(57)【要約】  本発明は臓器移植の被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の生体試料から臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）及び被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の特異的核酸配列間の比率を測定し、臓器移植の拒否反応を非侵襲的に予測する方法に関するもので、さらに詳しくは、臓器移植の被移植者の生体試料（例えば、血液）の検査を通じて表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカーに対して、提供者由来のマーカー配列及び被移植者由来のマーカー配列の比率を測定して、これを基づいて、臓器移植の拒否反応を予測する方法に関するものである。  本発明による次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法は、非常に少ない量のサンプルでも適用可能で、迅速で低廉で、データ分析の速度が早くて、全世界のあらゆる人種のすべての臓器移植に適用可能で、配列分析のエラー確率を同時に検出することができて、非侵襲的に臓器移植の拒否反応を予測するのに有用である。
2018514205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料における次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法：
臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有した生体試料を非侵襲的に入手する段階；
上記の生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を増幅する段階；
上記増幅された配列を次世代の塩基配列分析（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）又はデジタル塩基増幅を利用して分析する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階；及び
上記比率を一つ以上のカットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較する段階。
【請求項２】
前記生体試料は血液、血漿、血清、尿、または唾液であることを特徴とする請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
前記マーカー配列を増幅する段階は、表１ないし表１０から選択されるマーカー配列をさらに全部増幅することを特徴とする請求項１に記載の予測方法。
【請求項４】
前記マーカー配列別の比率は表１ないし表１０に示されたマーカーから選択される、それぞれの提供者由来のマーカー配列の量とそれぞれの被移植者由来のマーカー配列の量の比率であることを特徴とする請求項１に記載の予測方法。
【請求項５】
前記マーカー配列別の比率はエラー比率も共に計算することを特徴とする請求項１に記載の予測方法。
【請求項６】
前記生体試料の増幅されたマーカー配列は２００ｂｐ未満であることを特徴とする請求項１に記載の予測方法。
【請求項７】
前記カットオフ値は正常生体試料から確立された参照値である請求項１に記載の予測方法。
【請求項８】
次の段階を含む、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料における次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法：
臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有した生体試料を非侵襲的に入手する段階；
上記生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で表１ないし表１０で選択される三つ以上のマーカー配列を増幅する段階；
上記増幅された配列を次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階；及び
時間にわたって上記比率を測定して、提供者由来のマーカー配列の比率が増加すると臓器移植の拒否反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、移植機能障害（ｇｒａｆｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）または臓器不全（ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）であることと予測する段階。
【請求項９】
前記生体試料は血液、血漿、血清、尿、または唾液であることを特徴とする請求項８に記載の予測方法。
【請求項１０】
前記マーカー配列を増幅する段階は、表１ないし表１０から選択されるマーカー配列をさらに全部増幅することを特徴とする請求項８に記載の予測方法。
【請求項１１】
前記マーカー配列別の比率は表１ないし表１０に示されたマーカーから選択される、それぞれの提供者由来のマーカー配列の量とそれぞれの被移植者由来のマーカー配列の量の比率であることを特徴とする請求項８に記載の予測方法。
【請求項１２】
前記マーカー配列別の比率はエラー比率も共に計算することを特徴とする請求項８に記載の予測方法。
【請求項１３】
前記生体試料の増幅されたマーカー配列は２００ｂｐ未満であることを特徴とする請求項８に記載の予測方法。
【請求項１４】
上記比率測定時間は、臓器移植の前、臓器移植の直後及び臓器移植後の一日、二日、一週間、一ヶ月、二ヵ月、三ヶ月、１年、２年及び１０年で構成された群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の予測方法。
【請求項１５】
臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料における次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法の演算を遂行することができるようにコンピューティングシステムを制御するための複数の命令が暗号化されたコンピュータの判読可能な媒体を含むコンピュータシステムであって、
