(57)【要約】本開示は、制御性T細胞の活性と機能を調節する方法を提供する。2018518465.tif 000046
2018518465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000036
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000037
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、それを必要とする対象に投与する段階
を含む、対象において制御性T細胞（Treg)を除去する方法。
【請求項２】
抗体が、IgG1重鎖定常領域を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000038
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000039
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、サイトカイン分泌腫瘍を有する対象に投与する段階
を含む、対象においてサイトカイン分泌腫瘍への制御性T細胞（Treg）の遊走を阻害する方法。
【請求項４】
抗体が、IgG4重鎖定常領域を有する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
サイトカインが、CCl2、CCl4、CCL5、CCL17またはCCL22である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
定常領域がS228P変異を含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
エフェクターT細胞が実質的に除去されない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
エフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比が、腫瘍または対象において調節される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
エフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比が増加する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
エフェクターT細胞の増殖が増加するかまたは実質的に減少しない、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
エフェクターT細胞の数が増加するかまたは実質的に減少しない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
エフェクターT細胞集団からのサイトカインの放出が調節される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
サイトカインがインターフェロン-ガンマを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
エフェクターT細胞集団からのエフェクターポリペプチドの放出が調節される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
エフェクターポリペプチドが、グランザイムBまたはパーフォリンを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
制御性T細胞が濾胞性制御性T細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000040
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列
2018518465.tif 000041
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、それを必要とする対象に投与する段階
を含む、対象において腫瘍細胞増殖を阻害する方法。
【請求項１８】
腫瘍が、固形腫瘍または血液系腫瘍である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
血液系腫瘍が、皮膚T細胞性リンパ腫（CTCL）、菌状息肉腫（MF）、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（皮膚ALCL）、セザリー症候群、または成人T細胞白血病／リンパ腫（ATLL）である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
固形腫瘍が、腎細胞がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、皮膚がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頸がん、脳がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓もしくは胃のがん、ホジキン病、または多形性膠芽腫（GBM）である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、IgG4重鎖定常領域またはIgG1重鎖定常領域を有する、請求項3記載の方法。
【請求項２２】
抗原および抗CCR4抗体を対象に投与する段階を含む、抗原に対するワクチンを接種する方法。
【請求項２３】
抗CCR4抗体が、抗原投与前、同時または後に投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ヒト化抗CCR4抗体が、二重特異性抗体の第1のメンバーである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
二重特異性抗体の第2のメンバーが、腫瘍関連抗原、T細胞機能調節分子、T細胞受容体ポリペプチドに特異的である、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍関連抗原が、CA-IX、ErbB2またはHVEMである、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
T細胞機能調節分子が、PD-L1、PD1、CTLA4、GITR、IL21、IL21R、CD160、TIM3、LAG3またはGAL9である、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
T細胞受容体ポリペプチドがCD3である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000042
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000043
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体をCCR4+ Tregと接触させる段階
を含む、CCR4+ Tregに対するIL-2の結合を阻害する方法。
【請求項３０】
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000044
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列
2018518465.tif 000045
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体をTregと接触させる段階
を含む、CD25切断を誘導する方法。
【請求項３１】
薬学的組成物が1回または複数回投与されるヒト対象に存在する腫瘍内のまたは腫瘍に関連するエフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比を増加させるのに有効な量のヒト化抗CCR4抗体
を含む、薬学的組成物。
【請求項３２】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項28記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2015年5月1日に出願された米国仮出願第62/155,966号、2015年9月11日に出願された米国仮出願第62,217,419号および2015年10月6日に出願された米国仮出願第62/237,942号の恩典および優先権を主張し、それらの各々の内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、T細胞機能の調節に関する。
【０００３】
政府の利益
本発明は、National Institutes of Healthから授与されたU01 CA-152990の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に関して一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ケモカインは、主として白血球の活性化および走化性におけるそれらの役割に関して知られている分泌タンパク質のファミリーである。それらと標的細胞上のケモカイン受容体との特異的相互作用は、炎症メディエーターの放出、細胞形状の変化および細胞の遊走をもたらすシグナル伝達カスケードを始動させる。CCケモカイン受容体4（CCR4）は、CCケモカインCCL17およびCCL22の同族受容体であり、Tヘルパー2型細胞（Th2）を含むT細胞の機能的に特徴的なサブセットおよび制御性T細胞（Treg）の大部分で発現される。CCL17/22の分泌が、悪性物、例えば結腸直腸、卵巣、ホジキンリンパ腫および膠芽細胞腫付近の腫瘍浸潤性Treg数の増加を促進する証拠が蓄積されている。腫瘍内のTregのレベルの上昇は、効果的な抗腫瘍免疫応答を妨げ、しばしば乏しい臨床結果および腫瘍の進行に関連する。
【０００５】
したがって、がん治療の成功にとっての1つの大きな障害は、腫瘍へのTregの遊走およびそれによる腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答の抑制により生じ得る。Tregの抑制機能を打ち消し、結果として抗腫瘍免疫を促進するために、近年、Tregに対する免疫療法剤としてのモノクローナル抗体（mAb）が、前臨床および臨床研究において評価されている。しかし、mAb免疫療法による全身的なTreg除去について注意を要するのは、大いに予想される自己免疫への影響である。Tregにより誘導されるがん免疫逃避を回避する代替の戦略は、腫瘍組織におけるTregの誘引および蓄積を直接的に妨げる腫瘍関連Treg標的化療法を確立することである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000003
を有する3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000004
を有する3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、それを必要とする対象に投与することによる、対象において制御性T細胞（Treg)を除去する方法を提供する。任意で、抗体は、IgG1重鎖定常領域を有する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000005
を有する3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000006
を有する3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、サイトカイン分泌腫瘍を有する対象に投与することによる、対象においてサイトカイン分泌腫瘍への制御性T細胞（Treg）の遊走を阻害する方法を提供する。任意で、抗体は、IgG4重鎖定常領域を有する。いくつかの局面において、定常領域は、S228P変異を含む。サイトカインは、CCl2、CCl4、CCL5、CCL17またはCCL22である。
【０００８】
エフェクターT細胞は、実質的に除去されない。エフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比は、腫瘍または対象において調節される、例えば増加する。エフェクターT細胞の増殖は、増加するかまたは実質的に減少しない。エフェクターT細胞の数は、増加するかまたは実質的に減少しない。
【０００９】
いくつかの局面において、制御性T細胞は、濾胞性制御性T細胞である。
【００１０】
様々な局面において、エフェクターT細胞集団からのサイトカイン放出が調節される。サイトカインは、例えば、インターフェロン-ガンマである。別の局面において、エフェクターT細胞集団から放出されるエフェクターポリペプチドが調節される。エフェクターポリペプチドは、例えば、グランザイムBまたはパーフォリンである。
【００１１】
さらに別の局面において、本発明は、それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000007
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000008
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、それを必要とする対象に投与することによる、対象において腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。抗体は、IgG4重鎖定常領域またはIgG1重鎖定常領域を有する。
【００１２】
腫瘍は、固形腫瘍または血液系腫瘍である。血液系腫瘍は、皮膚T細胞性リンパ腫（CTCL）、菌状息肉腫（MF）、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（皮膚ALCL）、セザリー症候群、または成人T細胞白血病／リンパ腫（ATLL）である。
【００１３】
固形腫瘍は、腎細胞がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、皮膚がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頸がん、脳がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓もしくは胃のがん、ホジキン病、または多形性膠芽腫（GBM）である。
【００１４】
別の局面において、本発明は、抗原および抗CCR4抗体を対象に投与することによる、抗原に対するワクチンを接種する方法を提供する。抗CCR4抗体は、抗原投与前、同時または後に投与される。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000009
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000010
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体をTregと接触させる段階を含む、CCR4+ Tregに対するIL-2の結合を阻害する方法を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000011
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000012
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体をTregと接触させる段階を含む、CD25切断を誘導する方法を提供する。
【００１７】
様々な局面において、ヒト化抗CCR4抗体は、二重特異性抗体の第1のメンバーである。二重特異性抗体の第2のメンバーは、腫瘍関連抗原、T細胞機能調節分子、T細胞受容体ポリペプチドに特異的である。腫瘍関連抗原は、CA-IX、ErbB2またはHVEMである。T細胞機能調節分子は、PD-L1、PD1、CTLA4、GITR、IL21、IL21R、CD160、TIM3、LAG3またはGAL9である。T細胞受容体ポリペプチドは、CD3である。
【００１８】
薬学的組成物が1回または複数回投与されるヒト対象に存在する腫瘍内のまたは腫瘍に関連するエフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比を増加させるのに有効な量のヒト化抗CCR4抗体を有する薬学的組成物も、本発明によって提供される。腫瘍は、例えば、固形腫瘍である。
【００１９】
それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明を実施する際には、本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適当な方法および材料が記載されている。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、明示的に、それらの全体が参照により組み入れられる。相反する場合、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、本明細書に記載される材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、かつ以下の詳細な説明および特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】CD4+ T細胞集団におけるCCR4分子の同定。（A)ヒトT細胞集団およびCCR4発現T細胞サブセットの同定のためのゲーティング戦略。
【図１Ｂ】CD4+ T細胞集団におけるCCR4分子の同定。（B)T細胞部分集団の比率。
【図１Ｃ】CD4+ T細胞集団におけるCCR4分子の同定。（C）QuantiBRITE PEビーズ（赤色線）、CD25highCD127dim/-CCR4+ Treg（青色線）およびCD25dim/-CD127+CCR4+ T細胞（オレンジ色線）の蛍光ヒストグラムを、３体の独立した健常ドナーにおいてフローサイトメトリーによって実施した。PEビーズは、蛍光色素を含有する低レベル（474 PE分子／ビーズ）、中低レベル（5,359 PE分子／ビーズ）、中高レベル（23,843 PE分子／ビーズ）および高レベル（62,336 PE分子／ビーズ）のPE分子を示した。
