(57)【要約】  本開示は、感染性であるが非複製性である不活化改変ワクシニアアンカラ（MVA）、及び悪性固形腫瘍治療のための免疫療法（単独又は免疫チェックポイント遮断剤との併用）としてのその使用に関する。特筆すべき実施態様は、固形悪性腫瘍と診断された対象動物における免疫応答の誘発に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上の固形悪性腫瘍を罹患する対象動物を治療する方法であって、前記腫瘍の細胞に、不活化改変ワクシニアアンカラ（不活化MVA）をデリバリーし、それによって腫瘍を治療する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
量が下記の1つ以上の達成に有効である請求項1に記載の方法：
g．前記対象動物の免疫系を誘発して前記腫瘍に対する免疫応答を増大させること；
h．前記腫瘍のサイズを縮小すること；
i．前記腫瘍を根絶すること；
j．前記腫瘍の増殖を阻害すること；
k．前記腫瘍の転移を阻害すること；及び
l．転移腫瘍を縮小するか、又は根絶すること。
【請求項３】
前記腫瘍が、不活化MVAのデリバリー部位に位置する腫瘍、又は前記部位及び前記対象動物の身体の他の場所の両方に位置する腫瘍を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫応答が下記の1つ以上を含む、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法：
f．前記腫瘍内及び/又は腫瘍流入領域リンパ節の細胞傷害性CD8+T細胞を増加させること；
g．I型IFNの誘発を介して、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟を誘発すること；
h．腫瘍細胞を認識する前記対象動物の活性化CD4+エフェクターT細胞を前記腫瘍内で又は全身的に誘発すること；
i．免疫抑制（調節）CD4+T細胞を前記腫瘍内で減少させること；
j．前記腫瘍の細胞を誘発してそれらの表面にMHCクラスIを発現させ、さらにI型IFNを産生させること。
【請求項５】
前記腫瘍が原発性若しくは転移性メラノーマ又は原発性若しくは転移性結腸癌腫である、請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記不活化MVAのデリバリーが離れた時間間隔で反復される、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記反復デリバリーが、数週間、数カ月又は数年、或いは利益が持続するかぎり又は最大耐性用量に到達するまで無期限に継続する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記不活化MVAのデリバリーが非経口ルートによる、請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記不活化MVAのデリバリーが腫瘍内又は静脈内注射による、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象動物が人間である、請求項1−9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記不活化MVAが、各投与につき約105−1010プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる、請求項1−10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記不活化MVAが、各投与につき約106から約109プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記デリバリーが1カ月に1回から1週間に2回の範囲内の頻度で反復される、請求項1−12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記デリバリーが1週間毎に1回反復される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記不活化MVAがUV不活化MVAである、請求項1−14のいずれか1項以上に記載の方法。
【請求項１６】
前記不活化MVAが熱不活化MVAである、請求項1−14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
エフェクターT細胞の前記誘発及び活性化が前記腫瘍内の調節CD4+細胞の減少を伴う、請求項4に記載の方法。
【請求項１８】
前記不活化MVAが、I型IFNの誘発を介して前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟を誘発する、請求項4に記載の方法。
【請求項１９】
前記不活化MVAが、感染腫瘍細胞で、MHCクラスIの発現及びI型インターフェロンの誘発を誘発する、請求項4に記載の方法。
【請求項２０】
対象動物における固形悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象動物の免疫系を誘発して前記腫瘍に対する免疫応答を増大させるために有効な量の不活化MVAを前記対象動物の腫瘍細胞にデリバリーする工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
前記免疫応答が全身性である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫応答が、下記の1つ以上を達成するか又は達成の一助となる、請求項20に記載の方法：
前記腫瘍のサイズの縮小、前記腫瘍の根絶、腫瘍増殖又は転移増殖の阻害。
【請求項２３】
前記不活化MVAが下記の1つ以上の達成に有効である、請求項20又は21に記載の方法：
m．前記対象動物の免疫系を誘発して前記腫瘍に対する免疫応答を増大させること；
n．前記腫瘍のサイズを縮小すること；
o．前記腫瘍を根絶すること；
p．前記腫瘍の増殖を阻害すること；
q．前記腫瘍の転移を阻害すること；及び
r．転移腫瘍を縮小するか、又は根絶すること。
【請求項２４】
前記腫瘍が、不活化MVAのデリバリー部位に位置する腫瘍、又は前記部位及び前記対象動物の身体の他の場所の両方に位置する腫瘍を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫応答が下記の1つ以上を含む、請求項20−24のいずれか1項に記載の方法：
k．前記腫瘍内及び/又は腫瘍流入領域リンパ節の細胞傷害性CD8+T細胞を増加させること；
l．I型IFNの誘発を介して、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟を誘発すること；
m．腫瘍細胞を認識する前記対象動物の活性化CD4+エフェクターT細胞を前記腫瘍内で又は全身的に誘発すること；
n．免疫抑制（調節）CD4+T細胞を前記腫瘍内で減少させること；
o．前記腫瘍細胞を誘発してそれらの表面にMHCクラスIを発現させ、さらにI型IFNを産生させること。
【請求項２６】
前記腫瘍が原発性若しくは転移性メラノーマ又は原発性若しくは転移性結腸癌である、請求項20−25のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記不活化MVAのデリバリーが離れた時間間隔で反復される、請求項20−25のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記反復デリバリーが、数週間、数カ月又は数年、或いは利益が持続するかぎり又は最大耐性用量に到達するまで無期限に継続する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記不活化MVAのデリバリーが非経口ルートによる、請求項20−28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記不活化MVAのデリバリーが腫瘍内又は静脈内注射による、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象動物が人間である、請求項20−30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記不活化MVAが、各投与につき約105−1010プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記不活化MVAが、各投与につき約106から約109プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記デリバリーが1カ月に1回から1週間に2回の範囲内の頻度で反復される、請求項20−33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
前記デリバリーが1週間毎に1回反復される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記不活化MVAがUV不活化MVAである、請求項20−35のいずれか1項以上に記載の方法。
【請求項３７】
前記不活化MVAが熱不活化MVAである、請求項20−35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
対象動物における悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象動物の免疫系を誘発して前記腫瘍に対する免疫応答を増大させるために有効な量の不活化MVAを前記対象動物の腫瘍細胞にデリバリーする工程、及び、腫瘍細胞、間質細胞又は腫瘍浸潤免疫細胞によって引き出されて腫瘍内の免疫抑制メカニズムを遮断するために有効な免疫チェックポイント遮断剤の第二の量を前記対象動物に一体的に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記投与が非経口ルートによる、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記デリバリーが腫瘍内注射により、かつ前記投与が静脈内ルートによる、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記デリバリー及び前記投与の両方が静脈内ルートによる、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記デリバリー及び前記投与の両方が腫瘍内注射による、請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫チェックポイント遮断剤が、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤及びCTLA4阻害剤から成る群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４４】
前記阻害剤の各々が抗体である、請求項44に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍が原発性若しくは転移性メラノーマ又は原発性若しくは転移性結腸癌である、請求項38に記載の方法。
【請求項４６】
それぞれが、離れた間隔を有するそれ自身の投与スケジュールにしたがって、前記不活化MVAがデリバリーされ、前記免疫チェックポイント遮断剤が投与される、請求項38−46のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記不活化MVAの第一の用量が最初にデリバリーされ、ある時間の経過後に前記免疫チェックポイント遮断剤の第一の用量が投与される、請求項47に記載の方法。
【請求項４８】
前記デリバリー及び投与が同じ全期間を通して並行して実施される、請求項48又は49に記載の方法。
【請求項４９】
前記不活化MVA及び前記免疫チェックポイント遮断剤の一方又は両方が、数週間、数カ月又は数年の期間、或いは利益が持続するかぎり又は最大耐性用量に到達しないかぎり無期限にそれぞれデリバリー及び投与される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記不活化MVAが、各投与につき約105−1010プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる、請求項38又は48に記載の方法。
【請求項５１】
前記不活化MVAが、各投与につき約106から約109プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる、請求項51に記載の方法。
【請求項５２】
前記不活化MVAデリバリーが1カ月に1回から1週間に2回の範囲内の頻度で反復される、請求項47−52のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
前記不活化MVAデリバリーが1週間毎に1回反復される、請求項53に記載の方法。
【請求項５４】
前記不活化MVAがUV不活化MVAである、請求項38−54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
前記不活化MVAが熱不活化MVAである、請求項38−54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５６】
前記不活化MVA及び前記免疫チェックポイント遮断剤が同時に投与される、請求項38に記載の方法。
【請求項５７】
前記不活化MVA及び前記免疫チェックポイント遮断剤が同じ組成物で投与される、請求項57に記載の方法。
【請求項５８】
前記不活化MVA及び前記免疫チェックポイント遮断剤が腫瘍内にデリバリーされる、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記不活化MVA及び前記免疫チェックポイント遮断剤が連続的に投与される、請求項38に記載の方法。
【請求項６０】
前記不活化MVA及び前記免疫チェックポイント遮断剤が腫瘍内にデリバリーされる、請求項60に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）本出願は、米国仮特許出願62/120,862（2015年2月25日出願）の優先権を主張する。前記仮特許出願の完全な開示は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（政府援助）本明細書で開示する研究は、米国立衛生研究所のグラントK08AI073736及びR56 AI095692によって提供された補助を受けている。米国政府は本発明で権利を有することができる。
（技術分野）
本発明は、一般的に腫瘍学、ウイルス学及び免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、ポックスウイルス、特に感染性であるが非複製性であり、さらに例えば熱又は紫外線（UV）照射によって改変されてある不活化改変ワクシニアアンカラウイルス（“不活化MVA”）に関係する。本不活化MVAは、癌治療用免疫療法剤として、単独療法又は免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせる併用療法のいずれかとして用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
免疫系及び癌
悪性腫瘍はもともと通常療法に対して耐性を有し、目下の重大な治療課題である。免疫療法は、目覚ましい研究領域であり、ある種の癌タイプの治療に新たに加えられる選択肢となった。免疫療法によるアプローチは、免疫系を刺激して腫瘍細胞を識別しそれらを破壊の標的とすることができるという理論的根拠を拠りどころにする。
多くの研究が、癌進行における免疫系成分の弁別的存在の重要性を支持している[1]。臨床データは、腫瘍に高密度に浸潤するリンパ球は臨床結果の改善につながることを示唆している[2]。激しいリンパ球浸潤と患者の生存との間の相関関係が、多様なタイプの癌（メラノーマ、卵巣癌、頭頸部癌、乳癌、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、胆嚢癌、及び食道癌を含む）で報告されている[3]。腫瘍の免疫浸潤物は、マクロファージ、樹状細胞（DC）、マスト細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナイーブ及びメモリーリンパ球、B細胞並びにエフェクターT細胞（Tリンパ球）を含み、前記は主として、腫瘍細胞によって発現された抗原の認識及びその後のT細胞による腫瘍細胞の破壊に必要である。
癌細胞による抗原の提示及び腫瘍細胞に対して潜在的に作用し得る免疫細胞の存在にもかかわらず、多くの事例で免疫系は活性化されない。この現象に対する手がかりは、免疫系細胞に強制的に他の免疫系細胞を阻害させることによって自分自身を免疫応答から保護する腫瘍細胞の能力である。例えば、CD4+T細胞はT調節（Treg）細胞に分化する能力を有する（前記細胞は活性化T細胞を阻害する能力を有する）。加えて、癌細胞はCD8+T細胞のエフェクター機能を障害し、抗腫瘍免疫応答の回避をもたらすことができる。最終的には、腫瘍のミクロ環境の局所免疫抑制的本質は免疫監修作用と一緒になって、標的抗原を発現しない癌細胞亜集団の流出をもたらし得る。抗腫瘍活性の保存及び/又は復元を可能にする方法を見つけることは極めて重要である。
I型IFNは宿主の抗腫瘍免疫で重要な役割を果たすことが確定された[4]。IFNAR1欠損マウスは、腫瘍細胞移植後の腫瘍発育にいっそうの感受性を有する。IFNAR1欠損マウスでは偶発的な腫瘍特異性T細胞プライミングもまた不完全である[5,6]。より最近の研究は、細胞質ゾルDNAセンシング経路は、先天性免疫系による腫瘍由来DNAの認識で重要であることを示した。順繰りに、先天性免疫系は抗腫瘍CD8+T細胞免疫の発達をもたらす[7]。この経路はまた、放射線誘発抗腫瘍免疫でも重要な役割を果たす[8]。
【０００３】
メラノーマ
メラノーマ（もっとも致死性の高い癌）は米国及び全世界で最速で増加している癌である。その発生率は、主として過剰な日光暴露及び日焼け装置の使用により白人の若い女性で1980年以来50%増加した。アメリカ癌協会によれば、2016年に米国ではほぼ76,380人がメラノーマと診断され、10,130人（又は1時間に1人）がメラノーマで死亡すると予想される。ほとんどの事例で、進行性メラノーマは通常療法（化学療法及び放射線照射を含む）に耐性である。結果として、転移性メラノーマを有する人々は非常に予後が悪く、余命はわずかに6から10カ月である。約50%のメラノーマがBRAF（重要な腫瘍促進遺伝子）に変異を有するという発見は、この疾患の標的誘導療法への道を開いた。BRAF阻害剤を用いる初期臨床試験は、目覚ましいけれども残念ながら持続的ではない応答をBRAF変異メラノーマの患者で示した。したがって、これらの患者とともにBRAF変異を欠くメラノーマ患者のためのまた別の治療戦術が希求される。
ヒトの病理学データは、メラノーマ病巣内のT細胞浸潤物の存在は患者のより長期の生存と正の相関性を有することを示している[9]。メラノーマに対する防御における免疫系の重要性は、免疫療法（例えば免疫アクチベーターIFN-α2b及びIL-2［10］）の部分的成功とともに、免疫チェックポイント遮断療法（抗CTLA-4及び抗PD-1/PD-L1を含み、個々に用いられるか又は併用される[11−17]）に対する転移性メラノーマ患者の前例のない臨床応答によってさらに支持される。しかしながら、多くの患者は、免疫チェックポイント遮断療法単独に対しては応答しない。ウイルス療法の追加は免疫チェックポイント遮断に対する耐性を克服する可能性がある（前記は動物腫瘍モデルによって支持される）[18]。
【０００４】
ポックスウイルス
ポックスウイルス（例えば操作ワクシニアウイルス）は、転移癌の腫瘍溶解療法の最前線にある[19]。ワクシニアウイルスは大型ウイルスであり、迅速なライフサイクルを有する[20]。ポックスウイルスは、癌細胞で多数のトランスジーンを発現し、したがって治療有効性を強化するベクターとしてふさわしい[21]。前臨床試験及び臨床試験は、通常療法難治性進行癌の治療のために腫瘍溶解ワクシニアウイルス及び他のポックスウイルスを使用することの有効性を示した[22−24]。ポックスウイルス系腫瘍溶解療法は、細胞溶解、アポトーシス及び壊死の組み合わせにより癌細胞殺滅の利点を有する。前記はまた、先天的な免疫センシング経路を始動する（免疫センシング経路は、腫瘍への免疫細胞の補充及び抗腫瘍適応免疫応答の発達を促進する）。臨床試験（例えばJX-594）における従来の腫瘍溶解ワクシニア株は、腫瘍選択性を強化するためにチミジンキナーゼ欠損を有し、さらに免疫応答を刺激するためにトランスジーン（例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF））を有する野生型ワクシニアウイルスを用いる[21]。しかしながら、多くの試験が、野生型ワクシニアウイルスは抗原提示細胞（APC）に対して免疫抑制作用を有し[25−28]、したがって腫瘍それ自体の免疫抑制作用及び免疫回避作用に付け足されることを示した。
