(57)【要約】  標的化されたヌクレアーゼの一過性発現を通したゲノム操作のための材料および方法が本明細書に記載される。例えば、本明細書に記載の方法は、細胞内の選択された配列に対して標的化されたヌクレアーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞に導入するステップを含んでよく、ここで、ｍＲＮＡの安定性は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の付加によって改変される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、構造コード配列；および
（ｂ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方、
を含む核酸であって、
前記の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、前記構造コード配列に動作可能に連結される、
核酸。
【請求項２】
請求項１の核酸であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
核酸。
【請求項３】
請求項１の核酸であって、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
核酸。
【請求項４】
請求項１の核酸であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含み、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
核酸。
【請求項５】
請求項１の核酸であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
核酸。
【請求項６】
請求項１の核酸であって、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
核酸。
【請求項７】
請求項１の核酸であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含み、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
核酸。
【請求項８】
請求項１の核酸であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
核酸。
【請求項９】
請求項１の核酸であって、
前記核酸は、前記構造コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、
核酸。
【請求項１０】
請求項１の核酸であって、
前記核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、
核酸。
【請求項１１】
請求項１の核酸であって、
前記核酸は、ＤＮＡである、
核酸。
【請求項１２】
請求項１の核酸を含む、
発現ベクター。
【請求項１３】
発現ベクターを合成する方法であって、
（ａ）プロモーター配列；
（ｂ）構造コード配列；および
（ｃ）配列番号１０または配列番号１２と少なくとも９０％同一性を有する５’ＵＴＲ核酸配列
を、一緒に、動作可能に連結するステップを含む、
方法。
【請求項１４】
発現ベクターを合成する方法であって、
（ａ）プロモーター配列；
（ｂ）構造コード配列；および
（ｃ）配列番号１１または配列番号１３と少なくとも９０％同一性を有する３’ＵＴＲ核酸配列
を、一緒に、動作可能に連結するステップを含む、
方法。
【請求項１５】
植物、植物部分、または植物細胞のゲノム材料を改変する方法であって、
前記の植物、植物部分、または植物細胞に、（ａ）前記植物細胞内のゲノム配列を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、構造コード配列、および（ｂ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方、を含む核酸を導入するステップを含み、
ここで、前記の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、前記構造コード配列に動作可能に連結される、
方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
方法。
【請求項１７】
請求項１５の方法であって、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
方法。
【請求項１８】
請求項１５の方法であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含み、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
方法。
【請求項１９】
請求項１５の方法であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
方法。
【請求項２０】
請求項１５の方法であって、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
方法。
【請求項２１】
請求項１５の方法であって、
前記５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含み、
前記３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む、
方法。
【請求項２２】
請求項１５の方法であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項２３】
請求項１５の方法であって、
前記核酸は、前記構造コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、
方法。
【請求項２４】
請求項１５の方法であって、
前記の植物、植物部分、または植物細胞は、双子葉の植物、植物部分、または植物細胞である、
方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法であって、
前記の双子葉の植物、植物部分、または植物細胞は、アブラナ科、ナス科、マメ科、またはバラ科（Ｒｏｓｅａｃａｅａｅ）由来である、
方法。
【請求項２６】
請求項１５の方法であって、
前記の植物、植物部分、または植物細胞は、単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｕｓ）の植物、植物部分、または植物細胞である、
方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、
前記の単子葉の植物、植物部分、または植物細胞は、イネ科またはユリ科由来である、方法。
【請求項２８】
請求項１５の方法であって、前記核酸は、ｍＲＮＡである、
方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法であって、
前記の導入するステップは、前記核酸の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が介在する形質転換、エレクトロポレーションが介在する形質転換、または、微粒子銃が介在する形質転換を含む、
方法。
【請求項３０】
請求項１５の方法であって、
前記核酸は、ＤＮＡである、
方法。
【請求項３１】
請求項３０の方法であって、
前記の導入するステップは、前記核酸の、ＰＥＧが介在する形質転換、エレクトロポレーションが介在する形質転換、微粒子銃が介在する形質転換、または、アグロバクテリウムが介在する形質転換を含む、
方法。
【請求項３２】
請求項１５の方法であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項３３】
請求項１５の方法であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、前記の標的化された配列において部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
方法。
【請求項３４】
請求項１５の方法であって、
前記の植物細胞または植物部分を、植物に再生させるステップをさらに含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本文書は、標的化されたヌクレアーゼの一過性発現を通したゲノム操作のための材料および方法に関する。当該方法は、例えば、非翻訳領域（ＵＴＲ）の付加によってヌクレアーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性を改変するステップを含んでよい。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現、ＤＮＡからの情報をタンパク質に変換するプロセスは、ゲノムの非コード部分、（例えば、プロモーター、エンハンサー、遺伝子座制御領域およびサイレンサー）、転写因子、および転写後メカニズムによって調節される。ｍＲＮＡの安定性およびレベルは、遺伝子発現において極めて重要である。ｍＲＮＡ核細胞質間輸送の転写後制御、翻訳効率、細胞内局在および安定性は、５’および３’ｍＲＮＡ  ＵＴＲ内に位置するシス作用ＲＮＡエレメントによって仲介されることが知られている（Ｐｅｓｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ２７６：７３−８１，２００１；および、Ｍｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００４．１−０００４．１０，２００２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ｍＲＮＡを介したゲノム編集は、その非トランスジェニックの性質に起因して望ましくあり得る。しかしながら、ｍＲＮＡは、植物形質転換プロセス中に分解しやすい、壊れやすい分子であり、発現されたポリペプチドが効果を有するのに許容できるレベルに翻訳が到達することができる前に素早く分解され得る。本文書は、ｍＲＮＡ植物形質転換における特定のＵＴＲの利用が、ｍＲＮＡ分子の増大した安定性、局在、および翻訳効率を可能にするという知見に少なくとも一部基づく。例えば、１つまたは複数の特定のＵＴＲをｍＲＮＡ転写産物中に含むことにより、コードされるタンパク質（単数または複数）の一過性発現を増大することが可能である。ある場合には、したがって、ゲノム編集のための方法は、より安定したヌクレアーゼ転写を生じさせるために、本明細書に記載のｍＲＮＡ発現ベクターの使用を含んでよく、およびしたがって、部位特異的ゲノム改変が可能な配列特異的なヌクレアーゼを一時的に発現することがより可能であり、植物種の操作を高めることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本文書は、（ａ）レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、構造コード配列、および（ｂ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方、を含む核酸を特徴とし、ここで、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、構造コード配列に動作可能に連結される。
