(57)【要約】  本明細書では、３Ｄバイオプリンターから凝固形態で堆積される多層のファイバーを含む合成生組織構造体、ならびにそれに関するキット及び使用方法が提供される。ファイバーは、凝固生体適合性マトリックスに含まれて吐出される複数の哺乳類細胞を含んでいる。ファイバーの構造完全性は、追加で一切架橋することなく、堆積時もその後も維持される。ファイバーは、構造体の少なくとも２つの層を通して連続的にバイオプリントされる。一態様では、合成筋組織構造体は、容易にアッセイできる収縮機能性を示す。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオプリンターから吐出される凝固生体適合性マトリックス内の哺乳類細胞の重複するファイバーを含んでおり、前記凝固生体適合性マトリックスが前記ファイバーの構造完全性及び形状忠実度を堆積後も維持できる合成生組織構造体であって、前記凝固生体適合性マトリックスは、半径方向断面で均質であり、前記ファイバーは、前記構造体の少なくとも２つの層を通して連続的にバイオプリントされている、前記合成生組織構造体。
【請求項２】
前記ファイバーは、前記構造体の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０以上の層を通して連続的にバイオプリントされている、請求項１に記載の合成生組織。
【請求項３】
前記ファイバーの重複する層は、バイオプリンティング後も構造上別個のままである、請求項１に記載の合成生組織構造体。
【請求項４】
前記生体適合性マトリックスは、生理学的適合性がある、請求項１に記載の合成生組織構造体。
【請求項５】
筒／管を含み、前記フィラメントは前記筒の各層を通して実質的に連続している、請求項２に記載の合成生組織構造体。
【請求項６】
平板を含み、前記フィラメントは前記平板を通して実質的に連続している、請求項２に記載の合成生組織構造体。
【請求項７】
前記哺乳類細胞は筋細胞である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項８】
前記筋細胞は平滑筋細胞である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項９】
前記筋細胞は骨格筋細胞である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項１０】
前記筋細胞は心筋細胞である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項１１】
収縮機能があり、前記収縮機能性は前記構造体の直径及び／または外周の変化によって決定される、請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項１２】
さらに、少なくとも１種の追加の細胞型を含んでいる、請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項１３】
前記少なくとも１種の追加の細胞型は、前記フィラメント内に分散している、請求項１２に記載の組織構造体。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の追加の細胞型は、前記フィラメントの外周に外側の／第２の層として配置されている、請求項１２に記載の組織構造体。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞はヒト細胞である、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の組織構造体。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の組織構造体を含んでいる、キット。
【請求項１７】
試験因子及び／または条件が哺乳類筋細胞の収縮機能に及ぼす影響を評価する方法であって、ａ）請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の合成生組織構造体を前記試験因子及び／または条件と接触させるステップ、及びｂ）前記因子及び／または条件が前記哺乳類筋細胞に及ぼす影響を、前記構造体の寸法変化を測定することによって決定するステップを含んでいる、前記方法。
【請求項１８】
前記構造体は筒／管を含み、前記決定するステップは前記筒の面積、直径及び／または外周の寸法変化を測定することを含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、２０１５年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／１８０，１７４号、及び２０１６年３月８日に出願された米国特許仮出願第６２／１８０，１７４号の利益を主張し、これらの全文を参照により本明細書に援用するものとする。
【０００２】
