(57)【要約】  本発明は、肝毒性および脂肪性肝疾患の処置に有効な化合物およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)
【化１】
2018537517.tif 000045
〔式中、
Ｌは飽和または不飽和脂肪族基であり；
Ｒは水素、ポリオール基および(Ｇ)ｐのサッカライド基からなる群から選択され、ここで、Ｇは単糖残基であり、ｐは１〜１００の整数であり、(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の少なくとも１個はハロゲン原子により置換されており；
ｑは２〜４の整数であり、Ｒの各々は同一または異なる。〕
により表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｌが１〜４０炭素原子を有するアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｌが分枝鎖アルキル基、ベンゼン環で置換された直鎖アルキル基、ベンゼン環で置換された分枝鎖アルキル基、直鎖脂肪族基で置換されたベンゼニル基および分枝鎖脂肪族基で置換されたベンゼニル基からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ポリオール基が直鎖または環状、置換または非置換である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
単糖残基がヘキソースである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式(II)
Ｒ１−Ｏ−Ｘ−(ＣＨ２)ｍ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２  式(II)
〔式中、
ＸはＣ＝Ｏであり；
Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、水素、ポリオール基および(Ｇ)ｐのサッカライド基からなる群から選択され、ここで、Ｇは単糖残基であり、ｐは１〜１００の整数であり、(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の少なくとも１個はハロゲン原子により置換されており、Ｒ１が水素であるならば、Ｒ２は水素ではなく；
ｍは１〜４０の整数である、に記載の化合物。〕
により表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
ポリオール基が−ＣＨ(ＣＨＯＨ)ｎＣＨ２ＯＨであり、ここで、ｎが１〜１８の整数である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の２以上がハロゲン原子により置換されている、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
単糖残基がヘキソースである、請求項６に記載の化合物。
【請求項１０】
ヘキソースがアルドヘキソースおよびケトヘキソースからなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
サッカライド基Ｒ１またはＲ２が−Ｇ１−Ｏ−Ｇ２により表され、ここで、Ｇ１およびＧ２は同一または異なり、アルドヘキソースおよびケトヘキソースからなる群から選択され、Ｇ１におけるヒドロキシル基の少なくとも１個またはＧ２におけるヒドロキシル基の少なくとも１個がハロゲン原子により置換されている、請求項６に記載の化合物。
【請求項１２】
ハロゲン原子が塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ハロゲン原子が塩素である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｇ１がグルコースであり、ここで、ヒドロキシル基の１個が塩素で置換されており、Ｇ２はフルクトースであり、ここで、ヒドロキシル基の２個が塩素で置換されている、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１またはＲ２が式(Ｉａ)
【化２】
2018537517.tif 000046
により表される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
ｍおよびｎが４である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１７】
式１
【化３】
2018537517.tif 000047
の((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,５Ｒ,６Ｒ)−６−(((２Ｒ,５Ｒ)−２,５−ビス(クロロメチル)−３,４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル)オキシ)−３−クロロ−４,５−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル)メチル((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ)−２,３,４,５,６−ペンタヒドロキシヘキシル)アジペートからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
式２
【化４】
2018537517.tif 000048
のＣ６−マンニトールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
式Ｃ
【化５】
2018537517.tif 000049
〔式中、Ｐｈはフェニルであり、Ｂｎはベンジルである。〕
により表される、化合物。
【請求項２０】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項２１】
対象に有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、処置を必要とする対象における疾患または状態を予防または処置する方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、
