(57)【要約】  本発明は、遺伝子治療用のレンチウイルスベクター(LV)の製造の分野に関する。より詳細には、本発明は、自己不活性化(SIN)レンチウイルストランスファーベクターのパッケージング細胞株への安定した組み込みを得るためのシステムに関する。SINレンチウイルストランスファーベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)の末端逆位反復配列(ITR)を含むDNAフラグメントを使用して組み込まれ、それにより、SINレンチウイルスベクターの安定な産生細胞株が得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SINレンチウイルストランスファーベクターのパッケージング細胞株への安定した組み込みのためのシステムであって、5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントからなる、システム。
【請求項２】
前記SINレンチウイルストランスファーベクターが、5'位置に、U3セグメントがCMVプロモーターによって置換されているレンチウイルスLTR、並びに3'位置に、レンチウイルスLTRのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含む、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ゼオシン(登録商標)耐性遺伝子である、請求項1又は2に記載のシステム。
【請求項４】
前記耐性遺伝子の発現を調節するプロモーターが、CMVプロモーターである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
SINレンチウイルスベクターの産生細胞株を得るための方法であって、
i.5'末端から開始して、アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)、SINレンチウイルストランスファーベクター、抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター、抗生物質耐性遺伝子及びアデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)を含むDNAフラグメントを調製すること、
ii.そのようなDNAフラグメントをレンチウイルスベクター用のパッケージング細胞株にトランスフェクトすること、
iii.前記抗生物質の存在下においてその細胞を培養することによって前記産生細胞株を選択すること
を含む、方法。
【請求項６】
前記SINレンチウイルストランスファーベクターが、5'位置に、U3セグメントがCMVプロモーターによって置換されているレンチウイルスLTR、並びに3'位置に、レンチウイルスLTRのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記システムに用いられる抗生物質耐性遺伝子が、ゼオシン(登録商標)耐性遺伝子である、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項８】
前記抗生物質耐性遺伝子の発現を調節するプロモーターが、CMVプロモーターである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記パッケージング細胞株が、そのゲノムにレンチウイルスのgag/pol、レンチウイルスのrev及びエンベロープタンパク質を含む宿主細胞株から得られる安定なパッケージング細胞株である、請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記パッケージング細胞株が、ゲノムに安定して組み込まれたレンチウイルスtatをさらに含む、請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞株が、HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080又はHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項１２】
env遺伝子が、VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、キメラエンベロープタンパク質RD114-TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64 env若しくはGALV env又はそれらの派生物から選択される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項5〜12のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる産生細胞株。
【請求項１４】
5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントの少なくとも1コピーをそのゲノム中に含む産生細胞株。
【請求項１５】
SINレンチウイルスベクターを製造する方法であって、5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントの少なくとも1コピーをそのゲノム中に含む産生細胞株を培養することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療用のレンチウイルスベクター(LV)の製造の分野に関する。より詳細には、本発明は、自己不活性化(Self Inactivating)(SIN)レンチウイルストランスファーベクターのパッケージング細胞株への安定した組み込みを得るためのシステムに関する。SINレンチウイルストランスファーベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)の末端逆位反復配列(ITR)を含むDNAフラグメントを使用して組み込まれ、それにより、SINレンチウイルスベクターの安定な産生細胞株が得られる。
【背景技術】
【０００２】
