(57)【要約】本明細書では、ＰＶＳ−ＲＩＰＯワクチンを含むウイルスワクチンなどのウイルス由来の治療剤のための大規模並列シーケンシング法が記載される。方法は、微小不均一性の決定および低頻度の配列改変体の定量化を可能とし、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの場合には、ＲＮＡウイルス由来の治療剤のロットをスクリーニングするのに現在使用されている、サル神経毒力安全性試験（ＭＮＶＴ）およびＰＣＲおよび制限酵素切断による変異体解析（ＭＡＰＲＥＣ）法に置きかわることが予測される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス由来の治療剤を、ウイルス配列改変体についてアッセイする方法であって、
核酸分子を、マスターウイルスバンクまたはワーキングセルバンクから抽出するステップであって、前記マスターウイルスバンクまたは前記ワーキングセルバンクが、前記ウイルス由来の治療剤を含有する宿主細胞を含む、ステップと；
前記抽出された核酸分子を、宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡは実質的に消化するが、ウイルス核酸分子は実質的に消化しない条件下で、ＤＮアーゼと接触させ、これにより、濃縮されたウイルス核酸分子を生成するステップと；
前記濃縮されたウイルス核酸分子がＲＮＡである場合、二本鎖ｃＤＮＡを、濃縮されたウイルス核酸分子から作製し、これにより、ウイルス二本鎖ＤＮＡを生成するステップと；
前記ウイルス二本鎖ＤＮＡを増幅するステップと；
前記ウイルス二本鎖ＤＮＡを定量化するステップと；
シーケンシングライブラリーを、少なくとも５００ｐｇの前記ウイルス二本鎖ＤＮＡから作製するステップであって、前記シーケンシングライブラリーが、前記ウイルス二本鎖ＤＮＡへと接合させた５’アダプターおよび３’アダプターを含む、ステップと；
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、次世代シーケンシングを使用して、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと；
前記複数の配列リードを、前記ウイルス由来の治療剤の基準配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと；
前記ウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ウイルス由来の治療剤を、哺乳動物の宿主細胞へと導入するステップと；
前記ウイルス由来の治療剤の繁殖を可能とする条件下で、前記哺乳動物の宿主細胞を増殖させるステップと；
ウイルス核酸分子を、前記哺乳動物の宿主細胞から抽出するステップと；
任意選択で、前記抽出された核酸分子を、哺乳動物の宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび哺乳動物の宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡは実質的に消化するが、ウイルス核酸分子は実質的に消化しない条件下で、ＤＮアーゼと接触させるステップと；
前記抽出されたウイルス核酸分子がＲＮＡである場合、前記抽出されたウイルス核酸分子を逆転写し、第２のウイルス核酸鎖を生成し、これにより、ウイルス二本鎖ＤＮＡを生成するステップと；
前記ウイルス二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップと；
前記ウイルス二本鎖ｃＤＮＡを定量化するステップと；
シーケンシングライブラリーを、少なくとも５００ｐｇの前記ウイルス二本鎖ＤＮＡから作製するステップであって、前記シーケンシングライブラリーが、前記ウイルス二本鎖ＤＮＡへと接合させた５’アダプターおよび３’アダプターを含む、ステップと；
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、次世代シーケンシングを使用して、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと；
前記複数の配列リードを、前記ウイルス由来の治療剤の基準配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと；
前記ウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２つの異なるウイルス由来の治療剤についてアッセイし、
前記シーケンシングライブラリーを作製するステップが、各ウイルス由来の治療剤について、１または複数のシーケンシングライブラリーを作製し、前記１または複数のシーケンシングライブラリーをプールすることを含み、前記１または複数のシーケンシングライブラリーが、５’アダプターおよび３’アダプターを含み、前記１または複数のシーケンシングライブラリーの各々が、同定のためのバーコードを含み；
前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップが、前記プールされたシーケンシングライブラリーをシーケンシングすることを含み；
前記方法が、各シーケンシングライブラリーについて、デマルチプレックス化された生の配列データセットを作製するように、前記バーコードを使用して、プールされた生の配列データセットをデマルチプレックス化するステップをさらに含み；
前記複数の配列リードをアラインメントするステップが、前記デマルチプレックス化された生の配列データセットの各々を、前記ウイルス由来の治療剤の適切な基準配列とアラインメントすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリオウイルス由来の治療剤を、ポリオウイルス配列改変体についてアッセイする方法であって、
ＲＮＡを、マスターウイルスバンクまたはワーキングセルバンクから抽出するステップであって、前記マスターウイルスバンクまたは前記ワーキングセルバンクが、前記ポリオウイルス由来の治療剤を含有する宿主細胞を含む、ステップと；
前記抽出されたＲＮＡを、宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡは実質的に消化するが、ウイルスＲＮＡ分子は実質的に消化しない条件下、２Ｕ／μｌで４ＵのＤＮアーゼと、３７℃で２０〜４０分間にわたり接触させ、これにより、濃縮されたウイルスＲＮＡを生成するステップと；
二本鎖ｃＤＮＡを、前記濃縮されたウイルスＲＮＡから作製し、これにより、ウイルス二本鎖ｃＤＮＡを生成するステップと；
前記ウイルス二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップと；
前記ウイルス二本鎖ｃＤＮＡを定量化するステップと；
前記二本鎖ｃＤＮＡをランダムに断片化して、ｃＤＮＡ断片を作製し、５’アダプターおよび３’アダプターを、前記ｃＤＮＡ断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたｃＤＮＡ断片を作製し、前記アダプターをライゲーションされたｃＤＮＡ断片を増幅して、シーケンシングライブラリーを作製することにより、前記シーケンシングライブラリーを、５００ｐｇ〜１ｎｇの前記ウイルス二本鎖ｃＤＮＡから作製するステップと；
クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、前記５’アダプターおよび前記３’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドを使用して、前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅するステップと；
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、パラレルシングルエンドまたはペアドエンドシーケンシングを使用して、前記クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと；
前記複数の配列リードを、前記ポリオウイルス由来の治療剤の基準ポリオ配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと；
ポリオウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
前記ポリオウイルス由来の治療剤を、Ｖｅｒｏ宿主細胞へと導入するステップと；
前記ポリオウイルス由来の治療剤の繁殖を可能とする条件下で、前記Ｖｅｒｏ宿主細胞を増殖させるステップと；
ポリオＲＮＡ分子を、前記Ｖｅｒｏ宿主細胞から抽出するステップと；
任意選択で、前記抽出されたポリオＲＮＡを、Ｖｅｒｏ宿主細胞ゲノムＤＮＡおよびＶｅｒｏ宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡは実質的に消化するが、ポリオＲＮＡは実質的に消化しない条件下で、ＤＮアーゼと接触させるステップと；
抽出されたウイルス性ポリオＲＮＡを逆転写し、これにより、ポリオ二本鎖ＤＮＡを生成するステップと；
前記ポリオ二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップと；
前記ポリオ二本鎖ｃＤＮＡを定量化するステップと；
前記ポリオ二本鎖ｃＤＮＡをランダムに断片化して、ポリオｃＤＮＡ断片を作製し、５’アダプターおよび３’アダプターを、前記ポリオｃＤＮＡ断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたポリオｃＤＮＡ断片を作製し、前記アダプターをライゲーションされたポリオｃＤＮＡ断片を増幅して、シーケンシングライブラリーを作製することにより、前記シーケンシングライブラリーを、５００ｐｇ〜１ｎｇの前記ポリオ二本鎖ｃＤＮＡから作製するステップと；
クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、前記５’アダプターおよび前記３’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドを使用して、前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅するステップと；
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、パラレルシングルエンドまたはペアドエンドシーケンシングを使用して、前記クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと；
前記複数の配列リードを、前記ポリオウイルス由来の治療剤の基準ポリオ配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと；
ポリオウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アラインメントされた配列リードについて、平均リード長、アラインメントされたリードの百分率、カバレッジ、ＳＮＰ、またはこれらの組合せを決定するステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アラインメントされていない配列リードを作製する場合、前記アラインメントされていない配列リードを、同定のために、アラインメントされていない配列リードのプールに加える、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルス由来の治療剤の、前記ウイルス由来の治療剤の前記基準配列とのコンセンサスの相同性、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジ、リードに対して０．１％を超える不均一塩基、またはこれらの組合せについて報告するステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シーケンシングライブラリーを、前記二本鎖ＤＮＡから作製するステップが、
前記二本鎖ＤＮＡをランダムに断片化して、ＤＮＡ断片を作製し、５’アダプターおよび３’アダプターを、前記ＤＮＡ断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたＤＮＡ断片を作製し、前記アダプターをライゲーションされたＤＮＡ断片を増幅して、前記シーケンシングライブラリーを作製することと；
クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、前記５’アダプターおよび前記３’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドまたは粒子結合オリゴヌクレオチドを使用して、前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅することと
を含み；
複数の配列リードを含む、前記生の配列データセットを作製するように、前記クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングする、請求項１から３または６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記決定されたウイルス配列改変体が、禁忌でない場合、シーケンシングされたウイルス由来の治療剤を、被験体へと投与するステップ
をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞またはＶｅｒｏ細胞である、請求項１から４または６から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出された核酸分子を、ＤＮアーゼと接触させるステップが、前記抽出された核酸分子を、前記ＤＮアーゼと、３７℃で３０分間にわたりインキュベートすることを含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記シーケンシングライブラリーを、前記５’アダプターおよび前記３’アダプターと相補的なプライマーを使用してクローン増幅する、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記シーケンシングライブラリーを増幅することが、増幅時に、前記アダプターをライゲーションされたｃＤＮＡ断片へと、バーコードを付加することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅するステップが、ブリッジ増幅を含み、前記表面が、フローセルの表面を含む、請求項１１または１４に記載の方法。
【請求項１６】
シーケンシングが、パラレルペアドエンドシーケンシングである、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
報告するステップが、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記アラインメントされた配列中の各塩基の前記カバレッジが、４回またはこれを超える場合、前記アラインメントされた配列は、前記ウイルス由来の治療剤のスクリーニングに許容可能であると決定するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アラインメントされた配列中の各塩基の前記カバレッジが、４回未満であると決定するステップと、前記アラインメントされた配列の全体にわたり、４回またはこれを超えるカバレッジをもたらすように、サンガーシーケンシングを実施するステップとをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルス由来の治療剤が、ＲＮＡウイルスであるかまたはこれに由来する、請求項１から３または６から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルス由来の治療剤が、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、ＨＩＶ、もしくはＨＴＬＶであるかもしくはこれに由来するか；またはＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、インフルエンザワクチン、ＨＩＶワクチン、ＨＴＬＶワクチン、ヒトパピローマウイルス、もしくはポリオワクチンである、請求項１から３または６から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリオワクチンが、ＰＶＳ−ＲＩＰＯである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルス配列改変体が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）内の変異を含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／１９９，６６３号（これは、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、生弱毒化ポリオウイルスワクチンなど、ウイルス由来の治療剤のバッチについて解析する、ライブラリーベースのディープシーケンシング法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯとは、２型ヒトライノウイルス（ＨＲＶ２）に由来する、外来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を保有する、生弱毒化１型経口セービンワクチン株からなるキメラポリオウイルス（ＰＶ）である（Ｂｒｏｗｎら、（２０１４年）、Ｃａｎｃｅｒ、１２０巻：３２７７〜８６頁；Ｇｏｅｔｚら、（２０１１年）、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌ．、９巻：１０４５〜１０５８頁；ＧｏｅｔｚおよびＧｒｏｍｅｉｅｒ（２０１０年）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔ  Ｒｅｖ、２１巻：１９７〜２０３頁）。ポリオウイルスとは、重度の神経変性の疾患である灰白髄炎の原因作用因子である。ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）および他のＣＤ１５５＋がんを処置するための非病原性治療用ウイルスとなるように操作された（ＷＯ２０１４／０８１９３７）。
【０００４】
ＩＲＥＳは、５’末端の７−メチルグアノシン（「キャップ」）非依存的に翻訳開始を媒介するので、ピコルナウイルスゲノムＲＮＡの５’側非翻訳領域内の、極めて重要な非コード配列エレメントである（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、（２００３年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１００巻：１５１２５〜１５１３０頁；Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、（２００３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１１巻：２４１〜２５３頁；Ｄｕｆｒｅｓｎｅら、（２００２年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６巻：８９６６〜８９７２頁）。ＩＲＥＳは、３つのＰＶセービンワクチン株全ておよびＰＶＳＲＩＰＯの、神経弱毒化表現型の主要な決定因子である（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（２００５年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７９巻：６２８１〜６２９０頁；Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら（２００６年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８０巻：３３１０〜３３２１頁；ＢｒｏｗｎおよびＧｒｏｍｅｉｅｒ（２０１５年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｖｉｒｏｌ、１３巻：８１〜８５頁）。機構的に述べると、神経弱毒化（ｎｅｕｒｏ−ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）は、リボソームの動員を不可能にする、ニューロン特異的な（ＩＲＥＳ）リボヌクレオタンパク質複合体の形成から生じる。セービンワクチン株では、ニューロンのＩＲＥＳの機能不全は、ステムループドメイン５の個別の領域へとマッピングされる単一の点変異に依拠し、神経弱毒化のこの脆弱な基盤は、神経毒力へと逆戻りするセービンワクチン株の悪名高い傾向の原因である可能性が高い。逆戻り（ｂａｃｋ  ｒｅｖｅｒｔｉｏｎ）は、ワクチン製造時、または、生ウイルスを使用する場合は、患者への投与後における、ランダムな遺伝子変異、または野生型配列との相同組換えを介して生じうる。ＰＶＳＲＩＰＯは、天然に存在するエンテロウイルスである、無傷で、機能的に組み込まれたＨＲＶ２  ＩＲＥＳを特色とする。組織培養物中でその欠損が選択された、セービン１／３型のＩＲＥＳとは対照的に、ＨＲＶ２  ＩＲＥＳは内在的に、セービンＩＲＥＳよりはるかに大きな程度においてニューロンで機能不全である。ＨＲＶ２  ＩＲＥＳにおけるニューロンでの機能不全の遺伝子フットプリントは、ステムループのドメイン５（約４０ｎｔ）およびドメイン６（約２５ｎｔ）の少なくとも上部にわたる（Ｂｒｏｗｎら、（２０１４年）、Ｃａｎｃｅｒ、１２０巻：３２７７〜８６頁；Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、（２００３年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１００巻：１５１２５〜１５１３０頁；Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、（２００３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１１巻：２４１〜２５３頁；Ｄｕｆｒｅｓｎｅら、（２００２年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６巻：８９６６〜８９７２頁）。コンセンサスのＨＲＶ２  ＩＲＥＳ配列は、ヒトにおける数千年にわたる進化から生じた可能性が高いため、ＨＲＶ２の標的細胞（気道上皮内の有糸分裂活性細胞）内では、翻訳開始メディエーターの理想化形を表しうる。
【０００５】
ポリオウイルスおよびＰＶＳ−ＲＩＰＯは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであるので、ウイルス複製時（構築物の開発時および製造時など）における変異の天然の頻度は、ｄｓＤＮＡウイルスおよびＤＮＡゲノムを有する生物について観察される頻度より大きい。現在のところ、生ポリオウイルスまたは不活化ポリオウイルスの各臨床ロットは、臨床への出荷の前に、ロットが、灰白髄炎をもたらす神経毒性表現型を再生させうる、稀な遺伝子逆戻り変異を含有しないことを検証する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける霊長類神経毒性安全性試験およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるプラークシーケンシング法により、妥当性を確認しなければならない。ワクチンロットの霊長類神経毒性試験は、完了に数カ月間を要求することが典型的であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるプラークシーケンシング法は、感度が比較的低い。
ＰＶの神経弱毒化におけるそれらの顕著な役割のために、潜在的なポリオワクチンの神経毒性について評価するための、文献において記載されている方法の大半は、ＩＲＥＳ内の十分に規定された部位に焦点を絞っている（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１１年）、ＷＨＯ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  （ｏｒａｌ）：  ＴＲＳ  Ｎｏｓ．  ９０４  ａｎｄ  ９１０．  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｈｅｌｄ  ｏｎ  ２０−２２  Ｊｕｌｙ  ２０１０，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２９巻：６４３２〜６４３６頁；Ｒｅｚａｐｋｉｎら、（１９９８年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４５巻：１８３〜１８７頁；Ｃｈｕｍａｋｏｖら、（１９９４年）、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ、４２巻：７９〜８５頁；Ｌａａｓｓｒｉら、（２００６年）、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９３巻：１３４４〜１３４９頁）。ＰＶＳＲＩＰＯ内の、ポリオＩＲＥＳの、ＨＲＶ２  ＩＲＥＳによる完全な置き換えは、キメラウイルスの毒性プロファイルを、どのようにして特徴付けるのかという問題を提示している。ポリオワクチンの製造元により用いられているｉｎ  ｖｉｔｒｏ法（すなわち、ＭＡＰＲＥＣ）は、ＨＲＶ２  ＩＲＥＳ配列に対しては適当でないので、この問題は、製品の安全性の裁定者としての、ウイルスの遺伝子安定性についてのｉｎ  ｖｉｖｏの試験法および特徴付けへと委ねられる。投与後組織学を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける霊長類神経毒力試験は、ＷＨＯガイドラインに従い、カニクイザルを使用して実施された（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、（２０１２年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８６巻：２７５０〜２７５９頁）。かつての、ＨＴＢ−１５細胞異種移植（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける）／プラークシーケンシング研究は、ＰＶＳＲＩＰＯゲノムが、継代培養およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるウイルスの拡大の後で、安定的かつ非病原性であることを裏付けた。ＨＴＢ−１５異種移植研究では、サンガーシーケンシングを使用して、２つの多型部位だけが、９７および１８２４位として言及された（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、（２００８年）、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６巻：１８６５〜１８７２頁；Ｃｅｌｌｏ  Ｊら、（２００８年）、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ、８０巻：３５２〜３５９頁）。興味深いことに、ＰＶＳＲＩＰＯについてのＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングでは、これらの２つの部位のうちのいずれも、多型と同定されなかったことから、これらが、ＨＴＢ−１５細胞内の継代培養後における、デノボの塩基変異の結果であったことが指し示される。まとめると、かつての２つの研究の結果は、ＰＶＳＲＩＰＯの毒性の、野生型ＰＶと比べた欠如を裏付けた。これらの２つの一般的な手法を使用して、ＰＶＳＲＩＰＯは、霊長類において、神経障害性表現型を呈しないことが確立されており、直接的サンガーシーケンシング法およびプラークベースのサンガーシーケンシング法のいずれを使用しても、ＰＶＳＲＩＰＯが呈する配列不均一性は低レベルである。また、温度感受性試験（すなわち、ＲＣＴ４０）および一般的な安全性試験（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける付随作用因子試験およびＲＴ−ｑＰＣＲ）など、ウイルスの遺伝子安定性および均質性についての粗評価を行う、他の高感度ではない方法も利用された。シーケンシング技術が進歩しているので、サンガーシーケンシングに内在的な感度限界（塩基１つ当たり約１５〜２０％変動のＬｏＤ）は、塩基改変体に対する１％未満の理論感度が可能な「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ）法により克服されている（Ｃａｂａｎｎｅｓら、（２０１４年）、ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈ、６８巻：６３１〜６３８頁；Ｌｉｕら、（２０１２年）、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１２年、２０１２：２５１３６４；ＮｅｖｅｒｏｖおよびＣｈｕｍａｋｏｖ（２０１０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７巻：２００６３〜２００６８頁）。大半のＮＧＳディープシーケンシング法の感度は、それらの内在的な誤組込みまたはミスコールエラー率だけにより限定されており、これらは、根底をなす塩基検出技術の感度限界より大きい。
