(57)【要約】  本出願は、分析物を検出するためのバイオセンサー、各種キットおよびその使用方法に関する。特に、本バイオセンサーの動作モードは、ローリングサークル増幅および分析物の存在の指標としての増幅産物の検出を引き起こす、核酸配列に対する分析物の結合に基づいている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）鋳型である環状単鎖核酸分子と、
（ｂ）分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子と、
（ｃ）前記ＲＣＡ鋳型のためのプライマーである第１の核酸配列およびエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによって消化される第２の核酸配列を含む直鎖状単鎖核酸分子と
を含み、
前記分析物の非存在下では前記直鎖状単鎖核酸分子の前記第１の核酸配列は前記環状単鎖核酸分子の一部に結合し、かつ前記直鎖状単鎖核酸分子の前記第２の核酸配列は前記分析物に結合する単鎖核酸分子の一部に結合し、前記分析物の存在下では前記分析物に結合する単鎖核酸分子の前記一部に対する前記直鎖状単鎖核酸分子の前記第２の核酸配列の前記結合は破壊され、それにより前記第２の核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性を有する前記核酸ポリメラーゼによる消化のために利用可能にすることを特徴とする核酸アセンブリーを含む、分析物を検出するためのバイオセンサー。
【請求項２】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は独立してＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子から選択される、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はＤＮＡ分子である、請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はＲＮＡ分子である、請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はＤＮＡおよびＲＮＡ分子の組み合わせを含む、請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子は、核酸アプタマー、核酸酵素および核酸分子のアンチセンス配列から選択される、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記核酸アプタマーはＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーである、請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記核酸酵素はＤＮＡザイムまたはリボザイムである、請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
核酸分子の前記アンチセンス配列はウイルス核酸配列のアンチセンス配列または細菌核酸配列のアンチセンス配列である、請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
核酸ポリメラーゼをさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
前記核酸ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである、請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記核酸ポリメラーゼはφ２９ＤＰである、請求項１１および請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
分析物を含むことが疑われている試料において分析物を検出する方法であって、前記試料を請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサーと接触させる工程と、前記試料中の前記分析物の存在を示す前記ＲＣＡ鋳型からの核酸産物の存在を監視する工程とを含む方法。
【請求項１５】
前記分析物は、小分子薬物、ホルモン増殖因子、生体分子、毒素、ペプチド、タンパク質、ウイルス、細菌、細胞および組織から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＣＡ鋳型からの前記核酸産物は単鎖ＤＮＡ分子または単鎖ＲＮＡ分子である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＣＡ鋳型からの前記核酸産物の存在を電気泳動システムを用いて監視し、かつ前記分析物の存在を単一の分子量バンドの検出によって確認する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記電気泳動システムは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＣＡ鋳型からの前記核酸産物の存在を蛍光システムを用いて監視し、かつ前記分析物の存在を蛍光シグナルの検出によって確認する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光システムは飽和核酸挿入蛍光色素を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記飽和核酸挿入蛍光色素はシアニン色素である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が前記分析物を含む場合に、前記試料を請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオセンサーと接触させる工程により、
（ａ）前記直鎖状単鎖核酸分子の前記第２の核酸配列からの前記分析物に結合する単鎖核酸配列の放出を生じさせる、前記分析物に結合する単鎖核酸分子に対する前記分析物の結合、
（ｂ）前記第１の核酸配列を含む成熟したプライマー核酸配列を生じさせる、前記核酸ポリメラーゼによる前記第２の核酸配列のエキソヌクレアーゼ消化、および
（ｃ）前記環状単鎖核酸分子を用いるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を開始させて監視される単鎖核酸産物を産生させるための、前記成熟したプライマー核酸配列に対する前記核酸ポリメラーゼの結合
を誘導する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサーおよび核酸ポリメラーゼを含む分析物検出キット。
【請求項２４】
前記核酸ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡポリメラーゼである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記核酸ポリメラーゼはφ２９ＤＰである、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサーを用いてアッセイを行うための試薬をさらに含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
前記アッセイにおいて前記バイオセンサーを使用するための説明書および前記アッセイを行うために必要なあらゆる対照をさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
請求項１４〜２２のいずれか１項に記載のアッセイ方法のいずれかを行うために必要な全ての構成要素を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１８２，７１１号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、分析物を検出するためのバイオセンサー、各種キットおよびその使用方法に関する。特に、本バイオセンサーは、プライマーの活性化および増幅反応が分析物の結合によって引き起こされるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）鋳型を含む。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ増幅は、ゲノム科学、分子診断、化学生物学およびＤＮＡナノ技術における有益な手段である。ポリメラーゼ連鎖反応［１］に加えて、「ローリングサークル増幅」（ＲＣＡ）として知られている等温ＤＮＡ増幅法が最近になって大きな注目を集めている［２，３］。ＲＣＡでは、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＰ）などの鎖置換能力および高処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼによって環状ＤＮＡ鋳型上でＤＮＡプライマーを伸長させる［４］。これらのポリメラーゼは、新しく合成されたＤＮＡ鎖を環状鋳型から連続的に取り外し、それを何回ものコピーのために利用可能にすることができる。ＲＣＡ産物は何千もの繰り返し単位を有する極めて長い単鎖（ｓｓ）ＤＮＡである［２，３］。その増幅力および操作単純性により、ＲＣＡは一般的なＤＮＡ増幅法となった［５〜９］。
【０００４】
自然な働きでＤＮＡポリメラーゼは複数の機能を有する優れた酵素に進化してきた。例えば、φ２９ＤＰはそのＤＮＡ重合および鎖置換機能［４］に加えて、ｓｓＤＮＡ（但し二本鎖ＤＮＡではない）の３’−５’エキソヌクレアーゼ消化を行うことができる［１０］。ＤＮＡポリメラーゼの中で一般的な核酸分解活性は、生体内でＤＮＡ複製を校正するように進化されてきた［１１］。但し、この性質は生体外用途のために探究されることは稀である。
【発明の概要】
