(57)【要約】  本開示は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物であって、ここで前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、水系組成物を提供する。本開示はさらに、このような組成物を用いる方法及びこのような組成物を調製する成分を含むキットを提供する。
2018537971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、
許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質と
を含む水性組成物であって、
前記ポリペプチドの最高許容温度は、前記水溶性物質の最高許容温度より高い、
水系組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドの許容温度で、前記ポリペプチドは生物活性を有するか、又は前記ポリペプチドの生物活性は可逆的にブロックされている、請求項１に記載の水系組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドの最高許容温度より高い温度で、前記ポリペプチドは生物活性を有さず、かつ前記ポリペプチドの生物活性は不可逆的にブロックされている、請求項１又は２に記載の水系組成物。
【請求項４】
前記水溶性物質が前記水溶性物質の最高許容温度より高い温度にさらされない限り、前記水溶性物質の許容温度で、前記水溶性物質は機能的コンフォメーションであり、そして光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す、請求項１から３のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項５】
前記水溶性物質の最高許容温度より高い温度で、前記水溶性物質のコンフォメーションは不可逆的に変化し、それにより機能を失う、請求項４に記載の水系組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチド及び前記水溶性物質の両方に許容される第１の温度と比較して、第１の温度より高くかつ前記水溶性物質の最高許容温度より高い第２の温度で、
（ａ）前記ポリペプチドの５０％以上の生物活性があるか、又は可逆的にブロックされており、かつ
（ｂ）前記水溶性物質の７５％以上が機能を喪失したコンフォメーションである、
請求項１から５のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項７】
第２の温度で、前記ポリペプチドの少なくとも一定量の生物活性があるか、又は可逆的にブロックされており、ここで前記一定量は５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、及び９５％からなる群から選択される、請求項６に記載の水系組成物。
【請求項８】
第２の温度で、少なくとも一定量の前記水溶性物質は機能を喪失したコンフォメーションであり、前記一定量は８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％からなる群から選択される、請求項６又は７に記載の水系組成物。
【請求項９】
第２の温度で、前記組成物中において、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す前記水溶性物質の能力の７５％以上が不可逆的にブロックされている、請求項６から８のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項１０】
前記第２の温度で、前記組成物中において、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す前記水溶性物質の能力の一定量が不可逆的にブロックされており、ここで前記一定量は８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％からなる群から選択される、請求項６から９のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項１１】
生物活性を有する前記ポリペプチドが好熱性生体由来である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項１２】
生物活性を有する前記ポリペプチドが酵素である、請求項１から１１のいずれかに１項に記載の水系組成物。
【請求項１３】
前記組成物が酵素の基質である分子又は酵素に対する補基質である分子をさらに含む、請求項１２に記載の水系組成物。
【請求項１４】
前記酵素が鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼである、請求項１２又は１３に記載の水系組成物。
【請求項１５】
前記水溶性物質が、機能的コンフォメーションにおいて、可視光を吸収し、具体的には３８０ｎｍから７５０ｎｍの波長範囲の可視光を吸収する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項１６】
前記水溶性物質が、機能的コンフォメーションにおいて、可視光を吸収し、具体的には５００ｎｍから６５０ｎｍの波長範囲の可視光を吸収する、請求項１から１５のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項１７】
前記水溶性物質がポリペプチド成分及び任意に発色団を含む、請求項１５又は１６に記載の水系組成物。
【請求項１８】
前記水溶性物質がバクテリオロドプシン又はその機能的誘導体を含む、請求項１７に記載の水系組成物。
【請求項１９】
前記水溶性物質がハロバクテリウム・サリナルム（Halobacterium salinarum）由来のバクテリオロドプシンを含む、請求項１８に記載の水系組成物。
【請求項２０】
許容温度で機能的コンフォメーションである前記水溶性物質が蛍光を示し、前記蛍光は３００ｎｍから６５０ｎｍの範囲の波長を持つ光での励起により３５０ｎｍから７００ｎｍの範囲の発光波長を有する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項２１】
前記水溶性物質がポリペプチド成分及び任意に発色団を含む、請求項２０に記載の水系組成物。
【請求項２２】
前記水溶性物質が蛍光タンパク質であり、具体的には、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質／Ｒ−フィコエリトリン、及び赤色蛍光タンパク質／ｄｓＲｅｄからなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項２０又は２１に記載の水系組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、複数の異なる精製された熱に不安定な水溶性物質を含み、
前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質のそれぞれの最高許容温度より高い、請求項１から２２のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項２４】
許容温度で機能的コンフォメーションである少なくとも第１の水溶性物質が光を吸収し、許容温度で機能的コンフォメーションである少なくとも第２の水溶性物質が蛍光を示す、請求項２３に記載の水系組成物。
【請求項２５】
前記水系組成物が1つ以上の反応槽に格納されており、具体的にはマイクロウェルプレートの形態である複数の反応槽に格納されている、請求項１から２４のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項２６】
前記組成物がリアルタイムＰＣＲ装置に収納されている、請求項１４から２５のいずれか１項に記載の水系組成物。
【請求項２７】
前記組成物中に含まれる熱安定性ポリペプチドの存在を示すための、請求項１から２６のいずれか１項に記載の水系組成物の使用。
【請求項２８】
前記組成物が熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い温度にさらされていないことをさらに示すための、請求項２７に記載の水系組成物の使用であって、
前記水溶性物質は前記組成物に含まれ、
許容温度での機能的コンフォメーションにおいて、前記水溶性物質は光を吸収し、かつ／又は蛍光を示し、そして
前記ポリペプチドの最高許容温度は、前記水溶性物質の最高許容温度より高い、
請求項２７に記載の水系組成物の使用。
【請求項２９】
前記組成物が熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い温度にさらされたことをさらに示すための、請求項２７に記載の水系組成物の使用であって、
前記水溶性物質は前記組成物に含まれ、
許容温度での機能的コンフォメーションにおいて、前記水溶性物質は光を吸収し、かつ／又は蛍光を示し、そして
前記ポリペプチドの最高許容温度は、前記水溶性物質の最高許容温度より高い、
請求項２７に記載の水系組成物の使用。
【請求項３０】
組成物の処理状況を確認する方法であって、前記組成物の処理は温度変更の適用を含み、
ａ．生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物を用意する工程であって、ここで前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、工程；
ｂ．前記水溶性物質の最高許容温度より高い温度への変更を適用することによって工程（ａ）の組成物を処理する工程であって、ここで前記水溶性物質のコンフォメーションが不可逆的に変化し、それにより機能を失う、工程；および
ｃ．前記水溶性物質の機能的コンフォメーションを光学的手段によって評価する工程；
を含み、これらの工程によって前記組成物の処理状況を確認する、
方法。
【請求項３１】
組成物の第１の未処理状況及び第２の処理状況を確認する方法であって、前記組成物の処理は温度変更の適用を含み、
ａ．生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物を用意する工程であって、ここで前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、工程；
ｂ．前記水溶性物質の最高許容温度より低い温度で、温度変更することなく工程（ａ）の組成物を保持し、それにより前記水溶性物質のコンフォメーションは機能を維持する、工程；
ｃ．前記水溶性物質の機能的コンフォメーションを光学的手段により評価する工程；