【図１Ｄ】CD4+ T細胞集団におけるCCR4分子の同定。（D)各T細胞部分集団におけるCCR4+ サブセットの比率。
【図１Ｅ】CD4+ T細胞集団におけるCCR4分子の同定。（E)CD4+CD25-CD127+ TeffおよびCD4+CD25highCD127dim/- TregにおけるCCR4分子の発現レベル。すべての実験を、3体の独立したドナーで実施し、その平均±S.E.Mで示した。
【図２】CCR4+ Tregを介した免疫抑制。（A)CD4+CD25+FoxP3+ TregにおけるCCR4の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。健常ドナー血液サンプル中のCD3+CD4+リンパ球においてゲートしたCD25およびFoxP3発現の代表的な蛍光活性化細胞選別（FACS）プロット（左2つのプロット）ならびにCD25+FoxP3+リンパ球においてゲートしたCCR4染色（右プロット）。（B)20μg/ml PHAおよびTregまたはCCR4- Treg（Teff:Treg=10:1の比）ありまたはなしで培養されたCD4+エフェクターT細胞のCFSE細胞増殖プロフィールを、フローサイトメトリーを用いてCFSE+細胞をゲートすることによって分析した。CCR4- Tregを、mAb2-3結合ビーズを用いて分離した。比率は、7日間の培養後の分裂性CFSE標識CD4+ Teffの割合を表している。実験を、3体の独立したドナーにおいて再現した。（C)CCR4除去Tregの共培養下でのTeffのインビトロ抑制アッセイ。この抑制アッセイを、10/1のTeff/Treg比の3体の独立した健常ドナー由来のCD4+CD25+CD127dim/-CCR4+ Tregの存在下または非存在下で共培養し、PHAで5日間刺激したCFSE標識Teffの増殖によって測定した。CFSE希釈Teffの比率を計算した。二元配置ANOVAによって分析した平均±S.E.M.が示されている。値＜0.05。
【図３】インビトロおよびインビボでのmAb2-3による卵巣がん細胞を通じたTregの走化性の阻害。（A)細胞内ケモカインCCL22染色を、卵巣がん細胞株、IGROV-1、OVCAR-5およびOVCAR-8の培養物において、ブレフェルジンA（BFA）の添加あり（青色線）またはなし（赤色線）で実施した。（B)CCL22発現卵巣がん細胞上清により誘導されたCD4+CD25+ Tregのインビトロ走化性を、トランスウェルアッセイを用いて実施した。Tregの動員は、mAb2-3 IgG1およびIgG4によって阻害されたが、対照抗体によっては阻害されなかった。（C)ルシフェラーゼ発現CD4+ T細胞および（D)CD4+CD25+CD127dim/- Tregの注射後18時間の卵巣がん異種移植マウスモデルのインビボ生物発光画像。関心対象領域（ROI）の強度（赤色の丸、異種移植された腫瘍）をさらに、左パネルで定量した。結果を、平均±S.D.で表した。「＊」および「＊＊」は、それぞれ、スチューデントt検定のp値＜0.05および0.01を表している。
【図４Ａ】IGROV-1細胞に対する腫瘍プライムT細胞の活性。（A)腫瘍プライムT細胞を、抗CD3、CD4、CD8、CD25および（B)CCR4抗体によって染色した。mAb2-3結合ビーズによるCCR4除去腫瘍プライムT細胞および腫瘍プライムT細胞中のT細胞サブセットをフローサイトメトリーによって分析した。
【図４Ｂ】図4Aの続きを示す図である。
【図４Ｃ】IGROV-1細胞に対する腫瘍プライムT細胞の活性。（C)腫瘍プライムT細胞およびmAb2-3除去腫瘍プライムT細胞を、IGROV-1細胞と共に24および48時間インキュベートし、その後に上清を収集し、IFN-γの発現レベルを検出した。共培養上清中のIFN-γを、メソスケールディスカバリー（MSD）によって測定し、腫瘍プライムT細胞培養上清中のIFN-γ濃度の倍率で示した。
【図４Ｄ】IGROV-1細胞に対する腫瘍プライムT細胞の活性。（D)共培養物由来のCD4およびCD8 T細胞の細胞内IFN-γ染色。細胞を共培養後48時間で収集し、ブレフェルジンAの存在下で6時間インキュベートし、CD3、CD4およびCD8について染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、そして細胞内IFN-γについて染色した。この細胞を、サイズおよびCDマーカーによりリンパ球についてゲートし、フローサイトメトリーによって分析した。
【図４Ｅ】IGROV-1細胞に対する腫瘍プライムT細胞の活性。（E)さらに、腫瘍プライムT細胞およびmAb2-3除去腫瘍プライムT細胞の細胞傷害活性をLDH ELISAアッセイによって検出した。すべての実験を、各時点で3回行い、その平均±S.D.で表し、2回の独立した実験において実施した。*、**および***は、それぞれ、スチューデントt検定のp値＜0.05、0.01および0.005を表している。
【図５】mAb2-3はIGROV-1プライムT細胞を用いて再構成されたIGROV-1異種移植マウスにおいて腫瘍成長阻害を媒介する。（A)NSGマウスに、2x106個のルシフェラーゼ発現IGROV-1腫瘍細胞を皮下接種し、4x106個のIGROV-1プライムT細胞を静脈内注射し、そして抗CCR4抗体で処置した。NSGマウスにおけるルシフェラーゼ発現IGROV-1ヒト卵巣がん腫瘍異種移植片の腫瘍成長曲線を測定した。マウスを、3 mg/kgの対照IgG4（n=2）、mAb2-3 IgG1（n=3）およびmAb2-3 IgG4（n=3）ならびに等量のPBS（n=2）で処置した。抗体を、5週の間、週に2回、静脈内投与した。マウスを、10日毎に、IVIS画像化システムを用いて画像化した。カラースケール：発光シグナル強度：青色、最小強度のシグナル；赤色、最大強度のシグナル。（B)各グループの腫瘍組織のルシフェラーゼシグナルを定量した。抗体で処置したマウスにおける（C)腫瘍サイズおよび（D)体重を、週に2回測定した。（E)腫瘍組織および（F）腫瘍重量を収集および測定した。バースケール、1 cm。*、p<0.05；***、p<0.005；p値は、二元配置ANOVAを用いて計算した。すべてのデータを、平均±S.E.Mで示した。
【図６】IL-2とCD25の間の相互作用におけるmAb2-3の介在。（A)外因性IL-2の非存在下、mAb2-3ありまたはなしでインキュベートされた1x104個のCD4+CD25- Teff培養上清中の内因子性IL-2レベルをELISAによって分析した。（B)CD4+CD127dimCD49d- Treg（3000／反応）を、20μg/mlのmAbおよび0.5/1μg/mlのプレートに結合させた抗CD3/28抗体の存在下および非存在下で、0.25 IU/mlの外因性IL-2と共にインキュベートした。バーは、±S.D.を表している。（C)外因性IL-2の非存在下で、1x104個のTeff単独またはTregを伴うものおよび20μg/mlのmAb2-3で処置されたものの内因性IL-2の濃度を示した。バーは、±S.D.を表している。（D)4 IU/mlの外部から添加されたIL-2の存在下で、mAb2-3で処置されたTeffおよびTreg共培養物由来の上清中のIL-2の濃度。バーは、±S.D.を表わしている。（E)外因性IL-2（20 IU/ml）の存在下で、抗体（mAb2-3または抗CD25、抗TACおよび対照mAbを含む）でまたはそれなしで処置された2x105個のMac-1細胞由来の上清のIL-2濃度をELISAによって検出した。バーは、±S.D.を表している。（F)インビトロ細胞生存アッセイを、0.5 IU/mlのIL-2、20μg/mlのmAb2-3 IgG1および20μg/mlの対照IgG1の存在下または非存在下で5日間処置された培養Tregにおいて生存色素を測定することによって実施した。自然死したTregに対して正規化された、異なるグループの死滅したTregの比率が示されている。各点は、各グループの個々のドナーを示している。バーは、平均±S.E.M.を表している。「**」および「***」はそれぞれ、スチューデントt検定を使用することによるp値＜0.01および0.005を表している。
【図７】ヒト末梢血T細胞およびフィコエリトリン（PE）結合ビーズの代表的なフローサイトメトリープロット。（A)CD3+CD4+ T細胞をゲートし、PE-Cy5結合抗CD45RAおよびPerCp-Cy5結合抗CCR7抗体で染色して（図1に示されるように）Tcm、Tem、TeffおよびTnaiveを区別した。CD4+CD25-CD127+CCR4+ T細胞部分集団を、さらなる分析のためにゲートした。PEビーズおよびT細胞部分集団の蛍光ヒストグラムが、それぞれ、赤色および青色の線で示されている。（B)ビーズあたりのPE分子の数に対するPE蛍光に関する較正曲線。（C)T細胞部分集団におけるCCR4分子の発現レベル。すべての実験を、3体の独立したドナーにおいて行い、その平均±S.D.で示した。
【図８】mAb2-3の存在下および非存在下でのヒトPBMCのインビボ分布。（A)1x107個のヒトPBMCおよび抗体をマウスに静脈内注射した。24時間のインビボ循環の後、マウス血液を収集し、ヒトPBMCを、Pacific Blue結合抗CD3、Brilliant Violet結合抗CD4、APC結合抗CD25およびPE-Cy7結合抗CD127を用いて染色し、Tregを区別するようゲートした。（B)CD25+CD127- Tregの比率を、各グループの3匹の独立したマウスからの平均で示した。*、p値＜0.05。（C)インビボ循環後のTregの分析。
【図９】huPBL-NSG動物モデルにおけるmAb2-3 IgG4に対するヒトPBMCのインビボ応答。（A)107個の新たに単離したヒトPBMCを、成体NSG免疫不全マウスに尾静脈を通じて静脈内注射した。huPBL-NSGマウスに、週2回、尾静脈を通じて1 mg/kgの抗体を与えた。毎週、末梢血をhuPBL-NSGマウスから収集し、ヒトCD45、（B）CD19およびCD45、（C）CD3およびCD45、（D）CD4ならびにCD3およびCD45、（E）CD8ならびにCD3およびCD45、ならびに（F）CD25ならびにCD3およびCD45について、抗ヒト特異的抗体で染色し、フローサイトメトリーによって104個のPBMCあたりの定量をおこなった。（G）異なる処置において、各週、血液由来のCD45+細胞中のCD3+CD4+CD25+CD127-細胞の比率を試験した。（H）第3週時点での、血液、脾臓および骨髄由来のCD45+細胞中のCD3+CD4+CD25+CD127-細胞の比率が示されている。二元配置ANOVA試験を行った。各データ点は、その平均（n=6 NSGマウス、2体のPBMCドナー）±S.E.M.を表している。*および**、それぞれp値＜0.05および0.01。
【図１０】mAb2-3はCCL22を介する化学誘引を阻害した。（A)IGROV-1卵巣がん細胞におけるCCR4の発現。（B)mAb2-3は、用量依存的な様式で、CCR4リガンドであるCCL22に対するCD4+CD25-および（C）CD4+CD25+ T細胞の走化性を効果的に阻害した。
【図１１】CCL22分泌卵巣がん細胞によるヒトリンパ球の化学誘引はmAb2-3によって阻害される。（A)この画像は、ルシフェラーゼ発現CD4+CD25+CD127dim/- T細胞の注射後48時間の時点（画像化時）の卵巣がん異種移植マウスモデルのインビボ生物発光画像を示している。（B）ROIの強度の定量（赤色の円、異種移植腫瘍）は、mAb2-3が腫瘍組織へのTregの動員を阻害することを示した。（C)腫瘍組織を収集し、コラゲナーゼによって消化し、次いで抗CD3、CD4およびCD25抗体によって染色した。CD3+CD4+CD25+ T細胞をフローサイトメトリーによって分析および計数し、腫瘍組織由来の総細胞の比率として示した。
【図１２】IGROV-1パルス樹状細胞およびIGROV-1プライムT細胞の構築。（A)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン-4（IL-4）の組み合わせによる単球から樹状細胞（DC）への分化。単球をヒトPBMCから単離し、GM-CSF（100 ng/ml）およびIL-4（100 ng/ml）の組み合わせの存在下で培養した。7日間の培養後、細胞を収集し、示されている様々なDC分化マーカーの表面発現についてフローサイトメトリーによって分析した。（B)IFN-γ分泌を、腫瘍プライムT細胞（TP-T細胞）、未処置DCおよび腫瘍パルスDCの共培養上清から検出した。バーは、±S.D.を表している。「*」は、スチューデントt検定のp＜0.05を表している。
【図１３Ａ】mAb2-3は、IGROV-1プライムT細胞を有する大規模IGROV-1異種移植マウスにおける腫瘍成長阻害を媒介する。（A)NSGマウスに5x106個のIGROV-1腫瘍細胞を皮下接種し、1x107個のIGROV-1プライムT細胞を静脈内注射し、そして抗CCR4抗体で処置した。NSGマウスにおけるIGROV-1ヒト卵巣がん腫瘍異種移植片の腫瘍成長曲線を測定した。マウスを3 mg/kgの対照IgG4（n=2）、mAb2-3 IgG1（n=2）、mAb2-3 IgG4（n=2）および等量のPBS（n=2）で処置した。抗体を、4週の間、週に2回、静脈内投与した。抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズおよび（B)体重を週に1回測定した。
【図１３Ｂ】図13Aの続きを示す図である。
【図１３Ｃ】mAb2-3は、IGROV-1プライムT細胞を有する大規模IGROV-1異種移植マウスにおける腫瘍成長阻害を媒介する。（C)腫瘍組織を収集した。バースケール、1 cm。
【図１３Ｄ】mAb2-3は、IGROV-1プライムT細胞を有する大規模IGROV-1異種移植マウスにおける腫瘍成長阻害を媒介する。（D)マウスPBMCを、抗ヒトCD3、CD4、（E)CD8および（F)CD25抗体によって染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。*、P＜0.05；**、P＜0.01；p値は二元配置ANOVAを用いて計算した；黒色および灰色のアスタリスクは、対照グループとの比較でそれぞれmAb2-3 IgG1およびIgG4を示している。すべてのデータを、平均±S.E.M.として示した。
【図１３Ｅ】図13Dの続きを示す図である。
【図１３Ｆ】図13Eの続きを示す図である。
【図１３Ｇ】mAb2-3は、IGROV-1プライムT細胞を有する大規模IGROV-1異種移植マウスにおける腫瘍成長阻害を媒介する。（G）免疫組織化学染色を、各グループの腫瘍組織において抗CD3（上パネル）および抗CD25（下パネル）抗体を用いて行った。暗赤色に染色された膜（矢印）は、腫瘍内のCD3またはCD25TP-T細胞を表している。バースケール、50μm。
【図１４】Tregによる抑制性サイトカイン産生。Tregによる抑制性サイトカイン産生に対する抗体処置の効果を、未処置、対照mAbまたはmAb2-3とCD4+CD25-およびCD4+CD25+ T細胞の培養物から収集された上清においてIL-10およびTGF-βサイトカインのELISA測定を用いて評価した。mAbなしで培養されたT細胞を、IL-10およびTGF-βの検出されるバックグラウンドレベルの対照として使用した。データは、平均±S.D.で表されている。
【図１５】フローサイトメトリーベースのIL-2結合および競合分析。（A)Mac-1細胞を冷PBSで洗浄し、次いで20μg/mlまたは（B）3つの濃度の競合抗体（mAb2-3、抗TACもしくは対照mAb）、100 nMのビオチニル化IL-2およびAPC標識ストレプトアビジンで順に染色した。Mac-1細胞に対するビオチニル化IL-2の結合を、フローサイトメトリーによって検出した。
【図１６】IL-2結合に対するmAb2-3の作用機構。IL-2とCD25の間の相互作用におけるmAb2-3の介在。（A)外因性IL-2の非存在下で、mAb2-3ありまたはなしでインキュベートされた1x104個のCD4+CD25- Teff培養上清中の内因子性IL-2レベルをELISAによって分析した。（B)CD4+CD127dimCD49d- Treg（3000／反応）を、20μg/mlのmAbおよび0.5/1μg/mlのプレートに結合させた抗CD3/28抗体の存在下および非存在下で、0.25 IU/mlの外因性IL-2と共にインキュベートした。バーは、±S.D.を表している。（C)外因性IL-2の非存在下で、1x104個のTeff単独またはTregを伴うものおよび20μg/mlのmAb2-3で処置されたものの内因性IL-2の濃度を示した。バーは、±S.D.を表している。（D)4 IU/mlの外部から添加されたIL-2の存在下で、mAb2-3で処置されたTeffおよびTreg共培養物由来の上清中のIL-2の濃度。バーは、±S.D.を表している。（E)外因性IL-2（20 IU/ml）の存在下で、抗体（mAb2-3または抗CD25、抗TACおよび対照mAbを含む）でまたはそれなしで処置された2x105個のMac-1細胞由来の上清のIL-2濃度をELISAによって検出した。バーは、±S.D.を表している。
【図１７】mAb2-3およびケモカインはMac-1細胞からのCD25の脱落を誘導した。（A）Mac-1細胞を、MMP-9阻害剤の存在下もしくは非存在下でmAb2-3、CCL17もしくはCCL22と共にまたはMMP阻害剤の陰性対照と共にインキュベートした。24時間のインキュベート後、培養上清を収集し、ELISAによって可溶性CD25の濃度を試験した。バーは±S.E.M.を表している。（B)mAb2-3または対照mAbで処置したMac-1細胞の12時間、（C)24時間および（D)48時間培養上清における可溶性CD25の濃度を、ELISAを用いて調査した。図は、pg/mlで表される培養上清中の可溶性CD25濃度を示している。バーは、±S.E.M.を表している。「*」は、スチューデントt検定によるp値＜0.05を示している。
