(57)【要約】  本開示は、一般に、増加した量の１または複数種の目的タンパク質を産生する修飾グラム陽性菌細胞および増大した遺伝子コンピテンシーを有する修飾グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のある実施形態は、同じ目的タンパク質を発現する非修飾（親）グラム陽性菌細胞に比べ、増加した量の目的タンパク質を発現する修飾グラム陽性菌細胞に関し、ここで、修飾細菌細胞は、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む。ある実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子を、修飾細胞の染色体に組み込む。他の実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、修飾細胞中に導入された染色体外プラスミド上に含まれる。他の実施形態では、本開示は、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードする核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関し、ここで、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非修飾グラム陽性菌細胞に比べ、増加した量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する修飾グラム陽性菌細胞であって、前記修飾細菌細胞が、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む修飾グラム陽性菌細胞。
【請求項２】
前記変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする前記ｒｐｏＣ遺伝子が、前記修飾細胞の染色体に組み込まれる、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項３】
前記変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする前記ｒｐｏＣ遺伝子が、前記修飾細胞の染色体外プラスミド上に含まれる、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項４】
少なくとも１つの突然変異を含む前記変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする前記ｒｐｏＣ遺伝子が、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項５】
前記ｒｐｏＣ遺伝子が、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項６】
少なくとも１つの突然変異を含む前記変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする前記ｒｐｏＣ遺伝子が、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を含む。請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項７】
前記ｒｐｏＣ遺伝子が、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項８】
配列番号６の前記変異β’−サブユニットポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸残基位置７５１、７８４、７９７、７９６および／もしくは１０１８〜１０２０、または任意の細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む、請求項５に記載の修飾細胞。
【請求項９】
前記変異β’−サブユニットポリペプチドが、以下：配列番号６のアミノ酸残基７５１でのメチオニンからイソロイシンへの置換（Ｍ７５１Ｉ）、配列番号６のアミノ酸残基７８４のアルギニンからヒスチジンへの置換（Ｒ７８４Ｈ）、配列番号６のアミノ酸残基７９７のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ７９７Ｆ）、配列番号６のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ７９６Ｇ）、および／または配列番号６のアミノ酸残基１，０１８、１，０１９および１，０２０の欠失（ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１０】
配列番号８の前記変異β’−サブユニットポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸残基位置７５１、７８４、７９７、７９６および／もしくは１０１８〜１０２０、または任意の細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む、請求項７に記載の修飾細胞。
【請求項１１】
前記変異β’−サブユニットポリペプチドが、以下：配列番号８のアミノ酸残基７５１のメチオニンからイソロイシンへの置換（Ｍ７５１Ｉ）、配列番号８のアミノ酸残基７８４のアルギニンからヒスチジンへの置換（Ｒ７８４Ｈ）、配列番号８のアミノ酸残基７９７のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ７９７Ｆ）、配列番号８のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ７９６Ｇ）、および／または配列番号８のアミノ酸残基１，０１８、１，０１９および１，０２０の欠失（ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１２】
変異ＲＮＡＰβサブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＢ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異をさらに含む、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１３】
前記非修飾グラム陽性対照細胞に比べ、発現されるＰＯＩの増加量が、少なくとも５％である、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１４】
前記非修飾グラム陽性対照細胞に比べ、発現されるＰＯＩの増加量が、少なくとも１０％である、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１５】
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細胞が、以下：バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択される、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１６】
前記ＰＯＩが、前記修飾細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または前記修飾細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の修飾細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載の修飾細胞により産生される、単離された目的タンパク質（ＰＯＩ）。
【請求項１８】
グラム陽性宿主細胞において目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現を増大させる方法であって、以下：
（ａ）増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞を取得する工程において、前記修飾細菌細胞が、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む工程と、
（ｂ）前記ＰＯＩが発現される条件下で前記修飾細胞を培養する工程
を含み、ここで、増加した量のＰＯＩを発現する前記修飾細菌細胞が、非修飾グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの発現と比較される方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの突然変異を含む前記変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする前記ｒｐｏＣ遺伝子が、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの突然変異を含む前記変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする前記ｒｐｏＣ遺伝子が、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
変異ＲＮＡＰβサブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＢ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記非修飾グラム陽性対照細胞に比べ、発現されるＰＯＩの増加量が、少なくとも５％である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法によって生産される、単離された目的タンパク質（ＰＯＩ）。
【請求項２４】
増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞を取得する方法であって、以下：
（ａ）親グラム陽性菌細胞に少なくとも１つのｒｐｏＣ遺伝子修飾を導入する工程と、
（ｂ）増加した量の前記ＰＯＩを発現する１つまたは複数の娘細胞を選択する工程
を含む方法。
【請求項２５】
変異ＲＮＡ−ポリペプチド（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む、修飾ｒｐｏＣ遺伝子を含む組み込みベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組み込みプラスミドを含むグラム陽性菌細胞。
【請求項２７】
形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法であって、以下：
（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーによって、コンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に外来性ポリヌクレオチドを形質転換する工程において、前記修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、前記ｒｐｏＣポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであった前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、
（ｂ）前記外来性ポリヌクレオチドを含む前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換体を単離する工程
を含む方法。
【請求項２８】
前記コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、前記宿主細胞をさらにコンピテントにするために、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３０】
コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法であって、以下：
（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを、非コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入する工程において、前記修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、前記ｒｐｏＣポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記導入ポリヌクレオチドを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を単離する工程
を含む方法。
【請求項３１】
前記コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞が、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法から得られるコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３３】
プロモーター領域５’を含み、且つ配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、前記ｒｐｏＣポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであった前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性であるコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３４】
形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法であって、以下：
（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つｒｐｏＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーによって、コンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に外来性ポリヌクレオチドを形質転換する工程において、前記修飾ｒｐｏＢポリペプチドが、配列番４と９０％の配列同一性を含むと共に、配列番号４の４７８位にバリン残基を含み、前記ｒｐｏＢポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであった前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、
（ｂ）前記外来性ポリヌクレオチドを含む前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換体を単離する工程
を含む方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【請求項３６】
コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法であって、以下：
（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つｒｐｏＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを非コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入する工程において、前記ｒｐｏＢポリペプチドが、配列番号４と９０％の配列同一性を含むと共に、配列番号４の４７８位にバリン残基を含み、前記ｒｐｏＢポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記導入ポリヌクレオチドを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を単離する工程
を含む方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／２４８，２２８号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、微生物学、分子生物学、酵素学、タンパク質工学の分野に関する。ある実施形態では、本開示は、増加量の１または複数の目的タンパク質の発現を産生する修飾グラム陽性菌細胞に関する。ある他の実施形態では、本開示は、増大した遺伝子コンピテンシーを含む修飾グラム陽性菌細胞に関する。
【０００３】
配列表の提出
２０１６年１０月１２日作成、サイズ７１ＫＢの「ＮＢ４０９４８ＷＯＰＣＴ＿ＳＥＱ．ｔｘｔ」と称する配列表テキストファイルの電子提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ポリペプチドの工業生産を改善するために、様々な技術が開発されており、そうした技術として、例えば、高生産菌株のための複数ラウンドの突然変異誘発および選択物に菌株を付す、ゲノムに挿入された目的遺伝子の高いコピー数を有する、もしくはネイティブコピー数より高いコピー数を有する生産菌株を構築または遺伝子操作する、好適な発現ベクターの複数のコピーを生産菌株に導入するなどの古典的な菌株の改善方法、ベクター、プロモーター、融合タンパク質、分子シャペロンと目的タンパク質の同時発現などが挙げられる。
【０００５】
上に挙げた方法および技術の多くは、宿主微生物株の生産性を改善する上で有効であるが、これらはほぼ全て、個々の産物を製造するために複数ラウンドで行われる菌株構築の多大な労力、特に高コピー数の不安定プラスミドが宿主細胞の培養中に失われること、その染色体への多数の遺伝子コピーの組込みによって起こる宿主細胞の不安定性などといった制限を有する。
【０００６】
したがって、当技術分野には、目的の単一タンパク質の生産増加が可能な改善された宿主および／または生産菌株、１または複数種の目的タンパク質のタンパク質生産増加、１または複数集団の目的タンパク質のタンパク質生産増加、内在性タンパク質のタンパク質生産増加などが依然として要望されている。
【０００７】
ＲＮＡ−ポリメラーゼ（以後、「ＰＮＡＰ」）は、主要な転写調節ハブの１つであり、最も多く研究されている細菌ＲＮＡＰは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡＰであり、これは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、アエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をはじめとする、いくつかの細菌属から単離されるＲＮＡＰ酵素の代表的なものである（Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７を参照）。
【０００８】
ＲＮＡＰ「コア酵素」は、α（アルファ）、β（ベータ）、およびβ’（ベータ’）サブユニットからそれぞれ２：２：１比で構成される。ＲＮＡＰα（アルファ）、β（ベータ）、およびβ’（ベータ’）サブユニットは、それぞれｒｐｏＡ，ｒｐｏＢ、およびｒｐｏＣ遺伝子によってコードされる。
【０００９】
ＲＮＡＰに作用する突然変異は、公知の選択プロトコル（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）の実施中に起こり得る。αサブユニット（ＲｐｏＡ）タンパク質の突然変異バージョンは、細胞の表現型を実質的に改変することができる（Ｋｌｅｉｎ−Ｍａｒｃｕｓｃｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。同様に、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）にリファンピン耐性をもたらすβサブユニット（ＲｐｏＢ）タンパク質の特定の突然変異は、増殖、能力、胞子形成、および発芽に関与する改変された発現および／または調節と関連する（Ｍａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１０】
例えば、こうしたβサブユニット改変の結果の１つは、遺伝子活性の増加であり得るが、別のケースでは、このような改変は、ほとんどまたは全く影響をもたらさないこともある（Ｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）。リファンピシン耐性株について様々なレベルのホスファターゼ活性が報告されている（例えば、Ｓｈａｒｉｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照）。また、βサブユニット（ＲｐｏＢ）タンパク質の少なくとも１つの突然変異が、目的の産物の改変された生産をもたらすことも報告されている（国際公開第２００３／０５５９９６号パンフレット）。
【００１１】
さらに、β’サブユニット（ＲｐｏＣ）タンパク質は、最小培地中の最適増殖のための調節適応を可能にし（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、セフロキシム（ＣＥＦ）耐性に対する耐性をもたらす（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
詳細な説明において以下に記載するように、本開示は、増加した量の１または複数種の目的タンパク質を発現および産生することができる細菌細胞に対する当技術分野でのアンメットニーズに取り組む。さらに具体的には、本開示は、１または複数種の目的タンパク質の生産増加、１または複数の集団の目的タンパク質の生産増加、内在性タンパク質の生産増加などが可能な改善された細菌（宿主）細胞に対する当技術分野でのニーズに取り組む。また別の実施形態では、本開示は、改善または増大した遺伝子コンピテンシーを有するグラム陽性菌細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞）に対する当技術分野でのアンメットニーズに取り組むことによって、その形質転換細胞を高頻度で達成する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、一般に、増加した量の１または複数種の目的タンパク質を産生する修飾グラム陽性菌細胞に関する。したがって、ある実施形態では、本開示は、非修飾グラム陽性菌細胞に比べ、増加した量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する修飾グラム陽性菌細胞に関し、ここで、修飾細菌細胞は、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む。ある実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子を、修飾細胞の染色体に組み込む。他の実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、修飾細胞の染色体外プラスミド上に含まれる。別の実施形態では、少なくとも１つの突然変異を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある他の実施形態では、ｒｐｏＣ遺伝子は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする。また別の実施形態では、少なくとも１つの突然変異を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある実施形態では、ｒｐｏＣ遺伝子は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする。ある他の実施形態では、配列番号６の変異β’−サブユニットポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基位置７５１、７８４、７９７、７９６および／または１０１８〜１０２０、または任意の細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１４】
さらに別の実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドは、以下：配列番号６のアミノ酸残基７５１でのメチオニンからイソロイシンへの置換（Ｍ７５１Ｉ）、配列番号６のアミノ酸残基７８４のアルギニンからヒスチジンへの置換（Ｒ７８４Ｈ）、配列番号６のアミノ酸残基７９７のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ７９７Ｆ）、配列番号６のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ７９６Ｇ）、および／または配列番号６のアミノ酸残基１，０１８、１，０１９および１，０２０の欠失（ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態では、配列番号８の変異β’−サブユニットポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸残基位置７５１、７８４、７９７、７９６および／もしくは１０１８〜１０２０、または任意の細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１５】