(ｉ)ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(Ｔｗｅｅｎ  ２０)、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム二水和物、Ｂｒｉｊ  ３５、サッカリン、マンニトール、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ４０、スクラロース、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ１００、クロスカルメロースナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、メントール、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化デンプン、Ｄｅｘｔｒａｔｅｓ  ＮＦ水和、クエン酸、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ａｅｒｏｓｉｌ  ２００、Ｍｙｒｊ  ５２、ソルビン酸、レモン油、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、アセスルファムカリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース一水和物、マルトデキストリン、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｂｒｉｊ  ７６、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ４０００、ＰＥＧ  ８０００、Ｓｐａｎ  ６０、安息香酸ナトリウム、ヒドロキシエチルメチルセルロース、メチルセルロース、Ｓｐａｎ  ８０、シクラミン酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、鉄朱、グリセリンモノステアレート、ＣｏポビドンＫ２８、デンプンアセテート、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ３０、ＰＥＧ  ２０００およびＮ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第一活性剤；
(ii)ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、鉄朱、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリン、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンペロール、ウルソール酸、シリビニン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペレチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クェルシトリン、バイカレインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第二活性剤；および
(ｉ)および(ii)の任意の組み合わせ
からなる群から選択される１以上の付加的薬剤と組み合わせて投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１以上の付加的薬剤がリン酸二カルシウム二水和物、メントール、マンニトール、スクラロース、Ｎ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１以上の付加的薬剤が(１)サッカリンとマンニトールの組み合わせ、(２)メントールとマンニトールの組み合わせ、(３)スクラロースとマンニトールの組み合わせ、(４)エリオジクチオールとマンニトールの組み合わせ、(５)エリオジクチオールとスクラロースの組み合わせ、(６)メントール、マンニトールおよびエリオジクチオールの組み合わせおよび(７)スクラロース、マンニトールおよびエリオジクチオールの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩および１以上の付加的薬剤が同時にまたは逐次的に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
対象に有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるチトクロムＰ４５０活性増加またはフリーラジカルレベル上昇により特徴付けられる疾患または状態を予防または処置する方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、請求項２０に定義した付加的薬剤の１以上と組み合わせて投与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象に有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、臓器傷害を予防または処置する方法。
【請求項２９】
臓器傷害が肝臓または腎臓においてである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
臓器傷害が治療剤、ＣＣｌ４または脂質が原因である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
治療剤がアセトアミノフェンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、請求項２０に定義した付加的薬剤の１以上と組み合わせて投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
対象に有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、処置を必要とする対象における肝毒性を予防または処置する方法。
【請求項３４】
肝毒性が治療剤、ＣＣｌ４または脂質が原因である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
治療剤がアセトアミノフェンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、請求項２０に定義した付加的薬剤の１以上と組み合わせて投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
対象に有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、脂肪肝の予防または処置、肝機能保護または脂肪肝または他の関連障害が原因の肝疾患改善の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、請求項２０に定義した付加的薬剤の１以上と組み合わせて投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
