(57)【要約】  本開示は、ヒトＴ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）に結合する単離モノクローナル抗体に関する。該抗体は、そのＣＤＲ配列によって特徴づけられる。ヒト化及び二重特異性抗ＴＩＧＩＴ抗体も開示されている。選択された及び特許請求の範囲の抗体は、エフェクター細胞の優れた死滅活性を示し、ＴＩＧＩＴに高い親和性を示すので、ＴＩＧＩＴ受容体の阻害効果を防止し、したがって、抗癌剤としての使用に適する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）に結合する単離モノクローナル抗体、又は少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片であって、前記単離抗体又は抗体断片は、
（ｉ）配列番号７に記載の重鎖可変領域の３つの重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列番号８に記載の軽鎖可変領域の３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲを含む単離抗体若しくは抗体断片、又は前記抗体若しくは断片配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体又は誘導体；並びに
（ｉｉ）配列番号１８に記載の重鎖可変領域の３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１９に記載の軽鎖可変領域の３つの軽鎖ＣＤＲを含む単離抗体若しくは抗体断片、又は前記抗体若しくは断片配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体又は誘導体
からなる群から選択される単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２】
前記ＨＣ ＣＤＲ１が配列ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項３】
前記ＨＣ ＣＤＲ２が配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項４】
ＨＣ ＣＤＲ３が配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項５】
ＨＣ ＣＤＲ１が配列ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を含み、ＨＣ ＣＤＲ２が配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を含み、ＨＣ ＣＤＲ３が配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項６】
ＬＣ ＣＤＲ１が配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項７】
ＬＣ ＣＤＲ２が配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項８】
ＬＣ ＣＤＲ３が配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項９】
ＬＣ ＣＤＲ１が配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を含み、ＬＣ ＣＤＲ２が配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を含み、ＬＣ ＣＤＲ３が配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
ＨＣ ＣＤＲ１が配列ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を含み、ＨＣ ＣＤＲ２が配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を含み、ＨＣ ＣＤＲ３が配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を含み、ＬＣ ＣＤＲ１が配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を含み、ＬＣ ＣＤＲ２が配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を含み、かつＬＣ ＣＤＲ３が配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
配列番号７の重鎖可変領域、又は前記重鎖可変領域配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１２】
配列番号８の軽鎖可変領域、又は前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１３】
重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号７を含み、前記軽鎖が配列番号８を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体軽鎖又は重鎖と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１３に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片の変異体。
【請求項１５】
前記抗体が１０−９Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体又は抗体断片が、アミノ酸配列配列番号７を含む重鎖及びアミノ酸配列配列番号８を含む軽鎖を有するモノクローナルマウス抗体が結合するヒトＴＩＧＩＴタンパク質内のエピトープに結合する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１７】
ＨＣ ＣＤＲ１が配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１８】
ＨＣ ＣＤＲ２が配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を含む、請求項１７に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項１９】
ＨＣ ＣＤＲ３が配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を含む、請求項１７又は１８のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２０】
ＨＣ ＣＤＲ１が配列：ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を含み、ＨＣ ＣＤＲ２が配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を含み、ＨＣ ＣＤＲ３が配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２１】
ＬＣ ＣＤＲ１が配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２２】
ＬＣ ＣＤＲ２が配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２３】
ＬＣ ＣＤＲ３が配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２４】
ＬＣ ＣＤＲ１が配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を含み、ＬＣ ＣＤＲ２が配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を含み、ＬＣ ＣＤＲ３が配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２５】
ＨＣ ＣＤＲ１が配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を含み、ＨＣ ＣＤＲ２が配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を含み、ＨＣ ＣＤＲ３が配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を含み、ＬＣ ＣＤＲ１が配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を含み、ＬＣ ＣＤＲ２が配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を含み、ＬＣ ＣＤＲ３が配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を含む、請求項１７から２４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２６】
配列番号１８の重鎖可変領域、又は前記重鎖可変領域配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む、請求項１、及び１７〜２５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２７】
配列番号１９の軽鎖可変領域、又は前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む、請求項１、及び１７〜２６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２８】
重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１８を含み、前記軽鎖が配列番号１９を含む、請求項１、及び１７〜２７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項２９】
前記抗体軽鎖又は重鎖と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２８に記載の単離モノクローナル抗体又は抗体断片の変異体。
【請求項３０】
前記抗体又は抗体断片が、アミノ酸配列配列番号１８を含む重鎖及びアミノ酸配列配列番号１９を含む軽鎖を有するモノクローナルマウス抗体が結合するヒトＴＩＧＩＴタンパク質内のエピトープに結合する、請求項１、及び１７〜２９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗体断片。
【請求項３１】
前記抗体が、二重特異性抗体、ヒト化抗体、抗体コンジュゲート、又は少なくとも抗体結合部分を含む断片からなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３２】
前記二重特異性抗体が二組のＣＤＲ配列を含み、一組が、配列ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＨＣ ＣＤＲ１、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有するＨＣ ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有するＨＣ ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有するＬＣ ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有するＬＣ ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有するＬＣ ＣＤＲ３を含み、第２組が、配列：ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有するＨＣ ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥ ＫＦＫＮ（配列番号１３）を有するＨＣ ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有するＨＣ ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有するＬＣ ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有するＬＣ  ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有するＬＣ ＣＤＲ３を含む、請求項３１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３３】
ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２）、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドへのＴＩＧＩＴの結合を阻害することができる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３４】
配列番号９に記載のモノクローナル抗体重鎖可変領域の配列を含むポリヌクレオチド配列、又は配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体。
【請求項３５】
配列番号１０に記載のモノクローナル抗体軽鎖可変領域の配列を含むポリヌクレオチド配列、又は配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体。
【請求項３６】
請求項３４及び３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むハイブリドーマ細胞。
【請求項３７】
配列番号２０に記載のモノクローナル抗体重鎖可変領域の配列を含むポリヌクレオチド配列、又は配列番号２０と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体。
【請求項３８】
配列番号２１に記載のモノクローナル抗体軽鎖可変領域の配列を含むポリヌクレオチド配列、又は配列番号２１と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体。
【請求項３９】
請求項３７及び３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むハイブリドーマ細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を生成することができるハイブリドーマ細胞。
【請求項４１】
細胞傷害性部分、放射性部分、又は識別可能な部分に付着した、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４２】
有効成分として、請求項１〜３３又は４１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離抗体又はその断片、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、塩又は担体を含む医薬組成物。
【請求項４３】
ＮＫ細胞へのＴＩＧＩＴリガンドの結合を阻害することによってＮＫ細胞毒性の回復に使用するための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
癌の治療に使用するための、請求項４２の医薬組成物。
【請求項４５】
癌を治療する方法であって、請求項４２に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項４６】
さらに手術、化学療法、放射線療法、及び免疫療法から選択される追加の抗癌療法を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
追加の免疫調節因子、活性化リンパ球細胞、キナーゼ阻害剤、化学療法剤又は任意の他の抗癌剤を、前記対象に投与することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記追加の免疫調節因子が免疫チェックポイント分子に対する抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも呼ばれる）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗癌剤が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（登録商標））、及びネシツムマブ（ポルトラッザ（登録商標））からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌が、肺癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頚癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄癌、卵巣癌、子宮癌、肉腫、胆管癌、非小細胞肺癌及び子宮内膜細胞癌からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌が、黒色腫、乳癌、非小細胞肺癌及び結腸癌及び肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ（肝臓（ｌｉｖｅｒ））癌からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌が白血病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
ＴＩＧＩＴの発現を測定又は定量する方法であって、請求項１〜３３又は４１のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片と生体試料を接触させること、及び複合体形成のレベルを測定することを含む、方法。
【請求項５６】
ｉ．ＴＩＧＩＴに特異的な抗体又は少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片と試料をインキュベートする工程；
ｉｉ．検出可能なプローブを用いて結合したＴＩＧＩＴを検出する工程；
ｉｉｉ．既知量のＴＩＧＩＴを含有する参照試料から得られた標準曲線と（ｉｉ）の量とを比較する工程；
ｉｖ．標準曲線から試料中の前記ＴＩＧＩＴの量を計算する工程、
を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
生体試料中のＴＩＧＩＴの発現を測定するためのキットであって、請求項１〜３３又は４１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含むキット。
【請求項５８】
（ｉ）配列ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＨＣＣＤＲ１、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有するＨＣＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有するＨＣＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有するＬＣＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有するＬＣＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有するＬＣＣＤＲ３を含む第１の抗体又はその変異体若しくは断片；
（ｉｉ）配列：ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有するＨＣＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有するＨＣＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有するＨＣＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有するＬＣＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有するＬＣＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有するＬＣＣＤＲ３を含む第２の抗体又はその変異体若しくは断片；
（ｉｉｉ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、塩又は担体
