(57)【要約】  本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的化するｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、およびＴＴＲ関連疾患を治療または予防するためにかかるｉＲＮＡ剤を用いる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、前記ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤。
【請求項２】
式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、
ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’およびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３】
前記ＹＹＹモチーフが前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項４】
前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の前記５’末端から１１、１２および１３位に存在する、請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項５】
前記Ｙヌクレオチドが２’−フルオロ修飾を含む、請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項６】
前記Ｙ’ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項７】
前記二本鎖領域が１５〜３０ヌクレオチド対長である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項８】
前記二本鎖領域が１７〜２３ヌクレオチド対長である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項９】
前記二本鎖領域が１７〜２５ヌクレオチド対長である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１０】
前記二本鎖領域が２３〜２７ヌクレオチド対長である、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１１】
前記二本鎖領域が１９〜２１ヌクレオチド対長である、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１２】
前記二本鎖領域が２１〜２３ヌクレオチド対長である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１３】
各鎖が１５〜３０のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１４】
各鎖が１９〜３０のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１５】
ヌクレオチド上の修飾が、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体構造的に制限されたヌクレオチド、束縛エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホン酸基を含むヌクレオチド、５’−リン酸を含むヌクレオチド、および５’−リン酸模倣物を含むヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド上の前記修飾が２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項１５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１７】
前記センス鎖が、６以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１８】
前記センス鎖が、５以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１９】
前記センス鎖が、４以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２０】
前記アンチセンス鎖が、５以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２１】
前記アンチセンス鎖が、４以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２２】
前記アンチセンス鎖が、３以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２３】
前記アンチセンス鎖が、２以下の２’−フルオロ修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２４】
前記アンチセンス鎖の前記５’ヌクレオチドに５’−リン酸または５’−リン酸模倣物をさらに含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２５】
前記アンチセンス鎖の前記５’ヌクレオチドに５’−リン酸模倣物をさらに含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２６】
前記５’−リン酸模倣物が、５’−ビニルホスフェート（５’−ＶＰ）である、請求項２５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２７】
前記リガンドが、二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２８】
前記リガンドが
【化１】
2018523655.tif 000037
である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２９】
前記リガンドが、前記センス鎖の前記３’末端に結合される、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３０】
以下の模式図
【化２】
2018523655.tif 000038
（式中、ＸはＯまたはＳである）
で示されるようなリガンドに結合される、請求項２９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３１】
前記アンチセンス鎖が、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）、および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３２】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）；ならびに
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３３】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）を含む、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３４】
表１、３、５、６、または７のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３５】
細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、ここで前記ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に完全に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合され、前記リガンドが二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、
二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤。
【請求項３６】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’およびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである８〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、その修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾である）によって表される、請求項３５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項３７】
細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、ここで前記ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記センスおよびアンチセンス鎖が表５中のヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤。
【請求項３８】
細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、ここで前記ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が表６中のアンチセンス配列のいずれか１つと３以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤。
【請求項３９】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、表６中のヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項４０】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、表７中のヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項４１】
請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞。
【請求項４２】
請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含むベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４４】
請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または請求項４２に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項４５】
二本鎖ＲＮＡｉ剤が非緩衝液中で投与される、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記非緩衝液が生理食塩水または水である、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が緩衝液とともに投与される、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記緩衝液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法であって、
前記細胞を、請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、請求項４２に記載のベクター、または請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより前記細胞内での前記ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項５１】
前記細胞が対象内部に存在する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象がヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象がＴＴＲ関連疾患に罹患している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＴＲの発現が、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％もしくは約１００％阻害される、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、請求項４２に記載のベクター、または請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療有効量または予防有効量で前記対象に投与するステップを含み、それにより前記対象を治療する、方法。
【請求項５６】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量で前記対象に投与するステップを含み、
ここで前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
方法。
【請求項５７】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法であって、請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、請求項４２に記載のベクター、または請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療有効量または予防有効量で前記対象に投与するステップを含み、それにより、前記対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる、方法。
【請求項５８】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量で前記対象に投与するステップを含み、
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
方法。
【請求項５９】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法であって、請求項１、３５、３７、および３８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、請求項４２に記載のベクター、または請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療有効量または予防有効量で前記対象に投与するステップを含み、それにより前記対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる、方法。
【請求項６０】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量で前記対象に投与するステップを含み、
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
方法。
【請求項６１】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’およびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）によって表される、請求項５６、５８、および６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象がヒトである、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象がＴＴＲ関連疾患に罹患している対象である、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象がＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象である、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象が、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＴＴＲ関連疾患が、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイロキシン血症からなる群から選択される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象がＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、かつ前記方法が前記対象におけるアミロイドＴＴＲ沈着を低減する、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下、静脈内、筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与手段により前記対象に投与される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下、筋肉内または静脈内投与を介して前記対象に投与される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下投与を介して前記対象に投与される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記皮下投与が自己投与である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記自己投与がプレフィルドシリンジまたは自動注射器シリンジを介する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象由来のサンプル中でのＴＴＲ  ｍＲＮＡ発現またはＴＴＲタンパク質発現のレベルを評価するステップをさらに含む、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記アンチセンス鎖が、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）、および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５６、５８、および６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）；ならびに
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５６、５８、および６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、４週ごと、５週ごと、または６週ごとに前記対象に慢性的に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの一定用量で前記対象に投与するステップを含み、
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
方法。
【請求項７９】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法であって、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの一定用量で前記対象に投与するステップを含み、
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
方法。
【請求項８０】
ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法であって、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの一定用量で前記対象に投与するステップを含み、
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号２に相補的な領域を含み、
各鎖が約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が８以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記アンチセンス鎖が６以下の２’−フルオロ修飾を含み；
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
前記センス鎖が少なくとも１つのリガンドに結合される、
方法。
【請求項８１】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’およびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）によって表される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記アンチセンス鎖が、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）、および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）；ならびに
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記センスおよびアンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約５０ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約７５ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約１００ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約１２５ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約１５０ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約１７５ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約２００ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約２２５ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約２５０ｍｇの一定用量で前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記一定用量の前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約４週ごと、５週ごと、６週ごと、８週ごとまたは四半期ごとに１回、前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記一定用量の前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、四半期ごとに１回、前記対象に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が前記対象に慢性的に投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記対象がヒトである、請求項７８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記対象がＴＴＲ関連疾患に罹患している対象である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象がＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象がＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する、請求項７８〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＴＴＲ関連疾患が、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイロキシン血症からなる群から選択される、請求項７８〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記対象がＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、前記方法が前記対象におけるアミロイドＴＴＲ沈着を低減する、請求項７８〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下、静脈内、筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与手段により前記対象に投与される、請求項７８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下、筋肉内または静脈内投与を介して前記対象に投与される、請求項７８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下投与を介して前記対象に投与される、請求項７８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記皮下投与が自己投与である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記自己投与がプレフィルドシリンジまたは自動注射器シリンジを介する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象由来のサンプル中でのＴＴＲ  ｍＲＮＡ発現またはＴＴＲタンパク質発現のレベルを評価するステップをさらに含む、請求項７８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／１９９，５６３号明細書、および２０１６年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／２８７，５１８号明細書に対する優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の内容全体は、ここで参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本願は、２０１３年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／８８１，２５７号明細書、および２０１４年９月２３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５６９２３号明細書（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）に関する。さらに、本願は、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、２０１２年１１月１６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６０１号明細書、２０１２年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／６１５，６１８号明細書、２０１２年８月６日に出願された米国仮特許出願第６１／６８０，０９８号明細書、２０１４年５月１６日に出願された米国特許出願第１４／３５８，９７２号明細書、および２０１２年１１月１６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）に関する。
【０００３】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、ここでその全体は参照により援用される。２０１６年７月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１−０３０２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが６８，２８９バイトである。
【背景技術】
【０００４】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）（プレアルブミンとも知られる）は、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）中で見出される。ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）およびサイロキシン（Ｔ４）を輸送し、さらに血中およびＣＳＦ中のＲＢＰとのその会合を通じてレチノール（ビタミンＡ）の担体として作用する。トランスサイレチンは、そのサイロキシンおよびレチノールの輸送にちなんで名付けられている。ＴＴＲはまた、プロテアーゼとして機能し、アポＡ−Ｉ（主要なＨＤＬアポリポタンパク質）、アミロイドβペプチド、およびニューロペプチドＹを含むタンパク質を切断し得る。（非特許文献１）を参照のこと。
【０００５】
ＴＴＲは、βシート構造内に豊富に存在する４つの同一の１２７個のアミノ酸サブユニット（単量体）の四量体である。各単量体は、２つの４鎖βシートおよび長球面の形状を有する。逆平行βシート相互作用は、単量体を二量体に連結する。各単量体からの短いループは、主な二量体−二量体相互作用を形成する。これらの２つのループ対は、二量体の対抗する凸面のβシートを分離させ、内部チャネルを形成する。
【０００６】
肝臓は、ＴＴＲ発現の主要な部位である。発現の他の顕著な部位は、脈絡叢、網膜（特にレチナール色素上皮）および膵臓を含む。
【０００７】
トランスサイレチンは、アミロイド線維の形成における前駆体タンパク質である、少なくとも２７の異なるタイプのタンパク質の１つである。（非特許文献２）を参照のこと。臓器および組織におけるアミロイド線維の細胞外沈着は、アミロイドーシスの特徴である。アミロイド線維は、前駆体タンパク質の過剰な生成または前駆体タンパク質における特定の突然変異のいずれかに起因し得るミスフォールドタンパク質凝集体からなる。ＴＴＲのアミロイド形成能力は、その広範なβシート構造に関連することがあり；Ｘ線結晶学的試験によると、特定のアミロイド形成突然変異がタンパク質の四量体構造を不安定化させることが示されている。例えば、（非特許文献３）を参照のこと。
【０００８】
アミロイドーシスは、アミロイド沈着によって特徴づけられるアミロイド疾患群に対する一般用語である。アミロイド疾患は、その前駆体タンパク質に基づいて分類され、例えば、その名称はアミロイドの「Ａ」で始まり、それに前駆体タンパク質の略称が後続し、例えば、ＡＴＴＲはアミロイド形成（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）トランスサイレチンに対応する（同書）。
【０００９】
極めて多くのＴＴＲ関連疾患が存在し、それらの大部分はアミロイド疾患である。正常配列ＴＴＲは、高齢の人々における心アミロイドーシスと関連し、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）と称される（老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）または心アミロイドーシスとも称される）。ＳＳＡは、多くの他の臓器において顕微鏡的沈着を伴うことが多い。ＴＴＲアミロイドーシスは、様々な形態で出現する。末梢神経系がより顕著に冒されるとき、その疾患は家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）と称される。主に心臓が関与するが神経系が関与しないとき、その疾患は家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）と称される。ＴＴＲアミロイドーシスの第３の主要タイプは、軟膜アミロイドーシス（軟膜または髄膜脳血管アミロイドーシスとしても知られる）、中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、またはアミロイドーシスＶＩＩ型である。ＴＴＲにおける突然変異はまた、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群、および甲状腺機能正常性高サイロキシン血症（サイロキシンに対する親和性の増加を伴う突然変異体ＴＴＲ分子に起因するサイロキシンとＴＴＲとの会合の増加に続発すると考えられる非アミロイド性疾患である）を引き起こすことがある。例えば、（非特許文献４）を参照のこと。
【００１０】
異常なアミロイド形成タンパク質は、体細胞突然変異を通じて遺伝性または後天性のいずれであってもよい（非特許文献２）。トランスサイレチン関連ＡＴＴＲは、遺伝性全身性アミロイドーシスの最もよく見られる形態である（非特許文献５）。ＴＴＲ突然変異は、ＴＴＲアミロイド形成の過程を促進し、ＡＴＴＲの発症における最も重要なリスク因子である。８５を超えるアミロイド形成ＴＴＲ変異体は、全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られている。ＴＴＲ突然変異は通常、特に末梢神経系に関与した全身性アミロイド沈着を引き起こすが、一部の突然変異は、心筋症または硝子体混濁に関連する（同書）。
【００１１】
Ｖ３０Ｍ突然変異は、最もよく見られるＴＴＲ突然変異である。例えば、（非特許文献５）を参照のこと。Ｖ１２２Ｉ突然変異は、アフリカ系アメリカ人集団の３．９％によって保有され、ＦＡＣの最も一般的な原因である（非特許文献６）。ＳＳＡが８０歳を超える集団の２５％超に影響することが推定される（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｉｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，６２（６）：４２９−４３５
【非特許文献２】Ｇｕａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖ．４，２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８１５．２０１１
【非特許文献３】Ｓａｒａｉｖａ  Ｍ．Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（１２）：１−１１
【非特許文献４】Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，２０２５−２０３３
【非特許文献５】Ｌｏｂａｔｏ，Ｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１６：４３８−４４２
【非特許文献６】Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６（７）：４６６−７３
【非特許文献７】Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（７）：２８４３−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、当該技術分野ではＴＴＲ関連疾患にとって有効な治療への必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤、および組成物を提供する。本発明はまた、本発明のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤を用いて、ＴＴＲの発現を阻害する方法および対象におけるＴＴＲ関連疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、センス鎖上のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、かつセンス鎖上に８以下の２’−フルオロ修飾、アンチセンス鎖上に６以下の２’−フルオロ修飾、センス鎖の５’末端に２つのホスホロチオエート結合、アンチセンス鎖の５’末端に２つのホスホロチオエート結合、およびリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンドを含むＲＮＡｉ剤が、ＴＴＲ遺伝子の活性を停止させるのに有効であることが本明細書中で示されるという発見に基づく。これらの作用物質は、意外にも増強されたＴＴＲ遺伝子サイレンシング活性を示す。理論による制限を意図しない限り、これらのＲＮＡｉ剤における前述の修飾および特定の標的部位の組み合わせまたは部分的組み合わせにより、本発明のＲＮＡｉ剤に改善された有効性、安定性、効力、および耐久性が付与されると考えられる。
【００１５】
したがって、一態様では、本発明は、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００１６】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、
ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される；
各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’およびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
【００１７】
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１、１２および１３位に存在する。
【００１８】
一実施形態では、Ｙヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾を含む。
【００１９】
一実施形態では、Ｙ’ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００２０】
二本鎖領域は、１５〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２５ヌクレオチド対長、２３〜２７ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、または２１〜２３ヌクレオチド対長であってもよい。
【００２１】
二本鎖ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１５〜３０ヌクレオチドまたは１９〜３０ヌクレオチドを有してもよい。
【００２２】
