(57)【要約】  本開示は、自動化された中空繊維リアクターシステムの使用による大規模な、哺乳動物幹細胞を製造し、分化させる方法、一実施形態では、ヒト多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）、例えばｉＰＳｃ由来のニューロン前駆細胞に分化することができるヒトｉＰＳｃを製造する方法、が提供される。当該方法は、ｉＰＳｃまたは分化したｉＰＳｃのような幹細胞を中空繊維リアクターに播種し、適切な増殖因子および栄養素を用いて播種した細胞を増殖および増幅させ、増殖させた後の細胞を、例えば酵素の使用により、前記繊維リアクター壁から回収すること、を含む。当該方法は、最小数の出発幹細胞またはニューロン前駆細胞を前記リアクターに播種してから、週に数十億個の細胞を産生し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を培養して分化させる大規模な方法であって、
培地およびガス交換のための滅菌閉鎖ループ回路の一部である複数の繊維を含む中空繊維バイオリアクター；ガス交換モジュール；廃棄バッグ；細胞回収バッグ、を含むシステムを提供する工程；
誘導された多能性幹細胞を前記中空繊維に導入する工程；
細胞増殖および分化を可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程；および
前記バイオリアクターから前記細胞を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記繊維がポリスルホンまたはセルロース誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記繊維の分子量カットオフが、約５ｋＤａである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記繊維が、接着促進剤でコーティングされている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記条件が、心筋細胞への分化を可能にする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記条件が、ガス交換の制御、温度の制御、代謝産物濃度の制御、成長因子濃度の制御、分化因子濃度の制御、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ニューロン前駆細胞を培養するための大規模な方法であって、
培地およびガス交換のための滅菌閉鎖ループ回路の一部である複数の繊維を含む中空繊維バイオリアクター；ガス交換モジュール；廃棄バッグ；および細胞回収バッグを含むシステムを提供する工程であって、前記繊維が糖タンパク質および細胞接着を促進する分子または混合物でコーティングされている、工程；
幹細胞またはニューロン前駆細胞を前記中空繊維に導入する工程；
細胞増殖を可能にする条件下で前記細胞をインキュベートする工程；および
前記バイオリアクターから前記細胞を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項８】
前記細胞が幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記繊維がポリスルホンまたはセルロース誘導体を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記繊維の分子量カットオフが約５ｋＤａである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖タンパク質が細胞の接着および拡散を増強する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖タンパク質が、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせ、を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分子または混合物が、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリリシン、マトリゲルまたは植物由来タンパク質、を含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ニューロン前駆細胞がｉＰＳｃ由来である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記条件が、ガス交換の制御、温度の制御、代謝産物濃度の制御、成長因子濃度の制御、または時間、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１５年１０月１５日に出願された米国特許出願第６２／２４１，９７７号および２０１６年６月８日に出願された米国特許出願第６２／３４７，２０８号の利益を主張し、その開示は、参照に本明細書中に援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、一般に、哺乳動物幹細胞、例えばヒト由来の誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）の分野に関する。一実施形態では、本発明は、中空繊維バイオリアクターを使用して、ｉＰＳｃを製造し、ｉＰＳｃを分化させるか、またはニューロン前駆細胞を大規模に作製する方法を記載する。一実施形態では、本開示は、自動化された中空繊維バイオリアクターを使用して大規模にｉＰＳｃからニューロン前駆細胞を製造する方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