本発明は、種々の刺激に応答する筋肉の収縮と弛緩を試験するための、筋細胞を含んだ生物工学組織に関する。本発明はまた、そのような組織を作製するためのバイオプリンティングの方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨格筋系は身体の基本的な構造と機能の土台をなし、一方平滑筋は、血管系、呼吸系、リンパ系、消化系といった多くの生物学的系において重要な役割を果たしており、皮膚、眼、膀胱の他いくつかの器官にも存在している。どちらの種類の組織も、これらの系に関する多くの疾患において、重要な役割を果たしている。したがって、学術界及び製薬業界の研究者にとって、様々な化合物や他の刺激に対する骨格筋組織及び平滑筋組織の応答を試験して疾患経路や基礎生理をよりよく理解できるように、生理学的に関連のある組織モデルが利用できることは重要である。
【０００４】
そのようなモデルを作る試みは以前からなされており、その典型としては、型を使って細胞を（マトリックスに浮遊させるかまたは凝集させて）特定の形態に成型する、あるいは先に形成した足場の外側に細胞を播種する、などが挙げられる。最も高度なモデルは平滑筋組織の収縮など特定の機能を再現することができるが、製造に大変な手作業を要し、再現性が課題となっている。他のモデルでは、製造はそれほど複雑ではないが、組織が収縮する能力はない。
【０００５】
もっと最近では、付加製造（ＡＭ）技術の一形態である３Ｄプリンティングを利用して、デジタルファイルから三次元オブジェクトが直接作製されており、オブジェクトは層ごとに重ねられて所望の三次元構造が得られる。３Ｄバイオプリンティングと呼ばれる３Ｄプリンティングの技法を細胞コンストラクトや組織の作製に用いる初期の取り組みでは、直接の播種や後続の細胞材料のプリンティングとは別に、上述したような足場材料を初めにプリントすることにも重点が置かれた。たとえば米国特許第６，１３９，５７４号、同第７，０５１，６５４号、同第８，６９１，２７４号、同第９，００５，９７２号、及び同第９，３０１，９２５号を参照されたい。ところが、先行技術の足場形成に一般に用いられたポリマーは、概ね生体適合性とされているが、生理学的適合性はない。したがって、このアプローチでは、細胞生存率を犠牲にして、必須の足場の機構的安定性を得ている。
【０００６】
代替の３Ｄバイオプリンティング技法、つまり上記とは逆に機構的構造や形状忠実度を犠牲にして細胞生存率を得ることを強調するものも説明されている。これらのバイオプリンティング装置は、生体適合性マトリックスに含まれる細胞材料を吐出し、それを堆積後に架橋するか、そうではなく凝固させて固形または半固形の組織構造体とすることで、合成組織を作製する。たとえば米国特許第９，２２７，３３９号、同第９，１４９，９５２号、同第８，９３１，８８０号、及び同第９，３１５，０４３号、ならびに米国特許公報第２０１２／００８９２３８号、同第２０１３／０３４５７９４号、同第２０１３／０１６４３３９号、及び同第２０１４／０２８７９６０号を参照されたい。しかしこのような装置はどれも、堆積ステップと架橋ステップの間に時間的遅れが生じると、必然的に、プリントされた構造体の幾何的形状や該構造体の細胞とマトリックスの組成が制御できなくなる。さらには、後続の架橋または凝固のせいで、結局は細胞生存率が低下することも依然として多い。
【０００７】
この問題の一例として、Ｍａｒｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．は、３Ｄバイオプリンティングのバイオインクとして、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸といったヒドロゲルを非生理学的強化ファイバー材料、たとえばナノファイバー（ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ）セルロースと組み合わせて用いる装置を説明している（ＢｉｏＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １６：１４８９−９６  （２０１５））。このバイオインクは、材料の２Ｄ層として堆積され、二価カチオン（ＣａＣｌ２）のバスに浸漬されて１０分かけて架橋し、第１の層を凝固させてから、次の層をその上に堆積させる。これらのバイオインクには生細胞を成功裏に組み込むことができたが、細胞生存率を分析すると、架橋工程の結果、細胞生存率は包理前の約９５．３％から包理及び架橋後の約６９．９％と、かなり低下していることが判明した。さらに、非プリントのコントロールとの比較から、細胞生存率の低下は、実際の３Ｄプリンティング工程ではなく、バイオインク自体の調製と混合のせいである可能性が明らかになった。
【０００８】
したがって、既存の３Ｄバイオプリンティング技法と材料は、構造完全性及び形状忠実度と、生理学的適合性及び細胞生存率との技術的対立を十分に解決していない。本発明は、これらを含めた未解決の需要に取り組むものである。
【０００９】
先行技術
文献