を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野に属し、タンパク質ヒトＴＩＧＩＴに結合するモノクローナル抗体及びその断片、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列及びこれらの抗体を生成するハイブリドーマ細胞に関する。本発明はさらに、これらの抗体を含む治療用及び診断用組成物並びにこれらのモノクローナル抗体を用いる疾患、特に癌の治療及び診断の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法は、例えば、腫瘍細胞上の抗原に特異的な抗体での治療、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と融合した癌細胞での治療、又は抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化により、抗腫瘍免疫応答を生じさせ、増強するために利用される。
【０００３】
先天性免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍の免疫監視において重要な役割を果たしている（Ｓｍｙｔｈら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１．Ａｐｒ；２（４）：２９３−９）。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ欠損細胞、腫瘍、ウイルス、寄生虫及び細菌を直接的並びに間接的に死滅させる。ＮＫ細胞活性は、抑制性活性化ＮＫ細胞受容体によって送達されるシグナルのバランスによって制御される。ストレス誘発性の自己分子、ウイルス構成成分又は腫瘍タンパク質であり得る様々なリガンドを認識する活性化ＮＫ細胞受容体がいくつか存在する（Ｋｏｃｈら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１３，３４，１８２−１９１．；Ｓｅｉｄｅｌら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２）。しかし、一部には、いくつかの活性化ＮＫ細胞受容体の腫瘍リガンドが未知であるため、ＮＫ細胞が腫瘍を認識して、活性化受容体を介して腫瘍を排除する正確なメカニズムは、十分に理解されていない。対照的に、抑制性ＮＫ細胞受容体が認識するリガンドのアイデンティティーは、明確に定義されている。ＮＫ細胞は、抑制性受容体の膨大なレパートリーを発現する（Ｇａｒｄｉｎｅｒ Ｃ．Ｍ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００８，３５，１−８．；Ｇｏｎｅｎ−Ｇｒｏｓｓら，Ｐｌｏｓ ｏｎｅ ２０１０，５，ｅ８９４１；Ｌａｎｋｒｙら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０，６１２，２４９−２７３；）。これらの抑制性受容体の大部分は、ＫＩＲ（キラー抑制性受容体）ファミリーに属し、古典的及び非古典的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質の両方を認識する。ＫＩＲは、確率的にＮＫ細胞表面上で発現し、したがって、所与の個体におけるＮＫ細胞は選択されたＫＩＲを発現する。ＮＫ細胞はまた、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ３００ａ及びＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）などのＭＨＣクラスＩタンパク質を認識しないさらなる抑制性受容体を発現する。
【０００４】
ヒトＴＩＧＩＴタンパク質は、全てのＮＫ細胞上、並びにＴ調節（Ｔｒｅｇ）ＣＤ８＋細胞及び腫瘍浸潤リンパ球などの他の免疫細胞上で発現する（Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙら，ＰＮＡＳ．２００９，１０６，１７８５８−１７８６３）。ヒトＴＩＧＩＴタンパク質は、正常な上皮上で発現するだけでなく、様々な腫瘍細胞上で過剰発現する２つの非常に明確に定義されたリガンド：ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、ＣＤ１５５）及びネクチン２（ＰＶＲＬ２／ＣＤ１１２）を認識する。これらのリガンドの認識は、ＴＩＧＩＴの細胞質尾部に存在する２つのモチーフ：免疫受容体テールチロシン（ＩＴＴ）様モチーフ及び免疫優性チロシンベースの抑制性（ＩＴＩＭ）モチーフによって媒介される抑制性シグナルの送達につながる（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０１３．，２０，４５６−４６４；Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３．４３，２１３８−２１５０）。ＴＩＧＩＴは、そのＩＴＩＭドメインを介して、腫瘍細胞の免疫回避機構につながるＮＫ細胞毒性を阻害する。
【０００５】
ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴ発現はまた、嫌気性グラム陰性細菌フゾバクテリウムヌクレアタム（Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のＦａｐ２タンパク質に結合する受容体として機能する。Ｆ．ヌクレアタムとＴＩＧＩＴとの相互作用は、ＮＫ細胞毒性活性の低下につながる。フソバクテリウム門は、多くの場合、腸の炎症及び癌を有する患者において豊富である。Ｆ．ヌクレアタムがＴＩＧＩＴに結合すると、ＮＫ関連細胞毒性からの腫瘍の回避が促進されることが示唆され（Ｇｕｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １７；４２（２）：３４４−３５５）、腫瘍内に見出される細菌、特にＦ．ヌクレアタムが、腫瘍の増殖を促進し、腫瘍の進行を増強する方法の説明を提供する（Ｊｏｂｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１３；３：３８４−３８７；Ｓｅａｒｓ ａｎｄ Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１４；１５：３１７−３２８）。
【０００６】
最近、黒色腫患者において、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−１が腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を損傷させることが示された（Ｃｈａｕｖｉｎら．Ｊ  Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（５）：２０４６−２０５８）。加えて、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によるＴＩＧＩＴ発現は、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮癌及び腎臓癌を含む、いくつかのマウス及びヒトの固形腫瘍において遺伝子発現分析を使用して報告された。ＴＩＧＩＴ発現の上昇は、ＣＤ８及びＰＤ−１の発現と相関するように考えられる。ＣＤ８＋ＴＩＬ上でのＴＩＧＩＴ発現は、非小細胞肺癌及び結腸癌を含むマウス腫瘍及び３つのヒト腫瘍試料において観察された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＲＪ，ら．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１４；２６（６）：９２３−９３７）。
【０００７】
ＴＩＧＩＴは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において機能性Ｔ細胞の機能障害に寄与し、臨床転帰の不良と関連することが示唆された。最近、Ｋｏｎｇらによって発表された研究（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；  ２２（１２）；  ３０５７−６６）から、Ｔ細胞機能及び抗腫瘍免疫を回復させるためのＴＩＧＩＴの遮断が新規の効果的な白血病治療となり得ることが示唆される。
【０００８】
ＷＯ  ２００４／０２４０６８は、実際の抗体を開示してはいないが、後にＴＩＧＩＴとして同定された、自己免疫疾患及び癌の治療のための分子ＰＲＯ５２２５４に対するアゴニスト及びアンタゴニストについて記載している。
【０００９】
ＷＯ ２００６／１２４６６７は、リガンドＰＶＲへのＴＩＧＩＴ結合を遮断するモノクローナル抗体によるタンパク質ｚＢ７Ｒ１（ＴＩＧＩＴ）の調節を開示している。結合親和性は提供されていない。
【００１０】
ＷＯ  ２００９／１２６６８８は、免疫応答の調節のための標的としてＴＩＧＩＴ及びそのリガンドＰＶＲを開示しており、免疫関連疾患及び炎症性疾患の診断並びに治療のためのこれらのタンパク質のアゴニスト並びにアンタゴニストを示唆している。
【００１１】
ＷＯ  ２０１５／００９８５６は、癌及び慢性感染の治療のための、プログラム死１ポリペプチド（ＰＤ−１）アンタゴニストと抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせを開示している。
【００１２】
ＷＯ  ２０１６／０２８６５６は、抗ＴＩＧＩＴ抗体、並びに癌及び感染性疾患などの疾患の治療におけるこれらの抗体の使用を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
単独で、又は他の薬剤と組み合わせて、ヒトＴＩＧＩＴのサプレッサー活性を阻害することによって、免疫系細胞が腫瘍細胞を攻撃するのを可能にするさらなるより効果的で、特異的で、安全かつ／又は安定な薬剤を提供する必要がまだ満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、免疫細胞抑制性受容体「Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン」（ＴＩＧＩＴ）を認識し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞などのリンパ球に対するその抑制活性を阻害する薬剤を提供する。これらの薬剤は、例えば、特有のＣＤＲ配列のセット、ヒトＴＩＧＩＴに対する例外的に高い親和性及び高い特異性を有することを特徴とし、単独療法及び他の抗ＴＩＧＩＴ抗体及び／又は他の抗癌剤との併用において腫瘍免疫回避に対処するための癌免疫療法に有用な抗体及びその断片である。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のいくつかは、例えば、マウスＴＩＧＩＴと比較して、ヒトＴＩＧＩＴに対する絶対特異性、及びヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対する親和性を示し、これは、天然リガンドＰＶＲ（ＣＤ１５５）のヒトＴＩＧＩＴに対する親和性よりも高い。このことは、これらの優れたｍＡｂを癌免疫療法において使用するための貴重な候補にさせ、副作用の少ない低用量の投与を可能にする。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体のいくつかは、その主リガンドＰＶＲ（ＣＤ１５５）へのヒトＴＩＧＩＴの結合を妨害するだけでなく、少なくともある程度、ＣＤ１１２及びＣＤ１１３などの他のリガンドのうちの少なくとも１つへのＴＩＧＩＴの結合を阻害することが可能である。
【００１７】
他の免疫調節タンパク質又は受容体阻害剤などの追加の抗癌剤と組み合わせた場合、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体のいくつかは、相乗効果を有する。非限定的な例として、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる）、及び上皮成長因子受容体阻害剤（ＥＧＦＲ）に特異的なｍＡｂが挙げられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、一態様によれば、少なくとも１０−８Ｍの親和性でヒトＴＩＧＩＴを認識し、少なくとも１つのリガンドとの相互作用を阻害する少なくとも抗原結合部分を含む単離抗体又はその断片を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、該単離抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片である。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又は断片は、ＶＳＩＧ９＃１（又はＶｓｉｇ９．０１）と表されるモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、すなわち、配列番号７に記載の重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列及び配列番号８に記載の軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列を含む。ＣＤＲ配列の決定は、ＫＡＢＡＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＩＭＧＴとして知られる方法を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の任意の方法に従って行うことができる。選択されるＣＤＲのセットは、２種以上の方法によって同定された配列を含み、すなわち、いくつかのＣＤＲ配列は、例えば、ＫＡＢＡＴを用いて決定し、いくつかは、例えば、ＩＭＧＴを用いて決定することができる。
【００２１】
いくつかの特定の実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又は断片は、ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）、及びＴＳＹＧＩＳ（配列番号１１）からなる群から選択される配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＣＤＲ１）配列、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＣＤＲ２）、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＣＤＲ３）、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＣＤＲ１）、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＣＤＲ２）、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＣＤＲ３）、及び超可変領域（ＨＶＲ）配列に５％以下のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含むその類似体を含む。
【００２２】
いくつかの特定の実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又は断片は、配列ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＣＤＲ１）配列、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＣＤＲ２）、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＣＤＲ３）、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＣＤＲ１）、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＣＤＲ２）、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＣＤＲ３）、及び超可変領域（ＨＶＲ）配列に５％以下のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含むその類似体を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又は断片は、配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹＷＧＱＧＴＩＬＴＶＳＳ（配列番号７）を有する重鎖可変領域、又は該重鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体若しくは誘導体を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又は断片は、配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＡＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＩＹＮＡＮＳＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＭＫＩＮＳＭＱＰＥＤＴＡＴＹＦＣＫＱＡＹＤＶＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号８）を有する軽鎖可変領域、又は該軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００２５】
特定の実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又は断片は、配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹＷＧＱＧＴＩＬＴＶＳＳ（配列番号７）を有する重鎖可変領域、及び配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＡＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＩＹＮＡＮＳＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＭＫＩＮＳＭＱＰＥＤＴＡＴＹＦＣＫＱＡＹＤＶＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号８）を有する軽鎖可変領域、又は該軽鎖及び／若しくは重鎖配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００２６】
本発明はまた、ｍＡｂＶＳＩＧ−９＃１が結合するヒトＴＩＧＩＴタンパク質内のエピトープに高い親和性で結合することができる抗体又は抗体断片を包含する。
【００２７】
他の実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体は、＃４（又は２５８−ｃｓ１＃４）と表されるモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、すなわち、配列番号１８に記載の重鎖可変領域に含有される３つのＣＤＲ配列及び配列番号１９に記載の軽鎖可変領域に含有される３つのＣＤＲ配列を含む。
【００２８】
いくつかの特定の実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体は、配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＣＤＲ１）、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＣＤＲ２）、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＣＤＲ３）、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＣＤＲ１）、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＣＤＲ２）、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＣＤＲ３）、及び超可変領域（ＨＶＲ）配列に５％以下のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含むその類似体を含む。
【００２９】
