(57)【要約】本発明は、脂肪前駆細胞とマクロファージの三次元共培養に関し、脂肪前駆細胞とマクロファージを含むハイドロゲルスカフォールドで脂肪前駆細胞とマクロファージを共培養して脂肪様組織を形成することができ、これにより脂肪組織に関連する代謝性疾患の治療のための研究および新薬の開発に活用することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲルを含む混合物を調製するステップと、
（ｂ）三次元細胞‐プリンティングシステムを用いて、前記混合物から脂肪前駆細胞およびマクロファージを含むハイドロゲルスカフォールドを製造するステップと、
（ｃ）培養液を処理して、前記ハイドロゲルスカフォールドに含まれる脂肪前駆細胞およびマクロファージを、脂肪様組織を形成するように増殖および分化させるステップとを含む、脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）において、マクロファージが、前記脂肪前駆細胞に対して１．０〜２．０％（ｗ／ｖ）含まれる、請求項１に記載の脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法。
【請求項３】
前記ハイドロゲルが、アルジネート、コラーゲンおよびゼラチンを含むアルジネートハイドロゲルである、請求項１に記載の脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法。
【請求項４】
前記アルジネートの含有量が、前記ステップ（ａ）における混合物に対して２．０〜４．０％（ｗ／ｖ）である、請求項３に記載の脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法。
【請求項５】
（ａ）脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲルを含む混合物を調製するステップと、
（ｂ）三次元細胞‐プリンティングシステムを用いて、前記混合物から脂肪前駆細胞およびマクロファージを含むハイドロゲルスカフォールドを製造するステップと、
（ｃ）培養液を処理して、前記ハイドロゲルスカフォールドに含まれる脂肪前駆細胞およびマクロファージを、脂肪様組織を構成するように増殖および分化させるステップと、
（ｄ）脂肪細胞において遺伝子発現またはタンパク質活性のいずれか一つ以上を調査するステップとを含む、脂肪組織に関連する代謝性疾患の分析方法。
【請求項６】
前記代謝性疾患が、２型糖尿病である、請求項５に記載の脂肪組織に関連する代謝性疾患の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元的に形成された生体脂肪組織と類似した構造体をなすことができる細胞培養方法である、脂肪細胞およびマクロファージの三次元共培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満、糖尿、動脈硬化といった代謝性疾患（metabolic disease）治療剤の開発において、初期のin vitroで優れた薬効を示した薬物が、in vivo動物実験で薬効が減少して、新薬の開発に多くの困難をもたらしている。かかる問題を解決するために、薬物開発の初期段階で正確な効能および毒性を予測できる生体内（in vivo）モデルと類似した試験管内（in vitro）モデルが必要である。
【０００３】
ヒト細胞および組織（tissue）など生体内では細胞間相互作用による成長と分化が起こるため、複雑な３次構造を有することになる。一方、実験室などで細胞や組織培養のために使用される方法は、二次元的な培養に該当するため、生体内組織の機能や実際の組織で起こる反応を研究するには多くの困難がある。
【０００４】
生体内組織での反応およびその機能を研究するために、組織工学や生命工学分野では、三次元スカフォールド（scaffold）を用いた研究が活発に進められており、三次元人工組織スカフォールドを移植して細胞分化メカニズム、疾病治療剤の開発、組織再生といった研究が応用されている（韓国公開特許第２０１３‐０１１９６６３号）。しかし、三次元スカフォールドも人工的に製造されるものであるため、実際の組織や器官のように細胞間相互作用で構成される生体内構造はあまりにも多様で複雑なため、組織のような類似構造を形成するための技術的な限界が存在する。
【０００５】
本発明者らは、かかる既存の問題の解決および代謝性疾患の新薬の開発のために鋭意研究した結果、互いに異なる細胞が生体内のような三次元環境で細胞間相互作用により脂肪組織と類似した機能を示す培養方法を開発するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１３‐０１１９６６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞間相互作用により生体内組織と類似した機能を示す二つ以上の細胞を共培養する方法を提供すること、これにより、生体内組織の基礎研究および代謝性疾患の治療のための薬物効能スクリーニングシステムおよび新薬を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、脂肪様組織構造体を形成するために、脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲルが均一に混合された混合物を調製するステップと、三次元細胞‐プリンティング（three dimensional cell printing）システムを用いて前記混合物から脂肪前駆細胞およびマクロファージを含むハイドロゲルスカフォールドを製造するステップと、培養液を処理して、前記ハイドロゲルスカフォールドに含まれる脂肪前駆細胞およびマクロファージを、脂肪様組織構造体を形成するように分化させ増殖させるステップとを含む脂肪細胞およびマクロファージの三次元共培養方法を提供する。
