(57)【要約】止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた止血材が開示される。本発明によって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックス上に共有結合により固定化して、それを必要とするヒト患者への投与に適切な改善された止血材を得ることができることが初めて示される。好ましい実施形態として、ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ７またはＴＲＡＰ８を合成ヒドロゲルマトリックス（例えば、ポリビニルアルコールベースのポリマー）に共有結合によりカップリングすることにより、相当な期間にわたって安全な局所的方法で血小板活性化のための活性を維持して、特に血小板凝集の誘導によって止血の改善を可能にする適切な止血材が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた、止血材。
【請求項２】
前記生体適合性マトリックスが止血マトリックスであり、生体材料、好ましくはタンパク質、バイオポリマーまたは多糖マトリックス、特にコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、デンプンまたはキトサンマトリックス；および合成ポリマー、好ましくはポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールまたはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）からなる群より選択される、請求項１に記載の止血材。
【請求項３】
前記トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、好ましくはＴＲＡＰ８、ＴＲＡＰ７、ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ１−４１、ＳＬＩＧＫＶ（ＰＡＲ−２（ヒト）の場合）、ＴＦＲＧＡＰ（ＰＡＲ−３（ヒト）の場合）、ＧＹＰＧＱＶ（ＰＡＲ−４（ヒト）の場合）またはそれらのアミド化形態およびそれらの混合物である、請求項１または２に記載の止血材。
【請求項４】
前記マトリックスが、スポンジ、織布もしくは不織布、予成形形状、好ましくは抜歯のためのシリンダーもしくはコーン、微粒子状材料もしくは粒状材料またはシートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の止血材。
【請求項５】
前記マトリックスがポリビニルアルコールを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の止血材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の止血材を生産するための方法であって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングする、方法。
【請求項７】
前記トロンビン受容体活性化剤が、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、好ましくはＴＲＡＰ８、ＴＲＡＰ７、ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ１−４１、ＳＬＩＧＫＶ（ＰＡＲ−２（ヒト）の場合）、ＴＦＲＧＡＰ（ＰＡＲ−３（ヒト）の場合）、ＧＹＰＧＱＶ（ＰＡＲ−４（ヒト）の場合）またはそれらのアミド化形態およびそれらの混合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記トロンビン受容体活性化剤に結合する官能基で前記生体適合性マトリックスを活性化する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
好ましくはバイオ直交基、例えばアルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジンを有するペプチド配列で、特に−ＳＨ基を有するシステイン部分で、前記トロンビン受容体活性化剤を活性化する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
エン基で、特にノルボルネン、マレイミド、アリル、ビニルエステル、アクリレート、ビニルカーボネートまたはメタクリレートで、前記生体適合性マトリックスを活性化する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
光反応によって、好ましくは光誘発性クリックケミストリー（光誘発性バイオ直交反応）によって、特にチオール−ノルボルネン光クリックケミストリーによって、前記化学的カップリングを実施する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
手術において、ならびに／または傷害および／もしくは創傷の処置において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の止血材。
【請求項１３】
好ましくは、手術において、ならびに／または傷害および／もしくは創傷の処置において使用するためのキットであって、
−請求項１〜５のいずれか一項に記載の止血材、および
−好ましくは、緩衝溶液、特にＣａ２＋イオンを含有する緩衝溶液、シリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションの群より選択される少なくとも１つの投与デバイス
を含む、キット。
【請求項１４】
前記緩衝溶液が、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはＥＣＥＡ、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはＥＣＥＡ、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分を有する容器をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血材、ならびにこのような材料を生産および使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
制御不能な出血は依然として、外傷性傷害および外科的傷害の主な死亡原因である［１］。したがって、出血を制御するための有効な治療アプローチの開発は、最重要の臨床的および社会的な価値である。過去数十年で、フィブリンベースの接着剤または封止剤［３ａ，ｂ］、ゼオライト粉末［４ａ，ｂ］、架橋ゼラチンマトリックス［５ａ，ｂ］などを含む多くの止血製品［２］が開発されている。しかしながら、これらの各製品にはそれぞれ制限がある。フィブリン製品は、高コスト、短い保存期間および弱い機械的強度という欠点がある［６］。ゼオライト鉱物は重度の熱傷を引き起こす傾向があり、非分解性である［６］。架橋ゼラチンマトリックスは、高用量のトロンビンと組み合わせた場合にのみ、数分以内に出血を止めることができた［７］。しかしながら、トロンビンは、自己タンパク質分解性であるので、溶液中では不安定である。高濃度のトロンビンは、ヒトケラチノサイトのアポトーシスを誘導することが公知であり、創傷治癒の障害を引き起こし得る［８］。したがって、改善された安全性を有する代替止血材を設計する強い必要性が存在する。特に、高濃度トロンビンの使用を回避する有効な戦略を設計することが、望ましい解決策である。
【０００３】
トロンビンは、血液凝固（凝固）において重要な役割を果たすセリンプロテアーゼである［９ａ，ｂ］。重要な凝固プロテアーゼとして、トロンビンは、可溶性フィブリノゲンを、トランスグルタミナーゼ（ＦＸＩＩＩ）によって架橋されたフィブリンネットワークに変換する［１０］。加えて、トロンビンは、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）を刺激することによって、血小板の最も強力な活性化因子である［１１，１２］。トロンビンによって活性化されると、血小板は、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の立体構造を物理的に変化させ、フィブリノゲンに対する高親和性結合部位を提供し、フィブリノゲン架橋血小板凝集を提供する。ＰＡＲ−１およびＰＡＲ−４は両方ともヒト血小板上に存在するが、トロンビンによるヒト血小板の活性化は、ＰＡＲ−１によって主に媒介される［１３］。トロンビンによるＰＡＲ−１活性化の分子機構は、図７Ａに示されている。ＰＡＲ−１は血小板で高発現され［１４ａ，ｂ］、ＰＡＲ−１活性化は、トロンビンによるＰＡＲ−１受容体の細胞外Ｎ末端ドメインの一部のタンパク質分解切断によって開始される。タンパク質分解は、細胞外ループ２内の受容体と相互作用してＰＡＲ−１活性化のシグナル伝達経路をトリガーする新たなＮ末端リガンドドメイン（ＳＦＬＬＲＮ（配列番号１）、別名トロンビン受容体アゴニストペプチド−６、ＴＲＡＰ６）を生成する。短いＴＲＡＰ６ペプチド（ＳＦＬＬＲＮ）は、強力な血小板活性化因子として別個に働き、ＰＡＲ−１シグナル伝達を介して血小板凝集を刺激することが証明されている［１５］。Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）ＴＲＡＰ試験は、ＴＲＡＰ６によってトリガーされる血小板機能の定量的測定の、全血または多血小板血漿での標準的なインビトロアッセイになっている。ＴＲＡＰ試験は、フィブリン形成（他の方法では、サンプル中でトロンビン阻害剤を使用するので、トロンビンがアゴニストである場合にこれが起こる）をトリガーせずに、ＰＡＲ−１シグナル伝達によって活性化される血小板機能の分析を可能にする。
【０００４】
国際公開第９６／４００３３Ａ１号には、εアミノカプロン酸およびトロンビン受容体活性化ペプチドを含む止血剤を有する止血材であって、前記薬剤がマトリックス上に物理的に（しかし非共有結合により）吸着されたマトリックスが得られるように、前記止血剤が止血マトリックス上にスプレーまたはコーティングされた止血材が開示されている。このようなパッチは、患者の出血部位に接触されると、それに提供された止血剤がパッチから容易に剥離するという欠点を有する。特に循環アンタゴニストが循環中に存在しないので、全身血栓症イベントを誘発する潜在的な危険性がある。
【０００５】
国際公開第０３／０５７０７２Ａ２号には、セルロースおよびそれに共有結合された多糖を含む止血組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９６／４００３３号
【特許文献２】国際公開第０３／０５７０７２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】H.  B.  Alam,  D.  Burris,  J.  A.  DaCorta,  P.  Rhee,  Mil  Med  2005,  170,  63.
【非特許文献２】W.  D.  Spotnitz,  S.  Burks,  Transfusion  2008,  48,  1502;  A.  M.  Behrens,  M.  J.  Sikorski,  P.  Kofinas,  Journal  of  biomedical  materials  research.  Part  A  2014,  102,  4182.
【非特許文献３】H.  Redl,  G.  Schlag,  in  Fibrin  Sealant  in  Operative  Medicine,    (Eds:  G.  Schlag,  H.  Redl),  Springer  Berlin  Heidelberg,    1986,  13
【非特許文献４】H.  C.  Hedrich,  M.  Simunek,  S.  Reisinger,  J.  Ferguson,  H.  Gulle,  A.  Goppelt,  H.  Redl,  Journal  of  Biomedical  Materials  Research  Part  B:  Applied  Biomaterials  2012,  100B,  1507.
【非特許文献５】T.  A.  Ostomel,  Q.  Shi,  G.  D.  Stucky,  Journal  of  the  American  Chemical  Society  2006,  128,  8384
【非特許文献６】T.  A.  Ostomel,  Q.  Shi,  P.  K.  Stoimenov,  G.  D.  Stucky,  Langmuir  :  the  ACS  journal  of  surfaces  and  colloids  2007,  23,  11233.
【非特許文献７】M.  C.  Oz,  J.  F.  Rondinone,  N.  S.  Shargill,  Journal  of  cardiac  surgery  2003,  18,  486
【非特許文献８】L.  Y.  Han,  V.  Schimp,  J.  C.  Oh,  P.  T.  Ramirez,  International  journal  of  gynecological  cancer  :  official  journal  of  the  International  Gynecological  Cancer  Society  2004,  14,  621
【非特許文献９】R.  Lemmer,  M.  Albrech,  G.  Bauer,  The  journal  of  obstetrics  and  gynaecology  research  2012,  38,  435.
【非特許文献１０】M.  Mehdizadeh,  J.  Yang,  Macromol  Biosci  2013,  13,  271.
【非特許文献１１】T.  J.  Guzzo,  R.  A.  Pollock,  A.  Forney,  P.  Aggarwal,  B.  R.  Matlaga,  M.  E.  Allaf,  Journal  of  endourology  /  Endourological  Society  2009,  23,  279.
【非特許文献１２】A.  Gugerell,  K.  Schossleitner,  S.  Wolbank,  S.  Nuernberger,  H.  Redl,  H.  Gulle,  A.  Goppelt,  M.  Bittner,  W.  Pasteiner,  Journal  of  Biomedical  Materials  Research  Part  A  2012,  100A,  1239.
【非特許文献１３】H.  H.  Versteeg,  J.  W.  M.  Heemskerk,  M.  Levi,  P.  H.  Reitsma,  Physiological  Reviews  2013,  93,  327
【非特許文献１４】S.  R.  Coughlin,  Nature  2000,  407,  258.
【非特許文献１５】H.  P.  Kohler,  Blood  2013,  121,  1931.
【非特許文献１６】K.  J.  Clemetson,  Thrombosis  research  2012,  129,  220.
【非特許文献１７】S.  R.  Macfarlane,  M.  J.  Seatter,  T.  Kanke,  G.  D.  Hunter,  R.  Plevin,  Pharmacological  reviews  2001,  53,  245.
【非特許文献１８】H.  Andersen,  D.  L.  Greenberg,  K.  Fujikawa,  W.  Xu,  D.  W.  Chung,  E.  W.  Davie,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  1999,  96,  11189.
【非特許文献１９】S.  R.  Coughlin,  Journal  of  thrombosis  and  haemostasis  :  JTH  2005,  3,  1800
【非特許文献２０】K.  M.  Austin,  L.  Covic,  A.  Kuliopulos,  Blood  2013,  121,  431.