【図１８】mAb2-3はTregからのCD25の脱落を誘導した。Tregを、mAb2-3および対照IgG1と共にインキュベートした。48時間のインキュベート後、培養上清を収集し、ELISAによって可溶性CD25の濃度を試験した。（A)mAb2-3または対照IgG1で処置したTregの48時間培養上清における可溶性CD25（sCD25）の濃度を、ELISAを用いて調査した。示されているデータは、3体の独立したドナーからの平均である。バーは、±S.E.M.を表している。「*」および「**」は、それぞれ、二元配置ANOVAを使用することによるp値＜0.05および0.01を示している。（B)IL-2、mAB2-3 IgG1および対照IgG1の存在下または非存在下で5日間処置された培養Tregにおいて生存色素を測定することによって行われたインビトロ細胞生存アッセイからの結果が示されている。Tregの自然死に対して正規化された、異なるグループのTreg死滅率が、示されている。バーは、±S.E.M.を表している。「*」および「**」は、それぞれ、スチューデントt検定を使用することによるp値＜0.01および0.005を示している。
【図１９】マカクPBMCのCD4+CD25+FoxP3+ T細胞におけるCCR4発現の代表的な表現型分析。新たに単離したPBMCを、CD4、CD25、CCR4および細胞内FoxP3について染色した。CCR4発現を、CD4+CD25+FoxP3+集団において分析した。Tregにおける平均CCR4発現を、3匹の独立したマカクにおいて計算した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、一部、抗CCR4抗体であるmAb2-3が、制御性T細胞（Treg）の走化性を阻害することができ、エフェクターT細胞（Teff）の増殖を回復させることができ、かつCCR4+ Tregを除去することができるという発見に基づいている。
【００２３】
がん免疫療法におけるヒトmAbの1つの重要な役割は、免疫逃避を促進するタンパク質の表面発現および分泌の腫瘍細胞による乗っ取りにより引き起こされる免疫調節不全を好転させるそれらの能力に基づいている。腫瘍微小環境には、抗腫瘍応答を活性化させるかまたは腫瘍の進行を促進するかのいずれかによって腫瘍の免疫監視において矛盾する役割を果たす多くの免疫細胞型が混在して含まれている。これらの中で、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）は、様々な悪性物において局所腫瘍免疫の抑制に決定的な役割を果たすことが示されているCD4+CD25+FoxP3+ Tregである。腫瘍へのTregの動員は、腫瘍細胞および微小環境マクロファージによるCCR4受容体ケモカインCCL22の高レベル分泌を通じて行われる。これらのCCR4＋ Tregは、局所的な抗腫瘍免疫の調節不全および腫瘍成長の増進に好ましい環境を作り出す。さらに、CCR4の腫瘍関連ケモカインは、異なるタイプのがんを有する患者において検出されている。したがって、本明細書に記載されるヒト抗CCR4 mAb免疫療法の標的化アプローチは、がん免疫療法の効果の改善に大きな利益を提供しつつ、同時にその副作用を軽減する。
【００２４】
以下の実施例に詳細に記載されているように、Tregに対するヒト抗CCR4 mAbであるmAb2-3のインビトロおよびインビボ活性を試験した。CD4+CD25+FoxP3+ Tregの約85％がTeffと比較してCCR4を過剰発現し（図1および7）、それらは抑制活性の大部分を担っている。加えて、mAb2-3によるCCR4+ Tregの除去は、Teffの増殖を回復させる（図2）。インビトロ研究は、mAb2-3が、CCL22発現OvCA細胞に対するTregの走化性を阻害できることを示している。OvCA異種移植片を有するヒト化マウスモデルにおいて、mAb2-3は、ヒトTreg機能を調節し、抗腫瘍活性を増強する治療能を示した（図4、5および13）。
【００２５】
mAb2-3 IgG1がインビトロおよびインビボでCCR4発現腫瘍に対して強力な抗体依存細胞傷害（ADCC）および補体依存細胞傷害（CDC）活性を示すことが、以前に示されている（18,42）（その内容の全体が参照により組み入れられるWO2009/086514およびWO2013/166500を参照のこと）。本明細書に提供される実施例において、mAb2-3のIgG1およびIgG4アイソタイプの両方の生物学的機能を試験し、インビトロでCCR4+ Tregの遊走を阻止する同様の能力が示された（図3Bおよび10B）が、インビトロでのそれらの作用機構は異なることが明らかになった。特に、mAb2-3 IgG1は、インビボクリアランス研究によって示されたようなTregの強い免疫除去（図3Dおよび8B)ならびに腫瘍細胞浸潤の減少（図11）を誘導した。OvCA異種移植研究において、mAb2-3 IgG1処置は、腫瘍細胞増殖を顕著に阻害し（図5および13）、2つの動物研究において、マウスは有意な体重減少を示した（図5Dおよび13B）。対照的に、IgG4アイソタイプは、主としてリガンド受容体遮断を通じて作用するようであった（図3、9および11）。インビボ輸送研究は、このアイソタイプがCCL22を分泌するOvCA腫瘍に対するTregの走化性を阻止し、腫瘍細胞浸潤を減少させることを示した（図11）。IgG4アイソタイプはまた、Tregの除去がより緩やかでかつより低い完全性であった（図9G）。最近の報告でIgG4アイソタイプがIgG1と同様のADCP能を有することが示されていることから（43）、TregのIgG4媒介除去において観察されたより緩やかなインビボクリアランスは、異なる作用機構を通じたものであり得る。加えて、mAb2-3 IgG4処置は、より小さい抗腫瘍効果を示したものの、マウスの体重を減少させなかった（図5Dおよび5F）。これらの結果は、2つのmAb2-3アイソタイプがOvCA疾患の異なる段階で固有の役割を有し得、IgG4処置は、腫瘍量が少なく免疫機能不全がより容易に好転するより早期の段階で好ましい役割を有すると考えられることを示した。
【００２６】
加えて、mAb2-3は、CCR4+IL-2R+ Mac-1およびTreg細胞に対するIL-2の結合を阻害することができるが（図6）、IL-2Rサブユニット単独またはトランスフェクトされた293T細胞を用いた組み合わせに対しては交差結合しなかったことが示された。Mac1細胞を用いたとき、mAb2-3処置は、CCR4リガンドCCL22およびCCL17によって共有されている特性である、sCD25の切断を増進した（図18Aおよび図17B〜D）。この共有されている活性は、mAb2-3がアゴニスト活性を有し、CD25切断をもたらす細胞活性化を誘発することを示唆している。CCL22/CCL17結合を通じたCCR4シグナル伝達の研究は、PI(3)キナーゼ/AKT活性化の証拠を示した（25,26）。加えて、CCR4の異なる立体構造は、2つのリガンドに対して異なる応答をすることが報告されており、これはCCL22およびmAb2-3がCCL17よりも強力なsCD25切断の活性化因子であるという我々の証拠によって支持されている特性である（図17A）（44,45）。Tregにおける高レベルのCD25発現は、生存に必要であることが示されているより強いIL-2結合を支援する三量体高親和性IL-2受容体の形成をもたらす（46）。CD25切断の増加は、Tregに対するIL-2結合の親和性を減少させ、放出されたsCD25がTregによるIL-2取り込みの阻止およびそれらの生存性の低下に関与し得ると考えられる（図6A〜F）（47）。
【００２７】
本明細書に示されているデータは、末梢血CD4+CD25+FoxP3+ Tregの約85％が、Teffと比較してCCR4を過剰発現し、それらが抑制活性の大部分を担っていることを実証している。インビトロ研究は、mAb2-3によるCCR4+ Treg除去が、CCL22発現卵巣がん（OvCA）細胞に対するTregの走化性を阻害し、Teffの増殖および抗OvCA免疫を回復させることを実証している。OvCA異種移植片を有するヒト化マウスモデルにおいて、mAb2-3 IgG1およびIgG4の両アイソタイプが、ヒトTreg機能を調節し、抗腫瘍活性を増強する治療能を示した。
【００２８】
本明細書に示されているデータはまた、mAb2-3処置もまたTregによるIL-2の取り込みを阻止し、IL-2を通じた生存を阻害することを実証しており、これが非免疫除去性mAb2-3 IgG4を用いた場合に見られるインビボ抗腫瘍効果において役割を果たしていると考えられる。
【００２９】
mAb2-3のIgG1およびIgG4の両アイソタイプの生物学的機能を試験し、インビトロではCCR4+ Treg遊走を阻止する類似の能力が示されたが、インビボでは異なる作用機構であることが明らかになった。特に、mAb2-3 IgG1は、インビボクリアランス研究によって証明されたTregの強い免疫除去および腫瘍細胞浸潤の減少を誘導した。OvCA異種移植研究において、mAb2-3 IgG1処置は、腫瘍細胞増殖を顕著に阻害し、2匹の動物研究において、マウスは有意な体重減少を示した。対照的に、IgG4アイソタイプは、主としてリガンド・受容体の遮断を通じて作用するようであった。インビボ輸送研究は、このアイソタイプがCCL22を分泌するOvCA腫瘍へのTregの走化性を阻止し、腫瘍細胞浸潤を減少させることを示した。IgG4アイソタイプはまた、Tregの除去がより緩やかかつより低い完全性であった。
【００３０】
処置方法
本発明は、抗CCR4抗体を投与することによる、がんまたは他の疾患もしくは障害のおそれがある（またはその可能性がある）対象を処置する予防的および治療的方法を提供する。そのような疾患または障害は、例えば制御性T細胞を通じた免疫抑制に関連する疾患または障害を含むがこれらに限定されない。制御性T細胞は、Tregおよび／または濾胞性制御性T細胞（TFR）を含む意味を有する。予防剤の投与は、疾患が予防されるあるいはその進行が遅延するよう疾患の発症の前に行われ得る。本発明はさらに、CCR4抗体が抗原と共に含まれるまたは抗原と組み合わせて投与されるワクチン接種方法を提供する。CCR4抗体は、制御性T細胞を除去するおよび／またはエフェクターT細胞の増殖を増進することによって抗原に対する免疫応答を増進するアジュバントとして作用する。
【００３１】
例えば、この方法は、CCR4抗体を細胞と接触させるかまたは対象に投与することによって制御性T細胞（TregおよびもしくはTFR）を除去するためならびにまたはサイトカイン分泌腫瘍への制御性T細胞の遊走（例えば、走化性）を阻害するために使用される。サイトカイン分泌腫瘍は、CCL1、CCL4、CCl5、CCL17および／またはCCL22を分泌する。CCR4抗体が制御性細胞を除去するために使用される場合、この抗体は、好ましくは、IgG1重鎖定常領域を有する。CCR4抗体が制御性T細胞の遊走を阻害するために使用される場合、この抗体は、好ましくは、IgG4重鎖定常領域を有する。
【００３２】
様々な態様において、エフェクターT細胞は、実質的に除去されない。「実質的に除去されない」は、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％以下のエフェクターT細胞が除去されることを意味する。他の態様において、エフェクターT細胞の増殖およびまたは数は増加するかまたは実質的に減少しない。「実質的に減少しない」は、エフェクターT細胞の増殖および／またはが未処置細胞集団との比較で、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％を超えて減少しないことを意味する。
【００３３】
他の態様において、この方法は、エフェクターT細胞の増殖を増加させるために使用される。エフェクターT細胞の増殖は、未処置細胞集団との比較で、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上増加する。
【００３４】
他の態様において、この方法は、腫瘍または対象におけるエフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比を調節する（例えば、増加させる）。比は、1、2、3、4、5倍またはそれ以上増加する。
【００３５】
この方法は、エフェクターT細胞集団からのサイトカイン（例えば、インターフェロン-ガンマ）またはエフェクターポリペプチド（例えば、グランザイムBもしくはパーフォリン）の放出を調節する。調節は、サイトカインまたはエフェクターポリペプチドの放出の増加または減少を意味する。サイトカインまたはエフェクターポリペプチドの放出は、未処置細胞集団との比較で、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上増加または減少する。
【００３６】
別の局面においては、CCR4抗体を細胞と接触させるかまたは対象に投与することによって、腫瘍細胞の増殖が阻害されるかまたは遅延する。例えば、腫瘍は、血液系がん、例えば皮膚T細胞性リンパ腫（CTCL）、菌状息肉腫（MF）、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（皮膚ALCL）、セザリー症候群または成人T細胞白血病／リンパ腫（ATLL）である。
【００３７】
あるいは、腫瘍は、固形腫瘍、例えば腎細胞がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頸がん、脳がん、皮膚がん（例えば、黒色腫）、肝臓がん、膵臓がん、ホジキン病、多形性膠芽腫（GBM）または胃がんである。特定の態様において、がんは、卵巣がんまたは黒色腫である。
【００３８】
腫瘍成長の阻害または遅延は、腫瘍を有する対象の生存を延ばす。生存は、1、2、3、4、5年またはそれ以上延びる。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は、CCR4抗体を制御性T細胞と接触させることにより、CCR4+制御性T細胞に対するIL-2の結合を阻害するまたはCD25切断を誘導する方法を提供する。CD25を通じたIL-2結合の喪失は、制御性T細胞の生存におけるIL-2の依存性から、代謝飢餓をもたらし、それによって制御性T細胞の死滅を誘導する。制御性T細胞の増加は、エフェクターT細胞 対 調節性T細胞の比を増加させる。
【００４０】
いくつかの局面において、上記の方法において使用されるCCR4抗体は、IgG1またはIgG4重鎖定常領域を有する。いくつかの態様において、重鎖定常領域は、1つまたは複数の変異を有する。例えば、IgG4定常領域は、S228P変異を有する。
【００４１】
本発明の特定の態様において、対象には、IgG1重鎖定常領域を有するCCR4抗体およびIgG4重鎖定常領域を有するCCR4抗体の両方が与えられる。あるいは、対象は、疾患段階に依存して、IgG1重鎖定常領域を有するCCR4抗体またはIgG4重鎖定常領域を有するCCR4抗体を受け取るよう選択される。例えば、疾患の早期段階にある患者は、腫瘍量がより少なく免疫機能不全がより容易に好転するので、IgG4重鎖定常領域を有するCCR4抗体による処置を受けるのが有利であり得る。これに対して、患者が後期段階の疾患、例えば高腫瘍量を有する場合、対象はIgG1重鎖定常領域を有するCCR4による処置を受けるのが有利であり得る。
【００４２】
細胞は、CCR4を発現する任意の細胞である。例えば、細胞はT細胞である。T細胞は、制御性T細胞、濾胞性制御性T細胞およびエフェクターT細胞を含む。
【００４３】
CCR4抗体
CCR4抗体は、当技術分野で公知であり、本発明の方法において使用するのに適している。例示的なヒト化CCR4抗体は、例えば、それらの内容の全体が参照により組み入れられるWO2009/086514、WO2013/166500およびPCT/US2015/054202に記載されており、以下で説明されている。好ましいCCR4抗体は、mAb2-3である。本明細書に記載される例示的な抗体は、他のヒト化CCR4抗体、例えばモガムリズマブと比較して有利な特徴を有する。例えば、本発明の例示的な抗体、特にmAb2-3は、N末端ドメインを含む立体構造エピトープおよび生物学的シグナルを媒介する細胞外ループを認識する。これによって、Mac 1細胞およびTregのmAb2-3処置は、sCD25の脱離を促進し、これはCCR4リガンドCCL22およびCCL17と共有している特徴である。したがって、本発明の例示的な抗体、特にMAb2-3は、アゴニスト活性を有し、細胞の活性化を誘発する。加えて、モガムリズマブと異なり、本発明の例示的な抗体、特にmAb2-3は、補体依存細胞傷害性（CDC）を媒介する。これは、補体孔形成を許容する付加角度を実現するFc領域の最適な配向の直接的な結果であり得る。
【００４４】
（表１Ａ）mAb2-3の可変領域核酸配列
2018518465.tif 000013
【００４５】
（表１Ｂ）mAb2-3 IgG4の可変領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000014
【００４６】
（表２Ａ）抗体1-44の可変領域核酸配列
2018518465.tif 000015
【００４７】
（表２Ｂ）抗体1-44の可変領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000016
【００４８】
（表３Ａ）抗体1-49の可変領域核酸配列
2018518465.tif 000017
【００４９】
（表３Ｂ）抗体1-49の可変領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000018
【００５０】
（表４Ａ）抗体2-1の可変領域核酸配列
2018518465.tif 000019
【００５１】
（表４Ｂ）抗体2-1の可変領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000020
【００５２】
（表５Ａ）抗体2-2の可変領域核酸配列
2018518465.tif 000021
【００５３】
（表５Ｂ）抗体2-2の可変領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000022
【００５４】
（表６Ａ）huCCR4の可変領域核酸配列
2018518465.tif 000023
【００５５】
（表６Ｂ）huCCR4の可変領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000024
【００５６】
（表７Ａ）IgG4アイソタイプ領域核酸配列
2018518465.tif 000025
【００５７】
（表７Ｂ）IgG4アイソタイプ領域アミノ酸配列
2018518465.tif 000026
【００５８】
（表８Ａ）安定化されたIgG4コアヒンジを有するIgG4、核酸配列
2018518465.tif 000027
【００５９】
（表８Ｂ）安定化されたIgG4コアヒンジを有するIgG4、アミノ酸配列
2018518465.tif 000028
【００６０】