10年を超える研究及び開発により、遺伝子治療におけるHIVベースのレンチウイルスベクター(LV)技術の有効性及び安全性が劇的に高められてきた。臨床における安定なLVパッケージング細胞の実現は、製造コストを低減するため並びにベクターの全体的な品質及び安全性を向上させるために必須のマイルストーンである。今までのところは、いくつかの戦略は、基本的に、パッケージング遺伝子の送達、すなわち、プラスミド対組み込み型ベクターが異なり、また偽型エンベロープの異なる性質が異なる、安定なLVパッケージング細胞を生成してきた。レンチウイルスの構造タンパク質及び調節タンパク質並びに好適なエンベロープタンパク質を含む安定なパッケージング細胞株が一旦得られたら、目的の遺伝子を組み入れたトランスファーベクターをその細胞株のゲノムに組み込むことが必要である。得られた安定な細胞株は、産生細胞株と呼ばれる。産生細胞株は、目的の遺伝子を含むレンチウイルスベクターの製造のための決定的な安定したツールである。
【０００３】
原則として、外来遺伝子の標的細胞のゲノムへの安定した組み込みを可能にするいくつかの組み換えシステムが存在するが、複合遺伝子又は発現システムの場合、その組み込みと最終的な発現カセットの機能性を可能にする適切な遺伝子送達媒体を構築することが必要である。これは、自己不活性化レンチウイルスベクター(SIN)の産生細胞株の開発に関して特に重要である。この種のベクターでは、レンチウイルスの3'LTRからのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失は、結果として、標的細胞の感染の際にベクター長のRNAを転写することができないベクターを形成する。この改変のため、組み込まれたSINベクターはさらなる複製を行うことができず、それにより複製可能なウイルスを生成する可能性並びに近傍の内在性プロモーターの転写活性に意図しない影響を及ぼす危険性を低減させる。その構造のため、SINトランスファーベクターのパッケージング細胞株への導入は、その不活性化により欠失が機能性トランスファーベクターの組み込みに不適合という結果を生じるウイルス形質導入の従来の方法では達成できない。
【０００４】
この課題を克服するために、Xuらは、2001年に3'LTR U3転写調節エレメントを誘導性プロモーター(Tet応答性エレメント(Tet-responsive element))で置き換えた条件付きSINトランスファーベクターを開発した。この種のシステムは、課題を解決することができるが、LTRは基礎レベルの発現を保持し得るため、それはベクター設計における妥協である。
【０００５】
非レトロウイルス法による完全なSINトランスファーベクターの安定した組み込みを得るために可能な方法の1つは、ベクタープラスミドと選択可能な薬剤耐性プラスミドのコトランスフェクションである(Ikedaら、2003年)。このシステムは、組み込み及び組み込み体の安定性の両方に関して有効でない結果を生じる。Thromらは、2009年にコンカテマーアレイトランスフェクション(concatemeric array transfection)により完全なSINトランスファーベクターがゲノムに安定して組み込まれている産生細胞株を開示している。そのようなアレイは、SINトランスファーベクターゲノムをコードするDNAフラグメントの、アレイに含まれる薬剤耐性カセットとのライゲーションにより得られる。開示されている方法が産生細胞株の開発に有効な結果となるとしても、このシステムは、アレイ形成のさらなるステップを含み、したがって、これが技術にさらなるレベルの複雑さを加える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
有効な産生細胞株を得るために、完全なSINトランスファーベクターゲノムを安定なパッケージング細胞株に組み込むためのより簡単な方法を開発する必要性がある。本発明は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨
本発明は、自己不活性化レンチウイルスベクター(SIN LV)の製造の分野に関する。遺伝子送達媒体としてSIN-LVを使用したいくつかの遺伝子治療臨床試験が進行中である。安全性の理由から、この種のベクターは、臨床試験において最適なベクターと見なされているはずである。臨床試験の大部分において、SIN LVの製造は、依然として一過性のプロトコルに基づいている。SIN LVの安定な産生細胞株の開発のために解決すべき重要な問題の1つは、SINトランスファーベクターの安定した組み込みを可能にする単純なシステムの開発である。
【０００８】
本発明は、レンチウイルスSINトランスファーベクターを、既にレンチウイルス構造タンパク質(gag/pol)、調節タンパク質rev、及び最適なエンベロープタンパク質を含むパッケージング細胞株のゲノムに組み込むための新しい戦略を提供する。
【０００９】
そのような戦略は、少なくともSINトランスファーベクター及びレンチウイルス3'LTRの下流に位置し、独立したプロモーターによって発現させられる抗生物質耐性遺伝子を含む複合構築物に隣接する5'及び3'末端に、アデノ随伴ウイルス(AAV)の末端逆位反復配列(Inverted Terminal Repeats; ITR)を含むDNAフラグメントのトランスフェクションに基づく。
【００１０】
上記のDNAフラグメントを、レンチウイルス構造構成要素(gag/pol)及び調節(rev)構成要素、並びにエンベロープタンパク質を含むパッケージング細胞株に単にトランスフェクトすることによって、SIN LVに効果的な安定な産生細胞株を得ることができた。
【００１１】
本発明の記載
本発明の第1の態様によると、SINレンチウイルストランスファーベクターのパッケージング細胞株への安定した組み込みのためのシステムであって、そのようなシステムが、5'末端から開始して、以下のエレメント:
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントからなる、システムが提供される。
【００１２】
一実施形態において、SINレンチウイルストランスファーベクターは、5'位置にレンチウイルス長鎖末端反復配列(LTR)全体並びに3'位置にレンチウイルスLTRのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含む。
【００１３】
