(57)【要約】本開示の一部の実施形態は、抗原をコードする核酸を被験体に送達するステップであって、核酸は、腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して送達される、ステップと、抗原に結合する受容体を発現する免疫細胞を被験体に送達するステップとを含む方法を対象とする。抗原をコードする操作された核酸を腫瘍に送達するか、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、２つの該抗原に結合する二重特異性抗原受容体を発現する免疫細胞を該腫瘍に送達するステップとを含む方法。
2018532801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原をコードする操作された核酸を被験体に送達するステップであって、該操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して送達される、ステップと、
該抗原に結合する受容体を発現する免疫細胞を該被験体に送達するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記抗原が、自己抗原、非自己抗原、またはこれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が、非自己抗原である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非自己抗原が、細菌抗原、酵母抗原、原虫抗原、またはウイルス抗原である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記非自己抗原が、合成抗原である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍抗原が、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＩＧＦ２Ｂ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ−１６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲファミリー、ＦＡＰ、ＦＲα、グリピカン−３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−２３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープであるかまたはそれらを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９のエピトープであるかまたはそれを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原が、全長ＣＤ１９、ＣＤ１９の断片、ＣＤ１９の少なくとも１つのＣ２  Ｉｇ様ドメイン、またはＣＤ１９の直鎖状エピトープから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原をコードする前記操作された核酸が、前記腫瘍選択的ビヒクル内に封入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍選択的ビヒクルが、ウイルスまたはシュードウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水泡性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、またはパルボウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、キメラウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記キメラウイルスが、アデノ随伴ウイルスと、腫瘍選択的ペプチドを表面に表すバクテリオファージとを操作することにより得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、パピローマウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記パピローマウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記パピローマウイルスが、改変ヒトパピローマウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記パピローマウイルスが、非ヒトパピローマウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記パピローマウイルスが、改変非ヒトパピローマウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、シュードウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍選択的ビヒクルが、天然ポリマー、合成ポリマー、カチオン性ペプチド、細胞透過性ペプチド、生分解性ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、ポリプレックス、ミセル、デンドリマー、ゲル、粘膜接着剤、またはシリコンナノニードルであるかまたはそれらを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍標的化剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
抗原をコードする前記操作された核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
抗原をコードする前記操作された核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫細胞が、白血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記白血球が、リンパ球である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記リンパ球が、Ｔ細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫細胞が、樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記受容体が、組換え抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、非経口経路、腸内経路、または局所経路を介して送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記非経口経路が、腹内経路、羊膜内経路、動脈内経路、関節内経路、胆管内経路、気管支内経路、嚢内経路、心臓内経路、軟骨内経路、仙骨内経路、海綿内経路、腔内経路、脳内経路、槽内経路、角膜内経路、歯冠内経路、冠動脈内経路、体内経路、頭蓋内経路、皮内経路、椎間板内経路、腺管内経路、十二指腸内経路、硬膜内経路、表皮内経路、食道内経路、胃内経路、歯肉内経路、回腸内経路、病巣内経路、管腔内経路、リンパ内経路、髄内経路、髄膜内経路、筋肉内経路、眼内経路、卵巣内経路、心膜内経路、腹腔内経路、胸膜内経路、前立腺内経路、肺内経路、眼内経路、洞内経路、脊髄内経路、滑膜内経路、腱内経路、精巣内経路、クモ膜下腔内経路、胸内経路、管内経路、鼓室内経路、子宮内経路、血管内経路、静脈内経路（ボーラスまたは点滴）、脳室内経路、膀胱内経路、または皮下経路である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記操作された核酸を、前記腫瘍に注射する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
各々が異なる抗原をコードする、少なくとも２つの操作された核酸を被験体に送達するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を被験体に送達するステップであって、該操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して送達される、ステップと、
該自己抗原に結合する受容体を発現する免疫細胞を該被験体に送達するステップと
を含む方法。
【請求項４３】
前記自己抗原が、腫瘍抗原である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍抗原が、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＩＧＦ２Ｂ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ−１６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲファミリー、ＦＡＰ、ＦＲα、グリピカン−３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−２３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープであるかまたはそれらを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍抗原が、ペプチドタグであるかまたはそれを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドタグが、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＭＶペプチド、ＳＶ５ペプチド、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、イソペプタグ、Ｓｐｙタグ、ＢＣＣＰ、Ｈａｌｏタグ、Ｎｕｓタグ、Ｆｃタグ、およびＴｙタグからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、前記腫瘍選択的ビヒクル内に封入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍選択的ビヒクルが、ウイルス、ウイルス様粒子、またはシュードウイルスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍溶解性ウイルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水泡性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、またはパルボウイルスである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、キメラウイルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記キメラウイルスが、アデノ随伴ウイルスと、腫瘍選択的ペプチドを表面に表すバクテリオファージとを操作することにより得られる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたウイルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、パピローマウイルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記パピローマウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記パピローマウイルスが、改変ヒトパピローマウイルスである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記パピローマウイルスが、非ヒトパピローマウイルスである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記パピローマウイルスが、改変非ヒトパピローマウイルスであり、該改変非ヒトパピローマウイルスが、ウシパピローマウイルスである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、ウイルス様粒子である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、シュードウイルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
腫瘍選択的ビヒクルが、天然ポリマー、合成ポリマー、カチオン性ペプチド、細胞透過性ペプチド、生分解性ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、ポリプレックス、ミセル、デンドリマー、ゲル、粘膜接着剤、またはシリコンナノニードルであるかまたはそれらを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍標的化剤を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６５】
前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項６６】
前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、調節性ＲＮＡであるか、または調節タンパク質をコードする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、プロモーターを含有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記プロモーターが、天然プロモーターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記プロモーターが、組換えプロモーターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記構成的プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫細胞が、白血球である、請求項４２に記載の方法。
【請求項７７】
前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記白血球が、リンパ球である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記リンパ球が、Ｔ細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
免疫細胞が、樹状細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項８２】
前記受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項８３】
前記腫瘍選択的ビヒクルが、非経口経路、腸内経路、または局所経路を介して送達される、請求項４２に記載の方法。
【請求項８４】
前記非経口経路が、腹内経路、羊膜内経路、動脈内経路、関節内経路、胆管内経路、気管支内経路、嚢内経路、心臓内経路、軟骨内経路、仙骨内経路、海綿内経路、腔内経路、脳内経路、槽内経路、角膜内経路、歯冠内経路、冠動脈内経路、体内経路、頭蓋内経路、皮内経路、椎間板内経路、腺管内経路、十二指腸内経路、硬膜内経路、表皮内経路、食道内経路、胃内経路、歯肉内経路、回腸内経路、病巣内経路、管腔内経路、リンパ内経路、髄内経路、髄膜内経路、筋肉内経路、眼内経路、卵巣内経路、心膜内経路、腹腔内経路、胸膜内経路、前立腺内経路、肺内経路、眼内経路、洞内経路、脊髄内経路、滑膜内経路、腱内経路、精巣内経路、クモ膜下腔内経路、胸内経路、管内経路、鼓室内経路、子宮内経路、血管内経路、静脈内経路（ボーラスまたは点滴）、脳室内経路、膀胱内経路、または皮下経路である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記操作された核酸を、前記腫瘍に注射する、請求項４２に記載の方法。
【請求項８６】
抗原をコードする操作された核酸を腫瘍に送達するか、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、
２つの該抗原に結合する二重特異性抗原受容体を発現する免疫細胞を該腫瘍に送達するステップと
を含む方法。
【請求項８７】
前記二重特異性抗原受容体が、二重特異性Ｔ細胞受容体または二重特異性キメラ抗原受容体である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記二重特異性抗原受容体が、前記腫瘍が天然で発現する自己抗原にも結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記二重特異性抗原受容体がまた、単球上に存在する非腫瘍抗原にも結合し、阻害性シグナルをもたらす、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
