(57)【要約】  本発明は、１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を検出、同定、及び／又は定量する方法であって、以下のステップ：（ａ）対象体、物質、又は試料を発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）と接触させること；（ｂ）ａ）の前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の少なくとも１つの信号を検出すること；及び（ｃ）ｂ）における前記少なくとも１つの検出信号に基づいて、前記対象体上又は前記試料中の１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の有無、アイデンティティー、及び／又は量を決定することを含む方法に関する。さらに本発明は、微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の診断学及び診断の方法に関する。【選択図】図７Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を検出、同定、及び／又は定量する方法であって、以下のステップ：
（ａ）対象体、物質、又は試料を発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）と接触させること；
（ｂ）ａ）の前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の少なくとも１つの信号を検出すること；及び
（ｃ）ｂ）における前記検出された少なくとも１つの信号に基づいて、前記対象体上又は前記物質若しくは試料中の前記１つ以上の微生物ペプチド、微生物、又は微生物由来化合物の有無、アイデンティティー、及び／又は量を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を生じる感染症を診断する且つ原因微生物を同定する方法であって、以下のステップ：
（ａ’）対象体、物質、又は試料を発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）と接触させること；
（ｂ’）ａ’）の前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の少なくとも１つの信号を検出すること；及び
（ｃ’）ｂ’）において得られた前記検出された少なくとも１つの信号を、微生物ペプチドの既知試料の検出信号のデータを含むデータベースと比較すること
を含む方法。
【請求項３】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物に結合している又は微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物と接触しており、ＬＣＯ結合又は接触が、感染症の同定及び診断のためにデータベースと比較できる独自の信号を生じさせる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記データベースが、少なくとも１つの微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の以前に得られた試料のデータを含み、前記データが、少なくとも１つの微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の前記以前に得られた試料の検出信号を含み、前記データが、複数の以前に得られた試料の平均又は単一試料のデータである請求項２〜３に記載の方法。
【請求項５】
以下のステップ：
（ａ’’）前記対象体、物質、又は試料の前記少なくとも１つの検出信号を既知試料の検出信号のデータを含むデータベースと比較すること；
（ｂ’’）前記検出信号を前記データベースの以前の試料のデータに関連させて統計分析すること；並びに
（ｃ’’）ステップ（ｂ’’）から得られた結果に基づいて同定及び／又は定量すること
をさらに含む請求項１〜３に記載の方法。
【請求項６】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が、四量体〜十五量体発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）である先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が、五量体又は七量体発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）である先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が、チオフェン単量体及び／又は１つ以上の官能基若しくは側鎖を有するチオフェン単量体を含む先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記官能基又は側鎖が、カルボン酸、酢酸、プロピオン酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖類、多糖類、核酸及び誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が、少なくとも１つのチオフェン−構成単位を含み、前記チオフェン−構成単位が、インドール、セレノフェン、チアゾール、フェニルエン、フルオレン、ピロール、キノキサリン、又はベンゾジチアゾールからなる群から選択される他の複素環構成単位と交換される先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの検出信号が、光信号、電気信号、電気化学信号、又は磁気信号である先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細菌、ウイルス、藻類、又は真菌類の微生物ペプチドを検出、同定、及び／又は定量するための先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２つの相異なる微生物、微生物ペプチド、微生物由来化合物、細菌、ウイルス、藻類、又は真菌類を区別することができる先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
グラム陽性菌とグラム陰性菌を区別することができる先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、クラミジア門（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びスピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）のうち少なくとも１つを検出、同定、及び／又は定量する先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）とプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）を区別することができる先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ナイセリアＮｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモーナスＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ））、ウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ））、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）からなる群から選択される属の細菌を検出、同定、及び／又は定量する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモーナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｕｍ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及びマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択される細菌を検出、同定、及び／又は定量する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つ又はすべてのステップが、生体内、インビトロ、又はインサイチュで行われる先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
