(57)【要約】表面に接合した多層構造のコミュニティーをマイクローブに提供し、細胞外高分子材料マトリックス内に包まれているバイオフィルム産生物は、感染症の上方制御されている毒性と関連し、免疫系応答及び／又は治療剤の有効性を制限することができる。クオラムセンシングを調節し、バイオフィルム産生を阻害する又は低下させるための、且つマイクローブ感染症を処置するためのラメラ体の使用が提供される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムを形成することが可能なマイクローブ／微生物のマイクローブクオラムセンシングを撹乱する方法であって、ラメラ体をマイクローブに適用することを含む方法。
【請求項２】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための組成物。
【請求項３】
治療有効量のラメラ体と、少なくとも第１の非ラメラ体抗マイクローブ活性剤と、を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための組成物。
【請求項４】
治療有効量のラメラ体と、少なくとも第１の非ラメラ体抗マイクローブ活性剤と、を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項３に記載の組成物であって、
前記抗マイクローブ剤が抗生物質である組成物。
【請求項５】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物であって、
細菌感染症を処置するための組成物。
【請求項６】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項５に記載の組成物であって、
シュードモナス属、バークホルデリア属、及びスタフィロコッカス属の種から選択される細菌感染症を処置するための組成物。
【請求項７】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物であって、
感染症が肺又は眼の感染症である組成物。
【請求項８】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項３〜７のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記第１の非ラメラ体抗マイクローブ活性剤が、ラメラ体の経路と異なる経路によってマイクローブ感染症の部位に提供される組成物。
【請求項９】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項８に記載の組成物であって、
前記第１の非ラメラ体抗マイクローブ活性剤が静脈内に提供され、且つ前記ラメラ体が鼻腔内に提供される、
肺又は気道のマイクローブ感染症の処置のための組成物。
【請求項１０】
治療有効量のラメラ体を含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための請求項３〜９のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記少なくとも第１の抗マイクローブ活性剤及び前記ラメラ体が個別に、連続的に、又は同時に、組み合わせて提供される組成物。
【請求項１１】
微生物の個体群の細胞密度を高めるための請求項１に記載の方法であって、
ラメラ体を、バイオフィルムを形成することが可能な微生物の培養培地に導入することによって前記ラメラ体を適用するステップと、
ラメラ体を含む前記培養培地で前記微生物を増殖させるステップであって、前記微生物が、ラメラ体を含む培養物で増殖されるときに、前記ラメラ体を含まず且つ同一の培養条件下で培養された以外は同一の微生物の培養培地の細胞密度よりも大きい細胞密度に増殖するステップと、を含む方法。
【請求項１２】
微生物の個体群の容量産生性を高めるための請求項１に記載の方法であって、
ａ）ラメラ体を、バイオフィルムを形成することが可能な微生物の培養培地に導入することによって前記ラメラ体を適用するステップと、
ｂ）前記微生物を増殖させるステップと、を含み、
前記ラメラ体存在下で前記微生物によって産生される発酵産生物に関する前記微生物の容量産生性が、ラメラ体不存在下の前記微生物の前記醗酵産生物の容量産生性よりも高い方法。
【請求項１３】
醗酵産生物を提供するための請求項１２に記載の方法であって、
ａ）醗酵産生物を産生することが可能な遺伝子組換え微生物を用意するステップと、
ｂ）前記改変微生物をラメラ体が適用された培養培地で培養するステップであって、前記遺伝子組換え微生物が、前記ラメラ体を含まない培養培地で産生されたときの前記醗酵産生物に関する容量産生性よりも前記同一の醗酵産生物に関して高い容量産生性を達成する能力を有するステップと、を含む方法。
【請求項１４】
マイクローブを個別に、連続的に、又は同時に処置し、マイクローブのクオラムセンシング及びマイクローブのバイオフィルム形成を撹乱するための、ラメラ体及び抗マイクローブ活性剤を含むパーツキット。
【請求項１５】
前記ラメラ体が、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びコレステロールを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項１６】
前記ラメラ体が、４４〜７０重量％の範囲のホスファチジルコリン、１５〜２３重量％の範囲のスフィンゴミエリン、６〜１０重量％の範囲のホスファチジルエタノールアミン、２〜６重量％の範囲のホスファチジルセリン、２〜４重量％の範囲のホスファチジルイノシトール、及び４〜１２重量％の範囲のコレステロールを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項１７】
前記ラメラ体が、約５５重量％のホスファチジルコリン、約１９重量％のスフィンゴミエリン、約８質量％のホスファチジルエタノールアミン、約４重量％のホスファチジルセリン、約３重量％のホスファチジルイノシトール、及び約１０重量％のコレステロールを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項１８】
前記マイクローブバイオフィルムが、細菌、ウイルス、真菌、酵母、及び原生動物を含む群から選択されるマイクローブによって形成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項１９】
前記マイクローブバイオフィルムが細菌によって形成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項２０】
前記細菌がグラム陰性細菌である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項２１】
前記マイクローブ感染症が、インプラント関連感染症及び／又はカテーテル関連感染症及び／又は留置医療器具関連感染症である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項２２】
ラメラ体と組み合わせて使用される抗マイクローブ活性剤が、ピペラシリン、アズトレオナム、メロペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、タゾシン、及びシプロフロキサシン、セフタジジム、又はこれらの組合せを含む群から選択される抗生物質である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法又は組成物又はキット。
【請求項２３】
宿主対象におけるバイオフィルム産生に伴うマイクローブ感染症を処置する方法であって、
宿主におけるマイクローブ感染部位にラメラ体を提供するステップであって、前記ラメラ体がクオラムセンシング拮抗薬として作用するステップを含む方法。
【請求項２４】
状態が、マイクローブのクオラムシグナル伝達／センシング分子によって生じるときに、宿主におけるプロセス又は前記状態を処置又は阻止又は減速する方法であって、ラメラ体をマイクローブの部位に提供することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クオラムセンシングを調節し、バイオフィルム産生を阻害する又は低下させるためのラメラ体の使用に関する。表面に接合した多層構造のコミュニティーをマイクローブに提供し、細胞外高分子材料マトリックス内に包まれているバイオフィルム産生物は、感染症の上方制御されている毒性と関連し、免疫系応答及び／又は治療剤の有効性を制限することができる。したがって、ラメラ体はマイクローブ感染症の処置において重要な役割を果たす。
【背景技術】
【０００２】
細菌のクオラムセンシングをブロックすると、細胞がクオラムセンシングを介して同時に発生する毒性因子の産生などの挙動が開始するのを停止できることが判定されている（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｓ．Ｔ．及びＢａｓｓｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｑｕｏｒｕｍ  Ｓｅｎｓｉｎｇ：Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｔｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．（２０１２））。さらに、バイオフィルムが形成された場合、マイクローブ感染症は臨床的により深刻となり、且つ抗生物質で処置することが困難になり得る。慢性持続感染症は、マイクローブバイオフィルムの発生をしばしば伴う。
【０００３】
バイオフィルムは、自己産生された細胞外ポリマーマトリックス中に埋め込まれたマイクローブ細胞が密に包まれている個体群である。ＤＮＡ、タンパク質、及び多糖などの生体高分子マトリックスは、脱水、免疫系、及び抗マイクローブ剤からマイクローブ細胞を保護する。バイオフィルムは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真菌種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌、ＨＴＬＶ−１などのウイルス、及びアカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）などの原生動物と関連し得る。バイオフィルムで増殖するマイクローブ細胞は、液体培地において単細胞であり、同一の有機体である浮遊細胞とは生理学的に異なる。シュードモナス属、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、及びスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種などの臨床的に重要な細菌は、宿主免疫防御及び抗生物質からこれらを保護するバイオフィルムを形成する。バイオフィルムの形成は、嚢胞性線維症（ＣＦ）などの多くの慢性感染症及び疾患、並びにステント、シャント、人工関節、インプラント、気管チューブ、及びカテーテルを含む留置医療器具に伴う感染症と関連している。バイオフィルムはまた、免疫系及び抗感染症剤からマイクローブを保護することに加えて、管、分水界、貯蔵場所を詰まらせ、且つ食品を汚染する能力も有する。
