(57)【要約】  企図される免疫療法は、さらに遺伝子改変されている活性化ＮＫ細胞と癌治療剤の共投与を含む。好ましい実施形態では、活性化ＮＫ細胞はさらに、癌特異的抗原、癌関連抗原または腫瘍特異的抗原に対する親和性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ｔａＮＫ細胞に改変されている。活性化ＮＫ細胞は、高親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）を含むようさらに遺伝子改変されていてもよい。適切な癌治療剤としては、化学療法薬（例えば、ｎａｎｔ−パクリタキセル）または癌標的化抗体（例えば、トラスツズマブ）が挙げられる。【選択図】図２Ａ
2018537536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の活性化ＮＫ細胞であって、
第一の部分が、（ａ）癌関連抗原、癌特異的抗原もしくは癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するか、または（ｂ）ＣＤ１６受容体、ＣＤ１６ａ受容体および１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体からなる群より選択されるＦｃ受容体を発現するようさらに遺伝子改変されており、
第二の部分が、さらなる遺伝子改変が施されていない
複数の活性化ＮＫ細胞と、
抗体および化学療法薬からなる群より選択される癌治療剤と
を含む、キット。
【請求項２】
前記活性化ＮＫ細胞がＮＫ９２細胞である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記活性化ＮＫ細胞が不死化されている、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記活性化ＮＫ細胞が、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が減少または消失している、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記活性化ＮＫ細胞が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性が増強されるよう遺伝子改変されている、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
（取消し）
【請求項７】
前記Ｆｃ受容体が、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体である、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
活性化ＮＫ細胞の前記第一の部分が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
活性化ＮＫ細胞の前記第一の部分が、ｓｃＦｖ部分を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または癌ネオエピトープに対して結合特異性を有する外部ドメインを有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記キメラ抗原受容体が、癌関連抗原に対する結合特異性を有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記キメラ抗原受容体が、癌特異的抗原に対する結合特異性を有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
前記キメラ抗原受容体が、癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
前記活性化ＮＫ細胞が、複製が減少する、または回避されるよう放射線照射されている、請求項１に記載のキット。
【請求項１５】
前記癌治療剤が化学療法薬である、請求項１に記載のキット。
【請求項１６】
前記癌治療剤がチューブリン標的薬である、請求項１に記載のキット。
【請求項１７】
前記癌治療剤がパクリタキセルである、請求項１に記載のキット。
【請求項１８】
前記パクリタキセルがタンパク質と結合している、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記パクリタキセルがアルブミンナノ粒子と結合している、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記癌治療剤が抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項２１】
前記癌治療剤が、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項２２】
前記癌治療剤が、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項２３】
前記癌治療剤がトラスツズマブである、請求項１に記載のキット。
【請求項２４】
（取消し）
【請求項２５】
（取消し）
【請求項２６】
（取消し）
【請求項２７】
癌を治療する、または癌の再発を予防する方法であって、
さらに遺伝子改変されている活性化ＮＫ細胞を投与することと、
抗体および化学療法薬からなる群より選択される癌治療剤を共投与することと
を含む、方法。
【請求項２８】
前記活性化ＮＫ細胞が、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が減少または消失するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記活性化ＮＫ細胞が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性活性が増強されるようさらに遺伝子改変されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記活性化ＮＫ細胞が、Ｆｃ受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６受容体、ＣＤ１６ａ受容体および１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記活性化ＮＫ細胞が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記キメラ抗原受容体が、癌関連抗原に対する結合特異性を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記キメラ抗原受容体が、癌特異的抗原に対する結合特異性を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラ抗原受容体が、癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラ抗原受容体が、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、複数の活性化ＮＫ細胞を投与することをさらに含み、前記活性化ＮＫ細胞の第一の部分が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性化ＮＫ細胞の第二の部分が、ＣＤ１６受容体、ＣＤ１６ａ受容体および１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体からなる群より選択されるＦｃ受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、前記活性化ＮＫ細胞の投与とそれに続く遺伝子改変活性化ＮＫ細胞の前記第一の部分の投与を別個のイベントとして含み、前記別個のイベントが、少なくとも１日隔てられている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、さらなる遺伝子改変が施されていない第二の活性化ＮＫ細胞を投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、前記第二の活性化ＮＫ細胞の投与とそれに続く前記遺伝子改変活性化ＮＫ細胞の投与を別個のイベントとして含み、前記別個のイベントが、少なくとも１日隔てられている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌治療剤を共投与する段階を前記活性化ＮＫ細胞の投与の前に少なくとも１回実施する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌治療剤を共投与する段階を前記活性化ＮＫ細胞の投与の後に少なくとも１回実施する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌治療剤が化学療法薬である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
前記化学療法薬を共投与する段階を、低用量を用いて実施する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
