(57)【要約】本開示は、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡと対比して二本鎖ＤＮＡに対して実質的により高い活性を有するヌクレアーゼを使用して、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法を提供する。本開示はまた、標的突然変異体核酸を濃縮するための、およびその後に濃縮するための目的の非メチル化／メチル化核酸を調製するための方法を含む。この方法は、野生型核酸の優先的切断をもたらし、それにより、目的の突然変異標的配列をその後に濃縮することを可能にする新規な方法である。
2018518967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
【請求項２】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
【請求項３】
前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および／または耐熱性ＤＳＮと組み合わせた温度の上昇を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること；ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
【請求項５】
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸（ＸＮＡ）、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはＲＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムＤＮＡまたは循環ＤＮＡを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２または４に記載の方法を実行する前に、以下：前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を濃縮することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを増幅条件に供する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅条件が、ＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲまたはＣＯＬＤ−ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲおよび等温増幅からなる群より選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されている、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記ＤＳＮ切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるＤＮＡ分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）、パイロシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲからなる群より選択される方法の１つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して請求項２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して請求項２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含み；ならびに
前記反応混合物に対して請求項２または４に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；
（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；ならびに
（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
【請求項２４】
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記変性温度が６５〜８５℃である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ＤＮＡ上のそれらの対応する配列への、異なるＴｍを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程（ｃ）を実施する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＳＮ消化中に６７℃〜６４℃の漸減温度勾配を適用して、６４〜６７℃の異なるＴｍを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記温度勾配が２〜２０℃の範囲である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）と、ＰＣＲ増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること；
（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；
（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない）；ならびに
（ｄ）前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。
【請求項３５】
工程（ｄ）を行う前に、工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を２サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記変性温度が６５〜８５℃である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されている、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーが、工程（ｃ）において適用された温度未満の融解温度を有する、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
野生型核酸と比べて２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記増幅条件がＣＯＬＤ−ＰＣＲである、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供すること；
（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記ＤＳＮが、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
【請求項４５】
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；
（ｄ）前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに
（ｅ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記ＤＳＮが、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
【請求項４６】
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程；ならびに
（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない、方法。
【請求項４７】
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；
（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；
（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；
（ｄ）前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに
（ｅ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない、方法。
【請求項４８】
工程（ｂ）の前記核酸増幅反応が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程（ａ）においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記増幅条件が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にＡＴリッチな配列を除去する、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１５年６月２４日に出願された米国仮出願番号第６２／１８３，８５４号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下の優先権を主張しており、それらの内容は参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、国立衛生研究所によって認められた認可番号Ｒ２１ＣＡ１７５５４２の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝子分析において一般的に遭遇する状況は、大過剰の非変異体配列（「多数派対立遺伝子」）の存在下で、低割合の変異体ＤＮＡ配列（「少数派対立遺伝子」）を識別する必要がある。このような状況の例としては、以下のものが挙げられる：癌において一般的に遭遇する状況として、大過剰の正常（野生型）対立遺伝子の存在下における少数の突然変異対立遺伝子の識別および配列決定（例えば、大過剰の野生型対立遺伝子の存在下における癌患者の血液中または尿中の腫瘍循環ＤＮＡ（または、癌を有すると疑われる人の異常ＤＮＡ）の識別；エピジェネティック分析において、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の識別（または、逆もまた同様である）；大過剰の母性ＤＮＡ配列も存在する母体血中を循環する少数の胎児ＤＮＡ配列の識別および遺伝子型決定；感染因子（細菌またはウイルス）における突然変異株の識別；ならびに作物開発のための変異体配列の検出。
【０００４】
生殖系列または高頻度体細胞突然変異のための信頼性の高いハイスループットスクリーニング法が記載されているが、不均一性、間質汚染を有する腫瘍における、または体液における低頻度体細胞突然変異の検出は依然として問題である。しかし、いくつかの状況では、これらの突然変異を識別することの臨床的意義は非常に重要である。例えば、肺腺癌腫では、通常の配列決定によって識別され得ない低レベルのＥＧＦＲ突然変異は、チロシンキナーゼ阻害剤に対するポジティブな反応または薬物耐性を付与し得る。非常に過剰の野生型対立遺伝子は正常組織に由来するので、癌の早期検出または処置に対する癌の反応のためのバイオマーカーとして有用な血漿中の突然変異は、従来の方法を使用して配列決定され得ない。加えて、間質汚染が頻繁な腫瘍、例えば膵臓癌または前立腺癌における突然変異は、野生型対立遺伝子の存在によって「隠され」得るので、厄介な微小切開が必要であり、さもなければ突然変異を完全に見失う。
【０００５】
癌の他に、多くの他の分野および用途において、高レベルの非標的ＤＮＡの存在下における低レベルの標的ＤＮＡが存在する。例えば、母性対立遺伝子内における少量の胎児対立遺伝子の検出は、胎児対立遺伝子が低割合で含まれる妊娠初期の出生前診断のために特に重要である。この目的への特に興味深い適用は、胎児対立遺伝子が、母性対立遺伝子と比較して大幅に低メチル化されているという事実である。したがって、高レベルの非変異体多数派対立遺伝子の存在下における低レベルの少数派対立遺伝子（例えば、突然変異対立遺伝子または低／高メチル化対立遺伝子）の識別を可能にする技術を開発する一般的必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本開示は、野生型核酸の優先的切断をもたらし、それにより、目的の突然変異標的配列をその後に濃縮することを可能にする新規開発（ヌクレアーゼ支援突然変異濃縮（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、ＮａＭＥ）に関する。次いで、突然変異を識別するための任意の現在利用可能な方法、例えばサンガーシーケンシング、高解像度融解（ＨＲＭ）などを使用して、突然変異濃縮配列をスクリーニングし得る。
【０００７】
従って、本開示のうちのいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法を提供する。本方法は、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露することを含み、前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない。
【０００８】
本開示のうちのいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成することを含み、前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件は、有機溶媒の添加および／または耐熱性ＤＳＮと組み合わせた温度の上昇を含む。
【００１０】
本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること；ならびに前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露することを含み、前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様では、前記方法は、その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して本明細書中に記載されるＮａＭＥプロトコールを実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である。
【００１２】
いくつかの態様では、前記方法は、その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して本明細書中に記載のＮａＭＥプロトコールを実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である。
【００１３】
いくつかの態様では、前記方法は、その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアを含み；ならびに前記反応混合物に対して本明細書中に記載のＮａＭＥプロトコールを実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する。
【００１４】
いくつかの態様では、前記方法は、複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアを含む。
【００１５】
本開示のうちのいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；ならびに（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成することを含み、前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
【００１６】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）および（ｃ）が２サイクルまたはそれを超えて反復される。いくつかの実施形態では、前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記変性温度が６５〜８５℃である。
【００１７】
さらに、いくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ上のそれらの対応する配列への、異なるＴｍを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程（ｃ）を実施する。例えば、ＤＳＮ消化中に６７℃〜６４℃の漸減温度勾配を適用して、６４〜６７℃の異なるＴｍを有する多様なプローブがそれらの個々の標的に効率的にハイブリダイズすることを可能にし得る（「タッチダウンＮａＭＥ」）。温度勾配は、好ましくは、２〜２０℃の範囲であり得る。
【００１８】
本開示のいくつかの態様は、標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）と、ＰＣＲ増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること；（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；（ｃ）前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない）；ならびに（ｄ）前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することを含む、方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、増幅条件は、ハイブリダイズされた核酸ではなくプローブに増幅が適用されるようなものである。いくつかの実施形態では、ＤＳＮ切断の前または後のいずれかに、プローブがトップＤＮＡ標的鎖およびボトムＤＮＡ標的鎖に結合した後、精製工程を適用して、過剰の未結合プローブを除去する。次いで、ＤＳＮ切断の後、（標的ＤＮＡを増幅する代わりに）非カットプローブを増幅し、識別／定量する。ＷＴ  ＤＮＡに結合するプローブは、ＤＳＮによって選択的に消化されているので、増幅後の任意の所定のプローブの存在は、このプローブによってカバーされる領域下の突然変異を示す。
【００２０】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）を行う前に、工程（ｂ）および（ｃ）を２サイクルまたはそれを超えて反復する。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を２サイクルまたはそれを超えて反復する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、有機溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、変性温度は、６５〜８５℃である。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、工程（ｃ）において適用された温度未満の融解温度を有する。いくつかの実施形態では、増幅条件は、ＣＯＬＤ−ＰＣＲである。
【００２１】
本開示のいくつかの態様は、対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供すること；（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露することを含み、前記ＤＳＮが、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法を提供する。
【００２２】
本開示のいくつかの態様は、対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；（ｄ）前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに（ｅ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露することを含み、前記ＤＳＮが、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法を提供する。
【００２３】
本開示のいくつかの態様は、対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程；ならびに（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露することを含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない、方法を提供する。
【００２４】