動物細胞を定期的に培養する人は、標準的な技術で快適になる。しかし、過剰培地中で非常に低密度で細胞を播種し、培地枯渇の直前に回収する典型的なサイクルは、非常に生理学的ではないプロセスである。一般的な培養システムでは、最初に、栄養や酸素供給の変動が少ない多孔質マトリックスに高密度で接着させて成長した細胞を採取し、低密度で、スチレン結合またはアモルファス懸濁培養に適応させる。これらの方法はよく理解されて便利ではあるが、バッチ式のＴフラスコでの古典的な二次元培養または振盪フラスコおよびバイオリアクターでの三次元懸濁培養は実際には生理学的に関連するものではない。
【０００４】
近年、ロッキングバッグやデプスフィルターなどの通常ではないメカニズムで動作する著しい数の代替培養アプローチが導入されている。これらはしばしば、懸濁／接着またはバッチ／連続運転などの特性によって分類される。しかし、ほとんどの場合、２つの基本的な特徴がある。細胞は、播種から回収までの栄養、廃棄物、およびｐＨレベルの変動が大きく、一般的には高周期性ではあるが比較的低い培養密度で増殖している。
【０００５】
最近まで、これらの高度に人工的なプロトコルの悪影響は、あまり評価されていなかった。しかし、近代的な医薬品開発、再生医療、そして基礎的な科学的調査の要求が高まっていることから、代替的なアプローチの開発が奨励されている。灌流培養は現在、多くの（しばしば全く異なる）装置に存在する。
【０００６】
ＨＦＰＢは、高密度で連続的な灌流培養システムである。その特徴的な構成要素は、注入および排出ポートが取り付けられた管状のハウジングまたはカートリッジ内の平行アレイの半透性中空繊維のセットである。繊維束は各端で、体系的に詰め（取り付け）られているので、カートリッジに入る液体は必然的にその内部を流れる。
【０００７】
Ａｍｉｃｏｎ（現在はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ａｍｉｃｏｎの一部）、Ｅｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ（現Ｂｉｏｖｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｖｅｓｔ．ｃｏｍ）、およびＴＥＲＵＭＯＢＣＴ  ｗｗｗ．ｔｅｒｕｍｏｂｃｔ．ｃｏｍのような企業から早期に商業的に入手可能なシステムは、総濾過率が低いものを提供した。さらに、初期のユニットは、増殖された培養をサポートするには栄養素と廃棄物の交換が不十分であった。さらに、大規模な細胞培養は、乏しい可溶性酸素の物質移動速度に依存し、それが大規模な中空繊維システムでの初期の試みのアキレス腱であった。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本開示は、治療市場、再生医療市場および薬物するリーニング市場に向けた、哺乳動物幹細胞および分化した哺乳類幹細胞、例えば哺乳動物ｉＰＳｃおよび分化哺乳動物ｉＰＳｃ細胞、または前駆細胞、例えばニューロン前駆細胞を、自動化された様式で大量に製造する方法に関する。特に、一実施形態では、本開示は、中空繊維灌流バイオリアクターの利用によって、ヒト心筋細胞などの機能的に分化した細胞を生じるヒトｉＰＳｃの播種、スケールアップおよび分化を提供し、この細胞は、ハイスループット薬物スクリーニングを含むアプリケーションに用いられ得る。一実施形態では、本開示は、中空繊維灌流バイオリアクターの利用によるニューロン前駆細胞などのヒトｉＰＳｃ由来前駆細胞の播種およびスケールアップを提供する。次いで、ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）は、ハイスループット薬物スクリーニングを含むアプリケーションにおいて使用され得るか、薬物スクリーニング、再生医療または治療用インプラントのための３次元オルガノイド、ニューロン、もしくは他のニューロン特異的細胞タイプへ分化され得る。
【０００９】
本開示は、治療、再生および薬物スクリーニング市場のために、自動化された方法で哺乳動物幹細胞または前駆細胞、特にニューロン前駆細胞を大規模に製造する方法に関する。特に、一実施形態では、本開示は、中空繊維灌流バイオリアクターの利用によって、ヒトｉＰＳＣ由来前駆細胞の播種、スケールアップを提供する。次いで、ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）は、ハイスループット薬物スクリーニングを含む適用において使用され得るか、または薬物スクリーニング、再生医療もしくは治療インプラントのための３次元オルガノイド、ニューロン、他のニューロン特異的細胞型に分化され得る。
【００１０】
一実施形態では、この方法は、培地およびガス交換のための滅菌閉鎖ループ回路の一部である複数の繊維を含む中空繊維バイオリアクター、ガス交換モジュール；廃棄バッグ；および細胞回収バッグを含むシステムを提供する工程であって、ここで該繊維は、糖タンパク質および細胞接着を促進する分子でコーティングされている、工程を含む。幹細胞またはニューロン前駆細胞を中空繊維に導入し、前記細胞を、細胞増殖を可能にする条件下でインキュベートする。一実施形態では、細胞をバイオリアクターから回収する。一実施形態では、導入される細胞は接着細胞である。一実施形態において、導入される細胞は、ＣＴＩＰ２、ＣＵＸ１、ＭＡＰ２、ＮＥＵＮ、ＲＥＥＬＩＮ、ＳＡＴＢ２もしくはＴＢＧＲ１、それらの任意の組み合わせ、またはＣＴＩＰ２、ＣＵＸ１、ＭＡＰ２、ＮＥＵＮ、ＲＥＥＬＩＮ、ＳＡＴＢ２もしくはＴＢＲ１の全部を発現する。