チトクロムＰ４５０活性増加またはフリーラジカルレベル上昇により特徴付けられる疾患または状態の予防または処置用医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項４０】
臓器傷害の予防または処置用医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項４１】
肝毒性の予防または処置用医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項４２】
脂肪肝の予防または処置、肝機能保護または脂肪肝または他の関連障害が原因の肝疾患改善のための医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年９月２４日出願の米国仮出願６２／２２２,９５９号、２０１５年１１月１９日出願の米国仮出願６２／２５７,６９７号および２０１６年３月３１出願の特許協力条約出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７８０３９号に基づく優先権を主張し、これらの内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０００２】
技術分野
本発明は、肝毒性および脂肪性肝疾患の処置に有効な化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
臓器における傷害は、過量で投与されたとき、しばしば臓器、特に肝臓または腎臓の傷害をもたらす治療のような毒により引き起こされ得る。アセトアミノフェン(Panadolとしても知られる)は、パラセタモールまたはＮ−アセチル−パラ−アミノフェノール(ＡＰＡＰ)とも称され、市場で最も広く使用される鎮痛および解熱である。毎年、多くのＡＰＡＰの不適切な使用による薬物中毒または自殺が報告され、ＡＰＡＰが原因の肝損傷は、重篤な疾患および死亡の主因である。アルコールまたは四塩化炭素(ＣＣｌ４)のような有機溶媒も肝毒性を引き起こし得る。多数の臨床試験が、ＡＰＡＰにより誘発される肝毒性が予防可能であり、早期診断と共に解毒薬Ｎ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)のリアルタイム投与が、肝毒性発症を防止できることを示している。
【０００４】
アセトアミノフェン過量の早期発見は、最良の予後が、解毒薬が中毒後８時間以内に与えられたならば達成され得るため、必要である。薬物中毒の初期徴候は不快感、悪心および嘔吐を含む。しかしながら、アセトアミノフェンの血中濃度が中毒レベルであり、肝機能が明らかに異常であっても、初期段階(ステージ１)で中毒の徴候を示さない患者がいるかもしれない。腹痛、永続性嘔吐、黄疸、右上腹部痛のような肝毒性の徴候は、通常相当量のアセトアミノフェン摂取２４〜４８時間後に現れる(ステージ２)。血清アミントランスフェラーゼは、通常投与１６時間後、臨床症状を伴い上昇し始める。ステージ３は、通常投与３〜４日後に生じ、肝損傷ならびに予後は、その時点で十分に予測できる。肝毒性の徴候は、肝機能値増加(ＡＳＴ＞１,０００ＩＵ／Ｌ)を伴う軽度な症状から代謝性アシドーシス、黄疸、高血糖、ＡＳＴ＞１,０００ＩＵ／Ｌ、異常血液凝固および肝臓／脳病変を伴う重度の急性劇症肝炎に進行する。ステージ４は、乏尿腎不全または重度の症例においては死亡を引き起こす。
【０００５】
アセトアミノフェン中毒の一部の患者は、軽度肝損傷しか示さないが、尿細管のＰ−４５０(チトクロムＰ４５０、ＣＹＰ)でのＡＰＡＰの直接代謝により主に引き起こされる重度の腎毒性を伴う。それにもかかわらず、急性腎不全はまた肝腎症候群が急性肝不全により引き起こされ得て、Ｎａ排泄率(ＦｅＮａ)を、一次腎損傷(ＦｅＮａ＞１)と肝腎症候群(ＦｅＮａ＞１)を区別するために使用できる。ＦｅＮａの計算式は、(ナトリウム尿÷クレアチニン尿)÷(ナトリウム血漿÷クレアチニン血漿)×１００である。
【０００６】
血中のアセトアミノフェンピーク濃度は、経口投与１〜２時間後に達成され、相当量が肝臓により排出され、９０％超がグルクロニドおよび硫酸と抱合し、非毒性代謝物を形成し、わずか５％未満がＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４を含む種々のＣＹＰにより排出され、その中で、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ１Ａ２が代謝のための主要酵素である。これらの酵素により産生された代謝物であるＮ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン(ＮＡＰＱＩ)は、極めて活性な親電子物質である。正常条件下、ＮＡＰＱＩは細胞のグルタチオンと即時に反応し、非毒性メルカプチドを形成する。過量のアセトアミノフェンは、グルタチオン消費速度をその合成速度より大きくし、細胞のグルタチオンレベルが正常範囲の３０％より低くなったとき、ＮＡＰＱＩは、システインを含む大型分子または核酸と結合し、肝損傷を起こす。組織化学染色から、ＮＡＰＱＩは、肝細胞壊死が生じる前、小葉中心領域において、システインのチオール基と結合し、共有結合を形成する。
【０００７】
肝疾患、アルコール耽溺の患者またはカルバマゼピン、エタノール、イソニアジド、フェノバルビタール(他のバルビツレートでもあり得る)、フェニトイン、スルフィンピラゾン、スルホニル尿素、リファンピンおよびプリミドンのようなＰ４５０の活性を誘発し得る薬物を摂取している患者は、ＡＰＡＰが原因の重度の肝毒性を発症する感受性群であり、患者が成人呼吸窮迫症候群、脳浮腫、制御できない出血、感染または多臓器機能障害(ＭＯＤＳ)のような合併症も発症したならば、容易に死亡し得る。アルコールを例に取ると、アルコールは主に肝臓のＣＹＰ２Ｅ１により排出され、そのＡＰＡＰ中毒の機構は３段階に分かれる：第一段階で、アルコールはＣＹＰ２Ｅ１に対する受容体を肝臓においてＡＰＡＰと競合し、ＮＡＰＱＩの濃度はこの段階の間に低下し、第二段階で、アルコールはＣＹＰ２Ｅ１の半減期を７時間から３７時間に延長し、これは肝臓におけるＣＹＰ２Ｅ１のレベルを増加させ、ＮＡＰＱ１の濃度はこの段階の間にゆっくり上昇し、第三段階で、アルコール離脱中、さらなるＣＹＰ２Ｅ１がアセトアミノフェン排出のために肝臓で見られ、結果的にアセトアミノフェンの毒性代謝物が顕著に増加し、肝損傷に至る。最近の研究では、マウスにおいて、ジアリルスルフィドが、アセトアミノフェンが原因の肝毒性を効率的に予防できることが示されており、さらにジアリルスルフィドがＣＹＰ２Ｅ１の活性を阻害できることも示されている。アセトアミノフェンにより誘発される肝毒性に対するジアリルスルフィドの保護機構は、アセトアミノフェンからの中間体ＮＡＰＱＩの産生の阻害によると推測されている。先の試験は、肝細胞における還元型グルタチオンの消費阻害により、ＮＡＰＱＩが原因の酸化活性化、ミトコンドリア機能不全およびＤＮＡ損傷が低減され、その後アセトアミノフェンにより誘発される肝損傷が最小化され得ることを示唆している。例えば、サンシチニンジン(Panax notoginseng)、アデノシンおよびその誘導体アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸およびアデノシン三リン酸がこの保護機構によりアセトアミノフェンにより誘発される肝損傷を予防できる。
