(57)【要約】  【解決手段】  被験者において脂肪酸代謝障害、特に脂肪酸酸化障害を阻害、治療、および／または予防する組成物および方法が提供される。  【選択図】      図５Ａ
2018537435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における脂肪酸酸化障害を治療する方法であって、前記被験者に少なくとも１つのＳ−ニトロシル化剤を投与する工程を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記脂肪酸酸化障害は、超長鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症（ＶＬＣＡＤＤ）、長鎖３−ヒドロキシアシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症（ＬＣＨＡＤＤ）、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤＤ）、短鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＳＣＡＤＤ）、中／短鎖Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（Ｍ／ＳＣＨＡＤＤ）、マルチプルアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＡＤＤ）、ミトコンドリア三官能性タンパク質欠損症、短鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ＳＫＡＴＤ）、中鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ＭＣＫＡＴＤ）、２，４−ジエノイルＣｏＡ還元酵素欠損症、およびグルタル酸血症ＩＩ型（ＧＡ−ＩＩ）から成る群から選択される、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記脂肪酸酸化障害はＶＬＣＡＤＤである、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤は、ニトロ化脂肪酸またはトリグリセリド、酸性亜硝酸塩、塩化ニトロシル、亜硝酸アルキル、亜硝酸エチル、亜硝酸アミル、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンオリゴマー、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、硝酸オキシド、Ｓ−ニトロソヘモグロビン、Ｓ−ニトロソアルブミン、５−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−ガンマ−メチル−Ｌ−ホモシステイン、５−ニトロソ−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−ガンマ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−デルタ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソアルブミン、および薬学的に許容されるその塩から成る群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤はトリグリセリドであり、１つまたは２つの脂肪酸鎖が、硝酸、ニトロソ、またはニトロで置換されている、方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤はトリグリセリドであり、１つまたは２つの脂肪酸鎖が硝酸で置換されている、方法。
【請求項７】
請求項５記載の方法において、前記トリグリセリドの前記脂肪酸は少なくとも７炭素を有する、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記トリグリセリドの前記脂肪酸は７〜１１炭素長である、方法。
【請求項９】
請求項４記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤は、１，３−ジヘプタノイン−２−一硝酸塩、１，２−ジヘプタノイン−３−一硝酸塩、２，３−ジヘプタノイン−１−一硝酸塩、１，３−ニ硝酸−２−ヘプタノイン、１，２−ニ硝酸−３−ヘプタノイン、および２，３−硝酸−１−ヘプタノインから成る群から選択される、方法。
【請求項１０】
請求項４記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤は一硝酸−ジヘプタノインである、方法。
【請求項１１】
請求項５記載の方法であって、さらに、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（ＳＮＯ−ＮＡＣ）を投与する工程を有する、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法であって、さらに、前記脂肪酸酸化障害の治療のために少なくとも１つの他の治療薬を投与する工程を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記他の治療薬はトリヘプタノインまたはベンザフィブラートである、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法であって、さらに、前記Ｓ−ニトロシル化剤の投与の前に、前記被験者の脂肪酸酸化障害を診断する工程を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記診断する工程は、
ａ）前記被験者から生体サンプルを入手する工程と、
ｂ）前記サンプルにおける超長鎖アシル−補酵素Ａ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）の酵素活性を決定する工程と、
ｃ）工程ｂ）で決定したＶＬＣＡＤの酵素活性量と健常被験者由来の対応する生体サンプルにおけるＶＬＣＡＤ酵素活性量とを比較する工程であって、前記健常被験者と比較した被験者の生体サンプルにおけるＶＬＣＡＤ酵素活性の低下が、前記被験者の脂肪酸酸化障害を示す、前記比較する工程と
を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記診断する工程は、前記被験者から得られた生体サンプル中の超長鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）をコードする核酸分子の変異の有無を決定する工程を有し、前記ＶＬＣＡＤをコードする核酸分子における変異の存在が、前記被験者の脂肪酸酸化障害を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願書類は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）のもと、２０１５年１１月６日に提出された米国仮特許出願第６２／２５１，８６０号の優先権を請求するものである。前述の出願書類は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、脂肪酸酸化障害を治療、予防、および／または阻害する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明が関与する技術の状態を説明するため、本明細書に数件の出版物および特許文書が引用されている。これらの引用それぞれは、その全体が示されるように本明細書に組み込まれる。
【０００４】
超長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）は４種類あるアシルＣｏＡ脱水素酵素のうちの１つである。ＶＬＣＡＤはホモ二量体型ミトコンドリアタンパク質であり、脂肪酸β酸化の最初の段階を触媒する。ＶＬＣＡＤは主に１６〜２４炭素長の脂肪酸のＣｏＡ−エステルに活性を示し、ヒト組織および哺乳類臓器および細胞のパルミトイルＣｏＡ脱水素の８０％以上に関与し、ミトコンドリア脂肪酸酸化の重要因子であることを示している。
【０００５】
ＶＬＣＡＤ欠損症は１９９３年に初めて同定された常染色体劣性遺伝子疾患であり、現在は２番目に多いミトコンドリアβ酸化疾患と考えられている。関連疾患は主に３種類の表現型を示す。最も重症のＶＬＣＡＤ欠損症は新生児心筋症および肝不全を示し、一般に生後１年で死に至る。乳児の表現型は、心筋症のない低ケトン性低血糖症および肝腫大として小児期初期に現れることが多い。最も軽症の表現型は後発型偶発性筋障害型と関連し、間欠的横紋筋融解、筋痙攣、および／または疼痛、および運動不耐性を伴う。現在まで、ヌル変異（疾患の最も重症型と関連していることが多い）、またＶＬＣＡＤタンパク質全体で発生し、疾患の軽症型と関連するミスセンス変異など、１００種類以上の病的突然変異が知られている。ミスセンス変異では酵素活性が低下し、および／またはタンパク質の安定性が低下するため、ミトコンドリアのアシルＣｏＡ活性の定常状態レベルが低下する。ＶＬＣＡＤ疾患と診断されると、その症状の予防に努力の重きが置かれる。患者には中鎖トリグリセリドでカロリーが添加された低脂肪ミルクが処方されることが多い。これに勝る治療および予防法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に従い、脂肪酸代謝障害、特に脂肪酸酸化障害を治療、阻害、および／または予防する方法が提供される。前記方法は、少なくとも１種類のニトロシル化剤、特にＳ−ニトロシル化剤を被験者に投与する工程を有する。特定の実施形態では、前記脂肪酸酸化障害が超長鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症（ＶＬＣＡＤＤ）である。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（ＳＮＯ−ＮＡＣ）である。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がニトロ化脂肪酸またはトリグリセリドを有する。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤が一硝酸ジヘプタノインである。前記方法は、さらに、トリヘプタノインまたはベンザフィブラートなど、前記脂肪酸代謝障害の治療に少なくとも１種類の他の治療薬を投与する工程を有してもよい。前記方法は、前記Ｓ−ニトロシル化剤の投与前に、前記被験者の脂肪酸酸化障害を診断する工程を有してもよい。
【０００７】
本発明の別の態様に従い、脂肪酸代謝障害、特に脂肪酸酸化障害を治療、阻害、および／または予防する組成物が提供される。特定の実施形態では、前記組成物が少なくとも１種類のＳ−ニトロシル化剤、少なくとも１種類の薬学的に許容される担体、および選択的に、少なくとも１種類の他の脂肪酸代謝障害治療薬を有する。特定の実施形態では、前記組成物がニトロ化脂肪酸またはトリグリセリド、特に一硝酸ジヘプタノインを有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化部位の同定を示す。図１Ａおよび１Ｂは、ｏｂ／ｏｂ  ＧＳＮＯ注入マウスの肝ホモジネートおよびＧＳＮＯをｅｘ  ｖｉｖｏで投与後のＮＯＳ−／−肝（生物学的に再現した個体Ｎ＝３）から得られた超長鎖特異的アシル脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）の二重荷電スルホン酸含有トリプシンペプチドＳｅｒ２３１−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ２３８−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ２４８（配列ＩＤ番号：３；モノアイソトピックｍ／ｚ＝９６０．９５３９および９６０．９５６１）の代表的質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す。同ペプチドのスペクトルを野生型マウス肝から得た。図１Ｃおよび１Ｄは、ＭＳ／ＭＳスペクトルから配列が確認され、ＶＬＣＡＤのスルホン酸含有ペプチドの部位がＧＳＮＯを注入したｏｂ／ｏｂマウス肝およびＧＳＮＯをｅｘ  ｖｉｖｏで投与後のＮＯＳ−／−肝（生物学的に再現した個体Ｎ＝３）で同定されることを示している。配列ＩＤ番号：３を図１Ｃおよび１Ｄに示す。
【図２】図２Ａは、野生型およびｏｂ／ｏｂマウスの肝ホモジネートの３Ｈ標識パルミトイルＣｏＡ酸化率のグラフを示している。＊野生型ＰＢＳ投与マウスとｏｂ／ｏｂ  ＰＢＳ投与マウス（ｎ＝４匹）とのボンフェローニ事後検定を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりＰ<０．０５。＊＊ｏｂ／ｏｂ  ＰＢＳ投与マウスとｏｂ／ｏｂ  ＧＳＮＯ投与マウス（ｎ＝４匹）とのボンフェローニ事後検定を用いたＡＮＯＶＡによりＰ<０．０１。図２Ｂは、野生型マウス、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ投与ｏｂ／ｏｂマウスの肝トリグリセリド測定を示す。＊野生型ＰＢＳ投与マウスとｏｂ／ｏｂ  ＰＢＳ投与マウス（ｎ＝４匹）とのボンフェローニ事後検定を用いたＡＮＯＶＡによりＰ<０．０００１。＊＊ｏｂ／ｏｂ  ＰＢＳ投与マウスとｏｂ／ｏｂ  ＧＳＮＯ投与マウス（ｎ＝４匹）とのボンフェローニ事後検定を用いたＡＮＯＶＡによりＰ<０．００５。図２Ｃは、野生型マウス、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ投与ｏｂ／ｏｂマウスの血清トリグリセリド測定を示す。統計学的差はない（ｎ＝４匹）。図２Ｄは、野生型、ｏｂ／ｏｂ  ＰＢＳ、およびｏｂ／ｏｂ  ＧＳＮＯマウス肝ホモジネートのパルミトイルＣｏＡ濃度の関数として測定したＶＬＣＡＤ初期速度の代表的測定値を示している。図２Ｅおよび２Ｆは、ＶＬＣＡＤ酵素活性の動態解析から野生型およびＧＳＮＯ投与ｏｂ／ｏｂマウス肝と比較し、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウス肝ではＶｍａｘは同等であるが、ＫＭが有意に高いことを示している。＊ボンフェローニ事後検定を用いたＡＮＯＶＡによりＰ<０．０５（生物学的に再現した個体ｎ＝３）。図２Ｇは、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウス（上）と比較し、ＧＳＮＯ投与ｏｂ／ｏｂマウス（下）では、脂肪酸分解が減少することを示した肝組織の三重染色画像を示している。画像は検討した異なるマウス肝４検体の代表的画像である。スケールバーは、左は１５μｍ、右は７．５μｍに対応する。図２Ｈは、野生型およびｅＮＯＳ−／−マウス肝ホモジネートにおけるパルミトイルＣｏＡ（０．２５ｍＭ）を介したフェリセニウムイオンの減少をモニタリングすることで決定したＶＬＣＡＤ比活性度を示している。ｅＮＯＳ−／−の比活性度は、アッセイ前３０分では、５μＭ  ＧＳＮＯを投与した野生型またはｅＮＯＳ−／−マウス肝組織より有意に低かった。＊ボンフェローニ事後検定を用いたＡＮＯＶＡにより＊ｐ<０．０００１、＊＊ｐ<０．０５生物学的に再現した個体Ｎ＝３。図２Ｉは、ｅＮＯＳ−／−マウス肝ホモジネートとＧＳＮＯを投与したｅＮＯＳ−／−マウス肝ホモジネートの結合しなかったＶＬＣＡＤ分画（Ｕ＝非修飾ＶＬＣＡＤ）と有機水銀に結合したＶＬＣＡＤ分画（Ｂ＝Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤ）のウエスタンプロット解析を示している。非投与ホモジネートの結合分画にＶＬＣＡＤがなかったことは、前記タンパク質がｅＮＯＳ−／−肝ではＳ−ニトロシル化されなかったことを示していた。投与ホモジネートの結合分画の免疫反応性から示されたとおり、ＧＳＮＯをｅｘ  ｖｉｖｏ投与すると前記タンパク質分画がＳ−ニトロシル化した。この実験はさらに２回繰り返し、結果は同様であった。図２Ｊは、電子受容体として１５０μＭフェリセニウムヘ���サフルオロリン酸を用い、ＶＬＣＡＤアシル−脱水素酵素活性を追跡したものの典型例を示している。前記活性は、０．１２５ｍＭパルミトイルＣｏＡを追加後のＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウス肝ホモジネートで測定した。ＶＬＣＡＤ活性の測定法の特異性は、抗ＶＬＣＡＤ抗体存在下、フェリセニウム還元を消滅させることで確認した。Ｓ−ニトロシル化がＶＬＣＡＤ活性に与える影響は、肝可溶化物のＵＶ光分解後、酵素活性の消失により確認した。この実験は、別の生物学的に再現した個体でもう一度再試験し、結果は同等であった。図２Ｋは、３群のマウスの肝ホモジネートでパルミトイルＣｏＡ濃度の関数として測定した初期速度（Ｖ０）を示している。＊ｔ検定によりｐ<０．０５。生物学的に再現した個体Ｎ＝３。
