(57)【要約】  本開示は、癌を処置するための組成物および方法に関し、より具体的には、トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体とを含む方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする宿主中の癌の処置のためのリポソームイリノテカンとニボルマブとの組み合わせの使用であって、前記癌の処置において治療上相乗的である投与の量およびスケジュールでの使用。
【請求項２】
前記スケジュールが、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で５０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記スケジュールが、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で４３ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記スケジュールが、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で７０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記スケジュールが、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記癌が、黒色腫、ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記癌が黒色腫である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記リポソームイリノテカンが、イリノテカンを含む水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化状態または沈殿状態でカプセル封入する直径約１１０ｎｍの単層脂質二重層小胞を有するリポソームを含み、前記小胞が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬで構成されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
各ｍＬがまた、緩衝剤としての２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）４．０５ｍｇ／ｍＬおよび等張剤としての塩化ナトリウム８．４２ｍｇ／ｍＬも含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記宿主がヒトであり且つＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型でないことが分かっている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗新生物剤リポソームイリノテカンと３ｍｇ／ｋｇの抗新生物剤ニボルマブとの組み合わせを、合計で少なくとも６週間にわたり２週間毎に１回ヒト宿主に投与し、リポソームイリノテカンの各投与が、合計で４３、５０、７０または８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）の投与、続いてリポソームイリノテカンと同日での３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与を含み、前記６週間の間は他の抗新生物剤を投与しない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
必要とする宿主中の癌の処置のためのリポソームイリノテカンとペンブロリズマブとの組み合わせの使用であって、前記癌の処置において治療上相乗的である投与の量およびスケジュールでの使用。
【請求項１３】
前記スケジュールが、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の２ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記スケジュールが、以下の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：２週間にわたり２週間毎に１回の合計で４３、５０、７０または８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）および３週間毎に１回の２ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブの投与、ならびに悪化または許容されない毒性を観測するまで前記処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記スケジュールが、以下の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：２週間にわたり２週間毎に１回の合計で８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）および３週間毎に１回の２ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブの投与、ならびに悪化または許容されない毒性を観測するまで前記処置サイクルを繰り返すことを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記癌が、黒色腫、ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣからなる群から選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌が黒色腫である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記リポソームイリノテカンが、イリノテカンを含む水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化状態または沈殿状態でカプセル封入する直径約１１０ｎｍの単層脂質二重層小胞を有するリポソームを含み、前記小胞が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬで構成されている、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の使用。ＭＭ−３９８
【請求項１９】
前記癌の処置のために他の抗新生物剤を投与しない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２１９，５４８号明細書の優先権の利益を主張し、この開示は、その全体が本明細書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は癌を処置するための組成物および方法に関し、より具体的には、トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを含む方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般に、癌は、細胞分裂、分化およびアポトーシス細胞死を制御する正常プロセスの調節解除に起因し、無制限の増殖、局所的増殖および全身転移の可能性を有する悪性細胞の増殖を特徴とする。正常プロセスの調節解除には、シグナル伝達経路での異常と、正常細胞で見られるものとは異なる因子への応答とが含まれる。
【０００４】
トポイソメラーゼはＤＮＡ酵素のファミリであり、ＤＮＡの巻き戻しならびに複製および転写の間中でのねじれひずみの緩和に関与する。トポイソメラーゼは、正常な細胞周期中にＤＮＡ鎖のホスホジエステル主鎖の切断および再結合を触媒することによりＤＮＡ構造の変化を制御する核酵素である。この酵素は、他のＤＮＡ鎖の通過の一時的なゲートまたは中心点としての機能を果たす酵素架橋鎖切断を形成することによりＤＮＡを緩和させる。トポイソメラーゼ阻害剤は、このＤＮＡトポイソメラーゼの切断−再結合反応を妨げるように思われ、最終的には細胞死を引き起こす。トポイソメラーゼ阻害剤は癌細胞増殖を阻害するのに有効であることが分かっている。
【０００５】
腫瘍細胞自体の増殖を防止することに加えて、標的腫瘍細胞に対する患者自身の免疫応答を刺激することは癌治療のための別の選択肢であり、多くの研究により、腫瘍抗原を使用して免疫応答を誘導する免疫療法の有効性が実証されている。ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド−１）はＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）に結合し、そのため両方とも、免疫および自己免疫寛容を含む免疫系機能の調節において役割を果たす。ＰＤ−Ｌ１は腫瘍中で発現され、ＰＤ−Ｌ１の上方調節により癌が宿主の免疫系を回避することが可能になり得ると思われる。そのため、ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１経路を介した阻害シグナルを妨げることは、抗腫瘍免疫を増強させるための治療選択肢である。プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体の活性化をブロックする抗体は、癌細胞を標的とするために免疫細胞を強化するのに有効であることが分かっているが、長期にわたる応答は、免疫療法で処置された患者のほんの一部で観測されるだけである。
【０００６】
黒色腫は高度に侵襲型の皮膚癌であり、この罹患率および死亡率は絶えず増加している。抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体のような免疫療法剤の開発により、黒色腫の処置で根本的な進歩がもたらされた。しかしながら、長期にわたる応答は、免疫療法で処置された黒色腫患者のほんの一部で観測されるだけである。この不足は、腫瘍感受性または免疫療法に対する抵抗性を支配する分子メカニズムの更なる理解の必要性を強調する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの進歩にもかかわらず、癌を処置するために、改善された方法および組成物が依然として必要とされている。本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害するためにおよび抗腫瘍免疫を増強するために治療アプローチを組み合わせることに関する。例えば、腫瘍の免疫療法に対して観測された臨床応答は不均一であり、様々な因子に起因して一部の患者では制限されており、この因子として、例えば免疫無菌腫瘍を有する患者、より高い突然変異負荷、患者の癌の間の遺伝的差異または後成的差異に起因する腫瘍内および腫瘍間の変動性、ならびに腫瘍学の分野では免疫療法に対する応答または抵抗性を媒介すると信じられている他の未知のメカニズムが挙げられる。結果として、免疫療法に対する応答を正確に予測することができないことに起因して、免疫療法は一部の患者では臨床的利益が制限されている。腫瘍をより免疫原性にし且つ腫瘍処置における免疫療法の有効性を高める必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一部の実施形態では、本発明者らは、特定の生物活性化合物で腫瘍細胞を処置することにより、Ｔ細胞媒介性の細胞毒性への患者由来の腫瘍細胞の感受性を増強することができることを発見しており、それにより、癌免疫療法の有効性を改善するための新規の組み合わせ薬物療法が提供される。例えば、本発明者らは本明細書において、癌の処置でのＴｏｐ１阻害剤と免疫ベースの治療との間の相乗効果を開示する。本発明は、自己Ｔ細胞への曝露前のＴｏｐ１阻害剤による黒色腫腫瘍細胞の処置により、活性化カスパーゼ３の細胞内染色により測定してＣａｌｃｕＳｙｎを使用して算出した場合に腫瘍細胞死が相乗的に増加したという発見に部分的に基づく。
【０００９】
一実施形態では、Ｔ細胞媒介性の細胞毒性をアッセイするためのスクリーニングアプローチが開示されている。別の実施形態では、特定のトポイソメラーゼＩ阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ媒介性死滅を相乗的に改善させることができ且つｉｎ  ｖｉｖｏでリポソームイリノテカン（例えばＭＭ−３９８）と抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体との組み合わせを使用して抗腫瘍応答を増強することができる治療用組み合わせ等の、細胞媒介性免疫療法の増強剤として同定されている。別の実施形態では、ｐ５３調節遺伝子の役割は、Ｔｅａｐの上方調節を引き起こすトポイソメラーゼ１阻害、関連する表現型を再現することを観測したＴｅａｐ過剰発現およびＴｅａｐのノックダウンが関連する表現型を妨げるという観測等の、Ｔ細胞媒介性死滅に対する応答の増強で重要や役割と果たすと同定されている。
【００１０】
Ｔ細胞媒介性の細胞毒性に対する黒色腫細胞の感受性を増加させる化合物を同定するために、自己患者由来腫瘍細胞系統および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたカスパーゼ３ベースのハイスループットスクリーニングで用いた。このスクリーニングは、８５０個の生物活性化合物のライブラリからなった。黒色腫細胞のＴ細胞死滅を最も増強し得た化合物の一群は、トポテカンおよびイリノテカン等のトポイソメラーゼＩ（Ｔｏｐ１）阻害剤であった。また、本明細書で開示されているのは、イリノテカンのナノ粒子リポソーム製剤と組み合わせて共阻害分子プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体で処置した腫瘍担持マウスにおいて、抗体または薬物のいずれかのみで処置したコホートと比べて良好な抗腫瘍効果が観測されたｉｎ  ｖｉｖｏモデルでもある。これらの発見は、黒色腫の処置でのＴｏｐ１阻害剤と免疫ベースの治療との間の相乗作用に関する。
【００１１】
黒色腫のＴ細胞媒介性死滅へのＴｏｐ１阻害剤の効果を媒介する分子因子を同定するために、Ｔｏｐ１の阻害により誘発されるゲノム変化およびプロテオミクス変化を現在研究している。本発明者らの目的は、免疫抑制を緩和し得る且つ細胞毒性Ｔ細胞ベースの免疫療法の活性を増強し得る、黒色腫腫瘍細胞および／または腫瘍微小環境でＴｏｐ１阻害により媒介される分子変化を同定することである。
【００１２】
提供されるのは、生体試料中の癌細胞を死滅させる方法であって、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体とを接触させることを含む方法である。
【００１３】
提供されるのは、生体試料中の癌細胞の増殖を阻害する方法であって、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体とを接触させることを含む方法である。
【００１４】
提供されるのは、必要とする対象中の癌を処置する方法であって、この対象に有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む方法である。
【００１５】
提供されるのは、癌を処置する方法であって、治療上有効な量のα−ＰＤＬ−１抗体およびトポイソメラーゼＩ阻害剤の投与を含む方法である。一態様では、癌を処置する方法は、必要とする患者に、治療上有効な量のα−ＰＤＬ−１抗体、続いてトポイソメラーゼＩ阻害剤を投与することを含むことができる。別の態様では、このトポイソメラーゼＩ阻害剤は、ＭＭ−３９８等のリポソームイリノテカン製剤である。
【００１６】
提供されるのは、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物である。
【００１７】
提供されるのは、癌の処置で使用するための、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物である。
【００１８】
提供されるのは、癌を処置するための薬剤の製造のための、請求項２３で列挙された組成物の使用である。
【００１９】
提供されるのは、必要とする対象中の癌を処置するためのキットであって、ａ）トポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体と、ｂ）癌を処置するために有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与するための指示書とを含むキットである。
【００２０】
提供されるのは、生体試料中の癌細胞を死滅させる方法であって、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体とを接触させることを含む方法である。
【００２１】
提供されるのは、生体試料中の癌細胞の増殖を阻害する方法であって、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体とを接触させることを含む方法である。
【００２２】
提供されるのは、必要とする対象中の癌を処置する方法であって、この対象に有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体を投与する工程を含む方法である。
【００２３】
提供されるのは、癌を処置する方法であって、治療上有効な量のα−ＰＤ−１抗体およびトポイソメラーゼＩ阻害剤の投与を含む方法である。一態様では、癌を処置する方法は、必要とする患者に、治療上有効な量のα−ＰＤ−１抗体、続いてトポイソメラーゼＩ阻害剤を投与することを含むことができる。別の態様では、このトポイソメラーゼＩ阻害剤は、ＭＭ−３９８等のリポソームイリノテカン製剤である。
【００２４】
提供されるのは、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体を含む組成物である。
【００２５】
提供されるのは、癌の処置で使用するための、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体を含む組成物である。
【００２６】
提供されるのは、癌を処置するための薬剤の製造のための、請求項２３で列挙された組成物の使用である。
【００２７】
提供されるのは、必要とする対象中の癌を処置するためのキットであって、ａ）トポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体と、ｂ）癌を処置するために有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−１抗体を対象に投与するための指示書とを含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】活性化カスパーゼ３に対しても陽性である腫瘍細胞（細胞トラッカー色素ＤＤＡＯで染色した）を決定するためのＦＡＣＳ分析（図１Ａ）および得られたデータの概略（図１Ｂ）を示す図である。
【図２】パーセント活性化カスパーゼ３により測定した場合の、３時間にわたる様々なエフェクターＴ細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比での自己ＴＩＬ処置による、患者由来の黒色腫細胞系統２３３８（図２Ａ、上部）および２４００（図２Ｂ、下部）からの黒色腫細胞のＴ細胞媒介性死滅へのＴｏｐ１阻害剤（ＴＩＬ）の相乗効果を示す図である。