・Ｃｙｒｉｌｌｅ  Ｎｏｒｏｔｔｅ，  Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｓ．  Ｍａｒｇａ，  Ｌａｕｒａ  Ｅ．  Ｎｉｋｌａｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｇａｂｏｒ  Ｆｏｒｇａｃｓ，  “Ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ”，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｏｌ．  ３０，  ２００９，  ｐｐ．  ５９１０−５９１７．
・Ｊｉｎ−ｙａｕ  Ｌａｉ，  Ｃｈｅｏｌ  Ｙｏｎｇ  Ｙｏｏｎ，  Ｊａｍｅｓ  Ｊ．  Ｙｏｏ，  Ｔｉｎａ  Ｗｕｌｆ，  ａｎｄ  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ａｔａｌａ，  “Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｌａｄｄｅｒｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １６８，  ２００２，  ｐｐ．  １８５３−１８５８．
・Ｂｙｕｎｇ−Ｓｏｏｎ  Ｋｉｍ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ｍｏｏｎｅｙ  “Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｕｎｄｅｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｃｈ  Ｅｎｇ，  Ｖｏｌ．  １２２（３＿，  ２０００，  ｐｐ．  ２１０−２１５．
特許
・米国特許公開第２０１４０２８７９６０号
・米国特許公開第２０１３０３４５７９４号
・米国特許公開第２０１４０３７７２３２号
・米国特許第７３６８２７９号
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、３Ｄバイオプリンティング技術における従来の構造完全性と細胞生存率の目的の対立を成功裏に解決するものであり、架橋またはその他の後続の凝固ステップの必要がなく、高度な細胞生存率と生理学的機能性を有する、凝固形態で堆積させた合成生組織構造体を提供する。本発明の態様には、バイオプリンターから吐出される凝固生体適合性マトリックス内の複数の哺乳類細胞を含む合成組織ファイバーを含む合成生組織構造体が含まれ、ファイバーの構造完全性は、堆積時もその後も追加の架橋ステップ（複数可）なしに維持される。好ましい実施形態では、本発明は、連続する合成組織ファイバーの重複する層を含む合成生組織構造体を提供し、該重複する層は構造上別個とすることもできる。特定の実施形態では、バイオプリンターから吐出される凝固生体適合性マトリックス内の複数の哺乳類筋細胞を含む連続する合成組織ファイバーの２つ以上の層を含む合成筋組織構造体を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、バイオプリンターから吐出される合成組織ファイバーを含む合成生組織構造体を提供し、該ファイバーは、バイオプリンターから吐出される凝固生体適合性マトリックス内の複数の哺乳類細胞を含み、該ファイバーの構造完全性はプリントヘッドからの吐出後も維持され、堆積面との接触後にマトリックスを架橋する必要はない。好ましい実施形態では、本発明は、生体適合性マトリックス内に分散されバイオプリンターから吐出される哺乳類細胞の連続した重複するファイバーを含む合成生組織構造体を提供し、該ファイバーは、構造体の少なくとも２つ以上の層を通して、より好ましくは少なくとも３または４層、さらに好ましくは組織構造体の少なくとも５、６、７、８、９、１０以上の層を通して、連続的にバイオプリントされる。哺乳類細胞は、ファイバーの構造完全性及び形状忠実度を維持できる凝固生体適合性マトリックス内に好ましくは含まれるので、ファイバーの重複するセグメント間には明白な境界が存在している。
【００１２】
凝固生体適合性マトリックスは、生細胞の生存を支える多様な天然ポリマーまたは合成ポリマー、たとえばアルギン酸、ラミニン、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ（エチレン）グリコール系のゲル、ゼラチン、キトサン、アガロース、またはそれらの組合せなどをどれでも含むことができる。好ましい実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、アルギン酸、またはプリントヘッドからの吐出中に瞬間的に凝固可能な好適な他の生体適合性ポリマーを含んでいる。
【００１３】