【０００８】
脂肪肝は、肝損傷に至る他の因子であると考えられる。正常な状況下、脂肪は、肝臓の３重量％を構成する。臨床的に、“脂肪性肝疾患(ＦＬＤ)”は、肝臓の５重量％を超える肝臓内の脂肪または肝臓組織切片における１０％を超える肝細胞が小胞性脂肪変化を示すことを意味する。疾患の原因により、脂肪肝はアルコール性脂肪性肝疾患(ＡＦＬＤ)、非アルコール性脂肪性肝疾患(ＮＡＦＬＤ)または薬物のような他の因子由来の他の脂肪性肝疾患に分けることができる。脂肪性肝疾患は、脂肪変態または脂肪肝、脂肪性肝炎などの出現により、病理学的に特徴付けられる。脂肪肝に罹患している肝細胞のパーセンテージから、脂肪肝は軽度(＜３３％)、中程度(３３〜６６％)および重度(＞６６％)に分類される。以前は、脂肪肝は良性および可逆性状態と考えられ、故に、あまり重大に受け取られていなかったが、最近の試験で、それが重度の肝線維症および硬変および肝臓癌にいたることが判明している。肥満人口が増えるに連れ、ＦＬＤの有病率も増加する。
【０００９】
欧米諸国での肝疾患の主原因は常習的な過度の飲酒であり、それ故に、肝疾患の大部分はアルコール病変により引き起こされる。しかし最近１５〜２０年で、ＮＡＦＬＤは欧米諸国で肝機能不全について考慮すべき疾患の第一原因となってきている。Thalerは、１９６２年にＮＡＦＬＤについて記載している。１９８０年に、Ludwigが、糖尿病および高脂血症を有する肥満女性患者群から彼が発見した随伴するＮＡＦＬＤから“非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)”を提案した。その後、１９８６年に、Schaffnerは、ＮＡＳＨがＮＡＦＬＤの経過における線維症誘導の機構において、重要な役割を有することを再び強調した。１９９８年まで、Dayは、ＮＡＳＨを有する患者の１５〜５０％が種々の程度の線維症誘導に罹患していることを発見し、従って臨床医は、ＮＡＦＬＤに注意を払い始めた。今日、ＡＦＬＤに加えて、ＮＡＳＨは、臨床業務においてＮＡＦＬＤの自然の進行における単なる１ステージではない。ＮＡＳＨの存在により、ＮＡＦＬＤはもはや良性肝疾患とは考えられていない。
【００１０】
ＮＡＦＬＤの機構に関し、英国のDayおよびJamesは、多数の臨床研究および動物実験に基づき、２ヒット仮説を提案した。脂肪肝は、第一ヒットにより生じ、脂肪性肝炎は第二ヒットにより生じる。第一ヒットは、肥満、高脂血症などが原因の肝臓における脂肪の過度の蓄積により促される。第二ヒットは、酸化的ストレスおよびミトコンドリアにおける活性酸素種(ＲＯＳ)の影響により、肝細胞膜の脂質過酸化、元の炎症性サイトカインおよびフリーラジカルの遊離および星状細胞活性化による線維症をもたらし、肝細胞壊死に至る。ＮＡＳＨの機構は、肝細胞におけるトリグリセリド過酸化、酸化的ストレス、ＲＯＳ応答、脂質過酸化増加または、一連の自己免疫性相互作用に至るサイトカインおよび肝臓酵素増加を含む。
【００１１】
脂肪肝の原因は、大部分、肥満および脂肪肝に至る、体内で蓄積される脂肪に変換される過剰のカロリーである過度の動物脂肪、タンパク質、炭水化物の長期の摂取に関連する。脂肪肝の患者は、正常血中ＧＯＴ／ＧＰＴ値を有し得る。それ故に、脂肪肝の正確な診断は腹部超音波を使用すべきであり、これは、現在９７％を超える精度を提供する。
【００１２】
現在、ＦＬＤについて特異的治療効果を提供する理想的薬物はなく、その処置ガイドラインは、薬物を使用する潜在的リスク因子の改善または慢性疾患の進行制御を目的とする。脂肪肝の原因に応じた対症処置の適用が推奨される。例えば、過体重が原因の脂肪肝に罹患する者は、適度に減量すべきである。アルコール性脂肪肝を有する者は誰でも、状態改善のために飲酒を止め、バランスの良い食事を食べる必要がある。長期接触により肝臓を損傷させ、脂肪性肝疾患に至る化学物質または薬物は、即時に使用停止すべきである。Ｃ型肝炎、高脂質血症などのような疾患が原因の脂肪肝は、Ｃ型肝炎処置または血中脂質管理のような元の疾患の処置により処置すべきである。しかしながら、過度のトリグリセリドが個人的に身体的因子によるならば、減量による脂肪性肝疾患改善は難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、血清トリグリセリドおよびコレステロールを下げるために一般に臨床で使用される現在の薬物は、しばしば副作用、例えば、肝毒性、筋痛、筋炎、横紋筋融解症のような筋障害などが不随する。脂質低下薬物に関して、筋肉毒性は最も顕著な副作用である。特に、スタチンが、筋肉毒性の発生率が最高であり、フィブリン酸がそれに続く。さらに、脂質低下薬物は、“脂肪駆動”効果を有し、これは血中脂質を肝臓に“駆動”し、そこで脂肪蓄積は既に存在し、脂質流入は処理が困難であり、肝臓における脂肪の過度の蓄積に至り、脂肪肝を悪化させる。脂質低下薬物は、ＦＬＤの処置に適さないことが判明している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要約
ある態様において、本発明は、新規化合物またはその薬学的に許容される塩を提供し、その構造は、次の式(Ｉ)により示される。
【化１】
2018537517.tif 000002
〔式中、
Ｌは飽和または不飽和脂肪族基であり；
Ｒは水素、ポリオール基および(Ｇ)ｐのサッカライド基からなる群から選択され、ここで、Ｇは単糖残基であり、ｐは１〜１００の整数であり、(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の少なくとも１個はハロゲン原子により置換されており；
Ｑは２〜４の整数であり、Ｒの各々は同一または異なる。〕
【００１５】
ある実施態様において、本発明の化合物は、次の式(II)
Ｒ１−Ｏ−Ｘ−(ＣＨ２)ｍ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２  式(II)
