(57)【要約】  オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム（例えば、４．７ｋｂを上回る）を含有するＡＡＶ粒子を産生するための方法が、本明細書に提供される。一部の態様において、本発明は、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子およびＡＡＶベクターを提供する。オーバーサイズゲノムを含むＡＡＶ粒子を産生するための産生細胞株もまた、提供される。
2018510648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含むＡＡＶ粒子を産生するための方法であって、
ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成するような条件下で、
ｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびに
ｉｉ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノム
を含むＡＡＶ産生細胞株を培養する工程と、
ｂ）ＡＡＶヘルパー機能を提供する工程と、
ｃ）オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子を回収する工程と
を含む前記方法。
【請求項２】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂであり、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）で回収されたＡＡＶ粒子は、約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）で回収されたＡＡＶ粒子は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂのｒＡＡＶゲノムを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
イントロンは、合成イントロンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
産生細胞株は、霊長類細胞に由来する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ＨＳＶ、またはバキュロウイルスによって提供される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｒＡＡＶ粒子の精製をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
精製は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー工程を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法によって産生されたオーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子。
【請求項３７】
ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、該ｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％が、約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムがキャプシド化されている、前記組成物。
【請求項３８】
ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項３７または３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
イントロンは、合成イントロンである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項３７〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項３８〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項３８〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６１】
ｒＡＡＶ粒子は、産生細胞株において産生される、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている、請求項６１または６２に記載の組成物。
【請求項６４】
産生細胞株は、霊長類細胞に由来する、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
ｒＡＡＶ粒子は、産生細胞株にＡＡＶヘルパー機能を提供することによって産生される、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６８】
ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ＨＳＶ、またはバキュロウイルスによって提供される、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現を強化するための方法であって、産生細胞株にＡＡＶヘルパー機能を提供することによって、該産生細胞株においてｒＡＡＶ粒子を産生させる工程を含み、該産生細胞株は、
ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびに
ｂ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノム
を含む、前記方法。
【請求項７１】
オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現よりも、約１．２５倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２．０倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３倍、または約５倍多い、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
産生細胞株によって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態と比較して速い発現動態である、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
産生細胞株によって産生されるｒＡＡＶゲノムからのオーバーサイズｒＡＡＶ粒子の発現動態は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態よりも、約５％速い、約１０％速い、約２５％速い、約５０％速い、約７５％速い、または約９０％速いである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む、請求項７０〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項７０〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである、請求項７０〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである、請求項７０〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、請求項７０〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする、請求項７０〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項７０〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である、請求項７０〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項７０〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む、請求項７０〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
イントロンは、合成イントロンである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項７０〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項７０〜８９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９１】
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項７６〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項７６〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
産生細胞株は、霊長類細胞に由来する、請求項７０〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞である、請求項７０〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている、請求項７０〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ＨＳＶ、またはバキュロウイルスによって提供される、請求項７０〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ｒＡＡＶ粒子の精製をさらに含む、請求項７０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
精製は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー工程を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含むＡＡＶ粒子を産生するための細胞株であって、
ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸と、
ｂ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムと
を含む前記細胞株。
【請求項１０７】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている、請求項１０６に記載の細胞株。
【請求項１０８】
ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている、請求項１０６または１０７に記載の細胞株。
【請求項１０９】
ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む、請求項１０６〜１０８のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１０】
ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項１０６〜１０９のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１１】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである、請求項１０６〜１１０のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１２】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである、請求項１０６〜１１１のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１３】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、請求項１０６〜１１１のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１４】
異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする、請求項１０６〜１１３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１５】
異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項１０６〜１１４のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１６】
異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である、請求項１０６〜１１５のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１７】
異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１０６〜１１６のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１１８】
プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項１１７に記載の細胞株。
【請求項１１９】
ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む、請求項１０６〜１１８のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１２０】
イントロンは、合成イントロンである、請求項１１９に記載の細胞株。
【請求項１２１】
ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１０６〜１２０のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１２２】
ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１２１に記載の細胞株。
【請求項１２３】
ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１０６〜１２２のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１２４】
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項１２３に記載の細胞株。
【請求項１２５】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項１０９〜１２４のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１２６】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項１０９〜１２５のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１２７】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する、請求項１２３〜１２６のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１２８】
ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する、請求項１２７に記載の細胞株。
【請求項１２９】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１２３〜１２６のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１３０】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む、請求項１２９に記載の細胞株。
【請求項１３１】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡ８キャプシドを含む、請求項１２９に記載の細胞株。
【請求項１３２】
産生細胞株は、霊長類細胞に由来する、請求項１０６〜１３１のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１３３】
産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する、請求項１０６〜１３２のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１３４】
産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている、請求項１０６〜１３３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１３５】
ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ＨＳＶ、またはバキュロウイルスによって提供される、請求項１０６〜１３４のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項１３６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドによってキャプシド化されたｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子であって、該ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂを上回る、前記ＡＡＶ粒子。
【請求項１３７】
ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む、請求項１３６に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１３８】
ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む、請求項１３６または１３７に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１３９】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである、請求項１３６〜１３８のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４０】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである、請求項１３６〜１３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４１】
ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、請求項１３６〜１３９のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４２】
異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする、請求項１３６〜１４１のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４３】
異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項１３６〜１４２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４４】
異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である、請求項１３６〜１４３のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４５】
異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４６】
プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項１４５に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４７】
ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む、請求項１３６〜１４６のいずれか１項に記ＡＡＶ粒子。
【請求項１４８】
イントロンは、合成イントロンである、請求項１４７に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１４９】
ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１３６〜１４８のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５０】
ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１４９に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５１】
ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１３６〜１５０のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５２】
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項１５１に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５３】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項１３７〜１５２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５４】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである、請求項１５１〜１５３のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５５】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する、請求項１３７〜１５４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５６】
ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する、請求項１５５に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５７】
ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１５１〜１５４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５８】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む、請求項１５７に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１５９】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む、請求項１５８に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１６０】
ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、請求項１３６〜１４２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１６１】
ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、ウシ成長ホルモン合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、請求項１３６〜１４２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１６２】
ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのすべてまたは一部の欠失を含む、請求項１６０または１６１に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１６３】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む、請求項１６０〜１６２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１６４】
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドを含む、請求項１６０〜１６２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１６５】
ｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターであって、該ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、前記ｒＡＡＶベクター。
【請求項１６６】
ｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターであって、該ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、ウシ成長ホルモン合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、前記ｒＡＡＶベクター。
【請求項１６７】
ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのすべてまたは一部の欠失を含む、請求項１６５または１６６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１６８】
個体における疾患または障害の治療のための方法であって、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を投与する工程を含み、該オーバーサイズＡＡＶゲノムは、疾患または障害を治療するのに好適な導入遺伝子を含む、前記方法。
【請求項１６９】
疾患または障害は、血友病Ａであり、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子は、第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子をコードする、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
ＡＡＶ粒子は、請求項１６０〜１６４のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
疾患または障害は、筋ジストロフィーであり、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子は、ジストロフィン導入遺伝子をコードする、請求項１６８に記載の方法。  
【請求項１７２】
疾患または障害は、ジスフェリン異常症であり、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子は、ジスフェリン導入遺伝子をコードする、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７３】
疾患または障害は、嚢胞性線維症であり、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子は、ＣＦＴＲ導入遺伝子をコードする、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７４】
個体は、ヒトである、請求項１６８〜１７３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月８日に出願された米国仮出願第６２／１４４，８６２号および２０１５年９月１７日に出願された米国仮出願第６２／２２０，０６７号の優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は、あらゆる目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１５９７９２０１３２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、データ記録日：２０１６年４月６日、サイズ：２７ｋｂ）。
【０００３】
本発明は、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを有するＡＡＶ粒子を産生するための方法および細胞株に関する。
【背景技術】
【０００４】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、遺伝子疾患および慢性疾患に関して、遺伝子導入のための魅力的な送達ビヒクルになっている。ｒＡＡＶベクターの使用に関する制限の１つは、パッケージング容量が小さいことであり、このため、大きなｃＤＮＡ、例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ジストロフィン、ジスフェリン、および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を必要とする多数の臨床用途での遺伝子療法を妨げている。初期の研究では、パッケージング限度は４．７〜４．８ｋｂと定義されていた（非特許文献１）。より最近の研究では、パッケージングされるベクターゲノムの限度は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８キャプシドでは、およそ５．０〜５．２ｋｂのサイズであることが確認された。これらの研究において、オーバーサイズの（または「フラグメント化された」）ゲノムは、いずれの向きのものも、典型的には、５’末端で欠失しており、パッケージングされたゲノムの大半は、約５．２ｋｂを上回らなかった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｎｇ，Ｊ−Ｙら（１９９６年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：２１０１〜２１１２頁
【非特許文献２】Ｌｕ，Ｈ．ら（２００８年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：６４８〜６５４頁
【非特許文献３】Ｗｕ，Ｚ．ら（２０１０年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：８０〜８６頁
【非特許文献４】Ｇｒｏｓｅ，Ｗ．Ｅ．ら（２０１２年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３９２３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、十分な品質を高い収率で生成することを可能にする、オーバーサイズベクターのためのより優れた産生プラットフォームが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
産生細胞株（ＰＣＬ）プラットフォームによるオーバーサイズベクターの産生に関する包括的な分析が、本明細書に記載される。以下に記載されるように、このＰＣＬプラットフォームは、高品質のオーバーサイズアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを高収率で生成する。生成されたｒＡＡＶベクターは、標準的なトリプルトランスフェクション方法によって作製されたベクターにおいて観察されるものよりも、キャプシド化された大きなゲノムを多くの量で含有する。加えて、細胞株は安定しており、ベクターは、異常な混入ＤＮＡをほとんど含有しない。ベクターは、インビボでの遺伝子導入の際に完全な発現カセットを生成し、機能性タンパク質の産生をもたらす。
【０００８】
本発明は、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含むＡＡＶ粒子を産生するための方法であって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成するような条件下において、ｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびにｉｉ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ産生細胞株を培養する工程と；ｂ）ＡＡＶヘルパー機能を提供する工程と；ｃ）オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子を回収する工程とを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである。一部の実施形態において、工程ｃ）で回収されたＡＡＶ粒子は、約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、工程ｃ）で回収されたＡＡＶ粒子は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂのｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、もしくは９．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【０００９】