他の実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドは、以下：配列番号８のアミノ酸残基７５１のメチオニンからイソロイシンへの置換（Ｍ７５１Ｉ）、配列番号８のアミノ酸残基７８４のアルギニンからヒスチジンへの置換（Ｒ７８４Ｈ）、配列番号８のアミノ酸残基７９７のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ７９７Ｆ）、配列番号８のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ７９６Ｇ）、および／または配列番号８のアミノ酸残基１，０１８、１，０１９および１，０２０の欠失（ΔＩ１０１８〜Ｒ１０２０）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１６】
他の実施形態では、修飾細胞はさらに、変異ＲＮＡＰβサブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＢ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの突然変異を含むｒｐｏＢ遺伝子は、野生型ｒｐｏＢ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある他の実施形態では、ｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドをコードする。別の実施形態では、配列番号２の変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基位置４６９、４７８、４８２、４８５、もしくは４８７、または任意の真正細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む。また別の実施形態では、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基４７８のアラニンからアスパラギン酸への置換（Ａ４７８Ｄ）、配列番号２のアミノ酸残基４８２のヒスチジンからアルギン酸への置換（Ｈ４８２Ｒ）、配列番号２のアミノ酸残基４８２のヒスチジンからチロシンへの置換（Ｈ４８２Ｙ）、配列番号２のアミノ酸残基４８２のヒスチジンからプロリンへの置換（Ｈ４８２Ｐ）および配列番号２のアミノ酸残基４６９のグルタミンからリシンへの置換（Ｑ４６９Ｋ）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１７】
ある実施形態では、非修飾グラム陽性対照細胞に対し、発現されるＰＯＩの増加量は、少なくとも５％である。別の実施形態では、非修飾グラム陽性対照細胞に対し、発現されるＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％である。
【００１８】
また別の実施形態では、グラム陽性菌（宿主）細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーである。ある他の実施形態では、グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。また別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択される。他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【００１９】
他の実施形態では、ＰＯＩは、修飾細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または修飾細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＰＯＩは、細胞外に分泌または輸送される。ある他の実施形態では、分泌または輸送されたＰＯＩは、単離され、精製される。
【００２０】
他のある実施形態では、ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
ある他の実施形態は、本開示の修飾細胞により産生される、単離された目的タンパク質（ＰＯＩ）に関する。
【００２２】
他の実施形態では、本開示は、グラム陽性菌細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現を増大させる方法に関し、これは、（ａ）増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞を取得する工程であって、修飾グラム陽性菌細胞が、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む工程と、（ｂ）ＰＯＩが発現されるような条件下で修飾細菌細胞を培養する工程とを含む方法に関し、ここで、増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞が、非修飾グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの発現と比較される。ある実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、修飾細胞の染色体に組み込まれる。他の実施形態では、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、修飾細胞の染色体外プラスミド上に含まれる。
【００２３】
他の実施形態では、少なくとも１つの突然変異を含む、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある他の実施形態では、ｒｐｏＣ遺伝子は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドをコードする。また別の実施形態では、少なくとも１つの突然変異を含む、変異β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子は、野生型ｒｐｏＣ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を含む。別の実施形態では、ｒｐｏＣ遺伝子は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異β’−サブユニットポリペプチドをコードする。ある他の実施形態では、配列番号６の変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸残基位置７５１、７８４、７９７、７９６および／もしくは１０１８〜１０２０、または任意の細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２４】
本方法のある他の実施形態では、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、以下：配列番号６のアミノ酸残基７５１でのメチオニンからイソロイシンへの置換（Ｍ７５１Ｉ）、配列番号６のアミノ酸残基７８４のアルギニンからヒスチジンへの置換（Ｒ７８４Ｈ）、配列番号６のアミノ酸残基７９７のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ７９７Ｆ）、配列番号６のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ７９６Ｇ）、ならびに配列番号６のアミノ酸残基１，０１８、１，０１９および１，０２０の欠失（ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態では、配列番号８の変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸残基位置７５１、７８４、７９７、７９６および／もしくは１０１８〜１０２０、または任意の細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置に、少なくとも１つの突然変異を含む。ある他の実施形態では、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、以下：配列番号８のアミノ酸残基７５１のメチオニンからイソロイシンへの置換（Ｍ７５１Ｉ）、配列番号８のアミノ酸残基７８４のアルギニンからヒスチジンへの置換（Ｒ７８４Ｈ）、配列番号８のアミノ酸残基７９７のセリンからフェニルアラニンへの置換（Ｓ７９７Ｆ）、配列番号８のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ７９６Ｇ）、ならびに配列番号８のアミノ酸残基１，０１８、１，０１９および１，０２０の欠失（ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２５】
他の実施形態では、本方法は、変異ＲＮＡＰβサブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＢ遺伝子をさらに含む。ある実施形態では、少なくとも１つの突然変異を含むｒｐｏＢ遺伝子は、野生型ｒｐｏＢ遺伝子、またはその変異体から得られ、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある他の実施形態では、ｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を含む変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドをコードする。別の実施形態では、配列番号２の変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基位置４６９、４７８、４８２、４８５、もしくは４８７、または任意の真正細菌ＲＮＡＰβ’−サブユニットファミリーメンバーにおける同等位置のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。また別の実施形態では、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基４７８のアラニンからアスパラギン酸への置換（Ａ４７８Ｄ）、配列番号２のアミノ酸残基４８２のヒスチジンからアルギン酸への置換（Ｈ４８２Ｒ）、配列番号２のアミノ酸残基４８２のヒスチジンからチロシンへの置換（Ｈ４８２Ｙ）、配列番号２のアミノ酸残基４８２のヒスチジンからプロリンへの置換（Ｈ４８２Ｐ）および配列番号２のアミノ酸残基４６９のグルタミンからリシンへの置換（Ｑ４６９Ｋ）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２６】
本方法の他の実施形態では、非修飾グラム陽性対照細胞に比べ、発現されるＰＯＩの増加量は、少なくとも５％である。別の実施形態では、非修飾グラム陽性対照細胞に比べ、発現されるＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％である。ある他の実施形態では、グラム陽性菌（宿主）細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーである。別の実施形態では、グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。また別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択される。ある他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。他の実施形態では、ＰＯＩは、修飾細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または修飾細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる。ある実施形態では、ＰＯＩは、細胞外に分泌または輸送される。他の実施形態では、細胞外に分泌または輸送されたＰＯＩは、単離される。別の実施形態では、単離されたＰＯＩは、精製される。
【００２７】
別の実施形態では、ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２８】
本開示のある他の実施形態は、本開示の方法によって生産される、単離された目的タンパク質（ＰＯＩ）に関する。
【００２９】
別の実施形態では、本開示は、増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）親グラム陽性菌細胞に少なくとも１つのｒｐｏＣ遺伝子修飾を導入する工程と、（ｂ）増加した量のＰＯＩを発現する１つまたは複数の娘細胞を選択する工程とを含む。
【００３０】
ある実施形態では、本開示は、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＢ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む、修飾ｒｐｏＣ遺伝子を含む組み込みベクターに関する。他の実施形態では、本開示は、組み込みプラスミドを含むこうしたグラム陽性菌細胞に関する。
【００３１】
ある実施形態では、本開示は、形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーによって、コンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に外来性ポリヌクレオチドを形質転換する工程であって、修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）外来性ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換体を単離する工程とを含む。いくつかの実施形態では、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、宿主細胞をさらにコンピテントにするために、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む。ある他の実施形態では、ＣｏｍＫポリヌクレオチドは、配列番号３５または配列番号３７のＣｏｍＫポリヌクレオチドと９０％の配列同一性を含む。別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。本開示のある他の実施形態は、こうした方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞である。
【００３２】
別の実施形態では、本開示は、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを、非コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入する工程であって、修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）工程（ａ）の導入ポリヌクレオチドを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を単離する工程とを含む。ある実施形態では、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む。また別の実施形態では、ＣｏｍＫポリヌクレオチドは、配列番号３５または配列番号３７のＣｏｍＫポリヌクレオチドと９０％の配列同一性を含む。別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【００３３】
本開示のある他の実施形態は、こうした方法から得られるコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。
【００３４】
ある実施形態では、本開示は、プロモーター領域５’を含み、且つ配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関し、ここで、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である。
【００３５】
別の実施形態では、本開示は、形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つｒｐｏＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーによって、コンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に外来性ポリヌクレオチドを形質転換する工程であって、修飾ｒｐｏＢポリペプチドが、配列番４と９０％の配列同一性を含むと共に、配列番号４の４７８位にバリン残基を含み、ｒｐｏＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）外来性ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換体を単離する工程とを含む。
【００３６】
また別の実施形態では、本開示は、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つｒｐｏＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを、非コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入する工程であって、ｒｐｏＢポリペプチドが、配列番号４と９０％の配列同一性を含むと共に、配列番号４の４７８位にバリン残基を含み、ｒｐｏＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）工程（ａ）の導入ポリヌクレオチドを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を単離する工程とを含む。
【００３７】
本開示のある他の実施形態は、こうした方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】表１に記載される本開示の例示的なｒｐｏＣ遺伝子修飾（すなわち、置換および欠失突然変異体）のプラスミドマップを示す。表１に記載される具体的なアミノ酸置換または欠失は、配列番号６の野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする、配列番号５の親バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｐｏＣ遺伝子に対するものである。例えば、図１に示すｐＣＺ２１１プラスミドのマップは、配列番号６のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）残基によるアミノ酸置換を含む修飾ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質（図１では「ｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ」と標識）をコードする。このプラスミドは、さらに、「ＥｃｏＲＩ」制限部位、「ＸｂａＩ」制限部位、Ｉ−Ｓｃｅ部位、カナマイシン（「Ｋｍ」）耐性遺伝子、βラクタマーゼ（「ｂｌａ」）遺伝子、ｃｏｐ−６および「ｒｅｐＣ」タンパク質をコードする遺伝子も含む。
【図２】表２に記載される本開示の例示的なｒｐｏＣ遺伝子修飾（すなわち、置換および欠失突然変異体）のプラスミドマップを示す。表２に記載される具体的なアミノ酸置換または欠失は、配列番号８の野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする、配列番号７の親バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｐｏＣ遺伝子に対するものである。例えば、図２に示すｐＣＺ２０１プラスミドのマップは、配列番号８のアミノ酸残基７９６のアスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）残基によるアミノ酸置換を含む修飾ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする。このプラスミドは、さらに、「ＥｃｏＲＩ」制限部位、「Ｓａｌ−Ｉ」制限部位、Ｉ−Ｓｃｅ部位、カナマイシンプロモーター（「Ｋａｎプロモーター」）と作動可能に連結したカナマイシン（「Ｋｍ」）耐性マーカー（「Ｋａｎ  ＣＤＳ」）コード配列、「λターミネーター」、リボソームｒｒｎＢターミネーター（「Ｔｅｒｍ  ｒｒｎＢ」）およびｐＥ１９４温度感受性レプリコン（「Ｔｓレプリコン」）も含む。
【図３】実施例２に記載のベクターｐＫＢ３２０のプラスミドマップを示す。ｐＫＢ３２０プラスミドは、様々な制限酵素部位、ＰＥ１９４温度感受性レプリコン（Ｔｓレプリコン）、カナマイシンコード配列（Ｋａｎ  ＣＤＳ）、カナマイシンプロモーター（Ｋａｎプロモーター）、リボソームターミネーター配列（Ｔｅｒｍ  ｒｒｎＢ）およびλターミネーター（λＴｅｒｍ）を含む。
【図４】実施例３に記載のｒｐｏＢコンストラクトの概略図であり、ここで、ｒｐｏＢコンストラクトは、スペクチノマイシン（ＳｐｅｃＲ）耐性マーカー、ならびに配列番号２のアミノ酸位置４６９のグルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）への置換（すなわち、Ｑ４６９Ｒ置換）、配列番号２のアミノ酸位置４６９のグルタミン（Ｑ）からリシン（Ｋ）への置換（すなわち、Ｑ４６９Ｋ置換）、または配列番号２のアミノ酸位置４８２のヒスチジン（Ｈ）からチロシン（Ｙ）への置換（すなわち、Ｈ４８２Ｙ置換）を含む。
【図５】実施例７に記載のアミラーゼ−４酵素産生を示す（時間の関数として）データを表示する。図５に示すデータは、親（野生型）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞におけるＯＤ当たり（図５Ａ）または単位量当たり（図５Ｂ）のアミラーゼ−４酵素産生と、ｒｐｏＣ遺伝子変異体（すなわち、ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）「Ｄ７９６Ｇ」ポリペプチド変異体）を含む修飾（娘）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中のアミラーゼ−４産生を比較する。
【図６】実施例８に記載のアミラーゼ−３酵素産生を示すデータを表示する。図６に示すように、親（野生型）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、およびｒｐｏＣ遺伝子変異体（すなわち、ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）「Ｄ７９６Ｇ」ポリペプチド変異体）を含む修飾（娘）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞からのアミラーゼ−３酵素活性（単位／グラム／ＯＤ）を時間（ｈｒ）の関数としてプロットする。
【図７】ｐＢＲ３２２複製起点をコードするＤＮＡ配列、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）スペクチノマイシン耐性（Ｓｐｅｃｒ）遺伝子ｓｐｃ（ａａｄ９とも呼ばれる）、バチルス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）における複製のためのバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｎａｔｔｏ）プラスミドｐＴＡ１０６０ｒｅｐ遺伝子、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡプロモーターにより制御されるバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子、およびバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＲ遺伝子を含む。
【図８】アミラーゼをコードするｐＨＰＬＴのプラスミドマップを示す。
【図９】ｒｐｏＢ（４７８Ｖ）および野生型（ネイティブ）ｒｐｏＣポリペプチドを含む／コードする親（対照）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞のバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞形質転換効率データ（ＯＤ６００およびＣＦＵ）を示す。
【図１０】突然変異ｒｐｏＢポリペプチド（Ｖ４７８Ａ）および野生型（ネイティブ）ｒｐｏＣポリペプチドを含む／コードする娘（修飾）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞のバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞形質転換効率データ（ＯＤ６００およびＣＦＵ）を示す。
【図１１】ｒｐｏＢ（４７８Ｖ）ポリペプチドおよび修飾ｒｐｏＣポリペプチド（Ｄ７９６Ｇ）を含む／コードする娘（修飾）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞のバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞形質転換効率データ（ＯＤ６００およびＣＦＵ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §§  １．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／もしくはアミノ酸配列開示を含む特許出願要件（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ）−−配列規則（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」を満たし、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ）ＳＴ．２５（２００９）および欧州特許会議の配列表要件（ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＣ）および特許協力条約（Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ）（ＰＣＴ）規則（Ｒｕｌｅｓ）５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）のＳｅｃｔｉｏｎ  ２０８およびＡｎｎｅｘ  Ｃに一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される符号およびフォーマットは、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２２に記載の規則に従う。