２つの異なる抗原をコードする、２つの操作された核酸を腫瘍に送達するか、または２つの異なる自己抗原の発現を誘導する、２つの操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、
それぞれが、該２つの異なる抗原の各々に結合する、２つの異なる抗原受容体を発現する免疫細胞を該腫瘍に送達するステップと
を含む方法。
【請求項９１】
前記２つの異なる抗原受容体が、組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記腫瘍が、眼腫瘍、黒色腫、頭頚部腫瘍、肺腫瘍、膀胱腫瘍、乳腺腫瘍、結腸直腸腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肝臓腫瘍、または腎臓腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１０月３０日出願の米国仮出願第６２／２４９，０１３号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。この仮出願は、その全体が本明細書において参照として援用される。
【背景技術】
【０００２】
養子細胞移入とは、標的化免疫細胞療法であって、これは、患者自らの腫瘍（複数可）を認識し攻撃するように患者の免疫細胞を操作することを伴うことが多い。患者の血液から回収された免疫細胞を、免疫細胞の表面上に受容体を発現するように遺伝子操作することができ、これにより、免疫細胞による、腫瘍細胞表面上で発現する、特異的なリガンドタンパク質（抗原）の認識が可能となる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大されたこれらの遺伝子操作された免疫細胞の集団を患者に注入して戻すと、免疫細胞は、患者の体内で増え、操作された受容体からの指図で、表面抗原を擁するがん細胞を認識し、死滅させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
免疫療法の１つの手法は、患者自らの腫瘍を認識および攻撃するように、患者自身の免疫細胞を操作するステップを伴う。しかし、操作された免疫細胞は、腫瘍細胞に加えて正常細胞も攻撃することから、免疫療法の有効性を低下させ、望ましくない副作用を増大させることが多い。これは、一部では、腫瘍細胞と正常細胞とが類似の表面抗原を異なるレベルで発現しうるためである。本開示は、がんを処置するために、免疫細胞を腫瘍細胞に選択的に標的化するための組成物および方法を提供する。これは、被験体の腫瘍細胞と免疫細胞とを相補的様式で操作する（例えば、遺伝子操作する）ことから選択的に得られ、高度に特異的な免疫療法標的化システム（immunotherapeutic  targeting  system）がもたらされる。一部の実施形態では、正常（非腫瘍）細胞が発現しない抗原（例えば、非自己抗原）を発現するように操作する一方、他の実施形態では、腫瘍細胞を、正常な腫瘍細胞（normal  tumor  cell）が抗原（例えば、自己抗原）を発現する発現レベルより高い発現レベルで、それと同じ抗原を発現するように、腫瘍細胞を操作する。次いで、これらの抗原に、コグネイト受容体（これらの抗原に特異的に結合する受容体）を発現するように操作された免疫細胞が、選択的に結合する。一部の実施形態では、腫瘍細胞を、正常細胞上で発現するレベルと同様のレベルで、抗原（例えば、自己抗原）を発現するように操作する。これらの正常細胞（例えば、Ｂ細胞）は、典型的に、腫瘍細胞と共に消失するが、これは、患者において、ほとんどまたは全く毒性を引き起こさない。
【０００４】
従って、本発明のある実施形態は、（少なくとも１つの）抗原をコードする（少なくとも１つの）操作された核酸を被験体に送達するステップであって、該操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して送達される、ステップと、該抗原に結合する受容体を発現する免疫細胞（例えば、白血球）を該被験体に送達するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、各々が異なる抗原をコードする、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ）の操作された核酸を被験体に送達する。
【０００５】
一部の実施形態では、抗原は、自己抗原、非自己抗原、または自己抗原と、非自己抗原との組合せ（組換えキメラ）である。非自己抗原は、例えば、細菌抗原、酵母抗原、原虫抗原、ウイルス抗原、植物抗原または魚抗原であり得る。一部の実施形態では、非自己抗原は、合成（人工）抗原である。
【０００６】
一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原（例えば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））である。腫瘍抗原は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＩＧＦ２Ｂ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ−１６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲファミリー、ＦＡＰ、ＦＲα、グリピカン−３（glupican-3）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−２３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープであるかまたはそれらを含み得る。
【０００７】
一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクル内に封入される。
【０００８】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、ウイルス（例えば、天然に存在するウイルス、改変ウイルス、またはハイブリッドウイルス）、ウイルス様粒子、またはシュードウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水泡性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、またはパルボウイルス）である。
【０００９】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、腫瘍細胞を標的とするように改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など、腫瘍細胞を標的とするように改変された非腫瘍溶解性ウイルスである。一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とバクテリオファージとのキメラウイルスなど、真核細胞ウイルスと原核細胞ウイルスとのキメラウイルスである。例えば、キメラウイルスは、ＡＡＶおよびバクテリオファージ（ファージ）から得られたエレメント（例えば、シスエレメント）を含みうる。一部の実施形態では、バクテリオファージは、腫瘍標的化ペプチドを表面に表す。
【００１０】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、パピローマウイルスまたはパピローマシュードウイルスである。パピローマウイルスは、ヒトパピローマウイルス、改変ヒトパピローマウイルスまたは非ヒトパピローマウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス）であり得る。
【００１１】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、天然ポリマー、合成ポリマー、カチオン性ペプチド、細胞透過性ペプチド、生分解性ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、ポリプレックス、ミセル、デンドリマー、ゲル、粘膜接着剤、またはシリコンナノニードルであるかまたはそれらを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、腫瘍標的化剤（例えば、アルキルホスホコリン（ＡＰＣ）分子）を含む。一部の実施形態では、腫瘍標的化剤は、低分子（薬物または他の化学物質）またはペプチドである。
【００１３】
一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））である。
【００１４】
一部の実施形態では、免疫細胞は、白血球である。白血球は、一部の実施形態では、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である。一部の実施形態では、白血球は、リンパ球である。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞であり得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。
【００１５】
一部の実施形態では、免疫細胞によって発現される受容体は、組換え抗原受容体である。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現される受容体は、キメラ抗原受容体である。
【００１６】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、非経口経路、腸内経路、または局所経路を介して送達される。例えば、腫瘍選択的ビヒクルは、腹内経路、羊膜内経路、動脈内経路、関節内経路、胆管内経路、気管支内経路、嚢内経路、心臓内経路、軟骨内経路、仙骨内経路、海綿内経路、腔内経路、脳内経路、槽内経路、角膜内経路、歯冠内経路、冠動脈内経路、体内（intracorporus）経路、頭蓋内経路、皮内経路、椎間板内経路、腺管内経路、十二指腸内経路、硬膜内経路、表皮内経路、食道内経路、胃内経路、歯肉内経路、回腸内経路、病巣内経路、管腔内経路、リンパ内経路、髄内経路、髄膜内経路、筋肉内経路、眼内経路、卵巣内経路、心膜内経路、腹腔内経路、胸膜内経路、前立腺内経路、肺内経路、眼内経路、洞内経路、脊髄内経路、滑膜内経路、腱内経路、精巣内経路、クモ膜下腔内経路、胸内経路、管内経路、鼓室内経路、子宮内経路、血管内経路、静脈内経路（ボーラスまたは点滴）、脳室内経路、膀胱内経路、または皮下経路を介して送達され得る。
【００１７】
一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸が、腫瘍に注射される。
【００１８】
本明細書ではまた、抗原（例えば、非自己抗原）をコードする操作された核酸を腫瘍に送達するか、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、２つの抗原に結合する二重特異性抗原受容体を発現する免疫細胞を腫瘍に送達するステップとを含む方法も提供される。一部の実施形態では、二重特異性抗原受容体は、二重特異性Ｔ細胞受容体または二重特異性キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、二重特異性抗原受容体は、操作された核酸によってコードされる抗原に結合し、かつ、腫瘍が天然で発現する自己抗原にも結合する。一部の実施形態では、二重特異性抗原受容体は、操作された核酸によってコードされる抗原に結合し、かつ、単球上に存在する非腫瘍抗原にも結合し、阻害性シグナルをもたらす。
【００１９】
さらに、２つの異なる抗原をコードする、２つの操作された核酸を腫瘍に送達するか、または２つの異なる自己抗原の発現を誘導する、２つの操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、それぞれが、該２つの異なる抗原の各々に結合する、２つの異なる抗原受容体を発現する免疫細胞を該腫瘍に送達するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、２つの異なる抗原受容体は、組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体である。
【００２０】
本明細書ではまた、抗原をコードする操作された核酸を腫瘍に送達するか、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、２つの異なる抗原受容体であって、それらのうちの一方が、操作された核酸によりコードされる抗原に結合し、それらのうちの他方が、腫瘍内で内因的に発現する抗原に結合する抗原受容体を発現する免疫細胞を腫瘍に送達するステップとを含む方法も提供される。一部の実施形態では、２つの異なる抗原受容体は、組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体である。
【００２１】
一部の実施形態では、自己抗原の発現を誘導する核酸は、調節性ＲＮＡであるか、または調節タンパク質をコードする。
【００２２】
一部の実施形態では、自己抗原の発現を誘導する操作された核酸は、プロモーター（例えば、天然プロモーターまたは組換えプロモーター）を含有する。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の場合もあり、誘導性プロモーターの場合もある。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
【００２３】
以下の図面は本明細書の一部をなし、かつ、本開示のある特定の態様をさらに裏付けるために含められ、本明細書で提示される具体的実施形態についての詳細な記載と組み合わせ、これらの図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、よりよく理解される。図面中で例示されるデータは、いかなる形でも、本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本開示のがん標的化療法の例を描示する。この例では、ＣＤ１９抗原をコードする核酸を封入するように、向腫瘍性パピローマウイルス（ＰＶ）シュードウイルス（ＰｓＶ）を操作し、ＣＤ１９抗原に特異的に結合する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を操作する。ＰｓＶおよび免疫細胞の両方を、腫瘍／腫瘍細胞を有する被験体に投与する。ＰｓＶは、核酸を、腫瘍細胞（複数可）に送達するビヒクルとして働き、免疫細胞は、細胞表面におけるＣＤ１９の発現の後、腫瘍細胞（複数可）を標的とする。
【００２５】
【図２】図２は、ＣＤ１９発現ベクタークローン（ヒトＣＤ１９およびマウスＣＤ１９それぞれについての、クローン番号Ｂおよびクローン番号Ｄ、ならびにクローン番号６およびクローン番号８）のトランスフェクション後の、ＨａＣａＴヒト角化細胞およびＰＡＭ２１２マウス角化細胞の細胞における、ＣＤ１９発現の結果を示す。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現ベクターのトランスフェクションを、陽性対照として使用し、非トランスフェクト細胞を、陰性対照として使用した。
【００２６】
【図３Ａ】図３Ａ（右画像）は、２つのＤＮＡ発現ベクター：改変ＨＰＶ１６／３１  Ｌ１／Ｌ２と、（ヒト）ｈＣＤ１９（クローン番号Ｂ、図２を参照されたい）または（マウス）ｍＣＤ１９（クローン番号６、図２を参照されたい）とをトランスフェクトした２９３ＴＴ細胞の細胞溶解物から得られた精製画分を示す、電気泳動ゲル画像である。改変Ｌ１タンパク質および改変Ｌ２タンパク質は、発現し、ＣＤ１９発現ベクターを優先的にカプシド封入しながら自己組織化して、ＰｓＶを生成させる。２日後、細胞を溶解させ、密度遠心分離を使用して、ＰｓＶを精製し、画分を回収する（ＰｓＶの作製および精製については、Buck、２００７年において記載されている）。図３Ａ（左画像）は、２つのＤＮＡ発現ベクター：ＢＰＶ１  Ｌ１／Ｌ２と、（ヒト）ｈＣＤ１９（クローン番号Ｂ、図２を参照されたい）または（マウス）ｍＣＤ１９（クローン番号６、図２を参照されたい）とをトランスフェクトされた２９３ＴＴ細胞の細胞溶解物から得られた精製画分を示す、電気泳動ゲル画像である。最も純粋な画分を、「＊」で描示し、これらを、後段の検証実験において使用した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＤ１９をコードする核酸を保有するＰｓＶの画分を感染させた２９３ＴＴ細胞内の、ＣＤ１９の発現を裏付けるグラフ（図３Ａにおいて、＊で描示した）を示す。改変ＨＰＶ１６／３１  ＰｓＶおよびＢＰＶ  ＰｓＶの画分１μｌを、感染のために使用した。