【非特許文献２１】R.  R.  Vassallo,  Jr.,  T.  Kieber-Emmons,  K.  Cichowski,  L.  F.  Brass,  The  Journal  of  biological  chemistry  1992,  267,  6081.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、出血を制御するための改善された止血材であって、トロンビン受容体活性化剤を有する止血材を提供することである。
【０００９】
それゆえ、本発明は、止血材であって、トロンビン受容体活性化剤が生体適合性マトリックスに共有結合によりカップリングされた、止血材を提供する。
【００１０】
本発明によって、トロンビン受容体活性化剤を生体適合性マトリックス上に共有結合により固定化して、それを必要とするヒト患者への投与に適切な改善された止血材を得ることができることが初めて示される。好ましい実施形態として、ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ７またはＴＲＡＰ８を合成ヒドロゲルマトリックス（例えば、ポリビニルアルコールベースのポリマー）に共有結合によりカップリングすることにより、相当な期間にわたって安全な局所的方法で血小板活性化のための活性を維持して、特に血小板凝集の誘導によって止血の改善を可能にする適切な止血材が得られた。
【００１１】
本発明の生体適合性マトリックスは、特にヒト患者の創傷被覆または（例えば、器官内の）容積不足の充填のために、ヒト患者への投与に使用可能な任意のマトリックスであり得る。本発明によれば、このような目的のために先行技術で示唆されているマトリックス材料を使用することが好ましい。一般に、「生体適合性」マトリックスは、ヒト患者に投与され得るマトリックスであって、この投与および患者との接触の間にネガティブな効果を誘導しないマトリックスである。「生体適合性」マトリックスは、生存組織（例えば、創傷の表面に露出したヒト組織）を脅かし、汚染し、妨害し、または悪影響を与える材料または成分を含有しないマトリックスである。このようなマトリックスの例は、「古典的な」創傷被覆材、例えばパッチ、スポンジだけではなく、流動性または噴霧性マトリックス、粉末など、例えばＦｌｏＳｅａｌ（商標）（架橋ゼラチンマトリックス）、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（ウシゼラチンペースト）もある。パッチは、一般的な創傷被覆材にとって有利であるのに対して、最も顕著な流動性マトリックスである非物質性（ｎｏｎ−ｍａｔｅｒｉａｌ）止血薬は、液体／固体アプローチとは対照的に同じ相内に送達され得るか、または空洞をフレキシブルに充填し、もしくはフレキシブルな足場を提供するために使用され得る（「容積不足」）。マトリックスは、トロンビン受容体活性化剤が本発明のマトリックスに共有結合によりカップリングされ得るように、化学的に活性であるべきかまたは化学的に活性化されるべきである。例えば、マトリックスへのトロンビン受容体活性化剤の共有結合を可能にするために、マトリックスは、ヒドロキシル基、ビニル基、カルボキシル基またはアミノ基を有し得る。
【００１２】
好ましくは、マトリックスは、止血マトリックスである（すなわち、マトリックス材料自体が止血特性を既に有する）。このような材料は当技術分野で十分に利用可能であり、例えば、コラーゲン、ゼラチンまたはキトサンを含む。
【００１３】
好ましい生体適合性マトリックスは、生体材料、好ましくはタンパク質、バイオポリマーまたは多糖マトリックス、特にコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、デンプンまたはキトサンマトリックス；および合成ポリマー、好ましくはポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などからなる群より選択される。
【００１４】
好ましくは、本発明のマトリックスは、生分解性である（すなわち、それは、しばらくすると患者の体によって自然に吸収される）。いずれにせよ、材料（マトリックスを含む）は、生体適合性でなければならない（すなわち、材料が投与される患者に有害な効果を及ぼさない）。止血が体内で達成され（すなわち、手術の過程において）、その部位が手術後に閉鎖される状況では、このような生分解性材料が特に適切である。
【００１５】
したがって、マトリックスは、好ましくは、バイオポリマー、例えばタンパク質または多糖から選択される生体材料である。特に好ましいのは、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、多糖、例えばヒアルロン酸、キトサンおよびそれらの誘導体、より好ましくはコラーゲンおよびキトサンからなる群より選択される生体材料、特に好ましくはコラーゲンである。本発明に使用されるこのようなコラーゲンマトリックスは、多孔性マトリックスまたは繊維性マトリックスおよび粒子に加工され得る液体材料、ペースト状材料、繊維材料または粉末コラーゲン材料からの材料を含む、ゲルを形成するために適切な任意のコラーゲンに由来し得る。スポンジまたはシートの生産のためのコラーゲンゲルの調製は、ゲル形成が起こるまで酸性化し、続いてｐＨを中和することを含み得る。ゲル形成能または溶解性を改善するために、乾燥時に安定なスポンジまたはシートを形成する特性が低下しない限り、コラーゲンは、（部分的に）加水分解または改変され得る。トロンビン受容体活性化剤をカップリングするために使用されるマトリックスは、バイオポリマー（すなわち。天然に存在するポリマー）もしくはその誘導体であり得るか、または合成ポリマーであり得る。本発明の止血材において有用なバイオポリマーの例としては、ポリペプチド、例えばコラーゲン、コラーゲン誘導体、例えばゼラチン、エラスチンおよびエラスチン誘導体ならびに多糖、例えばヒアルロン酸、デンプン、セルロースまたはその誘導体、例えば酸化セルロースが挙げられる。好ましくは、バイオポリマーはヒトバイオポリマーであり、個体から単離され得るか、または合成バイオポリマー、例えば組換え生産されたバイオポリマーであり得る。
【００１６】
様々な実施形態では、マトリックスは、組換えヒトポリマーを含む。特に、組換えヒトポリマーは、組換えヒトコラーゲン、例えば組換えヒトＩ型コラーゲン、組換えヒトＩＩＩ型コラーゲンまたはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、マトリックスは、組換えヒトＩＩＩ型コラーゲンを含む。別の実施形態では、マトリックスは、組換えヒトＩ型コラーゲンを含む。例えば、組換えヒトゼラチンは、組換えヒトＩＩＩ型コラーゲンに由来し得る。さらに別の実施形態では、マトリックスは、組換えヒトＩ型コラーゲン由来の組換えゼラチンを含む。さらなる実施形態では、マトリックスは、コードするポリヌクレオチドの発現によって直接生産される組換えゼラチンを含む。
【００１７】
本発明においてマトリックスとして使用される多糖は、好ましくは、セルロース、アルキルセルロース、メチルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギン酸塩、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、ポリグルロン酸、前記多糖の誘導体またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１８】
本発明のマトリックスはまた、合成ポリマーをベースとするものであり得る。合成吸収性ポリマーは、脂肪族ポリエステルポリマー、脂肪族ポリエステルコポリマーまたはそれらの組み合わせであり得る。
【００１９】
本発明のマトリックスはまた、繊維から作製される織布または不織布の形態で提供され得る。このような繊維は、好ましくは、生体適合性および／または生分解性材料から作製される。止血用布地を提供するために、多くのこのような繊維がこれまでに使用されてきた。いくつかの実施形態では、このような不織布または織布は、ペクチン、アセチル化ペクチン、ヒアルロン酸およびそれらの誘導体などの１つまたはそれを超える多糖を含み得る。いくつかの実施形態では、ペクチンおよび／またはアセチル化ペクチンは、サトウダイコンに由来し得る。他の実施形態では、多糖は、非セルロースの多糖であり得る。織布または不織布はまた、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ｔ−カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリカプロラクトン、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシ吉草酸）、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、ゼラチン、フィブリノゲン、エラスチン、ポリエーテル、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリトリメチレンカーボネートなどを含む他の生分解性ポリマーを含む繊維を含み得る。加えて、綿、絹および羊毛などの天然タンパク質繊維も使用され得る。
【００２０】
本発明のマトリックス材料は、好ましくは、流動性止血薬のための粉末またはマトリックスを含む様々な形態の顆粒として提供され得る。例えば、顆粒は、１〜１．０００μｍ、好ましくは１０〜１．０００μｍ、特に２００〜８００μｍの（平均粒子）サイズを有し得る。流動性止血薬として適切なマトリックスは、例えば、国際公開第９８／０８５５０Ａ号または国際公開第２００３／００７８４５号Ａに開示されている。
【００２１】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、マトリックス材料としてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用する。ＰＶＡは、ポリ酢酸ビニルの部分的加水分解から生じる水溶性ポリマーである。本発明のマトリックスとして使用されるＰＶＡ系ヒドロゲルは、それらの優れた生体適合性（ＦＤＡ承認）のために、組織工学および薬物送達システムにおいて広く使用されている［１６ａ，ｂ］。加えて、ＰＶＡヒドロゲルは、ほとんどの他の合成ヒドロゲルよりも比類なく強いことが周知である。
【００２２】
本発明は、止血に適切なマトリックスに共有結合されたトロンビン受容体活性化剤を使用する。トロンビン受容体活性化剤の好ましい実施形態は、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）である。ＴＲＡＰは、トロンビン受容体の新たなＮ末端領域に対応する様々なアミノ酸長のペプチドのファミリーである。これらの合成ペプチドまたは組換えペプチドは、トロンビン受容体タンパク質の細胞外部分の活性化形態を模倣し、トロンビンアゴニストとして機能する。
【００２３】
米国特許第５，２５６，７６６号Ａおよび国際公開第９６／４００３３Ａ１号には、例えば血友病の内部出血部位への局所適用における血液凝固を促進するために有用なＴＲＡＰまたは「アゴニスト」を含有する医薬化合物および止血パッチが記載されている。アゴニストは、線維芽細胞増殖およびそれと同時に血小板凝集を刺激するトロンビンの能力を模倣するものとして開示されている。したがって、ＴＲＡＰは、止血および創傷治癒の促進において有用であり得る。ＴＲＡＰの使用によって、トロンビンおよびフィブリノゲンなどの生物学的化合物を全く含まず、ウイルス汚染の付随する危険性を全く伴わないことを可能にする有効な止血材および止血包帯が提供され得る。
【００２４】
本発明の材料に組み込まれ得る代表的なＴＲＡＰとしては、トロンビン受容体を活性化することができるペプチド、例えば米国特許第５，２５６，７６６号において式ＡＡｘ−−ＡＡｙ−−（ＡＡｉ）ｎ−−ｚで識別されるアゴニストが挙げられる。
【００２５】
開示されている他のＴＲＡＰであって、線維芽細胞を活性化し、創傷治癒に関与する他のＴＲＡＰとしては、ペプチドＴＲＡＰ  ５０８〜５３０、アミノ酸ＡＧＹＫＰＤＥＧＫＲＧＤＡＣＥＧＤＳＧＧＰＦＶ（配列番号２）；およびＴＲＡＰ  ５１７〜５３０、アミノ酸ＲＧＤＡＣＥＧＤＳＧＧＰＦＶ（配列番号３）が挙げられる。さらなる適切なＴＲＡＰは、Ｃａｒｎｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１４６９１４７７（１９９２）；Ｆｕｒｍａｎら、ＰＮＡＳ  ９５（１９９８），３０８２−３０８７およびＣｒｏｍａｃｋら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５３：１１７（１９９２）に開示されている。したがって、本発明において有用な適切なＴＲＡＰとしては、例えば、ペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号４）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号５）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ（配列番号６）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹ（配列番号７）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫ（配列番号８）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ（配列番号９）、ＳＦＬＬＲＮＰＮ（ＴＲＡＰ８（配列番号１０））、ＳＦＬＬＲＮＰ（ＴＲＡＰ７（配列番号１１））、ＳＦＬＬＲＮ（ＴＲＡＰ６）、ＳＦＬＬＲ、ＳＦＬＬおよびＳＦＬならびにそれらのアミド化形態が挙げられる。ＴＲＡＰは小さいペプチドであるので、それらは、トロンビンなどの大型タンパク質性血小板活性化剤よりも安定である。ＴＲＡＰの安定性は、冷凍せずに保存することを可能にする本材料の特性に寄与する。
【００２６】