一実施形態では、ヌクレオチド上の修飾は、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体構造的に制限されたヌクレオチド、束縛エチルヌクレオチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホン酸基を含むヌクレオチド、５’−リン酸を含むヌクレオチド、および５’−リン酸模倣物を含むヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２３】
一実施形態では、ヌクレオチド上の修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾である。
【００２４】
センス鎖は、７以下の２’−フルオロ修飾、６以下の２’−フルオロ修飾、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾を含んでもよい。
【００２５】
アンチセンス鎖は、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾を含んでもよい。
【００２６】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’−リン酸または５’−リン酸模倣物をさらに含む。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’−リン酸模倣物をさらに含む。
【００２７】
一実施形態では、５’−リン酸模倣物は、５’−ビニルホスフェート（５’−ＶＰ）である。
【００２８】
一実施形態では、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。別の実施形態では、リガンドは、
【化１】
2018523655.tif 000002
である。
【００２９】
一実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
【００３０】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、以下の模式図に示されるようなリガンドに結合される。
【化２】
2018523655.tif 000003
（式中、ＸはＯまたはＳである）
【００３１】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）、および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
一実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）；ならびに
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１および３のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤のいずれか１つの群から選択される。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−６５４９２である。
【００３３】
一態様では、本発明は、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に完全に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合され、リガンドは二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【００３４】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、Ｎａ’およびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである８〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、その修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾である）
によって表される。
【００３５】
本発明はまた、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞、本発明のベクターを含む細胞、および本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本発明のベクターを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、非緩衝液、例えば生理食塩水または水中で投与される。
【００３７】
別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、緩衝液とともに投与される。一実施形態では、緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【００３８】
別の態様では、本発明は、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、（ａ）細胞を本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物と接触させるステップと；（ｂ）ステップ（ａ）で生成された細胞をＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持するステップと、を含み、それにより細胞内でのＴＴＲ遺伝子の発現が阻害される。
【００３９】
一実施形態では、細胞は対象内部に存在する。
【００４０】
一実施形態では、対象はヒトである。
【００４１】
一実施形態では、対象はＴＴＲ関連疾患に罹患している。
【００４２】
一実施形態では、ＴＴＲの発現は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％もしくは約１００％阻害される。
【００４３】
さらに別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象を、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を対象に治療有効量で投与することにより治療する方法を提供し、それにより対象を治療する。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を発症するリスクがある対象を、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を対象に予防有効量で投与することにより予防的に治療する方法を提供し、それにより対象を予防的に治療する。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を発症するリスクがある対象を予防的に治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を予防有効量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００４７】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を治療有効量で対象に投与するステップを含み、それにより対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法を提供する。本方法は、対象に二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量で投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号２に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００４９】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を治療有効量で対象に投与するステップを含み、それにより対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）が増加する。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法を提供する。本方法は、対象に二本鎖ＲＮＡｉ剤を治療有効量で投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号２に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００５１】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す。
【００５２】
一実施形態では、対象はヒトである。
【００５３】
一実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患に罹患している対象である。別の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象である。一実施形態では、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象、またはＴＴＲ関連疾患の家族歴を有する対象、またはＴＴＲアミロイドーシスの発症を示唆する徴候または症状を有する対象は、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する。
【００５４】
一実施形態では、ＴＴＲ関連疾患は、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイロキシン血症からなる群から選択される。
【００５５】
一実施形態では、対象はＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、本方法は対象におけるアミロイドＴＴＲ沈着を低減する。
【００５６】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下、静脈内、筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与手段により、対象に投与される。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下、筋肉内または静脈内投与を介して対象に投与される。さらに別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下投与を介して対象に投与される。
【００５７】
一実施形態では、本方法は、対象由来のサンプル中のｍＲＮＡ発現またはＴＴＲタンパク質発現のレベルを評価するステップをさらに含む。
【００５８】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与する結果、対象由来のサンプル中のＧ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインまたはケモカインのレベルに基づいて評価されるような対象における炎症性応答をもたらさない。
【００５９】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約１２．５ｍｇ〜約２００ｍｇ（例えば、約１２．５ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、または約２００ｍｇ）の一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６０】
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を発症するリスクがある対象を予防的に治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約１２．５ｍｇ〜約２００ｍｇ（例えば、約１２．５ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、または約２００ｍｇ）の一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６１】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ）の用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６２】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を発症するリスクがある対象を予防的に治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ）の用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６３】
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ）の用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６４】
さらに別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇ）の用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６５】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約１０ｍｇ〜約６００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約３００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約３００ｍｇ（例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１２５、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１７５、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２２５、約２３０、約２４０、約２５０ｍｇ、約２６０、約２７０、約２７５、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３２５、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３７５、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４２５、約４３０、約４４０、約４５０ｍｇ、約４６０、約４７０、約４７５、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５２５、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５７５、約５８０、約５９０、または約６００ｍｇ）の一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６６】
一態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を発症するリスクがある対象を予防的に治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約１０ｍｇ〜約６００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約３００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約３００ｍｇ（例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１２５、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１７５、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２２５、約２３０、約２４０、約２５０ｍｇ、約２６０、約２７０、約２７５、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３２５、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３７５、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４２５、約４３０、約４４０、約４５０ｍｇ、約４６０、約４７０、約４７５、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５２５、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５７５、約５８０、約５９０、または約６００ｍｇ）の一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６７】
別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約１０ｍｇ〜約６００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約３００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約３００ｍｇ（例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１２５、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１７５、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２２５、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２７５、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３２５、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３７５、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４２５、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４７５、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５２５、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５７５、約５８０、約５９０、または約６００ｍｇ）の一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６８】
さらに別の態様では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連障害を有する対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約１０ｍｇ〜約６００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約３００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約３００ｍｇ（例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１２５、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１７５、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２２５、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２７５、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３２５、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３７５、約３８０、約３９０、約４００、約４１０、約４２０、約４２５、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４７５、約４８０、約４９０、約５００、約５１０、約５２０、約５２５、約５３０、約５４０、約５５０、約５６０、約５７０、約５７５、約５８０、約５９０、または約６００ｍｇ）の一定用量で対象に投与するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、センス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は８以下の２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンス鎖は６以下の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖およびアンチセンス鎖は各々独立して、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００６９】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩｅ）：
センス：５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
アンチセンス：３’−ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−５’  （ＩＩＩｅ）
（式中、
ｎｐ’は２ヌクレオチドオーバーハングであり、かつｎｐ’内部の各ヌクレオチドはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各Ｎａ、Ｎｂ、ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立して、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
【００７０】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）、
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）、
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）、および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
一実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇｇｕｕａｃａｕｇＡｆａａｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号６）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）；
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＵｆｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号８）；ならびに
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号９）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合であり；かつＶＰは５’−リン酸模倣物である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
一実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列
５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）および
５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）を含む。
【００７３】
一定用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４週ごと、５週ごと、６週ごと、８週ごとまたは四半期ごとに１回、対象に投与されてもよい。
【００７４】
その用量の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約４週ごと、５週ごと、６週ごと、８週ごとまたは四半期ごとに１回、対象に投与されてもよい。
【００７５】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約四半期ごとに１回、対象に投与される。
【００７６】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に慢性的に投与される。
【００７７】
一実施形態では、対象はヒトである。
【００７８】
一実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患に罹患している対象である。別の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象である。一実施形態では、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象、またはＴＴＲ関連疾患の家族歴を有する対象、またはＴＴＲアミロイドーシスの発症を示唆する徴候または症状を有する対象は、ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する。
【００７９】
一実施形態では、ＴＴＲ関連疾患は、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、および高サイロキシン血症からなる群から選択される。
【００８０】
一実施形態では、対象はＴＴＲ関連アミロイドーシスを有し、本方法は対象におけるアミロイドＴＴＲ沈着を低減する。
【００８１】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下、静脈内、筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される投与手段により、対象に投与される。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下、筋肉内または静脈内投与を介して対象に投与される。さらに別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下投与を介して、例えば自己投与を介して、例えばプレフィルドシリンジまたは自動注射器シリンジを介して対象に投与される。
【００８２】
一実施形態では、本方法は、対象由来のサンプル中のｍＲＮＡ発現またはＴＴＲタンパク質発現のレベルを評価するステップをさらに含む。
【００８３】
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与する結果、対象由来のサンプル中のＧ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインまたはケモカインのレベルに基づいて評価されるような対象における炎症性応答をもたらさない。
【００８４】
一実施形態では、本発明の方法における使用に適した作用物質は、ＡＤ−６５４９２である。ＡＤ−６５４９２は、４週ごと、５週ごと、または６週ごと、または四半期ごとに対象に慢性的に投与されてもよい。
【００８５】
一態様では、本発明は、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する場合に用いられる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供する。その作用物質は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、ここでセンスおよびアンチセンス鎖は、表５中のヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
別の態様では、本発明は、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する場合に用いられる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供する。その作用物質は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖、アンチセンス鎖は表６中のアンチセンス配列のいずれか１つと３以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み、ここでセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべては修飾ヌクレオチドであり；かつセンス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合される。
【００８７】
センスおよびアンチセンス鎖は、表６または表７におけるヌクレオチド配列のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００８８】
一態様では、本発明は、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する場合に用いられる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）を含み、かつアンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）を含む（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）。
【００８９】
別の態様では、本発明は、ＴＴＲ関連疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約５０ｍｇ〜約３００ｍｇの用量で対象に投与するステップを含み、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）を含み、かつアンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）を含み（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）、それによりＴＴＲ関連疾患に罹患している対象を治療する。
【００９０】
さらに別の態様では、本発明は、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象を予防的に治療する方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約５０ｍｇ〜約３００ｍｇの用量で対象に投与するステップを含み、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）を含み、かつアンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）を含み（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）、それによりＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象を予防的に治療する。
【００９１】
一態様では、本発明は、ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約５０ｍｇ〜約３００ｍｇの用量で対象に投与するステップを含み、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）を含み、かつアンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）を含み（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）、それにより対象におけるニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）または改訂ＮＩＳ（ｍＮＩＳ＋７）を減少、緩徐化、または停止させる。
【００９２】
別の態様では、本発明は、ＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる方法を提供する。本方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤を約５０ｍｇ〜約３００ｍｇの用量で対象に投与するステップを含み、ここでＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓｇｓｇｇａｕＵｆｕＣｆＡｆＵｆｇｕａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号１０）を含み、かつアンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−ｕｓＣｆｓｕｕｇＧｆｕｕＡｆｃａｕｇＡｆａＡｆｕｃｃｃａｓｕｓｃ−３’（配列番号７）を含み（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’−フルオロＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；かつｓはホスホロチオエート結合である）、それによりＴＴＲ関連疾患に罹患しているかまたはＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象における６分歩行試験（６ＭＷＴ）を増加させる。
【００９３】
本発明は、以下の詳細な説明および図面により、さらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】２４時間トリトソーム安定性アッセイにおける指定のＲＮＡｉ剤の安定性を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、２４時間ラットサイトゾル安定性アッセイにおける指定のＲＮＡｉ剤の安定性を示すグラフであり、図２Ｂは、２４時間トリトソーム安定性アッセイにおける指定のＲＮＡｉ剤の安定性を示すグラフである。
【図３】指定のＲＮＡｉ剤の単回皮下用量１ｍｇ／ｋｇでの投与後の、ヒトＴＴＲのＶ３０Ｍ変異体（Ｖ３０Ｍ  ｈＴＴＲ）を発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。
【図４】指定のＲＮＡｉ剤の単回皮下用量２．５ｍｇ／ｋｇでの投与後の、ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。
【図５】ＡＤ−６５４９２の毎週２ｍｇ／ｋｇ用量で３週間（ＱＷ×３）の投与後の、ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、指定のＲＮＡｉ剤の毎月０．３ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４＠０．３ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与後の、ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。図６Ｂは、指定のＲＮＡｉ剤の毎月１ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４＠１ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与後の、ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。図６Ｃは、指定のＲＮＡｉ剤の毎月３ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４＠３ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与後の、ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍを発現するトランスジェニックマウスにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。
【図７】カニクイザルに対するＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７皮下投与の試験設計を示す。
【図８】図８Ａは、指定のＲＮＡｉ剤の単回皮下用量０．３ｍｇ／ｋｇでの投与後の、カニクイザルにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。図８Ｂは、ＡＤ−６５４９２の単回皮下用量１ｍｇ／ｋｇ、ＡＤ−６６０１７の単回皮下用量１ｍｇ／ｋｇ、またはＡＤ−５１５４７の単回皮下用量２．５ｍｇ／ｋｇでの投与後の、カニクイザルにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。図８Ｃは、ＡＤ−６５４９２の単回皮下用量３ｍｇ／ｋｇ、ＡＤ−６６０１７の単回皮下用量３ｍｇ／ｋｇ、またはＡＤ−５１５４７の単回皮下用量５ｍｇ／ｋｇでの投与後の、カニクイザルにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、ＡＤ−６５４９２の毎月皮下用量１ｍｇ／ｋｇで４か月間（ＱＭ×４）、ＡＤ−６６０１７の毎月皮下用量１ｍｇ／ｋｇで４か月間（ＱＭ×４）、またはＡＤ−５１５４７の一日量５ｍｇ／ｋｇで５日間、その後の毎週５ｍｇ／ｋｇ用量で４週間（ＱＤ×５、ＱＷ×４）の投与後の、カニクイザルにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。図９Ｂは、指定のＲＮＡｉ剤の毎月皮下用量３ｍｇ／ｋｇで４か月間（ＱＭ×４）の投与後の、カニクイザルにおけるＴＴＲタンパク質抑制を示すグラフである。
【図１０Ａ】カニクイザルにおける、ＡＤ−６５４９２の単回１ｍｇ／ｋｇ（破線）での皮下投与後のＴＴＲ抑制と比べてのＡＤ−６５４９２の毎月１ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４；実線）の皮下投与によるＴＴＲ抑制の維持を示すグラフである。
【図１０Ｂ】カニクイザルにおける、ＡＤ−６６０１７の単回皮下用量１ｍｇ／ｋｇ（破線）と比べてのＴＴＲタンパク質抑制に対するＡＤ−６６０１７の毎月１ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４；実線）の皮下投与の相加的効果を示すグラフである。