【０００５】
５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【０００６】
５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含む。
【０００７】
５’ＵＴＲは、配列番号１４に示す核酸配列、または、配列番号１４と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１５に示す核酸配列、または、配列番号１５と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１４に示す核酸配列、または、配列番号１４と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１５に示す核酸配列、または、配列番号１５と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【０００８】
５’ＵＴＲは、配列番号１６に示す核酸配列、または、配列番号１６と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１７に示す核酸配列、または、配列番号１７と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１６に示す核酸配列、または、配列番号１６と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１７に示す核酸配列、または、配列番号１７と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【０００９】
レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。核酸は、構造コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含んでよい。請求項１の核酸は、ここで、核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはＤＮＡであってよい。
【００１０】
別の態様では、本文書は、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターを特徴とする。
【００１１】
別の態様では、本文書は、発現ベクターを合成する方法を特徴とする。一部の実施態様では、当該方法は、（ａ）プロモーター配列、（ｂ）構造コード配列、および（ｃ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または、配列番号１６と、少なくとも９０％同一性を有する５’ＵＴＲ核酸配列を、一緒に、動作可能に連結するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、（ａ）プロモーター配列、（ｂ）構造コード配列、および（ｃ）配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または、配列番号１７と少なくとも９０％同一性を有する３’ＵＴＲ核酸配列を、一緒に、動作可能に連結するステップを含んでよい。
【００１２】
また、本文書は、植物、植物部分、または植物細胞のゲノム材料を改変する方法も特徴とする。当該方法は、植物、植物部分、または植物細胞に、（ａ）植物細胞内のゲノム配列を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、構造コード配列、および（ｂ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方、を含む核酸を、導入するステップを含んでよく、ここで、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、構造コード配列に動作可能に連結される。
【００１３】
５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す核酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す核酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【００１４】
５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す核酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す核酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【００１５】
５’ＵＴＲは、配列番号１４に示す核酸配列、または、配列番号１４と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１５に示す核酸配列、または、配列番号１５と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１４に示す核酸配列、または、配列番号１４と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１５に示す核酸配列、または、配列番号１５と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【００１６】
５’ＵＴＲは、配列番号１６に示す核酸配列、または、配列番号１６と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。３’ＵＴＲは、配列番号１７に示す核酸配列、または、配列番号１７と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。ある場合には、５’ＵＴＲは、配列番号１６に示す核酸配列、または、配列番号１６と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよく、３’ＵＴＲは、配列番号１７に示す核酸配列、または、配列番号１７と少なくとも９５％同一性を有する核酸配列を含んでよい。
【００１７】
レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。核酸は、構造コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含んでよい。植物、植物部分、または植物細胞は、双子葉の植物、植物部分、または植物細胞（例えば、アブラナ科、ナス科、マメ科、またはバラ科（Ｒｏｓｅａｃａｅａｅ）由来の、双子葉の植物、植物部分、または植物細胞）であってよい。植物、植物部分、または植物細胞は、単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｕｓ）の植物、植物部分、または植物細胞（例えば、イネ科またはユリ科由来の、単子葉の植物、植物部分、または植物細胞）であってよい。核酸は、ｍＲＮＡであってよく、ある場合には、導入するステップは、核酸の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が介在する形質転換、エレクトロポレーションが介在する形質転換、または、微粒子銃が介在する形質転換を含んでよい。核酸は、ＤＮＡであってよく、ある場合には、導入するステップは、核酸の、ＰＥＧが介在する形質転換、エレクトロポレーションが介在する形質転換、微粒子銃が介在する形質転換、または、アグロバクテリウムが介在する形質転換を含んでよい。レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、標的化された配列において部位特異的な突然変異誘発をもたらし得る。当該方法は、植物細胞または植物部分を植物に再生させるステップをさらに含んでよい。
【００１８】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野における通常の技術を有する者によって共通して理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定であることを意図しない。
【００１９】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細は、以下の説明および付随する図面に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＬＳ２遺伝子由来の代表的なＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。下線を引いた配列（配列番号２および３）は、ＡＬＳ２遺伝子を認識する転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ）に関する標的部位を表わす。
【図２】Ａｔ１Ｇ０９７４０  ５’および３’ＵＴＲを含む改変ｐＳＰ７２ベクターのダイアグラムである。
【図３】試験された４つのＵＴＲペアを含む、転写された配列を示す図である。
