(57)【要約】本開示は、合成モジュールポリペプチドライブラリ、及び、このような合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸を提供する。合成モジュールポリペプチドライブラリの作製方法、及び、合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸の製造方法もまた提供する。合成モジュールポリペプチドライブラリをスクリーニングして、合成モジュールポリペプチドライブラリのメンバーに関連する選択した表現型を同定する方法もまた提供するが、このような方法は、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法であって、前記方法は、
ａ）核酸のバーコードライブラリを宿主細胞へと導入することにより、遺伝子組換え宿主細胞の不均質な集団を生成することと、核酸の前記バーコードライブラリは複数のメンバーを含み、複数のメンバーのそれぞれは、異なる合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
ｂ）刺激物に応答して前記選択した表現型を示す遺伝子組換え宿主細胞を前記不均質な集団内において同定することと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記合成モジュールポリペプチドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記刺激物は、その表面に前記ＣＡＲが結合した抗原を示す抗原提示細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激物は共刺激分子と接触する、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記合成モジュールポリペプチドはモジュール受容体ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モジュール受容体ポリペプチドはキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記刺激物は、前記キメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドのリガンドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記合成モジュールポリペプチドはモジュール足場タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記合成モジュールポリペプチドは、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成モジュールポリペプチドは、モジュール転写制御因子タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成モジュールポリペプチドは、モジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記合成モジュールポリペプチドは、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択した表現型は、２つ以上の表現型を含む表現型特徴を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記同定した遺伝子組換え宿主細胞の前記バーコードをシークエンシングして、前記表現型に関連する前記合成モジュールポリペプチドを同定することを更に含む、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記表現型に関連する前記合成モジュールポリペプチドを定量化することを更に含む、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記表現型に関連する、核酸の前記バーコードライブラリ中の前記合成モジュールポリペプチドにおける個々のモジュールを定量化することを更に含む、請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列は、前記合成モジュールポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結した検出可能なレポーターをコードする配列を更に含み、前記方法は、前記発現した検出可能なレポーターに基づいて、遺伝子組換え宿主細胞の前記不均質な集団を区画化することを更に含む、請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記同定はインビトロで行われる、請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
宿主動物を、遺伝子組換え宿主細胞の前記不均質な集団と接触させることを更に含み、前記同定はエクスビボで行われる、請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記表現型は、
ａ）増殖、
ｂ）サイトカイン産生、
ｃ）細胞表面マーカーの発現、
ｄ）レポータータンパク質の発現、
の１つまたは複数である、請求項１から請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸の前記バーコードライブラリは、１００以上の固有メンバーを含み、前記同定は、前記選択した表現型のために前記ライブラリにおける１００以上の固有メンバーをスクリーニングすることを含む、請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数のメンバーは、抗原結合ドメイン、特異的結合ドメインまたは特異的結合パートナータンパク質、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、足場タンパク質ドメイン、タンパク質キナーゼタンパク質ドメイン、タンパク質ホスファターゼタンパク質ドメイン、受容体チロシンキナーゼタンパク質ドメイン、脂質キナーゼタンパク質ドメイン、脂質ホスファターゼタンパク質ドメイン、ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、脱ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質ドメイン、アセチル化酵素タンパク質ドメイン、脱アセチル化酵素タンパク質ドメイン、メチル化酵素タンパク質ドメイン、脱メチル化酵素タンパク質ドメイン、ヌクレアーゼタンパク質ドメイン、リコンビナーゼタンパク質ドメイン、転写因子タンパク質ドメイン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるモジュールドメインを含む合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸のバーコードライブラリであって、前記ライブラリは、
それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、それぞれの固有ポリヌクレオチドは、
ｉ）第２のモジュールをコードする第２のコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールをコードする第１のコード配列を含む、前記固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域と、
ｉｉ）前記第２のコード配列に特異的な第２のバーコードに連結した前記第１のコード配列に特異的な第１のバーコードを含むバーコード領域と、を含み、前記第１及び第２のバーコードは、前記第１及び第２のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´であり、
それぞれのバーコード領域をシークエンシングすることにより、それぞれの固有合成モジュールポリペプチドの前記同定が可能となる、
前記バーコードライブラリ。
【請求項２４】
前記第１及び第２のコード配列は、非コードヌクレオチドを何ら介在させずに直接連結する、請求項２３に記載のライブラリ。
【請求項２５】
前記複数の固有ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００の固有ポリヌクレオチドを含む、請求項２３または請求項２４に記載のライブラリ。
【請求項２６】
前記バーコード領域は、前記コード領域の５´に存在する、請求項２３から請求項２５のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項２７】
前記コード領域は、前記バーコード領域の５´に存在する、請求項２３から請求項２５のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項２８】
前記固有合成モジュールポリペプチドは共刺激ドメインを含む、請求項２３から請求項２７のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項２９】
前記第１及び第２のモジュールは、異なる共刺激ドメインを含む、請求項２８に記載のライブラリ。
【請求項３０】
それぞれの固有ポリヌクレオチドは、前記コード領域及び検出可能なポリペプチドをコードするレポーター配列の両方に機能的に連結したプロモーター配列を更に含む、請求項２３から請求項２９のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項３１】
前記検出可能なポリペプチドは、光学的に検出可能なポリペプチドである、請求項３０に記載のライブラリ。
【請求項３２】
前記光学的に検出可能なポリペプチドは、蛍光ポリペプチドである、請求項３１に記載のライブラリ。
【請求項３３】
前記コード領域は、前記第２のコード配列にインフレームで連結した第３のモジュールをコードする第３のコード配列を更に含み、前記バーコード領域は、前記第２のバーコードに連結した前記第３のコード配列に特異的な第３のバーコードを含み、前記第１の、第２の及び第３のバーコードは、前記第１の、第２の及び第３のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´である、請求項２３から請求項３２のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項３４】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項３５】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール受容体ポリペプチドである、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項３６】
前記モジュール受容体ポリペプチドはキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドである、請求項３５に記載のライブラリ。
【請求項３７】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール足場タンパク質である、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項３８】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項３９】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール転写制御因子タンパク質である、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項４０】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項４１】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である、請求項２３から請求項３３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項４２】
前記複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、抗原結合ドメイン、特異的結合ドメインまたは特異的結合パートナータンパク質、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、足場タンパク質ドメイン、タンパク質キナーゼタンパク質ドメイン、タンパク質ホスファターゼタンパク質ドメイン、受容体チロシンキナーゼタンパク質ドメイン、脂質キナーゼタンパク質ドメイン、脂質ホスファターゼタンパク質ドメイン、ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、脱ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質ドメイン、アセチル化酵素タンパク質ドメイン、脱アセチル化酵素タンパク質ドメイン、メチル化酵素タンパク質ドメイン、脱メチル化酵素タンパク質ドメイン、ヌクレアーゼタンパク質ドメイン、リコンビナーゼタンパク質ドメイン、転写因子タンパク質ドメイン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるモジュールドメインを含む、請求項２３から請求項４１のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項４３】
細胞ライブラリであって、前記ライブラリは、
それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、それぞれの固有ポリヌクレオチドは、
ｉ）第２のモジュールをコードする第２のコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールをコードする第１のコード配列を含む、前記固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域と、
ｉｉ）前記第２のコード配列に特異的な第２のバーコードに連結した前記第１のコード配列に特異的な第１のバーコードを含むバーコード領域と、を含み、前記第１及び第２のバーコードは、前記第１及び第２のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´であり、
それぞれのバーコード領域をシークエンシングすることにより、前記ライブラリのそれぞれの細胞における、それぞれの固有合成モジュールポリペプチドの前記同定が可能となる、
前記細胞ライブラリ。
【請求項４４】
前記細胞は原核細胞である、請求項４３に記載のライブラリ。
【請求項４５】
前記細胞は真核細胞である、請求項４３に記載のライブラリ。
【請求項４６】
前記真核細胞はヒト細胞である、請求項４５に記載のライブラリ。
【請求項４７】
前記ヒト細胞はヒトＴ細胞である、請求項４６に記載のライブラリ。
【請求項４８】
前記第１及び第２のコード配列は、非コードヌクレオチドを何ら介在させずに直接連結する、請求項４３から請求項４７のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項４９】
前記コード領域は、前記第２のコード配列にインフレームで連結したレポーターをコードするレポーターコード配列を更に含む、請求項４３から請求項４８のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５０】
前記レポーターはエピトープタグである、請求項４９に記載のライブラリ。
【請求項５１】
前記レポーターは蛍光タンパク質である、請求項４９に記載のライブラリ。
【請求項５２】
前記複数の細胞は、少なくとも１０００の固有ポリヌクレオチドを含む、請求項４３から請求項５１のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５３】
前記コード領域は、前記第２のコード配列にインフレームで連結した第３のモジュールをコードする第３のコード配列を更に含み、前記バーコード領域は、前記第２のバーコードに連結した前記第３のコード配列に特異的な第３のバーコードを含み、前記第１の、第２の及び第３のバーコードは、前記第１の、第２の及び第３のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´である、請求項４３から請求項５２のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５４】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５５】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール受容体ポリペプチドである、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５６】
前記モジュール受容体ポリペプチドはキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドである、請求項５５に記載のライブラリ。
【請求項５７】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール足場タンパク質である、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５８】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５９】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール転写制御因子タンパク質である、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項６０】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項６１】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である、請求項４３から請求項５３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項６２】
前記複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる前記固有合成モジュールポリペプチドは、抗原結合ドメイン、特異的結合ドメインまたは特異的結合パートナータンパク質、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、足場タンパク質ドメイン、タンパク質キナーゼタンパク質ドメイン、タンパク質ホスファターゼタンパク質ドメイン、受容体チロシンキナーゼタンパク質ドメイン、脂質キナーゼタンパク質ドメイン、脂質ホスファターゼタンパク質ドメイン、ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、脱ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質ドメイン、アセチル化酵素タンパク質ドメイン、脱アセチル化酵素タンパク質ドメイン、メチル化酵素タンパク質ドメイン、脱メチル化酵素タンパク質ドメイン、ヌクレアーゼタンパク質ドメイン、リコンビナーゼタンパク質ドメイン、転写因子タンパク質ドメイン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるモジュールドメインを含む、請求項４３から請求項６１のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項６３】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法であって、前記方法は、
第１のバーコード配列に連結した第１のモジュールコード配列を含む第１のポリヌクレオチドを、第２のバーコード配列に連結した第２のモジュールコード配列を含む第２のポリヌクレオチドと、前記第２のコード配列と前記第２のバーコード配列との間の連結部において、前記第１のポリヌクレオチドを前記第２のポリヌクレオチドへと挿入して、バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドを生成するのに十分な条件下で、接触させることを含み、
前記バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドは、前記第２のバーコード配列に連結した前記第１のバーコード配列に連結した前記第１のモジュールコード配列にインフレームで連結した前記第２のモジュールコード配列を含む、
前記方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、前記方法は、前記第１及び第２のポリヌクレオチドを、第３のバーコード配列に連結した第３のモジュールコード配列を含む第３のポリヌクレオチドと接触させることを更に含み、前記第１のコード配列と前記第１のバーコード配列との間の連結部において、前記第３のポリヌクレオチドを前記第１のポリヌクレオチドへと挿入して、バーコード化トリモジュールポリヌクレオチドを生成し、
前記バーコード化トリモジュールポリヌクレオチドは、前記第２のバーコード配列に連結した前記第１のバーコード配列に連結した前記第３のバーコード配列に連結した前記第３のモジュールコード配列にインフレームで連結した前記第１のモジュールコード配列にインフレームで連結した前記第２のモジュールコード配列を含む、前記方法。
【請求項６５】
前記第１及び第２のモジュールコード配列は、非コードヌクレオチドを何ら介在させずにインフレームで連結する、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記バーコードライブラリは、それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする１０００以上の固有核酸を含む、請求項６３から請求項６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記バーコード配列は、前記モジュールコード配列の５´側に存在する、請求項６３から請求項６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記バーコード配列は、前記モジュールコード配列の３´側に存在する、請求項６３から請求項６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記挿入は、前記第２のポリヌクレオチド上の制限酵素認識部位を認識し、前記第２のコード配列と前記第２のバーコード配列との間の前記第２のポリヌクレオチドを開裂させる制限酵素の活性が関与する、請求項６３から請求項６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記制限酵素はＴｙｐｅ  ＩＩ制限酵素である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記制限酵素はＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１のポリヌクレオチドはまた、前記制限酵素認識部位を含む、請求項６９から請求項７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
請求項６３から請求項７２のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法は、前記バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドを、レポーターコードポリヌクレオチドと、前記第１のモジュールコード配列と前記第１のバーコード配列との間の連結部において、前記レポーターコードポリヌクレオチドを前記バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドへと挿入して、レポーターが連結したバーコード化バイモジュールポリヌクレオチドを生成するのに十分な条件下で、接触させることを更に含み、前記レポーターが連結したバーコード化バイモジュールポリヌクレオチドは、前記第２のバーコード配列に連結した前記第１のバーコード配列に連結した前記レポーターコード配列にインフレームで連結した前記第１のモジュールコード配列にインフレームで連結した前記第２のモジュールコード配列を含む、前記方法。
【請求項７４】
前記レポーターコード配列は、エピトープタグをコードする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記レポーターコード配列は、蛍光レポーターをコードする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲは、表３または表４に記載の共調節ドメインを少なくとも１つ含む、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項７７】
前記ＣＡＲは抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む、請求項７６に記載のＣＡＲ。
【請求項７８】
前記ＣＡＲはＣＤ３ζ第１シグナル伝達ドメインを含む、請求項７６または請求項７７に記載のＣＡＲ。
【請求項７９】
前記ＣＡＲは、Ｔ細胞活性を刺激し、表３に記載の共刺激ドメインを少なくとも１つ含む、請求項７６から請求項７８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項８０】
前記ＣＡＲは、Ｔ細胞活性を抑制し、表４に記載の共抑制ドメインを少なくとも１つ含む、請求項７６から請求項７８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項８１】
請求項７６から請求項８０のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年９月１日に出願された米国特許仮出願第６２／２１２，９９９号の利益を主張するものであり、その全体は本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所による認可番号ＥＹ０１６５４６、Ｐ５０  ＧＭ０８１８７９、Ｒ０１  ＣＡ１９６２７７、Ｆ３２  ＧＭ００６４９９、及び、Ｒ０１  ＧＭ０５５０４０のもとで、政府による支援を受けて成立した。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
テキストファイルとして提供した配列表の参照による組み込み
配列表は、本明細書にて、２０１６年８月２９日に作成され、１４５ＫＢのサイズを有するテキストファイル、「ＵＣＳＦ−５１８ＷＯ  ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
序文
多くの真核細胞タンパク質は、タンパク質全体としての入力及び出力機能を制御または促進するモジュールドメインまたはモチーフを介して機能する。真核細胞タンパク質のモジュールドメインの再構成及び組換えにより、入力／出力関係を変化させて完全に新規の総合的な機能を有する新規のタンパク質が既に提供され始めている。入力ドメイン及び出力ドメインの簡便な組換えを用いて個々のモジュールタンパク質の改変を成功させることにより、新規タンパク質開発へのこのモジュール法の原理証明を提供してきた。
【０００５】
新規合成タンパク質（例えば、治療用細胞に用いる）の構築は、これまで構築ごとの構築に基づいて（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ−ｂｙ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｂａｓｉｓ）実施されてきた。同様に、このような合成タンパク質のトランスフェクション及びスクリーニングもまた、一度に１つずつスクリーニングした個々のコンストラクトを用いた、または、場合により同時にスクリーニングした少数の個々のコンストラクトを用いた、低スループット手法により実施されてきた。同時スクリーニングは、個々のコンストラクトを一度に１つずつスクリーニングすることと比較してより効率的ではあるが、良好に機能するコンストラクトを最終段階で容易に同定するには個々のコンストラクトを物理的に分離させておく必要があるため、拡張性には限界がある。多数の新規タンパク質を別々にスクリーニングすることは、インビトロでアッセイを行う際に負担となるが、インビボモデルで行うアッセイに試験が進んだ際には更に手に負えないほど厄介となり高価となる。このような個々の作製及び個別スクリーニングは、新規合成タンパク質の開発速度を著しく制限する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、合成モジュールポリペプチドライブラリ、及び、このような合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸を提供する。合成モジュールポリペプチドライブラリの作製方法、及び、合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸の製造方法もまた提供する。合成モジュールポリペプチドライブラリをスクリーニングして、合成モジュールポリペプチドライブラリのメンバーに関連する選択した表現型を同定する方法もまた提供するが、このような方法は、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方において有用である。
【０００７】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法を提供し、方法は以下の内容を含む。ａ）核酸のバーコードライブラリを宿主細胞に導入することにより、遺伝子組換え宿主細胞の不均質な集団を生成すること（核酸のバーコードライブラリは複数のメンバーを含み、複数のメンバーのそれぞれは、異なる合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）、及び、ｂ）刺激物に応答して選択した表現型を示す遺伝子組換え宿主細胞を不均質な集団内において同定すること。
【０００８】
方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであり、刺激物は、その表面にＣＡＲが結合した抗原を示す抗原提示細胞である。
【０００９】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、刺激物は共刺激分子と接触する。
【００１０】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドはモジュール受容体ポリペプチドである。
【００１１】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドはキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドである。
【００１２】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、刺激物は、キメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドのリガンドである。
【００１３】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドはモジュール足場タンパク質である。
【００１４】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドは、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である。
【００１５】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドはモジュール転写制御因子タンパク質である。
【００１６】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドはモジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である。
【００１７】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、合成モジュールポリペプチドは、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である。
【００１８】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、選択した表現型は、２つ以上の表現型を含む表現型特徴を含む。
【００１９】
同定した遺伝子組換え宿主細胞のバーコードをシークエンシングして、表現型に関連する合成モジュールポリペプチドを同定することを含む、細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供する。
【００２０】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、方法は、表現型に関連する合成モジュールポリペプチドを定量化することを含む。
【００２１】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、方法は、表現型に関連する、核酸のバーコードライブラリ中の合成モジュールポリペプチドにおける個々のモジュールを定量化することを含む。
【００２２】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、異なる合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結する、検出可能なレポーターをコードする配列を含み、方法は更に、発現した検出可能なレポーターに基づいて、遺伝子組換え宿主細胞の不均質な集団を区画化することを含む。
【００２３】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、同定はインビトロまたはエクスビボで行われる。
【００２４】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、表現型は、ａ）増殖、ｂ）サイトカイン産生、ｃ）細胞表面マーカーの発現、ｄ）レポータータンパク質の発現、の１つまたは複数である。
【００２５】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、方法は、１００以上の固有メンバーを含む核酸のバーコードライブラリを含み、同定は、選択した表現型のためにライブラリにおける１００以上の固有メンバーをスクリーニングすることを含む。
【００２６】
細胞内の合成モジュールポリペプチドに関連する選択した表現型を同定するための方法もまた提供し、方法は、複数のメンバーを含む核酸のバーコードライブラリを含み、複数のメンバーは、抗原結合ドメイン、特異的結合ドメインまたは特異的結合パートナータンパク質、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、足場タンパク質ドメイン、タンパク質キナーゼタンパク質ドメイン、タンパク質ホスファターゼタンパク質ドメイン、受容体チロシンキナーゼタンパク質ドメイン、脂質キナーゼタンパク質ドメイン、脂質ホスファターゼタンパク質ドメイン、ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、脱ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質ドメイン、アセチル化酵素タンパク質ドメイン、脱アセチル化酵素タンパク質ドメイン、メチル化酵素タンパク質ドメイン、脱メチル化酵素タンパク質ドメイン、ヌクレアーゼタンパク質ドメイン、リコンビナーゼタンパク質ドメイン、転写因子タンパク質ドメイン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるモジュールドメインを含む合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
核酸のバーコードライブラリを提供し、ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、それぞれの固有ポリヌクレオチドは、ｉ）第２のモジュールをコードする第２のコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールをコードする第１のコード配列を含む、固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域、ｉｉ）第２のコード配列に特異的な第２のバーコードに連結した第１のコード配列に特異的な第１のバーコードを含むバーコード領域、を含み、第１及び第２のバーコードは、第１及び第２のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´（５´  ｔｏ  ３´）であり、それぞれのバーコード領域をシークエンシングすることにより、それぞれの固有合成モジュールポリペプチドの同定が可能となる。
【００２８】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、第１及び第２のコード配列は、非コードヌクレオチドを何ら介在させずに直接連結する。
【００２９】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、複数の固有ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００の固有ポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコード領域は、コード領域の５´に存在する。
【００３１】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、コード領域は、バーコード領域の５´に存在する。
【００３２】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、固有合成モジュールポリペプチドは、共刺激ドメインを含む。
【００３３】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、第１及び第２のモジュールを含む固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、第１及び第２のモジュールは、異なる共刺激ドメインを含む。
【００３４】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、それぞれの固有ポリヌクレオチドは、コード領域及び検出可能なポリペプチドをコードするレポーター配列の両方に機能的に連結したプロモーター配列を更に含み、検出可能なポリペプチドは光学的に検出可能なポリペプチドであり、例えば、光学的に検出可能な蛍光ポリペプチドを含む。
【００３５】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、コード領域を含む固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、コード領域は、第２のコード配列にインフレームで連結した第３のモジュールをコードする第３のコード配列を更に含み、バーコード領域は、第２のバーコードに連結した第３のコード配列に特異的な第３のバーコードを含み、第１の、第２の及び第３のバーコードは、第１の、第２の及び第３のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´である。
【００３６】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである。
【００３７】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール受容体ポリペプチドポリペプチドである。
【００３８】
モジュール受容体ポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリもまた提供し、モジュール受容体ポリペプチドは、キメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドである。
【００３９】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール足場タンパク質である。
【００４０】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である。
【００４１】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール転写制御因子タンパク質である。
【００４２】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である。
【００４３】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である。
【００４４】
核酸のバーコードライブラリもまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複数の固有ポリヌクレオチドを含み、複数のそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、抗原結合ドメイン、特異的結合ドメインまたは特異的結合パートナータンパク質、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、足場タンパク質ドメイン、タンパク質キナーゼタンパク質ドメイン、タンパク質ホスファターゼタンパク質ドメイン、受容体チロシンキナーゼタンパク質ドメイン、脂質キナーゼタンパク質ドメイン、脂質ホスファターゼタンパク質ドメイン、ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、脱ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質ドメイン、アセチル化酵素タンパク質ドメイン、脱アセチル化酵素タンパク質ドメイン、メチル化酵素タンパク質ドメイン、脱メチル化酵素タンパク質ドメイン、ヌクレアーゼタンパク質ドメイン、リコンビナーゼタンパク質ドメイン、転写因子タンパク質ドメイン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるモジュールドメインを含む。
【００４５】
