(57)【要約】本発明は、糖タンパク質の酵素的改変のための方法に関する。この方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、非天然の糖誘導体ヌクレオチドと接触させるステップを含む。非天然の糖誘導体ヌクレオチドは式（３）：2018518149.tif 000098（式中、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｈ２）ｉＣ≡Ｃ−Ｒ４、−ＳＨ、−ＳＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＳＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＳＣ（Ｓ）ＯＲ８、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５、末端Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル基、Ｃ４〜Ｃ８アルカジエニル基、末端Ｃ３〜Ｃ２４アレニル基及びアミノ基からなる群から選択される）で表される。本発明は、本発明の方法により得られる糖タンパク質、糖タンパク質とリンカー−コンジュゲートをコンジュゲートすることにより得ることのできるバイオコンジュゲート、及び本発明の糖タンパク質を調製することにおいて使用可能なβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに更に関する。【選択図】なし
2018518149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させるステップを含む、糖タンパク質の改変のための方法であって、
（ｉ）グリコシルトランスフェラーゼはβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来し；
（ｉｉ）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
【化１】
2018518149.tif 000074
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖、又は２〜２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である）
で表され、
（ｉｉｉ）糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは式（３）：
【化２】
2018518149.tif 000075
（式中：
ａは０又は１であり；
ｆは０又は１であり；
ｇは０又は１であり；
Ｎｕｃはヌクレオチドであり；
Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここでｎは１〜２４の範囲の整数であり；ｏは０〜１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ及び置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から選択され；
ＴはＣ３〜Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は置換されていてもよく；
Ａは、
（ａ）−Ｎ３
（ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３
（ここでＲ３は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基である）；
（ｃ）（ヘテロ）シクロアルキニル基又は−（ＣＨ２）ｉＣ≡Ｃ−Ｒ４部分）
（ここでｉは０〜１０であり、Ｒ４は水素又は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基である）；
（ｄ）−ＳＨ
（ｅ）−ＳＣ（Ｏ）Ｒ８
（ここでＲ８は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である）；
（ｆ）−ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８
（ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である）；
（ｇ）−Ｘ
（ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）；
（ｈ）−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５
（ここでＲ５はＣ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は置換されていてもよい）；
（ｉ）Ｒ１２
（ここでＲ１２は置換されていてもよい、末端Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル基及びＣ４〜Ｃ８アルカジエニル基からなる群から選択される）；
（ｊ）Ｒ１３
（ここでＲ１３は置換されていてもよい末端Ｃ３〜Ｃ２４アレニル基である）；及び
（ｋ）Ｎ（Ｒ１７）２
（ここでＲ１７はＨ及びＣ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から独立して選択される）
からなる群から選択され；
ＺはＣＨ２、ＣＦ２若しくはＣ（Ｏ）であるか；又はｇが０であり、ｆが１であり、かつａが０若しくは１であるという条件で、ＺはＣＨＯＨであり；
ＹはＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１５）及びＮ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択され
（ここでＲ１５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである）；
Ｒ１４は、
【化３】
2018518149.tif 000076
（式中：
ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは上記定義の通りであり；
ｈは０又は１であり；
ＷはＯ、Ｓ、ＮＲ１５、ＮＨＳ（Ｏ）２Ｏ及びＮＨＳ（Ｏ）２ＮＲ１５からなる群から選択され、ここでＲ１５は上記定義の通りである）
からなる群から選択される）
で表される、方法。
【請求項２】
前記β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、７１、７２及び７３からなる群から、又は配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０及び７４からなる群から選択される配列であるか又はそれに由来する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、７１、７２及び７３からなる群から、又は配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０及び７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ａが−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（１５）、（１６）、（１７）又は（１８）：
【化４】
2018518149.tif 000077
【化５】
2018518149.tif 000078
（式中：
Ｎｕｃ、ａ、ｆ、Ｒ１４、Ｒ１５、Ａ、Ｕ及びＴは請求項１に定義された通りである）
で表される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）又は（６９）：
【化６】
2018518149.tif 000079
【化７】
2018518149.tif 000080
【化８】
2018518149.tif 000081
【化９】
2018518149.tif 000082
【化１０】
2018518149.tif 000083
（式中：
Ｒ１４及びＲ１５は請求項１に定義された通りであり；
Ｒ１６はＨ及びＦからなる群から独立して選択される）
で表される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１４が−Ｎ３であるか又はＲ１４が：
【化１１】
2018518149.tif 000084
（式中：
ａ、ｆ、ｈ、Ｔ、Ａ、Ｕ及びＷは請求項１に定義された通りである）
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（２７）、（２８）、（２９）、（３０）若しくは（３１）で表されるか、又は式（３６）：
【化１２】
2018518149.tif 000085
【化１３】
2018518149.tif 000086
【化１４】
2018518149.tif 000087
（式中：
Ｎｕｃは請求項１に定義された通りである）
で表される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１４が−ＯＨである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３５）：
【化１５】
2018518149.tif 000088
（式中：
Ｎｕｃは請求項１に定義された通りである）
で表される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中の前記ヌクレオチドがＵＤＰである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む前記グリカンが式（１）、（９）、（１０）又は（１１）：
【化１６】
2018518149.tif 000089
【化１７】
2018518149.tif 000090
【化１８】
2018518149.tif 000091
（式中：
ｂは請求項１に定義された通りである）
で表される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む前記糖タンパク質が式（７）、（８）又は（８ｂ）：
【化１９】
2018518149.tif 000092
【化２０】
2018518149.tif 000093
（式中、
ｂ、ｄ、ｅ及びＧは請求項１に定義された通りであり；
ｙは独立して１〜２４の範囲の整数であり；
Ｐｒはタンパク質である）
で表される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む前記糖タンパク質が抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により得られる、糖タンパク質。
【請求項１７】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項１６に記載の糖タンパク質。
【請求項１８】
Ｒ１４が−ＮＨＣＯＭｅである、請求項１６又は１７に記載の糖タンパク質。
【請求項１９】
式（７５）、（７６）又は（７７）：
【化２１】
2018518149.tif 000094
【化２２】
2018518149.tif 000095
【化２３】
2018518149.tif 000096
（式中：
Ｐｒはタンパク質であり；
ｙは独立して１〜２４の範囲の整数であり；
ＣＧはＳｕをＳｐ又はＤに連結する連結基であり；
Ｓｐはスペーサーであり；
Ｄは標的分子であり；
ｊは独立して１、２、３、４又は５であり；
ｋは独立して１〜１０の範囲の整数であり；
ｍは０又は１であり；
Ｓｕは式（７８）：
【化２４】
2018518149.tif 000097
（式中：
ｂ、ｄ、ｅ、Ｇ、Ｒ１４、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、ｇ、ｆ及びａは請求項１に定義された通りである）
で表され、ＳｕはＣ１を介してβ−１，４−Ｏ−グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に、Ｚ、Ｙ、Ｕ又はＴを介してＣＧに連結される）
で表される、バイオコンジュゲート。
【請求項２０】
Ｒ１４が−ＮＨＣＯＭｅである、請求項１９に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２１】
Ｄが細胞毒素である、請求項１９又は２０に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２２】
抗体−薬物−コンジュゲートである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２３】
配列番号１０〜１４及び配列番号２５〜７４からなる群から、好ましくは配列番号１０〜１３、配列番号２５〜４８、配列番号５０〜７０及び配列番号７２〜７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の酵素的改変方法に関する。より詳細には、本発明は、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼ酵素を用いる、糖誘導体ヌクレオチドによる糖タンパク質の改変方法に関する。本発明は、この方法によって得られる糖タンパク質、糖タンパク質をリンカー−コンジュゲートとコンジュゲートすることによって得られるバイオコンジュゲート、及び本発明の糖タンパク質を調製することにおいて使用可能なβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼにも関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシルトランスフェラーゼは糖タンパク質及び糖脂質に存在する複合糖質の合成に関与する酵素のスーパーファミリーを構成する。グリコシルトランスフェラーゼの基本的な役割はヌクレオチド誘導体のグリコシル部分を特定の糖受容体に転移することである。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４Ｇａｌ−Ｔｓ）（ＥＣ  ２．４．１．３８）は少なくとも７つのメンバーＧａｌ−Ｔ１〜Ｇａｌ−Ｔ７を含むグリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのサブファミリーの１つを構成しており、ＵＤＰ−Ｇａｌから様々な糖受容体へのガラクトース（Ｇａｌ）の転移を触媒する。末端ＧｌｃＮＡｃ残基へのガラクトーストランスフェラーゼの結果得られる共通のモチーフはラクトサミン配列Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（ＬａｃＮＡｃ又はＬＮ）であり、これはその後他の糖及び硫酸基の付加によって多様な方法で修飾される。膜複合糖質の最も一般的で重要な糖構造はポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン（ポリ−ＬＮ）であり、これはタンパク質（又は脂質）に結合し、細胞の伝達、接着、及びシグナル伝達において重要な役割を果たし、免疫応答の制御において重要な分子である。
【０００３】
脊椎動物及び無脊椎動物の複合糖質に見られるもう１つ別の共通な末端モチーフはＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（ＬａｃｄｉＮＡｃ又はＬＤＮ）配列である。ＬＤＮモチーフは哺乳類下垂体の糖タンパク質ホルモンに存在し、末端ＧａｌＮＡｃ残基が４−Ｏ−硫酸化されており、内皮細胞のＭａｎ／Ｓ４ＧＧｎＭ受容体によるクリアランスのための認識マーカーとして機能している。しかしながら、非下垂体の哺乳類糖タンパク質もＬＤＮ決定基を含有している。更に、ＬＤＮ及びＬＤＮ配列の改変体は多くの寄生性の線虫及び吸虫に共通の抗原決定基である。ＬＤＮの生合成には、極めて特異的なＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼにより実行されるプロセスである末端ＧｌｃＮＡｃへのＧａｌＮＡｃの転移が関与している。例えば、Ｍｉｌｌｅｒらにより、参照により組み込まれるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８、２８３、ｐ．１９８５に、２つの密接に関連するβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるβ４ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３及びβ４ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４は、糖タンパク質黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び炭酸脱水酵素−６（ＣＡ６）を含む幾つかの糖タンパク質のＡｓｎ−結合オリゴ糖へのβ１，４−結合ＧａｌＮＡｃのタンパク質−特異的な付加を担うと考えられることが報告されている。
【０００４】
β−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴｓ）は、ヒト、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｋａｗａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、３４９２４）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００７、３１６、１６２５、参照により組み込まれる）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（Ｖａｄａｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４、２７９、３３５０１、参照により組み込まれる）を含む様々な生物で同定されている。
【０００５】
最後に、Ｎ−糖タンパク質修飾に関与するＧａｌＴｓ及びＧａｌＮＡｃＴｓ以外に、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓとも称される）と呼ばれる関連のない種類の酵素が、ムチン型連結（ＧａｌＮＡｃ−α−１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の生合成を担っている。これらの酵素は糖供与体ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＧａｌＮＡｃをセリン及びスレオニン残基に転移して、Ｏ−糖タンパク質に典型的なアルファアノマー結合を形成する。ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓ触媒機能の見かけ上の単純さにも関わらず、インシリコ解析に基づいて、２４の独特なｐｐＧａｌＮＡｃＴｓヒト遺伝子が独立に存在すると見積もられている。Ｏ−結合グリコシル化は段階的に進行するので、ＧａｌＮＡｃのセリン又はスレオニンへの付加はムチン生合成に関係する最初のステップに相当する。この見かけ上の単純さにも関わらず、そのタンパク質基質を完全にグリコシル化するには複数のｐｐＧａｌＮＡｃＴｓファミリーメンバーが必要なようである。
【０００６】
ガラクトシルトランスフェラーゼは、その自然の基質ＵＤＰ−Ｇａｌに加えて、様々な非天然のガラクトース誘導体を受容体ＧｌｃＮＡｃ基質に転移することができることが示されている。例えば、Ｅｌｌｉｎｇらは、参照により組み込まれるＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００１、２、８８４において、様々なガラクトシルトランスフェラーゼの作用の下で、末端ＧｌｃＮＡｃ含有タンパク質が、ＵＤＰ−糖からの６−修飾ガラクトースの転移によってビオチン化され得ることを示した。同様に、Ｐａｎｎｅｃｏｕｃｋｅらにより、参照により組み込まれるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２００８、４９、２２９４において、ウシβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに供されることにより、６−アジド−６−デオキシガラクトースが（ある程度まで）対応するＵＤＰ−糖から小分子ＧｌｃＮＡｃ基質に転移され得ることが立証された。改変ガラクトース誘導体のグリコシルトランスフェラーゼの使用は、先に米国特許出願公開第２００８／０１０８５５７号（国際公開第２００６／０３５０５７号、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ａ／Ｓ）においても報告され、ここでは、（ウシ又はヒト）β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの作用の下で、２〜１０当量のＵＤＰ−糖を用いて、Ｃ−６（例えば、チオール、アジド、Ｏ−プロパルギル、アルデヒド）において修飾された広範なガラクトース誘導体がＧｌｃＮＡｃ基質に転移され得ることがクレームされている。しかしながら、そのような請求項を裏付けるために提供されたデータは、ガラクトースの６−Ｏ−プロパルギル及び６−アルデヒド変異体のみに関する。Ｃ２に化学的ハンドルを有する様々なＧａｌＮＡｃ誘導体も、グリコシルトランスフェラーゼの基質としてクレームされているが、例は提供されなかった。
【０００７】
特に、参照により組み込まれるＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２３、２０８３３により報告されているように、ウシβ４Ｇａｌ−Ｔ１のＴｙｒ２８９残基のＬｅｕ２８９への突然変異は、ＵＤＰ−Ｇａｌ分子がＣ２に２−ケト−Ｇａｌのような化学的ハンドルを保持することを助長できる酵素の触媒ポケットを創り出す。非天然のガラクトース部分の最初の転移とその後のＣ−２ハンドル上へのオキシム連結との２ステップ法により、この突然変異体酵素β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）は、タンパク質上のＯ−ＧｌｃＮＡｃ残基又は通常及び悪性の腫瘍組織の細胞表面グリカン上の末端ＧｌｃＮＡｃ部分の存在のインビトロ検出に使用される。
【０００８】
例えば、参照により組み込まれるＫｈｉｄｅｋｅｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３、１２５、１６１６２は、β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）をもつＯ−ＧｌｃＮＡｃ改変タンパク質への非天然のケトン官能性の化学選択的な設置を開示している。ケトン部分は、オキシム連結を用いてＯ−ＧｌｃＮＡｃグリコシル化タンパク質をビオチンで「タグ付けする」のに独特なマーカーとして機能する。一旦ビオチニル化されたら、複合糖質は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたストレプトアビジンを用いて化学発光により容易に検出することができる。
【０００９】
例えば、いずれも参照により組み込まれる国際公開第２００７／０９５５０６号、国際公開第２００８／０２９２８１号（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、国際公開第２０１４／０６５６６１号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ  Ｂ．Ｖ．）及びＣｌａｒｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８、１３０、１１５７６は、β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）及びガラクトサミンのアジドアセチル変異体を用いて同様の成功を収めた同様な手法を報告している。
【００１０】
例えば、参照により組み込まれる米国特許第８，６９７，０６１号（Ｇｌｙｋｏｓ）は、同様の成功を収めた、β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）及び２−修飾糖を用いて同様の成功を収めた同様の手法を報告している。
【００１１】
Ｚｅｇｌｉｓらにより、参照により組み込まれるＢｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１３、２４、１０５７に報告されているように、ごく最近、突然変異体β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）はまた、抗体の重鎖グリカンの部位−選択的な放射性標識にも調製的に応用された。特に、アジド改変Ｎ−アセチルガラクトサミン単糖（ＧａｌＮＡｚ）の抗体のグリカンへの組み込みにより、適当なキレート剤のクリック化学導入後８９Ｚｒによる制御された標識が可能になった。
【００１２】
Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎらは、参照により組み込まれるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４、４３、１２５１３において、二重突然変異体β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ，Ｍ３４４Ｈ）が、そのＭｎ２＋−依存性の活性の９８％を失うが、にもかかわらずＭｇ２＋の存在下でＣ−２改変ガラクトース基質に転移する能力を含めて２５〜３０％の活性を示すことを記載している。二重突然変異体β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ、Ｍ３４４Ｈ）は、５〜１０ｍＭのＭｎ２＋の典型的な要件が細胞に対して潜在的な細胞毒性効果を有することが知られているので、インビトロガラクトシル化アッセイに有用であることが見出された。
【００１３】
参照により組み込まれるＭｅｒｃｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１３、２４、１４４は、二重突然変異体Ｙ２８９Ｌ−Ｍ３４４Ｈ−β４Ｇａｌ−Ｔ１酵素がＭｇ２＋の存在下でＧａｌＮＡｃ及び類似の糖を受容体ＧｌｃＮＡｃに転移することを記載している。
【００１４】
本明細書中ではβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴとも称される野生型β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼをＣ−２改変ＧａｌＮＡｃの転移のために使用する試みは今まで殆ど成功していない。
【００１５】
Ｂｅｒｔｏｚｚｉらは、参照により本明細書に組み込まれるＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９、４、１０６８で、バイオ直交型の化学レポーター技術を生きたＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）でムチン型Ｏ−グリカンの分子イメージングに応用した。蠕虫をＮ−アセチルガラクトサミンのアジド−糖変異体（ＧａｌＮＡｚ）で処理してこの非天然の糖のインビボ取り込みを起こさせた。ＧａｌＮＡｚの糖タンパク質への代謝取り込みが観察されたが、Ｃ．エレガンス溶解物のコンドロイチナーゼＡＢＣ及びペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）消化、それに続くホスフィン−Ｆｌａｇタグを用いるＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション及びその後のα−Ｆｌａｇ抗体を利用したウェスタンブロッティングによる糖タンパク質のプローブ探査により、糖タンパク質のＧａｌＮＡｚ残基の大部分がＮ−グリカンより他の型のグリカンに位置していることが示された。更に、アジド−標識糖タンパク質のＮ−グリカン特異的レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）への検出可能な結合は観察されなかったが、これは標識グリカンの大部分がＯ−結合しており、Ｎ−結合していないという仮説と一致している。これらの観察に基づいて、ＧａｌＮＡｚはこの生物ではＮ−ＧｌｃＮアシル化タンパク質に代謝的に取り込まれないと結論できる。
【００１６】
ごく最近、Ｂｕｒｎｈａｍ−Ｍａｒｕｓｉｃｈらにより、参照により本明細書に組み込まれるＰｌｏｓ  Ｏｎｅ  ２０１２、７、ｅ４９０２０において同様な結論が導かれた。ここでも、ＰＮＧＡｓｅ処理の際の信号低下の欠如（これは、ＧａｌＮＡｚのＮ−糖タンパク質への明らかな取り込みがないことを示す）が観察された。Ｂｕｒｎｈａｍ−Ｍａｒｕｓｉｃｈらは、代謝的に標識された糖タンパク質を検出するために、アジド標識糖タンパク質による末端アルキン−プローブのＣｕ（Ｉ）に触媒されるアジド−アルキン付加環化反応を用いた研究を記載している。結果は、ＧａｌＮＡｚ標識の大部分が、ｐＮＧａｓｅ  Ｆに対して感受性でない、したがって、Ｎ−糖タンパク質ではないグリカン種に取り込まれることを示している。
【００１７】
参照により組み込まれるＫａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、３４９２４に報告されているように、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに対するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴの高い基質特異性は、それぞれ０．７％、０．２％及び１％のトランスフェラーゼ活性が残存しているＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ及びＵＤＰ−Ｇａｌの不良な認識から明らかになる。
【００１８】
上記に基づき、２−ケト又は２−アジドアセチル誘導体のような非天然のＧａｌＮＡｃ誘導体のＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼによる糖タンパク質の改変のためのインビトロ方法が報告されていないことは驚くべきことではない。
【００１９】
同時に、参照により組み込まれるＱａｓｂａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００７、３６５、５７０により、ヒトβ４Ｇａｌ−Ｔ１オルソログ酵素のＴｙｒ−２８９残基に対応する、無脊椎動物ＧａｌＮＡｃＴのＩｌｅ又はＬｅｕ活性部位残基のＴｙｒ残基への置換が、そのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を約１０００倍低減する一方、そのガラクトシルトランスフェラーゼ活性を８０倍高めることによって、この酵素をβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼに変換することが報告された。
【００２０】
参照により組み込まれるＴａｒｏｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０１２、３６２、６２は、ＧＰＩ−アンカーにおけるＧａｌＮＡｚのインビボ代謝取り込みを記載している。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させるステップを含む、糖タンパク質の改変のための方法であって、
（ｉ）グリコシルトランスフェラーゼはβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来し；
（ｉｉ）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
【化１】
2018518149.tif 000003
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖、又は２〜２０の糖部分を含む直鎖又は分岐オリゴ糖である）
で表され、
（ｉｉｉ）糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは式（３）：
【化２】
2018518149.tif 000004
（式中：
ａは０又は１であり；
ｆは０又は１であり；
ｇは０又は１であり；
Ｎｕｃはヌクレオチドであり；
Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここで、ｎは１〜２４の範囲の整数であり；ｏは０〜１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から選択され；
ＴはＣ３〜Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよく；
Ａは、
（ａ）−Ｎ３
（ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３
（ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基である）；
（ｃ）（ヘテロ）シクロアルキニル基又は−（ＣＨ２）ｉＣ≡Ｃ−Ｒ４部分
（ここでｉは０〜１０であり、Ｒ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基である）；
（ｄ）−ＳＨ
（ｅ）−ＳＣ（Ｏ）Ｒ８
（ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である）；
（ｆ）−ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８
（ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である）；
（ｇ）−Ｘ
（ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）；
（ｈ）−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５
（ここでＲ５はＣ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい）；
（ｉ）Ｒ１２
（ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル基及びＣ４〜Ｃ８アルカジエニル基からなる群から選択される）；及び
（ｊ）Ｒ１３
（ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３〜Ｃ２４アレニル基である）；及び
（ｋ）Ｎ（Ｒ１７）２
（ここでＲ１７はＨ及びＣ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から独立して選択される）；
からなる群から選択され；
ＺはＣＨ２、ＣＦ２若しくはＣ（Ｏ）であるか；ｇが０であり、ｆが１であり、かつａが０若しくは１であるという条件で、ＺはＣＨＯＨであり；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１５）及びＮ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択され
（ここでＲ１５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである）；
Ｒ１４は、
【化３】
2018518149.tif 000005
（式中：
ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは、上記定義の通りであり；
ｈは、０又は１であり；
Ｗは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１５、ＮＨＳ（Ｏ）２Ｏ及びＮＨＳ（Ｏ）２ＮＲ１５からなる群から選択され、ここでＲ１５は上記定義の通りである）
からなる群から選択される）
で表される。
【００２２】
更に本発明は、本発明の方法によって得ることのできる糖タンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の方法によって改変され得る、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質のいくつかの例を示す図である。
【図２】糖タンパク質が抗体である場合の糖タンパク質の改変方法の１つの実施形態を示す図である。この実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼの作用の下で、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが抗体グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分に結合されて、改変された抗体を形成し、ここでグリコシルトランスフェラーゼは、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来する。
【図３】抗体グリカンの様々な糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆを示す図である。
【図４】糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物をシアリダーゼ及びガラクトシダーゼで処理することによって式（１０）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を提供する方法、並びに糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物をエンドグリコシダーゼで処理することによって式（１）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を提供する方法を示す図である。式（１０）又は（１）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を、アジド−改変ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、６−アジドＧａｌＮＡｃと共にインキュベートすることにより、それぞれアジド−改変された糖タンパク質（３３）又は（３２）が得られる。
【図５】図５は、本発明の改変された糖タンパク質中の官能基（Ａ）の代表的な組を示し、これは、反応性基Ｑ１との反応の際に連結基ＣＧ及び官能化された糖タンパク質をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、動詞「含む」及びその活用形態は、その非限定的な意味で使用されており、その単語の後に記載される事項が包含されるが、具体的に述べられていない事項が排除されないことを意味する。更に、不定冠詞によるある要素への言及は、文脈から１つ及び１つのみの要素が存在することが明白に求められない限り、１つより多くの要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００２５】
非置換アルキル基は一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有し、直鎖状でも分岐状でもよい。非置換アルキル基はまた環状の部分を含有してもよく、したがって、付随する一般式ＣｎＨ２ｎ−１を有し得る。任意選択で、アルキル基は本明細書中で更に特定されている１又は複数の置換基により置換される。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｔ−ブチル、１−ヘキシル、１−ドデシル、等がある。
【００２６】
アリール基は６〜１２個の炭素原子を含み、単環状及び二環状の構造を含み得る。任意選択で、アリール基は本明細書で更に特定されている１又は複数の置換基によって置換されていてもよい。アリール基の例はフェニル及びナフチルである。
【００２７】
アリールアルキル基及びアルキルアリール基は少なくとも７個の炭素原子を含み、単環状及び二環状の構造を含み得る。任意選択で、アリールアルキル基及びアルキルアリールは本明細書で更に特定されている１又は複数の置換基により置換されていてもよい。アリールアルキル基は例えばベンジルである。アルキルアリール基は例えば４−ｔ−ブチルフェニルである。
【００２８】
ヘテロアリール基は少なくとも２個の炭素原子（即ち少なくともＣ２）及び１個又は複数のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、Ｐ又はＳを含む。ヘテロアリール基は単環状の又は二環状の構造を有し得る。任意選択で、ヘテロアリール基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されていてもよい。適切なヘテロアリール基の例としては、ピリジニル、キノリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピロリル、フラニル、トリアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、プリニル、ベンゾキサゾリル、チエニル、ホスホリル及びオキサゾリルがある。
【００２９】
ヘテロアリールアルキル基及びアルキルヘテロアリール基は少なくとも３個の炭素原子（即ち少なくともＣ３）を含み、単環状及び二環状の構造を含み得る。任意選択で、ヘテロアリール基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されていてもよい。
【００３０】
アリール基が（ヘテロ）アリール基と表示されている場合、この表記はアリール基及びヘテロアリール基を包含することを意味する。同様に、アルキル（ヘテロ）アリール基はアルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を包含して意味し、（ヘテロ）アリールアルキルはアリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を包含することを意味する。したがって、Ｃ２〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基はＣ２〜Ｃ２４ヘテロアリール基及びＣ６〜Ｃ２４アリール基を包含するものと解釈される。同様に、Ｃ３〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基はＣ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ３〜Ｃ２４アルキルヘテロアリール基を包含して意味し、Ｃ３〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキルはＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基及びＣ３〜Ｃ２４ヘテロアリールアルキル基を包含することを意味する。
【００３１】
別段の指定がない限り、アルキル基、アルケニル基、アルケン、アルキン、（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基、アルキル（ヘテロ）アリール基、アルキレン基、アルケニレン基、シクロアルキレン基、（ヘテロ）アリーレン基、アルキル（ヘテロ）アリーレン基、（ヘテロ）アリールアルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、（ヘテロ）アリールオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５〜Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８〜Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ及びシリル基からなる群から独立して選択される１又は複数の置換基で置換されていてもよく、ここでシリル基は式（Ｒ２）３Ｓｉ−で表すことができ、式中Ｒ２はＣ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、ここでアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択で置換されていてもよく、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、任意選択でＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により中断されてもよい。
【００３２】
アルキニル基は炭素−炭素三重結合を含む。１つの三重結合を含む非置換アルキニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ−３を有する。末端アルキニルは、三重結合が炭素鎖の末端位置に位置するアルキニル基である。任意選択で、アルキニル基は、本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されているか、及び／又は酸素、窒素及びイオウの群から選択されるヘテロ原子により中断されている。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニル、等がある。
【００３３】
シクロアルキニル基は環状のアルキニル基である。１つの三重結合を含む非置換のシクロアルキニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ−５を有する。任意選択で、シクロアルキニル基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されている。シクロアルキニル基の一例はシクロオクチニルである。
【００３４】
ヘテロシクロアルキニル基は酸素、窒素及びイオウの群から選択されるヘテロ原子により中断されているシクロアルキニル基である。任意選択で、ヘテロシクロアルキニル基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されている。ヘテロシクロアルキニル基の一例はアザシクロオクチニルである。
【００３５】