【０００４】
一般的に、細菌は、２つの生存形態である個体挙動の期間と群挙動の期間との周期を増殖及び繁殖中に有する。個体挙動では、細菌は単一の、独立の、活発に分裂している且つ増殖している（浮遊）細胞として存在するが、集団挙動では、これらは代謝活性が低下（定着）しているが、抗生物質又は免疫防御系に対する耐性を介した疾患（毒性）をもたらす能力が高まっている細胞集団に構造化される。これらの遷移は、クオラムセンシングと呼ばれる細胞−細胞コミュニケーションプロセスによってコントロールされる。クオラムセンシング分子は、細菌群によって放出され、蓄積され、且つ同時に検出され、遺伝子発現細菌にコミュニティー全体の変化をもたらし、生物発光、バイオフィルム形成、さらに毒性因子産生などの挙動を集団で行わせる。
【０００５】
定着細胞に観察されるように、増殖速度が低下すると、薬物耐性の一因となり得ることを示唆するいくつかの根拠がある。この状態の細菌の遺伝子発現プロファイルを鑑みて、これらの定着凝集体は、通常、バイオフィルム増殖表現型と称される。バイオフィルムは、細菌が水性環境中の表面に付着し、粘性物質の分泌を開始するときに、接着剤様物質を形成する。典型的には、最初に表面へ付着する第１の細菌コロニスト（ｃｏｌｏｎｉｓｔ）が、ファンデルワールス力と呼ばれる可逆的な弱い結合によって最初に付着する。コロニストが表面から直ぐに分離されない場合に、コロニストは細胞付着分子を使用してより恒久的にそれ自体を固定することができる。これらの細菌コロニストは、より多様な付着部位を提供することによって他の病原体の発生を促進する。コロニストはまた、バイオフィルムを一緒に保持するマトリックスを構築し始める。コロニスト自体の表面に接合することができない種が存在する場合、その種は大抵の場合、マトリックスにその種自体を又は最初のコロニストに直接固定することができる。
【０００６】
細胞の定着コミュニティーを包むバイオフィルムのマトリックス又は細胞外高分子物質（ＥＰＳ）は、宿主の天然防御メカニズムに対する有効な配備に対する障壁として、抗生物質の拡散に対する障壁として、及び／又は抗生物質に結合する帯電表面として作用すると考えられている。慢性バイオフィルム性感染症は、典型的には抗生物質及び従来の他の多くの抗マイクローブ剤に強い耐性を示し、さらに、宿主の防御を回避するための優れた能力を有する。バイオフィルム中の細菌は抗生物質の処置で生存し続ける傾向があるが、バイオフィルムが撹乱又は除去されると、細菌は処置に対して感受性を示すようになるため、バイオフィルム抗生物質耐性は、抗生物質耐性と混同されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在のところ、細菌バイオフィルム感染症を阻止又は抑制するために、（ｉ）早期積極的な抗生物質処置と、バイオフィルムが定着し、物理的に除去できない場合（ｉｉ）長期抑制的な抗生物質処置との２つの方法が使用されている。しかし、従来の耐性メカニズムにより固有のバイオフィルム耐性メカニズムが強化されることがあるため、細菌バイオフィルムを処置するために抗生物質を投与するには、いくつかの異なる抗生物質を高用量で長期間にわたって組み合わせることがしばしば必要とされる。したがって、細菌バイオフィルムの発生を阻害し、撹乱し、又は除去し、そのためにマイクローブを宿主の免疫系及び／又は抗生物質によって破壊できることを伴う、マイクローブバイオフィルム関連感染症のより有効な処置方法を開発する必要性が認識されている。バイオフィルムの発生及び定着状態への遷移と並行して典型的に上方制御されている感染症の毒性プロファイルもまた、低下される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、ラメラ体が、浮遊相から定着相に変化するために細菌によって使用されるクオラムセンシングメッセージ交換システムに干渉すること；バイオフィルム、特に細菌バイオフィルムを除去すること；バイオフィルムの形成を阻害すること；及び／又は細菌細胞壁の浸透性を高めることが可能であることを判定した。特に本発明者らは、マイクローブ感染症を呈する宿主対象にラメラ体を投与すると、上記マイクローブに対する免疫応答が改善されること、及び／又は抗生物質の相乗効果が宿主対象にもたらされ、マイクローブの増殖若しくは破壊を阻害することを判定した。
【０００９】
広範囲に及ぶ実験の後、本発明者らは、バイオフィルムを撹乱及び／又は除去し、結果としてマイクローブが浮遊相で維持されること又は浮遊相に戻ることによって、ラメラ体が宿主の免疫応答を促進できることを明らかにした。理論に拘束されることを望むものでもないが、本発明者らは、ラメラ体がバイオフィルム、特に細菌バイオフィルムを撹乱し、細菌がクオラムセンシング分子を産生及び／又は放出することを阻害又は妨害し、そのためにバイオフィルムの産生を開始し且つ毒性関連遺伝子を発現するための細菌による「判断」に対して必須の前駆体である、細菌の互いのコミュニケーションが阻害されると考える。その結果、バイオフィルムは除去され、その形成は低減又は阻止され、細菌が宿主の防御及び／又は抗感染症治療に対してより高い感受性を示すようになる。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、マイクローブクオラムセンシングを阻害又は撹乱するためのラメラ体の使用が提供される。実施形態において、マイクローブクオラムセンシングを阻害又は撹乱し、マイクローブバイオフィルムの存在又は形成の撹乱に使用するためのラメラ体の使用が提供される。
【００１１】
実施形態において、ラメラ体のこのような使用により、宿主対象におけるマイクローブ感染症、特に、宿主におけるバイオフィルム産生に伴うマイクローブ感染症の処置が可能になる。実施形態において、ラメラ体はクオラムセンシング拮抗薬として作用することができる。
【００１２】
実施形態において、ラメラ体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びコレステロールを含む。特に、ラメラ体は、４４〜７０重量％の範囲のホスファチジルコリン、１５〜２３重量％の範囲のスフィンゴミエリン、６〜１０重量％の範囲のホスファチジルエタノールアミン、２〜６重量％の範囲のホスファチジルセリン、２〜４重量％の範囲のホスファチジルイノシトール、及び４〜１２重量％の範囲のコレステロールを含むことができる、又はこれらからなることができる。他の好ましい実施形態において、組成物は０〜３重量％の範囲のリソホスファチジルコリンをさらに含む。
【００１３】
実施形態において、ラメラ体は、約５５重量％のホスファチジルコリン、約１９重量％のスフィンゴミエリン、約８重量％のホスファチジルエタノールアミン、約４重量％のホスファチジルセリン、約３重量％のホスファチジルイノシトール、及び約１０重量％のコレステロールを含む、又はこれらからなる（本明細書において論じされるＬＭＳ−６１１組成物）。詳細には、実施形態において、ラメラ体組成物は、５５．１％のＰＣ、１９．４％のＳＰ、８．２％のＰＥ、４．１％のＰＳ、３．１％のＰＩ、及び１０．１％のＣＨを含むことができる。ある実施形態において、組成物は、約２重量％のリソホスファチジルコリンをさらに含む。
【００１４】
実施形態において、バイオフィルムは、動物、適切には哺乳動物、特にヒト対象、植物、又は不活性材料に存在することができる。
【００１５】
実施形態において、本発明の１つのラメラ体／複数のラメラ体は、ラメラ体を、バイオフィルムが形成された又は形成されているデバイス又は部位に適用することによって、バイオフィルムの形成を効果的に阻害し、且つ細菌による汚染を効果的に低減することができる。
【００１６】
実施形態において、細菌汚染を低減する方法であって、物体を本発明によるラメラ体と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のある実施形態において、状態が、マイクローブ又は細菌のクオラムセンシング活性又はシグナル伝達によって生じるときに、プロセス又は状態を、処置又は阻止又は減速する方法が提供される。
【００１８】
ある実施形態において、ラメラ体とラメラ体が適用される物体又は対象との間の接触は、本発明のラメラ体を含む溶液を処置される部位へ、噴霧、浸漬、刷毛塗することによって又は別の適用によって提供することができる。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、治療有効量のラメラ体と少なくとも第１の非ラメラ体抗マイクローブ活性剤、好ましくは抗生物質とを含む、マイクローブ感染症の処置に使用するための組成物が提供される。
【００２０】
実施形態において、ラメラ体は、抗マイクローブ剤と、同時に、個別に、又は連続的に使用するための組成物として投与又は提供することができる。
【００２１】
本発明の第３の態様によれば、マイクローブ感染症を処置する方法であって、マイクローブバイオフィルムの形成を阻害又は撹乱するための治療有効量のラメラ体を、このような処置を必要とする対象へ投与することを含む方法が提供される。実施形態において、対象は動物である。実施形態において、対象は、適切にはヒトである。
【００２２】
本発明の第４の態様によれば、マイクローブバイオフィルム、特に宿主対象のマイクローブ感染症を、個別に、連続的に、又は同時に処置するための、ラメラ体及び組合せ処置、例えば抗マイクローブ活性剤を含むパーツキットが提供される。キットは、治療有効用量の抗マイクローブ剤を含むことが適切である。抗マイクローブ剤又はラメラ体は、処置される特定の部位に対して使用するために、例えば、鼻腔内投与用に、局所投与用に、又は静脈内投与用に配合されることが適切である。抗マイクローブ剤又はラメラ体は、処置される対象へ、異なる投与経路によって提供されるように配合されることが適切である。