【０００５】
本出願は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）と、標的認識およびエキソヌクレアーゼトリミングのための構造スイッチング核酸分子と、２つの二本鎖三部分核酸アセンブリーを特徴とする核酸ポリメラーゼの核酸依存性重合機能とを独自に一体化させた汎用的増幅バイオセンシング戦略を実証する。本出願のバイオセンシング戦略は、その対応する分析物に結合する構造スイッチング核酸分子の解離定数よりも数桁低い検出限界を与えることができる。
【０００６】
従って、本出願は、
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）鋳型である環状単鎖核酸分子と、
（ｂ）分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子と、
（ｃ）ＲＣＡ鋳型のためのプライマーである第１の核酸配列およびエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによって消化される第２の核酸配列を含む直鎖状単鎖核酸分子と
を含み、
分析物の非存在下では直鎖状単鎖核酸分子の第１の核酸配列は環状単鎖核酸分子の一部に結合し、かつ直鎖状単鎖核酸分子の第２の核酸配列は分析物に結合する単鎖核酸分子の一部に結合し、分析物の存在下では分析物に結合する単鎖核酸分子の一部に対する直鎖状単鎖核酸分子の第２の核酸配列の結合は破壊され、それにより第２の核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによる消化のために利用可能にすることを特徴とする核酸アセンブリーを含む、分析物を検出するためのバイオセンサーを含む。
【０００７】
本出願は、本出願のバイオセンサーを利用するアッセイ方法も含む。いくつかの実施形態では、本アッセイは分析物を含むことが疑われている試料において分析物を検出する方法であって、試料を本出願のバイオセンサーと接触させる工程と、試料中の分析物の存在を示すＲＣＡ鋳型からの核酸産物の存在を監視する工程とを含む方法である。
【０００８】
本出願は、本出願のバイオセンサーを含むキットをさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、バイオセンサーと、バイオセンサーを用いるアッセイを行うための任意のさらなる試薬、例えばエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼとを含む。いくつかの実施形態では、本キットは、本アッセイにおいてバイオセンサーを使用するための説明書と、本アッセイを行うために必要なあらゆる対照とを含む。対照はバイオセンサー自体の上にあっても、代わりとして別個の基板上にあってもよい。いくつかの実施形態では、本キットは、本出願のアッセイ方法のいずれかを行うために必要な全ての構成要素を含む。
【０００９】
本出願の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。但し当然のことながら、詳細な説明および具体例は、本出願の実施形態を示しながらも単に例示として与えられており、特許請求の範囲はこれらの実施形態によって限定されるべきではなく、全体として本説明に一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【００１０】
以下、本出願の実施形態について添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）は本出願のバイオセンサーの一実施形態の概略図を示し、（Ｂ）〜（Ｄ）は２０％ｄＰＡＧＥで分析した、０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰによる１μＭの放射性ＰＰ１を含む１つの例示的なバイオセンサーの消化を示し、（Ｂ）は０〜６０分間でのＰＰ１のみの場合、（Ｃ）は０〜２．５μＭのＡＰ１の存在下３０分間での場合、（Ｄ）は１．５μＭのＡＰ１および０．５ｍＭのＡＴＰの存在下での場合を表す。
【図２】（Ａ）０〜２．５μＭのＣＴ１、（Ｂ）１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＡＰ１、０．５ｍＭのＡＴＰおよび（Ｃ）１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＡＰ１、０．５ｍＭのＧＴＰの存在下での、０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰによる３０分間での１μＭの放射性ＰＰ１を含む本出願の１つの例示的なバイオセンサーの消化を示す。
【図３】本出願の例示的なバイオセンサーにおけるＡＴＰの非存在下（Ａ）および存在下（Ｂ）でのＰＰ１、ＣＴ１およびＡＰ１のＲＣＡ反応からのＲＣＡ産物（ＲＰ）のアガロースゲル分析を示す。
【図４】（Ａ）１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＩ−ＡＰ２および１００ｎＭのＰＤＧＦの存在下３０分間での０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰによる１μＭの放射性ＰＰ２の消化、（Ｂ）および（Ｃ）本出願の例示的なバイオセンサーの１００ｎＭのＰＤＧＦの非存在下および存在下での１μＭのＰＰ２、１μＭのＣＴ１および１．５μＭのＩ−ＡＰ２の様々な組み合わせを含有するＲＣＡ反応混合物におけるＲＰのアガロースゲル分析を示す。
【図５】本出願の例示的なバイオセンサーを用いるＰＤＧＦの検出、すなわち（Ａ）１μＭのＰＰ２、１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＩ−ＡＰ２および増加する濃度のＰＤＧＦを含有するＲＣＡ反応混合物におけるＲＰのアガロースゲル分析、（Ｂ）超分岐ＲＣＡ（ＨＲＣＡ）の作動原理、（Ｃ）ＥｖａＧｒｅｅｎによるＨＲＣＡ反応のリアルタイム蛍光監視（ここでは、濃度は、０（基線）、１ｆＭ（ｘ軸から２番目の線）、１０ｆＭ（ｘ軸から３番目の線）、１００ｆＭ（ｘ軸から４番目の線）、１ｐＭ（ｘ軸から５番目の線）、１０ｐＭ（ｘ軸から６番目の線）、１００ｐＭ（ｘ軸から７番目の線）、１ｎＭ（一番上の線）として表されている）、および（Ｄ）ＰＤＧＦ濃度の関数としての１２０分後の蛍光の読み取りを示す。
【図６】ＰＰ１−ＡＰ１ハイブリッドにおけるφ２９ＤＰによる５’−ＦＡＭで標識したＡＰ１を含む本出願のバイオセンサーの一実施形態の核酸分解消化を示す。各反応を１μＭのＡＰ１、０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰおよび可変濃度のＰＰ１を含有する５０μＬの１×ＲＣＡ反応緩衝液中３０℃で６０分間行った。反応混合物を２０％ｄＰＡＧＥで分析した。
【図７】例示的なバイオセンサー（ＰＰ１−ＡＰ１ハイブリッド）におけるＰＰ１分解に対するＧＴＰの効果を示す。この実験を１μＭのＰＰ、１．５μＭのＡＰ１、０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰおよび０．５ｍＭのＧＴＰを含有する５０μＬの１×ＲＣＡ反応緩衝液中３０℃で３０分間行った。反応混合物を２０％ｄＰＡＧＥで分析した。
【図８】（Ａ）２０％ｄＰＡＧＥで分析した、反応混合物と共に０〜２．５μＭのＣＴ１の存在下３０分間での０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰによる１μＭの放射性Ｉ−ＰＰ１を含む例示的なバイオセンサーの消化、（Ｂ）ＰＰ１−ＣＴ１またはＩ−ＰＰ１−ＣＴ１（Ｉ：ＰＰ１の３’末端における逆方向ｄＴ（画像内のドット））を含有するＲＣＡ反応混合物におけるＲＰの０．６％アガロースゲル分析を示す。
【図９】ＰＤＧＦのための本出願の例示的なバイオセンサーを用いる特異性試験を示す。（Ａ）突然変異アプタマープローブであるＩ−ＡＰ２Ｍ（その配列については表１を参照）によるＲＣＡ反応。標的結合反応を最初に１μＭのＰＰ２、１．５μＭのＩ−ＡＰ２Ｍ、１μＭのＣＴ１、１００ｎＭのＰＤＧＦまたは図示されているこれらの組み合わせを含有する５０μＬの１×ＲＣＡ反応緩衝液中、室温で３０分間行った。次いで、５ＵのＤＮＡＰ、０．４ｍＭのｄＮＴＰを添加してＲＣＡ反応を開始させ、その後３０℃で１時間インキュベートした。（Ｂ）各種タンパク質標的とのＲＣＡ反応。標的結合反応を最初に１μＭのＰＰ２、１．５μＭのＩ−ＡＰ２、１μＭのＣＴ１および１００ｎＭのＢＳＡ、トロンビン、ＩｇＧまたはＰＤＧＦを含有する５０μＬの１×ＲＣＡ反応緩衝液中、室温で３０分間行った。反応混合物を０．６％アガロースゲルで分析した。
【図１０】１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＩ−ＤＰ１および１００ｎＭのHCV-1 DNAの存在下３０分間での０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰによる１μＭの放射性ＰＰ３を含む本出願の例示的なバイオセンサーの消化を示す。反応混合物を２０％ｄＰＡＧＥで分析した。
【図１１】本出願の例示的なバイオセンサーのＤＮＡ検出を示す。（Ａ）は０．２ｐＭ（ｘ軸から５番目の線）、２ｐＭ（ｘ軸から６番目の線）、２０ｐＭ（ｘ軸から７番目の線）、０．２ｎＭ（ｘ軸から８番目の線）、２ｎＭ（ｘ軸から９番目の線）および２０ｎＭ（一番上の線）の濃度におけるＨＣＶ−１の検出のためのＨＲＣＡ反応のＥｖａＧｒｅｅｎを用いた蛍光監視を示し、（Ｂ）は０ａＭ（ｘ軸から１番目の線）、２０ａＭ（ｘ軸から２番目の線）、０．２ｆＭ（ｘ軸から３番目の線）、２ｆＭ（ｘ軸から４番目の線）および２０ｆＭ（一番上の線）の濃度におけるＨＣＶ−１の検出のためのＨＲＣＡ反応のＥｖａＧｒｅｅｎを用いた蛍光監視を示し、（Ｃ）はＨＣＶ−１濃度の関数としての０．０２〜２００ｆＭのＨＣＶ−１によるＨＲＣＡ反応から１８０分後の蛍光の読み取りを示し、（Ｄ）はＨＣＶ−Ｍ１（ｘ軸から１番目の線）、ＨＣＶ−Ｍ２（ｘ軸から２番目の線）およびＨＣＶ−１（一番上の線）の特異性試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．定義