【図４】Ａｔ１Ｇ０９７４０  ５’ＵＴＲ、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼサブユニットをコードする配列、および、Ａｔ１Ｇ０９７４０  ３’ＵＴＲを含む、改変ｐＳＰ７２ベクターのダイアグラムである。
【図５】ＡＬＳ２遺伝子における、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼによって誘導された突然変異の例を示す。上の列は、改変されていないＤＮＡ配列を示し、ＡＬＳ２  ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼに関する認識部位の配列に下線が引かれている。他の配列は、不正確な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘導された代表的な突然変異を示す。欠失サイズは右に示される。
【図６】Ａｔ１Ｇ０９７４０  ＵＴＲペアを保有するｍＲＮＡの送達後に、ＡＬＳ２遺伝子においてＴＡＬＥ−ヌクレアーゼによって誘導される突然変異のさらなる例を示す。
【図７】コード配列が、異なるＵＴＲペアに融合された場合の、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼに関するＮＨＥＪ突然変異頻度をプロットしたグラフである。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼおよびＵＴＲ配列は、指示のとおりにｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして細胞に送達された。
【図８】挿入のサイズに対して、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ標的部位内の挿入の数をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
食料の量および質に関する世界的需要は、今まで増大している。これらの増えているニーズに対応するために、伝統的な育種が提供することができるよりも速い速度で作物を得るためのいくつかのゲノム操作ストラテジーが採用されている。遺伝子操作は、環境的および農業的制約の下で生長することが可能な新規の植物品種を開発するための手段を提供して、投資に対して返還されるエネルギーを最適化する。遺伝子操作（ＧＥ）作物の大部分は、トランスジェニック方法を用いて導入された、除草剤および殺虫剤耐性のような特性を有する。効果的である一方で、そのような方法は典型的に、外来遺伝物質の挿入を伴い、したがって、トランスジェニック株は、典型的に、公共利用が承認される前に、長くて骨の折れる規制ステップを必要とする（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＳＢ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，２０１４）。対照的に、本明細書に記載の方法は、ｍＲＮＡ転写産物の送達によって、所望のポリペプチドの一過性発現を伴う。ｍＲＮＡは植物ゲノム内に挿入されることができないので、ｍＲＮＡによる植物、植物部分、または植物細胞の形質転換は特に有用であり得る。したがって、本明細書に示す方法は、外来核酸の組込みを伴わずに新規の作物を生産することが可能であるツールを提供することができ、それは、そうでなければプラスミドＤＮＡの偶発性の組込みがないＧＥ植物を同定するために必要とされる、大スケールのスクリーニングを減らす。
【００２２】
真核生物では、成熟ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、コード領域、および、３’ＵＴＲで構成される３つに分かれた構造を有する。ＵＴＲは、ｍＲＮＡの、転写後翻訳効率（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３１：８７−１０６，１９９９）、細胞内局在（Ｊａｎｓｅｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：２４７−２５６，２００１）、および、安定性（Ｂａｓｈｉｒｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（１３）：７０２５−７０２８、２００１）において主な役割を果たすことができる。ｍＲＮＡの半減期は、生産される対応するタンパク質の量に影響を及ぼし得るので、ｍＲＮＡ安定性は、遺伝子発現の調節に必須であり得る。ある場合には、３’ＵＴＲ内のシス作用エレメント、例えばＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、ｍＲＮＡ転写産物の安定性および翻訳効率を調整することが可能である（Ｍｕｈｌｒａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：２１００−２１１１，１９９２；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６５４８−６５５９，１９９８）。ある場合には、例えば、これらのエレメントは、対応する転写産物の迅速な崩壊を誘導し得ることに注意すべきである。ｍＲＮＡ安定性および翻訳効率の低下は、レアカットエンドヌクレアーゼによる高度に標的化された突然変異誘発を有することが有害である適用において有用であり得る（例えば、遺伝子のシングルコピーの破壊）。
【００２３】
本明細書に記載のように、転写産物の半減期を増大または低減するＵＴＲの能力は、植物、植物部分、または植物細胞にｍＲＮＡを導入するための新規の方法を提供し得る。ｍＲＮＡが、植物内の特定の配列を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼをコードする場合、半減期の増大は、所望の標的配列におけるゲノム操作のレベルの増大をもたらし得る。
【００２４】
本明細書において用いられる用語、「植物」および「植物部分」は、親植物の際立った特徴を保持する、細胞、組織、器官、種子、および切断部分（例えば、根、葉、および花）を指す。「種子」は、受精の存在下または不存在下で形成されるかに関係なく、および、種子構造が稔性または不稔性であるか否かに関係なく、開花におけるその正常な成熟ポイントに続く、植物の胚珠の継続的な分化により形成される任意の植物構造を指す。
【００２５】
本明細書において用いられる「突然変異誘発」は、突然変異が、選択されたＤＮＡ配列内に導入されるプロセスを指す。エンドヌクレアーゼによって誘導される突然変異は、一般に、二本鎖切断によって得られて、それは、ディープ−シーケンシング解析により検出することができる挿入／欠失突然変異（「インデル」）をもたらす。そのような突然変異は典型的に、数個の塩基対の欠失であり、突然変異された対立遺伝子を不活化する作用を有する。本明細書に記載の方法では、例えば、突然変異誘発は、植物細胞内の選択されたＤＮＡ配列を標的化するヌクレアーゼによりなされる二本鎖ＤＮＡ切断を介して生じる。そのような突然変異誘発は、「ヌクレアーゼによって誘導される突然変異」（例えば、ヌクレアーゼによって誘導されるノックアウト、例えば、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼによって誘導されるノックアウト）、および、標的化された遺伝子の発現低下をもたらす。突然変異誘発の後に、植物は、公知の技術を用いて、処理された細胞から再生され得る（例えば、従来の培養手順に従って種子を植えて、その後に自家受粉させる）。
【００２６】
本明細書において用いられる用語「発現」は、センスまたはアンチセンスのＲＮＡまたはｍＲＮＡを生産するための特定の核酸配列の転写、および／または、ポリペプチドを生産するためのｍＲＮＡ分子の翻訳（その後に翻訳後イベントを伴うまたは伴わない）を指す。
【００２７】
本明細書において用いられる用語「調整」は、ｍＲＮＡの翻訳効率の増大または低減を指す。これは、５’ＵＴＲ配列、３’ＵＴＲ配列、または、５’および３’ＵＴＲ配列を、挿入、除去、または変更することによって達成され得る。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「核酸」は、ヌクレオチドモノマーで構成されるポリマーを指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であってよく、線状または環状であってよい。一本鎖である場合は、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であってよい。核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせ）、ＲＮＡ、または、ＤＮＡおよびＲＮＡからなり得る。さらに、核酸は、制限されないが、プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、コード配列、およびターミネーターを含む、遺伝子発現に関する情報を含んでよい。
【００２９】
「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製を引き起こすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得る、プラスミド、ファージ、またはコスミドのようなレプリコンである。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントと関連する場合に複製が可能である。適切なベクター主鎖は、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣのような、当該分野で日常的に用いられるものを含む。用語「ベクター」は、クローニングおよび発現ベクター、ならびに、ウイルスベクターおよび組込みベクターを含む。「発現ベクター」は、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターであり、および「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。適切な発現ベクターは、制限されずに、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および、アデノ随伴ウイルスに由来する、プラスミドおよびウイルスベクターを含む。非常に多くのベクターおよび発現システムが、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、および、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような会社から市販される。
