(57)【要約】  本発明は、安定な融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチド、前記ポリペプチドを含む免疫原性組成物、ならびにＲＳＶ感染を防止および／または処置するためのその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドであって、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質中のＲＳＶ  Ｆ１および／またはＦ２ドメインと比較して、少なくとも２つの安定化変異をＦ１および／またはＦ２ドメイン中に含み、前記安定化変異の少なくとも１つは、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異である、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド。
【請求項２】
２１５位のアミノ酸残基Ｓの変異、好ましくは、前記２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異をさらに含む、請求項１に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項３】
融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される、請求項１または２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項４】
三量体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項５】
短縮されたＦ１ドメインを含み、前記短縮されたＦ１ドメインに連結された異種三量化ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項６】
前記異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む、請求項５に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項７】
前記三量化ドメインは、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸残基５１３に連結されている、請求項５または６に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１つのさらなる変異を含み、前記変異は、
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）６７位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）８３位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基の変異；
（ｇ）４８６位のアミノ酸残基の変異；および
（ｈ）４８７位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）前記４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）前記６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異；
（ｃ）前記８３位のアミノ酸残基ＬのＭへの変異；
（ｄ）前記９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｅ）前記１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｆ）前記２０７位のアミノ酸残基ＶのＩへの変異；
（ｇ）前記４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異；および
（ｈ）前記４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、Ｎ、またはＩへの変異
からなる群から選択される、請求項８に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインは、ＲＳＶ  Ａ株由来である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインは、ＲＳＶ  Ｂ株由来である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１４】
哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは１４に記載の核酸分子、および／または請求項１５に記載のベクターを含む組成物。
【請求項１７】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは１４に記載の核酸分子、および／または請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは１４に記載の核酸分子、および／または請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】
ＲＳＶ感染の予防および／または処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは１４に記載の核酸分子、および／または請求項１５に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。本発明は、特に、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、および例えば免疫原性組成物におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が発見されると、このウイルスは、直ちにヒトにおける上下気道感染症に関連した認定病原体になった。世界中で毎年６４００万件のＲＳウイルス感染が発生し、その結果、１６０，０００人が死亡していると推定されている（ＷＨＯ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に、未熟児、高齢者、および免疫無防備状態の個体である。２年未満の小児では、ＲＳＶは、最もよく見られる呼吸器病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークとなるのは２〜４ヶ月齢である。ほとんどすべての小児が２歳までにＲＳＶに感染したことが報告されている。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果を有さないことに起因する。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染によって引き起こされるものと類似している。
【０００３】
ＲＳＶは、ニューモウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）亜科に属するパラミクソウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパク質をコードする。Ｆ１タンパク質の融合媒介部分に対する抗体は、細胞のウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用がある。
【０００４】
現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは入手することができないが、疾患による高い負担のために要望されている。上述したように、ＲＳＶ融合糖タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）は、ヒト血清中の中和抗体の主要な標的であることから、魅力的なワクチン抗原である。実際、ＲＳＶ  Ｆに対する中和モノクローナル抗体（パリミズマブ）は、重い疾患を予防することができ、幼児の予防に承認されている。
【０００５】
ＲＳＶ  Ｆは、不可逆性タンパク質が不安定な融合前コンフォメーションから安定した融合後コンフォメーションにリフォールディングすることにより、ウイルスと宿主細胞膜とを融合する。両方のコンフォメーションの構造は、ＲＳＶ  Ｆについても（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２，５９２−５９８（２０１３）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７，２４８−２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，１１１３−１１１７（２０１３）；Ｓｗａｎｓｏｎ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，９６１９−９６２４（２０１１））、関連するパラミクソウイルスの融合蛋白質についても決定されており、この複雑な融合装置のメカニズムを知る上での手掛かりとなっている。他のＩ型融合タンパク質のように、不活性な前駆体、ＲＳＶ  Ｆ０は、フーリン様プロテアーゼによって細胞内成熟中に切断される必要がある。ＲＳＶ  Ｆは２つのフーリン部位を有し、それにより３つのポリペプチド：Ｆ２、ｐ２７およびＦ１に分けられ、Ｆ１はそのＮ末端に疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を有する。融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションにリフォールディングするために、ＦＰおよびヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）を含むアミノ酸残基１３７〜２１６のリフォールディング領域１（ＲＲ１）は、へリックス、ループおよびストランドのアセンブリから長い連続へリックスに変形する必要がある。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、融合前ＦスパイクにおいてＣ末端ステムを形成し、かつヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、ＲＳＶ  Ｆヘッドの他方の側に位置を変え、ＨＲＡコイルドコイルトリマーをＨＲＢドメインと結合させて、６へリックスバンドルを形成する。６へリックスバンドルを完成するためのＲＲ１コイルドコイルの形成およびＲＲ２の移動は、リフォールディングの過程で起こる最も劇的な構造変化である。