〔式中、
ＸはＣ＝Ｏであり；
Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、水素、ポリオール基および(Ｇ)ｐのサッカライド基からなる群から選択され、ここで、Ｇは単糖残基であり、ｐは１〜１００の整数であり、(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の少なくとも１個はハロゲン原子により置換されており、Ｒ１が水素であるならば、Ｒ２は水素ではなく；
ｍは１〜４０の整数である。〕
により表される。
【００１６】
他の態様において、本発明は、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１個を薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに他の態様において、本発明は、有効量のここに記載する化合物の少なくとも１個またはその薬学的に許容される塩を処置を必要とする対象に投与することによる、処置法を提供する。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象におけるチトクロムＰ４５０活性増加またはフリーラジカルレベル上昇により特徴付けられる疾患または状態の予防または処置のために提供される。
【００１９】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象における臓器傷害の予防または処置のために提供される。
【００２０】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象における肝毒性の予防または処置のために提供される。
【００２１】
ある実施態様において、本発明の方法は、脂肪肝予防または処置、肝機能保護または脂肪肝または他の関連障害が原因の肝疾患改善のために提供される。
【００２２】
さらに他の態様において、本発明は、医薬製造のための、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。特に、医薬は、(ｉ)チトクロムＰ４５０活性増加またはフリーラジカルレベル上昇により特徴付けられる疾患または状態、(ii)臓器傷害および／または(iii)肝毒性の予防または処置および／または(iv)脂肪肝の予防または処置、肝機能保護または脂肪肝または他の関連障害が原因の肝疾患改善に有用である。
【００２３】
本発明の１以上の実施態様の詳細は、下に示す。本発明の他の特性および利点は、いくつかの実施態様を詳述する次の詳細な記載およびまた添付する特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
前記要約ならびに続く本発明の詳細な記載は、添付する図面と組み合わせて読んだとき、よりよく理解される。本発明を説明する目的で、現在好ましい実施態様を図面において示す。しかしながら、本発明は示す厳密な配置および装置に限定されないことは理解されるべきである。
【００２５】
図面には次のことが記載される。
【００２６】
【図１】血中でのプロドラッグ残存パーセンテージまたはその関連代謝物形成を示す(インビトロ)。
【００２７】
【図２】ＳＤラットにおけるプロドラッグ経口投与後のプロドラッグおよびスクラロースの血漿濃度対時間プロファイルを示す。
【００２８】
【図３】ＳＤラットにおけるプロドラッグ経口投与後のマンニトールの血漿濃度対時間プロファイルを示す。
【００２９】
【図４】動物における肝臓組織のＨ＆Ｅ染色結果を示す。(Ａ)正常対照、(Ｂ)ＡＰＡＰ誘発肝傷害の対照群、(Ｃ)ＮＡＣで処置の陽性対照群、(Ｄ)マンニトール(１.６７mg／kg)で処置の実験群、(Ｅ)スクラロース(１.６７mg／kg)で処置の実験群、(Ｆ)マンニトール(２.５１mg／kg)＋スクラロース(２.５１mg／kg)で処置の実験群、(Ｇ)マンニトール(３.３４mg／kg)＋スクラロース(３.３４mg／kg)で処置の実験群および(Ｈ)ＮＡＣおよびマンニトール(３.３４mg／kg)とスクラロース(３.３４mg／kg)の組み合わせで処置の実験群。
【００３０】
【図５】脂肪肝を誘発し、その後、群により異なる試験化合物で４週間処置したマウスから採った肝臓組織切片を示す。
【００３１】
【図６】本発明の化合物の合成法の一般的スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な記載
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００３３】
ここで使用する単数表現は、文法の対象物が１または１を超える(すなわち、少なくとも１)ことを意味する。例として、“要素”は１要素または１を超える要素を意味する。
【００３４】
Ｉ. 化合物
ある態様において、本発明は新規化合物またはその薬学的に許容される塩を提供し、その構造は、次の式(Ｉ)により示される。
【化２】
2018537517.tif 000003
〔式中、
Ｌは飽和または不飽和脂肪族基であり；
Ｒは水素、ポリオール基および(Ｇ)ｐのサッカライド基からなる群から選択され、ここで、Ｇは単糖残基であり、ｐは１〜１００の整数であり、(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の少なくとも１個はハロゲン原子により置換されており；
Ｑは２〜４の整数であり、Ｒの各々は同一または異なる。〕
【００３５】
ここで使用する用語“脂肪族”または“脂肪族基”は、直鎖(すなわち、非分枝)、分枝または環状(縮合、架橋およびスピロ縮合多環式を含む)であってよく、完全飽和であってよくまたは１以上の不飽和単位を含んでよいが、芳香族ではない、炭化水素部分を意味する。一般に、脂肪族基は、１〜４０炭素原子を含む。ある実施態様において、脂肪族基は、１〜２０炭素原子または１〜１２炭素原子、１〜８炭素原子または１〜４炭素原子を含む。ある実施態様において、脂肪族基は、３〜２０炭素原子または３〜１２炭素原子、３〜８炭素原子または３〜４炭素原子を含む。適当な脂肪族基は、直鎖または分枝の、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基および(シクロアルキル)アルキル、(シクロアルケニル)アルキルまたは(シクロアルキル)アルケニルのようなこれらのハイブリッドを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
