(57)【要約】本発明は、抗ヒプシン抗体、ならびにヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを含有するポリペプチドの検出及び単離における抗ヒプシン抗体の使用と、抗ヒプシン抗体を含む組成物及びキットと、を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド中のヒプシンに特異的に結合する単離された抗体であって、ヒプシンに隣接する、異なるアミノ酸配列を有するヒプシン含有ポリペプチドに結合する、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、前記ヒプシンを含有するポリペプチドに対して９００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を呈する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、（ｉ）前記ヒプシンを含有するポリペプチドに対して３００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）、及び（ｉｉ）前記デオキシヒプシンを含有するポリペプチドに対して２００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を呈する、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、抗原結合断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１、２、及び４〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記重鎖可変領域は、配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、配列番号２０もしくは２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１もしくは１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１及び３〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域は、配列番号２７もしくは２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１及び３〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ポリペプチド中のヒプシンに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、単離された抗体。
【請求項１５】
前記重鎖可変領域は、配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、配列番号２０もしくは２１のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
前記重鎖は、配列番号３３もしくは３４のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖は、配列番号２９もしくは３０のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
ポリペプチド中のヒプシンと特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１もしくは１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、単離された抗体。
【請求項１８】
前記重鎖可変領域は、配列番号２７もしくは２８のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
前記重鎖は、配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項２０】
ポリペプチド中のヒプシンと特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、単離された抗体。
【請求項２１】
前記重鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
前記重鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記軽鎖は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
前記抗体は、検出剤に結合している、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２６】
発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２４に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２８】
抗体を産生するための方法であって、請求項２７に記載の宿主細胞を、前記抗体を産生する条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法であって、（ａ）前記試料を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、（ｂ）前記試料中の前記ポリペプチドに結合した前記抗体を検出するステップと、を含む、前記方法。
【請求項３１】
前記抗体は、検出剤に結合している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドに結合した前記抗体は、二次薬剤を使用することによって検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出剤は、化学発光標識、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択される１つ以上のアッセイによる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料は、生体試料である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体試料は、細胞または組織を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体試料は流体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
試料中のヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法であって、（ａ）前記試料を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、（ｂ）前記抗体に結合した前記ポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記抗体は、固体表面に固定化される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料は生体試料である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体試料は、細胞または組織を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記生体試料は流体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項４４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体または請求項４３に記載の組成物を含む、キット。
【請求項４５】
試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法で前記抗体を使用するための１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
試料中のヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法で前記抗体を使用するための１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月２８日出願の米国仮特許出願第６２／２１１，６４２号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３４４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年８月２５日、サイズ：４２ＫＢ）。
【０００３】
発明の概要
本発明は、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを含有するポリペプチドを検出及び単離するための方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００４】
異常アミノ酸であるヒプシン（Ｎε−（４−アミノ−２−ヒドロキシブチル）−リジン）は、翻訳後修飾リジンである。真核細胞翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ５Ａ）は、今のところ、ヒプシンを含有することが報告されている唯一の天然型タンパク質である（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２９：７９１−７９７，１９８２、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，７８：２８６９−２８７３，１９８１）。ヒプシンを有するｅＩＦ５Ａの修飾は、２つの酵素反応を伴う。まず第１に、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）が、スペルミジンのブチルアミン部分をｅＩＦ５Ａの１つの特異的リジン残基（ヒトｅＩＦ５Ａ上の残基Ｋ５０）のε−アミノ基に輸送し、デオキシヒプシンを生じる。第２に、ヒプシン生合成は、デオキシヒプシンヒドロキシラーゼ（ＤＯＨＨ）によって触媒されるヒドロキシル化によって完了する（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，１０３：５１−５６，２００６）。翻訳伸長、ＲＮＡ結合、及びリボソームの会合等のｅＩＦ５Ａの最もよく知られている機能はヒプシン化に依存するため、ヒプシン化ｅＩＦ５Ａは、その活性形態のようである（Ｊａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７：５８３−５９８，２００６、Ｓａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４５９：１１８−１２１，２００９）。ｅＩＦ５Ａ、ならびにＤＨＳ及びＤＯＨＨのアミノ酸配列は、真核生物全体に高度に保存され、デオキシヒプシン／ヒプシンは、古細菌及び真核生物における細胞増殖のために絶対に必要である（Ｊａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１１５８−１１６１，２０００、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ．６：１１５−１２３）。ｅＩＦ５Ａにおけるヒプシンに変換されるリジン残基（Ｋ５０）及びこの修飾部位を取り囲む一次配列は高度に保存され、真核生物の進化を通じてこの異常タンパク質修飾の重要性を強調する。しかしながら、ｅＩＦ５Ａ以外の他のヒプシン化タンパク質は、これらを同定する膨大な努力にもかかわらず報告されていない（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２９：７９１−７９７，１９８２、Ｓｉｅｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１：１２８９−１３０５，２０１２）。
【０００５】
抗体に基づく親和性精製は、同定のために少量のタンパク質を濃縮するのに広く使用されている。この手法は、タンパク質リジンアセチル化（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２３：６０７−６１８，２００６、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，８：２１５−２２５，２００９）、アルギニンメチル化（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．：１１９−１２６，２００４）、及びチロシンリン酸化（Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，９７：１７９−１８４，２０００、Ｒｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｌｌ，１３１：１１９０−１２０３，２００７）の網羅的解析のために良好に使用されている。しかしながら、高親和性翻訳後修飾（ＰＴＭ）特異的かつ配列非依存性抗体は、ＰＴＭが小さいため、目的とするＰＴＭのために得るのが容易ではない。さらに、ＰＴＭ特異的状況非依存性抗体の複合体構造はこれまで報告されていない。ポリクローナルを含むいくつかの抗ヒプシンまたは抗デオキシヒプシン抗体（Ｃｌｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：４２５４−４２６３，２００３、Ｃｒａｃｃｈｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．ｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９４：２１７−２２２，２００４）及びモノクローナル抗体（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ…Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（２０）：３８８８−３９００，１９９８）が報告されている。しかしながら、これらの抗体は、ｅＩＦ５Ａペプチドに対して産生され、ｅＩＦ５Ａに結合することに対して特徴づけられている。したがって、これらの抗体はヒプシンに隣接する異なる配列を有する新規のヒプシン化タンパク質の同定にあまり適していない可能性がある。さらに、ポリクローナル抗体は、入手が困難であり、モノクローナル抗体の配列はまだ報告されていない。結果として、放射標識されたスペルミジン及びＧＣ７（ＤＨＳ阻害剤）は、依然としてｅＩＦ５Ａの機能性の研究のために最も頻繁に使用されているツールである。ヒプシンと隣接するアミノ酸配列に非依存性の、ポリペプチド上のヒプシンに結合する高親和性抗ヒプシン抗体を開発する必要性が依然として存在する。そのような抗ヒプシン抗体の発見は、新規のヒプシン化ポリペプチドの同定及び単離を可能にし得る。
【０００６】
特許出願、特許公報、及び科学文献を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
抗ヒプシン抗体、それを含む組成物、及びそれを使用する方法を本明細書に提供する。
【０００８】
隣接するアミノ酸配列に最低限依存して翻訳後修飾（ＰＴＭ）ヒプシンに結合する汎抗ヒプシン抗体を本明細書に提供する。この抗体は、ヒプシン及びデオキシヒプシンに結合し得るか、またはヒプシンには選択的に結合するが、デオキシヒプシンには結合し得ない。
【０００９】
一態様において、ポリペプチド中のヒプシンに特異的に結合する単離された抗体が本明細書に提供され、該抗体は、ヒプシンに隣接する、異なるアミノ酸配列を有するヒプシン含有ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない。いくつかの実施形態において、該抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、該抗体は、ヒプシンを含有するポリペプチドに対して９００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を呈し得る。さらなる実施形態において、該抗体は、（ｉ）ヒプシンを含有するポリペプチドに対して３００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）、及び（ｉｉ）デオキシヒプシンを含有するポリペプチドに対して２００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を呈する。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される抗体は、抗原結合断片であってもよい。本明細書の実施形態のうちのいくつかにおいて、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態において、該重鎖可変領域は、配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、配列番号２０もしくは２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。本明細書の実施形態のうちのいくつかにおいて、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１もしくは１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態において、該重鎖可変領域は、配列番号２７もしくは２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。本明細書の実施形態のうちのいくつかにおいて、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態において、該重鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、検出剤に結合している。
【００１０】
一態様において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する単離された抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態において、該重鎖可変領域は、配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、配列番号２０もしくは２１のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、該重鎖は、配列番号３３もしくは３４のアミノ酸配列を含み、かつ／または該軽鎖は、配列番号２９もしくは３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、検出剤に結合している。
【００１１】
別の態様において、ポリペプチド中のヒプシンに特異的に結合する単離された抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１もしくは１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態において、該重鎖可変領域は、配列番号２７もしくは２８のアミノ酸配列を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、該重鎖は、配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列を含み、かつ／または該軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、検出剤に結合している。
【００１２】
さらに別の態様において、ポリペプチド中のヒプシンに特異的に結合する単離された抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態において、該重鎖可変領域は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、該重鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、かつ／または該軽鎖は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、検出剤に結合している。
【００１３】
別の態様において、上記及び本明細書に記載される任意の抗体をコードする配列を含む単離された核酸が本明細書に提供される。さらに別の態様において、本明細書に記載される核酸を含むベクターが本明細書に提供される。一実施形態において、該ベクターは、発現ベクターである。さらに別の態様において、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、該宿主細胞は、抗体を発現し、産生する。
【００１４】
別の態様において、抗体を産生する方法が本明細書に提供され、本方法は、抗体を産生する条件下で、本明細書に記載され、かつ本明細書に記載される核酸を含む任意の宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞によって産生された抗体を回収することをさらに含む。
【００１５】
一態様において、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）試料を上記及び本明細書に記載される抗体と接触させるステップと、（ｂ）試料中のポリペプチドに結合した抗体を検出するステップと、を含む。一実施形態において、該抗体は、検出剤に結合している。一実施形態において、該ポリペプチドに結合した抗体は、二次薬剤を使用することによって検出される。さらなる実施形態において、検出剤は、化学発光標識、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。本明細書の方法の実施形態のうちのいくつかにおいて、検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択される１つ以上のアッセイによる。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、該試料は、生体試料であってもよい。さらなる実施形態において、該生体試料は、細胞または組織を含む。別のさらなる実施形態において、該生体試料は流体である。
【００１６】
さらに別の態様において、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法が本明細書に提供され、本方法は、（ａ）試料を上記及び本明細書に記載される抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合したポリペプチドを単離するステップと、を含む。さらなる実施形態において、該抗体は、固体表面に固定化される。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、該試料は、生体試料であってもよい。さらなる実施形態において、該生体試料は、細胞または組織を含む。別のさらなる実施形態において、該生体試料は流体である。
【００１７】
別の態様において、上記及び本明細書に記載される抗体を含む組成物が本明細書に提供される。
【００１８】
一態様において、上記及び本明細書に記載される抗体またはその組成物を含むキットが本明細書に提供される。ある実施形態において、該キットは、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法で該抗体を使用するための１つ以上の薬剤をさらに含む。別の実施形態において、該キットは、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法で該抗体を使用するための１つ以上の薬剤をさらに含む。
【００１９】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性うちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成し得ることが理解される。本発明のこれら及び他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、汎抗ヒプシン抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを示す図である。図１Ａ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２０）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２１）の軽鎖可変領域、図１Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２４）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２５）の重鎖可変領域、図１Ｃ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２３）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２３）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２２）の軽鎖可変領域、及び図１Ｄ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２７）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２８）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２６）の重鎖可変領域。親抗体（ｍＡｂＨｐｕ２４またはｍＡｂＨｐｕ９８）と親和性成熟変異体（ｍＡｂＨｐｕ２４．ＢまたはｍＡｂＨｐｕ９８．６１）との間の配列の違いが強調されている。ｍＡｂＨｐｕ９１と近縁ｍＡｂＨｐｕ９８とｍＡｂＨｐｕ９８．６１抗体との間の配列の違いも強調されている。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、汎抗ヒプシン抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを示す図である。図１Ａ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２０）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２１）の軽鎖可変領域、図１Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２４）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２５）の重鎖可変領域、図１Ｃ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２３）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２３）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２２）の軽鎖可変領域、及び図１Ｄ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２７）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２８）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２６）の重鎖可変領域。親抗体（ｍＡｂＨｐｕ２４またはｍＡｂＨｐｕ９８）と親和性成熟変異体（ｍＡｂＨｐｕ２４．ＢまたはｍＡｂＨｐｕ９８．６１）との間の配列の違いが強調されている。ｍＡｂＨｐｕ９１と近縁ｍＡｂＨｐｕ９８とｍＡｂＨｐｕ９８．６１抗体との間の配列の違いも強調されている。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、汎抗ヒプシン抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを示す図である。図１Ａ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２０）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２１）の軽鎖可変領域、図１Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２４）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２５）の重鎖可変領域、図１Ｃ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２３）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２３）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２２）の軽鎖可変領域、及び図１Ｄ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２７）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２８）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２６）の重鎖可変領域。親抗体（ｍＡｂＨｐｕ２４またはｍＡｂＨｐｕ９８）と親和性成熟変異体（ｍＡｂＨｐｕ２４．ＢまたはｍＡｂＨｐｕ９８．６１）との間の配列の違いが強調されている。ｍＡｂＨｐｕ９１と近縁ｍＡｂＨｐｕ９８とｍＡｂＨｐｕ９８．６１抗体との間の配列の違いも強調されている。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、汎抗ヒプシン抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを示す図である。図１Ａ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２０）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２１）の軽鎖可変領域、図１Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ２４（配列番号２４）及びｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ（配列番号２５）の重鎖可変領域、図１Ｃ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２３）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２３）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２２）の軽鎖可変領域、及び図１Ｄ）ｍＡｂＨｐｕ９８（配列番号２７）、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１（配列番号２８）及びｍＡｂＨｐｕ９１（配列番号２６）の重鎖可変領域。親抗体（ｍＡｂＨｐｕ２４またはｍＡｂＨｐｕ９８）と親和性成熟変異体（ｍＡｂＨｐｕ２４．ＢまたはｍＡｂＨｐｕ９８．６１）との間の配列の違いが強調されている。ｍＡｂＨｐｕ９１と近縁ｍＡｂＨｐｕ９８とｍＡｂＨｐｕ９８．６１抗体との間の配列の違いも強調されている。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、ｍＡｂＨｐｕ２４、ｍＡｂＨｐｕ９１及びｍＡｂＨｐｕ９８がヒプシンを特異的に認識することを示す一連のパネルである。図２Ａ）未精製のハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡによって示される、隣接する配列に非依存性のヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体。ペプチド（Ｐ１〜Ｐ６）の配列は、表１に提供する。塗りつぶされた棒は、ヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体のデータを示す。星印（＊）を有する塗りつぶされた棒は、非ヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体のデータを示す。図２Ｂ）ヒプシン化に必要な酵素ＤＨＳ及びＤＯＨＨの融合タンパク質を使用した、２９３個の細胞中の成熟ｅＩＦ５Ａの過剰発現の構成デザイン。図２Ｃ）ウエスタンブロット法分析によって示された天然無傷タンパク質ｅＩＦ５Ａ中のヒプシンに特異的に結合した抗ヒプシン抗体。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃは、ｍＡｂＨｐｕ２４、ｍＡｂＨｐｕ９１及びｍＡｂＨｐｕ９８がヒプシンを特異的に認識することを示す一連のパネルである。図２Ａ）未精製のハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡによって示される、隣接する配列に非依存性のヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体。ペプチド（Ｐ１〜Ｐ６）の配列は、表１に提供する。塗りつぶされた棒は、ヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体のデータを示す。星印（＊）を有する塗りつぶされた棒は、非ヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体のデータを示す。図２Ｂ）ヒプシン化に必要な酵素ＤＨＳ及びＤＯＨＨの融合タンパク質を使用した、２９３個の細胞中の成熟ｅＩＦ５Ａの過剰発現の構成デザイン。図２Ｃ）ウエスタンブロット法分析によって示された天然無傷タンパク質ｅＩＦ５Ａ中のヒプシンに特異的に結合した抗ヒプシン抗体。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、ｍＡｂＨｐｕ２４、ｍＡｂＨｐｕ９１及びｍＡｂＨｐｕ９８がヒプシンを特異的に認識することを示す一連のパネルである。