ポックスウイルスは、多数の先天性免疫シグナリング経路の細胞外及び細胞内成分を差し止めるタンパク質をコードすることによって、それら経路の回避及び対抗に極めて優れている[29]。改変ワクシニアウイルスアンカラ（MVA）は、ニワトリ胚線維芽細胞での連続継代により開発された弱毒ワクシニアウイルスである。MVAは親ワクシニアゲノムの31kbが欠失し、WHOがスポンサーとなった天然痘根絶キャンペーン時のワクチンとして用いられ成功した[30−32]。MVAは、HIV、結核、マラリア、インフルエンザ、及びコロナウイルスだけでなく癌でもワクチンベクターとして重点的に研究されてきた[33−38]。
MVAは、いくつかの細胞内免疫調節遺伝子（K1L、N1L及びA52Rを含む）の欠失又は切り詰めを有する（前記遺伝子は先天性免疫応答の調節に関与している[39−46]）。他方、MVAは二機能性Z-DNA/dsRNA結合タンパク質（重要なワクシニア病毒性因子）をコードするE3L遺伝子を保持する[47−55]。ヒト単球由来樹状細胞のMVA感染はDC活性化を引き起こすことが示されている[56]。Waiblerら[57]は、ネズミF1t3L-DCのMVA感染はTLR-非依存I型IFN応答を始動することを報告した。加えて、ヒトマクロファージのMVA感染は、TLR2/TLR6/MyD88及びMDA5/MAVS依存経路を介してI型IFN及び前炎症性サイトカイン及びケモカインを始動する[58]。
細胞質ゾルのDNAのセンシングは、I型IFN及びサイトカインの産生とともに細胞ストレス応答に至る連続事象を始動する。STING（IFN遺伝子の刺激因子）が、細胞質ゾルDNAセンシング経路のための重要なアダプターとして同定された[59−61]。DNAセンサーの本質は、重要なDNAセンサーとしての環状GMP-AMPシンターゼ（cGAS）及びその生成物の環状GMP-AMPの発見まであいまいであった（前記はGpA段階で予期されない2’,5’結合及びApG段階で標準的な3’,5’を含む[62−68]）。その後の研究で、STINGがcGAMPによって活性化されるキーアダプターであり、したがって、インターフェロン応答をもたらすキナーゼ及び転写因子を必要とする下流事象のカスケードを媒介することが確認された[66,68,69]。我々は、ネズミの通常的樹状細胞のMVA感染は、細胞質ゾルDNAセンサーcGAS、そのアダプターSTING、及び転写因子IRF3及びIRF7によって媒介される細胞質ゾルDNAセンシング経路を介してI型IFNを誘発することを報告した。対照的に、野生型ワクシニアウイルスはこの経路を活性化できない。尾静脈注射によるMVAの静脈内接種はWTマウスでI型IFN分泌を誘発した（前記はSTING又はIRF3欠損マウスでは減少した[70]）。さらにまた、我々は、ワクシニア病毒因子E3及びN1は細胞質ゾルDNAセンシング経路で阻害的役割を果たすことを示した[70]。
【発明の概要】
【０００５】
ある特徴では、本開示は1つ以上の固形悪性腫瘍を罹患する対象動物を治療する方法を提供し、前記方法は、腫瘍の細胞に不活化した改変ワクシニアアンカラ（不活化MVA）をデリバリーし、それによって腫瘍を治療する工程を含む。
別の特徴では、対象動物で固形悪性腫瘍を治療する方法が提供され、前記方法は、当該対象動物の免疫系を誘発して当該腫瘍に対する免疫応答を増大させるために有効な不活化MVA量を対象動物の腫瘍細胞にデリバリーする工程を含む。
さらに別の特徴では、本開示は対象動物で悪性腫瘍を治療する方法を提供し、前記方法は、当該対象動物の免疫系を誘発して当該腫瘍に対する免疫応答を増大させるために有効な不活化MVA量を当該対象動物の腫瘍細胞にデリバリーする工程、及び腫瘍によって発現される免疫チェックポイントを遮断するために有効な免疫チェックポイント遮断剤の第二の量を当該対象動物に一体的に投与する工程を組み合せて、それによって当該腫瘍を治療する工程を含む。本明細書で用いられるように、“デリバリー”は“投与”を意味し、前者はほとんどの場合不活化MVAの関係で用いられ、後者は免疫チェックポイント遮断剤の関係で用いられる。
明確にそうではないと述べないかぎり、下記に記載する実施態様は上述の特徴の各々に関係すること、及びさらに別の又はより具体的な実施態様の特色物はある特定の特徴内で個々に提示され得るか又はそれらの1つ以上が合体され得ることは理解されるであろう。
【０００６】
いくつかの実施態様では、不活化MVAの量は下記の1つ以上を達成するために有効である：
a．対象動物の免疫系を誘発して腫瘍に対する免疫応答を増大させる；
b．腫瘍のサイズを縮小する；
c．腫瘍を根絶する；
d．腫瘍の増殖を阻害する；
e．腫瘍の転移を阻害する；及び
f．転移腫瘍を減少させるか、又は根絶する。
いくつかの実施態様では、治療される腫瘍には、不活化MVAのデリバリー部位に位置する腫瘍、又は前記部位及び対象動物の身体の他の場所の両方に位置する腫瘍が含まれる。換言すれば、たとえ不活化MVAが対象動物の固形腫瘍の1つだけに又はいくつかにのみデリバリーされ得るとしても、MVAデリバリーの効果は全身性である。
より具体的な実施態様では、免疫応答は下記の1つ以上を含む：
a．腫瘍内及び/又は腫瘍流入領域リンパ節内の細胞傷害性CD8+T細胞の増加；
b．I型IFNの誘発を介する、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟誘発；
c．腫瘍細胞を認識する対象動物の活性化CD4+エフェクターT細胞を腫瘍内で又は全身的に誘発する；
d．腫瘍内の免疫抑制（調節）CD4+T細胞の減少；
e．腫瘍表面にMHCクラスIを発現し、さらにI型IFN並びに他の炎症性サイトカイン及びケモカインの1つ以上を産生する腫瘍細胞の誘発。
いくつかの実施態様では、腫瘍は、原発性若しくは転移性メラノーマ又は原発性若しくは転移性結腸癌である。
【０００７】
いくつかの実施態様では、対象動物は人間である。
いくつかの実施態様では、不活化MVAのデリバリーは、離れた時間間隔で反復され、より具体的な実施態様では、反復デリバリーは、数週間、数カ月又は数年、或いは利益が持続するかぎり又は最大耐性用量に到達するまで無期限に継続され、さらに別の実施態様では、不活化MVAのデリバリーは、1カ月に1回から1週間に2回の範囲内の頻度で反復され、いくつかのより具体的な実施態様では、デリバリーは1週間毎に1回反復される。
いくつかの実施態様では、不活化MVAのデリバリーは非経口ルートにより、より具体的な実施態様では、腫瘍内注射又は静脈内注射による。
いくつかの実施態様では、不活化MVAは、各投与につき約105−1010プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされ、より具体的な実施態様では、各投与につき約106から約109プラーク形成単位（pfu）の範囲内の投薬量でデリバリーされる。
いくつかの実施態様では、不活化MVAはUV不活化MVAであり、他の実施態様では、熱不活化MVAであり、さらに他の実施態様では、熱及びUV不活化MVAの組合せである。
いくつかの実施態様では、エフェクターT細胞の誘発及び活性化は前記腫瘍の調節CD4+細胞の減少を伴い、いくつかの実施態様では、不活化MVAは、I型IFNの誘発を介して前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟を誘発し、いくつかの実施態様では、不活化MVAは、感染腫瘍細胞で、MHCクラスIの発現を誘発し、さらに1つ以上のI型インターフェロン並びに他の炎症性サイトカイン及びケモカインを誘発する。
いくつかの実施態様では、誘発される免疫応答は、下記の1つ以上を達成するか又は役立つ：腫瘍サイズの縮小、腫瘍の根絶、腫瘍又は転移増殖の阻害。繰り返せば、腫瘍は不活化MVAを注射される腫瘍に限定されない。
【０００８】
上記に記載した第三の特徴の具体的な実施態様には上述の実施態様及び下記の追加される実施態様が含まれる：
いくつかの実施態様では、不活化MVAのデリバリーは腫瘍内注射により、免疫チェックポイント遮断剤の投与は静脈内ルートによる。他の実施態様では、デリバリー及び投与の両方が静脈内ルートにより、さらに他の実施態様では、デリバリー及び投与の両方が腫瘍内注射による。いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント遮断剤は、抗PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤及びCTLA4阻害剤から成る群から選択される。具体的な実施態様では、前記は抗体である。
いくつかの実施態様では、それぞれが、離れた間隔のそれ自身の投与スケジュールにしたがって、不活化MVAはデリバリーされ、免疫チェックポイント遮断剤は投与される。いくつかの実施態様では、デリバリー及び投与は同じ全期間を通して並行して実施される。
いくつかの実施態様では、不活化MVAの第一の用量が最初にデリバリーされ、ある時間の経過後に（例えば1週間後に）免疫チェックポイント遮断剤の第一の用量が投与される。いくつかの実施態様では、不活化MVA及び免疫チェックポイント遮断剤の一方又は両方が、数週間、数カ月又は数年の期間、或いは利益が持続するかぎり又は最大耐性用量に到達しないかぎり無期限にそれぞれデリバリー及び投与される。
いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント遮断剤及び不活化MVAは同時に投与され、いくつかの実施態様では、それらは同じ組成物で投与され、いくつかの実施態様では、それらは両方とも腫瘍内にデリバリーされる。いくつかの実施態様では、同時デリバリーは、免疫チェックポイント遮断剤のより低い用量の利用を可能にし、当該2つの活性薬剤の併用効果は相乗的であり得る。
開示したいずれの実施態様又は複数の実施態様から選択されるいずれの実施態様の特色物又は特色物の組合せも除外することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】MVAよりも加熱-MVAがより高レベルのI型IFN産生をネズミcDCで誘発することを示すデータの一連のグラフによる提示である。図1Aは、MVA（MOI＝10）又は等価量の加熱-MVAを感染させたcDC（GM-CSF培養の骨髄由来DC）で、無ウイルスコントロールと比較した相対的なIFNA4及びIFNB mRNAの発現レベルを示す棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図1Bは、cDCのMVA又は加熱-MVA感染に続いて時間とともに培地に分泌されるIFN-α及びIFN-βの濃度のグラフである（***、p＜0.001）。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図1Cは、ワクシニアE3のp25、p-IRF-3、及びβ-アクチン（ローディングコントロール）のタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの走査画像である。“hpi”＝感染後時間。“M”＝疑似感染コントロール。
【図２】加熱MVA誘発I型IFN産生は、cGAS及びSTINGによって媒介される細胞質ゾルDNAセンシング経路に依存することを示すデータの一連のグラフによる提示である。図2Aは、cGAS+/+及びcGAS-/-マウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCで、無ウイルスコントロールと比較したIFNA4及びIFNBの相対的mRNA発現を示す棒グラフである（***、p＜0.001）。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図2Bは、cGAS+/+及びcGAS-/-マウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCの培地中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度の棒グラフである（***、p＜0.001）。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図2Cは、STING+/+及びSTINGGt/Gtマウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCで、無ウイルスコントロールと比較したIFNA4及びIFNBの相対的mRNAの発現を示す棒グラフである（***、p＜0.001）。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図2Dは、STING+/+及びSTINGGt/Gtマウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCの培地中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度の棒グラフである（***、p＜0.001）。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図2Eは、加熱-MVA感染後のcGAS+/+及びcGAS-/- cDCのp-IRF-3及びβ-アクチンのタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの走査画像である。“hpi”＝感染後時間。“M”＝疑似感染コントロール。図2Fは、加熱-MVA感染後のSTING+/+及びSTINGGt/Gt cDCのp-IRF-3及びβ-アクチンのタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの走査画像である。“hpi”＝感染後時間。“M”＝疑似感染コントロール。図2Gは、STINGGt/Gt及びWTマウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCの表面マーカーMHCI（MHCクラスI）、CD40、CD86及びCD80の発現を示す一連のグラフである。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。
【図３】加熱-MVA誘発I型IFN産生は、転写因子IRF3、IRF7及びIFNAR1に依存することを示す一連のグラフである。図3Aは、WY、IRF3-/-、IRF5-/-及びIRF7-/-マウスから作製したcDCを加熱-MVAに感染させた後のIFNA4及びIFNB mRNA発現の倍数誘発を示すグラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図3Bは、WT、IRF3-/-、IRF5-/-及びIRF7-/-マウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCの培地中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度を示すグラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。図3Cは、IFNAR+/+及びIFNR-/-マウスから作製したcDCの加熱-MVA感染後のIFNA4及びIFNB mRNAの倍数誘発を示す棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図3Dは、IFNAR+/+及びIFNR-/-マウスから作製し加熱-MVAに感染させたcDCの培地中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度を示す棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図４】加熱-MVAはin vivoでMVAよりも高レベルのI型IFNを誘発し、さらにSTING/IRF3/IRF7依存態様であることを示す一連の散布図である。図4Aは、MVA（2ｘ107pfu）又は等価量の加熱-MVAを尾静脈注射により接種したWTマウスの血清中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度の散布図である。血清は注射後6時間で収集した（***、p＜0.001；n＝5）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図4Bは、加熱-MVAを接種したIFNAR+/+及びIFNR-/-マウスの血清中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度の散布図である（**、p＜0.01；***、p＜0.001；n＝5）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図4Cは、加熱-MVAを接種したWT、IRF3-/-、IRF7-/-又はSTINGGt/Gtマウスの血清中の分泌IFN-α及びIFN-βの濃度の散布図である（n＝5）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図５】B16-F10メラノーマ細胞の加熱-MVA感染は、I型IFN並びに前炎症性サイトカイン及びケモカインの産生を誘発することを示す一連のグラフによる提示である。図5Aは、B16-F10メラノーマ細胞の加熱-MVA又はMVA感染に続く、IFNA4、IFNB、CCL5及びIL6のmRNAレベルの倍数誘発を示す一連の棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図5Bは、加熱-MVA又はMVA感染に続くB16-F10メラノーマ細胞の培地中の分泌IFN-α及びIFN-β、CCL5及びIL6の濃度を示す一連の棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図5Cは、加熱-MVA又はMVAに感染させたB16-F10細胞のp-IRF、IRF及びGAPDH（ローディングコントロール）のタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの走査画像である。“hpi”＝感染後時間。図5Dは、無ウイルスコントロール又は、MVA若しくは加熱-MVAに感染させたB16-F10細胞でのMHCI発現のグラフである。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図６】55℃で1時間の熱不活化を用いて処理したMVAは、cDCの高レベルIFN分泌を誘発することを示すデータの一連のグラフによる提示である。図6A及び6Bは、種々の温度で1時間熱処理したMVAを感染させたcDCの培地中の分泌IFN-α（A）及びIFN-β（B）の濃度をそれぞれ示す棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。
【図７】加熱-MVAの注射は腫瘍の根絶及び全身性抗腫瘍免疫をもたらすことを示すデータの一連のグラフによる提示である。図7Aは、PBS（白丸；n＝5）又は加熱-MVA（黒丸、n＝10）の注射後の時間（日数）に対する腫瘍体積の図である。代表的な実験が示され、少なくとも5回繰り返されている。図7Bは、PBS（白丸；n＝5）又は加熱-MVA（黒丸、n＝10）を注射した担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である（****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、少なくとも5回繰り返されている。図7Cは、致死用量のB16-F10メラノーマ細胞（1ｘ106細胞）を反対側脇腹に再チャレンジされたナイーブマウス（白丸；n＝5）及び加熱-MVA処置マウス（黒丸、n＝10）のカプランマイヤー生存率曲線である（****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、少なくとも5回繰り返されている。図7Dは、1ｘ106細胞の静脈内デリバリーの3週間後にナイーブマウス（白丸；n＝9）又は加熱-MVA処置マウス（黒丸、n＝10）から収集した肺表面の腫瘍病巣数の散布図である（****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、少なくとも2回繰り返されている。