【００２７】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、各々が、ｈＣＤ１９をコードする核酸を含有する、改変ＨＰＶ１６／３１  ＰｓＶまたはＢＰＶ  ＰｓＶの感染後の、多様ながん型の腫瘍細胞における、感染およびヒトＣＤ１９の表面発現の確認を示す。図４Ａは、異なる系統またはがん型のヒト細胞における、ｈＣＤ１９の表面発現を示す。図４Ｂは、マウスＴＣ−１細胞における、ｍＣＤ１９の表面発現を示す。図４Ａおよび図４Ｂのいずれについても、ＣＤ１９の表面染色は、１μｌの改変ＨＰＶ１６／１３ＰｓＶまたはＢＰＶ  ＰｓＶの感染の４８時間後に完了した。各ＣＤ１９発現ベクター上ではまた、ＧＦＰも発現し、その発現の検出は、遺伝子送達についての内部陽性対照としての働きをする。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、各々が、ｈＣＤ１９をコードする核酸を含有する、改変ＨＰＶ１６／３１  ＰｓＶまたはＢＰＶ  ＰｓＶの感染後の、多様ながん型の腫瘍細胞における、感染およびヒトＣＤ１９の表面発現の確認を示す。図４Ａは、異なる系統またはがん型のヒト細胞における、ｈＣＤ１９の表面発現を示す。図４Ｂは、マウスＴＣ−１細胞における、ｍＣＤ１９の表面発現を示す。図４Ａおよび図４Ｂのいずれについても、ＣＤ１９の表面染色は、１μｌの改変ＨＰＶ１６／１３ＰｓＶまたはＢＰＶ  ＰｓＶの感染の４８時間後に完了した。各ＣＤ１９発現ベクター上ではまた、ＧＦＰも発現し、その発現の検出は、遺伝子送達についての内部陽性対照としての働きをする。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
腫瘍細胞は、典型的には、宿主被験体において免疫応答を引き起こす腫瘍抗原を発現する。これらの腫瘍抗原は、腫瘍細胞を同定するためのマーカーとして働き、また、がん標的化療法のための候補物質としても働く。しかし、多くの場合、腫瘍が発現する抗原はまた、一部の正常細胞も発現する。これらの抗原を、腫瘍関連抗原と称する。したがって、治療剤を腫瘍に導くシグナルとして腫瘍関連抗原を使用するようにデザインされた治療はまた、正常細胞も標的化する危険性があり、その結果として、望ましくない副作用をもたらし、治療有効性を低下させる場合もある。
【００２９】
本明細書では、また、相当な数の正常細胞は標的化せずに、腫瘍細胞を選択的に標的とし、これにより、望ましくない副作用を低減するか、または消失させ、処置の有効性を増大させるのに使用される治療が提供される。一部の実施形態では、被験体の免疫細胞および腫瘍細胞を、それぞれ、受容体およびコグネイト抗原を発現するように遺伝子操作する。一部の実施形態では、抗原をコードする（または１つを超える抗原をコードする）操作された核酸（または１つを超える操作された核酸）を含有する腫瘍選択的ビヒクル（腫瘍細胞に選択的にホーミングする）を被験体に送達することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の改変を達成する。他の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸を、腫瘍内注射を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、腫瘍に向けて送達する。核酸の送達後（または操作された核酸の送達に先立つか、もしくはこれと組み合わせて）、コグネイト受容体（または複数のコグネイト受容体）を発現するように操作された免疫細胞を、被験体に送達する。受容体−抗原（リガンド）間結合により導かれる免疫細胞は、操作された核酸によりコードされる抗原を発現する腫瘍細胞を選択的に標的化する。次いで、操作された免疫細胞が、腫瘍細胞を死滅させる。
【００３０】
抗原
本開示の一部の実施形態は、典型的に、腫瘍選択的ビヒクルまたは腫瘍内注射を介して送達される操作された（外因性）核酸によりコードされる抗原を対象とする。「抗原」とは、Ｔ細胞などの白血球を含む免疫細胞の受容体に対するリガンドとして働く分子である。抗原は、自己抗原の場合もあり、非自己抗原の場合もある。
【００３１】
「自己抗原」とは、体内に由来する抗原を指す。自己抗原は、腫瘍細胞に加えて一部の正常細胞も発現する場合がある。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、自己抗原を、正常腫瘍細胞が、同じ自己抗原を発現する発現レベルより高い発現レベルで発現する。すなわち、腫瘍細胞が発現する自己抗原は、過剰発現する。一部の実施形態では、自己抗原をコードする操作された核酸を、自己抗原の発現レベルをさらに増大させることを目的として、自己抗原を天然で発現するかまたは過剰発現する腫瘍細胞に送達する（腫瘍選択的ビヒクルまたは腫瘍内注射を介して）。したがって、コグネイト受容体を発現するように遺伝子操作された免疫細胞は、正常細胞にまさって、腫瘍細胞を選択的に標的とする。「自己抗原」は、体内に由来するが、操作された（外因的に送達された）核酸が、それを腫瘍内で発現するならば、この抗原の組換え形態もやはり、「自己抗原」と称することを理解されたい。例えば、ＣＤ１９およびＣＤ２０は、腫瘍細胞が過剰発現する自己抗原である。本開示は、ＣＤ１９またはＣＤ２０をコードする操作された核酸を被験体に送達するステップ（本明細書では、自己抗原をコードする操作された核酸を被験体に送達するステップと称するステップ）を包含する。
【００３２】
一部の実施形態では、自己抗原をコードする操作された核酸は、腫瘍細胞に送達され、内因性自己抗原は、非改変腫瘍細胞（操作された核酸を含有しない腫瘍細胞）内で発現するレベルより高レベルで発現される。例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター）またはＧｒｐ７８プロモーターなど、強力な構成的プロモーターに作動可能に連結した操作された核酸によりコードされる自己抗原は、腫瘍細胞内で、内因性自己抗原を非改変腫瘍細胞内で発現するレベルより、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％高いレベルで発現され得る。
【００３３】
一部の実施形態では、自己抗原は、腫瘍抗原である。「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞が発現する抗原である。本開示の腫瘍抗原の例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＩＧＦ２Ｂ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ−１６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲファミリー、ＦＡＰ、ＦＲα、グリピカン−３（glupican-3）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−２３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、またはＶＥＧＦＲ２が挙げられるがこれらに限定されない。他の腫瘍抗原の例についても記載されている（参照により本明細書に組み込まれる、der  Bruggen  Pら、Peptide  database:  T  cell-defined  tumor  antigens、Cancer  Immun、２０１３年、ＵＲＬ：cancerimmunity.org/peptide）。
【００３４】
腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む。「腫瘍特異的抗原」は、腫瘍細胞だけが発現するものである（他のいかなる細胞も発現しない）。「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞も発現するが、一部の正常（非腫瘍）細胞も発現するものである。
【００３５】
腫瘍抗原の例は、限定せずに述べると、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ１２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＡＳ７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＥ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍＩ−ＲＡＲアルファ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ２、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥファミリー抗原、ＣＡＧＥファミリー抗原、Ｃｙｃｌｉｎ−Ａ１、ＧＡＧＥファミリー抗原、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥファミリー抗原、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＰＲＡＭＥ、ＳＡＧＥファミリー抗原、Ｓｐ１７、ＳＳＸファミリー抗原、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、ＸＡＧＥファミリー抗原、ＣＥＡ、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、マンマグロビン−Ａ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、メソテリン（mesothilin）、ＮＹ−ＢＲ−１、ＯＡ１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、９Ｄ７、アジポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＩＮＧ−４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ４５、ＣＤ２７４、ＣＰＳＦ、サイクリン−Ｂ１、サイクリン  Ｄ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ガングリオシドＧＤ３、グリピカン−３、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、Ｈｅｐｓｉｎ、ＩＳＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ−フェトプロテイン、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン（Lengsin）、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ｐ５３、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＰ−１、セセルニン（ｓｅｃｅｒｎｉｎ）  １、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、テロメラーゼ、ＴＰＢＧ、ＶＥＧＦ、およびＷＴ１を含む。本開示には、他の腫瘍抗原も包含される。
【００３６】
「非自己抗原」とは、外部環境（体外）に由来する抗原である。非自己抗原は、天然では、被験体の細胞（正常細胞または腫瘍細胞）内で発現しない。ヒト被験体に関して述べると、非自己抗原は、例えば、異なる宿主／被験体、または細菌抗原、酵母抗原、原虫抗原、ウイルス抗原などの非ヒト抗原から得られるヒト抗原でありうる。非自己抗原は、天然に存在する抗原（別の生物における天然に存在する抗原）の場合もあり、合成抗原（天然に存在しない抗原、例えば、人工抗原）の場合もある。非自己抗原の例は、限定せずに述べると、緑色蛍光タンパク質、ＫＬＨ、およびトリオボアルブミンを含む。腫瘍選択的ビヒクルまたは腫瘍内注射を介して腫瘍細胞に送達される非自己抗原をコードする操作された核酸は主に、腫瘍細胞内で発現し、正常細胞内では発現しない。したがって、非自己抗原に結合するように遺伝子操作された免疫細胞は、腫瘍細胞を選択的に標的化する能力がある。
【００３７】
一部の実施形態では、抗原は、ペプチドタグであるか、または抗原は、ペプチドタグを含む。ペプチドタグの例は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ウイルスペプチド（例えば、ＣＭＶペプチド、ＳＶ５ペプチド）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、イソペプタグ、Ｓｐｙタグ、ＢＣＣＰ、Ｈａｌｏタグ、Ｎｕｓタグ、Ｆｃタグ、およびＴｙタグを含む。本開示には、他のペプチドタグも包含される。
【００３８】
送達ビヒクル
一部の実施形態では、抗原は、腫瘍選択的ビヒクルを介して被験体に送達される。「腫瘍選択的ビヒクル」とは、腫瘍細胞を優先的に標的とする（腫瘍細胞にホーミングする）、分子、作用物質（agent）、またはマトリックス、あるいはウイルスおよびシュードウイルスに関して述べると、腫瘍細胞内で優先的に複製され、かつ／またはこれらに感染もしくは偽感染する分子、作用物質、またはマトリックスである。一部の実施形態では、本開示の操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクル内に封入される。
【００３９】
腫瘍選択的ビヒクルの例は、限定せずに述べると、ウイルス（キメラウイルスおよび改変ウイルスを含む）およびシュードウイルスを含む。本明細書には、非ウイルス性腫瘍選択的ビヒクルもまた包含され、下記で記載される。
【００４０】
ウイルスとは、他の生物の生細胞の内部だけで複製される、小型の感染因子である。ウイルスは典型的に、（ｉ）ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡの形態の遺伝子材料と；（ｉｉ）カプシドと称するタンパク質コートであって、遺伝子材料を取り囲み、保護するタンパク質コートと；場合によって、（ｉｉｉ）タンパク質コートを取り囲む脂質のエンベロープとを含有する。ウイルスのタンパク質シェルであるカプシドは、各々をカプソメアと称する、いくつかの構造的サブユニットを含有する。
【００４１】
本開示のウイルスの非限定的な例は、腫瘍溶解性ウイルスおよび改変ウイルス（例えば、腫瘍細胞に優先的に感染するように改変された）を含む。一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸を、ウイルスゲノムの一部となるように操作する。一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、シュードウイルス内に封入される。
【００４２】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、腫瘍溶解性ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスとは、腫瘍細胞に優先的に感染し、これらを死滅させるウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスの例は、限定せずに述べると、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水泡性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、およびパルボウイルスを含む。
【００４３】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、標的化されたキメラウイルスである。標的化されたキメラウイルスは、少なくとも２つの異なる（difference）ウイルスに由来する構成要素を含有する組換えウイルスである。例えば、本開示の腫瘍選択的ビヒクルは、ＡＡＶＰと称する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）／バクテリオファージキメラウイルス（それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Hajitou  A.ら、２００６年、Cell、１２５巻：３８５〜３９８頁；Hajitou  A.ら、２００７年、Nat.  Protoc.、２巻（３号）：５２３〜３１頁；およびHajitou  A.ら、２０１０年、Adv.  Genet.、６９巻：６５〜８２頁）を含みうる。
