(57)【要約】  本願発明は、２つの分かれた可変ドメイン対のコアを備えた複数の抗体可変ドメインから成る新規ヘテロ二量体多重特異性フォーマットに関し、ここで、両方の可変軽ドメイン及び２つの同族可変重ドメインは、それぞれ２つの別個のタンパク質鎖上にタンデムに配置されている。
2018522545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一及び第二の一本鎖タンパク質を備えたヘテロ二量体タンパク質であって、
ここで、前記第一の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉａ）第一のＶＬドメイン；
（ｉｉａ）第一のポリペプチドリンカー；及び
（ｉｉｉａ）第二のＶＬドメイン、
から成る第一のアミノ酸配列を備え、且つ、
前記第二の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉｂ）第一のＶＨドメイン；
（ｉｉｂ）第二のポリペプチドリンカー；及び
（ｉｉｉｂ）第二のＶＨドメイン、
から成る第二のアミノ酸配列を備え、そして、
前記第一のＶＬドメインは、前記第一又は前記第二のＶＨドメインの一方を伴って、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに
前記第二のＶＬドメインは、前記第一又は前記第二のＶＨドメインの他方を伴って、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成し、且つ、
前記第一又は前記第二の一本鎖タンパク質のうちの少なくとも１つが、
（ｉｖ）第三のポリペプチドリンカーを介して、前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に融合される第三の機能ドメインとしての、少なくとも１つの追加ドメイン、
を更に備え；
前記ヘテロ二量体タンパク質は、前記第一及び第二の免疫グロブリン定常ドメインの同族対を備えず、ここで、前記第一の免疫グロブリン定常ドメインは、前記第一の一本鎖タンパク質内に含まれ、且つ、前記第二の免疫グロブリン定常ドメインは、前記第二の一本鎖タンパク質内に含まれる、
ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２】
（ｖ）第四のポリペプチドリンカーを介して、前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に融合される第四の機能ドメイン；
（ｖｉ）それぞれ第四及び第五のポリペプチドリンカーを介して、前記第一及び前記第二のアミノ酸配列に融合される第四及び第五の機能ドメイン；或いは、
（ｖｉ）それぞれ第四、第五及び第六のポリペプチドリンカーを介して、前記第一及び前記第二のアミノ酸配列に融合される第四、第五及び第六の機能ドメイン、
を更に含む、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３】
前記第一のポリペプチドリンカーが、５〜２０アミノ酸残基、特に６〜１５アミノ酸残基から成る、請求項１又は２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４】
（ａ）前記第一のＶＬドメイン（ｉａ）と前記第一のＶＨドメイン（ｉｂ）は、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに前記第二のＶＬドメイン（ｉｉａ）と前記第二のＶＨドメイン（ｉｉｂ）は、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成し；或いは、
（ｂ）前記第一のＶＬドメイン（ｉａ）と前記第二のＶＨドメイン（ｉｉｂ）は、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに前記第二のＶＬドメイン（ｉｉａ）と前記第一のＶＨドメイン（ｉｂ）は、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５】
前記第三、第四、第五、及び／又は第六の機能ドメインが、以下のリスト：
結合ドメイン、毒素、酵素、ホルモン、シグナルタンパク質、及びアルブミン、
から独立に選択され；
特に、前記第三、第四、第五、及び／又は第六の機能ドメインが、結合ドメインから独立に選択され；
特に、前記結合ドメインが、以下のリスト：
抗体ベースの結合ドメイン、具体的には、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント及び単一抗体可変ドメイン、並びに代替足場ベースの結合ドメイン、具体的には、アンキリンベースの領域、フィノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、及び抗体の定常ドメインに組み込まれた結合部位、
から独立に選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６】
前記抗体可変ドメインの少なくとも１つが、親ウサギ抗体由来のＣＤＲ領域を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７】
前記抗体可変ドメインの少なくとも１つが、ヒトフレームワーク領域を含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８】
前記第一及び前記第二のＶＬ及びＶＨドメインのうちの１つの同族対が：
癌標的；及び免疫エフェクタ細胞に存在する標的、特にＣＤ３、のリストから選択される抗原に対して特異性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質の第一及び第二の一本鎖タンパク質をコードする、１つ又は２つの核酸配列。
【請求項１０】
請求項９に記載の１つ又は２つの核酸配列を含んでなる、１つ又は２つのベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の１つ又は２つのベクターを含んでなる、１つ又は複数の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質、或いは前記ヘテロ二量体タンパク質の第一又は第二の一本鎖タンパク質を製造する方法であって、
（ｉ）請求項９に記載の１つ又は２つの核酸配列を提供するか、又は請求項１０に記載の１つ又は２つのベクターを提供し、前記１つ又は２つの前記核酸配列又は前記１つ又は２つのベクターを発現させ、そして、その発現系から前記ヘテロ二量体タンパク質を回収すること、或いは、
（ｉｉ）請求項１１に記載の１つ又は複数の宿主細胞を提供し、前記１つ又は複数の宿主細胞を培養し；そして、細胞培養物から前記第一及び第二の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質を回収すること、
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のヘテロ二量体タンパク質と医薬的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
疾患、特にヒトの疾患、より具体的には癌、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の処置に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の本発明のヘテロ二量体タンパク質であって、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの前記同族対、又は前記第三、第四、第五、又は第六の機能ドメインのうちの少なくとも１つが、対応する疾患に関して治療関連の標的と特異的に相互作用できるヘテロ二量体タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、２つの分かれた可変ドメイン対のコアを備えた複数の抗体可変ドメインから成る新規ヘテロ二量体多重特異性フォーマットに関し、ここで、両方の可変軽ドメイン及び２つの同族可変重ドメインは、それぞれ２つの別個のタンパク質鎖上にタンデムに配置されている。
【背景技術】
【０００２】
最初のモノクローナル抗体の開発［Ｒ１７］から過去４０年間で、抗体は、研究、診断及び治療目的のための生体分子のますます重要な種類となっている。
【０００３】
治療薬としての抗体は、より合理的に設計された機能性に向かって発展しており、それによって、それらの固有特性を改善及び拡張している。例としては、糖鎖工学によるエフェクタ機能の最適化［Ｒ１８］、血液脳関門を越える移動のような特異的局在化［Ｒ１９］、又は例えばＦｃＲｎ［Ｒ２０］への結合増加によって、調整された半減期が挙げられる。
【０００４】
抗体官能化の補完的アプローチは、二重特異性抗体ブリナツモマブ又は三重特異性抗体カツマキソマブによって例示されるように、二重又は多重特異性抗体又は抗体フラグメントを作り出し、それによって、Ｔ細胞の再標的化のような、作用の代替機構を可能にするために、１個の分子における異なった標的特異性の組み合わせである。
【０００５】
今までに開発された数多くの様々な多重特異性抗体フォーマットにもかかわらず［Ｒ２１］、二重及び多重特異性抗体フォーマットの現在のレパートリーは、三重及び多重特異性結合を可能にするいくつかのフォーマットだけを用いた相当な技術挑戦とわずかな柔軟性が、依然として産業に残されており、ヘテロ二量体タンパク質の形成を裏付けるフォーマットは更に少ない。
【０００６】
様々な多重特異性フォーマットが過去に提示された。概念的に、これらのフォーマットは、３つのカテゴリ：ａ）一本鎖多重特異性フォーマット（異なった標的結合ドメインが、単一遺伝子から発現される１つの単一タンパク質鎖上にすべて配置されている）、ｂ）ホモ二重及びホモ多量体フォーマット（異なった標的結合ドメインが、多量体化ドメインの使用によって集められ、二価／多価、そして任意にまた、多重特異性複合体をもたらす同一のタンパク質鎖上に配置されている）、並びにｃ）ヘテロ二量体フォーマット（標的結合ドメインが、異なったタンパク質鎖上に配置され、且つ、２つのタンパク質鎖の集合が、領域のヘテロ二量体化によっておこなわれる）、に分類される。
【０００７】
ヘテロ二量体多重特異性フォーマットは原則として、異なった特異性及び親和性を有する結合領域が２つのヘテロ二量体化タンパク質鎖の簡単な並べ替えによって様々な組み合わせで容易に試験でき、それによって、面倒なクローニングの必要なしに最終的なフォーマットで直接的に特異性と親和性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることを可能にするという利点を提供する。