（ヘテロ）アリール基はアリール基及びヘテロアリール基を含む。アルキル（ヘテロ）アリール基はアルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含む。（ヘテロ）アリールアルキル基はアリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含む。（ヘテロ）アルキニル基はアルキニル基及びヘテロアルキニル基を含む。（ヘテロ）シクロアルキニル基はシクロアルキニル基及びヘテロシクロアルキニル基を含む。
【００３６】
（ヘテロ）シクロアルキン化合物は、本明細書中で、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む化合物と定義される。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲に開示されている化合物の幾つかは、縮合（ヘテロ）シクロアルキン化合物、即ち第２の環構造が（ヘテロ）シクロアルキニル基に縮合、即ち環付加している（ヘテロ）シクロアルキン化合物と記述され得る。例えば、縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物において、シクロアルキル（例えばシクロプロピル）又はアレーン（例えばベンゼン）は（ヘテロ）シクロオクチニル基に環付加し得る。縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の（ヘテロ）シクロオクチニル基の三重結合は３つの可能な位置のいずれか１つ、即ちシクロオクチン部分の２、３又は４位に位置し得る（番号付けは「ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｒｕｌｅ  Ａ３１．２による）。本明細書及び特許請求の範囲における縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の記載は、シクロオクチン部分の３つの個々の位置異性体の全てを包含することを意味する。
【００３８】
総括的用語「糖」は、本明細書中で、単糖、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びフコース（Ｆｕｃ）を指すために使用される。用語「糖誘導体」は、本明細書中で、単糖の糖の誘導体、即ち置換基及び／又は官能基を含む単糖の糖を指すために使用される。糖誘導体の例としては、アミノ糖及び糖酸、例えばグルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）、ガラクトサミン（ＧａｌＮＨ２）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも称されるシアル酸（Ｓｉａ）、及びＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）及びイズロン酸（ＩｄｏＡ）がある。
【００３９】
用語「ヌクレオチド」は本明細書中でその通常の科学的な意味で使用される。用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオ塩基、五炭糖（リボース又は２−デオキシリボース）、及び１、２又は３つのリン酸基から構成される分子を指す。リン酸基がないと、ヌクレオ塩基及び糖はヌクレオシドを構成する。したがって、ヌクレオチドはヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド三リン酸と呼ばれる場合もある。ヌクレオ塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンであり得る。ヌクレオチドの例として、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）がある。
【００４０】
用語「タンパク質」は本明細書中でその通常の科学的な意味で使用される。ここで、約１０又は複数のアミノ酸を含むポリペプチドはタンパク質と考えられる。タンパク質は天然のアミノ酸を含むが、非天然のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００４１】
用語「糖タンパク質」は、本明細書中でその通常の科学的な意味で使用されており、タンパク質に共有結合された１又は複数の単糖又はオリゴ糖鎖（「グリカン」）を含むタンパク質を指す。グリカンは、タンパク質のヒドロキシル基（Ｏ−結合した−グリカン）、例えばセリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリシン若しくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、又はタンパク質の窒素機能（Ｎ−糖タンパク質）、例えばアスパラギン若しくはアルギニン、又はタンパク質の炭素（Ｃ−糖タンパク質）、例えばトリプトファンに結合し得る。糖タンパク質は、１より多くのグリカンを含んでもよいし、１又は複数の単糖及び１又は複数のオリゴ糖グリカンの組合せを含んでもよく、Ｎ−結合、Ｏ−結合した及びＣ−結合したグリカンの組合せを含んでもよい。全てのタンパク質の５０％より多くが何らかの形態のグリコシル化を有し、したがって、糖タンパク質の資格があると見積もられる。糖タンパク質の例には、ＰＳＭＡ（前立腺−特異的膜抗原）、ＣＡＬ（カンジダ・アンタルティカ（ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼ）、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、凍結防止タンパク質及び抗体がある。
【００４２】
用語「グリカン」は、本明細書中でその通常の科学的な意味で使用されており、タンパク質に結合した単糖又はオリゴ糖鎖を指す。したがって、用語グリカンは、糖タンパク質の糖質部分を指す。グリカンは１つの糖のＣ−１炭素を介してタンパク質に結合し、その糖は更なる置換がなくてもよいし（単糖）、又はそのヒドロキシル基の１又は複数で更に置換されていてもよい（オリゴ糖）。天然のグリカンは典型的には１〜約１０の単糖部分を含む。しかしながら、より長い単糖鎖がタンパク質に結合しているとき、上記単糖鎖も本明細書中ではグリカンと考えられる。
【００４３】
糖タンパク質のグリカンは単糖であり得る。典型的には、糖タンパク質の単糖グリカンはタンパク質に共有結合した単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）又はフコース（Ｆｕｃ）からなる。
【００４４】
また、グリカンはオリゴ糖であってもよい。糖タンパク質のオリゴ糖鎖は直鎖状でも分岐状でもよい。オリゴ糖の場合、タンパク質に直接結合している糖はコア糖と呼ばれる。オリゴ糖において、タンパク質に直接結合していないが、少なくとも２つの他の糖に結合している糖は内部糖と呼ばれる。オリゴ糖において、タンパク質に直接結合していないが、単一の他の糖に結合している、即ちその他のヒドロキシル基のうちの１つ又は複数に更なる糖置換基を担持しない糖は末端糖と呼ばれる。誤解を避けるために、糖タンパク質のオリゴ糖内には複数の末端糖が存在してもよいが、コア糖は１つのみである。
【００４５】
グリカンはＯ−結合したグリカン、Ｎ−結合したグリカン又はＣ−結合したグリカンであり得る。Ｏ−結合したグリカンの場合、単糖又はオリゴ糖グリカンは、典型的にはセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル基を介してタンパク質のアミノ酸のＯ−原子に結合している。Ｎ−結合したグリカンの場合、単糖又はオリゴ糖グリカンはタンパク質のアミノ酸のＮ−原子を介して、典型的にはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖のアミド窒素を介してタンパク質に結合している。Ｃ−結合したグリカンの場合、単糖又はオリゴ糖グリカンは、タンパク質のアミノ酸のＣ−原子に、典型的にはトリプトファン（Ｔｒｐ）のＣ−原子に結合している。
【００４６】
オリゴ糖の、タンパク質に直接結合している末端はグリカンの還元末端と呼ばれる。オリゴ糖の他の末端はグリカンの非還元末端と呼ばれる。
【００４７】
Ｏ−結合したグリカンには、極めて多様な鎖が存在する。天然のＯ−結合したグリカンは典型的にはセリン又はスレオニン−結合したα−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ部分を特徴とし、これが別のＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸及び／又はフコースにより更に置換されている。グリカン置換を有するヒドロキシル化されたアミノ酸はタンパク質のアミノ酸配列の一部であってもよい。
【００４８】
Ｎ−結合したグリカンには、極めて多様な鎖が存在する。天然のＮ−結合したグリカンは典型的にはアスパラギン−結合したβ−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ部分を特徴とし、次いでその４−ＯＨでβ−ＧｌｃＮＡｃにより更に置換され、次いでその４−ＯＨでβ−Ｍａｎにより更に置換され、次いで更にその３−ＯＨ及び６−ＯＨでα−Ｍａｎにより更に置換されて、グリカン五糖類Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２となる。コアのＧｌｃＮＡｃ部分はその６−ＯＨでα−Ｆｕｃにより更に置換されていてもよい。五糖類Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は殆ど全てのＮ−結合した糖タンパク質に共通のオリゴ糖足場であり、限定されることはないがＭａｎ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ及びシアル酸を始めとする広範な他の置換基を担持し得る。その側鎖でグリカンにより置換されたアスパラギンは典型的には配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はスレオニンのいずれかである。
【００４９】
用語「抗体」は本明細書中でその通常の科学的な意味で使用される。抗体は、免疫システムにより産生され、特定の抗原を認識し結合することができるタンパク質である。抗体は糖タンパク質の一例である。用語抗体は本明細書中でその最も広い意味で使用されており、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、抗体断片、並びに二本鎖及び一本鎖抗体を包含する。また、用語「抗体」は本明細書中でヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び癌抗原に特異的に結合する抗体を包含することも意味する。用語「抗体」は全抗体を包含するが、抗体の断片、例えば抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、開裂抗体に由来するＦｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）又はｓｃＦｖを包含することも意味する。また、この用語は遺伝子操作された抗体及び抗体の誘導体を包含する。抗体、抗体の断片及び遺伝子操作された抗体は当技術分野で公知の方法によって得ることができる。適切な市販抗体としては、特に、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ及びブレンツキシマブがある。
【００５０】
同一性／類似性
本発明の文脈において、タンパク質又はタンパク質断片はアミノ酸配列によって表される。
【００５１】
本明細書中で所与の配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）によって同定される各々のタンパク質若しくはタンパク質断片又はペプチド若しくは誘導されたペプチド若しくはポリペプチドは開示されているこの特定の配列に限定されないと理解されたい。「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列の間の関係と定義される。当技術分野で、「同一性」とは、場合によってアミノ酸配列の鎖間の一致により決定されるかかる配列間の配列類似性の程度も意味する。本明細書中他に示さない限り、所与の配列番号の同一性又は類似性は上記配列の全長に基づく（即ち、その全長にわたる、又は全体としての）同一性又は類似性を意味する。
【００５２】
その配列番号によって定義された具体的に示された配列に対して１００％未満の配列同一性を有する本発明に包含される任意の酵素は、配列番号によって定義された上記配列に対して１００％の同一性を有する酵素の酵素活性の好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は好ましくは少なくとも８０％若しくは９０％又は少なくとも１００％の酵素活性を有する。
【００５３】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定されることはないが（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを含めて公知の方法により容易に計算することができる。
【００５４】
同一性を決定するために好ましい方法は試験される２以上の配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は公的に入手可能なコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するのに好ましいコンピュータープログラム方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）がある。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するのに使用できる。
【００５５】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターには次のものが含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆによるＢＬＯＳＳＵＭ６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；Ｇａｐペナルティー：１２；及びＧａｐ長ペナルティー：４。これらのパラメーターと共に有用なプログラムはＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメーターはアミノ酸比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップのペナルティーなし）。任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者には明らかなように、当業者はいわゆる「保存的な」アミノ酸置換も考慮し得る。保存的なアミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンであり、アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、イオウを含有する側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換のグループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換変異体は、開示されている配列内の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその代わりに挿入されているものである。アミノ酸の変更は保存的であることが好ましい。各天然のアミノ酸に対する好ましい保存的な置換は：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ又はＨｉｓ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及び、ＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕである。
【００５６】
糖タンパク質の改変方法
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼの作用の下での糖タンパク質の改変方法に関し、ここで改変された糖タンパク質を得るために、グリコシルトランスフェラーゼはβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来する。この方法はインビトロの方法であることが好ましい。
【００５７】
特に、本発明は糖タンパク質の改変方法に関し、この方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させるステップを含み、
ここで：
（ｉ）グリコシルトランスフェラーゼはβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来し；
（ｉｉ）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
【化４】
2018518149.tif 000006
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖、又は２〜２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である）
で表され、
（ｉｉｉ）糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは式（３）：
【化５】
2018518149.tif 000007
（式中：
ａは０又は１であり；
ｆは０又は１であり；
ｇは０又は１であり；
Ｎｕｃはヌクレオチドであり；
Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここでｎは１〜２４の範囲の整数であり；ｏは０〜１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され；
ＴはＣ３〜Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよく；
Ａは、
（ａ）−Ｎ３
（ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３
（ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基である）；
（ｃ）（ヘテロ）シクロアルキニル基又は−（ＣＨ２）ｉＣ≡Ｃ−Ｒ４部分
（ここでｉは０〜１０であり、Ｒ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基である）；
（ｄ）−ＳＨ
（ｅ）−ＳＣ（Ｏ）Ｒ８
（ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である）；
（ｆ）−ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８
（ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である）；
（ｇ）−Ｘ
（ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）；
（ｈ）−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５
（ここでＲ５はＣ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい）；
（ｉ）Ｒ１２
（ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル基及びＣ４〜Ｃ８アルカジエニル基からなる群から選択される）；及び
（ｊ）Ｒ１３
（ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３〜Ｃ２４アレニル基である）；及び
（ｋ）Ｎ（Ｒ１７）２
（ここでＲ１７はＨ及びＣ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から独立して選択される）；
からなる群から選択され；
ＺはＣＨ２、ＣＦ２若しくはＣ（Ｏ）であるか；ｇが０であり、ｆが１であり、かつａが０若しくは１であるという条件で、ＺはＣＨＯＨであり；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１５）及びＮ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択され
（ここでＲ１５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである）；
Ｒ１４は、
【化６】
2018518149.tif 000008
（式中：
ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは、上記定義の通りであり；
ｈは、０又は１であり；
Ｗは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１５、ＮＨＳ（Ｏ）２Ｏ及びＮＨＳ（Ｏ）２ＮＲ１５からなる群から選択され、ここでＲ１５は上記定義の通りである）
からなる群から選択される）
で表される。
【００５８】
一実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＡは、式（３）で表され、上記定義の選択肢（ａ）〜（ｊ）からなる群から選択される。別の実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＡは、式（３）で表され、上記定義の選択肢（ａ）〜（ｄ）及び（ｇ）〜（ｋ）からなる群から、より好ましくは選択肢（ａ）〜（ｄ）及び（ｇ）〜（ｊ）からなる群から選択される。
【００５９】
上に記載したように、糖タンパク質の改変のための本発明の方法により、改変された糖タンパク質が得られる。改変された糖タンパク質は、本明細書で、式（４）又は（５）で表されるグリカンを含む糖タンパク質として定義され：
【化７】
2018518149.tif 000009
（式中：
ｂ、ｄ、ｅ及びＧは上記定義の通りであり；
Ｓｕ（Ａ）は式（６）で表される糖誘導体である）：
【化８】
2018518149.tif 000010
（式中：
Ｒ１４、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｇ、ｆ及びａは上記定義の通りである）。
【００６０】
式（４）及び（５）で表される改変された糖タンパク質グリカンにおいて、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）は、β−１，４−Ｏ−グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に連結している。
【００６１】
糖タンパク質の改変のための方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップを更に含み得る。したがって、本発明はまた、糖タンパク質の改変のための方法であって、
（１）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップであり、ここで末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記定義の式（１）又は（２）で表される、ステップ；及び
（２）上記糖タンパク質を、グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、より特定的にはその作用の下で、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させるステップであり、ここでグリコシルトランスフェラーゼは、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来し、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃは上記定義の式（３）で表される、ステップ
を含む、方法にも関する。
【００６２】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ及び改変された糖タンパク質、並びにこれらの好ましい実施形態について、以下により詳細に記載する。
【００６３】
β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼについて、以下により詳細に記載する。
【００６４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、７１、７２及び７３からなる群から選択される配列であるか又はそれに由来する。この実施形態は、Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａ又は−Ｎ３であるとき、特に好ましい。
【００６５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０及び７４からなる群から選択される配列であるか又はそれに由来する。この実施形態は、Ｒ１４が−ＯＨであるとき、特に好ましい。
【００６６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、７１、７２及び７３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。この実施形態において、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、７１、７２及び７３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５５％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが更に好ましい。これらの実施態様は、Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａ又は−Ｎ３であるとき、特に好ましい。
【００６７】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０及び７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。この実施形態において、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０及び７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも５５％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが更に好ましい。これらの実施形態は、Ｒ１４が−ＯＨであるとき、特に好ましい。
【００６８】
糖タンパク質
本発明の方法において改変される糖タンパク質はグリカンを含み、上記グリカンは末端ＧｌｃＮＡｃ部分、即ちグリカンの非還元末端に存在するＧｌｃＮＡｃ部分を含む。上記グリカンは１又は複数の単糖部分を含み、直鎖状でも分岐状でもよい。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
【化９】
2018518149.tif 000011
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖、又は２〜２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である）
で表される。
【００６９】
改変される糖タンパク質は末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む１より多くのグリカンを含んでいてもよい。この場合、２つ以上のグリカンは互いに異なっていてもよい。糖タンパク質は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含まない１又は複数の追加のグリカンを含んでもよい。
【００７０】
コア−ＧｌｃＮＡｃ部分、即ちタンパク質に結合しているＧｌｃＮＡｃ部分は任意選択でフコシル化される（ｂは０又は１である）。コア−ＧｌｃＮＡｃ部分がフコシル化されているとき、フコースは上記ＧｌｃＮＡｃ部分のＣ６にα−１，６結合していることが最も一般的である。
【００７１】
ｂが１である場合の式（１）で表されるグリカンのＧｌｃＮＡｃ部分、即ちフコシル化されたＧｌｃＮＡｃからなるグリカンのＧｌｃＮＡｃ部分は本明細書中で末端ＧｌｃＮＡｃ部分とも考えられることに留意すべきである。
【００７２】
１つの実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは１つのＧｌｃＮＡｃ部分からなり、グリカンはｂが０の場合の式（１）で表されるグリカンである。別の実施形態において、上記グリカンはフコシル化されたＧｌｃＮＡｃ部分からなり、グリカンはｂが１の場合の式（１）で表されるグリカンである。
【００７３】
別の実施形態において、上記グリカンは式（２）で表されるグリカンであり、ここでコア−ＧｌｃＮＡｃは、存在するならば、任意選択でフコシル化されている（ｂは０又は１である）。式（２）で表されるグリカンで、Ｇは単糖、又は１〜２０、好ましくは１〜１２、より好ましくは１〜１０、更により好ましくは１、２、３、４、５、６、７若しくは８、最も好ましくは１、２、３、４、５若しくは６個の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である。Ｇが分岐オリゴ糖であるとき、Ｇは１又は複数の末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含んでいてもよい。したがって、式（２）で表されるグリカンは１より多くの末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含み得る。グリカン（２）で、ｄが０のときはｅが１であり、ｅが０のときはｄが１であることが好ましい。グリカン（２）で、ｄが１であることがより好ましく、ｄが１で、ｅが１であることが更により好ましい。
【００７４】
グリカンに存在し得る糖部分は当業者に公知であり、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）又はシアル酸及びキシロース（Ｘｙｌ）がある。
【００７５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記定義の式（１）で表される。別の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（２）で表される。グリカンがＮ−結合したグリカンであることが更に好ましい。グリカンが式（２）で表されるＮ−結合したグリカンであるとき、ｄは１であることが好ましい。
【００７６】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが式（２）で表されるとき、式（２）で表されるグリカンは、式（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）：
【化１０】
2018518149.tif 000012
【化１１】
2018518149.tif 000013
【化１２】
2018518149.tif 000014
【化１３】
2018518149.tif 000015
【化１４】
2018518149.tif 000016
【化１５】
2018518149.tif 000017
（式中：
ｂは０又は１である）
で表されるグリカンであることが更に好ましい。
【００７７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表されるグリカンであり、より好ましくは式（１）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表されるＮ−結合したグリカンである。更に好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）、（９）、（１０）又は（１１）で表されるグリカンであり、より好ましくは式（１）、（９）、（１０）又は（１１）で表されるＮ−結合したグリカンである。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（１０）で表されるグリカンであることが最も好ましく、式（１）で表されるＮ−結合したグリカンであることがより好ましい。
【００７８】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は好ましくは式（７）、（８）又は（８ｂ）：
【化１６】
2018518149.tif 000018
【化１７】
2018518149.tif 000019
（式中：
ｂ、ｄ、ｅ及びＧ、並びにそれらの好ましい実施形態は上記定義の通りであり；
ｙは独立して１〜２４の範囲の整数であり；
Ｐｒはタンパク質である）
で表される。
【００７９】
本発明の方法において改変される糖タンパク質は末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む１又は複数のグリカンを含む（ｙは１〜２４である）。ｙは１〜１２の範囲の整数であることが好ましく、１〜１０の範囲の整数であることがより好ましい。ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることがより好ましく、ｙは１、２、３、４、５又は６であることが更により好ましい。ｙは１、２、３又は４であることが更により好ましい。改変される糖タンパク質が１より多くのグリカン（ｙは２以上である）を含むとき、グリカンは互いに異なっていてもよい。上記したように、糖タンパク質は末端ＧｌｃＮＡｃ部分を持たない１又は複数のグリカンを更に含んでいてもよい。
【００８０】
本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（７）、（８）又は（８ｂ）で表されるとき、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは、上記の式（１）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表されるグリカン、好ましくはＮ−結合したグリカン、より好ましくは式（１）、（９）、（１０）又は（１１）で表される、尚より好ましくは式（１）又は（１０）で表されるグリカン、好ましくはＮ−結合したグリカンであることも好ましい。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）で表されるＮ−結合したグリカンであることが最も好ましい。
【００８１】
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は抗体、より好ましくは式（７）、（８）又は（８ｂ）で表される抗体であり、ここでタンパク質（Ｐｒ）は抗体（Ａｂ）である。改変される糖タンパク質が抗体であって、抗体が１より多いグリカン（ｙは２以上である）を含むときも、グリカンは互いに異なっていてもよい。抗体は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を有さない１又は複数のグリカンを更に含んでもよい。また、改変される糖タンパク質が抗体であるとき、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記定義の式（１）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表される、より好ましくは式（１）、（９）、（１０）又は（１１）で表される、更により好ましくは式（１）又は（１０）で表されるグリカンであることが好ましい。この実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）又は（１４）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくは式（１）、（９）、（１０）又は（１１）で表されるＮ−結合したグリカン、最も好ましくは式（１）又は（１０）で表されるＮ−結合したグリカンであることが更に好ましい。
【００８２】
改変される糖タンパク質が抗体であるとき、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることが好ましく、より好ましくはｙが１、２、４、６又は８であり、更により好ましくはｙが１、２又は４であり、最も好ましくはｙが１又は２である。
【００８３】
上記で定義した通り、上記抗体は全抗体でもよいが、抗体断片であってもよい。抗体が全抗体であるとき、上記抗体は好ましくは各々の重鎖に１又は複数の、より好ましくは１つの末端非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンを含む。したがって、上記全抗体は好ましくは２以上の、好ましくは２、４、６又は８の上記グリカン、より好ましくは２又は４、最も好ましくは２のグリカンを含む。言い換えると、上記抗体が全抗体であるとき、ｙは好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片であるとき、ｙは１、２、３又は４であり、より好ましくはｙが１又は２であることが好ましい。
【００８４】
好ましい実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。上記抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されることが好ましい。上記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であることがより好ましく、上記抗体はＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。
【００８５】
本発明の方法において、フコシル化された並びにフコシル化されてないグリカンを含む糖タンパク質混合物を出発糖タンパク質として使用してもよい。上記混合物は例えば１又は複数のフコシル化された（ｂが１）グリカン（１）及び／又は（２）及び／又は１又は複数のフコシル化されてない（ｂが０）グリカン（１）及び／又は（２）を含む糖タンパク質を含み得る。したがって、本発明の方法の前にフコシル化されたグリカンからフコースを除去することは必要ではないが、任意選択である。
【００８６】
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は本明細書中で「末端非還元ＧｌｃＮＡｃタンパク質」とも称され、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは本明細書中で「末端非還元ＧｌｃＮＡｃグリカン」とも称される。用語「末端非還元ＧｌｃＮＡｃタンパク質」はｂが１である式（７）のタンパク質を含み、用語「末端非還元ＧｌｃＮＡｃグリカン」はｂが１である式（１）のグリカンを含むことに注意すべきである。
【００８７】
末端非還元ＧｌｃＮＡｃタンパク質は１又は複数の直鎖及び／又は１又は複数の分岐末端非還元ＧｌｃＮＡｃグリカンを含み得る。グリカンはグリカンコア−糖部分のＣ１を介してタンパク質に結合し、上記コア−糖部分はコア−ＧｌｃＮＡｃ部分であることが好ましい。その結果として、タンパク質に結合した末端非還元ＧｌｃＮＡｃグリカンが式（２）で表されるグリカンであるとき、ｄは１であることが好ましい。グリカンが式（２）で表されるとき、ｄは１であり、ｅは１であることがより好ましい。
【００８８】
好ましい実施形態において、末端非還元ＧｌｃＮＡｃグリカンのコア−糖部分のＣ１は、Ｎ−グリコシド結合を介して、上記タンパク質のアミノ酸残基の窒素原子、より好ましくはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸の側鎖の窒素原子に結合する。しかしながら、非還元ＧｌｃＮＡｃ−グリカンのコア−糖部分のＣ１はまた、Ｏ−グリコシド結合を介して、上記タンパク質のアミノ酸残基の酸素原子、より好ましくはセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の側鎖の酸素原子に結合してもよい。この実施形態において、上記グリカンのコア−糖部分はＧｌｃＮＡｃ部分又はＧａｌＮＡｃ部分、好ましくはＧｌｃＮＡｃ部分であることが好ましい。非還元ＧｌｃＮＡｃグリカンのコア−糖部分のＣ１はまた、Ｃ−グリコシド結合を介して、タンパク質の炭素原子、例えばトリプトファン（Ｔｒｐ）に結合してもよい。上に記載したように、糖タンパク質は１より多くのグリカンを含み得、Ｎ−結合した、Ｏ−結合した及び／又はＣ−結合したグリカンの組合せを含み得る。
【００８９】
末端非還元ＧｌｃＮＡｃグリカンはタンパク質の生来のグリコシル化部位に存在し得るが、タンパク質の異なる部位に導入してもよい。
【００９０】
糖タンパク質が抗体であるとき、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンはＦｃ−断片の領域２９０〜３０５のアスパラギン、典型的にはＮ２９７で保存Ｎ−グリコシル化部位に結合することが好ましい。
【００９１】
本発明の方法において改変され得る末端非還元ＧｌｃＮＡｃタンパク質の幾つかの例を図１に示す。図１（Ａ）は、単一の任意選択でフコシル化されたＧｌｃＮＡｃ部分を含む糖タンパク質を示す。このＧｌｃＮＡｃグリカンは例えばＮ−グリコシド又はＯ−グリコシド結合を介してタンパク質に結合され得る。図１（Ａ）の糖タンパク質は例えば正常な発現の後エンドグリコシダーゼ又はエンドグリコシダーゼの組合せを用いてトリミングすることによって得られる。図１（Ｂ）は、枝の１つが末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む分岐オリゴ糖グリカンを含む糖タンパク質を示す（このグリカンはＧｎＭ５とも表される）。コア−ＧｌｃＮＡｃ部分は任意選択でフコシル化されてもよい。図１（Ｂ）の糖タンパク質は、例えば、スワインソニンの存在下哺乳類システムでの糖タンパク質の発現により、又は工学処理した宿主生物、例えばＬｅｃ１  ＣＨＯ又はピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）での発現により得られる。図１（Ｃ）は、単一の、任意選択でフコシル化されていてもよいＧｌｃＮＡｃ部分を含む抗体を示す。このＧｌｃＮＡｃグリカンは、Ｎ−グリコシド結合を介して抗体に結合されることが好ましい。図１（Ｃ）の糖タンパク質は、例えば、正常な発現後にエンドグリコシダーゼ又はエンドグリコシダーゼの組合せを用いてトリミングすることによって得られ得る。図１（Ｄ）は、コア−ＧｌｃＮＡｃ部分が任意選択でフコシル化され、全ての枝が末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む分岐オリゴ糖グリカンを含む抗体を示す。図１（Ｄ）の糖タンパク質は、例えば、シアリダーゼ及びガラクトシダーゼの複合作用の際抗体糖型（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ）の正常の混合物のトリミングにより得られる。
【００９２】
図２に、糖タンパク質が抗体である場合の糖タンパク質の改変方法の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼの作用の下で、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）が、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃから抗体グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分へ転移されて改変抗体を形成する。
【００９３】
上に記載したように、糖タンパク質の改変のための本発明の方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップを更に含み得、したがって、本発明はまた、
（１）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップであり、ここで末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記で定義された式（１）又は（２）で表される、ステップ；及び
（２）上記糖タンパク質を、グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、より特定的にはその作用の下で、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させるステップであり、ここでグリコシルトランスフェラーゼはβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来し、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃは上記定義の式（３）で表される、ステップ
を含む、糖タンパク質の改変方法にも関する。
【００９４】
例えば、本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（１）で表されるグリカンを含むとき、方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、適切な酵素、好ましくはエンドグリコシダーゼの作用により、オリゴ糖グリカンを含む糖タンパク質をトリミングするステップを含む方法によって用意され得る。
【００９５】
非常に多くのグリカンにおいて、第２のＧｌｃＮＡｃ−残基は、図１（Ｂ）及び（Ｃ）にも見られるように、糖タンパク質に直接結合しているＧｌｃＮａｃ−残基に結合している。糖タンパク質に直接結合しているＧｌｃＮＡｃ−残基に第２のＧｌｃＮＡｃ−残基が結合しているグリカンは、式（１）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を得るためにトリミングすることができる。トリミングは上記２つのＧｌｃＮＡｃ−残基の間で起こる。