図２Ａ）未精製のハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡによって示される、隣接する配列に非依存性のヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体。ペプチド（Ｐ１〜Ｐ６）の配列は、表１に提供する。塗りつぶされた棒は、ヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体のデータを示す。星印（＊）を有する塗りつぶされた棒は、非ヒプシン化ペプチドに結合した抗ヒプシン抗体のデータを示す。図２Ｂ）ヒプシン化に必要な酵素ＤＨＳ及びＤＯＨＨの融合タンパク質を使用した、２９３個の細胞中の成熟ｅＩＦ５Ａの過剰発現の構成デザイン。図２Ｃ）ウエスタンブロット法分析によって示された天然無傷タンパク質ｅＩＦ５Ａ中のヒプシンに特異的に結合した抗ヒプシン抗体。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃは、汎抗ヒプシン抗体の特異性特性評価を示す一連のパネルである。図３Ａ）ヒプシン及びデオキシヒプシンの構造。図３Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ９８はヒプシン及びデオキシヒプシンの両方に結合することができた一方で、ＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９１はヒプシンと排他的に相互作用した。結合分析を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ器具を使用して、ビオチン標識したＰ１ヒプシン含有ペプチド（１またはマゼンタによって示す）、Ｐ１−デオキシヒプシン化ペプチド（２または橙色によって示す）または非ヒプシン化ペプチド（３または青色によって示す）をストレプトアビジンバイオセンサ上に固定化し、次いで２００ｎＭの抗Ｈｐｕ  Ｆａｂｓに浸漬することにより、行った。図３Ｃ）ＦａｂＨｐｕ９８残基ＶＨＹ５２は、デオキシヒプシン及びヒプシンへの二重結合に必要不可欠であった。Ｐ１−Ｈｐｕは、Ｐ１ヒプシン含有ペプチド（１またはマゼンタによって示す）を示し、Ｐ１−デオキシは、Ｐ１−デオキシヒプシン化ペプチド（２または橙色）を示し、Ｐ１は、非ヒプシン化ペプチド（３または青色によって示す）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃは、汎抗ヒプシン抗体の特異性特性評価を示す一連のパネルである。図３Ａ）ヒプシン及びデオキシヒプシンの構造。図３Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ９８はヒプシン及びデオキシヒプシンの両方に結合することができた一方で、ＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９１はヒプシンと排他的に相互作用した。結合分析を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ器具を使用して、ビオチン標識したＰ１ヒプシン含有ペプチド（１またはマゼンタによって示す）、Ｐ１−デオキシヒプシン化ペプチド（２または橙色によって示す）または非ヒプシン化ペプチド（３または青色によって示す）をストレプトアビジンバイオセンサ上に固定化し、次いで２００ｎＭの抗Ｈｐｕ  Ｆａｂｓに浸漬することにより、行った。図３Ｃ）ＦａｂＨｐｕ９８残基ＶＨＹ５２は、デオキシヒプシン及びヒプシンへの二重結合に必要不可欠であった。Ｐ１−Ｈｐｕは、Ｐ１ヒプシン含有ペプチド（１またはマゼンタによって示す）を示し、Ｐ１−デオキシは、Ｐ１−デオキシヒプシン化ペプチド（２または橙色）を示し、Ｐ１は、非ヒプシン化ペプチド（３または青色によって示す）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、汎抗ヒプシン抗体の特異性特性評価を示す一連のパネルである。図３Ａ）ヒプシン及びデオキシヒプシンの構造。図３Ｂ）ｍＡｂＨｐｕ９８はヒプシン及びデオキシヒプシンの両方に結合することができた一方で、ＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９１はヒプシンと排他的に相互作用した。結合分析を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ器具を使用して、ビオチン標識したＰ１ヒプシン含有ペプチド（１またはマゼンタによって示す）、Ｐ１−デオキシヒプシン化ペプチド（２または橙色によって示す）または非ヒプシン化ペプチド（３または青色によって示す）をストレプトアビジンバイオセンサ上に固定化し、次いで２００ｎＭの抗Ｈｐｕ  Ｆａｂｓに浸漬することにより、行った。図３Ｃ）ＦａｂＨｐｕ９８残基ＶＨＹ５２は、デオキシヒプシン及びヒプシンへの二重結合に必要不可欠であった。Ｐ１−Ｈｐｕは、Ｐ１ヒプシン含有ペプチド（１またはマゼンタによって示す）を示し、Ｐ１−デオキシは、Ｐ１−デオキシヒプシン化ペプチド（２または橙色）を示し、Ｐ１は、非ヒプシン化ペプチド（３または青色によって示す）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、親和性成熟抗ヒプシン抗体によって増加した抗原結合を示す一連のグラフである。図４Ａ）固定化されたＰ１−ＨｐｕペプチドまたはＰ１−デオキシＨｐｕペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。図４Ｂ）固定化されたＰ１−ＨｐｕペプチドまたはＰ１−デオキシＨｐｕペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、親和性成熟抗ヒプシン抗体によって増加した抗原結合を示す一連のグラフである。図４Ａ）固定化されたＰ１−ＨｐｕペプチドまたはＰ１−デオキシＨｐｕペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。図４Ｂ）固定化されたＰ１−ＨｐｕペプチドまたはＰ１−デオキシＨｐｕペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｅは、様々なヒプシン含有ペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図５Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図５Ｂ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図５Ｃ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図５Ｄ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図５Ｅ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｅは、様々なヒプシン含有ペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図５Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図５Ｂ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図５Ｃ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図５Ｄ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図５Ｅ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｅは、様々なヒプシン含有ペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図５Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図５Ｂ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図５Ｃ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図５Ｄ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図５Ｅ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｅは、様々なヒプシン含有ペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図５Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図５Ｂ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図５Ｃ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図５Ｄ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図５Ｅ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図５Ｅ】図５Ａ〜Ｅは、様々なヒプシン含有ペプチドに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図５Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図５Ｂ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図５Ｃ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図５Ｄ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図５Ｅ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合するＦａｂＨｐｕ２４またはＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｆは、様々なヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ペプチドに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図６Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図６Ｂ）Ｐ２−デオキシＨｐｕ、図６Ｃ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図６Ｄ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図６Ｅ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図６Ｆ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｆは、様々なヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ペプチドに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図６Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図６Ｂ）Ｐ２−デオキシＨｐｕ、図６Ｃ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図６Ｄ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図６Ｅ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図６Ｆ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｆは、様々なヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ペプチドに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図６Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図６Ｂ）Ｐ２−デオキシＨｐｕ、図６Ｃ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図６Ｄ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図６Ｅ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図６Ｆ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｆは、様々なヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ペプチドに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図６Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図６Ｂ）Ｐ２−デオキシＨｐｕ、図６Ｃ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図６Ｄ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図６Ｅ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図６Ｆ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図６Ｅ】図６Ａ〜Ｆは、様々なヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ペプチドに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図６Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図６Ｂ）Ｐ２−デオキシＨｐｕ、図６Ｃ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図６Ｄ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図６Ｅ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図６Ｆ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図６Ｆ】図６Ａ〜Ｆは、様々なヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ペプチドに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラムを示す一連のグラフである。固定化された図６Ａ）Ｐ２−Ｈｐｕ、図６Ｂ）Ｐ２−デオキシＨｐｕ、図６Ｃ）Ｐ３−Ｈｐｕ、図６Ｄ）Ｐ４−Ｈｐｕ、図６Ｅ）Ｐ５−Ｈｐｕ及び図６Ｆ）Ｐ６−Ｈｐｕに結合したＦａｂＨｐｕ９８またはＦａｂＨｐｕ９８．６１の典型的なバイオセンサのセンサグラム。Ｆａｂを以下の範囲の濃度：２００ｎＭ（赤色）、６６．７ｎＭ（橙色）、２２ｎＭ（緑色）、７．４ｎＭ（青色）、２．４ｎＭ（紫色）で注入し、近似曲線を示す（黒色）。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｂは、親和性成熟抗ヒプシン抗体がヒプシン化タンパク質ｅＩＦ５Ａのより良好な回収をもたらすことを示すクーマシーブルーで染色したゲルである。図７Ａ）より多くの内因性ｅＩＦ５ＡがｍＡｂＨｐｕ２４よりもｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂによって免疫沈殿されたことを示すクーマシーブルー染色。図７Ｂ）より多くの内因性ｅＩＦ５ＡがｍＡｂＨｐｕ９８よりもｍＡｂＨｐｕ９８．６１によって引き下ろされたことを示すクーマシーブルー染色。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、親和性成熟抗ヒプシン抗体がヒプシン化タンパク質ｅＩＦ５Ａのより良好な回収をもたらすことを示すクーマシーブルーで染色したゲルである。図７Ａ）より多くの内因性ｅＩＦ５ＡがｍＡｂＨｐｕ２４よりもｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂによって免疫沈殿されたことを示すクーマシーブルー染色。図７Ｂ）より多くの内因性ｅＩＦ５ＡがｍＡｂＨｐｕ９８よりもｍＡｂＨｐｕ９８．６１によって引き下ろされたことを示すクーマシーブルー染色。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂは、Ｆａｂ断片に結合したヒプシン含有ペプチドの電子密度マップである。図８Ａ）ＦａｂＨｐｕ２４と複合したヒプシンの電子密度を示す（３．０倍ＲＭＳＤで示した）模擬アニーリングｍＦｏ−ｄＦｃオミットマップ。図８Ｂ）ＦａｂＨｐｕ９８と複合したヒプシンの電子密度を示す（３．０倍ＲＭＳＤで示した）模擬アニーリングｍＦｏ−ｄＦｃオミットマップ。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂは、Ｆａｂ断片に結合したヒプシン含有ペプチドの電子密度マップである。図８Ａ）ＦａｂＨｐｕ２４と複合したヒプシンの電子密度を示す（３．０倍ＲＭＳＤで示した）模擬アニーリングｍＦｏ−ｄＦｃオミットマップ。図８Ｂ）ＦａｂＨｐｕ９８と複合したヒプシンの電子密度を示す（３．０倍ＲＭＳＤで示した）模擬アニーリングｍＦｏ−ｄＦｃオミットマップ。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｂは、ヒプシンとのＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９８の代替の結合様式を示す一連の図である。図９Ａ）ヒプシン含有Ｃ１ペプチド（黄色、真っ直ぐな矢印で示す）と複合したＦａｂＨｐｕ２４  Ｆａｂ  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（青色、左葉）ドメイン。図９Ｂ）ヒプシン含有Ｃ１ペプチド（黄色、真っ直ぐな矢印で示す）と複合したＦａｂＨｐｕ９８  ＦａｂのＶＬ（スミレ色、左葉）及びＶＨ（暗い青緑色、右葉）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｂは、ヒプシンとのＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９８の代替の結合様式を示す一連の図である。図９Ａ）ヒプシン含有Ｃ１ペプチド（黄色、真っ直ぐな矢印で示す）と複合したＦａｂＨｐｕ２４  Ｆａｂ  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（青色、左葉）ドメイン。図９Ｂ）ヒプシン含有Ｃ１ペプチド（黄色、真っ直ぐな矢印で示す）と複合したＦａｂＨｐｕ９８  ＦａｂのＶＬ（スミレ色、左葉）及びＶＨ（暗い青緑色、右葉）。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｂは、ヒプシン相互作用の水素結合ネットワークを示す一連の図である。図１０Ａ）ヒプシン含有Ｃ１ペプチドとのＦａｂＨｐｕ２４の広範囲な水素結合ネットワーク。示されるようにオングストロームでの長さで、推定上の水素結合を破線（橙色）で示した、ＶＨ（青色、左葉）、ＶＬ（サーモン色、右葉）、及びＣ１ペプチド（黄色、矢印で示す）を示す立体像図。図１０Ｂ）ＶＨ（マゼンタ、左葉）、ＶＬ（暗い青緑色、右葉）及びＣ１ペプチド（黄色、矢印で示す）を有するペプチドＣ１を有するＦａｂＨｐｕ９８の広範囲な水素結合ネットワーク。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｂは、ヒプシン相互作用の水素結合ネットワークを示す一連の図である。図１０Ａ）ヒプシン含有Ｃ１ペプチドとのＦａｂＨｐｕ２４の広範囲な水素結合ネットワーク。示されるようにオングストロームでの長さで、推定上の水素結合を破線（橙色）で示した、ＶＨ（青色、左葉）、ＶＬ（サーモン色、右葉）、及びＣ１ペプチド（黄色、矢印で示す）を示す立体像図。図１０Ｂ）ＶＨ（マゼンタ、左葉）、ＶＬ（暗い青緑色、右葉）及びＣ１ペプチド（黄色、矢印で示す）を有するペプチドＣ１を有するＦａｂＨｐｕ９８の広範囲な水素結合ネットワーク。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃは、ＦａｂＨｐｕ９８に結合するヒプシンとデオキシヒプシンとの比較を示す一連の図である。図１１Ａ）５．０倍ｒｍｓｄで示した、ヒプシンのヒドロキシル基の位置及びＶＨ  Ｙ５２側鎖のシフトを示す、同形のＦｏ−Ｆｏ差マップ。図１１Ｂ）ＦａｂＨｐｕ９８において、ヒプシン複合体、ヒプシンのヒドロキシル基が、ＶＬ  Ｓ９４及びＶＨ  Ｙ５２の両方と水素結合を形成する。図１１Ｃ）ＦａｂＨｐｕ９８において、デオキシヒプシン複合体、ＶＬ  Ｓ９４及びＶＨ  Ｙ５２が水素結合を形成する。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃは、ＦａｂＨｐｕ９８に結合するヒプシンとデオキシヒプシンとの比較を示す一連の図である。図１１Ａ）５．０倍ｒｍｓｄで示した、ヒプシンのヒドロキシル基の位置及びＶＨ  Ｙ５２側鎖のシフトを示す、同形のＦｏ−Ｆｏ差マップ。図１１Ｂ）ＦａｂＨｐｕ９８において、ヒプシン複合体、ヒプシンのヒドロキシル基が、ＶＬ  Ｓ９４及びＶＨ  Ｙ５２の両方と水素結合を形成する。図１１Ｃ）ＦａｂＨｐｕ９８において、デオキシヒプシン複合体、ＶＬ  Ｓ９４及びＶＨ  Ｙ５２が水素結合を形成する。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、ＦａｂＨｐｕ９８に結合するヒプシンとデオキシヒプシンとの比較を示す一連の図である。図１１Ａ）５．０倍ｒｍｓｄで示した、ヒプシンのヒドロキシル基の位置及びＶＨ  Ｙ５２側鎖のシフトを示す、同形のＦｏ−Ｆｏ差マップ。図１１Ｂ）ＦａｂＨｐｕ９８において、ヒプシン複合体、ヒプシンのヒドロキシル基が、ＶＬ  Ｓ９４及びＶＨ  Ｙ５２の両方と水素結合を形成する。図１１Ｃ）ＦａｂＨｐｕ９８において、デオキシヒプシン複合体、ＶＬ  Ｓ９４及びＶＨ  Ｙ５２が水素結合を形成する。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｄは、ヒプシンに結合する親和性成熟Ｆａｂｓの構造を示す一連の図である。図１２Ａ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、黄色、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ２４  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（青色、左葉）と、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂ  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（緑色、左葉）との比較。ＣＤＲ  Ｈ２及びＨ３の立体構造の変化が、ヒプシン相互作用のための接触領域を増加させた。図１２Ｂ）ヒプシン含有ペプチドＣ１とのＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの広範囲な水素結合ネットワーク。図１２Ｃ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ９８  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（シアン、右部分）と、ＦａｂＨｐｕ９８．６１  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（緑色、右部分）の比較。図１２Ｄ）ＦａｂＨｐｕ２４．ＢのＴ３３が、ヒプシンとの付加的な水素結合を作っている。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｄは、ヒプシンに結合する親和性成熟Ｆａｂｓの構造を示す一連の図である。図１２Ａ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、黄色、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ２４  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（青色、左葉）と、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂ  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（緑色、左葉）との比較。ＣＤＲ  Ｈ２及びＨ３の立体構造の変化が、ヒプシン相互作用のための接触領域を増加させた。図１２Ｂ）ヒプシン含有ペプチドＣ１とのＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの広範囲な水素結合ネットワーク。図１２Ｃ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ９８  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（シアン、右部分）と、ＦａｂＨｐｕ９８．６１  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（緑色、右部分）の比較。図１２Ｄ）ＦａｂＨｐｕ２４．ＢのＴ３３が、ヒプシンとの付加的な水素結合を作っている。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｄは、ヒプシンに結合する親和性成熟Ｆａｂｓの構造を示す一連の図である。図１２Ａ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、黄色、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ２４  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（青色、左葉）と、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂ  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（緑色、左葉）との比較。ＣＤＲ  Ｈ２及びＨ３の立体構造の変化が、ヒプシン相互作用のための接触領域を増加させた。図１２Ｂ）ヒプシン含有ペプチドＣ１とのＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの広範囲な水素結合ネットワーク。図１２Ｃ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ９８  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（シアン、右部分）と、ＦａｂＨｐｕ９８．６１  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（緑色、右部分）の比較。図１２Ｄ）ＦａｂＨｐｕ２４．ＢのＴ３３が、ヒプシンとの付加的な水素結合を作っている。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、ヒプシンに結合する親和性成熟Ｆａｂｓの構造を示す一連の図である。図１２Ａ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、黄色、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ２４  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（青色、左葉）と、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂ  ＶＬ（サーモン色、右葉）及びＶＨ（緑色、左葉）との比較。ＣＤＲ  Ｈ２及びＨ３の立体構造の変化が、ヒプシン相互作用のための接触領域を増加させた。図１２Ｂ）ヒプシン含有ペプチドＣ１とのＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの広範囲な水素結合ネットワーク。図１２Ｃ）Ｃ１ペプチド（ＧＳＧ−Ｈｐｕ−ＧＳＧ、矢印で示す）に結合する、ＦａｂＨｐｕ９８  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（シアン、右部分）と、ＦａｂＨｐｕ９８．６１  ＶＬ（スミレ色、左部分）及びＶＨ（緑色、右部分）の比較。図１２Ｄ）ＦａｂＨｐｕ２４．ＢのＴ３３が、ヒプシンとの付加的な水素結合を作っている。矢印は、ペプチドを含有するヒプシンを示す。
【図１３】ヒプシンを取り囲むアミノ酸配列に最低限依存して推定上のヒプシン含有ポリペプチド上のヒプシンに結合する、本明細書に記載される任意の抗ヒプシン抗体の模擬モデルを示す図である。矢印は、ヒプシン含有タンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明が特定の組成物または生物学的系に限定されず、当然変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図されていないことも理解されたい。
【００２２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、２つ以上のかかる分子の組み合わせを任意に含むといった具合である。
【００２３】
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００２４】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００２５】
本明細書の「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００２６】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００２７】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有し、かかる改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
【００２８】
「抗ヒプシン抗体」及び「ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗体」という用語は、抗体がヒプシン含有ポリペプチドに対する検出、診断または単離試薬として有用であるような十分な親和性でヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合することができる抗体を指すのに、同義に使用される。一実施形態において、非ヒプシン化ポリペプチドへの抗ヒプシン抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）で測定して、ヒプシン化タンパク質への抗ヒプシン抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、ヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンにも結合する。
【００２９】
「抗デオキシヒプシン抗体」及び「ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する抗体」という用語は、抗体がデオキシヒプシン含有ポリペプチドに対する検出、診断または単離試薬として有用であるような十分な親和性でデオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合することができる抗体を指すのに同義に使用される。いくつかの実施形態において、デオキシヒプシンに結合する抗体は、ポリペプチド中のヒプシンとも結合する。一実施形態において、非デオキシヒプシン化ポリペプチドへの抗デオキシヒプシン抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）で測定して、デオキシヒプシン化ポリペプチドへの抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、デオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、同じポリペプチド（例えば、ヒプシン及びデオキシヒプシンを含有するポリペプチド）上のヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、異なるポリペプチド上のヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する（例えば、ヒプシンを含有し、デオキシヒプシンを含有しないポリペプチド、及びデオキシヒプシンを含有し、ヒプシンを含有しないポリペプチド）。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない。
【００３１】
「結合」または「特異的結合」は、概して（抗体と１つ以上の標的との間、抗ヒプシン抗体とヒプシンとの間、または抗ヒプシン抗体とデオキシヒプシンとの間等の）２つの分子間の、十分な親和性での結合を指す。好ましくは、抗体が無関係の標的に結合する程度は例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定して、標的への抗体の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態において、標的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００３２】