【図３】Ｔｏｐ１阻害剤ＳＮ３８とＴ細胞の細胞毒性との組み合わせ指数を示す図である。
【図４】５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞をｓｃ接種し、次いでビヒクル、ＳＮ３８、α−ＰＤ−Ｌ１、またはＳＮ３８とα−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ（図４Ａ）、または遊離イリノテカンまたはＭＭ−３９８（図４Ｂ）で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスでの２つのｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。図４Ａは、ＳＮ３８とα−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせがＳＮ３８のみまたはα−ＰＤ−Ｌ１のみと比べて良い傾向があったが有意ではなかったことを示す。図４Ｂは、ＭＭ−３９８によるｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答が遊離イリノテカンと比べて有意に高いこと、および用量と共に有効性が増加することを示す（＊はＰ＜０．０００１を示す）。図４Ｃは、５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞をｓｃ接種し、次いでビヒクル、ＳＮ３８、α−ＰＤ−Ｌ１、またはＳＮ３８とα−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を示す。これは、腫瘍接種の７日後（図４Ａ）とは対照的に、処置を腫瘍接種の３日後に開始した（図４Ｃ）という顕著な変化を有する、図４Ａで示される実験の繰り返しである。図４Ｃで示すデータは、図１０で説明されている実験から得られた。これは、ＳＮ３８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせで処理された腫瘍担持マウスで観測された腫瘍制御は、コントロール群またはＳＮ３８のみもしくは抗ＰＤ−Ｌ１のみで処理されたコホートと比較して増強されていることを示す。
【図５】図５Ａは、マウス異種移植モデルにおいて実施例３の表２で説明したＭＭ−３９８リポソームイリノテカンおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与後に経時的に測定した腫瘍容積を示すグラフであり、図５Ｂは生存曲線（図５Ｂ）の対応するプロットである。図５Ｃは、本発明者らの前臨床マウスモデルでのＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせの抗腫瘍効果を決定するために設計された実験の概略を示す図である。
【図６】Ｔｏｐ１阻害後の抗原プロセシング遺伝子での遺伝子発現変化を示す図である。図６Ａのヒートマップは、抗原提示に関与する遺伝子のサブセットの差次的発現を表す。図６Ｂのヒートマップは、マイクロアレイ分析からのＴｏｐ１阻害後に差次的に発現された遺伝子のサブセットを表す。図６Ｂでは、折り畳み変化スペクトルの最も左側（下方調節を示す）は、上方調節と区別するために輪郭が描かれており、このアレイで下方調節された遺伝子（２４００および２５４９でのＡＰＡＦ１およびＵＳＰ１５、ならびに２５４９でのＥＧＲ１）も同様に輪郭が描かれている。
【図７】ナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ）ＭＭ３９８を示す図である。
【図８】図８Ａは、本明細書の組み合わせスコアを検出するための式を示し、図８Ｂは、特定のＴｏｐ１阻害剤化合物に関して選択されたデータ点を標識する散布図である。図８Ｃは、特定のトポイソメラーゼ１阻害剤およびＴ細胞（実施例１）に曝露された％カスパーゼ陽性腫瘍細胞に対してプロットされた、特定のトポイソメラーゼ１阻害剤に曝露された％カスパーゼ陽性腫瘍細胞を示す散布図である。
【図９】パーセント活性化カスパーゼ３で測定した場合の、３時間にわたる様々なエフェクターＴ細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比での自己ＴＩＬによる処置と併せた処置による、患者由来の黒色腫細胞系統２３３８（図９Ａ）および２４００（図９Ｂ、下部）からの黒色腫細胞のＴ細胞媒介性死滅へのＴｏｐ１阻害剤および自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の相乗効果を示す棒グラフである。図９Ａおよび図９Ｂのそれぞれでは、３つのバーのうちの最も左側の群の細胞はＴｏｐ１阻害剤またはＴＩＬで処理されておらず、（左から）２番目のバーで測定された細胞はＴｏｐ１阻害剤のみで処理されており、（左から）３番目のバーで測定された細胞はＴＩＬで処理されており、一番右のバーに関するデータは、ＴＩＬおよびＴｏｐ１阻害剤の相乗的組み合わせから得られた。
【図１０】様々な免疫調節化合物およびＴｏｐ１阻害剤ＳＮ３８の投与後の異種移植癌モデルでの経時的な腫瘍容積を示すグラフである。ＳＮ３８はイリノテカンの代謝産物である。
【図１１】ＳＮ３８および／または抗４１ＢＢ（図１１Ａ）、ＳＮ３８および／または抗ＣＴＬＡ−４（図１１Ｂ）、ＳＮ３８および／または抗Ｏｘ４０（図１１Ｃ）ならびにＳＮ３８および／または抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ４抗体（図１１Ｄ）の投与後に得られた癌異種移植モデルを示す折れ線グラフである。
【図１２】様々な免疫細胞集団へのＭＭ−３９８リポソームイリノテカンおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を決定するための動物モデル実験の概略を示す図である。
【図１３】ＣＤ８／グラム（図１３Ａ）、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ（図１３Ｂ）、ＧｒａｎｚＡ／グラム（図１３Ｃ）、ＧｒａｎｚＢ／グラム（図１３Ｄ）およびＭａｃ／グラム（図１３Ｅ）等の、図１２の動物モデル試験から得られた測定値を示すグラフである。
【図１４】Ｔｏｐ１阻害後のＴＰ５３ＩＮＰ１の変化を示すグラフである。
【図１５】２５４９Ｔｅａｐでの相対的なｍＲＮＡの発現および過剰発現（図１５Ａ）ならびに％カスパーゼ３陽性（図１５Ｂ）の測定値を示すグラフの一群である。
【図１６】２５４９Ｔｅａｐ  ＫＯでの相対的なｍＲＮＡ発現および遺伝子サイレンシング（図１６Ａ）ならびに％カスパーゼ３陽性（図１６Ｂ）の測定値を示すグラフの一群である。
【図１７Ａ】必要とするヒトへのＭＭ−３９８リポソームイリノテカンとニボルマブとの組み合わせを投与する第１の方法の概略を示す図である。
【図１７Ａ】必要とするヒトへのＭＭ−３９８リポソームイリノテカンとニボルマブとの組み合わせを投与する第２の方法の概略を示す図である。
【図１８】マウス異種移植モデル（図１８Ｂ）における経時的な腫瘍容積のプロットおよび生存曲線（図１８Ｃ）を含む、ナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ、ＭＭ−３９８）をα−ＰＤ１抗体を組み合わせた場合にｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答および生存が増加することを実証する図である。データを、図１８Ａの概略で説明された実験から得た。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
略語および定義
本開示の理解を容易にするために、本明細書で使用されている多くの用語および略語を以下のように定義する。
【００３０】
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、この要素のうちの１つまたは複数が存在することを意味すると意図されている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する」は包括的であることが意図されており、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【００３１】
用語「および（ａｎｄ）／または（ｏｒ）」、２つ以上の項目のリストで使用される場合には、列挙された項目のいずれか１つが、単独でまたは列挙された項目のいずれか１つもしくは複数との組み合わせで用いられ得ることを意味する。例えば、語句「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢのいずれかまたは両方を意味するように意図されており、即ちＡのみ、Ｂのみ、またはＡおよびＢの組み合わせを意味するように意図されている。語句「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢの組み合わせ、ＡおよびＣの組み合わせ、ＢおよびＣの組み合わせ、またはＡ、ＢおよびＣの組み合わせを意味するように意図されている。
【００３２】
用語「約」は、本明細書で使用される場合、化合物の量、用量、時間、温度および同類のもの等の測定可能な値を指す場合に指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％または更に０．１％の変動を包含するように意図されている。
【００３３】
カンプトテシンは癌の処置で使用される薬物であり、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩを阻害する。このカンプトテシンのＩＵＰＡＣ名は（Ｓ）−４−エチル−４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオンである。
【００３４】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、投与される組成物に含まれるトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体の量が、意図された目的を達成するのに（例えば、この場合には、生体試料中の癌細胞を死滅させるのに、生体試料中の癌細胞の増殖を阻害するのに、または必要とする対象中の癌を処置するのに）十分な量であることを意味する。
【００３５】
用語「ヒト化モノクローナル抗体」は、抗体（または断片）のフレームワーク領域中の露出したアミノ酸の少なくとも一部（最も相同なヒトカウンターパート中の対応するアミノ酸と一致しない）が例えば抗体をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発により変化していることを意味する。用語「ヒト化モノクローナル抗体」はまた、非ヒト細胞系統からのハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体の軽可変領域および重可変領域がそれぞれ、組換え技術を介して１つのヒト軽鎖定常領域および少なくとも１つの重鎖定常領域に付着されているキメラ抗体も含む。
【００３６】
イリノテカンは癌の処置に使用される薬物であり、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩを阻害する。このイリノテカンのＩＵＰＡＣ名は（Ｓ）−４，１１−ジエチル−３，４，１２，１４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−３，１４−ジオキソ１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−９−イル−［１，４’ビピペリジン］−１’−カルボキシレートである。
【００３７】
ラメラリンＤは癌の処置で使用される薬物であり、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩを阻害する。このラメラリンＤのＩＵＰＡＣ名は３，１１−ジヒドロキシ−１４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２，１２−ジメトキシ−６Ｈ−クロメノ［４’，３’：４，５］ピロロ［２，１−ａ］イソキノリン−６−オンである。
【００３８】
ＭＭ−３９８は、安定したカプセル封入および長期にわたる循環のために操作されたイリノテカン（約８０，０００個の分子／リポソーム）のリポソームカプセル封入体であるナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ）である。血中でＭＭ−３９８により送達される総イリノテカンのＡＵＣ０−ｔは１，６５２時間・μｇ／ｍＬ（１２０ｍｇ／ｍ２）であり、活性代謝産物ＳＮ−３８のＡＵＣ０−ｔは４７６時間・ｎｇ／ｍＬである。血液中の総イリノテカンのＴ１／２は２１．２時間であり、ＳＮ−３８のＴ１／２は８８．８時間である。ＭＭ−３９８は、商品名ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）（イリノテカンリポソーム注射剤）（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で販売されている。
【００３９】
ニボルマブはプログラム細胞死受容体１に対するヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、癌の処置で使用される。
【００４０】
ペンブロリズマブはプログラム細胞死受容体１に対するヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、癌の処置で使用される。
【００４１】
ＳＮ−３８はイリノテカンの活性代謝産物であり、このＳＮ−３８はイリノテカン自体と比べて１０００倍活性である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、イリノテカンに対してＳＮ−３８の効力が２〜２０００倍変化することを示す。このＳＮ−３８のＩＵＰＡＣ名は（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオンである。
【００４２】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は当分野で既知であり、多数の供給源から容易に得られ得るマウスＰＤ−Ｌ１−ＰＥ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）が挙げられる（例えばＢｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ，１０  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒ．，Ｓｕｉｔｅ  ２Ｂ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ  ０３７８４−１６７１  ＵＳＡ）。また、Ｒｏｄｉｇ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤ−Ｌ１  ａｎｄ  ＰＤ−Ｌ２  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ，”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；３３：３１１７−３１２６；Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｆｅｂ  １；１７０（３）：１２５７−６６；およびＤｒｅｅｓ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ＰＤ−Ｌ１  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，２０１４  Ｆｅｂ；９４：６０−６も参照されたい。アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブおよびデュルバルマブは開発中の抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００４３】
抗ＰＤ−１抗体は当分野で既知であり、ニボルマブおよびペンブロリズマブが挙げられる。
【００４４】
用語トポイソメラーゼＩ阻害剤は、正常な細胞周期中にＤＮＡ鎖のホスホジエステル主鎖の切断および再結合を触媒することによりＤＮＡ構造の変化を制御するトポイソメラーゼ酵素Ｉの作用を妨げるように設計された薬剤を指す。
【００４５】
用語相乗作用は、治療薬の組み合わせによる処置が、最適用量で使用されるこの組み合わせの個々の成分により達成される転帰に対して治療上優れた転帰を示す現象を指す（Ｔ．Ｈ．Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６６，１１８７）。この文脈では、治療上優れた転帰とは、患者が、ａ）有害事象のより低い発生を示す一方で、この組み合わせの個々の成分がこの組み合わせのときと同じ用量で単剤療法としてそれぞれ投与される場合と等しいもしくはこの場合を超える治療上の利益を受ける転帰、または、ｂ）容量制限の毒性は示さないが、各成分が個々の成分として投与される場合と同じ組み合わせ中の用量で投与される場合にこの組み合わせの個々の成分での処置の治療上の利益を超える治療上の利益を受ける転帰のことである。異種移植モデルでは、各成分がその個々の最大耐量を概して超えない用量で存在する組み合わせ（最大耐量で使用される）は、この組み合わせの投与により達成される腫瘍増殖の減少が、成分が単独で投与された場合に最良の成分の腫瘍増殖の減少の値よりも大きい場合に治療上の相乗作用を示す。
【００４６】
そのため、組み合わせでは、そのような組み合わせの成分は、単剤療法と比較して膵腫瘍増殖の抑制への相加効果または超相加効果を有する。「相加」は、個々の成分による単剤療法により達成された最良の別個の結果と比べて程度（例えば、腫瘍有糸分裂指数もしくは腫瘍増殖の減少の程度、または腫瘍縮小もしくは症状がないもしくは症状低下の期間の頻度および／もしくは持続時間の程度）が大きい結果を意味し、「超相加」は、そのような別個の結果の合計の程度を超える結果を示すために使用される。
【００４７】
トポテカンは癌の処置に使用される薬物であり、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩを阻害する。このトポテカンのＩＵＰＡＣ名は（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオンモノヒドロクロリドである。
【００４８】
α−ＰＤ−Ｌ１抗体は、プログラム細胞死リガンド１を標的とすることにより免疫系を活性化させるように働くモノクローナル抗体である。α−Ｐｄ−１抗体は、プログラム細胞死タンパク質１を標的とすることにより免疫系を活性化させるように働くモノクローナル抗体である。ＰＤ−１はＰＤ−Ｌ１の受容体であることから、これらの標的のいずれかとの干渉（例えば阻害）（それらの間の相互作用の阻害）により、免疫チェックポイント遮断による癌細胞の免疫標的化の改善が可能になる。
【００４９】
用語「対象」にはヒト等の全ての哺乳動物が含まれ、この「対象」は用語「患者」および「宿主」と等価である。対象の例として、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよびウサギが挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
【００５０】
方法