【００９６】
「適切な酵素」は、トリミングされるグリカンがその基質である酵素と定義される。本発明の方法のこの特定の実施形態のステップ（１）で使用される好ましい種類の酵素は、トリミングされる特定の１又は複数のグリカンに依存する。本発明の方法のこの特定の実施形態の好ましい実施形態において、本方法のこの特定の実施形態のステップ（１）の酵素はエンドグリコシダーゼの群から選択される。
【００９７】
エンドグリコシダーゼはグリカン構造の内部のグリコシド結合を開裂することができ、改造及び合成の試みに利することができる。例えば、エンドグリコシダーゼは、保存されたグリカン領域内の予測可能な部位で開裂するとき、不均一なグリカン集団の容易な均質化のために使用することができる。この点において最も重要な種類のエンドグリコシダーゼの１つはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９６、一般にエンド及びＥＮＧａｓｅとして知られている）を含み、これはＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースコア内のβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する（概説として参照により本明細書に組み込まれるＷｏｎｇら  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１、１１１、４２５９）ことによって糖タンパク質からＮ−グリカンを除去して単一コアＮ−結合ＧｌｃＮＡｃ残基を残す加水分解酵素の１種である。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは自然界に広く分布しており、一般的な化学酵素的変異体として、微量のマンノースに特異的なエンドＤ；高マンノースに特異的なエンドＡ及びエンドＨ；高マンノース型から二分岐複合型までの範囲のエンドＦサブタイプ；並びにフコシル化されたグリカンを除く殆どのＮ−グリカン構造（高マンノース型／複合型／混合型）を開裂することができるエンドＭがあり、高マンノース型オリゴ糖に対する加水分解活性は複合型及び混合型オリゴ糖に対するよりも有意に高い。これらのＥＮＧａｓｅは末端のＮ−グリカン構造に対して特異性を示すが、その構造を表示するタンパク質には特異性を示さないので、殆どのＮ−結合したグリカンを生来の条件下で糖タンパク質から開裂するのに有用である。
【００９８】
エンドグリコシダーゼＦ１、Ｆ２、及びＦ３は生来のタンパク質の脱グリコシル化に最も適している。エンドＦ１、Ｆ２、及びＦ３の結合特異性は、タンパク質を変性させることなくあらゆる種類のＮ−結合したオリゴ糖を除去し得るタンパク質の脱グリコシル化の一般的な方策を示唆している。二分岐及び三分岐の構造はそれぞれエンドグリコシダーゼＦ２及びＦ３により直ちに除去することができる。オリゴ−マンノース及び混合構造はエンドＦ１により除去することができる。
【００９９】
エンドＦ３は、その開裂がオリゴ糖のペプチド結合の状態、並びにコアフコシル化の状態に感受性であるという点で独特である。またフコシル化されてない二分岐及び三分岐構造を遅い速度で、しかしペプチド結合されている場合にのみ開裂する。コアフコシル化された二分岐構造はエンドＦ３に対する効率的な基質であり、その活性は４００倍も高い。オリゴマンノース及び混合分子に対しては活性がない。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｒｅｎｔｉｎｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５、５、５９９を参照。
【０１００】
Ｃｏｌｌｉｎら（参照により本明細書に組み込まれるＥＭＢＯ  Ｊ．２００１、２０、３０４６）により開示されているように、エンドＳは化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から分泌されるエンドグリコシダーゼであり、またグリコシドヒドロラーゼファミリー１８に属する。上述のＥＮＧａｓｅと対照的に、エンドＳはより明確な特異性を有し、ヒトＩｇＧのＦｃドメインの保存Ｎ−グリカンのみを特異的に開裂し（他の基質は今まで同定されていない）、酵素とＩｇＧとのタンパク質−タンパク質相互作用がこの特異性をもたらすことを示唆している。
【０１０１】
エンドＳ２としても知られているエンドＳ４９は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３７８２４号（Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ）に記載されている。エンドＳ４９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｙｏｇｅｎｅｓ）ＮＺ１３１から単離され、エンドＳの同族体である。エンドＳ４９は生来のＩｇＧに対して特異的なエンドグリコシダーゼ活性を有しており、エンドＳより大きい様々なＦｃグリカンを開裂する。
【０１０２】
好ましい実施形態において、この実施形態のステップ（１）の酵素はエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。更に好ましい実施形態において、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ及びエンドＡ、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１０３】
トリミングされるグリカンが複合型の二分岐構造であるとき、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼはエンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、又はこれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。
【０１０４】
糖タンパク質が抗体であり、トリミングされるオリゴ糖が複合型の二分岐構造（即ち図１（Ｃ）で表される）であり、Ｎ２９７のＩｇＧ保存されたＮ−グリコシル化部位に存在するとき、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは好ましくはエンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、又はこれらの組合せからなる群、より好ましくはエンドＳ及びエンドＳ４９、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１０５】
糖タンパク質が抗体であり、トリミングされるグリカンが複合型の二分岐構造であり、Ｎ２９７のＩｇＧ保存されたＮ−グリコシル化部位に存在しないとき、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは好ましくはエンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１０６】
トリミングされるグリカンが高マンノースであるとき、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは好ましくはエンドＨ、エンドＭ、エンドＡ及びエンドＦ１からなる群から選択される。
【０１０７】
したがって、本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（１）で表されるグリカンを含むとき、本方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、好ましくは、オリゴ糖グリカンを含む糖タンパク質のグリカンをエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用によりトリミングして、式（１）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を提供するステップを含む方法によって用意される。
【０１０８】
更に好ましい実施形態において、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ  ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ及びエンドＡ、並びにこれらの任意の組合せからなる群から選択される。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＨ、エンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、並びにこれらの任意の組合せからなる群から選択されることがより好ましい。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ又はエンドＳ４９であることが尚より好ましい。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼはエンドＨ及びエンドＳの組合せであることが最も好ましい。
【０１０９】
糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物のエンドグリコシダーゼによる処理によって式（１）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を用意する方法を図４に示す。図４は、糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ（上記糖型は図３に示されている）の混合物を含む糖タンパク質、この場合は抗体のエンドグリコシダーゼによる処理と、続く例えばβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素を用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚからのＮ−アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）の転移により、式（３２）で表される改変抗体が得られることを示す。
【０１１０】
例えば本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（９）で表されるグリカンを含むとき、「ＧｎＭ５」とも称される上記グリカンを含む糖タンパク質は様々な手段で提供され得る。この実施形態において、糖タンパク質は、例えば参照により組み込まれるＫａｎｄａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６、１７、１０４に記載されているように、スワインソニンの存在下での混合Ｎ−糖タンパク質の発現、及び必要であれば続くシアリダーゼ／ガラクトシダーゼ処理によって提供されることが好ましい。代わりの手法には、宿主生物の遺伝子操作がある。例えば、Ｌｅｃ１  ＣＨＯはＭｎｓ−ＩＩの発現のための遺伝子を欠如するノックアウトＣＨＯ細胞株である。結果として、Ｎ−グリカンの生合成はグリカンのＧｎＭ５−段階で停止せざるを得ず、これは上清から純粋な形で単離することができる。より広範な手法により、正常にプログラムされてない酵母又は昆虫細胞のような宿主生物の遺伝子操作を伴い、混合又は複合Ｎ−グリカンを生成する。しかしながら、これらの非哺乳類宿主細胞（例えばグリコスイッチ（Ｇｌｙｃｏｓｗｉｔｃｈ）（商標））も、ＧｎＭ５−型及びＭ５−型のグリカンを含む特定のＮ−糖タンパク質の単一の糖型の選択的な発現のために使用することができることは十分に立証されている。
【０１１１】
したがって、本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（９）で表されるグリカンを含むとき、本方法のステップ（１）において、式（９）の任意選択でフコシル化されたグリカンを含む糖タンパク質は、スワインソニンの存在下での宿主生物内における糖タンパク質の発現を含む方法によって提供されることが好ましい。上記宿主生物は、哺乳類の細胞株、例えばＨＥＫ２９３又はＮＳ０又はＣＨＯ−細胞株であることが好ましい。得られる糖タンパク質は、式（９）のグリカン（ＧｎＭ５とも称される）、ＧａｌＧｎＭ５と称されるグリカン、ＳｉａＧａｌＧｎＭ５と称されるシアル化されたグリカン及び／又はこれらの混合物を含むタンパク質の混合物として得ることができる。非還元シアル酸及び／又はガラクトース部分は、存在する場合、糖タンパク質のシアリダーゼによる処理（シアル酸部分の除去）及び／又はβ−ガラクトシダーゼによる処理（ガラクトース部分の除去）によって除去することができ、それにより式（９）のグリカンを含む糖タンパク質が得られる。シアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼによる処理は（１ｂ）の単一のステップで行うことが好ましい。この実施形態において、本方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、
（１ａ）スワインソニンの存在下における宿主生物での糖タンパク質の発現；及び
（１ｂ）式（９）のグリカンを含む糖タンパク質を得るための、得られた糖タンパク質のシアリダーゼ及び／又はβ−ガラクトシダーゼによる処理
のステップを含む方法によって提供されることが更に好ましい。
【０１１２】
本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（１０）で表されるグリカンを含むとき、本方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、例えば、糖タンパク質の糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物のシアリダーゼ及びガラクトシダーゼによる処理を含む方法によって提供され得る。図３に、二分岐のグリカンを含む抗体の糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆを示す。
【０１１３】
図４は、糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物のシアリダーゼ及びガラクトシダーゼによる処理、続くβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼの作用の下での糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−ＵＤＰ（ここでＡはアジド基である）、例えば、６−アジド−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰからの糖部分の転移により式（３３）で表される改変抗体を提供することにより、式（１０）で表されるグリカンを含む糖タンパク質、この場合は抗体を提供する方法を示す。
【０１１４】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ
本発明の糖タンパク質の改変のための方法において、式（１）又は（２）で表されるグリカンを含む糖タンパク質を、β−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼの作用の下で、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させる。糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（３）：
【化１８】
2018518149.tif 000020
（式中：
Ｎｕｃ、Ｒ１４、ａ、ｆ、ｇ、Ｕ、Ｔ、Ａ、Ｚ及びYは上記定義の通りである）
で表される。
【０１１５】
Ｎｕｃは本明細書中でヌクレオチドと定義される。Ｎｕｃは好ましくはヌクレオシド一リン酸及びヌクレオシド二リン酸からなる群から、より好ましくはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）からなる群から、より好ましくはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択される。Ｎｕｃはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）であることが最も好ましい。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）はＳｕ（Ａ）−ＵＤＰ（３４）：
【化１９】
2018518149.tif 000021
（式中、Ｒ１４、ａ、ｆ、ｇ、Ｕ、Ｔ、Ａ、Ｚ、及びＹは上記定義の通りである）
である。
【０１１６】
１つの実施形態において、Ａはアジド基−Ｎ３である。
【０１１７】
別の実施形態において、Ａはケト基−Ｃ（Ｏ）Ｒ３であり、ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基、好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル基、より好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基である。Ｒ３はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチルであることが更により好ましく、Ｒ３はメチルであることが最も好ましい。
【０１１８】
別の実施形態において、Ａはアルキニル基である。言い換えると、ＡはＣ≡Ｃ結合を含む官能部分、好ましくは（ヘテロ）シクロアルキニル基又は−（ＣＨ２）ｉＣ≡Ｃ−Ｒ４部分である。１つの実施形態において、アルキニル基は（ヘテロ）シクロアルキニル基、好ましくは（ヘテロ）シクロオクチニル基である。好ましい実施形態において、アルキニル基は−（ＣＨ２）ｉＣ≡Ｃ−Ｒ４であり、ここでｉは０〜１０であり、Ｒ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基、好ましくは水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル基、より好ましくは水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基である。Ｒ４は水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチルであることが尚より好ましく、Ｒ４は水素又はメチルであることがより好ましい。ｉは０、１、２、３、４、５又は６であることが好ましく、ｉは０、１、２、３又は４であることがより好ましく、ｉは０、１又は２であることが尚より好ましく、ｉは０又は１であることが更に尚より好ましく、ｉは１であることが最も好ましい。Ｒ４は水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチルであり、ｉは０、１又は２であることがより好ましい。Ｒ４は水素又はメチルであり、ｉは０、１又は２であることが尚より好ましい。この実施形態において、アルキニル基は末端アルキニル基であることが更に好ましく、即ちＲ４は最も好ましくは水素である。特に好ましい実施形態において、アルキニル基は−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ又は−Ｃ≡ＣＨであり、最も好ましくは−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨである。
【０１１９】
別の実施形態において、Ａはチオール基−ＳＨである。
【０１２０】
別の実施形態において、Ａはチオール基の前駆体−ＳＣ（Ｏ）Ｒ８であり、ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である。Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル基又はフェニル基であることが好ましく、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基又はフェニル基であることがより好ましく、Ｒ８はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル又はフェニルであることが尚より好ましい。Ｒ８はメチル又はフェニルであることが尚より好ましく、Ｒ８はメチルであることが最も好ましい。糖タンパク質の改変のための本発明の方法において、Ａがチオール基の前駆体である糖誘導体ヌクレオチドを使用し得る。この方法中に、チオール−前駆体はチオール基に変換される。
【０１２１】
別の実施形態において、Ａは−ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８であり、ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基又はフェニル基である。好ましい実施形態において、Ａは−ＳＣ（Ｏ）ＯＲ８である。別の好ましい実施形態において、Ａは−ＳＣ（Ｓ）ＯＲ８である。Ａが−ＳＣ（Ｏ）ＯＲ８であるときとＡが−ＳＣ（Ｓ）ＯＲ８であるときの両方で、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル基又はフェニル基であることが好ましく、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基又はフェニル基であることがより好ましく、Ｒ８はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル又はフェニルであることが尚より好ましい。Ｒ８はメチル又はフェニルであることが尚より好ましく、Ｒ８はメチルであることが最も好ましい。
【０１２２】
別の実施形態において、ＡはハロゲンＸである。ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から、好ましくはＣｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から、より好ましくはＣｌ及びＢｒからなる群から選択される。ＸはＣｌであることが最も好ましい。
【０１２３】
別の実施形態において、Ａはスルホニルオキシ基−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５であり、ここでＲ５はＣ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７〜Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい。Ｒ５はＣ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７〜Ｃ１２アリールアルキル基であることが好ましい。Ｒ５は−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、Ｃ３直鎖又は分岐アルキル基、Ｃ４直鎖又は分岐アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基及びＣ７アルキルアリール基からなる群から選択されることがより好ましい。Ｒ５はメチル基、エチル基、フェニル基又はｐ−トリル基であると更により好ましい。スルホニルオキシ基がメシレート基−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、ベンゼンスルホネート基（−ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ５））又はトシレート基（−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）であることが最も好ましい。
【０１２４】
別の実施形態において、ＡはＲ１２であり、ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル基及びＣ４〜Ｃ８アルカジエニル基からなる群から選択される。
【０１２５】
本明細書中で、用語「末端アルケニル基」は、炭素−炭素二重結合がアルケニル基の末端に位置するアルケニル基を指す。Ｒ１２が任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基であるとき、末端Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基は、末端が好ましくはＣ＝ＣＨ２部分、より好ましくはＣ（Ｈ）＝ＣＨ２部分で終了する。Ｒ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基であることが好ましく、任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基であることがより好ましい。末端アルケニル基は直鎖アルケニル基、好ましくは非置換の直鎖アルケニル基であることがより好ましい。Ｒ１２は−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２及び−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２からなる群から選択されることが更により好ましい。Ｒ１２は−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２及び−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２からなる群から選択されることが尚更により好ましい。Ｒ１２は−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２又は−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２であることが更に尚より好ましく、Ｒ１２は−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２であることが最も好ましい。
【０１２６】
Ｒ１２が任意選択で置換されていてもよいＣ３〜Ｃ５シクロアルケニル基であるとき、Ｒ１２はシクロプロペニル基を含むことが好ましい。（任意選択で置換されていてもよい）Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル基は：
【化２０】
2018518149.tif 000022
からなる群から選択されることがより好ましい。
【０１２７】
Ｒ１２が任意選択で置換されていてもよいＣ４〜Ｃ８アルカジエニル基であるとき、Ｃ４〜Ｃ８アルカジエニル基は、末端がＣ＝ＣＨ２部分で、より好ましくはＣ＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２部分で終了することが好ましい。Ｃ４〜Ｃ８アルカジエニル基は、好ましくはＣ（Ｈ）＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２及びＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２からなる群から、より好ましくはＣ（Ｈ）＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２及びＣＨ２−Ｃ＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２からなる群から選択される。Ｒ１２が任意選択で置換されていてもよいＣ４〜Ｃ８アルカジエニル基であるとき、Ｒ１２はＣ（Ｈ）＝Ｃ（Ｈ）−Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２であることが最も好ましい。
【０１２８】
別の実施形態において、ＡはＲ１３であり、ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３〜Ｃ２４アレニル基である。本明細書中で、用語「末端アレニル基」は、Ｃ＝Ｃ＝Ｃ部分がアレニル基の末端に位置するアレニル基を指す。末端Ｃ３〜Ｃ２４アルケニル基は末端が−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２部分で終了することが好ましい。Ｒ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３〜Ｃ１２アルケニル基、より好ましくは任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３〜Ｃ６アルケニル基であることが好ましい。末端アレニル基は直鎖アレニル基、好ましくは非置換の直鎖アレニル基であることがより好ましい。Ｒ１３は−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２、−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２からなる群から選択されることが更により好ましい。Ｒ１３は−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２からなる群から選択されることが尚更により好ましい。Ｒ１３は−Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２であることが最も好ましい。ＡがＲ１３であるとき、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）で、ＵとＴが両方とも存在しないことが特に好ましい。即ち、ａが０であり、ｆは０であることが特に好ましい。
【０１２９】
別の実施形態において、ＡはＮ（Ｒ１７）２であり、ここでＲ１７はＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｒ１７との関係において好ましいアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、最も好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル基である。Ｒ１７の少なくとも１つがＨであり、ＡがＮＨＲ１７であることが好ましく、両方のＲ１７がＨであり、ＡがＮＨ２であることが最も好ましい。ＡがＮ（Ｒ１７）２であるとき、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）で、Ｙが存在しない、即ち、ｇが０であることが好ましく、Ｕ及びＴも両方とも存在しないことがより好ましく、即ち、ｇが０であり、ａが０であり、ｆが０であることが特に好ましい
本発明の方法の好ましい実施形態、及び以下により詳細に記載するような（３）の好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）中のＡは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択され、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は上記定義の通りである。Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることがより好ましい。Ａは、Ｎ３であることが最も好ましい。
【０１３０】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）及び例えば、（３４）のようなその好ましい実施形態において、Ｒ１４は：
【化２１】
2018518149.tif 000023
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは、上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０１３１】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）の好ましい実施形態において、Ｒ１４は：
【化２２】
2018518149.tif 000024
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは、上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０１３２】
Ｒ１４は、−ＮＨＡｃであることが最も好ましい。
【０１３３】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは、上記定義の通りである。Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵの好ましい実施形態は、以下により詳細に記載されている。Ａの好ましい実施形態は、上でより詳細に記載されている。
【０１３４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）中のＲ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（３ａ）：
【化２３】
2018518149.tif 000025
（式中：
Ｎｕｃ、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｇ、ｆ及びａは、上記定義の通りである）
で表される。
【０１３５】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ａ）で表されるか又はその好ましい実施形態であるときも、ＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。
【０１３６】
また、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ａ）中でも、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択され、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることがより好ましい。ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１３７】
特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ａ）でＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択され、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることが尚より好ましい。ＮｕｃはＵＤＰであり、ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１３８】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は、−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（３ｂ）：
【化２４】
2018518149.tif 000026
（式中：
Ｎｕｃ、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、Ｗ、ｈ、ｇ、ｆ及びａは、上記定義の通りである）
で表される。
【０１３９】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｂ）において、Ａ、Ｔ、Ｕ、ａ及びｆは独立して選択される。言い換えると、（３ｂ）のＣ２における置換基中のＡ、Ｔ、Ｕ、ａ及びｆは、（３ｂ）のＣ６における置換基中のＡ、Ｔ、Ｕ、ａ及びｆと異なっていてもよい。
【０１４０】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ｂ）で表されるか又はその好ましい実施形態であるときも、ＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。
【０１４１】
また、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｂ）においても、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択されることが好ましく、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。Ａは、−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることがより好ましい。ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１４２】
特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｂ）中で、ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択され、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることが尚より好ましい。ＮｕｃはＵＤＰであり、ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１４３】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は、−ＯＨである。したがって、この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（３ｃ）：
【化２５】
2018518149.tif 000027
（式中：
Ｎｕｃ、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｇ、ｆ及びａは上記定義の通りである）
で表される。
【０１４４】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ｃ）で表されるか又はその好ましい実施形態であるときも、ＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。
【０１４５】
また、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｃ）中でも、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択されることが好ましく、ここで、ｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることがより好ましい。ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１４６】
特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｃ）中で、ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択され、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることが尚より好ましい。ＮｕｃはＵＤＰであり、ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１４７】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。したがって、この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（３ｄ）：
【化２６】
2018518149.tif 000028
（式中：
Ｎｕｃ、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｇ、ｆ及びａは上記定義の通りである）
で表される。
【０１４８】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ｄ）で表されるか又はその好ましい実施形態であるときも、ＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。
【０１４９】
また、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｄ）中でも、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択されることが好ましく、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることがより好ましい。ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１５０】
特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３ｄ）中で、ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｉＣ≡ＣＲ４及びＲ１２からなる群から選択され、ここでｉ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１２及びその好ましい実施形態は、上記定義の通りである。ＮｕｃはＵＤＰであり、Ａは−Ｎ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２及び−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨからなる群から選択されることが尚より好ましい。ＮｕｃはＵＤＰであり、ＡはＮ３であることが最も好ましい。
【０１５１】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）及び例えば、（３４）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）又は（３ｄ）のようなその好ましい実施形態において、ＴはＣ３〜Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよい。好ましい実施形態において、Ｔは存在しない（ａが０である）。別の好ましい実施形態において、Ｔが存在する（ａは１である）。ａが１であるとき、（３）の（ヘテロ）アリーレン基ＴはＡで置換されており、ここでＡは上記定義の通りである。
【０１５２】
（ヘテロ）アリーレン基Ｔは任意選択で１又は複数の置換基Ｒ２により更に置換されており、ここでＲ２はハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、好ましくは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５〜Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８〜Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、アミノ基（好ましくは−Ｎ（Ｒ１０）２）、オキソ基及び−Ｓｉ（Ｒ７）３基からなる群から独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基はＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で中断され、Ｒ７はＣ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、ここでアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択で置換されていてもよく、Ｒ９はＣ１〜Ｃ１２アルキル基であり、Ｒ１０は独立して水素及びＣ１〜Ｃ１２アルキル基から選択される。Ｒ９はＣ１〜Ｃ６アルキル基、更により好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチル基であることが好ましい。Ｒ１０は水素又はＣ１〜Ｃ６アルキル基、より好ましくは水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基であることが好ましく、Ｒ１０が水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチル基であることが最も好ましい。
【０１５３】
Ｒ２が−Ｓｉ（Ｒ７）３基であるとき、Ｒ７は独立してＣ１〜Ｃ１２アルキル基、より好ましくは独立してＣ１〜Ｃ６アルキル基、更により好ましくは独立してＣ１〜Ｃ４アルキル基であることが好ましく、最も好ましくはＲ７は、独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル又はｔ−ブチル基である。
【０１５４】
Ｒ２は存在するとき、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、アミノ基（−Ｎ（Ｒ１０）２）、オキソ基及び−Ｓｉ（Ｒ７）３基からなる群から独立して選択されることが好ましく、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０並びにＲ７、Ｒ９、Ｒ１０の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１５５】
Ｒ２は、存在するとき、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、アミノ基、オキソ基及び−Ｓｉ（Ｒ７）３基からなる群から独立して選択されることがより好ましく、ここでＲ７、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ７、Ｒ９、Ｒ１０の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１５６】
Ｒ２は、存在するとき、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基及びＣ１〜Ｃ４アルコキシ基からなる群から独立して選択されることが更により好ましく、ここでＲ９及びＲ１０、並びにＲ９及びＲ１の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１５７】