別の実施形態において、SINレンチウイルストランスファーベクターは、5'位置にU3セグメントがプロモーターによって置換されているレンチウイルスLTR並びに3'位置にレンチウイルスLTRのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含む。置換プロモーターは、CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α SFFV及びRSVから選択され、そのプロモーターは、CMV IEプロモーターがより好ましい。
【００１４】
システムに用いられる抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン又はゼオシン(Zeocin)(登録商標)耐性遺伝子から選択され、好ましくは、ゼオシン(登録商標)耐性遺伝子である。CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α SFFV及びRSVから選択されるプロモーターは、耐性遺伝子の発現を調節し、そのプロモーターは、SV40プロモーターが好ましい。
【００１５】
本発明の別の態様において、SINレンチウイルスベクターの産生細胞株を得るための方法であって、
1)5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントを調製すること、
2)そのようなDNAフラグメントをレンチウイルスベクター用のパッケージング細胞株にトランスフェクトすること、
3)抗生物質の存在下においてその細胞を培養することによって産生細胞株を選択すること
を含む、方法が提供される。
【００１６】
一実施形態において、SINレンチウイルストランスファーベクターは、5'位置に、レンチウイルス長鎖末端反復配列(LTR)全体、並びに3'位置に、レンチウイルスLTRのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含む。
【００１７】
別の実施形態において、SINレンチウイルストランスファーベクターは、5'位置に、U3セグメントがプロモーターによって置換されているレンチウイルスLTR、並びに3'位置に、レンチウイルスLTRのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含む。置換プロモーターは、CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α SFFV及びRSVから選択され、そのプロモーターは、CMV IEプロモーターがより好ましい。
【００１８】
システムに用いられる抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン又はゼオシン(登録商標)耐性遺伝子から選択され、好ましくは、ゼオシン(登録商標)耐性遺伝子である。CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α SFFV及びRSVから選択されるプロモーターは、耐性遺伝子の発現を調節し、そのプロモーターは、SV40プロモーターが好ましい。
【００１９】
パッケージング細胞株は、そのゲノムにレンチウイルスのgag/pol、レンチウイルスのrev及びエンベロープタンパク質を含む宿主細胞株から得られる安定なパッケージング細胞株が好ましい。さらなる実施形態において、パッケージング細胞株は、細胞のゲノムに安定して組み込まれたレンチウイルスtatをさらに含む。
【００２０】
宿主細胞株は、好ましくはHEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080又はHeLaから選択されるヒト細胞株であり、より好ましくはその細胞株は、HEK293-Tである。
【００２１】
env遺伝子は、VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、キメラエンベロープタンパク質RD114-TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64 env若しくはGALV env又はそれらの派生物から選択され、より好ましくはenv遺伝子は、RD114-TRをコードする遺伝子である。
【００２２】
本発明のさらなる態様において、上記方法によって得ることができるSINレンチウイルスベクターの産生細胞株が提供される。
【００２３】
本発明の追加の態様において、5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントの少なくとも1コピーをそのゲノム中に含む産生細胞株が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様において、SINレンチウイルスベクターを作製するための方法であって、5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントの少なくとも1コピーをそのゲノム中に含む産生細胞株を培養することを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】(a)SIN-GFP TVの模式図。略語・・AAV-ITR: アデノ随伴ウイルス末端逆位反復配列; CMV: サイトメガロウイルスプロモーター; ΔU3: 欠失したU3; RRE: rev応答性エレメント; SD: スプライスドナー; SA: スプライスアクセプター; Ψ: パッケージングシグナル; WPRE: ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント; cPPT: セントラルポリプリントラクト; SV40-P: サルウイルス40プロモーター; zeoR: ゼオシン耐性遺伝子。(b、c)SIN-RD114-TR LVの模式図である。略語・・CMV: サイトメガロウイルスプロモーター; ΔU3: 欠失したU3; IN: イントロン; BGI: ウサギベータ-グロビンイントロン; RRE: Rev応答性エレメント; A: ポリA配列; IRES: 配列内リボソーム進入部位; SD: スプライスドナー; SA: スプライスアクセプター; Ψ: パッケージングシグナル; WPRE: ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント; cPPT: セントラルポリプリントラクト。