前記低用量が、前記薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の５０％未満である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記低用量が、前記薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の２５％未満である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記低用量が、前記薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の１０％未満である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記低用量を少なくとも１週間にわたって反復投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記低用量を少なくとも２日隔てて投与する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌治療剤が、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌治療剤がトラスツズマブである、請求項２７に記載の方法。
【請求項５４】
患者の腫瘍サイズを減少させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項５５】
（取消し）
【請求項５６】
（取消し）
【請求項５７】
前記活性化ＮＫ細胞が不死化されている、請求項１〜２のいずれかに記載のキット。
【請求項５８】
前記活性化ＮＫ細胞が、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が減少または消失している、請求項１〜２および５７のいずれかに記載のキット。
【請求項５９】
前記活性化ＮＫ細胞が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性が増強されるよう遺伝子改変されている、請求項１〜２および５７〜５８のいずれかに記載のキット。
【請求項６０】
（取り消し）
【請求項６１】
前記Ｆｃ受容体が、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体である、請求項５５〜５９に記載のキット。
【請求項６２】
活性化ＮＫ細胞の前記第一の部分が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項１〜２および５７〜６１のいずれかに記載のキット。
【請求項６３】
活性化ＮＫ細胞の前記第一の部分が、ｓｃＦｖ部分を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項１〜２および５７〜６２のいずれかに記載のキット。
【請求項６４】
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または癌ネオエピトープに対して結合特異性を有する外部ドメインを有する、請求項６２〜６３のいずれかに記載のキット。
【請求項６５】
前記キメラ抗原受容体が、癌関連抗原に対する結合特異性を有する、請求項６２〜６４のいずれかに記載のキット。
【請求項６６】
前記キメラ抗原受容体が、癌特異的抗原に対する結合特異性を有する、請求項６２〜６５のいずれかに記載のキット。
【請求項６７】
前記キメラ抗原受容体が、癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する、請求項６２〜６６のいずれかに記載のキット。
【請求項６８】
前記活性化ＮＫ細胞が、複製が減少する、または回避されるよう放射線照射されている、請求項１〜２および５７〜６７のいずれかに記載のキット。
【請求項６９】
前記癌治療剤が化学療法薬である、請求項１〜２および５７〜６８のいずれかに記載のキット。
【請求項７０】
前記化学療法薬がチューブリン標的薬である、請求項１〜２および５７〜６９のいずれかに記載のキット。
【請求項７１】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１〜２および５７〜７０のいずれかに記載のキット。
【請求項７２】
前記パクリタキセルがタンパク質と結合している、請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
前記パクリタキセルがアルブミンナノ粒子と結合している、請求項７１に記載のキット。
【請求項７４】
前記癌治療剤が抗体である、請求項１〜２および５７〜７３のいずれかに記載のキット。
【請求項７５】
前記抗体が、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する、請求項１〜２および５７〜７４のいずれかに記載のキット。
【請求項７６】
前記抗体が、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する、請求項１〜２および５７〜７５のいずれかに記載のキット。
【請求項７７】
前記抗体がトラスツズマブである、請求項１〜２および５７〜７６のいずれかに記載のキット。
【請求項７８】
前記活性化ＮＫ細胞の前記一部が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項１〜２および５７〜７７のいずれかに記載のキット。
【請求項７９】
前記活性化ＮＫ細胞の前記一部が、ＣＤ１６受容体、ＣＤ１６ａ受容体および１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体からなる群より選択されるＦｃ受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
（取り消し）
【請求項８１】
請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットの内容物を含む組成物とともに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項８２】
前記組成物が、癌を有する患者の腫瘍サイズを減少させるのに有効な量で存在する、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記組成物が、癌を治療する、または癌の再発を予防するのに有効な量で存在する、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記組成物が、経口投与用または注射用に製剤化されている、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットの内容物を含む組成物の医薬組成物製造への使用。
【請求項８６】
癌を治療する、または癌の再発を予防するための、請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項８７】
ＨＥＲ２陽性乳癌を治療する、またはＨＥＲ２陽性乳癌の再発を予防するための、請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項８８】
腫瘍サイズを減少させるための、請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項８９】
腫瘍サイズを減少させる方法であって、癌を有する対象に請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットを投与する段階を含む、方法。
【請求項９０】
癌を治療する、または癌の再発を予防する方法であって、癌を有する対象に請求項１〜２および５７〜７９のいずれか１項に記載のキットを投与する段階を含む、方法。
【請求項９１】
（取り消し）
【請求項９２】
（取り消し）
【請求項９３】
前記活性化ＮＫ細胞が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性活性が増強されるようさらに遺伝子改変されている、請求項２７および２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記活性化ＮＫ細胞が、Ｆｃ受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７、２８および９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６受容体、ＣＤ１６ａ受容体および１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体からなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記活性化ＮＫ細胞が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７、２８および９３〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記キメラ抗原受容体が、癌関連抗原に対する結合特異性を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記キメラ抗原受容体が、癌特異的抗原に対する結合特異性を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記キメラ抗原受容体が、癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記キメラ抗原受容体が、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、複数の活性化ＮＫ細胞を投与することをさらに含み、前記活性化ＮＫ細胞の第一の部分が、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