【図８】加熱-MVAの腫瘍内注射は、腫瘍のミクロ環境に免疫学的変化をもたらすことを示すデータの一連のグラフによる提示である。図8Aは、CD3+CD45+ T細胞のフローサイトメトリー分析である。図8B−Cは、グランザイムB+（8B）又はKi-67（8C）を発現するCD8+細胞のサイトメトリー分析の散布図である。図8D−Fは、FoxP3（8D）、グランザイムB（8E）又はKi-67（8F）を発現するCD4+細胞のフローサイトメトリー分析の散布図である。図8G−Lは、PBS（n＝5）又は加熱-MVA（n＝5；***、p＜0.001；****、p＜0.0001）で処理したマウスの腫瘍内のCD45+CD3+（8G）、CD8+グランザイムB+（8H）、CD8+Ki-67+（8I）、CD4+Foxp3+（8J）、CD4+グランザイムB+（8K）及びCD4+Ki-67+（8L）細胞のパーセンテージの散布図である。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図９】加熱-MVAは、腫瘍流入領域リンパ節（TDLN）の免疫学的変化を誘発することを示すデータの一連のグラフによる提示である。図9A−Dは、PBS（n＝5）又は加熱-MVA（n＝5）処理マウスのTDLNから単離したグランザイムB+CD8+（9A）、グランザイムB+CD4+（9B）、Ki-67+CD8+（9C）及びKi67+CD4+（9D）細胞のフローサイトメトリー分析の散布図である。図9E−Hは、TDLN中のグランザイムB+CD8+（9E）、Ki67+CD8+（9F）、グランザイムB+CD4+（9G）及びKi67+CD4+（9H）細胞のパーセンテージを示すグラフである（n＝5；***、p＜0.001；****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１０】加熱-MVAは、野生型コントロールと比較して、STING欠損マウス又はBatf3欠損マウスでB16-F10メラノーマの根絶の有効性が低いことを示す一連のグラフによる提示である。図10Aは、担癌WT、STINGGt/Gt及びBatf3-/-マウスのPBS又は加熱-MVAの注射後の腫瘍体積対時間（日数）のグラフである。図10Bは、PBS又は加熱-MVAで処理した担癌WT、STINGGt/Gt及びBatf3-/-マウスのカプランマイヤー生存率曲線である（nは種々のグループについて5−8の範囲である；**、p＜0.01；****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１１】加熱-MVA誘発抗腫瘍作用は主としてCD8+T細胞によって媒介され、CD4+T細胞は腫瘍再チャレンジに対する全身性免疫の発達に役立つことを示すデータの一連のグラフによる提示である。図11Aは、B16-F10メラノーマ一側移植モデルにおけるCD4+、CD8+及びNK細胞枯渇抗体の存在下又は非存在下での加熱-MVA腫瘍内注射の模式図である。図11Bは、アイソタイプコントロール、CD4+、CD8+及びNK細胞枯渇抗体の存在下でPBS又は加熱-MVAにより処置したマウスのカプランマイヤー生存率曲線である（n＝10；*、p＜0.05；**、p＜0.01；****、p＜0.0001）。図11C−Gは、下記を含む多様な処置レジメン（PBS（11C）、加熱-MVA＋アイソタイプコントロール（11D）、加熱-MVA＋抗CD8（11E）、加熱-MVA＋抗CD4（11F）及び加熱-MVA＋抗NK（11G））後の日数に対してプロットした腫瘍体積のグラフである。図11Hは、ナイーブマウス及びCD4+及びNK細胞枯渇の存在下又は非存在下で右の脇腹に移植された最初の腫瘍を加熱-MVAで処置されて生存したマウスにおける1ｘ106の致死用量B16-F10細胞の左わき腹皮内移植による腫瘍再チャレンジの模式図である。図11Iは以下のマウスのカプランマイヤー生存率曲線である：ナイーブマウス（白丸、n＝6）、加熱-MVA処置マウス（黒丸、n＝10）、NK枯渇を有する加熱-MVA処置マウス（黒四角、n＝6）及びCD4+ T細胞枯渇を有する加熱-MVA処置マウス（黒三角、n＝6）。前記は致死用量のB16-F10メラノーマ細胞により反対側脇腹で再チャレンジされた（*、p＜0.05；**、p＜0.01； ****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１２】加熱-MVAの腫瘍内注射はSTING及びBatf3依存抗メラノーマ抗体応答を誘発することを示す一連のグラフによる提示である。図12Aは、加熱-MVA又はPBS（NT、無血清処理コントロール）で処理したSTINGGt/Gt、Batf3-/-及び齢適合WTマウスの血清中の抗メラノーマ抗体濃度（ELISAで決定）の散布図である。図12Bは、加熱-MVA又はPBS（NT、無血清処置コントロール）で処置したSTINGGt/Gt、Batf3-/-及び齢適合WTマウスの血清中の抗ワクシニアウイルス抗体濃度（ELISAで決定）の散布図である。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１３】下記の多様な処置レジメン後に時間（日数）に対してプロットした腫瘍体積のグラフである：PBSの腫瘍内注射＋アイソタイプ抗体コントロールの腹腔内デリバリー（13A、n＝5）、PBSの腫瘍内注射＋抗CTLA4抗体の腹腔内デリバリー（13B、n＝5）、加熱-MVAの腫瘍内注射＋アイソタイプコントロール（13C、n＝10）、及び加熱-MVAの腫瘍内注射＋抗CTLA4の腹腔内デリバリー（13D、n＝9）。図13Eは、下記で処置したマウスのウイルス注射開始時の腫瘍体積の散布図である：PBS＋アイソタイプ、加熱-MVA＋アイソタイプ、PBS＋抗CTLA4、及び加熱-MVA＋抗CTLA4抗体。図13Fは、下記で処置した担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である：PBS＋アイソタイプ、加熱-MVA＋アイソタイプ、PBS＋抗CTLA4、及び加熱-MVA＋抗CTLA4抗体（*、p＜0.05；**、p＜0.01； ****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１４】加熱-MVAの腫瘍内注射は、注射実施腫瘍の根絶とともに注射非実施腫瘍の増殖制御でもMVAより有効であることを示すデータの一連のグラフによる提示である。図14Aは処置プランの模式図で、前記プランでは、B16-F10メラノーマは、両側皮内腫瘍移植モデルでMVA又は加熱-MVAのどちらかにより処置された。図14Bは、B16-F10細胞におけるMOI 5（白丸）又はMOI 0.05（黒丸）のMVAの複製曲線のグラフである。図14Cは、PBS（白丸、n＝7）、MVA（黒四角、n＝9）又は加熱-MVA（黒丸、n＝9）のいずれかで処置した担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である（p＜0.01； ***、p＜0.001）。図14D−Eは、PBS注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（D）及び注射非実施（E）腫瘍の体積のグラフである。図14F−Gは、MVA注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（F）及び注射非実施（G）腫瘍の体積のグラフである。図14H−Iは、加熱-MVA注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（H）及び注射非実施（I）腫瘍の体積のグラフである。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１５】加熱-MVAの腫瘍内注射は、両側B16-F10メラノーマモデルにおける免疫細胞補充及び活性化でMVA又はPBSよりも注射非実施腫瘍で有効であることを示す一連のグラフによる提示である。担癌マウスは、図14Aの記載のようにPBS、MVA又は加熱-MVAの腫瘍内注射で処置された。注射非実施腫瘍を合計2回の処置の後で最初の処置から7日後に採集した。腫瘍浸潤免疫細胞をFACSで分析した。図15Aは、反対側の腫瘍にPBS、MVA又は加熱-MVAを腫瘍内注射した後の、注射非実施腫瘍の1グラム当たりの腫瘍浸潤CD45+、CD103+CD11c+、CD3+及びCD8+の絶対数のグラフである。図15Bは、反対側の腫瘍にPBS（n＝5）、MVA（n＝5）又は加熱-MVA（n＝5）を腫瘍内注射した後の、注射非実施腫瘍の1グラム当たりの腫瘍浸潤グランザイムB+CD8+、Ki67+CD8+、グランザイムB+CD4+、及びKi67+CD4+細胞の絶対数のグラフである。データは算術平均±SEMである（n＝5）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１６】加熱-MVAは、両側腫瘍移植モデルで野生型と比較してSTING欠損マウス又はBatf3欠損マウスではB16-F10メラノーマ根絶における有効性が劣ることを示すデータの一連のグラフによる提示である。図16A−Bは、PBS注射（n＝6）後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（A）及び注射非実施（ｂ）腫瘍の体積のグラフである。図16C−Dは、WTマウス（n＝10）の加熱-MVA注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（C）及び注射非実施（D）腫瘍の体積のグラフである。図16E−Fは、STINGGt/Gtマウス（n＝8）の加熱-MVA注射後の日数に対してプロットした注射実施（E）及び注射非実施（F）腫瘍の体積のグラフである。図16G−Hは、Batf3-/-マウス（n＝6）の加熱-MVA注射後の日数に対してプロットした注射実施（E）及び注射非実施（F）腫瘍の体積のグラフである。図16Iは、PBS又は加熱-MVAで処置した担癌WT、STINGGt/Gt、及びBatf3-/-マウスのカプランマイヤー生存率曲線である（**、p＜0.01； ****、p＜0.0001）。代表的な実験が示され、1回繰り返されている。
【図１７】加熱-MVAは、両側B16-F10メラノーマモデルで注射実施及び注射非実施腫瘍の免疫細胞補充及び活性化でBatf3-/-よりもWTマウスで有効であることを示すデータの一連のグラフによる提示である。図14Aに記載したように、担癌マウスをPBS又は加熱-MVAの腫瘍内注射で処置した。注射非実施腫瘍を合計2回の処置の後で最初の処置から7日後に採集した。腫瘍浸潤免疫細胞をFACSで分析した。図17A−Bは、WT及びBatf3-/-マウスの右の脇腹にPBS又は加熱-MVAを腫瘍内注射した後の、注射実施（A）及び注射非実施（B）腫瘍の1グラム当たりの腫瘍浸潤CD3+及びCD8+の絶対数のグラフである。図17C−Dは、WT及びBatf3-/-マウスの右の脇腹にPBS又は加熱-MVAを腫瘍内注射した後の、注射実施（C）及び注射非実施（D）腫瘍の1グラム当たりの腫瘍浸潤Ki67+CD8+及びKi67+CD4+の絶対数のグラフである（**、p＜0.01；***、p＜0.001； ****、p＜0.0001）。データは算術平均±SEMである（n＝4）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１８】加熱-MVAの腫瘍内注射と抗CTLA4、抗PD-1又は抗PD-L1抗体の全身デリバリーとの併用は担癌動物の全体的応答及び治癒率を有意に増加させることを示すデータの一連のグラフによる提示である。図18Aは処置プランの模式図であり、前記プランでは、両側性皮内腫瘍移植モデルでB16-F10メラノーマは、免疫チェックポイント遮断抗体の全身デリバリーの存在下又は非存在下でPBS又は加熱-MVAの腫瘍内注射で処置された。図18Bは、下記の処置を受けた担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である：PBS（n＝5）、加熱-MVA＋アイソタイプコントロール（n＝10）、加熱-MVA＋抗CTLA4抗体（n＝10）、加熱-MVA＋抗PD1抗体（n＝10）、又は加熱-MVA＋抗PD-L1抗体（n＝10；*、p＜0.05；**、p＜0.01； ****、p＜0.0001）。図18C−Dは、PBS注射後の日数に対する注射実施（C）及び注射非実施（D）腫瘍の体積のグラフである。図18E−Fは、加熱-MVAの腫瘍内注射及びアイソタイプコントロールの腹腔内デリバリー後の日数に対する注射実施（E）及び注射非実施（F）腫瘍の体積のグラフである。図18G−Hは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗CTLA4抗体の腹腔内デリバリー後の日数に対する注射実施（G）及び注射非実施（H）腫瘍の体積のグラフである。図18I−Jは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗PD-1抗体の腹腔内デリバリー後の日数に対する注射実施（I）及び注射非実施（J）腫瘍の体積のグラフである。図18K−Lは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗PD-L1抗体の腹腔内デリバリー後の日数に対する注射実施（K）及び注射非実施（L）腫瘍の体積のグラフである。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。
【図１９】UV不活化MVA（UV-MVA）は、cDCでSTING/IRF3依存細胞質ゾルDNAセンシング経路によりI型IFNを誘発することを示す一連のグラフによる提示である。図19A−Bは、下記による感染後の経過時間に対する培地中の分泌IFN-α（A）及びIFN-β（B）の濃度のグラフである：MVA（黒丸）、加熱-MVA（白四角）、又はUV-MVA（黒四角）（***、p＜0.001）。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図19C−Dは、STINGGt/Gt、IRF3-/-及びWTコントロールマウスから作製しUV-MVAを感染させたcDCの培地中の分泌IFN-α（C）及びIFN-β（D）の濃度の棒グラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図19Fは、UV-MVA感染後のSTING+/+及びSTINGGt/Gtのp-IRF3、IRF3、STONG及びβアクチンのタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの走査画像である（hpi、感染後時間；NT、無処置）。
【図２０】UV不活化MVA（UV-MVA）はMC38結腸腺癌細胞株で炎症性サイトカイン及びケモカインを誘発すること、及びUV-MVAの腫瘍内注射は腫瘍根絶及び加熱-MVAと同様な有効性を有する全身性抗腫瘍免疫の発達をもたらすことを示すデータの一連のグラフによる提示である。図20A−Cは、MVA、加熱-MVA、UV-MVA感染MC38細胞又は疑似コントロールの培地中の分泌IL-6（A）、CCL4（B）及びCCL5（C）の濃度のグラフである。データは算術平均±SEMである（n＝3）。代表的な実験が示され、2回繰り返されている。図20D−Fは、PBS（D）、加熱-MVA（E）、又はUV-MVA（F）の腫瘍内感染後の腫瘍体積対時間（日数）のグラフである。図20Gは、PBS（黒丸、n＝5）又は加熱-MVA（黒四角、n＝10）又はUV-MVA（黒三角、n＝7）に感染させた担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である。図20Hは、致死用量のMC38結腸腺癌細胞により反対側脇腹で再チャレンジされたナイーブマウス（黒丸、n＝5）、加熱-MVA処置マウス（黒四角、n＝7）及びUV-MVA処置マウス（黒三角、n＝5）のカプランマイヤー生存率曲線である。代表的な実験が示され、1回繰り返されている。
【図２１】加熱-MVAの腫瘍内注射と抗CTLA4又は抗PD-L1抗体の全身性デリバリーとの併用は、担癌動物の全体的応答及び治癒率を有意に増加させることを示すデータの一連のグラフによる提示である。図21A−Bは、PBS注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（A）及び注射非実施（B）腫瘍の体積のグラフである。図21C−Dは、PBSの腫瘍内注射及び抗CTLA4抗体の腹腔内デリバリー後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（C）及び注射非実施（D）腫瘍の体積のグラフである。図21E−Fは、PBSの腫瘍内注射及び抗PD-L1抗体の腹腔内デリバリー後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（E）及び注射非実施（F）腫瘍の体積のグラフである。図21G−Hは、加熱-MVAの腫瘍内注射及びアイソタイプコントロールの腹腔内デリバリー後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（G）及び注射非実施（H）腫瘍の体積のグラフである。図21I−Jは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗CTLA4抗体の腹腔内デリバリー後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（I）及び注射非実施（J）腫瘍の体積のグラフである。図21K−Lは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗PD-L1抗体の腹腔内デリバリー後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（K）及び注射非実施（L）腫瘍の体積のグラフである。図21Mは、PBS（n＝6）、抗CTLA4抗体（n＝7）、又は抗PD-L1抗体（n＝7；***、p＜0.001）で処置した担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である。図21Nは、PBS（n＝6）、加熱-MVA＋アイソタイプコントロール（n＝10）、加熱-MVA＋抗CTLA4抗体（n＝10）、又は加熱-MVA＋抗PD-L1抗体（n＝10；*、p＜0.05；**、p＜0.01； ****、p＜0.0001）で処置した担癌マウスのカプランマイヤー生存率曲線である。代表的な実験が示され、1回繰り返されている。
【図２２】加熱-MVA及び抗CTLA4の腫瘍内共同投与は、両側B16-F10腫瘍移植モデルで全体的応答及び治癒率を有意に増加させることを示すデータの一連のグラフによる提示である。図22A−Bは、PBS注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（A）及び注射非実施（B）腫瘍の体積のグラフである。図22C−Dは、加熱-MVA及びアイソタイプコントロールの腫瘍内注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（C）及び注射非実施（D）腫瘍の体積のグラフである。図21E−Fは、加熱-MVA及び抗CTLA4抗体（腹腔内デリバリーで用いた用量の1/10）の腫瘍内共同注射後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（E）及び注射非実施（F）腫瘍の体積のグラフである（n＝10）。図22G−Hは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗CTLA4抗体の腹腔内デリバリー後の時間（日数）に対してプロットした注射実施（G）及び注射非実施（H）腫瘍の体積のグラフである（n＝10）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義：
本明細書で用いられるように、以下の用語は、文脈が明瞭に別の意味を指し示していないかぎり、それら用語に対して下記に帰結せしめた意味を有するであろう。
“癌”は、制御不能の細胞の増殖を特徴とする、人間及び動物の疾患の1クラスを指す。明瞭にそうではないと指示されないかぎり、“癌”という用語は、本明細書では“腫瘍”（前記は続いて原発性腫瘍及び転移性腫瘍を含む）、“悪性疾患”、“過分裂”及び“新形成”という用語と互換的に用いることができる。“癌細胞”という用語は、“腫瘍細胞”、“悪性細胞”、“過分裂細胞”及び“新形成細胞”という用語と互換性である。