【０００９】
本発明は、ハイドロゲルにおいて、マクロファージが、脂肪前駆細胞の全体数に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）含まれる、脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法を提供する。
【００１０】
本発明は、脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲルが均一に混合された混合物において、ハイドロゲルが、アルジネート、コラーゲンおよびゼラチンを含むアルジネートハイドロゲルであることを特徴とする脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法を提供する。
【００１１】
本発明は、アルジネートハイドロゲルに含まれるアルジネートが混合物に対して２．０〜４．０％（ｗ／ｖ）である、脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法を提供する。
【００１２】
本発明は、脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法により脂肪組織と類似した構造体を形成した後、これを用いた遺伝子発現またはタンパク質活性のいずれか一つ以上を調査して代謝性疾患を分析する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法は、ハイドロゲルスカフォールド内での脂肪細胞およびマクロファージの細胞間相互作用によって、生体内脂肪組織と類似した機能を有する構造体を形成することができる。また、ハイドロゲルスカフォールド内で形成された脂肪様組織構造体は、生体内脂肪組織と遺伝子発現およびタンパク質活性が類似しており、脂肪組織に関する代謝性疾患の治療のための研究および新薬の開発に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】三次元細胞‐プリンティングシステムによって作製されたハイドロゲルスカフォールドを示す図である。
【図２】ハイドロゲルスカフォールドでの３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞の増殖および細胞の生存を示す図であり、（Ａ）で緑色蛍光は生きている細胞、赤色蛍光は死んだ細胞に示された蛍光像を示しており、（Ｂ）は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞を互いに異なる濃度を有するアルジネートと混合して構造体を作製した時に細胞の増殖程度を示すグラフであり、（Ｃ）は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞を互いに異なる濃度を有するアルジネートと混合して構造体を作製した時に細胞の増殖程度を示す蛍光像であり、（Ｄ）は３％（ｗ／ｖ）アルジネートスカフォールドで３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞の数を異ならせて構造体を作製した時の細胞の増殖を示すグラフであり、（Ｅ）はスカフォールドの高さによる３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞の増殖を示すグラフであり、結果は、繰り返し実験によって平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示される（初日に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１）。
【図３】（Ａ）、（Ｂ）はハイドロゲル中の３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞の分化をＢＯＤＩＰＹ（boron‐dipyrromethene）を使用した蛍光像として示す図であり、３％アルジネート濃度のハイドロゲルから分化した３Ｔ３‐Ｌ１脂肪細胞（adipocyte）を比較しており、（Ｃ）は３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞と３Ｔ３‐Ｌ１脂肪細胞のＧ６ＰＤ酵素の活性差を比較しており、（Ｄ）は脂肪細胞分化（adipogenesis）およびインスリン抵抗性に関連する代表的な遺伝子の変化を示す図であり、（Ｅ）は脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性に関連する代表的なタンパク質の発現差を示す図であり、結果は、繰り返し実験によって平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示される（脂肪前駆細胞群に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１）。