いくつかの特定の実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体は、配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＣＤＲ１）、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＣＤＲ２）、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＣＤＲ３）、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＣＤＲ１）、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＣＤＲ２）、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＣＤＲ３）、並びにその類似体及び誘導体を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又はその断片は、配列：ＱＶＱＬＬＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＩＹＣＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＣＣＡＩＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号１８）を有する重鎖可変領域、又は該重鎖配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体若しくは誘導体を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、該単離モノクローナル抗体又はその断片は、配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＥＲＶＳＬＴＣＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮＷＬＱＱＫＰＤＧＴＩＫＲＬＩＹＡＡＳＴＬＤＳＧＶＰＫＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＳＲＬＥＳＥＤＦＡＤＹＹＣＬＱＹＡＳＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１９）を有する軽鎖可変領域、又は該軽鎖配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体若しくは誘導体を含む。
【００３２】
本発明はまた、ｍＡｂ＃４が結合するヒトＴＩＧＩＴタンパク質内のエピトープに高い親和性で結合することができる抗体又は抗体断片を包含する。
【００３３】
該単離ｍＡｂ抗体の類似体及び誘導体、並びに上記の抗体断片も本発明の範囲内である。特に、配列番号７、８、１８及び１９からなる群から選択される配列に記載の少なくとも１つの可変領域を含む類似体又は単離ｍＡｂ又はその断片も、本発明の範囲内である。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、抗体又は抗体断片の類似体は、参照抗体配列の超可変領域と少なくとも９５％の配列同一性、又は参照抗体の重鎖若しくは軽鎖可変領域と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００３５】
特定の実施形態によれば、単離抗体若しくはその断片の類似体又は誘導体は、参照抗体配列の可変領域と少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００３６】
別の態様によれば、本発明は、軽鎖の３つのＣＤＲ及び重鎖の３つのＣＤＲを含む抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含み、ＴＩＧＩＴを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片を提供し、前記ＣＤＲは、（ｉ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号８の軽鎖可変領域を含むモノクローナルマウス抗体（本明細書ではＶＳＩＧ９＃１若しくはＶｓｉｇ９．０１クローンとして特定されている）；又は（ｉｉ）配列番号１８の重鎖可変領域及び配列番号１９の軽鎖可変領域を含むモノクローナルマウス抗体（本明細書では＃４若しくは２５８−ＣＳ１＃４クローンとして特定されている）のＡＢＤのＣＤＲと少なくとも９０％の配列同一性又は類似性を有する。いくつかの実施形態によれば、該ＣＤＲは、ＶＳＩＧ９＃１又は２５８−ＣＳ１＃４のものと少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％若しくは少なくとも９４％の配列同一性又は類似性を有する。他の実施形態によれば、該ＡＢＤはＶＳＩＧ−９＃１又は２５８−ＣＳ１＃４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性又は類似性を有する。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、本発明による抗体又は抗体断片は、配列番号７に記載の重鎖可変領域又は前記配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む。他の実施形態によれば、本発明による抗体又は抗体断片は、配列番号１８に記載の重鎖可変領域又は前記配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、抗体又は抗体断片は、配列番号８に記載の軽鎖可変領域、又は前記配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む。他の実施形態によれば、抗体又は抗体断片は、配列番号１９に記載の軽鎖可変領域又は前記配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含み、（ｉ）該重鎖は配列番号７を含み、該軽鎖は配列番号８を含むか、又は（ｉｉ）該重鎖は配列番号１８を含み、該軽鎖は配列番号１９を含む。前記重鎖又は軽鎖と少なくとも９５％の配列類似性を有する抗体又は断片の類似体も含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、該類似体は、上記の抗体の軽鎖若しくは重鎖の可変領域と少なくとも９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、該類似体は、超可変領域の１以上のＣＤＲ配列、すなわち、配列番号１〜６及び１２〜１７に記載のＣＤＲ配列のうちのいずれか１つに、１以下のアミノ酸置換、欠失又は付加を含む。いくつかの実施形態によれば、該アミノ酸置換は、保存的置換である。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸が、置換、欠失及び／又は付加された、上記で定義した軽鎖及び重鎖領域を有する超可変領域（ＨＶＲ）を含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、１以下のアミノ酸が置換、欠失又は少なくとも１つのＣＤＲ配列に付加された、配列番号１〜６及び１２〜１７から選択されるＣＤＲ配列のセットを有する超可変領域を含む。いくつかの実施形態によれば、該アミノ酸置換は、保存的置換である。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、Ｔ細胞上で発現したＴＩＧＩＴタンパク質を認識することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、樹状又はＮＫ細胞上で発現したヒトＴＩＧＩＴタンパク質を認識することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）上で発現したヒトＴＩＧＩＴタンパク質を認識することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上で発現したヒトＴＩＧＩＴタンパク質を認識することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、Ｔ細胞上で発現したリガンドへのヒトＴＩＧＩＴ結合を阻害することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、樹状細胞又はＮＫ細胞上で発現したリガンドへのヒトＴＩＧＩＴ結合を阻害することができる。
【００４８】
さらに他の実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、腫瘍細胞上で発現したリガンドへのヒトＴＩＧＩＴ結合を阻害することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２／ネクチン２）、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるリガンドにヒトＴＩＧＩＴが結合するのを阻害することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、該単離抗体又はその断片は、少なくとも約５０ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でヒトＴＩＧＩＴタンパク質に結合する。いくつかの実施形態によれば、該単離抗体又はその断片は、少なくとも１ｎＭの結合親和性でヒトＴＩＧＩＴタンパク質に結合する。したがって、いくつかの実施形態によれば、抗体又は本発明による抗体は、ヒトＴＩＧＩＴに対する少なくとも約５×１０−８Ｍの親和性を有する。他の実施形態によれば、抗体又は抗体断片は、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ又はさらにより高い親和性でヒトＴＩＧＩＴに結合する。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００５１】
特定の実施形態によれば、該ｍＡｂは、非ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体及び抗体の少なくとも抗原結合部分を含む抗体断片からなる群から選択される。特定の実施形態によれば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離ＣＤＲ領域、一本鎖抗体（ｓｃａｂ）、「ダイアボディ」、及び「線状抗体」からなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、該抗体は、２つの異なるエピトープ又は抗原に結合することができる二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片である。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、二重特異性ｍＡｂ又は二重特異性ｍＡｂ断片は、それぞれＣＤＲ配列の異なるセットを含む２つの異なる超可変領域（ＨＶＲ）を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、二重特異性ｍＡｂ又はその断片は、２つの異なる抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合ドメインを含む。これらの実施形態による二重特異性ｍＡｂ又はその断片の各ＨＶＲは、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質の異なるエピトープに結合することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、二重特異性ｍＡｂ又は断片の１つのＨＶＲは、モノクローナル抗体ＶＳＩＧ９＃１の配列番号７に記載の重鎖配列及び配列番号８に記載の軽鎖配列に含有されるＣＤＲを含み、第２のＨＶＲは、モノクローナル抗体＃４（又は２５８−ｃｓ１＃４）の配列番号１８に記載の重鎖配列及び配列番号１９に記載の軽鎖配列に含有されるＣＤＲを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、二重特異性ｍＡｂ又はその断片の１つのＨＶＲは、ＣＤＲ：配列番号１又は配列番号１１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６を含み、第２のＨＶＲは、ＣＤＲ：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７を含む。
【００５７】
他の実施形態によれば、本発明による二重特異性抗体又は二重特異性抗体断片の１つのＨＶＲはヒトＴＩＧＩＴに結合し、第２のＨＶＲは、免疫調節又は腫瘍抗原に関与するタンパク質などの別のタンパク質に結合する。いくつかの特定の実施形態によれば、二重特異性抗体の第２のＨＶＲは、チェックポイント分子に結合する。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、抗体又は抗体断片は、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、及びヒトＩｇＧ４からなる群から選択されるフレームワーク配列を含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００５９】
他の実施形態によれば、該抗体はヒト化抗体であるか、又は該抗体断片はヒト化抗体の断片である。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、ヒト化抗体又は抗体断片は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、及びヒトＩｇＧ４からなる群から選択されるフレームワーク配列を含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００６１】
さらに他の実施形態によれば、ＴＩＧＩＴを認識し、そのリガンドへの結合を阻害する少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含む抗体コンジュゲートを提供し、前記抗体又は抗体断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列：（ｉ）ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）、及びＴＳＹＧＩＳ（配列番号１１）から選択される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３；又は、（ｉｉ）配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態によれば、該コンジュゲートは、担体タンパク質を含む。
【００６３】
ＴＩＧＩＴに高い親和性及び特異性を有するモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列、並びにこれらのポリヌクレオチド配列を担持するベクター及び宿主細胞が、本発明の別の態様に従って提供される。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、該ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号８の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体（本明細書ではＶＳＩＧ９＃１として特定されている）；又は（ｉｉ）配列番号１８の重鎖可変領域及び配列番号１９の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体（本明細書では２５８−ＣＳ１＃４として特定されている）に結合するヒトＴＩＧＩＴタンパク質内のエピトープに結合することができる抗体又は抗体断片又は鎖をコードしている。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号７に記載の配列を含む抗体又は抗体断片又は鎖をコードしている。いくつかの実施形態によれば、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号８に記載の配列を含む抗体又は抗体断片又は鎖をコードしている。
【００６６】
他の実施形態によれば、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号１８に記載の配列を含む抗体又は抗体断片又は鎖をコードしている。追加の実施形態によれば、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号１９に記載の配列を含む抗体又は抗体断片又は鎖をコードしている。
【００６７】
さらにいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチド配列は、６つのＣＤＲ配列：（ｉ）ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）、及びＴＳＹＧＩＳ（配列番号１１）から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３；又は（ｉｉ）配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体又は抗体断片又は鎖をコードしている。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、上記で定義したポリヌクレオチド配列は、少なくとも抗原結合部分を含む抗体又は抗体断片、前記抗体又は抗体断片を含む抗体コンジュゲート、及び二重特異性抗体からなる群から選択される分子をコードする。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、配列番号９に記載のモノクローナル抗体の重鎖可変領域の配列、又はＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＧＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＡＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号９）と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチド配列が提供される。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、配列番号２０に記載のモノクローナル抗体の重鎖可変領域の配列、又はＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＧＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＡＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＡＴＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２０）と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチド配列が提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、配列番号１０に記載のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の配列、又はＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＴＡＣＴＡＣＡＧＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチド配列が提供される。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、配列番号２１に記載のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の配列、又はＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＡＴＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号２１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチド配列が提供される。
【００７３】
本発明は、いくつかの実施形態によれば、上記で開示された少なくとも１つのポリヌクレオチド配列がコードする少なくとも１つの配列を含むポリペプチドを提供する。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、本発明による少なくとも１つの抗体鎖又はその断片をコードする核酸分子を含む核酸構築物を提供する。いくつかの実施形態によれば、該核酸構築物はプラスミドである。
【００７５】
いくつかの実施形態によれば、該プラスミドは、配列番号９又は配列番号２０に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
他の実施形態によれば、該プラスミドは、配列番号１０又は配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