【００４０】
配列番号１は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＢ（βサブユニット）タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４１】
配列番号２は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＢ（βサブユニット）タンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号３は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＢ（βサブユニット）タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４３】
配列番号４は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＢ（βサブユニット）タンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号５は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４５】
配列番号６は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号７は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする核酸配列である。
【００４７】
配列番号８は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の野生型ＲｐｏＢ（β’−サブユニット）タンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号９は、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７−Ｉ−Ｓｃｅ  ＫＭを構築するのに使用される「Ｉ−Ｓｃｅ−１」オリゴヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号１０は、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７−Ｉ−Ｓｃｅ  ＫＭを構築するのに使用される「Ｉ−Ｓｃｅ−２」オリゴヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号１１は、順方向「ＥｃｏＲＩ−ｒｐｏＣ」プライマー核酸配列である。
【００５１】
配列番号１２は、逆方向「ＳａｌＩ−ｒｐｏＣ」プライマー核酸配列である。
【００５２】
配列番号１３は、プラスミドｐＣＺ２０１−ｐＣＺ２０５の好適な組み立てを確認するためのコロニーＰＣＲに使用される順方向プライマー核酸配列である。
【００５３】
配列番号１４は、プラスミドｐＣＺ２０１−ｐＣＺ２０５の好適な組み立てを確認するためのコロニーＰＣＲに使用される逆方向プライマー核酸配列である。
【００５４】
配列番号１５は、順方向「ｒｐｏＣ」プライマー核酸配列である。
【００５５】
配列番号１６は、逆方向「ｒｐｏＣ」プライマー核酸配列である。
【００５６】
配列番号１７は、シーケンシング確認のために使用される順方向「ｒｐｏＣ」プライマー核酸配列である。
【００５７】
配列番号１８は、アミラーゼ−３組み込みカセットを取得するために使用される順方向「ＮｏｔＩ−アミラーゼ−３」プライマー核酸配列である。
【００５８】
配列番号１９は、アミラーゼ−３組み込みカセットを取得するために使用される逆方向「ＮｏｔＩ−アミラーゼ−３」プライマー核酸配列である。
【００５９】
配列番号２０は、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６０】
配列番号２１は、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
配列番号２２は、ｒｐｏＢ遺伝子の３’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６２】
配列番号２３は、ｒｐｏＢ遺伝子の３’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６３】
配列番号２４は、ｒｐｏＢ遺伝子の３’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６４】
配列番号２５は、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
配列番号２６は、ｒｐｏＢ遺伝子の３’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６６】
配列番号２７は、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６７】
配列番号２８は、スペクチノマイシン耐性遺伝子および／−Ｓｃｅ制限酵素のための認識部位を含む合成ＤＮＡコンストラクトである。
【００６８】
配列番号２９は、ｒｐｏＢ遺伝子の３’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００６９】
配列番号３０は、ｒｐｏＢ遺伝子の３’配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００７０】
配列番号３１は、配列番号６のＲｐｏＣタンパク質のアミノ酸残基４６１〜５００を含む。
【００７１】
配列番号３２は、順方向ＥｃｏＲＩ−ＲｐｏＢプライマー核酸配列である。
【００７２】
配列番号３３は、逆方向ＮｏｔＩ−ＲｐｏＢプライマー核酸配列である。
【００７３】
配列番号３４は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣｏｍＫポリペプチドをコードする核酸配列である。
【００７４】
配列番号３５は、配列番号３４によりコードされたＣｏｍＫポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号３６は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＣｏｍＫポリペプチドをコードする別の核酸配列である。
【００７６】
配列番号３７は、配列番号３６によりコードされたＣｏｍＫポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００７７】
詳細な説明
本開示は、一般に、増加した量の１または複数種の目的タンパク質を産生する修飾グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のある実施形態は、同じポリペプチドの非修飾（親）グラム陽性細胞に比べ、増加した量の目的タンパク質（以下、「ＰＯＩ」）を発現する修飾グラム陽性菌細胞に関し、ここで、修飾細菌細胞は、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む。
【００７８】
１．定義
本明細書に記載される修飾細菌細胞、その組成物およびその方法を考慮して、以下の用語および語句が定義される。本明細書に定義されていない用語には、当技術分野で使用される通常の意味が付与されるべきである。
【００７９】
別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本組成物および本方法が属する技術分野において、通常の知識を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本組成物および本方法を実施または試験する際に、本明細書に記載のものに類似した、または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、代表的な、説明に役立つ方法および材料をここに記載する。本明細書中に引用する刊行物および特許は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
さらに、特許請求の範囲が任意選択要素を排除するように記載されている可能性があることにも留意すべきである。したがって、ここで述べることは、特許請求範囲の構成要件の記載に関連して「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語を使用する場合、または「負の」の限定を使用する場合の優先的基準となることを意図している。
【００８１】
この開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載され、説明された個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載された本組成物および本方法の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離され、または容易に統合することができる個別の成分および特徴を有する。記載された方法はいずれも、記載された事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００８２】
ある数値範囲が示された場合、（文脈中に明らかな別段の記載がない限り）その範囲の上限から下限の間に介在する値は、下限の単位の十分の一まで、またその記載範囲に記載された、または介在するいかなる他の値も本組成物および本方法に包含されると理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、その狭い範囲に独立して含まれてよく、また、記載の範囲で明示的に排除された境界の支配下にある、本組成物および本方法に含まれる。記載の範囲が、その範囲の一端または両端を含む場合、それらの含まれる境界の一方または両方を排除する範囲もまた、本組成物および本方法に含まれる。
【００８３】
本明細書において、いくつかの範囲は、「約」という用語が先行する数値で示される。本明細書においては、「約」という用語は、これが先行する正確な数、および、この用語が先行する数に近い数または近似する数に対するリテラルサポートを提供するために使用される。
【００８４】
本明細書で定義されるように、「修飾細胞」、「改変細胞」、「修飾細菌細胞」、「改変細菌細胞」、「修飾宿主細胞」、または「改変宿主細胞」は、互換的に使用され、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む組み換えグラム陽性菌（宿主）細胞を指し得る。例えば、本開示の「修飾」グラム陽性菌細胞は、さらに、親細菌細胞から誘導される「修飾（宿主）細胞」と定義され得、その修飾（娘）細胞は、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む。
【００８５】
本明細書で定義されるように、「非改変細胞」、「非変異細胞」、「非改変細菌細胞」、「非変異細菌細胞」、「非改変宿主細胞」または「非変異宿主細胞」は、互換的に使用され、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含まない「非修飾」（親）グラム陽性菌細胞を指し得る。
【００８６】
ある実施形態では、「非修飾」グラム陽性（親）細胞は、特に、「修飾」グラム陽性（娘）細胞と比較して、またはそれに対して、「対照細胞」と呼ばれ得る。本明細書で使用されるように、「非修飾」（親）細胞（すなわち、対照細胞）におけるＰＯＩの発現および／または産生が、「修飾」（娘）細胞におけるＰＯＩの発現および／または産生と比較される場合、「修飾」および「非修飾」細胞は、実質的に同じ条件（すなわち、培地、温度、ｐＨなどの同じ条件）下で増殖／培養されると理解される。
【００８７】
同様に、本明細書で定義されるように、「発現の増大」、「発現の増強」、［ＰＯＩ発現の増大］、「産生の増大」、「ＰＯＩ産生の増大」などの用語は、変異ＲＮＡＰβ’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む「修飾（された）」（娘）細菌細胞）を指す。ここで、「増大させる」は常に、同じＰＯＩを発現する「非修飾」（親）細胞と比較した（に対する（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ））ものである。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそのフラグメントもしくは一部、ならびにゲノムまたは合成由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡを指し、これらは、センス鎖であるかアンチセンス鎖であるかにかかわらず、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。遺伝子コードの縮退の結果として、多くのヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
【００８９】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド（または核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」および「プラスミド」が含まれると理解される。したがって、「遺伝子」という用語は、あるタンパク質コード配列の全てまたは一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびにコード配列を含み得る。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「コード配列」という用語は、その（コードされた）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接規定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレーム（以後、「ＯＲＦ」）によって決定されて、通常ＡＴＧ開始コドンで開始する。コード配列は、典型的に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および組み換えヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
本明細書で定義されるように、「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２以上のコドン、および（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸または核酸配列（天然由来であるか、天然由来でないか、また合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読まれる（または、翻訳される）。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、また、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、さらに、合成された核酸フラグメントを含んでもよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、種々の生育段階で、または種々の環境もしくは生理的条件に応じて遺伝子の発現を指示することは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。殆どの場合、調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡフラグメントが同じ活性を有し得ることがさらに確認されている。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、「機能可能に結合される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列（例えばＯＲＦ）の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）とき、それはコード配列に機能可能に結合している。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に調節配列に機能可能に結合することができる。
【００９４】
本明細書で定義されるように、「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、またはその下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含み得る。
【００９５】
本明細書で定義されるように、「導入する（こと）」という用語は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその遺伝子、またはそのベクターを「細菌細胞中に導入すること」などの語句に使用される場合、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するための当技術分野で公知の方法を含み、こうした方法として、限定されないが、プロトプラスト融合、天然もしくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション、共役などが挙げられる（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「形質転換された」または「形質転換」とは、組み換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換された細胞を意味する。形質転換は、典型的に細胞中への１または複数のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦもしくは遺伝子）の挿入によって起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換しようとする細胞中に天然に存在しない配列であってよい。
【００９７】
本明細書で使用されるとき、「形質転換」という用語は、ＤＮＡが、染色体成分または自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外来性ＤＮＡをグラム陽性宿主細胞中に導入することを指す。
【００９８】
本明細書で定義されるように、「コンピテンス」という用語は、外来性ＤＮＡが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞中に内在化されて、形質転換事象を達成することができる自然の生理的状態である。「コンピテンス」という用語は、エレクトロポレーション、プロトプラスト、熱ショックおよびＣａＣｌ２処理を必要とする「人工形質転換」とは異なる。
【００９９】
本明細書で定義されるように、「非コンピテント」、「形質転換しにくい」および「低形質転換性」は、互換的に使用され、これらの用語は、ＤＮＡのマイクログラム（μｇ）当たりの形質転換体数が、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）においてコンピテンス媒介性形質転換方法を使用する場合の自然突然変異頻度より２倍以上少ないことを意味する。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「ＣｏｍＫ」ポリペプチドという用語は、コンピテンス発生前の最終自動調節制御スイッチとして作用する転写因子である、ｃｏｍＫ遺伝子の産物として定義される。ＣｏｍＫポリペプチド（すなわち、転写因子）は、ＤＮＡ結合、取り込みおよび組み換えに関与する後期コンピテンス遺伝子の発現の活性化と関連する。
【０１０１】
本明細書で定義されるように、宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」、またはグラム陽性細菌（宿主）細胞「ゲノム」は、染色体および染色体外遺伝子を含む。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、「プラスミド」、「ベクターを」および「カセット」という用語は、典型的には細胞の主要な代謝の部分ではない遺伝子を往々にして伝搬し、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態をした染色体外エレメントを指す。こうしたエレメントは、あらゆる供給源に由来する自律的複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、ここで、いくつかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と一緒に細胞中に導入することができるユニークな構造に結合または組み換えられている。
【０１０３】
「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子以外に、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。
【０１０４】
「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子以外に、宿主細胞中に外来（異種）遺伝子の発現の「増大」を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【０１０５】
多くの原核および真核発現ベクターが、市販されており、当技術分野で公知である。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、核酸を、生物間、細胞間または細胞構成要素間で伝搬および／または移行させる手段をいう。ベクターとしては、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、ならびに、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）およびＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。これらは、「エピソーム」、すなわち、自律的に複製するか、または宿主微生物の染色体に組み込むことができる。
【０１０７】
「発現ベクター」は、異質細胞に異種ＤＮＡを組み込み、発現させる能力を有するベクターである。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。
【０１０８】
「ターゲティングベクター」は、形質転換する宿主細胞の染色体の領域に相同のポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを行わせるベクターである。ターゲティングベクターは、相同組み換えによって細胞の染色体に変異を導入するのに使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同配列、例えば、末端に加えられた配列（すなわち、スタッファー配列またはフランキング配列を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入など、ターゲティングベクターが閉環するように閉じることができる。適切なベクターの選択および／または構成は、当業者の知識の範囲内である。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、「プラスミド」という用語は、クローニングベクターとして使用され、多くの細菌や真核生物において染色体外の自己複製遺伝因子を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクを指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１１０】
本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」または「ＰＯＩ」は、修飾グラム陽性菌細胞（例えば、「宿主」細胞）中に発現させようとする目的のポリペプチドを指し、ここで、ＰＯＩは、増大したレベルで発現される（すなわち、非修飾（親）グラム陽性細菌に対して）。したがって、本明細書で使用されるとき、ＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質などであってよい。
【０１１１】
同様に、本明細書で定義されるように、「目的遺伝子」または「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子またはオープンリーディングフレーム）を指す。「目的タンパク質」をコードする「目的遺伝子」は、天然に存在する遺伝子、突然変異遺伝子または合成遺伝子であってもよい。
【０１１２】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む、あらゆる長さのポリマーを指す。伝統的なアミノ酸用１文字または３文字コードが本明細書で使用される。ポリペプチドは、直鎖または分岐状であってよく、修飾アミノ酸を含んでもよいし、非アミノ酸によって分断されていてもよい。