本開示のいくつかの態様は、対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ：（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること；（ｂ）前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること；（ｄ）前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること；ならびに（ｅ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露することを含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない、方法を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の前記核酸増幅反応が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程（ａ）においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する。いくつかの実施形態では、前記増幅条件が、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび変性時間限定ＣＯＬＤ−ＰＣＲからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然のＡＴリッチ配列を除去する。
【００２６】
上記の方法のいずれかにおいて、前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である。上記の方法のいずれかにおいて、前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記２つのプローブが互いに部分的に重複する。上記の方法のいずれかにおいて、各プローブが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはＲＮＡを含む。上記の方法のいずれかにおいて、対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である。上記の方法のいずれかにおいて、前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムＤＮＡまたは循環ＤＮＡを含む。
【００２７】
上記の方法のいずれかにおいて、前記方法は、本明細書中に記載のＮａＭＥプロトコールを実行する前に、以下：前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている。いくつかの実施形態では、前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている。
【００２８】
上記の方法のいずれかにおいて、本明細書中に記載のＮａＭＥプロトコールを実行する前に、前記核酸サンプルを増幅条件に供する。
【００２９】
上記の方法のいずれかにおいて、前記方法は、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記増幅条件が、ＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲまたはＣＯＬＤ−ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲおよび等温増幅からなる群より選択される。
【００３０】
上記の方法のいずれかにおいて、必要に応じて、各プローブは、ポリメラーゼ伸長を防止するように３’末端で改変されていてもよい。
【００３１】
上記の方法のいずれかにおいて、前記方法は、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記ＤＳＮ切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるＤＮＡ分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む。
【００３２】
上記の方法のいずれかにおいて、前記方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）、パイロシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲからなる群より選択される方法の１つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む。
【００３３】
提供される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＤＳＮ酵素は、ＤＮＡガイド酵素またはＲＮＡガイド酵素である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、酵素は、ＲＮＡガイド酵素、例えばＣａｓ９である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、酵素は、ＤＮＡガイド酵素、例えばアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）酵素である。
【００３４】
本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複し、前記プローブの一方または両方は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、ＰＣＲ増幅を遮断することができる任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはＲＮＡを含む）；ならびに前記トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを増幅条件に供することを含む方法を提供する。突然変異位置と重複するプローブ（単数または複数）は、野生型トップＤＮＡ鎖および野生型ボトムＤＮＡ鎖のためのＰＣＲ増幅を遮断するように作用し（例えば、クランプとして作用し）、それにより、野生型核酸の増幅を阻害する。プローブが部分的に相補的な標的突然変異体配列と二重鎖形成する場合、それはＰＣＲ増幅をあまり阻害することができず、それにより、切断酵素（例えば、ＤＳＮ）を必要とせずに、野生型と比較して突然変異体核酸を選択的に増幅することが可能になる。
【００３５】
本発明の実施形態および態様はそれぞれ、独立してまたは組み合わせて実施され得る。また、本明細書で使用される表現および専門用語は説明の目的のためのものであり、限定的であると見なされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する」、「含有する」、「伴う」およびそれらの変化形の使用は、その後に列挙される事項およびその等価物ならびにさらなる事項を包含することを意味する。
【００３６】
本発明のこれらのおよび他の態様ならびに様々な利点および有用性は、詳細な説明を参照することによって明らかになる。理解されるように、本発明の各態様は、様々な実施形態を包含し得る。
【００３７】
本出願で特定されるすべての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】図１Ａは、高温で二重鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）および配列選択的オリゴヌクレオチド（「プローブ」）を使用した野生型二本鎖ＤＮＡの選択的分解の概略図である。場合により、プローブの結合および両ＤＮＡ鎖の選択的野生型分解の前に一本鎖ＤＮＡを生成するために、ＤＳＮ作用前のＤＮＡ変性工程を適用し得る。
【図１Ｂ】図１Ｂは、５％の当初突然変異存在量（突然変異存在量＝野生型ＤＮＡに対する突然変異体の比であり、パーセンテージとして表される）を有する突然変異ＫＲＡＳアンプリコンのための、デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による、図１Ａに記載されているＮａＭＥベースの突然変異濃縮の検証を示す。この例では、ＤＮＡは、９５℃の変性工程を受けなかった；ＤＮＡ、２つのプローブおよびＤＳＮを混合し、温度を上昇させて（６７℃）、二重鎖を不安定化し、プローブの結合を可能にした。一定範囲の温度を適用して、ＷＴ特異的消化の最適温度を識別した。ＤＳＮ作用後、９５℃で加熱することによってＤＳＮを不活性化し、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を消化サンプルに適用した。ｄｄＰＣＲは、ＤＳＮ作用前後の突然変異存在量の割合を測定することによって達成される突然変異濃縮を定量する。
【図２】図２は、部分的に重複するプローブを使用して、突然変異に結合する際に両ＤＮＡ鎖に対して同時に選択性を提供することを示す概略図である。好ましくは、その後のポリメラーゼ伸張を防止するために、プローブの３’をブロックする。
【図３】図３は、二重鎖特異的ヌクレアーゼと、部分的に重複する配列選択的オリゴヌクレオチドとを使用して、二本鎖ＤＮＡまたは変性ＤＮＡの選択的分解を可能にすることを示す概略図である。突然変異体配列では、トップ鎖プローブとボトム鎖プローブとの間の相補性が制限され、より高い温度でプローブ間相互作用が妨げられる。
【図４】図４は、断片化ゲノムＤＮＡ（すなわち、前増幅されていないＤＮＡ）からの直接的な野生型対立遺伝子の分解を示す概略図である。マルチプレックスアプローチを採用し得ることに留意する；目的の選択ＤＮＡ標的に対して、数千のプローブを同時に使用し得る。
【図５】図５は、選択ＴＰ５３エクソン８標的配列のための断片化ゲノムＤＮＡに対する直接的なＤＳＮ反応後における、突然変異体配列の突然変異存在量の大幅な増加を示すシングルプレックスアッセイの結果を示す。サンプルをＤＳＮで処理する前後に、ｄｄＰＣＲを使用して、突然変異存在量を定量する。ＤＳＮヌクレアーゼに加えて、トッププローブおよびボトムプローブの両方が反応に含まれる場合にのみ、突然変異存在量は増加する。
【図６】図６は、断片化ゲノムＤＮＡに対する直接的なＤＳＮ反応後における、５％または０．３％の当初存在量で突然変異ＫＲＡＳおよびｐ５３を含有するサンプルの突然変異存在量を示すデュプレックスアッセイの結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、３つの異なる細胞株：Ｈ２００９、Ａ５４９およびＨＣＴ−１５におけるＫＲＡＳエクソン２の３つの異なる位置で突然変異されたＤＮＡを使用した、シングルプレックスアッセイのゲノムＤＮＡに対するＤＳＮ反応の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、１１プレックスアッセイによって断片化ゲノムＤＮＡに対して直接実施したＤＳＮ反応で見られた突然変異存在量を要約した表である。Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＤｘからのＤＮＡを使用して、１１個の突然変異標的を形成した。図中、１列目は、標的遺伝子の名称を示し、２列目および３列目は、それぞれ突然変異の位置および突然変異の種類を表し、４列目は、ＤＳＮを省略した場合のデジタルＰＣＲによって生じた突然変異存在量を示し；５列目は、ＤＳＮを適用した場合の突然変異存在量を示し（ＮａＭＥ）、６列目は、ＤＳＮおよびプローブの両方を省略した場合の突然変異存在量を表し、７列目は、いかなる処理も用いない場合のＨｏｒｉｚｏｎ製造業者による予想突然変異存在量を示す。
【図８】図８は、ターゲティングリシーケンシング前に野生型ＤＮＡを選択的に分解するための２つのアプローチを示す概略図である：１つは、マルチプレックスＰＣＲ後のものであり（上）、１つは、ビーズに対するＤＮＡ標的の選択的結合を使用したＰＣＲ前のものである（下）。後者の状況では、利用したプローブは、互いに部分的に重複し、トップＤＮＡ標的鎖およびボトムＤＮＡ標的鎖の両方に結合するように設計されている。加えて、それらは、ビオチン化されている。最初に、ＤＳＮなしでこれらのプローブを使用して、それらの標的に結合させ、選択ＤＮＡ標的をビーズに固定する。次いで、溶液から未固定ＤＮＡを除去する。次いで、それに応じて温度を調整し、ＮａＭＥを上記のように適用する。
【図９】図９は、「ヌクレアーゼ連鎖反応」を示す概略図である。ＤＳＮ消化プロセス中に、野生型分解を変性サイクルと組み合わせると、突然変異体とＷＴとの間の識別が改善されるので、突然変異濃縮が向上する。８５℃で短時間変性し、６５℃に冷却した後、２本の鎖の実質的な再ハイブリダイゼーション前に、反応サイクルを８５℃で再度行い得ることに留意する。
【図１０】図１０は、ＰＣＲ増幅およびヌクレアーゼ連鎖反応の両方が、単一チューブ中でサンプルに対して同時に作用するＰＣＲ−ＮａＭＥ連鎖反応を示す概略図である。ＰＣＲ合成および野生型特異的分解の連続サイクルは、突然変異配列の濃縮の改善をもたらす。
【図１１】図１１は、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ−ＮａＭＥを示す概略図である。突然変異体特異的合成および野生型特異的分解の連続サイクルは、突然変異配列を濃縮する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、逆鎖に対して２つまたはそれを超えるより長い（非重複）プローブを使用した突然変異スキャニングを示す概略図である。プローブは、ポリメラーゼ伸長を防止するために３’が優先的にブロックされており、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＸＮＡ、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）などの修飾塩基を含有し得るか、またはｄＵＴＰを含有し得るか、またはＲＮＡを含み得る。いくつかの場合では、プローブが複数のＤＮＡ標的に対して向けられ得るように、プローブの一部は、１つまたはそれを超えるランダムヌクレオチドを含み得る。２つのプローブ下で配列を合わせた合計がＮａＭＥ中に調査対象になる；突然変異が２つのプローブ下でどこかにあれば、鎖のカットが防止され得る。
【図１２Ｂ−１】図１２Ｂは、１２Ａに記載されている突然変異スキャニングのための変性およびＤＳＮの組み合わせが、野生型ＤＮＡの優先的カットをもたらすことを示す。突然変異が２つのプローブ下でどこかに存在すれば、その後のＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ中に、突然変異ＤＮＡが増幅される。突然変異濃縮に対するプローブの長さおよび濃度の効果がグラフに示されている。
【図１２Ｂ−２】図１２Ｂは、１２Ａに記載されている突然変異スキャニングのための変性およびＤＳＮの組み合わせが、野生型ＤＮＡの優先的カットをもたらすことを示す。突然変異が２つのプローブ下でどこかに存在すれば、その後のＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ中に、突然変異ＤＮＡが増幅される。突然変異濃縮に対するプローブの長さおよび濃度の効果がグラフに示されている。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、１２Ａに記載されているＮａＭＥにおける、２つの隣接プローブおよびＤＳＮを使用した突然変異スキャニングを示す。グラフは、列挙されている各突然変異の平均突然変異濃縮倍率を示す。
【図１３】図１３は、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを用いたＮａＭＥの適用を表す概略図である。ｃＤＮＡ合成またはＰＣＲの前に、多重野生型核酸分解を使用して、突然変異体を濃縮する。
【図１４】図１４は、標的配列上のメチル化対立遺伝子とマッチするように設計したプローブを使用した、断片化ゲノムＤＮＡからの低メチル化濃縮を示す概略図である。
【図１５】図１５は、選択Ｔｍよりも高いＴｍを有する配列の優先的ＤＳＮ消化後における、非メチル化ＤＮＡ配列の濃縮およびメチル化感受性耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲを示す。このスキームはゲノム全体で適用され、遺伝子特異的プローブの使用または標的配列の選択を必要としない。このスキームは、全ゲノム全体での低メチル化対立遺伝子を濃縮および増幅する。
【図１６】図１６は、亜硫酸水素塩変換の前に、エキソヌクレアーゼベースのＤＮＡ断片温度分画を使用して、より低いＴｍの断片を除去するプロセスを示す。
【図１７】図１７は、磁気ビーズに対するＤＮＡの結合を利用した、温度ベースのゲノムＤＮＡ断片溶出を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
低頻度体細胞突然変異の検出を伴うほとんどの用途において、突然変異体対立遺伝子は、突然変異体対立遺伝子および野生型対立遺伝子の両方を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程によって検出される。野生型対立遺伝子よりも突然変異対立遺伝子を優先的に増幅する方法も記載されている（例えば、低変性温度同時増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｔ  ｌｏｗｅｒ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）すなわちＣＯＬＤ−ＰＣＲおよび改良型完全濃縮（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）ＣＯＬＤ  ＰＣＲすなわちｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；Ｌｉ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｍａｍｏｎ  Ｈ，Ｋｕｌｋｅ  ＭＨ，Ｂｅｒｂｅｃｏ  Ｒ，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ＧＭ．Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ  ｅｎｒｉｃｈｅｓ  ｖａｒｉａｎｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００８；１４：５７９−８４；Ｍｉｌｂｕｒｙ  ＣＡ，Ｌｉ  Ｊ，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ＧＭ．  Ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ；３９：ｅ２）。しかしながら、数回の合成サイクル後、ポリメラーゼが、誤った組み込み（ＰＣＲエラー）（これは、突然変異として後に記録される）を不可避的に導入するので、このようなＰＣＲベースの方法によって得られ得る濃縮には限界がある。増幅の反復はまた、望ましくない非標的配列の増幅をもたらすミスプライミングを導入し得る。さらに、ＰＣＲの使用を完全に取り除き得る現在新たに登場した強力な遺伝子分析方法（「第３世代配列決定」Ｎａｎｏｐｏｒｅ，Ｐａｃ−Ｂｉｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ）がある。したがって、実施されるＰＣＲの量を減少させるか、またはＰＣＲなしで、もしくは必要な場合にはＰＣＲと併せて行い得る突然変異濃縮方法が重要である。
【００４０】
本開示は、少なくとも部分的には、非変異体／野生型ＤＮＡまたはＲＮＡの優先的切断をもたらし、それにより、変異体（突然変異体）標的配列を後に選択的に濃縮することを可能にする技術、ヌクレアーゼ支援突然変異濃縮（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＮａＭＥ）の新規開発に基づくものである。したがって、ＮａＭＥは、用途に応じて、ＰＣＲなどの増幅工程の前に、その間にもしくはその後に、またはいかなる増幅も伴わずに使用され得る。続いて、突然変異濃縮配列は、公知の突然変異の場合には、サンガーシーケンシング、高解像度融解（ＨＲＭ）、ＳＳＣＰ、次世代大量並列シーケンシングおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；ならびに低レベルの突然変異のハイスループットシーケンシングの場合には、単一分子シーケンシングまたは第３世代シーケンシングを含む、突然変異を識別するための任意の現在利用可能な方法によってスクリーニングされ得る。ＮａＭＥはまた、メチル化対立遺伝子の状況において低レベルの非メチル化対立遺伝子（メチル化感受性ヌクレアーゼ支援微量対立遺伝子濃縮（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｉｎｏｒ−ａｌｌｅｌｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）すなわちＭＳ−ＮａＭＥ）を検出するために適用され得る（または、逆もまた同様である）。