好ましくは、ＴＲＡＰをマトリックスに共有結合によりカップリングするために、トロンビン受容体活性化剤（好ましくは、ＴＲＡＰ）は、リンカーと共に提供される。好ましいリンカーは、アミノ酸（単一アミノ酸、例えばシステイン、アルギニン、リジン、セリン、グリシンなど（好ましくは、システイン）であるか、または例えば２〜５個のアミノ酸残基を有する短いアミノ酸リンカーであって、好ましくは、システイン、アルギニン、リジン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびグリシンの群より選択されるアミノ酸を含む短いアミノ酸リンカーである。好ましいジペプチドリンカーは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−（末端の「−」は、トロンビン受容体活性化剤に対する結合を示す）、−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ｃｙｓ、−Ａｓｎ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ａｓｎ−、−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−であり得る；好ましいトリペプチドリンカーは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−、Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−、−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓなどであり得るか、または担体もしくはマトリックスに対する医薬ペプチドカップリングについて公知の２〜５個のアミノ酸残基を含む任意の他のペプチドリンカーであり得る。
【００２７】
特に好ましい実施形態によれば、本材料のトロンビン受容体活性化剤は、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、好ましくはＴＲＡＰ８、ＴＲＡＰ７、ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ１−４１、ＳＬＩＧＫＶ（ＰＡＲ−２（ヒト）の場合（配列番号１２））、ＴＦＲＧＡＰ（ＰＡＲ−３（ヒト）の場合（配列番号１３））、ＧＹＰＧＱＶ（ＰＡＲ−４（ヒト）の場合（配列番号１４））またはそれらのアミド化形態およびまたはこのような因子の混合物である。
【００２８】
本発明の止血材は、止血材を必要とするヒト患者の処置に使用可能な任意の適切な形態（すなわち、流動可能形態もしくは噴霧可能形態；二次元形態（三次元拡大が他の二次元と比較して比較可能な程度に小さい場合（例えば、１／１０または１／２０未満））；または三次元形態（例えば、スポンジ、ペースト、口腔インプラントなど））を有し得る。本発明の材料の好ましい二次元実施形態または三次元実施形態は、例えば、スポンジ、織布もしくは不織布、予成形形状、好ましくは（例えば、抜歯のための）シリンダーもしくはコーンであり得るか、またはフレキシブルもしくは非フレキシブルな足場、微粒子状材料もしくは粒状材料もしくはシートとして使用され得る。材料を創傷に適用して血小板凝集を達成したら、マトリックスが創傷から流体を吸収して、創傷からさらなる血液凝固成分を誘引することができることが特に好ましい。さらに、材料は、好ましくは可撓性であり、様々な形状を有する多様な組織および場所に適用するために適切である。
【００２９】
本発明の止血材のさらに好ましい実施形態は、さらなる成分、例えば抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、例えばアプロチニンまたはＥＣＥＡ、成長因子、ビタミン、細胞などを含む。しかしながら、好ましい実施形態では、材料が、止血材の保存性または投与に悪影響を及ぼし得る成分を含まない限り、本発明の材料は、このようなさらなる成分を有していてもよいし、または有していなくてもよい。したがって、本止血材は、好ましくは、いかなるタンパク質分解活性も本質的に含まず、特にプロテアーゼ活性を含まず、具体的にはトロンビン活性を含まない。フィブリン切断および血餅形成を促進するために、トロンビンが止血材に添加されることが多い；しかしながら、それは、止血材に対してタンパク質分解性であり得、特に、このような材料の生産および保管中に望ましくない可能性がある。本発明では、トロンビンまたは同程度の成分の添加または存在は必要ないので、止血材の止血特性に悪影響を及ぼさずに省略することができる。
【００３０】
好ましくは、本発明の止血材は、血液などの液体材料を吸い上げることができる状態で提供される。血液（ならびに血餅形成、出血終結および創傷閉鎖を促進するその中の成分）吸い上げる能力は、止血材の全体的な有効性を有意に増強する。例えば、本発明の止血材は、材料がさらなる液体材料を取り込む（すなわち、その浸漬体積未満の量の液体で浸漬される）ことを依然として可能にする乾燥形態または湿式形態で提供される。これにより、血液が止血材に流入および／またはそれを通過して、例えば、適用された材料の拡大体積または全体積（または事実上の全体積）での創傷閉鎖プロセスにおいて有用な血液成分を提供することが可能になる。
【００３１】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の止血材を生産するための方法に関する。止血材を生産するためのこの方法は、トロンビン受容体活性化剤を止血マトリックスに共有結合によりカップリングする工程を特徴とする。
【００３２】
好ましくは、トロンビン受容体活性化剤は、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、好ましくはＴＲＡＰ８、ＴＲＡＰ７、ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ１−４１、ＳＬＩＧＫＶ（ＰＡＲ−２（ヒト）の場合）、ＴＦＲＧＡＰ（ＰＡＲ−３（ヒト）の場合）、ＧＹＰＧＱＶ（ＰＡＲ−４（ヒト）の場合）またはそれらのアミド化形態およびこれらの因子の混合物である。
【００３３】
当然のことながら、トロンビン受容体活性化剤は、生体適合性マトリックスに対する共有結合によるカップリング後にそのトロンビン受容体活性化活性を保持することが、本発明にとって重要である。いかなる生体分子も、生体適合性表面に単に結合してその生物機能性を保持し続けることはできない。本発明の生成過程において、本発明のトロンビン受容体活性化剤（例えば、ＴＲＡＰ６ペプチド）のＣ末端またはＮ末端を共有結合によりカップリングする従来の結合技術の使用は、通常、前記生物活性の喪失をもたらすことが判明した。したがって、（ペプチドである）トロンビン受容体活性化剤の完全な生物機能性を実際に保持する共有結合的固定アプローチの提供は自明ではなく、本明細書に含まれるこのような機能的実施形態を得るためには、本開示に依拠する必要がある。
【００３４】
例えば、ペプチドに関する伝統的なカップリング技術、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；Ｃ末端、ＡｓｐおよびＧｌｕの反応）またはＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；Ｎ末端、Ｌｙｓの反応）を使用した技術の使用は、活性な固定化トロンビン受容体活性化剤をもたらさなかった（なぜならば、それらは通常、非特異的であり、酸性アミノ酸またはリジンと副反応する傾向があるためである（Ｎ末端に依拠するペプチドの不活性化など）［２９］，［３０］，［３１］）。システインおよび／またはマイケル付加を使用した技術もまた、アミン基との副反応の可能性により、機能喪失のリスクがある［３２］。したがって、このような伝統的なカップリング技術は、活性の喪失をもたらす。ペプチド固定化のための様々な化学的アプローチが報告されているが［３４］、これらの方法のほとんどは、Ｃ末端のカルボキシル基との反応（例えば、ＥＤＣ）［２９］、またはＮ末端の第１級アミンとの反応（例えば、ＮＨＳ）［３０］，［３１］、またはマレイミドもしくはビニルスルホン基に基づくマイケル付加を介したシステイン残基との反応に依拠する［３２］。残念なことに、報告されているほとんどの反応は非特異的であり、酸性／塩基性アミノ酸（ＥＤＣ／ＮＨＳの場合）またはアミン基（マイケル付加の場合）のいずれかと副反応する傾向があり、ペプチド活性の好ましくない喪失を誘発する。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルコンジュゲーションは、ペプチドのＮ末端と反応させることによって、生物活性ペプチド（例えば、細胞接着性ＲＧＤ）をポリマー基質上に共有結合により固定化するための最も頻繁に使用されるアプローチである［３５］。第１級アミンは、ＮＨＳエステルの最も反応性の基であるが、最近の研究では、他のペプチド残基（例えば、チロシン、セリン、トレオニンの場合には−ＯＨ、アルギニンの場合にはグアニジニウム）で一連の副反応が起こり得ることが実証されている［３０］，［３１］。さらに、ＴＲＡＰ（ＳＦＬＬＲＮ−）の構造−機能関係に関する先の研究では、ペプチド活性を維持するためのＮ末端のアミノ酸の重要性が強調された［３６］。これらの考察を考慮して、その生物活性を保持するためには、（ＴＲＡＰ６などのペプチドである）トロンビン受容体活性化剤のＮ末端との副反応を回避するペプチド固定化アプローチを開発することが、本発明にとって重要であることが見出された。
【００３５】
したがって、本発明は、固定化形態のトロンビン受容体活性化活性剤（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）であって、保持された活性を有するトロンビン受容体活性化活性剤を提供する。これにより、ペプチド固定化のための従来の最先端アプローチによる提供が実行可能でないことが判明した。したがって、本発明はまた、例えば、ＰＶＡノルボルネン上へのシステイン含有ＴＲＡＰ６の光クリックコンジュゲーションなどのバイオ直交反応を使用することによって、Ｎ末端もしくはＣ末端または酸性アミノ酸もしくは塩基性アミノ酸との副反応のリスクを伴わない特異的カップリング技術（上記を参照のこと）の選択を提供し、非常に高度のコンジュゲーション効率（＞９５％）、部位特異性およびモジュール性を提供する。このコンジュゲーションアプローチが、ノルボルネン基を有する他の基質、例えば天然由来分子（ゼラチン、ヒアルロナン、アルギン酸など）および合成類似体、例えばＰＥＧにも適用可能であることは明らかである。加えて、本発明の生体適合性固体マトリックスとして適用されるポリマー基質、例えばＰＶＡ基質のサイズ（数百の反復単位）は、短いＴＲＡＰ６配列よりもはるかに大きいので、このポリマー結合トロンビン受容体活性化活性ペプチドコンジュゲートは、その可溶性形態よりも、ＰＡＲ−１受容体シグナル伝達を介して血液細胞によって内在化される確率が低い。全体として、（例えば、ＴＲＡＰ６ペプチド固定化の場合には光クリックコンジュゲーションによって）保持された活性を有するトロンビン受容体活性化活性剤を生体適合性固体マトリックスにカップリングすることによる本発明のアプローチは、局所止血および他の医療用途のための重要な実用的価値を提供する。
【００３６】
この方法の好ましい実施形態によれば、止血マトリックスは、化学基（例えば、アルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジン）、好ましくは、バイオ直交反応（例えば、チオール−エン付加、アルキン−アジド付加環化、ディールス−アルダー反応、ヒドラジド−ヒドラジン反応）によるトロンビン受容体活性化剤の高い効率の共有結合を可能にする基で官能化される。
【００３７】
好ましくは、トロンビン受容体活性化剤は、バイオ直交基（例えば、アルケン、スルフヒドリル、アルキン、アジド、ヒドロアジド、ヒドラジン）で操作されるペプチド配列で、特に−ＳＨ基を有するシステイン部分で改変される。
【００３８】
本発明の方法の好ましい実施形態では、止血材は、エン基、例えばノルボルネン、マレイミド、アリル、ビニルエステル、アクリレート、ビニルカーボネート、メタクリレートなどで官能化される。
【００３９】
本発明の方法の特に有利な実施形態によれば、化学的カップリングは、光誘導性反応によって、特にラジカル媒介性チオール−（ノルボルネン−）エン光クリックケミストリー（［１８ａに概説されている］）または（他の）光誘発性クリックケミストリー（［１８ｂに概説されている］）によって実施される。
【００４０】
本止血材は、本分野で実施される通常の工程によって、例えば、適切な滅菌工程およびパッケージング工程によって、市販品として完成され得る。例えば、本材料は、好ましくは、異なる吸収波長を有する光開始剤（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ  １８４，２９５９）、好ましくは水溶性開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９）の助けを借りて、ＵＶ／可視光線照射（２００〜５００ｎｍ）によって処理され得る。このような照射は、通常、１〜６０分間の照射時間で実施されるが、特定の方法に応じて、より長い照射時間も適用され得る。本発明の材料は、最終的には、使用まで無菌性を保持するように滅菌包装され、（例えば、特定の製品情報リーフレットを添加することによって）適切な容器（箱など）にパッケージングされ得る。
【００４１】
別の態様によれば、本発明はまた、手術において、ならびに／または傷害および／もしくは創傷の処置において使用するための本発明の止血材に関する。本発明の止血材は、血小板由来成長因子の放出を増加させるために、および創傷治癒を促進するために特に適切および有効である。
【００４２】
これにより、本発明の止血材は、吻合をシーリングするための、縫合線をシーリングするための、および切除部位における止血を保護するための優れたツールとなる。
【００４３】
本発明の別の態様によれば、本発明の止血材はまた、患者への材料の投与に必要な他の成分と組み合わせたキット形態で提供され得る。例えば、止血材が流動性乾燥形態（例えば、顆粒または粉末として）または流動性ペーストとして提供され得る場合、患者への投与の直前に添加され得る適切な緩衝溶液をこのような材料に提供することが好ましい。このような緩衝溶液は、通常、（緩衝液成分、例えばリン酸塩、炭酸塩、ＴＲＩＳなど、緩衝系の他に）二価金属イオン、好ましくはＣａ２＋イオン、または他の機能性成分（マトリックス上またはマトリックス中にまだ存在しない場合）、例えば抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、例えばアプロチニンまたはＥＣＥＡ、成長因子、ビタミン、細胞などを含有する。キットは、止血材を投与するための、または止血材の投与を準備するための手段、例えばシリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションなどをさらに含有し得る。