上記生体試料は臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有して、
上記演算は、上記生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析して得たデータを受信する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階；
上記比率を一つ以上のカットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較する段階；及び
このような比較に基づいて、被移植者の臓器移植の拒否反応が存在するかの可否を予測する段階を含む前記コンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器移植の被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の生体試料で臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）及び被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の特異的核酸配列間の比率を測定して臓器移植の拒否反応を非侵襲的に予測する方法に関するもので、さらに詳しくは臓器移植の被移植者の生体試料（例えば、血液）の検査を通じて提供者由来のマーカー配列及び被移植者由来のマーカー配列の比率を測定して、これを基に臓器移植の拒否反応を予測する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
正確で時期適切な臓器移植の拒否反応に対する診断は臓器移植の被移植者の生存に必須的な要素である。しかしながら、現在使用されている臓器移植の拒否反応の分析方法は、多くの短所がある。例えば、心臓移植の拒否反応を分析するためのゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）は、各時期別の組織検査であるが、尋常組織検査のためには手術が同伴されなければならなくて、高い費用、組織検査医師別の多様性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）及び深刻な患者の不便さなどの問題がある（Ｆ．Ｓａｒａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｖｏｌ．４３，ｐｐ．１９０８−１９１２，２０１１）。これを解決するため、臓器移植の拒否反応の発生時、増加する遺伝子発現信号、免疫タンパク質量の測定などのような非侵襲的な方法が使用されたが、上記方法らは多様な免疫反応の複雑な交差反応性のために偽陽性が高く、組織特異性を有する遺伝子発現信号に基盤を置いているという短所がある。
【０００３】
１９９０年代の後半に臓器移植の被移植者の尿及び血液に臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から由来した細胞遊離核酸（Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ，ｃｆｄＤＮＡ）が存在することが知られており（Ｊ．Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．１７４１−１７４６，１９９９．，Ｙ．Ｍ．Ｌｏｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３５１，ｐｐ．１３２９−１３３０，１９９８）、これを利用して非侵襲的に臓器移植の拒否反応を分析する方法が提示されてきた。例えば、男性の提供者から臓器の移植を受けた女性の被移植者の場合、提供者の特異的ＤＮＡはＹ染色体を検出する様々な分子化学的な方法を利用して分析することができる（Ｔ．Ｋ．Ｓｉｇｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．９７−１０１，２０１３）。しかしながら、このようなｃｆｄＤＮＡは莫大な量のｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ＤＮＡに比べて非常に少ない量が存在して、これを分析するための特異性と敏感度が高い方法が必要な実情である。
【０００４】
このような問題点を解決することができる次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）が多くの人々の関心を受けている。次世代の塩基配列分析技術は既存の方法と違って、大容量のデータを早い時間に生産することができるから、個人のゲノム解読に必要な時間と費用を画期的に節減させた技術である。次世代の塩基配列分析技術は、時間がたつことにつれてシークエンシングのプラットフォームは発展して分析価格はどんどん安くなっており、メンデル性遺伝疾患と希少疾患、癌などで次世代の塩基配列分析法を利用して疾病の原因遺伝子を探すことに成功している。次世代の塩基配列分析法は検体からＤＮＡを抽出した後、機械的に断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）をさせた後、特定のサイズを有するライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）を製作してシークエンシングに使用する。大容量のシークエンシング装備を使用して一個の塩基単位で四種類の相補的ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の結合及び分離反応を繰り返しながら、初期のシークエンシングデータを生産することになり、以後に初期データのトリミング（Ｔｒｉｍｍｉｎｇ）、マッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ）、遺伝体変異の同定及び変異情報の解析（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）など生物情報学（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を利用した分析段階を遂行して疾病及び多様な生物学的形態（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に影響を及ぼしたり、可能性が高い遺伝体変異を発掘し、革新的な治療剤の開発及び産業化を通じた新たな付加価値の創出に寄与している。