【００４１】
本明細書に記載される方法は、突然変異／メチル化検出技術の現在の検出限界を大幅に改善し、それにより、例えば異種腫瘍サンプルまたは循環ＤＮＡにおける患者特異的突然変異スクリーニングの信頼性を高める。本明細書に記載される方法はまた、標的の高多重度を可能にし（すなわち、ＤＮＡ領域パネルの同時スクリーニングを可能にし）、それにより、ハイスループット法を体細胞突然変異の検出に使用することを可能にする（例えば、大量並列シーケンシング、ＭＰＳ）。ＮａＭＥは、癌用途、出生前診断用途および感染性疾患用途のための循環バイオマーカーの分野において特に有用である。
【００４２】
「野生型標的配列」は、核酸サンプル中で、対応する標的配列（例えば、遺伝子領域は同じであるが核酸配列が異なるもの）よりも高頻度の核酸を指す。野生型配列は、サンプル中の野生型配列＋突然変異体標的配列の合計の５０％超を構成する。野生型配列は、標的配列の１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれを超えるＲＮＡおよび／またはＤＮＡレベルで発現され得る。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は、多数の正常細胞および少数の癌性細胞を含有し得る。正常細胞は、野生型対立遺伝子（非突然変異体）配列を含有する一方、少数の癌性細胞は、標的配列を含有する。本明細書で使用される場合、「野生型鎖」は、野生型配列の単一核酸鎖を指す。「野生型」という用語は、典型的には、集団における特定の遺伝子について最も一般的なポリヌクレオチド配列または対立遺伝子を指す。一般に、野生型対立遺伝子は、正常細胞から得られ得る。
【００４３】
野生型配列は、約１３〜２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、野生型配列は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ヌクレオチド長またはそれを超える長さである。野生型配列は、対応する標的配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える相同性を共有するが、標的配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは、メチル化シトシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは、非メチル化シトシンである。本発明の野生型配列は、突然変異体配列に使用されるものと同じプライマーペアを用いて、ＰＣＲによって増幅され得る。
【００４４】
本明細書で互換的に使用される「標的核酸」または「標的配列」は、核酸サンプル中で、対応する野生型配列よりも低頻度の核酸を指す。標的配列は、サンプル中の野生型配列＋標的配列の総量の５０％未満を構成する。好ましくは、標的配列は、野生型配列の１：１０、１：１５、１：２０、１：２５倍、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１５０、１：２００倍またはそれ未満のＲＮＡおよび／またはＤＮＡレベルで発現される。いくつかの実施形態では、標的配列は、突然変異体対立遺伝子である。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は、多数の正常細胞および少数の癌性細胞を含有し得る。正常細胞は、野生型（すなわち非突然変異体）配列を含有する一方、少数の癌性細胞は、標的突然変異体配列を含有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒトゲノムにおいて多数存在する反復配列である（限定されないが、ＡＬＵエレメント、ＬＩＮＥエレメント、ＳＩＮＥエレメント、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピートを含む）。疾患状態では、反復配列の変化が起こることが多く、反復配列の変化の検出における本発明の適用が関心対象である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、母親から得られた核酸サンプル中の胎児ＤＮＡを検出することを対象とする。この実施形態では、胎児ＤＮＡは標的配列である一方、高頻度の母性ＤＮＡは野生型配列である。いくつかの実施形態では、標的配列は、メチル化対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的配列は、非メチル化対立遺伝子である。本明細書で使用される場合、「標的鎖」は、標的配列の単一核酸鎖を指す。
【００４５】
いくつかの実施形態では、標的配列は、１３〜２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的配列は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ヌクレオチド長またはそれを超える長さである。標的配列は、対応する野生型配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える相同性を共有するが、野生型配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは、メチル化シトシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは、非メチル化シトシンである。本発明の標的配列は、野生型配列に使用されるものと同じプライマーペアを用いて、ＰＣＲによって増幅され得る。
【００４６】
「標的突然変異体配列」または「突然変異体標的配列」は、核酸サンプル中で、対応する野生型配列よりも低頻度の核酸を指す。標的突然変異体配列は、典型的には、サンプル中の野生型配列＋突然変異体配列の総量の５０％未満を構成する。標的突然変異体配列は、野生型配列の１：１０、１：１５、１：２０、１：２５倍、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１５０、ｌ：２００倍またはそれ未満のＲＮＡおよび／またはＤＮＡレベルで発現され得る。例えば、サンプル（例えば、血液サンプル）は、多数の正常細胞および少数の癌性細胞を含有し得る。正常細胞は、野生型（非突然変異体）対立遺伝子を含有する一方、少数の癌性細胞は、標的突然変異体配列を含有する。いくつかの実施形態では、本発明は、母親から得られた核酸サンプル中の胎児ＤＮＡを検出することを対象とする。この実施形態では、標的突然変異体配列は胎児ＤＮＡである一方、高頻度の母性ＤＮＡは野生型配列である。本明細書で使用される場合、標的突然変異体配列は、妊娠中の母親から得られた胎児ＤＮＡを含むことを意味する。いくつかの実施形態では、本開示は、エピジェネティック分析において、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下で、１つまたはそれを超えるメチル化対立遺伝子を検出することを対象とし、逆もまた同様である。
【００４７】
標的突然変異体配列は、１３〜２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的突然変異体配列は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ヌクレオチド長またはそれを超える長さである。標的突然変異体配列は、対応する野生型配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える相同性を共有するが、野生型配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。本発明の突然変異体標的配列は、野生型配列に使用されるものと同じプライマーペアを用いて、ＰＣＲによって増幅され得る。
【００４８】
「突然変異体」という用語は、核酸配列におけるヌクレオチドの変化（すなわち、単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入もしくはメチル化、またはポリヌクレオチドリピートの数の変化）を指す。突然変異を有する核酸は、対応する野生型配列のものと配列が異なる核酸配列（突然変異体対立遺伝子）を有する。本明細書に記載される方法は、野生型配列を優先的に切断する際に特に有用であり、それにより、いくつかまたは多数の突然変異体標的配列を同時に選択的に濃縮することを可能にする。突然変異体対立遺伝子は、１〜５００個のヌクレオチド配列変化を含有し得る。突然変異体対立遺伝子は、対応する野生型対立遺伝子と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個または５００個のヌクレオチド配列変化を有し得る。典型的には、突然変異体対立遺伝子は、１〜１０個のヌクレオチド配列変化、より典型的には１〜５個のヌクレオチド配列変化を含有するであろう。突然変異体対立遺伝子は、野生型対立遺伝子と５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える相同性を有するであろう。一般に、突然変異体対立遺伝子は、罹患組織または罹患細胞から得られ、疾患状態に関連する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「目的の領域」は、変異、例えば臨床関連突然変異およびメチル化／非メチル化パターンについて調査対象となる配列である。
【００５０】
「突然変異体標的配列の濃縮」は、突然変異体標的配列の量を増加させること、および／またはサンプル中の対応する野生型配列に対する突然変異体標的配列の比を増加させることを指す。例えば、当初、サンプル中で、野生型配列に対する突然変異体配列の比が５％〜９５％である場合、３０％野生型配列に対して７０％突然変異体配列の比になるように、突然変異体配列は、増幅反応で優先的に増幅され得る。したがって、この仮説例では、突然変異体配列は、野生型配列と比べて１４倍濃縮されている。一般に、突然変異体標的配列の濃縮は、濃縮前の野生型配列と比べて突然変異体標的配列の２倍〜２００倍の増加をもたらす。突然変異体標的配列の濃縮は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれを超える濃縮である。突然変異体標的配列の濃縮は、野生型配列と比較して１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超える突然変異体標的配列を有するサンプルをもたらす（例えば、１０％突然変異体標的配列：９０％野生型配列〜９５％突然変異体標的配列：５％野生型配列）。
【００５１】
「対立遺伝子」は、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める代替形態の遺伝子、その一部またはＤＮＡの非コード領域であって、ヌクレオチド配列において少なくとも１つの差異を有するものを指す。対立遺伝子という用語は、限定されないが、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物および古細菌を含む任意の生物由来のＤＮＡを説明するために使用され得る。対立遺伝子は、単細胞（例えば、１つは父親から遺伝し、１つは母親から遺伝した２つの対立遺伝子）において、または細胞集団（例えば、正常組織由来の野生型対立遺伝子および罹患組織由来の体細胞突然変異体対立遺伝子）内において見られ得る。
【００５２】
対立遺伝子は、１３〜２０００ヌクレオチド長であり得る。一実施形態では、対立遺伝子は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ヌクレオチド長またはそれを超える長さである。対立遺伝子は、一般に、互いに５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える相同性を共有するであろう。本発明の対立遺伝子は、同じプライマーペアを用いて、ＰＣＲによって増幅され得る。
【００５３】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、多型を濃縮するために使用される。任意の所定の遺伝子は、対立遺伝子型（多型）を有していなくてもよいし、１つまたは多くの対立遺伝子型（多型）を有していてもよい。対立遺伝子を生じさせる一般的な突然変異変化は、ヌクレオチドの天然または人工（例えば、化学発癌物質）欠失、付加または置換の結果であり得る。これらの種類の変化はそれぞれ単独で、または他のものと組み合わせて、所定の配列において１回またはそれを超えて起こり得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「融解温度」または「Ｔｍ」という用語は、ポリヌクレオチドがその相補配列から解離する温度を指す。一般に、Ｔｍは、二重鎖核酸分子におけるワトソン・クリック塩基対の半分が破壊または解離される（すなわち、「融解」される）が、二本鎖コンフォメーションにおいて、ワトソン・クリック塩基対のもう半分は依然としてインタクトである温度として定義され得る。換言すれば、Ｔｍは、２つの相補配列のヌクレオチドの５０％がアニーリングし（二本鎖）、ヌクレオチドの５０％が変性する（一本鎖）温度として定義される。したがって、Ｔｍは、二本鎖核酸分子から一本鎖核酸分子への移行における（または逆に、一本鎖核酸分子から二本鎖核酸分子への移行における）中点を規定する。
【００５５】
Ｔｍは、多くの方法によって、例えばＷｅｔｍｕｒ  １９９１（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．１９９１．ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７−２５９（これは、参照により本明細書に組み込まれる）による最近接計算によって、ならびに市販のプログラム（Ｏｌｉｇｏ（商標）Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎを含む）およびインターネット上で利用可能なプログラムによって推測され得る。あるいは、Ｔｍは、実際の実験によって決定され得る。例えば、核酸の実際のＴｍを決定するための融解曲線アッセイでは、二本鎖ＤＮＡ結合またはインターカレーティング色素、例えば臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が使用され得る。核酸のＴｍを決定するためのさらなる方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「反応混合物」は、構成成分（限定されないが、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを含む）と、野生型核酸のトップ鎖およびボトム鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプローブペアとの混合物を指す。反応混合物はまた、試薬、例えば限定されないが、塩、バッファーおよび酵素、例えば二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼを含み得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、核酸サンプルは、目的の核酸（標的配列および野生型配列）を含有するかもしくは含有すると推定される任意の物質、または目的の標的核酸を含有するかもしくは含有すると推定される核酸それ自体を指す。したがって、「核酸サンプル」という用語は、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織または体液のサンプル、例えば限定されないが、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、糞便、皮膚、呼吸器、腸管および尿生殖路の外分泌物、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織、インビトロ細胞培養構成成分のサンプル、天然単離物（例えば、飲料水、海水、固体物質）、微生物標本、および核酸トレーサー分子で「マーキング」されている対象物または標本を含む。核酸サンプルは、哺乳動物、ウイルス、細菌または植物から得られ得る。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、血漿、尿または他の体液中を循環するＤＮＡである。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチドプローブ」は、２つまたはそれを超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子を指す。本明細書に記載される方法は、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアを利用する。「相補的」は、プローブが、いかなるミスマッチも伴わずに、野生型核酸のトップ鎖およびボトム鎖における配列にハイブリダイズすることを意味する。オリゴヌクレオチドプローブは、同一ではない（すなわち、２つのプローブの配列は、互いに異なる）。いくつかの実施形態では、プローブは、互いに重複しない（すなわち、それらは、互いに結合しない）。プローブの少なくとも一方は、疑われる突然変異を含有する標的核酸上の配列と重複し（すなわち、プローブは、少なくとも１つのミスマッチを伴って、疑われる突然変異を含有する標的核酸上の配列にハイブリダイズし）、それにより、「部分的に相補的な」標的突然変異体−プローブ二重鎖を形成する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、プローブの一方は、突然変異を含有する標的核酸のトップ鎖上の配列と重複し、他方のプローブは、突然変異を含有する標的核酸のボトム鎖上の配列と重複する。したがって、プローブは、少なくとも１つのミスマッチを伴って、疑われる突然変異を含有する標的核酸のトップ配列およびボトム配列にそれぞれハイブリダイズする。このような実施形態では、プローブは、互いに部分的に重複する。しかしながら、それらは、互いに実質的に結合しない。
【００６０】
オリゴヌクレオチドプローブは、５〜１００塩基長のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、プローブは、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基長である。いくつかの実施形態では、プローブは、野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍〜１０億倍モル過剰である（例えば、野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、５００，０００倍、１００万倍、５億倍、１億倍、１０億倍過剰）。いくつかの実施形態では、プローブは、反応物中で１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭまたは１，０００μＭのモル濃度である。
【００６１】
「選択的に切断される」または「優先的に切断される」は、主題の方法が、パーフェクトマッチ二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖）中に存在するデオキシリボ核酸分子を優先的にカットする（すなわち、切断する）ことを意味する。パーフェクトマッチ二本鎖核酸は、同じ長さの部分的に相補的な核酸二重鎖と比較してミスマッチが存在しない相補鎖間のハイブリッド構造である。したがって、本明細書に記載される方法では、（すなわち、いかなるミスマッチも有しない）二重鎖核酸を含有する相補的ＤＮＡは、（すなわち、１つまたはそれを超えるミスマッチを有する）部分的に相補的な核酸二重鎖、非ＤＮＡ含有核酸二重鎖および／または一本鎖核酸よりもかなりの程度まで切断される。換言すれば、主題の方法は、処理されるサンプル中に存在し得る他の核酸分子よりもかなり高速で、サンプル中のパーフェクトマッチ核酸二重鎖を切断またはカットすることができ、パーフェクトマッチ核酸二重鎖の切断速度は、典型的には、処理されるサンプル中に存在し得る他の核酸の切断速度よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍大きい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、ＰＣＲ反応中に増幅産物を形成するように、突然変異体標的配列および野生型配列の逆鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドを指す。
【００６３】
（二本鎖ＤＮＡに対するＮａＭＥ）