上述の方法の一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む。さらなる実施形態において、イントロンは、合成イントロンである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む。さらなる実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
【００１０】
上述の方法の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。上述の方法の一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む。
【００１１】
上述の方法の一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される。一部の実施形態において、本方法は、ｒＡＡＶ粒子の精製をさらに含む。一部の実施形態において、精製は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー工程を含む。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生されたオーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。
【００１２】
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、ｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％が、約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムがキャプシド化されている、組成物を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、もしくは９．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【００１３】
上述の組成物の一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む。さらなる実施形態において、イントロンは、合成イントロンである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む。さらなる実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
【００１４】
上述の組成物の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。上述の方法の一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む。
【００１５】
上述の組成物の一部の実施形態において、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子は、産生細胞において産生される。一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される。
【００１６】
一部の態様において、本発明は、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現を強化するための方法であって、細胞株にＡＡＶヘルパー機能を提供することによって、産生細胞株においてｒＡＡＶ粒子を産生させる工程を含み、産生細胞株は、ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびにｂ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現よりも、約１．２５倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２．０倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３倍、または約５倍多い。一部の実施形態において、産生細胞株によって産生される粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態と比較して速い発現動態である。一部の実施形態において、産生細胞株によって産生されるオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態よりも、約５％速い、約１０％速い、約２５％速い、約５０％速い、約７５％速い、または約９０％速い。
【００１７】
オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現強化の一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである。
【００１８】
オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現強化の一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む。一部の実施形態において、イントロンは、合成イントロンである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
【００１９】
オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現強化の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む。
【００２０】
オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現強化の一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ＨＳＶ、またはバキュロウイルスによって提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される。一部の実施形態において、本方法は、ｒＡＡＶ粒子の精製をさらに含む。一部の実施形態において、精製は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー工程を含む。
【００２１】
一部の態様において、本発明は、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含むＡＡＶ粒子を産生するための細胞株であって、ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸と、ｂ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムとを含む、細胞株を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、８．７ｋｂ、もしくは９．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【００２２】
細胞株の一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む。さらなる実施形態において、イントロンは、合成イントロンである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む。さらなる実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
【００２３】
上述の細胞株の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。上述の方法の一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む。
【００２４】
上述の細胞株の一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶヘルパー機能を提供することによって、細胞株において産生される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される。
【００２５】
一部の態様において、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドによってキャプシド化されたｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂを上回る、ＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約５ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約８ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約９ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、８．７ｋｂ、もしくは９．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明は、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子であって、異種導入遺伝子が、治療的導入遺伝子産物をコードする、ＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、ジスフェリン、または嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む。さらなる実施形態において、イントロンは、合成イントロンである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む。さらなる実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
【００２７】
上述の細胞株の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。上述の方法の一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２  ＩＴＲおよびＡＡＶ８キャプシドを含む。
【００２８】
本発明の一部の実施形態において、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子は、産生細胞において産生される。一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される。
【００２９】
一部の実施形態において、本発明は、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶゲノムが、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、ＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、ウシ成長ホルモン合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのすべてまたは一部の欠失を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８キャプシドを含む。
【００３０】
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターであって、ｒＡＡＶゲノムが、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲプロモーター、合成イントロン、ヒトＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子、ウシ成長ホルモン合成ポリアデニル化配列、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインのすべてまたは一部の欠失を含む。
【００３１】
一部の実施形態において、本発明は、疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、個体に、疾患または障害を治療するのに好適な治療的導入遺伝子をコードするオーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、個体は、哺乳動物（例えば、ヒト）である。一部の実施形態において、疾患または障害は、血友病Ａである。一部の実施形態において、治療的導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子；例えば、Ｂドメイン欠失型ヒト第ＶＩＩＩ因子を含む、ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする。
【００３２】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるオーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を含むキットを提供する。
【００３３】
特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターに基づく、５．１〜５．４ｋｂベクターゲノムサイズ（示す通り）の範囲のｈＦＶＩＩＩ発現カセットを示す略図である。ＨＮＦ４結合部位（白丸）およびＨＮＦ３結合部位（黒丸）の配列改変、ならびにそれらの位置を示す。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃでの略号：ＩＴＲ、ｒＡＡＶ逆位末端反復配列；ｍＴＴＲ、マウストランスチレチンプロモーター（２０２または４８２ｂｐ）；ＨＩ、ハイブリッドイントロン；ＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩｃＤＮＡ；ｓｙｎ  ｐＡ、合成（ｓｙｎ  ｐＡ）；ＢＧＨまたはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ（ｐＡ）。
【図１Ｂ】本明細書に記載される実験で使用されるｍＴＴＲプロモーター配列のアライメントを示す図である。
【図１Ｃ】インビボでの、ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩ発現カセット由来のＦＶＩＩＩレベルを示すグラフである。Ｃ５６ＢＬ／６マウスへの大量注射によりプラスミドベクターを静脈内注射し、ＥＬＩＳＡアッセイにより血漿中の第ＶＩＩＩ因子レベルを測定した。
【図１Ｄ】５．１ｋｂのＦＶＩＩＩ発現カセットの構造を示す図である。このカセットは、ｒＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター、ハイブリッドイントロン（ＨＩ）、Ｂ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩｃＤＮＡ、および合成ポリＡ配列を含む。
【図１Ｅ】ＦＶＩＩＩベクターゲノム、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにピューロマイシンおよびカナマイシン薬物耐性に関与する遺伝子を含む、ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドを示す図である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、選択されたマスターウェルクローン（ＭＷ）由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す図である。（図２Ａ）ＦＶＩＩＩ  ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドを、１３ｋｂ直鎖状フラグメントを生成するＳｐｅＩで切断した。これを、単位長さのＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドについてのサイズ対照、および組み込まれたコピー数の基準として使用した。（図２Ｂ）ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｃＩＩでの消化により、組み込まれたベクターゲノムの完全性を分析した。これらの酵素はＦＶＩＩＩ発現カセット内を切断し、１．８および２．８ｋｂフラグメントを生じる。両方の図で、ベクターおよび制限部位を示す略図が与えられる。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターの産生収量および安定性についての分析を示すグラフである。（図３Ａ）ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂベクター産生の経時変化。振とう培養物に野生型アデノウイルス（ｗｔ  Ａｄ）を感染させ、サンプルを２日目、３日目および４日目に回収し、ｑＰＣＲによりベクター収量を１ｍｌあたりのベクターゲノム（ＶＧ／ｍｌ）として定量化した。（図３Ｂ）選択された高産生マスターウェルの安定性。ｒＡＡＶベクター産生レベルを、ＭＷ＃２８７（ＡＡＶ８／５．１ｋｂ）、ＭＷ＃３５（ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ）およびＭＷ＃１６３（ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．４ｋｂ）について示す。マスターウェルを継代数２０または２６まで継代し、ｒＡＡＶ産生能（ＤＲＰ／ｍｌ）をｑＰＣＲで定量化した。
【図４Ａ】オーバーサイズ５．１ｋｂ  ｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／ＦＶＩＩＩベクターの質についての分析を示すグラフである。ＰＣＬおよびＴＸＮにより産生された５．１ｋｂベクターロットを、ＡＵＣ分析により比較した。ＭＷ＃３５を使用して、ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩを３回生成させ（図４Ａ）、ＴＸＮ法によって産生された同じベクターと比較した（図４Ｂ）。ウイルスの質量差を測定する分析用超遠心分離分析（ＡＵＣ）により、ベクターの質を評価した。挿入部は、異なる沈降（Ｓ）値を有するキャプシドの％を示す。空キャプシドは通常、Ｓ値６３〜６６を有し、野生型のサイズのベクターゲノムを有するキャプシドは通常、Ｓ１００〜１０３である。
【図４Ｂ】オーバーサイズ５．１ｋｂ  ｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／ＦＶＩＩＩベクターの質についての分析を示すグラフである。ＰＣＬおよびＴＸＮにより産生された５．１ｋｂベクターロットを、ＡＵＣ分析により比較した。ＭＷ＃３５を使用して、ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩを３回生成させ（図４Ａ）、ＴＸＮ法によって産生された同じベクターと比較した（図４Ｂ）。ウイルスの質量差を測定する分析用超遠心分離分析（ＡＵＣ）により、ベクターの質を評価した。挿入部は、異なる沈降（Ｓ）値を有するキャプシドの％を示す。空キャプシドは通常、Ｓ値６３〜６６を有し、野生型のサイズのベクターゲノムを有するキャプシドは通常、Ｓ１００〜１０３である。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、オーバーサイズ５．４ｋｂ  ｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／ＦＶＩＩＩベクターの質についての分析を示すグラフである。ＰＣＬ（図５Ａ）およびＴＸＮ（図５Ｂ）により産生された５．４ｋｂベクターロットをＡＵＣ分析により比較した。挿入部は、異なる沈降（Ｓ）値を有するキャプシドの％を示す。空キャプシド（６４Ｓ／６３Ｓ）およびより大きいゲノムを有する粒子（１０１Ｓ／９９Ｓ）のパーセンテージを丸で囲んである。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、サザンブロットによる、ＰＣＬまたはＴＸＮにより生成されたｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂベクター中の、パッケージングされたベクターゲノムの特徴を示す図である。精製されたビリオンからベクターゲノムを単離し、アルカリゲル電気泳動でサイズについて分析し、その後、ベクターに特異的なプローブを使用してサザンブロットを行った。（図６Ａ）４．０ｋｂ  ＦＶＩＩＩプローブ（ＦＶＩＩＩドメインＡ１、Ａ２、Ａ３およびＣ１）を使用するサザン分析。ＶＧを１．１×１０９ＶＧ／レーンおよび６．０×１０９ＶＧ／レーンで１％アルカリゲルにローディングし、分離した。ＰＣＬ（ＭＷ＃３５）またはトリプルトランスフェクションにより生成された５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターを、４．６ｋｂサイズベクター（通常のサイズのベクターを作り出すためにＣ１ドメインを欠失させてあることを除いて、ｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂベクターと同一である）と比較した。（図６Ｂ）それぞれの明確なＶＧサイズのシグナル強度を定量化し、各レーンでの総シグナルに対する％としてグラフにした。
【図７】図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、ＤＮＡドットブロット分析による、ＰＣＬまたはＴＸＮにより生成されたｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂベクター中の、パッケージングされたベクターゲノムの５’末端の特徴を示す図である。図５で使用されたベクターロットを、各ベクターの２倍段階希釈液を膜にアプライすることで（２．４×１０９から開始；計８回ベクター濃度を減少させ、さらに陰性対照としてゲノム無しのものをアプライする）分析した。ベクターゲノム（プラスまたはマイナスの向き）の中間部または５’末端に特異的な３’末端標識オリゴヌクレオチドプローブで各ブロットをハイブリダイズした。シグナル強度を定量化し、４．６ｋｂベクター（完全にパッケージングされている）に正規化した。濃度３つを使用して標準誤差を生成させた。（図７Ａ）使用されたオリゴヌクレオチドプローブの位置を示す略図。値はヌクレオチドでの各３’末端からの距離を示す。（図７Ｂ）マイナス鎖の分析。（図７Ｃ）プラス鎖の分析。
【図８−１】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄは、ＰＣＬまたはＴＸＮにより生成されたｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂベクター中の、パッケージングされたベクターゲノムの５’および３’末端の特徴を示す図である。（図８Ａ）使用されたベクターゲノムのプラスおよびマイナス鎖の５’および３’末端に対するオリゴヌクレオチドプローブの位置を示す略図。（図８Ｂ）各ロットにおける５．１ｋｂベクターゲノムのプラスおよびマイナス鎖の定量化。分析されたベクターは、４．６ｋｂまたは５．１ｋｂ  ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩゲノムを含んでいた。ベクター産生方法（ＰＣＬまたはＴＸＮ）を示す。ベクターは全て同様の様式で精製した。図５に記載されるように、各ベクターの２倍段階希釈液を膜にアプライすることで（３．０×１０９から開始；計８回ベクター濃度を減少させた）分析を行った。ＦＩＸ（陰性対照）またはＦＶＩＩＩ（陽性対照）ｃＤＮＡを含むプラスミドを、シグナルの特異性についての対照として使用した。（図８Ｃ）５．１ｋｂベクターに対する３’および５’末端オリゴヌクレオチドプローブを使用するサザン分析。ＶＧを１．５×１０９ＶＧ／レーンおよび７．５×１０９ＶＧ／レーンで１％アルカリゲルにローディングし、分離した。ＰＣＬ（ＭＷ＃３５）またはトリプルトランスフェクション（ＴＸＮ）により生成された５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターを、４．６ｋｂサイズベクターと比較した。サイズマーカー（２．７、４．７および５．１ｋｂ）を示す。上のパネル、プラス鎖分析；下のパネル、マイナス鎖分析。各パネルに使用されたオリゴヌクレオチドを示す。白色矢印は失われたシグナルを示す。（図８Ｄ）各ベクターにおけるゲノムサイズの定量化。３’末端オリゴヌクレオチドプローブ（パッケージングされたゲノムを全て検出する）でプローブされたパネルのシグナル強度をＩｍａｇｅＪで定量化した。それぞれの明確なＶＧサイズ（４．７ｋｂ超、４．７ｋｂおよび４．７ｋｂ未満）の強度を定量化して、各レーンでの総シグナルに対する％としてグラフにした。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９−１】図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、ＰＣＬまたはＴＸＮにより生成されたｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．４ｋｂベクター中の、パッケージングされたベクターゲノムの５’および３’末端の特徴を示す図である。（図９Ａ）使用されたベクターゲノムのプラスおよびマイナス鎖の５’および３’末端に対するオリゴヌクレオチドプローブの位置を示す略図。（図９Ｂ）ドットブロット分析による、各ロットの５．４ｋｂベクターゲノムのプラスおよびマイナス鎖の定量化。図８に記載されるように分析を行った。（図９Ｃ）３’および５’末端オリゴヌクレオチドプローブを使用する、５．４ｋｂベクターのサザン分析。図８に記載されるように実験を行った。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、血友病Ａ  ＫＯマウスにおける、ＰＣＬにより産生されたｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂベクターのインビボでの効能を示すグラフである。ベクターを、マウスに尾静脈から３×１０１１および４×１０１０ＤＲＰ／マウスで投与し、血漿ＦＶＩＩＩレベルを５６日目まで分析した。（図１０Ａ）血漿ＦＶＩＩＩタンパク質活性。Ｃｏａｔｅｓｔアッセイにより、７日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目の血漿サンプルにおける活性を測定した。（図１０Ｂ）２８日目および５６日目の凝固時間。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）で凝固時間を分析した。各治療群はｎ＝マウス７〜１０匹／群を含んでいた。統計的有意性を以下の通り示す：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、血友病Ａ  ＫＯマウスを使用した、ＰＣＬおよびＴＸＮにより産生された５．１ｋｂ  ＡＡＶｒｈ８Ｒ／ＦＶＩＩＩベクターのインビボでの比較を示すグラフである。ベクターを、マウスに尾静脈から４×１０１０ＤＲＰ／マウスで投与した。（図１１Ａ）血漿ＦＶＩＩＩタンパク質活性。Ｃｏａｔｅｓｔアッセイにより、２１日目、３５日目、５６日目、７０日目および８４日目のサンプルにおける活性を測定した。（図１１Ｂ）２１日目の血漿凝固時間。（図１１Ｃ）５６日目の血漿凝固時間。血漿凝固時間はａＰＴＴアッセイで測定した。比較のため、マウス系統（１２９ＳおよびＢＡＬＢ／ｃ）の凝固時間を示す。（図１１Ｄ）８４日目の、肝臓におけるベクターゲノム（ＶＧ）コピー。ＶＧコピーをｑＰＣＲで定量化し、コピー／肝臓の総ＤＮＡ５００ｎｇで示す。各治療群はｎ＝マウス８匹／群を含んでいた。統計的有意性を以下の通り示す：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１。各パネルにウイルス産生方法を示す（ＰＣＬまたはＴＸＮ）。
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、血友病Ａ  ＫＯマウスを使用した、ＰＣＬおよびＴＸＮにより産生された５．４ｋｂ  ＡＡＶｒｈ８Ｒ／ＦＶＩＩＩベクターのインビボでの比較を示すグラフである。ベクターを、マウスに尾静脈から４×１０１０ＤＲＰ／マウスで投与し、ベクター投与から２４日および４３日後に血漿サンプルを回収した。（図１２Ａ）血漿ＦＶＩＩＩ活性。Ｃｏａｔｅｓｔアッセイにより、２４日目および４３日目の血漿サンプルにおける活性を測定した。（図１２Ｂ）ａＰＴＴアッセイによる、２４日目の血漿凝固時間。（図１２Ｃ）３日目および４３日目の、肝臓におけるベクターゲノム（ＶＧ）コピー。ベクター投与から３日および４３日後に動物を屠殺して、ｑＰＣＲでＶＧコピーを定量化し、コピー／肝臓総ＤＮＡ５００ｎｇで示す。各治療群はｎ＝マウス６〜８匹／群を含んでいた。統計的有意性を以下の通り示す：Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１。
【図１３】図１３Ａは、５．１、５．９および６．７ｋｂ  ＡＡＶ２／ＳＥＡＰベクターを示す略図である。図１３Ｂは、相対的および固有産生（ｎ＝２）アッセイでのベクター収量に関する、個々のマスターウェル（ＭＷ）のデータを示すグラフである。ベクター収量をＤＲＰ／ｍｌで示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書に詳細に考察されるように、本発明者らは、高品質のオーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを高収率で生成することができる産生細胞株プラットフォームを開発した。このプラットフォームは、例示的な構築物としてヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを含有するｒＡＡＶベクターを使用して特徴付けられた。標準的なトリプルトランスフェクション方法を使用した産生と比較して、このプラットフォームは、より大きなゲノムがより多くキャプシド化されたｒＡＡＶベクターを生成した。このプラットフォームを使用して生成されたｒＡＡＶベクターはまた、インビボでの遺伝子導入にも適しており、機能的第ＶＩＩＩ因子の産生をもたらした。
【００３６】
したがって、本発明は、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含有するＡＡＶ粒子を産生するための方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成するような条件下において、ｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびにｉｉ）約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂであるｒＡＡＶゲノムを含有するＡＡＶ産生細胞株を培養する工程と；ｂ）ＡＡＶヘルパー機能を提供する工程と；ｃ）オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含有するｒＡＡＶ粒子を回収する工程とを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約５ｋｂを上回る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、もしくは９．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。さらに、本明細書には、本開示の方法によって産生されたオーバーサイズ組換えＡＡＶゲノムを含有するｒＡＡＶ粒子が提供される。
【００３７】
なおもさらに、本明細書には、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、ｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％が、約５ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムがキャプシド化されている、組成物が提供される。
【００３８】
なおもさらに、本明細書には、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含有するＡＡＶ粒子を産生するための細胞株であって、ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸と、ｂ）約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂであるｒＡＡＶゲノムとを含む、細胞株が提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約５ｋｂを上回る。
【００３９】