ｄ．前記水溶性物質の最高許容温度より高い温度への変更を適用することによって工程（ａ）の組成物を処理する工程であって、ここで前記水溶性物質のコンフォメーションは不可逆的に変化し、それにより機能を失う、工程；および
ｅ．工程（ｃ）を繰り返す工程；
を含み、これらの工程によって第１の未処理状況及び第２の処理状況を確認する、
方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）が目視評価、比色測定、及び蛍光測定のいずれか１つによる評価を含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物を含む部材のキットであって、
ここで、前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、
キット。
【請求項３４】
前記ポリペプチド及び前記水溶性物質が１つの容器に混合物として存在する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
複数の成分を混合して混合物を調製する過程で、第１の成分の存在、及び任意に更なる成分の存在を確認する方法であって；
ａ．反応混合物の２つ以上の成分を別々の水溶液として用意する工程であって、ここで前記成分のうちの１つは生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドを含む、工程；
ｂ．第１の成分を選択し、そして許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す第１の精製された熱に不安定な水溶性物質を用いて前記第１の成分を染色する工程であって、ここで工程（ａ）のポリペプチドの最高許容温度は第１の水溶性物質の最高許容温度より高い、工程；
ｃ．任意に、更なる成分を選択し、そして許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す更なる精製された熱に不安定な水溶性物質を用いて前記更なる成分を染色する工程であって、ここで工程（ａ）のポリペプチドの最高許容温度は、前記更なる水溶性物質の最高許容温度より高い、工程；
ｄ．前記２つ以上の成分を混合する工程；
ｅ．工程（ｄ）で得られた混合物中の第１の精製された熱に不安定な水溶性物質の機能的コンフォメーションを評価し、それにより混合物中の第１の成分の存在を確認する工程；および
ｆ．任意に、工程（ｄ）で得られた混合物中の更なる精製された熱に不安定な水溶性物質の機能的コンフォメーションを評価し、それにより混合物中のそれぞれの更なる成分の存在を確認する工程；
を含み、これらの工程によって異なる成分を混合して混合物を調製する過程で、第１の成分の存在、及び任意に更なる成分の存在を確認する、
方法。
【請求項３６】
工程（ｄ）の前記混合物が、工程（ａ）の生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチド、工程（ｂ）の水溶性物質、及び任意に工程（ｃ）の更なる水溶性物質を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｄ）の前記混合物が水溶液である請求項３５及び３６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ａ）から（ｆ）が、前記水溶性物質の最高許容温度より低い温度で、温度変更することなく実施され、これにより、前記第１の水溶性物質及び任意に前記更なる水溶性物質のコンフォメーションは機能を維持する、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｅ）及び工程（ｆ）のいずれか１つが、目視評価、比色測定、及び蛍光測定のいずれか１つによる評価を含む、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記水溶性物質の最高許容温度より高い温度を適用することによって工程（ｄ）の前記組成物を処理する追加の工程（ｇ）を含み、
ここで、第１の水溶性物質及び任意の更なる水溶性物質のコンフォメーションが不可逆的に変化し、それにより機能を失う、請求項３５から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
光学的評価、具体的には目視評価、比色測定、及び蛍光測定のいずれか１つによる評価の追加を行う追加の工程（ｈ）を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す、精製された熱に不安定な水溶性物質を含む水系組成物であって、ここで前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、水系組成物を提供する。本開示はさらに、このような組成物を用いる方法及びこのような組成物を調製する成分を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
本開示は生化学的又は分子生物学的反応をセットアップし、処理し、更にそれらの状態をモニターする過程で有用な手段を目指している。生化学的又は分子生物学的反応に関する準備作業は、特に、所望の反応に必要なすべての反応物質を組み合わせる工程を含む。典型的には、生化学的又は分子生物学的反応は水溶液中で起こる。従って、様々な反応物質は、最初は別々の成分として用意される。それらを、混合して反応混合物を調製する。すなわち、規定の濃度の選択された成分を含む組成物を、決められた他の条件で調製し、のちに所望の反応を起こさせる。これらの成分を混合して、所望の組成物を水溶液で調製する。この目的に向けて、成分を乾燥物質の混合物として加えてもよいし、あらかじめ溶解した状態で加えてもよい。また、いくつかの成分を別々に集めて、溶解・混合し、試薬を調製し、その後、いくつかの試薬を併せて混合し、所望の反応のための所望の組成物（反応混合物）を調製してもよい。
【０００３】
反応混合物は典型的には、明らかな（例えば目に見える）際立った特徴のない異なる水溶液を混合して調製される。それゆえ、当業者は所望の反応混合物に必要なすべての反応物質を一つ以上の反応槽中で組み合わせる処理過程を注意深く監視するという課題に直面する。例えば、熟練した実験者は個別の試薬の在庫が用意されている容器につけられた印からの情報に頼る。しかし、ひとたび試薬が容器から取り出され、反応槽に移されると、試薬とそれぞれの印の物理的なつながりは絶たれてしまう。さらなる追跡手段なしには、反応槽中のそれぞれの試薬の存在及び確認に関する知見は失われる。これに関連しては、追跡手段は個別の試薬の在庫の一部が個別の反応槽に移されたことを示す具体的な記録であってもよい。別の追跡手段の例は特定の試薬中に存在しておりかつ目視などの光学的手段によって同定できる着色剤である。着色剤を含む試薬が反応槽に加えられると、着色剤が反応槽中のそれぞれの試薬の存在を示す。この原理はすでに生化学や分子生物学で、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられている。
【０００４】
Pelt-Verkuil, Elizabeth van, Belkum, Alex van, Hays, John P. (2008) “Principles and Technical Aspects of PCR Amplification”, Springer Netherlands (ISBN 978-90-481-7579-6)の“7.3 Taq DNA polymerase and its modifications”に報告されているように、いくつかの製造業者は、ポリメラーゼ活性、増幅されたＰＣＲ生成物の精製、配列決定または更なる後続の処理も妨害しないような不活性赤色色素を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又は既製のＰＣＲマスターミックス（予備混合物＝master mix）を提供している。これらの色素関連製品の市販品の例にはREDAccuTaq（登録商標）、REDTaq（登録商標）（Sigma）及びRed Hot（登録商標） Taq DNA polymerase（Thermo Fisher）、その他がある。このような製品は、ポリメラーゼ又はマスターミックスの実際の添加又は混合を視覚で制御できるようにする追跡手段として供給される。更に、それらはＰＣＲ増幅生成物のゲル電気泳動での視覚での追跡を容易にする。実際に、これらの色素は１２５塩基対のＤＮＡ断片に対応する分子量マーカーとして機能する。容器中の試薬の存否を可視化する目的の不活性着色剤として公表されている別の色素はVisiBlue（商標）(TATAA Biocenter)である。ＷＯ２０１５／０５４３９６にリアルタイムＰＣＲ装置でｑＰＣＲマスターミックスと共に用いられる着色剤として可視化色素処方が開示されている。
【０００５】
ＰＣＲ用の反応混合物は、セットアップ後、温度変更によって開始される生化学的又は分子生物学的反応用の例である。より一般的には、生化学的又は分子生物学的反応のセットアップ過程に関して、実施者は、反応混合物の成分が、（ｉ）化学的に安定であり、（ｉｉ）相互に反応せず、かつ（ｉｉｉ）のちに所望の反応を実施する際に機能を失わない、という特性を保持するような条件を望んでいる。周知でしばしば用いられるこの目的のための条件には、多くの生化学反応物質に対して望ましい条件をもたらす０℃から４℃の範囲などの低温の環境温度が含まれる。特に、そのような低温は、中温性生命体由来の酵素の生物活性を阻害する利点がある。しかしながら、熱安定性由来の多くの酵素は、それらの触媒活性がより高い温度で発現するので、室温でとり扱われる。従って、生化学的又は分子生物学的反応のセットアップをする多くの準備過程は、それぞれの反応が適切に実施される温度よりも低い温度で行われる。
【０００６】
技術的には第一の液状組成物の標識成分として着色試薬を有することが望ましい。そうしないと第一の組成物は他の液状組成物と識別できずに混同を生じる。そのような着色試薬は、異なる試薬を反応混合物に混合する手動過程で、視覚での制御ができる利点を供する。理想的にはそのような視覚での制御により、特定の試薬が混合物中にすでに存在するか否かの確認が可能になる。視覚での制御の他に、他の光学的手段、特に自動化可能な方法による評価に適した着色試薬が望ましい。
【０００７】
混合物の目的が生化学反応を起こすことであるという事実の観点では、着色試薬はさらに生化学的反応に関して不活性であることが望ましい。すなわち、着色剤は、混合物で実施される生化学反応を阻害してはならず、あるいは不都合となるほど妨害してはならない。
【０００８】