したがって、本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法を提供する。その後の濃縮は、増幅条件を生成反応混合物に適用することによって達成され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露することを含み、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない。
【００６５】
いくつかの実施形態では、前記方法は、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；ならびに前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成することを含み、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない。
【００６６】
ＮａＭＥは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡと対比して二本鎖ＤＮＡの切断に強い選好性を示すヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を利用する。本明細書に記載される方法において使用され得るＤＮａｓｅとしては、限定されないが、ネイティブなエビｄｓＤＮａｓｅ、組換えエビｄｓＤＮａｓｅ、カブトガニヌクレアーゼ（ＤＳＮ）およびウシＤＮａｓｅ  Ｉが挙げられる。図１Ａに示されているように、ＮａＭＥは、野生型ＤＮＡのトップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方から特定の配列を切断するＤＳＮ特性の利点を利用する。対照的に、突然変異含有ＤＮＡは切断されないか、または野生型ＤＮＡよりも有意に少ない程度で切断される。したがって、ＤＳＮ消化後のその後のＰＣＲ反応は、依然として実質的にインタクトな突然変異体対立遺伝子を優先的に増幅し、野生型対立遺伝子と対比して突然変異体対立遺伝子を濃縮する。
【００６７】
本開示の目的のために、「二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）」すなわち「ＤＳＮ」という用語は、一本鎖ＤＮＡと比較して、二本鎖ＤＮＡに対して優先的活性を有するＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素を含む。ＮａＭＥと併せて用いられ得るこのような酵素の例としては、ＲＮＡガイドＣａｓ９酵素（Ｇｕら、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｕｎｄａｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）：Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ      Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６；１７，４１）またはアルゴノートＤＮＡガイド酵素（Ｇａｏら、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｙ  ２０１６  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。これらのＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素は、プローブ（「ガイドオリゴヌクレオチド」）が標的ＤＮＡと完全にマッチする場合には、高い選好性でＤＮＡを消化し、ミスマッチが存在する場合には、低い選好性でＤＮＡを消化する。本発明に記載されるように、重複する様式でトップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方をターゲティングするプローブを用いることによって、本明細書に記載される他のＤＳＮヌクレアーゼを使用する場合と同じように、ＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素と共にＮＡＭＥを適用し得る。
【００６８】
ＮａＭＥの間に（図１Ａ）、ＤＳＮと、目的の野生型核酸のトップ鎖およびボトム鎖とマッチするオリゴヌクレオチドプローブペアとを、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルに添加して（すなわち、曝露または接触させて）、反応混合物を作る。核酸サンプルを、ＤＳＮが不活性である低い温度（例えば、４℃）で、ＤＳＮおよびオリゴヌクレオチドプローブに曝露する。オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも一方は、臨床的に重要な突然変異（例えば、ＫＲＡＳコドン１２／１３配列；ｐ５３配列；トリヌクレオチド反復配列など）を含有すると疑われる標的核酸上の配列と重複する。第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドプローブと逆の標的核酸鎖に結合し、第１のオリゴヌクレオチドと類似の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、この第２のプローブは、突然変異を通常は含有しない標的核酸上の配列とマッチするように設計される。いくつかの実施形態では、プローブは、野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、５００，０００倍、１００万倍、５億倍、１億倍、１０億倍モル過剰である。
【００６９】
次いで、反応混合物を、二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、野生型核酸および突然変異体核酸上の対応する配列へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供し、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖とを形成させる。「不安定化」は、プローブがそれらの対応する配列にハイブリダイズするが、野生型核酸および標的突然変異体核酸が完全に変性しないことを可能にする程度に、二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸が変性することを意味する。二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件は、有機溶媒、例えば限定されないが、ＤＭＳＯ、ベタインもしくはホルムアミドを添加すること、および／または耐熱性ＤＳＮと組み合わせて温度を上昇させることを含む。温度の上昇は、その対応する配列への特異的プローブハイブリダイゼーションを可能にするようなものである。反応混合物の温度は、二本鎖構造を不安定化するが（例えば、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃を含む６５℃〜８０℃）それを完全に変性させない温度に上昇される。この不安定化温度は、典型的には、核酸配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約１０〜２０℃低い。この温度では、オリゴヌクレオチドプローブは、野生型核酸および突然変異体核酸上の対応する配列に侵入および結合する。プローブは、野生型核酸上の配列と完全にマッチするので、相補的な野生型−プローブ二重鎖（すなわち、ミスマッチを有しない）を形成し得る。
【００７０】
疑われる突然変異が標的核酸上に存在する場合、プローブと標的核酸との間の結合は非効率的であり、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖（すなわち、ミスマッチを有する）をもたらす。相補的な野生型−プローブ二重鎖は、ＤＳＮ酵素によって認識および切断される。対照的に、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖は依然として、実質的にインタクトである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの一方は、突然変異を含有すると疑われる標的核酸上の配列と重複し、第２のプローブは、突然変異を通常は含有しない標的核酸上の異なる位置の配列とマッチするように設計される（図１Ａ）。したがって、図１Ａに示されているアプローチは、典型的には、野生型核酸の両方の鎖の切断をもたらす一方、突然変異体核酸のＤＮＡ鎖は１本のみ切断される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、最初に、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを不安定化することによって、本明細書に記載される方法を実施する。次いで、不安定化した野生型核酸および標的突然変異体核酸とオリゴヌクレオチドプローブとを接触させて、野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成させる。「接触」は、プローブを核酸に添加して成分を混合するか、または核酸をプローブに添加して成分を混合することを意味する。次いで、二重鎖をＤＳＮ（これは、相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的にカットするが、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖をカットしない）に曝露する。
【００７３】
本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること；前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること；ならびに前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）に曝露することを含み、前記ＤＳＮが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない方法を提供する。
【００７４】
これらの方法では、最初に、反応混合物を変性温度に供することによって（場合により、ＤＭＳＯ、ベタインまたはホルムアミドのような有機溶媒を含む）、二本鎖野生型核酸および二本鎖標的核酸を、２つのプローブの存在下で変性させる。変性温度は、野生型核酸および標的核酸の完全な変性を可能にするような十分に高いものでなければならない（例えば、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃）。いくつかの実施形態では、変性温度は、野生型配列および核酸配列のＴｍよりも約１℃〜３０℃高い（例えば、野生型配列および核酸配列のＴｍよりも１℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃高い）。
【００７５】
次に、反応混合物の温度を低下させて、野生型核酸および標的核酸がオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることを可能にして、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖（すなわち、ミスマッチを有しない）と、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖（すなわち、ミスマッチを有する）とを形成させる。いくつかの実施形態では、このハイブリダイゼーション温度は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃または７５℃）である。このハイブリダイゼーション温度では、２つのプローブが標的核酸と比べて非常に過剰であるので、それらは、それらの各標的に最初に結合する（すなわち、野生型核酸および標的核酸の２本の親鎖はまだ再会合しておらず、依然として実質的に一本鎖である）。いくつかの実施形態では、プローブは、野生型核酸および標的核酸と比較して１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、５００，０００倍、１００万倍、５億倍、１億倍、１０億倍モル過剰である。
【００７６】
前記方法では、場合により、変性温度におけるＤＳＮの部分的または完全な不活性化を回避するために、最初からＤＳＮを添加しない。温度が低下したらＤＳＮを添加して、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にする。次いで、ＤＳＮは、相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に分解する一方、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖は依然として、実質的にインタクトである。次いで、例えば、サンプルを１〜１０分間で９５℃に加熱して、ＤＳＮを不活性化することによって、ＤＳＮ活性を停止させ得る。その後のＰＣＲ反応は、依然として実質的にインタクトな突然変異対立遺伝子を優先的に増幅する一方、ＤＳＮ消化野生型対立遺伝子は増幅しない。図１Ｂは、このＰＣＲ反応後の突然変異存在量の割合の定量を実証する。ＤＳＮおよび／または両プローブの非存在下では、突然変異存在量は低いが（４〜６％）、ＤＳＮおよび両プローブの存在下では、得られる突然変異存在量は３７〜３８％であることがわかるが、すなわちこれは、ＮａＭＥを使用した突然変異対立遺伝子の濃縮を実証している。
【００７７】
いくつかの実施形態では、その後のＰＣＲ反応は、ハイブリダイズされた核酸ではなくプローブを増幅する。このアプローチでは、ＤＳＮ切断の前または後のいずれかに、プローブがトップＤＮＡ標的鎖およびボトムＤＮＡ標的鎖に結合した後、精製工程を適用して、過剰の未結合プローブを除去する（例えば、ＤＮＡアフィニティーカラム、例えばＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用する）。次いで、ＤＳＮ切断の後、（標的ＤＮＡを増幅する代わりに）非カットプローブを増幅し、識別／定量する。ＷＴ  ＤＮＡに結合するプローブは、ＤＳＮによって選択的に消化されているので、増幅後の任意の所定のプローブの存在は、このプローブによってカバーされる領域下の突然変異を示す。
【００７８】
（重複プローブを使用したＮＡＭＥ）
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、プローブは、プローブの一方が、突然変異を含有する標的核酸のトップ鎖上の配列と重複し、他方のプローブが、目的の突然変異を含有する標的核酸のボトム鎖上の配列と重複し、２つのプローブが互いに部分的に重複するように構築される（図２および３）。２つのプローブは、ＤＳＮ消化中にＮａＭＥに使用される温度（例えば、６５℃〜７０℃）において溶液中で互いに実質的に結合しないように、部分的にのみ重複する。したがって、プローブとそれらの対応する配列とのハイブリダイゼーション中は、プローブが鋳型に結合するために十分に低い温度であるが、実質的なプローブ間結合を可能にしないほど十分に高い温度を保持することが重要である。このアプローチは、突然変異配列に対するプロセスの特異性を増加させ、突然変異濃縮は、野生型核酸とマッチする第２のプローブと共に１つの突然変異特異的プローブのみを使用する場合よりもかなり顕著になる（図１Ａ）。
【００７９】
いくつかの実施形態では、耐熱性ＤＳＮ、例えば限定されないが、カブトガニヌクレアーゼが、本明細書に記載される方法において使用される。いくつかの実施形態では、非耐熱性ＤＳＮ、例えば限定されないが、ネイティブなエビｄｓＤＮａｓｅ、組換えエビｄｓＤＮａｓｅおよびウシＤＮａｓｅ  Ｉが、本明細書に記載される方法において使用される。ＮａＭＥ中に非耐熱性ＤＳＮが使用される場合、設計されるプローブ間の重複は、プローブ−核酸二重鎖形成に使用される温度（例えば、３７〜４５℃）において、プローブの相互結合が最小限である一方、それらが依然としてゲノムＤＮＡ標的に特異的に結合するようなものでなければならない。使用されるヌクレアーゼの最適温度とマッチするようにプローブのＴｍを低下させる１つの方法は、プローブのＴｍを低下させる有機溶媒（ＤＭＳＯ、ホルムアミド）を添加することである。例えば、耐熱性ＤＳＮ酵素の最適温度とマッチする６５℃のＴｍを有するプローブに代えて、プローブのＴｍおよびプローブ間重複領域のＴｍを低下させる１０％ＤＭＳＯの存在下で、エビヌクレアーゼを使用し得る。
【００８０】
本開示の目的のために、「二本鎖特異的ヌクレアーゼ」または「ＤＳＮ」という用語は、一本鎖ＤＮＡとは反対に、二本鎖ＤＮＡに対して優先的活性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｉｔｖｉｔｙ）を有するＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素を含む。ＮａＭＥと併せて用いられ得るこのような酵素の例としては、ＲＮＡガイドＣａｓ９酵素（Ｇｕら、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｕｎｄａｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）：Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ      Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６；１７，４１）またはアルゴノートＤＮＡガイド酵素（Ｇａｏら、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｙ  ２０１６  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。これらのＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素は、プローブ（「ガイドオリゴヌクレオチド」）が標的ＤＮＡと完全にマッチする場合には、高い選好性でＤＮＡを消化し、ミスマッチが存在する場合には、低い選好性でＤＮＡを消化する。本発明に記載されるように、重複する様式でトップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方をターゲティングするプローブを用いることによって、本明細書に記載される他のＤＳＮヌクレアーゼを使用する場合と同じように、ＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素と共にＮＡＭＥを適用し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を実行する前に、核酸サンプルを増幅条件に供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を含有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む。任意の公知の増幅条件が使用され得る。いくつかの実施形態では、増幅条件は、ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲ、複数のプライマーペアを使用したマルチプレックスＰＣＲ、ＡＬＵ、ＬＩＮＥ１、ポリヌクレオチドリピート、マイクロサテライトおよびゲノム全体に広がる他の反復エレメントに特異的なプライマーを使用した反復エレメントのＰＣＲ、任意プライムＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、ならびに等温増幅（例えば限定されないが、ｐｈｉ−２９塩基に基づく置換増幅；またはループ媒介性ＬＡＭＰ増幅；または任意の他の等温増幅法）からなる群より選択される。野生型核酸は、ＤＳＮによって選択的に切断されたので、この増幅工程中に増幅しないであろう。次いで、任意の利用可能な方法、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）、パイロシーケンシング、一本鎖高次構造多型分析ＳＳＣＰ、制限断片長多型ＲＦＬＰ、変性高精度液体クロマトグラフィーｄＨＰＬＣ、ミスマッチ化学的切断ＣＣＭ、キャピラリー電気泳動、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲを使用して、突然変異濃縮増幅産物を突然変異について分析し得る。
【００８２】