連続的に実行されうる先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される１つ以上からさらに構成される少なくとも１つのスペーサーを含む先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）が、金属、半導体材料、及びポリマー化合物からなる群から選択される１つ以上から構成される少なくとも１つの有機又は無機材料に結合する先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
処理能力を有する装置によって実行されたときに請求項５のステップｂ’’’）の前記分析を行うように適合された命令を有するコンピューター可読記録媒体を含むコンピュータープログラム製品。
【請求項２４】
前記コンピュータープログラム製品が、得られた結果について比率分析若しくは多変量解析又は機械学習を行うように適合された請求項２３に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
前記基本多変量解析が、主成分分析（ＰＣＡ）、及び階層的クラスタリングからなる群から選択される且つ／又は機械学習が、回帰法、好ましくは、線形判別分析である請求項２３〜２４に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２６】
発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）と接触した試料から集められた検出信号のアルゴリズム変換／数学的変換／統計的変換を実行する且つ／又は発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）と接触した試料からの検出信号をユーザーに提示するように適合された命令を有するコンピューター可読記録媒体を含み、好ましくは、
ａ’’’）データエクスポート機能；
ｂ’’’）先行請求項のいずれかに記載の発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）相互作用のデータが入っているデータベースとのデータ比較機能；
ｃ’’’）グラフ描画及び／又はデータ提示のための機能
を含む請求項２３〜２５に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に言及された前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）並びに１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の検出、同定、及び／又は定量並びに感染症の診断にその発光性共役オリゴチオフェンを使用するための取扱説明書を含むキット。
【請求項２８】
１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を検出、同定、及び／若しくは定量、並びに／又は感染症を診断するための少なくとも１つの発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を検出、同定、及び定量し、感染症の診断学及び診断を可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子は、タンパク質、炭水化物、核酸、及び脂質のクラスに分類される。各クラスは化学的及び構造的に異なり、生命に不可欠な独自の機能を果たす。タンパク質はアミノ酸から構成され、ペプチド（アミド）結合を介して互いに結合してポリマー鎖を形成する。一次配列は、第二、三次、及び最終的に四次構造をもたらすより高いレベルの複雑さで編成され、互いに関連する凝集タンパク質サブユニットの数及び配列を指す。ペプチド結合によって連結されたアミノ酸モノマーの短鎖はペプチドと呼ばれる。微生物によって産生されるペプチドは微生物ペプチドと呼ばれる。炭水化物は、主に炭素、水素及び酸素原子から構成される。それらの重合の度合いに基づいて、炭水化物は、糖、オリゴ糖及び多糖に分類することができる。ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸は、それぞれが糖、リン酸基、及び窒素塩基からなるヌクレオチドモノマーから構成される。脂質は、上記の高分子とは対照的に、有機溶媒に可溶な分子である。脂質は、細胞を包む細胞膜などの生体膜の主要な構成要素である。
【０００３】
微生物は上記のすべてのクラスの分子を産生することができる。微生物の同定を目的とした方法の標的となるものもある。抗体はタンパク質組成に基づいて微生物を識別し、レクチンは炭水化物を識別する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び次世代シーケンシングを含む方法は、核酸の配列に基づいて微生物を同定することができる。各分子クラスの化学組成及び構造の相違のため、これらの方法論は重複しない。
【０００４】
微生物は、さまざまな機能のために外表面に広範囲の分子を発現する。これらの分子は、安定性、コロニー形成又は表面接着、酵素反応、免疫回避、分子輸送などのための構造構成要素として機能しうる。微生物によって引き起こされる疾患の診断及び疾患におけるその同定は、典型的に、伝統的な微生物学的方法で少なくとも２〜３日かかる（図７Ｂ）。感染症の診断には、患者の病歴、患者の診察、及び検査データに基づいた所見を繋ぎ合わせることが必要とされる。診断のための臨床試料から微生物を単離することは困難な作業である。微生物を単離して十分な量まで増幅できる場合、微生物は広範囲にわたる一連の生化学検査に供される。結果の排除及び除外が最終的に病原体の同定につながる。よく使用される生化学検査は、周知の病原体を示す特有の酵素の有無に関する。しかし、検査は決定的ではないことが多い。医師は画一的なプロトコール及び広域スペクトルの作用薬で患者を治療することを余儀なくされ、それは抗生物質耐性の発生を促し、他の合併症を引き起こす可能性がある。研究から、これは非常に有害なアプローチであることが示されている。診断のための多くの方法は培養可能な生物にのみ有用であり、時間がかかり且つ高価である。時間を短縮し、診断の精度を向上し、間接的に治療コストを制御する方法及び技術が必要とされている。その方法は簡易で且つ迅速である必要がある。
【０００５】
発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）は、標的と相互作用する際に分子幾何学的構造が変化する蛍光分子群です。標的結合は、蛍光信号の変化を誘発し、標的に独自の光学的特徴を生み出す。ある場合には、この光信号はオン／オフのいずれかであり、他の場合には、信号は励起及び／若しくは発光スペクトル又は信号強度の変化でありうる。ＬＣＯはさまざまな異なる領域で使用されている又は使用されるよう提案されている。ほとんどの取り組みは、ＬＣＯをマーカーと造影剤として使用するよう行われている。Ｋｌｉｎｇｓｔｅｄｔら（Ｋｌｉｎｇｓｔｅｄｔ  Ｔ，Ｂｌｅｃｈｓｃｈｍｉｄｔ  Ｃ，Ｎｏｇａｌｓｋａ  Ａ，Ｐｒｏｋｏｐ  Ｓ，Ｈａｇｇｑｖｉｓｔ  Ｂ，Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ  ０，Ｅｎｇｅｌ  ＷＫ，Ａｓｋａｎａｓ  Ｖ，Ｈｅｐｐｎｅｒ  ＦＬ，Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＫＰ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３；１４（５）：６０７−１６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１２００７３１）には封入体タンパク質の検出のためのＬＣＯの使用が記載される一方で、Ｋｌｉｎｇｓｔｅｄｔ及びＮｉｌｓｓｏｎ（Ｋｌｉｎｇｓｔｅｄｔ  Ｔ，Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＫＰ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２０１２；４０（４）：７０４−１０．ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＳＴ２０１２０００９）には、タンパク質凝集体のイメージングのための発光性共役ポリチオフェン及びオリゴチオフェンの使用が例示されている。Ｎｉｌｓｓｏｎら（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＫＰ，  Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  Ｍ，Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；８４９：４２５−３４．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−５５１−０＿２９）は、タンパク質凝集体染色用のアニオン性プローブとして五量体ＬＣＯを使用している。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１４０２７３０００号は、タンパク質凝集体（β−アミロイド、α−シヌクレイン、ハンチンチン、タウタンパク質、過剰リン酸化タウタンパク質（ｐＴａｕ）、プリオンタンパク質、αＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ）、デスミン、セレノプロテイン、アクチン、及び／又はミオシン）に結合するであろうｐ−ＦＴＡＡ又は発光性共役ポリチオフェン（ＬＣＰ）又はｐ−ＦＴＡＡに関連するＬＣＯを用いる、異常タンパク質凝集に関連する疾患を検出する方法を提供し、それに対して、国際公開第２０１４１２５３２１号は、ミスフォールドタンパク質の検出のための磁性ナノ粒子に結合させたＬＣＯ（ｑ−ＦＴＡＡ）のイメージング用のマルチモーダル剤に関する。国際公開第２０１３０３６１９６号は、生存する患者におけるアミロイド沈着物及び凝集タンパク質のイメージングに用いるチオフェン化合物に関し、米国特許出願公開第２０１４１３５３２２号は、ミスフォールド又は凝集タンパク質によって引き起こされる疾患を治療するための治療用組成物としてのチオフェン化合物に関する。明らかにわかるように、上記刊行物及び特許出願は、ミスフォールドタンパク質又は凝集タンパク質の同定又は治療に関する。
【０００７】
米国特許第６８４１６６９号は、タンパク質、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体又は両抗体及びそれらの断片、核酸、オリゴヌクレオチド、ホルモン、医薬品、薬物、並びに非プロテイン化学的神経伝達物質の蛍光マーカーとして機能化チオフェンオリゴマーを提供する。Ｂｊｏｒｋらは、ＤＮＡや抗体抗原相互作を検出するための、両性イオンペプチド様側鎖をもつ水溶性ポリチオフェンＰＯＶＶＴに基づいたバイオセンサーを開発した（Ｂｊｏｒｋ  Ｐ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  ＮＫ，Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＫＰＲ，Ａｓｂｅｒｇ  Ｐ，Ｉｎｇａｎａｓ  Ｏ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２００５；２０（９）：１７６４−７１）。同様に、国際公開第２０１１１０２７８９号は、神経幹細胞及び神経がん幹細胞に特異的に結合するオリゴチオフェン誘導体を記載しているが、該特許出願はオリゴチオフェンが結合する構成要素について詳細に述べていない。
【０００８】
国際公開第２０１００４４７４４号は、生存する患者におけるアミロイド沈着物及び凝集タンパク質のイメージングに有用な新規置換チオフェン誘導体に関する。それはまた、酵母プリオン（Ｓｕｐ３５）、ポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ）プリオン（Ｈｅｔ−ｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質（カーリン）、マラリアコートタンパク質、クモの糸、哺乳類メラノソーム（ｐＭｅｌ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、カルシトニン、並びにアミロイドを作るように遺伝子操作されたタンパク質及びペプチドなどの生体天然アミロイドであるいくつかの非疾患アミロイドにも拡張される。国際公開第２０１４００７７３０号は、ＬＣＯで炭水化物を検出する方法を開示しているが、国際公開第２０１４００７７３０号は感染症診断の方法を何も提供していない。上記刊行物又は特許出願のいずれも、微生物ペプチドの同定又は微生物ペプチド若しくは炭水化物ベースの構造に基づいた診断のための解決策を提供していない。
【０００９】
本発明は、迅速かつ容易な方法を通して微生物標的を正確に検出及び定量するための特定のＬＣＯを使用することによって上記の欠点を克服することを意図している。ＬＣＯがアミロイドタンパク質のみを標的とする国際公開第２０１００４４７４４号では明らかにされていない知識の新たなギャップを本発明は埋める。非アミロイド標的に対するＬＣＯの使用は些細なことではなく、本発明で特定された新規領域である。国際公開第２０１４００７７３０号はＬＣＯで炭水化物を検出する方法を開示しているが、国際公開第２０１４００７７３０号は、微生物のタンパク質又はペプチドの検出について言及していない。アミノ酸含有タンパク質／ペプチド及び糖含有炭水化物の明らかに異なる化学組成及び構造のため、ＬＣＯがタンパク質／ペプチドに適用可能であることは予想外である。さらに、微生物因子を検出する試験の数日間にわたって微生物因子が一定して発現することに依存する従来の方法に対して、本発明による方法は診断及び治療に関連するコストを減らすことになる。本発明による方法はまた、特定の細菌構成要素を検出するために使用できる新規の結合標的を提示する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの目的は、微生物ペプチド、微生物、又は微生物由来化合物を検出する方法を提供することである。本発明の別の目的は、微生物ペプチド、微生物、又は微生物由来化合物を同定する方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、任意の試料から微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を診断する方法を提供することである。本発明のいっそう別の目的は、微生物ペプチド、微生物、又は微生物由来化合物を定量する方法を提供することである。本発明の別の目的は、微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の検出、又は同定、又は診断、又は定量を可能にするインターフェースを提供することである。
【００１１】
上記目的は、１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を検出、同定、及び／又は定量する方法によって達成され、その方法は、以下のステップ：
（ａ）対象体、物質、又は試料をＬＣＯと接触させること；
（ｂ）ａ）のＬＣＯの少なくとも１つの信号を検出すること；及び
（ｃ）ｂ）における前記検出信号に基づいて、塩基、前記対象体上又は前記試料中の１つ以上の微生物ペプチド又は微生物の有無、アイデンティティー、及び／又は量を決定することを含む。
【００１２】
