(57)【要約】相互拡散係数Ｄｍと溶媒内の溶質の濃度ｃとの関係を決定する方法。この方法は、溶質濃度ｃの複数の測定値を含むテイラーグラムを取得する（１００）こと、及び、テイラーグラムから、溶媒内の溶質の複数の異なる濃度ｃに対応する複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出する（２００）ことを含む。
2018527556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互拡散係数Ｄｍと溶媒内の溶質の濃度ｃとの関係を決定する方法であって、
溶質濃度ｃの複数の測定値を含むテイラーグラムを取得する（１００）ことと、
前記テイラーグラムから、前記溶媒内の溶質の複数の異なる濃度ｃに対応する複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出する（２００）ことと、
を含む、方法。
【請求項２】
関数を前記テイラーグラムに適合させる（３００）ことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記関数は、形式：
【数１】
2018527556.tif 000036
であり、
ここで、
【数２】
2018527556.tif 000037
であり、ここで、ｔは測定時間であり、ｃは濃度であり、ｔＭ、ｙ、及びｃ０は、適合から決定されるパラメータである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
時間に関する濃度の変化レート
【数３】
2018527556.tif 000038
を決定するため、前記テイラーグラムを微分する（２１２）ことを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記相互拡散係数値Ｄｍは、前記テイラーグラムに適合される前記関数及び時間に関する濃度の前記変化レートから導出される（２１３）、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記相互拡散係数値Ｄｍは、以下の数式を使用して決定され（２１３）、
【数４】
2018527556.tif 000039
ここで、ｒは毛細管の半径である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ξと濃度ｃとの関係を見出すため、前記テイラーグラムに対して変換を実施する（２２１）ことを更に含み、ここで、
【数５】
2018527556.tif 000040
である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
式
【数６】
2018527556.tif 000041
から界面ξＭを決定すること（２２２）を含み、ここで、ｃＬは濃度ｃの上限であり、ｃＲは濃度ｃの下限であるか、またはその逆である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
関係
【数７】
2018527556.tif 000042
から、各濃度値ｃに対応するｕの値を決定することと、
関係
【数８】
2018527556.tif 000043
を使用して、ｕとξとの関係に直線を適合させることによってパラメータｈ及びｍを決定すること（２３１）と、を更に含み、
前記溶媒内の溶質の複数の異なる濃度ｃに対応する前記複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出する（２３３）ことは、関係
【数９】
2018527556.tif 000044
を使用することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出することは、異なる濃度ｃに対応する複数の微分
【数１０】
2018527556.tif 000045
及び複数の積分
【数１１】
2018527556.tif 000046
を数値的に決定すること、及び、数式
【数１２】
2018527556.tif 000047
を使用することによって実施される（２４２）、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記相互拡散係数値Ｄｍと前記対応する濃度ｃとの関係Ｄｍ（ｃ）から、前記溶液内の溶質の拡散相互作用パラメータｋＤを決定することを更に含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