【０００６】
必要とされるものは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯなど、ウイルス由来の治療剤のロット内の変異を検出するための、改善された方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｅｚａｐｋｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９８年）２４５巻：１８３〜１８７頁
【非特許文献２】Ｃｈｕｍａｋｏｖら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ（１９９４年）４２巻：７９〜８５頁
【非特許文献３】Ｌａａｓｓｒｉら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００６年）１９３巻：１３４４〜１３４９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、ウイルス由来の治療剤を、ウイルス配列改変体の存在についてアッセイする方法が提示される。開示される方法を使用して解析しうる、例示的なウイルス由来の治療剤は、ウイルス、ウイルスの鋳型プラスミド、またはポリオウイルス（ＰＶＳ−ＲＩＰＯなど）、麻疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、ＨＩＶ、もしくはＨＴＬＶに由来するワクチンなどのワクチンを含むがこれらに限定されない。
【０００９】
開示される方法は、核酸分子を、ウイルスシードバンク、収集物、および／または精製医薬品ロット（マスターウイルスバンクまたはワーキングセルバンクなど）から抽出する（例えば、単離する）ステップであって、ウイルスシードバンク、収集物、および／または精製医薬品ロット（マスターウイルスバンクまたはワーキングセルバンクなど）が、ウイルス由来の治療剤を含有する宿主細胞を含むステップを含む。所望されない宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡが、結果として得られる試料中に存在するので、抽出された核酸分子を、宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡは実質的に消化するが、所望のウイルス核酸分子（ウイルスゲノムＲＮＡもしくはウイルスゲノムＤＮＡ、またはウイルス鋳型プラスミドなど）は実質的に消化しない条件下で、ＤＮアーゼとインキュベートする（例えば、接触させる）。このような条件の例は、３７℃で３０分間である。結果として得られる濃縮されたウイルス核酸分子は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もある。濃縮されたウイルス核酸分子がＲＮＡである場合、方法は、例えば、逆転写を使用して、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、濃縮されたウイルスＲＮＡから作製し、第２のウイルス核酸鎖を生成するステップを含む。ウイルスｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、増幅し（例えば、ＰＣＲを使用して）、増幅されたウイルスｄｓＤＮＡを定量化する。次いで、シーケンシングライブラリーを、少なくとも５００ｐｇの増幅されたウイルスｄｓＤＮＡから生成する。シーケンシングライブラリーは、ウイルスｄｓＤＮＡへと接合させた５’アダプターおよび３’アダプター（例えば、ウイルスｄｓＤＮＡ断片は、それらへとライゲーションされた５’アダプターおよび３’ーアダプターを含む）を含む。複数の配列リードを含む生の配列データセットを作製するように、次世代シーケンシングを使用して（例えば、パラレルシングルエンドまたはペアドエンドシーケンシングを使用して）、結果として得られるシーケンシングライブラリーをシーケンシングする。複数の配列リードを、ウイルス由来の治療剤についての基準配列（変異していない配列など）とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製する。アラインメントされた配列リードから、ウイルス由来の治療剤の配列を決定し、存在する場合、配列変動（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）（例えば、変異）の存在を同定することができる。
【００１０】
一部の例では、ウイルス由来の治療剤を、ＭＶＢからシーケンシングした後で、方法は、ＭＶＢからの、ウイルス由来の治療剤を、ウイルス由来の治療剤を産生させるための哺乳動物細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）などの宿主細胞へと導入するステップをさらに含む。次いで、結果として得られるウイルス由来の治療剤であって、第２の宿主細胞内で産生された治療剤をシーケンシングし、その配列を、ＭＶＢから得られ、シーケンシングされた、ウイルス由来の治療剤と比較することができる。例えば、方法は、ウイルス由来の治療剤を、哺乳動物の宿主細胞へと導入（例えば、形質転換）し、ウイルス由来の治療剤の繁殖を可能とする条件下で、哺乳動物の宿主細胞を増殖させるステップをさらに含みうる。ウイルス核酸分子を、哺乳動物の宿主細胞から抽出（例えば、単離）する。上記の通り、単離されたウイルス核酸分子は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もある。単離されたウイルス核酸分子がＲＮＡである場合、方法は、例えば、逆転写を使用して、ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、単離されたウイルスＲＮＡから作製し、第２のウイルス核酸鎖を生成するステップを含む。ウイルスｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、増幅し（例えば、ＰＣＲを使用して）、増幅されたウイルスｄｓＤＮＡを定量化する。次いで、シーケンシングライブラリーを、少なくとも５００ｐｇの増幅されたウイルスｄｓＤＮＡから生成し、シーケンシングし、結果として得られる複数の配列リードを、基準配列とアラインメントし、ウイルス由来の治療剤の配列を決定し、上記で記載した通り、存在する場合、配列変動（例えば、変異）の存在を同定する。
【００１１】
方法はまた、例えば、異なるウイルス由来の治療剤の識別を可能とする「バーコード」または「タグ」を使用することにより、少なくとも２つの異なるウイルス由来の治療剤（２つ、３つ、４つ、または５つの異なるウイルス由来の治療剤など）について、同時的または共時的にアッセイすることも可能とする。一部の例では、異なるウイルス由来の治療剤は、異なるウイルスである。他の例では、異なるウイルス由来の治療剤は、同じウイルスであるが、異なる供給源（異なるＭＶＢなど）に由来する。このような例では、シーケンシングライブラリーを作製するステップは、各ウイルス由来の治療剤について、１または複数のシーケンシングライブラリーを作製することを含むことが可能であり、１または複数のシーケンシングライブラリーは、５’アダプターおよび３’アダプターを含み、１または複数のシーケンシングライブラリーの各々は、同定のための固有のバーコードを含む。１または複数のシーケンシングライブラリーをプールし、シーケンシングする。プールされた生の配列データセットは、各シーケンシングライブラリーについて、デマルチプレックス化された生の配列データセットを作製するように、バーコードを使用して、デマルチプレックス化することができる。デマルチプレックス化された生の配列データセットの各々は、ウイルス由来の治療剤のその適切な基準配列とアラインメントすることができる。一部の例では、デマルチプレックス化された生の配列データセットの各々を、ウイルス由来の治療剤の適切な基準配列とアラインメントする場合、平均リード長、アラインメントされたリードの百分率、カバレッジ、ＳＮＰ、またはこれらの組合せを、アラインメントされた配列リードについて決定する。アラインメントされていない配列リードを作製する場合、アラインメントされていない配列リードは、同定のために、アラインメントされていない配列リードのプールに加えることができる。アラインメントされた配列リードから、解析された各ウイルス由来の治療剤の配列を決定し、存在する場合、配列変動（例えば、変異）の存在を同定することができる。
【００１２】
一部の例では、シーケンシングライブラリーを、ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）から作製するステップは、二本鎖ＤＮＡをランダムに断片化して、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片を作製し、５’アダプターおよび３’アダプターを、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を作製することを含む。このような方法では、アダプターをライゲーションされたＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片を増幅して、シーケンシングライブラリーを作製する。シーケンシングライブラリーは、例えば、５’アダプターおよび３’アダプターと相補的なプライマー（一部の例では、プライマーを、固体表面または粒子へと接合させる）を使用してクローン増幅し、これにより、クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製することができる。複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングする。例えば、クローン増幅されたシーケンシングライブラリーのシーケンシングは、５’アダプターおよび３’アダプターと相補的なプライマーを使用して実施することができる。
【００１３】
一部の例では、アラインメントされた配列リードを作製する場合、平均リード長、アラインメントされたリードの百分率、カバレッジ、ＳＮＰ、またはこれらの組合せを、アラインメントされた配列リードについて決定する。
【００１４】
一部の例では、アラインメントされていない配列リードを作製する場合、アラインメントされていない配列リードを、同定のために、アラインメントされていない配列リードのプールに加える。
【００１５】
一部の例では、方法は、ウイルス由来の治療剤の、ウイルス由来の治療剤の基準配列とのコンセンサスの相同性、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジ、リードに対する規定された百分率を超える不均一塩基（例えば、リードに対して０．１％を超える不均一塩基）、インデル、またはこれらの組合せについて報告するステップを含む。
【００１６】
一部の例では、ウイルス由来の治療剤についての解析の後、方法は、決定されたウイルス配列改変体が、禁忌でない場合（例えば、毒性表現型をもたらす変異が検出されない場合）に、シーケンシングされたウイルス由来の治療剤を、被験体へと投与するステップをさらに含む。
【００１７】
本開示の前出および他の目的および特色は、付属の図面への言及を先行させる、以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ディープシーケンシングデータの解析の一実施形態についての流れ図である。
【００１９】
【図２】図２は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯワクチンロットの希釈ライブラリーについてのアラインメント統計を示す。基準配列についての推定カバレッジを示す。
【００２０】
【図３】図３は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯワクチンロットの１００ｐｇの試料についての、例示的なリード長プロットである。
【００２１】
【図４】図４は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯワクチンロットの、毒性研究ロットである、Ｌ０６０３００６の１００ｐｇの試料についての、例示的なカバレッジプロットである。
【００２２】
【図５Ａ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｇ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｈ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｉ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｊ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｋ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｌ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｍ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｎ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｏ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｐ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｑ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｒ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｓ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｔ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｕ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｖ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｗ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｘ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｙ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５Ｚ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＡＡ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＢＢ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＣＣ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＤＤ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＥＥ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＦＦ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＧＧ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＨＨ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＩＩ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＪＪ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＫＫ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＬＬ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＭＭ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＮＮ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【図５ＯＯ】図５Ａ〜５ＯＯは、マスターウイルスシードバンクロット（配列番号８０）の変動を示す。
【００２３】
【図６】図６は、ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスバンクロットである、Ｌ０４０３００６のカバレッジ深度を示す。
【００２４】
【図７】図７は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル化製品ロットである、Ｌ０９０４０１０のカバレッジ深度を示す。
【００２５】
【図８】図８は、ＰＶＳＲＩＰＯ基準物質ロットである、Ｌ１３１０００１のカバレッジ深度を示す。
【００２６】
【図９】図９は、ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットである、Ｌ１４０５００１のカバレッジ深度を示す。
【００２７】
【図１０】図１０は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル化製品ロットである、Ｌ１４０２００１のカバレッジ深度を示す。
【００２８】
【図１１】図１１は、ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスバンクロットである、Ｌ１３１１００のカバレッジ深度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
配列表
核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において規定されている通り、ヌクレオチド塩基のための標準的な略号文字、およびアミノ酸のための三文字コードを使用して示す。各核酸配列について、１つの鎖だけを示すが、表示された鎖への任意の言及により、相補的な鎖も組入れられるものと理解される。２０１６年７月２９日に作成され（２４．３ｋｂ）、本明細書と共に提出される配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
配列番号１〜７９は、シーケンシングアッセイで使用される核酸プライマー配列である。
【００３１】
配列番号８０は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯマスターウイルスシードロットであるＬ０４０３００６の、ウイルスコンセンサス配列である。３’側最末端塩基（２９）は、逸失しており、５’側最末端塩基（１位）は、不正確であるが、これは、プライマーベースのエラーに起因する可能性が高い。
【００３２】
詳細な説明
そうでないことに言及されない限りにおいて、技術用語は、従来の使用法に従い使用する。分子生物学における共通の用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ刊、１９９９年；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．刊、１９９４年；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．刊、１９９５年；ならびに他の同様の参考文献において見出すことができる。
【００３３】
本明細書で使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、そうでないことが文脈により明確に指し示されない限りにおいて、単数形ならびに複数形の両方を指す。本明細書で使用される「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「核酸分子を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を除外せずに、「核酸分子を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。さらに、核酸について与えられる任意かつ全ての塩基サイズは、概数であり、そうでないことが指し示されない限りにおいて、記載を目的として提示されるものであることも理解されたい。本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の、多くの方法および材料を使用しうるが、下記では、特定の適切な方法および材料について記載する。値の範囲の列挙は、本明細書でそうでないことが指し示されない限りにおいて、各個別の値が範囲内に収まることに個別に言及することの縮約法として用いられることだけを意図するものであり、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとく、本明細書に組み込まれる。全ての範囲の端点は、範囲内に含まれ、独立に組合せ可能である。全ての本明細書で記載される方法は、本明細書でそうでないことが指し示されない限りにおいて、または文脈により明確に否定されない限りにおいて、適切な順序で実施することができる。利益相反の場合は、用語の説明を含む本明細書により管理する。加えて、材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。特許出願および特許、ならびに列挙されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号（２０１６年７月２９日現在）と関連する配列を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本開示の多様な実施形態についての総説を容易とするために、以下の具体的な用語についての説明を提示する。
【００３５】
３’末端：核酸分子の末端であって、末端残基の３’側に、ヌクレオチドを結合させていない末端である。
【００３６】
５’末端：核酸配列の末端であって、末端残基の５’位に、ヌクレオチドを結合させていない末端である。
【００３７】
アジュバント：免疫原性作用因子（開示される方法を使用して解析されるウイルスなど）と組み合わせて使用されると、結果として生じる免疫応答を強化するか、または他の形で変更もしくは修飾する化合物、組成物、または物質である。一部の例では、アジュバントは、被験体において、免疫原性作用因子により誘導される抗体の力価を増大させる。別の例では、抗原性作用因子が、多価抗原性作用因子である場合、アジュバントは、被験体において誘導される抗体が特異的に結合する、特定のエピトープ配列を変更する。
【００３８】
例示的なアジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、Ｂ３０−ＭＤＰ、ＬＡ−１５−ＰＨ、モンタニド、サポニン、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩（Ａｍｐｈｏｇｅｌ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、ミョウバン、脂質、キーホールリンペットヘモシアニンタンパク質、ヘモシアニン、ＭＦ５９マイクロエマルジョン、マイコバクテリア抗原、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ポリアニオン、両親媒性物質、ＩＳＣＯＭ（欧州特許第ＥＰ１０９９４２号において開示されている免疫刺激性複合体などの免疫刺激性複合体）、植物油、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、酸化アルミニウム、油エマルジョン（ＢａｙｏｌＦまたはＭａｒｃｏｌ５２など）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【００３９】
一例では、アジュバントは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞による免疫の活性化、例えば、生得免疫応答または適応免疫応答を刺激するＤＮＡモチーフを含む。免疫の活性化を刺激するＤＮＡモチーフの具体的で非限定的な例は、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；同第６，３３９，０６８号；同第６，４０６，７０５号；および同第６，４２９，１９９号において記載されているＣＧオリゴデオキシヌクレオチド、ならびにＩＬ−２または他の免疫モジュレーターを含む。
【００４０】
投与：開示される方法を使用して解析されるウイルスなどの作用因子を被験体に、任意の有効な経路によりもたらすかまたは施すことである。例示的な投与経路は、注射（皮下注射、筋内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、および静脈内注射など）、経口経路、経皮経路、鼻腔内経路、および吸入経路を含むがこれらに限定されない。
【００４１】