【０００６】
ヒトの血清中の大半の中和抗体は、融合前コンフォメーションに向けられるが、融合前コンフォメーションは、その不安定さのために、溶液中およびビリオン表面のいずれでも融合後コンフォメーションに早期にリフォールディングする傾向がある。高い発現レベルを有し、かつ安定な融合前コンフォメーションを維持するＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶに対するサブユニットワクチンまたはベクターワクチンにおいて使用する有望な候補となるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド、すなわち融合前コンフォメーションで安定化される組換えＲＳＶ  Ｆポリペプチドを提供する。本発明のＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは可溶性のポリペプチドである。本発明はまた、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子およびそのような核酸分子を含むベクターを提供する。
【０００８】
本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを含む組成物、好ましくは免疫原性組成物、ならびにＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導する際のその使用、具体的にはワクチンとしてのその使用に関する。本発明はまた、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを対象に投与することを含む方法に関する。誘導される免疫応答は、好ましくは、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘導するための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】タンパク質Ｆ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩ  Ｉ７６Ｖ  Ｌ２０３Ｉ  Ｓ２１５Ｐの精製である。Ａ）陽イオン交換カラムからの溶出液のクロマトグラム。青色線は２８０ｎｍの吸光度であり、褐色線は伝導度である。矢印は１５％溶出段階で溶出された収集ピークを示す。
【図１−２】タンパク質Ｆ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩ  Ｉ７６Ｖ  Ｌ２０３Ｉ  Ｓ２１５Ｐの精製である。Ｂ）陽イオン交換カラムからの溶出液のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラム。青色線は２８０ｎｍの吸光度であり、褐色線は伝導度である。矢印は収集ピークを示す。
【図２−１】Ａ）還元条件下および非還元条件下でのＳＥＣクロマトグラムからのピークを含む、Ｆ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩ  Ｉ７６Ｖ  Ｌ２０３Ｉ  Ｓ２１５Ｐ（Ａ）およびＦ（Ａ２）Ｋ６６Ｅ  Ｉ７６Ｖ  Ｌ２０３Ｉ  Ｓ２１５Ｐ（Ｂ）タンパク質試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。減圧下試料のＦ１、Ｆ２画分および非減圧下試料のＦ１＋Ｆ２が示されている。
【図２−２】Ｃ）Ｌ２０３Ｉを含むＦ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩ  Ｉ７６Ｖ  Ｓ２１５ＰおよびＬ２０３Ｉを含まないＦ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩ  Ｉ７６Ｖ  Ｓ２１５ＰＩ、ならびにＦ（Ａ２）Ｋ６６Ｅ  Ｉ７６Ｖ  Ｌ２０３Ｉ  Ｓ２１５ＰのＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ。ネイティブマーカーは相対的電気泳動移動度を示すが、タンパク質の分子量の決定に使用することはできない。２４２〜４８０ｋＤａのバンドの位置は、三量体ＲＳＶ  Ｆタンパク質の位置に対応する（矢印で示す）。ゲルはクマシーブリリアントブルーで染色されている。
【図３】Ｌｅｕ２０３のＩｌｅへの置換の追加により、Ｓ２１５Ｐ置換を有する準安定融合前Ｆタンパク質における融合前Ｆの安定性が増大する。細胞培養上清中の融合前ＲＳＶ  Ｆ濃度を、採取日（トランスフェクションの７２時間後＝第１日）と、４℃で５日間の保存後および１５日間の保存後とに試験した。
【図４】Ｌ２０３Ｉを含むタンパク質の温度安定性である。精製したタンパク質試料の溶融温度（Ｔｍ）をＤＳＦにより測定した。
【図５】Ｌ２０３Ｉ変異を含む精製Ｆタンパク質の還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。減圧下試料のＦ１、Ｆ２画分および非減圧下試料のＦ１＋Ｆ２が示されている。ゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。
【図６】Ｌ２０３Ｉ変異を含む精製Ｆタンパク質のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析である：Ａ：Ｆ（Ａ２）−ＫＮ６６ＥＩ−Ｉ７６Ｖ−Ｉ２０３Ｌ−Ｓ２１５Ｐ−Ｄ４８６Ｎ；Ｂ：Ｆ（Ａ２）−Ｋ６６Ｅ−Ｉ７６Ｖ−Ｉ２０３Ｌ−Ｓ２１５Ｐ−Ｄ４８６Ｎ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）は、ウイルス感染に必要とされる宿主細胞膜とウイルス膜との融合に関与する。ＲＳＶ  Ｆ  ｍＲＮＡは、Ｆ０と称される５７４個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質に翻訳され、それはＮ末端に、小胞体内のシグナルペプチダーゼで除去されるシグナルペプチド配列（例えば、配列番号１３で表わされるアミノ酸残基１〜２６）を含む。Ｆ０は、細胞プロテアーゼ（特に、フーリンまたはフーリン様）により２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間および１３６／１３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０〜１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる）が除去され、Ｆ１およびＦ２と称される２つのドメインまたはサブユニットが生成される。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７〜５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを有し、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０〜５５０）領域および細胞質領域（アミノ酸残基５５１〜５７４）を有する。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２７〜１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合する。Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。