特に明記しない限り、この箇所および他の箇所に記載されている定義および実施形態は、当業者によって理解されるようにそれらが好適である本明細書に記載されている出願の全ての実施形態および態様に適用可能であることが意図されている。
【００１３】
ここで使用される「分析物」という用語は、本出願のバイオセンサーを用いて検知または検出したいあらゆる物質を意味する。「分析物」という用語は、限定されるものではないが、コンビナトリアルライブラリーおよび生物または自然環境からの試料などの化合物または物質の混合物を含む。
【００１４】
ここで使用される「試料」という用語は、本出願のバイオセンサーを用いてアッセイしたいあらゆる材料を指す。当該試料は、あらゆる提供源、例えばあらゆる生物提供源（例えばヒトまたは動物の医学的試料）、環境提供源（例えば水または土壌）、天然源（例えば植物）、あるいは、あらゆる製造または合成提供源（例えば食品または飲料）からのものであってもよい。当該試料は１種以上の分析物を含んでいるか含むことが疑われているものである。
【００１５】
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。
【００１６】
ここで使用される「アプタマー」という用語は、例えばピコもしくはナノモル範囲の解離定数を有する特定の分析物に結合する特定の３次元（３Ｄ）構造に折り重なる短い化学合成された単鎖（ｓｓ）ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。
【００１７】
ここで使用される「ローリングサークル増幅」または「ＲＣＡ」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの環状分子の複数のコピーを素早く合成することができる一方向性核酸複製を指す。ＲＣＡという用語は、順方向および逆方向プライマーの両方を用いることによってＲＣＡの感度を高めるためのローリングサークル増幅由来の技術である「超分岐ローリングサークル増幅」または「ＨＲＣＡ」も含む。
【００１８】
ここで使用される「エキソヌクレアーゼトリミング」または「エキソヌクレアーゼ消化」という用語は、核酸エキソヌクレアーゼによってポリヌクレオチド鎖の末端（エキソ）からヌクレオチドを１つずつ切断することを指す。
【００１９】
ここで使用される「ゲル電気泳動」または「電気泳動システム」という用語は、タンパク質または核酸を含む生物学的巨大分子をそれらの電気泳動易動度に従って分離するための技術（核酸電気泳動）を指す。ゲル電気泳動プロセスは変性もしくは非変性条件下で行うことができる。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲においてここで使用される単数形の「１つの（ａ）」、の「１つの（ａｎ）」および「前記（その）（ｔｈｅ）」はその内容が明らかに他の意を示していない限り複数の参照物を含む。従って、例えば「分析物」を含有する組成物は、１種のそのような分析物または２種以上の分析物の混合物を含む。
【００２１】
本出願および特許請求の範囲で使用される「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のあらゆる形態、例えば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」のあらゆる形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のあらゆる形態、例えば「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」）、あるいは「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」のあらゆる形態、例えば「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」）という言葉は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる列挙されていない要素またはプロセス工程を排除しない。
【００２２】
本出願および特許請求の範囲で使用される「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という言葉およびその派生語は、記載されている特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在を明示すると共に他の記載されていない特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の存在を排除するクローズドエンド用語であることが意図されている。
【００２３】
ここで使用される「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語は、述べられている特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程ならびにこれらの特徴、要素、構成要素、群、整数および／または工程の基本的および新規な特性に実質的に影響を与えないものの存在を明示することが意図されている。
【００２４】
ここで使用される「約」、「実質的に」および「およそ」という用語は、最終結果が著しく変化しないように修正される用語の妥当な量の偏差を意味する。これらの程度に関する用語は、その偏差がそれにより修正される用語の意味を否定しなければ、修正される用語の少なくとも±５％の偏差を含むものとして解釈されるべきである。
【００２５】
ここで使用される「および／または」という用語は、列挙されている項目が個々または組み合わせで存在するか使用されることを意味する。実際にはこの用語は、列挙されている項目の「少なくとも１つ」または「１つ以上の」が使用されるか存在することを意味する。
【００２６】
ここで使用される「好適な」という用語は、特定の化合物または条件の選択が行われる特定の操作および変換される分子の同一性に依存するが、その選択は当業者の技量の範囲内であることを意味する。
【００２７】
ＩＩ．本出願のバイオセンサー
標的認識のための構造スイッチング核酸配列をφ２９ＤＰなどの核酸ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼトリミングおよびＤＮＡ依存性重合機能の両方と独自に一体化させた汎用的増幅バイオセンシング戦略が本出願に実証されている。本バイオセンサーは、環状ＤＮＡ鋳型、プレプライマーおよび分析物結合／認識配列を含む、２つの二本鎖三部分ＤＮＡアセンブリーを特徴とする。標的に誘導された分析物結合／認識配列構造スイッチングイベントは、核酸ポリメラーゼによって行われるトリミングイベントのための制御要素として機能し、次いで、同様に核酸ポリメラーゼによって実行される増幅イベントを制御する。本出願人の知識が及ぶ限りでは、一体化された認識−消化−増幅戦略は以前に報告されたことはない。さらに、この手法を小分子、タンパク質およびＤＮＡを含む広範囲の標的の検出のために採用することができる。ＨＲＣＡの組み込みにより、本出願のバイオセンシング戦略はアプタマーの解離定数よりも数桁も低い検出限界を与えることができ、例えばアトモル濃度ほどに低い分析物が検出される。従って、本手法はその標的のために比較的低い親和性を有する分析物結合／認識配列を超高感度バイオセンシングシステムに変えることができる。生体外選択によって好都合に作製することができる現在入手可能な多種多様な分析物結合／認識配列および新しい配列を用いれば、ここに記載されている戦略が多様な用途を有することが想定される。
【００２８】
従って、本出願は、ＲＣＡのための鋳型として使用することができる環状単鎖核酸配列（いくつかの実施形態では環状鋳型と呼ぶ）、遮断しているヌクレオチドの消化時にＲＣＡのためのプライマーとして使用することができる単鎖核酸配列（いくつかの実施形態ではプレプライマーと呼ぶ）、および分析物に結合する単鎖核酸配列（いくつかの実施形態では結合配列と呼ぶ）からなる核酸アセンブリーを含む分析物依存性ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を可能にするバイオセンサーを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、環状鋳型、プレプライマーおよび結合配列は全てＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、環状鋳型、プレプライマーおよび結合配列は全てＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、環状鋳型、プレプライマーおよび結合配列の１つ以上はＤＮＡ分子であり、それ以外はＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、結合配列はＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーである。いくつかの実施形態では、結合配列はＤＮＡザイムまたはリボザイムである。いくつかの実施形態では、結合配列は核酸分子のアンチセンス配列である。いくつかの実施形態では、環状鋳型、プレプライマーおよび結合配列は、核酸二本鎖の形成によりアセンブリーを形成する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーは以下の反応連鎖に従って機能する。ａ）分析物はプレプライマー／環状鋳型／結合配列アセンブリーからの結合配列の放出を引き起こし、ｂ）次いでＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ消化によりプレプライマー／環状鋳型アセンブリー上のプレプライマーを成熟したプライマーに変換し、ｃ）次いでＤＮＡポリメラーゼは成熟したプライマーを使用して環状鋳型をコピーし、長鎖ＤＮＡ産物を生じさせる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、蛍光、色の変化または他の方法によって長鎖ＤＮＡ産物を検出することができる。