【図４】（Ａ）は３％（ｗ／ｖ）アルジネート濃度のハイドロゲルスカフォールドにおけるマクロファージの細胞の増殖を脂肪前駆細胞と比較して示しており、（Ｂ）は３％（ｗ／ｖ）アルジネート濃度のハイドロゲルスカフォールドでのマクロファージの生存度を示す蛍光像であり、（Ｃ）は脂肪前駆細胞数の１０％（ｗ／ｖ）濃度のマクロファージを混合した共培養で脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性に関連する代表的なタンパク質の発現差を比較しており、（Ｄ）〜（Ｆ）はマクロファージ濃度が異なる場合の共培養における、脂肪細胞分化度および脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性に関連する代表的なタンパク質の発現差を比較した図であり、（Ｇ）〜（Ｉ）はマクロファージ濃度をより細分化した時の脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性に関連するタンパク質発現差および脂肪細胞分化度に対する蛍光像を示している。
【図５】（Ａ）は三次元細胞共培養スカフォールドで脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性に関連するタンパク質発現の変化を示しており、（Ｂ）は三次元細胞共培養スカフォールドでのインスリン抵抗性に対する変化をグルコース取り込み試験（glucose uptake）により示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について具体的に説明する。本発明に関する説明および図面において発明の要旨を不明瞭にし得る公知の内容は記載を省略してもよい。本発明に関する説明のために他に定義しない用語については、本発明が属する分野において通常の知識を有する者が一般的に理解できる意味に解釈すべきである。
【００１６】
本発明は、脂肪細胞（adipocytes）およびマクロファージ（macrophages）の三次元共培養方法およびその技術に関する。
【００１７】
本発明において、脂肪細胞およびマクロファージの共培養方法は、脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲルが均一に混合された混合物を調製するステップと、三次元細胞‐プリンティングシステムを用いて、前記混合物から脂肪前駆細胞およびマクロファージを含むハイドロゲルスカフォールドを製造するステップと、培養液を処理して、前記ハイドロゲルスカフォールドに含まれる脂肪前駆細胞およびマクロファージが脂肪組織と類似した機能を果たすように脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させて増殖させるステップとを含む脂肪細胞およびマクロファージを用いた三次元共培養方法である。
【００１８】
本発明の共培養方法において、脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲル混合物に含まれるマクロファージの濃度または細胞密度は、共培養の時に脂肪細胞の生存、分化、増殖および脂肪様組織構造体の形成のために調節され得る。マクロファージが極微量または非存在の場合、脂肪組織の機能を有することが困難で、マクロファージの濃度が増加するほど脂肪細胞の分化率が減少するにつれて脂肪細胞から発現して脂肪様組織を形成できる特異遺伝子発現の減少、タンパク質活性の減少などが生じる。
【００１９】
本発明の、ハイドロゲルスカフォールドを形成するための脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲル混合物において、脂肪前駆細胞の含有量は、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上、好ましくは１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、より好ましくは１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。脂肪前駆細胞が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ未満で含まれる場合には増殖および生存が活発でないことがあり、あるいは、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを超えて含まれる場合には細胞がスカフォールドの外部に分離され得る。
【００２０】
本発明の、ハイドロゲルスカフォールドを形成するための脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲル混合物において、マクロファージの含有量は、ハイドロゲルスカフォールドに含まれる脂肪前駆細胞に対して、１０％以下、１０〜５．５％、５．５〜４．５％、４．５〜３．５％、３．５〜２．５％、２．５〜１．５％、１．５〜０．５％、好ましくは２．０〜１．０％、より好ましくは１．２〜０．８％（ｗ／ｖ）である。例えば、脂肪前駆細胞が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの場合、１．０〜２．０％のマクロファージ含有量のためにマクロファージ細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ個以下に調節して含有させることができる。
【００２１】
本発明の一実施例によると、マクロファージの含有量は、ハイドロゲルスカフォールドの生成のための脂肪前駆細胞に比べ、１．０〜２．０％（ｗ／ｖ）で脂肪細胞の分化がスムーズに行われ、インスリン抵抗性の増加する結果と同様、実際の脂肪組織と類似した機能が現れる。
【００２２】