項２７、２８および９３〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記活性化ＮＫ細胞の第二の部分が、ＣＤ１６受容体、ＣＤ１６ａ受容体および１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体からなる群より選択されるＦｃ受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、前記活性化ＮＫ細胞の投与とそれに続く遺伝子改変活性化ＮＫ細胞の前記第一の部分の投与を別個のイベントとして含み、前記別個のイベントが、少なくとも１日隔てられている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、さらなる遺伝子改変が施されていない第二の活性化ＮＫ細胞を投与することをさらに含む、請求項２７、２８および９３〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記活性化ＮＫ細胞を投与する段階が、前記第二の活性化ＮＫ細胞の投与とそれに続く前記遺伝子改変活性化ＮＫ細胞の投与を別個のイベントとして含み、前記別個のイベントが、少なくとも１日隔てられている、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記癌治療剤を共投与する段階を前記活性化ＮＫ細胞の投与の前に少なくとも１回実施する、請求項２７、２８および９３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記癌治療剤を共投与する段階を前記活性化ＮＫ細胞の投与の後に少なくとも１回実施する、請求項２７、２８および９３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記癌治療剤が化学療法薬である、請求項２７、２８および９３〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記化学療法薬を共投与する段階を、低用量を用いて実施する、請求項２７、２８および９３〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記低用量が、前記薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の５０％未満である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記低用量が、前記薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の２５％未満である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記低用量が、前記薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の１０％未満である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記低用量を少なくとも少なくとも１週間にわたって反復投与する、請求項１０９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記低用量を少なくとも２日隔てて投与する、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記化学療法薬がパクリタキセルである、請求項１０９〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記癌治療剤が、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する抗体である、請求項２７、２８および９３〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記癌治療剤がトラスツズマブである、請求項２７、２８および９３〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
患者の腫瘍サイズを減少させる、請求項２７、２８および９３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５３８２号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、特にキメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変ナチュラルキラー細胞および微小管阻害剤による治療に関する、薬学的に増強された免疫療法である。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明には、本発明の理解に有用であると思われる情報が含まれている。本明細書に提供されるあらゆる情報が、本願で特許請求する発明の先行技術である、または本願で特許請求する発明に関連するものであることも、具体的または非明示的に参照されるあらゆる刊行物が先行技術であることも認めるものではない。
【０００４】
本明細書の刊行物はいずれも、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に明示された場合と同様に参照により組み込まれる。組み込まれる参考文献での用語の定義または使用が本明細書に記載されるその用語の定義と一貫性がない、またはそれと逆である場合、本明細書に記載されるその用語の定義が適用され、参考文献でのその用語の定義は適用されない。
【０００５】
チューブリン標的薬は一般に、細胞内で有糸分裂の紡錘体集合、染色体分離および細胞分裂に様々な障害を引き起こすものであり、このため、様々な癌、特に卵巣癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌およびその他のタイプの固形腫瘍癌の治療選択肢となっている。ただ、チューブリン標的薬のほとんどは特に分裂の速い健常細胞に対して重篤な副作用を示す。さらに、これらの薬物（例えば、パクリタキセル）の少なくとも一部は溶解度が低く、タンパク質結合と結合しにくいため、その送達には制約がある。このような問題を克服するために、パクリタキセルとアルブミンナノ粒子を結合させることがある。それでもなお、毒性が重要な問題となっている。
【０００６】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は浸潤性乳癌の最大２０％に過剰発現し、腫瘍の侵襲性を増大させ、再発までの期間を短くし、全生存率を低下させる原因であるとされている。モノクローナル抗体および小分子阻害剤を含めたＨＥＲ２標的療法により有意な臨床的有用性が得られている。
【０００７】
ごく最近では、通常はＴ細胞およびアデノウイルス遺伝子送達に基づく癌治療法および様々な方法において免疫療法が有望な選択肢となっており、少なくとも中程度の一時的な成功が報告されている。免疫療法の細胞媒介性殺作用を増大させるため、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を用いることができる。ＮＫ細胞は養子癌免疫療法に重要なエフェクター細胞の一種であり、進行癌の患者を対象とする初期臨床試験では、未改変の活性化ＮＫ−９２細胞（ａＮＫ）の安全性が示されており、数か月間にわたり間隔を空けて複数回注射を実施してもサイトカインストームを示す証拠は認められなかった。ごく最近では、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようＮＫ細胞を操作してその抗腫瘍活性を増強することが可能であり、安定なクローン性ＨＥＲ２特異的ＮＫ−９２細胞系（ＨＥＲ２．ｔａＮＫ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥＲ２発現ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の選択的かつ連続的な殺作用を媒介することが明らかにされている（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５；２３（２）：３３０−３３８）。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験でもＭＤＡ−ＭＢ−４５３／ＥＧＦＰのマウス異種移植でそのようなＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞の富化が示されており、腎細胞癌モデルでもＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞により肺転移の数が減少した。
【０００８】
