(57)【要約】  ビオチン化自己抗原または感染性疾患抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、任意の非結合コンジュゲートを除去することと、定量化可能な応答を生成することができる基質を導入すること、および基質から生成された応答を較正すること、を含む自己免疫疾患または感染性疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。【選択図】図１
2018510354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化自己抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、
前記固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、
前記固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、
前記免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、
前記免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合コンジュゲートを除去することと、
定量化可能な応答を生成することができる基質を導入することと、
前記基質から生成された前記応答を較正することと、
を含む自己免疫疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。
【請求項２】
前記固相複合体を前記血清試料とインキュベートする工程は、前記血清試料中に存在する自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）又は自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）を前記捕捉試薬に結合させることを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己抗原は、アグリカン、アラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−１２）、アルファベータクリスタリン、アルファフォドリン（Ｓｐｔａｎ１）、アルファアクチニン、α１アンチキモトリプシン、α１アンチトリプシン、α１ミクログロブリン、アルソラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、アミロイド（例えば、アミロイドベータ、アミロイドＰ）、アネキシン（例えば、アネキシンＩＩ、アネキシンＶ）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＪ）、アクアポリン（例えば、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４）、殺菌性／浸透性増加タンパク質（ＢＰＩ）、β−グロビン前駆体ＢＰ１、β−アクチン、β−ラクトグロブリンＡ、β２−糖タンパク質Ｉ、β２−ミクログロブリン、血液型抗原（例えば、Ｒｈ血液型抗原、Ｉ血液型抗原、ＡＢＯ血液型抗原）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルモジュリン、カルレティキュリン、カルジオリピン、カタラーゼ、カテプシンＢ、セントロメアタンパク質（例えば、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸、クロマチン、コラーゲン（例えば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩコラーゲン）、シトクロムＣ、シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６、サイトケラチン、デコリン、デルマタン硫酸、ＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ、エラスチン、エプスタイン−バール核抗原１（ＥＢＮＡ１）、エラスチン、エンタクチン、抽出可能な核抗原（Ｒｏ、Ｌａ、Ｓｍ、ＲＮＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ１）、ファクターＩ、ファクターＰ、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＸ、フィブリノーゲン（フィブリノーゲンＩＶ、フィブリノーゲンＳ）、フィブロネクチン、フォルミミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（ＬＣ−１）、グリアジンおよびアミド化グリアジンペプチド（ＤＧＰ）、ｇｐ２１０核エンベロープタンパク質、ＧＰ２（主要チモーゲン顆粒膜糖タンパク質）、糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、糖化アルブミン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ハプトグロビンＡ２、熱ショックタンパク質（例えば、Ｈｓｐ６０、ＨＳＰ７０）、ヘモシアニン、ヘパリン、ヒストン（例えば、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｊｏ−１）、ヒアルロニダーゼ、免疫グロブリン、インスリン、インスリン受容体、インテグリン（例えばインテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、α６β３、α１β１）、間質レチノール結合タンパク質３、内性ファクター、Ｋｕ（Ｐ７０／Ｐ８０）、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラミニン、肝細胞質抗原１型（ＬＣ１）、肝臓／腎臓ミクロソーム抗原１（ＬＫＭ１）、リゾチーム、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、Ｍｉ−２（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４）、ミトコンドリアタンパク質（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２、ＯＧＤＣ−Ｅ２、ＰＤＣ−Ｅ２）、ムスカリン受容体、ミエリン関連���タンパク質、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、リウマチ因子（ＩｇＭ  抗ＩｇＧ）、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体α鎖、ヌクレオリン、ヌクレオポリン（例えば、Ｎｕｐ６２）、ヌクレオソーム抗原、ＰＭ／Ｓｃｌ１００、ＰＭ／Ｓｃｌ  ７５、膵臓β細胞抗原、ペプシノゲン、ペルオキシレドキシン１、ホスホグルコースイソメラーゼ、リン脂質、ホスホチジルイノシトール、血小板由来成長因子、ポリメラーゼベータ（ＰＯＬＢ）、カリウムチャネルＫＩＲ４．１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、プロテイナーゼ−３、プロテオリピドタンパク質、プロテオグリカン、プロトロンビン、リカバリン、ロドプシン、リボヌクレアーゼ、リボ核タンパク質（例えば、Ｒｏ、Ｌａ、ｓｎＲＮＰ、ｓｃＲＮＰ）、リボソーム、リボソームリンタンパク質（例えば、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２）、ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）、Ｓｍタンパク質（例えば、ＳｍＢ、ＳｍＢ’、ＳｍＤ１、ＳｍＤ２、ＳｍＤ３、ＳｍＦ、ＳｍＧ、ＳｍＮ）、Ｓｐ１００核タンパク質、ＳＲＰ５４（シグナル認識粒子５４ｋＤａ）、セレクチン、平滑筋タンパク質、スフィンゴミエリン、連鎖球菌抗原、スーパーオキシドジスムターゼ、滑膜関節タンパク質、Ｔ１Ｆ１ガンマコラーゲン、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−７）、組織トランスグルタミナーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン受容体、トランスフェリン、トリオースリン酸イソメラーゼ、チューブリン、腫瘍壊死アルファ、トポイソメラーゼ、Ｕ１−ｄｎＲＮＰ  ６８／７０ｋＤａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ｃ、Ｕ−ｓｎＲＮＰ  Ｂ／Ｂ’、ユビキチン、血管内皮増殖因子、ビメンチンまたはビトロネクチンである、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ストレプトアビジン被覆培地は、ユニバーサル蛍光標識磁性微粒子を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の洗浄工程は、反応キュベットの閉鎖領域内で洗浄される前記複合体を磁気的に引き離すことによって前記複合体を洗浄することを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートする工程は、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む反応希釈剤によって懸濁液中に保持された捕捉試薬をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートする工程は、公称濃度のポリエチレングリコールを含むコンジュゲート希釈剤によって懸濁液中に保持された免疫複合体をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非結合試料を除去するために前記免疫複合体を洗浄する際に、間接標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
蛍光シグナルおよび化学発光シグナルの両方が定量化される光学ボックスに前記基質および前記免疫コンジュゲート複合体を移すこと、および
定量化された前記化学発光シグナルを調整するために初期の蛍光対最終の蛍光の比を使用して、報告された値を計算すること、
によりビーズ保持のための定量可能な前記応答を調整する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記光学ボックス内の蛍光を測定して、ビーズ保持を決定すること、および
前記光学ボックス内の発光を測定して、生成された相対光ユニット信号を検出すること、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光測定値および発光測定値をアルゴリズムに入力して、ビーズ保持調整相対光ユニット信号を生成することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生成された前記ビーズ保持調整相対光ユニット信号を、較正曲線相対光ユニット信号と比較する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ビオチン化感染性疾患抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、
前記固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、
前記固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、
前記免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、
前記免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合コンジュゲートを除去することと、
定量化可能な応答を生成することができる基質を導入することと、
前記基質から生成された前記応答を較正することと、
を含む感染性疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。
【請求項１４】
前記固相複合体を前記血清試料とインキュベートする工程は、前記血清試料中に存在する感染性因子特異的ヒトＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡをビオチン化捕捉試薬に結合させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記感染性疾患抗原は、細菌、ウイルス、ウイロイド、プリオン、線虫、寄生虫、および真菌から選択される感染性因子に由来する、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記捕捉試薬は、多数の抗原から構成される感染性因子抽出物のビオチン化に由来する、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記感染性疾患抗原は、タンパク質、糖タンパク質、核酸、酵素、脂質、リポサッカリド、抗体またはそれらの組み合わせである、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉試薬は、精製されたタンパク質、酵素、抗体および感染性因子抽出物から選択される複数のビオチン化捕捉試薬のアマルガムである、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ストレプトアビジン被覆培地は、ユニバーサル蛍光標識磁性微粒子を含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上の洗浄工程は、反応キュベットの閉鎖領域内で洗浄される前記複合体を磁気的に引き離すことによって前記複合体を洗浄することを含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートする工程は、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む反応希釈剤によって懸濁液中に保持された捕捉試薬をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートする工程は、公称濃度のポリエチレングリコールを含むコンジュゲート希釈剤によって懸濁液中に保持された免疫複合体をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