ある実施態様において、式(Ｉ)におけるＬ基は、(ａ)直鎖アルキル基、(ｂ)分枝アルキル基、(ｃ)ベンゼン環で置換された直鎖アルキル基、(ｄ)ベンゼン環で置換された分枝アルキル基、(ｅ)ベンゼン環が直鎖脂肪族基を含むベンゼニル基および(ｆ)ベンゼン環が分枝鎖脂肪族基を含むベンゼニル基から選択される。
【００３７】
ここで使用する用語“ポリオール基”は、分子あたり複数ヒドロキシル基(２以上のヒドロキシル基)を含むアルコールを意味する。特に、ポリオール基は、得られた複合体が水可溶性であり、薬学的に許容される限り、直鎖でも環状でも、置換でも非置換でもまたはその混合物でもよい。
【００３８】
ある実施態様において、ポリオール基は、２以上のヒドロキシル基を含むＣ３〜２４ポリオール、特に、Ｃ３〜２０ポリオール、より具体的に、Ｃ３〜１２ポリオールまたはＣ３〜１２ポリオールである。
【００３９】
より具体的な実施態様において、ポリオール基は−ＣＨ(ＣＨＯＨ)ｎＣＨ２ＯＨにより表され、ここで、ｎは１〜２２、１〜１８、１〜１０または１〜６である。ある特定の例において、ｎは４である。
【００４０】
好ましいポリオールは、糖アルコールである。ポリオールの例は、３−炭素ポリオール(例えばグリセロール、エリスリトールおよびトレイトール)；５−炭素ポリオール(例えばアラビトール、キシリトールおよびリビトール)；６−炭素ポリオール(例えばマンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトールおよびイノシトール)；１２−炭素ポリオール(例えばボレミトール、イソマルト、マルチトールおよびラクチトール)；１８−炭素ポリオール(例えばマルトトリイトール)；および２４−炭素ポリオール(マルトテトライトール)を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
式(Ｉ)において、Ｇは単糖残基を表す。ここで使用する単糖は、好ましくは化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有する６炭素単糖(すなわちヘキソース)である。ヘキソースは、Ｄ配置、Ｌ配置またはこれらの組み合わせであり得る。ヘキソースは、一般に官能基により分類される。例えば、アルドヘキソースは、１位にアルデヒドを有し、例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースであり、ケトヘキソースは２位にケトンを有し、例えば、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースである。ヘキソースはまた６ヒドロキシル基も含み、ヘキソースにおけるアルデヒドまたはケトン官能基は隣接ヒドロキシル官能基と反応して、それぞれ分子内ヘミアセタールまたはヘミケタールを形成し得る。得られた環状糖が５員環であるならば、それはフラノースである。得られた環状糖が６員環であるならば、それはピラノースである。環は自然に開環および閉環し、カルボニル基と隣接炭素原子の間の結合に関する回転が生じることを可能にし、２つの異なる配置(αおよびβ)を生じる。ヘキソースはＳ配置またはＲ配置であり得る。
【００４２】
本発明により、少なくとも式(Ｉ)において１以上の単糖残基におけるヒドロキシル基の１個はハロゲン原子により置換される。ハロゲン原子の例は、塩素、臭素およびヨウ素を含む。具体的に、ハロゲン原子は塩素である。
【００４３】
ここで使用する用語“Ｓ”または“Ｒ”は、Ｒ／Ｓシステムと称される、参照分子を含むことなく、その配置により光学異性体を名付ける方法である。各キラル中心を、そのリガンドが原子番号に基づき、カーン・インゴルド・プレローグ順位則に従い優先度を割り当てられるシステムによりＲまたはＳとラベルする。このシステムは、分子における各キラル中心をラベルする(そしてまたキラル中心に関与しないキラル分子への拡張も有する)。化合物が２キラル中心を有するならば、例えば、(Ｓ,Ｓ)異性体対(Ｓ,Ｒ)異性体と標識できる。
【００４４】
ここで使用する用語“薬学的に許容される塩”は、酸付加塩を含む。“薬学的に許容される酸付加塩”は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸および酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸などのような有機酸から形成される、遊離塩基の生物学的有効性および性質を保持する塩をいう。
【００４５】
ある実施態様において、式(Ｉ)において、ｑは２、３または４であり、Ｒ基の少なくとも１個は、他のＲの１個と異なる。
【００４６】
ある実施態様において、式(Ｉ)において、ｑは２である。
【００４７】
このような実施態様において、本発明の化合物は、次のとおり式(II)またはその薬学的に許容される塩により示される。
Ｒ１−Ｏ−Ｘ−(ＣＨ２)ｍ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２  式(II)
〔式中、
ＸはＣ＝Ｏであり；
Ｒ１およびＲ２は同一または異なり、水素、ポリオール基および(Ｇ)ｐのサッカライド基からなる群から選択され、ここで、Ｇは単糖残基であり、ｐは１〜１００の整数であり、(Ｇ)ｐにおけるヒドロキシル基の少なくとも１個はハロゲン原子により置換されており、Ｒ１が水素であるならば、Ｒ２は水素ではなく；
ｍは１〜４０の整数である。〕
【００４８】
ある実施態様において、式(II)において、Ｒ１はポリオール基であり、Ｒ２は(Ｇ)ｐのサッカライド基である。このような場合、式(II)の化合物は、エステル結合を介してリンカーにより糖部分に連結したポリオール部分のコンジュゲートと見なされる。特に、リンカーは−Ｏ−Ｘ−(ＣＨ２)ｍ−Ｘ−Ｏ−(式(Ｌ))により表され、ここで、ＸはＣ＝Ｏであり、ｍは１〜４０、１〜２０、１〜１２、１〜８または１〜４であり、より具体的には、ｍは３〜２０、３〜１２、３〜８または３〜４である。ある特定の例において、ｍは４である。
【００４９】
ある実施態様において、ｐは２である。サッカライド基は−Ｇ１−Ｏ−Ｇ２により合わされ、ここで、Ｇ１およびＧ２は同一または異なり、アルドヘキソースおよびケトヘキソースからなる群から選択され、Ｇ１におけるヒドロキシル基の少なくとも１個またはＧ２におけるヒドロキシル基の少なくとも１個は、ハロゲン原子により置換されている。
【００５０】
ある実施態様において、Ｇ１はグルコースであり、ここで、ヒドロキシル基の１個が塩素で置換されており、Ｇ２はフルクトースであり、ここで、ヒドロキシル基の２個が塩素で置換されている。
【００５１】
ある実施態様において、サッカライド基は、式(Ｉａ)
【化３】
2018537517.tif 000004
により表される。
【００５２】
本発明の化合物のいくつかの例は、次のとおりである。