【００４４】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、天然に存在するウイルスまたは腫瘍細胞に優先的に感染し（腫瘍細胞を標的とし）、これを死滅させるように改変されたウイルスである。腫瘍細胞を標的とするように改変されうるウイルスの非限定的な例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ＡＡＶのカプシドを改変する（例えば、受容体の標的化、ビリオンシェル内のカプシドの混合、または組換えウイルスを作製するためのマーカーのレスキュー；参照により本明細書に組み込まれる、Chengwen  Lら、２００５年、Cancer  Gene  Ther.、１２巻（１２号）：９１３〜２５頁）。一部の実施形態では、ＡＡＶのＴ細胞刺激性エピトープを改変する。
【００４５】
「シュードウイルス」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む遺伝子材料であって、特異的で所望される形質を伴う遺伝子材料を、原核細胞および真核細胞に注入するのに使用される合成ウイルスである。シュードウイルスは、構造および挙動においてウイルスと近縁であるが、真のウイルスにより呈示される多くの特徴であって、複製能を含む特徴を欠く。一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、シュードウイルス内に封入される。
【００４６】
一部の実施形態では、本開示のシュードウイルスは、パピローマウイルスタンパク質（例えば、Ｌ１タンパク質、Ｌ２タンパク質、またはＬ１タンパク質とＬ２タンパク質との組合せ）を含むかまたはこれらからなる。パピローマウイルスタンパク質（Ｌ１カプシドタンパク質およびＬ２カプシドタンパク質）は、ヒトパピローマウイルスタンパク質または非ヒト（例えば、ウシ、マウス、ワタオウサギ（cotton-rabbit）、マカクザル、またはアカゲザル）パピローマウイルスタンパク質でありうる。一部の実施形態では、これらのパピローマウイルスタンパク質を、野生型パピローマウイルスタンパク質を含むかまたはこれらからなるシュードウイルスと比べて、改変された抗原性を有するシュードウイルスを結果としてもたらすように改変する。例えば、本開示の改変Ｌ１パピローマウイルスタンパク質は、ＨＰＶ血清型１６とＨＰＶ血清型３１とに基づく組換えタンパク質であって、「改変ＨＰＶ１６／３１  Ｌ１タンパク質」と称し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０／１２０２６６号において記載されている組換えタンパク質でありうる。
【００４７】
他の標的化ビヒクルの例は、限定せずに述べると、天然ポリマー、合成ポリマー、カチオン性ペプチド、細胞透過性ペプチド、生分解性ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス（例えば、ＰＥＧ化リポプレックス）、ポリプレックス、ミセル、およびデンドリマーを含む。一部の実施形態では、合成送達ビヒクルは、ゲル、粘膜接着剤、またはシリコンナノニードルである。本開示には、他の腫瘍選択的ビヒクルも包含される。
【００４８】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、リポソームである。リポソームとは、少なくとも１つの脂質二重層を有する、球形の小胞である。「リポソーム」という用語は、多重層小胞（複数のラメラ相による脂質二重層を有する小胞）、小型の単層リポソーム小胞（１つの脂質二重層を有する小胞）、大型の単層小胞、および渦巻形の小胞を包含する。「リポプレックス」という用語は、ＤＮＡと共に形成される、カチオン性リポソームを指す。「ポリプレックス」という用語は、ＤＮＡと共に形成されるポリマーを指す。一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、リポソーム内、リポプレックス内、またはポリプレックス内に封入される。
【００４９】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、ポリマー性ミセルである。比較のために述べると、ポリマー性ミセルは、親水性の単量体単位および疎水性の単量体単位の両方からなる、ある特定の両親媒性コポリマーから調製される。一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、ポリマー性ミセル内に封入される。
【００５０】
一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクルは、デンドリマーである。デンドリマーもまた、ポリマーベースの送達ビヒクルである。デンドリマーは、規則的な間隔で枝分かれして、小型で、球形で、稠密な、ナノキャリアを形成するコアを有する。
【００５１】
送達経路
一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸を、腫瘍内注射を介して被験体に送達する。「腫瘍内注射」とは、操作された核酸を、例えば、注射デバイス（例えば、針およびシリンジ）を介して、腫瘍に直接送達する投与経路である。一部の実施形態では、腫瘍選択的ビヒクル、免疫細胞、またはこれらの両方を、非経口経路、腸内経路、または局所経路を介して被験体に送達する。
【００５２】
非経口経路の例としては、腹内経路、羊膜内経路、動脈内経路、関節内経路、胆管内経路、気管支内経路、嚢内経路、心臓内経路、軟骨内経路、仙骨内経路、海綿内経路、腔内経路、脳内経路、槽内経路、角膜内経路、歯冠内経路、冠動脈内経路、体内経路、頭蓋内経路、皮内経路、椎間板内経路、腺管内経路、十二指腸内経路、硬膜内経路、表皮内経路、食道内経路、胃内経路、歯肉内経路、回腸内経路、病巣内経路、管腔内経路、リンパ内経路、髄内経路、髄膜内経路、筋肉内経路、眼内経路、卵巣内経路、心膜内経路、腹腔内経路、胸膜内経路、前立腺内経路、肺内経路、眼内経路、洞内経路、脊髄内経路、滑膜内経路、腱内経路、精巣内経路、クモ膜下腔内経路、胸内経路、管内経路、鼓室内経路、子宮内経路、血管内経路、静脈内経路（ボーラスまたは点滴）、脳室内経路、膀胱内経路および皮下経路が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
腸内投与経路は、口を介する消化管への投与（経口投与）、胃を介する消化管への投与（胃内投与）、および直腸を介する消化管への投与（直腸内投与）を含む。胃内投与は典型的に、経鼻経路を介するチューブ（ＮＧチューブ）または直接胃に至る腹部チューブ（ＰＥＧチューブ）の使用を伴う。直腸内投与は典型的に、直腸坐剤を伴う。
【００５４】
局所投与経路は、皮膚または粘膜などの体表面への投与を含む。本開示の送達ビヒクルは、例えば、クリーム、フォーム、ゲル、ローション、または軟膏を介して、局所投与することができる。
【００５５】
本開示には、他の送達経路も包含される。例えば、操作された核酸または操作された核酸を含有する腫瘍選択的ビヒクルは、超音波標的化マイクロバブル破壊（ＵＴＭＤ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（参照により本明細書に組み込まれる、Qiu  L.ら、２０１２年、Gene  Therapy、１９巻：７０３〜７１０頁）を介して送達することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、抗原をコードする操作された核酸は、免疫細胞を送達する前に、またはその後で、被験体に（腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して）送達される。したがって、本開示の操作された核酸および免疫細胞は、逐次的に送達することができる。しかし、他の実施形態では、操作された核酸および免疫細胞を、同時に送達する。
【００５７】
免疫細胞
本開示の一部の実施形態は、抗原に結合する受容体を含む（例えば発現する）、白血球（有核白血球）などの免疫細胞を対象とする。本開示の白血球は、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球でありうる。一部の実施形態では、白血球は、リンパ球である。白血球の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔｈ（ヘルパーＴ）細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞、または調節性（サプレッサー）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、樹状細胞である。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示の免疫細胞を、抗原結合受容体を発現するように遺伝子操作する。細胞は、操作（外因性）核酸を含有する場合に、「操作された」と考えられる。本開示の操作された核酸は、任意の公知の（例えば、従来の）方法により、細胞に導入することができる。例えば、操作された核酸は、エレクトロポレーション（例えば、Heiser  W.C.、Transcription  Factor  Protocols:  Methods  in  Molecular  Biology（商標）、２０００年、１３０巻：１１７〜１３４頁を参照されたい）、化学物質（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）、トランスフェクション（例えば、Lewis  W.H.ら、Somatic  Cell  Genet.、１９８０年５月；６巻（３号）：３３３〜４７頁；Chen  C.ら、Mol  Cell  Biol.、１９８７年８月；７巻（８号）：２７４５〜２７５２頁を参照されたい）、組換えプラスミドを含有する細菌プロトプラストとの融合（例えば、Schaffner  W.、Proc  Natl  Acad  Sci  USA.、１９８０年４月；７７巻（４号）：２１６３〜７頁を参照されたい）、精製ＤＮＡの、細胞の核への直接的なマイクロインジェクション（例えば、Capecchi  M.R.、Cell.、１９８０年１１月；２２巻（２号２部）：４７９〜８８頁を参照されたい）、またはレトロウイルスの形質導入により、細胞に導入することができる。
【００５９】
本開示の一部の態様は、被験体から、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を単離するステップと、細胞を遺伝子操作する（例えば、キメラ抗原受容体などの抗原結合受容体を発現するように）ステップと、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大するステップと、次いで、細胞を被験体に再導入するステップとを伴う「養子細胞」手法を提示する。この方法は、被験体において、従来の遺伝子送達法およびワクチン接種法により達成されうる数と比べて、より大きな数の操作された免疫細胞を結果としてもたらす。一部の実施形態では、免疫細胞を、被験体から単離し、遺伝子改変を伴わずに、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大し、次いで、被験体に再導入する。
【００６０】
抗原結合受容体
本開示の免疫細胞は、本明細書で提供される通り、外因的に送達される核酸によりコードされる抗原などの抗原に結合する受容体を含む。一部の実施形態では、抗原に結合する受容体を発現するように、白血球を改変する（例えば、遺伝子改変する）。一部の実施形態では、受容体は、天然に存在する抗原受容体（正常では、免疫細胞上で発現する）の場合もあり、組換え抗原受容体（正常では、免疫細胞上で発現しない）の場合もあり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の場合もある。本開示に包含される、天然に存在する抗原受容体および組換え抗原受容体は、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、ＮＫ細胞受容体、ＮＫＴ細胞受容体、および樹状細胞受容体を含む。「キメラ抗原受容体」とは、腫瘍細胞が発現する抗原を認識し、これに結合するように操作された、人工免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞のためにデザインされ、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）複合体のシグナル伝達ドメインと、抗原認識ドメイン（例えば、抗体の単鎖断片（ｓｃＦｖ））とのキメラである（Enbladら、Human  Gene  Therapy.、２０１５年、２６巻（８号）：４９８〜５０５頁）。
【００６１】
一部の実施形態では、抗原結合受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲを発現したＴ細胞を、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」と称する。一部の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）複合体のシグナル伝達ドメインと、抗原認識ドメイン（例えば、抗体の単鎖断片（ｓｃＦｖ））とを含む（Enbladら、Human  Gene  Therapy.、２０１５年、２６巻（８号）：４９８〜５０５頁）。
【００６２】
それらの各々が、異なる構成要素を含有する、４世代ＣＡＲが存在する。第１世代ＣＡＲは、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを介して、抗体由来のｓｃＦｖを、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζまたはｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに繋ぐ。第２世代ＣＡＲは、共刺激性シグナルをもたらすように、さらなるドメイン、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（４１ＢＢ）、またはＩＣＯＳを組み込む。第３世代ＣＡＲは、ＴｃＲ  ＣＤ３−ζ鎖と融合させた、２つの共刺激性ドメインを含有する。第３世代の共刺激性ドメインは、例えば、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０の組合せを含みうる。一部の実施形態では、ＣＡＲは一般に、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来する外部ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３Ζおよび／または共刺激性分子に由来する、１つ（第１世代）、２つ（第２世代）、または３つ（第３世代）のシグナル伝達ドメインを有する内部ドメイン、を含有する（Maudeら、Blood.、２０１５年、１２５巻（２６号）：４０１７〜４０２３頁；KakarlaおよびGottschalk、Cancer  J.、２０１４年、２０巻（２号）：１５１〜１５５頁）。
【００６３】
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、第４世代ＣＡＲとしても公知の、ユニバーサルサイトカイン媒介殺滅に再度方向付けられたＴ細胞（ＴＲＵＣＫ；Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ）である。ＴＲＵＣＫとは、標的とした組織内、例えば、標的とした腫瘍組織内に蓄積する、トランスジェニックサイトカインを産生および放出するビヒクルとして使用される、ＣＡＲリダイレクトＴ細胞である。トランスジェニックサイトカインは、ＣＡＲが、標的に係合すると放出される。ＴＲＵＣＫ細胞は、標的内に、様々な治療用サイトカインを沈着させうる。これは、治療剤の、標的とした部位への濃縮を結果としてもたらし、全身毒性を回避しうる。
【００６４】
ＣＡＲは、典型的に、それらの機能的特性において異なる。Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、係合すると、Ｔ細胞を活性化し、その増殖を誘導するが、アネルギー（身体の防御機構による反応の欠如であって、末梢リンパ球寛容の直接的な誘導を結果としてもたらす反応の欠如）ももたらしうる。リンパ球は、それらが、特異的抗原に応答できない場合、アネルギー性であると考えられる。第２世代ＣＡＲにおける、共刺激性ドメインの付加は、改変Ｔ細胞の複製能および存続を改善した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＣＤ２８  ＣＡＲまたは４−１ＢＢ  ＣＡＲに関して、同様の抗腫瘍効果が観察されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける前臨床研究は、４−１ＢＢ  ＣＡＲが、優れた増殖および／または存続をもたらしうることを示唆する。臨床試験は、これらの第２世代ＣＡＲのいずれもが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、実質的なＴ細胞の増殖を誘導する能力があることを示唆するが、４−１ＢＢ共刺激性ドメインを含有するＣＡＲは、より長期にわたり存続するようである。第３世代ＣＡＲは、効能を増強するように、複数のシグナル伝達ドメイン（共刺激性）を組み合わせる。第４世代ＣＡＲは加えて、Ｔ細胞応答をモジュレートするように、ＣＡＲ  Ｔ細胞により放出されるトランスジェニックサイトカインのための、構成的発現カセットまたは誘導性発現カセットにより改変されている。例えば、Enbladら、Human  Gene  Therapy.、２０１５年、２６巻（８号）：４９８〜５０５頁；ChmielewskiおよびHinrich、Expert  Opinion  on  Biological  Therapy.、２０１５年、１５巻（８号）：１１４５〜１１５４頁を参照されたい。