非結合試料を除去するために前記免疫複合体を洗浄する際に、間接標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光シグナルおよび化学発光シグナルの両方が定量化される光学ボックスに前記基質および前記免疫コンジュゲート複合体を移すこと、および、
定量化された前記化学発光シグナルを調整するために初期の蛍光対最終の蛍光の比を使用して、報告された値を計算すること、
によりビーズ保持のための定量可能な前記応答を調整する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学ボックス内の蛍光を測定して、ビーズ保持を決定すること、および、
前記光学ボックス内の発光を測定して、生成された相対光ユニット信号を検出すること、
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
蛍光測定値および発光測定値をアルゴリズムに入力して、ビーズ保持調整相対光ユニット信号を生成することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生成された前記ビーズ保持調整相対光ユニット信号を、較正曲線相対光ユニット信号と比較することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本教示は、診断アッセイを実施するためのシステムおよびプロセス、より詳細には、感染および自己免疫疾患の診断アッセイを実施するための自動免疫分析システムおよびプロセスに関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本出願の特定の態様によれば、自己免疫疾患または感染性疾患の自動診断アッセイを実施するための定量的方法が提供され、ビオチン化自己抗原または感染性疾患抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、任意の非結合コンジュゲートを除去することと、定量化可能な応答を生成することができる基質を導入すること、および基質から生成された応答を較正すること、を含む。
【０００３】
本出願のさらに他の態様によれば、患者試料内の粒子に蛍光標識を結合させる制御されたプロセスが提供される。本開示のこの態様によれば、このプロセスは、発光標識を粒子に結合させ、患者試料からの発光シグナルを標準化するために一連の洗浄ステップ後に残った粒子を定量することを含む。この例示的なプロセスによれば、発光標識は、結合検体分子の数に比例して粒子に結合される。
【０００４】
本開示のさらなる他の態様によれば、自動化プラットフォーム上で使用するように設計された血清試料中の自己免疫特異的免疫グロブリンを評価するための定量的方法が提供される。この方法によれば、ビオチン化捕捉試薬がストレプトアビジン被覆固相とインキュベートされて、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の利用によって、固相への捕捉試薬の接着が引き起こされる。次いで、捕獲−試薬固相複合体を洗浄して、過剰のビオチン化捕獲試薬を除去する。次いで、血清試料が捕捉試薬固相複合体とインキュベートされて、血清中に存在する自己抗原特異的免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ）の提示された捕捉試薬への結合が引き起こされ、免疫複合体が作製される。次いで、免疫複合体を洗浄して非結合免疫グロブリンを除去し、次いで標識抗免疫グロブリンコンジュゲートとインキュベートして、コンジュゲートの、免疫複合体の自己抗原特異的免疫グロブリン成分への結合を引き起こし、免疫コンジュゲート複合体を作製する。免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合標識抗免疫グロブリンを除去し、次いで定量可能な応答を生じさせることができる基質を導入する。基質の添加によって生成された定量可能な応答を較正し、報告された値をビーズ保持のために調整する。
【０００５】
本開示のさらなる他の態様によれば、自動化プラットフォーム上で使用するように設計された血清試料中の感染性因子特異的免疫グロブリンを評価するための定量的方法が提供される。この方法によれば、ビオチン化捕捉試薬がストレプトアビジン被覆固相とインキュベートされ、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の利用によって、固相への捕捉試薬の接着が引き起こされる。次いで、捕獲−試薬固相複合体を洗浄して、過剰のビオチン化捕獲試薬を除去する。次いで、血清試料を捕捉試薬固相複合体とインキュベートして、血清中に存在する感染因子特異的免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ）の提示された捕捉試薬への結合を引き起こし、および免疫複合体を作製する。次いで、免疫複合体を洗浄して非結合免疫グロブリンを除去し、次いで標識抗免疫グロブリンコンジュゲートとインキュベートして、免疫複合体の自己抗原特異的免疫グロブリン成分へのコンジュゲートの結合を引き起こし、および免疫コンジュゲート複合体を作製する。免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合標識抗免疫グロブリンを除去し、次いで定量可能な応答を生じさせることができる基質が導入される。基質の添加によって生成された定量可能な応答を較正し、報告された値をビーズ保持のために調整する。
【０００６】
本明細書の特定の態様によれば、ビオチン化捕捉試薬は、ビオチン化自己抗原またはビオチン化感染性因子である。
【０００７】
本明細書の特定の態様によれば、ビオチン化捕捉試薬は、精製されたタンパク質、酵素、または抗体のビオチン化から誘導される。
【０００８】
本明細書の他の態様によれば、ビオチン化捕捉試薬は、多数の抗原から構成される感染性因子抽出物のビオチン化に由来する。
【０００９】
本開示の特定の例示的な態様によれば、ビオチン化捕捉試薬は、精製されたタンパク質、酵素、抗体および抽出物を含む様々な起源の複数のビオチン化捕捉試薬のアマルガムとして存在する。
【００１０】
本開示のさらに別の特定の例示的な態様によれば、ストレプトアビジン被覆固相は、ユニバーサル蛍光標識磁性微粒子である。
【００１１】
本開示の特定の態様によれば、１つ以上の洗浄工程は、反応キュベットの閉鎖領域内で洗浄される複合体を磁気的に引き離すことによって固相複合体を洗浄することを含む。
【００１２】
本開示のさらに別の特定の例示的な態様によれば、捕獲試薬固相複合体を血清試料とインキュベートする工程は、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む反応希釈剤によって懸濁液中に保持された捕捉試薬固相複合体をインキュベートすることを含む。
【００１３】
本開示のさらに別の特定の例示的な態様によれば、標識抗免疫グロブリンコンジュゲートと免疫複合体をインキュベートする工程は、公称濃度のポリエチレングリコールを含むコンジュゲート希釈剤によって懸濁液中に保持された免疫複合体をインキュベートすることを含む。
【００１４】
本開示の特定の態様によれば、特に、ＰＳ−ＡｔｔｏとＨＲＰ標識コンジュゲートとの反応が、溶液アッセイにおける最大検出感度に対して持続的な高強度発行を生成するため、非結合試料を除去するために免疫複合体を洗浄する際に、間接標識として、抗免疫グロブリン抗体とコンジュゲートされたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用する工程をさらに含む
【００１５】
本開示のさらに他の特定の態様によれば、免疫コンジュゲート複合体への基質の添加は、定量可能な応答を生成することができる基質としてＬｕｍｉｇｅｎ  ＰＳ−Ａｔｔｏを添加することを含み、定量可能な応答は、ＨＲＰ−ＰＳ−Ａｔｔｏレポーターシステムによって生成され、光学ボックス内の照度計によって検出される化学発光シグナルとして存在する。
【００１６】
本教示の特定の態様によれば、ビーズ保持のための定量可能な応答を調節する工程は、蛍光および化学発光シグナルの両方が定量される光学ボックスに基質および免疫コンジュゲート複合体を移す工程；ビーズ保持のために定量化された化学発光シグナルを調整するために初期蛍光対最終蛍光の比を使用する工程；報告された値を計算するために調整された化学発光シグナルを較正することを含む。基質および免疫コンジュゲート複合体を光学ボックスに移すために、試料を吸引する再使用可能なピペットチップを備えた自動ピペットアームを利用することができる。光学ボックス内で、ビーズ保持を決定するために蛍光を測定し、化学作用によって生成されたＲＬＵシグナルを検出するために発光を測定する。測定値をアルゴリズムに入力して、「ビーズ保持調整ＲＬＵ」を生成し、これを較正曲線ＲＬＵと比較し、その後、免疫グロブリン濃度を割り当てる。
【００１７】
本発明のさらに他の目的および利点は、添付図面とともに以下の記載から明らかになるであろう。
【００１８】
本開示の上記の態様およびそれらを得る方法は、添付の図面と関連してなされる本開示の実施形態の以下の説明を参照することにより、より明らかになるであろうし、その開示自体がよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本出願による自動診断アッセイを実施するための方法の概略図である。
【図２】本出願の教示による自動免疫化学分析装置および試薬システムの上面概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
対応する参照符号は、いくつかの図を通して対応する部分を示す。本明細書に記載された例示は本開示の実施形態を示すが、いくつかの形態において、以下に開示される実施形態は網羅的であること、または開示の正確な形態に本開示の範囲を限定するものとして解釈されることを意図するものではない。
【００２１】
本明細書では、自動免疫分析装置、試薬システム、および感染性および自己免疫疾患の診断アッセイを実施するための方法が開示される。
【００２２】
詳細に本開示の例示的な自動免疫分析システムおよび方法を説明する前に、過剰または非結合物質からのバックグラウンド信号を最小化する方法として、免疫アッセイは一般に、１つの以上の分離相が反応キュベット中で行われることを必要とすることが本明細書で理解され、認識されるべきである。分離または洗浄プロセスを容易にするために、ウェルコーティング技術、ビーズコーティング技術、または常磁性粒子の使用を含むが、これらに限定されない様々な技術を使用することができる。これらの分離媒体の各々は、患者の血液試料中の目的の検体分子に結合する捕捉試薬で被覆されている。本教示の特定の態様によれば、ビオチン化捕捉試薬は、アマルガムまたは混合物（すなわち、類似のカテゴリーであるが異なる属由来の捕捉試薬）として存在し得る。当業者が本明細書において理解し認識するように、多数の捕捉試薬が利用可能であり、本教示に従って使用することができる。本教示に従って使用される個々の捕獲試薬のそれぞれの量および容量は、それらの効力（すなわち、検出可能な応答を生じるそれらの能力）に依存することが理解されるべきである。
【００２３】
常磁性粒子が分離媒体として使用される場合、常磁性粒子は、洗浄プロセスの間に磁石によってキュベットの壁に引っ張られ、次いですべての液体が吸引される。当業者は、本明細書で理解し認識するように、従来の洗浄プロセスの間に、常磁性粒子の一部は液体とともに吸引され、したがって更なる化学処理のために失われることになる。免疫アッセイ手順がいくつかの洗浄工程を含む場合、磁性粒子の損失はさらに顕著になる。
【００２４】
本教示の目的の１つは、これらの洗浄プロセスの間に免疫化学分析装置で生じる常磁性粒子の損失を考慮に入れることである。これを達成するために、本教示の特定の態様によれば、患者の血液試料中の目的の分析検体は、常磁性粒子の表面に結合した捕捉試薬に結合する。次いで、発光標識がこれらの検体分子に結合される。発光試薬または基質がキュベットに加えられると、それは発光標識と反応して、分析装置の光検出器によって検出可能な光を生成する。さらに、常磁性粒子が蛍光標識を付着させる場合、キュベット内の内容物を蛍光的に読み取ることにより、洗浄工程中に失われた粒子の割合を決定する手段が提供される。
【００２５】