本発明にはいくつかの利点があり、それらのなかでも、微生物ペプチド及び微生物の簡単な同定を可能にし、検出及び診断の時間を短縮し、培養不可能な細菌を同定する方法を提供し、且つ診断の主観的な見方を減らす分析方法をさらに提供する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１：ＬＣＯプローブｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕを用いた微生物ペプチドの検出及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の２つの微生物ペプチドの区別。
【図２】図２：ＬＣＯプローブｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕを用いた微生物ペプチドグリカンの検出及び２つのグラム陽性微生物種のペプチドグリカンの区別。
【図３】図３：ＬＣＯプローブｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕを用いたグラム陰性菌のペプチドグリカンからの微生物ペプチドの検出。
【図４】図４：ＬＣＯプローブｐ−ＨＴＥＡを用いた真菌類の検出。
【図５】図５：ＬＣＯプローブｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕを用いた複数の細菌種の検出及び同定。
【図６】図６：ＬＣＯプローブｈ−ＦＴＡＡを用いたサルモネラ・エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））の１つの細菌株のバリアントの検出。
【図７】図７：プロファイリング、予測、及び診断のためのＬＣＯ方法（図７Ａ）並びに伝統的な診断方法（図７Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の具体的な実施形態を記載する。１つの実施形態では、本発明は、その方法は以下のステップ：
（ａ）対象体、物質、又は試料をＬＣＯと接触させること；
（ｂ）ａ）のＬＣＯの少なくとも１つの信号を検出すること；及び
（ｃ）ｂ）における前記検出された少なくとも１つの信号に基づいて、前記対象体上又は前記物質若しくは試料中の１つ以上の微生物ペプチド、微生物、又は微生物由来化合物の有無、アイデンティティー、及び／又は量を決定することを含む、１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を検出、同定、及び／又は定量する方法である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記の方法はまた、微生物及び微生物ペプチドの同定並びに感染症の診断法に使用することができる。別の態様では、そのための本発明は、以下のステップ：
（ａ’）対象体、物質、又は試料をＬＣＯと接触させること；
（ｂ’）ａ’）のＬＣＯの少なくとも１つの信号を検出すること；及び
（ｃ’）ｂ’）において得られた前記検出された少なくとも１つの信号を、微生物ペプチドの既知試料の検出信号のデータを含むデータベースと比較することを含む、１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物を生じる感染症を診断する且つ原因微生物を同定する方法である。
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は、微生物ペプチドを検出、同定、及び／又は定量する方法である。１つの実施形態では、本発明は、微生物を検出、同定、及び／又は定量する方法である。１つの実施形態では、前記発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）は、微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物に結合している又は微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物と接触しており、ＬＣＯ結合又は接触が、同定及び診断のためにデータベースと比較できる独自の信号を生じさせる。１つの実施形態では、独自の生成信号はＬＣＯ結合に起因して生じる。別の実施形態では、発光性共役オリゴチオフェン（ＬＣＯ）は、微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物に結合している又は微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物と接触しており、感染症の同定及び診断のためにデータベースと比較できる独自の信号を生じさせる。
【００１７】
１つの実施形態では、データベースは、少なくとも１つの微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の以前に得られた試料のデータを含み、前記データは、少なくとも１つの微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の前記以前に得られた試料の検出信号を含む。１つの実施形態では、微生物由来化合物は微生物炭水化物でありうる。好ましくは、前記データは、複数の以前に得られた試料の平均又は単一試料のデータである。前記データは、複数の以前に得られた試料を編集したもの又は単一試料のデータであってもよい。別の実施形態では、データベースは、体系的比較や保管のために整理及び／又は提示されている未加工の形と分析した形の両方のデータを含む。データは、比率分析又は多変量解析、例えば、クラスタリング分析や、主成分分析（ＰＣＡ）、因子分析、階層的クラスタリングを用いて図示又は分析することができる。データはまた、線形判別分析などのより複雑な機械学習手法を用いて図示又は分析することができる。別の実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
（ａ’’）対象体、物質、又は試料の前記少なくとも１つの検出信号を既知試料の検出信号のデータを含むデータベースと比較すること；
（ｂ’’）前記検出信号を前記データベースの以前の試料のデータに関連させて統計分析すること；並びに
（ｃ’’）ステップ（ｂ’’）から得られた結果に基づいて同定及び／又は定量することをさらに含む。
【００１８】
前記方法のいずれのステップも、インビトロ、生体内、又はインサイチュで行うことができ、逐次的又は連続的に行うことができる。これらのステップは手動でも自動でもよい。１つの実施形態では、少なくともステップａ）、及び／又はステップｂ）は、生体内、インビトロ、又はインサイチュで行われる。別の実施形態では、少なくともステップａ’）、及び／又はステップｂ’）は、生体内、インビトロ、又はインサイチュで行われる。別の実施形態では、少なくともステップａ”）、及び／又はステップｂ’’）は、生体内、インビトロ、又はインサイチュで行われる。そしてさらに別の実施形態では、少なくとも１つ又はすべてのステップは、生体内、インビトロ、又はインサイチュで行われる。
【００１９】
前記方法では、対象体、物質又は試料は、ヒト、動物、若しくは環境に由来することができ、又は「独立型（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ）」でありうる対象体又はヒト、動物、生物、若しくは環境由来の対象と相互作用している対掌体から入手することができ、溶液中で新鮮に入手可能な又は若しくは表面に結合するＬＣＯとさらに接触する。１つの実施形態では、前記対象体、物質、又は以前に得られた試料／複数の試料は、ヒト、動物、生物、若しくは環境由来である。別の実施形態では、前記対象体、物質、又は以前に得られた試料／複数の試料は、対象体に由来し、好ましくは、前記対象体は「独立型」でありうる又はヒト、動物、生物、若しくは環境由来の対象と相互作用している。例えば、試料はインプラントなどの体内の対象体に由来しうる。試料、物質、又は対象体は、結合ＬＣＯを収集又は除去するようにさらに加工されてもよい。
【００２０】
本発明に従って使用されるＬＣＯは、長さが四量体から十二量体の範囲にあり、好ましくは、長さが五量体又は七量体である。１つの実施形態では、前記ＬＣＯは四量体から十二量体のＬＣＯである。別の実施形態では、前記ＬＣＯは四量体〜十五量体のＬＣＯである。別の実施形態では、前記ＬＣＯは五量体又は七量体のＬＣＯである。１つの実施形態はさまざまな長さの混合物を含む。