「抗体がヒプシンと隣接する異なるアミノ酸配列を有するヒプシン含有ポリペプチドまたはデオキシヒプシン含有ポリペプチドに結合する」という用語は、ペプチドを取り囲む可変、またはタンパク質配列の文脈において、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを特異的に認識する抗体を指す。そのような抗体は、ヒプシンまたはデオキシヒプシンに隣接する異なるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのポリペプチド中のヒプシン及び／またはデオキシヒプシンに結合する。ある特定の実施形態において、そのような抗体は、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを取り囲むアミノ酸配列に最低限依存してポリペプチド中のヒプシン及び／またはデオキシヒプシンに結合し、例えば、該抗体は、２５％未満、２０％、１５％、１０％、７％、５％、２％または１％の親和性の変化でヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを取り囲む異なるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチドに結合する。
【００３３】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
【００３４】
「抗体断片」または「抗原結合断片」は、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体の一部を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；１本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ）’２抗体断片は、一般にヒンジシステインによってカルボキシ末端の近くに共有結合した一対のＦａｂ断片を含む。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００３６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインが、非共有結合で緊密に結合した二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗原結合特異性を抗体に与える、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【００３７】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要なクラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３８】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書で別途指定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従う。
【００３９】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において次の順序で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３が６つのＨＶＲのうち最も高い多様性を呈し、特にＨ３が、抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の不在下でのみ機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００４１】
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの折衷物であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで用いられている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲの各々の残基を、以下に記載する。
2018532376.tif 000002
【００４２】
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。
【００４３】
別途指定されない限り、可変ドメイン残基（ＨＶＲ残基及びフレームワーク領域残基）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って本明細書で番号付けされる。
【００４４】
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、「標準の」Ｋａｂａｔによって番号付けされた配列との抗体の配列の相同領域での整列によって決定され得る。
【００４５】
Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を指すときに用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵ指標」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基について言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）で報告されるＥＵ指標）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書に別途示されない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書に別途示されない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する（例えば、米国仮出願第６０／６４０，３２３号、ＥＵ番号付けに関する図を参照されたい）。
【００４６】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい）。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ、相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異抗体は例外であり、かかる変異型は一般的に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるものとして抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
【００４８】
「裸の抗体」は、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に複合されていない抗体を指す。裸の抗体は、製剤中に存在してもよい。
【００４９】
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。
【００５０】
「単離された」抗体とは、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説に関して、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００５１】
「単離された」核酸とは、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００５２】
「抗ヒプシン抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のかかる核酸分子（複数可）を含み、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【００５３】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同義で使用され、その中に外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は単離される（すなわち、その構成成分天然環境の構成成分から単離される）。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【００５５】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列し、配列同一性最大パーセントを実現するために必要に応じてギャップを導入した後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．２０５５９）においてユーザ文書とともに申請されており、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【００５６】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００５７】
「添付文書」という用語は、かかる試薬製品の使用法についての情報を含む試薬製品の商用パッケージに通例含まれる説明書を指すように使用される。
【００５８】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【００５９】
本明細書に使用されるとき、「試料」または「生体試料」という用語は、目的とする対象、細胞、または組織から得られたかまたはそれ由来の組成物を指す。試料としては、ある個体からの組織、全血、血清、または血漿が挙げられるがこれらに限定されない。試料には、組織、細胞、または組織もしくは細胞から得られた流体も含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書に使用されるとき、「評価を補助する」ための方法は、臨床的判断（例えば、アナフィラキシーのリスク）を下す際に補助する方法を指し、最終的な評価に関して結論的であってもよいか、または結論的でなくてもよい。
【００６１】
本明細書に使用されるとき、「基準値」は、絶対値、相対値、上限及び／もしくは下限がある値、値の範囲、平均値（ａｖｅｒａｇｅ  ｖａｌｕｅ）、中央値、平均値（ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ）、または特定の対照もしくは基礎値と比較した値であってもよい。
【００６２】
「検出する」または「検出」という用語は、特定の分子の質的測定及び量的測定の両方、本明細書ではヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシン等の特定の分析物分子の測定を含むために最も広義に使用される。一態様において、本明細書に記載される検出方法は、試料中の目的とする分析物分子の存在のみを確認するために使用される。別の態様において、検出方法は、試料中の分析物分子の量を定量化するために使用されてもよい。さらに別の態様において、該方法は、標的分子の目的とする分析物分子の相対的結合親和性を判定するために使用されてもよい。
【００６３】
「検出剤（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」、「検出剤（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」、「検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）」、及び「検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）」という用語は、抗ヒプシン抗体に結合することができる磁気標識、発色団標識、染料標識、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、もしくは化学発光標識等の標識を介して直接、または抗ヒプシン抗体と特異的と結合する抗体もしくは受容体等の標識化二次薬剤を介して間接的に、のいずれかで、抗ヒプシン抗体を検出する薬剤を指すように同義に使用される。二次薬剤の例としては、抗体、抗体フラグメント、可溶性受容体、受容体フラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「アッセイ表面」または「表面」という用語は、免疫測定で使用するために捕捉剤が固定化され得る基質を意味する。好適なアッセイ表面としては、ポリマーアッセイプレート、チップ、流動性カード（ｆｌｕｉｄｉｔｙ  ｃａｒｄ）、磁気ビーズ、樹脂、セルロースポリマースポンジ等が挙げられる。
【００６５】
「捕捉剤」または「捕捉試薬」という用語は、試料中の標的分子または分析物分子（例えば、ヒプシン及び／もしくはデオキシヒプシンを含有するポリペプチド）に結合し、捕捉することができる薬剤（例えば、抗ヒプシン抗体）を指す。捕捉剤または試薬は、例えば、微粒子またはビーズ、マイクロタイタープレート、カラム樹脂、チップ、流動性カード（ｆｌｕｉｄｉｔｙ  ｃａｒｄ）、磁気ビーズ、セルロースポリマースポンジ等の固体基質上に固定化されてもよい。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「標識」という用語は、核酸プローブ、ポリペプチドまたは抗体等の試薬に直接または間接的に複合または融合し、複合または融合した試薬の検出または捕捉を容易にする化合物または組成物を指す。この標識はそれ自体が検出可能（例えば、放射性同位標識、蛍光標識、光ルミネセンス標識、化学発光標識、もしくは電気化学発光標識）であり得るか、別の分子に結合した後に検出可能であり得るか、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学改変を触媒し得る。
【００６７】
「標的分子」という用語は、本明細書に記載される抗体の特異的結合標的を指す。一実施形態において、標的分子は、ヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンまたはヒプシン含有ポリペプチドである。一実施形態において、標的分子は、デオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンまたはデオキシヒプシン含有ポリペプチドである。
【００６８】
本明細書に使用されるとき、「分析物」及び「分析物分子」は、本発明の方法によって分析され、かつ限定されないがヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを含有するポリペプチドを含む分子を指す。
【００６９】
「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸ポリマー、または１組の２つ以上の相互作用しているかもしくは結合したアミノ酸ポリマーを意味するように同義に使用される。
【００７０】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合した２つ以上のアミノ酸を含有するペプチドまたはタンパク質を指し、ペプチド、オリゴマー、タンパク質等を含む。ポリペプチドは、天然、修飾、または合成アミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、例えば翻訳後プロセシングによって天然に、または例えばアミド化アシル化、架橋等、化学的に修飾もされ得る。
【００７１】
ＩＩ．抗ヒプシン抗体
一態様において、本発明は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、以下の  特質のうちの１つ以上を有する。（１）ポリペプチド中のヒプシンに結合する、（２）ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない、（３）ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する、（４）ヒプシンに隣接する異なるアミノ酸を有するヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合する、（５）デオキシヒプシンに隣接する異なるアミノ酸を有するデオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する、（６）９００ｎＭ以下の結合親和度でヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合する、（７）３００ｎＭ以下の結合親和度でヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合し、２００ｎＭ以下の結合親和度でデオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。
【００７２】
一態様において、本発明は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する単離された抗体を提供し、該抗体は、ヒプシンに隣接する異なるアミノ酸配列を有するヒプシン含有ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない。いくつかの実施形態において、該抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、表１に示すペプチドに結合する（例えば、配列番号５６〜６９の群から選択される１つ以上）。
【００７３】
一態様において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、モノクローナル抗体である。一態様において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、抗体フラグメント（抗原結合フラグメントを含む）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ′）２フラグメントである。一態様において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体のうちのいずれも、精製される。
【００７４】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７５】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１もしくは１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７６】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７７】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７８】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７９】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８０】
一態様において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８１】
本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、任意の好適なフレームワーク可変ドメイン配列を含んでいてもよいが、ただし、該抗体がポリペプチド中のヒプシンに結合する能力を保持していることを条件とする。いくつかの実施形態において、該抗体は、ポリペプチド中のヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する能力を保持する。本明細書に使用されるとき、重鎖フレームワーク領域は、「ＨＣ−ＦＲ１−ＦＲ４」と示され、軽鎖フレームワーク領域は、「ＬＣ−ＦＲ１−ＦＲ４」と示される。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号４６、５０、５１、及び５３の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４）。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号４７、５０、５２、及び５３の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４）。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号４８、５０、５２、及び５３の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４）。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号４９、５０、５２、及び５３の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、及びＨＣ−ＦＲ４）。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号３８、４０、４２、及び４５の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４）。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号３９、４１、４３、及び４５の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４）。いくつかの実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、配列番号３９、４１、４４、及び４５の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む（それぞれＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、及びＬＣ−ＦＲ４）。
【００８２】
一実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、フレームワーク配列及び超可変領域を含む重鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、それぞれ配列番号４６〜４９（ＨＣ−ＦＲ１）、配列番号５０（ＨＣ−ＦＲ２）、配列番号５１または５２（ＨＣ−ＦＲ３）、及び配列番号５３（ＨＣ−ＦＲ４）のＨＣ−ＦＲ１〜ＨＣ−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、フレームワーク配列及び超可変領域を含む重鎖可変ドメインを含み、該フレームワーク配列は、それぞれ配列番号４６〜４９（ＨＣ−ＦＲ１）、配列番号５０（ＨＣ−ＦＲ２）、配列番号５１または５２（ＨＣ−ＦＲ３）、及び配列番号５３（ＨＣ−ＦＲ４）のＨＣ−ＦＲ１〜ＨＣ−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該抗ヒプシン抗体は、フレームワーク配列及び超可変領域を含む重鎖可変ドメインを含み、該フレームワーク配列は、それぞれ配列番号４６〜４９（ＨＣ−ＦＲ１）、配列番号５０（ＨＣ−ＦＲ２）、配列番号５１または５２（ＨＣ−ＦＲ３）、及び配列番号５３（ＨＣ−ＦＲ４）のＨＣ−ＦＲ１〜ＨＣ−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１１または１２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗ヒプシン抗体は、フレームワーク配列及び超可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含み、該フレームワーク配列は、それぞれ配列番号３８または３９（ＬＣ−ＦＲ１）、配列番号４０または４１（ＬＣ−ＦＲ２）、配列番号４２〜４４（ＬＣ−ＦＲ３）、及び配列番号４５（ＬＣ−ＦＲ４）のＬＣ−ＦＲ１〜ＬＣ−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗ヒプシン抗体は、フレームワーク配列及び超可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含み、該フレームワーク配列は、それぞれ配列番号３８または３９（ＬＣ−ＦＲ１）、配列番号４０または４１（ＬＣ−ＦＲ２）、配列番号４２〜４４（ＬＣ−ＦＲ３）、及び配列番号４５（ＬＣ−ＦＲ４）のＬＣ−ＦＲ１〜ＬＣ−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗ヒプシン抗体は、フレームワーク配列及び超可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、それぞれ配列番号３８または３９（ＬＣ−ＦＲ１）、配列番号４０または４１（ＬＣ−ＦＲ２）、配列番号４２−４４（ＬＣ−ＦＲ３）、及び配列番号４５（ＬＣ−ＦＲ４）のＬＣ−ＦＲ１〜ＬＣ−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２４または２５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２０または２１のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２７または２８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、重鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＨＶＲ−Ｈ１（ＤＹＡＭＩ（配列番号９））、
ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２（ＩＩＹＧＧＳＮＫＬＡＹＡＫＷＡ（配列番号１３）またはＩＩＹＧＶＩＮＤＬＡＹＡＫＷＡ（配列番号１４））、及び
ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３（ＧＹＧＳＭＤＧＹＤＲＬＮＬ（配列番号１７））。
【００８４】
いくつかの実施形態において、重鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＨＶＲ−Ｈ１（ＴＹＴＩＮ（配列番号１０））、
ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２（ＤＩＷＳＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡ（配列番号１５））、及び
ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３（ＤＳＷＤＴＳＩＹＹＧＬＤＬ（配列番号１８））。
【００８５】
いくつかの実施形態において、重鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＨＶＲ−Ｈ１（ＴＹＴＭＮ（配列番号１１）、またはＨＣＴＭＮ（配列番号１２）、
ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２（ＤＩＹＴＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡ（配列番号１６））、及び
ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３（ＤＳＷＤＡＳＳＹＹＧＬＤＬ（配列番号１９））。
【００８６】
いくつかの実施形態において、重鎖ＦＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＨＣ−ＦＲ１（ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＲＬＶＡＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＤＩＳ（配列番号４６）、
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＦＳＬＳ（配列番号４７）、
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ（配列番号４８）、または
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＣＳＬＹ（配列番号４９））、
ｂ）ＨＣ−ＦＲ２（ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（配列番号５０）、
ｃ）ＨＣ−ＦＲ３（ＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲ（配列番号５１）、または
ＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲ（配列番号５２））、及び
ｄ）ＨＣ−ＦＲ４（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５３））。
【００８７】
いくつかの実施形態において、軽鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＨＶＲ−Ｌ１（ＱＳＳＥＴＶＹＲＧＤＷＬＳ（配列番号１）、またはＲＳＲＱＲＶＹＬＧＤＷＬＳ（配列番号２））、
ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２（ＤＡＳＹＬＡＳ（配列番号４）、またはＤＡＳＦＲＧＤ（配列番号５））、及び
ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３（ＬＧＧＹＹＤＤＡＤＤＴ（配列番号７））。
【００８８】
いくつかの実施形態において、軽鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＨＶＲ−Ｌ１（ＱＡＳＥＤＩＫＲＹＬＡ（配列番号３））、
ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２（ＡＡＳＫＬＡＳ（配列番号６））、及び
ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３（ＱＱＧＹＴＳＳＮＶＮＮＡ（配列番号８）、またはＱＱＧＹＴＳＴＮＶＮＮＡ（配列番号７２））。
【００８９】
いくつかの実施形態において、軽鎖ＦＲ配列は、以下を含む。
ａ）ＬＣ−ＦＲ１（ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣ（配列番号３８）、またはＡＩＫＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣ（配列番号３９））、
ｂ）ＬＣ−ＦＲ２（ＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号４０）、またはＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号４１））、
ｃ）ＬＣ−ＦＲ３（ＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号４２）、
ＧＶＳＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号４３）、または
ＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号４４））、及び
ｄ）ＬＣ−ＦＲ４（ＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号４５））。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該抗体は、以下を含む。
（ａ）重鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号４６〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号５１もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び
（７）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに／または
（ｂ）軽鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号３８もしくは３９のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号４０もしくは４１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号４２〜４４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ならびに
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメイン。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該抗体は、以下を含む。
（ａ）重鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号４６〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号５１もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び
（７）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに／または
（ｂ）軽鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号３８もしくは３９のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号４０もしくは４１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号４２〜４４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ならびに
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメイン。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該抗体は、以下を含む。
（ａ）重鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号４６〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号５１もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び
（７）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに／または