【図３】図３Ａは、天然ゲル（上図）およびＳＤＳゲル（中図）でＶＬＣＡＤを評価した代表的ウエスタンブロットを示している。１実験の非連続レーンは黒線で示している。図３Ｂは、全肝ホモジネートおよび肝濃縮ミトコンドリア分画において、還元条件でのＳＤＳゲル中ＶＬＣＡＤの存在量の定量化を示している。ＡＮＯＶＡによる統計学的差はない。ｎ＝マウス３匹。ｃｙｔ  ｃ：チトクロムｃ。図３Ｃは、有機水銀樹脂から溶出した肝ホモジネートのＶＬＣＡＤの代表的ウエスタンブロットを示している。シグナル強度を用い、結合（Ｂ）分画と、非結合（Ｕ）分画にある非修飾ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの存在量を決定した。このデータは、２つの独立した肝ホモジネートで再試験した。
【図４】図４Ａは、細胞可溶化物の水銀補助捕捉後に収集した非結合（ＶＬＣＡＤ）および結合分画（ＳＮＯ−ＶＬＣＡＤ）の代表的ウエスタンブロット解析を示している。ＦＬＡＧ（登録商標）標識の野生型またはＣ２３８Ａ  ＶＬＣＡＤを一時的に発現したＨｅｐａ  １〜６細胞をＧＳＮＯに曝露した。非結合分画は非修飾タンパク質の存在量を示している。結合分画はＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの存在量を示している。両方の存在量は精製ＶＬＣＡＤを用いた較正抗体結合曲線を用いて決定した。ＶＬＣＡＤの割合としてのＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤ分画を示している。ＮＤ、非検出。生物学的に再現した個体ｎ＝３。１実験の非連続レーンは黒線で示している。図４Ｂは、ＶＬＣＡＤの比活性度が野生型ＶＬＣＡＤを発現したＧＳＮＯ投与細胞では有意に高いが、等量のＣ２３８Ａ  ＶＬＣＡＤ変異タンパク質を発現したＧＳＮＯ処理細胞では高くないことを示している。＊ボンフェローニ事後検定を用いたＡＮＯＶＡにより＊ｐ<０．００１、＊＊ｐ<０．０５。生物学的に再現した個体Ｎ＝３。
【図５】図５Ａは、２つのモノマーのＣｙｓ２３８のＳ−ニトロシル化部位に金色でアノテーションを付けたＶＬＣＡＤダイマーの結晶構造を示す。Ｃｙｓ２３８はループにあり、二次構造では柔軟性の上昇を示すことに注意する。図５Ｂは、高周波数モードでは、Ｓ−ニトロシル化によりＣｙｓ２３８が大きく動くことを示している。通常モードの解析はウェブインターフェースのＥｌＮｅｍｏ（ｉｇｓ−ｓｅｒｖｅｒ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｅｌｎｅｍｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いた非修飾およびＳＮＯ−ＶＬＣＡＤ型である。下線は非修飾ＶＬＣＡＤのアミノ酸残基のＲ２値を示し、上線はＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの同じ残基の値を示す。非修飾システインと比較してＳ−ニトロソシステイン２３８のＲ２値が高いことは、Ｓ−ニトロシル化によりＣｙｓ２３８の動きが高まったことを示していることに注意する。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、細胞株１および２それぞれのＶＬＣＡＤ動態パラメータのグラフを示している。細胞可溶化物５μｇをフェロセニウム１５０μｇと混合した後、指定濃度のパルミトイルＣｏＡを追加した。３００ｎｍでの時間の関数としてフェリセニウムの吸光度の低下が記録され、前記酵素の初期速度は吸光度の総変化量の５％に対応する、時間０の曲線の傾きから決定した。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ｅＮＯＳ−／−マウスへの亜硝酸投与の効果を示している。図７Ａ：血清窒素酸化物濃度。図７Ｂ：心臓窒素酸化物濃度。図７Ｃ：ｍＦＡＯ率。図７Ｄ：  ＶＬＣＡＤ比活性度。括弧内にＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤ分画を示している。ＮＤは非検出を示す。＊はＮａＮＯ２投与マウスと野生型マウス（Ｎ＝３）と比較して統計学的差がｐ<０．０１であることを示す。＊＊はＮａＮＯ２投与マウスと野生型マウス（Ｎ＝３）の統計学的差がｐ<０．０５であることを示す。
【図８】図８は、特定の一硝酸モノヘプタノインと二硝酸ジヘプタノインの化学構造を示す。
【図９】図９Ａは、２−一硝酸−１，３−ジヘプタノイン（ＭＮＤＨ）またはトリヘプタノイン（ＴＨ）存在下でのパルミチン酸塩酸化率のグラフを示す。図９Ｂは、ＭＮＤＨ存在下でのＶＬＣＡＤ比活性度のグラフを示す。
【図１０】図１０Ａは、ＭＮＤＨ（黒線）またはＴＨ（白線）曝露後の総一酸化窒素代謝産物（ＮＯｍ）レベルのグラフを示す。図１０Ｂは、経時的な亜硝酸塩レベルのグラフを示す。図１０Ｃは、ＭＮＤＨ曝露後の経時的な総タンパク質Ｓ−ニトロソシステインのグラフを示す。
【図１１】図１１Ａは、ＭＮＤＨ（実薬）および／またはダイジン（阻害剤）曝露後の一酸化窒素代謝産物（ＮＯｍ）のグラフを示す。図１１Ｂは、ＭＮＤＨ（実薬）および／またはダイジン（阻害剤）曝露後の亜硝酸塩レベルのグラフを示す。図１１Ｃは、Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤプルダウンアッセイのブロット画像を示す。結合（Ｂ）および非結合（Ｕ）サンプルを示している。セルはＭＮＤＨまたはＴＨ（対照）で処理した。
【図１２】図１２Ａは、ＴＨ（対照）またはＭＮＤＨ（実薬）を曝露させた変異型ＶＬＣＡＤ（Ｇ１８５Ｓ／Ｇ２９４Ｅ）を有する線維芽細胞におけるＶＬＣＡＤ比活性度のグラフを示す。＊ｐ<０．００１、Ｎ＝３。図１２Ａは、ＴＨ（対照）またはＭＮＤＨ（実薬）を曝露させた変異型ＶＬＣＡＤ（Ｇ１８５Ｓ／Ｇ２９４Ｅ）を有する線維芽細胞におけるパルミチン酸酸化率のグラフを示す。＊ｐ<０．００１、Ｎ＝３。図１２Ｃは、ＶＬＣＡＤ、三官能性タンパク質（ＴＦＰ）、およびカルニチン・パルミトイルトランスフェラーゼ−２（ＣＰＴ２）のＳ−ニトロシル化を示すブロット画像を示す。Ｕ：非結合、Ｂ：結合。ＶＬＣＡＤタンパク質レベル＝０．４９±０．０８μｇ／ｍｇ。
【図１３】図１３Ａは、ＴＨ（対照）またはＭＮＤＨ（実薬）を曝露させた変異型ＶＬＣＡＤ（Ｐ９１Ｑ／Ｇ１９３Ｒ）を有する線維芽細胞におけるＶＬＣＡＤ比活性度のグラフを示す。＊ｐ<０．００１、Ｎ＝３。図１３Ａは、ＴＨ（対照）またはＭＮＤＨ（実薬）を曝露させた変異型ＶＬＣＡＤ（Ｐ９１Ｑ／Ｇ１９３Ｒ）を有する線維芽細胞におけるパルミチン酸酸化のグラフを示す。＊ｐ<０．００１、Ｎ＝３。図１３Ｃは、ＶＬＣＡＤ、三官能性タンパク質（ＴＦＰ）、およびカルニチン・パルミトイルトランスフェラーゼ−２（ＣＰＴ２）のＳ−ニトロシル化を示すブロット画像を示す。Ｕ：非結合、Ｂ：結合。ＶＬＣＡＤタンパク質レベル＝０．７０±０．１μｇ／ｍｇ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ミトコンドリア脂肪酸酸化（ｍＦＡＯ）は、生理学的状態で心臓、骨格筋、および腎臓のエネルギー産生の主な代謝プロセスである。ｍＦＡＯは栄養枯渇、寒さへの曝露，、および運動時に不可欠なエネルギー源でもある。ｍＦＡＯが遺伝的に欠損した小児では心臓、肝臓、および骨格筋機能障害が生じる。よく特徴付けられた遺伝的代謝疾患の域を超え、不十分なｍＦＡＯは非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および２型糖尿病などの高度に蔓延した代謝障害の病因に関与していた。本明細書では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｍＦＡＯ活性を上昇させる新規薬理学的アプローチが提供される。代謝代償不全および臨床表現型を予防するため、心臓特異的超長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）欠損症を有する前臨床マウスモデルを用い、ｍＦＡＯ活性を増大させてもよい。臨床的に報告されたＶＬＣＡＤ欠損症被験者由来のよく特徴付けられたヒト線維芽細胞株を用い、化合物のｍＦＡＯ回復の有効性を検討することができる。治療法はｍＦＡＯ欠損症小児および成人、また高度に蔓延した非先天性代謝障害患者の生命に多大な影響を与える。
【００１０】
長鎖脂肪酸代謝の主な経路はミトコンドリア脂肪酸のβ酸化（ｍＦＡＯ）である。心筋はｍＦＡＯにより正常な心血管機能に必要なエネルギー（ＡＴＰ）の５０％以上を生成する。ｍＦＡＯは、骨格筋（特に運動中）および腎臓（尿細管上皮細胞はエネルギー源としてｍＦＡＯに依存する）のＡＴＰ産生にも不可欠である。最後に、飢餓または絶食に対する生命適応反応の本質的要素は、主に肝ｍＦＡＯ活性に依存する。絶食は、脂肪組織にトリグリセリドとして保存された脂肪酸の放出、輸送、および脂肪酸の肝臓（ｍＦＡＯによる酸化がトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルと酸化的リン酸化を刺激する）への取り込みを誘発し、ケトン体、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸塩、およびアセトアセテートの合成と放出を刺激する。ケトン体は脳および腎臓による代謝の燃料として使用される。
【００１１】
ｍＦＡＯの生物学的重要性は、ｍＦＡＯ経路／タンパク質の欠損により引き起こされる遺伝的代謝障害患者で強調される。ｍＦＡＯ障害患者は、典型的には絶食、寒さ、および運動への不耐性を示し、生命に危険を及ぼす症候群に進行する可能性がある低ケトン性低血糖症、および心臓および骨格筋異常を示すことが多い。
【００１２】
ｍＦＡＯは、ｍＦＡＯに関与する約２０種類の遺伝子の発現を制御する転写機構、および転写後機構により制御される。ｍＦＡＯの転写後制御は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１およびＡＣＣ２）により生成されるマロニルＣｏＡによるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ１）のアロステリック阻害が関与する。ＣＰＴ１はミトコンドリアに輸送するため、脂肪酸−ＣｏＡ種をアシルカルニチンに変換する。ミトコンドリア内では、４段階の周期性酵素プロセスが各サイクル２つの炭素により長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ種を短縮し、最終的にアセチル−ＣｏＡおよび二酸化炭素を生成する。例えば、パルミトイルＣｏＡの完全な酸化には、８個のアセチルＣｏＡ分子を生成するβ酸化のスパイラルまで７サイクル必要であり、これはＴＣＡサイクルと分泌されたケトン体の産生で分割される。最近の根拠では、ｍＦＡＯ経路の重要タンパク質は転写後修飾、リン酸化、アセチル化、およびＳ−ニトロシル化により制御されることが示された。超長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）はヒトのパルミトイルＣｏＡ脱水素の８０％以上に関与し、一酸化窒素（ＮＯ）により制御される。心血管系におけるシグナル伝達分子としてのＮＯの発見は多数の研究を促し、これらの研究は内皮由来ＮＯの合成および生物学的利用能の欠損は心血管系および代謝障害の病因の中心であることを示している。革新的プロテオーム技術により、選択的Ｓ−ニトロシル化、すなわち、ＮＯ同等物によるシステイン残基の翻訳後修飾は代替的であるが、優遇されるＮＯを介したシグナル伝達経路であると判断された。このデータは、ｍＦＡＯ経路の酵素、特にＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化が脂肪酸酸化の重要な制御因子であることを確立している。マウス肝では、ＶＬＣＡＤタンパク質がシステイン２３８を内因的および選択的にＳ−ニトロシル化する。Ｓ−ニトロシル化はＶＬＣＡＤの触媒効率を２９倍上昇させる。
【００１３】
内皮一酸化窒素合成酵素ヌル（ｅＮＯＳ−／−）またはレプチンヌルマウスなどＮＯ欠損症の状態では、野生型マウスと比較してｍＦＡＯ速度が低下するＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化が行われず、肝トリグリセリドが著しく増加し、最終的に脂肪肝に至る。本明細書では、Ｓ−ニトロソ−グルタチオン（ＧＳＮＯ）または亜硝酸塩を介したＮＯ同等物の薬理学的送達がＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化と触媒効率を回復させ、全体的なｍＦＡＯを改善し、肝臓の病的表現型を抑制する。