【００２１】
ＬＣＯは、本発明によれば、限定されないが、カルボン酸、酢酸、プロピオン酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖類、多糖類、核酸及び誘導体、並びにそれらの組み合わせなどから構成される群から選択される側鎖で改変することができる。１つの実施形態では、前記ＬＣＯは、チオフェン単量体及び／又は１つ以上の官能基若しくは側鎖を有するチオフェン単量体を含む。別の実施形態では、前記官能基又は側鎖は、カルボン酸、酢酸、プロピオン酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖類、多糖類、核酸及び誘導体並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明はこれらの官能基又は側鎖によって限定されると見なされるべきでなく、他のバリアントも可能性がある。別の実施形態では、前記ＬＣＯは、少なくとも１つのチオフェン−構成単位を含み、前記チオフェン−構成単位は、インドール、セレノフェン、チアゾール、フェニルエン、フルオレン、ピロール、キノキサリン、又はベンゾジチアゾールからなる群から選択される他の複素環構成単位と交換される。
【００２２】
前記ＬＣＯの改変は、ＬＣＯの末端又は主鎖／骨格のいずれかに施すことができる。七量体ＬＣＯの例は、ｈ−ＦＴＡＡ、ｈ−ＨＴＡＡ、及びｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕであり、前記五量体ＬＣＯは、ｐ−ＨＴＡ−Ｈｉｓ、ｐ−ＨＴＡ−Ｌｙｓ、ｐ−ＨＴＥＡ、ｐ−ＨＴＩｍ、ｐ−ＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐ−ＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐ−ＨＴＡ−Ａｓｐ、及びｐ−ＨＴＡ−Ｇｌｕのいずれかである。１つの実施形態では、前記七量体ＬＣＯは、ｈ−ＦＴＡＡ、ｈ−ＨＴＡＡ、及びｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕであり、前記五量体ＬＣＯは、ｐ−ＨＴＡ−Ｈｉｓ、ｐ−ＨＴＡ−Ｌｙｓ、ｐ−ＨＴＥＡ、ｐ−ＨＴＩｍ、ｐ−ＨＴＡ−Ｔｙｒ、ｐ−ＨＴＡ−Ａｒｇ、ｐ−ＨＴＡ−Ａｓｐ、及びｐ−ＨＴＡ−Ｇｌｕのいずれかである。
【００２３】
本発明において、信号はＬＣＯと標的の相互作用について検出され、その標的は、分泌されうる、細胞内に位置しうる、又は微生物の膜又は細胞壁に局在しうる微生物ペプチド、微生物、又は微生物由来化合物である。さらに前記方法は、微生物由来の炭水化物とペプチドの組み合わせも検出する。信号はさまざまな方法を用いて評価することができる。１つの実施形態では、前記少なくとも１つの検出信号は、光信号、電気信号、電気化学信号、又は磁気信号である。１つの実施形態では、検出信号は、光信号、電気信号、電気化学信号、及び磁気信号からなる群のうち少なくとも２つの信号の組み合わせである。別の実施形態では、前記検出信号は、蛍光信号や発色信号などの光信号；伝導率や、抵抗率、誘電率などの電気的性質に基づいた検出を伴う電気信号；電荷蓄積容量や、インピーダンス、酸化還元電位などの電気化学的性質に基づいた検出を伴う電気化学信号；又はホール効果に基づいた磁気検出器やコイルに基づいた磁気検出器で検出されるような磁気信号、又はそれらの組み合わせである。いったん少なくとも１つの信号が得られると、その信号はさらに分析され、標的とＬＣＯの以前の相互作用の以前に得られた信号と比較されうる。これらの信号は、遠隔でアクセスできるデータベースとして保管されることがある。しかし、比較データベースのデータがどのように収集されたかに関係なく本発明は正しく機能する。前記方法は強固であり、微生物ペプチド間で区別すること、微生物由来化合物間で区別すること、及び１つの微生物を他の微生物から区別することを可能にする。本発明の方法を用いて検出できる微生物、微生物由来化合物、又は微生物ペプチドは、細菌、ウイルス、藻類、又は真菌類である。１つの実施形態では、細菌、ウイルス、藻類、又は真菌類の微生物ペプチドを検出、同定、及び／又は定量する方法が記載される。別の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つの相異なる微生物、微生物ペプチド、微生物由来化合物、細菌、ウイルス、藻類、又は真菌類を区別することができる。前記方法は、グラム陰性菌とグラム陽性菌を区別する機会をもたらす。１つの実施形態では、前記方法はグラム陽性菌とグラム陰性菌を区別する。１つの実施形態では、前記方法は、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、クラミジア門（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びスピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）のうち少なくとも１つを検出、同定、及び／又は定量する。１つの実施形態では、前記方法は、ウイルスタンパク質の断片をペプチドとして検出、同定、及び／又は定量する。別の実施形態では、本発明の方法は、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）とプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）を区別することができる。前記方法が微生物又は微生物ペプチドを検出、同定、及び／又は定量しうる場合、目的のペプチドは、ステムペプチド及びリンカーペプチド又は架橋ペプチドなどの構造ペプチド、バクテリオシンなどの抗微生物ペプチド、クオラムセンシング分子、例えば、ブドウ球菌クオラムセンシングペプチド自己誘導ペプチド（ＡＩＰ）などのシグナリングペプチドである。この場合、シグナリングペプチドは調節及び／又は分泌されうる。
【００２４】
１つの実施形態では、前記方法は、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ナイセリアＮｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモーナスＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シェワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ））、ウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ））、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）からなる群から選択される属の細菌を検出、同定、及び／又は定量する。しかし、本発明はこれらの細菌によって限定されると見なされるべきでなく、他のものも考えられる。好ましくは、前記方法は、ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモーナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎ���ｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｕｍ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及びマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択される細菌を検出、同定、定量、又は診断する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明で使用されるＬＣＯは、固定フォーマットである。ＬＣＯと、前記対象体、試料、又は物質との相互作用は、液体：液体、液体：固体、固体：液体、及び／又は固体：固体相互作用の形態でありうる。１つの実施形態では、本発明の方法は連続的に実行されうる。１つの実施形態では、ＬＣＯは表面上に固定した方法で配置され、前記試料、対象体、若しくは物質は、連続した流れで通過してＬＣＯと反応することが可能であり、又は前記試料は、表面上に固定した方法で配置され、ＬＣＯは連続した流れで通過して試料と接触することが可能である。ＬＣＯが表面上に固定した方法で配置され、前記試料、対象体、又は物質が連続した流れで通過してＬＣＯと接触することが可能である本発明の方法の一例は、カテーテルチューブにありうる。別の代替的な配置は、前記試料、対象体、又は物質が表面上に固定した方法で配置され、ＬＣＯが連続した流れで通過して試料、対象体、又は物質と接触することができるものでありうる。試料、対象体、又は物質がＬＣＯと接触することが可能になる場合、限定されないが、ファンデルワールス結合、水素結合、疎水性及び静電的相互作用、並びに共有結合相互作用などのいずれかのタイプの化学的相互作用が考えられる。