“メラノーマ”は、メラニンを産生できる細胞から生じる悪性新形成を指す。メラノーマという用語は“悪性メラノーマ”と同義である。メラノーマは、患者のリンパ節、皮膚、肝、肺及び脳組織を含み広範囲に転移する。
“固形腫瘍”は、全ての新形成細胞増殖及び分裂（原発性又は転移性）、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指すが、ただし血液癌（例えばリンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫を含む）を除く。固形腫瘍の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽腫。
本開示の組成及び方法が有用なもっとも一般的な固形腫瘍のいくつかには以下が含まれる：頭頸部癌、直腸腺癌、神経膠腫、髄芽腫、尿路上皮癌、膵腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺腺癌、非小細胞肺癌、（扁平上皮癌及び腺癌）、小細胞肺癌、メラノーマ、乳癌、腎細胞癌、及び肝細胞癌。
【００１１】
“転移”は、癌のその原発部位から近傍組織又は身体の遠位位置への拡散を指す。癌細胞は原発腫瘍から離脱してリンパ管及び血管に浸透し、血流を通して循環し、身体の別の場所の正常組織で増殖することができる。転移は連続的プロセスであり、原発腫瘍から離脱した腫瘍細胞（又は癌幹細胞）で起こりがちで、血流又はリンパ管に載って移動して遠位部位で停止する。いったん別の部位で停止すると、癌細胞は血管又はリンパ管壁を再度浸透し、増加を続けて最終的に新腫瘍（転移腫瘍）を形成する。いくつかの実施態様では、この新腫瘍は転移（二次）腫瘍と称される。
“免疫応答”は、リンパ球、抗原提示細胞、食作用細胞、顆粒球、及び前記細胞又は肝臓によって生成される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の1つ以上の作用を指し、前記作用は、癌性細胞、転移腫瘍細胞などの選択的損傷、破壊又は人間の体からの排除をもたらす。免疫応答は、細胞性応答、例えばT細胞応答を含むことができる。T細胞応答は、細胞機能（すなわちT細胞機能）の変更（調整、例えば顕著な強化、刺激、活性化、障害又は阻害）である。T細胞応答は、特定のタイプのT細胞、又はT細胞サブセット（例えばエフェクターCD4+、細胞傷害CD8+、又はナチュラルキラー（NK）細胞）の発生、分裂若しくは拡張、又は刺激を含むことができる。そのようなT細胞サブセットは、1つ以上の細胞受容体又は細胞表面分子（例えばCD又は分化分子クラスター）を検出することによって同定できる。T細胞応答はまた、細胞性因子、例えば可溶性メディエーターの発現変更（統計的に有意な増加又は減少）を含むことができる。前記メディエーターは、他の細胞の分化又は分裂に影響を与える、例えばサイトカイン、リンホカイン、サイトカイン結合タンパク質、又はインターロイキンである。例えば、I型インターフェロン（IFN-α/β）は、先天性免疫の重要な調節因子である[71]。動物及び人間の研究によって、抗原認識抗腫瘍免疫応答の初期相でCD4+及びCD8+の両T細胞の運命に直接的に影響を与えるIFN-α/βの役割が示された。I型IFNは、樹状細胞、続いて先天性免疫系の見張り番の活性化に応答して誘発される。
“腫瘍免疫”は、腫瘍が免疫系による認識及び除去を回避するプロセスを指す。したがって、治療概念としては、腫瘍免疫は、そのような回避が弱められるか排除されるときに“治療”され、腫瘍は免疫系によって認識及び攻撃される。腫瘍認識の例は腫瘍結合であり、腫瘍攻撃の例は、腫瘍縮小（数、サイズ又はその両方）及び腫瘍除去である。
【００１２】
“T細胞”は、多様な細胞媒介適応免疫反応に加わる胸腺由来リンパ球を指す。
“ヘルパーT細胞”はCD4+T細胞を指し、ヘルパーT細胞はMHCクラスII分子に結合した抗原を認識する。少なくとも2つのタイプのヘルパーT細胞、Th1及びTh2が存在し、前記は異なるサイトカインを産生する。
“細胞傷害性T細胞”は、通常その表面にCD8分子マーカーを保有し（CD8+）、特異的な抗原分子をその表面に有する標的細胞を破壊することによって機能するT細胞を指す。細胞傷害性T細胞はまたグランザイムを放出する（グランザイムは、パーフォリン形成孔を介して標的細胞に侵入してアポトーシス（細胞死）を誘発するセリンプロテアーゼである）。グランザイムは細胞傷害性表現型のマーカーとして役立つ。細胞傷害性T細胞の他の名称には、CTL、細胞溶解性T細胞、細胞溶解性Tリンパ球、キラーT細胞、又はキラーTリンパ球が含まれる。細胞傷害性T細胞の標的には、ウイルス感染細胞、細菌性又は原虫性寄生体感染細胞、又は癌細胞が含まれ得る。ほとんどの細胞傷害性T細胞はその細胞表面に存在するタンパク質CD8を有する。CD8はクラスI MHC分子の部分に引き付けられる。典型的には、細胞傷害性T細胞はCD8+細胞である。
“腫瘍浸潤リンパ球”は、癌（例えばメラノーマ）に罹患した対象動物の白血球を指し、前記は内在性であるか、そうでなければ循環（血液又はリンパ液）を出て腫瘍に移動してきている。
“免疫チェックポイント阻害剤”又は“免疫チェックポイント遮断剤”は、1つ以上のチェックポイントタンパク質の活性を完全に又は部分的に低下させるか、阻害するか、干渉するか又は調整する分子を指す。チェックポイントタンパク質はT細胞活性化又は機能を調節する。チェックポイントタンパク質には、CTLA-4とそのリガンドCD80及びCD86；PD-1とそのリガンドPDL1及びPDL2；LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、ICOS及びBTLAが含まれるが、ただしこれらに限定されない[72]。
治療物質の投与の関係で用いられるとき、“非経口”は消化管経由投与以外の任意の投与ルートを含む。特に本明細書で開示される方法に対応するものは、静脈内（例えば肝門脈経由を含む）、腫瘍内又は髄腔内投与である。
“抗体”は、特異的に抗原と結合する免疫グロブリン分子又はそのような分子の抗原結合フラグメントを指す。したがって、抗体は、天然供給源又は組換え供給源から誘導される完全な免疫グロブリンであっても、完全な免疫グロブリンの免疫反応（抗原結合）フラグメント又は部分であってもよい。抗体は多様な形態で存在できる。前記形態には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab及びF(ab)2とともに単鎖抗体（
scFv）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト組換え抗体並びに二及び三特異性抗体が含まれる。
【００１３】
“腫瘍溶解ウイルス”は、優先的に癌細胞に感染してそのような細胞で複製し、その複製プロセスを通して癌細胞の溶解を誘発するウイルスを指す。天然に存在する腫瘍溶解ウイルスの非限定的な例には、水疱性口内炎ウイルス、レトロウイルスとともに腫瘍選択性であるように操作されたウイルス、例えばアデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス及び単純ヘルペスウイルスが含まれる[19,73-75]。ワクシニアウイルスは多くのタイプの細胞に感染するが、以下の事実のために腫瘍細胞で優先的に複製する：腫瘍細胞は、複製に有利な代謝を有し、さらに複製に有利なある種の経路の活性化を示し、先天性免疫系を回避する環境を作り出す（このことはまたウイルスの複製に有利である）。熱不活化MVAは腫瘍溶解ウイルスの定義には適合しない。
“MVA”は“改変ワクシニアアンカラ”を意味し、アンカラ株から誘導され、ワクチン及びワクチンアジュバントとして使用するために開発された高度弱毒化ワクシニア株を指す。元のMVAはニワトリ胚細胞での連続継代によって野生型アンカラ株から単離された。このように処理されて、前記は、野生型ワクシニアのゲノムの15%（霊長類（ヒトを含む）で効率的に複製するその能力を含む）を失った[76]。天然痘のワクチン免疫株MVAのマーカー、遺伝子構造、非経口ワクチン免疫により得られる経験的能力、及び防御メカニズムの衰退生物における反応から、MVAは遺伝子のための組換えベクターとして、又は感染病若しくは腫瘍に対するワクチンデリバリーとして開発するために相応しい候補と考えられる[77]。MVAは長さが178kbのゲノムを有し、配列は最初Antoineらの論文で開示された[78]。配列はまたGenbank U94848.1でも開示されている。臨床等級のMVAは市場でも公的にも利用可能である（Bavarian Nordic A/S Kvistgaard, Denmark）。さらにまた、MVAはATCC（ATCC, Rockville, MD）からもCMCN（Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes, Paris, France）からも入手できる。変異体MVA E3Lノックアウト（ΔE3L-MVA）及びその調製は、例えば米国特許7,049,145号に記載されている。
【００１４】
“熱不活化MVA”又は“加熱-MVA”は、その免疫原性又はその標的細胞（腫瘍細胞）侵入能力を破壊しないが、当該ウイルスの残留する複製能力とともに宿主の免疫応答を阻害する因子（例えば感染細胞でIFN I型の誘発を阻害する因子）を除去する条件下で熱暴露することによってさらに処理されてあるMVAを意味する。そのような条件の例は、約50から約60℃の範囲内の温度に約1時間の間暴露することである。別の時間及び温度を日常的な実験で決定し、感染cDCでのIFN I型誘発を本明細書に記載する実験で用いられた加熱-MVAと比較することができる（そのような誘発はMVAの誘発よりも高いはずである）。本発明者らが実施したある実験では、65℃及び1時間の組合せの暴露で処理したMVAによるcDCの感染はIFN I型の誘発に失敗した。安全性と強力な免疫原性の本組合せは、野生型ワクシニアと比較してさらにはMVAと比較してもなお、加熱-MVAを特に魅力あるものにする。
“UV不活化MVA”又は“UV-MVA”は、その免疫原性又は標的細胞（腫瘍細胞）侵入能力を破壊しないが、当該ウイルスの残留する複製能力を除去する条件下でUV暴露することによって不活化されてあるMVAを意味する。そのような本方法で有用であり得る条件の例は、例えば365nm UV電球を用いて約30分から約1時間の間のUV暴露である[56,79]。繰り返せば、上記の加熱-MVAについて説明したように、UV波長及び暴露のこれらの条件の限界は、ある暴露を受けたUV-MVAによって誘発されるI型IFNを測定し、それを下記の実験で用いられるUV-MVAによって誘発されるI型IFN及び未処理MVAと比較することによって決定できる。UV-MVAは加熱-MVAと同様に安全で、顕著なI型IFNもまた誘発する。
したがって、“不活化MVA”は、熱不活化MVA及びUV不活化MVA（前記は、感染性非複製性であり、さらに感染DC細胞でI型IFN産生を抑制しない）を含む包括的用語として用いられるであろう。加熱及びUV照射の組合せによって不活化されるMVAもまた本開示の範囲内である。
“対象動物”は、癌に罹患し得る任意の動物（哺乳動物、人間又はその他）患者を意味する。
【００１５】
“治療的に有効な量”又は“有効量”は、1回以上の投薬及び十分な期間で投与されたとき、疾患の軽減、治癒又は緩和で所望の生物学的結果を提供するために十分な薬剤量を指す。本開示では、不活化MVAの有効量は、（適切な期間及び適切な頻度で投与されて）癌細胞数を減少させるか、又は腫瘍サイズを低下させるか、又は腫瘍を根絶させるか、又は周辺器官への癌細胞浸潤を阻害するか（すなわち浸潤を遅らせるか又は停止させる）、転移増殖を阻害させるか（すなわち遅らせるか又は停止させる）、腫瘍増殖を阻害するか（すなわち固定又は停止）、腫瘍の治療を可能にするか、及び/又は腫瘍に対する免疫応答を誘発する量である。任意の個々の症例における適切な治療量は、本開示に照らして当業者が日常的実験を用いて決定できる。そのような決定は、in vitroで有効と判明した量及び動物で有効と判明した量から開始されるであろう。治療的に有効な量は、先ず初めに培養細胞に利益を供与すると判明した濃度に基づいて決定されるであろう。有効量は、細胞培養データから推論することができ、さらに本明細書で詳述する要件に基づいて加減することができる。有効量の範囲の例は、投与につき105ウイルス粒子から約1012ウイルス粒子である。
特に本明細書に開示するウイルス系免疫刺激剤に関して言えば、“治療的に有効な量”又は“有効量”は不活化MVAを含む組成物の量を指し、前記量は、腫瘍細胞増殖を低下させ阻害し又は停止させ、それによって腫瘍を縮小させ又は排除するために十分であるか、又はin vitro若しくは対象動物での転移性拡散を阻害し低下させ又は停止させるために、或いは場合に応じて腫瘍の縮小、阻害及び/又は停止の1つ以上を最終的にもたらす腫瘍対抗免疫応答を引き出すために十分である。腫瘍細胞増殖の低下、阻害又は根絶は、壊死、アポトーシス若しくは免疫応答又は前述の2つ以上の組合せの結果であり得る。治療的に有効な量は下記のような要件に応じて変動し得る：組成物に用いられる個々の不活化MVA、処置される対象動物の齢及び症状、腫瘍形成の程度、他の治療用法の有無など。同様に、投与される組成物の投薬量及びその投与頻度も、多様な要件、例えば活性成分の性能、いったん投与されたときのその活性持続時間、投与ルート、対象動物のサイズ、齢、性別及び体調、有害反応のリスク、及び医師の判断に左右されるであろう。組成物は多様な剤形（例えば注射可能溶液）で投与される。
【００１６】
特に免疫チェックポイント阻害剤との併用に関して言えば、免疫チェックポイント遮断剤の“治療的に有効な量”は、処置される対象動物の腫瘍細胞内のアポトーシス応答回避から免疫チェックポイントを遮断するために十分な免疫チェックポイント遮断剤の量である。承認済み、臨床試験中或いは開発中のいくつかの免疫チェックポイント遮断剤があり、下記が含まれる：CD28阻害剤、例えばCTL4阻害剤（例えばイピリブマブ）；PD-1阻害剤（例えばニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ラムブロリズマブ）；PD-L1阻害剤（例えばMPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB 00107180）、ICOS及びBTLA又はそれらのおとり分子。前述の物質の投薬範囲は当業界で公知であるか、又はいくつかの用量決定臨床試験が完了しているので、当業界の技量範囲内で他の可能な薬剤に対して容易に推定できる。
好ましくは、腫瘍は特定のチェックポイントを発現するが、このことは厳密には必要ではない。なぜならば、免疫チェックポイント遮断剤は、腫瘍内の免疫抑制メカニズム（腫瘍細胞、基質細胞及び腫瘍浸潤免疫細胞によって引き出される）をより全般的に遮断するからである。
例えば、CTLA4阻害剤イピリムマブは、メラノーマの外科手術後にアジュバント療法として投与されるときは、3mg/kgの合計輸液量を90分かけて1−2mg/mLで、3週間毎に合計4用量投与される。この治療方法はしばしば重篤で生命にかかわる免疫媒介有害反応を伴い、前記有害反応は、不活化MVAと一体的にイピリムマブを投与するとき耐性用量とともにイピリムマブの投与可能な累積量を制限する。特に、以下に示す実験結果に照らせば、CTLA4阻害剤が不活化MVAと同時に又は連続して腫瘍に直接投与されるならば、CTLA4阻害剤の用量を減少させることがさらに可能であることは期待される。したがって、イピリムマブについて上記に提供される量は、一体的投与で患者に与えられる個々の投薬量及び累積量を決定するための出発点であろうが、用量決定試験は最適量の決定のために必要であろう。
ペムブロリズマブは、メラノーマのアジュバント療法としての投与のために処方され、25mg/mLに希釈したものが、2mg/kgの投薬量で30分かけて3週間毎に投与される。
ニボルマブは、2週間毎に静脈内輸液として3mg/kgで60分かける投与のために処方される。
【００１７】
“医薬的に許容できる賦形剤”には医薬的に許容できる担体又は希釈剤、例えば任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。前記賦形剤にはまた保存料並びに抗菌及び抗カビ剤が含まれる。生物学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当業界で周知である。賦形剤関する更なる詳細は以下に提供される。
本開示の不活化MVAを腫瘍のミクロ環境に配置する関係で用いられる“デリバリー”は、それが腫瘍への局所投与によって実施されるか又は全身投与（例えば静脈内ルート）によって実施されるかは問われない。前記用語は腫瘍それ自体に達する不活化MVAに着目する。
本明細書の“一体的投与”は、不活化MVAと併用されかつ不活化MVAと時間的に接近している、第二の治療用法の投与（例えば免疫チェックポイント遮断剤の投与）を指す。例えば、PD-1/PDL-1阻害剤及び/又はCTLA4阻害剤（より具体的な実施態様では抗体）は、熱不活化MVAと同時に投与されるか（不活化MVAが上記に述べるように腫瘍内又は全身的に投与されるときは、静脈内又は腫瘍内注射による）、又は不活化MVA投与の前又は後で投与できる。不活化MVA投与及び免疫チェックポイント遮断剤投与が1−7日離れているか又は3週間さえ離れても、これは、本明細書に言う“時間的に接近”の範囲内であろう。
＊＊＊
【００１８】
ある実施態様では、本開示は、腫瘍を有する対象動物で抗腫瘍免疫を引き出す方法に関し、前記方法は、以下のおよそ1つ以上をもたらすために有効な量の不活化MVAを当該腫瘍にデリバリーする工程を含む：
当該腫瘍内及び/又は腫瘍流入領域リンパ節内で細胞傷害性CD8+T細胞を増加させる；
I型IFNの誘発を介して、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟を誘発する；
当該腫瘍内又は腫瘍流入領域リンパ節内で腫瘍細胞を認識するエフェクターT細胞を当該対象動物で誘発する；
当該腫瘍内で免疫抑制（調節）CD4+T細胞を減少させる；
当該腫瘍細胞を誘発してそれらの表面にMHCクラスIを発現させ、さらにI型IFN又は他の炎症性サイトカイン若しくはケモカインの1つ以上を産生させる。
本発明者らは免疫応答のメカニズムを探求し、前記メカニズムは、I型IFNの産生を媒介するcGAS/STINGによって媒介される細胞質ゾルDNAセンシング経路によって開始すると結論した。当該メカニズム及び補充される免疫細胞の更なる洞察は実施例で提供される。実施例で提示される結論は、これらメカニズムが解明された個々の実験環境に限定されない。
ある実施態様では、本開示は、固形腫瘍を有すると診断された対象動物を治療する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載する加熱-MVAの治療的に有効な量を当該腫瘍にデリバリーする工程を含む。
ある実施態様では、本開示は、癌を有すると診断された対象動物で抗腫瘍免疫を誘発する方法を提供し、前記方法は、不活化MVAの治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む。本開示の方法は、腫瘍サイズを減少、腫瘍を根絶、腫瘍増殖を阻害、又は腫瘍の転移若しくは転移増殖を阻害できる抗腫瘍免疫の誘発を含む。
別の実施態様では、本開示は、固形悪性腫瘍を有すると診断された対象動物で、治療的に有効な量の不活化MVAに当該腫瘍を暴露することによって、抗腫瘍免疫応答（先天性免疫応答及び/又は適応免疫応答（例えばT細胞応答）を含むことができる）を強化し、刺激し又は引き出す方法を提供する。
【００１９】
具体的な実施態様では、本開示は、腫瘍細胞に対向するT細胞細胞傷害性及び腫瘍細胞にまた対抗するTヘルパー細胞の誘引の両方に関して適応免疫応答を媒介する免疫応答を引き出す方法を提供する。前記方法は、非複製性の加熱-MVA又はUV不活化MVAを含む組成物を対象動物の腫瘍内又は静脈内に投与する工程を含み、ここで前記組成物の投与は、当該腫瘍に対して腫瘍特異性免疫応答を生じ、最終的に腫瘍増殖の低下、阻害又は停止及び/又は転移増殖の阻害をもたらす。実際、本発明者らは、癌細胞は殺滅されること、及び免疫応答は転移の場合のように遠隔場所へ移動できることを示した。