細胞ライブラリを提供し、ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、固有ポリヌクレオチドを含む複数の細胞を含み、それぞれの固有ポリヌクレオチドは、ｉ）第２のモジュールをコードする第２のコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールをコードする第１のコード配列を含む、固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域、ｉｉ）第２のコード配列に特異的な第２のバーコードに連結した第１のコード配列に特異的な第１のバーコードを含むバーコード領域、を含み、第１及び第２のバーコードは、第１及び第２のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´であり、それぞれのバーコード領域をシークエンシングすることにより、ライブラリのそれぞれの細胞における、それぞれの固有合成モジュールポリペプチドの同定が可能となる。
【００４６】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞は、原核細胞または真核細胞である。細胞ライブラリもまた提供し、真核細胞はヒト細胞である。細胞ライブラリもまた提供し、ヒト細胞はヒトＴ細胞である。
【００４７】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、第２のモジュールをコードする第２のコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールをコードする第１のコード配列を含む、固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域を含む、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、固有ポリヌクレオチドを含む複数の細胞を含み、第１及び第２のコード配列は、非コードヌクレオチドを何ら介在させずに直接連結する。
【００４８】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、第２のモジュールをコードする第２のコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールをコードする第１のコード配列を含む、固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域を含む、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、固有ポリヌクレオチドを含む複数の細胞を含み、コード領域は、第２のコード配列にインフレームで連結したレポーターをコードするレポーターコード配列を更に含む。
【００４９】
第２のコード配列にインフレームで連結したレポーターをコードするレポーターコード配列を含む細胞ライブラリもまた提供し、レポーターはエピトープタグである。
【００５０】
第２のコード配列にインフレームで連結したレポーターをコードするレポーターコード配列を含む細胞ライブラリもまた提供し、レポーターは蛍光タンパク質である。
【００５１】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む複数の細胞を含み、複数の細胞は、少なくとも１０００の固有ポリヌクレオチドを含む。
【００５２】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域を含むヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、コード領域は、第２のコード配列にインフレームで連結した第３のモジュールをコードする第３のコード配列を更に含み、バーコード領域は、第２のバーコードに連結した第３のコード配列に特異的な第３のバーコードを含み、第１の、第２の及び第３のバーコードは、第１の、第２の及び第３のコード配列と比較して逆順の５´トゥ３´である。
【００５３】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである。
【００５４】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール受容体ポリペプチドである。
【００５５】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、モジュール受容体ポリペプチドはキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドである。
【００５６】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール足場タンパク質である。
【００５７】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である。
【００５８】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュール転写制御因子タンパク質である。
【００５９】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である。
【００６０】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である。
【００６１】
細胞ライブラリもまた提供し、細胞ライブラリは、それぞれが、固有合成モジュールポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む固有ポリヌクレオチドを含む、複数の細胞を含み、複数の細胞におけるそれぞれの固有ポリヌクレオチドによりコードされる固有合成モジュールポリペプチドは、抗原結合ドメイン、特異的結合ドメインまたは特異的結合パートナータンパク質、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、足場タンパク質ドメイン、タンパク質キナーゼタンパク質ドメイン、タンパク質ホスファターゼタンパク質ドメイン、受容体チロシンキナーゼタンパク質ドメイン、脂質キナーゼタンパク質ドメイン、脂質ホスファターゼタンパク質ドメイン、ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、脱ユビキチン化酵素タンパク質ドメイン、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質ドメイン、アセチル化酵素タンパク質ドメイン、脱アセチル化酵素タンパク質ドメイン、メチル化酵素タンパク質ドメイン、脱メチル化酵素タンパク質ドメイン、ヌクレアーゼタンパク質ドメイン、リコンビナーゼタンパク質ドメイン、転写因子タンパク質ドメイン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるモジュールドメインを含む。
【００６２】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法を提供し、方法は、第２のコード配列と第２のバーコード配列との間の連結部において、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドへと挿入して、バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドを生成するのに十分な条件下で、第１のバーコード配列に連結した第１のモジュールコード配列を含む第１のポリヌクレオチドを、第２のバーコード配列に連結した第２のモジュールコード配列を含む第２のポリヌクレオチドと接触させることを含み、バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドは、第２のバーコード配列に連結した第１のバーコード配列に連結した第１のモジュールコード配列にインフレームで連結した第２のモジュールコード配列を含む。
【００６３】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、方法は、第１及び第２のポリヌクレオチドを、第３のバーコード配列に連結した第３のモジュールコード配列を含む第３のポリヌクレオチドと接触させて、第１のコード配列と第１のバーコード配列との間の連結部において、第３のポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドへと挿入して、バーコード化トリモジュールポリヌクレオチドを生成することを更に含み、バーコード化トリモジュールポリヌクレオチドは、第２のバーコード配列に連結した第１のバーコード配列に連結した第３のバーコード配列に連結した第３のモジュールコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールコード配列にインフレームで連結した第２のモジュールコード配列を含む。
【００６４】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、第１及び第２のモジュールコード配列は、非コードヌクレオチドを何ら介在させずにインフレームで連結している。
【００６５】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、バーコードライブラリは、それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする１０００以上の固有核酸を含む。
【００６６】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、バーコード配列は、モジュールコード配列の５´側、または、モジュールコード配列の３´側に存在する。
【００６７】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、第２のコード配列と第２のバーコード配列との間の連結部における第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドへの挿入は、制限酵素活性が関与し、制限酵素は、第２のポリヌクレオチド上の制限酵素認識部位を認識し、第２のコード配列と第２のバーコード配列との間の第２のポリヌクレオチドを開裂させ、用いる制限酵素はＴｙｐｅ  ＩＩ制限酵素を含み、用いる制限酵素はＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素を含む。
【００６８】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、第１のポリヌクレオチドはまた、第２のポリヌクレオチド上に存在する制限酵素認識部位を含む。
【００６９】
それぞれが固有合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、方法は、第１のモジュールコード配列と第１のバーコード配列との間の連結部において、レポーターコードポリヌクレオチドをバーコード化バイモジュールポリヌクレオチドへと挿入して、レポーターが連結したバーコード化バイモジュールポリヌクレオチドを生成するのに十分な条件下で、バーコード化バイモジュールポリヌクレオチドを、レポーターコードポリヌクレオチドと接触させることを更に含み、レポーターが連結したバーコード化バイモジュールポリヌクレオチドは、第２のバーコード配列に連結した第１のバーコード配列に連結したレポーターコード配列にインフレームで連結した第１のモジュールコード配列にインフレームで連結した第２のモジュールコード配列を含む。バーコードライブラリを作製するための方法もまた提供し、レポーターコード配列は、エピトープタグまたは蛍光レポーターをコードする。
【００７０】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、ＣＡＲは、表３または表４に記載の共調節ドメインを少なくとも１つ含む。
【００７１】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲもまた提供し、ＣＡＲは抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む。
【００７２】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲもまた提供し、ＣＡＲはＣＤ３ζ第１シグナル伝達ドメインを含む。
【００７３】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲもまた提供し、ＣＡＲは、Ｔ細胞活性を刺激し、表３に記載の共刺激ドメインを少なくとも１つ含む。
【００７４】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲもまた提供し、ＣＡＲは、Ｔ細胞活性を抑制し、表４に記載の共抑制ドメインを少なくとも１つ含む。
【００７５】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲをコードする核酸もまた提供し、例えば、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本開示の一実施形態に従い、ライブラリアセンブリにサブクローニングしたバーコード化モジュール配列を示す図である。
【図２】ライブラリアセンブリ作製中における、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素消化後の図１のバーコード化モジュール配列を示す図である。
【図３】図１（Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素（ＲＥ）消化前、配列番号：１６）、及び、ＣＤ２８共刺激ドメインをコードする配列（Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ  ＲＥ消化済み断片の翻訳、配列番号：１８）を含む図２（Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ  ＲＥ消化後、配列番号：１７）に従った、配列断片の例を示す図である。
【図４−１】表１を提供する図である。表１内の配列における配列識別子を以下に示す。インデックス１−配列番号：１９、インデックス２−配列番号：２０、インデックス３−配列番号：２１、インデックス４−配列番号：２２、インデックス５−配列番号：２３、インデックス６−配列番号：２４、インデックス７−配列番号：２５、インデックス８−配列番号：２６、インデックス９−配列番号：２７、インデックス１０−配列番号：２８、インデックス１１−配列番号：２９、インデックス１２−配列番号：３０、インデックス１３−配列番号：３１、インデックス１４−配列番号：３２、インデックス１５−配列番号：３３、インデックス１６−配列番号：３４、インデックス１７−配列番号：３５、インデックス１８−配列番号：３６、インデックス１９−配列番号：３７、インデックス２０−配列番号：３８、インデックス２１−配列番号：３９、インデックス２２−配列番号：４０、インデックス２３−配列番号：４１、インデックス２４−配列番号：４２、インデックス２５−配列番号：４３、インデックス２６−配列番号：４４、インデックス２７−配列番号：４５、インデックス２８−配列番号：４６、インデックス２９−配列番号：４７、インデックス３０−配列番号：４８、インデックス３１−配列番号：４９、インデックス３２−配列番号：５０、インデックス３３−配列番号：５１、インデックス３４−配列番号：５２、インデックス３５−配列番号：５３、インデックス３６−配列番号：５４、インデックス３７−配列番号：５５、インデックス３８−配列番号：５６、インデックス３９−配列番号：５７、インデックス４０−配列番号：５８、インデックス４１−配列番号：５９、インデックス４２−配列番号：６０、インデックス４３−配列番号：６１、インデックス４４−配列番号：６２、インデックス４５−配列番号：６３、インデックス４６−配列番号：６４、インデックス４７−配列番号：６５、インデックス４８−配列番号：６６、インデックス４９−配列番号：６７、インデックス５０−配列番号：６８、インデックス５１−配列番号：６９、インデックス５２−配列番号：７０、インデックス５３−配列番号：７１、インデックス５４−配列番号：７２、インデックス５５−配列番号：７３、インデックス５６−配列番号：７４、インデックス５７−配列番号：７５、インデックス５８−配列番号：７６、インデックス５９−配列番号：７７、インデックス６０−配列番号：２６、インデックス６１−配列番号：２６、インデックス６２−配列番号：２６。
【図４−２】図４の続き。
【図４−３】図４の続き。
【図５】本開示の一実施形態に従い、バーコード化２次元共調節モジュールライブラリを段階的にアセンブリするための一般スキームを示す図である。
【図６】本開示の一実施形態に従い、６２×６２  ２次元共調節モジュールライブラリを作製するための一般スキームを示す図である。
【図７】本開示の一実施形態に従った、１次元キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライブラリメンバーの一般的な構成を示す図である。
【図８】Ｔ細胞を発現する刺激ＣＡＲの、得られた活性化レベルに基づいた機能性ソート（すなわち、ビン化）を示す図である。
【図９】モジュール特異的バーコードに対して定量的シークエンシングを行うことによる、ライブラリにおけるそれぞれの共調節ドメインのＴ細胞活性への相対的影響の定量化を示す図である。
【図１０】６２メンバーの１次元ライブラリを用いることで得た３つの抗原入力レベルについての、６つの共調節ドメインにおける用量反応特性を示す図である。
【図１１】本開示の一実施形態に従い、ＣＡＲにおける様々なドメインがライブラリ内において変化し得ることを示す、ＣＡＲライブラリの非限定的な例を示す図である。
【図１２】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１３】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１４】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１５】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１６】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１７】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１８】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図１９】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図２０】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図２１】本明細書に記載のバーコード化モジュールコード配列の図式化したアセンブリ手法を示す図である。
【図２２】本開示の実施形態に従い、モジュールキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライブラリの組み合わせ入れ子アセンブリの図式化した手法を示す図である。
【図２３】本開示の実施形態に従い、プール細胞モジュールＣＡＲライブラリ作製の図式化を示す図である。
【図２４】本開示の実施形態に従い、インビトロ用及び／またはインビボ用での表現型検出及びモジュールポリペプチド同定の統合方法に関して図式化した例を示す図である。
【図２５】表２を提供する図である。
【図２６】アセンブリしたライブラリをディープシークエンシングすることで測定した、６１×６１  ２次元ライブラリのそれぞれのメンバーにおける全発現を示す図である。
【図２７】本明細書に記載の正規化前組み合わせ核酸ライブラリメンバーのシークエンシングによる定量化を示す図である。
【図２８】図２７で定量化したライブラリメンバーに関する正規化調整を計算するのに用いた線形方程式を示す図である。
【図２９】本明細書に記載の方法に従い行った正規化調整の予測可能性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
定義
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において同じ意味で用いられ、任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形態（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のことを意味する。それゆえ、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、または、プリン塩基及びピリミジン塩基、もしくは、その他の天然ヌクレオチド塩基、化学的に修飾したヌクレオチド塩基もしくは生化学的に修飾したヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマー、を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において同じ意味で用いられ、任意の長さを有するアミノ酸のポリマー形態のことを意味し、遺伝的にコードされたアミノ酸もしくは遺伝的にコードされていないアミノ酸、または、化学的にもしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、及び、修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含んでいてもよい。この用語は、非相同アミノ酸配列を有する融合タンパク質、非相同及び相同リーダー配列を有する融合、Ｎ末端メチオニン残基を含むまたは含まない融合、免疫学的にタグを付加したタンパク質などを含むがこれらに限定されない、融合タンパク質を含む。
【００７９】
用語「ドメイン」及び「モチーフ」は、本明細書において同じ意味で用いられ、１つまたは複数の特定の機能を有する構造ドメイン、及び、ポリペプチドの非構造部分（非構造ではあるが、１つまたは複数の特定の機能を保持する）の両方を意味する。例えば、構造ドメインは、ポリペプチドの特定の機能に寄与する３次元構造体を含む折り畳まれたポリペプチド内の、連続的または不連続的な複数のアミノ酸またはその一部を包含し得るがこれらに限定されない。その他の例では、ドメインは、アンフォールディングまたは変性していてもポリペプチドの特定の機能を保持し、複数の２個以上のアミノ酸またはその一部を含む、ポリペプチドの非構造部分を含んでいてもよい。この定義内にはまた、変性または非構造化されても、標的パートナーまたは結合パートナーと会合すると構造化または正常化し得るドメインが包含される。本質的に非構造なドメイン及び本質的に非構造なタンパク質のドメインの非限定例は、例えば、Ｄｙｓｏｎ  ＆  Ｗｒｉｇｈｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１９７−２０８に記載されている。
【００８０】
本発明で使用する場合、用語「モジュール」とは、一部の機能、特に、生物学的機能に関連する、隣接ポリペプチド配列またはその断片のことを意味する。
【００８１】
用語「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」は、本明細書において同じ意味で用いられ、免疫細胞の活性化を誘発または抑制することができる人工マルチモジュール分子のことを意味し、通常は、細胞外ドメイン（例えば、リガンド／抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含むがこれらに限定されない。用語「ＣＡＲ」は特にＣＡＲ分子に限定されず、ＣＡＲ変異体もまた含む。ＣＡＲ変異体は分割ＣＡＲを含み、ＣＡＲの細胞外部分（例えば、リガンド結合部位）及び細胞内部分（例えば、細胞内シグナル伝達部位）は、２つの別々の分子上に存在する。ＣＡＲ変異体としては更に、条件付きで活性化可能／抑制可能なＣＡＲであるＯＮ−ｓｗｉｔｃｈ  ＣＡＲ及びＯＦＦ−ｓｗｉｔｃｈ  ＣＡＲが挙げられ、例えば、分割ＣＡＲを含み、分割ＣＡＲの２つの部分における条件付きヘテロ二量体化は、薬理学的に制御される。ＣＡＲ変異体としては更に、二重特異性ＣＡＲが挙げられ、１番目のＣＡＲの活性化を増強または抑制し得る（どちらか一方）２番目のＣＡＲ結合ドメインを含む。ＣＡＲ変異体としては更に、例えば、二重特異性ＣＡＲ機構の構成要素として用いることが可能な抑制性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）が挙げられ、２番目のＣＡＲ結合ドメインの結合が、１番目のＣＡＲの活性化を抑制することにつながる。ＣＡＲ分子及びその誘導体（すなわち、ＣＡＲ変異体）については、例えば、ＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１４／０１６５２７、Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１３）；５（２１５）：２１５ｒａ１７２；Ｇｌｉｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１５）６：２１；Ｋａｋａｒｌａ  ＆  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ５２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ（２０１４）２０（２）：１５１−５；Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ（２０１４）２０（２）：１４１−４；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ（２０１４）２０（２）：１２７−３３；Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）：９１−１０６；Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ（２０１４）６５：３３３−４７；Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ（２０１３）３（４）：３８８−９８；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）９５６３０４に記載されている（その開示全体は本明細書に参照として組み込まれる）。
【００８２】
用語「遺伝子」とは、生物の遺伝成分内にある特定の遺伝子座に存在する、特定の遺伝単位のことを意味する。遺伝子は核酸配列であってもよく、例えば、生物の核酸ゲノム内、ＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノム内に存在するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が挙げられ、一部の例においては、染色体上に存在していてもよい。遺伝子は、タンパク質をコードするｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であってもよい。遺伝子は、単一エキソンからなりイントロンがなくてもよく、または、複数のエキソン及び１つまたは複数のイントロンを含んでいてもよい。特定の遺伝子座に存在する遺伝子の２つ以上の同一または代替形態の一方は、「対立遺伝子」と呼ばれており、例えば、二倍体生物は通常、特定の遺伝子において２つの対立遺伝子を有している。特定の遺伝子における新しい対立遺伝子は、自然突然変異または誘発突然変異を介した、自然または人為的のいずれか一方で生成される場合があり、交配またはクローニングを介して遺伝する。遺伝子または対立遺伝子を生物のゲノムから単離して、複製及び／または操作してもよく、あるいは、遺伝子治療法を用いて遺伝子または対立遺伝子をｉｎ  ｓｉｔｕで改変してもよい。遺伝子または対立遺伝子の遺伝子座は調節因子と結合していてもよく、また一部の例において、遺伝子治療は、遺伝子または対立遺伝子のコード配列を未改変のまま残しつつ、遺伝子または対立遺伝子の調節因子を調整することを含んでいてもよい。
【００８３】
「機能的に連結する」とは、近位であり、そのように記載した構成要素同士が意図したように機能する関係のことを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。
【００８４】
「ベクター」または「発現ベクター」とは、細胞内において付加したセグメントの複製をもたらすように、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」を付加可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、または、コスミドのことである。
【００８５】
本発明で使用する場合、「非相同」とは、天然（例えば、自然に発生する）の核酸またはタンパク質それぞれには見られない、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のことを意味する。
【００８６】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗原に対する特異的結合を維持する抗体フラグメントを含み、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに、抗体の抗原結合部位及び非抗体タンパク質の抗原結合部位を含む融合タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ディアボディ、直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、一本鎖抗体分子、ならびに、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、それぞれが１つの抗原結合部位を有し「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、及び、残りの「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化可能であることを意味する呼称）がもたらされる。ペプシン処理により、なおも抗原に架橋可能な２つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが生じる。
【００８８】
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらドメインは１本のポリペプチド鎖内に存在する。一部の実施形態では、Ｆｖポリペプチドは更に、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含み、そのリンカーは、ｓＦｖが抗原結合に適切な構造を形成することを可能とする。ｓＦｖについて確認するため、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００８９】
本発明で使用する場合、用語「親和性」とは、２つの物質の可逆結合における平衡定数のことを意味し、また解離定数（Ｋｄ）と表現される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体親和性の、少なくとも１倍超、少なくとも２倍超、少なくとも３倍超、少なくとも４倍超、少なくとも５倍超、少なくとも６倍超、少なくとも７倍超、少なくとも８倍超、少なくとも９倍超、少なくとも１０倍超、少なくとも２０倍超、少なくとも３０倍超、少なくとも４０倍超、少なくとも５０倍超、少なくとも６０倍超、少なくとも７０倍超、少なくとも８０倍超、少なくとも９０倍超、少なくとも１００倍超、もしくは、少なくとも１０００倍超、またはそれ以上であってもよい。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、もしくは、約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）、またはそれ以上であってもよい。
【００９０】
用語「結合」とは、例えば、塩橋及び水素橋などの相互作用を含む、共有結合、静電結合、疎水結合、ならびに、イオン結合及び／または水素結合の相互作用による、２つの分子間の直接会合のことを意味する。非特異的結合とは、約１０−７Ｍ未満の親和性を有する結合、例えば、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍなどの親和性を有する結合のことを意味し得る。
【００９１】
本発明で使用する場合、用語「免疫細胞」は、一般に、骨髄内で産生された造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導される白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））を含む。「免疫細胞」は、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、及び、骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。
【００９２】
「Ｔ細胞」は、ＣＤ３を発現する全てのタイプの免疫細胞を含み、例えば、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ抑制細胞（Ｔｒｅｇ）、及び、ガンマ−デルタＴ細胞を含む。
【００９３】
「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び、好中球を含み、それら細胞は、細胞傷害性反応を媒介することができる。
【００９４】
本発明で使用する場合、用語「幹細胞」は、一般に、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を含む。「幹細胞」は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、及び、委任前駆細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄由来細胞など）を含む。
【００９５】
本発明で使用する場合、用語「治療」、「治療する」などは、望ましい薬理学的効果及び／または生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本発明で使用する場合、「治療」は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を抑制すること、すなわち、その発現を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患を退行させることを含む。
【００９６】
用語「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」は、本明細書において同じ意味で用いられ、哺乳動物のことを意味し、それら哺乳動物としては、ネズミ科（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、有蹄類（例えば、ウマ科、ウシ科、ヒツジ類、ブタ類、ヤギ類）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９７】
「治療有効量」または「有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物またはその他の対象へと投与する際に、疾患に対するこのような治療が十分効果的となる、１種の薬剤の量、または、２種の薬剤を混ぜ合わせた量のことを意味する。「治療有効量」は、薬剤（複数可）、疾患及びその重症度、ならびに、治療を受ける対象の年齢、体重などによって異なる。
【００９８】
用語「対照」、「対照反応」、「対照アッセイ」などは、予測結果が確実性高く既知である、反応、試験、または、実験もしくは診断手順、もしくは、実験設計におけるその他一部のことを意味し、例えば、関連実験試料から得た結果が信頼できるものかどうかを示すためのもの、関連実験結果が真の結果をどの程度確実に表すかを示すためのもの、及び／または、実験結果の較正を可能とするものである。例えば、一部の例において、対照は、アッセイの必須成分が陰性対照反応から除外されるような、陰性対照反応が陽性結果を生じさせないと実験者が強い確信を持ち得るような、「陰性対照」であってもよい。一部の例において、対照は、組み合わせる際、特定のアッセイにおける全成分が特性決定され既知であり、実施するアッセイにおいて特定の結果を生じさせるような、陽性対照反応が陰性結果を生じさせないと実験者が強い確信を持ち得るような、「陽性対照」であってもよい。
【００９９】
本発明で使用する場合、用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、プライマー伸長産物の合成を誘発させる条件下に置いたとき、例えば、ヌクレオチド、及び、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなどの重合を誘導する物質の存在下、適切な温度、ｐＨ、金属濃度、及び、塩濃度で、相補的な核酸鎖の合成を開始させるように作用するオリゴヌクレオチドのことを意味する。プライマーは通常、プライマー伸長産物の合成に用いるのに適した長さであり、その長さは、８〜１００ヌクレオチドの範囲、例えば、１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０などであってもよく、１８〜４０の、２０〜３５の、２１〜３０のヌクレオチド長の範囲、及び、明示した範囲間の任意の長さを含む。一部の例において、プライマーは、１０〜５０ヌクレオチド長の範囲、例えば、１５〜４５、１８〜４０、２０〜３０、２１〜２５など、及び、明示した範囲の任意の長さであってもよい。一部の実施形態では、プライマーは通常、長さが、約１０、約１２、約１５、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、または、約７０ヌクレオチド以下である。
【０１００】
用語「ハイブリダイズ」及び「ハイブリダイゼーション」とは、ワトソンクリック型塩基対による複合体を形成するのに十分相補的なヌクレオチド配列間における複合体の形成のことを意味する。例えば、プライマーが標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」する場合、このような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始させるＤＮＡポリメラーゼに必要なプライミング機能を満たすのに十分安定である。
【０１０１】
「生体試料」は、個体または個体集団から得た様々な試料種を包含し、診断用アッセイ、モニタリングアッセイ、または、スクリーニングアッセイに用いることができる。本定義は、血液、及び生体起源のその他液体試料、生検標本もしくは組織培養物またはそれから誘導した細胞及びその後代などの固体組織試料を包含する。本定義は更に、試料の入手後に、任意の方法、例えば、個々の試料を混合またはプールすること、試薬で処理すること、可溶化すること、または、特定の構成成分（細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）を濃縮することなどで操作した試料を含む。用語「生体試料」は、臨床試料を包含し、また更に、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び、組織試料を含む。用語「生体試料」は、尿、唾液、脳脊髄液、間質液、眼液、滑液、血液画分（血漿及び血清など）などを含む。用語「生体試料」は更に、固体組織試料、組織培養試料、及び、細胞試料を含む。
【０１０２】
用語「評価する」は、任意形態の測定法を含み、また成分が存在するか否かを決定することを含む。用語「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、及び、「アッセイする」は同じ意味で用いられ、定量的測定及び定性的測定を含む。評価することは、相対的または絶対的なものであってもよい。「存在を評価する」は、存在する何かの量を決定すること、及び／または、存在するか存在しないかを決定することを含む。本発明で使用する場合、用語「決定する」、「測定する」、「評価する」及び「アッセイする」は同じ意味で用いられ、定量的測定及び定性的測定の両方を含む。
【０１０３】
本発明を更に説明する前に、本発明が記載する特定の実施形態に限定されることはなく、それゆえ当然変化し得るということを理解されたい。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、限定することを意図するものではないということを理解されたい。
【０１０４】
数値の範囲を提供する場合、その範囲の上限と下限との間にある各介在値（文脈上明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、及び、その明示範囲内の任意のその他明示値または介在値が本発明に包含されることを理解されたい。これら狭めた範囲の上限値および下限値は、その狭めた範囲内に独立して含まれていてもよく、また、明示範囲内において特に除外した任意の値に従い、本発明に包含される。明示範囲がそれら上限値及び下限値のうち１つまたは両方を含む場合、それら包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に包含される。
【０１０５】
別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様または同等の任意の方法及び物質を、本発明の実施または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質については以下で説明する。本明細書で言及する全ての刊行物は、それら刊行物が引用する内容と関連させて本方法及び／または物質を開示及び説明するために、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。それゆえ、例えば、「ポリペプチド」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「抗原」への言及は、１つまたは複数の抗原及び当業者に周知のその同等物への言及を含む、などである。更に、特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいということに留意されたい。したがって、この記述は、クレーム要素の列挙と関連させて、「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または、「否定的な」限定の使用が、先行詞として機能することを意図するものである。
【０１０７】
明確性のために、個々の実施形態との関係において記載した本発明における特定の特徴を、更に、単一の実施形態内において組み合わせて提供してもよいということを理解されたい。逆の言い方をすれば、簡潔とするため、単一の実施形態との関係において記載した本発明における様々な特徴を、更に、別々に、または、任意の好適な副組み合わせで提供してもよい。本発明に属する実施形態の全ての組み合わせは、本発明により明示的に包含され、全ての組み合わせが個別にかつ明確に開示されるかのように本明細書において開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素における全ての副組み合わせもまた、本発明により明示的に包含され、全てのこのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書において開示されるかのように、本明細書において開示される。