核酸分子の増幅：ウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡなどの核酸分子のコピー数を増大させることである。結果として得られる産物を、増幅産物またはアンプリコンと呼ぶ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増幅の例は、試料（ウイルス核酸分子を含有する試料など）を、オリゴヌクレオチドプライマーの対と、プライマーの、試料中の核酸分子とのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で接触させる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。プライマーを、適切な条件下で伸長させ、鋳型から解離させ、次いで、再アニールさせ、伸長させ、解離させて、核酸分子のコピー数を増幅する。
【００４２】
弱毒化病原体：天然の病原体の能力と同様な免疫応答を刺激する能力を保持しながら、疾患をもたらす能力を減殺するかまたは弱めた病原体である。別の例では、ある特定の増殖条件下で、無毒性の改変体について選択することにより、病原体を弱毒化する（例えば、ＳａｂｉｎおよびＢｏｕｌｇｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．、１巻：１１５〜８頁、１９７３年；Ｓｕｔｔｅｒら、２００３年、Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ−−ｌｉｖｅ、６５１〜７０５頁、Ｓ．  Ａ．  ＰｌｏｔｋｉｎおよびＷ．  Ａ．  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ（編）、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、４版、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい）。例示的な弱毒化病原体は、セービンポリオウイルスである。
【００４３】
〜を接触させる：直接的な物理的会合下に置くことであり、固体形態または液体形態を含む。接触は、例えば、試薬を試料（ウイルスの鋳型プラスミドを発現する細菌細胞を含有する試料など）へと添加することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて生じる場合もあり、被験体へと投与すること（開示される方法を使用して解析されるウイルスの投与など）により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる場合もある。
【００４４】
有効量：作用因子（開示される方法を使用して解析されるウイルスなど）の量であって、抗がん応答などの防御的免疫応答など、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。
【００４５】
治療有効量は、当業者によりたやすく決定されうる、処置される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方式などのうちの１または複数に応じて変動しうる。有益な治療効果は、診断的決定を可能とすること；疾患、症状、障害、または病理学的状態の改善；疾患、症状、障害、もしくは状態を軽減するか、またはこれらの発症を妨げること；および、一般に、疾患、症状、障害、または病理学的状態に拮抗することを含みうる。一実施形態では、「有効量」（例えば、開示される方法を使用して解析されるウイルスの有効量）は、腫瘍（神経膠芽腫など）の容量／サイズ、腫瘍の重量、転移の数を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（治療剤を投与しない場合と比較して）低減し、転移の容量／サイズ、転移の重量、またはこれらの組合せをこのように低減するのに十分な量である。一実施形態では、「有効量」（例えば、開示される方法を使用して精製されるウイルスの有効量）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫応答を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（治療剤を投与しない場合と比較して）増大させ、例えば、免疫原に特異的な抗体の産生を、このように増大させるのに十分な量である。
【００４６】
宿主細胞（ＨＣ）：その中でベクターまたはウイルスを繁殖させ、その核酸を発現させうる細胞である。細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。用語はまた、対象宿主細胞の任意の子孫細胞も含む。こうして、宿主細胞は、それらが、ウイルスの鋳型プラスミドの核酸分子またはウイルスなど、細胞へと導入された核酸分子を含むという意味で、トランスジェニックでありうる。一例では、宿主細胞とは、その中でウイルス（ＰＶＳ−ＲＩＰＯなど）が増殖する細胞（哺乳動物細胞など）である。宿主細胞内のウイルスの増殖は、ウイルス材料の産生のために使用することもでき（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの産生のために使用されるＶｅｒｏ細胞）、場合によって、タンパク質発現のために使用することもできる。例えば、組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞（「バキュロウイルス発現系」）内の組換えタンパク質の発現のために使用することができる。ウイルス増殖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、細胞培養物中で生じる場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる場合もあり、この場合、ウイルスの宿主細胞は、生物の一部である。
【００４７】
免疫応答：被験体における、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、または多形核球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ）など、免疫系細胞の、免疫原性作用因子（開示される方法を使用して解析されるウイルスなど）に対する応答である。免疫応答は、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞など、宿主の防御応答に関与する、体内の任意の細胞を含みうる。免疫応答は、生得免疫応答または炎症を含むがこれらに限定されない。
【００４８】
応答は、ポリオウイルスなど、特定の抗原に特異的（「抗原特異的応答」）でありうる。特定の例では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の例では、応答は、Ｂ細胞応答であり、免疫原性作用因子に対して特異的な抗体の産生を結果としてもたらす。
【００４９】
一部の例では、このような免疫応答は、免疫原性作用因子または免疫原性作用因子の供給源からの被験体の保護をもたらす。例えば、応答は、ヒトまたは獣医科被験体などの被験体を、病原体による感染から保護する場合もあり、病原体による感染の進行に干渉する場合もある。免疫応答は、能動的であり、被験体の免疫系の刺激を伴う場合もあり、受動的な獲得免疫から生じる応答の場合もある。
【００５０】
増大または減少：対照値（治療剤を施さないことを表す値など）からの、数量の、統計学的に有意な、それぞれ、正または負の変化である。増大とは、対照値と比較して、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％の増大など、正の変化である。減少とは、対照値と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の減少など、負の変化である。一部の例では、減少とは、９０％を超えないか、９５％を超えないか、または９９％を超えない減少など、１００％未満の減少である。
【００５１】
単離された：「単離された」生物学的成分（開示される方法を使用して生成および解析されるウイルスなど）は、他の核酸分子およびタンパク質（例えば、宿主細胞の染色体のおよび染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡならびにタンパク質）などの成分が生じる細胞内または培地中の、他の生物学的成分と実質的に分離されているか、それらと別個に作製されているか、またはそれらから精製されている。一部の例では、開示される方法を使用して解析される単離ウイルスは、例えば、残留宿主細胞（ＨＣ）ＤＮＡにより測定される通り、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９９９９％、または少なくとも１００％純粋など、少なくとも５０％純粋である。一部の例では、開示される方法を使用して精製される単離ウイルス、または開示される方法を使用して拡大されるウイルス鋳型プラスミドは、残留ＨＣタンパク質（ＨＣＰ）により測定される場合、より低い純度を有し、例えば、総ＰＦＵの増大が所望される場合、少なくとも３％純粋、少なくとも４％純粋、または少なくとも５％純粋（３〜４％純粋など）などである。約３％のタンパク質純度であっても、ＨＣＰのレベルは、治療用製品についての許容可能な限界内にある。一部の例では、開示される方法を使用して解析される単離ウイルスであって、残留ＨＣＰにより測定される場合の単離ウイルスは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９９９９％純粋など、少なくとも５０％純粋である。
【００５２】
マスターセルバンク（ＭＣＢ）：単一のクローンから確立されうる細胞の集団であって、ワクチン（例えば、ポリオウイルス）の製造など、製造のための材料の供給源として使用される細胞の集団である。一部の例では、ＭＣＢの細胞は、ポリオウイルスをコードする、ウイルスの鋳型プラスミドなどのプラスミドもしくはベクター、またはポリオウイルスを含むか、あるいはウイルスを含む（したがって、マスターウイルスバンク（ＭＶＢ）と称する場合がある）。ＭＣＢに由来する細胞は、拡大されて、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を形成する。ＭＣＢおよびＷＣＢは、細胞ストックを創出するための、柔軟で実践的な手法を提供する。例えば、第１段階では、少量の細胞を増殖させ、採取し、プールし、凍結させて、例えば、１０〜２０のバイアルを含有するＭＣＢを創出する。次いで、このマスターストックから、単一のバイアルを、解凍し、例えば、１０〜２０のバイアルを含有する初期ＷＣＢを作製するのに十分な細胞が得られるまで培養する（１〜２回の継代にわたり）。本明細書の方法を使用して、例えば、変異（例えば、所望されない有毒のウイルスを結果としてもたらしうる）を含有しないＭＣＢまたはＷＣＢとして同定するように、ＭＣＢおよびＷＣＢを解析することができる。
【００５３】
次世代シーケンシング：また、大規模並列シーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはディープシーケンシングとも称し、数百万の小核酸断片（例えば、ＤＮＡ）の並列的なシーケンシングを実施する、核酸シーケンシング技術について記載する。個々のリードを、基準ゲノムへとマッピングすることにより、これらの断片をつなぎ合わせるのに、バイオインフォマティクス解析を使用する。ＮＧＳは、非選択的であるので、バイアスを伴わないゲノムの解析を可能とする。方法は一般に、ＤＮＡ合成の逐次的サイクルにおいて、蛍光標識されたｄＮＴＰの、ＤＮＡ鋳型鎖への組込みを触媒する、ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。各サイクル中、組込みの地点において、フルオロフォアの励起により、ヌクレオチドを同定する。数百万の断片を、大規模並列的な様式でシーケンシングする。このような方法の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａから市販されている方法（例えば、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ））、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、Ｓｏｌｅｘａ（登録商標）シーケンシング、４５４（登録商標）シーケンシング、チェインターミネーションシーケンシング（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ダイターミネーションシーケンシング（ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、またはパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含むがこれらに限定されない。一部の例では、単一分子シーケンシングを使用する。
【００５４】
薬学的に許容される担体：本発明において有用な、薬学的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１５版（１９７５年）は、開示される方法を使用して精製されたウイルスの薬学的送達に適する組成物および製剤について記載している。
【００５５】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は通例、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなど、薬学的かつ生理学的に許容される流体をビヒクルとして含む注射用液を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、および、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどのｐＨ緩衝剤など、少量の、非毒性の補助物質も含有しうる。
【００５６】
ポリオウイルス（ＰＶ）：灰白髄炎（ポリオ）の原因作用因子である、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のエンテロウイルスである。ポリオウイルスは、３つの血清型を有する。例示的なポリオ配列は、Ｔｏｙｏｄａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１７４巻：５６１〜８５頁、１９８４年（参照により本明細書に組み込まれる）において提示されている。
【００５７】
ポリオウイルスの非天然形態は、組換え腫瘍溶解性ポリオウイルスであるＰＶＳ−ＲＩＰＯと、弱毒化セービン経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）とを含み、開示される方法を使用して解析することができる。ＰＶＳ−ＲＩＰＯとは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を、２型ヒトライノウイルス（ＨＲＶ２）に由来するＩＲＥＳであって、潜在的な抗新生物活性を伴うＩＲＥＳで置きかえた１型セービン経口ポリオウイルスを含有する、組換え、生弱毒化、非病原性の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、Ｂｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ、１２０巻：３２７７〜８６頁、２０１４年；およびＧｏｅｔｚら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、２０１０年、２１巻（２〜３号）：１９７〜２０頁を参照されたい）である。ＯＰＶは、弱毒化セービン１株を、その有毒の親株（マホーニー血清型）から区別する、５７カ所のヌクレオチド置換を含み、セービン２株は、２カ所のヌクレオチド置換により弱毒化され、セービン３株の弱毒化には、１０カ所の置換が関与している。
【００５８】
３つのセービンワクチン全てに共通の、主要な弱毒化因子は、ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）内に位置する変異であって、ポリオウイルスのステムループ構造を変更し、宿主細胞内の、そのＲＮＡ鋳型を翻訳するポリオウイルスの能力を低減する変異である。例示的なセービン配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号：Ｅ０１５７２．１、Ｅ０１５７１．１、およびＥ０１５７０．１のほか、Ｎｏｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、７９巻（１９号）：５７９３〜５７９７頁、１９８２年にも提示されている。
【００５９】
ＰＶの別の形態は、Ｊｏｎａｓ  Ｓａｌｋ博士により開発された化学的不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）である。これは、３つの有毒株である、マホーニー株（１型ポリオウイルス）、ＭＥＦ−１株（２型ポリオウイルス）、およびソーケット株（３型ポリオウイルス）に基づく。このようなＰＶ株は、開示される方法を使用して解析することができる。
【００６０】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を要求するものではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製ウイルス調製物とは、ウイルスが、宿主細胞内または宿主細胞抽出物中のウイルスより濃縮されたウイルス調製物である。一例では、精製ウイルスが、調製物の全核酸含量のうちの少なくとも５０％を表すように、調製物を精製する。他の例では、医薬担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定化剤、保存剤、アジュバント、または他の共成分など、他の製剤成分との混合の前に、精製調製物中に存在する全ての高分子種のうちの少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、なおまたは少なくとも９９％を表すように、ウイルスを精製する。一部の例では、精製調製物は、本質的に均一であり、この場合、他の高分子種は、従来の技法では検出不可能である。このような精製調製物は、活性作用因子と混合されるか、またはこれとコンジュゲートさせた材料など、活性作用因子と共有結合的に会合させた材料であって、活性作用因子の修飾派生物もしくは修飾類似体をもたらすか、または組み合わせの治療用製剤もしくは組み合わせの治療用コンジュゲートを作製することが所望されうる材料を含みうる。
【００６１】
組換え：組換え核酸分子とは、天然に存在しない配列を有するか、または他の方法で隔てられた２つの配列セグメントの人工的な組合せにより作製された配列を有する核酸分子である。この人工的な組合せは、化学合成、または例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年において記載されている遺伝子操作法などの遺伝子操作法を介する、単離された核酸セグメントの人工的な操作によるなど、慣例的な方法を使用して達することができる。「組換え」という用語は、核酸分子の部分の付加、置換、または欠失により専ら変更された核酸分子を含む。同様に、組換えタンパク質とは、組換え核酸分子によりコードされるタンパク質でもある。組換えウイルスは、その遺伝子が、例えば、組換え操作技術を使用する、例えば、発現のために、非天然環境において構築されており、かつ／または非天然環境に置かれているウイルスを含む。
【００６２】
被験体：哺乳動物、例えば、ヒトなどの脊椎動物である。哺乳動物は、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、被験体は、サル、または他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、もしくはウシなどの非ヒト哺乳動物被験体である。一部の例では、被験体は、開示される方法を使用して解析されるポリオウイルスを使用して処置しうる神経膠芽腫などの腫瘍を有する。一部の例では、被験体は、マウス、ウサギ、またはラットなどの実験動物／生物である。
【００６３】
〜を形質転換するまたは〜にトランスフェクトする：ウイルスまたはベクターは、それが、核酸を、宿主細胞へと導入する場合に、宿主細胞「を形質転換する」か、または宿主細胞「へと形質導入する」。細胞は、細胞ゲノムへの核酸の組込みまたはエピソームでの複製を介して、ＤＮＡが、細胞により、安定的に複製される場合に、細胞へと形質導入される核酸により、「形質転換される」か、または「トランスフェクトされる」。
【００６４】
当業者には、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体介在型エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド−ＤＮＡ複合体）、および組換えウイルスなど、ウイルスによる生物学的感染など、多数のトランスフェクション法が公知である（Ｗｏｌｆｆ，  Ｊ．  Ａ．編、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ、１９９４年）。レトロウイルスによる感染の場合、感染するレトロウイルス粒子が、標的細胞により吸収される結果として、レトロウイルスＲＮＡゲノムの逆転写と、結果として得られるプロウイルスの、細胞ＤＮＡへの組込みとがもたらされる。
【００６５】
導入遺伝子：ベクターにより与えられる外因性遺伝子である。一例では、導入遺伝子は、ポリオ（天然のポリオウイルスまたは天然に存在しないポリオウイルス）など、ＲＮＡウイルスのための、ウイルスＤＮＡの鋳型配列など、ウイルスの鋳型配列を含む。
【００６６】
〜を処置すること、処置、および治療：傷害、病理、または状態の、緩和または改善における、任意の成功または成功の兆候であって、症状の軽減、寛解、減殺、もしくは状態の患者への忍容性を増大させること、変性もしくは減衰の速度を緩徐化すること、変性の終点の消耗性を小さくすること、被験体の身体的もしくは精神的な福利を改善すること、または生存期間を延長することなど、任意の客観的または主観的なパラメータを含む成功または成功の兆候である。処置は、客観的または主観的なパラメータであって、身体検査、血液試験、および他の臨床試験の結果などを含むパラメータにより評価することができる。一部の例では、開示されるＰＶによる処置は、腫瘍（例えば、脳腫瘍）および／または転移の、数、容量、および／または重量の減少を結果としてもたらす。
【００６７】
〜に十分な条件下で：所望の活性を可能とする任意の環境について記載するのに使用される語句である。一例では、所望の活性は、ウイルスの鋳型プラスミドによる宿主細胞の形質転換、またはこのような形質転換された宿主細胞の増殖である。一例では、所望の活性は、例えば、次世代シーケンシングを使用する、標的ウイルス核酸分子のシーケンシングである。一例では、所望の活性は、例えば、開示される方法を使用して精製されたウイルスを使用する、腫瘍の処置および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫応答の刺激である。
【００６８】
ワクチン：疾患または他の病理学的状態に対する活性の免疫などの免疫を付与するように、動物またはヒトへと投与されうる、免疫原性組成物である。ワクチンは、予防的に使用することもでき、治療的に使用することもできる。したがって、ワクチンを使用して、感染の可能性を低減することもでき、疾患または状態の症状の重症度を低減することもでき、疾患または状態の進行を制限することもできる。一例では、ワクチンは、開示される方法を使用して解析される、１または複数のウイルス（例えば、天然ポリオウイルスまたは天然に存在しないポリオウイルス）を含む。
【００６９】
ベクター：宿主細胞へと導入され、これにより、形質転換された宿主細胞を作製する核酸分子である。ベクターは、複製起点など、核酸分子を宿主細胞内で複製することを可能とする核酸配列を含みうる。ベクターはまた、１もしくは複数の治療用遺伝子、または当技術分野で公知の選択用マーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含みうる。ベクターを細胞へと形質導入するか、ベクターにより細胞を形質転換するか、またはベクターを細胞に感染させ、これにより、細胞に、細胞にとって生来のものである核酸分子またはタンパク質以外の核酸分子またはタンパク質を発現させることができる。ベクターは任意選択で、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなど、核酸の、細胞への移入を達成する一助となる材料を含む。一例では、ベクターは、細菌プラスミドなどのプラスミドである。
【００７０】
概観
ウイルス由来の治療剤業界では、現在使用されている、サル神経毒力安全性試験（ｍｏｎｋｅｙ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｔｅｓｔ）（ＭＮＶＴ）手順、およびプラークベースのシーケンシング法（ＰＣＲおよび制限酵素切断による変異体解析（ｍｕｔａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ）（ＭＡＰＲＥＣ）など）に置きかわりうる方法の同定が、長年にわたり必要とされている。例えば、２０１０年に、スイス、ジュネーブで開催された、灰白髄炎ワクチン（経口）の作製および制御についてのＷＨＯによる推奨の改定版についての、ＷＨＯ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによる討論（Ｖａｃｃｉｎｅ、２９巻（２０１１年）、６４３２〜６４３６頁を参照されたい）では、動物モデルにおける特定の変異の弱毒化効果は、種、遺伝子バックグラウンド、および接種経路に依存する場合があり、したがって、ヒトへの外挿を不確実なものとしていることについて言及された。加えて、ＭＡＰＲＥＣアッセイは、極めて煩瑣な試験であり、放射性同位元素の使用の要求が、その技術的困難に加わり、異なる実験室が、アッセイの多様な側面についての問題を有する。ウイルス由来の治療剤について調べるかまたは検証するのに現在使用されている神経毒力試験アッセイは、高価であり、かつ、時間がかかる。加えて、本分野において現在使用されているアッセイが、ヒトに対する神経毒力の潜在的可能性についての評価において妥当性を有するのかどうかも明らかでない。ＷＨＯ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐは、ポリオワクチンの品質管理のための新たな技術の開発を推奨した。本明細書で記載される方法は、ＲＮＡウイルス由来の治療剤、特にワクチンのための、改善された検証／安全性試験法を提供し、これにより、本業界における長年にわたる必要に対する解決策をもたらす。開示される方法は現在、米国ＦＤＡによる承認のための検討下にある。この承認が得られれば、本方法の商業的成功が達成されるであろう。
【００７１】