生化学反応の進行の間に反応混合物の何らかの光学特性が変化するような特殊な場合には、そのような変化の検出が着色剤によって悪影響を受けないことが望ましい。このことは、実行する生化学反応が熱サイクル工程の間、蛍光発光をモニターする工程を含むリアルタイムＰＣＲであるような場合の非常に特殊な要求である。この点での特別な課題は、ＰＣＲ過程の進行及び／または結果を示す検出系の一部として反応混合物中に存在する１種以上の蛍光色素の蛍光を消失させない着色試薬を見つけることである。さらに、もう一つの技術的目的は、目視による制御を、例えば、ただしこれに限定されないが、リアルタイムＰＣＲ用の熱サイクラーなどの装置によって発生させることができる光学的な読み取りを用いた自動化制御と結びつけるという要望である。
【０００９】
温度変更(temperature shift)を含む生化学反応により一般的な焦点を合わせて、本開示の著者らは、低濃度でも人間の眼で容易に見ることができる色だけでなく、蛍光を発することもできる色素を有する熱に不安定な色素を探索する取り組みを行った。具体的には、色素を含む反応混合物の処理の進行の事例である光学的検出への影響を最小にするような熱に不安定な色素に探索の焦点を置いた。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる第１の側面は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す、精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む、水系組成物であって、ここで、ポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い、水系組成物である。本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる第２の側面は、本明細書の開示による熱安定性ポリペプチド（ポリペプチドは前記組成物に含まれる）の存在を示すための水系組成物の使用である。本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる第３の側面は、複数の成分を混合し混合物を調製する過程で、第１の成分の存在、及び任意に更なる成分の存在を確認する方法である。この方法は、以下の工程を含む。（ａ）二つ以上の成分の混合物を別々の水溶液として用意する。ここで成分の一つは生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドを含む；（ｂ）第１の成分を選択し、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す第１の精製された熱に不安定な水溶性物質で、第１の成分を染色する。ここで工程（ａ）のポリペプチドの最高許容温度は第１の水溶性物質の最高許容温度より高い；（ｃ）任意に更なる成分を選択し、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示すさらなる精製された熱に不安定な水溶性物質で、さらなる成分を染色する。ここで工程（ａ）のポリペプチドの最高許容温度はさらなる水溶性物質の最高許容温度より高い；（ｄ）二つ以上の成分を混合する；（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中の第１の精製された熱に不安定な水溶性物質の機能的コンフォメーションを評価し、それにより混合物中の第１の成分の存在を確認する；（ｆ）任意に、工程（ｄ）で得られた混合物中のさらなる精製された熱に不安定な水溶性物質の機能的コンフォメーションを評価し、それにより混合物中のそれぞれのさらなる成分の存在を確認する。以上により異なる試薬を混合して、混合物を調製する過程における第１の成分の存在、及び任意に更なる成分の存在を確認する。本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる第４の側面は、組成物の処理状況を確認する方法である。ここで組成物の処理は温度変更の適用を含み、前記方法は、以下の工程を含む。
（ａ）生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物を用意する工程であって、ここでポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い、工程；（ｂ）前記水溶性物質の最高許容温度より高い温度に変更して、工程（ａ）の組成物を処理する工程であって、ここで前記水溶性物質のコンフォメーションは不可逆的に変化し、それにより機能を失う、工程；（ｃ）前記水溶性物質の機能的コンフォメーションを光学的手段によって評価する。以上により組成物の処理状況を確認する。本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる第５の側面は、組成物の第１の未処理状況及び第２の処理状況を確認する方法である。ここで、組成物の処理は温度変更の適用を含み、前記方法は、以下の工程を含む。
（ａ）生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す機能的コンフォメーションを有する精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物を用意する工程であって、ここで、前記ポリペプチドの最高許容温度は当該水溶性物質の最高許容温度より高い、工程；（ｂ）工程（ａ）の組成物を当該水溶性物質の最高許容温度より低い温度に温度変更することなく保持し、当該水溶性物質のコンフォメーションの機能を維持する工程；（ｃ）当該水溶性物質の機能的コンフォメーションを光学的手段により評価する工程；（ｄ）工程（ａ）の組成物を当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度に変更する工程であって、ここで当該水溶性物質のコンフォメーションは不可逆的に機能を失う、工程；（ｅ）工程（ｃ）を繰り返す工程。それにより組成物の第１の未処理状況及び第２の処理状況を確認する。本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる第６の側面は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質を含む水系組成物を含む部材のキットであって、ここで、前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、キットである。
【００１１】
発明の詳細な説明
この報告では、いくつかの用語は特別の意味で用いられるか、最初に定義される。本開示の目的に対して、用いられる用語は、それが存在するとき、それらの定義が下記の定義と矛盾する、又は部分的に矛盾する場合を除き、それらの技術分野で認められた定義で規定される。定義が矛盾する場合には、用語の意味は下記の定義のいずれかでまず規定される。
【００１２】
用語「含む」は、本発明の明細書及び請求項では、「含有するが、必ずしもそれに限定されない」を意味して用いられる。
【００１３】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、一つ又は一つ以上（すなわち少なくとも一つ）冠詞の文法上の目的語を参照して用いられる。例を挙げると、「１つの化合物」は１つ以上の化合物を意味する。
【００１４】
濃度範囲などの数値範囲を指定する時、その範囲は第１の値ｎ１と第２の値ｎ２によって示される。指定された範囲の低い方の境界は第１の値ｎ１に等しいかｎ１より高いものとして解釈される。指定された範囲の高い方の境界は第２の値ｎ２に等しいかｎ２より低いものとして解釈される。従って指定された範囲の値ｘはｎ１≦ｘ≦ｎ２で与えられる。
【００１５】
数値ｎと共に用いられる用語「約」（「約ｎ」）は数値±５％の値、すなわち、ｎ−０．０５ｎ≦ｘ≦ｎ＋０．０５ｎで与えられる区間を示すと解釈される。数値ｎと共に用いられる用語「約」（「約ｎ」）が具体的な実施態様を記述する場合には、他に別に示されていなければ、ｎの値はさらに具体的実施態様の値である。
【００１６】
用語「可視光」は電磁波のうちの人間の眼で認識できる部分を指す。人間の眼は約３８０ｎｍから約７５０ｎｍの波長に反応するとされている。スペクトル色という観点では、約３８０ｎｍから約４３０ｎｍの範囲の単色の波長を紫、約４３０ｎｍから約４９０ｎｍの範囲を青、約４９０ｎｍから約５７０ｎｍの範囲を緑、約５７０ｎｍから約６００ｎｍの範囲を黄、約６００ｎｍから約６４０ｎｍの範囲をオレンジ、及び約６４０ｎｍから約７５０ｎｍの範囲を赤と認識する。
【００１７】
光が物体に照射されると、吸収、反射及び／又は散乱が起こる。入射したすべての波長が表面で均等に吸収されると、人間は物体を黒と認識する。すべての波長が表面で均等に反射されると、物体は白と認識される。用語「色」は、上に述べたような赤、青、黄などと呼ばれる分類に対応する可視スペクトルの単色光に対する人間の視覚を意味する。白色光に含まれる波長の一部が吸収されると、視覚は吸収されなかったものを「色が付いた」光として検出する。認識される色は、除かれた色の補色と見做される。例えば、白色光から赤の波長が吸収によって除かれると、認識される色は青緑となる。青緑は赤の補色であり、赤は青緑の補色である。このように、色は、光のスペクトル、すなわち波長に対する光の強さの分布が、光受容体のスペクトル感度を有する眼と相互作用して派生する。「着色剤」は無色の物体と混合される第一の有色の物体であると解釈される。いくつかの物体、特に有色の液体は、光を反射するだけでなく、いくつかの実施態様では、光を透過し、又は、それ自身が光を放射し、それらもまた色に寄与する。無色透明な液体は液体に可溶な色素を着色剤として添加することにより着色することができる。「色素」は一つ以上の波長で光を吸収できる化合物である。本開示の文脈において、色素は、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す水溶性の物質である。当業者に周知の色素の具体的実施態様は非蛍光性色素（ただしこれに限定されない）である。当業者に周知の色素のさらなる具体的実施態様は蛍光色素（ただしこれに限定されない）である。蛍光色素は、励起により光を再放射する性質、すなわち「蛍光」によって特徴付けられる。
【００１８】
本開示の文脈において、材料（例えば、生物活性を有するポリペプチド、光を吸収する及び／又は蛍光を発する物質など、ただしこれらに限定されない）は、許容温度より高い温度での加熱による不可逆的な反応により、その化学的及び／又は物理的な構造を変化させて、損傷、変性、分解、機能喪失又は、別の方法で不活性化されるなどして、機能しなくなると、「熱不安定性 (thermolabile)」と解釈される。それぞれの材料について考えると、「許容温度 (permissive temperature)」は、その温度までは、機能を有し、許容温度より高い温度では不可逆的に機能を失う特徴的な性質を示すことのできる温度を規定する。特徴的な性質を示す性能とは、可逆的な失活を含むと解釈される；従って、その材料はある温度より高い温度で機能を停止するが、温度が再び下がると機能が戻る。従って、用語「許容温度」は、可逆的な失活となるような条件を含む。それぞれの材料について考えると、その温度より高いところでは不可逆的な変化が起こる温度を「最高許容温度」とする。用語「熱安定性」及び「熱に安定な」は、第２の材料に比べて、第２の材料が熱に不安定なある温度で、その化学的及び／又は物理的構造の不可逆的変化に耐える第１の材料の性質を意味する。