【００１４】
さらに、同様の戦略により、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化の薬理学的回復がＶＬＣＡＤ欠損症の条件でＶＬＣＡＤ比活性度を改善することが示された。皮膚線維芽細胞は臨床的に診断されたＶＬＣＡＤ欠損患者から採取し（ＶＬＣＡＤ遺伝子の変異：Ｇ１８５Ｓ／Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１２２Ｄ／Ｎ１２２Ｄ、Ｐ８９Ｓ／Ａ５３６ｆｓＸ５５０、およびＰ９１Ｑ／Ｇ１９３Ｒ）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（ＳＮＡＣ）を処理した。４例全員が残余ＶＬＣＡＤタンパク質および活性を有する。線維芽細胞をＳＮＡＣで処理し、ＶＬＣＡＤをシステイン２３７（マウスの配列では２３８、哺乳類ＶＬＣＡＤｓで保存されている残基）でＳ−ニトロシル化した時の変異型ＶＬＣＡＤ比活性度の大幅な上昇が報告された。さらに、ｍＦＡＯ活性およびアシルカルニチンレベルは、ＳＮＡＣ処理したＶＬＣＡＤ欠乏細胞で正常化した。全体として、これらのデータはｍＦＡＯを補正し、臨床症状を軽減するＮＯによる薬理学的介入の有用性を証明している。
【００１５】
ＮＯによる薬理は、ニトログリセリンに始まり、シルデナフィルおよび吸入ＮＯに至る長い歴史がある。現在の薬理学的展望には、無機硝酸塩および硝酸塩を使用して様々な心血管および代謝障害を有するヒトにおいて、ＮＯを補充するものを含む。内因的に生成したＮＯの代謝産物である硝酸塩は、数種類の経路で活性化し、生物活性ＮＯを生成することができるＮＯの保存プールである。数種類の形態の硝酸塩（経口錠剤、持続放出錠、および吸入）は安全と考えられ、ヒトの臨床試験に承認されている。他の選択肢は、（ｉ）Ｓ−ニトロソ−グルタチオン（ＧＳＮＯ）（生物活性ＮＯの生理的形態）またはＧＳＮＯ前駆体（トリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ））、（ｉｉ）Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（ＳＮＡＣ）（ＧＳＮＯと同じ）またはその前駆体Ｎ−アセチル−システインを含む。これらの２分子は生物活性ＮＯを送達するだけでなく、タンパク質のＳ−ニトロシル化を回復するため、タンパク質のシステイン残基の還元チオールと同等のＮＯの選択的移動を行うことができる。
【００１６】
ＶＬＣＡＤの場合のように、大規模なプロテオームの研究から、マウスプロテオソームが進化的に保存されたタンパク質セグメント内およびＳ−ニトロシル化で修飾された一般にアノテーションの付いた官能領域の外に独特のシステイン残基を有するタンパク質を含むことが明らかとなった。批判的に言えば、このデータは、Ｓ−ニトロシル化は生物学的に関連するタンパク質ネットワークおよび顕著には代謝経路内に制限されることを示した。この限られた、限定的生化学的所見は、タンパク質のＳ−ニトロシル化の回復が薬理学的に達成可能であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍＦＡＯタンパク質のＳ−ニトロシル化を標的とするファーマコフォアは、非効率な脂肪酸代謝により誘導される疾患の条件で使用することができることを意味している。本明細書では、明確な長期治療がないため、小児代謝障害をターゲットとしている。具体的には、ｍＦＡＯ障害の中で２番目に多いＶＬＣＡＤ欠損症をターゲットとする。（残余タンパク質および酵素活性を有する）ＶＬＣＡＤ欠損症小児は、肥大型または拡張型心筋症、心膜液、および不整脈、また低血圧、肝腫大、および間欠的低血糖を示す。また筋破壊、運動不耐性、および筋肉痛も示す。臨床的に診断された場合の治療には中鎖トリグリセリドでカロリーが添加された低脂肪ミルクが含まれる。この標準的治療アプローチの他に、２つの臨床試験で食品添加物として使用されるオイルのベザフィブラートおよびトリヘプタノインを検討した。ほとんどのタイプの原発性および続発性異脂肪血症で効果的なベザフィブラートも、長鎖脂肪酸酸化障害の臨床試験で使用されてきた。しかし、無作為化臨床試験では、ベサフィブラート単剤ではＶＬＣＡＤ欠損症患者の運動時の臨床症状または脂肪酸酸化を改善しなかった。グリセロール骨格にエステル化されるヘプタン酸（７炭素の脂肪酸）を３つ有するトリグリセリドのトリヘプタノインは、長鎖脂肪酸酸化欠損症小児を標的とし、筋肉痛の抑制を目的とし、心機能を改善するための第２相試験が行われている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ０１３７９６２５およびＮＣＴ０１８８６３７８）。トリヘプタノインは２つの役割を果たす可能性があり、ｍＦＡＯに単鎖脂肪酸を提供し、ピルビン酸塩の産生（カルボキシル化によりＴＣＡサイクルの中間基質であるオキサロ酢酸を産生する）に基質（パルミトイルＣｏＡ）を提供することでアナプレロティック機能も果たす。これらの好ましい機能およびＮＯ同等物を送達する必要性を考え、既知のエステル化手順に基づく新規誘導体を本明細書に提供する。３ニトロ基でエステル化されたグリセロール骨格は、生物活性ＮＯを補充するニトログリセリンを生成し、救命血管作用を有する。したがって、以下に説明するとおり、一硝酸ジヘプタノイングリセロール付加体、主に１，３−ジヘプタノイン−２−モノ硝酸塩を生成した。この分子はトリヘプタノインの二重代謝機能を保持し、ミトコンドリア内にＮＯ同等物を供給し、ミトコンドリアが触媒効率を増大させるＳ−ニトロシル化により残余ＶＬＣＡＤを選択的に修飾する。したがって、これらの新規化合物は３つの重要な生物学的機能を満たす。
【００１７】
以下に見られるとおり、ｍＦＡＯは生物活性一酸化窒素の有効性上昇によりｉｎ  ｖｉｖｏで強化される。これは、最新の臨床試験でヒトに安全に投与される亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）分子の使用により達成された。以下の例ではｅＮＯＳ−／−マウスを使用したが、亜硝酸塩は心特異的ＶＬＣＡＤ（ｃＶＬＣＡＤ）欠損症マウスに経口投与することができる。マウスでは、ＶＬＣＡＤの心特異的欠失により、先行するストレスがなくても、生後６ヵ月までに拡張型心筋症および左心室機能の低下に至る。同年齢で、ヘテロ接合性ｃＶＬＣＡＤ欠乏（ｃＶＬＣＡＤ＋／−）マウスは一部心機能に障害を示し、遺伝子量および時間依存的効果を示す。ｃＶＬＣＡＤ＋／−マウスは９〜１２ヵ月で進行性の心臓病態を発症する。したがって、前記ｃＶＬＣＡＤ＋／−は、経時的にモニター可能な表現型を生じ、薬理学的に調節可能な残余ＶＬＣＡＤ活性を有しているため、適切な前臨床モデルを提供する。包括的な質量分析に基づく技術および機能分析により、経口亜硝酸塩の投与が代謝の心臓、肝臓、および恒常性制御に与える長期的影響をモニターすることができる。心エコーおよび核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）技術を用い、心臓の構造および機能をそれぞれモニターしてもよい。心臓エネルギー論、エネルギー支出、および活動性は確立された生化学的方法および代謝ケージによりモニターしてもよい。脂肪酸酸化率、アシルカルニチン、およびアシルＣｏＡ種はＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量化してもよい。酵素活性、タンパク質発現レベル、および病巣部位の特定は確立された分析的および生化学的方法により評価してもよい。ＶＬＣＡＤの部位特異的Ｓ−ニトロシル化およびＳ−ニトロシル化により修飾された分画の定量化を行ってもよい。
【００１８】
特定の実施形態では、雄Ｃ５７／ＢＬ６および（バックグラウンドがＣ５７／ＢＬ６の）ヘテロ接合性心臓特異的ＶＬＣＡＤ欠乏（ｃＶＬＣＡＤ＋／−）マウスを使用してもよい。上記に説明したとおり、ｃＶＬＣＡＤ＋／−マウスは心臓ＶＬＣＡＤ欠損症を有するヒトの重大な代謝および表現型異常を再現している。ｃＶＬＣＡＤ＋／−マウスは、６ヵ月齢で心臓異常（軽度拡張型心筋症および左心室機能のわずかな低下）の徴候を示す。これらの機能障害は９〜１２ヵ月齢までに病的表現型（拡張終期および収縮終期の特徴亢進および短縮率の低下）に進行する。
【００１９】
試験化合物に対してｃＶＬＣＡＤマウスを用いる特定の実施形態では、ｃＶＬＣＡＤ＋／−マウスを２群に分ける。１群には投与を行わないが、もう１群には投与を行う（飲用水中に０．１ｍＭ  ＮａＮＯ２。この濃度は、一酸化窒素欠損症のモデルである内皮一酸化窒素合成酵素ヌルマウス（ｅＮＯＳ−／−）を用いた予備データに基づき選択した）。マウスが心機能障害の徴候を示さない場合、３ヵ月齢で投与（例えば、亜硝酸ナトリウムの投与）を開始してもよい。心臓表現型を確認するため、心臓の構造および左心室機能を非侵襲的画像法により毎月評価してもよい。非投与ｃＶＬＣＡＤ＋／−マウスの心臓病理が確定した時点で実験を終了してもよい。以下のパラメータの一部および／またはすべてを定量化してもよい。（１）代謝モニタリング：マウスは（例えばＣｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって）代謝ケージで個別飼育してもよい。体重、食餌および水分摂取量、活動量、体温、酸素消費量、および／または二酸化炭素産出量など、１若しくはそれ以上のパラメータをモニターする。パラメータは（例えばOxymax/ Comprehensive Lab Animal Monitoring System（ＣＬＡＭＳ）を用い）自動的にモニターする。典型的な実験では、マウスを１日ケージに順化し、２４時間モニターする（データは３０〜４０分間隔で収集する）。このモニタリングは治療開始後毎週実施する。エネルギー源の指標である呼吸商（ＶＣＯ２／ＶＯ２）は、酸素消費量および二酸化炭素産生量の測定から計算する。典型的には、摂食状態で呼吸商は１．０であり、呼吸商０．７０未満は脂肪が主な燃料源であることを示している。実験中、活動性、エネルギー支出、呼吸商（ＲＥＲ）、体温、および／または心拍数をモニターする。（２）心臓の構造および機能の評価。心臓の構造は、イソフルランで麻酔したマウスにおいてＭＲＩ技術により決定する。左心室の機能および構造を決定する。心機能はＭモード心エコー法により評価する。この技術は、ｃＶＬＣＡＤ−／−マウスの心機能をモニターすることへの応用に成功した。心臓ホモジネート中のＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、およびＮＡＤレベルの定量は、ＨＰＬＣ法により行う。（３）脂質代謝産物およびアシル−カルニチン種の定量とプロファイリング。トリグリセリド、遊離脂肪酸、およびリン脂質の血漿、心臓、および肝臓レベルを確立された測定法により定量する。診断に臨床的に使用されるバイオマーカーであるアシルカルニチンは、安定アイソトープ標識内部標準を用い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより行う。（４）恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）指数。標準的方法により、一晩絶食したマウスで血漿グルコースおよびインスリンを測定する。（５）脂肪肝および肝障害の評価。確立されたプロトコールにより、意識が消失したマウスで肝ＭＲＩを行う。ヘマトキシリン、Ｂｉｅｂｒｉｃｈ  Ｓｃａｒｌｅｔ−ｆｕｃｓｈｉｎ、およびアニリンブルー（トリクロム染色）を用いた肝組織染色を行い、表現型の有無を確認する。マウス血漿のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値を測定することで肝障害を評価する。（６）ｍＦＡＯ率の定量。ｍＦＡＯ率の定量については、未処理の心臓および肝臓にＵ１３−���１６パルミチン酸塩を灌流し、確立されたプロトコールにより［１，２］−１３Ｃ−アセチル−ＣｏＡの生成をモニターし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量する。ＶＬＣＡＤタンパク質レベル、酵素活性、動態、およびＳ−ニトロシル化の解析。（８）亜硝酸塩投与終了時の心臓および肝臓Ｓ−ニトロソプロテオームの機能的呼び出し。治療のためＮａＮＯ２を送達させる結果の１つの可能性は、タンパク質にシステイン残基に追加する修飾である。組織ホモジネートのＳ−ニトロソシステインプロテオームを入手し、遺伝子オントロジー（ＧＯ）の用語および機能的分類について分析する。これらの解析は、特異的分子機能がＮａＮＯ２投与マウスで高くなっているか否かを判定する。また、世界的なプロテオームの同定を行い、ＮａＮＯ２を投与したマウスのタンパク質発現の相対的変化を定量することができる。
【００２０】
タンパク質のＳ−ニトロソ化は、酵素活性、タンパク質局在化、および安定性を制御し、一酸化窒素を介したシグナル伝達に関与する重要な一酸化窒素由来可逆的翻訳後修飾である（Stamler et al.(2001) Cell 106:675-683; Hess et al.(2005) Nat. Rev. Mol.Cell Biol., 6:150-166; Benhar et al.(2008) Science 320:1050-1054; Jaffrey et al.(2001) Nat. Cell Biol., 3:193-197; Kornberg et al.(2010) Nat. Cell Biol., 12:1094-1100; Matsushita et al.(2003) Cell 115:139-150; Mitchell et al.(2005) Nat. Chem.Biol., 1:154-158; Cho et al.(2009) Science 324:102-105; Mannick et al.(2001) J. Cell Biol., 154:1111-1116）。Ｓ−ニトロシル化の機能的役割は個々のタンパク質で報告されたが、ｉｎ  ｖｉｖｏの生理的条件下でのＳ−ニトロシル化およびＳ−ニトロシル化部位の世界的解析はまだ限定的である。このため、質量分析（ＭＳ）に基づくプロテオームアプローチが実施され、これにより複雑な混合物のＳ−ニトロソシステイン残基の部位特異的同定が可能になる（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963）。この方法は、Ｓ−ニトロソシステインペプチドまたは未処理のＳ−ニトロシル化タンパク質の有機水銀化合物による選択的濃縮に基づいている。ペプチドは過ギ酸が放出され、これがシステインをスルホン酸に酸化することから、ＭＳによる修飾ペプチドの正確な検出が可能となる。代わりに、タンパク質をそのまま溶出し、特殊なタンパク質を抗体によりプローブし、修飾タンパク質分子を定量することができる。検出の特異度を確保するため、サンプルをＳ−ニトロソシステインを除去する紫外（ＵＶ）光で前処理してネガティブコントロールを作成し、同じ条件で分析する（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963）。これらの方法論を用い、６種類の野生型マウス臓器、および内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）欠乏マウスの同組織の内因性Ｓ−ニトロシル化タンパク質を同定した。マウスＳ−ニトロソシステインプロテオームの世界的発見により、一酸化窒素の重要な酵素源の１つがない状態で、Ｓ−ニトロシル化の中心となる生化学経路の潜在的機能的制御およびこのプロテオームの変化が明らかとなっている。実際、解糖、糖新生、トリカルボン酸サイクル、および酸化的リン酸化に関与する酵素の選択的Ｓ−ニトロシル化が認められ、この翻訳後修飾が代謝およびミトコンドリア生体エネルギーを制御することを示している。内皮一酸化窒素合成酵素欠乏マウスにはない、マウス肝酵素超長鎖アシル補酵素（ＣｏＡ）脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）のＣｙｓ２３８でのＳ−ニトロシル化がこの触媒効率を改善した。さらに、Ｓ−ニトロシル化剤を変異型ＶＬＣＡＤを有する細胞に投与すると酵素活性が上昇した。これらのデータは、ミトコンドリアにおける脂肪酸β酸化の制御にタンパク質のＳ−ニトロシル化が関与していることを示している。