ワクチンレシピエントにおける増殖時であり、また、細胞培養物中の繁殖時でもある、神経毒力の大きな変異体の蓄積は、特にウイルスシードストックについての神経毒力試験を要求している。現在のところ、サル神経毒力安全性試験（ＭＮＶＴ）手順が実施されている。略述すると、ＭＮＶＴ手順では、ワクチン製品のロットに由来する試料を、例えば、Ｍａｃａｃａ属またはＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ属のサルの中枢神経系の腰部領域へと注射し、脊髄内接種を行う。一般に、ワクチン調製物の評価には、１１〜１８匹のサルを使用するが、また、１１〜１８匹の対照サルも使用する。サルを、ウイルス感染、例えば、灰白髄炎の臨床徴候について、１７〜２４日間にわたり観察する。観察期間を越えて生存する全てのサルは、安楽死させ、脳組織内および脊髄組織内のウイルス特異的病変についての組織病理学的評価を含む解析のために加工する。特に、ポリオウイルスの場合における、ＭＮＶＴ試験の、ヒトに対する神経毒力の潜在的可能性についての評価への妥当性を支持する証拠は乏しい（Ｒｕｂｉｎ、「Ｔｏｗａｒｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｎｋｅｙ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ」、Ｐｒｏｃｅｄｉａ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ、５巻、２６１〜２６５頁（２０１１年））。加えて、試験は、時間がかかり、かつ、高価であり、結果は、信頼できない場合があり、例えば、Ｒｕｂｉｎによれば、ＭＮＶＹ試験に合格したムンプスワクチンは、ワクチン接種された個体における髄膜炎と因果関係があった。
【００７２】
ＲＮＡウイルス由来の治療剤のロットについて評価するのに、ＭＮＶＴ手順に加えてまた、プラークベースのシーケンシング法も使用されている。ＰＣＲおよび制限酵素切断による変異体解析（ＭＡＰＲＥＣ）法は、ウイルスＲＮＡ内の所与の地点における、単一塩基の変異の比率を決定するのに使用されている。この部位における変異の計算値が、許容可能値を超える場合、一価のバルクワクチン（例えば、経口ポリオワクチン）は、ＭＡＰＲＥＣ試験に不合格となるであろう。３型ポリオウイルスワクチンでは、ウイルスＲＮＡの５’側ＮＣＲ内の塩基位置４７２における、ＵからＣへの変異は、サルにおけるウイルスの神経毒力と直接関連する。１型および２型の経口ポリオワクチンでは、ヒト消化管内または細胞培養物中で継代されると、急速に逆戻りする、５’側ＮＣＲ内の変異が見られる。これらは、１型の塩基位置：４８０  Ｇ→Ａおよび５２５  Ｕ→Ｃ、ならびに２型の塩基位置：４８１  Ａ→Ｇを含む。これらの変異は、ウイルスの集団に高比率で存在する場合、またはウイルスゲノム内の他の変異との相互作用を介して、神経毒力の増大をもたらすと考えられている。興味深いことに、これらの変異が、ワクチンバッチ内で典型的に見出されるレベルで存在する場合、サルにおける毒力との相関は確立されていない（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ：    Ｍｕｔａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  （ＭＡＰＲＥＣ）  ｆｏｒ  Ｏｒａｌ  Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  （Ｓａｂｉｎ）  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｔｙｐｅｓ  １，  ２，  ｏｒ  ３」、５版（２０１２年））。したがって、ワクチン産生の一貫性を測定するために、１型および２型経口ポリオワクチンについてのＭＡＰＲＥＣ試験が開発されている。しかし、ＭＡＰＲＥＣ試験は、弱毒化マーカーを含有することが公知である、少数のゲノム遺伝子座だけの決定に限定されている（Ｒｕｂｉｎ、「Ｔｏｗａｒｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｎｋｅｙ  ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ」、Ｐｒｏｃｅｄｉａ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ、５巻、２６１〜２６５頁（２０１１年））。
【００７３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングプロトコールを使用して、一本鎖ＲＮＡウイルスＰＶＳＲＩＰＯの７つのロットについて解析した。ロットは、２００４年に製造された元のマスターウイルスバンク（ＭＶＢ、ロット番号：Ｌ０４０３００６）と、２００４年のＭＶＢに由来するウイルス生成物ロットであって、非臨床毒性研究ロット、２００９年のフェーズ１臨床ロット、２０１４年に製造された臨床原薬および医薬品ロット、および基準物質ロットを含むロットを含んだ。Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングはまた、プラスミドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写およびトランスフェクションを使用して、２０１３年に製造された第２のＭＶＢロット（ＭＶＢ、ロット番号：Ｌ１３１１００２）に対しても実施した。被験ロットの全ては、塩基１つ当たりの平均リード深度が２×１０５を超えるキメラウイルスゲノムにわたり、目覚ましく限定的な、配列の微小不均一性（ｍｉｃｒｏ−ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を呈した。観察された配列変動は、５’側最末端（ポリオ内の公知の超可変領域）を例外として、カノニカルの基準配列と比べて、１％未満の不均一塩基コールからなることが示され、５つの多型位置だけが、ＰＶＳＲＩＰＯの１つを超えるロット内で、反復的に観察された。これらの５つの不均一位置およびそれらの関連する塩基改変体パターンは、被験ロットの全てにわたって一貫して観察された。これは、ＰＶＳＲＩＰＯの臨床ロット内に存在する限定的な変動が、親ＭＶＢロット内に元来存在する変動に由来するか、またはウイルスの複製時またはｃＤＮＡシーケンシング時における、ポリメラーゼによる誤組込みの優先的な方式を表しうることを指し示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写（ＩＶＴ）によりＭＶＢを生成するのに使用されるプラスミドＤＮＡは、７つのＰＶＳＲＩＰＯロット内で観察される塩基変動パターンの第３の源でありうる。ＰＶＳＲＩＰＯについてのディープシーケンシングは、ＰＶＳＲＩＰＯが、驚くべきことに安定的な一本鎖ＲＮＡウイルスであることを指し示す、かつての解析データおよび神経毒性データの妥当性を確認する。ＰＶＳＲＩＰＯの第２のＭＶＢロット（ロットＬ１３１１００２）は、観察される、低レベルの配列微小不均一性と、配列変動パターンとは、２００４年の初期ＭＶＢロット、およびその後続の臨床ロットと符合することを示す。
【００７４】
本方法は、ウイルス由来の治療剤（例えば、マスターのウイルスシードバンクロットおよびワーキングセルバンクロットなど、ウイルスシードバンク、収集物、および精製医薬品ロット）について解析して、全ウイルスゲノムにわたり、実質的に全ての潜在的な遺伝子変異の存在および頻度を決定する他の方法と異なる。例えば、ＮｅｖｅｒｏｖおよびＣｈｕｍａｋｏｖ（ＰＮＡＳ、１０７巻：２００６３〜８頁、２０１０年）は、経口ポリオウイルスワクチンについて解析するシーケンシング法を提示している。Ｃｈｕｍａｋｏｖの研究室は、ポリオワクチンロットについて解析するのに現在使用されているＭＡＰＲＥＣ法を開発した。この論文の序説において言及されている通り、著者らは、弱毒化マーカーを含有することが公知である、少数のゲノム遺伝子座だけをモニタリングし、他の部位における変異は見逃す、その限定された能力など、ＭＡＰＲＥＣ法の限界を認めている。弱毒化の決定は、未知でありうるので、これは、ＭＡＰＲＥＣ法の有用性を限定する。ＮｅｖｅｒｏｖおよびＣｈｕｍａｋｏｖによる参考文献は、生のウイルスワクチンをシーケンシングする大規模並列シーケンシング法を提起している。しかし、この参考文献は、ウイルスの調製ステップに関する詳細を提供していない。なぜなら、おそらく大容量の高力価培養物（すなわち、清澄化上清）または「精製」ワクチンロットを使用した（ウイルスＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞上清またはＶｅｒｏ細胞上清から得た）ためである。すなわち、著者らは、ウイルスＲＮＡ抽出物を生成する場合に、試料容量による制限を受けなかった。これに対し、本発明者らは、ウイルス核酸の、宿主細胞核酸に対する比を増大させる（これは、より頑健なシーケンシング結果をもたらす）ために、過剰な宿主細胞核酸（ｄｓＤＮＡなど）を、マスターウイルスバンク試料またはワーキングセルバンク試料から除去するのに、ＤＮＡアーゼステップが必要とされることを見出した。ＮｅｖｅｒｏｖおよびＣｈｕｍａｋｏｖにより使用されたＰｕｒｅＬｉｎｋウイルスＲＮＡキットは、ＤＮアーゼを含まない。
【００７５】
Ｈａｌｌら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１９５巻：１９４〜２０４頁、２０１４年）は、遠心分離、濾過、およびヌクレアーゼ処理を使用して、エンテロウイルス配列を濃縮する方法について開示している。Ｈａｌｌらは、核酸分子を抽出する前におけるＤＮアーゼの使用であって、ＤＮアーゼは、抽出時に除去されるので、手順上より効率的である使用について教示している。これに対し、本発明者らは、核酸とＤＮアーゼとを接触させる前に、核酸を抽出することにより、抽出後に使用し、別個に不活化させる場合、ＤＮアーゼ反応の効率は、予測外かつ著明に改善されることを見出した。加えて、Ｈａｌｌらにより教示された、抽出の前におけるＤＮアーゼの使用は、抽出工程全体の効率を低減し、ＤＮアーゼが、被包されていない「遊離」ＲＮＡに結合するので、ウイルスＲＮＡ収量に負の影響を及ぼしうる。例えば、本発明者らは、ＲＮＡの抽出後にＤＮアーゼを使用して得られた、ウイルスＲＮＡ量の約２倍の増大を観察した。ＨａｌｌらおよびＤｊｉｋｅｎｇによる論文は、ＲＴプライミングおよび／または増幅プライミングのために、ランダムヘキサマーだけに依拠しているが、これは、任意のウイルス配列のいずれの末端においても、カバレッジ深度の大きな喪失をもたらす。開示される方法は、それが、ゲノム内および末端における、位置によるカバレッジバイアスをもたらす可能性があり、一部のＳＮＰをマスキングしうるので、ランダムヘキサマーだけの使用（オリゴ（ｄＴ）および／または保存的な「全長」配列プライマーと組み合わせた使用と対比される）を回避する。類似の方法は、Ｄｊｉｋｅｎｇら（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、９巻：５頁、２００８年）により提示されている。
【００７６】
表１は、開示される方法の、ウイルス由来の治療剤について解析するための他の方法との比較の概要を提示する。
【表１−１】
2018527948.tif 000002
【表１−２】
2018527948.tif 000003
【００７７】
ウイルス由来の治療剤を解析する方法
本明細書では、完全なウイルスゲノムにわたり、実質的に全ての潜在的な遺伝子変異の存在および頻度を決定するように、次世代シーケンシング法（例えば、大規模並列シーケンシング）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて使用して、ウイルス由来の治療剤（例えば、ポリオウイルスワクチン製品および他のウイルスワクチン製品）のロット（例えば、マスターのウイルスシードバンクロットおよびワーキングセルバンクロットなど、ウイルスシードバンク、収集物、および精製医薬品ロット）を、迅速かつ直接的にスクリーニングする方法が記載される。この方法は、配列改変体に対する、現行のプラークベースのシーケンシング法より数桁大きな（典型的に４  ｌｏｇ以上である）感度を慣例的に裏付けており、完了に数カ月間を要求することが典型的な、霊長類の神経毒性試験と異なり、１〜２週間以内で実施することができる。加えて、サンガー法は、使用されるプライマー配列に対する特異性が限定され、検出感度も、全シグナルのうちの約１０〜２０％までに限定されているので、本明細書で報告される結果は、従来のサンガーシーケンシング法を使用しては得ることができない。言い換えれば、サンガーシーケンシング法を使用して、信頼できる形で検出しえたのは、全試料のうちの約１０〜２０％を超える試料からなった遺伝子改変体だけであり、一般に、シーケンシング部位またはＰＣＲプライミング部位では生じなかった高頻度改変体だけである。
【００７８】
本明細書で開示されるシーケンシング法は、シーケンシング結果にバイアスを及ぼしうる、標的ウイルス核酸に特異的なシーケンシングプライマーもＰＣＲプライマーも必要としない。ライゲーションされた５’アダプター配列および３’アダプター配列をターゲティングし、ウイルスｃＤＮＡ配列を直接的にはターゲティングしない前増幅ＰＣＲプライマーおよびシーケンシングプライマーを用いるシーケンシングプロトコール（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プロトコールなど）を使用することができる。本明細書で記載される方法は、準ランダムなｃＤＮＡの断片化の使用を介して、重複リードの利点を維持しながら、シーケンシングの前またはシーケンシング時において、プライマーにより媒介されるバイアス（例えば、ＰＣＲプライミング部位において生じるＳＮＰおよびインデルの隠蔽）を低減する。加えて、本明細書で記載されるシーケンシング法は任意選択で、標的ウイルス由来の治療剤の、最小量のＰＣＲによる前増幅を、シーケンシング後の解析時にたやすく補償される前増幅レベルで利用するが、この場合、大きなＰＣＲサイクルを使用することにより、シグナル対ノイズ比を同時に低下させながら、感度閾値の上昇を使用して、偽陽性結果についての報告を最小化することができる。方法は、任意のレベル（例えば、＜０．０００１％またはＰＰＭが達成されている）の配列変動を検出することが可能であり、カバレッジの深度および／または試料中に存在する標的コピーの数だけにより限定される。
【００７９】
精製ウイルスについて調べることに加え、ＤＮアーゼを用いる、大量の宿主細胞核酸を含有する非精製試料（例えば、ＭＶＢに由来する粗細胞培養溶解物）のための、この方法の変法であって、アッセイ感度および配列リード深度に対する影響を最小限に限る変法を開発した。所与の試料容量中の、宿主細胞ＲＮＡおよび宿主細胞ＤＮＡのバックグラウンドの質量およびコピー数は、存在するウイルスＲＮＡ量を数ｌｏｇ大きい場合があり、サンガーシーケンシングの前における、広範な前増幅（ＰＣＲサイクリング）の必要のために、従来のサンガーシーケンシング法を、不可能であるか、または潜在的にバイアスのかかったものとしている。
【００８０】
本明細書では、ウイルス由来の治療剤を、ウイルス配列改変体の存在についてアッセイする方法が提示される。これらのシーケンシング法およびスクリーニング法を使用して、ウイルス由来の治療剤（ＭＶＢ内またはＷＣＢ内に存在する治療剤など）のロットを、所望されないウイルス配列変動（１または複数のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換など）の存在について解析することができる。開示される方法を使用して解析しうる、例示的なウイルス由来の治療剤は、ウイルス、ウイルスの鋳型プラスミド、またはワクチンを含むがこれらに限定されない。本明細書で開示される方法を使用してシーケンシングしうる、例示的なウイルス由来の治療剤は、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶなど、高変異率を呈するＲＮＡウイルスに基づく治療剤を含む。開示される方法により解析しうる、例示的なワクチンは、ＭＭＲ（麻疹、ムンプス、風疹）およびＭＭＲＶ（麻疹、ムンプス、風疹、水疱瘡）を含む。一例では、ＲＮＡウイルス由来の治療剤は、ワクチン、具体的には、２型ヒトライノウイルスに由来する、異種の内部リボソーム侵入部位を含有する、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ生弱毒化経口（ＳＡＢＩＮ）血清型１ポリオウイルスワクチンである。開示される方法はまた、例えば、マルチプレックス化を使用することにより、１つを超えるウイルス由来の治療剤を一度に解析することも可能とする。
【００８１】
開示される方法は、核酸分子を、ウイルスシードバンク、収集物、および精製医薬品ロット（例えば、マスターウイルスバンク（ＭＶＢ）またはワーキングセルバンク（ＷＣＢ））から抽出する（例えば、単離する）ステップを含む。ウイルスゲノムの核酸（例えば、ＲＮＡ）を含む核酸分子を、ウイルスシードバンク、収集物、および精製医薬品ロットから単離するステップは、Ｑｉａｇｅｎから市販されているＱＩＡａｍｐ（登録商標）ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉキットなど、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。全ＲＮＡは、分光光度法により定量化することもでき、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量化することもできる。
【００８２】
ウイルスシードバンク（例えば、ＭＶＢおよびＷＣＢ）は、ウイルス由来の治療剤を含有する宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌細胞、ならびにそれらの所望されない宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡなど）を含み、収集物（例えば、Ｖｅｒｏ細胞からの）は、所望されない宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡを含みうる。こうして、一部の例では、解析されるウイルス由来の治療剤は、ウイルスシードバンクおよび収集物（例えば、ＭＶＢまたはＷＣＢ）に由来する非精製試料などの非精製試料中に存在する。一態様では、ウイルス由来の治療剤の試料は、宿主細胞のゲノムＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡなど、ウイルス由来の治療剤以外の供給源に由来する全核酸のうちの少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含有する非精製試料などの非精製試料である。一例では、方法は、非精製試料から単離されたウイルスゲノムＲＮＡを、ＤＮアーゼで処理し、次いで、二本鎖ｃＤＮＡを、単離されたウイルスゲノムＲＮＡから作製する前に、ＤＮアーゼを不活化するステップを含む。ＤＮアーゼ処理は、遊離ＤＮＡを除去し、標的ウイルスＲＮＡについての、ｃＤＮＡ合成の改善を可能とする。一例では、方法は、非精製試料から単離されたウイルスゲノムＤＮＡを、ＤＮアーゼで処理し、次いで、ＤＮアーゼを不活化し、ウイルスゲノムＤＮＡを回収するステップを含む。このようなＤＮアーゼ処理は、宿主細胞ＤＮＡを除去するが、ウイルスＤＮＡ（例えば、カプシド内のウイルスＤＮＡの場合）の回収を可能とする。一部の例では、ウイルス由来の治療剤が、ＤＮＡウイルスである場合、抽出後において、ＤＮアーゼではなく、適切な構造特異的ヌクレアーゼを使用することができる。一部の例では、ウイルス由来の治療剤が、ＤＮＡウイルスである場合、ＤＮアーゼ処理を、核酸抽出の前に実施する。一部の例では、ＤＮアーゼ処理を、核酸抽出の前および後に実施する。
【００８３】
他の例では、解析されるウイルス由来の治療剤は、精製医薬品ロットに由来する精製試料などの精製試料中に存在する。精製試料は、例えば、ワクチンの臨床ロットを含む。精製試料は、ＲＮＡウイルス由来の治療剤に由来するそれらの全核酸のうち、７０％超、典型的には９５％超を含有することが典型的である。一部の例では、このような精製試料には、ＤＮアーゼ処理が要求されない。一例では、精製試料中に存在するウイルス由来の治療剤の配列を、非精製試料（例えば、加工の初期段階にある非精製試料）から既に得られた、ウイルス由来の治療剤の配列と比較する。こうして、開示される方法は、本明細書で提示される方法を使用して、非精製試料中の、ウイルス由来の治療剤について解析し、次いで、その後、本明細書で提示される方法を使用して、精製試料中の、ウイルス由来の治療剤について解析するステップを含みうる。これは、ウイルス由来の治療剤の配列が、ウイルス由来の治療剤の製造時に変化したのかどうかを決定することを可能とする。
【００８４】
所望されない宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡが、結果として得られる、非精製試料から抽出された試料中に存在するので、抽出された（例えば、単離された）核酸分子を、宿主細胞ゲノムＤＮＡおよび宿主細胞ミトコンドリアＤＮＡは実質的に消化するが、所望のウイルス核酸分子（ウイルスゲノムＲＮＡもしくはウイルスゲノムＤＮＡ、またはウイルス鋳型プラスミドなど）は実質的に消化しない条件下で、ＤＮアーゼとインキュベートする（例えば、接触させる）。このような条件の例は、３７℃で、少なくとも１０分間（少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、または少なくとも３０分間など）である。別の例では、条件は、２℃〜４０℃で、少なくとも１０分間（少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも１２０分間、または少なくとも１８０分間など）（低温は一般に、長いインキュベーション時間を要求する）である。熱安定性のＤＮアーゼを使用する場合、試料は、４０℃を上回る温度でインキュベートすることができる。一部の例では、抽出または単離された核酸分子を、ＤＮアーゼと、４５分間未満など、１時間未満、または１０〜３０分間など、３０分間を超えない時間にわたりインキュベートする。一部の例では、抽出または単離された核酸分子を、２Ｕ／ｕＬで１０Ｕ未満、２Ｕ／ｕＬで５Ｕ未満、例えば、２Ｕ／ｕＬで４Ｕなど、２Ｕ／ｕＬで１Ｕ〜１０Ｕまたは２Ｕ／ｕＬで１Ｕ〜５Ｕなど、低量のＤＮアーゼと共にインキュベートする。驚くべきことに、ＤＮアーゼは、ある程度のＲＮアーゼ活性を有するが、ＤＮアーゼは、ウイルスＲＮＡをそれほど分解しないことが見出された。ＤＮアーゼの存在は、所望のウイルス由来の治療剤核酸の、所望されない宿主細胞核酸に対するシグナル：ノイズ比を増大させる。一部の例では、ＤＮアーゼ処理後における、所望のウイルス由来の治療剤核酸の純度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。一部の例では、ＤＮアーゼ処理時に分解される、ウイルス由来の治療剤核酸の量は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満である。一部の例ではＤＮアーゼ処理時に分解される、宿主細胞核酸の量は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。
【００８５】
結果として得られる濃縮されたウイルス核酸分子は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もある。濃縮されたウイルス核酸分子がＲＮＡである場合、方法は、例えば、逆転写を使用して、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、濃縮されたウイルスＲＮＡから作製し、第２のウイルス核酸鎖を生成するステップを含む。例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）システムを、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーなどのオリゴ（ｄＴ）ｘプライマーおよびｄＮＴＰと共に使用して、ｃＤＮＡを作製することができる。別の例では、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製のＳＭＡＲＴｅｒ  Ｏｌｉｇｏ  ＩＩＡプライマーおよびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）ｘプライマーを伴う、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅシステムを使用して、ｃＤＮＡを、低ウイルスコピー試料から作製する。ＲＮアーゼＨを添加して、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド体を除去することができる。次いで、ｃＤＮＡを、例えば、分光光度法により定量化することができる。第２鎖ＤＮＡ合成は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔなど、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、ｄｓｃＤＮＡを精製することができ、次いで、これを、例えば、分光光度法により定量化することができる。ウイルスｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）（生成されたものであれ、宿主細胞から直接抽出されたものであれ）は、増幅することができ（例えば、ＰＣＲを使用して）、増幅されたウイルスｄｓＤＮＡは、例えば、分光光度法により定量化することができる。
【００８６】
次いで、シーケンシングライブラリーを、５００ｐｇ〜１ｎｇ、５００ｐｇ〜５ｎｇ、５００ｐｇ〜１０ｎｇ、または１ｎｇ〜５ｎｇの増幅されたウイルスｄｓＤＮＡなど、少なくとも５００ｐｇ（少なくとも１ｎｇ、少なくとも２ｎｇ、少なくとも５ｎｇ、または少なくとも１０ｎｇなど）の増幅されたウイルスｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）から生成する。シーケンシングライブラリーは、ウイルスｄｓＤＮＡへと接合させた５’アダプターおよび３’アダプター（例えば、ウイルスｄｓＤＮＡ断片は、それらへとライゲーションされた５’アダプターおよび３’ーアダプターを有する）を含む。シーケンシングライブラリーは、ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）をランダムに断片化して、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片を作製し、５’アダプターおよび３’アダプターを、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片へとライゲーションし、アダプターをライゲーションされたＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片を増幅すること（例えば、クローン増幅すること）により作製することができる。このような方法では、アダプターをライゲーションされたＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片を増幅して、シーケンシングライブラリーを作製する。一例では、増幅は、クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、５’アダプターおよび３’アダプターと相補的なオリゴヌクレオチド（この場合、プライマーは、固体表面または粒子へと接合することができる、例えば、表面に結合している粒子に結合している）を使用して実施する。シーケンシングライブラリーのＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片は、２００〜４００塩基対のサイズを有することが典型的である。ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を断片化し、５’アダプターおよび３’アダプターをライゲーションすることは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）による「タグメンテーション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」を使用して実施することができる。「タグメンテーション」工程では、ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を断片化すること（例えば、酵素的に切断すること）と、断片を、アダプター配列でタグ付けすることとを、単一のステップで実施する。断片化およびライゲーションはまた、個別のステップで行うこともできる。アダプターを、ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）へとライゲーションした後で、ＤＮＡリガーゼを不活化させることができる。したがって、シーケンシングライブラリーとは、ランダムに断片化された二本鎖ＤＮＡ分子であり、これらを、それらの３’端および５’端において、アダプター配列へとライゲーションする。タグメンテーション工程の使用は、試料収量を同時に改善しながら、断片長に対する良好な制御をもたらす。これは、良好な回収および潜在的に大きなリード深度および試料カバレッジを可能とする。タグメンテーション法はまた、動力学的断片化法より再現性も大きい。