【０１０８】
本明細書に記載する刊行物は、単に本願の出願日前にそれらの開示を提供したに過ぎない。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が、先行発明によりこのような刊行物に先行する権利を持たないことを認めるものとして解釈されるべきではない。更に、提供した刊行物の日付は実際の刊行日とは異なる場合があり、個別に確認する必要が生じる場合がある。
【０１０９】
発明の詳細な説明
本開示は、合成モジュールポリペプチドライブラリ、及び、このような合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸を提供する。合成モジュールポリペプチドライブラリの作製方法、及び、合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸の製造方法もまた提供する。合成モジュールポリペプチドライブラリをスクリーニングして、合成モジュールポリペプチドライブラリのメンバーに関連する選択した表現型を同定する方法もまた提供するが、このような方法は、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方において有用である。
【０１１０】
ライブラリ
本開示の態様は、複数の合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のバーコードライブラリに関する。本開示の態様は更に、それぞれの細胞が、個々のバーコード化核酸を発現する細胞ライブラリを含み、当該個々のバーコード化核酸は、固有合成モジュールポリペプチドまたは複数のこのような個々のバーコード化核酸をコードする。以下でより詳細に記載するように、本開示の態様は更に、このようなライブラリの作製方法、及び、このようなライブラリをスクリーニングして特定の表現型を検出するための方法を含む。
【０１１１】
本開示の核酸ライブラリは通常、モジュール構成要素を組み合わせてアセンブリされており、それぞれのライブラリメンバーのモジュール構成要素における同一性及び構成の両方を同定するために読み取り可能なマルチユニットバーコードを含む。このように、核酸ライブラリのそれぞれの個々のメンバーは、コード領域及びバーコード領域を少なくとも含有する。核酸ライブラリにおける個々のメンバーに関係するのだが、本発明で使用する場合、用語「コード領域」とは、目的の合成ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸、例えば、特定の表現型（望ましいまたは望ましくない）に影響を与えるためにスクリーニングされ得る１つまたは複数のポリペプチドモジュールを有する合成ポリペプチドの領域のことを意味する。一部の例において、コード領域は更に、例えば、目的の合成ポリペプチドの発現を検出及び／または測定するのに用いられるレポーター分子をコードする配列を含んでいてもよい。
【０１１２】
以下でより詳細に記載するが、コード領域は通常、単一のモジュールポリペプチドをコードする。しかしながら、この記載は、それぞれのライブラリメンバーにおけるコード領域が２つ以上の個々のモジュールポリペプチドをコードしているライブラリを除外するものではない。このようなライブラリメンバーとしては、例えば、分離可能なモジュールポリペプチドをコードする配列間に、除去可能なリンカー（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リボソーム分岐配列、自己開裂ペプチドをコードする核酸など）を介在させた、マルチシストロン性（例えば、バイシストロン性、ポリシストロン性など）の単一のコード領域を挙げてもよい。２つ以上の個々のモジュールポリペプチドをコードする配列を含むコード領域は、隣接しており、また、単一のモジュールポリペプチドを構築するために、本明細書に記載の方法に従いアセンブリ及びスクリーニングされる。
【０１１３】
コード領域は可変モジュール及び不変モジュールを含有しており、合成モジュールポリペプチドの特定の部位が可変であるか、または、不変であるかは、そのライブラリの使用目的によって変わる。コード領域の可変モジュールは通常、機能特性、及び／または目的の表現型への影響のために、個々にまたは組み合わせてスクリーニングされる可変モジュールである。一般的に、可変モジュールはモジュール識別バーコードと結合しており、不変モジュールはバーコードと結合していない。任意のモジュールは、特定のライブラリ構成、及び／または、ライブラリに関連するスクリーニングに応じて、可変モジュールまたは不変モジュールとして機能してもよい。
【０１１４】
非限定的な例として、コード領域がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする特定の実施形態では、ＣＡＲにおける任意のモジュールは、スクリーニングされるＣＡＲ活性に応じて可変モジュールとして機能することができ、細胞外ドメイン、共抑制ドメイン、または、第１シグナル伝達ドメインを含むがこれらに限定されない。例えば、図１１では、ライブラリにおけるそれぞれのメンバーが、細胞外ドメイン、共抑制ドメイン、及び、第１シグナル伝達ドメインを含有し、それぞれのドメインが可変モジュールとして機能する例における非限定例を提供する、ＣＡＲライブラリにおける単一のメンバーについて示している。
【０１１５】
一部の例においては、細胞外ドメインは、例えば、抗原を標的とすることを目的とする、抗原と細胞外ドメインとの間の相互作用力を目的とする、などの可変モジュールであってもよい。一部の例においては、共抑制ドメインは可変モジュールであってもよく、例えば、個々の共抑制ドメインまたは共抑制ドメインの組み合わせを機能活性を共調節するためにスクリーニングする。一部の例においては、第１シグナル伝達ドメインは可変モジュールであってもよく、例えば、異なる細胞内シグナル伝達活性をスクリーニングする。
【０１１６】
非限定的な例として、一部の例においては、コードされた合成モジュールポリペプチドは、細胞外結合ドメイン、開裂可能なＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドドメイン（結合に誘発される開裂部位を含む）、及び、細胞内ドメインを有するキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドであってもよい。有用なキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチド及びそれらのドメインとしては、例えば、米国ＰＣＴ出願第ＵＳ２０１６／０１９１８８号（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の例においては、キメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドの１つまたは複数のドメインは、例えば、細胞外結合ドメイン、Ｎｏｔｃｈ受容体ポリペプチドドメイン、細胞内ドメイン、細胞外結合ドメイン及びＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドドメイン、細胞外結合ドメイン及び細胞内ドメイン、または、Ｎｏｔｃｈ受容体ポリペプチドドメイン及び細胞内ドメインを含むがこれらに限定されない、可変ドメインとして機能する。
【０１１７】
コード領域に含まれている不変モジュールは、ライブラリにおける全てのメンバーが不変モジュールの機能を有することが望ましいように、すなわち、不変モジュールが与える機能がライブラリにおける全てのメンバー全体にわたり一定に保持されることが望ましいように、選択される。非限定的な例として、一部の例においては、上記の細胞外ドメイン、共抑制ドメイン、または、第１シグナル伝達ドメインは、望ましい不変モジュール、または、ライブラリにおける全てのメンバーが細胞外ドメイン、共抑制ドメイン、または、第１シグナル伝達ドメインの機能を有することがアッセイにとって必要な不変モジュールであってもよい。非限定的な例として、一部の例においては、上記の細胞外結合ドメイン、開裂可能なＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドドメイン、または、細胞内ドメインは、望ましい不変モジュール、または、ライブラリにおける全てのメンバーが細胞外結合ドメイン、開裂可能なＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドドメイン、または、細胞内ドメインの機能を有することがアッセイにとって必要な不変モジュールであってもよい。
【０１１８】
用いる特定のモジュール、及び、対象ライブラリに用いるスクリーニングアッセイにもよるが、それぞれのライブラリメンバーのコード領域は、可変モジュールのみをコードする最も単純なコード領域を有する、可変モジュール及び不変モジュールの任意の組み合わせをコードしていてもよい。一部の例においては、可変モジュールをその内部に挿入するそれぞれの個々のライブラリメンバー、例えば、それぞれのベクターは、可変モジュールの挿入前に、コード領域に可変モジュールを挿入すると可変モジュール及び既存コード配列を含むようになるような、１つまたは複数のコード配列を含んでいてもよく、不変モジュール及び／または非モジュールコード配列を含んでいてもいなくてもよい。一部の例においては、全てのライブラリメンバー内に存在するこのような既存コード配列は、「定常ドメイン」と呼ばれることもある。
【０１１９】
一部の例においては、コード領域は、２つ以上の可変モジュールをコードしていてもよく、例えば、３つ以上の可変モジュール、４つ以上の可変モジュール、５つ以上の可変モジュール、６つ以上の可変モジュール、７つ以上の可変モジュール、８つ以上の可変モジュールなどが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例においては、コード領域は、２つ以上の不変モジュールをコードしていてもよく、例えば、３つ以上の不変モジュール、４つ以上の不変モジュール、５つ以上の不変モジュール、６つ以上の不変モジュール、７つ以上の不変モジュール、８つ以上の不変モジュールなどが挙げられるがこれらに限定されない。コード領域内の可変モジュール及び不変モジュールの数は、コード配列のクローニング及びライブラリ構築における実施上の制約条件により制限され得る。
【０１２０】
固有合成モジュールポリペプチドをコードする固有ライブラリメンバーの数は、ライブラリ構築に用いる可変モジュールの数、及び、目的とするライブラリ全体の複雑性によって決まる。本明細書における一部の実施形態では、ライブラリの複雑性はライブラリの次元数（ライブラリの次元数は、ライブラリメンバーのコード領域内に存在する可変モジュールコード配列の数と関連する）を基準として記載され得る。それゆえ、１次元ライブラリは、それぞれのライブラリメンバーのそれぞれのコード領域内に１つの可変モジュールコード配列を含み、２次元ライブラリは、それぞれのライブラリメンバーのそれぞれのコード領域内に２つの可変モジュールコード配列を含み、３次元ライブラリは、それぞれのライブラリメンバーのそれぞれのコード領域内に３つの可変モジュールコード配列を含み、４次元ライブラリは、それぞれのライブラリメンバーのそれぞれのコード領域内に４つの可変モジュールコード配列を含む、などである。
【０１２１】
ライブラリの次元数はライブラリ全体にわたり均一である必要はないため、一部の例において、ライブラリは混合次元数を有し得る。「混合次元数」とは、ライブラリが、上記した２種以上の次元のライブラリメンバーを含むことを意味する。例えば、ライブラリは、部分的に１次元、部分的に２次元、部分的に３次元などであってもよい。このような混合次元数ライブラリは、１次元及び２次元の混合ライブラリ、２次元及び３次元の混合ライブラリ、１次元、２次元及び３次元の混合ライブラリなどであってもよい。混合次元数ライブラリについてのこのような記載は、制限されることを意図するものではなく、当業者であれば、本明細書に包含される様々な混合次元数ライブラリが、明確に記載したそれらライブラリの範囲を越えて及ぶことを容易に理解するであろう。
【０１２２】
それゆえ、固有合成モジュールポリペプチドをコードする固有ライブラリメンバーの数は互いに異なり、ライブラリの次元数とライブラリ構築に用いるモジュール数との積となる。例えば、２０の固有可変モジュールで構成された１次元ライブラリは、２０の固有ライブラリメンバーを含む。２０の固有可変モジュールで構成された２次元ライブラリは、２０×２０（すなわち、４００）の固有ライブラリメンバーを含む。２０の固有可変モジュールで構成された３次元ライブラリは、２０×２０×２０（すなわち、８０００）の固有ライブラリメンバーを含む。一部の例においては、多次元数ライブラリの固有ライブラリメンバーは、同一可変モジュールをコードする２つ以上の配列を含んでいてもよい。
【０１２３】
一部の例においては、それぞれのライブラリメンバーが２つ以上の可変モジュールを有する場合、モジュールは位置特異的であってもよく、それは、可変モジュールのサブセットが、その他の可変モジュールに対して、合成モジュールポリペプチド内における特定の部位にのみ位置することを意味する。例えば、２つの可変モジュールを有する合成モジュールポリペプチドは、可変モジュールの第１のセット及び可変モジュールの第２のセット（第１のセットのモジュールは、第２のセットのモジュールに対して、常に特定の部位にある）を含んでいてもよい。それゆえ、位置特異的な様式で、３０の固有可変モジュールで構成された２次元ライブラリ（１０の固有可変モジュールの第１のセット、及び、２０の固有可変モジュールの第２のセットを含む）は、１０×２０（すなわち、２００）の固有ライブラリメンバーを含んでいてもよい。
【０１２４】
当業者であれば、本開示のライブラリを構築（位置特異的であろうとなかろうと）する上で、組み合わされ得る上記の可変次元数及び可変モジュール数を与えると、ライブラリ構成には非常に高い多様性があることを容易に理解するであろう。それゆえ、固有ライブラリメンバーの合計数は、大幅に変化し、２０未満〜５０，０００以上の範囲で変動してもよく、例えば、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、５５０以上、６００以上、６５０以上、７００以上、７５０以上、８００以上、８５０以上、９００以上、９５０以上、１，０００以上、１，５００以上、２，０００以上、２，５００以上、３，０００以上、３，５００以上、４，０００以上、４，５００以上、５，０００以上、５，５００以上、６，０００以上、６，５００以上、７，０００以上、７，５００以上、８，０００以上、８，５００以上、９，０００以上、９，５００以上、１０，０００以上、２０，０００以上、３０，０００以上、４０，０００以上、５０，０００以上などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
プールアセンブリ内で多次元数ライブラリを構築する例においては、プール内の固有ライブラリメンバーの合計数は大幅に変化してもよく、上記のように２０未満〜５０，０００以上の範囲で変動してもよく、より高い多様性、例えば、１０５以上、１０６以上、１０７以上、１０８以上、または、１０９以上が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２６】
本明細書に記載するライブラリの固有メンバーを、ライブラリ構築またはスクリーニングの目的で物理的にアレイする必要はない。以下でより詳細に記載するように、それぞれの合成モジュールポリペプチドをコードする核酸構成要素の組み合わせアセンブリ、及び、マルチユニットバーコードのコアセンブリは、アセンブリモジュールの同一性及び方向を記録する方法で、本明細書に記載するライブラリのワンポット合成及びプールスクリーニングを可能とする。それゆえ、ライブラリ、及び、複数の固有ライブラリメンバーは、単一の適切な溶液中に存在していてもよく、及び／または、単一の適切な容器内に存在していてもよい。
【０１２７】
合成モジュールポリペプチド
合成モジュールポリペプチドのライブラリ、及び、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸を提供する。「モジュールポリペプチド」とは、モジュールが物理的に連結して単一ポリペプチド分子として共に機能するように、機能的に連結した２つ以上のモジュール構成要素を有する機能性タンパク質のことを意味する。モジュールポリペプチドのモジュールは、機能または活性と関連していてもしていなくてもよい。多くの実施形態では、合成モジュールポリペプチドのモジュール構成要素の少なくとも２つは、個々のタンパク質から誘導される。「個々のタンパク質」から誘導したモジュールは、機能的に関連しないまたは機能的に関連する異なるタンパク質から誘導してもよく、または、異種生物、同種生物、異なるオルソロガスタンパク質、異なるパラロガスタンパク質などから誘導してもよい。
【０１２８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドライブラリにおける個々のライブラリメンバーは、最低でも、特異的結合対（例えば、抗原−抗体結合対、リガンド−受容体結合対など）のメンバーであるモジュール、及び、細胞応答を誘発するように機能する機能性モジュールまたはシグナル伝達モジュールを含む。一部の例においては、特異的結合対のメンバーは、本明細書においては、細胞外ドメインまたは細胞外認識ドメインと呼ばれることもある。一部の例においては、特異的結合対のメンバーとは、タンパク質−タンパク質シグナル伝達相互作用に関与するタンパク質、または、タンパク質−脂質シグナル伝達相互作用に関与するタンパク質のことを意味し得る。
【０１２９】
多くの実施形態では、個々のライブラリメンバーに有用となり得る特異的結合対のメンバーは、抗原結合ドメインを含んでいてもよい。本開示のライブラリメンバーに用いるのに好適な抗原結合ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってもよく、多種多様なそれらは、当技術分野において周知である。一部の例においては、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。その他抗体ベース認識ドメイン（ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン））、ヒト化型（ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン））及びヒト化型（ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン））、ならびに、「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に好適である。一部の例においては、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベース認識ドメインもまた、使用に好適である。
【０１３０】
本開示のライブラリメンバーに用いるのに好適な抗原結合ドメインは、様々な抗原結合特異性を有していてもよい。一部の例においては、抗原結合ドメインは、がん細胞により発現（合成）される抗原（すなわち、がん細胞関連抗原）内に存在するエピトープに特異的である。がん細胞関連抗原は、例えば、乳がん細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、中皮腫、肺がん細胞（例えば、小細胞肺がん細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、中皮腫細胞、肺がん細胞（例えば、小細胞肺がん細胞）、黒色腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、グリオーマ、膠芽腫、髄芽腫、結腸直腸がん細胞などに関連する抗原であり得る。がん細胞関連抗原はまた、非がん性細胞により発現されてもよい。
【０１３１】
対象ライブラリメンバーの抗原結合ドメインが結合可能な抗原の非限定例としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＧＤ２などが挙げられる。
【０１３２】
一部の例においては、対象ライブラリのライブラリメンバーに用いるのに好適な特異的結合対のメンバーは、受容体のリガンドである。リガンドとしては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１３など）、増殖因子（例えば、ヘレグリン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）など）、インテグリン結合ペプチド（例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチド）、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えば、デルタ、鋸歯状、デルタ様、Ｘデルタ、ぎざぎざ状など、ならびに、それらのホモログ及びオルソログ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
対象ライブラリのライブラリメンバー内における特異的結合対のメンバーがリガンドである場合、特定のライブラリメンバーは、特異的結合対の第２のメンバーの存在下で活性化することができ、特異的結合対の第２のメンバーは、リガンドの受容体である。例えば、リガンドがＶＥＧＦである場合、特異的結合対の第２のメンバーは、ＶＥＧＦ受容体であってもよく、可溶性ＶＥＧＦ受容体を含む。別の例において、リガンドがＮｏｔｃｈリガンドである場合、特異的結合対の第２のメンバーは、Ｎｏｔｃｈ受容体またはそのリガンド結合部位であってもよい。別の例において、リガンドがヘレグリンである場合、特異的結合対の第２のメンバーは、Ｈｅｒ２であってもよい。
【０１３４】
一部の例においては、対象ライブラリのメンバーに含まれる特異的結合対のメンバーは、受容体、例えば、リガンドの受容体、共受容体などである。受容体は、受容体のリガンド結合フラグメントであってもよい。好適な受容体としては、増殖因子受容体（例えば、ＶＥＧＦ受容体）、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＮＫＧ２Ｄ）ポリペプチド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ及びＵＬＢ６の受容体）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−２受容体など）、Ｈｅｒ２、ＣＤ２７、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）（例えば、ＮＫＰ３０（ＮＣＲ３／ＣＤ３３７）ポリペプチド（ＨＬＡ−Ｂ関連転写物３（ＢＡＴ３）及びＢ７−Ｈ６の受容体）など）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えば、ヒトＮＯＴＣＨ１、ヒトＮＯＴＣＨ２、ヒトＮＯＴＣＨ３、ヒトＮＯＴＣＨ４など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
二量体対もまた、特異的結合パートナーに包含される。二量体対の単一メンバーは、対象ライブラリのライブラリメンバーにおける使用に適しており、二量体化因子結合対を含むがこれに限定されない。二量体化因子結合対は、同一分子の異なる部位に結合する（本明細書においては、「二量体化因子」と呼ぶ）。二量体化因子の存在下で、二量体化因子結合対の両方のメンバーは、二量体化因子の異なる部位に結合するため、互いに近接することになる。一部の実施形態では、二量体化因子への結合は可逆的である。一部の実施形態では、二量体化因子への結合は不可逆的である。一部の実施形態では、二量体化因子への結合は非共有結合である。一部の実施形態では、二量体化因子への結合は共有結合である。
【０１３６】
用いるのに好適なその他二量体対としては、二量体対の第１のメンバーが二量体化物質に結合すると二量体化する二量体化因子結合対が挙げられ、二量体化物質は、二量体対の第１のメンバー内のコンホメーション変化を誘起し、コンホメーション変化により、二量体対の第１のメンバーが二量体対の第２のメンバーに結合（共有結合または非共有結合）することが可能となる。用いるのに好適なその他二量体対としては、光（例えば、青色光）に曝されると二量体対の二量体化を誘起する、二量体対が挙げられる。
【０１３７】
一部の例において、特異的結合対のメンバーは、タンパク質−タンパク質シグナル伝達相互作用に関与するタンパク質、または、タンパク質−脂質シグナル伝達相互作用に関与するタンパク質を含んでいてもよく、それゆえ、本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドは、１つまたは複数のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインまたはタンパク質−脂質相互作用ドメインを含んでいてもよい。このようなタンパク質−タンパク質相互作用ドメインまたはタンパク質−脂質相互作用ドメインとしては、例えば、１４−３−３ドメイン（例えば、ＰＤＢ（www(dot)rcsb(dot)org、オンラインで利用可能なＲＣＳＢタンパク質構造データバンク）構造２Ｂ０５で示される）、アクチン脱重合因子（ＡＤＦ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＣＦＹで示される）、ＡＮＫドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＳＷ６で示される）、ＡＮＴＨ（ＡＰ１８０Ｎ末端相同性）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造５ＡＨＶで示される）、アルマジロ（ＡＲＭ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＢＫ６で示される）、ＢＡＲ（Ｂｉｎ／Ａｍｐｈｉｐｈｙｓｉｎ／Ｒｖｓ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｉ４Ｄで示される）、ＢＥＡＣＨ（ｂｅｉｇｅ  ａｎｄ  ＣＨＳ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＭＩ１で示される）、ＢＨ（Ｂｃｌ−２ホモロジー）ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４）（例えば、ＰＤＢ構造１ＢＸＬで示される）、バキュロウイルスＩＡＰ反復配列（ＢＩＲ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｇ７３で示される）、ＢＲＣＴ（ＢＲＣＡ１Ｃ末端）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｔ２９で示される）、ブロモドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｅ６Ｉで示される）、ＢＴＢ（ＢＲ−Ｃ、ｔｔｋ  ａｎｄ  ｂａｂ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｒ２Ｂで示される）、Ｃ１ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＰＴＱで示される）、Ｃ２ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ａ２５で示される）、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）（例えば、ＰＤＢ構造１ＣＷＷで示される）、コイルドコイル（ＣＣ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＱＥＹで示される）、ＣＡＬＭ（クラスリン集合リンパ性骨髄）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＨＦＡで示される）、カルポニンホモロジー（ＣＨ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＢＫＲで示される）、クロマチン構造調節因子（クロモ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＫＮＡで示される）、ＣＵＥドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＯＴＲで示される）、デスドメイン（ＤＤ）（例えば、ＰＤＢ構造１ＦＡＤで示される）、デスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）（例えば、ＰＤＢ構造１Ａ１Ｗで示される）、Ｄｉｓｃｈｅｖｅｌｅｄ、ＥＧＬ−１０  ａｎｄ  Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ（ＤＥＰ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＦＳＨで示される）、Ｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＦＯＥで示される）、ＥＦハンド（ＥＦｈ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造２ＰＭＹで示される）、Ｅｐｓ１５ホモロジー（ＥＨ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＥＨ２で示される）、エプシンＮＨ２末端相同性（ＥＮＴＨ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＥＤＵで示される）、Ｅｎａ／Ｖａｓｐホモロジードメイン１（ＥＶＨ１）（例えば、ＰＤＢ構造１ＱＣ６で示される）、Ｆボ���クスドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＦＳ１で示される）、ＦＥＲＭ（バンド４．１、エズリン、ラディキシン、モエシン）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＧＣ６で示される）、ＦＦドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＵＺＣで示される）、フォーミンホモロジー２（ＦＨ２）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＵＸ４で示される）、フォークヘッド関連（ＦＨＡ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｇ６Ｇで示される）、ＦＹＶＥ（Ｆａｂ−１、ＹＧＬ０２３、Ｖｐｓ２７及びＥＥＡ１）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＶＦＹで示される）、ＧＡＴ（ＧＧＡ及びＴｏｍ１）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｏ３Ｘで示される）、ゲルソリンホモロジードメイン（ＧＥＬ）（例えば、ＰＤＢ構造１Ｈ１Ｖで示される）、ＧＬＵＥ（ＥＡＰ４５によるＧＲＡＭ様ユビキチン結合）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造２ＣＡＹで示される）、ＧＲＡＭ（グルコシルトランスフェラーゼ、Ｒａｂ様ＧＴＰアーゼ活性化因子及びミオチューブラリン）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＬＷ３で示される）、ＧＲＩＰドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＵＰＴで示される）、グリシン−チロシン−フェニルアラニン（ＧＹＦ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＧＹＦで示される）、ＨＥＡＴ（ハンチントン、伸長因子３、ＰＲ６５／Ａ、ＴＯＲ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＩＢＲで示される）、Ｅ６−ＡＰカルボキシル末端に相同な（ＨＥＣＴ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｃ４Ｚで示される）、ＩＱドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｎ２Ｄで示される）、ＬＩＭ（Ｌｉｎ−１、Ｉｓｌ−１及びＭｅｃ−３）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＱＬＩで示される）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＹＲＧで示される）、悪性脳腫瘍（ＭＢＴ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＯＹＸで示される）、ＭＨ１（Ｍａｄホモロジー１）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＯＺＪで示される）、ＭＨ２（Ｍａｄホモロジー２）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＤＥＶで示される）、ＭＩＵ（ユビキチン相互作用モチーフ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造２Ｃ７Ｍで示される）、ＮＺＦ（Ｎｐｌ４ジンクフィンガー）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｑ５Ｗで示される）、ＰＡＳ（Ｐｅｒ−ＡＲＮＴ−Ｓｉｍ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｐ９７で示される）、Ｐｈｏｘ  ａｎｄ  Ｂｅｍ１（ＰＢ１）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＩＰＧで示される）、ＰＤＺ（シナプス後肥厚部９５、ＰＳＤ−８５、ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ、Ｄｌｇ、閉鎖帯−１、ＺＯ−１）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＢＥ９で示される）、プレクストリンホモロジー（ＰＨ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＭＡＩで示される）、Ｐｏｌｏボックスドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｑ４Ｋで示される）、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＳＨＣで示される）、Ｐｕｍｉｌｉｏ／Ｐｕｆ（ＰＵＦ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｍ８Ｗで示される）、ＰＷＷＰドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＫＨＣで示される）、Ｐｈｏｘホモロジー（ＰＸ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｈ６Ｈで示される）、ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナル伝達の制御因子）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＡＧＲで示される）、���ＩＮＧドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＦＢＶで示される）、ＳＡＭ（ステライルαモチーフ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｂ０Ｘで示される）、シャドウクロモ（ＳＣ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｅ０Ｂで示される）、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＳＨＢで示される）、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造３ＳＥＭで示される）、ＳＯＣＳ（サイトカインシグナル伝達の抑制因子）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＶＣＢで示される）、ＳＰＲＹドメイン（例えば、ＰＤＢ構造２ＡＦＪで示される）、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）関連脂質輸送（ＳＴＡＲＴ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＥＭ２で示される）、ＳＷＩＲＭドメイン（例えば、ＰＤＢ構造２ＡＱＦで示される）、Ｔｏｌｌ／Ｉｌ−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＦＹＶで示される）、テトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＥＬＷで示される）、ＴＲＡＦ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｆ３Ｖで示される）、ｔＳＮＡＲＥ（ＳＮＡＲＥ（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質（ＳＮＡＰ）受容体））ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＳＦＣで示される）、Ｔｕｂｂｙドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｉ７Ｅで示される）、ＴＵＤＯＲドメイン（例えば、ＰＤＢ構造２ＧＦＡで示される）、ユビキチン関連（ＵＢＡ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＩＦＹで示される）、ＵＥＶ（ユビキチンＥ２変異）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｓ１Ｑで示される）、ユビキチン相互作用モチーフ（ＵＩＭ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｑ０Ｗで示される）、ＶＨＬドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＬＭ８で示される）、ＶＨＳ（Ｖｐｓ２７ｐ、Ｈｒｓ及びＳＴＡＭ）ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＥＬＫで示される）、ＷＤ４０ドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１ＮＥＸで示される）、ＷＷドメイン（例えば、ＰＤＢ構造１Ｉ６Ｃで示される）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本明細書に記載の対象ライブラリにおける個々のライブラリメンバーは、調節ドメインを含んでいてもよい。調節ドメインは、刺激機能及び抑制機能を有するドメイン、及び、その他「上流」シグナル伝達ドメインの活性化機能及び／または抑制機能を調節するドメインを含む。一部の例においては、調節ドメインは共刺激ドメインを含む。一部の例においては、調節ドメインは共抑制ドメインを含む。
【０１３９】
対象ライブラリのライブラリメンバーに含ませるのに好適な調節ドメインは、３アミノ酸直鎖モチーフと同じくらい短いポリペプチド及びタンパク質全体と同じくらい長いポリペプチドからなる任意の機能性ユニットであってもよく、調節ドメインのサイズには、ドメインがその機能を保持するのに十分大きく、かつ望ましいアセンブリ法に適合するのに十分小さい必要があるという点においてのみ制限がある。したがって、調節ドメインのサイズは、３アミノ酸〜１０００アミノ酸以上の長さの範囲であってもよく、一部の例においては、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有していてもよく、例えば、調節ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または、約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有していてもよい。その他の例においては、調節ドメインは、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、または、２００ａａ超の長さを有していてもよい。
【０１４０】
一部の例においては、「共刺激ドメイン」は、本開示のライブラリにおける個々のライブラリメンバーに有用である。共刺激とは通常、主要な特異的刺激が伝わってからの、二次的な非特異的活性化機構のことを意味する。共刺激の例としては、Ｔ細胞受容体を介した抗原特異的なシグナル伝達の後に続く抗原非特異的なＴ細胞共刺激、及び、Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達の後に続く抗原非特異的なＢ細胞共刺激が挙げられる。共刺激、例えば、Ｔ細胞共刺激、及びその関連因子については、Ｃｈｅｎ  ＆  Ｆｌｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１３）１３（４）：２２７−４２に記載されている（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。共刺激ドメインは通常、受容体に由来するポリペプチドである。一部の実施形態では、共刺激ドメインはホモ二量体化する。対象共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分（すなわち、共刺激ドメインは膜貫通タンパク質に由来し得る）であってもよい。好適な共刺激ポリペプチドの非限定例としては、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。一部の例においては、共刺激ドメイン、例えば、本開示のライブラリメンバーに用いられる共刺激ドメインは、表１に記載した共刺激ドメインを含んでいてもよい。一部の例においては、ライブラリの個々のメンバーにおける共刺激ドメインは、本明細書に記載の共刺激ドメインに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