前記拡散相互作用パラメータｋＤと摩擦係数ｋｆの推定値と前記溶質の部分比容積ｖ２の推定値とから第２のビリアル係数Ａ２を決定する（５００）ことを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記テイラーグラムの継続期間にわたって前記相互拡散係数の値から溶質粒子の凝集の尺度を推定する（６００）ことを更に含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１４】
先行するいずれかの請求項に記載の方法を実行するように構成されるプロセッサ（５１）を備える装置（４０）。
【請求項１５】
テイラーグラムを取得するため、テイラー分散分析を実施するための機器（５０）を更に備える、請求項１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、試料の拡散特性を決定する方法に関し、より詳細には、テイラーグラムから拡散特性を決定することに関する。
蛋白質凝集に対して安定であるバイオ医薬品生成物を開発することは、バイオ医薬品業にとって大きな課題である。その結果、研究のかなりの部分は、蛋白質自己会合または凝集を支配するメカニズム及びその発生を防止または軽減する方法を理解するために行われてきた。その作用が濃縮蛋白質溶液においてより有意になる弱いまたは非特異的な蛋白質・蛋白質相互作用（ＰＰＩｓ）は、非可逆的凝集の形成の１つの経路として同定されてきた（Lehermayr et al, 2011, Assessment of net charge and protein-protein interactions of different monoclonal antibodies, Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(7): 2551-2562; Connolly et al, 2012, Weak interactions govern the viscosity of concentrated antibody solutions: high-throughput analysis using the diffusion interaction parameter, Biophysical Journal, 103:69-78）。
【０００２】
希釈蛋白質溶液内の相互作用的力の間の関係及び最終製剤における蛋白質凝集についての傾向は、簡単ではなく、溶質と、溶媒特性、例えば、濃度、イオン強度、及びｐＨとの間の複雑な相互作用の産物である（Saluja et al, 2008, Nature and consequences of protein-protein interactions in high protein concentration solutions, International Journal of Pharmaceutics, 358:1-15）。この関係は、添加剤の存在によって更に複雑化され、蛋白質・蛋白質相互作用の経験的決定が、開発下の各製剤について必要であることを意味する。そして、これは何百もの異なる組合せになり得る。
【０００３】
拡散相互作用パラメータ（ｋＤ）は、所与の媒体内の溶質分子間の相互作用力を記述する１つ指標であり、増加している一連の証拠は、拡散相互作用パラメータが、製剤の凝集傾向を成功裡に予測し得ることを示した（Saluja et al, 2010, Diffusion and sedimentation interaction parameters for measuring the second virial coefficient and their utility as predictors of protein aggregation, Biophysical Journal, 99:2657-2665）。ｋＤを決定するための最も広く使用されている技法は、動的光散乱（ＤＬＳ）である。その理由は、ＤＬＳが、相互拡散係数（Ｄｍ）の比較的ありふれた測定を可能にするからである。相互拡散係数（Ｄｍ）は、ｋＤの解明における臨界パラメータである。ｋＤを決定するため、一連の溶質濃度で相互拡散係数が測定され、濃度の関数としてのこの値のプロットが、傾斜からｋＤをもたらす（式１）。無限希釈における分子の拡散を記述し、且つ、単一分子のブラウン運動の尺度である自己拡散係数（Ｄ０）は、同様に、ｙ切片から抽出され得る。
【０００４】
【数１】
2018527556.tif 000003
【０００５】