ＮａＭＥ反応生成物が後に増幅される場合に、プローブによる増幅反応の干渉がないように、本明細書に記載される方法において使用されるプローブは、好ましくは、ポリメラーゼ伸長に対する３’ブロックを含有する。３’ポリメラーゼブロックは、単純なリン酸；または脱塩基部位；またはブロック後のポリメラーゼ合成を防止する任意の他の改変を含有し得る。加えて、ＮａＭＥ中に野生型配列と突然変異体配列とをさらに識別するために、いくつかの実施形態では、各プローブは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、オリゴヌクレオチドプローブとその標的核酸との間の突然変異誘導性ミスマッチによって引き起こされる不安定化を増加させる任意の公知の天然塩基もしくは修飾塩基、例えばｄＩＴＰもしくは２，６−ジアミノプリンｄＡＴＰを有する核酸、またはＲＮＡを含む。
【００８３】
いくつかの場合では、プローブが複数のＤＮＡ標的に対するものであり得るように、本明細書で提供される方法において使用されるプローブの一部は、１つまたはそれを超えるランダムヌクレオチドを含み得る。例えば、プローブは、目的の領域における野生型核酸配列、例えば疑われる突然変異部位に相補的な１つまたはそれを超えるヌクレオチドのコア領域を含み得る。プローブにおける残りのヌクレオチドのいずれか１つまたはそれよりも多くは、任意のまたはすべての可能なヌクレオチドからランダムに選択され得る。コア領域と１つまたはそれを超えるランダムヌクレオチドとを含有するプローブは、コア領域を同様に含有する完全に相補的な野生型核酸配列と二重鎖を形成し得る。相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しないために、切断酵素、例えばＤＳＮが使用され得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用される。このような実施形態では、異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアが使用される。各プローブペアについて、プローブの一方は、野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方は、野生型核酸のボトム鎖に相補的である。
【００８５】
上記実施形態ではすべて、トップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖のためのプローブの濃度は、必ずしも同じものである必要はないことも理解される。したがって、ボトム鎖のための高濃度のプローブと、トップ鎖のための低濃度のプローブとを組み合わせ得る（または、逆もまた同様である）。多くの標的が同時に濃縮される場合、プローブ濃度はまた、各ＤＮＡ標的について異なるものであり得る。配列の構成、局所的な配列のＴｍおよびターゲティングされる突然変異に応じて最適化された濃度が適用され得る。さらに、ＤＳＮの適用後におけるその後のＰＣＲ増幅反応は、各ＤＮＡ鎖のための等量のプライマーまたは異なる量のプライマーを利用し得る（非対称ＰＣＲまたは指数関数後線形（Ｌｉｎｅａｒ  Ａｆｔｅｒ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）Ｌ．Ａ．Ｔ．Ｅ  ＰＣＲ）。
【００８６】
（ゲノムＤＮＡに直接適用されるＮＡＭＥ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ゲノムＤＮＡに対して直接実施される。ゲノムＤＮＡは、場合により、ＮａＭＥの適用前に断片化され得る（図４）。このアプローチでは、ＮａＭＥは、（ａ）酵素的または物理的な手段を使用して、ゲノムＤＮＡを断片化すること；（ｂ）トップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方に対処する重複（または非重複）プローブを添加することであって、場合により、野生型核酸および標的核酸の両方を（例えば、９５℃で）変性させること；（ｃ）親ＤＮＡ鎖の実質的な再生前に、温度を例えば６０〜７０℃に低下させることであって、プローブがそれらの各標的を発見することを可能にし、プローブ間相互作用を最小限にするために十分に高い温度を維持すること；（ｄ）ＤＳＮを添加することであって、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を実質的にインタクトなままにしながら、１つまたはそれを超える（複数の）相補的な野生型−プローブ二重鎖ＤＮＡ標的を選択的に切断することによって適用される。切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する得られた反応混合物は、当技術分野で公知の方法、例えば限定されないが、ＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲまたはＣＯＬＤ−ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲまたは等温増幅（例えば、ｐｈｉ−２９ベース；またはＬＡＭＰベース；または任意の他の等温増幅法）を使用して増幅され、それにより、野生型と比較して標的突然変異体核酸が濃縮され得る。この増幅産物は、任意の利用可能な方法、例えば限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）、パイロシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲおよび定量ＰＣＲを使用して、突然変異について検査され得る（野生型核酸は、ＤＳＮによって選択的に切断されたので、この増幅工程中に増幅しない）。
【００８７】
図５は、ゲノムＤＮＡに直接適用したＮａＭＥ後、約１％の当初突然変異が８３％の突然変異に濃縮され、０．５％の突然変異が１４％の突然変異に濃縮されたことを表す。図６は、ＫＲＡＳ遺伝子およびＴＰ５３遺伝子における２つの突然変異標的に同時に二重適用したＮａＭＥを示す。図７Ａは、Ｋｒａｓのコドン１２およびコドン１３における３つの異なる突然変異をカバーする２つの重複プローブを使用したＮａＭＥの適用を示し、ＮａＭＥ中に、プローブ下の任意の突然変異が濃縮されることを示す。そして、図７Ｂは、ゲノムＤＮＡからＮａＭＥを直接適用した場合の、１１個の異なる標的の同時濃縮を実証する。各標的について、別個の重複プローブペアを設計し、ＮａＭＥ中は、すべてのプローブが単一反応物に含まれている。
【００８８】
いくつかの実施形態では、単一のプローブペアを使用して、ＮａＭＥによって複数の標的が同時に対処されるように、使用されるプローブは、ゲノム周辺に広がるポリヌクレオチドリピートに対するものである。例えば、標的がポリＡ含有配列である場合、２つの重複プローブが使用され、この場合、１つは、ポリＴを含有するボトム鎖のためのものであり、１つは、ポリＡを含有するトップ鎖のためのものである。また、プローブの長さを増加させるために、隣接塩基に一般に結合し得る任意の数のイノシンを添加し得る。
【００８９】
（ＮａＭＥと大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）との組み合わせ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）と併せて使用され得る。ＭＰＳは、現在、突然変異を識別するための最進のアプローチである。ＭＰＳのためのサンプル（「ライブラリー」）調製は、全ゲノムシーケンシングもしくは全エクソームシーケンシングまたはターゲティングリシーケンシングを適用する前の非常に重要な工程である。ＮａＭＥは、突然変異に関する多数の標的を予想通りに濃縮し、それにより、ＭＰＳが、過剰のシーケンスリード数を必要とせずに、本来的には非常に少ない存在量の突然変異を容易に識別することを可能にし得るので、ＭＰＳの前のサンプル調製のためのユニークな利点を提供する。これは、コストの削減ならびに感度および簡便性の増加を可能にする。図８は、ＭＰＳの前のＮａＭＥ強化サンプル調製プロセスの例を提供する。このアプローチでは、目的のすべての標的の野生型核酸を同時に選択的に切断するために、（先のセクションに記載されているように、多数の遺伝子突然変異に対する重複プローブを同時に使用した）多重ＮａＭＥを元の出発物質に適用する。次いで、サンプルを増幅して、突然変異ＤＮＡ標的を優先的に濃縮する。最後に、ＭＰＳの前に、得られた突然変異濃縮ＤＮＡをルーチンライブラリーの構築に使用する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、図４に記載されているように、目的の多数の標的に対するＮａＭＥの多重適用を、変性ゲノムＤＮＡから直接適用し得る。この後、目的のＤＮＡ標的に対処するプライマー（例えば限定されないが、Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  ｋｉｔまたはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｔｒｕｅｓｅｑ  ｋｉｔにおいて使用されているプライマー）を使用して、マルチプレックスＰＣＲを適用し得る。ＮａＭＥ処理を考慮すると、マルチプレックスＰＣＲ産物は突然変異が濃縮されているので、得られたライブラリー調製物は、ターゲティングリシーケンシングのための突然変異濃縮ＤＮＡを提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＮａＭＥ法を実行する前に、分子反転プローブ（ＭＩＰＳ）内のゲノムＤＮＡから；または「ベイト」オリゴヌクレオチドアプローチを使用して、目的の標的を捕捉する。いくつかの実施形態では、ＭＩＰＳまたはベイトオリゴヌクレオチドをビオチン化する（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｋｉｔに含まれているものと同様であるが、先のセクションのように、トップ標的ＤＮＡ鎖およびボトム標的ＤＮＡ鎖の両方を捕捉するように再設計する）。いくつかの実施形態では、ベイトオリゴヌクレオチドをビーズに付着させる。核酸サンプルと、目的の選択標的に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させ、目的の標的に対するベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にする。次に、それに結合した目的の領域を有するベイトオリゴヌクレオチドを、残りの核酸から単離する。最後に、単離した標的をビーズから分離し、（トップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方に対処する重複プローブであって、多数の標的遺伝子突然変異に同時にアニーリングする重複プローブを使用した）多重ＮａＭＥを使用して、異なる野生型核酸を同時に切断する。この後、ＭＰＳの前に、突然変異濃縮サンプルを使用したＰＣＲおよびライブラリー構築を使用し得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法において使用され得るプローブオリゴヌクレオチドは、目的のゲノム領域、例えばＹ染色体を体系的にタイリングする。いくつかの実施形態では、すべてのＡＴリッチ領域、すべてのＧＣリッチ領域、遺伝子プロモーター；またはＣｐＧ島をカバーする縮重オリゴヌクレオチドプローブを合成する。本明細書に記載されるように設計された、トップ鎖およびボトム鎖の両方をターゲティングする複数の重複プローブを使用して、「任意に」選択的切断について、目的の任意のゲノム画分をターゲティングし得る。
【００９３】
（その後に増幅しない場合の、ＮａＭＥを使用した突然変異濃縮。）
これまでに記載されている実施形態ではすべて、濃縮突然変異標的配列を有するサンプルを生産するために、野生型ＤＮＡ対立遺伝子のＤＳＮ消化の適用後に、増幅工程を行う。あるいは、突然変異標的配列を濃縮するための別の方法は、（増幅せずに）野生型配列を排除することである。
【００９４】
したがって、いくつかの実施形態では、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、ＤＳＮ切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるＤＮＡ分解条件に供して、切断位置で分解を開始させる。「ＤＮＡ分解条件」は、最適なエキソヌクレアーゼ活性の条件下（すなわち、温度、ｐＨイオン濃度などが、最適な酵素活性を提供するように維持されている）で、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物と、エキソヌクレアーゼ（例えば、ｅｘｏ  Ｉまたはｅｘｏ  ＩＩＩまたは３’末端からＤＮＡを消化する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用する）とを接触させることを含む。
【００９５】
このアプローチでは、前述のセクションに記載されているように、ゲノムＤＮＡを非断片化し得るか、またはそれをランダムに断片化し得る。ＤＮＡを断片化する場合、最初に、（例えば、３’末端ホスホロチオエート結合を有するアダプターを使用することによって）断片化ゲノムＤＮＡを、３’エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性のアダプターにライゲーションする。次に、ＤＮＡサンプルを変性させ、先のセクションに記載されているようにＮａＭＥを適用して、突然変異配列をインタクトなままにしながら、野生型配列の切断を生じさせる。次に、エキソヌクレアーゼ消化を適用する（例えば、ｅｘｏ  Ｉまたはｅｘｏ  ＩＩＩまたは３’末端からＤＮＡを消化する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用する）。エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ耐性３’末端を有しない（すなわち、３’末端ホスホロチオエートを有しない）すべての配列を消化する。ＤＳＮニック断片は３’末端ホスホロチオエートを有しないので、それらはこの酵素によって完全に消化され、それにより、野生型ＤＮＡ鎖が排除される。消化は、ＤＳＮ誘導性ニックの３’位置から５’末端に進行するが、（非ニック）突然変異標的配列はインタクトなままである。また、場合により、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを使用することによって、ニックの５’末端から３’末端に野生型配列を消化し得る。ＤＳＮニック野生型配列の完全消化の後、増幅を必要としないエンドポイント検出方法、例えば単一分子シーケンシングアプローチ（Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ；またはＰａｃｉｆｉｃ−Ｂｉｏ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、突然変異濃縮ＤＮＡサンプルを配列決定し得る。この実施形態は、いかなる形態の核酸増幅にも依拠しておらず、これらの配列決定システムのエラー率が比較的高いことを考慮すると、低レベルの突然変異が現在検出困難な小ゲノム（例えば、細菌ゲノムまたはウイルスゲノム）の配列決定において特に有用であり得る。このアプローチと、ビーズ上へのゲノム断片の選択的捕捉とを組み合わせて、より大きいゲノムの複雑性を低減し、続いて、ＮａＭＥによって野生型ＤＮＡを排除し、増幅なしで突然変異標的配列を濃縮し得る。
【００９６】
（ＮａＭＥを使用した突然変異スキャニング）
多くの場合、（ＫＲＡＳなどの単一のホットスポット位置における公知の突然変異の識別とは対照的に）長いＤＮＡ領域における突然変異をスキャンする必要がある。隣接ＤＮＡ配列に相補的な２つのより長いプローブ（第１のプローブはボトム鎖に対するものであり、第２の隣接プローブはトップ鎖に対するものである）を使用して、ＮａＭＥを「突然変異スキャニング」に適合させ得る。例えば、５０〜７０ｂｐのプローブを使用して、１００〜１４０塩基対の領域をカバーし得る。これら１４０塩基対のいずれかの位置に突然変異がある場合、対応する鎖は、ＤＳＮによって実質的に切断されない。したがって、突然変異体鎖は残るので、その後にＰＣＲ産物を得て、これを配列決定し得る（図１２Ａ）。このようにして、突然変異の位置にかかわらず、ｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子上のより長い領域を、突然変異について濃縮し得る（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。
【００９７】
（ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡを用いたＮａＭＥ適用）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、一本鎖形式の野生型ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡまたはＤＮＡを選択的に切断するために使用され得る。ｄｓＤＮＡでは、各逆鎖に対して１つのプローブが使用されるのとは反対に、このアプローチ（図１３）では、１つの標的遺伝子に必要なプローブは１つのみであろう。
【００９８】
（（プローブを用いた）メチル化感受性ＮａＭＥ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、その後の濃縮のための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用される。このような実施形態では、反応混合物に対してＮａＭＥを実行する前に、核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する（シトシンがＣｐＧジヌクレオチド位置でメチル化されていない限り、亜硫酸水素塩は、すべてのシトシンをウラシルに変換する）。これらの方法において使用されるオリゴヌクレオチドプローブペアは、目的のメチル化核酸のトップ鎖およびボトム鎖に相補的である（すなわち、亜硫酸水素塩変換の後、オリゴヌクレオチドプローブの一方は、目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、他方のオリゴヌクレオチドプローブは、目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である）。したがって、プローブは、完全メチル化ＤＮＡを含有する対立遺伝子におけるトップ鎖およびボトム鎖と相補的な（すなわち、いかなるミスマッチも有しない）二重鎖を形成する。対照的に、（亜硫酸水素塩変換前にはシトシンであった）ウラシルの位置におけるミスマッチにより、プローブは、非メチル化シトシンを含有する対立遺伝子と部分的に相補的な二本鎖を形成する。その結果、メチル化二重鎖はＤＳＮによって切断されるが、非メチル化二重鎖は依然として、その後の増幅のために実質的にインタクトである（図１４）。
【００９９】
単一点突然変異によって引き起こされるミスマッチがあると、ＮａＭＥはよく機能するので、複数のシトシンの変換によりいくつかのミスマッチが配列上に存在することは、ＤＳＮのマッチ／ミスマッチ識別作業をさらに向上させると予想され得る。したがって、場合により、このアプローチでは、より長い（例えば、５０〜２００ｂｐまたはそれを超える）プローブも使用し得る。さらに、通常の二本鎖ＤＮＡとは対照的に、化学処理後、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡは依然として一本鎖であり、２本のＤＮＡ鎖はもはや互いに相補的ではない。したがって、場合により、ＤＮＡの亜硫酸水素塩変換の後にトップＤＮＡ鎖のみとマッチするかまたはボトムＤＮＡ鎖のみとマッチするプローブを使用し得る。
【０１００】