このような治療により患者への毒性および有害副作用が大幅に減少するように思われるが、依然として完全寛解および永久寛解または癌細胞の根絶が一貫して達成されることはない。さらに、進行ＨＥＲ２陽性乳癌の患者は一次耐性を示す頻度が高く、最初にこれらの治療法に感受性を示した患者でも時間とともに必ず耐性を獲得した。このため、ＮＫ細胞ベースの癌免疫療法のための改善された組成物および方法ならびにＨＥＲ−２陽性転移性乳癌にさらに効果的な治療法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の主題は、活性化ＮＫ細胞またはさらなる遺伝子改変を有する活性化ＮＫ細胞を癌治療剤とともに投与して、癌に対するより強力な治療応答を生じさせるか、または再発を予防する癌免疫療法のための様々な医薬組成物、その使用および方法を企図するものである。好ましい態様では、活性化ＮＫ細胞は不死化されているか、またはＮＫ９２細胞に基づくものであり、癌治療剤は、低用量で長期間にわたってメトロノームのように投与する抗体（例えば、トラスツズマブなど）または化学療法薬（例えば、パクリタキセル、ｎａｎｔ−パクリタキセルなど）である。特に好ましい実施形態では、活性化ＮＫ細胞は、癌エピトープに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＦｃ受容体（例えば、ＣＤ１６受容体）、より好ましくは高親和性Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６ａ受容体、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体など）および好ましくは細胞内で保持される免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の発現を発現するよう遺伝子改変されている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、活性化ＮＫ細胞またはさらなる遺伝子改変を有する活性化ＮＫ細胞を投与することおよび癌治療剤（例えば、抗体、化学療法薬など）を共投与することにより癌を治療する、または癌の再発を予防する方法が企図される。好ましい実施形態では、活性化ＮＫ細胞を投与する前または後に化学療法薬を２回以上投与する。このような実施形態では、活性化ＮＫ細胞は、癌エピトープに対するＣＡＲを発現するようさらに改変されているのが好ましい。
【００１１】
本発明の主題のＮＫ細胞は、活性化されるよう改変されており、いくつかの実施形態では増殖が促進されるよう不死化されており、好ましくはＮＫ９２細胞であるのが好ましい。活性化ＮＫ細胞は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が減少または消失するようさらに遺伝子改変され得ることが企図される。活性化ＮＫ細胞のその他の企図される改変としては、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性の増強、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６）もしくは高親和性Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６ａ受容体、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体など）の発現または好ましくは細胞内で保持される免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の発現が挙げられる。活性化ＮＫ細胞は、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性（例えば、所望の結合特異性を有する外部ドメインを介するもの、ｓｃＦｖ部分を介するものなど）を有するキメラ抗原受容体を発現するよう改変されていてよい。いくつかの実施形態では、活性化ＮＫ細胞に放射線照射するか、または別の方法を実施して、細胞複製を減少または回避させるのが有利である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明の主題の癌治療剤としては、化学療法薬（例えば、チューブリン標的薬、パクリタキセル、タンパク質と結合したパクリタキセル、アルブミンナノ粒子と結合したパクリタキセルなど）および抗体（例えば、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する抗体、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有する抗体、トラスツズマブなど）が挙げられる。
【００１３】
本発明の主題のいくつかの組成物としては、追加の活性化ＮＫ細胞が挙げられ、その一部のものは、キメラ抗原受容体（例えば、癌関連抗原、癌特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するものなど）、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６受容体など）または高親和性Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６ａ受容体、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体など）および好ましくは細胞内で保持される免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の発現を発現するよう遺伝子改変されたものであり、その他の活性化ＮＫ細胞はさらなる遺伝子改変が施されていないものである。
【００１４】
本発明の主題のいくつかの方法では、別個のイベント（例えば、少なくとも１日隔てた投与など）として、活性化ＮＫ細胞の投与の後に、追加で改変されたＮＫ細胞または遺伝子改変が施されていないＮＫ細胞の投与を実施する。いくつかの実施形態では、活性化ＮＫ細胞を投与する前に癌治療剤の共投与を実施するが、活性化ＮＫ細胞の後または前と後の両方に癌治療剤を投与し得ることが企図される。好ましくは、低用量（例えば、薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の５０％、２５％または１０％など）を用いて、好ましくは、１週間以上にわたって反復投与する、または少なくとも２日隔てて投与する低用量を用いて、化学療法薬を投与する。好ましい治療方法では、癌治療剤の投与レジメンおよび活性化ＮＫ細胞の投与は、患者の腫瘍のサイズを減少させるのに効果的なものである。
【００１５】
以下の好ましい実施形態の詳細な説明および同じ番号が同じ構成要素を表す添付図面から、本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点がさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の主題による併用療法の例示的投与計画および比較データを示すグラフである。
【図２Ａ】図１の治療における治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図２Ｂ】図１の治療における治療後の平均体重の変化を示すグラフである。
【図２Ｃ】図１の治療における第３２日の測定１回当たりの腫瘍成長阻害を示す表である。
【図３Ａ】９０日間の観察周期における治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図３Ｂ】９０日間の観察周期における治療後の平均体重の変化を示すグラフである。
【図４Ａ】１０個の試料群の投与レジメンを示す表である。
【図４Ｂ】図４Ａの試料群１〜６の治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図４Ｃ】図４Ａの試料群１〜６の治療後の平均体重の変化を示すグラフである。
【図４Ｄ】図４Ａの試料群１、４および７〜１０の治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図４Ｅ】図４Ａの試料群１、４および７〜１０の治療後の平均体重の変化を示すグラフである。
【図４Ｆ】図４Ａの各試料群の腫瘍成長阻害および体重変化を示す表である。
【図５Ａ】ＰＢＳで治療したマウス細胞の切断カスパーゼに関するＩＨＣ染色を示す図である。
【図５Ｂ】トラスツズマブで治療したマウス細胞の切断カスパーゼ３に関するＩＨＣ染色を示す図である。
【図５ＣＡ】ｈａＮＫ細胞で治療したマウス細胞の切断カスパーゼ３に関するＩＨＣ染色を示す図である。
【図５Ｄ】ｈａＮＫ細胞とトラスツズマブで併用治療したマウス細胞の切断カスパーゼ３に関するＩＨＣ染色を示す図である。
【００１７】
（詳細な説明）
本発明者らは現時点で、活性化ＮＫ細胞またはさらなる遺伝子改変を有する活性化ＮＫ細胞の投与による治療効果が、いくつかの実施形態ではメトロノミック低用量レジメンで、癌治療剤（例えば、抗体、化学療法薬など）の共投与により相乗的に増大し得ることを新たに発見している。好ましい態様では、活性化ＮＫ細胞は、（例えば、癌関連抗原、癌特異的抗原および癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する）キメラ抗原受容体を発現するようさらに改変されている。ＮＫ細胞はまた、高親和性Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６ａ受容体、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａ受容体など）および好ましくは細胞内で保持される免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の発現を発現するよう改変されていてよい。いくつかの実施形態では、さらなる遺伝子改変を有する活性化ＮＫ細胞と、さらなる遺伝子改変を有さない活性化ＮＫ細胞の両方を共投与する。
【００１８】