【００２３】
実施形態において、マイクローブバイオフィルムは、細菌、ウイルス、真菌、酵母、及び原生動物を含む群から選択されるマイクローブによって形成される。実施形態において、マイクローブバイオフィルムは、細菌によって形成され得る。
【００２４】
実施形態において、撹乱されるクオラムセンシングは、グラム陽性細菌由来とすることができる。実施形態において、撹乱されるクオラムセンシングは、グラム陰性細菌由来とすることができる。
【００２５】
実施形態において、マイクローブ感染症は、インプラント関連感染症及び／又はカテーテル関連感染症及び／又は留置医療器具関連感染症とすることができる。バイオフィルムの産生物は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びニューモシスチス・イロベジイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）によって生じるものを含む、通常発生するいくつかの生死に関わる感染症にとっての重大な毒性因子であることは文献において十分に実証されている。
【００２６】
真菌バイオフィルムはエキソポリサッカライド系であり、これもラメラ体、特にＬＭＳ−６１１組成物による影響を受けるであろうと考えられている。例えばＨＴＬＶ−１を含むウイルスもまた、バイオフィルムを形成することが知られており、ラメラ体、特にＬＭＳ−６１１組成物を使用し、このようなバイオフィルムの形成を阻害し得ると考えられている。
【００２７】
実施形態において、ラメラ体と組み合わせて使用することができる抗マイクローブ活性剤は、これらに限定されないが、ピペラシリン、アズトレオナム、メロペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、タゾシン、セフタジジム、及びシプロフロキサシン、又はこれらの組合せを含む任意の１つの抗生物質又は複数の抗生物質とすることができる。
【００２８】
実施形態において、抗生物質は、ピペラシリン、アズトレオナム、メロペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、タゾシン、セフタジジム、及びシプロフロキサシン、又はこれらの組合せからなる群から選択することができる。
【００２９】
ラメラ体、特にＬＭＳ−６１１は細菌コロニーに提供してから、組合せ療法、例えば抗生物質、例えば、トブラマイシン、セフタジジム、タゾシン、又はシプロフロキサシンで処置することが適切である。少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも３０μｇ／ｍｌ、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度のラメラ体が、処置される部位に提供されることが適切である。実施形態において、ラメラ体、特にＬＭＳ−６１１は、例えば肺感染症の処置のために、例えばタゾシンの前に又はそれと同時に提供することができる。
【００３０】
処置される部位は、眼であり得ることが適切である。処置される部位は、肺であり得ることが適切である。ラメラ体は、提供される組合せ処置、例えば抗生物質（複数可）とは異なる投与経路によって処置される部位へ提供され得ることが適切である。例えば、ラメラ体が鼻腔内に提供されると同時に、抗生物質が静脈内に提供されてもよい。
【００３１】
クオラムセンシング、場合によりバイオフィルム産生物は、微生物を十分な密度で増殖させ、醗酵産生物を高収率で産生することを可能にする場合に、問題になり得る。クオラムセンシングを調節し、このような製造施設において細胞密度が増加することを可能し、且つバイオフィルムの産生を最小限にする能力は、有利であり得る。
【００３２】
したがって、既知の微生物の個体群の容量産生性を高める方法であって、
ａ）ラメラ体を、バイオフィルムを形成することが可能な微生物、例えば細菌の培養培地に導入するステップと、
ｂ）微生物、例えば細菌を増殖させるステップと
を含み、
ラメラ体存在下で微生物によって産生される発酵産生物に関する微生物の容量産生性が、ラメラ体不存在下の微生物の醗酵産生物の容量産生性よりも高い方法が提供される。
【００３３】
既知の微生物の個体群の細胞密度を高める方法であって、
ａ）ラメラ体を、バイオフィルムを形成することが可能な微生物、例えば細菌の培養培地に導入するステップと、
ｂ）ラメラ体を含む培養培地中の微生物を増殖させるステップであり、微生物が、ラメラ体を含む培養物で増殖されるときに、ラメラ体を含まず且つ同一の培養条件下で培養された他の点は同一の微生物の培養培地の細胞密度よりも大きい細胞密度に増殖するステップと
を含む方法もまた提供される。
【００３４】
醗酵産生物を産生する方法であって、
ａ）醗酵産生物を産生することが可能な既知の遺伝子組換え微生物、例えば細菌を用意するステップと、
改変微生物を培養培地で培養するステップであり、培養培地にラメラ体が提供されるときの遺伝子組換え微生物が、ラメラ体を含まない培養培地で産生されたときの醗酵産生物に関する容量産生性よりも同一の醗酵産生物に関して高い容量産生性に達する能力を有するステップと
を含む方法もまた提供される。
【００３５】
実施形態において、方法は、少なくとも１種の醗酵産生物を培養培地から採取する更なるステップ含むことができる。
【００３６】
本発明の更なる態様によれば、本発明において記載されるようラメラ体を使用し、クオラムセンシングを処置し、阻止し、及び／又はその進行を遅らせる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
次に、本発明の実施形態を、単に例として以下に記載の図面を参照しながら記述する。
【図１Ａ】ＬＭＳ−６１１で処置した後の遺伝子発現のデータを示すグラフであり、マウス肺を、新鮮な、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌ中の対数増殖期中期緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＬＥＳＢ６５用量２×１０６ＣＦＵで経鼻的に感染させた。０、２４、４８、及び７２、並びに１６８時間でマウス組織から単離したＲＮＡを処置し、毒性因子ａｌｇＤ、ｆｌｇＤ、ｌａｓＲ、ｒｈｌＲ、ｐｈｚＦ、及びｐｅｌＢに関してテストされたすべての宿主ＲＮＡ及び細菌ＲＮＡを取り出した。
【図１Ｂ】鼻咽頭の緑膿菌の遺伝子発現を示すグラフであり、未処置サンプルのｆｌｇＤ及びｐｅｌＢにおいて、７日間の間（１時点は０、２時点は２４時間、３時点は４８時間、４時点は７２時間、５時点は１６８時間（７日））に発現が著しく増加することが示され、また処置サンプルにおいてもｐｅｌＢが増加しているが、対照と比較して低い。未処置のサンプルはａｌｇＤ及びｌａｓＲにおいて大幅な増加を示し、ＬＭＳ−６１１処置サンプルには認められない。
【図２Ａ】ＬＭＳ−６１１で処置した後の人工痰培養物において検出されたピオシアニンレベルを示す画像であり、細菌を３日間でバイオフィルム状態に増殖させ、次いで、さまざまな濃度のＬＭＳ−６１１で２４時間処置し、ＡＳＭバイオフィルムアッセイの画像を撮影した。
【図２Ｂ】ＬＭＳ−６１１で処置した後の人工痰培養物において検出されたピオシアニンレベルを示す画像であり、細菌を３日間でバイオフィルム状態に増殖させ、次いで、さまざまな濃度のＬＭＳ−６１１で２４時間処置し、ピオシアニンの産生を５５０ｎｍの吸光度によって定量化した。ｎ＝２。
【図３】緑膿菌（ＰＡ）は依然として活性増殖期のままであることを示すグラフであり、緑膿菌はＬＭＳ−６１１で処置された後に代謝活性を示し、レサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）はマイクローブの代謝活性を測定する染料である。バイオフィルムを３日間増殖させ、次いで、さまざまな濃度のＬＭＳ−６１１を添加し、さらに２４時間増殖させた。ＡＳＭは人工痰培地である。次いで、培養物を、スプータゾル（Ｓｐｕｔａｓｏｌ）を使用してホモジネートし、レサズリンを添加し、３７℃で１時間インキュベートした後に測定を行った（ノンパラメトリック統計テスト（順位によるＡＮＯＶＡ（ＡＮＯＶＡ  ｏｎ  ｒａｎｋｓ）及びダンの事後検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ））を実施し、各処置をＢ６５対照と比較した。＊＝ｐ＜０．０５）。
【図４】３日間増殖させ、次いでさまざまな濃度のＬＭＳ−６１１で２４時間処置されたバイオフィルム中のＰＡに対するＬＭＳ−６１１の効果を示すグラフである。ＡＳＭにおけるＰＡバイオフィルムの画像。ＡＳＭバイオフィルム由来の細菌数の定量化（ＣＦＵ／ｍＬ）。順位によるＡＮＯＶＡ及びダンの事後検定を使用して、各処置のｃｆｕ／ｍｌが対照と有意に異なったかどうかを判定した。＊＝ｐ＜０．０５。
【図５】抗生物質の相乗作用を示すグラフであり、ある範囲の濃度の細菌を３日間でバイオフィルムに増殖させ、次いで、さまざまな濃度のＬＭＳ−６１１及び／又は抗生物質であるトブラマイシン（Ａ）及びシプロフロキサシン（Ｂ）で２４時間処置した。順位によるＡＮＯＶＡ及びダンの事後検定を使用し、各処置のｃｆｕ／ｍｌが対照と有意に異なったかどうかを判定した＊＝ｐ＜０．０５。
【図６】マウス感染症モデルにおけるＰＡの定量化を示すグラフであり、マウス肺はＬＥＳＢ６５（ＰＢＳ５０μｌ中２×１０６ＣＦＵ）で鼻腔内感染させ、感染してから２４及び４８時間後に鼻腔内にＬＭＳ−６１１（１回用量当たり１ｍｇ）及び／又は静脈内にタゾシン（１回用量当たりピペラシリン２ｍｇ及びタゾバクタム０．５ｍｇ）を投与した。細菌を鼻咽頭（Ａ）及び肺組織（Ｂ）より定量化した。データを、１群当たり５匹のマウスから得た。二元ＡＮＯＶＡ分析において、＊＝ｐ＜０．０５及び＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図７Ａ】ＬＭＳ−６１１のｉｎ  ｖｉｖｏテストにより、ネズミ肺モデルにおいてシュードモナス属コロニー形成単位（ＣＦＵ）を有意に（３日目でｐ＝０．０１）減少させることができることを示すグラフである。
【図７Ｂ】ＬＭＳ−６１１でシュードモナス属感染症に対するマクロファージ応答に有意な（１〜３日間でｐ＝０．０５）増加があることを示すブラフである。