【００１９】
本明細書に開示されたすべての他の側面及び実施態様に関わる一つの側面は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、そして／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物であって、ここで、前記ポリペプチドの最高許容温度は前記水溶性物質の最高許容温度より高い、水系組成物である。
【００２０】
本明細書に開示されるすべての側面の更なる実施態様は、当該組成物に含まれる熱安定性ポリペプチドの存在を示すための、本明細書に開示される水系組成物の使用である。更に、本明細書に開示されるすべての側面の具体的な実施態様は、当該組成物に含まれる熱に不安定な水溶性物質が最高許容温度より高い温度に組成物がさらされていないことを示すための本明細書に開示される水系組成物の使用である。ここで、当該水溶性物質は許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示し、ポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い。更に、本明細書に開示されるすべての側面のもう一つの施態様は、当該組成物に含まれる熱に不安定な水溶性物質が、最高許容温度より高い温度に組成物がさらされたことをさらに示すための本明細書に開示される水系組成物の使用である。ここで、当該水溶性物質は許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示し、ポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い。
【００２１】
重要なのは、ポリペプチドの最高許容温度が水溶性物質の最高許容温度より高いことである。本明細書に開示されるすべての側面の具体的な実施態様では、ポリペプチドの許容温度で、ポリペプチドは生物活性を有する、あるいはポリペプチドの生物活性が可逆的にブロックされている。上記の「許容温度」に関する理解の範囲で、ポリペプチドの物理化学的状態は、機能、ここでは生物学的機能を伴うコンフォメーションを示すこと、あるいは再獲得することと対応している。従って、本明細書に開示されるすべての側面の具体的な実施態様では、ポリペプチドの最高許容温度まで、ポリペプチドは生物活性を有する、あるいはポリペプチドの生物活性が可逆的にブロックされている。本明細書に開示されるすべての側面のより具体的な実施態様では、ポリペプチドの最高許容温度より高い温度では、ポリペプチドは生物活性を持たず、ポリペプチドの生物活性は不可逆的にブロックされている。
【００２２】
すでに上に述べたように、本明細書に開示される組成物では、水溶性物質の最高許容温度はポリペプチドの最高許容温度よりも低い。機能的コンフォメーションは許容温度に依存する。水溶性物質は、機能的コンフォメーションである時にのみ、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す。本明細書に開示されるすべての側面のさらに別の具体的な実施態様では、当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度に当該水溶性物質がさらされない限り、当該水溶性物質の許容温度において、当該水溶性物質は、機能的コンフォメーションであり、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す。従って、本明細書に開示されるすべての側面のさらなる具体的な実施態様では、当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度に当該水溶性物質がさらされない限り、当該水溶性物質の最高許容温度まで、当該水溶性物質は、機能的コンフォメーションであり、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す。従って、本明細書に開示されるすべての側面のより具体的な実施態様では、当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度で、当該水溶性物質のコンフォメーションは不可逆的に変化し、それにより機能を失う。
【００２３】
好都合にも、生物学的機能を有するポリペプチドの許容温度の範囲は、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す水溶性物質の許容温度の範囲と重なり合う。従って、本明細書に開示されるすべての側面に関係する更なる側面は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物であって、ここで、ポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高く、熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度は、ポリペプチドの許容温度である、水系組成物である。
【００２４】
非許容温度による水溶性物質の失活速度は一律ではない可能性がある。当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度に達する温度変化にさらされると、当該水溶性物質はその機能的コンフォメーションを失い始め、それにより光の吸収又は蛍光の発生能力を失う。このような機能の喪失は速いことも遅いこともあり、後者の場合、徐々に変化を起こす。分子レベルでは、当該水溶性物質の個々の分子が存在し、その大部分は不可逆的に機能を失うが、同時に、非許容の高温での培養の時間幅及び温度自体によっては、機能が残っている当該水溶性物質の残りの分子の少量の官能基が少なくとも短時間の間存在する。例えば、当該水溶性物質の最高許容温度よりわずかに高い非許容温度での非常に短い時間幅の培養では、当該水溶性物質の一定部分は依然として機能性を持っている。好都合にも、本明細書に開示されるすべての側面のさらなる具体的な実施態様では、熱に不安定な水溶性物質は、当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度で、組成物中の当該水溶性物質の光の吸収及び／又は蛍光の発生能力の７５％以上が不可逆的にブロックされるように選択される。短い時間間隔の後に徐々に失活する場合に、温度を再び当該水溶性物質の許容温度範囲の温度に下げると、機能的コンフォメーションを有する残った物質は、まだ、光を吸収し、かつ／又は蛍光を示すことができる。従って、本明細書に開示されるすべての側面のさらなる具体的な実施態様では、ポリペプチド及び当該水溶性物質の両方に許容される第１の温度よりも高く、かつ当該水溶性物質の最高許容温度より高い第２の温度にで、（ａ）ポリペプチドの生物活性の５０％以上が存在するかあるいは可逆的にブロックされており、（ｂ）当該水溶性物質の７５％以上が機能を失ったコンフォメーションである。より具体的には、第２の温度で、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、及び９５％からなる群から選択される量のポリペプチドの生物活性が存在するかあるいは可逆的にブロックされている。更に具体的には、第２の温度で、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％からなる群から選択される量の当該水溶性物質は機能を失ったコンフォメーションを有する。従って、第２の温度で、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％からなる群から選択される量の組成物中の当該水溶性物質の光の吸収及び／又は蛍光の発生能力が不可逆的にブロックされている。
【００２５】
生物活性を有するポリペプチドは、水溶性物質の許容温度範囲内で熱に安定なものが選ばれる。重要なのは、生物活性を有するポリペプチドの最高許容温度が水溶性物質の最高許容温度より高いことである。本明細書に開示されるすべての非常に有利な具体的実施態様では、生物活性を有するポリペプチドは、好熱性生体由来である。好熱性菌は約４０℃から約１２０℃の比較的高温の場所に存在する極限微生物体である。好熱性菌は中温菌とは区別される。多くの好熱性菌は古細菌であるが、好熱性真性細菌も又知られている。好熱性菌は、典型的には、温泉や深海熱水噴出孔などの地球上の様々な地熱で加熱された地域でも、泥炭湿原や堆肥など腐敗した植物でも発見される。他のタイプのバクテリアと違って、好熱性菌は同じ温度では他のバクテリアが損傷を受けたり、場合によっては死んでしまうような、より高い温度で生息できる。それらの生息条件として、好熱性菌は高温に耐え、かつ機能さえする酵素を含む。これらの酵素のいくつかは、分子生物学において、単離された形（例えば、ＰＣＲ用の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）で用いられている。本明細書に開示されるすべての側面の具体的実施態様では、生物活性を有するポリペプチドは酵素であり、より具体的には鋳型依存性ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼの活性を有する酵素である。
【００２６】
標的分子の観点であらゆる生物活性を考えると、本明細書に開示されるすべての側面のさらなる具体的実施態様では、開示されたあらゆる組成物は、更に酵素の基質又は酵素に対する補基質 (co-substrate)を含む。生化学及び分子生物学ではより具体的に、基質は酵素がそこで作用する分子である。酵素は基質を含む化学反応に触媒作用を及ぼす。単一の基質の場合、基質は酵素の活性部位に結合し、酵素−基質複合体を形成する。基質は１つ以上の生成物に転換され、その後、活性部位から離脱する。活性部位は遊離状態になり、その後他の基質分子を受け入れる。２種以上の基質の場合、これらは、共に反応して生成物を生成する前に、活性部位に特定の順序で結合する。この観点では、補基質（補酵素と呼ばれることもある）が、いくつかの酵素触媒反応に存在する。補基質はそれ自体では触媒活性を持たないが、酵素に対して補助的で、その触媒活性を発現する。補基質は典型的には、酵素で触媒される生化学的反応の転換部位を提供し、基質と共に酵素によって反応するヘルパー物質として作用する。
【００２７】