すべてのプロモーターをカバーし、ゲノム領域全体をタイリングする数千のプローブを使用し得る。例えば、（メチル化非依存性の酵素を使用した）ランダム断片化または制限酵素断片化のために、物理的剪断を使用して、ゲノムＤＮＡをより小さい断片に消化する。ＤＮＡをランダムに断片化し、末端を修復し、亜硫酸水素塩変換に耐性のメチル化アダプターにライゲーションする。これは、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング準備の標準的な第１工程である。次に、サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理して、非メチル化ＣをＵに変換する（図１４）。この時点のＤＮＡはほとんどが、一本鎖配列を含む。次に、ＤＳＮと、亜硫酸水素塩変換された形態の目的のメチル化領域とマッチするように設計された多くの合成されたオリゴヌクレオチドプローブとを添加することによって、ＮａＭＥ手順を適用する（例えば、ＴＰ５３もしくはＢＲＣＡ１のような全腫瘍抑制遺伝子；またはトリソミー２１が出生前診断の検査中である場合には、第２１染色体の大部分；または癌遺伝子におけるすべてのプロモーター；または循環ＤＮＡもしくは他の液体生検を検査する場合に原発組織の明確化を支援するために、様々な組織間で差次的にメチル化される領域）。完全メチル化ＤＮＡを含有する対立遺伝子では、プローブは、完全な二本鎖ＤＮＡ（すなわち、相補的な二重鎖）を形成するであろう。両方の親ＤＮＡ鎖が選択的に消化され、後に増幅されることを防止する必要があるので、使用されるオリゴヌクレオチドは、元のＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖の両方に対処する必要がある。プローブは、ウラシル（亜硫酸水素塩変換されたシトシン）の位置においてミスマッチを含有するので、非メチル化ＤＮＡを有する対立遺伝子は依然として未消化であろう。その結果、ＤＳＮはこれらの配列をカットせず、それにより、それらは後に増幅され得る（図１４）。目的のメチル化標的の選択的切断の後、増幅条件（例えば、一般的なアダプターを使用したＰＣＲ）を適用し、続いて、サンプルを配列決定し得る。あるいは、亜硫酸水素塩処理されたＡＬＵ、ＬＩＮＥ１およびゲノム全体に広がる他の反復エレメントに特異的なプライマーを使用した反復エレメントのＰＣＲ；または任意プライムＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）；またはＣＯＬＤ−ＰＣＲを適用し得る。ＰＣＲに代えて、等温型増幅も使用し得る。このアプローチは、多くの用途、例えば（グローバルな低メチル化を検出するための）癌の診断／治療、（例えば、実質的にメチル化されていない胎児配列を含有する胎盤ＤＮＡを検出するための）出生前診断、および低メチル化をもたらす／引き起こすことが公知の他の疾患、例えば全身性エリテマトーデスに関連する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、例えば亜硫酸水素ナトリウム処理の後、前記方法は、逆の様式で（すなわち、その後の濃縮のための目的のメチル化標的核酸を調製するために）適用される。このような実施形態では、使用されるオリゴヌクレオチドプローブペアは、目的の非メチル化核酸のトップ鎖およびボトム鎖に完全に相補的である（すなわち、亜硫酸水素塩変換の後、オリゴヌクレオチドプローブの一方は、目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、他方のオリゴヌクレオチドプローブは、目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である）。これは、目的の標的の非メチル化領域の優先的除去をもたらす。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、例えば亜硫酸水素塩処理の後、前記方法は、その後の濃縮のための目的の非メチル化標的核酸および目的の（異なる）メチル化標的核酸の両方を調製するために使用される。前記方法は、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアを含み；前記反応混合物に対して本明細書に記載されるＮａＭＥプロトコールを実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用される。このような実施形態では、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、および（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアが使用される。反応混合物に対してＮａＭＥを実行する前に、核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する。したがって、本明細書に記載される方法は、（ａ）（目的のメチル化遺伝子が容易に明らかになるように）腫瘍抑制遺伝子における非メチル化プロモーター、および（ｂ）（目的の非メチル化遺伝子が容易に明らかになるように）癌遺伝子におけるメチル化プロモーターの同時除去を可能にする。このようにして、メチル化癌遺伝子プロモーターおよび非メチル化癌遺伝子プロモーターを同時に濃縮し得る。
【０１０４】
最後に、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を使用して５−メチルシトシン（５ｍＣ）ベースの差示的メチル化／非メチル化ＤＮＡ領域を選択的に濃縮する上記のものと類似のアプローチもまた、目的の異なるエピジェネティックＤＮＡ改変、例えば５−ヒドロキシ−メチル化（５ｈｍＣ）を選択的に濃縮するために適用され得る。５−ヒドロキシ−メチル化は、５−メチルシトシン改変とは機能的および生物学的に異なるエピジェネティック改変である。したがって、これら２つの改変を別々に測定することが重要である。５ｈｍＣを含有するＤＮＡと、５ｍＣを含有するものとを分離するための１つの方法は、ＴＡＢ−ｓｅｑ（ｔｅｔ支援バイサルファイトシーケンシング、Ｉｔｏ  Ｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１  ３３３（６０４７）：１３００−１３０３；およびＹｕ  Ｍら、Ｃｅｌｌ  ２０１２：１４９：１３６８−８０）である。ＴＡＢ−ｓｅｑでは、亜硫酸水素塩変換を実施する前に、最初に、グリコシル化による保護でゲノム５ｈｍＣを保護する。次いで、ＤＮＡをＴｅｔ酵素で処理して、グリコシル化５−ヒドロキシ−メチル化をそのままにしながら、５ｍＣを５ｃａＣに変換する。したがって、得られたシーケンシングにおける任意のＣリードは、５−ヒドロキシ−メチル化として解釈される。したがって、亜硫酸水素塩処理を直接適用するかまたはグルコシル化後に適用するかに応じて、本発明は、５−メチルシトシン含有ＤＮＡまたは５−ヒドロキシ−メチルシトシン含有ＤＮＡのいずれかを濃縮することを対象とし得る。
【０１０５】
（ヌクレアーゼ連鎖反応）
本開示のいくつかの態様は、「連鎖反応アプローチ」を使用して、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法に関する。前記方法は、（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露して反応混合物を作る工程（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供して、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にする工程；ならびに（ｃ）前記温度を低下させて、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上の対応する配列への前記プローブの迅速なハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成する工程を含み、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない。
【０１０６】
より具体的には、いくつかの実施形態では、温度循環様式（連続的な短時間変性サイクルを含む）でＮａＭＥを適用し、続いて、プローブの存在下でＤＳＮをインキュベートし得る（図９）。変性温度の使用にかかわらず、耐熱性ＤＳＮを最初から反応混合物に含める。反応混合物中に同時に存在するＤＳＮ酵素を破壊せずに、野生型核酸および標的突然変異体核酸の変性を可能にするように、温度を上昇させる。いくつかの実施形態では、この変性温度は、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃または８５℃）である。いくつかの実施形態では、核酸のＴｍを低下させ得る有機溶媒を反応混合物に含める。溶媒は、ＤＳＮの活性を阻害せずに、核酸のＴｍを低下させる。このような溶媒の例としては、限定されないが、ＤＭＳＯ、ベタインまたはホルムアミドが挙げられる。いくつかの実施形態では、１０〜１５％のＤＭＳＯを反応混合物に含める。
【０１０７】
野生型核酸および標的核酸を短時間変性させた後、温度を低下させて、野生型核酸および突然変異体核酸上の対応する配列へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。このハイブリダイゼーション温度は、ＤＳＮ活性を可能にする。いくつかの実施形態では、このハイブリダイゼーション温度は、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃）である。オリゴヌクレオチドプローブは、野生型核酸および標的核酸と比較して非常に過剰であるので、それらはそれらの対応する配列に結合し、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖とを形成する。次いで、耐熱性ＤＳＮは、相補的な野生型−プローブ二重鎖を消化する一方、部分的に相補的な突然変異体−プローブ二重鎖は依然としてインタクトである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）（変性工程）および（ｃ）（ハイブリダイゼーション／ＤＳＮインキュベーション工程）を１サイクルまたはそれを超えて反復する。いくつかの実施形態では、これらの工程を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０サイクル反復する。ハイブリダイゼーション／ＤＳＮインキュベーション工程のみを断続的に（例えば、２〜４分間）適用し、別の変性サイクルによって中断し、続いて、ＤＳＮ消化のために再び温度を低下させるなど。このようにして、２つの親核酸鎖の実質的な再ハイブリダイゼーション（これは、突然変異体か否かにかかわらず、核酸の無差別な破壊をもたらす）を防止しながら、野生型核酸および突然変異体核酸の切断の差異を最大限にすることが可能である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件、例えば限定されないが、ＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性ＰＣＲまたはＣＯＬＤ−ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲおよび等温増幅（例えば限定されないが、ｐｈｉ−２９塩基に基づく置換増幅；またはループ媒介性ＬＡＭＰ増幅；または任意の他の等温増幅法）に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、プローブの一方は、突然変異を含有する標的核酸のトップ鎖上の配列と重複し、他方のプローブは、突然変異を含有する標的核酸のボトム鎖上の配列と重複し、２つのプローブは、互いに部分的に重複する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記方法は、異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアであって、各プローブペアについて、プローブの一方が、野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が、野生型核酸のボトム鎖に相補的である１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含む。
【０１１２】
（ＮａＭＥ−ＰＣＲ）
本開示のいくつかの態様は、図１０に示されているように、ＮａＭＥプロセスとＰＣＲ増幅とを単一工程で組み合わせた方法を提供する。したがって、本開示の態様は、標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、（ａ）二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペアと、ＰＣＲ増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製する工程（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する）；（ｂ）前記反応混合物を変性温度に供して、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にする工程；（ｃ）前記温度を低下させて、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上の対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成する工程（ここで、前記ＤＳＮは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない）；ならびに（ｄ）前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮する工程を含む方法を提供する。
【０１１３】
このアプローチでは、単一チューブ中で、ＮａＭＥおよびＰＣＲを実施する。すべてのＰＣＲ成分、例えば限定されないが、プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼおよびポリメラーゼバッファーを、ＤＳＮおよびオリゴヌクレオチドプローブと一緒に反応混合物に含める。このようにして、サイクリングプロセスにおいて、全標的ＤＮＡが依然として同じであるかまたは増加し、それと同時に突然変異ＤＮＡが継続的に濃縮されるように、野生型核酸は、ＤＳＮによって連続的に選択的に破壊され、またＰＣＲによって再合成される。いくつかの実施形態では、標準的なＰＣＲに代えてＣＯＬＤ−ＰＣＲ形式で、前記方法を実施する。
【０１１４】
ＤＳＮは、商業的に使用されるほとんどのＰＣＲバッファーと適合する；したがって、ＤＳＮ切断は、ＰＣＲ環境で機能する。ＤＳＮおよびポリメラーゼの両酵素は耐熱性であるので、一般的なサーモサイクラーで複合的な反応を行うことが可能である。工程（ｄ）において適用された増幅条件は、プライマーペアが野生型核酸および標的突然変異体核酸にアニーリングした後に伸長し、それにより、野生型と比べて標的突然変異体核酸を濃縮することを可能にする。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）（ＰＣＲ増幅）を行う前に、工程（ｂ）（変性工程）および（ｃ）（ハイブリダイゼーション／ＤＳＮインキュベーション工程）を２サイクルまたはそれを超えて反復する。いくつかの実施形態では、これらの工程を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０サイクル反復する。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）（変性工程）、（ｃ）（ハイブリダイゼーション／ＤＳＮインキュベーション工程）および（ｄ）（増幅工程）を２サイクルまたはそれを超えて反復する。いくつかの実施形態では、これらの工程を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０サイクル反復する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、反応混合物は、反応混合物に含まれる核酸のＴｍを低下させ得る有機溶媒をさらに含む。溶媒は、ＤＳＮの活性を阻害せずに、核酸のＴｍを低下させる。このような溶媒の例としては、限定されないが、ＤＭＳＯ、ベタインまたはホルムアミドが挙げられる。
【０１１７】
使用される変性温度は、反応混合物中に同時に存在するＤＳＮ酵素を破壊せずに、野生型核酸および標的突然変異体核酸の変性を可能にするようなものである。いくつかの実施形態では、この変性温度は、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃または８５℃であり、１秒間、３０秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間または１０分間の期間適用される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、プローブの一方は、突然変異を含有する標的核酸のトップ鎖上の配列と重複し、他方のプローブは、突然変異を含有する標的核酸のボトム鎖上の配列と重複し、２つのプローブは、互いに部分的に重複する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ伸長を防止するために、およびＮａＭＥ−ＰＣＲ中にプローブがプライマーとして作用しないようにするために、プローブは３’末端で改変される。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、工程（ｃ）において適用された温度未満の融解温度を有する。これは、ＤＳＮを使用して野生型核酸を選択的に切断する際に、プライマーが核酸に結合しないことを保証する。例えば、プライマーのＴｍは５５℃であり得るが、プライマーが干渉しない６５℃超で、ハイブリダイゼーション／ＤＳＮインキュベーション工程を実施する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、野生型核酸と比べて２つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記方法は、異なる野生型核酸に対する１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアであって、各プローブペアについて、プローブの一方が、野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が、野生型核酸のボトム鎖に相補的である１つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含む。
【０１２０】
図１０は、ＰＣＲによる連続ＤＮＡ合成のプロセス（この間、ＤＳＮは、核酸の実質的な切断のための十分な時間を有しないが、ポリメラーゼは、数秒以内に作用して鋳型を合成する）と、それに続く６５℃における１０分間の増幅停止（この間、ＤＳＮは、野生型核酸に対して選択的に作用する）を表す。この温度では、プライマーは結合しないので、ポリメラーゼの合成は進行しない。次いでこの後、ＰＣＲによるより多くのＤＮＡ合成およびより多くのＤＳＮ消化などが順次プロセスで起こる。最終産物は、主に突然変異体ＤＮＡを含有するＤＮＡである。他の公知の方法を使用して、この産物を直接配列決定し得るか、または突然変異について分析し得る。
【０１２１】
図１１は、突然変異含有核酸のさらなる濃縮のための、ＮａＭＥとＣＯＬＤ−ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＮａＭＥ−ＰＣＲ）との組み合わせを表す。ＰＣＲ中に突然変異含有核酸を選択的に増幅し、続いて、順次単一チューブ反応でＤＳＮを使用して野生型核酸を選択的に切断することを可能にするＣＯＬＤ−ＰＣＲ条件を適用する。限定されないが、完全ＣＯＬＤ、高速ＣＯＬＤ、ＩＣＥ−ＣＯＬＤ  ＰＣＲまたは変性時間限定ＬＤＴ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲを含むすべての種類のＣＯＬＤ−ＰＣＲが使用され得る。ＣＯＬＤ−ＰＣＲを実施するための方法はＮａＭＥ−ＰＣＲと非常に適合し、以前に記載されている（例えば、Ｌｉ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｍａｍｏｎ  Ｈ，Ｋｕｌｋｅ  ＭＨ，Ｂｅｒｂｅｃｏ  Ｒ，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ＧＭ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００８；１４：５７９−８４；Ｍｉｌｂｕｒｙ  ＣＡ，Ｌｉ  Ｊ，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ＧＭ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ；３９：ｅ２；Ｍｕｒｐｈｙ  ＤＭ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｒｉｚａｌｄｏｓ  Ｅ，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ＧＭ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１４  ６０：１０１４−６を参照のこと；これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２２】
（メチル化感受性ＮａＭＥ−プローブなし）
