセトニトリル（４ｍＬ）およびピペリジン（２ｍＬ）の混合物に溶かし、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−６を白色固体として得た（１１５ｍｇ、８３％）。
【０５３７】
化合物Ｆ−１３：
【化１３０】
2018537425.tif 000156
化合物Ｆ−１３は、化合物Ｅ−１１と同じ方法に従い、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）およびＴＦＡ（１００μＬ、３０当量）中、Ｂｏｃ保護アミンＦ−１３−６（５５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１．０当量）を用い、次いで、ＤＭＦ（１ｍＬ）で希釈し、ＤＩＥＡ（３２０μＬ、４５当量）で急冷した後、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１５ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、１．２当量）と反応させて製造された。分取ＨＰＬＣによる精製および凍結乾燥の後に、化合物Ｆ−１３を白色固体として得た（１４ｍｇ、２４％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３１４．８０６７（２％、ＭＨ＋、Ｃ６９Ｈ１０８Ｎ１１Ｏ１４理論値１３１４．８０７２）、６５７．９０６７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６９Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１４理論値６５７．９０７２）。
【０５３８】
化合物Ｆ−６１
Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１３１】
2018537425.tif 000157
【０５３９】
化合物Ｆ−６１−１：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル二塩酸塩
【化１３２】
2018537425.tif 000158
化合物１１Ｃ（１．０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ、１当量）をｉＰｒＯＨ中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）８ｍＬに溶かした。この混合物を室温で２時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）で２回摩砕し、真空下で乾燥させ、化合物Ｆ−６１−１を白色固体として得た（９１６ｍｇ、９８％）。
【０５４０】
化合物Ｆ−６１−２：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１３３】
2018537425.tif 000159
酸Ｅ−１１−３（７６９ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２．５ｍｌ）に溶かした後、ＤＩＥＡ（９５７μＬ、５．４８ｍｍｏｌ、４当量）およびＰｙＢＯＰ（１．０７ｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。アニリンＦ−６１−１（５６６ｍｇ、１．３６９ｍｍｏｌ、１当量）を加え、この混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、９６９ｍｇ（１０２％）の化合物Ｆ−６１−２を白色固体として得た。
【０５４１】
化合物Ｆ−６１−３：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
【化１３４】
2018537425.tif 000160
化合物Ｆ−６１−２（９６９ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ１０％（２７０ｍｇ）の存在下でＭｅＯＨ（２０ｍｌ）に溶かし、周囲温度および大気圧下で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ）で精製し、５２０ｍｇ（６７％）の化合物Ｆ−６１−３を白色固体として得た。
【０５４２】
化合物Ｆ−６１−４：（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１３５】
2018537425.tif 000161
酸Ｆ−６１−３（６７．５ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＤＥＣＰ（１７μＬ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．５当量）に溶かし、ＤＩＥＡ（３９μＬ、０．２２３ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。室温で１５分間撹拌した後、アミン１Ｙ（５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ、１当量）を加え、この溶液を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ６１−４を白色固体として得た（２８ｍｇ、２８％）
【０５４３】
化合物Ｆ−６１−５：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１３６】
2018537425.tif 000162
化合物Ｆ−６１−４（２８ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６１−５を無色の油状物として得た（３８ｍｇ、１３４％）。
【０５４４】
化合物Ｆ−６１：
【化１３７】
2018537425.tif 000163