【００１１】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではないが所望されている。ワクチン製造に有望な１つのアプローチは、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくサブユニットワクチンである。しかしながら、このアプローチの場合、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似したコンフォメーションにあり、経時的に安定であり、かつ十分な量で製造できることが望ましい。加えて、可溶性のサブユニットベースのワクチンの場合、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を膜貫通（ＴＭ）領域および細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦ）を生成させる必要がある。ＴＭ領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うため、アンカーなしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後最終状態に容易にリフォールディングすることになる。したがって、高い発現レベルおよび高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るために、融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。また、完全長（膜結合した）ＲＳＶ  Ｆタンパク質は準安定であるため、融合前コンフォメーションの安定化も弱毒化生ワクチンまたはベクターワクチンへのアプローチに望ましい。
【００１２】
融合前コンフォメーションにあるＦ１およびＦ２サブユニットに切断される可溶性ＲＳＶ  Ｆの安定化のために、フィブリチンに基づく三量化ドメインを可溶性ＲＳＶ−Ｆ  Ｃ末端のＣ末端に融合させた（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７：２−２４８−２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３−７（２０１３））。このフィブリチンドメイン、すなわち「フォルドン」はＴ４フィブリチンに由来し、以前は人工の天然三量化ドメインとして記載されている（Ｌｅｔａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｏｓｃｏｗ  ６４：８１７−８２３（１９９３）；Ｓ−Ｇｕｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５−９１５．（２００４））。しかし、三量化ドメインにより安定な融合前ＲＳＶ−Ｆタンパク質は得られない。さらに、これらの努力により、ヒトで試験するのに適した候補を未だ得るに至っていない。
【００１３】
最近、本発明者らは、ＲＳＶ融合前Ｆコンフォメーションを安定化することができるいくつかの変異の組み合わせを記載した（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット）。したがって、６７位のアミノ酸残基の変異および／または２１５位のアミノ酸残基の変異、好ましくは６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異、および／または２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異を含む、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが記載されている。さらに、短縮されたＦ１ドメイン、ならびに野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＲＳＶ  Ｆ１および／もしくはＦ２ドメインと比較して、Ｆ１および／もしくはＦ２ドメイン中に少なくとも１つの安定化変異を含む可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドであって、前記短縮されたＦ１ドメインに結合された異種三量化ドメインを含む可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが記載されている。またさらに、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドであって、少なくとも１つのさらなる変異を含み、前記変異が以下からなる群から選択される、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが記載されている：
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）７７位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）８０位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）１７５位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｇ）１８５位のアミノ酸残基の変異；
（ｈ）２０１位のアミノ酸残基の変異；
（ｉ）２０９位のアミノ酸残基の変異；
（ｊ）４２１位のアミノ酸残基の変異；
（ｋ）４２６位のアミノ酸残基の変異；
（ｌ）４６５位のアミノ酸残基の変異；
（ｍ）４８６位のアミノ酸残基の変異；
（ｎ）４８７位のアミノ酸残基の変異；および
（ｏ）５０８位のアミノ酸残基の変異。
【００１４】
少なくとも１つのさらなる変異は、好ましくは、以下からなる群から選択される：
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）７７位のアミノ酸残基ＫのＥへの変異；
（ｃ）８０位のアミノ酸残基ＫのＥへの変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｅ）１７５位のアミノ酸残基ＮのＰへの変異；
（ｆ）１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｇ）１８５位のアミノ酸残基ＶのＮへの変異；
（ｈ）２０１位のアミノ酸残基ＫのＱへの変異；
（ｉ）２０９位のアミノ酸残基ＫのＱへの変異；
（ｊ）４２１位のアミノ酸残基ＫのＮへの変異；
（ｋ）４２６位のアミノ酸残基ＮのＳへの変異；
（ｌ）４６５位のアミノ酸残基ＫのＥまたはＱへの変異；
（ｍ）４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異；
（ｎ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、Ｎ、またはＩへの変異；および
（ｏ）５０８位のアミノ酸残基ＫのＥへの変異。
【００１５】
これらの変異の１つのみ（特に、Ｓ２１５Ｐの変異）が適用される場合、準安定状態のタンパク質が得られ、それは代替置換の安定化効果の評価に使用できるであろう。
【００１６】
本発明では、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異により、融合前コンフォメーションにあるタンパク質がさらに安定化されることがわかった。
【００１７】
したがって、本発明は、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異を含む組換え融合前Ｆポリペプチドを提供する。
【００１８】
本発明は、特に、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドであって、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質中のＲＳＶ  Ｆ１および／またはＦ２ドメインと比較して、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの安定化変異をＦ１および／またはＦ２ドメイン中に含み、その安定化変異の少なくとも１つは、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異である、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明は、２１５位のアミノ酸ＳのＰへの変異（Ｓ２１５Ｐ）および２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異を含む組換え融合前Ｆポリペプチドをさらに提供する。
【００２０】
したがって、本発明は、安定な組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、すなわち融合前コンフォメーションで安定化される組換えＲＳＶ  Ｆポリペプチドを提供する新規な安定化変異を提供する。本発明の安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションで存在する、すなわち、それらは、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（示す）。融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは現れないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオンで発現するＲＳＶ  Ｆタンパク質のものと同じエピトープを含有することができ、したがって、予防的中和抗体を誘発する利点を備え得ると考えられる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（以下、ＣＲ９５０１と称する）、ならびに／または配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（ＣＲ９５０２と称する）によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０２は、それぞれ抗体５８Ｃ５および３０Ｄ８の重鎖および軽鎖可変領域を含み、したがって、それらの抗体の結合特異性を有するが、それらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合することが以前より示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットを参照）。