【００３２】
本出願は、
（ａ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）鋳型である環状単鎖核酸分子と、
（ｂ）分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子と、
（ｃ）ＲＣＡ鋳型のためのプライマーである第１の核酸配列およびエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによって消化される第２の核酸配列を含む直鎖状単鎖核酸分子と
を含み、分析物の非存在下では直鎖状単鎖核酸分子の第１の核酸配列は環状単鎖核酸分子の一部に結合し、かつ直鎖状単鎖核酸分子の第２の核酸配列は分析物に結合する単鎖核酸分子の一部に結合し、分析物の存在下では分析物に結合する単鎖核酸分子の一部に対する直鎖状単鎖核酸分子の第２の核酸配列の結合は破壊され、それにより第２の核酸配列をエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによる消化のために利用可能にすることを特徴とする核酸アセンブリーを含む、分析物を検出するためのバイオセンサーも含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は独立してＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子から選択される。いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はＤＮＡおよびＲＮＡ分子の組み合わせを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、環状単鎖核酸分子は、Ｔ４核酸リガーゼおよび環状化核酸鋳型を用いる環状化によって前駆体５’−リン酸化直鎖状単鎖核酸分子から調製する。いくつかの実施形態では、前駆体５’−リン酸化直鎖状単鎖核酸分子は、ACTGTAACCA TTCTT GTTTC GTATC ATTGC AGAATTCTAC TAATT TATCT GAATACCGTG［配列番号１］である。いくつかの実施形態では、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）鋳型である環状単鎖核酸分子はGTTAC AGTCA CGGTA T［配列番号２］である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子すなわち結合配列は、核酸アプタマー、核酸酵素および核酸分子のアンチセンス配列から選択される。いくつかの実施形態では、分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子はヌクレアーゼ消化に対して耐性がある配列である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ消化に対する耐性はヘアピン二次構造の存在によって核酸配列に与えられる。いくつかの実施形態では、上記直鎖状単鎖核酸分子は特異性を有する分析物に結合する。特異性を有する分析物に結合するとは、少なくとも本センサーの検出限界の範囲内で他の分析物の存在下であっても上記直鎖状単鎖核酸分子が検出される分析物にのみ結合することを意味する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、核酸アプタマーはＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーである。いくつかの実施形態では、核酸アプタマーは、例えばA. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346(6287), 818-822 (1990)に記載されているＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）法を用いて作製される。いくつかの実施形態では、核酸アプタマーはＤＮＡアプタマーである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡアプタマーはCACTG ACCTG GGGGA GTATT GCGGA GGAAGGT［配列番号７］である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡアプタマーはCAGGC TACGG CACGT AGAGC ATCAC CATGA TCCTG/3invdT/［配列番号８］である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡアプタマーはCAGGC TACGG CACTT TTTTC ATTTAAATTA TAATT/3invdT/［配列番号９］である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、核酸酵素はＤＮＡザイムまたはリボザイムである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、核酸分子のアンチセンス配列はウイルス核酸配列のアンチセンス配列または細菌核酸配列のアンチセンス配列である。いくつかの実施形態では、核酸分子のアンチセンス配列はウイルス核酸配列のアンチセンス配列である。いくつかの実施形態では、ウイルス配列のアンチセンス配列はAACGTCGGATCCCGCGTCGCC/3InvdT/［配列番号１０］である。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸配列はＣ型肝炎ウイルス配列である。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸配列はGGCGACGCGGGATCCGACGTT［配列番号１１］である。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸配列はGCCGATGGGGGATGTTCCGGA［配列番号１２］である。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸配列はGTTGACGCGCAAACCTACGTC［配列番号１３］である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、核酸アプタマー、核酸酵素および核酸分子のアンチセンス配列は、構造的認識によりそれらのそれぞれの分析物と相互作用してそれらに結合する。分析物に結合すると、核酸アプタマー、核酸酵素および核酸分子のアンチセンス配列は立体構造変化を受け、それにより核酸アプタマー、核酸酵素または核酸分子のアンチセンス配列が核酸アセンブリーから放出される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、分析物は、限定されるものではないが、無機小分子、有機小分子、金属イオン、ホルモン増殖因子、生体分子、毒素、生体高分子（炭水化物、脂質、ペプチドおよびタンパク質など）、細胞、組織および微生物（細菌およびウイルスを含む）から選択される。一実施形態では、分析物は天然源から単離されたものであるか合成のものである。分析物という用語は、限定されるものではないが、コンビナトリアルライブラリーおよび生物または自然環境からの試料など化合物または物質の混合物も含む。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーを使用して小分子、タンパク質またはＤＮＡである分析物を検出する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡアプタマーに結合する分析物はヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＴＰは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）から選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、直鎖状単鎖核酸配列の第１の核酸配列および第２の核酸配列はプレプライマー配列である。いくつかの実施形態では、プレプライマー配列はGTTAC AGTCA CGGTA TATTT ACCCA GGTCA GTG［配列番号３］である。いくつかの実施形態では、プレプライマー配列はGTTAC AGTCA CGGTA TATTTAGCCG TAGCC TG［配列番号４］である。いくつかの実施形態では、プレプライマー配列はGTTAC AGTCA CGGTA TATTTAGGATCCGACGTT［配列番号５］である。いくつかの実施形態では、プレプライマー配列はGTTAC AGTCACGGTA TATTT ACCCA GGTCA GTG/3invdT/［配列番号６］である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＲＣＡは、環状ＤＮＡ鋳型および適当なＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて短いＤＮＡまたはＲＮＡプライマーを増幅させて長い単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成する等温酵素プロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＣＡは、順方向および逆方向プライマーの両方を用いることによりＲＣＡの感度を高めるためのローリングサークル増幅由来の技術であるＨＲＣＡである。