さらに別の態様において、本発明は、特定のＣＤＲ配列並びに／又は上記で定義した特定の重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体又は抗体断片を生成することができるハイブリドーマ細胞を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、上記で開示した少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含むハイブリドーマ細胞が提供される。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、該ハイブリドーマは、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列：（ｉ）ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）及びＴＳＹＧＩＳ（配列番号１１）から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３；又は（ｉｉ）配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体を生成することができる。
【００８０】
本発明による抗体又はその断片は、細胞傷害性部分、放射性部分、又は識別可能な部分に付着することができる。
【００８１】
本発明は、別の態様によれば、高い親和性及び特異性でＴＩＧＩＴを認識し、そのリガンドの１つとの相互作用を阻害する少なくとも１つの抗体、抗体断片又はそのコンジュゲートを有効成分として含み、かつ必要に応じて、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、塩又は担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、（ｉ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号８の軽鎖可変領域を有する抗体（本明細書ではＶＳＩＧ９＃１又はＶｓｉｇ９．０１として特定されている）；及び（ｉｉ）配列番号１８の重鎖可変領域及び配列番号１９の軽鎖可変領域を有する抗体（本明細書では＃４又は２５８−ＣＳ１＃４として特定されている）からなる群から選択されるマウスモノクローナル抗体に結合するヒトＴＩＧＩＴタンパク質内のエピトープに結合することが可能であるモノクローナル抗体又はその断片を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、該モノクローナル抗体又はその抗体断片は、６つのＣＤＲ：（ｉ）ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）、及びＴＳＹＧＩＳ（配列番号１１）から選択される重鎖ＣＤＲ１配列、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３；又は（ｉｉ）配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、配列：（ｉ）ＱＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹＷＧＱＧＴＩＬＴＶＳＳ（配列番号７）；
又は（ｉｉ）ＱＶＱＬＬＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＩＹＣＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＣＣＡＩＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号１８）を有する重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその断片を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、配列：（ｉ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＡＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＩＹＮＡＮＳＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＭＫＩＮＳＭＱＰＥＤＴＡＴＹＦＣＫＱＡＹＤＶＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号８）；
又は（ｉｉ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＥＲＶＳＬＴＣＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮＷＬＱＱＫＰＤＧＴＩＫＲＬＩＹＡＡＳＴＬＤＳＧＶＰＫＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＳＲＬＥＳＥＤＦＡＤＹＹＣＬＱＹＡＳＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１９）を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその断片を含む。
【００８６】
特定の実施形態によれば、該医薬組成物は、配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹＷＧＱＧＴＩＬＴＶＳＳ（配列番号７）を有する重鎖可変領域及び配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＡＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＩＹＮＡＮＳＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＭＫＩＮＳＭＱＰＥＤＴＡＴＹＦＣＫＱＡＹＤＶＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号８）を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその断片を含む。
【００８７】
追加の特定の実施形態によれば、該医薬組成物は、配列：ＱＶＱＬＬＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＩＹＣＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＣＣＡＩＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号１８）を有する重鎖可変領域及び配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＥＲＶＳＬＴＣＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮＷＬＱＱＫＰＤＧＴＩＫＲＬＩＹＡＡＳＴＬＤＳＧＶＰＫＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＳＲＬＥＳＥＤＦＡＤＹＹＣＬＱＹＡＳＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１９）を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその断片を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、２つの異なるＨＶＲ領域を含む少なくとも１つの二重特異性抗体を含み、ＨＶＲの少なくとも１つが、ヒトＴＩＧＩＴに対する高い親和性及び選択性で結合する。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、第２のＨＶＲは、ヒトＴＩＧＩＴ上の別のエピトープ又は異なる抗原に結合する。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、１つのＨＶＲは、ＶＳＩＧ９＃１（又はＶｓｉｇ９．０１）と表される抗体のＣＤＲ配列を含み、第２のＨＶＲは、２５８−ｃｓ１＃４と表される（＃４とも表される）抗体のＣＤＲ配列を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、１つのＨＶＲは、ＶＳＩＧ９＃１と表される抗体の６つのＣＤＲ配列又は２５８−ｃｓ１＃４と表される抗体の６つのＣＤＲを含み、第２のＨＶＲは、ヒトＴＩＧＩＴ又は異なる抗原に結合することができる６つの異なるＣＤＲを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、ヒトＴＩＧＩＴを認識する少なくとも２つの抗体又は抗体断片の組み合わせを含み、該抗体の少なくとも１つは、ヒトＴＩＧＩＴに高い親和性及び選択性を有する。いくつかの実施形態によれば、ヒトＴＩＧＩＴへの高い親和性及び選択性を有する少なくとも１つの抗体又は抗体断片は、ＶＳＩＧ９＃１（又はＶｓｉｇ９．０１）と表される抗体又は２５８−ｃｓ１＃４（＃４とも表される）抗体のＣＤＲ配列を含む。
【００９３】
いくつかの特定の実施形態によれば、１つのモノクローナル抗体又は抗体断片はＶＳＩＧ９＃１と表される抗体のＣＤＲ配列を含み、第２の抗体又は抗体断片は２５８−ｃｓ１＃４（又は＃４）と表される抗体のＣＤＲ配列を含む。
【００９４】
さらに他の実施形態によれば、該組成物は、本発明によると、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する１つのｍＡｂ又は断片、並びに細胞受容体、腫瘍抗原又は免疫調節因子などの異なる抗原に特異的に結合する１つのｍＡｂ又は断片を含む。
【００９５】
ＮＫ細胞へのＴＩＧＩＴリガンドの結合を阻害することによってＮＫ細胞毒性を回復するのに使用するための、本発明による少なくとも１つの抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートを含む医薬組成物も提供される。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、癌免疫療法で又は免疫応答の増強に使用するためのものである。
【００９７】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記で定義したモノクローナル抗体又は抗体断片を使用することによって、少なくとも１つのリガンドへのヒトＴＩＧＩＴの結合を阻害する方法を提供する。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、該抗体又は抗体断片は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２）、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるリガンドにＴＩＧＩＴが結合するのを阻害することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞毒性を回復する方法は、ＮＫ細胞上で発現した少なくとも１つのリガンドへのＴＩＧＩＴの結合を阻害することによるものであって、高い親和性及び特異性でヒトＴＩＧＩＴを認識する少なくとも１つの抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、該抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートは、Ｔ細胞上で発現したリガンドにヒトＴＩＧＩＴが結合するのを阻害することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、該抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートは、樹状細胞又はＮＫ細胞上で発現したリガンドにヒトＴＩＧＩＴが結合するのを阻害することができる。
【０１０２】
さらに他の実施形態によれば、該抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートは、腫瘍細胞上で発現したリガンドにヒトＴＩＧＩＴが結合するのを阻害することができる。
【０１０３】
本発明は、別の態様において、それを必要とする対象における免疫応答を増強する方法であって、治療有効量の上記で定義したモノクローナル抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０４】
さらに別の態様によれば、本発明は、癌を治療する方法であって、高い親和性及び特異性でヒトＴＩＧＩＴを認識し、そのリガンドへの結合を阻害することができる少なくとも１つの抗体、その抗体断片又はコンジュゲートを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１０５】
いくつかの実施形態によれば、該癌は、肺癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頚癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄癌、卵巣癌、子宮癌、肉腫、胆管癌、非小細胞肺癌及び子宮内膜細胞癌からなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、該癌は、黒色腫、乳癌、非小細胞肺癌及び結腸癌及び肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）（肝臓（ｌｉｖｅｒ））癌からなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１０７】
いくつかの具体的な実施形態によれば、該癌は黒色腫である。
【０１０８】
いくつかの実施形態によれば、該癌は固形癌である。いくつかの具体的な実施形態によれば、該固形癌は、黒色腫（皮膚）、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、及び腎臓癌からなる群から選択される。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、該癌は白血病である。いくつかの具体的な実施形態によれば、該癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【０１１０】
いくつかの実施形態によれば、投与される医薬組成物中の抗体は、（ｉ）配列番号７に記載の重鎖可変領域に含有されるＣＤＲ配列及び配列番号８に記載の軽鎖可変領域に含有されるＣＤＲ配列を含むモノクローナル抗体；又は（ｉｉ）配列番号１８に記載の重鎖可変領域に含有されるＣＤＲ配列及び配列番号１９に記載の軽鎖可変領域に含有されるＣＤＲ配列を含むモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【０１１１】
いくつかの特定の実施形態によれば、投与される医薬組成物中のモノクローナル抗体は、配列：ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１１２】
他の具体的な実施形態によれば、投与される医薬組成物中のモノクローナル抗体は、配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、少なくとも１つの追加の抗癌療法を施すか又は実行することを含む。特定の実施形態によれば、追加の抗癌療法は、手術、化学療法、放射線療法、又は免疫療法である。
【０１１４】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、高い親和性及び特異性でヒトＴＩＧＩＴを認識するモノクローナル抗体及び追加の抗癌剤の投与を含む。いくつかの実施形態によれば、追加の抗癌剤は、免疫調節因子、活性化リンパ球細胞、キナーゼ阻害剤及び化学療法剤からなる群から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、追加の免疫調節因子は、ＶＳＩＧ９＃１（又はＶｓｉｇ９．０１）と表されるモノクローナル抗体が結合するヒトＴＩＧＩＴ上の異なるエピトープに結合する抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートである。
【０１１６】
他の実施形態によれば、追加の免疫調節因子は、ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に結合する抗体、抗体断片又は抗体コンジュゲートである。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、追加の免疫調節因子は、免疫チェックポイント分子に対する抗体である。いくつかの実施形態によれば、追加の免疫調節因子は、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも呼ばれる）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体である。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１１８】
いくつかの実施形態によれば、癌の治療方法は、ヒトＴＩＧＩＴを認識する本発明によるモノクローナル抗体及び抗ＰＤ−１抗体を含む医薬組成物の投与を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態によれば、癌の治療方法は、ヒトＴＩＧＩＴを認識する本発明によるモノクローナル抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む医薬組成物の投与を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、癌の治療方法は、少なくとも１つの追加の抗癌剤の投与を含む治療計画の一部として該医薬組成物を投与することを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、該抗癌剤は、アービタックス、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、カルムスチン、ロムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、ダカルバジン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、エトポシド、テニポシド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１２２】
いくつかの実施形態によれば、該抗癌剤は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（登録商標））、及びネシツムマブ（ポルトラッザ（登録商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、該ＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））である。
【０１２３】
したがって、本発明は、ＴＩＧＩＴを認識し、そのリガンドへの結合を阻害する少なくとも１つの抗体、コンジュゲート、又はその断片を含む医薬組成物を投与することによって、免疫応答を増強又は刺激する方法を提供する。
【０１２４】
本発明は、さらに、別の態様によれば、ＴＩＧＩＴの発現を測定又は定量する方法であって、抗体又は抗体断片と生体試料を接触させ、複合体形成のレベルを測定することを含む方法を含み、該抗体又は抗体断片は、（ｉ）配列：ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３；並びに（ｉｉ）配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１２５】
測定及び定量方法は、いくつかの実施形態によれば、インビトロ又はエクスビボで行うか、ＴＩＧＩＴの発現に関連する状態の診断に使用することができる。本発明による抗体は、スクリーニング方法を構成するために使用されてもよい。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、当技術分野で公知の抗体及び方法を用いて、分泌ポリペプチド又は細胞付着ポリペプチドのレベルを測定するために構築することができる。
【０１２６】
一実施形態によれば、
ｉ．ＴＩＧＩＴに特異的な抗体又は少なくとも抗原結合部分を含むその抗体断片と試料をインキュベートする工程；
ｉｉ．検出可能なプローブを用いて結合したＴＩＧＩＴを検出する工程
を含み、ＴＩＧＩＴの存在を検出又は定量化する方法が提供される。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、該方法は、さらに、
ｉｉｉ．既知量のＴＩＧＩＴを含有する参照試料から得られた標準曲線と（ｉｉ）の量とを比較する工程；