【００６５】
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第１世代ＣＡＲである。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第３世代ＣＡＲである。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第２世代ＣＡＲである。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第３世代ＣＡＲである。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第４世代ＣＡＲまたはユニバーサルサイトカイン媒介殺滅に再度方向付けられたＴ細胞（ＴＲＵＣＫ）である。
【００６６】
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、完全ヒトＣＡＲである。一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、１または複数の抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、「スペーサー」ドメインまたは「ヒンジ」ドメインを、ＣＡＲの外部ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と、膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと、膜貫通ドメインとの間に配置する。「スペーサードメイン」とは、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖内の外部ドメインおよび／または細胞質ドメインに連結するように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。「ヒンジドメイン」とは、ＣＡＲもしくはそのドメインに可撓性をもたらすか、またはＣＡＲもしくはそのドメインの立体障害を防止するように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジドメインは、最大で３００アミノ酸（例えば、１０〜１００アミノ酸、または５〜２０アミノ酸）を含みうる。一部の実施形態では、１または複数のスペーサードメインを、ＣＡＲの他の領域内に含めることもできる。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的な単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの抗原結合ドメインを含む。結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定する、リガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、がんまたは自己免疫疾患など、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。したがって、本開示のＣＡＲ内の抗原結合ドメインのリガンドとして作用しうる細胞表面マーカーの例は、がん細胞および／または罹患細胞の他の形態と関連する細胞表面マーカーを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される通り、操作された核酸によりコードされる、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する、所望の抗原結合ドメインを操作することにより、目的の腫瘍抗原を標的とするように、ＣＡＲを操作する。
【００６８】
標的またはエピトープに「特異的に結合する」抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とは、当技術分野で理解されている用語であり、当技術分野では、このような特異的結合を決定する方法もまた公知である。分子は、特定の標的抗原と、代替的な標的に対する場合より、高頻度で、急速に、長い持続期間で、かつ／または大きなアフィニティーで反応または会合する場合に、「特異的結合」を呈示するという。第１の標的抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、第２の標的抗原に特異的に結合する場合もあり、特異的に結合しない場合もある。それ自体、「特異的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要とされない（これを含みうるが）。
【００６９】
一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫細胞を、複数の標的または抗原を認識するように遺伝子改変し、これにより、腫瘍細胞上の、固有の標的または抗原発現パターンの認識を可能とする。複数の標的に結合しうるＣＡＲの例は、完全な免疫細胞の活性化を、複数の抗原を発現する腫瘍に限定する「スプリットシグナルＣＡＲ」；２つのｓｃＦｖを有する外部ドメインを含有する「タンデムＣＡＲ」（ＴａｎＣＡＲ）；およびタグ付きモノクローナル抗体（Ｍａｂ）と共にインキュベートされた腫瘍細胞を認識するように、アビジンまたはイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）特異的ｓｃＦｖを組み込む「ユニバーサル外部ドメインＣＡＲ」を含む。
【００７０】
ＣＡＲは、２つの別個の抗原を認識する（２つの別個の抗原認識ドメインを有する）場合に、「二重特異性」と考えられる。一部の実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、単一のトランスジェニック受容体上に、タンデムで存在する、２つの別個の抗原認識ドメインから構成される（ＴａｎＣＡＲと称する；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Grada  Zら、Molecular  Therapy  Nucleic  Acids、２０１３年、２巻：ｅ１０５頁を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、方法は、抗原をコードする操作された核酸を腫瘍に送達するか、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、それらのうちの一方が操作された核酸によりコードされる、２つの抗原に結合する、二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞を腫瘍に送達するステップとを含む。
【００７１】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、腫瘍外の毒性を回避するのに使用されうる、抗原特異的阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）（参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月１１日に、オンラインで公表された、Fedorov,  VDら、Sci.  Transl.  Med.）である。ｉＣＡＲは、例えば、腫瘍外の標的発現から生じうる、非特異的免疫抑制を遮断する、抗原特異的阻害性受容体を含有する。ｉＣＡＲは、例えば、阻害性分子である、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に基づきうる。一部の実施形態では、これらのｉＣＡＲは、それらの内因性Ｔ細胞受容体または活性化ＣＡＲのいずれかが活性化するＴ細胞からのＴ細胞応答を遮断する。一部の実施形態では、この阻害効果は、一過性である。
【００７２】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、免疫細胞を、被験体から取り除き、それらが、抗原、例えば、腫瘍特異的抗原に特異的な受容体を発現するように改変する、養子細胞移入において使用することができる。次いで、がん細胞を認識し、死滅させうる、改変免疫細胞を、被験体に再導入する（それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Puleら、Cytotherapy.、２００３年、５巻（３号）：２１１〜２２６頁；Maudeら、Blood.、２０１５年、１２５巻（２６号）：４０１７〜４０２３頁）。
【００７３】
腫瘍細胞
本開示は、原発性腫瘍および転移性腫瘍を含む、全ての種類の腫瘍の処置を包含する。本明細書には、結合組織、内皮、中皮、血液細胞、リンパ系細胞、筋肉、上皮組織、神経組織、および神経堤由来細胞から生じる腫瘍が包含される。本開示はまた、癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合型のがん（例えば、腺扁平上皮癌、中胚葉性混合腫瘍、癌肉腫、および奇形癌）も包含する。
【００７４】
以下は、本開示に包含される腫瘍／がんの非限定的な例のリストである。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、星状細胞腫、脳脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明の消化管癌、心臓（ｃａｒｄｉａｃ）（心臓（ｈｅａｒｔ））腫瘍、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、原発性リンパ腫、子宮頸がん、胆管癌、脊索種、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ｄｃｉｓ）、中枢神経系胚芽腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、脳幹神経膠腫、毛様細胞白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞（肝）がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓腫瘍、腎細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、および他の腎臓腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、口唇口腔がん、（原発性）肝がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、ｎｕｔ遺伝子が関連する正中線癌（midline  tract  carcinoma）、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成性腫瘍／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、骨髄腫、慢性骨髄増殖性腫瘍、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、眼がん、口腔がん（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔がん（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、口唇がん、口腔咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、上皮性卵巣がん、胚細胞腫瘍、低悪性度腫瘍、膵臓がん、膵臓神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭��ん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎）がん、腎盂尿管移行上皮がん、網膜がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫（骨がん）、横紋筋肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂尿管移行上皮がん、原発不明の尿管および腎盂の癌、原発不明の尿管および腎盂の希少がん、移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症。
【００７５】
核酸
本開示の一部の実施形態は、抗原（例えば、非自己抗原）をコードする核酸を対象とする。このような核酸を、被験体に送達し、腫瘍細胞に向かわせる（例えば、腫瘍選択的ビヒクルまたは腫瘍内注射を介して）が、ここで、核酸は、腫瘍細胞内で発現する（例えば、過剰発現する）。一部の実施形態では、抗原をコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態では、本開示の核酸は、操作された核酸である。「操作された核酸」とは、天然では生じない核酸（例えば、共有結合により一体に連結され、一部の場合、ホスホジエステル「骨格」と称する、ホスホジエステル結合を含有する、少なくとも２つのヌクレオチド）である。操作された核酸は、組換え核酸および合成核酸を含む。「組換え核酸」とは、核酸（例えば、単離核酸、合成核酸、またはこれらの組合せ）を繋げることにより構築される分子であり、一部の実施形態では、生細胞内で複製しうる。「合成核酸」とは、増幅されるか、または化学合成されるか、もしくは他の手段により合成される分子である。合成核酸は、化学改変されるか、または他の形で改変されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対合しうる（例えば、一過性に、または安定的に、天然に存在する核酸分子「に結合する」とまた称する）合成核酸を含む。組換え核酸および合成核酸はまた、前出のうちのいずれかの複製から生じる分子も含む。
【００７６】
操作された核酸は、全体としては、天然に存在しないが、野生型のヌクレオチド配列を含みうる。一部の実施形態では、操作された核酸は、異なる生物から得られる（例えば、異なる種から得られる）ヌクレオチド配列を含む。例えば、一部の実施形態では、操作された核酸は、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、ウイルスヌクレオチド配列、または前出の配列のうちの、任意の２つもしくはこれを超える配列の組合せを含む。
【００７７】
一部の実施形態では、本開示の操作された核酸は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含みうる。例えば、一部の実施形態では、操作された核酸は、ホスホルアミド連結、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、Ｏ−メチルホスホルアミダイト連結（O-methylphosphoroamidite  linkage）、ペプチド核酸、または前出の連結のうちの、任意の２つもしくはこれを超える連結の組合せを含みうる。操作された核酸は、指定された通り、一本鎖（ｓｓ）の場合もあり、または、操作された核酸は、二本鎖（ｄｓ）の場合もあり、一本鎖配列および二本鎖配列の両方の部分を含有する場合もある。一部の実施形態では、操作された核酸は、三本鎖配列の部分を含有する。操作された核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡとｃＤＮＡとの組合せ）、ＲＮＡ、または、例えば、核酸が、デオキシリボヌクレオチドと、リボヌクレオチド（例えば、人工または天然）との任意の組合せを含有する場合のハイブリッド分子、ならびに２つまたはこれを超える塩基であって、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の任意の組合せを含みうる。
【００７８】
本開示には、改変ｍＲＮＡの送達もまた包含される。改変ｍＲＮＡは、例えば、コードされたタンパク質の、コドン使用、安定性、および抗原プロセシング特徴を改善するために改変されたｍＲＮＡを含む。