【００２２】
特定の実施形態では、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、上記の少なくとも１つの融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含み、かつ三量体である。特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、短縮されたＦ１ドメインを含む。
【００２３】
ＲＳＶは、２つの抗原性サブグループ：ＡおよびＢを有する単一血清型として存在することが知られている。２つのグループのプロセシングされた成熟Ｆタンパク質のアミノ酸配列は約９３％同一である。本出願の全体にわたって使用されるように、アミノ酸位置は、Ａ２株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列（配列番号１３）を参照して付与される。したがって、本発明で使用される場合、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質の「ｘ」位のアミノ酸」という表現は、配列番号１３からなるＲＳＶ  Ａ２株のＲＳＶ  Ｆタンパク質の「ｘ」位にあるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願の全体にわたって使用される番号方式では、１は未成熟Ｆ０タンパク質（配列番号１３）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。Ａ２株と異なるＲＳＶ株が使用される場合、Ｆタンパク質のアミノ酸位置の番号付与は、配列番号１のＡ２株のＦタンパク質の番号付与に準拠し、配列番号１３のＦタンパク質を有する他のＲＳＶ株の配列を、必要に応じてギャップを挿入してアライメントすることにより行われる。配列アライメントは、当該技術分野でよく知られた方法、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｂｉｏｅｄｉｔ、またはＣＬＣ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用して行うことができる。
【００２４】
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）、または例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれらの変異体のいずれであってもよく、または例えばノルロイシンなどのタンパク質中に天然には見出されない、いずれの変異体であってもよい。標準アミノ酸は、それらの特性に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親水性または疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシステイン残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができるシステイン、ポリペプチド骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりもフレキシブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００２５】
タンパク質に対する変異は、ルーチン的な分子生物学手順により行い得ることが当業者に認識される。本発明による突然変異は、好ましくは、これらの変異を含まないＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの発現レベルの増大および／または安定性の増大をもたらす。
【００２６】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは可溶性である。
【００２７】
したがって、特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、短縮されたＦ１ドメインを含み、ポリペプチドはＦ１および／Ｆ２ドメイン中に、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＲＳＶ  Ｆ１および／Ｆ２ドメインと比較して少なくとも１つの安定化変異を含む。特定の実施形態では、可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、前記短縮されたＦ１ドメインに連結した異種三量化ドメインをさらに含む。本発明によれば、短縮されたＦ１ドメインのＣ末端アミノ酸残基への異種三量化ドメインの連結ならびに安定化突然変異により、高発現を示しかつ融合前特異的抗体に結合するＲＳＶ  Ｆポリペプチドが提供されることが示され、これは、このポリペプチドが融合前コンフォメーションにあることを示している。加えて、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションで安定化される、すなわち、ポリペプチドのプロセシング後でも、それらは融合前特異的抗体ＣＲ９５０１および／またはＣＲ９５０２に結合し、融合前特異的エピトープが保持されることを示す。
【００２８】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、少なくとも３つの突然変異（野生型のＲＶ  Ｆタンパク質に対して）を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）６７位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）８３位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基の変異；
（ｇ）４８６位のアミノ酸残基の変異；および
（ｈ）４８７位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される、少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
【００３０】
特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異；
（ｃ）８３位のアミノ酸残基ＬのＭへの変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｅ）１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基ＶのＩへの変異；
（ｇ）４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異；および
（ｈ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、Ｎ、またはＩへの変異
からなる群から選択される。
【００３１】
特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも２つの変異を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも３つの変異を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも４つ、５つ、または６つの変異を含む。
【００３４】
特定の他の実施形態では、異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む。
【００３５】
上記のように、特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは短縮されたＦ１ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「短縮された」Ｆ１ドメインは、完全長Ｆ１ドメインでないＦ１ドメインを指す、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端において、１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失している。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質側末端は、可溶性細胞外ドメインとしての発現を可能にするために欠失されている。
【００３６】
特定の他の実施形態では、三量化ドメインは、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に連結されている。特定の実施形態では、三量化ドメインは、配列番号１４を含み、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に連結されている。
【００３７】