提供されるのは、生体試料中の癌細胞を死滅させる方法であって、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを接触させることを含む方法である。
【００５１】
提供されるのは、生体試料中の癌細胞の増殖を阻害する方法であって、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを接触させることを含む方法である。
【００５２】
提供されるのは、必要とする対象中の癌を処置する方法であって、この対象に有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体を投与する工程を含む方法である。特定の実施形態では、このα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
【００５３】
特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００５４】
特定の実施形態では、癌は、皮膚癌またはそれらの異型から選択される。
【００５５】
特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体の投与は逐次的である。
【００５６】
特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与をα−ＰＤ−Ｌ１抗体の投与前に行なう。
【００５７】
特定の実施形態では、α−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体の投与をトポイソメラーゼＩ阻害剤の投与前に行なう。
【００５８】
特定の実施形態では、α−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とトポイソメラーゼＩ阻害剤との投与は本質的に同時である。
【００５９】
特定の実施形態では、α−ＰＤ−１抗体は、ニボルマブおよびペンブロリズマブから選択される。
【００６０】
特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびラメラリンＤから選択される。一部の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤がイリノテカンである、請求項１２に記載の方法。一部の実施形態では、イリノテカンは、リポソーム（リポソームイリノテカン）を含む組成物で提供される。
【００６１】
特定の実施形態では、イリノテカンは、水性媒体中にリポソームを含む組成物で提供され、このリポソームは、膜により水性媒体から分離された内部水性空間を有し、この膜は脂質を含み、この脂質は非荷電脂質成分および中性リン脂質を含み、リポソームの内側に以下が封入されており：
ａ．イリノテカンおよびスクロースオクタ硫酸塩、または
ｂ．イリノテカンおよびスクロースオクタ硫酸塩および置換アンモニウム化合物、
哺乳動物の血流に投与された場合には、前記イリノテカンは前記リポソームからの半放出時間（ｈａｌｆ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｉｍｅ）が少なくとも２４時間であり、リポソームの内側に封入されたイリノテカンは、水性媒体中のイリノテカン濃度を超える濃度である。
【００６２】
特定の実施形態では、リポソームイリノテカンはナノリポソームイリノテカンである。特定の実施形態では、リポソームイリノテカンはＭＭ−３９８（ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標））である。
【００６３】
特定の実施形態では、本方法は少なくとも１回のサイクルを含み、リポソームイリノテカンを、患者がＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型である場合を除いて約６０〜約１８０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクルの１日目に投与し、約４０〜約１２０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクル１の１日目にリポソームイリノテカンを投与し、このサイクルは２〜３週間の期間である。特定の実施形態では、患者がＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型である場合を除いて、約９０〜約１５０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクルの１日目にリポソームイリノテカンを投与し、約６０〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量でサイクル１の１日目にリポソームイリノテカンを投与する。特定の実施形態では、本方法は少なくとも１回のサイクルを含み、患者がＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型である場合を除いて、１２０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクルの１日目にリポソームイリノテカンを投与し、８０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクル１の１日目にリポソームイリノテカンを投与する。特定の実施形態では、このサイクルは２週間の期間である。特定の実施形態では、このサイクルは３週間の期間である。
【００６４】
また、本明細書で提供されるのは、必要とする宿主中の癌の処置の方法であって、この宿主に有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−１抗体またはα−ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかとを投与する工程を含む方法でもある。特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−１抗体またはα−ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかとをそれぞれ、前記癌の処置において治療上相乗的である投与の量およびスケジュールで投与する。特定の実施形態では、この方法は、この宿主に有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−１抗体とを投与する工程を含む。特定の実施形態では、この方法は、この宿主に有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体とを投与する工程を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤はイリノテカンである。特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤はリポソームイリノテカンである。特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤はＭＭ−３９８である。
【００６６】
特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−１抗体またはα−ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかとを２〜３週毎に投与する。
【００６７】
特定の実施形態では、α−ＰＤ−１抗体は、ニボルマブおよびペンブロリズマブから選択される。
【００６８】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、必要とする宿主中の癌の処置方法であって、前記癌の処置において治療上相乗的である投与の量およびスケジュールでのリポソームイリノテカンとニボルマブとの組み合わせの投与を含む方法である。
【００６９】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で５０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００７０】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で４３ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００７１】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で７０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００７２】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００７３】
特定の実施形態では、癌は、黒色腫、膵癌、結腸直腸癌、ホジキンリンパ腫、ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣからなる群から選択される。特定の実施形態では、癌は、黒色腫、ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣからなる群から選択される。特定の実施形態では、例えば癌は黒色腫である。
【００７４】
特定の実施形態では、リポソームイリノテカンは、イリノテカンを含む水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化状態または沈殿状態でカプセル封入する直径約１１０ｎｍの単層脂質二重層小胞を有するリポソームを含み、この小胞は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬで構成されている。
【００７５】
特定の実施形態では、各ｍＬはまた、緩衝剤としての２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）４．０５ｍｇ／ｍＬおよび等張剤としての塩化ナトリウム８．４２ｍｇ／ｍＬも含む。
【００７６】
特定の実施形態では、宿主はヒトであり、且つＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型でないことが分かっている。
【００７７】
特定の実施形態では、抗新生物剤リポソームイリノテカンと３ｍｇ／ｋｇの抗新生物剤ニボルマブとの組み合わせとを、合計で少なくとも６週間にわたり２週間毎に１回ヒト宿主に投与し、リポソームイリノテカンの各投与は、合計で４３、５０、７０または８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）の投与、続いてリポソームイリノテカンと同日での３ｍｇ／ｋｇのニボルマブの投与を含み、この６週間の間は他の抗新生物剤を投与しない。
【００７８】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、必要とする宿主中の癌の処置方法であって、前記癌の処置において治療上相乗的である投与の量およびスケジュールでのリポソームイリノテカンとペンブロリズマブとの組み合わせの投与を含む方法である。
【００７９】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の２８日間の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：合計で８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）、続いて２週間にわたり２週間毎に１回の２ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブの投与、および悪化または許容されない毒性を観測するまで前記２８日間の処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００８０】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：２週間にわたり２週間毎に１回の合計で４３、５０、７０または８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）および３週間毎に１回の２ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブの投与、ならびに悪化または許容されない毒性を観測するまで前記処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００８１】
特定の実施形態では、前記スケジュールは、以下の処置サイクルの間にヒト宿主に投与すること：２週間にわたり２週間毎に１回の合計で８０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカン（遊離塩基）および３週間毎に１回の２ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブの投与、ならびに悪化または許容されない毒性を観測するまで前記処置サイクルを繰り返すことを含む。
【００８２】
特定の実施形態では、癌は、黒色腫、膵癌、結腸直腸癌、ホジキンリンパ腫、ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣからなる群から選択される。特定の実施形態では、癌は、黒色腫、膵癌、ＮＳＣＬＣおよびＲＣＣからなる群から選択される。特定の実施形態では、例えば癌は黒色腫である。
【００８３】
特定の実施形態では、癌は黒色腫である。
【００８４】
特定の実施形態では、リポソームイリノテカンは、イリノテカンを含む水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化状態または沈殿状態でカプセル封入する直径約１１０ｎｍの単層脂質二重層小胞を有するリポソームを含み、この小胞は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬで構成されている。ＭＭ−３９８
【００８５】
上記で列挙した実施形態のうちの特定の実施形態では、癌の処置のために他の抗新生物剤は投与しない。
【００８６】
特定の実施形態では、本方法は、別の治療薬を投与することを含む。
【００８７】
一部の実施形態では、この治療薬は、タキサン、ｂｃｒ−ａｂｌの阻害剤、ＥＧＦＲの阻害剤、ＤＮＡ損傷剤および代謝拮抗薬から選択される。特定の実施形態では、この治療薬は以下から選択される：アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ｂｃｇ、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カンポテシン（ｃａｍｐｏｔｈｅｃｉｎ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、シプロテロン（ｃｙｐｒｏｔｅｒｏｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デメトキシビリジン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｖｉｒｉｄｉｎ）、ジクロロ酢酸塩（ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ジエンエストロール（ｄｉｅｎｅｓｔｒｏｌ）、ジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フルドロコルチゾン（ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、フルオキシメステロン（ｆｌｕｏｘｙｍｅｓｔｅｒｏｎｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒドロキシ尿素（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）、リュープロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、レバミソール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メスナ（ｍｅｓｎａ）、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、パミドロネート（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、ペリホシン（ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テムシロリムス（ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、チタノセンジクロリド（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）およびビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）。
【００８８】
一部の実施形態では、本方法は、癌処置の非化学的方法を適用することを更に含む。特定の実施形態では、この方法は放射線療法を適用することを含む。特定の実施形態では、この方法は、外科手術、熱切除（ｔｈｅｒｍｏａｂｌａｔｉｏｎ）、集束超音波療法、冷凍療法またはそれらの任意の組み合わせを適用することを更に含む。
【００８９】
また、本明細書で提供されるのは、リポソームイリノテカンとニボルマブとの組み合わせまたはリポソームイリノテカンとペンブロリズマブとの組み合わせの対応する使用を開示する、上記方法に等価の実施形態でもある。
【００９０】
組成物
本開示は、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを含む組成物を提供する。
【００９１】
一部の実施形態では、α−ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
【００９２】
一部の実施形態では、α−ＰＤ−Ｌ１抗体はニボルマブおよびペンブロリズマブから選択される。
【００９３】
一部の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびラメラリンＤから選択される。特定の実施形態では、トポイソメラーゼＩ阻害剤はイリノテカンである。
【００９４】
キット
本開示は、必要とする対象中の癌を処置するためのキットであって、
ａ．トポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１またはα−ＰＤ−１抗体と、
ｂ．癌を処置するために有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体を対象に投与するための指示書と
を含むキットを提供する。
【００９５】
トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを同時に投与する場合には、このキットは、トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを、単一の医薬組成物でまたは別々の医薬組成物で且つパッケージ化された状態で含むことができる。トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを同時に投与しない場合には、このキットは、トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを別々の医薬組成物で且つパッケージ化された状態で含むことができる。