一実施形態では、回収される細胞は、ＣＴＩＰ２、ＣＵＸ１、ＭＡＰ２、ＮＥＵＮ、ＲＥＥＬＩＮ、ＳＡＴＢ２もしくはＴＢＧＲ１、それらの任意の組み合わせ、またはＣＴＩＰ２、ＣＵＸ１、ＭＡＰ２、ＮＥＵＮ、ＲＥＥＬＩＮ、ＳＡＴＢ２もしくはＴＢＲ１の全部を発現する。一実施形態では、糖タンパク質は細胞外マトリックス糖タンパク質である。一実施形態では、糖タンパク質は、細胞の接着および／または拡散を増強する。一実施形態では、細胞接着を促進する分子は、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリリジン、または植物由来タンパク質、例えば、単離大豆タンパク質を含むＣｌａｒｉｓｏｙ（商標）１７０またはＣｌａｒｉｓｏｙ（商標）１８０（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｍｉｄｌａｎｄ）を含む。一実施形態では、繊維はポリスルホンまたはセルロース誘導体、例えばフッ化ポリビニリデンまたはポリオレフィンを含む。一実施形態では、条件は、ガス交換の制御、温度の制御、代謝産物濃度の制御、成長因子濃度の制御、または時間、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態では、条件は、ＦＧＦ−２、ＢＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦを含む細胞培養培地を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、典型的な中空繊維リアクターの断面を示す。
【図２】図２は、中空繊維灌流バイオリアクター（ＨＦＰＢ）に使用される典型的な中空繊維リアクター流体ループの一実施形態の画像を示す。
【図３】図３は、図２に示す実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
中空繊維ベースの技術は、タンジェンシャルフローろ過から排水処理における原核生物バイオフィルムに至るまで、多くのアプリケーションで一般的に使用されている。ここで、中空繊維灌流バイオリアクター（ＨＦＰＢ）技術は、哺乳動物細胞の培養に用いられる。哺乳動物細胞は、図１のＡと標識されている、カートリッジ毛細管内空間（ＩＣ）と、図１のＢと標識された、毛細管外空間（ＥＣ）として参照されているものの中空繊維の外に一般的に播種され得る。細胞は図１のＣとラベル付けされ、ＥＣ空間に存在する。したがって、ＩＣおよびＥＣは、膜として作用する繊維壁によって分離される。培養培地は、中空繊維の内腔を通してポンプ輸送され、栄養素および代謝産物が繊維壁を横切って両方向に拡散することを可能にする。カートリッジを通過した後、培地を酸素化してそれに戻すか、または新鮮な培地を導入しながら回収することができる。
【００１３】
ほとんどの培養システムでは、細胞は、非常に過剰な栄養素を含み、代謝産物を含まない培地中に播種される。それらは、栄養素が減少し、産物が増えている環境において、日数の問題が進行し、（培養物を新鮮な培地に分割する場合に）再度元の培地組成物に、または（新たな培地への培養物の逐次適応する間に）わずかに異なる変動のある製剤に単に突然曝露されることとなる。代謝フラックス分析の最近の進歩は、栄養素および代謝産物の可変および不連続サイクルへのそのような曝露の意義を支持する。しかしながら、ＨＦＰＢシステムにおける培養マトリックスおよび周囲の化学的環境の相対的な不変性は、より一貫した生理学的培養環境を提供する。新たに酸素を含ませた培地は、固定化された培養物を通して絶えず交換されるので、細胞は比較的一定の代謝産物および成長因子濃度の環境に存在する。これは多くのアプリケーションに利点がある。例えば、いくつかの初代細胞株および特殊細胞株は、培地の著しいまたは突然の変化に応じて、重要な経路を制御し、分化し、または「ショックになる（ｓｈｏｃｋ）」傾向がある。
【００１４】
ＨＦＰＢ培養チャンバー環境は、リアルタイムで連続的に制御可能である。ＨＦＰＢシステムはこのような効率的な培地交換機構を有するので、必要に応じていつでも入力培地組成物（したがって周囲の細胞環境）を変更することは容易である。これは、既存の培地成分の上の栄養素または試薬のボーラスを添加することのみを可能にする流加培養法とは異なる。さらに、ＨＦＰＢの制御された流体力学的条件における高密度培養は、自己分泌刺激、細胞アラインメント、および所望の細胞−細胞または細胞−表面相互作用のための細胞塊内の穏やかな間質勾配を確立する、方向性の流れの微小環境を提供することができる。
【００１５】
（繊維のＥＣ側上の）ＨＦＰＢ細胞培養は、標準懸濁培養の１００倍以上の濃度で存在するため、必要な血清が少なく、他のほとんどのシステムから何倍もの濃度で回収される。他の利点には、無血清培地への培養の適応の促進、並びに馴化培地および自己分泌依存培養のより良好なサポートが含まれる。培養ループの初期容量は、培養物を播種した時はとても低く、その後細胞数が増加するにつれて増やし、それにより、一定の細胞／培地比を維持することができる。
【００１６】
ＨＦＰＢ培養中の細胞は、規定可能な組成および多孔性の膜（例えば、繊維壁）によって、その培地の大部分から分離される。細胞は本質的に２つの異なる容量を経験する：グルコースおよび乳酸塩のような低分子量成分について見られるのは比較的多いが、一方で、より大きい成分およびいくつかの刺激性サイトカインについて見られる容量は１００倍少ない。システムの培養（ＥＣ）面および灌流培地（繊維内腔；ＩＣ）面の両方は、サンプリングおよび栄養供給が可能であるため、それぞれの異なる空間内で特定の成分を維持およびモニターすることが共通する。これは、操作において多くの貴重な機能を提供する。
【００１７】