化合物Ｆ−６１−５（２８．３ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）、次いで、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（９ｍｇ、０．０２９μｍｏｌ、１．４当量）およびＤＩＥＡ（２５μＬ、０．１４３ｍｍｏｌ、７当量）に溶かした。この混合物を４．５時間撹拌し、その後、ＨＰＬＣ分析は出発材料が存在するが、スクシンイミドは完全に消費されていたことを示した。従って、補助的に６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３ｍｇ、０．０１μｍｏｌ、０．５当量）を加え、この反応物を１．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は出発材料の完全な消費を示した。溶媒を蒸発させて乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（８０／２０）の混合物で２回摩砕し、化合物Ｆ−６１を灰白色固体として得た（１９．４ｍｇ、７０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３６１．７７２５（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７０Ｈ１０６Ｎ１２ＮａＯ１２Ｓ理論値１３６１．７６６６）、６７０．３９６１（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７０Ｈ１０８Ｎ１２Ｏ１２Ｓ理論値６７０．３９６０）。
【０５４５】
化合物Ｆ−６２：
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１３８】
2018537425.tif 000164
【０５４６】
化合物Ｆ−６２−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１３９】
2018537425.tif 000165
化合物Ｆ−６２−１は、ＤＭＦ（２ｍＬ）中、アミン３Ｄ（１００ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ、０．９当量）、酸Ｆ−６１−３（１０８ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＥＣＰ（４１μＬ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（９３μＬ、０．５３４ｍｍｏｌ、３当量）から、化合物Ｆ−６１−４と同様にして製造された。分取ＨＰＬＣによる精製の後、化合物Ｆ−６２−１を白色固体として得た（９３ｍｇ、３９％）。
【０５４７】
化合物Ｆ−６２−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１４０】
2018537425.tif 000166
化合物Ｆ−６２−１（３５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。１０分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６２−２を白色固体として得た（３４ｍｇ、１０５％）。
【０５４８】
化合物Ｆ−６２：
【化１４１】
2018537425.tif 000167
アミンＦ−６２−２（３４ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶かした。ＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ、５当量）および６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．２当量）を加えた。ＨＰＬＣ分析は出発材料の完全な消費を示した。溶媒を蒸発させて乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（８０／２０）の混合物で摩砕した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６２を白色固体として得た（５．５ｍｇ、１３％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３３６．７８５９（２％、ＭＮａ＋、Ｃ６９Ｈ１０７Ｎ１１ＮａＯ１４理論値１３３６．７８９１）、６５７．９０７３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６９Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１４理論値６５７．９０７２）。
【０５４９】
化合物Ｆ−６３：
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１４２】
2018537425.tif 000168
【０５５０】
化合物Ｆ−６３−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン
【化１４３】
2018537425.tif 000169
化合物Ｆ−６２−１（１５７ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ、１当量）を水（４．５ｍＬ）、アセトニトリル（４．５ｍＬ）およびピペリジン（３．５ｍＬ）の混合物に溶かし、室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＥｔ２Ｏ（６０ｍＬ）で摩砕した。固体を濾取し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で２回すすぎ、化合物Ｆ−６３−１を灰白色固体として得た（１５３ｍｇ、１００％）。
【０５５１】
化合物Ｆ−６３−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ビス２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１４４】
2018537425.tif 000170
化合物Ｆ−６３−１（１５３ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。１０分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６３−２を白色固体として得た（３４ｍｇ、１０５％）。
【０５５２】
化合物Ｆ−６３：
【化１４５】
2018537425.tif 000171
アミンＦ−６３−２（１００ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（２ｍＬ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合物に溶かし、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４５ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１．８当量）およびＤＩＥＡ（７１μＬ、０．４０９ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。室温で４．５時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、その後、化合物Ｆ−６３を白色固体として得た（４２ｍｇ、３６％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３００．７９０１（２％、ＭＨ＋、Ｃ６８Ｈ１０６Ｎ１１Ｏ１４理論値１３００．７９１５）、６５０．８９９０（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６８Ｈ１０７Ｎ１１Ｏ１４理論値６５０．８９９４）。