【００３０】
用語「調節領域」、「制御エレメント」および「発現制御配列」は、転写または翻訳の開始および速度、および、転写産物またはポリペプチド産物の安定性および／または可動性に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。調節領域は、制限されずに、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’ＵＴＲ、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、および、コード配列内に存在し得る他の調節領域、例えば、分泌型シグナル、核局在化配列（ＮＬＳ）およびプロテアーゼ切断部位を含む。
【００３１】
本明細書において用いられる「動作可能に連結される」は、発現制御配列が目的のコード配列の発現を効果的に制御するように遺伝構築物内に組み込まれることを意味する。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡに転写することが可能な場合、「動作可能に連結されて」、および、細胞内の発現制御配列の「制御下」であり、それは、ｍＲＮＡならば、それから、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る。したがって、調節領域は、改変された標的核酸を発現することが望まれる植物細胞、植物、または植物組織における転写を、調整、例えば、調節、促進、または駆動することができる。
【００３２】
プロモーターは、典型的には、転写開始点の１００ヌクレオチド上流内（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関する開始部位付近）のＤＮＡ分子の領域からなる発現制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始および調整するための他のタンパク質の認識および結合に関与する。コード配列を、プロモーターの制御下に置くために、典型的に、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置することが必要である。しかしながら、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドも上流に、または、転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に配置され得る。プロモーターは典型的に、少なくともコア（基礎）プロモーターを含む。またプロモーターは、上流エレメントのような少なくとも１つの制御エレメントを含んでもよい。そのようなエレメントは、上流活性化領域（ＵＡＲ）、および場合により、合成の上流エレメントのようなポリヌクレオチドの転写に影響を及ぼす他のＤＮＡ配列を含む。
【００３３】
含まれるべきプロモーターの選択は、制限されないが、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および、細胞または組織特異性を含むいくつかの因子に依存する。例えば、特定の組織、器官、および細胞型においてのみまたは優勢的にそれぞれ転写を与える、組織−、器官−および細胞−特異的プロモーターが用いられ得る。一部の実施態様では、茎、実質組織、基本分裂組織、維管束、形成層、師部、皮層、茎頂分裂組織、側枝分裂組織、根端分裂組織、側根分裂組織、葉原基、葉の葉肉、または葉の表皮のような植物性組織に特異的なプロモーターが、適切な調節領域であり得る。一部の実施態様では、種子に本質的に特異的なプロモーター（「種子選択的プロモーター」）が有用であり得る。種子特異的プロモーターは、種子発生中に、胚乳および子葉組織において、動作可能に連結された核酸の転写を促進することができる。あるいは、構成的プロモーターは、植物発生の全体を通して、植物のほとんどまたは全ての組織において、動作可能に連結された核酸の転写を促進することができる。他のクラスのプロモーターは、限定されないが、誘導性プロモーター、例えば、外部刺激、例えば化学薬品、発育刺激、または環境刺激に応答して転写を与えるプロモーターを含む。
【００３４】
本明細書で提供される核酸構築物内に含まれ得るプロモーターの非限定的な例は、構成的に発現されるプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域およびトウモロコシユビキチン−１プロモーター、果実特異的プロモーター、例えば、ＡＣＣ−オキシダーゼ（Ｂａｒｒｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．９：５２５−５３５，１９９６）およびＥ８プロモーター（Ｍｅｈｔａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６１３−６１８，２０１１）、種子特異的プロモーター、例えば、ＨａＧ３−Ａ（Ｂｏｇｕｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２２：４９−５７，１９９０）およびＰｓｌ（ｄｅ  Ｐａｔｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：１３３−１４０，１９９４）プロモーター、花組織特異的プロモーター、例えば、ＥＮＤ１（Ｇｏｍｅｚ，Ｐｌａｎｔａ  ２１９：９６７−９８１，２００４）およびＴｏｍＡ  １０８（Ｘｕ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２５：２３１−２４０，２００６）プロモーター、根特異的プロモーター、例えば、Ｂ３３（Ｆａｒｒａｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１１：３３７−３４６，２００２）およびＲＢ７（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ  ５７：３９０１−３９１０，２００６）プロモーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’または２’プロモーター、Ｂｕｓｋ（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１２８５−１２９５，１９９７）により記載のトウモロコシの葉特異的な遺伝子由来のプロモーター、トウモロコシおよび他の種由来のｋｎ  １−関連遺伝子、および化学物質−誘導性プロモーター、例えば、ＸＶＥ（Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２４：２６５−２７３，２０００）およびＧＶＧ（Ａｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｃｈｕａ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：６０５−６１２，１９９７）プロモーターシステムを含む。
【００３５】
５’ＵＴＲは、転写されるが、翻訳されず、転写開始部位と翻訳開始コドンとの間に存在し、＋１ヌクレオチドを含んでよい。３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンと転写末端との間に配置され得る。ＵＴＲは、ｍＲＮＡメッセージ安定性の増大または翻訳減衰のような特定の機能を有し得る。３’ＵＴＲの例は、限定されずに、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。コード領域の３’末端におけるポリアデニル化領域は、コード配列に動作可能に連結されてもよい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子由来、様々な他の植物遺伝子由来、または、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ由来であってよい。
【００３６】
本明細書において用いられる用語「レアカットエンドヌクレアーゼ」は、約１２〜４０ｂｐの長さ（例えば、１４〜４０、１５〜３６、または１６〜３２ｂｐの長さ；例えば、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：２３−２６，２０１２を参照）の認識配列（標的配列）を有する核酸配列に向けられるエンドヌクレアーゼ活性を有する天然または改変タンパク質を指す。典型的なレアカットエンドヌクレアーゼは、それらの認識部位の内側で切断を生じさせて、３’−ＯＨまたは５’−ＯＨ突出を有する４ｎｔスタガードカットを残す。一部の実施態様では、レアカットエンドヌクレアーゼは、野生型または変異型ホーミングエンドヌクレアーゼのようなメガヌクレアーゼであってよい（例えば、ドデカペプチドファミリーに属するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ；配列番号９）（ＷＯ２００４／０６７７３６を参照）。一部の実施態様では、レアカットエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断活性を有する触媒ドメインを含む融合タンパク質であってよい。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインの融合の例である。カスタム化されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、商品名ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の商品名の下で市販される。
【００３７】