（ｂ）軽鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号３８もしくは３９のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号４０もしくは４１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号４２〜４４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメイン。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該抗体は、以下を含む。
（ａ）重鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号４６〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号５１もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び
（７）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに／または
（ｂ）軽鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号３８もしくは３９のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号４０もしくは４１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号４２〜４４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメイン。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が本明細書に提供され、該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、該抗体は、以下を含む。
（ａ）重鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号４６〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号５１もしくは５２のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び
（７）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに／または
（ｂ）軽鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号３８もしくは３９のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号４０もしくは４１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号４２〜４４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメイン。
【００９５】
一態様において、配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２０もしくは２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。一態様において、配列番号２７もしくは２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。一態様において、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。
【００９６】
一態様において、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。一態様において、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。一態様において、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２３のアミノ酸配列を、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。一態様において、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。一態様において、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを、これらの配列の翻訳後修飾を含めて含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、配列番号２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２７または２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、基準配列と比較して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、基準配列と比較して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ポリペプチド中のヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５つのアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、配列番号２０または２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、基準配列と比較して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、基準配列と比較して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ポリペプチド中のヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５つのアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、図１Ｂまたは図１Ｄに示される重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。例えば、図１Ｂに示される抗体Ｈｐｕ２４の重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｂに示される抗体Ｈｐｕ２４．Ｂの重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｄに示される抗体Ｈｐｕ９８の重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｄに示される抗体Ｈｐｕ９８．６１の重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｄに示される抗体Ｈｐｕ９１の重鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、図１Ａまたは図１Ｃに示される軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。例えば、図１Ａに示される抗体Ｈｐｕ２４の軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ａに示される抗体Ｈｐｕ２４．Ｂの軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｃに示される抗体Ｈｐｕ９８の軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｃに示される抗体Ｈｐｕ９８．６１の軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、図１Ｃに示される抗体Ｈｐｕ９１の軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。
【０１０１】
一態様において、本発明は、図１Ｂまたは図１Ｄに示されるものから選択される重鎖可変ドメイン及び図１Ａまたは図１Ｃに示されるものから選択される軽鎖可変ドメインを含む抗ヒプシン抗体を提供する。例えば、図１Ｂに示される抗体Ｈｐｕ２４、図１Ｂに示される抗体Ｈｐｕ２４．Ｂ、図１Ｄに示される抗体Ｈｐｕ９１、図１Ｄに示される抗体Ｈｐｕ９８、または図１Ｄに示される抗体Ｈｐｕ９８．６１の重鎖可変ドメインと、図１Ａに示される抗体Ｈｐｕ２４、図１Ａに示される抗体Ｈｐｕ２４．Ｂ、図１Ｃに示される抗体Ｈｐｕ９１、図１Ｃに示される抗体Ｈｐｕ９８、図１Ｃに示される抗体Ｈｐｕ９８．６１の軽鎖可変ドメインと、を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。
【０１０２】
一態様において、本発明は、（ａ）図１Ｂまたは図１Ｄに示されるものから選択される１つ、２つ、もしくは３つのＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａまたは図１Ｃに示されるものから選択される１つ、２つ、もしくは３つのＶＬ  ＨＶＲを含む抗ヒプシン抗体を提供する。例えば、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｂに示されるＨｐｕ２４からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａに示されるＨｐｕ２４からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｂに示されるＨｐｕ２４．Ｂからの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａに示されるＨｐｕ２４．Ｂからの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９１からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９１からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９８からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９８からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９８．６１からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９８．６１からの１つ、２つ、もしくは３つのＣｈｏｔｈｉａ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｂに示されるＨｐｕ２４からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａに示されるＨｐｕ２４からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｂに示されるＨｐｕ２４．Ｂからの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａに示されるＨｐｕ２４．Ｂからの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９１からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９１からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９８からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９８からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄ��示されるＨｐｕ９８．６１からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９８．６１からの１つ、２つ、もしくは３つのＫａｂａｔ  ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｂに示されるＨｐｕ２４からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａに示されるＨｐｕ２４からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｂに示されるＨｐｕ２４．Ｂからの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ａに示されるＨｐｕ２４．Ｂからの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９１からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９１からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９８からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９８からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、（ａ）図１Ｄに示されるＨｐｕ９８．６１からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＨ  ＨＶＲ、及び／または（ｂ）図１Ｃに示されるＨｐｕ９８．６１からの１つ、２つ、もしくは３つの接触ＶＬ  ＨＶＲを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、配列番号３３もしくは３４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号２９もしくは３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ヒプシン抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する。
【０１０５】
本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない。
【０１０６】
本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得、本明細書の実施例において記載され得る。かかる特性（例えば、物理的特性）または活性（例えば、生物学的活性）をインビボ及び／またはインビトロで有する抗体が提供される。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、かかる特性（例えば、物理的特性）または活性（例えば、生物学的活性）について試験される。
【０１０７】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、１ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、１００ｎＭ  以下、１５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、４５０ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、５５０ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、６５０ｎＭ以下、７００ｎＭ以下、７５０ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、または９００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、１ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、７５ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、８５ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、９５ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、本明細書の表２に示される、ＫＤを有する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない。さらなる実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない抗ヒプシン抗体は、ヒプシンを含有するポリペプチドに対して少なくとも９００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を呈する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。さらなる実施形態において、デオキシヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体は、（ｉ）ヒプシンを含有するポリペプチドに対して３００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）、及び（ｉｉ）デオキシヒプシンを含有するポリペプチドに対して２００ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を呈する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、１ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、１００ｎＭ  以下、１１０ｎＭ以下、１２０ｎＭ以下、１３０ｎＭ以下、１４０ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１６���ｎＭ以下、１７０ｎＭ以下、１８０ｎＭ以下、１９０ｎＭ以下、または２００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、１ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、７５ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、８５ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、９５ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、本明細書の表２に示される、ＫＤを有する。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号２０もしくは２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、配列番号２７もしくは２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗原結合断片である。
【０１０８】
一実施形態において、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたアッセイは、約３００反応単位（ＲＵ）のＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングされ、１０ＲＵ未満のビオチン化抗原（例えば、ヒプシンを含有するポリペプチド）を捕捉するＣＭ５チップで行われる。一実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体（例えば、抗ヒプシンＦａｂ断片）は、固定化されたペプチド（例えば、ヒプシンを含有するペプチド）を流れるように注入前に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０中で段階希釈する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（ＫＤ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照のこと。上記表面プラズモン共鳴アッセイによるオンレートが１０６Ｍ−１ｓ−１  を超える場合、オンレートは、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される場合に、漸増する抗原（例えば、ヒプシンを含有するポリペプチド）濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗ヒプシン抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。
【０１０９】
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本発明の抗ヒプシン抗体は、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、放射免疫測定、表面プラズモン共鳴法、クロマトグラフィー、免疫沈殿法、免疫蛍光検査法、蛍光標識細胞分取法等の既知の方法によりその抗原結合活性に関して試験される。
【０１１０】
別の態様において、競合アッセイを使用して、ポリペプチド中のヒプシン及び／またはデオキシヒプシンに結合するために、本明細書に記載される抗体（例えばＨｐｕ９８）と競合する抗体を特定することができる。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体（例えばＨｐｕ９８）によって結合される、同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）内のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供される。
【０１１１】
一例示的な競合アッセイにおいて、ヒプシンを含有する固定化されたポリペプチドは、ポリペプチド中のヒプシンに結合する第１の標識された抗体（例えばＨｐｕ２４）Ｈｐｕ２４）と、第１の抗体とポリペプチド中のヒプシンへの結合について競合するその能力について試験される第２の非標識抗体とを含む溶液中で、インキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、ヒスプシン（ｈｙｓｐｕｓｉｎｅ）を含有する固定化されたポリペプチドを、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体のヒプシンを含有するポリペプチドへの結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、ヒプシンを含有する固定化されたポリペプチドに関連する標識の量を測定する。ヒプシンを含有する固定化されたポリペプチドに関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗体がポリペプチド中のヒプシンへの結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、デオキシヒプシンを含有する。いくつかの実施形態において、第１の抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗体は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する。
【０１１２】
別の態様において、アッセイを使用して、実施例１に記載される結合アッセイ等の本明細書に記載される抗ヒプシン抗体を特定することができる。いくつかの実施形態において、候補抗ヒプシン抗体を含有する試料は、ＥＬＩＳＡによるような、本明細書に記載される方法を用いてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、候補抗ヒプシン抗体を含有する試料は、ヒプシン化ペプチドと接触して置かれ、候補抗ヒプシン抗体のヒプシン化ペプチドへの結合が、当該技術分野で標準の技法（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、候補抗ヒプシン抗体を含有する試料は、デオキシヒプシン化ペプチドと接触して置かれ、候補抗ヒプシン抗体のデオキシヒプシン化ペプチドへの結合が、当該技術分野で標準の技法（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、候補抗ヒプシン抗体のヒプシン化ペプチド及び／またはデオキシヒプシン化ペプチドへの結合が、候補抗ヒプシン抗体の非ヒプシン化ペプチドへの結合と比較される。いくつかの実施形態において、ヒプシン化ペプチドは、表１に示される、ヒプシン化ペプチドである。いくつかの実施形態において、ヒプシン化ペプチドは、Ｐ１−Ｈｐｕ（配列番号５６）、Ｐ２−Ｈｐｕ（配列番号５９）、Ｐ３−Ｈｐｕ（配列番号６２）、Ｐ４−Ｈｐｕ（配列番号６４）、Ｐ５−Ｈｐｕ（配列番号６６）、及びＰ６−Ｈｐｕ（配列番号６８）からなる群から選択される１つ以上である。いくつかの実施形態において、デオキシヒプシン化ペプチドは、表１に示される、デオキシヒプシン化ペプチドである。いくつかの実施形態において、デオキシヒプシン化ペプチドは、Ｐ１−デオキシ（配列番号５７）及びＰ２−デオキシ（配列番号６０）からなる群から選択される１つ以上である。いくつかの実施形態において、非ヒプシン化ペプチドは、表１に示される、ヒプシン化ペプチドである。いくつかの実施形態において、非ヒプシン化ペプチドは、Ｐ１（配列番号５８）、Ｐ２（配列番号６１）、Ｐ３（配列番号６３）、Ｐ４（配列番号６５）、Ｐ５（配列番号６７）、及びＰ６（配列番号６９）からなる群から選択される１つ以上である。
【０１１３】
別の態様において、２つ以上のヒプシン化ペプチド及び／またはデオキシヒプシン化ペプチドに結合する汎抗ヒプシン抗体を選択するためのアッセイ及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、２つ以上のヒプシン化ペプチドに結合する汎抗ヒプシン抗体を選択するための方法は、ａ）候補抗体を、Ｐ１−Ｈｐｕ（配列番号５６）、Ｐ２−Ｈｐｕ（配列番号５９）、Ｐ３−Ｈｐｕ（配列番号６２）、Ｐ４−Ｈｐｕ（配列番号６４）、Ｐ５−Ｈｐｕ（配列番号６６）及びＰ６−Ｈｐｕ（配列番号６８）からなる群から選択される２つ以上のヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、ｂ）候補抗体が２つ以上のヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップであって、２つ以上のヒプシン化ペプチドへの結合は、候補抗体が汎抗ヒプシン抗体であることを示す、ステップと、ｃ）汎抗ヒプシン抗体を選択するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、選択された汎抗ヒプシン抗体を、Ｐ１−デオキシ（配列番号５７）及びＰ２−デオキシ（配列番号６０）からなる群から選択される１つ以上のデオキシヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、汎抗ヒプシン抗体が１つ以上のデオキシヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、選択された汎抗ヒプシン抗体を、Ｐ１（配列番号５８）、Ｐ２（配列番号６１）、Ｐ３（配列番号６３）、Ｐ４（配列番号６５）、Ｐ５（配列番号６７）、及びＰ６（配列番号６９）からなる群から選択される１つ以上の非ヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、汎抗ヒプシン抗体が１つ以上の非ヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のデオキシヒプシン化ペプチドに結合する汎抗ヒプシン抗体を選択するための方法は、ａ）候補抗体を、Ｐ１−デオキシ（配列番号５７）及びＰ２−デオキシ（配列番号６０）からなる群から選択される２つ以上のデオキシヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、ｂ）候補抗体が２つ以上のデオキシヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップであって、２つ以上のデオキシヒプシン化ペプチドへの結合は、候補抗体が汎抗ヒプシン抗体であることを示す、ステップと、ｃ）汎抗ヒプシン抗体を選択するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、選択された汎抗ヒプシン抗体を、Ｐ１−Ｈｐｕ（配列番号５６）、Ｐ２−Ｈｐｕ（配列番号５９）、Ｐ３−Ｈｐｕ（配列番号６２）、Ｐ４−Ｈｐｕ（配列番号６４）、Ｐ５−Ｈｐｕ（配列番号６６）、及びＰ６−Ｈｐｕ（配列番号６８）からなる群から選択される１つ以上のヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、汎抗ヒプシン抗体が１つ以上のヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、選択された汎抗ヒプシン抗体を、Ｐ１（配列番号５８）、Ｐ２（配列番号６１）、Ｐ３（配列番号６３）、Ｐ４（配列番号６５）、Ｐ５（配列番号６７）、及びＰ６（配列番号６９）からなる群から選択される１つ以上の非ヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、汎抗ヒプシン抗体が１つ以上の非ヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のデオキシヒプシン化ペプチド及び１つ以上のヒプシン化ペプチドに結合する汎抗ヒプシン抗体を選択するための方法は、ａ）候補抗体を、Ｐ１−デオキシ（配列番号５７）及びＰ２−デオキシ（配列番号６０）からなる群から選択される１つ以上のデオキシヒプシン化ペプチド、ならびにＰ１−Ｈｐｕ（配列番号５６）、Ｐ２−Ｈｐｕ（配列番号５９）、Ｐ３−Ｈｐｕ（配列番号６２）、Ｐ４−Ｈｐｕ（配列番号６４）、Ｐ５−Ｈｐｕ（配列番号６６）、及びＰ６−Ｈｐｕ（配列番号６８）からなる群から選択される１つ以上のヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、ｂ）候補抗体が１つ以上のデオキシヒプシン化ペプチド及び１つ以上のヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップであって、１つ以上のデオキシヒプシン化ペプチド及び１つ以上のヒプシン化ペプチドへの結合は、候補抗体が汎抗ヒプシン抗体であることを示す、ステップと、ｃ）汎抗ヒプシン抗体を選択するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、汎抗ヒプシン抗体を、Ｐ１（配列番号５８）、Ｐ２（配列番号６１）、Ｐ３（配列番号６３）、Ｐ４（配列番号６５）、Ｐ５（配列番号６７）及びＰ６（配列番号６９）からなる群から選択される１つ以上の非ヒプシン化ペプチドと接触させるステップと、汎抗ヒプシン抗体が１つ以上の非ヒプシン化ペプチドに結合するかどうかを決定するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態において、選択された汎抗ヒプシン抗体は、ヒプシン及びデオキシヒプシンに結合する。いくつかの実施形態において、選択された汎抗ヒプシン抗体は、ヒプシンに結合するが、デオキシヒプシンに結合しない。
【０１１４】
汎抗ヒプシン抗体を選択するための方法のいくつかの実施形態において、ステップａ）は、ヒプシン化ペプチド及び／またはデオキシヒプシン化ペプチドへの結合について単一候補抗体を試験することを含む。汎抗ヒプシン抗体の選択のための方法のいくつかの実施形態において、ステップａ）は、ヒプシン化ペプチド及び／またはデオキシヒプシン化ペプチドへの結合について複数の候補抗体を試験することを含む。汎抗ヒプシン抗体の選択のための方法のいくつかの実施形態において、ステップｃ）は、試験した複数の候補抗体から１つ以上の汎抗ヒプシン抗体を選択することを含む。例えば、ヒプシン化ペプチド及び／またはデオキシヒプシン化ペプチドに結合する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００であるが、５００以下の汎抗ヒプシン抗体を選択すること。本明細書に提供される汎抗ヒプシン抗体を選択する方法において試験される複数の抗体は、ハイブリドーマライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞等）由来のｍＲＮＡから調製された軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインｃＤＮＡを用いて調製されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー、溶液相ライブラリー、固相ライブラリー、及び親和性クロマトグラフィー選択を用いたもの等の合成ライブラリー法が含まれるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の組み合わせ抗体ライブラリー法の多くの手法のうちのいずれかを用いて得られ得る。かかるライブラリーの調製及びスクリーニング方法は、当該技術分野において周知である。ハイブリドーマライブラリー及びファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）を作製するための市販のキットに加えて、２４０６１２）、抗体ライブラリーを作製及びスクリーニングするために特に使用可能な方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／１８６１９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９１／１７２７１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／２０７９１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／１５６７９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９３／０１２８８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／０１０４７号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／０９６９０号に見出され得る。