ｉｖ．標準曲線から試料中のＴＩＧＩＴの量を計算する工程
を含む。
【０１２８】
いくつかの特定の実施形態によれば、該試料は体液である。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、該方法は、インビトロ又はエクスビボで行われる。
【０１３０】
生体試料中のＴＩＧＩＴの発現を測定するためのキットであって、（ｉ）配列：ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＹＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＫＧＰＹＹＴＫＮＥＤＹ（配列番号３）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＥＨＩＹＹＳＬＡ（配列番号４）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号５）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＫＱＡＹＤＶＰＲＴ（配列番号６）を有する軽鎖ＣＤＲ３；並びに（ｉｉ）配列ＩＹＣＩＨ（配列番号１２）を有する重鎖ＣＤＲ１、配列：ＥＩＳＰＳＮＧＲＴＩＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号１３）を有する重鎖ＣＤＲ２、配列：ＳＤＧＹＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１４）を有する重鎖ＣＤＲ３、配列：ＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＮ（配列番号１５）を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列：ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号１６）を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列：ＬＱＹＡＳＹＰＲＴ（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含むキットも提供される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、免疫関連疾患又は増殖性疾患を診断するか、重症度を評価するか、又は病期分類する方法であって、本発明による抗体又はその断片若しくはコンジュゲートを用いて対象からの試料中のＴＩＧＩＴの発現又は活性を決定すること、及びＴＩＧＩＴの発現又は活性を参照量のＴＩＧＩＴの発現又は活性と比較することを含む方法を提供する。前記参照量は、正常な対象から、疾患の異なる段階にある同じ対象から採取した試料から得ることができるか、又は対象の大集団の臨床データから決定される。
【０１３２】
本発明による抗体、抗体断片又はそのコンジュゲートは、それらが特異的に前記タンパク質に結合し、少なくとも１つのリガンドへの結合を阻害することができる限り、ヒトタンパク質ＴＩＧＩＴへの結合を利用する任意の診断、治療又は予防方法で使用することができる。
【０１３３】
さらなる実施形態及び本発明の適用性の完全な範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正は、発明を実施するための形態から当業者に明らかであるので、本発明の好ましい実施形態を示す発明を実施するための形態及び特定例は例示としてのみ与えられることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ】エフェクター免疫細胞上でのＴＩＧＩＴの発現。図１Ａ．２×１０５個のＹＴＳ細胞（左）又はＴＩＧＩＴを過剰発現しているＹＴＳ細胞（右）のＦＡＣＳヒストグラムプロット。左側の灰色の曲線は、対照マウスＩｇＧ（ｍｌｇＧ）での染色を表す。右の空の曲線は、示されている２つの抗ヒトＴＩＧＩＴ  ｍＡｂ（ＶＳＩＧ９＃１及び２５８−ＣＳ１＃４）での染色を表す。
【図１Ｂ】エフェクター免疫細胞上でのＴＩＧＩＴの発現。図１Ｂ．２人の健康なドナーのＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴ発現のＦＡＣＳヒストグラムプロット（示されるＩ及びＩＩ）。左の灰色の塗りつぶし曲線は、対照ｍｌｇＧによる染色を表す。右の空の曲線は、抗ＴＩＧＩＴ（クローンＶＳＩＧ９＃１）での染色を表す。
【図１Ｃ】エフェクター免疫細胞上でのＴＩＧＩＴの発現。図１Ｃ．２人の黒色腫患者（ＴＩＬ−Ｉ及びＴＩＬ−ＩＩ）からのＣＤ８＋ＴＩＬ細胞上のＴＩＧＩＴ発現のＦＡＣＳヒストグラムプロット。左の灰色の塗りつぶし曲線は、対照ｍｌｇＧでの染色を表す。右の空の曲線は、抗ＴＩＧＩＴ（クローンＶＳＩＧ９＃１）での染色を表す。
【図２Ａ】ｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１によるＴＩＧＩＴ結合の阻害。図２Ａ．ｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートした（１）、対照ｍＩｇＧと共にｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートした（２）、又は示した濃度で抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１と共にｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートした（３及び４）（高レベルのＰＶＲ、ネクチン−２及びネクチン−３を発現する）ＨｅｐＧ２細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロット。
【図２Ｂ】ｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１によるＴＩＧＩＴ結合の阻害。図２Ｂ．個々のプロットで示されるＨｅｐＧ２細胞が発現するＴＩＧＩＴリガンド（空のヒストグラム）のＦＡＣＳヒストグラムプロット。灰色の塗りつぶしヒストグラムは、対照ｍＩｇＧのみでの染色を表す。
【図３Ａ】増強した死滅活性をもたらすＴＩＧＩＴの阻止。図３Ａ．ＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞（１：１０の比）、及び対照ｍＩｇＧ（左のバー）又は抗ＴＩＧＩＴ−ＶＳＩＧ９＃１（右のバー）のいずれかとインキュベートした３５Ｓ標識７２１．２２１−ＰＶＲ細胞について特異的死滅活性を測定した。＊ｐ＜０．００５。
【図３Ｂ】増強した死滅活性をもたらすＴＩＧＩＴの阻止。図３Ｂ．健康なドナーからのＮＫ細胞（１：１０の比）、及び対照ｍＩｇＧ（左のバー）又は抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１（右のバー）とインキュベートした３５Ｓ標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞について特異的死滅活性を測定した。＊＊ｐ＜０．００２。
【図３Ｃ】増強した死滅活性をもたらすＴＩＧＩＴの阻止。図３Ｃ．健康なドナーからのＮＫ細胞（１：１０の比）、及び対照ｍＩｇＧ（右のバー）、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＳＩＧ９＃１（左のバー）、又は抗ＴＩＧＩＴ  ２５８−ＣＳ１＃４（中央のバー）とインキュベートした３５Ｓ標識Ｍｅｌ ５６２細胞について特異的死滅活性を測定した。＊＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｄ】増強した死滅活性をもたらすＴＩＧＩＴの阻止。図３Ｄ．抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（アービタックス（登録商標））とインキュベートし、対照ｍＡｂ（左のバー）又は抗ＶＳＩＧ９＃１（右のバー）と（それぞれエフェクター：標的細胞の１０：１の比で）プレインキュベートしたＮＫ細胞に加えた３５Ｓ標識ＨｅｐＧ２細胞について抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を測定した。
【図４Ａ】抗体２５８−ＣＳ１＃４及びＶＳＩＧ９＃１はＰＶＲへのＴＩＧＩＴ結合を阻止する。ＴＩＧＩＴリガンドＰＶＲを発現するＨｅｐＧ２細胞を、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートするか、ｍＡｂＶＳＩＧ−９＃１とのプレインキュベーション後にＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートするか（図４Ａ）、又はｍＡｂ  ２５８−ＣＳ１＃４（図４Ｂ）とインキュベートし、ＦＡＣＳを用いて結合を測定した。
【図４Ｂ】抗体２５８−ＣＳ１＃４及びＶＳＩＧ９＃１はＰＶＲへのＴＩＧＩＴ結合を阻止する。ＴＩＧＩＴリガンドＰＶＲを発現するＨｅｐＧ２細胞を、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートするか、ｍＡｂＶＳＩＧ−９＃１とのプレインキュベーション後にＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートするか（図４Ａ）、又はｍＡｂ  ２５８−ＣＳ１＃４（図４Ｂ）とインキュベートし、ＦＡＣＳを用いて結合を測定した。
【図５Ａ】ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いた、２つの商業的供給源からのヒトＴＩＧＩＴを装填したバイオセンサへのｍＡｂ ２５８−ｃｓ１＃４（＃４）（図５Ａ）及びＶＳＩＧ９＃１（図５Ｂ）の結合の速度論的分析。
【図５Ｂ】ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いた、２つの商業的供給源からのヒトＴＩＧＩＴを装填したバイオセンサへのｍＡｂ ２５８−ｃｓ１＃４（＃４）（図５Ａ）及びＶＳＩＧ９＃１（図５Ｂ）の結合の速度論的分析。
【図６Ａ】抗体ＶＳＩＧ９＃１は、市販の抗体ＭＢＳＡ４３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１２−９５００−４２）よりも著しく強くＴＩＧＩＴ細胞に結合する。図６Ａ．ＴＩＧＩＴに結合するＶＳＩＧ９＃１及び市販の抗体ＭＢＳＡ４３のＦＡＣＳヒストグラムプロット。ＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞（７５×１０３）を、段階希釈で２５０ｎｍから６５ｆＭの濃度範囲で抗ＴＩＧＩＴ抗体ＶＳＩＧ９＃１（黒オープンヒストグラム）又はＭＢＳＡ４３（灰色オープンヒストグラム）で染色した。背景−ｍＩｇＧの染色（灰色の塗りつぶしヒストグラム）。各パネルは、示した抗体の特定の濃度を表す。各パネルのＹ軸は細胞数であり、Ｘ軸は蛍光強度（ＦＬ１−Ｈ）である。
【図６Ｂ】抗体ＶＳＩＧ９＃１は、市販の抗体ＭＢＳＡ４３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１２−９５００−４２）よりも著しく強くＴＩＧＩＴ細胞に結合する。図６Ｂ．図６Ａに記載の結合のグラフ分析。最大強度の半分は、示した点で達成される（ＭＢＳＡ４３灰色破線、ｍＡｂ  ＶＳＩＧ＃９＃１黒破線）。
【図７Ａ】ＶＳＩＧ＃９抗体は、ＦＡＣＳ分析によって測定されるように、ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ相互作用の防止において市販の抗体ＭＢＳＡ４３よりも著しく強力である。図７Ａ．ＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞染色のヒストグラムプロット。７５×１０３個のＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞を、２倍希釈系列で２７から０．０１４ｐｍｏｌｅの抗体濃度の範囲で、ＶＳＩＧ９＃１（黒オープンヒストグラム）又はＭＢＳＡ４３（灰色点線ヒストグラム）の存在下で、２．５ｐｍｏｌｅのＰＶＲ−Ｆｃ（灰色のオープンヒストグラム）とインキュベートした。結合したＰＶＲを、抗アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）４８８マウス抗ヒトＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって検出した。
【図７Ｂ】ＶＳＩＧ＃９抗体は、ＦＡＣＳ分析によって測定されるように、ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ相互作用の防止において市販の抗体ＭＢＳＡ４３よりも著しく強力である。図７Ｂ．ＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞染色のヒストグラムプロット。７５×１０３個のＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞を、２倍希釈系列で２７から０．０１４ｐｍｏｌｅの抗体濃度の範囲で、ＶＳＩＧ９＃１（黒オープンヒストグラム）又はＭＢＳＡ４３（灰色点線ヒストグラム）の存在下で、２．５ｐｍｏｌｅのＰＶＲ−Ｆｃ（灰色のオープンヒストグラム）とインキュベートした。結合した抗ＴＩＧＩＴを、アレクサフルオロ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって検出した。図７Ａ及び７Ｂの各パネルは、示した抗体の特定の濃度を表す。各パネルのＹ軸は細胞数であり、Ｘ軸は蛍光強度（ＦＬＬ−Ｈ／ＦＬ−４）である。パネルの数値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図８】ｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１（Ｖｓｉｇ９．０１）によるＴＩＧＩＴの阻止は、単独で、又は抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ４との組み合わせでＴ細胞増殖を誘導する。健康なドナーからのＰＢＭＣを、５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、抗ＣＤ３抗体によって活性化し、その後、５〜９日間、４μｇ／ｍｌの示したｍＡｂの存在下でｈＣＤ８０を過剰発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とインキュベートした。増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。少なくとも５つの異なる実験からの代表的なデータを示している。＊ｐ＜０．０４ ＊＊＜０．０１５ ＊＊＊＜０．０００４。
【図９】抗ＴＩＧＩＴＶＳＩＧ−９＃１  ｍＡｂは、ＡＭＬ細胞内のＣＤ８ Ｔ細胞の増加において抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４と相乗作用する。ＡＭＬ患者から得られた骨髄吸引液から分離した免疫細胞を、１２日間、４μｇ／ｍｌの抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ−１及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体と共培養し、その後、Ｄ８ Ｔ細胞の量を決定した。
【発明を実施するための形態】
【０１３５】
本発明は、ヒトタンパク質ＴＩＧＩＴに特異的なモノクローナル抗体を提供し、ｍＡｂの一部はこのタンパク質に対して例外的に高い親和性を有し、いくつかは、二重特異性を有して、該タンパク質の異なるドメインに結合することができる。本発明はまた、治療薬としてのｍＡｂの生成及び使用を提供する。特に、本発明のｍＡｂは、単独で又は他の薬剤と組み合わせて、ＮＫ及び他の細胞の抗腫瘍死滅活性を回復及び増強するために、かつ診断試薬として使用することができる。
【０１３６】
本明細書で使用する用語「抗原」は、抗体の形成を誘発し、特異的に抗体が結合することができる分子又は分子の部分を指す。抗原は、１つ又は２以上のエピトープを有することができる。上記で言及した特異的結合は、抗原がその対応する抗体と高度に選択的な様式で反応し、他の抗原によって誘発され得る多くの他の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。本発明のいくつかの実施形態による抗原は、ＴＩＧＩＴタンパク質であり、ＮＰ＿７７６１６０．２；Ｑ４９５Ａ１．１；ＡＡＩ０１２９０．１；ＡＡＩ０１２９１．１；ＡＡＩ０１２９２．１；ＡＣＤ７４７５７．１；ＥＡＷ７９６０２．１；及びＡＩＣ５３３８５．１；又は前記ＴＩＧＩＴタンパク質のいずれかの断片からなる群から選択されるアクセッション番号を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的である。さらに他の実施形態によれば、本発明によるｍＡｂは、ヒトＴＩＧＩＴ及びマウス、サル、イヌ又は他のものなどの他の種からの少なくとも１つのＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの具体的な実施形態によれば、ｍＡｂは、ヒトＴＩＧＩＴ及びサル種の少なくとも１つのＴＩＧＩＴに結合する。
【０１３８】
本明細書で使用する用語「抗原決定基」又は「エピトープ」は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。エピトープ由来のペプチド配列は、動物を免疫し、追加のポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成するために当技術分野で公知の方法を適用し、単独で、又は担体部分と組み合わせて使用することができる。エピトープに由来する単離ペプチドは、抗体を検出するための診断方法で用いることができる。
【０１３９】
抗体又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって共に連結された２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、各軽鎖は、「Ｙ」型構成でジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に連結されている。抗体のタンパク質分解消化により、Ｆｖ（可変断片）及びＦｃ（結晶性断片）ドメインが生じる。抗原結合ドメインのＦａｂは、ポリペプチド配列が変化する領域を含む。用語Ｆ（ａｂ’）２は、ジスルフィド結合によって共に連結された２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸は、Ｆｃ断片と呼ばれる。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）及びその他端側に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列しており、軽鎖定常ドメインは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。軽鎖及び重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは４つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）として知られる３つの超可変ドメインによって連結されている。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性及び親和性に寄与する。
【０１４０】
ＣＤＲの決定−所与の重鎖又は軽鎖可変配列からのＣＤＲの同定は、典型的には当技術分野で知られているいくつかの方法のいずれかを用いて行われる。例えば、そのような決定は、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ Ｔ．Ｔ及びＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９７０；１３２：２１１−５０）並びにＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ−Ｐ，ら，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，２７：５５−７７）に従って行われる。
【０１４１】
用語「配列を有するＣＤＲ」、又は類似の用語が使用される場合、それは、ＣＤＲが特定の配列を含むオプション及びＣＤＲが特定の配列からなるオプションも含む。
【０１４２】
抗体の抗原特異性は、超可変領域、すなわち抗原結合部位を共に形成する軽鎖と重鎖の両方の特有のＣＤＲ配列に基づいている。
【０１４３】
