(57)【要約】本発明は、細胞免疫療法の分野、より具体的には、新世代のキメラ抗原受容体(CAR)に関し、これは、小分子との相互作用を介して、そのようなCARを付与された免疫細胞の制御を可能にする。より詳細には、本発明は、少なくとも1つのエクトドメインに、該受容体の抗原結合機能をオフからオン状態に、およびその逆に変える分子スイッチを含むキメラ抗原受容体に関する。したがって、本発明は、より制御された、かつ潜在的により安全な、遺伝子改変されたCAR付与免疫細胞、例えばTリンパ球を提供する。2018525006.tif 000008
2018525006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体(CAR)であって、
(a)(i) 細胞外抗原結合性ドメインと、
(ii) 少なくとも第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインを含むスイッチドメインであって、該2つの結合性ドメインが所定の多価リガンドに結合して、該2つの結合性ドメインとそれらに結合可能な多価リガンドとを含む多量体を形成することができる、スイッチドメインと、
を含む少なくとも1つのエクトドメイン；
(b) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン；ならびに
(c) シグナル伝達ドメイン、および任意で共刺激ドメインを含む少なくとも1つのエンドドメイン
を含み、該スイッチドメインが細胞外抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置していることを特徴とする、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、化学物質誘導二量体化(CID)システムから誘導される、請求項1記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインが同じであるか、または異なっている、請求項1または2記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、FK506結合タンパク質(FKBP12)：mTORのFKBP-ラパマイシン結合ドメイン(FRB)、FKBP12：FKBP12、FKBP(F36V)：FKBP(F36V)、FKBP12：FRB(T2098L)、FKBP12：カルシニューリンA(CnA)、FKBP12：シクロフィリン(CyP)、GyrB：GyrB、GAI：GID1A、GAI：GID1B、GAI：GID1C、Snap-tag：Halo-tag、Snap-tag：CLIP-tag、DHFR：DHFR、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン：DHFR、およびPYL1：ABI1からなる多量体化リガンド結合性ドメインの対から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の化学的抗原受容体。
【請求項５】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、FRB (SEQ ID NO: 2)、またはFRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項5記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、T2098にアミノ酸置換を含むFRBの変異体であり、T2098がロイシンで置き換えられている(SEQ ID NO: 4)、請求項5記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、SEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を有するFKBP12(F36V)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、SEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を有するFKBP12(F36V)である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、カルシニューリンA(CnA)(SEQ ID NO: 5)、またはCnA (SEQ ID NO: 5)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、シクロフィリン(CyP)(SEQ ID NO: 6)、またはCyP (SEQ ID NO: 6)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、GyrB (SEQ ID NO: 7)、そのクメルマイシン結合性断片、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)もしくはそのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
クメルマイシン結合性断片が、GyrBの24KDaアミノ末端サブドメインである、請求項12記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、GID1A (SEQ ID NO: 9)、またはGID1A (SEQ ID NO: 9)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、GID1B (SEQ ID NO:10)、またはGID1B (SEQ ID NO:10)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、GID1C (SEQ ID NO:11)、またはGID1C (SEQ ID NO:11)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、HaloTag (SEQ ID NO:13)、またはHaloTag (SEQ ID NO:13)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)、またはCLIP-tag(SEQ ID NO:14)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)、またはグルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２１】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、PYL1 (SEQ ID NO:17)、またはPYL1 (SEQ ID NO:17)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、ABI1 (SEQ ID NO:18)、またはABI1 (SEQ ID NO:18)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインが、ペプチドリンカーによって隔てられている、請求項1〜21のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２３】
第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインが直接融合している、請求項1〜21のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２４】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、第2の多量体化リガンド結合性ドメインのN末端に位置する、請求項1〜23のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２５】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインが、第2の多量体化リガンド結合性ドメインのC末端に位置する、請求項1〜24のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２６】
前記少なくとも1つのエクトドメインが、
(iii)スイッチドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する、ヒンジ
を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２７】
前記ヒンジが、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジおよびFcγRIIIαヒンジからなる群より選択される、請求項26記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２８】
前記ヒンジ領域がCD8αヒンジである、請求項26または27記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２９】
前記シグナル伝達ドメインが、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来する、請求項1〜28のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３０】
前記シグナル伝達ドメインがCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜29のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３１】
一本鎖CARである、請求項1〜30のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３２】
前記エンドドメインが共刺激ドメインを含む、請求項31記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３３】
共刺激ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメインに由来する、請求項32記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３４】
共刺激ドメインが4-1BBからの共刺激ドメインである、請求項32記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３５】
多重鎖CARである、請求項1〜30のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３６】
前記CARの少なくとも1つのエクトドメインおよび少なくとも1つのエンドドメインが、同じポリペプチド鎖上になく、それぞれが膜貫通ドメインを含む少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖上にあり、該少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖が相互作用して、二量体または多量体のキメラ抗原受容体を形成する、請求項35記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３７】
少なくとも1つの膜貫通ドメインと、共刺激ドメインを含む少なくとも1つのエンドドメインとを含む第3のポリペプチド鎖をさらに含む、請求項35または36記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３８】
共刺激ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメインに由来する、請求項37記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３９】
共刺激ドメインが4-1BBからの共刺激ドメインである、請求項37記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４０】
前記少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖が、FcεRIα鎖、FcεRIβ鎖および/もしくはFcεRIγ鎖の一部、またはその変異体を含む、請求項36〜39のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４１】
前記エクトドメインを含むポリペプチド鎖が、高親和性IgE受容体(FcεRI)のα鎖からの膜貫通ドメインを含む、請求項40記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４２】
前記シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含むポリペプチド鎖が、FcεRIのγ鎖またはβ鎖からの膜貫通ドメインを含む、請求項40または41記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４３】
前記共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むポリペプチド鎖が、FcεRIのγ鎖またはβ鎖からの膜貫通ドメインを含む、請求項40〜42のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４４】
前記CARが、多量体化リガンドの非存在下での該CARを発現する免疫細胞の細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、モジュレートされた細胞溶解活性を該免疫細胞に与える、請求項1〜43のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４５】
前記CARが、多量体化リガンドの非存在下での該CARを発現する免疫細胞の細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、増加した細胞溶解活性を該免疫細胞に与える、請求項1〜44のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４６】
前記CARが、多量体化リガンドの非存在下での該CARを発現する免疫細胞の細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、減少した細胞溶解活性を該免疫細胞に与える、請求項1〜44のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４７】
請求項1〜46のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項35〜46のいずれか一項記載の多重鎖CARを構成する2本以上のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項47または48記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５０】
(i) 免疫細胞を提供する段階；および
(ii) 該免疫細胞の表面に、請求項1〜46のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラ抗原受容体を発現させる段階
を含む、免疫細胞を遺伝子操作するための方法。
【請求項５１】
(a) 免疫細胞を提供する段階；
(b) 該細胞に、請求項37または38記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、または請求項36記載のベクターを導入する段階；および
(c) 該細胞において前記キメラ抗原受容体を発現させる段階
を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
(iii)前記免疫細胞の表面に、少なくとも1つの共刺激受容体を発現させる段階
をさらに含む、請求項50または51記載の方法。
【請求項５３】
(d) 前記細胞に、共刺激受容体をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入する段階；および
(e) 該少なくとも1つの共刺激受容体を発現させる段階
をさらに含む、請求項51または52記載の方法。
【請求項５４】
前記共刺激受容体がNKG2DおよびDAP10からなる群より選択される、請求項52または53記載の方法。
【請求項５５】
請求項50〜54のいずれか一項記載の方法に従って得ることができる、免疫細胞。
【請求項５６】
請求項1〜46のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラ抗原受容体を含む、免疫細胞。
【請求項５７】
内因性mTORタンパク質のアミノ酸配列内に、
セリンが別のアミノ酸で置き換えられる2035位でのアミノ酸置換を含む、1つまたは複数のアミノ酸置換
を含む、請求項56記載の免疫細胞。
【請求項５８】
内因性FKBP12遺伝子が不活性化されている、請求項56または57記載の免疫細胞。
【請求項５９】
T細胞である、請求項55〜58のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６０】
好ましくはドナーから分離された、ウイルス特異的T細胞(VST)である、請求項55〜58のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６１】
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項55〜60のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６２】
細胞傷害性Tリンパ球に由来する、請求項55〜61のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６３】
医薬として使用するための、請求項55〜62のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６４】
がんまたはウイルス感染の治療に使用するための、請求項55〜63のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６５】
固形腫瘍の治療に使用するための、請求項55〜63のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６６】
B細胞悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項55〜63のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６７】
第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインに結合することができる多価リガンドと組み合わせて使用するためのものである、請求項63〜66のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項６８】
(a) 請求項1〜46のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラ抗原受容体を含む免疫細胞を提供する段階 
(b) 該免疫細胞を患者に投与する段階
を含む、治療を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項６９】
前記方法が、
(c) 第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインに結合することができる多価リガンドの有効量を患者に投与する段階
をさらに含む、請求項68記載の患者を治療するための方法。
【請求項７０】
段階(a)のもとでの前記免疫細胞がドナーから回収される(同種異系モード)、請求項68または69記載の患者を治療するための方法。
【請求項７１】
段階(a)のもとでの前記免疫細胞が前記治療を必要とする患者から回収される(自家モード)、請求項68または69記載の患者を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞免疫療法の分野、より具体的には、新世代のキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor: CAR)に関し、これは、小分子との相互作用を介して、そのようなCARを付与された免疫細胞の制御を可能にする。より詳細には、本発明は、少なくとも1つのエクトドメインに、該受容体の抗原結合機能を制御する分子スイッチを含む、キメラ抗原受容体に関する。したがって、本発明は、より制御された、かつ潜在的により安全な、遺伝子改変されたCAR付与免疫細胞、例えばTリンパ球、を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
養子免疫療法は、エクスビボで作製された自己抗原特異的T細胞の移入を含む療法であって、ウイルス感染症およびがんを治療するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増殖、または遺伝子操作によるT細胞の向け直しのいずれかによって作製され得る(Park, Rosenberg et al. 2011)。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植関連ウイルス感染症および希少ウイルス関連悪性腫瘍の治療に使用される確立した手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の分離および移入は、メラノーマの治療に成功したことが示されている。
【０００３】
T細胞の新規な特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)の遺伝子移入によって首尾よく生み出されている(Jena, Dotti et al. 2010)。CARは、単一融合分子中に1つまたは複数のシグナル伝達ドメインと結びついた標的化部分からなる合成受容体である。一般に、CARの結合部分は、柔軟なリンカーによってつながれたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変フラグメントを含む一本鎖抗体(scFv)の抗原結合性ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾よく使用されている。第1世代CARのシグナル伝達ドメインは、CD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第1世代のCARは、T細胞の細胞傷害性を成功裏に向け直すことが示されているが、それらはインビボで長期の増殖および抗腫瘍活性を提供することができなかった。CAR改変T細胞の生存率を高めかつ細胞数を増やすために、CD28、OX-40(CD134)、ICOSおよび4-1BB(CD137)といった共刺激分子からのシグナル伝達ドメインが、単独で(第2世代)または組み合わせて(第3世代)追加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍などの様々な悪性腫瘍からの腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対してT細胞を成功裏に向け直すことができた(Jena, Dotti et al. 2010)。
【０００４】
しかし、多くの臨床研究は、がん治療のためのCAR T細胞の養子移入の可能性を実証したものの、それらはサイトカイン放出症候群(CRS)および「on-target off-tumor」(標的抗原を有する正常細胞への毒性)作用に関連するリスクをも高めてきた。これまでに、CAR改変T細胞を薬理学的に制御しかつ主に自殺機序を頼りにする戦略がいくつか開発されている。遺伝子改変T細胞の完全な根絶に至るそのような自殺戦略は、治療の中途終了をもたらすであろう。
【０００５】
その結果として、CAR T細胞技術およびその安全性を改善するために、遺伝子改変CAR T細胞を非致死的に制御することが大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
ここで、本発明者らは、抗原結合性ドメインを含むCARの細胞外部分の立体構造の制御された変化が小分子の添加により得られるシステムを開発した。この統合されたシステムは、抗原と抗原結合性ドメインとの相互作用をオン/オフ状態の間で切り替える。特に、CARの細胞外部分の立体構造を制御できることにより、そのようなキメラ抗原受容体を付与された免疫細胞の下流機能、例えばT細胞の細胞傷害性、を直接モジュレートすることが可能である。このシステムは、新規な、より制御された、潜在的により安全な、遺伝子改変されたCAR付与免疫細胞を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、第1の局面において、キメラ抗原受容体(CAR)を提供し、それは、
(a)(i) 細胞外抗原結合性ドメインと、
(ii) 少なくとも第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインを含むスイッチドメインであって、該2つの結合性ドメインが所定の多価リガンドに結合して、該2つの結合性ドメインとそれらに結合可能な多価リガンドとを含む多量体を形成することができる、スイッチドメインと
を含む少なくとも1つのエクトドメイン；
(b) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン；ならびに
(c) シグナル伝達ドメインおよび任意で共刺激ドメインを含む、少なくとも1つのエンドドメイン
を含み、該スイッチドメインが細胞外抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置していることを特徴とする。
【０００８】
本発明は、さらなる局面において、本発明のキメラ抗原受容体をコードする1つまたは複数の核酸配列を含むポリヌクレオチドおよびベクターを提供する。
【０００９】
本発明は、さらなる局面において、本発明の少なくとも1つのキメラ抗原受容体を含む(例えば、細胞表面上に発現する)免疫細胞、特に、単離された免疫細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、さらなる局面において、本発明の免疫細胞を遺伝子操作するための方法を提供する。