【００２１】
本発明は、脂肪酸代謝障害を阻害、処理、および／または予防する方法を含む。特定の実施形態では、脂肪酸代謝障害が脂肪酸酸化障害／欠損症（例えば、ｍＦＡＯ障害／欠損症）である。脂肪酸代謝障害には、これに限定されるものではないが、超長鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症（ＶＬＣＡＤＤ、例えば、１６〜２４炭素）、長鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症（ＬＣＡＤＤ、例えば、１２〜１８炭素）、長鎖３−ヒドロキシアシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症（ＬＣＨＡＤＤ）、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤＤ、例えば、６〜１２炭素）、短鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＳＣＡＤＤ、例えば、４〜６炭素）、中／短鎖Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症  （Ｍ／ＳＣＨＡＤＤ）、マルチプルアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＡＤＤ）、ミトコンドリア三官能性タンパク質欠損症、短鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ＳＫＡＴＤ）、中鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ＭＣＫＡＴＤ）、２，４−ジエノイルＣｏＡ還元酵素欠損症、およびグルタル酸血症ＩＩ型（ＧＡ−ＩＩ）を含む。特定の実施形態では、前記脂肪酸酸化障害がＶＬＣＡＤＤである。
【００２２】
本発明の方法は、少なくとも１種類のニトロシル化剤、特にＳ−ニトロシル化剤を被験者に投与する工程を有する。本明細書で用いるとおり、「ニトロシル化」の用語はポリペプチド、特にチオール基（ＳＨ）、酸素、炭素、または窒素への一酸化窒素（ＮＯ）の付加を指す。「ニトロシル化」の用語は一酸化窒素構造のチオール基への付加により、Ｓ−ニトロソチオール（ＳＮＯ）が形成する工程を指す。「ニトロシル化剤」は、一酸化窒素基をポリペプチドのチオールに移行し、Ｓ−ニトロソチオールを形成する化合物を指す。Ｓ−ニトロシル化剤の例は、Feelisch, J., Stamler, J. S. (1996) Donors of Nitrogen Oxides.Feelisch, M. Stamler, J. S. eds.Methods in Nitric Oxide Research , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UKに提供される。Ｓ−ニトロシル化剤には、これに限定されるものではないが、直接ニトロシル化を行うＳ−ニトロシル化剤（例えば、ＧＳＮＯ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳ−ニトロシル化剤に修飾される前駆体薬剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））、およびニトロシル化剤を生成する一酸化窒素発生源（例えば、亜硝酸塩＋ＧＳＨまたはＮＡＣ）、およびエステルおよび／またはその塩を含む。Ｓ−ニトロシル化剤には、これに限定されるものではないが、酸性亜硝酸塩、塩化ニトロシル、亜硝酸アルキル（例えば、亜硝酸エチル）、亜硝酸アミル、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンオリゴマー、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、硝酸オキシド、Ｓ−ニトロソヘモグロビン、Ｓ−ニトロソアルブミン、５−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−γ−メチル−Ｌ−ホモシステイン、５−ニトロソ−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−γ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−δ−チオ−Ｌ−ロイシン、およびＳ−ニトロソアルブミン、また薬学的に許容されるその塩を含む。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（ＳＮＯ−ＮＡＣ）である。本発明の方法は、さらに、脂肪酸代謝障害の治療に用いる少なくとも１種類の他の治療薬の（連続および／または同時）投与を有する。例えば、前記方法は、さらにトリヘプタノインおよび／またはベザフィブラートを有してもよい。前記被験者には、問題となる脂肪酸（例えば、欠乏する酵素の基質となる脂肪酸）、例えば、１２炭素以下の脂肪酸または（例えば、ＶＬＣＡＤＤの）１２または１６炭素以上の脂肪酸の存在量を減少または排除する食事を処方してもよい。
【００２３】
特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がニトロ化脂肪酸である／を有する。前記Ｓ−ニトロシル化剤は一硝酸、二硝酸、三硝酸、またはそれ以上を導入してもよい。特定の実施形態では、前記脂肪酸が１２炭素未満、特に１０炭素未満を有する。特定の実施形態では、前記脂肪酸が少なくとも７炭素を有する。特定の実施形態では、前記脂肪酸が約７〜約１１炭素、特に約７〜約９炭素を有する。前記Ｓ−ニトロシル化剤は１つの脂肪酸、２つの脂肪酸、３つの脂肪酸、またはそれ以上を有してもよい。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がトリグリセリドであり、１若しくは２つの脂肪酸がＮＯ同等物（例えば、硝酸、ニトロソ、ニトロなど）で置換される。特定の実施形態では、前記硝酸を３つの位置のいずれかでグリセロール骨格に追加することができる。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がヘプタノイン、特にジヘプタノインまたはモノヘプタノインを有する。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤がジヘフタノインを有する。ヘプタノインの例には、これに限定されるものではないが、１，３−ジヘプタノイン−２−一硝酸塩、１，２−ジヘプタノイン−３−一硝酸塩、２，３−ジヘプタノイン−１−一硝酸塩、１，３−ニ硝酸−２−ヘプタノイン；１，２−ニ硝酸−３−ヘプタノイン、および２，３−二硝酸−１−ヘプタノインを含む。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤が一硝酸ジヘプタノイン（ジヘプタノイン一硝酸塩）である。特定の実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤が二硝酸ヘプタノイン（例えば、１，３−二硝酸−２−ヘプタノイン）である。図８は、これらの化合物の特定の化学構造を提供する。
【００２４】
ジヘプタノイン一硝酸塩は、グリクレリル−２−一硝酸塩およびヘプタン酸から合成することができる。グリセリル−２−一硝酸塩（炭素２の位置にニトロ基を持つグリセロール）は粘度の高い吸湿性の液体であり、水、アルコール、およびエーテルに溶解する。前記グリセリル−２−一硝酸塩とヘプタノイン酸とのエステル化では、３−ジヘプタノイン，２一硝酸塩が得られる。グリセリル−２−一硝酸塩を塩基性触媒存在下、１：１．５のモル比でヘプタノイン酸と反応フラスコに入れる。前記混合物を２時間、その融点を超える温度に加熱してもよい。前記温度をゆっくりと低下させ、高分子量脂肪酸の１，３−ジグリセリドの選択的結晶化によりこの製剤で直接エステル交換が起こるようにしてもよい。前記触媒は酢酸および１，３−ジグリセリドにより不活性化し、ろ過により回収、結晶化により精製してもよい。２−一硝酸−１，３−ジグリセリドは、第４級アンモニウム塩存在下、ヘプタン酸を用いてグリセリル−２−一硝酸塩を加熱することで形成してもよい。いずれのアプローチも相対的に軽度の反応であり、収率が高く、１，３−ジグリセリドの純度が高くなる。典型的収率は９８％超である。純度はＨＰＬＣ−質量分析により評価してもよい。前記製剤は、ＶＬＣＡＤ遺伝子の変異を有するヒト線維芽細胞で検討してもよい（実施例２参照）。
【００２５】
Ｓ−ニトロシル化剤は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する組成物として、前記被験者に送達してもよい。特定の実施形態では、前記組成物はさらに、上述のとおり脂肪酸代謝障害の治療を目的とした少なくとも１つの他の治療薬を有する。
【００２６】
上文に述べたとおり、本発明は、被験者の脂肪酸代謝障害を阻害、処理、および／または予防する方法を含む。前記方法は、さらに、本発明の治療薬投与前に、前記被験者の脂肪酸代謝障害を診断する工程を有してもよい。より具体的には、前記方法は、さらに、前記被験者が健常被験者と比較し、不完全なＶＬＣＡＤ酵素活性を有するか否かを判定する工程を有してもよい。ＶＬＣＡＤ活性を決定する方法は当該分野で既知である。例えば、生体サンプルは前記被験者から採取し、ＶＬＣＡＤ酵素測定（例えば、フェリセニウムイオンを用いたアシルＣｏＡ脱水素酵素測定）を行い、（例えば健常被験者および／または脂肪酸代謝障害を有する被験者の）標準的な値と比較するか、または健常被験者および／または脂肪酸代謝障害を有する被験者の生体サンプルと直接比較してもよい。代わりに（または加えて）、前記被験者が（例えば、表１に示す）ＶＬＣＡＤのミスセンス変異および／または（例えば、活性が欠如したＶＬＣＡＤとなる）ヌル変異を有するか否かを決定することにより、ＶＬＣＡＤ活性を測定してもよい。ＶＬＣＡＤ変異については、Ｇｏｂｉｎ−Ｌｉｍｂａｌｌｅら（Am. J. Hum.Genet.(2007) 81:1133-1143（例えば、図１および表１参照））およびＡｎｄｒｅｓｅｎら（Am. J. Hum.Genet.(1999) 64:479-494（例えば、表参照２））の研究でも提供される。これらの参考文献それぞれは、その全体が示されるように本明細書に組み込まれる。ＶＬＣＡＤ変異を検出する方法は当該分野で既知である。例えば、生体サンプルは前記被験者から採取し、前記ＶＬＣＡＤ遺伝子の配列を決定するか、または（例えば、野生型または変異型に特異的な）１若しくはそれ以上のプローブにより生体サンプルの核酸を採取してもよい。代わりに、変異型ＶＬＣＡＤの有無は、野生型または変異型ＶＬＣＡＤに免疫学的に特異的な抗体を使用して検出してもよい。前記被験者がＶＬＣＡＤ酵素活性が欠如していると判断された、および／またはミスセンスまたはヌル変異を保持していると判断された場合、前記被験者は本発明の方法により治療してもよい。
【００２７】
本発明の組成物は、適切な経路、例えば、注射（例えば、局所、直接、または全身投与）、経口、経肺、局所、経鼻、または他の投与経路により投与することができる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、局所、吸入、経皮、肺内、動脈内、直腸内、筋肉内、および鼻腔内投与を含む適切な方法により投与してもよい。特定の実施形態では、前記組成物は経口および／または腹腔内投与される。一般に、前記組成物の薬学的に許容される担体は、希釈剤、保存料、安定剤、乳化剤、補助剤、および／または担体から成る群から選択される。前記組成物には、様々な緩衝剤含有量（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤、および界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、および充てん剤基質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含むことができる。前記組成物は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸／グリコシドコポリマー、エチレンビニル酢酸コポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子製剤、またはリポソームに組み込むことができる。そのような組成物は、本発明の薬学的組成物の成分に関する物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出率、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス率に影響することもある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences and Remington: The Science and Practice of Pharmacyを参照）。本発明の薬学的組成物は、例えば、液体形態で調製することができ、または乾燥粉末形態（例えば、後で再溶解する凍結乾燥製剤）とすることもできる。
【００２８】