【００７９】
本開示の操作された核酸は、標準的な分子生物学法を使用して作製することができる（例えば、GreenおよびSambrook、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual、２０１２年、Cold  Spring  Harbor  Pressを参照されたい）。一部の実施形態では、ＧＩＢＳＯＮ  ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇを使用して、核酸を作製する（例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Gibson,  D.G.ら、Nature  Methods、３４３〜３４５頁、２００９年；およびGibson,  D.G.ら、Nature  Methods、９０１〜９０３頁、２０１０年を参照されたい）。ＧＩＢＳＯＮ  ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）では、典型的に、単一の試験管による反応において、３つの酵素活性：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性、およびＤＮＡリガーゼ活性を使用する。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を削り取り、アニーリングのための相補的な配列を露出させる。次いで、ポリメラーゼ活性は、アニールする領域上のギャップを埋める。次いで、ＤＮＡリガーゼは、ニックをシールし、ＤＮＡ断片を、共有結合により、一体に連結する。隣接断片の重複配列は、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙにおいて使用される重複配列よりはるかに長く、したがって、より高いパーセンテージの正確なアセンブリーを結果としてもたらす。当技術分野では、操作された核酸を作製する他の方法も公知であり、本開示に従い使用することができる。
【００８０】
操作された核酸の発現は、典型的に、操作された核酸に作動可能に連結したプロモーターにより駆動される。「プロモーター」とは、残りの核酸配列の転写の開始およびその速度を制御する、核酸の制御領域を指す。プロモーターは、それが調節する核酸配列の転写を駆動し、したがって、遺伝子の転写開始部位またはその近傍に配置されることが典型的である。一部の実施形態では、プロモーターは、１００〜１０００ヌクレオチドの長さである。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子など、調節タンパク質および他の分子が結合しうる部分領域も含有しうる。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター（活性化可能プロモーターとも称される）、抑制的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生段階特異的プロモーター、または前出のプロモーターのうちの、任意の２つもしくはこれを超えるプロモーターの組合せでありうる。本開示に従う使用のための構成的プロモーターの例は、限定せずに述べると、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータ−アクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロンから得られたプロモーター、ならびにウサギベータ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含有する）、ＣＭＶプロモーター、および腫瘍特異的Ｇｒｐ７８プロモーターを含む（参照により本明細書に組み込まれる、Kia  A.、２０１２年、Mol.  Cancer  Ther.、１１巻（１２号）：２５６６〜７７頁）。
【００８１】
プロモーターは、それが調節する（例えば、核酸のの配列の転写の開始および／または発現を制御する（「駆動する」））該核酸の配列に対して、適正な機能的位置および配向にある場合に、「作動可能に連結された」と考えられる。
【００８２】
一部の実施形態では、プロモーターは、天然で核酸と会合し、所与の核酸のコード領域の上流に位置する、５’側非コード配列（複数可）を単離することにより得ることができる。このようなプロモーターを、「内因性」プロモーターと称する。
【００８３】
一部の実施形態では、プロモーターは、天然では、核酸と会合しない。このようなプロモーターを、「異種」プロモーターと称し、例えば、他の核酸を調節するプロモーター、および他の細胞から得られたプロモーターを含む。異種プロモーターは、合成プロモーターの場合もあり、組換えプロモーターの場合もある。一部の実施形態では、異種合成プロモーターは、公知の転写調節領域から得られた多様なエレメントを含有する。一部の実施形態では、異種合成プロモーターは、当技術分野で公知の遺伝子操作法により発現を変更する変異を含有する。一部の実施形態では、異種組換えプロモーターは、組換えクローニング、核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））、または組換えクローニングと、核酸増幅との組合せにより作製される（米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたい）。本明細書では、異種合成プロモーターおよび異種組換えプロモーターを作製する他の方法も想定される。
【００８４】
一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。「誘導性プロモーター」は、対応する調節タンパク質が、プロモーターに影響を及ぼすか、またはプロモーターに接触する場合、それが作動可能に連結された核酸の転写活性を調節する（例えば、活性化するか、または不活化する）。
【００８５】
したがって、本明細書で使用される「調節タンパク質」とは、プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）に由来する転写活性をモジュレートする（例えば、活性化させるか、または不活化させる）タンパク質である。一部の実施形態では、調節タンパク質は、誘導性プロモーターに（例えば、プロモーター内のヌクレオチドの配列に）直接結合する。一部の実施形態では、調節タンパク質は、誘導性プロモーターの上流（例えば、誘導性プロモーターから上流の、５０〜１００ヌクレオチド以内）の領域に結合する。一部の実施形態では、調節タンパク質は、誘導性プロモーターの近位に（例えば、これと隣接して）結合する。調節タンパク質の例は、限定せずに述べると、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）転写因子、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）転写因子、およびＬａｃ抑制性タンパク質を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、腫瘍細胞内では、抗原をコードする核酸が、過剰発現または誤発現する。核酸またはタンパク質は、その発現レベルが、その正常（野生型）発現レベルを超える（例えば、少なくとも１０％、５０％、１００％、２００％、またはこれを超える）場合に、「過剰発現した」と考えられる。核酸またはタンパク質は、それが、正常では発現しない細胞内または細胞のコンパートメント内で発現する場合に、「誤発現した」と考えられる。
【００８７】
さらなる実施形態
本開示のさらなる実施形態は、以下の番号のパラグラフに包含される：
【００８８】
パラグラフ１．  抗原をコードする操作された核酸を被験体に送達するステップであって、該操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して送達される、ステップと、
該抗原に結合する受容体を発現する免疫細胞を該被験体に送達するステップと
を含む方法。
【００８９】
パラグラフ２．  前記抗原が、自己抗原、非自己抗原、またはこれらの組合せである、パラグラフ１に記載の方法。
【００９０】
パラグラフ３．  前記抗原が、非自己抗原である、パラグラフ２に記載の方法。
【００９１】
パラグラフ４．  前記非自己抗原が、細菌抗原、酵母抗原、原虫抗原、またはウイルス抗原である、パラグラフ３に記載の方法。
【００９２】
パラグラフ５．  前記非自己抗原が、合成抗原である、パラグラフ３に記載の方法。
【００９３】
パラグラフ６．  前記抗原が、腫瘍抗原である、パラグラフ１または２に記載の方法。
【００９４】
パラグラフ７．  前記腫瘍抗原が、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、パラグラフ６に記載の方法。
【００９５】
パラグラフ８．  前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＩＧＦ２Ｂ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ−１６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲファミリー、ＦＡＰ、ＦＲα、グリピカン（glupican）−３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−２３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープであるかまたはそれらを含む、パラグラフ６に記載の方法。
【００９６】
パラグラフ９．  前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９のエピトープであるかまたはそれを含む、パラグラフ８に記載の方法。
【００９７】
パラグラフ１０．  前記腫瘍抗原が、全長ＣＤ１９、ＣＤ１９の断片、ＣＤ１９の少なくとも１つのＣ２  Ｉｇ様ドメイン、またはＣＤ１９の直鎖状エピトープから選択される、パラグラフ９に記載の方法。
【００９８】
パラグラフ１１．  前記抗原をコードする前記操作された核酸が、前記腫瘍選択的ビヒクル内に封入される、パラグラフ１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【００９９】
パラグラフ１２．  腫瘍選択的ビヒクルが、ウイルスまたはシュードウイルスである、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
パラグラフ１３．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍溶解性ウイルスである、パラグラフ１２に記載の方法。
【０１０１】
パラグラフ１４．  前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水泡性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、またはパルボウイルスである、パラグラフ１３に記載の方法。
【０１０２】
パラグラフ１５．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、キメラウイルスである、パラグラフ１２に記載の方法。
【０１０３】
パラグラフ１６．  前記キメラウイルスが、アデノ随伴ウイルスと、腫瘍選択的ペプチドを表面に表すバクテリオファージとを操作することにより得られる、パラグラフ１５に記載の方法。
【０１０４】
パラグラフ１７．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたウイルスである、パラグラフ１２に記載の方法。
【０１０５】
パラグラフ１８．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、パラグラフ１２に記載の方法。
【０１０６】
パラグラフ１９．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、パピローマウイルスである、パラグラフ１２に記載の方法。
【０１０７】
パラグラフ２０．  前記パピローマウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ１９に記載の方法。
【０１０８】
パラグラフ２１．  前記パピローマウイルスが、改変ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ１９に記載の方法。
【０１０９】
パラグラフ２２．  前記パピローマウイルスが、非ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ１９に記載の方法。
【０１１０】
パラグラフ２３．  前記パピローマウイルスが、改変非ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ２２に記載の方法。
【０１１１】
パラグラフ２４．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、シュードウイルスである、パラグラフ１２に記載の方法。
【０１１２】
パラグラフ２５．  腫瘍選択的ビヒクルが、天然ポリマー、合成ポリマー、カチオン性ペプチド、細胞透過性ペプチド、生分解性ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、ポリプレックス、ミセル、デンドリマー、ゲル、粘膜接着剤、またはシリコンナノニードルであるかまたはそれらを含む、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１３】
パラグラフ２６．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍標的化剤を含む、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１１４】
パラグラフ２７．  抗原をコードする前記操作された核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、パラグラフ１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１１５】
パラグラフ２８．  抗原をコードする前記操作された核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、パラグラフ１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
パラグラフ２９．  前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、パラグラフ２８に記載の方法。
【０１１７】
パラグラフ３０．  前記免疫細胞が、白血球である、パラグラフ１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
パラグラフ３１．  前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、パラグラフ３０に記載の方法。
【０１１９】
パラグラフ３２．  前記白血球が、リンパ球である、パラグラフ３１に記載の方法。
【０１２０】
パラグラフ３３．  前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、パラグラフ３２に記載の方法。
【０１２１】
パラグラフ３４．  前記リンパ球が、Ｔ細胞である、パラグラフ３３に記載の方法。
【０１２２】
パラグラフ３５．  免疫細胞が、樹状細胞である、パラグラフ１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１２３】
パラグラフ３６．  前記受容体が、組換え抗原受容体である、パラグラフ１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０１２４】
パラグラフ３７．  前記受容体が、キメラ抗原受容体である、パラグラフ１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
パラグラフ３８．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、非経口経路、腸内経路、または局所経路を介して送達される、パラグラフ１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