【図１１】ＡＤ−６５４９２の１ｍｇ／ｋｇ用量での単回皮下投与またはＡＤ−６５４９２の０．３ｍｇ／ｋｇ用量での単回皮下投与と比べての、ＡＤ−６５４９２の１ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４）の毎月皮下投与後、またはＡＤ−６５４９２の３ｍｇ／ｋｇ用量で４か月間（ＱＭ×４）の毎月皮下投与後の、カニクイザルにおける持続的血清ＴＴＲ抑制を示すグラフである。
【図１２】カニクイザルに対するＡＤ−６５４９２皮下投与の試験設計を示す。
【図１３】ＡＤ−６５４９２の０．３ｍｇ／ｋｇ用量で６か月間（ＱＭ×６）の毎月皮下投与後またはＡＤ−６５４９２の０．６ｍｇ／ｋｇ用量で６か月間（ＱＭ×６）の毎月皮下投与後またはＡＤ−６５４９２の単回１ｍｇ／ｋｇ初期用量（ＱＭｘ１）とその後のＡＤ−６５４９２の初期投与後２８日目開始の毎月０．３ｍｇ／ｋｇ用量で５か月間（ＱＭ×５）の投与後の、カニクイザルにおける強固な血清ＴＴＲ抑制を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤、および組成物を提供する。本発明はまた、ＴＴＲの発現を阻害する方法、および対象におけるＴＴＲ関連疾患を本発明のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤を用いて治療または予防する方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、センス鎖上のヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、かつセンス鎖上に８以下の２’−フルオロ修飾（例えば、７以下の２’−フルオロ修飾、６以下の２’−フルオロ修飾、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）、アンチセンス鎖上に６以下の２’−フルオロ修飾（例えば、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）、センス鎖の５’末端に２つのホスホロチオエート結合、アンチセンス鎖の５’末端に２つのホスホロチオエート結合、およびリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンドを含むＲＮＡｉ剤が、ＴＴＲ遺伝子の活性を選択的に停止させるのに有効であることが本明細書中で示されるという発見に基づく。これらの作用物質は、意外にも増強されたＴＴＲ遺伝子サイレンシング活性を示す。理論による制限を意図しない限り、これらのＲＮＡｉ剤における前述の修飾および特定の標的部位の組み合わせまたは部分的組み合わせにより、本発明のＲＮＡｉ剤に改善された有効性、安定性、効力、および耐久性が付与されると考えられる。
【００９６】
以下の詳細な説明は、ＴＴＲ遺伝子発現を選択的に阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作成して利用する方法、ならびＴＴＲ遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を受ける疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用、および方法を開示する。
【００９７】
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
【００９８】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
【００９９】
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
【０１００】
「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および／または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
【０１０１】
用語「約」は、当該技術分野で許容される典型的範囲内を意味するように本明細書で用いられる。例えば、「約」は、平均からの約２標準偏差以内として理解され得る。特定の実施形態では、約は＋１０％を意味する。特定の実施形態では、約は＋５％を意味する。約が一連の数またはある範囲の前にあるとき、「約」が一連の数の各々または範囲を修飾し得ると理解される。
【０１０２】
本明細書で用いられるとき、「トランスサイレチン」（「ＴＴＲ」）は、周知の遺伝子およびタンパク質を指す。ＴＴＲは、プレアルブミン、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢ、およびＴＢＰＡとしても知られる。ＴＴＲは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、サイロキシン（Ｔ４）およびレチノールのトランスポーターとして機能し、それはまた、プロテアーゼとして作用する。肝臓はＴＴＲを血液中に分泌し、また脈絡叢はＴＴＲを脳脊髄液中に分泌する。ＴＴＲはまた、膵臓およびレチナール色素上皮において発現される。ＴＴＲの最大の臨床的関連性は、正常および突然変異体ＴＴＲタンパク質の双方が、凝集して細胞外沈着物になるアミロイド線維を形成し、アミロイドーシスを引き起こし得ることである。レビューとして、例えば、Ｓａｒａｉｖａ  Ｍ．Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（１２）：１−１１を参照のこと。分子クローニングおよびラットトランスサイレチンのヌクレオチド配列、ならびにｍＲＮＡ発現の分布は、Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１３）８２１４−８２１９により記載されている。ヒトＴＴＲのＸ線結晶構造は、Ｂｌａｋｅ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８８，１−１２に記載されている。ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡ転写物の配列は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０００３７１（例えば、配列番号１および５）に見出すことができる。マウスＴＴＲ  ｍＲＮＡの配列は、ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０１３６９７．２に見出すことができ、またラットＴＴＲ  ｍＲＮＡの配列は、ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０１２６８１．１に見出すことができる。ＴＴＲ  ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ジェンバンク、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。
【０１０３】
本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡをはじめとする、ＴＴＲ遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、配列の標的部分は、ＴＴＲ遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。一実施形態では、標的配列は、ＴＴＲ遺伝子のタンパク質コード領域内部に存在する。別の実施形態では、標的配列は、ＴＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲ内部に存在する。
【０１０４】
標的配列は、例えば約１５〜３０ヌクレオチド長などの約９〜３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２ヌクレオチドなど、約１５〜３０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、標的配列は約１９〜約３０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、標的配列は約１９〜約２５ヌクレオチド長である。さらに他の実施形態では、標的配列は約１９〜約２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、標的配列は約２１〜約２３ヌクレオチド長である。上で列挙される範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であると考えられる。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態では、ＴＴＲ遺伝子の標的配列は、配列番号１のヌクレオチド６１５〜６３７または配列番号５のヌクレオチド５０５〜５２７（すなわち、５’−ＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’；配列番号４）を含む。
【０１０６】
本明細書の用法では、「配列を含む鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。
【０１０７】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば表２を参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。
【０１０８】
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、ＴＴＲ遺伝子発現を調節し、例えば阻害する。
【０１０９】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えばＴＴＲ標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論に拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼにより、分解され、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む短い二本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が得られると考えられる（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、これらのｄｓＲＮＡを処理して、２塩基の３’オーバーハングを特徴とする１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、これらのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内部で生成され、かつＲＩＳＣ複合体の形成を促進して標的遺伝子、すなわちＴＴＲ遺伝子のサイレンシングを行う、一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」はまた、上記のようなＲＮＡｉを指すように本明細書で用いられる。
【０１１０】
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するため、細胞または生物に導入される一本鎖ＲＮＡであってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼのアルゴノート２に結合し、次に標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５〜３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ＲＮＡのデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４に記載される。本明細書に記載されるあらゆるアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４に記載される方法で化学的に修飾して、使用してもよい。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明の組成物、使用、および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＴＴＲ遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含む、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。
【０１１２】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳述される通り、各鎖または両鎖はまた、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含み得る。さらに、本願中で用いられる通り、「ＲＮＡｉ剤」は化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでもよく；ＲＮＡｉ剤は複数のヌクレオチドに実質的修飾を含んでもよい。
【０１１３】
本明細書で用いられるとき、用語「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の作用物質における使用に適した修飾は、本明細書に開示または当該技術分野で公知のすべてのタイプの修飾を含む。任意のかかる修飾は、本願および特許請求の範囲を目的として、ｓｉＲＮＡ型分子中で用いられるとき、「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
【０１１４】
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９〜３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５〜３０塩基対長さ、例えば約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
【０１１５】
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、１０以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、８以下の不対ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４〜１０の不対ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４〜８のヌクレオチドであり得る。
【０１１６】
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
【０１１７】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を誘導するため、標的ＲＮＡ配列、例えばＴＴＲ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用するｄｓＲＮＡであり、その各鎖は２４〜３０ヌクレオチド長である。理論に拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。ＲＮＡｉ剤の一実施形態では、少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の１本の鎖の３’および５’末端の双方が、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【０１１８】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を誘導するため、ＴＴＲ  ＲＮＡ配列と相互作用するｄｓＲＮＡであり、その各鎖は１９〜２３のヌクレオチドを含む。理論に拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を誘導するため、ＴＴＲ  ＲＮＡ配列と相互作用する２４〜３０のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
【０１１９】
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。ｄｓＲＮＡの一実施形態では、少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５のヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の１本の鎖の３’および５’末端の双方が、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【０１２０】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、例えば、０〜３、１〜３、２〜４、２〜５、４〜１０、５〜１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１〜１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１〜１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
【０１２１】
特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、または双方におけるオーバーハングは、１０より長く拡張されたヌクレオチド長、例えば、１〜３０ヌクレオチド長、２〜３０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、または１０〜１５ヌクレオチド長を含み得る。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ以上がヌクレオシドチオリン酸と置き換えられる。特定の実施形態では、オーバーハングは、オーバーハングが生理的条件下で安定なヘアピン構造を形成する能力があるように自己相補性部分を含む。
【０１２２】
「平滑化された」または「平滑末端化された」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のその末端に不対ヌクレオチドが存在しない、すなわちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化された」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたり二本鎖である、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤（すなわち１つのオーバーハングと１つの平滑末端を有する作用物質）または両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
【０１２３】
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えばＴＴＲ  ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で用いられるとき、用語「相補性領域」は、本明細書で定義される通り、配列、例えば標的配列、例えばＴＴＲヌクレオチド配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域の標的配列に対する相補性が完全でない場合、ミスマッチは分子の内部または末端領域内に存在し得る。一般に、最も許容的なミスマッチは、末端領域内、例えば、ｉＲＮＡの５’末端および／または３’末端の５、４、３、２、もしくは１つのヌクレオチドの中に存在する。一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。一実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３、２、もしくは１つ目のヌクレオチドの中に存在する。別の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えばｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド内に存在する。
【０１２４】
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書で用いられるとき、本明細書中で定義される通りのアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
【０１２５】
本明細書で用いられるとき、用語「切断領域」は、切断部位に直に隣接して存在する領域を指す。切断部位は、切断がなされる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端上に直に隣接して３つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端上に直に隣接して２つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位に特に存在し、かつ切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
【０１２６】
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。
【０１２７】
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
【０１２８】
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２９】
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
【０１３０】
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＴＴＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ＴＴＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【０１３１】
したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＴＴＲ配列に完全に相補的である。他の実施形態では、本明細書で開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）に完全に相補的である。一実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、５’−ＵＣＵＵＧＧＵＵＡＣＡＵＧＡＡＡＵＣＣＣＡＵＣ−３’（配列番号３）である。
【０１３２】
他の実施形態では、本明細書で開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＴＴＲ配列に実質的に相補的であり、かつ、配列番号２（５’−ＵＧＧＧＡＵＵＵＣＡＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡ−３’）のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当領域、または配列番号１、２、および５のいずれか１つの断片に対して、その全長にわたり少なくとも約８０％相補的である、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％相補的である隣接ヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である（さらにアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＴＴＲ配列に対して相補的である）センス鎖を含み、ここでセンス鎖ポリヌクレオチドは、表１、３、５、６、および７における配列のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当領域に対して、その全長にわたり少なくとも約８０％相補的である、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％相補的である隣接ヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＴＴＲ配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖を含み、かつ表１および３における配列のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当領域に対して、その全長にわたり少なくとも約８０％相補的である、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％相補的である隣接ヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、片方または双方の鎖はまた、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドなどの１つまたは複数の非リボヌクレオチドも含み得る。さらに「ｉＲＮＡ」としては、化学修飾のあるリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾としては、本明細書で開示され、または当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾が挙げられる。本明細書および特許請求の目的で、あらゆるこのような修飾は、ｉＲＮＡ分子における用法では「ｉＲＮＡ」に包含される。
【０１３６】
本発明の一態様では、本発明の方法および組成物にて用いられる作用物質は、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンス核酸分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内部の配列に対して相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することにより化学量論的様式で翻訳を阻害することができ、Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １：３４７−３５５を参照のこと。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有してもよい。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に記載のアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれより多い隣接ヌクレオチドである配列を含んでもよい。
【０１３７】
「ＴＴＲ関連疾患」は、本明細書で用いられるとき、ＴＴＲ遺伝子またはタンパク質に関連した任意の疾患を含むように意図される。かかる疾患は、例えば、ＴＴＲタンパク質の過剰な生成により、ＴＴＲ遺伝子突然変異により、ＴＴＲタンパク質の異常な切断により、ＴＴＲと他のタンパク質または他の内因性もしくは外因性物質との間の異常な相互作用により、引き起こされる場合がある。「ＴＴＲ関連疾患」は、ＴＴＲが異常な細胞外凝集体の形成またはアミロイド沈着における役割を担う、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の任意のタイプを含む。ＴＴＲ関連疾患は、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群、および高サイロキシン血症を含む。ＴＴＲアミロイドーシスの症状は、感覚性ニューロパチー（例えば、知覚障害、四肢遠位における感覚鈍麻）、自律神経ニューロパチー（例えば、胃腸障害、例えば胃潰瘍、または起立性低血圧）、運動ニューロパチー、発作、認知症、脊髄症、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、実質的に低下したｍＢＭＩ（修正肥満度指数）、脳神経障害、および格子状角膜ジストロフィーを含む。
【０１３８】
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、１つまたは複数のＴＴＲ遺伝子発現を選択的に阻害するｉＲＮＡを提供する。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＴＴＲ関連疾患を有するヒトのような、哺乳類などの対象内の細胞などの細胞内で、ＴＴＲ遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下の長さ（例えば約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド以下の長さ）である。ＴＴＲ遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは選択的に、ＴＴＲ遺伝子（例えばヒト、霊長類、非霊長類、または鳥類Ｓｅｒｔｐｉｎｃ１遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法による、または例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、少なくとも約１０％阻害する。
【０１３９】
ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＴＴＲ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
【０１４０】
一般に、二本鎖構造は、例えば１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対長さなどの１５〜３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
【０１４１】
同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２ヌクレオチド長など１５〜３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２０ヌクレオチド長、または約２５〜約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約２１〜２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
【０１４３】
当業者は、例えば約１０〜３６、１１〜３６、１２〜３６、１３〜３６、１４〜３６、１５〜３６、９〜３５、１０〜３５、１１〜３５、１２〜３５、１３〜３５、１４〜３５、１５〜３５、９〜３４、１０〜３４、１１〜３４、１２〜３４、１３〜３４、１４〜３４、１５〜３４、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、９〜３２、１０〜３２、１１〜３２、１２〜３２、１３〜３２、１４〜３２、１５〜３２、９〜３１、１０〜３１、１１〜３１、１２〜３１、１３〜３２、１４〜３１、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対などの約９〜３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識するであろう。したがって一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５〜３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＴＴＲ発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
【０１４４】
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。特定の実施形態では、より長い、拡張されたオーバーハングが可能である。
【０１４５】
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。
【０１４６】
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。
【０１４７】
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖は、表１、３、５、６、および７のいずれか１つで提供される配列群から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は、表１、３、５、６、および７のいずれか１つの配列群から選択される。この態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、ＴＴＲ遺伝子発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがってこの態様では、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、表１、３、５、６、および７のいずれか１つのセンス鎖と説明され、第２のオリゴヌクレオチドは、表１、３、５、６、および７のいずれか１つのセンス鎖に対応するアンチセンス鎖と説明される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含有される。
【０１４８】
表１、３、５、６、および７の配列の一部は、修飾および／または共役配列と説明されるが、例えば本発明のｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未修飾、非共役、および／または説明されるものとは異なって修飾されおよび／または共役している、表１、３、５、６、および７に記載される配列のいずれか１つを含んでもよいものと理解される。
【０１４９】
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０〜２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ  １４：１７１４−１７１９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３：２２２−２２６）。上述の実施形態では、表１、３、５、６、および７のいずれか１つで提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表１、３、５、６、および７のいずれか１つの配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表１、３、５、６、および７のいずれか１つの配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、ＴＴＲ遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含むｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％の以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１５０】
さらに表１、３、５、６、および７のいずれか１つで提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＴＴＲ転写物中の部位を同定する。したがって本発明は、これらの配列の１つ内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＴＴＲ遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表１、３、５、６、および７のいずれか１つで提供される配列の１つからの約１５個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１５１】
標的配列は、一般に約１５〜３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって例えば表１、３、５、６、および７のいずれか１つ中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
【０１５２】
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表１、３、５、６、および７のいずれか１つ中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
【０１５３】
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＴＴＲ遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＴＴＲ遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
【０１５４】
ＩＩＩ．発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未変性であり、例えば当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの発明のｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的すべてが修飾される。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドのすべてが修飾される。一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的すべてが修飾され、かつｉＲＮＡは、センス鎖上に８以下の２’−フルオロ修飾（例えば、７以下の２’−フルオロ修飾、６以下の２’−フルオロ修飾、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）、またアンチセンス鎖上に６以下の２’−フルオロ修飾（例えば、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）を含む。他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドのすべてが修飾され、かつｉＲＮＡは、センス鎖上に８以下の２’−フルオロ修飾（例えば、７以下の２’−フルオロ修飾、６以下の２’−フルオロ修飾、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）、またアンチセンス鎖上に６以下の２’−フルオロ修飾（例えば、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）を含む。「ヌクレオチドの実質的すべてが修飾される」場合の本発明のｉＲＮＡは、全部ではないが大規模に修飾されており、５以下、４、３、２、もしくは１の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０１５５】