なおもさらに、本明細書には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドによってキャプシド化された、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂであるｒＡＡＶゲノムを含有するＡＡＶ粒子が、提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約５ｋｂを上回る。
【００４０】
Ｉ．一般的技法
本明細書に記載または参照される技法および手順は、一般に、従来的な手法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、２０１２年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２０１０年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９３〜８年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６年）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００２年）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０���０年）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）；ならびにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１年）に記載されている広く利用されている手法などを使用して、当業者により十分に理解され、一般的に利用されている。
【００４１】
ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書に使用されるとき、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞に送達されるべき核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
【００４２】
本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に見出すことができるような）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。代替として、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含み得、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ−ＮＨ２）または混合ホスホロアミデート−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補的な鎖を合成し、これらの鎖を適切な条件下でアニーリングすること、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーとともに使用して相補的な鎖をデノボ合成することのいずれかによって、一本鎖ポリヌクレオチドの化学合成産物から得ることができる。
【００４３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に使用され、最小の長さのものに限定されない。アミノ酸残基のこのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有し得、これらには、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸の二量体、三量体、および多量体が含まれるがこれらに限定されない。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義に包含される。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的で、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望される活性を維持する限り、天然の配列に対する欠失、付加、および置換（一般に、保存的な性質）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位指向的変異生成によるもののように意図的なものであってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるもののように偶発的なものであってもよい。
【００４４】
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む、組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸には、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。一部の実施形態において、組換え核酸には、２つのＩＴＲが隣接している。
【００４５】
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つまたは２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接した１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含む、ポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染している（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、ならびにＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞に存在する場合、感染性ウイルス粒子において複製され、そこにパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターが、より大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター）に組み込まれると、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター」と称することができ、これは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下において複製およびキャプシド化によって「レスキュー」することができる。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、線状人工染色体、脂質との複合体、リポソーム内に封入されたもの、およびウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子にキャプシド化されたものを含むがこれらに限定されない、多数の形態のうちのいずれかであり得る。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージングされて、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、「産生細胞株」は、ＡＡＶ粒子を産生することができる安定な細胞株である。一部の実施形態において、ＡＡＶ複製遺伝子および／またはキャプシド遺伝子は、宿主細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のＡＡＶ  ＩＴＲおよび異種核酸（例えば、異種導入遺伝子）を含むＡＡＶベクターゲノムは、宿主細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ複製遺伝子および／またはキャプシド遺伝子、ならびに１つまたはそれ以上のＡＡＶ  ＩＴＲおよび異種核酸（例えば、異種導入遺伝子）を含むＡＡＶベクターゲノムは、宿主細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ複製遺伝子、カプシド遺伝子、または１つもしくはそれ以上のＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターゲノムのうちの１つまたはそれ以上は、宿主細胞株のゲノムに安定に組み込まれている。当業者であれば、安定に維持されている核酸は、複数回の継代（例えば、５回、１０回、１５回、２５回、またはそれ以上の継代）時、宿主細胞株において維持されていることを理解するであろう。
【００４７】
「異種」とは、比較される実体または導入もしくは組み込まれる実体の残りの部分の遺伝子型とは、遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技法によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（また、発現された場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれた細胞の配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、そのベクターに対して異種のヌクレオチド配列である。
【００４８】
「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写することができ、場合によっては、適切な条件下で翻訳および／または発現することができる、ポリヌクレオチドを指す。いくつかの態様において、導入遺伝子は、導入された細胞に所望される特性を付与するか、またはそうでなければ、所望される治療結果または診断結果をもたらす。別の態様では、導入遺伝子は、ＲＮＡ干渉を媒介する分子、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡに転写される。
【００４９】
「トランスチレチン（ＴＴＲ）プロモーター」という用語は、トランスチレチン遺伝子に由来する遺伝子発現を作動させることができるポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態において、トランスチレチンプロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２２１３９によって表されるＭｕｓ筋トランスチレチン（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ））に由来し得る。ＴＴＲプロモーターの例は、図１Ｂに示される。
【００５０】
ウイルス力価に関して使用される「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」、または「ゲノムコピー」という用語は、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ  ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物におけるゲノム粒子の数は、本明細書の実施例に記載されているか、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１〜１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２年）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２〜２７８頁に記載されているものなどの手順によって測定することができる。
【００５１】
本明細書に使用される「ベクターゲノム（ｖｇ）」という用語は、ベクター、例えば、ウイルスベクターのポリヌクレオチド配列のセットを含む、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指し得る。ベクターゲノムは、ウイルス粒子にキャプシド化されている。具体的なウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡを含み得る。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターと関連する内在性配列および／または組換え技法を通じて特定のウイルスベクターに挿入された任意の異種配列を含み得る。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ配列、目的の配列（例えば、異種導入遺伝子）、場合によってはイントロン、およびポリアデニル化配列を含み得る。完全なベクターゲノムは、ベクターの完全なポリヌクレオチド配列セットを含み得る。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸力価は、ｖｇ／ｍＬ単位で測定することができる。この力価を測定するのに好適な方法は、当該技術分野で既知である（例えば、定量的ＰＣＲ）。
【００５２】
「オーバーサイズ組換えＡＡＶゲノム」という用語は、サイズ（ヌクレオチド塩基対で測定される）が、当該技術分野において４．７〜４．８ｋｂと定義されているＡＡＶゲノムの従来のパッケージング限度を上回る、組換えＡＡＶゲノムを指し得る（例えば、Ｄｏｎｇ，Ｊ−Ｙら（１９９６年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：２１０１〜２１１２頁を参照されたい）。一部の実施形態において、オーバーサイズ組換えＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂを上回る。一部の実施形態において、オーバーサイズ組換えＡＡＶゲノムは、約５ｋｂを上回る。一部の実施形態において、オーバーサイズ組換えＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである。
【００５３】
ウイルス力価に関して使用される「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」という用語は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３〜１９７３頁に記載されているような、複製中心アッセイとしても知られている感染中心アッセイによって測定された、感染性および複製適合性の組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
【００５４】
ウイルス力価に関して使用される「形質導入単位（ｔｕ）」という用語は、本明細書の実施例に記載されているか、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７年）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３〜１２４頁；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０〜５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載に記載されているような、機能性アッセイにおいて測定された、機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
【００５５】
「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列とは、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、ウイルスゲノムの末端に見られる、逆向きの比較的短い配列を指す。
【００５６】
当該技術分野で十分に理解されている用語である「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列とは、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの一番外側の１２５個のヌクレオチドは、２つの交互の配向のうちのいずれかで存在し得、異なるＡＡＶゲノム間における異種性、および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間における異種性をもたらす。一番外側の１２５個のヌクレオチドはまた、自己相補的な複数の短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、およびＤ領域と示される）を含有し、鎖内塩基対合がＩＴＲのこの部分で生じることが可能である。
【００５７】
「末端分離配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ｔｒｓ」は、ウイルスのＤＮＡ複製時にＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質によって切断される、ＡＡＶ  ＩＴＲのＤ領域内の配列である。変異体末端分離配列は、ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質による切断に不応性である。
【００５８】
「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶが宿主細胞によって複製され、パッケージングされることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ複製およびパッケージングを補助するヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含むがこれらに限定されない、多数の形式のうちのいずれかで提供される。遺伝毒性物質などの他のＡＡＶヘルパー機能が、当該技術分野において既知である。
【００５９】
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（欠損パブロウイルスである）が、宿主細胞によって複製され、パッケージングされるのを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、例えばワクシニア、およびバキュロウイルスを含む、多くのこのようなヘルパーウイルスが、特定されている。アデノウイルスは、多数の異なる下位群を包含するが、下位群Ｃのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が、最も一般的に使用されている。ヒト起源、非ヒト哺乳動物起源、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが既知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能である。これもＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能なヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルスウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。ＡＡＶの複製のためのアデノウイルスヘルパー機能の例としては、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能、およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。受託機関から入手可能なバキュロウイルスとしては、オートグラファカリフォルニアニュークレア多角体ウイルスが挙げられる。
【００６０】
ｒＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子の感染性ヘルパーウイルス粒子に対する比が、少なくとも約１０２：１、少なくとも約１０４：１、少なくとも約１０６：１、または少なくとも約１０８：１、またはそれ以上である場合に、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。一部の実施形態において、調製物はまた、相当量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上述のヘルパーウイルス粒子の混入物が破壊された形式で存在していたとして、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在するようなタンパク質）を含まない。ウイルスおよび／または細胞のタンパク質混入は、一般に、ＳＤＳゲルにおけるクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンドの出現）として観察することができる。
【００６１】
参照ポリペプチド配列または核酸配列に関する「配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後に、参照ポリペプチド配列または核酸配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義され、任意の保存的置換は配列同一性の一部とは見なさない。アミノ酸または核酸の配列同一性パーセントを判定する目的でのアライメントは、当業者の技能の範囲内の様々な手段で、例えば、例としてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、Ｓｕｐｐ．３０，節７．７．１８、表７．７．１に記載されているもの、ならびにＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含む、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して、達成することができる。アライメントプログラムの一例は、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書の目的で、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは、代替として、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む、所与のアミノ酸配列Ａと言い換えることができる）は、次のように計算される：分率Ｘ／Ｙを１００倍し、式中、Ｘは、配列アライメントプログラムによって、そのプログラムのＡとＢとのアライメントで同一な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくならないことが、理解される。本明細書の目的で、所与の核酸配列Ｄに対する所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（これは、代替として、所与の核酸配列Ｄに対して、ある特定の核酸配列同一性％を有するまたは含む、所与の核酸配列Ｃと言い換えることができる）は、次のように計算される：分率Ｗ／Ｚを１００倍し、式中、Ｗは、配列アライメントプログラムによって、そのプログラムのＣとＤとのアライメントで同一な一致としてスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが、核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％とは等しくならないことが、理解される。
【００６２】
「単離された」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞とは、それが、その天然の環境の成分から特定および分離されており、かつ／または回収されていることを意味する。
【００６３】
「有効量」とは、臨床結果（例えば、症状の緩和、臨床エンドポイントの達成など）を含む、有益な結果または所望される結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。疾患状態に関しては、有効量は、疾患を緩和、安定化、または疾患の発症を遅延させるのに十分な量である。
【００６４】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
【００６５】
本明細書に使用されるとき、「治療」は、有益な臨床結果または所望される臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的で、有益な臨床結果または所望される臨床結果としては、検出可能か検出不可能かに関係なく、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（例えば、悪化しないこと）、疾患の拡散（例えば、転移）の防止、疾患進行の遅延もしくは緩慢化、疾患状態の緩和または軽減、ならびに寛解（部分的または完全に関係なく）が挙げられるがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けなかった場合に予測される生存と比較して、生存を延長させることも意味し得る。
【００６６】
本明細書に使用されるとき、「予防的治療」という用語は、個体が、障害を有するかまたは有する危険性にあることがわかっているかまたはその疑いがあるが、疾患の症状を呈していないかまたは最低限の症状しか呈していない場合の治療を指す。予防的治療を受ける個体は、症状の発症前に治療を受ける場合がある。
【００６７】
本明細書に使用されるとき、「治療用」薬剤（例えば、治療的ポリペプチド、核酸、または導入遺伝子）は、上述の臨床結果例など、有益な臨床結果または所望される臨床結果をもたらすものである。そのため、治療用薬剤は、上述のような治療に使用することができる。
【００６８】
本明細書に使用されるとき、「微分係数分布値」または「Ｃ（Ｓ）」は、例えば、超遠心分離の際に、沈降する粒子の分布を表す、Ｌａｍｍ方程式の解の分布の変化形である。
【００６９】
本明細書に使用されるとき、「スベドベリ単位」は、沈降速度の単位を指す。所与のサイズおよび形状の粒子の沈降速度は、粒子がどれくらいの速度で沈降するかを測定する。１スベドベリ単位は、１０−１３秒に等しい。例えば、スベドベリ単位は、遠心分離装置の遠心力下で分子が移動する速度を反映して使用されることが多い。
【００７０】
本明細書に使用されるとき、「沈降速度条件」または「境界沈降速度条件」とは、サンプル溶液が沈降速度分析に供される、任意の実験条件を指し得る。沈降速度法は、広範なｐＨ条件およびイオン強度条件、ならびに４〜４０℃の温度での粒子の研究が可能である。沈降境界が移動する速度が、沈降する種の沈降係数の尺度である。沈降係数は、分子量に依存し（大きな分子ほど速く沈降する）、また分子の形状にも依存する。沈降境界の最小限の幅は、分子の拡散係数と関連し、類似の沈降係数を有する複数の種が存在すると、拡散だけに基づいて予測されるものよりも広い境界が生じる。沈降速度条件としては、限定することなく、ロータ速度、サンプルとロータ中心との間の距離、温度、溶媒、サンプル、緩衝液、超遠心分離時間、検出の時間間隔、セクターおよび光学窓特徴、ＡＵＣ機器（超遠心分離装置および検出装置を含む）、参照溶媒の平衡透析、ならびにデータ分析アルゴリズムに関する任意の条件を挙げることができる。
【００７１】
本明細書に使用されるとき、「解析用密度勾配沈降平衡法（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）」は、粒子の浮遊密度を測定するため、または浮遊密度の差を使用して様々な種の粒子を分離するための方法に関する。これらの方法は、例えば、ＡＵＣ沈降均衡技法を使用し得る。これらの方法では、粒子溶液（例えば、限定することなく、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはウイルスキャプシドの溶液）を、勾配溶媒和物、例えば勾配塩化セシウムまたは勾配硫酸セシウムにおいて、溶媒和物との平衡に達するまで、超遠心分離に供してもよい。平衡時、粒子溶液は、粒子の密度が溶媒和物のものと等しくなる勾配内の位置で、濃縮するかまたはバンドが出る。バンドの位置を使用して、粒子の密度を計算してもよく、またはバンドを抽出して、単一の粒子種を単離してもよい。
【００７２】
本明細書に使用されるとき、「ＳＥＤＦＩＴアルゴリズム」は、沈降速度などの流体力学的データを分析することを可能にするアルゴリズムである（Ｓｃｈｕｃｋ（２０００年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６〜１９頁）。ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムでは、予測範囲にわたり沈降係数の格子が作成される。各沈降係数についてＬａｍｍ方程式の解を使用して、沈降境界をシミュレーションするが、粒子形状および溶媒の摩擦比は一定と仮定する。
【００７３】
本明細書に使用されるとき、「Ｆ統計量（Ｆ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）」または「Ｆ比」とは、信頼性レベルを指す。このパラメーターは、使用される正則化の量を制御する。これは、異なる範囲では異なる意味を有する：０〜０．５では、正則化が使用されていない。０．５〜０．９９９の値は、確率Ｐ（信頼性レベル）に対応する。これらのＰ値から、正則化の削減制約に対して許容される所望のカイ二乗増加を、Ｆ統計量とともに計算する。０．５１の値は、正則化をほとんど引き起こさず、０．６８〜０．９０の値は、一般的に使用される信頼性レベルに対応し（通常、５０回またはそれ以上のスキャンで、０．７の確率に対応するカイ二乗増加は、約０．１％である）、一方で０．９９に近い値は、非常に高い正則化を引き起こす。これらの値と確率との関係性は、Ｆ統計量計算装置を使用して調べることができる。１を上回る数が入力されると、それらは、直接、カイ二乗比としてとられる（１を上回る確率がないため）。例えば、１．１という値は、１０％のカイ二乗増加で正則化をもたらす。
【００７４】
本明細書における値またはパラメーターへの「約」への言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００７５】
本明細書に使用されるとき、冠詞の単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、別途示されない限り、複数形の参照物が含まれる。
【００７６】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含むこと」、「それらからなること」、および／または「本質的にそれらからなること」を含むことが理解される。
【００７７】
ＩＩＩ．ウイルス粒子
本開示のある特定の態様は、（例えば、本明細書に開示される方法および／または細胞株によって産生される）オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子に関する。本開示のある特定の態様は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂのｒＡＡＶゲノムを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子に関する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約５ｋｂを上回り、ＡＡＶキャプシドによってキャプシド化されている。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂのｒＡＡＶゲノムを含有する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約５ｋｂを上回る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、約５ｋｂ〜約７．０ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜約６．７ｋｂである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．３ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、もしくは９．４ｋｂのうちのいずれかより大きく、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【００７８】