【図８Ａ】緑膿菌（株ＰＡ０１）バイオフィルムをポリスチレンペグに２４時間形成した。バイオフィルムを３種類の異なる濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．０３ｍｇ／ｍｌ）のＬＭＳ−６１１で１時間処置した。次いで、バイオフィルムを、１×ＭＩＣ（最小阻止濃度）の臨床的に重要な抗生物質であるアズトレオナムで１８時間処置した。処置後、バイオフィルム関連細胞の生存率を、代謝ＸＴＴアッセイを使用して評価し、処置されたバイオフィルムを未処置の対照バイオフィルムと比較して、細胞生存率（％）を計算した。エラーバーは、複製バイオフィルム間の標準偏差を表す。結果を、対照と処置バイオフィルムとの間を比較した不対両側Ｔテストを実施することによって分析した。＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．００１、＊＊＊＝Ｐ≦０．０００１。
【図８Ｂ】緑膿菌（株ＰＡ０１）バイオフィルムをポリスチレンペグに２４時間形成した。バイオフィルムを３種類の異なる濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．０３ｍｇ／ｍｌ）のＬＭＳ−６１１で１時間処置した。次いで、バイオフィルムを、１×ＭＩＣ（最小阻止濃度）の臨床的に重要な抗生物質であるセフタジジムで１８時間処置した。処置後、バイオフィルム関連細胞の生存率を、代謝ＸＴＴアッセイを使用して評価し、処置されたバイオフィルムを未処置の対照バイオフィルムと比較して、細胞生存率（％）を計算した。エラーバーは、複製バイオフィルム間の標準偏差を表す。結果を、対照と処置バイオフィルムとの間を比較した不対両側Ｔテストを実施することによって分析した。＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．００１、＊＊＊＝Ｐ≦０．０００１。
【図８Ｃ】緑膿菌（株ＰＡ０１）バイオフィルムをポリスチレンペグに２４時間形成した。バイオフィルムを３種類の異なる濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．０３ｍｇ／ｍｌ）のＬＭＳ−６１１で１時間処置した。次いで、バイオフィルムを、１×ＭＩＣ（最小阻止濃度）の臨床的に重要な抗生物質であるシプロフロキサシンで１８時間処置した。処置後、バイオフィルム関連細胞の生存率を、代謝ＸＴＴアッセイを使用して評価し、処置されたバイオフィルムを未処置の対照バイオフィルムと比較して、細胞生存率（％）を計算した。エラーバーは、複製バイオフィルム間の標準偏差を表す。結果を、対照と処置バイオフィルムとの間を比較した不対両側Ｔテストを実施することによって分析した。＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．００１、＊＊＊＝Ｐ≦０．０００１。
【図８Ｄ】緑膿菌（株ＰＡ０１）バイオフィルムをポリスチレンペグに２４時間形成した。バイオフィルムを３種類の異なる濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．０３ｍｇ／ｍｌ）のＬＭＳ−６１１で１時間処置した。次いで、バイオフィルムを、１×ＭＩＣ（最小阻止濃度）の臨床的に重要な抗生物質であるメロペネムで１８時間処置した。処置後、バイオフィルム関連細胞の生存率を、代謝ＸＴＴアッセイを使用して評価し、処置されたバイオフィルムを未処置の対照バイオフィルムと比較して、細胞生存率（％）を計算した。エラーバーは、複製バイオフィルム間の標準偏差を表す。結果を、対照と処置バイオフィルムとの間を比較した不対両側Ｔテストを実施することによって分析した。＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．００１、＊＊＊＝Ｐ≦０．０００１。
【図８Ｅ】緑膿菌（株ＰＡ０１）バイオフィルムをポリスチレンペグに２４時間形成した。バイオフィルムを３種類の異なる濃度（１０ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、及び０．０３ｍｇ／ｍｌ）のＬＭＳ−６１１で１時間処置した。次いで、バイオフィルムを、１×ＭＩＣ（最小阻止濃度）の臨床的に重要な抗生物質トブラマイシンで１８時間処置した。処置後、バイオフィルム関連細胞の生存率を、代謝ＸＴＴアッセイを使用して評価し、処置されたバイオフィルムを未処置の対照バイオフィルムと比較して、細胞生存率（％）を計算した。エラーバーは、複製バイオフィルム間の標準偏差を表す。結果を、対照と処置バイオフィルムとの間を比較した不対両側Ｔテストを実施することによって分析した。＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．００１、＊＊＊＝Ｐ≦０．０００１。
【図９】ＰＡ及びバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）菌群（ＢＣＣ）対照株と、ＬＭＳ−６１１で処置されたＰＡ及びＢＣＣ株の両方の走査型電子顕微鏡写真の構図を示す写真であり、ＬＭＳ−６１１処置株においてバイオフィルムが不十分であり且つ撹乱されたことが明らかになった。
【図１０】２４時間増殖させた未処置のＰＡ０１バイオフィルム（Ａ）並びに生理的食塩水４０ｍｇ／ｍｌ（Ｂ）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（Ｃ）、及び０．３２５ｍｇ／ｍｌ（Ｄ及びＥ）で１８時間復元されたＬＭＳ−６１１で処置し、２４時間増殖させたＰＡ０１バイオフィルムの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（５０００倍の倍率）を示す写真である。バイオフィルムを固定し、金で被覆し、次いでＪＥＯＬ  ６４００走査電子顕微鏡で画像化した。未処置の対照バイオフィルム（Ａ）は、多糖、タンパク質、及びＤＮＡからなるバイオフィルムの蜘蛛の巣状マトリックス（ｗｅｂ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｒｉｘ）内に包まれた杆菌様緑膿菌細胞の多重層を示す。最も高用量のＬＭＳ−６１１（４０ｍｇ／ｍｌ）（Ｂ）で処置されたバイオフィルムにおいて、ＬＭＳはバイオフィルム表面を覆っているようであり、且つ３Ｄ構造が減少しているように思われる。１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＬＭＳ−６１１（Ｃ）及び０．３２５ｍｇ／ｍｌ  ＬＭＳ−６１１（Ｄ）で処置されたバイオフィルムは、多重層の未処置バイオフィルム（Ａ）と比較して、存在する細胞数が明らかに減少していることを示した。０．３２５ｍｇ／ｍｌで処置されたバイオフィルムの拡大画像（Ｅ）において、緑膿菌細胞の数が減少するだけではなく、残った細胞が変形した形態を有している。多くの杆菌様細胞が、健常杆菌様細胞に代わり処置によって障害を受けた。
【図１１】シュードモナス属細胞のインキュベーションを示す写真であり（左側の倍率は×１００、右側の倍率は×１２００）、その蛍光染色によって実証されるように、ＬＭＳ−６１１により細胞膜はヨウ化プロピジウムを透過させるようになった（左画像はヨウ化プロピジウム単独であり、右画像はヨウ化プロピジウム及びＬＭＳ−６１１である）。
【図１２】雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９２（ＰＡ０１）眼感染症に対するシプロフロキサシン及びＬＭＳ−６１１の効果の結果を示すグラフである。０日目にＰＢＳ５μＬ中の緑膿菌懸濁液を動物の眼に接種した。テスト物質を、細菌を接種してから５及び１０時間後に５匹の動物の群に投与した。接種してから７．５、１１、１３、１５、及び１７時間後に、安楽死させた動物から個々の眼を外科的に採取した。眼をＰＢＳ１ｍＬでホモジネートし、ＣＦＵを判定するために希釈物をＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレートに蒔いた。眼のＣＦＵ／ｇを、各採取時点に対して計算した。データを平均＋／−ＳＥＭとして示した。一元ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を、各測定時点において処置群とビヒクル群との間を比較するために適用し、且つシプロフロキサシン単独群とＬＭＳ−６１１と組み合わせたシプロフロキサシン群との間を比較するために適用した。＊：ｐ＜０．０５処置対ビヒクル、＊＊：ｐ＜０．００１処置対ビヒクル、＊＊＊：ｐ＜０．０００５処置対ビヒクル、ｎｓ：有意な効果はない。投薬容量はマウス１匹当たり５μＬであった。
【図１３】雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９２（ＰＡ０１）眼感染症に対するシプロフロキサシン及びＬＭＳ−６１１の効果を示すグラフである。０日目にＰＢＳ５μＬ中の緑膿菌細胞懸濁液を動物の眼に接種した。テスト物質を、細菌を接種してから５及び１０時間後に１群当たり５匹の動物に投与した。接種してから１２、１８、又は２６時間後に、安楽死させた動物から個々の眼を外科的に採取した。眼をＰＢＳ１ｍＬでホモジネートし、ＣＦＵを判定するために希釈物をＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレートに蒔いた。眼のＣＦＵ／ｇを、各採取時点に対して計算した。データを＋／−ＳＥＭとして示した。一元ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を、各測定時点において処置群とビヒクル群との間を比較するために適用し、且つシプロフロキサシン単独群とＬＭＳ−６１１と組み合わせたシプロフロキサシン群との間を比較するために適用した。＊：ｐ＜０．０５対ビヒクル、＊＊：ｐ＜０．００１対ビヒクル、＊＊＊：ｐ＜０．０００５対ビヒクル、＃：ｐ＜０．０５対シプロフロキサシン、ｎｓ：有意な効果はない、Ｃｉｐｒｏ：シプロフロキサシン。
【図１４】緑膿菌株ＰＡ０１のバイオフィルムＭＩＣの減少における、ＬＭＳ−６１１のゲンタマイシンとの効果を示すグラフであり、この効果はゲンタマイシン単独のものよりも効果的である。
【図１５】緑膿菌株ＰＡ０１のバイオフィルムＭＩＣの減少における、ＬＭＳ−６１１のセフタジジムとの効果を示すグラフであり、この効果はセフタジジム単独のものよりも効果的である。
【図１６】緑膿菌株ＰＡ０１のバイオフィルムＭＩＣの減少における、ＬＭＳ−６１１のコリスチンとの効果を示すグラフであり、この効果はコリスチン単独のものよりも効果的である。
【図１７】緑膿菌株ＰＡ０１のバイオフィルムＭＩＣの減少における、ＬＭＳ−６１１のピペラシリンとの効果を示すグラフであり、この効果はピペラシリン単独のものよりも効果的である。
