(57)【要約】腫瘍溶解剤として使用することができる、天然に存在しないウイルス、例えば組換えポリオウイルス等の、核酸含有組成物を作製および精製するための改善されたプロセスが記載されている。記載されている改善されたプロセスの一部は、ウイルスＤＮＡ鋳型を作製するための改善されたプロセスに関する。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲによる検出等の、核酸含有組成物の１つまたは複数の核酸配列の迅速な検出方法を使用してクロマトグラフィー画分中の核酸を定量する、核酸含有組成物のクロマトグラフィー精製のための改善されたプロセスも記載されている。さらに、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ等の腫瘍溶解性ポリオウイルスを作製および精製するための改善されたプロセスも記載されている。これらの方法を使用して生成された組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生ウイルスを含む組成物を得るための精製プロセスであって、
該生ウイルスを含む水性流体をサイズ分離クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、
該サイズ分離カラムからの溶出液の少なくとも１つの画分中の、該生ウイルスにおいて見いだされる１つまたは複数の核酸配列を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定するステップと、
該生ウイルスにおいて見いだされる該１つまたは複数の核酸配列を含有する、該サイズ分離カラムからの該溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集するステップと、
該少なくとも１つの陽性画分をプールするステップと、
プールされた該少なくとも１つの陽性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、
該生ウイルスを含有する、該陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのフロースルー溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集するステップと
を含む精製プロセス。
【請求項２】
生ウイルスを含む組成物を得るための精製プロセスであって、
該生ウイルスを含む水性流体をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（ＦＦ）分離クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、
該生ウイルスにおいて見いだされる１つまたは複数の核酸配列を含有する、該Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ分離カラムからの溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集するステップと、
該少なくとも１つの陽性画分をプールするステップと、
プールされた該少なくとも１つの陽性画分をＳｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂陰イオン交換クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、
該生ウイルスを含有する、該Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのフロースルー溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集するステップと
を含む精製プロセス。
【請求項３】
生ウイルスを含む組成物を得るための精製プロセスであって、
該生ウイルスの鋳型配列を含むプラスミドＤＮＡを１つまたは複数の細菌細胞に導入し、それにより、該プラスミドＤＮＡで形質転換された１つまたは複数の細菌細胞を生成するステップと、
該１つまたは複数の形質転換された細菌細胞の固相培養物を成長させ、それにより、１つまたは複数の細菌コロニーを生成するステップと、
該１つまたは複数の細菌コロニーの少なくとも１つにおける該ウイルスの該鋳型配列に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在を検出するステップと、
該１つまたは複数の核酸配列の存在が検出された該少なくとも１つの細菌コロニーに由来する細菌細胞の培養物を繁殖させるステップ、および
該繁殖した細菌細胞から該ウイルスの該鋳型配列を含む該プラスミドＤＮＡを抽出するステップであって、該繁殖させるステップと該抽出するステップとの間に該細菌細胞を凍結させない、ステップと、
哺乳動物宿主細胞に該プラスミドＤＮＡを感染させるステップと、
該プラスミドＤＮＡを有する該哺乳動物宿主細胞を培養するステップと、
生ウイルスを含む、該哺乳動物宿主細胞、該哺乳動物宿主細胞のデブリ、またはその両方に由来する液体細胞培養培地を得るステップと、
該哺乳動物宿主細胞、該哺乳動物宿主細胞のデブリ、またはその両方に由来する該液体細胞培養培地を、溶液中の遊離核酸は消化することができるが封入されたウイルス核酸を消化することはできないヌクレアーゼ酵素と一緒にインキュベートし、それにより、該生ウイルスを含む水性流体を生成するステップと、
該生ウイルスを含む該水性流体をサイズ分離クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、
該サイズ分離カラムからの溶出液の少なくとも１つの画分中の、該生ウイルスにおいて見いだされる１つまたは複数の核酸配列を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定するステップと、
該生ウイルスにおいて見いだされる該１つまたは複数の核酸配列を含有する、該サイズ分離カラムからの溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集するステップと、
該少なくとも１つの陽性画分をプールするステップと、
プールされた該少なくとも１つの陽性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、
該生ウイルスを含有する、該陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのフロースルー溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集するステップと
を含む精製プロセス。
【請求項４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー分離ステップの後にいかなる別のクロマトグラフィー分離ステップも含有しない、請求項１から３までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項５】
２つのクロマトグラフィー分離ステップを含有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項６】
前記フロースルー溶出液中に溶出した前記生ウイルスを透析濾過によって濃縮するステップをさらに含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項７】
８時間未満で行われる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項８】
前記精製プロセスの精製収率が少なくとも５０％であり、該プロセスからの生ウイルスの収率が少なくとも５×１０１１ｐｆｕであり、前記フロースルー溶出液中に溶出した前記生ウイルスの感染力が少なくとも１×１０１２組織培養感染量（ＴＣＩＤ）５０である、またはこれらの組合せである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項９】
前記生ウイルスを含む前記水性流体が、該ウイルスに感染した宿主細胞を１ラウンドまたは複数ラウンドの細胞培養で培養するステップを含むプロセスによって得られる液体細胞培養培地である、請求項１から２までまたは請求項４から８までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項１０】
前記液体細胞培養培地が、培養後に、前記宿主細胞、該宿主細胞のデブリ、またはその両方から該液体細胞培養培地を分離するステップをさらに含む前記プロセスによって得られる、請求項９に記載の精製プロセス。
【請求項１１】
前記液体細胞培養培地が、溶液中の遊離核酸は消化することができるが、封入されたウイルス核酸を消化することはできないヌクレアーゼ酵素と一緒に該液体細胞培養培地をインキュベートするステップをさらに含む前記プロセスによって得られる、請求項９または１０に記載の精製プロセス。
【請求項１２】
前記生ウイルスが、
該生ウイルスの鋳型配列を含むプラスミドＤＮＡを１つまたは複数の細菌細胞に導入し、それにより、該プラスミドＤＮＡで形質転換された該１つまたは複数の細菌細胞を生成するステップと、
該１つまたは複数の形質転換された細菌細胞の固相培養物を成長させ、それにより、１つまたは複数の細菌コロニーを生成するステップと、
該１つまたは複数の細菌コロニーの少なくとも１つにおける該ウイルスの該鋳型配列に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在を検出するステップと、
該１つまたは複数の核酸配列の存在が検出された該少なくとも１つの細菌コロニーに由来する細菌細胞の培養物を繁殖させるステップと、
該繁殖した細菌細胞から該ウイルスの該鋳型配列を含む該プラスミドＤＮＡを抽出するステップであって、該繁殖させるステップと該抽出するステップとの間に該細菌細胞を凍結させない、ステップと
を含むプロセスによって得られる、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項１３】
前記ウイルスに感染した前記宿主細胞が、
該ウイルスの鋳型配列を含むプラスミドＤＮＡを１つまたは複数の細菌細胞に導入し、それにより、該プラスミドＤＮＡで形質転換された該１つまたは複数の細菌細胞を生成するステップと、
該１つまたは複数の形質転換された細菌細胞の固相培養物を成長させ、それにより、１つまたは複数の細菌コロニーを生成するステップと、
該１つまたは複数の細菌コロニーの少なくとも１つにおける該ウイルスの該鋳型配列に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在を検出するステップと、
１つまたは複数の核酸配列の存在が検出された該少なくとも１つの細菌コロニーに由来する細菌細胞の培養物を繁殖させるステップと、
該繁殖した細菌細胞から該ウイルスの該鋳型配列を含む該プラスミドＤＮＡを抽出するステップであって、該繁殖させるステップと該抽出するステップとの間に該細菌細胞を凍結させない、ステップと、
該鋳型配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって該ウイルスの裸のＲＮＡを生成するステップと、
該ウイルスの該裸のＲＮＡを宿主細胞に導入し、それにより、該ウイルスに感染した宿主細胞を生成するステップと
を含むプロセスによって得られる、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項１４】
前記プラスミドが、Ｅ．ｃｏｌｉ複製開始点を含む細菌プラスミドであり、前記１つまたは複数の細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項３、１２または１３に記載の精製プロセス。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の精製プロセス。
【請求項１６】
前記哺乳動物宿主細胞が、Ｖｅｒｏ細胞である、請求項３または１３に記載の精製プロセス。
【請求項１７】
前記ウイルスが、ＲＮＡウイルスまたは一本鎖ＤＮＡウイルスである、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記ＲＮＡウイルスが、天然に存在しない生ポリオウイルスである、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記天然に存在しない生ポリオウイルスが、腫瘍溶解性ポリオウイルスまたはＳａｂｉｎポリオウイルスである、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記天然に存在しない生ポリオウイルスが、ＰＶＳ−ＲＩＰＯである、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２１】
ウイルス鋳型核酸分子を含むプラスミドを生成する方法であって、
該ウイルス鋳型核酸分子を含むプラスミドＤＮＡを１つまたは複数の宿主細胞に導入し、それにより、該プラスミドＤＮＡで形質転換された該１つまたは複数の宿主細胞を生成するステップと、
該１つまたは複数の形質転換された細胞の固相培養物を成長させ、それにより、１つまたは複数のコロニーを生成するステップと、
該１つまたは複数のコロニーの少なくとも１つにおける該ウイルス鋳型核酸分子に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在を検出するステップと、
該ウイルス鋳型核酸分子に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在が検出された少なくとも１つのコロニーからの細胞の培養物を繁殖させるステップと、
該繁殖した細胞から該ウイルス鋳型核酸分子を含む該プラスミドＤＮＡを抽出するステップであって、該繁殖させるステップと該抽出するステップとの間に、該形質転換された細胞を凍結させない、ステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記ウイルス鋳型核酸分子が、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ、Ｓａｂｉｎポリオウイルス、またはネイティブなポリオウイルスをコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１から２２までに記載の方法のいずれかを使用して生成された組成物。
【請求項２４】
ウイルス鋳型プラスミドを含む組成物であって、２５％未満の、トランスポゾン挿入事象を伴うプラスミド、２５％未満の、二量体化したプラスミド、２５％未満の、ウイルス鋳型配列を伴わない空のプラスミド、またはこれらの組合せを含む組成物。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年６月１０日に出願された米国仮出願第６２／１７３，７７７号の優先権を主張し、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書には、抗がん剤またはワクチンとして使用することができる、ＲＮＡに基づく組換えウイルス（例えば、組換えポリオウイルス）等のウイルスに基づく核酸組成物を高純度で含む核酸含有組成物を製造するためのプロセスが開示されている。そのような方法を使用して生成された組成物も提供される。
【背景技術】
【０００３】
核酸に基づく生物製剤は、種々の疾患および状態に対する防御またはそれらの処置に有用である。例えば、ＤＮＡに基づくワクチンを感染症の処置または防止において使用される防御用ワクチンまたは治療用ワクチンとして使用することができ、組換えレトロウイルスベクターを遺伝子治療（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）に使用することができ、また、腫瘍細胞を選択的に破壊する腫瘍溶解性ウイルスを作製することができきる。いくつかの型のウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスが、潜在的な腫瘍溶解剤であると同定されている。
【０００４】
ヒトにおいて灰白髄炎を引き起こすポリオウイルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科の低分子ＲＮＡウイルスである。Gromeierら（Virology、２０００年、２７３巻（２号）：２４８〜５７頁）において考察されている通り、ポリオウイルスは、中枢神経系に、おそらく血液脳関門を渡り、ＣＤ１５５受容体に結合することによって感染するので、改変された弱毒化形態のポリオウイルスは、ヒト脳に核酸配列を送達するためのビヒクルとして潜在的に有用である。改変された弱毒化形態のポリオウイルスの潜在的な適用の１つは、神経膠腫および髄芽腫等の脳悪性腫瘍を処置するための治療用腫瘍溶解性組成物の作製である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gromeierら、Virology、２０００年、２７３巻（２号）：２４８〜５７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸に基づく生物製剤の分野では、腫瘍溶解性ウイルス等の臨床用製品の臨床的適用および製造のために、高度に精製された核酸材料が大量に必要になる。したがって、高純度の核酸材料が十分な量で生成される、複雑さが低減し、費用が低減した効率的な作製および精製プロセスが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書には、（ｉ）ウイルス鋳型プラスミドを生成するための改善されたプロセス、および（ｉｉ）カラムクロマトグラフィー分離の間またはその後に迅速な検出ステップを含む、生ウイルスを精製するための改善されたプロセスを別々にまたは組み合わせて使用する、精製された生ウイルス（例えば、組換えポリオウイルス）を作製するためのプロセスまたは方法が開示されている。ウイルス鋳型プラスミドを生成するための改善されたプロセス（例えば、ＲＮＡウイルスに対するＤＮＡ鋳型を含むもの）は、ウイルスゲノム（例えば、組換えポリオウイルスのもの）を含有するプラスミドの、一般に当該プラスミドを増やす宿主（例えば、細菌）細胞における遺伝的不安定性に関する問題に対処するものである。例えば、そのような鋳型の遺伝的不安定性に関する問題が存在する場合に、このプロセスを細菌細胞におけるウイルスＤＮＡ鋳型の作製に適用することができる。得られる産物の収率および／または純度を増加させ、かつ、精製時間を低減することが本明細書において示されている改善されたウイルス精製プロセスを、ウイルスに基づく組成物等の任意の核酸分子含有組成物の精製に一般に適用することが可能であり、また、臨床的適用に必要なもの等のネイティブなまたは組換え生ウイルスを精製するために使用することができる。
【０００８】
一実施例では、ウイルス鋳型プラスミドを作製するための改善されたプロセスは、「ウイルス鋳型プラスミド」またはより詳細には「組換えポリオウイルスプラスミドＤＮＡ鋳型」と称することができるウイルス鋳型配列（例えば、組換えポリオウイルス等のＲＮＡウイルスに対応するＤＮＡ配列）を含有するプラスミドＤＮＡ（例えば、細菌プラスミド）を生成する方法である。改善されたプロセスは、宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）をウイルス鋳型プラスミド（例えば、弱毒化組換えポリオウイルスプラスミドＤＮＡ）で形質転換するステップと、形質転換された細胞を固形培地上で成長させるステップと、適当なプラスミド配列（例えば、組換えポリオウイルスプラスミドＤＮＡ配列）を含有するコロニーを選択するステップとを含む。適当なプラスミド配列を含有する宿主細胞（例えば、プラスミドが空でなく、組換えは起こらなかった）を液体培養物中で繁殖させ、繁殖した宿主細胞からウイルス鋳型プラスミド（例えば、組換えポリオウイルスプラスミドＤＮＡ）を抽出する。細胞繁殖ステップおよび抽出ステップは、繁殖ステップにおいて作製された材料を凍結せずに実施し、これにより、プラスミドの遺伝的不安定性およびその結果生じるウイルス鋳型配列のエラーのリスクが低減する。一部の実施例では、抽出されたウイルス鋳型プラスミドを線状化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写して、感染性の裸のウイルスＲＮＡを生成し、次にそれを使用して哺乳動物細胞に感染させる。感染哺乳動物細胞を、培養物中、「増大（expansion）」と称することができる多段階プロセスで増幅させ、成長させて生ウイルスを作製し、次にそれを精製する（例えば、開示されている改善された方法を使用して）ことができる。
【０００９】
１つまたは複数のウイルス鋳型配列を含むプラスミドを含有する単離されたプラスミドＤＮＡ組成物を生成するための方法は、ウイルス鋳型配列（複数可）を含むプラスミドＤＮＡを、１つまたは複数の宿主細胞（例えば、細菌細胞）に、例えば形質転換によって導入し、それにより、１つまたは複数の、単離されたプラスミドＤＮＡで形質転換された細胞を生成するステップを含む。一部の実施例では、宿主細胞に導入されるプラスミドＤＮＡは、ストックに由来するもの（例えば、細胞バンクに由来するもの）である。他の実施例では、宿主細胞に導入されるプラスミドＤＮＡは、精製または単離されたものである。形質転換された細胞を、固相培養物上、例えば、選択的条件下で成長させ、それにより、１つまたは複数のコロニー（例えば、細菌コロニー）を生成する。１つまたは複数のコロニーを、１つまたは複数のウイルス鋳型配列に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在について試験する（例えば、プラスミド内に所望のウイルス配列が存在することを確実にするため）。１つまたは複数の核酸配列の存在が検出されたコロニー（複数可）由来の宿主細胞の液体培養物を、例えば発酵条件下で、繁殖させる。繁殖した形質転換された細胞に由来する１つまたは複数のウイルス鋳型配列を含むプラスミドＤＮＡを、形質転換された細胞から抽出するかまたは取り出し、それにより、単離されたプラスミドＤＮＡ組成物を作製する。そのような方法では、繁殖させるステップと抽出するステップとの間に、形質転換された細胞を凍結条件（例えば、−２０℃またはそれ未満の温度）に曝露させない。
【００１０】
本開示は、生ウイルス、例えば、組換え生ポリオウイルス等の核酸含有組成物を精製するための改善されたプロセスも提供する。そのような方法を使用して、精製された、ウイルス等の核酸分子含有組成物を得ることができる。この改善されたプロセスを、完全にまたは一部において、これだけに限定されないが、弱毒化ウイルスに基づく核酸組成物および非生ウイルスに基づく核酸組成物の作製および精製ならびにプラスミドＤＮＡ精製を含めた、種々の核酸含有組成物の作製および精製に適用することができる。プロセスは、２つのカラムクロマトグラフィー分離ステップ（サイズ分離、その後、陰イオン交換）、および、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）等の迅速な検出プロセスによる、カラムクロマトグラフィー画分中の標的核酸（例えば、組換え生ポリオウイルス）の検出を含む。クロマトグラフィー画分中の標的核酸の特異的配列の迅速な検出により、全体的な精製の一貫性および頑強性が強化され、また、使用されるクロマトグラフィーステップの数が減少し、したがって、その複雑さおよび費用が低減する。迅速な検出により、全体的な精製時間も低減され、また、標的核酸（例えば、組換え生ポリオウイルス）の収率および／または純度も改善される。したがって、例示的な精製プロセスは、迅速であり、効率的であり、かつ、予想外に改善された標的核酸分子（例えば、組換え生ポリオウイルス）の収率および／または純度をもたらすものである。
【００１１】
特定の実施例では、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルス（例えば、天然に存在しないポリオウイルス）に感染したウイルス宿主細胞を生成するためのプロセスが提供される。そのような方法は、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスの鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡ（例えば、細菌プラスミドのもの）を１つまたは複数の宿主細胞（例えば、細菌細胞）に導入し、それにより、プラスミドＤＮＡで形質転換された宿主細胞を生成するステップを含み得る。一部の実施例では、宿主細胞に導入されるプラスミドＤＮＡは、ストック（例えば、細胞バンクに由来する）に由来する。他の実施例では、宿主細胞に導入される単離されたプラスミドＤＮＡは、精製または単離される。形質転換された細胞を、固相培養物中、例えば選択的条件下で成長させ、それにより、１つまたは複数のコロニー（例えば、細菌コロニー）を生成する。１つまたは複数のコロニーを、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスに由来する１つまたは複数の核酸配列の存在について試験する（例えば、プラスミド内に所望のウイルス配列が存在することを確実にするため）。天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスに由来する１つまたは複数の核酸配列の存在が検出されたコロニー（複数可）に由来する宿主細胞の液体培養物を、例えば発酵条件下で、繁殖させる。繁殖した形質転換された細胞に由来する天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスの鋳型配列を含むプラスミドＤＮＡを形質転換された細胞から抽出する。任意選択で、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスの裸のＲＮＡを鋳型配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成する。得られた、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスの裸のＲＮＡをウイルス宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）に導入し、それにより、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスに感染したウイルス宿主細胞を生成する。そのような方法は、繁殖させるステップと抽出するステップとの間に、形質転換された細胞を凍結条件（例えば、−２０℃またはそれ未満の温度）に曝露することを含まない。
【００１２】
ウイルス含有組成物等の、精製された核酸組成物を作製するプロセスは、核酸組成物を含有する溶液をクロマトグラフィーカラム（例えば、サイズ分離カラム）で分離するステップ、次いで、クロマトグラフィーカラムから溶出した１つまたは複数の画分中の核酸内に存在する少なくとも１つの核酸配列を検出する（例えば、ｑＰＣＲを使用して）ステップ、次いで、少なくとも１つの核酸配列が閾値を超える量で存在することが検出される１つまたは複数の画分をプールするステップを含み得る。
【００１３】
一実施形態では、ポリオウイルスを感染させた哺乳動物宿主細胞を１ラウンドまたは複数ラウンドの細胞培養で培養してポリオウイルスを含有する液体細胞培養培地を作製するステップと、哺乳動物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞のデブリ、またはその両方に由来する液体細胞培養培地を分離し、それにより、ポリオウイルスを含有する上清を生成するステップと、ポリオウイルスを含有する上清をクロマトグラフィーカラムで分離するステップと、クロマトグラフィーカラムから溶出した１つまたは複数の画分中に存在するポリオウイルスを、ポリオウイルスにおいて見いだされる核酸配列を検出することによって検出するステップと、核酸配列が閾値を超える量で検出される画分をプールするステップとによって、天然に存在しない生ポリオウイルスを精製するためのプロセスが提供される。
【００１４】
別の実施形態では、天然に存在しないＲＮＡに基づくウイルスの鋳型配列を含有する細菌プラスミドの単離されたプラスミドＤＮＡのストックをもたらすステップと、単離されたプラスミドＤＮＡのストックを１つまたは複数の細菌細胞に導入し、それにより、単離されたプラスミドＤＮＡのストックで形質転換された細菌細胞を生成するステップと、単離されたプラスミドＤＮＡのストックで形質転換された１つまたは複数の細菌細胞の固相培養物を成長させ、それにより、１つまたは複数の細菌コロニーを生成するステップと、細菌コロニーの少なくとも１つにおけるＲＮＡに基づくウイルスの鋳型配列に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在を検出するステップと、１つまたは複数の核酸配列の存在が検出された細菌コロニーに由来する細菌細胞の培養物を繁殖させるステップであって、繁殖させるステップと抽出するステップとの間に細菌細胞を凍結させない、ステップと、繁殖した細菌細胞に由来するＲＮＡに基づくウイルスの鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡを抽出するステップと、ＲＮＡに基づくウイルスの裸のＲＮＡを鋳型配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成するステップと、ＲＮＡに基づくウイルスの裸のＲＮＡをウイルス宿主細胞に導入し、それにより、ＲＮＡに基づくウイルスに感染したウイルス宿主細胞を生成するステップと、ＲＮＡに基づくウイルスに感染したウイルス宿主細胞を１ラウンドまたは複数ラウンドの細胞培養で培養してＲＮＡに基づくウイルスを含有する液体細胞培養培地を作製するステップと、哺乳動物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞のデブリ、またはその両方に由来する液体細胞培養培地を分離し、それにより、ＲＮＡに基づくウイルスを含有する上清を生成するステップと、天然に存在しないＲＮＡに基づく生ウイルスを含有する上清をクロマトグラフィーカラム（例えば、サイズ分離カラム）で分離するステップと、クロマトグラフィーカラムから溶出した１つまたは複数の画分中に存在するＲＮＡに基づく生ウイルスを、ＲＮＡに基づくウイルスにおいて見いだされる１つまたは複数の核酸配列を検出する（例えば、ｑＰＣＲを使用して）ことによって検出するステップと、核酸配列が閾値を超える量で存在する画分をプールするステップとによって、精製された、天然に存在しないＲＮＡに基づく生ウイルスを得るためのプロセスが提供される。方法は、プールした画分を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用するステップと、陽性フロースルー溶出液を濃縮するステップとをさらに含み得る。
【００１５】
一実施例では、天然に存在しない生ポリオウイルスを含む組成物を得るための精製プロセスは、天然に存在しない生ポリオウイルスを含有する水性流体をサイズ分離クロマトグラフィーカラムで分離するステップと、天然に存在しない生ポリオウイルスにおいて見いだされる１つまたは複数の核酸配列を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって検出するステップと、天然に存在しない生ポリオウイルスにおいて見いだされる１つまたは複数の核酸配列を含有する、前記サイズ分離カラムからの溶出液の少なくとも１つの陽性画分を収集し、プールするステップと、プールされた陽性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムで分離するステップとを含む。天然に存在しない生ポリオウイルスは、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも１つの陽性画分中に収集される。一部の実施例では、この精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィー分離ステップの後にいかなる別のクロマトグラフィー分離ステップも含有しない。したがって、一部の実施例では、方法は、クロマトグラフィー分離ステップを２つのみ有する。精製プロセスは、フロースルー溶出液中に溶出した天然に存在しない生ポリオウイルスを透析濾過（diafilatration）によって濃縮するステップをさらに含み得る。一部の実施例では、精製プロセスは、８時間未満、例えば４〜８時間で行うことができる。一部の実施形態では、精製プロセスの収率は、５０％以上、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８３％、例えば、５０〜６０％、５０〜８０％、６０〜８０％、７０〜８５％、または５０〜８５％である。陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも１つの陽性画分に由来する天然に存在しない生ポリオウイルスの収率は、５０％以上であり得る。
【００１６】
生ウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス）を含有する水性流体は、ウイルスに感染したウイルス宿主細胞を１ラウンドまたは複数ラウンドの細胞培養で培養するステップを含むプロセスによって得られる液体細胞培養培地であってよい。液体細胞培養培地は、培養後に、ウイルス宿主細胞、ウイルス宿主細胞のデブリ、またはその両方から液体細胞培養培地を分離することによって得ることができる。細胞培養培地は、溶液中の遊離核酸は消化することができるが封入されたウイルス核酸を消化することはできないヌクレアーゼ酵素と一緒に液体細胞培養培地をインキュベートするステップによって得ることができる。ウイルスに感染したウイルス宿主細胞は、ウイルスの鋳型配列を含む細菌プラスミドの単離されたプラスミドＤＮＡのストックをもたらすステップと、単離されたプラスミドＤＮＡのストックを１つまたは複数の細菌細胞に導入し、それにより、単離されたプラスミドＤＮＡのストックで形質転換された１つまたは複数の細菌細胞を生成するステップと、１つまたは複数の形質転換された細菌細胞の固相培養物を成長させ、それにより、１つまたは複数の細菌コロニーを生成するステップと、１つまたは複数の細菌コロニーの少なくとも１つにおけるウイルスの鋳型配列に由来する１つまたは複数の核酸配列の存在を検出するステップと、１つまたは複数の核酸配列の存在が検出された少なくとも１つの細菌コロニーに由来する細菌細胞の培養物を繁殖させるステップと、繁殖した細菌細胞からウイルスの鋳型配列を含むプラスミドＤＮＡを抽出するステップであって、繁殖させるステップと抽出するステップとの間に細菌細胞を凍結させない、ステップと、ウイルスの裸のＲＮＡ（例えば、天然に存在しないポリオウイルスのもの）を鋳型配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成するステップと、ウイルスの裸のＲＮＡをウイルス宿主細胞に導入し、それにより、ウイルスに感染したウイルス宿主細胞を生成するステップとを含むプロセスによって得ることができる。細菌プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ複製開始点を有するプラスミドであってよく、１つまたは複数の細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。ウイルス宿主細胞は、Ｖｅｒｏ細胞等の哺乳動物宿主細胞であってよい。
【００１７】
開示されている方法を使用して精製したウイルスは、ＲＮＡウイルスであっても一本鎖ＤＮＡウイルス等のＤＮＡウイルスであってもよい。一実施例では、ウイルスは、ネイティブなポリオウイルスであってもＳａｂｉｎウイルスまたは腫瘍溶解性ポリオウイルス、例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ等の天然に存在しないポリオウイルスである。
【００１８】
開示されている方法を使用して生成された精製されたウイルス（または他の分析物）を含有する組成物およびキットも提供される。
【００１９】
本開示の前述および他の目的および特徴は、付属図を参照して進められる以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、組換え腫瘍溶解ポリオウイルスＰＶＳ−ＲＩＰＯの鋳型プラスミドＤＮＡによって形質転換した凍結Ｅ．ｃｏｌｉストックから成長させたＥ．ｃｏｌｉの液体培養物から単離したｐＵＣ１９ベースのＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクター構築物の電気泳動による分離（エチジウムブロミド染色アガロースゲル）結果のデジタル画像を示す。略図は、培養物から単離した正確なベクター配列と不正確なベクター配列を説明する（１−ＰＶＳ−ＲＩＰＯ配列にトランスポゾン挿入を有するベクター；２−正確なベクター配列（（「ＰＶＳＲＩＰＯ＿ｋａｎ」）；３−ウイルス鋳型配列を有しないｐＵＣ１９二量体；４−ウイルス鋳型配列を有しない「空の」ｐＵＣ１９ベクター）。
【００２１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａのゲルの拡大版を示すデジタル画像であり、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ受託バンク対照ロットＬ０３０５００６（左側のレーン２〜４）における正確なベクター配列と比較した、組込まれたトランスポゾンＩＳ１０Ｒを含有するＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミド生産ロットＬ０３１１００５（右側のレーン６〜８）のアガロースゲル分析である。レーン７（試験）からレーン３（対照）ではトランスポゾン組込みにより中央のバンドサイズがシフトすることに注目すべきであり、同様に、レーン４と比較してレーン８において線状化プラスミドの分子量が増加したことも注目すべきである。レーン１、５、および９は、１ＫｂプラスＤＮＡ分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）であり、上のマーカーバンドのサイズはおよそ１２Ｋｂｐである。レーン２および６は、切断されていない超らせん型および開環型ＰＶＳ−ＲＩＰＯであり、レーン３および７は、Ｍｕｎ  Ｉ切断プラスミドであり、レーン４および８は、Ｓａｌ  Ｉ切断線状化プラスミドである。
【００２２】
【図２】図２は、ウイルス鋳型プラスミド（例えばＰＶＳ−ＲＩＰＯ）を生産するための開示の改善されたプロセス（左）と、これまで使用されている手順（右）とを比較する図を示す。
【００２３】
【図３】図３は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの鋳型プラスミドＤＮＡを生産するための改善されたプロセスの略図を示す。
【００２４】
【図４】図４は、開示の改善されたプロセスによって生産されたＰＶＳ−ＲＩＰＯの鋳型プラスミドＤＮＡの２つのロット（ロット１およびロット２）の寒天電気泳動による分離を示すデジタル画像である。参照物質は、ＡＣＢロットＬ０３０５００６のプラスミドＤＮＡである。２つの試験試料は、プラスミド不安定性を示さなかったＰＶＳＲＩＰＯ開発ロットＬ０４０１０１４の２つの異なるフラスコである。
【００２５】
【図５】図５は、ウイルスを含有する宿主細胞培養培地からのウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ）の改善された精製プロセスの略図である。
【００２６】
【図６】図６は、Ｖｅｒｏ細胞培養培地からのＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスの改善された精製プロセスに使用されるサイズ分離クロマトグラフィーを示す。グラフは、２５４ｎｍでの吸光度を測定することによるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦクロマトグラフィー画分における核酸の連続的な光学的検出（上の線）と、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＰＶＳ−ＲＩＰＯ配列の検出（下の線）の比較を説明する。表は、クロマトグラフィー画分において検出されたＰＶＳ−ＲＩＰＯの量を示す。
【００２７】
【図７】図７は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の生産の概要を提供するフローチャートである。
【００２８】
【図８】図８は、ＰＶＳＲＩＰＯ（ＰＶＳＲＩＰＯ−ｋａｎ／ｐＵＣ１９）プラスミドＤＮＡの地図である。
【００２９】
【図９】図９は、ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４の生産を示すプロセスフローチャートである。
【００３０】
【図１０】図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αマスターセルバンクロットＬ０３０１０１４の分析証明書である。
【００３１】
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αワーキングセルバンクロットＬ０３０３０１１の分析証明書である。
【００３２】
【図１２】図１２は、ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４の分析証明書である。
【００３３】
【図１３】図１３は、ＰＶＳＲＩＰＯ初回ウイルスシードロットＬ０４０２０２６（Ｐ０）製造の要約を示すフローチャートである。
【００３４】
【図１４】図１４は、Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロット２００３−００４９の分析証明書である。
【００３５】
【図１５】図１５は、Ｖｅｒｏワーキングセルバンク、ロット２１７００２−２の分析証明書である。
【００３６】
【図１６】図１６は、ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６（Ｐ１）のウイルス製造プロセスのフローチャートである。
【００３７】
【図１７】図１７は、ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６の分析証明書である。
【００３８】
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｂは、細胞増大ロットＬ０９０３０１０、感染細胞溶解物ロットＬ０９０４００８、およびＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９（Ｐ２）の精製のプロセスフローチャートである。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｂは、細胞増大ロットＬ０９０３０１０、感染細胞溶解物ロットＬ０９０４００８、およびＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９（Ｐ２）の精製のプロセスフローチャートである。
【００３９】
【図１９】図１９は、ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８の分析証明書である。
【００４０】
【図２０】図２０は、ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９の分析証明書である。
【００４１】
【図２１】図２１は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の分析証明書である。
【００４２】
【図２２】図２２は、ＰＶＳＲＩＰＯ毒性学ロットＬ０６０３００６の分析証明書である。
【００４３】
【図２３】図２３は、製造されたＰＶＳＲＩＰＯのロットの履歴である。
【００４４】
【図２４】図２４は、最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１の生産プロセスの要約を示すフローチャートである。
【００４５】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｂは、細胞増大物ロットＬ１３１０００３、感染細胞溶解物ロットＬ１３１１００３、およびＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１の精製を示すプロセスフローチャートである。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｂは、細胞増大物ロットＬ１３１０００３、感染細胞溶解物ロットＬ１３１１００３、およびＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１の精製を示すプロセスフローチャートである。
【００４６】
【図２６】図２６は、ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ１３１１００３の分析証明書である。
【００４７】
【図２７】図２７は、ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１の分析証明書である。
【００４８】
【図２８】図２８は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１の分析証明書である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
配列表
核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。２０１６年６月１０日に作成され、これにより提出される配列表（３．０８ｋｂ）は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
配列番号１〜１３は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用される核酸プライマー配列およびプローブ配列である。
【００５１】
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin  Lewin、Genes  VII、Oxford  University  Pressにより出版、１９９９年；Kendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、Blackwell  Science  Ltd.により出版、１９９４年；およびRobert  A.  Meyers（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology：a  Comprehensive  Desk  Reference、VCH  Publishers,  Inc.により出版、１９９５年；ならびに他の同様の参考文献において見いだすことができる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「この（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、単数ならびに複数の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「核酸分子を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、他の要素を排除することなく、「核酸分子を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」を意味する。核酸に関して示されている任意のかつ全ての塩基サイズは、別段の指定のない限り、おおよそのものであり、説明のために提供されるものであることもさらに理解されたい。本明細書に記載のものと同様または同等である多くの方法および材料を使用することができるが、特定の適切な方法および材料が下に記載されている。矛盾する場合は、用語の説明を含めた本明細書により支配される。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。特許出願および特許を含めた全ての参考文献、および列挙されているＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号（２０１６年６月１０日時点）を伴う配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
本開示の種々の実施形態の精査を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する：
【００５４】
アジュバント：免疫原性因子（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルス）と組み合わせて使用した場合に、結果として生じる免疫応答を強化するまたは他のように変化させるまたは改変する化合物、組成物、または物質。一部の実施例では、アジュバントにより、被験体において免疫原性因子によって誘導される抗体の力価が増加する。別の実施例では、抗原性因子が多価抗原性因子である場合、アジュバントにより、被験体において誘導される抗体が特異的に結合する特定のエピトープの配列が変更される。
【００５５】
例示的なアジュバントとしては、これだけに限定されないが、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、Ｂ３０−ＭＤＰ、ＬＡ−１５−ＰＨ、モンタニド、サポニン、水酸化アルミニウム（Ａｍｐｈｏｇｅｌ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）等のアルミニウム塩、ａｌｕｍ、脂質、キーホールリンペットタンパク質、ヘモシアニン、ＭＦ５９マイクロエマルション、マイコバクテリア抗原、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ポリアニオン、両親媒性物質、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えば、欧州特許ＥＰ１０９９４２に開示されているもの）、植物油、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、酸化アルミニウム、油乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ  ＦまたはＭａｒｃｏｌ  ５２）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００５６】
一実施例では、アジュバントは、免疫活性化、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞による自然免疫応答または適応免疫応答を刺激するＤＮＡモチーフを含む。特異的な、免疫活性化を刺激するＤＮＡモチーフの非限定的な例として、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；同第６，３３９，０６８号；同第６，４０６，７０５号；および同第６，４２９，１９９号に記載されているＣＧオリゴデオキシヌクレオチド、ならびにＩＬ−２または他の免疫調節物質が挙げられる。
【００５７】
投与：被験体に、例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルス等の因子を任意の有効な経路によって提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、これだけに限定されないが、注射経路（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、および静脈内）、経口経路、経皮経路、鼻腔内経路、および吸入経路が挙げられる。
【００５８】
弱毒化病原体：疾患を生じさせる能力は低下しているまたは弱まっているが、免疫応答を刺激する能力は天然の病原体と同様である病原体。別の実施例では、病原体は、ある特定の成長条件下で非病原性バリアントを選択することにより弱毒化される（例えば、SabinおよびBoulger.  J.  Biol.  Stand.、１巻：１１５〜８頁；１９７３年；Sutterら、２００３年、Poliovirus  vaccine  --  live、６５１〜７０５頁、S.  A.  PlotkinおよびW.  A.  Orenstein（編）、Vaccines、第４版、W.B.  Saunders  Company、Philadelphiaを参照されたい）。例示的な弱毒化病原体は、Ｓａｂｉｎポリオウイルスである。