【０１１３】
ポリペプチドという用語は、天然に、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との共役などのいずれかその他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、あるアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸など）の１つまたは複数のアナログ、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドもこの定義に含まれる。
【０１１４】
ある実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせなどの商業的に関連する工業用目的タンパク質をコードする。
【０１１５】
本明細書で定義されるように、「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置にある遺伝子を指す。
【０１１６】
本明細書で定義されるように、「異種遺伝子」、「非内在性」遺伝子、または「外来」遺伝子は、通常、宿主生物に存在しないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子（またはＯＲＦ）を指す。外来（異種）遺伝子は、非ネイティブ生物に挿入されるネイティブ遺伝子（もしくはＯＲＦ）および／またはネイティブもしくは非ネイティブ生物中に挿入されるキメラ遺伝子を含む。
【０１１７】
本明細書で使用されるとき、「発現」という用語は、本発明の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す場合もある。したがって、「発現」という用語は、ポリペプチドの産生に関与する工程を包含し、そうしたものとして、限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、分泌などを含む。
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、「変異」ポリペプチドは、１もしくは複数個のアミノ酸の置換、付加、または欠失によって、典型的には組み換えＤＮＡ技術により親（もしくは参照）ポリペプチドから得られるポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは、親ポリペプチドとは少数のアミノ酸残基だけ異なる場合もあり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列相同性／同一性のレベルによって定義してもよい。
【０１１９】
好ましくは、変異ポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用されるとき、「変異」ポリヌクレオチドは、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、ここで、「変異ポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと、指定された程度の配列相同性／同一性を有するか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（もしくはその補体）とハイブリダイズする。好ましくは、変異ポリペプチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは、少なくとも９９％のヌクレオチド同一性を有する。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、「突然変異」は、核酸配列中の任意の変化または改変を指す。数種類の突然変異が存在し、そうしたものとして、点突然変異、欠失突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、スプライシング突然変異などがある。突然変異は、特異的に（例えば、部位指定突然変異誘発）またはランダムに（例えば、化学物質、修復マイナス菌株を介した継代により）実施してよい。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドまたはその配列に関連して、「置換」という用語は、別のアミノ酸によるあるアミノ酸の取り換え（すなわち、置換）を意味する。
【０１２２】
本明細書で定義されるように、「異種」核酸コンストラクトまたは「異種」核酸配列は、それが発現される細胞に対してネイティブではない配列の１部分を有する。
【０１２３】
本明細書で定義されるように、「異種対照配列」は、天然では、目的遺伝子の発現を調節（制御）する上で機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモータまたはエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、細胞、またはそれらの配列が存在するゲノムの一部に対して内在性（ネイティブ）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に付加される。「異種」核酸コンストラクトは、ネイティブ宿主細胞中に見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同じであるか、またはそれとは異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。
【０１２４】
本明細書で使用されるとき、「シグナル配列」および「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質の成熟タンパク質もしくはタンパク質の前駆体の分泌または直接輸送に参加し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的に、前駆体または成熟タンパク質配列のＮ末端側に位置する。シグナル配列は、内在性または外来性のいずれであってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的に、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０１２５】
本明細書で使用されるとき、「親」細胞は、「親」細胞のゲノムが修飾されて（例えば、１つまたは複数の突然変異が親細胞に導入されて）、修飾「娘」細胞を産生する微生物の任意の細胞または株を指す。
【０１２６】
「由来する」という用語は、「起源とする」「得られる」、「取得可能な」、および「創出される」という用語を包含し、一般に、ある指定された物質または組成物が、別の指定物質もしくは組成物にその起源を有するか、または別の指定物質もしくは組成物に関して記述することができる特徴を有することを意味する。
【０１２７】
本明細書で使用されるとき、タンパク質産生を「増大する」とは、産生されるタンパク質の量の増加を意味する。タンパク質は、宿主細胞内部で産生されてもよいし、または培地中に分泌（もしくは輸送）されてもよい。ある実施形態では、目的タンパク質は、培地中に産生される。
【０１２８】
タンパク質産生の増大は、例えば、親宿主細胞と比較して、より高い最大レベルのプロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性などのタンパク質もしくは酵素活性、または産生される総細胞外タンパク質として検出することができる。本明細書で定義されるように、細菌ＲＮＡＰ「コア酵素」は、それぞれ２：１：１比のα（アルファ）、β（ベータ）、およびβ’（ベータ’）サブユニットから構成される。ＲＮＡＰα（アルファ）、β（ベータ）、およびβ’（ベータ’）サブユニットポリペプチドは、それぞれｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、およびｒｐｏＣ遺伝子によってコードされる。したがって、本明細書で使用されるとき、「β−サブユニット」または「β−サブユニットポリペプチド」とは、ｒｐｏＢ遺伝子によってコードされるＲｐｏＢポリペプチチドを意味し、「β−サブユニット」または「β’−サブユニットポリペプチド」とは、ｒｐｏＣ遺伝子によってコードされるＲｐｏＣポリペプチチドを意味する。本明細書で使用されるとき、「β’−サブユニットファミリーメンバー」は、前述した２：１：１比の３つのサブユニットα、β、およびβ’から構成される任意の原核ＲＮＡＰを指し、ここで、β’−サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号６または配列番号８の４６１位から５００位までのＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質の配列とアラインメントすることができ、少なくとも７５％の相同性をもたらす４０の連続アミノ酸配列を含む。
【０１２９】
本明細書で使用されるとき、「同等位置」という用語は、配列番号６または配列番号８のアミノ酸残基４６１から５００までのＲｐｏＣ（β’−サブユニット）ポリペプチド配列とアラインメントした後のアミノ酸残基位置を意味する。配列番号６（すなわち、配列番号６の残基４６１から５００）および配列番号８（すなわち、配列番号８の残基４６１から５００）について前述した４０の連続アミノ酸残基（すなわち、同等位置）は、配列番号３８のアミノ酸配列に表示される。
【０１３０】
本明細書で使用されるとき、用語「相同性」は、相同性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。２つ以上のポリヌクレオチドまたは２つ以上のポリペプチドが相同性である場合、これは、相同性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにまた好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性の割合」を有することを意味する。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、本明細書で定義されるように相同性である上で十分高度の同一性を有するか否かは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ａｕｇｕｓｔ  １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）に提供される「ＧＡＰ」などの当技術分野で公知のコンピュータープログラムを用い、２つの配列をアラインメントすることによって好適に調べることができる。ＤＮＡ配列比較のために次の設定を含むＧＡＰを使用する：５．０のＧＡＰ形成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー。
【０１３１】
本明細書で使用されるとき、用語「同一性パーセント（％）」は、配列アラインメントプログラムを用いてアラインメントしたときの、ポリペプチドをコードする核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列同士の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
【０１３２】
本明細書で使用されるとき、用語「特定生産性」は、所与の期間にわたって細胞毎に生産されるタンパク質の総量である。
【０１３３】
本明細書において「精製」、「単離」または「富化」は、生体分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が、本来結合している、天然に存在するいくつかの構成要素または全ての構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを意味する。そのような単離または精製は、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫安沈澱または他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、または勾配による分離など、最終組成物中に望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質、もしくは酵素を除く、当該技術分野で知られた分離技術によって行うことができる。精製または単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物、または他の酵素もしくは化学物質を添加することができる。
【０１３４】
ＩＩ．ＲＮＡ−ポリメラーゼ
上に簡単に述べたように、あらゆる細胞性生物における転写は、マルチサブユニット、ＤＮＡ依存的ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）によって駆動され、これは、テンプレートＤＮＡを包み込む、維持されたカニの爪のような形状をしている（Ｃｒａｍｅｒ，２００２を参照）。ＲＮＡＰコア酵素は、それぞれ２：１：１比のα（アルファ）、β（ベータ）、およびβ’（ベータ’）サブユニットから構成され、これらは、それぞれｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、およびｒｐｏＣ遺伝子によって個別にコードされる。ホロ酵素は、通常シグマおよびオメガサブユニットを含む。シグマサブユニットは、プロモーター認識および結合を担う。
【０１３５】
グラム陽性菌は、弱いプロモーター部位でのＲＮＡＰ結合を阻止することにより、転写特異性を増強することが報告されている別のδ（デルタ）サブユニットを有する（Ｊｕａｎｇ  ＆  Ｈｅｌｍａｎｎ，１９９４；Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｓａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ホロ酵素ＲＮＡＰは、転写開始部位付近でＤＮＡを融解させることによって、開鎖複合体を形成した後、ＲＮＡの合成を開始する。シグマ因子は、放出されて、コア酵素が、ｍＲＮＡの合成を完了する（Ｂｏｒｕｋｈｏｖ  ＆  Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ，２００２；ｄｅ  Ｈａｓｅｔｈ  ＆  Ｈｅｌｍａｎｎ，１９９５）。コアＲＮＡＰは、細菌の種からヒトにわたるまで、特に大サブユニット（すなわち、細菌βおよびβ’サブユニット）ホモログの間で、配列および構造に高度に保存されている（Ｌａｎｅ  ＆  Ｄａｒｓｔ，２０１０）。β’ジョー、β’クランプ、βローブ、およびβフラップとして知られる４つの構造的に保存されたモジュールが、ＲＮＡＰおよびＤＮＡの適切な適応に重要な役割を果たしている（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１３６】
ＩＩＩ．細菌（宿主）細胞および使用方法
ある実施形態では、本開示は、増加した量の１または複数の目的タンパク質を産生する修飾グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のある実施形態は、同じＰＯＩを発現する非修飾（親）グラム陽性菌細胞に比べ、増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞に関し、ここで、修飾細菌細胞は、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む。他の実施形態では、本開示は、変異ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーター領域を含む発現コンストラクトを宿主細胞中に導入することによってコンピテントにされたグラム陽性菌宿主細胞に関する。
【０１３７】
したがって、ある実施形態では、本開示は、修飾（娘）細胞が、増加したレベルの目的タンパク質を産生するように、細菌細胞を修飾する方法に関する。他の実施形態では、本開示は、本開示の修飾（変異）細菌細胞を発酵させることによって産生された目的タンパク質に関する。本開示のある他の実施形態は、このようにして作製された１または複数種の目的タンパク質を含む１または複数のタンパク質性組成物に関する。また別の実施形態では本開示は、本明細書に記載の修飾（突然変異）細菌細胞を用いて、１または複数種の目的タンパク質を生成する方法、ならびに目的タンパク質を含む１または複数のタンパク質性組成物を製造および使用する方法に関する。
【０１３８】
ある実施形態では、本開示は、非修飾（親）細胞と比較して（に対して（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ））、増加したレベルの１または複数種の目的タンパク質を産生する修飾グラム陽性菌細胞に関し、ここで、１つまたは複数の修飾細胞は、ｒｐｏＣ遺伝子によりコードされるＲＮＡＰ（サブユニット）のβ’サブユニット中に少なくとも１つの突然変異を含む。ある他の実施形態では、本開示は、非修飾（親）細胞と比較して（に対して（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ））、増加したレベルの１または複数の目的タンパク質を産生する修飾細菌細胞に関し、ここで、修飾細胞は、（ａ）ｒｐｏＣ遺伝子によりコードされるＲＮＡＰのβ’サブユニット中の少なくとも１つの突然変異と（ｂ）ｒｐｏＢ遺伝子によりコードされるＲＮＡＰ（サブユニット）のβサブユニット中の少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１３９】
ＩＶ．ＲＮＡＰのＲｐｏＣ（β’−サブユニット）中に突然変異を含む修飾（宿主）細胞
いくつかの実施形態では、ＲＮＡＰのβ’サブユニット中の少なくとも１つの突然変異は、どんな種類の突然変異であってもよく、例えば、置換、挿入、欠失、転位、終結（ストップコドンの導入）、点突然変異などを含む、単一突然変異、または複数の突然変異のセットであってもよい。
【０１４０】
突然変異は、一塩基対置換であってもよく、これは、同じ位置の異なるヌクレオチド塩基による単一ヌクレオチド塩基の置換、ならびにＤＮＡの他方の鎖に基づく相補的塩基の対応する置換である。一塩基対置換は、考えられ得るものであり、実際に本発明の範囲内にあると考慮される。突然変異は、タンパク質コード領域、またはリボソームまたは転移ＲＮＡをコードする領域中に出現し得る。
【０１４１】
本開示の突然変異は、当技術分野で公知の任意の突然変異誘発方法を使用して作製することができ、そうした方法として、例えば、部位指定突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリングなどが挙げられる。
【０１４２】
部位指定突然変異誘発は、当該遺伝子をコードするポリヌクレオチド中の１または複数の規定部位に１または複数（例えば、数個）の突然変異を導入する技術である。部位指定突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するプライマーを使用するＰＣＲによってインビトロで達成することができる。部位指定突然変異誘発は、カセット突然変異誘発によってインビトロでも実施することができ、これは、初めに、当該遺伝子をコードするプラスミドにおける指定部位で制限酵素により切断し、その後、切断部位に、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチド断片を連結することを含む。典型的な実施形態では、同じ制限酵素を用いて、指定部位でプラスミドを消化または切断して、突然変異を含むオリゴヌクレオチド断片を作製し、これにより、プラスミドの付着末端と断片を互いに連結させることができる（例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９  ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０を参照）。
【０１４３】
部位指定突然変異誘発は、当技術分野で公知の方法を使用してインビボで達成することもできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ならびにＣａｌｉｓｓａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ，１９９６を参照されたい。あらゆる部位指定突然変異誘発方法が、本発明での使用に好適となり得る。そのために、変異体を作製するのに使用することができるいくつかの市販のキットがある。
【０１４４】
ランダム突然変異は、多くの公知の手段によって達成することができる。こうした公知の方法の１つは、中でも、２−アミノプリン（２ＡＰ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、またはメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの突然変異誘発試薬の存在下での発芽後成長による化学的突然変異誘発である。本明細書で好適な、および当技術分野で公知の化学的突然変異誘発方法についての詳細な説明は、Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．１９９２）に見出すことができる。
【０１４５】
突然変異誘発はまた、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１により記載されているように、プラスミドからｍｕｔＤ５などの突然変異誘発遺伝子を発現することによって達成することもできる。
【０１４６】
細胞ゲノムは、トランスポゾン突然変異誘発、ゲノムシャッフリング、プラスミドからの遺伝子の過剰発現、またはその他の細胞操作技術（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｐａｔｎａｉｋ，２００８）によって操作することができる。突然変異体は、米国特許第６，３６１，９６６号明細書の方法にある通り、細胞を単純に発芽後成長させ、複製エラーを自然に発生させることによっても生成することができる。
【０１４７】
一段と改善された突然変異体を得るために、２回（２）以上のラウンドの突然変異誘発を好適に実施することができ、各ラウンドで、同じまたは異なる突然変異誘発方法を使用してもよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ｒｐｏＣ遺伝子によりコードされるＲＮＡＰのβ’−サブユニットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）β’−サブユニットの天然に存在する変異体であり、これは、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１４９】
ある実施形態では、ＲＮＡＰのβ’−サブユニットは、異なる細菌細胞から得られ、これは、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５０】
Ｖ．増加したレベルの目的タンパク質を産生する修飾（宿主）細胞
修飾グラム陽性菌細胞が、増加したレベルのＰＯＩを産生することを確認するために、様々なスクリーニング方法を適用することができる。例えば、発現ベクターは、標的タンパク質とのポリペプチド融合物をコードし得るため、検出可能な標識として役立つか、あるいは、標的タンパク質自体が、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとして役立ち得る。標識タンパク質は、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング（こうした方法の詳細な説明は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓのウェブサイトで閲覧可能である）、ＥＬＩＳＡ、または標識がＧＦＰの場合には、全細胞蛍光もしくはＦＡＣＳを用いて、検出することもできる。
【０１５１】
例えば、６−ヒスチジンタグを含有させて、標的タンパク質との融合物を作製することができ、ウエスタンブロットを用いて、こうしたタグを検出することができる。さらに、標的タンパク質が十分に高レベルで発現すれば、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）／シルバー染色と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、野生型に対する突然変異体発現の増加を適切に検出することができ；このような場合、いずれの分子の標識も必要ない。
【０１５２】
他の実施形態では、非修飾（親）細胞に対する修飾（宿主）細胞中のＰＯＩの発現は、ｍＲＮＡ転写物レベルと相関する。例えば、ある実施形態は、ＰＯＩをコードする遺伝子またはＯＲＦの分子特性決定に関し、これは、通常、ＲＮＡ発現の時間的および空間的分布の徹底的な分析を含む。全またはポリ（Ａ）ＲＮＡサンプル中の特定のｍＲＮＡの存在量を検出および決定するために広く使用される方法がいくつか存在し、当技術分野では公知である。非限定的な例として、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）、インサイチュハイブリダイゼーション、および逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの方法がある。
【０１５３】
改善されたレベルの目的タンパク質を確認するために、他の方法を使用してもよく、例えば、培養もしくは発酵がより長時間効率的に継続することを可能にする、細胞当たりのタンパク質活性もしくは量、培地ミリリットル当たりのタンパク質活性もしくは量の増加の検出、またはこれらの方法の組み合わせが挙げられる。