選択された抗体の重鎖および軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を、以下の表9に示す。
【００６１】
（表９）重鎖および軽鎖のアミノ酸配列
2018518465.tif 000029
【００６２】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な一部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を表す。「〜に特異的に結合する」または「〜と免疫反応する」は、その抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原性決定基と反応し他のポリペプチドと反応しないことを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb（ドメイン抗体）、単鎖、Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメント、scFvおよびFab発現ライブラリを含むがこれらに限定されない。
【００６３】
単鎖Fv（「scFv」）ポリペプチド分子は、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたVHおよびVLをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現され得る、共有結合により連結されたVH::VLヘテロ2量体である（Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883を参照のこと）。自然界では一体となっているが化学的には別々の、抗体V領域由来の軽および重ポリペプチド鎖をscFv分子に変換し、これを抗原結合部位の構造に実質的に類似する3次元構造に折りたたむための化学構造を識別する多くの方法が記載されている。例えば、米国特許第5,091,513号；同第5,132,405号；および同第4,946,778号を参照のこと。
【００６４】
多くの標的分子に対する再構成された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するために、非常に大きなナイーブヒトscFvライブラリが作製されておりかつ作製され得る。よりも小さなライブラリは、疾患特異的な抗体を単離するために、感染疾患を有する個体から構築され得る（Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43(1992); Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)を参照のこと）。
【００６５】
一般に、ヒトから得られる抗体分子は、IgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのクラスのいずれかに関連し、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いと異なっている。特定のクラスはサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4等も有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を表す。抗原結合部位は、重（「H」）および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重および軽鎖のV領域内の3つの高多様性ストレッチが、「フレームワーク領域」または「FR」として公知のより保存されている隣接ストレッチの間に介在している。したがって、「FR」という用語は、自然界において、免疫グロブリンの超可変領域の間にまたは超可変領域に隣接して見られるアミノ酸配列を表す。抗体分子においては、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域が抗原結合表面を形成するよう3次元空間で相互に配置される。この抗原結合表面は、結合する抗原の3次元表面と相補的であり、重および軽鎖の各々の3つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と称される。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、scFvまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、そして通常、特定の3次元構造的特徴および特定の電荷的特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端またはC末端ペプチドに対して惹起され得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的相互作用を表す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、その相互作用の解離定数（Kd）の観点で表され得、より小さなKdはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量され得る。1つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度（rate）の測定を必要とするものであり、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。このようにして、「オンレート定数」（Kon）および「オフレート定数」（Koff）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Koff/Konの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの消去を可能にし、そしてそれは解離定数Kdに等しい（概要について、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の同様のアッセイによって測定される平衡結合定数（Kd）が≦1μM、好ましくは≦100nM、より好ましくは≦10nM、最も好ましくは≦100pM〜約1pMの場合にCCR4エピトープに特異的に結合すると言われる。
【００６８】
本発明のCCR4タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の作製において免疫原として使用され得る。
【００６９】
当業者は、過度の実験を要することなく、ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が後者のCCR4結合を妨げるかどうかを評価することによって決定することができることを理解しているであろう。試験されるヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合、その2つのモノクローナル抗体は同じまたは関係の近いエピトープに結合することが考えられる。
【００７０】
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定する別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を通常それと反応するCCR4タンパク質と共にプレインキュベートし、次いで試験されるヒトモノクローナル抗体を添加して、試験されるヒトモノクローナル抗体がCCR4結合能力に関して阻害されるかどうかを決定することである。試験されるヒトモノクローナル抗体が阻害される場合、それはほぼ確実に本発明のモノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価なエピトープ特異性を有する。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングはまた、CCR4を使用し、試験モノクローナル抗体がCCR4を中和することができるかどうかを決定することによって実施され得る。
【００７１】
当技術分野で公知の様々な手順が、本発明のタンパク質に対するまたはその誘導体、フラグメント、アナログホモログもしくはオルソログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。
【００７２】
抗体は、周知技術、例えば、主として免疫血清のIgGフラクションを提供するプロテインAまたはプロテインGを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。その後にまたはその代わりに、探索対象の免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープが、免疫親和性クロマトグラフィーによって免疫特異的な抗体を精製するためにカラムに固定され得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、D.Wilkinson（The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No.8 (April 17, 2000), pp.25-28）によって議論されている。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「mAb」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる単一分子種である抗体分子を含む抗体分子の集団を表す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、その集団の分子のすべてで同一である。mAbは、それに対する特有の結合親和性によって特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００７４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載される方法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法においては、典型的に、マウス、ハムスターまたはその他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫し、その免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球が生成される。あるいは、リンパ球が、インビトロで免疫され得る。
【００７５】
免疫剤は、典型的には、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含む。通常、ヒト起源の細胞が望まれる場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾細胞もしくはリンパ節が使用されるかのいずれかである。リンパ球は、次いで、適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含む適当な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（「HAT培地」）。
【００７６】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支援し、そして培地、例えばHAT培地に対する感受性を有するものである。より好ましい不死化細胞株は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CaliforniaおよびAmerican Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手できるマウス骨髄腫株である。ヒトモノクローナル抗体の産生に関しては、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp.51-63を参照のこと）。
【００７７】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地は、その後、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によってまたはインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（RIA）もしくは酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）によって決定される。そのような技術およびアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のScatchard分析によって決定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療適用においては、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【００７８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンが限外希釈手順によってサブクローニングされ、そして標準的な方法によって生育され得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103を参照のこと）。この目的に適した培養培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびRPMI-1640培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水としてインビボで生育され得る。
【００７９】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来的な免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーによって培養培地または腹水液から単離または精製され得る。
【００８０】
モノクローナル抗体はまた、組み換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載される方法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源となる。単離後、DNAは発現ベクターに入れられ、次いでこれがそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、その組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体が合成される。DNAはまた、例えば、ヒト重および軽鎖定常ドメインのコード配列をそれと相同なマウス配列と置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照のこと）または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合により接続することによって、修飾され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得、またはキメラ2価抗体を作製するために本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され得る。
【００８１】
完全ヒト抗体は、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から得られたものである抗体分子である。そのような抗体は、本明細書で、「ヒト化抗体」、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を製造するEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96を参照のこと）を使用して調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cole, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照のこと）またはインビトロでヒトB細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96を参照のこと）使用され得、製造され得る。
【００８２】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含むさらなる技術を用いて製造され得る（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)を参照のこと）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって作製され得る。チャレンジの後、遺伝子の再構成、構築および抗体レパートリーを含むすべての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号およびMarks et al., Bio/Technology, 10, 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００８３】
ヒト抗体は、加えて、抗原によるチャレンジに応じてその動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するよう修飾されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて製造され得る（PCT公開WO94/02602を参照のこと）。非ヒト宿主の重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は無力化され、ヒト重および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。その後、望まれる修飾のすべてを提供する動物が、修飾の補完性が完全でない中間トランスジェニック動物を交雑することにより子孫として取得される。そのような非ヒト動物の好ましい態様はマウスであり、PCT公開WO 96/33735およびWO 96/34096に開示されるようにXenomouse（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するB細胞を産生する。抗体は、関心対象の免疫原を用いた免疫後に動物から直接的に、例えばポリクローナル抗体調製物として、あるいはその動物由来の不死化B細胞、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、入手され得る。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子が、抗体を直接入手するために回収および発現され得、または抗体のアナログ、例えば単鎖Fv（scFv）分子を入手するためにさらに修飾され得る。