次世代の塩基配列分析法はＤＮＡだけでなく、ＲＮＡ及びメチル化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）の解読にも応用されることができ、この中にはタンパク質をコードするはエクソーム（Ｅｘｏｍｅ）領域だけを捕獲（Ｃａｐｔｕｒｅ）してシークエンシングする全長エクソームシークエンシング（Ｗｈｏｌｅ−ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＷＥＳ）が存在する。この方法は疾病の発生と最も直接的な関連性を有するタンパク質をコードする領域だけをシークエンシングする方法で、費用の側面及び効率性の面で全長遺伝体をシークエンシングすることよりはエクソーム領域だけをシークエンシングすることが有利であるために広く利用されている。エクソームのシークエンシング方法を変更して望む遺伝子領域だけをキャプチャーするプローブを作製して当該領域の遺伝体変異を検出することができる方法を使用すると少ない費用で望む主要ガン遺伝子の遺伝体変異の検出を容易に遂行することができる。このようなシークエンシング方法をＴａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇという。
【０００５】
このような次世代の塩基配列分析技法を利用する場合、サンプル内に存在する全ての核酸を分析することができるために、望むサンプルの濃度が非常に低いｃｆｄＤＮＡの分析にとても有用であるということが知られており、例えばＩｗｉｊｉｎ  Ｄｅ  Ｖｌａｍｉｎｃｋらは６５名の心臓移植患者から時間にわたって獲得した５６５個のサンプルを分析した結果、臓器移植の拒否反応が示されると、被移植者のサンプル内でｃｆｄＤＮＡの比率が増加すると発表した（Ｉｗｉｊｉｎ  Ｄｅ  Ｖｌａｍｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．６，２４１ｒａ７７，２０１４）。
【０００６】
しかしながら、上記方法は心臓特異的にマーカーを使用して、全てのサンプルを分析して、時間と費用が非常に多く消耗される短所がある。
【０００７】
従って、本発明者らは上記の問題点を解決するために鋭意努力した結果、表１のマーカーを１００ｂｐ未満で増幅して次世代の塩基配列分析を遂行する場合、ｃｆＤＮＡをｓａｍｐｌｅそのままに利用することができることと同時に敏感度と正確性は維持され、時間及び費用は大きく減少することを確認して、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料から次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料から次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法を遂行することができるようにコンピューティングシステムを制御するための複数の命令が暗号化されたコンピュータ判読可能な媒体を含むコンピュータシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は次の段階を含む臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料から次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法を提供する：
臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有した生体試料を非侵襲的に入手する段階；
上記の生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を増幅する段階；
上記増幅された配列を次世代の塩基配列分析（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階及び；
上記比率を一つ以上のカットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較する段階。
【００１１】
本発明はまた、次の段階を含む臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料から次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法を提供している：
臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有した生体試料を非侵襲的に入手する段階；
上記の生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を増幅する段階；
上記増幅された配列を次世代の塩基配列分析（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階及び；
時間にわたって上記比率を測定して、提供者由来のマーカー配列の比率が増加すると臓器移植の拒否反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、移植機能障害（ｇｒａｆｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）または臓器不全（ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）であることを予測する段階。
【００１２】
本発明はまた、次の段階を含むもののコンピュータシステムを提供する：
臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料から次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法を遂行することができるようにコンピューティングシステムを制御するための複数の命令が暗号化されたコンピュータ判読可能な媒体を含むコンピュータシステムとして、
上記生体試料は臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有して、
上記演算は上記の生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用し、分析して得たデータを受信する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階；
上記比率を一つ以上のカットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較する段階及び；
このような比較に基づいて、被移植者の臓器移植の拒否反応が存在するかの可否を予測する段階。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法に対する概念図である。患者から非侵襲的に獲得した生体試料（例えば血液）で、循環細胞遊離ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ＤＮＡ）を分離する。厳選されたマーカーセットに対してｍｕｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＰＣＲで増幅したサンプルを短い判読の次世代の塩基配列分析技法（ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で分析して、各マーカーの対立因子に対して比率を計数（ｃｏｕｎｔ）して臓器移植の拒否反応を予測する。
【図２】図２は一つのマーカーに対して設計したプライマーを通じて増幅して分析する場合、望むＳＮＰ  ｓｉｔｅがプライマーのすぐ後ろに存在してＮＧＳの速度が非常に早く遂行されることができることを示される例示である。
【図３】図３は表１で選択される２０２３個のマーカーに対して臓器移植の条件を人為的に作るためにＤＮＡを混合して移植の被移植者から提供者のＳＮＰマーカーの比率を測定した分析結果である。
【図４】図４は各々のＳＮＰのマーカー別に、人為的に混合したＤＮＡサンプルでの測定値を示した結果である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１４】
本発明による次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法は、非常に少ない量のサンプルにも適用可能で、迅速で低廉で、厳選されたマーカーを使用するので、データ分析の速度が早くて、全世界のあらゆる人種のすべての臓器移植に適用可能で、配列分析のエラーレートを同時に検出することができて、非侵襲的に臓器移植の拒否反応を予測するのに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
他の式で定義されない限り、本明細書で使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で熟練された専門家によって、通常的に理解されるものと同一な意味を有する。一般的に本明細書で使用された命名法は本技術分野でよく知られていて、通常的に使用されるものである。
【００１６】
本発明での用語「次世代の塩基配列分析技法」はＮｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇまたはＮＧＳを意味するものである。これは全長遺伝体（Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ）を断片化して、上記の断片を化学的な反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいて大容量でシークエンシングを遂行する技術を意味して、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｒｏｃｈｅ及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の技術を含めて、広い意味では第３世代の技術であるＰａｃｉｆｉｃｂｉｏ、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなどの技術及び第４世代の技術を含むものと定義する。
【００１７】
本発明での用語「臓器移植の拒否反応」は急性及び慢性臓器移植の拒否反応をすべて含む。「急性臓器移植の拒否反応（Ａｃｕｔｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ＡＲ）」は提供者の臓器が被移植者の免疫システムにより外部のものと判断された時起きる。急性臓器移植の拒否反応は移植を受けた臓器に被移植者の免疫細胞が浸透し、移植を受けた臓器を結果的に破壊することと定義される。これは非常に早く起こり、普通の臓器移植の手術以後、数週間の以内に発生することになる。一般的に急性臓器移植の拒否反応は、ｒａｍｐａｍｙｃｉｎ、ｃｙｓｌｏｓｐｒｉｎ  Ａ、ａｎｔｉ−ＣＤ４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙなどのような免疫抑制剤により抑制されたり阻害されることができる。「慢性臓器移植の拒否反応（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ＣＲ）」は一般的に、臓器移植後、数ヵ月または数年以内に発生する。あらゆる種類の慢性臓器移植の拒否反応で臓器の繊維化は共通的に発生する現象であり、各臓器別に機能の低下が発生するようになる。例えば、肺の移植を受けたが、慢性臓器移植の拒否反応が発生すると、気道が破壊される繊維化反応が起きて、肺炎が発生するようになる（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ）。