本明細書で説明された治療薬は、薬学的製剤として被験者／患者に投与される。本明細書で使用する「患者」の用語は、ヒトまたは動物被験者を指す。本発明の組成物は、医師の指導のもと、治療的または予防的に利用してもよい。
【００２９】
本発明の薬物を有する組成物は、薬学的に許容される担体を投与するため、都合よく製剤化してもよい。選択した媒体中の薬物濃度は変化する可能性があり、前記媒体は前記薬学的製剤の望みの投与経路により選択することができる。従来の媒体または薬物が投与される薬物と適合しない場合を除き、前記薬学的製剤での使用は検討される。
【００３０】
特定患者への投与に適した本発明の薬物の用量および投与方法は、前記薬物が投与される患者の年齢、性別、体重、全身の医学的状態、および治療または予防のため前記薬物が投与される特定の状態およびその重症度を考慮し、医師が決定することができる。前記医師は投与経路、薬学的担体、および薬物の生物活性を考慮してもよい。適切な薬学的製剤の選択は、選択された投与様式によっても決まる。
【００３１】
本発明の薬学的製剤は、投与を簡便にし、用量を均一とするため、投与量単位で製剤化することができる。本明細書で用いる投与量の単位形態は、治療または予防的療法を受ける患者に適した薬学的製剤の物理学的な離散単位を指す。各投与量は、選択された薬学的担体と関連した望みの作用を生じるために計算された量の活性成分を含む必要がある。適切な投与量単位を決定する方法は、当業者に周知である。
【００３２】
投与量単位は患者の体重に比例して増減してもよい。特定の状態を軽減または予防するために適した濃度は、当該分野で周知の投与量濃度曲線の計算から決定することができる。
【００３３】
前記薬物を有する薬学的製剤は、前記病的症状が軽減または改善するまで、適切な間隔、例えば、少なくとも１日２回以上で投与することができ、この後前記投与量を維持用量まで減量することができる。特定の症例において適切な間隔は、通常、前記患者の状態に依存する。
【００３４】
本明細書で説明された特定製剤の毒性および有効性（例えば、治療、予防上のもの）は、これに限定されるものではないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞培養、ｅｘ  ｖｉｖｏ、または実験動物を用いるなど、標準的な薬学手順により決定することができる。これらの研究で得られたデータは、ヒトで使用される投与量範囲の製剤化に使用することができる。前記投与量は、投与形態および経路によって変化しうる。投与量および投与間隔は、治療または予防的有効量を送達するために十分な活性成分レベルまで個別に調節してもよい。
【００３５】
定義
以下の定義は、本発明の理解を促すために提供される。
【００３６】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の言及も含む。
【００３７】
「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局により承認されているか、米国薬局方、または他の一般的に認識されている、動物、特にヒトに使用される薬局方に掲載されていることを示す。
【００３８】
「担体」は、例えば、希釈剤、補助剤、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、充てん剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤、または溶媒を指し、これとともに本発明の活性薬物が投与される。薬学的に許容される担体は水および石油、動物、植物、または合成由来のオイルを含むオイルなど、滅菌液体とすることができる。水または食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、担体、特に注射用溶液として利用してもよい。適切な薬学的担体は、例えば、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎの「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、米国ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ）、Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．  Ｒ．の「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(Lippincott, Williams and Wilkins)、Ｌｉｂｅｒｍａｎら編「Pharmaceutical Dosage Forms」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、米国ニューヨーク州Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＫｉｂｂｅら編「Handbook of Pharmaceutical Excipients」（米国薬剤師会、米国ワシントン州）に報告されている。
【００３９】
本明細書に用いる「治療する」の用語は、患者の状態の改善（例えば、１もしくはそれ以上の症状）、前記状態の進行遅延など、疾患に苦しむ患者に利益を与えるすべてのタイプの治療を指す。
【００４０】
本明細書に用いるとおり、「予防する」の用語は、状態（例えば、脂肪酸酸化障害）を発生するリスクがあり、被験者が前記状態を発生する可能性が低下する、被験者の予防的治療を指す。
【００４１】
化合物または薬学的組成物の「治療有効量」は、特定の障害または疾患および／またはその症状を予防、阻害、または治療するために有効な量を指す。例えば、「治療有効量」は、被験者における脂肪酸酸化を調節するために十分な量を指してもよい。
【００４２】
本明細書に用いるとおり、「被験者」の用語は、動物、特に哺乳類、特にヒトを指す。
【００４３】
本明細書に用いるとおり、「生体サンプル」は、組織、組織サンプル、細胞、および生体液（例えば、血液）を含む被験者、特にヒト被験者から採取した生体材料サンプルを指す。
【００４４】
本明細書に用いるとおり、「プローブ」の用語は、精製された制限酵素消化で自然に発生するか、合成されたかによらず、プローブと相補的な配列を有する核酸とアニーリングまたは特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＲＮＡまたはＤＮＡの核酸を指す。プローブは、１本鎖または２本鎖であってもよい。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブ源、および方法の利用など、多くの要因に依存する。例えば、診断の用途では、前記標的配列の複雑さによって、前記オリゴヌクレオチドプローブが典型的には１５〜２５ヌクレオチド以上を含むが、それよりも少ないヌクレオチドを含んでもよい。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖と相補的となるように選択される。これは、前記プローブが「特異的にハイブリダイズする」または所定の条件下でそれぞれの標的鎖とアニーリングすることができるよう、十分相補的である必要があることを意味する。したがって、前記プローブ配列は、前記標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントは前記プローブの５’または３’末端に結合し、前記プローブ配列の残りは標的鎖に相補的であってもよい。代わりに、前記プローブ配列が標的核酸配列と十分相補的で、それと特異的にアニーリングするならば、非相補的塩基またはより長い配列をプローブに散在させることができる。
【００４５】
以下の例は、本発明の様々な実施形態を説明するために提供される。例はいかなる方法でも本発明を制限する意図はない。
【実施例１】
【００４６】
材料と方法
化学物質と試薬
パルミトイルＣｏＡリチウム塩およびヘキサフルオロリン酸フェリセニウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびチトクロムｃ酸化酵素サブユニットＩは、それぞれＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＡｂｃａｍから入手した。ウサギおよびヤギ（Ｇ−１６クローン）ポリクローナル抗ＶＬＣＡＤ抗体は、それぞれＧｅｎｅＴｅｘおよびＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。使用したすべての化学物質および試薬は分析用グレードとした。
【００４７】
マウス器官の単離とタンパク質ホモジネートの調製
すべてのマウス研究はチルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア研究所、施設動物ケア・使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の審査および承認を得た。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｎｏｓ３ｔｍ１Ｕｎｃ（ｅＮＯＳ−／−）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、およびＬｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成獣マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ｏｂ／ｏｂマウスについては、２日ごとにＰＢＳまたは５ｍＭ  ＧＳＮＯを注入した４週間の期間中、食餌摂取量と体重を記録した。平均食餌摂取量はＰＢＳおよびＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスでそれぞれ４２±９ｇおよび４１±１０ｇであった（１遺伝子型あたりｎ＝４匹）。同期間の平均体重変化量は、ｏｂ／ｏｂ  ＰＢＳ注入マウスおよびｏｂ／ｏｂ  ＧＳＮＯ注入マウスでそれぞれ２８．２±１．０および２８．１±４．０であった（１遺伝子型あたりｎ＝４匹）。マウスはＣＯ２で麻酔し、血液は左心室から灌流前に採取した。傷のない臓器を採取し、直ちに液体窒素で凍結、使用まで−８０℃で保存した。組織は、テフロン製乳棒およびＪｕｍｂｏ  Ｓｔｉｒｒｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、氷上で溶菌緩衝液３ｍｌ［１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、０．１ｍＭネオクプロイン、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびプロテアーゼ阻害剤を含む２５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７）］にホモジナイズした。前記ホモジネートは４℃で３０分間、１３，０００ｇで遠心分離した。前記可溶性タンパク質分画を回収し、前記タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定した。陰性対照サンプルのサンプル調製および生成は、報告されているとおり行った（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963）。
【００４８】
Ｓ−ニトロソシステインプロテオームの化学濃縮と部位特異的同定
カラムの調製と活性化、有機水銀樹脂を用いた反応用のホモジネートの調製に関する詳細な実験手順は報告されている（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963）。各組織３つの生体サンプルを分析した。各サンプルは、同一条件下で対応するＵＶ前処理陰性対照を分析した。偽同定率は脳で<６％、他のすべての臓器で<３％であった。洗浄では、６つの臓器の脂質含有量に違いがあるため、厳密な条件を選択した。カラムは、最初に３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５％  ＳＤＳを含む５０ＢＶ（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）の５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）で洗った後、０．０５％  ＳＤＳを含む同じ緩衝剤５０ＢＶで洗った。次に、３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１Ｍ尿素を含む５０ＢＶの５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗った後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１Ｍ尿素を含む同じ緩衝剤５０ＢＶで洗った。最後に、２００ＢＶの水で洗った後、タンパク質を５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール水溶液１０ｍｌで溶出した。サンプルを濃縮し、ｇｅｌ−ＬＣ（液体クロマトグラフィー）−ＭＳ／ＭＳ分析で分析した。最後に水で洗浄後のオンカラム消化については、カラムを１０ＢＶの０．１Ｍ重炭酸アンモニウムで洗った。結合したタンパク質を、室温の暗所で１６時間、１ＢＶの０．１Ｍアンモニウム中Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ  （１μｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて消化することとした。次に、前記樹脂を３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１Ｍ重炭酸アンモニウム４０ＢＶで洗った後、ＮａＣｌを用いずに同じ緩衝剤４０  ｖｏｌｕｍｅｓで洗った。カラムは４０  ｖｏｌｕｍｅｓの０．１Ｍ重炭酸アンモニウムで洗った後、脱イオン水２００  ｖｏｌｕｍｅｓで洗った。結合したペプチドを溶出するため、１ＢＶの過ギ酸水（過ギ酸は、遮光したガラスバイアル中、振盪しながら、室温で６０分以上、１％ギ酸および０．５％過酸化水素を反応させて合成する）を用い、３０分間、室温でインキュベートした（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963）。溶出したペプチドは、１ＢＶの脱イオン水で前記樹脂を洗って回収した。溶出液は−８０℃で一晩保存した後、０．１％ギ酸３００μｌに凍結乾燥および再懸濁した。ペプチド再懸濁液を低保持チューブ（ｌｏｗ−ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｕｂｅｓ、Ａｘｙｇｅｎ）に移し、高速真空により３０μｌに減量した。ペプチド懸濁液２０μｌを高速液体クロマトグラフィーバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析用に提出した。