【００５９】
接触：固体または液体の形態を含めた、直接の物理的結合状態（physical  association）に置くこと。接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、試薬を試料（例えば、ウイルス鋳型プラスミドを発現する細菌細胞を含有するもの）に添加することによって、または、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、被験体への投与（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルスの投与）によって起こり得る。
【００６０】
有効量：有益なまたは所望の結果、例えば、抗がん応答等の防御免疫応答をもたらすために十分な因子（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルス）の量。
【００６１】
治療有効量は、処置される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式等の１つまたは複数に応じて変動し得、当業者が容易に決定することができる。有益な治療効果としては、診断的決定を使用可能にすること；疾患、症状、障害、または病態の好転；疾患、症状、障害または状態の発症の低減または防止；および疾患、症状、障害または病態を大体打ち消すことを挙げることができる。一実施形態では、「有効量」（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルスの）は、腫瘍（例えば、神経膠芽腫）の体積／サイズ、腫瘍の重量、転移の数を低減する、転移の体積／サイズ、転移の重量、またはこれらの組合せを、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減する（治療剤を投与しない場合と比較して）ために十分な量である。一実施形態では、「有効量」（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルスの）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫応答を増加させる、例えば、免疫原に特異的な抗体の産生を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増加させる（治療剤を投与しない場合と比較して）ために十分な量である。
【００６２】
宿主細胞：ベクターを増やし、その核酸を発現させることができる細胞。細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。この用語は、対象宿主細胞の任意の後代も包含する。したがって、宿主細胞は、ウイルス鋳型プラスミド核酸分子等の、細胞に導入されている核酸分子を含むという点で、トランスジェニックであり得る。一実施例では、宿主細胞は、ウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ）が増殖する細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。宿主細胞におけるウイルスの増殖を、ウイルス材料の作製のため（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯを作製するためにＶｅｒｏ細胞が使用される）、または、一部の場合では、タンパク質の発現のために使用することができる。例えば、組換えバキュロウイルスを、昆虫細胞における組換えタンパク質の発現のために使用することができる（「バキュロウイルス発現系」）。ウイルス増殖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えば細胞培養中で、または、ウイルス宿主細胞が生物体の一部である場合にはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて起こり得る。
【００６３】
免疫応答：被験体における、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、または多形核細胞等の免疫系の細胞の、免疫原性因子（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルス）に対する応答。免疫応答は、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞等の、宿主防衛応答に関与する身体の任意の細胞を含み得る。免疫応答としては、これだけに限定されないが、自然免疫応答または炎症が挙げられる。
【００６４】
応答は、特定の抗原に特異的（「抗原特異的応答」）であり得る。特定の実施例では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答等の、Ｔ細胞応答である。別の実施例では、応答は、Ｂ細胞応答であり、免疫原性因子に対する特異的抗体の産生をもたらす。
【００６５】
一部の実施例では、そのような免疫応答は、被験体を免疫原性因子または免疫原性因子の供給源からの保護を提供する。例えば、応答は、ヒトまたは動物被験体等の被験体を病原体による感染から保護する、または病原体による感染の進行に干渉することができる。免疫応答は、能動的で被験体の免疫系の刺激を伴い得、または受動的に獲得された免疫によって生じる応答であり得る。
【００６６】
増加または低減：それぞれ、対照値（例えば、治療剤なしを表す値）からの、量の統計的に有意な正または負の変化。増加は、対照値と比較して少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％の増加等の、正の変化である。低減は、対照値と比較して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の低減等の、負の変化である。一部の実施例では、低減は、１００％未満、例えば、９０％以下、９５％以下、または９９％以下の低減である。
【００６７】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルス）は、構成成分が存在する細胞または培地中の他の生物学的構成成分、例えば、他の核酸分子およびタンパク質（例えば、宿主細胞染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離された、それらとは別に作製された、またはそれらから離して精製されている。開示されている方法を使用して精製した単離されたウイルス、または開示されている方法を使用して増大させたウイルス鋳型プラスミドは、一部の実施例では、例えば、残留宿主細胞（ＨＣ）ＤＮＡによって測定して、少なくとも５０％純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９９９９％、または少なくとも１００％純粋である。一部の実施例では、開示されている方法を使用して精製した単離されたウイルス、または開示されている方法を使用して増大させたウイルス鋳型プラスミドは、例えば、総ＰＦＵの増加が望まれる場合に、残留ＨＣタンパク質（ＨＣＰ）によって測定して、より低い純度を有し、例えば、少なくとも３％純粋である、少なくとも４％純粋である、または少なくとも５％純粋である（例えば、３〜４％純粋）である。約３％のタンパク質純度であっても、ＨＣＰのレベルは治療用製品に対して許容される限度内に入る。一部の実施例では、開示されている方法を使用して精製した単離されたウイルス、または開示されている方法を使用して増大させたウイルス鋳型プラスミドは、残留ＨＣＰによって測定して、少なくとも５０％純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９９９９％純粋である。
【００６８】
薬学的に許容されるキャリア：本発明において有用な薬学的に許容されるキャリアは、従来のものである。Remington's  Pharmaceutical  Sciences、E.  W.  Martin、Mack  Publishing  Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）には、開示されている方法を使用して精製したウイルスの薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００６９】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与形式に左右される。例えば、非経口用製剤は、通常、例えば、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等の、薬学的にかつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与される医薬組成物は、微量の無毒性の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有してよい。
【００７０】
ポリオウイルス（ＰＶ）：灰白髄炎（ポリオ）の原因物質である、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のエンテロウイルス。ポリオウイルスには３種の血清型がある。例示的なポリオ配列は、Toyodaら、J.  Mol.  Biol．、１７４巻：５６１〜８５頁、１９８４年に提示されている。
【００７１】
ポリオウイルスの非天然形態としては、組換え腫瘍溶解性ポリオウイルスＰＶＳ−ＲＩＰＯおよび弱毒化Ｓａｂｉｎ経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）が挙げられ、また、開示されている方法を使用して生成することができる。ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、潜在的な抗新生物活性を有する、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）がヒトライノウイルス２型（ＨＲＶ２）に由来するＩＲＥＳで置き換えられた経口用ポリオウイルスＳａｂｉｎ  １型を含有する、組換え弱毒化生非病原性腫瘍溶解性ウイルスである（例えば、Brownら、Cancer、１２０巻：３２７７〜８６頁、２０１４年およびGoetzら、Cytokine  Growth  Factor  Rev.、２０１０年、２１巻（２〜３号）：１９７〜２０頁を参照されたい）。ＯＰＶは、弱毒化Ｓａｂｉｎ  １株をその病毒力の強い親（Ｍａｈｏｎｅｙ血清型）と区別する５７カ所のヌクレオチド置換を含み、２カ所のヌクレオチド置換はＳａｂｉｎ  ２株を弱毒化し、１０カ所の置換がＳａｂｉｎ  ３株の弱毒化に関与する。
【００７２】
３種のＳａｂｉｎワクチン全てに共通する主要な弱毒化因子は、当該ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に位置する変異であり、これは、ステムループ構造を変化させ、ポリオウイルスのそのＲＮＡ鋳型を宿主細胞内で翻訳する能力を低減する。例示的なＳａｂｉｎ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｅ０１５７２．１、Ｅ０１５７１．１およびＥ０１５７０．１、ならびにNomotoら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、７９巻（１９号）：５７９３〜５７９７頁、１９８２年に提示される。
【００７３】
ＰＶの別の形態は、Ｄｒ  Ｊｏｎａｓ  Ｓａｌｋにより開発された、化学的に不活化されたポリオワクチン（ＩＰＶ）である。これは、３種のビルレント株、Ｍａｈｏｎｅｙ（１型ポリオウイルス）、ＭＥＦ−１（２型ポリオウイルス）、およびＳａｕｋｅｔｔ（３型ポリオウイルス）に基づくものである。そのようなＰＶ株は、開示されている方法を使用して生成することができる。
【００７４】
精製された：精製されたという用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、開示されている方法を使用して生成された精製されたウイルス調製物とは、ウイルスが宿主細胞または宿主細胞抽出物中にある状態よりも富化された、ウイルス調製物である。一実施例では、調製物を、精製されたウイルスが調製物の総核酸含有量の少なくとも５０％になるように精製する。他の実施例では、ウイルスを、医薬キャリア、賦形剤、バッファ、吸収促進剤、安定剤、防腐剤、アジュバントまたは他の副成分等の他の製剤成分と混和する前の精製された調製物中に存在する全高分子種の少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも９９％になるように精製する。一部の実施例では、精製された調製物は、基本的に均一なものになり、他の高分子種は従来の技法によって検出可能ではない。そのような精製された調製物は、活性薬剤（active  agent）と混和またはコンジュゲートした材料等の、活性薬剤と共有結合により結びついた材料を含んでよく、活性薬剤の改変された誘導体または類似体をもたらすまたはコンビナトリアル治療用製剤またはコンジュゲートを生じることが望ましい場合がある。
【００７５】
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有する、または、そうでなければ分離している２つの配列のセグメントの人工的な組合せによって作出された配列を有するものである。この人工的な組合せは、例えば、化学合成によって、または、単離された核酸のセグメントを、例えばSambrookら（編）、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版、１〜３巻、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、１９８９年に記載されているもの等の遺伝子工学の技法により人工的に操作することによって等、常套的な方法を使用して実現することができる。組換えという用語は、単に核酸分子の一部の付加、置換、または欠失によって変更された核酸分子を包含する。同様に、組換えタンパク質とは、組換え核酸分子によりコードされるものである。組換えウイルスとは、遺伝子が、例えば発現のために、例えば組換え操作技法を使用して、天然ではない環境において構築され、かつ／または配置されたものを含む。
【００７６】
被験体：脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。一実施形態では、被験体は、サルまたは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシ等の非ヒト哺乳動物被験体である。一部の実施例では、被験体は、開示されている方法を使用して生成されたポリオウイルスを使用して処置することができる、神経膠芽腫等の腫瘍を有する。一部の実施例では、被験体は、マウス、ウサギ、またはラット等の実験動物／生物体である。
【００７７】
形質転換またはトランスフェクト：ウイルスまたはベクターにより宿主細胞に核酸が移行されれば、ウイルスまたはベクターにより宿主細胞が「形質転換」または「形質導入」される。細胞ゲノムへの核酸の組入れによって、またはエピソーム複製によってのいずれかで細胞によりＤＮＡが安定に複製されるようになるときに、細胞に形質導入された核酸により細胞が「形質転換」または「トランスフェクト」される。
【００７８】
化学的方法（例えば、カルシウム−リン酸トランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド−ＤＮＡ複合体）、および、組換えウイルス等のウイルスによる生物学的感染によるもの等の、多数のトランスフェクション方法が当業者に公知である（Wolff,  J.  A.編、Gene  Therapeutics、Birkhauser、Boston、USA、１９９４年）。レトロウイルスによる感染の場合では、感染性レトロウイルス粒子が標的細胞により吸収され、その結果、レトロウイルスのＲＮＡゲノムが逆転写され、得られたプロウイルスが細胞内ＤＮＡに組み込まれる。
【００７９】
導入遺伝子：ベクターから供給される外因性遺伝子。一実施例では、導入遺伝子は、ポリオ（天然のポリオウイルスまたは天然に存在しないポリオウイルス）等のＲＮＡウイルスのウイルスＤＮＡ鋳型配列等のウイルス鋳型配列を含む。
【００８０】
処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）：減退、寛解、症状を低減することまたは状態を患者にとってより耐容性のあるものにすること、変性もしくは衰弱の速度を遅くすること、変性の最終点をより消耗性の低いものにすること、被験体の身体的もしくは精神的健康状態を改善すること、または生存の長さを延長すること等の任意の客観的または主観的パラメータを含めた、傷害、病的状態または状態の減弱または好転における任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査、血液検査および他の臨床検査等の結果を含めた客観的または主観的パラメータによって評価することができる。一部の実施例では、開示されている方法を用いた処置により、腫瘍（例えば、脳腫瘍）および／または転移の数、体積、および／または重量の低減がもたらされる。
【００８１】
十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を記載するために使用される句。一実施例では、所望の活性とは、ウイルス鋳型プラスミドによる宿主細胞の形質転換、またはそのような形質転換された宿主細胞の成長である。一実施例では、所望の活性とは、例えばｑＰＣＲを使用した、標的ウイルス核酸分子の検出である。一実施例では、所望の活性とは、例えば、開示されている方法を使用して精製したウイルスを使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の処置および／または免疫応答の刺激である。
【００８２】
ワクチン：動物またはヒトに、疾患または他の病態に対する能動免疫等の免疫を付与するために投与することができる免疫原性組成物。ワクチンは、予防的にまたは治療的に使用することができる。したがって、ワクチンは、感染の可能性を低減するため、または疾患もしくは状態の症状の重症度を低減するため、または疾患もしくは状態の進行を限定するために使用することができる。一実施例では、ワクチンは、開示されている方法を使用して精製した１つまたは複数のウイルス（例えば、天然のポリオウイルスまたは天然に存在しないポリオウイルス）を含む。
【００８３】
ベクター：宿主細胞に導入されると、それにより、形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子。ベクターは、複製開始点等の、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の治療用遺伝子または選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターは、細胞に対する形質導入、形質転換または感染をなし、それにより、細胞に、細胞にネイティブな核酸分子またはタンパク質以外の核酸分子またはタンパク質を発現させることができる。ベクターは、任意選択で、細胞への核酸の進入の実現を補助する材料、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等を含む。一実施例では、ベクターは、細菌プラスミド等のプラスミドである。
【００８４】
核酸分子含有組成物
本開示は、核酸分子を含有する組成物を作製および精製するための改善されたプロセスまたは方法を提供し、ここでは、核酸分子含有組成物、製剤、材料等を作製する、単離する、精製するまたは得るための方法またはプロセスと称する。一部の実施例は、ネイティブなウイルスまたは組換えウイルスを作製するための核酸ＤＮＡ鋳型（例えば、ウイルスのプラスミドＤＮＡ鋳型）を作製するための改善されたプロセスを提供する。他の実施例は、一般に、核酸分子含有組成物を精製するための改善されたプロセス、および、精製された核酸分子含有組成物を得るための改善されたプロセスを提供する。「核酸分子含有組成物」という用語および関連する用語は、ポリマーヌクレオチドを含有する種々の組成物および分子を包含する。核酸分子含有組成物の例は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、ウイルス、プラスミド、ベクターおよび核タンパク質を含有する組成物である。核酸分子含有組成物は、天然に存在する核酸を含有してもよく、改変された（遺伝子改変または選択もしくは化学修飾等の他のプロセスによって）、人工的な、人工的に作り出した、合成の、遺伝子改変された、遺伝子操作された（genetically  engineered）、操作された（engineered）、組換えの、組換えによって作製されたまたは他の関連する用語によっても称される、天然に存在しない核酸を含有してもよい。核酸分子含有組成物としては、これだけに限定されないが、ウイルスに基づく核酸組成物、組換えウイルス、ＲＮＡに基づく組換えウイルス（例えば、組換えポリオウイルス）、弱毒化ウイルス、ウイルス配列を含有するプラスミド、およびウイルスＤＮＡ鋳型が挙げられる。
【００８５】
本開示は、天然に存在するウイルスおよび天然に存在しないウイルスを含めたウイルスを作製および精製するための改善されたプロセスを提供する。天然に存在しないウイルスは、天然に存在するウイルスと種々の程度で異なり得る。天然に存在しないウイルスは、例えば、組換え技法によって、人工的に作製された（「操作された」）、天然に存在するウイルスに由来するものであり得、その場合、天然に存在しないウイルスは、「組換え体」と称することができる。天然に存在しないウイルスの１つの例は、病原性が低減するまたは破壊されるように遺伝子操作（genetic  manipulation）または選択もしくは化学修飾等の他のプロセスによって改変された病原性ウイルスである。このプロセス、または、それぞれ、得られる改変されたウイルスは、「弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）」、「弱毒化された（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」と称されるまたは他の関連する用語により称することができる。
【００８６】
天然に存在しないウイルスとしては、これだけに限定されないが、ウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルスおよびワクチンとして使用される弱毒化または組換えウイルスが挙げられる。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に選択的に感染させ、かつ／またはそれを破壊するために使用されるウイルスである。ウイルスベクターは、種々の適用のためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞培養物において）のいずれかで遺伝子材料を細胞に送達するために使用されるウイルスである。例えば、ウイルスベクターは、遺伝子改変、遺伝子治療のため、タンパク質を発現させるため、またはウイルスワクチンとして、使用することができる。ウイルスワクチンは、防御免疫応答または治療的免疫応答を誘発する目的で、遺伝子材料を細胞または生物体に送達するために使用される。例えば、弱毒生ウイルスを、同じウイルス（例えば、ポリオウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス）の天然に存在する病原性型に対する免疫応答を誘発するためのワクチンとして使用することができる。腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクターおよびウイルスワクチンという用語は、時には意味が重複するが、それらの全てが、例えば、組換え操作技法を使用した天然に存在するウイルスの遺伝子改変によって人工的に作り出され得る。腫瘍溶解性ウイルスは、これらに限定されないが、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカウイルスまたはワクシニアウイルスに基づくものであり得る。ウイルスベクターとしては、これだけに限定されないが、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクターおよびモロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスに基づくベクターが挙げられる。ウイルスワクチンとしては、これだけに限定されないが、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン株、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、水痘（鶏痘）ワクチン、天然痘ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、ＨＩＶおよびＨＴＬＶワクチン、出血熱ワクチンまたは任意の生ウイルスワクチン、弱毒化ウイルスワクチンまたは不活化ウイルスワクチンが挙げられる。
【００８７】
一実施例では、開示されている方法によって作製および／または精製された天然に存在しないウイルスは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより例示される腫瘍溶解性弱毒化組換えポリオウイルス等の組換えポリオウイルスである。ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、ポリオウイルスのコグネイト内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をヒトライノウイルス２型（ＨＲＶ  ２）に由来するその対応物と交換して、正常なニューロン細胞では複製しないが、脳腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性活性を示すポリオウイルス株をもたらすことによって作り出された、Ｓａｂｉｎ  Ｉ型ポリオウイルスの弱毒化形態である。組換え腫瘍溶解性ポリオウイルスＰＶＳ−ＲＩＰＯを腫瘍内投与すると、ポリオウイルスは、ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体、ＰＶＲまたはＮＥＣＬ５）を発現する腫瘍細胞に選択的に取り込まれ、そこで複製し、最終的に腫瘍細胞溶解を引き起こす。癌胎児性細胞接着分子および腫瘍抗原であるＣＤ１５５は、多形神経膠芽腫（ＧＭＢ）等の、ある特定のがんにおいて異所的に発現する。この組換えウイルスにおける異種ＨＲＶ２  ＩＲＥＳに起因して、ＰＶＳ−ＲＩＰＯは、感染しやすい非ニューロン細胞（例えば、ＧＢＭ）においてのみ繁殖する。ＰＶＳ−ＲＩＰＯおよびその性質および適用は、例えば、Goetzら、Cytokine  Growth  Factor  Rev.、２０１０年２１巻（２〜３号）：１９７〜２０頁、Yangら、J.  Virol.  Methods.、２００９年、１５５巻（１号）：４４〜５４頁、Celloら、J.  Med.  Virol.、２００８年、８０巻（２号）：３５２〜９頁、およびDobrikovaら、Molecular  Therapy、２００８年、１６巻（１１号）：１８６５〜１８７２頁に記載されている。
【００８８】
一実施例では、開示されている方法によって作製および／または精製された天然に存在しないウイルスは、弱毒化Ｓａｂｉｎポリオウイルス（例えば、適切な変異を伴う１型、２型および／または３型ポリオウイルス）である。一実施例では、開示されている方法によって作製および／または精製されたウイルスは、開示されている方法を使用して産生した後に化学的に不活化することができる（例えば、ホルマリンを用いて）、不活化ポリオワクチン（例えば、１型、２型および／または３型ポリオウイルス）に使用されるものである。
【００８９】
改善されたウイルス精製方法と先行方法の比較
生ＰＶＳ−ＲＩＰＯを作製および精製するための先行方法は、例えば、Ouelletteら、BioProcessing  J.、２００５年、４巻（２号）：３１〜３８頁（「Oueletteら」）に記載されている。Oueletteらに記載されているプロセスは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドストックで形質転換した細菌細胞由来のＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡの調製、その後の制限エンドヌクレアーゼによるプラスミドＤＮＡの線状化、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したウイルスＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける合成、および、Ｖｅｒｏ細胞培養物においてＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスを産生させるために使用するウイルスシードストックを生成するためのウイルスＲＮＡのＶｅｒｏ細胞への電気穿孔を伴った。Ouelletteらに記載されている精製プロセスでは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスが、Ｖｅｒｏ細胞培養上清から単離され、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素によって処理され、一連の４つのカラムクロマトグラフィー分離ステップに供された。第１のステップは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦを使用したサイズ排除クロマトグラフィーであり、カラム溶出液が２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度および伝導率についてモニタリングされた。第２のステップは、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂を使用した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーであり、これは、ウイルス非結合性（すなわち、ウイルスはフロースルー中に収集された）であった。第３のステップは、ウイルス結合性ＣＤＭ樹脂を使用した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーであった。第２のステップおよび第３のステップはタンデムに実施され、ＣＤＭカラムから溶出した画分がＰＶＳ−ＲＩＰＯの存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験され、以下のステップのために、検出されたＰＶＳ−ＲＩＰＯの存在に基づいて選択され、プールされた。第４のステップは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５樹脂を使用したサイズ排除クロマトグラフィーであり、先のステップと同様に画分が試験され、選択され、プールされた。第４のステップは、さらなるＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製のため、および、ポリオウイルスは高塩に持続的に曝露されると感染力を失うので、ＣＤＭカラムからＰＶＳ−ＲＩＰＯを溶出させた高塩の緩衝液を除去するために、含められた。
【００９０】
ウイルスを精製するための改善されたプロセスが本明細書に提示される。これらの方法を使用して生成および精製することができる例示的なウイルスとしては、これだけに限定されないが、ＤＮＡウイルス（例えば、以下の科、Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ、ＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅおよびＳｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅのうちの１つに入るもの等の一本鎖ＤＮＡウイルス）、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｒｏｒｎａｖｉｒｕｓ、例えば、Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ（例えば、口蹄疫ウイルスおよびウシ鼻炎ウイルス）、Ａｑｕａｍａｖｉｒｕｓ、Ａｖｉｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ、Ｃｏｓａｖｉｒｕｓ、Ｄｉｃｉｐｉｖｉｒｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ（例えば、エンテロウイルスＡ〜ＪまたはライノウイルスＡ〜Ｃのいずれか）、Ｅｒｂｏｖｉｒｕｓ、Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ（例えば、Ａ型肝炎）、Ｋｏｂｕｖｉｒｕｓ、Ｍｅｇｒｉｖｉｒｕｓ、Ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓ（例えば、ヒトパレコウイルスまたはＬｊｕｎｇａｎウイルス）、Ｐｉｓｃｅｖｉｒｕｓ、Ｓａｌｉｖｉｒｕｓ、Ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ、Ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ、Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ、またはＴｒｅｍｏｖｉｒｕｓ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（例えば、狂犬病）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ（例えば、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ（例えば、デングウイルス、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および日本脳炎ウイルス）、およびＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラ））、またはＨＩＶもしくはＨＴＬＶ等のレトロウイルスが挙げられる。一実施例では、これらの方法を使用して生成および精製されるウイルスは、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、ライノウイルス、またはＨＩＶ等のＩＶ群またはＶＩ群ウイルスである。
【００９１】
一実施例では、これらの方法を使用して生成および精製されるウイルスは、天然に存在するポリオウイルスまたは天然に存在しないポリオウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより例示される腫瘍溶解性弱毒化組換えポリオウイルス）である。一実施例では、これらの方法を使用して生成および精製されるウイルスは、ＳａｂｉｎポリオウイルスまたはネイティブなＳａｌｋウイルス（精製後に化学的に不活化することができるもの）等のポリオウイルスまたはワクチンである。
【００９２】
開示されている方法は、ウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス等の生ウイルス）を含有する水性流体をサイズ分離クロマトグラフィーカラムで分離する、第１のクロマトグラフィー分離ステップと、サイズ分離クロマトグラフィーカラムから溶出した１つまたは複数の画分中のウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス等の生ウイルス）において見いだされる１つまたは複数の核酸配列を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって検出するステップと、１つまたは複数のウイルス核酸配列が検出される１つまたは複数の画分の画分をプールし、それにより、プールした画分を生成するステップとを含む。使用することができるｑＰＣＲおよび他の迅速な検出方法は、本明細書で考察されており、当技術分野で公知の方法を含む。
【００９３】
開示されている方法は、第２の、陰イオン交換クロマトグラフィー分離ステップを含む。第２のクロマトグラフィー分離ステップは、第１のクロマトグラフィーステップでプールされた陽性画分をさらに精製するものである。したがって、第１のクロマトグラフィーステップの後に得られるプールした画分を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに使用される樹脂は、ウイルスとは有意に結合しない、つまり、ウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス等の生ウイルス）は陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからフロースルー溶出液中に溶出するが、夾雑物は樹脂に結合する。このステップでは、ウイルス非結合性樹脂およびフロースルー溶出を使用することにより、ウイルス結合性樹脂とは対照的に、ウイルス結合性樹脂からウイルスを溶出するために必要になる高塩の溶出緩衝液へのウイルスの曝露が回避される。高塩の緩衝液への曝露によりウイルス不活化という結果をもたらし得るが、高塩の緩衝液への曝露を回避することにより、生ウイルスの収率が改善される。一実施例では、開示されている改善された精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィー分離ステップの後にいかなる追加的なクロマトグラフィー分離ステップも含有しない。したがって、特定の実施例では、改善された精製プロセスは、クロマトグラフィー分離ステップを２つ（サイズ分離およびイオン交換、ウイルスはフロースルー中に溶出する）のみ含有する（例えば、それらからなる）。一部の実施例では、改善された精製プロセスは、ウイルス結合性ＣＤＭ樹脂を利用するステップを含まない。改善された精製プロセスは、第２のクロマトグラフィー分離ステップ後に、例えば透析濾過による濃縮ステップをさらに含み得る。これにより、ウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス等の生ウイルス）のフロースルー溶出液中への溶出がもたらされる。
【００９４】
本明細書に記載されている改善された精製プロセスでは、サイズ分離カラムに適用されるウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス等の生ウイルス）を含有する水性流体は、ウイルス（例えば、天然に存在しないポリオウイルス）に感染したウイルス宿主細胞を１ラウンドまたは複数ラウンドの細胞培養において培養するステップによって得られる液体細胞培養培地であってよい。精製されるウイルスに感染したウイルス宿主細胞は、本明細書に記載されているプロセスによって得ることができる。ウイルスに感染したウイルス宿主細胞の培養後、かつ第１のクロマトグラフィー分離ステップの前に、ウイルスに感染したウイルス宿主細胞を含有する細胞培養培地を、ウイルス宿主細胞、ウイルス宿主細胞のデブリ、またはその両方から、例えば遠心分離または濾過によって分離することができる。液体細胞培養培地を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素等の、溶液中の遊離核酸は消化することができるが封入されたウイルス核酸を消化することはできないヌクレアーゼ酵素を用いて処理することもできる。１つまたは複数のＤＮアーゼ、１つまたは複数のＲＮアーゼ、またはＤＮアーゼとＲＮアーゼの混合物等の他のヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼ処理により、安全性を改善するため、採取粘度を低減させるため、および本明細書で考察されている検出方法である、精製プロセスにおいて使用されるウイルス検出方法のシグナル対ノイズ比を改善するために、遊離核酸を除去するまたは実質的に低減させる。
【００９５】
本明細書に記載されている改善された精製プロセスは、Oueletteらに記載されているプロセス等の、精製されたウイルス（例えば、天然に存在しないポリオウイルス）を大規模に製造するために使用される以前に記載された精製プロセスと比較して、含まれるステップ、および作製されるウイルスに多数の差異がある。例えば、本明細書に記載されている改善された精製プロセスでは、改善されたウイルス収率、実行間の高い再現性、実行時間の低減（すなわち、改善されたプロセスは以前から公知のものよりも速い）、および産物の収率と純度の間の望ましい折り合いを選択する能力（すなわち、より高いプロセス柔軟性）のうちの１つまたは複数が提供される。改善されたプロセスの実行時間の低減は、少なくとも一部において、改善されたプロセスに含有される精製ステップが少ないという事実に起因する。プロセスのステップの数が低減されると、材料費の低減にもつながり、ウイルス分解の機会が低減される。第１のクロマトグラフィーステップ後に収集されるカラム画分のサイズは、ウイルス産物の存在についての迅速かつ特異的な画分試験（例えば、ｑＰＣＲによる）を伴って細かく調整する（より大きくするまたはより小さくする）ことができるので、画分サイズを変動させ、いずれの画分を第１のクロマトグラフィーステップ後の精製のためにプールするかを選択することにより、改善されたプロセスを、より純度の高いウイルス産物が生成されるように、より純度の低いウイルス産物が改善された収率で生成されるように、または収率と純度の所望の組合せが容易に選択されるように調整することができる。
【００９６】
ウイルス作製の新しい方法と旧式の方法の間の１つの差異は、ステップの数、すなわち、クロマトグラフィー分離ステップの数の低減を含めた、ステップの数の低減である。単に例示のために、表１は、改善された精製プロセスの例示的な実施形態とOueletteらに記載されているプロセスの例示的な実施形態を並べた比較を示す。方法のプロセスのステップは表１の上から下に順番に列挙されている。Oueletteらのものは、４つのクロマトグラフィー精製ステップを含有する。対照的に、表１に例示されている改善された精製プロセスでは、２つのクロマトグラフィー分離ステップ、すなわち、最初のサイズ分離クロマトグラフィーステップ、その後、最終的なクロマトグラフィーステップとしてウイルス非結合性樹脂でのイオン交換クロマトグラフィーのみが使用される。これらのステップの後に濃縮ステップを続けることができる。Oueletteらのものとは対照的に、改善された精製プロセスは、陰イオン交換ＣＤＭ樹脂クロマトグラフィーステップ（「ＣＤＭ捕捉」）もＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂でのサイズ分離クロマトグラフィーも含まない。改善された精製プロセスでは、ＣＤＭ捕捉ステップを排除することにより、ウイルスがＣＤＭ樹脂カラムの溶出のために使用される高塩の緩衝液と接触することがないので、生ウイルスの収率が改善される。ＣＤＭ樹脂カラムを使用しないことにより、Oueletteらのプロセスで使用する最終的なサイズ分離ステップを排除することも可能となる。なぜなら、この最終的なサイズ分離ステップは前のＣＤＭ捕捉ステップの結果もたらされる高塩緩衝液を除去する必要があったからである。ＣＤＭ捕捉および最終的なサイズ分離クロマトグラフィーステップを省略することにより、今度は、これらのカラムから溶出した画分を試験し、画分を、検出されたウイルスの存在に基づいて選択し、プールする必要性が排除される。したがって、本明細書に記載されている改善された精製プロセスでは、ステップの数が低減し（例えば、クロマトグラフィー分離ステップの数の２分の１の低減）、これにより、より合理化された、かつあまり複雑でないプロセスがもたらされる。ステップの数の低減により、プロセスを実施するために必要な時間の低減ももたらされる。例えば、一部の実施形態では、改善された精製プロセスは、８時間もしくはそれ未満、または８時間未満（例えば、４〜８時間、４〜６時間、６〜８時間または７〜８時間）で実施することができる。
【表１】
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【００９７】
さらに、開示されている方法は、Thomassenら（Plos  One、８巻：８３３７４頁、２０１３年）の方法とは異なる。例えば、Thomassenらは２つのクロマトグラフィーステップを使用するが、サイズ排除クロマトグラフィーの間にウイルスの正確な位置を決定するためにインプロセスリアルタイム（ＰＡＴ）分析ステップ（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）は組み入れない。その代わりに、Thomassenらは、ポストホックＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて、カラムにおける吸光度値がウイルスカプシドタンパク質のみに起因すると仮定する。しかし、本発明者らは、これが必ずしも当てはまらないことを見いだし、（例えば図６を参照されたい）、プールする前に、ウイルスを最も多く含有する画分を同定するためにリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ等の方法を組み入れる。さらに、Thomassenらは、ウイルスプラスミド鋳型から開始しない。その代わりに、Thomassenらは、ウイルスストックから開始する。これらの差異の結果として、結果生成されるウイルスは、開示されている方法を用いて得られるものほど純粋でない。
【００９８】
改善された精製プロセスは、複雑さが低減することにより、大規模製造、例えば、臨床使用のためのＰＶＳ−ＲＩＰＯの生成に適したものになる。「大規模製造プロセス」という用語は、プロセスによって作製される生ウイルス産物の総量（プロセスアウトプット）を指し得る。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ等の生ウイルス産物については、プロセスアウトプットは、一般には、プラーク形成単位（ＰＦＵ）または組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）単位で表される。対照的に、不活化ウイルス材料収率のアウトプットは、質量および／またはコピー数として表すことができる。
【００９９】
さらに、改善された精製プロセスでは、生ウイルスの変動する不十分な収率をもたらす２つのクロマトグラフィー分離ステップが排除される。これらの２つのクロマトグラフィー分離ステップを排除して、それでもなお、改善された精製プロセスにより実現された、精製された天然に存在しないポリオウイルス産物の純度がOueletteらに記載されているプロセスによって実現される純度と同等であったことは予想外である。従来のクロマトグラフィーによるモニタリング技法、例えば、２５４ｎｍまたは２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度をモニタリングすること（例えば、核酸分子を検出するため）では、サイズ分離クロマトグラフィー、その後の、第２の陰イオン交換カラムからのウイルスのフロースルー溶出の後に、追加的なクロマトグラフィー分離ステップを使用することが必要になることが発見された。以前に記載された精製プロセスでは、２５４ｎｍまたは２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度をモニタリングすることによって選択されたウイルス陽性サイズ分離カラムクロマトグラフィー画分からは、溶出液の総吸光度に対する所望のウイルスの寄与は比較的小さいことが理由で、高レベルの夾雑ＤＮＡ、非ウイルスＲＮＡ、およびタンパク質を含有する画分が収集された。したがって、以前の方法では、大量の収集された材料が、所望のウイルス核酸分子（例えば、ポリオウイルスのウイルスＲＮＡ）には関連しなかった。さらに、以前の方法を使用すると、結果得られる、回収されるウイルス収率（例えば、ＰＦＵでの）は高度に変動し、予測不可能なものであった（例えば、数％しか回収できない場合もあり、約５０％までの回収率になる場合もある）。この問題は、第１のクロマトグラフィーステップ（サイズ分離）において溶出した画分中のウイルス核酸をリアルタイムｑＰＣＲ等の迅速かつ特異的な検出手順によって検出する、開示されている方法により解決される。この解決法の前には、クロマトグラフィーカラム画分中のウイルス産物の存在は特異的に決定されておらず、電気泳動、ウイルスプラークアッセイおよび他の特異的なアッセイは、特定の精製ステップ後に得られた産物中のウイルスの存在を検証するために画分をプールした後に完了させなければならなかった。例えば、Oueletteらのプロセス（表１に例示されている）は、ウイルス産物を検出するために２つのＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイステップを含むものであった。Oueletteらで使用されるこれらのアッセイは、プロセスの持続時間を増加させ、また、試験される画分のサイズ（体積）がカラムサイズに対して比較的大きなものであることが理由で、限られた価値の情報に依拠するものであった。対照的に、本明細書に記載のプロセスにおいてクロマトグラフィー画分（例えば、ｑＰＣＲ、例えば、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ）を試験するために迅速かつ特異的な検出方法を使用することにより、第１のクロマトグラフィーステップ後に収集されたより小さな体積画分を迅速に試験することが可能になり、また、高コピー数のウイルスを含有する画分の選択が可能になる。リアルタイムｑＰＣＲ等の迅速かつウイルス特異的な検出技法を使用することにより、いずれのサイズ分離カラム画分が最も高い力価のウイルスを含有するかを迅速に決定し、定量すること、ならびに、そのような画分を、プールおよびその後のウイルス非結合性イオン交換カラムへの適用のために選択することが可能になる。第１のクロマトグラフィーステップ後にその結果得られた、実現された精製の改善により、生ウイルス収率の改善ならびに複雑さおよび費用の低減がもたらされる。
【０１００】
精製されたウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより例示される腫瘍溶解性弱毒化組換えポリオウイルス等の天然に存在しない生ポリオウイルス）を作製するための改善されたプロセスにより、予想外なことに、Ouelletteらに記載されているプロセス等の以前から公知のプロセスと比較して感染性生ウイルスの収率の増加が実現される。精製収率（プロセス収率とも称される）は、最後のプロセスのステップ後に得られた精製されたウイルスからの総プラーク形成単位（ｐｆｕ）と宿主細胞培養物（例えば、精製されるウイルスの供給源として使用される、Ｖｅｒｏ細胞等の哺乳動物細胞中のウイルス）から採取されたウイルスの総プラーク形成単位（ｐｆｕ）の比として算出される。あるいは、精製収率は、コピー数（ｑＰＣＲによる）またはＴＣＩＤ５０に基づく。開示されている方法を使用して実現される精製収率は、一貫して、例えばＰＶＳ−ＲＩＰＯについての理論的な最大値の５０％以上、例えば、５０％〜６０％である。理論的な最大値は、採取物におけるｐｆｕ価の１００％が最終的な精製された「バルク」原薬において保持される（すなわち、総ｐｆｕベースで感染力が失われない）ことである。したがって、改善されたプロセスでは、予想外なことに、およそ５０％以上の感染性生ウイルスの精製収率、例えば、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、または少なくとも８５％の精製収率、例えば、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％の精製収率、例えば、５０％〜６０％、５０〜８０％、５０〜８３％、５０〜８５％、６０〜８３％、６０〜８５％、７０〜８３％、または７０〜８５％の精製収率がもたらされる。対照的に、Ouelletteらに記載されているプロセスによりもたらされる感染性生ウイルスの全収率はたった２９％である。２０〜３０％未満の収率は、一般に、経済的とはみなされず、プロセスをより大きな体積にスケールアップしようとする際に困難が生じる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（例えば、血清型５）および麻疹ウイルス等のウイルスについて他の公知のウイルスクロマトグラフィー精製プロトコールを使用してもたらされる収率は、一般には５０％未満であり、多くの場合、２０％未満であり得る。種々の精製プロセスの収率を、同等量のインプット材料ごとに生成される産物の総量を比較することによって比較することもできる。例えば、Oueletteらと同じまたは同等量のインプット材料（例えば、約１×１０１３ＰＦＵから開始する）を使用した本明細書に記載の改善されたプロセスでは、５×１０１２ｐｆｕの範囲の収率を確実に生成することができる。対照的に、Oueletteらに記載されているプロセスでは、およそ１×１０９〜５×１０１０ｐｆｕ（例えば、約３×１０１０超〜約１．５×１０１２超のＰＦＵから開始して）の収率しか生成されず、再現性が低い。したがって、本明細書に記載の改善されたプロセスでは、以前から公知のプロセスによって生成される最大で５００億ｐｆｕの高収量とは対照的に、５兆ｐｆｕの生ウイルス産物を確実に生成することができる。