特に好ましい実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、生理学的適合性があり、すなわち細胞増殖、細胞分化及び細胞間情報伝達にも通じる。そのようないくつかの実施形態では、生理学的適合性マトリックスは、アルギン酸を、コラーゲン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、接着糖タンパク質、エラスチン、及びそれらの組合せのうちの１つ以上と一緒に含んでいる。特定の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、またはコラーゲンＸＶＩＩＩからなる群より選択される。特定の実施形態では、ＧＡＧは、ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、またはケラチン硫酸からなる群より選択される。
【００１４】
本明細書で例示する好ましい実施形態では、哺乳類細胞には、筋細胞、たとえば平滑筋細胞、骨格筋細胞及び／または心筋細胞が含まれる。代替の実施形態では、組織または組織構造体はさらに、少なくとも１種の追加の細胞型、たとえば線維芽細胞、内皮細胞及び／または上皮細胞、幹細胞などを含んでいる。そのような一実施形態では、該少なくとも１種の追加の細胞型を該ファイバー内に分散させている。そのような別の実施形態では、該少なくとも１種の追加の細胞型は、該ファイバーの外周に外側の／第２の層として同軸状に配置されている。特に好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。有利にも、これらの合成生組織構造体内のバイオプリンティング後の細胞生存率は、プリント前の細胞生存率と比べて、約７０％〜約１００％であり、たとえば約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、約９９．５％、または約９９．９％である。
【００１５】
一実施形態では、構造体は筒／管を含み、ファイバーは筒の各層を通して実質的に連続している。代替の一実施形態では、構造体は平板を含み、ファイバーは平板全体にわたって実質的に連続している。特に好ましい実施形態では、合成筋肉構造体は収縮機能性を示し、この収縮機能性は該構造体の直径及び／または外周の変化により決定される。
【００１６】
別の態様では、適切な梱包及び／または使用説明書とともに対象である合成組織及び組織構造体を含むキットが提供される。
【００１７】
別の態様では、試験因子及び／または条件が哺乳類筋細胞の収縮機能に及ぼす影響を評価する方法が提供され、該方法は、ａ）対象である合成生組織構造体に試験因子及び／または条件を接触させるステップ、及びｂ）因子及び／または条件が哺乳類筋細胞に及ぼす影響を、筋肉機能を評価することによって、たとえば寸法変化（たとえば該構造体の面積、直径及び／または長さ）を測定すること、ならびに／または細胞生存率、増殖、極性化、及び／もしくは遺伝子発現、たとえば平滑筋アクチン、カルポニンもしくはカルデスモンの発現、抗平滑筋細胞抗体（ＡＳＭＡ）の結合などの測定結果を分析することによって、決定するステップを含む。好ましい実施形態では、構造体は、筒／管を含み、決定するステップは、筒の直径及び／または外周の変化を測定することを含む。
【００１８】
好ましい実施形態では、バイオプリンターは、複数の哺乳類細胞を含む凝固生体適合性マトリックスを単一開口部から吐出する。特に好ましい実施形態では、ＷＯ２０１４／１９７９９９（その開示の全文を参照により本明細書に援用する）でも説明され特許請求されているように、単一開口部はプリントヘッド内に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】層ごと（レイヤー・バイ・レイヤー）のゲル・フィラメント堆積工程の概略図である。
【図２】平滑筋環の収縮の前と後の上面図である。
【図３】ゲル・フィラメント内の平滑筋細胞の増殖を示す透過光顕微鏡像の上面図である。
【図４】平滑筋細胞及び別の細胞型を含む、同軸状に配置された管の概略図である。
【図５】同軸状に配置された平滑筋細胞と別の細胞型を有するゲル・フィラメントで構成される管の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の態様には、バイオプリンターから吐出される凝固生体適合性マトリックス内の複数の哺乳類細胞を含む合成組織ファイバーを含む合成生組織構造体が含まれ、ファイバーの構造完全性及び形状忠実度は、堆積時もその後も追加の架橋ステップ（複数可）なしに維持される。好ましい実施形態では、本発明は、連続する合成組織ファイバーの重複する層を含む合成生組織構造体を提供し、該重複する層は構造上別個とすることもできる。さらなる本発明の態様には、薬剤スクリーニング及び筋肉機能の評価に用いるための、バイオプリンターから吐出される凝固生体適合性マトリックス内の複数の哺乳類筋細胞を含む２層以上の連続する合成組織ファイバーを含む合成筋組織構造体が含まれる。
【００２１】