本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
【０１５６】
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’−５’結合、それらの２’−５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
【０１５７】
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５８】
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
【０１５９】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６０】
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載される。
【０１６１】
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［天然リン酸ジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
【０１６２】
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、すなわちアルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
【０１６３】
その他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
【０１６４】
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、デオキシチミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、具体的には５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンをはじめとする、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅ���ｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
【０１６５】
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６６】
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ以上の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含む糖部分を有し、それにより二環式環系を形成する、ヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’−炭素と２’−炭素とを接続する。したがって、一部の実施形態では、本発明の作用物質は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する余分な架橋を含むような修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すれば、ＬＮＡは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’−エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。本発明のポリヌクレオチドにおいて用いられる二環式ヌクレオシドの例として、限定はされないが、４’および２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’から２’への架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。かかる４’から２’に架橋された二環式ヌクレオシドの例として、限定はされないが、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「束縛エチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または保護基）（例えば米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）；および４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。前述の各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。
【０１６７】
ロックド核酸ヌクレオチドの調製について教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開として、限定はされないが、以下、すなわち、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；第６，５２５，１９１号明細書；第６，６７０，４６１号明細書；第６，７７０，７４８号明細書；第６，７９４，４９９号明細書；第６，９９８，４８４号明細書；第７，０５３，２０７号明細書；第７，０３４，１３３号明細書；第７，０８４，１２５号明細書；第７，３９９，８４５号明細書；第７，４２７，６７２号明細書；第７，５６９，６８６号明細書；第７，７４１，４５７号明細書；第８，０２２，１９３号明細書；第８，０３０，４６７号明細書；第８，２７８，４２５号明細書；第８，２７８，４２６号明細書；第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。
【０１６８】
前述の二環式ヌクレオシドのいずれかは、例えばα−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ以上の立体化学的糖配置を有するように調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
【０１６９】
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ以上の束縛エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で用いられるとき、「束縛エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、束縛エチルヌクレオチドは、本明細書中で「Ｓ−ｃＥｔ」と称されるＳ立体配置をなす。
【０１７０】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の「立体構造的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含んでもよい。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３およびＣ５’炭素を接続するリンカーを伴うヌクレオチドアナログである。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配置にロックし、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置し、リボース環のパッカリングの低減をもたらすのに十分な長さを有する。
【０１７１】
特定の上記のＣＲＮの調製について教示する代表的な公開として、限定はされないが、米国特許第出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；およびＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレット（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。
【０１７２】
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１つ以上はまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドを含んでもよい。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、非環式２’−３’−セコ−ヌクレオチド（「非ロックド核酸」（「ＵＮＡ」）修飾とも称される）である。
【０１７３】
ＵＮＡの調製について教示する代表的な米国公開として、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；第２０１３／００１１９２２号明細書；および第２０１１／０３１３０２０号明細書（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。
【０１７４】
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。
【０１７５】
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾は、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’リン酸または５’リン酸模倣物、例えば５’末端リン酸またはリン酸模倣物を含む。好適なリン酸模倣物は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書（その内容全体は参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【０１７６】
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、または２０１２年１１月１６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書（それら各々の内容全体は参照により本明細書中に援用される）に開示のような化学修飾を含む。
【０１７７】
より詳細には、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖の切断部位またはその近傍での３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾のモチーフを１つ以上有するように修飾されるとき、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に増強されたことが意外にも発見されている。
【０１７８】
したがって、本発明は、生体内で標的遺伝子（すなわちＴＴＲ遺伝子）の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長の範囲であってもよい。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長の間であってもよい。
【０１７９】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には本明細書中で「ＲＮＡｉ剤」とも称される二本鎖としての二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二本鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、または２１〜２３ヌクレオチド対長の間であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択される。
【０１８０】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、鎖の一方または双方の３’末端、５’末端、または両末端に１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含んでもよい。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、鎖の一方が他方より長いことの結果、または同じ長さの２本の鎖がねじれ形であることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得るか、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得るか、または別の配列であり得る。第１鎖および第２鎖はまた、例えば、ヘアピンを形成するのに付加的塩基により、または他の非塩基リンカーにより、連結され得る。
【０１８１】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域内のヌクレオチドは各々独立して、修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば限定はされないが、２’−糖修飾、例えば、２−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端におけるオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得るか、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得るか、または別の配列であり得る。
【０１８２】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖での５’−または３’−オーバーハングは、リン酸化されてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは同じかまたは異なる可能性がある。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’−オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一実施形態では、この３’−オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
【０１８３】
ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉの干渉活性をその全体的安定性に影響することなく強化し得る単一のオーバーハングのみを含んでもよい。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、または代替的にアンチセンス鎖の３’末端に位置してもよい。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）にまたはその逆として位置する平滑末端を有してもよい。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論によって拘束されたくないが、アンチセンス鎖の５’末端での非対称平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端でのオーバーハングでは、ガイド鎖をＲＩＳＣプロセスに負荷することが好ましい。
【０１８４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１のヌクレオチドセンス鎖および２３のヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’−Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３つの連続ヌクレオチド上に３つの２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含み、ここでＲＮＡｉ剤の一方の末端は平滑である一方、他方の末端は２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に存在する。
【０１８５】
２ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に存在するとき、３つのヌクレオチド末端間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在してもよく、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤はさらに、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の双方で、３つのヌクレオチド末端間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基は独立して、例えば交互モチーフにおいて、２’−Ｏ−メチルまたは３’−フルオロで修飾される。一実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドのすべてが修飾され、かつｉＲＮＡは、センス鎖上に８以下の２’−フルオロ修飾（例えば、７以下の２’−フルオロ修飾、６以下の２’−フルオロ修飾、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）、またアンチセンス鎖上に６以下の２’−フルオロ修飾（例えば、５以下の２’−フルオロ修飾、４以下の２’−フルオロ修飾、３以下の２’−フルオロ修飾、または２以下の２’−フルオロ修飾）を含む。任意選択的には、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくはＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
【０１８６】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾のモチーフを少なくとも１つ含み、ここでモチーフの１つはセンス鎖内の切断部位に存在する。
【０１８７】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖もまた、３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾のモチーフを少なくとも１つ含み、ここでモチーフの１つはアンチセンス鎖内の切断部位またはその近傍に存在する。
【０１８８】
１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤においては、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には５’末端から約１０、１１および１２位である。したがって、３つの同一修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位に存在してもよく、ここでカウントはアンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから開始するか、またはカウントはアンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖内の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化してもよい。
【０１８９】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位での３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾のモチーフを少なくとも１つ有してもよく；またアンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近傍での３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾のモチーフを少なくとも１つ有してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するとき、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフが少なくとも１つのヌクレオチド重複を有するように、すなわち、センス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つがアンチセンス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、または３つすべてのヌクレオチドが重複してもよい。
【０１９０】
一実施形態では、モチーフの一部のヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオチドは、修飾されてもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、その修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大量の置換；天然塩基の修飾または置換；およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
【０１９１】
核酸がサブユニットのポリマーであることから、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非連結Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内部で反復される位置で生じる。場合によっては、修飾は核酸中のあらゆる対象位置で生じることになるが、多くの場合、そうならない。例として、修飾は、３’もしくは５’末端位置に限って生じてもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその双方において生じてもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内に限って生じてもよく、またはＲＮＡの一本鎖領域内に限って生じてもよい。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一末端または両末端に限って生じてもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って生じてもよく、または二本鎖および一本鎖領域内、特に末端で生じてもよい。５’末端は、リン酸化され得る。
【０１９２】
例えば、安定性を増強させるか、オーバーハング中に特定塩基を含めるか、または一本鎖オーバーハング中、例えば５’もしくは３’オーバーハング中、または双方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることは可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、３’もしくは５’オーバーハング中の塩基の全部もしくは一部を、例えば本明細書に記載の修飾で修飾してもよい。修飾は、例えばリボース糖の２’位での当該技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば核酸塩基のリボ糖に代わるデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）もしくは２’−Ｏ−メチル修飾の使用、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０１９３】
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立してＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾される。それらの鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。
【０１９４】
少なくとも２つの異なる修飾は、典型的にはセンス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それら２つの修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾、またはその他であってもよい。
【０１９５】
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が１本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じるものを指す。交互ヌクレオチドは、１つ置きのヌクレオチドごとに１つまたは３つのヌクレオチドごとに１つ、または類似パターンを指してもよい。例えば、Ａ、ＢおよびＣの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
【０１９６】
交互モチーフ内に含まれる修飾のタイプは、同じであってもまたは異なってもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互パターン、すなわち１つ置きのヌクレオチドに対する修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」または「ＣＤＣＤＣＤ…」など、交互モチーフ内部の幾つかの修飾の可能性から選択され得る。
【０１９７】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、センス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンが、アンチセンス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンに対して変化することを含む。センス鎖のヌクレオチドの修飾基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応し、またその逆もいえるような変化であってもよい。例えば、センス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合するとき、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始してもよく、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始してもよい。別の例として、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始してもよく、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始してもよく、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全な変化または部分的変化が存在する。
【０１９８】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初のセンス鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾および２’−Ｆ修飾の交互モチーフのパターンが、最初のアンチセンス鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾および２’−Ｆ修飾の交互モチーフのパターンに対して変化を有する、すなわちセンス鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖上の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対合し、またその逆もいえることを含む。センス鎖の１位は２’−Ｆ修飾で開始してもよく、またアンチセンス鎖の１位は２’−Ｏ−メチル修飾で開始してもよい。
【０１９９】
センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対する３つの連続ヌクレオチド上への３つの同一修飾の１つ以上のモチーフの導入により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖内に存在する最初の修飾パターンが中断される。センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対して３つの連続ヌクレオチド上に３つの同一修飾の１つ以上のモチーフを導入することによる、センスおよび／またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、意外にも標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強する。
【０２００】
一実施形態では、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾のモチーフが鎖のいずれかに導入されるとき、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は「…ＮａＹＹＹＮｂ…」であり、ここで「Ｙ」は、３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾のモチーフの修飾を表し、かつ「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾を表し、またここでＮａおよびＮｂは、同じまたは異なる修飾であり得る。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウィング修飾（ｗｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が存在するとき、存在してもまたは不在であってもよい。
【０２０１】
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両鎖の、鎖の任意の位置における任意のヌクレオチド上に生じてもよい。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に生じてもよい；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上に交互パターンで生じてもよい；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含んでもよい。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでもまたは異なってもよく、またセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対して変化を有してもよい。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６〜８のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端での２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合および３’末端での２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含み、またセンス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含む。
【０２０２】
一実施形態では、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内部の末端の対合ヌクレオチドと連結するために設けられてもよい。例えば、少なくとも２、３、４、もしくはすべてのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよく、任意選択的には、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合が存在してもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在してもよく、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、かつ３つ目はオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端に存在してもよい。
【０２０３】
一実施形態では、２つのヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し、かつ末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在し、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、かつ第３のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択的には、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の双方で、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合をさらに有してもよい。
【０２０４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的との、二本鎖内部に、またはそれらの組み合わせにてミスマッチを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内または二本鎖領域内に存在してもよい。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて順位付けされてもよい（例えば、最も簡単な手法は、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーについて、その対合を個別の対合に基づいて検討することであるが、酷似または類似の分析もまた用いることができる）。解離を促進する観点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；かつＩ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非基準もしくは基準以外の対合（本明細書中の他の箇所で記載の通り）は、基準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく；またユニバーサル塩基を含む対合は、基準の対合よりも好ましい。
【０２０５】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、二本鎖の５’末端でのアンチセンス鎖の解離を促進するため、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、およびミスマッチ対、例えば非基準もしくは基準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択される、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２、３、４、もしくは５つの塩基対の少なくとも１つを含む。
【０２０６】
一実施形態では、アンチセンス鎖における５’末端からの二本鎖領域内部の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２もしくは３つの塩基対の少なくとも１つはＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の塩基対はＡＵ塩基対である。
【０２０７】
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉ）
（式中、
ｉおよびｊは、各々独立して０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立して０〜６であり；
各Ｎａは、独立して０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立して０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＮｂおよびＹは、同じ修飾を有さず；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立して３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表されてもよい。好ましくは、ＹＹＹは、すべての２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
【０２０８】
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
【０２０９】
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するとき、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に生じ得（例えば、６、７、８、７、８、９、８、９、１０、９、１０、１１、１０、１１、１２もしくは１１、１２、１３位に生じ得）、ここでカウントは５’末端から最初のヌクレオチドで開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始する。
【０２１０】
一実施形態では、ｉは１でｊは０か、またはｉは０でｊは１か、またはｉおよびｊは双方とも１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｄ）
によって表され得る。
【０２１１】
センス鎖が式（Ｉｂ）によって表されるとき、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０２１２】
センス鎖が式（Ｉｃ）によって表されるとき、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０２１３】
センス鎖が式（Ｉｄ）によって表されるとき、各Ｎｂは、独立して０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５もしくは６である。各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じであってもまたは異なってもよい。
【０２１４】
他の実施形態では、ｉが０でｊが０であり、かつセンス鎖は、式：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉａ）
によって表されてもよい。
【０２１５】