【図１８】コリスチンと組み合わせ、２種類の異なる操作様式（Ｐａｒｉ−ｂｏｙ（ジェット型）及びＰａｒｉ  Ｆｌｏｗ（振動メッシュ））でネブライザーを使用したときの、ＰＡ株２１７Ｍに対するＬＭＳ−６１１の噴霧効果を示すグラフであり、多段階液体インパクター（ＭＳＬＩ）を使用し、噴霧されたＬＭＳ−６１１組成物からの空気力学的粒子径分布及び沈着を測定し、Ｃｏｐｌｅｙ製のＭＳＬＩにより欧州薬局方ガイドライン（Ｃｈａｐｔｅｒ２９．９．１８）に従って粒子径を測定し、且つインパクターは５つのステージを有し、ヒト呼吸器系のさまざまな部位をシミュレーションしている。同一の慣性を有する粒子が特定のステージで衝突し、同時に小さい粒子は次の衝突ステージへ通過して、その結果、種々のステージで沈着したＬＭＳ−６１１の量を分析することによって、微細粒子の用量及びフラクションを計算することができ、その微細粒子の用量（吸入可能なフラクション）は、吸入デバイス（ネブライザー）から気道に提供される容量の割合であり、これは吸入中に誘導気道に達するＬＭＳ−６１１の容量と相関する。
【図１９】コリスチンと組み合わせたときの、ＰＡ２７８３株に対するＬＭＳ−６１１噴霧効果を示すグラフであり、図２１により、コリスチンがＬＭＳ−６１１と組み合わせたときにより効果的に送達され、且つその組合せは、嚢胞性線維肺疾患の部位である肺部分を表すＭＬＳＩステージでその最も高い殺菌効果を有することが示される。
【図２０】トブラマイシンと組み合わせたときの、ＰＡ株２１７Ｍに対するＬＭＳ−６１１の噴霧効果を示すグラフである。
【図２１】トブラマイシンと組み合わせたときの、ＰＡ株２７８５３に対するＬＭＳ−６１１の噴霧の効果を示すグラフであり、ＬＭＳ−６１１と組み合わせたトブラマイシンがＭＬＳＩのすべてのステージへ送達され、且つ組合せの殺菌効果は、肺嚢胞性線維肺疾患の部位を表し得るインパクターステージ６．８μｍ、３．１μｍ、及び１．７μｍで高いことが明らかであることが実証される。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の発明者らは、ラメラ体を細菌に投与すると、定着状態よりもむしろ浮遊状態と一致する遺伝子発現プロファイルが得られることを驚くべきことに発見した。いかなる理論に束縛されるものではないが、発明者らは、ラメラ体がバイオフィルムの形成を撹乱し、且つ遺伝子発現と関連する毒性を下方制御し、したがって細菌の病原性が低下し、且つ宿主対象の免疫応答及び／又は抗マイクローブ剤がマイクローブに接近することを可能にすると考える。したがって、バイオフィルムの形成を阻害するためのラメラ体の作用は、免疫系及び／又は抗生物質などの抗感染症薬によって細菌を阻害及び／又は殺傷することを可能にすると考えられる。発明者らはまた、緑膿菌によって産生されたピオシアニンの存在度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてラメラ体の影響下で減少することを実証した。ピオシアニンはクオラムセンシングメカニズムのコントロール下で細菌によって産生される鍵となる毒性因子である。発明者らは、ラメラ体をマイクローブ感染症の部位に投与すると、感染症部位に動員されたマクロファージの数を有意に増加できることを実証した。ラメラ体は細菌細胞壁の浸透性を変化させることができ、細胞壁に、宿主の免疫応答及び抗生物質に対するより高い感受性を与えることがさらに仮定される。
【００３９】
理論に拘束されることを望むものでもないが、バイオフィルムの一部になるマイクローブ、特に細菌は、マイクローブ細胞プロセスの助けとなる細胞間コミュニケーションの一種であるクオラムセンシングに関与すると考えられる。クオラムセンシングの背後にあるメカニズムは完全に理解されていないが、コミュニケーションプロセスが、例えば単細胞細菌が近傍の他の細菌を感知することを可能にすると考えられている。細菌が、他の病原体の十分に密集した個体群によって囲まれていることを感知できる場合、細菌は刺激され、バイオフィルムを形成する一因となり、且つピオシアニン及び遺伝子発現における変異を介した他の毒性因子を産生する。ラメラ体は、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）などのクオラムセンシング分子のシグナルを捕捉し且つ失活させる能力を有し得ると考えられる。
【００４０】
本発明者らは、ラメラ体、特にＬＭＳ−６１１を宿主に投与すると、宿主の免疫系細胞によるマイクローブ感染症のクリアランスが高められることを実証した。実施形態において、ラメラ体は、４４〜７７％の範囲のホスファチジルコリン（ＰＣ）、１５〜２３重量％の範囲のスフィンゴミエリン（ＳＰ）、６〜１０重量％の範囲のホスファチジルセリン（ＰＳ）、２〜４重量％の範囲のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及び４〜１２重量％の範囲のコレステロール（ＣＨ）のリン脂質組成を含み、特にＬＭＳ−６１１ラメラ体は、約５５％のＰＣ、１９％のＳＰ、８％のＰＥ、４％のＰＳ、３％のＰＩ、及び１０％のＣＨを含む。
【００４１】
ＬＭＳ−６１１はまた、細菌に対する抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ−肉眼で認められる微生物の増殖を阻害する抗マイクローブ薬の最小濃度）を低下させることによってある範囲の抗生物質を強化し、細菌クリアランスの改善及び／又は同一の有効性を有する低用量での（又は異なる経路を介した）ＬＭＳ−６１１／抗生物質組合せの使用に可能性を与えるようである。抗生物質の使用及び用量は、その副作用及び／又は毒性プロファイルによってしばしば制限されることを考慮すると、このことはまた、強力な抗生物質の潜在的な使用を促進し、そうでなければ強力な抗生物質の使用は限定されることになるであろう。
【００４２】
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の内容が示されることがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ」に対する言及は、１つ又は複数の方法、及び／又は本明細書において記載された様式のステップを含み、及び／又はこのことは本開示などを読んだ場合に当業者であれば明らかになるであろう。
【００４３】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される場合と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似する又は同等な任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が記述される。本明細書において挙げられたすべての出版物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【００４４】
本願にわたって使用される「ラメラ体」又は「マイクロ体」は、リン脂質、マルチラメラ、二重層構造体を指す。
【００４５】
「処置する」、「処置すること」、又は「処置」は、治療、阻止、及び予防を指し、詳細には、対象が患った場合に、疾患又は疾病又は状態又は事象を予防（阻止）するため又は治癒するため又はこれらの発症の度合い若しくは可能性を低減するために対象に対して医薬品を投与すること又は医療処置を行うことを指す。
【００４６】
「治療有効量」は、本発明の組成物を用いた治療が考えられる状態又は欠陥に伴う症状を、軽減又は阻止するために十分な量である。
【００４７】
「組合せ療法」は、本発明の薬剤の、他の活性薬剤又は処置様式との併用を指す。これらの他の薬剤又は処置は、抗マイクローブ薬、特に抗菌剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、又は抗原虫剤；コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症化合物、又は感染症の処置又は軽減に有用な他の薬剤などの薬物を含んでいてもよい。本発明の薬剤の、これらの他の療法若しくは治療様式との併用は同時であってもよく、又は、本発明の薬剤が、他の療法若しくは治療様式の前に、後に、若しくはこれらとは異なる経路を介して与えられてもよいように、処置を分割してもよい。
【００４８】
「局所投与」は、非全身経路によって、バイオフィルムによる不快な又は感染症の部位に又はその付近に直接投与することを意味する。
【００４９】
「治療部分」は、それが小さい有機化学化合物、又はタンパク質若しくはペプチド、又は核酸、又は抗体若しくは抗体フラグメント、又は炭水化物であろうとなかろうと、任意の治療上有効な分子を指し、ラメラ体に結合されて、処置が有益であり得る疾患又は状態を患っている対象へ投与されてもよい。任意選択で、治療部分を、ラメラ体を構成するリン脂質二重層上に又はその中に含むことができる。
【００５０】
合成ラメラ体の産生
本発明の焦点は、細菌感染症を処置するための及び／又はバイオフィルムの形成を阻害するためのラメラ体の治療上の使用である。以下の情報により、ラメラ体を産生する方法の詳細が提供される。
【００５１】
本発明において使用されるラメラ体の主要なリン脂質構成成分は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＰ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、並びにコレステロールである。
【００５２】
ラメラ体は、４４〜７０％の範囲のＰＣ、１５〜２３％の範囲のＳＰ、６〜１０％ＰＥの範囲の、２〜６％の範囲のＰＳ、２〜４％の範囲のＰＩ、４〜１２％の範囲のコレステロールのこれらの構成成分を含むことができる、又はこれらから実質的になることができる。これらの数値は重量百分率である。
【００５３】
リン脂質マルチラメラマイクロ体（ラメラ体）に関するリン脂質及びコレステロールの好ましい組成は、５５％のＰＣ、１９％のＳＰ、８％のＰＥ、４％のＰＳ、３％のＰＩ、１０％のコレステロールを含む。
【００５４】
合成ラメラ体は、リン脂質混合物をコレステロールとともに上記の重量百分率で取り、これらをクロロホルム／メタノール溶媒混合物（２：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）に溶解することによって調製することができる。次いで、脂質溶液を丸底フラスコへ入れ、ロータリーエバポレーターに接合することができる。フラスコの空気を抜き、サーモスタット制御水浴中、３０℃の温度で、乾燥脂質フィルムが沈着するまで６０ｒｐｍで回転させる。窒素をフラスコに導入し、残留溶媒を除去してから、室温で１時間高真空に曝す場合には、フラスコを凍結乾燥機に連結する。真空を開放し、窒素を流した後、捕捉するための溶質（選択された抗原）を含む生理食塩水を添加する。脂質をフラスコ内で水和し、窒素を流し、エバポレーターに接合し、室温、６０ｒｐｍで３０分間回転させる。懸濁液を室温で２時間放置し、膨潤プロセスを完了させる。