順方向プライマーは、多量体の単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または単鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を産生し、次いでこれが複数の逆方向プライマーのための鋳型になる。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼが伸長プロセス中に逆方向プライマーを伸長させ、下流ＤＮＡまたはＲＮＡが置き換えられて分岐すなわち分岐ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体が産生される。全てのｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡ鎖が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に変換された場合にこのプロセスは終了する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーは核酸ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはφ２９ＤＰである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＲＣＡ鋳型である環状単鎖核酸分子は、ＲＣＡ鋳型のためのプライマー配列として機能する直鎖状単鎖核酸分子の第１の核酸配列を有する核酸二本鎖を形成する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、直鎖状単鎖核酸分子のエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによって消化される第２の核酸配列は、分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子を有する核酸二本鎖を形成する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲は、ナノモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はピコモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はフェムトモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はアトモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はアトモル濃度とナノモル濃度との間の分析物である。
【００４８】
ＩＩＩ．本出願の方法
【００４９】
本出願は本出願のバイオセンサーを利用するアッセイ方法も含む。一実施形態では、本アッセイは、分析物を含んでいるか含むことが疑われている試料において分析物を検出する方法であって、当該試料を本出願のバイオセンサーに接触させる工程と、試料中の分析物の存在を示すＲＣＡ鋳型からの核酸産物の存在を監視する工程とを含む方法である。
【００５０】
当該試料は、あらゆる提供源、例えばあらゆる生物提供源（例えばヒトまたは動物の医学的試料）、環境提供源（例えば水または土壌）、天然源（例えば植物）、あるいは、あらゆる製造または合成提供源（例えば食品または飲料）からのものである。当該試料は液体であるか、好適な溶媒に溶解して溶液を生成するものであれば最も好都合である。定量的アッセイのために、溶液中の試料の量は公知でなければならない。当該試料は１種以上の分析物を含んでいるか含むことが疑われているものである。
【００５１】
一実施形態では、分析物は天然源から単離されたものであるか合成のものである。「分析物」という用語は、限定されるものではないが、コンビナトリアルライブラリーおよび生物または自然環境からの試料など化合物または物質の混合物も含む。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーを使用して小分子、タンパク質またはＤＮＡである分析物を検出する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、分析物は、無機小分子、有機小分子、金属イオン、ホルモン増殖因子、生体分子、毒素、生体高分子（炭水化物、脂質、ペプチドおよびタンパク質など）、微生物（細菌およびウイルスを含む）、細胞および組織から選択される。別の実施形態では、分析物は、無機小分子、有機小分子、ホルモン増殖因子、生体分子、ペプチド、タンパク質、細菌、ウイルスおよび細胞から選択される。いくつかの実施形態では、分析物は、ホルモン増殖因子、ウイルスおよび生体分子から選択される。いくつかの実施形態では、分析物は生体分子である。いくつかの実施形態では、分析物はホルモン増殖因子である。いくつかの実施形態では、分析物は細菌もしくはウイルスゲノムの核酸配列である。いくつかの実施形態では、分析物はアデノシン三リン酸である。いくつかの実施形態では、分析物は血小板由来増殖因子である。いくつかの実施形態では、分析物はＣ型肝炎ウイルスゲノムのＤＮＡ配列である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＲＣＡ鋳型からの核酸産物は単鎖ＤＮＡ分子または単鎖ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＲＣＡ鋳型からの核酸産物は、繰り返し核酸配列を含む長い単鎖ＤＮＡ分子または単鎖ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、「長い」という用語は、何千もの繰り返し配列単位を含む核酸配列を指す。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＲＣＡ鋳型からの核酸産物はローリングサークル増幅により産生される。ローリングサークル増幅反応は、本出願のバイオセンサー、ＲＣＡ反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、核酸ポリメラーゼおよび好適な溶媒の存在下で行う。環状単鎖核酸分子、分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む直鎖状単鎖核酸分子を、本バイオセンサーの核酸アセンブリーの形成にとって十分な温度および時間でインキュベートする。非限定的な反応温度の例としては、限定されるものではないが、１０℃〜約３０℃または約２０℃〜約２５℃が挙げられる。非限定的な反応時間の例としては、限定されるものではないが、５分間〜約１時間または約１５分間〜約３０分間が挙げられる。
【００５５】
その後、ＲＣＡ反応緩衝液、ｄＮＴＰ、核酸ポリメラーゼおよび好適な溶媒を添加してＲＣＡ反応を開始させる。反応混合物を第１の温度および時間でインキュベートし、次いでＲＣＡプロセスを完了させるのに十分な第２の温度および時間に供する。第１の温度のための非限定的な温度の例としては、限定されるものではないが、１０℃〜約４０℃または約２０℃〜約３０℃が挙げられる。第１の期間の非限定的な反応時間の例としては、限定されるものではないが、３０分間〜約３時間または約１時間〜約２時間が挙げられる。第２の温度のための非限定的な温度の例としては、限定されるものではないが、５０℃〜約１２０℃または約７０℃〜約９０℃が挙げられる。第２の期間のための非限定的な反応時間の例としては、限定されるものではないが、１分間〜約３０分間または約５分間〜約２０分間が挙げられる。いくつかの実施形態では、好適な溶媒は水性溶媒である。いくつかの実施形態では、水性溶媒は水である。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性、特に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＰである。
【００５６】
各回のＲＣＡプロセスにより核酸産物が産生される。核酸産物は多量体の単鎖核酸産物である。いくつかの実施形態では、多量体の単鎖核酸産物はＲＣＡ鋳型としてさらに機能する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＲＣＡ鋳型からの核酸産物は超分岐ローリングサークル増幅（ＨＲＣＡ）によって産生される。ＨＲＣＡ反応は、本出願のバイオセンサー、ＲＣＡ反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、飽和挿入蛍光色素、逆方向プライマー配列、核酸ポリメラーゼおよび好適な溶媒の存在下で行う。いくつかの実施形態では、一定温度で蛍光光度計セット内に置かれたキュベットにおいてＨＲＣＡプロセスを行い、最大蛍光プラトーに達するのに十分な時間間隔で蛍光強度を測定する。非限定的な反応温度の例としては、限定されるものではないが、１０℃〜約５０℃または約２０℃〜約３０℃が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＲＣＡ反応を１分の時間間隔で監視する。いくつかの実施形態では、好適な溶媒は水性溶媒である。いくつかの実施形態では、水性溶媒は水である。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性、特に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ＤＰである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、核酸産物の存在の監視によって分析物の検出を行う。