【００１１】
本発明は、さらなる局面において、治療における、例えばがんの治療に用いるための、本発明の免疫細胞の使用を提供する。
【００１２】
本発明のCARの構造は、分子スイッチを構成する第1の多量体化リガンド結合性ドメインと第2の多量体化リガンド結合性ドメインが同じポリペプチド分子上に存在するため、信頼できる機能性を提供する。こうした構造により、本発明のCARシステムは、両方のリガンド結合性ドメインが異なるポリペプチド分子上に存在して、制御が困難である場合に、細胞表面上での該リガンド結合性ドメインの適切な発現および配置に影響を与えかねない諸要因から独立している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】(A)本発明による一本鎖キメラ抗原受容体の模式図。(B)実施例で使用されたCARエクトドメインの模式図。下の両方の構造には、本発明に従ってFRBおよびFKBPドメインが組み込まれている。
【図２】本発明による多重鎖キメラ抗原受容体の模式図。
【図３Ａ】(A)ビヒクル(DMSO)またはラパマイシンの存在下でmcCARの表面検出に対して陽性である生細胞の割合。scFvのFab'2領域の検出が示される。
【図３Ｂ】(B)生細胞集団全体において示される、小分子ラパマイシンの添加時の中央値蛍光強度(median fluorescence intensity: MFI)の増加倍率。
【図４】生細胞集団全体において示される、T2098L変異型FKBP/FRB*構築物に関連して使用された小分子AP21967の添加時の中央値蛍光強度(MFI)の増加倍率。
【図５】(A)モデル抗原提示細胞に対するCAR T細胞の細胞溶解能に及ぼすAP21967ラパログの効果が、フローベースの細胞傷害アッセイで評価された。CD19陽性およびCD19陰性標的細胞の生存率を、AP21967の存在下または非存在下で遺伝子改変CAR T細胞と共培養した後に測定した。エフェクター/標的比を20：1に設定した。NTはトランスフェクトされていないT細胞を表す。(B)CAR活性を誘導するために本発明に従って漸増濃度のラパログAP21967を使用した場合の、Daudi CD19陽性細胞の溶解パーセントを示す図。
【図６】実施例3に記載される、AP21967(10nM)とタクロリムス(0〜500nM)との間の競合実験。
【図７】生細胞集団全体において示される、T2098L変異型FKBP/FRB*構築物に関連して使用された小分子AP21967の添加時の中央値蛍光強度(MFI)の増加倍率。
【図８】(A)CD19を標的とする遺伝子改変CARを用いたAP21967のEC50の測定。遺伝子改変CARをコードするmRNAの3つの用量(D、D1/2およびD1/4)をトランスフェクトしたT細胞を、漸増量のAP21967ラパマイシン合成アナログで処理した。scFvのFab'2領域が検出される。(B)CD123を標的とする遺伝子改変mcCARを用いたAP21967のEC50の測定。遺伝子改変mcCARをコードするmRNAの3つの用量(D、D1/2およびD1/4)をトランスフェクトしたT細胞を、漸増量のAP21967ラパログで処理した。scFvはFcフラグメントに融合した組換えCD123を用いて検出される。
【図９】漸増用量のAP21967の存在下でのFKBP/FRB*-mcCARの表面検出に対して陽性である生細胞の割合。
【図１０】実施例8に記載される、反復用量のラパログAP21967と併用してT細胞CAR CD123+で処置されるMOLM-13-Lucの処置計画。
【図１１】図10および実施例8に示されるように処置した後のMOLM-13-Lucマウスの生存曲線。
【図１２】図10および実施例8に示されるように処置した後のMOLM-13-Lucマウスの体重のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書で特に定義しない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学および分子生物学の分野の当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。
【００１５】
本発明の実施には、特に明記しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を採用しており、これらは当業者の技能の範囲内である。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、以下を参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins編, 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins編, 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); シリーズ, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon 主編集, Academic Press, Inc., New York), 特にVol.154および155 (Wu et al.編)ならびにVol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Vol.I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell編, 1986); ならびにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)。
【００１６】
本発明のキメラ抗原受容体
したがって、本発明は、第1の局面において、キメラ抗原受容体(CAR)を提供し、それは、
(a)(i) 細胞外抗原結合性ドメインと、
(ii) 少なくとも第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインを含むスイッチドメインであって、該2つの結合性ドメインが所定の多価リガンドに結合して、該2つの結合性ドメインとそれらに結合可能な多価リガンドとを含む多量体を形成することができる、スイッチドメインと
を含む少なくとも1つのエクトドメイン；
(b) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン；ならびに
(c) シグナル伝達ドメインおよび任意で共刺激ドメインを含む、少なくとも1つのエンドドメイン
を含み、該スイッチドメインが細胞外抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置していることを特徴とする。
【００１７】
多価リガンドが第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインに同時に結合すると、多量体の、例えば二量体の複合体が形成され、該複合体は、キメラ抗原受容体のエクトドメイン内の立体構造の変化をもたらし、ひいては該抗原結合性ドメインの表面露出を改善する。
【００１８】
「多量体化リガンド」(multimerizing ligand)または「多量体化剤」(multimerizer)は、第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインなどの少なくとも2つの結合パートナーに同時に結合することができ、結合すると、該結合パートナーの多量体化、例えば二量化、を引き起こすことができる多価リガンドである。より詳細には、「多価リガンド」は、少なくとも2つの結合パートナー、例えば第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメイン、の同時結合を可能にする少なくとも2つの結合部位を有する分子、好ましくは小分子である。用語「多量体化リガンド」、「多量体化剤」および「多価リガンド」は、本明細書では相互交換可能に使用することができ、それぞれ、用語「二量体化リガンド」、「二量体化剤」および「二価リガンド」を含む。「二量体化リガンド」、「二量体化剤」および「二価リガンド」は、2つのリガンド結合パートナー、例えば第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメイン、の結合を可能にする2つの結合部位を有し、それ故に、それらの二量体化を引き起こす分子、好ましくは小分子である。
【００１９】
本明細書で使用する「小分子」は、低分子量(＜2000ダルトン)の有機化合物である。本発明に適用される小分子の非限定的な例には、マクロライド系のラパマイシンおよび「ラパログ」(rapalog)としても知られるそのアナログ、例えば、AP21967、デホロリムス(AP23573)、エベロリムス(RAD00l)、テムシロリムス(CCI-779)など、が含まれる。本発明に適用される小分子の他の非限定的な例としては、タクロリムス(FK506)、FK506誘導体、例えばFK1012、FK506アナログ、例えばAP1903が挙げられる。本発明に適用される小分子のさらに他の非限定的な例としては、クメルマイシン、ジベレリン、HaXs、AP1510、AP20187およびAP21967が挙げられる。
【００２０】
「多量体化リガンド」は、ペプチドまたは核酸(天然または合成)であってもよい。
【００２１】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、化学物質誘導二量体化(chemical induced dimerization: CID)システムから誘導される。
【００２２】
CIDシステムは、2つのポリペプチドが特定の小分子または他の二量体化剤の存在下でのみ結合するメカニズムをベースにしている。様々なCIDシステムが知られており、本発明に従って使用することができる。適切なCIDシステムの非限定的な例を以下の表1に示す。
【００２３】
2018525006.tif 000003
2018525006.tif 000004
【００２４】
AP21967は、ヘテロ二量体化活性を有するラパマイシンのアナログである。二量体化剤AP21967は、FKBP12と、単一アミノ酸置換(T2098L)を含むFRBの変異体とのヘテロ二量体を形成する。
【００２５】
AP1903は、ホモ二量体化活性を有するタクロリムスのアナログである。二量体化剤AP1903は、単一アミノ酸置換(F36V)を含むFKBP12の変異体のホモ二量体を形成する。
【００２６】
特定の実施態様によれば、AP1903または他のマクロライド系免疫抑制剤のような、タクロリムスアナログは、本発明に従って、免疫細胞のCAR媒介活性化をさらにモジュレートするために使用され得る。それらは、遺伝子改変CAR T細胞のさらなる制御を提供する小分子競合剤として作用することができる。細胞表面上でオン状態にロックされたCARの量を調整する可能性の説明として、タクロリムス(FK506)は、FRBとの複合体の形成を可能にすることなくFKBP12に結合することが知られた小分子として、本発明者らによって使用された(実施例4および図6参照)。AP21967(またはラパマイシン)とタクロリムスは、同一のFKBP12結合性コアを有し、FKBP部分内の同じ結合部位について競合する(Wilson, K.P. et al. 1995. Comparative X-ray structures of the major binding protein for the immunosuppressant FK506 (tacrolimus) in unliganded form and in complex with FK506 and rapamycin. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 51, 511-521)。図9に示すように、一定量のAP21967および漸増量のタクロリムス(0〜10mM、好ましくは0〜500nM)と共にインキュベートされた改変CARトランスフェクトT細胞は、CARの表面検出の減少を示す。その結果、免疫細胞のCAR誘発活性化をスイッチオンすることを目的とする本発明の方法は、インビボまたはインビトロで該免疫細胞をタクロリムスアナログまたはマクロライド系免疫抑制剤と接触させることによって該誘発がモジュレートされる、追加の段階を含み得る。これは、本発明のCAR対象物による免疫細胞の活性化を調整する、低減させる、または抑制するために行うことができる。
【００２７】
二量体化剤HaXSは、例えば、Erhart, D. et al. (2013), "Chemical development of intracellular protein heterodimerizers", Chemistry & Biology 20: 549-557に記載されている。
【００２８】
二量体化剤scは、例えば、Gaultier, A. et al. (2009), "Selective cross-linking of interacting proteins using self-labeling tags", J Am Chem Soc. 131(49):17954-62に記載されている。
【００２９】
二量体化剤BisMTXは、例えば、Kopytek, S. J. et al. (2000), "Chemically induced dimerization of dihydrofolate reductase by a homobifunctional dimer of methotrexate", Chemistry & Biology 7:313-321に記載されている。
【００３０】
二量体化剤Dex-Mtxは、例えば、Lin, H. N., et al. (2000), "Dexamethasone-methotrexate: An efficient chemical inducer of protein dimerization in vivo", Journal of the American Chemical Society, 122(17):4247-4248に記載されている。
【００３１】
二量体化剤Dex-TMPは、例えば、Gallagher, S. S. et al. (2007) "An orthogonal dexamethasone-trimethoprim yeast three-hybrid system", Anal Biochem. 363(1):160-2に記載されている。
【００３２】
第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、同じであっても異なっていてもよい。かくして、特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインと第2の多量体化リガンド結合性ドメインは同じである。他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインと第2の多量体化リガンド結合性ドメインは異なっている。
【００３３】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、以下からなる多量体化リガンド結合性ドメインの対から選択される：FK506結合タンパク質(FKBP12)：mTORのFKBP-ラパマイシン結合ドメイン(FRB)、FKBP12：FKBP12、FKBP(F36V)：FKBP(F36V)、FKBP12：FRB(T2098L)、FKBP12：カルシニューリンA(CnA)、FKBP12：シクロフィリン(CyP)、GyrB：GyrB、GAI：GID1A、GAI：GID1B、GAI：GID1C、Snap-tag：Halo-tag、Snap-tag：CLIP-tag、DHFR：DHFR、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン：DHFR、およびPYL1：ABI1。
【００３４】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００３５】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)である。
【００３６】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するFKBP12の変異体である。
【００３７】
特定の実施態様によれば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインもまた、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００３８】
特定の実施態様によれば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)である。
【００３９】
他の特定の実施態様によれば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するFKBP12の変異体である。
【００４０】
特定の実施態様によれば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)、またはFRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００４１】
特定の実施態様によれば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)である。
【００４２】
他の特定の実施態様によれば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するFRBの変異体である。
【００４３】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)、またはFRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００４４】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)、またはFRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００４５】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)である。
【００４６】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するFRBの変異体である。
【００４７】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するFKBP12の変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)である。
【００４８】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するFKBP12の変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、FRB (SEQ ID NO: 2)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するFRBの変異体である。
【００４９】
FKBP12の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)と異なっていてもよい。
【００５０】
適切には、FKBP12の変異体は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、AP21967、AP23573、RAD001またはCCI-779など、に結合することができる。より具体的には、そのような変異体は、ラパマイシンまたはラパログ結合性配列を含む。
【００５１】
FKBP12変異体の非限定的な例は、SEQ ID NO: 3に示される単一のアミノ酸置換(F36V)を含むものである。FKBP12のこのような変異体は、例えば、第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインとして使用することができ、二量体化剤AP1903の結合時にホモ二量体を形成する。
【００５２】
したがって、特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、SEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を有するFKBP12(F36V)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、SEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を有するFKBP12(F36V)である。
【００５３】
FRBの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、FRB (SEQ ID NO: 2)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、FRB (SEQ ID NO: 2)と異なっていてもよい。
【００５４】
適切には、FRBの変異体は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、AP21967、AP23573、RAD001またはCCI-779など、に結合することができる。より具体的には、そのような変異体は、ラパマイシンまたはラパログ結合性配列を含む。
【００５５】
FRB変異体の非限定的な例には、L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105、およびF2108から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むものが含まれる。特定の実施態様によれば、FRBの変異体はT2098にアミノ酸置換を含み、その場合、T2098はロイシン(T2098L)、例えばSEQ ID NO: 4、またはフェニルアラニン(T2098F)で置き換えられる。特定の他の実施態様によれば、FRBの変異体はE2032にアミノ酸置換を含み、その場合、E2032は、フェニルアラニン(E2032F)、メチオニン(E2032M)、アルギニン(E2032R)、バリン(E2032V)、チロシン(E2032Y)、イソロイシン(E2032I)またはロイシン(E2032L)で置き換えられる。特定の他の実施態様によれば、FRBの変異体はE2032およびT2098にアミノ酸置換を含み、その場合、E2032は任意のアミノ酸で置き換えられ、T2098は任意のアミノ酸で置き換えられる。特定の他の実施態様によれば、FRBの変異体は、E2032IおよびT2098L置換を含む。特定の他の実施態様によれば、FRBの変異体は、E2032LおよびT2098L置換を含む。
【００５６】
T2098L置換を有するFRBの変異体は、例えば、第2の多量体化リガンド結合性ドメインとして使用することができ、二量体化剤AP21967の結合時にFKBP12またはその変異体とのヘテロ二量体を形成する。したがって、特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、T2098にアミノ酸置換を含むFRBの変異体(T2098がロイシンで置き換えられる(SEQ ID NO: 4))である。
【００５７】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、カルシニューリンA(CnA)(SEQ ID NO: 5)、またはCnA(SEQ ID NO: 5)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００５８】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、カルシニューリンA(CnA)(SEQ ID NO: 5)、またはCnA(SEQ ID NO: 5)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００５９】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するFKBP12の変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、カルシニューリンA(CnA)(SEQ ID NO: 5)、またはCnA(SEQ ID NO: 5)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００６０】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、カルシニューリンA(CnA)(SEQ ID NO: 5)である。
【００６１】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、カルシニューリンA(CnA)(SEQ ID NO: 5)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するカルシニューリンA(CnA)の変異体である。
【００６２】
カルシニューリンA(CnA)の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、CnA (SEQ ID NO: 5)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、CnA (SEQ ID NO: 5)と異なっていてもよい。適切には、CnAの変異体は、FK506に結合することができる。より具体的には、そのような変異体は、FK506結合配列を含む。
【００６３】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)、またはFKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、シクロフィリン(CyP)(SEQ ID NO: 6)、またはCyP(SEQ ID NO: 6)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００６４】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、シクロフィリン(CyP)(SEQ ID NO: 6)、またはCyP(SEQ ID NO: 6)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００６５】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するFKBP12の変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、シクロフィリン(CyP)(SEQ ID NO: 6)、またはCyP(SEQ ID NO: 6)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００６６】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、シクロフィリン(CyP)(SEQ ID NO: 6)である。