例えば、細胞含有区画の容積は非常に小さくてよく、したがって、懸濁培養よりも１００倍以上の濃度で産物を回収することができる。リアクターの繊維の多孔度を細胞の特性と一致させることによって、生成物をシステムのいずれかの側で蓄積し、維持し、測定することができる。１つの用途では、巨大分子培養因子を導入して、ＥＣ側に蓄積させることができる。
【００１８】
無制限の栄養供給およびカートリッジポートを介した培養の「減量化」能力などの特徴を組み合わせることにより、ＨＦＰＢシステムを数カ月またはそれ以上の間、相対的に平衡に維持することができる。長期間にわたる連続生産は、バッチ培養に比べていくつかの利点提供する：培養条件の一貫性、単位フットプリント及び培養量あたりの生産量の大幅な増加、適時に安定した処理または保存条件を可能にする連続または毎日の製品回収、及び細胞に対して毒性または阻害性である可能性のある培養物から生成物の連続的な除去の操作。
【００１９】
多くのハイスループット薬物スクリーニングで必要とされるエクスビボで増殖させた多数の細胞、およそ３８４プレートあたり約２００万個、および臨床細胞治療プロトコール（１患者あたり２億超）は、標準的な培養条件が問題となり、高価となり、その結果、大規模な人員や施設の資源を必要とし、汚染の可能性がある。このような臨床的要求を満たすために、堅牢な自動化され、閉鎖された細胞増殖方法が最適である。本方法で有用なＨＦＰＢシステムは、ＧＭＰまたは研究室環境のいずれかで、接着細胞および懸濁細胞の両方を再現可能に増殖させるよう設計された、機能的に閉鎖され、自動化された中空繊維バイオリアクターシステムである。このシステムは、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の臨床規模の量のエクスビボでの増殖に使用されている。前培養した細胞からのＭＳＣを、α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸを含み、抗生物質／抗真菌剤または補助因子を含まない培地とともに、当該システムで増殖させた。最適な培養条件を維持するために、培地中のグルコースおよび乳酸塩レベルをモニターした。ＨＦＰＢシステム増殖ＭＳＣは、表現型および分化に対し、すべて典型的なＭＳＣ特性を満たしていた。ＭＳＣの治療用量に適した細胞数が、約１５００〜約２０００万個の細胞の初期の充填から５日間で生成された。
【００２０】
ＨＦＰＢシステムは、接着細胞および懸濁細胞の両方を増殖させるように設計された、機能的に閉鎖され、自動化された中空繊維バイオリアクターシステムである。図２および図３に示すように、バイオリアクター培養システムは、培地およびガス交換のための滅菌閉鎖ループ回路の一部である合成中空繊維バイオリアクター１０、ガス交換モジュール２０、予め取り付けられた廃棄バッグ３０、および予め取り付けられた細胞収集バッグ４０、を含んでいる。
【００２１】
中空繊維には、ポリスルホンおよびセルロース誘導体のような広範囲の材料を使用することができる。分子量カットオフは５ｋＤａから始まり、事実上任意の所望の上限まで上昇する。繊維材料は、多孔性率、分子量カットオフ、および親水性のような特性が変更可能であり、それらは製造または実際の用途の間に、それらの表面上に特定の機能を導入するようさらに修飾され得る。ＨＦＰＢシステムの特徴は以下の通りである：非常に高い結合表面積対体積比、分泌される生成物または送達される培地の濃度などの目的のために、繊維の多孔性を選択できる長時間培養を支持する多孔質マトリックス上の非常に高い（生体模倣）密度での細胞の固定、分化因子、および目的の酵素。
【００２２】
一実施形態では、バイオリアクターおよび流体回路は、コロラド州レイクウッドのＴＥＲＵＭＯＢＣＴコーポレーションから購入することができるＱｕａｎｔｕｍシステムユニットに取り付けられたシングルユースの使い捨てセットである。一実施形態では、バイオリアクターは、２．１ｍ2の総毛細管内（ＩＣ）表面積を有する、約１１，５００個の中空繊維からなるものであってもよい。典型的な培養操作（例えば、細胞播種、培地交換、分化因子、トリプシン処理、細胞回収など）は、ポンプおよび自動弁を使用したコンピュータ制御システムによって管理され、それは使い捨てセットを通して流体を誘導し、培地で気体を交換する。使い捨てセットの機能的に閉鎖された性質は、すべての液体に使用されるバッグの無菌ドッキングによって維持される。これらのバッグ接続／切断はすべて無菌接続技術を利用する。一実施形態では、システムにおけるガス制御は、中空繊維酸素供給器（ガス移送モジュール２０、図２および図３）を使用して管理される。一実施形態では、ガスは、ユーザ提供のプレミックスガスタンクから供給される。所望のガス混合物を有するタンクを選択することにより、ユーザは、最適なガス濃度で細胞を増殖させることができる。一実施形態では、ｉＰＳｃ、ニューロン前駆細胞または心筋細胞などの接着細胞集団の接着を可能にするために、バイオリアクターのＩＣ膜を、フィブロネクチン、マトリゲル、ゼラチンまたは前記促進因子の組み合わせなどの接着促進剤でコーティングしてもよい。
【００２３】