センス鎖が式（Ｉａ）によって表されるとき、各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０２１６】
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’  （ＩＩ）
（式中、
ｋおよびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々独立して０〜６であり；
各Ｎａ’は、独立して０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は、独立して０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ここでＮｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有さず；かつ
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表されてもよい。
【０２１７】
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
【０２１８】
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するとき、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位に生じ得、ここでカウントは５’末端から最初のヌクレオチドで開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始する。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位に生じる。
【０２１９】
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、すべての２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
【０２２０】
一実施形態では、ｋが１でｌが０、またはｋが０でｌが１、またはｋおよびｌの双方が１である。
【０２２１】
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｄ）
によって表され得る。
【０２２２】
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表されるとき、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０２２３】
アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）によって表されるとき、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０２２４】
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）によって表されるとき、各Ｎｂ’は、独立して０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５もしくは６である。
【０２２５】
他の実施形態では、ｋが０でｌが０であり、かつアンチセンス鎖は、式：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’（Ｉａ）
によって表されてもよい。
【０２２６】
アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）として表されるとき、各Ｎａ’は、独立して２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同じであってもまたは異なってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾されてもよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾を表してもよい。
【０２２７】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔであるとき、鎖の９、１０および１１位に生じるＹＹＹモチーフを含んでもよく、カウントは５’末端から最初のヌクレオチドで開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始し、またＹは２’−Ｆ修飾を表す。
【０２２８】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位に生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでもよく、カウントは５’末端から最初のヌクレオチドから開始するか、または任意選択的には、カウントは５’末端から二本鎖領域内部の最初の対合ヌクレオチドで開始し、またＹ’は２’−Ｏ−メチル修飾を表す。
【０２２９】
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖は各々、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されているアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
【０２３０】
したがって、本発明の方法において用いられるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでもよく、各鎖は１４〜３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立して０〜６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立して０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは各々、存在または不在の場合があり、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して３つの連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
【０２３１】
一実施形態では、ｉが０でｊが０；またはｉが１でｊが０；またはｉが０でｊが１；またはｉおよびｊが双方とも０；またはｉおよびｊが双方とも１である。別の実施形態では、ｋが０でｌが０；またはｋが１でｌが０；ｋが０でｌが１；またはｋおよびｌが双方とも０；またはｋおよびｌが双方とも１である。
【０２３２】
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
５’−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’５’
（ＩＩＩｅ）
を含む。
【０２３３】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表されるとき、各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０２３４】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表されるとき、各Ｎｂは、独立して１〜１０、１〜７、１〜５または１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０２３５】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）として表されるとき、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２もしくは０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０２３６】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表されるとき、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立して２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ’の各々は、独立して交互パターンの修飾を含む。
【０２３７】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｅ）として表されるとき、各Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、およびＮｂ’は、独立して修飾もしくは非修飾のいずれかまたはその組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含む。
【０２３８】
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、および（ＩＩＩｅ）におけるＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じであってもまたは異なってもよい。
【０２３９】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、および（ＩＩＩｅ）によって表されるとき、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してもよい。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＹヌクレオチドの３つ全部はすべて、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０２４０】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してもよい。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＺヌクレオチドの３つ全部はすべて、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０２４１】
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表されるとき、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してもよい。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＸヌクレオチドの３つ全部はすべて、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０２４２】
一実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾はＹ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾はＺ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、かつ／またはＸヌクレオチド上の修飾はＸ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
【０２４３】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結される。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、またセンス鎖は、二価または三価分岐リンカー（下記）を介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、またセンス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、かつセンス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。
【０２４４】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、かつ少なくとも１つのｎｐ’は隣接ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、またセンス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、かつセンス鎖は、二価または三価分岐リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に結合される。
【０２４５】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、および（ＩＩＩｅ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、および３’末端の一方もしくは両方で互いに連結され、任意選択的にはリガンドに結合される。作用物質の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得るか、または作用物質の各々は、２つの異なる標的部位で同じ遺伝子を標的化し得る。
【０２４６】
様々な公開では、本発明の方法にて使用可能な多量体ＲＮＡｉ剤についての記載がある。かかる公開は、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレット（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）を含む。
【０２４７】
下記にさらに詳述される通り、１つ以上の炭水化物部分のＲＮＡｉ剤への結合を含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば炭水化物リガンドが結合した非炭水化物（好ましくは環状）担体と置換され得る。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書中でリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は炭素環式環系であってもよく、すなわちすべての環原子は炭素原子であるか、または複素環式環系、すなわち１つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってもよい。環状担体は、単環式環系であってもよく、または２つ以上の環、例えば融合環を含んでもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよく、または１つ以上の二重結合を含んでもよい。
【０２４８】
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着されてもよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。「骨格付着点」は、本明細書で用いられるとき、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えばリン酸塩の骨格、もしくは例えば硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。その部分は、例えば糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択的には、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、官能基、例えばアミノ基を含むことが多く、または一般に、別の化学的実体、例えばリガンドの構成環への組み込みまたは繋留に適した結合を可能にする。
【０２４９】
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドに結合されてもよく、ここで担体は、環式基または非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
【０２５０】
特定の具体的な実施形態では、例えば本発明の方法にて用いられるＲＮＡｉ剤は、表１、３、５、６、および７のいずれか１つの中に列挙される作用物質の群から選択される作用物質である。これらの作用物質は、リガンドをさらに含んでもよい。
【０２５１】
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−６６０１６、ＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１７、およびＡＤ−６６０１８からなる群から選択される作用物質である。
【０２５２】
ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）；例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）などの脂肪族鎖；例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２５３】
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
【０２５４】
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
【０２５５】
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、一価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓｅａｍｉｎｅ）多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態では、リガンドは、一価または多価ガラクトースを含む。特定の実施形態では、リガンドは、コレステロールを含む。
【０２５６】
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０２５７】
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ−κＢ活性化因子であり得る。
【０２５８】
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
【０２６０】
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
【０２６１】
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
【０２６２】
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド−ヌクレオチドまたはヌクレオシド−複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
【０２６３】
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
【０２６４】
Ａ．脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
【０２６５】
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
【０２６６】
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
【０２６７】
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
【０２６８】
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
【０２６９】
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα−らせん剤である。
【０２７０】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５〜５０アミノ酸長であり得る。
【０２７１】
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１１）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１２））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１３））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１４））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ−ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
【０２７２】
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ−アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ−１またはＶＥＧＦを標的にする。
【０２７３】
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα−らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０２７４】
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、ＴＴＲ以上（例えばＴＴＲ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＴＴＲ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
【０２７５】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法にて用いられる炭水化物複合体は、
【化３】
2018523655.tif 000004
【化４】
2018523655.tif 000005
【化５】
2018523655.tif 000006
【化６】
2018523655.tif 000007
【化７】
2018523655.tif 000008
からなる群から選択される。
【０２７６】
一実施形態では、単糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、例えば、
【化８】
2018523655.tif 000009
である。
【０２７７】
本明細書に記載の実施形態にて用いられる別の代表的な炭水化物複合体は、限定はされないが、
【化９】
2018523655.tif 000010
（式ＸＸＩＩＩ）（ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である）を含む。
【０２７８】
本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ剤に一価リンカーを介して結合される。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ剤に二価リンカーを介して結合される。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ剤に三価リンカーを介して結合される。
【０２７９】
一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合された１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５、または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々は独立して、二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに複数の一価リンカーを介して結合される。
【０２８０】
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と他方の各鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖によって接続された１つのより大きい分子の一部であるとき、ヘアピンループ内部の各不対ヌクレオチドは、独立して一価リンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでもよい。ヘアピンループはまた、二本鎖の一方の鎖において拡張されたオーバーハングにより形成されてもよい。
【０２８１】
一部の実施形態では、炭水化物複合体は、上記のような１つ以上のさらなるリガンド、例えば限定はされないが、ＰＫ修飾因子および／または細胞浸透ペプチドをさらに含む。
【０２８２】
本発明における使用に適したさらなる炭水化物複合体は、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレット（それら各々の内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載されるものを含む。
【０２８３】
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
【０２８４】
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含み、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４個の原子、３〜２４個の原子、４〜２４個の原子、５〜２４個の原子、６〜２４個の原子、６〜１８個の原子、７〜１８個の原子、７〜１７この原子、８〜１７個の原子、６〜１６個の原子、７〜１６個の原子、または、８〜１６個の原子である。
【０２８５】
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
【０２８６】
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
【０２８７】
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
【０２８８】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
【０２８９】
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
【０２９０】
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
【０２９１】
ｉ．酸化還元切断可能連結基
１つの実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
【０２９２】
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０２９３】
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ−ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０２９４】
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０２９５】
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０２９６】
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、
【化１０】
2018523655.tif 000011
【化１１】
2018523655.tif 000012
（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２９７】
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
【０２９８】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、
式（ＸＸＸＩＩ）〜（ＸＸＸＶ）、
【化１２】
2018523655.tif 000013
（式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０〜２０の各出現を表し、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０〜２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結され得て；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化１３】
2018523655.tif 000014
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＸＸＶＩ）、
【化１４】
2018523655.tif 000015
（式中、
Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
【０２９９】
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３００】
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３０１】
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
【０３０２】
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ  Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
【０３０３】
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
【０３０４】
Ｖ．発明のｉＲＮＡの送達
例えばヒト対象（例えばＴＴＲに関連する疾患、障害または状態を有する対象などのそれを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
【０３０５】
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎ  ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ  ２４：１３２−１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．，  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）、ＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ  ＳＨ．，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ＭＥ．，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉ��，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
【０３０６】
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＴＴＲ遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【０３０７】
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
【０３０８】
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
【０３０９】
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニターし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
【０３１０】
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。
【０３１１】
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
【０３１２】
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。
【０３１３】
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
【０３１４】
アデノウイルもまた、本発明のｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３（１９９５）にある。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載される。
【０３１５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）ベクターもまた、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用され得る（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。
【０３１６】
本発明のｉＲＮＡを送達するのに好適な別のウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
【０３１７】
ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１−８０１を参照されたい。
【０３１８】
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
【０３１９】
ＶＩ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤もまた含む。一実施形態では、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物である。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現または活性に関連する、疾患または障害を治療するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。一実施例は、例えば皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）送達による、非経口送達を通じた、全身投与のために調合される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ輸液などの脳内点滴による、脳実質内への直接送達のために調合される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与されてもよい。一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤は、薬学的に許容できる担体中で皮下投与用に製剤化される。
【０３２０】
医薬組成物は、ある期間にわたり、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、もしくは約２５分の期間にわたり、静脈内注入により投与され得る。投与は、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間もしくはそれより長い間、例えば定期的に、例えば毎週、隔週（すなわち２週ごと）、反復されてもよい。投与はまた、例えば、月ベースで、または四半期ベースで、例えば約１２週ごとに反復されてもよい。初期治療計画の後、治療薬はより低い頻度ベースで投与され得る。例えば、３か月間の毎週または隔週での投与後、投与は、６か月または１年以上の間、月１回で反復され得る。
【０３２１】
医薬組成物は、毎日１回投与し得て、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、２、３回以上の部分用量として投与し得て、または持続注入または放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与し得る。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投薬単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、特に、本発明の作用物質で使用し得る、特定部位への作用物質送達のために有用である。この実施形態では、投薬単位は、相当する複数の１日量を含有する。
【０３２２】
別の実施形態では、医薬組成物の単回投与は、引き続く用量が、３、４、もしくは５日間以下の間隔で、１、２、３、もしくは４週間以下の間隔、または９、１０、１１、もしくは１２週間以下の間隔で投与されるように、長期にわたり得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、週１回投与される。本発明の別の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、月２回投与される。他の実施形態では、単回用量の本発明の医薬組成物は、毎月投与される。さらに他の実施形態では、単回用量の本発明の医薬組成物は、四半期ごとに投与される。
【０３２３】
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。
【０３２４】
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
【０３２５】
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
【０３２６】
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
【０３２７】
Ａ．膜様分子アセンブリーを含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために調合し得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するので、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ｉＲＮＡを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
【０３２８】
ｉＲＮＡ剤を含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にｉＲＮＡ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はｉＲＮＡ剤と相互作用して、ｉＲＮＡ剤周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ｉＲＮＡ剤のリポソーム調製物を得る。
【０３２９】