本発明において、ハイドロゲル（hydrogel）は、細胞培養培地、培養液または水を溶媒としてポリマー鎖がネットワークをなすことができるものであり、水溶性高分子などが化学的に架橋結合をなすか、物理的に結合することができ、三次元ハイドロゲルスカフォールドを形成することができる。本発明において使用するハイドロゲルは、あまり制限されず、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸、ゼラチンを使用することができ、好ましくは、藻類（algae）から由来したアルジネート（alginate）を含むものが好ましい。藻類ベース（base）のハイドロゲルを使用する場合、アルジネートの含有量を適宜調節して脂肪細胞とマクロファージの共培養の時に脂肪前駆細胞の分化期間および以降の追加実験の進行期間の間にハイドロゲルスカフォールドが溶解されず維持されるようにすることが好ましい。
【００２３】
本発明において、アルジネートハイドロゲルは、藻類から由来したアルジネートを含んで製造したハイドロゲルを意味する。アルジネートハイドロゲルにおいて、アルジネートは、水溶性高分子電解質として塩化カルシウムのような多原子価カチオン塩を使用して架橋結合をなすことができる。藻類ベースのハイドロゲルの場合、アルジネートの含有量がハイドロゲルスカフォールドの生成のための脂肪細胞、マクロファージおよびアルジネートハイドロゲル混合物に対して２．５％超、２〜４％、２．５〜４％、２．８〜３．０％、３〜４％、３．５〜４％、好ましくは２．５％超３．０％（ｗ／ｖ）以下であり、最も好ましくは３．０％（ｗ／ｖ）である。アルジネートの含有量が十分でない場合、構造体の溶解度が増加し、アルジネートの含有量が高い場合、細胞の増殖および生存率が減少することがある。
【００２４】
本発明の一実施例によると、褐藻類から由来したアルジネートの含有量が２．０％（ｗ／ｖ）の場合、脂肪細胞の生存および増殖が非常に活発であるが、ハイドロゲルスカフォールドで脂肪細胞およびマクロファージの共培養の時に相対的に形が長く維持されず、培養および研究の適用が困難であり得る。また、アルジネートの含有量が２．５％（ｗ／ｖ）および３．０％（ｗ／ｖ）であると、ハイドロゲルスカフォールドの形が脂肪様組織形成されるまで十分に維持され得、脂肪細胞の生存および増殖も一定に維持される。また、アルジネート含有量が３．５％（ｗ／ｖ）以上の場合、ハイドロゲルスカフォールドの形の持続力は優秀であるが、脂肪細胞の生存および増殖が減少し得る。
【００２５】
本発明において、ハイドロゲルには、ゼラチンおよびコラーゲンがさらに含まれてもよく、ゼラチンとコラーゲンの含有量は、脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲル混合物に対してそれぞれ５．０〜１０．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましいが、これに制限されるものではない。
【００２６】
本発明において、ハイドロゲルスカフォールドの形成のための脂肪前駆細胞、マクロファージおよびハイドロゲルを均一に混合した後、混合物は、三次元細胞‐プリンティングシステムを用いてハイドロゲルスカフォールドを製造するための機械のディスペンサにより加工される。
【００２７】
本発明において、三次元細胞‐プリンティングシステム（3D cell‐printing system）は、立体構造のハイドロゲルスカフォールドを生成するために使用されるシステムである。三次元細胞‐プリンティングのために、ｘ‐ｙ‐ｚステージ（stage）、ディスペンサ、シリンジノズル（syringe nozzle）、圧縮コントローラおよびコンピュータシステムを備えて含む機械により行われ得る。本発明において三次元細胞‐プリンティングシステムにより製造されるハイドロゲルスカフォールドは、立体的な構造で、一般的に行われる培地での細胞培養のような二次元的培養とは差のある三次元的細胞培養が可能である。ハイドロゲルスカフォールドの構造は、混合物に含まれる成分および濃度、プログラムによるデザイン、細胞‐プロッティングの際に圧力および速度に応じて適宜形成され得る。細胞共培養のためのハイドロゲルスカフォールドのスカフォールドパターンおよび構造は制限されないが、スカフォールドパターンが直交方向で、多層細胞‐プロッティングによってスカフォールドを形成することが好ましい。
【００２８】
本発明の一実施例によると、スカフォールドパターンは、直交方向になるようにプログラムおよびデザインし、厚さ０．２〜０．３ｍｍの細胞‐プロッティングされたスカフォールドを形成して細胞‐プロッティングされたスカフォールドを積層させながら２．０〜３．０ｍｍ内外の厚さでハイドロゲルスカフォールドを製造することが好ましい。厚さは、０．１〜３．０ｍｍ、０．４〜２．５ｍｍ、０．８〜２．５ｍｍ、０．４〜２．５ｍｍ、０．８〜２．５ｍｍ、１．２〜２．５ｍｍ、１．６〜２．５ｍｍ、０．４〜２．０ｍｍ、０．８〜２．０ｍｍ、１．２〜２．０ｍｍ、好ましくは０．２〜０．３ｍｍ、より好ましくは１．６〜２．０ｍｍである。厚さをより増加させる場合、ハイドロゲルスカフォールド形成時に最下部に位置した細胞‐プロッティングされたスカフォールド層の構造が崩壊され得る。ハイドロゲルスカフォールドの構造が一定に維持されない場合、共培養の時に細胞の生存率、増殖および分化度が減少し得る。ハイドロゲルスカフォールドは、四角形状であり、面積は１０〜３０ｃｍ２、１５〜２５ｃｍ２、好ましくは２０〜２５ｃｍ２に製造することができる。
【００２９】
本発明において、細胞‐プロッティングによってハイドロゲルスカフォールドが製造される時に混合する（cells seeding）脂肪前駆細胞の数は、混合物またはハイドロゲルスカフォールドのデザインに応じて所定の増殖が起こるように調節することが好ましい。
【００３０】