【０５５３】
化合物Ｇ−１２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１４６】
2018537425.tif 000172
【０５５４】
化合物Ｇ−１２−１：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸二塩酸塩
【化１４７】
2018537425.tif 000173
塩化オキサリル（３ｍＬ）に６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（２００ｍｇ、０．９４７ｍｍｏｌ、１当量）を溶かした。この溶液を室温で５時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。化合物Ｇ−１２−１をベージュの固体として得（２１７ｍｇ、１００％）、精製せずに次の工程で用いた。
【０５５５】
化合物Ｇ−１２：
【化１４８】
2018537425.tif 000174
アニリン１２（４０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（８μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。３０分間撹拌した後、乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（１０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ（２５ｍｌ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で２回、ブライン（１０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗生成物を淡褐色固体として得た（５４ｍｇ）。これをシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）、次いで、分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。単離された生成物を凍結乾燥させ、白色固体を得（２３ｍｇ）、これを分取ＨＰＬＣにより再精製し、選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ−１２を白色固体として得た（９ｍｇ、１６％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１０９４．６５４３（２０％、ＭＮａ＋、Ｃ５９Ｈ８９Ｎ７ＮａＯ１１理論値１０９４．６５１２）、１０７２．６７２２（１６％、ＭＨ＋、Ｃ５９Ｈ９０Ｎ７Ｏ１１理論値１０７２．６６９３）、５３６．８３５８（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５９Ｈ９１Ｎ７Ｏ１１理論値５３６．８３８３）。
【０５５６】
化合物Ｇ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１４９】
2018537425.tif 000175
アニリン１３（１５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（８μＬ、０．０４６ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。乾燥ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（３．５ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ−１３を白色固体として得た（１１．４ｍｇ、６２％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１０５８．６５１０（３０％、ＭＨ＋、Ｃ５８Ｈ８８Ｎ７Ｏ１１理論値１０５８．６５３６）、５２９．８２８５（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５８Ｈ８９Ｎ７Ｏ１１理論値５２９．８３０５）。
【０５５７】
化合物Ｇ−１５
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１５０】
2018537425.tif 000176
アニリン１５（４０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（１０μＬ、０．０５６ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（１０８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ、１０当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１．５時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈し、水（５ｍＬ）で２回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗生成物をベージュの固体として得た。これを分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ１５を白色固体として得た（２７ｍｇ、５０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１０６６．６５１７（２％、ＭＮａ＋、Ｃ５７Ｈ８５Ｎ７ＮａＯ１１理論値１０６６．６１９９）、５２２．８２２４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５７Ｈ８７Ｎ７Ｏ１１理論値５２２．８２２６）。
【０５５８】
実施例１９：ＡＤＣの合成、精製および特性決定
下記の手順はキメラおよびヒト化ＩｇＧ１形態に当てはまる。ＩｇＧ２、ＩｇＧ４などの他の形態については、当業者(the person skilled n the art)ならば一般知識を用いてこの手順を適合させる(adapatting)ことができると理解されなければならない。
【０５５９】