Ｒ２は、存在するとき、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、メチル、メトキシ、エチル、エトキシ、ｎ−プロピル、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロピル、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブチル、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブチル、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブチル及びｔ−ブトキシからなる群から独立して選択されることが尚更により好ましい。Ｒ２は、存在するとき、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、メチル及びメトキシからなる群から独立して選択されることが最も好ましい。
【０１５８】
好ましい実施形態において、（３）中の（ヘテロ）アリーレン基は置換されていない。別の好ましい実施形態において、（３）中の（ヘテロ）アリーレン基は１又は複数の置換基Ｒ２を含み、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上に定義されている。
【０１５９】
用語「（ヘテロ）アリーレン基」は本明細書中で、アリーレン基及びヘテロアリーレン基を指す。用語「（ヘテロ）アリーレン基」は本明細書中で、単環状の（ヘテロ）アリーレン基及び二環状の（ヘテロ）アリーレン基を指す。Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）中の（ヘテロ）アリーレン基はあらゆるアリーレン基又はあらゆるヘテロアリーレン基であり得る。
【０１６０】
本発明の方法の好ましい実施形態において、（３）中の（ヘテロ）アリーレン基Ｔは、フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、ピロリレン基、ピロリウミレン基、フラニレン基、チオフェニレン基（即ちチオフラニレン基）、ピラゾリレン基、イミダゾリレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリウミレン基、イソオキサゾリレン基、オキサゾリレン基、オキサゾリウミレン基、イソチアゾリレン基、チアゾリレン基、１，２，３−トリアゾリレン基、１，３，４−トリアゾリレン基、ジアゾリレン基、１−オキサ−２，３−ジアゾリレン基、１−オキサ−２，４−ジアゾリレン基、１−オキサ−２，５−ジアゾリレン基、１−オキサ−３，４−ジアゾリレン基、１−チア−２，３−ジアゾリレン基、１−チア−２，４−ジアゾリレン基、１−チア−２，５−ジアゾリレン基、１−チア−３，４−ジアゾリレン基、テトラゾリレン基、ピリジニレン基、ピリダジニレン基、ピリミジニレン基、ピラジニレン基、ピラジジニレン基、ピリジニウミレン基、ピリミジニウミレン基、ベンゾフラニレン基、ベンゾチオフェニレン基、ベンズイミダゾリレン基、インダゾリレン基、ベンゾトリアゾリレン基、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニレン基、ピロロ［２，３−ｃ］ピリジニレン基、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジニレン基、ピロロ［３，２−ｂ］ピリジニレン基、イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニレン基、イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニレン基、ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリジニレン基、ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジニレン基、ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジニレン基、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニレン基、イソインドリレン基、インダゾリレン基、プリニレン基、インドリニレン基、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニレン基、イミダゾ［１，５−ａ］ピリジニレン基、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジニレン基、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジニレン基、イミダゾ［１，２−ｃ］ピリミジニレン基、キノリニレン基、イソキノリニレン基、シノリニレン基、キナゾリニレン基、キノキサリニレン基、フタラジニレン基、１，６−ナフチリジニレン基、１，７−ナフチリジニレン基、１，８−ナフチリジニレン基、１，５−ナフチリジニレン基、２，６−ナフチリジニレン基、２，７−ナフチリジニレン基、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［４，３−ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［２，３−ｂ］ピラジニレン基、ピリド［３，４−ｂ］ピラジニレン基、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジニレン基、ピラジノ［２，３−ｂ］ピラジニレン基及びピリミド［４，５−ｄ］ピリミジニレン基からなる群から選択され、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１６１】
更に好ましい実施形態において、（ヘテロ）アリーレン基Ｔはフェニレン基、ピリジニレン基、ピリジニウミレン基、ピリミジニレン基、ピリミジニウミレン基、ピラジニレン基、ピラジジニレン基、ピロリレン基、ピロリウミレン基、フラニレン基、チオフェニレン基（即ちチオフラニレン基）、ジアゾリレン基、キノリニレン基、イミダゾリレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリウミレン基、オキサゾリレン基及びオキサゾリウミレン基からなる群から選択され、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１６２】
（ヘテロ）アリーレン基Ｔは、フェニレン基、ピリジニレン基、ピリジニウミレン基、ピリミジニレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリウミレン基、ピロリレン基、フラニレン基及びチオフェニレン基からなる群から選択されることが更により好ましく、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１６３】
（ヘテロ）アリール基Ｔは、フェニレン基、イミダゾリレン基、イミダゾリウミレン基、ピリミジニウミレン基、ピリジニレン基及びピリジニウミレン基からなる群から選択されることが最も好ましく、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１６４】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）及び例えば、（３４）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）又は（３ｄ）のようなその好ましい実施形態において、Ｕは存在しても（ｆが１である）存在しなくてもよい（ｆが０である）。存在するとき、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ、ここでｎは１〜２４の範囲の整数であり；又はＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここでｏは０〜１２の範囲の整数であり、ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｐ、ｏ及びｑの少なくとも１つが０でないことが好ましい。
【０１６５】
好ましい実施形態において、Ｕは存在しない、即ち、ｆが０である。
【０１６６】
別の好ましい実施形態において、Ｕは存在する、即ち、ｆが１である。
【０１６７】
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、ｎは１〜２４の範囲の整数、好ましくは１〜１２の範囲の整数である。ｎは１、２、３、４、５、６、７又は８であることがより好ましく、ｎは１、２、３、４、５又は６であることが尚より好ましく、ｎは１、２、３、又は４であることが更に尚より好ましく、ｎは１、２又は３であることが更に尚より好ましく、ｎは１又は２であることが最も好ましい。
【０１６８】
Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群、好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群、より好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基又はｔ−ブチル基からなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ及びメチルからなる群から独立して選択されることが更により好ましく、Ｒ１がＨ及びＦからなる群から独立して選択されることが最も好ましい。
【０１６９】
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが１又は２であるとき、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃの−［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ−部分の好ましい例には−（ＣＨ２）−、−（ＣＦ２）−、−（ＣＣｌ２）−、−（ＣＢｒ２）−、−（ＣＭｅ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＦ２）−、−（ＣＨ２ＣＣｌ２）−、−（ＣＨ２ＣＢｒ２）−、−（ＣＨ２ＣＩ２）−、−（ＣＨ２ＣＭｅ２）−、−（ＣＦ２ＣＦ２）−、−（ＣＣｌ２ＣＣｌ２）−、−（ＣＢｒ２ＣＢｒ２）−及び−（ＣＭｅ２ＣＭｅ２）−、より好ましくは−（ＣＨ２）−、−（ＣＦ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２）−、−（ＣＨ２ＣＦ２）−及び−（ＣＦ２ＣＦ２）−がある。
【０１７０】
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが３以上であるとき、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃの−［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ−部分の好ましい例には、−（ＣｎＨ２ｎ）−、−（ＣｎＦ２ｎ）−、−（ＣｎＣｌ２ｎ）−、−（ＣｎＢｒ２ｎ）−、−（Ｃ（ｎ−１）Ｈ２（ｎ−１）ＣＦ２）−、−（Ｃ（ｎ−１）Ｈ２（ｎ−１）ＣＣｌ２）−、−（Ｃ（ｎ−１）Ｈ２（ｎ−１）ＣＢｒ２）−及び−（Ｃ（ｎ−１）Ｈ２（ｎ−１）ＣＭｅ２）−、例えば−（Ｃ３Ｈ６）−、−（Ｃ３Ｆ６）−、−（Ｃ３Ｃｌ６）−、−（Ｃ３Ｂｒ６）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＣｌ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＢｒ２）−及び−（Ｃ４Ｈ８）−がある。より好ましい例には、−（ＣｎＨ２ｎ）−、−（ＣｎＦ２ｎ）−、例えば−（Ｃ３Ｈ６）−、−（Ｃ４Ｈ８）−、−（Ｃ３Ｆ６）−及び−（Ｃ４Ｆ８）−がある。
【０１７１】
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏは０〜１２の範囲の整数であり、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。ｏは１〜１０の範囲の整数であることが好ましく、より好ましくはｏは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはｏは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはｏは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはｏは１、２又は３であり、尚更により好ましくは、ｏは１又は２であり、最も好ましくはｏは１である。別の好ましい実施形態において、ｏは０である。ｏは０、１又は２であることが特に好ましい。ｏが０である場合、ｐが０であるとき、ｑは１又は２であり、ｑが０であるとき、ｐは１又は２であることが更に好ましい。
【０１７２】
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏ及び／又はｐ及び／又はｑが１以上であるとき、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２４アルキル基からなる群、好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群、より好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基又はｔ−ブチル基からなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ及びメチルからなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ１がＨであることが最も好ましい。
【０１７３】
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃの−［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑ−部分の好ましい例には−ＣＨ２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−ＣＨ２−及び−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ−（ＣＨ２）２−があり、ここでｏは１、２、３、４、５又は６であり、好ましくはｏは１、２、３又は４であり、より好ましくはｏは１又は２であり、最も好ましくはｏは１である。
【０１７４】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）及び例えば、（３４）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）又は（３ｄ）のようなその好ましい実施形態において、ａ及びｆは両方とも０でないことが好ましい。別の好ましい実施形態において、ａは０であり、ｆは１であるか、又はａは１であり、ｆは０である。これらの実施形態において、ｇは０又は１であってもよい。
【０１７５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ａは０であり、ｆは１でありＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎである。この実施形態において、ａが０であり、ｆは１でありｎが１〜１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはａは０であり、ｆは１でありｎは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはａが０であり、ｆは１でありｎは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはａが０であり、ｆは１でありｎは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはａが０であり、ｆは１でありｎは１又は２であり、最も好ましくはａは０であり、ｆは１でありｎは１である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｎの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
【０１７６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ａは０であり、ｆは１でありＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑである。より好ましくはｐ、ｏ及びｑは全てが０ではなく、即ちｏは１〜１２の範囲の整数であり、及び／又はｐは１若しくは２であり、及び／又はｑは１若しくは２である。この実施形態において、ａは０であり、ｆは１でありｏは１〜１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはａは０であり、ｆは１でありｏは１〜１０の範囲であり、更により好ましくはａは０であり、ｆは１でありｏは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、尚更により好ましくはａは０であり、ｆは１でありｏは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはａは０であり、ｆは１でありｏは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはａは０であり、ｆは１でありｏは１又は２であり、最も好ましくはａは０であり、ｆは１でありｏは１である。また、この実施形態において、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
【０１７７】
更にもう１つ別の好ましい実施形態において、ａは１であり、ｆは１でありＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎである。この実施形態において、ｎが１〜１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはｎが１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはｎが１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはｎが１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはｎが１又は２であり、最も好ましくはｎが１である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｎの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
【０１７８】
更にもう１つ別の好ましい実施形態において、ａは１であり、ｆは１でありＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１〜１２の範囲の整数であり、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。この実施形態において、ｏは１〜１０の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはｏは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはｏは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはｏは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはｏは１又は２であり、最も好ましくはｏは１である。また、この実施形態において、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ−Ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ−［Ｃ（Ｒ１）２］ｑの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
【０１７９】
上記定義の通り、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）中のＺ及び例えば、（３４）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）又は（３ｄ）のようなその好ましい実施形態において、ＺはＣＨ２、ＣＦ２若しくはＣ（Ｏ）であるか；又はｇが０であり、ｆが１であり、かつａが０若しくは１であるという条件で、ＺはＣＨＯＨである。好ましい実施形態において、ＺはＣＨ２、ＣＦ２及びＣ（Ｏ）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、ｇが０であり、ｆが１であり、かつａが０又は１であるという条件で、ＺはＣＨＯＨである。
【０１８０】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）及び例えば、（３４）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）又は（３ｄ）のようなその好ましい実施形態において、Ｙは存在しなくても（ｇは０である）存在してもよい（ｇは１である）。Ｙが存在するとき、ＹはＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１５）及びＮ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択され、ここでＲ１５はＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである。ＹはＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＳ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択されることが好ましく、ここでＲ１５はＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである。これらの実施形態において、Ｒ１５はＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択されることが更に好ましく、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである。Ｒ１５はＨ、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピル及び（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａからなる群から独立して選択されることがより好ましく、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである。Ｒ１５はＨ及びメチルからなる群から選択されることが最も好ましい。
【０１８１】
好ましい実施形態において、ＺはＣＨ２であり、ｇは１である。この実施形態において、ＹはＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）及びＮ（Ｒ１５）Ｃ（Ｏ）Ｏからなる群から選択されることが更に好ましく、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１５）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏからなる群から選択されることがより好ましく、ここでＲ１５及びＲ１５の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１８２】
別の好ましい実施形態において、ＺはＣ（Ｏ）であり、ｇは１である。この実施形態において、ＹはＮ（Ｒ１５）であることが更に好ましく、ここでＲ１５及びＲ１５の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
【０１８３】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（１５）、（１６）、（１７）又は（１８）：
【化２７】
2018518149.tif 000029
【化２８】
2018518149.tif 000030
（式中：
Ｎｕｃ、ａ、ｆ、Ｒ１４、Ｒ１５、Ａ、Ｕ及びＴは、上記定義の通りである）
で表される。
【０１８４】
（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＯＨである。別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであり、ここでＷ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｈ、ｆ及びａは、上記定義の通りである。これらの実施形態において、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０１８５】
（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）中のＵ、Ｔ、ａ及びｆの好ましい実施形態は上記の通りである。上記定義のＡの好ましい実施形態は、（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）についても維持される。
【０１８６】
（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）の特に好ましい実施形態において、ａは０であり、ｆは１であり、Ｕは−ＣＨ２−ＣＦ２−である。この実施形態において、ＡはＮ３であることが更に好ましい。
【０１８７】
（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）の別の好ましい実施形態において、ａは１であり、Ｔは任意選択で置換されていてもよいフェニル基であることが好ましい。上記の通り、フェニル基は任意選択でＲ２により置換されていてもよく、Ｒ２は好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ及びＢｒからなる群から、より好ましくはＨ、Ｆ及びＣｌからなる群から、最も好ましくはＨ及びＦからなる群から選択される。この実施形態において、ｆは０又は１であり、ｆが１であるとき、Ｕは−ＣＨ２−であることが好ましい。これらの実施形態において、ＡはＮ３であることが更に好ましい。Ａは任意選択で置換されていてもよいフェニル基のパラ位に存在することが好ましい。
【０１８８】
本発明の方法の好ましい実施において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）又は（６６）で表され、好ましくは式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）又は（２６）；
【化２９】
2018518149.tif 000031
【化３０】
2018518149.tif 000032
【化３１】
2018518149.tif 000033
【化３２】
2018518149.tif 000034
（式中：
Ｒ１４及びＲ１５は上記定義の通りであり；
Ｒ１６はＨ及びＦからなる群から独立して選択される）
で表される。
【０１８９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（６７）、（６８）又は（６９）：
【化３３】
2018518149.tif 000035
（式中：
Ｒ１４は上記定義の通りである）
で表される。
【０１９０】
更に好ましい実施形態において、Ｒ１５はＨ及びＣ１〜Ｃ１２アルキル基からなる群から、好ましくはＨ及びＣ１〜Ｃ６アルキル基からなる群から、より好ましくはＨ、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル及びｔ−ブチルからなる群から、最も好ましくはＨ及びメチルからなる群から選択される。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１５は（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであり、ここでｆ、ａ、Ｕ、Ｔ及びＡ並びにその好ましい実施形態は上記定義の通りである。Ｒ１５が（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、Ｒ１５の（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａ基は、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃ（３）中のＺ−（Ｙ）ｇ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａ部分に由来する（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａ基に相当することが好ましい。例えば、（２４）中のＲ１５が（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、Ｒ１５はフェニルのパラ位にＮ３を有する−（Ｃ６Ｈ４（Ｎ３））であることが好ましい。これらの実施形態において、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０１９１】
（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）及び（６９）の好ましい実施形態並びに上記のその好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＯＨである。別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであり、ここでＷ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｈ、ｆ及びａは上記定義の通りである。これらの実施形態においても、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０１９２】
好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｒ１４は；
【化３４】
2018518149.tif 000036
（式中：
ａ、ｆ、ｈ、Ｔ、Ａ、Ｕ及びＷ、並びにその好ましい実施形態は、上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０１９３】
本発明の方法の更に好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（２７）、（２８）、（２９）、（３０）又は（３１）、或いは式（３６）：
【化３５】
2018518149.tif 000037
【化３６】
2018518149.tif 000038
【化３７】
2018518149.tif 000039
（式中：
Ｎｕｃは上記定義の通りである）
で表される。
【０１９４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｒ１４はＯＨである。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、式（３５）：
【化３８】
2018518149.tif 000040
（式中：
Ｎｕｃは上記定義の通りである）
で表されることが更に好ましい。
【０１９５】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（２７）、（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３５）又は（３６）で表されるときも、ＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。
【０１９６】
酵素
本発明の方法は、改変された糖タンパク質を提供するために、グリコシルトランスフェラーゼその存在下で、より特定的にはその作用の下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃと接触させるステップを含み、ここでグリコシルトランスフェラーゼは、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか又はそれに由来する。β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本明細書中で、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素、又はβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ、又はＧａｌＮＡｃＴとも称される。
【０１９７】
β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ）は当技術分野で公知である。典型的には、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴは、ウリジン二リン酸−ＧａｌＮＡｃ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、またＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰとも称される）から、糖タンパク質グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分への、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の転移を触媒する酵素であり、ここでＧａｌＮＡｃ部分のＣ１がβ−１，４−Ｏ−グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合する。上でより詳細に記載した通り、ｂが１である式（１）で表されるグリカン中のＧｌｃＮＡｃ部分、即ち、フコシル化されたＧｌｃＮＡｃからなるグリカン中のＧｌｃＮＡｃ部分は、本明細書中で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分とも考えられる。
【０１９８】
本発明の方法において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃから糖タンパク質グリカンの末端ＧａｌＮＡｃ部分への糖誘導体Ｓｕ（Ａ）の転移を触媒して、改変された糖タンパク質を提供し、ここで上で記載したように、Ｓｕ（Ａ）は式（６）で表され、Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃは式（３）で表され、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）で表され、改変された糖タンパク質は式（４）又は（５）で表される。この方法において、Ｓｕ（Ａ）部分のＣ１はβ−１，４−Ｏ−グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合する。
【０１９９】
本発明の方法で使用するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は無脊椎動物のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来し、即ち無脊椎動物種に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来することが好ましい。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は当業者に公知の無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であることができるか、又はそれに由来することができる。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、好ましくはクロマドラ綱（Ｃｈｒｏｍａｄｏｒｅａ）若しくは双腺綱（Ｓｅｃｅｒｎｅｎｔｅａ）、又は節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）、好ましくは昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来することが好ましい。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、カエノラブディティス・エレガンス、カエノラブディティス・レマネイ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｒｅｍａｎｅｉ）、カエノラブディティス・ブリグサエ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｂｒｉｇｇｓａｅ）、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）、イラクサギンウワバ、キイロショウジョウバエ、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、ロア糸状虫（Ｌｏａ  ｌｏａ）、クビレハリアリ（Ｃｅｒａｐａｃｈｙｓ  ｂｉｒｏｉ）、ネバダオオシロアリ（Ｚｏｏｔｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｎｅｖａｄｅｎｓｉｓ）、フロリダオオアリ（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ）、マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）又はオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）、好ましくはカエノラブディティス・エレガンス、豚回虫、イラクサギンウワバ又はキイロショウジョウバエに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来することが好ましい。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、カエノラブディティス・エレガンス、豚回虫又はイラクサギンウワバに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来することがより好ましい。更に好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、豚回虫に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来する。別の更に好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、イラクサギンウワバに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来する。別の更に好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はカエノラブディティス・エレガンスに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来する。
【０２００】
本明細書中で、カエノラブディティス・エレガンスはＣｅと、豚回虫はＡｓと、イラクサギンウワバはＴｎと、キイロショウジョウバエはＤｍとも称される。
【０２０１】
本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、配列番号２〜５及び１５〜２３からなる群から選択される配列、より好ましくは配列番号２〜５からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。言い換えると、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される配列、更により好ましくは配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列、更により好ましくは配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列、最も好ましくは配列番号４に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【０２０２】
β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中でＣｅＧａｌＮＡｃＴと命名されたカエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２）、本明細書中でＡｓＧａｌＮＡｃＴと命名された豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号３）、本明細書中でＴｎＧａｌＮＡｃＴと命名されたイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号４）、本明細書中でＤｍＧａｌＮＡｃＴと命名されたキイロショウジョウバエβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号５）、カエノラブディティス・レマネイβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１５）、カエノラブディティス・ブリグサエβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１６）、バンクロフト糸状虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１７）、ロア糸状虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１８）、クビレハリアリβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１９）、ネバダオオシロアリβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２０）、フロリダオオアリβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２１）、マガキβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２２）及びオオカバマダラβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２３）からなる群から選択される天然又は野生型のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来することが好ましい。
【０２０３】
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中でＣｅＧａｌＮＡｃＴと命名されたカエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２）、本明細書中でＡｓＧａｌＮＡｃＴと命名された豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号３）、本明細書中でＴｎＧａｌＮＡｃＴと命名されたイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号４）及び本明細書中でＤｍＧａｌＮＡｃＴと命名されたキイロショウジョウバエβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号５）からなる群から選択される天然若しくは野生型のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来する。
【０２０４】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中でＣｅＧａｌＮＡｃＴと命名されたカエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２）、本明細書中でＡｓＧａｌＮＡｃＴと命名された豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号３）及び本明細書中でＴｎＧａｌＮＡｃＴと命名されたイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号４）からなる群から選択される天然若しくは野生型のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来する。
【０２０５】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中でＡｓＧａｌＮＡｃＴと命名された豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号３）及び本明細書中でＴｎＧａｌＮＡｃＴと命名されたイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号４）からなる群から選択される天然若しくは野生型のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来する。
【０２０６】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中でＴｎＧａｌＮＡｃＴと命名されたイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号４）であるか又はそれに由来する。