より大きな正のｋＤ値は、蛋白質分子間の反発力が溶液内で優位になることを示す。一方、次第に大きくなる負の値は、相互作用が引きつける傾向を有することを示唆し、したがって、不安定状態を示す。
【０００６】
データ収集の行為が簡単で、技法が、プレートリーダによる高スループットスクリーニングを容易に受けるが、ＤＬＳによるｋＤ決定は、方法論的問題によってより難しくされる場合がある。第１のこうした困難さは、異なるサイズの粒子によって示されるバイアスをかけられた散乱強度に関連する。散乱強度は、分子半径の６乗（ｒ６）にほぼ比例する。報告されるのが平均拡散係数であるため、結果得られる値は、より大きな粒子により歪められる場合がある。最悪の場合、結果は、高次凝集体またはダストの存在下で使用不能にされ得る。実際には、これは、試料が、測定の継続期間にわたって比較的純粋でかつ安定していなければならないことを意味する。これは、フィルタリングなどの除去処理を必要とする場合があり、除去処理は、或るタイプの試料にとって望ましくもなく、適切でもない場合がある。第２の問題は、試料のバルク粘度に対する溶質濃度の考えられる影響に関しており、その影響は、その環境内の分子の拡散に影響を及ぼす場合がある。粘度の増加は、拡散を制限するように働き、したがって、粒子は、粒子が真にそうであるよりも大きく見えることになるであろう。ＤＬＳの場合、これは、制限された拡散が起こるデータポイントについて補正済み拡散係数を決定するために、全ての濃度における粘度が知られていなければならないこと、または、研究者が、もはや代表的でないまたは重要でない条件において作業することに限定されることを意味する。
【０００７】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、ｋＤを決定するために使用され得る第２の技法である。しかし、こうした決定はありふれていない。専用溶媒または専用試料構造体の使用は、試料調製に複雑さを導入する場合があり、また、測定条件は、最終製剤の測定条件と異なる場合がある。ＮＭＲ測定において、分子拡散もまた、特定の弛緩レジーム内で起こるはずであり、特に、これは、より大きな分子について正確な拡散係数を取得することをより難題にする。汚染の存在による考えられる誤解釈、及び、意味のある分析を行うために専用要員を必要とする場合がある過度に複雑なスペクトルに対して、考察も与えられなければならない。更に、拡散係数を決定するためにＮＭＲを使用することは、極端に時間がかかると共に、財政的にコストがかかり、したがって、大規模スクリーニングに適用できない。
【０００８】
超遠心沈降速度法（ＳＶ−ＡＵＣ）及び自己相互作用クロマトグラフィ（ＳＩＣ）は、ｋＤを直接測定できるのではなく、それぞれ、沈降相互作用パラメータ（ｋＳ）及び第２のビリアル係数（Ａ２）等の類似のパラメータを測定できる。
【０００９】
テイラー分散分析は、相互拡散係数を推測するために使用され得る。例えば、パルステイラーグラムに対する最良適合から見出されるガウス分布の幅は、注入試料について相互拡散係数を決定するために使用され得る。そのような相互拡散係数の単一値に対応する濃度は、一般に、分散による濃度の減少を全く考慮することなく、注入時の試料の濃度であると仮定される。異なる試料注入濃度におけるこうした測定のシーケンスは、濃度と相互拡散係数との関係を決定するために必要とされるだろう。
【００１０】
先に述べた技法は、正確に知られている濃度（ならびに粘度）における複数の試料の調製及び測定を必要とする。完全のままでかつ未処理の単一試料に取り組むことは、パラメータを特性に関係付けようと試みるときにより好ましいであろう。
【００１１】
これらの問題の少なくとも一部を克服または改善する試料の拡散特性、例えば、溶質濃度による相互拡散係数の変動及び拡散相互作用パラメータ、を調査するための方法が望ましい。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、相互拡散係数Ｄｍと溶媒内の溶質の濃度ｃとの関係を決定する方法が提供される。上記方法は、溶質濃度ｃの複数の測定値を含むテイラーグラムを取得すること、及び、テイラーグラムから、溶媒内の溶質の複数の異なる濃度ｃに対応する複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出することを含む。
【００１３】