特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインは、ＲＳＶ  Ａ株由来である。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号１３からなるＲＳＶ  Ａ２株由来である。
【００３８】
特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインは、ＲＳＶ  Ｂ株由来である。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号１５からなるＲＳＶ  Ｂ株由来である。
【００３９】
特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインは、ＲＳＶ  ＣＬ５７−ｖ２４４株由来である。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号２２からなるＲＳＶ  ＣＬ５７−ｖ２４４株由来である。
【００４０】
特定の実施形態では、Ｆ１およびＦ２ドメインは、同じＲＳＶ株由来である。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、キメラポリペプチドである、すなわち、異なるＲＳＶ株由来のＦ１およびＦ２ドメインを含む。
【００４１】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの発現レベルは、野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して増大している。特定の実施形態では、発現レベルは少なくとも５倍、好ましくは１０倍まで増大している。特定の実施形態では、発現レベルは１０倍超増大している。
【００４３】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは安定である、すなわち、例えば精製、凍結融解サイクル、および／または保存など、ポリペプチドの処理時に融合後コンフォメーションに容易に変化しない。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、突然変異のないＲＳＶ  Ｆポリペプチドと比較して、４℃での保存時の安定性が増大している。特定の実施形態では、ポリペプチドは、４℃での保存時に少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、より一層好ましくは少なくとも１年間安定である。「保存時に安定」とは、例えば、実施例７または９に記載の方法を用いて測定すると、溶液（例えば、培地）中でのポリペプチドの保存時、４℃で少なくとも３０日間、融合前特異的抗体（例えば、ＣＲ９５０１）に特異的な少なくとも１つのエピトープをポリペプチドが依然として示すことを意味する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの４℃での保存時に少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１年間、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示す。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、前記変異のないＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、熱に曝されたときの安定性が増大している。特定の実施形態では、融合前ＲＥＶ  Ｆポリペプチドは、５５℃の温度で、好ましくは５８℃の温度で、より好ましくは６０℃の温度で少なくとも３０分間にわたり熱に安定である。「熱に安定」とは、例えば、実施例６に記載の方法による測定で、ポリペプチドが、少なくとも３０分間、高温（すなわち、５５℃以上の温度）に曝された後も依然として少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示すことを意味する。
【００４６】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、適切な製剤緩衝剤中で１〜６回の凍結融解サイクルに供された後に少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示す。
【００４７】
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明によるコード化ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸１〜２６に対応する、シグナル配列またはシグナルペプチドとも呼ばれるリーダー配列をさらに含む。これは、分泌経路に向かうことが運命付けられている新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（一般に、５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドはリーダー配列を含まない。
【００４９】
特定の実施形態では、ポリペプチドはＨＩＳタグを含む。Ｈｉｓタグまたはポリヒスチジンタグは、多くの場合、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にある、少なくとも５個のヒスチジン（Ｈ）残基からなる、タンパク質中のアミノ酸モチーフであり、一般には精製目的のために使用される。
【００５０】
本発明は、本発明によるＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子をさらに提供する。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドンの最適化方法は知られており、これまでに記載がなされている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合、配列がコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において好ましくないコドンと比べてより高頻度に使用されるコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにおいて見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられる。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列において使用される。好ましいコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。
【００５２】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。当業者は、ポリペプチドが発現されることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子によりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を、ルーチン的な手法を用いて行い得ることも理解される。したがって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
【００５３】
核酸配列は、通常の分子生物学技術を用いてクローン化され得るか、またはＤＮＡ合成により新規に作製され得、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、通常の方法を用いて実施され得る。
【００５４】
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適し、かつ目的の核酸の転写に使用することができる任意のベクターとすることができる。本発明による好適なベクターは、例えば、アデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。当業者は好適な発現ベクターを選択し、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入することができる。
【００５５】
融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞も本発明の一部を形成する。融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施形態では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドなどの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でそのポリペプチドをコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるポリペプチド発現を可能にすることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核酸の発現をもたらし得る配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識する。プロモーターは構成的であっても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
【００５６】