本開示の特定の態様によれば、自動分析装置は、磁気ビーズまたは微粒子を含むがこれに限定されないアッセイのための共通の常磁性粒子を利用する。分析装置に搭載された各アッセイについて、捕捉試薬をインキュベートし、反応キュベット中のユニバーサル粒子に結合させて、時には捕捉試薬固相複合体として本明細書に言及する、アッセイ特異的粒子ベース試薬を生成する。本開示の特定の態様によれば、診断免疫アッセイを実施するために使用され得る捕捉試薬は、ビオチン−抗原、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．９％  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、最大５％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる。本開示のさらに他の態様によれば、診断免疫アッセイを実施するために使用され得る別の捕捉試薬は、ビオチン−抗原、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２５％（最大３０％）（ｖ／ｖ）グリセロールからなる。
【００２６】
洗浄プロセスを受けた後、患者試料、および必要に応じて任意の希釈剤をキュベット内の粒子に添加し、インキュベートする。これにより、患者の血液試料中の特定の検体分子が捕捉される。本開示の１つの特定の例示的な態様によれば、反応希釈剤（試料希釈剤）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ヒトＩｇＧ、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、０．００５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｂ  ｖ／ｖ、２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ６，０００からなる。本開示のさらに別の特定の例示的な態様によれば、反応希釈剤（試料希釈剤）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０からなる。
【００２７】
これらの例示的な実施形態によれば、高割合のＨＳＡ（２５％）は、インキュベーション工程の間に懸濁液中にビーズを保持するために、反応媒体の粘度を増加させるように部分的に機能することが理解されるべきである。さらに、高ＨＳＡは、このインキュベーションの間の非特異的結合も減少させ、患者試料の希釈時の相対光単位（ＲＬＵ）直線性を改善する。
【００２８】
次いで、過剰の又は非結合試料を除去するために別の洗浄プロセスが実施され、次いで発光ラベル及びコンジュゲートがキュベットに加えられる。キュベットに添加すると、インキュベーション期間の後にコンジュゲートの一部が常磁性粒子上の捕捉試薬／試料複合体に結合することが予想される。次いで、粒子は非結合コンジュゲートを除去するために別の洗浄プロセスを受け、次いで基質をキュベットに添加し、化学発光グロー反応が平衡に達するまでの短時間インキュベートする。
【００２９】
平衡に達した後、試料の発光および蛍光測定値がとられる。常磁性粒子は、共通の試薬バイアル内の分析装置に含まれ、反応キュベットにピペットで移される前に均一な懸濁状態に維持されるので、各試験に対する最終的な蛍光測定値と組み合わされたとき、キュベットにピペットで移された後の粒子の初期蛍光測定値は、免疫アッセイプロセス後にキュベット内に残っている初期の粒子の画分を決定するために使用することができる。残りの画分は次の式で与えられる。
【００３０】
【数１】
2018510354.tif 000003
【００３１】
ここで、Ｆは、補正された蛍光信号（すなわち、光検出器の計数効率によって補正された測定信号）を表す。光検出器は特定の時間分解能を有するので、単位時間当たりに検出される光子の数が増加すると、その時間分解能内で検出器に到達する２つの光子の可能性も増加する。これらの２つの光子は検出器によって分解することができないので、単一の光子としてカウントされる。したがって、光検出器の検出効率は、入射光子束が増加するにつれて減少する。
【００３２】
常磁性粒子のための容器壁と相互作用し、常磁性粒子のための容器壁から散乱する非常に高い蛍光励起光子の束のために、蛍光物質が存在しない場合であっても光検出器によって計数される特定数の光子が存在する。この補正されたバックグラウンド信号は、Ｆｂａｃｋｇｒｏｕｎｄで表される。
【００３３】
免疫アッセイプロセスを通じて反応キュベット内に残る初期常磁性粒子のパーセンテージを決定するための蛍光測定の使用は、プロセスがシステムスループットを制限しないため、特に、プロセスが達成され得るタイミングまたは並列処理を制限しないために、有益である。他方、ほとんどの従来の免疫アッセイ分析装置は、常磁性粒子および試料の非常に再現性のある処理に依存しており、それは達成され得るタイミングまたは並列処理を実際に制限し、その結果としてシステムスループットも制限する。これらの従来の免疫アッセイ分析装置では時間の経過に伴う処理効率の変化は検出されなくなる可能性があるが、これらの変化は蛍光検出で検出することができる。本開示の教示は、マイナーな機械的整列または流体の相違に起因する洗浄効率が変化する並列処理（例えば、複数の洗浄アーム）の使用を可能にする。免疫アッセイプロセスの各ステップ後にとられた蛍光測定値は、並行プロセスの同等の機能性を検証するのに有用である。
【００３４】
上記の方法および技術に従って、感染および自己免疫疾患の診断アッセイを実施するための自動免疫分析装置および試薬システムを、以下により詳細に記載する。このプロセスが記載されているので、アッセイを実施するために使用される開示された機器は、システムによって様々な異なる試験が実施され得るように、標準またはユニバーサル収集チューブを受け入れるように構成され得る。当業者はまた、原材料から感染性疾患および自己免疫抗原を含む抗原を単離するための多くの既知の方法が存在することを、本明細書において理解および認識するであろう。これらの単離方法は広く知られており、当技術分野で受け入れられているので、ここに詳細に議論しなくても、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、任意の許容される抗原単離方法を本発明のシステムに組み込むことができることを当業者は認識するであろう。感染症または自己免疫抗原を単離した後、それらをビオチンとコンジュゲートさせてビオチン化抗原または捕捉試薬を作製することができる。次いで、ビオチン化抗原をストレプトアビジン結合固体支持体または膜と接触させる。本開示の特定の態様によれば、ビオチン化捕捉試薬は、精製タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、核抽出物、細胞抽出物および非タンパク質抗原（例えば、薬物またはタンパク質に架橋された物質）を含むがこれに必ずしも限定されない成分に由来し得る。
【００３５】
当業者が本明細書において理解し、認識するように、診断的感染および自己免疫疾患の免疫アッセイに共通して使用される標準的なビオチン化プロセスおよび技術を、本教示に従って利用することができる。しかしながら、化学で使用される複数のビオチン化試薬の最適な性能を保証するために、必要に応じて反応のビオチン／タンパク質比を最適化することができる。本教示の特定の態様によれば、ビオチン試薬の特定のサイズのリンカーアームは、ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチンである。さらに、非タンパク質抗原については、材料をストレプトアビジンビーズ固相へのコーティングのためにビオチン化タンパク質に架橋することができ、一方、ＤＮＡなどの自己免疫抗原についてはビオチン化ジデオキシヌクレオチドをＤＮＡに組み込むことができる。
【００３６】
本開示の特定の態様による自動診断アッセイプロセスの概略図を図１に示す。この例示的な実施形態によれば、ストレプトアビジン被覆で製造された磁気ビーズまたは微粒子は、既知のビオチン化抗原と混合（インキュベート）される（工程１０）。当業者が理解し、認識するように、ストレプトアビジンとビオチンとの間の周知の親和性結合は、ビーズ表面への抗原被覆を容易にし、それにより、オンボード試薬調製物とのユニバーサルビーズの使用が可能になる。本教示によるビオチン化捕捉試薬のストレプトアビジン被覆固相とのインキュベートに必要な時間および関連する実験室条件は、実施される特定の実験の観点から変化するが、本開示の特定の態様によれば、特に有用なインキュベーション時間範囲は、約１分〜約１５分、より具体的には約５分〜約１０分であり、温度は、約２℃〜約４０℃、より具体的には約３６．８℃〜約３７．２℃であることも理解され、認識されるべきである。
【００３７】
以下の表１に示されるように、本開示のこの態様によれば、以下のビーズが、本明細書に開示される磁性支持体に使用され得る。
【００３８】
【表１】
2018510354.tif 000004
【００３９】
特定の実施形態によれば、ビオチン化抗原をストレプトアビジン被覆ビーズと混合またはインキュベートするために多数のプロセスを利用することができるが、抗原がビオチン／ストレプトアビジン相互作用によりビーズを被覆するように、生成物を反応キュベット中で混合する。例示的な一実施形態によれば、１０μＬのストレプトアビジン（ＳＡ）被覆ビーズが反応キュベットに分散され、続いて、４０μＬのビオチン化抗原が分散の間に混合される。混合物を１〜１５分間インキュベートする。磁気ビーズを反応キュベットの一方の側に引っ張り、それらを固定化する一方、緩衝液を反応キュベット中に流して洗浄することによって過剰のビオチン化抗原を洗い流すことができる（工程２０）。１つの例示的な実施形態によれば、緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡおよび１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０からなり得る。当業者は、磁気ビーズを反応キュベットの一方の側に留まらせるために当技術分野で知られている任意の容易に利用可能な固定化技術を利用することができるが、特定の例示的な実施形態によれば、洗浄ステップが実行されている間、磁気ビーズを固定するために外部磁石が使用される。
【００４０】
次いで、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを磁場から解放し、反応キュベット内で自由に移動させる。次いで、生物学的試料（血清または血漿）を反応キュベットに添加し、続いて４０μＬの反応緩衝液を添加して、磁性ビーズを再懸濁する（工程３０）。生物学的試料に加えて、本開示の特定の態様によれば、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）も懸濁液内で使用して、高分子結合を促進し、磁気ビーズを溶液内に保持する。反応を直線的に保つために、ヒトＩｇＧを緩衝液に添加する。
【００４１】
試料が任意の抗原ビーズコーティングのいずれかに反応性の任意の抗体（例えば、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）を含有する場合、このような抗体はこの試料インキュベーション工程中に結合する。試料のインキュベーションを３７℃で４０分間維持する。患者試料内の任意の抗体がビーズと結合した後、第２の洗浄ステップを実施して、結合していない患者試料を除去する（工程４０）。１５０μＬの洗浄緩衝液濃縮液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、４．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、０．０２％（ｖ／ｖ）  Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｃ  ｖ／ｖ）を添加してビーズを再懸濁させ、次いでビーズを１．５分間磁石で引っ張り下ろす。溶液を除去した後、磁石を離し、２００μＬの洗浄緩衝液を添加してビーズを再懸濁する。  次いで、洗浄をもう一度繰り返す。
【００４２】
第２の洗浄工程が行われた後、ビーズは、ヒト免疫グロブリンＧ、Ｍ、ＥまたはＡ（ＩｇＧ／Ｍ／Ｅ／Ａ）に特異的な抗体に再懸濁される。本開示の特定の態様によれば、抗体は、ビーズによって捕捉された任意の特定の患者の抗体に結合する酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）にコンジュゲートされる（工程５０）。次いでビーズを再度洗浄して過剰の抗体を除去し（工程６０）、検出感度を最大にするために高感度光形成試薬（例えば化学発光基質）を加える（工程７０）。本開示の教示に従って化学発光基質として使用することができる例示的試薬には、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＰＳ−ａｔｔｏ、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＳｕｂｓｔｒａｔｅまたはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、キサンテン染料、芳香族アミン及び複素環式アミンを含む様々な構造クラスの多数の化合物を用いて、これらの条件下で化学発光を生成できることを理解し、認識するであろう。これらの化合物は、特許文献中によく知られており、多くの商業的販売業者を通じて容易に入手可能である。非限定的な化学発光化合物には、ジオキセタン型分子、ルシフェリン、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＰＳ−２、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＰＳ−３、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ−６、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ−３が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