【００６７】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、FKBP12 (SEQ ID NO: 1)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、シクロフィリン(CyP)(SEQ ID NO: 6)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するCyPの変異体である。
【００６８】
シクロフィリン(CyP)の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、CyP (SEQ ID NO: 6)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、CyP (SEQ ID NO: 6)と異なっていてもよい。適切には、CyPの変異体は、FKCsAに結合することができる。より具体的には、そのような変異体は、FKCsA結合性配列を含む。
【００６９】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、そのクメルマイシン結合性断片、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)もしくはそのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体から選択される。
【００７０】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、そのクメルマイシン結合性断片、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)もしくはそのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体から選択される。
【００７１】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、そのクメルマイシン結合性断片、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)もしくはそのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体から選択される。
【００７２】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００７３】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００７４】
特定の他の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGyrBの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)、またはGyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００７５】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインはGyrBであり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインはGyrB (SEQ ID NO: 7)である。
【００７６】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGyrBの変異体である。
【００７７】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGyrBの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrB (SEQ ID NO: 7)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGyrBの変異体である。
【００７８】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片、またはGyrBのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片、あるいは、GyrB (SEQ ID NO: 7)またはそのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００７９】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片、またはGyrBのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００８０】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGyrBのクメルマイシン結合性断片の変異体である。
【００８１】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GyrBのクメルマイシン結合性断片である。
【００８２】
GyrBの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、GyrB (SEQ ID NO: 7)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、GyrB (SEQ ID NO: 7)と異なっていてもよい。適切には、GyrBの変異体は、クメルマイシンに結合することができる。より具体的には、そのような変異体は、クメルマイシン結合性配列を含む。
【００８３】
GyrBのクメルマイシン結合性断片の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、GyrBのクメルマイシン結合性断片と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、GyrBのクメルマイシン結合性断片と異なっていてもよい。適切には、そのような変異体は、クメルマイシンに結合することができる。より具体的には、そのような変異体は、クメルマイシン結合配列を含む。
【００８４】
本発明に従って使用できるクメルマイシン結合性断片は、GyrBの24KDaアミノ末端サブドメインであり得る。
【００８５】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)、またはGID1A (SEQ ID NO: 9)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００８６】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)、またはGID1A (SEQ ID NO: 9)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００８７】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGAIの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)、またはGID1A (SEQ ID NO: 9)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００８８】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)である。
【００８９】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 6)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGID1Aの変異体である。
【００９０】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)である。
【００９１】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGAIの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1A (SEQ ID NO: 9)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGID1Aの変異体である。
【００９２】
GAIの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、GAI (SEQ ID NO: 8)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、GAI (SEQ ID NO: 8)と異なっていてもよい。適切には、GAIの変異体はジベレリンに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はジベレリン結合性配列を含む。
【００９３】
GID1Aの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、GID1A (SEQ ID NO: 9)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、GID1A (SEQ ID NO: 9)と異なっていてもよい。適切には、GID1Aの変異体はジベレリンに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はジベレリン結合性配列を含む。
【００９４】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)、またはGID1B (SEQ ID NO:10)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００９５】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)、またはGID1B (SEQ ID NO:10)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００９６】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGAIの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)、またはGID1B (SEQ ID NO:10)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【００９７】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)である。
【００９８】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGID1Bの変異体である。
【００９９】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)である。
【０１００】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGAIの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1B (SEQ ID NO:10)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGID1Bの変異体である。
【０１０１】
GID1Bの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、GID1B (SEQ ID NO:10)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、GID1B (SEQ ID NO:10)と異なっていてもよい。適切には、GID1Bの変異体はジベレリンに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はジベレリン結合性配列を含む。
【０１０２】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)、またはGID1C (SEQ ID NO:11)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１０３】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)、またはGID1C (SEQ ID NO:11)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１０４】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGAIの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)、またはGID1C (SEQ ID NO:11)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１０５】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)である。
【０１０６】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)、またはGAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGID1Cの変異体である。
【０１０７】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)である。
【０１０８】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、GAI (SEQ ID NO: 8)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGAIの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、GID1C (SEQ ID NO:11)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するGID1Cの変異体である。
【０１０９】
GID1Cの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、GID1C (SEQ ID NO:11)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、GID1C (SEQ ID NO:11)と異なっていてもよい。適切には、GID1Cの変異体はジベレリンに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はジベレリン結合性配列を含む。
【０１１０】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)、またはHalo-tag(SEQ ID NO:13)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１１１】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)、またはHalo-tag(SEQ ID NO:13)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１１２】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するSnap-tagの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)、またはHalo-tag(SEQ ID NO:13)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１１３】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)である。
【０１１４】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するHalo-tagの変異体である。
【０１１５】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)である。
【０１１６】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するSnap-tagの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、Halo-tag(SEQ ID NO:13)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するHalo-tagの変異体である。
【０１１７】
Snap-tagの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、Snap-tag(SEQ ID NO:12)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、Snap-tag(SEQ ID NO:12)と異なっていてもよい。適切には、Snap-tagの変異体はHaXsに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はHaXs結合性配列を含む。
【０１１８】
Halo-tagの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、Halo-tag(SEQ ID NO:13)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、Halo-tag(SEQ ID NO:13)と異なっていてもよい。適切には、Halo-tagの変異体はHaXsに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はHaXs結合性配列を含む。
【０１１９】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)、またはCLIP-tag(SEQ ID NO:14)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１２０】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)、またはCLIP-tag(SEQ ID NO:14)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１２１】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するSnap-tagの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)、またはCLIP-tag(SEQ ID NO:14)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１２２】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)である。
【０１２３】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)、またはSnap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するCLIP-tagの変異体である。
【０１２４】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)である。
【０１２５】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、Snap-tag(SEQ ID NO:12)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するSnap-tagの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するCLIP-tagの変異体である。
【０１２６】
CLIP-tagの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、CLIP-tag(SEQ ID NO:14)と異なっていてもよい。適切には、CLIP-tagの変異体はSCに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はSC結合性配列を含む。
【０１２７】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１２８】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１２９】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するDHFRの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１３０】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)である。
【０１３１】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するDHFRの変異体である。
【０１３２】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)である。
【０１３３】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するDHFRの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するDHFRの変異体である。
【０１３４】
DHFRの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、DHFR (SEQ ID NO:15)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、DHFR (SEQ ID NO:15)と異なっていてもよい。適切には、DHFRの変異体はBisMTXに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はBisMTX結合性配列を含む。
【０１３５】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)、またはグルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１３６】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１３７】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメインの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)、またはDHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１３８】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)、またはグルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)である。
【０１３９】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)、またはグルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するDHFRの変異体である。
【０１４０】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)である。
【０１４１】
より特定の他の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するグルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメインの変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、DHFR (SEQ ID NO:15)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するDHFRの変異体である。
【０１４２】
グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、DHFR(SEQ ID NO:15)と異なっていてもよい。適切には、グルココルチコイド受容体リガンド結合性ドメイン(SEQ ID NO:16)の変異体はDex-MtxまたはDex-TMPに結合することができる。より具体的には、そのような変異体はDex-MtxまたはDex-TMP結合性配列を含む。
【０１４３】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)、またはPYL1 (SEQ ID NO:17)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)、またはABI1 (SEQ ID NO:18)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１４４】