また、心臓の移植を受けたが、慢性臓器移植の拒否反応が発生すると、頚動脈硬化症（ｆｉｂｏｔｉｃ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）が発生することになって、腎臓の移植を受けたが、慢性臓器移植の拒否反応が発生することになれば閉塞性腎臓病（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、腎硬化症（ｎｅｐｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、尿細管間質性腎症（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）などが発生するようになる。慢性臓器移植の拒否反応はまた、虚血侵襲（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｓｕｌｔ）、移植を受けた臓器の除神経（ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ）、免疫抑制剤と関連された高脂血症及び高血圧の症状で現れることもある。
【００１８】
本発明での用語「生体試料」は、被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から入手されて、関心ある一つ以上の核酸分子を含有する任意の試料を意味する。
【００１９】
本発明での用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらの重合体を意味する。別途に、特別に制限されない限り、上記用語は基準核酸と類似した結合の特性を有して天然ヌクレオチドと類似した方式で代謝される天然ヌクレオチドの公知された類似体を含有する核酸を含む。別途に記載されない限り、特定核酸の配列は、また、明確に記載された配列だけでなく、暗黙的にこの保存的に変形された変異体（例えば、縮退性コドンの置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ及び相補的配列を含む。具体的に、一つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基に、置換される配列を生成することによって、縮退性コドンの置換が達成されることができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；ａｎｄ  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。上記用語の核酸は遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合（Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）ＲＮＡ及び遺伝子または遺伝子座によりコーディングされた低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と相互交換的に使用される。
【００２０】
本発明での用語「単一塩基多型性（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）」は一つの種内の多数の集団で現れる単一塩基の違いをいうことである。例えば、臓器移植の提供者（ｄｏｎｏｒ）の染色体１３に存在するｒｓ７９８８５１４マーカーはＣ／Ｇであるが、臓器移植の被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）のマーカーはＴ／Ａである場合、本発明の方法を使用して被移植者の血液から提供者のマーカーの比率を分析して、臓器移植の拒否反応を予測することに使用することができる。
【００２１】
本発明での用語「カットオフ値」は生体試料に対して２つ以上の状態（例えば、正常状態及び臓器移植の拒否反応状態）間の分類の仲裁に使用される数値を意味する。例えば、被移植者の血液から提供者のマーカーの比率がカットオフ値より大きい場合、被移植者は、臓器移植の拒否反応の状態に分類されて、又は被移植者の血液から提供者のマーカーの比率がカットオフ値より小さい場合、被移植者は正常常態に分類される。
【００２２】
本発明では、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカーを使用して被移植者から獲得した生体試料を短い判読の次世代の塩基配列分析技法（ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはデジタル塩基増幅の方式で分析する場合（図１）、生体試料で臓器移植の拒否反応を高い正確度で早く予測することができることを確認しようとした。
したがって、本発明は一観点から、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有した生体試料を非侵襲的に入手する段階；
上記の生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を増幅する段階；
上記増幅された配列を次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階及び；
上記比率を一つ以上のカットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較する段階を含む、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料から次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法に関するものである。
【００２３】
本発明において、上記表１ないし表１０のマーカー配列は単一塩基多型性（ＳＮＰ）の特徴がｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃで、ハーディヴァインベルク分布（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を満足しながらｍｉｎｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（小対立遺伝子の比率）が０．４以上である単一塩基多型性のマーカーであることを特徴とすることができる。
【００２４】