高感度の光形成試薬が反応キュベットに加えられると、光が生成される（工程８０）。特定の実施形態によれば、ピペットチップ中の溶液を読み取りステーションに移して、発光シグナルおよび蛍光シグナルの両方を読み取ることによって、この光を測定することができる。しかし、本開示に従って放出される光は、限定されることなく、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、ケミカルアクチノメーター、または視覚的なものを含む、本技術分野内で使用可能な、任意の適切な公知の検出手段によって検出され得る。当業者が容易に理解し認識するように、各検出手段は、適用および使用、コストおよび利便性を含むいくつかの要因によって影響され得る選択された検出装置といった、異なるスペクトル感度を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、本開示に従って測定され得る定量可能または検出可能な応答は、抗原特異的免疫グロブリン（Ｉｇ、例えば、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）を有する陽性試料が、基質の添加時に光度（すなわち、ＲＬＵ＝相対光単位）を生成する抗Ｉｇ−ＨＲＰの結合を引き起こしたことを示唆する。さらに、定量可能または検出可能な応答はまた、陰性試料によって生成される定量可能な応答に適用され得ることも、ここで理解されるべきである。
【００４４】
本教示の特定の態様に従って、任意の抗原特異的Ｉｇ（ｓＩｇ）に対する陽性／陰性試料によって生成されたＲＬＵを、全ＩｇＥ（ｔＩｇ）較正曲線によって生成されたＲＬＵと比較される。較正曲線は、ビオチン化抗Ｉｇ捕捉試薬を用いて評価されたある範囲の予め希釈された全Ｉｇ（ｔＩｇ）を較正器（ＷＨＯ標準から生成される）にかけることによって生成される。
【００４５】
本開示の機械的態様をよりよく理解するために、図２は、本開示の教示に従って検体試料の発光シグナルを定量し、正規化するために使用され得る自動免疫化学分析装置および試薬システム１００を示す。この例示的な態様によれば、自動化免疫化学分析装置１００は、最初に蛍光標識された常磁性粒子またはフルオビーズ（ｆｌｕｏ−ｂｅａｄ）を反応ローター１０６内に配置されたキュベットに分注することによって開始する。本明細書の一実施形態によれば、例示的なフルオビーズは、Ｆｌｕｏ−Ｂｅａｄ（ＳＡ−Ｓｐｅｅｄ  Ｂｅａｄ、Ａｔｔｏ  ５９０）、１ｍｇ／ｍＬである。
【００４６】
フルオビーズは最初、ボルテックス装置１０２内に配置され、Ｒ１ピペッター１０４によって反応ローター１０６に移される。Ｒ１ピペッター１０４は、所望量のフルオビーズ混合物を吸引し、吸引された量を反応ローター１０６に移すことができ、その結果、フルオビーズを反応ローター１０６のキュベット内に注入することができる。キュベットへの注入に続いて、光学ピペット１０８が反応ローター１０６のキュベットから試験試料を吸引し、試験試料を光学ボックス１１０に移送することができる。試料が光学ボックス１１０内に配置されると、蛍光測定値および発光測定値を記録することができる。蛍光および発光信号の初期記録は、試料中のフルオビーズの初期濃度に対応することができる蛍光信号のベースライン測定値として使用することができる。測定値を記録した後、マルチリンスピペッター１１２は、洗浄緩衝液を用いてキュベットをリンスすることができる。
【００４７】
次に、Ｒ１ピペッター１０４を介してボルテクスサー１０２から反応ローター１０６のキュベットにフルオビーズを移動させ得る。その後、Ｒ１ピペッター１０４が試薬ローター１１４から捕捉試薬を吸引して、捕捉試薬を反応ローター１０６に配置されるキュベットに注入し得る。インキュベーション期間の後、単一のリンスピペッター１１６は、フルオビーズを再懸濁するためにリンス緩衝液を注入することができる。実質的な量の懸濁したフルオビーズは、その後、一定時間にわたって反応ローター１０６内の磁石によって局在化され得る。マグネットがキュベット内のフルオビーズを実質的に局在化させた後、マルチリンスピペッター１１２はリンス緩衝液の一部を吸引して廃棄し、キュベット内に局在化したフルオビーズの一部を残す。マルチリンスピペッター１１２は、反応ローター１０６のキュベットに洗浄緩衝液を注入して、フルオビーズを再懸濁するように進行してもよい。反応ローター１０６内の磁石によって、フルオビーズが再び局在化され、マルチリンスピペッター１１２が、反応ローター１０６のキュベットから局在化されていない試料の一部を吸引して廃棄してもよい。
【００４８】
患者試料は、試料ローター１１８上の試料チューブに収容されてもよい。患者試料は、さらに、試料希釈剤で部分的に希釈されてもよい。この時点で、試料ピペッター１２０は、患者試料の一部を吸引して、反応ローター１０６のキュベットに患者試料を注入してフルオビーズを再懸濁することができる。次いで、反応ローター１０６内の患者試料を含むキュベットを、特定の時間、特定の温度でインキュベートすることができる。インキュベーション後、単一のリンスピペッター１１６は、再びリンス緩衝液を注入して、再びふるいビーズを再懸濁することができる。フルオビーズが反応ローター１０６の磁石の近くのキュベット内に実質的に集まるようにすることにより、反応ローター１０６によって別の局在化プロセスが行われる。フルオビーズの局在化後、マルチリンスピペッター１１２は、局在化プロセス中に局在化されなかった反応ローター１０６のキュベット内の流体の一部分を吸引し、廃棄する。
【００４９】
２〜３回のリンスサイクルは、反応ローター１０６のキュベット内の試料上で実行されてもよい。リンスサイクルは、マルチリンスピペッター１１２を使用してフルオビーズを再懸濁するためにキュベット内に洗浄緩衝液を注入することを含んでいてもよい。別の局在化ステップは、反応ローター１０６内の磁石によってキュベット内にフルオビーズが収集されることを可能にしてもよい。フルオビーズの十分な局在化を可能にする期間の後、マルチリンスピペッター１１２は、一部の試料を吸引し、および非意図的に破棄し、反応ローター１０６のキュベット内に一部のフルオビーズを残してもよい。別のリンスサイクルが、マルチリンスピペッター１１２を使用することによって起こり、再びキュベット内に洗浄緩衝液を注入し、フルオビーズを再懸濁することを可能にしてもよい。別のフルオビーズ局在化プロセスは、反応ローター１０６内の磁石を利用して、フルオビーズを試料の残りの部分から局在化することができる。最後に、マルチリンスピペッター１１２は、局在化プロセスによって局在化されなかった試料の一部を吸引することができる。
【００５０】
この時点で、Ｒ２ピペッタ１２２は、試薬ロータ１１４内のコンジュゲートキュベットに含まれるコンジュゲートを吸引することができる。次に、Ｒ２ピペッタ１２２は、以前に吸引されたコンジュゲートを反応ローター１０６のキュベットに注入することができる。反応ローター１０６のキュベットを制御された時間および温度の下でインキュベートした後、単一のリンスピペッター１１６は、反応ローター１０６のキュベットにリンス緩衝液を注入することができる。別のフルオビーズ局在化サイクルを実施して、反応ローター１０６内の磁石により実質的にキュベット内のフルオビーズを局在化させることもできる。マルチリンスピペッター１１２は、局在化サイクル中に局在化されていないキュベット内の試料の一部を吸引し廃棄することができる。
【００５１】
反応ローター１０６のキュベット内の試料に対して２回以上のリンスサイクルを実施することができる。マルチリンスピペッター１１２は、キュベット内にフルオビーズを再懸濁するために洗浄緩衝液を注入することができる。別のフルオビーズ局在化サイクルは、適切な時間にわたって反応ローター１０６の磁石に近接してキュベットを配置することによって、フルオビーズを局在化することができる。局在化サイクルの後、マルチリンスピペッター１１２は、局在化サイクル中に局在化されなかった試料の一部を吸引し廃棄することができる。次いで、マルチリンスピペッター１１２を使用して洗浄緩衝液を注入してフルオビーズを再懸濁することにより、第２の洗浄サイクルを行うことができる。別の局在化サイクルは、反応ローター１０６内の磁石を利用してキュベット内のフルオビーズを局在化することができる。局在化プロセスの後、マルチリンスピペット１１２は、局在化サイクルの間に局在化されなかった試料の一部を吸引して廃棄してもよい。
【００５２】
この時点で、Ｒ２ピペッター１２２は、試薬ロータ１１４からコンジュゲートの一部を吸引し、コンジュゲートを混合基質容器１２４に注入して、混合基質試料を作製することができる。次いで、Ｒ２ピペッターは、混合基質試料を混合基質容器１２４から吸引し、混合基質試料を反応ローター１０６のキュベットに注入し、混合基質試料と共にフルオビーズを再懸濁することができる。次いで、反応ローター１０６のキュベット内の試料を、光学ピペッター１０８によって吸引し、光学ボックス１１０内に置くことができる。光学ボックスが蛍光および発光光学観察を行った後、試料を廃棄し、マルチリンスピペッターが反応ロータ１０６のキュベットを次の試験の準備のためにリンスする。
【００５３】
抗原は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、脂質、酵素、免疫グロブリン、またはヌクレオチドであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、１００アミノ酸より長いアミノ酸配列を指す。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、１０〜１００アミノ酸長のアミノ酸配列を指す。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、１０アミノ酸長未満の長さのアミノ酸配列を指す。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は単一のプリンまたはピリミジン分子を指し、「核酸」という用語はヌクレオチド配列を指す。例えば、ＤＮＡは核酸であり、グアニンはヌクレオチドである。
【００５４】
自己免疫疾患の診断のための被験体由来の血清試料中の自己抗原特異的抗体の検出のための自動診断アッセイを実施するための定量的方法も本明細書に開示される。
【００５５】
本明細書に開示される方法を使用して診断することができる自己免疫疾患の非限定的な例は、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、関節炎（例えば、一関節炎または関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、敗血症性関節炎のような多発性関節炎）、脊椎関節症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、１型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、子宮内膜症、胃腸障害（例えば、過敏性腸疾患またはクローン病もしくは潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患）、グッドパス病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本甲状腺炎、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、ループス（例えば、円板状紅斑性狼瘡、薬物誘発性エリテマトーデス、ループス腎炎、新生児狼瘡、亜急性皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス）、モルフェア、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、筋障害（例えば、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、筋炎）、神経炎、パーキンソン病、尋常性天疱瘡、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、再発性播種性脳脊髄炎、リウマチ熱、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、皮膚疾患（例えば、皮膚炎、湿疹、静脈皮膚炎、汗腺炎、乾癬、酒さまたは潰瘍性大腸炎）、腱鞘炎、ブドウ膜炎、血管炎（例えば、バージャー病、脳血管炎、チャーグ−シュトラウス動脈炎、クリオグロブリン血症、必須クリオグロブリン血症、巨細胞性動脈炎、ゴルファー脈管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、過敏性血管炎、川崎病、顕微鏡下の多発動脈炎／多発性血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛（ＰＭＲ）、リウマチ性血管炎、高安動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症）、または白斑が挙げられる。
【００５６】