【００８７】
５’側アダプターおよび３’側アダプターの具体的なデザインは、使用されるＮＧＳプラットフォームに依存する。アダプター配列は、例えば、後続のライブラリーの増幅またはシーケンシングプライマーのアニーリングを可能とする、公知の配列組成をもたらす。アダプターとして、公知の配列の二本鎖核酸または部分的な二本鎖核酸を使用することができる。アダプターは、平滑末端を有する場合もあり、３’突出または５’突出を伴う粘着末端を有する場合もあり、Ｙ字型アダプターによりもたらされる場合もあり、ステムループ型アダプターによりもたらされる場合もある。Ｙ字型アダプターについては、例えば、米国特許第７，７４１，４６３号において記載されており、ステムループ型アダプターについては、例えば、ＵＳ２００９／０２９８０７５において記載されており、これらは、アダプターの特異的なデザインに関して、参照により本明細書に組み込まれる。例示的なアダプターは、１０〜１００塩基、１５〜７５塩基、または２０〜６０塩基など、少なくとも７、少なくとも１０、または少なくとも１５塩基の長さを有する。同じアダプターまたは異なるアダプターを、断片の３’末端および５’末端において使用することができる。両方の末端に、Ｙ字型アダプターまたはステムループ型アダプターなど、同じ種類のアダプターを使用することは、ライブラリーの調製時に、アダプターの誤対合のために、断片を失わない利点を有し、これは、低量のＤＮＡで作業する場合の利点である。
【００８８】
タグ付けされた断片を作製したら、増幅ステップを実施する。標的ウイルスの、最小量のＰＣＲ前増幅を使用することにより、シグナル対ノイズ比を改善し、感度閾値を上昇させて、偽陽性結果についての報告を最小化することができる。増幅の変化は、シーケンシング後の解析時に、たやすく補償することができる。一例では、１２サイクルなど、１０〜１５サイクルのＰＣＲ増幅を利用する。任意選択で、増幅時に、バーコードを、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）断片へと付加する。バーコードとは、元の試料を同定するのに使用しうる、特異的なＤＮＡ配列である。バーコードを使用して、異なる試料に由来する配列リードを、デマルチプレックス化するか、または区別することができる。バーコードの使用はまた、コンピュータによる連鎖解析、２つまたはこれを超えるロットについての直接的なアッセイ内比較なども可能とする。固有のバーコードの使用はまた、かつての研究または同時的な研究に由来する、実験室における交差夾雑を迅速に同定するのにも使用することができる。
【００８９】
シーケンシングライブラリーを作製し、任意選択で、バーコード処理したら、例えば、５’アダプターおよび３’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドまたは粒子結合オリゴヌクレオチドを使用して、シーケンシングライブラリーをクローン増幅する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プロトコールでは、クローン増幅は、フローセルの表面に結合させた（例えば、接合させた）、５’アダプターおよび３’アダプターと相補的なオリゴヌクレオチドのブリッジ増幅を使用する。こうして、鋳型クラスターを、フローセル上に直接形成する。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）法では、ライブラリー断片を、マイクロビーズへとクローン増幅する。
【００９０】
次いで、複数の配列リードを含む生の配列データセットを作製するように、ＮＧＳ技術を使用して（例えば、パラレルシングルエンドまたはペアドエンドシーケンシングを使用して）、結果として得られる、クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングする。すなわち、クローン増幅されたライブラリー断片、または複数のライブラリーに由来する断片を、並列的な合成によりシーケンシングする。一態様では、パラレルペアドエンドシーケンシングを、使用する。ペアドエンドシーケンシングでは、同じ断片の両方の末端をシーケンシングする。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プロトコールでは、最初のリードの完了後、クローンクラスターをｉｎ  ｓｉｔｕで修飾して、ペアドリードのための鋳型を再生する。ペアドリードは、単一のリードより大規模なゲノム情報を生成する（例えば、１５０ｂｐの単一リードと比較した、２×７５ｂｐのベースペアドリード）。一例では、パラレルペアドエンドシーケンシングは、２×７５〜２×２００ｂｐにわたるシーケンシングである。一例では、５’アダプターおよび３’アダプターと相補的なプライマーを使用して、クローン増幅されたシーケンシングライブラリーのシーケンシングを実施する。
【００９１】
結果として得られる複数の配列リードを、ウイルス由来の治療剤の基準配列（同じウイルスの変異していない配列など）とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製する。一部の例では、配列リードのうちの少なくとも８５、少なくとも９０％、または少なくとも９５％など、少なくとも８０％が、ウイルス由来の治療剤の基準配列とアラインメントされる。アラインメントされた配列リードから、ウイルス由来の治療剤の配列を決定し、存在する場合、配列変動（例えば、変異）の存在を同定する（例えば、報告する）ことができる。一部の例では、複数の配列リードの平均リード長は、約７５〜約１５０塩基対である。
【００９２】
一部の例では、報告するステップは、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジを含む。カバレッジという用語は、シーケンシング工程において、特定のヌクレオチドが読み取られる回数を指す。したがって、カバレッジとは、いずれの方向であれ、アラインメントされた配列内の特定のヌクレオチドを表する平均リード数である。一例では、塩基１つ当たりのカバレッジは、少なくとも４回である。したがって、方法は、アラインメントされた配列中の各塩基のカバレッジが、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回または少なくとも１０回など、４回またはこれを超える場合、アラインメントされた配列は、ウイルス由来の治療剤のロットのスクリーニングに許容可能であると決定するステップを含みうる。平均カバレッジは、基準（または観察される）標的ゲノムのサイズで除した、塩基リードの総数に基づく。しかし、単一のＲＴプライマーを使用して、ウイルスゲノムをシーケンシングする場合、ｃＤＮＡの３’末端は、５’末端よりはるかに大きなカバレッジの深度を有することが典型的であるため、平均カバレッジは、誤解を招く場合がある。一部の例では、アラインメントされた配列中の各塩基のカバレッジが、４回未満であると決定される場合、アラインメントされた配列の全体にわたり、４回またはこれを超えるカバレッジをもたらすように、サンガーシーケンシングを、ウイルス由来の治療剤に対して実施することができる。例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ配列の５’末端では、ウイルスのＩＲＥＳドメイン内の、強力なＲＮＡ構造が、ＲＴ消耗をもたらしうる結果として、カバレッジの低減をもたらしうる。例えば、適切なカバレッジを欠くゲノムの部分が、ゲノムの５’末端の近傍にある場合、５’末端の、最小で４回の配列カバレッジをもたらすリバースプライマーだけを使用して、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ｃＤＮＡの線形ＰＣＲ増幅を実施することができる。高サイクル数の線形（非指数関数的）ＰＣＲを利用して、とりわけ、例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスの、過少に表われる（低コピーｄｓｃＤＮＡ）超可変性の５’末端における、プライマー配列による、天然ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス配列の上書きを防止することができる。配列の変異性を低減することが既に裏付けられている標的部位を使用して、さらなるカバレッジを要する領域のために、プライマーを選択またはデザインする。ＰＶＳ−ＲＩＰＯの基準配列とのコンセンサスの相同性と、サンガーシーケンシングされた領域にわたる任意の不均一塩基とを、最終報告に組み入れる。
【００９３】
一部の例では、生の配列データセットを、ウイルス由来の治療剤の適切な基準配列とアラインメントする場合、平均リード長、アラインメントされたリードの百分率、カバレッジ、ＳＮＰ、またはこれらの組合せを、アラインメントされた配列リードについて決定する。こうして、ＳＮＰを、アラインメントされた配列リードについて決定することができる。改変体は、以下の基準（例えば、ポリオワクチンの場合）に従い規定することができる：所与の塩基位置におけるシーケンシング深度が、４，０９６，０００と等しいかまたはこれを超える場合は、０．１％を超えての潜在的な変動をコールし；深度が、４，０９６，０００未満であるが、４０９６を超える場合は、頻度が４０９６またはそれを超える改変体をコールし；所与の塩基位置におけるカバレッジの深度が、４０９６リード未満である場合は、それらが１．０％超からなれば、潜在的な改変体をコールする。例えば、公表されているポリオワクチンの限界値（この場合、ポリオＩＲＥＳ内の、鍵となる神経毒力部位における、約０．１％超の多型であれば、サルにおける病原性の表現型の観察を結果としてもたらしうるであろう）に基づくと、０．１％閾値が、例示的な閾値である。しかし、閾値は、標的コピー数およびＲＴの忠実度、前ＰＣＲ、ならびに利用されるシーケンシング反応だけにより限定される任意の値に設定することができる。
【００９４】
一部の例では、方法は、ウイルス由来の治療剤の、ウイルス由来の治療剤の基準配列とのコンセンサスの相同性、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジ、リードに対する規定された百分率を超える不均一塩基（例えば、リードに対して０．１％を超える不均一塩基）、インデル、またはこれらの組合せについて報告するステップを含む。ウイルス由来の治療剤の、基準配列とのコンセンサスの相同性は、コンセンサス配列および配列データセットの一部もしくは全部についてのペアワイズアラインメント、コンセンサス配列および配列データセットの一部もしくは全部についての、個々の位置における変動の報告、または他の任意の適切なフォーマットとして報告することができる。ポリオウイルスの場合、各ウイルスロットのうちの５’末端（１〜３４位の塩基）では、多型レベルの上昇が予測（および観察）されるが；ポリオゲノムのこの領域（ＶＰｇ結合性領域およびＶＰｇ  Ｓｔｅｍ  ａ／ｂ領域）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、高度な配列の変異性を呈することが公知である。報告するステップはまた、コンセンサス配列および配列データセットの一部または全部についての、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジも含みうる。このようなデータは、例えば、表またはグラフとして提示することができる。カバレッジはまた、シーケンシングされた塩基の総数を求め、ゲノムのサイズで除することにより推定される総カバレッジも含みうる。報告するステップはまた、リードに対して０．１％を超える不均一塩基であって、シグナル対ノイズ閾値を上回ることが予測される、不均一塩基も含みうる。弱毒化についてのマーカーなど、有害なマーカーの同定が特に重要であるが、ワクチンロット内に変異が蓄積されないように要求することは、ワクチンの安全性を維持する一助となるであろう。したがって、本明細書で記載される方法を使用して、遺伝子的に不安定な領域を同定することができる。ワクチンバッチ内の変異を定量化することは、品質管理のために重要であるほか、ウイルスワクチンの製造の一貫性を維持するのにも重要である。別の態様では、供給源プラスミド〜ＭＶＢ／ＷＶＢ（ウイルスシード）〜臨床ロットの製造にわたる、変異プロファイルの変化について検討することができる。加えて、結果は、ウイルスバンクの遺伝子的安定性と、バンクが、臨床ロットの製造になおも適するのかどうかも指し示すであろう。
【００９５】
一部の例では、アラインメントされていない配列リードを作製する場合、アラインメントされていない配列リードを、同定のために、アラインメントされていない配列リードのプールに加える。一般に、アラインメントされていないリード配列は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｎにより解析して、それらの同一性を決定することができ；アラインメントされていないリード、とりわけ、非精製ウイルス試料に由来する、アラインメントされていないリードは、宿主細胞のゲノムＤＮＡ配列またはミトコンドリアＤＮＡ配列に由来することが予測されるが、ヒトＤＮＡまたは他の実験室夾雑ＤＮＡ配列も観察されうる。アラインメントされていない配列リードの、ＢＬＡＳＴｎ解析による同定は、宿主細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）ＤＮＡ以外の、潜在的な夾雑物の同定を可能とする。言い換えれば、アラインメントされていないリードの同定は、ウイルス夾雑物のＰＣＲおよびＡＶＡ安全性試験の一助として作用しうるほか、ヒトＤＮＡに由来する、潜在的な工程夾雑物または実験室夾雑物を同定する手段としても作用しうる。アラインメントされていない配列リードから確認されうる情報は、試料または試験室の夾雑；製造夾雑（先行製品、細胞株夾雑（例えば、ＨｅＬａ夾雑）、ヒトＤＮＡなど）；宿主細胞株内の外来性作用因子（溶解性または溶原性の、ウイルス、細菌、マイコプラズマなど）の検出および同定；ｍｔＤＮＡ配列および／またはｇＤＮＡ配列を介して、宿主細胞バンクロットを固有に同定する潜在的可能性；過剰な宿主細胞ＭＣＢ／ＷＣＢの年齢（継代数）、またはｍｔＤＮＡもしくはｇＤＮＡ配列（なおまたはｍＲＮＡの発現レベル）の変化に起因するストレスの可能な同定を含み；アラインメントされていないリードは、試料調製法および／またはシーケンシングの変化について診断的であることも可能であり；アラインメントされていないリードは、残留宿主細胞ＤＮＡの試験と同様な、試料純度についての尺度としても作用する。
【００９６】
一部の例では、ウイルス由来の治療剤を、ＭＶＢまたはＷＣＢからシーケンシングした後で、方法は、ＭＶＢから得られ、シーケンシングされた、ウイルス由来の治療剤を、ウイルス由来の治療剤（例えば、ワクチン）を産生させるための、哺乳動物細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞）などの宿主細胞へと導入するステップをさらに含む。次いで、このウイルス由来の治療剤（例えば、ワクチン）は、ＭＶＢまたはＷＣＢから得られた、ウイルス由来の治療剤より純度が高いので、ＤＮアーゼは一般に要求されないことを除き、ＭＶＢまたはＷＣＢのために使用したプロトコールと同様のプロトコールを使用して、第２の宿主細胞内で産生された結果として得られるウイルス由来の治療剤をシーケンシングすることができる。結果として得られる、ウイルス由来の治療剤の配列を、対応する基準配列および／またはＭＶＢまたはＷＣＢから得られた、ウイルス由来の治療剤の配列と比較することができる。
【００９７】
例えば、方法は、ウイルス由来の治療剤を、哺乳動物または他の宿主細胞へと導入（例えば、形質転換）し、ウイルス由来の治療剤の繁殖を可能とする条件下で、哺乳動物の宿主細胞を増殖させるステップをさらに含みうる。ウイルス核酸分子を、哺乳動物の宿主細胞から抽出（例えば、単離）し、例えば、上清から精製する。一部の例では、このような抽出および単離後における、所望のウイルス由来の治療剤核酸の純度は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％である。上記の通り、単離されたウイルス核酸分子は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もある。任意選択で、単離されたウイルス核酸分子を、上記で記載した通り、ＤＮアーゼで処理することができる（一部の例では、ウイルス核酸を単離する前、または単離した後で宿主細胞または培養上清をＤＮアーゼで処理する）。単離されたウイルス核酸分子がＲＮＡである場合、方法は、例えば、逆転写を使用して、ｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、単離されたウイルスＲＮＡから作製し、第２のウイルス核酸鎖を生成するステップを含む。ウイルスｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）を、増幅し（例えば、ＰＣＲを使用して）、増幅されたウイルスｄｓＤＮＡを定量化する。次いで、シーケンシングライブラリーを、５００ｐｇ〜１ｎｇ、５００ｐｇ〜５ｎｇ、５００ｐｇ〜１０ｎｇ、または１ｎｇ〜５ｎｇの増幅されたウイルスｄｓＤＮＡなど、少なくとも５００ｐｇ（少なくとも１ｎｇ、少なくとも２ｎｇ、少なくとも５ｎｇ、または少なくとも１０ｎｇなど）の増幅されたウイルスｄｓＤＮＡ（例えば、ｄｓｃＤＮＡ）から生成し、シーケンシングし、結果として得られる複数の配列リードを、基準配列とアラインメントし、ウイルス由来の治療剤の配列を決定し、上記で記載した通り、存在する場合、配列変動（例えば、変異）の存在を同定する。一部の例では、結果として得られる、ウイルス由来の治療剤の配列を、ＭＶＢまたはＷＣＢから得られた、ウイルス由来の治療剤の配列と比較することができる。
【００９８】
方法は、例えば、異なるウイルス由来の治療剤の識別を可能とする「バーコード」または「タグ」を使用することにより、少なくとも２つの異なるウイルス由来の治療剤（２つ、３つ、４つ、または５つの異なるウイルス由来の治療剤など、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも２０の異なるウイルス由来の治療剤）について、同時的または共時的にアッセイすることを可能とする。一部の例では、異なるウイルス由来の治療剤は、異なるウイルス（例えば、異なるポリオウイルスまたは異なるＲＮＡウイルス）である。他の例では、異なるウイルス由来の治療剤は、同じウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ）であるが、異なる供給源（異なるＭＶＢまたはＷＣＢなど）に由来する。方法は、シーケンシングライブラリーを作製するステップが、各ウイルス由来の治療剤について、１または複数のシーケンシングライブラリーを作製することを含むことが可能であり、１または複数のシーケンシングライブラリーが、５’アダプターおよび３’アダプターを含み、１または複数のシーケンシングライブラリーの各々は、同定のための固有のバーコードを含むことを除き、上記で記載した通りに行う。１または複数のシーケンシングライブラリーをプールし、本明細書で記載される通り、ＮＧＳを使用してシーケンシングし、上記で記載した通りに解析する。プールされた生の配列データセットは、各シーケンシングライブラリーについて、デマルチプレックス化された生の配列データセットを作製するように、バーコードを使用して、デマルチプレックス化することができる。デマルチプレックス化された生の配列データセットの各々は、ウイルス由来の治療剤のその適切な基準配列とアラインメントすることができる。アラインメントされた配列リードから、解析された各ウイルス由来の治療剤の配列を決定し、存在する場合、配列変動（例えば、変異）の存在を同定することができる。例えば、個々の配列リードは、基準配列とのそれらのアラインメントまたはアラインメントしないことに基づき、アラインメントされた配列リードおよびアラインメントされていない配列リードとして分類することができる。アラインメントされた配列リードは、平均リード長、アラインメントされたリードの百分率、カバレッジ、ＳＮＰ、挿入／欠失（インデル）、またはこれらの組合せについて評価することができる。一部の例では、方法は、ウイルス由来の治療剤の、ウイルス由来の治療剤の基準配列とのコンセンサスの相同性、位置１カ所当たり、塩基１つ当たりのカバレッジ、リードに対する規定された百分率を超える不均一塩基（例えば、リードに対して０．１％を超える不均一塩基）、インデル、またはこれらの組合せについて報告するステップを含む。
【００９９】
こうして、一部の例では、生の配列データセットを作製したら、データセットを、デマルチプレックス化する。デマルチプレックス化とは、一般に、バーコードを使用して、併せてシーケンシングされる複数の試料を選別することを指す。例えば、ＲＮＡウイルス由来の治療剤のロットのいくつかの希釈物を使用して、各ライブラリーが、固有のバーコードを含むライブラリーを形成することができる。または、個別のいくつかの、ＲＮＡウイルス由来の治療剤のロットを使用して、各ライブラリーが、固有のバーコードを含むライブラリーを形成することができる。デマルチプレックス化はまた、異なる試料調製法について解析する場合に有用でもある。ライブラリーは、プールすることができ、次いで、プールされたライブラリーを、併せてクローン増幅し、シーケンシングすることができる。シーケンシングが完了したら、次いで、バーコードを使用して、配列をデマルチプレックス化する、すなわち、配列を、特異的なライブラリーに割り当てる。次いで、デマルチプレックス化された各生配列を、さらに解析することができる。デマルチプレックス化は、各々が固有のバーコードを伴う、滴定された（低コピー）試料を使用する、コンピュータによる連鎖解析を可能とする。
【０１００】
一部の例では、ウイルス由来の治療剤についての解析の後、方法は、決定されたウイルス配列が、禁忌でない場合（例えば、毒性表現型をもたらす変異が検出されない場合）、シーケンシングされたウイルス由来の治療剤を、被験体へと投与するステップをさらに含む。開示される方法を使用して、ナンセンス変異を結果としてもたらすか、またはウイルスのＯＲＦ／コード配列（ＣＤＳ）を他の形で変化させる、何らかの変異（インデルまたはＳＮＰ）が検出された場合は、ウイルス由来の治療剤を投与しない。例えば、ポリオウイルス内で、以下の変異が検出された場合は、ウイルス由来の治療剤を投与しないが、ポリオウイルス内で、以下の変異が検出されなかった場合は、ウイルス由来の治療剤を投与しうるであろう：３型ポリオウイルスワクチンでは、ウイルスＲＮＡの５’側ＮＣＲ内の塩基位置４７２における、ＵからＣへの変異；１型および２型経口ポリオワクチンでは、ヒト消化管内または細胞培養物中で継代されると、急速に逆戻りする、５’側ＮＣＲ内の変異（ステムループドメイン５の個別の領域である、１型の塩基位置：４８０  Ｇ→Ａおよび５２５  Ｕ→Ｃ、ならびに２型の塩基位置：４８１  Ａ→Ｇなど）；ならびにＰＶセービンワクチン株およびＰＶＳＲＩＰＯでは、神経弱毒化表現型の逆戻りをもたらす、ＩＲＥＳ領域内の変異。しかし、ＰＶＳ−ＲＩＰＯについては、現時点で、病原性表現型または神経毒性表現型をもたらす、公知のＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ変異は存在しない。したがって、一部の例では、ＰＶＳ−ＲＩＰＯが、ウイルス由来の治療剤である場合、ウイルスのＵＴＲ領域、ＩＲＥＳ領域、およびポリプロテインＣＤＳ領域を含む、ＰＶＳＲＩＰＯゲノムの全体を再検討する。
【０１０１】
例示的なウイルス
１または複数の配列改変体（例えば、基準配列と比べた、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはこれらの組合せなどの変異）の存在を同定するように、本明細書で提示される方法を使用して解析されるウイルス由来の治療剤は、ウイルス、ウイルスのプラスミド鋳型（ベクターの一部であり、ウイルスの鋳型配列を含むプラスミド鋳型など）、またはウイルスを含有するワクチンでありうる。例えば、ウイルス由来の治療剤は、シーケンシングされるウイルスの鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡ（例えば、細菌プラスミド）を含みうる。このようなウイルスのプラスミドＤＮＡ鋳型は、宿主細胞内の、天然ウイルスまたは組換えウイルスの産生のために使用することができる。開示される方法を使用して解析しうるウイルスの例は、天然に存在しないＲＮＡベースのウイルス、天然に存在するＲＮＡベースのウイルス、天然に存在しないＤＮＡベースのウイルス、または天然に存在するＤＮＡベースのウイルスのほか、このようなウイルスをコードするウイルスのプラスミド鋳型、またはこのようなウイルスを含有するワクチンを含む。
【０１０２】
一部の例では、ウイルス由来の治療剤は、天然に存在しないＲＮＡベースのウイルス（例えば、天然に存在しないポリオウイルス）である。天然に存在しないウイルスは、天然に存在するウイルスと、様々な程度で異なりうる。天然に存在しないウイルスは、例えば、組換え法により人工的に作製された（「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」）、天然に存在するウイルスから導出することが可能であり、この場合、天然に存在しないウイルスを、「組換え」ウイルスと称することができる。天然に存在しないウイルスの１つの例は、遺伝子操作（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）、またはそれらの病原性を低減もしくは破壊する、選択もしくは化学修飾など、他の工程により改変された病原性ウイルスである。この工程または結果として得られる改変ウイルスのそれぞれを、「弱毒化」、「弱毒化された」と称することもでき、他の関連の用語で呼ぶこともできる。
【０１０３】