【０１１５】
別の態様において、抗ヒプシン抗体がヒプシン化ペプチドに結合する抗ヒプシン抗体（例えば、汎抗ヒプシン抗体）を産生する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ヒプシン化ペプチドに結合する抗ヒプシン抗体を産生する方法は、抗ヒプシン抗体を産生する条件下で、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞）を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞によって産生される抗ヒプシン抗体を回収することをさらに含む。別の態様において、抗ヒプシン抗体がデオキシヒプシン化ペプチドに結合する抗ヒプシン抗体（例えば、汎抗ヒプシン抗体）を産生する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、デオキシヒプシン化ペプチドに結合する抗ヒプシン抗体を産生する方法は、抗ヒプシン抗体を産生する条件下で、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞）を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞によって産生される抗ヒプシン抗体を回収することをさらに含む。別の態様において、ヒプシン化ペプチドに結合するが、デオキシヒプシン化ペプチドに結合しない汎抗ヒプシン抗体を産生する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ヒプシン化ペプチドに結合するが、デオキシヒプシン化ペプチドに結合しない汎抗ヒプシン抗体を産生する方法は、汎抗ヒプシン抗体を産生する条件下で、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞）を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞によって産生される汎抗ヒプシン抗体を回収することをさらに含む。
【０１１６】
ＩＩＩ．抗体の調製
本明細書に記載される抗体は、抗体を生成するための当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法は、以下の節により詳細に記載される。
【０１１７】
１．抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと、また、ＷＯ  ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照のこと。エピトープ残基を結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察に関しては、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。
【０１１８】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ  ４０４，０９７、ＷＯ  １９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１１９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１を参照のこと）。
【０１２０】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、無傷抗体のタンパク質消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない、様々な技法によって作製することができる。
【０１２１】
２．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。
【０１２２】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリー内でランダムに組換えられ、その後、これは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載される抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローン化して、いかなる免疫化も伴わずに幅広い非自己抗原及び自己抗原に抗体の単一源を提供することができる。最後に、ナイーブレパートリーは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローン化し、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再編成を達成することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１２３】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１２４】
３．抗体変異型
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異型が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異型は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列の残基からの欠失、及び／またはそこへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【０１２５】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異型
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異型が提供される。置換型変異誘発の目的とする部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表Ａに「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表Ａに「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換は、目的とする抗体に導入され得、生成物が所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合について、スクリーニングされる。
2018532376.tif 000003
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１２６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１２７】
置換変異体の一種は、親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択される、得られた変異型（複数可）は、親抗体と比べて、ある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加）における改変（例えば、改善）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換変異型は、例えば、本明細書に記載される技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異型抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１２８】
改変（例えば、置換）は、ＨＶＲにおいて、例えば抗体親和性を改善するために行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６  （２００８）を参照のこと）、及び／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異型ＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーの構築及びそれからの再選択による親和性成熟については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和成熟のいくつかの実施形態において、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異型を特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的とされる。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ間で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＨＶＲ内で行われ得る。かかる改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であってもよい。上に提供された変異型ＶＨ配列及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０１３０】
変異誘発のための標的とされ得る抗体の残基または領域の特定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかどうかを決定する。さらなる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異型がスクリーニングされて、それらが所望の特性を有するかを決定することができる。
【０１３１】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異型には、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増加させる。
【０１３２】
ｂ）グリコシル化変異型
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
【０１３３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の修飾は、ある特定の改善された特性の改善を有する抗体変異型を作製するために行われ得る。
【０１３４】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異型が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体内のわずかな配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち２９４〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異型は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ  ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ  ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異型に関する刊行物の例としては、ＵＳ  ２００３／０１５７１０８、ＷＯ  ２０００／６１７３９、ＷＯ  ２００１／２９２４６、ＵＳ  ２００３／０１１５６１４、ＵＳ  ２００２／０１６４３２８、ＵＳ  ２００４／００９３６２１、ＵＳ  ２００４／０１３２１４０、ＵＳ  ２００４／０１１０７０４、ＵＳ  ２００４／０１１０２８２、ＵＳ  ２００４／０１０９８６５、ＷＯ  ２００３／０８５１１９、ＷＯ  ２００３／０８４５７０、ＷＯ  ２００５／０３５５８６、ＷＯ  ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９  （２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ  ２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ  ２００４／０５６３１２  Ａ１、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４  （２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７）が挙げられる。
【０１３５】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異型がさらに提供される。かかる抗体変異型は、低減されたフコシル化を有し得る。かかる抗体変異型の例は、例えば、ＷＯ  ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）、及びＵＳ  ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異型も提供される。かかる抗体変異型は、例えば、ＷＯ  １９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ  １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ  １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１３６】
ｃ）Ｆｃ領域変異型
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異型が生成され得る。Ｆｃ領域変異型は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１３７】
ある特定の実施形態において、本発明は、いくつかであるが全てではなくエフェクター機能を保有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、さらにある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）が不必要であるか、または有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体変異型を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照のこと）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２  （１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ  ２００６／０２９８７９及びＷＯ  ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して行うこともできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。
【０１３８】
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上の置換を有するＦｃ変異体、例えば、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１３９】
ＦｃＲへの結合が改善または低減されたある特定の抗体変異型が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ  ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと）。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、抗体変異型は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ  ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、改変はＦｃ領域内で行われ、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の改変（すなわち、改善または低減）をもたらす。
【０１４２】
増加した半減期、及び胎児への母体ＩｇＧの移動を担う新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異型には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１４３】
Ｆｃ領域変異型の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ  ９４／２９３５１も参照のこと。
【０１４４】
ｄ）システイン操作された抗体変異型
ある特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、検出剤等の他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）のうちの任意の１つ以上をシステインで置換してもよい。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０１４５】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、１つを超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
【０１４６】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってもよく、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に隣接する細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
４．ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本発明の抗体の組換え産生では、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために、複製可能ベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、抗体の重鎖軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、宿主細胞は、原核生物または真核細胞（一般に哺乳動物）起源のいずれかの宿主細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解されるであろう。
【０１４８】
原核生物宿主細胞を使用した抗体の生成：
ａ）ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得られ得る。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技法を用いて合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、かつ当該技術分野で既知の多くのベクターが本発明のために使用され得る。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞によって異なるであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分には、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、それ故に形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内因性タンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターも含有し得るか、またはそれを含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳述される。
【０１５０】
加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、λＧΕΜ．ΤΜ．−１１等のバクテリオファージが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換するために使用され得る組換えベクターを作製する際に利用されてもよい。
【０１５１】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス、すなわち誘導プロモーター及び構成プロモーターに分けられる。誘導プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答してその制御下で増加したレベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
【０１５２】
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、かつ単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に結合することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／または発現を誘導するために使用することができる。いくつかの実施形態において、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１５３】
原核生物宿主との使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターが含まれる。しかしながら、細菌において機能的である他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーター等）も好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それにより、当業者が、任意の必要とされる制限部位を提供するためにリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに作動可能に連結することが可能になっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０１５４】
本発明の一態様において、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたる発現ポリペプチドの転位を誘導する分泌シグナル配列構成成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成成分であり得るか、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される原核シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態において、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異型である。
【０１５５】
別の態様において、本発明に従って免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質で生じ得、したがって、各シストロン内での分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点で、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、細胞質内で発現され、折り畳まれ、組み立てられて機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に有利な細胞質条件を提供し、それによって、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０１５６】
本発明の抗体はまた、発現したポリペプチド構成成分の定量的比率が、本発明の分泌及び適切に組み立てられた抗体の収率を最大限にするように調節され得る、発現系を用いることによっても産生され得る。かかる調節は、少なくとも部分的には、ポリペプチド構成成分に関する翻訳強度を同時に調節することによって達成される。
【０１５７】
翻訳強度を調節するための一技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓらの米国特許第５，８４０，５２３号に開示されている。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲに関して、一連のアミノ酸または核酸配列変異体が、一連の翻訳強度で作製され、それにより、この因子を特定鎖の所望の発現レベルに調整するための便利な手段を提供する。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を変更し得るコドン変化を生じる慣用的突然変異誘発技法により生成され得る。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲにおける変更には、例えば、シグナル配列における変更とともに、シャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の数または間隔における変更が含まれ得る。変異体シグナル配列を生成するための一方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変えない（すなわち、変化はサイレントである）コード配列の開始での「コドンバンク」の生成である。これは、各コドンの第三ヌクレオチド位置を変えることにより成し遂げられ得る、さらに、いくつかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンは、バンクを作製するに際して複雑性を付加し得る多重第一及び第二位置を有する。突然変異誘発のこの方法は、Ｙａｎｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載されている。
【０１５８】
一実施形態において、一組のベクターが、その中の各シストロンに関して一連のＴＩＲ強度で生成される。この限定された組は、種々のＴＩＲ強度の組み合わせの下で、各鎖の発現レベルならびに所望の抗体産物の収率の比較を提供する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓらの米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるようなレポーター遺伝子の発現レベルを定量することにより決定され得る。翻訳強度比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲは、本発明の発現ベクター構築物に組み合わせられるよう選択される。
【０１５９】
本発明の抗体の発現に好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌等のＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態において、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、本発明の宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲを有する株３３Ｄ３（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。特許第他の株及びそれらの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉλ  １７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれの誘導体の構築方法も、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。一般に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して適切な細菌を選択することが必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０等の周知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が宿主として好適に使用され得る。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素しか分泌すべきでなく、さらなるプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物に組み込まれることが望ましくあり得る。
【０１６０】
ｂ）抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。
【０１６１】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になるように、ＤＮＡを原核生物宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換がかかる細胞に適切な標準の技法を用いて行われる。一般に、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるなおも別の技法は、電気穿孔である。
【０１６２】
本発明のポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、当該技術分野で既知の、かつ選択された宿主細胞の培養に好適な培地で成長させられる。好適な培地の例としては、必要な栄養素補充物を含むルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、培地は、発現ベクターを含有する原核生物細胞の成長を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリンが、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるための培地に添加される。
【０１６３】
炭素、窒素、及び無機リン酸塩源に加えて、任意の必要な補充物も、単独で、または複合窒素源等の別の補充物もしくは培地との混合物として導入される適切な濃度で含まれ得る。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
【０１６４】
原核生物宿主細胞は、好適な温度で培養される。ある特定の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ成長の場合、成長温度は、約２０℃〜約３９℃の範囲、約２５℃〜約３７℃の範囲、または約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。ある特定の実施形態において、Ｅ．  ｃｏｌｉの場合、ｐＨは、約６．８〜約７．４、または約７．０である。
【０１６５】
誘導プロモーターが本発明の発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様において、ＰｈｏＡプロモーターが、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸塩制限培地で培養される。ある特定の実施形態において、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照されたい）。様々な他の誘導因子が、当該技術分野で既知の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。
【０１６６】
一実施形態において、本発明の発現ポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、それから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解等の手段による微生物の破壊を伴う。細胞が破壊されると、細胞残屑または全細胞は、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製される。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞が培養物から除去され得、培養上清が、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濾過及び濃縮される。発現ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイ等の一般に既知の方法を使用してさらに単離及び特定され得る。
【０１６７】
本発明の一態様において、抗体産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。様々な大規模供給バッチ発酵手順が組換えタンパク質の産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、ある特定の実施形態において、約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコースを分布させるために撹拌インペラーを使用する。小規模発酵とは、一般に、容積がおよそ１００リットル以下であり、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽での発酵を指す。
【０１６８】
発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０になるまで好適な条件下で成長した後に開始され、その段階で、細胞は、初期静止期にある。当該技術分野で知られており、また上述のように、様々な誘導因子が、用いられるベクター構築物に従って使用され得る。細胞は、誘導前により短い期間成長させられてもよい。細胞は、通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間も使用され得る。
【０１６９】
本発明のポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、様々な発酵条件が修正され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切な集合及び折り畳みを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及びまたはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス、トランス−イソメラーゼ）のシャペロンタンパク質を過剰発現するさらなるベクターを使用して、宿主原核生物細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解を容易にすることが実証されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１−１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５、Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３、Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０１７０】