本実施形態では、形成される核酸産物は、出発試薬のいずれかのシグナルとは異なる検出可能なシグナル（例えば、蛍光、分子量）を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核酸産物の存在は検出システムを含む。一実施形態では、検出システムは、蛍光システム、比色分析システム、電気泳動システムおよび電気化学システムから選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、電気泳動システムを用いてＲＣＡ鋳型からの核酸産物の存在を監視し、単一の分子量バンドの検出によって分析物の存在を確認する。試料の調製、ゲルの調製およびその後の電気泳動システムの可視化法のプロセスは先行技術において周知である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、核酸電気泳動を用いてＲＣＡ鋳型からの核酸産物を測定する。いくつかの実施形態では、変性条件下で核酸電気泳動を行う。いくつかの実施形態では、電気泳動システムは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｄＰＡＧＥ）およびアガロースゲル電気泳動から選択される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、蛍光システムを用いてＲＣＡ鋳型からの核酸産物の存在を監視し、蛍光シグナルの検出によって分析物の存在を確認する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、蛍光システムは核酸産物増幅の進行を監視する蛍光レポーター分子を含む。シグナル発生モードに応じて、蛍光レポーター分子は、プローブと呼ばれる蛍光標識したオリゴヌクレオチドまたは蛍光性ヌクレオチド結合色素のいずれかである。
【００６４】
一実施形態では、本バイオセンサーのための蛍光レポーター分子の選択は、限定されるものではないが、（ｉ）最大励起および発光波長、（ｉｉ）吸光係数、（ｉｉｉ）量子収率、（ｉｖ）寿命、（ｖ）、ストークスシフト、（ｖｉ）蛍光体の極性、および（ｖｉｉ）サイズなどの１つ以上のパラメータに基づく。
【００６５】
いくつかの実施形態では、蛍光レポーター分子は高解像度融解（ＨＲＭ）色素またはプローブである。ＨＲＭ分析はリアルタイムで核酸産生の存在を監視する能力を提供する。ＨＲＭ色素は、二本鎖核酸に大量に結合すると明るい蛍光シグナルを発生する飽和挿入蛍光色素である。いくつかの実施形態では、蛍光システムは飽和核酸挿入蛍光色素を含む。いくつかの実施形態では、飽和核酸挿入蛍光色素は、例えばLC Green（商標）、Ｐ２、ＳＹＴＯ９（商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）、Ｃｈｒｏｍｏｆｙ（商標）、ＢＥＢＯ（商標）、SYBR gold（商標）およびＢＯＸＴＯ（商標）から選択されるシアニン色素である。いくつかの実施形態では、飽和核酸挿入蛍光色素はＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、試料が分析物を含む場合、試料を本出願のバイオセンサーと接触させる工程は、
（ａ）直鎖状単鎖核酸分子の第２の核酸配列からの分析物に結合する単鎖核酸配列の放出を生じさせる、分析物に結合する単鎖核酸分子に対する分析物の結合、
（ｂ）第１の核酸配列を含む成熟したプライマー核酸配列を生じさせる、核酸ポリメラーゼによる第２の核酸配列のエキソヌクレアーゼ消化、
（ｃ）環状単鎖核酸分子を用いるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を開始させて監視される単鎖核酸産物を産生させるための、成熟したプライマー核酸配列に対する核酸ポリメラーゼの結合
を誘導する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はナノモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はピコモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はフェムトモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はアトモル濃度未満の分析物である。いくつかの実施形態では、本出願のバイオセンサーの検出範囲はアトモル濃度とナノモル濃度との間の分析物である。
【００６８】
本出願は、本出願のバイオセンサーを含むキットをさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、バイオセンサーと、バイオセンサーを用いるアッセイを行うための任意のさらなる試薬、例えばエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼとを含む。いくつかの実施形態では、試薬は、ＲＣＡ反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、飽和核酸挿入蛍光色素および水を含む。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本キットは、本アッセイにおいてバイオセンサーを使用するための説明書と、本アッセイを行うために必要なあらゆる対照とを含む。当該対照はバイオセンサー自体の上にあっても別個の基板上にあってもよい。いくつかの実施形態では、対照反応は、環状単鎖核酸分子、分析物に結合する直鎖状単鎖核酸分子、第１の核酸配列または第２の核酸配列を含む直鎖状単鎖核酸分子あるいはそれらの組み合わせを含んでいない。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本キットは、本出願のアッセイ方法のいずれかを行うために必要な全ての構成要素を含む。
【実施例】
【００７１】
以下の非限定的な例は本出願の例示である。
実施例１：核酸アセンブリーを含むバイオセンサーの開発
【００７２】
オリゴヌクレオチドおよび他の材料
【００７３】
全てのＤＮＡ分子の配列が表１に示されている。ＤＮＡオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies社（ＩＤＴ、米国アイオワ州コーラルビル）から入手し、１０％変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｄＰＡＧＥ）で精製した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、T4 DNAリガーゼ、φ２９ＤＰ、ＡＴＰおよびｄＮＴＰをThermo Scientific社（カナダのオンタリオ州オタワ）から購入した。α−［３２Ｐ］ＡＴＰをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（カナダのオンタリオ州ウッドブリッジ）から得た。Milli-Q Synthesis A10水精製システムを用いて水を精製した。全ての他の化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（カナダのオークヴィル）から購入し、さらに精製することなく使用した。
【００７４】
機器
【００７５】
Typhoon 9200 variable mode imager（GE Healthcare社）を用いて、ｄＰＡＧＥおよびアガロースゲルのオートラジオグラムおよび蛍光画像を得、Image Quantソフトウェア（Molecular Dynamics社）を用いて分析した。５００ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの蛍光波長を有するCary Eclipse蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ社）を用いて蛍光測定を行った。
【００７６】
環状鋳型ＣＴ１の調製
【００７７】
T4 DNAリガーゼおよび環状化ＤＮＡ鋳型ＣＤＴ１を用いた環状化により、５’−リン酸化直鎖状鋳型ＬＴ１から環状鋳型（ＣＴ）を調製した。ＬＴ１を５’末端においてリン酸化するために、２００ｐｍｏｌのＬＴ１を５０μＬの１×ＰＮＫ緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのスペルミジン）中で１０Ｕ（Ｕ：単位）のＰＮＫおよび２ｍＭのＡＴＰと混合し、３７℃で４０分間インキュベートし、９０℃で５分間加熱した。５’−リン酸化ＬＴ１を環状化させるために、３００ｐｍｏｌのＣＤＴ１を上記反応混合物の中に添加した。この混合物を９０℃で５分間加熱し、室温（約２３℃）で２０分間冷却した。続いて、１５μＬの１０×T4 DNAリガーゼ緩衝液（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ、２５℃でｐＨ７．８）および１０ＵのT4 DNAリガーゼを添加した。得られた混合物（全部で１５０μＬ）を室温で２時間インキュベートし、次いで９０℃で５分間加熱してリガーゼを不活性化させた。混合物中のＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮し、混合物中のＣＴ１を１０％ｄＰＡＧＥで精製した。
【００７８】
ＰＰ１、ＰＰ２およびＰＰ３のエキソヌクレアーゼ消化
【００７９】
プレプライマー（ＰＰ）１のみの消化のために（図１Ｂ）、１μＭの５’−３２Ｐで標識したＰＰ１を５０μＬの１×ＲＣＡ反応緩衝液（３３ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、６６ｍＭの酢酸カリウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中で１μＬのφ２９ＤＰストック（５Ｕ／μＬ）と共に３０℃でインキュベートした。５μＬの反応混合物を１、５、１０、２０、３０および６０分後に取り出し、５μＬの尿素系２×変性ゲルローディング緩衝液と１つにまとめ、９０℃で５分間加熱し、２０％ｄＰＡＧＥで分析した。