（単一の）テイラーグラムから、複数の異なる溶質濃度に対応する複数の相互拡散係数値を導出することは、異なる濃度で複数の試料を調製すること、及び、複数の試料のそれぞれについてテイラーグラムを取得することの必要性を回避する。異なる（初期）濃度における複数の試料の調製及び個別の分析（ＤＬＳによっても、ＴＤＡによっても）は、相互拡散係数Ｄｍと濃度ｃとの関係を決定するための従来技術のアプローチに相当する。本開示の実施形態は、単一テイラーグラム（したがって、単一試料）から相互拡散係数Ｄｍと濃度ｃとの関係を決定することを可能にする。本開示は、従来技術からの大きな進歩を示す。
【００１４】
上記方法は、テイラーグラムに対して関数を適合させることを更に含んでもよい。
関数は、形式：
【００１５】
【数２】
2018527556.tif 000004
【００１６】
であってもよく、
ここで、
【００１７】
【数３】
2018527556.tif 000005
【００１８】
であってもよく、ここで、ｔは測定時間であり、ｃは濃度であり、ｔＭ、ｙ、及びｃ０は、適合から決定されるパラメータである。
上記方法は、時間に関する濃度の変化レート
【００１９】
【数４】
2018527556.tif 000006
【００２０】
を決定するため、テイラーグラムを微分することを更に含んでもよい。
相互拡散係数値Ｄｍは、テイラーグラムに適合される関数及び時間に関する濃度の変化レートから導出されてもよい。
【００２１】
相互拡散係数値Ｄｍは、以下の数式：
【００２２】
【数５】
2018527556.tif 000007
【００２３】
を使用して決定されてもよく、
ここで、ｒは毛細管の半径である。
上記方法は、ξと濃度ｃとの関係を見出すため、テイラーグラムに対して変換を実施することを更に含んでもよく、ここで、
【００２４】
【数６】
2018527556.tif 000008
【００２５】
である。
上記方法は、式
【００２６】
【数７】
2018527556.tif 000009
【００２７】
から界面ξＭを決定することを更に含んでもよく、ｃＬは濃度ｃの上限であり、ｃＲは濃度ｃの下限である、または、ｃＬは濃度ｃの下限であり、ｃＲは濃度ｃの上限である。
上記方法は、
関係
【００２８】
【数８】
2018527556.tif 000010
【００２９】
から、各濃度値ｃに対応する値ｕの値を決定すること、
関係
【００３０】
【数９】
2018527556.tif 000011
【００３１】
を使用して、ｕとξとの関係に直線を適合することによってパラメータｈ及びｍを決定することを更に含んでもよく、
溶媒内の溶質の複数の異なる濃度ｃに対応する複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出することは、関係
【００３２】
【数１０】
2018527556.tif 000012
【００３３】
を使用することを含む。
複数の相互拡散係数値Ｄｍを導出することは、異なる濃度ｃに対応する微分
【００３４】
【数１１】
2018527556.tif 000013
【００３５】
の複数の値及び積分
【００３６】
【数１２】
2018527556.tif 000014
【００３７】
の複数の値を数値的に決定すること、及び、数式
【００３８】
【数１３】
2018527556.tif 000015
【００３９】
を使用することによって実施されてもよい。
上記方法は、相互拡散係数値Ｄｍと対応する濃度ｃとの関係Ｄｍ（ｃ）から、溶媒内の溶質の拡散相互作用パラメータｋＤを決定することを更に含んでもよい。
【００４０】
上記方法は、拡散相互作用パラメータｋＤと摩擦係数ｋｆの推定値と溶質の部分比容積ｖ２の推定値とから第２のビリアル係数Ａ２を決定することを更に含んでもよい。
上記方法は、テイラーグラムの継続期間にわたって相互拡散係数の値から溶質粒子の凝集の尺度を推定することを更に含んでもよい。
【００４１】
第２の態様によれば、第１の態様の方法を実行するように構成されるプロセッサを備える装置が提供される。
上記装置は、テイラーグラムを取得するため、テイラー分散分析を実施するための機器を更に備えてもよい。
【００４２】
第３の態様によれば、第１の態様による方法を実行するようプロセッサを構成するための命令を含む機械可読媒体が提供される。
実施例が、ここで、添付図面を参照して述べられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】拡散特性を調査するための方法の略図である。
【図２】相互拡散係数と濃度との関係を抽出するための３つの代替方法の概要を示す概略図である。
【図３】相互拡散係数と濃度との関係を抽出するための３つの代替方法のうちの第１の方法を示す概略図である。
【図４】相互拡散係数と濃度との関係を抽出するための３つの代替方法のうちの第２の方法を示す概略図である。