【００４９】
ゲル内消化およびＭＳ／ＭＳ解析条件の詳細は、すでに提供されている（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963; Keene et al.(2009) Proteomics 9:768-782）。以下の例外はあるが、説明するとおり、Ｓ−ニトロソシステインプロテオームを作成するＭＳ後解析（表Ｓ１〜Ｓ６）を行った。同じ臓器のタンパク質とマッチしなかったシステイン含有ペプチドを、他の臓器で独立して同定されたタンパク質とマッチさせた。
【００５０】
細胞内局在性は、既存のUniProt annotation(www.uniprot.org)またはBaCelLo(gpcr.biocomp.unibo.it/bacello)による予測で決定した。最も重要な生体機能を同定する機能分析をUniProtおよびFatigo(www.fatigo.org)により行った。ＭＳ／ＭＳの生データはwww.research.chop.edu/ tools/ msms/spectra.pdfに蓄積した。
【００５１】
ＶＬＣＡＤ活性アッセイ
ＶＬＣＡＤ酵素活性は報告されているとおり評価した（Lehman et al.(1990) Anal.Biochem., 186:280-284）。簡単に述べると、フェリセニウムイオンをＶＬＣＡＤを介したパルミトイルＣｏＡ脱水素化の人工電子受容体として用いた。０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．２）に肝ホモジネート（最終濃度０．０３μｇ／μｌ）または細胞可溶化物（最終濃度０．０９μｇ／μｌ）を溶解し、１５０ｍＭフェリセニウムイオンと混合し、パルミトイルＣｏＡ（前記アッセイの最終容積は１３０μｌであった）を追加して前記反応を開始した。３００ｎｍでの時間の関数としてフェリセニウムの吸光度の低下が記録され、前記酵素の初期速度（Ｖｏ）は、時間０（パルミトイルＣｏＡを追加した時間）から吸光度の総変化量の５％に対応する時間までの曲線の傾きから決定した。０．０１５〜２ｍＭの少なくとも９種類の濃度を、各動物でＶＬＣＡＤの見かけのＶｍａｘおよびＫＭを実験的に決定するために用いた。実験データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、ミカエリス―メンテン式の非線形回帰にあてはめた。酵素活性１単位は、室温で１分あたり１ｍｍｏｌのフェリセニウムイオンを還元する酵素量と定義される（３００ｎｍでε＝４．３ｍＭ−１ｃｍ−１）（Izai et al.(1992) J. Biol.Chem., 267:1027-1033）。アッセイの特異性を試験する実験では、肝ホモジネートと抗ＶＬＣＡＤ抗体１０ｍｇを２０分間プレインキュベートした。ＵＶ光分解を利用してＳ−ニトロソシステインを除去する場合、前記肝ホモジネートは、氷上で１０分間、従来のＵＶトランスイルミネーター下で照射した。肝ホモジネート（図２Ｈ）および細胞可溶化物（図４）のＶＬＣＡＤの比活性度は、それぞれ０．２５および０．１２５ｍＭのパルミトイルＣｏＡ存在下、測定した。
【００５２】
Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤ分画を定量するため、前記タンパク質は有機水銀樹脂に捕捉した。広範に洗浄後、結合タンパク質を溶出し、抗ＶＬＣＡＤ抗体でプローブした。広範に洗浄後、結合タンパク質を溶出し、抗ＶＬＣＡＤ抗体でプローブした。
【００５３】
肝組織像およびトリグリセリド濃度の定量
ホルマリン固定肝切片を製造業者の指示に従い、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。トリグリセリドはＦｏｌｃｈ法により肝臓から抽出した（Folch et al.(1957) J. Biol.Chem., 226:497-509）。血清および肝臓のトリグリセリド濃度は製造業者（Ａｂｃａｍ）の指示に従い、トリグリセリド定量キットで定量した。
【００５４】
脂肪酸β−酸化の測定
１ｍｇのタンパク質懸濁液を、無脂肪酸ウシ血清アルブミン（２．５ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｍＭパルミチン酸、１０ｍＭカルニチン、および４ｍＣｉの９，１０−３Ｈ−パルミトイルＣｏＡ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含む１ｍｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩緩衝液に加えた。前記混合物を３７℃の暗所で２時間振盪した後、９，１０−３Ｈ−パルミトイルＣｏＡおよび３Ｈ２ＯのＦｏｌｃｈ法による分離を行った（Folch et al.(1957) J. Biol.Chem., 226:497-509）。水相を回収し、１０％  ＴＣＡを加えてタンパク質を沈殿させた後、室温、８０００ｇで１０分間遠心分離した。残った放射性パルミトイルＣｏＡは、ＡＧ  １−Ｘ８ギ酸塩樹脂（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた強陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去した。３Ｈ２Ｏを含む流出液を回収し、シンチレーション計数に用いた。各実験は、タンパク質を含まないサンプルのバックグラウンド測定と対で行った。バックグラウンド計数を分析サンプルに対応する各測定から差し引いた。
【００５５】
Ｃ２３８Ａ  ＶＬＣＡＤ変異型を生成する部位特異的突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用し、ＶＬＣＡＤをコードする相補的ＤＮＡに単一アミノ酸変異を導入した。アミノ酸２３８位でのシステインからアラニンへの変異は、テンプレートとして前記タンパク質のＣ末端領域で３つのＦＬＡＧ（登録商標）タグに融合したマウスＶＬＣＡＤをコードするプラスミドのＥｘ−Ｍｍ０１０１３−Ｍ１４（以下ｐＶＬＣＡＤ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）とする）により作成した。フォワードプライマー５′−ＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＣＴＣＴＣ−３′（配列ＩＤ番号：１）およびリバースプライマー５′−ＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡ−３′（配列ＩＤ番号：２）を用い、ｐＶＬＣＡＤ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）のアラニンコドンをシステインコドンに置換することで、ｐＶＬＣＡＤ−Ｃ２３８Ａ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）を作成した。ｐＶＬＣＡＤ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＶＬＣＡＤ−Ｃ２３８Ａ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）両方の配列をその後の実験で使用する前に確認した。
【００５６】
細胞培養、形質移入、およびＧＳＮＯ投与
Ｈｅｐａ  １〜６細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、５％  ＣＯ２を含む空気中、３７℃で増殖した。細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、２４時間通常の条件で培養した。細胞は、製造業者が提供したプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＦＬＡＧ（登録商標）標識野生型ＶＬＣＡＤまたはＦＬＡＧ（登録商標）標識Ｃ２３８Ａ  ＶＬＣＡＤを形質移入した。形質移入後４８時間で、増殖培地を無血清ＤＭＥＭと置換し、新たに調製したＧＳＮＯ  ２５０ｍＭを３０分かけて追加した後、細胞をＰＢＳで広範に洗浄した。細胞可溶化物はＧＳＮＯ除去後直ちに、または６０、１２０、および２４０分後に採取した。サンプルはＵＶ光照射から遮光した。可溶化物のタンパク質濃度を測定し、１サンプルごとに等量のタンパク質を使用して有機水銀により捕獲した。
【００５７】
Ｓ−ニトロシル化システインの構造作成と通常モードの解析
ヒトＶＬＣＡＤの結晶構造をＰＤＢ（ＩＤ  ２ＵＸＷ）からダウンロードした。異常または欠落した残基をＰｙＭｏｌ（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）の変異原性ツールで完成させた。Ｓ−ニトロソシステインは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｔｏｏｌｋｉｔにおいて、Ｔｉｍｅｒｇｈａｚｉｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの"Ｓ−ｎｉｔｒｏｓａｔｏｒ" Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて作成した。Ｓ−ｎｉｔｒｏｓａｔｏｒでは、チオレドキシンの座標と、ヘリックス中のＳ−ニトロソシステイン残基のＰＣＭ−ＯＮＩＯＭ（ＰＢＥ０／ｄｅｆ２−ＴＺＶＰＰＤ：ＡｍｂｅｒＦＦ）計算から計算したχ３値を使用した。ＥｌＮｅｍｏ（Suhre et al.(2004) Nucleic Acids Res., 32:W610-W614）を使用し、１００種類の最低周波数モードを観察し、最初の５種類の非自明なＶＬＣＡＤモード用に摂動モデルを作成した。残基の平均二乗変位（ｒ２）を利用し、タンパク質の動きを同定した。
【００５８】
統計解析
データはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ｄソフトウェアにより解析した。正規分布データはすべて平均±ＳＤとして表示した。群は一元分散分析により解析した。
【００５９】
結果
マウスＳ−ニトロソシステインプロテオーム
野生型マウス脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、および胸腺では、１０１１個のＳ−ニトロソシステイン含有ペプチドが６４７種類のタンパク質で同定された。広範な文献検索からは、この拡大Ｓ−ニトロソシステインプロテオームにより、生理的状態で修飾されることが事前に報告されている４６タンパク質およびこれまで未知であったが、明らかになった内因性Ｓ−ニトロシル化部位９７１ヵ所が同定されたことが示された。６種類の臓器すべてで、Ｓ−ニトロシル化部位の数がタンパク質の数を超え、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質機能制御におけるポリ−Ｓ−ニトロシル化の潜在的役割を示している（Simon et al.(1996) Proc.Natl.Acad.Sci., 93:4736-4741）。各臓器で少なくとも３回生物学的に再現した６種類の臓器で同定されたタンパク質の比較から、平均７２％のタンパク質が１つ以上の臓器で同定され、同じパターンのＳ−ニトロシル化がｉｎ  ｖｉｖｏで全体的機能を果たしていることを示している。さらに、これらのデータは、これらのプロテオームの獲得に用いた方法が正確で再現性があることを示した。１臓器のみで同定されたタンパク質は２１〜４６％であり、Ｓ−ニトロシル化も臓器特異的役割を果たす可能性があることを示している。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳ−ニトロシル化部位のｅＮＯＳにより生成する一酸化窒素への依存性は、同臓器でｅＮＯＳヌルマウス（ｅＮＯＳ−／−）の内因性修飾部位を分析することで検討した。同定されたタンパク質の４７〜８７％のＳ−ニトロシル化でｅＮＯＳの存在が必要であるため、ｅＮＯＳは実質的に内因性Ｓ−ニトロソシステインに関与した。脳および心臓は他の臓器と比較してｅＮＯＳ活性への依存性が最も低く、これらの臓器のタンパク質をＳ−ニトロシル化するニューロンの一酸化窒素合成酵素など、他のイソ型の関与を示している。ｅＮＯＳ−／−マウス臓器のＳ−ニトロソシステインペプチドはかなりの数が不足していることが、このＳ−ニトロソシステインプロテオームの同定法の正確さを強調した。
【００６０】
Ｓ−ニトロソプロテオームの細胞内局在性の概要から、全マウスプロテオームと比較し、細胞質およびミトコンドリアタンパク質が組織規模で有意に濃縮していることが明らかとなった。細胞膜および核のタンパク質のＳ−ニトロシル化部位は過少発現であった。組織ホモジネーション法は膜タンパク質の抽出が最適化されていなかったため、膜タンパク質の過少発現は方法論的問題を反映している可能性がある。タンパク質のＳ−ニトロシル化は核でも起こり、核タンパク質の追加部位の発見はシグナル伝達および転写制御のＳ−ニトロシル化の潜在的重要性を強調している（Kornberg et al.(2010) Nat. Cell Biol., 12:1094-1100）。脳、腎臓、肝臓、肺、および胸腺のＳ−ニトロソプロテオームの２０％〜２５％はミトコンドリアタンパク質から成るが、修飾タンパク質の５６％はマウス心臓のミトコンドリアに限局していた。ミトコンドリアプロテオームは、心臓を除き、７０％以上がｅＮＯＳ活性に依存したが、Ｓ−ニトロシル化にｅＭＰＳ由来一酸化窒素が必要であったプロテオームは３６％のみである。心臓ミトコンドリアでＳ−ニトロシル化のｅＮＯＳ活性依存性が低いことは、別の機能的ＮＯＳイソ型があることを示している。Ｓ−ニトロソプロテオームの機能分類から、Ｓ−ニトロシル化酵素が中心的役割を果たしている重要な代謝経路が明らかとなった。解糖、糖新生、ピルビン酸塩代謝、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル、酸化的リン酸化、アミノ酸代謝、ケトン体形成、および脂肪酸代謝経路を制御するかなりの数の酵素がＳ−ニトロシル化されることが分かり、そのほとんどがｅＮＯＳ−／−マウスでＳ−ニトロシル化されているとして同定された。この所見は、前記ｅＮＯＳヌルマウスが代謝活性に障害があることを示した報告と一致する（Schild et al.(2008) Biochim.Biophys.Acta, 1782:180-187; Mohan et al.(2008) Lab.Invest., 88:515-528）。したがって、タンパク質のＳ−ニトロシル化はｅＮＯＳ活性と代謝制御を関連付ける機構的関連性を示すと考えられる。