((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,５Ｒ,６Ｒ)−６−(((２Ｒ,５Ｒ)−２,５−ビス(クロロメチル)−３,４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル)オキシ)−３−クロロ−４,５−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル)メチル((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ)−２,３,４,５,６−ペンタヒドロキシヘキシル)アジペート
【化４】
2018537517.tif 000005
および式２
【化５】
2018537517.tif 000006
のＣ６−マンニトール。
【００５３】
他の態様において、本発明は、次の式Ｃの中間体を提供する。
【化６】
2018537517.tif 000007
〔式中、Ｐｈはフェニルであり、Ｂｎはベンジルである。〕
【００５４】
式(Ｉ)の化合物は、例えば図６の一般的スキームに示す方法により、化学合成され得る。
【００５５】
特に、アルコールとエステル化するための１以上の−ＣＯＯＨ基を提供できるリンカーが提供される。ステップ１において、第一−ＣＯＯＨ基(その他は、利用可能であるならば保護される)を提供するリンカーは、第一遊離ヒドロキシル基(その他は、利用可能であるならば保護される)を有するＲと反応され、第一エステル化が進行し、ｑが１である式(Ｉ)の化合物を得る。ステップ２において、第二−ＣＯＯＨ基(その他は、利用可能であるならば保護される)を提供するリンカーは、第二遊離ヒドロキシル基(その他は、利用可能であるならば保護される)を有するＲと反応され、第二エステル化が進行し、ｑが２である式(Ｉ)の化合物を得る。ステップ３において、第三−ＣＯＯＨ基(その他は、利用可能であるならば保護される)を提供するリンカーは、第三遊離ヒドロキシル基(その他は、利用可能であるならば保護される)を有するＲと反応され、第三エステル化が進行し、ｑが３である式(Ｉ)の化合物を得る。ステップ４において、第四−ＣＯＯＨ基(その他は、利用可能であるならば保護される)を提供するリンカーは、第四遊離ヒドロキシル基(その他は、利用可能であるならば保護される)と反応され、第三エステル化が進行し、ｑが４であるである式(Ｉ)の化合物を得る。
【００５６】
ある実施態様において、エステル化を実施するためのリンカーは、式(Ｌａ)
Ｐ１−Ｏ−Ｘ−(ＣＨ２)ｍ−Ｘ−Ｏ−Ｐ２  式(Ｌａ)
〔Ｘおよびｍは上に定義したとおりであり、Ｐ１およびＰ２は同一または異なり、保護基またはＨである。〕
により表される。
【００５７】
ある実施態様において、エステル化を実施するためのリンカーは、式(Ｌｂ)
【化７】
2018537517.tif 000008
により表される。
【００５８】
ここで使用する“保護基”は、官能基が望ましくない方法で反応することを保護する、官能部分に結合した(例えばヒドロキシル基の酸素またはアミノ基の窒素について、水素を置き換える)化学基である。保護基は、例えば、ｔ−ブチル基、シクロアルキル基(例えば、シクロヘキシル基)、アリール基(例えば、２,４−ジニトロフェニル基)、アラルキル基(例えば、ベンジル基、２,６−ジクロロベンジル基、３−ブロモベンジル基、２−ニトロベンジル基、４−ジメチルカルバモイルベンジル基およびトリフェニルメチル基)、テトラヒドロピラニル基、アシル基、アルコキシカルボニル基(例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基)、アラルキルオキシカルボニル基(例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基)、ジアルキルホスフィノチオイル基(例えば、ジメチルホスフィノチオイル基)およびジアリールホスフィノチオイル基(例えば、ジフェニルホスフィノチオイル基)を含む。好ましい保護基はアシル基などを含む。
【００５９】
ある特定の例において、スキーム１を、本発明の化合物の特定の合成法を示す実施例１に提供する。
【００６０】
II. 本発明の化合物の使用
本発明の化合物を、処置法のための医薬として使用できる。一般に、式(Ｉ)の化合物は、投与後、ここに記載するとおり必要に応じて治療効果を提供する代謝物に代謝され得る、プロドラッグである。一例では、式(Ｉ)の化合物は化合物Ｆであり、これは、投与後、マンニトール、スクラロースおよびＣ６−マンニトールに代謝され得て、この全てＰ４５０阻害として作用し、例えば抗肝毒性効果を提供できる。下記実施例参照。
【００６１】
本発明は、処置を必要とする対象に有効量のここに記載する化合物の少なくとも１個またはその薬学的に許容される塩を投与することによる、処置法を提供する。
【００６２】
本発明の化合物は、例えば、Ｐ４５０阻害として有効であることが判明した。
【００６３】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象におけるチトクロムＰ４５０活性増加により特徴付けられる疾患または状態の予防または処置のために提供される。
【００６４】
このような疾患または状態の例を、表Ａに挙げる。
【表１】
2018537517.tif 000009
【００６５】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象における、フリーラジカルレベル上昇により特徴付けられる疾患または状態の予防または処置のために提供される。
【００６６】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象における、臓器傷害の予防または処置のために提供される。
【００６７】
具体例において、臓器傷害は肝臓または腎臓においてである。
具体例において、臓器傷害または肝毒性は、治療剤、ＣＣｌ４または脂質蓄積が原因である。
具体例において、治療はアセトアミノフェンである。
【００６８】
ある実施態様において、本発明の方法は、処置を必要とする対象における、肝毒性の予防または処置のために提供される。
【００６９】
ある実施態様において、本発明の方法は、脂肪肝の予防または処置、肝機能保護または脂肪肝または他の関連障害が原因の肝疾患改善のために提供される。
【００７０】