一実施形態では、細胞増殖セット装填タスク（Ｌｏａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｅｔ  Ｔａｓｋ）（全ての実行／継代はプロセス無菌性を保証するために新しい使い捨てセットの使用を必要とする）を使用して、新しい細胞増殖セットを装填した後、使い捨てセットを、Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）ＴＳＣＤまたはＴＳＣＤＩＩ無菌接続デバイスを使用して、使い捨てセットの細胞注入ライン（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｌｅｔ  ｌｉｎｅ）に接続された４Ｌ培地バッグ（Ｍｅｄｉａ  Ｂａｇ）のＰＢＳをプライミングしてもよい。一実施形態では、培地バッグアクセサリー（Ｍｅｄｉａ  Ｂａｇ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）へ流体をポンプ注入するために、チューブポンプ（Ｅａｓｙ−Ｌｏａｄ  ＩＩポンプヘッダを備えたＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ（登録商標）Ｌ／Ｓチューブポンプ）を利用して、バイオセーフティキャビネット下で、試薬ボトルから流体で培地バッグアクセサリーが充填される；使い捨てチューブラインのすべてのシーリングは、ＲＦシーラー（Ｓｅｂｒａ  Ｏｍｎｉ（商標）２６００シーラー）で行われる。一実施形態では、一旦使い捨てセットをプライミングしたら、バイオリアクターを１０ｍｇのマトリゲルで一晩コーティングして、バイオリアクターコーティングタスク（Ｃｏａｔ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｔａｓｋ）を用いて細胞接着を促進する。一実施形態では、１０ｍｇのマトリゲルを２０ｍＬの滅菌Ｈ2Ｏに３０分間可溶化し、８０ｍＬのＰＢＳで溶液容量を１００ｍＬにし、マトリゲル溶液をバイオセーフティキャビネット内の細胞注入バッグ（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｌｅｔ  Ｂａｇ）に移すことによって調製する。一実施形態では、一晩のバイオリアクターコーティングの後、過剰のマトリゲルをバイオリアクターセットから洗浄し、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク（Ｗａｓｈｏｕｔ  Ｔａｓｋ）を利用して細胞培養培地をセットに導入して、ＰＢＳ溶液を培地で交換し、４Ｌ培地バッグアクセサリーへと充填し、ＩＣ注入ライン（Ｉｎｌｅｔ  Ｌｉｎｅ）に無菌で接続される。新しく導入された培地が適切に酸素化されていることを保証するために、一実施形態では、培地馴化タスク（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  Ｔａｓｋ）は最低１０分間実行される。一実施形態では、使用されるガス混合物は、２０％Ｏ2、５％ＣＯ2および残部Ｎ2である。この時点で、使い捨てセットは、細胞の装填および増殖のために使用できる状態にある。
【００２４】
一実施形態では、１５００万〜２０００万個の前培養したｉＰＳｃをＨＦＰＢの細胞注入バッグ（ｃｅｌｌ  ｉｎｌｅｔ  ｂａｇ）に移し、体積を目的の増殖培地で１００ｍＬにする。一実施形態では、その後、バッグは、ＨＦＰＢの注入ラインに接続され、細胞は、循環プログラムを有する細胞充填（Ｌｏａｄ  Ｃｅｌｌ）を利用してバイオリアクターのＩＣ側に装填される。この工程は、バイオリアクターのＩＣ側全体にわたって細胞の均一な分布を可能にするように設計される。一旦このタスクが完了すると、一実施形態では、システムは、細胞接着タスクモード（Ａｔｔａｃｈ  ｃｅｌｌ  ｔａｓｋ  ｍｏｄｅ）に置かれ、それにより細胞がＩＣ膜表面に接着することを可能にする。一実施形態では、ＩＣ培地流速はゼロであり、細胞接着を可能にするが、ＥＣ流速はバイオリアクター内の酸素化を維持するために約３０ｍＬ／分であってもよい。一実施形態では、細胞を２４〜４８時間、接着させることが可能であり、続いて任意に非接触細胞を除去するために迅速なＩＣ洗浄が実施される。
【００２５】
一実施形態において、細胞は、バイオリアクターのＩＣ側に添加された新鮮な培地を有する細胞栄養供給タスク（Ｆｅｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋ）と、１日二回サンプルポートからモニタリングされるシステムにおけるグルコース消費および乳酸生成の速度によって必要に応じて調節されるＩＣ注入速度とを利用して４日間増殖される。供給速度に応じて、一実施形態では、標準的な５日間の増殖は、典型的には１５００万〜２０００万個の細胞が充填されたときに約８リットルの培地を消費する。ＩＣ廃棄弁は、ＩＣループ内のタンパク質の蓄積を防ぐために、廃液が廃棄バッグに回収されるように、増殖段階の期間中は開放される。
【００２６】
一実施形態では、５〜７日後に増殖が完了し、今や細胞が本発明の心筋細胞への分化を誘導する多くの因子に曝露される。一実施形態では、この増殖時点で、ＨＦＰＢに５億〜１０億個の細胞が存在し、分化因子の用量および正確な濃度が追加される。このような培地の例は、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭおよびＭ１９９培地、ＧＳＫ３−β阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、インスリン、ヒト血清アルブミン、およびアスコルビン酸の混合物を含む。細胞は、例えば２０日間の期間にわたって分化し、その間、一実施形態では、増殖培地は、廃棄物を除去し、回収まで細胞を生存可能に保つために隔日で交換される。
【００２７】