【００２６】
１つの実施形態では、ＬＣＯは少なくとも１つのスペーサーを含む。別の実施形態では、スペーサーは、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される。ＬＣＯは、１つの実施形態では、少なくとも１つのスペーサーを通して表面に付いている。しかし、本発明はこれらのスペーサーによって限定されると見なされるべきでなく、他のものも可能性がある。
【００２７】
１つの実施形態では、ＬＣＯは、金属、半導体材料、及びポリマー化合物からなる群から選択される１つ以上から構成される少なくとも１つの有機又は無機材料に結合する。１つの実施形態では、ＬＣＯは、金属、半導体材料、及びポリマー化合物からなる群から選択される１つ以上から構成されるナノ粒子に結合する。
【００２８】
１つの実施形態では、本発明による方法は、試料又は対象体からすべての前述の形態のＬＣＯを収集又は除去するためでありうる。１つの実施形態では、本発明の方法は、プローブを除去又は収集するために適合される。１つの考えられる関心領域は、ＬＣＯが担体又はナノ粒子に結合された場合の試料収集／試料濃縮である。
【００２９】
本発明の１つの態様は、前述のＬＣＯと、１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の検出、同定、及び／又は定量並びに感染症の診断にそれを使用するための取扱説明書を含むキットである。１つの実施形態では、キットは、限定されないが、エマルション、例えば、クリーム、ローション、軟膏、又は繊維製品、例えば、絆創膏、パッド、衣類、又は表面結合、例えば、チューブ、ディッシュ、フラスコ、若しくは同様の手段で固定される、マルチウェルプレートに固定される、金属表面に固定される、又は溶液中、例えばスプレー、バイアル、液体などの形態でありうる。さらに別の実施形態では、本発明は、ＬＣＯの既知の結合標的とともに微生物ペプチド及び微生物を検出、同定、又は定量するためのＬＣＯ並びにパッケージ内容物を較正の目的で検査基準として使用するための取扱説明書を含むキット又は商用パッケージを提供する。さらにキットは、限定されないが、教育や訓練を含むさまざまな目的でも使用することができる。
【００３０】
いっそう別の実施形態では、本発明は、ＬＣＯから集められた信号のアルゴリズム変換／数学的変換／統計的変換を編成及び／若しくは実行し、且つ／又はＬＣＯからの信号をユーザーに提示するためのユーザーインターフェースを提供する。前記ユーザーインターフェースは、データエクスポート機能及びデータ比較機能をさらに含んでもよい。前記データエクスポート機能及びデータ比較機能は、集められたデータをエクスポートし、次いで、ＬＣＯ相互作用の情報が入った前記データベース内の既知のデータと比較することを可能にしうる。インターフェースはデータベースを保管する又は遠隔でデータベースにアクセスする。
【００３１】
本発明の別の態様は、処理能力を有する装置によって実行されたときに、前述の分析、好ましくは、統計分析、好ましくは、比率分析又は多変量解析、例えば、クラスタリング分析、主成分分析（ＰＣＡ）、因子分析、及び階層的クラスタリングを行うように適合された命令を有するコンピューター可読記録媒体を含むコンピュータープログラム製品に関する。別の実施形態では、前記コンピュータープログラム製品は、得られた結果について比率分析又は多変量解析を実行するように適合される。
【００３２】
別の実施形態では、前記多変量解析は、ＰＣＡ及び階層的クラスタリングからなる群から選択される。１つの実施形態では、分析は機械学習の形態でありうる。１つの実施形態では、機械学習は、回帰法、好ましくは、線形判別分析である。別の実施形態では、コンピュータープログラム製品は、ＬＣＯと接触した試料から集められた検出信号のアルゴリズム変換／数学的変換／統計的変換を実行する且つ／又はＬＣＯと接触した試料からの検出信号をユーザーに提示するように適合された命令を有するコンピューター可読記録媒体を含み、前記コンピュータープログラム製品は、好ましくは、
ａ’’’）データエクスポート機能
ｂ’’’）本発明によるＬＣＯ相互作用のデータが入っているデータベースとのデータ比較機能；並びに
ｃ’’’）グラフ描画及び／又はデータ提示のための機能を含む。
【００３３】
本発明の別の態様は、１つ以上の微生物、微生物ペプチド、又は微生物由来化合物の検出、同定、及び／又は定量並びに感染症の診断のための少なくとも１つのＬＣＯの使用に関する。
【実施例】
【００３４】
実施例１：微生物ペプチドの検出
ａ．微生物ペプチドの検出及び２つの微生物ペプチドの区別
１ｍｌのｉ）スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ステムペプチド（シグマ、３０％体積／体積アセトニトリル／ＰＢＳ中２ｍＭ）；ｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ペンタグリシンペプチド（シグマ、１００％体積／体積ギ酸／ＰＢＳ中２ｍＭ）；ｉｉｉ）ＰＢＳ中のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８３２５−４株の細胞（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｒ．１９６７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３３：１，ｐ１５５−６６）（トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中での一晩培養物を１ｍｌ遠心分離することによって調製）；及びｉｖ）ＰＢＳ、ｐＨ７．４が入ったチューブを調製した。図１は、抽出ステムペプチド（…・）、抽出ペンタグリシンペプチド（……）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞（−−）、及びＰＢＳ（−−−−）にｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕ（最終濃度３μＭ）を加えた後に記録した励起スペクトル（３００〜５５０ｎｍ）を示す。ＰＢＳ対照と比較して、ステムペプチド、ペンタグリシンペプチド、及び完全なスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞はすべて、光学的特徴の変化を示し、その変化は異なる微生物ペプチドを区別するのに用いることができる。ＲＦＵ＝相対蛍光単位。
【００３５】
ｂ．微生物ペプチドグリカンの検出及び２つのグラム陽性微生物種のペプチドグリカンの区別