自己抗原の非限定的な例は、限定されるものではないが、アグリカン、アラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−１２）、アルファベータクリスタリン、アルファフォドリン（Ｓｐｔａｎ１）、アルファアクチニン、α１アンチキモトリプシン、α１アンチトリプシン、α１ミクログロブリン、アルソラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、アミロイド（例えば、アミロイドβ、アミロイドＰ）、アネキシン（例えば、アネキシンＩＩ、アネキシンＶ）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＪ）、アクアポリン（例えば、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４）、殺菌性／浸透性増加タンパク質（ＢＰＩ）、β−グロビン前駆体ＢＰ１、β−アクチン、β−ラクトグロブリンＡ、β２−糖タンパク質Ｉ、β２−ミクログロブリン、血液型抗原（例えば、Ｒｈ血液型抗原、Ｉ血液型抗原、ＡＢＯ血液型抗原）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルモジュリン、カルレティキュリン、カルジオリピン、カタラーゼ、カテプシンＢ、セントロメアタンパク質（例えば、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸塩、クロマチン、コラーゲン（例えば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩコラーゲン）、補体成分（例えばＣ１ｑ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）、シトクロムＣ、シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６、サイトケラチン、デコリン、デルマタン硫酸塩、ＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ、エラスチン、エプスタイン−バール核抗原１（ＥＢＮＡ１）、エラスチン、エンタクチン、抽出可能な核抗原（Ｒｏ、Ｌａ、Ｓｍ、ＲＮＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ１）、ファクターＩ、ファクターＰ、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＸ、フィブリノーゲン（フィブリノーゲンＩＶ、フィブリノーゲンＳ）、フィブロネクチン、フォルミミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（ＬＣ−１）、グリアジンおよびアミド化グリアジンペプチド（ＤＧＰ）、ｇｐ２１０核エンベロープタンパク質、ＧＰ２（主要チモーゲン顆粒膜糖タンパク質）、糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、糖化アルブミン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ハプトグロビンＡ２、熱ショックタンパク質（例えば、Ｈｓｐ６０、ＨＳＰ７０）、ヘモシアニン、ヘパリン、ヒストン（例えば、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｊｏ−１）、ヒアルロニダーゼ、免疫グロブリン、インスリン、インスリン受容体、インテグリン（例えばインテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、α６β３、α１β１）、間質レチノール結合タンパク質３、内性ファクター、Ｋｕ（Ｐ７０／Ｐ８０）、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラミニン、肝細胞質抗原１型（ＬＣ１）、肝臓／腎臓ミクロソーム抗原１（ＬＫＭ１）、リゾチーム、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、Ｍｉ−２（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４）、ミトコンドリアタンパク質（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、��５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２、ＯＧＤＣ−Ｅ２、ＰＤＣ−Ｅ２）、ムスカリン受容体、ミエリン関連糖タンパク質、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、リウマチ因子（ＩｇＭ  抗ＩｇＧ）、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体α鎖、ヌクレオリン、ヌクレオポリン（例えば、Ｎｕｐ６２）、ヌクレオソーム抗原、ＰＭ／Ｓｃｌ１００、ＰＭ／Ｓｃｌ  ７５、膵臓β細胞抗原、ペプシノゲン、ペルオキシレドキシン１、ホスホグルコースイソメラーゼ、リン脂質、ホスホチジルイノシトール、血小板由来成長因子、ポリメラーゼベータ（ＰＯＬＢ）、カリウムチャネルＫＩＲ４．１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、プロテイナーゼ−３、プロテオリピドタンパク質、プロテオグリカン、プロトロンビン、リカバリン、ロドプシン、リボヌクレアーゼ、リボ核タンパク質（例えば、Ｒｏ、Ｌａ、ｓｎＲＮＰ、ｓｃＲＮＰ）、リボソーム、リボソームリンタンパク質（例えば、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２）、ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）、Ｓｍタンパク質（例えば、ＳｍＢ、ＳｍＢ’、ＳｍＤ１、ＳｍＤ２、ＳｍＤ３、ＳｍＦ、ＳｍＧ、ＳｍＮ）、Ｓｐ１００核タンパク質、ＳＲＰ５４（シグナル認識粒子５４ｋＤａ）、セレクチン、平滑筋タンパク質、スフィンゴミエリン、連鎖球菌抗原、スーパーオキシドジスムターゼ、滑膜関節タンパク質、Ｔ１Ｆ１ガンマコラーゲン、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−７）、組織トランスグルタミナーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン受容体、トランスフェリン、トリオースリン酸イソメラーゼ、チューブリン、腫瘍壊死アルファ、トポイソメラーゼ、Ｕ１−ｄｎＲＮＰ  ６８／７０ｋＤａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ｃ、Ｕ−ｓｎＲＮＰ  Ｂ／Ｂ’、ユビキチン、血管内皮増殖因子、ビメンチンまたはビトロネクチンである。
【００５７】
自己免疫疾患の診断のための被験体由来の血清試料中の感染因子に対する抗体を検出することにより、感染性疾患の検出のための自動診断アッセイを行うための定量的方法も本明細書に開示される。
【００５８】
感染因子としては、細菌、ウイルス、ウイロイド、プリオン、線虫（例えば、回虫、虫垂）、寄生虫（マラリア、虫食き）および真菌（例えば、酵母、白癬）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「感染性因子」、「病原体」、「病原性微生物」および「微生物」はすべて、上記の感染因子を指す。
【００５９】
感染因子由来の抗原は、感染因子由来の任意の単離されたタンパク質、糖タンパク質、核酸、酵素、脂質、リポサッカリド、またはそれらの組み合わせであり得る。抗原はまた、複数の異なる抗原性部分を含む感染性因子からの抽出物またはホモジナイズされた調製物を含むことができる。
【００６０】
試料が自己抗原（ｓｅｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎ）（自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ））に対する自己免疫抗体または感染性因子に対する抗体を含有するかどうかを決定するために、蛍光標識された常磁性微粒子（例えばフルオビーズ）は、本明細書中に開示される方法に従って自己抗原または感染性疾患抗原に結合して、捕捉試薬を形成する。反応キュベット中の磁気ビーズの開始数を決定するために蛍光読み取りのために洗浄する前に、キュベットの試料を得る。
【００６１】
洗浄プロセスを受けた後、患者試料、および必要に応じて希釈剤をキュベット内の粒子に添加し、インキュベートする。これにより、患者の血液試料中の特定の検体分子（抗体）が捕捉される。次いで、過剰のまたは未結合の試料を除去するために別の洗浄プロセスが実施され、次いで、発光標識およびコンジュゲートがキュベットに添加される。キュベットに添加されると、インキュベーション期間の後にコンジュゲートの一部が常磁性粒子上の捕捉試薬／試料複合体に結合することが予想される。次いで、粒子は未結合コンジュゲートを除去するために別の洗浄プロセスを受け、次いで基質をキュベットに添加し、化学発光グロー反応が平衡に達するまで短時間インキュベートする。
【００６２】
平衡に達した後、試料の発光および蛍光読み取りを行い、抗原に対する抗体のレベルを本明細書に開示するように決定する。
【００６３】
本開示のプロセスおよび方法の利点および改良は、以下の実施例において実証される。これらの実施例は例示的なものに過ぎず、本開示の他の実施形態を限定または排除することを意図するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：抗ヒトＩｇまたは抗原抽出物のビオチン化：
ＤＭＳＯ中２５０ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）２マイクロリットルをリン酸緩衝化生理食塩水中（ＰＢＳ）中５．０ｍｇ／ｍＬのアフィニティー精製抗ヒトＩｇ（例えばＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）１ｍＬに添加する。または、ＤＭＳＯ中２５０ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）１．６μＬをＰＢＳ中１．０ｍｇ／ｍＬの抗原抽出物１ｍＬに添加する。
【００６５】
試薬溶液を混合し、氷上に２時間置く。遊離のビオチン試薬は、２〜８℃で４時間および一晩、２回のＰＢＳの交換（抗体対緩衝液の体積比−１：１００）に対する透析によってビオチン化抗体から分離される。
【００６６】
実施例２：フルオビーズの調製
ｄｄＨ２Ｏ中１ｍＭのＢｉｏｔｉｎ−Ｆｌｕｏ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  Ｂｉｏｃｙｔｉｎ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ、ライフテクノロジー）５マイクロリットルをＰＢＳＴＨＰ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０）４５ｍＬに加える。よく混合する。
【００６７】
５ミリリットルのＳＡ−スピードビーズ（Ｓｅｒａ−ｍａｇ  スピードビーズ  ストレプトアビジン被覆磁気粒子、サーモ）１０ｍｇ／ｍＬをＢｉｏｔｉｎ−Ｆｌｕｏ溶液に添加し、よく混合する。
【００６８】
実施例３：抗原に対する特異的免疫グロブリンレベルのアッセイ
ビーズ濃度１ｍｇ／ｍＬでの１０マイクロリットルのＦｌｕｏ−Ｂｅａｄ（蛍光標識された常磁性微粒子）を反応キュベットに分注する。４０μＬのビオチン抗原（例えば、感染性疾患抗原、自己抗原など）またはビオチン抗Ｉｇ抗体を分注し、Ｆｌｕｏ−Ｂｅａｄに混合し、３７℃で１〜１０分間インキュベートする。洗浄後、抗原または抗Ｉｇ被覆ビーズを４０μＬの反応緩衝液に再懸濁する。適切な個体から得られた血清試料を抗原に対してアッセイする。１０μＬの試料を、反応キュベット中の懸濁した抗原被覆ビーズ４０μＬに添加した。６点標準曲線については、１０μＬの血清標準（ＷＨＯ  Ｉｇ標準に対して較正された二次標準）を反応キュベット中の抗Ｉｇ被覆ビーズ４０μＬにそれぞれ添加する。様々な異なる標識抗Ｉｇコンジュゲートを本教示に従って利用することができるが、以下の抗Ｉｇコンジュゲートを利用する：アッセイのために：抗ＩｇＥ−ＨＲＰ；抗ＩｇＡ−ＨＲＰ、抗ＩｇＧ−ＨＲＰ、抗ＩｇＭ−ＨＲＰ、抗ＥＣＰ−ＨＲＰおよび抗トリプターゼ−ＨＲＰである。さらに、本明細書中で使用される場合、各コンジュゲートは、化学において使用するための最適化されたＨＲＰ取り込み比を有する。本教示の特定の態様によれば、列挙されたコンジュゲートに使用されるＨＲＰ取り込み比の範囲は、約１．２〜約５．４である。さらに、本教示は、アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびβ−ガラクトシダーゼコンジュゲートを含むがこれに限定されない他のタイプのコンジュゲート−レポーターシステムの組み込みも企図する。
【００６９】
溶液を混合し、３７℃で４０分間インキュベートする。洗浄後、ビーズを５０μＬの抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰコンジュゲートに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＳ−ａｔｔｏ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）５０μＬを各キュベットに加え、ビーズを再懸濁する。ビーズ懸濁液をピペットチップに移し、蛍光および発光信号の両方について視覚ボックス内に読み込む。標準曲線は、４パラメーターロジスティック関数式および標準曲線から補間された抗原に対する特異的Ｉｇのレベルを使用して決定した。