【００９６】
一実施形態では、このキットは、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と共にトポイソメラーゼＩ阻害剤が入った第１の容器と、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と共にα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体が入った第２の容器とを含む。このキットはまた、投与量および投与の指示等の指示書も提供することができる。そのような投与量および投与の指示は、医師に提供される種類（例えば医薬品ラベル）であることができる、または医師によって提供される種類（例えば患者への指示）であることができる。
【００９７】
製剤
本開示の組成物を、処置する状態または傷害に応じて決定され得る医学的に許容される任意の方法で投与することができる。可能な投与経路として、非経口経路（例えば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、硬膜内（ｉｎｔｒａｅｐｉｄｕｒａｌ）、髄腔内等）による注射、ならびに例えば吸入による経口、経鼻、眼、直腸、膣、局所または肺が挙げられる。本発明に従って製剤化されたリポソーム薬の中枢神経系の腫瘍への送達の場合は、腫瘍への直接的なリポソームの緩慢で持続性の頭蓋内注入（対流強化送達、即ちＣＥＤ）が特に有利である。Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．６４，ｐ．２５７２−２５７９，２００４；Ｍａｍｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６８，ｐ．１−９，２００４を参照されたい。この組成物を組織表面に直接適用してもよい。持続放出、ｐＨ依存性放出または他の特定の化学的なもしくは環境的な条件に媒介される放出投与も、例えば蓄積注射または受食性移植（ｅｒｏｄｉｂｌｅ  ｉｍｐｌａｎｔ）等の手段により本発明に具体的に含まれる。経口投与に適した組成物として、液体、ゲルまたは粉末を含み得る固体製剤が挙げられ、例えば錠剤、ロゼンジおよびカプセルが挙げられる。液体製剤として、軟カプセルまたは硬カプセルで使用され得る溶液、シロップおよび懸濁液を挙げることができる。そのような製剤は薬学的に許容される担体を含み得、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、セルロースまたは油を含み得る。この製剤は、１種または複数種の乳化剤および／または懸濁化剤も含むことができる。薬学的に許容される製剤の調製を当分野で既知の方法に従って達成することができる。
【００９８】
投与量および投与
本開示の組成物を単回用量または複数回用量で投与して、効果的な処置目的を達成することができる。典型的には、本発明のリポソーム医薬組成物の投与量は、体重１ｋｇ当たり治療実体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｎｔｉｔｙ）約０．００５〜約５００ｍｇの範囲で治療上有効な用量であり、最も頻繁には体重１ｋｇ当たり治療実体約０．１〜約１００ｍｇの範囲で治療上有効な用量である。
【００９９】
抗ＰＤ−１抗体を２〜３週間毎に２ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、適切には２〜３週間毎に３ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、適切には２〜３週間毎に５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、適切には２〜３週間毎に６ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体を２週間毎に上記のように投与する。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体を３週間毎に上記のように投与する。
【０１００】
典型的には、本発明のリポソーム医薬組成物を、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、局所または注射可能として調製する。しかしながら、注射前の液体ビヒクル溶液または液体ビヒクル懸濁液に適した固体形態も調製することができる。この組成物を、当分野で既知の方法に従って腸溶コーティングの錠剤またはゲルカプセルへと製剤化することもできる。
【０１０１】
本発明のリポソーム組成物を、処置する状態または傷害に応じて決定され得る医学的に許容される任意の方法で投与することができる。可能な投与経路として、非経口経路（例えば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、硬膜内（ｉｎｔｒａｅｐｉｄｕｒａｌ）、髄腔内等）による注射、ならびに例えば吸入による経口、経鼻、眼、直腸、膣、局所または肺が挙げられる。本発明に従って製剤化されたリポソーム薬の中枢神経系の腫瘍への送達の場合は、腫瘍への直接的なリポソームの緩慢で持続性の頭蓋内注入（対流強化送達、即ちＣＥＤ）が特に有利である。Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．６４，ｐ．２５７２−２５７９，２００４；Ｍａｍｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６８，ｐ．１−９，２００４を参照されたい。この組成物を組織表面に直接適用してもよい。持続放出、ｐＨ依存性放出または他の特定の化学的なもしくは環境的な条件に媒介される放出投与も、例えば蓄積注射または受食性移植等の手段により本発明に具体的に含まれる。治療上有効な用量を送達するのに必要なリポソーム医薬組成物の量を、薬物試験の分野で一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの方法で定型的に決定することができる。例えばＤ．Ｂ．Ｂｕｄｍａｎ，Ａ．Ｈ．Ｃａｌｖｅｒｔ，Ｅ．Ｋ．Ｒｏｗｉｎｓｋｙ（ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＷＷ，２００３を参照されたい。様々な治療実体に関する治療上有効な投与量は当業者に公知であり、本発明によれば、本発明の医薬リポソーム組成物により送達される治療実体は、その定型的な非リポソーム製剤でこの治療実体の同量を送達することにより得られる活性と比べて少なくとも同じ活性または２倍、４倍もしくは１０倍高い活性を提供する。
【０１０２】
本発明によれば、適切な温度（例えば、充填中は構成要素である脂質の相転移温度を超えるが実体の充填後はこの相転移温度未満に低下される温度）にて水性媒体中で所望の実体を本発明のリポソームと共にインキュベートすることにより、この所望の実体をリポソームに充填するまたは封入することができる。インキュベーション時間は通常、構成要素である脂質の性質、リポソームに充填される実体、およびインキュベーション温度に基づく。典型的には、インキュベーション時間は数分から数時間で十分である。８５％超の、典型的には９０％超の高い封入効率が達成されることから、通常は、未封入の実体を除去する必要はない。しかしながら、そのような必要性がある場合には、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、透析、限外ろ過、吸着または沈殿等の様々な手段により、未封入の実体を組成物から除去することができる。予想外なことに、特にカンプトテシン誘導体またはビンカアルカロイド誘導体等の実体の、本発明のリポソームとのインキュベーションの間の低イオン強度の維持、続いてこのインキュベーションの終了時でのイオン強度の増加により、充填効率がより高くなり、未封入の薬物がより良好に除去され、且つ凝集に対してリポソームがより安定になることを発見した。典型的には、このインキュベーションを、例えば水溶液中にて、５０ｍＭ  ＮａＣｌに等しいイオン強度未満のイオン強度で行ない、より好ましくは３０ｍＭ  ＮａＣｌに等しいイオン強度未満のイオン強度で行なう。このインキュベーション後、濃縮塩（例えばＮａＣｌ）溶液を添加して、このイオン強度を５０ｍＭ  ＮａＣｌのイオン強度よりも高くすることができ、より好ましくは１００ｍＭ  ＮａＣｌのイオン強度よりも高くすることができる。理論に拘束されることなく、本発明者らは、イオン強度の上昇によりリポソーム膜からの実体の解離が促進され、実質的に全ての実体がリポソーム内部空間にカプセル封入されたままになると仮定する。
【０１０３】
一般に、実体の充填時に得られる実体対脂質比（例えば薬物充填比）は、リポソーム内に封入された実体の量、封入された置換アンモニウムおよび／またはポリアニオン（例えば塩）の濃度、封入された実体の物理化学特性、ならびに使用される対イオン（アニオン）の種類（例えばポリアニオン）に応じて決定される。本発明の組成物で達成されるおよび／または本発明の方法により達成される高い充填効率により、リポソームに封入された実体に関する実体対脂質比は、充填プロセスで用いられる実体およびリポソーム脂質の量に基づいて算出された実体対脂質比（「投与量」比）の８０％超であり、９０％超であり、典型的には９５％超である。実際には、実質的に１００％（定量的）のカプセル封入が一般的である。リポソーム中の実体対脂質比を、重量比（リポソーム脂質の重量もしくはモル単位当たり実体の重量）またはモル比（リポソーム脂質の重量もしくはモル単位当たりの実体のモル）の観点で特徴付けることができる。以下に例示するように、実体対脂質比のある単位を、定型的な算出により他の単位へと変換することができる。本発明のリポソーム中の実体の重量比は概して、脂質１ｍｇ当たり少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３５、０．５または少なくとも０．６５ｍｇの実体である。モル比に関して、本発明に係る実体対脂質比は、リポソーム脂質１モル当たり少なくとも約０．０２〜約５モルであり、好ましくは少なくとも０．１〜約２モルであり、より好ましくは約０．１５〜約１．５モルの薬物である。一実施形態では、カンプトテシン誘導体の実体対脂質比（例えば薬物充填比）は、リポソーム脂質１モル当たり少なくとも０．１（例えば０．１モル）のカンプトテシン誘導体であり、好ましくは少なくとも０．２である。別の実施形態では、実体対脂質比（例えば薬物充填）は少なくとも約３００ｍｇの実体（例えば、リポソーム形成脂質１ｍｇ当たりのビンカアルカロイドまたはその誘導体である。更に別の実施形態では、実体対脂質比（例えば薬物充填）は、リポソーム形成脂質１ｍｇ当たり少なくとも約５００ｍｇの実体（例えばカンプトテシン誘導体またはカンプトテシンプロドラッグ）である。驚くべきことに、本発明により、リポソーム脂質１ｇ当たり０．８ｍｍｏｌ超の実体の薬物対脂質比で、リポソーム脂質１ｇ当たり１．３ｍｍｏｌ超の実体の薬物対脂質比で、更にはリポソーム脂質１ｇ当たり１．７ｍｍｏｌの実体という高い薬物対脂質比で、カンプトテシン誘導体薬物（例えばイリノテカン）の安定で且つほぼ定量的なリポソームカプセル封入が提供される（実施例７４を参照されたい）。
【０１０４】
リポソームがリン脂質を含む場合には、リポソームリン脂質のモル単位当たりの薬物の重量（質量）の単位（例えば、ｍｇ薬物／ｍｍｏｌリン脂質）で実体含有量を表すことが好都合である。しかしながら、当業者は、薬物含有量がリポソーム中のリン脂質の存在から独立した方法で同等に表され得ること、更にはリポソーム脂質含有量の単位（質量またはモル）当たりの薬物のモル量に換算して同等に表され得ることを認識するだろう。例えば、リポソームが３モル部のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、分子量７９０）、２モル部のコレステロール（分子量３８７）および０．０１５モル部のポリ（エチレングリコール）誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、分子量２７５０）を含み、且つ１５０ｍｇ／ｍｍｏｌリン脂質の薬物／脂質比で薬物ドキソルビシン（分子量５４３．５）を含む場合、同じ薬物含有量を、以下のようにｍｇ薬物／ｍｇ総脂質に換算して同等に表すことができる：
（ａ）以下のように、リポソームリン脂質のモル量の合計で成分のモル量を除算することにより、リポソームリン脂質（この例ではＤＳＰＣおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のモル単位に対して正規化されたリポソーム脂質成分のモル量を算出する：
ＤＳＰＣ  ３／（３＋０．０１５）＝０．９９５０２
コレステロール  ２／（３＋０．０１５）＝０．６６３３５
ＰＧ−ＤＳＰＥ  ０．０１５／（３＋０．０１５）＝０．００４９８
（ｂ）以下のように、リポソームリン脂質の単位モル量および成分の分子量に対応する総リポソーム脂質の質量を算出する：
総脂質ｍｇ／ｍｍｏｌリン脂質＝０．９９５０２×７９０＋０．６６３３５×３８７＋０．００４９８×２７５０＝１０５６．４８
（ｃ）以下のように、工程（ｂ）で得られた数値で、リン脂質のモル単位当たりの質量単位で表される薬物含有量を除算することにより、総脂質の質量単位当たりの薬物の質量を算出する：
ドキソルビシンｍｇ／ｍｇ総脂質＝１５０／１０５６．４８＝０．１４１９８
（ｄ）以下のように、薬物の分子量（この場合は５４３．５）で、工程（ｃ）で得られた数値を除算することにより、総脂質の単位質量当たりの薬物のモル量を算出する：
ドキソルビシンｍｍｏｌ／ｇ総脂質＝０．１４１９８／５４３．５×１０００＝０．２６１
（ｅ）以下のように、リポソーム脂質マトリックス中のリン脂質のモル部を算出する：
リン脂質のモル部＝（リン脂質の総モル）／（脂質の総モル量）＝（３＋０．０１５）／（３＋２＋０．０１５）＝０．６０１２
（ｆ）以下のように、総脂質に対するドキソルビシンのモル比を算出する：
ドキソルビシンｍｏｌ／ｍｏｌ総脂質＝（リン脂質のモル部）×（ドキソルビシンｇ／モル  リン脂質）／（ドキソルビシンの分子量）＝０．６０１２×１５０／５４３．５＝０．１６６
【０１０５】
そのため、様々な単位で表される薬物対脂質比と薬物対リン脂質比との間の関係が容易に確立される。本明細書で使用される場合、「脂質」には、限定されないがリポソーム膜のあらゆる膜形成成分（例えばポリマーおよび／または界面活性剤）が含まれる。例えば、全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８１４７８６７号明細書を参照されたい。
【０１０６】
本明細書においては別途示さない限り、ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの用量は等量のイリノテカン塩酸塩三水和物を指す。例えば、ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの１２０ｍｇ用量は、イリノテカン塩酸塩三水和物１２０ｍｇ中に存在するイリノテカンの量を含む。イリノテカン塩酸塩三水和物に基づく用量のイリノテカン遊離塩基に基づく用量への変換は、イリノテカン塩酸塩三水和物の分子量（６７７．１９ｇ／モル）をイリノテカン遊離塩基の分子量（５８６．６８ｇ／モル）で置き換えることにより達成され、変換係数は０．８６６である。
【０１０７】
本明細書で説明されている開示がより完全に理解され得るように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明を目的とするのみであり、いかなる方法によっても本開示を限定すると解釈すべきでないことを理解すべきである。
【０１０８】
生物学的アッセイ
黒色腫２３３８および２４００細胞のＴ細胞媒介性死滅へのＴｏｐ１阻害剤の相乗効果。患者由来の黒色腫細胞系統２３３８および２４００を、３時間にわたり様々なエフェクターＴ細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比にて自己腫瘍浸潤リンパ求（ＴＩＬ）で処理した。次いで、細胞を活性化カスパーゼ３に関して染色し、フローサイトメトリーでアポトーシスを定量化した。２３３８細胞および２４００細胞を、０．１２５〜１．０ｕＭの濃度範囲を使用して２４時間にわたりＴｏｐ１阻害剤ＳＮ３８で処理した。次いで、細胞を活性化カスパーゼ３に関して染色し、または薬物処理細胞を洗浄し、次いで３時間にわたり自己ＴＩＬと共にインキュベートした。
【０１０９】
次いで、ハイスループットのカスパーゼ３ベースの細胞毒性アッセイによりアポトーシスを定量化した。ヒト黒色腫細胞をＤＤＡＯ色素で染色し、（ｉ）本発明者らのスクリーン中の８５０個の化合物のそれぞれもしくはコントロールとしてのＤＭＳＯ  １μＭと共に９６ウェルプレート中で２４時間にわたり播種した、（ｉｉ）２４時間にわたり播種し、次いで３時間にわたり自己Ｔ細胞と共にインキュベートした、または（ｉｉｉ）１ｕＭの化合物と共に２４時間にわたり播種し、洗浄し、次いで３時間にわたり自己Ｔ細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、活性化カスパーゼ３に関して染色した。フローサイトメトリーを使用して、アポトーシスの尺度として染色を定量化した。結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【０１１０】
図２に示すデータをＣａｌｃｕｓｙｎで分析して、ＳＮ３８と２３３８および２４００ＴＩＬとの組み合わせの組み合わせ指数（ＣＩ）を算出した。２３３８および２４００のＣＩをそれぞれ、図３Ａおよび図３Ｂの正規化アイソボログラムで表す。Ｃａｌｃｕｓｙｎは、相乗効果を定量化するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法をベースとし、相乗効果はＣＩ＜１（対角線の下方の点）であり、相加効果はＣＩ＝１（対角線上の点）であり、拮抗作用はＣＩ＞１（対角線の上方の点）である。例えばＣｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．，“Ｄｒｕｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ  ｍｅｔｈｏｄ，”Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０，４４０−４４６（２０１０）を参照されたい。
【０１１１】