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨもまた調節して、凝縮を支援し得る。
【０３３０】
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成する方法は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載される。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用される適切なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組み合わせが挙げられる（例えばＭａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小型（５０〜２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合は、顕微溶液化を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、リポソーム内のｉＲＮＡ剤調製品の詰め込みに容易に適応される。
【０３３１】
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０３３２】
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０３３３】
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０３３４】
試験管内および生体内でリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【０３３５】
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０３３６】
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含み、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０３３７】
１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明された。どちらもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含む、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）で開示される。
【０３３８】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ｉＲＮＡ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
【０３３９】
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたｉＲＮＡ剤を代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
【０３４０】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質−核酸複合体を形成し、ｉＲＮＡ剤送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
【０３４１】
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
【０３４２】
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
【０３４３】
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
【０３４４】
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびｉＲＮＡ剤を皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ｉＲＮＡ剤を表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのｉＲＮＡ剤の浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０およびｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
【０３４５】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ｉＲＮＡ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
【０３４６】
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ｉＲＮＡ剤を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
【０３４７】
本発明に準じた他の製剤は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレット（その内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０３４８】
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
【０３４９】
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３５０】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
【０３５１】
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０３５２】
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
【０３５３】
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
【０３５４】
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３５５】
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
【０３５６】
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
【０３５７】
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
【０３５８】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
【０３５９】
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
【０３６０】
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
【０３６１】
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
【０３６２】
Ｂ．脂質粒子
例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、例えばＬＮＰまたはその他の核酸−脂質粒子などの脂質製剤中で完全にカプセル化して形成してもよい。
【０３６３】
本明細書の用法では、「ＬＮＰ」という用語は、安定核酸−脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＬＮＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸−脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
【０３６４】
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲である。上記に引用した範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
【０３６５】
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ  Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
【０３６６】
別の実施形態では、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用して、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
【０３６７】
一実施形態では、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
【０３６８】
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとすることができるが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
【０３６９】
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％または約２モル％であり得る。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
【０３７１】
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ  １４８７）（その内容を参照によって本明細書に援用する、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６の原液を例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で交換し得る。
【化１５】
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【０３７２】
ＬＮＰ０１製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載される。
【０３７３】
追加的な例示的脂質ｄｓＲＮＡ製剤は、表１に記載される。
【０３７４】
【表１】
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【０３７５】
【表２】
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【０３７６】
【表３】
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【０３７７】
ＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年４月１５日に出願された、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載される。
【０３７８】
ＸＴＣを含む製剤は、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１０／０８８５３７号パンフレット（その内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０３７９】
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書（その内容全体はここで参照により援用される）に記載されている。
【０３８０】
ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット（その内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０３８１】
Ｃ１２−２００を含む製剤は、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１０／１２９７０９号パンフレット（その内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０３８２】
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ��）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
【０３８３】
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
【０３８４】
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
【０３８５】
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
【０３８６】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
【０３８７】
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含む、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含む複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
【０３８８】
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。
【０３８９】
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５を参照されたい）。
【０３９０】
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
【０３９１】
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０３９２】
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
【０３９３】
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
【０３９４】
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
【０３９５】
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ  １８５−２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３〜５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０３９６】
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
【０３９７】
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３９８】
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第  ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
【０３９９】
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
【０４００】
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。
【０４０１】
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
【０４０２】
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
【０４０３】
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
【０４０４】
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、およびそのモノ−およびジ−グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照されたい）。
【０４０５】
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏ−２４，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ  ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照されたい）。
【０４０６】
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。  適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照されたい）。
【０４０７】
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
【０４０８】
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００  ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｉＲＮＡＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ  Ｄ１  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ���）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
【０４０９】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２−ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
【０４１０】
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
【０４１１】
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４１２】
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４１３】
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
【０４１４】
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４１５】
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
【０４１６】
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ｉＲＮＡ機序によって機能し、溶血性障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定される（ｌｍｉｔｅｄ）ものではない。
【０４１８】
それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
【０４１９】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
【０４２０】
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
【０４２１】
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、ＴＴＲ発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
【０４２２】
ＶＩＩ．ＴＴＲの発現を阻害するための方法
本発明はまた、細胞内でのトランスサイレチン（ＴＴＲ）の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞をＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤と細胞内でのＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量で接触させるステップを含み、それにより細胞内でのＴＴＲの発現を阻害する。
【０４２３】
細胞をＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることは、試験管内または生体内で行われてもよい。細胞を生体内でＲＮＡｉ剤と接触させることは、対象、例えばヒト対象内部の細胞または細胞群をＲＮＡｉ剤と接触させるステップことを含む。細胞または細胞群を接触させる試験管内および生体内での方法の組み合わせもまた可能である。細胞または細胞群を接触させることは、上で論じられた通り、直接的または間接的であってもよい。さらに、細胞または細胞群を接触させることは、標的リガンド、例えば本明細書に記載されるまたは当該技術分野で公知である任意のリガンドを介して行われてもよい。好ましい実施態様では、標的リガンドは、炭水化物部分、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば対象の肝臓に誘導する任意の他のリガンドである。
【０４２４】
用語「阻害する」は、本明細書で用いられるとき、「低減する」、「発現停止させる」、「下方制御する」、「抑制する」、および他の類似用語と交換可能に用いられ、任意レベルの阻害を含む。好ましくは、阻害するは、統計学的に有意な阻害または臨床的に有意な阻害を含む。
【０４２５】
語句「ＴＴＲの発現を阻害する」は、任意のＴＴＲ遺伝子（例えば、マウスＴＴＲ遺伝子、ラットＴＴＲ遺伝子、サルＴＴＲ遺伝子、またはヒトＴＴＲ遺伝子など）およびＴＴＲ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を指すように意図される。したがって、ＴＴＲ遺伝子は、野生型ＴＴＲ遺伝子、突然変異体ＴＴＲ遺伝子（アミロイド沈着を引き起こす突然変異体ＴＴＲ遺伝子など）、または遺伝子操作された細胞、細胞群、または生物との関連でのトランスジェニックＴＴＲ遺伝子であってもよい。
【０４２６】
「ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する」は、ＴＴＲ遺伝子の任意レベルの阻害、例えばＴＴＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＴＴＲ遺伝子の発現は、ＴＴＲ遺伝子発現に関連した任意の変数のレベル、またはそのレベルにおける変化、例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡレベル、ＴＴＲタンパク質レベル、またはアミロイド沈着の数もしくは程度に基づいて評価されてもよい。このレベルは、例えば対象由来のサンプルを含む、個別の細胞または細胞群にて評価されてもよい。
【０４２７】
阻害は、対照レベルと比べてのＴＴＲの発現に関連した１つ以上の変数の絶対的または相対的レベルにおける低下により評価されてもよい。対照レベルは、当該技術分野で利用される任意のタイプの対照レベル、例えば投与前ベースラインレベル、または対照（例えば、緩衝液のみの対照または不活性剤対照など）で治療されないかまたは治療される類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであってもよい。
【０４２８】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＴＴＲ遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％．少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはアッセイの検出レベル未満まで阻害される。一部の実施形態では、ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害は、治療前レベルと正常な対照レベルとの間の差異が少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％減少するように、ＴＴＲ遺伝子のレベルの正規化をもたらす。一部の実施形態では、阻害は、臨床的に関連する阻害である。
【０４２９】
ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害は、ＴＴＲ遺伝子が転写され、ＴＴＲ遺伝子の発現が阻害されるように、（例えば、１つもしくは複数の細胞を本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることにより、または本発明のＲＮＡｉ剤を細胞が存在するかもしくは存在した対象に投与することにより）治療されている第１の細胞または細胞群（かかる細胞は例えば対象由来のサンプル中に存在してもよい）によって発現されるｍＲＮＡの量の、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるがそのように治療されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比べたときの減少によって示されてもよい。好ましい実施態様では、阻害は、以下の式：
【数１】
2018523655.tif 000020
を用いて、処置細胞内でのｍＲＮＡのレベルを対照細胞内でのｍＲＮＡのレベルの百分率として表すことにより評価される。
【０４３０】
あるいは、ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害は、ＴＴＲ遺伝子の発現、例えばＴＴＲタンパク質の発現、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベル、またはＴＴＲを含むアミロイド沈着の存在に機能的に関連するパラメータの減少の観点で評価されてもよい。ＴＴＲ遺伝子サイレンシングは、ＴＴＲを発現する任意の細胞内で、構成的にまたはゲノム工学により、また当該技術分野で公知の任意のアッセイにより判定されてもよい。肝臓は、ＴＴＲ発現の主要な部位である。他の顕著な発現部位として、脈絡叢、網膜および膵臓が挙げられる。
【０４３１】
ＴＴＲタンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＴＴＲタンパク質のレベル（例えば、対象由来のサンプル中で発現されるタンパク質のレベル）における低下によって示されてもよい。ｍＲＮＡ抑制の評価について上で説明される通り、治療された細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、同様に対照細胞または細胞群におけるタンパク質のレベルの百分率として表されてもよい。
【０４３２】
ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害を評価するために用いられてもよい対照細胞または細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞または細胞群を含む。例えば、対照細胞または細胞群は、対象のＲＮＡｉ剤による治療に先立つ個別対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来してもよい。
【０４３３】
細胞または細胞群によって発現されるＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベル、または循環ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡの発現を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されてもよい。一実施形態では、サンプル中のＴＴＲの発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド、またはその一部、例えばＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより測定される。ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出技術を用いて、例えば、フェノール／グアニジンイソチオシアン酸抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを用いて、細胞から抽出されてもよい。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式は、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、原位置ハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析を含む。循環ＴＴＲ  ｍＲＮＡは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４号明細書（その内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）に記載の方法を用いて検出されてもよい。
【０４３４】
一実施形態では、ＴＴＲの発現レベルは、核酸プローブを用いて測定される。用語「プローブ」は、本明細書で用いられるとき、特定のＴＴＲに選択的に結合する能力がある任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成され得るか、または適切な生物学的製剤から誘導され得る。プローブは、標識されることに特化して設計されてもよい。プローブとして利用可能な分子の例として、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
【０４３５】
単離されたｍＲＮＡは、限定はされないが、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにて用いることができる。ｍＲＮＡレベルを測定するための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＴＴＲ  ｍＲＮＡとハイブリダイズ可能な核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定化され、プローブと接触されるが、それは例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で走らせ、そのｍＲＮＡをゲルから膜、例えばニトロセルロースへ移すことによる。他の実施形態では、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイで、プローブが固体表面上に固定化され、ｍＲＮＡがプローブと接触される。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＴＴＲ  ｍＲＮＡのレベルを測定するような用途に容易に適応させることができる。
【０４３６】
サンプル中のＴＴＲの発現レベルを測定するための代替方法は、サンプル中の例えばｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅および／または逆転写酵素、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）または任意の他の核酸増幅方法によるもの、それに続く当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出のプロセスを含む。これらの検出スキームは、核酸分子の検出において、かかる分子が極めて少ない数で存在する場合、特に有用である。本発明の特定の態様では、ＴＴＲの発現のレベルは、定量蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲ（すなわちＴａｑＭａｎ（商標）システム）により測定される。
【０４３７】
ＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析において用いられる）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたは線維（または結合核酸を含む任意の固体支持体）を用いて監視されてもよい。米国特許第５，７７０，７２２号明細書、第５，８７４，２１９号明細書、第５，７４４，３０５号明細書、第５，６７７，１９５号明細書および第５，４４５，９３４号明細書（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。ＴＴＲ発現レベルの測定はまた、溶液中での核酸プローブの使用を含んでもよい。
【０４３８】
好ましい実施態様では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書中に提示される実施例中に説明および例示される。
【０４３９】
ＴＴＲタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定用の当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されてもよい。かかる方法は、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体もしくはゲル沈降反応、吸収分光学、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどを含む。
【０４４０】
一部の実施形態では、本発明の方法の有効性は、アミロイドＴＴＲ沈着の減少を検出または監視することにより監視され得る。アミロイドＴＴＲ沈着を減少させることは、本明細書で用いられるとき、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて試験管内または生体内で評価されてもよい場合、ＴＴＲ沈着のサイズ、数、もしくは重症度における任意の減少、または対象の臓器内もしくは領域内でのＴＴＲ沈着の形成における阻止または減少を含む。例えば、アミロイド沈着を評価する一部の方法が、Ｇｅｒｔｚ，Ｍ．Ａ．＆  Ｒａｊｕｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｖ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）（２０１０），Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにて記載されている。アミロイド沈着を評価する方法は、生化学的分析、ならびに、例えば、免疫組織化学的染色、蛍光標識、光学顕微鏡、電子顕微鏡、蛍光顕微鏡、または他のタイプの顕微鏡を用いて可視化される場合の、アミロイド沈着の視覚的評価またはコンピュータ化された評価を含んでもよい。アミロイド沈着を評価するため、例えば、ＣＴ、ＰＥＴ、またはＮＭＲ／ＭＲＩイメージングを含む、侵襲的または非侵襲的イメージング様式が用いられてもよい。
【０４４１】
本発明の方法は、限定はされないが、心臓、肝臓、脾臓、食道、胃、腸（回腸、十二指腸および結腸）、脳、坐骨神経、後根神経節、腎臓および網膜を含む、身体の幾つもの組織または領域において、ＴＴＲ沈着を減少させることがある。
【０４４２】
用語「サンプル」は、本明細書で用いられるとき、対象から単離される類似の体液、細胞、または組織の収集物、ならびに対象内部に存在する体液、細胞、または組織を指す。生体液の例として、血液、血清および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、眼液などが挙げられる。組織サンプルは、組織、臓器または局所領域に由来するサンプルを含んでもよい。例えば、サンプルは、特定臓器、臓器の一部、またはそれら臓器内部の体液もしくは細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓の特定セグメントまたは肝臓における特定タイプの細胞、例えば肝細胞など）、網膜または網膜の一部（例えば、レチナール色素上皮）、中枢神経系または中枢神経系の一部（例えば、脳室または脈絡叢）、または膵臓もしくは膵臓の特定の細胞もしくは部分に由来してもよい。好ましい実施態様では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取される血液または対象由来の血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織またはレチナール組織を指す。
【０４４３】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が対象内部の特定部位に送達されるように対象に投与される。ＴＴＲの発現の阻害は、対象内部の特定部位からの体液もしくは組織に由来するサンプル中でのＴＴＲ  ｍＲＮＡもしくはＴＴＲタンパク質のレベルまたはレベルにおける変化の測定を用いて評価されてもよい。好ましい実施態様では、その部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される。その部位はまた、上述部位のいずれか１つからの細胞（例えば、肝細胞またはレチナール色素上皮）のサブセクションまたはサブグループであってもよい。その部位はまた、特定タイプの受容体を発現する細胞（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞）を含んでもよい。
【０４４４】
ＶＩＩＩ．ＴＴＲ関連疾患を治療または予防するための方法
本発明はまた、対象におけるＴＴＲ関連疾患を治療または予防するための方法を提供する。本方法は、本発明のＲＮＡｉ剤を治療有効量または予防有効量で対象に投与するステップを含む。
【０４４５】
本明細書で用いられるとき、「対象」は、動物、例えば哺乳動物、例えば、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、およびチンパンジーなど）、非霊長類（雌ウシ、ブタ、ラクダ、リャマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）、または鳥類（例えば、アヒルまたはガチョウ）などである。対象は、トランスジェニック生物を含んでもよい。
【０４４６】
一実施形態では、対象は、本明細書に記載の通り、ヒト、例えば、ＴＴＲ遺伝子発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害または状態に対して治療または評価されているヒト；ＴＴＲ遺伝子の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害または状態のリスクがあるヒト；ＴＴＲ遺伝子の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害または状態を有するヒト；および／またはＴＴＲ遺伝子の発現における減少から利益を受けることになる疾患、障害または状態に対して治療されているヒトである。