ＴＡＬＥは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属内の植物病原細菌において見られる。これらのタンパク質は、疾患における重要な役割を果たし、または、宿主ＤＮＡに結合してエフェクター特異的な宿主遺伝子を活性化することにより、防御を引き起こす（例えば、Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１１２２−１１２５，２００５；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１０５０３−１０５０８，２００６；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１，２００７；Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：１０７２０−１０７２５，２００７；および、Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４５−６４８，２００７を参照）。特異性は、エフェクター可変性の不完全な数（ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）、典型的には３４アミノ酸リピートに依存する（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６３：２５６−２７２，２００６；および、ＷＯ２０１１／０７２２４６）。多型は、主に、繰り返しの１２位および１３位に存在し、本明細書において、ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）と呼ぶ。
【００３８】
ＴＡＬＥのＲＶＤは、１つのＲＶＤが１つのヌクレオチドに、直接的な直線状でそれらの標的部位内のヌクレオチドに対応し、一部が縮重していて、明らかなコンテキスト依存性はない。タンパク質−ＤＮＡ認識に関するこのメカニズムは、新たな標的特異的なＴＡＬＥに関する標的部位の予測、ならびに、標的部位の選択および選択部位に関して結合特異性を有する新たなＴＡＬＥの工学を可能にする。
【００３９】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼ配列のような他の配列に融合され得て、特異的な、選択されたＤＮＡ配列を標的化するキメラエンドヌクレアーゼをもたらし、標的化された配列において、またはその近くで、ＤＮＡのその後の切断をもたらす。ＤＮＡにおけるそのような切断（二本鎖切断）は、例えば、ＮＨＥＪまたは相同組み換えを介して野生型ＤＮＡ配列内に突然変異を誘導することができる。ある場合には、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを用いて、複合体ゲノムにおける部位特異的な突然変異誘発を促進することができ、高精度および高効率で遺伝子機能をノックアウトまたは他の方法で変化させる。以下の実施例に記載のように、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  ＡＬＳ遺伝子を標的化するＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを用いて内因性遺伝子を突然変異誘発することができ、標的部位におけるインデルによって確認される。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）がダイマーとして機能するという事実を用いて、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼの標的特異性を高めることができる。例えば、ある場合には、異なるＤＮＡ配列（例えば、図１に示される下線を引いた標的配列；配列番号２および３）を標的化したＴＡＬＥ−ヌクレアーゼモノマーのペアが用いられ得る。２つのＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ認識部位が図１に示されるように極めて接近している場合は、不活性のモノマーが一緒になって、ＤＮＡを切断する機能性酵素を作ることができる。ヌクレアーゼを活性化するためにＤＮＡ結合を要求することによって、高度に部位特異的な制限酵素を作ることができる。
【００４０】
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法は、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、またはその一部（例えば、サブユニット）の使用を含んでよい。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ適応免疫系由来の、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）−関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）に基づいて開発されている新規のゲノム工学ツールである（例えば、Ｂｅｌａｈｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３９、２０１３を参照）。このシステムは、プロト−スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られる短い配列モチーフが隣接したＤＮＡ配列を切断することができる。切断は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと関連する標的配列に相補である特異的なＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計することによって達成される。この複合体では、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）：ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを同起源の標的配列に向かわせるガイドＲＮＡとして作用する。また、それ自体でＣａｓ９エンドヌクレアーゼを標的することが可能な、合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も開発されている。本明細書に記載のＵＴＲ配列を利用してこのツールを発現して、植物細胞を遺伝学的に操作することができる。したがって、一部の実施態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのコード配列およびｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡは、本発明に提供される発現プラスミドから一時的に発現され得る。
【００４１】
２型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの別のプログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼも説明されていて、遺伝子編集目的のために用いられている（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６３：７５９−７７１，２０１５）。このシステムは、Ｃｐｆ１タンパク質ファミリー由来の非特異的なエンドヌクレアーゼユニットを使用し、単一のｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ  ＲＮＡを欠く）によって与えられる切断の特異性を有する。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１コード配列を本明細書に記載のＵＴＲ配列に融合して、その安定性を、およびそれ故に、結果として生じる遺伝子編集方法の効率を、改善することができる。
【００４２】
したがって、本文書は、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼシステムを用いた遺伝子編集のための方法も提供し、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１コード配列は、本明細書に開示されるもののような適切な安定化ＵＴＲ配列に融合される。
【００４３】
特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号によって参照される配列との間の、配列同一性パーセントは、以下のように決定される。最初に、核酸またはアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンによるＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、特定の配列識別番号で示された配列と比較される。このＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてオンラインで得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使い方を説明するインストラクションは、ＢＬＡＳＴＺに付随するリードミー・ファイルに見つけることができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、２つの配列間の比較を、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて行なう。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために用いられ、一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するためには、オプションは以下のように設定される：−ｉは、比較される第一の核酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二の核酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定され（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは、−１に設定され；−ｒは、２に設定され；および、全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを用いて、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを作り出すことができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ  −ｑ  −１  −ｒ  ２。２つのアミノ酸配列を比較するためには、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のように設定される：−ｉは、比較される第一のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定され（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；および、全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを用いて、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを作り出すことができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較される配列がホモロジーを共有する場合は、その結果、指定の出力ファイルは、並べられた配列として、ホモロジーのこれらの領域を示す。２つの比較される配列がホモロジーを共有しない場合は、その結果、指定の出力ファイルは、並べられた配列を示さない。