【図２】産生細胞及び対応するLV中のベクタータンパク質の分析。RD3-MolPack24(a)及びRD2-MolPack64(b)産生細胞から、並びにウイルス粒子を含む対応する上清(100ng p24Gag/サンプル)から得た、細胞抽出物(35μg/サンプル)のウエスタンブロット分析。この膜を、抗HIVヒト血清と、及び示した抗Rev、抗Tat及び抗RD114-TR特異的抗体と、並びに取り除いた後、抗アクチン抗体と、連続的にハイブリダイズさせた。アスタリスク(*)は、非特異的なバンドを示す。
【図３】RD3-MolPack24又はVSV-G偽型化SIN-GFP-zeo LVのいずれかによる活性化末梢血Tリンパ球の形質導入効率。(a)PBMC全体をCD3/CD28 Dynabeadsにより48時間にわたり予め活性化し、IL-7及びIL-15の存在下において培養した。Tリンパ球を、その後、示したMOIでRD3-MolPack24 LVにより形質導入し、形質導入の6日及び14日後、GFP発現をFACS分析により評価して、形質導入効率を算出した。(b)組み込まれたベクターのパッケージング(Ψ)シグナル及び対照としてゲノムテロメラーゼ遺伝子を認識する特異的なプライマー・プローブセットを使用したQ-PCRによるパネルa)のTリンパ球中のSIN-GFP-zeo VCNの定量。(c)PBMCを(a)のようにして予め活性化した後、RD3-MolPack24 LV又はSIN-GFP-zeo TVを担持するVSV-G偽型化LVのいずれかの36ngのp24Gag等価物により形質導入した。形質導入の6日及び14日後、GFP発現をFACS分析により評価した。(d)(b)に記載されているようなパネルc)のTリンパ球中のSIN-GFP-zeo VCNの定量。結果は、n=3の独立した実験の平均±標準誤差である。*p≦0.05、**p≦0.01。
【図４】RD3-MolPack24又はVSV-G偽型化SIN-GFP-zeo LVのいずれかによる活性化末梢血Tリンパ球サブセットの形質導入効率。(a)末梢血単核細胞(PBMC)全体をCD3/CD28 Dynabeadsにより48時間にわたり予め活性化し、IL-7及びIL-15の存在下において培養した。Tリンパ球を、その後、RD3-MolPack24 LVの36ng p24Gag等価物により形質導入し、形質導入の6日後、FACS分析により、CD3+/CD8+及びCD3+/CD8- T細胞サブセットにおける(a)、並びにCD3+/CD8+及びCD3+/CD8- T細胞サブセットのメモリーT細胞亜集団(c)及び(d)におけるGFP発現を評価した。(b)LV及び模擬(mock)形質導入細胞におけるCD3+/CD8+及びCD3+/CD8- T細胞サブセットの相対頻度。(e及びf)LV及び模擬(mock)形質導入細胞のCD3+/CD8+(e)又はCD3+/CD8- T細胞サブセット(f)のいずれかにおけるセントラルメモリーT細胞(TCM)、ステムセルメモリーT細胞(TSCM)、エフェクターメモリーT細胞(TEM)及びエフェクターメモリーT細胞RA+(TEMRA)の相対頻度。結果は、n=4の独立した実験の平均±標準誤差である(形質導入の6日後)。*p≦0.05、**p≦0.01。
【図５】MOI 25でのRD3-MolPack24又はVSV-G偽型化SIN-GFP-zeo LVのいずれかによる活性化PB Tリンパ球の形質導入効率。(a)PBMC全体をCD3/CD28 Dynabeadsにより48時間にわたり予め活性化し、IL-7及びIL-15の存在下において培養した。Tリンパ球を、その後、MOI 25で、RD3-MolPack24 LV、又はSIN-GFP-zeo TVを担持するVSV-G偽型化LVにより形質導入し、形質導入の6日及び14日後、GFP発現をFACS分析により評価して、形質導入効率を算出した。(b)組み込まれたベクターのパッケージング(Ψ)シグナル及び対照としてゲノムテロメラーゼ遺伝子を認識する特異的なプライマー・プローブセットを使用したQ-PCRによるパネルa)のTリンパ球中のSIN-GFP-zeo VCNの定量。結果は、n=3の独立した実験の平均±標準誤差である。
【図６】MOI 25での、RD3-MolPack24又はVSV-G偽型化SIN-GFP-zeo LVのいずれかによる活性化PB Tリンパ球サブセットの形質導入効率。(a)PBMC全体をCD3/CD28 Dynabeadsにより48時間にわたり予め活性化し、IL-7及びIL-15の存在下において培養した。Tリンパ球を、その後、MOI 25でRD3-MolPack24 LVにより形質導入し、形質導入の6日後、FACS分析により、CD3+/CD8+及びCD3+/CD8- T細胞サブセットにおける(a)、並びにCD3+/CD8+及びCD3+/CD8- T細胞サブセットのメモリーT細胞亜集団(c)及び(d)における、GFP発現を評価した。(b)LV及び模擬(mock)形質導入細胞におけるCD3+/CD8+及びCD3+/CD8- T細胞サブセットの相対頻度。(e及びf)LV及び模擬(mock)形質導入細胞のCD3+/CD8+(e)又はCD3+/CD8- T細胞サブセット(f)のいずれかにおけるセントラルメモリーT細胞(TCM)、ステムセルメモリーT細胞(TSCM)、エフェクターメモリーT細胞(TEM)及びエフェクターメモリーT細胞RA+(TEMRA)の相対頻度。結果は、n=3の独立した実験の平均±標準誤差である。
【図７】RD3-MolPack24及びRD2-MolPack64細胞のLV産生及び細胞代謝の定量。標準的なT25フラスコにおける4日及び7日の培養後の細胞数(a)当たり及び(b)体積当たりで正規化したLV産生の分析。示した時点における(c)細胞数及び(d)生存率。示した時点における(e)デキストロース消費及びラクテート産生。(f)示した時点における懸濁液中の生細胞。**p≦0.01。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の好適な特徴及び実施形態の詳細な説明を、非限定例により説明する。
【００２７】