【０００８】
最終生成物フォーマットにおける斯かるスクリーニングが、二重特異性タンパク質の最適な効力を達成すると同時に、非特異的効果の危険性を最小限にするために、様々な領域の結合特性及び／又は効力を、互いに慎重に一致させる必要がある場合において必要である。臨床的状況では、これは、有害影響の最小限のリスクでの最適な有効性と言い換えられる。斯かる最適な組み合わせが必要とされる状況は、例えば、異なった濃度で疾患中に産生される２種類の疾患進行サイトカインの並行した遮断であり得る。この状況で、治療学用二重特異性タンパク質は、全く同一の治療量で両方のサイトカインを効果的に遮断することを可能にしなければならない。
【０００９】
多重特異性分子の標的結合ドメインの特徴が調整されなければならない別の例は、腫瘍細胞上の２種類の細胞表面標的を標的とする細胞傷害性抗体を用いた癌の治療法である。この状況における抗体の２種類の細胞表面標的が、癌細胞により排他的に同時発現される可能性がある一方で、それらは、さまざまな健常組織で個別に発現されてもよい。腫瘍治療において不利な副作用の最低限のリスクにて最良の有効性を達成するために、その細胞傷害性抗体は、両方の標的が同時発現される場合、優先的に細胞に結合しなければならないが、２種類の標的のうちの一方だけを発現している組織に結合すべきではない。これを達成するために、２つの標的結合ドメインの親和性は、一方で、それらの標的に対して個々のドメインの親和性は細胞溶解をもたらすことができないくらいに弱く、且つ、その一方で、両方の標的への二重特異性分子の同時に起こる結合から生じる協同的な結合力は、細胞溶解を引き起こすのに十分であるように、調整される必要がある。異なった細胞表面に固定された巨大分子への同時結合から生じる幾何制約のため、最大の協同的結合を達成するためのドメインの組み合わせは、親和性の関数だけではなく、エピトープの関数でもあり、実際の生成物フォーマットにおける異なったドメインの組み合わせを試験することによってのみ同定され得る。
【００１０】
天然のＩｇＧタイプの抗体は、ホモ二量体フォーマットであると考えられる。
【００１１】
足場として古典的なＩｇＧ構造を利用したホモ二量体抗体フォーマットの特異性の数を増やすために、例えば、一本鎖Ｆｖ［Ｒ１５］、Ｆｖｓ［Ｒ１６］、単一ドメイン［例えば、Nanobodies: Huang et al., Expert Rev Mol Diagn. 10 (2010): 777-85］又は代替の足場［例えば、Fynomers: Schlatter et al., MAbs. 4 (2012) 497-508］などの追加結合部分を、重鎖及び軽鎖の両方のアミノ又はカルボキシル末端のいずれかに添付することもできる。このアプローチの１つの利点は、二重〜三重特異性コンストラクトを、コアドメインとして従来のＩｇＧを用いて作り出すことができる点であり、そしてそれは、従来のＩｇＧに関して確立された製造及び修飾技術の大部分を利用することを可能にする。しかしながら、従来のＦｃ領域のホモ二量体の性質のため、このアプローチは常に、１分子あたり少なくとも２つの同一の結合領域を生じ、その結果、特定の標的への二価結合を生じる。これは常に望まれるものではない可能性があり、具体的には、（ａ）２つの標的への協同的結合が、所望の効果を生じなければならない場合、又は（ｂ）分子量が更に増加しないようにする場合、には望まれない。更に、このアプローチは、付加された結合部分の低いドメイン安定性が、それらを医薬開発にとって不適当にすることに悩まされることが多い。
【００１２】
特異性を増強するために更なる結合ドメインを融合するコンセプトもまた、Ｆａｂフラグメント［Ｒ１４］又はＩｇＧの他の抗原結合性フラグメント［Ｒ２３］に対して適用された。重鎖及び軽鎖から成るＦａｂのヘテロ二量体性質のため、そのＦａｂフラグメントはヘテロ二量体化ドメインとして使用できる。Ｆａｂフラグメントは、例えば、いわゆるＴｒｉｂｏｄｙを設計するために使用できた。このフォーマットでは、ｓｃＦｖフラグメントは、Ｆａｂの軽鎖及び重鎖の両方のカルボキシル末端に融合され、そして、正しくヘテロ二量体三重特異性分子をもたらした。Ｆａｂの軽鎖−重鎖結合は、ＣＬ−ＣＨ１間の相互作用によって主に駆動され、加えて、それは、共有結合性ジスルフィド結合［Ｒ２］によって接続される。このフォーマットの課題は、（ａ）最も安定していない成分（ほぼ確実に付加されたｓｃＦｖであろう）に対する安定性の制限、及び（ｂ）最大３標的の特異性に対する制限、である。
【００１３】
ホモ二量体二重特異性フォーマットの制限を解決するアプローチとして、ヘテロ二量体ＩｇＧが導入された［Ｒ３１］。１つの細胞からの２つの別個ｍＡｂｓの単純な同時発現は、２つの異なる重鎖が互いに対を成し、且つ、２つの異なる軽鎖がそれらの対応する重鎖と対を成すヘテロ二量体二重特異性ＩｇＧの集合に対する非常に低い確率につながる［Ｒ２４］。しかしながら、それはまた、Ａ）異なる特異性を有する重鎖と軽鎖のミスマッチ、並びにＢ）単一及び二重特異性変異型をもたらす異なる重鎖組み合わせの混合物、にもつながる。これらの困難に対処すべく、（分子に人工的な非対称を引き起こす）いくつかのアプローチがとられた。「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」コンセプト［Ｒ３、Ｒ４］は、重鎖／重鎖又は重鎖／軽鎖接合部分の工学を使用して、同時発現される鎖の結合を所望の立体配置に向かわせる。別のアプローチでは、ＣｒｏｓｓＭａｂ方法論［Ｒ５］は、遺伝子操作した軽鎖／重鎖対の選択的対合を可能にする。これらの方法論の欠点は、ミスマッチ分子の残存する画分を生成物と分離することが非常に難しいことである。そのため、他の技術が、単一及び二重特異性結合剤［Ｒ２２］の示差結合特性を設計することによって分離問題に注目し、もう一方で、変異型の推計学的分布によって引き起こされる収率の損失を黙認する。
【００１４】
ＩｇＧベースのヘテロ二量体フォーマットの更なる制限は、それらすべてがＦｃエフェクタドメインを備えていなければならない点である。ヘテロ二量体化が任意の標的の選択に向けられるように標的結合ドメインによって駆動されるフォーマットは、同じ又はより低い分子量にて特異性／機能性の数を増加させることを可能にする。低い分子量を有する分子は、より効率的に、標的組織（例えば、固形癌）に浸入するので、その結果、同じ又はより低い用量で改善された有効性を期待できる。斯かる小さいフォーマットは、例えば血清アルブミンと相互作用する結合ドメインを、単に付加することによって、ＩｇＧの半減期に匹敵する血清中半減期を有するように更に設計することもできる。
【００１５】
代替アプローチは、例えばｓｃＦｖ部分、の所望の多特異性を付与するために非抗体融合タンパク質を使用する。斯かる融合タンパク質の例としては、Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ［Ｒ２５］、バルナーゼ−バルスター［Ｒ２６］、ｊｕｎ−ｆｏｓ［Ｒ２７］、ＴＮＦ［Ｒ２８］、又はＨＳＡ［Ｒ２９］が挙げられる。これらのコンセプトは一般的に、ヘテロ二量体様式で二重又は多重特異性結合ドメインを一緒にもたらすように相互作用する少なくとも１対のドメインが付加されることである。これらのヘテロ二量体化領域は、標的結合に直接的に関与しないが、それにもかかわらず、それらは、Ｔｒｉｂｏｄｙフォーマットの定常ドメイン１（Ｃ１）と同様に−タンパク質の分子量を増大する。更に、それらは、ヒト以外のエピトープ及び配列を組み込むことによって、増強された免疫原性のリスクを伴うであろう。
【００１６】
先に考察したＣＬとＣＨ１との相互作用とは対照的に、パラトープを形成するＶＬ−ＶＨドメインの結合は、弱いと一般的に見なされる。しかしながら、排他的に抗体可変ドメインから成るいくつかのヘテロ二量体抗体フラグメントコンセプトが存在する。特に、ダイアボディ［Ｒ６］、ＤＡＲＴｓ［Ｒ１０］、及びタンダブ（tandabs）［Ｒ７、Ｒ８］のようなアプローチは、ホモ及びヘテロ二量体二重特異性、並びに二及び四価集合体を製造するための上品且つ最小限のアプローチを提供する。これらのフォーマットストラテジーの最も重要な制限は、（ａ）ダイアボディ又はＤＡＲＴｓのどちらかの鎖のアミノ又はカルボキシル末端に、例えばｓｃＦｖを、融合することによる更なる特異性の追加が、可変軽ドメインと可変重ドメインの鎖内対合をもたらす場合があり、それにより、２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化を非常に困難な状態にすること、及び（ｂ）過去に観察されることが多かった、可変軽鎖と可変重鎖との間の弱い領ドメイン域接合部分結合により、これらのフォーマットは、ＶＬ／ＶＨ接合部分を安定化させるドメイン間ジスルフィド結合［Ｒ１２］の導入などの更なる工学を必要とすると見なされるように、低い単量体安定性及び乏しい製作性に苦しめられた。
【００１７】
多重特異性一本鎖タンデムＦｖ抗体を構築することを目指し、Kipriyanovら［Ｒ３０］は、それぞれがＶＬ−（リンカー１）−ＶＨ−（リンカー２）−ＶＬ−（リンカー３）−ＶＨの順で配置された２つの分割Ｆｖドメインから成る、２つのタンパク質鎖を備えた設計を示唆した。ヘテロ二量体四重特異性タンパク質の構築のために、そのヘテロ二量体は、以下の構造を有する２つのタンパク質鎖から成るであろう。鎖１：ＶＬＡ−（リンカー１）−ＶＨＡ−（リンカー１２）−ＶＬＢ−（リンカー１３）−ＶＨＣ、及び鎖Ｂ：ＶＬＤ−（リンカー１）−ＶＨＤ−（リンカー２）−ＶＬＣ−（リンカー３）−ＶＨＢ、式中、ＦｖＢとＦｖＣの会合が、２本の鎖のヘテロ二量体化を駆動する（図１０Ａを参照）。タンデム一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ２）様フォーマットをもたらす鎖内会合を予防するために、且つ、２つの単量体タンパク質鎖のヘテロ二量体化を促進するために、最大１０アミノ酸のリンカー３の位置における短縮リンカーを示唆した（ＥＰ１２９３５１４ Ａ１）。しかしながら、少なくとも１５アミノ酸のリンカー２を伴った２つの分割可変ドメインの提案された組織化は、第二の可変ドメインが、Ｎ末ドメインに折り重なって戻る可能性をもたらし、非マッチングＶＨ／ＶＬ対から成る一本鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）様フォーマットにつながり、そしてそれは、多分、それらの標的に結合することができないだろう。加えて、タンパク質鎖１上のすべての可変重鎖及び軽鎖が、それぞれタンパク質鎖２の可変軽鎖及び重鎖と対合し、それによって、端末ｓｃＦｖｓ（ｓｃＦｖＡ及びｓｃＦｖＤ）の形成を予防し、非同族可変ドメインの対合をもたらすヘテロ二量体の形成の可能性もある。タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）又はｓｃＤｂタイプ副産物は、非多量体化タンパク質鎖の見かけの分子量で観察されたタンパク質の非常に高い画分の原因であるだろう［Ｒ３０］。