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（シグマ）及びミクロコッカス・ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）（シグマ）から抽出されたペプチドグリカンの１ｍｌの懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）が入った、凍結されたチューブを解凍した。ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕ（最終濃度３μＭ）を加えた後に、チューブをインキュベーションし（３７℃、１時間）、その後励起スペクトル（３００〜５５０ｎｍ）を記録した（図２Ａ）。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（−−−−）と混ぜたｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕと、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）（ミクロコッカス・ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ））（……）のペプチドグリカンと混ぜたｈ−ＨＴＡ−ＧｌｕのピークＲＦＵは明らかに互いに異なり、且つ陰性対照（蒸留水中３μＭ  ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕ）（−−）と異なった。正規化したスペクトルをプロットし、各スペクトルの最大値を１．０の設定することによって、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びミクロコッカス・ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）のペプチドグリカンのスペクトルの性質の変化は、陰性対照と比較して明白であった（図２Ｂ）。したがって、蛍光スペクトルは相異なる種のペプチドグリカンを区別する方法を提供する。
【００３６】
ｃ．グラム陰性菌の微生物ペプチドの検出
グラム陽性菌の細胞壁はペプチドグリカンペプチドの抽出に優れた供給源として役立つ一方で、グラム陰性菌のペリプラズムの薄いペプチドグリカン層は容易に精製のために利用できない。市販のグラム陰性菌のペプチドグリカンの非存在下において、ペプチドグリカンペプチド架橋結合に対するアンピシリンの効果のため、アンピシリンでの処理を、ペプチドグリカン構造を変えるのに用いることができる。この実験では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））細菌を利用し、正常なペプチドグリカン構造や変化したペプチドグリカン構造を表すようにさまざまな濃度のアンピシリンで処理せずに又は処理して、ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕがｉ）グラム陰性菌やｉｉ）グラム陰性菌のペプチドグリカンペプチドに結合するかどうか分析した。１００μｇ／ｍｌアンピシリン（シグマ）から始まる段階希釈（１００μｌ  ＬＢ培地で１：１）を９６ウェルプレートで調製した。各ウェルに、６μＭ  ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕを含有するＬＢに１：５０体積／体積希釈したエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）分離株番号１２（カロリンスカ大学病院の腎盂腎炎の小児から入手、Ｋａｉ−Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ６：７，ｅ１００１０１０で論文報告）の一晩培養物を１００μｌ加えた。９６ウェルプレートでのアンピシリンに対する添加エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の希釈効果により、最大アンピシリン濃度は５０ｐｇ／ｍｌであった。ブランク（３μＭ  ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕ含有ＬＢ中１００μｇ／ｍｌアンピシリン、細菌なし）も含めた。３７℃で２０時間インキュベーションした後、励起スペクトル（３００〜５５０ｎｍ）を記録した。図３Ａは、５０ｐｇ／ｍｌ（−−−−−）、２５ｐｇ／ｍｌ（−  −）、１２．５ｐｇ／ｍｌ（−−  −−）、６．２５ｐｇ／ｍｌ（−−−−）、及び３．１３ｐｇ／ｍｌ（…・）アンピシリンに供したエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞と混ぜたｈ−  ＨＴＡ−Ｇｌｕ及びブランク（……）の正規化した励起スペクトルを示す。励起ピークのより長い波長へのシフトは、ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕがエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌に結合できることを示す。
【００３７】
詳細な情報を得るために、シフトの変化をブランクの対応する位置で割った正規化スペクトルの各位置をプロットすることによって定量した（図３Ｂ）。変換したプロットは、さまざまな濃度のアンピシリンに暴露したエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の正規化ＲＦＵ比を示し、１２．５ｐｇ／ｍｌで最大信号がもたらされた。ペプチドグリカン構造がアンピシリンによって変えられ、正規化ＲＦＵ比がさまざまなアンピシリン濃度で変化するので、この実験は、ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕがエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペプチドグリカンに結合することを示す。
【００３８】
アンピシリンの致死効果を図３Ｃに示す。細菌増殖（……）をアンピシリンの漸増濃度に対してプロットした。細菌増殖が可能なように十分に低い抗生物質濃度にて、（Ｂ）の各曲線の最大正規化ＲＦＵ比を対応するアンピシリン濃度に対してプロットすることによって得られるピーク正規化ＲＦＵ比（−  −）は、ブランクと比べて２．５倍高かった。これはｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕのエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌への結合を裏付ける。興味深いことに、光学密度が下がるにつれて１２．５ｐｇ／ｍｌにおいて増加が起こる。これは、ペプチドグリカンが抗生物質によって大きく変えられるが、細菌を死滅させるのに十分ではない中間の状態を表す。まとめると、これらの実験はグラム陰性菌のペプチドグリカンペプチドに対するＬＣＯの結合能を例証する。ＲＦＵ＝相対蛍光単位、ＯＤ＝光学密度、エラーバー＝３回の実験の標準偏差。図３Ｃのｘ軸は対数目盛である。
【００３９】
ｄ．真菌類の検出
真菌類の検出のためのＬＣＯの使用を分析するために、ｐ−ＨＴＥＡ（最終濃度３μＭ）を、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））、ＡＴＣＣ株ＭＹＡ−２８７６）の一晩培養物の１％体積／体積接種菌を含有する２ｍｌの酵母ポテトデキストロース（ＹＰＤ）培地に加えた。ボルテックスした後、２００μｌアリコートを、陰性対照（３μＭ  ｐ−ＨＴＥＡ含有ＹＰＤ、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）なし）とともに９６ウェルプレートに移した。プレートを加湿雰囲気で３７℃にて４８時間インキュベーションし、励起スペクトル（３００〜５００ｎｍ）を記録した。図４Ａは、真菌類を含まないＹＰＤ（……）と比較して、ＹＰＤ（−−−−−）中のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）と混合したｐ−ＨＴＥＡの小さいがはっきりとしたスペクトルのシフトを示す。次いで、真菌類細胞層を乱さないように培地を注意深く各ウェルから除去し、陽性対照を除いて、ウェルあたり２００μｌのヒト血液を加えた。陽性対照には新鮮なＹＰＤ培地を加えた。再度励起スペクトルを記録した。図４Ｂは、血液中のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（−−−−−）と混合したｐ−ＨＴＥＡからの顕著な信号に対して、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を含まない血中ｐ−ＨＴＥＡ（……）からの信号は非常に低かったことを示す。まとめると、これは、実験室条件下及びヒト試料を用いた酵母カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を検出するためのＬＣＯ  ｐ−ＨＴＥＡの使用を実証する。