【０１５４】
特定生産性の検出は、タンパク質生産を評価するもう１つの好適な方法である。特定生産性（Ｑｐ）は、下記の式：
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」は、タンク中に生産されるタンパク質のグラム数であり；「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、接種時点からの発酵時間であり、これは、産生時間、ならびに増殖時間も含む）
を用いて決定することができる。
【０１５５】
ある実施形態では、本開示の修飾細菌細胞は、その非修飾（親）細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、または少なくとも約１０％以上のＰＯＩを産生する。
【０１５６】
ＶＩ．修飾ＲｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することによってコンピテントにした修飾（宿主）細胞
本開示のある実施形態は、非コンピテントグラム宿主細胞に関する。より具体的には、本開示のある実施形態は、修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸コンストラクトの導入によりコンピテントにされる非コンピテントグラム宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞）に関する。ある実施形態では、「導入」核酸コンストラクトによりコンピテントにされる非コンピテント修飾細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。
【０１５７】
例えば、ある実施形態では、本開示は、形質転換された宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーによってコンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に外来性ポリヌクレオチドを形質転換する工程であって、修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）外来性ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換体を単離する工程とを含む。いくつかの実施形態では、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、宿主細胞をさらにコンピテントにするために、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む。特定の実施形態では、ＣｏｍＫポリヌクレオチドは、配列番号３５または配列番号３７のＣｏｍＫポリヌクレオチドと７５％、８０％、９０％、９５％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。他の実施形態では、本開示は、こうした方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を提供する。
【０１５８】
他の実施形態では、本開示は、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを、非コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入する工程であって、修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）工程（ａ）の導入ポリヌクレオチドを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を単離する工程とを含む。いくつかの実施形態では、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む。ある実施形態では、ＣｏｍＫポリヌクレオチドは、配列番号３５または配列番号３７のＣｏｍＫポリヌクレオチドと７５％〜１００％の配列同一性を含む。別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。別の実施形態では、本開示は、こうした方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を提供する。
【０１５９】
ある他の実施形態では、本開示は、プロモーター領域５’を含み、且つ配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを含む、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を提供する。
【０１６０】
ＶＩＩ．細菌細胞
ある実施形態では、本開示の修飾細菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーである。他の実施形態では、修飾細菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。ある実施形態では、本開示の修飾細菌細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【０１６１】
当技術分野では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の分類学的再構成が続いていることは認識されている。したがって、この属は、限定されないが、現在はジェオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と称されるバチルス・ステアサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、または現在はパエニバシラス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）と称されるバシラス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）などの生物をはじめとする、再分類された種を含むことが意図される。
【０１６２】
ＶＩＩＩ．目的タンパク質産生のための修飾細胞の培養 
他の実施形態では、本開示は、非修飾（親）細胞と比較して（すなわち、それに対して）修飾細菌細胞のタンパク質生産性を増加する方法を提供する。より具体的には、ある実施形態において、修飾細菌細胞のタンパク質生産性を増加する方法は、好適な発酵条件下で修飾細菌細胞を培養する工程を含み、ここで、修飾細胞は、ｒｐｏＣ遺伝子によってコードされるＲＮＡＰのβ’−サブユニットに少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１６３】
したがって、宿主細胞および形質転換細胞は、従来の栄養培地中で培養することができる。形質転換宿主細胞の培地は、プロモーターの活性化および形質転換体の選択のために、必要に応じて、変更することができる。温度、ｐＨなどの具体的な培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に使用されるものと同じでよく、当業者には明らかであろう。さらに、培養条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２；  ２００１），Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）などの科学文献に、ならびにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から見出すことができる。
【０１６４】
ＩＸ．形質転換
ＰＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチドコンストラクトは、それが宿主細胞によって発現されるように構築することができる。遺伝暗号の公知の縮重のために、当技術分野で常用の技術を用いて、同一アミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチドを設計し、作製することができる。例えば、特定の宿主細胞中での産生を最適化するために、コドン最適化を適用することができる。
【０１６５】
目的タンパク質をコードする核酸をベクターに組み込むことができ、ここで、ベクターは、本明細書に開示されるものなどの公知の形質転換技術を使用して、宿主細胞中に移入することができる。同様に、ある実施形態では、修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーター領域を含む核酸コンストラクトをベクターに組み込むことができ、ここで、ベクターは、公知の形質転換技術を使用して、宿主細胞中に移入することができる。他の実施形態では、ＣｏｍＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーター領域を含む核酸コンストラクトをベクターに組み込むことができ、ここで、ベクターは、公知の形質転換技術を使用して、宿主細胞中に移入することができる。
【０１６６】
ベクターは、宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞）中に形質転換して、宿主細胞内で複製することができるいずれのベクターであってもよい。例えば、ＰＯＩをコードする核酸を含むベクターは、ベクターを伝播し、増幅する手段として細菌宿主細胞中で形質転換および複製することができる。さらに、タンパク質コード核酸（すなわち、ＯＲＦ）を機能性タンパク質として発現することができるように、ベクターを発現宿主中に形質転換することもできる。発現宿主（すなわち、修飾細菌「宿主」細胞）として役立つ細菌細胞としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーが挙げられる。
【０１６７】
ＰＯＩをコードする核酸を含み、これを発現するように、常用の技術で修飾することができる代表的なベクターは、ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，２００７を参照）である。
【０１６８】
ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中で転写を可能にする好適なプロモーターと作動可能に連結することができる。プロモーターは、選択宿主細胞中で転写活性を示すあらゆる核酸配列であってよく、宿主細胞と相同性または異種のいずれのタンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってもよい。
【０１６９】
ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指令する好適なプロモーターの例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡもしくはｃｅｌＡプロモーター、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【０１７０】
ある実施形態では、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指令するプロモーターは、国際公開第２００１／５１６４３号パンフレットに記載される野生型ａｐｒＥプロモーター、突然変異ａｐｒＥプロモーター、または共通ａｐｒＥプロモーターである。
【０１７１】
他の実施形態では、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指令するプロモーターは、リボソームＲＮＡプロモーターまたはリボソームタンパク質プロモーターなどのリボソームプロモーターである。特に、ある実施形態において、リボソームＲＮＡは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｒｒｎプロモーター、さらに具体的には、ｒｒｎプロモーターは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｒｒｎＢ、ｒｒｎＩまたはｒｒｎＥリボソームプロモーターである。ある実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレットに記載されるバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＰ２ｒｒｎプロモーターである。
【０１７２】
ＰＯＩコード配列は、シグナル配列と作動可能に連結させることができる。シグナル配列をコードする核酸配列は、発現させようとするＧＯＩ（ＰＯＩをコードする）と天然に関連するＤＮＡ配列であってもよいし、または異なる属もしくは種に由来するものでもよい。ポリヌクレオチドコンストラクトもしくはベクターを含むシグナル配列およびプロモーター配列を細菌宿主細胞中に導入することができ、こうした配列は、同じ供給源または異なる供給源のいずれに由来するものであってもよい。例えば、ある実施形態では、シグナル配列は、国際公開第２００１／５１６４３号パンフレットに記載されるａｐｒＥプロモーターと作動可能に連結したａｐｒＥシグナル配列である（例えば、Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照）。
【０１７３】
発現ベクターはまた、好適な転写ターミネーター、ならびに真核生物の場合、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列と作動可能に連結したあるポリアデニル化配列を含んでもよい。終結およびポリアデニル化配列は、好適には、プロモーターと同じ供給源に由来するものでよいが、他の実施形態では、終結およびポリアデニル化配列は、互いに異なる供給源および／またはプロモーターとは異なる供給源に由来するものであってもよい。
【０１７４】
好適なベクターは、宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列をさらに含んでもよい。このように複製を可能にする配列の例として、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２などの複製起点を含む。
【０１７５】
好適なベクターはまた、選択可能マーカー、例えば、その産物が、単離された宿主細胞の欠損を補う遺伝子、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子；または例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、テトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与する遺伝子などを含んでもよい。
【０１７６】
好適なベクターは、典型的に、例えば、選択した宿主細胞中でベクターの自律的複製を可能にするエレメントなどのクローニングベクターの成分および選択を目的とする１もしくは複数の表現型的に検出可能なマーカーを含む。発現ベクターは、典型的に、例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、ならびに任意選択で、レプレッサー遺伝子、１または複数の活性化遺伝子配列などの制御ヌクレオチド配列も含む。
【０１７７】
加えて、好適なベクターは、目的タンパク質をペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラ、または特定の修飾細胞コンパートメントにターゲティングさせることができるアミノ酸配列をコードする配列をさらに含む。こうしたターゲティング配列は、例えば、アミノ酸配列「ＳＫＬ」であってもよい。制御配列の指令下での発現のために、発現が起こるような好適な方法で、目的タンパク質の核酸配列を制御配列と作動可能に連結させることができる。
【０１７８】
目的タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクト、プロモーター、ターミネーターおよび／または他のエレメントを連結するために、およびこれらを、複製に必要な情報を含む好適なベクター中に挿入するために、本明細書に記載されるようなプロトコルが当技術分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，および３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１を参照）。
【０１７９】
ポリヌクレオチドコンストラクトまたは発現ベクターのいずれかを含む、単離された細胞は、ＰＯＩの組み換え産生における宿主細胞として有利に使用される。コンストラクト（１または複数のコピー）を宿主染色体に組み込むことによって、ＰＯＩをコードするＤＮＡコンストラクトで細胞を形質転換することができる。このようにして導入されたＤＮＡ配列は、細胞中に安定に維持される傾向が高いため、組み込みは概して利点とみなされる。宿主染色体中へのＤＮＡコンストラクトの組み込みは、従来の方法を適用することにより、例えば、相同性または異種組み換えによって、実施することもできる。あるいは、様々な宿主細胞型に関して前述したような発現ベクターで細胞を形質転換してもよい。
【０１８０】
他の実施形態では、発現宿主から遺伝子を欠失させることが有利であり、遺伝子欠損は、発現ベクターにより解消することができる。公知の方法を用いて、１または複数の非活性化遺伝子を有する細菌宿主細胞を取得することができる。遺伝子不活性化は、遺伝子が機能性タンパク質を発現するのを妨げるように、完全もしくは部分的な欠失によって、挿入による不活性化によって、または遺伝子を意図される目的について非機能性にするその他の任意の手段によって達成することができる。
【０１８１】
細菌の形質転換および細菌の培養技術は、標準的であり、当技術分野で公知である。これらの技術を用いて、目的の組み換えタンパク質生産のために、本発明の改善された宿主を形質転換することができる。宿主細胞中へのＤＮＡコンストラクトまたはベクターの導入としては、形質転換；エレクトロポレーション；核マイクロインジェクション；形質導入；トランスフェクション、例えば、リポフェクション媒介およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介のトランスフェクション；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡコートマイクロプロジェクティルの高速ボンバードメント；遺伝子ガンまたはバーティクルガン形質転換およびプロトプラスト融合などの技術が挙げられる。細菌の形質転換および発現方法は、Ｂｒｉｇｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）にも開示されている。プロテアーゼ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株のための好ましい一般的な形質転換および発現プロトコルがＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，２６４，３６６号明細書）に記載されている。
【０１８２】
上に簡単に述べたように、本開示のある実施形態は、形質転換されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーによってコンピテントにされたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に外来性ポリヌクレオチドを形質転換する工程であって、修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第１核酸コンストラクトの導入前には非コンピテントであったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）外来性ポリヌクレオチドを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換体を単離する工程とを含む。他の実施形態では、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、宿主細胞をさらにコンピテントにするために、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む。ある実施形態では、ＣｏｍＫポリヌクレオチドは、配列番号３５または配列番号３７のＣｏｍＫポリヌクレオチドと約７５％〜１００％の配列同一性を含む。別の実施形態では、本開示は、こうした方法から得られる形質転換バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。
【０１８３】
ある他の実施形態では、本開示は、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を取得する方法に関し、これは、（ａ）プロモーター領域５’を含み、且つ修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第１の核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを、「非コンピテント」バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中に導入する工程であって、修飾ｒｐｏＣポリペプチドが、配列番号８との９０％の配列同一性および配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含み、ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞とは外来性である工程と、（ｂ）導入されたポリヌクレオチドを含むコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を単離する工程とを含む。ある実施形態では、コンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、プロモーター領域５’を含み、且つＣｏｍＫポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第２の導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーをさらに含む。ある実施形態では、ＣｏｍＫポリヌクレオチドは、配列番号３５または配列番号３７のＣｏｍＫポリヌクレオチドと約７５％〜１００％の配列同一性を含む。ある実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。別の実施形態では、本開示は、こうした方法から得られるコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。
【０１８４】
例えば、以下の実施例９に記載するように、配列番号８との９０％の配列同一性および７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換（すなわち、配列番号８に対してＤ７９６Ｇ置換）を含む修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含む第１導入核酸コンストラクトの少なくとも１コピーを含む、修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、得られる形質転換体の数に有意な増加を示す（すなわち、第１導入核酸コンストラクトを含まない親（対照）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して）。したがって、ある実施形態では、第１導入核酸コンストラクトを含む修飾バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、配列番号８との９０％の配列同一性を含み、且つ７９６位のアスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への置換を含む修飾ｒｐｏＣポリペプチドをコードする）は、形質転換体の数を、非修飾（対照）「非コンピテント」親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に比べ、少なくとも２倍増加する。
【０１８５】
Ｘ．発酵
ある実施形態では、本開示は、ＰＯＩを生産する方法に関し、これは、修飾細菌細胞を発酵させる工程であって、修飾細胞が、ＰＯＩを培地中に分泌する工程を含む。修飾および非修飾細菌細胞を発酵させるために、当技術分野で公知の発酵方法を適用することができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、バッチまたは連続的発酵条件下で培養する。古典的なバッチ発酵は、発酵の開始時点で培地の組成を設定して、発酵の間それを改変しない閉鎖系である。発酵の開始時に、所望の生物を培地に接種する。この方法では、系に成分の添加を一切行わずに発酵を発生させる。典型的に、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」としてみなされ、多くの場合、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御する試みがなされる。バッチ系の代謝物およびバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。典型的なバッチ培養では、細胞は、静的な誘導期から高い増殖対数期まで進行し、最後に静止期に達して、増殖速度が減少または停止する。未処理の場合、静止期の細胞は、最終的に死滅する。一般に、対数期の細胞は、産物の大量生産を担う。
【０１８７】