【０２０７】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、線形動物門、好ましくはクロマドラ綱、好ましくはカンセンチュウ目（Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ）、好ましくはラブジチス科（Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａｅ）、好ましくはカエノラブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）の無脊椎動物種に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、配列番号２、１５及び１６からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。上記無脊椎動物種はカエノラブディティス・エレガンスのものであることがより好ましい。本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【０２０８】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、線虫門、好ましくは双腺綱（Ｓｅｃｅｍｅｎｔｅａ）、好ましくは回虫目（Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ）、好ましくは回虫科（Ａｓｃａｒｉｄｉｄａｅ）、好ましくは回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）の無脊椎動物種に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。上記無脊椎動物種は豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  Ｓｕｍ）のものであることがより好ましい。本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号３からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【０２０９】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、節足動物門（Ａｎｔｈｒｏｐｏｄａ）、好ましくは昆虫綱、好ましくはチョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、好ましくはヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、好ましくはトリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の無脊椎動物種に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。上記無脊椎動物種はイラクサギンウワバのものであることがより好ましい。イラクサギンウワバはときにフィトメトラ・ブラシカエ（Ｐｈｙｔｏｍｅｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、プルシア・インナタ（Ｐｌｕｓｉａ  ｉｎｎａｔａ）又はキャベツシャクトリムシと称されることもある。本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号４からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【０２１０】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、節足動物門、好ましくは昆虫綱、好ましくはハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、好ましくはショウジョウバエ科（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、好ましくはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の無脊椎動物種に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。上記無脊椎動物種はキイロショウジョウバエのものであることがより好ましい。本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号５からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【０２１１】
β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に「由来する」とは、本明細書中で、１又は複数の、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は付加により、それぞれ、天然のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素から変更されたアミノ酸配列を有するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解されたい。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中で、誘導されたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素又は改変されたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体酵素又はβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体とも称される。
【０２１２】
誘導された酵素は本分野で公知であり、膜貫通ドメインの除去、本明細書中で言及される溶解度及び／又は精製タグのようなタグの封入のような、アミノ酸配列の従来の及び標準的な改変を受けた酵素を含む。改変されたアミノ酸配列を有する酵素に至るそのような手順は、本分野で周知であり、本発明の方法により網羅される（ｃｏｖｅｅｄ  ｂｙ）。
【０２１３】
一実施形態において、誘導された酵素、即ち、本明細書中で言及される天然のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に対して１００％未満の配列同一性を有する酵素は、天然のβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素の酵素活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は好ましくは少なくとも８０％若しくは９０％又は少なくとも１００％の酵素活性を有することが好ましい。本明細書中で、活性は、糖タンパク質の末端ＧｌｃＮＡｃ残基へ（改変された）ＧａｌＮＡｃ残基を組み込むことにおける効果として好都合に測定される。
【０２１４】
酵素は、ガラクトシルトランスフェラーゼではない。一実施形態において、酵素はＥ．Ｃ．２．４．１．３８として又はＥ．Ｃ．２．４．１．１３３として分類されず、好ましくはＥ．Ｃ．２．４．１．２２として、Ｅ．Ｃ．２．４．１．３８として、Ｅ．Ｃ．２．４．１．９０として又はＥ．Ｃ．２．４．１．１３３として分類されない。
【０２１５】
一実施形態において、酵素は、Ｅ．Ｃ．２．４．１．４１として、Ｅ．Ｃ．２．４．１．９２として、Ｅ．Ｃ．２．４．１．１７４として又はＥ．Ｃ．２．４．１．２４４として、好ましくはＥ．Ｃ．２．４．１．９２として又はＥ．Ｃ．２．４．１．２４４として分類される。
【０２１６】
上記誘導されたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、安定性、溶解性、活性及び／又は精製の容易さを増大するように、追加のＮ−若しくはＣ−末端アミノ酸又は化学的部分を付加するか又はＮ−若しくはＣ−末端アミノ酸を欠失することにより改変されることが好ましい。
【０２１７】
β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＮ−末端細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを欠失することによって改変されることが好ましく、これは本明細書中でトランケート型酵素と命名される。これらのドメインの欠失は水溶液への増大した溶解性を示す酵素となることは当技術分野で公知である。
【０２１８】
例えば、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）は本明細書中で、配列番号２の位置３０〜３８３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解されたい。同様に、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）は本明細書中で、配列番号３の位置３０〜３８３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解され、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）は本明細書中で、配列番号４の位置３３〜４２１のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解され、ＤｍＧａｌＮＡｃＴ（４７−４０３）は本明細書中で、配列番号５の位置４７〜４０３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型キイロショウジョウバエβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解されたい。
【０２１９】
本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列のいずれか、より好ましくは配列番号６、配列番号７又は配列番号８の配列のいずれか、尚より好ましくは配列番号７又は配列番号８の配列のいずれか、尚より好ましくは配列番号８の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは少なくとも１００％の配列同一性を有することが好ましい。
【０２２０】
１又は複数のアミノ酸が置換、付加又は欠失されているβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中で誘導されたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素とも称される。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、Ｎ−末端細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを欠失させることによって、及び１又は複数のアミノ酸を置換することによって改変されることが好ましい。１又は複数のアミノ酸の置換は本明細書中で突然変異とも称される。１又は複数の置換されたアミノ酸を含む酵素はまた突然変異体酵素とも称される。
【０２２１】
本発明の方法において、グリコシルトランスフェラーゼがカエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はトランケート型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するとき、酵素は１又は複数の突然変異を更に含むことが好ましい。好ましい突然変異は、位置２５７のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉとも称される）の、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌとも称される）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）又はアラニン（Ａｌａ、またＡとも称される）による置換を含む。好ましい突然変異はまた、位置３１２のメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）のヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈとも称される）による置換も含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＣｅＧａｌＮＡｃＴ又はＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）に由来するとき、酵素はＩ２５７Ｌ、Ｉ２５７Ｍ又はＩ２５７Ａの突然変異、及び／又はＭ３１２Ｈの突然変異を含むことが好ましい。
【０２２２】
アミノ酸位置の番号付けは本明細書中で野生型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素のアミノ酸位置の番号付けに基づくことに留意すべきである。β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素が例えばトランケート型酵素であるとき、本明細書中で例えばアミノ酸置換の位置を示すために使用される番号は対応する野生型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素のアミノ酸位置の番号付けに対応する。
【０２２３】
一例を挙げると、野生型ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２）ではイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）がアミノ酸位置２５７に存在する。ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ｌ）では、位置２５７のイソロイシンアミノ酸がロイシンアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｌ）で置換されている。上に記載したように、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）は本明細書中で配列番号２の位置３０〜３８３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型ＣｅＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解され、一方ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）自体は配列番号６により表される。ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｌ）で、Ｉ２５７Ｌの番号「２５７」は、対応する野生型ＣｅＧａｌＮＡｃＴの位置２５７（即ち配列番号２の番号２５７のＩアミノ酸がＬアミノ酸で置換されていることを示す。配列番号２の位置２５７のイソロイシンアミノ酸は配列番号６の位置２２８のイソロイシンアミノ酸により表される。
【０２２４】
好ましいトランケート型カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体酵素には、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｌ）（配列番号１０）、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｍ）（配列番号１１）、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ａ）（配列番号１２）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｍ３１２Ｈ）（配列番号１３）がある。
【０２２５】
本発明の方法において、グリコシルトランスフェラーゼがイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はトランケート型イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するとき、酵素は１又は複数の突然変異を更に含むことが好ましい。好ましい突然変異は、位置３３６のトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗとも称される）のフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆとも称される）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈとも称される）又はバリン（Ｖａｌ、Ｖとも称される）による置換を含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来するとき、酵素はＷ３３６Ｆ、Ｗ３３６Ｈ又はＷ３３６Ｖの突然変異を含むことが好ましい。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）の好ましい突然変異はまた、位置３３９のグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅとも称される）のアラニン（Ａｌａ、Ａとも称される）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇとも称される）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄとも称される）又はセリン（Ｓｅｒ、Ｓとも称される）による置換も含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来するとき、酵素はＥ３３９Ａ、Ｅ３３９Ｇ、Ｅ３３９Ｄ又はＥ３３９Ｓの突然変異を含むことが好ましい。グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来するとき、位置３３６及び３３９の両方が上記の通りに突然変異することがより好ましい。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来するとき、酵素はＷ３３６Ｆ、Ｗ３３６Ｈ又はＷ３３６Ｖの突然変異及びＥ３３９Ａ、Ｅ３３９Ｇ、Ｅ３３９Ｄ又はＥ３３９Ｓの突然変異を含むことが好ましい。
【０２２６】
ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）の好ましい突然変異は位置３１１のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉとも称される）のチロシン（Ｔｙｒ、Ｙとも称される）による置換も含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来するとき、酵素はＩ３１１Ｙの突然変異を含むことが好ましい。
【０２２７】
グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来し、Ｉ３１１Ｙの突然変異を含むとき、酵素は上に記載したような位置３３６の突然変異及び／又は上に記載したような位置３３９の突然変異を更に含み得る。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）に由来し、Ｉ３１１Ｙの突然変異を含むとき、酵素はＷ３３６Ｆ、Ｗ３３６Ｈ又はＷ３３６Ｖの突然変異及び／又はＥ３３９Ａ、Ｅ３３９Ｇ、Ｅ３３９Ｄ又はＥ３３９Ｓの突然変異を更に含み得る。
【０２２８】
本発明の方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号２５）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ）（配列番号２６）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号２７）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）（配列番号２８）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｇ）（配列番号２９）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｄ）（配列番号３０）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｓ）（配列番号３１）からなる群から選択されるイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。
【０２２９】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ａ）（配列番号３２）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号３３）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号３４）からなる群から選択されるイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。
【０２３０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ）（配列番号３５）である。
【０２３１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｆ）（配列番号３６）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ）（配列番号３７）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｖ）（配列番号３８）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｅ３３９Ａ）（配列番号３９）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｅ３３９Ｇ）（配列番号４０）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号４１）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号４２）からなる群から選択されるイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。
【０２３２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ａ）（配列番号４３）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号４４）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号４５）からなる群から選択されるイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。
【０２３３】
本発明の方法において、グリコシルトランスフェラーゼが豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はトランケート型豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するとき、酵素は１又は複数の突然変異を更に含むことが好ましい。好ましい突然変異は、位置２８２のトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗとも称される）のヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈとも称される）による置換、及び／又は位置２８５のグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅとも称される）のアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄとも称される）による置換、及び／又は位置２５７のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉとも称される）のチロシン（Ｔｙｒ、Ｙとも称される）による置換を含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＡｓＧａｌＮＡｃＴ又はＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）に由来するとき、酵素はＷ２８２Ｈの突然変異、Ｅ２８５Ｄの突然変異及び／又はＩ２５７Ｙの突然変異を含むことが好ましい。
【０２３４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｗ２８２Ｈ）（配列番号４６）及びＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｅ２８５Ｄ）（配列番号４７）からなる群から選択される豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴである。
【０２３５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｙ）（配列番号４８）である。
【０２３６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｙ、Ｗ２８２Ｈ）及びＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｙ、Ｅ２８５Ｄ）からなる群から選択される豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴである。
【０２３７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、本明細書に規定されるβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは，精製を容易にするためのタグをコードする配列を含む。上記タグは、限定されることはないが、ＦＬＡＧ−タグ、ポリ（Ｈｉｓ）−タグ、ＨＡ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＵＭＯ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ又はＣＢＰ−タグからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくは上記タグが６ｘＨｉｓタグである。酵素に組み込まれる他の好ましいタグは、ＡＦＶ−タグ、ＳｌｙＤ−タグ、Ｔｓｆ−タグ、ＳＵＭＯ−タグ、Ｂｌａ−タグ、ＭＢＰ−タグ及びＧＳＴ−タグのような溶解度タグである。更に好ましい実施形態において、上記タグ（単数）又はタグ（複数）は、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素のＣ−末端で酵素に共有結合する。別の更に好ましい実施形態において、上記タグはβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素のＮ−末端で酵素に共有結合する。
【０２３８】
β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素がＣ．エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）−Ｈｉｓ（配列番号１４）であることが好ましい。
【０２３９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素がイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）（配列番号４９）であるか、又はそれに由来する。
【０２４０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素がイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号５０）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ）（配列番号５１）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号５２）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；３３９Ａ）（配列番号５３）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｇ）（配列番号５４）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｄ）（配列番号５５）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｓ）（配列番号５６）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ａ）（配列番号５７）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号５８）若しくはＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号５９）であるか、又はそれに由来する。
【０２４１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素がイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ）配列番号６０であるか、又はそれに由来する。
【０２４２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素がイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｆ）（配列番号６１）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ）（配列番号６２）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｖ）（配列番号６３）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１ＹＥ３３９Ａ）（配列番号６４）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ，Ｅ３３９Ｇ）（配列番号６５）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号６６）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号６７）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ａ）（配列番号６８）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号６９）若しくはＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ、Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号７０）であるか、又はそれに由来する。
【０２４３】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素が豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ−ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）（配列番号７１）であるか、又はそれに由来する。
【０２４４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素が豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ−タグ付けしたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ−ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｗ２８２Ｈ）（配列番号７２）、Ｈｉｓ−ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｅ２８５Ｄ）（配列番号７３）若しくはＨｉｓ−ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３；Ｉ２５７Ｙ）（配列番号７４）であるか、又はそれに由来する。
【０２４５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２〜２３及び配列番号２５〜７４からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２４６】
本発明の方法の好ましい実施形態において、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２〜２３からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。言い換えると、好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２４７】
本明細書中で、用語「由来する」は例えばトランケート型酵素、突然変異体酵素及び精製を容易にするためのタグを含む酵素を含み、これらの改変体は上でより詳細に記載されている。用語「由来する」はまた上でより詳細に記載された修飾の組合せを含む酵素を含む。
【０２４８】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２〜２３からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２４９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２〜９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。言い換えると、好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２５０】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２５１】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２５〜４５及び配列番号５０〜７０からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。言い換えると、好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２５２】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２５〜４５及び配列番号５０〜７０からなる群から、即ち、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２５３】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号４６〜４９及び配列番号７１〜７４からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。言い換えると、好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２５４】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号４６〜４９及び配列番号７１〜７４からなる群から、即ち、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２５５】
本発明の方法において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは式（３）又は上でより詳細に記載されたその好ましい実施形態で表される。Ｒ１４は：
【化３９】
2018518149.tif 000041
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵ、並びにその好ましい実施形態は上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０２５６】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３であるときの好ましいグリコシルトランスフェラーゼ
本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは上記定義の式（３ａ）で表される。
【０２５７】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ａ）又は上で記載された（３ａ）の好ましい実施形態で表されるとき、本方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、野生型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ、好ましくは無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。本方法の別の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。更に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）若しくはイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）若しくは（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴは、上でより詳細に記載されている。
【０２５８】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２〜９からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することが特に好ましい。Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、尚より好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することがより好ましい。本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号８であるか又はそれに由来することが最も好ましい。
【０２５９】
別の特に好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２〜９からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、尚より好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することがより好ましい。本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが最も好ましい。
【０２６０】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０２６１】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、ＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２若しくは配列番号６であるか、又はそれに由来する。
【０２６２】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４であるか、又はそれに由来する。
【０２６３】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２又は配列番号６に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２６４】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２６５】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０２６６】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の更に好ましい実施形態において、ＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４若しくは配列番号８であるか、又はそれに由来する。
【０２６７】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４又は配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２６８】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２６９】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２７０】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０２７１】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法のこの実施形態において、ＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３若しくは配列番号７であるか、又はそれに由来することが更に好ましい。
【０２７２】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３又は配列番号７に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２７３】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３であるか、又はそれに由来する。
【０２７４】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２７５】
本明細書に記載された、Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、本発明の方法及び上で記載されたグリコシルトランスフェラーゼの好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、上記定義の式（１５）、（１６）、（１７）又は（１８）で表されるか；又はＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、上記定義の式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）若しくは（６９）で表されるか；又は上記定義の式（２７）で表されることが更に好ましい。これらの特に好ましい実施形態において、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０２７６】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるときの好ましいグリコシルトランスフェラーゼ
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｒ１４−はＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは上記定義の式（３ｂ）で表される。
【０２７７】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ｂ）又は上で記載された（３ｂ）の好ましい実施形態で表されるとき、本方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、野生型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ、好ましくは無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。本方法の別の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。更に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）若しくはイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）若しくは（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴは、上でより詳細に記載されている。
【０２７８】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２〜９からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することが特に好ましい。Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、尚より好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することがより好ましい。本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号８であるか、又はそれに由来することが最も好ましい。
【０２７９】
別の特に好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２〜９からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、尚より好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することがより好ましい。本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが最も好ましい。