【００１８】
理論上、先に記載したアプローチにおけるｓｃＤｂ様構造物の形成は、２つの分割可変ドメインの間のリンカー（リンカー２）を短縮することによってもまた、更に低減される場合がある。しかしながら、これは、コンストラクトの柔軟性を制限し、そしてそれは、多くの場合、２つの標的の並行した結合を可能にするアクセス可能なエピトープの範囲に対して負の影響を与える。これらの幾何制約は、２つの膜タンパク質が同時に結合されるとき、特に制限される。しかしながら、更に、そして、最も重要なことには、両方の単量体が、統計的に最大３分の２の二量体生成物が２つのホモ二量体から成り、そして一方、３分の１だけが所望のヘテロ二量体から成る、ホモ二量体フラグメントを形成する場合がある（図１０Ｂを参照）。
【００１９】
要するに、簡単な並べ替えと、最終的なフォーマットにおける異なる結合ドメインのその後の特徴づけを可能にするヘテロ二量体多重特異性フォーマットの必要性を強く主張している産業が存在する。斯かるフォーマットに関する主な課題は、（ａ）準最適な生産高において得られる特異性ヘテロ二量体化の比較的乏しい効率、並びに（ｂ）血清中半減期の同調における乏しい柔軟性を伴い、且つ、分子量を増大せずに新規機能性を追加する際の柔軟性を制限する、ヘテロ二量体化ドメインとして非標的結合タンパク質又は設計されたヘテロ二量体Ｆｃエフェクタドメインを使用する必要性、である。
【００２０】
よって、最適なヘテロ二量体多重特異性フォーマットは、排他的に標的結合ドメインから成り、且つ、例えば、相互作用パートナー（標的）によって規定される幾何制約に対応するために、異なる結合領域の間のリンカー長を自由に変更することによって、分子の形状を調整することを可能にする。この問題に対する解決策、すなわち、単量体鎖における可変ドメインの順序の修飾は、これまで、従来技術において示されても、示唆されてもいない。
【発明の概要】
【００２１】
本願発明は、２つの分割可変ドメイン対のコアを備えた複数の抗体可変ドメインの新規ヘテロ二量体多重特異性フォーマットに関し、ここで、可変軽ドメインと２つの同族可変重ドメインの両方が、それぞれ、２つの別個のタンパク質鎖上にタンデムに配置され、それにより、２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化を駆動している。最大２つの追加結合ドメイン、特にｓｃＦｖフラグメントなどの抗体ベースの結合ドメインが、いずれかのタンパク質鎖のアミノ又はカルボキシル末端に融合され、最大六重特異性ヘテロ二量体タンパク質をもたらす。
【００２２】
よって、第一の態様において、本発明は、第一及び第二の一本鎖タンパク質を備えたヘテロ二量体タンパク質に関し、
ここで、前記第一の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉａ）第一のＶＬドメイン；
（ｉｉａ）第一のポリペプチドリンカー；及び
（ｉｉｉａ）第二のＶＬドメイン、
から成る第一のアミノ酸配列を備え、
前記第二の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉｂ）第一のＶＨドメイン；
（ｉｉｂ）第二のポリペプチドリンカー；及び
（ｉｉｉｂ）第二のＶＨドメイン、
から成る第二のアミノ酸配列を備え、
前記第一のＶＬドメインは、前記第一又は前記第二のＶＨドメインの一方を伴って、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに前記第二のＶＬドメインは、前記第一又は前記第二のＶＨドメインの他方を伴って、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成し、且つ、
前記第一又は前記第二の一本鎖タンパク質のうちの少なくとも１つが、
（ｉｖ）前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に第三のポリペプチドリンカーを介して融合される第三の機能ドメインとしての、少なくとも１つの追加ドメイン、
を更に備え、
任意選択により、前記ヘテロ二量体タンパク質は、前記第一及び第二の免疫グロブリン定常ドメインの同族対を備えず、ここで、前記第一の免疫グロブリン定常ドメインは、前記第一の一本鎖タンパク質内に含まれ、そして、ここで、前記第二の免疫グロブリン定常ドメインは、前記第二の一本鎖タンパク質内に含まれる。
【００２３】
第二の態様において、本発明は、前記第一及び第二の一本鎖タンパク質をコードする１つ又は２つの核酸配列に関する。
【００２４】
第三の態様において、本発明は、前記１つ又は２つの核酸配列を含んでなる１又は２つのベクターに関する。
【００２５】
第四の態様において、本発明は、１つ又は２つのベクターを含んでなる（単数若しくは複数の）宿主細胞に関する。
【００２６】
第四の態様において、本発明は、本発明の第一及び第二の一本鎖タンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質を製造する方法に関し、当該方法は、
（ｉ）本発明による１つ又は２つの核酸を提供するか、又は本発明による１つ又は２つのベクターを提供し、前記１つ又は２つの核酸、又は前記１つ又は２つのベクターを発現させ、そして、前記第一若しくは第二の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質をその発現系から回収すること、或いは、
（ｉｉ）本発明の１つ又は２つの宿主細胞を提供し、前記１つ又は２つの宿主細胞を培養し、そして、前記第一及び第二の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質をその細胞培養物から回収すること、
を含む。
【００２７】
第五の態様において、本発明は、本発明のヘテロ二量体タンパク質と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【００２８】
第六の態様において、本発明は、疾患、特にヒトの疾患、より具体的には癌、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患の処置に使用するための本発明のヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの前記同族対、又は前記第三、第四、第五、又は第六の機能ドメインのうちの少なくとも１つが、対応する疾患に関して治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【００２９】
第七の態様において、本発明は、疾患、特にヒトの疾患、特に癌、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択されるヒトの疾患に罹患している患者を治療する方法に関し、当該方法は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の有効量を対象に投与することを含み、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの前記同族対、又は前記第三、第四、第五、又は第六の機能ドメインのうちの少なくとも１つが、対応する疾患に関して治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【００３０】
本発明の特定の実施形態は、添付した従属クレームに記述されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、集合体１の略図を示す（実施例１を参照）。
【図２】図２は、集合体３の略図を示す（実施例１を参照）。
【図３】図３は、集合体５の略図を示す（実施例１を参照）。
【図４】図４は、集合体７の略図を示す（実施例１を参照）。
【図５−１】図５は、１ステップ精製後のサイズ排除クロマトグラムを示す。（Ａ）集合体１；（Ｂ）集合体３。
【図５−２】図５は、１ステップ精製後のサイズ排除クロマトグラムを示す。（Ｃ）集合体５；（Ｄ）集合体７。
【図６−１】図６は、１ステップ精製後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す：パネルＡ：ＰＲ０３５６（集合体１）：還元条件：レーン４；非還元条件：レーン１０；ＰＲ０３５７（集合体３）：還元条件：レーン５；非還元条件：レーン１１；ＰＲ０３５８（集合体５）：還元条件：レーン６；非還元条件：レーン１２；ＰＲ０３５５（集合体７）：還元条件：レーン３；非還元条件：レーン９。
【図６−２】図６は、１ステップ精製後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す：パネルＢ：ＰＲ０３５７（集合体３）非還元条件の顕著な架橋形成を示す、サンプル調製中に低い温度を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの再現。
【図７】図７は、４℃での保存（図７Ａ）と比較した、３７℃での２８日保存後のタンパク質含有量（１ｇ／Ｌ）（図７Ｂ）を示す：ＰＲ０３５６（集合体１）；ＰＲ０３５７（集合体３）；ＰＲ０３５８（集合体５）；ＰＲ０３５５（集合体７）。
【図８】図８は、４℃での保存（図８Ａ）と比較した、比較における３７℃での２８日保存後の単量体含有量（１ｇ／Ｌ）（図８Ｂ）を示す：ＰＲ０３５６（集合体１）；ＰＲ０３５７（集合体３）；ＰＲ０３５８（集合体５）；ＰＲ０３５５（集合体７）。
【図９】図９は、３７℃にて４週間のインキュベーション後の安定性サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す：ＰＲ０３５６（集合体１）：還元条件：レーン４；非還元条件：レーン１０；ＰＲ０３５７（集合体３）：還元条件：レーン５；非還元条件：レーン１１；ＰＲ０３５８（集合体５）：還元条件：レーン６；非還元条件：レーン１２；ＰＲ０３５５（集合体７）：還元条件：レーン３；非還元条件：レーン９。