例示的な天然に存在しないウイルスは、ウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルス、およびワクチンとして使用される、弱毒化ウイルスまたは組換えウイルスを含むがこれらに限定されない。腫瘍溶解性ウイルスとは、がん細胞に選択的に感染させ、かつ／またはこれらを選択的に破壊するのに使用されるウイルスである。ウイルスベクターとは、多様な適用のために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞培養物中）において、遺伝物質を、細胞へと送達するのに使用されるウイルスである。例えば、ウイルスベクターは、遺伝子的修飾のために使用することもでき、遺伝子治療のために使用することもでき、タンパク質発現のために使用することもでき、ウイルスワクチンとして使用することもできる。ウイルスワクチンを使用して、防御的免疫応答または治療的免疫応答の誘発を目的として、遺伝物質を、細胞または生物へと送達する。例えば、生弱毒化ウイルスは、同じウイルス（ポリオウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルスなど）の、天然に存在する病原性バージョンに対する免疫応答を誘発するワクチンとして使用することができる。腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター、およびウイルスワクチンという用語は、場合によって、意味が重複するが、それらの全ては、例えば、組換え操作技術を使用する、天然に存在するウイルスの遺伝子的改変により、人工的に創出することができる。腫瘍溶解性ウイルスは、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカウイルス（Ｓｅｎｅｃａ  ｖｉｒｕｓ）、またはワクシニアウイルスに基づきうるがこれらに限定されない。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターおよびモロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクターなどのレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ならびにアデノ随伴ウイルスに基づくベクターを含むがこれらに限定されない。ウイルスワクチンは、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン株、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、水痘（水疱瘡）ワクチン、天然痘ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、ＨＩＶワクチンおよびＨＴＬＶワクチン、出血熱ワクチンまたは任意の生弱毒化または不活化ウイルスワクチンを含むがこれらに限定されない。
【０１０４】
一例では、開示される方法によりシーケンシングされるウイルス由来の治療剤は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより例示される、腫瘍溶解性弱毒化組換えポリオウイルスなどの組換えポリオウイルスである。ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、ポリオウイルスの、同族の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を、２型ヒトライノウイルス（ＨＲＶ２）に由来するその対応物と交換して、正常なニューロン細胞内では複製されないが、脳腫瘍細胞に対する腫瘍溶解活性を呈するポリオウイルス株をもたらすことにより創出された、Ｉ型セービンポリオウイルスの弱毒化形態である。組換え腫瘍溶解性ポリオウイルスであるＰＶＳ−ＲＩＰＯを腫瘍内投与すると、ポリオウイルスは、ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体である、ＰＶＲまたはＮＥＣＬ５）を発現する腫瘍細胞内に選択的に取り込まれ、複製され、腫瘍細胞の溶解を最終的に引き起こす。腫瘍胎児性細胞接着分子および腫瘍抗原であるＣＤ１５５は、多形性膠芽腫（ＧＭＢ）など、ある特定のがん内で異所的に発現する。この組換えウイルス内の異種ＨＲＶ２  ＩＲＥＳのために、ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、感受性の非ニューロン細胞（例えば、ＧＢＭ）内だけで繁殖する。ＰＶＳ−ＲＩＰＯならびにその特性および適用については、例えば、Ｇｏｅｔｚら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、２０１０年、２１巻（２〜３号）：１９７〜２０頁、Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００９年、１５５巻（１号）：４４〜５４頁、Ｃｅｌｌｏら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００８年、８０巻（２号）：３５２〜９頁、およびＤｏｂｒｉｋｏｖａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年、１６巻（１１号）：１８６５〜１８７２頁において記載されている。
【０１０５】
一例では、開示される方法によりシーケンシングされるウイルス由来の治療剤は、弱毒化セービンポリオウイルス（例えば、適切な変異を伴う、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、および／または３型ポリオウイルス）である。一例では、開示される方法によりシーケンシングされるウイルス由来の治療剤は、開示される方法を使用するその解析（例えば、被験体への投与の前における）の後で、化学的に不活化させうる（例えば、ホルマリンにより）、不活化ポリオワクチン（例えば、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、および／または３型ポリオウイルス）中で使用されるウイルス由来の治療剤である。
【０１０６】
一例では、開示される方法によりシーケンシングされるウイルス由来の治療剤は、カプシドの存在が、ＲＮＡをＤＮアーゼから保護する、被包性正二十面体ＲＮＡウイルス（例えば、タンパク質ベースのカプシドを伴う、被包性正二十面体ＲＮＡウイルス）である。このようなウイルスの例は、ポリオウイルス（上記で記載したポリオウイルスなど）、風疹ウイルス、アルファウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パルボウイルス（例えば、Ｂ１９）、他のエンテロウイルスなどを含むがこれらに限定されない。
【０１０７】
一例では、開示される方法によりシーケンシングされるウイルス由来の治療剤は、カプシドの存在が、ＤＮＡをＤＮアーゼまたは他のヌクレアーゼから保護する、一本鎖または二本鎖の被包性ＤＮＡウイルス（例えば、タンパク質ベースのカプシドを伴う、一本鎖または二本鎖の被包性ＤＮＡウイルス）である。このようなウイルスの例は、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
一例では、開示される方法によりシーケンシングされるウイルス由来の治療剤は、麻疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）である、またはそれらに由来する。
【０１０９】
一部の例では、ウイルス由来の治療剤は、ウイルスの鋳型プラスミドである。一部の例では、ウイルスの鋳型プラスミドは、ポリオウイルスなど、ＲＮＡウイルスのＤＮＡ鋳型（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）、弱毒化ポリオウイルス（すなわち、セービンワクチン）の鋳型）を含む。一例では、ウイルスの鋳型プラスミドは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ（アフトウイルス（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｉｄａｅ）［例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶなど）］、Ａ型肝炎ウイルス、またはポリオウイルス）、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、およびポリオウイルス）；Ｒｈｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ（Ａ型ライノウイルス、Ｂ型ライノウイルス、またはＣ型ライノウイルスなどのライノウイルス））；トガウイルス（例えば、風疹ウイルス；アルファウイルス（西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスなど））；Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ（例えば、デングウイルス、ジカウイルス、ウェストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および日本脳炎ウイルス）；およびＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（例えば、Ｕｒｂａｎｉ株などのＳＡＲＳコロナウイルス）など、プラス鎖ＲＮＡウイルスのＤＮＡ鋳型を含む。一例では、ウイルスの鋳型プラスミドは、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｙｏｖｉｒｕｓ（Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスなど）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（狂犬病ウイルスなど）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（エボラウイルスなど）、およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ（麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスなど）など、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＤＮＡ鋳型を含む。一部の例では、ウイルスの鋳型プラスミドは、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（水痘帯状疱疹ウイルス、例えば、Ｏｋａ株；サイトメガロウイルス；ならびに１型単純ヘルペスウイルスおよび２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶなど））、アデノウイルス（１型アデノウイルス、１４型アデノウイルス、５型アデノウイルス、４０型アデノウイルス、または４１型アデノウイルスなど）、Ｐｏｘｖｉｒｕｓ（ワクシニアウイルスなど）、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ（パルボウイルスＢ１９など）に由来するＤＮＡウイルス配列などのＤＮＡウイルス配列を含む。一部の例では、ウイルスの鋳型プラスミドは、亜型Ｃなどの１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；およびトリ肉腫ウイルスなどのレトロウイルスの、ＤＮＡ鋳型またはＲＮＡ鋳型を含む。
【０１１０】
例示的なＮＧＳ法
いくつもの次世代シーケンシング技術が公知である。本開示は、特定のＮＧＳ法に制約されない。１つの例は、ジデオキシヌクレオチドによる鎖終結ではなく、ヌクレオチド組込み時のピロホスフェート放出の検出に依拠する合成技法によるシーケンシングである、パイロシーケンシングである。Ｂｉｏｔａｇｅにより市販されているパイロシーケンシング法（ロースループットシーケンシングのための）、および４５４（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより市販されているパイロシーケンシング法（ハイスループットシーケンシングのための）などのパイロシーケンシング法を使用することができる。
【０１１１】
別の例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、Ｈｅｌｉｃｏｓ（登録商標）、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）、Ｓｏｌｉｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または他の市販のシーケンシングシステムを使用して、シーケンシングライブラリーのアンプリコンをシーケンシングする。
【０１１２】
合成技術によるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングは、可逆性のダイターミネーターに基づく。まず、ＤＮＡ分子を、表面上のプライマーへと接合させ、局所的なクローンコロニーを形成するように増幅する（ブリッジ増幅）。４種類の、可逆性ターミネーター塩基（ＲＴ塩基）を添加し、組み込まれなかったヌクレオチドを洗い落とす。パイロシーケンシングと異なり、ＤＮＡは、一度に１つのヌクレオチドだけを伸長させることができる。カメラにより、蛍光標識されたヌクレオチドの画像を撮影し、次いで、末端の３’ブロッカーと共に、色素を、ＤＮＡから化学的に除去し、次のサイクルを可能とする。
【０１１３】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）システムとは、ヌクレオチド組込みの副産物として生成する水素イオンを検出することにより核酸鋳型をシーケンシングする、イオンベースのシーケンシングシステムである。イオンセンサーは、Ｈ＋イオンの存在または溶液ｐＨの変化を感知しうる、イオン感受性の検出層へとカップリングさせた電界効果トランジスター（ＦＥＴ）を含む。イオンセンサーは、その大きさが、それぞれのウェル内または反応チャンバー内のＨ＋イオン濃度と相関する電圧変化として表されうる、ヌクレオチドの組込みを指し示す、アウトプットシグナルをもたらす。異なるヌクレオチド型は、逐次的に反応チャンバーへと流入し、ポリメラーゼにより、伸長するプライマー（または重合化部位）へと、鋳型の配列により決定される順序で組み込まれる。各ヌクレオチドの組込みは、同時的な局所的ｐＨの変化と共に、反応ウェル内のＨ＋イオンの放出を伴う。Ｈ＋イオンの放出は、センサーのＦＥＴにより記録され、これは、ヌクレオチド組込みの発生を指し示すシグナルをもたらす。特定のヌクレオチド流の間に組み込まれなかったヌクレオチドは、シグナルをもたらさないであろう。ＦＥＴからのシグナルの振幅はまた、伸長する核酸分子へと組み込まれる、特定の種類のヌクレオチドの数とも相関し、これにより、ホモポリマー領域の分解を可能とする。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（商標）シーケンサーの組成、デザイン、および動作に関するさらなる詳細は、それらの出願の全てが、次世代シーケンシングについてのそれらの開示について、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００９／００２６０８２号；同第２０１０／０１３７１４３号；および同第２０１０／０２８２６１７号において見出すことができる。
【０１１４】
ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤ（商標）（「オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出によるシーケンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」）法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＷＯ０６／０８４１３２Ａ２）は、鋳型核酸のＰＣＲ増幅された断片の、ユニバーサルアダプター配列を介する、磁気ビーズへの接合と、アダプター配列へとハイブリダイズさせたプライマーへの、標識されたプローブのライゲーションを介する、断片配列の後続の検出とに基づく。読出しのためには、４つの蛍光標識された二塩基プローブのセットを使用する。読出しの後、プローブの一部を切断し、ライゲーション、検出、および切断の新たなサイクルを実施する。二塩基プローブを使用するためには、各鋳型配列について、２ラウンドのシーケンシングを実施しなければならない。
【０１１５】
ＰａｃＢｉｏ  ＲＳとは、ゼロモード導波管の特性に基づく、単一分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）プラットフォームである。単一のＤＮＡポリメラーゼ酵素を、鋳型としての単一の分子のＤＮＡと共に、ＺＭＷの底部に固定する。ＺＭＷとは、ＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる、ＤＮＡの単一のヌクレオチドだけを観察するのに十分小さな、照明された観察容量を創出する構造である。４つのＤＮＡヌクレオチドの各々を、４つの異なる蛍光色素の１つへと接合させる。ＤＮＡポリメラーゼにより１つのヌクレオチドが組み込まれると、蛍光タグは切断され、ＺＭＷの観察領域から拡散し、その蛍光は、もはや観察されない。検出器は、ヌクレオチド組込みの蛍光シグナルを検出し、対応する色素の蛍光に従い、塩基コールを下す。
【０１１６】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ（商標）技術では、アレイへと係留されたポリＴオリゴマーにより、断片を捕捉する。各シーケンシングサイクルでは、ポリメラーゼと、単一の蛍光標識されたヌクレオチドとを添加し、アレイをイメージングする。その後、蛍光タグを除去し、サイクルを反復する。
【実施例】
【０１１７】
本開示を、以下の非限定的な実施例により、さらに例示する。
【０１１８】
（実施例１）
精製されたウイルス試料のシーケンシングおよび解析
ＲＮＡの抽出および逆転写：Ｑｉａｇｅｎプロトコールの改定バージョンに準拠して、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、ゲノムＲＮＡを、全ての被験試料から単離する。略述すると、キャリアＲＮＡを伴わない、５６０μｌのＡＶＬ緩衝液（ウイルス溶解緩衝液「Ａ」：カオトロピック洗浄剤溶液）を、１４０μｌの試料へと添加する。試料をボルテックスし、室温（２３°±２℃）で、１０分間にわたりインキュベートする。１００％のエタノール５６０μｌを、試料へと添加し、ボルテックスし、次いで、試料の半分（約６３０μｌ）を、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムへと添加し、６０００×ｇで１分間にわたり遠心分離する。試料の残りをカラムへと添加し、スピンステップを反復する。次いで、カラムを、２つの緩衝液で洗浄する。各々４０μｌずつの溶出緩衝液による二重溶出を、約８０μｌの総最終容量について実施する。全ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計を使用する分光光度法により定量化する。次いで、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してｃＤＮＡを作製するのに、ＲＮＡを使用する。略述すると、９μｌのＲＮＡ、１μｌのオリゴ（ｄＴ）２０プライマー、およびｄＮＴＰを、６５℃で５分間にわたりインキュベートする。インキュベーション後、ｃＤＮＡ合成緩衝液、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴを、試料へと添加し、試料を、５０℃で４５分間にわたりインキュベートし、次いで、８５℃で５分間にわたりインキュベートして、反応を停止させる。ＲＮアーゼＨを、試料へと添加し、３７℃で２０分間にわたりインキュベートする。ｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計を使用する分光光度法により定量化する。次いで、５μｌのｃＤＮＡ産物を使用する、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製のＮＥＢＮｅｘｔ（商標）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して、第２鎖反応を実施する。ｃＤＮＡを、第２鎖合成緩衝液および第２鎖合成酵素ミックスと組み合わせ、１６℃で２．５時間にわたりインキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼ非含有水中に溶出させる。ｄｓｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計を使用する分光光度法により定量化し、短期保管のために、−２０±４℃で保管する。
【０１１９】
ライブラリーの調製：調製されたｄｓｃＤＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００上で、シーケンシングのためのライブラリーを調製する。各元の試料から１つずつのライブラリーを調製する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）製のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴライブラリー調製キットを使用して、ライブラリーを調製する。ｄｓｃＤＮＡの出発総インプットは、１ｐｇ〜１ｎｇの間のインプットｄｓｃＤＮＡを使用する、かつての開発範囲発見の試みに基づき、各ライブラリーにつき１ｎｇずつとする。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴライブラリー調製プロトコールに従い、ライブラリーを調製する。略述すると、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ化学を使用して、各試料を、酵素により断片化し、アダプター配列で同時にタグ付け（ライゲーション）する。工程は、インプットＤＮＡを断片化し、下流の加工における使用のために、断片の末端へと、アダプター配列を付加する。次いで、ライゲーション酵素を中和し、短い１２サイクルの増幅を実施して、バーコードを、各試料の５’末端および３’末端へと付加する。各ライブラリーには、異なるバーコードを割り当てて、解析時に、異なる試料を同定および画定することができる。２ラウンドにわたる、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズによる洗浄を使用して、ＰＣＲ反応物を清浄化し、次いで、ＴＥ緩衝液中に溶出させる。次いで、ライブラリーの各々を、高感度ＤＮＡチップを使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で解析して、ライブラリーの品質および数量について評価する。試料ライブラリーは、短期保管のために、−２０±４℃で保管する。
【０１２０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によるＤＮＡのシーケンシングおよび解析：Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００上で、各試料につき、１つのＲａｐｉｄフローセルを試行する。各フローセルでは、装置上のクラスタリングのために、ライブラリーを変性させ、希釈する。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＳＢＳシーケンシング技術／試薬を使用して、ペアドエンドの２×１５０ｂｐシーケンシングを、ライブラリーの各々について実施する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）ソフトウェアを使用して、結果として得られるデータをデマルチプレックス化し、次いで、解析する。各フローセルは、単一の試料を使用して試行する。全てのシーケンシングされた画分について、ＦａｓｔＱファイルを生成する。データ解析工程の全体的な流れを、図１に記載する。ｓａｍｔｏｏｌｓおよびｍｐｉｌｅｕｐソフトウェアを使用して、アウトプットファイルを、ＳＡＭフォーマットから、ＢＡＭフォーマットへと転換し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒによる検討のために、アウトプットファイルにインデックス付けする。ウイルスのカバレッジを調べ、潜在的な変動について探索するために、ｍｐｉｌｅｕｐを、フラグ（ｆｌａｇ）と共に使用して、各位置の深度を増大させる。
【０１２１】
Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴによるライブラリーの調製には、１２サイクルのＰＣＲによる前増幅が要求されるので、所与の位置におけるウイルス配列改変体をコールするための閾値を、２１２＝４０９６リードまたはリードのうちの０．１％のいずれか大きい方と確立する。改変体は、以下の基準に従い規定する：所与の塩基位置におけるシーケンシング深度が、４，０９６，０００と等しいかまたはこれを超える場合は、０．１％を超えての潜在的な変動をコールし；深度が、４，０９６，０００未満であるが、４０９６を超える場合は、頻度が４０９６を超える改変体をコールし；所与の塩基位置におけるカバレッジの深度が、４０９６リード未満である場合は、それらが１．０％超からなれば、潜在的な改変体をコールする。さらなるシーケンシングの試み（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）またはサンガー）が要求される前には、塩基位置１カ所当たりの最小のリードカバレッジは、４回（規制による最小回数）に設定する。
【０１２２】
Ｂｏｗｔｉｅ（短いリードの基準アライナ−（ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｅｒ））を使用して、リードを、各試料について、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの基準配列へとアラインメントする。各試料について、総塩基数、カバレッジ、および平均リード長、ならびに基準へとアラインメントされたリードのパーセントの値を計算し、アッセイの妥当性についてあらかじめ確立された規格と比較する。推定カバレッジは、シーケンシングされた全塩基を求め、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの基準配列のサイズ（７３０３塩基対）で除することにより見出す。各試料について基準にわたる場所と比較したカバレッジのプロットのほか、各試料について試料のリード長のプロットも作成する。解析を実施して、各試料中の、基準配列と比較した場合の改変体を調べる。各ウイルスロットのうちの５’末端（１〜３４位の塩基）では、多型レベルの上昇が予測（および観察）されるが；ポリオウイルスゲノムのこの領域（ＶＰｇ結合性領域およびＶＰｇ  Ｓｔｅｍ  ａ／ｂ領域）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、高度な配列の変異性を呈する。アラインメントされていないリード配列は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｎにより解析して、それらの同一性を決定することができ；アラインメントされていないリード、とりわけ、非精製ウイルス試料に由来する、アラインメントされていないリードは、Ｖｅｒｏ宿主細胞のゲノムＤＮＡ配列またはミトコンドリアＤＮＡ配列に由来することが予測されるが、ヒトＤＮＡまたは他の実験室夾雑ＤＮＡ配列も観察されうる。