一実施形態では、接着細胞剥離剤として、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡまたは同等の酵素パッケージを使用して、約２６日目に、増殖および分化させたヒトｉＰＳｃ心筋細胞をバイオリアクターのＩＣ膜から剥離させる。セルラーゼおよびコラゲナーゼなどのバイオリアクターで使用される中空繊維のタイプに応じて、他の酵素を使用することができる。一実施形態では、接着細胞剥離タスク（Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋ）を使用して、システムをＰＢＳでフラッシュし、次にバイオリアクター内で４〜１０分間循環する酵素溶液でバイオリアクターを満たす。この作業が完了すると、剥離された細胞は、ＩＣ注入ラインに取り付けられた回収バッグ（Ｈａｒｖｅｓｔ  ｂａｇ）内の適切な回収培地を用いて回収タスク（Ｈａｒｖｅｓｔ  ｔａｓｋ）を利用して回収される。回収が完了したら、回収バッグは密封されてリアクターから取り外される。その後、細胞カウント、生存率分析、表現型決定、形態学、および分化アッセイのために、細胞をバッグから取り出すことができる。
【００２８】
一実施形態では、細胞増殖セット装填タスク（Ｌｏａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｅｔ  Ｔａｓｋ）（全ての実行／継代は、プロセス無菌性を保証するために新しい使い捨てセットの使用を必要とする）を使用して新しい細胞増殖セットを装填した後、使い捨てセットを、Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）ＴＳＣＤまたはＴＳＣＤＩＩ無菌接続デバイスを使用して、使い捨てセットの細胞注入ライン（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｌｅｔ  ｌｉｎｅ）に接続された４Ｌ培地バッグ（Ｍｅｄｉａ  Ｂａｇ）のＰＢＳをプライミングしてもよい。一実施形態では、培地バッグアクセサリー（Ｍｅｄｉａ  Ｂａｇ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）へ流体をポンプ注入するために、チューブポンプ（Ｅａｓｙ−Ｌｏａｄ  ＩＩポンプヘッダを備えたＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ（登録商標）Ｌ／Ｓチューブポンプ）を利用して、バイオセーフティキャビネット下で、試薬ボトルから流体で培地バッグアクセサリーが充填される；使い捨てチューブラインのすべてのシーリングは、ＲＦシーラー（Ｓｅｂｒａ  Ｏｍｎｉ（商標）２６００シーラー）で行われる。一実施形態では、一旦使い捨てセットをプライミングしたら、バイオリアクターを１０ｍｇのマトリゲルで一晩コーティングして、バイオリアクターコーティングタスク（Ｃｏａｔ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｔａｓｋ）を用いて細胞接着を促進する。一実施形態では、１０ｍｇのマトリゲルを２０ｍＬの滅菌Ｈ2Ｏに３０分間可溶化し、８０ｍＬのＰＢＳで溶液容量を１００ｍＬにし、マトリゲル溶液をバイオセーフティキャビネット内の細胞注入バッグ（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｌｅｔ  Ｂａｇ）に移すことによって調製する。一実施形態では、一晩のバイオリアクターコーティングの後、過剰のマトリゲルをバイオリアクターセットから洗浄し、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク（Ｗａｓｈｏｕｔ  Ｔａｓｋ）を利用して細胞培養培地をセットに導入して、ＰＢＳ溶液を培地で交換し、４Ｌ培地バッグアクセサリーへと充填し、ＩＣ注入ライン（Ｉｎｌｅｔ  Ｌｉｎｅ）に無菌で接続される。新しく導入された培地が適切に酸素化されていることを保証するために、一実施形態では、培地馴化タスク（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  Ｔａｓｋ）は最低１０分間実行される。一実施形態では、使用されるガス混合物は、２０％Ｏ2、５％ＣＯ2および残部Ｎ2である。この時点で、使い捨てセットは、細胞の装填および増殖のために使用できる状態にある。
【００２９】
一実施形態では、８０００万〜１億個のＮＰＣが、ＨＦＰＢの細胞注入バッグに移され、容量は目的の増殖培地で１００ｍＬにする。一実施形態では、その後、バッグは、ＨＦＰＢの注入ラインに接続され、細胞は、循環プログラムを有する細胞充填（Ｌｏａｄ  Ｃｅｌｌ）を利用してバイオリアクターのＩＣ側に装填される。この工程は、バイオリアクターのＩＣ側全体にわたって細胞の均一な分布を可能にするように設計される。一旦このタスクが完了すると、一実施形態では、システムは、細胞がコーティングされたＩＣ膜表面に接着することを可能にする細胞接着タスクモード（Ａｔｔａｃｈ  ｃｅｌｌ  ｔａｓｋ  ｍｏｄｅ）に置かれ、細胞がＩＣ膜表面に接着することを可能にする。一実施形態では、ＩＣ培地流速はゼロであり、細胞接着を可能にするが、ＥＣ流速はバイオリアクター内の酸素化を維持するために約３０ｍＬ／分であってもよい。一実施形態では、細胞を２４〜４８時間、接着させることが可能であり、続いて任意に非接触細胞を除去するために迅速なＩＣ洗浄が実施される。
【００３０】
一実施形態において、細胞は、バイオリアクターのＩＣ側に添加された新鮮な培地を有する細胞栄養供給タスク（Ｆｅｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋ）と、１日二回サンプルポートからモニタリングされるシステムにおけるグルコース消費および乳酸生成の速度によって必要に応じて調節されるＩＣ注入速度とを利用して４日間増殖される。ＩＣ廃棄弁は、ＩＣループ内のタンパク質の蓄積を防ぐために、廃液が廃棄バッグに回収されるように、増殖段階の期間中は開放される。
【００３１】