【００６１】
Ｓ−ニトロシル化による超長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素の酵素活性の制御
脂肪酸代謝に関与するタンパク質のクラスター形成は、この解析で明らかであった。マウス肝臓では、Ｓ−ニトロシル化タンパク質が肝臓の反応からホルモンレプチンまでを含むネットワークでクラスター形成される（Doulias et al.(2010) Proc.Natl.Acad.Sci., 107:16958-16963）。ここでは、脂肪酸β酸化の律速段階を触媒する超長鎖アシル−補酵素Ａ（ＣｏＡ）脱水素酵素（ＶＬＣＡＤ）は野生型マウス肝臓でＳ−ニトロシル化されるが、レプチン欠乏マウス（ｏｂ／ｏｂ）またはｅＮＯＳ−／−マウスの肝臓ではＳ−ニトロシル化されないことが分かった（図１）。Ｓ−ニトロシル化が、重要な代謝器官である肝臓のＶＬＣＡＤ活性および脂肪酸代謝に与える生物学的効果が検討された。
【００６２】
レプチン欠乏マウスは通常の固形飼料で生後４〜５週間から自然に脂肪肝を発症し、その特徴は、パルミチン酸塩酸化速度の低下と肝細胞内のトリグリセリドの形態での脂肪滴の蓄積である（Brix et al.(2002) Mol.Genet.Metab., 75:219-226; de Oliveira et al.(2008) J. Am. Coll.Nutr., 27:299-305）。ｏｂ／ｏｂマウス肝ホモジネートの３Ｈ標識パルミトイルＣｏＡ酸化率は、野生型マウスの酸化率の４７％であった（図２Ａ）。この重大なパルミチル−ＣｏＡ酸化率の低下は、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化が欠乏していることを示している。Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステインの送達によるｏｂ／ｏｂマウスの脂肪肝回復を示した所見に基づき（de Oliveira et al.(2008) J. Am. Coll.Nutr., 27:299-305）、５週齢のｏｂ／ｏｂマウスにＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）を腹腔内注射した。この薬物は、細胞透過性が限られているにもかかわらず、Ｓ−ニトロシル化によりタンパク質を修飾する細胞モデルで広範に使用されているため、ＧＳＮＯを用い一酸化窒素を送達した（Hara et al.(2005) Nat. Cell Biol., 7:665-674; Chung et al.(2004) Science 304:1328-1331）。ＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスは野生型マウスと同等のパルミトイルＣｏＡ酸化率を示し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注入したｏｂ／ｏｂマウスよりも酸化率が有意に上昇した（図２Ａ）。さらに、ＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスのパルミトイルＣｏＡ酸化の回復は、肝トリグリセリド濃度の有意な低下と関連していた。ｏｂ／ｏｂマウスの肝トリグリセリド濃度は野生型マウスよりも有意に高く、ｏｂ／ｏｂマウスへのＧＳＮＯ投与は前記肝トリグリセリド濃度を有意に低下させた（図２Ｂ）。野生型マウス、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ投与ｏｂ／ｏｂマウスの血清トリグリセリド濃度は同等であった（図２Ｃ）。ＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスのパルミトイルＣｏＡ酸化の回復は、肝切片の組織学的評価からも実証され、ＰＢＳ注入ｏｂ／ｏｂマウスよりもＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスで脂肪沈着が少ないことを示した（図２Ｇ）。
【００６３】
ＭＳ／ＭＳ解析では、野生型およびＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスの両方で、Ｃｙｓ２３８へのＶＬＣＡＤ修飾部位を特定した（図１Ａおよび１Ｂ）。ＶＬＣＡＤはｅＮＯＳ−／−マウスではＳ−ニトロシル化により修飾されないが、ｅｘ  ｖｉｖｏでは、肝ホモジネートをＧＳＮＯ処理することで、システイン残基Ｃｙｓ２３８で容易に修飾されることも確認された（図２Ｈおよび２Ｉ）。
【００６４】
ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化は、ＧＳＮＯ処理ｏｂ／ｏｂマウス肝臓のパルミトイルＣｏＡのアシル脱水素酵素による酸化増加と関連していた（図２Ｄ、２Ｊ、および２Ｋ）。この増加はＵＶ光分解に対して感受性が高く、抗ＶＬＣＡＤ特異的抗体を組み込むことで消失した。ミカエリス―メンテン動態の解析から（図２Ｄ）、ＶＬＣＡＤのＶｍａｘは野生型、ＰＢＳ注入、およびＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスで同等であることが明らかとなった（図２Ｅ）。しかし、ＰＢＳ注入ｏｂ／ｏｂマウスホモジネートの見かけのミカエリス定数（ＫＭ）値は、野生型マウスおよびＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスの５倍以上高かった（図２Ｆ）。ＶＬＣＡＤ酵素活性のＫＭも、ｅｘ  ｖｉｖｏでは非処理ｅＮＯＳ−／−肝ホモジネートと比較し、ＧＳＮＯ処理したｅＮＯＳ−／−肝ホモジネートで５倍上昇した（図２Ｈ）。肝ホモジネートおよび濃縮ミトコンドリア製剤でＶＬＣＡＤタンパク質存在量を定量化し、野生型、ＰＢＳ注入、およびＧＳＮＯ注入ｏｂ／ｏｂマウスで存在量に差はないことが示された（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、天然ゲル電気泳動から、３群のマウスすべてでミトコンドリア分画のＶＬＣＡＤダイマーの存在量が同等であることが明らかとなった（図３Ａ、上図）。したがって、これらのデータはＳ−ニトロシル化によりＶＬＣＡＤのＫＭが低下することを示している。
【００６５】
Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤ分画の定量は、ＧＳＮＯ処理マウスでは肝臓ＶＬＣＡＤ分子の２５±３％がＳ−ニトロシル化されたことを示していた。これらの所見から、ＭＳ／ＭＳ解析が野生型およびＧＳＮＯ処理マウスの肝臓ではＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化を示すが、ＰＢＳ処理ｏｂ／ｏｂマウスではＳ−ニトロシル化を示さないことが確認される。ＶＬＣＡＤタンパク質の濃度はＰＢＳおよびＧＳＮＯ処理ｏｂ／ｏｂマウスで同等であったため、平均すると、定常状態でのＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの存在量は総タンパク質の２５％であり、Ｓ−ニトロシル化がＶＬＣＡＤの触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）を非修飾タンパク質と比較して２９倍上昇させることができる（Koshland, D.E.(2002) Bioorg.Chem., 30:211-213）。この触媒効率の実質的な上昇により、ｏｂ／ｏｂマウス肝臓の脂肪酸を効率的に除去することができる。
【００６６】
ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化の機能的結果の追加根拠は、一過性に野生型ＶＬＣＡＤまたはＳ−ニトロシル化することができない点変異（Ｃ２３８Ａ）を発現したマウス肝細胞で得られた。ＧＳＮＯ処理により、野生型ＶＬＣＡＤの２７±３％がＳ−ニトロシル化し（図４Ａ）、これはＶＬＣＡＤ特異的活性の５倍の上昇と一致していた（図４Ｂ）。同じ実験条件で、Ｃ２３８Ａ  ＶＬＣＡＤ変異体はＳ−ニトロシル化されておらず、その定常活性はＧＳＮＯ処理に反応して変化しなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。前記培地からＧＳＮＯを除去し、広範に洗浄を行った時点で、Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの存在量および酵素特異的活性は経時的に低下した（図４Ａおよび４Ｂ）。これらのデータは、ＶＬＣＡＤのＣｙｓ２３８でのＳ−ニトロシル化がその酵素活性の制御に必要であり、このプロセスは可逆的で脱ニトロシル化により制御されている可能性があることを示している。
【００６７】
分子力学シミュレーションを利用し、ＶＬＣＡＤ構造に対するＳ−ニトロシル化の効果に洞察を得た。最初に量子力学／分子力学計算を利用し、ＶＬＣＡＤのタンパク質構造内の２３８位にＳ−ニトロソシステイン残基を作成した［ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）  ＩＤ２ＵＸＷ］（図５Ａ）。タンパク質の大規模な全体的または集団運動を示す最低周波数の通常モードの検査では、Ｓ−ニトロシル化が大きな構造変化を誘導したことは示さなかった。結合部位付近で起こりうる、より小さな局所的運動を検討する高周波数モードの検査では、Ｃｙｓ２３８のＳ−ニトロシル化に反応した原子の動きに差があることが明らかとなった（図５Ｂ）。ループのＣｙｓ２３８残基およびループは、一般にタンパク質の可動部を示す。したがって、このデータは、Ｓ−ニトロシル化がループの可動性を高め、タンパク質の運動が高まり、これが基質の結合を促し、それによってＶＬＣＡＤのＫＭを低下させることを示している。Ｃｙｓ２３８は基質結合部位から３０Å以上あり、より長い範囲での運動が酵素の基質結合力に影響する可能性があることを示している。
【００６８】
システインのＳ−ニトロシル化は、生理的および病的条件でタンパク質活性、タンパク質−タンパク質相互作用、および細胞内局在性を調節する、一酸化窒素由来の翻訳後修飾である（Stamler et al.(2001) Cell 106:675-683; Hess et al.(2005) Nat. Rev. Mol.Cell Biol., 6:150-166; Benhar et al.(2008) Science 320:1050-1054; Jaffrey et al.(2001) Nat. Cell Biol., 3:193-197; Kornberg et al.(2010) Nat. Cell Biol., 12:1094-1100; Matsushita et al.(2003) Cell 115:139-150; Mitchell et al.(2005) Nat. Chem.Biol., 1:154-158; Cho et al.(2009) Science 324:102-105; Mannick et al.(2001) J. Cell Biol., 154:1111-1116）。野生型マウス組織のＳ−ニトロソシステイン残基の部位特異的マッピングを応用し、代謝経路に関するタンパク質の広範な修飾およびミトコンドリアの修飾タンパク質の大幅な局在化を同定した。この選択的局在化は、ミトコンドリアの生態（Brown et al.(1994) FEBS Lett., 356:295-298; Kobzik et al.(1995) Biochem.Biophys.Res.Commun., 211:375-381; Nisoli et al.(2005) Science 310:314-317）、特に心臓における一酸化窒素の機能的役割を示したいくつかの報告と一致しており、タンパク質のＳ−ニトロシル化が虚血−再潅流傷害から心臓を保護する（Prime et al.(2009) Proc.Natl.Acad.Sci., 106:10764-10769; Lima et al.(2009) Proc.Natl.Acad.Sci., 106:6297-6302; Kohr et al.(2012) Circ.Res., 111:1308-1312）。特に心臓への一酸化窒素ドナーの送達は、ミトコンドリアＳ−ニトロシル化タンパク質の全体的存在量を増加させ、虚血傷害から保護する（Prime et al.(2009) Proc.Natl.Acad.Sci., 106:10764-10769; Lima et al.(2009) Proc.Natl.Acad.Sci., 106:6297-6302; Kohr et al.(2012) Circ.Res., 111:1308-1312）。これらのミトコンドリアおよび代謝の機能調節における一酸化窒素の重要な生物学的寄与にもかかわらず、ミトコンドリアＳ−ニトロシル化タンパク質の同定は限られている。６種類のマウス組織でミトコンドリアタンパク質の特異的Ｓ−ニトロシル化部位を同定したことで、生体エネルギーおよび代謝の一酸化窒素を介した制御の分子的および生化学的経路を明らかにする機構的研究を促す実質的な進歩が起こっている。他の翻訳後修飾と同様、Ｓ−ニトロシル化は動態プロセスであり、この翻訳後修飾を逆転させるいくつかの経路が報告されている（Ｂｅｎｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：１０５０−１０５４）。したがって、最新のＳ−ニトロソシステインプロテオームは、通常の生理的条件下で内因的に修飾されたタンパク質の一部であってもよい。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＳ−ニトロシル化の生物的役割を調査するため、身体の重要代謝器官である肝臓の脂肪酸代謝が研究された。食事、脂肪組織、およびデノボ脂質生合成が主な肝臓の脂肪酸供給源である。肝臓の脂肪酸の考えられる経路はトリグリセリドへのエステル化などであり、保存されるか、または超低密度リポタンパク質粒子の一部として排出されるため、アポリポタンパク質Ｂ−１００とパッキングされる可能性がある。脂肪酸はリン脂質に変換することもでき、またはβ酸化を受けるミトコンドリアに輸送するため、アシル―カルニチンに変換することもできる（Cohen et al.(2011) Science 332:1519-1523）。脂肪酸の流入を増加する、または排出または代謝を抑制するすべてのプロセスが、脂肪肝の発症に寄与する可能性がある（Cohen et al.(2011) Science 332:1519-1523）。β酸化は４段階の酵素サイクルであり、前記サイクル１回転ごとに２炭素原子ずつ脂肪酸の長さが短くなり、これは脂肪酸が効率的に利用されるために重要である。ＶＬＣＡＤはβ酸化の最初の段階を触媒し、ヒト肝臓のパルミチン酸脱水素酵素活性の約８０％およびマウス肝臓のパルミチン酸酸化の約７０％の原因である（Aoyama et al.(1995) J. Clin.Invest., 95:2465-2473; Djordjevic et al.(1994) Biochemistry 33:4258-4264; Strauss et al.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci., 92:10496-10500）。ＶＬＣＡＤは６７ｋＤのサブユニットから成るホモダイマーであり、ミトコンドリア内膜に埋め込まれている（Aoyama et al.(1995) J. Clin.Invest., 95:2465-2473; Djordjevic et al.(1994) Biochemistry 33:4258-4264; Strauss et al.(1995) Proc.Natl.Acad.Sci., 92:10496-10500）。ＶＬＣＡＤの酵素活性はタンパク質の存在量とＳｅｒ５８６のリン酸化で制御されると考えられている（Kabuyama et al.(2010) Am. J. Physiol.Cell Physiol., 298:C107-C113）。以上に示したデータは、ｅＮＯＳ由来一酸化窒素によるＶＬＣＡＤのＣｙｓ２３８でのＳ−ニトロシル化により、前記酵素のＫＭを変化させ、脂肪酸のｉｎ  ｖｉｖｏ  β酸化に実質的に影響を与えることができる構造変化により、酵素活性を可逆的に活性化することを示している。全体として、マウス組織のＳ−ニトロシル化タンパク質の全体的解析から、この翻訳後修飾が細胞の代謝プロセスおよびミトコンドリア機能に大きな影響を与える可能性があることが明らかとなった。