【０１２３】
（実施例２）
粗ウイルス試料および非精製ウイルス試料のシーケンシングおよび解析
ＲＮＡの抽出および逆転写：キャリアＲＮＡを添加せずに、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ抽出キットを使用して、ウイルスＲＮＡを、被験試料の各々から抽出する。抽出には、各試料のアリコートを使用する。非精製ウイルス試料中の核酸の大半（コピー数および質量による）は、宿主細胞のゲノムＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡであるので、これらの干渉分子を除去するには、さらなる精製ステップが必要である。試料中の遊離ＤＮＡの、ＤＮアーゼによる消化であって、ウイルスＲＮＡに影響を及ぼさずに可能となる消化を使用する。その後、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（商標）キットを使用して、マスターウイルスバンク試料から抽出されたＲＮＡのアリコートを、ＤＮアーゼ処理する。
【０１２４】
試料を、２μｌのＴｕｒｂｏ  ＤＮアーゼで処理し、３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、次いで、ＤＮアーゼ不活化試薬で不活化させる。結果として得られる、濃縮されたウイルスＲＮＡを、Ｌｅｉｄｏｓ／ＢＤＰ−ＱＣ「ＰＯ１ＰＲ」ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して定量化する。次いで、ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用する逆転写および第２鎖合成のためのインプットとして使用する。第１鎖合成は、４２℃で９０分間にわたり、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＩＩＡ  ＣＤＳ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅプライマーを使用して実施する。ＰＶＳＲＩＰＯと共に使用すると、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩＡ  Ｏｌｉｇｏは、停滞したＲＴ進行事象から発生するｃＤＮＡのタグ付けを防止するＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩＡ  Ｏｌｉｇｏと共に、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ  ＲＴの５’末端トランスフェラーゼ活性を使用することにより、全長ポリアデニル化ＰＶＳＲＩＰＯ  ＲＮＡ（および夾雑Ｖｅｒｏ  ｍＲＮＡ）配列の回収を改善する。
【０１２５】
次いで、ｃＤＮＡ調製物中に導入したオリゴ−ｄＴおよびＳＭＡＲＴプライマーを使用する長距離ＰＣＲにより、結果として得られる全長ｃＤＮＡを増幅する。次いで、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して、プライマーおよびｄＮＴＰを除去するように、試料を研磨し、Ｑｕｂｉｔ  ２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ上またはＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００分光光度計上で定量化し、ＤＮＡチップを使用するＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で、サイズについて検証する。代替的に、ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳまたはポリオポリプロテインＣＤＳ配列の５’末端をターゲティングする定量的ＰＣＲ反応を使用して、シーケンシングの前に、標的コピー数を決定することができる。
【０１２６】
ライブラリーの調製：２つの異なる調製物に由来するｄｓｃＤＮＡを、ライブラリー調製のための鋳型として使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）製のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用する。各ｄｓｃＤＮＡ試料１ナノグラムずつを使用して、各ライブラリーを調製する。Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）キットは、単一のインキュベーションステップで、インプットを断片化し、アダプターでタグ付けする「タグメンテーション」技術を使用する。次いで、ライゲーション酵素を中和し、各試料を、短い１２サイクルの増幅によりバーコード処理し、次いで、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して精製する。精製後、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップを使用して、各ライブラリーの数量および品質について評価する。
【０１２７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング：次いで、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００装置上のシーケンシングのために使用する。装置は、Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎモードで使用し、各ライブラリーを、１つずつのＲａｐｉｄ  Ｒｕｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ上でシーケンシングする。ライブラリーを変性させ、希釈し、次いで、装置に取り付けられたクラスタリング能力を、クラスター形成のために使用する。ライブラリーは、２×１００ｂｐペアドエンドシーケンシングを使用してシーケンシングする。結果として得られる配列は、全ての塩基にわたり、最小で４回のカバレッジを得なければならないか、またはさらなるサンガーシーケンシングを実施して、これらの領域にわたり、カバレッジを完結させるが、これは、ウイルスのＩＲＥＳドメイン内の強力なＲＮＡ構造のためにＲＴ消耗が生じる、ウイルスの５’側において生じることが予測される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列解析手順は、上記および図１で詳述した、精製ウイルス試料のための手順に従う。ＰＶＳＲＩＰＯ基準配列とのコンセンサスの相同性、塩基位置１カ所当たりのカバレッジ、および、該当する場合、リードのうちの０．１％超または４０９６超のリードにおける不均一塩基について詳述する報告を作成する。
【０１２８】
（実施例３）
サンガーシーケンシング
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）法を使用する、基準配列の任意の塩基対のカバレッジが４シーケンシングリード未満である場合は、サンガーシーケンシングを利用する。適切なカバレッジを欠くゲノムの部分が、ゲノムの５’末端近傍にある場合、Ｒｏｃｈｅ／４５４  ＦＬＸなどの、代替的なＮＧＳ法、および／またはプライマーによる５’側配列の変異性のマスキングを防止するように、リバースプライマーだけを使用する、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ｃＤＮＡの「線形増幅」などの、代替的な前増幅法を含む、いくつかのギャップフィリング法を使用することができる。高サイクル数の線形（非指数関数的）ＰＣＲを利用して、とりわけ、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスの、過少に表われる（低コピーｄｓｃＤＮＡ）超可変性の５’末端における、プライマー配列による、天然ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス配列の上書きを防止する。最後に、これらの手法のいずれも、残りの配列ギャップを首尾よく網羅しない場合は、従来型のＰＣＲに続いて、サンガー蛍光シーケンシングを実施することができる。これらのギャップフィリング法から得られる配列データであって、ＰＶＳＲＩＰＯ基準配列とのコンセンサス配列の相同性と、観察される任意の不均一塩基とを含む配列データを、最終的な報告に組み入れる。
【０１２９】
（実施例４）
妥当性試験についての基準
実施例１および２では、妥当性試験についての基準は、
１．抽出されたＲＮＡが、試料１例当たりの合計が最小で５ナノグラムでなければならないこと；
２．結果として得られるｃＤＮＡが、第２鎖反応における使用のために、試料１例当たりの合計が最小で２ナノグラムでなければならないこと；
３．ライブラリーが、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップを使用して検出可能でなければならず、シーケンシングに適切なサイズ（約３００ｂｐ）であること；
４．所望の領域について、複数回の線形増幅（可変性５’末端の場合）から最小で４回のカバレッジをもたらすように要求される場合、またはウイルスゲノム内の他の箇所の場合、複数のプライマーセットから、最小で４回のカバレッジをもたらすように要求される場合は、サンガーシーケンシングを用いること
を含む。
【０１３０】
実施例１および２では、配列許容基準は、
１．１つのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）フローセルについての総リードが、４５００万以上でなければならないこと；
２．基準へとアラインメントされたリードの百分率が、７５％を超えるものとすること；
３．基準ウイルス配列の平均カバレッジが、１８，０００回以上であること；
４．各塩基が、４回またはこれを超えて網羅されなければならないこと。これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）単独の場合もあり、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）と、サンガーシーケンシングとの組合せの場合もあること
を含む。
【０１３１】
（実施例５）
精製ウイルス試料および粗ウイルス試料に対するＲＴ−ＰＣＲおよびサンガーダイターミネーターシーケンシング
ＲＮＡの抽出および逆転写：承認された手順に従い、２５０μｌの被験試料を、１１２０μｌのＱｉａｇｅｎ  ＡＶＬ緩衝液／キャリアＲＮＡへと添加し、ボルテックスし、室温で１０分間にわたりインキュベートした。試料＋ＡＶＬ緩衝液の半分（６８５μｌ）を、第２のマイクロ遠心チューブへと移し、５６０μｌのエタノール（９６〜１００％）を、各チューブへと添加し、間欠的にボルテックスすることにより、１５秒間にわたり混合し、短時間にわたり遠心分離する。次いで、溶液を、ＱＩＡａｍｐスピンカラムへと添加し、適切な洗浄緩衝液で洗浄し、６０μＬのＡＶＥ緩衝液中に溶出させる。承認された手順に準拠して、分光光度計を使用して、ウイルスＲＮＡを定量化する。次いで、ウイルスＲＮＡを、使用まで≦−６５℃で保管する。
【０１３２】
ＰＣＲ増幅およびシーケンシングプライマーの選択：被験物品のＰＣＲ増幅およびサンガー配列解析のために使用する合成オリゴヌクレオチドは、ＰＶＳＲＩＰＯ基準配列（表２を参照されたい）から導出する。プライマーは、約２５０塩基隔ててアニールし、およそ５０％のＧＣ含量を有し、１８〜２４ｂｐの間の長さとなるようにデザインする。プライマー部位は、ｃＤＮＡの両方の鎖をシーケンシングしたときに、各プライマーの伸長から予測されるリード長に基づき、塩基対１つ当たり４つ（各鎖から２つずつ）またはこれを超えるリードを生成するようにデザインする。
【０１３３】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１３４】
抽出後、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＲＮＡを逆転写（ＲＴ）し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、約１２００塩基の区画内でＰＣＲ増幅する。抽出されたウイルスＲＮＡ約０．１マイクログラムを、２倍濃度の反応ミックス２５μｌ、ならびにフォワードライマーおよびリバースプライマーの各々１０ピコモルずつと組み合わせ、ヌクレアーゼ非含有水で、５０μｌの最終容量とする。承認された手順に準拠して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｃｏｌｕｍｎを使用して、アンプリコンを精製する。ＰＣＲ後に、予測されたサイズのアンプリコンが存在することを検証するために、各ＰＣＲ反応物のアリコートを、アガロースゲル電気泳動により解析し、イメージングのために、臭化エチジウムで染色する。その後、成功したＰＣＲ反応物は、さらなる使用まで、−１８±２℃で保管する。
【０１３５】
蛍光ダイターミネーター化学を使用するサンガーシーケンシング：承認された手順に準拠して、ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ  ｖ１．１  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、被験物品試料およびｐＧＥＭ３Ｚ対照プラスミドについての蛍光ダイターミネーターＤＮＡサイクルシーケンシングを実行する。５倍濃度のＢｉｇＤｙｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．０μｌを、２．０μｌのＲｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｍｉｘ、２μＭのシーケンシングプライマー２μｌ、２０ｎｇの精製ＰＣＲ産物、および精製水と組み合わせて、１０μｌの最終反応容量とする。反応および装置の対照として用いられるｐＧＥＭ３Ｚ対照反応物については、２００ｎｇのｐＧＥＭ３Ｚを、２０ｎｇ（約３．２ｐｍｏｌ）のＭ１３Ｆ−２０陽性対照プライマー（５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’；配列番号７９）によりシーケンシングする。対照反応は、各シーケンシング器具（すなわち、プレート）により実施し、承認された手順に準拠して、ＡＢＩ３１３０ｘｌ上で解析する。承認された手順に準拠して、ＰＴＣ−２２５  Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーを使用して、サイクルシーケンシング反応を実施した。解析の前に、Ｃｅｎｔｒｉｆｌｅｘ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを使用して、シーケンシング反応物を、組み込まれていないダイターミネーター、塩、および低分子量化合物から精製する。承認された手順に従い、ＡＢＩ３１３０ｘｌ  ＤＮＡシーケンサーを使用して、自動式ＤＮＡ配列解析を実行する。キャピラリー電気泳動および検出工程の間に、シーケンシングコンピュータにより、蛍光配列データを、３１３０ｘｌの各チャネルから収集し、解析する。承認された手順に準拠して、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して、生の配列試行データを、「コンティグ」としてもまた公知の、配列の連続配置へとトリミングおよびアラインメントする。次いで、各試料について、コンティグを、ＰＶＳＲＩＰＯ基準配列とアラインメントし、塩基変化部位、インデル部位、ギャップ部位、および多義性（多型）部位の検索を、ＡＢＩソフトウェア、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＢｉｏＥｄｉｔ、ＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒ、および他の配列解析セットからの自動支援を伴って、手作業で行う。
【０１３６】
サンガーベースの方法のための、シーケンシングの許容基準：各シーケンシングプレート上で試行した、ｐＧＥＭ３Ｚ陽性対照シーケンシング反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ３１３０ｘｌ）解析報告により決定される通り、少なくとも５００塩基長のリード（ＬＯＲ）を生成し、配列リードのうちの最初の５００ｂｐについて、２０以上の品質値（ＱＶ）を有さなければならない。プラスミド対照の全体的なシーケンシング品質は、９０％を超えなければならない。
【０１３７】
（実施例６）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯロットのシーケンシング
ＤＮＡの抽出および逆転写：ＡＩＢ  ＳＯＰ  ＭＯＬＢＩＯ０００５０の改定バージョンに準拠して、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、ゲノムＲＮＡを、全ての被験試料から単離した。略述すると、キャリアＲＮＡを伴わない、５６０μｌのＡＶＬ緩衝液を、１４０μｌの試料へと添加した。試料をボルテックスし、室温（２３°±２℃）で、１０分間にわたりインキュベートした。１００％のエタノール５６０μｌを、試料へと添加し、ボルテックスし、次いで、試料の半分（約６３０μｌ）を、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｍｉｎｉカラムへと添加し、６０００×ｇで１分間にわたり遠心分離した。試料の残りをカラムへと添加し、スピンステップを反復した。次いで、カラムを、２つの緩衝液で洗浄した。各々４０μｌずつの溶出緩衝液による二重溶出を、約８０μｌの総最終容量について実施した。ＲＮＡを、ＡＩＢ  ＳＯＰ  ＭＯＬＢＩＯ０００７７に準拠して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計を使用する分光光度法により定量化した。次いで、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してｃＤＮＡを作製するのに、ＲＮＡを使用した。略述すると、７μｌ中に１μｇのＲＮＡ、１μｌのオリゴｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、および水を、６５℃で５分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ｃＤＮＡ合成緩衝液、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴを、試料へと添加し、試料を、５０℃で４５分間にわたりインキュベートし、次いで、８５℃で５分間にわたりインキュベートして、反応を停止させた。ＲＮアーゼＨを、試料へと添加し、３７℃で２０分間にわたりインキュベートした。ｃＤＮＡを、ＡＩＢ  ＳＯＰ  ＭＯＬＢＩＯ０００７７に準拠して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計を使用する分光光度法により定量化した。次いで、合計１００ナノグラムのｃＤＮＡ産物を使用する、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製のＮＥＢＮｅｘｔ（商標）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して、第２鎖反応を実施した。ｃＤＮＡを、第２鎖合成緩衝液および第２鎖合成酵素ミックスと組み合わせ、１６℃で２．５時間にわたりインキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼ非含有水中に溶出させた。ｄｓｃＤＮＡを、ＡＩＢ  ＳＯＰ  ＭＯＬＢＩＯ０００７７に準拠して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計を使用する分光光度法により定量化し、短期保管のために、−２０±４℃で保管した。
【０１３８】
ライブラリーの調製：調製されたｄｓｃＤＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００上で、シーケンシングのためのライブラリーを調製した。各元の試料から、合計１１のライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）製のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴライブラリー調製キットを使用して、ライブラリーを調製した。ｄｓｃＤＮＡの出発総インプットは、調製された各ライブラリーについて異なり、以下：ライブラリー１：１０００ｐｇ、ライブラリー２：７５０ｐｇ、ライブラリー３：５００ｐｇ、ライブラリー４：２５０ｐｇ、ライブラリー５：１００ｐｇ、ライブラリー６：７５ｐｇ、ライブラリー７：５０ｐｇ、ライブラリー８：２５ｐｇ、ライブラリー９：１０ｐｇ、ライブラリー１０：５ｐｇ、ライブラリー１１：１ｐｇの通りであった。ｄｓｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計による定量化に基づき、種々のインプット量に希釈した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴライブラリー調製プロトコールに従い、ライブラリーを調製した。略述すると、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ化学を使用して、各試料を、タグ付けし、酵素により同時に断片化した。工程は、インプットＤＮＡを断片化し、下流の加工における使用のために、断片の末端へと、アダプター配列を付加する。次いで、短い１２サイクルの増幅を実施して、バーコードを、各試料へと付加した。各希釈物には、異なるバーコードを割り当てて、解析時に、異なる試料を分離した。２ラウンドにわたる、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズによる洗浄を使用して、ＰＣＲを清浄化し、次いで、ＴＥ緩衝液中に溶出させた。次いで、ライブラリーの各々を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で解析して、ライブラリーの品質および数量について評価した。ライブラリーは、短期保管のために、−２０±４℃で保管した。
【０１３９】
次世代ＤＮＡ配列解析：Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００上で、各元の試料につき、２つずつのフローセルを試行した。最初のフローセルは、単一のライブラリー：インプットが最高であるライブラリー（ライブラリー１）からなった。第２のフローセルは、等モル濃度で組み合わせた、１１のライブラリー全てを有した。各フローセルでは、装置上のクラスタリングのために、ライブラリーまたはライブラリープールを変性させ、希釈した。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＳＢＳシーケンシング技術および試薬を使用して、ペアドエンドの２×１５０ｂｐシーケンシングを、ライブラリーの各々について実施した。該当する場合は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）ソフトウェアを使用して、結果として得られるデータをデマルチプレックス化し、次いで、解析した。リードを、与えられた基準ゲノム配列であるＰＶＳ−ＲＩＰＯ（配列番号１）へとアラインメントした。全てのシーケンシングされた画分について、ＦａｓｔＱファイルを生成したが、これをドライブに供給し、メールで送付する。２つのレーンに由来するＦａｓｔＱファイルは、単一のデータセットへと組み合わせ、１つの試料として解析した。データ解析工程の全体的な流れを、図１に記載する。ｓａｍｔｏｏｌｓおよびｍｐｉｌｅｕｐを使用して、アウトプットファイルを、ＳＡＭフォーマットから、ＢＡＭフォーマットへと転換し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒでの検討のために、アウトプットファイルにインデックス付けした。ウイルスのカバレッジを調べ、潜在的な変動について探索するために、ｍｐｉｌｅｕｐを、フラグと共に使用して、各位置の深度を増大させた。改変体は、以下の基準に従い規定した：所与の位置におけるシーケンシング深度が、４，０９６，０００と等しいかまたはこれを超える場合は、０．１％を超えての潜在的な変動をコールし；深度が、４，０９６，０００未満であり、かつ、４０９６を超える場合は、頻度が４０９６を超える改変体をコールし；カバレッジの深度が、４０９６未満である場合は、１．０％を超える潜在的な改変体をコールする。最小のリードカバレッジは、４回に設定した。位置のカバレッジが、最小未満であった場合は、その位置について、データを報告しなかった。
【０１４０】
ＰＶＳＲＩＰＯの毒性研究材料である、ロットＬ０６０３００６のシーケンシング結果である、ＱＣ−０５２５４８−０２：
希釈系列：Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（登録商標）ソフトウェアを使用して、リードをデマルチプレックス化した。バーコードを分離した後で、Ｂｏｗｔｉｅ（短いリードの基準アライナ−）を使用して、リードを、基準配列へとアラインメントした。アラインメント統計を、表３および図２に示す。１０００ｐｇのインプットでは、リードのうちの、約８７％が、基準配列へとアラインメントされる。インプット量を減少させたところ、アラインメントされるリードの比率は減少した。１０００ｐｇの試料を使用して、潜在的な夾雑配列を同定するように、さらなる解析を実施した。少数のマッピングされていないリードを、非冗長データベースと比較したところ、多くのヒットは、宿主細胞Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ（Ｖｅｒｏ）のＤＮＡへと帰着した。
【表３】
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【０１４１】
全ての試料を解析して、最小リード長、最大リード長、および平均リード長を決定した（表４）。
【表４】
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【０１４２】
こうして、アラインメントされたリード（すなわち、「ジャンク」のＤＮＡ配列／ランダムなＤＮＡ配列および宿主細胞のＤＮＡ配列を含有するリードと対比した、ウイルス配列を含有するリード）は、ｄｓ−ｃＤＮＡインプットを約５００〜１０００ｐｇとするときにピークに達し、約２５ｐｇのインプットを上回っても、リード長に対する明らかな効果は見られない。
【０１４３】
試料のリード長プロットを、図３に示す。平均リード長は、約１００塩基対である。以下の式を使用して、およそのカバレッジを、ウイルスの全体について計算した。
【化１】
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【０１４４】
希釈系列中に含まれる各画分についての推定カバレッジを、表５に示す。カバレッジは、塩基ごとに変動するので、カバレッジの推定は、次世代シーケンシング実験の真の性格を反映せず、基準配列にわたってのカバレッジを記載するには、さらなる解析を実施した。例示的なカバレッジプロットを、図４に示す。全長カバレッジは、１ｎｇのインプットにより達成した。ウイルスの５’末端は、他の領域よりカバレッジが小さかった。