【００７０】
本教示に従って使用することができる例示的試薬および成分のリストは、限定されることなく、ビーズ：Ｆｌｕｏ−Ｂｅａｄ（ＳＡ−Ｓｐｅｅｄ  Ｂｅａｄ、Ａｔｔｏ  ５９０標識）、１ｍｇ／ｍＬ；捕獲試薬希釈剤：ＩｇＥ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．９％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、上限５％（ｖ／ｖ）グリセロール；ＡＮＡ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４，０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、上限２５％（３０％）（ｖ／ｖ）グリセロール；洗浄緩衝液濃縮液（５×）５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、４．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、０．０２％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｃ  ｖ／ｖ；試薬希釈剤（反応希釈剤および試料希釈剤）ＩｇＥ−１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ヒトＩｇＧ、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｂ  ｖ／ｖ、２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ６，０００；ＡＮＡ−１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、２５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０；キャリブレータおよびコントロール：キャリブレータ；試料希釈剤に希釈された患者試料；コントロール：患者試料プール；コンジュゲート；コンジュゲート希釈剤：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ６，０００、１％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０；ＩｇＥ：１００ｎｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥ−ＨＲＰ、１００μｇ／ｍＬ  ａｐｏ−ＨＲＰ、希釈剤中、０．０１５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｂ  ｖ／ｖ；および基質：ＰＳ−ａｔｔｏ  Ａ＆Ｂ、０．０１％  Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ｂ  ｖ／ｖ。
【００７１】
実施例４：自己抗原に対する特異的免疫グロブリンレベルのアッセイ
ビーズ濃度１ｍｇ／ｍＬでの１０マイクロリットルのＦｌｕｏ−Ｂｅａｄ（蛍光標識された常磁性微粒子）を反応キュベットに分配する。ビオチン抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質、コラーゲン、インスリンなど）またはビオチン抗ＩｇＧ抗体（あるいは抗ＩｇＭまたは抗ＩｇＡ）４０μＬを分注し、Ｆｌｕｏ−Ｂｅａｄに混合し、３７℃で１〜１０分間インキュベートする。ビーズの開始数を決定するために、標識したＦｌｕｏ−Ｂｅａｄの試料を得る。洗浄後、抗原または抗ＩｇＧ被覆ビーズを４０μＬの反応緩衝液に再懸濁する。個体から得られた血清試料を抗原に対してアッセイする。１０μＬの試料を反応キュベット中の懸濁した抗原被覆ビーズ４０μＬに添加する。６点標準曲線については、１０μＬの血清標準（ＷＨＯ  ＩｇＧ標準に対して較正された二次標準）を、反応キュベット中の抗ＩｇＧ被覆ビーズ４０μＬにそれぞれ添加する。
【００７２】
溶液を混合し、３７℃で４０分間インキュベートする。洗浄後、ビーズを５０μＬの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートする。  ＰＳ−ａｔｔｏ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）５０μＬを各キュベットに加え、ビーズを再懸濁する。  ビーズ懸濁液をピペットチップに移し、蛍光および発光シグナルの両方について視覚ボックス内に読み込む。標準曲線は、４パラメーターロジスティック関数式および標準曲線から補間された自己抗原に対する特異的ＩｇＧのレベルを用いて決定される。
【００７３】
実施例５：感染性因子抗原に対する特異的ＩｇＧレベルのアッセイ
ビーズ濃度１ｍｇ／ｍＬでの１０マイクロリットルのＦｌｕｏ−Ｂｅａｄ（蛍光標識された常磁性微粒子）を反応キュベットに分配する。ビオチン抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、エボラウイルス、結核菌など）またはビオチン抗ＩｇＧ抗体（あるいは、抗ＩｇＭまたは抗ＩｇＡ）４０μＬを分注し、Ｆｌｕｏ−Ｂｅａｄに混合し、３７℃で１〜１０分間インキュベートする。ビーズの開始数を決定するために、標識したＦｌｕｏ−Ｂｅａｄの試料を得る。洗浄後、抗原被覆ビーズまたは抗ＩｇＧ被覆ビーズを４０μＬの反応緩衝液に再懸濁する。個体から得られた血清試料を抗原に対してアッセイする。１０μＬの試料を反応キュベット中の懸濁した抗原被覆ビーズ４０μＬに添加する。６点標準曲線については、１０μＬの血清標準物質（ＷＨＯ  ＩｇＧ標準に対して較正された二次標準物質）を、反応キュベット中の抗ＩｇＧ被覆ビーズ４０μＬにそれぞれ添加する。
【００７４】
溶液を混合し、３７℃で４０分間インキュベートする。洗浄後、ビーズを５０μＬの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＳ−ａｔｔｏ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）５０μＬを各キュベットに加え、ビーズを再懸濁する。ビーズ懸濁液をピペットチップに移し、蛍光および発光シグナルの両方について視覚ボックス内に読み込む。標準曲線は、４パラメーターロジスティック関数式および標準曲線から補間された感染性因子抗原に対する特異的ＩｇＧのレベルを使用して決定される。
【００７５】
他に示されない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量、反応条件などの特性を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。本明細書で使用する「約」および「およそ」という用語は、１０〜１５％、好ましくは５〜１０％の範囲を意味する。したがって、反対に示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に依存して変化し得る近似値である。最低限、クレームの範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数と通常の周辺技術を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。
【００７６】
本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および類似の指示対象は、単数形および複数形の両方を包含するものと解釈されるべきであり、本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内の各別個の値を個々に参照する略式の方法として役立つことを単に意図するものである。本明細書中で他に示されない限り、個々の値は、個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的な言語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、他に請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００７７】
本明細書で開示される本発明の代替要素または実施形態のグループ分けは、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループ内の他のメンバーまたはここに記載されている他の要素と任意の組み合わせで参照され、請求されることがある。利便性および／または特許性の理由から、１つまたは複数のグループのメンバーがグループに含まれるか、グループから削除されることが予想される。そのような包含または削除が生じた場合、明細書は修正されたグループを含むとみなされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述を満たすものとみなされる。
【００７８】
本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。当然のことながら、これらの記載された実施形態の変形は、上記の説明を読むことによって当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、あるいは文脈によって明らかに否定されない限り、それらのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【００７９】
本明細書で開示された特定の実施形態は、言語で構成された、または本質的に言語からなる用語を使用している請求項においてさらに限定されている。特許請求の範囲において使用される場合、特許請求の範囲に記載されているか否かに関わらず、「からなる」という移行用語は、特許請求の範囲に記載されていない要素、ステップまたは成分を排除する。「本質的に〜からなる」という移行用語は、特定の材料またはステップ、および基本的および新規な特性に重大な影響を及ぼさないものに、請求の範囲を限定する。そのように請求された本発明の実施形態は、本質的にまたは明示的に記載され、有効にされる。
【００８０】
さらに、本明細書を通して特許および刊行物に多数の参考文献がなされている。上に引用した参考文献および印刷された刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が個々に本明細書に組み込まれる。
【００８１】
最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。使用され得る他の修飾も本発明の範囲内である。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替構成を本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は図示され説明されたものに厳密に限定されるものではない。
【００８２】
（付記）
（付記１）
ビオチン化自己抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、
前記固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、
前記固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、
前記免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、
前記免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合コンジュゲートを除去することと、
定量化可能な応答を生成することができる基質を導入することと、
前記基質から生成された前記応答を較正することと、
を含む自己免疫疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。
【００８３】
（付記２）
前記固相複合体を前記血清試料とインキュベートする工程は、前記血清試料中に存在する自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）又は自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）を前記捕捉試薬に結合させることを含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８４】
（付記３）