具体的実施態様では、本明細書のすべての側面及び実施態様に開示される組成物に含まれる基質は、核酸、より具体的には、鋳型依存性ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼによって処理できる核酸又はそれらの機能的な同等物、更に具体的には、任意に一つ以上の検出可能な標識を含む、更に具体的には二本鎖、一本鎖又はそれらの混じったコンフォメーションのＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。更にこの観点では、ビオチン残基、ジゴキシゲニン残基又はフルオロフォア（蛍光色素分子）（ただしこれらに限定されない）などの検出可能な標識を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。更にこの観点では、ジオキシヌレオシド、及びジゴキシゲニン残基又はフルオロフォア（ただしこれらに限定されない）などの検出可能な標識を含むヌクレオシド（ただしこれらに限定されない）などのヌクレオシド類似体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。さらにより具体的な実施態様では、基質は、ヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、又はそれらの機能的な同等物である。この観点では、それらの機能的な同等物は、酵素、すなわち鋳型依存性ＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼによって処理できる。そのような機能的な同等物は、ビオチン残基又はフルオロフォア（ただしこれらに限定されない）などの検出可能な標識を含むヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
【００２８】
本明細書に開示されるすべての側面及び具体的実施態様では、許容温度で機能的コンフォメーションを有する精製された熱に不安定な水溶性物質は、光、具体的には可視光、より具体的には、３８０ｎｍから７５０ｎｍの光、更に具体的には、波長範囲５００ｎｍから６５０ｎｍの光を吸収する。好都合な熱に不安定な水溶性物質はポリペプチド成分及び任意に発色団を含むことが知られている。従って、非常に好都合なことに、本明細書に開示されるすべての側面の具体的実施態様では、当該水溶性物質はバクテリオロドプシン又はそれらの機能的な変異体又は誘導体を含む。
【００２９】
主題である熱安定性ポリペプチド（例えば酵素）及び熱に不安定な可溶性色素、すなわち、この実施態様では許容温度で光の吸収及び／又は蛍光の発生を伴う機能的コンフォメーションを有する精製された熱に不安定な水溶性物質の色素は、異なる温度でのそれぞれの機能的な状態に関する異なる具体的特性により特徴づけられる。本質的には、ポリペプチドの最高許容温度は当該水溶性物質の最高許容温度より高い。未変性の形態、すなわちその機能的コンフォメーションにある熱に不安定な色素は、可視光を吸収する。未変性の形態は、色素をその光吸収特性に対応する化学的及び／又は物理的状態で存在させる許容温度で存在する。ひとたび、温度が最高許容温度より高くなると、色素は不可逆的に可視光を吸収する能力を失う。本開示による水系組成物中の熱に不安定な色素の温度の閾値は、水系組成物中の熱安定性ポリペプチド（例えば熱安定性酵素）の機能的な温度範囲内になるように選ばれる。具体的な実施態様では、熱に不安定な色素は、組成物中で熱安定性酵素がまだ活性があるか、わずかに可逆的に阻害されているが、本質的に相当量は変性されていない温度範囲で不可逆的にその可視光を吸収する能力を失う。
【００３０】
この報告で開示されるすべての側面の具体的実施態様では、熱に不安定な色素は、熱に不安定なバクテリオロドプシンである。一般名「バクテリオロドプシン」（＝ＢＲ；Trivedi S.によりRecent Patents on DNA & Gene sequences 5 (2011) 35-40にまとめられている）は、主として高度好塩菌（Halobacteria）（古細菌）中の紫膜中に発見された内在性膜タンパク質を指す。この細菌バイオマスから精製されたタンパク質は緑色光（波長５００−６５０ｎｍ、約５６８ｎｍ吸収極大を有する）を吸収し、それを細菌の中でＡＴＰ生成に用いられる電気化学的な勾配に変換する。ＢＲの結合部位に共有結合している補助因子レチナールは多くの異なる化学構造で置換され、そこで実現される改変された特性には、色及び光化学的挙動が含まれる。機能性レチナール類似体中の共役二重結合の数により、ほとんどすべての可視光及び近赤外線での吸収特性の物質を創出できる（Oesterheld D. et al. Quarterly Reviews of Biophysics 24 (1991) 425-478）。更に、ＢＲのポリペプチド部分は分子設計、例えば、ＢＲ分子の表面のある種の特性を変えるための分子設計の主題である（Mitra K. et al. Protein Engineering 15 (2002) 485-492）。バクテリオロドプシン又はそれらの機能的な変形体及び同等物について記述された異なる物理的及び化学的コンフォメーションに関して、本開示による解釈では、機能的コンフォメーションは、許容温度で光を吸収できる熱に不安定なコンフォメーションに相当する。
【００３１】
ＢＲの三次元の三次構造は、脊椎動物のロドプシンのそれに類似している。ＢＲは、典型的なレチリニデンタンパク質構造を有し、そこには７つの膜透過アルファらせんがあり、その中に１個のレチナールが埋め込まれている。発色団は、シッフ塩基結合を介してリシン残基に共有結合している。ロドプシン及びバクテリオロドプシンの機能は異なっており、それらのアミノ酸配列はわずかな相同性しかない。ＢＲは、塩がない時に安定であり、ほとんどのプロテアーゼによる消化に耐性を持ち、長期間に亘って光化学特性を保持し、ｐＨ範囲１−１１で０℃から４５℃の間で機能し、かつ水中で８０℃を超える温度で、又、乾燥状態で１４０℃まで耐性があると報告されている（Trivedi S.、上記参照）。ＢＲを単離する方法は当業者にはよく知られており、本明細書では、実施例１による（ただしこれに限定されない）方法に示される。その他の方法は、例えば、Seyedkarimi, M.-S. ら、Extremophiles 19 (2015) 1021-1028に報告されている。本明細書に開示される、及び同じ証拠によるすべての側面に関して、精製されたバクテリオロドプシンに関係する具体的実施態様は、ユリアーキオタ（Euryarchaeota）の１種を培養したバイオマスから単離された（例えば、バクテリオロドプシンを含有する紫膜小胞として残渣バイオマスから単離された）、バクテリオロドプシンを有する可溶化された膜小胞を包含する。本開示の目的では、バクテリオロドプシン及び／又は紫膜小胞の調製は、プロトン転座系として機能する必要はないが、許容温度で光の吸収を伴う機能的コンフォメーションを有するそのような材料である限り、又、そのような材料が、許容温度で光の吸収を伴う機能的コンフォメーションを有する当該水溶性物質（ここでポリペプチド（例えば熱安定性酵素）の最高許容温度は当該水溶性物質の最高許容温度より高い）に対して一般論として記述されるような熱に不安定である限り、技術的に十分である。
【００３２】
本報告で開示されるすべての側面の更に具体的な実施態様では、熱に不安定な色素、すなわち、許容温度で光の吸収を伴う機能的コンフォメーションを有する熱に不安定な水溶性物質は、ハロバクテリウム・ハロビウム(Halobacterium halobium)としても知られるハロバクテリウム・サリナルム(Halobacterium salinarum)由来のバクテリオロドプシンである。この特定の熱に不安定なＢＲはバクテリオロドプシンの最初の例として、ある程度文献に述べられている。示差走査熱量測定により、Jackson, MB & Sturtevant JM Biochemistry 17 (1978) 911-915は、Halobacterium halobiumから単離された紫膜で、一つは約８０℃（文献では、前転移としても参照されている）、もう一つ（主転移）は約９５℃−１００℃の二つの転移を報告している。０℃から７５℃には転移は見られない。その後の研究で、Cladera Jら（Eur. J. Biochem. 207 (1992) 581 -585）は紫膜の主たる熱転移は、静電及び水素結合の相互作用の網目の崩壊を含む共同のコンフォメーションの変化によることを見出した。ＢＲの熱転移は、ＢＲポリペプチドの結合部位への共有結合であるレチナールシッフ塩基の加水分解による脱色を伴うと述べられている。事実、ＢＲの熱漂白は、ＢＲポリペプチドの不可逆的な変性、補助因子レチナールへの共有結合の開裂、及びそれによる色媒介補助因子の喪失の結果である。
【００３３】
一方では、古細菌の紫膜由来の野生、すなわち未変性のＢＲは可視光を吸収可能な水溶性色素として用いられる。熱安定性ヌクレオチドポリメラーゼ酵素との反応混合物に関して、意外にも、ＢＲはヌクレオシド／デオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ酵素に対して不活性成分として作用することが見いだされた。又、ＢＲの光誘導脱色のいかなる生成物、すなわち、無機能化され、光吸収に関して機能を喪失した形態のＢＲ（特にHalobacterium salinarum由来のバクテリオロドプシン）は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ酵素を妨害せず、また、それらのヌクレオシド／デオキシヌクレオシド三リン酸との相互作用を妨害せず、さらに、鋳型核酸との酵素／基質相互作用に関して、検出されるような抑制作用は存在しない。
【００３４】
本明細書に開示されるすべての側面及び実施態様では、許容温度で機能的コンフォメーションを有する精製された熱に不安定な水溶性物質は蛍光を示す。本明細書に開示されるすべての側面の具体的な実施態様では、当該水溶性物質の蛍光は３５０ｎｍから７００ｎｍの範囲の発光波長を有する。本明細書に開示されるすべての側面の別の具体的な実施態様では、蛍光は波長範囲３００ｎｍから６５０ｎｍの光で励起されて発光する。好都合にも、熱に不安定な蛍光物質は、ポリペプチド成分及び任意に発色団を含むことが見いだされている。従って、非常に好都合にも、本明細書に開示されるすべての側面の実施態様で、当該水溶性物質は、蛍光タンパク質又はそれらの機能的変形体または誘導体を含む。
【００３５】