パラグラフ３９．  前記非経口経路が、腹内経路、羊膜内経路、動脈内経路、関節内経路、胆管内経路、気管支内経路、嚢内経路、心臓内経路、軟骨内経路、仙骨内経路、海綿内経路、腔内経路、脳内経路、槽内経路、角膜内経路、歯冠内経路、冠動脈内経路、体内経路、頭蓋内経路、皮内経路、椎間板内経路、腺管内経路、十二指腸内経路、硬膜内経路、表皮内経路、食道内経路、胃内経路、歯肉内経路、回腸内経路、病巣内経路、管腔内経路、リンパ内経路、髄内経路、髄膜内経路、筋肉内経路、眼内経路、卵巣内経路、心膜内経路、腹腔内経路、胸膜内経路、前立腺内経路、肺内経路、眼内経路、洞内経路、脊髄内経路、滑膜内経路、腱内経路、精巣内経路、クモ膜下腔内経路、胸内経路、管内経路、鼓室内経路、子宮内経路、血管内経路、静脈内経路（ボーラスまたは点滴）、脳室内経路、膀胱内経路、または皮下経路である、パラグラフ３８に記載の方法。
【０１２７】
パラグラフ４０．  前記操作された核酸を、前記腫瘍に注射する、パラグラフ１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
パラグラフ４１．  各々が異なる抗原をコードする、少なくとも２つの操作された核酸を被験体に送達するステップを含む、パラグラフ１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
パラグラフ４２．  自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を被験体に送達するステップであって、該操作された核酸は、腫瘍選択的ビヒクルを介して、または腫瘍内注射を介して送達される、ステップと、
該自己抗原に結合する受容体を発現する免疫細胞を該被験体に送達するステップと
を含む方法。
【０１３０】
パラグラフ４３．  前記自己抗原が、腫瘍抗原である、パラグラフ４２に記載の方法。
【０１３１】
パラグラフ４４．  前記腫瘍抗原が、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１３２】
パラグラフ４５．  前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＢＣＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＩＧＦ２Ｂ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍｅｌｏｅ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ−１６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲファミリー、ＦＡＰ、ＦＲα、グリピカン−３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−２３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、またはＶＥＧＦＲ２のエピトープであるかまたはそれらを含む、パラグラフ４４に記載の方法。
【０１３３】
パラグラフ４６．  前記腫瘍抗原が、ペプチドタグであるかまたはそれを含む、パラグラフ４４に記載の方法。
【０１３４】
パラグラフ４７．  前記ペプチドタグが、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＭＶペプチド、ＳＶ５ペプチド、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、イソペプタグ、Ｓｐｙタグ、ＢＣＣＰ、Ｈａｌｏタグ、Ｎｕｓタグ、Ｆｃタグ、およびＴｙタグからなる群から選択される、パラグラフ４６に記載の方法。
【０１３５】
パラグラフ４８．  自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、前記腫瘍選択的ビヒクル内に封入される、パラグラフ４２〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
パラグラフ４９．  腫瘍選択的ビヒクルが、ウイルス、ウイルス様粒子、またはシュードウイルスである、パラグラフ４２〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
パラグラフ５０．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍溶解性ウイルスである、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１３８】
パラグラフ５１．  前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水泡性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、またはパルボウイルスである、パラグラフ５０に記載の方法。
【０１３９】
パラグラフ５２．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、キメラウイルスである、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１４０】
パラグラフ５３．  前記キメラウイルスが、アデノ随伴ウイルスと、腫瘍選択的ペプチドを表面に表すバクテリオファージとを操作することにより得られる、パラグラフ５２に記載の方法。
【０１４１】
パラグラフ５４．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたウイルスである、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１４２】
パラグラフ５５．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍細胞を標的とするように改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１４３】
パラグラフ５６．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、パピローマウイルスである、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１４４】
パラグラフ５７．  前記パピローマウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ５６に記載の方法。
【０１４５】
パラグラフ５８．  前記パピローマウイルスが、改変ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ５６に記載の方法。
【０１４６】
パラグラフ５９．  前記パピローマウイルスが、非ヒトパピローマウイルスである、パラグラフ５６に記載の方法。
【０１４７】
パラグラフ６０．  前記パピローマウイルスが、改変非ヒトパピローマウイルスであり、該改変非ヒトパピローマウイルスが、ウシパピローマウイルスである、パラグラフ５９に記載の方法。
【０１４８】
パラグラフ６１．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、ウイルス様粒子である、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１４９】
パラグラフ６２．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、シュードウイルスである、パラグラフ４９に記載の方法。
【０１５０】
パラグラフ６３．  腫瘍選択的ビヒクルが、天然ポリマー、合成ポリマー、カチオン性ペプチド、細胞透過性ペプチド、生分解性ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、ポリプレックス、ミセル、デンドリマー、ゲル、粘膜接着剤、またはシリコンナノニードルであるかまたはそれらを含む、パラグラフ４２〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
パラグラフ６４．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、腫瘍標的化剤を含む、パラグラフ４２〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
パラグラフ６５．  前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、パラグラフ４２〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
パラグラフ６６．  前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）である、パラグラフ４２〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
パラグラフ６７．  前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、パラグラフ６６に記載の方法。
【０１５５】
パラグラフ６８．  前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、調節性ＲＮＡであるか、または調節タンパク質をコードする、パラグラフ６６に記載の方法。
【０１５６】
パラグラフ６９．  前記自己抗原の発現を誘導する前記操作された核酸が、プロモーターを含有する、パラグラフ６５に記載の方法。
【０１５７】
パラグラフ７０．  前記プロモーターが、天然プロモーターである、パラグラフ６９に記載の方法。
【０１５８】
パラグラフ７１．  前記プロモーターが、組換えプロモーターである、パラグラフ６９に記載の方法。
【０１５９】
パラグラフ７２．  前記プロモーターが、構成的プロモーターである、パラグラフ６９に記載の方法。
【０１６０】
パラグラフ７３．  前記構成的プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、パラグラフ７２に記載の方法。
【０１６１】
パラグラフ７４．  前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、パラグラフ６９に記載の方法。
【０１６２】
パラグラフ７５．  前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、パラグラフ６９に記載の方法。
【０１６３】
パラグラフ７６．  前記免疫細胞が、白血球である、パラグラフ４２〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
パラグラフ７７．  前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、パラグラフ７６に記載の方法。
【０１６５】
パラグラフ７８．  前記白血球が、リンパ球である、パラグラフ７７に記載の方法。
【０１６６】
パラグラフ７９．  前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、パラグラフ７８に記載の方法。
【０１６７】
パラグラフ８０．  前記リンパ球が、Ｔ細胞である、パラグラフ７９に記載の方法。
【０１６８】
パラグラフ８１．  免疫細胞が、樹状細胞である、パラグラフ４２〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
パラグラフ８２．  前記受容体が、キメラ抗原受容体である、パラグラフ４２〜８１のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
パラグラフ８３．  前記腫瘍選択的ビヒクルが、非経口経路、腸内経路、または局所経路を介して送達される、パラグラフ４２〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
パラグラフ８４．  前記非経口経路が、腹内経路、羊膜内経路、動脈内経路、関節内経路、胆管内経路、気管支内経路、嚢内経路、心臓内経路、軟骨内経路、仙骨内経路、海綿内経路、腔内経路、脳内経路、槽内経路、角膜内経路、歯冠内経路、冠動脈内経路、体内経路、頭蓋内経路、皮内経路、椎間板内経路、腺管内経路、十二指腸内経路、硬膜内経路、表皮内経路、食道内経路、胃内経路、歯肉内経路、回腸内経路、病巣内経路、管腔内経路、リンパ内経路、髄内経路、髄膜内経路、筋肉内経路、眼内経路、卵巣内経路、心膜内経路、腹腔内経路、胸膜内経路、前立腺内経路、肺内経路、眼内経路、洞内経路、脊髄内経路、滑膜内経路、腱内経路、精巣内経路、クモ膜下腔内経路、胸内経路、管内経路、鼓室内経路、子宮内経路、血管内経路、静脈内経路（ボーラスまたは点滴）、脳室内経路、膀胱内経路、または皮下経路である、パラグラフ８３に記載の方法。
【０１７２】
パラグラフ８５．  前記操作された核酸を、前記腫瘍に注射する、パラグラフ４２〜８３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７３】
パラグラフ８６．  抗原をコードする操作された核酸を腫瘍に送達するか、または自己抗原の発現を誘導する操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、
２つの該抗原に結合する二重特異性抗原受容体を発現する免疫細胞を該腫瘍に送達するステップと
を含む方法。
【０１７４】
パラグラフ８７．  前記二重特異性抗原受容体が、二重特異性Ｔ細胞受容体または二重特異性キメラ抗原受容体である、パラグラフ８６に記載の方法。
【０１７５】
パラグラフ８８．  前記二重特異性抗原受容体が、前記腫瘍が天然で発現する自己抗原にも結合する、パラグラフ８７に記載の方法。
【０１７６】
パラグラフ８９．  前記二重特異性抗原受容体がまた、単球上に存在する非腫瘍抗原にも結合し、阻害性シグナルをもたらす、パラグラフ８７に記載の方法。
【０１７７】
パラグラフ９０．  ２つの異なる抗原をコードする、２つの操作された核酸を腫瘍に送達するか、または２つの異なる自己抗原の発現を誘導する、２つの操作された核酸を腫瘍に送達するステップと、
それぞれが、該２つの異なる抗原の各々に結合する、２つの異なる抗原受容体を発現する免疫細胞を該腫瘍に送達するステップと
を含む方法。
【０１７８】
パラグラフ９１．  前記２つの異なる抗原受容体が、組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体である、パラグラフ９０に記載の方法。
【０１７９】
パラグラフ９２．  前記腫瘍が、眼腫瘍、黒色腫、頭頚部腫瘍、肺腫瘍、膀胱腫瘍、乳腺腫瘍、結腸直腸腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肝臓腫瘍、または腎臓腫瘍である、パラグラフ１〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
本開示を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらを、さらに限定的なものとしてはみなさないものとする。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１）
パピローマウイルスのシュードビリオン（ＰｓＶ）の作製
本実施例および以下の実施例では、腫瘍細胞上の抗原としてのＣＤ１９をコードする核酸を含むパピローマウイルス（ＰＶ）ＰｓＶの送達と、ＣＤ１９を認識し、これに結合する受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞により、これらのＣＤ１９発現腫瘍細胞を標的化することとを伴う方法について論じる。図１は、このような処置法のための構成要素を描示する。目的は、ＣＤ１９をコードするｃＤＮＡを発現するＰＶシュードビリオンを使用して、被験体における腫瘍を標的とし、次いで、被験体に由来するＴ細胞であって、ＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体断片を含有するキメラ抗原受容体（receipt）（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞を被験体に投与することである。
【０１８２】
ヒトおよびマウスの角化細胞である、ＨａＣａＴおよびＰＡＭ２１２を使用して、まず、プラスミドＤＮＡのトランスフェクション後における、対応するＣＤ１９遺伝子の、発現ベクターからの発現を検証した。図２は、ＨａＣａＴヒト角化細胞の細胞内およびＰＡＰ２１２マウス角化細胞の細胞内の、ベクタークローンのトランスフェクション後における、ＣＤ１９の発現の確認を提供する。
【０１８３】