前記自己抗原は、アグリカン、アラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−１２）、アルファベータクリスタリン、アルファフォドリン（Ｓｐｔａｎ１）、アルファアクチニン、α１アンチキモトリプシン、α１アンチトリプシン、α１ミクログロブリン、アルソラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、アミロイド（例えば、アミロイドベータ、アミロイドＰ）、アネキシン（例えば、アネキシンＩＩ、アネキシンＶ）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＪ）、アクアポリン（例えば、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４）、殺菌性／浸透性増加タンパク質（ＢＰＩ）、β−グロビン前駆体ＢＰ１、β−アクチン、β−ラクトグロブリンＡ、β２−糖タンパク質Ｉ、β２−ミクログロブリン、血液型抗原（例えば、Ｒｈ血液型抗原、Ｉ血液型抗原、ＡＢＯ血液型抗原）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルモジュリン、カルレティキュリン、カルジオリピン、カタラーゼ、カテプシンＢ、セントロメアタンパク質（例えば、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸、クロマチン、コラーゲン（例えば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩコラーゲン）、シトクロムＣ、シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６、サイトケラチン、デコリン、デルマタン硫酸、ＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ、エラスチン、エプスタイン−バール核抗原１（ＥＢＮＡ１）、エラスチン、エンタクチン、抽出可能な核抗原（Ｒｏ、Ｌａ、Ｓｍ、ＲＮＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ１）、ファクターＩ、ファクターＰ、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＸ、フィブリノーゲン（フィブリノーゲンＩＶ、フィブリノーゲンＳ）、フィブロネクチン、フォルミミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（ＬＣ−１）、グリアジンおよびアミド化グリアジンペプチド（ＤＧＰ）、ｇｐ２１０核エンベロープタンパク質、ＧＰ２（主要チモーゲン顆粒膜糖タンパク質）、糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、糖化アルブミン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ハプトグロビンＡ２、熱ショックタンパク質（例えば、Ｈｓｐ６０、ＨＳＰ７０）、ヘモシアニン、ヘパリン、ヒストン（例えば、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｊｏ−１）、ヒアルロニダーゼ、免疫グロブリン、インスリン、インスリン受容体、インテグリン（例えばインテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、α６β３、α１β１）、間質レチノール結合タンパク質３、内性ファクター、Ｋｕ（Ｐ７０／Ｐ８０）、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラミニン、肝細胞質抗原１型（ＬＣ１）、肝臓／腎臓ミクロソーム抗原１（ＬＫＭ１）、リゾチーム、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、Ｍｉ−２（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４）、ミトコンドリアタンパク質（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２、ＯＧＤＣ−Ｅ２、ＰＤＣ−Ｅ２）、ムスカリン受容体、ミエリン関連���タンパク質、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、リウマチ因子（ＩｇＭ  抗ＩｇＧ）、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体α鎖、ヌクレオリン、ヌクレオポリン（例えば、Ｎｕｐ６２）、ヌクレオソーム抗原、ＰＭ／Ｓｃｌ１００、ＰＭ／Ｓｃｌ  ７５、膵臓β細胞抗原、ペプシノゲン、ペルオキシレドキシン１、ホスホグルコースイソメラーゼ、リン脂質、ホスホチジルイノシトール、血小板由来成長因子、ポリメラーゼベータ（ＰＯＬＢ）、カリウムチャネルＫＩＲ４．１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、プロテイナーゼ−３、プロテオリピドタンパク質、プロテオグリカン、プロトロンビン、リカバリン、ロドプシン、リボヌクレアーゼ、リボ核タンパク質（例えば、Ｒｏ、Ｌａ、ｓｎＲＮＰ、ｓｃＲＮＰ）、リボソーム、リボソームリンタンパク質（例えば、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２）、ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）、Ｓｍタンパク質（例えば、ＳｍＢ、ＳｍＢ’、ＳｍＤ１、ＳｍＤ２、ＳｍＤ３、ＳｍＦ、ＳｍＧ、ＳｍＮ）、Ｓｐ１００核タンパク質、ＳＲＰ５４（シグナル認識粒子５４ｋＤａ）、セレクチン、平滑筋タンパク質、スフィンゴミエリン、連鎖球菌抗原、スーパーオキシドジスムターゼ、滑膜関節タンパク質、Ｔ１Ｆ１ガンマコラーゲン、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−７）、組織トランスグルタミナーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン受容体、トランスフェリン、トリオースリン酸イソメラーゼ、チューブリン、腫瘍壊死アルファ、トポイソメラーゼ、Ｕ１−ｄｎＲＮＰ  ６８／７０ｋＤａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ｃ、Ｕ−ｓｎＲＮＰ  Ｂ／Ｂ’、ユビキチン、血管内皮増殖因子、ビメンチンまたはビトロネクチンである、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８５】
（付記４）
前記ストレプトアビジン被覆培地は、ユニバーサル蛍光標識磁性微粒子を含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８６】
（付記５）
１つ以上の洗浄工程は、反応キュベットの閉鎖領域内で洗浄される前記複合体を磁気的に引き離すことによって前記複合体を洗浄することを含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８７】
（付記６）
捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートする工程は、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む反応希釈剤によって懸濁液中に保持された捕捉試薬をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８８】
（付記７）
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートする工程は、公称濃度のポリエチレングリコールを含むコンジュゲート希釈剤によって懸濁液中に保持された免疫複合体をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００８９】
（付記８）
非結合試料を除去するために前記免疫複合体を洗浄する際に、間接標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用する工程をさらに含む、付記１に記載の方法。
【００９０】
（付記９）
蛍光シグナルおよび化学発光シグナルの両方が定量化される光学ボックスに前記基質および前記免疫コンジュゲート複合体を移すこと、および
定量化された前記化学発光シグナルを調整するために初期の蛍光対最終の蛍光の比を使用して、報告された値を計算すること、
によりビーズ保持のための定量可能な前記応答を調整する工程をさらに含む、付記１に記載の方法。
【００９１】
（付記１０）
前記光学ボックス内の蛍光を測定して、ビーズ保持を決定すること、および
前記光学ボックス内の発光を測定して、生成された相対光ユニット信号を検出すること、
をさらに含む、付記９に記載の方法。
【００９２】
（付記１１）
蛍光測定値および発光測定値をアルゴリズムに入力して、ビーズ保持調整相対光ユニット信号を生成することをさらに含む、付記１０に記載の方法。
【００９３】
（付記１２）
生成された前記ビーズ保持調整相対光ユニット信号を、較正曲線相対光ユニット信号と比較する工程をさらに含む、付記１０に記載の方法。
【００９４】
（付記１３）
ビオチン化感染性疾患抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、
前記固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、
前記固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、
前記免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、
前記免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合コンジュゲートを除去することと、
定量化可能な応答を生成することができる基質を導入することと、
前記基質から生成された前記応答を較正することと、
を含む感染性疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。
【００９５】
（付記１４）
前記固相複合体を前記血清試料とインキュベートする工程は、前記血清試料中に存在する感染性因子特異的ヒトＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡをビオチン化捕捉試薬に結合させることを含む、付記１３に記載の方法。
【００９６】
（付記１５）
前記感染性疾患抗原は、細菌、ウイルス、ウイロイド、プリオン、線虫、寄生虫、および真菌から選択される感染性因子に由来する、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【００９７】
（付記１６）
前記捕捉試薬は、多数の抗原から構成される感染性因子抽出物のビオチン化に由来する、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【００９８】
（付記１７）
前記感染性疾患抗原は、タンパク質、糖タンパク質、核酸、酵素、脂質、リポサッカリド、抗体またはそれらの組み合わせである、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【００９９】
（付記１８）
前記捕捉試薬は、精製されたタンパク質、酵素、抗体および感染性因子抽出物から選択される複数のビオチン化捕捉試薬のアマルガムである、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【０１００】
（付記１９）
前記ストレプトアビジン被覆培地は、ユニバーサル蛍光標識磁性微粒子を含む、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【０１０１】
（付記２０）
１つ以上の洗浄工程は、反応キュベットの閉鎖領域内で洗浄される前記複合体を磁気的に引き離すことによって前記複合体を洗浄することを含む、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【０１０２】
（付記２１）
捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートする工程は、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む反応希釈剤によって懸濁液中に保持された捕捉試薬をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【０１０３】
（付記２２）
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートする工程は、公称濃度のポリエチレングリコールを含むコンジュゲート希釈剤によって懸濁液中に保持された免疫複合体をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする付記１３に記載の方法。
【０１０４】
（付記２３）
非結合試料を除去するために前記免疫複合体を洗浄する際に、間接標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用する工程をさらに含む、付記１３に記載の方法。
【０１０５】
（付記２４）
蛍光シグナルおよび化学発光シグナルの両方が定量化される光学ボックスに前記基質および前記免疫コンジュゲート複合体を移すこと、および、
定量化された前記化学発光シグナルを調整するために初期の蛍光対最終の蛍光の比を使用して、報告された値を計算すること、
によりビーズ保持のための定量可能な前記応答を調整する工程をさらに含む、付記１３に記載の方法。
【０１０６】
（付記２５）
前記光学ボックス内の蛍光を測定して、ビーズ保持を決定すること、および、
前記光学ボックス内の発光を測定して、生成された相対光ユニット信号を検出すること、
をさらに含む、付記２４に記載の方法。
【０１０７】
（付記２６）
蛍光測定値および発光測定値をアルゴリズムに入力して、ビーズ保持調整相対光ユニット信号を生成することをさらに含む、付記２５に記載の方法。
【０１０８】
（付記２７）
生成された前記ビーズ保持調整相対光ユニット信号を、較正曲線相対光ユニット信号と比較することをさらに含む、付記２５に記載の方法。
【図１】
2018510354.tif 000005
【図２】