第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃にて２時間、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファー  ｐＨ８．４中、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で部分的に還元した。一般に、それぞれ４前後の薬物−抗体比（ＤＡＲ）を目標とするために２．５〜３ｍｏｌ当量のＴＣＥＰを使用した。部分的抗体還元は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。遊離した鎖内システイン残基へのリンカー−薬物のカップリングの前に、還元混合物を室温まで放冷した。次に、抗体濃度を１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファー  ｐＨ８．４で１ｍｇ／ｍｌに調整し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭ溶液から、抗体に対して５モル過剰の薬物を加えた。カップリング中に水性媒体での薬物の溶解度を維持するために、最終ＤＭＳＯ濃度は１０％に調整した。反応は室温で１時間行った。薬物過剰分は、薬物１モル当たり１．５モルのＮ−アセチルシステインを加えて室温で１時間インキュベートすることによって急冷した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  Ｈｉｓバッファー  ｐＨ６．５に対して４℃で一晩透析した後、抗体−薬物複合体を、市販のクロマトグラフィーカラムおよび限外濾過装置に基づく当業者に公知の方法を使用することにより精製した。まず、非結合薬物とＡＤＣ凝集物をＳ２００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により除去した。次に、精製されたＡＤＣモノマーを３０または５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ濾過装置での限外濾過またはプロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーにより２〜３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。精製されたＡＤＣを０．２μｍフィルターで濾過除菌した後に４℃で保存した。それらをさらに、薬物コンジュゲーションを確認するために還元条件および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、また、モノマーおよび凝集形態の含量を決定するために分析的Ｓ２００またはＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラムでのＳＥＣにより分析した。タンパク質濃度は、標品としてＩｇＧを用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用することにより決定した。ＤＡＲは各精製ＡＤＣに関してＨＩＣおよびＬＣ−ＭＳにより評価した。一般に、凝集形態の含量は５％未満であり、ＤＡＲは３．５〜５の間に含まれる。
【０５６０】
実施例２０：種々の薬物とカップリングされたＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞傷害性評価
２０．１  ＭＣＦ−７細胞におけるキメラ型の第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の評価
５つの第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体は急速にリソソームへ内部移行されること、および酸性環境になると低結合能を有することが示された。この点で、これらの第２の (secondf)ＩＧＦ−１Ｒ  ＡｂはＡＤＣとして使用されるべき総ての特性を備えていた。従って、これら５つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を３つの異なる化合物（Ｇ−１３；Ｅ−１３およびＦ−６３）とカップリングさせた。これらのＡＤＣの薬物抗体比は約４であった。非特異的細胞傷害性を評価するために、無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４も同じＤＡＲでこれらの化合物とカップリングさせた。ＭＣＦ−７細胞を完全培養培地で、３７℃にて６日間、漸増濃度の各ＡＤＣとともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルは、Ｍｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。Ｅ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４は、ＭＣＦ−７細胞で細胞傷害活性を全く示さなかったかまたは低活性であった（図２６）。これに対して、第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体をＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた後に得られた他の総てのＡＤＣを加えると、ＭＣＦ−７細胞の生存率は劇的に低下した。
【０５６１】
２０．２  正常細胞でのキメラ第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の評価
ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを、ｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂを用い、正常細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ）で評価した。この目的で、細胞（０．５×１０６細胞／ｍｌ）を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのｃ２０８Ｆ２抗体とともにインキュベートした。次に、それらを３回洗浄し、暗所にて４℃でさらに２０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８をカップリングさせた適当な二次抗体とともにインキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。発現レベル（Ｂｍａｘ）は、ＭＣＦ−７細胞でのＩＧＦ−１Ｒ発現（実施例５、表９参照）に比べて正常細胞では低かった（表１５）。
【０５６２】
【表２１】
2018537425.tif 000177
【０５６３】