細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が、目的のタンパク質、ここでは融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを発現するようにルーチン的に選択することができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
【００５７】
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、宿主細胞に天然には存在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学手法によりベクターに導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さらなる調節配列を加えることもできる。多くのプロモーターは、導入遺伝子の発現のために使用することができ、当業者に知られており、例えば、これらは、ウイルス、哺乳動物、合成のプロモーターなどを含むことができる。真核生物細胞内での発現を得るのに適したプロモーターの非限定な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使用されている発現ベクター、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系列、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどが当該技術分野で商用供給源から入手可能であり、これらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または好適なプロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することができる。
【００５８】
細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞の培養および懸濁培養など、任意のタイプの細胞培養であってよい。多くの大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチまたはフェドバッチ工程として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあり、また好適でもある。好適な培地も当業者によく知られており、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコルに従って注文生産することが可能である。培養は、例えば、バッチ、フェドバッチ、連続系などを用いて、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で実施し得る。細胞の好適な培養条件は知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９）を参照）。
【００５９】
本発明は、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子、および／またはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在しないエピトープを示す融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、このような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子および／またはベクターを含む組成物を提供する。本発明は、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを含む免疫原性組成物をさらに提供する。本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための、本発明による安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための方法であって、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。また、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用する薬剤を製造するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを提供する。
【００６０】
本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、またはベクターは、ＲＳＶ感染の防止（予防）および／または処置に使用することができる。特定の実施形態では、防止および／または処置は、ＲＳＶに感染しやすい患者群を標的にすることができる。そのような患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若齢者（例えば、５歳以下、１歳以下）、入院患者、および抗ウイルス性化合物で処置されたが、不十分な抗ウイルス応答を示した患者が挙げられる。
【００６１】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターは、例えば、ＲＳＶを原因とする疾患もしくは病態のスタンドアロンの処置および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防処置および／または治療処置と組み合わせて使用することができる。
【００６２】
本発明は、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを利用して、対象のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法をさらに提供する。特定の実施形態では、対象のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法は、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによる感染から生じる疾患または病態を防止、寛解、および／または処置するのに効果のあるポリペプチド、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、ＲＳＶの伝播の阻害もしくは低減、またはＲＳＶによる感染に関連した症状の１つもしくは複数の発症、進展、もしくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に見えるもしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはインフルエンザ感染の他の任意の計測可能な徴候の低減を指す。
【００６３】
ヒトなどの対象に投与するために、本発明は、本明細書に記載する融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくないまたは有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたは核酸分子は、凍結乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、無菌溶液として製剤化し、投与することが好ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥または医薬投与容器に充填される。一般に、溶液のｐＨは、ｐＨ３．０〜９．５、例えば、ｐＨ５．０〜７．５である。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、通常、薬学的に許容される好適な緩衝剤を含む溶液中に存在し、組成物はまた塩を含有してもよい。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれる。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは注射剤に製剤化することができる。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数のアジュバントをさらに含む。当該技術分野では、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントが知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のＲＳＶ  Ｆポリペプチドに対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生物のタンパク質（例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、抗原自体またはＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると同時に免疫応答を刺激する））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇの濃度のアルミニウム含有量で、アジュバントとして含んでいる。
【００６５】