【図１０】図１０は、Kipriyanovら［Ｒ３０］に従って、多重特異性一本鎖タンデムＦｖ抗体の概略図を示す：ＶＬドメイン：灰色の背景；ＶＨドメイン：白色の背景；同じ塗りつぶしパターンによって示した同族対。（Ａ）一本鎖及びヘテロ二量体生成物の概略図。（Ｂ）可能性があるホモ二量体の概略図。
【図１１−１】図１１は、ＭＡＴＣＨ（同族ヘテロ二量体化による多重特異性抗体ベースの治療薬）分子がセンサーチップ上に固定され、そして、４つの抗原が示された流れで適用される、ＳＰＲ実験の結果を示す。得られたセンソグラムは、それぞれのＭＡＴＣＨフォーマットによる４つの抗原すべてに関する同時関与と一致したＲＵシフトを示す。
【図１１−２】図１１は、ＭＡＴＣＨ（同族ヘテロ二量体化による多重特異性抗体ベースの治療薬）分子がセンサーチップ上に固定され、そして、４つの抗原が示された流れで適用される、ＳＰＲ実験の結果を示す。得られたセンソグラムは、それぞれのＭＡＴＣＨフォーマットによる４つの抗原すべてに関する同時関与と一致したＲＵシフトを示す。
【図１２−１】図１２は、結合量対不活性なＭＡＴＣＨ分子の分析の結果を示す。ＭＡＴＣＨ分子を、過剰量のＴＮＦ（Ｆｖ領域を形成する二量体の一方に対する抗原）と共にプレインキュベートし、そして、複合体をＳＥ−ＨＰＬＣに泳動した。得られたクロマトグラムを分析して、「活性（結合）」対「不活性」ＭＡＴＣＨ分子の画分について計算した。分析では、保存的なピークフィットを適用したとき、１１．４〜４．７％の不活性タンパク質が明らかになった。
【図１２−２】図１２は、結合量対不活性なＭＡＴＣＨ分子の分析の結果を示す。ＭＡＴＣＨ分子を、過剰量のＴＮＦ（Ｆｖ領域を形成する二量体の一方に対する抗原）と共にプレインキュベートし、そして、複合体をＳＥ−ＨＰＬＣに泳動した。得られたクロマトグラムを分析して、「活性（結合）」対「不活性」ＭＡＴＣＨ分子の画分について計算した。分析では、保存的なピークフィットを適用したとき、１１．４〜４．７％の不活性タンパク質が明らかになった。
【図１２−３】図１２は、結合量対不活性なＭＡＴＣＨ分子の分析の結果を示す。ＭＡＴＣＨ分子を、過剰量のＴＮＦ（Ｆｖ領域を形成する二量体の一方に対する抗原）と共にプレインキュベートし、そして、複合体をＳＥ−ＨＰＬＣに泳動した。得られたクロマトグラムを分析して、「活性（結合）」対「不活性」ＭＡＴＣＨ分子の画分について計算した。分析では、保存的なピークフィットを適用したとき、１１．４〜４．７％の不活性タンパク質が明らかになった。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の詳細な説明
ここに、我々は、複数の抗体可変ドメインを含む２つのタンパク質鎖の定量的なヘテロ二量体集合体を呈する新規フォーマットを提供する。このフォーマットは、２つの分割可変ドメイン対（２つのＦｖフラグメント）のコアから成り、ここで、両方の可変軽ドメイン及び両方の可変重ドメインのそれぞれが、別個のタンパク質鎖上に配置され、それにより、２つのタンパク質鎖のヘテロ二量体化を駆動している。高い領域内及び領域間安定性を有するｓｃＦｖフォーマットの最大２つの追加可変ドメインが、いずれかのペプチド鎖のアミノ及び／又はカルボキシル末端に融合され、最大六重特異性ヘテロ二量体タンパク質をもたらす。
【００３３】
よって、第一の態様において、本発明は、第一及び第二の一本鎖タンパク質を備えたヘテロ二量体タンパク質に関し、
ここで、前記第一の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉａ）第一のＶＬドメイン；
（ｉｉａ）第一のポリペプチドリンカー；及び
（ｉｉｉａ）第二のＶＬドメイン、
から成る第一のアミノ酸配列を備え、
ここで、前記第二の一本鎖タンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉｂ）第一のＶＨドメイン；
（ｉｉｂ）第二のポリペプチドリンカー；及び
（ｉｉｉｂ）第二のＶＨドメイン、
から成る第二のアミノ酸配列を備え、
ここで、前記第一のＶＬドメインは、前記第一又は前記第二のＶＨドメインの一方を伴って、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに前記第二のＶＬドメインは、前記第一又は前記第二のＶＨドメインの他方を伴って、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成し、且つ、
前記第一又は前記第二の一本鎖タンパク質のうちの少なくとも１つが、
（ｉｖ）前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に第三のポリペプチドリンカーを介して融合される第三の機能ドメインとして少なくとも１つの追加ドメイン、
を更に備える。
【００３４】
以下のこの明細書及び請求項を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含んでなる（comprise）」という語、及び例えば「comprises」や「comprising」などの変化形は、記載した整数、組成物若しくはステップ、又は整数、組成物若しくはステップの群の包含を意味すると理解される一方で、追加の整数、組成物若しくはステップ、又は整数、組成物若しくはステップの群が存在しない実施形態を含めて、任意の追加の整数、組成物若しくはステップ、又は整数、組成物若しくはステップの群が、任意選択で、同様に存在してもよい。よって、斯かる後者の実施形態に関して、「含む（comprising）」という用語は、「から成る（consist of）」という下位の用語を包含する。
【００３５】
いくつかの書類が、この明細書の文章中に引用される。（すべての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、取扱説明書、GenBank Accession Number配列提出書類などを含め）本明細書中に引用した書類のそれぞれは、前掲又は後掲にかかわらず、各特許法の下、可能な範囲内までその全体を、参照によって援用する。本明細書中において、先願発明に基づいて斯かる開示に先行する権利が本発明に与えられないことを認めると解釈されるべきではない。
【００３６】
本発明との関連において、「ＶＬドメイン」及び「ＶＨドメイン」という用語は、抗体の可変軽鎖領域及び可変重鎖領域をそれぞれ指す。本発明との関連において、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、少なくとも抗体の抗原結合性フラグメントを含んでなる抗体部分を含めた、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子、を指す。
【００３７】
本発明との関連において、抗体、又は一般に、任意の結合性分子は、それが、標的としての前記抗原／同族結合パートナーに対して、１００μΜ以下、好ましくは５０μΜ以下、好ましくは３０μΜ以下、好ましくは２０μΜ以下、好ましくは１０μΜ以下、好ましくは５μΜ以下、より好ましくは１μΜ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、より一層好ましくは１００ｎＭ以下、より一層好ましくは９０ｎＭ以下、より一層好ましくは８０ｎＭ以下、より一層好ましくは７０ｎＭ以下、より一層好ましくは６０ｎＭ以下、より一層好ましくは５０ｎＭ以下、より一層好ましくは４０ｎＭ以下、より一層好ましくは３０ｎＭ以下、より一層好ましくは２０ｎＭ以下、そして、より一層好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫDを有する場合、抗原（抗体の場合）又は同族結合パートナー（一般の結合性分子の場合）に「特異的に結合する」と見なされる。
【００３８】
本発明との関連において、「機能ドメイン」という用語は、例えば酵素活性又は同族リガンドへの特異的結合など、事前に規定された機能を有するタンパク性領域を指し、ここで、前記タンパク性領域は、少なくとも二次構造要素を有する構造化領域である。例えば、Ｘ線結晶学、円偏光二色性（ＣＤ）、振動円偏光二色性（ＶＣＤ）、ＮＭＲ、又はＦＴ−ＩＲなどのポリペプチド又はタンパク質の二次構造の存在を判断する方法、或いは、例えば、ＰＥＰ−ＦＯＬＤ（Shen et al., J. Chem. Theor. Comput. 10 (2014) 4745-4758）などのポリペプチドの二次構造を予測する方法は、当該技術分野の専門家にとって周知である。特定の実施形態において、前記タンパク性領域は、三次構造を有する構造化領域である。特定の実施形態において、前記タンパク性領域は、少なくとも約２０アミノ酸残基（Heitz et al., Biochemistry 38 (1999) 10615-25を参照）、特に少なくとも約５０アミノ酸残基、より具体的には少なくとも約１００アミノ酸残基を含む。
【００３９】
本発明との関連において、「ポリペプチドリンカー」という用語は、それぞれリンカーの片端に取り付けられた、２つの領域を接続するペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖から成るリンカーを指す。特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、２〜３０アミノ酸残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸残基）から成る連続した鎖を有する。特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、非構造化ポリペプチドである。先に言及したように、例えば、Ｘ線結晶学、円偏光二色性（ＣＤ）、振動円偏光二色性（ＶＣＤ）、ＮＭＲ、又はＦＴ−ＩＲなどのポリペプチドの二次構造の存在を判断する方法、或いは、例えば、ＰＥＰ−ＦＯＬＤ（Shen et al., J. Chem. Theor. Comput. 10 (2014) 4745-4758）などのポリペプチドの二次構造を予測する方法は、当該技術分野の専門家にとって周知である。
【００４０】
本願発明は、次のものによって特徴づけされる：
・両方のＶＬが１つのタンパク質鎖上に位置すると同時に、対応するＶＨが第二のタンパク質鎖上に位置する、ヘテロ二量体フォーマットを製造するための抗体可変ドメインの使用。
・ヘテロ二量体コア領域は、三重、四重、五重又は六重特異性実体 (entity)を製造するために、例えば結合ドメインなどの、追加の機能ドメインの付加を可能にする。
・ヘテロ二量体コア集合体の高効率対合に関する複数の例。