発現異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株が本発明に使用され得る。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせをコードする遺伝子において遺伝子変異（複数可）をもたらすように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）（上記参照）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０１７１】
一実施形態において、タンパク質分解酵素が欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株が、本発明の発現系における宿主細胞として使用される。
【０１７２】
ｃ）抗体精製
一実施形態において、本明細書で産生される抗体タンパク質は、さらなるアッセイ及び使用のために、実質的に同種の調製物を得るようにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手順は、好適な精製手順の例示である：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥ等のシリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用したゲル濾過。
【０１７３】
一態様において、固相に固定化されたプロテインＡが、本発明の抗体産物の免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、高親和性で抗体のＦｃ領域に結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓからの４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡが固定化される固相は、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、または、制御孔ガラスカラムもしくはケイ酸カラムであり得る。いくつかの適用では、カラムは、夾雑物の非特異的結合を防ぐ可能性があるためにグリセロール等の試薬でコーティングされている。
【０１７４】
精製の第１のステップとして、上述のように細胞培養から得られた調製物がプロテインＡ固定化固相に適用されて、目的とする抗体のプロテインＡへの特異的結合を可能にし得る。次いで、固相は、固相に非特異的に結合している夾雑物を除去するために洗浄され得る。最後に、目的とする抗体が、溶出により固相から回収される。
【０１７５】
真核性宿主細胞を使用した抗体の生成：
真核性宿主細胞において使用するためのベクターは、一般に、非限定的構成成分：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含む。
【０１７６】
ａ）シグナル配列構成成分
真核宿主細胞において使用するためのベクターもまた、目的とする成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドを含有してもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシング（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳類細胞発現においては、哺乳類シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、抗体をコードするＤＮＡに連結される。
【０１７７】
ｂ）複製起点
一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は、ただ初期プロモーターを含有するため、一般的に、使用され得る。
【０１７８】
ｃ）選択遺伝子構成成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか（関連性のある場合）、または（ｃ）複合培地から入手不可能な必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【０１７９】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、それ故に選択レジメンで生き残る。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０１８０】
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の、抗体核酸を取り込むための細胞成分の特定を可能にするものである。
【０１８１】
例えば、いくつかの実施形態において、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体の全てを培養することによって、特定される。いくつかの実施形態において、野生型ＤＨＦＲが用いられるときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０１８２】
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等の別の選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８等の選択可能なマーカー用の選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）が欠損した細胞株を含む、ＮＳ０、ＣＨＯＫ１、または誘導体を含み得る。哺乳類細胞のために選択可能なマーカーとしてＧＳを使用するための方法は、米国特許第５，１２２，４６４号、及び米国特許第５，８９１，６９３号において記載されている。
【０１８３】
ｄ）プロモーター構成成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、かつ目的とするポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結するプロモーターを含有する。真核生物のためのプロモーター配列が知られている。例えば、実質的に全ての真核遺伝子が、転写が始まる部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。ある特定の実施形態において、これらの配列のうちのいずれかまたは全てが、真核性発現ベクターに好適に挿入され得る。
【０１８４】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御されるが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０１８５】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳類宿主におけるＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾については、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現を記載する、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０１８６】
ｅ）エンハンサーエレメント構成成分
より高次の真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）からの多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素を記載している、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５’位または３’位でベクターにスプライスされ得るが、通常、プロモーターから５’部位に位置する。
【０１８７】
ｆ）転写終結構成成分
真核性宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有し得る。かかる配列は、一般に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそれらで開示される発現ベクターを参照されたい。
【０１８８】
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター内でのＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核生物の細胞が含まれる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の調製は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ＣＨＯＫ１または誘導体及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１８９】
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
【０１９０】
ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許第３０，９８５号に記載の培地のうちのいずれも、宿主細胞のための培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬等）、微量要素（マイクロモルの範囲の最小濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の補充物もまた、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞にこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１９１】
ｉ）抗体の精製
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞内、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、まず濃縮され得る。タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を阻止するための抗生物質が含まれてもよい。
【０１９２】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが典型的な精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに応じて異なる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧが全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースであり得るが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成可能なものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１９３】
任意の予備精製ステップ（複数可）後、目的とする抗体及び夾雑物を含む混合物が、例えば、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用して、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによってさらなる精製に供され得る。
【０１９４】
一般に、研究、試験、及び臨床で使用するための抗体を調製するための様々な方法論が当該技術分野で十分に確立されており、上述の方法論と一致しており、かつ／または当業者により目的とする特定の抗体に適切であると見なされる。
【０１９５】
ＩＶ．組成物
本明細書に記載される抗ヒプシン抗体の組成物または製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、１つ以上の任意の許容される担体と混合することによって調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体は、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、アクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。
【０１９６】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが含まれ、後者の製剤にはヒスチジン−酢酸緩衝液が含まれる。
【０１９７】
本明細書における組成物はまた、必要に応じて、２つ以上の活性成分（例えば、検出剤、二次薬剤等）を含み得る。かかる活性成分は、好適には、意図される目的のために有効な量で組み合わせで存在する。
【０１９８】
抗ヒプシン抗体は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１９９】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
【０２００】
インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成され得る。
【０２０１】
Ｖ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体はいずれも、試料中のヒプシン含有ポリペプチドの存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。ある特定の実施形態において、試料は生体試料である。実施形態において、生体試料は、細胞、または臓器からの組織等の組織を含む。いくつかの実施形態において、組織は、乳房組織、皮膚組織、脳組織、肝臓組織、腎臓組織、卵巣組織、子宮組織、頸部組織、心臓組織、肺組織、またはリンパ系組織であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、循環腫瘍細胞、組織から単離された細胞、細胞株であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、生体試料は、洗浄液、細胞溶解物、血漿、血液、または血清等の流体である。本明細書に記載される試料は、試料中のポリペプチドの検出を可能にするために、当該技術分野で常法を用いてプロセスされる。
【０２０２】
一実施形態において、診断または検出方法において使用するための抗ヒプシン抗体が提供される。さらなる態様では、試料中のヒプシン含有ポリペプチドの存在の検出方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、ヒプシン含有ポリペプチドへの抗ヒプシン抗体の結合を許容する条件下で、試料を本明細書に記載される抗ヒプシン抗体と接触させることと、抗ヒプシン抗体とヒプシン含有ポリペプチドとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することと、を含む。さらなる態様では、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドの存在の検出方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、デオキシヒプシン含有ポリペプチドへの抗ヒプシン抗体の結合を許容する条件下で、試料を本明細書に記載される抗ヒプシン抗体と接触させることと、抗ヒプシン抗体とデオキシヒプシン含有ポリペプチドとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。一実施形態において、例えば、ポリペプチド中のヒプシン及び／またはデオキシヒプシンが患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗ヒプシン抗体を使用して、治療薬を用いた療法に適格な対象を選択する。
【０２０３】
ある特定の実施形態において、検出剤を含むまたは検出剤に結合している（本明細書では、「複合される」とも称される）抗ヒプシン抗体が提供される。検出剤（本明細書では、「標識」とも称される）としては、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識等）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される部分、例えば、酵素またはリガンドが含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン等のフルオロフォア及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ等）とカップリングした複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、ジゴキシゲニン等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、検出剤は、化学発光基質、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。
【０２０４】
抗ヒプシン抗体または二次薬剤（例えば、抗体）の検出剤への複合化は、免疫アッセイ技法における標準の操作手技である。例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ及びＨ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ，Ｖｏｌ．７３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８１），ｐｐ．１４７−１６６を参照されたい。標識部分をタンパク質またはポリペプチドに共有結合させる従来の方法が利用可能である。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジン等のカップリング剤を使用して、抗体を、上述の蛍光標識、化学発光標識、及び酵素標識で標識化することができる。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光測定法）及び米国特許第３，６４５，０９０号（酵素）、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４−１０２１、Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４０：２１９−２３０、及びＮｙｇｒｅｎ  Ｊ．，１９８２，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７−４１２を参照されたい。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ヒプシンを含有するポリペプチド及び／またはデオキシヒプシンに結合した抗ヒプシン抗体は、二次薬剤を使用して検出される。二次薬剤は、抗体の検出のために当該技術分野で日常的に使用される任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態において、二次薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態において、二次薬剤は、本明細書に記載される検出剤に結合している。
【０２０６】
一態様において、本発明は、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法を提供し、本方法は、（ａ）試料を本明細書に記載される抗ヒプシン抗体と接触させるステップと、（ｂ）試料中のポリペプチドに結合した抗ヒプシン抗体を検出するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される検出剤に結合している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドに結合した抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される二次薬剤を使用して検出される。いくつかの実施形態において、検出剤は、化学発光基質、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。いくつかの実施形態において、検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択されるであるが、これらに限定されない、本明細書に記載される１つ以上のアッセイによる。いくつかの実施形態において、試料は、本明細書に記載される生体試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、流体である。
【０２０７】
一態様において、本発明は、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法を提供し、本方法は、（ａ）試料を本明細書に記載される抗ヒプシン抗体と接触させるステップと、（ｂ）試料中のポリペプチドに結合した抗ヒプシン抗体を検出するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される検出剤に結合している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドに結合した抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される二次薬剤を使用して検出される。いくつかの実施形態において、検出剤は、化学発光基質、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。いくつかの実施形態において、検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択されるであるが、これらに限定されない、本明細書に記載される１つ以上のアッセイによる。いくつかの実施形態において、試料は、本明細書に記載される生体試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、流体である。
【０２０８】
当該技術分野で既知の方法を使用して、抗ヒプシン抗体とヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチドとの間の結合を検出することができる。ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））、Ｉｍｍｕｎｏｃａｐ（登録商標）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法アッセイを使用してもよい。アッセイは、同種、半同種、または非同種であり得る。例えば、ほとんどのＥＬＩＳＡは、標的タンパク質の補足及び検出のために抗体及び／またはリガンドを使用する。これらのＥＬＩＳＡは、同種、半同種、または非同種のアッセイ形式を使用して、感度を最大にする、またはマトリックス干渉を軽減することができる。
【０２０９】
同種アッセイは、捕捉剤（例えば、抗ヒプシン抗体）及び検出剤（例えば、検出剤、二次薬剤等）の両方が液相反応で標識タンパク質（例えば、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチド）を含有するマトリックス試料で同時にプレインキュベートする形式を使用する。次いで、捕捉剤−標的タンパク質−検出剤の複合体は、固相（ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート）上で捕捉し、洗浄し、表面に捕捉された検出剤の量を検出することによって（例えば、検出剤が酵素である場合、適切な基質溶液の添加によって）定量化する。半同種アッセイは、捕捉剤のみが液相反応でマトリックス試料とともにプレインキュベートされる形式を使用する。次いで、この捕捉剤−標的タンパク質の複合体を、固相上に捕捉し、洗浄し、次いで、検出剤とともにインキュベートし、洗浄し、定量化する。非同種アッセイは、いかなる液相のプレインキュベーションステップも使用しないが、その代わりに、連続ステップを使用する。捕捉剤を固相に捕捉し、洗浄し、標的タンパク質を含有するマトリックス試料を添加し、捕捉剤によって結合し、洗浄し、検出試薬によって結合し、洗浄し、最終的に定量化する。
【０２１０】
捕捉試薬（例えば、抗ヒプシン抗体）は、アッセイ手順前の、不水溶性マトリックスまたは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）、または米国特許第３，６４５，８５２号もしくはＲｏｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５７：８７−９８に記載される、例えば、硝酸及び還元剤で支持体の事前活性化を行うもしくはこの事前活性化を行わない、例えば、グルタルアルデヒドもしくはカルボジイミド架橋結合を用いることによる非共有もしくは共有結合のような、あるいはアッセイ手順後の、捕捉試薬を不溶性にすることによって固相に固定化され得る。いくつかの実施形態において、固定化後に捕捉試薬（例えば、抗ヒプシン抗体）は、試料からの標的分子（例えば、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチド）に結合させるために使用できる。
【０２１１】
本明細書に記載される任意の固相または表面（小シート、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、塩化ポリビニル、プラスチックビーズ、微小粒子、アッセイプレート、またはポリスチレンから製造される試験管、及びポリスチレン）は、本明細書の方法のいくつかの実施形態において使用され得る。固定化のために使用される固相または表面は、例えば、表面、粒子、多孔質マトリックス、セルロースポリマースポンジ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）、Ｐｈａｄｉａ）等の形態の支持体を含む、本質的に水不溶性であり、かつ免疫測定アッセイに有用な任意の不活性支持体または担体であり得る。一般に使用されている支持体の例としては、小シート、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、微小粒子、アッセイプレート、またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等から製造された試験管が挙げられる。かかる支持体としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、ならびに濾紙等の粒子材料、アガロース、架橋デキストラン、及び他の多糖が挙げられる。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、及び同第４，３３０，４４０号に記載の反応性水不溶性マトリックス、例えば、臭化シアン活性化炭水化物及び反応性基質が、捕捉試薬固定化に好適に用いられる。ある実施形態において、固定化捕捉試薬は、一度にいくつかの試料を分析するために使用され得るマイクロタイタープレート、好ましくはマルチウェルマイクロタイタープレート上にコーティングされる。
【０２１２】
固相は、非共有結合もしくは共有結合相互作用、または所望の場合、物理的結合によって結合し得る、捕捉試薬（例えば、抗ヒプシン抗体）でコーティングされる。結合技法としては、米国特許第４，３７６，１１０号及びそこに引用される参考文献に記載のものが挙げられる。プレートに対して捕捉試薬の共有結合が用いられる場合、プレートまたは他の固相は捕捉試薬とともに架橋剤とインキュベートすることができる。固相基質に捕捉試薬を付着するために一般的に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル類、例えば４−アジドサリチル酸を有するエステル類、３，３’−ジチオビス（サクシンイミドイルプロピオネート）等のジサクシンイミドイルエステル類、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド類を含むホモ二官能性イミドエステルが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能である、光活性化することができる中間体を産出する。コーティングされた固相材料は、典型的には、結合部位に非特異的に結合してプレートのウェル上の過剰な結合部位への遊離分析分子の望ましくない結合を阻止するための結合部位を飽和させる遮断剤で処理される。適切な遮断剤の例としては、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂乳が含まれる。遮断処理は、典型的には、約１〜４時間、好ましくは約１．５〜３時間、周囲温度の条件下で行われる。
【０２１３】
分析される本明細書に記載される試料は、必要に応じて希釈し、固定化プレートに添加され得る。希釈に使用され得る緩衝液としては、例えば、（ａ）０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ２０（商標）、洗剤（Ｐ２０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｃｈａｐｓ界面活性剤、０．２％  ベータ−ガンマグロブリン、及び    ０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、（ｂ）０．５％  ＢＳＡ及び０．０５％  Ｐ２０を含有するＰＢＳ、（ｃ）０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｐ２０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３５を含有するＰＢＳ、（ｄ）０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｐ２０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ベータ−ガンマグロブリン、及び０．３５  Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、（ｅ）０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｐ２０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｃｈａｐｓ、及び０．３５Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳ、及び（ｆ）０．５％  Ｐ２０を含有するＰＢＳが挙げられる。
【０２１４】
本明細書に記載される試料及び捕捉試薬（例えば、ヒプシン抗体）のインキュベーションの条件は、アッセイの感度を最大にし、解離を最小限に抑えるように選択される。インキュベーション時間は、主に温度に応じて異なる。
【０２１５】
本明細書に記載される方法で使用されるインキュベーション緩衝液のｐＨは、捕捉される分析物（例えば、ヒプシンを含有するポリペプチド）に捕捉試薬（例えば、抗ヒプシン抗体）が特異的に結合するための有意なレベルを維持するように選択する。いくつかの実施形態において、インキュベーション緩衝液のｐＨは、約６〜９．５（約６〜７のｐＨを含む）である。いくつかの実施形態において、インキュベーション緩衝液のｐＨは、約７．２である。ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス−ＨＣｌもしくはＴｎｓ−リン酸塩、アセテート、バルビタール等を含む、様々な緩衝液を使用して、このステップの間に所望のｐＨに達し、維持することができる。通常、用いられる特定の緩衝液は重要でないが、それぞれのアッセイで、２以上の緩衝液よりも１つの緩衝液が好ましい場合がある。
【０２１６】
試料は、洗浄溶液を用いて固定化捕捉試薬（例えば、抗ヒプシン抗体）から分離して、システムから、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを含有しないポリペプチド等の非特異的分子を除去することができる。洗浄溶液は、通常、緩衝液である。上述のインキュベーション緩衝液は、好適な洗浄溶液である。洗浄溶液のｐＨは、インキュベーション緩衝液に対して上述のように決定される。ある実施形態において、洗浄溶液のｐＨは、約６〜９、より好ましくは約６〜７である。洗浄は、１つ以上行われ得る。洗浄溶液の温度は、約０〜４０℃、より好ましくは約４〜３０℃であるであり得る。自動プレート洗浄機を利用することができる。
【０２１７】
系から、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシンを含有しないポリペプチド等の非特異的分子の除去後に、捕捉分析物分子（例えば、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチド）は、検出剤と接触され得る。分析物分子を検出剤と接触させるための温度及び時間は、主に用いられる検出手段に応じて異なる。例えば、ストレプトアビジンにコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＳＡ−ＨＲＰ）が検出手段として用いられる場合には、検出剤は、約０．５〜２時間、より好ましくは約１時間、捕捉された分析物とインキュベートするのが好ましい。系から結合しない検出剤を除去するために上記の通りに系を洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を加えて反応させ、室温で約１５分間、または色が十分に可視化されるまでプレートをインキュベートすることによって発色させる。ある実施形態において、結合していない分析物が系から洗浄された後に、過剰モルの検出剤が系に加えられる。
【０２１８】