ＡＤＣ  ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３の細胞傷害性を正常細胞で評価した。これらの細胞を、完全培養培地中、３７℃にて６日間、漸増濃度のｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３とともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルは、Ｍｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。ＨＢＳＭＣ、ＨＰＭＥＣ、ＨＡｏＥＣおよびＨＲＥｐＣでは、主要な細胞傷害性は全く見られなかった（図３０）。ＨＵＣでは、高濃度のｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３でのみ若干の細胞毒性が測定された。
【０５６４】
２０．３  ｈｚ２０８Ｆ２のヒト化変異体の評価
２０８Ｆ２の１６のヒト化変異体を化合物Ｇ−１３とカップリングさせた。これらのＡＤＣの薬物抗体比は約４であった。非特異的細胞傷害性を評価するために、無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４も同じＤＡＲでこれらの化合物とカップリングさせた。キメラ抗体ｃ２０８Ｆ２もＧ−１３とカップリングさせた。ＭＣＦ−７細胞を完全培養培地で、３７℃にて６日間、漸増濃度の各ＡＤＣとともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルは、Ｍｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。Ｇ−１３とカップリングさせた無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４は、ＭＣＦ−７細胞で細胞傷害活性を全く示さなかったかまたは低活性であった（図２６）。これに対して、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＧ−１３とカップリングさせた後に得られた他の総てのＡＤＣを加えると、ＭＣＦ−７細胞の生存率は劇的に低下した。１６のヒト化変異体の細胞傷害性誘導能は、表１６に示され、また図３１に１つのヒト化変異体で例示されるように、キメラ型ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３で測定されたものと少なくとも同等か、より良好でさえあった。
【０５６５】
【表２２】
2018537425.tif 000178
【０５６６】
実施例２１：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３化合物のいずれかとコンジュゲートされたｃ２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
Ｇ−１３、Ｅ−１３またはＦ−６３化合物とカップリングされたｃ２０８Ｆ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性がｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳可能であったことを確認するために、それらがＭＣＦ−７異種移植モデルで試験された。
【０５６７】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注射前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
【０５６８】
ＭＣＦ−７細胞移植の２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を５個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｅ−１３、Ｆ−１３またはＦ−６３のいずれかと約ＤＡＲ４でカップリングされたｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂの抗腫瘍活性は、Ｄ２０およびＤ２７に７ｍｇ／ｋｇ用量の２回の注射の後に評価した（図２７Ａ、２７Ｂおよび２７Ｃ）。並行して、キャップされた薬物部分Ｅ−１３、Ｆ−１３およびＦ−６３を、７ｍｇ／ｋｇのｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３、ｃ２０８Ｆ２−Ｆ−１３およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３  ＤＡＲ約４に相当するものと同等の用量で注射した。
【０５６９】
ｃ２０８−Ｅ−１３（図２２Ａ）、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２７Ｂ）またはｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３（図２７Ｃ）のいずれかの注射は、腫瘍成長を有意に阻害し、完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえした（対応するキャップ薬物に対してｐ＜０．０５）。ｃ２０８−Ｅ−１３、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３の間に統計的な活性の違いは認めることができなかった。キャップ薬物はＭＣＦ−７腫瘍の成長に影響を及ぼさなかった（対照群に対してｐ＞０．０５）。
【０５７０】
従前に記載したＭＣＦ−７異種移植モデルにおいて、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされたｃ２０８Ｆ２およびＥ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされた無関連抗体ｃ９Ｇ４を用いて第２の試験セットを実施した。Ｄ２０およびＤ２７に、マウスに７ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣをｉ．ｐ．注射した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。
【０５７１】
ｃ９Ｇ４−Ｅ−１３とｃ９Ｇ４−Ｆ−１３の注射はいずれも、ＭＣＦ−７異種移植腫瘍の成長にあまり大きくない一時的な影響を及ぼすだけであった。しかしながら、この第２の試験により、Ｄ４３にこれらのＡＤＣの高い抗腫瘍活性が示されたことから、ｃ２０８−Ｅ−１３またはｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３のいずれの注射も完全な腫瘍退縮を誘導したことが確認された。