図１に示すように、複数の哺乳類細胞、たとえばヒト平滑筋細胞、骨格筋細胞または心筋細胞を含有する凝固生体適合性マトリックスがバイオプリンターから吐出され、堆積面に合成組織ファイバーを形成する。したがって、プリントヘッドから既に凝固したマトリックスが吐出された後は、後続の架橋または他の凝固ステップは不要である。こうすれば、第１の層の上に合成組織ファイバーの第２の及びそれ以降の層を連続して堆積させて多層構造を作ることができ、その一方で各層の構造完全性及び形状忠実度も維持される。この工程は、所定の時間にわたって所望の高さの構造体ができるまで続く。
【００２２】
凝固生体適合性マトリックスは、有利にも、アルギン酸、またはプリントヘッドからの吐出中に瞬間的に凝固可能な好適な他の生体適合性ポリマーを含むことができる。本明細書では、「凝固（している）」という用語は、堆積後も形状忠実度及び構造完全性を維持している固形または半固形状態の材料を指す。本明細書では、「形状忠実度」という用語は、材料がその三次元の形状を維持する能力を意味する。いくつかの実施形態では、凝固した材料は、その三次元の形状を約３０秒以上、たとえば約１分、１０分または３０分以上、たとえば約１時間、１０時間、２４時間、または４８時間以上維持する能力がある材料である。本明細書では、「構造完全性」という用語は、材料が自重を含めたある負荷の下で破損、曲げ、または崩壊などに耐えて壊れない能力を意味する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、弾性係数が、約１５、２０または２５キロパスカル（ｋＰａ）よりも高い、より好ましくは約３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０ｋＰａよりも高い、さらに好ましくは約１００、１１０、１２０または１３０ｋＰａよりも高いものである。対象であるバイオプリントされる合成組織ファイバーの好ましい弾性係数の範囲は、約１５、２５または５０ｋＰａ〜約８０、１００、１２０または１４０ｋＰａなどである。
【００２４】
ある好ましい実施形態では、アルギン酸ベースのマトリックスは、プリントされ、それと同時に、プリントヘッドからの吐出時またはその前に二価カチオン架橋液（たとえばＣａＣｌ２溶液）との接触によって架橋される。特に好ましい実施形態では、アルギン酸ベースの生体適合性マトリックスは、さらに、本明細書で詳しく説明する１種以上の生理学的材料を含んでいる。さらに好ましい実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、各合成組織ファイバーの半径方向断面全体にわたって、アルギン酸の均質な組成を含む。
【００２５】
本発明の主要な利点のひとつは、ファイバーベースの３Ｄバイオプリンティング法により製造されることであり、組織は容易に環形状に製造され、その高さや幅をプログラムで修正することが可能である。また、構造完全性及び形状忠実度を反復的に得る手段も提供している。層厚さ、層の数、層の幾何的形状、細胞密度、材料組成、及び細胞型といったパラメーターの同一セットを用いて複数の組織をプリントした場合、それらの組織は実質的に同じになる。本発明の重要な利点は、筋細胞がプリントされた後もその収縮能力を保持するか再建することであり、種々の刺激が筋肉の収縮とその後の弛緩に及ぼし得る効果を定量化することが可能になる。理論に縛られるものではないが、本明細書で説明する多層連続ファイバーは、ファイバーの各層内である程度の閉じ込めを生成でき、それによって細胞は、ファイバーを横断するのではなく実質的にファイバーの方向に増殖するように促進され、その結果として細胞は、自然の状態と同じように、均一の方向に収縮することが可能になる。発明者らが知る限り、連続的な層ごとの堆積工程で製造された筋組織の収縮のデモンストレーションとしてはこれが初めてとなる。
【００２６】
一実施形態では、本明細書は筋組織の多層管を説明する。管は層ごとの堆積工程で作製され、筋細胞は凝固生体適合性マトリックス内に分散され、連続するファイバーとしてバイオプリントされる。一実施形態では、ファイバーは、環様のパターンで堆積されて層を形成する。これらが積層されて管が形成されるが、その高さは層の数を変えることで制御しながら変化させることができる。好ましくは、マトリックス組成物は、筋細胞が収縮性表現型へと完全に分化できるように生理学的適合性がある。バイオプリンティング時、管に収縮性はない。収縮性を得るには、管を形成した後で一般にはこれを細胞培養培地に浸漬し、細胞培養インキュベーター内で典型的には数日間培養し、すると細胞はその収縮能力を回復する。収縮性が得られると、この管を使って種々の刺激に対する筋肉の収縮または弛緩の応答を調査することができ、このことは管が収縮または弛緩したときの直径及び／または外周の変化を測定することで実施できる。
【００２７】