本発明の一実施例によると、ハイドロゲルと混合する細胞数が多い場合、培養時間が経つほど増殖率が上昇することになり、混合される細胞数は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上が好ましいが、これに制限されるものではない。しかし、細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ未満の場合、増殖がスムーズに行われないこともある。本発明においてハイドロゲルスカフォールドは、共培養の時に細胞が分化、増殖および細胞間相互作用によって類似組織が形成される箇所である。平面培地のように一般的な培地で細胞培養をする場合、細胞それぞれが特定の部分でのみ細胞間で相互作用し、増殖方向が一方的で、分化および増殖により細胞数が増加する場合にも細胞それぞれが細胞間で相互作用ができる細胞が限定的である。また、細胞から分泌する様々な代謝物質が蓄積され、不均衡の濃度勾配をなすことになる。そのようにして、二次元的に体外（in vitro）で細胞培養する場合には細胞間の相互作用が体内で（in vivo）のような相互作用が誘導されることができず、体内と類似した構造体を形成することも困難である。
【００３１】
一方、本発明に係るハイドロゲルスカフォールドの場合、脂肪細胞とマクロファージが立体的な構造のハイドロゲルスカフォールドに含まれており、細胞それぞれが生体内の細胞のように周囲のすべての方向で細胞間相互作用が可能で、増殖方向が一方的でなく、分化および増殖により細胞数が増加する場合にも細胞それぞれが継続して周囲の細胞と細胞間相互作用が可能となる。また、細胞から分泌する様々な代謝物質が特定の箇所に蓄積されず、生体内と同様、周囲のすべての方向に分泌することができ、濃度勾配のバラツキを防止することができる。かかる特徴により、脂肪細胞とマクロファージの共培養の時に体内のような細胞間相互作用を誘導することができ、これにより、体内脂肪組織のように機能が類似した脂肪様組織を形成することになる。
【００３２】
本発明の一実施例によると、一般培地で脂肪前駆細胞（preadipocyte）および脂肪細胞（adipocyte）を培養した場合とハイドロゲルスカフォールドで脂肪細胞およびマクロファージを共培養した場合、生体内脂肪組織の遺伝子発現およびタンパク質活性の差が確実に現れ、ハイドロゲルスカフォールドでの脂肪細胞およびマクロファージの共培養により形成された脂肪様組織は、肥満および糖尿モデルとして広く知られているＣ５７ＢＬ／６‐ＤＩＯマウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊｏｂ／ｏｂマウスの生体内脂肪組織で脂肪分化因子が増加し、インスリン抵抗性が増加することと類似した遺伝子発現およびタンパク質活性を示す。
【００３３】
本発明により、ハイドロゲルスカフォールドを製造した後、ハイドロゲルスカフォールドに含まれる細胞を、細胞間相互作用によって類似組織を形成するように増殖および分化させる。ハイドロゲルスカフォールドに含まれる細胞の増殖および分化は、増殖または分化のための培養液をハイドロゲルスカフォールドに処理してハイドロゲルスカフォールドに培養液を吸収させることによって起こる。ハイドロゲルスカフォールドの多孔性の立体的な構造により吸収された培養液が各細胞に均一に接し得る。
【００３４】
培養液処理によってハイドロゲルスカフォールドに含まれる脂肪前駆細胞およびマクロファージが分化および増殖することになり、細胞間相互作用によって脂肪細胞およびマクロファージは脂肪組織と類似した機能を示すことになる。
【００３５】
本発明により、三次元的共培養された脂肪細胞とマクロファージは、脂肪様組織構造体を形成することになり、脂肪様組織の形成可否は、構造体での脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性に関連するタンパク質の発現度の差およびグルコース取り込み評価（glucose uptake）試験により分かる。
【００３６】
本発明の一実施例によると、ハイドロゲルスカフォールドでの脂肪細胞およびマクロファージの共培養によって形成された脂肪様構造体は、ＦＡＢＰ４、ＦＡＳ、ＡＣＣおよびＰＰＡＲγ２のような脂肪細胞分化関連マーカータンパク質の発現が増加し、Ａｋｔリン酸化およびＧＬＵＴ４のようなインスリン抵抗性関連マーカータンパク質の発現および活性度が減少する。一方、ハイドロゲルスカフォールドで脂肪前駆細胞または脂肪細胞をそれぞれ単一培養した場合、脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性関連マーカータンパク質の発現がいずれも増加する。
【００３７】
［実施例］
以下、本発明を実施するための好ましい実施例について具体的に説明する。本発明は、下記の実施例に制限されたり実施例によって制限解釈されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
以下のような方法により脂肪細胞とマクロファージを共培養して脂肪様構造体を形成した。
【００３９】
脂肪前駆細胞およびマクロファージ培養および調製