【０５７２】
実施例２２：３＋ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＧ−１３化合物とコンジュゲートされたｈｚ２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
Ｇ−１３化合物とカップリングされた２０８Ｆ２のヒト化型をＭＣＦ−７異種移植モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。
【０５７３】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注射前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
【０５７４】
ＭＣＦ−７細胞移植の２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を６個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により、４日ごとに１回の４回注射のプロトコール（Ｑ４ｄ４）として接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｇ−１３化合物とカップリングされたｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂの抗腫瘍活性は、これもまたＧ−１３とカップリングされた種々のヒト化型と同等であった（図３２）。供試したヒト化型を下表１７に記載した。
【０５７５】
【表２３】
2018537425.tif 000179
【０５７６】
ｃ２０８−Ｇ−１３または２０８Ｆ２ヒト化型いずれかの注射は、腫瘍成長を有意に阻害し、完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえした（対応する対照に対してｐ＜０．０５）。ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３と供試したヒト化型の間に統計学的な活性の差異は見られなかった。
【０５７７】
従前に記載したＭＣＦ−７異種移植モデルにおいて、Ｇ−１３とカップリングされたｃ２０８Ｆ２またはｈｚ２０８Ｆ２−４のいずれかを用いて第２の試験セットを実施した。Ｄ２０およびＤ２７に、マウスに７ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣをｉ．ｐ．注射した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。マウスに各ＡＤＣ３ｍｇ／ｋｇを、４日ごとの４回の注射（Ｑ４ｄ４）でまたは１回のみｉ．ｐ．注射した。
【０５７８】
ＭＣＦ異種移植モデルにおいてＡＤＣを４回または１回のみ注射した場合、同等の強い抗腫瘍活性が見られた。
【０５７９】
実施例２３：２＋ＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるＧ−１３またはＥ−１３化合物とコンジュゲートされた２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０５８０】
また、２＋発現腫瘍としての、卵巣癌細胞株であるＣａＯＶ−３異種移植モデルでも抗腫瘍活性を検討した。この目的で、Ｄ０においてマウスに７×１０６細胞を皮下注射した。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注射１９日後）、動物を同等の腫瘍サイズを有する５個体の５群に分け、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされたｃ２０８Ｆ２およびＥ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされた無関連の抗体ｃ９Ｇ４を用いて腹腔内処置した。マウスに各ＡＤＣ  ３ｍｇ／ｋｇを４日ごとに１回の６回注射のサイクルで腹腔内注射した。このマウスに異種移植片成長速度の観察を行った。腫瘍体積は式：π／６×長さ×幅×高さで計算した。
【０５８１】
成長の減速をあまり大きくなく、一時的に誘導したｃ９Ｇ４−Ｅ−１３に比べて、ｃ９Ｇ４−Ｇ−１３の注射は、ＣａＯＶ−３異種移植腫瘍の成長に影響を及ぼさなかった。その一方、ｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３またはｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３いずれかの注射は、５０日目にそれぞれ９５％および７７％の腫瘍成長阻害を誘導した（図３４Ａおよび３４Ｂ）。
【０５８２】
実施例２４：第１のＩＧＦ−１Ｒ抗体の（８１０Ｄ１２または８１６Ｃ１２）と第２のＩＧＦ−１Ｒ抗体（２０８Ｆ２）の間の結合競合の評価
本試験の目的は、マウスモノクローナル抗体ｍ８１０Ｄ１２およびｍ８１６Ｃ１２の両方が可溶型のｈ−ＩＧＦ１Ｒの、ヒト化抗体２０８Ｆ２（変異体Ｈｚ２０８Ｆ２−４）の結合部位とはかけ離れた領域に結合するかどうかを定義することである。
【０５８３】
本試験は、表面プラズモン共鳴技術に基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置で行った。ＣＭ５センサーチップを、アミンカップリング化学を用いてカルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的結合させたマウス抗ポリヒスチジンＩｇＧ１モノクローナル抗体で活性化させた。一般に、１２４５１ＲＵおよび１２２５７ＲＵの抗体をそれぞれフローセル１（ＦＣ１）およびフローセル２（ＦＣ２）にグラフトした。従来のＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーをランニングバッファーとして使用した。このバッファーをタンパク質溶液の作製にも使用した。試験は２５℃、流速１０μｌ／分で行った。
【０５８４】
自家製の可溶型ＩＧＦ１Ｒは、２本のα鎖と、Ｃ末端が６ヒスチジン配列で終わるβ鎖の２つの細胞外ドメインにより構成されるヘテロ四量体である。このタンパク質は、ＦＣ２に３０μｇ／ｍｌ（約８０ｎＭ）の濃度で１分間注入される。抗体は５０μｇ／ｍｌ（約３３０ｎＭ）の濃度で注入される。第１の抗体溶液（図３５Ｂおよび３５Ｄ）またはランニングバッファー（図３５Ａおよび３５Ｃ）を両フローセルに９０秒注入する。次に、第２の抗体溶液を両フローセルに注入する。第１の抗体の結合の後に第２の抗体の結合が無いことが、両抗体がその抗原上の近い位置に結合するという証明となる（図３５Ｂ）。反対に、第１の抗体の結合の後に第２の抗体の結合があれば、第２の抗体の結合部位が第１の抗体の結合部位とかけ離れているという証明となる（図３５Ｄ）。各サイクルの終了時に、センサーチップ表面を、グリシン、ＨＣｌ  １０ｍＭ  ｐＨ１．５バッファーを３０秒間注入することにより再生する。