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接した異種核酸（例えば、異種導入遺伝子）を含む核酸を含む、組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子にキャプシド化されている。ＡＡＶ粒子はまた、キャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、核酸は、目的のコード配列（例えば、異種導入遺伝子）、転写の方向に作動可能に連結された成分、転写開始配列および転写終結配列を含む制御配列を含み、それによって発現カセットが形成される。発現カセットは、５’末端および３’末端で、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接している。「機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに意図されるように機能することを意味する。Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００年、９７（７）３４２８〜３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年、７７（１２）：７０３４〜４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００９年、１６：１０〜１６頁を参照されたく、これらのすべては、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の一部の態様を実施する目的で、組換えベクターは、キャプシド化に必須のＡＡＶの配列の少なくともすべておよびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクターにおいて使用するためのＡＡＶ  ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９４年、５：７９３〜８０１頁に記載されている）を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換によって改変させてもよく、またはＡＡＶ  ＩＴＲは、複数のＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来してもよい。４０種類を上回るＡＡＶの血清型が現時点で既知であり、新しい血清型および既存の血清型の変化形が、特定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２年、９９（１８）：１１８５４〜６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００（１０）：６０８１〜６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３年、７７（１２）：６７９９〜８１０頁を参照されたい。いずれのＡＡＶ血清型の使用も、本発明の範囲内と見なされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶなどを含むが、これに限定されないＡＡＶ血清型に由来するベクターである。例えば、一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲの核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲなどである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶの核酸は、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。
【００７９】
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、もしくは米国付与前公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されている、ＳｈＨ１０などの変化形ＡＡＶ６キャプシド）、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシド、ＡＡＶ９キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、もしくは米国付与前公開第２０１３／０３２３２２６号に記載されている修飾ＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、チロシンキャプシド変異体、ヘパリン結合キャプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２−７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ  ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ−ＤＪ／９キャプシド、もしくは米国付与前公開第２０１２／００６６７８３号に記載されている任意のその他のキャプシド）、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開第ＷＯ／２００３／０４２３９７号に記載されているＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施形態において、変異体キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５チロシン変異体キャプシド（Ｚｈｏｎｇ  Ｌ．ら（２００８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５（２２）：７８２７〜７８３２頁）を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４年、７８（１２）：６３８１頁）。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質またはその変異体を含む。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質またはその変異体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドまたはその変異体を含む。
【００８０】
特定の標的細胞の形質導入を最適化するため、または特定の標的組織（例えば、肝臓またはＣＮＳ組織）内の特定の細胞型を標的とするために、異なるＡＡＶ血清型が使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型に由来するかまたは異なる血清型に由来する（例えば、混合血清型の）ウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含み得る。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２  ＩＴＲを含み得るか、またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１  ＩＴＲを含み得る。ｒＡＡＶ粒子の産生のためのＡＡＶ血清型の任意の組み合わせは、各組合せが明示的に本明細書に記載されているかのように、本明細書に提供される。一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＡＡＶ２  ＩＴＲが隣接した、本開示のＡＡＶ１キャプシドおよびｒＡＡＶベクター（例えば、異種核酸を含む発現カセット）を含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ２キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。他の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し、キャプシドは、ＡＡＶｒｈ８Ｒに由来する。
【００８１】
本開示のさらなる態様は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、ｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂのｒＡＡＶゲノムがキャプシド化されている、組成物に関する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、約５ｋｂを上回るゲノムがキャプシド化されている。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、もしくは９．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回るゲノムがキャプシド化されている。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、５’末端の短縮を含んでいなかった。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、３’末端の短縮を含んでいなかった。ｒＡＡＶゲノムのサイズをアッセイするための方法は、当該技術分野で既知であり、以下に記載されるように、限定することなくサザンブロットおよび解析用超遠心分離法が挙げられる。
【００８２】
一部の実施形態において、本開示の組成物は、ｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、約４．７ｋｂを上回る、約５．０ｋｂを上回る、約５．１ｋｂを上回る、約５．２ｋｂを上回る、約５．３ｋｂを上回る、約５．４ｋｂを上回る、約５．５ｋｂを上回る、約５．６ｋｂを上回る、約５．７ｋｂを上回る、約５．８ｋｂを上回る、約５．９ｋｂを上回る、約６．０ｋｂを上回る、約６．５ｋｂを上回る、約７．０ｋｂを上回る、約７．５ｋｂを上回る、約８．０ｋｂを上回る、約８．５ｋｂを上回る、約９．０ｋｂを上回る、または約９．４ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムがキャプシド化されている、ｒＡＡＶ粒子を含有する。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、５’末端の短縮を含んでいなかった。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、３’末端の短縮を含んでいなかった。
【００８３】
本発明の一部の実施形態において、組成物中の組換えウイルス粒子は、高度に精製され、好適に緩衝され、濃縮されている。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｍＬ〜約９×１０１３ｖｇ／ｍＬ、またはこの範囲内の任意の濃度に、濃縮されている。
【００８４】
本明細書に記載されるように、ウイルス粒子の調製物（例えば、ベクターゲノムのサイズおよび／または組込みに関連する１つまたはそれ以上の特性）を特徴付けるための１つの技法は、サザンブロットの使用によるものである。例えば、以下の実施例により詳細に記載されるように、ｒＡＡＶ粒子の調製物（場合によっては、本明細書に記載されるように精製されている）は、キャプシド化されていないすべての核酸を除去するためにＤＮａｓｅで処理し、ＤＮａｓｅ消化を停止させるために薬剤（例えば、ＥＤＴＡ）で処理し、プロテイナーゼで消化させた後、パッケージングされたベクターゲノムを取り出すためにＤＮＡ抽出に供してもよい。ベクターゲノムを、次いで、電気泳動を使用して分離し、膜に架橋させ、ベクターゲノムに特異的にハイブリダイズする１つまたはそれ以上の標識化プローブでプローブしてもよい。標識化プローブへのハイブリダイゼーションによって標識されたＤＮＡフラグメントのサイズ（例えば、１つまたはそれ以上の特定のサイズのマーカーと比較して）が、ベクターゲノムのサイズを表す。加えて、ベクターゲノムの既知のセグメント（例えば、５’末端または３’末端）にハイブリダイズする１つまたはそれ以上のプローブを使用してもよい。これらのプローブのうちの１つまたはそれ以上が、ベクターゲノムにハイブリダイズできなかった場合、これは、調製物のベクターゲノムが、短縮されているか、そうでなければ欠失しており、そのため、予測された全長よりも短くなっていることを示す。ＡＡＶゲノムのパッケージングは、３’末端で開始して生じることが既知であるため（Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ａ．ら（２００１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：３２８２〜３２９１頁）、オーバーサイズベクターは、ゲノムサイズが４．７ｋｂを超える場合に、マイナス鎖およびプラス鎖の５’末端において配列が欠如している可能性がある。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、約５．０ｋｂを上回るオーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含み、ここで、ｒＡＡＶ粒子内にキャプシド化されているウイルスゲノムは、例えば、５’末端および／または３’末端に特異的なプローブへのハイブリダイゼーションによって測定した場合に、比較的無傷な５’末端および３’末端を含む。ハイブリダイゼーションは、サザンブロット分析またはＰＣＲなどであるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、５’末端の短縮を含んでいなかった。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、３’末端の短縮を含んでいなかった。
【００８５】
解析用超遠心分離法
本明細書に記載されるように、ウイルス粒子の調製物（例えば、ベクターゲノムのサイズおよび／または組込みに関連する１ついまたはそれ以上の特性）を特徴付けるための１つの技法は、解析用超遠心分離法（ＡＵＣ）の使用によるものである。例えば、一部の実施形態において、ＡＵＣは、完全な無傷のゲノムを有するウイルス粒子、空のウイルスキャプシド、および変化形（例えば、短縮形、凝集物、不純物など）ウイルスゲノムを有するウイルス粒子を区別するために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の調製物へのｒＡＡＶ粒子のベクターゲノム組込みを評価するために使用される。ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を特徴付けるための解析用超遠心分離法の使用に関するさらなる説明は、２０１５年１月２０日に出願された、米国仮特許出願第６２／１０５，７１４号「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
解析用超遠心分離法は、タンパク質または他の巨大分子の分子量ならびに流体力学的および熱力学的特性を評価するための手段である。沈降速度によるタンパク質または巨大分子の不均質性は、濃度、温度、イオン強度、およびｐＨを含む条件範囲にわたる。例えば、タンパク質は、臨床的に関連する製剤において分析することができる。アデノウイルス調製物を特徴付けるための解析用超遠心分離法の使用は、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，ＳＡ＆Ｐｈｉｌｏ  ＪＳ（２００７年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６２：１６〜３７頁に提供されている。
【００８７】
ＡＵＣ分析は、粒子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびウイルスキャプシド）の遠心力場における溶媒を通じた移行を測定することによって、粒子の生物物理学的特性を特徴付けるための定量的方法を指す。ＡＵＣ分析は何十年にも間にわたって十分に特徴付けられており、多用途性が高い。ＡＵＣ分析は、第一原理の流体力学的および熱力学的情報に依存するため、ＡＵＣを適用して、広範な粒子の濃度およびサイズにわたり、多くの種類の粒子の生物学的特性を決定することができる。ＡＵＣ分析は、典型的に、次の２つの基本的な種類の実験を含む：沈降速度法および沈降均衡法。沈降均衡分析により、粒子の熱力学的特性が得られ、これを使用して、化学量論および結合定数などの特徴を測定することができる。沈降速度法により、粒子の流体力学的特性が得られ、これを使用して、サイズ、形状、および濃度などの特徴を測定することができる。ウイルス調製物のＡＵＣ分析の特徴は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列にもキャプシドの血清型にも関係なく、同じアッセイ条件を使用して、様々なウイルス粒子調製物を分析することができることである。
【００８８】
本開示のある特定の態様は、ウイルスキャプシドの特性を特徴付けるために沈降速度分析を使用することに関する。一部の実施形態において、沈降速度分析は、それぞれが、光がコンパートメントを透過するのを可能にする２つの光学窓を含む、透析平衡状態の２つのセクター（１つが、実験サンプル用であり、もう１つが溶媒のみの参照サンプル用である）を有する、超遠心分離装置の速度セルを使用する。超遠心分離法は、セルに角速度を適用し、溶質粒子をセクターの底部に向かって急速に沈降させる。沈降が起こると、溶質は、セル上部のメニスカスでは枯渇され、枯渇領域と沈降している溶質との間に沈降境界が生じる。沈降境界の移動または移行の速度は、サンプルセクターと参照セクターとの特性を比べる測定値を、特定の時間間隔（沈降速度法では、これらの間隔は、典型的に、約数分である）で取得することによって、測定される。複数の溶質種が存在している場合、これは、それぞれが分解可能な種に対応した複数の沈降境界の形成につながり得る。
【００８９】
光学的に沈降境界を検出し、その移動または移行の速度を測定するためのいくつかの方法が、当該技術分野で既知である（参考については、Ｃｏｌｅら（２００８年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８４：１４３〜７９頁を参照されたい）。一部の実施形態において、参照セクターおよびサンプルセクターは、吸光度検出法を使用してアッセイすることができる。この検出方法では、特定の波長における吸光度を、サンプルセクターおよび参照セクターについて、各セクター内で異なる半径方向位置で測定することができる。代替として、単一の半径方向位置における経時的な吸光度を測定してもよい。ベールの法則により、吸光度と溶質の吸光係数との間の数学的関連性が得られる。
【００９０】
一部の実施形態において、参照セクターおよびサンプルセクターは、干渉検出法（例えば、レイリー干渉検出法）を使用してアッセイしてもよい。レイリー干渉検出法では、干渉光学系は、２つの並列スリットを含んでいる。単一のコヒーレント光線は、両方の窓を通るように分離され、その後、２つの光線は再び交わる。これらの２つの光波が交わると、明と暗が交互になった縞模様の干渉パターンが形成される。サンプルおよび参照サンプルが、同一の屈折率を有していた場合、結果として得られる干渉縞は、完全にまっすぐになる。溶質の濃度が増加すると、溶液の屈折率が高くなり、それによって、サンプル光線が妨害され、垂直な縞シフトをもたらす。この縞シフトを測定することによって、サンプル中の溶質濃度を測定することができる。サンプルおよび参照の絶対値を測定する吸光度検出法とは異なり、干渉検出法は、サンプルと参照との間の相対差を測定する。しかしながら、干渉検出法は、統合されたピークをもたらし、これは、濃度に正比例し、吸光度が低い種類のサンプルに使用することができる。レイリー干渉光学系をＡＵＣとともに使用することに関する参考文献については、Ｆｕｒｓｔ（１９９７年）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３５：３０７〜１０を参照されたい。
【００９１】
沈降境界が移動する速度の測定値を使用して、溶質粒子の多数の物理的特性を導くことができる。境界の移動速度により、粒子の質量および形状（摩擦係数）に基づいて沈降係数が決まる。粒子の沈降係数ｓは、遠心力場によって適用される、粒子の速度の加速度に対する比を指す。沈降係数は、スベドベリ単位Ｓで表される（１スベドベリ単位は、１０−１３秒に等しい）。粒子または粒子溶液の沈降係数は、その特性、例えば、分子量（浮力に関して補正される）、および溶媒の特性に依存する。
【００９２】
超遠心分離中の経時的な溶質の濃度境界の変化は、Ｌａｍｍ方程式を使用して判定することができる（Ｓｃｈｕｃｋ（２０００年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６〜１９頁）。簡単に述べると、Ｌａｍｍ方程式は、沈降（溶質を濃縮させる）と拡散（溶質を分散させる）との競合力に応答した経時的な溶質の濃度境界の変化を、セクター形状のセルおよびロータによって生じる遠心力場を考慮して計算する。Ｌａｍｍ方程式は、次のように表すことができる：
方程式１：∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ［（∂＾２ｃ／∂ｒ＾２）＋１／ｒ（∂ｃ／∂ｒ）］−ｓω＾２［ｒ（∂ｃ／∂ｒ）＋２ｃ］
式中、ｃは溶質濃度であり、Ｄは溶質拡散定数を表し、ｓは沈降係数を表し、ωはロータの角速度を表し、ｒは半径であり、ｔは時間である。
【００９３】
未加工のＡＵＣデータを、Ｌａｍｍ方程式の解に当てはめることによって、沈降係数および濃度分布における変化といった、溶質の特徴を決定することが可能である。例えば、沈降境界の変化速度に関する実験的に決定された値は、Ｌａｍｍ方程式を使用して、沈降係数、分子量、または境界を形成する溶質の濃度を導くことで、モデリングすることができる。ＳＥＤＦＩＴ（Ｓｃｈｕｃｋ（２０００年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６〜１９頁）など、当該技術分野で既知のいくつかのプログラムを使用して、Ｌａｍｍ方程式をＡＵＣデータにモデリングすることができる。これらのプログラムはまた、Ｌａｍｍ方程式を、複数の溶質または複数の沈降境界を含む溶液に適用することもできる。
【００９４】
溶質の特徴を判定するのに好適なプログラムの一例は、ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムである。一部の実施形態において、ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムは、粒子種の混合物を含有する溶液からのＡＵＣデータを使用して、微分係数分布値、すなわちＣ（Ｓ）を計算するために使用することができる（参考文献については、Ｓｃｈｕｃｋ（２０００年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６〜１９頁を参照されたい）。ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムでは、予測範囲にわたり沈降係数の格子が作成される。各沈降係数についてＬａｍｍ方程式の解を使用して、沈降境界をシミュレーションするが、粒子形状および溶媒の摩擦比は一定と仮定する。実際のＡＵＣデータを、次いで、これらのＬａｍｍの解に当てはめて、微分係数分布値、すなわちＣ（Ｓ）が導かれる。ＡＵＣデータを分析するのに有用な多数の他のプログラムは、ＣｏｌｅおよびＨａｎｓｅｎ（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈ．１０：１６３〜７６頁に見出すことができる。
【００９５】
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、好適な宿主細胞において生成され、精製される。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。ＡＡＶ粒子を精製するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、クロマトグラフィー媒体に固定化したウイルスキャプシドタンパク質の抗体またはウイルスキャプシドタンパク質の結合リガンドを利用するものである。
【００９６】
一部の実施形態において、解析用沈降速度超遠心分離（ＳＶ−ＡＵＣ）分析は、生物学的に関連する溶液条件下において、サンプルをその天然の状態で特徴付けることができる解析用超遠心分離装置を使用して行われる（例えば、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＸＬ−Ｉ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））。ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＸＬ−１を使用する場合、サンプルは、セクターが２つある速度セルのうちのサンプルセクターに充填され、ビヒクル対照（例えば、組換えウイルスを含まないＰＢＳ）は、対応する参照セクターに充填される。サンプルを、４つ穴ロータに入れ、約２０℃の温度および完全な真空が維持されるまで、約１時間、機器において均衡させる。例示的な実施形態において、沈降速度遠心分離は、約２０，０００ＲＰＭ、約２０℃、および半径約０．００３ｃｍの段階の設定で、遅延なし、複製なしで行われる。以下に留意されるように、遠心分離には異なるパラメーターを使用してもよい。一部の実施形態において、吸光度（２６０ｎｍ）および／または干渉光学系（例えば、レイリー干渉光学系）を使用して、半径方向濃度を、最も小さい沈降成分が光学窓から見えなくなるまで、時間の関数として同時に記録する。一部の実施形態において、半径方向の濃度は、最も密度が低い沈降種がセクターからなくなるまで、記録される。一部の実施形態において、沈降は、最も低い密度を有する組換えウイルス粒子が、超遠心分離装置のセクターの底部に沈降するまで、監視される。セクターは、超遠心分離装置の一部、例えば、超遠心分離装置の速度セルであってもよい。一部の実施形態において、セクターは、サンプルが検出される超遠心分離装置の一部であってもよい。一部の実施形態において、超遠心分離法は、超遠心分離装置速度セルを備える超遠心分離装置を利用する。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子が超遠心分離装置の速度セルの底部に沈降するまで、監視される。一部の実施形態において、沈降は、最も密度が低い組換えウイルス粒子が沈降し、光学窓から見えなくなるまで、監視される。一部の実施形態において、半径方向濃度は、少なくとも、およそで、０．５時間、０．７５時間、１．０時間、１．５時間、２．０時間、３．０時間、４．０時間、または５．０時間のうちのいずれかの間、記録される。一部の実施形態において、半径方向濃度は、約１．２時間記録される。実行条件の最適化としては、例えば、沈降している種のすべてが完全にセクターの底部に沈降するまで、２０℃の一定に保った温度および１８，０００ｒｐｍ〜２０，０００ｒｐｍの速度で、実行を継続することが挙げられる。以下に留意されるように、その他の温度および速度を使用してもよい。
【００９７】
完全キャプシドパーセントは、ＳＥＤＦＩＴの連続サイズＣ（Ｓ）分布モデルを使用して、各検出法からの複数回のスキャン（例えば、７５回）を分析することによって決定される。二次導関数正則化を当てはめに適用する。一部の実施形態において、Ｆ統計量の信頼性レベルは、約０．６８である。一部の実施形態において、Ｆ統計量の信頼性レベルは、およそで、０．６８、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、もしくは０．９９のいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。一部の実施形態において、以下のＣ（Ｓ）パラメーターは一定に保たれる：分解能は約２００Ｓ〜約５０００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１Ｓ〜約１００Ｓであり、Ｓｍａｘは約１００Ｓ〜約５０００Ｓであり、摩擦比は約１．０であるか、または浮動して遠心分離ソフトウェアによって決定される値に委ねられる。一部の実施形態において、分解能は、およそで、２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓ、もしくは１０００Ｓのいずれか、またはこれらの間の任意の値である。一部の実施形態において、分解能は、約２００Ｓである。一部の実施形態において、Ｓｍａｘは、およそで、１００Ｓ、２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓ、もしくは１０００Ｓのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値である。一部の実施形態において、Ｓｍａｘは、約２００Ｓである。一部の実施形態において、摩擦比は、浮動して遠心分離ソフトウェアによって決定される値に委ねられる。一部の実施形態において、摩擦比は、約１．０である。一部の実施形態において、半径方向不変量（ＲＩ）および時間不変量（ＴＩ）のノイズ減算を適用する。一部の実施形態において、メニスカス位置の浮動を可能にし、ソフトウェアに最適な位置を選択させる。一部の実施形態において、摩擦比の浮動を可能にし、ソフトウェアに最適な位置を選択させる。モデルにより、データをＬａｍｍ方程式に当てはめ、結果として得られるサイズ分布は、各ピーク下の面積が縞単位またはＯＤ２６０単位の濃度に比例したクロマトグラムのような「沈降係数の分布」である。沈降係数（スベドベリ単位）および相対濃度（ＯＤ単位）を、分布内の各成分に関して判定する。一部の実施形態において、複数回のＡＵＣ実施は独立したアッセイであり、各分析において以下の属性を監視して、結果の品質を確保する：当てはめの良好さ（ｒｍｓｄ）、各ピークについての縞のＯＤ２６０ｎｍ／干渉シグナルの比（Ａ２６０／ＩＦ比）、実施間でのそれぞれの種の沈降係数の一貫性、およびスキャンの全体的な品質。
【００９８】
本発明の一部の実施形態において、消散係数を使用して、吸光度データから無傷なベクターピークのモル濃度および実際のパーセント値を計算する。空キャプシドのモル吸光度の消散係数（ε２６０／ｃａｐｓｉｄ＝３．７２ｅ６）および無傷なベクターのモル吸光度の消散係数（ε２６０／ｖｅｃｔｏｒ＝３．００ｅ７）のいずれも、公開済みの式に基づいて計算することができる（Ｓｏｍｍｅｒら（２００３年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，７：１２２〜８頁）。消散係数は、空キャプシドおよび無傷なベクターのピークに利用可能である。Ｃ（Ｓ）値は、Ｓｃｈｕｃｋ（２０００年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６〜１９頁に記載されているＳＥＤＦＩＴアルゴリズムを使用して決定することができる。無傷なベクターおよび空キャプシドの両方のモル濃度は、ベールの法則を使用して計算することができ、完全キャプシドの割合は、これらの値から計算される。一部の実施形態において、値は、完全キャプシドの割合に関して報告される。
【００９９】
一部の実施形態において、特定の種の組換えウイルス粒子（例えば、サイズおよび配列が未知のフラグメント化ゲノムを有するウイルス粒子）の消散係数を、経験的に決定することは不可能である。Ｓ値とゲノムサイズとの関係は、既知のヌクレオチドサイズのキャプシド化ウイルスゲノムを有する組換えウイルスベクター調製物を分析することによって確立することができ、対応するＳ値は、本明細書に記載されるように決定される。計算されたＳ値をプロットして標準曲線を生成することができ、これと、分子量またはゲノムサイズが未知の組換えウイルス種とを比較して、未知の種の分子量を決定することができる。
【０１００】
一部の態様において、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の調製物は、以下の工程を行うことによって特徴付けることができる：ａ）調製物を、境界沈降速度条件下において解析用超遠心分離法に供し、組換えウイルス粒子の沈降を時間間隔（例えば、１回またはそれ以上）で監視する工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベリ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（ｓ）分布における各ピーク下面積を積分して、各ピークの相対濃度を決定し、各ピークが、組換えウイルス粒子の種を表す工程。一部の実施形態において、特定される組換えウイルス粒子の種としては、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：無傷な組換えウイルスゲノムを含む完全組換えウイルス粒子、空組換えウイルスキャプシド粒子、および変化形組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子。一部の実施形態において、変化形ゲノムは、無傷な組換えウイルスゲノムよりも小さい（例えば、短縮型ゲノム）。一部の実施形態において、変化形ゲノムは、無傷な組換えウイルスゲノムよりも大きい（例えば、凝集体、組換え体など）。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の調製物は、以下の工程を行うことによって特徴付けられる：ａ）調製物を境界沈降速度条件下において解析用超遠心分離法に供し、組換えウイルス粒子の沈降を時間間隔（例えば、１回またはそれ以上）で監視する工程、ｂ）微分沈降係数分布値Ｃ（ｓ）をスベドベリ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）プロットにおけるＳ値に対応するピークの存在によって調製物中の組換えウイルス粒子の種を特定し、特定の種の組換えウイルス粒子のゲノムサイズが、その種のＳ値を、様々な既知のサイズのキャプシド化ウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子のＳ値によって生成された標準曲線と比較することによって計算される工程。一部の実施形態において、本方法は、さらに、Ｃ（Ｓ）分布における各ピーク下面積を積分して、それぞれの種の組換えウイルス粒子の相対濃度を決定する工程を含む。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降は、１つの時間間隔で監視される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降は、１つを上回る時間間隔で監視される。
【０１０１】