特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)、またはABI1 (SEQ ID NO:18)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１４５】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するPYL1の変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)、またはABI1 (SEQ ID NO:18)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１４６】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)、またはPYL1 (SEQ ID NO:17)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)である。
【０１４７】
他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)、またはPYL1 (SEQ ID NO:17)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するABI1の変異体である。
【０１４８】
より特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)である。
【０１４９】
他のより特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、PYL1 (SEQ ID NO:17)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するPYL1の変異体であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、ABI1 (SEQ ID NO:18)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するABI1の変異体である。
【０１５０】
PYL1の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、PYL1 (SEQ ID NO:17)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、PYL1 (SEQ ID NO:17)と異なっていてもよい。適切には、PYL1の変異体はS-(+)-アブシシン酸(ABA)に結合することができる。より具体的には、そのような変異体はS-(+)-アブシシン酸(ABA)結合性配列を含む。
【０１５１】
ABI1の変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、ABI1 (SEQ ID NO:18)と異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、ABI1 (SEQ ID NO:18)と異なっていてもよい。適切には、ABI1の変異体はS-(+)-アブシシン酸(ABA)に結合することができる。より具体的には、そのような変異体はS-(+)-アブシシン酸(ABA)結合性配列を含む。
【０１５２】
第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、互いに直接融合していてもよいし、ペプチドリンカーによって隔てられていてもよい。
【０１５３】
したがって、特定の実施態様によれば、ペプチドリンカーによって隔てられている。ペプチドリンカーは、50個までのアミノ酸、例えば25個までのアミノ酸から構成され得る。特定の実施態様によれば、ペプチドリンカーは5〜25個のアミノ酸から構成される。本発明に従って使用され得るペプチドリンカーの非限定的な例には、4-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:19)、−GS-4x-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:20)、およびそれらの変異体が含まれる。かくして、特定の実施態様によれば、ペプチドリンカーは、4-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:19)、または4-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:19)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。他の特定の実施態様によれば、ペプチドリンカーは、−GS-4x-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:20)、または−GS-4x-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:20)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。
【０１５４】
特定の他の実施態様によれば、第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、直接融合している(例えば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインのC末端が第2の多量体化リガンド結合性ドメインのN末端と直接融合している）。「直接融合」とは、第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメイン間にペプチドリンカーが存在しないこと、すなわち2つのドメインが炭素-窒素結合によって連結していることを意味する。
【０１５５】
第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインは、任意の可能な順序で配置することができ、すなわち、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、第2の多量体化リガンド結合性ドメインのN末端に位置してもよいし、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、第2の多量体化リガンド結合性ドメインのC末端に位置してもよい。したがって、特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、第2の多量体化リガンド結合性ドメインのN末端に位置する。他の特定の実施態様によれば、第1の多量体化リガンド結合性ドメインは、第2の多量体化リガンド結合性ドメインのC末端に位置する。
【０１５６】
本発明によるキメラ抗原受容体は、少なくとも1つのエクトドメイン内にヒンジをさらに含み得る。ヒンジは、スイッチドメインと膜貫通ドメインとの間に適切に配置される。
【０１５７】
本明細書で使用する用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」は、一般に、膜貫通ドメインをスイッチドメインに連結するように機能する任意のオリゴ-またはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジは、細胞外リガンド結合性ドメインに、より高い柔軟性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、300アミノ酸まで、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含むことができる。ヒンジは、例えば、CD8、CD4またはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部から、または抗体定常領域の全部もしくは一部からなど、天然に存在する分子の全部もしくは一部から誘導され得る。あるいは、ヒンジは、天然のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、完全に合成のヒンジ配列であってもよい。本発明に従って使用され得るヒンジの非限定的な例には、ヒトCD8α鎖、FcγRIIIα受容体またはIgG1の一部が含まれる。
【０１５８】
特定の実施態様によれば、ヒンジは、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジおよびFcγRIIIαヒンジからなる群より選択される。
【０１５９】
特定の実施態様によれば、ヒンジは、CD8αヒンジ(SEQ ID NO:21)、またはCD8αヒンジ(SEQ ID NO:21)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。より特定の実施態様によれば、ヒンジは、CD8αヒンジ(SEQ ID NO:21)である。他のより特定の実施態様によれば、ヒンジは、CD8αヒンジ(SEQ ID NO:21)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するCD8αヒンジの変異体である。CD8αヒンジの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、CD8αヒンジと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、CD8αヒンジと異なっていてもよい。
【０１６０】
他の特定の実施態様によれば、ヒンジは、IgG1ヒンジ(SEQ ID NO:22)、またはIgG1ヒンジ(SEQ ID NO:22)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。より特定の実施態様によれば、ヒンジは、IgG1ヒンジ(SEQ ID NO:22)である。他のより特定の実施態様によれば、ヒンジは、IgG1ヒンジ(SEQ ID NO:22)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するIgG1ヒンジの変異体である。IgG1ヒンジの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、IgG1ヒンジと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、IgG1ヒンジと異なっていてもよい。
【０１６１】
他の特定の実施態様によれば、ヒンジは、FcγRIIIαヒンジ(SEQ ID NO:23)、またはFcγRIIIαヒンジ(SEQ ID NO:23)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体である。より特定の実施態様によれば、ヒンジは、FcγRIIIαヒンジ(SEQ ID NO:23)である。他のより特定の実施態様によれば、ヒンジは、FcγRIIIαヒンジ(SEQ ID NO:23)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％、の配列同一性を有するFcγRIIIαヒンジの変異体である。FcγRIIIαヒンジの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、FcγRIIIαヒンジと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、FcγRIIIαヒンジと異なっていてもよい。
【０１６２】
キメラ抗原受容体のエクトドメインに含まれる「細胞外抗原結合性ドメイン」は、リガンド、より具体的には抗原、に結合することができる任意のオリゴまたはポリペプチドであり得る。該ドメインは細胞表面分子と相互作用できることが好ましい。例えば、細胞外リガンド結合性ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。こうして、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患、ならびにがん細胞に関連するものが含まれる。特に、細胞外リガンド結合性ドメインは、標的の抗原に対する抗体に由来する抗原結合性フラグメントを含むことができる。
【０１６３】
したがって、特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。抗原結合性フラグメントは、例えば、scFvまたはFabであり得る。
【０１６４】
特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、scFvであり、好ましくは標的の抗原に対するモノクローナル抗体に由来するものである。より具体的には、細胞外リガンド結合性ドメインは、任意で例えば5〜25アミノ酸からなるペプチドリンカー(例えば、SEQ ID NO:24に示されるGGGGSGGGGSGGGGSリンカー)により結合された、標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変フラグメント(VL)と重鎖可変フラグメント(VH)を含む一本鎖抗体フラグメント(scFv)を含むことができる。
【０１６５】
他の特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、Fabであり、好ましくは標的の抗原に対するモノクローナル抗体に由来するものである。
【０１６６】
非限定的な例として、標的の抗原は以下のものであり得る：分化分子(例：CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123およびCD138)の任意のクラスター、腫瘍関連表面抗原、例えばErbB2 (HER2/neu)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、上皮成長因子受容体(EGFR)、EGFR変異体III (EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、導管上皮ムチン、gp36、TAG-72、グリコスフィンゴリピド、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、M-CSF、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン、PSMA、生存(surviving)およびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン成長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインA (EDA)およびエクストラドメインB (EDB)、ならびにテネイシンCのA1ドメイン(TnC A1)および線維芽細胞関連タンパク質(fap)；細胞系統特異的または組織特異的抗原、例えばCD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、GM-CSF、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子、BCMA (CD269、TNFRSF 17)、またはウイルス特異的表面抗原、例えばHIV特異的抗原(例：HIV gp120)；HBV特異的抗原、EBV特異的抗原、CMV特異的抗原、HPV特異的抗原、ラッサウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、真菌特異的抗原または細菌特異的抗原、ならびにこれらの表面マーカーの任意の誘導体または変異体。抗原は必ずしも表面マーカー抗原である必要はなく、細胞表面にHLAクラスIによって提示される内在性の小さな抗原であってもよい。
【０１６７】
特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、CD19を標的抗原とし得る。そのような細胞外抗原結合性ドメインは、CD19モノクローナル抗体に由来するscFv、例えば4G7であり得る(Peipp, Saul et al., 2004)。特定の実施態様によれば、該scFvは、任意でペプチドリンカーによって連結された、CD19モノクローナル抗体4G7免疫グロブリンγ1重鎖の可変フラグメント(SEQ ID NO:25)およびCD19モノクローナル抗体4G7免疫グロブリンκ軽鎖の可変フラグメント(SEQ ID NO:26またはSEQ ID NO:27)を含む。
【０１６８】
特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、CD123を標的抗原とする。そのような細胞外抗原結合性ドメインは、CD123モノクローナル抗体に由来するscFvであり得る。
【０１６９】
他の特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、ROR1を標的抗原とする。に対して向けられる。そのような細胞外抗原結合性ドメインは、ROR1モノクローナル抗体に由来するscFvであり得る。
【０１７０】
他の特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、BCMAを標的抗原とする。そのような細胞外抗原結合性ドメインは、BCMAモノクローナル抗体に由来するscFvであり得る。
【０１７１】
他の特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、CD20を標的抗原とする。そのような細胞外抗原結合性ドメインは、CD20モノクローナル抗体に由来するscFvであり得る。
【０１７２】
他の特定の実施態様によれば、細胞外抗原結合性ドメインは、CD33を標的抗原とする。そのような細胞外抗原結合性ドメインは、CD33モノクローナル抗体に由来するscFvであり得る。
【０１７３】
本発明によるキメラ抗原受容体は、シグナル伝達ドメインおよび任意で共刺激ドメインを含む少なくとも1つのエクトドメインを含む。
【０１７４】
本発明のCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、細胞外リガンド結合性ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達に関与しており、免疫細胞の活性化と免疫応答を生じさせる。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、CARが発現されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担っている。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０１７５】
本出願において、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクターシグナル機能のシグナルを伝達して、その細胞に特殊機能を行わせる、タンパク質の部分を指す。
【０１７６】
一本鎖または多重鎖CARで使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原-受容体結合後にシグナル伝達を開始するために共同して作用する、Fc受容体またはT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能として作用するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル伝達配列の2つの異なるクラス、すなわち、抗原依存性の一次活性化を開始するものと、二次または共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するものとを含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)として知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ITAMは、syk/zap70クラスのチロシンキナーゼの結合部位としての役割を果たす種々の受容体の細胞質内尾部に見出される、明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明に従って使用できるITAMの非限定的な例には、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来するものが含まれる。
【０１７７】
特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメイン、またはFcεRIβ鎖もしくはγ鎖の細胞質内ドメインを含む。
【０１７８】
特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む。より特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:28に示されるCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。他のより特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:28に示されるCD3ζシグナル伝達ドメインに対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、SEQ ID NO:28に示されるCD3ζシグナル伝達ドメインの変異体を含む。CD3ζシグナル伝達ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、CD3ζシグナル伝達ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、CD3ζシグナル伝達ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、CD3ζシグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:28)に見られるのと同じまたは類似の機能および活性を有するものである。
【０１７９】
他の特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、FcεRIβ鎖もしくはγ鎖の細胞質内ドメインまたはその変異体を含む。
【０１８０】
より特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、FcεRIβ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:29)を含む。他のより特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、FcεRIβ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:29)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、FcεRIβ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:29)の変異体を含む。FcεRIβ鎖の細胞質内ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該細胞質内ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該細胞質内ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、FcεRIβ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:29)に見られるのと同じまたは類似の機能および活性を有するものである。
【０１８１】
他のより特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、FcεRIγ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:30)を含む。他のより特定の実施態様によれば、シグナル伝達ドメインは、FcεRIγ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:30)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、FcεRIγ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:30)の変異体を含む。FcεRIγ鎖の細胞質内ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該細胞質内ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該細胞質内ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、FcεRIγ鎖の細胞質内ドメイン(SEQ ID NO:30)に見られるのと同じまたは類似の機能および活性を有するものである。
【０１８２】
特定の実施態様によれば、本発明のCARは、少なくとも1つのエンドドメインに共刺激ドメインを含む。
【０１８３】
共刺激ドメインは、共刺激分子の任意の細胞質ドメインであり得る。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【０１８４】
「共刺激リガンド」は、T細胞上のコグネイト共刺激分子に特異的に結合し、それによりシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指し、該シグナルは、例えばTCR/CD3複合体とペプチド負荷MHC分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介する。共刺激リガンドには、限定するものではないが、CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS-L)、細胞間接着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが含まれる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、T細胞上に存在する共刺激分子、例えば、限定するものではないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドなど、と特異的に結合する抗体を包含する。