重鎖（ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロン又はミュー）のアイソタイプは、免疫グロブリンクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）を決定する。軽鎖は、全ての抗体クラスに見られる２つのアイソタイプ（カッパ、κ又はラムダ、λ）のいずれかである。
【０１４４】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示すのに、すなわち、ヒトＴＩＧＩＴに結合するのに十分な長さのモノクローナル抗体（完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
【０１４５】
抗体又は本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの無傷の抗体、並びにＦａｂ又はＦ（ａｂ'）２断片などのそのタンパク質分解断片を含む。一本鎖抗体も、本発明の範囲内にある。
【０１４６】
「抗体断片」は、一般的には無傷の抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持する無傷の抗体の一部のみを含む。本定義によって包含される抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を有するＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４１，５４４−５４６）；（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４２，４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１９８８，８５，５８７９−５８８３）；（ｘ）同じポリペプチド鎖の中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，６４４４−６４４８を参照されたい）；（ｘｉ）相補軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１９９５，８，１０５７−１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号）が挙げられる。
【０１４７】
抗体断片
抗体断片の生成のための様々な技術が開発されている。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化によるものである（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生成することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。もう１つの方法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生成のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態において、選択抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。
【０１４８】
一本鎖抗体は、抗原結合能力を有し、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域に相同性又は類似性のあるアミノ酸配列を含む一本鎖複合ポリペプチド、すなわち、連結されたＶＨ−ＶＬ又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）であり得る。一本鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）の生成のための技術は、ＴＩＧＩＴに対する一本鎖抗体を生成するように適合させることができる。
【０１４９】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、少量で存在しうる天然変異の可能性を除いて、集団を含む個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一抗原に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。ｍＡｂは当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６，４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５２，６２４−６２８又はＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１−５９７に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【０１５０】
機能的な可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子の迅速な同定及びクローニングを介してモノクローナル抗体に由来する組換え一価抗原結合分子の設計及び開発並びに組換え細菌内での発現用に最適化された合成ＤＮＡ配列の設計及びクローニングは、Ｆｉｅｌｄｓら、２０１３，８（６）：１１２５−４８に記載されている。
【０１５１】
本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。ｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養することができる。高力価のｍＡｂは、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスティンプライミングＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を生成するインビボ生成によって得ることができる。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのｍＡｂは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、かかる腹水又は培養上清から精製することができる。
【０１５２】
インビボで抗体を生成する従来の方法に加えて、抗体は、ファージディスプレイ技術を用いてインビトロで作製することができる。組換え抗体のそのような生成は、従来の抗体生成と比較してはるかに高速であり、それらは膨大な数の抗原に対して作製することができる。さらに、従来の方法を使用するときに、多くの抗原が、非免疫原性であるか又は非常に有毒であることが判明し、したがって、動物において抗体を作製するために使用することができない。また、組換え抗体の親和性成熟（すなわち、親和性及び特異性の増加）は、非常に簡単かつ比較的速い。最後に、特定の抗原に対する多数の異なる抗体は、１つの選択手順で作製することができる。組換えｍＡｂを作製するために、ディスプレイライブラリーに基づく全ての様々な方法を使用して、異なる抗原認識部位を有する抗体の大きなプールを作製することができる。そのようなライブラリーは、いくつかの方法で行うことができる：Ｈ鎖生殖系列遺伝子のプール中の合成ＣＤＲ領域をクローニングし、従って、多数の抗体レパートリーを作製することによって合成レパートリーを作製し、そこから様々な特異性を有する組換え抗体断片を選択することができる。抗体ライブラリーの構築のための出発物質として、ヒトのリンパ球のプールを使用することができる。ヒトＩｇＭ抗体のナイーブレパートリーを構築し、大規模な多様性のヒトライブラリーを作成することが可能である。この方法は、異なる抗原に対する多数の抗体を首尾よく選択するために広く使用されてきた。バクテリオファージライブラリーの構築及び組換え抗体の選択のためのプロトコルは、例えば、免疫学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社（１９９２−２０００）、第１７章、１７．１節に提供されている。
【０１５３】
非ヒト抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によってヒト化することができる。１つの方法では、非ヒトＣＤＲを、ヒト抗体又はコンセンサス抗体ＦＲ配列に挿入する。次いで、親和性又は免疫原性を調節するために、さらなる変更を抗体フレームワークに導入することができる。
【０１５４】
例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号は、ヒト化免疫グロブリン及びヒト化免疫グロブリンの調製方法を開示しており、その中のヒト化免疫グロブリンは、ドナー免疫グロブリンからのＣＤＲ並びにヒトアクセプター免疫グロブリンＨ及びＬ鎖からのＶＨ並びにＶＬ領域ＦＲを含み、前記ヒト化免疫グロブリンは、カバット及びコチアのＣＤＲの外のドナー免疫グロブリンＦＲ由来のアミノ酸を含み、ドナーアミノ酸は、アクセプター免疫グロブリンＨ又はＬ鎖フレームワーク中の対応するアミノ酸を置換する。
【０１５５】
また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物などの他の生物も、ヒト化抗体を発現させるために使用することができる。
【０１５６】
Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号はまた、改変抗体又はその抗原結合断片及びそれらの調製方法を開示しており、該抗体又は抗原結合断片のＶドメインは、第１の免疫グロブリンＨ又はＬ鎖のＶドメインのＦＲ並びに第２の免疫グロブリンＶＨ又はＶＬドメインのＣＤＲを有し、前記第２の免疫グロブリンのＶＨ又はＶＬドメインは、前記第１の免疫グロブリンのＶＨ又はＶＬドメインと、抗原結合特異性、抗原結合親和性、安定性、種、クラス又はサブクラスの点で異なる。
【０１５７】
本発明の抗体の超可変領域と特異的に免疫応答する抗イディオタイプ抗体も包含される。
【０１５８】
あるいは、ファージディスプレイ技術は、抗ＶＥＧＦを処理するためにスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅ｖ遺伝子のレパートリー又はライブラリーのいずれかから、ヒトＴＩＧＩＴに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択するために利用することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４；Ｍａｒｋｓら，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３）。これらの抗体の親和性はまた、例えば、鎖のシャッフルによって改善することができる（Ｃｌａｃｋｓｏｎら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２８）。
【０１５９】
上記抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するためにポリペプチドを発現するクローンを単離又は同定するために使用することができる。
【０１６０】
本発明は、軽鎖の３つのＣＤＲ及び重鎖の３つのＣＤＲを含む抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むモノクローナル抗体又は抗体断片を提供し、前記ＡＢＤは、（ｉ）アミノ酸配列配列番号７を含む重可変鎖及びアミノ酸配列配列番号８を含む軽可変鎖（本明細書ではＶＳＩＧ９＃１として特定される）；又はアミノ酸配列配列番号１８を含む重可変鎖及びアミノ酸配列配列番号１９を含む軽可変鎖（本明細書では２５８−ＣＳ１＃４（又は＃４）として特定される）を含むモノクローナルマウス抗体のＡＢＤと少なくとも９０％の配列同一性又は類似性を有する。そのような抗体は、対応するＶＳＩＧ９＃１又は２５８−ＣＳ１＃４のＡＢＤと少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性若しくは類似性又は１００％の配列同一性を有するＡＢＤドメインを有してよい。
【０１６１】
配列同一性は、２つの異なる配列間で正確に一致するアミノ酸又はヌクレオチドの量である。配列類似性は、同一のアミノ酸として決定されるアミノ酸の保存的置換を可能にする。
【０１６２】
本発明はまた、本発明による抗体分子の保存的アミノ酸変異体を提供する。コードされるタンパク質の全体的な分子構造を保存する本発明による変異体も作製することができる。開示されるタンパク質生成物を含む個々のアミノ酸の性質を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識される。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は関与する残基の両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。本明細書で使用する用語「抗体類似体」は、１以上の保存的アミノ酸置換による別の抗体に由来する抗体を指す。
【０１６３】
本明細書で使用する用語「抗体変異体」は、本発明の抗体を含む任意の分子を指す。例えば、抗体又はその抗原結合断片が別の化学物質に連結された融合タンパク質は、抗体変異体と考えられる。
【０１６４】
抗体配列の類似体及び変異体も、本出願の範囲内である。これらには、配列内のアミノ酸の保存的及び非保存的置換、挿入及び欠失を含むが、これらに限定されない。そのような改変及び得られた抗体の類似体又は変異体は、それらがヒトＴＩＧＩＴへの抗体の結合を与えるか、又はさらに改善する限り、本発明の範囲内である。
【０１６５】
当業者に知られているようなアミノ酸の保存的置換は、本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換は、１個のアミノ酸を、同じ種類の官能基又は側鎖、例えば、脂肪族、芳香族、正に帯電したもの、負に帯電したものを有する別のアミノ酸と置換することを含む。これらの置換は、経口バイオアベイラビリティ、膵島への浸透を高め、特定のβ細胞集団、及び免疫原性などを標的とすることができる。当業者は、単一アミノ酸もしくはコード配列中の少しの割合のアミノ酸を変更、付加又は欠失するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列の個々の置換、欠失又は付加が、「保存的改変変異体」であり、改変によりアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸に置換することを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。例えば、当技術分野で知られている１つの表によれば、以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１６６】
本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成され、かつ／又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して製造された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生成することができる。
【０１６７】
本明細書で使用する用語「抗体の抗原結合部位を有する分子」及び「抗原結合断片」は、任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリン分子及び任意の動物細胞株又は微生物によって作製された免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、その重鎖及び／又は軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（例えば、ＷＯ  ９３／１５２１０、米国特許出願０８／２５６，７９０、ＷＯ  ９６／１３５８３、米国特許出願０８／８１７，７８８、ＷＯ  ９６／３７６２１、米国特許出願０８／９９９，５５４を参照されたい）、二量体の二重特異性ミニ抗体（Ｍｕｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ｊｕｌ ３１；４３２（１−２）：４５−９を参照されたい）及びそのような反応性画分を組み込んだ一本鎖抗体、並びにそのような抗体反応性画分が物理的に挿入された任意の他の種類の分子を含むが、これらに限定されないその抗原結合反応性画分を含むことが意図される。そのような分子は、酵素的切断、ペプチド合成又は組換え技術を含むが、これらに限定されない任意の公知の技術によって提供され得る。
【０１６８】
本明細書で使用する用語「非完全ヒト化モノクローナル抗体」は、ＣＤＲに隣接する、かつ／又はすぐ隣のアミノ酸配列が完全にヒトではない、すなわち、天然のヒト抗体から取得された任意の公知の相同性配列又は対応する配列と同一ではない重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを有するモノクローナル抗体を指す。
【０１６９】
ヒト化抗体及びヒト抗体
ヒト化抗体は、典型的には、非ヒトＣＤＲを移植されたヒトＦＲを有する。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１以上のアミノ酸配列を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる場合が多い。ヒト化は、本質的に、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列と置換することによる、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って行うことができる（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。従って、そのような「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている無傷のヒトＶドメインが実質的により少ないキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体であり、その中のいくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基は、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されている。
【０１７０】
ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒトＶＨ及びＶＬドメインの選択は、免疫原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」に従って、齧歯類抗体のＶドメインの配列は、既知のヒトドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトＦＲとして受け入れられる（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、Ｈ又はＬ鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のＦＲを使用する。同じＦＲは、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１７１】
抗体が、抗原及び他の好ましい生物学的特性のために、高い特異性及び親和性を保持した状態でヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測される三次元立体配座構造を示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能面での残基の可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このように、ＦＲ残基は、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、最も実質的に抗原結合への影響に直接関与する。
【０１７２】
もう１つの方法として、免疫化の際に、内因性免疫グロブリン生成がない状態で、ヒト抗体の全レパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生成することが現在可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性が欠失すると、内因性抗体生成が完全に阻害されることが説明されている。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原負荷時にヒト抗体の生成をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；及びＤｕｃｈｏｓａｌら，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー由来のものであり得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９（１９９６））。