【００５５】
実施形態において、ラメラ体は、薬学的に許容される担体とともに治療有効用量で提供することができる。１つの実施形態において、ラメラ体は、正確な投薬を容易にするために、ユニット投薬形態で存在していてもよい。「ユニット投薬形態」という用語は、ヒト対象及び他の動物、特に哺乳動物に対する単一の投薬量として適した物理的に個別の単位を指し、各ユニットは、所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性材料を、適切な医薬賦形剤とともに含む。典型的なユニット投薬形態としては、液体組成物が予め充填され、予め測定されたアンプル若しくは注射器、又は固体組成物の場合、丸剤、錠剤、若しくはカプセル剤などがある。ユニットは、例えば、使い捨てバイアル、プレフィルド注射器、及び単独の経皮パッチなどとすることができる。ユニット投薬形態はユニット用量又は使用ユニット包装とすることができる。当技術分野において知られているように、ユニット投薬包装は使いやすく、患者が直ぐに使用できるユニットである。ユニット投薬形態は、５ｍｌのラメラ体懸濁液であり得、ラメラ体にはホスファチジルコリン５５ｍｇ、スフィンゴミエリン１９ｍｇ、ホスファチジルエタノールアミン８ｍｇ、ホスファチジルセリン４ｍｇ、ホスファチジルイノシトール３ｍｇ、及びコレステロール１０ｍｇが存在し得る。
【００５６】
特定の実施形態において、「薬剤学的に許容可能」という用語は、動物における、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦又は州政府の監督機関によって承認されていること、或いは米国薬局方又は他の一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療用物質とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような医薬担体は水及び油などの滅菌液とすることができ、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、及びゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成原料のものが挙げられる。
【００５７】
医薬組成物を静脈内投与するときは、滅菌等張水性緩衝液が好ましい担体である。生理食塩水溶液、並びにデキストロース及びグリセロール水溶液はまた、液体担体として、詳細には注射用溶液用に使用することができる。
【００５８】
適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールなどがある。組成物はまた、必要に応じて少量の湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、及び持続放出配合剤などの形態をとることもできる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体とともに坐剤として配合することができる。経口配合剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによって「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、好ましくは精製された形態の治療有効用量の化合物を適切な量の担体とともに含み、こうして対象へ適切に投与するための形態が提供される。配合剤は投与様式に適するべきである。
【００５９】
好ましい実施形態において、組成物は、対象への静脈内投与に適した医薬組成物として所定の手順に従って配合される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤及びリドカインなどの局所用麻酔薬を含み、注射部位の痛みを和らげる。一般的には、成分は、ユニット投薬形態で、例えば、活性薬剤の量が表示されているアンプル又は分包などの密閉容器中の凍結乾燥粉末又は水不含濃縮物として別々に又は混合して一緒に供給される。組成物が点滴によって投与される場合には、医薬品級滅菌水又は生理食塩水を含む点滴ボトルに分注することができる。組成物が注射によって投与される場合には、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを、成分が投与前に混合されてもよいように提供することができる。
【００６０】
本明細書において記載された状態の処置に効果的な、ラメラ体組成物及び／又はラメラ体と抗マイクローブ薬との組合せの量は、本説明を基本にした標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを任意選択で使用し、最適な投薬量範囲の識別の助けとしてもよい。配合剤に使用される正確な用量はまた、投与経路及び疾患又は障害の重篤度に依存し、開業医の判断及び各対象の環境に応じて決定されるべきである。しかし、静脈内投与の適切な投薬量範囲は一般的に、体重１ｋｇ当たり活性化合物約２０〜５００マイクログラムである。鼻腔内投与の適切な用量範囲は一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。効果的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデルテスト系から得られる用量反応曲線より推定してもよい。
【００６１】
本発明はまた、本発明の組成物が充填された１つ又は複数の容器を含む、医薬パック又はキットを提供する。任意選択で、このような容器（複数可）は、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連し得、その通知には（ａ）ヒト投与のための製造、使用、又は販売に対する機関による承認、（ｂ）使用説明書、又は両方が反映されている。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、処置を必要とする部分に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、外科手術中の局所点滴によって若しくは手術後に曝露された組織にラメラ体を含む溶液を噴霧することによって、局所適用によって、注射によって、カテーテルを用いて、又はインプラントを用いて達成してもよく、上記インプラントは、多孔質、非多孔質、又はゼラチン様の材料のものであり、シラスティック膜などの膜、又はＥｌｖａｘなどの繊維又はコポリマーを含む（Ｒｕａｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：１０８７２〜１０８７６頁を参照のこと）。１つの実施形態において、エアゾール剤吸入による直接噴射によって投与することができる。
【００６３】
さらに別の実施形態において、ラメラ体は、制御放出システムで送達することができる。１つの実施形態において、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４頁を参照のこと）。他の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｏｌｅｎ及びＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ，Ｊ．（１９８３）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１頁を参照のこと；またＬｅｖｙら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇら（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１頁；Ｈｏｗａｒｄら（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５頁も参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御放出システムは治療標的の付近に配置することができ、したがって、全身用量の何分の一かが必要となるのみである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９８４）ｓｕｐｒａ、第２巻、１１５〜１３８頁を参照のこと）。他の適切な制御放出システムはＬａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁による総説において論じされている。
【００６４】
本発明は、以下の実施例を参照しながら記述され、その実施例は例示を目的として提供されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されることを意図するものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１
細菌バイオフィルムを形成する遺伝子の発現に対する合成ラメラ体の作用
多くの細菌、例えば、シュードモナス属、バークホルデリア属、及びスタフィロコッカス属は、宿主の免疫防御及び抗マイクローブ薬から細菌を保護するように機能するバイオフィルムを生成することは既知である。
【００６６】
シュードモナス感染症のモデルマウスにおいて、マウスを、緑膿菌株であるＬＥＳＢ６５（ＰＢＳ５０μｌ中２×１０６ＣＦＵ）で鼻腔内感染させ、ＬＭＳ−６１１処置マウスには１用量当たりＬＭＳ−６１１を１ｍｇを与えた。
【００６７】
細菌ＲＮＡを、０、１、２、３、及び７日目にマウスの肺及び鼻咽頭から単離した。
【００６８】
対照（ＬＭＳ−６１１未処置）マウス及びＬＭＳ−６１１処置マウスの遺伝子発現プロファイルを、ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）分析によって完成させ、その分析により、細胞内の発現遺伝子（メッセンジャーＲＮＡ）の「スナップ写真」が可能になった。
【００６９】