【０１０１】
Oueletteらに記載されているもの等の以前に記載されたプロセスでは、溶出したカラム画分中のウイルスの「位置」および量が、方法が完了した後まで正確に分からなかったので、純度レベルは所望のものであったにもかかわらず、改善された精製プロセスによって実現された収率は実現可能でなかった。Oueletteらでは、最後の２つのクロマトグラフィーステップ（ウイルス結合性イオン交換およびサイズ分離クロマトグラフィー）の間に溶出した画分中のウイルスを検出するために、時間のかかる検出方法、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが使用された。Oueletteらに記載の方法における第３のクロマトグラフィーステップおよび第４のクロマトグラフィーステップおよび遅い検出の組合せにより、感染性生ウイルスの収率の低減がもたらされることが発見された。クロマトグラフィーステップ（特に、高塩の緩衝液を用いた溶出が必要とされるウイルス結合性イオン交換クロマトグラフィー）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出手順によって引き起こされる遅延により、ウイルス不活化（感染力の喪失）が引き起こされる可能性がある。改善された精製方法では、第１のクロマトグラフィーステップの間に溶出画分中のウイルスを検出するための迅速かつ特異的な方法を使用して、不活化をもたらす可能性がある、その後の精製ステップを排除すること、および総精製時間を低減することが可能になり、その結果、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより例示される腫瘍溶解性弱毒化組換えポリオウイルス等の天然に存在しない感染性生ポリオウイルスの収率の予想外の改善がもたらされる。予想外に改善された精製収率の結果として、本明細書に提示される作製プロセスにより、本明細書に記載のものと同等の１０個の１０段「セルファクトリー」の製造スケールでおよそ３×１０１２組織培養感染量（ＴＣＩＤ）５０のＰＶＳ−ＲＩＰＯを製造することができる。そのような高いアウトプットに起因して、改善された精製プロセスは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯにより例示される腫瘍溶解性弱毒化組換えポリオウイルス等の天然に存在しない生ポリオウイルスを生成する大規模製造プロセスに適合させるまたは組み入れることができる。
【０１０２】
一部の実施例では、以前に記載されたプロセスと比較して、改善された精製方法を使用して得られる最終産物の全体的な純度（例えば、残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の検出およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素によって測定される）の低下が観察されたが、作製されたウイルス（例えば、天然に存在しない生ポリオウイルス）の、その結果得られた純度の程度は、大規模な臨床的製造に関して許容されるものであった。以前のプロセスに対して５〜１０倍の収率の増加が実現され、同時に生じる、残留ＨＣＰおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素によって測定される全体的な純度の低下は、臨床的製造に関して許容される限度内にとどまることが本明細書に示されている。一部の実施例では、最終産物中のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素の量が、５０ｎｇ／ｍＬ未満（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ未満、１０ｎｇ／ｍＬ未満、５ｎｇ／ｍＬ未満、または１ｎｇ／ｍＬ未満）であり、最終産物中のＨＣＰの量が、１０ｍｇ／ｍＬ未満（例えば、５ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満または０．５ｍｇ／ｍＬ未満）である、またはこれらの組合せである。本明細書における教示に基づいて、第１のクロマトグラフィーステップ後の画分の選択に使用するパラメータを変動させることにより、ウイルス産物の純度の改善を実現することができることが当業者には理解されよう。
【０１０３】
ウイルス鋳型プラスミドの生成
本開示は、ウイルス鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡを生成するための改善されたプロセスを提供する。新しい方法と旧式の方法の比較が図２に提示されており、新しい方法の詳細が図３に提示されている。ウイルスＤＮＡ鋳型プラスミドを生成するための改善されたプロセスにより、ウイルス配列を生成するために使用されるウイルスＤＮＡ鋳型が適当なウイルス鋳型配列を含有することを確実なものにする。開示されている方法は、以下により詳細に記載される以下のステップのうちの１つまたは複数を含む：ウイルス鋳型プラスミドを１つまたは複数の宿主細胞（例えば、細菌細胞）に導入するステップ（例えば、形質転換）；ウイルス鋳型プラスミドで形質転換された１つまたは複数の宿主細胞の固形培地培養物を成長させるステップ；固形培地培養物上で成長した１つまたは複数のコロニー中の１つまたは複数のウイルス配列の存在を検出するステップ；１つまたは複数のウイルス鋳型配列の存在が検出された１つまたは複数のコロニーの細胞を繁殖させるステップ（例えば、液体培養物中での発酵によって）、および繁殖した宿主細胞からウイルスプラスミドを抽出するステップ。一部の実施例では、繁殖ステップと抽出ステップの間に、宿主細胞（例えば、細菌細胞）または宿主細胞（例えば、細菌細胞）に由来する材料の凍結（例えば、−２０℃もしくはそれ未満または−８０℃もしくはそれ未満の温度への曝露、またはその温度でのインキュベーション）は意図的に実施しない。繁殖時間も限定することができる。一部の実施例では、開示されているプラスミド調製の方法は、形質転換された宿主細胞を、一般には貯蔵媒体（例えば、ＤＭＳＯ）に添加されたグリセロールまたは他の試薬に曝露させることを含まない。したがって、一部の実施例では、開示されているプラスミド調製の方法は、形質転換された宿主細胞を、一般には貯蔵媒体（例えば、ＤＭＳＯ）に添加されたグリセロールまたは他の試薬を含有する培地中でインキュベートすることを含まず、また、形質転換された宿主細胞を凍結させない。
【０１０４】
旧式の方法と新しい開示されている方法の比較の概要が図２に提示されている。どちらの方法においても、ウイルス配列および選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性）を含有するウイルス鋳型プラスミドを宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質導入する。形質転換された細胞を、形質転換体の選択を可能にするために、カナマイシン等の選択化合物を含有する適切な成長培地の存在下で成長させる。新しい方法では、この成長は固形培地上でなされるが、以前の方法では、この成長は、液体培地中でなされる。固形培養物上での成長により、所望の、欠陥がないプラスミドが同定された、個々の形質転換されたクローンの選択が可能になる（ＰＡＴ管理）。新しい方法におけるＰＡＴ（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）管理ステップにより、製造プロセスの間にリアルタイムにモニタリングすることおよびデータに基づく決定を行うことが可能になる。例えば、ＰＡＴは、発酵および発酵後の「バルク試料」分析の前に、クローン選択により、プラスミドがインタクトであり、適当なサイズであることを確実にするための、プラスミドの迅速な電気泳動的分析を含み得る。対照的に、旧式の方法では、形質転換された細胞を液体培地中で成長させ、その結果、欠陥があるプラスミドおよび欠陥がないプラスミドの両方が増える。先行方法では、形質転換、液体培養での成長、および選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）によるコロニー選択の後に、細胞を高力価まで経過させ、次いで、細胞バンキングを実施する。この段階で、形質転換された細胞を貯蔵媒体（一般には、グリセロールを含有する）に入れて、その後の製造のための凍結細胞バンクを作り出す。非ＧＭＰバンクは、一般にはＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｓ（ＡＣＢ）とみなされ、その一部を使用して、液体培地発酵によって第１のＧＭＰ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＭＣＢ）を作り出す。細胞バンクは、図２の≠符号によって示される通り、無期限に保管することができる。ＭＣＢロットの一部は、一般には、産物発酵プロセスにおいて使用される、液体培地発酵によるＷｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＷＣＢ）を生成するために使用される。新しい方法では、固形培地上での成長、および適当なプラスミドを有する検証されたクローンの選択の後、形質転換された細胞を、プラスミドを製造するために、液体成長培地中、最適化された条件下で再増大させる（発酵）。以前の方法では、バンク化細胞（それらのプラスミドが検証されていない）を、プラスミドを製造するために、液体成長培地中、最適化された条件下で増大させる（発酵）。その後、どちらの方法でも、液体培養物をペレット化し、細胞を破壊してプラスミドＤＮＡを放出させる（プラスミド精製）。その後のクロマトグラフィー、濾過、洗浄、緩衝液交換、および濃度ステップを使用して、宿主細胞染色体ＤＮＡ、内毒素（ＬＰＳ）、および／または宿主細胞タンパク質の残留濃度が低い精製されたプラスミドＤＮＡを生成することができる。
【０１０５】
改善されたプロセスは、宿主（例えば、細菌）細胞において増やしたウイルス鋳型プラスミドの遺伝的不安定性に関する問題に対処する。以前の精製方法を使用すると、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ培養物において増やすときに、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ鋳型配列が不安定であり、細菌トランスポゾン挿入事象を起こしやすい。例えば、大多数のグラム陰性菌に存在する細菌トランスポゾンＴＮ１０／ＩＳＲ１０は、自身をウイルス鋳型配列に迅速に挿入し得、その結果、欠陥があるウイルス鋳型がもたらされる。細菌培養物中で繁殖し、凍結した形質転換Ｅ．ｃｏｌｉストック（例えば、プラスミド精製前に発酵させた、Oueletteらにおいて使用されるウイルスプラスミドストック−Oueletteら、３２頁、コラム１を参照）として提供されるＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミド産物は、一般には、空のｐＵＣ１９ベクター、二量体化ｐＵＣ１９ベクター、またはＥ．ｃｏｌｉトランスポゾンＤＮＡ挿入物を含め、かなりの数の不純物を含有する（図１に模式的に例示されている）。
【０１０６】
ウイルス鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡを生成する先行方法はまた、ウイルス鋳型プラスミドを１つまたは複数の宿主（例えば、細菌）細胞に導入するが、その後、そのような細胞を液体培地中で成長させ、次いで、「バンク化」または凍結させることも含んだ（図２を参照されたい）。さらに、プラスミドがインタクトなままであることを確認するための検証プロセスは実施されなかった。典型的なプラスミド産物は、製造目的の発酵の前に最大３つまたはそれ超の細胞バンキング発酵および凍結手順を受け得る。得られた、ウイルス鋳型を含有するプラスミドＤＮＡのバンクは、分解された（例えば、例えば望ましくないトランスポゾン事象に起因して適当なウイルス鋳型配列を含まなかった）プラスミドの大集団を含有し、したがって、最適ではないことが決定されている。これらのバンクの出発材料から全長クローンを得ることは難しかった。一部の実施例では、以前の精製方法を使用したときに、プラスミド集団の少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはさらには時には１００％）が、適当なウイルス鋳型配列を含まなかった。バンキングステップを回避する（例えば、凍結ステップがない）新しい方法を使用することにより、おそらくトランスポゾン挿入事象がより少ないことに起因して、分解されたプラスミドの集団がより少なくなることが示されている。例えば、開示されている、ウイルス鋳型プラスミドを作製する方法を使用することにより、適当なウイルス鋳型配列を含有するプラスミド集団（またはプラスミド集団の５０％未満が不適当なウイルス鋳型配列を含有する（例えば、４０％未満、４５％未満、３０％未満または２５％未満）のアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）およびＲＥ地図作成によって示される通り、コロニーの少なくとも５０％が遺伝的に「安定」である（例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％）、ウイルス鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡの集団を生成することができる。
【０１０７】
本明細書に記載の改善されたプロセスでは、以前の方法に関連する問題が、以下の特徴のうちの１つまたは複数によって対処された。一部の実施例では、改善されたプロセスは、最初のウイルス鋳型プラスミドストック（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスＤＮＡ鋳型プラスミド）を、形質転換された宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する代わりに、単離されたウイルス鋳型プラスミドストック（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ）を含有する組成物として提供し、単離されたウイルス鋳型プラスミドストック（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ）を使用して宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の新鮮な形質転換を実施する。一部の実施例では、改善されたプロセスは、形質転換された細胞を、適当なプラスミド配列の存在について試験すること（例えば、アガロースゲル電気泳動およびＲＥ地図作成を使用して）を含む。本明細書に記載されている例示的な方法では、試験は、固形培地で成長させた細菌細胞のコロニーに対して実施されるが、任意の適切な技法を使用して、形質転換された細菌細胞を適当なウイルス鋳型配列の存在について試験し、そのような配列が存在する細胞をさらなる繁殖のために選択することができる。最初のプラスミドストックから形質転換された細胞から成長させた細菌コロニーにおける１つまたは複数のウイルス鋳型配列の検出によって例示される試験ステップまたは選択ステップを含めることによって、改善されたプロセスは、適当なまたは実質的に適当なウイルス鋳型プラスミド配列を含有する細菌細胞がさらなる繁殖のために選択されることを確実にする。一部の実施例では、改善されたプロセスは、繁殖ステップおよび単離ステップを行っている間、または繁殖ステップと単離ステップの間に、形質転換された宿主細胞を凍結させることを含まず、これによっても、細菌細胞に存在するウイルス鋳型配列の遺伝的不安定性のリスクが低減する。改善されたプロセスにおいて、欠陥があるウイルス鋳型配列を含有するプラスミドクローンが増幅するリスクを低減するために、意図的に限定した繁殖時間を使用することもできる。
【０１０８】
開示されている方法の概要が図３、１００に提示されている。ウイルス鋳型配列を含有するプラスミドＤＮＡ  １１０、１２０は、プラスミドウイルスＤＮＡ鋳型、ウイルスＤＮＡ鋳型プラスミド、ウイルス鋳型プラスミド、プラスミド、ウイルスＤＮＡ鋳型と称すること、および他の関連する用語によって称することもでき、ウイルスＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を特定する（それと相補的であるまたは一致することを意味する）１つまたは複数のウイルスＤＮＡ鋳型配列を含有するプラスミドである。ウイルス鋳型プラスミドは、プラスミドバンク（１１０）からのプラスミド等の精製されたプラスミドストックの形態で得ることもでき、いくつかの他の形態で得ることもできる。一実施例では、プラスミドは、単離された形態（１２０）で提供され、これは、細菌細胞に含有された状態ではないことを意味する。ウイルスＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は、ネイティブなウイルス配列、操作されたもしくは改変されたウイルス配列、または非ウイルス配列、例えば、宿主細胞において発現させる非ウイルスタンパク質をコードする配列を含有し得る。ウイルスＤＮＡ鋳型は、ウイルス配列を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するため（例えば、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてウイルスＤＮＡ鋳型配列からウイルスＲＮＡ配列を合成することができる）、または、ウイルスＤＮＡ鋳型配列を宿主細胞に導入する際にｉｎ  ｖｉｖｏで合成するために使用される。
【０１０９】
開示されている方法を用いて、任意のウイルス鋳型プラスミドを精製することができる。一部の実施例では、ウイルス鋳型プラスミドは、ポリオウイルス等のＲＮＡウイルスに対するＤＮＡ鋳型（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）、弱毒化ポリオウイルス（すなわち、Ｓａｂｉｎワクチン）に対する鋳型）を含む。一実施例では、ウイルス鋳型プラスミドは、ピコルナウイルス（例えば、Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｉｄａｅ［例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）］、Ａ型肝炎、またはポリオ）、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、およびポリオウイルス）；Ｒｈｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ライノウイルス、例えばライノウイルスＡ、ＢまたはＣ））；トガウイルス（例えば、風疹；アルファウイルス（例えば、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス））；Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ（例えば、デングウイルス、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および日本脳炎ウイルス）；ならびにＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス、例えば、Ｕｒｂａｎｉ株）等のプラス鎖ＲＮＡウイルスに対するＤＮＡ鋳型を含む。一実施例では、ウイルス鋳型プラスミドは、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｙｏｖｉｒｕｓ（例えば、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ等のインフルエンザ）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（例えば、狂犬病）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラ）、およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ（例えば、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス）等のマイナス鎖ＲＮＡウイルスに対するＤＮＡ鋳型を含む。一部の実施例では、ウイルス鋳型プラスミドは、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（例えば、水痘帯状疱疹ウイルス、例えば、Ｏｋａ株；サイトメガロウイルス；および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス１型、１４型、５型、４０型、または４１型）、Ｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、ワクシニアウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ（例えば、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）に由来するもの等のＤＮＡウイルス配列を含む。一部の実施例では、ウイルス鋳型プラスミドは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、例えば亜型Ｃ、ＨＩＶ−２；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；およびトリ肉腫ウイルス等のレトロウイルスに対するＤＮＡ鋳型またはＲＮＡ鋳型を含む。
【０１１０】
図３に示されている通り、ウイルス鋳型プラスミドを１つまたは複数の宿主細胞に導入する（例えば、形質転換）、１３０。使用することができる例示的な宿主細胞としては、これだけに限定されないが、細菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、および昆虫細胞、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ５α、Ｋ１２、またはＥ．ｃｏｌｉのＫ１２に由来する株）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。宿主細胞へのウイルス鋳型プラスミドの導入は、任意の適切な方法によって実現することができる。例示的な形質転換方法としては、これだけに限定されないが、電気穿孔または宿主細胞の二価カチオン、例えばＣａ２＋への曝露、その後の熱ショックが挙げられる。
【０１１１】
形質転換１３０の後、形質転換された宿主細胞を固形培地（例えば、寒天プレート）上、選択マーカー（例えば、抗生物質）の存在下で成長させる。ウイルス鋳型プラスミドを用いて形質転換された１つまたは複数の細胞の固形培地培養物の成長は、任意の適切な方法によって実現することができる。例えば、形質転換された細胞を寒天に基づく細菌成長培地等の固形培地上に画線または希釈プレーティングすることができる。個々のコロニーを選択し、液体培地中（例えば、５０ｍＬの培地中）で別々に増大させる、１４０。液体培地または固形培地における適切な選択マーカーを使用した形質転換された細胞についての選択を使用することができる。例えば、ウイルスプラスミドＤＮＡに含有される、抗生物質耐性を付与する遺伝子についての選択は、これだけに限定されないが、プラスミド形質転換体のＫａｎＲ選択のためのカナマイシンを含有する培地（または他のもの、例えば、プラスミド形質転換体のＡｍｐＲ選択のためのアンピシリンを含有する培地）等の、抗生物質を含有する成長培地を使用することによって実現することができる。使用することができる他の抗生物質耐性マーカーとしては、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、およびピューロマイシンが挙げられる。さらに、ベータ−ガラクトシダーゼアルファ相補（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺΔＭ１５を宿主として使用する）およびＸ−ｇａｌと共にプレーティングすること等の、他の選択方法を使用することができる。
【０１１２】
形質転換された宿主細胞を成長させた後（例えば、選択条件下で）、いずれの細菌コロニーが適当なウイルス鋳型配列を含有するかを決定する、１５０。固形培地培養物で成長させた１つまたは複数の細菌コロニーにおける１つまたは複数のウイルス鋳型配列の存在の検出は、１つまたは複数の適切な検出方法によって実現することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase  change  reaction）（ＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定、制限分析、ゲル電気泳動、ブロッティングまたは他の方法のうちの１つまたは複数を実施することができる。一実施例では、制限地図作成アガロースゲル電気泳動、その後、最終的に完全なプラスミド配列決定を使用する。１つまたは複数のウイルス鋳型配列の存在の検出を実施して、試験した１つまたは複数のコロニーの細胞が適当なまたは実質的に適当なウイルス鋳型のＤＮＡ配列を含有すること、および、例えばウイルス鋳型配列を含有しない「空の」プラスミドベクター、プラスミド二量体等の実質的な量の不純物を含有しないこと、または欠失、挿入または置換等のウイルスＤＮＡ配列の変動またはエラー、を検証する。
【０１１３】
１つまたは複数のウイルス鋳型プラスミド配列の存在が検出された１つまたは複数のコロニーの形質転換された細胞の繁殖、ならびに、繁殖した細胞からのウイルスプラスミドの抽出は、任意の適切な方法によって実現することができる。例えば、ステップ１６０に示されている通り、１つまたは複数のウイルス鋳型プラスミド細胞の存在が検出されたコロニーを使用して、形質転換された細胞の液体培養物に接種することができ、次いで、それを適切な程度まで成長（「発酵」）させることができる。次いで、プラスミドを含有する細胞を、精製すること、例えば、沈降、濾過または他の適切な分離プロセスによって成長培地から分離することができる。適切な技法によってウイルスＤＮＡ鋳型プラスミドを細胞から抽出（例えば、精製または単離）することができる、１７０。得られた単離されたウイルスＤＮＡ鋳型プラスミドを、プラスミドの量およびプラスミドの品質について（例えば、プラスミドが適当な配列を含むかどうかを決定するために）分析することができる、１８０。例えば、ステップ１８０は、得られた試料のＤＮＡ濃度、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＡＬ（内毒素）濃度、得られた試料中のプラスミドＤＮＡ純度、またはこれらの組合せを決定することを含み得る。そのような方法は、制限酵素消化分析および／または配列決定分析を含み得る。精製、透析濾過、および滅菌濾過の後、得られたプラスミドを、例えば、２〜３ｍＬのガラスバイアル中１ｍＬとしてパッケージングすることができる、１９０。一部の場合では、開示されている方法は、繁殖ステップと抽出ステップの（例えば、ステップ１３０〜１７０）間にいかなる凍結ステップまたは期間も意図的に含まない。繁殖時間をおよそ１４時間のプラスミドスターター培養およびおよそ２０時間の主発酵に意図的に限定することができる。
【０１１４】
改善されたプロセスの特定の実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、熱ショックを使用して、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスＤＮＡ鋳型プラスミド（２つの異なるロットを使用した）で形質転換した。形質転換された細胞を固形培地上で成長させた。ＡＧＥを使用して、得られたＥ．ｃｏｌｉ細胞のコロニーをスクリーニングして適当なＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドを含有するコロニーを同定した（ｓｃＤＮＡおよびＲＥ地図作成分析）。プラスミドＤＮＡ配列決定によって追加的なスクリーニングを実施することができる。適当なＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞をさらなる繁殖のために選択し、ＬＢ−Ｓｏｙｔｏｎｅを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと共に含有する液体Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養培地中で繁殖させ、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドを、繁殖したＥ．ｃｏｌｉ細胞（細胞ペーストを遠心分離し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＥｎｄｏＦｒｅｅ  ＧｉｇａＰｒｅｐキットを使用して溶解／精製した）から単離し、細菌を凍結しなかった。ＯＤ６００ｎｍを測定すること、スターター種培養と主発酵の間にゲルに基づく確認を使用すること、スターターおよび主発酵の両方について並行培養を使用すること、およびプラスミドを即時処理する（すなわち、凍結細胞ペーストではない）ことにより、繁殖を所定の細胞密度に限定する。図４は、図１Ａおよび１Ｂと比較した、改善されたプラスミド作製プロセスによって得られるＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドの改善された純度を例示する。開示されている方法を使用すると、高いスーパーコイル（ｓｃ）ＤＮＡの百分率（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、例えば、７０〜９５％、７５〜８５％、または８０〜９０％）を伴うインタクトな全長（約１０ｋｂｐ）プラスミドの回収が実現された。さらに、ＡＧＥおよびＡＧＥ／ＲＥ地図作成分析を使用して、完全なまたは部分的なプラスミドの喪失、プラスミドインサートの喪失、組換え、またはトランスポゾン組込みの徴候はなかった。
【０１１５】
開示されている方法を使用して作製されたウイルス鋳型プラスミドＤＮＡも提供される。例えば、開示されている方法を使用して作製されたウイルス鋳型プラスミドＤＮＡを含有する組成物は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０等の緩衝液を含み得る。一部の実施例では、得られたウイルス鋳型プラスミドＤＮＡはプラスミドを含み、その少なくとも５０％が、適切なウイルスＤＮＡ鋳型プラスミドを含有する（例えば、クローンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、例えば、５０〜７５％、５０〜８５％、または５０〜６０％が、開示されている方法に従って、例えば、ＰＶＳＲＩＰＯ  ｐＤＮＡについて、所望のサイズおよび制限地図作成パターンの唯一のプラスミド構築物を含有する）。一部の実施例では、開示されている方法を使用して作製されたウイルス鋳型プラスミドＤＮＡを含有する組成物に含まれるトランスポゾン挿入事象を伴うプラスミド、二量体化したプラスミド、ウイルス鋳型配列を伴わない空のプラスミド、またはこれらの組合せは、他の精製方法を使用した場合に観察されるそのような事象と比較して少ない。したがって、一部の実施例では、開示されている方法を使用して作製されたウイルス鋳型プラスミドＤＮＡを含有する組成物は、約５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満等、例えば、１０〜５０％、２０〜４０％、または１〜２０％）の、トランスポゾン挿入事象を伴うプラスミド、約２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満等、例えば、１〜２５％、または１０〜２０％）の、二量体化したプラスミド、約２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満、例えば、１〜２５％、または１０〜２０％）の、ウイルス鋳型配列を伴わない空のプラスミド、またはこれらの組合せを含む。
【０１１６】
開示されている方法を使用して作製されたウイルス鋳型プラスミドＤＮＡをさらに処理すること、例えば、線状化してウイルスＤＮＡ鋳型を作製し、宿主細胞に導入することができる。例えば、ＲＮＡに基づくウイルスについては、ウイルスＤＮＡ鋳型からｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用してウイルスＲＮＡ配列を生成し、ウイルス宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。トランスフェクトされた宿主細胞から清澄化されたウイルスを収集し、これを「マスターウイルスバンク」（ＭＶＢ）と称することができる。ＭＶＢは、ウイルスを含有し、宿主細胞は含有しない。感染細胞は、寿命が短いので、通常は細胞バンクに収集されない。ＭＶＢは、清澄化されたウイルスを含有するトランスフェクション後細胞溶解物を含有する。次いで、感染ウイルス宿主細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養において等の適切なやり方で成長させる。感染細胞の成長は、細胞を培養物中で成長させることを意味する、感染哺乳動物細胞を培養物中で１ラウンドまたは複数ラウンド増幅（増大）させること、次いで、成長させた細胞を使用してさらなる細胞培養物を「播種する」（開始する）ことを含み得るが、これは、感染後の細胞変性効果および細胞死の迅速性に起因して可能でない場合がある。
【０１１７】
改善されたプロセスの一例では、マスターウイルスシード（ＭＶＳ）を、ＩＶＴにより生成されたウイルスＲＮＡで形質転換されたＶｅｒｏ細胞において作り出す；ＭＶＢウイルスを、ＭＶＳを感染させた増大させたＶｅｒｏ細胞を使用して作り出し、その後、清澄化するが精製はしない；作製ロットでは、ＭＶＢロットからのウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞を使用する；全ての場合において、トランスフェクション（ＭＶＳへのウイルスＲＮＡ）または感染（ＭＶＢ）および作製の前にＶｅｒｏの増大を行う。しかし、必要な細胞増大は、一般には、小さなＭＶＳ／ＭＶＢバンクの生成では、より大きなスケールのウイルスの製造ロットと比較して少ない。したがって、上記の通り作製されたＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡを使用し、得られた裸のウイルスＲＮＡ配列を使用してＶｅｒｏ哺乳動物細胞をトランスフェクトした。Ｖｅｒｏ培養物を、ＲＮＡトランスフェクションまたはウイルス感染前に所望の細胞カウントまで増大させる。ＰＶＳ−ＲＩＰＯおよび他のウイルスについては、感染後に細胞を増大させない。感染Ｖｅｒｏ細胞においてウイルス複製および増幅を行って、ＰＶＳ−ＲＩＰＯの採取ロットを生成する。
【０１１８】
クロマトグラフィー画分中の核酸配列の迅速な検出方法を使用する精製プロセス
精製されたまたは単離された核酸分子含有組成物を得るための改善されたプロセスまたは方法が本明細書に提示される。改善された精製プロセスは、ウイルス等の所望の核酸分子を含有する試料のクロマトグラフィーによる分離を含む。溶出したクロマトグラフィーカラム画分中の精製される所望の核酸分子含有組成物（例えば、「分析物」）を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）等の迅速な検出方法を使用して検出すること、および検出結果に基づいて画分を選択すること（例えば、所望の核酸分子を含有する画分を選択し、組み合わせること）により、試料検出が従来のクロマトグラフィーによるモニタリング技法、例えば、クロマトグラフィーカラム溶出液の吸光度および伝導率のモニタリングにより行われるプロセスに比べ精製の改善が実現されたことが本明細書に示されている。本明細書に記載されている改善された精製プロセスで感染性生ウイルスの収率の増加が実現されたが、方法は、生ウイルスの精製に限定されない。例えば、開示されている方法を使用して、不活化ウイルス（例えば、ワクチンに使用されるもの）等の他の分析物および精製されたウイルス核酸を精製することができる。
【０１１９】
改善された精製プロセスにより、分析物のより高い収率、分析物の純度の増加、および精製時間の低減のうちの１つまたは複数をもたらすことができる（表２参照）。精製時間の低減により、精製効率の改善、および一部の場合では、精製された分析物の品質の改善がもたらされる。例えば、改善された精製プロセスを使用したＰＶＳ−ＲＩＰＯの精製は、４〜８時間で実現され（Oueletteらの方法では少なくとも２日間または少なくとも３日間であることと比較して）、これにより、精製されたＰＶＳ−ＲＩＰＯの感染力（力価）の改善がもたらされる。言い換えれば、精製時間がより短いことにより、感染性生ウイルスの収率および安定性の改善がもたらされる。改善された精製プロセスによって得られる分析物の収率および純度、または精製時間等のパラメータは、精製パラメータを調整することによって操作することができる。例えば、収集および／または分析物の存在について迅速な検出方法によって試験されるいくつかのクロマトグラフィー画分を調整する（増加または低減させる）こと、クロマトグラフィーカラム分解能を増加させること、さらなる精製および／または検出ステップを追加すること、または異なる型の迅速な検出方法を選択することができる。一実施例では、多数のクロマトグラフィー画分を試験し、さらなる調製ステップのために、分析物を含有する画分をより多くプールすることによって、分析物の全体的な収率を改善することができる。別の実施例では、より小さな画分を収集し、分析物含有量が最も多い少数の画分をさらなる調製ステップのためにプールすることによって分析物の純度を改善することができる。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１２０】
改善された方法の概要が図５に提示されている、２００。ポリオウイルス（例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ）を感染させたＶｅｒｏ細胞等の、ウイルス鋳型プラスミドを予め感染させ、培養物中で成長させた宿主細胞を、ウイルスにより溶解する。得られた上清を、ヌクレアーゼ酵素と一緒にインキュベートする、２１０。ヌクレアーゼは、溶液中の遊離ＲＮＡおよびＤＮＡを消化するが、封入されたウイルス核酸（すなわち、インタクトなウイルス粒子に含有されるもの）はインタクトなままにすることができる。したがって、ヌクレアーゼを、所望のウイルスを含有する上清と一緒に、宿主細胞ＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）およびＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、存在する場合には他の潜在的な夾雑ＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、内因性／外因性ウイルス）、ならびに封入されていない遊離のウイルスＲＮＡの消化（したがって、低減および／または除去）を可能にする条件下でインキュベートする。一実施例では、ヌクレアーゼを５０単位／ｍｌ（またはそれ未満）の濃度で、例えば、２〜８℃で１６〜２４時間存在させる。一部の実施例では、ヌクレアーゼをより高い温度（例えば、２５〜３７℃）でより短い時間にわたって使用するが、ウイルスカプシド分解が起こり得る。一実施例では、ヌクレアーゼは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素等のエンドヌクレアーゼである。一実施例では、ヌクレアーゼは、１つもしくは複数のＤＮａｓｅ、１つもしくは複数のＲＮアーゼ、または１つもしくは複数のＤＮａｓｅと１つもしくは複数のＲＮアーゼの組合せである。
【０１２１】
次いで、ヌクレアーゼ消化した上清をサイズ分離（またはゲル濾過）クロマトグラフィーに供す、２２０。例えば、ヌクレアーゼ消化した上清を、アガロースに基づく樹脂（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を含有するもの等のサイズ分離カラムに適用することができる。一実施例では、サイズ分離カラムは、流速が大きいＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）樹脂である。一部の実施例では、４ＦＦカラムの代わりに６ＦＦを使用することにより、ウイルスの純度を改善すること、および／または精製のスピードを増加させることができる。カラムから収集された１つまたは複数の画分を、ｑＰＣＲ（例えば、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して標的核酸分子の存在について（例えば、標的ウイルスの標的配列の検出によって）分析する、２３０。一部の実施例では、吸光度（例えば、２８０ｎｍ、２１５ｎｍ、もしくは２５４ｎｍの１つもしくは複数の波長におけるもの）および／または伝導率等の、溶出液の他のパラメータもモニタリングする。次いで、標的核酸分子（例えば、ウイルス）を含有する同定された画分をプールするまたは合わせる、２４０。一実施例では、陽性画分は、１０７コピー／ｍＬ超を有するものである（コピーは、ウイルスＲＮＡまたはｃＤＮＡゲノムコピーを指す）。
【０１２２】
プールした画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供す、２５０。例えば、プールした画分を、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂を含有するカラムに適用することができる。一部の実施例では、吸光度（例えば、２８０ｎｍ、２１５ｎｍ、もしくは２５４ｎｍの１つもしくは複数の波長におけるもの）および／または伝導率等の、陰イオン交換からの溶出液のパラメータをモニタリングする。一部の実施例では、陰イオン交換からの溶出液を、ウイルスの存在について、例えば、ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）を使用してモニタリングする。例えば、少なくとも５×１０９コピー／ｍＬを含有する画分を維持およびプールすることができるが、これを、少なくとも２×１０９コピー／ｍＬを含有する画分に増大させて、費用対純度（例えば、高純度よりも収率の方が所望される場合）に関して収率を改善することができる。
【０１２３】
結果得られる、陰イオン交換カラムから収集された、標的核酸分子（複数可）を含有するフロースルーピークを、透析濾過を使用して濃縮することができる、２６０。得られた透過液および／またはフラッシュ液（flush）を収集する、プールする、滅菌濾過する、またはこれらを組み合わせることができる。所望であれば、得られた透過液および／またはフラッシュ液をさらに分析する、例えば、ｐＨ、ＢＣＡ（タンパク質含有量）、Ｖｅｒｏ  ＨＣＰ含有量、ＨＣ  ＤＮＡ含有量、ＬＡＬを決定する、プラーク（ＰＦＵ）試験を実施する、またはこれらを組み合わせることができる。一部の実施例では、得られた精製された核酸分子調製物に、アジュバント、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、糖（マンニトール、スクロース等）、界面活性物質（例えば、Ｔｗｅｅｎ／Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）等のうちの１つまたは複数等の追加的な材料を添加する。
【０１２４】
クロマトグラフィー
精製されたウイルス等の核酸分子を含有する組成物を得るための、開示されている方法は、所望の核酸分子を含有する試料を液体カラムクロマトグラフィーで分離するステップと、カラムクロマトグラフィーから溶出した画分を収集するステップと、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ等の迅速な検出方法を使用して画分のうちの１つまたは複数における核酸混合物中の標的核酸配列を検出するステップと、標的核酸分子の所定の閾値（「カットオフ」）濃度（例えば、＞１０９コピー／ｍＬの閾値（すなわち、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲによって決定されるウイルスゲノムのコピー数）に基づいて、標的核酸分子が検出される画分のうちの１つまたは複数を選択するステップとを含む。カラムクロマトグラフィーは、核酸分子を含有する試料の構成成分の分離を可能にし、試料が可溶性である固定相（クロマトグラフィー媒体）および移動相（液体溶離液）を充填したカラムを伴う全ての方法を包含する。試料をカラムに適用し、その後、溶離液を適用する。固定相および移動相は、試料の種々の構成成分が固定相を通って異なって移動するように選択する。核酸を含有する試料の分離に適した例示的な液体クロマトグラフィー法は公知であり、例えば、McLaughlin、TrAC  Trends  in  Analytical  Chemistry、５巻（８号）：２１５〜２１９頁（１９８６年）またはMcGrathら、J  Virol.、２５巻（３号）：９２３〜９２７頁（１９７８年）に記載されている。例えば、液体カラムクロマトグラフィー法は、媒体の型および／または必要な分離プロセスに基づいて分類することができる。一部の例は、サイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーである。開示されている方法で使用することができる適切なクロマトグラフィー媒体の一部の例は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５、Ｃａｐｔｏ−Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ−Ｑ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、Ｚｅｎｉｘ−Ｃ、Ｓｏｕｒｃｅ−Ｓ、Ｐｈｅｎｙｌ／Ｂｕｔｙｌ／Ｏｃｔｏ−Ｃａｐｔｏ等である。
【０１２５】
カラムからの溶出液は、一般には、一連の画分（所定の体積の試料）中に収集される。画分は、分析物と称することができる試料構成成分のうちの１つまたは複数の存在または非存在を決定するための種々の検出方法に供すことができる。溶出液の継続的なモニタリングも使用することができ、したがって、カラム溶出液に対して検出を連続的に行い、次いで、それを画分中に収集する。例示的な検出方法は、核酸および／もしくはタンパク質を検出するために適した波長における吸光度による検出、または塩等の電解質を検出するための伝導率のモニタリングである。画分を、例えば酵素活性試験、電気泳動、ブロッティング等の適切な分析技法の１つまたは複数を使用して、生体分子の存在または非存在について分析することができる。核酸を含有する試料の分離中に一般に使用される検出技法は特異性を欠く。例えば、ＲＮＡについて２５４ｎｍ等の適切な波長における吸光度を測定することによる検出を使用することができるが、これは、特異的な核酸配列（例えば、ウイルス標的配列）の検出を可能にするものではなく、したがって、得られる試料は、宿主細胞ＲＮＡ等の望ましくない夾雑物を含有する可能性がある。しかし、より特異的な検出方法は、時間がかかり、それにより、検出結果を得る間に試料の望ましくない分解をもたらす可能性がある。
【０１２６】
開示されている改善された精製プロセスでは、核酸分子を含有する試料（例えば、ウイルス核酸）を分離するために使用されるクロマトグラフィー媒体の型にかかわらず、方法は、画分のうちの１つまたは複数中の標的核酸分子を、核酸分子を含有する分析物中の１つまたは複数の配列を特異的に検出することができる迅速な検出方法を使用して検出または測定するステップを含む。そのような方法の例は、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ検出である。吸光度および伝導率のモニタリング等の他の検出技法を迅速な検出と併せて使用することができる。例えば、迅速な検出にリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用する場合、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ検出のための画分を吸光度および伝導率のモニタリングの結果に基づいて選択することができる。しかし、標的核酸分子が存在する画分のうちの１つまたは複数の選択は、試料中の標的核酸配列のリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ検出に基づく。画分を、試料中に存在する標的核酸配列の所定の閾値（「カットオフ」）濃度に基づいて選択する。すなわち、閾値またはそれを上回る濃度の標的核酸配列を含有する画分を選択する。次いで、複数の画分を合わせることができる。得られた組成物は、クロマトグラフィーカラムに最初に適用された試料よりも高い濃度の標的核酸分子を含有する。得られた組成物はまた、所望の核酸以外の試料構成成分をより低い濃度で含有し得る。
【０１２７】