【０１７３】
薬学
医薬品及び医薬製剤において、活性剤は、好ましくは、１以上の薬学的に許容される担体（複数可）及び必要に応じて、任意の他の治療成分と共に利用される。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して過度に有害でないという意味で、薬学的に許容されなければならない。活性剤は、上記のように、所望の薬理学的効果を達成するのに有効な量で提供され、所望の日用量を達成するのに適切な量である。
【０１７４】
典型的には、抗体の抗原結合部分を含むか、又はペプチド模倣物を含む別のポリペプチドを含む本発明の抗体及びその断片及びコンジュゲートは、治療用途のための滅菌生理食塩水溶液中に懸濁される。該医薬組成物は、もう１つの方法として、有効成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出を制御するように、又は患者の系におけるその存在を延長するように製剤化することができる。多数の適切な薬物送達システムが知られており、例えば、移植可能な薬物放出システム、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、及びマイクロスフェアなどを含む。制御放出調製物は、本発明による分子を組み合わせるか、又は吸着するポリマーの使用を介して調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーは、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス及びステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスを含む。本発明による分子、すなわち、このようなマトリックスからの抗体又は抗体断片の放出速度は、分子の分子量、マトリックス内の分子の量、及び分散粒子のサイズに依存する。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、関節内投与、病巣内投与又は非経口投与などの任意の適切な手段によって投与することができる。通常、静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、抗体を送達するために使用される。
【０１７６】
本発明による分子の治療有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される分子の単位用量、分子が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、免疫状態及び患者の健康状態、投与される分子の治療活性並びに治療医師の判断に依存することは当業者には明らかであろう。本明細書で使用する「治療有効量」は、ある期間にわたって治療される障害に関連する１以上の症状を軽減するのに必要な分子の量を指す。
【０１７７】
用語「治療有効量」は、哺乳動物における疾患又は障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。癌の場合には、薬物の治療有効量は、癌細胞の数を減少させ、腫瘍の大きさを低下させ、末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止し）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止し）、ある程度まで腫瘍増殖を阻害し、かつ／又はある程度まで障害に関連する症状の１以上を緩和することができる。薬物は、増殖を防ぎ、かつ／又は既存の癌細胞を死滅させる程度まで、細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。癌治療については、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質を評価することによって測定することができる。
【０１７８】
本発明による治療が可能な癌には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）癌又は腎臓（ｒｅｎａｌ）癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症と関連する異常な血管増殖、（脳腫瘍に関連するものなどの）浮腫、及びメグズ症候群が挙げられる。好ましくは、癌は、乳癌、結腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。本発明の治療が可能な癌性状態には転移性癌が含まれる。
【０１７９】
有効成分としての本発明の分子は、薬学的に許容され、周知の有効成分と適合性のある賦形剤に溶解、分散又は混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど、及びそれらの組み合わせである。他の適切な担体は、当業者に周知である。加えて、所望であれば、該組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。
【０１８０】
本発明による医薬組成物は、抗新生物組成物と共に投与することができる。
【０１８１】
本明細書で使用する用語「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指す。治療を必要とするものは、既に障害を有するもの及び障害が予防されるべきものを含む。
【０１８２】
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には、調節されない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頚癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄癌、卵巣癌、子宮癌、肉腫、胆管癌、又は子宮内膜癌が挙げられる。
【０１８３】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、少なくとも１つの追加の抗癌剤の投与を含む治療計画の一部として医薬組成物を投与することを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態によれば、抗癌剤は、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、アスパラギナーゼ、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１８５】
いくつかの実施形態によれば、代謝拮抗剤は、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ゲムシタビン、及びヒドロキシウレアからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、有糸分裂阻害剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカン及びイリノテカンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、アルキル化剤は、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、ダカルバジン、及びプロカルバジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、抗腫瘍性抗生物質は、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、及びプリカマイシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、トポイソメラーゼＩＩは、エトポシド及びテニポシドからなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１８６】
いくつかの特定の実施形態によれば、抗癌剤は、ベバシズマブ、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩、ゲムシタビン塩酸塩、トポテカン塩酸塩、チオテパ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１８７】
本発明によるモノクローナル抗体は、少なくとも１つの抗癌剤との併用療法の一部として使用されてもよい。いくつかの実施形態によれば、追加の抗癌剤は、免疫調節因子、活性化リンパ球細胞、キナーゼ阻害剤又は化学療法剤である。
【０１８８】
いくつかの実施形態によれば、抗癌剤は、アゴニスト又はアンタゴニストに関わらず、チェックポイント分子に対する抗体などの免疫調節因子である。
【０１８９】
チェックポイント免疫療法の遮断は、癌治療の興味深い新しい手段であることが判明した。免疫チェックポイント経路は、自己寛容を維持し、生理学的条件下で免疫系による損傷から組織を保護するために、協調して動作する共刺激分子及び阻害分子の範囲からなる。腫瘍は、免疫系を回避するために、特定のチェックポイント経路を利用する。したがって、そのような経路の阻害は、有望な抗癌治療戦略として浮上している。
【０１９０】
抗細胞傷害性Ｔリンパ球４（ＣＴＬＡ−４）抗体イピリムマブ（２０１１年に承認された）は、癌患者の治療のために有益性を示した最初の免疫療法剤であった。抗体は、Ｔ細胞への抗原提示の際に阻害シグナルと干渉する。抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）抗体ペンブロリズマブ（２０１４年に承認された）は、Ｔ細胞が発現するＰＤ−１受容体の負の免疫調節シグナルを阻止する。追加の抗ＰＤ−１剤は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のための薬事承認のために２０１４年に提出された。活発な研究により、現在、多くの他の免疫チェックポイント、その中でもＣＥＡＣＡＭ１、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも呼ばれる）、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）が探索されている。
【０１９１】
いくつかの特定の実施形態によれば、免疫調節因子は、ＣＴＬＡ−４を阻害する抗体、抗ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２抗体、活性化細胞傷害性リンパ球細胞、リンパ球活性化剤、ＣＥＡＣＡＭに対する抗体、及びＲＡＦ／ＭＥＫ経路阻害剤からなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態によれば、追加の免疫調節因子が、ＰＤ−１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ２に対するｍＡｂ、ＣＥＡＣＡＭ１に対するｍＡｂ、ＣＴＬＡ−４に対するｍＡｂ、インターロイキン２（ＩＬ−２）又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される。
【０１９２】
他の実施形態によれば、抗癌剤は化学療法剤である。本発明による抗体と共に投与するか、又は別々に投与することができる化学療法剤は、ミトキサントロン、トポイソメラーゼ阻害剤、スピンドル毒ビンカ：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（タキソール）、パクリタキセル、ドセタキセル、アルキル化剤：メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、ポドフィロトキシン：エトポシド、イリノテカン、トポテカン、ダカルバジン、抗生物質：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン、ニトロソ尿素：カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、無機イオン：シスプラチン、カルボプラチン、インターフェロン、アスパラギナーゼ、ホルモン類：タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、及び酢酸メゲストロールを含むがこれらに限定されない抗癌活性を示す、当技術分野で公知の任意のそのような薬剤を含むことができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態によれば、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体及び関連阻害薬、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、及びゴナドトロピン放出ホルモン類似体から選択される。別の実施形態によれば、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル及びドキセタキセルからなる群から選択される。１以上の化学療法剤を使用することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、癌の治療に使用するため、又は免疫応答の増強に使用するためのものである。
【０１９５】
用語「免疫応答の増強」は、免疫系の応答性を高め、その記憶を延長することを指す。本発明による医薬組成物は、ワクチン接種の際に免疫系を刺激するために使用することができる。したがって、一実施形態において、該医薬組成物は、免疫化を向上させるために使用することができる。
【０１９６】
特定の実施形態において、癌は、肺癌、甲状腺癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頚癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄、卵巣癌、子宮癌、肉腫、胆管癌、及び子宮内膜細胞癌から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本発明による少なくとも１つの抗体又はその断片を含む医薬組成物、及び追加の免疫調節因子又はキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物は、別々の投与による癌の治療に使用される。
【０１９８】
さらに別の態様によれば、本発明は、それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の本発明によるモノクローナル抗体又は抗体断片を投与することを含む方法を提供する。
【０１９９】
用語「治療すること」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための工程を取ることを指す。有益な又は所望の臨床結果は、筋ジストロフィーと関連する１以上の症状の軽減又は改善、その障害の遅延又は緩徐化、その障害の寛解、緩和又は安定化、及び他の有益な結果を含むが、これらに限定されない。
【０２００】
本明細書で使用する用語「有効量」は、対象に投与したときに意図した治療効果を有する抗体断片のモノクローナル抗体の十分な量を指す。治療最終結果を達成するのに必要な有効量は、例えば、特定の種類の腫瘍及び患者の状態の重症度を含むいくつかの要因、かつ併用剤がさらに放射線と同時投与されるかどうかに依存し得る。本発明の文脈において、有効量（用量）の活性薬剤は、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖速度の低下、腫瘍及び転移増殖の防止並びに生存強化を含むがこれらに限定されない、対象における有益な治療応答を時間と共にもたらすのに十分でなければならない。
【０２０１】
本明細書に記載の組成物の毒性及び治療的有効性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＩＣ５０（５０％阻害を与える濃度）及び対象化合物の最大耐量を決定することによって決定することができる。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための範囲の投与量を製剤化するのに使用することができる。投与量は、とりわけ、使用される剤形、選択された投与計画、治療に使用される薬剤の組成及び他の関連要因の中で利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な製剤化、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる。治療すべき症状の重症度及び応答性に依存して、数日から数週間続く治療経過、又は治癒するまで、又は疾患状態の低下が達成されるまで、投薬はまた、徐放性組成物の単回投与であり得る。投与されるべき組成物の量は、もちろん、治療される対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断、及び他の全ての関連要因に依存する。
【０２０２】
用語「投与すること」又は対象への物質、化合物又は薬剤「の投与」は、当業者に公知の様々な方法の１つを使用して行うことができる。例えば、化合物又は薬剤は、経腸投与又は非経口投与することができる。経腸投与は、経口、舌下又は直腸を含む胃腸管を経由する投与を指す。非経口投与は、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、点眼、舌下投与、鼻腔内投与、吸入、脊髄内投与、脳内、及び経皮投与（吸収による、例えば、皮膚ダクトを介する）を含む。化合物又は薬剤は、再充電可能な（ｒｅｃｈａｒｇｅａｂｌｅ）若しくは生分解性のポリマーデバイス又は他のデバイス、例えば、パッチ及びポンプ、又は化合物若しくは薬剤の持続放出、徐放又は制御放出を提供する製剤によって適切に導入することができる。投与はまた、例えば、一回、複数可、及び／又は１以上の長い期間にわたって行うことができる。いくつかの実施形態において、投与は、自己投与を含む直接投与と薬物を処方する行為を含む間接的な投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用するように、薬物を自己投与することを患者に指示する医師、又は他人によって薬物を投与させるように指示する医師、及び／又は薬物の処方箋を患者に提供する医師が、患者に薬物を投与している。
【０２０３】
抗体は、一般的に、患者の体重の約０.１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、一般に約０.５〜約１０ｍｇ／ｋｇ、しばしば約１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。この点で、少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも４日、より好ましくは最大２１日の循環半減期を有する抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体及びヒト化抗体は、それぞれ、最大４日及び最大１４〜２１日の循環半減期を有することが期待される。場合によっては、治療期間にわたって、大きな負荷用量に続き、周期的（例えば、毎週）維持用量を投与することが有利であり得る。抗体はまた、徐放性送達システム、ポンプ、及び連続注入のための他の既知の送達系によって送達することができる。
【０２０４】
用語「約」は、例えば、特定の値の５％又は１０％まで許容される誤差範囲が想定されるべきであることを意味する。
【０２０５】
以下の実施例は、より完全に本発明のいくつかの実施形態を例示するために提示される。しかし、それらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２０６】
実施例
実験手順
様々な腫瘍のＮＫ細胞の細胞毒性は、全てのヒトＮＫ細胞及び様々なＴ細胞上に存在するＴＩＧＩＴタンパク質へのリガンド結合により抑制される。抗ｈＴＩＧＩＴ  ｍＡｂを作製し、ｈＴＩＧＩＴとのリガンド相互作用によって与えられる死滅抑制に拮抗する能力について試験した。
【０２０７】
以下の細胞株：ヒトＥＢＶ形質転換７２１.２２１細胞、ヒトＮＫ腫瘍細胞株ＹＴＳ  ＥＣＯ、ＭＥＬ５６２黒色腫細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞及びＨｅｐＧ２ヒト肝細胞を使用した。様々なＹＴＳ ＥＣＯ形質移入体の作製：ＹＴＳ ｈＴＩＧＩＴについては以前に記載された（Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙら、２００９）。全ての細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地中で増殖させた。
【０２０８】