【００４４】
並べられた時点で、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を数えることにより、マッチ数を決定する。配列同一性パーセントは、同定された配列（例えば、配列番号１）に示される配列の長さ、または、連結された（ａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ）長さ（例えば、同定された配列に示される配列由来の１００の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで、マッチ数を割って、その後、生じた値に１００を掛けることにより決定される。例えば、配列番号１に示される配列と並べた場合に２４０マッチを有する核酸配列は、配列番号３に示される配列と９４．９％同一である（すなわち、２４０÷２５３×１００＝９４．９）。配列同一性パーセント値は、小数第一位に四捨五入されることに注意すべきである。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は、７５．１に切り捨てられて、一方で、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さの値は常に整数であることにも注意すべきである。
【００４５】
本文書は、（ａ）コード配列および（ｂ）５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む、発現プラスミドを提供する。一部の実施態様では、５’ＵＴＲは、配列番号１０または配列番号１２に示す配列、または、配列番号１０または配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する配列を有してよい。一部の実施態様では、３’ＵＴＲは、配列番号１１または配列番号１３に示される配列、または、配列番号１１または配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する配列を有してよい。一部の実施態様では、５’ＵＴＲは、配列番号１０に示す配列、または、配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する配列を有してよく、３’ＵＴＲは、配列番号１１に示す配列、または、配列番号１１と少なくとも９５％同一性を有する配列を有してよい。一部の実施態様では、５’ＵＴＲは、配列番号１２に示す配列、または、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有する配列を有してよく、３’ＵＴＲは、配列番号１３に示す配列、または、配列番号１３と少なくとも９５％同一性を有する配列を有してよい。本明細書において提供される発現プラスミドは、ｍＲＮＡ転写産物のインビトロでの発現または植物内での発現のために構築され得る。
【００４６】
本明細書において提供される発現プラスミドは、例えば、（ａ）５’プロモーター領域、（ｂ）５’ＵＴＲ、（ｃ）ポリペプチドをコードする構造コード配列、および（ｄ）ポリアデニル化テール［ポリ（Ａ）−テール］を含んでよく、ここで、５’プロモーター領域および５’ＵＴＲは、ポリペプチドをコードする配列が、植物細胞へのプラスミドの導入後に植物細胞内で一時的に発現され得るように、構造コード配列に動作可能に連結される。一部の実施態様では、本明細書において提供される発現プラスミドは、（ａ）５’プロモーター領域、（ｂ）ポリペプチドをコードする構造コード配列、（ｃ）３’ＵＴＲ、および（ｄ）ポリ（Ａ）−テールを含んでよく、ここで、５’プロモーター領域および３’ＵＴＲは、ポリペプチドをコードする配列が、植物細胞へのプラスミドの導入後に植物細胞内で一時的に発現され得るように、構造コード配列に動作可能に連結される。一部の実施態様では、発現プラスミドは、（ａ）５’プロモーター領域、（ｂ）５’ＵＴＲ、（ｃ）ポリペプチドをコードする構造コード配列、（ｄ）３’ＵＴＲ、および（ｅ）ポリ（Ａ）−テールを含んでよく、ここで、５’プロモーター領域、５’ＵＴＲ、および、３’ＵＴＲは、ポリペプチドをコードする配列が、植物細胞へのプラスミドの導入後に植物細胞内で一時的に発現され得るように、構造コード配列に動作可能に連結される。
【００４７】
５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよい（例えば、アグロバクテリウムのような細菌系、または、ジェミニウイルスのようなウイルス系のいずれかに由来してよいプロモーター配列）。５’プロモーター領域は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含んでよい。プロモーターが誘導性である場合は、本明細書において提供される方法は、プロモーターを誘導するステップを含んでよい。
【００４８】
ポリペプチドをコードする配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニット（例えば、ダイマーとして機能するエンドヌクレアーゼのモノマー）をコードしてよい。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらし得る。
【００４９】
任意の適切なＵＴＲ、または、ＵＴＲの組み合わせが用いられ得る。本明細書における実施例に記載されるように、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのｍＲＮＡ転写産物に由来する特定のＵＴＲは、ポリペプチドをコードする配列に動作可能に連結されると、配列特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの安定性を増大させることが可能である。そのようなＵＴＲは、遺伝子Ａｔ１Ｇ０９７４０（配列番号１０および１１）由来であってよく、鉄イオン飢餓、鉄イオン輸送、硝酸輸送に対する細胞応答、真菌起源の分子に対する応答、および、硝酸に対する応答に関与すると解釈されている。このタンパク質は、ユニバーサルストレスタンパク質Ａ（ＵｓｐＡ）ドメインをコードし、それは、小細胞質細菌性タンパク質であり、その発現は、細胞がストレス作用物質に曝された場合に高められる（Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ［ＴＡＩＲ］，ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｓｅｒｖｌｅｔｓ／ＴａｉｒＯｂｊｅｃｔ？ｔｙｐｅ＝ｌｏｃｕｓ＆ｎａｍｅ＝Ａｔ１ｇ０９７４０でオンラインにより利用可能である）。Ａｔ１Ｇ０９７４０  ｍＲＮＡ転写産物は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるｍＲＮＡ崩壊速度のゲノムワイド分析において、７３．８時間の半減期を有することが決定された（Ｎａｒｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９：３４１８−３４３６，２００７）。したがって、一部の実施態様では、Ａｔ１Ｇ０９７４０  ＵＴＲによって与えられる増大した安定性は、より高くてより持続したレベルで部位特異的なヌクレアーゼが発現されるのを可能にし得て、増大した頻度の標的化された突然変異誘発をもたらす。
【００５０】
ある場合には、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｍＲＮＡ転写産物に由来するＵＴＲは、配列特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの安定性を低下させ得る。そのようなＵＴＲは、遺伝子Ａｔ５Ｇ２８０５０（配列番号１２および１３）由来であってよく、プリンヌクレオシド異化プロセスと関連すると解釈されて、亜鉛イオン結合において機能する（Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ［ＴＡＩＲ］、上記）。Ａｔ５Ｇ２８０５０  ｍＲＮＡ転写産物は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおけるｍＲＮＡ崩壊速度のゲノムワイド分析において、３４．１時間の半減期を有することが決定された（Ｎａｒｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。したがって、ある場合には、Ａｔ５Ｇ２８０５０  ＵＴＲによって与えられる低下した安定性は、部位特異的なヌクレアーゼがより低いレベルで発現されるのを可能にし得て、それは、低下した転写（例えば、低下した毒性、低下したオフターゲット切断、標的化された遺伝子コピーの低下）によって恩恵を受ける適用において有用であり得る。
【００５１】
本明細書において提供される材料および方法において有用であり得るＵＴＲ配列の他の例は、Ｎａｒｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）によって記載されて、それは、Ａｔ１Ｇ０９７４０遺伝子のものと同様の効果を有し得る、ＵＴＲを有する数千個の遺伝子のリストを含む。
【００５２】