【０１８５】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって細胞による共刺激応答、例えば、限定するものではないが、増殖など、を媒介するT細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体を含むが、これに限定されない。共刺激分子の例としては、CD27、CD28、CD8、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０１８６】
本明細書で使用する「共刺激シグナル」とは、TCR/CD3連結などの一次シグナルと組み合わせて、T細胞の増殖および/または鍵分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。
【０１８７】
共刺激ドメインは、例えば、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子からの細胞質ドメインであり得る。
【０１８８】
したがって、特定の実施態様によれば、共刺激ドメインは、4-1BBからの共刺激ドメインである。特定の実施態様によれば、共刺激ドメインは、SEQ ID NO:31に示される4-1BBからの共刺激ドメインである。他の特定の実施態様によれば、共刺激ドメインは、SEQ ID NO:31に示される4-1BBからの共刺激ドメインに対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、SEQ ID NO:31に示される4-1BBからの共刺激ドメインの変異体である。4-1BBからの共刺激ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該共刺激ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該共刺激ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、4-1BBからの共刺激ドメイン(SEQ ID NO:31)に見られるのと同じまたは類似の機能および活性を有するものである。
【０１８９】
本発明によるキメラ抗原受容体は、少なくとも1つの膜貫通ドメインを含む。適切な膜貫通ドメインの際立った特徴は、細胞、好ましくは本発明では免疫細胞、特にリンパ球細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞、の表面に発現され、かつ免疫細胞の細胞応答を所定の標的細胞へ向かわせるために一緒に相互作用する能力を含む。少なくとも1つの膜貫通ドメインは、天然源または合成源から誘導され得る。少なくとも1つの膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、α、β、γもしくはδのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55(α鎖)、p75(β鎖)もしくはγ鎖、Fc受容体(特にFcγ受容体III)のサブユニット鎖、またはCDタンパク質であり得る。あるいは、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、合成であってよく、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むことができる。
【０１９０】
少なくとも1つの膜貫通ドメインは、例えば、CD8α鎖に由来し得る。したがって、特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメインである。特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:32)である。他の特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:32)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:32)の変異体である。CD8α膜貫通ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:32)に見られるのと同じまたは類似の機能を有するものである。
【０１９１】
あるいは、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、4-1BBに由来し得る。したがって、特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、4-1BB膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:33)である。特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、4-1BB膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:33)である。他の特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、4-1BB膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:33)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、4-1BB膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:33)の変異体である。4-1BB膜貫通ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、4-1BB膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:33)に見られるのと同じまたは類似の機能を有するものである。
【０１９２】
あるいは、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、Fcε受容体鎖またはその変異体に由来し得る。特に、膜貫通ドメインは、FcεRIのα、βおよびγ鎖の膜貫通ドメイン、それらの断片または変異体から選択され得る。したがって、特定の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、高親和性IgE受容体(FcεRI)のα鎖(SEQ ID NO:34)からの膜貫通ドメインである。特定の他の実施態様によれば、少なくとも1つの膜貫通ドメインは、FcεRIα鎖(SEQ ID NO:34)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有する、FcεRIα鎖の膜貫通ドメインの変異体である。FcεRIα鎖の膜貫通ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、FcεRIα鎖(SEQ ID NO:34)の膜貫通ドメインに見られるのと同じまたは類似の機能を有するものである。
【０１９３】
キメラ抗原受容体が、少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖で構成され、各ポリペプチド鎖が少なくとも1つの膜貫通ドメインを含む、多重鎖CARである場合、これらの膜貫通ドメインは、例えば、FcεRIのα、βおよびγ鎖の膜貫通ドメイン、それらの断片または変異体から選択することができる。
【０１９４】
したがって、本発明による少なくとも1つのエクトドメインを含む第1のポリペプチド鎖に含まれる少なくとも1つの膜貫通ドメインは、高親和性IgE受容体(FcεRI)のα鎖(SEQ ID NO:34)、またはFcεRIα鎖(SEQ ID NO:34)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体からの膜貫通ドメインであり得る。本発明による少なくとも1つのエンドドメインを含む第2のポリペプチド鎖に含まれる少なくとも1つの膜貫通ドメインは、FcεRIのγ鎖もしくはβ鎖(それぞれSEQ ID NO:35および36)、またはFcεRIのγ鎖もしくはβ鎖(それぞれSEQ ID NO:35および36)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体からの膜貫通ドメインであり得る。本発明による少なくとも1つのエンドドメインを含む第3のポリペプチド鎖に含まれる少なくとも1つの膜貫通ドメインは、FcεRIのγ鎖もしくはβ鎖(それぞれSEQ ID NO:35および36)、またはFcεRIのγ鎖もしくはβ鎖(それぞれSEQ ID NO:35および36)に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％、の配列同一性を有するその変異体からの膜貫通ドメインであり得る。
【０１９５】
FcεRIγ鎖またはβ鎖の膜貫通ドメインの変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の置換の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてよい。代替的に、または追加的に、そのような変異体は、1個または複数個(例えば、1〜10、1〜5、または1〜3個)のアミノ酸残基の付加または欠失の点で、該膜貫通ドメインと異なっていてもよい。適切な変異体は、FcεRIγ鎖またはβ鎖(それぞれSEQ ID NO:35または36)の膜貫通ドメインに見られるのと同じまたは類似の機能を有するものである。
【０１９６】
本発明のキメラ抗原受容体は一本鎖CARであり得る。一本鎖CARは、該CARを構成している全てのドメインが1本のポリペプチド鎖上に位置するキメラ抗原受容体である。本発明による一本鎖CARの非限定的な例は、図1Aに示される。
【０１９７】
あるいは、本発明のキメラ抗原受容体は多重鎖CARであってもよい。本発明による多重鎖CARの非限定的な例は、図2に示される。この構造によれば、少なくとも1つのエクトドメインと少なくとも1つのエンドドメインは、異なるポリペプチド鎖上にある。これらの異なるポリペプチド鎖は、互いに近接して膜に固定されており、相互作用が可能である。こうした構造では、シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインは、膜近傍位置にあり(すなわち、その内側で細胞膜に隣接しており)、これは共刺激ドメインの機能の改善を可能にすると考えられる。多重サブユニット構造はまた、T細胞の活性化をこれまで以上に制御できるCARを設計するためのより多くの柔軟性と可能性を提供する。例えば、異なる特異性を有する数種類の細胞外抗原認識ドメインを含めて、多特異的CAR構造を得ることが可能である。また、多重鎖CARへの異なるサブユニット間の相対比率を制御することも可能である。このタイプの構造については、本出願人がPCT/US2013/058005に最近記載している。
【０１９８】
したがって、本発明による多重鎖CARは、以下を含むものであり得る：
(A)(a)(i) 細胞外抗原結合性ドメインと、
(ii) 少なくとも第1の多量体化リガンド結合性ドメインおよび第2の多量体化リガンド結合性ドメインを含むスイッチドメインであって、該2つの結合性ドメインが所定の多価リガンドに結合して、該2つの結合性ドメインとそれらに結合可能な多価リガンドとを含む多量体を形成することができる、スイッチドメインと
を含む少なくとも1つのエクトドメイン;および
(aa) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン；
を含む第1のポリペプチド鎖
ならびに
(B)(b) シグナル伝達ドメインおよび任意で共刺激ドメインを含む、少なくとも1つのエンドドメイン；および
(bb) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン
を含む第2のポリペプチド鎖。
【０１９９】
特定の実施態様によれば、本発明の多重鎖CARは、以下をさらに含むことができる：
(C)(c) 共刺激ドメインを含む少なくとも1つのエンドドメイン；および
(cc) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン
を含む第3のポリペプチド鎖。
【０２００】
単一の多重鎖CARの一部としての異なる鎖のアセンブリは、例えば、IgEの高親和性受容体(FcεRI)の異なるα、βおよびγ鎖を使用することによって可能になる(Metzger, Alcaraz et al. 1986)。このような多重鎖CARは、FcεRIα鎖の高親和性IgE結合ドメインを本明細書に詳述するエクトドメインで置き換える一方で、FcεRIβ鎖および/またはγ鎖のNおよび/またはC末端尾部を、それぞれ、シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含む本明細書に詳述するエクトドメインに融合することによって、FcεRIから誘導することができる。細胞外リガンド結合性ドメインは、T細胞特異性を標的細胞の方へ向け直す役割を有し、一方シグナル伝達ドメインは免疫細胞応答を活性化する。FcεRIのα、βおよびγポリペプチドに由来する異なるポリペプチド鎖が、膜近傍位置に存在する膜貫通型のポリペプチドであるという事実は、より柔軟な構造をCARに提供して、標的抗原に対する特異性を改善し、かつ免疫細胞のバックグラウンド活性化を低減させる。
【０２０１】
こうして、特定の実施態様によれば、エクトドメインを含む第1のポリペプチド鎖(A)は、高親和性IgE受容体(FcεRI)のα鎖からの膜貫通ドメインを含むのに対して、シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含む第2のポリペプチド鎖(B)は、FcεRIのγ鎖またはβ鎖からの膜貫通ドメイン、例えばFcεRIのγ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。存在すれば、共刺激ドメインを含むエンドドメインを含む第3のポリペプチド鎖(C)は、FcεRIのγ鎖またはβ鎖からの膜貫通ドメイン、例えばFcεRIのβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。
【０２０２】
キメラ抗原受容体の少なくとも1つのエクトドメインの立体構造は、好ましくは、対応する多量体化リガンドの非存在下では、細胞外抗原結合性ドメインが標的抗原に結合できないようなものである。多量体化リガンドがスイッチドメインに結合すると、細胞外抗原結合性ドメインの標的抗原への結合を可能にするように該結合性ドメインを露出する立体構造の変化が起こる(この機構はスイッチオンと呼ばれる）。適切な立体構造は、該CARを発現している免疫細胞の細胞溶解活性(細胞傷害性)に基づいて判定することができる。「細胞溶解活性」とは、該CARを発現している免疫細胞によってもたらされる標的細胞の細胞溶解パーセントを意味する。
【０２０３】
細胞傷害性を測定する方法を以下に記載する：
付着標的細胞に関して：2×104個の特異的標的抗原(STA)陽性細胞またはSTA陰性細胞を、96ウェルプレートでウェルあたり0.1ml中に播種する。プレーティングの翌日に、STA陽性細胞とSTA陰性細胞をCellTrace CFSEで標識し、4×105個のT細胞と4時間共培養する。次いで、細胞を回収し、固定可能な生存率解析用色素fixable viability dye (eBioscience社)で染色し、MACSQuantフローサイトメーター(Miltenyi社)を用いて解析する。
【０２０４】
特異的溶解パーセントは、下記の式：
2018525006.tif 000005
を用いて算出される。
【０２０５】
浮遊標的細胞に関して：STA陽性細胞およびSTA陰性細胞をそれぞれCellTrace CFSEおよびCellTrace Violetで標識する。約2×104個のROR1陽性細胞を、96ウェルプレートでウェルあたり0.1ml中にて2×104個のSTA陰性細胞と共に4×105個のT細胞と共培養する。4時間のインキュベーション後、細胞を回収し、fixable viability dye (eBioscience社)で染色し、MACSQuantフローサイトメーター(Miltenyi社)を用いて解析する。
【０２０６】
特異的溶解パーセントは、上記の式を用いて算出される。
【０２０７】
「特異的標的抗原(STA)陽性細胞」とは、キメラ抗原受容体が特異性を示す標的抗原を発現している細胞を意味するのに対して、「STA陰性細胞」は、その特異的標的抗原を発現していない細胞を意味する。非限定的な例として、CARがCD19に対して向けられたものであれば、特異的標的抗原はCD19である。したがって、細胞溶解活性を測定するためには、CD19陽性細胞とCD19陰性細胞を使用する必要がある。
【０２０８】
それ故に、上記の細胞傷害アッセイは、免疫細胞によって発現されるキメラ抗原受容体の抗原特異性に応じて、それぞれの標的細胞に適応させる必要があろう。
【０２０９】
細胞溶解活性をアッセイするための同様の方法は、例えば、Valton et al. (2015)またはPoirot et al. (2015)にも記載されている。
【０２１０】
特定の実施態様によれば、本発明によるキメラ抗原受容体は、それを発現する免疫細胞の多量体化リガンドの非存在下での細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、モジュレートされた細胞溶解活性を該免疫細胞に与える。
【０２１１】
特定の実施態様によれば、本発明のキメラ抗原受容体は、それを発現する免疫細胞の多量体化リガンドの非存在下での細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、増加した細胞溶解活性を該免疫細胞に与えるものである。「増加した細胞溶解活性」とは、多量体化リガンドの非存在下で該CARを発現する免疫細胞によりもたらされる標的細胞の細胞溶解％と比較して、多量体化リガンドの存在下では、該免疫細胞によりもたらされる標的細胞の細胞溶解％が少なくとも10％、例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％増加することを意味する。
【０２１２】
他の特定の実施態様によれば、本発明のキメラ抗原受容体は、多量体化リガンドの非存在下での該CARを発現する免疫細胞の細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、減少した細胞溶解活性を該免疫細胞に与えるものである。「減少した細胞溶解活性」とは、多量体化リガンドの非存在下で該CARを発現する免疫細胞によりもたらされる標的細胞の細胞溶解％と比較して、多量体化リガンドの存在下では、該免疫細胞によりもたらされる標的細胞の細胞溶解％が少なくとも10％、例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも100％減少することを意味する。
【０２１３】
「対応する多量体化リガンド」とは、第1の多量体化リガンド結合性ドメインと第2の多量体化リガンド結合性ドメインの両方によって結合され、したがって、第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメイン間の多量体化(例えば、二量体化)を促進する多量体化リガンドを意味する。非限定的な例として、第1の多量体化リガンド結合性ドメインがKBP12であり、かつ第2の多量体化リガンド結合性ドメインがFRBである場合、「対応するリガンド結合性ドメイン」はラパマイシンであり得る。
【０２１４】
ポリヌクレオチド、ベクター
本発明はまた、本発明によるキメラ抗原受容体をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびベクターに関する。本発明は、キメラ抗原受容体をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、DNAおよびRNA分子などの、ポリヌクレオチドを提供する。キメラ抗原受容体が多重鎖CARである場合には、少なくとも1つのポリヌクレオチドが提供され、それは、本発明による多重鎖CARを構成するポリペプチド鎖をコードする2つ以上のヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様によれば、第1のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第1のポリヌクレオチド、および第2のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。任意で、該組成物は、第3のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。
【０２１５】
前記ポリヌクレオチド(複数可)は、発現カセットまたは発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞への導入用のプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクション用のバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクション用のプラスミドもしくはレンチウイルスなどのウイルスベクター)に含めることができる。
【０２１６】
特定の実施態様によれば、複数の異なるヌクレオチド配列は、2Aペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードするヌクレオチド配列を含む、1つのポリヌクレオチドまたはベクターに含めることができる。2Aペプチドは、ピコルナウイルス科アフトウイルス属(Aphthovirus)のサブグループにおいて同定されたものであり、コドンによってコードされた2個のアミノ酸の間にペプチド結合を形成することなしに、1つのコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす(Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)を参照されたい)。「コドン」とは、リボソームによって1個のアミノ酸残基に翻訳されるmRNA上の(またはDNA分子のセンス鎖上の)3個のヌクレオチドを意味する。したがって、2つのポリペプチドが、インフレームで存在する2Aオリゴペプチド配列により隔てられる場合には、これら2つのポリペプチドはmRNA内の単一の連続したオープンリーディングフレームから合成され得る。そのようなリボソームスキップ機構は当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによりコードされる数種のタンパク質を発現させるための幾つかのベクターにおいて使用されることが知られている。非限定的な例として、本発明では、多重鎖CARの異なるポリペプチドを細胞内で発現させるために、2Aペプチドが使用されている。
【０２１７】
FcεRなどの膜貫通型ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ向かわせるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる)がポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に提供される。分泌シグナル配列は、FcεRのものであってもよいし、別の分泌タンパク質(例えば、t-PA)に由来してもよいし、デノボ合成されてもよい。分泌シグナル配列は膜貫通核酸配列に機能的に連結され、すなわち、これらの2つの配列は正しいリーディングフレームで連結され、かつ新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ向かわせるように配置される。分泌シグナル配列は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'側に配置するのが一般的であるが、特定の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の位置に配置することもできる(例えば、Welch et al., 米国特許第5,037,743号; Holland et al., 米国特許第5,143,830号を参照されたい)。好ましい実施態様では、該シグナルペプチドはFcεRIα鎖の残基1-25を含む。
【０２１８】
当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間では少なからぬ配列変異が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞での発現のために、好ましくはヒト細胞での発現のために、コドン最適化される。コドン最適化は、対象となる配列において、所与の種(species)の高度発現遺伝子中で一般的に稀であるコドンを、そうした種の高度発現遺伝子中で一般的に頻度の高いコドンと交換することを指し、そのようなコドンは、交換されているコドンと同じアミノ酸をコードする。
【０２１９】
免疫細胞を遺伝子操作するための方法
本発明はさらに、免疫療法のための免疫細胞を作製する方法であって、該免疫細胞に本発明によるCARを導入する段階、および該細胞を増殖させる段階を含む、方法に関する。特に、免疫細胞を遺伝子操作するための方法が提供され、この方法は、以下の段階を含む：
(i) 免疫細胞、例えばT細胞など、を提供する段階；および
(ii) 該免疫細胞の表面に、本発明による少なくとも1つのキメラ抗原受容体を発現させる段階。
【０２２０】
特定の実施態様によれば、前記方法は、以下の段階を含む：
(a) 免疫細胞を提供する段階；
(b) 該細胞に本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドまたはベクターを導入する段階；および
(c) 該細胞において本発明のキメラ抗原受容体を発現させる段階。
【０２２１】
好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドは、細胞内で安定に発現されるという観点から、レンチウイルスベクターに含められる。
【０２２２】
例えば、抗腫瘍効果を高めるために、前記免疫細胞の表面に少なくとも1つの共刺激受容体をさらに発現させることが考えられる。したがって、免疫細胞を遺伝子操作するための前記方法は、(iii) 該免疫細胞の表面に少なくとも1つの共刺激受容体を発現させる段階；を含むことができる。
【０２２３】
特定の実施態様によれば、前記方法は、以下の段階をさらに含む：