ＬＭＳ−６１１未処置サンプルは、エキソポリサッカライド（バイオフィルム構築ブロック）の産生及びクオラムセンシングに伴う遺伝子の上方制御を示した。特に、ｐｅｌＢ（バイオフィルム形成と関連するエキソポリサッカライド）、ｆｌｇＤ（鞭毛／運動関連遺伝子）、ａｌｇＤ（バイオフィルムアルギン酸遺伝子）、及びｌａｓＲ（クオラムセンシングにおける中心遺伝子）は、未処置サンプルで増加し、且つＬＭＳ−６１１処置マウス由来のサンプルで有意に減少した。
【００７０】
このことは図１ＢのＬＭＳ−６１１未処置サンプルで示されており、ｆｌｇＤ及びｐｅｌＢの発現が７日間で著しく増加していることが示される。処置サンプルのｐｅｌＢは増加しているが、未処置対照サンプルに関しては減少している。これらのマーカーの発現は参照遺伝子であるｐｒｏＣに正規化されたため、数値は観察された細菌数の増加による影響を受けない。
【００７１】
このデータは、ＬＭＳ−６１１がクオラムセンシング機構への干渉を介してバイオフィルム形成を阻害するという判定を支持する。
【００７２】
抗生物質は噴霧され、噴霧を行うために２０〜３０分かかることがあるため、この処置時間で体積が減少したとしても、肺に関しては低レベルのＬＭＳ−６１１、例えば（３０〜４０μｇ／ｍｌのＬＭＳ−６１１）を与えることは有利であり得、抗生物質の体積及び関連する副作用をすべて低減することができる。眼に関しても同様に、眼に入れることができる容量には限界があり、したがって、減少させることは利点であり得る。
【００７３】
実施例２
ＣＦで認められる典型的なバイオフィルムを表すと考えられる人工痰モデル（ＡＳＭ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用し、緑膿菌感染症を研究した。
【００７４】
ピオシアニンは緑膿菌によって産生される青緑色のフェナジン色素であり、且つクオラムセンシングシステム（個体群の密度に相関する細胞間シグナル伝達システム）によってコントロールされているため、細菌培養物におけるピオシアニンの存在及び濃度を使用して、クオラムセンシング活性強度を得ることができる。ある濃度範囲のＬＭＳ−６１１に曝露されたＰＡ感染ＡＳＭにおいて検出されるレベルを測定した。
【００７５】
図２で実証されたように、人工痰培養物において検出されたピオシアニンレベルにより、ピオシアニンの存在度はＬＭＳ−６１１処置培養物において減少することが示唆される。より高濃度のＬＭＳ−６１１で処置されたウエルを撮影したこれらの画像において、ピオシアニンの青緑色は強度が次第に低下するのを認めることができる。存在するピオシアニンレベルは、１０ｍｇ／ｍｌから０．３１２５ｍｇ／ｍｌに低減される。
【００７６】
シュードモナス属及びバークホルデリア属のコロニーの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像をＬＭＳ−６１１存在下及び非存在下で増殖させた。図９により、ＬＭＳ−６１１が存在した場合には、細菌バイオフィルムが根絶されたことが示される。
【００７７】
図１１は、２４時間増殖させた未処置のＰＡ０１バイオフィルム（Ａ）並びに生理的食塩水４０ｍｇ／ｍｌ（Ｂ）、１．２５ｍｇ／ｍｌ（Ｃ）、及び０．３２５ｍｇ／ｍｌ（Ｄ及びＥ）で１８時間復元されたＬＭＳ−６１１で処置し、２４時間増殖させたＰＡ０１バイオフィルムの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（５０００倍の倍率）である。未処置の対照バイオフィルム（Ａ）は、多糖、タンパク質、及びＤＮＡからなるバイオフィルムの蜘蛛の巣状マトリックス内に包まれた杆菌様緑膿菌細胞の多重層を示す。最も高用量のＬＭＳ−６１１（４０ｍｇ／ｍｌ）（Ｂ）で処置されたバイオフィルムにおいて、ＬＭＳはバイオフィルム表面を覆っているようであり、且つ３Ｄ構造が減少しているように思われる。１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＬＭＳ−６１１（Ｃ）及び０．３２５ｍｇ／ｍｌ（Ｄ）で処置されたバイオフィルムは、多重層の未処置バイオフィルム（Ａ）と比較して、存在する細胞数が明らかに減少していることを示した。０．３２５ｍｇ／ｍｌで処置されたバイオフィルムの拡大画像（Ｅ）において、緑膿菌細胞の数が減少するだけではなく、残った細胞が変形した形態を有している。多くの杆菌様細胞が、健常杆菌様細胞に代わり処置によって障害を受けた。
【００７８】
実施例３
蛍光を検出するレサズリンアッセイを使用した人工痰モデル（ＡＳＭ）における緑膿菌の代謝活性の測定値は、細菌の代謝活性に正比例する（図３）。
【００７９】
図３の結果より、緑膿菌は依然として、最もその生物学的活性があり且つ宿主の免疫応答及び抗マイクローブ剤に対して最も感受性がある活性増殖期のままであることが示される。
【００８０】
このことは、ＬＭＳ−６１１が浮遊促進効果を有することを示す。
【００８１】
この浮遊促進効果は図４によってさらに示され、緑膿菌細菌を３日間でバイオフィルムに増殖させ、次いで異なる濃度のＬＭＳ−６１１で２４時間処置すると、細菌数が増加することがＬＭＳ−６１１処置バイオフィルムで判定された。人工痰モデルは、マウスモデルと一致するようである。１ｍｌ当たりのコロニー形成単位は、形成されたバイオフィルムをＬＭＳ−６１１で処置した後に、未処置の対照と比較して有意に増加する。その増加は用量依存性のようであり、高濃度のＬＭＳ−６１１（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）で処置された培養物において最も高く増加している。レサズリンによって３つの処置（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、及び０．３１３ｍｇ／ｍｌ）で検出された代謝活性において有意な増加があり、ＬＭＳ−６１１は培養物の代謝活性を増加できることが実証された。
【００８２】
実施例４
人工痰培地に予め形成されたバイオフィルムにシプロフロキサシン及びトブラマイシンと個々に組み合わせたＬＭＳ−６１１で処置すると、抗生物質単独での処置と比較して細菌クリアランスが有意に増加した（図５）。
【００８３】
ＭＢＥＣペグプレート上に予め形成されたバイオフィルムにおいて、緑膿菌成熟バイオフィルムを２４時間形成し、ある濃度範囲のＬＭＳ−６１１で１時間前処置した。ＬＭＳで処置後、バイオフィルムを生理的食塩水で完全にすすぎ、ＬＭＳを除去した。次いで、バイオフィルムを、１／１０×、１／５×、及び１×ＭＩＣの抗生物質であるアズトレオナム、シプロフロキサシン、セフタジジム、メロペネム、及びトブラマイシンで処置した。処置後、バイオフィルム関連細胞の生存率（％）を、代謝ＸＴＴアッセイを使用して評価した。ＬＭＳを前処置すると、テストされたすべての抗生物質の活性に対するバイオフィルム中の細胞の感受性が高められるようである。
【００８４】
図５に示されるように、ＬＭＳ−６１１を４０μｇ／ｍｌで使用したときに抗生物質の相乗効果が最も顕著に現れ、トブラマイシンとシプロフロキサシンの両方ですべての細胞が殺傷されたことが観察された。
【００８５】
この効果をｉｎ  ｖｉｖｏで検証した。マウス肺をシュードモナス属で感染させたネズミモデルを作製し、次いでＬＭＳ−６１１又は生理食塩水を吸入させて処置した。主要変数としてコロニー形成単位（ＣＦＵ）を使用し、ＬＭＳ−６１１がＣＦＵ数を３日目に有意に減少させることを実証した。ＬＭＳ−６１１が、細菌の潜伏を阻止し及び／又は細菌を曝露することによって体内の免疫応答を促進するという論拠を支持すると、このことはまた、マクロファージの数が有意に増加することによっても実証され、バイオフィルムを除去すると及び／又はそのバイオフィルムを阻害すると、免疫細胞に対して細菌がさらに認識されるようになることを示す。このことは図７Ｂ及び図１３において示される。
【００８６】
ネズミ呼吸器感染症モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウス群を軽度に麻酔し、鼻からの吸入（ｎａｓａｌ  ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）によってＬＭＳ−６１１（２０ｍｇ／ｍＬ）又はビヒクル対照（０．９％ＮａＣｌ）５０μｌで処置した（Ｃａｒｔｅｒら、２０１０）。処置してから約１２０分後、すべてのマウスに１×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌である緑膿菌（ＬＥＳ６５Ｂ）をチャレンジした。ＬＭＳ−６１１及び対照での処置を、約２４、４８、及び７２時間後に繰り返した。コロニー形成単位、炎症細胞浸潤、及び全炎症性メディエーターが測定されたときに、臨床徴候を、０日目の感染してから５時間後、及び１、２、３日目の処置してから５時間後、及び感染してから７日目に、鼻咽頭、肺、及び血液を採取して（１時点当たり動物５匹で）モニターした。
【００８７】
ＬＭＳ−６１１は、緑膿菌（ＬＥＳ６５Ｂ）に感染したマウスの肺に吸入されたときに、鼻咽頭及び肺におけるコロニー形成単位数を減少させた。３日目に、コロニー形成単位数は、ＬＭＳ−６１１で処置されたマウスにおいて、対照と比較して有意に（ｐ＜０．０５）１．５ｌｏｇ（９２％）減少し、感染症がそれほど重篤ではないことが示された。対照群の感染プロファイルは、３日目に感染「スパイク」を伴う歴史的データと一致した（Ｃａｒｔｅｒら、２０１０）。感染は７日目まで継続し、その時点で処置群間に違いは認められなかった。
【００８８】
ＬＭＳ−６１１で処置すると、対照群と比較して、マクロファージの数において有意な増加が促進された。対照的に、多形核白血球、単核細胞数、マクロファージ炎症タンパク質−２（ＭＩＰ２）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レベルの減少は、両群間で類似していた。ＬＭＳ−６１１処置動物におけるコロニー形成単位の有意な減少は、細菌感染症の重症度を低下させるために十分な食作用マクロファージの増加に及び／又は細菌がマウスの炎症応答へ曝露されることを促進するＬＭＳ−６１１の浮遊促進効果に起因するようである。
【００８９】
この研究により、ＬＭＳ−６１１（２０ｍｇ／ｍｌ）の繰り返し投与は抗感染症効果を有し、ネズミ肺に誘発された緑膿菌感染症を有意に低下させることが実証される。
【００９０】
実施例５
本発明者らはまた、ＬＭＳ−６１１が抗生物質の効果を増強するように作用するかどうかも調査した。この理論をテストするために、本発明者らは、種々の抗生物質のシュードモナス属コロニーに対するＭＩＣを、ＬＭＳ−６１１とともに及びＬＭＳ−６１１なしで判定した。
【００９１】