死滅アッセイのために、標的細胞を、メチオニンを含まない培地（Ｓｉｇｍａ）に添加した３５Ｓ−メチオニンの存在下で一晩増殖させた。エフェクター細胞（ＮＫ細胞）とのインキュベーションの前に、細胞を洗浄し、計数し、５０００個の細胞／ウェルを播種した。ブロッキング抗体のｍＡｂ０.５μｇを使用した。各標的について、エフェクター細胞とインキュベートしなかった細胞を用いて自発的３５Ｓ放出を計算し、標的細胞に１００μｌの０.１Ｍ  ＮａＯＨを適用することによって最大[３５Ｓ]放出を計算した。[３５Ｓ]放出の量を、β−カウンターＭｉｃｒｏＢｅｔａ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって、エフェクターとのインキュベーション（３７℃で）の５時間後に測定した。
【０２０９】
ビアコアを用いたＫＤ決定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサービアコア（商標）Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ、及び抗体とＴＩＧＩＴとの間のＫＤを決定した。
【０２１０】
実施例１．ＴＩＧＩＴに特異的なモノクローナル抗体の生成
ヒトＴＩＧＩＴに対するモノクローナル抗体を、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化することにより、一例に従って作製した。ヒトＴＩＧＩＴのコード配列は、ＩｇＧ１のＦｃ断片との融合体としてクローニングすることによって生成した。作製した組換え融合タンパク質をマウスに注射し、ハイブリドーマ上清を、ＴＩＧＩＴを発現するＹＴＳ ＮＫ細胞株形質移入体の特異的認識について試験した。
【０２１１】
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号：１５５９６−０２６）の技術マニュアルに従って得られたハイブリドーマ細胞から抽出し、アガロースゲル電気泳動により分析した。全ＲＮＡを、アイソトープ特異的抗センスプライマー又はユニバーサルプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：６１１０Ａ）の技術マニュアルに従ってｃＤＮＡに逆転写した。ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ及びＣＬの抗体断片を、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）の標準操作手順に従って増幅した。増幅した抗体断片を、標準的な分子クローニング手順を使用して標準的なクローニングベクターに別々にクローニングした。
【０２１２】
コロニーＰＣＲスクリーニングを行い、正しいサイズの挿入物を有するクローンを同定した。正しいサイズのインサートを有する５個程度の単一コロニーを、各抗体断片について配列決定した。
【０２１３】
結果
生成したヒトＴＩＧＩＴに特異的な２つの例示的モノクローナル抗体を、＃４（又は２５８−ｃｓ１＃４）及びＶＳＩＧ９＃１（又はＶｓｉｇ９.０１）と命名した。これらのｍＡｂは、図１Ａに示されているように、ヒトＴＩＧＩＴで形質転換したＹＴＳ細胞を認識する。
【０２１４】
試料の単離した全ＲＮＡを、１.５％アガロース／ＧｅｌＲｅｄ（商標）ゲル上でＤＮＡマーカーのマーカーＩＩＩ（ＴＩＡＧＥＮ、カタログ番号：ＭＤ １０３）と共に泳動した。
【０２１５】
各々の試料のＰＣＲ生成物の４マイクロリットルを、１.５％アガロース／ＧｅｌＲｅｄ（商標）ゲル上でＤＮＡマーカーＩＩＩと共に泳動した。ＰＣＲ生成物を精製し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
【０２１６】
異なるクローンのＶＨ、ＶＬを配列決定した。下記の可変領域の配列は、ＶＳＩＧ９＃１及び２５８−ｃｓ１.０４と命名した２つのハイブリドーマクローンによって生成した抗体の配列である。各アミノ酸鎖の中のＣＤＲ配列に下線を引いてある。
【０２１７】
抗体ＶＳＩＧ９＃１重鎖：ＤＮＡ配列
【化１】
2018532383.tif 000002
【０２１８】
抗体ＶＳＩＧ９＃１重鎖：アミノ酸配列
【化２】
2018532383.tif 000003
【０２１９】
抗体ＶＳＩＧ９＃１軽鎖：ＤＮＡ配列
【化３】
2018532383.tif 000004
【０２２０】
抗体ＶＳＩＧ９＃１軽鎖：アミノ酸配列
【化４】
2018532383.tif 000005
【０２２１】
抗体２５８−ｃｓ１.０４（＃４とも表される）
抗体２５８−ＣＳ１.０４重鎖：ＤＮＡ配列
【化５】
2018532383.tif 000006
【０２２２】
抗体２５８−ｃｓ１.０４＿重鎖：アミノ酸配列
【化６】
2018532383.tif 000007
【０２２３】
抗体２５８−ｃｓ１.０４＿軽鎖：ＤＮＡ配列
【化７】
2018532383.tif 000008
【０２２４】
抗体２５８−ｃｓ１.０４＿軽鎖：アミノ酸配列
【化８】
2018532383.tif 000009
【０２２５】
表１は２つの抗ヒトＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＣＤＲ及び可変領域のアミノ酸配列並びに可変領域配列を記載する。
【表１】
2018532383.tif 000010
【０２２６】
実施例２．エフェクター免疫細胞上のＴＩＧＩＴの幅広い発現
ｍＡｂによるＴＩＧＩＴの認識を調べるために、発現細胞上の２×１０５個のＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ（Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙらによって以前記載されているように、前出）を、３０分間、氷上で０.２マイクログラムの抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂクローンＶＳＩＧ９＃１又は＃４とインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液での２回の洗浄後に、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体アレクサフルオロ（登録商標）６４７コンジュゲート（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、氷上でさらに３０分間添加した。図１Ａに示すように、ｍＡｂは、ＹＴＳ細胞上ではなく、発現細胞上のＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ上のＴＩＧＩＴタンパク質を認識する（右の曲線）。ｍＩｇＧを対照として使用した。次に、ＶＳＩＧ−９＃１を、２人の健康なドナーからの活性化ＮＫ細胞について調べた。図１Ｂに示すように、ｍＡｂは、ＮＫ細胞（ＦＡＣＳヒストグラムプロット中の右の曲線）を認識した。ｍＩｇＧを対照として使用した（左の曲線）。
【０２２７】
次に、ＶＳＩＧ９＃１を、黒色腫患者から得られた２つのＣＤ８＋Ｔ細胞集団（ＴＩＬ−Ｉ及びＴＩＬ−ＩＩ）上で調べた。図１Ｃに示すように、該ｍＡｂはＴ細胞を認識した（ＦＡＣＳヒストグラムプロット中の右の曲線）。ｍＩｇＧを対照として使用した（左の曲線）。全体的に、図１Ａ〜１Ｃは、免疫細胞上のＴＩＧＩＴの広範な発現を示し、ＶＳＩＧ９＃１ ｍＡｂは、免疫細胞に結合することができることを実証する。
【０２２８】
実施例３．抗ＴＩＧＩＴ ＶＳＩＧ９＃１は腫瘍細胞へのＴＩＧＩＴ−Ｆｃ結合を阻止する
腫瘍細胞へのＴＩＧＩＴ−Ｆｃ結合に対するＶＳＩＧ９＃１の効果を調べるために、２.５×１０５個のＨｅｐＧ２細胞（高レベルのＰＶＲ、ネクチン−２及びネクチン−３を発現する）を、氷上で３０分間、ｍＡｂを含めず（図２Ａ、矢印１）、示した濃度のｍＩｇＧ（図２Ａ、矢印２）又は抗ＴＩＧＩＴ−ＶＳＩＧ９＃１（図２Ａ、矢印３及び４）を含めて、２５マイクログラム／ウェルのｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートし、アレクサフルオロ（登録商標）６４７抗ヒトＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて検出を行った。ＨｅｐＧ２細胞上のＴＩＧＩＴリガンド、ＰＶＲ、ネクチン−２及びネクチン−３の発現を、図２Ｂに示している。
【０２２９】
結果は、ｍＡｂが腫瘍細胞へのＴＩＧＩＴ結合を防止できることを実証し、該抗体が免疫応答の阻害を防止することができることを示唆する。
【０２３０】
実施例４．ＶＳＩＧ−９＃１ ｍＡｂは死滅活性を高める
エフェクター細胞の死滅活性に対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの効果を調べるために、ＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ ＮＫ細胞を、２.５マイクログラム／ｍｌの対照ｍＩｇＧ（左のバー）又は抗ＴＩＧＩＴ ＶＳＩＧ９＃１（右のバー）の存在下で３５Ｓ標識７２１.２２１−ＰＶＲ細胞とインキュベートした（＊ｐ＜０.０２）。前述のように、特異的死滅を計算した（Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙら、前出）。死滅率を５時間後に調べた。図３Ａに示すように、抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１は死滅活性を高める。次に、特異的な死滅活性を、３５Ｓで標識し、対照ｍＩｇＧ（左のバー）又はＶＳＩＧ９＃１（右のバー）の存在下で健康なドナーからのＮＫ細胞とインキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞について調べた。死滅率を、５時間後に測定した（＊＊ｐ＜０.００２）。図３Ｂに示すように、ＶＳＩＧ９＃１は死滅効果を高める。２つの抗体の特異的な死滅活性も、ＭＥＬ５６２黒色腫細胞を用いて調べた。図３Ｃに示すように、２つのｍＡｂの２５８−ＣＳ１＃４（中央のバー）及びＶＳＩＧ９＃１（左のバー）は、対照抗体ｍＩｇＧと比較して、これらの細胞の死滅効果を有意に（＊＊ｐ＜０.０５）高める（右のバー）。最後に、ＶＳＩＧ９＃１の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（アービタックス（登録商標））とインキュベートし、それぞれ、１０：１のエフェクター細胞：標的細胞の割合で対照ｍＡｂ（左のバー）又はＶＳＩＧ９＃１（右のバー）とプレインキュベートしたＮＫ細胞に添加した３５Ｓで標識したヒト肝細胞ＨｅｐＧ２細胞上で調べた（＊＊＊ｐ＜０.０００７）。図３Ｄに示すように、ＶＳＩＧ９＃１は死滅効果を高めることができる。
【０２３１】
結果は、試験した抗ヒトｍＡｂ ＶＳＩＧ９＃１及び２５８−ＣＳ１＃４が、異なる標的細胞上で及び様々な条件において死滅効果を高めることができることを実証する。ｍＡｂは、ＴＩＧＩＴ受容体の阻害効果を防止し、したがって、抗癌剤としての使用に適する。
【０２３２】
実施例５．抗体＃４及びＶＳＩＧ９＃１はＰＶＲへのＴＩＧＩＴ結合を阻止する
ＴＩＧＩＴのそのリガンドとの相互作用を阻止するｍＡｂ２５８−ＣＳ１＃４及びＶＳＩＧ９＃１の能力を調べるために、ＰＶＲ、ネクチン−２及びネクチン−３を発現するＨｅｐＧ２細胞を、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートするか、又はｍＡｂ ＶＳＩＧ−９＃１（図４Ａ）若しくはｍＡｂ  ２５８−ＣＳ１＃４（図４Ｂ）とプレインキュベートした後にＴＩＧＩＴ−Ｆｃとインキュベートした。結果は、ＶＳＩＧ−９＃１とＴＩＧＩＴ−ＦｃのプレインキュベーションがＴＩＧＩＴ−Ｆｃ結合を完全に阻止するが（図４Ａ）、ｍＡｂ ２５８−ＣＳ１＃４とのプレインキュベーションは、部分的にＴＩＧＩＴ−Ｆｃ結合を阻止した（図４Ｂ）ことを示した。
【０２３３】
実施例６．抗体２５８−ＣＳ１＃４及びＶＳＩＧ−９＃１はＴＩＧＩＴに対する高い卓越した親和性を示す
２つの供給源からのヒトＴＩＧＩＴに対するｍＡｂの完全結合動態分析を、ビアコアを用いて行った。図５Ａ及び５Ｂに示す結果は、２つのｍＡｂがヒトＴＩＧＩＴに高い親和性を示すことを示す。２５８−ＣＳ１＃４（＃４）と命名したｍＡｂは、約１×１０−７Ｍの平均Ｋｄを有してるが（平均９.９６×１０−８Ｍ及び１.０７×１０−７Ｍ）、ｍＡｂ  ＶＳＩＧ−９＃１は、４.５×１０−１０Ｍ（平均５.１３×１０−１０Ｍ及び３.８７×１０−１０Ｍ）のＫｄを有するヒトＴＩＧＩＴに非常に高い親和性で結合する。
【０２３４】
ｍＡｂ  ＶＳＩＧ−９＃１は、ヒトのＴＩＧＩＴに特異的であり、マウスＴＩＧＩＴと結合しないことがさらに示された。
【０２３５】
実施例７．抗体ＶＳＩＧ９＃１は市販の抗体ＭＢＳＡ４３と比較してＴＩＧＩＴに対してより高い親和性を示す
ＴＩＧＩＴに対する抗体ＶＳＩＧ９＃１及びＭＢＳＡ４３の結合親和性を比較した。７５×１０３個のＴＩＧＩＴ発現ＹＴＳ細胞を、ＦＡＣＳによる決定後に、２５０ｎＭから６５ｆＭの連続希釈濃度で、２つの抗体で染色した。図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＶＳＩＧ＃９は６２.５ｆＭのような低濃度で細胞を染色したが、ＭＢＳＡ４３は、１９５０ｆＭ（１.９５ｐＭ）を超えた時だけ細胞を染色し、最後の４つの希釈で染色を示さなかった。２つの抗体間での明瞭な染色の違いは、２５０ｐＭの濃度まで見られる。ＭＢＳＡ４３抗体と比較したＶＳＩＧ９＃１抗体の優位性も、図６Ｂに示している。
【０２３６】
実施例８．ＶＳＩＧ９＃１の阻止活性は市販の抗体ＭＢＳＡ４３の１つよりも高い
ＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ結合に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体阻止効果を調べるために、ＰＶＲ−ＦｃでのＴＩＧＩＴ発現ＹＴＳ細胞の染色アッセイを行った。７５×１０３個のＹＴＳ−ＴＩＧＩＴ細胞を２倍希釈系列で、２７から０.０１４ｐｍｏｌｅの濃度範囲で、ＶＳＩＧ９＃１又はＭＢＳＡ４３の存在下で、２.５ｐｍｏｌｅのＰＶＲ−Ｆｃとインキュベートした。
【０２３７】
図７Ａ（結合したＰＶＲの検出）及び７Ｂ（結合した抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂの検出）に示すように、ＶＳＩＧ−９＃１のＰＶＲ−ＴＩＧＩＴ阻止活性は、ＭＢＳＡ４３と比較して有意に高かった。
【０２３８】
実施例７及び８の結果は、ＶＳＩＧ９＃１が、ＭＢＳＡ４３と比較してヒトＴＩＧＩＴに対して有意に高い親和性を有すること、かつ濃度の範囲にわたって、高親和性リガンド（ＰＶＲ）の結合を防止するのに有意に優れていることを実証する。
【０２３９】
実施例９．他のチェックポイント分子阻害剤との抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂの相乗活性
単独で又は他の免疫調節剤と組み合わせたｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１（Ｖｓｉｇ９.０１）の、ＴＩＧＩＴの阻止によるＴ細胞増殖の誘導に対する効力を調べた。健康なドナーからのＰＢＭＣを、５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、抗ＣＤ３抗体で活性化した後、単独で又は組み合わせた４μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ＶＳＩＧ９＃１、抗ＰＤ−１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）及び抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）の存在下で、ｈＣＤ８０を過剰発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と５〜９日間インキュベーションした。増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。
【０２４０】
少なくとも５つの異なる実験からまとめた図８に示す結果は、他のチェックポイント抗体とＶＳＩＧ９＃１の組み合わせについて有意に増加したＴ細胞増殖によって実証された抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂと抗ＰＤ−１又は抗ＣＴＬＡ４の相乗作用を示す（＊ｐ＜０.０４ ＊＊＜０.０１５ ＊＊＊＜０.０００４）。
【０２４１】
実施例１０．ヒト腫瘍のマウスモデルにおけるヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体のインビボ効果
抗体の抗腫瘍効果は、インビボで研究されている。ヒト癌の阻害における本明細書に記載の抗体の有効性を推定するために、該抗体は、腫瘍とヒト由来のリンパ球の両方を組み合わせたモデルにおいて研究されている。免疫能力を回復するために、重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）にｈＰＢＬを移植する。マウスにヒト癌細胞を負荷し、腫瘍負荷の数日後に単回又は複数回の血管内用量で投与する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体で濃度を増加して治療する。
【０２４２】
ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍株を有する同様のモデルを、Ｐａｉｎｅ−Ｍｕｒｒｉｅｔａ ＧＤ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７；４０（３）：２０９−１４に従って行う。
【０２４３】
実施例１１．ヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＳＣＩＤマウスにおけるヒト黒色腫（ＳＫ−２８）の阻害
ヒト癌の阻害における抗ＴＩＧＩＴ抗体の有効性を推定するために、腫瘍とヒト由来のリンパ球の両方を組み合わせたモデルにおいて該改変抗体を調べる。免疫能力を回復するために、重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）にｈＰＢＬを移植する。マウスに、ヒト黒色腫細胞（ＳＫ−２８）を負荷し、腫瘍接種後１１日目に、単一のｉ．ｖ．用量で投与する抗体で濃度を増加して治療する。
【０２４４】
同様に、Ｈａｒｄｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９７ Ｍａｙ ２７；９４（１１）：５７５６−５７６０によって記載されたモデルを用いる。
【０２４５】
実施例１２．ヌードマウスにおける抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂによるヒト結腸癌肝転移の免疫療法
ＬＩＭ６及びＨＭ７は、高いムチン合成及び転移能について選択されたヒトＣＲＣ細胞株ＬＳ１７４Ｔの２つのサブクローンである。腫瘍細胞を、麻酔したヌードマウスの露出した脾臓に注入する。数分後、脾臓を除去し、切除部を塞ぐ。低用量の本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を１０日後に投与し、マウスを腫瘍接種後３５日目に屠殺する。肝臓は秤量し、転移性結節の数を計数し、組織学及び免疫組織化学研究のために肝臓組織を処理する。
【０２４６】
本発明の抗体及びその断片を試験するために使用することができる追加の転移モデルは、Ｙｕｎｇら，Ｏｃｕｌ Ｏｎｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１５ Ａｐｒ；１（３）：１５１−１６０によって記載された。
【０２４７】
実施例１３．抗ＴＩＧＩＴ抗体はＡＭＬ細胞上で相乗効果を有する
骨髄穿刺液をフィコール分離後にＡＭＬ患者から得、免疫細胞及び芽細胞を１２日間様々な抗体（４μｇ／ｍｌで）と共培養し、１２日後にＴ細胞の量を確立した。
【０２４８】
図９に示すように、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＳＩＧ−９＃１ ｍＡｂの存在下で、ＣＤ８ Ｔ細胞の量の有意な増加が観察された。興味深いことに、ＴＩＧＩＴの阻止は、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の阻止と相乗効果を有していた。
【０２４９】
特定の実施形態の上記の説明は、過度の実験をすることなく、一般的な概念から逸脱することなく、現在の知識を適用することにより、そのような特定の実施形態を容易に変更及び／又は様々な用途に適合させることができるほど完全に本発明の一般的な性質を明らかにしているので、したがって、そのような適合及び変更は、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書中で用いられる用語又は専門用語は、説明の目的のためであり、限定するものではないことが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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