いくつかの実施態様では、本開示は、腫瘍細胞に対向するT細胞細胞傷害性及び腫瘍細胞にまた対抗するTヘルパー細胞の誘引の両方に関して適応免疫応答を媒介する免疫応答を引き出す方法を提供する。前記方法は、不活化MVAを含む組成物を非経口的に対象動物に投与する工程を含み、ここで前記組成物の投与は、当該腫瘍に対して腫瘍特異性免疫応答を生じ、最終的に腫瘍増殖の低下、阻害又は根絶及び/又は転移増殖の阻害をもたらす。実際、本発明者らは、癌細胞は殺滅されること、及び免疫応答は転移の場合のように遠隔場所へ移動できることを示した。
不活化MVAは複製不能であるので、複製可能ワクチン又はベクターと同じ態様で免疫系に影響を示すことはない。したがって、免疫系の刺激は腫瘍溶解の有効性にとって障壁と考えられているが[19]、不活化MVAは先天性免疫を利用して、腫瘍に対する細胞傷害性及びより広くはTエフェクター細胞活性化の両方に関して適応免疫を刺激することができる。
本開示はしたがって、固形悪性腫瘍を処置して、腫瘍における細胞傷害性CD8+細胞の増加及び調節CD4+細胞の減少をもたらすために有効な量の不活化MVAを対象動物の腫瘍にデリバリーし、固形腫瘍を有すると診断された対象動物で免疫応答を誘発する方法を提供する。
本開示はまた、固形悪性腫瘍を処置することによって抗腫瘍全身性免疫を発生させる方法を提供し、前記方法は、注射非実施腫瘍内に顕著な場合によって劇的な免疫細胞（CD103+ DC、細胞傷害性CD8+細胞及びCD4+エフェクター細胞を含む）の増加をもたらすために有効な量の不活化MVAを対象動物の腫瘍にデリバリーし、それによって前記対象動物の注射非実施腫瘍の拒絶及び腫瘍転移の妨害（前記を本発明者らは腫瘍再チャレンジによって試験している）の一方又は両方引き起こす工程を含む。
【００２０】
改変ワクシニアアンカラ（MVA）
改変ワクシニアアンカラ（MVA）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属の一メンバーである。MVAは、ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）による約570回の連続継代ワクシニアウイルスアンカラ株（CVA）から生じた。このような長期継代の結果として、得られたMVAウイルスは広範囲のゲノム欠失を含み、宿主細胞は鳥類細胞に強力に限定される[30]。得られたMVAは顕著に非病毒性であることが多様な動物モデルで示された[76]。
MVAの安全性及び免疫原性は広範囲に試験され、臨床試験では特にヒト天然痘に対して証拠立てられている。これらの試験は120,000人を超える個体を含み、ヒトでの優れた有効性及び安全性を示した。さらにまた、他のワクシニア系ワクチンと比較して、MVAは減弱病毒性（感染性）を有するが、一方、MVAは良好な特異的免疫応答を始動させる。したがって、MVAは安全なワクチンベクターとして確立され、特異的免疫応答を誘発する能力を有する。
上述の特徴のゆえに、MVAは、組換え遺伝子発現及びワクチンに用いられる操作MVAベクターの開発の有力な標的となった。ワクチンベクターとして、MVAは多くの病的状態（HIV、結核及びマラリアの他に癌を含む）に対して研究されてきた[33.34]。
ヒト単球由来樹状細胞（DC）のMVA感染は、DC活性化を引き起こすことが示された（DC活性化は、共刺激性分子のアップレギュレーション及び前炎症性サイトカインの分泌を特徴とする[56]）。この点で、MVAは標準的な野生型ワクシニアウイルス（WT-VAC）と相違する（WT-VACはDCを活性化しない）。樹状細胞は、2つの主要なサブタイプ（通常樹状細胞（cDC）及び形質細胞様樹状細胞（pDC））に分類できる。前者（特にCD8+サブタイプ）はT細胞への抗原提示に適応し、後者はI型IFNの強力な産生細胞である。
ヒト細胞のウイルス感染は、I型IFN（特にインターフェロン-アルファ）によって媒介される先天性免疫応答（第一線防御）の活性化をもたらす。前記活性化は通常、免疫学的“カスケード”を生じて、活性化T細胞（CTL及びヘルパーの両細胞）を補充及び分裂させ、最終的に抗体を産生させる。しかしながら、ウイルスは宿主の免疫応答を弱める因子を発現する。MVAはWT-VACよりも良好な免疫原であり、哺乳動物細胞では貧弱な複製を示す[81]。
しかしながらMVAは完全には非複製性ではなく、さらに、本発明者らが示すようにいくらかの免疫抑制活性を保有する。
【００２１】
免疫応答
特定の免疫系の活性のアップレギュレーションによる免疫応答の誘発に加えて（例えば抗体及び/又はサイトカインの産生、又は細胞媒介免疫の活性化）、免疫応答はまた、検出することができる免疫の抑制、減弱又は任意の他のダウンレギュレーションを含み、ホメオスタシスを再構築し宿主自身の器官及び組織の過剰な損傷を予防することができる。いくつかの実施態様では、本開示の方法にしたがって誘発される免疫応答は、細胞傷害性CD8+T細胞又は活性化Tヘルパー細胞又はその両方を発生させる（前記細胞は直接的又は間接的な腫瘍細胞死又は腫瘍細胞の増殖能力の低下をもたらすことができる）。
本開示の方法による免疫応答の誘発は、多様な周知の免疫学的パラメーターのいずれかを検出することによって決定できる[82,83]。免疫応答の誘発は、したがって多数の周知のアッセイ（免疫学的アッセイを含む）のいずれかによって確認できる。そのようなアッセイには以下をin vivo、ex vivo又はin vitroで測定するものが含まれるが、必ずしもそれらに限定されない：可溶性免疫グロブリン又は抗体；可溶性メディエーター（例えばサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などとともに他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド及び/又は脂質メディエーター）；免疫系の細胞の機能的又は構造的特性の変化によって決定される細胞の活性化状態の変化（例えば細胞分裂、運動性変化、細胞内陽イオン（例えばカルシウム）勾配又は濃度の変化；細胞内ポリペプチドのリン酸化又は脱リン酸化；特殊な活性の誘発（例えば特異的な遺伝子の発現又は細胞溶解動作；免疫系細胞による細胞分化（表面抗原発現プロフィールの変化又はアポトーシス（プログラムされた細胞死）の開始を含む）；又は免疫応答の存在を検出できる任意の他の規準。例えば、免疫細胞のタイプを識別する細胞表面マーカーは、CD4+、CD8+又はNK細胞と結合する特異的な抗体によって検出できる。検出可能な他のマーカー及び細胞成分には、インターフェロンγ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子（TNF）、IFN-α、IFN-β、IL-6及びCCL5が含まれるが、ただしそれらに限定されない。免疫応答を検出する一般的な方法にはフローサイトメトリー、ELISA、免疫組織化学が含まれるが、ただしそれらに限定されない。これらアッセイ及び類似のアッセイを実施する手順は広く知られており、例えば以下の文献で見出すことができる（Letkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998）。
【００２２】
医薬組成物及び調製物
不活化MVAを含む医薬組成物は、1つ以上の医薬的に許容できる賦形剤、例えば担体又は希釈剤を含むことができる。それらは、本開示のワクチン成分の活性又は有効性に干渉せず毒性でない成分である。担体又は希釈剤は溶媒又は分散媒体であることができ、例えば、水、デキストロース溶液、ポリオール（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール及び流動ポリエチレングリコールなど）、血清アルブミン、リンゲル溶液、前記の適切な混合物、及び植物油を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤及び/又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム又はエタノール）の使用によって維持できる。微生物作用の予防は、多様な保存料、抗菌及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどによって実行できる。多くの事例で、等張剤、例えば糖類（例えばマンニトール、ソルビトール、ラクトース）又は塩化ナトリウム若しくはカリウムを加えることが好ましい。注射可能な組成物の吸収延長は、吸収を遅らせる薬剤（例えばステアリン酸一アルミニウム及びゼラチン）を組成物で使用することによってもたらし得る。
不活化MVAを含む医薬組成物及び調製物は、通常的な混合、溶解、乳化、又は凍結乾燥プロセスの手段によって製造できる。ウイルス性医薬組成物は、通常的な態様で1つ以上の生理学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤（前記はin vitro、in vivo又はex vivoでの使用に適切なウイルス調製物の処方を容易にする）を用いて処方することができる。当該組成物は、1つ以上の追加の生物学的に活性な薬剤（例えばGM-CSFの並行投与）と組み合わせることができ、さらに医薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とともに処方して、非経口投与又は腫瘍内投与に適切な本開示の医薬組成物（生物学的組成物を含む）又は獣医組成物を生成することができる。
【００２３】
多くのタイプの処方が可能であり周知である。選択される個々のタイプは、当業界ではよく認識されているように選択される投与ルートに左右される。例えば、全身用処方物は、一般的には注射による投与のために設計されるであろう（例えば静脈内の他に腫瘍内投与のために設計されるもの）。好ましくは、全身用又は腫瘍内処方物は無菌的である。
無菌的な注射可能溶液は、必要な量の適切な溶媒に不活化MVAを必要に応じて本明細書に記載の多様な他の成分とともに取り込み、続いて適切な滅菌手段を実施することによって調製される。一般的には、分散剤が、活性成分を無菌的ベヒクルに取り込むことによって調製される。無菌的ベヒクルは、基本的分散媒体及び上記に記載のものに由来する必要な他の成分を含む。無菌的な注射可能溶液を調製するための無菌的散剤の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、前記は不活化MVA＋任意の追加される所望成分（先にろ過滅菌したその溶液に由来する）を生じる。
いくつかの実施態様では、本開示の不活化MVA組成物は、水溶液として又は生理学的に適合する溶液若しくは緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、マンニトール溶液又は生理学的緩衝食塩水として処方できる。ある種の実施態様では、不活化MVA組成物はいずれも、処方薬剤、例えば懸濁剤、安定化剤、浸透若しくは分散剤、緩衝剤、凍結保護剤、又は保存料、例えばポリエチレングリコール、ポリソルベート80、1-ドデシルヘキサヒドロ-2H-アゼピン-2-オン（ラウロカプラン）、オレイン酸、クエン酸ナトリウム、トリスHCl、デキストロース、プロピレングリコール、マンニトール、ポリソルベートポリエチレンソルビタンモノラウリン酸（Tween(商標)-20）、ミリスチン酸イソプロピル、ベンジルアルコール、イソプロピルアルコール、エタノール、シュクロース、トレハロースを含むことができ、さらに当業界で一般的に公知である他のそのような物質を本開示の組成物のいずれにも用いることができる[84]。
本開示の生物学的組成物又は医薬組成物は、対象動物に当該組成物を投与したときにその中に含まれるウイルスを腫瘍細胞に感染させるために利用可能にするために処方できる。投与後の血清、腫瘍、及び所望の場合には他の組織中のウイルスレベルは、多様なしっかりと確立された技術（例えば抗体系アッセイ(例えばELISA、免疫組織化学など)）によってモニターできる
【００２４】
不活化MVAの投薬量
一般的には、対象動物は、約105から約1010プラーク形成単位（pfu)の範囲で不活化MVAを投与されるが、ただし当業者の決定にしたがってより低い又は高い用量を投与してもよい。好ましい実施態様では、投薬量は約106−109pfuである。この投薬量は、約1から約10mLのユニット剤形で処方できる。ウイルス粒子と等価量のpfuは用いられる具体的なpfu力価測定方法にしたがって相違し得る。一般的には、pfuは約5から100ウイルス粒子に等しい。治療的に有効な不活化MVAの量は、処方された投与頻度で処方された期間の間に1回以上に分割した用量で投与することができる。例えば、本開示の不活化MVAの治療的に有効な量は、複数の要件、例えば疾患の状態、対象動物の齢、性別、体重及び一般的状態、腫瘍のサイズ、個々の対象動物で腫瘍と戦うために十分な程度で所望の免疫学的応答を引きだす不活化MVAの能力、及び対象動物の免疫系がそのような応答を立ち上げる能力にしたがって変動し得る。癌治療分野に従事する人々には明白であるように、投薬量の多様性は、例えば処置される対象者、投与経路、及び当該治療に対する対象者の応答、及び対象者の最大耐性用量によって生じるとは限らないであろう。対象者への不活化MVAのデリバリーで、投薬量はまた、例えば一般的病状、以前の病歴、疾患の予後、腫瘍負荷などの要件にしたがって変動するであろう。
投与の容易さ及び投薬の均一性のために、本開示の組成物を投薬量ユニット型で処方することは有益であり得る。本明細書で用いられる投薬量ユニット型は、処置される対象哺乳動物のために一単位の投薬量として一致する物理的に別個のユニットを指し、各ユニットは、所望の治療効果を生じるように予め定めた量の活性物質を医薬的に許容できる必要な担体とともに含む。
【００２５】
不活化MVAの投与及び治療レジメン
不活化MVAの投与は、ルート（非経口、例えば腫瘍内又は静脈内投与を含む）の組合せを用いて達成できる。ある実施態様では、不活化MVAは、例えば腫瘍内注射によって腫瘍に直接投与され、この場合直接的な局所反応が所望される。加えて、不活化MVAの投与ルートは変動させることができ、例えば第一の投与は腫瘍内注射を用い、その後の投与は静脈内注射を介するか、又は前記の任意の組合せによる。治療的に有効な量の不活化MVA注射は、処方された投与頻度で処方された期間にわたって投与することができる。ある種の実施態様では、不活化MVAは他の治療的処置と併せて用いることができる。例えば、不活化MVAは、巨大原発腫瘍をもつ対象動物のためのネオアジュバント（術前）又はアジュバント（術後）設定で投与できる。そのような最適化治療レジメンは腫瘍に対して免疫応答を誘発し、一次治療法（例えば外科手術）の前に及び/又は後で対象動物の腫瘍負荷を縮小することは予想されるであろう。さらにまた、不活化MVAは、他の治療的処置（例えば化学療法又は放射線照射）と併せて投与できる。
ある種の実施態様では、不活化MVAは、離れた時間間隔で（例えば毎週又は毎月少なくとも1回）繰返し投与することができるが、必要な場合にはより頻繁に、例えば毎週2回で数週間、数カ月、数年又は場合によって持続するかぎり無期限に投与し得る。より頻繁な投与は、耐性が存在する場合及びそのような投与が利益を維持するか又は利益を増大させる場合に意図される。本方法の利益には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：癌細胞の数の減少、腫瘍サイズの縮小、腫瘍の根絶、癌細胞の周辺器官への浸潤の阻害、転移増殖の阻害又は固定、腫瘍増殖の阻害又は固定、及び生活の質の安定化又は改善。さらにまた、当該利益は、腫瘍に対する免疫応答の誘発、Tヘルパー細胞の活性化、細胞傷害性CD8+T細胞の増加、又は調節CD4+細胞の減少を含むことができる。例えばメラノーマの関係では、利益は、メラノーマの最初の診断から1年、2年、3年、4年、5年以内の又は6年を超える再発又は転移が存在しないことであり得る。同様な評価が結腸癌及び他の固形腫瘍について為し得る。
ある種の他の実施態様では、腫瘍体積又は腫瘍細胞はin vivo、ex vivo又はin vitroで不活化MVAにより処置される。
【実施例】
【００２６】
材料と方法
一般的には、本明細書で用いられる試薬は市場の供給源から得られるか、又はそれと同等なものが市場から又は公的に入手できる。
ウイルス及び細胞株
MVAウイルスはGerd Sutter氏（ミュンヘン大学）の好意により提供され、BHK-21（ベビーハムスター腎細胞、ATCC CCL-10）細胞で増殖させたが、ただし両材料は市販され及び/又は公的に入手することもできる。ウイルスは36%のシュクロースクッションで精製した。BSC40細胞は、以下を補充したダルベッコー改変イーグル培地（DMEM、Life Technologiesから購入できる（Cat# 11965-092））で維持した：5%ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン（100単位/mL）及びストレプトマイシン（100μg/mL）。BHK-21は、以下を含むイーグル最少必須培地（イーグルMEM、Life Technologiesから購入できる（Cat# 11095-080））で培養した：10% FBS、0.1mM非必須アミノ酸（NEAA）及び50mg/mLのゲンタマイシン。ネズミメラノーマ細胞株B16-F10は元々I.Fidler氏（MD Anderson Cancer Center）から入手した。B16-F10細胞は、以下を補充したRPMI1640で維持した：10% FBS、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、0.1 mM NEAA、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム及び10mM HEPES緩衝剤。
全ての細胞を5% CO2インキュベーターにより37℃で増殖させた。
加熱-MVAは、精製MVAウイルスを55℃で1時間インキュベートすることによって作製した。UV-MVAの作製のために、St ratalinker 1800 UVクロスリンカー（Stratagene）で365nm UVランプを用いて15分間 MVAにUVを照射した。
C57BL/6J雌マウス（6から10週齢）をJackson Laboratory（ストック番号000664）から購入し、骨髄由来樹状細胞の調製及びin vivo実験に用いた。これらのマウスはスローン・ケッタリング研究所の動物施設で維持した。全ての手順は、米国立衛生研究所の実験動物管理使用規定の推奨に厳密にしたがって実施した。プロトコルは、スローン・ケッタリング癌研究所の動物実験倫理委員会によって承認された。cGAS-/-、IRF3-/-、IRF7-/-、IRF5-/-、Batf3-/-、及びSTINGGt/Gtマウスは以下の研究者の実験室で作製された：Zhijian Chen（University of Texas Southwestern Medical Center；cGAS-/-）、谷口維紹（東京大学；IRF3-/-及びIRF7-/-）、Tak Mak（University of Toronto；IRF5-/-）、Kenneth Murphy（Washington University；Batf3-/-）、及びRussell Vance（University of California, Berkeley；STINGGt/Gt）。IFNAR1-/-マウスは、Dr. Eric Pamer（Sloan Kettering Institute）から提供された（このマウスはB&K Universalから購入され、C57BL/6マウスと6世代を超えて戻し交配された）。IRF5-/-マウスは、スローン・ケッタリング研究所に移される前に、Dr. Paula M. Pithaの研究室で少なくとも6世代C57BL/6Jマウスと戻し交配された。
上述の動物の市場供給源は以下のとおりである：
2018510143.tif 000002
【００２７】
骨髄由来樹状細胞の作製
マウスの脛骨及び大腿骨から、最初に筋肉を除去し続いて0.5cc U-100インスリン注射器（Becton Dickinson）を用いて10% FCS含有RPMIで細胞を洗い出すことによって骨髄細胞を収集した。遠心分離後、細胞をACK溶解緩衝液（Lonza）に再懸濁し、氷上で1−3分間細胞をインキュベートして赤血球を溶解させた。続いて細胞を収集し、新鮮な培地に再懸濁し、40μmの細胞ろ過器（BD Biosciences）でろ過した。細胞数を数えた。GM-CSF-BMDCの作製のために、骨髄細胞（各15cm細胞培養皿に5百万細胞）をGM-CSF（30ng/mL、スローン・ケッタリング研究所のモノクローナル抗体中核施設によって製造）の存在下で10−12日間、CM中で培養した。CMは以下を補充したRPMI1640倍地である：10%ウシ胎児血清（FBS）、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、0.1mM必須及び非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム及び10mM HEPES緩衝剤。細胞は2日毎に古い培地の50%を新鮮な培地に交換することによって培養し、さらに3−4日毎に再プレートして接着細胞を除去した。非接着細胞だけを実験に使用した。