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の沈降は、光学密度または約２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって監視される。吸光度を測定する手段は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態において、ＡＵＣに使用される超遠心分離装置は、吸光度を測定するための手段を備える。他の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降は、干渉によって監視される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降は、レイリー干渉によって監視される。干渉を測定する手段は、当該技術分野で既知である（Ｆｕｒｓｔ（１９９７年）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３５：３０７〜１０頁）。一部の実施形態において、ＡＵＣに使用される超遠心分離装置は、干渉を測定するための手段を備える。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降は、吸光度および干渉の両方によって監視される。一部の実施形態において、吸光度および／または干渉は、参照標準を使用して測定される。一部の実施形態において、参照標準は、組換えウイルス調製物の溶液と一致するが、組換えウイルスが存在していない場合を除く。例えば、組換えウイルス調製物は、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液中の組換えウイルスを含み得る。この例では、参照標準は、組換えウイルス粒子を含まないリン酸緩衝食塩水であり得る。
【０１０２】
一部の実施形態において、超遠心分離中のウイルス粒子の沈降速度は、超遠心分離中に継続的にウイルス粒子の沈降を監視することによって測定される。異なる種類のウイルス粒子のＡＵＣのパラメーターを最適化することは、当業者の趣旨内である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のデータ取得は、約３，０００〜約２０，０００ｒｐｍのＡＵＣ速度で行われる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のデータ分析は、約１ＳのＳｍｉｎおよび約１０００ＳのＳｍａｘで行われる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のデータ分析は、約２００Ｓ〜約１，０００Ｓの分解能で行われる。一部の実施形態において、分解能は、およそで、２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓ、もしくは１０００Ｓのいずれか、またはこれらの間の任意の値である。一部の実施形態において、分解能は、約２００Ｓである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のデータ分析は、およそで、１００Ｓ、２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓ、もしくは１０００Ｓのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値のＳｍａｘで行われる。一部の実施形態において、Ｓｍａｘは、約２００Ｓ〜約５０００Ｓである。一部の実施形態において、Ｓｍａｘは、約２００Ｓである。一部の実施形態において、半径方向不変量（ＲＩ）および時間不変量（ＴＩ）のノイズ減算を適用する。一部の実施形態において、メニスカス位置の浮動を可能にし、ソフトウェアに最適な位置を選択させる。一部の実施形態において、摩擦比の浮動を可能にし、ソフトウェアに最適な位置を選択させる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のデータ分析は、１に一定に保たれる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のデータ分析は、ＦＩＴコマンドを、非線形回帰を使用して最適化した値で使用することによって、浮動にすることができる。
【０１０３】
組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）に関して、一部の実施形態において、超遠心分離中の組換えウイルスの沈降速度は、組換えウイルス粒子の沈降を、およそで、１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間（６０秒間）、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間を上回る毎に１回、監視（例えば、スキャン）することによって、判定される。スキャンは、光学系が許容できる限り迅速に、遅延することなく連続的に取得することができる。干渉のスキャンは、高速であり、１回のスキャンは、約１０〜１５秒以内に完了し、一方で、吸光度のスキャンは、約６０秒間かかる。二重検出が使用される場合、両方のスキャン取得速度は、吸光度系によって決定される。本発明の一部の実施形態において、およそで、５回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回、６５回、７０回、７５回、８０回、８５回、９０回、９５回、または１００回を上回るスキャンを使用して、超遠心分離中の組換えウイルス粒子の沈降を監視する。一部の実施形態において、分析には最低３０回のスキャンが必要であり、スキャンは、沈降プロセスが完了するまで収集される。一部の実施形態において、沈降プロセスは、典型的に、４０回〜７５回のスキャンによって表すことができる。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、約７５回のスキャンに基づいて決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、約５５回のスキャン〜約７５回のスキャンに基づいて決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、約５５回のスキャン〜約６０回のスキャンに基づいて決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、約６０回のスキャン〜約７５回のスキャンに基づいて決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、約６０回のスキャン〜約７０回のスキャンに基づいて決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、複数回の超遠心分離（実施）に基づいて決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の沈降速度は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の超遠心分離実施のうちのいずれかに基づいて、決定される。一部の実施形態において、沈降速度は、ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムを使用してＣ（Ｓ）値を決定するために使用される。一部の実施形態において、二次導関数正則化を、約０．６８のＦ統計量の信頼性レベルで当てはめレベルに適用する。一部の実施形態において、以下のＣ（Ｓ）パラメーターは一定に保たれる：分解能は１００Ｓ〜約２００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１であり、Ｓｍａｘは約２００Ｓ〜３００Ｓであり、摩擦比は約１．０〜１．２Ｓである。一部の実施形態において、半径方向不変量（ＲＩ）および時間不変量（ＴＩ）のノイズ減算を適用する。
【０１０４】
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子調製物中の組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の境界沈降速度は、組換えウイルス粒子の調製物を、およそで、５，０００ｒｐｍ；１０，０００ｒｐｍ；１５，０００ｒｐｍ；２０，０００ｒｐｍ；２５，０００ｒｐｍ；３０，０００ｒｐｍ；３５，０００ｒｐｍ；４０，０００ｒｐｍ；４５，０００ｒｐｍ；もしくは５０，０００ｒｐｍのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る値で超遠心分離することによって決定される。本発明の一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度は、組換えウイルス粒子の調製物を、約２０，０００ｒｐｍで超遠心分離することによって決定される。本発明の一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度は、組換えウイルス粒子の調製物を、約１５，０００ｒｐｍ〜約２０，０００ｒｐｍで超遠心分離することによって決定される。
【０１０５】
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度は、組換えウイルス粒子の調製物を、約４℃もしくはそれを上回る、約１０℃もしくはそれを上回る、約１５℃もしくはそれを上回る、約２０℃もしくはそれを上回る、約２５℃もしくはそれを上回る、または約３０℃もしくはそれを上回る温度で、またはこれらの間の任意の温度で超遠心分離することによって決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度は、組換えウイルス粒子の調製物を、約２０℃で超遠心分離することによって決定される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度は、組換えウイルス粒子の調製物を、約１５℃〜約２０℃で超遠心分離することによって決定される。
【０１０６】
発現が強化されたウイルス粒子
一部の態様において、本発明は、発現が強化された、オーバーサイズベクターゲノムを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株を使用してＡＡＶ粒子にパッケージングされた場合、細胞の一過性トランスフェクションによって調製されたＡＡＶ粒子と比較して強化された発現を呈する。一部の実施形態において、本発明は、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現を強化するための方法であって、産生細胞株にＡＡＶヘルパー機能を提供することによって、産生細胞株においてｒＡＡＶ粒子を産生させる工程を含み、産生細胞株は、ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびにｂ）約４．７ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現は、一過性トランスフェクションによって産生された場合のオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現よりも、約１．２５倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２．０倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３倍、約３．２５倍、約３．５倍、約３．７５倍、約４倍、約４．２５倍、約４．５倍、約４．７５倍、または約５倍多い。一部の実施形態において、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの強化された発現は、一過性トランスフェクションによって産生されるＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態と比較して速い発現動態である。一部の実施形態において、より速い発現動態とは、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を細胞に送達した後の、より速いオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現の経時的な増加である。一部の実施形態において、より速い発現動態とは、一過性トランスフェクションによって調製されたｒＡＡＶ粒子由来のオーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子の送達後のオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現レベルと比較して、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を細胞に送達した後の、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムの最大または安定な発現レベルに達するまでの時間がより速いことである。一部の実施形態において、産生細胞株によって産生されるオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態は、一過性トランスフェクションによって産生されるｒＡＡＶ粒子からのオーバーサイズｒＡＡＶゲノムの発現動態よりも、およそで、５％速い、１０％速い、１５％速い、２０％速い、２５％速い、３０％速い、３５％速い、４０％速い、４５％速い、５０％速い、５５％速い、６０％速い、６５％速い、７０％速い、７５％速い、８０％速い、８５％速い、９０％速い、９５％速い、または１００％速いのうちのいずれかである。一部の実施形態において、オーバーサイズベクターゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．���ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、もしくは９．４ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【０１０７】
異種導入遺伝子
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接した異種核酸（例えば、異種導入遺伝子）を含むオーバーサイズベクターゲノムを含む、組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子にキャプシド化されている。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶゲノムは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含有する。例えば、一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。ある特定の実施形態において、本開示のｒＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異種導入遺伝子を含有する。一部の実施形態において、ベクターゲノムは、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである。一部の実施形態において、ベクターゲノムは、約５ｋｂを上回る。一部の実施形態において、ベクターゲノムは、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、もしくは約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂ、またはこれらの間の任意の値である。一部の実施形態において、ベクターゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．３ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、もしくは９．４ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【０１０８】
一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、治療的導入遺伝子産物をコードする。一部の実施形態において、治療的導入遺伝子産物は、治療的ポリペプチドである。治療的ポリペプチドは、例えば、細胞または生物に存在しないかまたは低減されたレベルで存在するポリペプチドおよび／または酵素活性を提供することができる。代替として、治療的ポリペプチドは、細胞または生物における不均衡に間接的に対抗するポリペプチドおよび／または酵素活性を提供することができる。例えば、代謝酵素または代謝活性の欠如によって引き起こされる代謝産物の蓄積と関連する障害のための治療的ポリペプチドは、欠如している代謝酵素もしくは代謝活性を提供することができるか、または代謝産物の低減をもたらす代替的な代謝酵素もしくは代謝活性を提供することができる。治療的ポリペプチドはまた、例えば、ドミナントネガティブポリペプチドとして作用することによって、ポリペプチド（例えば、過剰発現するもの、機能獲得変異によって活性化されるもの、またはそうでなければ活性が誤制御されるもの）の活性を低減させるために使用することができる。
【０１０９】
一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子をコードする。一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、限定することなく、ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子によって発現される任意のコード配列を含む、ヒト第ＶＩＩＩ因子コード配列である。ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２１５７）は、ＡＨＦ、Ｆ８、Ｆ８Ｂ、Ｆ８Ｃ、ＨＥＭＡ、ＦＶＩＩＩ、およびＤＸＳ１２５３Ｅとしても知られている。一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を有する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５２４８４によって表される）。第ＶＩＩＩ因子をコードする異種導入遺伝子は、例えば、第ＶＩＩＩ因子の欠損と関連する劣性Ｘ連鎖型凝固障害である血友病Ａを患う個体において第ＶＩＩＩ因子を発現させるために使用することができる。第ＶＩＩＩ因子は、内在性血液凝固経路の一部として血液凝固に関与することが既知であり、通常、肝臓類洞細胞および全身の内皮細胞によって発現される。
【０１１０】
一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ジストロフィンをコードする。一部の実施形態において、ジストロフィンは、限定することなく、ヒトジストロフィン遺伝子によって発現される任意のコード配列を含む、ヒトジストロフィンコード配列である。ヒトジストロフィン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １７５６）はまた、ＤＭＤ、ＢＭＤ、ＣＭＤ３Ｂ、ＭＲＸ８５、ＤＸＳ１４２、ＤＸＳ１６４、ＤＸＳ２０６、ＤＸＳ２３０、ＤＸＳ２３９、ＤＸＳ２６８、ＤＸＳ２６９、ＤＸＳ２７０、およびＤＸＳ２７２としても知られている。一部の実施形態において、ジストロフィンは、ヒトジストロフィンのアミノ酸配列を有する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５３１８９によって表される）。ジストロフィンをコードする異種導入遺伝子は、例えば、ジストロフィンにおける変異と関連する劣性Ｘ連鎖型筋ジストロフィーであるＤｕｃｈｅｎｎｅ型またはＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーを患う個体においてジストロフィンを発現させるために、使用することができる。Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィーは、ジストロフィンにおける機能喪失型変異によって引き起こされる重症度の低い障害であり、一方、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーは、ジストロフィンにおける重症度の高い機能喪失型変異または無発現型変異（例えば、ナンセンス変異またはフレームシフト変異）と関連している。ジストロフィンは、ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）において機能することが知られており、これは、筋細胞のＦアクチンを細胞外マトリックスに結合させ、それによって、筋収縮および筋弛緩中に筋線維鞘を安定化させるのに必要である。
【０１１１】
一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードし、これは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー７としても知られている。一部の実施形態において、ＣＦＴＲは、限定することなく、ヒトＣＦＴＲ遺伝子によって発現される任意のコード配列を含む、ヒトＣＦＴＲコード配列である。ヒトＣＦＴＲ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １０８０）はまた、ＣＦ、ＭＲＰ７、ＡＢＣ３５、ＡＢＣＣ７、ＣＦＴＲ／ＭＲＰ、ＴＮＲ−ＣＦＴＲ、またはｄｊ７６０Ｃ５．１としても知られている。一部の実施形態において、ＣＦＴＲは、ヒトＣＦＴＲのアミノ酸配列を有する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４８３として表される）。ＣＦＴＲをコードする異種導入遺伝子は、例えば、肺、膵臓、腸、および多数の他の器官を冒す、ＣＦＴＲにおける変異と関連する常染色体劣性障害である嚢胞性線維症を患う個体においてＣＦＴＲを発現させるために使用することができる。ＣＦＴＲは、Ｃｌ−イオン輸送に関与するＡＴＰ開口型イオンチャネルとして機能することが知られている。十分なＣＦＴＲ機能がないことにより、複数の病理が生じるが、その一例としては、上皮細胞を越えるイオン輸送が破壊され、細胞の水分吸収が増加し、肺および他の組織において粘液の病的粘度増加および蓄積がもたらされることである。
【０１１２】
一部の実施形態において、治療的導入遺伝子産物は、治療的核酸である。一部の実施形態において、治療的核酸としては、限定することなく、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、またはＤＮＡザイムを挙げることができる。このように、治療的核酸は、ベクターの核酸から転写されると、障害と関連する異常または過剰なタンパク質の翻訳または転写に干渉することによって障害を治療することができる、ＲＮＡをコードし得る。例えば、異種導入遺伝子は、異常および／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的な排除または低減によって障害を治療する、ＲＮＡをコードする。治療的ＲＮＡ配列としては、異常および／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的な排除または低減によって障害を治療することができる、ＲＮＡｉ、小型阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはリボザイム（ハンマーヘッド型およびヘアピン型リボザイム）が挙げられる。
【０１１３】
一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。一部の実施形態において、異種導入遺伝子は、プロモーターに連結されている。一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される異種核酸）は、プロモーターに作動可能に連結されている。例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／トリベータアクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター、Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１年、１０８（２）：１９３〜９頁）および伸長因子１−アルファプロモーター（ＥＦｌ−アルファ）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０年、９１（２）：２１７〜２３およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９６年、３（９）：８０２〜１０頁）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、プロモーターは、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、またはトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されているサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または抑制性プロモーターであり得る。一部の実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチンプロモーターである。
【０１１４】
構成的プロモーターの例としては、限定することなく、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によっては、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によっては、ＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ，４１：５２１〜５３０頁（１９８５年））、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、１３アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌａプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【０１１５】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、外来的に供給される化合物、温度などの環境要因、または特定の生理学的状態の存在によって、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、もしくは複製細胞のみにおいて、制御することができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、限定することなく、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含む、様々な商業的供給源から入手することができる。多数の他の系も説明されており、当業者によって容易に選択することができる。外来的に供給されるプロモーターによって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１頁（１９９６年））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１頁（１９９２年））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６〜１７６９頁（１９９５年）、またＨａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２〜５１８頁（１９９８年）を参照されたい）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９〜２４３頁（１９９７年）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２〜４４１頁（１９９７年））、およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５〜２８７２頁（１９９７年））が挙げられる。この文脈において有用であり得る誘導性プロモーターのさらなる他の種類は、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて制御されるものである。
【０１１６】
別の実施形態において、導入遺伝子の天然のプロモーターまたはそのフラグメントが、使用される。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが所望される場合には、天然のプロモーターが好ましい場合がある。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現を、一時的もしくは発生的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して、制御しなければならい場合に、使用することができる。さらなる実施形態において、他の天然の発現制御エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはＫｏｚａｋコンセンサス配列もまた、天然の発現を模倣するために使用することができる。
【０１１７】
一部の実施形態において、制御配列は、組織特異的遺伝子発現能力を与える。一部の事例において、組織特異的制御配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。例えば、肝臓、肺、筋肉、腸、膵臓、および／または他の組織における組織特異的発現が、所望される場合がある。適切な組織特異的制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当該技術分野で周知である。例えば、一部の実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターであり、これは、肝臓における遺伝子発現を作動させることが知られている。
【０１１８】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、イントロンを含む。一部の実施形態において、イントロンは、ハイブリッドイントロンである。
【０１１９】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む。多数のポリアデニル化シグナルが、当該技術分野で既知である。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、合成ポリアデニル化シグナルである。他の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。ＢＧＨポリアデニル化シグナルのより詳細な説明については、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｅ．Ｃ．およびＲｏｔｔｍａｎ，Ｆ．Ｍ．（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３３０〜１６３３４頁を参照されたい。
【０１２０】
一部の実施形態において、本発明は、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子であって、ＡＡＶゲノムが、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲ２０２プロモーター、ハイブリッドイントロン、Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子、合成ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、ＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、オーバーサイズＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲ２０２ｏｐｔプロモーター、ハイブリッドイントロン、Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子、合成ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、オーバーサイズＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ハイブリッドイントロン、Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子、合成ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、オーバーサイズＡＡＶゲノムは、５’から３’に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ハイブリッドイントロン、Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。
【０１２１】
上述のｒＡＡＶゲノムのエレメント（例えば、プロモーター、イントロン、およびポリアデニル化シグナル）は、単独で存在してもよく、または本開示の異種導入遺伝子との任意の組合せで存在してもよい。ｒＡＡＶゲノムは、異種導入遺伝子の発現を確立させるための任意のエレメント、例えば、プロモーター、異種核酸、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、終結因子、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル、および／または複製起点を含み得る。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、異種導入遺伝子、ならびに本開示のプロモーター、本開示のイントロン、および本開示のポリアデニル化シグナルから選択される１つまたはそれ以上のエレメントを含有する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、異種導入遺伝子、ならびに本開示のプロモーター、本開示のイントロン、および本開示のポリアデニル化シグナルから選択される１つまたはそれ以上のエレメントに隣接した、少なくとも１つのＩＴＲ配列を含み得る。