【００８４】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠失している、マウスとして例示される、非ヒト宿主を作製する方法の例は、米国特許第5,939,598号に開示されている。それは、胚性幹細胞の少なくとも1つの内因性重鎖遺伝子座からJセグメント遺伝子を除去してその遺伝子座の再構成を防止するおよび再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する方法、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的指向ベクターにより欠失を行う方法；ならびにその体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から作製する方法、を含む方法によって入手され得る。
【００８５】
関心対象の抗体、例えばヒト抗体を作製する1つの方法は、米国特許第5,916,771号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養下の1つの哺乳動物宿主細胞に導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入し、そして2つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成することを含む。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【００８６】
この手順のさらなる改善として、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法および該関連エピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する関連法が、PCT公開WO 99/53049に開示されている。
【００８７】
抗体は、上記の単鎖抗体をコードするDNAセグメントを含むベクターによって発現され得る。
【００８８】
これらは、ベクター、リポソーム、ネイキッドDNA、アジュバントアシストDNA、遺伝子銃、カテーテル等を含み得る。ベクターは、化学コンジュゲート体、例えば標的指向部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）を有するWO 93/64701に記載されるもの、ウイルスベクター（例えば、DNAまたはRNAウイルスベクター）、融合タンパク質、例えば標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質であるPCT/US 95/02140（WO 95/22618）に記載されるもの、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは、染色体、非染色体または合成であり得る。
【００８９】
好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学コンジュゲート体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。DNAウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、ポックスベクター、例えばオルソポックスまたは鳥ポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えば単純ヘルペスIウイルス（HSV）ベクター（Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed (Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)を参照のこと）、アデノウイルスベクター（LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)を参照のこと）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M.G. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)を参照のこと）を含む。
【００９０】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。鳥ポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターは、神経細胞への核酸の導入に好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約4ヶ月）よりも短期間の発現（約2ヶ月）をもたらし、これはHSVベクターよりも短い。選択される個々のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存すると考えられる。導入は、標準的技術、例えば感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によるものであり得る。遺伝子移入の様式の例は、例えば、ネイキッドDNA、CaPO4沈降、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクションおよびウイルスベクターを含む。
【００９１】
ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために使用され得る。例えば、定位注射が、ベクター（例えば、アデノウイルス、HSV）を所望の場所に送るために使用され得る。加えて、粒子は、ミニポンプ注入システム、例えばSynchroMed Infusion Systemを用いる脳室内（icv）注入によって送達され得る。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法も、大型の分子を脳の広い領域に送達するのに効果的であることが証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用であり得る（Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照のこと）。使用することができる他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口またはその他の公知の投与経路を含む。
【００９２】
これらのベクターは、様々な目的で、例えばサンプルにおけるCCR4の存在を検出するために使用され得る抗体を多量に発現させるために使用され得る。抗体はまた、CCR4に結合しCCR4活性を妨害する試みを行うために使用され得る。
【００９３】
技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の製造のために適合させることができる（例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと）。加えて、方法は、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの高速かつ効率的な同定を可能にするFab発現ライブラリの構築のために適合させることができる（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281を参照のこと）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、（i）抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2フラグメント；（ii）F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるFabフラグメント；（iii）パパインおよび還元剤による抗体分子の処置によって生成されるFabフラグメント；ならびに（iv）Fvフラグメントを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の技術によって作製され得る。
【００９４】
ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合により接続された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的指向させるため（米国特許第4,676,980号を参照のこと）およびHIV感染の処置のため（WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089を参照のこと）に提案されている。抗体が、架橋剤を利用するものを含む合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製され得ることも想定されている。例えば、免疫毒素が、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示されるものを含む。ヘテロコンジュゲート抗体はまた二重特異性抗体であり得、二重特異性抗体は、例えば、2つの共有結合した単鎖抗体、またはscFv、または異なる抗原を認識する2つの抗体由来の、2つの共有結合した可変重鎖-可変軽鎖二量体である。
【００９５】
本発明の抗体を、例えばがんの処置における該抗体の効果を増強するために、エフェクター機能に関して修飾することが望ましいことがある。例えば、システイン残基がFc領域に導入され、それによってこの領域に鎖間ジスルフィド結合が形成され得る。そのようにして作製されるホモ2量体抗体は、改善されたインターナライゼーション能力ならびに／または増大した補体媒介細胞殺傷性および抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を有し得る（Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと）。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するよう、そしてそれによって増強された補体溶解およびADCC能力を有し得るよう改造され得る（Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)を参照のこと）。
【００９６】
本発明はまた、細胞傷害剤、例えば毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性を有する毒素またはそのフラグメント）または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート体）にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲート体に関する。
【００９７】
使用することができる酵素活性を有する毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害物質、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体の作製に利用可能である。例は、212Bi、131I、131In、90Yおよび186Reを含む。
【００９８】
抗体および細胞傷害剤のコンジュゲート体は、様々な2官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの2官能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートHCL）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン2,6-ジイソシアネート（tolyene 2,6-diisocyanate））、および二活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるようにして調製され得る。炭素14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションにおける例示的なキレート剤である（WO94/11026を参照のこと）。
【００９９】
当業者は、本発明の得られる抗体または他の分子に非常に多様な候補部分をカップリングさせることができることを理解しているであろう（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと）。
【０１００】
カップリングは、抗体および他の部分がそれら各々の活性を保持する限リ、2つの分子を結合させる任意の化学反応によって達成され得る。この連結は、多くの化学メカニズム、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および錯体化を含み得る。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的縮合によってまたは外部架橋分子の組み込みによってのいずれかによって達成され得る。多くの2価または多価連結剤が、タンパク質分子、例えば本発明の抗体、の他の分子へのカップリングに有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンを含み得る。このリストは、当技術分野で公知の様々なクラスのカップリング剤を網羅することを意図したものではなく、より一般的なカップリング剤の例示にすぎない（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); およびVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。好ましいリンカーは、文献に記載されている（例えば、MBS（M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載するRamakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。オリゴペプチドリンカーによって抗体にカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載する米国特許第5,030,719号も参照のこと。特に好ましいリンカーは：（i）EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミドヒドロクロリド）；（ii）SMPT（4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル（pridyl）-ジチオ)-トルエン）（Pierce Chem. Co., Cat.(21558G)）；（iii）SPDP（スクシンイミジル-6[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem. Co., Cat #21651G）；（iv）スルホ-LC-SPDP（スルホスクシンイミジル 6 [3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem. Co., Cat. #2165-G）；および（v）EDCにコンジュゲートされたスルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド：Pierce Chem. Co., Cat. #24510）を含む。
【０１０１】
上記のリンカーは、異なる特質を有する要素を含み、それによって生理化学的特性が異なるコンジュゲートが生成される。例えば、アルキルカルボン酸のスルホ-NHSエステルは、芳香族カルボン酸のスルホ-NHSエステルよりも安定である。NHS-エステル含有リンカーは、スルホ-NHSエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーSMPTは、立体的に妨げられたジスルフィド結合を含み、高い安定性のコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド連結は、一般に、インビトロで切断されるため他の連結よりも安定性が低く、コンジュゲートの利用性を低下させるものである。スルホ-NHSは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強し得る。カルボジイミドカップリング（例えば、EDC）は、スルホ-NHSと組み合わせて使用される場合、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対する抵抗性が高いエステルを形成する。
【０１０２】
いくつかの態様において、変異は、mAbの抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ADCC）活性が変化するようmAbの定常領域に導入される。例えば、変異は、CH2ドメイン内のLALA変異であり、Fc領域の234位および235位のロイシンをアラニンに変異させ、特異的Fc受容体による結合を排除する。ある態様において、mAbは、ヘテロ二量体mAbの一方のscFv分子に、ADCC活性を減少させる変異を含む。別の局面において、mAbは、ヘテロ二量体mAbの両方の鎖に、ADCC活性を完全に除去する変異を含む。例えば、mAbの一方または両方のscFv分子に導入される変異は、CH2ドメイン内のLALA変異である。様々なADCC活性を有するこれらのmAbは、そのmAbによって認識される1つの抗原を発現する細胞に対して最大の選択的殺傷性を示すが、そのmAbによって認識される第2の抗原に対しては最小限の殺傷性を示すように最適化され得る。
【０１０３】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。該抗体を含むリポソームは、当技術分野で公知の方法、例えばEsptein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；ならびに米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載される方法、によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１０４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するよう定義された孔サイズのフィルターを通じて押出される。本発明の抗体のFab'フラグメントは、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるようにジスルフィド交換反応を通じてリポソームにコンジュゲートされ得る。