一部の例においては、「共抑制ドメイン」は、本開示のライブラリにおける個々のライブラリメンバーに有用である。このような共抑制ドメインは通常、受容体に由来するポリペプチドである。共抑制とは通常、共刺激を阻害する、主要な抗原特異的活性化機構の二次的な抑制のことを意味する。共抑制、例えば、Ｔ細胞共抑制、及びその関連因子については、Ｃｈｅｎ  ＆  Ｆｌｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１３）１３（４）：２２７−４２、及び、Ｔｈａｖｅｎｔｈｉｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）Ｓ１２に記載されている（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、共抑制ドメインはホモ二量体化する。対象共抑制ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分（すなわち、共抑制ドメインは膜貫通タンパク質に由来し得る）であってもよい。好適な共抑制ポリペプチドの非限定例としては、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例においては、共抑制ドメイン、例えば、本開示のライブラリメンバーに用いられる共抑制ドメインは、表１に記載した共抑制ドメインを含んでいてもよい。一部の例においては、ライブラリの個々のメンバーにおける共刺激ドメインは、本明細書に記載の共刺激ドメインに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
一部の例においては、合成モジュールポリペプチドライブラリにおける個々のライブラリメンバーは、細胞内シグナル伝達ドメインモジュールを含んでいてもよい。本開示のライブラリにおけるモジュールとして用いるのに好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、個々のライブラリメンバーの活性化に応答して、特異かつ検出可能なシグナル（例えば、細胞による１つまたは複数のサイトカインの増産、標的遺伝子の転写における変化、タンパク質活性の変化、細胞挙動の変化（例えば、細胞死、細胞増殖、細胞分化、細胞生存、細胞シグナル伝達応答）など）を提供する任意の望ましいシグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、個々のライブラリメンバーに共有結合していてもいなくてもよく、例えば、全てのライブラリメンバーが共通の細胞内シグナル伝達ドメインを利用している場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば細胞質内に拡散しているライブラリメンバーに結合していなくてもよい。
【０１４３】
一部の例においては、本開示の対象ライブラリにおける個々のライブラリメンバーは、真核細胞膜内へと挿入するための膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、ライブラリメンバー内の任意の好都合な部位に存在していてもよく、それら部位は、例えば、ライブラリのモジュール構成要素のＮ末端側、ライブラリのモジュール構成要素のＣ末端側、ライブラリの少なくとも２つのモジュール構成要素間の挿入部位（例えば、ＣＡＲモジュールライブラリのメンバーにおける、抗原結合ドメインと共刺激ドメインとの間）などである。
【０１４４】
真核生物（例えば、哺乳動物）細胞の細胞膜内へとポリペプチドの挿入をもたらす任意の膜貫通（ＴＭ）ドメインが使用に好適である。１つの非限定的な例として、ＴＭ配列ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号：１）を用いてもよい。好適なＴＭ配列の更なる非限定例としては、ａ）ＣＤ８β由来の、ＬＧＬＬＶＡＧＶＬＶＬＬＶＳＬＧＶＡＩＨＬＣＣ（配列番号：２）、ｂ）ＣＤ４由来の、ＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣ（配列番号：３）、ｃ）ＣＤ３ζ由来の、ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶ（配列番号：４）、ｄ）ＣＤ２８由来の、ＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号：５）、ｅ）ＣＤ１３４（ＯＸ４０）由来の、ＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬ（配列番号：６）、及び、ｆ）ＣＤ７由来の、ＡＬＰＡＡＬＡＶＩＳＦＬＬＧＬＧＬＧＶＡＣＶＬＡ（配列番号：７）が挙げられる。
【０１４５】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、１つまたは複数の別のモジュール要素を含むように構成されていてもよい。例えば、ライブラリがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライブラリである例においては、個々のライブラリメンバーは、例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１２７２６１（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）に記載の１つまたは複数の別の構成要素を含むように構成されていてもよい。
【０１４６】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、マルチドメイン足場タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。本発明で使用する場合、用語「足場タンパク質」は、アンカータンパク質及びアダプタータンパク質を含む。このようなタンパク質は、それぞれがシグナル伝達経路における特定のメンバーを動員またはアンカーする複数の結合ドメインを含み、それら複数の結合ドメインは、例えば、それら特定のメンバーを複合体内につなぎ留めるか、それら特定のメンバーを細胞内に局在化させるか、または、シグナル伝達を調節する（例えば、正のフィードバック及び／または負のフィードバックを抑制すること、不活性化により活性化シグナル伝達コンポーネントを安定化させることなど）。それゆえ、マルチドメイン足場タンパク質、マルチドメインアンカータンパク質、及び、マルチドメインアダプタータンパク質におけるドメインは通常、シグナル伝達経路メンバー結合ドメインを含む。
【０１４７】
それらが内部で機能する足場タンパク質及び経路の非限定例としては、例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路のＳｔｅ５足場、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）シグナル伝達経路のＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）、ＭＡＰＫ経路におけるＲａｓ１のキナーゼ抑制因子（ＫＳＲ）、ＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路及びＭＡＰＫ経路のＢ細胞リンパ腫１０（ＢＣＬ−１０）、ＪＮＫ経路及びＭＡＰＫ経路のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ１（ＭＥＫＫ１）、カルシウムシグナル伝達経路のＡＨＮＡＫ−１、カルシウムシグナル伝達経路のＨＯＭＥＲ、自然免疫シグナル伝達経路のＰｅｌｌｉｎｏタンパク質、自然免疫シグナル伝達経路におけるＮＬＲファミリー−ピリンドメイン含有（ＮＬＲＰ）タンパク質、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路のＤｉｓｋｓ  ｌａｒｇｅホモログ１（ＤＬＧ１）、樹状細胞シグナル伝達経路のスピノフィリンなどが挙げられる。足場タンパク質としては更に、例えば、Ｂｕｄａｙ  ＆  Ｔｏｍｐａ．ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１０）２７７：４３４８−４３５５に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。一部の例においては、足場タンパク質は、遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｃａｆｆｏｌｄ」（ＧＯ：００３２９４７）及び類似用語に関連付けられたタンパク質であってもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、タンパク質キナーゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１４８】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、タンパク質キナーゼの１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。タンパク質キナーゼは、基質タンパク質にリン酸基を付加することにより、基質タンパク質の活性を誘導したり、その他タンパク質と会合させたり、及び／または、局在化させるように機能するようなタンパク質である。タンパク質キナーゼとしては、ＧＯ用語、「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ」（ＧＯ：０００６４６８）、「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４６７２）、「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４６７４）、「ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００１６３０１）、及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、タンパク質キナーゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼの触媒機能を持つ１つまたは複数のキナーゼドメインを含む。タンパク質キナーゼドメインは、Ｐｆａｍ識別子ＰＦ０００６９に関連付けられており、例えば、オンライン（pfam(dot)xfam(dot)org）でその識別子を用いて、タンパク質キナーゼドメインを持つタンパク質であるタンパク質キナーゼドメイン（配列及び構造を含む）を検索することができる。
【０１４９】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、タンパク質ホスファターゼの１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。タンパク質ホスファターゼは、リン酸基をその基質タンパク質のリン酸化アミノ酸残基から除去することにより、脱リン酸化をもたらし、基質タンパク質の活性を誘導するように機能するようなタンパク質であり、タンパク質キナーゼに対して逆に作用する。タンパク質ホスファターゼは、以下に示す３つの部類にグループ分けされるが、一部のタンパク質ホスファターゼは依然としてグループ分けされていない。リンタンパク質ホスファターゼ（例えば、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ１ＣＢ、ＰＰＰ１ＣＣ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＰＰ３ＣＡ、ＰＰＰ３ＣＢ、ＰＰＰ３ＣＣ、ＰＰＰ４Ｃ、ＰＰＰ５Ｃ、ＰＰＰ６Ｃなど）、タンパク質Ｔｙｒホスファターゼ（例えば、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＣ１４Ｂ、ＣＤＣ１４Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＰＴＥＮ、ＳＳＨ１、ＳＳＨ２、ＳＳＨ３など）、及び、デュアル特異性タンパク質ホスファターゼ（例えば、ＤＵＳＰ１、ＤＵＳＰ２、ＤＵＳＰ３、ＤＵＳＰ４、ＤＵＳＰ５、ＤＵＳＰ６、ＤＵＳＰ７、ＤＵＳＰ８、ＤＵＳＰ９、ＤＵＳＰ１０、ＤＵＳＰ１１、ＤＵＳＰ１２、ＤＵＳＰ１３、ＤＵＳＰ１４、ＤＵＳＰ１５、ＤＵＳＰ１６、ＤＵＳＰ１８、ＤＵＳＰ１９、ＤＵＳＰ２１、ＤＵＳＰ２２、ＤＵＳＰ２３、ＤＵＳＰ２６、ＤＵＳＰ２７、ＤＵＳＰ２８など）。タンパク質ホスファターゼとしては、ＧＯ用語、「ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００１６７９１）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、タンパク質ホスファターゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。タンパク質ホスファターゼは、タンパク質ホスファターゼの脱リン酸化機能を持つ１つまたは複数のホスファターゼドメインを含む。タンパク質ホスファターゼドメインは、Ｐｆａｍ識別子ＰＦ１５６９８に関連付けられており、例えば、pfam(dot)xfam(dot)orgでその識別子を用いて、タンパク質ホスファターゼドメインを持つタンパク質であるタンパク質ホスファターゼドメイン（配列を含む）を検索することができる。
【０１５０】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、チロシンキナーゼ受容体タンパク質（受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）とも呼ばれる）の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。ＲＴＫは膜結合細胞表面受容体である。タンパク質チロシンキナーゼのサブクラス、ＲＴＫは、細胞外におけるリガンドの結合に続くタンパク質の細胞質部分のリン酸化を介して機能する。ＲＴＫは、例えば、上皮成長因子受容体ファミリー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）ファミリー、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、ＲＥＴ受容体ファミリー、及び、ジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリーを含むファミリーに分類することができる。ＲＴＫとしては、ＧＯ用語「ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４７１４）、「ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ」（ＧＯ：０００７１６９）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、ＲＴＫ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。ＲＴＫは、ＲＴＫのキナーゼ機能を持つ１つまたは複数のチロシンキナーゼドメインを含む。ＲＴＫキナーゼドメインは、Ｐｆａｍ識別子ＰＦ０７７１４に関連付けられており、例えば、pfam(dot)xfam(dot)orgでその識別子を用いて、ＲＴＫキナーゼドメイン、及びＲＴＫキナーゼドメインを持つタンパク質（配列及び構造を含む）を検索することができる。
【０１５１】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、脂質キナーゼタンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。脂質キナーゼタンパク質は細胞脂質をリン酸化することにより、脂質反応性の調節、シグナル伝達、及び／または、脂質の局在化をもたらす。脂質キナーゼは、例えば、ホスファチジルイノシトールキナーゼ、及び、スフィンゴシンキナーゼを含むファミリーに分類することができる。脂質キナーゼとしては、ＧＯ用語「ｌｉｐｉｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００１７２７）、「ｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ」（ＧＯ：００４６８３４）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、脂質キナーゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５２】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、脂質ホスファターゼタンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。脂質ホスファターゼタンパク質は細胞脂質を脱リン酸化することにより（脂質キナーゼの活性を逆転するように作用する）、脂質反応性の調節、シグナル伝達、及び／または、脂質の局在化をもたらす。脂質ホスファターゼとしては、ＧＯ用語、「ｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００４２５７７）、「ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ」（ＧＯ：００４６８３９）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、脂質ホスファターゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５３】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、ユビキチン化酵素タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。ユビキチン化酵素タンパク質は、ユビキチン化による翻訳後修飾（ユビキチンの基質タンパク質への結合）を媒介するようなタンパク質である。基質タンパク質のユビキチン化により、基質タンパク質の分解、基質タンパク質の再局在化、基質タンパク質活性の調節、基質タンパク質におけるタンパク質−タンパク質相互作用の調節などをもたらすことができる。ユビキチン化酵素としては、ＧＯ用語、「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ」（ＧＯ：００１６５６７）、「ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４８４２）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、ユビキチン化酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５４】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、脱ユビキチン化酵素タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。脱ユビキチン化酵素タンパク質は、ユビキチン化の逆転（基質タンパク質からのユビキチンの除去）を媒介するようなタンパク質である。基質タンパク質の脱ユビキチン化は、ユビキチン化酵素の作用を逆転させて基質タンパク質の分解を阻害させること、ユビキチンが関与する基質タンパク質の再局在化を逆転させること、ユビキチンが関与する基質タンパク質活性の調節を逆転させること、ユビキチンが関与する基質タンパク質におけるタンパク質−タンパク質相互作用の調節を逆転させることなどを可能とする。脱ユビキチン化酵素としては、ＧＯ用語、「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ」（ＧＯ：００１６５７９）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、脱ユビキチン化酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５５】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、ＳＵＭＯ化酵素タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。ＳＵＭＯ化酵素タンパク質は、ＳＵＭＯ化による翻訳後修飾（基質タンパク質への低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質の付加）を媒介するようなタンパク質である。ＳＵＭＯ化により、タンパク質の安定化、核−細胞質基質間輸送、転写制御などを含む様々なタンパク質機能が調節され得る。ＳＵＭＯ化酵素としては、ＧＯ用語、「ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ」（ＧＯ：００１６９２５）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、ＳＵＭＯ化酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５６】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、アセチル化酵素タンパク質（アセチル基転移酵素とも呼ばれる）の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。アセチル基転移酵素は、基質タンパク質へのアセチル基の転移を触媒する転移酵素であり、エピジェネティック調節及び転写調節に関与している。アセチル基転移酵素は、例えば、ヒストンアセチル基転移酵素、コリンアセチル基転移酵素、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素、セロトニンＮ−アセチル基転移酵素、ＮａｔＡアセチル基転移酵素、ＮａｔＢアセチル基転移酵素を含むグループに分類され得る。アセチル基転移酵素としては、ＧＯ用語、「ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００１６４０７）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、アセチル基転移酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５７】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、脱アセチル化酵素タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。脱アセチル化酵素タンパク質は、アセチル基転移酵素の作用を逆転させて基質タンパク質に転移したアセチル基を除去するため、同様に、エピジェネティック調節及び転写調節に関与する。脱アセチル化酵素としては、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素及びサーチュインが挙げられる。脱アセチル化酵素としては、ＧＯ用語、「ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００１９２１３）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、脱アセチル化酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５８】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、メチル化酵素タンパク質（メチル基転移酵素とも呼ばれる）の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。メチル基転移酵素は、基質へとメチル基を転移することにより、支持基質（タンパク質及び核酸の基質を含む）をアルキル化させ、エピジェネティック調節及び転写調節に関与する。メチル基転移酵素は、それらの構造に基づいて、例えば、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩなどを含むクラスに分類することができ、それらの基質またはメチル化様式に従い、例えば、タンパク質メチル基転移酵素、ＤＮＡメチル基転移酵素、天然産生メチル基転移酵素、及び、非ＳＡＭ依存性メチル基転移酵素を含むグループに分けることができる。メチル基転移酵素としては、ＧＯ用語、「ＤＮＡ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００９００８）、「ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００４２０５４）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、メチル基転移酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１５９】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、脱メチル化酵素タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。脱メチル化酵素は、メチル基転移酵素の作用を逆転させて基質（タンパク質及び核酸の基質を含む）からのメチル基除去を触媒するため、またエピジェネティック調節及び転写調節に関与する。脱メチル化酵素としては、ＧＯ用語、「ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００３２４５１）、「ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００３５５１４）、「ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００３２４５２）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、脱メチル化酵素（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１６０】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、ヌクレアーゼタンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。ヌクレアーゼは、核酸基質におけるヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合の開裂を触媒する。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼなどの、相互排他的でないカテゴリーに細分することができる。ヌクレアーゼとしては、ＧＯ用語、「ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４５１８）、「ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４５３０）、「ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４５２３）、「ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｂｏｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ」（ＧＯ：００９０３０５）、「ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４５１９）、「ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：０００４５２７）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、ヌクレアーゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１６１】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、リコンビナーゼタンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。リコンビナーゼは、それぞれのリコンビナーゼに特異的な標的部位配列間における、方向性に影響されやすい核酸交換反応を触媒し、除去／挿入、逆位、転座、及び核酸フラグメント交換をもたらす。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。リコンビナーゼとしては、ＧＯ用語、「ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ＧＯ：００００１５０）、「ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」（ＧＯ：０００６３１０）及び類似用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、リコンビナーゼ（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１６２】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、転写因子タンパク質の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。転写因子は、特定のＤＮＡ配列に結合して転写を制御するようなタンパク質である。転写因子は、転写の上方制御をもたらす活性化因子であってもよく、または、転写の下方制御をもたらす抑制因子であってもよい。転写因子は、そのＤＮＡ結合ドメインの構造により、例えば、基本ドメイン転写因子、亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメイン転写因子、ヘリックスターンヘリックス転写因子、β足場因子転写因子などのスーパークラス、及び、上記スーパークラスの１つに含まれない転写因子を含むスーパークラスに分類することができる（例えば、Ｓｔｅｇｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍ（２００４）１５（２）：２７６−８６を参照されたい）。転写因子は、１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインを含む。転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、Ｐｆａｍ識別子、ＰＦ０００１０、ＰＦ００１７０、ＰＦ００１７２、ＰＦ０００４６、ＰＦ００３１９、ＰＦ０８２７９、ＰＦ０００９６、ＰＦ００１０５などに関連付けられたＤＮＡ結合ドメインの１つまたは複数であってもよく、例えば、pfam(dot)xfam(dot)orgでその識別子を用いて、ドメイン配列及びドメイン構造を検索することができる。転写因子はまた、１つまたは複数のトランス活性化ドメイン、及び、１つまたは複数のシグナル感知ドメインを含んでいてもよい。転写因子としては、ＧＯ用語、「ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ」（ＧＯ：０００５６６７）、ならびに、類似及び関連用語に関連付けられたようなタンパク質を含んでいてもよく、例えば、オンライン（www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk/QuickGO）でそれらの用語を用いて、転写因子（配列を含む）に関する情報を検索することができる。
【０１６３】
その他のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、転写因子に由来しないＤＮＡ結合ドメイン、または、非転写因子ＤＮＡ結合ドメインはまた、一部の例において、本明細書に記載の個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーにおける１つまたは複数のモジュールに有用であってもよい。このような非転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡに非特異的に結合するか、または、ＤＮＡの特定配列に結合する、天然及び合成ポリペプチドドメインを含む。非転写因子ＤＮＡ結合ドメインとしては、例えば、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼポリペプチドの天然または改変ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様エフェクタ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドの天然または改変ＤＮＡ結合ドメイン、Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）などを含む）の天然または改変ＤＮＡ結合ドメインなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１６４】
一部の例においては、個々の合成モジュールポリペプチドライブラリメンバーは、ＰＣＴ出願番号ＵＳ２００４／０１９７７８（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）に記載の１つまたは複数のモジュールを含むように構成されていてもよい。
【０１６５】
本明細書に記載の合成モジュールポリペプチド内におけるモジュール構成を行うことにより、共通機能を共有可能な（しかし、必須である必要はない）、複数の個々のモジュール機能性タンパク質を含むライブラリを作製する。例えば、個々のライブラリメンバーは、モジュール足場タンパク質である合成モジュールポリペプチド、モジュール受容体タンパク質である合成モジュールポリペプチド、モジュールタンパク質キナーゼまたはホスファターゼタンパク質である合成モジュールポリペプチド、モジュール転写制御因子タンパク質である合成モジュールポリペプチド、モジュールエピジェネティック制御因子タンパク質である合成モジュールポリペプチド、モジュールリコンビナーゼまたはヌクレアーゼタンパク質である合成モジュールポリペプチドなどを含むかまたはそれらで構成されていてもよい。所望の表現型のために、例えば、本明細書に記載の方法に従い、このようなライブラリをスクリーニングしてもよい。
【０１６６】
レポーター
本明細書に記載のライブラリは、それらタンパク質をコードする核酸配列が発現する、検出可能なシグナル産生タンパク質を含む。本明細書に記載のライブラリシステムに用いる特定の検出可能なシグナル産生タンパク質は様々であり、ある程度は選択した産生シグナル検出法に依存する。例えば、シグナルが光学的に検出される場合、例えば、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）を含む）を用いる場合、蛍光レポーターを用いる。
【０１６７】
好適な検出可能シグナル産生タンパク質としては、例えば、蛍光タンパク質、検出可能なシグナルを産物として産生する反応を触媒する酵素、エピトープタグ、表面マーカーなどが挙げられる。検出可能なシグナル産生タンパク質は、直接検出されてもよく、または、間接的に検出されてもよい。例えば、蛍光レポーターを用いる場合、レポーターの蛍光は直接検出されてもよい。一部の例においては、エピトープタグまたは表面マーカーを用いる場合、エピトープタグまたは表面マーカーは、例えば、エピトープタグまたは表面マーカーに特異的に結合する検出可能な結合物質を用いて、例えば、エピトープタグまたは表面マーカーに特異的に結合する蛍光標識抗体を用いて、間接的に検出されてもよい。一部の例においては、通常は間接的に検出されるレポーター、例えば、エピトープタグまたは表面マーカーは直接検出されてもよく、または、通常は直接検出されるレポーターは、例えば、蛍光レポーターに特異的に結合する検出可能な抗体を用いて間接的に検出されてもよい。
【０１６８】
好適な蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰの青緑色蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−ｍｏｎｏｍｅｒ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｄｉｍｅｒ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ及びｋｉｎｄｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ならびに、Ｂ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリスリン及びアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質及びフィコビリタンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質のその他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）などが挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載されている、花虫綱種由来の様々な蛍光タンパク質及び着色タンパク質のいずれかが好適に用いられる。
【０１６９】
好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
リンカー及び連結部
個々のライブラリメンバー内において、単一ポリペプチドをコードするモジュール構成要素間の連結部は通常、「インフレーム」に保持されるが、それは、マルチモジュールコード配列のコドン読み取り枠が１つのモジュールから次のモジュールへと維持されることを意味している。このような連結部は、本明細書においては、インフレーム連結部及び／またはインフレーム接合部と呼ばれることもある。マルチモジュールポリペプチドにおけるモジュール構成要素間のリンカーは通常、フレキシブルであり、及び／または、モジュールドメインの機能と干渉するアミノ酸残基を含まない。
【０１７１】
このようなインフレーム連結部は、以下でより詳細に記載するように、コード配列、及びモジュール構成要素の入れ子アセンブリがインフレームリンカーを含むように構成される、任意の簡便な方法により達成され得る。
【０１７２】
好適なリンカーは、容易に選択することが可能であり、また多数の好適な長さ、例えば、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸などのいずれかであってもよく、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または、７アミノ酸〜８アミノ酸を含み、また１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であってもよい。
【０１７３】
例示的なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号：８）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：９）を含み、配列中ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び、当該技術分野において周知のその他フレキシブルリンカーが挙げられる。グリシン、及びグリシン−セリンポリマーを用いることができ、またＧｌｙ及びＳｅｒの両方は比較的自由であるため、構成要素間の中間テザーとして機能することができる。グリシンポリマーを用いることができ、グリシンは、アラニンよりも更に相当φ−ψ空間に接近し、また長い側鎖を有する残基と比べはるかに制限を受けない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照されたい）。例示的なリンカーとしては、ＧＧＳＧ（配列番号：１０）、ＧＧＳＧＧ（配列番号：１１）、ＧＳＧＳＧ（配列番号：１２）、ＧＳＧＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＳＧ（配列番号：１４）、ＧＳＳＳＧ（配列番号：１５）などが挙げられるがこれらに限定されない、アミノ酸配列を含み得る。
【０１７４】
一部の例においては、リンカーは、クローニング用のＢａｍＨＩ制限認識部位配列を含み、またＢａｍＨＩ部位がＧＳをコードすることから、リンカーの一部としてＢａｍＨＩ部位を含む。
【０１７５】
一部の例においては、１つまたは複数のクローニング工程（例えば、ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの使用中、または相同組換え中）中に、または、直接消化（例えば、ＢａｍＨＩ消化）により、リンカー配列を除去してもよい。
【０１７６】
一部の例においては、インフレーム連結部は、２つのモジュール構成要素の連結部においてリンカーが存在しないことにより達成される。それゆえ、一部の例においては、インフレーム連結部は、モジュールコード配列間にアミノ酸コード介在核酸を含んでいなくてもよい。一部の例においては、インフレーム連結部は、モジュールコード配列間に、２つ以下の介在核酸塩基対を含んでいてもよい。一部の例においては、インフレーム連結部は、モジュールコード配列間に、１つ以下の介在核酸塩基対を含んでいてもよい。一部の例においては、インフレーム連結部は、モジュールコード配列間に、介在核酸塩基対を含んでいなくてもよい。
【０１７７】
バーコード
核酸バーコードは、例えば、ハイブリダイゼーションをベースとした同定（すなわち、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、増幅をベースとした同定（すなわち、ＰＣＲベースの同定）、及び核酸シークエンシングが挙げられるがこれらに限定されない、任意の簡便な核酸配列同定法を用いて同定することが可能な、特定の固有核酸配列である。本開示のバーコードはモジュール特異的なバーコードであってもよく、それは、特定のバーコードの同定が結合したモジュールコード配列の明確な同定に相当するように、マルチモジュールライブラリにおけるそれぞれの固有モジュールが特定の固有バーコードと相関していることを意味する。
【０１７８】
本明細書に記載のモジュール特異的なバーコードは、利用するライブラリアセンブリ法による制約を受ける。例えば、マルチモジュールコンストラクトの入れ子アセンブリが制限酵素ベースの方法によって達成される場合、アセンブリに利用する制限酵素のための制限酵素認識部位を構成する任意の配列は、バーコードから除外される。それゆえ、一部の例においては、バーコード配列は制限酵素認識配列を含まない。一部の例においては、バーコード配列は、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識配列を含まない。
【０１７９】
シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング法を含む）によりバーコード同定及び／またはバーコード定量化を実施する例では、シークエンシングにより検出されたバーコードには通常の要件が適用される。一部の例においては、バーコード及び／またはバーコードアダプターを含有する市販のバーコード及び／またはキット（例えば、限定されるわけではないが、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などの供給元から市販されているようなバーコード及び／またはバーコードアダプターキットが挙げられる）を、本明細書に記載の方法を用いるのに使用または調整してもよく、または、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手可能な委託製造品を用いてもよい。