【０１２２】
一部の実施形態において、オーバーサイズｒＡＡＶベクターは、自己相補的ｒＡＡＶベクター、例えば、組換え自己相補性（「自己相補的」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる）ゲノムを含むものである。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子、および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；同第７，４６５，５８３号；同第７，７８５，８８８号；同第７，７９０，１５４号；同第７，８４６，７２９号；同第８，０９３，０５４号；および同第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ  Ｚ．ら（２００３年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：２１０５〜２１１１頁に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補性の配列（例えば、導入遺伝子の相補性コード鎖および非コード鎖）に基づき、二本鎖ＤＮＡ分子を急速に形成する。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列、およびこの核酸の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）をコードする第２の核酸配列を含み、ここで、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸と鎖内塩基対を形成することができる。
【０１２３】
一部の実施形態において、第１の異種核酸配列および第２の異種核酸配列は、変異型ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結されている。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２４）を含む。変異型ＩＴＲは、末端分離配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを変異型ＩＴＲにおいて切断せず、そのため、５’から３’の順に次のものを含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスキャプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ  ＩＴＲ、制御配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、変異型ＡＡＶ  ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドとは逆の配向の第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ  ＩＴＲ。一部の実施形態において、ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、もしくは７．０ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【０１２４】
ＩＶ．ウイルス粒子を産生する方法
本開示のある特定の態様は、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含有するＡＡＶ粒子を産生するための方法に関する。一部の実施形態において、本方法は、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成するような条件下において、ｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびにｉｉ）約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂであるｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ産生細胞株を培養する工程と；ｂ）ＡＡＶヘルパー機能を提供する工程と；ｃ）オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含有するｒＡＡＶ粒子を回収する工程とを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする安定に維持されている核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである安定に維持されているｒＡＡＶゲノムを含んでいた。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする安定に維持されている核酸、ならびに約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである安定に維持されているｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする、細胞株ゲノムに安定に組み込まれている核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである、細胞株ゲノムに安定に組み込まれているｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびに約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂである、細胞株ゲノムに安定に組み込まれているｒＡＡＶゲノムを含む。上述の実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．３ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、もしくは９．４ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、５’末端の短縮を含んでいなかった。一部の実施形態において、パッケージングされたＡＡＶゲノムは、３’末端の短縮を含んでいなかった。
【０１２５】
本開示の他の態様は、オーバーサイズ組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含むＡＡＶ粒子を産生するための細胞株であって、ａ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸と、ｂ）約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜６．７ｋｂであるｒＡＡＶゲノムとを含む、細胞株に関する。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする安定に維持されている核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜約６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、安定に維持されているｒＡＡＶゲノムを含んでいた。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする安定に維持されている核酸、ならびに約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜約６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである安定に維持されているｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする、細胞株ゲノムに安定に組み込まれている核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜約６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、細胞株ゲノムに安定に組み込まれているｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ産生細胞株は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸、ならびに約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜約６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂである、細胞株ゲノムに安定に組み込まれているｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．３ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、もしくは９．４ｋｂのうちのいずれか、またはこれらの間の任意の値を上回る。
【０１２６】
トランスフェクション、安定な細胞株産生、ならびにアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら（１９９７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（１１）：８７８０〜８７８９頁）、およびバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む、ｒＡＡＶベクターの産生のための多数の方法が、当該技術分野で既知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養物はすべてが；１）好適な宿主細胞、２）好適なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列（例えば、オーバーサイズｒＡＡＶベクターゲノム）が隣接した核酸（治療的核酸など）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を補助するのに好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態において、好適な宿主細胞は、霊長類宿主細胞である。一部の実施形態において、好適な宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、２９３細胞、またはＰｅｒｃ．６細胞などのヒト由来細胞株である。一部の実施形態において、好適なヘルパーウイルス機能は、野生型または変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物は、任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。強制ではないが、一般には、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物がｒＡＡＶゲノムを複製し、パッケージングするように機能し得る限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型のものである。当該技術分野で既知の好適な培地を、ｒＡＡＶベクターの産生に使用することができる。これらの培地としては、限定することなく、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨ製の培地、例えば、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、米国特許第６，５６６，１１８号に記載のものなどの特注の配合物、および米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地が挙げられ、これらの文献のそれぞれは、特に、組換えＡＡＶベクターの産生において使用するための特注の培地配合物に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞）である。
【０１２７】
ｒＡＡＶ粒子を産生するための１つの方法は、トリプルトランスフェクション法である。簡単に述べると、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドとともに、細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）にトランスフェクトしてもよく（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）、ウイルスを、回収し、場合によっては精製してもよい。このように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、宿主細胞への、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸のトリプルトランスフェクションによって産生したが、この場合、宿主細胞への核酸のトランスフェクションにより、ｒＡＡＶ粒子を産生することができる宿主細胞が生成される。
【０１２８】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下に提供される例示的な産生細胞株法などの産生細胞株法によって産生することができる（Ｍａｒｔｉｎら（２０１３年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：２５３〜２６９頁；米国付与前公開第２００４／０２２４４１１号；およびＬｉｕ，Ｘ．Ｌ．ら（１９９９年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：２９３〜２９９頁も参照されたい）。簡単に述べると、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株、２９３細胞株、Ａ５４９細胞株、またはＰｅｒｃ．６細胞株）に、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター−異種核酸配列を含むオーバーサイズゲノムを含有するプラスミドを安定にトランスフェクトすることができる。細胞株をスクリーニングして、ｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択し、これを、次いで、産生バイオリアクターに展開し、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶ）を感染させて、ｒＡＡＶ産生を開始させることができる。続いて、ウイルスを採取してもよく、アデノウイルスを不活性化（例えば、熱により）および／または除去してもよく、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。このように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸のうちの１つまたはそれ以上を含む、産生細胞株によって産生させた。本明細書に記載されるように、産生細胞株法は、トリプルトランスフェクション法と比較して、オーバーサイズゲノムを有するｒＡＡＶ粒子の産生に有利であり得る。
【０１２９】
一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株において安定に維持されている。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸を、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入して、産生細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドが安定にトランスフェクトされている細胞株は、複数回の細胞株継代（例えば、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、または５０回を上回る細胞の継代）にわたり、プラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞複製物として複製されるか、またはプラスミドは、細胞ゲノムに組み込まれる。プラスミドが細胞（例えば、ヒト細胞）において自律的に複製するのを可能にする様々な配列が、特定されている（例えば、Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８９年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１０２６〜１０３３頁を参照されたい）。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする、選択的マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有し得る。哺乳動物細胞において一般的に使用される選択的マーカーとしては、限定することなく、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ｚｅｏｃｉｎ、ピューロマイシン、およびこれらの誘導体が挙げられる。核酸を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で既知であり、これらには、限定することなく、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランなどのカチオン性ポリマーまたはリポフェクタミンなどのカチオン性脂質を使用する）、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロ注入、微粒子銃、電気泳動、ならびにナノ粒子トランスフェクションが挙げられる（さらなる詳細については、例えば、Ｋｉｍ，Ｔ．Ｋ．およびＥｂｅｒｗｉｎｅ，Ｊ．Ｈ．（２０１０年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９７：３１７３〜３１７８頁を参照されたい）。
【０１３０】
一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸ならびに／またはｒＡＡＶゲノムは、産生細胞株のゲノムに安定に組み込まれている。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸を、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入して、産生細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする、選択的マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有し得る。様々な宿主細胞株に核酸を安定に組み込むための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、核酸の安定な組込みによって作製される例示的な産生細胞株のより詳細な説明については、以下の実施例を参照されたい）。例えば、反復選択（例えば、選択的マーカーの使用を通じて）を、選択的マーカーを含有する核酸（ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノム）が組み込まれている細胞を選択するために使用してもよい。他の実施形態において、核酸が、部位特異的方式で細胞株に組み込まれて、産生細胞株が生成される。ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１〜１３５５頁）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６〜５１７０頁）、ならびにｐｈｉ  Ｃ３１−ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ．ら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５〜６０００頁を参照されたい）など、いくつかの部位特異的組換え系が、当該技術分野で既知である。
【０１３１】
一部の実施形態において、産生細胞株は、霊長類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株またはＦＲｈＬ−２細胞株などの非ヒト霊長類細胞株）に由来する。一部の実施形態において、細胞株は、ヒト細胞株に由来する。一部の実施形態において、産生細胞株は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞に由来する。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびに／またはオーバーサイズｒＡＡＶゲノムをコードする核酸を細胞株に導入ならびに／または安定に維持／組み込んで産生細胞株を生成する前、細胞株は、ＨｅＬａ細胞株、２９３細胞株、Ａ５４９細胞株、もしくはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞株、またはこれらの誘導体である。
【０１３２】
一部の実施形態において、産生細胞株は、懸濁液での増殖に適合されている。当該技術分野で既知のように、足場依存性細胞は、典型的に、マイクロ担体ビーズなどの基質なしに懸濁液で増殖することができない。細胞株を、懸濁液での増殖に適合させることには、例えば、撹拌パドルを使用してかき混ぜ培養で細胞株を増殖させること、集塊化を防止するためにカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まない培養培地（および場合によっては消泡剤）を使用すること、ケイ化化合物でコーティングした培養容器を使用すること、ならびに各継代で培養物中（大きな集塊物中または容器の側面ではなく）の細胞を選択することが含まれる。さらなる説明については、例えば、ＡＴＣＣのよくある質問文書（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｇｌｏｂａｌ／ＦＡＱｓ／９／１／Ａｄａｐｔｉｎｇ％２０ａ％２０ｍｏｎｏｌａｙｅｒ％２０ｃｅｌｌ％２０ｌｉｎｅ％２０ｔｏ％２０ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−４０．ａｓｐｘで入手可能）およびそこの引例を参照されたい。
【０１３３】
一部の態様において、本明細書に開示される任意のｒＡＡＶ粒子を産生するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が産生される条件下で、（ｉ）それぞれがＡＡＶ複製タンパク質および／またはキャプシド化タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲが隣接した、本明細書に記載される異種核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクター、ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能を含む、宿主細胞を培養する工程と；（ｂ）宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶ粒子を回収する工程とを含む方法が、提供される。一部の実施形態において、この少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲなどからなる群から選択される。例えば、一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶの核酸は、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、このキャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ２  Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２  Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２  Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ  Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、もしくはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドタンパク質、またはこれらの変異体からなる群から選択される。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、チロシンキャプシド変異を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質である。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、チロシンキャプシド変異を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質であり、ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドまたはその変異体を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ならびにＡＡＶ２  ＩＴＲ、変異体ＡＡＶ２  ＩＴＲを含む組換えゲノム、および治療的導入遺伝子／核酸をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ  ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し、キャプシドは、ＡＡＶ２に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し、キャプシドは、ＡＡＶｒｈ８Ｒに由来する。
【０１３４】
本発明の好適なｒＡＡＶ産生培養培地には、血清または血清由来の組換えタンパク質が０．５％〜２０％（体積／体積または重量／体積）のレベルで補充される。あるいは、当該技術分野で既知のように、ｒＡＡＶベクターは、血清不含条件において産生することができ、これは、動物由来産物不含培地とも称することができる。当業者であれば、ｒＡＡＶベクターの産生を補助するように設計された市販または特注の培地にはまた、産生培養物におけるｒＡＡＶの力価を増加させるために、限定することなくグルコース、ビタミン類、アミノ酸、および／または成長因子を含む、当該技術分野で既知の１つまたはそれ以上の細胞培養成分が補充されることを、理解することができる。
【０１３５】
ｒＡＡＶ産生培養物は、特定の宿主細胞を利用するのに好適な様々な条件下（広い温度範囲にわたって、様々な長さの時間など）において増殖させることができる。当該技術分野で既知のように、ｒＡＡＶ産生培養物は、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロ担体、および充填床もしくは流動床バイオリアクターなどの好適な付着依存性容器で培養することができる、付着依存性培養物を含む。ｒＡＡＶベクター産生培養物はまた、例えば、かき混ぜフラスコ、撹拌槽バイオリアクター、およびＷａｖｅバッグ系などの使い捨て系を含む様々な手段で培養することができる、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＳＦ−９細胞などの懸濁液適合宿主細胞も含み得る。
【０１３６】
本開示のある特定の態様は、オーバーサイズｒＡＡＶゲノムを含有するｒＡＡＶ粒子を回収する工程に関する。本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、産生培養物の宿主細胞の溶解によって、または産生培養物からの使用済み培養物の回収によって、ｒＡＡＶ産生培養物から回収することができるが、ただし、米国特許第６，５６６，１１８号により詳細に記載されているように、細胞を、無傷な細胞から培地中にｒＡＡＶ粒子を放出させるような当該技術分野で既知の条件下で培養することを条件とする。細胞を溶解させる好適な方法はまた、当該技術分野で既知であり、例えば、複数回の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流体化、ならびに界面活性剤および／またはプロテアーゼなどの化学物質での処理を含む。
【０１３７】
一部の実施形態において、回収されたＡＡＶ粒子は、約５．０ｋｂを上回るｒＡＡＶゲノムを含有している。一部の実施形態において、回収されたｒＡＡＶ粒子は、長さが、およそで、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、もしくは７．０ｋｂ、８．０ｋｂ、もしくは９．０ｋｂ、またはこれらの間の任意の値を上回る、ｒＡＡゲノムを含有する。一部の実施形態において、回収されたｒＡＡＶ粒子は、約５．０ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約８．０ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約７．５ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約７．０ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約６．５ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約６．０ｋｂ、約５．０ｋｂ〜約５．５ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約８．０ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約７．５ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約７．０ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約６．５ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約６．０ｋｂ、約５．２ｋｂ〜約５．５ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約８．０ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約７．５ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約７．０ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約６．５ｋｂ、約５．５ｋｂ〜約６．０ｋｂ、約６．０ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約６．０ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約６．０ｋｂ〜約８．０ｋｂ、約６．０ｋｂ〜約７．５ｋｂ、約６．０ｋｂ〜約７．０ｋｂ、約６．０ｋｂ〜約６．５ｋｂ、約６．５ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約６．５ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約６．５ｋｂ〜約７．５ｋｂ、約６．５ｋｂ〜約７．０ｋｂ、約７．０ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約７．０ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約７．０ｋｂ〜約８．０ｋｂ、約７．０ｋｂ〜約７．５ｋｂ、約７．５ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約７．５ｋｂ〜約８．５ｋｂ、約７．５ｋｂ〜約８．０ｋｂ、約８．０ｋｂ〜約９．０ｋｂ、約８．０ｋｂ〜約８．５ｋｂ、または約８．５ｋｂ〜約９．０ｋｂのうちのいずれかのｒＡＡＶゲノムを含有する。一部の実施形態において、回収されたｒＡＡＶ粒子は、約４．７ｋｂ〜約９．４ｋｂ、場合によっては約４．７ｋｂ〜約６．７ｋｂまたは約５．２ｋｂ〜約８．７ｋｂのｒＡＡＶゲノムを含有する。
【０１３８】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間で回収される。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、または約９６時間で回収される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘルパー機能の提供後、約４８時間〜約９６時間、約４８時間〜約８４時間、約４８時間〜約７２時間、約４８時間〜約６０時間、約６０時間〜約９６時間、約６０時間〜約８４時間、約６０時間〜約７２時間、約７２時間〜約９６時間、約７２時間〜約８４時間、または約８４時間〜約９６時間で回収される。
【０１３９】