本開示のいくつかの態様は、ＤＳＮまたはエキソヌクレアーゼなどの酵素を使用した全ゲノムレベルにおける目的の対立遺伝子の温度ベースの優先的濃縮を使用して、目的の非メチル化核酸またはメチル化核酸を調製するための方法を提供する。このアプローチでは、プローブを使用する必要がない。ゲノムＤＮＡをより小さい断片に消化する。末端修復および亜硫酸水素塩耐性アダプターのライゲーション後、亜硫酸水素塩処理を適用する。Ｃ＞Ｔ変換を考慮すると、非メチル化配列はより低いＴｍに戻るが、メチル化配列は依然として高いＴｍである。次に、増幅された二本鎖ＤＮＡライブラリーを作製するために、ライゲーションアダプターを使用して、ＰＣＲを適用する。（あるいは、前記方法を反復配列にのみ適用するために、亜硫酸水素塩処理されたＡＬＵ、ＬＩＮＥ１およびゲノム全体に広がる他の反復エレメントに特異的なプライマーを使用した反復エレメントのＰＣＲ；または前記方法を大きい任意のゲノム画分に適用するために、任意プライムＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）を適用し得る；または、ＣＯＬＤ−ＰＣＲを適用し得る。ＰＣＲに代えて、等温型増幅も使用し得る）。
【０１２３】
増幅後、優先的変性アプローチまたは優先的ハイブリダイゼーションアプローチのいずれかを使用して、非メチル化配列を濃縮し得る。これら２つのアプローチは、以下に記載されている。
【０１２４】
優先的変性アプローチでは、温度を、より低いＴｍの配列の部分的または完全な変性をもたらす選択レベルに上昇させる。これらは、元々メチル化されていない配列を含み、Ｃ＞Ｕ変換の結果、最終ＰＣＲ産物ではＣ＞Ｔ変換されて、メチル化配列よりも低いＴｍに戻る。高いＴｍの配列は依然として二本鎖である。これらは、高メチル化ＧＣリッチ配列を含む。当業者であれば、当技術分野で公知の方法および本明細書に記載される方法を使用して、配列のＴｍを決定し得る。低いＴｍの配列のこの優先的変性に使用される温度としては、限定されないが、５０℃、５５℃、６０℃、６６℃、７０℃、７５℃、７８℃、８０℃または８５℃）が挙げられる。次に、ＤＳＮを添加し、核酸をＤＳＮ活性に最適な条件に曝露する。ＤＳＮ活性に最適な条件は、酵素が相補的二重鎖を切断するために最も効率的に機能することを可能にする最も好ましい条件を含む。最適なＤＳＮ活性は、温度；ｐＨ；および塩濃度を含む条件によって影響を受け得る。いくつかの実施形態では、最適なＤＳＮ活性のために使用される温度としては、限定されないが、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃が挙げられる。より低いＴｍを有する元々メチル化されていない配列（および、より低いＴｍを有する天然ＡＴリッチ配列）は変性する（すなわち、一本鎖になる）ので、ＤＳＮ消化を免れるが、元々メチル化されている配列は依然として、選択変性温度で二本鎖形成するので、切断されるであろう。続いて、共通のライゲーションアダプターを使用して残りの配列を増幅することにより、インタクトな非メチル化配列が優先的に増幅され、非メチル化対立遺伝子の下流大量並列シーケンシングが可能になるであろう。いくつかの実施形態では、核酸のＴｍを低下させ得る有機溶媒の存在下で、ゲノムＤＮＡの優先的変性を実施する。例としては、限定されないが、ベタイン、ＤＭＳＯまたはホルムアミドが挙げられる。ベタインは、ＤＮＡ二重鎖の融解ピークを狭めることが公知であるので、ベタインを添加することによって、所定の変性温度における高いＴｍの配列と低いＴｍの配列との識別が「より鮮明になる」であろう。
【０１２５】
したがって、いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションする工程；（ｂ）前記アダプター連結核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供して、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成する工程；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程；ならびに（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露する工程を含み、前記ＤＳＮは、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない。
【０１２６】
あるいは、優先的再ハイブリダイゼーションアプローチでは、完全変性工程を適用する。変性温度は、核酸の完全な変性を可能にするために十分に高いものでなければならない（例えば、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃）。いくつかの実施形態では、変性温度を３０秒間、１分間、２分間または３分間適用する。いくつかの実施形態では、９５℃の変性温度を２分間適用する。この後、温度を、メチル化（または他の高いＴｍの）配列は（それらのより高いＴｍにより）迅速に再ハイブリダイズするが、非メチル化配列は実質的に一本鎖の状態にとどまることを可能にするレベルに低下させる。次に、最適なＤＳＮ活性のための条件でＤＳＮ酵素を適用して、メチル化二重鎖を優先的に消化する。いくつかの実施形態では、核酸のＴｍを低下させる有機溶媒、例えばＤＭＳＯの存在下で、ＤＳＮを使用した同時消化と組み合わせて（すなわち、後の工程でＤＳＮを添加することに代えて）、再ハイブリダイゼーションを行う。ＤＭＳＯなどの有機溶媒の使用は、再ハイブリダイゼーション中に、ＤＳＮの作用と適合する温度（例えば、６０〜７５℃）を適用することを可能にする。最後に、ＰＣＲ増幅工程を適用して、未消化の非メチル化対立遺伝子を優先的に増幅し、続いて、配列決定し得る。
【０１２７】
したがって、いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションする工程；（ｂ）前記アダプター連結核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供して、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成する工程；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供して、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成する工程；（ｄ）前記温度を低下させて、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にする工程；ならびに（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）と、最適なＤＳＮ活性のための条件とに曝露する工程を含み、前記ＤＳＮは、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない。
【０１２８】
ＤＮＡの亜硫酸水素塩変換は、個々の遺伝子のメチル化状態を識別する基礎を形成している。ハイスループット並列シーケンシング法の出現により、この技術は、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡのライブラリーの配列決定に拡大されている。このアプローチは、ＤＮＡを断片化し、アダプターをライゲーションし、亜硫酸水素塩処理を行い、次いで、ハイスループットシーケンシングのためにライブラリーを増幅することを伴う（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３４号、米国特許出願公開第２００８／０２５４４５３号、米国特許出願公開第２００９／０１４８８４２号および米国特許第８４４０４０４号を参照のこと）。
【０１２９】
メチル化対立遺伝子を濃縮することを目的とする逆のアプローチでは、より低いＴｍの配列（これは、非メチル化対立遺伝子を含む）の優先的変性の後、（二本鎖とは逆に）一本鎖ＤＮＡに対する選択的作用を有する任意の酵素、例えば限定されないが、エキソヌクレアーゼＩまたはＩＩＩによる処理を適用して、一本鎖配列を除去する。続いて、（実質的にメチル化されている対立遺伝子を含む）残りの配列を増幅および配列決定し得る。したがって、いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションする工程；（ｂ）前記アダプター連結核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供して、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成する工程；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程；ならびに（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露する工程を含み、前記エキソヌクレアーゼは、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションする工程；（ｂ）前記アダプター連結核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供して、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成する工程；（ｃ）前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供して、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成する工程；（ｄ）前記温度を低下させて、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にする工程；ならびに（ｄ）前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露する工程を含み、前記エキソヌクレアーゼは、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成するために使用される核酸増幅反応は、ＰＣＲ；完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ＬＤＴ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ＡＰ−ＰＣＲ；および反復エレメントＰＣＲ（ＡＬＵ、ＬＩＮＥ１および他の反復配列）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、得られた切断非メチル化一本鎖核酸および非切断メチル化二重鎖を、亜硫酸水素塩耐性ライゲーションアダプターを使用した増幅条件に供する。いくつかの実施形態では、増幅条件は、ＰＣＲ；ＬＤＴ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ；ＡＰ−ＰＣＲ；および反復エレメントＰＣＲ（ＡＬＵ、ＬＩＮＥ１および他の反復配列）からなる群より選択される。
【０１３２】
非メチル化単一遺伝子配列に対してＣＯＬＤ−ＰＣＲを使用することによって以前に実証されているように（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｒｉｚａｌｄｏｓ，Ｅ．，Ｍｉｌｂｕｒｙ，Ｃ．Ａ．，Ｋａｒａｔｚａ，Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍｅｒｅｗｏｏｄ，Ａ．（２０１４）ＣＯＬＤ−ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ＤＮＡ  ａｌｌｏｗｓ  ｔｈｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｕｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，９，ｅ９４１０３．）、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ形式における全ゲノム増幅を実施することの特有の利点は、増幅中に所望の変性温度を用いることによって、ＣＯＬＤ−ＰＣＲが、より低いＴｍの配列のさらなる濃縮を提供することである。選択変性温度を超えるＴｍを有する配列は、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ中に増幅しない。記載されているＣＯＬＤ−ＰＣＲ形式のいずれかを使用して、選択画分の非メチル化配列をゲノムから増幅し得る（完全ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（１１）；高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（１１）；ｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（１２）；耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲ（１３）；および変性時間限定ＬＤＴ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＤＭ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｒｉｚａｌｄｏｓ  Ｅ，Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ  ＧＭ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１４  ６０：１０１４−６）。各ＣＯＬＤ−ＰＣＲ形式は、異なるゲノム分画の増幅を達成するであろう。例えば、高速ＣＯＬＤ−ＰＣＲは単一の変性温度を利用するので、この温度を超える高いＴｍを有するいかなる配列も全く増幅されないであろう。あるいは、耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲは、変性温度を増加させて広い温度範囲（例えば、それぞれが１℃の１０段階で１０℃の範囲）をカバーする連続工程を利用するので、より広範囲の非メチル化配列をゲノムから増幅する。用途に応じて、異なるＣＯＬＤ−ＰＣＲプログラムを用い得る。図１５には、グローバルにメチル化されていない対立遺伝子のさらなる濃縮のための、メチル化配列のＤＳＮ消化と、非メチル化配列のタンデム耐温ＣＯＬＤ−ＰＣＲ増幅との組み合わせが記載されている。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドプローブを使用せずに目的の非メチル化核酸またはメチル化核酸を調製するために使用される方法のいくつかの実施形態では、亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然ＡＴリッチ配列を除去する。具体的には、非メチル化ＤＮＡ（またはメチル化ＤＮＡ）の優先的増幅のための本明細書に記載されるアプローチでは、元々より高いＴｍであった配列（非メチル化ＧＣリッチ配列）を、（Ｃ＞Ｔ変換により）より低いＴｍの配列に変換する亜硫酸水素塩工程を適用する。対照的に、メチル化対立遺伝子は、それらの高いＴｍを保持する。このようにして、優先的変性工程と、それに続くＤＳＮ消化およびその後の増幅により、非メチル化対立遺伝子が優先的に濃縮される。しかしながら、この増幅工程中に、メチル化状態にかかわらず、本来的に低いＴｍを有する配列も増幅されるであろう（例えば、ＡＴリッチ配列）。いくつかの実施形態では、選択温度未満の融解温度（Ｔｍ）を有する配列を除去して、低いＴｍを有するこれら複数の「情報価値のない正常」配列が標的配列と競合的に増幅し、それにより、目的の配列の増幅を上回ることを回避する。
以下のように、亜硫酸水素塩変換工程を実施する前に、このような「情報価値のない」配列をサンプルから実質的に枯渇させ得る。
【０１３４】
（ａ）より低いＴｍの配列の除去。亜硫酸水素ナトリウム処理の直前に、出発物質の温度ベースの分画を実施する（図１６）。ゲノムＤＮＡの剪断後、平滑末端（例えば、「末端修復」）を作る酵素、例えば限定されないが、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡを処理する。次に、温度を所望のカットオフ温度に上昇させる。この所望のカットオフ温度は、より低いＴｍを有する配列が選択的に除去されるべき温度である。一例として、所望のカットオフ温度が８０℃であると仮定する。温度を、１秒間〜５分間（例えば、１秒間、５秒間、１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間、２分間、３分間、４分間または５分間）の期間で８０℃に上昇させることによって、８０℃未満のＴｍを有するＤＮＡ断片は実質的に変性するが、８０℃超のＴｍを有する他の断片は依然として二本鎖であろう。次に、例えば、サンプルを氷上に置くことによって、温度を急速に低下させる。次に、一本鎖ＤＮＡを優先的に分解する酵素を添加し（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはＩＩＩ）、温度を、１分間〜６０分間（例えば、１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間または６０分間）で、この酵素の活性に最適な温度（例えば、３７℃）に上昇させる。ゲノムＤＮＡは複雑であるので、この期間中に、変性を受ける一本鎖断片は実質的に再生せず、これらは酵素によって分解される。最後に、エキソヌクレアーゼを熱不活性化する。このプロセスは、約８０℃よりも高いＴｍを有する二本鎖ＤＮＡ断片をもたらす。このようにして、選択カットオフ温度よりも実質的に低いＴｍを有する断片を実質的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、より厳密な温度分画が必要である場合、前記プロセスをさらなるラウンドで反復する。さらなるラウンドは、同じ温度（例えば、８０℃）または異なる温度（例えば、８２〜８５℃）におけるものであり得る。所望のカットオフ温度未満のＴｍを有する配列の除去後、亜硫酸水素ナトリウム工程を適用して、核酸中の非メチル化ＣｐＧ位置においてＣをＵに選択的に変換する。したがって、これらの非メチル化ＤＮＡ断片は、より低いＴｍを有する配列に戻るであろう。本来的に低いＴｍを有する配列（例えば、ＡＴリッチ配列）の大部分は、エキソヌクレアーゼベースの温度分画中に除去されているので、二本鎖配列の優先的ＤＳＮ消化によって、より高いＴｍのメチル化配列を除去し、ＰＣＲ（またはＣＯＬＤ−ＰＣＲ）などの増幅工程によって、より低いＴｍのＡＴリッチ配列の干渉を伴わずに、非メチル化配列を優先的に増幅することが可能である。
【０１３５】
（ｂ）固体支持体ベースの温度分画
選択Ｔｍを有する配列をゲノムＤＮＡサンプルから除去するための別のアプローチは、固体支持体ベースの温度分画を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁気ビーズを含む。さらなる処理の前に、ゲノムＤＮＡ断片を別個の温度ドメインに分離することを可能にするために、磁気ビーズをゲノムＤＮＡサンプルの固定化に使用し得る（図１７）。ゲノムＤＮＡ断片を別個の温度ドメインに分離した後、非メチル化対立遺伝子の優先的増幅を各ドメイン内で別々に適用して、いかなる濃縮利益も提供しない望ましくないより低いＴｍのＤＮＡ断片の増幅による干渉を最小限にし得る。このプロトコールを適用するために、ビオチン化亜硫酸水素塩耐性アダプターと非ビオチン化亜硫酸水素塩耐性アダプターとの混合物を用いて、図１５に表されているライゲーション工程を実施し、その後、ゲノムＤＮＡ断片の大部分を一方の鎖のみからストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ上に捕捉する（逆鎖は依然としてビオチン化されていない）。適用される条件（全ＤＮＡに対する全ビーズ）は、十分な配列コピーが固定化されて、低レベルの事象が断片集団で保持されるように、数百ナノグラムのビオチン化ＤＮＡの固定化を可能にする。未結合ＤＮＡの洗浄後、５つの異なる連続工程（例えば、３℃異なる）で、温度を上昇させる。各工程中に、より低いＴｍの断片由来の非ビオチン化ＤＮＡ鎖は徐々に変性して上清から溶出し、次いで、ビーズ磁化後にこれを回収する（図１７）。約４〜５℃の間隔内で、ＤＮＡは、二本鎖からほぼ一本鎖に変化する。３℃の温度間隔で上清を回収することによって、所定の温度ドメイン内の配列において、ゲノムＤＮＡ断片を高濃縮する（例えば、１０〜１００倍）。
【０１３６】
（ＤＳＮなし）