本発明は、別に指示がある場合を除いて、化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNA及び免疫学の従来の技法を使用する当業者が実施することができる。そのようなすべての技法は公開された文献に開示され、説明されている。例えば、J. Sambrook、E. F. Fritsch、及びT. Maniatis、1989年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Second Edition、Books 1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel、F.M.ら(1995年及びperiodic supplements;Current Protocols in Molecular Biology、9、13、及び16章、John Wiley & Sons、New York、N.Y.);Current Protocols in Immunology、12章、John Wiley & Sons、New York、N.Y.);B. Roe、J. Crabtree、及びA. Kahn、1996年、DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques、John Wiley & Sons;J. M. Polak及びJames O' D. McGee、1990年、In Situ Hybridization: Principles and Practice;Oxford University Press;M. J. Gait (編集者)、1984年、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach、IrI Press;並びに、D. M. J. Lilley及びJ. E. Dahlberg、1992年、Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology、Academic Pressを参照。
【００２８】
SINトランスファーベクターの組み込みのためのシステム
本発明は、自己不活性化型(SIN)レンチウイルスベクターの製造に必要な安定な産生細胞株を得るための新しい戦略を提供する。本明細書中で使用される場合、安定な産生細胞株という用語は、少なくとも1コピーのレンチウイルストランスファーベクターが導入され、ゲノム中に安定して組み込まれているレンチウイルスベクター用のパッケージング細胞株を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、パッケージング細胞株という用語は、そのゲノムにレンチウイルス構造タンパク質gag/pol、レンチウイルス調節タンパク質rev、及び目的のエンベロープタンパク質を含む宿主細胞株を意味する。好ましくは、エンベロープタンパク質は、VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、キメラエンベロープタンパク質RD114-TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64 env又はGALV envからなる群から選択される。任意に、パッケージング細胞株は、そのゲノムに安定して組み込まれるレンチウイルスタンパク質tatをさらに含んでもよい。
【００３０】
「レンチウイルストランスファーベクター」という用語は、少なくとも、ビリオンへのパッケージングのために必要なレンチウイルス配列(すなわち:プサイシグナル)及び形質導入細胞のゲノムへの組み込みのために必要なレンチウイルス配列(すなわち:5'及び3'長鎖末端反復配列、LTR)に隣接する目的の遺伝子を含む構築物を意味する。より詳細には、レンチウイルストランスファーベクター構築物は、5'末端から開始して少なくとも以下の構成要素を含むDNAフラグメントである:レンチウイルス5'LTR、スプライスドナー部位(SD)、パッケージング配列(プサイ、Ψ)、末端切断型gag配列、及びレンチウイルスのRev応答性エレメント(RRE)、スプライスアクセプター部位(SA)、独立したプロモーターによって発現が調節される目的の遺伝子、並びにレンチウイルス3'LTR。任意に、トランスファーベクター中に、WPRE又はセントラルポリプリントラクト(central polypurine tract; cPPT)などの追加のエレメントが含まれてもよい。任意に、トランスファーベクターの5'LTRは、第3世代のレンチウイルスベクターを得るために5'LTRのU3領域がCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α SFFV及びRSVから選択される構成型プロモーターによって置換されるような方法で改変されてもよい。
【００３１】
本発明により開発されるシステムは、レンチウイルスのエンハンサー配列及びプロモーター配列が欠失した3'LTRを含むことを特徴とするいわゆるSINレンチウイルスベクターの安定した製造を目的とする。特定の実施形態において、SINレンチウイルスベクターは、Zuffreyら、1998年に開示されているとおり3'LTRに400ヌクレオチドの欠失を含む。自己不活性化は、逆転写の過程でプロウイルスDNAの5'LTRに写し取られ、それにより、形質導入細胞に組み込まれたウイルスゲノムがさらに転写されることをできないようにするこの欠失の存在に、依存する。
【００３２】
SINレンチウイルスベクターの製造には、3'LTRにレンチウイルスのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を含むトランスファーベクターの使用が必要である。この構造のため、SINトランスファーベクターのパッケージング細胞株への導入は、不活性化欠失により結果として機能性トランスファーベクターの組み込みへの不適合を生ずるウイルス形質導入の従来の方法では達成できない。
【００３３】
本発明は、安定な産生細胞株を得るためのSINトランスファーベクターのパッケージング細胞株のゲノムへの効率的な組み込みのための新しいシステムを提供する。このシステムは、5'末端から開始して、
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントからなる。
【００３４】
DNAフラグメントは、直鎖状であっても、又は環状であってもよい。
【００３５】
DNAフラグメントは、上記の構成要素を含むプラスミドの直鎖化によりもたらされてもよい。或いは、DNAフラグメントは、2つのAAV-ITRの間の配列のみを含んでもよい。
【００３６】
AAV ITRの存在は、パッケージング細胞株のゲノムへの安定した組み込みを可能にする。抗生物質耐性遺伝子は、レンチウイルスLTRの外、特にレンチウイルス3'LTRの下流に位置する。この構成により、抗生物質耐性遺伝子を最終的なウイルスベクターに組み入れることなく、外来遺伝子が安定して組み込まれている細胞クローンを選択することが可能である。