・一般的なヘテロ二量体コア領域を共有する複数の結合ドメインプールの組み合わせスクリーニングに対する簡易な解決法。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、前記第一又は前記第二の一本鎖タンパク質は：
（ｖ）第四のポリペプチドリンカーを介して前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に融合される第四の機能ドメイン、
を更に含む。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、前記第一又は前記第二の一本鎖タンパク質は：
（ｖｉ）第五のポリペプチドリンカーを介して前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に融合される第五の機能ドメイン、
を更に含む。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、前記第一又は前記第二の一本鎖タンパク質は：
（ｖｉｉ）第六のポリペプチドリンカーを介して前記第一又は前記第二のアミノ酸配列に融合される第六の機能ドメイン、
を更に含む。
【００４４】
特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は、前記第三及び前記第四の機能ドメインを含む。斯かる実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は四価であり、特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は四重特異性である。
【００４５】
特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は、前記第三、前記第四、前記第五、及び前記第六の機能ドメインを含む。斯かる実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は六価であり、特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は六重特異性である。
【００４６】
特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は、第一及び第二の免疫グロブリン定常ドメインの同族対を含まず、ここで、前記第一の免疫グロブリン定常ドメインは、前記第一の一本鎖タンパク質内に含まれ、そして、ここで、前記第二の免疫グロブリン定常ドメインは、前記第二の一本鎖タンパク質内に含まれる。特定の実施形態において、前記第一及び前記第二の一本鎖タンパク質のうちの少なくとも一方は、免疫グロブリン定常ドメインを含まない。特定の実施形態において、前記第一及び前記第二の一本鎖タンパク質の両方が、免疫グロブリン定常ドメインを含まない。
【００４７】
特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質は、（ｉ）前記第一のＶＬドメインと前記第一のＶＨドメイン、及び（ｉｉ）前記第二のＶＬドメインと前記第二のＶＨドメインの同族対以外に、前記第一の一本鎖タンパク質内に含まれた第一のタンパク性相互作用領域と前記第二の一本鎖タンパク質内に含まれた第二のタンパク性相互作用領域の同族対を含まない。
【００４８】
特定の実施形態において、前記第一のポリペプチドリンカーは、５〜２０アミノ酸残基、特に６〜１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され；且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択される｝を有する。
【００４９】
他の特定の実施形態において、前記第一のポリペプチドリンカーは、１１〜２０アミノ酸残基、特に１１〜１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され；且つ、ｎが３、４、及び５から選択される｝を有する。
【００５０】
特定の実施形態において、前記第二のポリペプチドリンカーは、５〜２０アミノ酸残基、特に６〜１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され；且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択される｝を有する。
【００５１】
他の特定の実施形態において、前記第二のポリペプチドリンカーは、１１〜２０アミノ酸残基、特に１１〜１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され；且つ、ｎが３、４、及び５から選択される｝を有する。
【００５２】
特定の実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六のポリペプチドリンカーは、独立して８〜２０アミノ酸残基、特に１０〜１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、独立して配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に４であり、且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に２及び３である｝を有する。
【００５３】
特定の実施形態において、前記第一のＶＬドメイン（ｉａ）と前記第一のＶＨドメイン（ｉｂ）は、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに前記第二のＶＬドメイン（ｉｉａ）と前記第二のＶＨドメイン（ｉｉｂ）は、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成する。斯かる実施形態において、前記第一及び前記第二の一本鎖タンパク質は、前記一本鎖タンパク質の並列配置で前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する。
【００５４】
特定の斯かる実施形態において、前記第一のポリペプチドリンカーは、１０〜２０アミノ酸残基、特に１２〜１７アミノ酸残基、特に１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に４であり；且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に３である｝を有する。
【００５５】
特定の斯かる実施形態において、前記第二のポリペプチドリンカーは、１０〜２０アミノ酸残基、特に１２〜１７アミノ酸残基、特に１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に４であり；且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に３である｝を有する。
【００５６】
特定の斯かる実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六のポリペプチドリンカーは、独立して１０〜２０アミノ酸残基、特に１２〜１７アミノ酸残基、特に１５アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に４であり、且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に３である｝を有する。
【００５７】
他の特定の実施形態において、前記第一のＶＬドメイン（ｉａ）と前記第二のＶＨドメイン（ｉｉｂ）は、第一の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第一の同族対を形成し、並びに前記第二のＶＬドメイン（ｉｉａ）と前記第一のＶＨドメイン（ｉｂ）は、第二の標的抗原に対して特異性を有する可変ドメインの第二の同族対を形成する。斯かる実施形態において、前記第一及び前記第二の一本鎖タンパク質は、前記一本鎖タンパク質の逆並列配置で前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する。
【００５８】
特定の斯かる実施形態において、前記第一のポリペプチドリンカーは、５〜１２アミノ酸残基、特に５〜１２アミノ酸残基、特に６アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に２であり；且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に２である｝を有する。
【００５９】
特定の斯かる実施形態において、前記第二のポリペプチドリンカーは、５〜１２アミノ酸残基、特に６〜１０アミノ酸残基、特に８アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に３であり；且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に２である｝を有する。
【００６０】
特定の斯かる実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六のポリペプチドリンカーは、独立して１０〜２０アミノ酸残基、特に８〜１２アミノ酸残基、特に１０アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧmＳ）n｛ｍが２、３、及び４から独立に選択され、特に４であり、且つ、ｎが１、２、３、４、及び５から選択され、特に２である｝を有する。
【００６１】
特定の実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六の機能ドメインは、以下のリスト：
結合ドメイン、毒素、酵素、ホルモン、シグナルタンパク質、及びアルブミン、
から独立に選択される。
【００６２】
特定の実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六の機能ドメインは、結合ドメインから独立に選択される。
【００６３】
特定の斯かる実施形態において、結合ドメインは、以下のリスト：
これだけに限定されるものではないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び単一抗体可変ドメイン、を含めた抗体ベースの結合ドメイン、サメ由来のＶＮＡＲ構造ベースの単一領域抗体、並びにこれだけに限定されるものではないが、アンキリンベースの領域、フィノマー（fynomers）、アビマー（avimers）、アンチカリン（anticalins）、フィブロネクチン、及び抗体の定常ドメインに組み込まれた結合部位（例えばf-star technology）を含めた代替足場ベースの結合ドメイン、