捕捉試薬（例えば、抗ヒプシン抗体）に結合した（例えば、ヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチド）の量は、固定化相から結合していない検出剤を洗浄して、標識に適切である検出法を用いて分析物に結合した検出剤の量を計量することによって決定される。ある実施形態において、標識部分は、酵素である。酵素部分の場合、発色色素の量が、捕捉された分析物の量の直接の測定値である。例えば、ＨＲＰが標識部分である場合、色素は、（例えば、４５０ｎｍで）の吸光度で光学密度（Ｏ．Ｄ．）を定量化することによって検出される。別の実施形態において、捕捉試薬に結合した分析物の量は、間接的に測定される。非標識の検出剤のシグナルは、標識部分に複合化される抗検出剤抗体を用いた検出のために増幅することができる。例えば、標的分子を結合する非標識マウス抗体のシグナルは、ＨＲＰで標識したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて増幅することができる。標識部分は、標識に適切である検出法を用いて検出される。例えば、ＨＲＰは、比色基質とＨＲＰとを反応させ、４５０ｎｍ吸光度で反応した基質の光学密度を測定することによって検出することができる。
【０２１９】
システムのｐＨ及び／または温度を、標的分子を結合する分子を特定するために変更することができる。
【０２２０】
陽性対照を、アッセイを構築し、アッセイの感度を評価するために使用してもよく、及び／またはアッセイのための対照を使用してもよい。陽性対照を、本明細書に記載される方法のうちのいずれかで使用してもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、デオキシヒプシンに結合しない陽性対照抗ヒプシン抗体を試験することを含む。いくつかの実施形態において、アッセイは、ヒプシンに結合する陽性対照抗ヒプシン抗体を試験することを含む。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体の試料中のヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチドへの結合及び陽性対照抗体のヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチドへの結合が、検出され、比較される。
【０２２１】
陰性対照を、アッセイを構築し、アッセイの感度を評価するために使用してもよく、及び／またはアッセイのための対照を使用してもよい。陰性対照を、本明細書に記載される方法のうちのいずれかで使用してもよい。いくつかの実施形態において、アッセイは、デオキシヒプシンに結合しない陰性対照抗ヒプシン抗体を試験することを含む。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体の試料中のヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチドへの結合及び陰性対照抗体のヒプシン及び／またはデオキシヒプシン含有ポリペプチドへの結合が、検出され、比較される。
【０２２２】
一態様において、本発明は、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法を提供し、本方法は、（ａ）試料を本明細書に記載される抗ヒプシン抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合したポリペプチドを単離するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される検出剤に結合している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドに結合した抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される二次薬剤を使用して検出される。いくつかの実施形態において、検出剤は、化学発光基質、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。いくつかの実施形態において、検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択されるであるが、これらに限定されない、本明細書に記載される１つ以上のアッセイによる。いくつかの実施形態において、該抗体は、本明細書に記載される固体表面に固定化される。いくつかの実施形態において、試料は、本明細書に記載される生体試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、流体である。
【０２２３】
一態様において、本発明は、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法を提供し、本方法は、（ａ）試料を本明細書に記載される抗ヒプシン抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合したポリペプチドを単離するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される検出剤に結合している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドに結合した抗ヒプシン抗体は、本明細書に記載される二次薬剤を使用して検出される。いくつかの実施形態において、検出剤は、化学発光基質、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。いくつかの実施形態において、検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択されるであるが、これらに限定されない、本明細書に記載される１つ以上のアッセイによる。いくつかの実施形態において、該抗体は、本明細書に記載される固体表面に固定化される。いくつかの実施形態において、試料は、本明細書に記載される生体試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、流体である。
【０２２４】
ヒプシン含有ポリペプチド及びデオキシヒプシン含有ポリペプチドは、本明細書に記載されるもののような当該技術分野での標準技法を用いて単離することができる。例えば、ヒプシン含有ポリペプチド及びデオキシヒプシン含有ポリペプチドは、免疫親和性またはイオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びゲル濾過によって単離することができる。
【０２２５】
単離されたヒプシン含有ポリペプチド及びデオキシヒプシン含有ポリペプチドは、当該技術分野での標準技法を用いて特定することができる。例えば、単離されたポリペプチドのアミノ酸配列が、標準的なシークエンシング法によって得られ得る。別例として、単離されたポリペプチドの物理的特性もまた、質量分析法を用いることによって決定することができる。
【０２２６】
ＶＩ．製品またはキット
本発明はまた、本明細書に記載される方法で用いるためのキットも提供する。
【０２２７】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体またはその組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法において、抗ヒプシン抗体の使用のための１つ以上の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法において、抗ヒプシン抗体の使用のための１つ以上の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の薬剤は、本明細書に記載される緩衝液、固体表面、検出剤、二次薬剤、陽性対照、または陰性対照である。いくつかの実施形態において、陽性対照は、ヒプシン含有ポリペプチドを含む。本明細書のいくつかの実施形態において、陰性対照は、非ヒプシン含有ポリペプチドを含む。本明細書のいくつかの実施形態において、陽性対照は、デオキシヒプシン含有ポリペプチドである。本明細書のいくつかの実施形態において、陰性対照は、非デオキシヒプシン含有ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、試料は、生体試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含有する。いくつかの実施形態において、生体試料は、流体である。
【０２２８】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体またはその組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法において、抗ヒプシン抗体の使用のための１つ以上の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法において、抗ヒプシン抗体の使用のための１つ以上の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の薬剤は、本明細書に記載される緩衝液、固体表面、検出剤、二次薬剤、陽性対照、または陰性対照である。いくつかの実施形態において、陽性対照は、ヒプシン含有ポリペプチドを含む。本明細書のいくつかの実施形態において、陰性対照は、非ヒプシン含有ポリペプチドを含む。本明細書のいくつかの実施形態において、陽性対照は、デオキシヒプシン含有ポリペプチドである。本明細書のいくつかの実施形態において、陰性対照は、非デオキシヒプシン含有ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、試料は、生体試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含有する。いくつかの実施形態において、生体試料は、流体である。
【０２２９】
本明細書の実施形態のうちのいくつかにおいて、キットは、本明細書に記載される検出剤に結合した抗ヒプシン抗体を含む。いくつかの実施形態において、検出剤は、化学発光基質、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である。
【０２３０】
本発明のキットは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って用いるための任意の取扱説明書をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、取扱説明書は、本明細書に記載される任意の方法に従って、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを抗ヒプシン抗体で検出する説明を含む。いくつかの実施形態において、取扱説明書は、本明細書に記載される任意の方法に従って、試料中のヒプシン含有ポリペプチドを抗ヒプシン抗体で単離する説明を含む。いくつかの実施形態において、取扱説明書は、本明細書に記載される任意の方法に従って、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドを抗ヒプシン抗体で検出する説明を含む。いくつかの実施形態において、取扱説明書は、本明細書に記載される任意の方法に従って、試料中のデオキシヒプシン含有ポリペプチドを抗ヒプシン抗体で単離する説明を含む。取扱説明書は、ラベルまたは添付文書上に提供され得る。キットは、本明細書に記載される方法を実行するために、緩衝液及び試薬等のさらなる構成成分を任意に含み得る。
【０２３１】
キットの試薬（抗ヒプシン抗体等）は、容器内にあってもよい。本発明のキットは、好適な包装内にある。好適な包装としては、バイアル、瓶、ジャー、可撓性パッケージング（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）等が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてシグナル検出のためのデバイス等の特定のデバイスと組み合わせて使用する包装も企図される。
【０２３２】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上述の概要を得ると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【実施例】
【０２３３】
実施例１：抗ヒプシン抗体の特定及び特性評価
周囲のアミノ酸配列に最低限依存してポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が生成された。かかる抗ヒプシン抗体はまた、本明細書において、「汎抗ヒプシン抗体」と称される。
【０２３４】
材料及び方法
Ｆａｂ産生及び精製
劇的に改善された収率及び９５％超の純度を有するヒプシン化ペプチドの自動化固相合成のために直角に保護されているヒプシン試薬が、これまでに開発されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８０：３６７７−３６８１，２０１５）。汎ヒプシン抗体を生成するために、１０匹のウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンまたはチログロブリンに複合化したＩ１及びＩ２ペプチド（ＹｅｎＺｙｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）のカクテルで免疫化した。ブースト間の３週間で３ラウンドの免疫付与後、ウサギを、対応する非ヒプシン化ペプチドを上回るヒプシン含有ペプチドへの結合のそれらの選択性について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。結合の最高の選択性を有する４匹のウサギを、１つのさらなるラウンドの免疫化に供した。次いで、ウサギモノクローナル抗体を生成した（Ａｂｃａｍ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７：１０２３２−１０２４３，２０１３）。ハイブリドーマウェルからの上清を、ヒプシン化及び一致した非ヒプシン化ペプチドへの結合のために、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（表１）。隣接する配列を有するヒプシン化ペプチドの全てに結合することができた５つのハイブリドーマクローンである、例えば、ヒプシン化ｅＩＦ５Ａペプチドを、さらなる特性評価のために選択した。
2018532376.tif 000004
１ｐｅｇ６は、ポリエチレングリコールを示し、Ｈｐｕは、ヒプシンを示し、デオキシＨｐｕは、デオキシヒプシンを示す。ペプチドのアミノ末端は、ビオチンまたはアセチル基によって遮断される。ペプチドのカルボキシ末端は、アセチル基によって覆われる。
【０２３５】
抗体配列は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いたＲＮＡの抽出、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを用いた逆転写、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥＲ  ５’キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた増幅、及びＴＡクローニングによって得られた。ＣＨＯ細胞を、プラスミドでトランスフェクトし、２週間培養した。ＩｇＧを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。Ｆａｂ断片を、パパイン消化によって調製した。ＩｇＧ分子を、２０ｍＭ  リン酸塩  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  塩酸システイン、及び４ｍＭ  ＥＤＴＡ中の２０：１のモル比のパパインとインキュベートした。３７℃で４時間後、３０ｍＭ  ヨードアセトアミドを添加することによって、反応を停止した。Ｆａｂ断片を、Ｆｃ断片及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅクロマトグラフィーによって消化されないＩｇＧから分離し、流入物を回収した。Ｆａｂ断片を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ８．０及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ中のＳｕｐｅｒＤｅｘ  Ｄ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でさらに精製した。
【０２３６】
抗ヒプシン抗体のｅＩＦ５Ａへの特異性
Ｆｌａｇタグ化ヒトＷＴまたはＫ５０Ａ  ｅＩＦ５Ａを、Ｍｙｃタグ化ＤＨＳ及びＨＡタグ化ＤＯＨＨとともに、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞内において発現させた。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．４）中で溶解した。上清を、遠心分離（３０分、１６，０００ｇ、及び４℃）後に回収した。次いで、試料を、各抗ヒプシンモノクローナル抗体の特異性を決定するために、ウエスタンブロット法によって分析した。
【０２３７】
結果
ヒプシンを、以前に記載のように作成し（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８０：３６７７−３６８１，２０１５）、異なるヒプシン化ペプチドのパネルを合成するために使用した（表１）。あるいは、１０匹のウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンまたはチログロブリンのいずれかに複合化したアセチル−ヒプシン−ｐｅｇ６−Ｃ−アミド及びアセチル−ＧＳＧ−ヒプシン−ＧＳＧ−ｐｅｇ６−Ｃ−アミドペプチドで免疫化した。３ラウンドの免疫付与後、１０匹のウサギのうちの４匹のウサギがＥＬＩＳＡによりそれらの非ヒプシン化対照物よりもヒプシン含有ペプチドに対してわずかに高い反応を示したため、それらをモノクローナル抗体の生成のために追求した。非精製のウサギハイブリドーマ上清を、免疫付与のために使用したヒプシン化ペプチドへの選択的結合のために、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、陽性ウェルは、異なるヒプシン化ペプチドのパネルへの結合のためにさらにスクリーニングした（表１）。７，６８０のうちの１４６のハイブリドーマ上清が、免疫付与のために使用したヒプシン化ペプチドに選択的に結合することが見出されたが、対応する非ヒプシン化ペプチドには見出されなかった。これらの１４６のうちの５つのハイブリドーマ上清は、対応する非ヒプシン化ペプチドに最低限結合してヒプシン化ペプチドの全てに結合した。これらの５つのウサギモノクローナル抗体を、分子クローニングし、組換え発現し、精製し、特性評価した。これらの５つのウサギのうちの３つのウサギモノクローナル抗体（ｍＡｂＨｐｕ２４、ｍＡｂＨｐｕ９１、及びｍＡｂＨｐｕ９８）は、異なるヒプシン化ペプチドの全てを認識することが確認されたが、対応する非修飾ペプチドは確認されなかった（図１Ａ〜Ｄ及び図２Ａ）。これらの結果は、これらの抗ヒプシン抗体が多くの異なるヒプシン化タンパク質と相互作用する可能性があり、ヒプシン、すなわち、汎抗ヒプシン抗体の一次配列及び二次構造環境から独立していることを示唆している。
【０２３８】
抗ヒプシン抗体は、天然無傷ｅＩＦ５Ａタンパク質中のヒプシンに結合するそれらの能力について特徴付けられた。ヒト胎児腎臓２９３細胞を、ｆｌａｇタグ化野生型（またはＫ５０Ａ変異体）ｅＩＦ５Ａ、及び自己切断型Ｔ２Ａペプチドリンカーを介してＨＡタグ化ＤＯＨＨに融合したｍｙｃタグ化ＤＨＳをコードするプラスミドによって同時トランスフェクトした（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２７２７−２７３２，１９９１）（図２Ｂ）。全細胞溶解物を、抗ｆｌａｇまたは抗ヒプシン抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。野生型及びＫ５０Ａ変異体ｅＩＦ５Ａタンパク質を、抗ｆｌａｇ抗体をブロッティングすることによって示されるように同様の量で発現した（図２Ｃ）。３つの抗ヒプシン抗体は、トランスフェクトした野生型ｅＩＦ５Ａを検出したが、ヒプシン化のために必要とされるリジンを欠いているＫ５０Ａ変異体を検出しなかった。抗ヒプシン抗体はまた、内在性ｅＩＦ５Ａを認識し、これらの大部分は、ヒプシン化されている（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０３：５１−５６，２００６）。
【０２３９】
汎ヒプシン抗体は、その後、生合成中間体、デオキシヒプシンへの結合に対してスクリーニングした（図３Ａ）。ＦａｂＨｐｕ９１は、可変ドメインにおいて８つのアミノ酸のみがＦａｂＨｐｕ９８とは異なるが、ＦａｂＨｐｕ９８のみがデオキシヒプシンに結合した（図１Ｃ〜Ｄ及び図３Ｂ）。ＦａｂＨｐｕ９１からの単一アミノ酸残基を、デオキシヒプシンの特異性への基盤を理解するためにＦａｂＨｐｕ９８の等価位置で導入した。ＦａｂＨｐｕ９８  Ｙ５２Ｗ変異体は、バイオ層干渉分光法（Ｏｃｔｅｔ）によって判断されるように、ＦａｂＨｐｕ９１のように、デオキシヒプシンよりヒプシンを好んだ（図３Ｃ）。ＦａｂＨｐｕ９１  Ｗ５２Ｙ対照物が、作製され、デオキシヒプシンに結合する改善された能力及びヒプシンに結合する弱化した能力を有することが見出された（図３Ｃ）。それ故に、ＶＨ  Ｙ５２は、ヒプシン及びデオキシヒプシンに対する結合特異性を決定するスイッチとしての役割を果たし得る。
【０２４０】
実施例２：抗ヒプシン抗体の親和性成熟
ファージディスプレイ技術を用いて、汎抗ヒプシン抗体の親和性をさらに増強した。
【０２４１】
材料及び方法
親和性成熟のためのファージディスプレイ
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるウサギＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９８のファージディスプレイを改善するために、細菌コドン最適化されたウサギＦａｂＨｐｕ２４及びＦａｂＨｐｕ９８配列を合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、ファージディスプレイベクターにクローン化した。ファージディスプレイライブラリーを、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発によって作成した（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８２：４８８−４９２，１９８５）。各ライブラリーにおいて、ヌクレオチド塩基と過剰量の野生型ヌクレオチドの７０−１０−１０−１０の混合物で合成された縮重オリゴヌクレオチドを用いて、変異を、同じＣＤＲループ上にすべての位置に導入した。その結果として、得られたライブラリーは、約５０％の頻度で野生型残基を好む。標準プロトコルに従って、すべてのファージ調製を行った（Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５２５：３５３−３７６，２００９）。簡潔には、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、５μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで、４℃で一晩コーティングし、続いて、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（商標）Ｔ２０（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液で、２０℃で１時間ブロックした。第１ラウンドでは、Ｐ１−Ｈｐｕペプチドを、５００ｎＭの濃度で１０分間振とうした後に、プレート上に捕捉した。過剰なペプチドを除去した後、１００μｌのライブラリーファージ（ブロッキング緩衝液中３×１０１２粒子／ｍｌ）を各ウェルに添加し、プレートを、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０で１０回洗浄した。結合ファージを、０．１Ｍ  ＨＣｌ及び０．５Ｍ  ＫＣｌで２０分間プレートから溶出し、等体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和させ、その後のラウンドのために増幅した。第２ラウンド以降は、Ｆａｂ提示ファージを、まず、低下している濃度のビオチン化ペプチドと混合し、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎコーティングしたウェル上で１５分間捕捉した。数ラウンド後に、選択されたクローンを、ＩｇＧとして再フォーマットし、Ｅｘｐｉ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。
【０２４２】
バイオ層干渉分光法
ペプチドとＦａｂとの間の相互作用の検出を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて、バイオ層干渉分光法によって行った。ペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化した。使用前に、センサチップを、１×動態緩衝液に１分間浸漬した。Ｆａｂを、２００ｎＭの濃度に調節した。Ｏｃｔｅｔに使用されるマイクロプレートを、１ウェル当たり２００μｌの緩衝液または試料で充填した。データは、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ７．０ソフトウェアによって自動作成された。
【０２４３】
表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴法データは、ＢｉａｃｏｒｅモデルＴ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップを、約３００ＲＵのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングし、ビオチン化抗原を、１０ＲＵ未満捕捉した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０中の段階希釈のＦａｂ断片を、固定化ペプチドに流し、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して、各Ｆａｂ：抗原対のｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫＤを計算した。
【０２４４】
ｅＩＦ５Ａの免疫沈殿
４つのプレート（１５０ｍｍ）のサブコンフルエント状態の２９３Ｔ細胞を回収し、５ｍｌの氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．４）中で溶解した。上清を、遠心分離（３０分、５×１０４ｇ、４℃）後に収集し、１、２、４、または８倍に希釈した。各希釈物からの試料（５００μｌ）を、５μｇの精製されたｍＡｂＨｐｕ２４、ｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ、ｍＡｂＨｐｕ９８、またはｍＡｂＨｐｕ９８．６１が予め充填された５０μｌのプロテインＡダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、４℃で４時間インキュベートした。次いで、ビーズを、溶解緩衝液で３回洗浄し、５０μｌの１×ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液とともに、７０℃で１０分間インキュベートした。電気泳動後に、タンパク質を、クマシーブルー染色によって可視化した。
【０２４５】
結果
Ｐ１ヒプシン化ペプチドに対するＦａｂＨｐｕ９８及びＦａｂＨｐｕ２４の結合親和性（ＫＤ）（表２）は、それぞれ、約１１３ｎＭ及び約１９２ｎＭであった。これまでの研究は、ｅＩＦ５Ａが多くの異なる細胞型において豊富なヒプシン化タンパク質であることを示している（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：７９１−７９７，１９８２）。ヒプシンに対する抗体の高い親和性は、少量のヒプシン化タンパク質を特定する可能性を高めるために望ましい。
【０２４６】
ヒプシンを固定させるためのコア水素結合ネットワークを潜在的により良好に支持するために、工学は、末梢ＣＤＲ残基に焦点を合わせた。複合体の構造に基づいて（実施例３を参照）、ＦａｂＨｐｕ２４のＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ２及びＦａｂＨｐｕ９８のＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｌ３を多様化した。ビオチン−ｐｅｇ６−ＧＳＧ−ヒプシン−ＧＳＧ（Ｐ１）ペプチド及び配列分析を用いてファージライブラリー選択の数ラウンド後に、目的とするクローンを、Ｆａｂ断片としてＥｘｐｉ２９３細胞中に発現し、精製し、ヒプシンへの結合についてＳＰＲによって試験した。改善されたＶＬ及びＶＨ配列（Ｌ１、Ｌ２、Ｈ２）の組み合わせは、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂ変異体をもたらし、これは、ヒプシン化ペプチド、Ｐ１におけるその親クローンよりも３２倍高い結合親和性を有した（図１Ａ〜Ｂ）。ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂは、６ｎＭのＫＤでヒプシンへの特異性を維持し、デオキシヒプシンへの非常に弱い結合を有した（表２）。対照的に、ＦａｂＨｐｕ９８．６１を生み出すためのＦａｂＨｐｕ９８の親和性成熟により、ヒプシン（１８ｎＭ  ＫＤ）及びデオキシヒプシン（２０ｎＭ  ＫＤ）の両方に対して高い親和性結合をもたらした（図１Ｃ〜Ｄ及び表２）。
2018532376.tif 000005
１  Ｈｐｕは、ヒプシンを示し、デオキシＨｐｕは、デオキシヒプシンを示す。親和性測定（平均±標準偏差）は、表面プラズモン共鳴法によって行われた。結合親和性における改善倍率（「倍率」として示される）は、親及び対応する親和性成熟抗体のＫＤ値の比率として計算した
【０２４７】
構造に基づいて、変異は、末梢ＣＤＲループに位置し、ペプチド中の他の残基と接触することは期待されない。増加した親和性がヒプシンまたは隣接する配列との改善された相互作用によるものかどうかを評価するために、選択したＦａｂを、６対のヒプシン化または非ヒプシン化ペプチドに対して評価した（図４Ａ〜Ｂ、図５Ａ〜Ｅ、及び図６Ａ〜Ｆ）。親和性成熟ＩｇＧは、それらの親クローンよりも高い最大結合（Ｒｍａｘ）ですべてのヒプシン化ペプチドに結合することができるが、匹敵する非ヒプシン化ペプチドには結合することができない（表２）。抗ヒプシン抗体は、わずかに配列選択性を有し、例えば、ＦａｂＨｐｕ９８．６１は、Ｐ３ヒプシン含有ペプチドに弱く結合するが、一方、それは、他のペプチドに対してはるかに良好な反応を有する（図６Ａ〜Ｆ）。第三に、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂは、ヒプシン化ペプチドに最良の結合を有するが、一方、ＦａｂＨｐｕ９８．６１は、デオキシヒプシン含有ペプチドに結合する能力を保持する。それ故に、ＦａｂＨｐｕ２４．ＢとＦａｂＨｐｕ９８．６１の組み合わせは、異なる、可能性のあるヒプシン修飾タンパク質及びデオキシヒプシン修飾タンパク質の発見に好ましいと思われる。
【０２４８】
親和性成熟抗体が、可能性のあるヒプシン化タンパク質を引き出す際に効率性の高まりをもたらすかどうかを研究するために、ｍＡｂＨｐｕ２４、ｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂ、ｍＡｂＨｐｕ９８、及びｍＡｂＨｐｕ９８．６１を用いて、一連の２９３Ｔ細胞溶解物希釈液から内在性ｅＩＦ５Ａタンパク質を免疫沈降した。親ｍＡｂＨｐｕ２４は、すべての溶解物希釈液中でｅＩＦ５Ａを免疫沈降したが、一方、１２倍の親和性改善を有するｍＡｂＨｐｕ２４．Ｂは、ｅＩＦ５Ａの回収を劇的に増加させた（図７Ａ〜Ｂ）。さらに、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１のみが、Ｐ２−Ｈｐｕペプチドへの結合において２倍の親和性改善を有したにもかかわらず、ｍＡｂＨｐｕ９８．６１はまた、ｅＩＦ５Ａを回収する際に、ｍＡｂＨｐｕ９８よりもはるかに効率が良かった（図７Ａ〜Ｂ、表２）。したがって、親和性成熟した汎ヒプシン抗体は、潜在的な新規の少量のヒプシン化タンパク質の質を高めるのに十分であり得る。
【０２４９】
実施例３：ヒプシン化ペプチドまたはデオキシヒプシン化ペプチドと複合した抗体の構造分析
ヒプシン化またはデオキシヒプシン化ペプチドと複合した汎抗ヒプシン抗体を、構造分析によって特徴付けた。
【０２５０】
材料及び方法
Ｘ線結晶学的構造分析
精製したＦａｂＨｐｕ２４を、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、シッティングドロップ法によって結晶化する前に、アセチル−ＧＳＧ−ヒプシン−ＧＳＧ−アミドペプチドと１：２のモル比で混合した。ＦａｂＨｐｕ２４の複合体の最適化結晶条件は、４℃で、２０％  ポリエチレングリコール（ｐｅｇ）  ３３５０、０．１Ｍ  ビス−トリスプロパンｐＨ７．０、及び０．２Ｍ  カリウム／リン酸ナトリウムである。データ収集のために、液体窒素中で瞬間冷凍する前に、結晶を、抗凍結剤溶液（２５％  グリセロール、２０％  ｐｅｇ  ３３５０、０．１Ｍ  ビス−トリスプロパンｐＨ７．０、及び０．２Ｍ  カリウム／リン酸ナトリウム）中に短時間浸漬し、データセットを、ビームラインＡＬＳ  ５．０．２で収集した。
【０２５１】
精製したＦａｂＨｐｕ２４．Ｂを、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、シッティングドロップ法によって結晶化する前に、アセチル−ＧＳＧ−ヒプシン−ＧＳＧ−アミドペプチド（Ｃ１）と１：４のモル比で混合した。ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの複合体の最適化結晶条件は、１９℃で、１４％  ｐｅｇ  ６０００、０．５Ｍ  ＮａＣｌである。データ収集のために、液体窒素中で瞬間冷凍する前に、結晶を、抗凍結剤溶液（３５％  エチレングリコール、１４％  ｐｅｇ  ６０００、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  Ｃ１ペプチド）中に短時間浸漬し、データセットを、ビームラインＡＬＳ  ５．０．２で収集した。