本発明において、上記表１ないし表１０のマーカー番号（ｒｓ数）はＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｓｎｐ）で検索できるｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳＮＰ  ｎｕｍｂｅｒであることを特徴とすることができる。
【００２５】
【表１】
2018514205.tif 000003
【００２６】
【表２】
2018514205.tif 000004
【００２７】
【表３】
2018514205.tif 000005
【００２８】
【表４】
2018514205.tif 000006
【００２９】
【表５】
2018514205.tif 000007
【００３０】
【表６】
2018514205.tif 000008
【００３１】
【表７】
2018514205.tif 000009
【００３２】
【表８】
2018514205.tif 000010
【００３３】
【表９】
2018514205.tif 000011
【００３４】
【表１０】
2018514205.tif 000012
【００３５】
本発明において、上記生体試料は血液、血漿、血清、尿、または唾液であることを特徴とすることができる。
【００３６】
本発明において、上記マーカーの配列は各々のＳＮＰ  ｓｉｔｅに対して下記の表１１のような遺伝子型を有することができて、これによってどのようなＳＮＰ組合せ（赤）は臓器移植の拒否反応の予測に有用な情報を提供することができないが、どのようなＳＮＰ組合せ（黄及び緑）は有用な情報を提供することができ、これは全的に提供者及び被移植者のＳＮＰ遺伝子の無作為分布によって決定されることを特徴とすることができる。
【００３７】
【表１１】
2018514205.tif 000013
【００３８】
例えば、４５％のｍｉｎｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙを有するＳＮＰマーカーの組合せを分析に利用する場合、ハーディヴァインベルク平衡によって計算した提供者及び被移植者の各対立遺伝子別の比率を計算すると、下記表１２のようである。
【００３９】
【表１２】
2018514205.tif 000014
【００４０】
本発明において、上記マーカーの配列を増幅する段階は、表１ないし表１０に開示されたマーカー配列を追加ですべて増幅することを特徴とすることができる。
【００４１】
本発明において、上記マーカー配列別の比率は表１ないし表１０のマーカー別に、配列分析の結果、提供者由来のマーカー配列の量と被移植者由来のマーカー配列の量の比率であることを特徴とすることができる。
【００４２】
本発明に使用されるＮＧＳ  ｐｌａｔｆｏｒｍは大部分１００ｂｐの大きさの配列の断片を分析するのに最適化されている。ＮＧＳ  ｐｌａｔｆｏｒｍを選択するときに、考慮しなければならない要素は一度に読むことができる判読の長さ、基本エラーレート、分析速度及び反応効率などである。
【００４３】
本発明では、上記要素を最適化するため、上記表１ないし表１０のマーカーを増幅する場合、望むＳＮＰサイトは配列分析の開始地点から３５ｂｐ以内に存在することになり、増幅されるマーカー配列も平均７０ｂｐであることを確認した（図２）。
【００４４】
したがって、本発明において、上記生体試料の増幅されたマーカー配列は２００ｂｐ未満であることを特徴とすることができる。
【００４５】
本発明で使用するマーカーはｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ＳＮＰ  ｓｉｔｅであるので、位置と期待される塩基配列の値は、すべて知られているマーカーを分析することであるから、その位置の塩基配列が知られた値と異なる場合（例えば、Ｇ／Ｔで読まれなければならないのにＡで読まれること）、これはエラーでカウントすることができる。
【００４６】
図３で表示されたことのように本発明の方法で２０２３個のマーカーに対して分析した結果、エラーレートも容易に計算可能であることを確認することができた。
【００４７】
したがって、本発明において、上記マーカー配列別の比率はエラー比率も共に計算することを特徴とすることができる。
【００４８】
本発明において、上記カットオフ値は正常生体試料から確立された参照値である予測方法であることを特徴とすることができる。
【００４９】
一方、臓器移植の拒否反応の場合、臓器の移植を受けた被移植者で時間によって、提供者のＤＮＡ量の変化を観察することで拒否反応を予想することができることと予測した。
【００５０】
本発明の他の実施例では臓器の移植を受けた被移植者で生体試料を臓器の移植を受ける前、受けた直後、その後一定時間の間隔を置いて獲得した後、これを分析した結果、臓器移植の拒否反応が示される時は提供者のＳＮＰマーカーの比率が増加することを確認することができた。
したがって、本発明は別の観点から、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有した生体試料を非侵襲的に入手する段階；
上記生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で表１ないし表１０で選択される三つ以上のマーカー配列を増幅する段階；
上記増幅された配列を次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階及び；
時間にわたって上記比率を測定して、提供者由来のマーカー配列の比率が増加すると臓器移植の拒否反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、移植機能障害（ｇｒａｆｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）または臓器不全（ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ）であることと予測する段階を含む、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料で次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法に関するものである。