開示されている精製方法を、Ｖｅｒｏ細胞から得たＰＶＳ−ＲＩＰＯの精製プロセスにおいて例示的に使用した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ作製プロセスは、マスターウイルスバンクから得た第１継代（Ｐ１）ＰＶＳ−ＲＩＰＯを感染させたＶｅｒｏ細胞の多数の１０段セルファクトリーを伴った。採取した材料（細胞培地上清）をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素で処理し、２つのカラムクロマトグラフィーステップ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦサイズ分離クロマトグラフィーおよびＳｕｐｅｒ−Ｑ  ６５０Ｍ陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。どちらのクロマトグラフィーステップもＰＶＳ−ＲＩＰＯについては「フロースルー」であった、つまり、ＰＶＳ−ＲＩＰＯはカラム媒体に結合せず、したがって、フロースルー溶出液中に溶出した。第１のクロマトグラフィーステップでは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦカラムを、細胞培養培地中のより小さい分子量の夾雑物を分離するため、および緩衝液交換ステップとして使用した。連続的な吸光度モニタリング（２６０ｎｍ／２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収）を使用して主要なウイルスピークを同定することに加えて、当該ピークにわたって画分を収集し、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用してさらに分析した。クロマトグラムは、通常、２つの定義されたＵＶ吸光度ピークを含有した。Oueletteらに記載されているもの（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦではなくＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦが使用される）等の以前のＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製プロセスでは、画分プール決定は、吸収モニタリングに基づくものであり、この段階でおよそ８０％の精製収率をもたらした。対照的に、ＲＴ−ｑＰＣＲ検出では、この段階でおよそ１００％の収率をもたらした。驚いたことに、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲによる画分分析から、主要なＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスピークは小さな最初のＵＶ吸光度ピークのほぼ近くに位置するが、より大きなその後の吸光度ピークは痕跡量のＰＶＳ−ＲＩＰＯにのみ含有されることが示された。一部の場合では、Ａ２５４「小さな最初のピーク」とＲＴ−ｑＰＣＲ結果は完全には重複せず、これにより、最初のＡ２５４ｎｍのピークがウイルスＲＮＡのみに起因するものではない可能性が示された。したがって、ＲＴ  ｑＰＣＲ検出は、さらなる処理のために収集するのに適した画分（＞１０７コピー／ｍＬ閾値を使用した）の確認において予想外に重要であった。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦクロマトグラフィー後に得られた予想外のＰＶＳ−ＲＩＰＯ濃度の増加および夾雑物の低減により、Oueletteらに記載されているＣＭＤ陰イオン交換クロマトグラフィーステップおよびＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５クロマトグラフィーステップが不必要になった。選択された画分をプールし、第２のＳｕｐｅｒＱ  ６５０Ｍクロマトグラフィーステップにおいてさらに精製した。ＳｕｐｅｒＱ  ６５０Ｍカラムを使用して、宿主細胞タンパク質夾雑物を非結合性ウイルスから除去した。精製後、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ組成物を濃縮し、濾過し、バイアルに入れた。
【０１２８】
開示されているプロセスによって得られる感染性生ＰＶＳ−ＲＩＰＯの平均作製収率は、再現性よく５０％以上、例えば、５０％〜８０％の範囲であった。カラムクロマトグラフィーステップを２つのみ使用するので、Oueletteらに記載されている４つのクロマトグラフィーステップと比較して、精製プロセスの時間、費用および複雑さは有意に低減した。この改善された作製および精製プロセスを組換えポリオウイルスまたは他のウイルスの臨床的製造に使用することができ、その結果、最終的な精製産物の作製収率、感染力、および純度の改善のうちの１つまたは複数がもたらされる。例えば、開示されている方法を、他の組換えウイルス、例えば、不安定なプラスミドベクターから作製された組換えウイルスの臨床的製造のために使用することができる。インタクトなネイティブなＲＮＡウイルス配列（特に、ｓｓＲＮＡウイルスに由来するもの）を含有するＥ．ｃｏｌｉにおいて増やしたプラスミドはいずれも、本質的に不安定である。例としては、これだけに限定されないが、ＨＩＶ、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、狂犬病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルスおよび他の出血性ウイルスが挙げられる。
【０１２９】
クロマトグラフィー画分中の標的の検出
クロマトグラフィー画分中の分析物を検出するための種々の迅速な検出方法を改善された精製プロセスにおいて使用することができる。検出方法は、核酸を含有する分析物中の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）の検出を可能にすることができるものである。例示的な検出方法は、核酸配列決定、核酸の増幅（例えば、ＰＣＲ）、および標識された配列特異的核酸プローブを使用した直接検出を含む。一実施例では、標識は、蛍光または酵素的／比色定量に基づく。したがって、一部の実施例では、検出方法として、ウイルス配列に結合するプローブを使用した、迅速な直接配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａまたはナノポアに基づく方法からのもの）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴）およびＯｃｔｅｔ（干渉法）が挙げられる。一部の実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用する。定量的ＰＣＲとは、一般に、ＰＣＲ反応の開始時に使用される標的核酸配列の量の定量を可能にする方法を指す。
【０１３０】
定量的ＰＣＲ技法では、定量のための種々の手法を使用する。定量的ＰＣＲ法の１つの例は、ＲＴ−ｑＰＣＲ（逆転写定量的ＰＣＲ）である。本明細書では、「定量的ＰＣＲ」という用語は、最初に存在する標的核酸配列の定量を可能にするＰＣＲに基づく技法を全て包含する。「リアルタイムＰＣＲ」という用語は、ＰＣＲ反応全体を通して、またはリアルタイムでのＰＣＲ産物の検出を可能にする定量的ＰＣＲ技法のサブセットを意味する。リアルタイムＰＣＲの原理は、一般に、Heldら、Genome  Research、６巻：９８６〜９９４頁（１９９６年）に記載されている。一般に、リアルタイムＰＣＲでは、各増幅サイクルでシグナルを測定する。従来のリアルタイムＰＣＲ技法は、増殖サイクル（multiplication  cycle）が完了するごとにシグナルを放射するフルオロフォアに依拠する。そのようなフルオロフォアの例は、ＳＹＢＲグリーン等の、二本鎖ＤＮＡに結合すると定義された波長で蛍光を放射する蛍光色素である。したがって、各増幅サイクルの間の二本鎖ＤＮＡの増加により、ＰＣＲ産物の蓄積に起因した蛍光強度の増加がもたらされる。リアルタイムＰＣＲにおいて使用されるフルオロフォアの別の例は、配列特異的蛍光レポータープローブである。そのようなプローブの例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびＦＲＥＴプローブである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、フルオロフォアおよびフルオロフォアにより放射される蛍光を低減する蛍光クエンチャーを含有する。ＰＣＲの伸長相の間、プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって切断され、それにより、フルオロフォアが放出される。フルオロフォア放出により、ＰＣＲ産物の量に比例する蛍光シグナルの増加がもたらされる。ＦＲＥＴプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用する。２つの標識された配列特異的プローブを設計して、ＰＣＲのアニーリング相の間にＰＣＲ産物に結合させ、それにより、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアへのエネルギー移動が生じる。その結果、アニーリング相の間の蛍光の増加がもたらされ、これは、ＰＣＲ産物の量に比例する。配列特異的レポータープローブの使用により、標的配列の検出が高い特異性でもたらされ、非特異的ＤＮＡ増幅の存在下であっても定量が可能になる。異なる色の標識を有する特異的なプローブに基づいて同じ反応でいくつかの遺伝子を検出するための多重アッセイにおいて蛍光プローブを使用することもできる。例えば、多重アッセイでは、種々のフルオロフォア（これだけに限定されないが、ＦＡＭ、ＪＡ２７０、ＣＹ５．５、およびＨＥＸを含む）で標識された、いくつかの配列特異的プローブを同じＰＣＲ反応混合物において使用することができる。
【０１３１】
精製されたウイルスの使用
開示されている方法を用いて精製されたウイルスは、臨床的に、例えば、がん免疫療法等において、または、防御免疫応答をもたらすために、ワクチンとして使用することができる。
【０１３２】
一実施例では、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ等の精製されたポリオウイルスを使用して、神経膠芽腫等のがんを有する被験体を処置する。例えば、被験体に、直接腫瘍投与当たり約１×１０８  ＴＣＩＤ５０を投与することができる。少なくとも２週間後に、被験体は、生検を受けて、がんの診断／再発を確認することができる。診断が確認されたら、被験体に、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ（５×１０７  ＴＣＩＤ５０）を対流増強送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するためのカテーテルを設置することができる。カテーテルの設置後、被験体に、ＰＶＳ−ＲＩＰＯを６．５時間にわたって注入する。注入の完了後にカテーテルを取り出すことができる。治療をモニタリングするためにＭＲＩを実施することができる。
【０１３３】
一実施例では、ポリオからの保護のために、弱毒化Ｓａｂｉｎポリオウイルス等の精製されたポリオウイルスを使用して被験体にワクチン接種する。例えば、精製された弱毒化Ｓａｂｉｎポリオウイルスを、単回用量で経口投与することができる（通常、１，０００，０００感染単位のＳａｂｉｎ  １（ＰＶ１に対して有効）、１００，０００感染単位のＳａｂｉｎ  ２株、および６００，０００感染単位のＳａｂｉｎ  ３を含有する２滴）。そのようなワクチンは、微量の抗生物質（例えば、ネオマイシンおよびストレプトマイシン）も含み得るが、防腐剤は含まない。
【０１３４】
一実施例では、ポリオからの保護のために、不活化ポリオウイルス等の精製されたポリオウイルスを使用して被験体にワクチン接種する。例えば、精製されたＯＰＶを、単回用量で注射により投与することができる（例えば、ジフテリア、破傷風、および無細胞百日咳ワクチンと一緒に）。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１）
細胞培養でのＰＶＳ−ＲＩＰＯの生産
【０１３６】
細胞培養
Ｖｅｒｏワーキングセルバンク細胞（ロット２１７００２−２）の２個のバイアルを解凍した。それぞれのバイアルの内容物を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を有する加温した完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）９ｍＬに添加した。細胞カウントを行って、細胞を１０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。全ての細胞を再懸濁させて、１つの７５ｃｍ２フラスコに入れた。フラスコのキャップを緩めてインキュベータに入れた。これは、継代数１４２（解凍後の継代数１）であった。新しい培地を２回再供給して（two  re-feeds）１週間後、細胞をトリプシン処理し、新しい７５ｃｍ２フラスコに２０，０００個／ｃｍ２で播種して再分散させた（継代数１４３）。この時点で細胞の生存率は９２％であった。
【０１３７】
７５ｃｍ２フラスコの細胞を、２個の２２５ｃｍ２フラスコにスケールアップして、３３，２８０個／ｃｍ２で播種した（継代数１４４）。この時点で、細胞は９４％生存であった。３日後、細胞は１００％生存であった。両方の２２５ｃｍ２フラスコを共にプールした。プールの前後の両方で得られたいくつかの試料の最終細胞密度は、２１３，０００〜２３４，０００個の細胞／ｃｍ２の範囲であり、試料中の細胞生存率は８６％〜９６％の範囲であった。
【０１３８】
２個の２２５ｃｍ２フラスコの細胞から得た培養物を、３個の２２５ｃｍ２フラスコに播種して（継代数１４５）、「セルファクトリー」（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）とも記述されうる１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）細胞培養チャンバーにスケールアップした。最初に、３個の２２５ｃｍ２からの細胞を６個の２２５ｃｍ２フラスコに増大させた。これらの６個のフラスコの細胞（継代数１４７）をトリプシン処理して、共にプールした。このプールから、１個の５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、１個の１段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、および５個の２２５ｃｍ２フラスコに、細胞３９，０００個／ｃｍ２（全て、継代数１４８）で播種した。
【０１３９】
５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー（継代数１４８）を使用して、１個の１０段および４個の１段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーに４２，０００個の細胞／ｃｍ２で播種した。１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーを感染の１つのために使用した。１個の１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーの播種から感染までの時間は、９０時間であった。４個の１段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーのうちの１個の細胞をカウントして、１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーを感染させるために必要なウイルス量を決定した。この時点での細胞カウントは、３３２，９３２個の細胞／ｃｍ２であり、細胞は９６％生存であった。もう１つの１段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーを、対照として使用した。
【０１４０】
最初の２２５ｃｍ２フラスコから作製した１段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（継代数１４８）を使用して、５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー（継代数１４９）を作製した。次に、この５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーを使用して、２個の１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー（継代１５０）に４２，０００個／ｃｍ２で播種した。２個の１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーの播種から感染までの時間は９４時間であった。これらの２個の１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーを、他の２つの感染のために使用した。
【０１４１】
感染
ＭＶＢロットを使用して産生細胞を感染させた。ＰＶＳ−ＲＩＰＯロットおよびＭＶＢロットを生産するための手順を以下に要約する。Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロットを、世界保健機構のシードのＶｅｒｏ細胞を使用して作製した。Ｖｅｒｏ細胞をトリプシン処理によって採取した。遠心分離後、細胞を、９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の凍結保護剤溶液におよそ１×１０７個の細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。Ｖｅｒｏ  ＷＣＢロットを、以下のようにＶｅｒｏ  ＭＣＢロットの増大によって生産した。Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロットの１個のバイアルを使用してＶｅｒｏ  ＷＣＢを開始した。高グルコース、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、およびＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で４回継代後、ＷＣＢを体積１ｍＬ／バイアルおよび濃度４．７×１０６個の細胞／ｍＬでバイアルに充填した。ＶｅｒｏマスターＷＣＢロットを含有するバイアルを、気相式液体窒素に入れた。ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡロットを生産した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロット４０μｇをＳａｌ  Ｉ消化によって線状にした。線状化ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出して、エタノール沈殿を、−７０℃以下で一晩実施した。ＤＮＡを、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーの蒸留水４０μＬに再懸濁させた。消化／精製前および消化／精製後のプラスミドＤＮＡの試料を、アガロースゲル電気泳動によって分析して、産物サイズおよび回収率を確認した。
【０１４２】
線状化ＤＮＡ  ２０μｇを鋳型として使用して、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡを２つの同一の反応で合成した。それぞれの反応を、線状化ＤＮＡ  １０μｇを使用して実施した。反応を開始するために、線状化プラスミドＤＮＡ  １０μｇをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応ミックス（ＲｉｂｏＭＡＸ大規模ＲＮＡ産生システム、Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加して、最終体積を１００μｌとした。転写反応物を３７℃で２．５〜３時間インキュベートした。反応が完了したときに、反応チューブを保存のため−７０℃以下に置いた。適格なワーキングセルバンク（ＷＣＢ）からのＶｅｒｏ細胞を電気穿孔ステップに使用した。Ｖｅｒｏ細胞ＷＣＢロットの２個のバイアルを、Ｌ−グルタミンを有し１０％ＦＢＳを富化した、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ中で増大させて、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートして３回継代した。
【０１４３】
トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加して、Ｖｅｒｏ細胞をトリプシン処理して、３７℃および５％ＣＯ２で４〜６分間インキュベートした。トリプシン処理した細胞を収集しておよそ４℃および１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。収集した細胞をＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）１００±２ｍＬに懸濁させた。細胞懸濁液の試料を使用して細胞カウントを決定した。残りの細胞を１０００ＲＰＭおよび４℃の設定で１０分間の遠心分離によって収集した。清澄化したＰＢＳを除去して、細胞ペレットを、最終的な計算細胞密度１．２５×１０７個の細胞／ｍＬとなるように新しいＰＢＳに再懸濁させた。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡおよそ５５μｇおよび増大させたＶｅｒｏ細胞９ｍＬを混合して、０．８ｍＬアリコートでキュベットに移した。キュベットの内容物に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ電気穿孔ユニットを使用して、０．５キロボルトおよび０．２５マイクロファラッドで２回の電気ショックを与えた。室温で１５〜２０分間インキュベートした後、キュベットの内容物を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＴ７５フラスコに移した。Ｔ７５フラスコを３３℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。完全な細胞変性効果がインキュベーションの３日目に観察された。
【０１４４】
フラスコの内容物を、遠心分離によって採取して清澄化して、初回ウイルスシード（ＩＶＳ）ロットを得た。Ｖｅｒｏ細胞増大は以下の通りであった：Ｖｅｒｏ細胞を、Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２個のＴ２５フラスコに播種して、３７℃および５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベータでインキュベートした。Ｖｅｒｏ細胞を、３回の細胞継代後に５０個のＴ１６２フラスコへとさらに増大させた。３回目の継代の３日目に、５０個のＴ１６２フラスコの内容物を顕微鏡下で調べて、細胞の状態を決定した。純粋な培養物で少なくとも９５％コンフルエントである４３個のフラスコを選択した。選択したＴ１６２フラスコの１つにおける細胞を調べて、細胞数および生存率を決定し、もう１つのフラスコを細胞の品質管理フラスコとしてインキュベートした。残りの４１個のフラスコのうち１つを、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ：栄養混合物Ｆ１２の１：１混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の接種後に陰性対照として維持した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ電気穿孔後シードロットを、保管庫から取り出して室温で解凍し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用して希釈した。４０個のＴ１６２フラスコ（増大させたＶｅｒｏ細胞を含有する）にＰＶＳ−ＲＩＰＯ電気穿孔後シードロットを感染多重度（ＭＯＩ）０．５で感染させた。新しいＤＭＥＭ／Ｆ−１２細胞培養培地を添加した後、接種したフラスコを、３３℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。ウイルス感染フラスコおよび対照フラスコを、目に見える汚染、細胞の状態、およびパーセントコンフルエンシーなどの属性に関して、インキュベーションの間モニターした。
【０１４５】
感染の７０時間後、インキュベーションを終了して、フラスコを、目に見える汚染、細胞状態、およびパーセントコンフルエンシーなどの属性に関して調べた後、採取した。フラスコの内容物を遠心ボトルに移して、４℃および２５００ＲＰＭで３３分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスを含有する上清を、８５０ｃｍ２ローラーボトルにプールした。プールした上清を２個の３０ｍＬおよび２４個の１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトルにそれぞれ、２０ｍＬおよび８０ｍＬアリコートで移した。さらに、１２個の２ｍＬクライオバイアルに１ｍＬアリコートを充填した。残りの上清（全体で３．８ｍＬ）を、３個の２ｍＬクライオバイアルに移し、全体で１５個の２ｍＬクライオバイアルを得て、これらをＰＶＳ−ＲＩＰＯマスターウイルスシードロットとしてラベル表示した。１１個の２ｍＬクライオバイアル、２３個の１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトル、および２個の３０ｍＬ  ＰＥＴＧボトルを−７０℃以下で凍結した後、−７０℃以下の制御保管庫（controlled  storage）に移した。２ｍＬクライオバイアルのうちの４個を、力価（ｐｆｕおよびＴＣＩＤ５０による）、ウイルス粒子、およびＤＮＡ配列放出試験に関するプロセス解析／生物学的製剤品質管理に提出した。放出試験の残りを必要に応じて実施し、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ材料取り扱い手順を開発した。
【０１４６】
先の章で産生された細胞培養物を有する３個の１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーを、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって洗浄した後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、感染多重度（ＭＯＩ）０．１で感染させた。Ｐ１マスターウイルスバンク（ロット番号Ｌ０４０３００６）の８０ｍＬアリコート１個を解凍し、２１ｍＬアリコートを使用して、５％ＣＯ２インキュベータにおいて３３℃で７２時間、それぞれの１０段細胞チャンバーに感染させた。１０段のセルファクトリーを、顕微鏡を使用して１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を視覚的に確認した後、感染の７０時間後に採取した。採取した材料を４℃、３，８００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を直ちに処理するか（ロット番号Ｌ１３０８００２Ｂ、表３を参照されたい）、または精製するまで最大９日間−７０℃で保存した（ロット番号Ｌ１３０８００２ＣおよびＬ１３０８００２Ｄ、表３を参照されたい）。
【０１４７】
（実施例２）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯの精製
３個の１０段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバーのそれぞれからの採取物を、図５に模式的に図示するプロトコールに従って、すなわちヌクレアーゼ処理後にゲル濾過クロマトグラフィーを行い、その後にｑＰＣＲ分析を行い、その後に陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、その後に透析濾過による濃縮を行うことによって精製した。精製プロトコールを３回の産生実行のそれぞれに関して繰り返した。
【０１４８】
ヌクレアーゼ処理
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、溶液中の遊離のＲＮＡおよびＤＮＡの両方を消化するエンドヌクレアーゼである。完全に封入されたウイルス核酸（すなわち、インタクトウイルス粒子に含有される）は、影響を受けない。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素は、１）宿主細胞ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）およびＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）；２）存在する場合、他の可能性がある混入ＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、内因性／外因性ウイルス）；３）封入されていない遊離のウイルスＲＮＡ、を低減および／または除去するために必要である。遊離の核酸の除去は、安全性、採取粘度の低減、ならびにＡ２５４ｎｍおよびＲＴ−ｑＰＣＲなどの下流のウイルス検出方法のシグナル対ノイズ比の改善という理由から必要である。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素の性能は、それが含有される緩衝溶液に左右される。
【０１４９】
１００ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２の最終濃度が得られるように、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素の添加前に３つの清澄化採取物のそれぞれに添加した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素の添加は、それぞれの採取物において５０μｇ／ｍＬの最終Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素濃度が達成されるように採取物の体積に基づいた。次に、それぞれの採取ボトルを２〜８℃で１６〜２４時間インキュベートした。
【０１５０】
ゲル濾過クロマトグラフィー
１０ｃｍ（内径（ｉ．ｄ．））ＢＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）にＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）３１４０ｍＬを４０ｃｍのベッド高まで充填した。使用前に、充填したカラムを０．５Ｎ  ＮａＯＨによって消毒して、周囲温度で２６〜２８時間静置した。カラムに水を流して、カラムを精製プロセスまで０．０５Ｍ  ＮａＯＨ中で保存した。精製前に、カラムに５Ｍ  ＮａＣｌを流して、精製プロセスを開始するまで５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で２４時間静置した。次に、カラムを２カラム容積の４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．５で飽和し、３カラム容積の４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５によって流速５０ｍＬ／分で平衡化した。
【０１５１】
３つの精製のそれぞれに関して、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素処理採取物を、１カラム注入において２５％カラム容積、３０ｃｍ／時間でアプライした。カラムを４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５の緩衝液を使用して溶出させた。溶出液の吸光度を、３波長（２８０／２１５／２５４ｎｍ）を使用して連続的にモニターし、伝導率も同様に連続的に測定した。それぞれのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦクロマトグラフィーカラムステップからの溶出画分を、１５０〜２００ｍＬの体積で収集した。３つの実行全てからの選択画分を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ（実施例３を参照されたい）によって分析して、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ分析からのＰＶＳ−ＲＩＰＯコピー数（＞１×１０７コピー／ｍＬ）に基づいてプールした。プールした材料を第２のクロマトグラフィーステップで精製した。
【０１５２】
陰イオン交換クロマトグラフィー
２．６ｃｍ（ｉ．ｄ．）ＸＫカラムにＳｕｐｅｒ  Ｑ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）５３ｍＬを、最終ベッド高１０ｃｍとなるように充填した。充填したカラムを０．５Ｎ  ＮａＯＨによって消毒して、周囲温度で１時間静置した。充填したカラムに水を流してＮａＯＨを除去した後、カラムに５Ｍ  ＮａＣｌを流して、５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で２４時間静置した。
【０１５３】
カラムを、４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５で飽和し、４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５によって１０ｍＬ／分の流速で平衡化した。３回の精製のそれぞれに関して、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦプール画分を単一カラム注入でアプライした。カラムを、４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５の緩衝液を使用して溶出した。溶出液の吸光度を、３波長（２８０／２１５／２５４ｎｍ）を使用して連続的にモニターして、伝導率も同様に連続的にモニターした。収集したメインピークは、フロースルーピークであり、夾雑物はカラムに結合した。メインピークの収集後、カラムを４．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．５を使用してストリップして、二次容器にストリップピークを収集し、一例において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１５４】
濃縮／透析濾過
次に、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ６５０Ｍカラム後に収集したフロースルーピークをおよそ５０ｍＬまで濃縮して、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４  ５００ｍＬによって透析濾過した。それぞれの濃縮ステップにおいて、接線流濾過（ＴＦＦ）フィルターに５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４を２×２５ｍＬ流した。透過液を収集して、一例において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。フラッシュ液および濃縮精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯを共にプールして、２０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４を、０．２％ＨＳＡの最終調合物となるように精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯに添加した。
【０１５５】
プールおよびバイアル充填
最終調合したＰＶＳ−ＲＩＰＯの３個のロットを共にプールして、０．２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）２０フィルターを使用して濾過滅菌した。次に、濾過滅菌材料を、体積０．５ｍＬで３ｍＬガラスバイアルに分配した。バイアルを−７０℃で保存した。
【０１５６】
（実施例３）
精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯの分析
ゲル濾過ステップおよびクロマトグラフィーステップから選択した画分を、プラークアッセイ（ＮＩＨ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、生物学的製剤開発プログラム（ＢＤＰ）標準業務手順書（ＳＯＰ）２２１６３  ポリオウイルスのプラークアッセイ）において試験した。ＴＣＩＤ５０（ＢＤＰ  ＳＯＰ  ２２１６５、Ｈｅｐ−２Ｃ細胞を使用したポリオウイルスのＴＣＩＤ５０アッセイ）を、プールする前の最終バルク材料についての、３つの精製実行のそれぞれの終了時に実施した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯをモニターするために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィーの画分を、リアルタイムｑＰＣＲ（ＢＤＰ  ＳＯＰ２２１９５、核酸の検出および定量のための定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法）によってアッセイした。
【０１５７】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ画分を、ＰＶＳ−ＲＩＰＯのＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ領域を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのＲＴ−ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）アンプリコンを使用して総ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスＲＮＡに関して試験した。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ増幅の前に、画分試料を、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡＱ）ウイルスＲＮＡミニプレップキットを使用して抽出した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよび二重蛍光色素標識プローブを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して設計した。７１−ｂｐのＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ１）アンプリコンは、フォワードプライマー：5’-  (AAC  CCA  ATG  TGT  ATC  TAG  TCG  TAA  TGA)  (配列番号１);リバースプライマー:  5’-  (TGA  AAC  ACG  GAC  ACC  CAA  AG)  (配列番号２);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5’-[6FAM]-(  CAA  TTG  CGG  GAT  GGG  ACC  AAC  T)-[TAMRA]  (配列番号３)からなった。プライマーおよびプローブをそれぞれ、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）によって１０および５ｐｍｏｌ／μｌに希釈した。反応は、ＲＯＸ色素を含むＴａｑＭａｎ（登録商標）１−ステップＲＴ−ＰＣＲ  ２Ｘマスターミックス２５μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤１μｌ、ＮＦＷ  １μｌ、フォワードプライマー１μｌ、リバースプライマー１μｌ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ１μｌ、および試料２０μｌからなり、最終反応体積は５０μｌであった。（ＲＯＸ色素を含む１−ステップＲＴ−ＰＣＲ  ２Ｘマスターミックスは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から販売されている）。反応混合物を９６ウェルプレートにロードして、光学フィルムで覆い、５−ステップｑＰＣＲプロファイル（２．００分、５０．０℃；６０．０℃で４５分間（ＲＴ−ステップ）；５．００分、９５．０℃；９４．０℃で２０秒を４５サイクル、６２．０℃で１．００分）を使用して、ＡＢＩモデル７９００ＨＴ  ９６ウェル配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）によって増幅した。定量のためのアンプリコンｃＤＮＡ標準曲線は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡから作製され、ＮＦＷに１０倍連続希釈して反応あたり１ｎｇ〜１ｆｇとした。ＰＣＲ阻害、抽出、緩衝液／ＮＴＣ、および逆転写対照をそれぞれのアッセイに使用した。
【０１５８】
３つの精製実行のそれぞれからの精製産物は、一貫した結果を示した。表３は、精製収率を示す。全体的なＰＶＳ−ＲＩＰＯ収率は６０％またはそれ超であった。検出された回収率の変動はおそらく、部分的にプラークアッセイの変動によるものであった。その結果、プロセスの重要な段階では、エンドポイント希釈アッセイによって試料を分析した。このアッセイからの最終調合精製バルクの結果はそれぞれ、５．８３×１０１１、３．７７×１０１１、および２．９８×１０１１ＴＣＩＤ５０であった。これらの結果は、３つの精製に関して一定の収率および濃度を示す。
【０１５９】
３つの精製実行からのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラムとＳｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍカラムのクロマトグラフィープロファイルの比較から、ゲル濾過ステップおよび陰イオン交換クロマトグラフィーステップの両方で精製の一貫性が示された。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦクロマトグラムは、２つの明白なピークを含有した。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲによる画分分析により、図６に説明されるように、ＰＶＳ−ＲＩＰＯのメインピークが最初の小さいピーク内に位置することが示された。この直後の大きいピークは、残留塩であるようであった。波長２５４ｎｍで特異的にモニターする場合、光学的にモニターしたクロマトグラムとリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ結果とを比較できるように重ねると、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ含有画分の一部が光学的に検出されるピーク内に出現しなかったことが示された。したがって、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ結果は、どの画分がＰＶＳ−ＲＩＰＯを含有し（＞１０７コピー／ｍＬのカットオフを使用した）、さらなる処理のためにプールすべきであるかを確認するために重要であった。ＳｕｐｅｒＱ  ６５０Ｍクロマトグラムは、１つの大きいフロースルーピークを示した。ＳｕｐｅｒＱ  ６５０Ｍ精製ステップにおいて、フロースループロセスに何らかの余分な夾雑物が存在した。カラムを４．７Ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５の緩衝液でストリップすると、メインピーク収集の直後に大きいピークが出現した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ材料がプロセスを通して失われなかったことを確認する試みで、このピークから収集した試料ならびに濃縮ステップからの透過物試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。両方のアッセイから、ＰＶＳ−ＲＩＰＯがいずれの試料にも存在しないことが示された。
【０１６０】
最終濃縮／透析濾過プロセスの際に、ウイルスの外観は、濃縮されるにつれて半透明から乳白色に変化した。３つ全ての最終濃縮試料が同じ外観を示した。それらを共にプールして濾過すると、外観は、乳白色から透明／半透明の産物へと変化した。濾過前のＴＣＩＤ５０が１．４×１０１２であり、濾過後に２．４×１０１２であったことから、濾過プロセスによる産物の損失がないことが示された。バイアルに分配する前のＰＶＳ−ＲＩＰＯ産物の最終濃度は、６．０９×１０９  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであると決定された。
【表３−１】
2018527885.tif 000005
【表３−２】
2018527885.tif 000006
【０１６１】
（実施例４）
ワクチン組成物の精製
臨床で使用するための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）の精製は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素処理の後にＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦクロマトグラフィーを利用する。ＨＳＶキャプシドのサイズにより、濾過滅菌は使用しない。この問題は、宿主細胞ＤＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質と比較して、ウイルス画分の位置が、カラムのＡ２８０またはＡ２６０測定によって直ちに明らかとならないという点において、ＰＶＳ−ＲＩＰＯと同じである。このため、ＨＳＶ−１含有画分の同定を助けるために、ｑＰＣＲを本明細書において記述されるように使用することができる。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲに対する代替として、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）または表面干渉法（Ｏｃｔｅｔ）アプローチを使用して、ＢＩＡコアチップまたはＯｃｔｅｔセンサー上のＨＳＶ−１カプシドエピトープ（結合）密度を定量してもよい。このようにして、カラム画分におけるウイルスの位置および量を独自に同定する。
【０１６２】
（実施例５）
非病原性腫瘍溶解性ポリオウイルスキメラ（ＰＶＳＲＩＰＯ）最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０のケミストリー、製造、および管理情報
本実施例は、神経膠芽腫の治療に使用するためのＰＶＳ−ＲＩＰＯロットＬ０９０４０１０を生産するために使用される方法を記述する。図７に要約を提供する。簡単に説明すると、精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４を転写してＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡを産生した。次に、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡを、適格なＶｅｒｏ細胞に電気穿孔して、増大させ、初回ウイルスシードロットＬ０４０２０２６（Ｐ０）を生産した。初回ウイルスシードロットＬ０４０２０２６を、適格なＶｅｒｏ細胞において増大させて、マスターウイルスシードロットＬ０４０３００６（Ｐ１）を生産した。マスターウイルスシードロットＬ０４０３００６を増大させて精製し、精製濾過バルクロットＬ０９０４００９（Ｐ２）を生産した。精製濾過バルクロットＬ０９０４００９を充填してＦＶＰロットＬ０９０４０１０を生産した。得られた濃縮精製ウイルスを、０．９％塩化ナトリウム中の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋０．２％ヒト血清アルブミンにおいて調合して、濾過滅菌した。
【０１６３】
ＰＶＳＲＩＰＯ−ｋａｎ／ｐＵＣプラスミドＤＮＡ配列（ロットＬ０４０１０１４）に関して完全長の配列決定を行った。ロットＬ０４０１０１４を、現行の医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＣＧＭＰ）下で生産および精製して、これをさらに使用してマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６を生産し、次いでＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９および最終のバイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０を生産した。配列は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミド参照配列ロットＬ０３０５００７と１００％相同であることが見出された。プラスミドＤＮＡについて実施したＢＬＡＳＴｎ検索から、腫瘍形成性、毒性、または予想外のウイルス配列が存在しないことが示された。
【０１６４】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯゲノム配列の配列決定もまた、マスターウイルスシードロットＬ０４０３００６、精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９、および最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０からの材料を使用して実施し、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ参照配列ロットＬ０４０１０１４と１００％の相同性を確認した。
【０１６５】
材料
ＰＶＳＲＩＰＯの製造に使用した動物起源の原材料には、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清アルブミン、およびトリプシン−ＥＤＴＡが挙げられる。原材料の製造元は、以下を示す文書を提供した：
（１）Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素調製物は、発酵増殖培地中で牛乳からカザミノ酸を使用する微生物発酵によって組換えにより産生した。牛乳は、１９９０年以降その地域で飼育された動物においてＢＳＥ症例が記録されていない国を起源とし、ヒトによる消費にとって適合すると考えられる。
（２）ＦＢＳは、米国内のＵＳＤＡ監査屠畜場で収集したウシ胎児血液から製造され、検査したウシウイルスに関して陰性であった。
（３）ＨＳＡは、ヒトでの使用に関する販売のために血漿誘導体を製造および調製することがＵＳ  ＦＤＡにより認可された施設であるＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製であった。血漿は、ＵＳＡにおいてＵＳドナーに限って収集され、関係するＵＳ  ＦＤＡ規則に従った。
（４）トリプシンはブタ起源であり、米国／カナダを起源とした。原料トリプシンを試験して、ブタパルボウイルスに関して陰性であることが見出され、調合前に放射線照射した。
【０１６６】
遺伝子構築物
ａ．ＰＶＳＲＩＰＯプラスミド
組換えＰＶＳＲＩＰＯ  ＤＮＡ（７．７ｋｂ）を改変ｐＵＣ１９ベクター（アンピシリン耐性遺伝子の代わりにカナマイシン耐性遺伝子を有する）にクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換して、プラスミドＤＮＡを増幅した。ＰＶＳＲＩＰＯ−ｋａｎ／ｐＵＣ１９プラスミド地図を図８に示す。
【０１６７】
ｂ．ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスゲノム
ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（５’−ＮＴＲ）、ＰＶＳ−ＲＩＰＯオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および３’非翻訳領域（３’−ＮＴＲ）からなる。５’−ＮＴＲは、ヒトライノウイルス２型内部リボソーム侵入部位（ＨＲＶ−ＩＲＥＳ）を含有する。ＰＶＳ−ＲＩＰＯオープンリーディングフレームは、単一のタンパク質をコードし、これはタンパク質分解によってウイルス構造タンパク質（Ｐ１）および非構造タンパク質（Ｐ２およびＰ３）へとプロセシングされる。Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３は、さらにプロセシングを受ける。ＰＶＳ−ＲＩＰＯゲノムは、ＨＲＶ−ＩＲＥＳ領域を除き、弱毒化ポリオウイルスＩ型Ｓａｂｉｎ株と同じである。ＰＶＳ−ＲＩＰＯの遺伝子型は、５’−クローバー葉構造［ＰＶ１（Ｍ）；Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＣ＿００２０５８；ヌクレオチド１〜１０９］−制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの切断部位−ＩＲＥＳ［ＨＲＶ２；Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＸＯ２３１６；ヌクレオチド１０５〜６１０］−オープンリーディングフレーム［ＰＶ１（Ｓ）；Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１１５０；ヌクレオチド７４３〜７３６９；ヌクレオチド７４８（ｔからａ）］−３’ＵＴＲ［ＰＶ１（Ｓ）；ヌクレオチド７３７０〜７４４１］−ポリ（Ａ）である。