次いで、ヒトＣＤ１９およびマウスＣＤ１９それぞれの、ＣＤ１９ベクタークローン番号ＢおよびＣＤ１９ベクタークローン番号６に、ＰＶ  Ｌ１タンパク質およびＰＶ  Ｌ２タンパク質をコードするベクターを共トランスフェクトして、下に記載される通り、ＣＤ１９をコードする核酸を封入したＰｓＶを作製した。各ＣＤ１９構築物の各ＰｓＶ（改変ＨＰＶ１６／３１または改変ＢＰＶ）のために、２９３ＴＴ細胞を、Ｔ２２５組織培養フラスコ内で培養した。図３Ａは、溶解させた細胞の、ｏｐｔｉｐｒｅｐ精製画分を示す。最適（高純度の高ビリオン含有量）であると同定された画分を、使用のために選択した。最適な画分中の、ＰｓＶを含有する細胞内のＣＤ１９の表面発現の確認を、図３Ｂに示す。
【０１８４】
材料および方法
ＣＤ１９発現ベクターの作製
ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９；受託番号：ＮＭ＿００１７７０）およびマウスＣＤ１９（ｍＣＤ１９；受託番号：ＮＭ＿００９８４４）のｃＤＮＡ配列は、ｐＣＭＶ６ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ）で購入した。次いで、それらを、ＣＭＶプロモーターにより駆動され、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を含有するｐＣＩベースのベクターにクローニングした。クローニングは、以下の通りであった。プラスミドｐＣＬｕｃＦ（home.ccr.cancer.gov/lco/pCLucf.htm）のルシフェラーゼ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで除去した。マウスＣＤ１９の場合、ＮｏｔＩによる消化の前に、ベクターを、平滑末端処理した。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩにより、ｈＣＤ１９を、ｐＣＭＶ６−ＸＬ５から除去し、ベクターにライゲートした。ＰｖｕＩにより、ｍＣＤ１９を、ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙから除去し、平滑末端処理し、次いで、ＮｏｔＩで消化してから、ベクターにライゲートした。ＣＭＶプロモーター内のプロモーターとポリＡ領域とを使用して、まずクローンの配列決定を実施し、次いでここから２つのクローンを、配列番号１〜４のプライマーを使用する内部配列決定のために送った。
【０１８５】
ＣＤ１９発現ベクターを配列決定するためのプライマー
AGCTGTATGTGTGGGC  (配列番号1)
GCTCCACACTTTGGCTGT  (配列番号2)
CTTCAAAGTGACGCCTCC  (配列番号3)
TCTATGAGAACGACTCC  (配列番号4)。
【０１８６】
改変ＨＰＶ１６／３１および改変ＢＰＶ−１のＰｓＶの作製
標的とした腫瘍抗原のｃＤＮＡ（例えば、ヒトＣＤ１９タンパク質をコードする）をコードする標的プラスミドをパッケージングしたＰｓＶを作製した。ＰｓＶは、BuckおよびThompson（２００７年）において記載されている通りに作製した。略述すると、ウイルスコートタンパク質（Ｌ１およびＬ２）を共発現する大型のプラスミド（＞８Ｋｂ）を、抗原を発現する標的プラスミド（＜８Ｋｂ；例えば、ヒトＣＤ１９タンパク質を発現する）と共に、２９３ＴＴ細胞に共トランスフェクトした。標準的な分子クローニング技法を使用して、パッケージングされるｃＤＮＡを、ｐＣＩ−ｎｅｏ骨格に基づく哺乳動物発現ベクタープラスミドにクローニングした。複数のタンパク質を、同じプラスミド上でコードさせることもでき、個別のプラスミド上でコードさせることもでき、この場合、いずれのＣＤ１９発現ベクターも、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。４８時間にわたり、ウイルスコートタンパク質である、Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質は、部分組織化粒子（partially-assembled  particle）またはプロトカプシドに自己組織化し、標的プラスミドを、そのサイズにより、優先的にパッケージングして、封入した。４８時間後、細胞を溶解し、BuckおよびThompson（２００７年）において記載されている通り、部分組織化粒子またはプロトカプシドをさらに成熟させ、密度超遠心分離により精製した。ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配を、精製のために使用することができる。
【０１８７】
２９３ＴＴへの遺伝子形質導入（「感染」）および表面発現ＣＤ１９の検出
２×１０４個の２９３ＴＴ細胞を、２４ウェルプレート内の５００μｌの培地中に予め蒔き、一晩にわたりインキュベートした。２４時間後、１μｌのシュードウイルス調製物を細胞に添加し、４８時間にわたりインキュベートした。次いで、１０ｍＭのＥＤＴＡを使用して、細胞を、プレートから剥離させ、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、以下の抗体：抗ヒトＣＤ１９  ＡＰＣ、クローンＳＪ２５Ｃ１  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ型番３６３００６、５ｕｌ／１０６個の細胞；抗マウスＣＤ１９  ＡＰＣ、クローン６Ｄ５  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ型番１１５５１２、１：１００／１０６個の細胞を使用して、ＣＤ１９の表面発現について染色した。バックグラウンド対照として用いるために、非感染細胞を、抗体で染色し、感染細胞を、アイソタイプマッチ抗体で染色した。細胞を、ＢＤ  Ｆａｃｓ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ上で収集し、データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０で解析した。データは、表面結合抗体の蛍光強度により決定される未加工の細胞カウントを示すヒストグラムとして報告した。
【０１８８】
（実施例２）
感染性および抗原ＣＤ１９の表面発現に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検証
ＰｓＶにより送達される腫瘍抗原
腫瘍細胞を、低密度（２×１０４個）で、一晩にわたり、予め蒔いた。次いで、細胞を、３７℃、１μｌのＰｓＶで処理した。４８時間後、細胞を、解離により採取し、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）の、細胞表面における発現を、抗原に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用する、免疫蛍光の検出に続き、フローサイトメトリーを使用する検出により測定した。図４Ａおよび４Ｂは、実施例１で記載した通り、ヒトＣＤ１９またはマウスＣＤ１９をコードする核酸を保有する、改変ＨＰＶ１６／３１  ＰｓＶまたはＢＰＶ  ＰｓＶを感染させた、異なる系統の細胞における、ＣＤ１９の表面発現を示す。図４Ａは、ヒトＣＤ１９をコードする核酸を保有するＰｓＶによる感染に成功した、多様なヒトがん型の細胞を示す。改変ＨＶＰ１６／３１  ＰｓＶは、ＢＰＶ  ＰｓＶよりも効率的にＨ４６０大細胞肺がん細胞、ＨｅＬａ子宮頸がん細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫細胞、およびＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌細胞に感染した。ＨＳＣ−３口腔がん細胞およびＴ２４膀胱癌細胞では、改変ＨＶＰ１６／３１  ＰｓＶおよびＢＰＶ  ＰｓＶのいずれの効率も同等である。図４Ｂは、マウスＣＤ１９をコードする核酸を保有するＰｓＶを感染させた、マウス腫瘍細胞ＴＣ−１を示すが、ＧＦＰの発現により裏付けられる通り、遺伝子送達の成功の証拠にも拘らず、発現は、検出閾値を下回った。
【０１８９】
（実施例３）
抗原を発現する腫瘍細胞の、抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける標的化
腫瘍細胞上の、抗原の表面発現を検証し、抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、形質導入された標的とした腫瘍細胞と共に、様々な比（例えば、１：１、１：５、５：１、１０：１、１：１０）で共培養する。多様ながんの腫瘍細胞について調べる。２日後、上清および細胞を採取して、サイトカインの産生および細胞生存率を測定する。非特異的Ｔ細胞および／または非感染腫瘍細胞の対照としての包含は、標的とされた腫瘍細胞が、ＣＡＲ特異的かつＰｓＶ特異的に死滅させられることを実証する。
【０１９０】
（実施例４）
抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による、抗原を発現する腫瘍細胞の標的化の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける検証
ＰｓＶにより送達される腫瘍抗原
同系または異種移植腫瘍を、マッチさせたマウス株または免疫不全（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおいて確立し、触知可能な腫瘍が得られるまで成長させる。異種移植腫瘍は、ヒト腫瘍細胞系、患者由来の（ＰＤＸ）細胞系、および／または原発性ヒト患者腫瘍を含む。５０〜１００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを、処置のために無作為化する。最適濃度のＰｓＶを、ＩＶ投与、ＩＰ投与、または腫瘍内（ＩＴ）投与する。２日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１０５〜１０９個）を、多様な経路、好ましくはＩＶ経路、ＩＰ経路、またはＩＴ経路を介して注射する。腫瘍体積およびマウスの生存を測定する。さらなる実験では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の存在下における腫瘍退縮を測定するために、腫瘍体積が、１００ｍｍ３を超える（例えば、２００〜５００ｍｍ３）ようにする。腫瘍モデルの例は、卵巣がんの異種移植モデルである。確立した卵巣がんモデルについては、０日目に、６〜１２週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスまたはＮＯＤ／ＳＣＩＤ／共通ガンマ鎖欠損マウスの脇腹に、１×１０６個のＡ１８４７細胞、ＳＫＯＶ３細胞、またはＯＶＣＡＲ細胞（例えば、系２、３、または５）を皮下接種する。約６週間を経て、腫瘍が触知可能となった後で、ヒト初代Ｔ細胞または胎盤由来の複能性細胞（ＰＤＭＣ）を活性化させ、記載した通りに、レンチウイルスＣＡＲ発現ベクターで形質導入する。Ｔ細胞拡大の２週間後、腫瘍負荷は、＞１００ｍｍ３である。次いで、マウスに、最適量のＰｓＶを、ＩＶ注射、ＩＰ注射、またはＩＴ注射し、２日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＶ注射を行った。卵巣がんの腹腔内モデルについては、６〜１２週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスまたはＮＯＤ／ＳＣＩＤ／共通ガンマ鎖欠損欠損マウスに、１０×１０６個のＡ１８４７細胞、ＳＫＯＶ３細胞、またはＯＶＣＡＲ細胞（例えば、系２、３、または５）をＩＰ注射する。腹膜接種の２週間後、確立されたＡ１８４７腫瘍を保有するマウスに、ＰｓＶを施し（ＩＶ、ＩＰ、またはＩＴ）、２日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＩＶ注射する。マウスが苦しむか、または瀕死となったら、屠殺し、（例えば、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞の）イメージングにより、腫瘍量を優先的に定量する。全ての実験では、期間を通して血液を回収して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および拡大を測定し、サイトカインの分泌を評価する。動物のサブセットを、多様な時点で安楽死させて、腫瘍の浸潤および腫瘍の生存を測定する。
【０１９１】
同系腫瘍モデルの別の例は、がん遺伝子Ｅ６、Ｅ７、および変異体Ｈａ−ｒａｓで形質転換された、マウス初代肺細胞に由来する腫瘍細胞であるＴＣ１である（Lin、１９９６年）。皮下に植え込まれた腫瘍が、４０〜６０ｍｍ３のサイズに達したら、１０７〜１０１０感染単位の、腫瘍抗原を発現するＰｓＶを、静脈内投与または腫瘍内投与する。２日後、形質導入され、拡大された抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞（１０５〜１０９個）または胎盤由来の複能性細胞（ＰＤＭＣ）を、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、および腫瘍内経路を介して注射する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍の表面において発現する外来抗原（例えば、ＰｓＶにより送達されたＣＤ１９）と、特異的に相互作用するため、腫瘍の成長を、特異的に阻害する。ＴＣ−１モデルではまた、抗腫瘍免疫が発生するのかどうかを決定するために、内因性腫瘍特異的タンパク質（ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＨＰＶ１６  Ｅ７）に対するＴ細胞応答を測定することにより、エピトープの拡散も測定することができる。
【０１９２】
参考文献
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Gallardo  HF,  Tan  C,  Ory  D,  Sadelain  M.  Recombinant  retroviruses  pseudotyped  with  the  vesicular  stomatitis  virus  G  glycoprotein  mediate  both  stable  gene  transfer  and  pseudotransduction  in  human  peripheral  blood  lymphocytes.  Blood.  1997  Aug  1;90(3):952-7.  
Lee  J,  Sadelain  M,  Brentjens  R.  Retroviral  transduction  of  murine  primary  T  lymphocytes.  Methods  Mol  Biol.  2009;506:83-96.  
Lin  KY,  Guarnieri  FG,  Staveley-O'Carroll  KF,  Levitsky  HI,  August  JT,  Pardoll  DM,  Wu  TC.  Treatment  of  established  tumors  with  a  novel  vaccine  that  enhances  major  histocompatibility  class  II  presentation  of  tumor  antigen.  Cancer  Res.  1996  Jan  1;56(1):21-6.
Salmon  P,  Trono  D.  Production  and  titration  of  lentiviral  vectors.  Curr  Protoc  Hum  Genet.  2007  Jul;Chapter  12:Unit  12.10.  
【０１９３】
均等物
当業者は、常習的な実験だけを使用して、本明細書で記載される本開示の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するかまたは確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０１９４】
本明細書で開示される、特許文献を含む、全ての参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【図１】
2018532801.tif 000003
【図２】
2018532801.tif 000004
【図３Ａ】
2018532801.tif 000005
【図３Ｂ】
2018532801.tif 000006
【図４Ａ】
2018532801.tif 000007
【図４Ｂ】
2018532801.tif 000008
【配列表】
2018532801000001.app
【国際調査報告】
2018532801.tif 000009
2018532801.tif 000010
2018532801.tif 000011
2018532801.tif 000012