【００３７】
さらなる実施形態において、SINレンチウイルスベクターの安定な産生細胞株を得るための方法であって、
1)5'末端から開始して、少なくとも以下の構成要素：
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントを調製すること、
2)そのようなDNAフラグメントをレンチウイルスベクター用のパッケージング細胞株にトランスフェクトすること、
3)抗生物質の存在下においてその細胞を培養することによって産生細胞株を選択すること
を含む、方法が提供される。
【００３８】
いくつかのタイプのパッケージング細胞株が当該技術分野において開示されてきたが、これらは、レンチウイルス構造タンパク質gag/pol、調節タンパク質rev並びにエンベロープタンパク質の組み込みシステムに関してのみ互いに異なる。例えば、WO04/22761は、ガンマレトロウイルスベクターによる形質導入によってレンチウイルス構造タンパク質が宿主細胞に組み込まれているパッケージング細胞株を開示しているが、Thromら、2009年は、SINガンマレトロウイルスベクターを使用している。WO2012/028681では、バキュロAAVハイブリッドベクターに組み入れられた2つの独立した発現カセットを含む複合構築物を使用してgag/pol及びrevの組み込みが得られ、WO2013121194では、レンチウイルスgag/polは部位特異的組み換えによって組み込まれる。安定なパッケージング細胞株のこれらすべての例は、SINレンチウイルストランスファーベクターとそれに続く抗生物質耐性遺伝子を伴う発現カセットを含む本発明に係るDNAフラグメント(このフラグメントの両側にAAV ITRが隣接している)をトランスフェクトすることによって安定な産生細胞株を得るために、使用することができる。
【００３９】
追加の実施形態において、5'末端から開始して、少なくとも以下の構成要素：
i.アデノ随伴ウイルスの末端逆位反復配列(AAV ITR)
ii.SINレンチウイルストランスファーベクター
iii.抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する構成型プロモーター
iv.抗生物質耐性遺伝子
v.アデノ随伴ウイルスの内部末端反復配列(AAV ITR)
を含むDNAフラグメントの少なくとも1コピーをそのゲノム中に含むSINレンチウイルスベクターの産生細胞株が提供される。
【実施例】
【００４０】
実施例I: いくつかのRD3-MolPack-SIN-GFP産生細胞の誘導
WO2012028681に開示されているパッケージング細胞株RD-MolPackから開始して産生細胞株RD3-MolPack-SIN-GFPを得た。簡単にいえば、キメラバキュロAAVベクターによりすべてのベクター遺伝子:第1のHIV-1 gag、pol、rev及びハイグロマイシン耐性遺伝子を、トレースされたHEK-293T細胞に連続的に投入し、それによりPK-7というクローンを得ることによってRD-Molpackパッケージング細胞株を得たrd114-tr遺伝子をその後、SIN-LV送達によってPK-7細胞に導入した。詳細には、rd114tr遺伝子の効率的な形質導入を得るために、PK-7細胞に、SIN-RD114-TR-IN及びSIN-RD114-TR-IN-RREトランスファーベクター(図1b及び図1c)を含むVSV-G偽型化一過性誘導LVを用いて形質導入して、異なるRD3-MolPackパッケージング細胞を生成した。2〜3週間のピューロマイシン選択及びいくつかのコロニーにおけるSIN-RD114-TRベクターコピー数(VCN)の測定後、PK-7-RD314細胞及びPK-7-RD28細胞(それぞれ6コピーのSIN-RD114-TR-IN及び12コピーのSIN-RD114-TR-IN-RREを含む)を2つの独立したRD3-MolPackパッケージング細胞として選択した(表1)。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
SIN-LVのプロトタイプ第3世代RD3-MolPack産生細胞を得るための最終ステップは、SIN-TVをPK-7-RD314パッケージング細胞又はPK-7-RD28パッケージング細胞のいずれかに導入することで構成される。LTR-TVが形質導入によって組み込まれている第2世代産生株とは反対に、第3世代細胞では、そうすることによりTVが5'LTRで自己不活性化されるため、この方法は適用できない。したがって、SIN-TVは、安定したトランスフェクションによって組み込まれなければならない。SIN-GFP-zeoトランスファーベクター(TV)は、図1aに開示されている。トランスファーベクターは、CMVプロモーターとそれに続くΔU3レンチウイルス5'LTR、スプライスドナー部位とSA部位の間のフラグメント(パッケージングシグナルΨ及びレンチウイルスRREを含む)を含むSIN GFPカセット(Dullら、1998年);セントラルポリプリントラクト(cPPT)(Follenziら、2000年);並びに3'LTRに400ヌクレオチドの欠失を含むウッドチャック肝炎転写後調節エレメント(WPRE)自己不活性化レンチウイルス3'LTR(Zuffreyら、1998年)を含む。この構築物をpBSAAVzeoプラスミドにクローン化して、中間体SIN-GFP-zeo構築物を生成し、その中間体SIN-GFP-zeo構築物においてTVはまたその両側が2つのアデノ随伴ウイルス(AAV)-末端逆位反復配列(ITR)に隣接されており(Palomboら、1998年)、3'ΔU3-LTRの下流にSV40P-ゼオシン発現カセットを含む(図1a)。PstI切断後、SIN-GFP-zeoカセットをpGEM3.1MluI構築物のSmaI部位にクローン化し、それによりSIN-GFP-zeo TVプラスミドを生成した。SIN-GFP-zeo TVプラスミドを、その後、PstIによって直鎖化して、SIN-GFP-zeo DNAフラグメントを生成し、これを、3つの独立したRD-MolPackパッケージング細胞:上記の第3世代PK-7-RD314及びPK-7-RD28並びに以前にWO2012028681に記載された第2世代PK-7-Tat7-RD19(すなわちRD2-MolPack)細胞に、トランスフェクションした。