本開示のいくつかの態様は、野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること；前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させて、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上の対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること（ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複し、前記プローブの一方または両方は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、またはＰＣＲ増幅を遮断することができる任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはＲＮＡを含む）；ならびに前記トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを増幅条件に供することを含む方法を提供する。突然変異位置と重複するプローブは、野生型トップＤＮＡ鎖および野生型ボトムＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅を遮断するように作用し（例えば、クランプとして作用し）、それにより、野生型核酸の増幅を阻害する。プローブが部分的に相補的な標的突然変異体配列と二重鎖形成する場合、それはＰＣＲ増幅をあまり阻害することができず、それにより、切断酵素（例えば、ＤＳＮ）を必要とせずに、野生型と比較して突然変異体核酸を選択的に増幅することが可能になる。
【０１３７】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これは、さらなる限定として決して解釈すべきではない。本出願全体を通して引用されているすべての参考文献（論文、発行特許、公開特許出願および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０１３８】
（二本鎖ＤＮＡに対するＮａＭＥ）
ＮａＭＥは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と対比して二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対して実質的により高い活性を有するヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を利用する。ネイティブなエビｄｓＤＮａｓｅ、組換えエビｄｓＤＮａｓｅ、カブトガニヌクレアーゼ（ＤＳＮ）およびウシＤＮａｓｅ  Ｉを含む多くのＤＮａｓｅは、このような活性を示す。以下のセクションでは、ＤＳＮ耐熱性ヌクレアーゼに関するＮａＭＥ実施形態が提供されるが、ｓｓＤＮＡと対比してｄｓＤＮＡに対して実質的により高い活性を示すすべての他のヌクレアーゼについて、同じアプローチを使用し得る。耐熱性ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）は、二本鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）を選択的に分解するが、それは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡに対してほとんどまたは全く作用しない。
【０１３９】
本開示の目的のために、「二本鎖特異的ヌクレアーゼ」または「ＤＳＮ」という用語は、一本鎖ＤＮＡとは反対に、二本鎖ＤＮＡに対して優先的活性を有するＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素を含む。ＮａＭＥと併せて用いられ得るこのような酵素の例としては、ＲＮＡガイドＣａｓ９酵素（Ｇｕら、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｕｎｄａｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）：Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｕｎｗａｎｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ      Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６；１７，４１）またはアルゴノートＤＮＡガイド酵素（Ｇａｏら、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｙ  ２０１６  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。これらのＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素は、プローブ（「ガイドオリゴヌクレオチド」）が標的ＤＮＡと完全にマッチする場合には、高い選好性でＤＮＡを消化し、ミスマッチが存在する場合には、低い選好性でＤＮＡを消化する。本発明に記載されるように、重複する様式でトップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方をターゲティングするプローブを用いることによって、本明細書に記載される他のＤＳＮヌクレアーゼを使用する場合と同じように、ＤＮＡ／ＲＮＡガイド酵素と共にＮＡＭＥを適用し得る。
【０１４０】
ＮａＭＥは、野生型（ＷＴ）ＤＮＡのトップＤＮＡ鎖およびボトムＤＮＡ鎖の両方から特定の配列を分解するＤＳＮ特性の利点を利用する（図１Ａ）。対照的に、突然変異含有ＤＮＡは分解されないか、またはＷＴ  ＤＮＡよりもかなり分解されにくい。したがって、ＤＳＮ消化後のその後のＰＣＲ反応は、依然として実質的にインタクトな突然変異体対立遺伝子を特異的に増幅する。
【０１４１】
このアプローチの適用例は、図１Ｂに実証されている：５％の突然変異を有する１１４ｂｐのｄｓＫＲＡＳ  ＰＣＲアンプリコンを図１Ａのプロセスに供した。ＫＲＡＳカッター（５００ｎＭ）の有無にかかわらず、使用したＤＮＡ鋳型は、５％の突然変異（１：１０００、１：１０，０００（約０．００１ｎＭ）および１：１００，０００）を有するＫＲＡＳ  ＰＣＲアンプリコンと、ｗｔＤＡＮ−Ｔａｑｍａｎ−プローブ（５００ｎＭ）とからなるものであった。次いで、サンプルをＤＳＮ（１Ｕ）と共にインキュベートし、またはＤＳＮなしでインキュベートした。１：１０００サンプルおよび１：１００，０００サンプルについては、混合物を１０分間で６７℃に加熱し、次いで２分間で９４℃に加熱した。１：１０，０００サンプルについては、混合物を１０分間で選択温度（６３℃、６７℃、７０℃または７３℃）に加熱し、次いで２分間で９４℃に加熱した。ＤＳＮなしの平行反応における突然変異存在量を、ＤＳＮありの反応と対比して比較することによって、図１Ｂおよび表１のデータは、６３〜６７℃の温度について、約１０倍の突然変異濃縮を実証している。
【０１４２】
【表１】
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【０１４３】
（ゲノムＤＮＡから直接適用したＮａＭＥ）
図５〜７は、単一ＫＲＡＳ標的配列または単一ｐ５３配列（図５）、同時に２つの標的（二重ＫＲＡＳおよびｐ５３）（図６）、および単一標的反応で３つの異なるＫＲＡＳ突然変異（図７Ａ）について、ゲノムＤＮＡに直接適用したＮａＭＥを実証している。図５では、別々の反応において、約０．５％のＫＲＡＳ突然変異またはｐ５３突然変異を有するゲノムＤＮＡを９５℃で変性させ、重複ブロックプローブおよびＤＳＮの存在下、６５℃で２０分間インキュベートした。突然変異存在量を定量するその後のデジタルＰＣＲによって、ＫＲＡ突然変異またはｐ５３突然変異の濃縮を検出した。図６では、単一チューブ中で、ＫＲＡＳ突然変異ゲノムＤＮＡおよびｐ５３突然変異ゲノムＤＮＡを混合したことを除いて、ゲノムＤＮＡは図５と同じプロトコールを受けた。ＫＲＡＳ突然変異およびｐ５３突然変異の両方を含有するＳＷ４８０細胞株由来のゲノムＤＮＡを野生型ＤＮＡと混合して、低存在量の突然変異を両遺伝子上に作った。２つの突然変異の割合を試験した：約５％および約０．３％。図７Ａでは、１〜５％のＫＲＡＳ突然変異を有するゲノムＤＮＡであって、３つの異なる細胞株由来のゲノムＤＮＡが、別々の反応で、上記と同じプロトコールを受けた。図７Ｂでは、ＤＮＡを変性させ、温度を６７℃に低下させ、２０分間のインキュベーションのために、ＤＳＮおよび重複プローブを添加した。ＤＳＮを不活化し、各標的アンプリコンに対してＰＣＲおよびデジタルＰＣＲを実施して、それらの各突然変異存在量を求めた。突然変異はすべて、ＮａＭＥによって同時に濃縮される。図７Ｂは、各標的上に公知の低レベル突然変異を含有する１１個の標的に同時に（すなわち、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｘから入手したゲノムＤＮＡから直接）ＮａＭＥを適用した場合の、突然変異の濃縮を表す。ＮａＭＥをゲノムＤＮＡに直接適用した後、１１個すべての標的が同時に濃縮されていることが実証されている。
【０１４４】
（ＮａＭＥを使用した突然変異スキャニング）
図１２Ｂおよび１２Ｃは、ＴＰ５３エクソン８における４０〜８０ｂｐの領域の突然変異濃縮のためにＮａＭＥを使用した場合の結果を表す。試験した４つの突然変異はすべて、ＮａＭＥによって濃縮される。図１２Ｂでは、ＰＦＳＫ細胞株またはＨＣＣ細胞株由来の突然変異含有ＤＮＡをＷＴ  ＤＮＡに連続希釈し、次いで、１回目のＰＣＲを適用して目的の標的（ｔｐ５３）を増幅した。アンプリコンを変性させ、次いで、プローブおよびＤＳＮの存在下、６５℃でインキュベートした。２つのプローブは、それぞれＷＴのトップ鎖およびボトム鎖に対応する。突然変異の存在はＤＳＮ消化を阻害するので、ＰＣＲラウンド中に、突然変異ＤＮＡが増幅される。突然変異濃縮に対するプローブの長さおよび濃度の効果も図１２Ｂに表されている。図１２Ｃでは、ＰＦＳＫ細胞株、ＨＣＣ細胞株、ＳＷ４８０細胞株およびＭＤＡＭＢ細胞株由来の突然変異含有ＤＮＡ（これらはすべて、ｐ５３エクソン８上に異なる突然変異を有する）をＷＴ  ＤＮＡに連続希釈し、次いで、図１２Ｂに記載されているのと同じプロトコールを実施した。ＮａＭＥ適用の前後両方にデジタルＰＣＲを実施することによって、突然変異濃縮倍率を計算した。
【０１４５】
（参考文献）
1.  Thomas,  R.K.,  Baker,  A.C.,  Debiasi,  R.M.,  Winckler,  W.,  Laframboise,  T.,  Lin,  W.M.,  Wang,  M.,  Feng,  W.,  Zander,  T.,  Macconnaill,  L.E.  et  al.  (2007)  High-throughput  oncogene  mutation  profiling  in  human  cancer.  Nat  Genet,  39,  347-351.
2.  Chou,  L.S.,  Lyon,  E.  and  Wittwer,  C.T.  (2005)  A  comparison  of  high-resolution  melting  analysis  with  denaturing  high-performance  liquid  chromatography  for  mutation  scanning:  cystic  fibrosis  transmembrane  conductance  regulator  gene  as  a  model.  Am  J  Clin  Pathol,  124,  330-338.
3.  Thomas,  R.K.,  Nickerson,  E.,  Simons,  J.F.,  Janne,  P.A.,  Tengs,  T.,  Yuza,  Y.,  Garraway,  L.A.,  Laframboise,  T.,  Lee,  J.C.,  Shah,  K.  et  al.  (2006)  Sensitive  mutation  detection  in  heterogeneous  cancer  specimens  by  massively  parallel  picoliter  reactor  sequencing.  Nat  Med,  12,  852-855.
4.  Paez,  J.G.,  Janne,  P.A.,  Lee,  J.C.,  Tracy,  S.,  Greulich,  H.,  Gabriel,  S.,  Herman,  P.,  Kaye,  F.J.,  Lindeman,  N.,  Boggon,  T.J.  et  al.  (2004)  EGFR  Mutations  in  Lung  Cancer:  Correlation  with  Clinical  Response  to  Gefitinib  Therapy.  Science,  304,  1497-1500.
5.  Janne,  P.A.,  Borras,  A.M.,  Kuang,  Y.,  Rogers,  A.M.,  Joshi,  V.A.,  Liyanage,  H.,  Lindeman,  N.,  Lee,  J.C.,  Halmos,  B.,  Maher,  E.A.  et  al.  (2006)  A  rapid  and  sensitive  enzymatic  method  for  epidermal  growth  factor  receptor  mutation  screening.  Clin  Cancer  Res,  12,  751-758.
6.  Engelman,  J.A.,  Mukohara,  T.,  Zejnullahu,  K.,  Lifshits,  E.,  Borras,  A.M.,  Gale,  C.M.,  Naumov,  G.N.,  Yeap,  B.Y.,  Jarrell,  E.,  Sun,  J.  et  al.  (2006)  Allelic  dilution  obscures  detection  of  a  biologically  significant  resistance  mutation  in  EGFR  -amplified  lung  cancer.  The  Journal  of  clinical  investigation.
7.  Diehl,  F.,  Li,  M.,  Dressman,  D.,  He,  Y.,  Shen,  D.,  Szabo,  S.,  Diaz,  L.A.,  Jr.,  Goodman,  S.N.,  David,  K.A.,  Juhl,  H.  et  al.  (2005)  Detection  and  quantification  of  mutations  in  the  plasma  of  patients  with  colorectal  tumors.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  102,  16368-16373.
8.  Kimura,  T.,  Holland,  W.S.,  Kawaguchi,  T.,  Williamson,  S.K.,  Chansky,  K.,  Crowley,  J.J.,  Doroshow,  J.H.,  Lenz,  H.J.,  Gandara,  D.R.  and  Gumerlock,  P.H.  (2004)  Mutant  DNA  in  plasma  of  lung  cancer  patients:  potential  for  monitoring  response  to  therapy.  Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences,  1022,  55-60.
9.  Nilsen,  I.W.,  Overbo,  K.,  Jensen  Havdalen,  L.,  Elde,  M.,  Gjellesvik,  D.R.  and  Lanes,  O.  (2010)  The  enzyme  and  the  cDNA  sequence  of  a  thermolabile  and  double-strand  specific  DNase  from  Northern  shrimps  (Pandalus  borealis).  PLoS  One,  5,  e10295.
10.  Castellanos-Rizaldos,  E.,  Milbury,  C.A.,  Karatza,  E.,  Chen,  C.C.,  Makrigiorgos,  G.M.  and  Merewood,  A.  (2014)  COLD-PCR  amplification  of  bisulfite-converted  DNA  allows  the  enrichment  and  sequencing  of  rare  un-methylated  genomic  regions.  PLoS  One,  9,  e94103.
11.  Li,  J.,  Wang,  L.,  Mamon,  H.,  Kulke,  M.H.,  Berbeco,  R.  and  Makrigiorgos,  G.M.  (2008)  Replacing  PCR  with  COLD-PCR  enriches  variant  DNA  sequences  and  redefines  the  sensitivity  of  genetic  testing.  Nat  Med,  14,  579-584.
12.  Milbury,  C.A.,  Li,  J.  and  Makrigiorgos,  G.M.  (2011)  Ice-COLD-PCR  enables  rapid  amplification  and  robust  enrichment  for  low-abundance  unknown  DNA  mutations.  Nucleic  Acids  Res,  39,  e2.
13.  Castellanos-Rizaldos,  E.,  Liu,  P.,  Milbury,  C.A.,  Guha,  M.,  Brisci,  A.,  Cremonesi,  L.,  Ferrari,  M.,  Mamon,  H.  and  Makrigiorgos,  G.M.  (2012)  Temperature-Tolerant  COLD-PCR  Reduces  Temperature  Stringency  and  Enables  Robust  Mutation  Enrichment.  Clin  Chem,  58,  1130-1138.
14.  Shagin,  D.A.,  Rebrikov,  D.V.,  Kozhemyako,  V.B.,  Altshuler,  I.M.,  Shcheglov,  A.S.,  Zhulidov,  P.A.,  Bogdanova,  E.A.,  Staroverov,  D.B.,  Rasskazov,  V.A.  and  Lukyanov,  S.  (2002)  A  novel  method  for  SNP  detection  using  a  new  duplex-specific  nuclease  from  crab  hepatopancreas.  Genome  Res,  12,  1935-1942.
15.  Qiu,  X.,  Zhang,  H.,  Yu,  H.,  Jiang,  T.  and  Luo,  Y.  (2015)  Duplex-specific  nuclease-mediated  bioanalysis.  Trends  in  biotechnology,  33,  180-188.
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018518967.tif 000009
【図６】
2018518967.tif 000010
【図７Ａ】
2018518967.tif 000011
【図７Ｂ】
2018518967.tif 000012
【図８】
2018518967.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2018518967.tif 000015
【図１１】
2018518967.tif 000016
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ−１】
2018518967.tif 000018
【図１２Ｂ−２】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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