(d) 該細胞に、共刺激受容体をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入する段階；および
(e) 該少なくとも1つの共刺激受容体を発現させる段階。
【０２２４】
本明細書で使用する「共刺激受容体」とは、T細胞受容体(TCR)によるTリンパ球の活性化をモジュレートする受容体ファミリーのメンバーであることを意味する。該受容体は、抗原提示細胞上に見出される1つ以上のB7抗原に応答し、特異的リガンド-受容体の組み合わせに応じて、クローン増殖の速度、細胞生存およびサイトカイン産生といった、様々なT細胞機能をモジュレートしている。本発明の免疫細胞によって発現される適切な共刺激受容体の非限定的な例としては、NKG2D (UniProtKB: P26718)およびDAP10 (UniProtKB: Q9UBK5)が挙げられる。
【０２２５】
特定の実施態様によれば、前記免疫細胞はその表面上に少なくともNKG2Dを発現する。
【０２２６】
特定の他の実施態様によれば、前記免疫細胞はその表面上に少なくともDAP10を発現する。
【０２２７】
少なくとも1つの共刺激受容体の発現は、一過性または構成的であり得る。したがって、特定の実施態様によれば、少なくとも1つの共刺激受容体は、免疫細胞によって一過性に発現される。他の特定の実施態様によれば、少なくとも1つの共刺激受容体は、免疫細胞によって構成的に発現される。
【０２２８】
送達方法
上記の種々の方法は、CARを細胞に導入する段階を含む。非限定的な例として、該CARは、1つのプラスミドベクターによってコードされるトランスジーンとして導入され得る。該プラスミドベクターは、そのベクターを受け取った細胞の同定および/または選択を提供する選択マーカーをも含むことができる。
【０２２９】
ポリペプチドは、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した結果として、細胞内においてその場で合成され得る。あるいは、該ポリペプチドを細胞の外側で産生させて、その後細胞に導入することもあり得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれる安定な形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過性の形質転換法、およびウイルスが媒介する方法などがある。該ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例：レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって、細胞に導入され得る。一過性の形質転換法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントなどを含む。該ポリヌクレオチドは、細胞内で発現されることを考慮して、ベクター、より具体的にはプラスミドまたはウイルス、に含めることができる。
【０２３０】
遺伝子改変された免疫細胞
本発明はまた、細胞を遺伝子操作する前記方法によって得ることができる免疫細胞、例えば、単離された免疫細胞、または細胞株に関する。
【０２３１】
特に、本発明による免疫細胞、例えば、単離された免疫細胞は、本発明の少なくとも1つのCARを含む。特定の実施態様によれば、免疫細胞、例えば、単離された免疫細胞は、CARの集団を含み、各CARは異なる細胞外リガンド結合性ドメインを含む。特に、該免疫細胞、例えば、単離された免疫細胞は、少なくとも1つのCARを構成するポリペプチド(複数可)をコードする1つまたは複数の外因性ポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変された免疫細胞は、抗原結合機構とは無関係に活性化されて増殖する。
【０２３２】
本明細書で言及する「免疫細胞」とは、自然免疫応答および/または適応免疫応答の開始および/または遂行に機能的に関与する造血起源の細胞を意味する。本発明による免疫細胞は幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。該免疫細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、NK細胞、B細胞またはT細胞であってもよく、T細胞は炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択される。特定の実施態様によれば、該免疫細胞は、CD4+ Tリンパ球およびCD8+ Tリンパ球からなる群より誘導され得る。より特定の実施態様によれば、該免疫細胞は、CD4+ Tリンパ球から誘導され得る。
【０２３３】
特定の実施態様によれば、該免疫細胞は、ヒト免疫細胞、例えばヒトTリンパ球である。
【０２３４】
ラパマイシンは、サイトゾルタンパク質のFK結合タンパク質12 (FKBP12)との相互作用およびその後のFKBP12/ラパマイシン複合体によるmTOR(ラパマイシンの哺乳動物標的)の阻害を介して、T細胞などの免疫細胞を直接阻害するので、内因性FKBP12/ラパマイシン/mTOR複合体の形成を阻害することが望ましいかもしれない。
【０２３５】
内因性FKBP12/ラパマイシン/mTOR複合体の形成を阻害することは、例えば、mTORタンパク質配列(NCBI参照配列: NP_004949.1; SEQ ID NO:37)内に、2035位でのアミノ酸置換などの、1つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって、達成することができる。タンパク質のアミノ酸配列内にアミノ酸置換を導入する技術は、当業者に周知であり、非限定的な例として、部位特異的変異誘発が含まれる。
【０２３６】
したがって、本発明の免疫細胞は、内因性mTORタンパク質内に、少なくとも2035位でのアミノ酸置換(セリンが別のアミノ酸で置き換えられる)を含むように、さらに改変され得る。こうして、特定の実施態様によれば、該免疫細胞は、内因性mTORタンパク質のアミノ酸配列内に、1つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、セリンがIleなどの別のアミノ酸で置き換えられる2035位でのアミノ酸置換を含む。
【０２３７】
内因性FKBP12/ラパマイシン/mTOR複合体の形成を阻害することは、例えば、内因性FKBP12遺伝子を不活性化することによっても、達成することができる。遺伝子を「不活性化する」または遺伝子の「不活性化」とは、対象となる遺伝子(例えば、FKBP12遺伝子)が機能性タンパク質の形態で発現されないことを意図している。遺伝子を不活性化する技術は、当業者に周知であり、非限定的な例として、この遺伝子を標的とする特異的なレアカットエンドヌクレアーゼ、例えば、TAL-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、またはRNA誘導型エンドヌクレアーゼの使用を含む。さらなる非限定的な例には、WO2014/191128およびSwarts et al (2014)にそれぞれ開示されるような、Cas9/Crisprまたはアルゴノート(argonaute: Ago)ベースのシステムが含まれる。
【０２３８】
したがって、本発明の免疫細胞は、内因性FKBP12遺伝子を不活性化するようにさらに改変され得る。こうして、特定の実施態様によれば、該免疫細胞は不活性化されたFKBP12遺伝子を含む。結果として、そのような免疫細胞はFKBP12タンパク質を発現しない。
【０２３９】
免疫細胞を増殖状態に保持して、新しい遺伝子改変免疫細胞の早期の再投与を避けるために、ウイルス特異的T細胞(VST)を使用することが適切であり得る。VSTは、天然形態では細胞傷害性を示すことなく、その天然受容体の仲介により内因性ウイルス抗原によって刺激され、その後増殖させられる。増殖および持続は、CAR標的抗原の存在にかかわりなく起こるであろう。本発明に従って遺伝子改変された場合、すなわち、エクトドメインスイッチシステムを有する場合、VSTは、CAR標的抗原の存在なしに増殖するその特性から利するところがあり、一方非VST T細胞は増殖せずに、最終的に死滅するであろう。CD19特異的キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたドナー由来のウイルス特異的T細胞およびその作製は、Cruz et al. (2013)に記載されている。
【０２４０】
したがって、特定の実施態様によれば、前記免疫細胞は、好ましくはドナーから単離された、ウイルス特異的T細胞(VST)である。
【０２４１】
本発明の免疫細胞の増殖および遺伝子改変に先立って、細胞の供給源が、様々な非限定的な方法を介して対象者から採取され得る。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めて、多くの非限定的な供給源から細胞を取得することができる。本発明の特定の実施態様では、入手可能な、当業者に公知の、いくつものT細胞株が使用可能である。別の実施態様では、該細胞は、健常ドナー、がんと診断された患者、または感染症と診断された患者由来であり得る。別の実施態様では、該細胞は、異なる表現型特性を提示する細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲には、前述の方法により形質転換T細胞から得られた細胞株も包含される。免疫抑制処置に耐性でありかつ前述の方法によって取得されやすい改変細胞は、本発明の範囲に包含される。
【０２４２】
本発明の免疫細胞は、同種異系(allogenic)であるようにさらに改変され得る。したがって、特定の実施態様によれば、免疫細胞は、CD52、GR、TCRα、TCRβ、HLA遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、例えばPD1およびCTLA-4、からなる群より選択される、少なくとも1つの不活性化された遺伝子をさらに含むか、またはpTalphaトランスジーンを発現することができる。より具体的には、該免疫細胞は、TCRαまたはTCRβ遺伝子から選択される、少なくとも1つの不活性化された遺伝子を含み得る。そのような不活性化は、TCRを該細胞内で機能しないようにする。この戦略は、移植片対宿主病(GvHD)を回避するのに特に有用である。遺伝子を不活性化する方法は当技術分野で公知であり、対象となる遺伝子(複数可)を、DNA開裂、好ましくは二本鎖切断によって、選択的に不活性化できるレアカットエンドヌクレアーゼの使用を含む。したがって、CD52、GR、TCRα、TCRβ、HLA遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、例えばPD1およびCTLA-4、からなる群より選択される遺伝子を、DNA開裂、好ましくは二本鎖切断によって、選択的に不活性化できるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで免疫細胞を形質転換することによって、前記遺伝子を不活性化することができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはTALEヌクレアーゼであり得る。特定の実施態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。好ましい方法および関連するTALEヌクレアーゼは、WO2013176915に記載されている。他の特定の実施態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばCas9、またはDNA誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばWO2014189628に記載されるようなアルゴノートベースの技術である。
【０２４３】
本発明の免疫細胞は、化学療法剤に耐性を有するようにさらに改変され得る。したがって、特定の実施態様によれば、免疫細胞は、少なくとも1つの不活性化された、該細胞の該薬剤への感受性に関与する遺伝子(薬剤感受性遺伝子(複数可))、例えばdcKおよび/またはHPRT遺伝子、をさらに含む。遺伝子を不活性化する方法は当技術分野で公知であり、対象となる遺伝子(複数可)を、DNA開裂、好ましくは二本鎖切断によって、選択的に不活性化できるレアカットエンドヌクレアーゼの使用を含む。したがって、該細胞の該薬剤への感受性に関与する少なくとも1つの遺伝子(薬剤感受性遺伝子)を、DNA開裂、好ましくは二本鎖切断によって、選択的に不活性化できるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで免疫細胞を形質転換することによって、前記遺伝子(複数可)を不活性化することができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはTALEヌクレアーゼであり得る。特定の実施態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼである。好ましい方法および関連するTALEヌクレアーゼは、WO2013176915に記載されている。他の特定の実施態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばCas9、またはDNA誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばWO2014189628に記載されるようなアルゴノートベースの技術である。
【０２４４】
あるいは、薬剤に対する耐性は、T細胞などの免疫細胞に、薬剤耐性遺伝子を発現させることによって、付与することができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ2 (IMPDH2)、カルシニューリンまたはメチルグアニントランスフェラーゼ(MGMT)などの、いくつかの遺伝子の変異型対立遺伝子は、本発明による免疫細胞に薬剤耐性を付与することが確認されている。
【０２４５】
T細胞の活性化および増殖
免疫細胞の遺伝子改変の前または後に関わらず、たとえ本発明の遺伝子改変免疫細胞が抗原結合機構とは無関係に活性化されて増殖するとしても、本発明の免疫細胞、特にT細胞は、一般的に、例えば以下に記載される方法を用いて、さらに活性化および増殖させることができる：米国特許6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; および米国特許出願公開第20060121005号。T細胞は、インビトロまたはインビボで増殖させることができる。
【０２４６】
一般的に、本発明の免疫細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞の活性化シグナルを発生させる物質との接触によって増殖される。
【０２４７】
例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)、またはフィトヘマグルチニン(PHA)のような分裂促進性レクチンなどの化学物質は、T細胞の活性化シグナルを発生させるために使用され得る。
【０２４８】
非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または抗CD2抗体との接触により、あるいはカルシウムイオノフォアと併用したプロテインキナーゼCアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のためには、該アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞の集団を抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞の培養に適した条件は、増殖および生存に必要な諸因子、例えば血清(例：ウシ胎仔血清またはヒト血清)、インターロイキン-2 (IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、-10、-2、IL-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に知られている細胞増殖用の他の添加剤を含むことができる適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5 (Lonza社))を含む。細胞増殖用の他の添加剤には、限定するものではないが、界面活性剤、プラスマネート(plasmanate)、およびN-アセチル-システイン、2-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれる。培地としては、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1およびX-Vivo 20、Optimizerが挙げられ、添加されたアミノ酸類、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類を含み、無血清であるか、または適量の血清(もしくは血漿)、もしくは所定のホルモンセット、および/もしくはT細胞の成長・増殖に十分な量のサイトカイン(複数可)が補充される。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養物にのみ含めて、対象者に注入することになっている細胞の培養物には含めない。標的細胞は、例えば適切な温度(例：37℃)および雰囲気(例：空気＋5％CO2)などの、増殖を支持するのに必要な条件下で維持される。刺激時間を変えて暴露されたT細胞は、異なる特性を示す可能性がある。
【０２４９】
特定の実施態様によれば、前記細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖させることができる。前記細胞はまた、インビボで、例えば、該細胞を対象者に投与した後に対象者の血液中で、増殖させることもできる。
【０２５０】
治療への応用
本発明により得られる免疫細胞は、医薬として、特にそれを必要とする患者(例えば、ヒト患者)のがんを治療するための医薬として、使用することが意図される。したがって、本発明は医薬として使用するための免疫細胞を提供する。特に、本発明は、がんの治療に用いるための免疫細胞を提供する。また、本発明の少なくとも1つの免疫細胞を含む組成物、特に薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、組成物は本発明の免疫細胞の集団を含むことができる。
【０２５１】
前記治療は、軽減的、治癒的または予防的であり得る。それは、自家免疫療法の一環であってもよいし、同種免疫療法処置の一環であってもよい。自家(autologous)とは、患者の治療に使用される細胞、細胞株または細胞集団が、該患者に由来するか、またはヒト白血球抗原(HLA)適合性ドナーに由来することを意味する。同種(allogeneic)とは、患者の治療に使用される細胞または細胞集団が、該患者に由来するのではなく、ドナーに由来することを意味する。
【０２５２】
本発明は、同種免疫療法に特に適しているが、ただし、それが、典型的にはドナーから得られるT細胞などの免疫細胞の非アロ反応性細胞への形質転換を可能にする限りにおいてである。これは標準的なプロトコルの下で行われ、必要に応じて何度でも再現することができる。得られた改変免疫細胞はプールされ、「在庫があってすぐに入手できる」(off the shelf)治療用製品として利用できるようになり、1人または数人の患者に投与され得る。
【０２５３】
治療は、主に、がんと診断された患者を治療することである。本発明に従って治療される特定のがんは、固形腫瘍を有するものであるが、液性腫瘍にも関係し得る。成人の腫瘍/がんおよび小児の腫瘍/がんも含まれる。
【０２５４】
特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、がんの治療に、より具体的には固形または液性腫瘍の治療に、使用するためのものである。特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、固形腫瘍の治療に使用される。他の特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、液性腫瘍の治療に使用される。
【０２５５】
特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、肺がん、小肺がん、乳がん、子宮がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、膵臓がんおよび皮膚がんからなる群より選択されるがんの治療に使用するためのものである。より特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は肺がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は小肺がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は乳がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は子宮がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は前立腺がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は腎臓がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は結腸がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は肝臓がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は膵臓がんの治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は皮膚がんの治療に使用される。
【０２５６】
他の特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、肉腫(sarcoma)の治療に使用するためのものである。
【０２５７】
他の特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、癌腫(carcinoma)の治療に使用するためのものである。より特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、腎臓、肺または結腸の癌腫の治療に使用される。
【０２５８】
他の特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性骨髄単球性白血病(CMML)の治療に使用するためのものである。より特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は急性リンパ芽球性白血病(ALL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は急性骨髄性白血病(AML)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は慢性リンパ球性白血病(CLL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は慢性骨髄性白血病(CML)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は慢性骨髄単球性白血病(CMML)の治療に使用される。
【０２５９】
他の特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、リンパ腫、例えばB細胞リンパ腫、の治療に使用するためのものである。より特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は原発性CNSリンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物はホジキンリンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は非ホジキンリンパ腫の治療に使用される。より特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物はびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は濾胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は辺縁帯リンパ腫(MZL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は小細胞型リンパ球性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物はマントル細胞リンパ腫(MCL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物はバーキットリンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物はワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は節性辺縁帯B細胞性リンパ腫(NMZL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は脾辺縁帯リンパ腫(SMZL)の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は血管内大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は原発性滲出性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物はリンパ腫様肉芽腫症の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、CNS(中枢神経系)の原発性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、皮膚の原発性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、高齢者のEBV陽性びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、炎症に関連するびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、ALK陽性大細胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は形質芽球性リンパ腫の治療に使用される。他のより特定の実施態様によれば、該免疫細胞または組成物は、HHV8関連多中心性キャッスルマン病で発生する大���胞型B細胞性リンパ腫の治療に使用される。