【０１８０】
バーコード長は様々であり、またライブラリの複雑性及び利用するバーコード検出法によっても変わる。核酸バーコード（例えば、ＤＮＡバーコード）が周知である場合、核酸バーコードの設計、合成及び使用については、当業者の知るところである。
【０１８１】
一部の例においては、利用するバーコードの長さは更に、個々のバーコード配列が、ライブラリの一部その他構成要素（例えば、モジュールコード配列、ベクター、ベクター構成要素などが挙げられるがこれらに限定されない）内または２つのバーコードユニット間の連結部に偶然現れる可能性によって変わる。例えば、一部の例においては、非バーコード配列が意図せずバーコード配列として検出され得る可能性が高い場合（例えば、非常に複雑なライブラリの場合）、より長いバーコードユニットを利用してもよい。一部の例においては、必要なバーコード長を決定する際にバーコード検出法を考慮に入れてもよく、例えば、ハイブリダイゼーションバーコード検出を用いる例においては、特定のシークエンシングプライマーを用いたシークエンシングの場合と比較してより長いバーコードを採用してもよい。
【０１８２】
本発明で使用する場合、用語「バーコード領域」（核酸ライブラリにおける個々のメンバーに関係する）とは、合成ポリペプチドの可変モジュール部位に特異的な核酸配列を含むそれぞれの核酸における領域のことを意味する。一部の例においては、バーコード領域を用いて、可変モジュール、または、ライブラリにおける特定のメンバーのコード領域内に存在するモジュールを特異的に同定してもよい。一部の例においては、バーコード領域を用いて、可変モジュール（複数可）を特異的に同定して、ライブラリにおける特定のメンバー（すなわち、構造）のコード領域内に存在する可変モジュールの順番を同定してもよい。一部の例においては、バーコード領域を用いて、例えば、半定量的に、ライブラリにおける特定メンバーの頻度、または、複数のライブラリメンバーを含有する集団内における特定モジュールの頻度を定量化してもよい。
【０１８３】
本明細書に記載のライブラリにおけるバーコード化合成モジュールポリペプチド内において、バーコード領域のバーコードユニットは、モジュールコード配列と比較して逆方向である。加えて、バーコード領域のバーコードユニットは、結合したそれらに対応するモジュールコード配列と比較して逆順である。しかしながら、コードしたポリペプチドとの関係において、バーコード領域は、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸配列の「Ｎ末端」側または「Ｃ末端」側に位置していてもよい。
【０１８４】
ベクター特異的要素
「ベクター特異的要素」とは、そのベクターの構築の前、その間、またはその後において、ベクターを作製、構築、増殖、維持、及び／または、アッセイするのに用いる要素のことを意味する。このようなベクター特異的要素としては、例えば、ベクターの使用中にベクターの増殖、クローニング及び選択に必要なベクター要素が挙げられるがこれらに限定されず、また例えば、複製起点、マルチクローニング部位、原核細胞プロモーター、ファージプロモーター、選択マーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、コードされた酵素タンパク質、コードされた蛍光または発色タンパク質など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。任意の好都合なベクター特異的要素は、必要に応じ、本明細書に記載のベクターとして有用であってもよい。
【０１８５】
ベクター特異的要素として有用な、好適なプロモーター要素及びエンハンサー要素は当技術分野において周知である。細菌性細胞内における発現用として好適なプロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ、及びｔｒｃが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞内における発現用として好適なプロモーターとしては、軽鎖及び／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター要素及びエンハンサー要素、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復配列内に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、及び当該技術分野において周知の様々な組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当技術分野において周知である。このような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物及び原核生物から単離及び誘導することができる。第２の生物に用いる第１の生物から誘導した可逆的プロモーターの調節、例えば、第１の原核生物及び第２の真核生物、第１の真核生物及び第２の原核生物などは、当該技術分野において周知である。このような可逆的プロモーター、及び、別の対照タンパク質もまた含むこのような可逆的プロモーターに基づいたシステムとしては、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質に応答するプロモーター（ＡｌｃＲ）など）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒｓ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦなどを含むプロモーターシステム）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステムなど）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターシステムなど）、病原関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−９０、ダイズ熱ショックプロモーター）など）、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
一部の例においては、好適なプロモーターを含む遺伝子座、コンストラクトまたは導入遺伝子は、誘導性システムの誘導により不可逆的に切り替わる。不可逆的な切り替えを誘導する好適なシステムは当該技術分野において周知であり、例えば、不可逆的切り替えの誘導においては、Ｃｒｅ−ｌｏｘ媒介性組換えを利用してもよい（例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎ−Ｂｅｎｚａｋｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０００）２８：ｅ９９を参照されたい（その開示は参照として本明細書に組み込まれる））。当業者に周知のリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組換え部位などの任意の好適な組み合わせを、不可逆的に切り替え可能なプロモーターを作製するのに用いてもよい。本明細書の他の箇所で記載する部位特異的組換えを実施するための方法、機構及び必要条件は、不可逆的に切り替わるプロモーターを作製するのに有用であり、また当該技術分野において周知である。例えば、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６７−６０５、及びＴｒｏｐｐ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）を参照されたい（その開示は本明細書に参照として組み込まれる）。
【０１８８】
ライブラリの作製方法
本開示は、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のライブラリを作製するための方法を提供する。ライブラリにおけるそれぞれの核酸は、モジュールポリペプチドの可変モジュール（複数可）を同定するマルチユニットバーコードを含み、複数の可変モジュールが存在し、それらの方向は互いに相対的である。多数の実施形態において、本開示は、合成モジュールポリペプチドをコードする得られた核酸のそれぞれが、インフレームモジュールのコード領域及びマルチユニットバーコードを含むことになるように（バーコードユニットの配列はインフレームモジュールの配列に対応する）、バーコード化モジュールコード核酸から、合成モジュールポリペプチドを段階的に組み合わせてアセンブリするための方法を提供する。一般的に、複数の可変モジュールがライブラリのそれぞれのメンバー内に含まれる場合、コアセンブリしたマルチユニットバーコードは、それぞれのライブラリメンバーにおける可変モジュールのアセンブリ記録を提供する。
【０１８９】
理論に束縛されるものではないが、本明細書で示す、合成モジュールポリペプチドを段階的に組み合わせてアセンブリすることは、従来の個々の（すなわち、一度に１つずつ）ポリペプチド設計法を用いて可能または実用的であったよりも、より大きくより複雑なライブラリの構築を提供する。本発明者は、従来の合成モジュールポリペプチド設計が、合成モジュールポリペプチドのハイスループットスクリーニングに対して大きな技術的障害となっていることを認識していた。本明細書で示す、それぞれのマルチモジュール合成ポリペプチドと対応するマルチユニットバーコードとの整合アセンブリは、この障害を克服し、スクリーニング可能な合成モジュールポリペプチドをコードする複数の固有核酸の「ワンポットアセンブリ」を可能とする。このようなハイスループットワンポットアセンブリは、従来のポリペプチド設計では実施することはできなかった。
【０１９０】
本発明者はまた、従来の物理的にアレイした合成ポリペプチドライブラリが更に、ハイスループットスクリーニングへの大きな技術的障害を示していることを認識していた。とりわけ大きなライブラリをスクリーニングする場合、物理的に分離した反応チャンバの数、及び、それぞれのチャンバ間のアッセイ条件のばらつきにより、大きなライブラリ全体における複雑性のスクリーニング、及び、生成データの解析を行おうとする際に、技術的ハードルが相当高くなる。本発明者は、プールライブラリスクリーニングがこの問題を克服し得るが、その他の大きな障害、例えば、固有モジュールポリペプチドの複合混合プールからスクリーニングで所望の表現型を示す個々のポリペプチドを同定及び／または定量化することにおける困難性または非実用性などを示すことを認識していた。短いマルチユニットバーコードを用いて、マルチユニットバーコードのみをシークエンシングすることで、複合プール内で所望の表現型を示す個々の固有合成モジュールポリペプチドに対する、事後の効率的で明確な同定及び／または定量化を可能とすることにより、この問題を克服する。
【０１９１】
クローニング手法
全体として、本開示は、本明細書に記載のとおり、バーコード連結ポリペプチドモジュールコード核酸の入れ子アセンブリを用いたライブラリの作製方法を提供する。例えば、図１２に示すように、モジュール特異的バーコード（１０２）と連結したポリペプチドモジュールをコードする配列（１０１）を含む核酸ベクター（１００）を、ポリペプチドモジュールをコードする配列とモジュール特異的バーコードとの間の連結を開裂させることにより直鎖化（１０３）する。第１のモジュールコード配列及び第１のモジュール特異的バーコードを含むベクターの直鎖化に続き、第２のモジュールコード配列（１０４）及び第２のモジュールに特異的な第２のバーコード（１０５）を含む核酸を、第１のモジュールコード配列と第１のバーコードとの間に挿入（すなわち、入れ子）する（１０６）。アセンブリした核酸は、合成モジュールポリペプチドをコードするコード領域、及び、マルチユニットバーコード（すなわち、「バーコード」（ＢＣ））を含むバーコード領域を含む。一部の例においては、モジュールコード配列は、本明細書に記載のとおり、所望のリンカーをコードする配列によりそれらが連結するようにアセンブリされる。特定の例においては、モジュールコード配列は、リンカー配列を用いることなく、例えば、１つまたは複数のリンカーアミノ酸をコードするリンカー配列を用いることなく、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間に非コードヌクレオチドを何ら介在させずに、などで連結されるようにアセンブリされる。それゆえ、「所望のリンカー配列」または「リンカー」という表記は、とりわけ図面内で用いる場合、任意のリンカーまたはリンカー配列が全く存在しないこと、及び、ポリペプチドモジュールとモジュールコード配列とが直接連結していることを包含する。
【０１９２】
第１のモジュールコード配列と第１のモジュール特異的バーコードとの間の開裂によるベクター配列の直鎖化は、任意の簡便かつ適切な手法により達成され得る。例えば、モジュールコード配列及びバーコードを含むポリヌクレオチドは、モジュールコード配列とバーコードとの間に制限酵素（すなわち、制限エンドヌクレアーゼ）開裂部位を含むように構成されていてもよい。開裂部位は、Ｔｙｐｅ  ＩＩ制限酵素開裂部位であってもよく、更に具体的には、用いるＴｙｐｅ  ＩＩ制限酵素の認識配列内に含まれる開裂部位であってもよい。その認識配列内において開裂を行う任意の簡便なＴｙｐｅ  ＩＩ制限酵素は、それらの認識配列（当技術分野において周知）内において開裂を行うそれらＴｙｐｅ  ＩＩ制限酵素を含む本記載の目的に有用であってもよい。一部の例においては、開裂部位は、５´−ＧＧＡＴＣＣ−３´の認識配列を有し、両ストランド上における認識配列の最初のＧが５´−ＧＡＴＣ−３´のオーバーハングから離れた後に開裂するＢａｍＨＩ開裂部位であってもよい。本目的に用いることが可能なその他の制限酵素としては、例えば、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
一部の例においては、入れ子アセンブリは、第１のモジュールコード配列と第１のモジュール特異的なバーコードとの間、及び、第２のバーコード化モジュールコード配列の前後に位置する２つの制限酵素部位（ＲＥ１及びＲＥ２）を用いることにより達成される（図１３）。この２つの制限酵素を用いたアセンブリ手法では、ＲＥ１及びＲＥ２の両方における消化により、ベクターの直鎖化、及び、第２のバーコード化モジュールコード配列を含む断片の遊離がもたらされる。直鎖化ベクターと遊離断片とのライゲーションが終わると、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間に所望のリンカー配列が存在することになり、第１及び第２のバーコードは、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向となる。
【０１９４】
一部の例においては、入れ子アセンブリは、４つの制限酵素部位（ＲＥ１、ＲＥ２、ＲＥ３及びＲＥ４）を用いることにより達成され、ＲＥ１及びＲＥ２は、モジュールコード配列とそれらの対応するバーコードとの間（両方）に位置し、ＲＥ３及びＲＥ４は、第２のバーコード化モジュールコード配列の前後に位置する（図１４）。この４つの制限酵素を用いたアセンブリ手法では、第１のベクター（ＲＥ１及びＲＥ２において）及び第２のベクター（ＲＥ３及びＲＥ４において）を別々に消化することにより、ベクターの直鎖化、及び、第２のバーコード化モジュールコード配列を含む断片の遊離がもたらされる。直鎖化ベクターと遊離断片とのライゲーションが終わると、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間に所望のリンカー配列が存在することになり、第１及び第２のバーコードは、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向となる。
【０１９５】
一部の例においては、制限酵素は、具体的には、ライゲーションが終わると、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間の連結部、及び、第１のバーコードと第２のバーコードとの間の連結部には、ＲＥ１、ＲＥ２、ＲＥ３またはＲＥ４制限酵素認識配列が含まれないように選択される。通常、この手法に従い、利用するＲＥ１、ＲＥ２、ＲＥ３及びＲＥ４部位は、ライゲーション後に、得られたベクターが、第２のモジュールコード配列とその対応するバーコードとの間に活性なＲＥ１及びＲＥ２部位のみを含むように不活性化される。それゆえ、この手法は、直近で挿入したバーコード化モジュールコード配列のＲＥ１及びＲＥ２における制限酵素消化により得られたベクターを繰り返し直鎖化することにより、２次元以上のコンストラクトとなる連続的な入れ子アセンブリが可能となる。
【０１９６】
この４つの制限酵素を用いた方法では、ＲＥ１は、消化後に、直鎖化ベクターの得られた末端が、ＲＥ３を用いた消化により生成された遊離断片の末端と適合する（すなわち、ライゲート可能となる）ように選択される。ＲＥ２は、消化後に、直鎖化ベクターの得られた末端が、ＲＥ４を用いた消化により生成された遊離断片の末端と適合する（すなわち、ライゲート可能となる、及び／または、完全もしくは少なくとも部分的にハイブリダイズ可能となる）ように選択される。一部の例においては、ＲＥ１とＲＥ３との間、または、ＲＥ２とＲＥ４との間に適合末端を生成するために、ＲＥ１、ＲＥ２、ＲＥ３またはＲＥ４を用いた消化により生成された１つまたは複数の末端を、例えば、１つもしくは複数のヌクレオチドの付加もしくは欠失、または、その他の化学修飾により修飾してもよい。末端修飾の任意の簡便な方法は、当該技術分野において周知である末端修飾法（例えば、末端平滑化、リン酸化、脱リン酸化などが挙げられるがこれらに限定されない）を含む、適合末端の生成に有用であってもよい。
【０１９７】
一部の例においては、入れ子アセンブリは、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識配列（ＲＥ１）を用いることにより達成され、２つのＲＥ１部位は、第１のモジュールコード配列とそのバーコードとの間に存在し、また２つのＲＥ１部位は、第２のバーコード化モジュールコード配列の前後に存在する（図１５）。Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素が介在するこの手法では、ＲＥ１認識部位に隣接した部位における消化により、ベクターの直鎖化、及び、第２のバーコード化モジュールコード配列を含む断片の遊離がもたらされる。ＲＥ１認識部位に隣接した開裂部位は、開裂後に、ベクターの３´末端が断片の５´末端と適合し、かつ、ベクターの５´末端が断片の３´末端と適合するように構成される。一部の例においては、これら適合末端は、適合「オーバーハング」と呼ばれ得る。それゆえ、直鎖化ベクターと遊離断片とのライゲーションが終わると、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間に所望のリンカー配列が存在することになり、第１及び第２のバーコードは、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向となる。
【０１９８】
本明細書に記載のこのような酵素を利用したアセンブリ手法に有用であり得る、任意の簡便なＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素としては、例えば、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｕＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＧＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｖｅＩ、ＤｒｄＩＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＦａｑＩ、ＦｉｎＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＬｇｕＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｇｅＩなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
一部の例においては、例えば、ベクターの直鎖化、及び／または、第２のモジュールを含む断片の遊離に利用する制限酵素は、その認識部位の両側を開裂させる制限酵素である。このような機能を有する任意の簡便な制限酵素は、本明細書に記載のアセンブリ法に有用であってもよく、例えば、ＢｃｇＩが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２００】
一部の例においては、入れ子アセンブリは、複数のＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識配列、例えば、２つのＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識配列（ＲＥ１及びＲＥ２）を用いることにより達成され、２つのＲＥ１部位は、モジュールコード配列とそれらの対応するバーコードとの間（両方）に存在し、また２つのＲＥ２部位は、第２のバーコード化モジュールコード配列の前後に存在する（図１６）。この２つのＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素を用いた手法では、第１のベクター（ＲＥ１部位において）及び第２のベクター（ＲＥ２部位において）を別々に消化することにより、ベクターの直鎖化、及び、第２のバーコード化モジュールコード配列を含む断片の遊離がもたらされる。直鎖化ベクターと遊離断片とのライゲーションが終わると、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間に所望のリンカー配列が存在することになり、第１及び第２のバーコードは、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向となる。
【０２０１】
通常、この手法に従い、直鎖化及び断片遊離の第１のラウンドに利用したＲＥ１及びＲＥ２部位はベクターから除去され、得られたベクターが、第２のモジュールコード配列とその対応するバーコードとの間に活性なＲＥ１部位のみを含むように挿入される。それゆえ、この手法は、直近で挿入したバーコード化モジュールコード配列のＲＥ１認識部位を用いた制限酵素消化により得られたベクターを繰り返し直鎖化することにより、２次元以上のコンストラクトとなる連続的な入れ子アセンブリが可能となる。
【０２０２】
この２つのＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素を用いた方法では、ＲＥ１及びＲＥ２認識配列に隣接した開裂部位は、消化後に、直鎖化ベクターの得られた末端が遊離断片の末端と適合する（すなわち、ライゲート可能となる）ように構成される。一部の例においては、適合末端を生成するために、ＲＥ１及び／またはＲＥ２を用いた消化により生成された１つまたは複数の末端を、例えば、１つもしくは複数のヌクレオチドの付加もしくは欠失、または、その他の化学修飾により修飾してもよい。末端修飾の任意の簡便な方法は、当該技術分野において周知である末端修飾法（例えば、末端平滑化、リン酸化、脱リン酸化などが挙げられるがこれらに限定されない）を含む、適合末端の生成に有用であってもよい。
【０２０３】
一部の例においては、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、エキソヌクレアーゼを用いることにより、適合末端を生成してもよい。例えば、一部の実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターまたは核酸断片は、第１のベクターを第１の制限酵素（ＲＥ１）で、また第２のベクターまたは核酸を第２の制限酵素（ＲＥ２）で制限酵素消化を行った後、新しく生成された末端が、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いた後にライゲーションに適合するように構成される。エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いた適合末端の生成方法は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
一部の例においては、制限酵素消化した第１のベクター及び第２の核酸（例えば、核酸断片の第２のベクター）のアセンブリは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を用いることにより達成され、またこのような例においては、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いることにより生成された適合末端は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎオーバーハング（ＩＦオーバーハング）と呼ばれることもある（図１７）。２つのＩＦオーバーハングの連結は、核酸の２つの連結末端間の所望のリンカー及び／または所望のリンカー配列を生成するように構成されていてもよい。例えば、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間の連結ＩＦオーバーハングは、第１及び第２のモジュールがインフレームとなるように構成されていてもよい。本明細書でより詳細に記載するように、インフレームモジュールコード配列は、１つまたは複数のリンカーアミノ酸をコードする配列によって分離されていてもいなくてもよい。例えば、図１７に示すように、第１のベクターを第１の制限酵素の認識部位（ＲＥ１）で消化することにより、第２のベクターまたは核酸断片上に存在する認識部位（ＲＥ２）により認識された開裂部位におけるＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素による第２のベクターまたは核酸断片の消化により生成された末端に適合する、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ末端が生成される。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応で適合末端をライゲートすることにより、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間に所望のリンカー配列、ならびに、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向である第１及び第２のバーコードユニットを有するマルチユニットバーコードをもたらす。一部の例においては、第１及び第２のモジュールコード配列、ならびに、マルチユニットバーコードのＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリを行った後に、更なるモジュールコード配列及びバーコードユニットの挿入を可能とするための制限酵素部位が、コード領域とバーコード領域との間に存在する。
【０２０５】
一部の例においては、第１のモジュールコード配列を含む核酸を、第２のモジュールコード配列を含む第２の核酸とライゲーションした後、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間にリンカー及び介在非コードヌクレオチドが存在しないように、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列を連結させる。１つの非限定例においては、第１のモジュールコード配列及びその対応するバーコードを含む第１のベクターは、制限酵素消化によって、リンカーまたは介在非コードヌクレオチドを伴わずに、第２のモジュールコード配列及びその対応するバーコードを含む第２のベクターまたは核酸断片に連結する（図１８）。第１のベクター及び第２のベクターまたは核酸断片の両方は、２つの異なる認識部位（ＲＥ１及びＲＥ２）を有する２種類の異なるＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素を用いて消化され、第１の制限酵素は、核酸の両方のストランドを、同一部位（「平滑末端」を残すその認識部位（ＲＥ１）から一定の距離の）で開裂させ、第２の制限酵素は、核酸の両方のストランドを、異なる部位（オーバーハングまたは「付着末端」を残すその認識部位（ＲＥ２）から一定の距離の）で開裂させる。出発核酸は、第１のベクター及び第２のベクターを第２の制限酵素で開裂させた後、生成された付着末端がライゲーションに適合するように構成される。それゆえ、生成した平滑末端及び付着末端をライゲーションすると、得られたベクターは、リンカーまたは介在非コード核酸を伴わずに、第２のモジュールコード配列に直接結合した第１のモジュールコード配列、ならびに、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向である第１のモジュールコード配列のバーコード及び第２のモジュールコード配列のバーコードを含むマルチユニットバーコードを含む。
【０２０６】
消化後に平滑末端をもたらす任意の簡便なＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素は、平滑末端ライゲーションを利用した本明細書に記載の方法に有用であってもよく、例えば、ＳｌｙＩ、ＭｌｙＩなどを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において周知の制限酵素を含む。加えて、平滑末端、すなわち、「平滑化」をもたらさない制限エンドヌクレアーゼを用いた消化後に、平滑末端を生成するための方法、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（すなわち、クレノウ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、大豆ヌクレアーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない、ＤＮＡポリメラーゼを用いた「末端フィリング」を適切に利用してもよく、または、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて末端不対ヌクレオチドを除去してもよい。
【０２０７】
一部の例においては、非Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素に適合する配列がモジュールコード配列の末端に存在する場合、非Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素、例えば、その認識配列内を開裂させるＴｙｐｅ  ＩＩ制限酵素を用いて消化を行ってもよい。このような例においては、モジュールコード配列が、制限酵素認識配列の全てまたは一部をその３´末端または５´末端に含む場合、モジュールコード配列の末端に、平滑末端を生成する制限酵素を用いてもよい。一部の例においては、モジュールコード配列が、その認識配列内を切断し平滑末端を生成しない制限酵素認識配列の全てまたは一部を含む場合、非平滑末端制限酵素を用いてもよく、例えば、本明細書に記載の方法が挙げられるがこれらに限定されない、任意の簡便な方法を用いて、生成したオーバーハングを平滑化してもよい。
【０２０８】
モジュールコード配列の末端においては、配列がモジュールの末端アミノ酸に制約を受けるため、適切な制限酵素認識配列が、モジュールコード配列の１つまたは複数の末端に都合よく存在し（または修飾され得る）、適切な開裂及び／または平滑末端の生成が可能となる例は、採用する特定のモジュールにもよるが、めったに起こり得ない。それゆえ、多くの例において、合成モジュールポリペプチドの大きなライブラリまたは多次元数ライブラリの生成効率は、モジュールコード配列の外側に存在する酵素認識部位によって決まる。そのため、一部の例においては、ライブラリアセンブリに利用する１つまたは複数（全てを含む）の酵素認識配列は、モジュールコード配列の外側に存在する。多くの例において、ライブラリアセンブリに利用する１つまたは複数（全てを含む）の酵素認識配列は、バーコード配列の外側に存在する。
【０２０９】
一部の例においては、合成モジュールポリペプチドが生成されるが、モジュールコード配列と、リンカードメインを有するそれらの対応する連結部との間に介在配列が存在しないように、モジュールコード配列がリンカードメインの末端に継ぎ目なく連結する。１つの非限定例においては、モジュールコード配列の、リンカードメインへのこのような継ぎ目のない連結は、モジュールコード配列末端の一方に継ぎ目なく連結した所望のリンカー配列の一部を含むように構成されたベクターまたは核酸断片により促進される。例えば、第１のベクターは、第２のベクターまたは核酸断片にライゲートしたリンカードメインの第１の部位に継ぎ目なく連結した第１のモジュールコード配列を含むように構成されていてもよく、または、第２のモジュールコード配列に継ぎ目なく連結したリンカードメインの第２の部位を含むように構成されていてもよい（図１９）。第１のベクターは、モジュールコード配列とその対応するバーコードとの間に、第１のＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識部位（ＲＥ１）を２つ含むように構成されていてもよい。第２のベクターまたは核酸断片は、バーコード化した第２のモジュールコード配列の前後に、第２のＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識部位（ＲＥ２）を２つ含むように構成されていてもよい。第３のベクターまたは核酸断片は、残りの、例えば、２つの第２のＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素認識部位（ＲＥ２）が隣接するリンカードメインの「中央」部を含んで利用されてもよい。前消化したベクター及び／または核酸断片の配列は、消化されると、適合末端が、リンカードメインの第１の部位とリンカードメインの中央部との間、リンカードメインの第２の部位とリンカードメインの中央部との間、及び、２つのバーコード間に生成されるように構成されている。消化及びライゲーションが終わると、得られたベクターは、第１及び第２のモジュールコード配列と比較して逆方向である第１及び第２のバーコードを含むバーコード領域に連結した第２のモジュールコード配列に継ぎ目なく連結したリンカードメインに継ぎ目なく連結した第１のモジュールコード配列を含む（図１９）。継ぎ目のないアセンブリ（例えば、モジュールとリンカードメインとの間に）は、エキソヌクレアーゼ媒介性アセンブリ（例えば、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法など）を用いて、または、用いずに達成されてもよい。
【０２１０】
一部の例においては、上記の消化ベースアセンブリ手法を、本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドライブラリを作製するのに有用な方法に到達するための任意の簡便かつ適切な方法と、全面的にまたは部分的に組み合わせてもよい。加えて、消化ベースアセンブリの代替方法が当技術分野において周知であり、かつ本明細書に記載の方法に適合し得る場合、そのような代替方法は、本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドライブラリのアセンブリに有用であってもよい。一部の例においては、記載した消化ベース手法を、核酸アセンブリの非消化ベース法と、全面的にまたは部分的に組み合わせてもよい。
【０２１１】
本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドライブラリをコードする核酸のアセンブリは、消化ベース、すなわち、制限酵素ベースのアセンブリ手法に限定されない。一部の例においては、非消化ベース法は、本明細書に記載のライブラリのアセンブリに有用であってもよく、例えば、増幅ベース手法、組換えベース手法などが挙げられるがこれらに限定されない。消化ベース手法の代わりに非消化ベース法を用いてもよく（すなわち、全アセンブリ手法が全体として制限酵素消化を伴わないように）、または、非消化ベース法を消化ベース手法と組み合わせて用いてもよい（すなわち、アセンブリ手法が全体として制限酵素ベース消化法及び非消化ベース法の両方を伴うように）。
【０２１２】
一部の例においては、例えば、ＰＣＲクローニング、ＴＡクローニング、ＰＣＲオーバーハング伸長などが挙げられるがこれらに限定されない増幅ベースアセンブリを用いて、本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドライブラリを、全体的にまたは部分的にアセンブリしてもよい。このような増幅ベース手法は様々であるが、一般に、出発ベクター及び／または出発核酸断片内における複数のプライマー結合部位を利用する。このようなプライマー結合部位を、所望の最終作製物にもよるが、とりわけベクター及び／または核酸断片に付加してもよく、または、ベクターもしくは核酸断片内に存在する既存配列を、様々な増幅ベースアセンブリ手法に従い、プライマー結合部位として利用してもよい。プライマー結合部位は、所望のクローン産物を作製するのに十分な、任意の簡便な構成及び／または方向で配置されてもよく、モジュールコード配列とその対応するバーコードとの間にモジュールコード配列に向かって５´トゥ３´方向で配置すること、モジュールコード配列とその対応するバーコードとの間にバーコードに向かって５´トゥ３´方向で配置すること、モジュールコード配列の上流（すなわち、５´）にモジュールコード配列に向かって５´トゥ３´方向で配置すること、モジュールバーコード配列の下流（すなわち、３´）にモジュールバーコード配列に向かって５´トゥ３´方向で配置することなどが挙げられるがこれらに限定されない。プライマー結合部位配列は、増幅ベースクローニング後（増幅ベースクローニングの１ラウンド後を含む）に構成されていてもよく、１つまたは複数の所望のリンカー配列は、アセンブリした要素（例えば、アセンブリしたモジュールコード配列、アセンブリしたバーコード配列などを含む）間に存在する。
【０２１３】
増幅ベースアセンブリ手法の非限定的な例として、ＰＣＲオーバーハング伸長手法を採用してもよく（図２０）、第１のベクターは、モジュールコード配列とその対応するバーコード配列との間に位置する、第１のプライマー結合部位（ＰＢＳ１）、及び反対の５´トゥ３´方向の第２のプライマー結合部位（ＰＢＳ２）を含む。第１及び第２のプライマー結合部位（ＰＢＳ１及びＰＢＳ２）が隣接する第２のバーコード化モジュールコード配列を有する第２のベクターまたは核酸断片を利用する。ＰＢＳ１部位及びＰＢＳ２部位に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いたオーバーハング伸長ＰＣＲによる伸長及び増幅の後に、アセンブリ産物を作製するのだが、第１のモジュールコード配列は所望のリンカーで第２のモジュールコード配列と連結し、第２のモジュールコード配列は、それらの対応するモジュールコード配列と比較して逆方向である第１及び第２のバーコードを含むマルチユニットバーコードと連結する（図２０）。
【０２１４】
上記のアセンブリ手法に照らして、当業者は、上記の手法のいずれかをどのように組み合わせる（全面的にまたは部分的に）ことによって、所望の結果をもたらすのか、及び／または、所望のライブラリ及び／またはライブラリ構成要素を含むアセンブリに応じた特定のクローニング技術における、利点を最大化させるか、及び／または、欠点を最小化させるかを、容易に理解するであろう。非限定的な例として、増幅ベース手法を消化ベース手法と組み合わせてもよく、このような手法を組み合わせることにより、所望のライブラリ及び／またはライブラリ構成要素を含むアセンブリがもたらされる。例えば、図２１に示すように、第１のモジュールコード配列とそのバーコードとの間に位置する制限認識部位酵素部位（ＲＥ１）による第１のベクターの制限酵素消化を、第２のベクターまたは核酸断片内に含まれる第２のバーコード化モジュールコード配列の前後にあるプライマー結合部位を用いたＰＣＲベース増幅と組み合わせて、入れ子アセンブリを可能としてもよい。記載したハイブリッドアセンブリ手法によるアセンブリを行った後に、アセンブリ産物を作製するのだが、第１のモジュールコード配列は所望のリンカーで第２のモジュールコード配列と連結し、第２のモジュールコード配列は、それらの対応するモジュールコード配列と比較して逆方向である第１及び第２のバーコードを含むマルチユニットバーコードと連結する（図２１）。
【０２１５】
ハイブリッド手法は消化ベース手法及び増幅ベース手法の組み合わせに限定されず、その他のクローニング方法及び／または合成生物学的方法を全面的にまたは部分的に含んでいてもよく、例えば、組換えベースのクローニング手法（例えば、Ｇａｔｅｗａｙベースのクローニング手法、Ｃｒｅ／Ｆｌｐリコンビナーゼベースのクローニング（組換え後に部位を不活性化させることを含む）などが挙げられるがこれらに限定されない）、新規の配列アセンブリ、新規の核酸合成などが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例においては、組換えベースのクローニング手法、新規の配列アセンブリ、新規の核酸合成などを個別に、すなわち、個々のクローニング手法として、またハイブリッドクローニング手法の一部としてではなく、単独で用いてもよい。
【０２１６】
一部の例においては、特定のクローニング手法を採用する場合、結果として２つのクローン要素間に望ましくない介在配列（クローニングスカーまたはシームとしても周知）が存在することになり、単分子開裂、及びスカーの再ライゲーションを含むベクターにより、このようなクローニングスカーを低減または除去することができる。例えば、制限酵素媒介性単分子開裂及び再ライゲーション（例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ単分子開裂及び再ライゲーションなど）が挙げられるがこれらに限定されない任意の簡便な方法を用いて、単分子開裂及び再ライゲーションを実施してもよい。例えば、一部の例においては、単分子開裂及び再ライゲーションを用いて、組換えベースアセンブリによる組換え部位の全部または一部を含むシームを、部分的にまたは全体的に除去してもよい。一部の例においては、単分子開裂及び再ライゲーションを用いて、消化ベースアセンブリによる制限酵素認識部位の全部または一部を含む開裂スカーを、部分的にまたは全体的に除去してもよい。一部の例においては、単分子開裂及び再ライゲーションを用いて、増幅ベースアセンブリによるプライマー結合部位の全部または一部を含むシームを、部分的にまたは全体的に除去してもよい。
【０２１７】