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、精製される。本明細書に使用される「精製された」という用語は、ｒＡＡＶ粒子が天然に生じるか場合または最初に調製される場合に存在する可能性のある他の成分のうちの少なくともいくつかを含まない、ｒＡＡＶ粒子の調製物を含意する。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、それを富化するように精製技法を使用して、培養溶解物または産生培養上清などの原料混合物から調製することができる。富化は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率によって、または感染力によってなど、様々な手段で測定することができるか、あるいは、富化は、原料混合物中に存在する第２の潜在的な干渉物質、例えば、産生培養混入物質またはプロセス内混入物質を含む混入物質、例えば、ヘルパーウイルス、培地成分などに関連して測定することもできる。
【０１４０】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養採取物は、宿主細胞片を取り除くために、浄化される。一部の実施形態において、産生培養採取物は、例えば、グレードＤＯＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋  ＨＣ  Ｐｏｄ  Ｆｉｌｔｅｒ、グレードＡ１ＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋  ＨＣ  Ｐｏｄ  Ｆｉｌｔｅｒ、および０．２μｍのＦｉｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ１Ｏ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅフィルターを含む、一連のデプスフィルターを通じた濾過によって、浄化される。浄化は、遠心分離または当該技術分野で既知の細孔サイズが０．２μｍもしくはそれ以上の任意の酢酸セルロースフィルターを通した濾過など、当該技術分野で既知の様々な他の標準的な技法によって達成することもできる。
【０１４１】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養採取物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するために、さらに、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理される。一部の実施形態において、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば、３０分間〜数時間の期間、周囲温度から３７℃範囲の温度における最終濃度１〜２．５単位／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含む、当該技術分野で既知の標準的な条件下において行われる。
【０１４２】
ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程のうちの１つまたはそれ以上を使用して、単離または精製することができる：平衡遠心分離；フロースルーアニオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェント流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；ならびにアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。一部の実施形態において、精製は、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー工程（例えば、上述のクロマトグラフィー工程のうちの１つまたはそれ以上）を含む。これらの工程は、単独、様々な組合せ、または異なる順序で、使用することができる。一部の実施形態において、本方法は、以下に記載される順序ですべての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Ｘｉａｏら（１９９８年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：２２２４〜２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびにＷＯ２０１０／１４８１４３に見出される。
【０１４３】
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、医薬組成物中にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物中にある。当該技術分野で周知のように、医薬上許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質であり、液体の溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体中に溶解もしくは懸濁するのに好適な固体形態として、提供することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度をもたらすか、または希釈剤として作用し得る。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、オスモル濃度を変化させるための塩、封入剤、ｐＨ緩衝物質、ならびに緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。このような賦形剤は、過度の毒性を伴わずに投与することができる、標的組織への送達に好適な任意の医薬用薬剤を含む。医薬上許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のうちのいずれか、ならびに水、生理食塩水、グリセリン、およびエタノールなどの液体が挙げられるがこれらに限定されない。医薬上許容される塩、例えば、塩酸酸、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などといった鉱酸塩；ならびに酢酸、プロピオン酸、マロン酸、安息香酸などの有機酸の塩が、中に含まれる。医薬上許容される賦形剤の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１年）で入手可能である。
【０１４４】
このような医薬上許容される担体は、水および油など、例えば、石油、動物、植物、もしくは合成起源のもの、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油などといった、滅菌液体であってもよい。生理食塩水、ならびにデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）水溶液、およびグリセリン水溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。医薬組成物は、追加の成分、例えば、保存剤、緩衝液、等張剤、抗酸化剤および安定化剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含んでもよい。本明細書に記載される医薬組成物は、単回単位剤形または複数回剤形でパッケージングすることができる。本組成物は、一般に、滅菌または実質的に等張性の溶液として製剤化される。
【０１４５】
Ｖ．治療の方法
一部の態様において、本発明は、疾患または障害の治療を、それを必要とする個体において行う方法であって、個体に、ＡＡＶ粒子を投与する工程を含む方法を提供する。ＡＡＶ粒子は、特定の目的組織に投与してもよく、または全身に投与してもよい。一部の実施形態において、有効量のＡＡＶ粒子は、非経口投与される。非経口の投与経路としては、限定することなく、静脈内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内などを挙げることができる。一部の実施形態において、有効量のＡＡＶ粒子は、１つの投与経路を通じて投与してもよい。一部の実施形態において、有効量のＡＡＶ粒子は、１つを上回る投与経路の組合せを通じて投与してもよい。一部の実施形態において、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態において、個体は、ヒトである。
【０１４６】
オーバーサイズＡＡＶゲノムを含む有効量のＡＡＶ粒子は、治療の目的に応じて、投与される。例えば、低い割合の形質導入により、所望される治療効果を達成することができる場合、治療の目的は、概して、このレベルの形質導入を満たすか、それを上回ることである。一部の事例において、このレベルの形質導入は、所望される組織型の標的細胞のうちの約１〜５％のみの形質導入、一部の実施形態では所望される組織型の細胞のうちの少なくとも約２０％、一部の実施形態では所望される組織型の細胞のうちの少なくとも約５０％、一部の実施形態では所望される組織型の細胞のうちの少なくとも約８０％、一部の実施形態では所望される組織型の細胞のうちの少なくとも約９５％、一部の実施形態では所望される組織型の細胞のうちの少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。指標として、１回の注入で投与される粒子の数は、概して、約１×１０６〜約１×１０１４個の粒子、約１×１０７〜１×１０１３個の粒子、約１×１０９〜１×１０１２個の粒子、または約１×１０９個の粒子、約１×１０１０個の粒子、または約１×１０１１個の粒子である。ｒＡＡＶ組成物は、同じ治療の間に、または数日間、数週間、数カ月間、もしくは数年間の間を空けてのいずれかで、１回またはそれ以上の投与で投与してもよい。本明細書に記載される投与経路のうちのいずれかの１つまたはそれ以上を使用することができる。一部の実施形態において、ヒトを治療するために、複数のベクターを使用してもよい。
【０１４７】
ＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された細胞を特定するための方法は、当該技術分野で既知であり；例えば、免疫組織化学もしくは高感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を、ウイルス粒子；例えば、アミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶキャプシドを含むウイルス粒子の形質導入を検出するために用いてもよい。
【０１４８】
一部の実施形態において、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子は、１つを上回る位置に、同時または逐次的に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、または２４時間以下で間が空いている。
【０１４９】
一部の実施形態において、本発明は、個体における疾患または障害の治療の方法であって、オーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を投与する工程を含み、オーバーサイズＡＡＶゲノムは、疾患または障害の治療に好適な導入遺伝子を含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、血友病Ａを、第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子）をコードするオーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子で治療するための方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、筋ジストロフィーを、ジストロフィン導入遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン導入遺伝子）をコードするオーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子で治療するための方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ジスフェリン異常症を、ジスフェリン導入遺伝子（例えば、ヒトジスフェリン導入遺伝子）をコードするオーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子で治療するための方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、嚢胞性線維症を、ＣＦＴＲ導入遺伝子（例えば、ヒトＣＦＴＲ導入遺伝子）をコードするオーバーサイズＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子で治療するための方法を提供する。本発明は、しかしながら、４．８ｋｂのＡＡＶベクターゲノムに適合するものを上回る導入遺伝子の発現を必要とする疾患または障害に限定されない。例えば、一部の実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上の異種導入遺伝子を含むＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子であって、異種導入遺伝子と制御因子（プロモーター、エンハンサー、イントロンなど）との組み合わせが、結果として約５．０ｋｂを上回るＡＡＶゲノムをもたらす、ＡＡＶ粒子を提供する。
【０１５０】
ＶＩ．キット
一部の実施形態において、本発明は、本発明のオーバーサイズゲノムを含むＡＡＶ粒子を含む、キットを含む。一部の実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物の送達（例えば、非経口投与）のためのデバイスをさらに含む。一部の実施形態において、使用のための指示書には、本明細書に記載されている方法のうちの１つによる指示書が含まれる。一部の実施形態において、指示書は、容器に提供される（例えば、貼り付けられる）ラベルに印刷されている。一部の実施形態において、使用のための指示書には、疾患または障害の治療のための指示書が含まれる。
【０１５１】
一部の実施形態において、キットは、単一の流体（例えば、有効量のベクターを含む医薬上許容される流体）を含む。一部の実施形態において、キットは、２つ以上の流体を含む。流体としては、希釈剤、緩衝液、賦形剤、または本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野で既知の本開示のＡＡＶ粒子の送達、希釈、安定化、緩衝化、もしくはそれ以外では輸送に好適な任意の他の液体を挙げることができる。一部の実施形態において、系は、１つまたはそれ以上の緩衝液、例えば、ｐＨ緩衝水溶液を含む。緩衝液の例としては、限定することなく、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、および任意の他の有機酸緩衝液を挙げることができる。
【０１５２】
一部の実施形態において、キットは、容器を含む。好適な容器としては、例えば、バイアル、バッグ、シリンジ、およびボトルを挙げることができる。容器は、ガラス、金属、またはプラスチックなど、１種類またはそれ以上の物質でできていてもよい。一部の実施形態において、容器は、本開示のｒＡＡＶ組成物を保持するために使用される。一部の実施形態において、容器は、流体および／または他の治療剤も保持し得る。
【実施例】
【０１５３】
本発明は、以下の実施例に言及することでより十分に理解されるであろう。しかしこれらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は例示のためだけのものであり、その観点から当業者は各種改変または変更を思いつくものであり、各種改変または変更が、本出願の意図および趣旨ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【実施例１】
【０１５４】
５．１ｋｂおよび５．４ｋｂのオーバーサイズＦＶＩＩＩベクターを有する産生細胞株の生成
先に論じられたように、収量が大きく、産物が均一でゲノムの質が高い、オーバーサイズのゲノムを有するｒＡＡＶベクターを産生することができるプラットフォームが必要とされている。本実施例では、大きい構築物（例えば５ｋｂ超）を含むゲノムを有するｒＡＡＶベクターを産生するのに特に有利な、産生細胞株（ＰＣＬ）プラットフォームの生成について記載する。
【０１５５】
方法
５．１および５．４ｋｂのオーバーサイズＦＶＩＩＩベクター用のｐＴＰプラスミドの構築
ＦＶＩＩＩ発現カセットを、ｐＵＣ５７ベースのプラスミドにおいて生成させた。ＦＶＩＩＩ発現カセットは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（Ｃｏｓｔａ，ＲＨら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８６、６：４６９７〜４７０８頁）（１００ｂｐエンハンサー配列有りおよび無しの２０２ｂｐコア配列）、ハイブリッドイントロン（Ｊｉａｎｇ，Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ２００６  １０８：１０７〜１１５頁）、コドン最適化されたヒトＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩｃＤＮＡ、合成またはＢＧＨポリＡ、およびｒＡＡＶ２逆位末端反復配列からなるものであった。これらは、５．１〜５．４ｋｂの範囲のベクターゲノムサイズを有するｒＡＡＶベクターを生成した（図１Ａ）。
【０１５６】
ＦＶＩＩＩ発現カセットを有するプラスミドベクターを、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに大量注射することにより、インビボでのＦＶＩＩＩ産生について試験した。ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクター用の産生細胞株（ＰＣＬ）を生成するため、ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミド、ｐＡＦＴＧＥＮ−ＳＥＡＰ−ｃａｐｒｈ８ＲをＢｇｌＩＩで消化し、平滑末端化させた。隣接する５’および３’ＡＡＶ２  ＩＴＲを有するＦＶＩＩＩベクターゲノムを、ＰｖｕＩおよびＳａｐＩ部位を使用して、ｐＵＣ５７−ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩｃｏ（ｐＩＴＲ−ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩＳＱｃｏ−ＳｐＡ）から切り取った。ＰｖｕＩ／ＳａｐＩで平滑末端化された５．５ｋｂフラグメントをＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドにライゲーションし、５．１ｋｂのＦＶＩＩＩベクターおよびＡＡＶｒｈ８Ｒｃａｐ遺伝子を有するプラスミドを生成させた。ＡＡＶ８ｃａｐ遺伝子を含む同様の構築物を生成させた。合成ポリＡ領域をウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡで置換することにより、ＡＡＶｒｈ８Ｒｃａｐ遺伝子および５．４ｋｂベクターを有するＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドを作製した。生じたカナマイシン抵抗性クローンをＨｕｈ７細胞にトランスフェクトし、ＦＶＩＩＩタンパク質産生について試験した。
【０１５７】
標準的なＥＬＩＳＡアッセイによる、培地でのＦＶＩＩＩレベルの定量化により、選択されたＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドからのＦＶＩＩＩ産生を確認した。選択されたＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミド（ｐＴＧＥＮ／ＡＡＶｒｈ８Ｒ／ｍＴＴＲｈＦＶＩＩＩまたはｐＴＧＥＮ／ＡＡＶ８／ｍＴＴＲｈＦＶＩＩＩ）からのｒＡＡＶベクター生成について、２９３細胞にｐＡｄｈｅｌｐｅｒをコトランスフェクションすることによって試験した。細胞ライセートを収集し、ＦＶＩＩＩプライマー／プローブによるｑＰＣＲを行って、パッケージングされたゲノムの量を定量化した。
【０１５８】
本明細書で提示する実施例で使用されるプライマーおよびプローブを表１に記載する。
【０１５９】
５．１ｋｂおよび５．４ｋｂのＦＶＩＩＩベクター用の産生細胞株の生成
プラスミドｐＴＧＥＮ／ＡＡＶｒｈ８Ｒ／ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩ（５．１または５．４ｋｂベクターを有する）またはプラスミドｐＴＧＥＮ／ＡＡＶ８／ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩを、リポフェクタミンおよびＰｌｕｓ試薬を用いてＨｅＬａＳ３細胞にトランスフェクトした。細胞を６０×９６ウェルプレートにプレーティングし、プレートを毎週洗浄および給餌した。選択後、コロニーの増殖についてプレートを採点した。マスターウェル（ＭＷ）を収集して２４ウェルディッシュに移し、サイズに基づいて２４ウェルディッシュに収集した。
【０１６０】
次いで、相対的産生（ＲＰ）スクリーニングのため、マスターウェルを９６ウェルプレートにプレーティングし、次いで、ＲＰスクリーニングからベクター産生について陽性であったＭＷを、例えばｑＰＣＲによるベクター産生により、固有産生（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）（ＳＰ）レベルについて試験した（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．ら、２０１３  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．２４：２５３〜２６９頁）。
【０１６１】
５．１ｋｂおよび５．４ｋｂのＦＶＩＩＩベクターを有する産生細胞株のゲノムＤＮＡの特徴
各配列に特異的なプライマーおよびプローブを使用するｑＰＣＲにより、ベクター、ｒｅｐおよびピューロマイシン配列のコピー数についてゲノムＤＮＡを分析した。さらに、組み込まれた「ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙ」プラスミドのサイズおよび完全性をサザンブロットにより分析した。これに関しては、ゲノムＤＮＡをＳｐｅＩ（ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドにおけるシングルカッター）で消化して、組み込まれたＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドのサイズを決定し、また、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｃＩＩで消化して、ベクター発現カセットの完全性を探った。ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｃＩＩ消化によりｍＴＴＲプロモーター内が切断され、ＦＶＩＩＩｃＤＮＡおよび合成ポリＡが１．８および２．８ｋｂのフラグメントを生成する。消化されたゲノムＤＮＡおよびＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミド（ゲノムＤＮＡにスパイクとして加えて、コピー数およびサイズマーカーとして使用される）を０．８％アガロースゲルで泳動した。ＤＮＡをナイロン膜に転写し、ＤＩＧ標識ＦＶＩＩＩ  ＮｃｏＩフラグメントでプローブした。
【０１６２】
産生細胞株からのＡＡＶ／ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩベクター産生の特徴
選択されたＭＷを、ｒＡＡＶベクター産生について分析した。比較のため、プラスミドｐＵＣ５７−ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩｃｏを２９３細胞にトランスフェクトすることによるトリプルトランスフェクション産生法で、５．１および５．４ｋｂのＦＶＩＩＩベクターを作製した。細胞を収集、溶解させ、産生細胞株法と同様に精製を行った。両方法由来のサンプルをｑＰＣＲによりベクターゲノムコピーについて定量化し、ウイルス回収率および収量を算出した。キャプシドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＡＵＣ分析により、パッケージングされたゲノムサイズについてベクターロットを特徴付けた（以下を参照のこと）。
【０１６３】
産生細胞株から生成されたｒＡＡＶ／ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩベクターゲノムの特徴
以下の通り、パッケージングされたベクターゲノム（ＶＧ）を、精製されたキャプシドから抽出した。ウイルスをＤＮＡ分解酵素１１０Ｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。ＥＤＴＡを添加して消化を停止させ、その後、Ｎ−ラウリルサルコシルの存在下で、５０℃で４５分間、プロテイナーゼＫで消化させながらインキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）でＤＮＡを２回抽出し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心処理した。温度−８０℃で１時間、１００％エタノールおよび３Ｍ酢酸ナトリウムでＤＮＡを沈殿させ、１時間遠心処理した。ＤＮＡおよびペレットをＴＥ中で再懸濁させた。
【０１６４】
サザン分析のため、３０ｍＭ  ＮａＯＨおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる泳動緩衝液中で、１％アルカリゲル電気泳動によりゲノムを分離した。Ｈｙｂｏｎｄ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にサンプルを転写および架橋結合させ、ＦＶＩＩＩ発現カセットに特異的な各種フラグメントでプローブした。これらは、Ｃ２を除くＦＶＩＩＩドメイン全てを含む、４．０ｋｂ  ＮｈｅＩ−ＸｃｍＩフラグメントを含んでいた。さらに、各種２５〜３０ｍｅｒの鎖に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用した。より大きいプローブはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。製造業者の説明書に従いＤＩＧ  Ｏｌｉｇｏ  ３’−Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、オリゴヌクレオチドプローブを３’末端で標識した。
【０１６５】
ＤＮＡドットブロット分析のため、ＶＧを１００℃で５分間加熱することによりＴＥ緩衝液ｐＨ７．０中で変性させ、その後５分間氷上で冷却し、マルチチャンネルピペットを使用してナイロン膜に手動でアプライした。ＵＶ架橋結合によりＤＮＡを膜に固定した。各ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブについて、Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ緩衝液中で、５０℃で６時間ハイブリダイゼーションを実施し、その後、高ストリンジェンシー洗浄、ブロッキングステップ（３０分間）、アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメントによる検出（３０分間）、さらなる洗浄、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ基質との反応（５分間）および３’−Ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従ってのＸ線フィルムへの曝露を行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊで入手可能）を使用して、サザンブロットおよびドットブロットでのシグナル密度を定量化した。
【０１６６】
【表１】
2018510648.tif 000003
【０１６７】
インビボで産生細胞株から生成されたＡＡＶ／ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩベクターの評価
ｒＡＡＶベクターを、８〜１２週齢の、オスの血友病Ａ  ＫＯマウス（Ｃ５６ＢＬ／６、１２９Ｓ−Ｆ８ｔｍ１Ｋａｚ［エクソン１６にｎｅｏ遺伝子］）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で評価した。ベクター（４、１０および３０×１０１０ＤＲＰ／マウス）を、尾静脈から静脈内経路で投与した。後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から血液をクエン酸ナトリウム試験管に回収し、分析まで血漿を凍結保存した。製造業者のプロトコール（９６ウェルの様式に改変）に従い、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用して、ＦＶＩＩＩ活性レベルについて血漿サンプルを分析した。値を正常血漿中に存在するＦＶＩＩＩ活性％として測定し、ｎｇ／ｍｌ（ＦＶＩＩＩ１００％＝ＦＶＩＩＩ１５０ｎｇ／ｍｌ）に変換した。一部のサンプルは、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ、ＩＤＥＸＸ）についても試験した。基準として、プールされた正常なヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用する、標準的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によりＦＶＩＩＩタンパク質レベルを定量化した。
【０１６８】
各研究終了時に肝臓サンプルを回収した。β−メルカプトエタノール１０μｌおよび１／４インチのジルコニア１ｍｍビーズを加えたＲＬＴｐｌｕｓ１ｍＬ中で、肝臓（５０〜４００ｍｇ）をビーズビーター−１６でホモジナイズした。ホモジネートの一部をトリゾール（ＲＮＡの場合）またはＤＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（ＤＮＡの場合）に入れた。Ｔｒｉｍｅｇａのプロトコールを使用してＲＮＡを精製し、その後、製造業者に従いスピンカラム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｚ３１００）で精製した。ＲＮＡをヌクレアーゼ不含の水で溶出させ、１５，０００ｘｇで１分間遠心処理した。ＲＮＡを使用してｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を生成させた。製造業者の説明書に従って、ＤＮＡ抽出Ｐｕｒｅｌｉｎｋカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＤＮＡを精製した。次いで、ｃＤＮＡおよびＤＮＡ両方を使用して、ＦＶＩＩＩ  Ａ２領域に特異的なプライマーおよびプローブ（表１）を使用するｑＰＣＲにより、それぞれＦＶＩＩＩｍＲＮＡおよびベクターゲノムコピーを定量化した。
【０１６９】
結果
オーバーサイズｒＡＡＶベクター産生用のＰＣＬプラットフォームを生成するため、ＦＶＩＩＩを発現させるための新規のカセットを構築した。これらのカセットはＡＡＶ  ＩＴＲと隣接しており、５．１〜５．４ｋｂベクターゲノムの範囲であった（図１Ａ）。各カセットはｍＴＴＲプロモーター由来のプロモーターを含んでおり、発現に対する効果を試験するため様々なｍＴＴＲバリアントが構築された（図１Ｂで与えるバリアントのアライメントおよび説明を参照のこと）。
【０１７０】
マウスにおいてインビボで試験したところ、プラスミドにおけるこれらの発現カセットは全てＦＶＩＩＩを産生した（図１Ｃ）。図１Ａおよび１Ｂに示す、ＨＮＦ３およびＨＮＦ４結合部位の改変により、コアｍＴＴＲプロモーター（「２０２」）を上回ってＦＶＩＩＩ産生が増加したが、ｍＴＴＲエンハンサーおよびＢＧＨポリＡなどのさらなる改変では増加しなかった（図１Ｃ）。図１ＤはＦＶＩＩＩ発現カセットの略図を示す。図１ＥはＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドの設計を示す。
【０１７１】
コアｍＴＴＲを有する発現カセット（５．１ｋｂ）、ならびにエンハンサー、ｍＴＴＲおよびＢＧＨポリＡを有する発現カセット（５．４ｋｂ）を、それぞれについてＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドを生成させた後、ＰＣＬによるオーバーサイズＦＶＩＩＩベクター産生についてのその後の試験に使用した。ＦＶＩＩＩのＥＬＩＳＡ結果から、トランスフェクトされたＴｒｉｐｌｅＰｌａｙ／ＦＶＩＩＩプラスミドが、Ｈｕｈ７細胞にトランスフェクトされると、インビトロでＦＶＩＩＩを産生することが確認された。ＦＶＩＩＩプラスミドは、小規模パッケージング実験でもｒＡＡＶを生成することができた。
【０１７２】
要約すれば、インビボで、コアｍＴＴＲプロモーターからの発現を増加させるｍＴＴＲプロモーター改変が生成された。全てのＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドがインビトロでＦＶＩＩＩを発現し、小規模パッケージング実験でウイルスを生成することができた。
【０１７３】