主題である熱安定性ポリペプチド（例えば酵素）及び可溶性の熱に不安定な蛍光物質（例えば蛍光タンパク質）、すなわち、この実施態様では許容温度で蛍光を発生する機能的コンフォメーションを有する精製された熱に不安定な水溶性物質は、異なる温度でのそれぞれの機能的な状態に関する異なる具体的特性により特徴づけられる。本質的には、ポリペプチドの最高許容温度は当該水溶性物質の最高許容温度より高い。未変性の形態、すなわちその機能的コンフォメーションにある熱に不安定な蛍光色素は、特定の励起波長の光を吸収し蛍光を発する。未変性の形態は、蛍光色素をその光を吸収し蛍光を発する特性に対応する化学的及び／又は物理的状態で存在させる許容温度で存在する。ひとたび、温度が最高許容温度より高くなると、色素は不可逆的に光の吸収及び／又は蛍光の発生能力を失う。本開示による水系組成物中の熱に不安定な蛍光色素の温度の閾値は、水系組成物中の熱安定性ポリペプチド（例えば熱安定性酵素）の機能的な温度範囲内になるように選ばれる。具体的な実施態様では、熱に不安定な蛍光色素は、組成物中で熱安定性酵素がまだ活性があるか、わずかに可逆的に阻害されているが、実質的にほとんどの量は変性されていない温度範囲で不可逆的にその光の吸収及び／又は蛍光の発生能力を失う。
【００３６】
本報告で開示されるすべての側面の更に具体的な実施態様では、熱に不安定な蛍光色素、すなわち、許容温度で蛍光の発生を伴う機能的コンフォメーションを有する熱に不安定な水溶性物質は、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質／Ｒ−フィコエリトリン、及び赤色蛍光タンパク質／ｄｓＲｅｄからなる群から選択される蛍光タンパク質である。
【００３７】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、２３８アミノ酸残基（２６．９ｋＤａ）からなるタンパク質で、青から紫外領域の光を照射すると明るい緑色の蛍光を示す。多くの他の海洋生物が同様の緑色蛍光タンパク質を有するが、ＧＦＰは伝統的にAequorea victoria（オワンクラゲ）から最初に単離されたタンパク質を指す。A. victoria由来の緑色蛍光タンパク質は、３９５ｎｍの波長に主励起ピークを、４７５ｎｍに小さい励起ピークを有する。その発光ピークは５０９ｎｍで、可視光スペクトルの緑の低波長部分にある。ウミシイタケ（Renilla reniformis）由来のＧＦＰは４９８ｎｍに単一の主励起ピークを有する。細胞及び分子生物学では、ＧＦＰ遺伝子はしばしば発現を示すものとして用いられる。変性形態では、バイオセンサーを作製するのに用いられ、遺伝子が所与の生体のあらゆるところで発現する概念の確認として特定のＧＦＰ発現する多くの動物が創出されている。ＧＦＰ遺伝子は、育種、ウィルスベクターを用いた注入、又は細胞形質転換により生体に導入され、それらのゲノムに保持される。増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）は、組み換え技術によって発現し、形質転換された大腸菌（E. coli.）から精製される。組み換えＥＧＦＰ(Gene Bank Accession no. U57607)は、２９３アミノ酸を有する３２．７ｋＤａの単量体で、任意にHis-tagを含む。組み換え型ＥＧＦＰの励起及び発光スペクトルは、Aequorea victoriaから精製されたＧＦＰと同一であり、励起／発光波長はそれぞれ４８８ｎｍ、５０７ｎｍである。ＥＧＦＰは例えばBioVision, Inc., Milpitas, CA (USA)から, 品番4999-100の名で市販されている。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）は組み換え技術によって発現し、形質転換された大腸菌（E. coli.）から精製される。このタンパク質は２３８アミノ酸を有する２６．４ｋＤａの単量体で、励起／発光波長は５２５ｎｍ、５３８ｎｍである。ＹＦＰは例えばBioVisionから品番4998-100の名で市販されている。青色タンパク質（ＢＦＰ）は組み換え技術によって発現し、形質転換された大腸菌（E. coli.）から精製される。このタンパク質は２５９アミノ酸を有する２９ｋＤａの単量体で、任意にHis-tagを含み、等電点は６．１７である。励起波長は３０８ｎｍから３８３ｎｍであり；発光波長は４４０ｎｍから４４７ｎｍである。ＢＦＰ例えばBioVisionから品番4994-100の名で市販されている。シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）は組み換え技術によって発現し、形質転換された大腸菌（E. coli.）から精製される。このタンパク質は２８４アミノ酸を有する３１．３ｋＤａの単量体で、任意にHis-tagを含み、励起／発光波長はそれぞれ、４５８ｎｍ、４８０ｎｍである。ＣＦＰは例えばBioVisionから品番5986-100の名で市販されている。赤色蛍光タンパク質／ｄｓＲｅｄは組み換え技術によって発現し、形質転換された大腸菌（E. coli.）から精製される。このタンパク質は２７．６ｋＤａの単量体で、任意にHis-tagを含み、励起／発光波長はそれぞれ５５７ｎｍ、５８５ｎｍである。赤色蛍光タンパク質／ｄｓＲｅｄは例えばBioVisionから品番4997-100の名で市販されている。赤色蛍光タンパク質／Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）は紅藻から単離された極めて鮮やかなフィコビリタンパク質で、高量子収率で、極めて明るい赤オレンジ色の蛍光を発する。Ｒ−ＰＥはａ、ｂ及びｇサブユニットからなり、（ａｂ）６ｇとして存在する。Ｒ−ＰＥ及び密接な関係のあるＢ−ＰＥ（Ｂ−フィコエリトリン）はオレンジ色の蛍光を有する最も強いオレンジ色蛍光フィコビリタンパク質である。Ｒ−ＰＥは、複合体（コンジュゲート）に含まれて、蛍光に基づく検出にしばしば用いられる大きな分子である。赤色蛍光タンパク質／Ｒ−フィコエリトリンは例えばBioVisionから品番6005-1の名で市販されている。
【００３８】
本明細書に開示されるすべての側面の別の具体的実施態様では、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物であって、ここで、ポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い、水系組成物が報告される。ここで、当該組成物はさらに複数の異なる精製された熱に不安定な水溶性物質を含み、ここで、ポリペプチドの最高許容温度はそれぞれの熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い。本明細書に開示されるすべての側面のさらに具体的実施態様では、少なくとも第１の物質は、許容温度で光の吸収を伴う機能的コンフォメーションを有し、少なくとも第２の物質は、許容温度で蛍光の発生を伴う機能的コンフォメーションを有する。非常に好都合で、この関連で高度に実用的なのは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ活性を持った（１つ以上の）精製された熱安定性鋳型依存酵素、熱に不安定な蛍光タンパク質、及び組成物中の色素として熱に不安定なバクテリオロドプシンを含む水系組成物である。そのような具体的実施態様では、酵素の許容温度で、酵素は生物活性を有する、あるいは酵素の生物活性は可逆的にブロックされている。酵素（又は組成物中に存在する複数の熱安定性酵素）の許容温度範囲は、蛍光タンパク質及びバクテリオロドプシン両方の最高許容温度より高い温度まで広がる。従って、酵素及び色素両方に許容の第１の温度と比較して、第１の温度より高く、色素の最高許容温度より高い第２の温度では、（ａ）５０％以上の酵素の生物活性があり、あるいは可逆的にブロックされ、かつ、（ｂ）７５％以上のそれぞれの色素が機能を喪失したコンフォメーションである。より具体的には、第２の温度では、それぞれの色素の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％からなる群から選択される量が機能を喪失したコンフォメーションである。
【００３９】
本明細書に開示されるすべての側面のさらに具体的実施態様では、水系組成物は、１つ以上の反応槽、具体的にはマイクロウェルプレートの形態の複数の反応槽に格納されている。本明細書に開示されるすべての側面のより具体的実施態様では、水系組成物は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ活性を持った１種以上の熱安定性酵素を含み、かつ水系組成物を含む１つ以上の反応槽はリアルタイムＰＣＲ装置に設置される。
【００４０】
温度変化で開始される生化学的又は分子生物学的反応にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる（ただしこれに限定されない）。ＰＣＲは以下のサイクルを通じて、ＤＮＡのセグメントの多数の複製を生成する過程である；（１）変性（熱で誘導された二本鎖ＤＮＡの一本鎖への分裂）；（２）アニーリング（標的セグメントの両端への特定のプライマーの結合）；及び（３）伸長（ＤＮＡポリメラーゼを用いたヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の取り込みによる標的セグメントへのプライマー配列の拡張）。一定数のサイクル（例えば３０以上）のそれぞれのサイクルで増幅された生成物（ＰＣＲ生成物）は、次に、さらなる試験に供される。変性工程（１）は温度変化を必要とするので、ＰＣＲは、典型的には、Thermus aquaticus、Pyrococcus furiosus及びThermococcus litoralis（ただし、これに限定されない）などの好熱性生体から誘導される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される。
【００４１】
終点の評価は最後のＰＣＲサイクルの終わりに、積算されたＰＣＲ生成物の量を測定するが、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）では、ＰＣＲが進行する間、増幅が起こった時に（すなわちリアルタイムに）ＰＣＲの増幅をモニターする。従って、最後のサイクルすなわち終点の後のＰＣＲの最後ではなく、ＰＣＲ過程全体を通して（一定数のサイクルの間）データを収集する。リアルタイムＰＣＲでは、反応は、一定数のサイクルの後の積算されたＰＣＲ生成物の量よりはむしろ、ＰＣＲ生成物の増幅が最初に検出されたときの、サイクルの時間で特徴づけられる。標的核酸の最初の複製数が多いほど、ＰＣＲ生成物の増幅の指標の明白な増加が早く観測される。
【００４２】
リアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＲ生成物の増幅の指標の効果を示す多くの異なる技術的可能性がある。典型的で、当業者によく知られている指標は、蛍光に基づく光である。リアルタイムＰＣＲ過程の間モニターされる蛍光は、標的配列とは無関係な特異的でない検出方法、例えばｄｓＤＮＡに結合すると特別な蛍光特性を有する蛍光色素（例えば、SYBR（登録商標） Green I又は他の挿入色素）によって、又は、配列特異的な蛍光オリゴヌクレオチドプローブすなわち配列特異的方法（TaqMan（登録商標） 加水分解プローブ、Molecular Beaconsなど）を用いて、検出される。