【００４０】
実施例２：診断法のための複数の細胞腫の検出及び同定
細菌株の検出及び同定のためのＬＣＯの使用は、近縁のスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）の種の分離株を用いて示した。カロリンスカ大学病院から入手したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＨＹ−８８６株、ＨＹ−８３６／９１株、ＨＹ−６８６株、ＨＹ−８３４株、ＨＹ−８４２株）及びスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、ＨＹ−８４０株、ＨＹ−８２２／１株、ＨＹ−８３９／９１株、ＨＹ−８４４／１株、ＨＹ−８４２／１株、ＨＹ−８２９株、ＨＹ−８３２／１０株）の臨床分離株のトリプチックソイブロス（ＴＳＢ、シグマ）中での一晩培養物から１００μｌを１０ｍｌ  ＴＳＢで希釈し、次いでチューブに分注して１ｍｌアリコートとし、ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕを２μＭの最終濃度で加えた。混合した後に、２００μｌの各培養物を３連で９６ウェルプレートに加え、３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、励起スペクトル（３００〜５５０ｎｍ）を記録した。図５Ａは、励起スペクトルのヒートマップ表示及びブレイ・カーティス階層的クラスタリング分析を示し、後者は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）株を左方向に（……）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株を右方向（−−−−）にクラスタリング化し、２つのスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）の種はっきりと区別する。図５Ｂは、励起スペクトルの主成分分析（ＰＣＡ）を示し、グラフの上部にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（○）株の、下部にスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（●）株のクラスタリングを示している。したがって、階層的クラスタリング分析及びＰＣＡは、２つの独立したＬＣＯに基づく細菌種区別のための分析方法を表す。図５Ｃは、機械学習が入院患者から分離された未知の細菌株の同定を予測するのに使用することができることを示す。機械学習プロセス・方法由来線形判別予測が、既知のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株及び既知のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）株について示されている。未知の株の機械学習プロセス由来線形判別予測をスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＣＮＳと同じグラフに追加した際、我々は、ＣＮＳ株として分類された陽性線形判別予想をもつ未知の株及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）として分類された陰性線形判別予想をもつ株を見出した。
【００４１】
混合試料中の細菌株の同定のためのＬＣＯの使用を示すために、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＨＹ−８３４株及びスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＨＹ−８４０株の一晩培養物を、１００：０（●）、７５：２５（■）、
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、２５：７５（□）、及び０：１００（○）の比で混ぜ、ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕ（最終濃度３μＭ）を加えた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、２００μｌの各試料を９６ウェルプレートに移した。励起スペクトル（３００〜５５０ｎｍ）を記録し、ＰＣＡ分析を行った。図５Ｄは、ＰＣＡグラフの底部に位置する、純粋なスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含む試料を示す。混合培養中でスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の量を増加させていくと、位置が予測可能なパターンでＰＣ２軸に沿って上に移動し、純粋なスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）試料の一番上の位置に達する。これは、ｈ−ＨＴＡ−Ｇｌｕが混合試料に存在する細菌を同定し、且つそれら細菌の相対濃度を決定する実現可能性を明らかに示す。
【００４２】
実施例３：１つの細菌株のバリアントの検出
遺伝的なばらつきに起因して、１つの細菌株のバリアントが多数存在する。特定遺伝子の明らかな変異を除いて同一の遺伝子型を有するこれらの株は、感染症の病態生理に大きな影響を及ぼしうる、タンパク質、微生物化合物、及び病原性因子の異なる発現パターンを示す。図６Ａは、２８℃でインキュベーションした、塩を含まない、コンゴーレッド含有ＬＢ寒天プレート上で見られたサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）３９３４株（Ｓｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６（３）：６７４−８）の赤く、乾いて、粗い（ｒｄａｒ）コロニーを示す。これは、カーリ及びセルロースを発現する細菌の特徴的な形態である。カーリを発現できない変異株（３９３４ΔｃｓｇＡ）、セルロースを発現できない変異株（３９３４ΔｂｃｓＡ）、又は両方を発現できない変異株（３９３４ΔｃｓｇＤ）（Ｌａｉａｓａ  ｅｉ  ａｌ  ２００５  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８（５）：１３２２−３９）は、明らかに異なるコロニー形態を示す。
【００４３】
４つの異なる株の同定にＬＣＯが使用できるかどうかを調べるために、２８℃で４８時間、塩を含まないルリア・ベルターニ（ＬＢ）寒天プレート上で増殖させた各株のコロニーを、滅菌ループを用いて採取し、０．５ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁した。懸濁液を超音波処理し、次いでＰＢＳ中で約ＯＤ６００＝０．２に希釈した。各懸濁液の１８０μｌアリコートを９６ウェルプレートに移し、２０μｌのｈ−ＦＴＡＡ（最終濃度１μＭ）を各ウェルに加えた。陰性対照（ｈ−ＦＴＡＡを含むＰＢＳ、細菌なし）も含めた。励起スペクトル（３００〜６００ｎｍ）を記録し、４５０〜５２０ｎｍ間隔で集めたデータをＰＣＡ分析に供した。図６Ｂは、セルロース産生を欠く株（３９３４ΔｂｃｓＡ（■）、３９３４ΔｃｓｇＤ（●））がグラフの下部にクラスター化する一方で、セルロース産生株（３９３４（○）、及び３９３４ΔｃｓｇＡ（□））はグラフの上部に位置することを示す。まとめると、これは、同じ種の株を表現型的に区別し、タンパク質、微生物化合物、及び病原性因子発現を予測／定義するためのＬＣＯの使用を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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