トランスフェクションは、キットPromega: ProFection(登録商標)Mammalian Transfection System-Calcium-Phosphate #E1200を使用して実施した。本発明者らは、TatがSIN-LVの性能を何らかの形で向上させることができたかどうかを検証するためにRD2-MolPackも試験した。ゼオシン選択並びに各細胞型についての物理的及び機能的力価によるいくつかのコロニーのスクリーニングの後(表2)、以下の4つの独立した産生細胞を選定した:1)SIN-RD114-TR-INを担持し、16コピーのSIN-GFP-zeoを含むPK-7-RD314細胞由来のRD3-MolPack1;2〜3)SINRD114-TR-IN-RREを担持し、それぞれ、48コピー及び119コピーのTVを含む、共にPK-7-RD28細胞由来の、RD3-MolPack24及びRD3-MolPack28;並びに4)SIN-RD114-TR-IN-RREを担持し、2.7コピーのTVを含む、PK-7-Tat7-RD19細胞由来のRD2-MolPack64(表1)。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
RD3-MolPack-SIN-GFP産生株の特徴づけ
RD3-MolPack24及びRD2-MolPack64ベクタータンパク質の発現を細胞及びビリオン抽出物のウエスタンブロット分析によって検証した(図2)。すべてのタンパク質がパッケージング細胞、産生細胞において適切に翻訳され、また得られたウイルス粒子において適切にプロセシングされた(図2a及び2b)。
【００４５】
RD3-MolPack24による活性化Tリンパ球の形質導入
本発明者らは、血液悪性腫瘍の治療に重要な細胞としてのPB Tリンパ球の形質導入に関心を集中させた。本発明者らは、形質導入の6日又は14日後のいずれかにCD3/CD28活性化PB Tリンパ球がRD3-MolPack24 LVによってMOI=25で>92%及びMOI=1.5で>75%形質導入されたことを見出した(図3a)。したがって、VCNは、形質導入の14日後まで安定なままであり、MOI=25及びMOI=1.5でそれぞれ7.4から4に及んだ(図3b)。
【００４６】
本発明者らは、その後、RD3-MolPack24 LV(感染力=9×103TU/ng p24Gag)又は一過性誘導VSV-G偽型化SIN-GFP-zeo LV(感染力=3×105TU/ng p24Gag)のいずれかの36ng p24Gag等価物のCD3/CD28活性化T細胞に対する形質導入効率を比較した。形質導入の6日後、GFP+細胞のパーセンテージは、CD3+/CD8-及びCD3+/CD8+サブセット(図4a)の両方においてほぼ同等であった(図3c)。対照的に、14日目には、RD114-TR偽型化LVにより形質導入されたT細胞中のGFP導入遺伝子のVCNは、VSV-G偽型化LVにより形質導入したT細胞中の場合の3分の1に低下した(図3d)。最も重要なことに、CD3+/CD8-及びCD3+/CD8+サブセットのメモリーT細胞亜集団は、2つの異なる形で偽型化したLVにより同一の効率で形質導入された(図4c及び図4d)。さらに、両LVによる形質導入はT細胞分化表現型に影響を及ぼさず、これは、模擬(mock)形質導入細胞と同様であった(図4b、図4e及び図4f)。2つのLVを同じMOIで使用した場合、類似の結果が観察された(図5及び6)。
【００４７】
RD3-MolPack24及びRD2-MolPack64細胞の細胞代謝
RD2-及びRD3-MolPack技術の製造拡張能を調べるために、本発明者らは、RD2-MolPack64及びRD3-MolPack24細胞の両方を1.5×104/cm2で標準的なフラスコに播き、7日間の連続培養の間いくつかのパラメータをモニタリングした(図7)。興味深いことに、2つのシステムは、TU/細胞又は10TU/ml(図7a及び7b)のいずれかとして評価した場合のLV産生に関しては同等であったが、代謝及び増殖に関しては異なっていた。RD3-MolPack64細胞は、より速く増殖し(T=25.7±1.4時間 対 T=32.7±2.9(標準誤差)時間)(図7c及び7e)、培養の4〜7日後、その生存率が低下し、同時に懸濁液中の生細胞数が増加した(図7d及び7f)。要するに、これらの発見は、RD3-MolPackシステムには固定床及び中空糸ベースのバイオリアクターが好ましい一方、RD2-MolPackには懸濁バイオリアクタープラットフォームが好ましいことを示す。
【００４８】
RD3-MolPack24細胞の中規模増殖及びLV濃縮
RD3-MolPack24細胞が接着増殖に最適な候補であることを確かめた後、本発明者らは、その培養条件及びLV濃縮を中〜大規模製造に向けて最適化した。本発明者らは、細胞培養及び収集条件の最適化後にほぼ4倍の力価の増大(4.0×105〜1.5×106TU/ml)、及び清澄な上清を高速よりもむしろ低速で遠心分離した場合にわずかに高い力価を観察した(表3)。本発明者らは、その後、1.7×107細胞を多層HYPERFlask(商標)に播種した。6日目から、細胞が上清産生の最適な濃度(すなわち、4×108細胞/HYPERFlask(商標)に相当する2.2〜2.3×105細胞/cm2)に達すると、本発明者らは、6回の独立した収集で、7.8×103±8.1×102TU/ng p24Gagの平均感染力を有する2.4×109総TUを含む上清をおよそ3L回収した(表S2)。まとめると、これらの結果は、多段容器又はバイオリアクターのいずれかにおける大規模製造の将来的な計画に希望を与えるものである。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
細胞
ヒト胎児腎臓293T(HEK-293T)細胞及びその派生細胞を、10%FCS及びペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(PSG)(Lonza、バーゼル、スイス)を補充したイスコフ改変ダルベッコ改変イーグル培地(IMDM)中で増やした。CEM A3.01 T細胞を10%FCS及びPSGを補充したRPMI 1640中で増殖させた。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、健康なドナーから単離し、Ficoll-Hypaque勾配(Lymphoprep; Stemcell Technologies、バンクーバー、カナダ)での遠心分離後にその後、アリコートとして凍結した。その後、PBMCを解凍し、CD3/CD28 Dynabeads(LifeTechnologies Italia、モンツァ、イタリア)により予め活性化した後10%FCS、PSG並びにIL-7及びIL-15(5ng/ml、それぞれ)を補充したRPMI 1640(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ)中で培養した。