特に好ましい態様では、活性化ＮＫ細胞は、ＮＫ−９２誘導体であり、（阻害の欠如または低下を介して）そのような細胞を恒常的に活性化させる少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が減少または消失するよう改変されている。したがって、適切な改変細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用が減少または消失するよう変異した１つまたは複数の改変キラー細胞免疫グロブリン様受容体を有し得る。当然のことながら、１つまたは複数のＫＩＲが欠失していても、あるいは（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを介して）発現が抑制されていてもよいことに留意するべきである。最も典型的には、２つ以上のＫＩＲが変異、欠失または発現停止しており、特に企図されるＫＩＲとしては、短いまたは長い細胞質側末端を有する２つまたは３つのドメインを有するものが挙げられる。異なる観点からみると、改変、発現停止または欠失を施したＫＩＲとしては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３およびＫＩＲ３ＤＳ１が挙げられる。このような改変細胞は、当該技術分野で周知のプロトコルを用いて調製し得る。あるいは、このような細胞をＮａｎｔＫｗｅｓｔ社（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍを参照されたい）からａＮＫ細胞（活性化ナチュラルキラー細胞）として購入してもよい。さらなる企図される態様では、活性化ナチュラルキラー細胞は、患者に由来し、当該技術分野で既知のプロトコルに従ってｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させたものであってもよい。
【００１９】
ＮＫ−９２は細胞溶解性癌細胞系の１つであり、非ホジキンリンパ腫に罹患している患者の血液中に発見され、その後ｅｘ  ｖｉｖｏで不死化されたものである。ＮＫ−９２細胞はＮＫ細胞に由来するものであるが、正常なＮＫ細胞が提示する主要な抑制性受容体が欠如していると同時に、活性化受容体の大部分が保持されている。ＮＫ−９２細胞は、正常細胞を攻撃することも、ヒトに許容できない免疫拒絶反応を誘発することもない。国際公開第１９９８／４９２６８号および米国特許出願公開第２００２−００６８０４４号にはＮＫ−９２細胞系の特徴付けが開示されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ａＮＫは、キメラ抗原受容体を発現するようさらに遺伝子改変されている。このような細胞は、治療上適切な量まで迅速に増殖させることが可能な不死化または別の方法で操作された細胞に基づくものであることが企図される。したがって、このような細胞は、拡張された複製能を有するよう遺伝子操作されているか、またはＮＫ９２誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ａＮＫ細胞は、好ましくは細胞内で保持される免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を発現するようさらに遺伝子改変されている。特に好ましい態様では、さらに遺伝子改変されたａＮＫは、キメラＴ細胞受容体をコードする組換え核酸を含む。最も典型的には、キメラＴ細胞受容体は、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＥＡ−ＣＡＭ）、腫瘍特異的抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなど）または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ部分またはその他の外部ドメインを有する。このようなキメラＴ細胞受容体を発現するようａＮＫ細胞をさらに遺伝子操作する方法は多数存在し、いずれの方法も本明細書で使用するのに適したものであると考えられる。例えば、適切なキメラ抗原受容体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または癌ネオエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ部分および／またはその他の外部ドメインを含み得る。あるいは、このような細胞をＮａｎｔＫｗｅｓｔ社からｔａＮＫ細胞（「標的活性化ナチュラルキラー細胞」）として購入してもよい。
【００２１】
最も典型的には、キメラ抗原受容体は、１つまたは複数の癌関連抗原に対する親和性を有するよう（または癌関連抗原に対する特異性を有する抗体を保有するよう）操作されており、あらゆる既知の癌関連抗原が使用に適しているものと見なされることが企図される。例えば、癌関連抗原としては、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＹＰＢ１などが挙げられる。同様に、キメラ抗原受容体が癌特異的抗原に対する親和性を有するよう（または癌関連抗原に対する特異性を有する抗体を保有するよう）操作されている場合、あらゆる既知の癌特異的抗原が使用に適しているものと見なされることが企図される。例えば、癌特異的抗原としては、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２、ＰＳＡ、ブラキュリなどが挙げられる。細胞が癌ネオエピトープに対する親和性を有するよう（または癌ネオエピトープに対する特異性を有する抗体を保有するよう）操作されている場合、ネオエピトープを特定するあらゆる既知の方法が適切な標的に導くことが企図される。例えば、第一段階で、腫瘍生検組織（またはリンパ生検組織もしくは転移部分の生検組織）およびこれとマッチする正常組織（すなわち、同じ患者の非患部組織）の全ゲノム解析を実施し、そのように入手したオミクス情報の同時位置誘導アライメント比較（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）（例えば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０号）により、患者の腫瘍からネオエピトープを特定し得る。有力な抗原標的またはネオエピトープ標的の追加の選別または特定は、有力な標的について予測される、または実際の（非）発現レベル、細胞内位置または細胞外提示に基づくものであり得る。次いで、特定されたネオエピトープを患者のＨＬＡタイプとのマッチに関してさらに選別し、ネオエピトープの抗原提示の可能性を増大させ得る。最も好ましくは、このようなマッチングをコンピュータで実施し得る。ネオエピトープに対する抗体を国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／２９２４４号に記載されているように単離または作製してもよい。
【００２２】
上記のものに代えて、またはこれに加えて、活性化ＮＫ細胞と、高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を発現し、好ましくはその受容体が上記の癌関連抗原、癌特異的抗原および癌ネオエピトープに対する結合特異性を有する抗体と結合した遺伝子改変ＮＫ細胞とを併用してもよい。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、高親和性Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、１５８位にバリンを有するＣＤ１６ａなど）を発現するよう改変されたＮＫ−９２誘導体である。Ｆｃγ受容体の高親和性バリアントの配列は当該技術分野で周知であり、あらゆる作製および発現の方法が本明細書での使用に適しているものと考えられる。このような受容体の発現により、本明細書で企図される治療に応答する患者が産生した抗体または患者の腫瘍細胞（例えば、ネオエピトープ）、特定の腫瘍タイプ（例えば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなど）に特異的な抗体または癌に関連する（例えば、ＣＥＡ−ＣＡＭ）抗体を用いて、腫瘍細胞を特異的に標的化することが可能になると考えられる。このような細胞は、ＮａｎｔＫｗｅｓｔ社からｈａＮＫ細胞（「高親和性ナチュラルキラー細胞」）として購入し、次いでさらに改変し得る点で有利である。
【００２３】
活性化ＮＫ細胞および遺伝子改変ＮＫ細胞のタイプに関係なく、細胞を医薬組成物、典型的には、投与単位当たり１０４〜１０１１個の細胞、より典型的には１０５〜１０９個の細胞を含む無菌注射用組成物として製剤化した、医薬組成物の形で使用することが企図される。ただし、これに代わる製剤も本明細書での使用に適するものと考えられ、あらゆる既知の投与経路および投与様式が本明細書で企図される。好ましい実施形態では、細胞の増殖を抑えるために、投与前に細胞に放射線を照射する。細胞増殖を低下させる、または阻害するのに、その他の適切な細胞改変を用い得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される医薬組成物または薬物を「投与すること」という用語は、医薬組成物または薬物の直接投与および間接投与の両方を指し、ここでは、医薬組成物または薬物の直接投与は、典型的には医療専門家（例えば、医師、看護師など）が実施するものであり、間接投与は、医療専門家が（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などにより）直接投与するための医薬組成物または薬物を提供するか、あるいは医薬組成物または薬物を医療専門家が直接投与に使用できるようにする段階を含むものである。
【００２４】