Ｔｏｐ１阻害剤ｎａｌ−ＩＲＩ（ＭＭ−３９８）によるｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答は、遊離イリノテカンと比較して有意に高い。第１の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞を皮下注射した。マウスを、４０ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８（毎週３回腹腔内）、１５０ｕｇのα−ＰＤ−Ｌ１（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ，１０  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒ．，Ｓｕｉｔｅ  ２Ｂ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ  ０３７８４−１６７１  ＵＳＡから得たマウスＰＤ−Ｌ１−ＰＥ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２））（３日毎に腹腔内）、またはＳＮ３８とα−Ｐｄ−Ｌ１との組み合わせで処置した。コントロール群には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびラットＩｇＧ２Ｂコントロール抗体を投与した。マウスを３週間にわたり処置した。結果を図４Ａに示し、この図４Ａは、ＳＮ３８とα−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせがＳＮ３８のみまたはα−ＰＤ−Ｌ１のみと比べて良い傾向があったが有意ではなかったことを示す。第２の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞を皮下注射した。腫瘍が触診可能であった３日後、マウスを処置群（ｎ＝５）に無作為化した。３日目に始めて、マウスに、ｎａｌ−ＩＲＩ（ＭＭ−３９８、静脈内）、遊離イリノテカン（腹腔内）またはビヒクルとしてのＰＢＳ（静脈内）を３週間にわたり毎週１回投与した。結果を図４Ｂに示し、この図４Ｂは、ＭＭ−３９８が全ての用量で遊離イリノテカンと比べて良好であったこと、および用量が増加するにつれてますます有効であったことを示す（４０ｍｇ／ｋｇで有意性を達成する）。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答および生存は、ナノリポソームイリノテカン、ｎａｌ−ＩＲＩ（ＭＭ−３９８）をα−ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた場合に増加する。第１の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞を皮下注射した。腫瘍が触診可能であった３日後、マウスを、ｎａｌ−ＩＲＩ（４０ｍｇ／ｋｇ）を投与する処置群（ｎ＝５）、α−ＰＤ−Ｌ１抗体（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ，１０  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒ．，Ｓｕｉｔｅ  ２Ｂ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ  ０３７８４−１６７１  ＵＳＡから得たマウスＰＤ−Ｌ１−ＰＥ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）（１５０ｕｇ／マウス）を投与する処置群（ｎ＝５）、またはｎａｌ−ＩＲＩおよびα−ＰＤ−Ｌ１抗体の両方を投与する処置群（ｎ＝５）に無作為化した。ビヒクルコントロール群には、ＰＢＳおよびアイソタイプ一致コントロール抗体ラットＩｇＧ２ｂ（１５０ｕｇ）を投与した。３日目に始めて、マウスにｎａｌ−ＩＲＩの毎週１回の用量を投与し、抗体を３日毎に投与した。図５Ａは２１日目までの腫瘍容積を示し、図２Ｂは、ＭＭ−３９８のみもしくはα−ＰＤ−Ｌ１抗体のみまたは両方の薬剤の組み合わせで処置したマウスに関する腫瘍生存データを示す。
【０１１３】
Ｔｏｐ１阻害後の抗原プロセシング遺伝子における遺伝子発現変化。ＳＮ３８またはコントロールとしてのＤＭＳＯで処理した患者由来黒色腫細胞系統からＲＮＡを単離した。図６Ａのヒートマップは、抗原提示に関与する遺伝子のサブセットの差次的発現を表す。図６Ａは、実施例５で説明するＳＮ３８処置腫瘍細胞に対して実施したマイクロアレイ分析のデータのサブセットである。このデータのサブセットは、腫瘍細胞中での抗原のプロセシングおよび提示に関与する遺伝子の差次的発現変化に焦点を合わせた。抗原のプロセシングおよび提示は、細胞溶解性Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識を可能にする癌免疫サイクルにおける基本的な段階である。本発明者らは、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）およびベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）およびトランスポータータンパク質ＴＡＰおよびＴＡＰ結合タンパク質（ＴＡＰＢＰ）（全てが抗原のプロセシングおよび提示の経路に不可欠である）の発現の有意な上方調節を観測した。このデータは、黒色腫腫瘍細胞のＴｏｐ１阻害剤処置によりＴ細胞媒介性死滅が改善され得る１つの方法は、抗原のプロセシングおよび提示の増加によるものであることを示唆しており、この増加により、Ｔ細胞による認識および標的化の増加、その後の腫瘍細胞死滅のより大きな誘導が可能になり得る。
【０１１４】
図６Ｂおよび図１４を参照すると、図６Ｂのヒートマップは、マイクロアレイ分析からの、Ｔｏｐ１阻害後に差次的に発現された遺伝子のサブセットを表す。示されたデータは、実施例５で説明した遺伝子発現分析の一部を表す。このデータの部分は、ｐ５３シグナル伝達に関連するいくつかの遺伝子の差次的発現に焦点を合わせる。具体的には、本発明者らは、腫瘍細胞中でのアポトーシス応答の誘導に関与することが示されているｐ５３調節遺伝子であるＴＰ５３ＩＮＰ１（またはＴｅａｐ）に焦点を合わせることを選択した（Ｇｉｒｏｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；Ｔｏｍａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１）。本発明者らは、黒色腫においてＳＮ３８処理によるＴｅａｐの発現の有意な上方調節を観測した。この表現型を、２つの異なるＴｏｐ１阻害剤（Ｔｏｐ１  ｉｎｈ．１＝ＳＮ３８、Ｔｏｐ１  ｉｎｈ．２＝トポテカン）で処理した多くの黒色腫患者由来の腫瘍細胞系統に対して実施した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によっても検証した。
【０１１５】
別途示さない限り、図中の対応するデータにより示される場合に使用されるナノリポソープイリノテカン材料は、図７で示すようにリポソーム中にカプセル封入されたイリノテカンスクロースオクタ硫酸塩を含む。図７は、ナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ）ＭＭ−３９８を示す。ＭＭ−３９８イリノテカンスクロースオクタ硫酸塩リポソーム注射はイリノテカンＨＣｌリポソーム注射とも称され、なぜならば、イリノテカンＨＣｌ（三水和物）は、ＭＭ−３９８リポソームを調製すべくトリエチルアンモニウムスクロースオクタ硫酸塩を含むリポソームにイリノテカンを充填するために使用される活性医薬成分であるからである。イリノテカンＨＣｌの塩酸塩イオンがトリエチルアンモニウムスクロースオクタ硫酸塩のトリエチルアンモニウムイオンと反応してトリエチルアンモニウムクロリド（トリエチルアミンヒドロクロリド）が生じ、イリノテカンスクロースオクタ硫酸塩を、ＭＭ−３９８リポソーム内にカプセル封入された医薬品とするにもかかわらず、この命名法を使用することができる。イリノテカンリポソームについての更なる詳細は、２０１３年６月１２日に出願された公報国際公開第２０１３／１８８５８６号パッフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１１６】
このリポソームイリノテカンは、イリノテカンを含む水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化状態または沈殿状態でカプセル封入する直径約１１０ｎｍの単層脂質二重層小胞を有するリポソームを含み、小胞は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬおよびメトキシ末端ポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬで構成されている。各ｍＬはまた、緩衝剤としての２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）４．０５ｍｇ／ｍＬおよび等張剤としての塩化ナトリウム８．４２ｍｇ／ｍＬも含む。
【０１１７】
本明細書に記載されているように、イリノテカンを、イリノテカンスクロース硫酸塩リポソーム注射（その他には「イリノテカンスクロースオクタ硫酸塩リポソーム注射」または「イリノテカンスクロスオフェートリポソーム注射」と呼ばれる）としての安定したリポソーム製剤として投与することができ、この製剤は本明細書において「ＭＭ−３９８」（ＰＥＰ０２としても既知である、米国特許第８，１４７，８６７号明細書を参照されたい）と称される。ＭＭ−３９８を、静脈注射用の無菌の注射可能な非経口液体として提供することもできる。ＭＭ−３９８の必要量を例えば５％デキストロース注射ＵＳＰ  ５００ｍＬで希釈し、９０分の期間にわたり点滴することができる。
【０１１８】
ＭＭ−３９８リポソームは、スクロースオクタ硫酸塩との塩としてゲル化状態または沈殿状態で複合体化されたイリノテカンを含む水性空間をカプセル封入する直径約８０〜１４０ｎｍの単層脂質二重層小胞である。このリポソームの脂質膜は、ホスファチジルコリン、コレステロール、および２００個のリン脂質分子に対して約１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の量でのポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンで構成されている。
【０１１９】
このイリノテカンの安定したリポソーム製剤は、治療指数の改善を提供し得るいくつかの特質を有する。ＤＮＡ複製プロセスにおける予備段階としてＤＮＡの巻き戻しが必要とされる場合に細胞周期のＳ期の間に細胞のより高い割合で存在することを可能にする特質である、制御され且つ持続した放出は、薬物への腫瘍組織の曝露の持続時間を増加させることにより、このスケジュール依存性の薬物の活性を改善する。リポソームでの長期の循環薬物動態および高い血管内薬物保持により、増強された透過性および保持（ＥＰＲ）効果を促進することができる。ＥＰＲは、悪性腫瘍等の部位でリポソームの堆積を可能にするが、血管系（特に毛細血管）の正常な完全性が危険にさらされており、その結果、リポソーム等の粒子の毛細血管腔外への漏れが生じる。そのため、ＥＰＲは固形腫瘍へのリポソームの部位特異的薬物送達を促進することができる。ＭＭ−３９８のＥＰＲはその後の貯蔵効果をもたらし得、リポソームは、イリノテカンを代謝する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）中に蓄積し、イリノテカンを実質的により細胞毒性のＳＮ−３８に局所的に変換する。この局所的な生物活性化は、毒性の候補部位での薬物曝露の低下および腫瘍内の癌細胞での曝露の増加をもたらすと考えられている。
【０１２０】
イリノテカンは、ＭＭ−３９８リポソームからの放出時に身体内でＳＮ−３８へと変換される。（例えば血漿中での）ＭＭ−３９８のＳＮ−３８への代謝変換は以下の２つの工程を含む：（１）リポソームからのイリノテカンの放出、および（２）遊離イリノテカンのＳＮ−３８への変換。理論により限定されることを意図するものではいが、イリノテカンはリポソームを一旦離れると、従来の（遊離）イリノテカンと同じ代謝経路により分解されると考えられる。従って、イリノテカンおよびＭＭ−３９８の毒性および有効性に予測的なヒトでの遺伝的多型は同様と考えられ得る。それにもかかわらず、遊離イリノテカンと比較してＭＭ−３９８製剤では、不完全な遺伝的多型は、深刻な有害事象および／または有効性との低い関連を示すことができる。
【０１２１】
抗ＰＤＬ−１抗体の投与前に、リポソームイリノテカンを、単独でまたは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）および／もしくはロイコボリンとの組み合わせで静脈内投与することができる。一実施形態では、チェックポイント阻害抗体（例えば抗ＰＤ１に結合する抗体）の前に、リポソームイリノテカンを（単独でまたは５−ＦＵおよびロイコボリンとの組み合わせでもしくは前に）投与する。別の実施形態では、リポソームイリノテカンを、治療上有効な用量のＭＭ−３９８の投与、続いて合計約４８時間の期間にわたる一連の点滴としてロイコボリンおよび５−ＦＵの投与を含む処置サイクルの一部として投与する。リポソームイリノテカン処置サイクルに続いて、チェックポイント阻害抗体を投与することができる。例えば、リポソームイリノテカンを９０分にわたり静脈内投与することができ、ロイコボリンを３０分にわたり投与することができ、５−ＦＵを４６時間にわたり静脈内投与することができる。ロイコボリンを、約２００ｍｇ／ｍ２の活性（ｌ）型を含む組成物としてまたは４００ｍｇ／ｍ２の（ｌ＋ｄ）ラセミ型を含む組成物として、３０分にわたり静脈内投与することができる。様々な実施形態では、リポソームイリノテカンはＭＭ−３９８である。
【０１２２】
癌を処置する１つの方法は、抗ＰＤ１に結合す３ｍｇ／ｋｇのチェックポイント阻害剤抗体の投与との組み合わせで、少なくとも約２４時間の半減期を有する６０〜１２０ｍｇ／ｍ２のＭＭ−３９８リポソームイリノテカン（即ち、６０〜１２０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に対応する量のイリノテカンを含むＭＭ−３９８の用量）の投与を含む。例えば、ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンを２週間毎に６０、８０または１２０ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。抗体は、２週間毎に６０分をかけて投与されるニボルマブであることができる。任意選択で、この方法は、チェックポイント阻害剤抗体の投与の前に、ＭＭ−３９８との組み合わせで５−フルオロウラシル（例えば２，４００ｍｇ／ｍ２）およびロイコボリン（例えば２００ｍｇ／ｍ２のｌ型または４００ｍｇ／ｍ２のｌ＋ｄラセミ型）の投与を更に含む。８０ｍｇ／ｍ２（塩酸塩三水和物基準、７０ｍｇ／ｍ２遊離塩基に相当する）で２週間毎に１回投与する場合、ＭＭ−３９８は、以下の表１中の平均（＋／−標準偏差）の総イリノテカンおよび総ＳＮ−３８を有する。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
特定の例では、癌を処置する方法は、（ａ）９０分にわたる１２０ｍｇ／ｍ２のＭＭ−３９８の用量、続いて３０分にわたるロイコボリン、続いて４６時間にわたる５−フルオロウラシルを含むまたはからなるリポソームイリノテカン処置サイクル；続いて（ｂ）抗ＰＤ１に結合する抗体を含むチェックポイント抗体処置サイクル（例えば、６０分にわたり投与される３ｍｇ／ｋｇのニボルマブ）を３週間毎に１回、必要とする患者への点滴により適用することを含む。治療上有効な期間を、リポソームイリノテカン処置サイクルの適用とチェックポイント抗体処置サイクルの適用との間で選択することができる。１２０ｍｇ／ｍ２で３週間毎に１回投与する場合には、ＭＭ−３９８は、１，６５２時間・ｕｇ／ｍｌ（１２０ｍｇ／ｍ２）である血液中の総イリノテカンのＡＵＣ０−１を有し、ＳＮ３８（活性代謝産物）は４７６時間・ｎｇ／ｍｌであり、血液中の総イリノテカンのＴ１／２は２１．２時間でありＳＮ３８は８８．８時間である。
【０１２５】
別の特例の例では、癌を処置する方法は、（ａ）９０分にわたる８０ｍｇ／ｍ２のＭＭ−３９８の用量、続いて３０分にわたるロイコボリン、続いて４６時間にわたる５−フルオロウラシルを含むまたはからなるリポソームイリノテカン処置サイクル；続いて（ｂ）抗ＰＤ１に結合する抗体を含むチェックポイント抗体処置サイクル（例えば、６０分にわたり投与される３ｍｇ／ｋｇのニボルマブ）を、必要とする患者への点滴により適用することを含む。治療上有効な期間を、リポソームイリノテカン処置サイクルの適用とチェックポイント抗体処置サイクルの適用との間で選択することができる。
【０１２６】
特定の一例では、癌を処置する方法は、（ａ）９０分にわたる６０ｍｇ／ｍ２のＭＭ−３９８の用量、続いて３０分にわたるロイコボリン、続いて４６時間にわたる５−フルオロウラシルを含むまたはからなるリポソームイリノテカン処置サイクル；続いて（ｂ）抗ＰＤ１に結合する抗体を含むチェックポイント抗体処置サイクル（例えば、６０分にわたり投与される３ｍｇ／ｋｇのニボルマブ）を、必要とする患者への点滴により適用することを含む。治療上有効な期間を、リポソームイリノテカン処置サイクルの適用とチェックポイント抗体処置サイクルの適用との間で選択することができる
【０１２７】
癌を処置する１つの方法は、３ｍｇ／ｋｇのチェックポイント阻害剤抗体（例えばニボルマブ）の投与の組み合わせた、少なくとも約２４時間のイリノテカン半減期を有する６０〜１２０ｍｇ／ｍ２のリポソームイリノテカンオクタ硫酸塩（６０〜１２０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に相当するイリノテカンの量を含む）の投与を含む。例えば、ＭＭ−３９８を２週間毎に６０、８０または１２０ｍｇ／ｍ２の用量で投与することができる。ニボルマブを２週間毎に６０分にわたり投与することができる。
【０１２８】
他の実施形態
上記の詳細な説明は、本開示の実施で当業者を助けるために提供される。しかしながら、本明細書で説明され且つ特許請求された開示は、本明細書で開示された特定の実施形態により範囲が限定されるものではなく、なぜならば、この実施形態は、本開示のいくつかの態様の説明として意図されているからである。あらゆる等価の実施形態は、本開示の範囲内であると意図されている。実際には、本明細書で示され且つ説明されたものに加えて、上述の説明から、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない本開示の様々な改変が当業者に明らかになるだろう。そのような改変も、添付された特許請求の範囲に含まれると意図されている。
【０１２９】
また、提供されるのは、上記の実施形態のうちのいずれかがこれらの実施形態のうちのいずれか１つまたは複数と組み合わされ得る（但し、この組み合わせは相互に排他的ではない）実施形態である。本明細書で使用される場合、２つの実施形態は、一方が他方と重複し得ないものであると定義される場合には「相互に排他的である」。
【０１３０】
一部の実施形態では、生体試料中の癌細胞を死滅させる方法は、この生体試料と、有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体とを接触させることを含むことができる。この実施形態または他の実施形態は、単独でまたは任意の組み合わせで以下のうちの１つまたは複数を特徴とすることができる：
・α−ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはα−ＰＤ−１抗体はヒト化モノクローナル抗体であり得る；
・対象はヒトであり得る；
・癌は、皮膚癌、膵癌もしくはそれらの異型から選択され得る；
・トポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはα−ＰＤ−１抗体との投与は逐次的であることができる；
・トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与をα−ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはα−ＰＤ−１抗体の投与前に行なう；