【００５１】
一過性及び連続的なレンチウイルスベクター(LV)産生、濃縮、細胞形質導入及び力価算出
以下のプラスミドによるHEK-293T細胞の一過性の共トランスフェクションによってLVを得た:パッケージング構築物pCMV-ΔR8.9(第3世代)、VSV-GエンベロープをコードするpMD.Gプラスミド又はRD114-TRエンベロープをコードするSIN-RD114-TRプラスミド、及び第3世代(SIN-GFP)トランスファーベクター(TV)。トランスフェクションの48時間後に上清を収集した。
【００５２】
RD-MolPack細胞をさまざまな細胞培養デバイス:標準的なフラスコ、小さな使い捨てバイオリアクター及びHyperflask、において培養することによって連続的なLV産生が日常的に得られた。RD-MolPack細胞の生産性を評価するために、T75フラスコに10%FBS及びPSGを補充したIMDM 0.5ml/cm2中に2.5×106/cm2を播種し、24時間後に上清を収集した。2.5×107のRD-MolPack細胞をCELLine AD 1000バイオリアクター(INTEGRA Biosciences AG、CH)に播種し、細胞コンパートメント培地(15ml IMDM+10%FCS)を48時間毎に、1回の収集と対応して交換し、一方、培地コンパートメント(1000ml IMDM+1% FCS)は、最大3か月間にわたり週に1回交換することによってRD-MolPack LVも製造した。選択した実験において、1.7×107細胞/フラスコを播種し、6日後、細胞の総数がおよそ4×108に達したときに上清を回収することによってRD-MolPack細胞をCorning(登録商標)HYPERFlask(商標)(Corning Inc.Life Science、ローウェル、MA)中で培養した。すべての製造システムにおいて、収集した上清を0.45μmろ過によって清澄化し、-80℃で使用まで保存した。示した場合、その上清を、低速(Multifuge 32-R遠心分離機中3,761×g、+4℃で16時間)又は高速遠心分離(Beckman L-80超遠心分離機中、50,000×g、+4℃で2時間)のいずれかで100倍濃縮した。ウイルスのペレットを、10%FBSを補充したIMDM培地に再懸濁し、繰り延べの使用のために-80℃で凍結した。CEM A3.01細胞株及び活性化Tリンパ球の形質導入は、ポリブレン(8μg/ml)(Sigma-Aldrich、セントルイス、MO)の存在下における1,024×g、37℃での2時間の1サイクルのスピノキュレーション(spinoculation)によって行った。形質導入効率はDIVAソフトウェア(BD Bioscience)によるGFP(SIN-GFP)のフローサイトメトリー分析(FACS Canto II Instrument、BD Bioscience、サンホゼ、CA)によってモニタリングした。CEM A3.01細胞に対するLV力価は、以前に記載されたとおり[Porcelliniら、2010年]、5〜25%の範囲の形質導入効率を使用して算出した。物理的粒子(pp)産生は、製造業者の説明書に従ってAlliance HIV-1 p24 Antigen ELISAキット(Perkin Elmer,Inc.ウォルサム、MA)により上清に放出されたp24Gagを測定することによって推定した。1ngのp24Gagが1×107ppに相当するものとする。
【００５３】
ウエスタンブロットアッセイ
細胞タンパク質及びウイルスタンパク質(後者は単離した無細胞VLP又はLV由来)を以前に記載されたようにして調製し、その後、4〜15%Mini-PROTEAN(登録商標)TGX(商標)プレキャストゲル(Biorad、ハーキュリーズ、CA、米国)上でSDS-PAGEによって分離した。使用した一次抗体は以下のものであった:AIDS患者から得られ、G. Poli(OSR、ミラノ、イタリア)によって親切にも寄付された抗HIV血清(1:1,000に希釈); F.L. Cosset(INSERM、フランス)によって親切にも提供された抗TM RD114-TRウサギ血清(1:1,000に希釈);Santa Cruz Biotechnologyからの抗Revマウス抗体(sc-69730)(1:500に希釈);NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(米国)から入手した抗Tatマウス抗体(1:500に希釈);抗アクチンウサギ抗体(A 2066)(Sigma-Aldrich)(1:2,500に希釈)。使用したHRP結合二次抗体は以下のものであった:抗ヒト(NA933V)及び抗ウサギ(NA934V)(GE Healthcare、Europe GmbH)(1:5,000に希釈);抗マウス(A2066)(Sigma-Aldrich)(1:10,000に希釈)。化学発光反応のために、本発明者らは、ECL-Western Blotting Detection Reagents(RPMN2106)(GE Healthcare)を使用した。
【００５４】
RD3-MolPack24及びRD2-MolPack64細胞代謝
RD3-MolPack24及びRD2-MolPack64細胞を1.5×104細胞/cm2の密度でT25フラスコに播いた。各時点において細胞を毎日、1週間カウントし、上清を収集して、YSI 2700 SELECT Biochemistry Analyzer(YSI、イエロースプリングス、OH)によってグルコース消費及びラクテート産生、並びに上記のとおり機能的及び物理的力価を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2018537990.tif 000013
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