【０１６８】
ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡの生産
ロットＬ０４０１０１４  ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ生産プロセスを図９に説明する。
【０１６９】
ａ．宿主細胞系の説明および試験
宿主細胞系であるＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た後、適格であることを確認して、ＢＤＰで増大させて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αマスターセルバンク（ＭＣＢ）ロットＬ０３０１０１４を生産し、その後Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αワーキングセルバンク（ＷＣＢ）ロットＬ０３０３０１１を生産した。
【０１７０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＭＣＢロットＬ０３０１０１４は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αロット１１５９２５１の１つのバイアル（およそ１ｍＬ）を、それぞれが滅菌調製培養培地（塩化ナトリウム１０ｇ／ｍＬ、ソイトン１０ｇ／ｍＬ、および酵母抽出物５ｇ／ｍＬ）１５０ｍＬを含有する３個の５００ｍＬフラスコ中での増大によって生産した。凍結したバイアルを３７±１℃のインキュベータ内で５分間解凍した。接種した培養培地を３７±１℃でおよび１５０±１０ｒｐｍでおよそ１８時間インキュベートした。グリセロール溶液を、最終グリセロール濃度が２０％となるように、フラスコ１の内容物（ＯＤ６００＝４．３１）と混合した。細胞懸濁液を１．０±０．２ｍＬ／バイアルでバイアルに充填して、１４４個の充填済みバイアルを得た。充填済みバイアルを、速度制御凍結（controlled-rate  freeze）を使用して−７０℃以下に凍結して、−７０℃以下の制御保管庫に入れた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＭＣＢロットＬ０３０１０１４の規格および放出試験結果を図１０の分析証明書に提供する。
【０１７１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＷＣＢロットＬ０３０３０１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＭＣＢロットＬ０３０１０１４の２個のバイアル（２個のバイアルのおよそ全量＝２ｍＬ）を、それぞれが滅菌調製培養培地（塩化ナトリウム１０ｇ／ｍＬ、ソイトン１０ｇ／ｍＬ、酵母抽出物５ｇ／ｍＬ、および硫酸マグネシウム七水和物５ｇ／ｍＬ）４０ｍＬを含有する３個の１２５ｍＬ第１段階シードフラスコ（接種容積はおよそ４００μＬ）、次いでそれぞれが同じ滅菌調製培養培地３９０ｍＬを含有する２個の２Ｌ第２段階シードフラスコ（接種容積はおよそ４ｍＬ）において増大させることによって生産した。凍結バイアルを３７±１℃のインキュベータで５分間解凍した。接種した培養物を３７±１℃および２３５ｒｐｍに設定した速度でインキュベートした。第１段階シードフラスコをＯＤ６００＝２．５となるまで一晩（およそ１６時間）インキュベートし、第２段階シードフラスコを、ＯＤ６００＝０．３６１となるまでおよそ２．６時間インキュベートした。第２段階シードフラスコ１の内容物を、以下の設定で７分間遠心分離した：１６００×ｇおよび４℃。細胞ペレットを１００ｍＭ塩化カルシウム／１５％ｖ／ｖグリセロール溶液中に再懸濁させて、以下の設定で５分間遠心分離した：１１００×ｇおよび４℃。得られた細胞ペレットを、１００ｍＭ塩化カルシウム／１５％ｖ／ｖグリセロール溶液中に再懸濁させて（最終グリセロール濃度は１５％）、０．１５ｍＬ／バイアルの体積でバイアルに充填し、９５個の充填済みバイアルを得た。充填済みバイアルをドライアイス／エタノール浴中で凍結させて、−７０℃以下の制御保管庫に入れた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＷＣＢロットＬ０３０３０１１の規格および放出試験結果を図１１の分析証明書に提供する。
【０１７２】
ｂ．精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０２１２１７を生産するための起源のＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡの精製
起源のＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡは、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌにより提供された。この材料を使用してさらなるプラスミドＤＮＡを作製して精製した。起源のＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ  １０マイクロリットル（μＬ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１８２６３−０１２）に形質転換した。プラスミドミニキットおよびマキシキット（それぞれ、Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２７１０４および１２１６５）を使用して、得られた１８個の形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡ、およびＤｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌから得た起源のＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動および制限酵素消化によって分析した。分析結果により、２．５ｋｂから１０．３ｋｂの範囲で多数のバンドが観察されることが示された。さらに調べるために形質転換体１０個を選択した。制限酵素消化分析に基づいて、Ｓ−１と同定された形質転換体の１つからのＤＮＡを配列決定すると、１．３キロベース（Ｋｂ）の挿入を有することが見出され、これはＢＬＡＳＴｎによって細菌ミニトランスポゾンＩＳ１０Ｒであると決定された。他のコロニーは、空のベクター（およそ２．５ｋｂ）、二量体ベクター（およそ５．０ｋｂ）、またはＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ（およそ１０ｋｂ）のいずれかとして出現した。
【０１７３】
アガロースゲル電気泳動を使用して、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌから得た起源のＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡのバンド形成パターンをさらに分析した。８個のバンドをゲルから切り出して、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２７１０４）を使用して精製し、−２０℃で保存した。８個のバンドのそれぞれからの精製したＤＮＡを、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換して、選択した形質転換体を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した液体ソイ−ＬＢ培地中で、３７℃で一晩成長させた。ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２７１０６）を使用して精製したＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動および制限酵素消化によって分析した。＃６−３（バンド＃６の形質転換から）および＃５−３（バンド＃５の形質転換から）として同定された２つのクローンは、正確なプラスミドサイズを保有するようであり、さらに調べるために選択した。
【０１７４】
２つのクローン＃６−３および＃５−３をそれぞれ、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するソイ−ＬＢ培地において３７℃および１２０回／分（ＲＰＭ）で増大させ、細胞を収集した。ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドメガキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２２８１）をＤＮＡ精製のために使用した。制限酵素消化分析により、２つのクローンのそれぞれからの精製プラスミドＤＮＡが、正確な制限酵素パターンを有することおよび１．３Ｋｂのインサートが存在しないことが示された。クローン＃６−３から増大させたロットにロット番号Ｌ０２１２１７を割付し、精製したロットＬ０２１２１７のＤＮＡを配列決定した。得られた配列は、予想される正確な配列と１００％相同であることが見出された。ロットＬ０２１２１７を１ｍＬアリコートで、−７０℃以下で凍結した。
【０１７５】
ｃ．精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ受託バンクロットＬ０３０５００７の生産および試験
精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０３０５００７受託バンクを、精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０２１２１７から生産した。精製プラスミドＤＮＡロットＬ０２１２０１７の２個のバイアルおよびＤＨ５αコンピテントワーキングセルバンクロットＬ０３０３０１の６個のバイアルを、−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、クールパック（０〜−２０℃）上で解凍した。６個の解凍ＤＨ５αコンピテントワーキングセルバンクロットＬ０３０３０１１バイアルの内容物を合わせて、１００μＬを３本の冷却チューブのそれぞれに分注した。精製ＤＮＡロットＬ０２１０１７を、エンドトキシンフリーの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で５倍希釈した。希釈したＤＮＡロットＬ０２１２１７の１μＬを２本の冷却チューブに加え、第３のチューブを陰性対照として使用した。３本のチューブを密封してクールパック上でおよそ３０分間インキュベートした。次に、３本のチューブを４０±２℃の水浴中におよそ４２秒間入れて熱ショックを与えた。チューブをクールパック上でおよそ４分間冷却した。バイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）内で作業して、ソイトン−ＬＢ培地（ソイ−ＬＢ培地の調合に関しては表４を参照されたい）およそ９００μＬを３本のチューブのそれぞれに添加して、チューブを３７℃および１２０ＲＰＭの設定でおよそ１時間インキュベートした。プラスミド調製溶液を含有する２本のチューブのそれぞれからのアリコート（１００、２００、および４００μＬ）を、ソイトン−ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン寒天プレート（ソイ−ＬＢ寒天プレートの調合に関しては表５を参照されたい）上に、全体で６個のプレートについて均一に分配した。陰性対照チューブ（２００μＬ）の内容物をソイトン−ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン寒天プレート上に均一に分配した。７個のプレートを３７℃の設定で一晩インキュベートした。
【表４】
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【表５】
2018527885.tif 000008
【０１７６】
それぞれが、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した滅菌のソイトンＬＢ培地５０±１ｍＬを含有する、２５０ｍＬシェークフラスコを使用して６個のスターター培養物を調製した。接種したソイトン−ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン寒天プレートをコロニーの成長に関して調べ、６個のスターター培養物のそれぞれに単一のコロニーを接種した。接種したフラスコを３７℃および１２０ＲＰＭの設定で一晩インキュベートした。
【０１７７】
１ミリリットル試料を、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ分析のために各スターター培養フラスコから取り出し、培養フラスコを２〜８℃で保存した。１個のフラスコを選択して、４個の２Ｌ培養フラスコ（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充したソイトン−ＬＢ培地６００ｍＬを含有する）のそれぞれにおよそ３ｍＬ（０．５％）の接種物を与えた。接種したフラスコを、３７℃および１２０ＲＰＭの設定で一晩インキュベートした。
【０１７８】
培養物を、４℃、６０００×ｇの設定でおよそ１５分間の遠心分離によって採取した。上清を廃棄物としてデカントして捨て、細胞ペーストを全体で１６．１グラム収集した。細胞ペーストを４個のサブバッチに分けて、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドギガキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２３９１）を使用して精製した。精製後、４個のサブバッチのそれぞれを２〜８℃で保存した。４個のサブバッチをプールして、エンドトキシンフリーの１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を使用して、最終濃度０．５±０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡを、２ｍＬクライオバイアルに１．０±０．１ｍＬアリコートで充填してＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０３０５００７としてラベル表示し、さらなる製造での使用のために−７０℃以下で保存した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０３０５００７の試験の要約を表６に提供する。
【表６】
2018527885.tif 000009
【０１７９】
ｄ．精製ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４を生産するための発酵およびＤＮＡ精製
精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０３０５００７およびＧＭＰ  ＤＨ５アルファコンピテントワーキングセルバンクロットＬ０３０３０１１を、ＤＮＡ形質転換のために使用して、精製ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４を生産した。コンピテント細胞（ＤＨ５αコンピテントワーキングセルバンクロットＬ０３０３０１１）を解凍して、穏やかに混合し、冷却したポリプロピレン微量遠心チューブ（濡れた氷上）に１００μＬアリコートで移した。
【０１８０】
精製ＤＮＡロットＬ０３０５００７を、エンドトキシンフリーの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で１０倍希釈した。希釈したＤＮＡ  １マイクロリットルを、コンピテント細胞アリコートを含有する微量遠心チューブに添加した。微量遠心チューブの内容物を穏やかに混合した。コンピテント細胞／精製ＤＮＡ懸濁液を氷上で３０±１分間インキュベートした後、４０±２℃に設定した水浴中で４５±２秒間の熱ショックステップに供した。コンピテント細胞／精製ＤＮＡ懸濁液を濡れた氷上に２分間置いた。室温のソイ−ＬＢ培地（０．９ｍＬ）をそれぞれの微量遠心チューブに添加した。ソイ−ＬＢ培地調合を表４に記述する。懸濁液を１２０ＲＰＭの速度設定で３７±１℃で６１分間振とうさせて、５０μｇ／ｍＬカナマイシンと共に調製した選択的寒天プレート（ソイ−ＬＢ寒天プレート）に１００μＬ、２００μＬ、および４００μＬアリコートを広げた。選択的寒天培地を表５に記述する。プレートを３７±１℃で２０時間５８分間インキュベートして、翌日、コロニーの成長に関して調べた。
【０１８１】
２５０ｍＬバッフル付きフラスコ中で５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するソイ−ＬＢ培地５０ｍＬを使用して、１２個のスターター培養物を調製した。１２個のスターター培養物のそれぞれに、選択的寒天プレートからの新しい単一コロニーを接種した。１２個のスターター培養物を、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）での光学密度が１超または１に等しくなるまで２２時間成長させた。インキュベーションは、１２０ＲＰＭの速度に設定した３７±１℃のシェーカー／インキュベータ中で実施した。翌日、１２個のスターター培養物のそれぞれを、Ｍｕｎ  Ｉを使用する制限酵素消化によって分析すると、バンドは予測されるサイズの１０％以内であることが見出された（試験報告ＱＣ−０２０６２８）。スターター培養物の１つを使用して、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを富化したソイ−ＬＢ培地６００ｍＬを含有する４個の２Ｌシェークフラスコのそれぞれに接種物３ｍＬ（０．５％）を与えた。接種した２Ｌシェークフラスコをシェーカー／インキュベータ内で１８．５時間成長させた。インキュベーションは、１２０ＲＰＭの速度に設定して３７±１℃で実施した。培養物を制限酵素消化によって調べると、対照および予想されるパターンと一致することが見出された。培養物を４℃および６，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって採取した。細胞を収集して、４個のサブバッチに分割し、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドギガキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２３９１）を使用して精製した。４個のサブバッチのそれぞれを制限酵素消化によって試験すると、対照および予想パターンと一致することが見出された。４個のサブバッチをプールして、エンドトキシンフリーの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を使用して、最終濃度０．３±０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。精製ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡを、２ｍＬクライオバイアルに１．０±０．１ｍＬアリコートで充填して、ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロット０４０１０１４としてラベル表示し、さらなる製造での使用のために−７０℃以下で保存した。
【０１８２】
ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４が適格であることを確認するために実施した試験、方法、規格、および結果を、分析証明書（図１２）に示す。
【０１８３】
ＰＶＳＲＩＰＯ初回ウイルスシードロットＬ０４０２０２６（Ｐ０）の生産
ＢＤＰウイルス生産施設で実施されたＰＶＳＲＩＰＯ初回ウイルスシードロットＬ０４０２０２６（Ｐ０）を生産するための製造プロセスを、図１３に要約して、以下に記述する。
【０１８４】
ａ．宿主細胞系の説明および試験
Ｖｅｒｏ細胞（世界保健機構［ＷＨＯ］シード、継代数１３４、１９８７年１０月）を使用して、Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロット２００３−００４９を作製した。Ｖｅｒｏ細胞をトリプシン処理によって採取した。遠心分離後、Ｖｅｒｏ細胞を、９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の凍結保護剤溶液中で濃度およそ１×１０７個の細胞／ｍＬで再懸濁させた。Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロット２００３−００４９の放出試験、方法、規格、および結果の要約を、図１４に示す分析証明書に含める。
【０１８５】
Ｖｅｒｏ  ＷＣＢロット２１７００２−２は、Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロット２００３−００４９の増大によって生産した。Ｖｅｒｏ  ＭＣＢロット２００３−００４９の１個のバイアルを使用してＶｅｒｏ  ＷＣＢを開始した。高グルコース、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、およびＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で４回継代後、ＷＣＢを体積１ｍＬ／バイアルおよび濃度４．７×１０６個の細胞／ｍＬでバイアルに充填した。ＶｅｒｏマスターＷＣＢロット２１７００２−２としてラベル表示されるバイアルを気相式液体窒素に入れた。Ｖｅｒｏ  ＷＣＢロット２１７００２−２の放出試験、方法、規格、および結果の要約を、図１５に含める。放出試験の１つは、４回継代されている細胞を使用してＶｅｒｏワーキングセルバンクロット２１７００２−２について実施した腫瘍形成能試験であった。試験結果から、Ｖｅｒｏ  ＷＣＢがこれらの条件下で非腫瘍形成性であることが示された。Ｖｅｒｏ  ＷＣＢ、ロット２１７００２−２を、ＰＶＳＲＩＰＯウイルス生産を通して使用した。ＷＣＢからの開始継代数は、継代数１４２であった。
【０１８６】
ｂ．ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡを合成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（Ｌ０４０２００１）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡロットＬ０４０２００１を生産した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０４０１０１４  ４０μｇをＳａｌ  Ｉ消化によって線状にした。線状化ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿を−７０℃以下で一晩実施した。ＤＮＡを、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーの蒸留水４０μＬ中に再懸濁させた。消化／精製前および消化／精製後のプラスミドＤＮＡの試料を、アガロースゲル電気泳動によって分析して、産物サイズおよび回収率を確認した。
【０１８７】
線状化ＤＮＡ  ２０μｇを鋳型として使用して、２つの同一の反応においてＰＶＳＲＩＰＯ  ＲＮＡを合成した。それぞれの反応は、線状化ＤＮＡ  １０μｇを使用して実施した。反応を開始するために、線状化プラスミドＤＮＡ  １０μｇを、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写反応ミックス（ＲｉｂｏＭＡＸ大規模ＲＮＡ産生システム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｐ１３００）に、最終体積１００μＬとなるように添加した。転写反応を３７±１℃で２．５〜３時間インキュベートした。反応が完了したとき、反応チューブを−７０℃以下の保管庫に入れた。
【０１８８】
産物サイズをチェックして反応からのＲＮＡの収率を推定するために、反応混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーの蒸留水およびＲＮＡ試料緩衝液を使用して１対１０または１対２０で希釈した。次に、希釈した反応混合物を、ＲＮＡ変性アガロースゲル［Ｒｅｌｉａｎｔゲル、１×ＭＯＰＳ緩衝液中の１．２５％  ＳｅａＫｅｍ  Ｇｏｌｄ、Ｌｏｎｚａ（以前にＣａｍｂｒｅｘとして公知）カタログ番号５４９４８］にＲＮＡラダー標準物質（ＲＮＡラダー、０．２４〜９．５ｋｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５６２０−０１６）と共にロードした。アガロースゲルにおいて観察されたＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物は、予想されるサイズを有することが見出された。反応混合物中のＲＮＡの推定濃度は６．６ｍｇ／ｍＬであった。
【０１８９】
ｃ．ＰＶＳＲＩＰＯ初回ウイルスシード（ロットＬ０４０２０２６）を生産するための電気穿孔
適格のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）ロット２１７００２−２からのＶｅｒｏ細胞を、電気穿孔ステップで使用した。Ｖｅｒｏ  ＷＣＢは、ＢＤＰで確立され、本明細書において記載される。Ｖｅｒｏ細胞ＷＣＢロットＬ２１７００２−２の２個のバイアルを、Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を含むフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において増大させて、３７℃および５％ＣＯ２の設定で３回継代の間インキュベートした。トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加して、３７℃および５％ＣＯ２の設定で４〜６分間インキュベートすることによって、Ｖｅｒｏ細胞をトリプシン処理した。トリプシン処理細胞を収集して、およそ４℃および１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。収集した細胞をＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）１００±２ｍＬに懸濁させた。細胞懸濁液の試料を使用して細胞カウントを決定した。残りの細胞を、１０００ＲＰＭおよび４℃の設定で１０分間の遠心分離によって収集した。清澄化したＰＢＳを除去して、細胞ペレットを、最終計算細胞密度１．２５×１０７個の細胞／ｍＬとなるように新しいＰＢＳに再懸濁させた。
【０１９０】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ロットＬ０４０２００１）およそ５５μｇと、増大させたＶｅｒｏ細胞９±０．２ｍＬとを混合して、０．８±０．０１ｍＬアリコートでキュベットに移した。キュベットの内容物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ電気穿孔ユニットを使用して、０．５キロボルト（ｋｖ）および０．２５マイクロファラッド（μＦ）で２回の電気ショックに供した。室温で１５〜２０分間インキュベーション後、キュベットの内容物を、次に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１０４１−０２５）を含むＴ７５フラスコに移した。Ｔ７５フラスコを３３℃および５％ＣＯ２の設定でインキュベートした。同じプロセスを繰り返して、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡをトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞のＴ７５フラスコを全体で２０個作製した。２つのさらなる対照フラスコは、電気穿孔後のＶｅｒｏ細胞、および電気穿孔に供しなかったＶｅｒｏ細胞のみを含有した。フラスコの内容物を、インキュベーション期間の間、細胞変性効果（ＣＰＥ）に関してモニターした。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡをトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞を含有する全てのフラスコにおいて、完全なＣＰＥがインキュベーションの３日目に観察された。
【０１９１】
バイオセーフティキャビネットにおいて作業して、フラスコの内容物を採取した後、遠心分離によって清澄化して、最初のウイルスシードロットＬ０４０２０２６（Ｐ０）を得た。２５００ＲＰＭの設定での３２分間の遠心分離後、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスを含有する上清を収集した。次に、上清をプールして、６個の１２５ｍＬポリエチレンテレフタレートグリコール（ＰＥＴＧ）ボトルに６０ｍＬアリコートで移し、４個の２ｍＬクライオバイアルに１ｍＬアリコートで移した。試料を、インプロセス試験のためのプロセス解析（生物学的製剤品質管理としても公知である）に提出した。６個のボトルをＰＶＳ−ＲＩＰＯ電気穿孔後シードロットＬ０４０２０２６としてラベル表示し、−７０℃以下の保管庫に移した。
【０１９２】
ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６（Ｐ１）の生産および試験
ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６（Ｐ１）製造プロセスを図１６に要約する。
【０１９３】
ａ．Ｖｅｒｏ細胞の増大
Ｖｅｒｏ細胞（ＷＣＢロット２１７００２−２）の２個のバイアルを、Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７０．０３ＩＲ）を含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２１０６３）を含有する２個の２５ｃｍ２（Ｔ２５）フラスコに播種して、３７℃および５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベータにおいてインキュベートした。Ｖｅｒｏ細胞を３回継代後、該Ｖｅｒｏ細胞をさらに５０個の１６２ｃｍ２（Ｔ１６２）フラスコに増大させた。３回目の継代のインキュベーションの３日目に、５０個のＴ１６２フラスコの内容物を、顕微鏡下で調べて、細胞の状態を決定した。純粋な培養物で少なくとも９５％コンフルエントである４３個のフラスコを選択した。選択したＴ１６２フラスコのうちの１つ中の細胞を調べて、細胞数および生存率を決定し、選択したフラスコのもう１つを「細胞品質管理」フラスコとしてインキュベートした。選択したＴ１６２フラスコの残りの４１個のうち、１つのフラスコを、フェノールレッド不含のＤＭＥＭ：栄養混合物Ｆ１２の１：１混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１０４１）の接種後に陰性対照として維持した。
【０１９４】
ｂ．ＰＶＳ−ＲＩＰＯマスターウイルスシード（Ｌ０４０３００６）の感染および採取
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ電気穿孔後シードロットＬ０４０２０２６を−７０℃以下の保管庫から取り出して室温で解凍した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ電気穿孔後シードロットＬ０４０２０２６を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して希釈し、４０個のＴ１６２フラスコ（増大させたＶｅｒｏ細胞を含有する）に、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ電気穿孔後シードロットＬ０４０２０２６を感染多重度（ＭＯＩ）０．５で感染させた。接種したフラスコを、新しいＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地の添加後、３３℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１９５】
ウイルス感染フラスコおよび対照フラスコを、インキュベーションの間、目に見える汚染、細胞の状態、およびパーセントコンフルエンシーなどの属性に関してモニターした。感染の７０時間後、インキュベーションを終了して、フラスコを、目に見える汚染、細胞状態、およびパーセントコンフルエンシーなどの属性に関して調べた後、採取するためにバイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）に移した。フラスコの内容物を遠心ボトルに移して、４℃および２５００ＲＰＭの設定で３３分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルスを含有する上清を８５０ｃｍ２ローラーボトルにプールした。プールした上清を２個の３０ｍＬおよび２４個の１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトルにそれぞれ、２０±１ｍＬおよび８０±５ｍＬアリコートで移した。さらに、１２個の２ｍＬクライオバイアルに１±０．２ｍＬアリコートで充填した。残りの上清（全体で３．８ｍＬ）を３個の２ｍＬクライオバイアルに移して全体で１５個の２ｍＬクライオバイアルを得た。ＰＥＴＧボトルおよびバイアルをそれぞれ、ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６としてラベル表示した。１１個の２ｍＬクライオバイアル、２３個の１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトル、および２個の３０ｍＬ  ＰＥＴＧボトルを−７０℃以下で凍結して、その後−７０℃以下の制御保管庫に移した。２ｍＬクライオバイアルのうち４個を、力価（ｐｆｕおよびＴＣＩＤ５０による）、ウイルス粒子、およびＤＮＡ配列放出試験に関してプロセス解析（ＰＡ）／生物学的製剤品質管理（ＢＱＣ）に提出した。放出試験の残りを、適切なアッセイとして実施し、ＰＶＳＲＩＰＯ材料取り扱い手順を開発した。残りの１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトル（２０±１ｍＬ充填）を−７０℃以下で凍結した。
【０１９６】
偽感染フラスコ（陰性対照）の上清もまた収集してバイアルに充填した。プロセスコントロール材料２０±１ｍＬをそれぞれ含む２個の３０ｍＬ  ＰＥＴＧボトルと、プロセスコントロール材料１±０．２ｍＬをそれぞれ含む４個の２ｍＬクライオバイアルを作製して、「ＰＶＳＲＩＰＯプロセスコントロール」としてラベル表示した。２個の３０ｍＬ  ＰＥＴＧボトルを、試験のためにＰＡ／ＢＱＣに移した。４個の２ｍＬクライオバイアルを−７０℃以下で凍結して、−７０℃以下の制御保管庫に入れた。
【０１９７】
ＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６の放出試験を、図１７に含める分析証明書に要約する。
【０１９８】
ｃ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ外来ウイルスアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ外来ウイルス試験を、ＰＶＳ−ＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６について実施した。アッセイは、細胞変性効果（ＣＰＥ）、血球吸着（ＨＡＤ）、および血球凝集（ＨＡ）に関して３つのタイプの指標細胞株の観察を通して外来ウイルス夾雑物の存在に関して試験品目を評価するために実施した。外来因子を検出するために利用した細胞は、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、およびＡ５４９である。全てが、ＰＶＳ−ＲＩＰＯによる感染に対して感受性であり、結果としてＣＰＥを有する。したがって、試験を実施するためには、試験試料中のＰＶＳ−ＲＩＰＯを中和しなければならない。本発明者らは、アッセイに干渉対照を含めて、アデノウイルス５、パラインフルエンザ３およびヘルペスウイルスを利用した。ウイルスを１０ｐｆｕおよび１００ｐｆｕに希釈して、ＰＶＳ−ＲＩＰＯと同じ中和手順に供した。偽中和対照を含めた。全てのウイルスが、偽中和対照と同じ期間および同じ濃度で検出された。抗体によって検出可能な効果はなく、またはこれらの他のモデルウイルスの検出に及ぼす中和手順そのものの効果はないようであった。
【０１９９】
試験を実施するために、使用した３つの指標細胞培養物は：ＭＲＣ−５、正常なヒト男性胚細胞培養物；Ｖｅｒｏ、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓株、およびＡ５４９、ヒト成人男性肺癌であった。これらの指標細胞培養物を、ポリオウイルスＩ型抗血清で中和されている試験試料に接種して、週に少なくとも３回、少なくとも２８日間調べた。［中和手順は、以下の手順を使用して接種前に実施した：試験品目を、２〜８℃、１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、ＦＤＡ（Ｅｖｇｅｎｉａ  Ｄｒａｇｕｎｓｋｙ／ＣＢＥＲ）から得たポリオウイルスＩ型抗血清の１：２．５倍希釈物の等量（３．０ｍＬ）と混合して、３６±２℃で１時間インキュベートした。それぞれの細胞株に、この溶液の０．２ｍＬ／ウェルを添加して、３６±２℃で１時間インキュベートした後、接種物を除去して、細胞を適当な培地２．０ｍＬで洗浄した。次に、この洗浄液を除去して、新しい培地２．０ｍＬと交換して、細胞を３６±２℃のインキュベータに戻した。］
【０２００】
培養物を、ウイルス因子の存在に起因する形態の任意の変化の発生に関して調べた。インキュベーション期間のおわりに、培養物を、ニワトリ赤血球、モルモット赤血球、およびヒト赤血球を使用して血球凝集および血球吸着に関して調べた。パラインフルエンザ３をアッセイの陽性対照として使用した。干渉対照のために利用したウイルスは、ＦＤＡから得たポリオウイルスＩ型抗血清によって中和したアデノウイルス５、ヘルペスウイルス、およびパラインフルエンザウイルス３であった。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭをＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５細胞の陰性対照として使用し、１０％ＦＢＳを含むＦ−１２ＫをＡ５４９細胞の陰性対照として使用した。
【０２０１】
ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏ外来ウイルスアッセイ（ＡＶＡ）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６を、ｉｎ  ｖｉｖｏでモルモット（改良ヨーロッパ型）、成体マウス、哺乳期マウス、および孵化鶏卵において、承認された手順に従って外来ウイルスに関して評価した。このアッセイの目的は、細胞株に存在しうるが、細胞培養系においていかなる区別可能な効果も引き起こさないウイルスの存在に関して試験試料を評価することであった。ＭＶＳロットＬ０４０３００６に対するｉｎ  ｖｉｖｏ  ＡＶＡ試験を完了するために、試験試料を中和して、アッセイで使用するＰＶＳ−ＲＩＰＯ試験試料の高濃度に起因する試験動物における潜在的な非特異的毒性を回避した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス負荷に起因する非特異的毒性は、試料に存在しうる他の外来因子の検出を妨害しうる。抗体が、他の外来因子の検出に及ぼす効果を有しうるかどうかを決定するために、上記のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて抗体に関して干渉対照を設定した。
【０２０２】
モルモットは、パラミクソウイルス（センダイ）およびレオウイルスを含む多数のウイルス因子に感染しやすい。モルモットに筋肉内および腹腔内経路の両方を使用して試験品目を接種して、少なくとも２８日間試験のために維持した。試験試料を、３７℃に設定した水浴中で解凍し、次に、中和抗体の等量と混合した。試験品目／中和抗体混合物を、２０分毎に穏やかに混合しながら３７℃に設定した水浴中で１時間維持した。５匹の成体モルモットに、調製した試験品目を、０．２ｍＬの筋肉内注射および５．０ｍＬの腹腔内注射により接種した。５匹の他の成体モルモットに、陰性対照としてイーグル最少必須培地を、０．２ｍＬの筋肉内注射および５．０ｍＬの腹腔内注射により接種した。各動物を有病率または死亡率に関して２８日間毎日観察した。
【０２０３】
成体マウスは、コクサッキーウイルスおよびフラビウイルス群のメンバー（セントルイス脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルス）を含む多数のウイルス因子に感染しやすい。新生児哺乳期マウスは、トガウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ群、エコーウイルス）、およびヘルペスウイルスを含む広範囲のウイルスに感染しやすい。孵化鶏卵には、尿膜および卵黄嚢の両方を通して接種する。尿膜経路による接種は、尿膜の内胚葉細胞におけるオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）およびパラミクソウイルス（パラインフルエンザ、ムンプス、および麻疹）の複製にとって都合がよい。卵黄嚢を通しての接種は、ヘルペスウイルス、リケッチア、マイコプラズマ、および細菌の繁殖にとって都合がよい。接種した哺乳期マウスおよび接種した孵化鶏卵からの材料を、新しい試験系への副次継代（subpassage）は、このアッセイの感度を増加させる役割を果たす。なぜなら、元の接種物に存在するいかなるウイルス因子も新しい試験系において増幅されるからである。
【０２０４】
孵化鶏卵
試験品目および中和抗体を３７±２℃の水浴を使用して解凍した。試験品目および中和抗体を１：１の比率で混合して６０分間インキュベートした。接種の前に、陰性対照のために使用したイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）と、試験品目抗体希釈物の両方を、０．４５ミクロンの酢酸セルロース低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。
【０２０５】
接種経路あたり６個の鶏卵を送達対照とした。これらを、各作業日にろうそくの光を当てて生存能について調べ、孵化期間の終わりに冷却した。これらの鶏卵は、採取しなかったか、または冷却後に調べた。
【０２０６】
尿膜試験：１２個の鶏卵（１０日齢）の尿膜腔に、調製した試験品目０．５ｍＬを接種した。鶏卵を３７〜３８℃で３日間孵化した。胚を各作業日にろうそくの光を当てて生存能について調べた。孵化期間の終了前に死んだ胚は冷却し、全ての胚を孵化期間の終わりに調べた。継代１（Ｐ１）の尿膜腔液を採取して、プールし、血球凝集活性（ＨＡ）に関してアッセイするまで、または１０個の鶏卵（１１日齢）の第２の組に副次継代するまで−６０℃またはそれ未満で保存した。第２の組の鶏卵に接種する前に、副次継代した材料を、低速遠心分離によって清澄化して、０．４５ミクロン酢酸セルロース低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。第２の組の鶏卵を、第１の組と同じ条件下で孵化した。次に、継代２（Ｐ２）の尿膜腔液を採取して、プールし、ＨＡに関してアッセイするまで−６０℃またはそれ未満で保存し、その時点の後に胚を調べた。陰性対照を確立するために、０．４５ミクロン濾過したＥＭＥＭを初回接種物として使用して、さらに２組の孵化鶏卵に関してこの手順を並行して実施した。
【０２０７】
卵黄嚢試験：１２個の孵化鶏卵（６日齢）の卵黄嚢に、調製した試験品目０．５ｍＬを接種した。鶏卵を３７〜３８℃で９日間孵化した。胚を各作業日にろうそくの光を当てて生存能について調べた。孵化期間の終了前に死んだ胚を冷却し、全ての胚を孵化期間の終わりに調べた。Ｐ１の卵黄嚢を採取して、洗浄し、プールした。１０％卵黄嚢懸濁液を調製して、１２個の鶏卵（６日齢）の第２の組に副次継代するまで−６０℃またはそれ未満で保存した。第２の組の鶏卵に接種する前に、副次継代した材料を、低速遠心分離によって清澄化して、０．４５ミクロン酢酸セルロース低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。第２の組の鶏卵を、第１の組と同じ条件下で孵化させて、その時点の後に胚を調べた。陰性対照を確立するために、０．４５ミクロン濾過したＥＭＥＭを初回接種物として使用して、さらに２組の孵化鶏卵に関してこの手順を並行して実施した。
【０２０８】
Ｐ１およびＰ２の両方のプールした尿膜腔液、対応するＰ１およびＰ２陰性対照、陽性対照の役割を果たすストックのインフルエンザＡ型ウイルスの連続２倍希釈物を作製することによって、血球凝集アッセイをマイクロタイタープレートにおいて実施した。ＥＭＥＭは、アッセイの陰性対照としての役割を果たした。洗浄したニワトリ赤血球、モルモット赤血球、およびヒトＯ型の赤血球を０．５％懸濁液として個別に添加した。反復実験のプレート（replicate  plate）を、２〜８℃および３７±２℃の両方で１〜２時間インキュベーション後にＨＡ活性に関して観察した。
【０２０９】
試験品目は、接種した胚の少なくとも８０％が試験期間に生存すれば（外傷または細菌の汚染により死んだ胚を除く）、外観が正常であれば、および接種した胚から収集した尿膜腔液が血球凝集を生じなければ、検出可能な外来ウイルス夾雑物の存在に関して陰性であるとみなされた。
【０２１０】
成体および哺乳期のマウス
凍結した試験品目を３７℃に設定した水浴中で解凍した後、等量の中和抗体と混合した。試験品目／中和抗体混合物を３７℃に設定した水浴中で、１５分毎に穏やかに混合しながら１時間維持した。２０匹の成体マウスに、調製した試験品目を接種し、５匹の成体マウスに対照品目（ＥＭＥＭ）を接種した。各試験マウスまたは対照マウスに、適切な材料の０．０３ｍＬの脳内注射および０．５ｍＬの腹腔内注射を行った。動物を、感染を示唆する臨床徴候に関して毎日観察した。接種後２１日目に、マウスを屠殺した。
【０２１１】
２０匹の新生児哺乳期マウスに、調製した試験品目を接種し、２０匹の新生児哺乳期マウスに対照品目を接種した。各マウスに、適切な材料の０．０１ｍＬの脳内注射および０．１ｍＬの腹腔内注射を行った。動物を、異常な臨床徴候に関して毎日観察した。接種後１４日目に、マウスを屠殺して組織を採取し、ホモジナイズして、試験群または対照群内でプールした。組織をＥＭＥＭでホモジナイズし、低速で遠心分離した。組織ホモジネートを、適切なサイズの注射用シリンジに取り付けた低タンパク質結合０．４５ミクロン酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。２０匹の新生児哺乳期マウスに、試験マウス組織上清を接種し、２０匹のマウスに対照マウス組織上清（０．０１ｍＬの脳内注射および０．１ｍＬの腹腔内注射）を注射した。組織ホモジネートの注射後１４日目に、マウスを屠殺した。
【０２１２】
試験品目は、哺乳期マウスの少なくとも８０％および成体マウスの少なくとも８０％が、夾雑物である外来の伝染性因子と整合する有害な臨床知見を示すことなく、試験期間に生存していれば、検出可能な外来のウイルス夾雑物の存在に関して陰性であるとみなされた。
【０２１３】
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９（Ｐ２）の生産
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９（Ｐ２）を生産するための製造プロセスを図１８Ａ〜１８Ｂに説明する。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を、出発材料としてＶｅｒｏワーキングセルバンク（ＷＣＢ）ロット２１７００２−２およびＭＶＳロットＬ０４０３００６を使用して製造した。Ｖｅｒｏ  ＷＣＢロット２１７００２−２の３個のバイアルを増大させて、１０個の６３６０ｃｍ２セルファクトリーにおいて細胞増大ロットＬ０９０３０１０を生産した。細胞増大ロットＬ０９０３０１０にＰＶＳＲＩＰＯ  ＭＶＳロットＬ０４０３００６を感染させ、採取した材料（採取プールロットＬ０９０４００８）を、ＰＶＳＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７およびその後のＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９の生産のために使用した。
【０２１４】
ａ．Ｖｅｒｏ細胞の開始および増大
細胞増大ロットＬ０９０３０１０からのＶｅｒｏ細胞を、細胞採取ロットＬ０９０４００８の生産のために使用した。増大を通して、Ｖｅｒｏ細胞を、Ｌ−グルタミンおよび１０％放射線照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭにおいて成長させて、３７℃および５％ＣＯ２の設定でインキュベートした。Ｖｅｒｏワーキングセルバンク（ＷＣＢ）ロット２１７００２−２の３個のバイアルを、３７±２℃の水浴中で解凍して、これを使用して、およそ５０，８６４個の細胞／ｃｍ２の密度で１つのＴ−１６２ｃｍ２フラスコに播種した（凍結からの継代数１）。上記の増殖培地および条件を使用して、細胞をＴ−１６２ｃｍ２フラスコから６３６０ｃｍ２セルファクトリー、６３６ｃｍ２セルファクトリー、およびＴ−１５０ｃｍ２フラスコへと増大させ、全体で凍結物から５回の継代を行った（図１８Ａ〜１８Ｂを参照されたい）。
【０２１５】
ｂ．Ｖｅｒｏ細胞の感染
感染細胞溶解物ロットＬ０９０４００８を生産するために、９５〜１００％コンフルエンスの健康な細胞を含有し、目に見える汚染の兆候を有しないＶｅｒｏ細胞ロットＬ０９０３０１０（１０個の６３６０ｃｍ２セルファクトリー、３個の６３６ｃｍ２セルファクトリー、および５個のＴ−１５０ｃｍ２フラスコ）を使用した。４個のＰＶＳ−ＲＩＰＯマスターウイルスシード（ＭＶＳ）ロットＬ０４０３００６ボトル（ＭＶＳアリコート８０ｍＬを有する１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトル）を、−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、３３〜３８℃の水浴中で解凍し、感染プロセスにおいて感染多重度（ＭＯＩ）０．１ｐｆｕ／細胞で使用した。解凍したＭＶＳロットＬ０４０３００６  ２６５ｍＬを、調製された感染培地（Ｌ−グルタミンを含む、Ｈｅｐｅｓおよびフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に添加して、全量およそ８リットルの感染培地調合物を調製した。
【０２１６】
洗浄培地（Ｌ−グルタミンを含む、Ｈｅｐｅｓおよびフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２）およそ７５０ｍＬで洗浄した後、調製し調合された感染培地およそ７５０ｍＬを満たすことによって、１０個の６３６０ｃｍ２セルファクトリーを感染のために調製した。陽性対照および陰性対照も同様に調製した。感染したセルファクトリーおよび対照を、３３℃、５％ＣＯ２濃度、および８０％湿度の設定でインキュベートした。感染の７０時間後に、１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が９個のセルファクトリーにおいて、および１つのセルファクトリーにおいて８０％ＣＰＥが示され、対照フラスコのそれぞれにおいて予想された結果が示された。
【０２１７】