【００４４】
したがって、本発明は、キット、好ましくは、手術において、ならびに／または傷害および／もしくは創傷の処置において使用するためのキットに関し、このキットは、
−本発明の止血材、および
−好ましくは、緩衝溶液、特にＣａ２＋イオンを含有する緩衝溶液、シリンジ、チューブ、カテーテル、鉗子、ハサミ、滅菌パッドまたはローションの群より選択される少なくとも１つの投与デバイス
を含む。
【００４５】
したがって、緩衝溶液は、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはＥＣＥＡ、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分をさらに含む。あるいは、このキットはまた、抗菌剤、凝固活性剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗フィブリン溶解剤、特にアプロチニンまたはＥＣＥＡ、成長因子、ビタミン、細胞またはそれらの混合物の群より選択される成分を有する容器をさらに含んでもよい。
【００４６】
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに例証されるが、それに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】図１は、（Ａ）ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の合成スキーム（無水ＤＭＳＯ中、５０℃で１２時間の反応、ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸、Ｉ２９５９：Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９、すなわち一般に使用される水溶性ＰＩ）；（Ｂ）ＰＶＡ、ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）スペクトル；ならびにＭＴＴアッセイ（ｎ＞３）によって調査した、様々なポリマー濃度（１％、０．５％および０．１％）の（Ｃ）ＰＶＡ−ＮＢおよび（Ｄ）ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液に２４／４８時間曝露した後のＣ２Ｃ１２細胞の正規化生存率を示す。
【図１Ｂ】図１は、（Ａ）ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の合成スキーム（無水ＤＭＳＯ中、５０℃で１２時間の反応、ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸、Ｉ２９５９：Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９、すなわち一般に使用される水溶性ＰＩ）；（Ｂ）ＰＶＡ、ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）スペクトル；ならびにＭＴＴアッセイ（ｎ＞３）によって調査した、様々なポリマー濃度（１％、０．５％および０．１％）の（Ｃ）ＰＶＡ−ＮＢおよび（Ｄ）ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液に２４／４８時間曝露した後のＣ２Ｃ１２細胞の正規化生存率を示す。
【図１Ｃ−Ｄ】図１は、（Ａ）ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の合成スキーム（無水ＤＭＳＯ中、５０℃で１２時間の反応、ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸、Ｉ２９５９：Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９、すなわち一般に使用される水溶性ＰＩ）；（Ｂ）ＰＶＡ、ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）スペクトル；ならびにＭＴＴアッセイ（ｎ＞３）によって調査した、様々なポリマー濃度（１％、０．５％および０．１％）の（Ｃ）ＰＶＡ−ＮＢおよび（Ｄ）ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液に２４／４８時間曝露した後のＣ２Ｃ１２細胞の正規化生存率を示す。
【図２Ａ−Ｂ】図２は、（Ａ）〜（Ｃ）調査材料に応じた全血の凝固プロセスのＲＯＴＥＭ特性評価を示す（ＣＴ：凝固時間（秒）（すなわち、血餅が２ｍｍの硬度に達するまでの待ち時間；ＭＣＦ：最大血餅硬度（ｍｍ））。（Ａ）ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６−）、ＰＶＡ−ＮＢおよび０．９％ＮａＣｌ対照に応じた全血の凝固プロセスを示すＲＯＴＥＭ曲線のプロット；（Ｂ）ＣＴに対する様々な投与量（０．０１、０．１、１ｍＭ）における非コンジュゲートおよびコンジュゲートＴＲＡＰ６（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６）の影響；ならびに（Ｃ）最適ＴＲＡＰ６濃度（０．１ｍＭ）におけるＴＲＡＰ６、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＰＶＡ−ＮＢ間のＣＴの比較分析。（Ｄ）ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６）およびＰＶＡ−ＮＢに応じた血小板機能のＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ分析；各測定を２回反復で実施した。（Ｅ）Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるキーパラメータの比較：凝集面積（ユニット）。
【図２Ｃ−Ｄ】図２は、（Ａ）〜（Ｃ）調査材料に応じた全血の凝固プロセスのＲＯＴＥＭ特性評価を示す（ＣＴ：凝固時間（秒）（すなわち、血餅が２ｍｍの硬度に達するまでの待ち時間；ＭＣＦ：最大血餅硬度（ｍｍ））。（Ａ）ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６−）、ＰＶＡ−ＮＢおよび０．９％ＮａＣｌ対照に応じた全血の凝固プロセスを示すＲＯＴＥＭ曲線のプロット；（Ｂ）ＣＴに対する様々な投与量（０．０１、０．１、１ｍＭ）における非コンジュゲートおよびコンジュゲートＴＲＡＰ６（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６）の影響；ならびに（Ｃ）最適ＴＲＡＰ６濃度（０．１ｍＭ）におけるＴＲＡＰ６、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＰＶＡ−ＮＢ間のＣＴの比較分析。（Ｄ）ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６）およびＰＶＡ−ＮＢに応じた血小板機能のＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ分析；各測定を２回反復で実施した。（Ｅ）Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるキーパラメータの比較：凝集面積（ユニット）。
【図２Ｅ】図２は、（Ａ）〜（Ｃ）調査材料に応じた全血の凝固プロセスのＲＯＴＥＭ特性評価を示す（ＣＴ：凝固時間（秒）（すなわち、血餅が２ｍｍの硬度に達するまでの待ち時間；ＭＣＦ：最大血餅硬度（ｍｍ））。（Ａ）ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６−）、ＰＶＡ−ＮＢおよび０．９％ＮａＣｌ対照に応じた全血の凝固プロセスを示すＲＯＴＥＭ曲線のプロット；（Ｂ）ＣＴに対する様々な投与量（０．０１、０．１、１ｍＭ）における非コンジュゲートおよびコンジュゲートＴＲＡＰ６（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６）の影響；ならびに（Ｃ）最適ＴＲＡＰ６濃度（０．１ｍＭ）におけるＴＲＡＰ６、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＰＶＡ−ＮＢ間のＣＴの比較分析。（Ｄ）ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６）およびＰＶＡ−ＮＢに応じた血小板機能のＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ分析；各測定を２回反復で実施した。（Ｅ）Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるキーパラメータの比較：凝集面積（ユニット）。
【図３Ａ】図３は、（Ａ）１５分間インキュベートした後のＣＤ６２ｐ／ＣＤ４２共発現を決定することによって測定したＴＲＡＰ６媒介性血小板活性化のＦＡＣＳ分析を示す。実験を２回反復で行い、データは、ＣＤ６２ｐエピトープおよびＣＤ４１エピトープの両方について陽性の血小板の割合±ＳＤとして示されている。（Ｂ）特異的ＣＤ４１  ＰＥおよびＣＤ６２ｐ  ＡＰＣ抗体で染色したサンプルの値を示すヒストグラムプロット。（Ｃ）１５分間インキュベートした後のＴＲＡＰ６処理サンプル、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６処理サンプルおよびＰＶＡ−ＮＢ処理対照のＣＤ６２ｐおよびＣＤ４１の発現の代表的なドットプロット。
【図３Ｂ】図３は、（Ａ）１５分間インキュベートした後のＣＤ６２ｐ／ＣＤ４２共発現を決定することによって測定したＴＲＡＰ６媒介性血小板活性化のＦＡＣＳ分析を示す。実験を２回反復で行い、データは、ＣＤ６２ｐエピトープおよびＣＤ４１エピトープの両方について陽性の血小板の割合±ＳＤとして示されている。（Ｂ）特異的ＣＤ４１  ＰＥおよびＣＤ６２ｐ  ＡＰＣ抗体で染色したサンプルの値を示すヒストグラムプロット。（Ｃ）１５分間インキュベートした後のＴＲＡＰ６処理サンプル、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６処理サンプルおよびＰＶＡ−ＮＢ処理対照のＣＤ６２ｐおよびＣＤ４１の発現の代表的なドットプロット。
【図３Ｃ】図３は、（Ａ）１５分間インキュベートした後のＣＤ６２ｐ／ＣＤ４２共発現を決定することによって測定したＴＲＡＰ６媒介性血小板活性化のＦＡＣＳ分析を示す。実験を２回反復で行い、データは、ＣＤ６２ｐエピトープおよびＣＤ４１エピトープの両方について陽性の血小板の割合±ＳＤとして示されている。（Ｂ）特異的ＣＤ４１  ＰＥおよびＣＤ６２ｐ  ＡＰＣ抗体で染色したサンプルの値を示すヒストグラムプロット。（Ｃ）１５分間インキュベートした後のＴＲＡＰ６処理サンプル、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６処理サンプルおよびＰＶＡ−ＮＢ処理対照のＣＤ６２ｐおよびＣＤ４１の発現の代表的なドットプロット。
【図４Ａ】図４は、（Ａ）ラジカル媒介性光クリックケミストリーを介した、ＰＶＡ−ＮＢとジチオスレイトール（ＤＴＴ）とのＵＶ光架橋によるＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルの調製を示す概略図を示す。（Ｂ）インサイチュー振動光レオメトリー：Ｇ’−ゲル貯蔵弾性率、１０％ＰＶＡ−ＮＢ、０．５％Ｉ２９５９、６０秒遅延、光強度：２０ｍＷｃｍ−２；ギャップ厚５０μｍ、歪み１０％、１０Ｈｚを使用した、様々なチオール対ＮＢ比（０．４、０．８、１．０および１．２）を有するＰＶＡヒドロゲルの機械的特性評価。（Ｃ）代表的な光重合ＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルペレット（スケールバー：１ｃｍ）。（Ｄ）Ｇ’プラトー値に対するチオール対ＮＢ比（Ｎ）の影響：Ｎ＝０．４（Ｉ）、０．８（ＩＩ）、１．０（ＩＩＩ）、１．２（ＩＶ）。（Ｅ）ＰＢＳ中で４８時間膨潤した後のＰＶＡ−ＮＢヒドロゲル（Ｉ〜ＩＶ）の平衡質量膨潤比。
【図４Ｂ−Ｃ】図４は、（Ａ）ラジカル媒介性光クリックケミストリーを介した、ＰＶＡ−ＮＢとジチオスレイトール（ＤＴＴ）とのＵＶ光架橋によるＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルの調製を示す概略図を示す。（Ｂ）インサイチュー振動光レオメトリー：Ｇ’−ゲル貯蔵弾性率、１０％ＰＶＡ−ＮＢ、０．５％Ｉ２９５９、６０秒遅延、光強度：２０ｍＷｃｍ−２；ギャップ厚５０μｍ、歪み１０％、１０Ｈｚを使用した、様々なチオール対ＮＢ比（０．４、０．８、１．０および１．２）を有するＰＶＡヒドロゲルの機械的特性評価。（Ｃ）代表的な光重合ＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルペレット（スケールバー：１ｃｍ）。（Ｄ）Ｇ’プラトー値に対するチオール対ＮＢ比（Ｎ）の影響：Ｎ＝０．４（Ｉ）、０．８（ＩＩ）、１．０（ＩＩＩ）、１．２（ＩＶ）。（Ｅ）ＰＢＳ中で４８時間膨潤した後のＰＶＡ−ＮＢヒドロゲル（Ｉ〜ＩＶ）の平衡質量膨潤比。
【図４Ｄ−Ｅ】図４は、（Ａ）ラジカル媒介性光クリックケミストリーを介した、ＰＶＡ−ＮＢとジチオスレイトール（ＤＴＴ）とのＵＶ光架橋によるＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルの調製を示す概略図を示す。（Ｂ）インサイチュー振動光レオメトリー：Ｇ’−ゲル貯蔵弾性率、１０％ＰＶＡ−ＮＢ、０．５％Ｉ２９５９、６０秒遅延、光強度：２０ｍＷｃｍ−２；ギャップ厚５０μｍ、歪み１０％、１０Ｈｚを使用した、様々なチオール対ＮＢ比（０．４、０．８、１．０および１．２）を有するＰＶＡヒドロゲルの機械的特性評価。（Ｃ）代表的な光重合ＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルペレット（スケールバー：１ｃｍ）。（Ｄ）Ｇ’プラトー値に対するチオール対ＮＢ比（Ｎ）の影響：Ｎ＝０．４（Ｉ）、０．８（ＩＩ）、１．０（ＩＩＩ）、１．２（ＩＶ）。（Ｅ）ＰＢＳ中で４８時間膨潤した後のＰＶＡ−ＮＢヒドロゲル（Ｉ〜ＩＶ）の平衡質量膨潤比。