から独立に選択される。
【００６４】
特定の斯かる実施形態において、前記結合ドメインは：一本鎖Ｆｖフラグメント及び単一抗体可変ドメイン、から選択される抗体ベースの結合ドメインである。
【００６５】
特定の斯かる実施形態において、斯かる一本鎖Ｆｖフラグメントにおける可変ドメインの順序は、（Ｃ末端からＮ末端に向かって）ＶＬ−（リンカー）−ＶＨ及びＶＨ−（リンカー）−ＶＬから選択される。特定の実施形態において、可変ドメインの順序は、ヘテロ二量体タンパク質に含まれるすべての一本鎖Ｆｖフラグメントについて同じである。特定の実施形態において、例えば、順序ＶＬ−（リンカー）−ＶＨの一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記第一のアミノ酸配列からＣ末端にある場合、３つのＶＬドメインは、それぞれ、前記第一のポリペプチドリンカーと、前記第三、第四、及び第五のポリペプチドリンカーのうちの１つによって互いに連結される。特定の実施形態において、例えば、順序ＶＬ−（リンカー）−ＶＨの一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記第二のアミノ酸配列からＮ末端にある場合、３つのＶＨドメインは、それぞれ、前記第二のポリペプチドリンカーと、前記第三、第四、及び第五のポリペプチドリンカーのうちの１つによって互いに連結される（図１及び４を参照）
【００６６】
よって、特定の実施形態において、前記第一及び前記第二の一本鎖タンパク質の少なくとも１つは、それぞれ、２つのポリペプチドリンカーによって連結された３つのＶＬドメイン又は３つのＶＨドメインから成るアミノ酸配列を含んでなる。
【００６７】
他の特定の実施形態において、前記第一又は第二のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、対応するリンカーを介して直接的連結される当該抗体ベースの結合ドメインの可変ドメインは、（ａ）それが前記第一のアミノ酸配列に融合される場合には、ＶＨドメイン、そして、（ｂ）それが前記第二のアミノ酸配列に融合される場合には、ＶＬドメイン、である。よって、ＶＨドメインは、ＶＬ−リンカー−ＶＬコア領域のＮ末端及び／又はＣ末端に融合され、そして、ＶＬドメインは、ＶＨ−リンカー−ＶＨコア領域のＮ末端及び／又はＣ末端に融合される（例えば、図３を参照）。
【００６８】
特定の実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六の結合ドメインは、一本鎖Ｆｖフラグメントである。
【００６９】
特定の斯かる実施形態において、前記一本鎖Ｆｖフラグメントの可変ドメインを接続するポリペプチドリンカーは、１５〜２５アミノ酸残基、特に２０アミノ酸残基から成る。特定の実施形態において、前記ポリペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）n｛ｎが３、４、及び５から選択され、特に４である｝を有する。
【００７０】
特定の実施形態において、前記抗体可変ドメインの少なくとも１つは、親ウサギ抗体由来のＣＤＲ領域を含んでなる。
【００７１】
特定の実施形態において、前記抗体可変の領域の少なくとも１つは、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【００７２】
特定の斯かる実施形態において、前記ＶＬドメインの少なくとも１つが、（ｉ）ヒトＶＫフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩ；（ｉｉ）ＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；並びに（ｉｉｉ）フレームワーク領域ＩＶを含んでなり：
ａ．フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列、特にＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１６〜２２から選択されるＶλ生殖系配列；
ｂ．Ｖλベースの配列であって、（ｂｉ）フレームワーク領域ＩＶのためのヒトＶλ生殖系配列由来のコンセンサスＶλ配列、特にＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１７；又は（ｂｉｉ）フレームワーク領域ＩＶのための再配列されたヒトＶλ配列由来のコンセンサスＶλ配列、特にＷＯ２０１４／２０６５６１による配列番号１６及び１７のリストから選択されるＶλコンセンサス配列であるＶλベースの配列；及び、
ｃ．Ｖλベースの配列であって、フレームワーク領域ＩＶのための最も近いヒトＶλ生殖系配列と比較して、１又は２の突然変異、特に１つの突然変異を有するＶλベースの配列、
から選択される。
【００７３】
特定の実施形態において、前記第一及び前記第二のＶＬ及びＶＨドメインのうちの１つの同族対は：癌標的；及び例えばＣＤ３などの免疫エフェクタ細胞に存在する標的、のリストから選択される抗原に対して特異性である。
【００７４】
特定の斯かる実施形態において、前記第三、第四、第五、及び／又は第六の結合ドメインは：癌の標的及び例えばＣＤ３などの免疫エフェクタ細胞に存在する標的、のリストから選択される標的に対して特異性を有する一本鎖Ｆｖフラグメントである。
【００７５】
本願との関連において、「標的」という用語は、例えば斯かる結合ドメインによって特異的に結合する抗体の抗原などの結合ドメインの同族結合パートナーを指す。
【００７６】
特定の実施形態において、前記標的は、非腫瘍細胞の表面と比較して、高い濃度及び／又は異なる立体配置で１若しくは複数の腫瘍細胞型又は腫瘍関連細胞の表面に存在する癌標的、特に抗原又はエピトープである。特に、前記癌標的は、１若しくは複数の腫瘍又は腫瘍間質細胞型の表面に提示されるが、非腫瘍細胞の表面には提示されない。
【００７７】
他の特定の実施形態において、前記標的は、自己免疫疾患に関与する細胞で優先的に発現される抗原又はエピトープである。他の実施形態において、前記抗原又はエピトープは、炎症性疾患に関与する細胞で優先的に発現される。
【００７８】
特定の実施形態において、前記標的は、免疫エフェクタ細胞に存在する標的である。特定の実施形態において、前記標的はＣＤ３である。
【００７９】
特定の実施形態において、前記第一及び前記第二の一本鎖タンパク質は、以下のリストから選択され、ここで、ＶＬＡ、ＶＬＢ、ＶＨＡ、及びＶＨＢは、前記第一及び第二のＶＬ及びＶＨドメインに相当し、並びにＶＬＣ、ＶＬＤ、ＶＬＥ、ＶＬＦ、ＶＨＣ、ＶＨＤ、ＶＨＥ、及びＶＨＦは、それぞれ、第三、第四、第五、及び／又は第六のリンカーＬＩＮＫＥＲ３、ＬＩＮＫＥＲ４、ＬＩＮＫＥＲ５及びＬＩＮＫＥＲ６を介して（太文字の）コア領域に連結した、前記第三、第四、第五、及び／又は第六の機能ドメインに対応するリンカーを伴った一本鎖フラグメントの一部であり；すべてのコンストラクトが、Ｎ末端からＣ末端に向かって記載されている：
【００８０】
Ａ（並列６Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
鎖２：ＶＬＥ−（リンカー）−ＶＨＥ−（ＬＩＮＫＥＲ５）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ６）−ＶＬＦ−（リンカー）−ＶＨＦ
【００８１】
Ｂ（逆並列６Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
鎖２：ＶＬＥ−（リンカー）−ＶＨＥ−（ＬＩＮＫＥＲ５２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ６）−ＶＬＦ−（リンカー）−ＶＨＦ
【００８２】
Ｃ１（逆並列４Ｆｖｓ）（図１を参照）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ
【００８３】
Ｃ２（逆並列４Ｆｖｓ）（図３を参照）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【００８４】
Ｃ３（逆並列４Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ
【００８５】
Ｃ４（逆並列４Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【００８６】
Ｄ１（並列４Ｆｖｓ）（図４を参照）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ
【００８７】
Ｄ２（並列４Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ
鎖２：ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【００８８】
Ｄ３（並列４Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ
【００８９】
Ｄ４（並列４Ｆｖｓ）：
鎖１：ＶＬＡ−（ＬＩＮＫＥＲ１）−ＶＬＢ−（ＬＩＮＫＥＲ３）−ＶＬＣ−（リンカー）−ＶＨＣ
鎖２：ＶＨＡ−（ＬＩＮＫＥＲ２）−ＶＨＢ−（ＬＩＮＫＥＲ４）−ＶＬＤ−（リンカー）−ＶＨＤ
【００９０】
このフォーマットでは、一方のタンパク質鎖上の２つの分割可変重ドメインＶＨＢとＶＨＣ、及びもう片方のタンパク質鎖上の２つの対応する可変軽ドメインＶＬＢとＶＬＣ（ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬ）の局在が、鎖内領域対合の形成を妨げ、そして、それが、−Kipriyanovらによって示唆された設計に類似した−従来の二重特異性抗体のＶＨ−ＶＬ／ＶＨ−ＶＬ配置がヘテロ二量体化を駆動するのに使用される場合であるから、不活性な一本鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）様構造物をもたらす。対照的に、ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬ配置は、排他的にヘテロ二量体二重〜六重特異性タンパク質の形成が強制される。
【００９１】