ＬＭＳ−６１１はある範囲の抗生物質を強化し、細菌クリアランスを改善する及び／又は同一の有効性を有するＬＭＳ−６１１／抗生物質の組合せの低用量（又は異なる経路）での使用の可能性を与えることが認められた。抗生物質の使用及び用量は、その副作用プロファイルによってしばしば制限されることを考慮すると、このことはまた、強力な抗生物質の潜在的な使用を促進し、そうでなければ強力な抗生物質の使用は限定されることになるであろう。
【００９２】
抗生物質に対するＬＭＳ−６１１相乗効果は多因子性であり得る。細菌に浮遊状態を選択させる又は浮遊状態のままにさせることに加えて、ＬＭＳ−６１１は細菌細胞壁の浸透性を変化することができ、抗生物質及び免疫応答に対して感受性を潜在的に高めると考えられる（図１４を参照のこと）。
【００９３】
実施例６
緑膿菌株ＰＡ０１、ＰＡ１４、２種類の嚢胞性線維症（ＣＦ）臨床株Ｈ１８３、ＹＨ１、並びにバークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）株Ｋ５６−２、ＹＨＢＣＣ５、ＹＨＢＣＣ６、ＹＨＢＣＣ７、及びＹＨＢＣＣ８を、振とう台上のＮｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐ  ＰＥＧプレートモデルで４８時間増殖させた。バイオフィルムを、ＰＡ株に関しては、抗生物質のピペラシリン、アズトレオナム、メロペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、及びシプロフロキサシンを、並びにＢＣＣ株に関しては、抗生物質のピペラシリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、及びシプロフロキサシンと組み合わせたＬＭＳ−６１１（９．８ｍｇ／ｍｌ）を使用して、チェッカーボードアレイでテストした。ピペラシリン及びゲンタマイシンをチャレンジする前の異なる時点（５分、１、８、及び２４時間）においてＬＭＳ−６１１でバイオフィルムを前処置することの効果も調査した。走査電子顕微鏡を使用して、処置されたバイオフィルムを評価した。
【００９４】
呼吸器感染症の処置に使用される種々の抗生物質と組み合わせてＰＡ株に対してテストしときに、ＬＭＳ−６１１（９．８ｍｇ／ｋｇ）は、ピペラシリン（４〜１６倍）、ゲンタマイシン（４〜８倍）、シプロフロキサシン（１〜１６倍）の定着ＭＩＣを有意に低下させることが認められた。相乗作用は、アズトレオナム（２〜４倍）、メロペネム（１〜２倍）、及びトブラマイシン（１〜４倍）でも実証された。
【００９５】
呼吸器感染症の処置に使用される種々の抗生物質と組み合わせてＢＣＣ株に対してテストしときに、ＬＭＳ−６１１（９．８ｍｇ／ｋｇ）は、ピペラシリン（４〜８倍）、ゲンタマイシン（４〜８倍）、シプロフロキサシン（２〜４倍）の定着ＭＩＣを有意に低下させることが認められた。エリスロマイシンでは効果は観察されなかった（表１及び表２）。
【００９６】
【表１】
2018518538.tif 000003
【００９７】
【表２】
2018518538.tif 000004
【００９８】
ＰＡ及びＢＣＣ対照株とＬＭＳ−６１１で処置されたＰＡ及びＢＣＣ株の両方の走査型電子顕微鏡写真を比較すると、細菌バイオフィルムはＬＭＳ−６１１で処置した後に不十分となり且つ分散されたことが示された。
【００９９】
実施例７
ＬＭＳ−６１１が鼻腔内に投与され且つタゾシン（１用量当たりピペラシリン２ｍｇ及びタゾバクタム０．５を含む薬物、タゾバクタムはピペラシリンに対する耐性を阻止するβラクタム阻害物質である）が静脈内に提供されたシュードモナス属マウスモデルにおいて、感染してから７２時間後に単離された鼻咽頭組織並びに肺組織由来の増殖コロニーは、シュードモナス属のコロニー数の劇的な減少を示した。肺組織に対する結果は、２つの理由のために特に予想外であった。１つめは、タゾシンと組み合わせたＬＭＳ−６１１が、このｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて細菌を完全に殺傷したことである。２つめは、タゾシンの相乗効果が、ＬＭＳ−６１１及びタゾシンが異なる経路、すなわちそれぞれ鼻腔内及びＩＶによって適用されたにもかかわらず達成されたことである。この２つ目の結論により、ＬＭＳ−６１１の浮遊／クオラムセンシングシグナル伝達遮断作用機序の促進は、細菌が抗生物質及び免疫防御システムの効果を受け入れたままにされることを実証する（例えば、図７Ｂを参照のこと）。
【０１００】
実施例８
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの角膜感染症モデルにおける緑膿菌株ＡＴＣＣ１５６９２（ＰＡ０１）に対するシプロフロキサシン及びＬＭＳ−６１１の抗菌活性を評価するために研究を実施した。左角膜を剥離し、緑膿菌株ＡＴＣＣ１５６９２（ＰＡ０１）の懸濁液を１．７９×１０６ＣＦＵ／マウスの接種菌量で接種した。テスト物質の局所処置を、１回の適用当たり５μｌで、感染してから５及び１０時間後に適用した。
【０１０１】
テスト物質は、０．００１％シプロフロキサシンの単独投与（単独療法）、及びシプロフロキサシンの（１０ｍｇ／ｍＬの）ＬＭＳ−６１１との組み合わせ投与、及びＬＭＳ−６１１（１０ｍｇ／ｍＬ）の単独投与であった。
【０１０２】
動物を、接種してから７．５、１１、１３、１５、及び１７時間後に安楽死させ、左眼を撮影し、摘出した。細菌数は、眼組織１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定した。
【０１０３】
０．００１％シプロフロキサシン単独療法で投与すると、ビヒクル処置群と比較して、感染してから７．５、１１、１３、１５、及び１７時間後の細菌数が有意に減少した（図１５）。
【０１０４】
ＬＭＳ−６１１（１０ｍｇ／ｍＬ）のシプロフロキサシンと組合せはまた、ビヒクル対照群と比較して、感染してから７．５、１１、１３、１５、及び１７時間後の細菌数の減少に有意に効果的であった。しかし、その組合せは、シプロフロキサシン単独療法と比較して、すべての時点において有意な効果を引き起こさなかった。
【０１０５】
１０ｍｇ／ｍＬのＬＭＳ−６１１単独での処置は、ビヒクル対照群と比較して、すべての時点で細菌数の減少における有意な効果との関連がまったくなかった。
【０１０６】
実施例９
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの角膜感染症モデルにおける緑膿菌株ＡＴＣＣ１５６９２（ＰＡ０１）に対するシプロフロキサシン及びＬＭＳ−６１１の抗菌活性を評価するために研究を実施した。左角膜を剥離し、緑膿菌細胞株ＡＴＣＣ１５６９２（ＰＡ０１）の懸濁液を１．７４×１０６／マウスの接種菌量で接種した。テスト物質の局所処置を、１回の適用当たり５μｌで、感染してから５及び１０時間後に適用した。シプロフロキサシンは、０．００１％で、単独（単独療法）と（１０ｍｇ／ｍＬの）ＬＭＳ−６１１との組み合わせの両方でテストした。ＬＭＳ−６１１を単独でテストするときは、１０及び２０ｍｇ／ｍＬで投与した。動物を、接種してから２、５、１２、１８、２６、又は３６時間後に安楽死させ、左眼を摘出した。細菌数は、眼組織１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定した。
【０１０７】
細菌数の減少における０．００１％シプロフロキサシンの有効性は、時間依存性であった。シプロフロキサシン単独療法は、ビヒクル処置群と比較して、感染してから１８、２６、及び３６時間後の細菌数を有意に減少させた。しかし、シプロフロキサシン単独療法は、感染してから１２時間後に測定したときに、細菌数を有意に減少させなかった（図１６）。
【０１０８】
シプロフロキサシンのＬＭＳ−６１１（１０ｍｇ／ｍＬ）との組合せ処置は、感染してから１２時間後の細菌数を有意に減少させた。この有意な効果はビヒクル及びシプロフロキサシン単独療法群と比較して認められた。ＬＭＳ−６１１（１０ｍｇ／ｍＬ）のシプロフロキサシンとの組合せはまた、ビヒクル対照群と比較して、感染してから１８、２６、及び３６時間後の数の減少に有意に効果的であった。しかし、その組合せは、シプロフロキサシン単独療法と比較して、３６時間から後の時点において有意な効果を引き起こさなかった。
【０１０９】
１０ｍｇ／ｍＬのＬＭＳ−６１１単独での処置は、ビヒクル対照群と比較して、テストされたすべての時点で細菌数の減少における有意な効果と関連がまったくなかった。２０ｍｇ／ｍＬの用量は、１８時間の時点で細菌数の減少に一時的ではあるが有意な効果を有していた。
【０１１０】
本明細書において参照されるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。本発明の記載された実施形態に対する種々の修正及び変形は、当業者であれば発明の範囲から逸脱することなく、直ぐに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記述されているが、特許請求された発明が、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことは理解されるべきである。実際、本発明を実行する上記様式の種々の修正は、当業者には自明であり、本発明によって保護されることが意図されている。
【図１Ａ】
2018518538.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018518538.tif 000011
【図６】
2018518538.tif 000012
【図７Ａ】
2018518538.tif 000013
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2018518538.tif 000015
【図８Ｂ】
2018518538.tif 000016
【図８Ｃ】
2018518538.tif 000017
【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2018518538.tif 000019
【図９】
2018518538.tif 000020
【図１０】
2018518538.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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2018518538.tif 000034
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