【図５】図５は、（Ａ）連続凍結乾燥および低温粉砕によるＰＶＡヒドロゲル（Ｉ、−ＳＨ：−ＮＢ＝０．４）微粒子（ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ）の調製の概略図を示す。（Ｂ）光誘発性チオール−ＮＢコンジュゲーション、−ＳＨ：−ＮＢ＝１．２、ＰＢＳ中０．１％ＰＩ（Ｌｉ−ＴＰＯ）、２０ｍＷｃｍ−２を介した、システイン含有ＴＲＡＰ６ペプチドによるＰＶＡ−ＮＢ−Ｐの表面機能化の概略図；（Ｃ、Ｄ）ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−ＰのＳＥＭ画像、スケールバー：１００μｍ（Ｃ）、１０μｍ（Ｄ）。
【図６Ａ−Ｂ】図６は、（Ａ）〜（Ｂ）ＰＶＡ−ＮＢ−ＰおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ（生理食塩水中１０重量％）の懸濁液に応じた全血の凝固プロセスのＲＯＴＥＭ特性評価を示す。（Ａ）ＰＶＡ−ＮＢ−ＰおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ懸濁液に応じた全血の凝固プロセスを示すＲＯＴＥＭ曲線のプロット；（Ｂ）ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＮａＣｌ（対照）間のＣＴの比較分析。（Ｃ）〜（Ｆ）粒状ポリマーのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）１５分間インキュベートした後のＣＤ６２ｐ／ＣＤ４１共発現を決定することによって測定したＴＲＡＰ６媒介性血小板活性化のＦＡＣＳ分析。異なるドナー（ｎ＝２）由来の血液サンプルを使用して実験を２回反復し、データは、ＣＤ６２ｐエピトープおよびＣＤ４１エピトープの両方について陽性の血小板の割合±ＳＤとして示されている。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）１５分間インキュベートした後のＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ処理サンプルおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ処理サンプル（陽性対照：０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６、陰性対照：ＮａＣｌ）のＣＤ６２ｐおよびＣＤ４１の共発現の代表的なドットプロット。
【図６Ｃ−Ｄ】図６は、（Ａ）〜（Ｂ）ＰＶＡ−ＮＢ−ＰおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ（生理食塩水中１０重量％）の懸濁液に応じた全血の凝固プロセスのＲＯＴＥＭ特性評価を示す。（Ａ）ＰＶＡ−ＮＢ−ＰおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ懸濁液に応じた全血の凝固プロセスを示すＲＯＴＥＭ曲線のプロット；（Ｂ）ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＮａＣｌ（対照）間のＣＴの比較分析。（Ｃ）〜（Ｆ）粒状ポリマーのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）１５分間インキュベートした後のＣＤ６２ｐ／ＣＤ４１共発現を決定することによって測定したＴＲＡＰ６媒介性血小板活性化のＦＡＣＳ分析。異なるドナー（ｎ＝２）由来の血液サンプルを使用して実験を２回反復し、データは、ＣＤ６２ｐエピトープおよびＣＤ４１エピトープの両方について陽性の血小板の割合±ＳＤとして示されている。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）１５分間インキュベートした後のＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ処理サンプルおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ処理サンプル（陽性対照：０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６、陰性対照：ＮａＣｌ）のＣＤ６２ｐおよびＣＤ４１の共発現の代表的なドットプロット。
【図６Ｅ−Ｆ】図６は、（Ａ）〜（Ｂ）ＰＶＡ−ＮＢ−ＰおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ（生理食塩水中１０重量％）の懸濁液に応じた全血の凝固プロセスのＲＯＴＥＭ特性評価を示す。（Ａ）ＰＶＡ−ＮＢ−ＰおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ懸濁液に応じた全血の凝固プロセスを示すＲＯＴＥＭ曲線のプロット；（Ｂ）ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＮａＣｌ（対照）間のＣＴの比較分析。（Ｃ）〜（Ｆ）粒状ポリマーのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）１５分間インキュベートした後のＣＤ６２ｐ／ＣＤ４１共発現を決定することによって測定したＴＲＡＰ６媒介性血小板活性化のＦＡＣＳ分析。異なるドナー（ｎ＝２）由来の血液サンプルを使用して実験を２回反復し、データは、ＣＤ６２ｐエピトープおよびＣＤ４１エピトープの両方について陽性の血小板の割合±ＳＤとして示されている。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）１５分間インキュベートした後のＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ処理サンプルおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ処理サンプル（陽性対照：０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６、陰性対照：ＮａＣｌ）のＣＤ６２ｐおよびＣＤ４１の共発現の代表的なドットプロット。
【図７】図７は、（Ａ）プロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）活性化の分子機構を示す。（Ｂ）ＴＲＡＰ６ペプチドモチーフは、合成ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲル（すなわち、非常に局所的に血小板を活性化することができるＴＲＡＰ６提示ヒドロゲル）内で共有結合により固定化されている。
【図８】図８は、回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）によって測定した、血液凝固に対するＴＲＡＰ６（非コンジュゲート、１ｍＭ）およびポリマー−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの影響を示す。Ａ、凝固時間（ＣＴ）；Ｂ、血餅形成時間（ＣＦＴ）。ＰＥＧ−１０ｋ−ＮＨＳをＴＲＡＰ６のＮ末端と反応させることによってＰＥＧ−ＴＲＡＰ６を調製し、光クリック可能なＰＶＡノルボルネン（２２ｋＤａ）をＴＲＡＰ６（ＳＦＬＬＲＮＰＮＣ）のシステイン残基と反応させることによってＰＶＡ−ＴＲＡＰ６を調製した。ブランクポリマー対照として、ＰＥＧ−１０ｋ−グリシンを使用した。すべてのサンプルを３回反復で測定した。
【図９】図９は、１ｍＭ  ＴＲＡＰ６、１ｍＭ  ＰＶＡ−ＮＢおよび生理食塩水と比較した、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（１ｍＭ）における生物活性の保持の実験的証拠を示す。Ａ、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ−ＴＲＡＰ法によって測定した全血小板凝集面積、Ｂ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定した、血小板活性化に起因するＣＤ４１／ＣＤ６２Ｐ共発現のレベル。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
実施例：
局所止血を誘導する合成血小板活性化ヒドロゲルマトリックスの開発
本実施例は、止血の安全かつ局所的な促進について、血小板活性化ポリマーのモデルとしての水溶性ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートおよび不溶性（架橋）ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６ヒドロゲル微粒子（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ）によって、本発明を実証する。本研究では、出血管理のために、ＴＲＡＰ６などのＴＲＡＰ血小板活性化ペプチドを合成ヒドロゲルマトリックスに共有結合により固定化することができる（図７Ｂ）ことが初めて実証される。ポリマーコンジュゲートＴＲＡＰ６ペプチドは、止血を安全かつ局所的に促進しながら血小板活性化のそれらの活性を維持するので、血小板活性化剤の全身放出は起こらないという仮説を、この止血材を用いて試験した。止血の安全かつ局所的な促進について、血小板活性化ポリマーのモデルとしての水溶性ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートおよび不溶性（架橋）ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６ヒドロゲル微粒子（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ）を設計した。高い効率のチオール−ノルボルネン光クリックケミストリーを使用して、これらの新たなポリマー−ペプチドコンジュゲートを調製した。回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）、血小板凝集アッセイ（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、これらの材料が血小板を活性化することができる程度を系統的に特性評価した。
【００４９】
いくつかの止血戦略は、フィブリノゲンおよびトロンビンなどの血液成分の使用に依拠しており、高コストおよび短い保存期間という欠点がある。本実施例では、迅速な局所止血のために、費用効果の高い合成生体材料を開発する。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲル中で、トロンビンを使用する代わりに、トロンビン受容体アゴニスト−ペプチド−６（ＴＲＡＰ６）を共有結合により操作する。最初に、光コンジュゲーションを介してシステイン含有ＴＲＡＰ６をＰＶＡ−ノルボルネン（ＰＶＡ−ＮＢ）の骨格に共有結合することによって、可溶性ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６を調製した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を使用した細胞傷害性研究では、ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６が非毒性であることが示された。トロンボエラストグラフィーにより、ＴＲＡＰ６の止血活性はコンジュゲート形態で保持されており、等濃度の遊離ＴＲＡＰ６溶液と同程度であったことが明らかになった。０．１％ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液は、凝固時間（ＣＴ）を生理学的ＣＴの約４５％まで短縮することができる。血小板凝集アッセイおよびＦＡＣＳによって、高い血小板活性化効率をさらに確認した。潜在的な臨床用途では、局所的な血小板活性化および止血のために、ＴＲＡＰ６提示ヒドロゲル微粒子（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ）を開発した。光重合されたＰＶＡ−ＮＢヒドロゲル微粒子（ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ）をＴＲＡＰ６で生体機能化することによって、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐを調製した。ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐは、ＣＴを約５０％まで有効に短縮することができることが実証された。ＦＡＣＳにより、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐは、可溶性ＴＲＡＰ６対照と同程度に血小板を活性化することができることが示された。要するに、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐは、安全な止血および創傷治癒のための有望な生体材料クラスである。
【００５０】
１．実験セクション
１．１．材料および試薬。
すべての試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、特に明記しない限り、そのまま使用した。
【００５１】
１．２．ＰＶＡ−ノルボルネン（ＰＶＡ−ＮＢ）の合成。
三口フラスコ中で、１０ｇのＰＶＡ（２２ｋＤａ）および２０ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸を、２５０ｍＬの無水ＤＭＳＯに、アルゴン雰囲気下、６０℃で１時間かけて溶解した。第２のフラスコ中で、アルゴン雰囲気下、２ｇのシス−５−ノルボルネン−エンド−２，３−ジカルボン酸無水物（−ＯＨ基に対して０．１当量）を、５０ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。得られた溶液を、ＰＶＡを含有する第１のフラスコに滴下した。反応を５０℃で１２時間維持した。反応後、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液に対して２４時間透析し、続いて脱イオン（ＤＩ）水に対して１２時間透析することによって、粗生成物を精製した。凍結乾燥後、ＰＶＡ−ＮＢを９５％の収率で無色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）：６．２（２Ｈ，ｓ，−ＣＨ＝ＣＨ−），３．３（２Ｈ，ｓ，−Ｃ＝ＣＣＨ−ＣＨ−），３．１（２Ｈ，ｓ，−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ−ＣＨ−），１．３（２Ｈ，ｓ，−ＣＨ２−）．置換度（ＤＳ）：７．５％．