2018510354.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月5日(2018.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化自己抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、
前記固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、
前記固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、
前記免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、
前記免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合コンジュゲートを除去することと、
定量化可能な応答を生成することができる基質を導入することと、
前記基質から生成された前記応答を較正することと、
を含む自己免疫疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。
【請求項２】
前記固相複合体を前記血清試料とインキュベートする工程は、前記血清試料中に存在する自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）又は自己免疫特異的ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）を前記捕捉試薬に結合させることを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己抗原は、アグリカン、アラニル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−１２）、アルファベータクリスタリン、アルファフォドリン（Ｓｐｔａｎ１）、アルファアクチニン、α１アンチキモトリプシン、α１アンチトリプシン、α１ミクログロブリン、アルソラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、アミロイド（例えば、アミロイドベータ、アミロイドＰ）、アネキシン（例えば、アネキシンＩＩ、アネキシンＶ）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＪ）、アクアポリン（例えば、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４）、殺菌性／浸透性増加タンパク質（ＢＰＩ）、β−グロビン前駆体ＢＰ１、β−アクチン、β−ラクトグロブリンＡ、β２−糖タンパク質Ｉ、β２−ミクログロブリン、血液型抗原（例えば、Ｒｈ血液型抗原、Ｉ血液型抗原、ＡＢＯ血液型抗原）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルモジュリン、カルレティキュリン、カルジオリピン、カタラーゼ、カテプシンＢ、セントロメアタンパク質（例えば、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ）、コンドロイチン硫酸、クロマチン、コラーゲン（例えば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩコラーゲン）、シトクロムＣ、シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６、サイトケラチン、デコリン、デルマタン硫酸、ＤＮＡ（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ、エラスチン、エプスタイン−バール核抗原１（ＥＢＮＡ１）、エラスチン、エンタクチン、抽出可能な核抗原（Ｒｏ、Ｌａ、Ｓｍ、ＲＮＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ１）、ファクターＩ、ファクターＰ、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＸ、フィブリノーゲン（フィブリノーゲンＩＶ、フィブリノーゲンＳ）、フィブロネクチン、フォルミミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（ＬＣ−１）、グリアジンおよびアミド化グリアジンペプチド（ＤＧＰ）、ｇｐ２１０核エンベロープタンパク質、ＧＰ２（主要チモーゲン顆粒膜糖タンパク質）、糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、糖化アルブミン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ハプトグロビンＡ２、熱ショックタンパク質（例えば、Ｈｓｐ６０、ＨＳＰ７０）、ヘモシアニン、ヘパリン、ヒストン（例えば、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）、ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｊｏ−１）、ヒアルロニダーゼ、免疫グロブリン、インスリン、インスリン受容体、インテグリン（例えばインテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、α６β３、α１β１）、間質レチノール結合タンパク質３、内性ファクター、Ｋｕ（Ｐ７０／Ｐ８０）、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラミニン、肝細胞質抗原１型（ＬＣ１）、肝臓／腎臓ミクロソーム抗原１（ＬＫＭ１）、リゾチーム、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、Ｍｉ−２（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４）、ミトコンドリアタンパク質（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２、ＯＧＤＣ−Ｅ２、ＰＤＣ−Ｅ２）、ムスカリン受容体、ミエリン関連���タンパク質、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、リウマチ因子（ＩｇＭ  抗ＩｇＧ）、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体α鎖、ヌクレオリン、ヌクレオポリン（例えば、Ｎｕｐ６２）、ヌクレオソーム抗原、ＰＭ／Ｓｃｌ１００、ＰＭ／Ｓｃｌ  ７５、膵臓β細胞抗原、ペプシノゲン、ペルオキシレドキシン１、ホスホグルコースイソメラーゼ、リン脂質、ホスホチジルイノシトール、血小板由来成長因子、ポリメラーゼベータ（ＰＯＬＢ）、カリウムチャネルＫＩＲ４．１、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、プロテイナーゼ−３、プロテオリピドタンパク質、プロテオグリカン、プロトロンビン、リカバリン、ロドプシン、リボヌクレアーゼ、リボ核タンパク質（例えば、Ｒｏ、Ｌａ、ｓｎＲＮＰ、ｓｃＲＮＰ）、リボソーム、リボソームリンタンパク質（例えば、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２）、ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）、Ｓｍタンパク質（例えば、ＳｍＢ、ＳｍＢ’、ＳｍＤ１、ＳｍＤ２、ＳｍＤ３、ＳｍＦ、ＳｍＧ、ＳｍＮ）、Ｓｐ１００核タンパク質、ＳＲＰ５４（シグナル認識粒子５４ｋＤａ）、セレクチン、平滑筋タンパク質、スフィンゴミエリン、連鎖球菌抗原、スーパーオキシドジスムターゼ、滑膜関節タンパク質、Ｔ１Ｆ１ガンマコラーゲン、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＰＬ−７）、組織トランスグルタミナーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、チログロブリン、甲状腺刺激ホルモン受容体、トランスフェリン、トリオースリン酸イソメラーゼ、チューブリン、腫瘍壊死アルファ、トポイソメラーゼ、Ｕ１−ｄｎＲＮＰ  ６８／７０ｋＤａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ａ、Ｕ１−ｓｎＲＮＰ  Ｃ、Ｕ−ｓｎＲＮＰ  Ｂ／Ｂ’、ユビキチン、血管内皮増殖因子、ビメンチンまたはビトロネクチンである、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ビオチン化感染性疾患抗原である捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートして、固相複合体を形成することと、
前記固相複合体を洗浄して、過剰な捕捉試薬を除去することと、
前記固相複合体を血清試料とインキュベートして、免疫複合体を形成することと、
前記免疫複合体を洗浄して、非結合試料を除去することと、
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートして、免疫コンジュゲート複合体を作製することと、
前記免疫コンジュゲート複合体を洗浄して、非結合コンジュゲートを除去することと、
定量化可能な応答を生成することができる基質を導入することと、
前記基質から生成された前記応答を較正することと、
を含む感染性疾患の自動診断アッセイを行うための定量的方法。
【請求項５】
前記固相複合体を前記血清試料とインキュベートする工程は、前記血清試料中に存在する感染性因子特異的ヒトＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡをビオチン化捕捉試薬に結合させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記感染性疾患抗原は、細菌、ウイルス、ウイロイド、プリオン、線虫、寄生虫、および真菌から選択される感染性因子に由来する、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉試薬は、多数の抗原から構成される感染性因子抽出物のビオチン化に由来する、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記感染性疾患抗原は、タンパク質、糖タンパク質、核酸、酵素、脂質、リポサッカリド、抗体またはそれらの組み合わせである、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記捕捉試薬は、精製されたタンパク質、酵素、抗体および感染性因子抽出物から選択される複数のビオチン化捕捉試薬のアマルガムである、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ストレプトアビジン被覆培地は、ユニバーサル蛍光標識磁性微粒子を含む、
ことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の洗浄工程は、反応キュベットの閉鎖領域内で洗浄される前記複合体を磁気的に引き離すことによって前記複合体を洗浄することを含む、
ことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。
【請求項１２】
捕獲試薬をストレプトアビジン被覆培地とインキュベートする工程は、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む反応希釈剤によって懸濁液中に保持された捕捉試薬をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫複合体をコンジュゲートとインキュベートする工程は、公称濃度のポリエチレングリコールを含むコンジュゲート希釈剤によって懸濁液中に保持された免疫複合体をインキュベートすることを含む、
ことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。
【請求項１４】
非結合試料を除去するために前記免疫複合体を洗浄する際に、間接標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用する工程をさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光シグナルおよび化学発光シグナルの両方が定量化される光学ボックスに前記基質および前記免疫コンジュゲート複合体を移すこと、および、
定量化された前記化学発光シグナルを調整するために初期の蛍光対最終の蛍光の比を使用して、報告された値を計算すること、
によりビーズ保持のための定量可能な前記応答を調整する工程をさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１６】
前記光学ボックス内の蛍光を測定して、ビーズ保持を決定すること、および、
前記光学ボックス内の発光を測定して、生成された相対光ユニット信号を検出すること、
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
蛍光測定値および発光測定値をアルゴリズムに入力して、ビーズ保持調整相対光ユニット信号を生成することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生成された前記ビーズ保持調整相対光ユニット信号を、較正曲線相対光ユニット信号と比較することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
2018510354.tif 000007