【０２６０】
特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は、ウイルス感染症、例えば、HIV感染症またはHBV感染症、の治療に使用するためのものである。
【０２６１】
特定の実施態様によれば、前記免疫細胞は、治療すべき患者、例えばヒト患者、に由来する。特定の他の実施態様によれば、該免疫細胞は少なくとも1人のドナーに由来する。
【０２６２】
前記治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子治療、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される1つまたは複数の治療法と組み合わせて行うことができる。
【０２６３】
特定の実施態様によれば、本発明の免疫細胞は、患者に投与されると、強力なインビボ免疫細胞増殖を起こすことができ、かつ体液中で長期間、好ましくは1週間、より好ましくは2週間、さらにより好ましくは少なくとも1ヶ月間、生き続けることができる。本発明による免疫細胞はこれらの期間中生き残ると予想されるが、患者の体内でのその寿命は、1年、好ましくは6ヶ月、より好ましくは2ヶ月、さらにより好ましくは1ヶ月、を超えないことを目的としている。
【０２６４】
本発明による免疫細胞または組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、埋め込みまたは移植を含めて、任意の都合のよい方法で行うことができる。本明細書に記載の免疫細胞または組成物は、患者に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄腔内に、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ内注射により、または腹腔内に投与され得る。
【０２６５】
特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は静脈内注射によって投与される。
【０２６６】
他の特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は非経口的に投与される。
【０２６７】
他の特定の実施態様によれば、前記免疫細胞または組成物は腫瘍内に投与される。こうした投与は、腫瘍への直接注射または腫瘍に隣接した注射によって行うことができる。
【０２６８】
前記細胞または細胞集団の投与は、体重1kgあたり104〜109個の細胞、好ましくは105〜106細胞/kg体重(これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む)の投与からなり得る。該細胞または細胞集団は、1回量以上で投与することができる。別の実施態様では、前記有効量の細胞は単回量として投与される。別の実施態様では、前記有効量の細胞は、ある期間にわたって2回量以上として投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。該細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々のニーズは様々であるとはいえ、特定の疾患または状態のための所与の細胞タイプの有効量の最適範囲を決定することは、当業者の技能の範囲内である。有効量とは、治療上または予防上の利益をもたらす量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば、同時治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。
【０２６９】
特定の実施態様によれば、免疫細胞は、様々な関連する治療法と併せて(例えば、その前に、それと同時に、またはその後に)患者に投与され、そのような治療法としては、限定するものではないが、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン-2、シタラビン(ARA-Cとしても知られる)などの薬剤による治療、またはMS患者に対するナタリズマブ治療、または乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはPML患者に対する他の治療などがある。さらなる実施態様では、本発明のT細胞は、以下と組み合わせて使用することができる：化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸およびFK506、抗体、または他の免疫除去剤(immunoablative agent)、例えばCAMPATH、抗CD3抗体もしくは他の抗体療法、サイトキン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射。これらの薬剤は、カルシウム依存性ホスファターゼのカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびFK506)か、または増殖因子誘発型シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93)。さらなる実施態様では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植と併せて、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体を用いるT細胞除去療法と併せて(例えば、その前に、それと同時に、またはその後に)、患者に投与される。別の実施態様では、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤(例：リツキサン)のようなB細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施態様では、対象者は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。特定の実施態様では、移植に続いて、対象者は、増殖させた本発明の遺伝子改変免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施態様では、増殖させた細胞が手術の前または後に投与される。
【０２７０】
また、本発明のこの局面には、治療を必要とする患者を治療する方法であって、(a)本発明の少なくとも1つの免疫細胞、好ましくは該免疫細胞の集団、を提供する段階；および(b)該免疫細胞または集団を該患者に投与する段階；を含む方法が包含される。
【０２７１】
また、本発明のこの局面には、本発明の少なくとも1つの免疫細胞、好ましくは該免疫細胞の集団を用いて、医薬を調製する方法が包含される。したがって、本発明は、医薬の製造における、本発明の少なくとも1つの免疫細胞、好ましくは該免疫細胞の集団の使用を提供する。好ましくは、そのような医薬は、上記で特定した疾患の治療に使用するためのものである。
【０２７２】
本発明の免疫細胞は、第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインに結合することができる多価リガンドと組み合わせて使用される(または使用するためのものである)ことが特に想定される。これに関して、本発明は、有効量の第1および第2の多量体化リガンド結合性ドメインの多価リガンドを前記患者に投与することを企図している。
【０２７３】
ラパマイシンなどの、多価リガンドは、例えば約0.01〜10mg/kg体重の用量で、前記患者に投与することができる。特定の実施態様によれば、多価リガンドは約0.01〜5mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.01〜4mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.01〜3mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.01〜2mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.01〜1mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.05〜5mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.05〜4mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.05〜3mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.05〜2mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.05〜1mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.1〜5mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.1〜4mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.1〜3mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.1〜2mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.1〜1mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.5〜5mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.5〜4mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.5〜3mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.5〜2mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約0.5〜1mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約1〜5mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約2〜5mg/kg体重の用量で投与される。特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは約2.5〜5mg/kg体重の用量で投与される。
【０２７４】
多価リガンドの投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、埋め込みまたは移植を含めて、任意の都合のよい方法で行うことができる。多価リガンドは、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄腔内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ内注射により、または腹腔内に投与することができる。
【０２７５】
特定の実施態様によれば、多価リガンドは静脈内注射によって投与される。
【０２７６】
特定の他の実施態様によれば、多価リガンドは、任意で本発明による免疫細胞または免疫細胞の集団と共に、腫瘍内に投与される。このようなアプローチは、治療される腫瘍(例えば固形腫瘍)の外側にあるCAR含有免疫細胞の活性化(オン・スイッチング)を妨げるか、または制限する。
【０２７７】
その他の定義
-「エクトドメイン」は、細胞外空間(細胞の外側の空間)へと延びる本発明のキメラ抗原受容体の一部を指す。
【０２７８】
-「エンドドメイン」は、細胞の細胞質へと延びる本発明のキメラ抗原受容体の一部を指す。
【０２７９】
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書では一文字コードにより指定され、例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、DはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０２８０】
-「置換」または「置換された」とは、1つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と取り換えることによるポリペプチドの改変を意味し、例えば、ポリペプチド配列中のアルギニン残基をグルタミン残基と取り換えることは、アミノ酸置換である。
【０２８１】
-「保存的置換」とは、あるアミノ酸残基を類似の側鎖を有する異なる残基で置換することを意味し、したがって、典型的には、同一または類似のアミノ酸のクラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を含む。限定ではなく例として、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換され得る；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えばセリンおよびトレオニンで置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンで置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばリシンおよびアルギニンで置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換される；疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される。
【０２８２】
-「非保存的置換」とは、ポリペプチド中のアミノ酸を、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸で置換することを指す。非保存的置換は、特定されたグループ内ではなく、グループ間のアミノ酸を使用することができ、(a)置換(例えば、グリシンのプロリンによる置換)の領域におけるペプチド骨格の構造、(b)電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、酸性アミノ酸の塩基性または脂肪族アミノ酸による置換；芳香族アミノ酸の小さなアミノ酸による置換；および親水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換であり得る。
【０２８３】
-「欠失」または「欠失された」は、基準ポリペプチド中の1個または複数個のアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を指す。欠失は、ポリペプチド機能を保持しながら、該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうちの1個以上のアミノ酸、2個以上のアミノ酸、5個以上のアミノ酸、10個以上のアミノ酸、15個以上のアミノ酸、もしくは20個以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の10％まで、またはアミノ酸の総数の20％までを除去することを含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部および/または末端部分に向けられ、様々な実施態様では、欠失は連続セグメントを含んでもよいし、不連続であってもよい。
【０２８４】
-「挿入」または「挿入された」とは、基準ポリペプチドへの1個または複数個のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。挿入は、1個以上のアミノ酸、2個以上のアミノ酸、5個以上のアミノ酸、10個以上のアミノ酸、15個以上のアミノ酸、または20個以上のアミノ酸の付加を含み得る。挿入は、ポリペプチドの内部、またはカルボキシもしくはアミノ末端に存在し得る。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであってもよいし、基準ポリペプチド中のアミノ酸の1個以上によって隔てられてもよい。
【０２８５】
- ヌクレオチドは次のように指定される：ヌクレオシドの塩基を指定するために一文字コードが使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドの場合、rはgまたはa (プリンヌクレオチド)を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、aまたはtを表し、vはg、aまたはcを表し、bはg、tまたはcを表し、hはa、tまたはcを表し、nはg、a、tまたはcを表す。
【０２８６】
- 本明細書で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片などの、ヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)、または天然に存在するヌクレオチドの類似体(例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマーの形態)、または両方の組み合わせから構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に改変を有し得る。糖修飾は、例えば、1個以上のヒドロキシル基をハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基で置き換えることを含むか、または糖はエーテルまたはエステルとして官能基化され得る。さらに、糖部分の全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造体で置き換えることができる。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン、または他の周知の複素環式置換物が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０２８７】
-「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤/化学物質および分子(タンパク質または核酸)を細胞接触の状態にする(すなわち、「接触させる」)か、または細胞内もしくは細胞内コンパートメントに送達する(すなわち、「導入する」)ために、本発明で使用することができる任意の送達ベクターを意味する。それには、限定するものではないが、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学物質キャリア、高分子キャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルションまたは他の適切なトランスファーベクターが含まれる。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、巨大分子(遺伝子、タンパク質)、またはプラスミドなどの他のベクター、または透過性ペプチドの送達を可能にする。これらの後の方のケースでは、送達ベクターは分子キャリアである。
【０２８８】
- 用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」には、限定するものではないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体の、非染色体の、半合成のもしくは合成の核酸からなり得る線状もしくは環状のDNAもしくはRNA分子が含まれる。好ましいベクターは、自律複製が可能なもの(エピソーマルベクター)および/またはそれに連結されている核酸の発現が可能なもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
【０２８９】
ウイルスベクターとしては、以下が挙げられる：レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例：アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルトミクソウイルス(例：インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例：狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例：麻疹およびセンダイウイルス)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖DNAウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例:単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、およびポックスウイルス(例：ワクシニア、鶏痘およびカナリア痘ウイルス)。その他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例としては、以下が挙げられる：トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLVグループ、レンチウイルス、スプーマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
【０２９０】
-「レンチウイルスベクター」とは、HIVベースのレンチウイルスベクターを意味し、該レンチウイルスベクターは、その比較的大きなパッケージング能力、低い免疫原性、および広範囲の様々な細胞タイプに高効率で安定に形質導入するその能力のために、遺伝子送達にとって非常に有望である。レンチウイルスベクターは、通常、3種のプラスミド(パッケージング、エンベロープおよびトランスファー)またはそれより多くのプラスミドを産生細胞に一過性にトランスフェクトした後に生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上の受容体との相互作用を介して標的細胞に侵入する。侵入すると、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスDNAであり、これは感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質である。「組込み型レンチウイルスベクター(またはLV)」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムへの組み込みが可能な、そのようなベクターを意味する。反対に、「非組込み型レンチウイルスベクター(またはNILV)」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を介して標的細胞のゲノムに組み込まれない、効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０２９１】
- 送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーションもしくはエレクトロポレーションまたはこれらの派生技術のような任意の細胞透過化技術と関連させるか、または組み合わせることができる。
【０２９２】
-「細胞」とは、インビトロ培養のための、任意の真核生物の生細胞、これらの生物に由来する初代細胞および細胞株を意図している。
【０２９３】
-「初代細胞」とは、生体組織(すなわち、生検材料)から直接採取されて、インビトロでの増殖のために樹立された細胞であって、集団倍加をほとんど起こしておらず、したがって、腫瘍形成性のまたは人工的に不死化された連続細胞株と比較して、それらが由来する組織の主要な機能的構成要素および特徴をより代表している細胞を意図している。
【０２９４】
非限定的な例として、細胞株は、以下からなる群より選択することができる：CHO-K1細胞; HEK293細胞; Caco2細胞; U2-OS細胞; NIH 3T3細胞; NSO細胞; SP2細胞; CHO-S細胞; DG44細胞; K-562細胞; U-937細胞; MRC5細胞; IMR90細胞; Jurkat細胞; HepG2細胞; HeLa細胞; HT-1080細胞; HCT-116細胞; Hu-h7細胞; Huvec細胞; Molt 4細胞。
【０２９５】
これらの細胞株は全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を産生、発現、定量、検出、研究するための細胞株モデルを提供するために、本発明の方法によって改変され得る；これらのモデルはまた、研究および生産において、ならびに非限定的な例として化学、バイオ燃料、治療学および農学などの様々な分野において、関心対象の生物学的活性分子をスクリーニングするために使用され得る。
【０２９６】
-「幹細胞」とは、自己複製能および分化細胞を生成する能力を備えた細胞を意味する。より明確には、幹細胞は、母細胞と同一の娘細胞を生成すること(自己複製)ができ、かつより制限された能力を有する子孫(分化細胞)を産生することができる細胞である。
【０２９７】
-「NK細胞」とは、ナチュラルキラー細胞を意味する。NK細胞は、大型顆粒リンパ球として定義され、Bリンパ球とTリンパ球を生成する共通のリンパ球系前駆細胞から分化した第3種の細胞を構成する。
【０２９８】
-「(突然)変異」とは、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)またはポリペプチド配列中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50個またはそれ以上のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図している。こうした変異は、遺伝子またはその調節配列のコード配列に影響し得る。それはまた、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造/安定性にも影響し得る。
【０２９９】
-「変異体」とは、親分子のアミノ酸配列中の少なくとも1個の残基の変異または交換によって得られるポリペプチド変異体を意図している。
【０３００】