本発明の主題を限定するわけではないが、活性化ＮＫ細胞と遺伝子改変ＮＫ細胞の比は、典型的には１：１００〜１００：１、より典型的には１：２〜２：１、１：３〜３：１、１：４〜４：１、１：５〜５：１、１：６〜６：１、１：７〜７：１、１：８〜８：１、１：９〜９：１、１：１０〜１０：１、１：２０〜２０：１、１：３０〜３０：１または１：５０〜５０：１である。さらに、複数回の注射（典型的には、少なくとも１日または２日隔てる）で投与する場合、活性化ＮＫ細胞とさらに遺伝子改変したＮＫ細胞の比は典型的には同じであることが企図される。ただし、比の適度な変化も明示的に企図される。例えば、組み合わせた細胞の投与を個別の注射で１日または２日隔てて１〜５回（またはそれ以上）実施し得る。別の例では、投与は、最初に活性化ＮＫ細胞を１回または２回（またはそれ以上）注入し、その後、さらに遺伝子改変したＮＫ細胞を（１回もしくは２回またはそれ以上）注入することを含み得る。また別の例では、さらに遺伝子改変したＮＫ細胞の投与と活性化ＮＫ細胞の投与を交互に実施し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態は、化学療法薬、ａＮＫ細胞およびｔａＮＫ細胞を組み込んだ組成物または方法を含み得るが、このような実施形態は、他の癌治療剤または活性化ＮＫ細胞の代わりとなり得る、あるいはこれを加え得ることが理解されるべきである。例えば、諸実施形態は、１つまたは複数の化学療法薬、１つまたは複数の抗体、ａＮＫ細胞、ｔａＮＫ細胞（同じまたは異なる結合特異性を有するＣＡＲを有する）またはｈａＮＫ細胞（同じまたは異なる結合基質に対する高い親和性を有する）あるいは癌治療剤、ａＮＫ細胞、ｔａＮＫ細胞およびｈａＮＫ細胞の任意の組合せを含み得る。
【００２６】
ｈａＮＫ細胞治療および抗体（例えば、トラスツズマブ）治療は単独でも腫瘍サイズを有意に減少させ得るが、併用治療により相乗的に腫瘍サイズが減少する、または癌の再発が予防されることが企図されることが理解されるべきである。癌標的化抗体治療とｈａＮＫ細胞治療との間の相乗作用の機序として有力なものには、抗体が抗体標的化腫瘍の免疫促進を誘導して、同じくｈａＮＫ細胞の高親和性ＣＤ１６ａ受容体（Ｖ１５８）によって増幅されるｈａＮＫ細胞による認識および殺作用を増大させるというものがある。したがって、本発明の主題は、癌、腫瘍または癌関連構造を特異的に標的とする抗体を、癌細胞全般に対して（例えば、ＮＫＧ２Ｄを介する）高い親和性を有するか、あるいは特定の癌、腫瘍または特定の癌に関連する構造に対して高い親和性を有する数用量のＮＫ細胞プラットフォームと共投与することによる特定の癌に対する治療を企図する。このような治療は、癌の腫瘍サイズ減少または腫瘍再発の予防をさらに増強するため、低用量のメトロノミックレジメンで投与する化学療法薬をさらに含み得る。
【００２７】
本発明の主題の化学療法薬を長期間にわたって（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間またはそれ以上にわたって）投与してよく、したがって、投与を２〜１０回もしくは５〜１５回またはそれ以上実施してよい。最も典型的には、化学療法薬の投与を少なくとも１日または２日（いくつかの場合には、それより長く）隔てる。化学療法薬の投与の回数／間隔に関係なく、化学療法薬を低用量で投与するのが好ましい。特に好ましい低用量は、薬物を単独で投与する場合の最大認可用量の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下である。低用量化学療法により免疫系の細胞に対する有害作用が軽減され、このため癌関連抗原に対する患者の免疫反応が温存されるものと考えられる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の主題の癌治療剤は化学療法薬である。本発明の主題を限定するわけではないが、一般に、化学療法薬は抗微小管剤、最も好ましくはパクリタキセル（ｎａｎｔ−パクリタキセル、アブラキサン（登録商標）などのようにタンパク質、例えばアルブミンナノ粒子と結合させたものであり得る）であるのが好ましい。ただし、その他の薬物も適切であると考えられることが理解されるべきであり、好ましい化学療法薬としては、サリドマイド、アスパラギナーゼ、ベバシズマブ、５‐フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、ストレプトゾシン、６−メルカプトプリン、シクロホスファミドおよび様々な抗代謝産物（例えば、ゲムシタビンなど）、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、スニチニブなどの受容体タンパク質−チロシンキナーゼ阻害剤など）、細胞傷害性抗体、白金系薬物（例えば、シスプラチンなど）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブなど）、抗生物質（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、エピルビシンなど）およびエピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドなど）などが挙げられる。ただし、最も典型的には、これらの薬物をメトロノミック低用量レジメン（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ．２０１４；４０（８）：９４２−９５０を参照されたい）で投与するのが好ましい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、化学療法薬はキメラ担体タンパク質コンジュゲート、特にキメラアルブミン薬物コンジュゲートと結合している。最も好ましくは、キメラ担体タンパク質は、１つまたは複数のＦｃ結合ドメインを有するよう遺伝子操作されたアルブミンであり、ここでは、アルブミンはさらに化学療法薬と結合している。企図される組成物は一般構造
Ｔ−ｘ−Ａ−ｙ−Ｄ
を有し、式中、Ｔは標的化部分であり、ｘは標的化部分とアルブミンまたはその他の担体タンパク質Ａとの結合様式であり、化学療法薬Ｄは、結合様式ｙを介してアルブミンまたはその他の担体タンパク質と結合している。最も好ましい態様では、標的化部分は抗体または抗体誘導体であり、ｘはＦｃ結合タンパク質であり、Ａはヒト血清アルブミンであり、Ｄは、適切な方法、特に非共有結合でアルブミンと結合したタキソール誘導体（例えば、パクリタキセル）である。
【００３０】
企図される化学療法薬の組成物は、キメラ担体タンパク質を作製する必要を省き、標的化部分および治療薬と担体タンパク質との直接的または間接的な非共有結合に依存するものであってもよい。このような化合物は一般構造
Ｔ−ｎ１−Ａ−ｎ２−Ｄ
を有し、式中、Ｔは標的化部分であり、ｎ１は標的化部分とアルブミンまたはその他の担体タンパク質Ａとの非共有結合様式であり、化学療法薬Ｄは、非共有結合様式ｎ２を介してアルブミンまたはその他の担体タンパク質と結合している。最も好ましい態様では、標的化部分は抗体または抗体誘導体であり、ｎ１およびｎ２は疎水性相互作用であり、Ａはヒト血清アルブミンであり、Ｄはアルブミンと結合したタキソール誘導体（例えば、パクリタキセル）、特にタキソール誘導体（例えば、パクリタキセル）である。
【００３１】
具体的な化学療法薬および担体タンパク質によっては、結合方法が大幅に異なり得ることが理解されるべきであり、担体タンパク質と薬物との間の適切な結合としては、非共有結合、共有結合および遺伝子融合が挙げられる。例えば、担体タンパク質がアルブミンである場合、薬物との疎水性相互作用および／または非共有結合相互作用を用い得る。一方、１つまたは複数の特定の化学反応を介して、典型的には、アルブミン上の遊離リジンとの結合を用いること、またはアルブミンのＣｙｓ３４とのマレイミド結合またはＤＡＣ結合を介することなどにより、薬物を担体と結合させてもよい。したがって、異なる観点からみると、親水性薬物はアルブミンと共有結合させてよく、疎水性薬物は疎水性相互作用により結合させてよい。
【００３２】
本発明の主題のいくつかの方法および組成物は、癌治療剤として抗体を含む。一般に、このような抗体は、特定の癌、腫瘍または癌に関連する細胞内構造もしくは細胞外構造に対する結合特異性を有するのが好ましい。特に好ましい実施形態は、乳癌腫瘍、より具体的にはＨＥＲ２陽性乳癌腫瘍に対する特異的結合親和性を有する抗体（例えば、トラスツズマブ）を含む。ただし、本発明の主題はその他のまたは追加の癌関連抗体（例えば、アレムツズマブ、アバゴボマブ、アビツズマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツマブラブタンシン、アポリズマブ、アスクリンバクマブ、アテゾリズマブ、バビツキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ブロンチクツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダラツムマブ、エドレコロマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブイブリツモマブチウキセタン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブべドチン、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、ラベツズマブ、ニボルマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、タカツズマブテトラキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブエムタンシン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブなど）の使用を企図することが理解されるべきである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ある用量の活性化ＮＫ細胞を投与する前に抗体を患者に投与する。少なくとも活性化ＮＫ細胞（例えば、ＮＫ９２、ａＮＫ、ｔａＮＫ、ｈａＮＫまたはその組合せ）を投与する３時間前に数用量の抗体を患者に送達するのが好ましいが、抗体をＮＫ細胞治療の４時間以上、５時間以上、６時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上または３２時間以上前に送達することが企図される。さらに、抗体およびＮＫ細胞を投与する連続法またはバッチ法が企図される。抗体に代えて、またはこれに加えて、その他の癌治療剤（例えば、化学療法剤）を投与し得る。