標的Ａ及びＢ結合ＶＨＡ−ＶＨＢ／ＶＬＡ−ＶＬＢコア領域のＶＨ／ＶＬドメイン対合が、ＶＬＡとＶＬＢ及びＶＨＢとＶＨＡの不適当な対合のため不活性なコア領域をもたらし、そして、ＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ組をもたらす、理論上の可能性がある。思いがけなく、且つ、驚いたことに、斯かる不活性変異体は、今までのところ観察されていない。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、二量体化は、非マッチング対合で生じる潜在的充填干渉とは対照的に、同族対のＣＤＲのより効率的な充填による同族対合に向かって駆動されることもあり得る。
【００９２】
ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬコア領域の活性対合に向かってヘテロ二量体化を更に駆動するために、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ又は同様の技術が、ＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬコア領域のＶＬ／ＶＨ対の一方に、又は−相互的に適用される場合−その両方に適用されることもあり得る。よって、特定の実施形態において、前記ヘテロ二量体タンパク質のＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬコア領域の活性対合は：ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ及び鎖間システイン架橋、から選択される技術によって更に裏付けられる。
【００９３】
第二の態様において、本発明は、前記第一及び第二の一本鎖タンパク質をコードする１つ又は２つの核酸配列に関する。
【００９４】
第三の態様において、本発明は、前記１つ又は２つの核酸配列を含んでなる、１つ又は２つのベクターに関する。
【００９５】
第四の態様において、本発明は、１つ又は２つのベクターを含んでなる、１つ又は複数の宿主細胞に関する。
【００９６】
第四の態様において、本発明は、本発明の第一及び第二の一本鎖タンパク質、又はヘテロ二量体タンパク質を製造する方法に関し、当該方法は、（ｉ）本発明による１つ又は２つの核酸を提供するか、又は本発明による１つ又は２つのベクターを提供し前記１つ又は２つの核酸、又は前記１つ又は２つのベクターを発現させ、そして、前記第一若しくは第二の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質をその発現系から回収すること、或いは、（ｉｉ）本発明の１つ又は複数の宿主細胞を提供し、前記１つ又は複数の宿主細胞を培養し、そして、前記第一及び第二の一本鎖タンパク質、又は前記ヘテロ二量体タンパク質をその細胞培養物から回収すること、を含む。
【００９７】
第五の態様において、本発明は、本発明のヘテロ二量体タンパク質と医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【００９８】
第六の態様において、本発明は、癌、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾病の処置に使用するための本発明のヘテロ二量体タンパク質に関し、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの前記同族対、又は前記第三、第四、第五、又は第六の機能ドメインのうちの少なくとも１つが、対応する疾患に関して治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【００９９】
第七の態様において、本発明は、癌、炎症性疾患、及び自己免疫疾患から選択される疾病に罹患している患者を治療する方法に関し、当該方法は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の有効量を対象に投与することを含み、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインの前記同族対、又は前記第三、第四、第五、又は第六の機能ドメインのうちの少なくとも１つが、対応する疾患に関して治療関連の標的と特異的に相互作用することができる。
【０１００】
文献
【化１】
2018522545.tif 000003
【０１０１】
【化２】
2018522545.tif 000004
【０１０２】
【化３】
2018522545.tif 000005
【実施例】
【０１０３】
実施例１：多重特異性フォーマットの構築
同族ヘテロ二量体化（ＭＡＴＣＨ）による、多重特異性抗体ベースの治療薬と名づけられたヘテロ二量体多重特異性フォーマットの構築のために、それぞれヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）、ヒトインターロイキン−５受容体（ＩＬ５Ｒ）、ヒトＣＤ３イプシロン（ＣＤ３）及びインターロイキン−２３受容体（ＩＬ２３Ｒ）に対する、十分に特徴づけした４種類の可変ドメインを選択した。ｓｃＦｖフォーマットにおけるそれぞれの可変ドメインの既知の結合特性に基づいて、活性とそれによる同族ＶＬ／ＶＨ対の正しい結合を、多重特異性分子との関連において評価した。分子周縁部のそれぞれの可変ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとしてそれぞれのタンパク質鎖のアミノ（Ｎ）末端又はカルボキシル（Ｃ）末端のいずれかに位置するか、又はヘテロ二量体化コア領域に位置した。ＶＬ及びＶＨが同じタンパク質鎖上に配置された周縁部ｓｃＦｖフラグメントとは対照的に、コア領域の同族可変ドメインのＶＬ及びＶＨは、２つの異なるタンパク質鎖上に位置した。以下に提示した実施例では、２つのコア領域に位置する標的結合ドメインは、それぞれＣＤ３又はＴＮＦに向けられている。ＩＬ２３Ｒ又はＩＬ５Ｒに結合する可変ドメインを、１０又は１５アミノ酸の多目的アミノ酸リンカーを使用したコア領域のＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合された周縁部ｓｃＦｖモジュールに使用した。
【０１０４】
本明細書中に提示したヘテロ二量体コア集合体の異なるバリエーションについて調査するために、それぞれコア領域のＮ又はＣ末端に付加された１つ又は２つの追加ｓｃＦｖモジュールを有する、並列方向、並びに逆並列方向の同族可変ドメイン対を製造した。
【０１０５】
逆並列配置では、コア領域は、それぞれのタンパク質鎖（タンパク質鎖１〜９）のＮ末端からＣ末端に向かって、ＶＨＡ−ＶＨＢ／ＶＬＢ−ＶＬＡの方向で構築された。一実施形態において、四重特異性フォーマットは、それぞれ２つのタンパク質鎖（タンパク質鎖１＋２から成るコンストラクト）への１つのｓｃＦｖモジュールのＮ末端融合によって形成される。対応する三重特異性フォーマットは、２つのタンパク質鎖（コンストラクト１＋５）のうちの一方だけに融合したｓｃＦｖモジュールを含んでいる。遺伝子操作したジスルフィド架橋によるコア領域集合体の見込まれる安定化効果を調査するために、上記の２つのフォーマットを、それぞれのタンパク質鎖のコア領域における同族Ｆｖｓの架橋をもたらすＣ末端システインも用いて製造した。それぞれのヘテロ二量体フォーマットは、四重特異性フォーマットではタンパク質鎖３＋４、そして、三重特異性フォーマットではタンパク質鎖４＋６から成る。逆並列配置のバリエーションでは、コア領域にタンデムＶＨを含有する鎖に配置されたｓｃＦｖモジュールが、Ｎ末端ではなくＣ末端に融合され、そして、Ｎ末端にて組み立てられたｓｃＦｖモジュールを含有するタンパク質鎖と組み合わせられ、四重特異性フォーマット（タンパク質鎖１＋７）をもたらすか、又はコア領域だけを含有するタンパク質鎖と組み合わせられ、三重特異性フォーマット（タンパク質鎖５＋７）をもたらす。
【０１０６】
並列配置では、コア領域は、それぞれのタンパク質鎖配置のＮ末端からＣ末端に向かって、ＶＨＡ−ＶＨＢ／ＶＬＡ−ＶＬＢの方向で構築された。コア領域のＮ末端側に融合した両方のｓｃＦｖモジュールを伴う、四重特異性フォーマットを、タンパク質鎖９＋１０の同時発現によって製造した。タンデムＶＨ含有鎖上に単独でｓｃＦｖモジュールを伴った、対応する三重特異性集合体を、タンパク質鎖１０＋１１の同時発現によって製造した。
表１に概説したコンストラクトを製造するために、Ｆｖ領域及びリンカーのアミノ酸配列を、対応する核酸配列内に逆翻訳し、そしてそれをデノボ合成した。コード配列を組み立て、そして、標準的な分子生物学技術（例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual）によって、遺伝子組み換えタンパク質分泌のために好適な発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、Invitrogen）内にクローニングした。
【０１０７】
実施例２：発現と精製
多重特異性フォーマット集合体の発現を、一過性遺伝子発現プロトコール（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸシステム）を使用して懸濁細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｓ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）、Invitrogen）内へのコンストラクトの同時形質移入によって実施した。多重特異性フォーマット集合体の作出のための同時発現される発現ベクターの組み合わせを、表２に概説する。数日間の培養後に、抗体フラグメント分泌細胞の上清を、精製のために回収した。タンパク質を、好適な親和性樹脂（例えば、Capto L、GE Healthcare）上に捕捉させ、十分に洗浄し、そして、ｐＨシフトによって溶出した。溶出したタンパク質を、中和し、そして、バッファー交換して、精製プールを得た。そのタンパク質を、純度についてサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）（表３及び図５）及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（図６）によって分析し、並びにタンパク質含有量についてＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって分析した。タンパク質濃度を要求される水準に調整し、そして、安定性分析を実施した。
【０１０８】