標準的バッチ系の好適な変形は、「フェドバッチ発酵」系である。おの典型的なバッチ系の変形では、発酵が進行するにつれ、基質を段階的に増量しながら添加する。フェドバッチ系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性があるとき、ならびに培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系中の実際の基質濃度の測定は、困難であることから、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２のような廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定する。バッチおよびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で公知である。
【０１８８】
連続発酵は、規定発酵培地を連続的にバイオリアクターに添加し、プロセシングのために等量の馴化培地を除去する開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、その場合、細胞は、主に対数期増殖の状態にある。連続発酵は、細胞増殖および／または産物濃度に影響を与える１もしくは複数の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源または窒素源などの栄養素の制限が定速で維持され、他の全てのパラメーターを緩和させることができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持しながら、増殖に影響を与えるいくつかの因子を連続的に改変することができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努める。したがって、回収される培地による細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度と釣り合わせるべきである。連続的な発酵工程のために栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに産物形成の速度を最大化する技術は、工業微生物学の分野でよく知られている。
【０１８９】
このように、ある実施形態では、形質転換（修飾）宿主細胞により産生されるＰＯＩは、遠心分離または濾過によって培地から宿主細胞を分離する工程、または必要であれば、細胞を破砕し、細胞画分および残屑から上清を取り出す工程を含む、従来の方法によって培地から回収することができる。典型的に、清澄化の後、塩、例えば、硫酸アンモニウムを用いて、上清または濾過物のタンパク質性成分を沈殿させる。次に、沈殿したタンパク質を可溶化させ、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過などの様々なクロマトグラフィ方法により精製してもよい。
【０１９０】
ＸＩ．修飾（宿主）細胞により産生される目的タンパク質
別の実施形態では本開示は、増加したレベルのＰＯＩを生産する方法を提供し、これは、増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞を取得する工程であって、修飾グラム陽性菌細胞が、変異ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）β’−サブユニットポリペプチドをコードするｒｐｏＣ遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を含む工程と、ＰＯＩが発現されるような条件下で修飾細菌細胞を培養する工程とを含み、ここで、増加した量のＰＯＩを発現する修飾グラム陽性菌細胞が、非修飾グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの発現と比較される。
【０１９１】
ＰＯＩは、内在性または異種タンパク質のいずれであってもよく、そうしたＰＯＩの変異体であってもよい。タンパク質は、１もしくは複数のジスルフィド結合を含有することができる、またはその機能性形態が、単量体もしくは多量体であるタンパク質である。すなわち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同性）もしくは非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩまたはその変異ＰＯＩは、好ましくは目的の特性を備えるものである。
【０１９２】
ある実施形態では、ＰＯＩまたはその変異ＰＯＩは、以下：アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１９３】
ＰＯＩまたは変異ＰＯＩは、ペプチド、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ  Ｅ７など）、およびその変異体またはその断片であってもよい。
【０１９４】
他のタイプの目的タンパク質（または変異体）は、食品または穀物に栄養価を賦与することができるものであってもよい。非限定的な例として、抗栄養因子の形成を阻害することができる植物タンパク質およびより望ましいアミノ酸組成（例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量）を有する植物タンパク質が挙げられる。
【０１９５】
ＸＩＩ．タンパク質性組成物の使用
別の実施形態では、本開示は、１または複数種の目的タンパク質を含むタンパク質性組成物を提供する。タンパク質性組成物は、本明細書に記載される方法を用いて、好適に生成される。タンパク質性組成物は、本明細書に記載の方法を用いて発現された目的遺伝子によりコードされた目的タンパク質を含む。この組成物は、例えば、バイオマス加水分解、洗浄用途、穀物加工、家畜栄養、食品組成物、織物加工、パーソナルケアなど、多種の有用な産業分野で使用することができる。
【０１９６】
例えば、タンパク質性組成物は、洗浄用途で使用することができる。酵素洗浄成分は、そうでなければ従来の化学洗剤で容易に除去されない汚れ、シミ、およびその他の残屑を分解する能力のために人気がある。洗浄に有用な公知の酵素として、プロテアーゼおよびアミラーゼ、ならびにリパーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、さらにはいくつかのセルラーゼなどの他の酵素が挙げられ、これらはそれぞれ、一連の異なる機能性を賦与する。例えば、プロテアーゼは、タンパク質ベースの汚れを落とし；アミラーゼは、炭水化物およびデンプンに作用し；リパーゼは、脂質または脂肪を分解する。本開示は、タンパク質生産の改善が実証され、洗浄用途でのそうした使用に有益な工業用酵素、変異体、および混合物の生産体として好適且つ有利な修飾細菌細胞を提供する。
【０１９７】
別の例では、このようにして作製されたタンパク質性組成物を穀物加工に使用することができる。デンプンは、植物において最も一般的な貯蔵炭水化物であり、植物自身によって、ならびに微生物および高等生物によっても使用されている。非常に多様な酵素が、デンプンの加水分解を触媒することができる。全ての植物供給源からのデンプンは、顆粒状で存在するが、植物供給源の種に応じて、デンプンは、大きさおよび物理的特徴が著しく異なる。デンプンの酸性加水分解は、過去に使用が広がったが、この方法は、主に酵素法に取って代わられており、酵素法は、耐食材料をあまり必要としないことや、それ以外の利点、すなわち、加熱に要するエネルギーが少なく、酸性法よりも制御が容易であることがわかっている。本開示は、タンパク質生産の改善が実証され、デンプン分解および穀物加工におけるそうした使用に有益な工業用酵素、変異体、および混合物の生産体として好適且つ有利な、操作、形質転換、または誘導真正細菌細胞を提供する。
【０１９８】
別の例では、このようにして作製されたタンパク質性組成物を食品用途に使用することができる。細菌、酵母およびカビによって産生される酵素は、何千年にもわたってパン、チーズ、ビールおよびワインなどの食品を製造するために食品用途に使用されてきた。今日、酵素は、パン製造、チーズ製造、デンプン加工ならびにフルーツジュースおよび他の飲料の製造に使用され、食感、外観および栄養価の改善といった様々な利点をもたらし、望ましい風味および香りなどを生み出す。食品用酵素は、典型的に、動物および植物起源のもの（例えば、デンプン消化酵素、アミラーゼは、発芽オオムギ種子から得られる）、ならびに多種多様な有益微生物に由来するものがある。酵素は、伝統的な化学物質による技術に対する実行可能で、望ましい代替方法であり、多くの工程で合成化学物質に取って代わっている。酵素は、食品生産工程の環境性能を改善し、エネルギー消費を低減すると共に廃物または副産物の生分解性を高める。酵素は、合成化学物質よりもその作用が特異的となる傾向があるため、酵素による加工は、発生する副反応および廃物もしくは副産物が少なく、その結果、より高品質の製品を生産すると共に汚染の可能性を低減する傾向がある。酵素による加工は、多くの場合、オンリープロセス可能（ｏｎｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ）でもある。この一例は、クリアリンゴジュース濃縮物の製造の場合であり、これは、酵素、ペクチナーゼの使用に依存する。食品用酵素のほとんどは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの微生物から生産される。本開示は、タンパク質生産の改善が実証され、食品用途におけるそうした使用に有益な工業用酵素、変異体、および混合物の生産体として好適且つ有利な、操作、形質転換、または誘導真正細菌細胞を提供する。
【０１９９】
別の例では、このようにして作製されたタンパク質性組成物を家畜飼料添加剤に使用することができる。セルラーゼ、キシラナーゼ、β−グルカナーゼ、目的タンパク質、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼおよび他のカルボヒドラーゼは、家畜飼料産業で広く使用されている。多くの植物を基材とする飼料は、動物の成長を抑える抗栄養因子を含む物質を含有することから、こうした飼料に添加される酵素は、繊維、タンパク質、デンプンおよびフィチン酸塩を分解し、それらを動物により消化しやすくすることによって、これらの抗栄養因子の消化性を改善し、肉、卵または牛乳の生産性を最大限にしながら、より安価で、しかも一般に現地生産される飼料の使用を可能にする。同時に、こうした飼料に添加される酵素は、腸の健康および動物の能力の増強を支持するという利点ももたらし得る。本開示は、タンパク質生産の改善が実証され、家畜飼料用途におけるそうした使用に有益な工業用酵素、変異体、および混合物の生産体として好適且つ有利な操作、形質転換、または誘導真正細菌を提供する。
【０２００】
また別の例では、このようにして作製されたタンパク質性組成物を織物用途に使用することができる。酵素は、織物加工の不可欠な部分となっている。織物産業には２つの確立された酵素用途がある。第１に、アミラーゼなどの酵素は、一般に、糊抜きのための予備仕上げ部分に使用される。第２に、セルラーゼなどの酵素は、一般に、柔軟性、バイオストニング（ｂｉｏ−ｓｔｏｎｉｎｇ）および木綿製品のピリング傾向の低減のための仕上げ部分に使用される。
【０２０１】
例えば、ペクチナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼなどの他の酵素も織物加工に使用されている。さらには、酵素の使用を含む様々な用途があり、そうしたものとして、デニムおよび非デニムの褪色、バイオ洗浄、バイオポリッシング、羊毛仕上げ、過酸化物除去、染料の脱色が挙げられる。したがって、ある実施形態では、本開示は、織物用途におけるそうした使用に有益な工業用酵素、変異体、および混合物の生産体としての修飾グラム陽性菌細胞（タンパク質生産の改善が本明細書で実証される）を提供する。
【実施例】
【０２０２】
本発明の細菌細胞、組成物およびその方法の態様を以下の実施例を参照にして、より深く理解され得るが、これらの実施例は、限定的なものとして解釈すべきではない。材料および方法に対する変更は、当業者には明らかであろう。
【０２０３】
実施例１
ｒｐｏＣ遺伝子に突然変異を含む修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞
本実施例では、５つ（５）の異なるｒｐｏＣ突然変異遺伝子のうちの１つ（１）を含む修飾バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞においてプロテアーゼおよびアミラーゼ酵素の生産を試験し、野生型バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｐｏＣ遺伝子（配列番号６）を含む非修飾（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞と比較した。計５つ（５）の異なるｒｐｏＣ突然変異遺伝子改変（例えば、置換および欠失）を設計、構築および試験する。５つのｒｐｏＣ遺伝子改変を以下の表１に挙げる。
【０２０４】
【表１】
2018532413.tif 000003
【０２０５】
ヌクレオチド置換または欠失は、上の表１に記載のＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質（例えば、配列番号６の野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする配列番号５を参照）中にアミノ酸改変を達成するように設計する。
【０２０６】
例えば、配列番号６のアミノ酸位置７５１のメチオニン（Ｍ）からイソロイシ（Ｉ）への置換（以後、「Ｍ７５１Ｉ」）は、配列番号５のヌクレオチド２２５１、２２５２および２２５３のＡＴＧコドンをＡＴＣ、ＡＴＴまたはＡＴＡコドンで置換することにより実施し；配列番号６のアミノ酸位置７８４のアルギニン（Ｒ）からヒスチジン（Ｈ）への置換（以後、「Ｒ７８４Ｈ」）は、配列番号５のヌクレオチド２３５０、２３５１および２３５２のＣＧＴコドンをＣＡＴまたはＣＡＣコドンで置換することにより実施し；配列番号６のアミノ酸位置７９７のセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換（以後、「Ｓ７９７Ｆ」）は、配列番号５のヌクレオチド２３８９、２３９０および２３９１のＴＣＡコドンをＴＴＴまたはＴＴＣコドンで置換することにより実施し；配列番号６のアミノ酸位置７９６のアスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への置換（以後、「Ｄ７９６Ｇ」）は、配列番号５のヌクレオチド２３８６、２３８７および２３８８のＧＡＣコドンをＧＧＣ、ＧＧＴ、ＧＧＡまたはＧＧＧコドンで置換することにより実施する。上の表１に記載する３つ（３）のアミノ酸欠失コンストラクト（以後、「ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０」）は、配列番号５のコドンを欠失させることにより実施し、これらは、それぞれ配列番号６の残基１０１８、１０１９および１０２０のＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質のイソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）およびアルギニン（Ｒ）アミノ酸に対応する。
【０２０７】
組み込みプラスミドの構築。上に簡単に述べたように、ｐＣＺ２１１（例えば、図１を参照）、ｐＣＺ２１２、ｐＣＺ２１３、ｐＣＺ２１４およびｐＣＺ２１５と称する計５つの組み込みプラスミド（表１）を本明細書に記載の通りに構築する。５つの修飾ｒｐｏＣ遺伝子は、ＳＧＩ−ＤＮＡ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により合成するか、または部位突然変異誘発により作製して、制限消化酵素および連結反応を用いて、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７−Ｉ−Ｓｃｅ中にクローン化する。連結反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカルベンシリンを含有するＬＡプレート上にプレーティングする。コロニーＰＣＲおよびシーケンシングによってコロニーをスクリーニングした。
【０２０８】
温度感受性プラスミドの構築。上のパラグラフで述べた温度感受性組み込みプラスミドｐＫＳＶ７−Ｉ−Ｓｃｅは、次のようにして構築する：２０ピコモルの２つ（２）の一本鎖オリゴマー、Ｉ−ＳｃｅＩ−１：ｃｇａｔＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴａｔ（配列番号９）、およびＩ−ＳｃｅＩ−２：ｃｇａｔＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡａｔ（配列番号１０）（ここで、大文字は、Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素部位の相同性配列である）を９８℃で７分間インキュベートした後、オリゴマーをアニーリングするために、５５℃で５分間維持する。アニーリングした断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）でリン酸化した後、ｐＫＳＶ７組み込みベクター（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，１９９２）のＣｌａＩ部位と連結させる。ｐＫＳＶ７中に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子を排除するために、プラスミドをＮｃｏＩおよびＭｆｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で平滑末端化する。アガロースゲル電気泳動によってクロラムフェニコール耐性遺伝子断片からｒｅｐＦおよびｃｏｐ−６を含有する断片を分離し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した後、自己連結させて、ｐＫＳベクターを作製する。ｐＫＳベクターを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化後に、プラスミドｐＤＧ７８０（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）由来のカナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子と連結させる。得られたプラスミドは、「ｐＫＳＶ７−Ｉ−Ｓｃｅ  Ｋｍ」と称する。
【０２０９】
突然変異ｒｐｏＣ遺伝子のバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞中への形質転換およびｒｐｏＣ突然変異体のスクリーニング。表１に記載される突然変異ｒｐｏＣ遺伝子を含有するプラスミドの各々をバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞中に形質転換し、３０℃で１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢプレート上で形質転換体を選択する。続いて、コロニーを採取し、振盪フラスコ内の２５ｍＬのＬＢ中に接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で３時間インキュベートする。
【０２１０】
プラスミドをバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体中に組み込むために、温度を３７℃に変更して、一晩インキュベートする。翌日、階段希釈物を１０−６および１０−７まで作製し、培養物をＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。コロニーＰＣＲおよびシーケンシングによって、ｒｐｏＣ突然変異体クローンをスクリーニングする。
【０２１１】
修飾（突然変異体）ｒｐｏＣ遺伝子を含む修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞における目的タンパク質の発現。ｒｐｏＣ突然変異をバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に導入後、修飾および非修飾バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、２つの異なるプロテアーゼ酵素の一方または２つの異なるアミラーゼ酵素の一方のいずれかをコードする発現カセットで形質転換する。
【０２１２】
発現カセットによってコードされる２つのプロテアーゼ酵素は、（１）米国特許第５，９７２，６８２号明細書に記載および説明されているバチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）変異プロテアーゼ（本明細書では「プロテアーゼ−１」と称する）、および（２）国際公開第２０１０／０５６６３５号パンフレットに記載および説明されているバチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）変異プロテアーゼ（本明細書では「プロテアーゼ−２」と称する）である。
【０２１３】
同様に、発現カセットによってコードされる２つのアミラーゼ酵素は、（１）国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載および説明されているパエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）アミラーゼ変異体（本明細書では、「アミラーゼ−１」と称する）、ならびに（２）国際公開第２００９／１４９４１９号および同第２００９／１４９３９５号パンフレットに記載および説明されているバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミラーゼの野生型または変異体（本明細書では、「アミラーゼ−２」と称する）である。修飾および非修飾バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞における各酵素の生産を振盪フラスコ内で試験し、非修飾（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞と比較する。
【０２１４】
実施例２
ｒｐｏＣ遺伝子に突然変異を含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞
本実施例では、５つ（５）の異なるｒｐｏＣ突然変異（修飾）遺伝子のうちの１つを含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞においてアミラーゼ酵素の生産を試験し、野生型バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｐｏＣ遺伝子（配列番号７）を含む非修飾（親）バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較した。５つのｒｐｏＣ遺伝子改変を以下の表２に記載する。
【０２１５】
【表２】
2018532413.tif 000004
【０２１６】
このように、本実施例では、ヌクレオチド置換または欠失は、上の表２に記載するＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質（例えば、配列番号８のバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）野生型ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質をコードする配列番号７を参照）中にアミノ酸改変を達成するように設計する。
【０２１７】
例えば、配列番号７に記載の野生型ｒｐｏＣヌクレオチド配列に関して、アミノ酸位置７５１のメチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への置換（Ｍ７５１Ｉ）は、配列番号７のヌクレオチド位置２２５３のグアニン（Ｇ）をシトシン（Ｃ）で置換すること（すなわち、
【化１】
2018532413.tif 000005
）により実施し；アミノ酸位置７８４のアルギニン（Ｒ）からヒスチジン（Ｈ）への置換（Ｒ７８４Ｈ）は、配列番号７のヌクレオチド位置２３５１のグアニンをアデニン（Ａ）で置換すること（すなわち、
【化２】
2018532413.tif 000006
）により実施し；アミノ酸位置７９７のセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｓ７９７Ｆ）は、配列番号７のヌクレオチド位置２３９０および２３９１のシトシン−アデニンヌクレオチド（ＣＡ）をチミン−チミンヌクレオチド（ＴＴ）で置換すること（すなわち、
【化３】
2018532413.tif 000007
）により実施し；アミノ酸位置７９６のアスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への置換（Ｄ７８６Ｇ）は、配列番号７のヌクレオチド位置２３８７のアデニン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換すること（すなわち、
【化４】
2018532413.tif 000008