脂肪前駆細胞である３Ｔ３‐Ｌ１（＃ＣＬ‐１７３、ＡＴＣＣ）およびマクロファージでＲＡＷ２６４．７（＃ＴＩＢ‐７１、ＡＴＣＣ）を準備して１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、Carsbad、CA、USA）、１００μｇ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）の混合物１％を含むダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium、Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞は３７℃、５％ＣＯ２条件の培養用インキュベータで培養した。培養後、ＤＰＢＳ（Dulbecco's phosphate‐Buffered Saline、Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、０．２％トリプシン‐ＥＤＴＡ（trypsin‐ethylenediaminetetraacetic acid、Invitrogen）２ｍｌ添加して３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで１分間培養した。次に、１，５００ｒｐｍで２分間細胞懸濁液（suspension）を遠心分離して細胞ペレット（pellet）を取得し、実験に用いた。
【００４０】
ハイドロゲルスカフォールド製造のための脂肪前駆細胞、マクロファージおよびアルジネートハイドロゲルを含む混合物の製造
ゼラチン５００ｕｌ（Sigma‐Aldrich）、コラーゲン５００ｕｌ（Sigma‐Aldrich）と１×１０７個の脂肪前駆細胞および１×１０５個のマクロファージを均一に混合した後、ダルベッコ変法イーグル培地で最終９．７ｍｌに調整する。混合物に３ｍｇアルギン酸ナトリウム（Sigma‐Aldrich）を入れた後、迅速に撹拌させて３％アルジネートハイドロゲルスカフォールド製造のための混合物を調製し、三次元スカフォールド作製のために２００〜３００ｕｍサイズのノズルで構成されたディスペンサに移した。スムーズな細胞‐プリンティングのために１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離してハイドロゲルスカフォールドの作製準備をした。
【００４１】
以上の方法と同じ混合物製造方法により、ゼラチン、コラーゲンの量は同様にしてダルベッコ変法イーグル培地を使用して脂肪前駆細胞、マクロファージおよびアルギン酸ナトリウムの含有量がそれぞれ互いに異なる混合物を製造した。アルジネートの含有量は２、２．５、３．０、３．５、４．０％にそれぞれ調節して互いに異なる濃度のハイドロゲルスカフォールドを製造することにした。また、脂肪細胞の密度（seeding density）は使い捨て血球計算盤（hemocytometer‐based cell counter、SKC Co．Ltd．，Seoul、Korea）で計算して１×１０４、５×１０４、１×１０５、４×１０５、８×１０５および１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌにそれぞれ細胞数を異ならせて互いに異なる脂肪細胞を含むハイドロゲルスカフォールドを製造した。マクロファージは、脂肪細胞に対して１、２、３、４、５、１０％（ｗ／ｖ）にそれぞれ調節し、脂肪細胞とマクロファージの共培養の時にマクロファージの濃度による変化を観察した。
【００４２】
ディスペンサにより作製されたハイドロゲルスカフォールドは、迅速に予め調製された５％塩化カルシウム水溶液と反応させた。この際、スカフォールドは、塩化カルシウム処理によって架橋結合をなす。
【００４３】
三次元細胞‐プリンティングシステムを用いたハイドロゲルスカフォールドの製造
三次元細胞‐プリンティングシステム（3D cell‐printing system）を用いたハイドロゲルスカフォールドの製造は、ｘ‐ｙ‐ｚステージ（stage）、ディスペンサ、シリンジノズル（syringe nozzle）、圧縮コントローラおよびコンピュータシステムを備えた機械を用いた（3D Bio‐Scaffold Plotting system、PROTek）。ディスペンサは、ハイドロゲルホルディングのための貯蔵タンクであり、コンピュータシステムは、圧力、フィーディング（feeding）速度、ストランド（strand）大きさおよびスカフォールドの形状を調節した。細胞‐プロッティング（cell‐plotting）システムの速度は１５０ｍｍ／ｓ、圧力は６５０ｋＰａにそれぞれ調節した。ディスペンサに一定の圧力が加えられて脂肪細胞、マクロファージおよびハイドロゲル混合物が三次元スカフォールド形態としてｘ‐ｙ‐ｚステージに細胞‐プロッティングされたスカフォールドが一層ずつ（layer‐by‐layer）プロッティングされて製造された。スカフォールドパターンは直交方向になるようにデザインして製造し、四角形（５×５ｃｍ）形状の細胞‐プロッティングされたスカフォールドを積層して厚さがそれぞれ０．４、０．８、１．２、１．６、２ｍｍになるように脂肪前駆細胞およびマクロファージを含むハイドロゲルスカフォールドを製造した。
【００４４】
製造されたハイドロゲルスカフォールドは１００μｇ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）およびウシ胎児血清１０％を含むダルベッコ変法イーグル培地で１日間増殖および細胞の安定化を誘導し、以降、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリンを処理したウシ胎児血清１０％を含むダルベッコ変法イーグル培地に取り替え分化を誘導した。分化誘導後、２日から３日後、インスリンを処理したウシ胎児血清１０％を含むダルベッコ変法イーグル培地に取り替え、インスリン処理２日後にウシ胎児血清１０％を含むダルベッコ変法イーグル培地で１日から２０日まで実験目的に応じて培養して細胞の生存、増殖、分化に対する分析を行った。培養培地は、少なくとも２日に一度ずつ取り替えた。