１つの非限定実施形態では、消化ベースクローニング法及びＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を用いて、ライブラリ構成要素におけるそれぞれの次元を繰り返しクローニングすることにより、組み合わせライブラリを作製する。例えば、図２２で詳細に記載するとおり、工程１では、ＳｃＦｖコード配列及び隣接したＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む出発核酸（例えば、ベクター）を、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー内のＢａｍＨＩ部位またはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーに隣接したＢａｍＨＩ部位で消化する。工程２では、第１のモジュール特異的なバーコードに結合した第２のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーに連結した第１のモジュールコード配列を含む核酸断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法で消化したＢａｍＨＩ部位にクローニングする。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によるライゲーション後、ＳｃＦｖと第１のモジュールコード配列との間のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーは維持される。工程３では、工程２でアセンブリした核酸を、第１のモジュールコード配列核酸断片のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー内またはその隣に導入したＢａｍＨＩ部位で消化してから、第２のモジュール特異的なバーコードに結合した第３のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーに連結した第２のモジュールコード配列を含む第２の核酸断片に対して、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を繰り返す。工程２と同様に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によるライゲーション後、第１のモジュールコード配列と第２のモジュールコード配列との間のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーは維持される。より高い次元のライブラリメンバーが望ましい場合、工程３を繰り返し反復してもよい。工程４では、核酸を含む最後に付加したモジュールコード配列のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー内またはその隣に導入したＢａｍＨＩ部位で消化することにより、最終モジュールコード配列と下流マルチユニットバーコード配列との間に、末端レポーター配列（例えば、「終止」シグナル配列（例えば、終止コドン）もまた含むＧＦＰコード配列）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングすることが可能となる。この実施形態では、得られたライブラリメンバーのそれぞれは、組み合わせインフレームＣＡＲ、及び、組み合わせインフレームＣＡＲ構造を示す組み合わせバーコードを含む。
【０２１８】
プールライブラリ
本開示は、バーコード化合成モジュールポリペプチドのプールライブラリを作製するための方法を提供する。プールライブラリとは、ライブラリメンバーが共通の容器内及び／または共通の溶液中に存在し、かつ個々のライブラリメンバーを空間をあけて物理的に分離させる必要がないことを意味し、例えば、個々のライブラリメンバーは、ライブラリの構築中に（例えば、「ワンポットアセンブリ」におけるような）、または、個々のライブラリメンバーの構築後にプールされてもよい。例えば、組み合わせ入れ子アセンブリで構築したプール合成モジュールポリペプチドライブラリの場合、ライブラリメンバーのアセンブリ中に、ライブラリメンバーのアセンブリ完了前に、及び／または、ライブラリメンバーのアセンブリ完了後などに、ライブラリの構成要素をプールしてもよい。本発明で使用する場合、プールライブラリは、合成モジュールポリペプチドのみのライブラリに限定されず、合成モジュールポリペプチドを発現する細胞のプールライブラリ、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸のプールライブラリなどもまた含む。
【０２１９】
したがって、一部の例においては、ライブラリメンバーをアセンブリするのに用いる個々の核酸構成要素は、アセンブリ前にプールされてもよく、またライブラリメンバーのアセンブリ中にプールされたままであってもよい。その他の例では、アセンブリしたライブラリメンバーをアセンブリ後に混合して、プールライブラリを作製してもよい。
【０２２０】
本明細書に記載のライブラリ及びライブラリアセンブリ法は、結合バーコード領域をシークエンシングすることにより同定可能なライブラリメンバーの作製を含み、下流アッセイがなおも可能な状態で、個々のライブラリメンバーのアセンブリ、同定及び定量化を行う前、その間、またはその後など任意の時点で個々の核酸をプールしてもよい。一部の例においては、アセンブリ中の特定の時点において、ライブラリ構成要素をプールすることにより、ライブラリの最終次元数を操作してもよい。例えば、次元数の異なる部分的なライブラリを別々にアセンブリしてから、その部分的なライブラリをプールすることにより（例えば、「ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｐｏｏｌ」アセンブリを用いて）、混合次元数ライブラリを得てもよい。一部の例においては、例えば、次元数の異なる部分的なライブラリをプールした後、更なるアセンブリ（更なる可変ドメインの付加を含む）を行ってもよい。
【０２２１】
１つの非限定実施形態では、図２３に示すように、合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のプールライブラリをバルクで初代ヒトＴ細胞へと形質転換して、初代ヒトＴ細胞を発現する合成モジュールＣＡＲポリペプチドを生成する。任意選択的に、コードされた合成モジュールＣＡＲポリペプチドライブラリメンバーが１つまたは複数のレポーターモジュールを含む場合、合成モジュールＣＡＲポリペプチドライブラリメンバーの均一な発現を有する形質転換細胞を単離するために、形質転換Ｔ細胞を、それらのレポーターモジュールの発現（合成モジュールＣＡＲポリペプチドの発現を示す役割を果たす）を基準としてソートしてもよい。このようにソートした均一に発現する形質転換Ｔ細胞は、Ｔ細胞を発現する合成モジュールＣＡＲポリペプチドのプールライブラリを示す。
【０２２２】
一部の例においては、核酸及び／または初代ヒトＴ細胞を発現する合成モジュールＣＡＲポリペプチドの形質転換効率を調整する。このような調整は、様々な実施上の理由、例えば、ライブラリにおけるそれぞれのメンバーの発現可能性を制御するために、及び／または、それぞれの細胞が最大で１つのライブラリメンバーを発現する可能性を制御するために行ってもよい。このような調整は、任意の簡便な方法により行ってもよく、例えば、形質転換中に含まれる合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸の初期量を調整すること、形質転換中に含まれる初代Ｔ細胞の初期量を制御すること、形質転換中におけるコード核酸と初代Ｔ細胞の比率を制御することなどが挙げられるがこれらに限定されない。それゆえ、一部の例においては、それぞれの導入Ｔ細胞が実質的に、１つの固有合成モジュールＣＡＲポリペプチドを発現するように、形質転換効率を調整する。一部の例においては、下流アッセイの必要条件に応じて、固有合成モジュールＣＡＲポリペプチドを発現する得られたプール細胞ライブラリに対して、培養、増殖、保存などを行ってもよい。
【０２２３】
このようなプールライブラリ（プール核酸、プールモジュールポリペプチド、プール導入細胞などのどれでも）は、合成モジュールＣＡＲポリペプチドをコードする核酸、合成モジュールＣＡＲポリペプチド、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）に限定されない。本明細書に記載の方法に従い作製した、モジュールポリペプチドをコードする核酸の任意のライブラリ、モジュールポリペプチド、及び／またはモジュールポリペプチドを発現する適切な導入細胞を同様にプールして、例えば、スクリーニングアッセイに有用なプールライブラリを生成してもよい。
【０２２４】
それぞれのライブラリメンバーに結合した特定のマルチユニットバーコードに基づいて、本明細書に記載のプールライブラリにおける個々のメンバーを明確に同定してもよい。それぞれのモジュールコード配列とその対応するバーコード配列との間の位置関係を予測可能とする特定の組み合わせ入れ子アセンブリにより、結合マルチユニットバーコードを単にシークエンシングすることで、それぞれの合成モジュールポリペプチドの同一性及び構造を再構築することが可能となる。それゆえ、一部の例においては、ライブラリメンバーのバーコード領域に関連する配列情報から、合成モジュールポリペプチドライブラリにおける個々のメンバーの同一性及び／または構造を同定することができる。例えば、一部の例においては、例えば、ライブラリの構築後、特定のアッセイでライブラリを用いた後などに、本明細書に記載のプールライブラリにおける複雑性及び／またはそれぞれの個々のメンバーを同定することができる。
【０２２５】
区画化ライブラリ構成要素
一部の例においては、コード領域及びバーコード領域を含む個々の核酸メンバーを区画化してもよい。プールライブラリ及び区画化構成要素を含むライブラリは、相互排他的である必要はなく、例えば、一部の例においては、ライブラリは、異なる回数プールしたライブラリ、及び異なる回数区画化した構成要素を含むライブラリの両方であってもよく、例えば、ライブラリを構築してもよく、例えば、ライブラリメンバーをプールで（例えば、ワンポットアセンブリで）アセンブリしてもよく、それから、例えば、核酸ライブラリメンバーを個々の細胞または非細胞区画へとトランスフェクションすることにより、続けて区画化してもよい。その他の例では、ライブラリメンバーをそれらのアセンブリの途中で区画化してもよく、その後、更なる処理（例えば、更なるアセンブリまたはスクリーニングが挙げられるがこれらに限定されない）のために続けてプールしてもよい。一般的に、本明細書に記載の入れ子アセンブリ及びクローニング手法に従いアセンブリした、バーコード化合成ポリペプチドコード核酸は、プールでアセンブリされ、その後区画化されてもされなくてもよい。
【０２２６】
アセンブリしたバーコード化合成ポリペプチドコード核酸の区画化は、それぞれの核酸ライブラリメンバーがそれらのコード産物との結合を維持するように、個々の核酸ライブラリメンバーからの転写及び翻訳を可能とする、任意の簡便な方法を用いて実施してもよい。一部の例においては、以下でより詳細に記載するように、細胞ライブラリを作製することにより区画化を行ってもよく、個々の細胞は、「区画」として機能し、また核酸ライブラリメンバーからの翻訳及び転写を提供する。
【０２２７】
一部の例においては、非細胞ライブラリ（例えば、封入ベースライブラリ）を作製することにより、区画化を行ってもよい。無細胞封入ベースライブラリは通常、２種以上の不混和性液体からなるエマルションを含み、核酸ライブラリメンバーは第１の液体（例えば、水または水性緩衝液などの水性溶液）に可溶性であり、第２の液体（例えば、油またはその他有機溶媒）に不溶性である。そのため、第１の液体は区画（例えば、個々のライブラリメンバーを含有する液滴）を形成する。エマルションを含むライブラリは、それぞれの区画が任意の望ましい数の個々のライブラリメンバー（区画あたり最大で１つのメンバーが挙げられるがこれらに限定されない）を含むように構成されていてもよい。転写産物及び翻訳産物が、そこからそれらがコードされる個々の核酸ライブラリメンバーとの結合を維持する（すなわち、区画内に維持される）ような条件下で、封入ライブラリの核酸メンバーを転写（例えば、インビトロ転写）及び翻訳（例えば、インビトロ翻訳）してもよい。ポリペプチドをコードする核酸の封入ライブラリを作製するための任意の簡便かつ適切な方法は、本明細書に記載する方法に有用であってもよく、例えば、Ｂｅｒｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００４）３２５（１）：１５１−７に記載される方法が挙げられるがこれらに限定されない（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。
【０２２８】
区画内にライブラリメンバーのコード産物を作製した後、核酸ライブラリメンバー及びコード合成モジュールポリペプチドは、物理的に連結していてもいなくてもよい。例えば、一部の例においては、例えば、化学結合または化学共役（すなわち、核酸ライブラリメンバーとコード合成モジュールポリペプチドとの間における共有結合の生成）を含む任意の簡便かつ適切な方法を用いて、または、分子結合（例えば、ライブラリメンバーとコード合成モジュールポリペプチドとの間の直接的な結合により、または、１つもしくは複数の結合介在物（例えば、結合パートナー、基質など）を介したライブラリメンバーとコード産物との間の間接的な結合により）を用いて、核酸ライブラリメンバー及びコード産物を連結させてもよい。区画化コードポリペプチドを核酸ライブラリメンバーに連結させるための任意の簡便かつ適切な方法は、本明細書に記載の方法に有用であってもよく、例えば、核酸ライブラリメンバーがコードするエピトープタグに特異的に結合する、結合エピトープタグ結合物質を含む基質の使用（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＆  Ｔａｗｆｉｋ．ＥＭＢＯ  Ｊ（２００３０  ２２（１）：２４−３５に記載される）が挙げられるがこれらに限定されない（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。一部の例においては、連結後に、核酸ライブラリメンバーの区画をなくしてもよく（例えば、プールする）、プールライブラリで更なるアッセイを行ってもよい。
【０２２９】
一部の例においては、核酸ライブラリメンバー及びコード産物は、例えば、区画（細胞区画及び非細胞区画を含む）内における区画化により、物理的に連結することなく十分な結合を維持する。
【０２３０】
区画化（細胞または非細胞のどちらでも）により通常、合成モジュールポリペプチドまたはその一部の同定が可能となり、合成モジュールポリペプチドまたはその一部は、合成モジュールポリペプチドをコードする個々のライブラリメンバー核酸におけるバーコード領域のシークエンシングにより検出した表現型と関連し、個々のライブラリメンバー核酸は、それらの区画化状態またはそれらの区画化中に形成された物理的連結の結果により、合成モジュールポリペプチドとの結合を維持する。
【０２３１】
細胞ライブラリ
上記で少し詳細に説明したとおり、本発明で使用する場合、ライブラリは細胞ライブラリを含み、ライブラリの細胞は合成モジュールポリペプチドを発現する。例えば、ウイルストランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、ボンバードメント、化学的形質転換、導入可能なキャリア（例えば、導入可能なキャリアタンパク質）の使用などが挙げられるがこれらに限定されない、任意の簡便な方法を用いて、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸の形質転換を行ってもよい。一部の例においては、合成モジュールポリペプチドコード核酸を形質導入する細胞のことを、本明細書では、宿主細胞と呼ぶ。
【０２３２】
宿主細胞は、固有合成モジュールポリペプチドをコードする単一の個々のバーコード化核酸を発現してもよく、または、固有合成モジュールポリペプチドをコードする複数の（２つ以上を含む）個々のバーコード化核酸を発現してもよい。例えば、宿主細胞内へと対象核酸を導入する頻度または可能性を制御することにより、例えば、導入法のパラメータを調節することにより、宿主細胞が発現する個々のバーコード化核酸の数を制御可能であることが理解されるであろう。一部の例においては、宿主細胞内に存在する固有合成モジュールポリペプチドをコードする個々のバーコード化核酸の得られた数は、感染多重度（ＭＯＩ）と呼ばれることもあり、導入前または導入後のいずれかにおける宿主細胞に対する核酸の比率と定義され得る。例えば、導入前における宿主細胞に対する核酸の比率を上げることまたは下げることによりＭＯＩを調節する通常の方法を用いて、導入後における宿主細胞あたりの、固有合成モジュールポリペプチドをコードする個々のバーコード化核酸の望ましい最終数を得てもよい。
【０２３３】
合成モジュールポリペプチドをコードする核酸を、任意の適切な宿主細胞または細胞株（例えば、原核細胞及び真核細胞を含む）へと形質導入してもよい。宿主細胞型の選択は、スクリーニングする合成モジュールポリペプチドライブラリのタイプ、及び、特定のスクリーニングアッセイを含む多数の因子によって決まる。一部の例においては、宿主細胞は、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及び、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａが挙げられるがこれらに限定されない、原核細胞であってもよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌性細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであってもよい。一部の例においては、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）などの供給業者から市販されているものが挙げられるがこれらに限定されない、通常の菌株を用いてもよい。
【０２３４】
好適な真核細胞は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、類人猿、有蹄類、イヌ科動物、ネコ科動物、ウサギ、げっ歯類などを含む）、爬虫類、両生類（例えば、ｘｅｎｏｐｕｓ、サンショウウオ、イモリなど）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュなど）、鳥類（例えば、ニワトリなど）、無脊椎動物（例えば、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）、ぜん虫類（例えば、線虫など）、海洋無脊椎動物（例えば、ウニなど）など）、酵母菌などが挙げられるがこれらに限定されない宿主動物に元々由来する初代細胞及び培養細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、マウスまたはラットに由来する初代げっ歯類細胞または培養げっ歯類細胞であってもよい。その他の実施形態では、細胞は、初代ヒト細胞または培養ヒト細胞であってもよい。スクリーニングする特定のライブラリ及び特定のスクリーニングアッセイに応じ、任意の簡便な真核細胞が宿主細胞として有用であってもよく、一部の例においては、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）などの供給業者から市販されているものが挙げられるがこれらに限定されない通常の真核細胞株を用いてもよい。
【０２３５】
一部の例においては、細胞ライブラリの細胞は、初代細胞（例えば、初代単球、初代リンパ球（例えば、初代Ｔ細胞、初代Ｂ細胞、初代ＮＫ細胞など）、初代樹状細胞など）、初代内皮細胞、初代上皮細胞、初代線維芽細胞、初代造血幹細胞、初代ケラチノサイト、初代メラノサイト、初代間葉系幹細胞、初代脂肪前駆細胞、初代筋細胞（例えば、初代平滑筋細胞、初代骨格筋細胞など）などである。一部の例においては、細胞ライブラリの細胞は、樹立細胞株（例えば、ジャーカット細胞など）である。一部の例においては、細胞ライブラリの細胞は、患者特異的細胞（患者特異的免疫細胞（例えば、初代Ｔ細胞など）、患者特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞など）、患者特異的がん細胞（例えば、腫瘍細胞、血液がん細胞など））である。
【０２３６】
好適な哺乳動物細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ−７８、ジャーカット、ＨＬ−６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３７】
一部の例においては、細胞は不死化細胞株ではないが、代わりに、個体から採取した細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、一部の例においては、細胞は、個体から採取した免疫細胞である。１つの例としては、細胞は、個体から採取したＴリンパ球である。別の例としては、細胞は、個体から採取した細胞傷害性細胞である。別の例としては、細胞は、個体から採取した幹細胞または前駆細胞である。
【０２３８】
ライブラリにおける合成モジュールポリペプチドをコードする複数の核酸を形質転換した後、形質転換宿主細胞を、それらの合成モジュールポリペプチドの発現に基づいてソートして、例えば、合成モジュールポリペプチドを発現しないそれら細胞をライブラリから除去すること、合成モジュールポリペプチドを特定の発現閾値超で発現するそれら細胞のみを単離すること、合成モジュールポリペプチドを特定の発現閾値未満で発現するそれら細胞のみを単離すること、合成モジュールポリペプチドを特定の発現範囲内で発現するそれら細胞のみを単離することなどを行ってもよい。一部の例においては、ライブラリ中の均一な発現を有するそれら細胞のみを単離するために、発現に基づいた形質転換細胞のソートを行ってもよく、均一な発現は、特定の処理によって変化する場合があり、一部の例においては、集団における発現の平均超及び平均未満である特定の範囲内の発現レベルとして定義され得る。
【０２３９】
特定の実施形態では、それらのライブラリメンバーの発現に基づいて形質転換細胞をソートすること、例えば、ライブラリメンバーの発現またはおおよそ等しい発現を有する細胞をソートすることにより、ライブラリメンバー及び／またはそこに含まれるモジュールの影響の評価を向上させることが可能となる。例えば、ライブラリメンバーを所定の範囲内で発現するそれら細胞のみを単離することにより、特定の表現型に影響を与えるライブラリメンバーの同定が、特定のライブラリメンバーがいかに良好に発現するかではなく、ライブラリメンバー及びそこに含まれるそれらのモジュールの実際の機能に基づくことになる。一部の実施形態では、例えば、個々のライブラリメンバー及び／またはそれらのモジュールの頻度に対して半定量解析を行う場合、ライブラリメンバーを所定の範囲内で発現する細胞をソートすることにより、それらライブラリメンバー及び／またはモジュールを、それらの相対的発現レベルではなく、それらの特定の表現型への影響に基づいて、より精度高く定量解析及び定量化することが可能となる。
【０２４０】
加えて、ソートすることにより、特定の発現範囲内または特定の閾値超及び特定の閾値未満で発現する場合に（例えば、低レベルで発現する場合、または高レベルで発現する場合を含む）、特定の表現型を示すように機能する、または特定の表現型に影響を与えるように機能するライブラリメンバー及びそれらのモジュールの同定が可能となる。
【０２４１】
ライブラリの正規化
ライブラリを作製する状況、及び／またはライブラリの意図する最終用途に応じて、本開示のライブラリを正規化してもしなくてもよい。本発明において記載するライブラリに関して使用する場合、「正規化」とは、それぞれのライブラリメンバーの相対量を、それぞれのライブラリメンバーの相対量を調節する前よりも少なくとも均等に近づくように調節することを意味する。一部の例においては、ライブラリを正規化することにより、最も多く発現するライブラリメンバーの量と最も少なく発現するライブラリメンバーとの間がより狭い範囲となるライブラリがもたらされる。一部の例においては、正規化により、最も少なく発現するライブラリメンバー（複数可）の量が上昇することになる。一部の例においては、正規化により、最も多く発現するライブラリメンバー（複数可）の量が低下することになる。
【０２４２】
一部の例においては、ライブラリの正規化は、ライブラリメンバーの全てもしくは大部分または代表的なサンプリング（または代表的なサンプリングの全てもしくは大部分）を定量化して、ライブラリ内におけるそれぞれのライブラリメンバーの相対量を測定することを含み得る。定量化の後、その定量化に基づいて調整を行い、ライブラリ内におけるそれぞれのライブラリメンバーの相対存在量を平準化する。状況に応じて、ライブラリが直接正規化されるように、このような調整を、既に作製したライブラリに対して直接行ってもよい。あるいは、次の調製ライブラリが正規化されるように、ライブラリ調製法に対して調整を行ってもよい。
【０２４３】
例えば、核酸ライブラリ、ポリペプチドライブラリ、非細胞封入ライブラリ、細胞ライブラリなどが挙げられるがこれらに限定されない、本開示の任意のライブラリを正規化してもよく、また正規化するライブラリに応じて様々な方法を利用してもよい。例えば、正規化するライブラリのタイプに応じて、ライブラリメンバーの相対量を定量化するための様々な方法を利用してもよい。核酸ライブラリメンバーを定量化するために利用可能な様々な方法としては、例えば、定量的シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、定量的ＰＣＲ、定量的ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ）などが挙げられるがこれらに限定されない。ポリペプチドライブラリメンバーを定量化するために利用可能な様々な方法としては、例えば、定量的質量分析、ＥＬＩＳＡなどが挙げられるがこれらに限定されない。細胞ライブラリメンバーを定量化するために利用可能な様々な方法としては、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、定量的シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、定量的ＰＣＲ、定量的ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４４】
一部の例においては、ライブラリメンバーを定量化すると、正規化に必要な調整（複数可）が計算され得る。ライブラリのタイプ及び／またはライブラリのサイズに応じて、任意の簡便かつ適切な正規化計算法を採用してもよい。一部の例においては、例えば、図２８に示す線形方程式が挙げられるがこれらに限定されない、線形方程式を用いてもよい。
【０２４５】
一部の例においては、ライブラリにおけるそれぞれのメンバーに対して正規化計算を行うと、ライブラリは調整され得る。ライブラリを直接調整するための様々な方法を採用してもよい。例えば、一部の例においては、ＦＡＣＳを用いて細胞ライブラリを正規化して、ライブラリにおけるそれぞれのメンバーを発現する等しい数の細胞を、プールまたは個別に処理可能な区画のいずれかへとソートしてもよい。一部の例においては、ライブラリが既に区画化されている場合、それぞれの区画容積を調節することによりライブラリを正規化してもよく、例えば、それぞれの区画に、濃度を平準化するのに十分な一定容積の液体を加えることにより、それぞれの区画内における異なる濃度のライブラリメンバーを正規化することを含む。
【０２４６】
一部の例においては、核酸プールライブラリの正規化を行ってもよい。様々な目的で核酸プールライブラリを正規化してもよい。一実施形態では、ライブラリ内における個々のライブラリメンバーの発現上昇または発現低下（例えば、組み合わせアセンブリ中、特定の核酸モジュールをライブラリメンバーへと導入する際の効率性の上昇または低下に起因）を調整するために、核酸プールライブラリを正規化してもよい。
【０２４７】
一部の例においては、核酸ライブラリメンバー、及び／または、ライブラリメンバーを構成する核酸モジュールを定量化してもよい（例えば、定量的シークエンシングにより）。このような定量化の後、正規化に必要なそれぞれのメンバーの調整を計算する。一実施形態では、計算した調整をライブラリの次の組み合わせアセンブリへと適用してもよく、例えば、核酸ライブラリをアセンブリするのに用いるそれぞれの核酸モジュールの量を、定量化ライブラリにおけるそのモジュールの相対的発現に基づいて調整してもよい。その結果、ライブラリの次のアセンブリ前に核酸モジュールの出発量を調整することにより、得られる組み合わせライブラリが正規化されることになる。したがって、一部の例においては、本明細書に記載のライブラリの正規化は、ライブラリのアセンブリに続いて、アセンブリしたライブラリの定量化、及び、その定量化に基づいた正規化バージョンライブラリの再アセンブリを含んでいてもよい。
【０２４８】
スクリーニング方法
例えば、インビトロスクリーニング法及びインビボスクリーニング法が挙げられるがこれらに限定されない、合成モジュールポリペプチドライブラリのスクリーニング方法を提供する。「インビボスクリーニング」とは通常、生体の生物学的環境内でアッセイされる、複数の固有合成モジュールポリペプチドを含むライブラリのことを意味する。本明細書に記載の方法に従いインビボでアッセイ可能な生体としては、単細胞生物及び多細胞生物が挙げられる。
【０２４９】
単細胞生物のインビボスクリーニングは通常、単細胞生物を合成モジュールポリペプチドライブラリ（合成モジュールポリペプチドライブラリは、合成モジュールポリペプチドを発現するポリペプチドライブラリまたは細胞ライブラリであってもよい）と接触させること、及び、単細胞生物内における表現型を検出することを含む。その他の例では、単細胞生物のインビボスクリーニングは、単細胞生物がコード合成モジュールポリペプチドを発現するのに十分な条件下で、単細胞生物または複数の単細胞生物を、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸ライブラリと接触させることを含んでいてもよい。
【０２５０】
多細胞生物のインビボスクリーニングは通常、多細胞生物を合成モジュールポリペプチドライブラリ（合成モジュールポリペプチドライブラリは、合成モジュールポリペプチドを発現するポリペプチドライブラリまたは細胞ライブラリであってもよい）と接触させること、及び、多細胞生物内における表現型を検出することを含む。その他の例では、多細胞生物のインビボスクリーニングは、多細胞生物（複数可）がコード合成モジュールポリペプチドを発現するのに十分な条件下で、多細胞生物または複数の多細胞生物を、合成モジュールポリペプチドをコードする核酸ライブラリと接触させることを含んでいてもよい。スクリーニングする特定のライブラリ及び用いる特定のインビボアッセイに応じて、任意の簡便な多細胞生物を本明細書に記載するライブラリのインビボスクリーニングに用いてもよく、特定の多細胞生物としては、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラットなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５１】
「インビトロスクリーニング」とは通常、通常の生物学的環境（例えば、ライブラリのポリペプチドモジュール、スクリーニングに用いる生体物質またはスクリーニングした表現型）の外側でアッセイされる、複数の固有合成モジュールポリペプチドを含むライブラリのことを意味する。例えば、一部の例においては、インビトロスクリーニングは、例えば、単離試料、単離細胞、細胞培養物、単離組織または切開組織、規定試料、規定培地、人工組織、人工器官、細胞抽出物、組織抽出物、試料アレイなどが挙げられるがこれらに限定されない、人工または合成の実験環境を用いて行ってもよい。インビトロスクリーニングは、例えば、反応容器、反応チャンバ、試験管、バイアル瓶、プレート、フラスコ、シャーレ、スライドガラスなどが挙げられるがこれらに限定されない、任意の簡便かつ適切な容器内で行ってもよい。
【０２５２】
試料（細胞試料または非細胞試料を含む）のインビトロスクリーニングは通常、試料を合成モジュールポリペプチドライブラリ（合成モジュールポリペプチドライブラリは、合成モジュールポリペプチドを発現するポリペプチドライブラリまたは細胞ライブラリであってもよい）と接触させること、及び、細胞表現型またはその他の反応表現型もしくは分子表現型を検出することを含む。スクリーニングする特定のライブラリ及び用いる特定のインビトロアッセイに応じて、任意の簡便な試料を本明細書に記載するライブラリのインビトロスクリーニングに用いてもよく、特定の試料としては、例えば、生体試料、細胞試料、ポリペプチド試料、核酸試料、化学試料などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５３】
一部の例においては、無細胞合成モジュールポリペプチドライブラリをインビトロでスクリーニングしてもよい。例えば、区画化合成モジュールポリペプチドライブラリを、ライブラリにおける個々のメンバーが反応すると予測される１つまたは複数の物質と接触させることにより、区画化合成モジュールポリペプチドライブラリの表現型をスクリーニングしてもよい。無細胞ポリペプチドライブラリ（封入またはプールのどちらでも）をスクリーニングするための任意の簡便な方法は、本明細書に記載する方法に有用であってもよく、例えば、無細胞封入ベースアッセイにおけるフローサイトメトリーベースの表現型検出またはＦＡＣＳベースの表現型検出、例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＆  Ｔａｗｆｉｋ．ＥＭＢＯ  Ｊ（２００３）２２（１）：２４−３５、及び、Ｂｅｒｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００４）３２５（１）：１５１−７に記載される方法が挙げられるがこれらに限定されない（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。
【０２５４】
表現型及び同定方法
スクリーニング法（インビボまたはインビトロのどちらか）は通常、表現型を検出すること、及び、表現型に関連する１つまたは複数のライブラリメンバーを同定することを含む。本発明で使用する場合、用語「表現型」とは通常、特定のアッセイで検出された、分子、細胞、組織、器官または生体における特徴のことを意味し、例えば、分子表現型、細胞表現型、生物表現型、組織表現型、器官表現型、生物表現型などを挙げることができるがこれらに限定されない。特定のアッセイで検出された表現型は、所定の表現型、例えば、既知もしくは予想される表現型（例えば、既知または予想されるレベルの特定の特徴、既知または予想されるレベルの特徴の有無を含む）であってもよく、または、アッセイ時に同定されてもよく、例えば、新たに検出されたもしくは以前には同定されていなかった表現型（例えば、新たに検出されたまたは以前には同定されていなかったレベルの特定の特徴、新たに検出されたまたは以前には同定されていなかった特徴の有無などを含む）である。本明細書に記載の合成モジュールポリペプチドライブラリに関連する表現型を検出するための任意の簡便なアッセイは、このようなライブラリをスクリーニングするのに有用であってもよい。
【０２５５】
合成モジュールポリペプチドのライブラリ、または、合成モジュールポリペプチドのライブラリをコードする核酸をスクリーニングすることにより、所望の表現型を有効に示すポリペプチド及び／またはそれらのモジュール部位の同定が可能となる。それゆえ、本開示は一般に、本明細書に記載のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるポリペプチドを含む。
【０２５６】
一部の例においては、細胞表現型は、細胞集団を本明細書に記載のライブラリと接触させた後に検出される。細胞表現型としては、例えば、細胞挙動（例えば、細胞生存能、細胞増殖、細胞活性化、細胞形態、細胞遊走、細胞接着、細胞分化、細胞多能性などが挙げられるがこれらに限定されない）、細胞発現（例えば、遺伝子発現、タンパク質発現、非コードＲＮＡ発現、遺伝子活性化、遺伝子抑制などが挙げられるがこれらに限定されない）、レポーター発現（例えば、導入遺伝子レポーター発現、マーカー発現が挙げられるがこれらに限定されない）などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【０２５７】
一部の例においては、組織表現型、器官表現型、または生物表現型は、組織、器官、または生物を本明細書に記載のライブラリと接触させた後に検出される。組織表現型としては、例えば、組織生存能、組織形態、物理的な組織特性（例えば、境界機能、機械的強度、弾力性などが挙げられるがこれらに限定されない）、組織発現（例えば、組織遺伝子発現、組織タンパク質発現などが挙げられるがこれらに限定されない）、組織レポーター発現（例えば、導入遺伝子レポーター発現、マーカー発現が挙げられるがこれらに限定されない）などが挙げられるがこれらに限定されない。器官表現型としては、例えば、器官の外観、器官生存能、器官形態、器官機能（例えば、生体分子（例えば、酵素、代謝産物、タンパク質など）産生、濾過作用、機械的機能などが挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。生物表現型としては、例えば、生物の外観、生物生存能（例えば、寿命）、生物生理機能、生物生殖能／繁殖力、生物挙動などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５８】
一部の例においては、疾患状態と関連させて表現型をアッセイしてもよく、疾患状態は、モデルとなる疾患状態（例えば、特定疾患の特徴を示すように変質または処理された細胞、組織または生物）であってもよく、または、臨床的な疾患状態（例えば、疾患の特徴を示す生物、または、疾患または疾患に由来する細胞もしくは組織を有すると診断された生物）であってもよい。例えば、細胞レベル、組織レベル、器官レベル、生物レベルが挙げられるがこれらに限定されない任意の簡便なレベルで、疾患に関連した表現型をアッセイしてもよい。一部の例においては、アッセイする疾患表現型は、例えば、腫瘍表現型、がん細胞表現型、自己免疫細胞表現型、病原菌（細菌、ウイルスなど）の表現型などが挙げられるがこれらに限定されない疾患原因そのものの表現型であってもよい。その他の例では、アッセイする疾患表現型は、疾患を発症した細胞、組織もしくは生物の表現型であってもよく、または、例えば、細胞活性化（例えば、免疫細胞活性化）、疾患応答（例えば、免疫応答）、バイオマーカー、細胞カウント、生物生理機能、臨床結果などが挙げられるがこれらに限定されない疾患の存在及び／または進行に関わる情報を示す疾患モデルに関連した細胞、組織もしくは生物の表現型であってもよい。
【０２５９】
一部の例においては、集団レベルで表現型の評価を行ってもよく、例えば、細胞集団を評価してもよく、また生物集団を評価するなどである。一部の例においては、集団ベースの表現型評価において、集団表現型の有無における特定ライブラリメンバーの影響を測定してもよい。例えば、細胞集団の細胞表現型における特定ライブラリメンバーの影響を評価してもよい。その他の例では、生物集団の生物表現型における特定ライブラリメンバーの影響を評価してもよい。
【０２６０】
一部の実施形態では、加えた刺激物に応じて表現型を評価するが、刺激物を加えることは、例えば、細胞を刺激物と接触させること、組織を刺激物と接触させること、器官を刺激物と接触させること、生物を刺激物と接触させることなどが挙げられるがこれらに限定されない。インビトロまたはインビボで刺激物と接触させてもよいこのような試験試料または試験対象は、採用するアッセイによって決まり、刺激物によって決まり、またスクリーニングする特定のライブラリによって決まる。異なる刺激物を、単独でまたは組み合わせて用いてもよい。刺激物は、遊離刺激物（例えば、可溶性刺激物、遊離リガンドなど）、結合刺激物（例えば、固体支持体に結合）、細胞が発現する刺激物（例えば、発現された共刺激分子、発現された抗原、発現された細胞リガンドなど）などであってもよい。
【０２６１】
一部の実施形態では、合成モジュールＣＡＲライブラリを発現するＴ細胞集団をインビトロで刺激物と接触させて、得られた表現型を検出する。合成モジュールＣＡＲを発現する細胞ライブラリをスクリーニングするのに有用なインビトロでの刺激物は通常、例えば、遊離抗原、結合抗原、細胞が発現する抗原（例えば、抗原提示細胞上に発現された抗原、標的細胞上に発現された抗原など）などを含む抗原である。有用な抗原は、スクリーニングする特定のＣＡＲライブラリ、及びスクリーニングによる所望の結果によって様々である。抗原の非限定的な例としては、例えば、可溶性抗原、固体支持体に結合した抗原（例えば、プレートに結合した抗原、ビーズに結合した抗原、スライドガラスに結合した抗原など）、発現された抗原（例えば、抗原を発現する遺伝子組換え細胞、自然に抗原を発現する細胞（例えば、天然抗原を発現する細胞、がん抗原を発現するがん細胞など））が挙げられるがこれらに限定されない。インビトロでライブラリをスクリーニングするのに有用な天然抗原を発現する細胞は様々であり、例えば、未処置腫瘍細胞（例えば、腫瘍生検で採取した）を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０２６２】
一部の実施形態では、合成モジュールＣＡＲライブラリを発現するＴ細胞集団をインビボで刺激物と接触させて、得られた表現型を検出する。合成モジュールＣＡＲライブラリスクリーニングのインビボ環境は大いに様々であり、動物モデルを挙げることができるがこれらに限定されない。一部の例においては、例えば、げっ歯類モデル（例えば、マウスモデル、ラットモデルなどが挙げられるがこれらに限定されない）などの小型動物モデルでインビボスクリーニングを行ってもよい。一部の例においては、マウス腫瘍モデル（遺伝子組換えマウス腫瘍モデル、及び、非遺伝子組換えマウス腫瘍モデルを含む）でインビボスクリーニングを行う。
【０２６３】
一部の例においては、利用モデルは異種移植モデルであってもよい。例えば、利用モデルは「ヒト化」モデルであってもよく、このようなヒト化モデルは、１つまたは複数のヒト由来の構成要素（例えば、ヒト化免疫機構、ヒト化Ｔ細胞、ヒトタンパク質を発現する、ヒトがん細胞を収容するなど）を有するものと定義される。それゆえ、ヒト化モデルは、完全にまたは部分的にヒト化されていてもよい。その他の例では、モデルは、完全にまたは部分的にヒト化されていなくてもよく、その代わりに、注入または移植によりヒト細胞またはヒト組織を単純に導入していてもよい。例えば、一部の例においては、ヒトがん細胞またはヒトがん細胞株の細胞を、動物モデル内へと導入する。任意の簡便なヒト腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞株は、例えば、Ｋ５６２細胞、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞などが挙げられるがこれらに限定されない、このようなモデルに有用であってもよい。
【０２６４】