バイオプリンティングにより管構造体を作るための筋細胞を調製するには、まず細胞を単離し、バイオプリントの構造体とするのに十分な量だけ培養しなければならない。測定可能な収縮を提供するためには、細胞密度を十分に高める必要があり、典型的には、ゲル材料１ｍＬ当たり１００万〜１億個の細胞である。筋細胞は、提供されたヒト器官または組織、分化胚細胞または誘導多能性幹細胞、不死化細胞株、または動物組織から単離されたかまたはそれに由来する細胞といった多くの異なる可能な供給源から単離することができる。単離された細胞は次に非凝固形態で浮遊させ、バイオプリンターにロードする。この工程により、細胞はその収縮性の表現型を失う。
【００２８】
バイオプリンティング後、筋肉構造体は、細胞培養培地に浸漬し、温度と二酸化炭素のレベルを制御した細胞培養インキュベーターに入れなければならない。細胞培養液中でしばらく、典型的には数日間経った後、細胞はその収縮性表現型を回復し、収縮し弛緩する能力を得る。図２は１４日間培養した筋肉管の上面図であり、収縮が刺激されている。収縮は、４０分かけてゆっくりと生じる。白い点線は、弛緩状態にある管の直径を示す。収縮状態では、管の直径は小さくなり、この変化は測定可能である。この例では、ヒスタミンを用いて収縮を開始させているが、多くの化合物や他の刺激によっても収縮を開始させることができる。いくつか例を挙げると、塩化ナトリウム、アセチルコリン、ヒスタミン、及び電荷などがある。好ましい実施形態では、収縮と弛緩は、管の直径の変化を視認して測定される。これは、顕微鏡の対物レンズで低拡大率で管を観察し、顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで動画撮影して、行うことができる。あるいは、適切な拡大レベルのカメラを平滑筋管の上方に設置して、上から見た管の動画が撮れるようにしてもよい。動画の場面から筋肉管構造体を隔離するのに、ソフトウェアのエッジ検出アルゴリズムを用いるか、または手動でエッジを定めることもできる。筋肉管の面積、半径、直径または外周の変化を定量化することができる。この機能を容易に実行できる多くのソフトウェア・ツールが利用可能であるが、その一例はＭａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｍａｔｌａｂである。
【００２９】
図３は、フィラメント内で培養１４日目の平滑筋細胞の透過光顕微鏡像である。図から、平滑筋細胞がファイバーを横断するのではなくファイバーの長さ方向に成長する傾向があるのがわかるが、それによって、協調的収縮性応答が可能になるかまたは増強され得る。理論に縛られるものではないが、筋細胞があらゆる方向に均一に増殖すると、収縮応答は不可能かまたは有意ではなくなる可能性がある。したがって、好ましい実施形態では、合成筋組織ファイバーは、バイオプリンティング工程後もその構造完全性及び形状忠実度を維持し、その結果として、連続する各層の間での材料の結合は最小限となる。好ましくは、図３に明白に示すように、層は互いに構造上別個である。最も好ましくは、生理学的適合性があり、ファイバー層をプリント面に堆積する時またはその後も架橋ステップの必要性がないような生体適合性マトリックス材料が用いられる。
【００３０】
生体適合性マトリックス材料
凝固生体適合性マトリックスは、生細胞の生存を支える多様な天然ポリマーまたは合成ポリマー、たとえばアルギン酸、ラミニン、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ（エチレン）グリコール系のゲル、ゼラチン、キトサン、アガロース、またはそれらの組合せなどをどれでも含むことができる。好ましい実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、アルギン酸、またはプリントヘッドからの吐出中に瞬間的に凝固可能な好適な他の生体適合性ポリマーを含んでいる。さらに好ましい実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、各合成組織ファイバーの半径方向断面全体にわたって、アルギン酸の均質な組成を含む。
【００３１】
特に好ましい実施形態では、凝固生体適合性マトリックスは、生理学的適合性があり、すなわち細胞増殖、細胞分化及び細胞間情報伝達にも通じる。「生理学的マトリックス材料」とは、天然の哺乳類組織に見られる生物学的材料を意味する。そのような生理学的マトリックス材料の非限定的例としては、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（たとえばヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、またはケラチン硫酸）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、接着糖タンパク質、及びコラーゲン（たとえばコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、またはコラーゲンＸＶＩＩＩ）が挙げられる。
【００３２】