ｃ．感染細胞溶解物の採取および清澄化
ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス感染細胞懸濁液ロットＬ０９０４００８を、それぞれのセルファクトリーから採取して、滅菌培地バッグにプールした。ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８の放出試験のために、感染細胞懸濁液から試料を採取した。ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８の放出試験の試験、規格、方法、および結果を要約する分析証明書を、図１９に含める。
【０２１８】
感染細胞懸濁液を、１Ｌポリカーボネート遠心ボトルにおよそ７５０ｍＬアリコートで移した。感染細胞懸濁液を４℃および３８００×ｇの設定でおよそ２０分間遠心分離した。遠心ボトルのそれぞれからの清澄化上清を滅菌１０Ｌ培地バッグにプールして、室温で精製群（Purification  Group）に移した。
【０２１９】
ｄ．最終採取物のＢｅｎｚｏｎａｓｅ処理
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７の生産の際の宿主ゲノムＤＮＡのレベルを低減させるために、清澄化したＰＶＳＲＩＰＯロットＬ０９０４００８採取物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素とともにインキュベートした。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素の添加前に、塩化マグネシウムを、１ｍＭ最終濃度となるように、清澄化したＰＶＳＲＩＰＯロットＬ０９０４００８採取物に混合しながら添加した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素を、混合しながら最終濃度５０単位／ｍＬとなるように添加した。バッグを２〜８℃で１６時間インキュベートした。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素処理溶解物を２〜８℃で除去して試料を採取した。プラークアッセイを使用して試料を分析し、ウイルス力価を決定した。
【０２２０】
ｅ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦクロマトグラフィーステップは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７の生産の際の緩衝液交換、および低分子量の宿主細胞夾雑物からのウイルスプールの部分精製を提供する。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を充填したクロマトグラフィーカラムを使用して、さらに精製するための用意として、ウイルスの緩衝液を、低伝導度リン酸緩衝液に交換した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素処理溶解物をロードする前に、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦカラムに５Ｍ  ＮａＣｌを流し、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５を満たし、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５によって平衡化した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ処理溶解物を、２００９年５月１９日に２回の等量の注入でＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦカラムにロードした。産物を４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５によって溶出し、両方の注入からのＰＶＳ−ＲＩＰＯメインピーク画分を、同じ受容バッグに収集した。収集した溶出物の試料を、プラークアッセイを使用して分析して、ウイルス力価を決定した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯメインピークを２〜８℃で保存した。
【０２２１】
ｆ．Ｑ６５０Ｍフロースルークロマトグラフィー
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦステップの後、ロットＬ０９０３００７の溶出物を、Ｑ６５０Ｍフロースルークロマトグラフィーカラムにアプライして、残りの宿主細胞タンパク質夾雑物を非結合ウイルスから除去した。クロマトグラフィーカラムにＳｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂を充填して、５Ｍ  ＮａＣｌを流した後に、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５を満たし、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５を使用して平衡化することによってカラムを調製した。カラムに、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦメインピークをロードして、ウイルス産物を含有するフロースルーを収集した。溶出の際に使用した緩衝液は、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５であった。収集したＱ６５０ＭメインピークのＮａＣｌ濃度を、５Ｍ  ＮａＣｌを使用して１５０ｍＭ  ＮａＣｌに調節した。Ｑ６５０Ｍメインピーク材料をサンプリングした後、２〜８℃で保存した。試料を、プラークアッセイを使用して分析して、ウイルス力価を決定した。
【０２２２】
ｇ．接線流濾過による濃縮および透析濾過
Ｑ６５０ＭメインピークロットＬ０９０３００７材料を２〜８℃の保管庫から取り出して、限外濾過中空繊維メンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＦＰ−５０−Ｃ−４ＭＡ）を使用して濃縮した。次に、濃縮したウイルス材料を調合緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）に対して透析濾過した。透析濾過したＰＶＳ−ＲＩＰＯ溶液の試料をプラークアッセイによって分析して、ウイルス力価を決定した。ＨＳＡ（２５％）を、透析濾過したＰＶＳ−ＲＩＰＯロットＬ０９０３００７に最終濃度０．２％となるように添加した。調合したＰＶＳ−ＲＩＰＯの試料をプラークアッセイおよび微生物含有量によって分析した。
【０２２３】
ｈ．ＰＶＳ−ＲＩＰＯのバルクアリコート、サンプリング、および保存
調合したＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７をクラス１００バイオセーフティキャビネットに移して、９個の１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトルにそれぞれおよそ３０ｍＬの体積で分配した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７の９個のボトルを、ラベルを貼ってエタノール／ドライアイス浴中で凍結して、さらに製造に使用するために−７０℃以下で保存した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７を−７０℃以下の制御保管庫に移した。
【０２２４】
ｉ．精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９（Ｐ２）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７の９個のボトルを、−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、−７０℃以下のフリーザーに移した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７の９個のボトルを、２４〜３１℃の水浴中で解凍した。産物の温度は１１〜１７℃であった。総解凍時間は４３分であった。９個の容器の内容物を１Ｌ  ＰＥＴＧボトルにプールして、最終総体積２７１．０９ｍＬを得た。プールしたＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７をポンプで送って、使用前試験に合格し希釈剤（０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４中に５０ｍＭ  ＮａＰＯ４＋０．２％ＨＳＡ）で予め湿らせた０．２ミクロン滅菌Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターに通した。産物の濾過後、フィルターに同じ希釈剤を流して全量２８３．２４ｍＬの濾過産物を得た。フィルターは、濾過後の完全性試験に合格した。試料を収集し（２５．５ｍＬ）、精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９放出試験に関するプロセス解析／生物学的製剤品質管理に提供し、総最終体積２５７．７４ｍＬを残した。次に、精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を、充填ステップに進めた。ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８の放出試験、方法、規格、および結果を図１９に提供する。
【０２２５】
ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８の試験方法の説明
【０２２６】
ａ．ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０アッセイ）
このアッセイは、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８、精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９、および最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０におけるＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス力価を、Ｈｅｐ−２Ｃ指標細胞のＴＣＩＤ５０によって決定するために実施した。希釈培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）１００マイクロリットル（１００μＬ）を、個別の９６ウェルプレート（参照標準物質、陽性対照および試験試料に関してそれぞれ個別のプレートを提供する）の各ウェルに加えた。ＦＤＡポリオウイルス１型参照標準物質（１：１００００）、Ｓａｂｉｎ原型１型（Sabin  Original  Type  1）陽性対照ポリオウイルス（１：１００００００）、および試験試料（１：１００００００）の初回希釈物を、希釈培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）によって調製した。各最終希釈物の１００μＬアリコートを、それぞれの９６ウェルプレートの最初の列の８個のウェルのそれぞれに加えた。較正したマルチチャンネルピペッターを使用して、１列目の各ウェルから１００μＬを採取して、２列目の隣接するウェルに移して十分に混合して、次の列へと連続してプロセスを繰り返すことによって、連続１：２倍希釈物をそれぞれの９６ウェルプレートにおいて作製した。ＦＤＡ参照標準物質に関して、希釈は１１列目で終了し、１２列目は陰性対照ウェル（希釈培地のみを含有する）として使用した。１１列目の過剰な１００μＬを廃棄した。陽性対照および試験品目に関しては、希釈スキームを第２の９６ウェルプレートにおいて継続して、２３列目で終了し、２４列目を陰性対照ウェルとして使用した。増殖培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中のＨｅｐ−２Ｃ細胞１００００個（１×１０５個の細胞／ｍＬを０．１ｍＬ）を、各９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で３６±１℃で１０日間インキュベートした。プレートを、１、３、７および１０日目に細胞変性効果（ＣＰＥ）に関して調べた。アッセイの完了の際に、各試料に関してＣＰＥを示すウェルの数を、ＦＤＡによって提供された計算プログラムテンプレートの適当なフィールドに記入した。プログラムは、ＦＤＡポリオウイルス１型参照標準物質の応答に基づいて、各試料に関してＴＣＩＤ５０／ｍＬを計算する。
【０２２７】
ｂ．拡張バイオバーデン
バイオバーデンは、水性試料中に存在する生きた好気性微生物の数の推定である。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８のバイオバーデン試験を、微生物を検出および計数するための迅速なハイスループット濾過デバイスであるＭｉｌｌｉｆｌｅｘ−Ｓｅｎｓｏｒ  ＩＩシステムを使用して実施した。
【０２２８】
２つ組（duplicate）の試験試料（２．５ｍＬ）を、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって５０ｍＬに希釈して、個別のＭｉｌｌｉｆｌｅｘ濾過漏斗の上部に直接添加した。陰性対照は、ＰＢＳ  １００ｍＬを濾過することによって調製した。真空を各濾過デバイスに適用して、試験試料または対照をフィルターメンブレンに吸収させた。漏斗を外して、存在するいかなる微生物の増殖も促進するために、フィルターメンブレンを適切なタイプの寒天に適用した。２つ組の試験試料からのフィルターメンブレンの１つをトリプチックソイ寒天（ＴＳＡ）（細菌の増殖を助けるために使用する）に適用し、他のフィルターメンブレンをＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（ＳＤＡ）（酵母およびカビの増殖を助けるため）に適用した。ＴＳＡおよびＳＤＡ媒体の両方を、原材料放出試験の一部として成長促進に関して試験した。ＴＳＡ試料を３０〜３５℃で１２０時間インキュベートし、ＳＤＡ試料を２０〜２５℃で逆の位置で１２０時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、寒天プレートを増殖に関して調べて、コロニー（観察されれば）の数を計数して、コロニー形成単位／ｍＬとして報告した。
【０２２９】
ｃ．ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用したマイコプラズマの検出（ＰＴＣ）
マイコプラズマの検出は、間接的および直接的手順の両方を使用して採取プールロットＬ０９０４００８について実施した。
【０２３０】
間接的検出法は、マイコプラズマをＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞株）上で成長させ、次いでＤＮＡ結合蛍光色素染色を使用して染色することによって、マイコプラズマ、特に培養不能マイコプラズマの可視化を可能にする。陰性対照および陽性対照の両方をアッセイで使用した。陽性対照は、強い細胞吸着性（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）および弱い細胞吸着性（Ｍ．  ｏｒａｌｅ）のマイコプラズマ種の両方を含んだ。ＤＮＡ結合蛍光色素による培養物の染色により、観察された染色パターンに基づいてマイコプラズマを検出することができる。陰性培養物では、細胞核の蛍光のみが観察されるが、陽性培養物では核および核外蛍光が観察される。
【０２３１】
直接培養は高感度で特異的なマイコプラズマの検出法である。使用した寒天培地およびブロス培地は、培養可能マイコプラズマの成長にとって必要な炭素およびエネルギーと共に栄養を供給する。陽性対照および陰性対照の両方を直接アッセイで使用した。陽性対照は、発酵性マイコプラズマ（Ｍ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および非発酵性マイコプラズマ（Ｍ．  ｏｒａｌｅ）を含んだ。この手順は、ＦＤＡ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによって推奨される、添付文書＃２の１９９３年「Points  to  Consider  in  the  Characterization  of  Cell  Lines  Used  to  Produce  Biologicals」に記載されるプロトコールに基づく。
【０２３２】
ｄ．カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）によるエンドトキシン
ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８、精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９、およびＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０のエンドトキシン（ＬＡＬ）含有量を、動態発色試験を使用して決定した。試験は、試験品目中のエンドトキシンを決定するために、Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓアメボサイトの誘導体であるカブトガニ血球抽出成分の反応性に基づく。手順は、１９８７年１２月に発行された、「Validation  of  the  Limulus  Amebocyte  Lysate  Test  (LAL)  as  an  End-Product  Endotoxin  Test  for  Human  and  Animal  Parenteral  Drug,  Biological  Products,  and  Medical  Devices」に関するＦＤＡ指針に記載の推奨を満たすように設計される。
【０２３３】
発熱物質は、グラム陰性細菌細胞壁を起源とすることが最も多い熱産生物質である。細菌細胞壁由来の発熱物質は、細菌エンドトキシンと呼ばれ、動態比色ＬＡＬ試験システムによって容易に検出される。動態比色ＬＡＬ法は、検出されたエンドトキシンレベルの直接定量を提供し、低レベルのエンドトキシンの検出にとって特に有用である。試薬および標準物質は、製造元の指示に従って調製される。
【０２３４】
試験は、試験試料２５μＬをピペットで採取して、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−Ｌｉｃｅｎｓｅｄ  ＰＴＳエンドトキシンカートリッジの４つの試料リザーバーのそれぞれに加えることによって実施する。ＰＴＳは、試験試料を引き出して２つのチャネルでＬＡＬ試薬と混合し、他の２つのチャネルでＬＡＬ試薬と製品陽性対照（ＰＰＣ）と混合する。試料をインキュベートした後、色素産生基質と混合する。混合後、ウェルの光学密度を測定して、内部保管のバッチ特異的標準曲線に対して分析する。ＰＴＳは、２つ組の試験を同時に実施して、ＵＳＰのガイドラインに従って結果を平均する。アッセイは、変動係数（ＣＶ）が２つの試料反復実験の間で２５％未満であり、ＣＶが２つのＰＰＣ反復実験（replicate）の間で２５％未満であれば有効である。結果は、ＰＰＣの回収率が５０〜２００％であれば有効である。このアッセイの検出限界は、０．００５ＥＵ／ｍＬである。
【０２３５】
ｅ．ｒｃｔ４０によるウイルス安定性
アッセイを使用して、Ｖｅｒｏ指標細胞でのプラーク形成によって、３６℃および４０℃で、採取プールロットＬ０９０４００８、最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０、および対照におけるＰＶＳＲＩＰＯの力価を決定した。３６℃および４０℃でのウイルスの力価の常用対数（ｌｏｇ１０  ｔｉｔｅｒ）を比較して、３６℃と４０℃の間での対数の低減が少なくとも５である場合、試料は、４０℃での成長に対して感受性があると決定され、試験に合格したとみなされる。３３℃での試料の力価も同様に決定して、３３℃での試料の既に決定された力価と比較することができる。陽性対照はＲＣＴ  ４０＋対照：ポリオウイルス１  ＳａｂｉｎクローンＳ３３ロットＬ０４０６００８およびＲＣＴ  ４０−対照：ポリオウイルス１  ＳａｂｉｎクローンＳ７１ロットＬ０４０６００４を含んだ。陰性対照は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭであった。
【０２３６】
Ｖｅｒｏ細胞を蒔いて８０〜１００パーセントコンフルエンスが達成されるまで成長させた。増殖培地を除去して、Ｖｅｒｏ細胞に試験試料または対照試料０．２ｍＬを添加した。次に、反復実験の培養皿を３３℃、３６℃、および４０℃でおよそ１時間インキュベートした。接種物を除去して、細胞シートにアガロース／２×イーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）を重層した。アガロースを固化させて、プラークが陽性対照において完全に形成されるまで、反復実験の培養皿を３３℃、３６℃、および４０℃でインキュベートした（２日）。次に培養皿に、ニュートラルレッドを含有するアガロース／２×ＥＭＥＭを暗所で重層して、ニュートラルレッドが細胞シートを染色した後、プラークを計数した。平均プラーク値を決定した。式：平均プラーク値×希釈倍率／接種体積、を使用して、力価（ｐｆｕ／ｍＬ）を計算した。
【０２３７】
ｆ．ｉｎ  ｖｉｖｏ外来因子
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８を、ｉｎ  ｖｉｖｏで成体マウス、哺乳期マウス、および孵化鶏卵において外来ウイルスに関して評価した。このアッセイの目的は、細胞株に存在しうるが細胞培養システムにおいていかなる区別できる効果も引き起こさないウイルスの存在に関して試験試料を評価することであった。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＡＶＡ試験の前に、この試験を完了するために使用したアプローチを評価するために、ＱＣ−０４０６６４の下で、Ｒ＆Ｄ試験を実施した。これらのＲ＆Ｄ試験から、ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス溶解物の調製物を２×１０８ｐｆｕ／ｍＬの濃度で投与した場合に、哺乳期マウスにおいて有害効果が観察されないことが示された。したがって、中和抗体処置を含めることなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＡＶＡ試験を、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８について実施した。孵化鶏卵では、材料を非希釈（２．１４×１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）で試験した。材料を次に、２×１０８ｐｆｕ／ｍＬに希釈して、成体マウスおよび哺乳期マウスにおいて試験した。
【０２３８】
成体マウスは、コクサッキーウイルスおよびフラビウイルス群のメンバー（セントルイス脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルス）を含む多数のウイルス因子に感染しやすい。哺乳期マウスは、トガウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ群、エコーウイルス）、およびヘルペスウイルスを含む広範囲のウイルスに感染しやすい。孵化鶏卵には、尿膜および卵黄嚢の両方を通して接種する。尿膜経路による接種は、尿膜の内胚葉細胞におけるオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）およびパラミクソウイルス（パラインフルエンザ、ムンプス、および麻疹）の複製にとって都合がよい。卵黄嚢を通しての接種は、ヘルペスウイルス、リケッチア、マイコプラズマ、および細菌の繁殖にとって都合がよい。接種した哺乳期マウスおよび接種した孵化鶏卵からの材料を、新しい試験系に副次継代することは、元の接種物に存在するいかなるウイルス因子もこの連続継代を通して増幅されることから、このアッセイの感度を増加させる役割を果たす。
【０２３９】
孵化鶏卵
接種経路あたり６個の鶏卵を送達対照とした。これらを、各作業日にろうそくの光を当てて生存能について調べ、孵化期間の終わりに冷却した。これらの鶏卵は、採取しなかったか、または冷却後に調べた。
【０２４０】
尿膜試験：１２個の鶏卵（１０日齢）の尿膜腔に、試験品目０．５ｍＬを接種した。鶏卵を３７〜３８℃で３日間孵化した。胚を各作業日にろうそくの光を当てて生存能について調べた。孵化期間の終了前に死んだ胚は冷却し、全ての胚を孵化期間の終わりに調べた。継代１（Ｐ１）の尿膜腔液を採取して、プールし、血球凝集活性（ＨＡ）に関してアッセイするまで、または１２個の鶏卵（１０日齢）の第２の組に副次継代するまで−６０℃またはそれ未満で保存した。第２の組の鶏卵に接種する前に、副次継代した材料を、低速遠心分離によって清澄化して、０．４５ミクロン酢酸セルロース低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。第２の組の鶏卵を、第１の組と同じ条件下で孵化した。次に、継代２（Ｐ２）の尿膜腔液を採取して、プールし、ＨＡに関してアッセイするまで−６０℃またはそれ未満で保存し、その時点の後に胚を調べた。陰性対照を確立するために、０．４５ミクロン濾過したＥＭＥＭを初回接種物として使用して、さらに２組の孵化鶏卵に関してこの手順を並行して実施した。ＨＡアッセイは、Ｐ１およびＰ２両方のプールした尿膜腔液、対応するＰ１およびＰ２陰性対照、および陽性対照としての役割を果たすストックインフルエンザＡ型ウイルスの連続２倍希釈物を作成することによって、マイクロタイタープレートで実施した。ＥＭＥＭはアッセイの陰性対照としての役割を果たした。洗浄したニワトリ赤血球、モルモット赤血球、およびヒトＯ型の赤血球を個別に０．５％懸濁液として添加した。反復実験のプレートを２〜８℃および３７±２℃の両方で１〜２時間インキュベーション後にＨＡ活性に関して観察した。
【０２４１】
卵黄嚢試験：１２個の孵化鶏卵（６日齢）の卵黄嚢に、０．４５ミクロン濾過した試験品目０．５ｍＬを接種した。鶏卵を３７〜３８℃で９日間孵化した。胚を各作業日にろうそくの光を当てて生存能について調べた。孵化期間の終了前に死んだ胚を冷却し、全ての胚を孵化期間の終わりに調べた。Ｐ１の卵黄嚢を採取して、洗浄し、プールした。１０％卵黄嚢懸濁液を調製して、１２個の鶏卵（６日齢）の第２の組に副次継代するまで−６０℃またはそれ未満で保存した。第２の組の鶏卵に接種する前に、副次継代した材料を、低速遠心分離によって清澄化して、０．４５ミクロン酢酸セルロース低タンパク質結合フィルターを通して濾過した。第２の組の鶏卵を、第１の組と同じ条件下で孵化させて、その時点の後に胚を調べた。陰性対照を確立するために、０．４５ミクロン濾過したＥＭＥＭを初回接種物として使用して、さらに２組の孵化鶏卵に関してこの手順を並行して実施した。
【０２４２】
試験品目は、接種した胚の少なくとも８０％が試験期間に生存すれば（外傷または細菌の汚染により死んだ胚を除く）、外観が正常であれば、および接種した胚から収集した尿膜腔液が血球凝集を生じなければ、検出可能な外来ウイルス夾雑物の存在に関して陰性であるとみなされた。
【０２４３】
成体マウスおよび哺乳期マウス
２０匹の成体マウスに調製した試験品目を接種して、５匹の成体マウスに対照品目を接種した。感染を示唆する臨床徴候に関して、動物を毎日観察した。接種後２１日目にマウスを屠殺した。２０匹の新生児哺乳期マウスに、調製した試験品目を接種し、２０匹の新生児哺乳期マウスに対照品目を接種した。動物を異常な臨床徴候に関して毎日観察した。接種後１４日目に、マウスを屠殺して、組織を採取し、液化して試験群または対照群内でプールした。組織をＥＭＥＭでホモジナイズし、低速で遠心分離した。２０匹の新生児哺乳期マウスに試験マウス組織上清を接種し、２０匹のマウスに対照マウス組織上清を注射した。組織上清を、最初に０．４５μｍのフィルターを通して濾過して、適切なサイズの注射用シリンジに充填した。注射後１４日目に、マウスを屠殺した。哺乳期マウスの少なくとも８０％および成体マウスの少なくとも８０％が、伝染性因子の存在と整合する有害な臨床知見もなく試験期間に生存すれば、試験品目は、検出可能な外来ウイルス夾雑物の存在に関して陰性であるとみなされた。
【０２４４】
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９の放出試験、方法、規格、および結果を、図２０の分析証明書に提供する。
【０２４５】
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９に関する試験法の説明
【０２４６】
ａ．完全なゲノムの配列決定
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９および最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の包括的４×配列分析を、承認された手順に従って実施した。ウイルスＲＮＡを試験品目から単離して、ゲノムを逆転写し、およそ１２００ｂｐの部分を増幅した。アンプリコンのＤＮＡ配列分析を、オリゴヌクレオチドを使用して得た。プライマーを、およそ５０％ＧＣ含有量を有し、長さ１８〜２４ｂｐの間となるように、およそ２５０塩基離して設計し、増幅されたウイルスｃＤＮＡの両方の鎖がそれぞれの鎖からの２つのリードによって配列決定されるように配置した。
【０２４７】
試験品目およびｐＧＥＭ３Ｚ対照プラスミドの蛍光色素ターミネーターＤＮＡサイクル配列決定を、ＢｉｇＤｙｅ  ｖ１．１配列決定キットを使用して実施した。試験試料に関して、５×ＢｉｇＤｙｅ配列決定緩衝液２．０μＬを、２μＭプライマー２μＬ、精製ＰＣＲ産物２０ｎｇ、およびｄｄＨ２Ｏと混合して最終体積を１０μＬとした。反応および機器の対照としての役割を果たすｐＧＥＭ３Ｚ対照反応に関して、ｐＧＥＭ３Ｚ  ２００ｎｇを、Ｍ１３Ｆ−２０プライマー（５’  ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’、配列番号４）２０ｎｇ（およそ３．２ｐｍｏｌ）を用いて配列決定した。対照反応をそれぞれの配列決定設定で実施して、ＡＢＩ３１３０ｘｌにおいて分析した。サイクル配列決定反応は、ＰＴＣ−２２５  Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーを使用して実施した。分析前に、配列反応を、Ｃｅｎｔｒｉｆｌｅｘゲル濾過カートリッジを使用して、取り込まれていない色素ターミネーター、塩、および低分子量化合物から精製した。配列データを配列決定コンピューターから収集して、データをトリミングし、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアバージョン４．７（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して、連続する一連の断片（「コンティグ」として公知である）に整列させた。整列させたＤＮＡ配列を参照配列と比較して、試験試料の配列と参照配列との間の塩基ミスマッチまたは多型を、もし存在すれば同定した。
【０２４８】
ＤＮＡ配列分析は、プロセス解析／生物学的製剤品質管理試験報告書ＱＣ０３７６５７（異種移植毒性試験（Toxicology  Xenograph  Study）ウイルスロット０２２２０８、試料は、Ｄｒ．  Ｍ．  Ｇｒｏｍｅｉｅｒ、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣによって提供された）から得た参照配列を使用した。ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９および最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の配列は、ＱＣ０２０６５８からのＰＶＳＲＩＰＯプラスミド参照配列（ＧＭＰプラスミドロットＬ０４０１０１４）に含有されるクローニングされたウイルスプラスミド配列、およびマスターウイルスシード（ＭＶＳ）配列、ロットＬ０４０３００６、ＱＣ０２２２７１からのウイルスｃＤＮＡ配列と比較すると、全ての７３０３塩基位置において１００％相同であることが見出された。
【０２４９】
ｂ．宿主細胞ＤＮＡ（Ｖｅｒｏ）
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を、シングルコピー遺伝子であるＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ）特異的ネクチン−１α遺伝子の遺伝子内重複（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＦ３０８６３５）を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）アンプリコンを使用して、ＶｅｒｏゲノムＤＮＡ負荷量に関して試験した。アッセイの検出限界は、１ｎｇ  ＶｅｒｏゲノムＤＮＡ／ｍＬである。Ｖｅｒｏ細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を陽性対照（１００ｎｇ〜１ｐｇ）として使用し、試験品目のＶｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ５ｎｇのスパイクをＰＣＲ阻害対照として使用し、望まれる陰性対照結果は、ヌクレアーゼフリー水による試験なし対照反応（no  test  control  reaction）であり、抽出対照は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液／反応あたりＶｅｒｏ  ｇＤＮＡ  １００ｐｇの当量を含有するＰＢＳ緩衝液であった。
【０２５０】
リアルタイムｑＰＣＲは、試料中の低コピー数の残留ＤＮＡまたはＲＮＡの定量を含む、遺伝子発現分析、遺伝子型決定、病原体検出／定量、変異スクリーニング、および正確なＤＮＡ検出のために利用することができる感度のよい定量的増幅方法である。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  ９６ウェル機器を使用して、増幅プロセスの際に連続的にＰＣＲ増幅産物の蓄積を検出し、ＰＣＲの対数期における正確な標的の定量が可能となった。９６ウェルブロックを使用することにより、３８４ウェルブロックより大きい反応体積が可能となり、このように、残留ＤＮＡおよび夾雑物ＤＮＡ試験に関するアッセイ感度が増加する。
【０２５１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲケミストリーは、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用する。ヒトゲノムＤＮＡを検出するために使用されるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、識別可能な放射極大を有する２つの蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド末端で構成される。プローブの５’末端は、レポーター色素、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）によって標識され、３’プローブ末端は、消光色素、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）によって標識される。オリゴヌクレオチドプローブは、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ）ネクチン−１α遺伝子ＰＣＲアンプリコン内の内部標的配列と相同であり、Ｖｅｒｏ細胞およびＣＶ−１細胞に対して非常に特異的である。ＶｅｒｏのヒトｇＤＮＡに対する高い拒絶比は、プローブ標的の一部としてヒトｇＤＮＡに存在しないＣ．  ａｅｔｈｉｏｐｓにユニークな９塩基配列重複事象を利用することによって達成される。インタクトで遊離の溶液中では、プローブ消光色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介して蛍光色素レポーターからの放射を低減させる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応の伸長相において、プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素がプローブから放出されて、レポーターからの放射を増加させる。
【０２５２】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴは、２軸スキャンヘッドを使用して、アルゴンイオン（４８８ｎｍ）レーザーからの励起光を９６ウェル全てに分配する。電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャーが、それぞれのウェルからの蛍光スペクトルおよび強度を測定して、ＰＣＲ増幅の際のリアルタイムスペクトルデータを作成する。ＡＢＩ配列検出ソフトウェア（ＳＤＳ）は、レポーター色素、クエンチャー色素、およびノーマライザー（ＲＯＸ）色素の蛍光強度を逆畳み込みして、増幅の過程にわたって、正規化したレポーターからの放射強度の増加を計算する。
【０２５３】
それぞれのＰＣＲ反応における初回標的の正確な定量は、試薬が消耗する前または副産物による反応の阻害が起こる前に、増幅の対数（ｌｏｇ２）期の間に起こる。しかし、反応のシグナル対ノイズ限界および一般的なバックグラウンド蛍光により、最も正確なデータは典型的に対数期後期に得られる。正規化レポーター蛍光を、ＰＣＲサイクル数によって表される時間に対してプロットする。標的コピー数または質量値は、バックグラウンドを超える蛍光閾値を割付することおよびそれぞれの試料の増幅プロットが閾値（閾値サイクルまたはＣｔとして定義される）に達するサイクル点を決定することによって得られる。それぞれの反応の閾値サイクル値を使用して、既知標準物質と比較した、それぞれの試験品目反応内に最初に含有される標的の量を定量する。
【０２５４】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を、シングルコピー遺伝子であるＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ）特異的ネクチン−１α遺伝子の遺伝子内重複（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＦ３０８６３５）を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのｑＰＣＲアンプリコンを使用して、ＶＥＲＯゲノムＤＮＡ負荷量に関して試験した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよび二重蛍光色素標識プローブを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（バージョン２．０．０）を用いて設計した。１１１ｂｐのアンプリコンは、フォワードプライマー：5'-(CCT  CTG  CCC  AGC  GTG  AAG;配列番号５);  リバースプライマー:  5'-(CAC  AGA  CAC  GCC  CAT  GGA  T  配列番号６);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(CAC  CCA  AGC  CAC  CAA  TGG  CTC  CAA)-[TAMRA]配列番号７からなる。プライマーおよびプローブをそれぞれ、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）によって１０および５ｐｍｏｌ／μＬに希釈した。反応混合物は、ＵＮＧおよびＲＯＸ色素を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ  ２×マスターミックス２５μＬ、ＮＦＷ  ２μＬ、フォワードプライマー１μＬ、リバースプライマー１μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ１μＬ、および試料２０μＬ（最終反応体積５０μＬ）からなった。反応混合物を９６ウェルプレートにロードして、光学フィルムで覆い、ＡＢＩモデル７９００ＨＴ  ９６ウェル配列検出システムによって２−ステップｑＰＣＲプロファイル（２．００分、５０．０°Ｃ；１０．００分、９５．０°Ｃ；０．１５分、９５．０°Ｃを４０サイクル；１．００分、６０．０°Ｃ）を使用して増幅した。精製ＤＮＡ（ＡＴＣＣ、パート番号１５８７Ｄ）から作製したＶＥＲＯゲノムＤＮＡ標準曲線は、ＮＦＷに１００ｎｇから１ｐｇまで１０倍連続希釈するものであった。およそ２．６および０．２６遺伝子コピー／ｒｘｎと等価の１０および１ｐｇ／ｒｘｎ標準物質からの陽性反応が希に観察される。総試験試料ＤＮＡを緩衝液ＡＬの１：２によって不活化して、ｑＰＣＲ反応の前に、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップ法を使用して抽出した。試料の組成に起因する潜在的なＰＣＲ阻害は、抽出された試験品目試料にゲノムＤＮＡ  ５ｎｇを添加することによってモニターした。抽出効率をＰＢＳ緩衝液ブランクおよびｑＰＣＲ反応あたりＶＥＲＯ  ｇＤＮＡの１００ｐｇ当量を添加したＰＢＳ緩衝液試料を使用してモニターした。緩衝液（鋳型を含まないＮＦＷ）対照試料を、試験のために実施した。夾雑物（センチネル）対照を定期的に含める。試験試料における初回ゲノムＤＮＡ混入レベルを、試料閾値サイクル値をヒトＤＮＡ標準曲線の式と比較することによって、ＡＢＩ  ７９００ＨＴソフトウェアを使用して計算した。初回ＤＮＡレベルを、式：試料希釈係数（２）＊［（試験試料の平均質量（ｐｇ）−鋳型なしの平均質量（ｐｇ））÷（平均抽出前スパイク回収効率（抽出対照が１０％以上の回収率を有する場合、１００％に設定））］÷［（試料体積、μＬ／反応（２０μＬ））＊１０００μＬ／ｍＬ］を使用してｐｇ  ＤＮＡ／ｍＬに変換した。
【０２５５】
ＰＶＳＲＩＰＯウイルス採取プールを精製前にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素処理した。ヌクレアーゼ処理は、典型的に、平均で１２ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチド断片を生成し、消化後の断片集団はカイ分布に従う。このアッセイに使用したＣ．ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ細胞株およびＣＶ−１細胞株）ネクチン−１  ｑＰＣＲアンプリコンは１１１ｂｐであった。アッセイから得られた結果は、インタクト一倍体Ｃ．ａｅｔｈｉｏｐｓゲノムＤＮＡ（約３．８８ｐｇ／一倍体コピー）の質量に基づく残留宿主細胞ＤＮＡ濃度のワーストケースの推定値を表す。
【０２５６】
ｃ．残留Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を生産するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼを精製プロセスで使用したことから、承認された手順を使用して試験試料を調べて、残留Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼレベルを決定した。残留Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼの濃度は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼＥＬＩＳＡキットＩＩを使用して決定した。標準物質、試料、および対照を、アフィニティ精製ポリクローナル捕捉抗体を予めコーティングしたマイクロタイターストリップに添加することによってアッセイを開始した。ウェルを室温で２時間の期間インキュベートした後洗浄した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼに対する二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体を各ウェルに添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。これによって、以下のサンドイッチ複合体：固相抗体−Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ−ＨＲＰコンジュゲート抗体が形成された。ウェルを洗浄して吸引し、いかなる未結合反応体も除去した。ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加することによって、残留Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を検出した。ウェルを、１５分間のインキュベーション期間の間に発色させた。得られた色の強度は検体の量に相関し、これを、較正したＳｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  ３４０プレートリーダーを使用して定量した。試料のシグナルを、同時にアッセイしたＢｅｎｚｏｎａｓｅエンドヌクレアーゼ標準物質と比較することによって正確な測定が得られた。陽性対照は、０．２５〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ標準物質であった。アッセイ希釈物を陰性対照として使用した。アッセイの検出限界は、０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０２５７】
ｄ．ＢＣＡによる総タンパク質
核酸による干渉および／または低タンパク質濃度により分光光度法によって直接定量することができない溶液中の総タンパク質の検出は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）反応および５６２ｎｍでの比色定量を使用することによって達成することができる。高いｐＨ条件下タンパク質の存在によりＣｕ＋２がＣｕ＋１に還元され、ＢＣＡ  ２分子が単一の第一銅Ｃｕ＋１イオンとキレートを形成すると、水溶性の青紫色の反応産物が形成される。ＢＣＡ  Ｃｕ＋１キレートは、５６２ｎｍのλｍａｘを示し、吸光度は３ｌｏｇのタンパク質濃度（０．５μｇ／ｍＬ未満から５００μｇ／ｍＬ超）にわたって強く相関するが、特異的反応条件および計測手段によってしばしば、有効線形範囲は２ｌｏｇのみに限定される。Ｃｕ＋２の存在下でＢＣＡと反応するタンパク質溶液の吸光度は、溶液の凝集タンパク質構造、ペプチド結合の総数、ならびに溶液中のシステイン／シスチン、トリプトファン、およびチロシン残基の相対的割合に依存することが公知である。
【０２５８】
２０ｍＭトリス、４２ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝溶液中の試験試料、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７を、ＢＣＡアッセイを使用して総タンパク質に関して分析した。試験試料は、ＢＣＡアッセイを干渉する濃度の緩衝液構成成分を含有せず、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７にＨＳＡを添加する前に採取した。ＢＣＡ作業用試薬およびＢＳＡストック溶液ならびに標準曲線は、アッセイの直前にＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットから作製した。試料緩衝液による干渉がないことは、試験試料１００μＬをＢＳＡ（５０μＬ／ｍＬ）５００μＬおよび緩衝液希釈剤４００μＬと共に、２５μｇ／ｍＬ有効スパイク濃度となるようにＢＣＡ作業用試薬１ｍＬに添加することによって生成される試料−ＢＳＡスパイク反応の生成によって確認した。１００μＬの２つ組の試験試料を、緩衝液希釈剤９００μＬおよびＢＣＡ作業用試薬１ｍＬに添加した。ＢＣＡ作業用試薬の添加後、試料および対照を室温で２時間インキュベートした後、５６２ｎｍの吸光度を測定した。緩衝液希釈剤−ＢＣＡ作業用試薬試料を使用して、分光光度計をゼロ（ブランク）に設定した。各反応を２つ組で測定して、ＢＳＡ標準物質をさらなる分析の前に平均した。ＢＳＡ標準曲線（０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）を線形回帰にフィットさせ、Ｒ２＝０．９８９の結果を得て、標準曲線上のいかなる点も外れ値でないことが判明し、結果は有効であった。試験試料の反復実験は、平均値と比較して過度の変動を示さなかった。対照の２５μｇ／ｍＬのＢＳＡスパイク試料は、１１４．６１％（全体で２８．６５μｇ／ｍＬ）の回収率を示し、試料の組成がアッセイに干渉しないことを示した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ０９０３００７試験試料の全平均値は、ＢＳＡ標準曲線の式：Ｘ＝（（（Ｙ−Ａ）／Ｂ）＊１０）（式中、「Ｘ」はタンパク質濃度であり、「Ｙ」は吸光度の値であり、「Ａ」および「Ｂ」は曲線のパラメータであり、ならびに１０は反応あたり試料１００μＬを使用したことを指す）を使用して計算した場合に、−０．０１９７  ＡＵ５６２であると計算され、これは検出レベル未満のタンパク質濃度（１μｇ／ｍＬ未満）に等しかった。方法の定量限界は５μｇ／ｍＬであり、したがってＢＣＡによって決定する場合、試験結果は５μｇ／ｍＬ未満のタンパク質として報告される。
【０２５９】
ｅ．差別的殺滅
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９のＵ８７−ＭＧヒト神経膠芽種およびＨＥＫ２９３ヒト胎児腎細胞に対する差別的殺滅活性（differential  killing  activity）を決定した。アッセイを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイを使用して、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩（ＭＴＳ）および電子カップリング試薬フェナジンエトスルファート（ＰＥＳ）を用いて実施した。
【０２６０】
アッセイを実施するために、Ｕ８７−ＭＧ細胞を、Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、および１％非必須アミノ酸溶液を含むＤＭＥＭ中で培養した。ＨＥＫ２９３細胞をＬ−グルタミンを有し１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞を９６ウェルプレートに４×１０４個／ウェル（４×１０５個の細胞／ｍＬ、０．１ｍＬ／ウェル）蒔いた。試験品目を初回推定力価２×１０７ＰＦＵ／ｍＬまで希釈した後、連続４倍希釈した。希釈したウイルス試料（１００μＬ／ウェル）を、細胞を含むプレートに移した。試験品目の最終ウイルス力価（ＭＯＩ）は、およそ５０〜０．０００２ＰＦＵ／細胞（ＴＣＩＤ５０に基づいて計算したＭＯＩ）の範囲であった。プレートを５％ＣＯ２、８０％湿度の環境下、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション期間の後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して（２０μＬ／ウェル）、５％ＣＯ２および湿度８０％の環境下、３７℃でさらに４時間インキュベートした。ＳＤＳ（１０％溶液を２５μＬ／ウェル）をウェルに添加した。プレートをプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４９０ｎｍの吸光度で５分以内に読み取った。細胞増殖培地のみを有する（細胞を含まない）ウェルのバックグラウンドの読みを、試験試料ウェルの読みから差し引いた。データを非線形４−パラメータ曲線フィット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓのＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ）を使用して分析した。アッセイに使用した対照は、ＰＶＳＲＩＰＯ毒性学ロットＬ０６０３００６（陽性対照）および細胞増殖培地（陰性対照）を含んだ。