【図５】相互拡散係数と濃度との関係を抽出するための３つの代替方法のうちの第３の方法を示す概略図である。
【図６】ξに対してプロットされた濃度を示すグラフである。
【図７】一実施形態に係る装置の概略図である。
【図８】一実施形態に係る、相互拡散係数と濃度との関係を決定するために使用され得る、ヨウ化物溶液内のＢＳＡのフロンタルテイラーグラムである。
【図９】一実施形態に係る、テイラーグラムから取得される推定値と比較するための、自己拡散係数Ｄ０及び拡散相互作用パラメータｋＤの推定値を、取得するために使用される一連のＤＬＳ測定値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
テイラー分散は、試料の効果的な拡散性を高めるためにせん断流が使用されるプロセスである。毛細管内の層流は、半径方向位置に応じて流速の変動をもたらす。壁の近くで、流れは実質的に静止しており、流速は、中央で最大である。これは、隣接する層流のせん断作用をもたらし、せん断作用は、試料の分散を高める。
【００４５】
テイラー分散分析（ＴＤＡ）は、試料内の種の特性を分析するために使用され得る。試料プラグは、微小孔毛細管に注入され、その後、層流レジーム内で毛細管に沿って試料が横断するときに実質的に分散する場合がある。注入される試料プラグは、狭い（短い継続期間を有する）場合があり、これは試料パルスと呼ばれ、パルステイラーグラムをもたらす。別の方法として、注入される試料プラグは、長い（すなわち、より長い継続期間を有する）場合があり、これは、試料スラグと呼ばれる場合があり、フロンタルテイラーグラムをもたらす。プラグによって示される分散の程度は、プラグ内の分子の拡散性に依存し、注入場所の下流の１つまたは複数のポイントで測定され得る。濃度検出器は、試料の種に応じて、注入場所の下流の１つまたは複数の場所に位置決めされてもよい。濃度検出器（例えば、ＵＶ−可視分光計）は、それにより、検出器を通過する流れの各断面内の分子の濃度に比例する信号を生成してもよい。検出器からの結果として得られる信号（通常、テイラーグラムと呼ばれる）は、その幅が試料種の流体力学的半径に関連する分子濃度の時間分解分布に対応する。
【００４６】
図１を参照すると、例示的な実施形態に係る方法は、ステップ１００にて、テイラーグラムを取得すること、及び、その後、例えば、対応する複数の異なる濃度値において相互拡散係数の複数の値を計算することによって、ステップ２００にて、テイラーグラムから、相互拡散係数Ｄｍと濃度ｃとの関係Ｄｍ（ｃ）を抽出（または決定）することを含む。有意には、以降でより完全に開示される方法は、単一テイラーグラムから、相互拡散係数と濃度との関係を決定し得る。
【００４７】
１００にて取得されるテイラーグラムは、プラグまたはパルス注入から生成されてもよく、また、単一検出ポイントまたは複数検出ポイントを含んでもよい。
Ｄｍ（ｃ）が取得されると、ステップ３００にて、例えば、Ｄｍ（ｃ）をプロットし、その関係に直線を適合させることによって、関数がＤｍ（ｃ）に適合されてもよい。その後、ステップ４００にて、関数のパラメータが、抽出され、拡散相互作用係数ｋＤを決定するために使用されてもよい。
【００４８】
選択的なステップ６００にて、相互拡散係数と濃度との関係Ｄｍ（ｃ）が使用されて、テイラーグラムの過程にわたって凝集％を決定してもよい。例えば、凝集は、相互拡散係数の変化をもたらすことになるため、相互拡散係数Ｄｍ（ｃ）の不連続性は、粒子の凝集を示す場合がある。
【００４９】
選択的なステップ５００にて、拡散相互作用係数ｋＤは、例えば、分子重量の推定値、摩擦係数、及び溶質の部分比容積を使用して第２のビリアル係数Ａ２を決定するために使用されてもよい。
【００５０】
図２を参照すると、相互拡散係数Ｄｍと濃度ｃとの関係Ｄｍ（ｃ）を決定するための３つの異なる例示的な方法が概略的に示される。Ｄｍ（ｃ）が抽出されるステップ２００は、３つの異なる方法に拡張される。これらの方法のうちの第１の方法２１０は、第２の方法２３０及び第３の方法２４０と異なる。第２及び第３の方法２３０、２４０は共に、ステップ２２０にて界面ξＭを決定することを含む。
【００５１】
上記方法のそれぞれは、ここでより詳細に述べられる。本発明は、単一測定から生成されるテイラーグラムから相互作用パラメータｋＤを決定するのに適する。試料は、フロンタルテイラーグラムを生成するためスラグで、または、パルステイラーグラムを生成するためパルスで、注入されてもよい。例示的な方法における算出は、フロンタルテイラーグラムを扱うが、当業者は、パルステイラーグラムのための方法を採用することが簡単であることを認識するであろう。上記方法は、テイラーグラムの過程にわたる濃度の固有の変動を使用して、一連の濃度であって、そこにおいて、分子間の相互作用の状態が、相互拡散係数Ｄｍの濃度依存性を参照して決定される、一連の濃度を提供する。