また、本文書は、本明細書に記載の発現プラスミドを含む宿主細胞も提供する。適切な宿主細胞は、制限されずに、植物細胞または植物細胞株（例えば、プロトプラスト、葉肉細胞、胚軸細胞、または未分化カルス細胞）、細菌細胞、酵母細胞、および動物細胞（例えば、非ヒト細胞、または、哺乳類のような動物由来の細胞）を含む。
【００５３】
加えて、本文書は、植物細胞におけるポリペプチドの一過性発現を調整する（例えば、増大または低減させる）方法を提供する。当該方法は、例えば、植物細胞内に、（ａ）５’プロモーター領域、（ｂ）任意選択の５’ＵＴＲ、（ｃ）ポリペプチドをコードする構造コード配列、（ｄ）任意選択の３’ＵＴＲ、および（ｅ）ポリ（Ａ）−テール、を含む核酸を導入するステップを含んでよく、ここで、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの一方または両方が存在し、ここで、５’プロモーター領域、５’ＵＴＲ（存在する場合）、および３’ＵＴＲ（存在する場合）は、ポリペプチドが植物細胞内で一時的に発現されるように、構造コード配列に動作可能に連結される。上述のように、５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよく、５’プロモーター領域は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含んでよく（その場合は、その方法は、プロモーターを誘導するステップを含んでよい）、ポリペプチドをコードする配列は、植物細胞内のＤＮＡ配列（例えば、内因性ゲノム配列）を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよい。植物細胞におけるレアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、エンドヌクレアーゼがその標的部位でＤＮＡを切断する場合、部位特異的な突然変異誘発をもたらし得る。
【００５４】
任意の適切な方法を用いて、核酸を植物細胞内に導入することができる。一部の実施態様では、例えば、本明細書に記載の方法は、植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物（例えば、アグロバクテリウムのようなバクテリウム）と接触させるステップを含んでよく、ここで、生物は、プロモーター、ＵＴＲ、コード配列、および、ポリ−Ａテールを含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、ＴｉまたはＲｉプラスミドを含む。他の実施態様では、植物細胞におけるポリペプチドの一過性発現を調整するための方法は、核酸を含むプラスミドを導入するための、ＰＥＧが介在する、微粒子銃が介在する、またはエレクトロポレーションが介在する、植物細胞（例えば、プロトプラスト）の形質転換を用いるステップを含んでよい。
【００５５】
また、本文書は、植物を生産するための方法も提供する。当該方法は、例えば、（ａ）植物細胞に、（ｉ）５’プロモーター領域、（ｉｉ）任意選択の５’ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ポリペプチドをコードする配列、（ｉｖ）任意選択の３’ＵＴＲ、および（ｖ）ポリ（Ａ）−テール、を含む核酸を導入するステップ（ここで、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの一方または両方が存在し、ここで、５’プロモーター領域、５’ＵＴＲ（存在する場合）、および、３’ＵＴＲ（存在する場合）は、ポリペプチドが植物細胞内で一時的に発現されるように、構造コード配列に動作可能に連結される）、および（ｂ）植物細胞を植物に再生させるステップ、を含んでよい。ポリペプチドをコードする配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよく、再生植物は、レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現によって生産される１つまたは複数の突然変異を含んでよい。
【００５６】
再度、任意の適切な方法を用いて、プラスミドを植物細胞内に導入することができる。例えば、植物細胞は、ポリペプチドをコードする配列が植物細胞内で発現されるように、前述の核酸を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する改変されたＴｉまたはＲｉプラスミドを含む遺伝子水平伝播が可能な生物（例えば、アグロバクテリウム）と接触され得る。他の実施態様では、ＰＥＧが介在する、微粒子銃が介在する、または、エレクトロポレーションが介在する形質転換を用いて、前述の核酸を含む発現プラスミドを、植物細胞に導入することができる。
【００５７】
一部の実施態様では、内因性遺伝子内に突然変異を有する植物、植物細胞、または植物部分を生産するために、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲに動作可能に連結されたレアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づくヌクレアーゼ）を用いるための方法は、例えば、本明細書における実施例に記載のベクターを用いるステップを含んでよい。例えば、選択された配列（例えば、図１に示されるＡＬＳ２配列）を標的化するＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードする１つまたは複数の核酸は、それらが発現され得る植物細胞（例えば、プロトプラスト、葉肉細胞、胚軸細胞、または未分化カルス細胞）内に形質転換され得る。ある場合には、１つまたは複数のＴＡＬＥ−ヌクレアーゼタンパク質は、植物細胞（例えば、プロトプラスト）内に導入され得る。植物細胞、または、植物細胞から生産される植物細胞株または植物部分（単数または複数）をその後に分析して、ゲノムの遺伝子座における突然変異を検出するための核酸に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング、または、ＰＣＲ後のＴ７Ｅ１アッセイ；Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２８３−９２９３，２０１１）を用いて、標的部位（単数または複数）に突然変異が導入されたかどうか決定することができる。
【００５８】
また、本文書は、本明細書に記載の方法での使用のために、本明細書に記載の１つまたは複数の発現プラスミドを、パッキング材料および１つまたは複数のさらなる構成要素（例えば、バッファーまたは他の試薬）と組み合わせて含む製品も提供する。一部の実施態様では、製品は、本明細書において提供される発現プラスミドにより形質転換された宿主細胞を含んでよい。１つまたは複数のプラスミドおよび／または宿主細胞は、製品を準備するために、当技術分野でよく知られているパッケージング材料を用いてパッケージされ得る。また、製品は、ラベル（例えば、パッケージング材料に固定されたタグまたはラベル、パッケージング材料上に印刷されたラベル、または、パッケージ内に挿入されたラベル）を有してもよい。ラベルは、パッケージ内に含まれるプラスミド（単数または複数）および／または宿主細胞が、例えば遺伝子改変植物を生産するために用いられ得ることを示し得る。
【００５９】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されて、それは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００６０】
実施例１−ＡＬＳ２遺伝子を突然変異誘発するための配列特異的ヌクレアーゼの操作
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ内のＡＬＳ２遺伝子を完全に不活性化またはノックアウトするために、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を特異的に同定するソフトウェア（例えば、ＴＡＬＥ−ＮＴ２．０；Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０：Ｗ１１７−１２２，２０１２）を用いて、ＡＬＳ２タンパク質コード配列のすぐ下流の配列を標的化する配列特異的ヌクレアーゼを設計した。ＡＬＳ２遺伝子に関するＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ標的部位を図１に示し、以下の表１にも示す；このＴＡＬＥ−ヌクレアーゼペアは、ＡＬＳ２＿Ｔ１と指定される。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から得られた。
【００６１】
実施例２−酵母におけるＡＬＳ２−Ｔ１  ＴＡＬＥヌクレアーゼ活性
ＡＬＳ２遺伝子を標的化するＴＡＬＥ−ヌクレアーゼの活性を評価するために、他のどこかに記載のもの（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：７５７−７６１，２０１０）と同様の方法を用いて、酵母において活性アッセイを実施した。これらのアッセイのために、非機能性β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子内にＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ認識部位がクローニングされた標的プラスミドを構築した；ＰＥＧが介在する形質転換（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、プラスミドを酵母に形質転換した。標的部位を含む配列は、レポーター遺伝子が、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼペア（翻訳伸長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ１）プロモーターによって発現される）によって切断されたら、組み換えがダイレクトリピート間で生じて、機能がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に回復されるように、β−ガラクトシダーゼコード配列のダイレクトリピートによって隣接された。β−ガラクトシダーゼ活性は、したがって、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ切断活性の尺度としての役割を果たした。酵母アッセイでは、ＡＬＳ２＿Ｔ１  ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼペアは、切断活性を示した。活性を、ベンチマークのヌクレアーゼ、Ｉ−ＳｃｅＩに標準化した。結果を表２に要約する。