RNA単離及びリアルタイムPCR
RNAを全細胞溶解物からRNeasyミニキット（Qiagen）で抽出し、第一鎖cDNA合成キット（Fermentas）を用いて逆転写した。定量的リアルタイムPCRは、SYBRグリーンPCRマスターミックス（Life Technologies）及びアプライドバイオシステムズ7500リアルタイムPCR装置（Life Technologies）を用いてトリプリケートで実施し、遺伝子特異的プライマーを用いた。相対的発現は、グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）のレベルに対して標準化した。
以下のプライマーをリアルタイムPCRに用いた：IFNA4フォワード、5’-CCTGTGTGATGCAGGAACC-3’；IFNA4リバース、5’-TCACCTCCCAGGCACAGA-3’；IFNBフォワード、5’-TGGAGATGACGGAGAAGATG-3’；IFNBリバース、5’-TTGGATGGCAAAGGCAGT-3’；GAPDH forward: 5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3’, GAPDH reverse: 5’-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3’。相対的発現は、グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）のレベルに対して標準化した。
【００２８】
サイトカインアッセイ
細胞を多様なウイルスとMOI 10で1時間感染させるか又は疑似感染させた。接種物を除去し、、細胞をPBSで2回洗浄し、新しい培地でインキュベートした。感染後種々の時間で上清を収集した。サイトカインレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットを用いて測定した（IFN-α/β（PBL Biomedical Laboratories）、IL-6、CCL4及びCCL5（R & D systems））。
ウェスタンブロット分析
WT及びKOマウス由来のBMDC（1ｘ106）に10のMOI（感染の多重度）のMVAを、又は等価量の加熱-MVA若しくはUV-MVAを感染させた。感染から種々の時間後に、培地を除去し、細胞を収集した。全細胞溶解物を調製した。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動に付し、ポリペプチドをニトロセルロース膜に移した。IRF3のホスホセリン-396に特異的なウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）を用いて、IRF3のリン酸化を測定した。IRF3のレベルは、IRF3に対するウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）を用いて測定した。抗STING抗体はCell Signalingから購入した。ワクシニアE3タンパク質レベルは、Dr. Stuart N. Isaacs（University of Pennsylvania）から供与されたE3モノクローナル抗体（MAb 3015B2）によって測定した[85]。抗グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）又は抗β-アクチン抗体（Cell Signaling）をローディングコントロールとして用いた。
B16-F10メラノーマ細胞にMOI 10でMVAを、又は等価量の加熱-MVAを感染させた。感染から種々の時間後に細胞溶解物を収集した。抗ホスホ-IRF3、抗IRF3及び抗GAPDH抗体を上記のように用いて、ウェスタンブロット分析を実施した。
【００２９】
一側皮内腫瘍移植及び免疫チェックポイント遮断剤の全身性投与の存在下又は非存在下でのウイルスの腫瘍内注射
B16-F10メラノーマ（50μLの体積中に1ｘ105細胞）を、STINGGt/Gt、Batf3-/-、又は齢適合WT C57BL/6Jマウスの右わき腹の剃毛皮内に移植した。移植後10から12日して、腫瘍サイズを測定し、直径が3mm以上の腫瘍はマウスの麻酔時に加熱-MVA（50μLの体積中にMVAの2ｘ107pfuと等価量）又はPBSが注射されるであろう。ウイルスは、各実験で指定するように週1回又は週2回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に2回測定した。腫瘍体積は下記式にしたがって計算した：l（長さ）ｘw（幅）ｘh（高さ）/2。抑うつ徴候があれば又は腫瘍の直径が10mmに達したとき、マウスを安楽死させた。マウスの安楽死時に血清を収集した。
加熱-MVAと免疫チェックポイント遮断剤の併用を評価するために、我々は、腹腔内にデリバリーされる抗CTLA-4抗体（100μLの体積中に100μg）の存在下又は非存在下で、加熱-MVA又はPBSのどちらかの腫瘍内注射によりマウスを処置した。マウスはウイルス及び抗体を3−4日毎に（週に2回）与えられた。動物を毎日モニターし、さらに3日毎に腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は下記式にしたがって計算した：l（長さ）ｘw（幅）ｘh（高さ）/2。抑うつ徴候があれば又は腫瘍の直径が10mmに達したとき、マウスを安楽死させた。
いくつかの事例では、1ｘ105のMC38結腸腺癌細胞を剃毛マウスの右わき腹の皮内に移植した。7日後に、腫瘍に週に2回PBS、加熱-MVA又はUV-MVAを上記に記載した用量と同じ用量で注射した。動物を毎日モニターし、さらに3日毎に腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は下記式にしたがって計算した：l（長さ）ｘw（幅）ｘh（高さ）/2。抑うつ徴候があれば又は腫瘍の直径が10mmに達したとき、マウスを安楽死させた。
【００３０】
全身性抗腫瘍免疫の上昇を査定するための腫瘍チャレンジ
B16-F10ネズミメラノーマモデルのために、1ｘ105細胞（50μLの体積）を右わき腹の皮内に注射により移植し、PBS又は加熱-MVA（50μLの体積中にMVAの2ｘ107pfuと等価量）の腫瘍内デリバリーにより処置した。マウスを腫瘍増殖及び30−80日生存についてモニターした。生存マウスを、反対側脇腹に致死用量のB16-F10（1ｘ105細胞）の皮内デリバリーで再チャレンジした。マウスを腫瘍増殖について30−80日間モニターした。また別に、マウスを致死用量のB16-F10（1ｘ105細胞）の静脈内デリバリーでチャレンジし、続いて再チャレンジから3週間後に安楽死させ肺臓表面の腫瘍の存在を判定した。
MC38ネズミ結腸腺癌モデルのためには、1ｘ105細胞を右わき腹の皮内に注射により移植し、PBS、加熱-MVA又はUV-MVA（MVAの2ｘ107pfuと等価量の加熱-MVA又はUV-MVA）の腫瘍内デリバリーにより処置した。マウスを腫瘍増殖及び60日生存についてモニターした。生存マウスを、反対側脇腹に致死用量のB16-F10（1ｘ105細胞）の皮内デリバリーで再チャレンジした。マウスを腫瘍増殖について60日間モニターした。
T細胞枯渇実験
B16-F10ネズミメラノーマ細胞（50μLの体積中に1ｘ105細胞）を剃毛WT C57B/6マウス（6−8週齢）の右わき腹の皮内に移植した。腫瘍移植から8日後に、当該腫瘍に加熱-MVA（MVAの2ｘ107pfuと等価の用量）又はPBSを週に2回注射した。CD4+、CD8+及びNK細胞のための枯渇抗体（GK1.5、2.43、及びPK136の200μg）（モノクローナル抗体中核施設（Monoclonal Antibody Core Facility）、MSKCC）（以下を参照されたい：Avogadri et al., PloS One 2010）を、ウイルス感染の1日前から開始して腹腔内に週に2回注射し、それらマウスを死亡するまで或いは安楽死させるまで、又は腫瘍が完全に除去されるまで用いた。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを測定した。標的の免疫細胞の枯渇は、抗体の4回投与後にマウスの末梢血のFACSによって立証した。
【００３１】
両側腫瘍移植モデル及び免疫チェックポイント遮断の全身又は腫瘍内投与の存在下又は非存在下でのウイルスの腫瘍内注射
簡単に記せば、B16-F10ネズミメラノーマ細胞をC57B/6マウスの左及び右わき腹の皮内に移植した（5ｘ105を右わき腹及び1ｘ105を左わき腹）。腫瘍移植から8日後に、2ｘ107pfuのMVA及び等価量の加熱-MVAをより大きな右わき腹腫瘍の腫瘍内に注射した。腫瘍サイズを測定し、さらに腫瘍に週に2回注射した。マウスの生存をモニターした。
いくつかの実験では、MC38結腸腺癌細胞をC57B/6マウスの左及び右わき腹の皮内に移植した（5ｘ105を右わき腹及び1ｘ105を左わき腹）。
いくつかの実験では、STINGGt/Gt、Batf3-/-マウス及び齢適合WTコントロールを両側B16-F10メラノーマ移植に用い、マウスのより大きな右わき腹腫瘍をPBS又は加熱-MVAで処置した。
いくつかの実験では、両側腫瘍を有するマウスを、より大きな右わき腹腫瘍への加熱-MVAの腫瘍内注射及び免疫チェックポイント遮断抗体（抗CTLA-4、抗PD-1又は抗PD-L1を含む）の腹腔内デリバリーにより処置した。
いくつかの実験では、両側腫瘍を有するマウスを、より大きな右わき腹腫瘍への加熱-MVA及び抗CTLA-4抗体（腹腔内デリバリーに用いた用量の1/10）の両方の腫瘍内注射で処置した。注射実施及び注射非実施腫瘍の両方のサイズを測定し、さらにマウスの生存をモニターした。
DC成熟のフローサイトメトリー分析
DC成熟分析のために、WT及びSTINGGt/GtマウスからBMDCを作製し、MOI 10でMVAを感染させるか、又は等価量の加熱-MVAを感染させた。感染後14時間で細胞を収集し、続いて固定緩衝液I（BD Biosciences）で37℃、15分間固定した。細胞を洗浄し、氷上で30分間PermBuffer（BD Biosciences）を用いて細胞を透過性にし、MHCクラスI、CD40、CD86及びCD80に対する抗体で30分間染色した。LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて細胞を分析した。データはFlowJoソフトウェア（Treestar）により分析した。
【００３２】
腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー分析
腫瘍内又は腫瘍流入領域リンパ節内の免疫細胞の表現型及び特徴を分析するために、以下のプロトコルにしたがってFACS分析前に細胞懸濁物を作製した（Zamarin et al., 2014）。まず初めに、PBS、MVA又は加熱-MVAによる第二の処置から3日後及び第一の処置から7日後にピンセットと外科用ハサミを用いて注射実施及び/又は注射非実施腫瘍を単離した。続いてこれら腫瘍を秤量した。腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節を細切してから、リベラーゼ（1.67 Wunsch U/mL）及びDNase（0.2mg/mL）とともに37℃で30分間インキュベートした。細胞懸濁物を以下の操作によって作製した：ピペット操作を繰り返し、70μmのナイロンフィルターでろ過し、続いて完全RPMIで洗浄しフィコール精製を実施して死細胞を除去する。細胞を抗CD3、CD45、CD4及びCD8抗体による表面標識のために処理した。固定可能染料eFluor506（eBioscience）を用いて、生細胞を死細胞から区別する。それらをさらにFoxP3固定及び透過化キット（eBioscience）により透過性にし、Ki-67、FoxP3及びグランザイムBのために染色する。データはLSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）で得た。データはFlowJoソフトウェア（Treestar）により分析した。
ELISAによる抗メラノーマ及び抗ウイルス抗体の測定
マウス血清中の抗B16メラノーマ抗体を決定するために、5ｘ104のB16-F10細胞を96ウェル培養プレートの100μL培地/ウェルに添加し、37℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSTで2回洗浄した。細胞を10%緩衝ホルマリン（125μL）で処理し、室温で15分間固定した。続いて、プレートをPBSで2回洗浄した。1% BSAを含むPBS（250μL）を用いて室温で1時間ブロックした後、1% BSA含有PBSで希釈したマウス血清（1：500）を100μL/ウェルで添加した。プレートをPBSTで5回洗浄し、37℃で1時間インキュベートした。続いて、1% BSA含有PBSで希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合抗マウスIgG（1：2000）をプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートを5回PBSで洗浄し、基質の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジンTMB（100μL/ウェル）とともに室温で10分間インキュベートした。硫酸（2N、50μL/ウェル）を添加して反応を停止させた。450nmに設定したマイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの光学濃度を決定した。
マウス血清中の抗ワクシニアウイルス抗体を決定するために、加熱-MVA（10μg/mL）を96ウェル培養プレートの100μL PBS/ウェルに添加し、37℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSTで2回洗浄した。1% BSAを含むPBS（250μL）を用いて室温で1時間ブロックした後、1% BSA含有PBSで希釈したマウス血清（1：200）を100μL/ウェルで添加した。検出プロトコルの後の部分は上記と同じである。
試薬
試薬の市場供給源は以下のとおりである：
CpGオリゴデオキシヌクレオチドODN2216（Invitrogen）；
抗体は以下を用いた：治療用抗CTLA4（クローン9H10及び9D9）、抗PD1（クローンRMP1-14）はBioXcellから購入；フローサイトメトリーに使用した抗体はeBioscienceから購入（CD45.2 Alexa Fluor 700、CD3 PE-Cy7、CD4 APC-efluor780、CD8 PerCP-efluor710、FOXP3 Alexa Fluor 700、MHCクラスI APC、CD40 APC、CD80 APC、CD86 APC）；Invitrogen（CD4 QDot 605、グランザイムB PE-テキサスレッド、グランザイムB APC）；BD Pharmingen（Ki-67-Alexa Fluor 488）。
統計
両側独立スチューデントｔ検定を試験の2つのグループの比較に用いた。生存データはログランク（マンテル-コックス）検定によって分析した。有意とみなされるp値は下記のような数字で示される：*、p＜0.05；**、p＜0.01；***、p＜0.001；****、p＜0.0001。              
【実施例１】
【００３３】
熱不活化MVAはネズミcDCでMVAより高レベルのI型IFNの産生を誘発する
熱不活化MVA（加熱-MVA）がMVAよりも高レベルのI型IFN産生をもたらすか否かを試験するために、MVAを55℃で1時間インキュベートした（これは1000倍の感染低下をもたらした）。骨髄由来樹状細胞をGM-CSFの存在下で培養し（GM-CSF-BMDC又はcDC）、10の感染多重度（MOI）でMVA又は等価量の加熱-MVAに感染させた。感染後6時間で細胞を採集し、感染細胞及び擬似感染細胞から単離したRNAの定量的リアルタイムPCR分析を実施した。cDCのMVA感染は、疑似感染細胞と比較して、IFNA4及びIFNB mRNAレベルをそれぞれ4.8倍及び148倍増加させることが見出された。対照的に、加熱-MVAの感染は、IFNA4及びIFNB mRNAレベルをそれぞれ22.4倍及び697倍に劇的に増加させた（図1A）。これらの結果は、加熱-MVAは、MVAよりも強力なIFNA4及びIFNB遺伝子発現の誘発因子であることを示す（***、p＜0.001）。
加熱-MVA又はMVA感染cDCによるI型IFN分泌誘発の動態を査定するために、加熱-MVA又はMVA感染後種々の時間（0、4、8、16及び22時間）に上清を収集し、分泌IFN-α及びIFN-βのレベルをELISAで決定した。加熱-MVAはIFN-α（1650pg/mL）及びIFN-β（1975pg/mL）の両方を感染後8時間で強力に誘発し、これは同じ時点でMVAが誘発したものより10倍及び6倍高かった。一方、MVA誘発IFN-α及びIFN-βは感染後8から22時間の間上昇し続け、加熱-MVA誘発IFN-αレベルはこの時間枠で緩やかに増加したが、加熱-MVA誘発IFN-βは感染後8時間にピークとなりそれ以降水平になった（図1B）。ウェスタンブロット分析は、E3タンパク質（先天的免疫応答を減弱させる）は加熱-MVA感染cDCでは産生されないが、MVA感染細胞では発現されることを示した（図1C）。さらにまた、加熱-MVAは、感染後4及び8時間でMVAよりも高レベルのIRF3リン酸化を始動させた（図1C）。総合すれば、これらの結果は、加熱-MVAは、MVAよりもcDCのI型IFN産生の強力な誘発因子であることを示している。
【実施例２】
【００３４】
加熱-MVA誘発I型IFN産生は、cGAS/STINGによって媒介される細胞質ゾルDNAセンシング経路並びに転写因子IRF3/IRF7並びにIFNAR1に依存する
cDCの加熱-MVA感染が、細胞質ゾルDNAセンサーcGAS（環状GMP-AMPシンターゼ）[62,63]、及びそのアダプターSTING[59,69]によって媒介される細胞質ゾルDNAセンシング経路を介してI型IFN産生を始動させるか否かを試験するために、cGAS-/-マウス[86]及び齢適合WTコントロールからcDCを作製し、加熱-MVAに感染させた。定量的リアルタイムPCR分析を用いて、感染6時間後の加熱-MVA誘発IFNA4及びIFNB遺伝子発現はともにcGAS欠損細胞で減少することが見出された（図2A、2B）。感染後22時間で収集した上清の分析もまた、加熱-MVA誘発IFN-α/β分泌はcGAS欠損細胞で失われることを示した（図2A、2B）。
STINGは細胞質ゾルDNAセンシング経路の重要なアダプターである[59,69,87,88]。STINGGt/Gtマウス（機能的STINGを欠く[89]）からもcDCを作製した。加熱-MVA誘発I型IFN遺伝子発現及びcDCからのIFN-α/β分泌もまたSTINGに依存することが見出された（図2C、D）。ウェスタンブロット分析は、感染から4及び8時間後におけるIRF3のser-396の加熱-MVA誘発リン酸化はcGAS又はSTING欠損細胞で失われることを示した（図2E、F）。加熱-MVA感染が、細胞質ゾルDNAセンシング経路を介するDC成熟を始動させるか否かを試験するために、STINGGt/Gtマウス及び齢適合WTコントロールのcDCを加熱-MVAに感染させた。細胞を感染後14時間で収集し、DC活性化マーカー（MHCクラスI（MHCI）、CD40、CD86及びCD80を含む）について染色した。加熱-MVA感染は、WT細胞でCD40及びCD86の発現を顕著に誘発し、MHCI及びCD80の発現を軽度に増加させた（図2G）。しかしながら、活性化マーカーの発現はSTING欠損細胞で顕著に低下した（図2G）。これらの結果は、DC成熟の加熱-MVA誘発は主として細胞質ゾルDNAセンシング経路を介して媒介されることを示している。我々の結果は、MVA及び加熱-MVAのウイルスDNAは感染cDCの細胞質に放出され、細胞質DNAセンサーcGAS（前記は第二のメッセンジャーcGAMPを続いて生成する）によって検出され、STING及び下流のシグナリング経路の活性化をもたらすことを示唆している。