【００５２】
ＵＶ吸収が、テイラーグラムにおける濃度を決定するために通常使用されるが、上記方法は、同様に、任意の検出方法と共に動作することになる。この任意の検出方法は、例えば、屈折率、吸光係数による蛍光のうちのいずれかに基づいて、濃度と粒子からの信号とに合理的に関係付けされ得る信号を生成する。テイラーグラムにおける各ポイントは濃度を示すため、単一テイラーグラムは、複数の溶質濃度を提供する。
【００５３】
＜方法１−陽的微分法＞
この方法２１０は、図３に概略的に示される。第１に、ステップ２１１にて、関数がテイラーグラムに適合される。関数は、形式：
【００５４】
【数１４】
2018527556.tif 000016
【００５５】
であってもよく、ここで、
【００５６】
【数１５】
2018527556.tif 000017
【００５７】
であり、ここで、ｔは測定時間であり、ｔＭは、適合から決定されるパラメータである。ｔ±ｔＭ項のプラスまたはマイナス符号は、それぞれ、フロンタルテイラーグラムの前縁及び後縁についての分析を指定するために使用される。ｙが推定されるが、ｙがこの方法において冗長である場合があることに留意されたい。
【００５８】
次に、ステップ２１２にて、テイラーグラム（または、テイラーグラムに適合される関数）は、例えば、Ｓａｖｉｔｚｙ−Ｇｏｌａｙ微分（または差分法）を使用して微分されて、
【００５９】
【数１６】
2018527556.tif 000018
【００６０】
を取得する。
次に、
【００６１】
【数１７】
2018527556.tif 000019
【００６２】
は、以下の式４からｈ’を決定する。
【００６３】
【数１８】
2018527556.tif 000020
【００６４】
ｈ’の値は、テイラーグラムにおける各データポイントについて決定され得る。ｈ’の決定が不可欠なステップであるのではなく、計算のより洗練された記述を提供するだけであることに留意されたい。幾つかの実施形態において、ｈ’についての数式は、以下の式５、Ｄｍ（ｃ）に代入されてもよい。
【００６５】
最後に、以下の数式を使用して相互拡散係数Ｄｍを決定する。
【００６６】
【数１９】
2018527556.tif 000021
【００６７】
＜方法２及び３の一般的な特徴＞
第２及び第３の例示的な方法は共に、図２、４、及び５に示すように、基準値ξＭを決定するためのステップ２２０を共有する。
【００６８】
半径ｒの毛細管内でｖの平均速度で流れる緩衝液内の試料プラグについてのテイラー分散関係は、
【００６９】
【数２０】
2018527556.tif 000022
【００７０】
によって与えられ、
ここで、ｃは濃度であり、ｘは、プラグの初期縁に対して分散する距離であり、ｋは、
【００７１】
【数２１】
2018527556.tif 000023
【００７２】
で与えられる分散係数である。
ボルツマン変換を使用すると、
【００７３】
【数２２】
2018527556.tif 000024
【００７４】
である。
式６は、再配置されて、
【００７５】
【数２３】
2018527556.tif 000025
【００７６】
を与え得る。
これは、解かれて、
【００７７】
【数２４】
2018527556.tif 000026
【００７８】
が与えられ得る。
ここで、ξＭは、物理的に代表している相互拡散係数について適切に決定されなければならない基準ポイントを定義する。基準ポイントは、要件：
【００７９】
【数２５】
2018527556.tif 000027
【００８０】
によって制約され、ここで、ｃＬ及びｃＲは、テイラーグラムの左及び右に対する濃度の限界である（すなわち、上記方法が、フロンタルテイラーグラムの前縁に関して実施されるか、後縁に関して実施されるかに応じて、濃度の最大値及び最小値に対応する）。基準ポイントξＭは、界面を定義してもよく、また、一般的ではなく、また、ξ＝０に一致しない場合がある。
【００８１】
しかし、一定容積分散（テイラー分散においてそうである）の場合、界面は、ξ＝０に一致してもよい（すなわち、プラグの初期縁に対応する）。通常、この縁は、かなりの分散後に定義不十分であるが、以下の関係から決定され得る。
【００８２】
【数２６】
2018527556.tif 000028