融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子などのナノ粒子と組み合わせて、またはそれにコンジュゲートさせて投与することができる。融合前Ｆポリペプチドは、アジュバンドを含む、または含まないナノ粒子と組み合わせるか、その中に封入するか、またはそれにコンジュゲートさせることができる。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号明細書に記載されている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号明細書または米国特許第４，４７４，７５７号明細書に開示されている。
【００６６】
その他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、本発明による組成物を準備する工程、およびそれを薬学的に許容される組成物中に製剤化する工程を含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、特定の病原体または疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに効果的な活性成分を含有する薬剤または組成物を指し、これにより、病原体による感染に関連する症状または疾患の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減（最大で完全消失）する。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、および／または融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、入院に至る重篤な下気道疾患を防止し、対象のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。本発明による「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組合せワクチンであってもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明のワクチンとさらなる活性成分の併用製剤を投与することによって行われてもよい。
【００６８】
組成物は、対象、例えばヒト対象に投与することができる。単回投与のための組成物中のＲＳＶ  Ｆポリペプチドの総用量は、例えば約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、例えば１μｇ〜１ｍｇ、例えば１０μｇ〜１００μｇとすることができる。推奨用量の決定は実験により行われ、当業者にはルーチン的である。
【００６９】
本発明による組成物の投与は、標準投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔内、口腔内などの粘膜投与などの非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、例えばワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を認識している。
【００７０】
本明細書で使用する対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットなどのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００７１】
ポリペプチド、核酸分子、ベクター、および／または組成物はまた、初回免疫としてまたは追加免疫として、同種または異種初回免疫−追加免疫レジメンで投与することができる。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、通常、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に対象に組成物を投与した後（このような場合には「初回ワクチン接種」と呼ばれる）、１週〜１年、好ましくは２週〜４ヶ月のある時点で同じ対象に投与される。特定の実施形態では、投与は初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。
【００７２】
加えて、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに結合可能な抗体が個体の血清中にあるか否かを確定することにより、個体の免疫状態を検査するための診断ツールとして使用することができる。したがって、本発明はまた、患者のＲＳＶ感染の存在を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法であって、ａ）前記患者から得られた生体試料を本発明によるポリペプチドと接触させる工程と、ｂ）抗体−ポリペプチド複合体の存在を検出する工程とを含む方法に関する。
【００７３】
本発明は、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの融合前コンフォメーションを安定化させる方法であって、野生型ＲＳＶＦ１および／またはＦ２ドメインと比較して、ＲＳＶ  Ｆ１および／またはＦ２ドメイン中に少なくとも１つの変異を導入することを含み、その少なくとも１つの変異は、ＲＳＶ先端部の３重へリックス（アルファヘリックス１、４および５）における変異によるアルファへリックス４の可動または移動を止める方法をさらに提供する。特定の実施形態では、アルファ４中の少なくとも１つの変異は、２０３位のアミノ酸残基ＬｅｕのＩｌｅへの変異である。
【００７４】
このような方法によって得ることができ、かつ／または得られる安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドも上記のようなその使用と共に本発明の一部を形成する。
【実施例】
【００７５】
実施例１
ＲＶＳ  Ｆ融合前コンフォメーションの不安定な先端部を安定化させるために、安定化Ｓ２１５Ｐ変異およびＣ−末端フィブリチンモチーフを有する、準安定ＲＳＶ  Ｆ変異体にアルファ４のＬｅｕ２０３Ｉｌｅ置換を導入した。
【００７６】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現および精製
２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞内で組換えタンパク質を発現させた。製造業者の説明書に従い、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、３７℃、１０％ＣＯ２の振盪インキュベーター中で培養した。トランスフェクションから５日目に、Ｆタンパク質を含む培養上清を採取した。除菌ろ過した上清を使用時まで４℃で保存した。陽イオン交換クロマトグラフィーに次いでサイズ排除クロマトグラフィーを使用する２工程プロトコルにより組換えポリペプチドを精製した（図１）。イオン交換工程のために、培養上清を２容量の５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で希釈し、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に毎分５ｍｌで通した。次いで、カラムを、１０カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で洗浄し、１５％段階溶離の５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で溶出した。溶出液を濃縮し、ランニングバッファーとして４０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０およびｐＨ７．４を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりタンパク質をさらに精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥにより分析した（図２）。タンパク質はクマシーブリリアントブルーで染色して、ゲル上に可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの主バンドは、還元化試料では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＦ１およびＦ２ドメインに対応し、非還元化試料では、主バンドはジスルフィド結合で連結しているＦ１＋Ｆ２ドメインのサイズに対応する。Ｎａｔｉｖｅ  Ｐａｇｅでは、タンパク質の電気泳動移動度は、ＲＳＶ  Ｆ三量体の１つに対応する。精製したタンパク質の融合前コンフォメーションを、ＣＲ９５０１抗体に結合させることにより確認した（データは示さず）。精製した融合前三量体ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、次の分析まで４Ｃで保存した。
【００７７】
安定性試験
融合前タンパク質の融合後コンフォメーションへの自然転換能を保存安定性試験により評価した。粗製の細胞培養上清試料を４℃で保存し、上述の定量分析法により、Ｏｃｔｅｔ装置を使用して試料のＦタンパク質濃度を測定した。測定は、上清採取日（第１日）、および示した保存期間後に行った。ＣＲ９５０１は、融合前Ｆコンフォメーションのみを認識するモノクローナル抗体であり（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレット）、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質濃度の測定に使用した。