動物モデル、及び／または、動物モデル内へと導入した細胞もしくは組織は、遺伝子組換え（例えば、１つまたは複数の導入遺伝子を発現するように改変された）であってもなくてもよい。例えば、一部の例においては、動物モデルは、非相同遺伝子、例えば、レポーター遺伝子（例えば、宿主動物の細胞を同定するための）、標的遺伝子（例えば、インビボスクリーニングで標的とされる遺伝子産物をコードする遺伝子）を発現するように遺伝子組換えで改変されていてもよい。一部の例においては、動物モデル内へと導入した細胞は、非相同遺伝子、例えば、レポーター遺伝子（例えば、導入細胞を同定するための）、標的遺伝子（例えば、インビボスクリーニングで標的とされる遺伝子産物をコードする遺伝子）を発現するように遺伝子組換えで改変されていてもよい。非限定的な例として、本明細書に記載の方法に従ってマウス腫瘍モデルをスクリーニングしてもよく、がん標的導入遺伝子（例えば、ＣＤ１９、メソテリンなど）を発現するヒト腫瘍細胞をマウス内へと導入する。
【０２６５】
表現型が、スクリーニングされる特定のライブラリ、特定のインビボ環境（例えば、動物モデル）などによって決定し得る任意の簡便な表現型のために、インビボシステム内へと導入したライブラリメンバーをスクリーニングしてもよい。一部の例においては、例えば、インビボシステムが動物腫瘍モデルである場合、例えば、ライブラリを２種類の異なる腫瘍を有する動物モデル内へと導入することにより、腫瘍抗原を異なるレベルで発現する腫瘍を有する動物モデルまたは複数の動物モデル内へと、ライブラリを導入することによりなどで、ライブラリメンバーの腫瘍選択性に関連する表現型のためにライブラリをスクリーニングしてもよい。表現型をアッセイするための任意の簡便な方法（本明細書に記載のそれら細胞及び生化学的／分子的な方法を含む）は、インビボシステムを評価するのに有用であってもよく、このような評価は通常、動物モデルから生体試料を採取することを含む。一部の例においては、インビボモデルを評価するのに有用な生体試料は、組織試料（例えば、血液、腫瘍など）または器官試料（例えば、脾臓）を含んでいてもよい。
【０２６６】
一部の例においては、Ｔ細胞表現型に応じて、インビトロまたはインビボでライブラリをスクリーニングしてもよい。Ｔ細胞表現型は様々であり、刺激Ｔ細胞表現型（すなわち、抗原反応）を含む。Ｔ細胞表現型の非限定例としては、例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＬＴ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＴ−α、ＴＮＦ  ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２６、ＴＮＦ、ＣＣＬ２０、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０など）、Ｔ細胞表面マーカー発現（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８など）、Ｔ細胞活性化マーカー（例えば、ＣＤ６９など）、細胞内シグナル伝達マーカー（例えば、リン酸化ＥＲＫ１／２、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫなど）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６７】
Ｔ細胞表現型を、インビトロ及びインビボでアッセイしてもよく、また任意の簡便な方法を用いて検出してもよい。一部の例においては、細胞カウンターまたはフローサイトメーターを用いてＴ細胞表現型（例えば、Ｔ細胞増殖及び／またはＴ細胞定量化を含む）をアッセイしてもよい。例えば、フローサイトメトリーを用いた細胞トレース色素希釈でＴ細胞増殖をアッセイしてもよい。一部の例においては、フローサイトメトリーを用いて細胞表面マーカーの発現もまたアッセイしてもよい。細胞に関する方法（例えば、フローサイトメトリー、ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ、細胞内フローサイトメトリー、免疫蛍光、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）を用いて細胞内マーカーの発現を同定してもよく、または、分子的方法及び／または生化学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、サイトカイン捕捉、増幅ベース法（例えば、定量的ＰＣＲ）、シークエンシングベース法（例えば、定量的シークエンシング）、定量的質量分析など）を用いてアッセイしてもよい。
【０２６８】
一部の例においては、「ナチュラルキラー」活性化表現型のために、Ｔ細胞をアッセイしてもよい。ナチュラルキラー活性化を評価するための任意の簡便な方法は、このようなアッセイに有用であってもよい。例えば、ＣＤ１０７ａ／ｂの発現のために、例えば、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞を解析してもよい。
【０２６９】
一部の例においては、１つまたは複数の分化表現型のためにＴ細胞をアッセイしてもよい。Ｔ細胞分化を評価するための任意の簡便な方法は、このようなアッセイに有用であってもよい。例えば、任意の簡便な細胞に関する方法または分子的／生化学的方法を用いて、例えば、メモリーＴ細胞のマーカー（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇなど）をアッセイすることにより、メモリーＴ細胞への分化を評価してもよい。一部の例においては、メモリーＴ細胞分化を示す１つまたは複数の細胞内転写因子の発現を評価してもよい（例えば、Ｇａｔａ３、Ｔｂｅｔ、ＲＯＲｙｔ、ＦｏｘＰ３、Ｂｃｌ−６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６９など）。
【０２７０】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリ、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリをコードする核酸をスクリーニングすることにより、所望のＴ細胞表現型を有効に示すＣＡＲ及び／またはその一部（例えば、抗原結合ドメイン、第１シグナル伝達ドメイン、共調節ドメインなど）の同定が可能となる。したがって、本開示は、本明細書に記載のライブラリに加え、このようなＣＡＲをコードする核酸をスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲを含む。本開示はまた、本明細書に記載のライブラリに加え、このようなＣＡＲをコードする核酸をスクリーニングすることにより同定される有用なＣＡＲモジュール（例えば、抗原結合ドメイン、第１シグナル伝達ドメイン、共調節ドメインなど）を含有するＣＡＲを含む。
【０２７１】
一部の例においては、本開示のＣＡＲは、本明細書に記載の合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリ、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をスクリーニングすることにより、Ｔ細胞刺激またはＴ細胞抑制として同定される共調節ドメインの１つまたは複数を含んでいてもよい。したがって、ＣＡＲのＴ細胞表現型全体は、Ｔ細胞活性を刺激するため、または、Ｔ細胞活性を抑制するためであってもよい。刺激または抑制され得るＴ細胞活性としては、例えば、本明細書に記載のそれらＴ細胞活性が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７２】
一部の例においては、ライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲは、表３または表４に記載する少なくとも１つの共調節ドメインを含んでいてもよく、例えば、記載するドメイン配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共調節ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例においては、ライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲは、表３及び表４に記載する２つ以上のそれら共調節ドメインを含んでいてもよく、例えば、記載するドメイン配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共調節ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例においては、本開示のＣＡＲは、本明細書に記載のスクリーニングにより共刺激ドメイン（例えば、表３に記載するものが挙げられるがこれらに限定されない）として同定される共調節ドメインを含んでいてもよく、例えば、記載するドメイン配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共調節ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例においては、本開示のＣＡＲは、本明細書に記載のスクリーニングにより共抑制ドメイン（例えば、表４に記載するものが挙げられるがこれらに限定されない）として同定される共調節ドメインを含んでいてもよく、例えば、記載するドメイン配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む共調節ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例においては、１つまたは複数の共抑制ドメインを含むＣＡＲは、ｉＣＡＲであってもよい。
【０２７３】
一部の例においては、２つ以上の共調節ドメインを有するＣＡＲは、２つの共刺激ドメイン（例えば、表３に記載する２つ以上の共刺激ドメインが挙げられるがこれらに限定されない）を含んでいてもよい。一部の例においては、２つ以上の共調節ドメインを有するＣＡＲは、２つの共抑制ドメイン（例えば、表４に記載する２つ以上の共抑制ドメインが挙げられるがこれらに限定されない）を含んでいてもよい。一部の例においては、２つ以上の共調節ドメインを有するＣＡＲは、共刺激ドメイン及び共抑制ドメインの組み合わせ（表３に記載する少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、表４に記載する少なくとも１つの共抑制ドメインが挙げられるがこれらに限定されない）を含んでいてもよい。
【０２７４】
表３：刺激機能を示す共調節ドメイン（共刺激ドメイン）
2018525992.tif 000002
【０２７５】
表４：抑制機能を示す共調節ドメイン（共抑制ドメイン）
2018525992.tif 000003
【０２７６】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリ、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲは、任意の有用な抗原結合ドメインを含んでいてもよく、例えば、様々なＣＡＲコンストラクトに臨床的に用いられるもの、例えば、抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１２３抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１３８抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１７１抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２２抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３０抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３３抗原結合ドメイン、抗ＣＤ７抗原結合ドメイン、抗ＣＤ７０抗原結合ドメイン、抗ＣＥＡ抗原結合ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメイン、抗ＥＰＣＡＭ抗原結合ドメイン、抗ＥｐｈＡ２抗原結合ドメイン、抗ＥｒｂＢ抗原結合ドメイン、抗ＦＡＰ抗原結合ドメイン、抗ＧＤ２抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ３抗原結合ドメイン、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメイン、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗原結合ドメイン、抗Ｋａｐｐａ抗原結合ドメイン、抗ＬｅＹ抗原結合ドメイン、抗Ｍｅｓｏ抗原結合ドメイン、抗ＭＧ７抗原結合ドメイン、抗ＭＵＣ１抗原結合ドメイン、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合ドメイン、抗ＰＳＣＡ抗原結合ドメイン、抗ＲＯＲ１抗原結合ドメインなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７７】
合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリ、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲは、任意の有用な第１シグナル伝達ドメイン（本明細書ではまた、細胞内シグナル伝達ドメインと呼ぶ）を含んでいてもよく、例えば、１つまたは複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むドメインが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７８】
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含有するポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフ含有部位であってもよい。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質に由来するＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであってもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、由来するタンパク質全体の全配列を含有する必要はない。好適なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例としては、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃε受容体Ｉγ鎖）、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３δ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ζ）、及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体結合タンパク質α鎖）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７９】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質、ＫＡＲＡＰ、ＰＬＯＳＬ、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２、ＫＡＲ結合タンパク質、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ−結合タンパク質、キラー活性化受容体結合タンパク質、キラー−活性化受容体−結合タンパク質などとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（４つのアイソフォーム）のいずれかに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
2018525992.tif 000004
【０２８０】
2018525992.tif 000005
【０２８１】
2018525992.tif 000006
または、
【０２８２】
2018525992.tif 000007
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２８３】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２８４】
2018525992.tif 000008
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２８５】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ、Ｆｃε受容体Ｉγ鎖、Ｆｃ受容体γ−鎖、ｆｃ−εＲＩ−γ、ｆｃＲγ、ｆｃｅＲＩγ、高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットγ、免疫グロブリンＥ受容体、高親和性γ鎖などとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２８６】
2018525992.tif 000009
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２８７】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２８８】
2018525992.tif 000010
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２８９】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３δ鎖（ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３−ＤＥＬＴＡ、Ｔ３Ｄ、ＣＤ３抗原、δサブユニット、ＣＤ３δ、ＣＤ３ｄ抗原、δポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）、ＯＫＴ３、δ鎖、Ｔ細胞受容体Ｔ３δ鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３δ鎖などとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（２つのアイソフォーム）のいずれかにおける、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、または、約１５０ａａ〜約１７０ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２９０】
2018525992.tif 000011
または、
2018525992.tif 000012
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２９１】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３δアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２９２】
2018525992.tif 000013
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２９３】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ε鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ−４ε鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ε鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３ε、Ｔ３ｅなどとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列における、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、または、約１５０ａａ〜約２０５ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２９４】
2018525992.tif 000014
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２９５】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３εアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２９６】
2018525992.tif 000015
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２９７】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３γ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３γ鎖、ＣＤ３−ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、γポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）などとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列における、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、または、約１５０ａａ〜約１８０ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０２９８】
2018525992.tif 000016
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０２９９】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３γアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３００】
2018525992.tif 000017
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０３０１】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ζ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３−ＺＥＴＡ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺなどとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（２つのアイソフォーム）のいずれかにおける、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、または、約１５０ａａ〜約１６０ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
2018525992.tif 000018
または、
2018525992.tif 000019
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０３０２】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３ζアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３０３】
2018525992.tif 000020
2018525992.tif 000021
2018525992.tif 000022
または、
2018525992.tif 000023
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０３０４】
一部の例においては、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体結合タンパク質α鎖、ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン結合α）、ＭＢ−１膜糖タンパク質、ｉｇ−α、膜結合免疫グロブリン結合タンパク質、表面ＩｇＭ結合タンパク質などとしても周知）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（２つのアイソフォーム）のいずれかにおける、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１５０ａａの、約１５０ａａ〜約２００ａａの、または、約２００ａａ〜約２２０ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３０５】
2018525992.tif 000024
または、
【０３０６】
2018525992.tif 000025
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０３０７】
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部位を含んでいてもよい。それゆえ、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
2018525992.tif 000026
（配列中、ＩＴＡＭモチーフは、太字とし下線を引いている）。
【０３０８】
本開示のＣＡＲに用いるのに好適な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型のシグナル伝達鎖が挙げられる。
【０３０９】
ＤＡＰ１０シグナル伝達鎖の一例は、
2018525992.tif 000027
のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列
2018525992.tif 000028
の完全長に対して、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３１０】
ＣＤ２８シグナル伝達鎖の一例は、
2018525992.tif 000029
のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列
2018525992.tif 000030
の完全長に対して、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３１１】
本開示のＣＡＲに用いるのに好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＺＡＰ７０ポリペプチド、例えば、以下のアミノ酸配列における、約３００アミノ酸〜約４００アミノ酸の、約４００アミノ酸〜約５００アミノ酸の、または、約５００アミノ酸〜６１９アミノ酸の連続ストレッチに対して、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０３１２】
ＭＰＤＰＡＡＨＬＰＦＦＹＧＳＩＳＲＡＥＡＥＥＨＬＫＬＡＧＭＡＤＧＬＦＬＬＲＱＣＬＲＳＬＧＧＹＶＬＳＬＶＨＤＶＲＦＨＨＦＰＩＥＲＱＬＮＧＴＹＡＩＡＧＧＫＡＨＣＧＰＡＥＬＣＥＦＹＳＲＤＰＤＧＬＰＣＮＬＲＫＰＣＮＲＰＳＧＬＥＰＱＰＧＶＦＤＣＬＲＤＡＭＶＲＤＹＶＲＱＴＷＫＬＥＧＥＡＬＥＱＡＩＩＳＱＡＰＱＶＥＫＬＩＡＴＴＡＨＥＲＭＰＷＹＨＳＳＬＴＲＥＥＡＥＲＫＬＹＳＧＡＱＴＤＧＫＦＬＬＲＰＲＫＥＱＧＴＹＡＬＳＬＩＹＧＫＴＶＹＨＹＬＩＳＱＤＫＡＧＫＹＣＩＰＥＧＴＫＦＤＴＬＷＱＬＶＥＹＬＫＬＫＡＤＧＬＩＹＣＬＫＥＡＣＰＮＳＳＡＳＮＡＳＧＡＡＡＰＴＬＰＡＨＰＳＴＬＴＨＰＱＲＲＩＤＴＬＮＳＤＧＹＴＰＥＰＡＲＩＴＳＰＤＫＰＲＰＭＰＭＤＴＳＶＹＥＳＰＹＳＤＰＥＥＬＫＤＫＫＬＦＬＫＲＤＮＬＬＩＡＤＩＥＬＧＣＧＮＦＧＳＶＲＱＧＶＹＲＭＲＫＫＱＩＤＶＡＩＫＶＬＫＱＧＴＥＫＡＤＴＥＥＭＭＲＥＡＱＩＭＨＱＬＤＮＰＹＩＶＲＬＩＧＶＣＱＡＥＡＬＭＬＶＭＥＭＡＧＧＧＰＬＨＫＦＬＶＧＫＲＥＥＩＰＶＳＮＶＡＥＬＬＨＱＶＳＭＧＭＫＹＬＥＥＫＮＦＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＬＶＮＲＨＹＡＫＩＳＤＦＧＬＳＫＡＬＧＡＤＤＳＹＹＴＡＲＳＡＧＫＷＰＬＫＷＹＡＰＥＣＩＮＦＲＫＦＳＳＲＳＤＶＷＳＹＧＶＴＭＷＥＡＬＳＹＧＱＫＰＹＫＫＭＫＧＰＥＶＭＡＦＩＥＱＧＫＲＭＥＣＰＰＥＣＰＰＥＬＹＡＬＭＳＤＣＷＩＹＫＷＥＤＲＰＤＦＬＴＶＥＱＲＭＲＡＣＹＹＳＬＡＳＫＶＥＧＰＰＧＳＴＱＫＡＥＡＡＣＡ（配列番号：１３２）。
【０３１３】
一部の例においては、合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリ、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲ（表３及び表４に記載の共調節ドメインの少なくとも１つ、２つまたはそれ以上を有するＣＡＲを含む）を、二量体化因子の存在下で、それぞれの鎖に存在する二量体化ドメインにより連結可能な２つのポリペプチド鎖へと分割してもよい。このような分割ＣＡＲは、例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１４／１２７２６１に記載されるように、条件付きで活性化し薬理学的に誘導可能／抑制可能である（その開示全体は参照として本明細書に組み込まれる）。
【０３１４】
したがって、一部の例においては、本明細書に記載のライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲの分割ＣＡＲ型におけるそれぞれのポリペプチドは、二量体化対（二量体化因子結合対とも呼ばれる）の２分の１を含んでいてもよい。好適な二量体（例えば、二量体化因子結合対）の非限定例としては、ａ）ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ、ｂ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、ｃ）ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、ｄ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ−ラパマイシン結合タンパク質（ＦＲＢ）、ｅ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）及びＧｙｒＢ、ｆ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びＤＨＦＲ、ｇ）ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ、ｈ）ＰＹＬ及びＡＢＩ、ｉ）Ｃｒｙ２及びＣＩＢ１、ｊ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３１５】
一部の例においては、対象ＣＡＲにおける二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーは、ＦＫＢＰ由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＦＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号：７８）。
【０３１６】
一部の例においては、対象ＣＡＲの二量体化因子結合対メンバーはカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＰＰＰ３ＣＡ、ＣＡＬＮ、ＣＡＬＮＡ、ＣＡＬＮＡ１、ＣＣＮ１、ＣＮＡ１、ＰＰＰ２Ｂ、ＣＡＭ−ＰＲＰ触媒サブユニット、カルシニューリンＡα、カルモジュリン依存性カルシニューリンＡサブユニットαアイソフォーム、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ、触媒サブユニット、αアイソフォームなどとしても周知）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列（ＰＰ２Ａｃドメイン）に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＬＥＥＳＶＡＬＲＩＩＴＥＧＡＳＩＬＲＱＥＫＮＬＬＤＩＤＡＰＶＴＶＣＧＤＩＨＧＱＦＦＤＬＭＫＬＦＥＶＧＧＳＰＡＮＴＲＹＬＦＬＧＤＹＶＤＲＧＹＦＳＩＥＣＶＬＹＬＷＡＬＫＩＬＹＰＫＴＬＦＬＬＲＧＮＨＥＣＲＨＬＴＥＹＦＴＦＫＱＥＣＫＩＫＹＳＥＲＶＹＤＡＣＭＤＡＦＤＣＬＰＬＡＡＬＭＮＱＱＦＬＣＶＨＧＧＬＳＰＥＩＮＴＬＤＤＩＲＫＬＤＲＦＫＥＰＰＡＹＧＰＭＣＤＩＬＷＳＤＰＬＥＤＦＧＮＥＫＴＱＥＨＦＴＨＮＴＶＲＧＣＳＹＦＹＳＹＰＡＶＣＥＦＬＱＨＮＮＬＬＳＩＬＲＡＨＥＡＱＤＡＧＹＲＭＹＲＫＳＱＴＴＧＦＰＳＬＩＴＩＦＳＡＰＮＹＬＤＶＹＮＮＫＡＡＶＬＫＹＥＮＮＶＭＮＩＲＱＦＮＣＳＰＨＰＹＷＬＰＮＦＭ（配列番号：７９）。
【０３１７】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはシクロフィリン（シクロフィリンＡ、ＰＰＩＡ、ＣＹＰＡ、ＣＹＰＨ、ＰＰＩａｓｅ  Ａなどとしても周知）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＭＶＮＰＴＶＦＦＤＩＡＶＤＧＥＰＬＧＲＶＳＦＥＬＦＡＤＫＶＰＫＴＡＥＮＦＲＡＬＳＴＧＥＫＧＦＧＹＫＧＳＣＦＨＲＩＩＰＧＦＭＣＱＧＧＤＦＴＲＨＮＧＴＧＧＫＳＩＹＧＥＫＦＥＤＥＮＦＩＬＫＨＴＧＰＧＩＬＳＭＡＮＡＧＰＮＴＮＧＳＱＦＦＩＣＴＡＫＴＥＷＬＤＧＫＨＶＶＦＧＫＶＫＥＧＭＮＩＶＥＡＭＥＲＦＧＳＲＮＧＫＴＳＫＫＩＴＩＡＤＣＧＱＬＥ（配列番号：８０）。
【０３１８】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＭＴＯＲ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合タンパク質、ＦＫ５０６結合タンパク質１２−ラパマイシン結合タンパク質１、ＦＫ５０６結合タンパク質１２−ラパマイシン結合タンパク質２、ＦＫ５０６結合タンパク質１２−ラパマイシン複合体−結合タンパク質１、ＦＲＡＰ、ＦＲＡＰ１、ＦＲＡＰ２、ＲＡＦＴ１、及び、ＲＡＰＴ１としても周知）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列（「Ｆｒｂ」、Ｆｋｂｐ−ラパマイシン結合ドメインとしても周知）に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＭＩＬＷＨＥＭＷＨＥＧＬＥＥＡＳＲＬＹＦＧＥＲＮＶＫＧＭＦＥＶＬＥＰＬＨＡＭＭＥＲＧＰＱＴＬＫＥＴＳＦＮＱＡＹＧＲＤＬＭＥＡＱＥＷＣＲＫＹＭＫＳＧＮＶＫＤＬＬＱＡＷＤＬＹＹＨＶＦＲＲＩＳＫ（配列番号：８１）。
【０３１９】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＧｙｒＢ（ＤＮＡジャイレースサブユニットＢとしても周知）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の以下のＧｙｒＢアミノ酸配列（または、任意の生物由来のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ配列）における、約１００アミノ酸〜約２００アミノ酸（ａａ）の、約２００ａａ〜約３００ａａの、約３００ａａ〜約４００ａａの、約４００ａａ〜約５００ａａの、約５００ａａ〜約６００ａａの、約６００ａａ〜約７００ａａの、または、約７００ａａ〜約８００ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列含んでいてもよい。
【０３２０】
ＭＳＮＳＹＤＳＳＳＩＫＶＬＫＧＬＤＡＶＲＫＲＰＧＭＹＩＧＤＴＤＤＧＴＧＬＨＨＭＶＦＥＶＶＤＮＡＩＤＥＡＬＡＧＨＣＫＥＩＩＶＴＩＨＡＤＮＳＶＳＶＱＤＤＧＲＧＩＰＴＧＩＨＰＥＥＧＶＳＡＡＥＶＩＭＴＶＬＨＡＧＧＫＦＤＤＮＳＹＫＶＳＧＧＬＨＧＶＧＶＳＶＶＮＡＬＳＱＫＬＥＬＶＩＱＲＥＧＫＩＨＲＱＩＹＥＨＧＶＰＱＡＰＬＡＶＴＧＥＴＥＫＴＧＴＭＶＲＦＷＰＳＬＥＴＦＴＮＶＴＥＦＥＹＥＩＬＡＫＲＬＲＥＬＳＦＬＮＳＧＶＳＩＲＬＲＤＫＲＤＧＫＥＤＨＦＨＹＥＧＧＩＫＡＦＶＥＹＬＮＫＮＫＴＰＩＨＰＮＩＦＹＦＳＴＥＫＤＧＩＧＶＥＶＡＬＱＷＮＤＧＦＱＥＮＩＹＣＦＴＮＮＩＰＱＲＤＧＧＴＨＬＡＧＦＲＡＡＭＴＲＴＬＮＡＹＭＤＫＥＧＹＳＫＫＡＫＶＳＡＴＧＤＤＡＲＥＧＬＩＡＶＶＳＶＫＶＰＤＰＫＦＳＳＱＴＫＤＫＬＶＳＳＥＶＫＳＡＶＥＱＱＭＮＥＬＬＡＥＹＬＬＥＮＰＴＤＡＫＩＶＶＧＫＩＩＤＡＡＲＡＲＥＡＡＲＲＡＲＥＭＴＲＲＫＧＡＬＤＬＡＧＬＰＧＫＬＡＤＣＱＥＲＤＰＡＬＳＥＬＹＬＶＥＧＤＳＡＧＧＳＡＫＱＧＲＮＲＫＮＱＡＩＬＰＬＫＧＫＩＬＮＶＥＫＡＲＦＤＫＭＬＳＳＱＥＶＡＴＬＩＴＡＬＧＣＧＩＧＲＤＥＹＮＰＤＫＬＲＹＨＳＩＩＩＭＴＤＡＤＶＤＧＳＨＩＲＴＬＬＬＴＦＦＹＲＱＭＰＥＩＶＥＲＧＨＶＹＩＡＱＰＰＬＹＫＶＫＫＧＫＱＥＱＹＩＫＤＤＥＡＭＤＱＹＱＩＳＩＡＬＤＧＡＴＬＨＴＮＡＳＡＰＡＬＡＧＥＡＬＥＫＬＶＳＥＹＮＡＴＱＫＭＩＮＲＭＥＲＲＹＰＫＡＭＬＫＥＬＩＹＱＰＴＬＴＥＡＤＬＳＤＥＱＴＶＴＲＷＶＮＡＬＶＳＥＬＮＤＫＥＱＨＧＳＱＷＫＦＤＶＨＴＮＡＥＱＮＬＦＥＰＩＶＲＶＲＴＨＧＶＤＴＤＹＰＬＤＨＥＦＩＴＧＧＥＹＲＲＩＣＴＬＧＥＫＬＲＧＬＬＥＥＤＡＦＩＥＲＧＥＲＲＱＰＶＡＳＦＥＱＡＬＤＷＬＶＫＥＳＲＲＧＬＳＩＱＲＹＫＧＬＧＥＭＮＰＥＱＬＷＥＴＴＭＤＰＥＳＲＲＭＬＲＶＴＶＫＤＡＩＡＡＤＱＬＦＴＴＬＭＧＤＡＶＥＰＲＲＡＦＩＥＥＮＡＬＫＡＡＮＩＤＩ（配列番号：８２）。一部の例においては、二量体化因子結合対メンバーは、上記したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＧｙｒＢアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２０に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３２１】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素、ＤＨＦＲＰ１、ＤＹＲとしても周知）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＭＶＧＳＬＮＣＩＶＡＶＳＱＮＭＧＩＧＫＮＧＤＬＰＷＰＰＬＲＮＥＦＲＹＦＱＲＭＴＴＴＳＳＶＥＧＫＱＮＬＶＩＭＧＫＫＴＷＦＳＩＰＥＫＮＲＰＬＫＧＲＩＮＬＶＬＳＲＥＬＫＥＰＰＱＧＡＨＦＬＳＲＳＬＤＤＡＬＫＬＴＥＱＰＥＬＡＮＫＶＤＭＶＷＩＶＧＧＳＳＶＹＫＥＡＭＮＨＰＧＨＬＫＬＦＶＴＲＩＭＱＤＦＥＳＤＴＦＦＰＥＩＤＬＥＫＹＫＬＬＰＥＹＰＧＶＬＳＤＶＱＥＥＫＧＩＫＹＫＦＥＶＹＥＫＮＤ（配列番号：８３）。
【０３２２】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＤｍｒＢ結合ドメイン（すなわち、ＤｍｒＢホモ二量体化ドメイン）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＭＡＳＲＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号：８４）。
【０３２３】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＰＹＬタンパク質（アブシジン酸受容体、及びＲＣＡＲとしても周知）由来である。例えば、対象二量体化因子結合対のメンバーは、シロイヌナズナのタンパク質、ＰＹＲ１、ＲＣＡＲ１（ＰＹＬ９）、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、ＰＹＬ４、ＰＹＬ５、ＰＹＬ６、ＰＹＬ７、ＰＹＬ８（ＲＣＡＲ３）、ＰＹＬ１０、ＰＹＬ１１、ＰＹＬ１２、ＰＹＬ１３などのタンパク質由来であってもよい。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３２４】
ＰＹＬ１０：
ＭＮＧＤＥＴＫＫＶＥＳＥＹＩＫＫＨＨＲＨＥＬＶＥＳＱＣＳＳＴＬＶＫＨＩＫＡＰＬＨＬＶＷＳＩＶＲＲＦＤＥＰＱＫＹＫＰＦＩＳＲＣＶＶＱＧＫＫＬＥＶＧＳＶＲＥＶＤＬＫＳＧＬＰＡＴＫＳＴＥＶＬＥＩＬＤＤＮＥＨＩＬＧＩＲＩＶＧＧＤＨＲＬＫＮＹＳＳＴＩＳＬＨＳＥＴＩＤＧＫＴＧＴＬＡＩＥＳＦＶＶＤＶＰＥＧＮＴＫＥＥＴＣＦＦＶＥＡＬＩＱＣＮＬＮＳＬＡＤＶＴＥＲＬＱＡＥＳＭＥＫＫＩ（配列番号：８５）。
【０３２５】
ＰＹＬ１１：
ＭＥＴＳＱＫＹＨＴＣＧＳＴＬＶＱＴＩＤＡＰＬＳＬＶＷＳＩＬＲＲＦＤＮＰＱＡＹＫＱＦＶＫＴＣＮＬＳＳＧＤＧＧＥＧＳＶＲＥＶＴＶＶＳＧＬＰＡＥＦＳＲＥＲＬＤＥＬＤＤＥＳＨＶＭＭＩＳＩＩＧＧＤＨＲＬＶＮＹＲＳＫＴＭＡＦＶＡＡＤＴＥＥＫＴＶＶＶＥＳＹＶＶＤＶＰＥＧＮＳＥＥＥＴＴＳＦＡＤＴＩＶＧＦＮＬＫＳＬＡＫＬＳＥＲＶＡＨＬＫＬ（配列番号：８６）。
【０３２６】
ＰＹＬ１２：
ＭＫＴＳＱＥＱＨＶＣＧＳＴＶＶＱＴＩＮＡＰＬＰＬＶＷＳＩＬＲＲＦＤＮＰＫＴＦＫＨＦＶＫＴＣＫＬＲＳＧＤＧＧＥＧＳＶＲＥＶＴＶＶＳＤＬＰＡＳＦＳＬＥＲＬＤＥＬＤＤＥＳＨＶＭＶＩＳＩＩＧＧＤＨＲＬＶＮＹＱＳＫＴＴＶＦＶＡＡＥＥＥＫＴＶＶＶＥＳＹＶＶＤＶＰＥＧＮＴＥＥＥＴＴＬＦＡＤＴＩＶＧＣＮＬＲＳＬＡＫＬＳＥＫＭＭＥＬＴ（配列番号：８７）。
【０３２７】
ＰＹＬ１３：
ＭＥＳＳＫＱＫＲＣＲＳＳＶＶＥＴＩＥＡＰＬＰＬＶＷＳＩＬＲＳＦＤＫＰＱＡＹＱＲＦＶＫＳＣＴＭＲＳＧＧＧＧＧＫＧＧＥＧＫＧＳＶＲＤＶＴＬＶＳＧＦＰＡＤＦＳＴＥＲＬＥＥＬＤＤＥＳＨＶＭＶＶＳＩＩＧＧＮＨＲＬＶＮＹＫＳＫＴＫＶＶＡＳＰＥＤＭＡＫＫＴＶＶＶＥＳＹＶＶＤＶＰＥＧＴＳＥＥＤＴＩＦＦＶＤＮＩＩＲＹＮＬＴＳＬＡＫＬＴＫＫＭＭＫ（配列番号：８８）。
【０３２８】
ＰＹＬ１：
ＭＡＮＳＥＳＳＳＳＰＶＮＥＥＥＮＳＱＲＩＳＴＬＨＨＱＴＭＰＳＤＬＴＱＤＥＦＴＱＬＳＱＳＩＡＥＦＨＴＹＱＬＧＮＧＲＣＳＳＬＬＡＱＲＩＨＡＰＰＥＴＶＷＳＶＶＲＲＦＤＲＰＱＩＹＫＨＦＩＫＳＣＮＶＳＥＤＦＥＭＲＶＧＣＴＲＤＶＮＶＩＳＧＬＰＡＮＴＳＲＥＲＬＤＬＬＤＤＤＲＲＶＴＧＦＳＩＴＧＧＥＨＲＬＲＮＹＫＳＶＴＴＶＨＲＦＥＫＥＥＥＥＥＲＩＷＴＶＶＬＥＳＹＶＶＤＶＰＥＧＮＳＥＥＤＴＲＬＦＡＤＴＶＩＲＬＮＬＱＫＬＡＳＩＴＥＡＭＮＲＮＮＮＮＮＮＳＳＱＶＲ（配列番号：８９）。
【０３２９】
ＰＹＬ２：
ＭＳＳＳＰＡＶＫＧＬＴＤＥＥＱＫＴＬＥＰＶＩＫＴＹＨＱＦＥＰＤＰＴＴＣＴＳＬＩＴＱＲＩＨＡＰＡＳＶＶＷＰＬＩＲＲＦＤＮＰＥＲＹＫＨＦＶＫＲＣＲＬＩＳＧＤＧＤＶＧＳＶＲＥＶＴＶＩＳＧＬＰＡＳＴＳＴＥＲＬＥＦＶＤＤＤＨＲＶＬＳＦＲＶＶＧＧＥＨＲＬＫＮＹＫＳＶＴＳＶＮＥＦＬＮＱＤＳＧＫＶＹＴＶＶＬＥＳＹＴＶＤＩＰＥＧＮＴＥＥＤＴＫＭＦＶＤＴＶＶＫＬＮＬＱＫＬＧＶＡＡＴＳＡＰＭＨＤＤＥ（配列番号：９０）。
【０３３０】
ＰＹＬ３：
ＭＮＬＡＰＩＨＤＰＳＳＳＳＴＴＴＴＳＳＳＴＰＹＧＬＴＫＤＥＦＳＴＬＤＳＩＩＲＴＨＨＴＦＰＲＳＰＮＴＣＴＳＬＩＡＨＲＶＤＡＰＡＨＡＩＷＲＦＶＲＤＦＡＮＰＮＫＹＫＨＦＩＫＳＣＴＩＲＶＮＧＮＧＩＫＥＩＫＶＧＴＩＲＥＶＳＶＶＳＧＬＰＡＳＴＳＶＥＩＬＥＶＬＤＥＥＫＲＩＬＳＦＲＶＬＧＧＥＨＲＬＮＮＹＲＳＶＴＳＶＮＥＦＶＶＬＥＫＤＫＫＫＲＶＹＳＶＶＬＥＳＹＩＶＤＩＰＱＧＮＴＥＥＤＴＲＭＦＶＤＴＶＶＫＳＮＬＱＮＬＡＶＩＳＴＡＳＰＴ（配列番号：９１）。