【００８０】
プレプライマー１（ＰＰ１）−アプタマー１（ＡＰ１）ハイブリッドの消化（図１Ｃ）のために、５０ｐｍｏｌの５’−３２Ｐで標識したＰＰ１および可変量の５’−ＦＡＭで標識したＡＰ１を含有する４０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。混合物を９０℃で５分間加熱し、室温になるまで２０分間冷却した。消化を開始するために、１μＬのφ２９ＤＰストック、５μＬの１０×ＲＣＡ反応緩衝液および４μＬの水を添加した。ＰＰ１の最終濃度は１μＭであり、ＡＰ１の最終濃度は０．２、０．５、１．０、１．５または２．５μＭであった。反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートした後、等体積の２×変性ゲルローディング緩衝液を添加し、かつ９０℃で５分間加熱した。得られた混合物を２０％ｄＰＡＧＥで分析した。ＰＰ１−ＣＴ１ハイブリッドを消化させ、ＡＰ１をＣＴ１で置き換えたこと以外は同じように分析した（図２Ａ）。
【００８１】
ＡＴＰまたはＧＴＰの存在下でのＰＰ１−ＡＰ１およびＰＰ１−ＡＰ１−ＣＴ１の消化のために（図１Ｄ、図２Ｂ、図２Ｃ、図７）、５０ｐｍｏｌの５’−３２Ｐで標識したＰＰ１および７５ｐｍｏｌのＡＰ１（ＰＰ１−ＡＰ１のため）ならびに５０ｐｍｏｌのＣＴ１（ＰＰ１−ＡＰ１−ＣＴ１のため）を含有する４０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液中で上記同じ手順を用いてハイブリダイゼーション反応を行った。次いで、５μＬの１０×ＲＣＡ反応緩衝液、１μＬの２５ｍＭのＡＴＰまたはＧＴＰ、３μＬの水および１μＬのφ２９ＤＰストックを添加した。ＡＰ１、ＣＴ１、ＡＴＰ、ＧＴＰまたはこれらの組み合わせを含んでいない様々な対照反応も同じように準備した。各反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、次いで上記同一の手順を用いて２０％ｄＰＡＧＥ分析に供した。
【００８２】
ＰＤＧＦを含むまたは含まないＰＰ２のみまたはＩ−ＡＰ２−ＰＰ２およびＩ−ＡＰ２−ＰＰ２−ＣＴ１ハイブリッド中での消化では（図４Ａ）、この手順はＡＴＰシステムのために使用した手順と同様であった。反応混合物は１μＭの放射性ＰＰ２、１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＩ−ＡＰ２、１００ｎＭのＰＤＧＦおよび０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰの様々な組み合わせを含有していた。各反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、２０％ｄＰＡＧＥで分析した。
【００８３】
HCV-1 DNAを含むまたは含まないＰＰ３のみまたはＩ−ＤＰ１−ＰＰ３およびＩ−ＤＰ１−ＰＰ３−ＣＴ１ハイブリッド中での消化（図１０）も同様に行った。反応混合物は１μＭの放射性ＰＰ３、１μＭのＣＴ１、１．５μＭのＩ−ＤＰ１、１００ｎＭのI-HCV-1 DNAおよび０．１Ｕ／μＬのφ２９ＤＰの様々な組み合わせを含有していた。各反応混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、２０％ｄＰＡＧＥで分析した。
【００８４】
ＲＣＡ反応
【００８５】
ＡＴＰセンシングシステムを用いるＲＣＡ反応では（図３）、４０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液中での５０ｐｍｏｌのＰＰ１、５０ｐｍｏｌのＣＴ１および７５ｐｍｏｌのＡＰ１を用いるハイブリダイゼーション反応後に、１μＬの２５ｍＭのＡＴＰを添加し、得られた混合物を室温で３０分間インキュベートした。次いで、５μＬの１０×ＲＣＡ反応緩衝液、２μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰをそれぞれ１０ｍＭ）、１μＬのφ２９ＤＰストックおよび２μＬの水の添加によってＲＣＡ反応を開始させた。反応混合物を３０℃で１時間インキュベートした後、９０℃で５分間加熱した。ＰＰ１、ＣＴ１、ＡＴＰまたはこれらの組み合わせを含んでいない様々な対照反応も同じように準備した。これらの反応からのＲＣＡ産物を０．６％アガロースゲル電気泳動で分析した。
【００８６】
ＰＤＧＦセンシングシステムを用いるＲＣＡ反応では（図４Ｂおよび図４Ｃ）、その手順は、ＡＰ１をＩ−ＡＰ２、ＰＰ１をＰＰ２、およびＡＴＰをＰＤＧＦ（最終濃度として１００ｎＭ）で置換したこと以外はＡＴＰ誘導反応のために使用した手順と同一であった。ＢＳＡ、トロンビンおよびＩｇＧも非標的対照として使用した。ＰＤＧＦの濃度を０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０および５０ｎＭで試験した。
【００８７】
ＨＲＣＡ反応を用いたＰＤＧＦおよびHCV-1 DNAの検出
【００８８】
３０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液中での５０ｐｍｏｌのＰＰ２、５０ｐｍｏｌのＣＴ１および７５ｐｍｏｌのＩ−ＡＰ２間でのハイブリダイゼーション後に、５μＬの１０×ＲＣＡ反応緩衝液、１μＬの所与のＰＤＧＦストック溶液、１μＬのφ２９ＤＰストック、２μＬのｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭ）、２μＬのＦＰ１（１０μＭ）、２μＬのＲＰ１（１０μＭ）および２．５μＬの２５×ＥｖａＧｒｅｅｎおよび４．５μＬの水を添加した。これらの反応を３０℃の一定温度に設定した蛍光光度計内に置いたキュベット内で行い、蛍光強度を１分間隔で記録した。
【００８９】
HCV-1 DNA検出のための手順は、試薬を以下のように使用（すなわち、２ａＭ〜２０ｎＭの間で異なるＨＣＶ−１濃度と共に５０ｐｍｏｌのＰＰ３および７５ｐｍｏｌのＩ−ＤＰ１を使用）したこと以外はＰＤＧＦ検出のための手順と同様であった。
【００９０】
結果および考察
【００９１】
アプタマーＡＰ１
【００９２】
周知の抗ＡＴＰ DNAアプタマー［１３］を用いて、アプタマー（ＡＰ）の非存在下および存在下での（プレプライマー）ＰＰの消化を評価した。ＡＴＰ検出用のＡＰおよびＰＰをそれぞれＡＰ１およびＰＰ１と命名した（この研究のために使用されるＤＮＡ分子の配列は表１に示されている）。図１Ｂに示すように、９０％超のＰＰ１（１μＭ）が３０分以内にφ２９ＤＰ（０．１単位／μＬ）によって分解された。しかし、ＰＰ１の分解は２．５μＭのＡＰ１の存在下では３％まで減少した（図１Ｃ）。この結果は、ＡＰ１がＡＰ１−ＰＰ１二本鎖の形成によってφ２９ＤＰによるＰＰ１の核酸分解消化を実際に阻止することができることを示している。
【００９３】
ＡＰ１は、同じ条件下でのＰＰ１（図１Ａ）の９６％と比較して６０分後に５％未満が消化されたように（図６）、どちらかといえばφ２９ＤＰによる核酸分解消化に対して耐性がある。これは、アプタマーが、アプタマーの報告されているヘアピン構造モデルと一致する［１３ｂ］、φ２９ＤＰによるエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性がある構造を有することを示している。
【００９４】
その後に、ＡＴＰが構造スイッチングによってＡＰ１−ＰＰ１二本鎖からのＡＰ１放出を誘導することを予想して［１２］、ＰＰ１消化に対するＡＴＰの効果を評価した。実際に、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）の添加によりＡＰ１の存在下でＰＰ１の切断の有意な増加が生じた（ＡＴＰが存在しない場合の４％に対して４５％、図１Ｄ）。対照的に、ＧＴＰを供給した場合にＰＰ１消化において有意な変化は観察されなかった（図７）。この結果はＡＰ１放出がＡＴＰ依存性であることを示している。
【００９５】
次に、ＣＴ１（０〜２．５μＭ、図２Ａ）の存在下でのＰＰ１（１μＭ）の消化を調べた。ＣＴ１を供給した場合にＰＰ１消化パターンが変化した。すなわち、増加する濃度のＣＴ１により小さい消化産物の量は減少したが、中間の断片（ＭＲＦと示されている）の量は増加した（図２Ａ）。この観察はＰＰ１の不対領域がφ２９ＤＰによってトリミングされたという予想と一致している。
【００９６】
次いで、ＰＰ１−ＡＰ１−ＣＴ１アセンブリー内のＰＰ１の消化パターンを調べた。ＡＴＰの非存在下では、ＭＲＦが観察されないように、ＰＰ１はφ２９ＤＰによるエキソヌクレアーゼ消化から保護されていた（図２Ｂ、レーン４、四角形）。しかし、ＡＴＰの添加により、ＭＲＦの出現によって反映される露出された３’末端のトリミングが生じた（図２Ｂ、レーン８、四角形）。ＡＴＰをＧＴＰで置き換えた場合、ＭＲＦは消えた（図２Ｃ、レーン４、四角形）。
【００９７】
図１および図２は、（１）φ２９ＤＰがｓｓＰＰ１を消化することができ、（２）ＰＰ１−ＡＰ１二本鎖の形成がＰＰ１消化を阻止し、（３）ＡＴＰの添加が三部分アセンブリーからのＡＰ１の放出を促進し、かつ（４）φ２９ＤＰがＰＰ１の露出されたｓｓ断片をトリミングし、それを成熟したプライマーに変換させることを示している。
【００９８】
ＰＰ１の核酸分解トリミングによりＲＣＡを開始させることができる成熟したプライマーを得ることができることを示すために、ＰＰ１−ＣＴ１ハイブリッドを用いてＲＣＡ反応を行った。対照として、Ｉ−ＰＰ１−ＣＴ１（３’末端に逆方向ｄＴを含む修正されたＰＰ１）を用いて同じ反応を行った。この修正によりＩ−ＰＰ１をφ２９ＤＰによる消化に対して完全に耐性があるようにしなければならない。実際には、φ２９ＤＰはＩ−ＰＰ１を分解することができないことが分かった（図８Ａ）。アガロースゲル分析から、ＰＰ１をＣＴ１、ｄＮＴＰおよびφ２９ＤＰと共にインキュベートした場合にＲＣＡ産物（ＲＰ）が産生されることが分かった（図８Ｂ）。しかし、Ｉ−ＰＰ１を使用してＰＰ１を置き換えた場合にＲＰは観察されなかった。これらの結果から、φ２９ＤＰによるＰＰ１のトリミングの成功がＲＣＡにとって必須であることが分かる。