・α−ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはα−ＰＤ−１抗体の投与を、トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与前に行ない得る、またはα−ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはα−ＰＤ−１抗体とトポイソメラーゼＩ阻害剤との投与は本質的に同時であり得る；
・α−ＰＤ−Ｌ１抗体を、ニボルマブおよびペンブロリズマブから選択することができる；
・トポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびラメラリンＤもしくはそれらのリポソーム製剤から選択され、または好ましくは、トポイソメラーゼＩ阻害剤はリポソームイリノテカンであり、または、このイリノテカンは、水性媒体中にリポソームを含む組成物で提供され、このリポソームは、膜により水性媒体から分離された内部水性空間を有し、この膜は脂質を含み、この脂質は非荷電脂質成分および中性リン脂質を含み、リポソームの内側に以下が封入されており：イリノテカンおよびスクロースオクタ硫酸塩、もしくはイリノテカンおよびスクロースオクタ硫酸塩および置換アンモニウム化合物、哺乳動物の血流に投与された場合には、前記イリノテカンは前記リポソームからの半放出時間が少なくとも２４時間であり、リポソームの内側に封入されたイリノテカンは、水性媒体中のイリノテカン濃度を超える濃度である；
・この方法は少なくとも１回のサイクルを含み、リポソームイリノテカンを、患者がＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型である場合を除いて約６０〜約１８０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクルの１日目に投与し、リポソームイリノテカンを約４０〜約１２０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクル１の１日目に投与し、このサイクルは２〜３週間の期間である；
・トポイソメラーゼＩ阻害剤は、患者がＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型である場合を除いて約９０〜約１５０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクルの１日目に投与するリポソームイリノテカンであり、リポソームイリノテカンを約６０〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量でサイクル１の１日目に投与する；
・この方法は少なくとも１回のサイクルを含み、リポソームイリノテカンを、患者がＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子に関してホモ接合型である場合を除いて１２０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクルの１日目に投与し、リポソームイリノテカンを８０ｍｇ／ｍ２の用量でサイクル１の１日目に投与する；
・サイクルは２週間の期間である；
・サイクルは３週間の期間である；
・この方法は別の治療薬を投与することを更に含み、この治療薬は、タキサン、ｂｃｒ−ａｂｌの阻害剤、ＥＧＦＲの阻害剤、ＤＮＡ損傷剤およびそれらの代謝拮抗薬から任意選択で選択される、もしくは、この治療薬は以下から選択される：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デメトキシビリジン、ジクロロ酢酸塩、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、ロニダミン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトホルミン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、ペリホシン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン；
・この方法は癌処置の非化学的方法を適用することを更に含む；
・この方法は放射線療法を適用することを更に含む；ならびに／または
・この方法は、外科手術、熱切除、集束超音波療法、冷凍療法もしくはそれらの任意の組み合わせを適用することを更に含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、提供されるのは、ヒト治療で有用な有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤とα−ＰＤ−Ｌ１抗体またはα−ＰＤ−１抗体とを含む組成物である。この組成物は、癌の処置で使用するために有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−Ｐｄ−Ｌ１抗体を含むことができる。一部の実施形態では、組成物の使用は、癌を処置するための薬剤の製造のためであることができる。
【０１３２】
一部の実施形態では、提供されるのは、必要とする対象中の癌を処置するためのキットであって、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体と、癌を処置するために有効量のトポイソメラーゼＩ阻害剤およびα−ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与するための指示書とを含むキットである。
【０１３３】
一部の実施形態では、提供されるのは、癌を処置する方法であって、治療上有効な量のＰｄ−Ｌ１ブロッキング抗体の投与と組み合わせて、治療上有効な量のＭＭ３９８イリノテカンリポソームを、必要とする患者に投与することを含む方法である。ＭＭ３９８イリノテカンリポソームを、６０〜１２０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に相当するイリノテカンの量を提供する用量で投与することができる。ＭＭ３９８イリノテカンリポソームを、６０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に相当するイリノテカンの量を提供する用量で投与することができる。ＭＭ３９８イリノテカンリポソームを、８０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に相当するイリノテカンの量を提供する用量で投与することができる。ＭＭ３９８イリノテカンリポソームを、１２０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に相当するイリノテカンの量を提供する用量で投与することができる。ＭＭ−３９８リポソームを９０分にわたる点滴として投与することができる。ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの投与に続いて、ロイコボリンおよび５−フルオロウラシルを更に投与することができる。ロイコボリンを、２００ｍｇ／ｍ２の（ｌ）型のロイコボリンとして投与することができる。ロイコボリンを、４００ｍｇ／ｍ２の（ｌ＋ｄ）ラセミ型のロイコボリンとして投与することができる。５−フルオロウラシルを１，８００〜２，４００ｍｇ／ｍ２の用量として投与することができる。ＭＭ−３９８を６０ｍｇ／ｍ２の用量で投与し得、５−フルオロウラシルを１，８００ｍｇ／ｍ２の用量として投与する。ＭＭ−３９８を８０ｍｇ／ｍ２の用量で投与し得、５−フルオロウラシルを２，４００ｍｇ／ｍ２の用量として投与する。治療上有効な量のＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体を、ＭＭ−３９８の後に投与することができる。このＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体はニボルマブであることができる。このＰｄ−Ｌ１ブロッキング抗体を３ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。このＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体を６０分にわたる点滴により投与することができる。このＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体を２週間毎に投与することができる。治療上有効な量のＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体の投与に続いて、ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームを投与することができる。癌は黒色腫であることができる。癌は転移性黒色腫であることができる。患者は、ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの投与前にニボルマブにより既に処置されていることがあり得る。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：ハイスループット細胞毒性アッセイ
一実施形態では、Ｔ細胞媒介性の細胞毒性をアッセイするためのスクリーニングアプローチが開示されている。ヒト黒色腫癌細胞系統（ＢＲＡＦ／ＮＲＡＳ／ＣＫＩＴ／ＮＦ１野生型）を、２４時間にわたり１マイクロモル濃度の様々な試験化合物と共にインキュベートした。このヒト黒色腫細胞を細胞トラッカー色素ＤＤＡＯ（ＡＰＣチャンネル）で染色し、（ｉ）本発明者らのスクリーン中の８５０個の化合物のそれぞれもしくはコントロールとしてのＤＭＳＯ  １ｕＭと共に９６ウェルプレート中に２４時間にわたり播種した、（ｉｉ）２４時間にわたり播種し、次いで３時間にわたり自己Ｔ細胞と共にインキュベートした、または（ｉｉｉ）１ｕＭの化合物と共に２４時間にわたり播種し、洗浄し、次いで３時間にわたり自己Ｔ細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、活性化カスパーゼ３に関してＰＥ共役抗体で染色した。フローサイトメトリーを使用して、アポトーシスの尺度として染色を定量化した。示されたゲート中の細胞はＤＤＡＯ（ＡＰＣ）および活性化カスパーゼ３（ＰＥ）の両方に関して陽性のはずであり、ＤＤＡＯ陽性腫瘍細胞の総数のパーセンテージとして定量化した。
【０１３５】
活性化カスパーゼ３に関する細胞内染色のフローサイトメトリー分析を図１Ａに示す。図１Ａは、ハイスループットスクリーンのためのフローサイトメトリーＴ細胞細胞毒性アッセイから得られたデータを示す。図１Ｂは、ハイスループットスクリーンのための、フローサイトメトリーをベースとするＴ細胞細胞毒性アッセイの方法論を示す。ゲーティングおよびフローサイトメトリー分析に関するドットプロットを右側に示す。簡潔に言うと、患者由来の黒色腫腫瘍細胞（遠赤色細胞トラッカー色素で染色した）を反応性自己Ｔ細胞と共にインキュベートし、続いて活性カスパーゼ３に関して細胞内染色する。細胞毒性のレベルを、活性カスパーゼ３陽性腫瘍細胞（ＰＥ共役カスパーゼ３抗体）のパーセンテージで測定する。
【０１３６】
実施例２：トポイソメラーゼ１阻害剤は、患者由来の黒色腫細胞系統２３３８および２４００においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞媒介性腫瘍死滅を増強する
別の実施形態では、特定のトポイソメラーゼＩ阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＴＬ媒介性死滅の相乗的改善をもたらし得る治療用組み合わせ等の、Ｔ細胞媒介性免疫療法の増強剤と同定される。ＮＲＡＳ変異またはＢＲＡＦ変異を有する更なる患者由来の黒色腫細胞系統で試験を行ない、この試験はＴ細胞媒介性腫瘍死滅の増強も示した。
【０１３７】
Ｔｏｐ１阻害剤がヒットとして同定されたハイスループットアッセイからの観測に基づいて、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多くの黒色腫患者由来の細胞系統のＴ細胞媒介性死滅へのＴｏｐ１阻害剤の効果を更に評価した。本明細書で示した実験では、黒色腫患者由来の細胞系統２３３８および２４００を、１ｕＭの濃度にて２４時間にわたり、Ｔｏｐ１阻害剤イリノテカンの活性代謝産物であるＳＮ３８で処理した。ＤＭＳＯを溶媒コントロールとして使用した。次いで、薬物処理細胞を、細胞毒性アッセイで概説したように処理した。簡潔に言うと、次いで、ＳＮ３８処理細胞をフローサイトメトリー分析のために処理した、または２３３８の場合には４：１および２４００の場合には１０：１のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で３時間にわたり２３３８自己ＴＩＬもしくは２４００自己ＴＩＬと共にインキュベートした。活性化カスパーゼ３に関するフローサイトメトリー分析を使用して、Ｔｏｐ１阻害剤のみまたはＴＩＬのみおよびＴｏｐ１阻害剤とＴＩＬとの組み合わせのアポトーシス効果を定量化した。示された正規化アイソボログラムは、黒色腫腫瘍細胞中でのアポトーシスへのＳＮ３８およびＴＩＬの複合効果に関するＣＩを示す。ＣａｌｃｕＳｙｎを使用して、ＳＮ３８およびＴＩＬの効果に関する組み合わせ指数（ＣＩ）を計算した。１未満のＣＩは２種の薬剤間の相乗作用を示す。１超のＣＩは拮抗作用を示すことになり、１と等しいＣＩは相加効果を示す。（注記：本明細書で示したデータは、０．１２５〜１ｕＭのＳＮ３８の濃度範囲ならびに１〜４：１（２３３８）および１〜１０：１（２４００）のＥ：Ｔ比で行なった完全な実験を示す本特許出願草案の図２Ａ、図２Ｂおよび図３Ａで示すデータのサブセットである）。
【０１３８】
図２Ａ、図２Ｂ、図９Ａ、図９Ｂ、図３Ａおよび図３Ｂは、パーセント活性化カスパーゼ３で測定した場合の、３時間にわたる様々なエフェクターＴ細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比での自己ＴＩＬによる処置と併せた処置による患者由来の黒色腫細胞系統２３３８（図２Ａ、上部）および２４００（図２Ｂ、下部）の黒色腫細胞のＴ細胞媒介性死滅へのＴｏｐ１阻害剤（ＴＩＬ）の相乗効果を示す。図２Ａまたは図９Ａおよび図２Ｂまたは図９Ｂのそれぞれでは、３つのバーの内の最も左側の群の細胞をＴＩＬで処理しなかった。３つのバーのうちの最も右側の４つの群のそれぞれでは、細胞を所与の濃度のＴＩＬで処理し、且つエフェクターＴ細胞（右側）で処理せず（右側）、腫瘍細胞との２：１の比にてエフェクターＴ細胞で処理し、または腫瘍細胞との４：１の比にてエフェクターＴ細胞で処理した。患者由来の黒色腫細胞系統２３３８（ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）および２４００（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）を、３時間にわたり様々なエフェクターＴ細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比にて自己ＴＩＬで処理した。次いで、細胞を活性化カスパーゼ３に関して染色して、フローサイトメトリーによりアポトーシスを定量化した。２３３８細胞および２４００細胞を、０．１２５〜１．０マイクロモルの濃度範囲を使用して２４時間にわたりＴｏｐ１阻害剤ＳＮ３８で処理した。次いで、細胞を活性化カスパーゼ３に関して染色し、または薬物処理細胞を洗浄し、次いで３時間にわたり自己ＴＩＬと共にインキュベートした。次いで、説明したようにアポトーシスを定量化した。
【０１３９】
本発明者らは、ＳＮ３８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせで良好な処置効果を観測したが、本発明者らは、抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせて使用するためにより好ましい化学的特性（例えば、安定性、溶解性、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験の使用のし易さ）を有するＴｏｐ１阻害剤を発見したかった。従って、本発明者らは、イリノテカンのナノリポソーム製剤（ｎａｌ−ＩＲＩ）であるＭＭ−３９８の抗腫瘍活性を試験し、遊離イリノテカンの抗腫瘍活性と比較して、これが、本発明者らのモデルシステムにおける更なる前臨床試験のために使用するのに適したＴｏｐ１阻害剤であるかどうかを決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５００Ｋ個のｍｃ３８／ｇｐ１００腫瘍細胞を接種した。腫瘍が触診可能であった３日後、マウスを以下の５つの実験群のうちの１つに無作為化した：４回の用量にわたり、（ｉ）ＰＢＳ  −  １週間に１回の２００ｕｌ  ｉｐ、（ｉｉ）遊離イリノテカン  −  １週間に１回の５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ、または１週間に１回の（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇ、（ｉｖ）２０ｍｇ／ｋｇもしくは（ｖ）４０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖでのＭＭ−３９８。この実験から、本発明者らは、組み合わせ試験でのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために２０または４０ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８用量を使用して処理することを選択した。
【０１４０】
ソフトウェアプログラムＣａｌｃｕＳｙｎを使用して、本発明者らは、トポイソメラーゼ１（Ｔｏｐ１）阻害がＴ細胞の腫瘍細胞を死滅させる能力を相乗的に改善することを確認した。図３に示すデータをＣａｌｃｕＳｙｎで分析し、ＳＮ３８と２３３８ＴＩＬおよび２４００ＴＩＬとの組み合わせの組み合わせ指数（ＣＩ）を算出した。ＣＩを上記の正規化アイソボログラムで表す。Ｃａｌｃｕｓｙｎは、相乗効果を定量化するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法をベースとし、相乗効果はＣＩ＜１（線の下方の点）であり、相加効果はＣＩ＝１（線上の点）であり、拮抗作用はＣＩ＞１（線の上方の点）である。図３は、Ｔｏｐ１阻害剤ＳＮ３８とＴ細胞の細胞毒性との組み合わせ指数を示す。図２に示すデータをＣａｌｃｕｓｙｎで分析して、ＳＮ３８と２３３８ＴＩＬおよび２４００ＴＩＬとの組み合わせの組み合わせ指数（ＣＩ）を算出した。ＣＩを上記の正規化アイソボログラムで表す。Ｃａｌｃｕｓｙｎは、相乗効果を定量化するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法をベースとし、相乗効果はＣＩ＜１（赤線の下方の点）であり、相加効果はＣＩ＝１（赤線上の点）であり、拮抗作用はＣＩ＞１（赤線の上方の点）である。
【０１４１】
薬物とＴ細胞との組み合わせと比較して、薬物のみにより誘導された細胞毒性のレベルを評価し、このレベルを使用して、スクリーンからのヒットを同定するために組み合わせスコアを算出した。図８Ａは、組み合わせスコアを算出するために開発された式であり、この組み合わせスコアを、ＨＴＰＳからのヒット化合物の数を最初に絞るための分析ツールとして使用した。