【表５】
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【０１４５】
単一のインプット実験：単一の１０００ｐｇの試料を使用して、第２のフローセルを試行した。試料中には、１７１，００１，３６９のリードが存在し、これらのうちの８７．２％は、基準配列へとアラインメントされた。推定カバレッジは、７５１，２９４倍であった。
【０１４６】
（実施例７）
Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングを使用して、ＰＶＳＲＩＰＯの７つのロットについて解析したが、これらのうちの３つについては、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、既にシーケンシングした（ウイルスゲノムの約１２００塩基の区画について）後、ＡＢＩ  ３１３０ｘｌシーケンサーによるＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ化学を使用する、サンガー蛍光シーケンシングを施した。初期のＮＧＳ開発の試みは、どの方法が、シーケンシングの前における、逆転写および前増幅に起因する、内在的なエラー率を最小化しながら、最大のカバレッジ深度をもたらすのかを同定することに焦点を絞った。鍵となる基準は、ＰＣＲと、ウイルスゲノムの一部ではない配列をターゲティングするシーケンシングプライマーとを用いることであった。これは、ウイルスｃＤＮＡの断片化に従い選択される、任意のＮＧＳ法のためのアダプタマー（ａｄａｐｔａｍｅｒ）を使用することを意味した。
【０１４７】
かつてのサンガーシーケンシング法は、ＰＣＲの前増幅と、理論上のウイルス配列に由来し、ウイルスｃＤＮＡ配列を直接ターゲティングする、シーケンシングプライマーとを用いた。十分に重複するシーケンシングリードの使用にも拘らず、直接的ＰＣＲおよびシーケンシングプライミングの使用は、使用されるプライマー配列を優先する、強力なバイアスを創出し、プライミング位置における、任意の異種塩基の回収を、有効に妨げる。このバイアス発生効果はとりわけ、重複するリードが単一の方向に限定される、ウイルスｃＤＮＡの最末端において甚だしい。この効果は、逆転写（ＲＴ）のために、オリゴｄＴプライミングを使用する場合であってもなお、ポリアデニル化シグナルを含有するウイルス配列の３’側最末端の回収を不可能とする。この、３’側最末端配列の回収が不可能であることは、配列均一性の増大（すなわち、ホモ多量体のアデニン）と組み合わされた、蛍光シグナルレベルの低減が、この領域内の正確な塩基コールを妨げるためでありうる。
【０１４８】
ウイルスの３’側最末端の回収に対するあらゆる酵素的限界を最小化するのに、ＮＧＳアダプタマー法を使用したが、これは、コンピュータ集約的なデノボのゲノムアセンブリーを要求する。Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムによるディープシーケンシングでは、迅速にアラインメントし、ウイルスゲノムのコンセンサス配列を生成し、塩基改変体を同定するためのガイドとして、７３０３ヌクレオチドの、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＭＶＢ基準配列を用いた。しかし、基準配列の使用を伴わずに生成される、デノボのアラインメントは、ウイルスの３’側最末端を回収し、ウイルスゲノム内に存在する、任意の大型（＞１０ｎｔ）のインデルを同定することが予測される。
【０１４９】
ＰＶＳＲＩＰＯの全てのロットは、２００４年以来、マスターウイルスバンク（シード）ロットであるＬ０４０３００６に由来するサンガー配列を、基準配列として用いている。ＭＶＢ配列は、サンガーシーケンシング法を使用して、供給源プラスミド配列（ロットＬ０４０１０１４）と完全に相同となるように決定した。シーケンシングのために解析されるＰＶＳＲＩＰＯ試料は、４つのカテゴリー（精製プラスミド、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドバンク、粗Ｖｅｒｏ収集物およびＭＶＢロット、ならびに精製ウイルス）に分けられた。４つの試料型に要求される抽出法および調製法は、必然的に異なる。概要を、表６に提示する。
【表６】
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【０１５０】
（実施例８）
結果
ＰＶＳＲＩＰＯ内の塩基の不均一性の場所および程度を解明するために、ディープシーケンシング法を使用した。既に、プラスミド材料およびマスターウイルスバンク材料を含むＰＶＳＲＩＰＯロットについては、サンガーシーケンシングにより解析した（２００３〜２００９年）。代替法として、ＨＴＢ−１５グリオーマ細胞の継代培養およびプラークサンガーシーケンシング法を、２００７〜２００８年に、６つのＰＶＳＲＩＰＯ単離物により行った（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら（２００８年）、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６巻：１８６５〜１８７２頁）。これは、ＰＶＳＲＩＰＯゲノム内の２つの場所（９７および１８２４位）であって、サンガーシーケンシングによる多型塩基を呈する場所だけを同定した（すなわち、全ウイルス集団のうちの約１５％超からなった）。継代後のプラークシーケンシングを含むサンガーシーケンシングにより、ＰＶＳＲＩＰＯ内で観察される、限定的なウイルス配列変動は、ＰＶＳＲＩＰＯが、Ｖｅｒｏ（およびＨＴＢ−１５グリオーマ細胞）内の繁殖時に、ポリオ野生型またはワクチン株について予測されるより安定的であることを指し示した（Ｓａｎｊｕａｎら（２０１０年）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８４巻：９７３３〜４８頁）。しかし、ＰＶＳＲＩＰＯの遺伝子安定性を明確に裏付けるためには、所与のロット内の、個々の（すなわち、低コピーの）ビリオン配列について報告することが可能なディープシーケンシング法が要求されるであろう。市販のディープシーケンシング法の総説については、表７（Ｌｉｕら（２０１２年）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１２：２５１３６４頁）において詳述されている。
【表７】
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【０１５１】
精製ＰＶＳＲＩＰＯ試料中の、ウイルスの短いゲノム長（＜７４００ｎｔ）および高力価（１ｍＬ当たり＞１×１０９  ＴＣＩＤ５０）を踏まえ、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによるアダプタマーライブラリーの調製を、ＰＶＳＲＩＰＯ試料から、高品質リードを、高リード深度と同時に生成する方法として選択した（ＮｅｖｅｒｏｖおよびＣｈｕｍａｋｏｖ（２０１０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７巻：２００６３〜２００６８頁）。
【０１５２】
初期の方法開発活動は、２００４年のＭＶＢロット（Ｌ０４０３００６）および２００６年の非臨床ロットＬ０６０３００６により実施し、残りのロットについて調べる前に、上記で詳述した一般法に、いくつかの改善を施した。ＭＶＢロットで使用したＳＭＡＲＴｅｒ超低コピー法の最適化の結果の１つは、ＲＴ忠実度を改善し、２０１３年のＭＶＢロット試験についての解析で、後に利用される共通のＲＴエラーモチーフを同定することであった。この理由で、ＰＶＳＲＩＰＯのロットＬ０４０３００６およびＬ０６０３００６は、Ｌ０４０３００６  ＭＶＢに由来する他のロットより、低頻度の多型を伴う塩基位置の容量（エラー率）が大きいと考えられる。方法開発に使用された２つのロットについて観察される高度なバックグラウンドにも拘らず、これらのいずれも、他の５つの被験ロットと符合する多型のパターンを裏付ける。
【０１５３】
核酸抽出の概要、およびＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴライブラリーの調製結果を、表８に示す。２つのＭＶＢバンク（Ｌ０４０３００６およびＬ０１３１１００２）はいずれも、これらの試料中に存在する低コピー数と符合する低い抽出質量、ならびにバックグラウンドの宿主細胞由来の核酸の、はるかに高度なレベルを呈する。７つのロット全てについて観察される、ゲノムカバレッジ深度の平均は、２．２×１０５〜１．５×１０６の間の範囲であり、回収されたウイルスＲＮＡの質量に基づく、計算された理論的な最大カバレッジより、およそ１〜２ｌｏｇ小さかった。
【表８】
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【０１５４】
表９で詳述される通り、各ロットについて、１ギガベースを超えてシーケンシングしたところ、多様なロットについての平均リード長は、８８〜１０８ｂｐの間の範囲であった。サンガーにより導出されたＭＶＢ基準配列へとアラインメントされたリードの百分率は、全ての場合において、８５％〜９３％の間であり、アラインメントされていないリードの大多数は、アラインメントされていないリードをランダムに選択したものを使用して、ｎＢＬＡＳＴにより決定される通り、Ｖｅｒｏ細胞のｍｔＤＮＡ配列、ｇＤＮＡ配列、およびｍＲＮＡ配列に対応した。アラインメントされていないリードの小画分は、基準から失われ、なおよりまれな（およびこれまでに観察されていない）ウイルス配列を潜在的に含有し得る、ウイルスの３’側最末端配列であって、ＰＶＳＲＩＰＯ基準配列へとたやすくアラインメントされない、「大型」（＞１０ｎｔ）のインデルを擁しうる３’側最末端配列を表す。任意の大型のインデル（存在する場合）およびＰＶＳＲＩＰＯの３’末端配列の不均一性を同定し、特徴付けるように、コンピュータ集約的な、デノボのウイルスゲノムアセンブリーが追求されている。表９にはまた、各ロットについて、「コールされる改変体閾値」のレベルを超える塩基位置の数も示す（深度が、塩基１つ当たり４０９６リードを超える場合、この閾値は、ＰＶＳＲＩＰＯゲノムの大部分にわたり、０．１％以上である）。
【表９】
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【０１５５】
リード深度が大きなロットであり、とりわけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ法で使用される２つのロットについては、より多数の多型塩基位置が観察される。２つの方法開発ロット（Ｌ０４０３００６およびＬ０６０３００６）を組み入れなければ、残りの５つの被験ロットでは、コールされる改変体塩基位置の数は、２７〜３３１の間の範囲である。ＰＶＳＲＩＰＯ（およびポリオ）ゲノムの５’末端超可変領域は、１〜３４位内にあり、予測される通り、かつ、低リード深度にも拘らず（またはおそらくこのために）、これは、表１０で詳述される通り、最高頻度の塩基改変体および塩基多型を呈する、ウイルスゲノムの領域である。表１０はまた、ＰＶＳＲＩＰＯゲノムの各主要領域内の、多型塩基位置および改変体塩基位置であって、大部分がポリオポリプロテインのコード配列（ウイルスゲノム内の最大のエレメント）内で生じる、多型塩基位置および改変体塩基位置の数を分類する。
【表１０】
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【０１５６】
細胞内におけるウイルス親和性および病原性の変化に最も重要な領域は、ｅＩＦ４Ｇ−リボソーム複合体の結合およびアセンブリーを媒介するＩＲＥＳドメインＶおよびＶＩである。ＰＶＳＲＩＰＯのこの領域内では、解析した７つのロット中、４つにおいて、単一の多型（６１８位における）だけが観察された（表１１）。ロットのうちの３つは、６１８位では、カノニカルのグアニンが、全てのリードのうちの９９．９％超を構成したので、多型であることが見出されなかったのに対し、残りの４つのロットでは、６１８位においてグアニンであるのは、全てのリードのうちの９７％超であった。６１８位において多型を呈する４つのロットは、同一の置換パターン（Ｇ＞＞Ｔ＞Ａ＞Ｃ）を有する。ＭＶＢに由来する４つのロット内の６１８位における多型の観察にも拘らず、親ＭＶＢロット（Ｌ０４０３００６）内またはＬ０９０４０１０臨床ロット内では、６１８位における多型は観察されなかった。この転換が、製造中のウイルスの拡大時の、６１８位における真の配列変異を表すのか、シーケンシング工程時のポリメラーゼ置換の優先部位であるのかは、即座に決定することはできないが、頻度は、前者を示唆する程度に十分に高度（最大で２．６％）である。興味深いことに、６１８位において最大の置換（約２．６％）を呈したＰＶＳＲＩＰＯロットは、非臨床毒性研究ロットである、Ｌ０６０３００６であった。このロットは、ＰＶＳＲＩＰＯの非病原性の表現型および安定的な遺伝子型を裏付けた、かつてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける動物研究および異種移植研究で使用された。表１１で詳述される通り、ＰＶＳＲＩＰＯの１つを超えるロット内では、合計５つの配列変動部位だけが観察されたが、ＭＶＢロット内で見出されるのは、これらのうちの２つだけである。５つの位置の全ては、５’ＵＴＲ  ＩＲＥＳの３５、６０、８０、３４０、および６１８位に位置する。５つの部位の好ましい置換パターンはまた、最も重要な場合を挙げると、独立に生成されたマスターウイルスバンク内に存在する２つの多型部位（３５および６０位）の間にも保存されている。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０１５７】
ＩＲＥＳ（３５〜６２２位）を含有する、ゲノムの５’側半分にわたるリード深度は、ＲＴの消耗およびＩＲＥＳドメインの強力な二次構造のために、平均を下回る。ＲＴ効率に対するこれらの影響にも拘らず、リード深度は依然として、ＩＲＥＳドメイン内の塩基位置１カ所当たりのリード１０３〜１０５の間の範囲にある。興味深いことに、２０１０年のＨＴＢ−１５異種移植研究で同定された２つの多型位置（９７および１８２４位）は、ロットＬ０６０３００６を含む、ＰＶＳＲＩＰＯについての、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングにおいて、多型として同定されなかったことから、それらが、ＨＴＢ−１５異種移植中の継代培養後における、デノボの塩基変異の結果であったことが示唆される。１８２４位は、変異を受けやすいが、また、Ｉｌｌｕｍｉｎａ試料調製時の内部におけるオリゴ−ｄＴプライミング（下記を参照されたい）により部分的にマスキングされる場合もある、内部のホモ多量体のアデニンのストレッチの中に納まる。
【０１５８】
ＰＶＳＲＩＰＯのＩｌｌｕｍｉｎａリード深度は、３’ＵＴＲ（および第１鎖のプライミング部位であるポリＡ部位）から、５’ＵＴＲおよび５’末端における超可変領域へと進むと、急速に低下する（図４および６〜１１）。このカバレッジの降下は、カバレッジ深度の周期的なスパイクとして観察されうるＲＴの停滞のために生じ、かつ、第１鎖の３’側プライミング部位から進む場合のＲＴ消耗により生じる。幸い、ＰＶＳＲＩＰＯは、３’側ポリアデニンシグナルより伸長効率ははるかに低いが、第１鎖合成のための、代替的な内部オリゴ−ｄＴプライミング部位として作用する１８２２〜１８３３位における、１１塩基の内部ポリアデニンのストレッチ（１８３１位における単一のグアニンを介在させる）を含有する。内部ポリアデニン部位の存在は、鍵となるＩＲＥＳドメインを含む、１８２２位の下において、リード深度の約３倍の増大を可能とする。
【０１５９】
１または複数のＰＶＳＲＩＰＯ特異的な、第１鎖のプライマー配列を使用して、ウイルスゲノム内の、約４０００〜約２０００位の下における、リード深度および配列カバレッジを改善することができる。とりわけ、２０１３年のＭＶＢロット内の、高宿主細胞バックグラウンドの存在下における、５’末端近傍のリード深度の急速な減衰のために、いくつかの他の手法を用いて、この領域（１〜約６０位）内のウイルス配列を検証した。まず、ＩＯＮ  ＴｏｒｒｅｎｔおよびＦＬＸによるパイロシーケンシングＮＧＳ法を試みたが、ゲノム内の約３５位の下における深度の改善は最小限のものであった。結局、３’側ＰＣＲプライミング部位を使用する、線形ＰＣＲ「増幅」によってもなお、ＮＧＳ法を使用して、５’側最末端（１０位の下）を、塩基１つ当たりのリードを３超とする深度で、回収することはできなかった。ＰＶＳＲＩＰＯの精製ロットについては、５’末端リード深度の急速な低減が観察されたが、低濃度で、宿主細胞バックグラウンドが高度な、ＭＶＢロットへの影響が、最も重大であった。
【０１６０】
２０１３年のＭＶＢロットである、Ｌ１３１１００２の５’末端における最初の約２０塩基を回収するための代替法として、サンガー法と、ＰＶＳＲＩＰＯ特異的な幾何学的ＰＣＲ増幅プライマーとを使用してシーケンシングした。残念ながら、この手法は、ウイルスｃＤＮＡ試料中に存在する真の配列ではなく、ＰＣＲプライマー配列の回収を結果としてもたらした。この影響は、１位の塩基を、アデニンではなく、チミンとして専ら同定することにもよく表れている。５’側ＰＣＲプライマー内の１位にチミンが存在し、そしてサンガー由来の基準配列内の最初の塩基として間違って同定される。バイアスのないＩｌｌｕｍｉｎａ法および他のＮＧＳ法により、アデニンが、ＰＶＳＲＩＰＯゲノムのｃＤＮＡ内の１位における真の塩基であることが確認されている。約２０００未満の塩基位置をターゲティングする、ＰＶＳＲＩＰＯ特異的第１鎖プライマーの使用は、５’側最末端におけるｃＤＮＡコピー数の改善を可能とし、リード深度を大幅に改善し、収集物、シードストック、およびバンクなど、非精製の低濃度ウイルス試料による補足的なサンガーシーケンシング法の必要をなくす。
【０１６１】
表８は、野生型ポリオについて公表された複製エラー率、ならびにＰＶＳＲＩＰＯのディープシーケンシングにより使用される、多様なポリメラーゼについての推定組込みエラー率を比較する。天然ポリオ塩基の組込みについての推定エラー率が、約９×１０−５〜約９×１０−６であるのに対し、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる増幅およびシーケンシングを伴う２つのＲＴ法についてのエラー率は、０．０５％と等しい約５×１０−４と推定される。したがって、シーケンシング法における塩基組込みエラー率は、感染細胞内の、天然のウイルス複製エラー率の約５〜５５倍エラーしやすいことが予測される。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０１６２】
解析されるＰＶＳＲＩＰＯの７つのロット内の、アラインメントされた配列について観察されたエラー率は、初期方法開発ロットについては、０．１９％〜０．８％の範囲であり、最終的なシーケンシング法を使用するロットについては、０．０１％〜０．０３％の範囲である。非精製ＭＶＢである、ロットＬ１３１１００２と、精製ウイルスロットとの間では、エラー率の明らかな差違は見られなかった。これらのエラー率は一般に、０．０５％でのシーケンシング法について推定される最悪の場合のエラー率を下回るので、観察される低頻度改変体の多くが、実際にはポリメラーゼによる組込みエラーの結果であり、真のウイルス配列変動を表すものではないことを考慮しないわけにはいかない。これは、とりわけ、最適化前の、２００４年のＭＶＢロットおよび２００６年の毒性研究ロットでは、多型塩基が高頻度で観察されていることに基づき、真であると考えられる。１つの興味深い観察は、増大するリード深度の関数として同定される、多型塩基の増大（すなわち、０．１％超の変動）であり；これは、とりわけ、ウイルスゲノムの３’末端（天然ポリオポリメラーゼのＣＤＳと、３’ＵＴＲ領域とを含有する）において明らかである。この領域内の塩基改変体の多くは、ポリメラーゼによる組込みエラーの結果であり、真のウイルス多型ではない可能性が高い。データのさらなる解析であって、シーケンシング法におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合化ステップおよび増幅ステップで、ポリメラーゼによる誤組込み事象を促進する配列モチーフを同定しようとする試みにおいてこれらの改変体をさらに特徴付ける解析が進行中である。
【０１６３】
さらなる情報を、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＭＶＢからの結果を示す図５Ａ〜５ＮＮに提示する。
【０１６４】
考察
Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングにより調べられた、ＰＶＳＲＩＰＯウイルスの７つのロットは、驚くべきことに、塩基１つ当たりの平均リード深度が２×１０５を超えるキメラウイルスゲノムにわたり限定的な配列の微小不均一性を呈した。観察された配列変動は、５’側最末端を例外として、カノニカルの基準配列と比べて、１％未満の総不均一塩基コールからなることが示され、５つの多型位置だけが、ＰＶＳＲＩＰＯの１つを超えるロット内で、反復的に観察された。これらの５つの反復性の不均一位置は全て、ＨＲＶ２  ＩＲＥＳ（３５、６０、８０、３４０、および６１８位）内に位置し、それらの関連する塩基置換パターンは、被験ロットの全てにわたり一貫することが観察された。これは、ＰＶＳＲＩＰＯの臨床ロット内に存在する限定的な変動が、親ＭＶＢロット内に元来存在する変動（すなわち、３５および６０位）に由来するか、またはウイルスの複製時またはｃＤＮＡシーケンシング時における、ポリメラーゼによる誤組込みの優先的な方式を表しうることを指し示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写およびトランスフェクションを介してＭＶＢを生成するのに使用されるプラスミドＤＮＡは、７つのＰＶＳＲＩＰＯロット内で観察される塩基変動パターンの第３の源でありうる。
【０１６５】
ＰＶＳＲＩＰＯについてのＮＧＳは、ＰＶＳＲＩＰＯが、驚異的に安定な一本鎖ＲＮＡウイルスであることを指し示す、かつての解析データおよび神経毒性データの妥当性を確認する。したがって、観察される低レベルの微小不均一性と、その配列変動パターンの、２００４年に製造された第１のＭＶＢに由来する、ＰＶＳＲＩＰＯの初期臨床ロットとの符合を踏まえると、ＰＶＳＲＩＰＯの第２のＭＶＢロット（ロットＬ１３１１００２）の使用の前に、広範なｉｎ  ｖｉｖｏ非ヒト霊長類神経毒性研究を必要としない場合もある。さらなるシーケンシング開発の試み（すなわち、３’ＵＴＲ配列を回収するためのデノボのアセンブリー）は、進行中であるか、またはウイルス配列の鍵となる５’ＵＴＲにおけるカバレッジの深度を改善することが保証されている。野生型ポリオウイルスと比べたＰＶＳＲＩＰＯの固有の特徴は、ＨＲＶ２由来のＩＲＥＳの存在に起因するので、ＮＨＰまたは患者由来の試料を使用する、さらなる投与後ディープシーケンシング研究を使用して、臨床的に意味があるｉｎ  ｖｉｖｏ状況下における、変異率およびＨＲＶ２  ＩＲＥＳ組換えの潜在的可能性を決定することができる。
【０１６６】
本明細書で提示される結果は、将来の臨床研究を比較しうるベースラインを提示する。２０１３年のＭＶＢロットである、Ｌ１３１１００２と、製造時にＶｅｒｏ細胞内で拡大された５つのロットとにおける場合を含めて、ＩＲＥＳ領域内の著明な塩基の不均一性の欠如により、ＰＶＳＲＩＰＯが、遺伝子的に安定であり、十分に特徴付けられたＭＶＢを使用する場合、ウイルスの発現、表現型、および病原性の、ロット間の変化が生じる可能性は低いことが確認されている。
【０１６７】
本開示の原理を適用しうる、多くの可能な実施形態を念頭に、例示される実施形態は、本開示の例であるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして理解すべきではないことを認識されたい。そうではなくて、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神の中に収まる全てを、本発明であると主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図５Ｓ】
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【図５Ｔ】
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【図５Ｕ】
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【図５Ｖ】
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【図５Ｗ】
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【図５Ｘ】
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【図５Ｙ】
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【図５Ｚ】
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【図５ＡＡ】
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【図５ＢＢ】
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【図５ＣＣ】
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【図５ＤＤ】
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【図５ＥＥ】
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【図５ＦＦ】
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【図５ＧＧ】
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【図５ＨＨ】
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【図５ＩＩ】
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【図５ＪＪ】
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【図５ＫＫ】
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【図５ＬＬ】
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【図５ＭＭ】
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【図５ＮＮ】
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【図５ＯＯ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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