【０２５２】
精製したＦａｂＨｐｕ９８を、１５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、シッティングドロップ法によって結晶化する前に、アセチル−ＧＳＧ−ヒプシン−ＧＳＧ−アミドペプチド（Ｃ１）またはアセチル−ＧＳＧ−デオキシヒプシン−ＧＳＧペプチド（Ｃ２）と１：４のモル比で混合した。ＦａｂＨｐｕ９８の複合体の最適化結晶条件は、４℃で、２０％  ｐｅｇ  ８０００及び０．５Ｍ  Ｌｉ２ＳＯ４である。データ収集のために、液体窒素中で瞬間冷凍する前に、結晶を、抗凍結剤溶液（３０％  エチレングリコール、５％  ｐｅｇ  ８０００、０．４Ｍ  Ｌｉ２ＳＯ４、３０％  エチレングリコール、及び１ｍＭの対応するペプチド）中に短時間浸漬し、データセットを、先端放射光施設（ＡＰＳ）のビームライン２２−ＩＤＧで収集した。
【０２５３】
すべてのＸ線回析データセットは、ＨＫＬ２０００ソフトウェアパッケージで処理された（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅ．Ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３０７−３２６，１９９７）。構造を、同種Ｆａｂに構築された開始モデル（タンパク質データバンク［ＰＤＢ］  ４ＨＢＣ）を用いて、ＰｈｅｎｉｘソフトウェアパッケージのＰｈａｓｅｒによる分子置換によって決定した（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６：２１３−２２１，２０１０、及びＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４０：６５８−６７４，２００７）。
【０２５４】
結果
ＦａｂＨｐｕ２４−ヒプシン化ペプチド複合体
ＦａｂＨｐｕ２４−ヒプシン化Ｃ１ペプチド複合体のＸ線結晶学的構造を、ヒプシンへの抗体結合に対する分子的洞察を得るために２．０Åの解像度で決定した（表３）。複合体は、非対称単位（０．１５Åのｒｍｓｄ）で、２つのすべて類似のＦａｂＨｐｕ２４−ヒプシン複合体とともにＰ２１空間群で結晶化した。ヒプシンの４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基は、模擬アニーリングｍＦｏ−ｄＦｃオミット電子密度マップにおいて明確に視認できたが（図８Ａ）、ヒプシンの残りは、視認できなかった。これらの観察は、ＦａｂＨｐｕ２４が、ヒプシンのみに結合し、隣接アミノ酸残基には結合しなかったことを示唆した。実際に、ヒプシンは、ＦａｂＨｐｕ２４の重鎖及び軽鎖可変ドメインによって形成された深いポケットに挿入された（図９Ａ）。ヒプシン結合ポケットは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖によって、それぞれ与えられた、１１２Å２及び１８９Å２の、全体で約３０１Å２の溶媒曝露された表面積に埋め込まれた。
2018532376.tif 000006
2018532376.tif 000007
１括弧内の値は、最高分解能シェルのものである。
【０２５５】
ヒプシン結合ポケットは、主に、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬ１、Ｌ３、及びＨ３内の残基からなった。極性相互作用に使用可能であるヒプシンの側鎖上にわずか３つのヘテロ原子があった（図３Ａ）。ヒプシン−ＦａｂＨｐｕ２４界面の検査は、水素結合及び塩橋相互作用を含む、ヒプシン−４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基の遠位末端で相互作用のネットワークを示した（図１０Ａ）。具体的には、ヒプシンの末端アミノ基の第１のヘテロ原子（１１−Ｎ）は、その予測されたｐＫａは、分析連続静電気（ＡＣＥ）によって９．８であったため、結晶条件下で正電荷を持つと思われた（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１００：１５７８：１５９９，１９９６）。ヘテロ原子（１１−Ｎ）は、ポケットの底部でＶＬＤ９６、ならびにＶＬＤ９５の側鎖及びＶＨＹ９２の主鎖カルボニル基への２つのさらなる水素結合を有する塩橋によって固定された。さらに、ＶＬＤ９６は、水素結合によって、ＶＨＹ１００ｂ及びＶＬ  Ｙ９２によって安定化する。第２のヘテロ原子、ヒプシンの９−ヒドロキシル基は、ＶＬ  Ｄ９５、ＶＨ  Ｙ１００ｂ、及び水分子への水素結合を形成した。さらに、ＶＨＤ１００によって配位された、水分子もまた、第３のヘテロ原子（７−Ｎ）と相互作用し、その予測されたｐＫａは、１０．２であり、ＶＬ  Ｙ９３のカルボニル基への水素結合も形成した。対照的に、ヒプシンの遠位末端は、少量の電子密度によって示唆されるように、より可撓性であり得る。このことは、脂肪族鎖のみが、疎水性相互作用によって制限され得るため、驚くべきことではない。それでもなお、ヒプシンの遠位部分は、遠位末端が結合ポケットの底部に達することができるスペーサとしての役割を果たす。
【０２５６】
ＦａｂＨｐｕ９８ヒプシン及びデオキシヒプシン複合体
ＦａｂＨｐｕ９８は、ヒプシン及びデオキシヒプシンの両方に結合したという点で二重特異性を有した。ＦａｂＨｐｕ９８−ヒプシン及びＦａｂＨｐｕ９８−デオキシヒプシン複合体の結晶を、同じ条件下で成長させ、それらのＸ線結晶学的構造を、２．０Åの解像度で決定した。複合体は、非対称単位（０．７６４Åのｒｍｓｄ）で、２つのすべて類似のＦａｂＨｐｕ９８とともにＣ２２２空間群で結晶化した。１つのＦａｂＨｐｕ９８分子は、ヒプシンまたはデオキシヒプシンとの複合体を形成したが、一方、他方のＦａｂＨｐｕ９８分子は、そのパラトープが分子間の接触によってブロックされたため、複合されていない形態であった。
【０２５７】
ＦａｂＨｐｕ９８複合体において、ヒプシンまたはデオキシヒプシンはまた、ＶＨ及びＶＬ界面によって構成された深いポケットにおいて結合し、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、１４８Å２及び１５６Å２の埋め込まれた表面積を有した（図９Ｂ）。ヒプシンは、ＦａｂＨｐｕ９８の結合ポケットに押し込むように傾斜していたが、ＦａｂＨｐｕ２４の可変ドメイン間に突出するようにほぼ垂直であった。２つのヒプシン部分は、互いに対して４６°の角度で突出した。
【０２５８】
ＦａｂＨｐｕ９８−ヒプシン複合体では、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基はまた、完全に埋め込まれ、静電相互作用及び水素結合によって配位したが、一方、ヒプシンの残りは、部分的に埋め込まれた。ポケットの底部で、ヒプシンの末端アミノ基（１１−Ｎ）は、ＶＨフレームワーク残基Ｎ３５、Ｄ９５、及び秩序付けられた水分子で水素結合を形成した。末端アミノ基はまた、静電相互作用によって、ＶＨ  Ｄ５０と相互作用した。これらの接触残基のすべては、隣接残基を有する水素結合ネットワークを通してさらに位置付けられた（図１０Ｂ）。ヘテロ原子（７−Ｎ）は、ＶＬ  Ｙ９２のカルボニル基及び硫酸イオンと水素結合を形成した。ＨＥＰＥＳ及びＴｒｉｓ緩衝液を用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）実験は、ＦａｂＨｐｕ９８が類似の親和性でヒプシンまたはデオキシヒプシンに結合したことを示したため、後者は、特異性及び親和性に欠かせなかった。
【０２５９】
芳香族残基は、ヒプシンまたはデオキシヒプシンの脂肪族部分のために有利な疎水性環境を明らかに提供した。ＦａｂＨｐｕ２４ヒプシン複合体とは異なり、近隣残基もまた、模擬アニーリングｍＦｏ−ｄＦｃオミット電子密度マップに示された（図８Ｂ）。モデルは、ペプチド主鎖原子のみが、ＦａｂＨｐｕ９８と接触したことを示した。
【０２６０】
デオキシヒプシン及びヒプシンの相互作用の比較
ヒプシン及びデオキシヒプシンは、ＦａｂＨｐｕ９８によって構成された深いポケットに挿入するために同様の立体構造に採用した。しかしながら、デオキシヒプシン及びヒプシンの相互作用の差があった。第一に、ヒプシンのヒドロキシル基は、Ｆｏ（ヒプシン）−Ｆｏ（デオキシヒプシン）差マップに明確に示され、これを、ＦａｂＨｐｕ９８：ヒプシンモデルからの相を用いることによって計算した（図１１Ａ）。ヒプシンのヒドロキシル基は、ＶＬ  Ｓ９４、ＶＨ  Ｙ５２、及び硫酸イオンとともに水素ネットワークを形成した（図１１Ｂ）。
【０２６１】
上述のように、ＶＨ  Ｙ５２の機能は、デオキシヒプシンの相互作用には欠かせなかった。ヒプシンのヒドロキシル基は、ＶＬＳ９４（３．０Å）及びＶＨ  Ｙ５２側鎖（３．０Å）と２つの比較的長い水素結合を形成した（図１１Ｂ）。ＦａｂＨｐｕ９８−デオキシヒプシン複合体にある間、ヒドロキシル基への２つの水素結合は、もはや存在しなかった。その代わりに、ＶＨ  Ｙ５２は、側鎖の運動を示し、ＶＬ  Ｓ９４に対して突出し、明らかに（２．８Å）水素結合を形成した（図１１Ｃ）。これらの観察は、変異誘発及びＳＰＲ研究と一致した。ＶＨ  Ｙ５２Ｆ変異体は、恐らく水素結合の減少のため、野生型ＦａｂＨｐｕ９８と比較して、ヒプシン含有ペプチドに対してより弱い結合親和性を示した（図３Ｃ）。さらに、ＶＨ  Ｙ５２Ｆ変異は、恐らくＶＬ  Ｓ９４で水素結合を形成することができないため、デオキシヒプシンと検出可能な相互作用を停止した。それ故に、ＶＨ残基Ｙ５２は、デオキシヒプシンとの相互作用で中心的役割を果たした。
【０２６２】
ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂヒプシン化ペプチド複合体
ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂヒプシン化Ｃ１ペプチド複合体の結晶構造を、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの３０倍の親和性改善のための分子基盤をより理解するために、２．４Åの解像度で決定した。単位格子は、ＦａｂＨｐｕ２４の２倍の大きさであるが、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの結晶は、ＦａｂＨｐｕ２４に同形であった。ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂの一次配列は、ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＨ２においてその親ＦａｂＨｐｕ２４とは異なったが、主鎖立体構造変化は、ＣＤＲ  Ｈ２においてのみ観察され、ヒプシン部分に対してＣＤＲ  Ｈ３をさらに押し込んだ（図１２Ａ）。結果として、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂ  ＶＨ  Ｄ１００とＶＬ  Ｙ２８との間の水素結合は、ヒプシンを包含するために、より大きな接触領域を形成した。ヒプシンは、配位水の代わりに、第３のヘテロ原子（７−Ｎ）がＦａｂＨｐｕ２４．ＢにおいてＶＨ  Ｇ１００ａのカルボニル基で水素結合を直接形成したことを除いては、同じ水素ネットワークを有する深いポケットに明らかに固定した（図１２Ｂ）。さらに、ヒプシンに隣接する隣接残基もまた、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂとの相互作用に関与した。ＶＨＭ９９及びＶＨ  Ｄ５６側鎖のカルボニル基は、Ｃ１ペプチドの主鎖と水素結合を形成した。さらに、ＶＨ残基Ｄ５６はまた、ペプチドＳ６中の隣接残基の側鎖と相互作用した。これらの結果は、６ｎＭから１８６ｎＭの間で異なる、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂと異なる隣接配列を有するヒプシンとの間の結合親和性の差の説明となり得る。ヒプシンのみが、ＦａｂＨｐｕ２４−ヒプシン複合体において観察されたが、隣接配列もまた、ＦａｂＨｐｕ２４とヒプシンとの間の相互作用に影響を及ぼした。それにもかかわらず、ＦａｂＨｐｕ２４．Ｂは、すべての６つの合成されたヒプシン化ペプチドに結合することができた。
【０２６３】
ＦａｂＨｐｕ９８．６１ヒプシン化ペプチド複合体
ＦａｂＨｐｕ９８．６１−ヒプシン化Ｃ１ペプチド複合体のＸ線結晶学的構造を、ヒプシンへの抗体結合に対する分子的洞察を得るために２．２Åの解像度で決定した。複合体は、非対称単位（０．１４Åのｒｍｓｄ）で、２つのすべて類似のＦａｂＨｐｕ９８．６１−ヒプシン複合体とともにＣ２空間群で結晶化した。ＦａｂＨｐｕ９８．６１及びＦａｂＨｐｕ９８は、ＣＤＲ  Ｈ１ループを除いては、非常に類似の様式でヒプシン化Ｃ１ペプチドに結合し、その中で、Ｃ２７及びＣ３２は、ジスルフィドを形成した（図１２Ｃ）。結果として、ＦａｂＨｐｕ９８．６１  ＣＤＲ  Ｈ１は、ＶＨ  Ｗ９の方向に傾き、ヒプシンに対してその充填を改善し得る。加えて、ＶＨ  Ｔ３３は、より接近し、ヒプシンの１１−ＮでさらなるＨ結合を形成し、他の相互作用は、同じ相互作用を維持した。
配列
Ｈｐｕ２４軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＱＳＳＥＴＶＹＲＧＤＷＬＳ（配列番号１）
Ｈｐｕ２４．Ｂ軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＲＳＲＱＲＶＹＬＧＤＷＬＳ（配列番号２）
Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＱＡＳＥＤＩＫＲＹＬＡ（配列番号３）
Ｈｐｕ２４軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＡＳＹＬＡＳ（配列番号４）
Ｈｐｕ２４．Ｂ軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＡＳＦＲＧＤ（配列番号５）
Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＡＡＳＫＬＡＳ（配列番号６）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＬＧＧＹＹＤＤＡＤＤＴ（配列番号７）
Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＱＱＧＹＴＳＳＮＶＮＮＡ（配列番号８）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＹＡＭＩ（配列番号９）
Ｈｐｕ９１重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＴＹＴＩＮ（配列番号１０）
Ｈｐｕ９８重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＴＹＴＭＮ（配列番号１１）
Ｈｐｕ９８．６１重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＨＣＴＭＮ（配列番号１２）
Ｈｐｕ２４重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＩＩＹＧＧＳＮＫＬＡＹＡＫＷＡ（配列番号１３）
Ｈｐｕ２４．Ｂ重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＩＩＹＧＶＩＮＤＬＡＹＡＫＷＡ（配列番号１４）
Ｈｐｕ９１重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＩＷＳＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡ（配列番号１５）
Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＩＹＴＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡ（配列番号１６）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＧＹＧＳＭＤＧＹＤＲＬＮＬ（配列番号１７）
Ｈｐｕ９１重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＳＷＤＴＳＩＹＹＧＬＤＬ（配列番号１８）
Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＤＳＷＤＡＳＳＹＹＧＬＤＬ（配列番号１９）
Ｈｐｕ２４軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＥＴＶＹＲＧＤＷＬＳＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＹＬＡＳＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＹＤＤＡＤＤＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号２０）
Ｈｐｕ２４．Ｂ軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＲＳＲＱＲＶＹＬＧＤＷＬＳＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＦＲＧＤＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＹＤＤＡＤＤＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号２１）
Ｈｐｕ９１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＡＩＫＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＤＩＫＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＡＳＧＶＳＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＱＧＹＴＳＴＮＶＮＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号２２）
Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＡＩＫＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＤＩＫＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＱＧＹＴＳＳＮＶＮＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号２３）
Ｈｐｕ２４重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＲＬＶＡＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＤＩＳＤＹＡＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＧＳＮＫＬＡＹＡＫＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＧＳＭＤＧＹＤＲＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２４）
Ｈｐｕ２４．Ｂ重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＲＬＶＡＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＤＩＳＤＹＡＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＶＩＮＤＬＡＹＡＫＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＧＳＭＤＧＹＤＲＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
Ｈｐｕ９１重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＦＳＬＳＴＹＴＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＷＳＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＤＳＷＤＴＳＩＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２６）
Ｈｐｕ９８重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＴＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＹＴＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＤＳＷＤＡＳＳＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２７）
Ｈｐｕ９８．６１重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＣＳＬＹＨＣＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＹＴＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＤＳＷＤＡＳＳＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２８）
Ｈｐｕ２４軽鎖のアミノ酸配列
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＥＴＶＹＲＧＤＷＬＳＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＹＬＡＳＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＹＤＤＡＤＤＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ（配列番号２９）
Ｈｐｕ２４．Ｂ軽鎖のアミノ酸配列
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＲＳＲＱＲＶＹＬＧＤＷＬＳＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＦＲＧＤＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＹＤＤＡＤＤＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ（配列番号３０）
Ｈｐｕ９１軽鎖のアミノ酸配列
ＡＩＫＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＤＩＫＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＡＳＧＶＳＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＱＧＹＴＳＴＮＶＮＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ（配列番号３１）
Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１軽鎖のアミノ酸配列
ＡＩＫＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＤＩＫＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＫＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＱＧＹＴＳＳＮＶＮＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ（配列番号３２）
Ｈｐｕ２４重鎖のアミノ酸配列
ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＲＬＶＡＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＤＩＳＤＹＡＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＧＳＮＫＬＡＹＡＫＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＧＳＭＤＧＹＤＲＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴ（配列番号３３）
Ｈｐｕ２４．Ｂ重鎖のアミノ酸配列
ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＲＬＶＡＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＤＩＳＤＹＡＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＶＩＮＤＬＡＹＡＫＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＧＳＭＤＧＹＤＲＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴ（配列番号３４）
Ｈｐｕ９１重鎖のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＦＳＬＳＴＹＴＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＷＳＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＤＳＷＤＴＳＩＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴ（配列番号３５）
Ｈｐｕ９８重鎖のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＴＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＹＴＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＤＳＷＤＡＳＳＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴ（配列番号３６）
Ｈｐｕ９８．６１重鎖のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＣＳＬＹＨＣＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＹＴＤＧＮＴＹＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＤＳＷＤＡＳＳＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴ（配列番号３７）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ軽鎖ＦＲ１のアミノ酸配列
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣ（配列番号３８）
Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＦＲ１のアミノ酸配列
ＡＩＫＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣ（配列番号３９）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列
ＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号４０）
Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＦＲ２のアミノ酸配列
ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号４１）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列
ＧＶＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号４２）
Ｈｐｕ９１軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列
ＧＶＳＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号４３）
Ｈｐｕ９８及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＦＲ３のアミノ酸配列
ＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号４４）
Ｈｐｕ２４、Ｈｐｕ２４．Ｂ、Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１軽鎖ＦＲ４のアミノ酸配列
ＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号４５）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列
ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＲＬＶＡＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＤＩＳ（配列番号４６）
Ｈｐｕ９１重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＦＳＬＳ（配列番号４７）
Ｈｐｕ９８重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ（配列番号４８）
Ｈｐｕ９８．６１重鎖ＦＲ１のアミノ酸配列
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＡＣＳＬＹ（配列番号４９）
Ｈｐｕ２４、Ｈｐｕ２４．Ｂ、Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１重鎖ＦＲ２のアミノ酸配列
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（配列番号５０）
Ｈｐｕ２４及びＨｐｕ２４．Ｂ重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列
ＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲ（配列番号５１）
Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１重鎖ＦＲ３のアミノ酸配列
ＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲ（配列番号５２）
Ｈｐｕ２４、Ｈｐｕ２４．Ｂ、Ｈｐｕ９１、Ｈｐｕ９８、及びＨｐｕ９８．６１重鎖ＦＲ４のアミノ酸配列
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５３）
Ｈｐｕ９１軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
ＱＱＧＹＴＳＴＮＶＮＮＡ（配列番号７２）
【図１Ａ】
2018532376.tif 000008
【図１Ｂ】
2018532376.tif 000009
【図１Ｃ】
2018532376.tif 000010
【図１Ｄ】
2018532376.tif 000011
【図２Ａ】
2018532376.tif 000012
【図２Ｂ】
2018532376.tif 000013
【図２Ｃ】
2018532376.tif 000014
【図３Ａ】
2018532376.tif 000015
【図３Ｂ】
2018532376.tif 000016
【図３Ｃ】
2018532376.tif 000017
【図４Ａ】
2018532376.tif 000018
【図４Ｂ】
2018532376.tif 000019
【図５Ａ】
2018532376.tif 000020
【図５Ｂ】
2018532376.tif 000021
【図５Ｃ】
2018532376.tif 000022
【図５Ｄ】
2018532376.tif 000023
【図５Ｅ】
2018532376.tif 000024
【図６Ａ】
2018532376.tif 000025
【図６Ｂ】
2018532376.tif 000026
【図６Ｃ】
2018532376.tif 000027
【図６Ｄ】
2018532376.tif 000028
【図６Ｅ】
2018532376.tif 000029
【図６Ｆ】
2018532376.tif 000030
【図７Ａ】
2018532376.tif 000031
【図７Ｂ】
2018532376.tif 000032
【図８Ａ】
2018532376.tif 000033
【図８Ｂ】
2018532376.tif 000034
【図９Ａ】
2018532376.tif 000035
【図９Ｂ】
2018532376.tif 000036
【図１０Ａ】
2018532376.tif 000037
【図１０Ｂ】
2018532376.tif 000038
【図１１Ａ】
2018532376.tif 000039
【図１１Ｂ】
2018532376.tif 000040
【図１１Ｃ】
2018532376.tif 000041
【図１２Ａ】
2018532376.tif 000042
【図１２Ｂ】
2018532376.tif 000043
【図１２Ｃ】
2018532376.tif 000044
【図１２Ｄ】
2018532376.tif 000045
【図１３】
2018532376.tif 000046
【配列表】
2018532376000001.app
【国際調査報告】
2018532376.tif 000047
2018532376.tif 000048
2018532376.tif 000049