シングルステップ親和性クロマトグラフィー手順を用いて、すべてのコンストラクトを高純度且つ単量体画分の状態で溶出し（図５及び６）、同族可変ドメインの効果的且つ正しい対合を確認した。更に、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＰＲ０３５７が、共有結合したヘテロ二量体（〜１０６ｋＤａ）のサイズに量的に大部分が移行し、適当なＭＡＴＣＨ鎖間結合を裏付け、そして、鎖間ジスルフィド結合の高能率且つほぼ完全な形成を実証した。構造的制約のため、誤対合した可変ドメインの間このジスルフィド結合の形成は、非常に可能性が低い。そのため、この結果は、ほぼ例外なくヘテロ二量体化が同族可変ドメイン対の間で起こったことを示唆する。
【０１０９】
実施例３：保存安定性の評価
効果的なＭＡＴＣＨ鎖二量体化を、タンパク質Ｌ精製サンプル中のタンパク質含有量の顕著な均質性によって更に実証した。タンパク質を、４週間、且つ、４℃及び３７℃での保存の経過にわたって、ＳＥ−ＨＰＬＣによってオリゴマー化に関して、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解に関して分析した（図７〜９を参照）。この試験前に、サンプル濃度を１ｇ／Ｌに調整し、ｔ０時点にて測定した。単量体含有量を、Shodex KW-402.5-4F（Showa Denko）上でサンプルを分離し、生じるクロマトグラムの評価により定量する。タンパク質モノマーの相対的割合の算出のために、モノマーのピーク面積を、サンプルマトリックスに帰すことができないピークの総面積で割る。タンパク質分解を、Any kD Mini-Protean TGXゲル（Bio-Rad Laboratories）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価し、クマシーブリリアントブルーを用いて染色する。タンパク質濃度を、Nanoquant プレート（Tecan Group Ltd.）を取り付けたInfinity reader M200 Proを用いてＵＶ−Ｖｉｓ分光法により、異なる時点にて追跡する。本出願に開示したものに密接に相関するコンストラクトを用いて作成された代表的データを表３に示す。
【０１１０】
実施例４：熱変性
試験したコンストラクトの熱変性の転移の中点を、示唆走査フローサイトメトリー（ＤＳＦ）によって、基本的にNiesenによって記載されているように決定した（Niesen et al., Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21）。ＤＳＦアッセイをｑＰＣＲ装置中で実施する（例えば、MX3005p、Agilent Technologies）。サンプルを、２５μｌの合計体積の最終濃度の５×ＳＹＰＲＯオレンジを含有する緩衝剤（クエン酸−リン酸ｐＨ６．４、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）中で希釈した。サンプルを三連で測定し、温度を２５から９６℃に傾斜するようにプログラムした。蛍光シグナルを取得し、生データをGraphPad Prismを用いて解析した（GraphPad Software Inc.）。
【０１１１】
実施例５：親和性の測定
遺伝子組み換え標的タンパク質であるヒトＩＬ−５受容体（ＩＬ５Ｒ）、ヒトＩＬ−２３受容体ＥＣＤ（ＩＬ２３Ｒ）、ヒトＣＤ３ガンマ−イプシロン一本鎖（ＣＤ３）に対する、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォーマットの個々の標的結合ドメイン、並びに精製したヘテロ二量体四重特異性コンストラクトの結合親和性を、ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）を使用した表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって計測した。親和性測定（ＨＥＰＥＳ泳動バッファー：０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣＩ、０．０５％のＴｗｅｅｎ中で実施）のために、ヒトヘテロ二量体一本鎖ＣＤ３γδ細胞外領域（社内で製造）、ヒトＩＬ５Ｒ（R&D Systems）、ヒトＩＬ２３Ｒ（Trenzyme）及びヒトＴＮＦ（Peprotech）標的タンパク質を、標準的なアミン結合手順を使用して、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity Amine、Sierra Sensors）上にそれぞれの個々の標的に最適化したバッファー系を使用して１００〜２５０ＲＵｓにて固定した。ヒトＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ）のために、標準的なアミンセンサーを使用した。９０〜０．７０３ｎＭの範囲にわたる精製ヘテロ二量体四重特異性コンストラクトの二倍希釈系列を、３分間（２０μｌ／分）フローセル内に注入し、そして、分離を７２０秒間継続させた。それぞれの注入サイクル後に、表面を、１０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣＩ ｐＨ１．５の４５秒間の注入を用いて再生した。平均Ｃｈｉ2が１０％又はＲmaxを下回るように、少なくとも６つの濃度のセンソグラムを当てはめることによって、親和性を計算した。ＴＮＦに関しては、希釈系列ではなく、９０ｎＭにて単一濃度の測定だけを実施した。データから二重に差し引いた（基準チャンネル及び対照サイクルを差し引いた）。
【０１１２】
それぞれ４つの標的に対するヘテロ二量体四重特異性コンストラクトの親和性は、免疫反応が適切な二量体化に依存すると考えられるそれらのＣＤＲｓを含む、四重特異性フォーマットに使用される個々の結合ドメイン（ｓｃＦｖｓ）の親和性（すなわち、それぞれＴＮＦαとＣＤ３εを標的とする二量体を形成するＦｖｓによって示されるもの）と非常に類似していた。これは、四重特異性コンストラクトのそれぞれの可変ドメインの完全な機能性を実証し、そして、同族可変ドメイン対の正しい集合体を確認する。
【０１１３】
更に、３つの多重特異性はそれぞれ、固定されたＭＡＴＣＨタンパク質のＳＰＲ分析によって実証されるように、抗原接触の順序の如何にかかわらず、同時に４つの標的抗原のすべてに結合することができる（図１１）。これらのデータは、適切なＭＡＴＣＨ鎖間集合体を示唆している一方で、それらが、非同族可変ドメイン結合の不存在、具体的には、キメラＣＤＲセットを生じさせるＭＡＴＣＨ鎖の「逆」対合、を必ず示すというわけではないことを認識することは重要である。ＣＤＲセットが、ＶＬ−ＶＨ対合の効率に影響を及ぼすことが示唆され、そして、我々のＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＳＰＲデータは、ＭＡＴＣＨ鎖の同族対合が、非常に都合が良いことを示唆しているように思われる。しかしながら、ＭＡＴＣＨ鎖の逆対合の程度を評価する試みにおいて、我々は、モル当量の三量体ＴＮＦα（すなわち、３倍過剰量のＴＮＦαエピトープ）を伴ったＭＡＴＣＨタンパク質のインキュベーション後に、抗体及び抗体−抗原複合体のＳＥ−ＨＰＬＣ分析法を実施した。この分析方法を親抗ＴＮＦα ｓｃＦｖに適用するとき（データ未掲載）、ＳＥ−ＨＰＬＣトレースは、１、２、３倍のｓｃＦｖ：ＴＮＦα複合体の異なるサイズを反映する、３つの異なる抗体−抗原複合体集団と一致した離散的なピークを示した。更に、溶液中の残りの、非複合型ＴＮＦαの存在と一致するピークが観察された一方で、非複合型ｓｃＦｖは、溶液から完全に無くなっており、よって、この方法の適用の正当性を確認することにより、「不活性な」抗ＴＮＦα抗体を同定する。
【０１１４】
ＭＡＴＣＨタンパク質及びＭＡＴＣＨ−抗原複合体の分離は、多重特異性分子の大きい分子量のためそれほど効果的でなかった。しかしながら、我々の結果（図１２）はまた、３つのＭＡＴＣＨ−ＴＮＦα複合体集団と残留非複合型ＴＮＦαの存在を明確に解明した。更に、１×ＭＡＴＣＨ：ＴＮＦα複合体ピークの「ショルダリング (shouldering)」は、非活性であるが、二量体のＭＡＴＣＨタンパク質の存在を示唆した。溶液中の不活性なＭＡＴＣＨタンパク質の割合を概算するために、ピークを、各ピークにガウス分布を仮定するPeakFit v.1.2ソフトウェアを使用して解析し、そして、適合度を最適化するようにプロットした（図１２）。この分析では、不活性なＭＡＴＣＨタンパク質の割合が、総ＭＡＴＣＨタンパク質含有量の４．７〜１１．４％（ＰＲ０３５７＜ＰＲ０３５６＜ＰＲ０３５５）であることが概算され、そして、ＭＡＴＣＨ鎖の適切な二量体化が、特に逆並列フォーマットにおいて、非常に好都合であることが裏付けられた。
【０１１５】
【表１】
2018522545.tif 000006
【０１１６】
【表２】
2018522545.tif 000007
【０１１７】
【表３】
2018522545.tif 000008
【０１１８】
【表４】
2018522545.tif 000009
【０１１９】
【表５】
2018522545.tif 000010
【図１】
2018522545.tif 000011
【図２】
2018522545.tif 000012
【図３】
2018522545.tif 000013
【図４】
2018522545.tif 000014
【図５−１】
2018522545.tif 000015
【図５−２】
2018522545.tif 000016
【図６−１】
2018522545.tif 000017
【図６−２】
2018522545.tif 000018
【図７】
2018522545.tif 000019
【図８】
2018522545.tif 000020
【図９】
2018522545.tif 000021
【図１０Ａ】
2018522545.tif 000022
【図１０Ｂ】
2018522545.tif 000023
【図１１−１】
2018522545.tif 000024
【図１１−２】
2018522545.tif 000025
【図１２−１】
2018522545.tif 000026
【図１２−２】
2018522545.tif 000027
【図１２−３】
2018522545.tif 000028
【配列表】
2018522545000001.app
【国際調査報告】
2018522545.tif 000029
2018522545.tif 000030
2018522545.tif 000031
2018522545.tif 000032