【００４５】
細胞の生存および増殖の分析
ハイドロゲルスカフォールドで細胞の生存は、Live／Dead細胞分析キット（Live／Dead cell assay kit、invitrogen）および蛍光顕微鏡（ＴＥ２０００‐Ｕ、Nikon）を使用して確認した。ハイドロゲルスカフォールドをＰＢＳで洗浄し、カルセイン（calcein）およびＥｔｈＤ‐１（ethidium homodimer）でＰＢＳで１５分間着色した。着色後、ＰＢＳで二度洗浄し、蛍光顕微鏡で緑色（生存細胞、４９５〜５１５ｎｍ）および赤色（死細胞、４９５〜６３５ｎｍ）蛍光を観察した。細胞の増殖は細胞計算キット（Cell Counting Kiｔ‐８（ＣＣＫ‐８）、Dojindo Laboratories）を使用した。ハイドロゲルスカフォールドを２４‐ウェル（well）プレート中でＣＣＫ‐８１００ｕｌ含有培地１ｍｌによって処理し、３７℃で４時間培養後、マイクロ‐プレート分光光度計（BIORAD Inc．）で４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００４６】
３Ｔ３‐ＬＩ細胞の増殖および生存はアルジネートが２％である時に最も活発であったが、アルジネートが２％である時にハイドロゲルスカフォールド構造は約２週後から変形または崩壊した。アルジネートが２．５％である時に細胞の増殖および生存は活発であったが、３週後からは同様にハイドロゲルスカフォールド構造が変形または崩壊した。アルジネートが３％である時に細胞が細胞の増殖および生存が活発で４週以上の長期間でもハイドロゲルスカフォールドの構造が維持された。アルジネートが３．５％以上である時に、ハイドロゲルスカフォールドの構造は長期間維持され続けたが、細胞の増殖および生存が目視で確認できるほど減少した（図２のＢ、Ｃ）。
【００４７】
３Ｔ３‐Ｌ１細胞の数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ未満の時には増殖がスムーズに生じなかった（図２のＤ）。また、ハイドロゲルスカフォールドの高さが２．０ｍｍである時に増殖率が最も高く、３．０ｍｍを超える場合、ハイドロゲルスカフォールドの下部構造が２週〜３週の間に変形または崩壊した。
【００４８】
製造したスカフォールド中の脂肪細胞およびマクロファージ分化
ハイドロゲルスカフォールドを２０μｇ／ｍｌのインスリン、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（isobutylmethylxanthine）、１μＭデキサメタゾン（dexamethasone）を含む分化誘導培地を用いて３日間分化させて２０μｇ／ｍｌインスリンを含む培地に取り替え２日間放置し、次に、細胞を一般培地（maintained medium）で１日間培養した。
【００４９】
培養後、ＢＯＤＩＰＹ（boron‐dipyrromethene）（ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、Invitrogen）に成熟された脂肪細胞の脂肪粒子を着色した。着色した後、ＰＢＳで二回洗浄して蛍光顕微鏡で着色された脂肪粒子を観察したところ、均一に分布している脂肪粒子を確認した（図３のＡおよびＢ）。
【００５０】
培養後、Ｇ６ＰＤ分析キット（Glucose ６ Phosphate Dehydrogenase Assay Kit、abcam）でハイドロゲルスカフォールド中のＧ６ＰＤ酵素活性を測定し、分化した脂肪細胞で活性化するＧ６ＰＤ酵素活性を確認した（図３のＣ）。
【００５１】
また、トリゾール（Tri‐reagent）（TRIzolR、Invitrogen）を使用してハイドロゲルスカフォールド内細胞でＲＮＡを分離しＲＮＡ２μｇを逆転写させた後、ｍＲＮＡのReal‐Time PCRによる遺伝子発現度およびウエスタンブロット（western blot assay）によりタンパク質の活性を確認した。逆転写は、AccuPower RT PreMix（Bioneer Inc．，Korea）を使用し、すべてのプライマーデザインはプライマー３ソフトウェア（http：//bioinfo．ut．ee/primer３/）を用いており、これらの５´から３´配列は表１に示されている。
【００５２】
遺伝子発現度およびタンパク質活性の確認結果、脂肪細胞分化過程に関連する転写因子および脂肪細胞関連マーカーであるＰＰＡＲγ２、ＣＥＢＰ／α  ＦＡＢＰ４、ＦＡＳ、Ｇ３ＰＤ  ａｎｄＧＬＵＴ４が相当増加したことが分かった（図３のＤ、Ｅ）。
【００５３】
【表１】
2018522556.tif 000003
【００５４】
マクロファージとの共培養による脂肪様組織構造体形成の確認
まず、共培養時にマクロファージの濃度による３Ｔ３‐Ｌ１生存、増殖および分化能を確認した。マクロファージと共培養時にＦＡＢＰ４、ＧＬＵＴ４およびＰＰＡＲγの発現が１０％ほど減少した。また、マクロファージの濃度が増加するほどＦＡＢＰ４、ＧＬＵＴ４の発現およびＧ６ＰＤ活性度が減少することを確認し、脂肪細胞とマクロファージの共培養時にマクロファージの濃度は２％の時ＦＡＢＰ４は増加するがＧＬＵＴ４は減少し、マクロファージの濃度が３％である時にＦＡＢＰ４の活性も急激に減少して脂肪前駆細胞が脂肪細胞への分化が急激に減少することを確認することができた（図４のＧ〜Ｉ）。
【００５５】