【０２８０】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０２８１】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の特に好ましい実施形態において、ＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２若しくは配列番号６であるか、又はそれに由来する。
【０２８２】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４であるか、又はそれに由来する。
【０２８３】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２又は配列番号６に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２８４】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２８５】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０２８６】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の更に好ましい実施形態において、ＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４若しくは配列番号８であるか、又はそれに由来する。
【０２８７】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４又は配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２８８】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２８９】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２９０】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０２９１】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、方法のこの実施形態において、ＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３若しくは配列番号７であるか、又はそれに由来することが更に好ましい。
【０２９２】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３又は配列番号７に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２９３】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０２９４】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０２９５】
Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、本明細書に記載された本発明の方法及び上で記載されたグリコシルトランスフェラーゼの好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、Ｒ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、上記定義の式（１５）、（１６）、（１７）若しくは（１８）で表されるか；又はＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、上記定義の式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）若しくは（６９）で表されるか；又は上記定義の式（２８）、（２９）、（３０）若しくは（３１）で表されることが更に好ましい。これらの特に好ましい実施形態において、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０２９６】
Ｒ１４が−ＯＨであるときの好ましいグリコシルトランスフェラーゼ
本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｒ１４−は−ＯＨである。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは上記定義の式（３ｃ）で表される。
【０２９７】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ｃ）又は上で記載された（３ｃ）の好ましい実施形態で表されるとき、本方法の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、野生型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ、好ましくは無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴに由来する。本方法の別の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴに由来する。更に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）又はイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）に由来する。（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）又は（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）に由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴは、上でより詳細に記載されている。
【０２９８】
本発明の方法の別の特に好ましい実施形態、ここでＲ１４は−ＯＨである、において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）に由来する。
【０２９９】
Ｒ１４が−ＯＨである、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）に由来する。
【０３００】
Ｒ１４が−ＯＨである、本方法の更に好ましい実施形態において、ＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３５若しくは配列番号６０であるか、又はそれに由来する。
【０３０１】
Ｒ１４が−ＯＨである、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３５又は配列番号６０に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３０２】
Ｒ１４が−ＯＨである、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０３０３】
Ｒ１４が−ＯＨである、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３０４】
Ｒ１４が−ＯＨである、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）に由来する。
【０３０５】
Ｒ１４が−ＯＨである、本方法のこの実施形態において、ＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４８若しくは配列番号７４であるか、又はそれに由来することが更に好ましい。
【０３０６】
Ｒ１４が−ＯＨである、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４８又は配列番号７４に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３０７】
Ｒ１４が−ＯＨである、本明細書に記載された本発明の方法及び上で記載されたグリコシルトランスフェラーゼの好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、Ｒ１４は−ＯＨである、上記定義の式（１５）、（１６）、（１７）若しくは（１８）で表されるか；又はＲ１４は−ＯＨである、上記定義の式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）若しくは（６９）で表されるか；又は上記定義の式（３５）で表されることが更に好ましい。これらの特に好ましい実施形態において、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０３０８】
Ｒ１４が−Ｎ３であるときの好ましいグリコシルトランスフェラーゼ
本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは上記定義の式（３ｄ）で表される。
【０３０９】
Ｓｕ（Ａ）−Ｎｕｃが式（３ｄ）又は上で記載された（３ｄ）の好ましい実施形態で表されるとき、本方法の好ましい実施形態において、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、野生型β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ、好ましくは無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。本方法の別の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、無脊椎動物β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来する。更に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）若しくはイラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）若しくは（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来するβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴは、上でより詳細に記載されている。
【０３１０】
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＲ１４が−Ｎ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２〜９からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することが特に好ましい。Ｒ１４が−Ｎ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、尚より好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することがより好ましい。本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号８であるか、又はそれに由来することが最も好ましい。
【０３１１】
別の特に好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃ中のＲ１４が−Ｎ３である場合、本方法で使用されるβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２〜９からなる群から、即ち、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。Ｒ１４が−Ｎ３であるとき、本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から、尚より好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することがより好ましい。本方法で使用されるβ−（１，４）−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが最も好ましい。
【０３１２】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼはカエノラブディティス・エレガンスβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０３１３】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、ＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２若しくは配列番号６であるか、又はそれに由来する。
【０３１４】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３若しくは配列番号１４であるか、又はそれに由来する。
【０３１５】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２又は配列番号６に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３１６】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４の配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３１７】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、イラクサギンウワバβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０３１８】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の更に好ましい実施形態において、ＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４若しくは配列番号８であるか、又はそれに由来する。
【０３１９】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４又は配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３２０】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０３２１】
Ｒ１４が−Ｎ３である、別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３２２】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、豚回虫β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。
【０３２３】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法のこの実施形態において、ＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３若しくは配列番号７であるか、又はそれに由来することが更に好ましい。
【０３２４】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号３又は配列番号７に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３２５】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
【０３２６】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０３２７】
Ｒ１４が−Ｎ３である、本明細書に記載された本発明の方法及び上で記載されたグリコシルトランスフェラーゼの好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃは、Ｒ１４が−Ｎ３である、上記定義の式（１５）、（１６）、（１７）若しくは（１８）で表されるか；又はＲ１４が−Ｎ３である、上記定義の式（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）若しくは（６９）で表されるか；又は上記定義の式（３６）で表されることが更に好ましい。これらの特に好ましい実施形態において、ＮｕｃはＵＤＰであることが更に好ましい。
【０３２８】
酵素
一態様において、本発明は、本明細書中で規定された酵素、即ち、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼ、特に、β−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴに由来するグリコシルトランスフェラーゼ、即ち、誘導されたβ−（１，４）−ＧａｌＮＡｃＴ酵素に関する。一実施形態において、酵素は、無脊椎動物種に由来する。一実施形態において、この態様の酵素は、単離された形態である。酵素及びその好ましい実施形態は、本発明の方法の関係において上で更に規定され、これは本態様の酵素自体に等しくあてはまる。
【０３２９】
一実施形態において、本発明のこの態様の酵素は、β−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに由来し、好ましくは配列番号２〜２３及び配列番号２５〜７４からなる群から、より好ましくは配列番号１０〜１４及び配列番号２５〜７４からなる群から、最も好ましくは配列番号１０〜１３、配列番号２５〜４８、配列番号５０〜７０及び配列番号７２〜７４からなる群から選択される配列を有するβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに由来する。この実施形態の酵素は、典型的には単離された形態である。
【０３３０】
一実施形態において、本発明のこの態様の酵素は、配列番号２〜２３及び配列番号２５〜７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有するβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに関する。この実施形態の酵素は、典型的には単離された形態である。本発明は、配列番号１０〜１４及び配列番号２５〜７４からなる群から、最も好ましくは配列番号１０〜１３、配列番号２５〜４８、配列番号５０〜７０及び配列番号７２〜７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有するβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに関することが好ましい。
【０３３１】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様の酵素は、配列番号６〜１４からなる群から、即ち、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群から、好ましくは、配列番号１０〜１３からなる群から、即ち、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有するβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに関する。
【０３３２】
別の好ましい実施形態において、本発明のこの態様の酵素は、配列番号２５〜４５及び配列番号５０〜７０からなる群から選択される配列、即ち、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有するβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに関する。
【０３３３】
別の好ましい実施形態において、本発明のこの態様の酵素は、配列番号４６〜４８及び配列番号７２〜７４からなる群から、即ち、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号７２、配列番号７３及び配列番号７４からなる群から選択される配列に対して少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有するβ−（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに関する。
【０３３４】
本発明は、本明細書中、上で規定された糖タンパク質の改変方法における、好ましくは本発明の方法における本発明の酵素の使用にも関する。本方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、酵素の存在下で、糖誘導体ヌクレオチドと接触させるステップを含む。好ましい実施形態において、糖タンパク質は本明細書中で規定された通りであり、最も好ましくは本明細書中で更に規定された式（１）又は（２）で表されるグリカンを含む糖タンパク質である。好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドは、本明細書中で更に規定された式（３）で表される糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）−Ｎｕｃである。
【０３３５】
改変された糖タンパク質
更に本発明は、糖タンパク質の改変のための本発明の方法により得ることのできる改変された糖タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、式（４）又は（５）：
【化４０】
2018518149.tif 000042
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖又は２〜２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖であり；
Ｓｕ（Ａ）は式（６）：
【化４１】
2018518149.tif 000043
（式中：
Ｒ１４、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｇ、ｆ及びａは（３）についての上記定義の通りである）
で表される）
で表されるグリカンを含む糖タンパク質に関する。
【０３３６】
（６）中のＲ１４、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、Ａ、ｇ、ｆ及びａの好ましい実施形態は、（３）並びに例えば、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）及び（３ｄ）のような（３）の好ましい実施形態について上でより詳細に記載された通りである。
【０３３７】
本発明の改変された糖タンパク質において、Ｓｕ（Ａ）部分のＣ１は、β−１，４−Ｏ−グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合されている。
【０３３８】
本発明の改変された糖タンパク質は、１より多い式（４）又は（５）で表されるグリカンを含み得る。この場合、２以上のグリカンは互いに異なっていてもよい。糖タンパク質は、追加の１又は複数の、Ｓｕ（Ａ）部分を含まないグリカンも含み得る。
【０３３９】
好ましい実施形態において、改変された糖タンパク質は、式（４）で表されるグリカンを含み、ここで、ｂは０である。別の好ましい実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４）で表されるグリカンを含み、ここで、ｂは１である。
【０３４０】
別の好ましい実施形態において、改変された糖タンパク質は、式（５）で表されるグリカンを含み、ここで、ｂは０である。別の好ましい実施形態において、改変された糖タンパク質は、式（５）で表されるグリカンを含み、ここで、ｂは１である。式（５）で表されるグリカンにおいて、Ｇは単糖又は１〜２０、好ましくは１〜１２、より好ましくは１〜１０、尚より好ましくは１、２、３、４、５、６、７又は８、最も好ましくは１、２、３、４、５又は６の糖部分を含む直鎖又は分岐オリゴ糖である。グリカン（５）において、ｄが０であるとき、ｅは１であり、ｅが０であるとき、ｄは１であることが好ましい。グリカン（５）において、ｄは１であり、尚より好ましくはｄは１であり、ｅは１であることがより好ましい。グリカン中に存在し得る糖部分は、当業者に公知であり、例えば、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン、（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）又はシアル酸及びキシロース（Ｘｙｌ）を含む。グリカンが式（５）で表されるとき、グリカンは式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）：
【化４２】
2018518149.tif 000044
【化４３】
2018518149.tif 000045
【化４４】
2018518149.tif 000046
【化４５】
2018518149.tif 000047
【化４６】
2018518149.tif 000048
【化４７】
2018518149.tif 000049
（式中：
ｂは０又は１であり；
Ｓｕ（Ａ）は上記定義の式（６）で表される）
で表されることが更に好ましい。
【０３４１】
好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質は式（４）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるグリカン、より好ましくは式（４）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質は、式（４）、（３７）、（３８）又は（３９）で表されるグリカン、より好ましくは式（４）、（３７）、（３８）又は（３９）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。本発明の改変された糖タンパク質は、式（４）又は（３８）で表されるグリカン、より好ましくは式（４）又は（３８）で表されるＮ−結合したグリカンを含むことが最も好ましい。
【０３４２】
本発明の改変された糖タンパク質は、式（４３）、（４４）又は（４５）：
【化４８】
2018518149.tif 000050
【化４９】
2018518149.tif 000051
（式中：
ｂ、ｄ、ｅ及びＧ、並びにその好ましい実施形態は上記定義の通りであり；
Ｓｕ（Ａ）は上記定義の式（６）で表され；
ｙは独立して１〜２４の範囲の整数であり；
Ｐｒはタンパク質である）
で表されることが好ましい。
【０３４３】
改変された糖タンパク質は、１又は複数のグリカン（４）又は（５）を含んでもよい（ｙは１〜２４である）。ｙは、１〜１２の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数であることが好ましい。ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはｙは１、２、３、４、５又は６であることがより好ましい。ｙは１、２、３又は４であることが尚より好ましい。ｙが２以上であるとき、グリカンは互いに異なっていてもよい。改変された糖タンパク質は、また１又は複数のグリカン（４）及び１又は複数のグリカン（５）の組合せを含んでもよい。上で記載された通り、糖タンパク質はＳｕ（Ａ）部分を有さない１又は複数のグリカンを更に含んでもよい。
【０３４４】
本発明の改変された糖タンパク質が式（４３）、（４４）又は（４５）で表されるとき、糖タンパク質は、上記の式（４）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるグリカン、より好ましくはグリカン、好ましくは式（４）、（３７）、（３８）又は（３９）、尚より好ましくは式（４）又は（３８）で表されるＮ−結合したグリカンを含むことも好ましい。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは、式（４）又は（３８）で表されるＮ−結合したグリカンであることが最も好ましい。
【０３４５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は抗体、より好ましくは式（４３）、（４４）又は（４５）で表される抗体であり、ここで、タンパク質（Ｐｒ）は抗体（Ａｂ）、又はより具体的にはＰｒは抗体のポリペプチド部分である。改変される糖タンパク質が抗体であり、抗体が１より多いグリカン（ｙは２以上である）を含むときも、グリカンは互いに異なっていてもよい。抗体は、Ｓｕ（Ａ）部分を有さない１又は複数のグリカンを更に含んでもよい。改変された糖タンパク質が抗体であるときも、改変された抗体が、上記定義の式（４）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表される、より好ましくは式（４）、（３７）、（３８）又は（３９）で表される、尚より好ましくは式（４）又は（３８）で表されるグリカンを含むことが好ましい。この実施形態において、抗体は、式（４）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくは式（４）、（３７）、（３８）又は（３９）で表されるＮ−結合したグリカン、最も好ましくは式（４）又は（３８）で表されるＮ−結合したグリカンを含むことが更に好ましい。
【０３４６】
改変された糖タンパク質が抗体であるとき、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、より好ましくはｙは１、２、４、６又は８であり、尚より好ましくはｙは１、２又は４であり、最も好ましくはｙは１又は２であることが好ましい。
【０３４７】
上記定義の通り、上記抗体は全抗体であってもよいが、抗体断片であってもよい。抗体が全抗体であるとき、上記抗体は、好ましくは１又は複数、より好ましくは１のグリカンを各重鎖に有する。よって、上記全抗体は、好ましくは２以上、好ましくは２、４、６又は８の上記グリカン、より好ましくは２又は４、最も好ましくは２のグリカンを含む。言い換えると、上記抗体が全抗体であるとき、ｙは２、４、６又は８であることが好ましく、ｙは２又は４であることがより好ましく、ｙは２であることが最も好ましい。抗体が抗体断片であるとき、ｙは１、２、３又は４であることが好ましく、ｙは１又は２であることがより好ましい。
【０３４８】
好ましい実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。好ましくは、上記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択される。上記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であることがより好ましく、上記抗体はＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。
【０３４９】
本発明の改変された糖タンパク質において、式（６）で表されるＳｕ（Ａ）中のＲ１４は：
【化５０】
2018518149.tif 000052
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０３５０】
本発明の改変された糖タンパク質の好ましい実施形態において、式（６）で表されるＳｕ（Ａ）中のＲ１４は：
【化５１】
2018518149.tif 000053
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０３５１】
式（６）で表されるＳｕ（Ａ）中のＲ１４は−ＮＨＡｃであることが最も好ましい。
【０３５２】
更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−ＯＨである、式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５３】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−Ｎ３である、式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５４】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５５】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくは式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）中のＲ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであり、ここで、Ｗ、ｈ、Ｕ、ｆ、Ｔ、ａ及びＡ、並びにその好ましい実施形態は上でより詳細に記載された通りである。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５６】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−ＯＨである、式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５７】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−Ｎ３である、式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５８】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である、式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３５９】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくはＳｕ（Ａ）（６）中のＲ１４が−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａである、式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含む。この実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３６０】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくはグリカン、尚より好ましくは式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（４６）、（４７）、（４８）又は（４９）：
【化５２】
2018518149.tif 000054
【化５３】
2018518149.tif 000055
（式中：
ａ、ｆ、Ｒ１４、Ｒ１５、Ａ、Ｕ及びＴ、並びにその好ましい実施形態は、（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）についての上記定義の通りである）
で表される。
【０３６１】
Ｓｕ（Ａ）（６）が式（４６）、（４７）、（４８）又は（４９）で表される、これらの実施形態において、更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＯＨである。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであり、ここで、Ｗ、ｈ、Ｕ、ｆ、Ｔ、ａ及びＡ、並びにその好ましい実施形態は上でより詳細に記載された通りである。これらの実施形態においても、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３６２】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくはグリカン、尚より好ましくは式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）又は（７１）、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）：
【化５４】
2018518149.tif 000056
【化５５】
2018518149.tif 000057
【化５６】
2018518149.tif 000058
【化５７】
2018518149.tif 000059
（式中：
Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６、並びにその好ましい実施形態は、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（６５）、（６６）、（６７）、（６８）及び（６９）についての上記定義の通りである）
で表される。
【０３６３】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくはグリカン、尚より好ましくは式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカン、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（７２）、（７３）又は（７４）：
【化５８】
2018518149.tif 000060
（式中：
Ｒ１４及びその好ましい実施形態は、（７２）、（７３）及び（７４）についての上記定義の通りである）
で表される。
【０３６４】
更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（３７）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表され、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカンを含み、好ましくは式（３８）で表されるＮ−結合したグリカン、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表され、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（３９）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表され、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４０）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表され、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４１）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表され、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表され、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される。
【０３６５】
Ｓｕ（Ａ）（６）が式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）、（５７）、（７０）、（７１）、（７２）、（７３）又は（７４）で表される、好ましくは式（５０）、（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、（５５）、（５６）又は（５７）で表される、これらの実施形態において、更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＯＨである。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−Ｎ３である。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。別の更に好ましい実施形態において、Ｒ１４は−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｗ）ｈ−（Ｕ）ｆ−（Ｔ）ａ−Ａであり、ここで、Ｗ、ｈ、Ｕ、ｆ、Ｔ、ａ及びＡ、並びにその好ましい実施形態は上でより詳細に記載された通りである。これらの実施形態においても、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３６６】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくはグリカン、尚より好ましくは式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）：
【化５９】
2018518149.tif 000061
【化６０】
2018518149.tif 000062
で表される。
【０３６７】
更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（３８）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（３９）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４０）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４１）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）で表される。
【０３６８】
Ｓｕ（Ａ）（６）が式（５８）、（５９）、（６０）、（６１）又は（６２）で表されるこれらの実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３６９】
別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、より好ましくは式（４）又は（５）で表されるＮ−結合したグリカン、より好ましくはグリカン、尚より好ましくは式（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（６３）又は（６４）：
【化６１】
2018518149.tif 000063
で表される。
【０３７０】
更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（３８）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（６３）又は（６４）で表される。別の更に好ましい実施形態において、本発明の改変された糖タンパク質はグリカン、好ましくは式（３９）で表されるＮ−結合したグリカンを含み、ここで、Ｓｕ（Ａ）（６）は式（６３）又は（６４）で表される。
【０３７１】
Ｓｕ（Ａ）（６）が式（６３）又は（６４）で表されるこれらの実施形態において、改変された糖タンパク質は式（４３）、（４４）又は（４５）で表されることが好ましい。
【０３７２】
本発明は、バイオコンジュゲート、好ましくは本発明のバイオコンジュゲートを調製する方法における、本明細書中の上記定義の本発明の改変された糖タンパク質の使用にも関する。本方法は、抗体−薬物−コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製するためであることが好ましい。本方法は、改変された糖タンパク質をリンカー−コンジュゲートと接触させるステップを含む。好ましい実施形態において、リンカー−コンジュゲートは、本明細書中で定義された通りである。好ましい実施形態において、バイオコンジュゲートは、本明細書中、以下に更に定義される式（７５）、（７６）又は（７７）で表されるバイオコンジュゲートである。
【０３７３】
バイオコンジュゲート
更に本発明は、リンカー−コンジュゲートを本発明の改変された糖タンパク質にコンジュゲートすることによって得られるバイオコンジュゲートに関する。リンカー−コンジュゲートは、本分野においてバイオコンジュゲーション反応における反応物の１つとして知られ、ここで、本発明の改変された糖タンパク質のような糖タンパク質は他の反応物である。本明細書中でリンカー−コンジュゲートは、標的分子がリンカーを介して反応性基Ｑ１に共有結合される化合物として定義される。反応性基Ｑ１は、本発明の改変された糖タンパク質上に存在する官能基Ａと反応することができる。リンカー−コンジュゲートは、１より多い反応性基Ｑ１及び／又は１より多い標的分子を含み得る。適切なリンカー−コンジュゲートは、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１４／０６５６６１号及び国際公開第ＷＯ２０１６／０５３１０７号に開示されたものを含む。
【０３７４】
バイオコンジュゲーション反応は、抗体−薬物−コンジュゲート（ＡＤＣ）のような抗体−コンジュゲートの分野で公知であり、ここで、それらは抗体と標的分子、典型的には細胞毒素のコンジュゲートを調製するために使用される。そのようなバイオコンジュゲーション反応において、本発明の改変された糖タンパク質は、改変された糖タンパク質上に存在する官能基Ａとリンカー−コンジュゲート上に存在する反応性基Ｑ１の間の反応のおかげでリンカー−コンジュゲートにカップリング又はコンジュゲートされる。本発明のバイオコンジュゲートは、抗体が標的分子にコンジュゲートされる抗体−コンジュゲートであることが好ましく、抗体が薬物、典型的には細胞毒素にコンジュゲートされる抗体−薬物−コンジュゲートであることが最も好ましい。
【０３７５】
より詳細には、本発明は、式（７５）、（７６）又は（７７）：
【化６２】
2018518149.tif 000064
【化６３】
2018518149.tif 000065
【化６４】
2018518149.tif 000066
（式中：
Ｐｒはタンパク質であり；
ｙは独立して（４３）についての上記定義の通りであり；
ｂ、ｄ、ｅ及びＧは独立して（５）についての上記定義の通りであり；
ＣＧはＳｕをＳｐ又はＤに連結する連結基であり；
Ｓｐはスペーサーであり；