【００５２】
１．３．ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの合成。
チオール−エン光クリックコンジュゲーションによってシステイン含有ＴＲＡＰ６ペプチド（Ｎ−Ｃ：ＳＦＬＬＲＮＰＮＣ（配列番号１５）、Ｃｈｉｎａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．）をＰＶＡ−ＮＢの骨格に共有結合することによって、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６を調製した。具体的には、６０ｍｇのＰＶＡ−ＮＢを０．５％Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９（Ｉ２９５９，ＢＡＳＦ）のＰＢＳ溶液に溶解して、５％の最終マクロマー濃度を得た。この溶液に、１００ｍｇのＴＲＡＰ６−Ｃｙｓペプチド（ＮＢ基に対して１．２当量）を添加した。得られた溶液をアルゴン下で撹拌し、フィルタＵＶ光（３２０〜５００ｎｍ）を２０ｍＷｃｍ−２で３００秒間照射した。Ｏｍｎｉｃｕｒｅ  Ｓ２０００  ｌａｍｐから、ＵＶ光を誘導した。
【００５３】
１．４．ＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルの調製。
ＰＶＡ−ＮＢ（ＤＳ−７．５％）を０．５％Ｉ２９５９溶液に溶解し、１０％の最終濃度を達成した。次いで、この溶液のアリコートを適量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）と混合して、−ＳＨ／−ＮＢ比をそれぞれ０．４（Ｉ）、０．８（ＩＩ）、１．０および１．２（ＩＩＩ）とした。マルチウェルＰＤＭＳモールド（ウェル直径：６ｍｍ）中で光重合によって、ヒドロゲルペレットを調製した。具体的には、ＰＤＭＳモールド（厚さ：１．５ｍｍ）によって隔てられた、２つのガラスカバースリップ間に２００μＬのマクロマー溶液をピペッティングし、次いで、フィルタＵＶ光（２０ｍＷｃｍ−２）に６００秒間曝露した。スライドからペレットを剥がし、滅菌ＰＢＳで洗浄した。
【００５４】
１．５．ＰＶＡ−ＮＢヒドロゲル微粒子（ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ）の調製。
ヒドロゲル前駆体溶液（Ｉ〜ＩＩＩ）を上述のように調製し、モールドとして１０ｍＬ円筒形ガラスバイアルを使用する以外は同じ条件で光重合した。光重合後、ヒドロゲルシリンダーを１００ｍＬビーカーに移し、未反応のポリマーおよびＰＩを除去するために、ＰＢＳ（２回交換）で１２時間洗浄した。その後、液体Ｎ２で膨潤ヒドロゲルを凍結し、凍結乾燥した。最後に、ＲＥＴＳＣＨ  Ｃｒｙｏｍｉｌｌ  ＲＳ２３２を使用して、乾燥ＰＶＡ−ＮＢマトリックスを微粉末に粉砕した。
【００５５】
１．６．ＴＲＡＰ６提示ＰＶＡヒドロゲル微粒子（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ）の調製。
ＴＲＡＰ６−ＣｙｓペプチドをＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ上の残存ＮＢ基に共有結合することによって、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐを調製した。具体的には、１００ｍｇのＰＶＡ−ＮＢを０．１％可視光ＰＩ（ＬＡＰ）［１９］のＰＢＳ溶液に分散させて、最終ポリマー含量を５％とした。この懸濁液に、特定量のＴＲＡＰ６−Ｃｙｓペプチド（ＮＢ基に対して１．２当量）を添加した。得られた懸濁液をアルゴン下で撹拌し、ＵＶ光（３６５ｎｍ）を２０ｍＷｃｍ−２で３００秒間照射した。Ｏｍｎｉｃｕｒｅ  ＬＸ４００  ＬＥＤ  ｌａｍｐから、ＵＶ光を誘導した。
【００５６】
１．７．光レオメトリー。
以前に報告されているように［２７］、モジュラー光レオメーター（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ−３０２）によって光レオメトリーを実施した。具体的には、光ガイド（Ｏｍｎｉｃｕｒｅ  Ｓ２０００）からガラスプレートの底部に、ＭＣＲ３０２をフィルタＵＶ光（３２０〜５００ｎｍ）と一体化した。具体的には、光重合中のヒドロゲル製剤の硬化動態のリアルタイムモニタリングのために、プレート間振動光レオメトリーを適用した。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＵＳＢ  ２０００＋分光計によって決定したところ、プレート表面の光強度は、約２０ｍＷ・ｃｍ−２であった。照射時間の関数として、サンプルの貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ’  ’）をモニタリングすることができた。Ｇ’およびＧ’  ’クロスオーバーの近傍において、ゲル点を決定した。
【００５７】
１．８．水分取り込み。
一般的なプロトコール［２８］を使用して、ＰＶＡ−ＮＢヒドロゲルの質量膨脹比を試験した。ヒドロゲルペレット（ｎ＝３）を上述のように調製し、ＤＩ  Ｈ２Ｏ中、室温で２４時間膨潤させた。湿ったペレットを計量して平衡膨潤質量（Ｍｓ）を決定し、次いで、凍結乾燥して乾燥重量（Ｍｄ）を求めた。平衡質量膨潤比（Ｑｍ）をＭｓ／Ｍｄとして計算した。
【００５８】
１．９．ＭＴＴアッセイ。
ＭＴＴアッセイによって、ＰＶＡ、ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６マクロマー溶液の細胞傷害性を評価した。５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてがＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａｕｓｔｒｉａ製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、Ｃ２Ｃ１２細胞を培養した。３つの濃度（５％、１％および０．１％）のマクロマー溶液をＤＭＥＭ培養培地で調製した。次いで、２００μＬの培養培地中で、Ｃ２Ｃ１２細胞を細胞５×１０３個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した後、１００μＬの各マクロマー溶液を細胞に三連で添加した。２４時間インキュベートした後、細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄してから、１００μＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）希釈標準溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。１時間インキュベートした後、液体を廃棄し、１００μｌのＤＭＳＯを添加して、ホルマザン結晶を溶解した。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、吸光度を５４０ｎｍで測定した。
【００５９】
１．１０．回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）。
ＲＯＴＥＭ（ＴＥＭ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用して、血小板活性化ポリマーと全血との相互作用を経時的にモニタリングした。ＲＯＴＥＭシステムは振動センサーピンを含有しており、これを、血液サンプルを含有する温度制御キュベットに浸漬する。同じデバイスで、４回の測定を並行して実施することができる。一般に、再石灰化によって、クエン酸血サンプルの凝固を開始させる。統合コンピュータによって、フィブリン塊の形成動態を機械的にモニタリングし、典型的な曲線および数値パラメータに計算することができる。
【００６０】
２１ゲージの針を介して、正中静脈からの最小静止を使用して、３人の未治療健常ドナーから血液を収集した。最初の３ｍｌを廃棄した後、血液を、０．３ｍｌの緩衝３．２％クエン酸ナトリウムを含有する３．５ｍｌチューブ（Ｖａｃｕｅｔｔｅ；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に収集した。分析前に、サンプルを３７℃の予熱段階で少なくとも１０分間維持し、３時間以内に処理した。２０μｌのＣａＣｌ２（ｓｔａｒ−ＴＥＭ（登録商標）、２００ｍＭ）を添加して再石灰化することによって、全血サンプルのＲＯＴＥＭ分析を開始した。クエン酸塩添加血の再石灰化直後に、ポリマー溶液および／またはポリマー懸濁液をキュベットに直接添加し、以前に報告されているように［２１］、上下に穏やかにピペッティングすることによって混合した。ＲＯＴＥＭキュベット当たりの最終反応体積は３７０μｌであり、３００μｌのクエン酸塩添加全血、２０μｌのＣａＣｌ２および５０μｌのポリマー溶液またはポリマー懸濁液から構成されていた。
【００６１】
以下のＲＯＴＥＭパラメータはシグナルから計算したものであり、統計分析に含めた：凝固時間（ＣＴ）（秒）（ｓｅｃ）、すなわち、血餅が２ｍｍの堅さに達するまでの待ち時間（これは、初期フィブリン形成の尺度である）；血餅形成時間（ＣＦＴ）（秒）、すなわち、血餅がＣＴから２０ｍｍの堅さ（ｆｉｒｍｎｅｓｓ）に達するまでの待ち時間（これは、血小板機能およびフィブリノゲン品質を示す）；α角（ｘ軸と、ＣＴ点から始まる成形曲線の接線との間の角度（°））（これは、ＣＦＴと比較可能である）；最大血餅堅さ（ＭＣＦ）（ｍｍ）（血餅の絶対強度を示す曲線の最大振幅）；およびＡ３０（ｍｍ）、すなわち、３０分後の血餅堅さ
【００６２】
１．１１．Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ分析。
【００６３】
Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ試験の原理は、活性化により血小板は粘着性になるので、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ試験キュベット中の金属センサーワイヤー上に付着および凝集する傾向があるという事実に基づいている。センサーワイヤーは、銀コーティングされた高導電性銅で作られている。活性化血小板がセンサーワイヤー上に付着および凝集するにつれて、ワイヤ間の電気抵抗が上昇し、これをリアルタイムでモニタリングすることができる。各測定のために、３００μＬの生理食塩水および３００μＬのヒルジン化全血をＭｕｌｔｉｐｌａｔｅキュベットに連続的に添加した。３７℃で３分間インキュベートした後、２０μＬのサンプル溶液を添加し、それと同時に、プログラムがシグナルを収集し始めた。Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅデバイスは、並行して４回の測定を可能にする。各測定を重複して６分間実施した。
【００６４】
１．１２．ＦＡＣＳ分析。
【００６５】
２人の未治療健常ドナーの血液を収集し、クエン酸ナトリウムによって安定化した。１１０μＬの全血（ＷＢ）に、２０μＬのＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液（２ｍＭおよび０．２ｍＭのＷＢ中で最終ＴＲＡＰ６濃度を得るために３０ｍｇｍＬ−１および３ｍｇｍＬ−１）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。２０μｌのＴＲＡＰ６−Ｃ溶液（１４ｍｇｍＬ−１）および／または２０μＬのＮａＣｌ溶液（０．９％）をそれぞれ陽性対照および陰性対照として添加した。インキュベートした混合物を３００μＬの１％パラホルムアルデヒドと室温で１５分間混合した。洗浄および遠心分離した後、ＣＤ４１に対する２０μＬのフィコエリトリン（ＰＥ）標識モノクローナル抗体およびＣＤ６２Ｐに対する２０μＬのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識モノクローナル抗体を使用して、二重免疫染色を実施した。アイソタイプ対照を、それぞれＡＰＣまたはＰＥ色素とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした（すべての抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した）。室温で３０分間インキュベートした後、蛍光フローサイトメトリーを使用して、血小板の活性化状態を決定した。Ｕｎｉｐｈａｓｅ  Ａｒｇｏｎ  ｉｏｎ  ｌａｓｅｒ，４８８ｎｍ，２０ｍＷ  ｏｕｔｐｕｔを備えるＢｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ−５００を使用して、血小板活性化マーカーＣＤ６２Ｐおよび構成的に存在する血小板マーカーＣＤ４１の発現を検出した。全体として、１サンプル当たり１０００００個の血小板を測定し、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＣＸＰソフトウェアを用いて分析した。実験を２回反復した。
【００６６】
１．１３．統計。
すべてのエラーバーは、標準偏差を示す。スチューデントｔ検定によって、統計的有意性を決定した（「＊」、「＊＊」、「＊＊＊」は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１を示す）。
【００６７】
２．結果および考察
２．１．材料の設計および合成
本研究では、以下の理由により、強力な血小板活性化ペプチド（ＴＲＡＰ６）の共有結合による固定化のための基質として、線状合成ポリマーポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を選択した。第１に、ＰＶＡは、優れた費用対効果および細胞適合性を有するＦＤＡ承認ポリマーであるので、多くの生物医学的用途にとって興味深い［１７］。第２に、ＰＶＡにおける多数のヒドロキシル基の存在は、生物活性リガンドの調節可能な機能化および提示のための重要な自由度を提供するが、これは、アーム依存性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの他の合成基質では利用可能ではない。