【０１０５】
薬学的組成物
CCR抗体（本明細書で「活性化合物」とも称される）およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的に、該抗体または剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤等を含むことが意図されている。適当な担体は、参照により本明細書に組み入れられる、この分野の標準的参考文献であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および5％ヒト血清アルブミンを含むがこれらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来的な媒体または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、該組成物におけるその使用が想定されている。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、意図されている投与経路に適合するよう処方される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下適用で使用される溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および浸透圧調節剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに収納され得る。
【０１０７】
注射用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌注射溶液または分散物を即時準備するための滅菌粉末を含む。静脈内投与に適した担体は、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射容易性（easy syringeability）が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の混入行動に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によっておよび表面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の行動の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０１０８】
注射可能な滅菌溶液は、上記の成分の1つまたは組み合わせを含む適当な溶媒に必要量の活性化合物を添加し、必要な場合、その後に濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒および上記のうちの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を添加することによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０９】
経口組成物は、通常、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに収容されるかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物は賦形剤と共に添加され、そして錠剤、トローチまたはカプセルの形式で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄液として使用するために流体担体を用いて調製され得、この場合、流体担体中の化合物が経口的に適用され、そしてうがいされ吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質が、組成物の一部分として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれかまたは類似の性質を有する化合物を含み得る：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelもしくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸塩（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバー。
【０１１０】
吸入による投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからのエアゾール噴霧の形式で送達される。
【０１１１】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、透過したい障壁に適した浸透剤が製剤で使用される。そのような浸透剤は、一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐薬の使用を通じて達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、一般に当技術分野で公知のように軟膏、サルヴェ（salve）、ゲルまたはクリームにより処方され得る。
【０１１２】
化合物はまた、直腸送達のために（例えば、従来的な坐薬基剤、例えばココアバターおよびその他のグリセリドを含む）坐薬または停留浣腸剤の形式で調製され得る。
【０１１３】
1つの態様において、活性化合物は、体内からの迅速な排除から該化合物を保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む制御放出製剤、を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。これらの物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞に標的指向化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に活性な担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法にしたがい、例えば米国特許第4,522,811号に記載されるようにして調製され得る。
【０１１４】
投与の容易さおよび用量の均一さのために経口または非経口組成物を単位剤形で処方することが特に有益である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に対する単回の投薬に適した物理的に隔離されている単位であって；各単位が、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生ずるよう計算された既定量の活性化合物を含むものを表す。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成したい特定の治療効果ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物の配合の分野に特有の制約により決定づけられ、かつそれらに直接的に依存する。
【０１１５】
薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、袋またはディスペンサーに含まれ得る。
【０１１６】
二重特異性抗体
二重特異性抗体（bsAb）は、得られる抗体が2つの異なる抗原を認識するよう2つの可変ドメインまたはscFvユニットを含む抗体である。本発明は、CCR4および第2の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。例示的な第2の抗原は、腫瘍関連抗原、サイトカイン、およびT細胞受容体ポリペプチドなどの細胞表面受容体を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、CAIX（炭酸脱水酵素IX、またはG250）、ErbB2、PD-L1、CTLA-4、PD1、IL21、IL21R、HVEM、CD160、TIM3、CD3、またはGAL9であり得る。
【０１１７】
本発明の二重特異性抗体は、本明細書に開示されるCCR4抗体の重鎖および軽鎖の組み合わせまたはscFvを含む。
【０１１８】
本発明の二重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて構築され得る。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、各々異なる抗原を認識する2つの異なる重-軽鎖ヘテロ二量体もしくは2つの異なるscFv抗体またはそのフラグメントが、2つの重鎖および2つの軽鎖を有する二重特異性抗体を形成するよう2つのscFv分子間の分子内会合を実現するのに十分な長さの長いリンカーポリペプチドにより接続されている単一ポリペプチドである。1つの態様において、scFv分子の一方はCCR4を認識する、例えば本明細書に記載されるscFv抗体のいずれかである。他の態様において、二重特異性抗体は、共有または非共有結合により連結された2つ以上のポリペプチド、例えば、2つの別個のscFv抗体またはそのフラグメントからなり、scFv抗体の1つがCCR4を認識する。
【０１１９】
ある態様において、二重特異性抗体は、「ノブ・イントゥー・ホール（knob into hole）」法を用いて構築される（Ridgway et al., Protein Eng 7:617-621 (1996)）。この方法では、2つの異なる可変ドメインのIg重鎖が、重-軽鎖対を維持しつつ重鎖対を選択的に開裂するよう還元される。2つの異なる抗原を認識する2つの重-軽鎖ヘテロ2量体は、CH3ドメインの人工「ノブ・イントゥー・ホール」を介したヘテロライゲーション対形成が行われるよう混合される。
【０１２０】
別の態様において、二重特異性抗体は、2つまたはそれ以上の異なる抗体由来の重-軽鎖ヘテロ2量体の交換により、第1の重-軽鎖ヘテロ2量体がCCR4を認識し第2の重-軽鎖ヘテロ2量体が第2の抗原を認識するハイブリッド抗体を生成することによって構築され得る。2つの異なる抗体由来の2つの重-軽鎖ヘテロ2量体からなる二重特異性抗体を形成するためのメカニズムは、これも二重特異性分子として機能するヒトIgG4の形成に類似するものである。IgG重鎖の2量体化は、分子内力、例えば各重鎖のCH3ドメインの対形成およびジスルフィド架橋によってもたらされる。CH3ドメインにおける特定アミノ酸（R409）の存在は、2量体交換およびIgG4分子の構築を促進することが示されている。重鎖対はまた、抗体のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋によってさらに安定化される。特に、IgG4では、ヒンジ領域が、アミノ酸226〜230に（配列Cys-Pro-Pro-Cysを含む安定なIgG1のヒンジ領域に対して）アミノ酸配列Cys-Pro-Ser-Cysを含んでいる。この229位のセリンの配列の違いは、IgG4がそのヒンジ領域において新たな鎖内ジスルフィドを形成する傾向と関連付けられている（Van der Neut Kolfschoten, M. et al., 2007, Science 317:1554-1557およびLabrijn, A.F. et al, 2011, Journal of immunol 187:3238-3246）。
【０１２１】
別の態様において、グルタチオンおよびグルタチオンジスルフィドの使用が、2つの別個の完全抗体から二重特異性抗体を作製する際に使用され得る。例えば、各々が異なる抗原を認識する完全抗体が、その抗体を重-軽鎖ヘテロ二量体または分子に分離させる還元性グルタチオンと共にインキュベートされる。この重-軽鎖ヘテロ二量体は、酸化型グルタチオン（GSSG）と混合され得、それによって極めて純粋な二重特異性抗体が形成されるよう再構築および再酸化される。
【０１２２】
したがって、本発明の二重特異性抗体は、重-軽鎖二量体交換により、CCR4を認識する1つの重-軽鎖二量体および本明細書に開示される任意の抗原である第2の抗原を認識する第2の重-軽鎖二量体を有する抗体分子が生成されるよう、CH3ドメインにおけるR409残基の導入およびCCR4または第2の抗原を認識する抗体のヒンジ領域におけるCys-Pro-Ser-Cys配列の導入を通じて作製され得る。重-軽鎖ヘテロ二量体交換はまた、還元剤、例えば還元型グルタチオンの添加によって交換を促進することによって促進され得る。既知のIgG4分子もまた、本明細書に開示されるように、重および軽鎖がCCR4または第2の抗原を認識するよう変更され得る。本発明の二重特異性抗体の構築におけるこの方法の使用は、そのFc領域が、免疫応答のエフェクター系、例えば補体および特定の白血球細胞によって発現されるFc受容体とほとんど相互作用しない点で他のIgGサブタイプと相違するというIgG4分子の固有の特徴のために有益であり得る。この特定の性質は、これらのIgG4ベースの二重特異性抗体を、抗体が標的に結合しその標的に関連するシグナル伝達経路を機能的に変更することを必要とするがエフェクター活性を誘発することは必要としない治療適用において魅力的なものにしている。
【０１２３】
いくつかの態様において、bsAbの抗体依存細胞媒介細胞傷害（ADCC）活性が変化するよう、bsAbの定常領域に変異が導入される。例えば、変異は、Fc領域の234および235位のロイシンがアラニンに変異し特定のFc受容体が結合しないようにするCH2ドメインにおけるLALA変異である。1つの局面において、bsAbは、ヘテロ二量体bsAbの一方のscFv分子上に、ADCC活性を減少させる変異を含む。別の局面において、bsAbは、ヘテロ二量体bsAbの両方の鎖上に、ADCC活性を完全になくす変異を含む。例えば、bsAbの一方または両方のscFv分子に導入される変異は、CH2ドメインにおけるLALA変異である。多様なADCC活性を有するこれらのbsAbは、bsAbがそのbsAbにより認識される1つの抗原を発現する細胞に対して最大限の選択的殺傷性を示すが、そのbsAbにより認識される第2の抗原に対しては最小限の殺傷性を示すよう、最適化され得る。
【０１２４】
本発明は、CCRおよび第2の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。1つの態様において、第2の抗原はPD-L1である。別の態様において、第2の抗原はCAIXである。他の態様において、第2の抗原は、CA-IX、ErbB2、PD-L1、PD1、CD3、IL21、IL21R、HVEM、CD160、TIM3、GITR、LAG3およびGAL9である。
【０１２５】
本明細書に開示される二重特異性抗体は、疾患または医学的状態、例えばがんの処置に有用であり得る。がんは、例えば、固形がん、例えば腎細胞がん、乳がんまたは前立腺がんである。他の態様において、がんは、がんを有さない組織または対象と比較してCAIX、PD-L1またはHVEMが過剰発現されるがんである。本発明の二重特異性抗体は、がんの症状を処置、予防または軽減するために使用され得る。
【０１２６】
本発明の二重特異性抗体は、T細胞増殖を増加させるために使用され得、ここでT細胞は制御性T細胞である。本発明の二重特異性抗体は、T細胞応答、例えば抗原特異的T細胞応答を促進または増進するために特に有用であり得る。本発明の二重特異性抗体はまた、エフェクターT細胞増殖の制御性T細胞を通じた抑制を打ち消すために有用であり得る。
【０１２７】
融合タンパク質
いくつかの態様において、本明細書に開示されるCCR4-IgG4抗体またはその機能的フラグメントは、第2のタンパク質に直接的に接続される。他の態様において、CCR4-IgG4抗体またはその機能的フラグメントは、リンカー、例えばフレキシブルなポリペプチド鎖を介して第2のタンパク質に接続される。リンカーは、任意の長さの任意の適当なリンカーであり得るが、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25または30アミノ酸長であり得る。1つの態様において、リンカーは、そのリンカーの存在が哺乳動物によるリンカー配列に対する免疫応答を生じないよう宿主の免疫グロブリン分子中に天然に存在するアミノ酸配列である。CCR4抗体に対する2つ以上の追加のタンパク質を含む本発明の融合タンパク質は、各々の追加のタンパク質またはペプチド配列を接続する複数のリンカー配列を有し得る。
【０１２８】
本発明の融合タンパク質は、当業者に公知の組み換え法によって構築され得る。例えば、本発明のCCR4抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、第2のタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結され得、そしてその融合タンパク質を翻訳および産生する発現システムに導入され得る。あるいは、当業者は、本明細書に記載される融合タンパク質を製造するためにデノボタンパク質合成技術を容易に利用することができるであろう。
【０１２９】
併用方法
本発明は、CCR4タンパク質の同一のエピトープあるいはCCR4タンパク質の2つの異なるエピトープに結合する2つの抗体を投与することによる患者におけるがんの処置を提供する。また、がんは、CCR4に結合する第1の抗体およびCCR4以外のタンパク質に結合する第2の抗体を投与することによって処置される。
【０１３０】
加えて、本発明は、CCR4タンパク質に結合する抗体および抗新生物剤、例えば低分子、成長因子、サイトカインまたは生体分子、例えばペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ポリヌクレオチド、脂質由来メディエーター、低分子生体アミン、ホルモン、神経ペプチドおよびプロテアーゼを含むその他の治療剤の投与を提供する。低分子は、無機分子および有機低分子を含むがこれらに限定されない。適当な成長因子またはサイトカインは、IL-2、GM-CSF、IL-12およびTNF-アルファを含む。低分子ライブラリは、当技術分野で公知である（Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997を参照のこと）。