加熱-MVAのI型IFN誘発がcGAS及びSTINGの他にIRF3、IRF5及びIRF7を必要とするか否かを試験するために、cDCをIRF3-/-、IRF5-/-、IRF7-/-マウス及び齢適合WTマウスから作製し、加熱-MVAに感染させた。加熱-MVA誘発IFNA4遺伝子発現及びIFN-αタンパク質産生はIRF3及びIRF7に依存するが、IRF5には依存しない（図3A、B）。加えて、加熱-MVA誘発IFNB遺伝子発現及びIFN-α分泌と同様にIFN-βタンパク質分泌は、IRF3及びIRF7に依存するが、IRF5には依存しない（図3A、B）。加熱-MVA誘発IFNB遺伝子発現及びIFN-β産生は、IRF7欠損細胞でそれぞれ74%及び67%に低下した（図3A、B）。加熱-MVA誘発IFNA4遺伝子発現及びIFN-αタンパク質分泌はIFNAR1に依存したが、一方、加熱-MVA誘発IFNB遺伝子発現及びIFN-β分泌は、IFNAR1欠損細胞でそれぞれ82%及び62%低下した（図3C、D）。これらの結果は、加熱-MVA誘発I型IFNの誘発は転写因子IRF3及びIRF7とともに、IFNAR1によって媒介されるI型IFNの正のフィードバックループを必要とすることを示している。
【実施例３】
【００３５】
加熱-MVAはMVAより高レベルのI型IFNをin vivoで誘発する
加熱-MVAがMVAより高レベルのI型IFNをin vivoで誘発するか否かを試験するために、加熱-MVA又はMVAをC57B/6マウスに尾静脈注射により接種し、感染後6時間で血清を収集した。血清中のIFN-α及びIFN-βの両レベルが、MVA処置マウスより加熱-MVA処置マウスで顕著に高かった（図4A）（***、p＜0.001）。これらの結果は、加熱-MVAは培養cDCでMVAよりも高レベルのI型IFNを誘発するだけでなく、in vivoでもMVAよりも高レベルのI型IFNを誘発することを示している。
【実施例４】
【００３６】
加熱-MVAはSTING/IRF3/IRF7依存態様でI型IFN誘発をin vivoで始動させる
加熱-MVAのI型IFNのin vivo誘発はIFNAR1を必要とするか否かを試験するために、IFNAR1-/-マウス及び齢適合WTコントロールマウスの尾静脈注射による精製加熱-MVAの静脈内（IV）接種を実施した。WTマウスの加熱-MVA感染は、それぞれ2256pg/mL及び1901pg/mLのレベルでIFN-α及びIFN-β産生を誘発し、IFNAR-/-マウスでは、それぞれ60%及び35%低下した（図4B）（**、p＜0.01；***、p＜0.001）。
加熱-MVA誘発IFN-α分泌はWTコントロールと比較してSTINGGt/Gtマウスで89%低下し、一方、加熱-MVA誘発IFN-β分泌はSTINGGt/Gtマウスで失われ（図4C）、in vivoでの加熱-MVA誘発I型IFN産生もまたSTINGに依存することが示された。さらにまた、加熱-MVA誘発IFN-αはWTコントロールと比較してIRF3-/-マウスで74%低下したが、一方、加熱-MVA誘発IFN-βはIRF3-/-マウスで98%低下した。加熱-MVA誘発IFN-α及びIFN-β分泌はIRF7-/-マウスで減少した（図4C）。これらの結果は、in vivoでの加熱-MVAのI型IFN誘発はSTING及びIRF3/IRF7を必要とすることを示している。
【実施例５】
【００３７】
B16-F10メラノーマ細胞の加熱-MVA感染はI型IFN並びに前炎症性サイトカイン及びケモカインの産生を誘発する
腫瘍細胞の加熱-MVA感染が先天性免疫応答を始動させるか否かを試験するために、B16-F10メラノーマ細胞をMVA（MOI 10）又は等価量の加熱-MVAに感染させ、感染6時間後に細胞を収集し、さらに感染22時間後に上清を収集した。定量的リアルタイムPCR分析は、B16-F10細胞の加熱-MVA感染は、MVAよりも高レベルのIfna4、Ifnb、Ccl5及びIl6遺伝子発現を誘発することを示した（図5A）。ELISA分析は、加熱-MVAは、MVAよりも高レベルのIFN-α、IFN-β、CCL5及びIL-6タンパク質分泌をB16-F10細胞で誘発することを示した（図5B）。ウェスタンブロット分析は、加熱-MVA感染は、B16-F10メラノーマ細胞でMVAよりも高レベルのIRF3リン酸化を誘発することを示した（図5C）。さらにまた、加熱-MVA感染はB16細胞でMHCクラスI分子発現を誘発したが、MVA感染はそのような発現を誘発できなかった。これらの結果は、B16細胞の加熱-MVA感染は、I型IFN並びに前炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を介して腫瘍細胞に対する先天性免疫応答を誘発するだけでなく、腫瘍細胞でのMHCクラスI分子の誘発を介して腫瘍の免疫原性を変化させる（強化する）ことを提唱する。
【実施例６】
【００３８】
55℃で1時間がMVA不活化の最適条件である
55℃がMVA不活化に最適な温度であるか否かを評価するために、MVAを多様な種々の温度（45℃、50℃、55℃、60℃及び65℃を含む）で1時間インキュベートした。WTマウスのcDCをこれらのウイルス調製物に感染させ、感染後22時間で上清を収集した。分泌IFN-α及びIFN-βの濃度をELISAで測定した。55℃で1時間不活化したMVAによる感染がcDCの最高レベルのIFN-α及びIFN-β分泌を誘発することが見出された（図6A、B）。
【実施例７】
【００３９】
加熱-MVAの腫瘍内注射は移植可能B16-F10メラノーマネズミモデルで腫瘍根絶及び全身性抗腫瘍免疫をもたらす
移植可能in vivo B16-F10メラノーマモデルは、C57B/6マウスの一方の脇腹へのネズミB16-F10メラノーマ細胞（1ｘ105）の移植を含む。腫瘍移植から10日後に（このとき腫瘍は直径が約3mm）、加熱-MVA（MVAの2ｘ107 pfuと等価量で）又はPBSを毎週腫瘍に注射した。加熱-MVAの腫瘍内注射は腫瘍の根絶及びマウスの100%生存をもたらし（図7A、B）、優れた治療有効性を示した。対照的に、PBSの腫瘍内注射を受けた全てマウスで腫瘍増殖は継続し、腫瘍移植から19日及び21日後に安楽死された（図7A、B）。
加熱-MVAの腫瘍内注射後にその腫瘍が根絶されたマウスは全身性抗腫瘍免疫を発達させたか否かを試験するために、最初の腫瘍根絶から8週間後に反対側脇腹に致死用量のB16メラノーマ細胞（1ｘ105）の皮内移植によって動物をチャレンジした。B16メラノーマ細胞又は加熱-MVAに全く暴露されたことがないナイーブマウスをコントロールとして用いた。腫瘍チャレンジ後70日間動物の経過を追った。加熱-MVA処置マウスの90%が腫瘍チャレンジに対して生存し、一方、ナイーブマウスの全てが腫瘍増殖を発達させ、最終的に安楽死された（図7C）。加熱-MVA処置マウスが全身性抗腫瘍免疫を種々の器官で発達させたか否か（転移と類似）を試験するために、我々は、加熱-MVA処置マウスがB16-F10メラノーマ細胞の静脈内デリバリーを介する腫瘍チャレンジを拒絶できるか否かを試験した。ナイーブマウス及び加熱-MVA処置マウスの両方が1ｘ105のB16-F10細胞の静脈内デリバリーを受けた。マウスを腫瘍チャレンジ後3週間で安楽死させた。マウスの肺臓を収集し、ホルマリン含有溶液で固定した。肺表面の腫瘍を解剖顕微鏡下で可視化して数を数えた。ナイーブマスの全てが肺表面に可視化された平均58の腫瘍を発達させたが、10匹の加熱-MVA処置マウスのうち1匹のみが顕微鏡下で見ることができる2つの腫瘍病巣を発達させただけであった（図7D；****、p＜0.0001）。総合すれば、これらの結果は、加熱-MVAは、注射腫瘍の根絶及び全身性抗腫瘍免疫の発達の両方をもたらすことを示している。これらの結果は、加熱-MVAの注射は、強力なワクチン作用を、ことによると腫瘍抗原提示強化及び腫瘍特異的T細胞の活性化を通して引き出すことができることを示唆している。
【実施例８】
【００４０】
加熱-MVAは腫瘍のミクロ環境で免疫学的変化をもたらす
加熱-MVAの腫瘍内注射によって誘発される腫瘍内の免疫学的変化を精査するために、加熱-MVA又はPBSの腫瘍内注射から3日後に腫瘍を採集し、免疫細胞浸潤物をFACSによって分析した。腫瘍内の生細胞のCD3+CD45+ T細胞のパーセンテージは、PBS処置腫瘍の6.5%から加熱-MVA処置腫瘍の19.5%に増加した（P＝0.0002；図8A、G）。グランザイムBを発現する（すなわち細胞傷害性表現型を発現する）CD8+ T細胞のパーセンテージの増加もまた腫瘍内で観察され、PBS処置腫瘍の47.9%から加熱-MVA処置腫瘍の92.8%の範囲であった（P＜0.0001；図8B、H）。Ki-67+CD8+ T細胞（すなわち分裂CD8+ T細胞）のパーセンテージは51.2%から71.7%に増加した（P＝0.0008；図8C、I）。同様な変化が、PBS処置腫瘍と比較して加熱-MVA処置腫瘍内のCD4+ T細胞について観察され、グランザイムB+CD4+ T細胞（すなわち活性化Tヘルパー細胞）のパーセンテージは、PBS処置腫瘍の3%から加熱-MVA処置腫瘍の75%に劇的に上昇した（P＝0.0002；図8D、J）。さらにまた、PBS処置腫瘍の37.5%から加熱-MVA処置腫瘍の79%へのKi-67+CD4+ T細胞（すなわち分裂CD4+ T細胞）パーセンテージの増加があった（P＜0.0001；図8E及びK）。対照的に、Foxp3+CD4+ T細胞（すなわち調節CD4+ T細胞）のパーセンテージは、PBS処置腫瘍の34.7%から加熱-MVA処置腫瘍の9.1%へ減少した（P＜0.0001；図8F、N）。これらの結果は、加熱-MVAの腫瘍内注射は腫瘍のミクロ環境の免疫答を劇的にアップレギュレートすることを示している。前記免疫応答には、腫瘍内のヘルパーCD4+、細胞傷害性CD4+（包括的に“エフェクターT細胞”）及び細胞傷害性CD8+ T細胞の活性化、並びにCD4+調節T細胞の同時減少が含まれる。実施例8の結果を総合すれば、これらの結果は、加熱-MVAの腫瘍内注射は、腫瘍免疫の抑制性ミクロ環境を変化させて抗腫瘍免疫の発達を促進することを示している。
【実施例９】
【００４１】
加熱-MVAはまた腫瘍流入領域リンパ節（TDLN）で免疫学的変化を誘発する
加熱-MVAの腫瘍内注射がTDLNで免疫学的変化を引き起こすか否かを試験するために、加熱-MVA処置又はPBS処置マウスからTDLNを単離し、FACSで分析した。TDLNのグランザイムB+CD8+ T細胞のパーセンテージは、PBS処置マウスの0.15%から加熱-MVA処置マウスの3.04%に増加した（P＜0.0001；図9A及びE）。加えて、Ki-67+CD8+ T細胞のパーセンテージは、PBS処置マウスの7.2%から加熱-MVA処置マウスの17%に増加した（P＝0.0003；図9C、F）。これらの結果は、PBS処置マウスの場合よりも加熱-MVA処置マウスのTDLNでより活性化され及び複製性であるCD8+ T細胞が存在することを示している。活性化及び複製性CD4+ T細胞の同様な増加はまた、PBS処置マウスと比較して加熱-MVA処置マウスで観察された。TDLNのグランザイムB+CD4+ T細胞のパーセンテージは、PBS処置マウスの0.25%から加熱-MVA処置マウスの0.77%に増加し（P＝0.002；図9B、G）、TDLNのKi-67+CD4+ T細胞のパーセンテージは、PBS処置マウスの10.6%から加熱-MVA処置マウスの18.4%に増加した（P＝0.002；図9D、H）。総合すれば、これらの結果は、加熱-MVAの腫瘍内注射は、腫瘍内だけでなく循環でもまたCD8+及びCD4+ T細胞の両方の活性化及び分裂をもたらすことを示している。
【実施例１０】
【００４２】
加熱-MVAの腫瘍内注射は、STING欠損マウス又はBatf3欠損マウスではB16メラノーマの根絶の有効性は野生型コントロールと比較して低い
最近の研究で、STING媒介細胞質ゾルDNAセンシング経路は、腫瘍に対する偶発的T細胞応答とともに放射線照射抗腫瘍免疫で役割を有することが示された[7,8,90]。BATF3は、CD8α+系列のDCの発達のために重要な転写因子であり、前記はウイルス及び腫瘍相互提示で重要な役割を有する[91,92]。Batf3欠損マウスは高度に免疫原性である腫瘍を拒絶できなかった[91]。STING又はBatf3が加熱-MVA媒介腫瘍除去で役割を有するか否かを試験するために、我々は、B16-F10メラノーマ細胞をWT C57B/6、STINGGt/Gt、又はBatf3-/-マウスの右脇腹皮内に移植した。腫瘍移植後11日に、この腫瘍に加熱-MVA（2ｘ107pfuと等価用量）又はPBSを表示のように週単位で注射した（図10A及びB）。加熱-MVA処置腫瘍を有するWTマウスの100%の生存が見出され、残留腫瘍があるとしても極めてわずかであったが、一方、PBS処置WTマウスはいずれも死亡した。（中央値生存は24日）（図10A及びB）。さらにまた、加熱-MVA処置STING欠損マウスではわずかに7.7%の生存が観察され、PBS処置STING欠損マウスは全て死亡した。加熱-MVA処置後のWT及びSTINGGt/Gt間の生存における相違は統計的に有意であった（P＜0.0001）。STINGGt/Gtマウスの加熱-MVA処置は、生存中央値を21日から28日に伸ばした（P＜0.0001）（図10A及びB）。さらに目覚ましいことには、Batf3-/-マウスは、加熱-MVAで処置されようがPBSで処置されようがいずれも死亡した。しかしながら、Batf3-/-マウスの加熱-MVA処置は、生存中央値を21日から30日に伸ばした（P＝0.0025）（図10A及びB）。これらの結果は、STING媒介細胞質ゾルDNAセンシング経路及びCD8α+ DCの両方が加熱-MVA誘発抗腫瘍作用に必要であることを示している。
【実施例１１】
【００４３】
CD8+ T細胞は加熱-MVA誘発抗腫瘍作用に必要である
どの免疫細胞タイプが加熱-MVAの治療効果に必要かを決定するために、抗体枯渇実験を実施した。簡単に記せば、WT C57B/6マウスの右脇腹皮内にB16-F10メラノーマ細胞（2ｘ105）を移植した。腫瘍移植8日後に、腫瘍に加熱-MVA（2ｘ107pfuと等価用量）又はPBSを表示のように週単位で2回注射した（図10A）。CD4+、CD8+及びNK細胞に対する枯渇抗体（GK1.5、2.43及びPK136の200μg）を、ウイルス注射の1日前から週に2回腹腔内に注射した（図11A）。加熱-MVAの腫瘍内デリバリーは効率的な腫瘍根絶をもたらすが、一方、CD8+ T細胞の枯渇は加熱-MVAの治療効果の劇的な消失を生じることが見出された（****、p＜0.0001）（図11B、C、D、E）。CD4+及びNK/NKT細胞の枯渇は、加熱-MVAの治療効果の部分的消失を生じるだけである（図11F、G）。これらの結果は、CD8+ T細胞は加熱-MVAによって引き出される抗腫瘍作用に必要であるが、一方、CD4+及びNK/NKT細胞はまた抗腫瘍作用に寄与することを示している。抗腫瘍作用におけるCD4+ T細胞の役割はさらに、CD4枯渇抗体の下で加熱-MVAで首尾よく処置されたマウスの腫瘍チャレンジに対する防御欠如によって示された（図11H−I）。対照的に、NK/NKT枯渇抗体の存在下又は非存在下で加熱-MVAにより首尾よく処置されたマウスは、腫瘍チャレンジを効果的に拒絶した（図11H−I）。我々は、CD4+ T細胞は加熱-MVA注射腫瘍の根絶に絶対必要というわけではないが、それらは、抗腫瘍適応免疫の発達のために、ことによると抗腫瘍抗体の発生のために重要であると結論した。実施例8、9、10及び11を総合すれば、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーは免疫細胞及び腫瘍細胞のI型IFNの誘発をもたらし、これはCD103+樹状細胞の活性化をもたらし、結果として、腫瘍内及び循環中のCD8+ T細胞への腫瘍抗原相互提示とともに抗腫瘍適応免疫の発生をもたらすと要約される。
【実施例１２】
【００４４】
STING媒介細胞質ゾルDNAセンシング経路及びCD103+ DCの両方が加熱-MVAによる抗メラノーマ抗体の誘発に必要である
抗腫瘍抗体産生は適応免疫の重要な特徴である。加熱-MVAが抗メラノーマ抗体産生を誘発するか否かを試験するためにELISAを実施して、加熱-MVA又は疑似処置マウスの抗B16メラノーマ抗体の血清濃度を測定した。加熱-MVA処置マウスのみが抗メラノーマ抗体を産生することが見出された（図12A）。この誘発は、STING又はBatf3欠損マウスで失われる（図12A）。対照的に、抗ウイルス抗体の産生はSTING又はBatf3のどちらにも依存しない（図12B）。これらの結果は、この動物モデルでは腫瘍及びウイルス抗原認識を促進するプロセスはおそらく相違することを示唆している。実施例11から、我々が知ったのは、CD8+ T細胞は注射実施腫瘍での腫瘍殺滅に重要で、したがって腫瘍抗原の放出に重要であり、この工程はB細胞によって処理されて、ヘルパーCD4+ T細胞の存在下で抗原特異的抗体が生成され得るということである。我々は、したがって、Batf3欠損マウスでは抗腫瘍CD4+及びCD8+ T細胞の両方が欠如し、これが抗メラノーマ抗体産生の不首尾に関係すると仮定する。
【実施例１３】
【００４５】
加熱-MVAの腫瘍内注射と抗CTLA-4抗体との併用は一側メラノーマ移植モデルで相乗的抗腫瘍作用をもたらす
加熱-MVAの腫瘍内注射が従来の免疫療法（例えば免疫チェックポイント遮断、例えば抗CTLA-4抗体）の治療効果を強化する能力を有するか否かを究明するために、加熱-MVAの腫瘍内注射を抗CTLA-4抗体の腹腔内デリバリーと組み合わせて担癌マウスを処置した。簡単に記せば、WT C57B/6マウスの右脇腹皮内にB16-F10メラノーマ細胞（2ｘ105）を移植した。腫瘍移植10日後に、腫瘍が実施例7、10又は11より大きく増殖したとき、マウスを以下の組合せで処置した：PBS＋アイソタイプコントロール；PBS＋抗CTLA-4抗体；加熱-MVA＋アイソタイプコントロール；及び加熱-MVA＋抗CTLA-4抗体。図11Eに示すように、腫瘍体積はウイルス注射開始時には試験グループ間で一致していた。PBS＋アイソタイプコントロール又はPBS＋抗CTLA-4抗体で処置されたマウスは腫瘍増殖のために急激に死亡した（図13A、B）。しかしながら、加熱-MVA処置の後では、加熱-MVA注射を受けた腫瘍は顕著に縮小するか又は根絶され、実験終了時（ウイルス注射後73日）には30%のマウスで腫瘍は存在しなかった（図13C）。加熱-MVA及び抗CTLA-4抗体による処置は、加熱-MVA処置単独と比較して優れた治療有効性をもたらし、実験終了時には78%のマウスで腫瘍は存在しなかった（図13D）。我々は、加熱-MVAの腫瘍内注射と抗CTLA-4抗体の腹腔内デリバリーの相乗効果を観察し、前記は治癒率及び生存に劇的な増加をもたらした（図13F；*、p＜0.05；**、p＜0.01；****、p＜0.0001）。これらの結果は、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーは、腫瘍免疫の抑制的ミクロ環境のCD8+及びCD4+ T細胞応答の発生による変化をもたらし、前記応答は抗CTLA-4抗体の存在下で強化又は解放されることを示している。
【実施例１４】
【００４６】
加熱-MVAはMVAよりも強力な抗腫瘍免疫の誘発因子である
MVAは、大半の哺乳動物で非複製性の弱毒化ワクチンウイルスである。我々は、MVAはB16メラノーマ細胞で軽度に複製することを見出した（図12A）。加熱-MVAは感染性が1000倍低下し、B16メラノーマ細胞では複製しない（データは示されていない）。我々は、加熱-MVAはMVAよりも強力な抗腫瘍免疫アクチベーターの可能性があるが、ただし加熱-MVAが、感染cDC及び腫瘍細胞でin vitro並びにin vivoでMVAよりも高レベルのI型IFNを誘発することを条件とすると仮説を立てた（実施例4）。我々は以下の実験を実施して、両側性B16-F10メラノーマ移植における腫瘍根絶及び全身性免疫発生の有効性を加熱-MVA対MVAの腫瘍内注射で直接比較した。簡単に記せば、B16-F10メラノーマ細胞をC57B/6マウスの左及び右脇腹の皮内に移植した（5ｘ105を右脇腹及び1ｘ105を左脇腹）。腫瘍移植8日後に、2ｘ107pfuのMVA又は等価量の加熱-MVAを右脇腹のより大きな腫瘍の皮内に注射した。腫瘍サイズを測定し、さらに腫瘍に注射を週に2回実施した。マウスの生存も同様にモニターした。PBS処置マウスでは、腫瘍は右脇腹で急激に増殖し、早期の死亡をもたらすことを見出した（図12C、D及びB）。加熱-MVA又はMVAの腫瘍内注射は、PBSと比較して腫瘍増殖の遅延をもたらし、生存を改善した（図14B；MVA対PBSでは***、p＜0.001；加熱-MVA対PBSでは****、p＜0.0001）。加熱-MVAの腫瘍内注射は、MVAよりも、注射された腫瘍の根絶で（加熱-MVAでは9/9が腫瘍無しに対してMVAでは6/9が腫瘍無し）、さらに反対側脇腹の注射非実施腫瘍の増殖の遅延又は根絶で（加熱-MVAでは5/9が腫瘍無しに対してMVAでは1/9が腫瘍無し）より有効である（図14E−H）。MVA処置マウスと比較して、加熱-MVA処置マウスでは生存が改善されることが観察された（図14B；**、p＜0.01）。これらの結果は、（i）ウイルス複製は抗腫瘍作用の達成には必要ではないこと；及び（ii）加熱-MVAの抗腫瘍作用はI型IFNを強力に誘発するその能力と相関性があることを示している。