【００６８】
ＴＲＡＰ６ペプチドをＰＶＡ上に導入するために、本発明者らは、コンジュゲーションアプローチとして、ロバストなチオール−エン光クリックケミストリーを選択した。一方、チオール−エン反応に向かう反応性が非常に高く、細胞傷害性が低いので［１８，１９］、エン官能基としてノルボルネン基を選択した。他方、ＴＲＡＰ６配列のＮ末端は、その血小板活性化能力に重要であることが認められているので［１５］、本発明者らは、遊離チオール基を有するシステイン部分をＴＲＡＰ６ペプチド配列（ＳＦＬＬＲＮＰＮＣ）のＣ末端に操作した。
【００６９】
ＤＭＳＯ中、５０℃で、１２時間にわたるＰＶＡとノルボルネン無水物との間の簡易エステル化反応によって、ＰＶＡ−ＮＢを合成した（図１Ａ）。この改変アプローチの顕著な利点の１つは、改変後に、多数のカルボキシレート基をナトリウム塩形態に中和して、優れた水溶性を有する生成物を提供することができることである。中和のために１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３に対して、その後にＨ２Ｏに対して連続透析を行うことによって粗生成物を精製し、最後に凍結乾燥した（収率＞９５％）。合成を確認するために、１Ｈ−ＮＭＲを使用して、未改変ＰＶＡと比較してＰＶＡ−ＮＢを分析した。図１Ｂ（下）に示されているように、未改変ＰＶＡのスペクトルは、それぞれ−ＣＨ−およびメチレン基に対応する４．０ｐｐｍおよび１．６ｐｐｍの２つの主要ピークを表す。ＰＶＡ−ＮＢのスペクトル（図１Ｂ、中央）は、それぞれ６．２ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ−）、３．３ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ、−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ−ＣＨ−）、３．１ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ、−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ−ＣＨ−）および１．３ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ、−ＣＨ２−）における新たなピークを示す。シグナル（ａ、ｄ、ｆ）に対応する整数値を比較することによって、ＰＶＡ−ＮＢの置換度（ＤＳ）を決定した。反応物間の化学量論または反応時間のいずれかを変化させることによって、５％〜５０％の広範囲でＤＳを正確に制御することが可能であった（表Ｓ１）。ＰＶＡ（２２ｋＤａ）は、約５００個の反復単位からなる線状ポリマーであるので、本発明者らは、最も低いＤＳ（ＤＳ−７％）を有するＰＶＡ−ＮＢを前駆体として選択し、システイン含有ペプチドとの光コンジュゲーションのための約３５個の反応部位を得た。
【００７０】
システイン含有ＴＲＡＰ６ペプチドと、光開始剤（ＰＩ）であるＩ２９５９のＰＢＳ溶液中ＰＶＡ−ＮＢのＮＢ基との光コンジュゲーションによって、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートを調製した。コンジュゲーション効率を確認するために、最初に、Ｄ２Ｏ中でＮＭＲモデル反応を実施した。ＮＭＲ反応に基づいて、図１Ｂ（上段）は、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートのスペクトルを表す。６．２ｐｐｍにおけるＮＢプロトンシグナル（ａ）の有意な減少は、コンジュゲーションの成功を示す。その上、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６のスペクトルはまた、ＴＲＡＰ６配列におけるフェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）部分の芳香族プロトンに対応する７．４ｐｐｍにおける新たなピークを示す。
【００７１】
２．２．インビトロ細胞傷害性
生物医学的用途に関する調製材料の適用性を証明するために、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を使用したＭＴＴアッセイによって、ＰＶＡ、ＰＶＡ−ＮＢおよびＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液のインビトロ生体適合性を調査した。ＭＴＴアッセイにより、ＰＶＡおよびＰＶＡ−ＮＢ（図１Ｃ）の溶液は、２４時間および４８時間インキュベートした後、様々な濃度（０．１、０．５、１％）で非毒性であったことが示された。ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートでは、２４時間インキュベートした後のＣ２Ｃ１２細胞の代謝活性（図１Ｄ）は、１％ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６と混合した場合に有意に増加したが（Ｐ＜０．００１）、０．５％および０．１％ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６では増加しなかった。４８時間インキュベートした後、３つの濃度すべての代謝活性は、対照と比較して有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。他のグループによるいくつかの研究では、ＴＲＡＰ６などのＰＡＲ−１活性化ペプチドは、ヒト歯肉線維芽細胞、内皮細胞、腸上皮細胞およびヒト筋肉筋芽細胞を含む異なる細胞型からのサイトカイン放出を刺激することができることが示されている［２０ａ，ｂ，ｃ］。したがって、本発明者らは、ＭＴＴアッセイ中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞の代謝活性の増加が、ＴＲＡＰ６誘導性ＰＡＲ−１活性化に起因すると推定する。１％ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液は５ｍＭのＴＲＡＰ６濃度を与えるのに対して、血小板活性化のための有効なＴＲＡＰ６濃度は５〜１００μＭの範囲内であることを考慮すると［１２］、毒性結果は、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６が、その有効範囲内で細胞適合性材料であることを示唆している。
【００７２】
２．３．止血活性
２．３．１．トロンボエラストメトリー
次に、本発明者らは、回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）［２１，２２］（これは、凝固中の血餅の粘弾性特性のインサイチュー特性評価を可能にする臨床診断ツールである）を使用して、ＴＲＡＰ６およびＰＶＡ−ＮＢと比較して、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の止血有効性を研究した。図２Ａは、再石灰化全血と混合した研究サンプルのＲＯＴＥＭ曲線のプロットを示す。凝固時間（ＣＴ）は、血餅が２ｍｍの堅さに達するまでの待ち時間を指し、最大血餅硬度（ＭＣＦ）は、血餅の絶対強度を示す曲線の最大振幅を指す。
【００７３】
ＲＯＴＥＭの結果から、０．１ｍＭのＰＶＡ−ＴＲＡＰ６のＣＴは０．１ｍＭのＴＲＡＰ６のものと全く同程度であったが、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６のＭＣＦはＴＲＡＰ６対照のものと比べて相対的に小さかったことが観察された。より小さいＭＣＦは、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（これは高分子コンジュゲート（６５ｋＤａ）であり、ＴＲＡＰ６（１ｋＤａ）よりも有意に大きい）におけるコンジュゲーション後の血小板に対するＴＲＡＰ６−のアクセシビリティの減少に起因する可能性がある。比較すると、ＰＶＡ−ＮＢ対照（図２Ｃ）は、生理学的曲線（ＮａＣｌ対照）に非常に類似した曲線を示し、ＰＶＡ−ＮＢ骨格の止血活性を示さなかった。
【００７４】
ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の止血活性は用量依存的であるか否かを試験するために、本発明者らは、ＲＯＴＥＭによって、３つのペプチド濃度（０．０１、０．１、１ｍＭ）のＴＲＡＰ６溶液と比較して、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６溶液を試験した（図２Ｂ）。ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の最適な止血濃度は０．１ｍＭであったが、ＴＲＡＰ６対照については、選択範囲内で有意な用量影響はなかったことが見出された。これもやはり、血小板活性化について、ＴＲＡＰ６の飽和レベルに対するＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＴＲＡＰ６ペプチドの差示的分子構造の影響を示唆している可能性がある。
【００７５】
２．３．２．Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ分析
血小板活性化の程度を定量するために、本発明者らは、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅアッセイを利用して、血小板凝集に対するＰＶＡ−ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ６およびＰＶＡ−ＮＢの影響を調査した。この方法の原理は、活性化により血小板は粘着性になるので、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ試験キュベット中の金属センサーワイヤー上に付着および凝集する傾向があるという事実に基づいている。活性化血小板がセンサーワイヤー上に付着および凝集するにつれて、ワイヤ間の電気抵抗が上昇し、これを連続的にモニタリングすることができる。典型的なＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ曲線（図２Ｄ）は、血小板凝集の程度に対応する電子シグナルの蓄積を表す。Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅアッセイの１つの重要なパラメータは、凝集面積（ユニット）、すなわち凝集曲線下面積である。ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）は、ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）のものと同程度の凝集曲線（図２Ｄ）を誘導したが、ＰＶＡ−ＮＢ対照は、無視可能な血小板凝集能力を示したことが観察された。ＴＲＡＰ６の凝集面積値（図２Ｅ）は１４７Ｕであったのに対して、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６およびＰＶＡ−ＮＢの面積値はそれぞれ１３０Ｕおよび２Ｕであった（ｐ＜０．００１）。まとめると、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅアッセイにより、血小板活性化について、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６は高い効率を示したが、基質（ＰＶＡ−ＮＢ）は示さなかったことが証明された。
【００７６】
２．３．２．可溶性系のＦＡＣＳ
次に、本発明者らは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を利用して、血小板活性化の程度を定量した。ＧｐＩＩＩａ（インテグリンβ３鎖）と非共有結合により会合してＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を形成する血小板膜糖タンパク質ＧｐＩＩｂを認識する表面抗原ＣＤ４１の構成的発現によって、血小板を他の血液細胞と区別することができる。重要なことに、ＣＤ６２ｐ（Ｐ−セレクチン）膜糖タンパク質は、活性化血小板上でのみ発現される。ＣＤ６２ｐマーカーを使用して、研究材料（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６、ＴＲＡＰ６、ＰＶＡ−ＮＢおよびＮａＣｌ）と共にインキュベートした後のヒト血小板における活性化の程度を識別した。これらの材料で１５分間処理した血液サンプルにおけるＣＤ４１／ＣＤ６２ｐ共発現（図３Ａ〜Ｃ）の測定により、ＣＤ４１ｐ陽性細胞におけるＣＤ６２ｐ発現に対するＰＶＡ−ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）の効果は有意であった（約８０％）ことが明らかになった。ＣＤ６２ｐ陽性細胞に関する活性化血小板表現型の割合は、ＴＲＡＰ６（０．１ｍＭ）で処理した対照サンプルと同じレベルにとどまった。対照的に、ＣＤ４１陽性細胞におけるＣＤ６２ｐ発現に対するＰＶＡ−ＮＢの効果は有意ではなかった（＜１０％）（これは、０．９％ＮａＣｌで処理した陰性対照サンプルと同じレベルであった）。全体として、ＦＡＣＳ分析により、血小板活性化に関するＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の高い効率がさらに確認された。
【００７７】
２．４．ＰＶＡヒドロゲルの調製および特性評価
国際公開第９６／４００３３号などにおける可溶性形態または放出可能形態の血小板活性化ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６は、循環中の血栓症リスクを引き起こす可能性があるので、本発明者らは、局所止血のための不溶性ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６系をさらに開発し、それにより、ＴＲＡＰ６ペプチドを光架橋ＰＶＡヒドロゲルマトリックスに共有結合により固定化した。本発明者らは、ＰＶＡヒドロゲルマトリックスを作るアプローチとして、ラジカル媒介性チオール−ＮＢ光重合を選択した（図４Ａ）。（メタ）アクリレートの従来の架橋化学反応とは対照的に、チオール−ＮＢ光重合は、ロバストな動態、優れた時空間制御および細胞適合性条件を含むいくつかの利点を提供する［１９，２３］。例えば、ＰＥＧベースのチオール−ＮＢヒドロゲルは、高い生存率（＞９０％）を有する哺乳動物細胞のインサイチュー光カプセル化を可能にした［１９］。本研究では、モデルの架橋剤（ジチオスレイトール、ＤＴＴ）と組み合わせたＰＶＡ−ＮＢマクロマーを、水溶性かつ生体適合性ＰＩとしてのＩ２９５９の存在下で、ＵＶ照射によって光重合した。