【００８３】
したがって、ξの関数としてのｃの濃度プロファイルならびに基準ポイントξＭが与えられると、ｃの関数としてのｋの値が決定され得る。これは、第２の方法または第３の方法によって達成され得る。
【００８４】
＜方法２＞
この方法は、図６に示すように、ξの関数としての濃度プロファイルｃを考える。
関数：
【００８５】
【数２７】
2018527556.tif 000029
【００８６】
が評価されて、テイラーグラムの各値ｃについてｕの値を取得する。ボルツマン変換（式７によって定義される）が使用されて、ξと濃度ｃとの関係を決定する。濃度ｃを介して、その後、ｕとξとの間で関係が決定され得る。以下に従って（例えば、ξに対してｕをプロットし、直線を適合することによって）、関数がこの関係を記述するために適合され得る。
【００８７】
【数２８】
2018527556.tif 000030
【００８８】
ここで、ｈ及びｍは、適合によって決定されるパラメータである。式１３を式１２に挿入し、その後、式９のｋ（ｃ）について解くことは、
【００８９】
【数２９】
2018527556.tif 000031
【００９０】
を与える。式１４からＤｍ（ｃ）を決定することは簡単である。
＜方法３＞
この方法は、数値的にまたはグラフ的に実施される可能性があり、また、変換済み濃度プロファイルｃ（ξ）からの、式９における積分
【００９１】
【数３０】
2018527556.tif 000032
【００９２】
及び微分
【００９３】
【数３１】
2018527556.tif 000033
【００９４】
の直接の評価の推定を含む。プロットから数値的にまたはグラフ的に、広い範囲の技法がこうしたデータからの微分及び積分を近似するために存在することに、当業者は気づくであろう。データの平滑化またはフィルタリングは、例えば、移動平均を使用してまたはＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタによって、変換を実施する前にまたは後に実施されてもよい。
【００９５】
＜第２のビリアル係数＞
蛋白質・蛋白質相互作用を測定するのに適する別の密接に関連するパラメータは、第２のビリアル係数、Ａ２（浸透ビリアル係数（Ｂ２２またはＢ２）としても知られる）である。第２のビリアル係数は、以下の数式（式１５）によってｋＤに結び付けられる。ここで、ＭＷは蛋白質の分子重量であり、ｋｆは摩擦係数であり、ｖ２は部分比容積である。
【００９６】
【数３２】
2018527556.tif 000034
【００９７】
ここで、正及び負のＡ２値は、それぞれ、蛋白質分子間の反発力及び引力を示唆する。
摩擦係数及び部分比容積がわかっている、あるいは別途推定または決定され得る場合、Ａ２パラメータも、ｋＤを使用して抽出され得る。
【００９８】
＜凝集＞
相互拡散係数Ｄｍ（Ｃ）は、分析下の種の平均サイズの尺度を提供する。種は、毛細管を通って移行するとき、プラグ内で空間的に分配される。この知識、及び、或る期間にわたって収集される全てのデータポイントにおける拡散係数の測定値を用いて、凝集の尺度は、テイラーグラムにわたる拡散係数Ｄｍ（Ｃ）の変化から推定され得る（例えば、割合または％凝集）。
【００９９】
＜装置＞
図７を参照すると、一実施形態に係る装置４０が示される。装置４０は、機器５０、プロセッサ５１、出力手段５２、及び入力手段５３を備える。機器５０は、テイラーグラムデータ７１を生成するため、試料に対してテイラー分散分析を実施するように動作可能である。プロセッサ５１は、（例えば、上述したように）一実施形態に従って、テイラーグラムデータ７１にモデル（例えば、ガウス関数、誤差関数）を適合させるためのパラメータを推定するように構成されてもよい。プロセッサ５１は、出力手段５２に出力７２を提供してもよい。出力手段５２は、ディスプレイまたはプリンタを備えていてもよい。出力７２は、モデルパラメータ推定値、及び／または、プロセッサ５１によってデータ７１に適合されるモデルに基づいて機器５０によって分析された試料の特性の推定値を含んでもよい。プロセッサ５１は、（例えば、最小自乗に基づく回帰分析による）テイラーグラムデータ７１に対する最良適合のために数値探索用の開始ポイントとして、（一実施形態に従って決定された）推定済みモデルパラメータを使用するように構成されてもよい。入力手段５３は、プロセッサ５１及び／または機器を制御するために設けられてもよい。入力手段５３は、キーボード、マウス、または他の適したユーザインタフェースデバイスを備えてもよい。
【０１００】