【００３４】
実施例１
本発明者らは、ＨＥＲ２陽性乳癌のマウスモデルを用いてＨＥＲ２．ｔａＮＫとメトロノミックＮａｎｔ−パクリタキセル（アブラキサン）の併用の効果を明らかにする１つの例示的治療法で、既に記載されている（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５；２３（２）：３３０−３３８）ようにＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞を使用した。雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（７〜８週齢）の左右側腹部にＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（１ｍＬ当たり１×１０８個の細胞を含む５０％マトリゲル０．１ｍＬ）をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したとき、マウスを１グループあたり４匹のマウスからなる４のグループに無作為に割り付け、生理食塩水、ｎａｎｔ−パクリタキセル、γ線照射（１０Ｇｙ）ａＮＫ細胞／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞またはｎａｎｔ−パクリタキセルとγ線照射（１０Ｇｙ）ａＮＫ細胞／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞（細胞が増殖しないよう細胞にγ線を照射した）を（ｉ．ｖ．）投与した。投与前に週２回、その後週２回、カリパスで腫瘍成長を測定し、細胞を注射する前、投与前、その後週２回、マウスの体重を測定した。データはいずれも平均±ＳＥＭで表し、ＡＮＯＶＡおよびスチューデントのｔ検定を用いて統計解析を実施した。
【００３５】
図１に、記載の治療法の４種類の異なる治療プロトコルを模式的に示す。生理食塩水（１０ｍＬ／ｋｇ）およびｎａｎｔ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を第１日、第３日、第５日、第８日、第１０日、第１２日、第１５日、第１７日、第１９日、第２３日、第２５日および第２７日に投与し、ａＮＫ細胞を第２日に投与し、ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞を第４日および第６日に投与した。図２Ａおよび２Ｂから容易にわかるように、腫瘍体積は、生理食塩水注射では増大し、ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞およびｎａｎｔ−パクリタキセルを個別に用いると中程度に抑制された。予想外にも、ａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞とｎａｎｔ−パクリタキセルの併用治療では、全実験期間を通じて腫瘍体積の有意で持続的な減少がみられたが、体重は中程度かつ一時的にＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞およびａＮＫ細胞による影響を受けた。図２Ｃの表には、第３２日の腫瘍成長阻害で表した変化が示されており、併用治療プロトコルを用いて癌成長が実質的に減少したことがわかる。
【００３６】
ＨＥＲ２陽性乳癌のマウスモデルではｎａｎｔ−パクリタキセル単独およびａＮＫ細胞／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞単独で腫瘍成長が有意に阻害されたが、ｎａｎｔ−パクリタキセルとａＮＫ細胞／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞の併用は相乗的なものであり、有意な腫瘍退縮および各薬剤単独よりも有意に優れた効果をもたらすように思われたことが理解されるべきである。注目すべきことに、この実験では初期にＨＥＲ２．ｔａＮＫ細胞を投与したのはわずか２回であったが、それでも腫瘍成長に持続的な影響を及ぼした。この一連の実験で明らかになった低用量パクリタキセルとＮＫ細胞ベースの免疫療法との間の相乗効果の機序として有力なのは、パクリタキセルが腫瘍の免疫促進を誘導して、腫瘍標的化ＮＫ−９２プラットフォームによる抗原カスケードを介した認識および殺作用を増大させたということである。したがって、結果から、メトロノミック（低用量）化学療法とＮＫベースの免疫療法の併用が転移性乳癌およびその他の癌の患者を対象とする臨床試験に有望であることがわかる。
【００３７】
したがって、企図される治療は、特定の癌または癌関連構造を標的とし、低用量の癌治療薬（例えば、化学療法薬）とメトロノミックな方法で共投与する、細胞ベースの組成物を含み得る。このような治療は、患者に対する癌治療剤の悪影響を最小限に抑えて腫瘍サイズの有意な減少（または癌再発の予防）をもたらすという点で有利である。
【００３８】
図３Ａおよび３Ｂに、上記のものとほぼ同じ９０日間の治療プロトコルおよび観察期間を示す。図３Ａにおいて、別個のａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ治療レジメンおよびＮａｎｔ−パクリタキセル治療レジメンでは初期（最初の３０日）に腫瘍体積が減少したものの、第３０日の印以降、腫瘍が成長し続けたことに注目するべきである。両治療レジメンとも、ＨＥＲ２陽性乳癌のマウスモデルに長期的または持続的な腫瘍減少をもたらすことはできなかった。最も注目すべきことは、両治療レジメンでは腫瘍体積が治療開始時の腫瘍体積（すなわち、１００ｍｍ３）を上回ったということである。実際、第９０日の印に近づくと、ａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ治療レジメンおよびＮａｎｔ−パクリタキセル治療レジメンの腫瘍体積はそれぞれ約４００ｍｍ３および約２００ｍｍ３になった。
【００３９】
特に注目すべきなのは、ＨＥＲ２陽性乳癌のマウスモデルにおいて、ａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫとＮａｎｔ−パクリタキセルの併用治療レジメンにより腫瘍体積の予想外の相乗的減少がもたらされたのみならず、予想外にも長期的かつ持続的な腫瘍減少ももたらされたことである。実際、別個のａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫ治療レジメンおよびＮａｎｔ−パクリタキセル治療レジメンでは、早くもそれぞれ第２０日および第４０日には腫瘍成長を防ぐことができなくなったが、ａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫとＮａｎｔ−パクリタキセルの併用治療レジメンでは、９０日の観察期間にわたって腫瘍サイズ減少および有意な腫瘍成長の防止の両方に成功を収めた。このような結果から、ａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫとＮａｎｔ−パクリタキセルの併用治療レジメンは、腫瘍サイズを短期間（３０日）にわたって相乗的に減少させるのに効果的であるのみならず、ＨＥＲ２陽性乳癌に対する免疫反応を増強する、あるいは最大９０日間にわたって新たな腫瘍成長を防止するという点でも有利であることが示唆される。このような証拠は本発明の主題の治療が癌再発の予防に有意に効果的であることを示しているのは特に注目すべきことである。
【００４０】
さらに、図３Ｂに示されるように、９０日の観察期間では、ａＮＫ／ＨＥＲ２．ｔａＮＫとＮａｎｔ−パクリタキセルの併用治療レジメンの初期（最初の１０日間）の体重減少が短期間で回復し治療前の体重を上回っており、このことは、併用治療の見かけの毒性作用が短期間のものである、あるいは患者がこの治療レジメンの負の生物学的作用に順応することを示唆している。
【００４１】
実施例２
本発明者らは、ＨＥＲ２陽性乳癌のマウスモデルを用いてｈａＮＫ細胞とトラスツズマブの併用の効果を明らかにする第二の例示的治療法で、既に記載されているｈａＮＫ細胞を使用した。ｈａＮＫ細胞は、親ａＮＫ細胞系にＣＤ１６の（１５８位にバリンを有する）高親和性Ｖバリアントおよび外因性ＩＬ−２の不在下でｈａＮＫ細胞を増殖させる細胞内保持ＩＬ−２を含むバイシストロニックプラスミドベクターをトランスフェクトすることにより開発されたものである。プラスミドには、形質転換特性が一切ないヒト起源のＣＤ１６およびＩＬ−２の配列がいくつか含まれていた。
【００４２】
雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕ１１（ＮＳＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）マウス（７〜８週齢）の左右側腹部にＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（１ｍＬ当たり１×１０８個の細胞を含む５０％マトリゲル０．１ｍＬ）を皮下注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したとき、図４Ａに示されるように、マウスを１グループあたり４匹のマウスからなる１０のグループの１つに無作為に割り付け、尾静脈に生理食塩水（ＰＢＳ）、ＩｇＧ１（用量１ｇｍ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ（用量１ｇｍ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）、既に記載したｈａＮＫ細胞（１×１０７個）、ＩｇＧ１とｈａＮＫ細胞の併用治療（用量１ｇｍ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１）およびトラスツズマブとｈａＮＫ細胞の併用治療（用量１ｇｍ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ）を静脈内投与した。図４Ｆに示されるように、ＩｇＧ１およびトラスツズマブの対照群には投与を週１回、４週間実施し、生理食塩水、ｈａＮＫ細胞およびＩｇＧ１／トラスツズマブとｈａＮＫ細胞の併用治療レジメント抗体は週１回、４週間投与し、ｈａＮＫ細胞は週２回、４週間投与した。併用治療では、ｈａＮＫ細胞を注射する少なくとも３時間前、マウスに抗体投与を実施した。
【００４３】
図４Ｂ〜４Ｆに記録されているように、腫瘍成長およびマウスの重量を週２回測定した。図４Ｆ（Ｐ値）に報告されるように、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニ検定を用いて、グループ間の腫瘍体積または体重変化の差に関する統計解析を評価した。データはいずれもＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５を用いて解析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。図４Ｆに報告されているＴ／Ｃ（％）とはΔΤ／ΔＡＣ×１００のことであり、式中、ΔΤおよびΔＣは、それぞれ治療群および対照群の第２９日から測定初日までの平均腫瘍体積の変化である。ＭＷＬは、観察した治療サイクルでのマウスの体重減少の最大値である。
【００４４】
図４Ｂおよび４Ｃには、対照群および用量１ｍｇ／ｋｇの抗体群（図４Ａのグループ１〜６）で記録された腫瘍サイズおよび体重変化の結果が示されている。生理食塩水治療およびＩｇＧ１治療ではそれぞれ腫瘍サイズの正味の増大がみられ、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ｈａＮＫ細胞およびＩｇＧ１とｈａＮＫ細胞の併用治療では腫瘍サイズの正味の減少がみられたことに注目するべきである。ｈａＮＫ細胞治療では、トラスツズマブによる有意な治療（Ｔ／Ｃ値は１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇがそれぞれ−３４．５％および−９５．２％）と同じように、腫瘍成長が有意に阻害された（Ｔ／Ｃ値−２０．３％）。
【００４５】
特に注目すべきなのは、トラスツズマブ（１ｍｇ／ｋｇ）とｈａＮＫ細胞の併用治療で驚くべきことに腫瘍サイズの相乗的で有意な減少（図４ＦではＴ／Ｃ値−６０．１％）がみられたことである。別個のトラスツズマブレジメンおよびｈａＮＫ細胞レジメンそれぞれの腫瘍サイズの減少と、トラスツズマブとｈａＮＫ細胞の併用レジメンの腫瘍サイズの相乗的減少との間の有意差は、ｈａＮＫ細胞と併用した１ｍｇ／ｋｇ未満のトラスツズマブの投与レジメンにより、ＨＥＲ２陽性乳癌モデルの腫瘍サイズを相乗的に減少させることができた（例えば、１ｋｇ当たり０．９ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下、０．７ｍｇ以下、０．６ｍｇ以下、０．５ｍｇ以下、０．４ｍｇ以下、０．３ｍｇ以下、０．２ｍｇ以下または０．１ｍｇ以下）ことを示唆している。
【００４６】
図４Ｄおよび４Ｅには、対照群および用量３ｍｇ／ｋｇの抗体群（図４Ａのグループ１、４、７〜１０）で記録された腫瘍サイズおよび体重変化の結果が示されている。ＩｇＧ１  ３ｍｇ／ｋｇとｈａＮＫ細胞による治療では予想外にも、腫瘍サイズの減少がＩｇＧ１  １ｍｇ／ｋｇとｈａＮＫ細胞による治療の２倍を上回った（Ｔ／Ｃ値はそれぞれ−２６．４と−１０．７％；図４Ｆ）ことに注目するべきである。このことは、一般に抗体の濃度が増大するとＨＥＲ２陽性乳癌に対するｈａＮＫ細胞の抗腫瘍活性が増強され得ることを示唆している。
【００４７】
また、トラスツズマブ３ｍｇ／ｋｇによる治療単独とトラスツズマブ３ｍｇ／ｋｇとｈａＮＫ細胞の併用治療とでほぼ同じ腫瘍減少がみられたことにも注目するべきである。このことは、このような高用量のトラスツズマブによりトラスツズマブとｈａＮＫ細胞の併用治療の相乗作用がマスクされることを示唆している。したがって、トラスツズマブとｈａＮＫ細胞の併用治療では、これより低い用量のトラスツズマブ（例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇなど）の方がＨＥＲ２陽性乳癌の腫瘍減少に対する効果が高いものと思われる。
【００４８】
さらに、１用量当たり１×１０７個のｈａＮＫ細胞を含む治療ではいずれも体重の変動および正味の減少がみられたことは、これより低い用量のｈａＮＫ細胞（例えば、５×１０６、１×１０６、５×１０５、１×１０５、５×１０４、１×１０４など）の方が、投与の患者に対する毒性作用の可能性を低下させる効果が高く、トラスツズマブとｈａＮＫ細胞の併用治療により得られる腫瘍サイズの相乗的減少が増大する可能性があることを示唆している。ただし、ｈａＮＫ細胞または併用治療により観察された体重減少は有意であると見なされたことに留意するべきである。
【００４９】
さらに、パラフィンに包埋した腫瘍を１：１００の切断カスパーゼ３ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、カタログ番号９５７９）で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。図５Ａ〜５Ｄに示されるように、このような染色から、トラスツズマブ（ｌｍｇ／ｋｇ）とｈａＮＫ細胞の併用治療では生理食塩水対照およびいずれかの薬剤単独と比較してカスパーゼ３活性が増大することがわかった。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および特許請求するのに使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数値が、「約」という用語によって修飾される場合もあることが理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告される有効数字を考慮し、丸め法を適用することにより解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を記載する数値範囲および数値パラメータは近似値であるものの、具体例に記載される数値は実施可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定値にみられる標準偏差から必然的に生じるわずかな誤差を含み得る。
【００５１】
本明細書の記載およびのちの請求項全体で使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味には、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象が含まれる。また、本明細書の記載で使用される「ｉｎ」の意味には、文脈上そうでないことが明らかでない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」が含まれる。
【００５２】
当業者には、本明細書の本発明の概念を逸脱することなく、既に記載したもの以外にも多数のさらなる改変が可能であることが明らかなはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて制限されるべきではない。さらに、明細書および請求項の解釈にあたっては、いずれの用語も文脈と矛盾しない最も広い範囲で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、構成要素または段階に非排他的に言及するものであり、言及される要素、構成要素または段階が、明示的に言及されていない他の要素、構成要素または段階とともに存在しても、使用されても、または組み合わさってもよいことを示していると解釈されるべきである。本明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群より選択されるもののうち少なくとも１つを指す場合、その文章は、グループのＡとＮまたはＢとＮなどではなく１つの要素のみを必要とするものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【国際調査報告】
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