【０４４７】
一部の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患を患っている。他の実施形態では、対象は、ＴＴＲ関連疾患を発症するリスクがある対象、例えば（例えばＴＴＲアミロイドーシスの発症を示唆する徴候または症状の発生前に）ＴＴＲ関連疾患の発症に関連したＴＴＲ遺伝子突然変異を有する対象、（例えばＴＴＲアミロイドーシスの発症を示唆する徴候または症状の発生前に）ＴＴＲ関連疾患の家族歴を有する対象、またはＴＴＲアミロイドーシスの発症を示唆する徴候または症状を有する対象である。
【０４４８】
「ＴＴＲ関連疾患」は、本明細書で用いられるとき、原線維前駆体が変異体または野生型ＴＴＲタンパク質からなる場合のアミロイド沈着の形成によって引き起こされるかまたはそれを伴う任意の疾患を含む。突然変異体および野生型ＴＴＲは、アミロイド沈着の様々な形態（アミロイドーシス）を生じさせる。アミロイドーシスは、臓器機能を損なわせる細胞外沈着を生じさせるミスフォールドタンパク質の形成および凝集を含む。ＴＴＲ凝集を伴う臨床症候群として、例えば、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）；全身性家族性アミロイドーシス；家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）；家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）；および軟膜または髄膜脳血管アミロイドーシスとしても知られる軟膜アミロイドーシス、中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、またはアミロイドーシスＶＩＩ型が挙げられる。
【０４４９】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）に罹患している対象に投与される。別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、混合表現型を伴うＦＡＣに罹患している対象、すなわち心機能障害および神経学的障害の双方を有する対象に投与される。さらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、混合表現型を伴うＦＡＰに罹患している対象、すなわち神経学的障害および心機能障害の双方を有する対象に投与される。一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、同所性肝移植（ＯＬＴ）で治療されている、ＦＡＰに罹患している対象に投与される。別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）に罹患している対象に投与される。本発明の方法の他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、家族性アミロイド性心筋症（ＦＡＣ）および老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）に罹患している対象に投与される。正常配列ＴＴＲは、高齢者の人々において心アミロイドーシスを引き起こし、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）と称される（老人性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）または心アミロイドーシスとも称される）。ＳＳＡは、多くの他の臓器にて顕微鏡的沈着を伴うことが多い。ＴＴＲ突然変異は、ＴＴＲアミロイド形成の過程を促進し、臨床的に有意なＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ（アミロイドーシス−トランスサイレチン型）とも称される）の発症における最も重要なリスク因子である。８５を超えるアミロイド形成ＴＴＲ変異体が全身性家族性アミロイドーシスを引き起こすことは知られている。
【０４５０】
本発明の方法の一部の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）に関連した家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）に罹患している対象に投与される。かかる対象は、眼の徴候、例えば硝子体混濁および緑内障に罹患していることがある。レチナール色素上皮（ＲＰＥ）によって合成されるアミロイド原性トランスサイレチン（ＡＴＴＲ）が眼アミロイドーシスの進行において重要な役割を果たすことは当業者に公知である。以前の試験では、ＲＰＥ細胞を減少させる汎網膜レーザー光凝固が、硝子体におけるアミロイド沈着の進行を阻止したことが示されており、これはＲＰＥにおけるＡＴＴＲ発現の有効な抑制が眼アミロイドーシスに対する新規な治療になり得ることを示す（例えば、Ｋａｗａｊｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．（２０１０）１１７：５５２−５５５を参照）。本発明の方法は、ＴＴＲ関連ＦＡＰの眼の徴候、例えば眼アミロイドーシスの治療にとって有用である。ＲＮＡｉ剤は、特定組織、例えば眼の標的化に適した様式で送達され得る。眼送達の様式は、球後、眼瞼皮下、結膜下、テノン嚢下、前房または硝子体内注射（または内部注射もしくは注入）を含む。眼送達用の特定製剤は、点眼剤または軟膏剤を含む。
【０４５１】
別のＴＴＲ関連疾患は、「異常トランスサイレチン血症性高サイロキシン血症」または「異常プレアルブミン性高サイロキシン血症」としても知られる高サイロキシン血症である。このタイプの高サイロキシン血症は、サイロキシンに対する親和性が増加した突然変異体ＴＴＲ分子に起因する、サイロキシンとＴＴＲとの会合の増加に続発することがある。例えば、Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６，２０２５−２０３３を参照のこと。
【０４５２】
本発明のＲＮＡｉ剤は、限定はされないが、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で公知の任意の投与様式を用いて対象に投与されてもよい。
【０４５３】
好ましい実施態様では、作用物質は、対象に皮下投与される。一部の実施形態では、対象に、ＲＮＡｉ剤が単回用量で皮下注射、例えば腹部、大腿、または上腕注射を介して投与される。他の実施形態では、対象に、ＲＮＡｉ剤が分割用量で皮下注射を介して投与される。一実施形態では、分割用量のＲＮＡｉ剤が、対象に、皮下注射を介して対象における２つの異なる解剖学的位置に投与される。例えば、対象は、分割用量として右腕に約２５０ｍｇ（例えば５００ｍｇ用量の約半分）、また左腕に約２５０ｍｇが皮下注射されてもよい。本発明の一部の実施形態では、皮下投与は、例えばプレフィルドシリンジまたは自動注射器シリンジを介する自己投与である。一部の実施形態では、皮下投与用のＲＮＡｉ剤の用量は、例えば薬学的に許容できる担体の１ｍｌ以下の体積中に含有される。
【０４５４】
いくつかの実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期にわたり、一貫性を持ってＲＮＡｉ剤を放出してもよい。したがって蓄積注射は、例えば所望のＴＴＲ阻害、または治療的または予防的効果などの所望の効果を得るのに、必要な投薬頻度を低下させてもよい。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供してもよい。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉内注射が挙げられる。好ましい実施形態では、蓄積注射は皮下注射である。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ、または外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、点滴ポンプである。点滴ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外輸液のために使用してもよい。好ましい実施形態では、点滴ポンプは、皮下点滴ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡｉを肝臓に送達する、外科的に埋め込まれたポンプである。
【０４５６】
ＲＮＡｉ剤が皮下注入ポンプを介して投与される実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約４５分〜約５分、例えば、約４５分、約４０分、約３５分、約３０分、約２５分、約２０分、約１５分、約１０分、または約５分の期間にわたり単回用量で対象に投与されてもよい。
【０４５７】
他の投与様式として、硬膜外、脳内、脳室内、経鼻投与、動脈内、心臓内、骨内注入、髄腔内、および硝子体内、および肺が挙げられる。投与様式は、局所または全身治療が所望されるか否かに基づき、また治療されるべき領域に基づき、選択されてもよい。投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択されてもよい。
【０４５８】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、対象内部の細胞内でのＴＴＲ発現を阻害するのに有効な量で対象に投与される。対象内部の細胞内でのＴＴＲ発現を阻害するのに有効な量は、上で考察された方法、例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡ、ＴＴＲタンパク質、または関連する変数、例えばアミロイド沈着の阻害の評価を含む方法を用いて評価されてもよい。
【０４５９】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、治療的または予防有効量で対象に投与される。
【０４６０】
「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、ＴＴＲ関連疾患を治療するために患者に投与されるとき、（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を軽減、寛解または維持することにより）疾患の治療を奏功させるのに十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むように意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、作用物質がいかに投与されるか、疾患およびその重症度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＴＴＲ発現によって媒介される病理学的過程の段階、（もしあれば）先行治療もしくは併用治療のタイプ、ならびに治療されるべき患者の他の個別特性に応じて変動してもよい。
【０４６１】
「予防有効量」は、本明細書で用いられるとき、ＴＴＲ関連疾患の症状をまだ経ていないかまたは呈していないが、その疾患に罹りやすい可能性がある対象に投与されるとき、疾患または疾患の１つ以上の症状を予防または寛解するのに十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。寛解され得る症状は、感覚神経障害（例えば、知覚障害、四肢遠位における感覚鈍麻）、自律神経障害（例えば、胃腸機能障害、例えば胃潰瘍、または起立性低血圧）、運動ニューロパチー、発作、認知症、脊髄症、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、実質的に低下したｍＢＭＩ（修正肥満度指数）、脳神経機能障害、および格子状角膜ジストロフィーを含む。疾患を寛解することは、疾患の経過を緩徐化することまたは後発性疾患（ｌａｔｅｒ−ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）の重症度を低減することを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、作用物質がいかに投与されるか、疾患リスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、（もしあれば）先行治療もしくは併用治療のタイプ、ならびに治療されるべき患者の他の個別特性に応じて変動してもよい。
【０４６２】
「治療有効量」または「予防有効量」はまた、任意の治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で幾らかの所望される局所的または全身的効果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法で用いられるＲＮＡｉ剤は、かかる治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与されてもよい。
【０４６３】
本明細書で用いられるとき、語句「治療有効量」および「予防有効量」はまた、ＴＴＲ発現によって媒介される病理学的過程または病理学的過程の症状の治療、予防、または管理において利益をもたらす量を含む。ＴＴＲアミロイドーシスの症状は、感覚性ニューロパチー（例えば、知覚障害、四肢遠位における感覚鈍麻）、自律神経ニューロパチー（例えば、胃腸障害、例えば胃潰瘍、または起立性低血圧）、運動ニューロパチー、発作、認知症、脊髄症、多発ニューロパチー、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、実質的に低下したｍＢＭＩ（修正肥満度指数）、脳神経障害、および格子状角膜ジストロフィーを含む。
【０４６４】
一実施形態では、例えば、対象が、ＦＡＰ、混合表現型を有するＦＡＰ、混合表現型を有するＦＡＣ、またはＦＡＰを有し、かつＯＬＴを有していた場合、本発明のｄｓＲＮＡ剤による対象の治療は、神経障害の進行を遅くする。別の実施形態では、例えば、対象が、ＦＡＰ、混合表現型を有するＦＡＰ、混合表現型を有するＦＡＣ、ＳＳＡ、またはＦＡＰを有し、かつＯＬＴを有していた場合、本発明のｄｓＲＮＡ剤による対象の治療は、神経障害および心筋症の進行を遅くする。
【０４６５】
例えば、一実施形態では、本発明の方法は、神経障害を緩徐化、低減または停止させる。対象が神経障害を低減、緩徐化または停止させているか否かを判定するため、神経障害の任意の好適な尺度を用いることができる。
【０４６６】
１つの好適な尺度は、ニューロパチー障害スコア（ＮＩＳ）である。ＮＩＳは、特に末梢性ニューロパチーに関する筋力低下、感覚、および反射を測定するスコアリングシステムを指す。ＮＩＳスコアは、筋力低下についての標準筋肉群（１は２５％の低下、２は５０％の低下、３は７５％の低下、３．２５は重力に反した運動、３．５は排除された重力下の運動、３．７５は運動を伴わない筋攣縮、また４は麻痺状態である）、標準筋伸展反射群（０は正常、１は低い、２はなしである）、ならびに触圧、振動、関節位置および運動、およびピン痛覚（すべてが人指し指および母趾について段階分けされる：０は正常、１は低い、２はなしである）を評価する。評価は、年齢、性別、および体力について補正される。
【０４６７】
一実施形態では、本発明の方法は、ＮＩＳを少なくとも１０％減少させる。他の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０％、もしくは少なくとも５０％のＮＩＳの減少をもたらす。他の実施形態では、本方法は、ＮＩＳスコアの増加を停止させ、例えば本方法は、ＮＩＳスコアの０％の増加をもたらす。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＩＳスコアが増加する速度、例えば本発明のＲＮＡｉ剤で治療される対象におけるＮＩＳスコアの増加の速度を、本発明のＲＮＡｉ剤で治療されていない対象におけるＮＩＳスコアの増加の速度と比べて遅くする。
【０４６８】
ヒト対象におけるＮＩＳを決定するための方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｄｙｃｋ，ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７．４９（１）：ｐｇｓ．２２９−２３９）；Ｄｙｃｋ  ＰＪ．（１９８８）Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．Ｊａｎ；１１（１）：２１−３２にて見出すことができる。
【０４６９】
神経障害の別の好適な尺度は、改訂ニューロパチー障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）である。当業者に公知の通り、ｍＮＩＳ＋７は、小神経線維機能および大神経線維機能（ＮＣＳおよびＱＳＴ）の電気生理学的尺度、ならびに自律機能（体位性血圧）の尺度と組み合わされた神経障害（ＮＩＳ）の臨床試験に基づく評価を指す。ｍＮＩＳ＋７スコアは、（ＮＩＳ＋７つの試験を表す）ＮＩＳ＋７スコアの改訂である。ＮＩＳ＋７では、筋力低下および筋伸展反射が分析される。７つのうちの５つの試験は、神経伝導の属性を含む。これらの属性は、腓骨神経結合筋活動電位振幅、運動神経伝導速度および運動神経遠位潜時（ＭＮＤＬ）、脛骨ＭＮＤＬ、および腓腹感覚神経活動電位振幅である。これらの値は、年齢、性別、身長、および体重の変数について補正される。７つのうちの残り２つの試験は、振動検出閾値および深呼吸を伴う心拍数減少を含む。
【０４７０】
ｍＮＩＳ＋７スコアは、新しい自律神経評価としてのスマート定量的体性感覚検査（Ｓｍａｒｔ  Ｓｏｍａｔｏｔｏｐｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）の使用と、尺骨、腓骨、および脛骨神経の振幅の結合筋活動電位、ならびに尺骨および腓腹神経の感覚神経活動電位の使用を考慮するため、ＮＩＳ＋７を改訂したものである（Ｓｕａｎｐｒａｓｅｒｔ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，３４４（１−２）：ｐｇｓ．１２１−１２８）。
【０４７１】
一実施形態では、本発明の方法は、ｍＮＩＳ＋７を少なくとも１０％減少させる。他の実施形態では、本発明の方法は、ｍＮＩＳ＋７スコアの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０％、もしくは少なくとも５０％の減少をもたらす。他の実施形態では、本方法は、ｍＮＩＳ＋７の増加を停止させ、例えば本方法は、ｍＮＩＳ＋７の０％の増加をもたらす。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、ＮＩＳ＋７スコアが増加する速度、例えば本発明のＲＮＡｉ剤で治療される対象におけるＮＩＳ＋７スコアの増加の速度を、本発明のＲＮＡｉ剤で治療されていない対象におけるＮＩＳ＋７スコアの増加の速度と比べて遅くする。
【０４７２】
本発明の治療的および予防的方法はまた、治療中の対象における歩行能力のような他の臨床パラメータを改善することがある。例えば、治療期間の最中または後に、対象は、増強された運動能力または活動性を有することがある。
【０４７３】
対象が増強された運動能力または活動性を有するか否かを判定するため、運動能力の任意の好適な尺度を用いることができる。１つの好適な尺度は、対象が６分以内にどれくらい遠くまで歩くことができるか、すなわち６分歩行距離（６ＭＷＤ）を測定する６分歩行試験（６ＭＷＴ）である。一実施形態では、本発明の方法は、６ＭＷＤにおけるベースラインからの少なくとも約１０分、例えば、約１０、１５、２０、もしくは約３０分の増加を対象に提供する。
【０４７４】
本発明のＲＮＡｉ剤の治療有効量および予防有効量はまた、ベースラインに対する１つ以上の生活の質パラメータを改善する量、例えば、ＳＦ−３６（登録商標）健康調査機能スケールの少なくとも１つに対するスコアの増加；および／または寿命延長；および／または入院の減少を含む。
【０４７５】
生活の質の任意の好適な尺度が用いられてもよい。例えば、ＳＦ−３６（登録商標）健康調査は、８つの健康パラメータ：身体機能、身体的健康問題に起因する役割制限、身体の疼痛、一般健康、活力（エネルギーおよび疲労）、社会的機能、感情的問題に起因する役割制限、およびメンタルヘルス（心理的窮迫および精神的充足）を測定する自己報告式の多項目スケールを提供する。調査はまた、身体的健康度（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｕｍｍａｒｙ）および精神的健康度（Ｍｅｎｔａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｕｍｍａｒｙ）を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、ＳＦ−３６身体的健康関連パラメータ（身体的健康、役割−身体的、身体の疼痛および／または一般健康）の少なくとも１つおよび／またはＳＦ−３６メンタルヘルス関連パラメータ（活力、社会的機能、役割−感情的および／またはメンタルヘルス）の少なくとも１つにおけるベースラインに対する改善を対象に提供する。かかる改善は、任意の１つ以上のパラメータについてのスケールに対する、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つまたは少なくとも３つのポイントの増加の形態を取り得る。
【０４７６】
本発明の方法はまた、治療中の対象の予後を改善することがある。例えば、本発明の方法は、対象に治療期間中での臨床的悪化事象の確率における減少を提供することがある。
【０４７７】
対象に投与されるＲＮＡｉ剤の用量は、例えば、（上で定義される通り、例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡ抑制、ＴＴＲタンパク質発現、またはアミロイド沈着における減少に基づいて評価されるとき）所望されるレベルのＴＴＲ遺伝子抑制または所望される治療的もしくは予防的効果を達成する一方、望ましくない副作用を同時に回避するため、特定用量のリスクおよび利益を平衡させるという目的に合わせてもよい。
【０４７８】
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、対象に体重に基づく用量として投与される。「体重に基づく用量」（例えば、ｍｇ／ｋｇ単位の用量）は、対象の体重に応じて変化することになるｉＲＮＡ剤の用量である。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、一定用量として対象に投与される。「一定用量」（例えばｍｇ単位の用量）は、ｉＲＮＡ剤のある用量が、任意の具体的な対象に関連する要素、例えば体重と無関係に、すべての対象に用いられることを意味する。特定の一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤の一定用量は、所定の体重または年齢に基づく。
【０４７９】
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、または約５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８０】
例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、脂質とを含む特定の実施形態では、対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８１】
例えばｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８２】
例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、脂質とを含む特定の実施形態では、対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８３】
例えばｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８４】
一部の実施形態では、例えば、本発明の組成物が本明細書に記載のようなｄｓＲＮＡおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含むとき、対象に、ｉＲＮＡが、治療量、例えば、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量、投与され得る。一実施形態では、本発明の組成物が本明細書に記載のようなｄｓＲＮＡおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含むとき、対象に、治療量の約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８５】
例えば、対象には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
【０４８６】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約２５ｍｇ〜約９００ｍｇの間、例えば、約２５ｍｇ〜約８５０ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約８００ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約７５０ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約７００ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約６５０ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約６００ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約５５０ｍｇの間、約２５ｍｇ〜約５００ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約８５０ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約７５０ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約７００ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約６５０ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約６００ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約５５０ｍｇの間、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約８５０ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約８００ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約７５０ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約６５０ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約５５０ｍｇの間、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約８５０ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約８００ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約７５０ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約７００ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約６５０ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約６００ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約５５０ｍｇの間、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約８５０ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約８００ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約７５０ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約７００ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約６００ｍｇの間、約４００ｍｇ〜約５５０ｍｇの間、または約４００ｍｇ〜約５００ｍｇの間の一定用量として投与される。
【０４８７】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約１２．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、または約９００ｍｇの一定用量として投与される。
【０４８８】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、３か月ごとに１回（すなわち四半期に一度）、約２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、または約６００ｍｇの一定用量として対象に投与される。一実施形態では、投与は、皮下投与、例えば自己投与であり、例えばプレフィルドシリンジまたは自動注射器シリンジを介する。一部の実施形態では、皮下投与用のＲＮＡｉ剤の用量は、例えば薬学的に許容できる担体の１ｍｌ以下の体積中に含有される。
【０４８９】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２回以上の用量で投与される。反復または頻回注入を促進することが所望される場合、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または関節内）、またはリザーバーの移植が得策であり得る。一部の実施形態では、後続用量の数または量は、所望される効果の達成、例えばＴＴＲ遺伝子の抑制、または治療的もしくは予防的効果の達成、例えばアミロイド沈着の低減もしくはＴＴＲ関連疾患の症状の軽減に依存する。
【０４９０】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、スケジュールに従って投与される。例えば、ＲＮＡｉ剤は、週２回、週３回、週４回、または週５回投与されてもよい。一部の実施形態では、スケジュールは、所定間隔ごと、例えば、１時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、８時間ごと、１２時間ごと、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、毎週、隔週ごと、毎月、または四半期ごとの投与を含む。一実施形態では、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇの用量が毎月投与される。別の実施形態では、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇの用量が四半期ごとに投与される。
【０４９１】
他の実施形態では、スケジュールは、密な間隔での投与と、その後の作用物質が投与されない期間の長期化を含む。例えば、スケジュールは、比較的短期間に（例えば、約６時間ごと、約１２時間ごと、約２４時間ごと、約４８時間ごと、または約７２時間ごと）投与される初期の用量セットと、その後のＲＮＡｉ剤が投与されない期間の長期化（例えば、約１週、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、または約１２週）を含んでもよい。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初に毎時間投与され、その後はより長い間隔で（例えば、毎日、毎週、隔週ごと、毎月、または四半期ごと）投与される。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初に毎日投与され、その後はより長い間隔で（例えば、毎週、隔週ごと、毎月、または四半期ごと）投与される。特定の実施形態では、より長い間隔は、経時的に増加するか、または所望される効果の成果に基づいて決定される。
【０４９２】
具体的な実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、第１週の間に１日１回投与され、その後は投与の８日目に毎週、毎月または四半期ごとの投与が開始する。別の具体的な実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、第１週の間、隔日ごとに投与され、その後は投与の８日目に毎週、毎月または四半期ごとの投与が開始する。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、第１週の間の５日間に１日１回投与され、その後は毎週、毎月または四半期ごと投与される。
【０４９３】
これらのスケジュールのいずれがは、任意選択的には１回以上反復されてもよい。反復回数は、所望される効果の成果、例えばＴＴＲ遺伝子の抑制、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベル、および／または治療的もしくは予防的効果の成果、例えばアミロイド沈着の低減もしくはＴＴＲ関連疾患の症状の軽減に依存してもよい。
【０４９４】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、他の治療薬または他の治療計画を伴って投与される。例えば、ＴＴＲ関連疾患の治療に適した他の作用物質または他の治療計画は、体内の突然変異体ＴＴＲレベルを低減し得る肝臓移植；ＴＴＲ四量体を動力学的に安定化させ、ＴＴＲアミロイド形成に要求される四量体解離を阻止するタファミジス（ビンダケル）；および例えば心臓に関連したＴＴＲアミロイドーシスにおける水腫を軽減するために用いられてもよい利尿薬を含んでもよい。
【０４９５】
一実施形態では、対象に、ＲＮＡｉ剤が初期用量および１回以上の維持用量で投与される。１回以上の維持用量は、同じかまたは初期用量未満、例えば初期用量の半分であり得る。維持投与計画は、０．０１μｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば、１週あたり、１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、もしくは０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の１回以上の用量、または約１２．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、例えば、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、もしくは約９００ｍｇの１回以上の用量で対象を治療することを含み得る。例えば、維持用量は、２日ごとに１回、５日ごとに１回、７日ごとに１回、１０日ごとに１回、１４日ごとに１回、２１日ごとに１回、３０日ごとに１回、もしくは９０日ごとに１回以下、投与される。さらに、治療計画は、特定疾患の性質、その重症度および患者の全身状態に応じて変動することになる期間にわたり持続してもよい。特定の実施形態では、その用量は、１日１回以下、例えば２４、３６、４８時間、もしくはより多くの時間ごとに１回以下、例えば５もしくは８日ごとに１回以下、送達されてもよい。治療後、患者は、彼／彼女の状態における変化について監視され得る。ＲＮＡｉ剤の用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない事象にて増加させるか、または用量は、病態の症状の軽減が認められる場合、病態が消失している場合、もしくは望ましくない副作用が認められる場合、減少させてもよい。
【０４９６】
ＶＩ．キット
本発明はまた、本発明の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。かかるキットは、１つ以上のＲＮＡｉ剤および使用説明書、例えば細胞内でのＴＴＲの発現を、細胞をＲＮＡｉ剤とＴＴＲの発現を阻害するのに有効な量で接触させることにより阻害するための使用説明書を含む。キットは、任意選択的には、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させるための手段（例えば、注射デバイスまたは注入ポンプ）、またはＴＴＲの阻害を測定するための手段（例えば、ＴＴＲ  ｍＲＮＡまたはＴＴＲタンパク質の阻害を測定するための手段）をさらに含んでもよい。ＴＴＲの阻害を測定するためのかかる手段は、サンプル、例えば血漿サンプルなどを対象から得るための手段を含んでもよい。本発明のキットは、任意選択的には、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段または治療有効量もしくは予防有効量を決定するための手段をさらに含んでもよい。
【０４９７】
本発明のキットにおける封入に適したＲＮＡｉ剤は、表１、３、５、６、または７のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤のいずれか１つを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−６６０１６、ＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１７、およびＡＤ−６６０１８からなる群から選択される。
【０４９８】
ＲＮＡｉ剤は、任意の便宜的形態、例えば注射用滅菌水中の溶液で提供されてもよい。例えば、ＲＮＡｉ剤は、注射用滅菌水中、５００ｍｇ／ｍｌ、４５０ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、３５０ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、または５０ｍｇ／ｍｌの溶液として提供されてもよい。