一実施形態では、５〜７日後に増殖が完了する。一実施形態では、この増殖時点で、ＨＦＰＢには５億〜２０億個の細胞が存在する。一実施形態では、接着細胞剥離剤として０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡまたは同等の酵素パッケージを用いて、細胞をバイオリアクターのＩＣ膜から剥離させる。セルラーゼおよびコラゲナーゼなどのバイオリアクターで使用される中空繊維のタイプに応じて、他の酵素を使用することができる。一実施形態では、接着細胞剥離タスク（Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋ）を使用してシステムをＰＢＳでフラッシュし、次にバイオリアクター内で４〜１０分間循環する酵素溶液でバイオリアクターを満たす。この作業が完了すると、剥離された細胞は、ＩＣ注入ラインに取り付けられた回収バッグ内の適切な回収培地を用いる回収タスク（Ｈａｒｖｅｓｔ  ｔａｓｋ）を利用して回収される。回収が完了したら、回収バッグを密封してリアクターから取り外される。その後、細胞カウント、生存率分析、表現型決定、形態学、および分化アッセイのために、細胞をバッグから取り出すことができる。
【００３２】
一実施形態では、８０００万〜１億個のＮＰＣをＨＦＰＢの細胞注入バッグに移し、体積を目的の増殖培地で１００ｍＬにする。一実施形態では、その後、バッグは、ＨＦＰＢの注入ラインに接続され、循環プログラムを有する細胞充填（Ｌｏａｄ  Ｃｅｌｌ）を利用してバイオリアクターのＩＣ側に細胞が装填される。この工程は、バイオリアクターのＩＣ側全体にわたって細胞の均一な分布を可能にするように設計される。一実施形態では、システムは、細胞接着タスクモード（Ａｔｔａｃｈ  ｃｅｌｌ  ｔａｓｋ  ｍｏｄｅ）に置かれ、それにより細胞がＩＣ膜表面に接着することを可能にする。一実施形態では、ＩＣ培地流速はゼロであり、細胞接着を可能にするが、ＥＣ流速はバイオリアクター内の酸素化を維持するために約３０ｍＬ／分であってもよい。一実施形態では、細胞を２４〜４８時間、接着させることが可能であり、続いて任意に非接触細胞を除去するために迅速なＩＣ洗浄が実施される。
【００３３】
一実施形態において、細胞は、バイオリアクターのＩＣ側に添加された新鮮な培地を有する細胞栄養供給タスク（Ｆｅｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋ）と、１日二回サンプルポートからモニタリングされるシステムにおけるグルコース消費および乳酸生成の速度によって必要に応じて調節されるＩＣ注入速度とを利用して少なくとも３〜５日間増殖される。ＩＣ廃棄弁は、ＩＣループ内のタンパク質の蓄積を防ぐために、廃液が廃棄バッグに回収されるように、増殖段階の期間中は開放される。
【００３４】
一実施形態では、５〜７日後に増殖が完了する。一実施形態では、一実施形態では、この増殖時点で、ＨＦＰＢには５億〜２０億個の細胞が存在する。一実施形態では、接着細胞剥離剤として０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡまたは同等の酵素パッケージを用いて、細胞をバイオリアクターのＩＣ膜から剥離させる。セルラーゼおよびコラゲナーゼなどのバイオリアクターで使用される中空繊維のタイプに応じて、他の酵素を使用することができる。一実施形態では、接着細胞剥離タスク（Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋ）を使用してシステムをＰＢＳでフラッシュし、次にバイオリアクター内で４〜１０分間循環する酵素溶液でバイオリアクターを満たす。この作業が完了すると、剥離された細胞は、ＩＣ注入ラインに取り付けられた回収バッグ内の適切な回収培地を用いる回収タスク（Ｈａｒｖｅｓｔ  ｔａｓｋ）を利用して回収される。回収が完了したら、回収バッグを密封してリアクターから取り外される。その後、細胞カウント、生存率分析、表現型決定、形態学、および分化アッセイのために、細胞をバッグから取り出すことができる。
【００３５】
一般的な製造プロセスを説明するフロー図を以下に示す。
【表１】
2018537073.tif 000002
【実施例】
【００３６】
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【００３７】
実施例
Ａ．神経前駆細胞  材料／装置
ａ．消耗品
ｉ．Ｑｕａｎｔｕｍ  増殖セット（１ｘ）
ｉｉ．４Ｌ培地バッグ（９ｘ）
ｉｉｉ．細胞注入バッグ（５ｘ）
ｉｖ．廃棄バッグ（５ｘ）
ｖ．ガス供給（５％のＣＯ2、２０％のＯ2、残部Ｎ2）
ｖｉ．グルコース  ストリップ
ｖｉｉ．ラクテート  ストリップ
ｂ．培地／試薬
ｉ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２（カタログ番号：１１３３０−０３２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）
ｉｉ．カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳ
ｉｉｉ．ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ；カタログ番号：Ｐ３６５５、Ｓｉｇｍａ）
ｉｖ．ラミニン（カタログ番号：２３０１７−０１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ｖ．Ａｃｃｕｔａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号：Ａ１１１０５−０１、Ｔｈｅｒｍｏ）
ｖｉ．Ｂ２７、Ｎ２サプリメント