【実施例２】
【００７０】
一酸化窒素（ＮＯ）は正常状態および病的状態でミトコンドリアの代謝を制御する。一酸化窒素がその制御効果を発揮するメカニズムの１つは、タンパク質のシステイン残基のＳ−ニトロシル化である。以上に示すとおり、ＶＬＣＡＤ分子の２５％はｉｎ  ｖｉｖｏでシステイン２３８がＳ−ニトロシル化されている（マウスモデル）。Ｓ−ニトロシル化はＶＬＣＡＤの見かけのＫｍを非修飾酵素と比較して５倍低下させ、触媒効率を２９倍向上させる。ヒト疾患の特徴（低ＶＬＣＡＤ活性、低β酸化率、肝臓のトリグリセリド蓄積）を模倣した動物モデルでは、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化が酵素活性を回復させ、β酸化率を正常化し、脂肪肝の表現型を抑制した。これらの結果に基づき、ミスセンスヒトＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化はその触媒効率を改善し、疾患の転帰に良好な影響を与える。
【００７１】
この結論を検証するため、病的ＶＬＣＡＤ変異を有するヒト線維芽細胞株４種を使用した（表１）。細胞は３０分間、１００μＭ  Ｎ−アセチルシステインまたはＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（ＳＮＯ−ＮＡＣ）に曝露し、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化状態は以上に示すとおり、有機水銀補助捕捉および質量分析により決定した。細胞株１および２の可溶化物を用い、ＶＬＣＡＤはＳＮＯ−ＮＡＣ処理後システイン２３７（ヒトＶＬＣＡＤでは１つ少ないアミノ酸）で修飾されたと判断された。ＶＬＣＡＤの酵素活性は、前記酵素の基質としてパルミトイルＣｏＡ存在下、フェロセニウム還元をモニタリングすることで細胞可溶化物において評価した。図６は、細胞株１および２のミカエリス−メンテントレースを示し、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化がＫｍに顕著な影響を与え（非修飾酵素と比較して１４倍低い）、それよりも程度は少ないがＶｍａｘに影響を与えることを示している。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
詳細な動態解析は他の変異型および野生型ＶＬＣＡＤについても行った（表２）。対照細胞と比較し、ＮＡＣ処理したＶＬＣＡＤ欠乏線維芽細胞では、ミトコンドリア脂肪酸酸化（ｍＦＡＯ）能とＶＬＣＡＤ活性が低いことが報告された。表２では、時間０から初期吸光度の５％消失に対応する時間までの傾きを計算し、反応曲線の直線部分で初期速度（Ｖｏ）を決定した。ＫｍとＶｍａｘの決定では、０．０１５〜２ｍＭの範囲でパルミトイルＣｏＡの濃度１０種類を用いた。ｍＦＡＯ率は、３Ｈ−パルミチン酸塩をインキュベートした細胞の培地に放出された３Ｈ２Ｏを定量することで決定した。この表は、２種類の実験の平均値を示している。２つの値に１０％以上の差はない。
【００７４】
すべてのケースで、タンパク質は典型的なミカエリス―メンテンの動態に従っている。すべての変異は野生型ＶＬＣＡＤの対応する活性よりもはるかに低い定常活性であった。その見かけのミカエリス定数（Ｋｍ）は野生型タンパク質のＫｍより７〜１４倍高かったが、見かけのＶｍａｘは１５〜５０％低いか、野生型ＶＬＣＡＤの２倍であった。重要なことに、変異型ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化により、見かけのＫｍは７〜１４倍低下した（平均で１１倍の低下）。さらに、変異型ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化によりＶｍａｘはわずかに低下した。全体として、このデータは、ＶＬＣＡＤのシステイン２３７でのＳ−ニトロシル化は、Ｋｍを低下させることで変異型ＶＬＣＡＤの酵素欠乏を補正することを示している。つまり、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン（ＳＮＡＣ）の投与により見かけのＫＭの正常値で反映されるＶＬＣＡＤ酵素活性が上昇し、ＶＬＣＡＤ欠乏細胞のｍＦＡＯ能力が回復した。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
さらに、水銀樹脂補助捕捉（ＭＲＣ）技術後、質量分析による検出を利用し、ＳＮＯ−ＮＡＣ処理によりシステイン２３７がＳ−ニトロシル化されたことを確認した。具体的には、ＭＳ／ＭＳスペクトルから、ＳＮＡＣ処理ＶＬＣＡＤ欠乏細胞の細胞ホモジネートのみで、ヒトＶＬＣＡＤの配列２３１〜２４７に対応する両荷電ペプチドＴＳＡＶＰＳＣ２３７ＧＫＹＹＴＬＮＧＳＫ（配列ＩＤ番号：４）があることが明らかとなった。特に、ＶＬＣＡＤの他の修飾は検出されなかった。これらのデータは、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化が他の変異存在下で触媒効率を上昇させたことを証明し、タンパク質のＳ−ニトロシル化がＶＣＬＡＤ酵素欠損症を補正することを示している。
【実施例３】
【００７７】
野生型マウスと比較して血清および心臓の生物活性窒素種レベルが低下したマウス（ｅＮＯＳ−／−）で実験を行った（図７Ａおよび７Ｂ）。ｅＮＯＳ−／−マウスは野生型マウスと比較して心筋のｍＦＡＯ率低下を示した（図７Ｃ）。この所見は、ｅＮＯＳ−／−マウスの肝臓および骨格筋でｍＦＡＯ活性の低下を報告した事前研究と一致し、ｅＮＯＳ由来ＮＯが全身のｍＦＡＯ活性に影響することを証明している。心臓ＶＬＣＡＤタンパク質の存在量はｅＮＯＳヌルマウスおよび野生型マウスで同等であった（それぞれ４．３±０．１μｇ／ｍｇと４．２±０．３μｇ／ｍｇ、両遺伝子型ともＮ＝３）。しかし、比活性度は野生型マウスと比較し、ｅＮＯＳ−／−マウスで３倍以上低かった（図７Ｄ）。ＶＬＣＡＤ分子の１９±２％は野生型の心臓では内因的にＳ−ニトロシル化されていると判断された。これらのデータは、ｅＮＯＳ由来ＮＯが心臓ＶＬＣＡＤの内因性Ｓ−ニトロシル化に必要であり、Ｓ−ニトロシル化されていないと、前記酵素活性は有意に低く、Ｓ−ニトロシル化のプラスの制御作用を示しているという根拠を提供する。
【００７８】
０．１ｍＭの濃度の亜硝酸ナトリウムを飲用水に入れ、１０日間ｅＮＯＳ−／−マウスに投与した。ＮａＮＯ２投与マウスは非投与ｅＮＯＳ−／−マウスと比較し血清および心臓の一酸化窒素レベルが上昇し（図７Ａおよび７Ｂ）、野生型マウスと比較して同等であることを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。心臓ｍＦＡＯ率は対照マウスで正常化した（図７Ｃ）。ＶＬＣＡＤタンパク質の存在量は、非投与ｅＮＯＳ−／−マウスおよび野生型マウスと比較して差はなかった（４．１±０．３μｇ／ｍｇ、Ｎ＝３）。重要なことに、非投与の対照と比較し、ＮａＮＯ２投与マウスではＶＬＣＡＤ比活性度が４倍以上の増加することが報告された（図７Ｄ）。酵素活性の上昇はＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化回復と関連していた。まとめると、このデータは以下の点を示している：（ｉ）ＶＬＣＡＤは野生型の心臓では内因的にＳ−ニトロシル化され、この翻訳後修飾は酵素活性を制御する、（ｉｉ）亜硝酸ナトリウムはｉｎ  ｖｉｖｏでＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化を効率的に回復する、（ｉｉｉ）ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化はｉｎ  ｖｉｖｏで酵素活性を上昇させ、心筋のｍＦＡＯ活性の正常化に寄与する。
【実施例４】
【００７９】
非疾患対照ヒト線維芽細胞に２−一硝酸−１，３−ジヘプタノイン（ＭＮＤＨ）または対照として使用するトリヘプタノイン（ＴＨ）を曝露した。図９Ａは、ＭＮＤＨ存在下でパルミチン酸塩酸化の濃度依存的増加を示しているが、ＴＨ対照ではこのような関係は示されない。図９Ｂは、ＭＮＤＨ存在下でのＶＬＣＡＤ比活性度の濃度依存的増加を示す。
【００８０】
ＭＮＤＨおよびＴＨの毒性も研究した。特に、３−一硝酸−１，３−ジヘプタノイン（ＭＮＤＨ）またはトリヘプタノイン（ＴＨ）に４、８、または１２時間曝露後２４時間では、生細胞数は非投与対照と同じである。さらに、タンパク質レベルは対照と比較し、ＭＮＤＨまたはＴＨに２４時間曝露後も同じであった。したがって、ＭＮＤＨとＴＨに毒性はなかった。
【００８１】
ヒト線維芽細胞におけるＭＮＤＨの代謝も研究した。図１０Ａは、全一酸化窒素代謝産物（ＮＯｍ）レベルが１００μＭのＭＮＤＨに曝露後最初の６時間は上昇し、その後低下したことを示している。ＴＨはＮＯ代謝産物レベルを上昇させない。図１０Ｂは、ＭＮＤＨに曝露後、細胞の亜硝酸塩レベルは経時的に上昇することを示している。したがって、総ＮＯ代謝産物の減少はＭＮＤＨの代謝を反映している可能性がある。図１０Ｃは、ＭＮＤＨ曝露後の総タンパク質Ｓ−ニトロソシステインレベルも上昇したことを示す。このレベルは時間とともに低下したため、タンパク質Ｓ−ニトロシル化の代謝回転を示している。ＴＨ処理細胞のＳ−ニトロシル化タンパク質レベルは１０ｐｍｏｌｅ／ｍｇタンパク質未満であった。
【００８２】
図１１Ａは、ダイジンを１時間前投与することによるミトコンドリアアルデヒド脱水素酵素２の阻害がＭＮＤＨの代謝を阻害することを示している。前記阻害剤は前記活性化合物をインキュベーション中に存在していた。図１１Ｂは、ＫＩ／Ｉ２の低下により測定されるＭＮＤＨにより発生する亜硝酸塩を示しており、１時間ダイジンを前投与することでＭＮＤＨの代謝が抑制されることを示している。
【００８３】
ＭＮＤＨによるＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化についても確認した。図１１Ｃは、ＭＮＤＨのＴＨに細胞を曝露後のＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの選択的捕捉について示している。重要なことに、図１１ＣはＶＬＣＡＤ分子の約５０％がＭＮＤＨの存在下で修飾されたが、ＴＨ存在下では修飾されなかったことを示している。システイン２３７のＳ−ニトロシル化は、ペプチド消化およびＭＳ／ＭＳ解析により確認された。
【００８４】
Ｇ１８５Ｓ／Ｇ２９４Ｅ  ＶＬＣＡＤ変異を有する線維芽細胞にＢＳＡ結合ＴＨ（対照）またはＭＮＤＨ（活性）１００μＭを４時間処理した。図１２Ａに見られるとおり、ＭＮＤＨに曝露しているが、ＴＨに曝露していない場合、変異型ＶＬＣＡＤ比活性度は４０倍増加した。さらに、図１２Ｂに見られるとおり、ＭＮＤＨに曝露しているが、ＴＨに曝露していない場合、ｍＦＡＯ率は１６倍増加した。図１２Ｃに見られるとおり、ＭＮＤＨに曝露しているが、ＴＨに曝露していない場合、ＶＬＣＡＤ、三官能性タンパク質（ＴＦＰ）、およびカルニチン・パルミトイルトランスフェラーゼ−２（ＣＰＴ２）のＳ−ニトロシル化が得られた。
【００８５】
Ｐ９１Ｑ／Ｇ１９３Ｒ  ＶＬＣＡＤ変異を有する線維芽細胞にＢＳＡ結合ＴＨ（対照）またはＭＮＤＨ（活性）１００μＭを４時間処理した。図１３Ａに見られるとおり、ＭＮＤＨに曝露しているが、ＴＨに曝露していない場合、変異型ＶＬＣＡＤ比活性度は７５倍増加した。さらに、図１３Ｂに見られるとおり、ＭＮＤＨに曝露しているが、ＴＨに曝露していない場合、ｍＦＡＯ率は２８倍増加した。図１３Ｃに見られるとおり、ＭＮＤＨに曝露しているが、ＴＨに曝露していない場合、ＶＬＣＡＤ、三官能性タンパク質（ＴＦＰ）、およびカルニチン・パルミトイルトランスフェラーゼ−２（ＣＰＴ２）のＳ−ニトロシル化が得られた。
【００８６】
本発明の特定の好適な実施形態が説明され、具体的に上記に例示されているが、本発明はそのような実施形態に限定されることは意図していない。以下の請求項に示されるとおり、本発明の範囲および精神から離れずに、様々な変形形態が可能である。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｆ】
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【図２Ｇ−２Ｈ】
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【図２Ｉ−２Ｋ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１２Ａ−１２Ｃ】
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【図１３Ａ−１３Ｃ】
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【国際調査報告】
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