【０１３１】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬ならびに実施例に限定されない。本明細書で使用される用語および例は、個々の態様を説明する目的しか有さず、当業者に手引きを提供する意図および目的を有するものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１３２】
実施例1  一般的方法
T細胞表面上の分子密度の決定
T細胞を、データシートで推奨されている濃度のPacBlue-抗CD3、BV570-抗CD4、APC-抗CD25、PE-Cy7-抗CD127、PE-Cy5-抗CD45RA、PerCP-Cy5.5-CCR7およびPE-抗CCR4 mAbと共にインキュベートした。細胞を、100μlのFACS緩衝液（5 mM EDTAおよび1％BSAを補充したPBS）中、4℃で30分間染色した。T細胞を、CDマーカーにしたがい異なるT細胞サブセットにゲートし、PE蛍光強度について分析した。蛍光強度を、標準較正BD QuantiBRITE PEビーズ（BD Biosciences, San Jose, CA）と比較して細胞あたりの総分子数／ビーズを決定し、これを細胞／ビーズ表面積で割り、部位密度を得た。
【０１３３】
Treg抑制アッセイ
CD4+CD25- T細胞を、5μMの濃度のCFSE（BioLegend, San Diego, CA）で標識し、96ウェルプレートにおいて、それぞれT細胞増殖の陽性および陰性対照としての20μg/mlのフィトヘマグルチニン（PHA, Sigma, St.Louis, MO）の存在下および非存在下、5x104細胞／ウェルで培養した。CD4+およびCD4+CCR4- Tregを、Treg Enrichment Kit（StemCell, Vancouver, Canada）およびmAb2-3結合Dynabeads M-280（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて単離した。5x103個のCD4+およびCD4+CCR4- Tregを個別にCFSE標識CD4+CD25- T細胞と共に37℃で7日間インキュベートした。CFSE標識T細胞の増殖を測定するため、共培養された細胞を、Viability Dye eFluor 506（eBioscience, San Diego, CA）で染色し、次いで生きているCFSE+細胞を、フローサイトメトリーを用いてゲートし分析した。
【０１３４】
生存アッセイのために、CD4+CD127dim/-CD49d Tregを、Treg Cell Enrichment Kitを用いてPBMCから単離した。1x105個のTregを、0.5 IU/mlのIL-2、20μg/mlのmAb2-3 IgG1および20μg/mlの対照IgG1の個々または組み合わせと共に培養し、37℃で5日間インキュベートした。次いで細胞を、Viability Dye（eBioscience）で染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１３５】
細胞
OvCA細胞株、IGROV-1、OVCAR-5およびOVCAR-8を、37℃、5％CO2含有大気下でインキュベートした。OVCAR-5およびOVCAR-8を、10％ウシ胎仔血清（FBS）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies）を補充したRPMI-1640（Life Technologies）中で培養した。IGROV-1を、10％FBSおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Life Technologies）中で培養した。ルシフェラーゼ発現IGROV-1およびT細胞に、ルシフェラーゼレポーターレトロウイルスを安定的に形質導入し、発光を検出することによってこれを確認した。著者らはこれらの細胞株の追加の確認を行わなかった。
【０１３６】
動物
6〜8週齢のメスNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）をこの研究で使用した。2x106個または5x106個のルシフェラーゼ発現IGROV-1細胞を、NSGマウスの背面脇に皮下（s.c.）注射し、それぞれ1または3日間インキュベートした。次いで、マウスを無作為に異なるグループに割り当て、i.v.注射によってIGROV-1プライムT細胞（4x106個または1x107個）ならびに3 mg/kgのmAb2-3 IgG1、mAb2-3 IgG4および対照mAb（5週の間、週に2回）で処置した。体重および腫瘍サイズを、電子カリパスおよびXenogen画像化を用いて測定した。腫瘍体積を、「長さx(幅)2x0.52」として算出した。動物の世話は、Animal Care and Use Committee of Dana-Farber Cancer Institute（Boston, MA）のガイドラインにしたがい行った。
【０１３７】
走化性
T細胞（1x106細胞／ウェル）を、mAb2-3と共にまたはそれを伴わずに37℃で5時間、トランスウェル遊走ウェル（Corning, Tewksbury, MA）上に静置した。遊走した細胞を、OvCA細胞培養培地または100 ng/mLのヒトCCL22（R&D Systems）を含む下部チャンバーから収集し、FACS分析によって計数した。OvCA細胞培養培地は、IGROV-1、OVCAR-5およびOVCAR-8培養培地（1x106細胞/ml）の上清から収集した。T細胞の遊走を、培養物またはCCL22補充培地に対する相対比率として計算した。
【０１３８】
腫瘍プライムT（TP-T）細胞の樹立
PBMC（2x106/ml）を、組み換えIL-2（30 IU/ml）およびIL-7（5 ng/ml）を含む完全培地中で、自己IGROV-1パルス樹状細胞（DC、2x105/ml）と共にインキュベートした。細胞を、37℃の5％CO2インキュベーターにおいて、50ml組織培養フラスコ中でインキュベートした。PBMCを、2週ごとに、溶解産物でパルスした自己DCで再刺激し、その培養物に、5日ごとに、組み換えIL-2およびIL-7を含む新しい培地を供給した。3〜4サイクルの抗原刺激および選択の後、TP-T細胞が樹立し、細胞を、組み換えIL-2およびIL-7を含む完全培地中で2週間増殖させ、機能試験に供した。
【０１３９】
サイトカイン産生の分析
TP-T細胞（1x105）を、完全培地中、37℃で、自己IGROV-1パルスDC（2x104）、未パルスDC（2x104）またはDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies）と共にインキュベートした。48時間のインキュベート後、上清を収集し、IFN-γを、Human IFN-γ Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）およびMeso Scale Discovery Sector Imager 2400（MSD, Rockville, MD）を用いて検出した。さらに、CCR4+ TP-T細胞を除去するために、TP-T細胞を、mAb2-3結合ビーズと共にインキュベートした。TP-TまたはCCR4- TP-T細胞（1x105）を、完全培地中、20μg/mlのmAb2-3 IgG1またはIgG4の存在下または非存在下で、IGROV-1（1x104）と共にインキュベートした。24および48時間のインキュベート後、TP-T細胞によるIFN-γ産生を、MSDおよび細胞内FACS分析によって評価した。
【０１４０】
上清のサイトカイン、IL-2およびsCD25の検出
細胞培養上清において、サイトカインおよび可溶性CD25を、IL-2、IL-10およびTGF-β用のELISA Ready-SET-Go! Kit（eBioscience）ならびにHuman IL-2 sRα ELISA Set（BD Biosciences）を製造元の指示にしたがい用いて検出した。サンプルを、RPMI-1640培地で希釈した（必要な場合）。IL-10およびTGF-βの場合、自己CD4+CD25-およびCD4+CD25+ T細胞（1:1）を、抗CD3/28（1/0.5μg/ml）コーティングされたプレートにおいて、20μg/mlの抗体の存在下または非存在下、10％ FBS RPMI-1640培地中で培養した。IL-2の場合、TeffおよびTregの単独または共培養物を、外因性IL-2または抗体の存在下または非存在下、10％FBS RPMI-1640培地中でインキュベートした。外因性IL-2（20 IU/ml）の存在下で、2x105個のMac-1細胞を、抗体（mAb2-3または抗CD25、抗TACおよび対照mAbを含む）と共にまたはそれを伴わずにインキュベートした。競合アッセイのために、Mac-1細胞を、異なる濃度の抗体の存在下または非存在下で、ビオチニル化IL-2を用いて染色し、次いでFACSによって検出した。sCD25研究のために、Mac-1細胞を、MMP-9阻害剤（CAS 1177749-58-4）またはCalbiochem製の陰性対照であるGM6001（EMD Biosciences, San Diego, CA）の存在下および非存在下で、mAb2-3、CCL17またはCCL22と共にインキュベートした。細胞を、12、24および48時間インキュベートし、その後に培養上清をELISA用に収集した。
【０１４１】
統計学的分析
インビトロおよびインビボ実験において、データを、それぞれ、両側、対応のないスチューデントt検定および二元配置ANOVAを用いて分析した。*、**および***は、それぞれ、P値＜0.05、0.01および0.005を示している。
【０１４２】
実施例2：ヒトT細胞集団におけるCCR4発現プロフィール
T細胞の部分集団を区別するために、ヒト末梢血単核細胞（hPBMC）を、健常なドナーから単離し、複数のT細胞表面マーカーを用いて染色した（図1A)。細胞マーカー（CD3、CD4、CD25およびCD127）を用いて、CD4+CD25highCD127dim/- TregおよびCD4+CD25-CD127+ Teffを同定した。加えて、抗CCR7および抗CD45RA抗体を用いて、Teffを4つのサブセット、すなわち、ナイーブ（Tnaive）、セントラルメモリー（Tcm）、エフェクターメモリー（Tem）および他のTeff集団（oTeff）に割り当てた。hPBMCからの各CD4+ T細胞サブセットの比率を測定した（図1B)。CD4+ T細胞サブセットのCCR4発現プロフィールをさらに、フローサイトメトリーを用いてQuantiBRITE PEビーズおよびPE標識抗CCR4抗体によってスクリーニングおよび定量した（図1C、7AおよびS1B）。CCR4分子は、Teff（8063±165、n=3）よりも約2.5倍高い表面密度（19,717±1416、n=3）で（図1E）、Tregにおいて均一に発現していた（図1D）。TeffにおけるCCR4発現はばらつきがあったものの（4〜40％）（図1D）、同程度の数のCCR4分子が、CCR4陽性細胞上に存在した（図7C)。
【０１４３】
実施例3：Teff細胞増殖に対するCCR4+ Tregの免疫抑制能
CCR4+ Tregが免疫抑制を媒介するかどうかを評価するため、CCR4染色を、CD25およびFoxP3同時染色と合わせて行った。図2Aにおいて、CD3+、CD4+、CD25+およびFoxP3+ T細胞ゲート内の細胞の85％が、CCR4を共発現することが見出された。次にTreg抑制アッセイを行い、CCR4+ Tregの生物学的機能を決定した。図2Bおよび2Cに示されているように、Teff増殖は、総Tregとの共培養下で抑制されたが、CCR4- Tregとの共培養下では抑制されず、これによりCCR4+ Tregサブセットが抑制活性において重要な役割を果たしていることが示唆された。
【０１４４】
実施例4：huPBL-NSGマウスにおけるmAb2-3 IgG1によるTregのインビボ除去
mAb2-3処置がインビボでTreg集団を調節し得るかどうかを調査するため、mAb2-3の2つのアイソタイプである、IgG1ならびにその狭い範囲およびFcγ受容体（FcγR）に対する低い親和性のためにインビボ除去活性が限定的である（20）IgG4アイソタイプを使用した。これらの抗体を、ヒト末梢血リンパ球NSGマウス（aka huPBL-NSGマウス）に注射し、マウス血液におけるTregの比率を試験した。図8Aに示されるように、処置後第1日に、CD4+CD25+CD127dim/- Treg集団が、mAb2-3 IgG1グループにおいて顕著に減少したが、予想された通り、mAb2-3 IgG4または対照mAb処置グループでは減少しなかった（図8Bおよび8C)。第7日に、mAb2-3 IgG4および対照mAb処置グループと比較してmAb2-3処置マウスにおいて＜50％のTreg回復が見られた。hu-PBL-NSGマウスにおけるmAb2-3 IgG4複数回処置の長期効果も調査した。図9は、マウス血液、脾臓および骨髄におけるヒトCD45+リンパ球中のCD3+CD4+CD25+CD127-細胞の比率が3週間の研究の間有意に変化しなかったことを示している。興味深いことに、CD3+ T細胞およびCD8+ T細胞の総数は、最終時点で、mAb2-3 IgG4で処置したマウスにおいて増加した（それぞれ、図9CおよびE）。これらの結果は、mAb2-3 IgG4ではなくIgG1がTregのインビボ除去をもたらすことを示している。
【０１４５】
実施例5：インビトロおよびインビボでのmAb2-3によるOvCAを通じたTreg遊走の阻害
3つのOvCA細胞株IGROV-1、OVCAR-5およびOVCAR-8におけるCCL22発現レベルを試験した。転写プロファイリング研究（データ示さず）と同様、CCL22発現は、IGROV-1で最も高く、OVCAR-5で中間であり、OVCAR-8細胞で検出不可能であった（図3A)。CCR4発現は、これらの細胞株のいずれにおいても検出されなかった（図10A）。我々はさらに、これらの細胞株由来の培養上清または組み換えヒトCCL22のいずれかを用いて走化性アッセイを行った。3つすべての培養培地が、新鮮な培地と比較してTreg遊走の増加を示した。しかし、mAb2-3 IgG1およびIgG4は両方とも、CCL22含有IGROV-1およびOVCAR-5上清により誘導されるTregの走化性を阻害することができたが、OVCAR-8上清によるものは阻害しなかった（図3B）。CCL22へのTregの走化性はまた、用量依存的な様式でmAb2-3により阻害された（図10B）。これらの結果は、mAb2-3 IgG1およびIgG4の両方がインビボでCCL22分泌OvCA細胞へのTregの動員を阻害することができることを示している。
【０１４６】
mAb2-3がインビボでTregの動員を阻止することができるかどうかを評価するため、ルシフェラーゼ形質導入CD4+またはCD4+CD25+ T細胞を、IGROV-1異種移植腫瘍を有するマウスに注射し、その後にmAb2-3または対照抗体で処置した。18時間後、生物発光画像は、対照IgG1で処置したマウスにおいてはCCL22分泌腫瘍がCD4+およびCD4+CD25+ T細胞を動員したが、そのような動員はmAb2-3 IgG1処置によって減少したことを示した（それぞれ、図3Cおよび3D）。48時間のmAb2-3処置後のCD4+CD25+CD127dim/- Tregの動員を調査したところ、a）対照IgG1グループにおいてはTregが腫瘍組織に蓄積されたこと、b）TregがmAb2-3 IgG1によって除去されたこと、およびc）mAb2-3 IgG4で処置したマウスにおいてはTregがまばらに分布していたことが見出された（図11A）。mAb2-3 IgG1およびIgG4の両方の処置は、対照グループよりも低い腫瘍組織内生物発光強度（図11B）およびより少ない腫瘍浸潤Treg（図11C)をもたらした。これらの結果は、インビボでmAb2-3 IgG1処置がTregを除去し、mAb2-3 IgG4処置が腫瘍浸潤性Tregの動員を阻害することを示している。
【０１４７】
実施例6：インビトロでmAb2-3を介してもたらされる強化された抗腫瘍免疫
後でインビボ免疫療法について試験することができるOvCA異種移植片を有するヒト化マウスモデルを構築するため、IGROV-1特異的T細胞をインビトロで作製した。樹状細胞（DC）を、hPBMCから収集した単球から分化させ（図12A）、IGROV-1細胞溶解産物でパルスし、自己hPBMCと共培養して、腫瘍プライムT（TP-T）細胞を作製した。これらのTP-T細胞は、腫瘍抗原に反応し、IGROV-1パルスDCとの共培養下でIFN-γを産生した（図12B）。さらに、図4Aの代表的実験に示されるように、TP-T細胞は、全CD4+ T細胞中約31.6±1.4％（n=3）がCD25+CCR4+ T細胞からなるものであった。これらのCCR4+ TP-T細胞はまた、mAb2-3結合磁気ビーズを用いて除去することができた（図4B)。図4Cに示されるように、IGROV-1細胞と共培養されたTP-T細胞は、単独培養されたTP-T細胞と比較して増加したIFN-γ放出を示した。細胞染色研究は、IGROV-1細胞に対して反応するCD8+およびCD4+の両方のTP-T細胞において、同一ドナー由来の非プライムT細胞との比較でIFN-γ発現の増加を示した（図4D）。
【０１４８】
加えて、共培養は、CCR4+細胞がmAb2-3によってTP-T集団から除去されたときに、IFN-γ活性の向上を示した（図4C）。しかし、対照IgG1との比較で、可溶性mAb2-3 IgG1またはIgG4処置の効果の向上は見られなかった。このmAb2-3による向上の欠如は、Treg除去が、このインビトロ系において、おそらく共培養物におけるTregの高い比率、それらの抑制性メディエーターの放出および／または細胞・細胞接触の必要性から、TP-T抑制の好転を達成するために必要とされ得ることを示唆した。さらに、mAb2-3除去TP-T細胞は、IGROV-1細胞に対して非除去TP-T細胞よりも高い細胞傷害性を誘導することができた（図4E）。これらのデータは、TP-T細胞、特にmAb2-3除去CCR4+ TP-T細胞が、抗腫瘍応答を誘導し、腫瘍細胞死を媒介することができることを示している。
【０１４９】
実施例7：インビボでのmAb2-3の抗腫瘍効果の評価