）により実施する。上の表２に記載する３つ（３）のアミノ酸欠失コンストラクト（ΔＩ１０１８−Ｒ１０２０）は、配列番号７のコドンを欠失させることにより実施し、これらは、それぞれ配列番号８の残基１０１８、１０１９および１０２０のＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質のイソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）およびアルギニン（Ｒ）アミノ酸に対応する。
【０２１８】
ｒｐｏＣ組み込みプラスミドの構築。上に簡単に述べたように、ｐＣＺ２０１（例えば、図２を参照）、ｐＣＺ２０２、ｐＣＺ２０３、ｐＣＺ２０４およびｐＣＺ２０５と称する計５つの組み込みプラスミド（表２）を本明細書に記載のように構築した。これらのプラスミド（すなわち、ｐＣＺ２０１〜ｐＣＺ２０５）の各々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点、カナマイシン（「Ｋｍ」）選択マーカー、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＥ１９４温度感受性レプリコン（「Ｔｓレプリコン」）、および前述した５つのアミノ酸改変（表２）の１つを引き起こすコドン変化を有するｒｐｏＣ遺伝子を含有する。
【０２１９】
５つのプラスミドはすべて、制限消化酵素および連結反応を用いることにより、約３．２ｋｂ合成（既製）ベクターｐＫＢ３２０（以下および図３、ｐＫＢ３２０プラスミドマップを参照）の挿入から取得した。表２に表示するこれら５つの合成修飾（突然変異）ｒｐｏＣ遺伝子を各々個別に、ＳＧＩ−ＤＮＡ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によりｐＵＣ０２ベクター中に挿入し、プラスミド調製物として送達した。ＰＣＲを使用して、プラスミドから各修飾（突然変異）ｒｐｏＣ断片を増幅し、下記のプライマー：
ＥｃｏＲＩ−ｒｐｏＣ順方向プライマー：ｔｃｇｇａａｔｔｃｃｇａｇｃｃｇｔａｔｇｇｇｔｃｔｔｇｔ（配列番号１１）および 
ＳａｌＩ−ｒｐｏＣ逆方向プライマー：ｔａａｇｔｃｇａｃｔｔａｔｔｃａｇｃｃｇｇａａｃｃａｔｔｔｃ（配列番号１２）
を用いて、２つの制限部位（すなわち、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ）を両端に付加した。
【０２２０】
ＰＣＲ産物を首尾よく取得したら、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素を用いて、ＰＣＲ産物、ならびにｐＫＢ３２０プラスミドの両方を消化した。次に、Ｔ４リガーゼによる標準的連結反応を１６℃で一晩実施した。一晩の連結反応混合物をＴｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞中に形質転換し、１０ｐｐｍのカナマイシン選択物を含有するＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２２１】
プレート上に単一大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーが形成した後、５つのプラスミド全ての組み立ての達成を確認するために、下記プライマー：
順方向プライマー：ｃｔｃｇｔｇｃａｃｃｃａａｃｔｇａｔｃｔｔｃａｇ（配列番号１３）および；
逆方向プライマー：ｃｔｇｃｇｔｃｃｇｔｔａｔｃｇａｔｃａａｔｇｃｇｔｃ（配列番号１４）
を用いて、コロニーＰＣＲを実施した。
【０２２２】
組み立てが達成された（確認された）クローンをＬＢ液体培地に接種し、翌日、標準的ミニプレップ（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ）手順を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドサンプルをシーケンシングし、各々が正しいことを確認した。
【０２２３】
バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中へのｒｐｏＣ組み込みプラスミドのプロトプラスト形質転換およびｒｐｏＣ突然変異体選択。標準的プロトプラスト形質転換（国際公開第２００５／１１１２０３号パンフレットを参照）を用いて、表２に記載の修飾ｒｐｏＣ遺伝子を含む５つのプラスミド全てをバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中に形質転換した。ＤＮＡおよびプロトプラスト混合物を、選択物として４０ｐｐｍのネオマイシンと一緒にバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中再生プレート上にプレーティングした。再生プレート上で３日間の増殖後、個々の形質転換体コロニーからのサンプルを採取し、１０ｐｐｍのネオマイシンと一緒にＬＢプレート上に再度線状に塗布した。
【０２２４】
翌日、単一コロニーを採取し、振盪フラスコ内の２５ｍＬのＬＢ培地中に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで３時間振盪した。次に、温度を４６℃まで上昇させ、培養物を一晩振盪した。翌日、一晩培養物の各々を１０６および１０７希釈し、１００μＬをＬＢプレートに広げ、単一コロニーが形成するまで３０℃で一晩インキュベートした。次に、コロニーＰＣＲおよびシーケンシング確認のために、プレートをＱｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｌｂａｎｙ，ＣＡ）に発送した。
【０２２５】
コロニーＰＣＲのために、次の２つ（２）のプライマー：
ｒｐｏＣ順方向プライマー：ｃａｇｃｔａａｇｇａｔａｃｇａｔｃｃａａｇｇｃａａｇ（配列番号１５）および 
ｒｐｏＣ逆方向プライマー：ｔｃｇｃｔｔｔａｔｃｔｔｃｇｔｃｇａｔｃａｇｃｔｃ（配列番号１６）
を用いた。
【０２２６】
シーケンシングのためには、下記のプライマー：
ｒｐｏＣ順方向プライマー：ｇｇｃａａｇｃｔｇａｔｇａａａｔｃｃｔｔｇｇａｔｇ（配列番号１７）
を用いた。
【０２２７】
修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞におけるアミラーゼ発現。前述した修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（すなわち、５つのｒｐｏＣ突然変異体で形質転換した修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞）においてアミラーゼ酵素を発現するために、アミラーゼ酵素を発現する組み込みカセットを作製した。組み込みカセットは、国際公開第２００８／１１２４５９号パンフレットに記載および説明されているアミラーゼ変異体（本明細書では「アミラーゼ−３」と称する）を含む。アミラーゼ−３組み込みカセットを作製するために、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、次の２つ（２）のプライマー：
ＮｏｔＩ−アミラーゼ順方向：ｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａｔａｔｔｃｃｇｃａｔｔｃｇｃａａｔｇｃｃｔａｃ（配列番号１８）および
ＮｏｔＩ−アミラーゼ逆方向：ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａａａｔａａａａａａａｃｇｇａｔｔｔｃｃｔｔｃａｇｇ（配列番号１９）
を用いることにより、ＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。
【０２２８】
次に、１ｕｇのＰＣＲ産物をＮｏｔＩ酵素による制限消化に付してから、３７℃で４時間インキュベートした。続いて、断片をカラム精製し、１０ｕＬのこうしたカラム精製断片を、３０ｕＬの反応物中の５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いることによって連結させ、１６℃で一晩インキュベートした。翌日、５ｕＬの一晩連結反応混合物をローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のために採取し、これは、５ｕＬの一晩連結反応混合物を５ｕＬのサンプルバッファーと混合し、９６℃で３分間インキュベートした後、０．２ｕＬの酵素ミックスを含む５ｕＬの反応バッファーを添加し、これを３０℃で６時間インキュベートすることによって実施した。
【０２２９】
形質転換のために、ＲＣＡ混合物全部を、１５０μＬのｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ置換を含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）コンピテント細胞およびｒｐｏＣ−Ｍ７５１Ｉ置換を含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）コンピテント細胞に添加し、３７℃のガラスチューブ中で１時間振盪した。次に、形質転換混合物（１５０μＬ）を、１０ｐｐｍクロラムフェニコールと一緒にＬＢ／１％不溶性デンプンプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。単一のハロ陽性（ｈａｌｏ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）形質転換体を選択し、７５ｐｐｍの所望レベルまでクロラムフェニコール濃度を増加しながら培地中で増幅した。これらの２つのバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株（すなわち、ｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ置換を含むものとｒｐｏＣ−Ｍ７５１Ｉ置換を含むもの）のグリセロールストックを、１ｍＬの一晩培養物と５００ｕＬの４０％グリセロールと混合することによって収集した。
【０２３０】
実施例３
修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞中へのｒｐｏＢ（β−サブユニット）置換突然変異体Ｑ４６９Ｋ、Ｑ４６９ＲまたはＨ４８２Ｙの導入
ＲｐｏＣ（βサブユニット）タンパク質をコードするｒｐｏＢ遺伝子中の３つの突然変異（すなわち、突然変異Ｑ４６９Ｋ、Ｑ４６９ＲおよびＨ４８２Ｙ）をバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リファンピシン耐性コロニーの単離およびシーケンシングから同定した（Ｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｆｕｒｎｅａｕｘ，２０００）。ネイティブ（野生型）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲｐｏＢ（β−サブユニット）タンパク質配列は配列番号２に記載され、ネイティブＲｐｏＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載される。バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｐｏＢ遺伝子中に前述の突然変異を導入するために、ｒｐｏＢ  Ｑ４６９Ｋ、Ｑ４６９ＲまたはＨ４８２Ｙ置換を含む３つのコンストラクトを以下のように作製する。
【０２３１】
Ｑ４６９Ｋ突然変異は、配列番号１のヌクレオチド位置１４０５、１４０６および１４０７のＣＡＡコドンをＡＡＡコドンに変更することによって実施する。この突然変異を導入するために、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を配列番号２０および配列番号２１中のオリゴヌクレオチドで増幅し；ｒｐｏＢ遺伝子の３’部分を配列番号２２および配列番号２３中のオリゴヌクレオチドで増幅する。融合ＰＣＲは、配列番号２０および配列番号３３中のオリゴヌクレオチドを用いて実施する。
【０２３２】
Ｑ４６９Ｒ突然変異は、配列番号１のヌクレオチド位置１４０５、１４０６および１４０７のＣＡＡコドンをＣＧＡコドンに変更することによって実施する。この突然変異を導入するために、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を配列番号２０および配列番号２５中のオリゴヌクレオチドで増幅し；３’配列を配列番号２２および配列番号２４中のオリゴヌクレオチドで増幅する。融合ＰＣＲは、配列番号２０および配列番号２３中のオリゴヌクレオチドを用いて実施する。
【０２３３】
Ｈ４８２Ｙ突然変異は、配列番号１のヌクレオチド位置１４４５、１４４６および１４４７のＣＡＣコドンをＴＡＣコドンに変更することによって実施する。この突然変異を導入するために、ｒｐｏＢ遺伝子の５’配列を配列番号２０および配列番号２７中のオリゴヌクレオチドで増幅し；３’配列を配列番号２３および配列番号２６中のオリゴヌクレオチドで増幅する。融合ＰＣＲは、配列番号２０および配列番号２３中のオリゴヌクレオチドを用いて実施する。
【０２３４】
スペクチノマイシン耐性（ＳｐｃＲ）遺伝子およびＩ−Ｓｃｅ制限酵素の認識配列を含む、配列番号２８に記載の合成コンストラクトは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）からｇ−Ｂｌｏｃｋとして合成を注文したものである。
【０２３５】
ｒｐｏＢ遺伝子のＣ末端部分は、配列番号２９および配列番号３０中のオリゴヌクレオチドを用いて増幅する。
【０２３６】
ｒｐｏＢ突然変異を含むＤＮＡ断片、スペクチノマイシン耐性マーカーおよび部分的ｒｐｏＢ配列（図４を参照）は、配列番号２０および配列番号３０中のオリゴヌクレオチドを用いた融合ＰＣＲによって組み立てる。
【０２３７】
バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の形質転換。精製後、Ｑ４６９Ｒ、Ｑ４６９ＫまたはＨ４８２Ｙ置換をｒｐｏＢに含む前述のコンストラクトの各々をバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コンピテント細胞中に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で陽性形質転換体を選択し、２００μｇ／ｍｌのリファンピシンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で再単離する。
【０２３８】
Ｉ−Ｓｃｅ制限エンドヌクレアーゼを発現するプラスミドｐＫＢＪ２３３（Ｊａｎｅｓ  ＆  Ｓｔｉｂｉｔｚ，２００６に記載）を前述の細胞中に形質転換する。１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で陽性コロニーを選択する。再単離後、１２時間毎に新鮮な培地中に接種することにより、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス中でバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を連続３日間にわたり増殖させ、続いて、単一コロニー単離を実施する。
【０２３９】
スペクチノマイシンマーカーの除去および修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞中の選択突然変異の導入を、スペクチノマイシン感受性且つリファンピシン耐性コロニーについて選択することにより確認する。次に、ｒｐｏＢＣオペロンのＤＮＡシーケンシングにより、突然変異Ｑ４６９Ｋ、Ｑ４６９ＲまたはＨ４８２Ｙの導入を確認する。
【０２４０】
実施例４
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるプロテアーゼ発現に対するｒｐｏＢまたはｒｐｏＣ遺伝子中の突然変異の作用
ｒｐｏＢまたはｒｐｏＣ遺伝子中に突然変異を含む修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞中のプロテアーゼ−２発現の作用を試験するために、プロテアーゼ−２発現コンストラクトをｒｐｏＢまたはｒｐｏＣ修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のａｐｒＥ遺伝子座中に導入する。
【０２４１】
プロテアーゼ−２発現コンストラクトを２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で増幅する。修飾および野生型バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を５ｍＬのルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス中で一晩増殖させる。プロテアーゼ発現を試験するために、１ｍｌの前培養物を用いて、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ内の２５ｍｌの２×ＮＢ（２×栄養ブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）、１×ＳＮＢ塩、国際公開第２０１０／１４４８３号パンフレットに記載）に接種する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用し、２０倍に希釈した培養液全体の細胞密度を６００ｎｍで、１時間間隔で測定した。
【０２４２】
ＰＣＴ国際公開の国際公開第２０１０／１４４２８３号パンフレットに記載されているように、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．のＡＡＰＦ）を使用して、プロテアーゼ−２の発現をモニターした。簡単に説明すると、アッセイバッファー（１００ｍＭ  トリス、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）中で培養液全体を４０倍に希釈し、希釈試料１０μｌをマイクロタイタープレートに配置した。ＡＡＰＦ原液を希釈し、アッセイバッファー（ＤＭＳＯ中、１００ｍｇ／ｍｌのＡＡＰＦストックを１００倍に希釈）と、この溶液１９０μｌとをマイクロタイタープレートに加え、この溶液の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して４０５ｎｍで測定した。
【０２４３】
実施例５
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるアミラーゼ発現に対するｒｐｏＢまたはｒｐｏＣ遺伝子中の突然変異の作用
ｒｐｏＢまたはｒｐｏＣ遺伝子中に突然変異を含む修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞中のアミラーゼ−２発現の作用を試験するために、ａｐｒＥプロモーターからのアミラーゼ−２タンパク質の発現を駆動する発現コンストラクトを作製する。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔＲ）マーカー遺伝子を含むアミラーゼ発現コンストラクトを（１）修飾ｒｐｏＣ遺伝子を含む修飾（娘）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のａｐｒＥ遺伝子座、（２）修飾ｒｐｏＢ遺伝子を含む修飾（娘）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のａｐｒＥ遺伝子座、ならびに（３）非修飾バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（親）細胞のａｐｒＥ遺伝子座中に導入する。２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で細胞を増幅する。修飾および非修飾細胞を５ｍＬのルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス培地中で一晩増殖させる。アミラーゼ−２タンパク質の発現を試験するために、１ｍｌの前培養物を用いて、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪フラスコ内の２５ｍｌのルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス培地に接種する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用し、細胞密度を６００ｎｍで、１時間間隔で測定する。
【０２４４】
Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して、培養液全体についてアミラーゼ−２タンパク質の活性を測定した。Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキットのＣｅｒａｌｐｈａ試薬混合物を、まず１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、次いで、５０ｍＭのリンゴ酸塩バッファ、ｐＨ５．６を３０ｍｌ加えた。培養物の上澄みをＭｉｌｌｉＱ水で４０倍に希釈し、５μｌの希釈試料を５５μｌの希釈作用性基質溶液に加えた。ＭＴＰプレートを振盪後、室温で４分間、インキュベートした。７０μｌの２００ｍＭホウ酸塩バッファ、ｐＨ１０．２（停止溶液）を加え、反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用し、４００ｎｍで溶液の吸光度を測定した。
【０２４５】
実施例６
ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の両方に修飾を含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の両方における突然変異の作用を試験するために、特異的ｒｐｏＢ遺伝子突然変異（すなわち、ＲｐｏＢ−Ａ４７８Ｖ置換をコードする）および特異的ｒｐｏＣ遺伝子突然変異（すなわち、ＲｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ置換をコードする）を含むバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を以下に記載するように作製する。
【０２４６】
野生型バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｐｏＢ（βサブユニット）タンパク質は、配列番号４に記載され、配列番号３として記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。野生型バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｐｏＣ（β’−サブユニット）タンパク質は、配列番号８に記載され、配列番号７として記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２４７】
バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞中に所望のｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ突然変異を導入する２つの代替方法があり、その各々を以下に記載する。例えば、一方法は、ＲｐｏＢ−Ａ４７８Ｖ置換をすでに含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）中にＲｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ突然変異を導入するか、またはその逆を行うものである。これらの２つの手法は、以下に方法１および方法２として説明する。
【０２４８】
方法１：組み込みプラスミドｐＣＺ２０５構築。プラスミドｐＣＺ２０１（例えば、実施例２を参照）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点、カナマイシン選択マーカー、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＥ１９４温度感受性レプリコン、およびアミノ酸改変（Ｄ７９６Ｇ）をもたらすＤＮＡ配列変化（配列番号７のヌクレオチド配列位置２０６２の
【化５】
2018532413.tif 000009
）を有するｒｐｏＣ遺伝子を含む。
【０２４９】
ｐＣＺ２０５プラスミドは、制限消化および連結反応方法を用いて、約３．２ｋｂの合成修飾ｒｐｏＣ遺伝子をベクターｐＫＢ３２０中に挿入することによって作製する。当技術分野で公知の方法により、この合成修飾ｒｐｏＣ遺伝子をｐＵＣ０２ベクター中に挿入して、プラスミド調製物を作製する。ＰＣＲを使用して、プラスミドからｒｐｏＣ断片を増幅し、下記プライマー：
ＥｃｏＲＩ−ｒｐｏＣ  ＦＷ：ｔｃｇｇａａｔｔｃｃｇａｇｃｃｇｔａｔｇｇｇｔｃｔｔｇｔ（配列番号１１）および
ＳａｌＩ−ｒｐｏＣ  ＲＶ：ｔａａｇｔｃｇａｃｔｔａｔｔｃａｇｃｃｇｇａａｃｃａｔｔｔｃ（配列番号１２）
を用いて、２つの制限部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを両端に付加する。
【０２５０】
ＰＣＲ産物を首尾よく取得したら、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限酵素を用いて、ＰＣＲ産物、ならびにｐＫＢ３２０プラスミドの両方を消化し、続いて、Ｔ４リガーゼによる標準的連結反応を１６℃で一晩実施する。一晩の連結反応混合物をＴｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞中に形質転換し、１０ｐｐｍのカナマイシン選択物を含有するＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。プレート上に単一大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーが形成した後、下記プライマー：