【０２６１】
ｆ．無菌性（直接接種）
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９および最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の無菌性試験を直接接種法によって実施した。
【０２６２】
ｇ．静菌／静真菌（滅菌後）
静菌／静真菌（Ｂ＆Ｆ）試験を、２１  ＣＦＲ  ６１０．１２に従って米国薬局方（ＵＳＰ）の浸漬法を使用して、ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９滅菌後試験において実施した。Ｂ＆Ｆ試験は、試験品目に固有のいかなる静菌および／または静真菌活性も、無菌性試験法の信頼性に有害な影響を及ぼさないことを確実にするために実施した。
【０２６３】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９の安定性
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を、バイアル充填前に保管庫に入れずに、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填生物学的製品ロットＬ０９０４０１０を生産した。したがって、ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９に関しては、最後の濾過と同じ日にバイアルに充填したことから、安定性試験を実施しなかった。
【０２６４】
最終バイアル充填製品
０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４＋０．２％ＨＳＡ中の５０ｍＭリン酸ナトリウム中で調合したＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を、０．２μｍ  ＰＶＤＦメンブレンフィルターを使用して濾過滅菌して、最終バイアル充填製品を生産した。最終バイアル充填製品は、米国連邦規則集２１ＣＦＲ  ２１０、２１１および６００に記載の現行の医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＣＧＭＰ）、ならびにフェーズＩ／ＩＩ治験薬の製造および試験に関するＦＤＡ／ＩＣＨガイドラインに従って製造、試験、および維持した。
【０２６５】
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９を充填して、最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０を生産した。充填操作は、バイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）内で、承認された手順に従って実施した。２ｍＬ−１３ｍｍ  Ｉ型ホウケイ酸ガラスバイアル（Ｗｈｅａｔｏｎカタログ番号２２３６８３、ロット番号１４３８１７４）を使用した。各バイアルの目標分配量は、０．５７ｍＬ（０．５６４〜０．５７６ｍＬ）であった。インプロセス重量チェックを実施した。
【０２６６】
４４２個のバイアルを充填後、Ｂ２  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ  Ｗｅｓｔａｒ  ＲＳストッパー（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａカタログ番号１９７０−０００２、ロット番号Ｊ８２８１）を挿入して、圧着操作を行った。圧着操作の際の圧着の完全性を肉眼で検査し、拒絶されたバイアルはなかった。充填、栓封止、および圧着操作の完了後、ラベルを貼付していないバイアル（４４２個）を検査した。
【０２６７】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の放出試験、方法、および規格を、以下の図２１の分析証明書に提供する。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の試験に使用した方法［ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０アッセイ）、ＬＡＬによるエンドトキシン、およびｒｃｔ４０によるウイルス安定性、全ゲノム配列、および無菌性（直接接種）を除く］を以下に記載する。ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０アッセイ）、ＬＡＬによるエンドトキシン、およびｒｃｔ４０によるウイルス安定性の方法は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ採取プールロットＬ０９０４００８に関して記述されており、本明細書において見出すことができる。全ゲノム配列および無菌性（直接接種）の方法は、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ０９０４００９に関して記述されており、本明細書において見出すことができる。
【０２６８】
ａ．外観
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の試料を肉眼で調べた。製品を、容器の完全性、溶液の清澄性、および容器ラベルの正確性に関して調べた。容器を、ひび割れまたは劣化に関して検査して、上部がしっかり閉じていることを確認した。溶液の清澄性を、肉眼での検査によって評価して、液体製剤中の可溶性産物が、任意の微粒子物質、不清澄性および容器中の流体の色合い、または容器中の流体の任意の濁りもしくは曇りを含まないかを決定した。容器のラベルを検査して、クライオバイアルに適切にラベルが貼付されておりかつラベルが確実に適合していることを確認した。
【０２６９】
ｂ．ＲＴ−ｑＰＣＲ（ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳおよびポリオポリタンパク質）
組換えポリオウイルスＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０を、ＰＶＳＲＩＰＯ中のＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ−１）およびポリオポリタンパク質遺伝子（ＰＯ１）を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのＲＴ−ｑＰＣＲアンプリコンを使用して、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ−１）およびポリオポリタンパク質（ＰＯ１）ＲＮＡ負荷量に関して試験した。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、遺伝子発現分析、遺伝子型判定、病原体検出／定量、変異スクリーニング、および試料中の低コピー数の残留ＤＮＡまたはＲＮＡの定量を含む正確なＤＮＡ検出のために利用することができる感度のよい定量的増幅法である。プロセス解析／生物学的製剤品質管理検査室は、増幅プロセスの際に連続的にＰＣＲ増幅産物の蓄積を検出するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  ９６ウェル機器を使用し、ＰＣＲの対数相における正確な標的の定量を可能にした。９６ウェルブロックの使用により、３８４ウェルブロックより大きい反応体積が可能となり、このため、残留ＤＮＡおよび夾雑物ＤＮＡ試験のアッセイ感度が増加した。
【０２７０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲケミストリーは、それぞれのアンプリコンについて二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用する。ヒトゲノムＤＮＡの検出のために使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、識別可能な放射極大を有する２つの蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチド末端で構成される。プローブの５’末端を、レポーター色素である６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）で標識し、プローブの３’末端を、消光色素であるカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識する。オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＨＲＶ−２由来ＩＲＥＳ内の内部標的配列およびポリオポリタンパク質ＲＴ−ＰＣＲアンプリコンと相同であり、共に使用する場合、ＰＶＳＲＩＰＯに対して特異的である。ＰＶＳＲＩＰＯは一本鎖ＲＮＡウイルスであることから、ｑＰＣＲ増幅の前に熱サイクルプロトコールの一部として、増幅プライマーを使用して試料をｃＤＮＡに逆転写する。インタクトで遊離の溶液中では、プローブ消光色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介して蛍光色素レポーターからの放射を低減させる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応の伸長相において、プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素がプローブから放出されて、レポーターからの放射を増加させる。
【０２７１】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴは、２軸スキャンヘッドを使用して、アルゴンイオン（４８８ｎｍ）レーザーからの励起光を９６ウェル全てに分配する。ＣＣＤイメージャーが、それぞれのウェルからの蛍光スペクトルおよび強度を測定して、ＰＣＲ増幅の際のリアルタイムスペクトルデータを作成する。ＡＢＩ配列検出ソフトウェア（ＳＤＳ）は、レポーター色素、クエンチャー色素、およびノーマライザー（ＲＯＸ）色素の蛍光強度を逆畳み込みして、増幅の過程にわたって、正規化したレポーターからの放射強度の増加を計算する。
【０２７２】
それぞれのＰＣＲ反応における初回標的の正確な定量は、試薬が消耗する前または副産物による反応の阻害が起こる前に、増幅の対数（ｌｏｇ２）期の間に起こる。しかし、反応のシグナル対ノイズ限界および一般的なバックグラウンド蛍光に起因して、最も正確なデータは典型的に対数期後期に得られる。正規化レポーター蛍光を、ＰＣＲサイクル数によって表される時間に対してプロットする。標的コピー数または質量値は、バックグラウンドを超える蛍光閾値を割付することおよびそれぞれの試料の増幅プロットが閾値（閾値サイクルまたはＣｔとして定義される）に達するサイクル点を決定することによって得られる。それぞれの反応の閾値サイクル値を使用して、既知標準物質と比較した、それぞれの試験品目反応内に最初に含有される標的の量を定量する。
【０２７３】
ＢＤＰでアッセイを実施するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよび二重蛍光色素標識プローブを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（バージョン２．０．０）によって設計した。７１ｂｐのＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ−１）アンプリコンは、フォワードプライマー：5'-  (AAC  CCA  ATG  TGT  ATC  TAG  TCG  TAA  TGA,   配列番号1);リバースプライマー:  5'-  (TGA  AAC  ACG  GAC  ACC  CAA  AG  配列番号2);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(CAA  TTG  CGG  GAT  GGG  ACC  AAC  T  配列番号３)-[TAMRA]からなる。ＰＯ１の７０ｂｐのアンプリコンは、フォワードプライマー：5'-  (TTG  GTG  GGA  ACG  GTT  CAC  A  SEQ  ID  NO:  8);リバースプライマー:  5'-  (TCA  CCT  TGA  CTC  TGA  GTG  AAG  TAT  GA  配列番号9);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(TTG  CAG  CGG  CCC  TGA  AGC  G  配列番号10)-[TAMRA]からなる。プライマーおよびプローブをそれぞれ、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）によって１０および５ｐｍｏｌ／μＬに希釈した。反応混合物は、ＲＯＸ色素を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）１−ステップＲＴ  ＰＣＲ  ２×マスターミックス２５μＬ、ＲＮアーゼ阻害剤１μＬ、ＮＦＷ  １μＬ、フォワードプライマー１μＬ、リバースプライマー１μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ１μＬ、および試験試料２０μＬ（最終反応体積５０μＬ）からなった。反応混合物を９６ウェルプレートにロードして、光学フィルムで覆い、ＡＢＩモデル７９００ＨＴ  ９６ウェル配列検出システムによって３−ステップｑＰＣＲプロファイル（２．００分、５０．０°Ｃ；４８．０℃で３０分（ＲＴ−ステップ）；１０．００分、９５．０°Ｃ；０．１５分、９５．０°Ｃを４０サイクル、１．００分、６０．０°Ｃ）を使用して増幅した。アンプリコンｃＤＮＡ標準曲線をＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡから作製して、ＮＦＷ中で１ｎｇから１０ｆｇまで１０倍連続希釈した。総試験試料ＲＮＡを緩衝液ＡＶＬの１：４によって不活化して、ＲＴ−ｑＰＣＲ反応の前に、ＱｉａｇｅｎウイルスＲＮＡミニプレップ法を使用して抽出した。試料の組成に起因する潜在的なＰＣＲ阻害を、抽出された試験試料にＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡ  ５００ｐｇを添加することによってモニターした。緩衝液（鋳型を含まないＮＦＷ）陰性対照試料を、試験のために実施した。ＰＶＳＲＩＰＯプラスミドＤＮＡロットＬ０３０５００６を陽性対照として使用した。アッセイ間変動をなくすために、両方のＰＶＳＲＩＰＯアンプリコンを同じ９６ウェルプレートで実施した。試験試料中の初回ＰＶＳＲＩＰＯ  ＲＮＡ濃度を、ＡＢＩ  ７９００ＨＴソフトウェアを使用して、試料閾値サイクル値をプラスミドＤＮＡ標準曲線の式と比較することによって計算した。初回ＲＮＡレベルを、式：試料希釈係数（２）＊［（試験試料の平均質量（ｐｇ）−鋳型なしの平均質量（ｐｇ））÷（平均抽出前スパイク回収効率（１００％に設定））］÷［（試料体積、μＬ／反応（２０μＬ））＊１０００μＬ／ｍＬ］を使用してｐｇＲＮＡ／ｍＬに変換した。
【０２７４】
ｃ．ｐＨ
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０について、ｐＨ試験を実施した。ｐＨ値は、水素イオン活動度に対して感度が高い指示電極、ガラス電極、および適した参照電極を使用して、ｐＨ値を０．０２ｐＨ単位に再現することができる適切に標準化された電位測定機器（ｐＨメーター）から得た。機器は、電極対の間の電位を検知することができ、温度および／または勾配制御を通してｐＨの読みの単位変化あたりのミリボルトの変化を制御することができる。測定は２５±２℃で行う。アッセイを実施するために、ｐＨメーターを２つの標準化緩衝液２組を使用して標準化した：ｐＨ４．０と７．０、およびｐＨ７．０と１０．０。次に、プローブをすすぎ、水分を吸い取らせて乾燥させた（blotted  dry）後、試験試料のｐＨを決定した。アッセイは、２つの標準化の勾配値が９２．０％〜１０２．０％の範囲内に入ったことから、有効であった。陽性対照はｐＨ４．０標準物質、ｐＨ７．０標準物質、ｐＨ１０．０標準物質であった。
【０２７５】
ｄ．電子顕微鏡法（ＥＭ）によるウイルス粒子
このアッセイは、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって、試験試料（ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０）中のウイルス粒子数／ｍＬを定量するために設計された。１０個のグリッド空間の写真を撮影して、各区画のウイルス粒子数を計数し、これを使用してウイルス粒子／ｍＬを計算した。試験試料を等量の固定液（２×ＰＢＳ中の８％ホルムアルデヒド）によって希釈して固定した。試験試料（０．５μＬ）をホルムバール処理／炭素被覆グリッドの上に置いて、風乾させた。次に試料を２回蒸留した水（ＤＤＨ２Ｏ）５μＬによって洗浄して、試料から塩／リン酸緩衝液を洗浄した。次に、１％リンタングステン酸（ＰＴＡ、ｐＨ７．０）水溶液（０．５μＬ）をグリッド上に添加して、風乾させた。グリッドを電子顕微鏡法で調べた。１０個のグリッド空間の写真を撮影して、ウイルス粒子数を以下の計算によって決定した：
ウイルス粒子数（ｖｐ）＝（平均ｖｐ数）×（グリッドの面積／写真の面積）×（１ｍＬ／μＬで添加したウイルス量）
【０２７６】
ｅ．感染単位あたりのウイルス粒子の比率
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０に関する感染単位あたりのウイルス粒子の比率（ｖｐ／ＩＵ）は、ウイルス粒子濃度１．０１×１０１１ｖｐ／ｍＬ（ＱＣ−０４２１７２）をウイルス力価３．９８×１０９  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ＱＣ−０４２１６５）で除することによって、計算した。
【０２７７】
ｆ．安定性試験
【０２７８】
１．ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０の安定性試験は、プロトコールＳＰ−１３７の下で４年の期間で実施されている。安定性試験のために指定されたバイアルを−７０℃以下の制御保管庫で保存する。安定性に関して試験される最終バイアル充填ＰＶＳ−ＲＩＰＯ製品の属性は、目に見える外観、効力（ＴＣＩＤ５０によるウイルス力価）、および安全性（エンドトキシン／ＬＡＬ、ｐＨ、およびバイオバーデン）を含む。外観およびＴＣＩＤ５０によるウイルス力価は、０、６、１２、２４、３６、および４８ヶ月の安定性時点で試験する。安全性（エンドトキシン／ＬＡＬ、ｐＨ、およびバイオバーデン）試験は、０、１２、２４、３６、および４８ヶ月の安定性時点で実施する。ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０に関して６ヶ月間の安定性時点で収集した安定性データの要約を表８に含める。結果は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品毒性学ロットＬ０９０４０１０が−７０℃以下で６ヶ月間安定であることを示している。
【表８】
2018527885.tif 000010
【０２７９】
２．ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品毒性学ロットＬ０６０３００６
【０２８０】
これまでの試験的ロット（ＰＶＳ−ＲＩＰＯ毒性学ロットＬ０６０３００６）を製造した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ毒性学ロットＬ０６０３００６は、カニクイザルにおけるＰＶＳ−ＲＩＰＯの範囲探索試験に使用した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ毒性学ロットＬ０６０３００６は、プロセスの規模に関連する問題のみが異なる、臨床ロットＬ０９０４０１０と同等のプロセスを使用して製造された。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ毒性学ロットＬ０６０３００６の分析証明書を図２２に含める。
【０２８１】
−７０℃以下で保存したＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０６０３００６の安定性試験を４８ヶ月間実施した。プロトコールを、電子顕微鏡検査アッセイによるウイルス粒子を除外して（この方法は、安定性を示すものと考えられていないことから）、ウイルス粒子の感染単位に対する比（比ＶＰ／ＩＵ）の決定を除外し、年１回のバイオバーデン試験を追加するように改訂した。ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品毒性学ロットＬ０６０３００６に関して４８ヶ月間の安定性時点で収集された完全な安定性データの要約を、表９に含める。結果は、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品毒性学ロットＬ０６０３００６が、−７０℃以下で４８ヶ月間安定であることを示している。
【表９−１】
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【表９−２】
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【０２８２】
バイアルのラベルを作成して、１つのラベルをそれぞれのバイアルに貼付した。このプロセスにより、４３５個のラベル貼付済み充填バイアルを得た。ラベルを貼付したバイアルを箱に入れて、−７０℃以下の保管庫に入れた。試料（ラベルを貼付したバイアル５２個）を、ＢＱＣ放出試験のために指定した。残りの３８３個のラベル貼付バイアルを製品として指定した。３８３個の産物バイアルを−７０℃以下の制御保管庫に移した。
【０２８３】
１つのバッグラベルを３８３個のミニグリップバッグのそれぞれに挿入した。３６個のミニグリップバッグ（それぞれが、挿入されたバッグラベルを含有する）を、それぞれラベルを貼付した梱包箱に入れた。ラベルを貼付した梱包箱を、バイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）の中のドライアイスを満たしたトレイの上に置いて冷却し、梱包操作を通してドライアイス上で維持した。全体で３８３個のＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０のラベル貼付バイアルを、−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、同じＢＳＣのドライアイス上に置いた。これには、３４９個の製品バイアルが含まれ、３個を残し、３１個の製品バイアルを安定性試験のために指定した。それぞれのＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ０９０４０１０のバイアルを個々のミニグリップバッグ（それぞれが挿入されたバッグラベルを含有する）の中に入れた。
【０２８４】
梱包されたバイアルのそれぞれの箱を、吸収材料と共にバイオハザードバッグに入れて、−７０℃以下（＜70℃  Ｃ）の保管庫に戻した。全体で３８３個のバイアルを−７０℃以下の制御保管庫に入れた。
【０２８５】
（実施例６）
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１のケミストリー、製造、および管理の修正
図２３は、本出願人が生産したＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットの履歴を提供する。ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１は、実施例５に記述された手順と同じであるが、以下の変更を加えた手順を使用して製造した。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ試験を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦクロマトグラフィーステップの際に使用して、高い力価（１×１０７コピー／ｍＬ以上）のＰＶＳＲＩＰＯウイルスＲＮＡを含有する画分を同定した。これによって、選択される画分の範囲がわずかに異なり、それによってこのロットに関して、より高い残留タンパク質および遊離のウイルスＲＮＡが得られた。同様に、総感染性（ＴＣＩＤ５０ＩＵ）ウイルス収量のおよそ６倍の増加も可能となった。２つの追加のマイコプラズマ試験を採取プール試験に追加した。１つは、Ｖｅｒｏ細胞を使用したウイルス製品のマイコプラズマ検出試験であり、他方は、タッチダウン（ＴＤ）−ＰＣＲによるマイコプラズマ検出試験であった。全てのマイコプラズマ試験は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の代わりにＶｅｒｏ細胞を最初に使用して採取プールについて実施した。次に、アッセイを、ＰＶＳＲＩＰＯによる感染に対して不応性であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用して実施した。タッチダウンＰＣＲアッセイもまた、凍結試料保存後にマイコプラズマＤＮＡが存在しないことを確認するために実施した。ポリオウイルスＩＲＥＳに関する追加のＲＴ−ｑＰＣＲ試験を、野生型ウイルスが存在しないことを確実にするために最終バイアル充填製品放出試験に追加した。精製滅菌バルクおよび最終バイアル充填製品放出試験のためのゲノム配列決定法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代配列決定（ＮＧＳ）法を使用した。
【０２８６】
図２４は、製造プロセスの概要を提供する。ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１は、上記のＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填臨床ロットＬ０９０４０１０に関して使用したものと同じマスターウイルスシードロットＬ０４０３００６およびＶｅｒｏワーキングセルバンクロット２１７００２−２から作製した。上記の臨床ロットのために使用した手順と同じ手順（実施例５を参照されたい）に従って、Ｖｅｒｏ細胞を増大させて、１０段セルファクトリーでマスターウイルスシードを感染させた。ウイルスを遠心分離によって採取してプールした。採取プールをＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素によって処理して、宿主ゲノムＤＮＡレベルを低減させ、２つのカラムクロマトグラフィーステップ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦクロマトグラフィーおよびＱ６５０Ｍフロースルークロマトグラフィー）を使用して精製した。次に材料を、中空繊維限外濾過メンブレンを使用して濃縮して、調合緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）に対して透析濾過した。この材料を、−７０℃以下でおよそ３ヶ月間凍結した。解凍後、材料をプールして、０．２ミクロン濾過滅菌し、２ｍＬガラスバイアルに充填した。製造プロセスの簡単な要約を以下に概要する。
【０２８７】
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品は、０．２％ＨＳＡ（ＨＳＡ）を含有する、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４の緩衝液中で調合された無色の液体である。ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品をバイアルあたり０．５ｍＬの体積、および４．４８×１０９  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（２．２×１０９  ＴＣＩＤ５０／バイアル）の濃度で充填する。この製品を−７０℃以下で保存する。
【０２８８】
生産材料
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１の製造に使用した生産材料／試薬は、実施例５に記載のものと同じであった。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素は、植物起源の酵素であり、発酵によって産生される。カゼインの酸加水分解産物を発酵培地に使用する。カゼインの酸加水分解産物の産生のために使用したミルクは、ヒトによる消費のために収集されたミルクと同じ条件下のオーストラリアおよびニュージーランドの健康な動物を起源とする。カゼインの酸加水分解産物は、牛乳以外の反芻動物材料を含まずに調製される。ＦＢＳは、米国内にあるＵＳＤＡ監査屠畜場で収集したウシ胎児血液から製造され、検査したウシウイルスに関して陰性であった。ＨＳＡは、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａから購入した。ＨＳＡは、ＧＭＰ規則に従って製造され、米国薬局方および欧州薬局方に従う製造および製品試験の判定基準を満たす。全ての供血の血漿を個々に試験して、ＨＢＳＡｇ、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２  Ａｂ、およびＨＣＶ  Ａｂに対して非反応性であった。それぞれの血漿プールを試験して、ＨＢＳＡｇ、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２  Ａｂ、およびポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によるＨＣＶ−ＲＮＡに関して陰性であることが見出された。トリプシンは、カナダ起源の動物から収集したブタ膵腺起源であった。獣医師の監督下で、動物に死亡前および死後の検査を行い、動物は、見かけ上感染性疾患および伝染性疾患を有しない。原材料トリプシンを放射線照射する。供給業者は、１：２５０の強度を達成するために希釈剤としてウシ乳糖を使用した。この乳糖は、米国起源の健康なウシからの、ヒトによる消費に適合する牛乳を起源とする。この産生に使用される原材料トリプシンを試験して、ブタパルボウイルス、マイコプラズマ、ならびにＰＣＶ  １および２に関して陰性であることが見出された。
【０２８９】
生産の要約
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１（Ｐ２）を生産するための製造プロセスを、図２５Ａ〜２５Ｂに説明する。ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１３１１００４は、出発材料として、Ｖｅｒｏワーキングセルバンク（ＷＣＢ）ロット２１７００２−２およびＭＶＳロットＬ０４０３００６を使用してＢＤＰで製造した。Ｖｅｒｏ  ＷＣＢロット２１７００２−２の２個のバイアルを増大させて、１０個の６３６０ｃｍ２セルファクトリーにおいて細胞増大ロットＬ１３１０００３を生産した。細胞増大ロットＬ１３１０００３に、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＭＶＳロットＬ０４０３００６を感染させ、採取材料（採取プールロットＬ１３１１００３）をＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１の生産のために使用した。
【０２９０】
ａ．Ｖｅｒｏ細胞の開始および増大
細胞増大ロットＬ１３１０００３からのＶｅｒｏ細胞を、細胞採取ロットＬ１３１１００３の生産のために使用した。細胞増大活動は、ＡＴＲＦ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ａ、ＧＭＰ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＦａｃｉｌｉｔｙのＢＤＰで実施した。増大を通して、Ｖｅｒｏ細胞を、Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳを含む、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ中で成長させた。ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７０．０３ＩＲ）を１０％濃度で添加した。細胞を、全細胞増大プロセスの間、３７℃および５％ＣＯ２の設定でインキュベートした。
【０２９１】
Ｖｅｒｏワーキングセルバンク（ＷＣＢ）ロット２１７００２−２の２個のバイアルを、一定に攪拌しながら３７±２℃の水浴中で解凍した。それぞれのバイアルからの細胞を、１５ｍＬ遠心チューブ中の完全に加温した培地９ｍＬに添加した。混合後、試料を採取して計数し、生存率を決定した（７９％および８４％）。次に細胞を１０００ｒｐｍの設定で、４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨てて、細胞ペレットを、７５ｃｍ２フラスコにおいてＤＭＥＭ培地（上記）３０ｍＬの総混合体積中で再懸濁させた。細胞を、上記の増殖培地および条件を使用して、凍結から全体で８回の継代で７５ｃｍ２フラスコから６３６０ｃｍ２セルファクトリーへと増大させた。
【０２９２】
追加の腫瘍形成能試験を、産生に必要な追加のスケールアップ継代をモデル化するために、初回解凍から１０継代のＥＯＰ細胞に実施した。ブタサーコウイルス試験も同様に追加した。加えて、野生型ポリオウイルスＩＲＥＳの試験も追加した。
【０２９３】
ｂ．Ｖｅｒｏ細胞の感染
Ｖｅｒｏ細胞ロットＬ１３１０００３（１０個の６３６０ｃｍ２セルファクトリー、３個の６３６ｃｍ２セルファクトリー）を、それぞれの容器が９５〜１００％コンフルエンスの健康な細胞を含有すること、および夾雑物の目に見える兆候がないことを確認後、感染細胞溶解物を産生するために使用した。４個のＰＶＳＲＩＰＯマスターウイルスシード（ＭＶＳ）ロットＬ０４０３００６ボトル（８０ｍＬ  ＭＶＳアリコートを有する１２５ｍＬ  ＰＥＴＧボトル）を−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、３３〜３８℃の水浴中で解凍し、感染プロセスにおいて感染多重度（ＭＯＩ）０．１ｐｆｕ／細胞で使用した。解凍したＭＶＳロットＬ０４０３００６  ２２６ｍＬを、調製した感染培地（Ｌ−グルタミン含む、Ｈｅｐｅｓおよびフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に添加することによって、全体積およそ８リットルの調合感染培地を調製した。
【０２９４】
洗浄培地（Ｌ−グルタミンを含む、Ｈｅｐｅｓおよびフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２）およそ７５０ｍＬによって洗浄した後、調製し調合された感染培地およそ７５０ｍＬを満たすことによって、１０個の６３６０ｃｍ２セルファクトリーを感染用に調製した。陽性対照および陰性対照も同様に調製した。感染セルファクトリーおよび対照を、３３℃、５％ＣＯ２濃度、および８０％湿度の設定でインキュベートした。感染の７０時間後、９５〜１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が１０個全てのセルファクトリーにおいて示され、対照フラスコのそれぞれにおいて予想された結果が示された。
【０２９５】
ｃ．感染細胞溶解物の採取および清澄化
ＰＶＳＲＩＰＯウイルス感染細胞懸濁液ロットＬ１３１１００３を、それぞれのセルファクトリーから採取して、滅菌培地バッグに共にプールした。ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ１３１１００３の放出試験のために、感染細胞懸濁液の試料を採取した。ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ１３１１００３の放出試験の試験、規格、方法、および結果を要約する分析証明書を、図２６に含めて示す。
【０２９６】
感染細胞懸濁液を、１Ｌポリカーボネート遠心ボトルにおよそ７５０ｍＬアリコートで移した。感染細胞懸濁液を、４℃および３８００×ｇの設定でおよそ２０分間遠心分離した。遠心ボトルのそれぞれからの清澄化上清を１０Ｌバッグに共にプールして、１Ｌ滅菌ＰＥＴＧボトル１０個に分配して、凍結し、−７０℃以下で保存するためにＭＭＩＣに移した。
【０２９７】
ｄ．最終採取物のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４の生産の際の宿主ゲノムＤＮＡのレベルを低減させるために、清澄化したＰＶＳ−ＲＩＰＯロットＬ１３１１００３採取物を、−７０℃以下でおよそ３ヶ月間保存後に室温で２１時間解凍した。解凍したＰＶＳ−ＲＩＰＯを２個の１０Ｌバッグにプールして穏やかに混合した。それぞれの個々のバッグからの３ミリリットル試料を、１個の１５ｍＬ円錐チューブに合わせた。試料を以下の試験に関してそれぞれのバッグから採取した：ＴＥＭ、Ｖｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ｑＰＣＲ、プラークアッセイ、ＨＣＰ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および全ゲノム配列決定。
【０２９８】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素の添加前に、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２最終濃度となるように、清澄化したＰＶＳＲＩＰＯロットＬ１３１１００３採取物のそれぞれのバッグ（２個のバッグ）に混合しながら添加した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素を、混合しながら最終濃度５０単位／ｍＬとなるように添加した。バッグを２〜８℃で１８〜２１時間インキュベートした。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理溶解物を２〜８℃で除去して試料を採取した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、全ゲノム配列決定、ＨＣＰ、ＴＥＭ、Ｖｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ｑＰＣＲ、プラークアッセイ、およびＴＣＩＤ５０によって分析した。
【０２９９】
ｅ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗクロマトグラフィー
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦクロマトグラフィーステップは、ＰＶＳＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４の生産の際の緩衝液交換、および低分子量の宿主細胞夾雑物からのウイルスプールの部分精製を提供する。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を充填したクロマトグラフィーカラムを使用して、さらに精製するための用意として、ウイルスの緩衝液を、低伝導度リン酸緩衝液に交換した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理溶解物をロードする前に、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラムに５Ｍ  ＮａＣｌを流して、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５を満たし、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５によって平衡化した。
【０３００】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理溶解物を、２回の等量の注入でＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラムにロードした。産物を４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５によって溶出し、それぞれの注入からのＰＶＳ−ＲＩＰＯメインピーク画分を、複数の２Ｌ  ＰＥＴＧボトルに収集した。２つのクロマトグラフィー実行からの個々の画分の試料を、リアルタイム逆転写ｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって分析した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯメインピーク画分を２〜８℃で８〜１７時間保存した。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ結果および両方のＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ実行からのＵＶ吸光度に基づいて選択した画分を、２０Ｌ滅菌バッグにプールした。プールしたクロマトグラフィー実行の試料を、以下に関して分析した：プラークアッセイ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＣＰ、ＴＥＭ、およびＶｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ｑＰＣＲ。
【０３０１】
ｆ．Ｑ６５０Ｍフロースルークロマトグラフィー
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦステップの後、ロットＬ１３１１００４の溶出物を、Ｑ６５０Ｍフロースルークロマトグラフィーカラムにアプライして、残存宿主細胞タンパク質夾雑物を非結合ウイルスから除去した。クロマトグラフィーカラムにＳｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍ樹脂を充填して、５Ｍ  ＮａＣｌを流した後に、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５を満たし、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５を使用して平衡化することによってカラムを調製した。
【０３０２】
カラムに、ＰＶＳ−ＲＩＰＯ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦメインピークをロードして、ウイルス産物を含有するフロースルーを収集した。溶出の際に使用した緩衝液は、４．７ｍＭ  ＮａＰＯ４、４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５であった。収集したＱ６５０ＭメインピークのＮａＣｌ濃度を、５Ｍ  ＮａＣｌを使用して１５０ｍＭ  ＮａＣｌに調節した。Ｑ６５０Ｍメインピーク材料をサンプリングした後、２〜８℃でおよそ１６時間保存した。試料を、以下に関して分析した：ウイルス力価を決定するためのプラークアッセイ、ＴＣＩＤ５０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＣＰ、ＴＥＭ、およびＶｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ｑＰＣＲ。
【０３０３】
ｇ．接線流濾過による濃縮および透析濾過
Ｑ６５０ＭメインピークロットＬ１３１１００４材料を２〜８℃の保管庫から取り出して、中空繊維限外濾過メンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＦＰ−５０−Ｃ−４ＭＡ）を使用して濃縮した。次に、濃縮したウイルス材料を調合緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）に対して透析濾過した。透析濾過したＰＶＳ−ＲＩＰＯ溶液の試料を、ウイルス力価を決定するためのプラークアッセイ、ＴＣＩＤ５０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＣＰ、ＴＥＭ、およびＶｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ｑＰＣＲに関して分析した。ＨＳＡ（２５％）を、透析濾過したＰＶＳ−ＲＩＰＯロットＬ１３１１００４に最終濃度０．２％となるように添加した。調合したＰＶＳ−ＲＩＰＯの試料を、拡張バイオバーデン（extended  bioburden）、プラークアッセイ、ＴＣＩＤ５０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＣＰ、ＴＥＭ、およびＶｅｒｏ  ｇＤＮＡ  ｑＰＣＲに関して分析した。
【０３０４】
ｈ．ＰＶＳ−ＲＩＰＯのバルクアリコート、サンプリング、および保存
調合したＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４をクラス１００  ＢＳＣに移して、４個の５００ｍＬ  ＰＥＴＧボトルにそれぞれおよそ２５０ｍＬを３個および１６７ｍＬを１個の体積で分配した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４の４個のボトルを、ラベルを貼付してエタノール／ドライアイス浴中で凍結し、さらに製造に使用するために−７０℃以下で保存した。ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４を−７０℃以下の制御保存フリーザー（controlled  storage  freezer）に移した。
【０３０５】
ｉ．精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１（Ｐ２）
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４の２５０ｍＬボトル３個および１６７ｍＬボトル１個を、ＭＭＩＣでの−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、−７０℃以下に移した。次に、ＰＶＳＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１３１１００４の４個のボトルを、２１〜２５℃の水浴中で解凍した：室温および製品の温度は２０℃であった。総解凍時間は１９５分であった。４個の容器の内容物を２Ｌ  ＰＥＴＧボトルにプールして、最終総体積９３４．３ｍＬを得た。精製ＰＶＳ−ＲＩＰＯの２．５ｍＬ試料を、０．５ｍＬアリコートで分配し、−７０℃以下で保存した。新たに作製した５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４中の０．２％ＨＳＡ  １２２ｍＬを、プールしたＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１４０５００１に添加した。０．２％ＨＳＡを含有する５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４中のＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製バルクロットＬ１４０５００１をポンプで送って、使用前完全性試験に合格し希釈剤（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４＋０．２％ＨＳＡ）で予め湿らせた０．２ミクロン滅菌Ｍｉｌｌｉｐａｋ２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターに通した。産物の濾過後、フィルターに同じ希釈剤を流して全量１，０５４ｍＬの最終濾過産物を得た。フィルターは、濾過後の完全性試験に合格した。滅菌ピペットを使用して、精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１  ２７ｍＬを取り出して滅菌試料容器に分配した。試料を、精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１放出試験に提出し、総最終体積はおよそ１０２７ｍＬを残した。次に、精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１を、充填ステップに進めた。
【０３０６】
バイアル充填してＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１を生産する
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１を充填して最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１を生産した。手作業での充填操作は、バイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）内で承認された手順に従って実施した。２ミリリットル、１３ｍｍ  ＵＳＰ／ＥＰ  Ｉ型ホウケイ酸ガラスバイアルを使用した（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、カタログ番号６８００３１４、ロット６１０２１２４８２６）。各バイアルの目標分配体積は、０．５５ｍＬ（０．５４５〜０．５５６ｍＬ）であった。インプロセス重量チェックを実施した。
【０３０７】
１７９２個のバイアルを充填後、Ｂ２  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ  Ｗｅｓｔａｒ  ＲＳストッパー（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、カタログ番号１９７０−０００２、ロットＤ３１６１２００）を挿入して、圧着操作を行った。圧着操作の際の圧着の完全性を肉眼で検査し、５個のバイアルを拒絶した。充填、栓封止、および圧着操作の完了後、ラベルを貼付していない状態でバイアルを検査した。ラベルを貼付していないバイアル２１個を検査の際に拒絶し、残りが全体で１７６６個のバイアルになった。
【０３０８】
プロセスを継続してラベル貼付操作を行い、試験および保持のために確保した５４個のバイアルを取り出した後、１７１２個のラベル貼付充填バイアルを使用のために得た。全てのバイアルを、ラベルを貼付した保存用の箱に入れて、−７０℃以下で保存した。その後さらに２個のバイアルを試験用に採取して、残りは１７１０個のバイアルとなった。
【０３０９】
ＰＶＳＲＩＰＯを梱包した。ウイルス濃度が記されたさらなるラベルをプラスチックミニグリップバッグに挿入した。３６個のミニグリップバッグ（それぞれが、挿入されたバッグラベルを含有する）をそれぞれのラベル貼付梱包箱に入れた。ラベル貼付梱包箱を、ＢＳＣの中のドライアイスを満たしたトレイ上に置いて、冷却し、梱包操作を通してドライアイス上に置いたままにした。全体で１７１０個のＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１ラベル貼付バイアルを、−７０℃以下の制御保管庫から取り出して、同じＢＳＣ内のドライアイス上でミニグリップバッグ（１つのバイアル／バッグ）に梱包した。ミニグリップバッグへの梱包の間、全てのバイアルおよび箱をドライアイス上で維持した。梱包したバイアルの３６個のそれぞれをラベル貼付した箱に入れた。箱を−７０℃以下の制御保管庫に入れた。
【０３１０】
許容限界と分析方法