-「遺伝子」とは、染色体に沿って直線状に配列されたDNAのセグメントからなる遺伝の基本単位を意味し、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメントをコードする。遺伝子は、典型的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1つまたは複数のコード配列(エキソン)、場合によりイントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサーおよび/またはサイレンサーをさらに含み得る。
【０３０１】
- 本明細書で使用する用語「遺伝子座」は、染色体上のDNA配列の(例えば、遺伝子の)特定の物理的位置である。用語「遺伝子座」は、染色体上のレアカットエンドヌクレアーゼ標的配列の特定の物理的位置を指すことができる。そのような遺伝子座は、本発明に従ってレアカットエンドヌクレアーゼにより認識され、かつ/または開裂される標的配列を含むことができる。本発明の関心対象の遺伝子座は、細胞の遺伝物質の本体(すなわち、染色体中)に存在する核酸配列を適格とするだけでなく、該遺伝物質の本体とは独立して存在し得る遺伝物質の部分、例えば、非限定的な例としてプラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアなどの細胞小器官をも適格とする、ことが理解される。
【０３０２】
-「融合タンパク質」とは、もとは別々のタンパク質またはそれらの一部をコードする2つ以上の遺伝子の接合によりもたらされる、当技術分野で周知のプロセスの結果を意図しており、この「融合遺伝子」の翻訳によって、もとのタンパク質のそれぞれから誘導された機能特性を有する単一のポリペプチドが生じる。
【０３０３】
-「同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、「配列同一性％」および「同一性パーセント」は、本明細書では、アミノ酸配列と参照アミノ酸配列との間の比較を指すために使用される。本明細書で使用する「配列同一性％」は、次のように2つのアミノ酸配列から算出される：Genetic Computing GroupのGAP(グローバルアラインメントプログラム)のバージョン9を用いて、ギャップオープンペナルティ-12(ギャップの最初のヌル(null)に関して)およびギャップ伸長ペナルティ-4(ギャップ中の各追加ヌルに関して)を有するデフォルトのBLOSUM62マトリックスを使用して、配列同士をアラインメントする。アラインメント後、一致した数を参照アミノ酸配列のアミノ酸数に対する百分率として表すことによって同一性パーセントを算出する。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドに対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％または99％の同一性を有し、かつ好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。
【０３０４】
-「参照配列」または「参照アミノ酸配列」とは、別の配列と比較される、定義された配列を指す。
【０３０５】
- 本明細書で使用する用語「対象者」または「患者」は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーを含む。
【０３０６】
本発明の上記の説明は、当業者が同じものを作製して使用することを可能にさせるように、それを作製しかつ使用する方法およびプロセスを提供するものであり、この実施可能性は、特に、原記載の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために提供される。
【０３０７】
数量的限界または範囲が本明細書に記載されている場合には、その終点が含まれる。また、数量的限界または範囲内の全ての数値および部分範囲は、明示的に記入されているかのように、具体的に含められる。
【０３０８】
本発明を一般的に説明してきたが、さらなる理解は特定の具体的な例を参照することによって得ることができる。こうした例は、本発明の説明のためのみに提供され、特に明記しない限り、限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０３０９】
実施例1：小分子(ラパマイシン)スイッチオンmcCAR19およびmcCAR123の開発 - mRNA送達 - 表面検出
構築物およびmRNA調製
全ての構築物はpCLS24707 (SEQ ID NO:38)が起源であったが、これは多重鎖CAR(mcCAR)のα鎖(SEQ ID NO:39)、β鎖(SEQ ID NO:40)およびγ鎖(SEQ ID NO:41)をコードする。FRBドメイン(SEQ ID NO: 2)およびFKBPドメイン(SEQ ID NO: 1)をコードする配列は、デノボ合成された(GeneCust社)。scFv、ヒンジ-膜貫通-細胞質内α鎖ドメイン、FRBおよびFKBPをPCRによりさらに増幅して、ゴールデンゲートアセンブリ(golden gate assembly)適合性の断片(SEQ ID NO:42〜45)を作製した。さらに、FRB-FKBPおよびFKBP-FRB断片を、4-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:19)または−GS-4x-EAAAR-リンカー(SEQ ID NO:20)を用いて標準的な分子生物学手法により作製した(SEQ ID NO:46および47)。次いで、これらの断片を一連の制限およびライゲーションによりアセンブルして、pCLS26563、pCLS26564、pCLS26881、およびpCLS27123 (SEQ ID NO:48〜51)を生じさせた。これらの構築物によってコードされるそれぞれのアミノ酸配列をSEQ ID NO:52〜55に示す。
【０３１０】
全ての個々の鎖は、mRNA合成の前に、α鎖-F/α鎖-R、β鎖-F/β鎖-Rおよびγ鎖-F/γ鎖-R (SEQ ID NO:56〜61)のオリゴ対を用いてPCRにより増幅した。該PCR産物から、異なるα鎖、β鎖、γ鎖をコードするmRNAをインビトロで転写し、mMessage mMachine T7 Ultraキット(Life technologies社)を用いてメーカーの指示に従ってポリアデニル化した。RNAをRNeasyカラム(Qiagen社)で精製し、サイトポレーション媒体T(cytoporation medium T)中に溶出し、Nanodrop ND-1000分光光度計を用いて260nmでの吸光度を測定することにより定量した。RNAの品質を変性ホルムアルデヒド/MOPSアガロースゲル上で確認した。
【０３１１】
トランスフェクション
活性化の3〜6日後、Tリンパ球に、AgilePulse MAXシステム(Harvard Apparatus社)を用いてメッセンジャーRNAのエレクトロトランスファー(electrotransfer)によりトランスフェクトした。活性化ビーズの除去後、細胞をペレット化し、サイトポレーション媒体T中に＞28×106細胞/mlで再懸濁した。5×106個の細胞を、0.4cmキュベット中で6.9μgの全RNA (2.5μgのα鎖、1.9μgのβ鎖および2.5μgのγ鎖)と、または8.4μgの全RNA (4μgの改変α鎖、1.9μgのβ鎖および2.5μgのγ鎖)と混合した。エレクトロポレーションは、2回の1200Vでの0.1msパルス、続いて4回の130Vでの0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーション後、細胞を2mLの培地中に希釈し、37℃/5％CO2でインキュベートした。mRNAエレクトロトランスファーの2時間後、ビヒクル(DMSO)またはラパマイシン(100nM)を19時間添加した。
【０３１２】
フローサイトメトリー
α鎖の検出のための1回目の標識化は、2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジド中の抗Fab'2-ビオチン(ヤギ抗マウスIgG、Fab'2フラグメント特異的、115-066-072、Jackson Immunoresearch社)を用いて4℃で20分間行い、続いて2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジドを用いて2回の洗浄工程を行った。2回目の標識化は、2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジド中のストレプトアビジン-APCを用いて4℃で20分間行い、続いて2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジド中での洗浄工程とPBS中での洗浄工程を行った。細胞の生存を、PBS中のefluor450 (ebioscience社 65-0863-14)を用いて4℃で20分間モニターし、続いて2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジドによる洗浄工程を行い、2％PFAで固定した。フローサイトメトリーをMACSQUANT (Miltenyi Biotec社)を用いて行い、データ解析をFlowJoソフトウェアで行った。
【０３１３】
得られたデータは、FRB-FKBPまたはFKBP-FRBドメインがα鎖に組み込まれた場合に、ラパマイシンの存在下で表面露出が改善されたことを明確に示した(図3Aおよび3B)。
【０３１４】
実施例2：小分子(AP21967)スイッチオンmcCARCD19の開発 - mRNA送達 - 表面検出
構築物、mRNA調製およびフローサイトメトリー
scFv/抗原相互作用をオン/オフ状態間で切り替える統合システムを設計するために、FRB、FKBP12、またはFRBとFKBP12の融合物を、CD8aヒンジドメインとscFvドメインの間に挿入した(図1B)。開始実験として、初代T細胞に、多重鎖CAR (mcCAR)の各鎖をコードするmRNAをトランスフェクトした。ラパマイシンの添加後に、細胞外ヒンジドメインの検出の変化を、CD19標的化scFvのFab'2ドメイン(100nM、20時間)を追跡することによってモニターした。小分子(ラパマイシン)の非存在下では、高レベルの表面検出は、図3Aに示されるように、野生型mcCARおよびFKBP-mcCARについてのみ達成され、この場合、陽性細胞が90％超で、全体的に高いMFIを有することが見出された。ストーク(stalk)領域におけるFKBPとFRBの両方の存在は、それらの相互位置とは無関係に、CD19 scFvの表面検出を事実上消滅させた(陽性細胞が40％未満で、該mcCARと比較してMFIの最大40倍減少を有する)。興味深いことに、陽性細胞の割合またはMFIを考慮するとき、ラパマイシンの添加は、mcCAR、FRB-mcCARおよびFKB-mcCAR構築物にほとんど影響を与えなかった(図3B)が、それは、FKBP/FRB-mcCARおよびFRB/FKBP-mcCAR構築物の表面検出を強く改善し(MFIを考慮する場合には最大15倍、陽性細胞の割合を考慮する場合には3倍)、該システムをオフからオンの状態に変えた。ラパマイシン添加時のこの検出の変化は、スイッチオン成分を含有しているCAR鎖の安定化を含めて、様々な要因に起因し得る。しかし、この小分子は、T細胞の表面で該CARのFKBP/FRB-CARの検出を効率的にオンにするために、常にいつでも必要とされた、ことに留意しなければならない。
【０３１５】
また、ラパマイシンの合成アナログである合成非免疫抑制性AP21967も試験された；これはFKBP12に結合するが、mTORのFRBドメインへの結合を促進しない。そのため、T2098L変異をFRBドメインに導入して(FRB*と称する)、FKBP/AP21967/FRB*複合体が形成されるようにした。
【０３１６】
FRBドメイン中のT2098L変異を、市販のキット(Agilent社)および標準的な分子生物学的手法を用いてFKBP-FRBドメインに導入して、FKBP-FRB*ドメイン(SEQ ID NO:62)を生じさせた。scFv、FKBP-FRB*ドメイン、ヒンジ-膜貫通-細胞質内ドメインを含むα鎖のアセンブリは、pCLS27039 (SEQ ID NO:63)をもたらした。この構築物によってコードされるアミノ酸配列をSEQ ID NO:64に示す。FRB*は、T2098L変異を有するFRBの変異体(SEQ ID NO:4)を指す。
【０３１７】
mRNA調製、トランスフェクションおよびフローサイトメトリーによる表面提示の測定は、ラパマイシンの代わりにAP21967を用いて実施例1に記載のように実施した。
【０３１８】
得られたデータは、FKBP-FRB*ドメインがα鎖に組み込まれた場合に、AP21697の存在下で表面露出が改善されたことを明確に示した(図4)。
【０３１９】
スイッチオンシステムのためのAP21967の有効用量範囲を求めるために、用量応答アッセイを行った(図8A)。得られた結果は、トランスフェクトされた改変CARの量とは無関係に、100nMでの最大シグナル誘導および約10nM (8.2〜10.1nM)のEC50値を示した。スイッチオンアプローチのポータビリティ(portability)を検証するために、CD123を標的とするCARも設計した。10nMの同様のEC50値(7.3〜8.7nM、図8B)によって示されるように、scFvの性質はスイッチオン特性に影響しないことが判明した。注目すべきことに、EC50は、患者の末梢血または腫瘍組織において報告されたラパマイシン濃度と同じ範囲にあり、スイッチオンシステムが臨床上関連のある濃度に感受性であり得ることを示唆している。
【０３２０】
実施例3：小分子(AP21967)スイッチオンmcCARの開発 - mRNA送達 - 細胞傷害性の誘導
実施例2からのFKBP-FRB* mcCAR CD19を付与された遺伝子改変T細胞の細胞溶解活性は、フローサイトメトリーベースの細胞傷害アッセイを用いて評価した。このアッセイでは、CAR標的抗原を提示する標的細胞(Daudi CD19陽性)がCellTrace(商標)CFSEで標識され、対照細胞がCellTrace(商標)バイオレットで標識される。混合した標的細胞集団(1：1比)は、X-Vivo-15培地100μLの最終容量中の様々な比率の遺伝子改変エフェクターCAR T細胞(エフェクター/標的比20：1)と共に、ビヒクル(エタノール)またはAP21967 (100nM)の存在下に一定時間(5時間)にわたり37℃で共インキュベートした。
【０３２１】
全細胞集団を回収し、PBSで洗浄し、eFluor780生存マーカーで標識し、その後2％PFAで固定した。固定した細胞をフローサイトメトリーで解析して、それらの生存率を決定した。フローサイトメトリーおよびデータ解析は、実施例1に記載のように実施した。
【０３２２】
得られたデータは、AP21697の存在下でオンに切り替わった細胞溶解活性の改善を明確に示した(図5A)。
【０３２３】
AP21967の用量応答(0、1、5、10、33、100nM)も実施され、遺伝子改変CAR T細胞の結果として生じる細胞溶解能を測定した。その結果、標的細胞殺傷のレベルは、予想通り、AP21967の変化と相関した(図5B)。約10nM (12.7nM)のEC50が算出され、表面検出を用いて測定されたものの範囲内であった。標的細胞殺傷のレベルはまた、CAR検出のレベルとも相関した(図9)。
【０３２４】
全体として、ここに示した結果は、論理ゲーティング(logic gating)戦略のための統合スイッチオンシステムを作製するために、CAR分子のヒンジドメインを遺伝子操作することの原理の証拠を提供する。
【０３２５】
実施例4：小分子(AP21967)スイッチオンmcCARの開発 - mRNA送達 - 他の小分子競合調整
mRNA調製、トランスフェクションおよびフローサイトメトリーによる表面提示の測定は、実施例2に記載のように実施し、トランスフェクトされたT細胞を10nMのAP21967および漸増量のタクロリムスと共に同時にインキュベートした。
【０３２６】
条件：AP21967：10nM、タクロリムス：0nM、10nM、30nM、100nMまたは500nM。T細胞を37℃/5％CO2で20時間インキュベートした。
【０３２７】
得られたデータは、FKBP-FRB*ドメインがα鎖に組み込まれた場合に、小分子AP21967に起因する改変CARの表面提示を、第2の小分子(タクロリムス)を用いて調整できることを明確に示した(図6)。
【０３２８】
実施例5：小分子(AP21967)スイッチオンscCARの開発 - mRNA送達 - 表面検出
実施例2に示したCAR細胞外ドメイン(α鎖)を、一本鎖CAR (scCAR)をコードするプラスミドDNAを作製するための鋳型として使用した。CD8α膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:32)、CD3-T細胞受容体のζ鎖の細胞質内シグナル伝達領域(SEQ ID NO:28)、および共刺激4-1BB (CD137)由来のシグナル伝達ドメイン(SEQ ID NO:31)を用いてCARを完成させた。標準的な分子生物学的手法に従って、一連の制限およびライゲーションを用いたゴールデンゲートクローニングによりscCARをアセンブルして、pCLS27572 (FKBP-FRB*)(SEQ ID NO:65)、pCLS27603 (FKBP)(SEQ ID NO:66)、pCLS27604 (FRB*)(SEQ ID NO:67)を生じさせた。これらの構築物によりコードされるそれぞれのアミノ酸配列をSEQ ID NO:68〜70に示す。
【０３２９】
mRNA調製(CAR中およびプラスミド上にそれぞれ位置するオリゴ対scCAR-F (SEQ ID NO:71)およびscCAR-R (SEQ ID NO:72)を使用)、トランスフェクションおよびフローサイトメトリーによる表面提示の測定は、ラパマイシンの代わりにAP21967を用いて実施例1に記載のように実施した。scCARの検出のための一次標識化は、2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジド中のFcタグ付き組換えCD123 (Lake Pharma社)を用いて4℃で20分間行い、続いて2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジドによる2回の洗浄工程を行った。二次標識化は、2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジド中のPE標識ヤギ抗マウスIgG(サブクラス1+2a+2b+3)Fcγフラグメント特異的(Jackson Immunoresearch社)を用いて4℃で20分間行い、続いて2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジド中での洗浄工程とPBS中での洗浄工程を行った。細胞外標識化の後、PBS中のefluor450またはefluor780 (ebioscience社)を用いて細胞の生存を4℃で20分間モニターし、続いて2％PBS FBS, 2mM EDTA, 0.1％アジドによる洗浄工程を行い、2％PFAで固定した。
【０３３０】
得られたデータは、FKBP-FRB*ドメインがα鎖に組み込まれた場合に、AP21697の存在下で表面露出が改善されたことを明確に示した(図7)。
【０３３１】
実施例6：mTORゲノム編集と組み合わせた小分子(ラパマイシン)スイッチオンmcCARの開発
ラパマイシンは、サイトゾルタンパク質のFK結合タンパク質12 (FKBP12)との相互作用、続いてFKBP12/ラパマイシン複合体によるmTORの阻害によってT細胞を直接阻害する。
【０３３２】
セリン/トレオニン-プロテインキナーゼmTORのアミノ酸(セリン)2035をコードするトリプレットの周辺配列(またはトリプレットそれ自体)を標的とする、一本鎖または二本鎖切断を生じるデザイナーヌクレアーゼを設計して、構築/産生させる。位置2035の遺伝子修正/変異を行うために、内因性配列の2つの相同性アームによって囲まれた所望の変異塩基(複数可)を含むドナーDNAを設計した。デザイナーヌクレアーゼによるドナーDNAまたは修正/変異したゲノムDNAの開裂を防ぐために、さらなるサイレント変異を加える。
【０３３３】
T細胞に、デザイナーヌクレアーゼをコードする遺伝物質およびドナーDNAをトランスフェクションまたは形質導入する。次に、内因性遺伝子座に所望の変異を含むT細胞を選択または単離する。ラパマイシンの存在下での遺伝子改変T細胞の改善された増殖特性を記録して、非遺伝子改変T細胞と比較する。
【０３３４】
その後、実施例1に示したスイッチオンCARを、新たに遺伝子改変されたT細胞において実施し、ラパマイシンの存在下での改善されたCARの表面提示および細胞溶解特性を記録する。
【０３３５】
実施例7：FKBP12ゲノム編集(ノックアウト)と組み合わせた小分子(ラパマイシン)スイッチオンmcCARの開発
ラパマイシンは、サイトゾルタンパク質のFK結合タンパク質12 (FKBP12)との相互作用、続いてFKBP12/ラパマイシン複合体によるmTORの阻害によってT細胞を直接阻害する。
【０３３６】
FKBP12遺伝子の配列を標的とする、二本鎖切断を生じるデザイナーヌクレアーゼを設計して、構築/産生させる。T細胞に、該デザイナーヌクレアーゼをコードする遺伝物質をトランスフェクションまたは形質導入する。次に、内因性遺伝子座に所望のノックアウトを含むT細胞を選択または単離する。ラパマイシンの存在下での遺伝子改変T細胞の改善された増殖特性を記録して、非遺伝子改変T細胞と比較する。
【０３３７】
その後、実施例1に示したスイッチオンCARを、新たに遺伝子改変されたT細胞において実施し、ラパマイシンの存在下での改善されたCARの表面提示および細胞溶解特性を記録する。
【０３３８】
実施例8：MOLM13-Luc腫瘍細胞を静脈注射したNOGマウスにおけるヒト改変誘導性CD123 CAR+ T細胞の抗腫瘍活性研究
この研究の目的は、ヒトCD123抗原に対する誘導性キメラ抗原受容体(CAR)を発現するようにCellectis社によって遺伝子改変された、ヒトT細胞のインビボでの抗腫瘍活性を実証することであった。この誘導性システムは、非免疫抑制性のラパマイシン合成アナログ(ARIAD社が開発したAP21967, # 635055)により作動する。
【０３３９】
実施例1に記載したスイッチオンmcCAR-CD123を発現するヒトT細胞の抗腫瘍活性は、MOLM13-Luc腫瘍細胞を静脈注射したNOGマウスにおいて評価した。ラパマイシン合成アナログAP21967の反復注射(3mg/kg/注射)を、マウスの腹膜腔(腹腔内、IP)に図10に示すように行った。
【０３４０】
MOLM13-Luc細胞株を確立するために、MOLM13細胞(DSMZ ACC 554)は、GFPおよびホタルルシフェラーゼ(amsbio社 LVP438-PBS)をコードするレンチウイルスを形質導入された。GFP陽性細胞はネオマイシン(参照番号10131-027, Gibco社, Life Technologies社, Saint-Aubin社, フランス)を用いて選択された。MOLM13-Luc細胞は、15％ウシ胎仔血清(参照番号: 3302, Lonza社, Verviers, ベルギー)、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン(参照番号: DE17-602E, Lonza社)を補充した2.05mM L-グルタミン(参照番号: BE12-702F, Lonza社)を含有するRPMI 1640培地に懸濁して、加湿雰囲気(5％CO2、95％空気)中37℃で増殖させる。細胞を血球計で計数し、その生存率を0.25％トリパンブルー排除アッセイにより評価し、新鮮培地中で週に2回(80万個/mL)継代する。
【０３４１】
マウスへの注射当日、スイッチオンmcCAR-CD123 CARにより形質転換された凍結ヒトT細胞は、1mLあたり1〜2×106個の生細胞の範囲内にあると評価される。
【０３４２】
7〜8週齢の18匹の健康な雌NOG (NOD.Cg-Prkdcscidll2rgtm1Sug/JicTac)マウスをTaconic社(Ry, デンマーク)から入手し、実験動物の管理と使用に関するNRCガイド(NRC Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に従って飼育した。
【０３４３】
MOLM13-Luc細胞(0.25×106個/マウス)の静脈注射をD-7(7日目)に実施した。
【０３４４】
細胞の注射および処置は以下のように計画された：
第1群(形質導入されていないT細胞/ビヒクル)は、D0(0日目)に、x個の形質導入されていないT細胞(RPMI 1640中200μL)の単回IV注射を受け、続いてビヒクルの1日2回のIP注射を10日間連続して受ける(2Q1D×10)；
第2群(形質導入されていないT細胞/AP21967)は、D0に、x個の形質導入されていないT細胞(RPMI 1640中200μL)の単回IV注射を受け、続いて3mg/kg/注射のAP21967の1日2回のIP注射を10日間連続して受ける(2Q1D×10)；
第3群(CAR T細胞/ビヒクル)は、D0に、X個のCAR陽性T細胞を含むx個の改変CAR T細胞(RPMI 1640中200μL)の単回IV注射を受け、続いてビヒクルの1日2回のIP注射を10日間連続して受ける(2Q1D×10)；
第4群(CAR T細胞/AP21967)は、D0に、X個のCAR陽性T細胞を含むx個の改変CAR T細胞(RPMI 1640中200μL)の単回IV注射を受け、続いてAP21967の1日2回のIP注射を10日間連続して受ける(2Q1D×10)。
【０３４５】
T細胞の注射をDO、D2、D4、D7、D10、D15およびD21に行い、マウスにラパログを1日2回注射した。
【０３４６】
マウスを体重測定に関して毎日モニターし、臨床および死亡記録、ならびに処置をVivo Manager(登録商標)データベース(Biosystemes社, Dijon, フランス)で記録した。生存曲線およびグラフ体重がそれぞれ図11および図12に報告されるが、そこからはAP21967によって誘導されたmcCAR-CD123 CARがマウスの生存率を増加させたことが明らかである。
【０３４７】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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