順方向プライマー：ｃｔｃｇｔｇｃａｃｃｃａａｃｔｇａｔｃｔｔｃａｇ（配列番号１３）および；
逆方向プライマー：ｃｔｇｃｇｔｃｃｇｔｔａｔｃｇａｔｃａａｔｇｃｇｔｃ（配列番号１４）
を用いてコロニーＰＣＲを実施して、プラスミドの組み立ての達成を確認する。
【０２５１】
確認されたクローンをＬＢ液体培地に接種し、翌日、標準的ミニプレップ（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ）手順を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出する。正しいプラスミドが得られたことを確認するシーケンシングのために、プラスミドサンプルを発送する。
【０２５２】
バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中への組み込みプラスミドｐＣＺ２０５のプロトプラスト形質転換およびｒｐｏＣ突然変異体選択。ｐＣＺ２０５プラスミドを標準的プロトプラスト形質転換（国際公開第２００５／１１１２０３号パンフレットを参照）を用いて、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中に形質転換し、ＤＮＡおよびプロトプラスト混合物を、選択物として４０ｐｐｍのネオマイシンと一緒にバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）再生プレート上にプレーティングする。再生プレート上で３日間の増殖後、個々の形質転換体を採取し、１０ｐｐｍのネオマイシンと一緒にＬＢプレート上に再度線状に塗布する。翌日、単一コロニーを採取し、振盪フラスコ内の２５ｍＬのＬＢ培地中に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで３時間振盪した後、温度を４６℃まで上昇させ、一晩振盪を続ける。翌日、一晩培養物の１０６および１０７倍希釈物を調製し、１００μｌをＬＢプレートに広げて、３０℃で一晩インキュベートするか、または単一コロニーの形成までインキュベートする。コロニーＰＣＲおよびシーケンシングによって、正しい突然変異の存在を確認する。コロニーＰＣＲのために使用される２つのプライマーは、以下：
ｒｐｏＣ順方向プライマー：ｃａｇｃｔａａｇｇａｔａｃｇａｔｃｃａａｇｇｃａａｇ（配列番号１５）および 
ｒｐｏＣ逆方向プライマー：ｔｃｇｃｔｔｔａｔｃｔｔｃｇｔｃｇａｔｃａｇｃｔｃ（配列番号１６）
である。
【０２５３】
シーケンシングのためのプライマーは、以下：
ｒｐｏＣ順方向プライマー：ｇｇｃａａｇｃｔｇａｔｇａａａｔｃｃｔｔｇｇａｔｇ（配列番号１７）
である。
【０２５４】
方法２：組み込みプラスミドｐＣＺ２１１構築。プラスミドｐＣＺ２１１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点、カナマイシン選択マーカー、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＥ１９４温度感受性レプリコン、および配列番号２のアミノ酸位置４７８（「Ａ４７８Ｖ」）のアラニン（Ａ）からバリン（Ｖ）への置換を引き起こす突然変異を有するｒｐｏＢ遺伝子を含む。
【０２５５】
ｐＣＺ２１１プラスミドは、制限消化および連結反応方法を用いて、約３．５ｋｂの修飾ｒｐｏＢ遺伝子（「Ａ４７８Ｖ」置換をコードする）をベクターｐＫＢ３２０中に挿入することによって作製する。ｒｐｏＢ遺伝子（ＤＮＡ配列位置１４３３で
【化６】
2018532413.tif 000010
）を含有する約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得するために、次の２つのプライマー：
ＥｃｏＲＩ−ＲｐｏＢ順方向プライマー：
【化７】
2018532413.tif 000011
および
ＮｏｔＩ−ＲｐｏＢ逆方向プライマー：
【化８】
2018532413.tif 000012
ならびにテンプレートとしてのバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施する。
【０２５６】
ｒｐｏＢ  ＰＣＲ産物をｐＫＢ３２０ベクター中に挿入するために、挿入片およびベクターの両方をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、続いて、Ｔ４リガーゼによる標準的連結反応を１６℃で一晩実施する。一晩の連結反応混合物をＴｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞中に形質転換し、１０ｐｐｍのカナマイシン選択物と共にＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。単一大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを採取し、液体培地に接種し、一晩増殖させた後、標準的ミニプレップ（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ）手順を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出する。ｐＣＺ２１１プラスミドが得られたことを確認するシーケンシングのために、プラスミドサンプルを発送する。
【０２５７】
バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中への組み込みプラスミドｐＣＺ２１１のプロトプラスト形質転換およびｒｐｏＢ突然変異体選択。ｐＣＺ２１１プラスミドを標準的プロトプラスト形質転換（国際公開第２００５／１１１２０３号パンフレットを参照）を用いて、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中に形質転換し、ＤＮＡおよびプロトプラスト混合物を、選択物として４０ｐｐｍのネオマイシンと一緒にバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）再生プレート上にプレーティングする。再生プレート上で３日間の増殖後、個々の形質転換体を採取し、１０ｐｐｍのネオマイシンと一緒にＬＢプレート上に再度線状に塗布する。翌日、単一コロニーを採取し、振盪フラスコ内の２５ｍＬのＬＢ培地中に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで３時間振盪した後、温度を４６℃まで上昇させ、一晩振盪を続ける。翌日、一晩培養物の１０６および１０７倍希釈物を調製し、１００μｌをＬＡプレートに広げて、３０℃で一晩、単一コロニーが形成されるまでインキュベートする。単一コロニーを採取し、選択物なしのＬＡプレート、ＬＡプレート＋１ｐｐｍのリファンピシン、およびＬＡプレート＋１０ｐｐｍのカナマイシン上に塗布する。陽性クローンまたはｒｐｏＢ−Ａ４７８Ｖ置換を有するクローンは、リファンピシンに対して耐性であり、且つカナマイシンに対して感受性となる（ｐＣＺ１１１プラスミドの喪失により）。
【０２５８】
実施例７
修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中のアミラーゼ酵素の振盪フラスコ産生
本実施例では、いくつかの合成ＤＮＡ断片から構築されたＤＮＡカセットで、実施例２に記載の「ｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ」置換を含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞および野生型（親）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を形質転換した。より具体的には、ＤＮＡ断片１は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｄａＡ領域、ｃａｔプロモーター領域、ａｌｒ１遺伝子、およびｃａｔターミネーター領域を含み；Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から注文したものである。ＤＮＡ断片２は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ネイティブｒｒｎＩ  Ｐ２プロモーター領域、５’−ａｐｒＥ  ＵＴＲおよびバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｌａｔシグナル配列を含み；二本鎖遺伝子断片として調製されたものである（例えば、ＩＤＴ製のＧブロック（Ｇ−ｂｌｏｃｋｓ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）。ＤＮＡ断片３は、アミラーゼ遺伝子配列とバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｌａｔターミネーター領域を含む。ＤＮＡ断片３アミラーゼ遺伝子は、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載および説明されているサイトファーガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種由来のアミラーゼ変異体であり、本明細書では、「アミラーゼ−４」と称する。
【０２５９】
これらの３つのＤＮＡ断片をＰＣＲにより融合し、３’および５’ＮｏｔＩ制限消化配列を使用して連結した後、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて増幅し、最終的に、修飾（ｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞および野生型（親）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のゲノム中に形質転換して、組み込んだ。１％スターチ・アズール（Ｓｔａｒｃｈ  Ａｚｕｒｅ）（レマゾールブリリアントブルー（Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｒと共有結合したジャガイモデンプン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ７６２９）、および３００ｍｇ／ｌのβ−クロロ−Ｄ−アラニン（ＣＤＡ）（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）を添加したＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（Ｂａｃｔｏ）寒天プレートを使用して、形質転換体を選択した。
【０２６０】
アミロース分解活性を示す透明なゾーンは、アミラーゼ−４発現カセットが組み込まれたコロニーの周囲にはっきりと見ることができた。
【０２６１】
ＣＤＡ（３００ｍｇ／ｌ）耐性形質転換体は、ＲＢＢ−デンプンプレート上のハロ形成により判断される通り、アミラーゼ−４を分泌する。ＮＨ４Ｃｌ２、ＦｅＳＯ４、およびＣａＣｌ２を基本培地から省き、３ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４を使用し、基本培地に６０ｍＭ尿素、７５ｇ／Ｌのグルコース、および１％ソイトンを添加した以外は、振盪フラスコ中で細胞を増殖させ、実質的に当技術分野で公知の通りに（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４を参照）調製したＭＯＰＳ基本培地ＭＢＤ培地を用いて、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞によるアミラーゼ−４酵素の産生を実験した。
【０２６２】
１リットル中、４００ｍｇのＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４  Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４  ２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７  １０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２、および１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムの１００×ストック溶液として、微量栄養素を調製した。ＣａＣｌ２を５ｍＭまで添加し、ｐＨを６．８に調節した。Ｉｎｆｏｒｓインキュベーター（３５℃、２８０ｒｐｍ）内で６４時間の増殖後、α−Ａｍｙｌａｓｅ  Ｃｅｒａｌｐｈａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて、全細胞ブロス中のアミラーゼ−４酵素濃度を決定した。
【０２６３】
Ｃｅｒａｌｐｈａα−アミラーゼアッセイは、規定条件下で基質混合物と一緒に全培養ブロスをインキュベートする工程を含み、塩基溶液の添加により反応を停止させる（これに続き、発色が起こる）。基質は、規定オリゴ糖「非還元末端遮断ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド」（ＢＰＮＰＧ７基質）と過剰レベルのグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ（これらは、「遮断基」の存在のためにネイティブ基質に作用をもたらさない）の混合物である。エンド活性α−アミラーゼ（またはＣ６アミラーゼ）によるオリゴ糖の加水分解時に、混合物中に存在する過剰量のα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼが、ｐ−ニトロフェニルマルトサッカライド断片の即時および定量的加水分解を起こし、グルコースおよび遊離ｐ−ニトロフェノールをもたらす。４０５ｎｍでの吸光度を測定し、これは、分析したサンプル中のアミラーゼレベルと直接関係する。
【０２６４】
この一連のアッセイのために使用される装置は、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）；ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＭＴＰ  Ｒｅａｄｅｒ（３４０型−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。このアッセイ系において、使用される試薬および溶液は、以下：（１）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｃｅｒａｌｐｈａキット）；（２）希釈バッファー：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０バッファー、ｐＨ７．１５；および（３）２００ｍＭホウ酸／ＮａＯＨバッファー、ｐＨ１０．２（ＳＴＯＰバッファー）である。
【０２６５】
５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７基質を含有するバイアルを１０ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に溶解させた。アミラーゼサンプル（全細胞ブロス）を希釈バッファーで１６００×希釈した。２５μｌの希釈アミラーゼ溶液をＭＴＰのウェルに添加した後、３５μｌの５．４５ｍｇ／ｍｌのＢＰＮＰＧ７基質溶液を添加することにより、アッセイを実施した。溶液を混合し、ＭＴＰをプレートシールで密封してから、インキュベーター／シェーカー（ｉＥＭＳ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に２５℃で８分間配置した。１００μｌのＳＴＯＰバッファーを添加して反応を停止させた後、ＭＴＰ−リーダーにて４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。非酵素対照を用いて、バックグラウンド吸光度値を修正した。アミラーゼ−４酵素濃度（ｍｇ／ｌ）を計算するために、精製済アミラーゼ−４酵素標準対照サンプルの希釈シリーズを実験に組み込んだ。アミラーゼ−４酵素の活性（すなわち、生産性）を図５Ａおよび図５Ｂに示す。
【０２６６】
実施例８
修飾および親バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞中のアミラーゼ酵素の１リットルバイオリアクター生産
４回反復で標準バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）発酵工程を実行するように設定された１リットルバイオリアクターを使用して、実施例２に記載の「ｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ」置換を含む修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞および野生型（親）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞におけるアミラーゼ−３酵素発現を比較した。修飾および非修飾（野生型；親）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞はさらに、実施例２に記載のアミラーゼ−３発現カセットも含む。１Ｌ発酵は９０時間実行し、その際、表示した時点で（図６参照）サンプルを採取し、ＯＤ６００およびアミラーゼ−３活性を測定した。
【０２６７】
図６に示すように、修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（ｒｐｏＣ−Ｄ７９６Ｇ置換を含む）は、親（野生型）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比べて酵素活性に有意な増加を示した。同様に、修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、より高いＯＤ６００読み取り値を有し、これは、より大きな細胞集団（単独でより高い酵素活性を生み出すことができた）を示している。ＯＤ差を説明するために、図６に示すデータは、ＯＤ６００単位当たりのＵ／ｇとして表され、これは、親バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に対して、修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞からの酵素活性の明らかな増加を示すものである。
【０２６８】
実施例９
修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞の形質転換効率
本実施例では、修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞の形質転換効率は、米国特許第８，３６１，７５５号明細書に記載されているように、それらが、ＧＣ３５８アミラーゼをコードする目的遺伝子を含む複製プラスミドを取り込む能力について分析した。
【０２６９】
より具体的には、以下の３つのバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞の形質転換効率を分析した：宿主細胞１は、ｒｐｏＢ（４７８Ｖ）ポリペプチド（配列番号４）および野生型（ネイティブ）ｒｐｏＣポリペプチド（配列番号８）をコードする親（対照）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞であり；宿主細胞２は、修飾ｒｐｏＢポリペプチド（すなわち、配列番号４の４７８位のバリンからアラニンへの置換）および野生型（ネイティブ）ｒｐｏＣポリペプチド（配列番号８）をコードする修飾（娘）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞であり、宿主細胞３は、ｒｐｏＢ（Ｖ４７８Ａ）ポリペプチド（配列番号４）および修飾ｒｐｏＣポリペプチド（すなわち、配列番号８の７９６位のアスパラギン酸からグリシンへの置換）をコードする修飾娘バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞である。さらに、前述の修飾細胞を用いてコンピテンシーアッセイを実施するために、各宿主細胞は、キシロース誘導性プロモーターからＣｏｍＫを発現するｐＢＬ−ＣｏｍＫプラスミドを含む（例えば、図７プラスミドマップを参照）。
【０２７０】
形質転換効率アッセイ
前述した親（対照）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、宿主細胞１）および修飾（娘）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、宿主細胞２および宿主細胞３）を、１００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩培養した。１００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含有する２５ｍｌのＬＢを含む２回反復前培養振盪フラスコに、単一コロニーから接種し、５０ｍｌスロー（ｔｈｒｏｗ）を用いて、３７℃、２５０ＲＰＭで一晩培養した。
【０２７１】
この前培養物から、本培養に１００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含有する５０ｍｌのＬＢにおいて０．７のＯＤ６００で接種した（２回反復）。２５０ｍｌバッフル付き三角（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ中で本培養を実施し、５０ｍｌスロー（ｔｈｒｏｗ）を用いて、３７℃、２５０ＲＰＭで培養した。計８時間にわたって１時間毎に１回ＯＤ６００を測定した。最初の１時間後、０．３％キシロースを培養物に添加した。３、４、５、６、７および８時間の時点で、１１２．５μｌの培養ブロスを１２．５μｌの１００％ＤＭＳＯに添加し、−８０℃で保存した。
【０２７２】
プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＣ３５８アミラーゼを使用して、形質転換効率を試験した（図８）。このプラスミドは、ｐＨＰＬＴベクター（Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）にクローン化した、ＧＣ３５８アミラーゼの発現用の遺伝子を含有する（例えば、米国特許第８，３６１，７５５号明細書を参照）。プラスミドＤＮＡの添加後、１０００ＲＰＭに設定した卓上サーモシェーカー内で、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。２０ｍｇ／ｌネオマイシンを含有するデンプンプレート上に細胞をプレーティングした。３７℃で２日のインキュベーション後、全てのハロ形成コロニーをカウントした。
【０２７３】
結果
図９に示すように、対照（親）バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、宿主細胞１；ｒｐｏＢ（４７８Ｖ）、野生型（ネイティブ）ｒｐｏＣポリペプチドおよびプラスミドｐＢＬＣｏｍＫを含む／コードする）は、１０前後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の形質転換効率を示し、７時間で１５ＣＦＵのピークを有した。修飾ｒｐｏＢポリペプチド（Ｖ４７８Ａ；図１０を参照）を含む／コードする修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、宿主細胞２）は、ＣＦＵ平均カウントが３ＣＦＵと、親（対照）宿主細胞（図９）に対して形質転換効率の低下を示した。これらの結果は、ｒｐｏＢ（４７８Ｖ）が形質転換効率に３倍超の増加をもたらすことを示唆している。
【０２７４】
対照的に、ｒｐｏＢポリペプチド（Ｖ４７８Ａ）と修飾ｒｐｏＣポリペプチド（Ｄ７９６Ｇ）を含む／コードする修飾バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞（すなわち、宿主細胞３；図１１を参照）は、親（対照）宿主細胞（図９）に対して１４倍超の形質転換効率増加を、また宿主細胞２（図１０）に対して７３倍超の形質転換効率増加を呈示し、これは、ｒｐｏＣ「Ｄ７９６Ｇ」突然変異が、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の形質転換効率に有意且つプラスの効果を有することを示している。
【０２７５】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５ＡＢ】
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【図６】
2018532413.tif 000019
【図７】
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【図８】
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【図９】
2018532413.tif 000022
【図１０】
2018532413.tif 000023
【図１１】
2018532413.tif 000024
【配列表】
2018532413000001.app
【国際調査報告】
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