【００４３】
リアルタイムＰＣＲ、すなわち、リアルタイムＰＣＲ熱サイクルを実施するための多くの異なる市販装置がある。リアルタイムＰＣＲ熱サイクル装置の本質的な部分は、温度サイクルを行う熱システム、放射された蛍光をとらえるためのシステムを伴ったフルオロフォアの活性化に必要な光を発するための光学系、及び装置の操作を制御し、発生したデータを収集し解析するソフトウェアである。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲ熱サイクル装置の光学系は、１種以上の蛍光色素を励起する光源、及び放射された蛍光をモニターする検出器の二つの主要部分を含む。励起光源は広いスペクトル又は狭いスペクトルの２種類に分類される。広いスペクトルでは、光源フィルターは特定のフルオロフォアに適した波長範囲に光を狭めるのに用いられる。他の装置ではレーザー及び光放射ダイオードを含む狭いスペクトルの光源が用いられる。光学系の検出器部分はレポーターフルオロフォアから放射される光を記録する。ほとんどのシステムで光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、又は電荷結合素子（ＣＣＳ）カメラが用いられる。フォトダイオード及びＰＭＴがいずれも一度に１点を記録するのに対し、ＣＣＤカメラは、全てのウェルを同時に記録でき、より安定した機械設計となる。いくつかの装置では、可動部の数を減らす複数のフォトダイオード又はＰＭＴが利用される。検出されるチャンネルの数は典型的には１から６個である。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲ装置のそれぞれのチャンネルは、規定の光スペクトルの波長幅によって特徴づけられ、それに対応する光源、フィルターセット及び検出器を有する。検出されるチャンネルの波長幅は、対応する蛍光色素の発光に合わせて選択される。すなわち、マルチチャンネル装置では、特定の色素から発する蛍光は、他のチャンネルではなく単一のチャンネルのみで理想的に検出される。特に、例えば、TaqMan（登録商標）プローブに基づく多重ＰＣＲ法及びＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）に基づくシステムは典型的には、ＦＩＴＣ、ＪＯＥＬ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、Texas Red、Quasar 705及びCy5（ただしこれに限定されない）などの蛍光色素で実施され、多重光学チャンネルを持つ装置で用いられる。
【００４６】
リアルタイムＰＣＲを実施する多くの装置は特定の色素に最適化されている。プラットフォームの中には、ある色素に前もって較正されて供給され、従って、これらの特定の色素で最適の性能を示すものもあるが、同じような励起及び 発光波長を持つ色素を用いることもできる。いくつかのプラットフォームには、装置を使用する前に較正を行う必要のあるものがある。
【００４７】
典型的には、ＰＣＲ及び特にリアルタイムＰＣＲは、１つ以上のバイアル瓶（試験管）で実施される。バイアル瓶は、複数で用意され、アレイ（マイクロウェル又はマルチウェルとも言う）にグループ化される。サイクル装置のプラットフォームで用いられる多数の反応バイアル瓶には異なるフォーマット（型）がある。いくつかの市販装置では標準の９６−ウェルブロックフォーマットが用いられる。更に、３８４−及び／又は１５３６−ウェルブロックを用いることができ、時には同じ装置で９６−ウェルブロックフォーマットにもなる。加えて、単一の試験管（バイアル瓶）の取扱いと９６−ウェルプレートの使用の間の中間体溶液を提供する４８−ウェルまでのプラットフォームが市販されている。
【００４８】
反応を開始する前に、一つの反応に必要な成分を含む反応試薬をそれぞれのバイアル瓶で混合しなければならない。反応試薬は典型的には、鋳型ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ヌクレオシド三リン酸（又はその機能を持った類似物）、標識化されたオリゴヌクレオチド、挿入色素、緩衝剤液、塩、及びその他の化合物を含む水溶液として提供される。しばしば、ある種の成分はＰＣＲ反応混合物に添加される前に、あらかじめ混合（「プレミックス」）される。それらの例として、いわゆる「マスターミックス」がある。ＰＣＲ「マスターミックス」はＰＣＲのワークフローを効率化し単純化するようにプレミックスされ最適化されたフォーマットで、ＰＣＲを実施するために必要な複数の成分を提供する。典型的な市販のマスターミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、塩、マグネシウム又は他の２価イオン、ｄＮＴＰ、及び最適化された反応緩衝液を含む。ＰＣＲを実施するのに適した完全な反応混合物の調製には、鋳型ＤＮＡおよびプライマーのみを加える必要がある。
【００４９】
本開示では、酵素（ただしこれに限定されない）などの熱安定性ポリペプチド及び可溶性の熱に不安定な色素を含む水系組成物を報告する。ここで、熱に不安定な色素は、可視光の吸収を伴うその機能を有し、未変性の形態を有する。本明細書に開示される標識指示色素は、異なる反応試薬を反応混合物中で混合し、温度変化させるプロセス、特に手動で行われるプロセスでの目視による制御で好都合に用いられる。温度を変化させる前に、反応試薬の一部である熱に不安定な指示色素は、人間の眼に見える形で反応試薬の存在を示す。従って、２つ以上の異なる無色の水溶液を混合して反応混合物を調製する時、１つの成分、すなわち、指示色素を含む成分の存否を目視で確認できる。従って、本開示では、異なる反応試薬を混合して反応混合物を調製する過程で、第１の成分の存在を確認する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：（ａ）反応混合物の２つ以上の成分を別々の水溶液として用意する、（ｂ）第１の成分を第１の色素と混合する、（ｃ）第２の成分を、染色した第１の成分と混合し、混合物中の第１の色素を検出し、それにより混合物中の第１の成分の存在を確認する。このような方法は、数多くの反応混合物を手動で調製しなければならない時に、特に有用である。例示のケースでは、多くの所望の反応混合物に対応する多くの反応槽がある。液体を取り扱う第１の工程、具体的には手動でのピペット操作の工程では、成分Ａの水溶液をそれぞれのバイアル瓶に加える。この段階では、未処理の空のバイアル瓶と、既に成分Ａの一定量が加えられているバイアル瓶を、目視又は他の制御で区別することはそれほど困難ではない。液体を取り扱う次の工程では、成分Ｂを加える。特に成分Ａと成分Ｂの添加量が成分Ａ単独の量と大きく違わない場合に、手動での液体の取扱いのあらゆる誤操作をモニターする目視による制御には課題があり、一定数の反応槽が最終的に成分Ｂを欠くことがある。すなわち、バイアル瓶中に成分Ｂを欠くことになるピペットの誤操作を認識できない。二つの成分の体積の差が小さく、特に、一方の第１の成分と第２の成分の合計体積と、他方の第１の成分のみの体積を人間の眼では区別できないような場合に、同じような種類の誤操作がありうる。そのような誤操作の原因は、一つの成分、具体的にはその存在を目視又は色素の検出に基づいた他の方法で認識することが必要な成分に色素を加えることによって避けられる。
【００５０】
混合物に加える更に本質的な成分がある場合には、更なる成分の含有物として用いられるさらなる（第２の）色素が、混合物中の更なる成分の存在を確認するのに、技術的に有用である。しかしながら、この目的には、さらなる色素は、第１の色素の存在下で確認される必要がある。従って、本開示は、異なる反応試薬を混合して反応混合物を調製する過程で、第１の成分及び第２の成分の存在を確認する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：（ａ）反応混合物の３つ以上の成分を別々の水溶液として用意する、（ｂ）第１の成分を第１の色素と混合し、第２の成分を第２の色素と混合する、（ｃ）第３の成分を、染色した第１の成分と混合し、任意に混合物中の第１の色素を検出し、それにより混合物中の第１の成分の存在を確認する、（ｄ）染色した第２の成分を、工程（ｃ）の混合物と混合し、任意に混合物中の第２の色素を検出し、それにより混合物中の第２の成分の存在を確認する、（ｅ）工程（ｃ）及び／又は（ｄ）ですでに実施されている場合を除き、混合物中の第１の及び／又は第２の色素を検出し、それにより混合物中の第１及び第２の成分の存在を確認する。重要なのは、色素をそれぞれの色素を他とは独立して検出できるように選択することである。従って、第１の色素は第２の色素を完全に隠してはならず、逆もまた同様である。
【００５１】
反応試薬に関する異なる成分は、混合した反応混合物を調製する水溶液として用意される。すなわち、異なる反応試薬は、混合物に相互に混合されたときに、反応を起こす条件下で、反応に加わる反応相手を含む。
【００５２】
上に述べたように、本明細書に開示されるすべての他の側面及び実施態様に関する側面は、熱安定性ポリペプチドの存在を示すための、本明細書の開示による水系組成物の使用である（ポリペプチドは前記組成物に含まれる）。更に、本明細書に開示されるすべての他の側面及び実施態様に関する更なる側面は、複数の成分を混合して混合物を調製する過程で、第１の成分の存在、及び任意に更なる成分の存在を確認する方法である。この方法は以下の工程を含む；（ａ）反応混合物の２つ以上の成分を別々の水溶液として用意する。ここで成分の一つは生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドを含む。（ｂ）第１の成分を選択し、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す第１の精製された熱に不安定な水溶性物質（ここで工程（ａ）のポリペプチドの最高許容温度は第１の熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い）で第１の成分を染色する；（ｃ）任意に、更なる成分を選択し、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す更なる精製された熱に不安定な水溶性物質（ここで工程（ａ）のポリペプチドの最高許容温度は更なる熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い）で更なる成分を染色する；（ｄ）２つ以上の成分を混合する；（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中の第１の精製された熱に不安定な水溶性物質の機能的コンフォメーションを評価し、それにより混合物中の第１の成分の存在を確認する；（ｆ）任意に、工程（ｄ）で得られた混合物中の更なる精製された熱に不安定な水溶性物質の機能的コンフォメーションを評価し、それにより混合物中のそれぞれの更なる成分の存在を確認する；以上により、異なる反応試薬を混合して混合物を調製する過程で、第１の成分の存在、及び任意に更なる成分の存在を確認する。