オーバーサイズ５．１ｋｂ  ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターを有する産生細胞株を生成するため、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒ／ＦＶＩＩＩ産生レベルについてＭＷを分析した。これらのうち、高産生株、中産生株、および低産生株を特定した。したがって、オーバーサイズｒＡＡＶ／ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクター用のＰＣＬを生成させることができることが示された。
【実施例２】
【０１７４】
ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターを有する産生細胞株のゲノムＤＮＡの特徴
ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドの組み込まれたコピー、および実施例１に記載されるＦＶＩＩＩ発現カセットの完全性を評価するため、ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．４ｋｂ、またはＡＡＶ８／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターを含むＭＷをゲノムＤＮＡ分析用に選択した。
【０１７５】
高産生ＭＷ（ＭＷ＃３５）では、サザン分析により、細胞株ゲノム中のベクターが約５０コピーであったことが明らかとなり、中産生ＭＷ＃２７２は、サザンによりそれぞれ１０コピー未満を有していた（図２Ａ）。
【０１７６】
ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩを有するＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．４ｋｂまたはＡＡＶ８／５．１ｋｂの産生について、高産生および中産生ＭＷをｑＰＣＲでも分析した（表２）。ＦＶＩＩＩ、ｒｅｐおよびｐｕｒｏＲ遺伝子のコピー数を、それぞれに特異的なプライマー／プローブを使用して決定し、コピー数を、ＨｅＬａＳ３細胞に存在するＥ６遺伝子（ＨｅＬａＳ３ゲノムあたり１１コピー）に正規化した。高産生ＭＷ（ＭＷ＃３５）では、ｑＰＣＲ分析により、ベクター、ｒｅｐおよびピューロマイシンが約５９〜６７コピーであった（表２）ことが明らかとなり、中産生ＭＷ＃２７２では、ｑＰＣＲによりそれぞれ１５〜１８コピーを有していた（表２）。これらの値は、サザンで得られた結果と比較してわずかに高かったが、同様の順位を有していた（図２Ａ）。比較のため、ＳＥＡＰを発現する通常のサイズのベクター（４．３ｋｂ）をＡＡＶ２またはＡＡＶ８キャプシドにパッケージングして分析した。
【０１７７】
【表２】
2018510648.tif 000004
【０１７８】
ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙ／ＦＶＩＩＩプラスミドを１回だけ切断すると予測される制限酵素（ＳｐｅＩ）で消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、ゲノムＤＮＡにスパイクとして加えた直鎖状ＴｒｉｐｌｅＰｌａｙ／ＦＶＩＩＩプラスミドと同様に泳動された約１３ｋｂのバンドの生成が示された。したがって、全てのクローンが、ＨｅＬａＳ３ゲノムに組み込まれたプラスミド全体を含んでいた。
【０１７９】
図２Ａに示すように、全てのＭＷが、組込み部位に隣接するゲノムＤＮＡを表す、様々なサイズの低コピー（１コピー）バンドも有していた。２７２（中産生株）および３５（高産生株）は、組込み部位が１つ（隣接フラグメントが２つだけ観察された）であることを示すパターンを有していたが、ＭＷ４１８は、複数の隣接フラグメント、ならびに組み込まれたプラスミドのフォワードおよびリバース方向のタンデムを表す可能性のあるより大きい（約２ｘ１４＝２４ｋｂ）フラグメントを有していた。このことは、複数の組込みパターンとともに、ＭＷ４１８がクローンの混合物であったことを示唆している。
【０１８０】
図２Ｂに示すように、ＦＶＩＩＩ発現カセット内を切断する酵素（ＨｉｎｃＩＩ、ＢｇｌＩＩ）で消化することにより、ＦＶＩＩＩベクターゲノムの完全性を分析した。対照と比較して、元のＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドを消化することで得られた同様の結果に基づき、適切なサイズフラグメントが観察された。これらの結果は、組込みの際、ベクターの再構成が発生しないことを実証した。５．４ｋｂベクターを有する産生細胞株、およびＡＡＶ８キャプシドを伴う５．１ｋｂベクターを有する産生細胞株について同様の分析を行い、同等の結果を得た。要約すれば、組み込まれた５．１または５．４ｋｂベクター配列における再構成または欠失は、産生細胞株から単離されたゲノムＤＮＡでは観察されなかった。このことは、オーバーサイズＡＡＶベクターゲノムを含む産生細胞株の生成が実行可能であることを示した。
【実施例３】
【０１８１】
産生細胞株を使用してのオーバーサイズベクター産生、およびベクター分析
次に、上記のＭＷ３５細胞株を使用して、ｒＡＡＶベクター産生について試験した。ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターの高産生クローン（ＭＷ３５）を、小規模培養物におけるｒＡＡＶベクター産生について試験した。ｒＡＡＶ産生ピークは３日目および４日目に見られ、培養スケールアップ中、高い産生レベルが維持された（図３Ａ）。
【０１８２】
このことは、以下の表３に示す結果でさらに実証された。ＭＷ＃３５による産生をスケールアップしてベクター産生レベルを比較した。さらに、細胞ペレット（細胞）および培養培地（ＣＭ）におけるベクターレベルを定量化した。比較のため、通常のサイズのＡＡＶ２／ＳＥＡＰベクターについて示す。
【０１８３】
【表３】
2018510648.tif 000005
【０１８４】
使用したベクター血清型では、細胞ペレットおよび培養培地でベクターが等しく検出された。ＭＷ３５および４１８はともに、数回の継代にわたって安定であった。ＭＷ３５は、継代数５〜継代数２０にかけて高レベルの産生（１×１０１０ＤＲＰ／ｍｌ以上）を維持した（図３Ｂ）。同様に、ＭＷ４１８（中産生株に分類される）は、継代数５〜継代数２１にかけて安定な中レベルの産生（１×１０９ｄｒｐ／ｍｌ以上）を維持した。異なるキャプシド血清型（ＡＡＶ８）を有する５．１ｋｂベクターを生成するＭＷ２８７についても、安定なベクター産生が実証された（図３Ｂ）。
【０１８５】
これらのデータは、以前に通常のサイズのベクターで示されたもの（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．ら（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１：２２０５〜２２１６頁）と同様に、キャプシド血清型とは無関係に、オーバーサイズベクターから高く安定な産生が得られることを実証している。５．４ｋｂ  ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターを有するＰＣＬ、およびＡＡＶ８キャプシドを伴う５．１ｋｂベクターを有するＰＣＬでも強力なベクター産生が得られ、同等の結果を生じた。
【０１８６】
次に、高産生マスターウェル（ＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩのＭＷ＃３５、ＡＡＶ８／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩのＭＷ＃２８７、およびＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．４ｋｂ  ＦＶＩＩＩのＭＷ＃１６３）を使用するベクター産生をスケールアップし、ベクターの収量および質を評価した（表４および図４Ａ）。ベクター産生を、トリプルトランスフェクション法により生成されたベクターと比較した（表４および図４Ｂ）。ＰＣＬ３種およびＴＸＮ２種のロットをＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターの比較に含めた。例として、５．１ｋｂゲノムを有するＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドのデータを示す。
【０１８７】
【表４】
2018510648.tif 000006
【０１８８】
ＡＵＣ分析で評価したところ、ＭＷ３５によるＰＣＬ産生実行によって、一貫性のある産物プロファイルが生じた（図４Ａ）。上記表４に要約するように、この分析で決定された、ベクターゲノムを含むキャプシドのパーセンテージは、ＰＣＬにより生成されたウイルスでは４４〜５０％であり、トリプルトランスフェクション物質はより小さいレベルを有していた（３０％；大きい骨格のベクタープラスミドであるＨＬＰ１９ではわずか１〜５％）。さらに、ＰＣＬにより生成された物質中には、より大きいゲノム（４．７ｋｂ以上）を有するウイルスがより高い割合で存在していた。ベクター収量／細胞は、高産生ＰＣＬで１×１０５ＤＲＰ／細胞、ＴＸＮで１〜３×１０４ＤＲＰ／細胞であった（ＨＬＰ１９および大きいベクター骨格ではより小さく、１×１０３ＤＲＰ／細胞）。
【０１８９】
【表５】
2018510648.tif 000007
【０１９０】
ＭＷ１６３を使用する、５．４ｋｂベクターについての同様の分析により、トリプルトランスフェクションと比較して、ＰＣＬによるＤＲＰ／細胞レベルがわずかに小さいことが示された（上記の表５）。ＶＧを含むキャプシドの総パーセンテージは同等であったが、ＰＣＬにより生成されたウイルスは、より大きいゲノムを有するウイルスをより高いレベルで有していた（図５Ｂ）。
【０１９１】
ＰＣＬ物質およびトリプルトランスフェクション物質をＡＵＣ分析により特徴付けると、トリプルトランスフェクション物質（図５Ｂ）と比較して、ＰＣＬ物質ではより大きいゲノムの割合が２倍大きかった（図５Ａ）。
【０１９２】
【表６】
2018510648.tif 000008
【０１９３】
パッケージングされたウイルス中の、プラスミド由来の抗生物質抵抗性遺伝子（ＰＣＬではピューロマイシン、ＴＸＮではアンピシリン）の存在により測定される、異常な望ましくないＤＮＡパッケージングのレベルは、ＰＣＬにより生成されたウイルスでは低かった（１％未満）（表６）。対照的に、ＴＸＮにより生成されたウイルスは、異常なパッケージングを約１０倍高いレベルで有していた。
【０１９４】
要約すれば、選択された産生細胞株が、オーバーサイズベクターを高レベルで生成可能であることがデータにより示された（１００，０００ＤＲＰ／細胞超）。さらに、これらの細胞株は、製造のための大規模スケールアップに必要なベクター産生能力を、数回の継代（２０超）にわたって維持していた。ＰＣＬにより産生されたベクターを、標準的なトリプルトランスフェクション方法により生成されたベクターと比較すると、ＰＣＬ物質は、ウイルスを含むベクターゲノムをより多く、また、野生型サイズまたはより大きいベクターゲノムをより高い割合で含み、さらに望ましくない非ベクター関連ＤＮＡをより少なく含むことが示された。
【実施例４】
【０１９５】
ＰＣＬにより産生されたオーバーサイズベクター中の、パッケージングされたベクターゲノムの特徴
次に、ＰＣＬプラットフォームにより産生されたオーバーサイズｒＡＡＶベクター中の、キャプシド化されたベクターゲノムを分析した。精製されたビリオンからベクターゲノムを単離し、アルカリゲル電気泳動で一本鎖ゲノムサイズについて分析し、その後、ベクターに特異的なプローブを使用してサザンブロット分析を行った（図６Ａ）。ＦＶＩＩＩ発現カセットの４．０ｋｂフラグメントでプローブしたサザンブロットにより、いずれの方法でも、生成されたベクター中のＶＧサイズの大部分が、約４．６ｋｂまたはそれよりも大きいことが示された（図６Ｂ）。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用して、サザンブロットでのシグナル密度を定量化した。
【０１９６】
鎖特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによってもＶＧを分析し、欠失した５’末端の割合を定量化した。ＡＡＶゲノムのパッケージングは、３’末端から開始して起こることが知られている（Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ａ．ら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：３２８２〜３２９１頁）ため、ゲノムサイズが４．７ｋｂを上回る場合、オーバーサイズベクターはマイナスおよびプラス鎖の５’末端の配列を欠いている可能性がある。図４Ａおよび４Ｂで使用されたベクターロットを、各ベクターの２倍段階希釈液を膜にアプライすることで（２．４×１０９から開始；計８回ベクター濃度を減少させ、さらに陰性対照としてゲノム無しのものをアプライする）分析した。ベクターゲノム（プラスまたはマイナスの向き）の３’または５’末端に特異的な３’末端標識オリゴヌクレオチドプローブで各ブロットをハイブリダイズした。シグナル強度を定量化し、４．６ｋｂベクター（完全にパッケージングされたもの）に正規化した。濃度３つを使用して標準誤差を生成させた。
【０１９７】
４．７ｋｂを超える領域に相補的なオリゴヌクレオチドを両方の向きの一本鎖ゲノムに使用すると、完全にパッケージングされた４．６ｋｂベクター（ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインをコードする領域を除き、５．１ｋｂベクターと同等の配列を有する）と比較して、５．１ｋｂベクターはより小さいシグナル強度を有することがデータにより示された（図７Ａおよび７Ｂおよび７Ｃ）。この差は、使用された５’プローブのほとんどで、ＰＣＬベクターと比較してトリプルトランスフェクトによる物質でより大きかった。
【０１９８】
ＰＣＬおよびトリプルトランスフェクションにより生成されたベクターの５’末端における差が、＋または−鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプローブでサザンブロットをプローブした場合でも観察された。各３’末端からの各オリゴヌクレオチドプローブの距離を示す（図８Ａ）。まず、ＰＣＬおよびトリプルトランスフェクション（ＴＸＮ）により生成されたウイルスが等しく検出されるかについて、鎖特異的なオリゴヌクレオチドプローブによるＤＮＡドットブロット分析で比較し、これにより各鎖で各ウイルス量が同等であることが示された（４．６ｋｂウイルスを、完全にパッケージングされたウイルスについての対照として使用した；ＦＩＸおよびＦＶＩＩＩを含むプラスミドを、検出特異性についての陰性および陽性対照として使用した）（図８Ｂ）。３’末端に対するオリゴヌクレオチドプローブでサザンブロットをプローブすると、ＰＣＬおよびＴＸＮにより生成されたウイルスはともに、＋および−鎖の存在を実証した（図８Ｃ、左パネル）。図６Ａで示された観察結果と同様に、ＰＣＬウイルスで、４．６ｋｂより大きいベクターゲノムがより高いレベルで検出された。５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドでサザンブロットをプローブすると、ＰＣＬベクターは、４．６ｋｂより大きいパッケージングされたゲノムの存在を示したが、トリプルトランスフェクションにより生成されたウイルスは、これらのより大きいゲノムのシグナルを明らかに欠いていることを示した（使用されたプローブは、３’末端から４．９ｋｂの領域を検出した）（図８Ｃ）。サザンブロット（３’末端に対するプローブを使用）における各種サイズのパッケージングされたゲノムのシグナル強度を定量化することによっても、４．７ｋｂよりも大きいゲノムがより高い割合で確認された（図８Ｄ）。定量化により、ＴＸＮベクターと比較して、ＰＣＬベクターではフラグメント化された／より小さいゲノム（４．７ｋｂ未満）がより少ないことも示された。
【０１９９】
次に発明者らは、同様の方法で、ＰＣＬおよびＴＸＮにより生成された５．４ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターのベクターゲノムパッケージングを評価した。５．４ｋｂゲノムの各３’末端からの、各オリゴヌクレオチドプローブに対する相補的配列の位置を示す（図９Ａ）。５．１ｋｂベクターでの結果と同様に、５．４ｋｂベクターの＋および−鎖が、ゲノムの３’末端に対するオリゴヌクレオチドプローブと同等のレベルで検出された（図９Ｂ）。しかし、ＴＸＮ法により生成されたベクターでは、３’末端から４．７ｋｂよりも遠くに位置する領域に特異的なプローブはゲノムを検出しなかった（図９Ｃ）。対照的に、ＰＣＬ法により生成されたベクターは、４．７ｋｂよりも大きい（しかし５．４ｋｂほど大きくはない）ゲノムの存在を示した。
【０２００】
要約すれば、ＴＸＮ法と比較して、ＰＣＬ法により生成されたベクターでは、より大きいベクターゲノムパッケージングがより高いレベルで存在することがデータにより実証された。
【実施例５】
【０２０１】
オーバーサイズｒＡＡＶ／ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターのインビボでの効能
次に、ＰＣＬプラットフォームにより産生されたオーバーサイズｒＡＡＶベクターを、インビボでの効能について試験した。ベクターを、マウスに尾静脈から３×１０１１および４×１０１０ＤＲＰ／マウスで投与し、５６日目まで分析した。ＰＣＬにより産生されたＡＡＶｒｈ８Ｒ／５．１ｋｂ  ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターは、治療された血友病Ａ  ＫＯマウスの血漿中で、検出可能な活性ＦＶＩＩＩタンパク質を用量反応様式で生成した（図１０Ａ）。Ｃｏａｔｅｓｔ活性アッセイに加え、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを使用して、凝固時間による機能についてもＦＶＩＩＩ活性を評価した。このアッセイにより、試験された低用量および高用量で凝固時間が同等であったことが示され、したがって、臨床的に意義のある低用量が、血友病Ａ  ＫＯマウスでの凝固時間を正規化するのに十分であることが示された（図１０Ｂ）。
【０２０２】
次いで、臨床的に意義のあるベクター用量（２×１０１２ＤＲＰ／ｋｇ、４×１０１０ＤＲＰ／マウス）を使用して、ＰＣＬにより生成されたベクターをトリプルトランスフェクションにより産生されたベクターと比較した。ベクターを、血友病Ａ  ＫＯマウスに尾静脈から投与した。Ｃｏａｔｅｓｔ活性アッセイにより決定したところ、ＰＣＬにより生成されたウイルスは、ＴＸＮにより産生されたウイルスよりも活性なＦＶＩＩＩタンパク質を産生した（図１１Ａ）。このことは、ＰＣＬにより生成されたベクターでは、ａＰＴＴアッセイによる２１日目の凝固時間が有意により短かったこととも相関していた（図１１Ｂ）。５６日目のＰＣＬおよびＴＸＮ物質間ではほとんど差が観察されず、ＰＣＬ物質がより迅速な発現動態をもたらしたことが示唆される（図１１Ｃ）。肝臓ベクターゲノムコピーの定量化により、ＰＣＬにより生成されたベクターで治療された動物では、ＴＸＮ物質で観察されたものよりもベクターゲノムが持続することが示された（図１１Ｄ）。
【０２０３】
ＰＣＬおよびＴＸＮにより生成された、より大きい５．４ｋｂ  ＦＶＩＩＩベクターについても、血友病Ａノックアウトマウスで試験した。５．１ｋｂベクターと同様に、ＰＣＬにより生成された５．４ｋｂベクターは、２４日目に、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイでより高いＦＶＩＩＩ活性、およびより短い凝固時間を示した（図１２Ａ、Ｂ）。肝臓におけるベクターゲノムレベルの動態を分析するため、ベクター投与から３日および４３日後の両方でベクターゲノムコピーを定量化した。両日ともに、ＰＣＬにより生成されたベクターで治療された動物では、ＴＸＮ物質で治療された動物と比較して約２倍のベクターゲノムが存在していたことがデータにより実証された（図１２Ｃ）。
【０２０４】
要約すれば、血友病Ａ  ＫＯ疾患モデルにおいてインビボで試験すると、ＰＣＬ法により生成されたオーバーサイズｒＡＡＶ／ｍＴＴＲ−ＦＶＩＩＩベクターは、ＴＸＮ法と比較して２倍高いＦＶＩＩＩ活性およびより短い凝固時間をもたらした。これらの結果は、治療された動物の肝臓に存在する、持続するベクターゲノムが２倍高いレベルであったことと相関していた。したがって、これらの結果は、オーバーサイズｒＡＡＶベクターのベクター産生方法２つの間で、パッケージングされたゲノムの質において観察された差は、ＰＣＬにより生成されたベクターのインビボでの効力がより高いことを意味し、これらの差は、標的器官における転写的に活性なベクターゲノムの生成効率が増大したことに基づくことを実証している。
【実施例６】
【０２０５】
オーバーサイズ５．１、５．９、および６．７ｋｂ  ＳＥＡＰベクターを有する産生細胞株の生成
方法：５．１ｋｂから５．９および６．７ｋｂの範囲のベクターサイズ（図１３Ａを参照のこと）で段階的に増加させつつ、オーバーサイズＡＡＶ２−ＳＥＡＰベクターゲノムを生成させた。３種類の長さ（０．８、１．６および２．４ｋｂ）のＡＡＴスタッファーＤＮＡフラグメントを、ＡＡＶｓｐ７０プラスミドを鋳型として使用するＰＣＲで増幅させ、各スタッファーフラグメントを、ＡＡＶ２  ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子ならびに各ＳＥＡＰベクターゲノムを有するＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミドにクローニングして、一連のｐＡＦ−ＳＥＡＰプラスミドを生成させた。
【０２０６】
オーバーサイズＳＥＡＰベクター用の細胞株を生成させるため、ベクターゲノムならびにＡＡＶ２  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む対応するプラスミドを、２４ウェルハイスループット分析的トランスフェクションで、高産生細胞株を生成する能力について並行して比較した。ＨｅＬａＳ３細胞のＴ７５フラスコ２組に、標準的なプロトコールに準拠して各構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション翌日、トランスフェクション１回につき８×２４ウェルプレートに７５，０００細胞／ウェルを播種し、薬物選択を開始した。相対的産生能スクリーニングの準備として、サンプルを培養し、コロニーサイズおよびコンフルエンスについて評価した。
【０２０７】
結果：まず、５．１、５．９および６．７ｋｂオーバーサイズベクタープラスミド（図１３Ａ）を、ＨｅＬａＳ３細胞（＋ｗｔＡｄ５）への一過性トランスフェクションによるパッケージングについて確認した。結果により、各プラスミドがベクターパッケージングを促進することが示された（データは示さない）。
【０２０８】
相対的産生スクリーニングで、各構築物についてマスターウェル約１００〜１７０個をスクリーニングした。相対的産生スクリーニングで、陽性マスターウェル（１×１０７ＤＲＰ／ｍｌ超を産生）パーセントは全体的に高く（８０％超）、６．７ｋｂ構築物のみが量の減少を示した（６５．７％）。さらに、５．１ｋｂ構築物のみが、高い（１×１０１０ＤＲＰ／ｍｌ超）範囲で産生するマスターウェルを生じた（合計で３つ）が、全ての場合で、中〜高い範囲（１×１０９ＤＲＰ／ｍｌ超）で産生するマスターウェルが特定された。中〜高のパーセンテージは予期されたパターンに従い、５．１ｋｂで２０％、５．９ｋｂで１５．４％および６．７ｋｂで１０．７％であった。
【０２０９】
次いで、より高産生のマスターウェル全てに、固有産生能についての分析を行った。２回の固有産生能スクリーニングの結果を図１３Ｂ（灰色および白いバー）に示し、各マスターウェルでの相対的産生能値（黒いバー）と比較した。結果により、多くの場合で、ベクター収量が固有産生能スクリーニングにおいて安定なままであることが示された。
【０２１０】
要約すれば、少なくとも６．７ｋｂサイズのベクター用の産生細胞株が生成可能であることがデータにより実証された。
【０２１１】
配列
別途注記されない限り、ポリペプチド配列は全てＮ末端〜Ｃ末端で提示される。
【０２１２】
別途注記されない限り、核酸配列は全て５’〜３’で提示される。
ｍＴＴＲ２０２−ＨＩ−ｈＦＶＩＩＩｃｏ−ｓｐＡ（５０９７ｂｐ）
ＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡ
ＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＴＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＧ
ＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＴＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡ
ＴＣＡＴＴＧＣＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＣＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣ  （配列番号１）
ｍＴＴＲ２０２ｏｐｔ
ＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣ  （配列番号２）
ｍＴＴＲ４８２ｏｐｔ
ＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＡＣＧＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣ  （配列番号３）
ｐＴＧＥＮｃａｐｒｈ８Ｒ−ＩＴＲｍＴＴＲＦＶＩＩＩ（ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシドおよび５．１ｋｂ  ＩＴＲ−ｍＴＴＲ−ｈＦＶＩＩＩｃｏを有するＴｒｉｐｌｅＰｌａｙプラスミド）１３５２４ｂｐ
ＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＧＣＧＧＴＴＴＴＡＧＧＣＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＣＣＧＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴ
ＧＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＴＡＡＧＣＣＣＧＡＧＴＧＡＧＣＡＣＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＡＣＧＧＡＡＴＧＧＣＧＣＣＧＴＧＴＧＡＧＴＡＡＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＧＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＴＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＣＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＴＴＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＣＧＴＧＴＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＧＣＧＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＧＡＴＣＣＣＣＡＡＴＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＣＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＧＧＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＧＡＣＴＣＣＣＧＴＧＡＴＣＧＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＡＡＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＣＧＧＧＴＧＣＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＧＴＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＣＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＧＣＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＣＴＧＣＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＴＴＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＴＴＡＧＧＡＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＴＣＡＧＧＣＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＧＴＧＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＣＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＧＧＧＣＴＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＧＴ
ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＡＡＴＡＣＣＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＴＡＧＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＴＴＴＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＧＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＴＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡ
ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＴＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣ
ＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＣＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＡＧＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＧＣＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＴＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＣＴＣＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＡＴＧＡ
ＴＧＡＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧＣＧＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＣＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＧＣＧＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＣＣＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴ（配列番号４）
【図１Ａ】
2018510648.tif 000009
【図１Ｂ】
2018510648.tif 000010
【図１Ｃ】
2018510648.tif 000011
【図１Ｄ】
2018510648.tif 000012
【図１Ｅ】
2018510648.tif 000013
【図２】
2018510648.tif 000014
【図３】
2018510648.tif 000015
【図４Ａ】
2018510648.tif 000016
【図４Ｂ】
2018510648.tif 000017
【図５】
2018510648.tif 000018
【図６】
2018510648.tif 000019
【図７】
2018510648.tif 000020
【図８−１】
2018510648.tif 000021
【図８−２】
2018510648.tif 000022
【図９−１】
2018510648.tif 000023
【図９−２】
2018510648.tif 000024
【図１０】
2018510648.tif 000025
【図１１】
2018510648.tif 000026
【図１２】
2018510648.tif 000027
【図１３】
2018510648.tif 000028
【配列表】
2018510648000001.app
【国際調査報告】
2018510648.tif 000029
2018510648.tif 000030
2018510648.tif 000031
2018510648.tif 000032
2018510648.tif 000033
2018510648.tif 000034