【０１４２】
Ｔａｂｌｅａｕプロットは、自己２５４９ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞）により患者由来の黒色腫細胞系統２５４９に対して実施した、既に説明されているハイスループット細胞毒性アッセイから得られたデータを示す。薬物のみにより誘導されるアポトーシス（ｙ軸上でカスパーゼ３陽性腫瘍細胞のパーセンテージとして示す）を、Ｔ細胞と薬物との組み合わせにより誘導されるアポトーシス（ｘ軸上でカスパーゼ３陽性腫瘍細胞のパーセンテージとして示す）に対してグラフ化した。算出した組み合わせスコアに基づいてスクリーンからのヒットを同定し、この組み合わせスコアは、いずれかの単剤により誘導される死滅のレベルと比較して薬物とＴ細胞との組み合わせにより誘導される死滅のレベルを考慮する。Ｔ細胞死滅を改善した薬物は高い組み合わせスコア（＞１．５）を生じるはずであり、Ｔ細胞死滅への効果がないまたは悪影響がある薬物は低い組み合わせスコア（＜１）を生じるはずである。スクリーンからのヒットとして同定した３種のＴｏｐ１阻害剤を、Ｔｏｐ１阻害剤１、２および３と示し、カンプトテシン、トポテカンおよびイリノテカンであり、黒色腫腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を増加させることが分かった。
【０１４３】
図８Ｃは、トポイソメラーゼ１阻害剤が黒色腫癌細胞のＴ細胞媒介性死滅を増強し得ることを示す散布図である。図８Ｂのトポテカン、イリノテカンおよびカンプトテシンを参照すると、Ｔｏｐ１の全ての阻害剤は高い組み合わせスコアを有すると判定され、このことは、これらの薬剤による前処置により、Ｔ細胞のみまたは薬物のみに曝露されたのみである場合と比べて多くの黒色腫細胞がＴ細胞により死滅されることを示す。図８Ｃの散布図を参照すると、データ点は、低から最小のＴ細胞死滅を示す低（０．５）から高いＴ細胞死滅を示す高（１．５）の範囲の、図８Ａの式に従って算出した組み合わせスコアを示す。観測したヒットは最小の細胞毒性のみであり、腫瘍細胞の相乗的なＴ細胞媒介性死滅を示した。トポイソメラーゼ１のカンプトテシン由来阻害剤を、スクリーンからトップ化合物として同定した。
【０１４４】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＮ３８と様々な免疫調節抗体との組み合わせ
別の実施形態では、特定のトポイソメラーゼＩ阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ媒介性死滅の相乗的改善をもたらし得る治療用組み合わせ等の、Ｔ細胞媒介性免疫療法の増強剤と同定される。一連の動物モデル異種移植試験を実施して、Ｔｏｐ１阻害剤と様々な免疫調節抗体との組み合わせの抗腫瘍活性を実証した。
【０１４５】
ＳＮ３８が腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を増強し得ることがｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証されたことから、本発明者らは次に、前臨床マウスモデルを使用して異なるＴ細胞ベースの免疫療法に対する抗腫瘍応答へのＳＮ３８の効果を調べた。この実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５００Ｋ個のｍｃ３８／ｇｐ１００細胞を皮下接種した。腫瘍接種の３日後、マウスを無作為化して以下で処置した：（ｉ）ビヒクル＋アイソタイプ一致コントロール抗体（ＩｇＧ２Ｂ  −  クローンＬＴＦ−２）、（ｉｉ）ＳＮ３８  −  １週間当たり４０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐを３回、（ｉｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１  −  ３日毎に１５０ｕｇ  ｉｐ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）、（ｉｖ）抗４１ＢＢ  −  ３日毎に３５０ｕｇ（クローンＬＯＢ１２．３）、（ｖ）抗ＣＴＬＡ４  −  ３日毎に１００ｕｇ（クローン９Ｈ１０）、（ｖｉ）抗ＯＸ４０  −  ３日毎に２５０ｕｇ（クローンＯＸ−８６）、ＳＮ３８と（ｖｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１との、（ｖｉｉ）抗４１ＢＢとの、（ｉｘ）抗ＣＴＬＡ４との、（ｘ）抗ＯＸ４０との、（ｘｉ）抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ４との組み合わせ、または（ｘｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＣＴＬＡ４との組み合わせ。このデータは経時的な腫瘍容積を示す。図１０は、Ｔｏｐ１阻害剤ＳＮ３８、抗抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗アルフォ（ａｌｐｈｏ）−ＣＴＬＡ４抗体、抗抗ｏｘ４０抗体、抗４１ＢＢ抗体およびこれらの様々な組み合わせによる処置後に、約３週間にわたり測定した腫瘍容積を示すグラフである。
【０１４６】
これらの抗体の配列を以下の表２に記載する。
【０１４７】
【表２】
2018527377.tif 000003
【０１４８】
図１１Ａ〜１１Ｄは、（本明細書の実施例３の表２で説明されている）抗４１ＢＢ、抗ＣＴＬＡ４、抗ＯＸ４０および抗ＰＤ−Ｌ１に対するＴｏｐ１阻害剤ＳＮ３８と様々な抗体との特定の組み合わせの投与後に経時的に測定した腫瘍容積のグラフである。図１１Ａ〜１１Ｄで表されるデータは、単剤処置群およびコントロール処置群と比較して様々な組み合わせ群の経時的な腫瘍容積を示すために、図１０で説明された実験から引き出された。示されているように、ＳＮ３８のみまたは述べた免疫療法のみで処置した腫瘍担持マウスと比較して、ＳＮ３８と抗４１ＢＢまたは抗ＣＴＬＡ４または抗ＯＸ４０との組み合わせで処置した腫瘍担持マウスでは腫瘍制御の増加を観測しなかった。
【０１４９】
ＳＮ３８が腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を増強し得ることがｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証されたことから、本発明者らは次に、前臨床マウスモデルを使用して異なるＴ細胞ベースの免疫療法に対する抗腫瘍応答へのＳＮ３８の効果を調べた。この実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５００Ｋ個のｍｃ３８／ｇｐ１００細胞を皮下接種した。腫瘍接種の７日後、マウスを無作為化して以下で処置した：（ｉ）ビヒクル＋アイソタイプ一致コントロール抗体（ＩｇＧ２Ｂ  −  クローンＬＴＦ−２）、（ｉｉ）ＳＮ３８  −  １週間当たり４０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐを３回、（ｉｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１  −  １５０ｕｇ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）、または（ｉｖ）ＳＮ３８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ。このデータは経時的な腫瘍容積を示す。この実験から本発明者らは異なる処置群の間の腫瘍制御の差異に全体的な有意性を見出せず、このことは、更なる最適化が必要であることを示唆した。Ｍｃ３８／ｇｐ１００は、急速に増殖し且つ潰瘍を起こしやすい侵襲性の腫瘍モデルである。本発明者らは、接種後７日の遅い時点の代わりに腫瘍接種から３日後に無作為化および処置を実施し得ると決定した。従って、腫瘍容積および生存をモニタリングするｉｎ  ｖｉｖｏ実験を進行させるために、腫瘍が最初に触診可能である腫瘍接種の３日後に無作為化および処置を開始する。これにより、本発明者らは、単独でまたは組み合わせで各薬剤の抗腫瘍効果を機能させ且つ決定する治療ウィンドウを有することが可能になる。図４Ａは、本明細書の実施例３の表２で説明されたＴｏｐ１阻害剤ＳＮ３８と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との特定の組み合わせの投与後に経時的に測定した腫瘍容積のグラフである。
【０１５０】
リポソームイリノテカンを特定の免疫調節抗体と組み合わせて投与した場合には、動物異種移植モデルでの腫瘍制御の増加を観測した。図４Ｂは、様々な濃度のリポソームイリノテカン（ＭＭ−３９８）の投与後に経時的に測定した腫瘍容積のグラフである。
【０１５１】
図５Ｃは、図５Ａおよび図５Ｂのデータを得るために実施したマウス異種移植実験の概略である。Ｃ５７ＢＬ／６に５００Ｋ個のｍｃ３８／ｇｐ１００腫瘍細胞を接種した。３日後、腫瘍担持マウスを以下の４つの実験群のうちの１つに無作為化した：（ｉ）ビヒクル、（ｉｉ）ＭＭ−３９８（Ｔｏｐ１  Ｉｎｈ．）  −  １週間に１回の４０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ、（ｉｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１  −  ３日毎に１５０ｕｇ  ｉｐ、（ｉｖ）ＭＭ−３９８および抗ＰＤ−Ｌ１（Ｔｏｐ１  Ｉｎｈ＋抗ＰＤ−Ｌ１）。上部のパネルは処置スケジュールを示す。下に示すのは、経時的な腫瘍容積および生存に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。このデータは、ＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせが、ＭＭ−３９８のみまたは抗ＰＤ−Ｌ１のみと比較して抗腫瘍活性の増加をもたらしたことを示す。このことはまた、いずれかの単剤で処置したコホートと比較して、ＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせで処置した腫瘍担持マウスの生存の有意な増加へと翻訳される。図５の実験からのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答および生存が、マウス異種移植モデル（図５Ａ）および生存曲線（図５Ｂ）での経時的な腫瘍容積のプロット等の、ナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ、ＭＭ−３９８）がα−ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされる場合に増加することを示す。このデータを、図５Ｃの概略で説明されている実験から得た。
【０１５２】
図５Ａは、実施例３の表２で説明されているＭＭ−３９８リポソームイリノテカンおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与後に経時的に測定した腫瘍容積のグラフである。図５は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答および生存が、ナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ、ＭＭ−３９８）がα−ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされる場合に増加することを示す。図５Ａは２１日までの腫瘍容積を示す（＊はＰ＜０．０００１を示す）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が触診可能であった３日後に、マウスを、Ｔｏｐ１阻害剤ＭＭ−３９８イリノテカンリポソーム（４０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１５０マイクログラム／マウス）またはＭＭ−３９８イリノテカンリポソームおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体の両方を投与する処置群（ｎ＝５）に無作為化した。ビヒクルコントロール群には、ＰＢＳおよびアイソタイプ一致コントロール抗体ラットＩｇＧ２ｂ（１５０マイクログラム）を投与した。３日目に始めて、マウスに、ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの毎週１回の用量を投与し、抗体を３日毎に投与した。本明細書で示すのは２１日までの腫瘍容積であり、Ｐ＜０．０００１である。図５Ａはｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答を示し、図５Ｂは生存を示し、ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンＴｏｐ１阻害剤を抗ＰＤＬ−１抗体と組み合わせた場合には両方とも増加した。図５Ｂは、図５Ａのように処置したマウスの経時的な生存率を示し、５Ｂでの最も右側の階段状の曲線はＭＭ−３９８とα−ＰＤ−Ｌ１との組み合わせを表し、左に移るにつれて、階段状の曲線はそれぞれＭＭ−３９８、α−ＰＤ−Ｌ１およびビヒクルを表す（＊はＰ＜０．０１７４を示す）。ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンのみもしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみまたは組み合わせで処置したマウスの腫瘍生存データを図５Ｂに示し、Ｐ＜０．０１７４を有する。
【０１５３】
図１８のデータを、本発明者らの前臨床マウスモデルにおいてＭＭ−３９８と抗ＰＤ１との組み合わせの抗腫瘍効果を決定するために設定された実験から得た。ＰＤ１はＰＤ−Ｌ１の受容体であり、本発明者らが治療的に調べることができるこのＴ細胞チェックポイント障壁の第２の部分を形成する。従って、本発明者らは、ＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせで観測したようにＭＭ−３９８と抗ＰＤ１との組み合わせで抗腫瘍効果の同様の増加を見出すことがでるかどうかを確かめたかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５００Ｋ個のｍｃ３８／ｇｐ１００腫瘍細胞を接種した。３日後、腫瘍担持マウスを以下の４つの実験群のうちの１つに無作為化した：（ｉ）ビヒクル、（ｉｉ）ＭＭ−３９８（Ｔｏｐ１  Ｉｎｈ．）  −  １週間に１回の２０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ、（ｉｉｉ）抗ＰＤ１  −  ３日毎に２００ｕｇ（クローン２９Ｆ．１Ａ１２）ｉｐ、（ｉｖ）ＭＭ−３９８および抗ＰＤ１（Ｔｏｐ１  Ｉｎｈ＋抗ＰＤ−Ｌ１）。上部のパネルは処置スケジュールを示す。下に示すのは、経時的な腫瘍容積および生存に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。このデータは、ＭＭ−３９８と抗ＰＤ１との組み合わせが、ＭＭ−３９８のみまたは抗ＰＤ１のみと比較して抗腫瘍活性の増加をもたらしたことを示す。ＭＭ−３９８と抗ＰＤ１との組み合わせの更なる生存利益は、ＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせで観測した更なる生存利益と同程度に広範囲ではなかった。
【０１５４】
図１８のデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答および生存が、ナノリポソームイリノテカン（ｎａｌ−ＩＲＩ、ＭＭ−３９８）をα−ＰＤ１抗体と組み合わせた場合に増加することを示す。図１８Ａは、図１８Ｂおよび図１８Ｃのデータを得るために実施したマウス異種移植実験の概略である。図１８Ｂは、実施例３の表２で説明されているＭＭ−３９８リポソームイリノテカンおよび抗ＰＤ１抗体の投与後に経時的に測定した腫瘍容積のグラフである。図１８Ｂは２１日までの腫瘍容積を示す（＊＊はＰ＜０．０１を示す）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＭＣ３８／ｇｐ１００細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が触診可能であった３日後に、マウスを、Ｔｏｐ１阻害剤ＭＭ−３９８イリノテカンリポソーム（２０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ１抗体（２００マイクログラム／マウス）またはＭＭ−３９８イリノテカンリポソームおよび抗ＰＤ１抗体の両方を投与する処置群（ｎ＝５）に無作為化した。ビヒクルコントロール群には、ＰＢＳおよびアイソタイプ一致コントロール抗体ラットＩｇＧ２ｂ（２００マイクログラム）を投与した。３日目に始めて、マウスにＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの毎週１回の用量を投与し、抗体を３日毎に投与した。本明細書で示すのは２１日までの腫瘍容積であり、Ｐ＜０．０１である。図１８Ｂはｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答を示し、図１８Ｃは生存を示し、ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンＴｏｐ１阻害剤を抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた場合には両方とも増加した。図１８Ｂは、図１８Ａのように処置したマウスの経時的な生存率を示し、１８Ｂでの底部の曲線はＭＭ−３９８とα−ＰＤ１との組み合わせを表し、上に移るにつれて、階段状の曲線はそれぞれＭＭ−３９８、α−ＰＤ１およびビヒクルを表す（＊はＰ＜０．０２７３を示す）。ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンのみもしくは抗ＰＤ１抗体のみまたは組み合わせで処置したマウスの腫瘍生存データを図１８Ｃに示し、Ｐ＜０．０２７３を有する。
【０１５５】
実施例４：抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたリポソームイリノテカンの投与に対する免疫応答のプロファイル
別の実施形態では、特定のトポイソメラーゼＩ阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリポソームイリノテカン（例えばＭＭ−３９８）および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせを使用する抗腫瘍応答の増強等の、Ｔ細胞媒介性免疫療法の増強剤と同定される。
【０１５６】