ｖｉｉ．線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）
ｖｉｉｉ．ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）
ｉｘ．ＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）
【００３８】
Ｂ．手順（増殖）
ａ．細胞増殖セットの装填
ｂ．「細胞」ライン中、２ＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２で増殖セットをプライミングする。
ｃ．ＰＬＯ／ラミニンを用いて神経前駆細胞用の細胞外マトリックスを調製する。
ｉ．ＰＬＯ調製：ＰＬＯ粉末を細胞培養水に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を調製し、１ｍＬずつ分注する。１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を細胞培養水で希釈して１０μｇ／ｍＬ（１：１０００）とする。
１．１００ｍＬの細胞培養水を空の１２５ｍＬボトルに入れ、１００μＬのＰＬＯストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を加える。１００ｍＬの溶液を試薬バッグに入れる。
ｉｉ．ラミニン調製：ＰＢＳ−（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＳ２４４）中のラミニンを希釈して５μｇ／ｍＬ（１：２００）とする。
１．１００ｍＬのＰＢＳを空の１２５ｍＬボトルに入れ、ラミニンストック溶液５００μＬを加えて５μｇ／ｍＬ（１：２００）とする。１００ｍＬの溶液を試薬バッグに入れ、試薬バッグを４℃の冷蔵庫に保存する。
ｉｉｉ．培地バッグに４Ｌの細胞培養水を調製する。
ｄ．バイオリアクターのコーティング
ｉ．調整されたＰＬＯ試薬バッグを「試薬」ラインに接続する。バイオリアクターを３７℃で一晩コーティングする。
ｉｉ．翌日、ＩＣ／ＥＣ（毛細管内空間／毛細管外空間）洗浄を行うことにより、工程Ｂ．ｉｉｉで調製した１．４Ｌの細胞培養水でバイオリアクターを３回洗浄する。
１．各洗浄によりＩＣ／ＥＣ体積の約９０％が除去される。
ｉｉｉ．ＰＬＯ試薬バッグを取り外し、ラミニン充填試薬バッグを「試薬」ラインに接続し、バイオリアクターを少なくとも２時間コーティングする。
ｅ．２ＬのＮＢＦ培地を調製し、培地バッグに導入する。
ｉ．ＭＥＭ／Ｆ１２  ５０／５０混合培地中の０．５×Ｎ−２サプリメント、０．５×Ｂ−２７サプリメント、および１×ペニシリン−ストレプトマイシン。
ｆ．細胞を装填可能な状態になるまで、ＮＢＦおよび馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）でＩＣ／ＥＣ洗浄を行う。
ｇ．ＮＰＣの約１０×１０ｃｍのディッシュを取り外すことにより、約８０００万のＮＰＣを充填する。
ｈ．細胞を接着させる。
ｉ．適切な容量の培地と流速で細胞に栄養供給する。
ｉ．１日目のｉＰＳＣ接着の２４時間後、細胞に０．１ｍＬ／分で栄養供給し始める。グルコース／乳酸塩を測定し、増殖施行が終了するまで毎日記録する。
１．  ２日目に、３００ｍｌのＮＢＦを調製し、培地バッグに充填する。０．２ｍＬ／分で細胞に栄養供給する。
２．  ３日目に、６００ｍｌのＮＢＦを調製し、培地バッグに充填する。０．４ｍＬ／分で細胞に栄養供給する。
３．  ４日目に、１２００ｍｌのＮＢＦを調製し、培地バッグに充填する。０．８ｍＬ／分で細胞に栄養供給する。
４．  ５日目に、２４００ｍｌのＮＢＦを調製し、培地バッグに充填する。１．６ｍＬ／分で細胞に栄養供給する。
５．  ＊＊毎日の培地調製は、異なり、調整可能である可能性があるが、最終的に回収される細胞の数は約１３億個になり、おそらく約１０億個の生きた細胞を有する。
ｊ．ＰＢＳを有する２Ｌの培地バッグ、及び１００ｍＬの試薬バッグにＡｃｃｕｔａｓｅを作製する（試薬バッグを３７℃の水浴中に保つ）。
ｋ．バイオリアクターにおいてＩＣ／ＥＣ洗浄を２ＬのＰＢＳ−で１回実施し、次いで予め加熱した１００ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅで約５分間剥離することにより、増殖したＮＰＣを回収し始める。
ｌ．すべての回収された細胞は「回収」バッグに入っている。バッグをバイオセーフティキャビネットフードに移す。回収バッグを切断し、細胞を５０ｍＬコニカルチューブに入れる。２００×ｇで５分間遠心分離し、１００ｍｌの新鮮なＮＢＦでペレットを再懸濁する。
【００３９】
上記プロトコルに従った結果、７日後に以下の神経前駆細胞増殖が得られた。
平均細胞数
１．総細胞数：８４１Ｍ（充填された約１００Ｍ）
２．生細胞：６４４Ｍ
３．生存率：７６％
【００４０】
すべての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書では、本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載するものであり、多くの詳細は説明のために記載したものであるが、本発明は、追加の実施形態が可能であり、本明細書の特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく、かなり変化し得ることは、当業者にとって明白であろう。
【図１】
2018537073.tif 000003
【図２】
2018537073.tif 000004
【図３】
2018537073.tif 000005
【国際調査報告】
2018537073.tif 000006
2018537073.tif 000007