【００５１】
本発明において、上記生体試料は血液、血漿、血清、尿、または唾液であることを特徴とすることができる。
【００５２】
本発明において、上記マーカー配列を増幅する段階は表１ないし表１０に開示されたマーカー配列を追加ですべて増幅することを特徴とすることができる。
【００５３】
本発明において、上記マーカー配列別の比率は表１ないし表１０のマーカー別に、配列分析結果、提供者由来のマーカー配列の量と被移植者由来のマーカー配列の量の比率であることを特徴とすることができる。
【００５４】
本発明において、上記マーカー配列別の比率はエラーの比率も共に計算することを特徴とすることができる。
【００５５】
本発明において、上記生体試料の増幅されたマーカー配列は２００ｂｐ未満であることを特徴とすることができる。
【００５６】
本発明において、上記時間は、これに限定されないが、臓器移植の前、臓器移植の直後及び臓器移植後の一日、二日、一週間、一ヶ月、二ヵ月、三ヶ月、１年、２年及び１０年で構成された群から選択されることを特徴とすることができる。
【００５７】
本発明はまた、臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から得た生体試料で次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用した臓器移植の拒否反応の予測方法を遂行することができるようにコンピューティングシステムを制御するための複数の命令が暗号化されたコンピュータの判読可能な媒体を含むコンピュータシステムであって、
上記生体試料は臓器提供者（ｄｏｎｏｒ）から臓器の移植を受けた被移植者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）から提供者及び被移植者の細胞遊離核酸分子を含有して、
上記演算は、上記生体試料から分離した細胞遊離核酸分子で、表１ないし表１０から選択される三つ以上のマーカー配列を次世代の塩基配列分析技法（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）またはデジタル塩基増幅の方式を利用して分析して得たデータを受信する段階；
このような配列分析に基づいて、提供者と被移植者のマーカー配列別の比率を決定する段階；
上記比率を一つ以上のカットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）と比較する段階及び；
このような比較に基づいて、被移植者の臓器移植の拒否反応が存在するかの可否を予測する段階を含む前記コンピュータシステムに関するものである。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることで解釈されないことは当業界で通常の知識を有した者において自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【００５９】
実施例１：人為的に作った臓器移植の被移植者で臓器移植の拒否反応の予測
１−１．臓器移植の被移植者の人為的なＤＮＡサンプルの作製及び分析のための前処理
男性ＤＮＡ（提供者）と女性ＤＮＡ（被移植者）を利用して女性ＤＮＡでの男性ＤＮＡの比率を各々０％、０．６２５％、１．２５％、２．５％、５％、１０％で混合して人為的な臓器移植患者のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅを作った。
【００６０】
各々のｇＤＮＡ１００ｎｇを利用してＴｒｕＳｅｑ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ（ＴＳＣＡ）Ａｓｓａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＵＳＡ）を進行するために、Ｃｕｓｔｏｍ  Ａｍｐｌｉｃｏｎを作製した。Ｈｅａｔ  ｂｌｏｃｋを９５℃に合わせておいてＤＮＡとＣＡＴ（Ｃｕｓｔｏｍ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｏｌｉｇｏ  Ｔｕｂｅ）を各々５μｌずつ１．７ｍｌのチューブにいれた。この時ｃｏｎｔｒｏｌ試薬であるＡＣＤ１とＡＣＰ１も５μｌずつ共に準備した。そして各グループに４０μｌずつＯＨＳ１（Ｏｌｉｇｏ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １）をピペットを利用してよく混ぜるように加えて９５℃、１ｍｉｎ後、温度を４０℃に合わせて８０ｍｉｎの間、Ｏｌｉｇｏ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応をさせた。温度が下がったことを確認した後にＦＰＵ（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｕｎｉｔ）ｐｌａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅにＳＷ１（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  １）試薬を４５μｌずつ加えた後、遠心分離機に入れて２，４００Ｘｇ、２０℃、１０ｍｉｎにして前処理の準備を終えて、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを終えたサンプルチューブをｓｐｉｎ−ｄｏｗｎした後、ピペットを利用してＦＰＵ  ｐｌａｔｅに移した後、２，４００Ｘｇ、２０℃、２ｍｉｎにしてＳＷ１試薬を４５μｌ加えて２回の洗浄過程を繰返して、ＵＢ１（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ１）試薬を４５μｌずつ加えて同一な条件で遠心分離して反応しなかったＵｎｂｏｕｎｄ  Ｏｌｉｇｏを除去した。
【００６１】
Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ＯｌｉｇｏのＥｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＬｉｇａｔｉｏｎのためにＥＬＭ３（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ３）を４５μｌずつ入れてホイールをかぶせて３７℃  ｉｎｃｕｂａｔｏｒで４５ｍｉｎ反応させた。反応を終えると、ホイールを除去して２，４００Ｘｇ、２ｍｉｎ遠心分離した後に予め作っておいた５０ｍＭ  ＮａＯＨを２５μｌずつ加えてピペットで５−６回ピペッティングして５分間ｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅで反応させた。反応時間の間にＰＭＭ２／ＴＤＰ１（ＰＣＲ  Ｍｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２／ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １）Ｍｉｘｔｕｒｅを作ってＰ５、Ｐ７  ｉｎｄｅｘが各々４μｌずつ含まれたＰＣＲ  ｔｕｂｅに加えた。反応を終えてＮａＯＨに溶けたＤＮＡ２０μｌを混合して総５０μｌのＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎサンプルの準備を終え、以下の条件のＰＣＲ  ｐｒｏｇｒａｍで反応させた。
【００６２】
ＰＣＲ条件
−  ９５℃、３ｍｉｎ
−  ２８  ｃｙｃｌｅｓ
−  ９５℃、３０ｓｅｃ
−  ６６℃、３０ｓｅｃ
−  ７２℃、６０ｓｅｃ
−  ７２℃、５ｍｉｎ
−  Ｈｏｌｄ  ａｔ  １０℃
【００６３】
反応を終えたサンプルはＱＩＡｘｃｅｌの装備を利用してバンドを確認して６０μｌのｂｅａｄを利用したｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎの過程を経て、３０μｌのＲｅｓｕｓｐｅｎｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＳ）を収得した。
【００６４】
１−２．臓器移植の被移植者の人為的なＤＮＡサンプルの分析
上記サンプルはシークエンシング装備を利用して塩基配列を明らかにすることができ、該当Ｍａｋｅｒをｃｏｕｎｔｉｎｇして自体のアルゴリズムとパイプラインを通じて臓器移植の拒否反応に対するモニタリングが可能であることを確認することができた（図３及び図４）。
【００６５】
次世代の塩基解読装置（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて得たＳＮＰマーカーに対応する各々のａｌｌｅｌｅの数をグラフに表示するが、横軸には多数の対立遺伝子（Ｒｅｆｅｒｎｅｃｅ  ａｌｌｅｌｅまたはＭａｊｏｒ  ａｌｌｅｌｅ）のｃｏｕｎｔｉｎｇ数、縦軸には、少数の対立遺伝子（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ａｌｌｅｌｅまたはＭｉｎｏｒ  ａｌｌｅｌｅ）のｃｏｕｎｔｉｎｇ数をｌｏｇ２値で取って表示した（図３）。特に、本ＳＮＰマーカーは染色体１３、１８、２１番に位置したＳＮＰのみを選別したものであるために、各々青（●）、緑（■）、赤（×）で色と印を利用して区分した（図３）。
【００６６】
下段の表で見られるように、本混合されたＤＮＡの表現型は総９種類であることができる。
【００６７】
【表１３】
2018514205.tif 000015
【００６８】
人為的に作ったＤＮＡ表現型はＡＡ、Ａａ、ａＡ、ａａで示されることができるから、その分布が８つのケースとして示されることができる（ＡＡａａ，ａａＡＡは同じ表現型とみなす）。提供者のＤＮＡが多くなるほど、ＡａＡＡ、Ａａａａの分布が一定な比率で増加することを確認することができた（図３）。
【００６９】
図３で記載されたことのように、提供者のバイオマーカーの混合程度によって分布図が変わることを確認することができる。この分布図を定量的に測定計算して、提供者の血液内に存在する微量の提供者の遺伝子を検出したり、測定することができて、提供者の遺伝子変異の量を測定して観察することで、臓器移植の拒否反応を予測、または観察することができる。
【００７０】
また、表１４に開示されたことのように他の比率で二つの混合したＤＮＡを実際に次世代の塩基配列分析方式で測定すると、次世代の塩基配列のバイオマーカーを定量的に分析して混合されたＤＮＡ量を非常に少ない量でも正確に測定することができることを確認した。
【００７１】
【表１４】
2018514205.tif 000016
【００７２】
このような脈絡で各々の人為的に混合された提供者のＡＡとａａに該当する塩基をｃｏｕｎｔｉｎｇすると次の表１４のように数値化することができる。実験上混合されたＤＮＡ数値と分析を通じて出た数値とは約２倍の差があるが、測定したＤＮＡ量は絶対量ではないので差が出ることができる。
【００７３】
図４に開示されたことのように、各々のマーカーは個別的な違いを示しているが、複数のマーカーを使用の時、とても正確に測定したり観察することができる。
【００７４】
実際の患者に適用のとき、時間別に提供者のＤＮＡを数値化することができて、臓器移植に対する拒否反応をモニタリングすることができる。
【００７５】
以上で本発明内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有した者においてこのような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけで、これにより本発明の範囲が制限されることではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の方法は非侵襲的に臓器移植の拒否反応を予測またはモニタリングすることができるので、産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2018514205.tif 000017
【図２】
2018514205.tif 000018
【図３】
2018514205.tif 000019
【図４】
2018514205.tif 000020
【国際調査報告】
2018514205.tif 000021
2018514205.tif 000022
2018514205.tif 000023
2018514205.tif 000024