Ｄは標的分子であり；
ｊは独立して１、２、３、４又は５であり、好ましくはｊは１であり；
ｋは独立して１〜１０の範囲の整数であり、好ましくはｋは１、２、３又は４であり、最も好ましくはｋは１であり；
ｍは０又は１であり、好ましくはｍは１である）
で表されるバイオコンジュゲートに関する。
【０３７６】
Ｓｕは式（７８）：
【化６５】
2018518149.tif 000067
（式中：
Ｒ１４、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、ｇ、ｆ及びａは（３）についての上記定義の通りである）
で表され、ＳｕはＣ１を介してβ−１，４−Ｏ−グリコシド結合によりＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に、Ｚ、Ｙ、Ｕ又はＴを介してＣＧに連結される。
【０３７７】
（７５）、（７６）又は（７７）中のＰｒ及びｙの好ましい実施形態は、（４３）、（４４）及び（４５）についてより詳細に上で記載された通りである。好ましい実施形態において、糖タンパク質は抗体である。バイオコンジュゲート、特に抗体は、１より多い官能化されたグリカン（ｙは２以上である）を含んでもよく、グリカンは互いに異なっていてもよい。抗体はＳｕ−（ＣＧ−（Ｓｐ）ｉ−（Ｄ）ｋ）ｊ部分を有さない１より多いグリカンを更に含んでもよい。官能化されたグリカンがＮ−結合したグリカンであることが更に好ましい。本発明のバイオコンジュゲートが抗体−コンジュゲートであるとき、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることが好ましく、ｙは１、２、４、６又は８であることがより好ましく、ｙは１、２又は４であることがより好ましく、ｙは１又は２あることが最も好ましい。
【０３７８】
上記定義の通り、上記抗体は全抗体であってもよいが、抗体断片であってもよい。抗体が全抗体であるとき、上記抗体は好ましくは１又は複数、より好ましくは１のグリカンを各重鎖上に含む。よって、上記全抗体は好ましくは２以上、好ましくは２、４、６又は８の上記官能化されたグリカン、より好ましくは２又は４、最も好ましくは２の官能化されたグリカンを含む。言い換えると、上記抗体が全抗体であるとき、ｙは好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片であるとき、ｙは好ましくは１、２、３又は４であり、より好ましくはｙは１又は２である。
【０３７９】
好ましい実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。上記抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されることが好ましい。上記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であることがより好ましく、上記抗体はＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。
【０３８０】
（７５）、（７６）又は（７７）中のグリカン鎖、特にｂ、ｄ、ｅ及びＧの好ましい実施形態は、（４）及び（５）並びに例えば、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）又は（４２）のようなその好ましい実施形態についてより詳細に上で記載された通りである。
【０３８１】
（７８）中のＲ１４、Ｚ、Ｙ、Ｕ、Ｔ、ｇ、ｆ及びａの好ましい実施形態は、（３）並びに例えば、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）及び（３ｄ）のようなその好ましい実施形態についてより詳細に上で記載された通りである。ＡはＱ１と反応してＣＧを生成するが、式（７８）で表されるＳｕについての好ましい実施形態は、（６）についてより詳細に上で記載された（４６）〜（６４）及び（７０）〜（７４）のいずれか１つで表されるＳｕ（Ａ）及びその好ましい実施形態に相当する。
【０３８２】
本発明のバイオコンジュゲートにおいて、式（７８）で表されるＳｕ中のＲ１４は：
【化６６】
2018518149.tif 000068
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０３８３】
本発明の改変された糖タンパク質の好ましい実施形態において、式（７８）で表されるＳｕ中のＲ１４は；
【化６７】
2018518149.tif 000069
（式中：
Ｗ、ｈ、ａ、ｆ、Ｔ、Ａ及びＵは上記定義の通りである）
からなる群から選択される。
【０３８４】
式（７８）で表されるＳｕ中のＲ１４は、−ＮＨＡｃであることが最も好ましい。
【０３８５】
Ｄは標的分子である。本明細書中で標的分子は、コンジュゲーションの際に生体分子に与えられる所望の特性を有する分子構造体と定義される。標的分子Ｄは、活性物質、レポーター分子、ポリマー、固相表面、ヒドロゲル、ナノ粒子、マイクロ粒子及び生体分子からなる群から選択されることが好ましい。標的分子Ｄは活性物質であることが最も好ましい。
【０３８６】
本明細書中で、用語「活性物質」は、薬理学的及び／又は生物学的物質、即ち、生物学的及び／又は薬学的に活性である物質、例えば、薬物、プロドラッグ、診断薬、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドタグ、アミノ酸、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡに関する。ペプチドタグとしては、ヒトラクトフェリン又はポリアルギニンのような細胞透過性ペプチドが挙げられる。グリカンとしてはオリゴマンノースが挙げられる。アミノ酸としてはリジンが挙げられる。標的分子が活性物質であるとき、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択されることが好ましい。活性物質は薬学的に活性な化合物、特に、低分子量〜中分子量化合物（例えば、約２００〜約２５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１７５０Ｄａ）からなる群から選択されることがより好ましい。更に好ましい実施形態において、活性物質は細胞毒素、抗ウイルス薬、抗細菌薬、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。細胞毒素としては、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、イリノテカン、阻害ペプチド、アマニチン、デボウガニン（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）、デュオカルミシン、メイタンシン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）又はピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）（ＰＢＤ）が挙げられる。
【０３８７】
本明細書中で、用語「レポーター分子」は、その存在が容易に検出される分子、例えば、診断薬、染料、フルオロフォア、放射活性同位体標識、造影剤、磁気共鳴造影剤又は質量ラベル（ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌ）を指す。蛍光プローブとも称される多種多様なフルオロフォアは、当業者に公知である。数種のフルオロフォアが、例えば、参照により組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版、２０１３、１０章：「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ」、３９５〜４６３ページにより詳細に記載されている。フルオロフォアとしては、全ての種類のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５）、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５）及びシアニン染料誘導体、クマリン誘導体、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、ローダミン及びローダミン誘導体、ボロンジピロメテン誘導体、ピレン誘導体、ナフタルイミド誘導体、フィコビリタンパク質誘導体（例えば、アロフィコシアニン）、クロモマイシン、ランタニドキレート及び量子ドットナノ結晶が挙げられる。放射活性同位体標識としては、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１５Ｉｎ、１８Ｆ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、２１２Ｂｉ、８８Ｙ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、６６Ｇａ、６７Ｇａ及び１０Ｂが挙げられ、これは、例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸無水物）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＴＴＡ（Ｎ１−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−四酢酸）、デフェロキサミン又はＤＦＡ（Ｎ’−［５−［［４−［［５−(アセチルヒドロキシ−アミノ)ペンチル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］−Ｎ−（５−アミノペンチル）−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド）又はＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）のようなキレーティング部分を介して任意選択で連結されてもよい。同位体標識技術は、当業者に公知であり、例えば、参照により組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版、２０１３、１２章：「Ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、５０７〜５３４ページにより詳細に記載されている。
【０３８８】
本発明の化合物において標的分子Ｄとしての使用に適切なポリマーは、当業者に公知であり、数種の例が、例えば、参照により組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版、２０１３、１８章：「ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、７８７〜８３８ページにより詳細に記載されている。標的分子Ｄがポリマーであるとき、標的分子Ｄはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、１，ｘ−ジアミノアルカンポリマー（ここでｘはアルカン中の炭素原子の数であり、ｘは２〜２００、好ましくは２〜１０の範囲の整数であることが好ましい）、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン及びより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、多糖（例えば、デキストラン）、ポリ（アミノ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−リジン））及びポリ（ビニルアルコール）、ポリ（２−オキサゾリン）（ＰＡＯｘ）からなる群から独立して選択されることが好ましい。
【０３８９】
標的分子Ｄとしての使用に適切な固相表面は、当業者に公知である。固相表面は、例えば、機能性表面（例えば、ナノ材料、カーボンナノチューブ、フラーレン又はウイルスカプシドの表面）、金属表面（例えば、チタニウム、金、銀、銅、ニッケル、スズ、ロジウム又は亜鉛表面）、合金表面（ここで、合金は、例えば、アルミニウム、ビスマス、クロム、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀、ニッケル、カリウム、プルトニウム、ロジウム、スカンジウム、銀、ナトリウム、チタニウム、スズ、ウラニウム、亜鉛及び／又はジルコニウムに由来する）、ポリマー表面（ここでポリマーは、例えば、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（ジメチルシロキサン）又はポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミドである）、ガラス表面、シリコーン表面、クロマトグラフィー支持体表面（ここで、クロマトグラフィー支持体は、例えば、シリカ支持体、アガロース支持体、セルロース支持体又はアルミニウム支持体である）などである。標的分子Ｄが固相表面であるとき、Ｄは機能性表面又はポリマー表面からなる群から独立して選択されることが好ましい。
【０３９０】
ヒドロゲルは、当業者に公知である。ヒドロゲルは、ポリマー成分間の架橋によって形成された水膨潤性ネットワークである。例えば、参照により組み込まれるＡ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２０１２、６４、１８を参照されたい。標的分子がヒドロゲルであるとき、ヒドロゲルはポリマー主成分としてポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含むことが好ましい。
【０３９１】
標的分子Ｄとしての使用に適切なマイクロ及びナノ粒子は当業者に公知である。多様な適切なマイクロ及びナノ粒子が、例えば、参照により組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版、２０１３、１４章：「Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、５４９〜５８７ページにより詳細に記載されている。マイクロ又はナノ粒子は、任意の形状、例えば、球、桿体、管、立方体、三角形及び三角錐であってもよい。マイクロ又はナノ粒子は球形であることが好ましい。マイクロ及びナノ粒子の化学組成は変化してもよい。標的分子Ｄがマイクロ又はナノ粒子であるとき、マイクロ又はナノ粒子は、例えば、ポリマーマイクロ又はナノ粒子、シリカマイクロ又はナノ粒子或いは金マイクロ又はナノ粒子である。粒子がポリマーマイクロ又はナノ粒子であるとき、ポリマーは、ポリスチレン又はスチレンのコポリマー（例えば、スチレンとジビニルベンゼン、ブタジエン、アクリレート及び／又はビニルトルエンのコポリマー）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルトルエン、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）又はポリ（エチレングリコールジメタクリレート／（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［ポリ（ＥＤＧＭＡ／ＨＥＭＡ）］であることが好ましい。マイクロ又はナノ粒子の表面は、例えば、界面活性剤により、二次ポリマーのグラフト重合により或いは別のポリマー又はスペーサー部分などの共有結合により、任意選択で改変されてもよい。
【０３９２】
標的分子Ｄは生体分子であってもよい。標的分子Ｄが生体分子であるとき、生体分子は（糖タンパク質及び抗体を含む）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、酵素、ホルモン、アミノ酸及び単糖からなる群から選択されることが好ましい。
【０３９３】
ＣＧは連結基である。本明細書中の用語「連結基」は、化合物の１の部分及び同じ化合物の別の部分を連結する構造要素を指す。典型的に、バイオコンジュゲートは、リンカーコンジュゲート中に存在する反応性基Ｑ１と本発明の改変された糖タンパク質中に存在する官能基Ａとの反応を介して調製される。ＣＧは反応性基Ｑ１と官能性部分Ａの反応の際に形成される部分である。当業者に理解される通り、ＣＧの性質は、本発明の改変された糖タンパク質とリンカー−コンジュゲートの間の連結を確立するために使用された有機反応のタイプに依存する。言い換えると、ＣＧの性質は、リンカー−コンジュゲート上の反応性基Ｑ１の性質と生体分子中の官能基Ａの性質に依存する。改変された糖タンパク質とリンカー−コンジュゲートの間の連結を確立するための多数の異なる化学反応が利用可能であるため、結果としてＣＧについて多数の可能性がある。Ｆ１及びＱ１の数個の適切な組合せ及びＱ１を含むリンカー−コンジュゲートが相補的な官能基Ｆ１を含む生体分子にコンジュゲートされるときに、バイオコンジュゲート中に存在する連結基Ｚ３のいくつかの例が図５に示される。
【０３９４】
例えば、Ａがチオール基であるとき、相補性基Ｑ１はＮ−マレイミジル基及びアルケニル基を含み、対応する連結基ＣＧは図５に示される通りである。Ａがチオール基であるとき、相補性基Ｑ１はアレナミド（ａｌｌｅｎａｍｉｄｅ）基も含む。
【０３９５】
例えば、Ａがアミノ基であるとき、相補性基Ｑ１はケトン基、活性化されたエステル基及びアジド基を含み、対応する連結基ＣＧは図５に示される通りである。
【０３９６】
例えば、Ａがケトン基であるとき、相補性基Ｑ１は（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基及びヒドラジン基を含み、対応する連結基ＣＧは図５に示される通りである。
【０３９７】
例えば、Ａがアルキニル基であるとき、相補性基Ｑ１はアジド基を含み、対応する連結基ＣＧは図５に示される通りである。
【０３９８】
例えば、Ａがアルケン基であるとき、相補性基Ｑ１はＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加反応において反応性であるチオール、ジエン又はヘテロジエン基及びテトラジニル基を含み、対応する連結基ＣＧは、それぞれ、チオエーテル、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加物（シクロへキセン若しくはその類似体）又はジヒドロピリダジンであってもよい。
【０３９９】
例えば、Ａがアジド基であるとき、相補性基Ｑ１はアルキニル基を含み、対応する連結基ＣＧは図５に示される通りである。
【０４００】
例えば、Ａがシクロプロペニル基、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン基又はシクロオクチン基であるとき、相補性基Ｑ１はテトラジニル基を含み、対応する連結基Ｚ３は図５に示される通りである。これらの特別な場合において、Ｚ３は唯一の中間構造であり、Ｎ２を排出し、それによって、（アルケンとの反応からの）ジヒドロピリダジン又は（アルキンとの反応からの）ピリダジンを創り出す。
【０４０１】
例えば、Ａがハロゲン（Ｘ）であるとき、相補性基Ｑ１はチオールを含み、対応する連結基ＣＧはチオエーテルであってもよい。
【０４０２】
例えば、Ａが−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５であるとき、相補性基Ｑ１はヒドロキシル及び（一級及び二級）アミン基を含み、対応する連結基ＣＧはエーテル又は（二級若しくは四級）アミン基であってもよい。
【０４０３】
例えば、Ａがアレニル基であるとき、相補性基Ｑ１はチオールを含み、対応する連結基ＣＧはチオエーテル、典型的にはメチル−置換チオエーテルであってもよい。
【０４０４】
例えば、Ａが−ＳＣ（Ｏ）Ｒ８又は−ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８であるとき、典型的にＡは最初にチオールと反応し、相補性基Ｑ１はＮ−マレイミジル基、アルケニル基、アレナミド基を含む。対応する連結基ＣＧはＡについて図５に示される通りであってもよく、チオールである。
【０４０５】
Ａ及びＱ１の追加の適切な組合せ、並びに結果として生じる連結基ＣＧの性質は当業者に公知であり、例えば、参照により組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版、２０１３（ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０）、特に、３章、２２９〜２５８ページに記載されている。バイオコンジュゲーション方法に適切な相補的反応性基のリストは、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版、２０１３（ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０）３章の表３．１、２３０〜２３２ページに開示されており、この表の内容は参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０４０６】
Ｓｐはスペーサー又はリンカーである。本明細書中でリンカーは、化合物の２以上の要素を連結する部分として定義される。例えば、バイオコンジュゲートにおいて、生体分子及び標的分子はリンカーを介して共有結合により互いに連結され；リンカー−コンジュゲートにおいて反応性基Ｑ１がリンカーを介して共有結合により標的分子に連結される。バイオコンジュゲート、特に抗体−コンジュゲートにおける使用に適切であることが本分野で公知の任意のリンカーは、Ｓｐとして使用可能である。そのようなスペーサー部分は当業者に公知である。適切なスペーサー部分としては、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール鎖又はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール鎖又はポリプロピレンオキシド鎖及び１、ｘ−ジアミノアルカン、ここで、ｘはアルカン中の炭素原子の数である、が挙げられる。適切なスペーサー部分の別のクラスは、切断可能なスペーサー部分又は切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは本分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｈａｂａｔら、Ｓｏｆｔ  ｍａｔｔｅｒ、２０１２、６、１０７３は、生物学的なトリガー、例えば、酵素的切断又は酸化事象の際に放出される、自壊性部分を含む切断可能なリンカーを開示する。適切な切断可能なリンカーのいくつかの例は、還元の際に切断されるジスルフィドリンカー、プロテアーゼ、例えば、カテプシン、プラスミン又はメタロプロテアーゼによる特異的認識の際に切断されるペプチドリンカー、或いはグリコシダーゼ、例えば、グルクロニダーゼによる特異的認識の際に切断されるグリコシドに基づくリンカー、或いは貧酸素の低酸素領域において還元される芳香族ニトロ化合物である。本明細書中で、適切な切断可能なスペーサー部分は、アミノ酸の特定の切断可能な配列を含むスペーサー部分も含む。例としては、例えば、Ｖａｌ−Ａｌａ（バリン−アラニン）又はＶａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン）部分を含むスペーサー部分が挙げられる。
【０４０７】
好ましい実施形態において、Ｓｐは直鎖又は分枝Ｃ１〜Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２〜Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３〜Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５〜Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８〜Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７〜Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７〜Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８〜Ｃ２００アリールアルケニレン基及びＣ９〜Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から選択され、上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１９からなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で置換され、任意選択で中断されていてもよく、ここでＲ１９は水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル基及びＣ３〜Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよい。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が１又は複数の上記定義のヘテロ原子で中断されているとき、上記基は、１又は複数のＯ原子により及び／又は１又は複数のＳ−Ｓ基により中断されていることが好ましい。
【０４０８】
Ｓｐは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２〜Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３〜Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５〜Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８〜Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７〜Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７〜Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８〜Ｃ１００アリールアルケニレン基及びＣ９〜Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群から選択され、上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１９からなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で置換され、任意選択で中断されていてもよく、ここでＲ１９は水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル基及びＣ３〜Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよいことがより好ましい。
【０４０９】
Ｓｐは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３〜Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５〜Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８〜Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７〜Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７〜Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８〜Ｃ５０アリールアルケニレン基及びＣ９〜Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群から選択され、上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１９からなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で置換され、任意選択で中断されていてもよく、ここでＲ１９は水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル基及びＣ３〜Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよいことが尚より好ましい。
【０４１０】
Ｓｐは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５〜Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８〜Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７〜Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７〜Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８〜Ｃ２０アリールアルケニレン基及びＣ９〜Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群から選択され、上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１９からなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で置換され、任意選択で中断されていてもよく、ここでＲ１９は水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル基及びＣ３〜Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよいことが更に尚より好ましい。
【０４１１】
これらの好ましい実施形態において、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、非置換であり、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１９からなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子、好ましくはＯにより任意選択で中断されていてもよく、ここでＲ１９は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択され、好ましくは水素又はメチルであることが更に好ましい。
【０４１２】
Ｓｐは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基からなる群から選択され、上記アルキレン基はＯ、Ｓ及びＮＲ１９からなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で置換され、任意選択で中断されていてもよく、ここでＲ１９は水素、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２４アルキニル基及びＣ３〜Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよいことが最も好ましい。この実施形態において、アルキレン基は非置換であり、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１９、好ましくはＯ及び／又はＳ−Ｓからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で中断されていてもよいことが更に好ましく、ここでＲ１９は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択され、好ましくは水素又はメチルである。
【０４１３】
特に好ましいＳｐ部分としては、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−が挙げられ、ここでｎは１〜５０の範囲、好ましくは１〜４０の範囲、より好ましくは１〜３０の範囲、尚より好ましくは１〜２０の範囲、更に尚より好ましくは１〜１５の範囲の整数である。ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７又は８、尚より好ましくは１、２、３、４、５又は６、更に尚より好ましくは１、２、３又は４であることがより好ましい。
【実施例】
【０４１４】
実施例１．ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの選択及び設計
初期の評価のために、４つの特定の配列、特にＵｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＧＵＭ２（Ｃ．エレガンス；本明細書中では配列番号２として識別される）、Ｕ１ＭＥＶ９（豚回虫（Ａ．ｓｕｕｍ）；本明細書中では配列番号３として識別される）、Ｑ６Ｊ４Ｔ９（イラクサギンウワバ（Ｔ．ｎｉ）；本明細書中では配列番号４として識別される）及びＱ７ＫＮ９２（キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）；本明細書中では配列番号５として識別される））を選択した。ポリペプチドを予測される細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの欠失に基づいて構築した。これらのポリペプチドは予測されるＣ．エレガンス（配列番号６で識別されるＣｅＧａｌＮＡｃＴ［３０−３８３］）、豚回虫（配列番号７で識別されるＡｓＧａｌＮＡｃＴ［３０−３８３］）、イラクサギンウワバ（配列番号８で識別されるＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３−４２１］）及びキイロショウジョウバエ（配列番号９で識別されるＤｍＧａｌＮＡｃＴ［４７−４０３］）を含む。加えて、Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグを含有するポリペプチド変異体を、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ［３０−３８３］：（配列番号７１で識別されるＨｉｓ−ＡｓＧａｌＮＡｃＴ［３０−３８３］）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３−４２１］（配列番号４９で識別されるＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３−４２１］）に対して構築した。
【０４１５】
実施例２．イラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体及び豚回虫ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴ及びＡｓＧａｌＮＡｃＴの突然変異体を、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＰＤＢエントリー１ＯＱＭ）と複合体を形成したウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１及びＱａｓｂａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７：２０８３３〜２０８３９、参照により組み込まれる）により報告されたβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）突然変異体に対する結晶構造を基にして設計した。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ及びＡｓＧａｌＮＡｃＴの突然変異体をＴｎＧａｌＮＡｃＴ及びＡｓＧａｌＮＡｃＴとウシβ（１，４）Ｇａｌ−Ｔ１との配列アラインメントに基づいて設計した。これらのタンパク質間の対応するアミノ酸残基を表１に示す。
【０４１６】
【表１】
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【０４１７】
実施例３．Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）突然変異体の部位特異的突然変異誘発
ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間のＴｎＧａｌＮＡｃＴの残基３３−４２１（配列番号８で識別される）をコードするコドン最適化配列を含有するｐＥＴ１５ｂ−ベクターをＧｅｎｓｃｒｉｐｔから入手し、その結果Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）（配列番号４９で識別される）を得た。ＴｎＧａｌＮａｃＴ突然変異遺伝子を、一組の重複するプライマーを用いて線形増幅ＰＣＲにより上述した構築体から増幅した。各々の突然変異体のために用いた重複するプライマーセットを表２に示す。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号５０で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号７９及び配列番号８０として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｈ）（配列番号５１で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８１及び配列番号８２として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号５２で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８３及び配列番号８４として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）（配列番号５３で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８５及び配列番号８６として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｇ）（配列番号５４で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８７及び配列番号８８として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ｄ）（配列番号５５で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８９及び配列番号９０として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ）（配列番号６０で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号９１及び配列番号９２として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の後、反応混合物をＤｐｎＩで処理してテンプレートＤＮＡを消化し、続いてＮＥＢ  １０−ベータコンピテント細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手）に形質転換した。ＤＮＡを単離し、突然変異体Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号５０で識別される）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号５２で識別される）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）（配列番号５３で識別される）、及びＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｉ３１１Ｙ）（配列番号６０で識別される）に対する配列解析によって配列を確認した。
【０４１８】
【表２】
2018518149.tif 000071
【０４１９】
実施例４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｆ）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｖ）、及びＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）の発現及びリフォールディング
Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｆ）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｗ３３６Ｖ）、及びＨｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）を、実施例３に記載したようにして得られた対応するｐＥＴ１５ｂ−構築体から発現させた。発現、封入体単離及びリフォールディングは、Ｑａｓｂａら（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３、３０、２１９〜７６２２９、参照により組み込まれる）により報告された手順に従って行った。リフォールディング後、不溶性のタンパク質を遠心分離（１０分、８．０００×ｇ）及びそれに続く０．４５μＭ−孔径のフィルターに通すろ過によって除去した。可溶性のタンパク質は、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  ５ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し濃縮した。最初にカラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス緩衝液、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。保持されたタンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５、１０ｍＬ）で溶出した。画分をポリアクリルアミドゲル（１２％）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、精製された標的タンパク質を含有する画分を合わせ、緩衝液を、一晩４℃で実施した透析によって２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して交換した。精製されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、更に使用するまで−８０℃で保存した。
【０４２０】
実施例５．ＣＨＯにおけるＧａｌＮＡｃＴ及び変異体の一過性発現
Ｅｖｉｔｒｉａ（チューリッヒ、スイス）により２０ｍＬの規模でタンパク質をＣＨＯ  Ｋ１細胞内で一過性に発現させた。以下のＧａｌＮＡｃＴ変異体を発現させた：（配列番号６により識別される）ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）、（配列番号７により識別される）ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）、（配列番号８により識別される）ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）、（配列番号９により識別される）ＤｍＧａｌＮＡｃＴ（４７−４０３）及び（配列番号２８により識別される）ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）。典型的な精製実験において、発現したＧａｌＮＡｃＴを含有するＣＨＯで産生した上清を２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析した。上清（典型的には２５ｍＬ）を０．４５μＭの孔径のフィルターに通してろ過し、続いて使用前に２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したカチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ  ５ｍＬカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。精製は外部画分収集機を備えたＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステムで実施した。サンプルをシステムポンプＡから装填した。結合していないタンパク質を、１０カラム体積（ＣＶ）の２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５でカラムを洗浄することによってカラムから溶出した。保持されたタンパク質は溶離緩衝液（２０ｍＭトリス、１ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＬ）で溶出した。収集した画分をポリアクリルアミドゲル（１２％）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、標的タンパク質を含有する画分を合わせ、スピンろ過を用いて０．５ｍＬの体積に濃縮した。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１；Ｅ３３９Ａ）以外は、次に、タンパク質をＡＫＴＡ清浄機−１０系（ＵＮＩＣＯＲＮ  ｖ６．３）を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製して、純粋なモノマー画分を得た。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、モノマータンパク質を含有する画分を更に使用するまで−８０℃で保存した。
【０４２１】
ＩｇＧの質量スペクトル解析のための一般的なプロトコル