【００６２】
実施例３−高い安定性の発現プラスミドの構築
標的細胞のゲノムへの外因性ＤＮＡの組込みを伴わずに所望のヌクレアーゼの一過性発現を達成するために、Ａｔ１Ｇ０９７４０（配列番号１０および１１）、Ａｔ５Ｇ２８０５０（配列番号１２および１３）、アクチン（配列番号１４および１５）、または、Ａｔ４Ｇ１６１９０（配列番号１６および１７）のいずれか由来の５’および３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ発現ベクターを合成した（図３）。これらのＵＴＲを発現構築物に加える効果を評価して、ＮＨＥＪ頻度によって測定されるヌクレアーゼまたはヌクレアーゼｍＲＮＡに関する増大した安定性および／または翻訳効率のレベルを決定した。高いｍＲＮＡ発現プラスミドを構築するために、制限酵素を用いてｐＳＰ７２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）（図２）を改変して、（ｉ）５’ＵＴＲ配列、（ｉｉ）リンカー配列、および（ｉｉｉ）３’ＵＴＲ配列を含む、合成カセット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を挿入した。このカセットを合成して、付着端制限部位ライゲーションを用いて改変ｐＳＰ７２にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉでの検証後に、このプラスミドを制限酵素消化に供して、その後にＴＡＬＥ−ヌクレアーゼサブユニットのライゲーションをして、所望の産物を得た（図４）。
【００６３】
実施例４−５’および３’ＵＴＲを含む発現ベクターを用いた、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストにおける増大したＮＨＥＪ頻度
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ内の内因性標的部位におけるＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ活性を、プロトプラストにおいて、Ａｔ１Ｇ０９７４０（配列番号１０および１１）、Ａｔ５Ｇ２８０５０（配列番号１２および１３）、アクチン（配列番号１４および１５）、または、Ａｔ４Ｇ１６１９０（配列番号１６および１７）のいずれか由来の５’および３’ＵＴＲに動作可能に連結されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを発現することによって測定して、その後に、ＮＨＥＪによって導入された突然変異に関する標的部位を調べた。プロトプラスト調製のための方法は、他のどこかに記載のとおりに行なった（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５，２００５）。手短には、種子を、１００％エタノール、５０％漂白剤およびそれから滅菌蒸留水を用いて連続的にそれらを洗浄することによって滅菌した。滅菌された種子を、鉄で補充されたＭＳアガロース培地上に植えた。プロトプラストを、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記）によって記載されるプロトコルを用いて、若い広がった葉から単離した。
【００６４】
５’および３’ＵＴＲに動作可能に連結されたＴＡＬＥヌクレアーゼコード配列を含むプラスミドを、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードするプラスミドとともに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が介在する形質転換（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１５６５−１５７２，２００７）によって、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラスト内に導入した。処理の２４時間後、蛍光顕微鏡を用いて形質転換効率を測定して、形質転換されたプロトプラストのアリコート中のＹＦＰ蛍光をモニターした。形質転換されたプロトプラストの残部を採取して、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に基づく方法を用いてゲノムＤＮＡを調製した。プロトプラストから調製されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ認識部位を包含する２３５ｂｐフラグメントを、ＰＣＲによって増幅した。スペーサー領域内に挿入／欠失（インデル）突然変異を有するシーケンシングリードは、ＮＨＥＪによる切断されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ認識部位の不正確な修復に由来すると考えられた。突然変異誘発頻度を、全シーケンシングリードのうちのＮＨＥＪ突然変異を有するシーケンシングリードの数として計算した。
【００６５】
３つの生物学的レプリケートを実施した。ＵＴＲの付加を有するまたは有さないＡＬＳ２  ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼペアの活性を表３に要約する。Ａｔ５Ｇ２８０５０  ＵＴＲを伴って送達されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡに関して５．１％、および、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡがＵＴＲを含まなかった形質転換に関して７．７％であったのと比べて、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼがＡｔ１Ｇ０９７４０  ＵＴＲを有するｍＲＮＡとして送達された場合は、１５．５％のＮＨＥＪ頻度がＡＬＳ２遺伝子座において観察された。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードするＤＮＡがＡｔ５Ｇ２８０５０  ＵＴＲを伴って送達された形質転換に関して２７．１％、および、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードするＤＮＡがＵＴＲを含まなかった形質転換に関して７０．７％であったのと比べて、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼが、Ａｔ１Ｇ０９７４０  ＵＴＲを有するＤＮＡとして送達された場合は、７７．３％のＮＨＥＪ頻度がＡＬＳ２遺伝子座において観察された。ＡＬＳ２における、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼによって誘導される突然変異の例を、図５および図６に示す。全ての４つのＵＴＲペアによる突然変異頻度の要約を図７に示す。
【００６６】
実施例５−ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼがｍＲＮＡによって送達される場合の挿入頻度の低下
ヌクレアーゼ送達に関してＤＮＡよりもｍＲＮＡを用いることの利点は、外来ＤＮＡを含まない植物が作られる可能性がより高いことであり、このことは、ゲノム操作を通して作られる作物品種に関する規制負荷を減らし得る。この仮定と一致して、４５４ピロシーケンスデータからの挿入／欠失（インデル）突然変異プロファイルの分析は、ｍＲＮＡおよびＤＮＡ試薬によって作られる突然変異のタイプにおいて大きな不一致を明らかにした。ｍＲＮＡを用いて形質転換された細胞に関する１．９８％の挿入頻度と比較して、ＤＮＡ構築物を用いて形質転換された細胞は、６．２５％の平均挿入頻度を有した。ＤＮＡ試薬を用いて作られた挿入のうち、８８％は＞１０ｂｐであり、９０ｂｐのメジアン挿入サイズであった（図８）。対照的に、ｍＲＮＡ送達によって生じる挿入のたった２４％のみが＞１０ｂｐであり、３ｂｐのメジアン挿入サイズを有した。ＤＮＡ形質転換実験に関して、挿入≧１０ｂｐの大多数（＞９０％）は、プラスミドベクター；すなわち、ＴＡＬＥＮをコードするプラスミド由来の挿入された配列に由来した。対照的に、ｍＲＮＡ形質転換実験に起因する挿入のたった１つのみが、ＴＡＬＥＮコード配列と一致する挿入（１３１ｂｐ）を有した。この挿入は、発現ベクターがインビトロ転写後にＤＮａｓｅ処理によって完全に消化されなかった場合、ＤＮＡ汚染によって生じた可能性がある。
【００６７】
組み合わせると、これらのデータは、ｍＲＮＡ送達は、稀にしかＤＮＡ挿入を伴わない突然変異プロファイルを生じさせることを示し、それは、突然変異を含むが外来ＤＮＡを含まない植物を作るのに有利であり得る。
【００６８】
2018527004.tif 000002
2018527004.tif 000003
【００６９】
【表１】
2018527004.tif 000004
【００７０】
【表２】
2018527004.tif 000005
【００７１】
【表３】
2018527004.tif 000006
【００７２】
［他の実施態様］
本発明は、その詳細な説明とともに説明されているが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2018527004.tif 000007
【図２】
2018527004.tif 000008
【図３】
2018527004.tif 000009
【図４】
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【図５】
2018527004.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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