【０５８５】
Ａｃ１不含時（図３５Ａおよび３５Ｂ）または含有時（図３５Ｃおよび３５Ｄ）のＡｃ２の結合レベル（矢印）は注射の終了２０秒後に記録した。これらのデータを図３６のヒストグラムグラフに表す。
【０５８６】
Ａｃ１として使用される場合、ｚ２０８Ｆ２−４は、それ自体の結合を完全に遮断するが、両マウスモノクローナル抗体（ｍ８１０Ｄ１２およびｍ８１６Ｃ１２）の結合に対して事実上全く効果を持たない（これら３つの抗体をＡｃ２として使用する場合）。
【０５８７】
結論：  各マウスモノクローナルｍ８１０Ｄ１２およびｍ８１６Ｃ１２の結合部位は、Ｈｚ２０８Ｆ２−４抗体の結合部位から、Ｈｚ２０８Ｆ２−４抗体と結合したｈ−ＩＧＦ１Ｒ上に各マウスモノクローナル抗体の結合を可能とするに十分にかけ離れている。
【０５８８】
実施例２５：２＋ＮＣＩ−Ｈ２１２２異種移植モデルにおけるＧ−１３化合物とコンジュゲートされた２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０５８９】
また、第２の２＋発現腫瘍としての、非小細胞肺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２１２２異種移植モデルでも抗腫瘍活性を検討した。この目的で、Ｄ０においてマウスに７×１０６細胞を皮下注射した。腫瘍がおよそ１７０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注射１３日後）、動物を同等の腫瘍サイズを有する６個体の３群に分け、Ｇ−１３とカップリングされたｃ２０８Ｆ２を用いて腹腔内処置した。マウスに５または１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣを７日ごとに１回の４回注射のサイクルでｉ．ｐ．注射した。このマウスに異種移植片成長速度の観察を行った。腫瘍体積は式：π／６×長さ×幅×高さで計算した。
【０５９０】
２０８Ｆ２−Ｇ−１３の注射は、３０日を超えて不活発な腫瘍成長を誘導するに過ぎなかった（図３７）。
【０５９１】
実施例２６：３＋ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＧ−１３化合物とコンジュゲートされたｈｚ２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性およびｅｘ  ｖｉｖｏ分析（ｍ８１０Ｄ１２またはｍ８１６Ｃ１２のいずれかを用いた増殖および標的拘束）
Ｇ−１３化合物とカップリングされたヒト化型２０８Ｆ２を、その活性および標的拘束をバリデートするために、ＭＣＦ−７異種移植モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ評価した。
【０５９２】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注射前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
【０５９３】
ＭＣＦ−７細胞移植２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、動物をｉ）抗腫瘍活性を追跡するために、腫瘍サイズおよび外観に従ってマウス６個体の２群、およびｉｉ）ＩＨＣ試験のためにマウス３個体の１５群（Ｔ０として１群、および対照および２０８Ｆ２−Ｇ−１３として２×７群基）に分けた。種々の処置を２０８Ｆ２−Ｇ−１３では３ｍｇ／ｋｇで、単回注射プロトコールとしての腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。ＩＨＣ分析のための腫瘍の摘出は、Ｔ０（無作為化当日、化合物注射の前に相当）に行い、次に、２０８Ｆ２−Ｇ−１３および対照の各ロットの３腫瘍を、注射後６時間、４日、７日、１４日、および２６日に取り出した。腫瘍をホルモール固定し、パラフィン包埋した後、増殖を追跡するためにはＫｉ６７抗体を、また、ＩＧＦ−１Ｒ発現を追跡するためにはｍ８１０Ｄ１２またはｍ８１６Ｃ１２を用いて染色した。
【０５９４】
ＩＧＦ−１Ｒ発現および増殖のいずれかに対する腫瘍成長の影響を確認するために、Ｔ０から無作為化１４日後まで対照群におけるＩＧＦ−１ＲおよびＫｉ６７発現を確認した。試験時間によらず、ＩＧＦ−１ＲおよびＫｉ６７染色レベルは腫瘍中で安定を維持した（図３８）。ＩＧＦ−１Ｒは、Ｔ０から無作為化１４日後までスコア３＋とされ、増殖指数（Ｋｉ６７）は＞８０％であった。
【０５９５】
次に、２０８Ｆ２−Ｇ−１３の単回注射後に腫瘍を分析した（図３９）。マウスで見られた腫瘍成長阻害は、腫瘍におけるＫｉ６７発現の強い低下により、Ｔ０の８３％から単回注射２６日後の１３％まで損なった(traduced)（図３９パネルＡ）。ｍ８１６Ｃ１２またはｍ８１０Ｄ１２のいずれかを用いた２０８Ｆ２−Ｇ−１３の単回注射の２６日後にＩＧＦ−１Ｒ発現を追跡した（図３９Ｂ）。４日後、２６日まで、腫瘍のＩＧＦ−１Ｒレベルは劇的に低下し、ｉ）２０８Ｆ２−Ｇ−１３後の標的拘束、およびｉｉ）ｍ８１６Ｃ１２およびｍ８１０Ｄ１２の２０８Ｆ２−Ｇ−１３活性追跡能を損なった(traduced)。
【０５９６】
実施例２７：ｍ８１０Ｄ１２またはｍ８１６Ｃ１２を用いたＩＧＦ−１Ｒの分布度試験
ｍ８１０Ｄ１２またはｍ８１６Ｃ１２のいずれかを用いたヒト癌におけるＩＧＦ−１Ｒ分布度を、Ｓｕｐｅｒｂｉｏｃｈｉｐｓ製の腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）にて検討した。スライドを従前に記載のように染色し、Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａアルゴリズムを用いて、コアの膜性ＩＧＦ−１Ｒ発現を分析した（表１８）。ＩＧＦ−１Ｒは正常組織（乳房および肺）では検出されなかったが、乳癌の６０％、肺扁平上皮癌の５０％超、および頭頸部癌（喉頭、扁平上皮癌）の３０％に高レベル（３＋）のＩＧＦ−１Ｒが見られた。
【０５９７】
【表２４】
2018537425.tif 000180
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
2018537425.tif 000191
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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