図１２は、黒色腫抗原ｇｐ１００を発現するように形質導入されているＭＣ３８結腸癌細胞の投与、続いてリポソームイリノテカンおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与を含むマウス異種移植実験の概略である。図１２は、腫瘍微小環境における様々な免疫細胞サブセットへのＭＭ−３９８のみもしくは抗ＰＤ−Ｌ１のみまたは組み合わせの効果を調査するための本発明者らの実験計画を概説する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５００Ｋ個のｍｃ３８／ｇｐ１００腫瘍細胞を接種した。７日後、マウスを以下の４つの実験群のうちの１つに無作為化した：（ｉ）ビヒクル、（ｉｉ）ＭＭ−３９８  −  １週間に１回の４０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ、（ｉｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１  −  ３日毎の１５０ｕｇ  ｉｐ、（ｉｖ）ＭＭ−３９８および抗ＰＤ−Ｌ１。１８日目（腫瘍接種後）に腫瘍を採取し、ＣＤ８Ｔ細胞およびそのエフェクター機能、調節性Ｔ細胞および骨髄由来マクロファージに関するフローサイトメトリー分析に供した。
【０１５７】
図１２で説明されている実験から腫瘍を分離し、エフェクターＴ細胞および調節性Ｔ細胞に関してフローサイトメトリー分析により分析した。図１３Ａ〜図１３Ｂは以下の実験から得られたグラフである。ＣＤ８Ｔ細胞を以下の基準に基づいて同定した：ＣＤ３＋、ＣＤ８＋。調節性Ｔ細胞をＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＦｏｘＰ３＋と定義する。本発明者らは、ＭＭ−３９８のみの群はＣＤ８Ｔ細胞集団の増加を示さないが、抗ＰＤ−Ｌ１のみおよびＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ群の両方はコントロール群と比較して腫瘍１グラム当たりのＣＤ８Ｔ細胞の数の増加を示すことを観測した。ＣＤ８Ｔ細胞対調節性Ｔ細胞（ＣＤ８／Ｔｒｅｇ）の比に関しても同じであり、これは抗ＰＤ−Ｌ１群および組み合わせ群でより高い。ＣＤ８Ｔ細胞の数およびＣＤ８Ｔ細胞対調節性細胞の比のこの増加は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果によってより促進されていると思われる。
【０１５８】
図１３Ｃおよび図１３Ｄのデータを以下のように得た。標的腫瘍細胞に細胞溶解シグナルを送るＴ細胞により産生される機能的酵素であるグランザイムＡおよびＢの発現レベルを調べることにより、ＣＤ８Ｔ細胞のエフェクター活性を評価した。ＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＧｚＡ／ＧｚＢ＋のフローサイトメトリー分析に基づいてエフェクター活性を定量化した。図１３Ｃおよび図１３Ｄに示すように、グランザイムのレベル（特に、ＣＤ８Ｔ細胞の主なエフェクター分子であるグランザイムＢ）の有意な増加が存在する。このデータは、ＭＭ−３９８と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせの設定においてＣＤ８Ｔ細胞で最高量の細胞溶解活性を検出したことを示す。Ｔ細胞の細胞溶解活性の増加に許容されるであろう腫瘍および腫瘍微小環境へのＭＭ−３９８の効果をより包括的に理解するためには、更なる実験が必要である。
【０１５９】
図１３Ｅのデータを以下のように得た。様々なＴ細胞集団を調べることに加えて、本発明者らはまた、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋細胞により定義される骨髄由来マクロファージへのＭＭ−３９８、抗Ｐｄ−Ｌ１およびこれら２つの組み合わせの効果も評価した。図１３Ｅのデータは、単剤処置群で検出されるマクロファージの数の増加に向かう一般的傾向を示し、組み合わせ処置群でも同様であり、組み合わせの設定で検出される腫瘍１グラム当たりのマクロファージの数が最も高い。ＭＭ−３９８の製剤はそれ自体、マクロファージによる取り込みに役立ち、腫瘍関連マクロファージの増加というこの観測に気づくことは本発明者らにとって驚くことではなかった。
【０１６０】
実施例５：腫瘍タンパク質５３誘導性核タンパク質１（Ｔｅａｐ）の上方調節をもたらすＴｏｐ１阻害
Ｔ細胞媒介性死滅のＴｏｐ１阻害剤増強に関与する腫瘍分子メカニズムをより理解するために、本発明者らはＳＮ３８で処理した黒色腫細胞系統の遺伝子発現分析を実施した（同じ黒色腫細胞系統のＤＭＳＯ処理はコントールとして機能した）。この分析のために、４種の黒色腫細胞系統を選択し（Ａ：２３３８、Ｂ：２４００、Ｃ：２５４９およびＤ：２５５９）、１ｕＭのＳＮ３８で２４時間にわたり処理した後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐアレイを使用するマイクロアレイ分析用に採取した。収集したデータは、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してＳＮ３８処理細胞においてどのシグナル伝達経路および細胞マスター調節因子が差次的に調節されるかを決定するためにＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して実施する経路分析であった。経路および調節因子をそれぞれ、Ｌｏｇ２倍数変化および活性化スコアに基づいてランク付けする。データは、本発明者らのＴｏｐ１阻害剤で処理した腫瘍細胞におけるｐ５３シグナル伝達経路の有意で高度にランク付けされた活性化を示した。
【０１６１】
本発明者らのＳＮ３８で処理した黒色腫腫瘍細胞におけるｐ５３シグナル伝達の差次的活性化のＩＰＡ分析はまた、ｐ５３シグナル伝達経路に関与する因子の遺伝子発現変化に基づいて、これらの細胞における細胞死経路ならびに増殖および生存シグナルにおける抑制の有意な活性化が存在することも示した。遺伝子発現変化に基づくこれらの計算は、Ｔｏｐ１阻害剤で処理した腫瘍細胞におけるアポトーシス応答の増加を示す。このことは、Ｔｏｐ１阻害剤が腫瘍細胞を調節してＴ細胞からの更なる死シグナルの影響をより受けやすくする方法を理解しようとする本発明者らの研究に重要である。
【０１６２】
一部の実施形態では、トポイソメラーゼ１阻害とチェックポイント遮断との間の相乗作用の発見は、癌を処置する新規の方法であって、Ｔｏｐ１阻害剤（例えばリポソームイリノテカン）およびチェックポイント阻害剤化合物の投与を含む方法を提供する。この実施形態では、ｐ５３調節遺伝子の役割は、腫瘍タンパク質５３誘導性核タンパク質１（「Ｔｅａｐ」）の上方調節をもたらすトポイソメラーゼ１阻害等のＴ細胞媒介性死滅に対する応答の増強において必須の役割を果たすと同定され、関連する表現型とＴｅａｐのノックダウンにより関連する表現型が妨げられるという観測とを概括するためにＴｒｅｐ過剰発現を観測した。マイクロアレイ分析は、ｐ５３誘導性核タンパク質１（ＴＰ５３ＩＮＰ１）レベルがＴｏｐ１阻害に応答して増加することを示唆した。実施例５では、本発明者らは、Ｔｏｐ１阻害がエフェクターＴ細胞を増加させることができ且つエフェクター対調節性Ｔ脂肪の比を増加させることができるかどうかに加えて、ＴＰ５３ＩＮＰ１（Ｔｅａｐ）がアポトーシスセンサーとして作用することができ且つＴＰ５３により調節されるアポトーシス経路の活性化を介して腫瘍細胞でのアポトーシス閾値を低下させることができ、それによりＴ細胞により誘導される細胞死に対してより感受性にさせるかどうかを調べた。
【０１６３】
ｐ５３経路はＴｏｐ１の阻害後に高度に活性化される。Ｔｏｐ１の阻害により、細胞死経路が活性化され且つ増殖および生存のシグナル伝達が抑制される。ｐ５３経路の誘導を、ｐ５３の非存在下でｐ７３により活性化することができる。Ｔｅａｐは、ｐ２１、ｂａｘまたはｍｄｍ２のようなストレス応答遺伝子の調節等の細胞ストレスに応答してアポトーシスを誘導する。Ｔｅａｐはまた、ＬＣ３との相互作用ならびにＡＴＧ５およびベクリン−１活性の調節によりオートファジーを調節することもできる。
【０１６４】
図６Ｂは、３種の細胞系統（２３３８、２４００および２５４９）で発現される様々な遺伝子に関する遺伝子発現「ヒートマップ」である。図６Ｂで示すデータは、上記で説明した遺伝子発現分析の一部を表す。このデータの部分は、ｐ５３シグナル伝達に関連するいくつかの遺伝子の差次的発現に焦点を合わせる。具体的には、本発明者らは、腫瘍細胞中でのアポトーシス応答の誘導に関与することが示されているｐ５３調節遺伝子であるＴＰ５３ＩＮＰ１（またはＴｅａｐ）に焦点を合わせることを選択した（Ｇｉｒｏｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；Ｔｏｍａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１）。本発明者らは、黒色腫においてＳＮ３８処理によるＴｅａｐの発現の有意な上方調節を観測した。この表現型を、２つの異なるＴｏｐ１阻害剤（Ｔｏｐ１  ｉｎｈ．１＝ＳＮ３８、Ｔｏｐ１  ｉｎｈ．２＝トポテカン）で処理した多くの黒色腫患者由来の腫瘍細胞系統に対して実施した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によっても検証した。
【０１６５】
図１４は、第１のＴｏｐ１阻害剤と第２のＴｏｐ１阻害剤とに応答したＴＰ５３ＩＮＰ１の比較変化を示すグラフである。
【０１６６】
Ｔｅａｐの過剰発現により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞媒介性死滅が増加する。Ｔｏｐ１阻害剤で処理した腫瘍細胞においてＴＰ５３ＩＮＰ１の発現レベルで有意な増加を観測したことから、本発明者らは次に、本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを使用して、Ｔ細胞媒介性死滅に対するこの変化の機能的関連性を調べた。本発明者らはレンチウイルスシステムを使用して、黒色腫腫瘍細胞中でＧＦＰタグ付きＴｅａｐを過剰発現させた（ＧＦＰの発現をコントロールとして使用した）。本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより腫瘍細胞中でのＴｅａｐの過剰発現を検証した。本発明者らは、ＧＦＰまたはＴｅａｐを過剰発現する２５４９黒色腫細胞を２５４９自己Ｔ細胞と共にインキュベートして、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅に対してＴｅａｐの過剰発現がどのような効果を有するかを決定した。本発明者らは、コントロールであるＧＲＰ過剰発現２５４９細胞と比較して、Ｔｅａｐを過剰発現する２５４９腫瘍細胞のＴ細胞死滅の増加を観測した。この観測は、本発明者らがＴｏｐ１阻害剤による黒色腫細胞の処置により観測したものを再現し、これは、Ｔｅａｐの発現の増加および腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅の増加をもたらした。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＧＡＰＤＨ（図１５Ａ）および％カスパーゼ３陽性（図１５Ｂ）に対して正規化されたＴｅａｐの相対的なｍＲＮＡ発現を示すグラフである。
【０１６７】
Ｔｅａｐのサイレンシングは、Ｔｏｐ１阻害剤で処理した腫瘍細胞でのＴ細胞媒介性死滅を妨げる。次いで、本発明者らは、黒色腫腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅のＴｏｐ１阻害剤増強のためのＴｅａｐの必要性の補足的な質問をした。本発明者らは、黒色腫腫瘍細胞中でＴｅａｐの発現を停止させるためにレンチウイルスｓｈＲＮＡを使用することにより、この質問に取り組んだ（ルシフェラーゼを標的とするｓｈＲＮＡをコントロールとして使用した）。本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＴｅａｐ発現のノックダウンを検証した。次いで、本発明者らは、Ｔｅａｐの発現が停止された場合に、Ｔｏｐ１阻害剤による処置により黒色腫腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅の増加がもたらされるかどうかを質問した。示すように、黒色腫細胞中でのＴｅａｐの発現停止は、Ｔｏｐ１阻害剤による処置の腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅を増強する能力を妨げた。しかしながら、ＴＥＡＰサイレンシングは、ＴＯＰ１阻害のみまたはＴＩＬ共インキュベーションのみによる腫瘍細胞中でのカスパーゼ活性化を妨げなかった。このことは、Ｔｏｐ１阻害剤により処理された腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅で観測される増強にはＴｅａｐが必要であることを示す。図１６Ａは、Ｔｅａｐノックアウト黒色腫細胞系統の場合の２５４９および％カスパーゼ３陽性（図１６Ｂ）に関してＧＡＰＤＨに対して正規化された相対的なｍＲＮＡ発現を示すグラフである。
【０１６８】
実施例６：ヒト癌の処置のための併用Ｔｏｐ１／免疫調節療法
別の実施形態では、黒色腫等の癌と診断されたヒトを処置する方法は、抗ＰＤ１抗体（例えばニボルマブ）と組み合わされたトポイソメラーゼ１阻害剤（例えばＭＭ−３９８リポソームイリノテカン）の投与を含む。
【０１６９】
図１７Ａおよび図１７Ｂは、ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンと抗ＰＤ１療法ニボルマブとの併用療法でヒトを処置する例示的な方法の概略図である。図１７Ａの方法は、例えば、併用療法の薬物動態の決定等の、この併用療法での抗ＰＤ−１抗体（例えばニボルマブ）およびリポソームイリノテカン（例えばＭＭ−３９８）の推奨される第二相用量を決定するのに有用である。図１７Ｂの方法は、例えば、無増悪生存および全生存の決定等の、以前の抗ＰＤ−１抗体療法に対して抵抗性である患者の併用療法での抗ＰＤ−１抗体（例えばニボルマブ）およびリポソームイリノテカン（例えばＭＭ−３９８）の全体的な応答率を決定するのに、ならびにこの併用療法の安全性プロファイルの評価に有用である。図１７Ａおよび図１７Ｂの一方または両方の方法は、以下のうちの一方または両方を更に含むことができる：（ａ）バイオマーカー分析のために処置前および処置後の生検および血液サンプルを評価すること、例えば、臨床前試験に基づいて目的の標的と同定されているＴＰ５３ＮＰ１（Ｔｅａｐ）の評価を特に含む、併用療法と共に登録された転移性黒色腫の患者中の免疫学的マーカーおよび分子マーカーの評価、ならびに／または（ｂ）分析する免疫学的マーカーは、循環エフェクターおよび調節性Ｔ細胞をモニタリングするためにＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３を含む。図１７Ａおよび図１７Ｂのいずれかまたは両方の方法の間に、ＴＰ５３ＩＮＰ１等の腫瘍内性因子およびプロアポトーシス分子の発現をモニタリングすることもできる。これらの方法を医学的に適切な患者で実施することができる。好ましくは、この患者は以下の特徴のうちの１つ、複数または全てを有する：年齢＞１８、ＥＣＯＧ  ０−；ＲＥＣＩＳＴ  １．１により測定可能な疾患；測定可能な疾患としてカウントされない連続生検に適した腫瘍；適切な臓器／骨髄機能；および／または抗ＰＤ−１もしくは抗Ｐｄ−Ｌ１をベースとする療法に対する処置抵抗性。また、好ましくは、慢性的なステロイド補充（＞１０ｍｇプレドニゾン／等価物）を必要とする活性な自己免疫疾患の患者は処置から除外される。加えて、疾患が処置の少なくとも４週間前に処置されており且つ安定であるならば、以前のＣＮＳ転移を有する患者は許容され得る。
【０１７０】
本処置方法は、ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンの特定の用量（イリノテカンの遊離塩基をベースとする用量）およびニボルマブに対応する、（２８日間の処置サイクルにおいて）１４日毎に１回静脈内投与する以下の表３からの用量レベル１、−１、２または３のうちの少なくとも１つでヒト患者を処置することを含む。
【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
好ましくは、ＭＭ−３９８リポソームイリノテカンをニボルマブの前に投与する。好ましくは、本処置方法を使用して、ニボルマブに関してＦＤＡに承認されている癌の形態と診断されたヒト患者を処置する。ニボルマブは、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）およびホジキンリンパ腫で現在ＦＤＡに承認されている。ベイジアンデザインを、図１７Ａの処置方法を使用する第一相試験に使用することができる。図１７Ｂの処置方法を使用する第二相試験は、２０％の全奏効率（ＯＲＲ）の目標を有する（例えば、処置した合計５０例の患者を、５％の片側有意レベルおよび７５％のパワーで２０％ＯＲＲの目標に対して推定する）ことができる。
【０１７３】
上記のプロコトルをいくつかの方法で変更して、有効性および適切な投薬を評価することができた。ペンブロリズマブをニボルマブの代わりに使用して、リポソームイリノテカンと組み合わせて試験することができた。ペンブロリズマブを概して３週間毎に２ｍｇ／ｋｇで投与し、そのため、各サイクルが２週間の代わりに３週間長となるように図１７Ａおよび図１７Ｂに示すプロトコルを変更することができた。好ましくは、この処置方法を使用して、ペンブロリズマブに関してＦＤＡに承認されている癌の形態と診断されたヒト患者を処置することができる。ペンブロリズマブは黒色腫で現在ＦＤＡに承認されている。或いは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を抗ＰＤ−１抗体の代わりに使用することができた。
【０１７４】
他の実施形態
上記の詳細な説明は、本開示の実施で当業者を助けるために提供される。しかしながら、本明細書で説明され且つ特許請求された開示は、本明細書で開示された特定の実施形態により範囲が限定されるものではなく、なぜならば、この実施形態は、本開示のいくつかの態様の説明として意図されているからである。あらゆる等価の実施形態は本開示の範囲内であることが意図されている。実際には、本明細書で示され且つ説明されたものに加えて、上述の説明から、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない本開示の様々な改変が当業者に明らかになるだろう。そのような改変も、添付された特許請求の範囲に含まれると意図されている。
【０１７５】
本明細書で引用されている全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書での参考文献の議論は、その著者によりなされた主張を要約することのみが意図されており、いかなる参考文献も特許性に関連する先行技術を構成するということを承認してない。出願人は、引用した参考文献の正確性および妥当性に異議を申し立てる権利を保留する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2018527377.tif 000012
【図６Ａ−６Ｂ】
2018527377.tif 000013
【図７】
2018527377.tif 000014
【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
2018527377.tif 000019
【図１１Ｃ−１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【国際調査報告】
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