【００７８】
精製したタンパク質の温度安定性を示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。精製した融合前Ｆタンパク質を９６ウェル光学ｑＰＣＲプレート内でＳＹＰＲＯ橙色蛍光染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓ６６５０）と混合した。染料とタンパク質の最適濃度を実験により決定した（データは示さず）。タンパク質の希釈はすべてＰＢＳにより行い、減算参照用として染料のみを含有する陰性対照試料を使用した。測定はｑＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ  ７）により、次のパラメータを使用して行った：２５〜９５℃は毎秒０．０１５℃の速度で昇温。データは連続的に取得した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア（バージョン５．０４）を使用して、溶融曲線の１次導関数をプロットした。導関数曲線の最小点で溶融温度を算出した。
【００７９】
図３に示すように、Ｓ２１５Ｐ置換でのみ安定化させた準安定Ｆ変異体は、４℃で５日間の保存後、融合前に特異的なＭａｂ  ＣＲ９５０１へのほぼすべての結合を喪失していた。対照的に、ｌＬ２０３Ｉ置換を追加すると、この準安定ＲＳＶ  Ｆ変異体の安定性が劇的に増大した。採取日のＣＲ９５０１結合の全結合はより多く、４℃で１５日間の保存後でＣＲ９５０１結合のごく僅かな低下が観察された。Ｌｅｕ２０３のＩｌｅへの置換を追加することにより、Ｓ２１５Ｐの単一置換のみを含有する準安定融合前Ｆタンパク質と比べて、融合前Ｆ安定性の貯蔵安定性が増大する。ＤＳＦ実験によれば、Ｌ２０３Ｉ置換の追加により、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐ置換を含有する変異体（５７．０℃）と比べて、熱安定性も増大（５９．５℃）した（図４）。
【００８０】
コンストラクトの、発現レベル、保存安定性、およびＲＳＶ−Ｆの融合前コンフォメーションに特異的なＣＲ９５０１抗体との抗体結合について試験した。重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにこの抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を以下に示す。ＣＲ９５０１は、国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレット中の５８Ｃ５と呼ばれる抗体の結合領域を含む。
【００８１】
実施例２
本発明によれば、Ｌｅｕ２０３Ｉｌｅ置換と他の安定化変異との組み合わせにより、非常に安定なＲＳＶ  Ｆタンパク質が得られることが示された。
【００８２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現、精製および特徴付け
組換えタンパク質を発現させ、上記のように精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図５）。タンパク質はゲル上で、還元試料ではＲＳＶ  Ｆタンパク質のＦ１およびＦ２ドメインに対応するバンドのみが、および非還元試料では互いに結合したＦ１＋Ｆ２ドメインに対応するバンドのみが観察され、純粋であった。精製した試料のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析（図６）では、試料中に存在する唯一のタンパク質種が、グリコシル化ＲＳＶ  Ｆ三量体の予測された分子量に対応する約１７０ｋＤａの分子量を有することが示された。ＳＥＣ−ＭＡＬＳは、ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムによりを行った。ＭＡＬＳ測定は、ＭｉｎｉＤＡＷＮ  Ｔｒｅｏｓインライン検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行った。タンパク質濃度は、２８０ｎｍのＵＶモニターおよび６６０ｎｍの屈折率検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ  ＴｒＥＸ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してモニターした。次の順序で検出器の垂直性を調べた：ＵＶ、ＭＡＬＳ、ＲＩ。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験では、ＭＡＬＳバッファー（１７．３ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４＊２  Ｈ２Ｏ／Ｌ、７．３ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ／Ｌ、２．９ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ、ｐＨ７）および流量１ｍｌ／ｍｉｎを用いた。屈折率検出器および０．１４１ｍｌ／ｇの屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を使用し、Ａｓｔｒａソフトウェア６．１（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりデータを分析した。屈折率結果のピークの最大値を使用して分子量を決定し、吸光係数で補正したＵＶ−信号の全ピーク面積％を使用して全ピーク面積を決定する。
【００８３】
安定性試験
実施例１で記載したように、精製したタンパク質の温度安定性を示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。図４に示すように、Ｌ２０３Ｉ置換をＳ２１５ＰおよびＤ４８６Ｎと組み合わせた場合、Ｎ６７Ｉの有無にかかわらず、タンパク質の熱安定性はそれぞれ約６７℃および約７０℃に増大する。
【００８４】
【表１】
2018527897.tif 000002
【００８５】
【表２】
2018527897.tif 000003
【００８６】
融合前ＲＳＶ  Ｆコンストラクトのいくつかのアミノ酸配列を以下に示す。本明細書に記載の異なるコンストラクトにおけるアミノ酸の番号付与は、野生型配列（２つの修飾（Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖ）を含む配列番号１３）に基づいていることに留意されたい。
【００８７】
配列
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ａ２完全長配列（配列番号１３）
【化１】
2018527897.tif 000004
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｂ１完全長配列（配列番号１５）
【化２】
2018527897.tif 000005
配列番号１４（フィブリチン）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｓ２１５Ｐ（配列番号２０）
【化３】
2018527897.tif 000006
ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ（配列番号２１）
【化４】
2018527897.tif 000007
ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ（配列番号２３）
【化５】
2018527897.tif 000008
ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｎ６７Ｉ、Ｉ７６Ｖ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ（配列番号２４）
【化６】
2018527897.tif 000009
ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＣＬ５７−ｖ２２４完全長配列（配列番号２２）
【化７】
2018527897.tif 000010
ＣＲ９５０１重鎖（配列番号１６）：
【化８】
2018527897.tif 000011
ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号１７）：
【化９】
2018527897.tif 000012
ＣＲ９５０２重鎖（配列番号１８）：
【化１０】
2018527897.tif 000013
ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号１９）：
【化１１】
2018527897.tif 000014
【図１−１】
2018527897.tif 000015
【図１−２】
2018527897.tif 000016
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018527897.tif 000024
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