【００７８】
２．４．１．光レオメトリー
本発明者らは、インサイチュー光レオメトリーを利用して、ＰＶＡヒドロゲルの光反応性および機械的特性を試験した。チオール対ＮＢ比を調整することによって、ＰＶＡヒドロゲルの化学的−物理的特性を容易に調整することができると仮説した。等しいマクロマー含量（１０％）を有するがチオール対ＮＢ比（０．４、０．８、１．０、１．２）が異なる４つのＰＶＡ−ＮＢ／ＤＴＴ製剤を、光レオメトリーでスクリーニングした（図４Ｂ）。６０秒間のブランク期間（ＵＶなし）後、ＵＶ照射により、ＰＶＡヒドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は、Ｇ’−プラトーに達するまで、数秒間で異なる程度（８〜１２０ｋＰａ）に増加した。光重合ＰＶＡヒドロゲルはすべて完全に透明であったことが見出された（図４Ｃ）。チオール対ＮＢ比を０．４から１．２に増加させることによって、Ｇ’−プラトー値（図４Ｄ）は、それぞれ８、２２、１２０から４５ｋＰａに変化した。最も高いＧ’−プラトー値はヒドロゲル（ＩＩＩ）の場合に得られ、チオール対ＮＢ比は１：１であったが、これは、最も高い架橋度を示している。特に、膨潤プロセスはヒドロゲルの貯蔵弾性率に影響を及ぼし得るので［２４］、光レオメトリー測定からのこれらのＧ’プラトー値は、プレ膨潤状態のＰＶＡヒドロゲルの一時的な貯蔵弾性率を表し得るに過ぎない。ＡＦＭナノインデンテーションなどの別のアプローチを使用することによって、膨潤ＰＶＡヒドロゲルの機械的特性に関するさらなる調査が必要である。
【００７９】
２．４．２．水分取り込み
さらに、本発明者らは、ＰＶＡヒドロゲル（Ｉ〜ＩＶ）の水分取り込み特性を分析した。光重合ＰＶＡヒドロゲルペレットをＰＢＳに４８時間浸漬して平衡湿潤重量（ｍｗｅｔ）に達し、これを凍結乾燥後のポリマー乾燥重量（ｍｄｒｙ）と比較し、平衡質量膨潤比（Ｑｍ）を求めた。図４Ｅに示されているように、ヒドロゲル（Ｉ〜ＩＶ）のＱｍ値は、１３０、４５、１０から１７に変化した。Ｇ’−プラトー値と組み合わせると、これらのデータは、チオール対ＮＢ比が１：１（ＩＩＩ）であった場合に、最も高い架橋度が得られたことを示唆している。この観察結果は、他のグループによるＰＥＧベースのチオール−ＮＢヒドロゲルに関する以前の研究［１９，２５］と相関する。例えば、Ｌｉｎらは、エステル結合が存在するので、チオール−ＮＢ光重合ＰＥＧヒドロゲルは加水分解により分解可能であることを実証した［２５］。分解速度は、チオール対ＮＢ比およびマクロマー含量によって影響されるゲルの架橋密度に依存していた。示されているＰＶＡヒドロゲルはまた、多くのエステル結合を有するので、本発明者らは、これらのヒドロゲルが加水分解により分解可能であると予想する。ＤＴＴの他に、別のジ−システインプロテアーゼ感受性ペプチドもまた、細胞リモデリングおよび創傷治癒を促進するために、酵素により切断可能な架橋剤として使用することができる。それにもかかわらず、示されているＰＶＡヒドロゲルのインビトロおよびインビボにおける分解挙動に関するさらなる研究が必要である。
【００８０】
２．５．生体機能化
２．５．１．ＴＲＡＰ６機能化ヒドロゲル微粒子の調製
ＴＲＡＰ６機能化のための適切なヒドロゲルマトリックスを調製するために、光重合ＰＶＡヒドロゲル（Ｉ、−ＳＨ：−ＮＢ＝０．４）を逐次的に凍結乾燥し、微小粒子に凍結粉砕した（図５Ａ）。光重合後に過剰なＮＢ基が存在するので、システイン含有ＴＲＡＰ６ペプチドとの光クリックコンジュゲーション（図５Ｂ）のために、これらの残存基を利用した。ＳＥＭ分析（図５Ｃ）により、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐの長さスケールは５〜５０μｍの範囲内であったことが明らかになった。ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐの部分的な凝集はおそらく、ＮＢ基の電荷効果によるものであった。
【００８１】
２．５．２．ＲＯＴＥＭ分析
本発明者らは、ＲＯＴＥＭによって、ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐと比較して、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐの止血能力を試験した。試験前に、これらの微粒子を生理食塩水と慎重に混合して、注射可能なスラリーを形成した。図６Ａ〜Ｂに示されているように、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐを全血に添加すると、ＣＴが生理学的ＣＴの約５０％まで有意に減少した。興味深いことに、ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐ対照もまた、ＣＴが約７０％まで減少した。負電荷表面が凝固に寄与することは公知であるので（すなわち、内因性経路）［２６］、本発明者らは、ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐの観察された止血活性がＮＢ基の電荷効果によるものであると推定する。
【００８２】
２．５．３．ＦＡＣＳ分析
これらの微粒子状材料が血小板を活性化する能力を定量するために、本発明者らは、ＦＡＣＳによって、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐおよび／またはＰＶＡ−ＮＢ−Ｐと共にプレインキュベートした全血サンプルを分析した。ＦＡＣＳ分析（図６Ｃ〜Ｆ）により、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐの場合には、活性化血小板（ＣＤ４１＋／ＣＤ６２ｐ＋）の割合は、陽性対照（０．１ｍＭ  ＴＲＡＰ６）と同程度の約５５％であったことが明らかになった。対照的に、ＰＶＡ−ＮＢ−Ｐと共にインキュベートした血液サンプルは、最小量の活性化血小板（＜１０％）を示したに過ぎない。これらの結果は、ＴＲＡＰ６提示ヒドロゲルマトリックス（ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６−Ｐ）が、局所的に血小板を活性化する優れた効力を示すことを示している。
【００８３】
２．６．従来の固定化技術と、ペプチドトロンビン受容体活性化剤の活性を保存するカップリング技術との比較
適切な固定化技術を慎重に選択することの重要性を示すために、従来のペプチド固定化方法（例えば、ＮＨＳコンジュゲーション）と、本発明の過程で選択した方法、例えば光クリックコンジュゲーションとの比較を、ポリマー基質に対するＴＲＡＰ６ペプチドの共有結合プロセスについて実施した。従来のペプチド固定化方法は、その生物活性の喪失をもたらすことが判明した。これは、トロンビン受容体活性化の欠如および血液凝固誘導の欠如をもたらし、得られた材料を局所止血に有用ではないものにする。
【００８４】
ＮＨＳコンジュゲーションを介してポリマー−ＴＲＡＰ６を調製するために、末端ＮＨＳ基（ＰＥＧ−１０ｋ−ＮＨＳ）を有するポリエチレングリコール（１０ｋＤａ）をポリマー基質として使用した。Ｎ末端における反応を介してＴＲＡＰ６をＰＥＧ−１０ｋ−ＮＨＳに連結し、未反応のＮＨＳ基をグリシンでブロッキングした。さらに、過剰なグリシンと反応したＰＥＧ−１０ｋ−ＮＨＳを陰性対照として調製した。蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した後、コンジュゲートを高収率で達成し、続いて、標準的な回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）によって分析して、血液凝固に対するそれらの効果を研究した。異なるアプローチによって調製したポリマー−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの生物活性を比較するために、特許請求の範囲に記載されている本発明者らのアプローチ（すなわち、光クリックコンジュゲーション）によって調製したＰＶＡ−ＴＲＡＰ６を陽性対照として含めた。サンプルは、１ｍＭ  ＴＲＡＰ６、１ｍＭ  ＰＥＧ−ＴＲＡＰ６、１ｍＭ  ＰＥＧ−グリシン、１ｍＭ  ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６および生理食塩水からなる。
【００８５】
図８に示されているように、非コンジュゲートＴＲＡＰ６（１ｍＭ）は、生理食塩水対照と比較して、凝固時間（ＣＴ）および血餅形成時間（ＣＦＴ）の有意な減少を誘導した。しかしながら、この効果は、従来のＮＨＳコンジュゲーション手順を使用してＴＲＡＰ６をＰＥＧ１０ｋにコンジュゲートした場合には喪失した。ＰＥＧ−グリシンコンジュゲート対照についても同様の効果を観察することができるが、これは、ポリマー骨格および調製手順の効果が最小であることを示している。それにもかかわらず、光クリックコンジュゲーションによって調製したＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートは依然として、ＣＴおよびＣＦＴを有意に短縮することができたが、これは、ＴＲＡＰ６の生物活性が保持されていることを示している。要約すると、これらのデータは、伝統的なＮＨＳ固定化アプローチがＴＲＡＰ６の生物活性を保持することができないことを示している。対照的に、チオール−ノルボルネン光クリックコンジュゲーションに基づく共有結合による固定化アプローチは、ＴＲＡＰ６ペプチドの完全な生物機能性をほとんど保持することができる。
【００８６】
血小板活性化に関するＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートの能力をさらに実証するために、本発明者らは、標準的な血小板凝集アッセイ（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、サンプルを試験した。図９Ａに示されているように、等しいペプチド濃度では、ＰＶＡ−ＴＲＡＰ６の総血小板凝集面積はＴＲＡＰ６のものと同程度であるが、ＰＶＡ−ＮＢ基質対照および生理食塩水対照は、無視可能なレベルの血小板凝集を示す。さらに、ＦＡＣＳ結果（図９Ｂ）は、光クリックコンジュゲーションによって調製したＰＶＡ−ＴＲＡＰ６コンジュゲートが、血小板活性化（すなわち、ＣＤ４１／ＣＤ６２Ｐ共発現）を、ＴＲＡＰ６対照（１ｍＭ）と非常に類似のレベルまで誘導することができることを裏付けているが、ＰＶＡ−ＮＢおよび生理食塩水対照については、有意な血小板活性化を観察することができなかった。これらの知見は、ＰＶＡに共有結合により固定化する場合であっても、本発明者らのコンジュゲーションアプローチが実際に、ＴＲＡＰ６の生物活性を保持することができることを証明している。
【００８７】
ペプチド固定化のための最先端アプローチとは対照的に、本発明のアプローチは、例えば、ＰＶＡノルボルネン上へのシステイン含有ＴＲＡＰ６の光クリックコンジュゲーションなどのバイオ直交反応を使用することによって、Ｎ末端もしくはＣ末端または酸性アミノ酸もしくは塩基性アミノ酸との副反応のリスクを伴わない特異的カップリング技術に基づくものであり、非常に高度のコンジュゲーション効率（＞９５％）、部位特異性およびモジュール性を提供する。このコンジュゲーションアプローチは、ノルボルネン基を有する他の基質、例えば、天然由来分子（ゼラチン、ヒアルロナン、アルギン酸など）および合成類似体、例えばＰＥＧにも適用可能である。加えて、ＰＶＡ基質のサイズ（数百の反復単位）は、短いＴＲＡＰ６配列よりもはるかに大きいので、ポリマー結合ＴＲＡＰ６コンジュゲートは、可溶性ＴＲＡＰ６ペプチドよりも、ＰＡＲ−１受容体シグナル伝達を介して血液細胞によって内在化される確率が低い。全体として、（例えば、ＴＲＡＰ６ペプチド固定化の場合には光クリックコンジュゲーションによって）保持された活性を有するトロンビン受容体活性化活性剤（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）をカップリングすることによる本発明のアプローチは、局所止血および他の医療用途のための重要な実用的価値を提供する。
【００８８】
３．結論
本研究では、本発明者らは、血小板を効率的に活性化して止血を局所的に促進することができる合成止血系を開発した。この系では、非常に強力なプロテアーゼであるトロンビンの使用が回避される。その代わりに、高い効率のチオール−ノルボルネン光コンジュゲーションを介して、細胞適合性ＰＶＡヒドロゲル上で、トロンビン受容体アゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）を共有結合により操作した。示されているＴＲＡＰ６機能化アプローチは、限定されないが、他の合成材料／ヒドロゲル、例えばＰＥＧならびに天然由来ヒドロゲル、例えばゼラチンおよびヒアルロン酸にも適用可能である。生物学的観点から、活性化血小板は、細胞増殖を調節して血管形成（血管新生）において重要な役割を果たす血小板由来成長因子（ＰＤＮＦ）を放出することが公知である。したがって、本発明者らは、これらの血小板活性化ヒドロゲルマトリックスが、安全な止血のためだけではなく、組織再生および創傷治癒の潜在用途のための汎用的生体材料であると予想する。
【００８９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2018527082.tif 000003
【図１Ｃ−Ｄ】
2018527082.tif 000004
【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
2018527082.tif 000008
【図３Ｂ】
2018527082.tif 000009
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
2018527082.tif 000015
【図６Ｃ−Ｄ】
2018527082.tif 000016
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018527082.tif 000023