質量スペクトル解析の前に、軽鎖と重鎖の両方の分析を可能とするＤＴＴ又はＦｃ／２断片の解析を可能とする（Ｇｅｎｏｖｉｓ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎから市販）ファブリケーター（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ）（商標）のいずれかによってＩｇＧを処理した。軽鎖及び重鎖両方の解析のために、４μＬの全体積中、２０μｇの（改変された）ＩｇＧの溶液を、１００ｍＭのＤＴＴと共に３７℃で５分間インキュベートした。存在する場合、アジド−官能基はこれらの条件下でアミンに還元される。Ｆｃ／２断片の解析のために、１０μＬの全体積中、２０μｇの（改変された）ＩｇＧの溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中のファブリケーター（商標）（１．２５Ｕ／μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。還元又はファブリケーター消化後、サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてｍｉｌｌｉＱで２回洗浄し、およそ４０μＬの最終的なサンプル体積が得られた。次に、サンプルをＪＥＯＬ  ＡｃｃｕＴＯＦでエレクトロスプレイイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）により分析した。Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを用いて解析されたスペクトルを得た。
【０４２２】
実施例６．エンドＳ処理によるトリミングされたトラスツズマブの調製
トラスツズマブのグリカンのトリミングは、化膿レンサ球菌に由来するエンドＳ（Ｇｅｎｏｖｉｓ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎから市販）を用いて実施した。よって、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）をエンドＳ（４０Ｕ／ｍＬ）と共に、２５ｍＭトリスｐＨ８．０中、３７℃でおよそ１６時間インキュベートした。脱グリコシル化されたＩｇＧを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で洗浄した。ピークの解析後、質量スペクトルは軽鎖の１つのピークと重鎖の２つのピークを示した。重鎖の２つのピークは、コアＧｌｃＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブに由来する１つの主要な生成物（４９４９６Ｄａ、全重鎖の９０％）及びトリミングされたトラスツズマブに由来する少ない生成物（４９３５１Ｄａ、全重鎖の±１０％）に属していた。
【０４２３】
実施例７．ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１の作用の下でのトリミングされたトラスツズマブへの６−アジド−Ｇａｌ−ＵＤＰのグリコシル転移
上で記載されたトラスツズマブのエンドＳ処置により得られた、トリミングされたトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、６−アジド−Ｇａｌ−ＵＤＰ（１ｍＭ、ＧｌｙｃｏＨｕｂから市販）及び０．１又は０．５ｍｇ／ｍＬいずれかのウシβ（１，４）Ｇａｌ−Ｔ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから市販）と共に、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中、３０℃で一晩インキュベートした。還元されたサンプルの質量スペクトル解析は、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１の両濃度について生成物の形成を示さなかった（コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ由来の４９４９４Ｄａの主要重鎖ピーク、全重鎖の９０％）。
【０４２４】
実施例８．ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（１３０−１４２；Ｙ２８９Ｌ、Ｃ３４２Ｔ）の作用の下でのトリミングされたトラスツズマブへの６−アジド−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＵＤＰのグリコシル転移
Ｙ２８９Ｌ、Ｃ３４２Ｔ突然変異を含有し、触媒ドメイン（アミノ酸残基１３０−４０２）のみを含有する、（配列番号１により識別される）ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１由来の突然変異体を使用した。このウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（１３０−１４２；Ｙ２８９Ｌ、Ｃ３４２Ｔ）突然変異体は、Ｑａｓｂａら（参照により組み込まれるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、２０８３３〜２０８３９）により記載され、Ｑａｓｂａら（参照により組み込まれるＰｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．、２００３，３０、２１９〜７６２２９）により報告された手順に従って、発現され、封入体単離及びリフォールディングされた。上で記載されたトラスツズマブのエンドＳ処理によって得られたトリミングされたトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、６−アジド−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（２．５ｍＭ、ＧｌｙｃｏＨｕｂから市販）及び１ｍｇ／ｍＬのβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（１３０−４０２；Ｙ２８９Ｌ、Ｃ３４２Ｔ）と共に、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中、３７℃で一晩インキュベートした。還元されたサンプルの質量スペクトル解析は、生成物の形成を示さなかった（コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ由来の４９５０２Ｄａの主要重鎖ピーク、全重鎖の９０％）。
【０４２５】
実施例９．ＧａｌＮＡｃＴの作用の下でのトリミングされたトラスツズマブへの６−アジド−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ＵＤＰのグリコシル転移
実施例５に記載した通りに発現され、精製された（配列番号６により識別される）ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）、（配列番号７により識別される）ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）、（配列番号８により識別される）ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）及び（配列番号９により識別される）ＤｍＧａｌＮＡｃＴ（４７−４０３）について、６−アジド−ＧａｌＮＡｃの取り込みを試験した。上で記載された通りにトラスツズマブのエンドＳ処理により得られたトリミングされたトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中、６−アジド−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（１ｍＭ、ＧｌｙｃｏＨｕｂから市販）及び０．２又は０．５ｍｇ／ｍＬいずれかの上記ＧａｌＮＡｃＴの１つと共にインキュベートした。
【０４２６】
ファブリケーター（商標）消化したサンプルの質量スペクトル解析は、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）及びＤｍＧａｌＮＡｃＴ（４７−４０３）の両濃度について生成物の形成がなかったことを示したが（コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ由来の２４１３９Ｄａの主要なＦｃ／２ピーク、全重鎖の９０％）、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０−３８３）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）は両方とも、６−アジド−ＧａｌＮＡｃのコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへの転移に起因する、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ（実測質量２４１３９Ｄａ）の生成物（実測質量２４３６６Ｄａ）への部分的な変換を示した。得られた変換を表３に示す。
【０４２７】
【表３】
2018518149.tif 000072
【０４２８】
【化６８】
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【０４２９】
実施例１０．６−アジド−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８０の合成
アセチル化糖７９は、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００９、１９、５４３３中の手順に従って調製され得る。
【０４３０】
ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中のアセチル化糖７９（４．９ｇ、１１．９ｍｍｍｏｌ）の懸濁液に、２５％ＮＨ４ＯＨ水溶液（６０ｍＬ）を加えた。室温で反応物を攪拌し、ＬＣＭＳにより変換をモニターした。４時間後、減圧下で混合物を濃縮し、−２０℃で２日間保存した。次いで、２５％のＮＨ４ＯＨ水溶液（７５ｍＬ）に固体を再び溶解し、室温で攪拌し、３時間後、ＭＳは完全な変換を示した。溶媒の濃縮により、粗生成物を黄色の固体として得た。定量ＮＭＲを行い、６０重量％が生成物８０であり、３．２ｇ（８３％）の収量を得たことを示した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，３．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．１２（ｄｄ，Ｊ＝６．８，６．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．０６（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８，３．２，２．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．９２〜３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．４７（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，７．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，６．４Ｈｚ，１Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ８Ｈ１５Ｎ４Ｏ８Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値３２５．０６、実測値３２５．３０。
【０４３１】
実施例１１．６−アミノ−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８１の合成
Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中のアジド８０（５．９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（４００ｍｇ）を加え、反応混合物にＨ２を１時間通気した。反応物の変換をＴＬＣ（７：３ＭｅＯＨ：ＭｅＣＮ）によりモニターした。反応混合物をセライトでろ過し、ＭｅＯＨ及びＨ２Ｏにより完全に洗浄し、真空中で濃縮して、粗生成物８１を１．８ｇの収量で得た（９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．２５（ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．０９〜４．０４（ｍ，１Ｈ）、３．９０〜３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．１９〜３．０８（ｍ，２Ｈ）、１．８５（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ８Ｈ１７Ｎ２Ｏ８Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値２９９．０６、実測値２２９．２９。
【０４３２】
実施例１２．６−（２−クロロアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８２の合成
クロロ酢酸スクシニミジルエステルを、Ｈｏｓｚｔａｆｉら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９６、７９、１３３中の手順に従って調製した。
乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中、糖８１（１２ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下でクロロ酢酸スクシニミジルエステル（９ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（６．７μＬ、０．０４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で攪拌し、真空中で濃縮して、粗生成物８２を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．４２〜５．３２（ｍ，１Ｈ）、４．１３〜４．０２（ｍ，４Ｈ）、３．９２〜３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．５３〜３．４６（ｍ，１Ｈ）、３．３３〜３．２６（ｍ，１Ｈ）、１．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１０Ｈ１８ＣｌＮ２Ｏ９Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値３７５．６８（１００％）、３７７．０３（３０％）、実測値３．７５．０８（１００％）、３７７．１９（２５％）。
【０４３３】
実施例１３．６−（４−アジドベンズアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８３の合成
４−アジド安息香酸スクシニミジルエステルを、Ｈａｒｔｍａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、２０１２、４８、４７５５に従って調製した。
乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中、糖８１（３８ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下でＥｔ３Ｎ（２１μＬ、０．１５２ｍｍｏｌ）及び４−アジド安息香酸スクシニミジルエステル（３６ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で攪拌した。追加の４−アジド安息香酸スクシニミジルエステル（３６ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４２μＬ、０．３０４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で５時間、攪拌した。ＴＬＣ及びＭＳにより生成物の形成をモニターした。６時間後に反応混合物を濃縮して、粗生成物８３を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１５Ｈ２０Ｎ５Ｏ９Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値４４４．０９、実測値４４４．２０。
【０４３４】
実施例１４．６−（Ｎ−２−アジド−２，２−ジフルオロエチルカルバメート）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８４の合成
２−アジド−２，２−ジフルオロエタノールを、国際公開第ＷＯ２０１５／１１２０１６号に記載された手順に従って調製した。
２−アジド−２，２−ジフルオロエタノール（２００ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下でＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、４−ニトロフェニエルクロロホルメート（２９５ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２２６μＬ、１．６３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１時間攪拌した。次に、糖８１（１２２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（１１３μＬ、０．８１ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（５ｍＬ）を加え、得られた溶液を反応混合物に加えた。反応物を室温で１６時間攪拌し、ＴＬＣ及びＬＣＭＳが糖８１の完全な消費を確認した。減圧下で溶媒を除去して、粗生成物を得た。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬ及び１×１５ｍＬカラム）によって精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％のＢ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶出し、１００％のＢでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物８４（１４７ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．１７（ｄｄ，Ｊ＝６．４，３．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．４０〜４．２４（ｍ，２Ｈ）、４．０７〜３．９３（ｍ，２Ｈ）、３．８５〜３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．２８〜３．１３（ｍ，２Ｈ）、１．８７（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１１Ｈ１８Ｆ２Ｎ５Ｏ１０Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値４４８．０７、実測値４４８．１４。
【０４３５】
実施例１５．６−（Ｎ−１−（２−アジドエチル）ウレア）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８５の合成
２−アジドエチルアミンを、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１５、１３７、６０００に記載された手順に従って調製した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．４０〜３．３３（ｍ，２Ｈ）、２．９１〜２．８１（ｍ，２Ｈ）。
カルボニルジイミダゾール（３７７ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下で攪拌した。２−アジドエチルアミン（２００ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＣＤＩに滴下した。得られた溶液を室温で１時間攪拌し、続いて６０℃に加熱した。糖８１をＨ２Ｏ（２ｍＬ）及びＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、反応物に加えた。得られた懸濁液を６０℃で１６時間攪拌した。所望の生成物の形成をＬＣＭＳでモニターした。１６時間攪拌後、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を加え、続いてＤＣＭ（１５ｍＬ）中の新に活性化した２−アジドエチルアミンを加えた。得られた混合物を再度、６０℃で１６時間攪拌し、減圧下で溶媒を除去した。次いで、粗生成物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１５ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で洗浄した。水性相を濃縮して、粗生成物を得て、これをイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬ及び１×１５ｍＬカラム）で精製した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％のＢ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶出し、１００％のＢでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物８５（１４７ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．３０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．１３〜３．９３（ｍ，２Ｈ）、３．９１〜３．７６（ｍ，２Ｈ）、３．３５〜３．１０（ｍ，５Ｈ）、１．９２（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１１Ｈ２１Ｎ６Ｏ９Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値４１１．１０、実測値４１１．２４。
【０４３６】
実施例１６．６−（Ｎ−（２−Ｓ−アセチル）−メルカプトアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８６の合成
糖８１（１０５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（１．７ｍＬ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。別個のバイアル中でＳ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（２１０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．７ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（１４７μＬ、１．０５ｍｍｏｌ）と共に反応物に加えた。得られた混合物を室温で１６時間攪拌し、ＬＣＭＳが糖８１の完全な消費を示した。減圧下で溶媒を除去し、フラッシュクロマトグラフィー（６：２：１−４：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により粗生成物を精製して、生成物８６（９５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、６５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．３３（ｄｄ，Ｊ＝６．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．１１〜４．００（ｍ，２Ｈ）、３．９０〜３．８０（ｍ，２Ｈ）、３．６３〜３．５３（ｍ，２Ｈ）、３．４４（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，５．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．２３（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．３１（ｓ，３Ｈ）、１．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１２Ｈ２１Ｎ２Ｏ１０ＰＳ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値４１５．０６、実測値４１５．１８。
【０４３７】
実施例１７．６−（Ｎ−３−アジドアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−１−モノホスフェート８７の合成
アジド酢酸（１０１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（１９２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１１５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。次に、糖８１（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（３ｍＬ）に溶解し、反応物に加えて、室温で１６時間攪拌した。所望の生成物の形成をＬＣＭＳでモニターした。アジド酢酸の他の一部を上記の通りに活性化し、反応物に加えた。４時間後、反応物を真空中で濃縮した。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬ及び１×１５ｍＬカラム）により精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶出し、１００％の緩衝液Ｂでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物８７（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、７９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．３４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．１３〜４．０３（ｍ，２Ｈ）、３．９３（ｓ，２Ｈ）、３．９２〜３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，４．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．２９（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ）、１．９５（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１０Ｈ１８Ｎ５Ｏ９Ｐ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値３８２．０８、実測値３８２．１５。
【０４３８】
実施例１８．６−（２−クロロアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ８８の合成
Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３により記載された手順に従って、モノホスフェート８２をＵＭＰにカップリングさせた。
簡単に言えば、トリブチルアンモニウムウリジン−５’−モノホスフェート（３１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（１３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（２．５μＬ）を加え、１５分間攪拌して過剰のＣＤＩを除去した。残ったＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。続いて、モノホスフェート８２（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解して、反応混合物に加え、続いて、Ｎ−メチルイミダゾール、ＨＣｌ塩（２５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。真空中での濃縮前に、反応物を室温で一晩攪拌した。モノホスフェート中間体の消費をＭＳによりモニターした。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ＨＩＴＲＡＰ、１×５ｍＬカラム）で精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶離し、１００％の緩衝液Ｂでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物８８（１ｍｇ、１．４６μｍｏｌ、４％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１９Ｈ２９ＣｌＮ４Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６８１．０６（１００％）、６８３．０６（３２％）、実測値６８１．１３（１００％）、６８３．１５（４０％）。
【０４３９】
実施例１９．６−（４−アジドベンズアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ８９の合成
Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３により記載された手順に従って、モノホスフェート８３をＵＭＰにカップリングさせた。
簡単に言えば、トリブチルアンモニウムウリジン−５’−モノホスフェート（７７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（４１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（６．２μＬ）を加え、１５分間攪拌して過剰のＣＤＩを除去した。残ったＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。続いて、モノホスフェート８３（５６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解して、反応混合物に加え、続いて、Ｎ−メチルイミダゾール、ＨＣｌ塩（７９ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を加えた。真空中での濃縮前に、反応物を室温で一晩攪拌した。モノホスフェート中間体の消費をＭＳによりモニターした。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬカラム、１×１５ｍＬカラム）で精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶離し、１００％のＢでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物８９（１３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、１４％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２４Ｈ３１Ｎ７Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値７５０．１２、実測値７５０．３３。
【０４４０】
実施例２０．６−（Ｎ−２−アジド−２，２−ジフルオロエチルカルバメート）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ９０の合成
Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３により記載された手順に従って、モノホスフェート８４をＵＭＰにカップリングさせた。
簡単に言えば、トリブチルアンモニウムウリジン−５’−モノホスフェート（２００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（１０６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１６μＬ）を加え、１５分間攪拌して過剰のＣＤＩを除去した。残ったＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。続いて、モノホスフェート８４（１４７ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に懸濁して、反応混合物に加え、続いて、Ｎ−メチルイミダゾール、ＨＣｌ塩（２０４ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）を加えた。モノホスフェート中間体の消費をＭＳによりモニターした。反応物を室温で３日間攪拌した。ＵＭＰの他の一部を上で記載された通りに活性化し、１ｍＬのＨ２Ｏと共に反応物に加えた。一晩攪拌後、反応が完結し、減圧下で溶媒を除去した。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬカラム、１×１５ｍＬカラム）で精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶離し、１００％の緩衝液Ｂでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物９０（１２２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、４９％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２０Ｈ２９Ｆ２Ｎ７Ｏ１８Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値７５４．０９、実測値７５４．１６。
【０４４１】
実施例２１．６−（Ｎ−１−（２−アジドエチルアミン）ウレア）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ９１の合成
Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３により記載された手順に従って、モノホスフェート８５をＵＭＰにカップリングさせた。
簡単に言えば、トリブチルアンモニウムウリジン−５’−モノホスフェート（１２６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（６７ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１０μＬ）を加え、１５分間攪拌して過剰のＣＤＩを除去した。残ったＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。続いて、モノホスフェート８５（８５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解して、反応混合物に加え、続いて、Ｎ−メチルイミダゾール、ＨＣｌ塩（１２９ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を加えた。真空中での濃縮前に、反応物を室温で２日間攪拌した。モノホスフェート中間体の消費をＭＳによりモニターした。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬカラム、１×１５ｍＬカラム）で精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶離し、１００％の緩衝液Ｂでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物９１（８３ｍｇ、０１２ｍｍｏｌ、５６％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２０Ｈ３２Ｎ８Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値７１７．１３、実測値７１７．２７。
【０４４２】
実施例２２．６−（Ｎ−（２−Ｓ−アセチル）−メルカプトアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ９２の合成
Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３により記載された手順に従って、モノホスフェート８６をＵＭＰにカップリングさせた。
【０４４３】
簡単に言えば、トリブチルアンモニウムウリジン−５’−モノホスフェート（１３９ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（７４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１１μＬ）を加え、１５分間攪拌して過剰のＣＤＩを除去した。残ったＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。続いて、モノホスフェート８６（９５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解して、反応混合物に加え、続いて、Ｎ−メチルイミダゾール、ＨＣｌ塩（１４２ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を加えた。真空中での濃縮前に、反応物を室温で３日間攪拌した。モノホスフェート中間体の消費をＭＳによりモニターした。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１−４：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）で精製を実施して、生成物９２（９７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、４９％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２１Ｈ３２Ｎ４Ｏ１８Ｐ２Ｓ（Ｍ−Ｈ＋）の計算値７２１．０８、実測値７２１．３９。
【０４４４】
実施例２３．６−（２−アジドアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ９３の合成
Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３により記載された手順に従って、モノホスフェート８７をＵＭＰにカップリングさせた。
簡単に言えば、トリブチルアンモニウムウリジン−５’−モノホスフェート（１９１ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（１０２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１６μＬ）を加え、１５分間攪拌して過剰のＣＤＩを除去した。残ったＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。続いて、モノホスフェート８７（１２０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に懸濁して、反応混合物に加え、続いて、Ｎ−メチルイミダゾール、ＨＣｌ塩（１９５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を加えた。モノホスフェート中間体の消費をＭＳによりモニターした。反応物を室温で１６時間攪拌した。反応物中の全ての成分を溶解するために、１ｍＬのＨ２Ｏを加えた。３時間攪拌後、減圧下で溶媒を除去した。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ＨＩＴＲＡＰ、３×５ｍＬカラム、１×１５ｍＬカラム）で精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶離し、１００％の緩衝液Ｂでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物９３（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、５％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１９Ｈ２９Ｎ７Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６８８．１０、実測値６８８．１０。
【０４４５】
実施例２４．６−アミノ−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ９４の合成
Ｈ２Ｏ（０．５ｍＬ）中、６−アジド−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＴＴ（６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を加え、数滴のＥｔ３Ｎを加えた。反応物を室温で２時間攪拌し、続いてＬＣＭＳを行った。反応のスピードを上げるために、追加のＤＴＴ（１２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加え、１時間後に反応が完結し、真空中で濃縮した。イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ＨＩＴＲＡＰ、１×５ｍＬカラム）で精製を実施した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）を添加することによりカラムへの最初の結合を達成し、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次に、４０％の緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）までの勾配を実施して、生成物を溶離し、１００％の緩衝液Ｂでカラムを洗い流して、残留副生成物を除去した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の生成物９４（１２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、５１％）を得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１７Ｈ２８Ｎ４Ｏ１６Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６０５．０９、実測値６０５．１１。
【０４４６】
実施例２５．ブレンツキシマブ−（６−アミノ−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ）、９５の調製
実施例６に記載されたトラスツズマブのトリミングと同様にブレンツキシマブをトリミングした。
トリミングされたブレンツキシマブ（１５ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中、６−アミノ−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ９４（５ｍＭ）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（１．５ｍｇ／ｍＬ）と共に３０℃で一晩インキュベートした。反応混合物のサンプル（２μＬ）を、全体積１０μＬ中、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中、ファブリケーター（商標）（１．２５Ｕ／μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。このサンプルの質量スペクトル解析は、生成物ブレンツキシマブ−（６−アミノ−ＧａｌＮＡｃ）（２４３０７Ｄａ（７０％）及び２４４３５（３０％、Ｃ末端リジン変異体））への完全な変換を示した。
【０４４７】
実施例２６．ブレンツキシマブ−（６−（２−アジドアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ）、９６の調製
トリミングされたブレンツキシマブ（１５ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中、６−（２−アジドアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ９３（５ｍＭ）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（１．５ｍｇ／ｍＬ）と共に３０℃で一晩インキュベートした。反応混合物のサンプル（２μＬ）を、全体積１０μＬ中、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中、ファブリケーター（商標）（１．２５Ｕ／μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。このサンプルの質量スペクトル解析は、生成物ブレンツキシマブ−（６−（２−アジドアセトアミド）−６−デオキシ−ＧａｌＮＡｃ）（２４３９１Ｄａ（７０％）及び２４５１８（３０％、Ｃ末端リジン変異体））への７０％の変換を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018518149.tif 000105
2018518149.tif 000106
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