脂肪前駆細胞の三次元単独培養および分化では肥満と連関したＡＣＣ、ＦＡＳおよびＦＡＢＰ４の発現増加とインスリン抵抗性に関連したＡＫＴのリン酸化およびＧＬＵＴ４の発現が増加し（図５のＡ）、脂肪前駆細胞とマクロファージの三次元共培養および分化されたスカフォールドでは脂肪前駆細胞の三次元単独培養および分化されたスカフォールドに比べ、肥満に関連したＡＣＣ、ＦＡＳおよびＦＡＢＰ４の発現の差は現れず、脂肪細胞への分化がスムーズに行われたことを確認することができ（図５のＡ）、インスリン抵抗性に関連したＡＫＴのリン酸化およびＧＬＵＴ４の発現が減少し、インスリン抵抗性がマクロファージの共培養によって誘導されることをタンパク質水準で確認することができた。これは、一般的に知られた脂肪前駆細胞の二次元的な単独培養および分化でＡＣＣ、ＦＡＳおよびＦＡＢＰ４のような脂肪生成に関連した因子の増加、インスリン抵抗性に関連したＡＫＴのリン酸化およびＧＬＵＴ４のような因子がいずれも増加し、インスリン抵抗性が高くなることができない結果と確実な差を示している。グルコース取り込み評価試験キット（abcamR、UK）を用いたグルコース取り込み（glucose uptake）試験結果（図５のＢ）でもマクロファージの共培養したスカフォールドで脂肪細胞のみ単独培養したスカフォールドに比べ、高濃度のインスリン（１μｇ／ｍｌ）の供給にもかかわらず有意的減少によりインスリン抵抗性が増加することを確認した。
【００５６】
［配列リストフリーテキスト］
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> Method for 3-dimensional co-culture of adipocytes with
macrophages
<130> P15040500418
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPARγ2 forward primer
<400> 1
ccctggcaaa gcatttgtat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPARγ2 reverse primer
<400> 2
gaaactggca cccttgaaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3PD forward primer
<400> 3
agagatgctc gccacagaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3PD reverse primer
<400> 4
aaagggtctc tggggtctgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FABP4 forward primer
<400> 5
catcagcgta aatggggatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FABP4 reverse primer
<400> 6
tcgactttcc atcccacttc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLUT4 forward primer
<400> 7
ctccttctat ttgccgtcct c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLUT4 reverse primer
<400> 8
ctgttttgcc cctcagtcat t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAS forward primer
<400> 9
acatggtagc tgccctcaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAS reverse primer
<400> 10
gcgcagtacc gtagaaggac 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18SrRNA forward primer
<400> 11
cggttctatt ttgttggt 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18SrRNA reverse primer
<400> 12
agtcggcatc gtttatggtc 20
【図１】
2018522556.tif 000004
【図２ＡＢ】
2018522556.tif 000005
【図２Ｃ】
2018522556.tif 000006
【図２ＤＥ】
2018522556.tif 000007
【図３Ａ】
2018522556.tif 000008
【図３ＢＣ】
2018522556.tif 000009
【図３Ｄ】
2018522556.tif 000010
【図３Ｅ】
2018522556.tif 000011
【図４Ａ−Ｄ】
2018522556.tif 000012
【図４Ｅ−Ｈ】
2018522556.tif 000013
【図４Ｉ】
2018522556.tif 000014
【図５Ａ】
2018522556.tif 000015
【図５Ｂ】
2018522556.tif 000016
【配列表】
2018522556000001.app
【国際調査報告】
2018522556.tif 000017
2018522556.tif 000018
2018522556.tif 000019
2018522556.tif 000020
2018522556.tif 000021
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