【００９９】
次に、ＰＰ１−ＡＰ１−ＣＴ１アセンブリーのＡＴＰで促進されるＲＣＡ反応を評価した。３つのイベント、すなわち（１）ＡＴＰで促進される構造スイッチング、（２）φ２９ＤＰによるＰＰ１のエキソヌクレアーゼトリミング、および（３）φ２９ＤＰによるＲＣＡが生じることが予想された。構造スイッチングイベント（ＤＮＡアセンブリーのＡＴＰとの混合）は、プライマートリミングおよびＲＣＡイベント（ＡＴＰ／ＤＮＡ溶液のφ２９ＤＰ／ｄＮＴＰとの混合）とは別であった。その結果は図３に示されている（パネルａ：−ＡＴＰ、パネルｂ：＋ＡＴＰ）。各パネルの最初の６つのレーンは陰性対照としての役割を果たす（ＰＰ１またはＣＴ１が省略される場合、ＲＣＡは生じないはずである）。各レーン７は陽性対照としての役割を果たす（ＰＰ１およびＣＴ１の両方が提供されるがＡＰ１が省略される場合、ＲＣＡは生じるはずである）。各パネルの最終レーンはＡＴＰ依存試験としての役割を果たす。予想通りに、陰性対照のいずれにおいてもＲＰは観察されなかったが２種類の陽性対照において認められた。さらに重要なことに、ＡＴＰの存在により有意により多くのＲＰ産生が実際に生じた。すなわち、パネルｂのレーン８におけるＲＰバンドはパネルａにおける同じバンド（四角形によって示されている）よりも非常に濃い。理論によって縛られたくはないが、ＲＰはＡＴＰの非存在下で観察されるべきではなかった。しかし、ＤＮＡアプタマーはｄＡＴＰに結合することができることも知られている［１３］。従って、ＡＴＰの非存在下での少量のＲＰは、ＤＮＡ増幅にとって必要なｄＮＴＰの一部としてｄＡＴＰが供給された核酸分解トリミング−ＲＣＡ工程から生じた可能性が高い。これは、構造スイッチング工程がトリミングおよびＲＣＡ工程とは別であった理由でもある。
【０１００】
アプタマーＡＰ２
【０１０１】
リガンド応答性ＲＣＡが構造スイッチングアプタマーの一般的な特徴であることを実証するために、別のアプタマーシステムを調べた。ヒトの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に結合することが報告されているアプタマーに基づく新しいＤＮＡアプタマープローブ「ＡＰ２」を調べた［１４］。このアプタマーはφ２９ＤＰの核酸分解消化に対して耐性がある固有構造を有していないため、φ２９ＤＰによる分解を防止するために、３’末端における逆方向ｄＴによってＡＰ２を修正した（Ｉ−ＡＰ２と命名）。
【０１０２】
三部分アセンブリーはＩ−ＡＰ２−ＰＰ２−ＣＴ１で作られている。各種条件下で放射性ＰＰ２の消化を行い、その結果はＡＴＰシステムとほぼ同一であった（図４Ａ）。簡単に言うと、Ｉ−ＡＰ２およびＣＴ１の非存在下で、ＰＰ２は完全に消化された（レーン１および５）。Ｉ−ＡＰ２が提供されるがＣＴ１が省略される場合、ＰＰ２はＰＤＧＦの非存在下で非常に多く保護されていたが（レーン２）、ＰＤＧＦの存在下では大部分が消化された（レーン６）。しかし、ＣＴ１が提供されたがＩ−ＡＰ２が省略される場合、ＰＰ２はＰＤＧＦの非存在下（レーン３）および存在下（レーン７）の両方で部分的に消化されてＭＲＦに変換されていた。さらに重要なことに、Ｉ−ＡＰ２およびＣＴ１の両方が提供される場合、ＰＰ２はＰＤＧＦの非存在下で完全に保護されていたが（レーン４）、ＰＤＧＦの存在下ではトリミングされてＭＲＦに変換されていた（レーン８、四角形）。
【０１０３】
Ｉ−ＡＰ２−ＰＰ２−ＣＴ１アセンブリーのＲＣＡ反応の結果は図４Ｂおよび図４Ｃに示されている。ＡＴＰシステムとは対照的に、構造スイッチング、核酸分解トリミングおよびＲＣＡ反応を同時に行うことができる。予想通りに、ＰＤＧＦの非存在下で、ＲＣＡ反応は停止された（図４Ｂ、レーン８、ＡＴＰシステムの場合と同様にレーン１〜７は様々な対照としての役割を果たす）。しかし、ＰＤＧＦを添加するとＲＰが観察された（図４Ｃ、レーン８）。他のタンパク質（ＢＳＡ、トロンビンおよびＩｇＧ）ならびに突然変異ＤＮＡアプタマー（Ｉ−ＡＰ２Ｍ）を用いる対照実験は、ＲＣＡ反応がアプタマーの適合標的（図９Ａ）および特異的アプタマー配列（図９Ｂ）の両方に依存性であることを実証した。これらの結果は、刺激応答性の消化活性化ＲＣＡを構造スイッチングアプタマーのために一般に採用することができることを実証している。さらに、増加する濃度のＰＤＧＦに応答するＲＰ産生を分析した。図５Ａに示すように、アガロースゲル分析によって１０ｐＭもの低い濃度を検出することができる。
【０１０４】
検出感度をさらに高めるために、超分岐ＲＣＡ（ＨＲＣＡ）を用いた［１５］。ＨＲＣＡ（図５Ｂに示すようなもの）では、順方向プライマー（ＦＰ１）を用いてＲＣＡから産生されたＤＮＡ産物を、第２のプライマー（逆方向プライマー、ＲＰ１）を用いてφ２９ＤＰによってさらにコピーしてＤＮＡ産物を産生し、これをＦＰ１を用いてさらに増幅させることができる。このプロセスにより指数関数的増幅が生じる［１６］。交差増幅プライマーとしてＦＰ１およびＲＰ１を使用するこの戦略を採用した。ＤＮＡ挿入色素ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）を使用してＨＲＣＡ産物のリアルタイム監視を達成した。ＰＤＧＦの存在下で蛍光強度は反応時間と共に徐々に増加し、これはＰＤＧＦが実際にＨＲＣＡを開始させることができることを示している（図５Ｃ）。この方法を用いて、ＰＤＧＦを１ｆＭほどの低い濃度で検出することができる（図５Ｄ）。注目すべきことに、ＨＲＣＡは通常のＲＣＡ（１０ｐＭ）よりも４桁も良好な検出感度を与える。ＰＤＧＦアプタマーは約０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有し［１４］、以前に報告された構造スイッチング蛍光アプタマーバイオセンサーは約２ｎＭの検出限界しか達成することができなかった［１７ａ］。従って、本出願で教示されているバイオセンシング戦略は劇的に向上した検出限界を与える。本出願人の知識が及ぶ限りでは、１ｆＭの検出限界はこれまでＰＤＧＦアプタマーで達成された最も低い検出濃度を表している［７ｂ，１７］。
【０１０５】
ＤＮＡプローブＤＰ１
【０１０６】
アプタマーを用いる検出を超えるまで消化活性化ＲＣＡ手法を拡張させるために、ＤＮＡ検出のために同じ戦略を適用した（図１０および図１１）。ＤＮＡプローブ「Ｉ−ＤＰ１」は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムからの相補的なＤＮＡ配列の一部を表すHCV-1 DNAを認識するように設計された特異的ＤＮＡ配列を有する［１８］。この場合も、ＤＮＡ単位複製配列のリアルタイム検出のためにＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）を使用するＨＲＣＡ戦略を採用した。蛍光強度はHCV-1 DNAに応答して時間依存的に増加した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。ＤＮＡ濃度に対して１８０分後に得られた蛍光強度をプロットして確立された検出限界（図１１Ｃ）は２０ａＭであることが分かり、これは５０μＬ中に６００コピーのＤＮＡに対応している。目を見張る検出限界に加えて、この方法は優れた選択性も示した。ＨＣＶ−Ｍ１およびＨＣＶ−Ｍ２（それぞれ７個および９個のミスマッチヌクレオチドを含む、図１１Ｄ）などの意図しないＤＮＡ標的を用いて本システムを試験した場合、蛍光の増加は観察されなかった。
【０１０７】
実施例を参照しながら本出願について説明してきたが、当然のことながら特許請求の範囲は実施例に記載されている実施形態によって限定されるべきではなく、全体として本説明に一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【０１０８】
全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願があたかも具体的かつ個々に参照により全体が組み込まれることが示されているかのように、同程度に全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願中の用語が参照により本明細書に組み込まれる文献におけるものとは異なるように定義されていることが分かった場合、本明細書に提供されている定義をその用語の定義の代わりとする。
【表１】
2018523991.tif 000003
【０１０９】
参考文献
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【図１】
2018523991.tif 000004
【図２ａ】
2018523991.tif 000005
【図２ｂ】
2018523991.tif 000006
【図２ｃ】
2018523991.tif 000007
【図３ａ】
2018523991.tif 000008
【図３ｂ】
2018523991.tif 000009
【図４ａ】
2018523991.tif 000010
【図４ｂ】
2018523991.tif 000011
【図４ｃ】
2018523991.tif 000012
【図５】
2018523991.tif 000013
【図６】
2018523991.tif 000014
【図７】
2018523991.tif 000015
【図８】
2018523991.tif 000016
【図９】
2018523991.tif 000017
【図１０】
2018523991.tif 000018
【図１１】
2018523991.tif 000019
【国際調査報告】
2018523991.tif 000020
2018523991.tif 000021