【０４９９】
本発明は、限定するものとして解釈されるべきでない以下の実施例によりさらに例示される。本願全体を通じて引用されるすべての参考文献および公開された特許および特許出願の内容は、ここで参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０５００】
実施例１：ＴＴＲを標的にする化学修飾ＲＮＡｉ剤の試験管内での安定性およびサイレンシング活性
以下の実験で、ＴＴＲを標的にするＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に対する、センス鎖上での８以下の２’−フルオロ修飾、アンチセンス鎖上での６以下の２’−フルオロ修飾、６つのホスホロチオエートヌクレオチド結合、およびリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンドを含む特定の化学修飾の有益な効果を実証した。検討した作用物質の配列を下の表１に提示する。
【０５０１】
ＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ配列を、固体支持体に媒介されるホスホラミダイト化学を用いて、Ｍｅｒｍａｄｅ  １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上、１μモルスケールで合成した。固体支持体は、カスタムなＧａｌＮＡｃリガンドまたはユニバーサルな固体支持体（ＡＭ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を負荷した制御された細孔ガラス（５００Ａ）であった。補助合成試薬である２’−Ｆおよび２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよびデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびＨｏｎｇｅｎｅ（Ｃｈｉｎａ）から入手した。２’Ｆ、２’−Ｏ−メチル、ＧＮＡ（グリコール核酸）、５’リン酸および脱塩基修飾を、対応するホスホラミダイトを用いて導入した。３’ＧａｌＮＡｃが結合された一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体上で実施した。アンチセンス一本鎖の合成については、カスタムＣＰＧのユニバーサルな固体支持体を用いた。すべてのホスホラミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）における結合時間は、アクチベーターとして５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）（アセトニトリル中０．６Ｍ）を用いて５分であった。ホスホロチオエート結合は、無水アセトニトリル／ピリジン（１：１  ｖ／ｖ）中、３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手）の５０ｍＭ溶液を用いて得られた。酸化時間は３分であった。すべての配列は、ＤＭＴ基の最終的除去（「ＤＭＴオフ」）とともに合成された。
【０５０２】
固相合成の完了時、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、２００μＬの水性メチルアミン試薬を用いて、密封した深い９６ウェルプレート内、６０℃で２０分間脱保護した。切断および脱保護ステップの終了時、合成プレートを室温に戻して放置し、１ｍＬのアセトニトリル：エタノール混合物（９：１）の添加により沈殿させた。プレートを、−８０℃で２時間冷却し、マルチチャンネルピペットの助けにより、上清を慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラーおよびＦｒａｃ  ９５０フラクションコレクターを備えたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム上で５ｍＬのＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルを９６ウェルプレート内で収集した。各シークエンスからのサンプルを、ＬＣ−ＭＳにより分析し、同一性を確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量化し、選択したサンプルセットをＩＥＸクロマトグラフィーによって分析し、純度を決定した。
【０５０３】
ＴＴＲ一本鎖のアニーリングを、Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングロボット上で実施した。センスおよびアンチセンス一本鎖の等モル混合物を結合させ、９６ウェルプレート内でアニールした。相補的一本鎖を結合後、９６ウェルプレートを堅く密封し、乾燥器内、１００℃で１０分間加熱し、２〜３時間かけて徐々に室温に戻して放置した。各二本鎖の濃度を１×ＰＢＳ中、１０μＭに正規化した。
【０５０４】
これらの二本鎖の試験管内での代謝安定性について、ラットサイトゾル安定性アッセイを用いてアッセイした。かかるアッセイにおいては、雌ラット肝臓サイトゾル（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｒ１５００．Ｃ）を室温に解凍し、５０ｍＭトリス緩衝液：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭｍｇＣｌ２で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。２４時間サンプルを、マイクロ遠心チューブ内で１ｍｇ／ｍＬのサイトゾル１００μＬを０．４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡサンプル２５μＬと混合させ、３７℃および３００ｒｐｍに設定したエッペンドルフサーモミキサー内で２４時間インキュベートすることにより調製した。インキュベーションの２４時間後、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＡＬＯ−８４９８）３００μＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬの内部標準ｓｉＲＮＡ１２．５μＬを各サンプルに添加した。０時間サンプルを、１ｍｇ／ｍＬのサイトゾル１００μＬを０．４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡサンプル２５μＬ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ３００μＬ、および０．４ｍｇ／ｍＬの内部標準ｓｉＲＮＡ１２．５μＬと混合することにより調製した。ｓｉＲＮＡを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｌａｒｉｔｙ  ＯＴＸスターターキット（カタログ番号ＫＳＯ−８４９４）を用いて、２４時間サンプルおよび０時間サンプルから抽出した。サンプルを抽出後、それらをマイクロ遠心チューブに移し、Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＣｅｎｔｒｉＶａｐ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（カタログ番号７８１００１０）を用いてドライダウンさせた。次に、サンプルをヌクレアーゼ遊離水５００μＬで再懸濁した。各サンプル５０μＬを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎａｒｙ  ＬＣ上で走らせた。二重カラム装置を再生モードで用いて分析を行った。クォータナリポンプの方法を、以下の時刻表で、０．４００ｍＬ／分で１２．２０分間実行した。
【０５０５】
【表４】
2018523655.tif 000021
【０５０６】
バイナリポンプの方法を、以下の時刻表で、０．７００ｍＬ／分で１２．２０分間実行した。
【０５０７】
【表５】
2018523655.tif 000022
【０５０８】
左および右カラムの双方を７５．００℃に設定した。ＵＶシグナルを２６０ｎｍの波長で測定した。各鎖の残存パーセントを、以下の方程式：
％残存する鎖＝１００＊（ピーク面積鎖 ２４時間／ピーク面積鎖 ０時間＊（ピーク面積鎖 ２４時間／ピーク面積鎖 ０時間））
を用いて算出した。
【０５０９】
これらの２４時間サイトゾル安定性アッセイの結果は、二本鎖のすべてが非常に安定であることを実証する。
【０５１０】
これらの作用物質のサブセットの試験管内での代謝安定性についても、トリトソーム安定性アッセイを用いて評価した。トリトソーム安定性アッセイにおいては、ラット肝臓トリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカスタム製品ＰＲ１４０４４）を室温に解凍し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液で０．５単位／ｍＬの酸性ホスファターゼに希釈した。２４時間サンプルを、マイクロ遠心チューブ内で０．５単位／ｍＬの酸性ホスファターゼトリトソーム１００μＬを０．４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡサンプル２５μＬと混合させることにより調製し、３７℃および３００ｒｐｍに設定したエッペンドルフサーモミキサー内で２４時間インキュベートした。インキュベーションの２４時間後、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＡＬＯ−８４９８）３００μＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬの内部標準ｓｉＲＮＡ１２．５μＬを各サンプルに添加した。０時間サンプルを、０．５単位／ｍＬの酸性ホスファターゼトリトソーム１００μＬを０．４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡサンプル２５μＬ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ３００μＬ、および０．４ｍｇ／ｍＬの内部標準ｓｉＲＮＡ１２．５μＬと混合することにより調製した。ｓｉＲＮＡを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｌａｒｉｔｙ  ＯＴＸスターターキット（カタログ番号ＫＳＯ−８４９４）を用いて、２４時間サンプルおよび０時間サンプルから抽出した。サンプルを抽出後、それらをマイクロ遠心チューブに移し、Ｌａｂｃｏｎｃｏ  ＣｅｎｔｒｉＶａｐ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（カタログ番号７８１００１０）を用いてドライダウンさせた。次に、サンプルをヌクレアーゼ遊離水５００μＬで再懸濁した。各サンプル５０μＬを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎａｒｙ  ＬＣ上で走らせた。二重カラム装置を再生モードで用いて分析を行った。クォータナリポンプの方法を、以下の時刻表で、０．４００ｍＬ／分で１２．２０分間実行した。
【０５１１】
【表６】
2018523655.tif 000023
【０５１２】
バイナリポンプの方法を、以下の時刻表で、０．７００ｍＬ／分で１２．２０分間実行した。
【０５１３】
【表７】
2018523655.tif 000024
【０５１４】
左および右カラムの双方を７５．００℃に設定した。ＵＶシグナルを２６０ｎｍの波長で測定した。各鎖の残存パーセントを、以下の方程式：
％残存する鎖＝１００＊（ピーク面積鎖 ２４時間／ピーク面積鎖 ０時間＊（ピーク面積鎖 ２４時間／ピーク面積鎖 ０時間））
を用いて算出した。
【０５１５】
図１に提供する２４時間トリトソーム安定性アッセイの結果は、二本鎖のすべてがトリトソーム中で非常に安定であることを実証する。
【０５１６】
【表８】
2018523655.tif 000025
【０５１７】
【表９】
2018523655.tif 000026
【０５１８】
【表１０】
2018523655.tif 000027
【０５１９】
ＴＴＲを標的化するさらなる作用物質セットを設計し、合成した。これらの作用物質の配列を下の表３に提示する。
【０５２０】
これらのさらなる作用物質は、試験管内アッセイにて評価した。特に、各ｉＲＮＡ剤におけるＩＣ５０を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ヒト肝腫瘍細胞株）または一次カニクイザル肝細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを用いる標準的なリバーストランスフェクションにより決定した。１０％ＦＢＳを有するＥＭＥＭ中でＨｅｐ３Ｂ細胞を培養した一方、一次カニクイザル肝細胞を使用直前に解凍し、１０％ＦＢＳを有するＷＭＥＭ中で培養した。リバーストランスフェクションを、５μＬのＲＮＡ二本鎖／ウェルを、４．９μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．１μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）とともに３８４ウェルプレートに添加することにより実施し、室温で１５〜２０分間インキュベートした。インキュベーション後、次いで５，０００個のＨｅｐ３Ｂ細胞または一次カニクイザル肝細胞を含有する、抗生物質を含まない完全増殖培地４０μＬを各ウェルに添加した。コラーゲンでコーティングしたプレートを一次肝細胞用に用いた。ＲＴ−ｑＰＣＲによるＴＴＲおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの溶解および分析に先立ち、細胞を５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。１０ｎＭ〜０．３８ｆＭの範囲の８つの異なるｓｉＲＮＡ濃度を、ＩＣ５０の決定のために評価し、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞におけるＴＴＲ／ＧＡＰＤＨを、１０ｎＭのルシフェラーゼｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に正規化した。
【０５２１】
一次カニクイザル肝細胞における遊離取り込みサイレンシング（Ｆｒｅｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を、ＴＴＲ  ｓｉＲＮＡとの２４時間のインキュベーション後、評価した。本方法は、完全増殖培地５μＬをリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘおよびＯｐｔｉｍｅｍを含有する５μＬと交換した以外では、上記方法と同様であった。ＴＴＲおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡについての下流分析を、上記のように実施した。典型的な用量応答曲線においては、ｓｉＲＮＡを５００ｎＭから０．１．８ｐＭにかけて８点の６倍連続希釈により滴定した。
【０５２２】
（表４に提示する）これらのアッセイの結果は、二本鎖のすべてがＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現を強力に阻害することを示す。
【０５２３】
これらのさらなる作用物質の試験管内安定性もまた、上記のサイトゾルおよびトリトソーム安定性アッセイを用いて評価した。
【０５２４】
２４時間サイトゾル安定性アッセイの結果を図２Ａに提示し、２４時間トリトソーム安定性アッセイの結果を図２Ｂに提示し、二本鎖のすべてがトリトソームおよびラットサイトゾルにて非常に安定であることが示される。
【０５２５】
【表１１】
2018523655.tif 000028
【０５２６】
【表１２】
2018523655.tif 000029
【０５２７】
実施例２．生体内ＴＴＲサイレンシング
上記のさらなる作用物質の生体内有効性を、ヒトＴＴＲのバリン３０メチオニン変異体（Ｖ３０Ｍ  ｈＴＴＲ）を発現するトランスジェニックマウスにて評価した（例えば、Ｎａｇａｔａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１６９−１７５；Ｋｏｈｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５０（４）：１４９７−５０８を参照）。ＴＴＲのＶ３０Ｍ変異体は、ヒトにおける家族性アミロイド多発ニューロパチーＩ型を生じさせることが知られている。例えば、Ｌｏｂａｔｏ，Ｌ．（２００３）Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１６（３）：４３８−４２を参照のこと。
【０５２８】
１１〜１３月齢ＴＴＲ  Ｖ３０ｍマウスに、１ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇ用量の作用物質を単回で皮下投与し、ＴＴＲのレベルを、投与前と投与後３、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、５６、７０および８４日目、動物の血清中で測定した。つまり、確認されたＴＴＲ酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）を用いてＴＴＲレベルをアッセイした（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９：８１９を参照）。ＴＴＲ血清タンパク質ＥＬＩＳＡアッセイの開始の２４時間前、９６ウェルの免疫マイクロプレートに、ウサギ抗ヒトＴＴＲ  ｐＡｂ（Ａｂｃａｍ）を４℃でコーティングした。アッセイ当日、プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１×Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）で室温で２時間ブロッキングした。血清サンプルを１×Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで１５，０００倍に希釈した。ヒトＴＴＲタンパク質標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ１７４２）を用いる１２点のヒトＴＴＲ検量線を、２５０〜０ｎｇ／ｍＬの範囲の１．６×連続希釈を用いて作成した。ブロッキング後、１００μＬ体積の標準およびサンプルをプレートに添加し、室温で２時間インキュベートしておいた。プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１×Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで１：２５００に希釈したヒツジ抗ｈＴＴＲ一次抗体（ＡｂＣａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ洗浄後、プレートを、１×Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで３：１００００に希釈したロバ抗ヒツジアルカリホスファターゼ二次抗体（ＡｂＣａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１００μＬ体積の調製した基質（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ｐ−ニトロフェニルリン酸錠剤）を１ウェルあたり添加し、暗所、室温で３０分間反応させておいた。反応物を０．０５ｍｌ／ウェルの１Ｍ  ＮａＯＨでクエンチした。４０５ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで読み取り、血清ＴＴＲタンパク質レベルをμｇ／ｍＬ単位で決定するため、データを４パラメータ曲線にフィットさせた。投与前に対して残存するＴＴＲ画分を決定するため、個体動物からのタンパク質レベルを、それら各個体の投与前血漿タンパク質値に正規化した。
【０５２９】
１ｍｇ／ｋｇ単回用量実験の結果を図３に提示し、２．５ｍｇ／ｋｇ単回用量実験の結果を図４に提示する。結果は、すべての作用物質が強力かつ耐久的にＴＴＲの発現を阻害し、投与後約７日目に最下点に達したことを示す。結果はまた、単回で１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１７、またはＡＤ−６６０１８を投与後４２日目、４０％を超える血清ＴＴＲの抑制が持続され、単回で２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５４９２またはＡＤ−６６０１８を投与後４２日目、６０％を超える血清ＴＴＲの抑制が持続されることを示す。ベースライン血清ＴＴＲ濃度への回復が、単回で１ｍｇ／ｋｇ用量に従う投与後５６〜８４日目の間、および単回で２．５ｍｇ／ｋｇ用量に従う投与後７０〜８４日目の間に生じる。
【０５３０】
動物における８０％のサイレンシングのための有効用量（ＥＤ８０）を、１ｍｇ／ｋｇとして算出した。したがって、これらのデータは、ＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１６、ＡＤ−６６０１７、およびＡＤ−６６０１８がＴＴＲ関連障害を有する対象を低用量および／または月単位の投与計画で治療するために有効であることを示す。
【０５３１】
実施例３．ラット探索毒性試験
ＡＤ−６６０１６、ＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１７、およびＡＤ−６６０１８の前臨床毒性試験もまた、ラットにて実施した。つまり、１、８、および１５日目、１群あたり雄ラット５匹に、ＡＤ−６６０１６、ＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１７、またはＡＤ−６６０１８を、３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかで皮下投与した。１、８、および１５日目、対照動物にプラセボを投与した。１６日目、すべての動物を屠殺した。屠殺前、動物を任意の臨床症状について毎日監視し、体重を毎週測定した。屠殺後、動物を剖検し、完全な血清化学、血液学および血液凝固パネルにより、肝臓および腎臓の病理組織学により、また肝臓トランスアミナーゼ濃度についてサンプルを分析した。
【０５３２】
これらの分析結果は、ＡＤ−６６０１６、ＡＤ−６５４９２、ＡＤ−６６０１７、およびＡＤ−６６０１８が臨床的に良好な耐容性を示し、有害な臨床的徴候または体重変化を伴わなかった。
【０５３３】
実施例４．ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７の複数回用量投与の有効性
ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおけるＴＴＲタンパク質発現に対するＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７の多回投与計画の効果を評価した。
【０５３４】
１つの実験セットでは、１１〜１３月齢ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍマウスに、ＡＤ−６５４９２を毎週２ｍｇ／ｋｇ用量で３週間（ＱＷ×３）皮下投与し、上記のように、投与前と投与後７、１４、１７、および２１日目、ＴＴＲタンパク質のレベルを動物の血清中で測定した。
【０５３５】
図５は、ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍ  ＴｇマウスへのＱＷ×３投与計画でのＡＤ−６５４９２の投与を行い、血清ＴＴＲタンパク質発現の９０％を超える抑制が持続されたことを示す。
【０５３６】
別の実験セットでは、１１〜１３月齢ｈＴＴＲ  Ｖ３０Ｍ  Ｔｇマウスに、ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７を、０．３ｍｇ／ｋｇ用量、月１回で４か月間（ＱＭ×４＠０．３ｍｇ／ｋｇ）、１ｍｇ／ｋｇ用量、月１回で４か月間（ＱＭ４＠１ｍｇ／ｋｇ）、または３ｍｇ／ｋｇ用量、月１回で４か月間（ＱＭ４＠３ｍｇ／ｋｇ）、皮下投与した。投与前と投与後７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、８４、９１、９８、および１８５日目、血清ＴＴＲタンパク質レベルを上記のように測定した。
【０５３７】
図６Ａ〜６Ｃに示すように、投与後７日目のＴＴＲノックダウンレベルは、２回目、３回目および４回目投与後と同様であり、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇ用量で得られたＴＴＲ発現の最下点は各々、８０％、約７０〜８５％、および約２５〜３５％超である。これらのグラフはまた、ＡＤ−６５４９２が、最終投与後１００日超にわたり、ＡＤ−６６０１７よりも持続的なレベルのＴＴＲサイレンシングをもたらし、約６０％、４０％、および約３５％が各々、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇでＴＴＲ抑制を維持することを示す。さらに、ＡＤ−６５４９２については、多回投与（ＱＭ×４）が０．３ｍｇ／ｋｇ用量で相加的であり、４か月投与後、約２５〜３５％のノックダウンを有する初回投与と比べて約４０％のＴＴＲノックダウンをもたらす。さらに、各作用物質につきすべての用量レベルを通じて毎月の各投与に先立ちＴＴＲタンパク質レベルの部分的回復が認められたが、単回皮下用量のように、多回投与計画において８０％のノックダウン（ＥＤ８０）を得るための有効用量を約１ｍｇ／ｋｇとして算出した。したがって、３つすべての投与計画における両化合物の薬力学的活性および動態は、同じ化合物の単回用量として投与されるときの薬力学的活性および動態と同等であった。
【０５３８】
実施例５．非ヒト霊長類におけるＴＴＲサイレンシング
上の実施例で示すように、ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７は、生体内で良好な耐容性を示し、強力かつ耐久的にＴＴＲタンパク質レベルを抑制する。
【０５３９】
したがって、ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７の有効性を、カニクイザルへのこれらｉＲＮＡ剤の異なる用量および異なる投与計画での投与により、さらに試験した。図７は、この試験の概要を提示する。つまり、グループ１、２、４、および５の４つのグループに、単回で０．３ｍｇ／ｋｇ用量（グループ１および４）または単回で１ｍｇ／ｋｇ用量（グループ２および５）のいずれかのｉＲＮＡ剤を皮下投与した。グループ３および６〜８の他の４つのグループに、毎月１ｍｇ／ｋｇ用量で４か月（ＱＭｘ４）（グループ７および８）または毎月３ｍｇ／ｋｇ用量で４か月（ＱＭｘ４）（グループ３および６）のいずれかで投与した。投与前−７および−１日目と、投与後３、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、１０５、および１１９日目に血清を収集し；投与１日前と、投与後０．５、１、２、４、８、２４、４８、９６および１６８時間後に血漿を収集した。ＴＴＲタンパク質の血清レベルを上記のように測定した。
【０５４０】
図８Ａは０．３ｍｇ／ｋｇ単回用量試験の結果を提示し、図８Ｂは１ｍｇ／ｋｇ単回用量試験の結果を提示し、また図８Ｃは３ｍｇ／ｋｇ単回用量試験の結果を提示する。比較を目的として、図８Ｂはまた、カニクイザルにおけるＴＴＲ発現に対するＡＤ−５１５４７の単回皮下２．５ｍｇ／ｋｇ用量での投与の効果を示し、また図８Ｃもまた、カニクイザルにおけるＴＴＲ発現に対するＡＤ−５１５４７の単回皮下５ｍｇ／ｋｇ用量での投与の効果を示す。これらのグラフは、ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７双方のｉＲＮＡ剤におけるＥＤ５０が約０．３ｍｇ／ｋｇであり、両用量および両ｉＲＮＡ剤において約２８日目にＴＴＲ発現の最下点に達し、またＡＤ−６５４９２が、単回用量でのより高い用量レベルで、ＴＴＲタンパク質発現の抑制においてＡＤ−６６０１７よりも有効であることを示す。グラフはまた、ＡＤ−６５９４２が、単回での１ｍｇ／ｋｇ投与後４２日目にかけて９０％を超えるＴＴＲ発現の持続的抑制、６３日目にかけて８０％を超えるＴＴＲ抑制とともに、投与後１１９日目までに約４０％の残りのＴＴＲ抑制をもたらし、またＡＤ−６６０１７が、単回での１ｍｇ／ｋｇ投与後、最大で７３％のＴＴＲ発現の抑制とともに、３５日目以前にＴＴＲ発現の回復が始まり、投与後１１９日目までにベースラインの約２０％以内までの回復をもたらすことを示す。
【０５４１】
ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７について、図９Ａは１ｍｇ／ｋｇ複数回用量試験の結果を提示し、図９Ｂは３ｍｇ／ｋｇ複数回用量試験の結果を提示する。比較を目的として、図９Ａはまた、カニクイザルにおけるＴＴＲ発現に対するＡＤ−５１５４７の毎日５ｍｇ／ｋｇ用量で５日間（０〜４日目の最初の５つの矢印）、その後の毎週５ｍｇ／ｋｇ用量で４週間（７、１４、２１、および２８日目の矢印）（ＱＤ×５、ＱＷ×４）の投与の効果を示す。グラフは、両ｉＲＮＡ剤が強固なＴＴＲタンパク質抑制を提示し、また両ｉＲＮＡ剤が３ｍｇ／ｋｇ用量で２１および２８日目の間にＴＴＲタンパク質発現を完全に抑制することを示す。グラフはまた、ＡＤ−６５４９２が、１ｍｇ／ｋｇ用量でＡＤ−６６０１７よりも有効であることを示す。さらに、グラフは、ＴＴＲ発現の最下点が１ｍｇ／ｋｇの両ｉＲＮＡ剤にて３５および４２日目の間で達成され、ＡＤ−６５４９２の２か月ごとの投与前に８５％を超える抑制、およびＡＤ−６６０１７の２か月ごとの投与前に約７０％の抑制が得られた。ＡＤ−６５４９２およびＡＤ−６６０１７における３か月および４か月ごとの投与後、各々、約９５％および８５％の抑制の維持が達成された。
【０５４２】
さらに、図１０Ａに示すように、ＡＤ−６５４９２の毎月投与（ＱＭ×４）の結果、９５％を超えるＴＴＲ抑制が維持され、図１０Ｂに示すように、ＡＤ−６６０１７の多回投与（ＱＭ×４）が１ｍｇ／ｋｇ用量で相加的である。図１０Ｂはまた、ＡＤ−６６０１７の２か月ごとの投与後にＴＴＲタンパク質発現の８５％の抑制が認められ、またこの抑制は３か月および４か月ごとの投与とともに維持されることを示す。
【０５４３】
実施例６．ＴＴＲを標的化する化学修飾剤の設計および合成
センス鎖ヌクレオチドの実質的すべておよびアンチセンス鎖ヌクレオチドの実質的すべてが修飾ヌクレオチドであり、かつ配列番号２に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖を含む、ＴＴＲを標的化するさらなる二本鎖ＲＮＡｉ剤を、上記のように設計し、合成した。
【０５４４】
これらの作用物質のセンスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を表５に提示する。
【０５４５】
実施例７．ＴＴＲを標的化する化学修飾剤の設計および合成
ＴＴＲを標的化するさらなる二本鎖ＲＮＡｉ剤を、上記のように設計し、合成した。
【０５４６】
これら作用物質の非修飾センスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を表６に提示し、またこれら作用物質の修飾センスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を表７に提示する。
【０５４７】
【表１３】
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【０５４８】
【表１４】
2018523655.tif 000031
【０５４９】
【表１５】
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【０５５０】
【表１６】
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【０５５１】
【表１７】
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【０５５２】
【表１８】
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【０５５３】
【表１９】
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【０５５４】
実施例８．投与ｏｆＡＤ−６５４９２ｔｏカニクイザル
ＡＤ−６５４９２の有効性を、カニクイザルへの投与により、さらに評価した。
【０５５５】
第１の実験セットでは、４グループ（グループ１、２、３、および７）に、単回０．３ｍｇ／ｋｇ用量（グループ１）；単回用量１ｍｇ／ｋｇ（グループ２）；毎月用量１ｍｇ／ｋｇで４か月間（ＱＭ×４）（グループ７）；または毎月用量３ｍｇ／ｋｇで４か月間（ＱＭ×４）（グループ３）として皮下投与した。
【０５５６】
グループ３および４においては、投与前と、３、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８、１１２、１２６、１５４、１７５、２０３、２３０、２６０、２９０、３１０、３３５、および３６４日目、血清、血漿、および低密度肝臓サンプルを収集した。
【０５５７】
グループ１および２においては、投与前−７および−１日目と投与後３、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、１０５、および１１９日目、血清を収集し；投与１日前と投与の０．５、１、２、４、８、２４、４８、９６および１６８時間後、血漿を収集した。
【０５５８】
グループ３および７においては、投与前−７および−１日目と投与後３、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８、１１２、１２７、１５５、１７６、２０４、２３２、２６０、２８８、３１６、３４４および３７２日目、血清を収集し；投与１日前と投与の０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、９６および１６８時間後、血漿を収集し；血漿を、投与８５日前と投与の０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、９６および１６８時間後にも収集した。
【０５５９】
グループ７においては、１日目、投与の８時間前に低密度肝臓サンプルを収集し（すなわち、ＡＤ−６５４９２の用量を対象に投与する８時間前に低密度肝臓サンプルを対象から収集した）；また投与後、７日目；２２日目；２９日目、投与の８時間前；５７日目、投与の８時間前；８５日目、投与の８時間前；９１日目；１０６日目；および１４１日目、低密度肝臓サンプルを収集した。
【０５６０】
グループ３においては、投与後、２９日目、投与の８時間前；５７日目、投与の８時間前；８５日目、投与の８時間前；９１日目、１０６日目、および１４１日目、低密度肝臓サンプルを収集した。
【０５６１】
ＴＴＲタンパク質の血清レベルを上記のように測定した。
【０５６２】
図１１は、これらの試験の結果を提示し、またＡＤ−６５４９２の投与により達成されたＴＴＲ発現の強固な抑制を示す。データは、ＡＤ−６５４９２が、１ｍｇ／ｋｇ（グループ７）のＡＤ−６５４９２または３ｍｇ／ｋｇ（グループ３）のＡＤ−６５４９２の各々の、毎月投与で４か月（ＱＭ×４）経ての最終投与後の約６週および１７週にわたり、９０％を超えるＴＴＲ発現の持続的抑制をもたらすことを示す。データはまた、１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５４９２（グループ７）の毎月投与で４か月（ＱＭ×４）経ての最終投与後１７週目、約４０％のＴＴＲ発現の抑制を示す。
【０５６３】
データは、ヒト対象へのＡＤ−６５４９２の四半期ごとの投与が、カニクイザルおよびヒトにおける投与間で１：１の翻訳を仮定すると、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの中間、例えば２ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＴＴＲ発現の抑制において有効となることを示す。
【０５６４】
第２の実験セットでは、３グループ（グループ９、１０、および１１；図１２を参照）に、毎月用量０．３ｍｇ／ｋｇで６か月間（ＱＭ×６）（グループ９）；毎月用量０．６ｍｇ／ｋｇで６か月間（ＱＭ×６）（グループ１０）；または初期用量１ｍｇ／ｋｇと、次いで初期用量で５か月（ＱＭ×５）後、毎月維持用量０．３ｍｇ／ｋｇで１か月間（ＱＭ×１）（グループ１１）として皮下投与した。
【０５６５】
投与前−７および−１日目と投与後４、８、１１、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、７１、７８、８５、９２、９９、１１３、１２７、１５５、１７６、および２０４、２３２、２６０および２８８日目、血清サンプルを収集した。ＴＴＲタンパク質の血清レベルを上記のように測定した。
【０５６６】
図１３は、これらの試験の結果を提示し、またＡＤ−６５４９２により毎月用量０．６ｍｇ／ｋｇで２か月間（ＱＭ×２）経てから達成されたＴＴＲの強固な抑制を示し、それは１ｍｇ／ｋｇ初期用量に従うＴＴＲ発現の抑制に匹敵する。データはまた、ＡＤ−６５４９２が、０．３ｍｇ／ｋｇで２か月にわたる毎月投与後に約８０％のＴＴＲ発現の持続的抑制をもたらし；４匹中３匹のサルが、毎月０．３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５４９２で２か月後、６０％〜８５％のＴＴＲ抑制を達成したことを示す。単回１ｍｇ／ｋｇの投与後、最大で９０％のＴＴＲ発現の抑制が示され、２回目用量０．３ｍｇ／ｋｇで２回目投与後３週にわたり最下点が維持される。
【０５６７】
均等物：
当業者は、本明細書に記載の具体的な実施形態および方法に対する多くの均等物を理解するか、または通常の実験を用いるだけで確認できるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲の範囲によって包含されるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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