【実施例１５】
【００４７】
加熱-MVAは注射非実施腫瘍でMVAよりも多くの免疫活性化細胞を誘発する
全身性抗腫瘍免疫の誘発におけるMVAを超える加熱-MVAの優位性の基礎となる免疫メカニズムを理解するために、我々は、加熱-MVA又はMVA処置マウスの注射非実施腫瘍の免疫細胞浸潤物を精査した。簡単に記せば、マウスの左脇腹に2.5ｘ105のB16-F10メラノーマ細胞を、右脇腹に5ｘ105のB16-F10メラノーマ細胞を皮内移植した。腫瘍移植7日後に、2ｘ107pfuのMVA若しくは等価量の加熱-MVA又はPBSを右脇腹のより大きな腫瘍内に注射した。注射は3日後に繰り返した。注射非実施腫瘍を採集し、細胞懸濁物を作製した。腫瘍浸潤物中の生免疫細胞をFACSで分析した。MVA又はPBS処置マウスのものと比較して、加熱-MVA処置マウスの注射非実施腫瘍でCD45+、CD103+、CD3+及びCD8+免疫細胞の劇的な増加を観察した。MVA処置もまたPBS処置マウスのものと比較して注射非実施腫瘍でこれらの免疫細胞の増加をもたらしたが、注射非実施腫瘍での免疫細胞誘発ではMVAは加熱-MVAよりも能力は低い（図15A）。加熱-MVA処置は、注射非実施腫瘍内の細胞傷害性グランザイムB発現CD8+及びCD4+ T細胞の補充及び分裂をもたらした（図15B）。MVAは、注射非実施腫瘍のグランザイムB+CD8+の誘発では加熱-MVAよりも能力は低い（図15B）。これらの結果は、注射非実施腫瘍での多様な免疫細胞、特にグランザイムB+CD8+ T細胞の補充及び活性化では加熱-MVAはMVAよりも能力が高いことを示している。このことは、MVAと比較して、注射非実施腫瘍の根絶及び増殖遅延並びに生存の延長における有効性の強化と相関性がある。
【実施例１６】
【００４８】
加熱-MVAの腫瘍内デリバリーはSTING又はBatf3欠損マウスの両側腫瘍移植モデルでB16-F10メラノーマを治癒できない
実施例10で、我々は、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーは一側移植モデルのB16-F10メラノーマの根絶で有効ではないことを示した。この試験をさらに発展させるために、我々は両側性腫瘍移植モデルで加熱-MVAの腫瘍内デリバリーの有効性を試験した。PBS処置グループでは、全てのマウスが右脇腹のより大きな腫瘍の急激な増殖のために死亡した（生存中央値16日）（図16A、B、I）。加熱-MVAの腫瘍内注射は、注射実施腫瘍の全ての根絶をもたらすが、注射非実施腫瘍はWTマウス10匹のうち3匹で除去しただけである（図16C、D、I；加熱-MVA対PBSについて****、p＜0.0001）。加熱-MVA処置はWTマウスでメラノーマの30%治癒をもたらすが、Batf3 KOマウスでは治療利益を示すことはできないことを見出した（図16G、H、I）。STING欠損マウスでは、加熱-MVAの腫瘍内注射は腫瘍増殖の遅延及び生存中央値の延長をもたらした（図16E、F、I；**、p＜0.01）。実施例10と併せて、我々は、Batf3依存CD103+ DCは、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーによる抗腫瘍免疫の誘発に重要であると結論した。STINGによって媒介される細胞質ゾルDNAセンシング経路もまた加熱-MVAによって誘発される適応腫瘍免疫で重要な役割を果たす。
【実施例１７】
【００４９】
Batf3 KOマウスは加熱-MVAの腫瘍内デリバリーに応答する抗腫瘍CD8+及びCD4+ T細胞の発達が不完全である
実施例10及び16で示された加熱-MVAによって誘発される抗腫瘍免疫におけるCD103+ DCの重要性、並びに加熱-MVA媒介抗腫瘍作用におけるCD8+及びCD4+ T細胞の重要な役割を前提として、我々は、Batf3 KOマウスでは加熱-MVAの腫瘍内注射に応答する抗腫瘍CD4+及びCD8+ T細胞生成に欠損が存在するか否かを、両側腫瘍移植モデルを用いて解明した。簡単に記せば、Batf3-/-マウス及び齢適合WTコントロールの左脇腹に2.5ｘ105のB16-F10メラノーマ細胞を、右脇腹に5ｘ105のB16-F10メラノーマ細胞を皮内移植した。腫瘍移植7日後に、加熱-MVA又はPBSを右脇腹のより大きな腫瘍に注射した。注射は3日後に繰り返した。注射非実施腫瘍を最初の注射から7日後に採集し、細胞懸濁物を作製した。注射実施及び注射非実施腫瘍中の浸潤物の生免疫細胞をFACSで分析した。実施例15と同様に、PBS処置マウスのものと比較して、加熱-MVA処置マウスの注射実施及び注射非実施腫瘍の両方でCD3+及びCD8+免疫細胞の劇的な増加を観察した（図17A−B；**、p＜0.01；***、p＜0.001）。我々はまた、注射実施及び注射非実施腫瘍の両方でKi-67+CD8+及びKi-67+CD4+ T細胞の顕著な増加を観察した（図17C−D；**、p＜0.01；***、p＜0.001；****、p＜0.0001）。対照的に、Batf3 KOマウスでは、注射実施及び注射非実施腫瘍へのCD8+及びCD4+ T細胞の補充及び分裂は減少した（図17A−D）。これらの結果は、CD103+ DCは、腫瘍抗原の相互提示及び加熱-MVA処置に応答するCD8+ T細胞生成において重要であることを示している。CD103+ DC以外の多くの細胞タイプが、ナイーブCD4+ T細胞に対してMHCクラスII上に腫瘍抗原を提示する能力を有する。我々は、注射非実施腫瘍の腫瘍反応性CD4+ T細胞の数は、WTマウスよりもBatf3-/-マウスではるかに少ないことを見出した（図17D）。Batf3-/-マウスの腫瘍のCD8+ T細胞の欠如が不完全な腫瘍殺滅及び貧弱な腫瘍抗原の放出をもたらすことは可能であり、このことは腫瘍反応性CD4+ T細胞の生成に影響を与える。実施例10、12及び16を総合して、我々は、Batf3依存CD103+/CD8αDCは、加熱-MVA誘発抗腫瘍作用で重要な役割（腫瘍反応性CD8+、CD4+ T細胞とともに抗腫瘍抗体の生成を含む）を有すると結論する。
【実施例１８】
【００５０】
加熱-MVAの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断剤の腹腔内デリバリーの併用は両側性メラノーマ移植モデルで相乗的な治療効果を生じる
続いて我々は、加熱-MVAの腫瘍内注射が、両側性B16-F10メラノーマモデルで免疫チェックポイント遮断療法（例えば抗CTLA-4、抗PD-1又は抗PD-L1抗体）の治療効果を強化するか否かを精査した（前記療法は転移疾患を有する個体を刺激する）。略記すれば、B16-F10ネズミメラノーマ細胞をC57B/6マウスの左及び右脇腹に皮内移植した（5ｘ105を右脇腹及び1ｘ105を左脇腹）。腫瘍移植から8日後に、加熱-MVA（MVAの熱不活化2ｘ107pfu）又はPBSをより大きな右脇腹腫瘍内に週に2回注射した。マウスの4グループを加熱-MVAで処置し、各グループはアイソタイプコントロール、抗CTLA-4、抗PD-1又は抗PD-L1抗体のいずれかの腹腔内デリバリーを受けた（図18A）。
PBS処置マウスはその後の20日間の腫瘍増殖の増加により急激に死亡し（図18B、C、D）、加熱-MVA＋アイソタイプコントロールで処置されたマウスは注射実施腫瘍を根絶し、反対側の注射非実施腫瘍の増殖を遅らせた（図18E、F）。結果として、加熱-MVA＋アイソタイプによる処置は、PBSグループと比較して生存を顕著に延長した（図18B；****、p＜0.0001）。加熱-MVAの腫瘍内注射と抗CTLA-4、抗PD-1及び抗PD-L1抗体の全身性デリバリーとの併用はさらに延命及び注射非実施腫瘍の排除をもたらした。結果として、加熱-MVA＋アイソタイプ処置マウスの10%が腫瘍無しと比較して、加熱-MVA＋抗CTLA-4処置マウスの50%、加熱-MVA＋抗PD-1処置マウスの50%、及び加熱-MVA＋抗PD-L1処置マウスの70%が実験終了時に腫瘍無しであった（図18E−L）。
加熱-MVA＋アイソタイプコントロールと比較して、注射非実施遠隔腫瘍の増殖を制御する能力は、加熱-MVA＋免疫チェックポイント遮断併用グループにおける生存の改善と相関性があった（図18B；****、p＜0.0001）。抗CTLA-4、抗PD-1又は抗PD-L1抗体の腹腔内デリバリー単独は、B16-F10メラノーマモデルで最小限の治療利益を有する（図13B及びデータは示されていない）。これらの結果は、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーは、転移性B16メラノーマモデルでの免疫チェックポイント遮断に対する治療耐性を克服することを示し、このことは、このアプローチを人間の治療法に振り替えて有益な結果が得られることの予兆となる。
この実験は、免疫チェックポイント遮断と不活化MVA療法の結合におけるより長期の利点を査定するために繰り返されるであろう。
【実施例１９】
【００５１】
UV-MVAはcDCでSTING依存態様によりI型IFNを誘発する
我々は、MVAの紫外光不活化はまた、STING媒介細胞質ゾルDNAセンシング経路の活性化により免疫活性化ウイルスを生じ得ると仮説を立てた。この仮説を試験するために、STINGGt/Gtマウス及び齢適合WTコントロールマウスのcDCを感染させた。細胞（1ｘ106）にMOI 10でMVA、又は等価量の加熱-MVA若しくはUV-MVAを感染させた。感染後22時間で上清を収集し、分泌されたIFN-α及びIFN-βの濃度をELISAで決定した。加熱-MVAと同様に、UV不活化MVAもまた、WT cDCでMVAよりも高レベルのI型IFNを誘発する（図19A、B）。UV-MVA誘発I型IFNはSTING欠損細胞で完全に失われる（図19A、B；***、p＜0.001）。これらの結果は、IFN-α及びIFN-βの加熱-MVA媒介誘発もUV-MVA媒介誘発もSTING経路に依存することを示し、さらに加熱-MVA及びUV-MVAはそれらの腫瘍抑制作用を類似のメカニズムを介して発揮することを裏付ける。
【実施例２０】
【００５２】
UV-MVA及び加熱-MVAの腫瘍内注射は一側結腸腺癌モデルで注射実施腫瘍の根絶及び全身性抗腫瘍免疫の発達をもたらす
実施例7及び14に示した実験は、加熱-MVAの腫瘍内注射はネズミの移植可能B16-F10メラノーマモデルで腫瘍の根絶及び全身性抗腫瘍免疫をもたらすことを示した。加熱-MVA又はUV-MVAが他の固形腫瘍を根絶できるか否かを試験するために、加熱-MVA又はUV-MVAの抗腫瘍効果をネズミMC38結腸腺癌移植モデルで試験した。結腸腺癌はメラノーマとは無関係の代表的な固形腫瘍であるが、単に任意に選択した。5ｘ105のMC38結腸癌細胞をC57B/6マウスの右脇腹の皮内に移植した。腫瘍を7日間増殖させ、その後で加熱-MVA又はUV-MVA（MVA 2ｘ107pfuに当たる加熱-MVA又はUV-MVA）又はPBSコントロールを週に2回腫瘍内に注射した。腫瘍を週2回測定し、腫瘍体積を下記式にしたがって計算した：l（長さ）ｘw（幅）ｘh（高さ）/2。PBS処置マウスの全てが腫瘍増殖のために死亡するのが見出された（図20D、G）。加熱-MVA処置マウスの70%及びUV-MVA処置マウスの71%が実験終了時に生存した（ウイルス注射後60日ごろ）（図20E、F）。したがって、加熱-MVA又はUV-MVAの腫瘍内注射は、PBSコントロールと比較してマウスの生存を顕著に引き延ばした（図20G；****、p＜0.0001）。
生存マウスが全身性抗腫瘍免疫を生じたか否かを試験するために、致死用量のMC38細胞（1ｘ105）を用いてこのマウスの反対側の脇腹でマウスをチャレンジし、生存をモニターした。ナイーブマウスの全てが腫瘍を発達させて死亡し、加熱-MVA又はUV-MVA処置マウスの100%が腫瘍チャレンジを拒絶するのが見出された（図20H）。我々はまた、加熱-MVA又はUV-MVAによるMC38細胞の感染が、MVAより高レベルの炎症性サイトカイン及びケモカインを誘発するか否かを試験した。MC38細胞にMOI 10のMVA又は等価量の加熱-MVA若しくはUV-MVAを感染させた。感染後22時間で上清を収集した。上清中の分泌IL-6、CCL4及びCCL5の濃度をELISAで測定した。我々はまた、加熱-MVA又はUV-MVAはMVAよりも高レベルのIL-6、CCL4及びCCL5をMC38から誘発することを見出した（図20A、B、C）。総合すれば、実施例7、14及び実施例20で観察された結果は、加熱-MVA及びUV-MVAは多様な固形腫瘍の抗腫瘍作用促進に有効であること、さらに本開示に記載する所見はメラノーマに限定されず多様な起源の他の固形腫瘍で推定できることを示している。
【実施例２１】
【００５３】
加熱-MVAの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断剤の腹腔内デリバリーの併用は両側性MC38結腸腺癌移植モデルで相乗的な治療効果をもたらす
我々はさらに、加熱-MVAの腫瘍内注射が、免疫チェックポイント遮断療法（例えば抗CTLA-4、抗PD-1又は抗PD-L1抗体）の治療効果を強化するか否かを他の両側腫瘍移植モデルで精査した（前記療法は転移性疾患を有する個体を刺激する）。略記すれば、MC38結腸腺癌細胞をC57B/6マウスの左及び右脇腹に皮内移植した（5ｘ105を右脇腹及び1ｘ105を左脇腹）。腫瘍移植から8日後に、加熱-MVA（MVAの熱不活化2ｘ107pfu）又はPBSをより大きな右脇腹腫瘍内に週に2回注射した。PBS処置マウスには3グループあり、各グループは、PBS又は抗CTLA-4若しくは抗PD-L1抗体のいずれかの腹腔内デリバリーを受けた（図21A−F）。加熱-MVA処置マウスには3グループあり、各グループはアイソタイプコントロール又は抗CTLA-4若しくは抗PD-L1抗体のいずれかの腹腔内デリバリーを受けた（図21G−L）。PBS処置マウスはその後の14日間の腫瘍増殖の増加により急激に死亡し（図21B、C、D）、PBS＋抗CTLA-4又はPBS＋抗PD-L1で処置されたマウスの全てが死亡したが、ただし免疫チェックポイント遮断剤の腹腔内注射は、PBSグループと比較して延命をもたらす（図21A−F、M；***、p＜0.001）。B16-F10両側性移植モデル（実施例14参照）で我々が観察したものと同様に、加熱-MVAの腫瘍内注射は、注射実施MC38腫瘍の根絶をもたらしたが（図21G、8/10で腫瘍無し）、しかしながらそれは反対側の注射非実施腫瘍の増殖を遅らせそれらのうち1/10の腫瘍を根絶しただけであった（図21H；****、p＜0.0001加熱-MVA対PBS）。対照的に、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーと抗CTLA-4抗体の腹腔内デリバリーの併用、又は加熱-MVA＋抗PD-L1は、加熱-MVA単独よりもはるかに高い有効性で注射非実施遠隔腫瘍の根絶をもたらし（図21G−L）、これは、加熱-MVA単独と比較して併用療法による生存の改善と相関性を示した（図21N；*p＜0.05；**、p＜0.01）。これらの結果は、不活化MVAと免疫チェックポイント遮断剤の組合せを用いる転移固形腫瘍の治療を示唆する。
【実施例２２】
【００５４】
加熱-MVAの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断抗CTLA-4抗体の腫瘍内デリバリーの併用は両側性B16-F10移植モデルで相乗的治療効果をもたらす
実施例13、18及び21で、我々は、加熱-MVAの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断剤の全身性（腹腔内）デリバリーの併用は、メラノーマ及び結腸腺癌モデルで相乗的抗腫瘍作用をもたらすことを示した。ここで我々は、加熱-MVAと抗CTLA-4抗体（腹腔内デリバリ―用量の1/10）の共同投与が厳密な両側腫瘍移植モデルで抗腫瘍効果を達成するか否かを試験する。略記すれば、B16-F10メラノーマ細胞をC57B/6マウスの左及び右脇腹に皮内移植した（5ｘ105を右脇腹及び1ｘ105を左脇腹）。腫瘍移植から8日後に、加熱-MVA（MVAの熱不活化2ｘ107pfu）又はPBSをより大きな右脇腹腫瘍内に週に2回注射した。3グループのマウスを加熱-MVAで処置し、各グループは以下の処置を受けた：（i）抗CTLA-4抗体の腹腔内デリバリー（100μg/マウス）、（ii）アイソタイプ抗体の腫瘍内デリバリー（10μg/マウス）、又は（iii）抗CTLA-4抗体の腫瘍内デリバリー（10μg/マウス）（図22）。全てのPBS処置マウスが、注射実施及び注射非実施腫瘍の急激な増殖のために早期に死亡した（図22A−B）。加熱-MVA及びアイソタイプ抗体の腫瘍内共同注射は10の注射実施腫瘍のうち7つを根絶したが、注射非実施腫瘍は10のうち1つのみ除去した（図22C−D）。対照的に、加熱-MVA及び抗CTLA-4抗体（10μg/マウス）の腫瘍内共同注射は、10の注射実施腫瘍の10個を根絶し、注射非実施腫瘍では10のうち7つを除去した（図22E−F）。これは、加熱-MVAの腫瘍内注射及び抗CTLA-4抗体（100μg/マウス）の腹腔内デリバリーの併用治療効果に匹敵する（図22G−H）。これらの結果は、加熱-MVA及びはるかに低い用量の免疫チェックポイント遮断剤（抗CTLA-4抗体）の共同投与は、加熱-MVAの腫瘍内デリバリーとより高用量の抗CTLA-4抗体の全身デリバリーとの併用と同様な全身性抗腫瘍効果を達成できることを示している。この刷新的アプローチは以下のいくつかの利点を有する：（i）このアプローチは、STING依存性細胞質ゾルDNAセンシングメカニズムを介する先天性免疫の活性化及びBatf3依存性CD103+/CD8α相互提示DCを介する適応免疫の活性化によって“in situ治療ワクチン”を提供する；（ii）このアプローチは、抗CTLA-4抗体の存在下でCD8+及びCD4+細胞傷害性T細胞の激しい活性化を可能にする；（iii）この併用は、CD4+調節T細胞の更なる枯渇をもたらす；（iv）この結果は、CD8+及びCD4+細胞傷害性T細胞の活性化、腫瘍抗原の遊離、及び抗腫瘍免疫（抗腫瘍抗体を含む）の最適な発生による腫瘍大量殺滅をもたらす；及び（v）このアプローチはまた、腹腔内デリバリーで用いられる投薬量の1/10を腫瘍内にデリバリーすることによって抗CTLA-4抗体の全身性毒性を低下させる。
抗CTLA-4抗体及び抗PD-1抗体の併用は、PD-L1陰性腫瘍のフェーズIII臨床試験でいずれかの薬剤単独よりも有効である（Larkin et al., 2015）という前提で、本発明者らは、不活化MVAと抗CTLA-4及び抗PD-1/抗PD-L1の両方とを組み合わせてデリバリーするであろう。前記遮断剤は典型的には単独療法よりも低用量でデリバーされ、さらに異なるルート（腫瘍内に対し例えば静脈内）による共同投与よりも低い用量が腫瘍内に投与されるであろう。これは、抗腫瘍免疫の更なる強化及び生存の更なる改善を副作用の発生の低下とともにもたらすことが予想される。加えて、より最近開発された免疫チェックポイント遮断抗体（例えば抗LAG-3、抗TIM-3及び抗TIGT抗体）がそのような共同デリバリーに、又は上記に記載したような前臨床モデルでの多様な固形腫瘍の治療に加えられるであろう。
前述の実施例は本明細書に記載した方法及び特徴の例示であり、制限を意図しない。さらにまた、それらは本開示の一般的な適用の記述を含み、そのような記述はそれらが示されている特定の実施例に限定されるのではなく、本明細書に記載した実験結果の結論の説明及びより広範囲の含意を構成する。
【００５５】
以下の全ての引用文献の内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
参考文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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