【０３３１】
ＰＹＬ４：
ＭＬＡＶＨＲＰＳＳＡＶＳＤＧＤＳＶＱＩＰＭＭＩＡＳＦＱＫＲＦＰＳＬＳＲＤＳＴＡＡＲＦＨＴＨＥＶＧＰＮＱＣＣＳＡＶＩＱＥＩＳＡＰＩＳＴＶＷＳＶＶＲＲＦＤＮＰＱＡＹＫＨＦＬＫＳＣＳＶＩＧＧＤＧＤＮＶＧＳＬＲＱＶＨＶＶＳＧＬＰＡＡＳＳＴＥＲＬＤＩＬＤＤＥＲＨＶＩＳＦＳＶＶＧＧＤＨＲＬＳＮＹＲＳＶＴＴＬＨＰＳＰＩＳＧＴＶＶＶＥＳＹＶＶＤＶＰＰＧＮＴＫＥＥＴＣＤＦＶＤＶＩＶＲＣＮＬＱＳＬＡＫＩＡＥＮＴＡＡＥＳＫＫＫＭＳＬ（配列番号：９２）。
【０３３２】
ＰＹＬ５：
ＭＲＳＰＶＱＬＱＨＧＳＤＡＴＮＧＦＨＴＬＱＰＨＤＱＴＤＧＰＩＫＲＶＣＬＴＲＧＭＨＶＰＥＨＶＡＭＨＨＴＨＤＶＧＰＤＱＣＣＳＳＶＶＱＭＩＨＡＰＰＥＳＶＷＡＬＶＲＲＦＤＮＰＫＶＹＫＮＦＩＲＱＣＲＩＶＱＧＤＧＬＨＶＧＤＬＲＥＶＭＶＶＳＧＬＰＡＶＳＳＴＥＲＬＥＩＬＤＥＥＲＨＶＩＳＦＳＶＶＧＧＤＨＲＬＫＮＹＲＳＶＴＴＬＨＡＳＤＤＥＧＴＶＶＶＥＳＹＩＶＤＶＰＰＧＮＴＥＥＥＴＬＳＦＶＤＴＩＶＲＣＮＬＱＳＬＡＲＳＴＮＲＱ（配列番号：９３）。
【０３３３】
ＰＹＬ６：
ＭＰＴＳＩＱＦＱＲＳＳＴＡＡＥＡＡＮＡＴＶＲＮＹＰＨＨＨＱＫＱＶＱＫＶＳＬＴＲＧＭＡＤＶＰＥＨＶＥＬＳＨＴＨＶＶＧＰＳＱＣＦＳＶＶＶＱＤＶＥＡＰＶＳＴＶＷＳＩＬＳＲＦＥＨＰＱＡＹＫＨＦＶＫＳＣＨＶＶＩＧＤＧＲＥＶＧＳＶＲＥＶＲＶＶＳＧＬＰＡＡＦＳＬＥＲＬＥＩＭＤＤＤＲＨＶＩＳＦＳＶＶＧＧＤＨＲＬＭＮＹＫＳＶＴＴＶＨＥＳＥＥＤＳＤＧＫＫＲＴＲＶＶＥＳＹＶＶＤＶＰＡＧＮＤＫＥＥＴＣＳＦＡＤＴＩＶＲＣＮＬＱＳＬＡＫＬＡＥＮＴＳＫＦＳ（配列番号：９４）。
【０３３４】
ＰＹＬ７：
ＭＥＭＩＧＧＤＤＴＤＴＥＭＹＧＡＬＶＴＡＱＳＬＲＬＲＨＬＨＨＣＲＥＮＱＣＴＳＶＬＶＫＹＩＱＡＰＶＨＬＶＷＳＬＶＲＲＦＤＱＰＱＫＹＫＰＦＩＳＲＣＴＶＮＧＤＰＥＩＧＣＬＲＥＶＮＶＫＳＧＬＰＡＴＴＳＴＥＲＬＥＱＬＤＤＥＥＨＩＬＧＩＮＩＩＧＧＤＨＲＬＫＮＹＳＳＩＬＴＶＨＰＥＭＩＤＧＲＳＧＴＭＶＭＥＳＦＶＶＤＶＰＱＧＮＴＫＤＤＴＣＹＦＶＥＳＬＩＫＣＮＬＫＳＬＡＣＶＳＥＲＬＡＡＱＤＩＴＮＳＩＡＴＦＣＮＡＳＮＧＹＲＥＫＮＨＴＥＴＮＬ（配列番号：９５）。
【０３３５】
ＰＹＬ８：
ＭＥＡＮＧＩＥＮＬＴＮＰＮＱＥＲＥＦＩＲＲＨＨＫＨＥＬＶＤＮＱＣＳＳＴＬＶＫＨＩＮＡＰＶＨＩＶＷＳＬＶＲＲＦＤＱＰＱＫＹＫＰＦＩＳＲＣＶＶＫＧＮＭＥＩＧＴＶＲＥＶＤＶＫＳＧＬＰＡＴＲＳＴＥＲＬＥＬＬＤＤＮＥＨＩＬＳＩＲＩＶＧＧＤＨＲＬＫＮＹＳＳＩＩＳＬＨＰＥＴＩＥＧＲＩＧＴＬＶＩＥＳＦＶＶＤＶＰＥＧＮＴＫＤＥＴＣＹＦＶＥＡＬＩＫＣＮＬＫＳＬＡＤＩＳＥＲＬＡＶＱＤＴＴＥＳＲＶ（配列番号：９６）。
【０３３６】
ＰＹＬ９：
ＭＭＤＧＶＥＧＧＴＡＭＹＧＧＬＥＴＶＱＹＶＲＴＨＨＱＨＬＣＲＥＮＱＣＴＳＡＬＶＫＨＩＫＡＰＬＨＬＶＷＳＬＶＲＲＦＤＱＰＱＫＹＫＰＦＶＳＲＣＴＶＩＧＤＰＥＩＧＳＬＲＥＶＮＶＫＳＧＬＰＡＴＴＳＴＥＲＬＥＬＬＤＤＥＥＨＩＬＧＩＫＩＩＧＧＤＨＲＬＫＮＹＳＳＩＬＴＶＨＰＥＩＩＥＧＲＡＧＴＭＶＩＥＳＦＶＶＤＶＰＱＧＮＴＫＤＥＴＣＹＦＶＥＡＬＩＲＣＮＬＫＳＬＡＤＶＳＥＲＬＡＳＱＤＩＴＱ（配列番号：９７）。
【０３３７】
ＰＹＲ１：
ＭＰＳＥＬＴＰＥＥＲＳＥＬＫＮＳＩＡＥＦＨＴＹＱＬＤＰＧＳＣＳＳＬＨＡＱＲＩＨＡＰＰＥＬＶＷＳＩＶＲＲＦＤＫＰＱＴＹＫＨＦＩＫＳＣＳＶＥＱＮＦＥＭＲＶＧＣＴＲＤＶＩＶＩＳＧＬＰＡＮＴＳＴＥＲＬＤＩＬＤＤＥＲＲＶＴＧＦＳＩＩＧＧＥＨＲＬＴＮＹＫＳＶＴＴＶＨＲＦＥＫＥＮＲＩＷＴＶＶＬＥＳＹＶＶＤＭＰＥＧＮＳＥＤＤＴＲＭＦＡＤＴＶＶＫＬＮＬＱＫＬＡＴＶＡＥＡＭＡＲＮＳＧＤＧＳＧＳＱＶＴ（配列番号：９８）。
【０３３８】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＡＢＩタンパク質（アブシジン酸非感受性としても周知）由来である。例えば、対象二量体化因子結合対のメンバーは、シロイヌナズナのタンパク質、ＡＢＩ１（アブシジン酸非感受性１、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ  ５６、ＡｔＰＰ２Ｃ５６、Ｐ２Ｃ５６、及び、ＰＰ２Ｃ  ＡＢＩ１としても周知）、及び／または、ＡＢＩ２（Ｐ２Ｃ７７、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ  ７７、ＡｔＰＰ２Ｃ７７、アブシジン酸非感受性２、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ  ＡＢＩ２、及び、ＰＰ２Ｃ  ＡＢＩ２としても周知）などのタンパク質由来であってもよい。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列のいずれかにおける、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、約１５０ａａ〜約１６０ａａの、約１６０ａａ〜約１７０ａａの、約１７０ａａ〜約１８０ａａの、約１８０ａａ〜約１９０ａａの、または、約１９０ａａ〜約２００ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３３９】
ＡＢＩ１：
ＭＥＥＶＳＰＡＩＡＧＰＦＲＰＦＳＥＴＱＭＤＦＴＧＩＲＬＧＫＧＹＣＮＮＱＹＳＮＱＤＳＥＮＧＤＬＭＶＳＬＰＥＴＳＳＣＳＶＳＧＳＨＧＳＥＳＲＫＶＬＩＳＲＩＮＳＰＮＬＮＭＫＥＳＡＡＡＤＩＶＶＶＤＩＳＡＧＤＥＩＮＧＳＤＩＴＳＥＫＫＭＩＳＲＴＥＳＲＳＬＦＥＦＫＳＶＰＬＹＧＦＴＳＩＣＧＲＲＰＥＭＥＤＡＶＳＴＩＰＲＦＬＱＳＳＳＧＳＭＬＤＧＲＦＤＰＱＳＡＡＨＦＦＧＶＹＤＧＨＧＧＳＱＶＡＮＹＣＲＥＲＭＨＬＡＬＡＥＥＩＡＫＥＫＰＭＬＣＤＧＤＴＷＬＥＫＷＫＫＡＬＦＮＳＦＬＲＶＤＳＥＩＥＳＶＡＰＥＴＶＧＳＴＳＶＶＡＶＶＦＰＳＨＩＦＶＡＮＣＧＤＳＲＡＶＬＣＲＧＫＴＡＬＰＬＳＶＤＨＫＰＤＲＥＤＥＡＡＲＩＥＡＡＧＧＫＶＩＱＷＮＧＡＲＶＦＧＶＬＡＭＳＲＳＩＧＤＲＹＬＫＰＳＩＩＰＤＰＥＶＴＡＶＫＲＶＫＥＤＤＣＬＩＬＡＳＤＧＶＷＤＶＭＴＤＥＥＡＣＥＭＡＲＫＲＩＬＬＷＨＫＫＮＡＶＡＧＤＡＳＬＬＡＤＥＲＲＫＥＧＫＤＰＡＡＭＳＡＡＥＹＬＳＫＬＡＩＱＲＧＳＫＤＮＩＳＶＶＶＶＤＬＫＰＲＲＫＬＫＳＫＰＬＮ（配列番号：９９）。
【０３４０】
ＡＢＩ２：
ＭＤＥＶＳＰＡＶＡＶＰＦＲＰＦＴＤＰＨＡＧＬＲＧＹＣＮＧＥＳＲＶＴＬＰＥＳＳＣＳＧＤＧＡＭＫＤＳＳＦＥＩＮＴＲＱＤＳＬＴＳＳＳＳＡＭＡＧＶＤＩＳＡＧＤＥＩＮＧＳＤＥＦＤＰＲＳＭＮＱＳＥＫＫＶＬＳＲＴＥＳＲＳＬＦＥＦＫＣＶＰＬＹＧＶＴＳＩＣＧＲＲＰＥＭＥＤＳＶＳＴＩＰＲＦＬＱＶＳＳＳＳＬＬＤＧＲＶＴＮＧＦＮＰＨＬＳＡＨＦＦＧＶＹＤＧＨＧＧＳＱＶＡＮＹＣＲＥＲＭＨＬＡＬＴＥＥＩＶＫＥＫＰＥＦＣＤＧＤＴＷＱＥＫＷＫＫＡＬＦＮＳＦＭＲＶＤＳＥＩＥＴＶＡＨＡＰＥＴＶＧＳＴＳＶＶＡＶＶＦＰＴＨＩＦＶＡＮＣＧＤＳＲＡＶＬＣＲＧＫＴＰＬＡＬＳＶＤＨＫＰＤＲＤＤＥＡＡＲＩＥＡＡＧＧＫＶＩＲＷＮＧＡＲＶＦＧＶＬＡＭＳＲＳＩＧＤＲＹＬＫＰＳＶＩＰＤＰＥＶＴＳＶＲＲＶＫＥＤＤＣＬＩＬＡＳＤＧＬＷＤＶＭＴＮＥＥＶＣＤＬＡＲＫＲＩＬＬＷＨＫＫＮＡＭＡＧＥＡＬＬＰＡＥＫＲＧＥＧＫＤＰＡＡＭＳＡＡＥＹＬＳＫＭＡＬＱＫＧＳＫＤＮＩＳＶＶＶＶＤＬＫＧＩＲＫＦＫＳＫＳＬＮ（配列番号：１００）。
【０３４１】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＣｒｙ２タンパク質（クリプトクロム２としても周知）由来である。例えば、対象二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーは、任意の生物（例えば、植物）由来のＣｒｙ２タンパク質（限定するわけではないが、シロイヌナズナのタンパク質など）由来であってもよい。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列のいずれかにおける、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、約１５０ａａ〜約１６０ａａの、約１６０ａａ〜約１７０ａａの、約１７０ａａ〜約１８０ａａの、約１８０ａａ〜約１９０ａａの、または、約１９０ａａ〜約２００ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３４２】
Ｃｒｙ２（シロイヌナズナ）
ＭＫＭＤＫＫＴＩＶＷＦＲＲＤＬＲＩＥＤＮＰＡＬＡＡＡＡＨＥＧＳＶＦＰＶＦＩＷＣＰＥＥＥＧＱＦＹＰＧＲＡＳＲＷＷＭＫＱＳＬＡＨＬＳＱＳＬＫＡＬＧＳＤＬＴＬＩＫＴＨＮＴＩＳＡＩＬＤＣＩＲＶＴＧＡＴＫＶＶＦＮＨＬＹＤＰＶＳＬＶＲＤＨＴＶＫＥＫＬＶＥＲＧＩＳＶＱＳＹＮＧＤＬＬＹＥＰＷＥＩＹＣＥＫＧＫＰＦＴＳＦＮＳＹＷＫＫＣＬＤＭＳＩＥＳＶＭＬＰＰＰＷＲＬＭＰＩＴＡＡＡＥＡＩＷＡＣＳＩＥＥＬＧＬＥＮＥＡＥＫＰＳＮＡＬＬＴＲＡＷＳＰＧＷＳＮＡＤＫＬＬＮＥＦＩＥＫＱＬＩＤＹＡＫＮＳＫＫＶＶＧＮＳＴＳＬＬＳＰＹＬＨＦＧＥＩＳＶＲＨＶＦＱＣＡＲＭＫＱＩＩＷＡＲＤＫＮＳＥＧＥＥＳＡＤＬＦＬＲＧＩＧＬＲＥＹＳＲＹＩＣＦＮＦＰＦＴＨＥＱＳＬＬＳＨＬＲＦＦＰＷＤＡＤＶＤＫＦＫＡＷＲＱＧＲＴＧＹＰＬＶＤＡＧＭＲＥＬＷＡＴＧＷＭＨＮＲＩＲＶＩＶＳＳＦＡＶＫＦＬＬＬＰＷＫＷＧＭＫＹＦＷＤＴＬＬＤＡＤＬＥＣＤＩＬＧＷＱＹＩＳＧＳＩＰＤＧＨＥＬＤＲＬＤＮＰＡＬＱＧＡＫＹＤＰＥＧＥＹＩＲＱＷＬＰＥＬＡＲＬＰＴＥＷＩＨＨＰＷＤＡＰＬＴＶＬＫＡＳＧＶＥＬＧＴＮＹＡＫＰＩＶＤＩＤＴＡＲＥＬＬＡＫＡＩＳＲＴＲＥＡＱＩＭＩＧＡＡＰＤＥＩＶＡＤＳＦＥＡＬＧＡＮＴＩＫＥＰＧＬＣＰＳＶＳＳＮＤＱＱＶＰＳＡＶＲＹＮＧＳＫＲＶＫＰＥＥＥＥＥＲＤＭＫＫＳＲＧＦＤＥＲＥＬＦＳＴＡＥＳＳＳＳＳＳＶＦＦＶＳＱＳＣＳＬＡＳＥＧＫＮＬＥＧＩＱＤＳＳＤＱＩＴＴＳＬＧＫＮＧＣＫ（配列番号：１０１）。
【０３４３】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＣＩＢ１シロイヌナズナタンパク質（転写因子ｂＨＬＨ６３としても周知）由来である。例えば、好適な二量体（例えば、二量体化因子結合対）メンバーは、以下のアミノ酸配列における、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、約１５０ａａ〜約１６０ａａの、約１６０ａａ〜約１７０ａａの、約１７０ａａ〜約１８０ａａの、約１８０ａａ〜約１９０ａａの、または、約１９０ａａ〜約２００ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３４４】
ＭＮＧＡＩＧＧＤＬＬＬＮＦＰＤＭＳＶＬＥＲＱＲＡＨＬＫＹＬＮＰＴＦＤＳＰＬＡＧＦＦＡＤＳＳＭＩＴＧＧＥＭＤＳＹＬＳＴＡＧＬＮＬＰＭＭＹＧＥＴＴＶＥＧＤＳＲＬＳＩＳＰＥＴＴＬＧＴＧＮＦＫＫＲＫＦＤＴＥＴＫＤＣＮＥＫＫＫＫＭＴＭＮＲＤＤＬＶＥＥＧＥＥＥＫＳＫＩＴＥＱＮＮＧＳＴＫＳＩＫＫＭＫＨＫＡＫＫＥＥＮＮＦＳＮＤＳＳＫＶＴＫＥＬＥＫＴＤＹＩＨＶＲＡＲＲＧＱＡＴＤＳＨＳＩＡＥＲＶＲＲＥＫＩＳＥＲＭＫＦＬＱＤＬＶＰＧＣＤＫＩＴＧＫＡＧＭＬＤＥＩＩＮＹＶＱＳＬＱＲＱＩＥＦＬＳＭＫＬＡＩＶＮＰＲＰＤＦＤＭＤＤＩＦＡＫＥＶＡＳＴＰＭＴＶＶＰＳＰＥＭＶＬＳＧＹＳＨＥＭＶＨＳＧＹＳＳＥＭＶＮＳＧＹＬＨＶＮＰＭＱＱＶＮＴＳＳＤＰＬＳＣＦＮＮＧＥＡＰＳＭＷＤＳＨＶＱＮＬＹＧＮＬＧＶ（配列番号：１０２）。
【０３４５】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＧＡＩシロイヌナズナタンパク質（ジベレリン酸非感受性、及びＤＥＬＬＡタンパク質ＧＡＩとしても周知）由来である。例えば、好適な二量体化因子結合対メンバーは、以下のアミノ酸配列における、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、約１５０ａａ〜約１６０ａａの、約１６０ａａ〜約１７０ａａの、約１７０ａａ〜約１８０ａａの、約１８０ａａ〜約１９０ａａの、または、約１９０ａａ〜約２００ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３４６】
ＭＫＲＤＨＨＨＨＨＨＱＤＫＫＴＭＭＭＮＥＥＤＤＧＮＧＭＤＥＬＬＡＶＬＧＹＫＶＲＳＳＥＭＡＤＶＡＱＫＬＥＱＬＥＶＭＭＳＮＶＱＥＤＤＬＳＱＬＡＴＥＴＶＨＹＮＰＡＥＬＹＴＷＬＤＳＭＬＴＤＬＮＰＰＳＳＮＡＥＹＤＬＫＡＩＰＧＤＡＩＬＮＱＦＡＩＤＳＡＳＳＳＮＱＧＧＧＧＤＴＹＴＴＮＫＲＬＫＣＳＮＧＶＶＥＴＴＴＡＴＡＥＳＴＲＨＶＶＬＶＤＳＱＥＮＧＶＲＬＶＨＡＬＬＡＣＡＥＡＶＱＫＥＮＬＴＶＡＥＡＬＶＫＱＩＧＦＬＡＶＳＱＩＧＡＭＲＫＶＡＴＹＦＡＥＡＬＡＲＲＩＹＲＬＳＰＳＱＳＰＩＤＨＳＬＳＤＴＬＱＭＨＦＹＥＴＣＰＹＬＫＦＡＨＦＴＡＮＱＡＩＬＥＡＦＱＧＫＫＲＶＨＶＩＤＦＳＭＳＱＧＬＱＷＰＡＬＭＱＡＬＡＬＲＰＧＧＰＰＶＦＲＬＴＧＩＧＰＰＡＰＤＮＦＤＹＬＨＥＶＧＣＫＬＡＨＬＡＥＡＩＨＶＥＦＥＹＲＧＦＶＡＮＴＬＡＤＬＤＡＳＭＬＥＬＲＰＳＥＩＥＳＶＡＶＮＳＶＦＥＬＨＫＬＬＧＲＰＧＡＩＤＫＶＬＧＶＶＮＱＩＫＰＥＩＦＴＶＶＥＱＥＳＮＨＮＳＰＩＦＬＤＲＦＴＥＳＬＨＹＹＳＴＬＦＤＳＬＥＧＶＰＳＧＱＤＫＶＭＳＥＶＹＬＧＫＱＩＣＮＶＶＡＣＤＧＰＤＲＶＥＲＨＥＴＬＳＱＷＲＮＲＦＧＳＡＧＦＡＡＡＨＩＧＳＮＡＦＫＱＡＳＭＬＬＡＬＦＮＧＧＥＧＹＲＶＥＥＳＤＧＣＬＭＬＧＷＨＴＲＰＬＩＡＴＳＡＷＫＬＳＴＮ（配列番号：１０３）。
【０３４７】
一部の例においては、二量体（例えば、二量体化因子結合対）のメンバーはＧＩＤ１シロイヌナズナタンパク質（ジベレリン受容体ＧＩＤ１としても周知）由来である。例えば、好適な二量体メンバーは、以下のアミノ酸配列のいずれかにおける、約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）の、約１１０ａａ〜約１１５ａａの、約１１５ａａ〜約１２０ａａの、約１２０ａａ〜約１３０ａａの、約１３０ａａ〜約１４０ａａの、約１４０ａａ〜約１５０ａａの、約１５０ａａ〜約１６０ａａの、約１６０ａａ〜約１７０ａａの、約１７０ａａ〜約１８０ａａの、約１８０ａａ〜約１９０ａａの、または、約１９０ａａ〜約２００ａａの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０３４８】
ＧＩＤ１Ａ：
ＭＡＡＳＤＥＶＮＬＩＥＳＲＴＶＶＰＬＮＴＷＶＬＩＳＮＦＫＶＡＹＮＩＬＲＲＰＤＧＴＦＮＲＨＬＡＥＹＬＤＲＫＶＴＡＮＡＮＰＶＤＧＶＦＳＦＤＶＬＩＤＲＲＩＮＬＬＳＲＶＹＲＰＡＹＡＤＱＥＱＰＰＳＩＬＤＬＥＫＰＶＤＧＤＩＶＰＶＩＬＦＦＨＧＧＳＦＡＨＳＳＡＮＳＡＩＹＤＴＬＣＲＲＬＶＧＬＣＫＣＶＶＶＳＶＮＹＲＲＡＰＥＮＰＹＰＣＡＹＤＤＧＷＩＡＬＮＷＶＮＳＲＳＷＬＫＳＫＫＤＳＫＶＨＩＦＬＡＧＤＳＳＧＧＮＩＡＨＮＶＡＬＲＡＧＥＳＧＩＤＶＬＧＮＩＬＬＮＰＭＦＧＧＮＥＲＴＥＳＥＫＳＬＤＧＫＹＦＶＴＶＲＤＲＤＷＹＷＫＡＦＬＰＥＧＥＤＲＥＨＰＡＣＮＰＦＳＰＲＧＫＳＬＥＧＶＳＦＰＫＳＬＶＶＶＡＧＬＤＬＩＲＤＷＱＬＡＹＡＥＧＬＫＫＡＧＱＥＶＫＬＭＨＬＥＫＡＴＶＧＦＹＬＬＰＮＮＮＨＦＨＮＶＭＤＥＩＳＡＦＶＮＡＥＣ（配列番号：１０４）。
【０３４９】
ＧＩＤ１Ｂ：
ＭＡＧＧＮＥＶＮＬＮＥＣＫＲＩＶＰＬＮＴＷＶＬＩＳＮＦＫＬＡＹＫＶＬＲＲＰＤＧＳＦＮＲＤＬＡＥＦＬＤＲＫＶＰＡＮＳＦＰＬＤＧＶＦＳＦＤＨＶＤＳＴＴＮＬＬＴＲＩＹＱＰＡＳＬＬＨＱＴＲＨＧＴＬＥＬＴＫＰＬＳＴＴＥＩＶＰＶＬＩＦＦＨＧＧＳＦＴＨＳＳＡＮＳＡＩＹＤＴＦＣＲＲＬＶＴＩＣＧＶＶＶＶＳＶＤＹＲＲＳＰＥＨＲＹＰＣＡＹＤＤＧＷＮＡＬＮＷＶＫＳＲＶＷＬＱＳＧＫＤＳＮＶＹＶＹＬＡＧＤＳＳＧＧＮＩＡＨＮＶＡＶＲＡＴＮＥＧＶＫＶＬＧＮＩＬＬＨＰＭＦＧＧＱＥＲＴＱＳＥＫＴＬＤＧＫＹＦＶＴＩＱＤＲＤＷＹＷＲＡＹＬＰＥＧＥＤＲＤＨＰＡＣＮＰＦＧＰＲＧＱＳＬＫＧＶＮＦＰＫＳＬＶＶＶＡＧＬＤＬＶＱＤＷＱＬＡＹＶＤＧＬＫＫＴＧＬＥＶＮＬＬＹＬＫＱＡＴＩＧＦＹＦＬＰＮＮＤＨＦＨＣＬＭＥＥＬＮＫＦＶＨＳＩＥＤＳＱＳＫＳＳＰＶＬＬＴＰ（配列番号：１０５）。
【０３５０】
ＧＩＤ１Ｃ：
ＭＡＧＳＥＥＶＮＬＩＥＳＫＴＶＶＰＬＮＴＷＶＬＩＳＮＦＫＬＡＹＮＬＬＲＲＰＤＧＴＦＮＲＨＬＡＥＦＬＤＲＫＶＰＡＮＡＮＰＶＮＧＶＦＳＦＤＶＩＩＤＲＱＴＮＬＬＳＲＶＹＲＰＡＤＡＧＴＳＰＳＩＴＤＬＱＮＰＶＤＧＥＩＶＰＶＩＶＦＦＨＧＧＳＦＡＨＳＳＡＮＳＡＩＹＤＴＬＣＲＲＬＶＧＬＣＧＡＶＶＶＳＶＮＹＲＲＡＰＥＮＲＹＰＣＡＹＤＤＧＷＡＶＬＫＷＶＮＳＳＳＷＬＲＳＫＫＤＳＫＶＲＩＦＬＡＧＤＳＳＧＧＮＩＶＨＮＶＡＶＲＡＶＥＳＲＩＤＶＬＧＮＩＬＬＮＰＭＦＧＧＴＥＲＴＥＳＥＫＲＬＤＧＫＹＦＶＴＶＲＤＲＤＷＹＷＲＡＦＬＰＥＧＥＤＲＥＨＰＡＣＳＰＦＧＰＲＳＫＳＬＥＧＬＳＦＰＫＳＬＶＶＶＡＧＬＤＬＩＱＤＷＱＬＫＹＡＥＧＬＫＫＡＧＱＥＶＫＬＬＹＬＥＱＡＴＩＧＦＹＬＬＰＮＮＮＨＦＨＴＶＭＤＥＩＡＡＦＶＮＡＥＣＱ（配列番号：１０６）。
【０３５１】
容易に理解されるように、合成モジュールＣＡＲポリペプチドコード核酸のライブラリ、または、合成モジュールＣＡＲポリペプチドのライブラリをスクリーニングすることにより同定されるＣＡＲを、例えば、１つまたは複数のドメイン（例えば、共調節ドメイン）を付加すること、１つまたは複数のドメインを除去すること（例えば、スクリーニング操作に利用する蛍光レポーターの除去）、ＣＡＲを２つのポリペプチドへと分割する（また二量体化ドメインを付加する）こと、ドメインを再構成することなどにより、改変してもよい。
【０３５２】
一部の例においては、特定の細胞環境への細胞応答に関連する表現型のために、ライブラリをスクリーニングしてもよい。それゆえ、細胞表現型を、特定の環境に曝した際の細胞の応答（例えば、活性化または抑制）により定義してもよい。例えば、特定の細胞環境への曝露により、Ｔ細胞応答を評価してもよい。一部の実施形態では、腫瘍微環境への曝露による応答で、Ｔ細胞抑制を評価してもよい。
【０３５３】
一部の例においては、細胞局在化（例えば、ホーミングまたは細胞標的化に影響される）に関連する表現型のために、ライブラリをスクリーニングしてもよい。それゆえ、細胞標的化へのライブラリメンバーの影響をスクリーニングしてもよい。例えば、細胞ライブラリを宿主生物へと導入してもよく、どの細胞が成功裏に標的位置へ向かったかを評価するために、一定時間後にライブラリ細胞を宿主生物の標的位置から回収してもよい。一部の例においては、インビボで腫瘍へと標的化させるためにＴ細胞をアッセイしてもよい。
【０３５４】
一部の例においては、患者特異的な状態の表現型のためにライブラリをスクリーニングしてもよい。この方法でスクリーニングした患者特異的な状態は大いに様々であり、患者における特定の疾患状態に関連する状態を挙げることができ、患者特異的な状態における亢進または最適表現型を示す特定のライブラリメンバー（複数可）を同定するためにライブラリをスクリーニングすることを含む。一部の例においては、患者由来の外植片または異種移植片へと曝した後に、細胞ライブラリメンバーの局在化を評価してもよい。例えば、患者特異的な腫瘍異種移植片へと曝した後に、細胞性Ｔ細胞ライブラリを発現するＣＡＲのＴ細胞局在化を評価してもよい。一部の例においては、患者由来の外植片または異種移植片へと曝した後に、細胞ライブラリメンバーの増殖を評価してもよい。例えば、患者特異的な腫瘍異種移植片へと曝した後に、細胞性Ｔ細胞ライブラリを発現するＣＡＲのＴ細胞増殖を評価してもよい。一部の例においては、細胞ライブラリまたは特定の細胞ライブラリメンバーに曝した後に、生存能の上昇及び低下のために患者特異的な外植片または異種移植片をアッセイしてもよい。例えば、患者特異的な腫瘍異種移植片へと曝した後に、細胞性Ｔ細胞ライブラリを発現するＣＡＲのＴ細胞殺傷性を評価してもよい。このように、特定の患者を治療するための最適なライブラリメンバー（複数可）を同定するために、ライブラリをスクリーニングしてもよい。
【０３５５】
一部の例においては、ダイナミックな抗原誘発により、インビトロで表現型をアッセイしてもよい。ダイナミックな抗原誘発とは、単なる抗原の有無以上に表現型を評価することにより、抗原がダイナミックに様々となり得る、例えば、濃度範囲にわたってダイナミックに変化し得る、時間範囲にわたってダイナミックに変化し得るということなどを意味する。例えば、様々な用量でスクリーニングした表現型を評価するために（すなわち、用量反応を評価するために）、抗原濃度を滴定してもよい（例えば、様々な濃度で）。任意の簡便な方法を用いて、抗原を異なる濃度で提示させてもよい。非限定的な例として、抗原を異なる濃度（濃度範囲を含む）で発現する細胞を用いて、異なる量の抗原を提示させてもよい。一部の例においては、例えば、タイムポイントアッセイで表現型を評価するための、または、スクリーニングした表現型の動態を評価するための、抗原提示タイミングはダイナミックに変化し得る。
【０３５６】
一部の例においては、表現型特徴のためにライブラリをスクリーニングしてもよい。本発明で使用する場合、用語「表現型特徴」とは通常、個々の表現型の組み合わせのことを意味する。例えば、一部の例においては、細胞は、特定マーカーの発現と結びついた特定形態を含む表現型特徴を有していてもよい。表現型特徴は、類似したまたは異なる表現型カテゴリーに由来する表現型の組み合わせであってもよく、例えば、表現型特徴は、関連してはいるが異なる２つの細胞表面マーカーの発現を含んでいてもよく、表現型特徴は、細胞表面マーカー及び細胞増殖マーカーの発現を含んでいてもよく、表現型特徴は、細胞表面マーカー及び特定の分泌マーカー（例えば、サイトカイン）の発現を含んでいてもよく、または、表現型特徴は、２種類の異なるサイトカインの発現を含んでいてもよいなどである。任意の簡便な表現型（本明細書に記載の表現型を含む）は、表現型特徴の構成要素として有用であってもよい。
【０３５７】
合成モジュールポリペプチドに関連する表現型の同定
本開示は、特定の検出表現型に関連するライブラリメンバーを同定するための方法を含む。理論に束縛されるものではないが、それぞれのマルチモジュール合成ポリペプチドにそれぞれの対応するマルチユニットバーコードを加えた整合アセンブリにより、アセンブリに続いて、それぞれの固有合成モジュールポリペプチドを同定することが可能となる。上記のとおり、それぞれの合成モジュールポリペプチドコード核酸のバーコード領域は、それぞれの合成モジュールポリペプチドを構成する個々のモジュールの同一性だけではなく、そのモジュールの特定の配置（本明細書では、構造と呼ぶ）もまた提供する。それゆえ、バーコード領域をシークエンシングすることにより、それぞれのライブラリメンバーの同一性及び構造を同定することができる。
【０３５８】
そのため、物理的に分離したライブラリメンバーを用いてライブラリのスクリーニングを行う必要はなく、ライブラリメンバーを同時に「プール」及びスクリーニングしてもよい。ライブラリメンバーのプールを、インビトロで（例えば、試験管内、または、関連生物の外側の細胞試料）、または、インビボで（動物または組織）行ってもよい。同時スクリーニングの後、結合バーコード領域の同定及び／または定量化により、ライブラリメンバー及び／またはそれらのモジュールに関連する表現型を決定してもよい。一部の例においては、プールスクリーニングにより、従来の逐次的スクリーニングまたは同時スクリーニングでは実用的ではなかった多数の固有ライブラリメンバーのスクリーニングが可能となる。表現型のためにスクリーニング可能な固有ライブラリメンバーの数は、ライブラリのサイズ及び複雑性によって決まるため様々であってもよく、９６以下〜数百万以上の範囲であってもよく、例えば、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、１０，０００以上、２０，０００以上、３０，０００以上、４０，０００以上、５０，０００以上、６０，０００以上、７０，０００以上、８０，０００以上、９０，０００以上、１００，０００以上などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５９】
一部の例においては、高く発現したモジュールを同定するために、特定バーコードの量または頻度を測定してもよい。例えば、最も頻度の高いバーコードが試料内において最も高く発現したそれらモジュールを同定するように、ライブラリメンバーを含有するプール試料、及び、ライブラリメンバーをコードする結合核酸からそれぞれのバーコードの頻度を定量化してもよい。特定の実施形態では、このような試料は細胞試料であってもよい。
【０３６０】
一部の例においては、高く発現したモジュールポリペプチドを同定するために、特定マルチユニットバーコード（例えば、バーコード領域）の量または頻度を測定してもよい。例えば、最も頻度の高いマルチユニットバーコードが試料内において最も高く発現したそれらモジュールポリペプチドを同定するように、ライブラリメンバーを含有するプール試料、及び、ライブラリメンバーをコードする結合核酸からそれぞれのマルチユニットバーコードの頻度を定量化してもよい。特定の実施形態では、このような試料は細胞試料であってもよい。
【０３６１】
一部の例においては、表現型の検出、ならびに、ライブラリメンバー及びそれらの構成要素の同定を統合方法の一部として行ってもよい。例えば、一部の例においては、フローサイトメトリーを用いて表現型を検出してもよく、またシークエンシングによりライブラリメンバーを同定してもよい。このような統合方法を、例えば、図２４に示すようなインビトロ及び／またはインビボアッセイ（統合方法の非限定的な例として、ＦＬＯＷ−Ｓｅｑを用いる）と共に行ってもよい。
【０３６２】
本発明で使用する場合、用語「ＦＬＯＷ−Ｓｅｑ」とは通常、単一の連続ワークフロー内において、分離フローサイトメトリー法（例えば、ＦＡＣＳ）をシークエンシング法（例えば、次世代シークエンシング）と組み合わせることを意味する。任意の簡便かつ適切な分離フローサイトメトリー法、及び、任意の簡便かつ適切なシークエンシング法は、このようなＦＬＯＷ−Ｓｅｑ法に有用であってもよい。例えば、一部の例においては、フローサイトメトリーを用いて、本明細書に記載のバーコード化合成モジュールポリペプチドを発現する細胞ライブラリを表現型のためにアッセイしてもよく、特定の表現型を有するそれら細胞をソートしてもよく、続いてそれらバーコードをシークエンシングして、ソートした細胞内に存在する、特定のライブラリメンバーの同定、及び／または、特定ライブラリメンバー及び／またはそれらのモジュールにおける頻度の定量化を行ってもよい。例えば、フローサイトメトリーで検出した表現型に基づいて１つまたは複数のビンへとソートすることを含む、任意の簡便かつ適切な方法を用いてソートを行ってもよい。ソート後に、ソート試料及び／またはソート細胞に対して直接シークエンシングを行ってもよく、または、ソート試料及び／またはソート細胞を増殖及び／または培養させてから（例えば、ライブラリメンバーをコードする核酸の複製を増殖させるために）、ソートしてもよい。例えば、細菌内におけるタンパク質濃度を表現型的に測定して関連する遺伝的要素を同定するためのＦＬＯＷ−ｓｅｑ法（例えば、Ｋｏｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１３）１１０（３４）：１４０２４−９、及び、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２（６１５７）：４７５−４７９）を参照されたい）が用いられており、更に、機能に基づいてソートしたＴ細胞と配列決定したそれら対応するＴ細胞受容体遺伝子とを相関させるために、シークエンシングとＦＡＣＳを組み合わせることもまた行われている（例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）３２：６８４−６９２を参照されたい）。
【０３６３】
一部の例においては、特定の表現型に関連する合成モジュールポリペプチドを同定することは、ライブラリを導入したインビボモデル由来の組織または器官を外科的に分離することを含んでいてもよい。例えば、一部の例においては、アッセイのための十分な時間をおいてから、器官または組織を宿主動物から除去してもよく、器官または組織内に存在する個々のライブラリメンバーを同定するために、器官または組織内に存在する核酸をシークエンシングしてもよい。その他の例では、器官または組織内における特定ライブラリメンバーの相対的な頻度または存在量を定量化するために、器官もしくは組織または宿主動物から単離した核酸を定量的に（半定量的を含む）シークエンシングしてもよい。更に他の例では、器官または組織内における特定モジュールの相対的な頻度または存在量を定量化するために、器官もしくは組織または宿主動物から単離した核酸を定量的に（半定量的を含む）シークエンシングしてもよい。
【０３６４】
一部の例においては、例えば、半定量化後に特定モジュールが高く発現する場合、または、個々のモジュールが所望の表現型に寄与すると同定された場合、新規ライブラリアセンブリによる続くラウンドを実施してもよく、同定されたモジュールは、新たに作製したライブラリメンバー全てに含まれており（すなわち、同定された可変モジュールを不変モジュールとして続けて用いる）、新たに生成したライブラリをスクリーニングして、最初に同定されたモジュールと共に、表現型に協同的に影響を与える更なるモジュールを同定する。ライブラリアセンブリ及びスクリーニングを繰り返し行うことにより、所望の表現型を有するライブラリ及び個々のライブラリメンバーを発生可能であることを、当業者は容易に理解するであろう。
【実施例】
【０３６５】
以下の実施例は、完全な開示及び本発明をどのように実施して利用するかの説明を当業者に提供するために記載するものであり、本発明者が本発明とみなす範囲を制限することを意図するものではなく、以下の実験が実施される実験の全てまたは唯一の実験であると示すことを意図するものでもない。使用する数値（例えば、量、温度など）に対する精度を確保するための努力を行ってはいるが、一定の実験的誤差及び偏差は発生するであろう。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、また圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍは筋肉内（に）、ｉ．ｐは腹腔内（に）、ｓ．ｃは皮下（に）などを用いてもよい。
【０３６６】
実施例１：共調節ドメインモジュールライブラリの構築及びスクリーニング
ライブラリ構築に必要な要素を含むバーコード化モジュールコード核酸断片を作製するために、ポリペプチドモジュール（すなわち、共調節ドメイン（すなわち、共刺激または共抑制））をコードする核酸を、シークエンシング及びＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素消化に好適なクローニングベクターにサブクローニングした。サブクローニング後、ベクターは、モジュールコード配列、モジュールコード配列の前後に存在する最適なＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー配列、モジュール特異的バーコード配列、モジュール特異的バーコード配列の前後に存在する３´クローニングホモロジーアーム、モジュールコード配列とモジュール特異的バーコード配列との間のＢａｍＨＩ制限部位、ならびに、モジュールコード配列の５´末端側及びモジュール特異的バーコード配列の３´末端側の両方に存在するＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素部位を含んでいた（図１）。サブクローニングしたベクターインサートをシークエンシングし、挿入した共調節ドメインの同一性を確認した。この組み合わせライブラリに用いた共調節ドメイン及びそれらの対応するタンパク質配列を表１に提供する。
【０３６７】
Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素を用いてバーコード化モジュールコード配列を含むクローニングベクターを消化し、それぞれのポリペプチドモジュールをコードする「完全配列」核酸を遊離させた（図２）。記載した要素及びＣＤ２８共刺激ドメインをコードする配列を含むクローニングベクター部位の例（Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素消化の前後）を提供するが（図３）、この例は、ライブラリ構築に用いたそれぞれのモジュールプラスミド／断片の一般的な構成を示す。
【０３６８】
脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（ｐＳＦＦＶ）のＢａｍＨＩ部位３´における制限酵素消化により、発現ベクター（すなわち、レンチウイルスパッケージングベクターｐＨＲ（レシピエントベクターとも呼ばれる））の作製を行った。ライブラリメンバーコンストラクトを段階的な方法でアセンブリした（図５）。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法を最初に用いて、ライブラリにおける全てのメンバーに共通する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び膜貫通（ＴＭ）ドメイン（ｓｃＦＶ−ＴＭ）をコードする発現ベクター配列へと挿入した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応混合物をコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。形質転換細胞を培養した。コロニーを選択し、ＤＮＡを抽出するためにミニプレップを行ってから、構築プラスミドを回収した。ｓｃＦＶ−ＴＭ含有発現プラスミドを成功裏に構築した後、マルチモジュールポリペプチドのそれぞれの連続構成要素（ＥＧＦＰレポーターを含む）を、図５に従った個々の工程における前の構成要素の３´側へと挿入した。それぞれの工程は、ＢａｍＨＩによる消化及びＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリに続き、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応によるトランスフェクション、コロニー選択、及びプラスミド精製を含む。
【０３６９】
図５に示すように、最後のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応で得られたそれぞれのライブラリメンバーは、共通のレポーター（ＣＤ３ｚ−ＥＧＦＰ）に連結した２つの共調節ドメインのメンバー特異的組み合わせに連結した共通のｓｃＦＶ−ＴＭ、及び、共調節ドメインに対して逆方向である一対のモジュール特異的バーコードを含む。バーコードはプライマー結合部位に隣接しているため、ライブラリメンバー特異的な共調節ドメインの組み合わせに相当する、特定のバーコードの組み合わせの増幅及び／またはシークエンシングが可能となる。
【０３７０】
最終プラスミドライブラリの競合を行ってから、個々のライブラリメンバーをＨＥＫ−２９３細胞へとトランスフェクションし、常法によりレンチウイルスを産生した。産生レンチウイルスを用いてＴ細胞を感染させ、マルチモジュールポリペプチドを発現する遺伝子改変免疫細胞を作製した。
【０３７１】
レポーターのＥＧＦＰ発現に基づいて、遺伝子改変免疫細胞をＦＡＣＳでソートした。均一な発現レベルを有する遺伝子改変細胞の集団を単離するためにソートを行った。マルチモジュールポリペプチドを均一に発現するソート細胞を、続く機能性スクリーニングに利用した。
【０３７２】
この一般手順を用いて４つの独立ライブラリを作製した。１次元ライブラリ（すなわち、それぞれのライブラリメンバーが１つの共調節ドメインを含む）及び２次元ライブラリ（すなわち、それぞれのライブラリメンバーが２つの共調節ドメインを含む）を構築した。２次元ライブラリのメンバーを、図６に示す一般スキームに従いアセンブリした。４つのライブラリ、及び実施した関連スクリーニングは以下のとおりである。
【０３７３】
１）２０メンバーの１次元ライブラリを構築して、Ｔ細胞機能に関するＦＬＯＷｓｅｑ解析の実現性を試験するために用いた。ＣＤ３Ｚドメインに結合した共調節ドメインモジュールに結合したＣＤ８ドメインを含むように、それぞれのライブラリメンバーを構成した。遺伝子改変Ｔ細胞を、ＦＡＣＳによるそれらのレポーター発現に応じたビンに分けてから、ライブラリをスクリーニングして、プレート結合抗原に対するＴ細胞活性（ＣＤ６９）の用量反応を測定した。
【０３７４】
２）６２メンバーの１次元抗ＣＤ１９ライブラリを構築して、インビボマウス腫瘍モデルを用いてスクリーニングした。ＥＧＦＰレポーターに結合したＣＤ３Ｚドメインに結合した共調節ドメインモジュールに結合した抗ＣＤ１９ドメインを含むように、それぞれのライブラリメンバーを構成した。
【０３７５】
３）６２×６２メンバーの２次元ライブラリを構築した。それぞれのライブラリメンバーは、ＥＧＦＰレポーターに結合したＣＤ３Ｚドメインに結合した第２の共調節ドメインモジュールに結合した第１の共調節ドメインモジュールに結合した抗ＣＤ１９ドメインを含んでいた。
【０３７６】
４）６２メンバーの１次元抗メソテリンライブラリを構築した。それぞれのライブラリメンバーは、ＥＧＦＰレポーターに結合したＣＤ３Ｚドメインに結合した共調節ドメインモジュールに結合した抗メソテリンドメインを含んでいた。
【０３７７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）内における別の共調節配列のために、プールした６２メンバーの１次元抗ＣＤ１９ライブラリに対して機能性スクリーニングを行った。ライブラリにおけるそれぞれのメンバーは、標的がん細胞抗原に特異的な抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、表１の共調節ドメインモジュールの１つ、及び、ＣＤ３Ｚ第１シグナル伝達ドメインを含んでいた（図７）。
【０３７８】
プールライブラリの遺伝子改変Ｔ細胞に対して抗原刺激（３２ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、及び、１０００ｎｇ／ｍｌの抗原）を行ってから、ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ６９発現に基づいた「高」刺激ビンまたは「低」刺激ビンへとそのＴ細胞を機能性でソートした（図８）。シークエンシング（抗原濃度１０００ｎｇ／ｍｌ）により、高刺激ビン及び低刺激ビンの両方において、個々の共調節ドメインに対応する特定バーコードの相対的濃縮度を測定した（図９）。この手法により、抗ＣＤ１９−ＣＤ３Ｚ  ＣＡＲ内及び用いた特定の抗原刺激環境内のそれぞれの共調節ドメインにおける刺激結果と抑制結果との比較が可能となった。例えば、スクリーニング結果を、異なる抗原入力レベルに対して更に解析することにより、個々の共調節ドメインにおける用量反応の迅速な評価が可能となった（図１０）。
【０３７９】
実施例２：６１×６１  ２次元ライブラリの包括的アセンブリの確認
入れ子アセンブリにより、６１種の可変ＣＡＲモジュール（表２、図２５に記載）を、２次元（２Ｄ）合成モジュールＣＡＲポリペプチドをコードするバーコード化核酸ライブラリへとアセンブリした。ＭｉＳｅｑ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を利用したｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法を用いてライブラリをディープシークエンシングして、アセンブリしたそれぞれのライブラリメンバーのリードカウントを測定した（図２６）。
【０３８０】
発生し得る全ライブラリメンバーのうち発生し得るライブラリメンバー（すなわち、ＣＡＲ変異体）の総数３，７２１（最大頻度１２１６カウント、最低頻度２カウント）を、シークエンシングにより検出した。ライブラリ全体のカウント平均数は３３３（中央値は３１１カウント）であり、ライブラリメンバーにおける１４０．９０％の標準偏差は、中央値の２倍以内または中央値の３倍以内９８％のカウントで表した。
【０３８１】
このように、シークエンシングにより、入れ子アセンブリ法で、可変モジュールの全ての可能な組み合わせを発現するライブラリメンバーを含む２Ｄライブラリを作製可能であることを確認した。
【０３８２】
実施例３：ライブラリパーツの正規化
ライブラリパーツの正規化を用いた、組み合わせライブラリ内のクローン分布を向上させる方法を開発した。
【０３８３】
任意の組み合わせアセンブリ反応では、一部のパーツ（例えば、モジュール）は、その他のパーツと比べてより効率的に、アセンブリ産物へと一体化する。ゆえに、比較的非効率的に一体化するパーツを含むアセンブリ産物（例えば、タンパク質変異体）は、最終組み合わせライブラリ内で低発現しているか、または、存在しないことになる。同様の理由で、その他のアセンブリ産物（例えば、効率的に一体化するパーツを含むタンパク質変異体）は過剰に豊富となり、結果として、全ての下流アッセイにおいて試料が過剰となってしまう。
【０３８４】
この問題に対応するために、ライブラリアセンブリを向上させる方法を開発した。この方法では、全てのパーツ（ＤＮＡインサート）が同一容量で存在する状態で、最初のアセンブリ反応が実施される。この目的のため、それぞれのパーツを１ｕＬずつ含有するようにマスターミックスを調製した。組み合わせアセンブリの完了後、任意の簡便な定量的アッセイを用いて、産物の混合物を求める。例えば、本実施例では、次世代シークエンシングを用いて（図２７を参照されたい）、ライブラリ全体におけるそれぞれのパーツの比率を計算した（図２８に示す線形方程式内で、ｅ１、ｅ２…として表す）。それから、線形代数を用いてそれぞれのパーツ（マスターミックス中の）の新たな最適容量を同時に計算し、その後、ライブラリを再合成してより均一に分布する変異体を得た。
【０３８５】
ＣＡＲの組み合わせライブラリ（それぞれのＣＡＲは、直列に連結した、６１の異なる共刺激ドメインを２つ含有する（６１２、つまり、３７２１種のタンパク質変異体））を合成することにより、この手法を実証した。アセンブリした組み合わせライブラリ内のパーツにおける効率性、濃度、豊富度間の簡便な比例関係を利用することによって、この方法を用いて特定パーツの相対的頻度を定量的に制御可能であることが証明された。図２９に示すように、アセンブリマスターミックス中のパーツセットの相対濃度における１０倍の倍率変化が、組み合わせライブラリの得られた組成物中のパーツ頻度における１０倍の倍率変化となり得ることが予測された（黒色バー）。アセンブリした組み合わせライブラリ内における５パーツの平均頻度を測定した際に（白色バー）、１０倍の倍率変化で予測した効果が実際に確認された。得られた正規化済み大規模組み合わせライブラリ（図２６に示すとおり）は、ライブラリ内の変異体分布において著しい向上を示した（例えば、正規化前ライブラリ内の変異体分布（図２７）と比較して）。
【０３８６】
本発明における特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことが可能であること、また均等物で置き換え可能であることを当業者は理解するであろう。更に、特定の状態、材料、物質の組成物、プロセス、１つのプロセス工程または複数のプロセス工程について多くの修正を行い、本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させることも可能である。全てのこのような修正は、本書に添付する特許請求の範囲の範囲内となることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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