mAb2-3を通じた除去または遮断による腫瘍浸潤Tregの減少が抗腫瘍活性を強化し得るという発見の機能的、したがって潜在的な治療的妥当性が確認された。ルシフェラーゼ発現IGROV-1異種移植片を有するマウスに4x106個のTP-T細胞を与え、5週の間、週に2回mAb2-3で処置した。10日ごとに生物発光画像を撮影し、腫瘍サイズを定量した（図5A）。mAb2-3 IgG1およびIgG4で処置したマウスは、対照グループと比較して相対的に低い発光強度を示し、mAb2-3 IgG1処置は、mAb2-3 IgG4よりも高い抗腫瘍効果を示した（図5B）。腫瘍サイズの測定においても同じ観察がなされた（図5C)。興味深いことに、マウス体重の最も大きな減少は、mAb2-3 IgG1で処置されたグループで見られた（図5D)。mAb2-3の抗腫瘍効果はまた、腫瘍組織（図5E)および腫瘍重量（図5F)においても観察された。これらの結果は、mAb2-3が、インビボでTP-T細胞と腫瘍に介在し、腫瘍成長を阻害することを示した。
【０１５０】
mAb2-3の強力な治療効果を確認するために、我々は、IGROV-1異種移植片を有するマウスに注射するTP-T細胞の数を2.5倍に増やした。これらの実験条件の下で、mAb2-3 IgG1およびIgG4の両方で処置したマウスにおいて、腫瘍成長曲線の統計的に有意な阻害が見られた（図13A）。体重および腫瘍組織も図5と同様の結果を示した（図13Bおよび13C）。TP-T細胞（CD3+）は、すべての処置グループにおいて腫瘍移植部位に浸潤することが見出された（図13G、上パネル）。加えて、CD25+ TP-T細胞は、PBSおよび対照mAbで処置された異種移植腫瘍において検出可能であり蓄積されていたが、CD25+ TP-T細胞の蓄積は、mAb2-3 IgG1およびIgG4で処置された腫瘍において減少した（図13G、下パネル）。マウス血液中のTP-T細胞をFACSによってさらに調査し、その結果は、各処置グループの間でCD4+およびCD8+ T細胞に差がないが、Treg集団はmAb2-3 IgG1処置グループにおいてのみ減少することを示した（図13D〜F）。まとめると、これらのデータは、mAb2-3 IgG1によるTregの除去およびmAb2-3 IgG4による腫瘍に動員されるTregの阻止が、インビボで抗腫瘍免疫を強化することができることを示している。
【０１５１】
実施例8：mAb2-3の作用機構
Tregにより使用される抑制機構は、阻害性サイトカインおよび細胞溶解酵素の放出ならびにCD25/IL-2およびCD39/アデノシンによる代謝破壊の媒介を含む（21）。Tregによるサイトカイン産生を研究し、mAb2-3が抑制性サイトカイン、すなわちIL-10およびTGF-βのレベルを変化させなかったことが見出された（図14）。次に、TeffおよびTregにおけるCCR4に対するmAb2-3の結合がCD25（TAC）、IL-2受容体（IL-2R）のα鎖およびIL-2の間の相互作用に影響し得るかどうかを決定した。図6Aは、Teffからの内因性IL-2の分泌がmAb2-3処置によって誘導されなかったことを示している。対照的に、外因性IL-2をTreg培養物に添加した場合、IL-2蓄積の顕著な増加が、mAb2-3を含む上清でのみ検出された（図6B）。加えて、細胞をmAb2-3またはまたは対照mAbで処置し、外因性IL-2なし（図6C）またはあり（図6D）でインキュベートするTeff/Treg共培養系を設定した。結果は、mAb2-3処置が両方の共培養上清においてIL-2レベルの増加をもたらし、対照mAb処置ではそうならなかったことを示した。
【０１５２】
次いで、CCR4およびIL-2Rの両方を発現するMac-1細胞を使用して、mAb2-3が競合アッセイにおいてIL-2Rに対するIL-2の結合に影響するかどうかを試験した。結果は、抗TAC（IL-2Rα）mAbと同様、mAb2-3が、IL-2結合を阻止しない対照抗CD25 mAb処置と比較した場合に、Mac-1細胞に対するビオチニル化IL-2の結合を効果的に阻害したことを示した（図15Aおよび15B）（22）。さらに、Mac-1細胞培養上清を、外因性IL-2および異なるmAbによる処置の後に収集し、可溶性IL-2の検出のためにELISAアッセイに供した。抗TAC mAbおよびmAb2-3の両方による処置は、おそらくMac-1細胞に対する外因性IL-2の結合の阻害により、培養上清中のIL-2レベルを上昇させたが、対照mAb処置または未処置グループではそうならなかった（図6E）。
【０１５３】
IL-2Rはα、βおよびγ鎖という3つのサブユニットからなり、α鎖はIL-2に対する受容体の親和性をKd=1 nM（βγ鎖）からKd=10 pM（αβγ鎖）に顕著に向上させることが知られている。一過的にトランスフェクトされた293T細胞を用いた対照実験において、IL-2結合の阻害は、個々のα、βおよびγサブユニット鎖またはその複合体に対するmAb2-3の直接的結合に起因するものではないことが見出された。CD25はまた、報告されているところによれば、T細胞活性化後にKd=30 nMで可溶性形態（sCD25）（23）に切断される（24）。mAb2-3または対照mAb処置後の培養上清中のsCD25をモニターした。データは、細胞をmAb2-3で処置したときに、上清中のsCD25のレベルが用量依存的な様式で上昇すること（図18A）およびこの効果がインキュベート時間と正の相関関係にあること（図17B〜17D）を実証した。この結果から、CCR4のmAb2-3結合が、おそらくそのリガンドであるCCL17およびCCL22（25, 26）と同様にT細胞の活性化をもたらすことが示唆された。実際、両リガンドもまた、sCD25の脱落を誘導した（図17A）。Tregの生存に対するmAb2-3を通じたsCD25脱落の機能をさらに決定するため、Tregを、IL-2および／またはmAb2-3/対照IgG1と共に培養した。IL-2は、Tregの生存を維持する能力を示したが、興味深いことに、Tregの生存に対するIL-2の正の効果は、mAb2-3によって阻害された（図6F）。これらの結果は、TregにおけるCCR4のmAb2-3結合がIL-2/IL-2R複合体を調節し、Tregの死滅を増加させ得ることを示している。
【０１５４】
mAb2-3はCCL17/22とCCR4との相互作用を阻止することができるので、我々は、CCR4のCCL17/22結合がmAb2-3と同様にsCD25脱落を誘導するかどうかを理解することを試みた。図17Aは、CCL17およびCCL22の両方のリガンドがsCD25脱落を誘導する活性を示したことを実証しており、これは以前に報告されていなかったことである。
【０１５５】
いくつかの研究は、マトリクスメタロプロテイナーゼ9（MMP9)がCD25を切断する能力を有していることを示した（27〜29）。sCD25脱落の誘導におけるmAb2-3、CCL17およびCCL22の作用機構を調査するため、培養物を、MMP-9阻害剤または対照MMP阻害剤で処置した（図17A）。興味深いことに、MMP-9阻害剤は、すべての処置グループにおいてsCD25の脱落を減少させ、対照阻害剤からは効果が観察されなかった（図17Aおよび図18A〜B）。これらの結果は、mAb2-3処置がCCL22/17と類似の様式でCD25の切断をもたらすことを示しており、これはmAb2-3がアゴニスト活性を有し、MMP-9機能およびsCD25切断を活性化させる能力をCCR4リガンドと共有しており、最終結果はIL-2結合の消失であることを示唆している。
【０１５６】
参考文献
2018518465.tif 000030
2018518465.tif 000031
2018518465.tif 000032
2018518465.tif 000033
2018518465.tif 000034
2018518465.tif 000035
【０１５７】
他の態様
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、これまでの記載は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義されるものである。他の局面、利点および改変も、添付の特許請求の範囲に包含される。
【図１Ａ】
2018518465.tif 000047
【図１Ｂ】
2018518465.tif 000048
【図１Ｃ】
2018518465.tif 000049
【図１Ｄ】
2018518465.tif 000050
【図１Ｅ】
2018518465.tif 000051
【図２】
2018518465.tif 000052
【図３】
2018518465.tif 000053
【図４Ａ】
2018518465.tif 000054
【図４Ｂ】
2018518465.tif 000055
【図４Ｃ】
2018518465.tif 000056
【図４Ｄ】
2018518465.tif 000057
【図４Ｅ】
2018518465.tif 000058
【図５】
2018518465.tif 000059
【図６】
2018518465.tif 000060
【図７】
2018518465.tif 000061
【図８】
2018518465.tif 000062
【図９】
2018518465.tif 000063
【図１０】
2018518465.tif 000064
【図１１】
2018518465.tif 000065
【図１２】
2018518465.tif 000066
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2018518465.tif 000068
【図１３Ｃ】
2018518465.tif 000069
【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４】
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【図１５】
2018518465.tif 000075
【図１６】
2018518465.tif 000076
【図１７】
2018518465.tif 000077
【図１８】
2018518465.tif 000078
【図１９】
2018518465.tif 000079
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月1日(2018.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
[本発明1001]
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000080
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000081
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、それを必要とする対象に投与する段階
を含む、対象において制御性T細胞（Treg)を除去する方法。
[本発明1002]
抗体が、IgG1重鎖定常領域を有する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000082
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000083
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、サイトカイン分泌腫瘍を有する対象に投与する段階
を含む、対象においてサイトカイン分泌腫瘍への制御性T細胞（Treg）の遊走を阻害する方法。
[本発明1004]
抗体が、IgG4重鎖定常領域を有する、本発明1003の方法。
[本発明1005]
サイトカインが、CCl2、CCl4、CCL5、CCL17またはCCL22である、本発明1003の方法。
[本発明1006]
定常領域がS228P変異を含む、本発明1004の方法。
[本発明1007]
エフェクターT細胞が実質的に除去されない、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
エフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比が、腫瘍または対象において調節される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
エフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比が増加する、本発明1008の方法。
[本発明1010]
エフェクターT細胞の増殖が増加するかまたは実質的に減少しない、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1011]
エフェクターT細胞の数が増加するかまたは実質的に減少しない、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
エフェクターT細胞集団からのサイトカインの放出が調節される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
サイトカインがインターフェロン-ガンマを含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
エフェクターT細胞集団からのエフェクターポリペプチドの放出が調節される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
エフェクターポリペプチドが、グランザイムBまたはパーフォリンを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
制御性T細胞が濾胞性制御性T細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000084
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列
2018518465.tif 000085
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体を、それを必要とする対象に投与する段階
を含む、対象において腫瘍細胞増殖を阻害する方法。
[本発明1018]
腫瘍が、固形腫瘍または血液系腫瘍である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
血液系腫瘍が、皮膚T細胞性リンパ腫（CTCL）、菌状息肉腫（MF）、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（皮膚ALCL）、セザリー症候群、または成人T細胞白血病／リンパ腫（ATLL）である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
固形腫瘍が、腎細胞がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、皮膚がん、前立腺がん、結腸がん、子宮頸がん、脳がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓もしくは胃のがん、ホジキン病、または多形性膠芽腫（GBM）である、本発明1018の方法。
[本発明1021]
抗体が、IgG4重鎖定常領域またはIgG1重鎖定常領域を有する、本発明1003の方法。
[本発明1022]
抗原および抗CCR4抗体を対象に投与する段階を含む、抗原に対するワクチンを接種する方法。
[本発明1023]
抗CCR4抗体が、抗原投与前、同時または後に投与される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
ヒト化抗CCR4抗体が、二重特異性抗体の第1のメンバーである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
二重特異性抗体の第2のメンバーが、腫瘍関連抗原、T細胞機能調節分子、T細胞受容体ポリペプチドに特異的である、本発明1020の方法。
[本発明1026]
腫瘍関連抗原が、CA-IX、ErbB2またはHVEMである、本発明1021の方法。
[本発明1027]
T細胞機能調節分子が、PD-L1、PD1、CTLA4、GITR、IL21、IL21R、CD160、TIM3、LAG3またはGAL9である、本発明1021の方法。
[本発明1028]
T細胞受容体ポリペプチドがCD3である、本発明1021の方法。
[本発明1029]
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000086
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000087
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体をCCR4+ Tregと接触させる段階
を含む、CCR4+ Tregに対するIL-2の結合を阻害する方法。
[本発明1030]
それぞれアミノ酸配列：
2018518465.tif 000088
を含む3つのCDRを有する重鎖、ならびに
それぞれアミノ酸配列
2018518465.tif 000089
を含む3つのCDRを有する軽鎖
を有するヒト化抗CCR4抗体をTregと接触させる段階
を含む、CD25切断を誘導する方法。
[本発明1031]
薬学的組成物が1回または複数回投与されるヒト対象に存在する腫瘍内のまたは腫瘍に関連するエフェクターT細胞 対 制御性T細胞の比を増加させるのに有効な量のヒト化抗CCR4抗体
を含む、薬学的組成物。
[本発明1032]
腫瘍が固形腫瘍である、本発明1028の薬学的組成物。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、かつ以下の詳細な説明および特許請求の範囲に包含される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（表９）重鎖および軽鎖のアミノ酸配列
2018518465.tif 000090
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018518465000001.app
【国際調査報告】
2018518465.tif 000091
2018518465.tif 000092
2018518465.tif 000093
2018518465.tif 000094
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