ＰＶＳＲＩＰＯ採取プール、精製滅菌バルク、および最終バイアル充填製品の試験および規格は、以下の変更を除き、実施例５の記述と同じであった。２つのさらなるマイコプラズマ試験を採取プール試験に追加した。１つは、Ｖｅｒｏ細胞を使用したウイルス産物のマイコプラズマ検出試験であり、他方は、タッチダウン（ＴＤ）−ＰＣＲによるマイコプラズマ検出試験であった。採取プールのマイコプラズマ検出は、最初、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の代わりにＶｅｒｏ細胞を使用した。次に、アッセイを、ＰＶＳＲＩＰＯによる感染に対して不応性であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用して実施した。タッチダウンＰＣＲアッセイもまた実施して、試料の凍結保存後にマイコプラズマＤＮＡが存在しないことを確認した。野生型またはワクチン株ポリオウイルスが存在しないことを確実にするために、ポリオウイルスＩＲＥＳに関するＲＴ−ｑＰＣＲ試験を最終バイアル充填製品放出試験に追加した。精製滅菌バルクおよび最終バイアル充填製品放出試験のゲノム配列決定方法を、より進化したＩｌｌｕｍｉｎａ次世代配列決定（ＮＧＳ）法に変更した。
【０３１１】
ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールロットＬ１３１１００３、精製滅菌バルクロットＬ１４０５００１、および最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１に関する放出試験、方法、規格、および結果は、図２７〜２８の分析証明書に見出すことができる。
【０３１２】
分析方法の変更およびアッセイの説明
ＰＶＳＲＩＰＯ採取プール、精製滅菌バルク、および最終バイアル充填製品の試験は、複数の追加のマイコプラズマ試験を採取プール試料に実施したことを除き、実施例５に記述されるとおりに実施した。これらの方法を、追加のマイコプラズマ試験および新しい次世代配列決定方法と共に以下に説明する。
【０３１３】
ａ．Ｖｅｒｏ細胞を使用したウイルス産物のマイコプラズマ
マイコプラズマの検出を、間接手順および直接手順の両方を使用して採取プールロットＬ１３１１００３について実施した。Ｖｅｒｏ細胞を用いたこの試験は、この採取プールロットのみに関して偶発的に実施され、これまでの試験は、ポリオ感染に対して不応性であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用していた（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞についての試験も同様に実施した）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞と共に使用した採取プール試料は、Ｖｅｒｏ細胞アッセイと比較して追加の期間凍結保存されていたことから、採取プール中にマイコプラズマＤＮＡが存在しないことを確認するために、タッチダウンＰＣＲ（ＴＤ−ＰＣＲ）アッセイも同様に実施した。
【０３１４】
間接的検出法は、Ｖｅｒｏ細胞上に接種した後、ＤＮＡ結合蛍光色素染色を使用して染色することにより、マイコプラズマ、特に培養不能マイコプラズマの可視化を可能にする。陰性対照および陽性対照の両方をアッセイで使用した。陽性対照は、強い細胞吸着性（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）および弱い細胞吸着性（Ｍ．ｏｒａｌｅ）のマイコプラズマ種の両方を含んだ。ＤＮＡ結合蛍光色素による培養物の染色により、観察された染色パターンに基づいてマイコプラズマを検出することができる。陰性培養物では、細胞核の蛍光のみが観察されるが、陽性培養物では核および核外蛍光が観察される。
【０３１５】
直接培養は高感度で特異的なマイコプラズマの検出法である。使用した寒天培地およびブロス培地は、培養可能マイコプラズマの成長にとって必要な炭素およびエネルギーと共に栄養を供給する。陽性対照および陰性対照の両方を直接アッセイで使用した。陽性対照は、発酵性マイコプラズマ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および非発酵性マイコプラズマ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）を含んだ。
【０３１６】
間接的検出法に関して、採取プール試料を３７±２℃で解凍して、滅菌リン酸緩衝食塩水を使用して、１：５および１：１０倍希釈物を調製した。非希釈試験試料およびそれぞれの希釈物を、Ｖｅｒｏ細胞を含有する２個のカバーガラス（試料／希釈物あたり）それぞれの上に接種した。カバーガラスを、３６±１℃および５〜１０％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。８％ウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ  ２ｍＬをそれぞれのカバーガラスに添加した。カバーガラスを３６±１℃および５〜１０％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの３日後、カバーガラスを固定して染色し（ヘキスト染色）、落射蛍光顕微鏡を使用して読み取った。
【０３１７】
非希釈試験品目２ミリリットルを２つのＳＰ−４寒天プレートのそれぞれに接種し、ＳＰ−４ブロス５０ｍＬを含有する７５ｃｍ２フラスコに１０ｍＬを接種した。プレートを３６±１℃で最短で１４日間嫌気的にインキュベートした。フラスコを３６±１℃で嫌気的にインキュベートして、３、７、および１４日目に、２個のＳＰ−４寒天プレート（０．２ｍＬ／プレート）のそれぞれに副次培養した。これらのプレートを３６±１℃で最短で１４日間嫌気的にインキュベートした。ブロスフラスコを、それぞれの作業日に色または濁度の変化に関して１４日間観察した。一般的に、マイコプラズマの成長は、ブロスの混濁を引き起こす。寒天プレートを、１４日間のインキュベーション後に観察した（０日目）。ＳＰ−４ブロスで副次培養したプレート（３、７、および１４日目）を１４日間のインキュベーション後に観察した。マイコプラズマコロニーは寒天の中に成長し、コロニーの中心は不透明に見えるようになり、周辺表面の成長は半透明に見える。これらのコロニーは、光学顕微鏡下で容易に観察することができる。
【０３１８】
ｂ．ＴＤ−ＰＣＲによるマイコプラズマ
マイコプラズマの検出を、タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応（ＴＤ−ＰＣＲ）試験を使用して採取プールロットＬ１３１１００３について実施した。この試験は、ＰＴＣマイコプラズマＶｅｒｏ細胞試験およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞試験の実施の間の−７０℃以下の試料保持時間によって、保持された採取プール試料における生存の可能性がある任意のマイコプラズマが失われうる場合に実施した。ＰＣＲベースのマイコプラズマアッセイは、凍結融解に影響されず、採取プールの超低温保存は維持される。
【０３１９】
ＰＣＲは、細胞試料、血清試料、または組織試料中のマイコプラズマＤＮＡの検出にとって非常に感度のよいツールである。ＰＣＲは、その感染度にかかわらず、マイコプラズマＤＮＡを増幅する。プライマーの組によってマイコプラズマ配列の選択された保存領域の境界を定義することによって、標的配列を数時間で１０００万倍超に増幅することが可能である。増幅された標的ＤＮＡの存在を、エチジウム染色ゲル電気泳動によって確認する。このアッセイを使用して、１ｃｆｕもの少量のマイコプラズマＤＮＡを検出することができる。タッチダウンＰＣＲは、特異性および感度を大きく増加させるためにアニーリング勾配を使用する改変サイクリング法である。
【０３２０】
試験試料ＤＮＡは、細胞または上清の溶解および精製によって得られる。得られたＤＮＡを、ある量のヌクレアーゼフリー水に再懸濁させて、０．１μｇ／μＬのＤＮＡを生成する。ＰＣＲ増幅に関して、適切なプライマー、ｄＮＴＰ、緩衝液、水、ＭｇＣｌ２、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬のマスターミックスを調製して、アッセイにおけるあらゆる反応物に添加した。偽プライミング事象の発生を低減させるために、反応物を８−メトキシソラレンによって処理し、Ｕ／Ｖ光に曝露した。試験品目の６個のアリコートをＰＣＲ反応チューブに分配した。３つのアリコートは、さらなる対照ＤＮＡを添加せずに処理した。他の３つのアリコートには、マイコプラズマＤＮＡ  １、１０、および１００ｃｆｕを添加した。試薬対照の４個のアリコートを処理した；１つの反応物は、試料を除く反応ミックスの全ての構成成分を含有した。他の反応チューブには、マイコプラズマＤＮＡ  １、１０、および１００ｃｆｕを添加した。精製ヒト細胞Ｈ９  ＤＮＡの１つのアリコートを陰性対照として使用した。Ｈ９  ＤＮＡの３つのアリコートに、マイコプラズマＤＮＡ  １、１０、および１００ｃｆｕを添加した。ＴＤ−ＰＣＲ増幅後、アンプリコンをゲル電気泳動によって分離して、ＵＶ光によって調べた。
【０３２１】
ｃ．ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）
ＴＣＩＤ５０によるウイルス力価を、Ｈｅｐ−２Ｃ指標細胞を使用して実施して、ＰＶＳＲＩＰＯ採取プール、精製滅菌バルク、および最終バイアル充填製品におけるＰＶＳＲＩＰＯウイルス力価を決定した。希釈培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０）１００マイクロリットル（１００μＬ）を個別の９６ウェルプレート（それぞれの参照標準物質、陽性対照、および試験試料に関して個別のプレートを提供する）のそれぞれのウェルに添加した。ＦＤＡポリオウイルス１型参照標準物質、ＦＤＡロットＴＡ４（１：１０，０００）、Ｓａｂｉｎ原型１型陽性対照ポリオウイルス（１：１，０００，０００）および試験試料（１：１，０００，０００）の初回希釈物を、希釈培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％  ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０）で調製した。それぞれの最終希釈物１００μＬアリコートを、それぞれの９６ウェルプレートの最初の列のウェル８個のそれぞれに添加した。較正したマルチチャンネルピペッターを使用して、１列目の各ウェルから１００μＬを採取して、２列目の隣接するウェルに移して十分に混合して、次の列へと連続してプロセスを繰り返すことによって、連続１：２倍希釈物をそれぞれの９６ウェルプレートにおいて作製した。ＦＤＡ参照標準物質に関して、希釈は１１列目で終了し、１２列目は陰性対照ウェル（希釈培地のみを含有する）として用いた。１１列目からの過剰な１００μＬを廃棄した。陽性対照および試験品目に関しては、希釈スキームを第２の９６ウェルプレートにおいて継続して、２３列目で終了し、２４列目を陰性対照ウェルとして用いた。増殖培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中のＨｅｐ−２Ｃ細胞１００００個（１×１０５個の細胞／ｍＬを０．１ｍＬ）を、各９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、３６±１℃の加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で１０日間インキュベートした。プレートを、１、３、７および１０日目に細胞変性効果（ＣＰＥ）に関して調べた。アッセイの完了の際に、各試料に関してＣＰＥを示すウェルの数を、ＦＤＡによって提供された計算プログラムテンプレートの適当なフィールドに記入した。プログラムは、ＦＤＡポリオウイルス１型参照標準物質の応答に基づいて、各試料に関してＴＣＩＤ５０／ｍＬを計算する。ＦＤＡ参照標準物質の入手可能性によっては、他の良好に特徴付けされたＰＶＳＲＩＰＯおよびＳａｂｉｎ株標準物質を、陽性対照ウイルスとして使用してもよい。
【０３２２】
ｄ．ｒｃｔ４０によるウイルス安定性
アッセイは、Ｖｅｒｏ指標細胞でのプラーク形成によって、３３℃、３６℃および４０℃で、ＰＶＳＲＩＰＯ採取プールおよび最終バイアル充填製品、ならびに対照のウイルス力価を決定する。アッセイは、潜在的遺伝子変化の指標として成長特性の温度関連変化を使用するウイルスの安定性の間接的尺度である。アッセイは、２００２年のＷＨＯ技術報告書シリーズ９０４号に基づく。報告書は、ウイルスの濾過バルク懸濁液を、同じウイルス型のポリオウイルスの適切なｒｃｔ／４０−およびｒｃｔ／４０＋株と比較して、３６℃および４０℃の温度での再生特性に関して試験すべきであると述べている。インキュベーション温度は、±０．１℃内となるよう制御しなければならない。３６℃でのバルク懸濁液および適切な参照標準物質の力価が、４０℃で決定された力価より少なくとも５．０ｌｏｇ大きい場合、濾過バルクは試験に合格である。参照材料の全ての力価が、予想される値の範囲内でなければならない。
【０３２３】
３６℃および４０℃でのウイルスのｌｏｇ１０力価を比較して、３６℃と４０℃の間での対数の低減が少なくとも５である場合、試料は、４０℃での成長に対して感受性があると決定され、試験に合格したとみなす。３３℃での試料の力価も同様に決定して、３３℃での試料の過去に決定された力価と比較することができる。陽性対照は、ＲＣＴ  ４０＋対照：ポリオウイルス１  ＳａｂｉｎクローンＳ３３ロットＬ０４０６００８およびＲＣＴ  ４０−対照：ポリオウイルス１  ＳａｂｉｎクローンＳ７１ロットＬ０４０６００４を含む。陰性対照は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭである。
【０３２４】
Ｖｅｒｏ細胞を蒔いて８０〜１００パーセントコンフルエンスに達するまで成長させた。増殖培地を除去して、Ｖｅｒｏ細胞に試験試料または対照試料０．２ｍＬを与えた。次に、反復実験の培養皿を３３℃、３６℃、および４０℃でおよそ１時間インキュベートした。接種物を除去して、細胞シートに１．５％アガロース／２×ＥＭＥＭ／２０％ＦＢＳを重層した。アガロースを固化させて、プラークが陽性対照において完全に形成されるまで、反復実験の培養皿を３３℃、３６℃、および４０℃でインキュベートした（２日）。次に培養皿に、アガロース／ニュートラルレッドを含有する２×ＥＭＥＭを暗所で重層して、ニュートラルレッドが細胞シートを染色したときに、プラークを計数した。平均プラーク値を決定した。式：平均プラーク値×希釈倍率／接種体積、を使用して、力価（ｐｆｕ／ｍＬ）を計算した。
【０３２５】
ｅ．全ゲノム配列
ＰＶＳＲＩＰＯ精製滅菌バルクおよび最終バイアル充填製品ロットの包括的なディープシークエンス分析を実施した。
【０３２６】
１．ＲＮＡ抽出および逆転写
ゲノムＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）のＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキットを使用して、標準的なＱｉａｇｅｎのプロトコールの改訂版に従って、試験試料から単離した。簡単に説明すると、キャリアＲＮＡを含まない緩衝液ＡＶＬ  ５６０μＬを、試料１４０μＬに添加した。試料をボルテックスして、室温（２３°±２℃）で１０分間インキュベートした。１００％エタノール  ５６０マイクロリットルを試料に添加して、ボルテックスし、次に、試料の半分（約６３０μＬ）をＱＩＡａｍｐミニカラムに添加して、６０００×ｇで１分間遠心分離した。試料の残りをカラムに添加して、遠心分離を繰り返した。次に、カラムを２つの緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液各４０μＬの２回溶出を実施して、最終総体積を約８０μＬとした。総ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００分光光度計を使用して分光光度法によって定量した。次に、ＲＮＡを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用してｃＤＮＡを作製するために使用した。簡単に説明すると、ＲＮＡ  ９μＬ、オリゴ（ｄＴ）２０プライマー１μＬ、およびｄＮＴＰを６５℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、ｃＤＮＡ合成緩衝液、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴおよびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを試料に添加して、試料を５０℃で４５分間インキュベートした後、８５℃で５分間インキュベートして反応を停止させた。ＲＮアーゼＨを試料に添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。ｃＤＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００分光光度計を使用して分光光度法によって定量した。次に、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓのＮＥＢＮｅｘｔ第二鎖合成キットを使用して、ｃＤＮＡ産物５μＬを使用して第二鎖反応を実施した。ｃＤＮＡを、第二鎖合成緩衝液および第二鎖合成酵素ミックスと混合し、１６℃で２．５時間インキュベートした。産物をＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）３０μｌに溶出させた。ｄｓ−ｃＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００分光光度計を使用して分光光度法によって定量して、短期間保存のために−２０±４℃で保存した。
【０３２７】
２．ライブラリの調製
調製されたｄｓｃＤＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００において配列決定のためのライブラリを調製した。それぞれの元の試料から１つのライブラリを調製した。ライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴライブラリ調製キットを使用して調製した。ｄｓｃＤＮＡの出発時の総投入量は、１ｐｇ〜１ｎｇの間の投入ｄｓ−ｃＤＮＡを使用する開発前範囲探索努力に基づき、各ライブラリに関して１ｎｇであった。ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴライブラリ調製プロトコールに従って調製した。簡単に説明すると、各試料を酵素によって断片化して、同時にＮｅｘｔｅｒａタグ付断片化ケミストリーを使用して、アダプター配列でタグ付けを行った（ライゲートした）。プロセスは、投入されたＤＮＡを断片化して、断片の末端に、下流のプロセシングで使用するためのアダプター配列を付加する。次に、ライゲーション酵素を中和し、短い１２サイクルの増幅を実施して、各試料の５’末端および３’末端にバーコードを付加した。分析の際に異なる試料を同定して明確に示すために、それぞれのライブラリに異なるバーコードを割付した。ＰＣＲ反応物を２ラウンドのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ洗浄を使用して洗浄した後、ＴＥ緩衝液に溶出させた。ライブラリの品質および量に関して評価するために、次に、ライブラリのそれぞれを、高感度ＤＮＡチップを使用してＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザで分析した。試料ライブラリを、短期間保存のために−２０±４℃で保存した。
【０３２８】
３．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｃＤＮＡ配列決定と分析
それぞれの試料に関して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００において１つのＲａｐｉｄフローセルを実行した。それぞれのフローセルに関して、機器上でのクラスタリング（on-instrument  clustering）のために、ライブラリを変性させて希釈した。次に、ペアエンド２×１５０ｂｐの配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＳＢＳ配列決定技術および試薬を使用してライブラリのそれぞれに実施した。得られたデータを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑソフトウェアを使用してデマルチプレックスした後、分析した。それぞれのフローセルは、単一試料を使用して実行した。配列決定した全ての画分に関してＦａｓｔＱファイルを作成した。Ｓａｍｔｏｏｌおよびｍｐｉｌｅｕｐソフトウェアを使用して、ＳＡＭからの出力ファイルをＢＡＭフォーマットに変換し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒで検査ために出力ファイルにインデックスをつける。Ｍｐｉｌｅｕｐは、ウイルスのカバレッジを調べて潜在的変種を探すために、それぞれの位置の深さを増加させるためにフラグと共に使用した。１２サイクルのＰＣＲプレ増幅がＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴライブラリ調製のために必要であったことから、所定の位置でウイルス配列バリアントをコールする閾値は、２１２＝４０９６またはリードの０．１％のどちらか大きいほうであることが確立された。バリアントは以下の判定基準に従って定義され、所定の塩基位置での配列決定の深さが４，０９６，０００に等しいかまたはそれを超えた場合、潜在的変種は、０．１％超でコールされ；深さが４，０９６，０００未満であるが、４０９６超であった場合、４０９６またはそれ超の頻度を超えるバリアントがコールされた：所定の塩基位置でのカバレッジの深さが４０９６リード未満であった場合、それらが１．０％超からなる場合には、潜在的バリアントがコールされた。追加の配列決定努力（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎｇｅｒ、または他のＮＧＳ方法）が必要とされる前に、塩基位置あたりの最小のリードカバレッジを４Ｘ（規定の最小値）に設定した。
【０３２９】
リードを、Ｂｏｗｔｉｅ（ショートリード参照アライナー）を使用して各試料に関して、ＰＶＳＲＩＰＯ参照配列と整列させた。それぞれの試料に関して、塩基総数、カバレッジ、ならびに平均リード長および参照と整列させたリードのパーセントを計算して、アッセイの妥当性に関して予め確立された規格と比較した。推定されるゲノムカバレッジは、総配列決定塩基を得て、ＰＶＳＲＩＰＯ参照配列（７３０３塩基対）のサイズで除することによって見出された。それぞれの試料の参照全体の位置と比較したカバレッジのプロット、ならびに、それぞれの試料の試料リード長のプロットを作製した。分析を行って、参照配列と比較したときの、それぞれの試料中のバリアントを調べた。ポリオゲノムのこの領域（ＶＰｇ結合およびＳｔｅｍ  ａ／ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで高い配列変動性を示すことが公知であることから、多型レベルの上昇がそれぞれのウイルスロットの５’末端（塩基位置１〜３４位）で予想された（および観察された）。非整列リード配列を、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｎによって分析して、その同一性を決定した；非整列リード（non-aligned  read）、特に非精製ウイルス試料からのリードはＶｅｒｏ宿主細胞ゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡ配列に由来するが、まれにヒトＤＮＡまたは他の実験時の夾雑物ＤＮＡ配列も同様に観察されうると予想される。
【０３３０】
ｆ．宿主細胞ＤＮＡ
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクロットを、シングルコピー遺伝子であるＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ）特異的ネクチン−１α遺伝子の遺伝子内重複（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＦ３０８６３５）を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）アンプリコンを使用して、ＶｅｒｏゲノムＤＮＡ負荷量に関して試験した。アッセイの検出限界は、５ｎｇ  ＶｅｒｏゲノムＤＮＡ／ｍＬ未満であった。Ｖｅｒｏ細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を陽性対照（１００ｎｇ〜１０ｐｇ）として使用し、内部陽性対照（ＩＰＣ）の約２２５０コピーを試験品目に添加したものをＰＣＲ阻害対照として使用した。陰性の試験なし対照（Negative  No  Test  Control）（ＮＴＣ）の複数の対照（controls）は、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）を使用して実施し、それぞれの試料の核酸抽出対照は、反応あたりＩＰＣ約１０，０００コピーの等量を含有した。ＩＰＣは、ＶＩＣ標識プローブを利用して、試験およびＩＰＣアンプリコンの両方を同じＰＣＲ反応において定量することができる。Ｖｅｒｏ宿主細胞ＤＮＡ法からのＩＰＣ結果はまた、同時に実施したウイルス定量ＲＴ−ｑＰＣＲ法のための抽出対照および阻害対照としての役割も果たす。
【０３３１】
リアルタイムｑＰＣＲは、試料中の低コピー数の残留ＤＮＡまたはＲＮＡの定量を含む、遺伝子発現分析、遺伝子型決定、病原体検出／定量、変異スクリーニング、および正確なＤＮＡ検出のために利用することができる感度のよい定量的増幅方法である。Applied  Biosystems７９００ＨＴ  ９６ウェル機器を使用して、増幅プロセスの際に連続的にＰＣＲ増幅産物の蓄積を検出し、ＰＣＲの対数期における正確な標的の定量が可能となった。９６ウェルブロックを使用することにより、３８４ウェルブロックより大きい反応体積が可能となり、このように、残留ＤＮＡおよび夾雑物ＤＮＡ試験に関するアッセイ感度が増加する。
【０３３２】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲケミストリーは、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用する。ヒトゲノムＤＮＡを検出するために使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、識別可能な放射極大を有する蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド末端で構成される。プローブの５’末端を、レポーター色素、６−ＦＡＭによって標識し、３’プローブ末端は、消光色素によって標識した。内部陽性対照（ＩＰＣ）アンプリコンは、標的アンプリコンからの放射干渉を回避するために非蛍光クエンチャーを有するＶＩＣ標識プローブを使用した。オリゴヌクレオチドプローブは、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ）ネクチン−１α遺伝子ＰＣＲアンプリコン内の標的配列と相同であり、Ｖｅｒｏ細胞に対して非常に特異的である。ＶｅｒｏのヒトｇＤＮＡに対する高い拒絶比は、プローブ標的の一部としてヒトｇＤＮＡに存在しないＣ．ａｅｔｈｉｏｐｓにユニークな９塩基配列重複事象を利用することによって達成された。インタクトで遊離の溶液中では、プローブ消光色素は、ＦＲＥＴを介して蛍光色素レポーターからの放射を低減させる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応の伸長相において、プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素がプローブから放出されて、レポーターからの放射を増加させる。
【０３３３】
それぞれのＰＣＲ反応における初回標的の正確な定量は、試薬が消耗する前または副産物による反応の阻害が起こる前に、増幅の対数（ｌｏｇ２）期の間に起こる。しかし、反応のシグナル対ノイズ限界および一般的なバックグラウンド蛍光により、最も正確なデータは典型的に対数期後期に得られる。正規化レポーター蛍光を、ＰＣＲサイクル数によって表される時間に対してプロットする。標的コピー数または質量値は、バックグラウンドを超える蛍光閾値を割付することおよびそれぞれの試料の増幅プロットが閾値（閾値サイクルまたはＣｔとして定義される）に達するサイクル点を決定することによって得られる。それぞれの反応の閾値サイクル値を使用して、既知標準物質と比較した、それぞれの試験品目反応内に最初に含有される標的の量を定量する。
【０３３４】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ精製滅菌バルクを、シングルコピー遺伝子であるＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ（ＶＥＲＯ）特異的ネクチン−１α遺伝子の遺伝子内重複（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３０８６３５）を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）アンプリコンを使用して、ＶＥＲＯゲノムＤＮＡ負荷量に関して試験した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよび二重蛍光色素標識プローブを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（バージョン２．０．０）によって設計する。１１１−ｂｐのアンプリコンは、フォワードプライマー：5'-(CCT  CTG  CCC  AGC  GTG  AAG,  配列番号5);リバースプライマー:  5'-(CAC  AGA  CAC  GCC  CAT  GGA  T,   配列番号6);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(CAC  CCA  AGC  CAC  CAA  TGG  CTC  CAA)-[クエンチャー],  配列番号7からなる。プライマーおよびプローブをヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）によってそれぞれ、１０および５ｐｍｏｌ／μＬに希釈した。反応混合物は、ＵＮＧおよびＲＯＸ色素を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ  ２×マスターミックス２５μＬ、ＩＰＣアンプリコンプライマー／プローブ（またはＮＦＷ）１．５μＬ、ＩＰＣ  ＤＮＡ（またはＮＦＷ）０．５μＬ、フォワードプライマー１μＬ、リバースプライマー１μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ１μＬ、および試料２０μＬ（最終反応体積５０μＬ）からなった。反応混合物を９６ウェルプレートにロードして、光学フィルムで覆い、ＡＢＩモデル７９００ＨＴ  ９６ウェル配列検出システムによって２−ステップｑＰＣＲプロファイル（２．００分、５０．０°Ｃ；１０．００分、９５．０°Ｃ；０．１５分、９５．０°Ｃを４０サイクル、１．００分、６０．０°Ｃ）を使用して増幅した。精製および光学的に定量されたＤＮＡ抽出物から作製したＶｅｒｏゲノムＤＮＡ標準曲線は、ＮＦＷ中で１００ｎｇから１０ｐｇまで１０倍連続希釈するものであった。およそ２．６遺伝子コピー／ｒｘｎに相当する１０ｐｇ／ｒｘｎ標準物質からの陽性反応がまれに観察される。総試験試料ＤＮＡを、ｑＰＣＲ反応の前に、承認されたＱｉａｇｅｎ洗浄剤スピンカラムミニプレップ法を使用して抽出した。試料の組成に起因する潜在的なＰＣＲ阻害は、適切な抽出された試験品目試料にＩＰＣ標的ＤＮＡ約２２５０等量のコピーを添加することによってモニターした（すなわち、抽出効率をモニターするためにＩＰＣを既に添加した試料ではない）。抽出効率を、ＩＰＣ  ＤＮＡ  １０，０００コピーの等量を添加した試験試料を使用してモニターした。陰性（ＮＴＣ）対照試料を、ＮＦＷを使用して試験のために実施した。標準物質、試験試料、ＩＰＣスパイク、および対照ＰＣＲ反応は全て、２つ組で実施した。ＮＴＣ  Ｃｔスコア、標準曲線Ｃｔスコア、およびフィット（Ｒ２）、ならびにＩＰＣ抽出および干渉スパイク回収率を含む試料の結果を報告するために、方法の管理およびシステム適格性判定基準を満たさなければならない。試験試料中の初回ゲノムＤＮＡ混入レベルを、ＡＢＩソフトウェアを使用して、試料閾値サイクル値をＶｅｒｏ  ＤＮＡ標準曲線の式と比較することによって計算した。
【０３３５】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯウイルス採取プールを、精製前にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素処理した。ヌクレアーゼ処理は典型的に、平均≦１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド断片を生成し、消化後の断片集団はカイ分布に従う。このアッセイに使用したＣ．ａｅｔｈｉｏｐｓ（Ｖｅｒｏ細胞株）ネクチン−１  ｑＰＣＲアンプリコンは、長さが１１１ｂｐである。したがって、アッセイから得られた結果は、インタクトの一倍体Ｃ．ａｅｔｈｉｏｐｓゲノムＤＮＡの質量（約３．８８ｐｇ／一倍体コピー）に基づく残留宿主細胞ＤＮＡ濃度のワーストケースの推定値を表す。
【０３３６】
ポリオウイルスＩＲＥＳのＲＴ−ｑＰＣＲ
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットを、ネイティブポリオＩＲＥＳ配列を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースの逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）アンプリコン「ＰＯＳＡ」を使用して、野生型ポリオウイルス１型および２型ＩＲＥＳ配列の存在に関して試験した。ＰＶＳＲＩＰＯのＩＲＥＳ領域は、ＨＲＶ−２に由来し、ＰＯＳＡアンプリコンプライマー配列およびプローブ配列とは異種である。アッセイの検出限界は、それぞれのＰＣＲ反応において２．６×１０７コピーのＰＶＳＲＩＰＯあたり野生型ポリオＩＲＥＳの１００コピー未満であった。ＰＶＳＲＩＰＯ試験品目のコピー数は、ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳおよび本明細書において他所で記述されるＰＶＳＲＩＰＯにおけるポリタンパク質ＣＤＳ領域を標的とするＴａｑＭａｎアンプリコン「ＰＶＳ１」および「ＰＯ１」の使用を通して試験前に決定した。方法のＬＯＤを、Ｓａｂｉｎ  １型ポリオウイルスを添加した試料によって、アッセイ時に確認した。抽出したポリオＳａｂｉｎ  １型ウイルスＲＮＡを使用して標準曲線（１００ｐｇ〜１ｆｇ／反応）を作成し、試験品目のポリオＳａｂｉｎ  １型ＲＮＡ  １００コピーのスパイク（約０．４１ｆｇ）を、アンプリコン阻害対照として、およびアッセイの検出限界を確立する手段として使用した。試験試料のウイルスＲＮＡを、ｑＰＣＲ反応の前に、承認されたＱｉａｇｅｎミニプレップ法を使用して抽出した。全ての標準物質および試験試料反応は２つ組で実施した。陰性対照は、ヌクレアーゼフリー水による試験なし対照（ＮＴＣ）反応であった。一般的なＰＣＲ阻害対照および抽出対照は、残留Ｖｅｒｏ宿主細胞ＤＮＡに関して同時に実施されるＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ分析の際に試料抽出物と共に分析される、異種内部陽性対照（ＩＰＣ）ＤＮＡ、ならびに関連するＩＰＣ特異的プライマーおよびプローブからなった。
【０３３７】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  ９６ウェル機器を使用して、増幅プロセスの際に連続的にＰＣＲ増幅産物の蓄積を検出し、それによってＰＣＲの対数相における正確な標的の定量が可能となる。９６ウェルブロックを使用することにより、３８４ウェルブロックより大きい反応体積が可能となり、このため残留ＤＮＡおよび夾雑物ＲＮＡ試験に関するアッセイ感度が増加する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲケミストリーは、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用する。ヒトゲノムＤＮＡを検出するために使用されるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、識別可能な放射極大を有する２つの蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド末端で構成される。プローブの５’末端を、レポーター色素、６−ＦＡＭによって標識し、３’プローブ末端を、非蛍光消光色素によって標識する。オリゴヌクレオチドプローブは、ポリオ１型および２型ＩＲＥＳ領域内の内部標的配列と相同であり、ＰＶＳＲＩＰＯにおけるＨＲＶ−２由来ＩＲＥＳと交叉反応しない。ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ配列のポリオＩＲＥＳ配列に対する高い拒絶比は、ＨＲＶ−２に存在しないポリオＩＲＥＳの高度異種領域を利用することによって達成される。インタクトで遊離の溶液中では、プローブ消光色素は、ＦＲＥＴを介して蛍光色素レポーターからの放射を低減させる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応の伸長相において、プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、プローブからレポーター色素を放出し、レポーターからの放射を増加させる。それぞれのＰＣＲ反応における初回標的の正確な定量は、試薬が消耗する前または副産物による反応の阻害が起こる前に、増幅の対数（ｌｏｇ２）期の間に起こる。しかし、反応のシグナル対ノイズ限界および一般的なバックグラウンド蛍光に起因して、最も正確なデータは典型的に対数期後期に得られる。正規化レポーター蛍光を、ＰＣＲサイクル数によって表される時間に対してプロットする。標的コピー数または質量値は、バックグラウンドを超える蛍光閾値を割付することおよびそれぞれの試料の増幅プロットが閾値（閾値サイクルまたはＣｔとして定義される）に達するサイクル点を決定することによって得られる。それぞれの反応の閾値サイクル値を使用して、既知標準物質と比較した、それぞれの試験品目反応内に最初に含有される標的の量を定量する。ＮＴＣ  Ｃｔスコア、標準曲線Ｃｔスコア、およびフィット（Ｒ２）、ならびに野生型ポリオＲＮＡ回収率を含む、試料の結果を報告するために、方法の管理およびシステム適格性判定基準を満たさなければならない。
【０３３８】
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品を、ポリオＩＲＥＳを標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのＲＴ−ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）アンプリコンを使用して、野生型（またはワクチン株）ポリオ１型および２型ＩＲＥＳ  ｃＤＮＡ配列に関して試験した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよび蛍光色素標識プローブは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（バージョン２．０．０）によって設計した。１０９−ｂｐアンプリコンは、フォワードプライマー：5'-(TTG  GCG  GCC  TAC  CTA  TGG,  配列番号11);リバースプライマー:  5'-(TGG  GAT  TAG  CCG  CAT  TCA,   配列番号12);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(AGC  CTA  TTG  AGC  TAC  ATA  AGA  ATC  CTC  CGG  C)-[クエンチャー],  配列番号13からなる。プライマーおよびプローブをそれぞれ、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）によって１０および５ｐｍｏｌ／μＬに希釈した。反応混合物は、ＵＮＧを有しないＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲユニバーサルマスターミックス２５μＬ、ＮＦＷ  １．５μＬ、フォワードプライマー１μＬ、リバースプライマー１μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ０．５μＬ、および試料２０μＬ（約２．６×１０７コピーＰＶＳＲＩＰＯを含有する）からなり、最終反応体積は５０μＬであった。反応混合物を９６ウェルプレートにロードして、光学フィルムで覆い、ＡＢＩモデル７９００ＨＴ  ９６ウェル配列検出システムによって４−ステージｑＰＣＲプロファイル（２．００分、５０．０°Ｃ；４５．００分、６０．０°Ｃ；５．００分、９５．０°Ｃ；０．２０分、９４．０°Ｃを４５サイクル、１．００分、６２．０°Ｃ）を使用して増幅した。精製ウイルスＲＮＡ（ＷＨＯ標準物質、ＢＤＰパート番号３０３７４）から作製したポリオＳａｂｉｎ  １型株の標準曲線は、ＮＦＷ中で１００ｐｇから１ｆｇ（約２．４３×１０７〜約２４３コピー／ｒｘｎ）まで１０倍連続希釈するものであった。
【０３３９】
ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳおよびポリオポリタンパク質のＲＴ−ｑＰＣＲ
ＰＶＳ−ＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットを試験して、ＰＶＳＲＩＰＯ中のＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ−１）およびポリオポリタンパク質遺伝子（ＰＯ１）を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのＲＴ−ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）アンプリコンを使用して、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ−１）およびポリオポリタンパク質（ＰＯ１）ＲＮＡ負荷量を決定した。
【０３４０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＶＳＲＩＰＯ  ＨＲＶ−２由来ＩＲＥＳおよびポリオポリタンパク質ＲＴ−ＰＣＲアンプリコン内の内部標的配列と相同であり、共に使用すると、ＰＶＳＲＩＰＯに対して特異的である。ＰＶＳＲＩＰＯは、一本鎖ＲＮＡウイルスであることから、ｑＰＣＲ増幅の前に熱サイクルプロトコールの一部として増幅プライマーを使用して、試料抽出物をｃＤＮＡに逆転写する。インタクトで遊離の溶液中では、プローブ消光色素は、ＦＲＥＴを介して蛍光色素レポーターからの放射を低減させる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応の伸長相において、プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素をプローブから放出し、レポーターからの放射を増加させる。
【０３４１】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴは、２軸スキャンヘッドを使用して、アルゴンイオン（４８８ｎｍ）レーザーからの励起光を９６ウェル全てに分配する。ＣＣＤイメージャーが、それぞれのウェルからの蛍光スペクトルおよび強度を測定して、ＰＣＲ増幅の際のリアルタイムスペクトルデータを作成する。ＡＢＩ配列検出ソフトウェア（ＳＤＳ）は、レポーター色素、クエンチャー色素、およびノーマライザー（ＲＯＸ）色素の蛍光強度を逆畳み込みして、増幅の過程にわたって、正規化したレポーターからの放射強度の増加を計算する。陰性対照は、ヌクレアーゼフリー水による試験なし対照（ＮＴＣ）反応であったが、一般的なＰＣＲ阻害対照および抽出対照は、異種内部陽性対照（ＩＰＣ）および試料抽出物について使用される関連するＩＰＣアンプリコンからなり、Ｖｅｒｏ宿主細胞ＤＮＡ増幅の際に同時に実施される。
【０３４２】
それぞれのＰＣＲ反応における初回標的の正確な定量は、試薬が消耗する前または副産物による反応の阻害が起こる前に、増幅の対数（ｌｏｇ２）期の間に起こる。しかし、反応のシグナル対ノイズ限界および一般的なバックグラウンド蛍光により、最も正確なデータは典型的に対数期後期に得られる。正規化レポーター蛍光を、ＰＣＲサイクル数によって表される時間に対してプロットする。標的コピー数または質量値は、バックグラウンドを超える蛍光閾値を割付することおよびそれぞれの試料の増幅プロットが閾値（閾値サイクルまたはＣｔとして定義される）に達するサイクル点を決定することによって得られる。それぞれの反応の閾値サイクル値を使用して、既知標準物質と比較した、それぞれの試験品目反応内に最初に含有される標的の量を定量する。
【０３４３】
ＢＤＰでアッセイを実施するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよび蛍光色素標識プローブをＡＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（バージョン２．０．０）によって設計した。７１−ｂｐ  ＨＲＶ−２  ＩＲＥＳ（ＰＶＳ−１）アンプリコンは、フォワードプライマー：5'-  (AAC  CCA  ATG  TGT  ATC  TAG  TCG  TAA  TGA,  配列番号1);リバースプライマー:  5'-  (TGA  AAC  ACG  GAC  ACC  CAA  AG,  配列番号2);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(CAA  TTG  CGG  GAT  GGG  ACC  AAC  T)-[BHQ],  配列番号3からなる。ＰＯ１の７０−ｂｐアンプリコンは、フォワードプライマー：5'-  (TTG  GTG  GGA  ACG  GTT  CAC  A,  配列番号8);リバースプライマー:  5'-  (TCA  CCT  TGA  CTC  TGA  GTG  AAG  TAT  GA,  配列番号9);およびTaqMan（登録商標）プローブ:  5'-[6FAM]-(TTG  CAG  CGG  CCC  TGA  AGC  G)-[BHQ],  配列番号10からなる。プライマーおよびプローブをそれぞれ、ヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）によって１０および５  ｐｍｏｌ／μＬに希釈した。反応混合物は、ＲＯＸ色素を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）１−ステップＲＴ  ＰＣＲ  ２×マスターミックス２５μＬ、ＲＮアーゼ阻害剤１μＬ、ＮＦＷ  １μＬ、フォワードプライマー１μＬ、リバースプライマー１μＬ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ１μＬ、および試験試料２０μＬ（最終反応体積は５０μＬ）からなった。反応混合物を９６ウェルプレートにロードして、光学フィルムで覆い、ＡＢＩモデル７９００ＨＴ  ９６ウェル配列検出システムによって３−ステップｑＰＣＲプロファイル（２．００分、５０．０°Ｃ；４８．０℃で３０分（ＲＴステップ）；１０．００分、９５℃；０．１５分、９５．０℃を４０サイクル、１．００分、６０．０°Ｃ）を使用して増幅した。アンプリコンｃＤＮＡ標準曲線をＰＶＳ−ＲＩＰＯプラスミドＤＮＡから作製して、ＮＦＷ中で１００ｐｇから１ｆｇまで１０倍連続希釈した。標準対照試料を２回の複製実験で実施し、様々なＰＶＳ−ＲＩＰＯ試験試料抽出物の３つの連続ｌｏｇ１０希釈物（１０から１０００倍希釈）を使用して、ＲＴステップの成績を確認して、１０００倍試料希釈でのウイルス標的コピー数を定量した。対照および試料ウイルスＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲ反応の前に承認された手順に従ってＱｉａｇｅｎミニプレップ法を使用して抽出した。一般的なＰＣＲ阻害対照および抽出対照は、残留Ｖｅｒｏ宿主細胞ＤＮＡに関して同時に実施されるＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ分析の際に試料抽出物と共に分析される、異種内部陽性対照（ＩＰＣ）ＤＮＡ、ならびに関連するＩＰＣ特異的プライマーおよびプローブからなった。緩衝液（ＮＦＷ、鋳型なし）陰性対照試料を、試験のために実施した。両方のＰＶＳ−ＲＩＰＯアンプリコンを、アッセイ間変動をなくすために同じ９６ウェルプレートで実行した。試験試料中のＰＶＳ−ＲＩＰＯ  ＲＮＡ濃度を、ＡＢＩ  ７９００ＨＴソフトウェアを使用して、試料閾値サイクル値をプラスミドＤＮＡ標準曲線の式と比較することによって計算した。質量からウイルスコピー数への変換は、約１０．８  ａｇ／コピーのＰＶＳＲＩＰＯプラスミド（ＰＣＲ標準物質）質量および約４．１  ａｇ／コピーのＰＶＳＲＩＰＯウイルスゲノム質量に基づく。
【０３４４】
ＥＭによるウイルス粒子
ネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を使用して、試験試料中のウイルス粒子数／ｍＬ（ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品）を定量する。１０個のグリッド空間の写真を撮影して、各区分におけるウイルス粒子数を計数し、ウイルス粒子／ｍＬを計算した。
【０３４５】
試験試料を等量の固定液（２×ＰＢＳ中の８％ホルムアルデヒド）によって希釈して固定した。試験試料（０．５μＬ）を、調製したＥＭＳ  ＣＦ２００−Ｃｕ被覆グリッドの上に置いて、風乾させた。次に試料を２回蒸留した水（ＤＤＨ２０）５μＬによって３回洗浄して、試料から塩／リン酸緩衝液を洗浄した。次に、０．５％酢酸ウラニル水溶液（５μＬ）をグリッド上に添加して、風乾させた。グリッドを電子顕微鏡検査で調べた。１０個のグリッド空間の写真を撮影して、ウイルス粒子数を以下の計算によって決定した：
ウイルス粒子数（ｖｐ）＝（平均ｖｐ数）×（グリッドの面積／写真の面積）×（１ｍＬ／μＬで添加したウイルス量）
【０３４６】
最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１の安定性試験
ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１（−７０℃以下で保存）の安定性試験は、外観、ＴＣＩＤ５０によるウイルス力価、エンドトキシン、ｐＨ、およびバイオバーデンを含む。全ての試験を、１２、２４、３６、４８、６０、および７２ヶ月に実施する。ウイルス力価は、６ヶ月に実施する。バイオバーデンは、無菌性が産物放出の一部として既に実施されていることからゼロ時点では実施しない。
【０３４７】
利用可能な安定性の結果を表１０に含める。ＴＣＩＤ５０の結果に基づき、ＰＶＳＲＩＰＯ最終バイアル充填製品ロットＬ１４０２００１は−７０℃以下で少なくとも６ヶ月安定である。
【表１０】
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【０３４８】
本開示の原理が適用されうる多くの可能な実施形態を考慮して、説明される実施形態は、本開示の例に過ぎず、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神に含まれる全てを本発明として主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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