生体適合性マトリックスは、生細胞の増殖と生存を支える多様な天然ポリマーまたは合成ポリマーで構成することができる。そのような材料の例としては、限定ではないが、コラーゲン、アルギン酸、ラミニン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ（エチレン）グリコール系のゲル、ゼラチン、キトサン、アガロース、ペプチド、またはそれらの組合せが挙げられる。筋肉管の直径は、バイオプリンターにより定めることができ、制御下で変更することもできるが、好ましい実施形態では、複数ウェルの細胞培養プレート内に組織を配置するためには２ｍｍ〜３０ｍｍの範囲であり、フィラメント直径は一般的には１０μｍ〜３００μｍの範囲となる。
【００３３】
哺乳類の細胞型
対象の半月板移植片に用いることができる哺乳類細胞型の非限定的例としては、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、間葉幹細胞、誘導多能性幹細胞、分化幹細胞、組織由来細胞、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。細胞は、ドナー（同種異系）から、またはレシピエント（自家）から得ることができる。細胞はまた、株化培養細胞から、または遺伝子操作された細胞及び／または所望の遺伝子型もしくは表現型が得られるように操作された細胞から得ることもできる。
【００３４】
好ましい一実施形態では、合成組織ファイバーは、ヒト筋細胞、たとえば平滑筋細胞、骨格筋細胞及び／もしくは心筋細胞、ならびに／またはそれらの筋芽細胞を含む。一実施形態では、合成組織構造体はさらに、筋組織ファイバー内に分散しているかまたはその周りに配置されている、たとえば線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、幹細胞などの少なくとも１種の追加の細胞型を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細胞は、好適なヒトまたは動物のドナーから、あるいは該細胞を移植する対象から得ることができる。哺乳類の種としては、限定ではないが、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットが挙げられる。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。他の実施形態では、細胞は動物、たとえばイヌ、ネコ、ウマ、サル、または他の任意の哺乳動物に由来する場合がある。
【００３６】
哺乳類細胞の適切な増殖条件は、当業界では周知である（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．  （２０００）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．  Ｈｏｂｏｋｅｎ  Ｎ．Ｊ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；  Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｍａｙ  １５，２０００、及びＬａｎｚａ  ＆  Ａｔａｌａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００１）。細胞培養培地は一般には必須栄養素を含み、任意選択で追加の要素、たとえば培養される細胞型（複数可）に応じて選択できる増殖因子、塩、ミネラル、ビタミンなどを含む。細胞増殖や分化、特定のタンパク質の分泌などを促進するための特定の成分を選択することができる。一般に、標準的な増殖培地としては、ダルベッコ改変イーグル低グルコース培地（ＤＭＥＭ）に１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸とグルタミンを加え、１０〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）または仔ウシ血清と１００Ｕ／ｍｌペニシリンを補充したものが、当業界で周知の様々な他の標準培地と同様に適切である。増殖条件は、使用する哺乳類細胞型や所望の組織により異なる。
【００３７】
ヒト細胞のさらなる供給源として、限定ではないが、間葉幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。ＭＳＣは、患者から単離でき、自家移植組織置換用に容易に増殖できるため、再生医療用途で関心を集めている。ドナーからの同種移植とは異なり、レシピエント由来のＭＳＣ自家移植は、他者からの疾患感染や免疫媒介性の組織拒絶のリスクがない。ＭＳＣのさらなる利点は、ＭＳＣが定着しその後骨格筋細胞へと分化するための決定的な要因が特定されていることである（Ｔｏｒｉｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２９０：２２７７１−８１  （２０１５）。
【００３８】
一実施形態では、筋肉管は、フィラメント内にあるかまたはフィラメントの外側に付着している１種以上の追加の細胞型、たとえば線維芽細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む。