【００５３】
具体的実施態様では、工程（ｄ）の混合物は、工程（ａ）の生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチド、工程（ｂ）の物質、及び任意に工程（ｃ）の更なる物質を含む。さらに具体的なより実施態様では、工程（ｄ）の混合物は水溶液である。より具体的には、生物活性を有する熱安定性ポリペプチドはＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ活性を持った鋳型依存酵素である。更に別の実施態様では、工程（ａ）から（ｆ）は、当該水溶性物質の最高許容温度より低い温度で、温度変化なしに実施される。これにより、第１の物質及び任意に更なる物質の機能は維持される。更なる具体的実施態様では、第１の物質は、熱に不安定な蛍光タンパク質であり、第２の物質は熱に不安定なバクテリオロドプシンである。更なる具体的実施態様では、工程（ｅ）及び工程（ｆ）のいずれも、目視評価、比色測定、及び蛍光測定のいずれかによる評価を含む。更なる実施態様では、この方法は、工程（ｄ）の組成物を当該水溶性物質の最高許容温度より高い温度にする処理の追加の工程（ｇ）を含む。ここで、第１の物質及び任意の更なる物質のコンフォメーションが変化し、それにより不可逆的に機能を失う。更なる実施態様では、この方法は更に、光学的評価、具体的には目視評価、比色測定、及び蛍光測定のいずれかによる評価の追加の工程（ｈ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ｑＰＣＲマスターミックス中の熱に不安定なタンパク質の可視化及び変性。Ａ）変性前に画像化した２０μＬRoche Multiplex DNA Master中のＹＦＰの希釈系。Ｂ）９５℃３０秒後に画像化したパネルＡに示したものと同じプレート。 Ｃ）変性前に画像化した２０μＬRoche Multiplex DNA Master中のＢＲの希釈系。Ｄ）９５℃３０秒後に画像化したパネルＣに示したものと同じプレート。 Ｅ）変性前に画像化した２０μＬRoche Multiplex DNA Master中の表記のフィコビリタンパク質の希釈系。Ｆ）９５℃３０秒後に画像化したパネルＣに示したものと同じプレート。
【図２】ｑＰＣＲマスターミックス中の熱に不安定性な可視化色素の蛍光／吸光特性。グラフ中、ｙ軸は蛍光強度、ｘ軸は培養時間を示す。Ａ）４６５−５１０ｎｍの波長検出チャンネルで定量された２０及び１０μｇのＹＦＰ。Ｂ）５３３−６１０ｎｍの波長検出チャンネルでの吸光度で測定された５００及び１０００μｇのＢＲ。Ｃ）５３３−５８０ｎｍの波長検出チャンネルでの２０００μｇから１２５ｎｇのＲ−ＰＥの２倍希釈系。Ｄ）６１８−６６０ｎｍの波長検出チャンネルでの２０００μｇから１２５ｎｇのＡＰＣの２倍希釈系。Ｅ）６１８−６６０ｎｍの波長検出チャンネルでの２０００μｇから１２５ｎｇのＣ−ＰＣの２倍希釈系。
【図３】デュプレックスｑＰＣＲ性能は、ＹＦＰ又はＢＲによって大きく影響されない。両グラフ中、ｙ軸は蛍光強度、ｘ軸はＰＣＲサイクル数を示す。Ａ）ＹＦＰ／ＢＲ混合物の有（緑、青の曲線）無（赤）でのβグロブリン遺伝子発現を定量するＦＡＭ検出チャンネル応答。鋳型制御なしを紫で示す。Ｂ）同じデュプレックス応答からのＨＥＸ検出チャンネルでのＰｘ００２評価。
【実施例】
【００５５】
実施例１
本発明は、生物活性を有する精製された熱安定性ポリペプチドと、許容温度での機能的コンフォメーションにおいて光を吸収し、かつ／又は蛍光を示す精製された熱に不安定な水溶性物質とを含む水系組成物（ここでポリペプチドの最高許容温度は熱に不安定な水溶性物質の最高許容温度より高い）を提供する。典型的な熱に不安定な水溶性物質の選択のために、人間の眼に見えるいくつかの候補タンパク質を試験した。特に、ｑＰＣＲ（定量ポリメラーゼ連鎖反応）マスターミックスに適した熱に不安定な可視化色素としてのそれらの使用を評価した。
【００５６】
本発明によれば、ユーザーは、上に述べたような水系組成物に提供される熱に不安定な水溶性物質を、標準の９６−又は３８４−ウェルプレート試験で、全ての充填したウェルを容易に確認できる。提供された熱に不安定な水溶性物質は、ＰＣＲ、又は、具体的な実施態様ではｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）の最初の昇温工程で変性されるので、そのような色素は、ＤＮＡ／ＲＮＡ試験、特にリアルタイムＰＣＲ試験の過程で生成する蛍光信号を妨害しない。この技術的効果は、他の充填、及び／又は当業者には既知の正規化色素（normalization dye）（例えばPatent Blue V 又は Rox dyes)全体に亘る際立った特徴及び利点である。先行技術の色素の発光スペクトルは、ＰＣＲの過程で生成する蛍光信号を検出する必要のある装置の検出チャンネルの標的波長と、部分的あるいは全体に重なっている。部分的又は完全な重なりは、プロセスの多重化を制限する。更に、具体的実施態様では、熱に不安定な水溶性物質は蛍光タンパク質なので、この特性は、熱サイクル装置制御ソフトウェアがプレートの充填されたウェルを自動的に検出できるようにする。他の実施態様では、具体的なＤＮＡ又はＲＮＡ試験を、試料中で、蛍光を有し熱サイクル装置の個別の検出チャンネルで独立して検出される多くの熱に不安定な物質の組み合わせを「バーコード」を用いて確認する。
【００５７】
実施例２
本発明による組成物中の熱に不安定な水溶性物質を例示するために、３つのタンパク質ファミリー：A. victoriaから誘導した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、好塩性古細菌H. salinarum由来のバクテリオロドプシン（ＢＲ）、及び深海藻（deep sea algae）から単離されたＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及びｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）のようなフィコビリタンパク質を、検討用に選択した。最初の検討は、Roche Multiplex DNA Masterの２０μＬ反応で、精製されたタンパク質の希釈系を用いて実施し、混合物を目で見るのに必要な可視化色素の量を決定した。次に、これらの反応をｑＰＣＲの開始時の最初の変性を模して、９５℃まで３０秒間加熱し、これらの条件下で、着色したタンパク質がどのように完全に変性されるかを評価した。図１に、希釈系及びそれに続く黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＧＦＰの変異誘導体との反応の変性を可視化したものを示す。図２に同じ条件下でのＢＲの性能を示し、図３にＲ−ＰＥ、ＡＰＣ、又はＣ−ＰＣを可視化色素に用いた時の結果を示す。
【００５８】
３つのタンパク質ファミリーはすべて、添加剤（ウェル中のマスターミックスの存在を示す指示色素としての熱に不安定な水溶性物質）を含むマスターミックスを含むウェルを、添加剤を含まないウェル及び空のウェルと目視で識別することに成功した。可視化に対し、ＹＦＰは、ほとんどのタンパク質で、２０μＬの反応で明らかな黄色を見るのに、最小限１４０μｇを要し（図１Ａ）、２００μｇを超えるＹＦＰを加えた時は、９５℃３０秒では色は完全には消失しなかった（図１Ｂ）。ＢＲでは、２．５μｇと５μｇの間で可視化が実現され（図１Ｃ）、試験したすべての試料で紫色が効果的に消失した（図１Ｄ）。最後に、フィコビリタンパク質はマスターミックスに加えられたわずかナノグラムのタンパク質で明らかに可視化された： Ｒ−ＰＥはわずか２５０−５００ｎｇで可視化され、ＡＰＣは５００ｎｇと１０００ｎｇの間で識別でき、Ｃ−ＰＣは５００ｎｇレベルまで明瞭な青色である（図１Ｅ）。フィコビリタンパク質では一般に、１μｇより低いレベルで９５℃、３０秒の熱パルスにより色が変性された。
【００５９】
実施例３
次に、可視化色素候補の熱不安定性を、Roche LightCycler 480 II ｑＰＣＲ装置で、蛍光／吸光度により試験した。２０μＬのMultiplex DNA Master反応で、具体的な標的タンパク質に適したフィルター：ＹＦＰ（４６５−５１０ｎｍ）、ＢＲ（吸光度のみ、５３３−６１０）、Ｒ−ＰＥ（５３３−５８０）、ＡＰＣ（６１８−６６０）、及びＣ−ＰＣ（６１８−６６０）を用いて、初期の蛍光を測定した。前述同様、９５℃３０秒保持をタンパク質色素の変性に用いた。図２にこれらの実験の結果を示す。ＹＦＰ（図２Ａ）との反応でも、Ｒ−ＰＥ（図２Ｃ）との反応でも、蛍光信号は変性パルスによりベースラインまで減少した。ＡＰＣ（図２Ｄ）及びＣ−ＰＣ（図２Ｅ）では、昇温により、減少したが消失はしない堅固な蛍光信号が見られ、一方、ＢＲ（図２Ｂ）では吸光度の減少蛍光は見られず、この信号はバックグラウンドノイズと明確に識別されなかった。
【００６０】
実施例４
ＤＮＡ又はＲＮＡマスターミックスへの全ての潜在的可視化色素添加剤（すなわち本発
明による水系組成物中に提供される熱に不安定な水溶性物質）で、ｑＰＣＲ性能は、色素添加剤の存在により悪影響を受けてはならない。我々は、まず、２０μＬのMultiplex DNA Master反応でＢＲ（７．５μｇ）及びＹＦＰ（２００ｎｇ）のブレンドを試験した。これらの反応はデュプレックス反応用に標的鋳型ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含み、ＦＡＭチャンネルでのβグロブリン遺伝子発現、及びＨＥＸチャンネルでの合成転写物、Ｐｘ００２検出した。図３は、この可視化色素のブレンドがｑＰＣＲ反応のＣｐ（交差点）を変えず、曲線の形状又は平坦部高さに大きく影響せず、試験したレベルでＢＲ及びＹＦＰの存否で同等の性能を示すことを表している。同様に、図４の同じデュプレックス反応試験で、Ｒ−ＰＥ添加剤４００ｎｇを試験し、Ｃｐ、曲線形状、又はＲＦＩ平坦部の高さへの影響は観察されなかった。
【図１】
2018537971.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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