機器５０は、２つの容器を連結する毛細管を備えてもよい。液体は、第１の容器から第２の容器まで（例えば、一定圧力で）駆動される。第１の容器は、泳動用（またはキャリア）溶液を含むため、毛細管は、泳動用溶液で最初に充填される。第１の容器は、その後、毛細管から外され、試料溶液を含む第３の容器が接続される。試料溶液は、泳動用／キャリア溶液内にまたは異なる媒体内に溶解する医薬品またはバイオ医薬品種であってもよい。異なる媒体は、泳動用／キャリア溶液内と比べて異なる濃度で溶解する添加剤、例えば塩または砂糖を有する点で泳動用／キャリア溶液と異なってもよい。これは、活性薬物種を安定化させるように設計される製剤において適切である場合がある。
【０１０１】
第１及び第２の窓は、第１の容器と第２の容器との間で毛細管の長さに沿って離間する。毛細管は、ループ状に形成されてもよい。このため、第１及び第２の窓の両方の窓は、例えば、エリア撮像検出器のピクセルアレイによって撮像されるエリア内において両方の窓が互いに隣接するように配置することによって、単一光学アセンブリを使用して撮像されてもよい。他の実施形態において、単一窓が使用されてもよいし、または、検出器が、ピクセルアレイではなく、単一要素を備えていてもよい。
【０１０２】
試料プラグを毛細管に注入するため、第３の容器は、毛細管に接続されてもよく、その後、適切な容積の試料が所定の圧力下で注入された後に外されてもよい。第２の容器は、第３の容器が毛細管から外されると、毛細管に接続される。検出器は、試料溶液のパルスまたは流頭が第１及び第２の窓のそれぞれを通過するときに、検出器の受信光強度の尺度を含むフレームシーケンスを取込む。それにより、検出器出力は、吸収対時間に関するデータ、つまり、テイラーグラムを提供する。
【０１０３】
＜例示的結果＞
本明細書で述べる方法は、３０ｍｇ／ｍＬの最終濃度でヨウ化物及び硫化物緩衝液内で調製されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から取得されたテイラーグラムに適用された。試料は、３分の継続期間中に１４０ｍｂａｒで微小孔毛細管（ＩＤ７５μｍ）に注入され、同じ圧力を使用して溶離された。テイラーグラムは、２８０ｎｍの波長のＵＶ検出を使用して記録された。
【０１０４】
図８は、一実施形態に係るヨウ化物緩衝溶液内のＢＳＡの試料から取得されたフロンタルテイラーグラム８０１の例を示す。自己拡散係数Ｄ０及び拡散相互作用パラメータｋＤがフロンタルテイラーグラム８０１から取得され得る。
【０１０５】
図９は、Ｄ０及びｋＤを決定するための従来技術の方法に従って、複数の試料濃度のそれぞれに対してＤＬＳを実施することによって取得された、ヨウ化物緩衝液９０１及び硫化物緩衝液２０３内のＢＳＡについての拡散係数値を示す。最良適合９０２，９０４は、（式１から）Ｄ０及びｋＤを決定するために使用され得る。
【０１０６】
明らかに、従来技術の方法による試料調製及び分析は共に、単一初期試料及び単一テイラーグラムを使用する本開示の実施形態と比較して、かなり骨が折れる。これらの論評は、従来技術のＴＤＡ法によるこれらのパラメータの決定に同様に当てはまる。従来技術のＴＤＡ法も、注入及び分析について同様の一連の試料濃度の調製を必要とすることになるであろう。自動希釈及び自動試料ハンドリングは、骨の折れる仕事の一部を減少させる場合があるが、より複雑でかつ高価な機器を招くことになるであろう。また、この種の一連の測定は、依然としてかなりの量の時間がかかり、かなりの量の試料を消費することになると思われ、それは、早期医薬品開発の状況では（試料の入手可能な量が非常に少ない／高価である場合）許されない場合がある。
【０１０７】
結果は、以下の表１において要約される。
表１−結果の要約。第１、第２、及び第３の例示的な方法を使用する、自己拡散係数及び相互作用パラメータの決定。伝統的なＤＬＳ法との比較が、同様に示される。
【０１０８】
【表１】
2018527556.tif 000035
【０１０９】
全ての方法は、ＤＬＳからの結果及び逆Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ効果から予想される傾向とよく一致している。
添付特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内で、幾つかの他の変形が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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