【００３９】
別の実施形態では、該１種以上の細胞型は、図４に示すように、筋肉管の外側及び／または内側に管と同軸状になるように配置され、細胞型１、細胞型２、または細胞型３のいずれかは収縮性筋細胞である。
【００４０】
さらに別の実施形態では、該１種以上の細胞型は、筋細胞の上または下に配置されてサンドイッチ構造を作っている（図示せず）。
【００４１】
さらに別の実施形態では、該１種以上の細胞型は、図５に示すように、ある細胞型が別の細胞型を同軸状に取り囲むようにフィラメント内に配置され、細胞型１か細胞型２が収縮性平滑筋細胞である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、バイオプリンティングが終了し、得られた筋肉管を数時間以上細胞培養液に入れておくと、フィラメントが溶解するか、そうではなく除去されて、「足場フリー」とも呼ばれる非細胞材料が実質的に含まれない管が得られる。細胞は相互接続されたネットワークを形成するので、筋肉管の全体的な構造はフィラメントの除去後も維持される。
【００４３】
スクリーニングの方法
本発明の態様には、試験因子及び／または条件が哺乳類筋細胞の収縮機能に及ぼす影響を評価する方法が含まれ、該方法は、ａ）対象である合成生組織構造体に試験因子及び／または条件を接触させるステップ、及びｂ）因子及び／または条件が哺乳類筋細胞に及ぼす影響を、筋肉機能を評価することによって、たとえば寸法変化（たとえば該構造体の面積、直径及び／または長さ）を測定すること、ならびに／または細胞生存率、増殖、極性化、及び／もしくは遺伝子発現、たとえば平滑筋アクチン、カルポニンもしくはカルデスモンの発現、抗平滑筋細胞抗体（ＡＳＭＡ）の結合などの測定結果を分析することによって、決定するステップを含む。好ましい実施形態では、構造体は、筒／管を含み、決定するステップは、筒の直径及び／または外周の変化を測定することを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、筋肉管は、薬物の効果または毒性の試験のモデルとして使用される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、筋肉管の収縮は、力変換器を使って測定される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、細胞生存率、増殖、極性化、ならびに／または遺伝子発現、たとえば平滑筋アクチン、カルポニン、及び／もしくはカルデスモンの発現などのさらなる測定値が評価され、あるいは抗平滑筋細胞抗体（ＡＭＳＡ）の結合や他の各種タンパク質が測定される。
【００４７】
筋肉の欠損を修復する方法
本発明の態様には、対象の筋肉の少なくとも一部分を修復及び／または置換する方法が含まれる。本明細書で説明する合成筋肉ファイバー組織及び管のどれでも、それを必要とする対象に移植して、筋肉の修復及び／または再生を行うことができる。したがって、対象の筋肉の欠損を修復するかまたは筋肉の再生を促進する方法も、本明細書で提供される。一実施形態では、方法は、本明細書で説明する合成筋組織構造体を、筋肉の修復または再生を必要とする欠損部位に移植することを含む。
【００４８】
「対象」という用語には、限定ではないが、ヒト、非ヒト霊長類、たとえばチンパンジーやその他の各種類人猿やサル；家畜、たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ；ペットの哺乳動物、たとえばイヌやネコ；実験動物、たとえばマウス、ラットやモルモットなどのげっ歯類が含まれる。この用語は特に年齢や性別を特定しない。したがって、雌雄のどちらでも、成体や新生児、ならびに胎児といった対象も含まれる。一実施形態では、対象は哺乳動物である。一実施形態では、対象はヒト対象である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、方法は、対象の欠損部位に筋移植片またはその一部分を固定すること、及び／または筋移植片の１つ以上の部分を対象の解剖学的構造の少なくとも一か所に固定することを含む場合がある。いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象の欠損筋肉の少なくとも一部分を除去することを含む場合もある。
【００５０】
本明細書で参照した全ての特許及び特許公報は、参照により本明細書に援用するものとする。
【００５１】
当業者であれば、本明細書を読めば一定の変更形態や改良形態に想到しよう。そのような変更形態や改良形態はすべて、簡潔さと読みやすさを考慮して本明細書では触れなかったものであり、以下の特許請求の範囲に適宜含まれることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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