ここで使用する用語“肝臓脂肪含量”は、対象の肝臓に蓄積される脂肪の含量をいい、トリグリセリド(ＴＧ)およびコレステロールのような広義に定義される脂質を含む。ここで使用する用語“肝臓脂肪含量減少”は、一般に対象における異常肝臓脂肪含量の減少、すなわち異常肝臓脂肪の含量の、より具体的に、異常肝臓脂肪含量の正常レベルまで低減するための減少をいう。例えば、正常な状況下、脂肪は肝臓の３重量％を構成する。肝臓における脂肪が肝臓の５重量％を超えたら、異常脂肪蓄積として定義される(上記肝臓脂肪含量は例示のための相対的パーセンテージであり、民族性および他の因子により変わり得る)。特定の態様において、ここで使用する用語“肝臓脂肪含量減少”は、対象における異常肝臓脂肪の含量が、例えば、肝臓の５重量％以上から、肝臓の３重量％まで減少することを意味する。肝臓脂肪含量は、超音波分析、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)、磁気共鳴分光法(ＭＲＳ)、コンピュータ断層撮影法(ＣＴ)および肝臓生検を含むが、これらに限定されない標準的分析法により評価できる。
【００７１】
ここで使用する用語“肝機能”は、肝臓により行われる１以上の生理学的機能をいう。肝機能は、アラニンアミノ基転移酵素(ＡＬＴ)分析またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素(ＡＳＴ)分析のような多数の従来アッセイにより分析できる。本発明により、ここに記載する化合物は、肝機能改善および肝臓の損傷からの保護を含む、肝機能維持に使用できる。
【００７２】
ここで使用する用語“肝疾患”は、肝機能不全に至る可能性がある、ある因子が原因の肝細胞傷害または損傷をいう。本発明により、ここで提案される化合物を、ある実施態様において脂肪肝が原因の肝疾患改善に使用できる。より具体的に、ここで使用する“肝損傷”は、正常肝臓と比較して、組織学的または生化学的機能不全を有する肝臓をいう。特定の実施態様において、“肝損傷”は、アルコール性または非アルコール性因子、例えば、高脂肪食または肥満または治療または有機溶媒が原因である肝臓病変をいう。特定の実施態様において、“肝損傷”は、脂肪肝、小葉炎症、肝細胞肥大化および肝細胞により産生される小胞性脂肪滴から選択される、１以上の特徴を有する肝臓組織損傷であり得る。特定の実施態様において、“肝損傷”は、アラニンアミノ基転移酵素(ＡＬＴ)またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素(ＡＳＴ)の活性から決定できる、肝臓の生化学的機能不全であり得る。ＡＬＴまたはＡＳＴの活性が高い程、肝臓の生化学的機能の機能不全が重度であることが示される。
【００７３】
ここで使用する用語“肝臓抗酸化活性”は、酸化的ストレスに対する活性または能力をいう。化合物本発明による対象の肝臓抗酸化活性改善は、酸化的ストレス減少または酵素活性または抗酸化システムのメンバーの含量増強を含むことをいうが、これに限定されない。抗酸化システムのメンバーは、グルタチオンペルオキシダーゼ(ＧＰｘ)、グルタチオン(ＧＳＨ)、グルタチオンレダクターゼ(ＧＲｄ)および／またはスーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ)であり得る。
【００７４】
本発明により、ここに記載する化合物は、共通の添加物およびバイオフラボノイドを含み、これは、肝臓脂肪含量減少および関連障害軽減に使用され得る。ここに記載する用語“関連障害”は、脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性硬変およびアルコール性硬変を含むが、これらに限定されない、肝臓脂肪の異常蓄積が原因の障害を含む(ICD-9-CM Diagnosis Codes: 571.8, 571.0, 571.1, 571.2, 571.3, 571.4, 571.5, 571.9)。
【００７５】
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患の症状または状態の予防的手段をいう。予防的手段は、疾患または疾患の症状または状態に罹患した患者としてはまだ診断されていないが、該疾患に感受性であるまたは素因があり得る対象への１以上の活性剤の適用または投与をいう。予防的手段の目的は、疾患または疾患の症状または状態の発生の回避、予防または延期である。
【００７６】
ここで使用する用語“処置”は、疾患または疾患の症状または状態の治療的手段をいう。治療的手段は、疾患または疾患の症状または状態または疾患増悪に罹患している対象への１以上の活性剤の適用または投与をいう。治療的手段の目的は、疾患、疾患の症状または状態、疾患または疾患増悪が原因の身体障害の処置、治癒、鎮静、軽減、改変、矯正、向上、改善または作用である。
【００７７】
ここで使用する“ＣＹＰ２Ｅ１阻害”は、ＣＹＰ２Ｅ１活性を阻害できるあらゆる化合物、物質または材料をいう。ヒトまたはラット肝ミクロソームアッセイのような多数のアッセイが、ＣＹＰ２Ｅ１活性分析のために利用可能である。
【００７８】
ここで使用する本発明による処置を必要とする対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む。非ヒト哺乳動物は、ネコ、イヌなどのようなコンパニオンアニマルおよびウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどのような家畜を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
用語“有効量”などは、薬誘発性副作用低減または１以上の症状または状態または疾患進行防止、改善、軽減、制限または予防のような、対象における所望の治療、予防および／または生物学的効果を達成するのに十分な活性剤の量をいう。実際の有効量は、投与経路および頻度、該医薬を受ける個体の体重および種および投与目的のような種々の理由により変わり得る。当業者は、各症例における用量を、本明細書の開示、確立された方法および自分自身の経験に基づき決定できる。
【００８０】
ここで使用する用語“標準用量”は、米国食品医薬品局を含む医薬社会における権威筋により推奨され、しばしば、通常の業務で使用される治療剤の有効用量をいい。ここで使用する用語“減少用量”は、標準用量より低いが、なお同じ治療剤の実質的に同じ治療効果を維持する、用量をいう。具体的に、本発明により、治療剤の減少用量は、治療剤の標準治療用量の約９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下である。
【００８１】
ある実施態様において、ここで使用する有効量の活性成分を、薬学的に許容される担体と、送達および吸収の目的で適切な形態の医薬組成物に製剤し得る。
【００８２】
ここで使用する“薬学的に許容される”は、担体が組成物中の活性成分と適合性であり、好ましくは該活性成分を安定化でき、処置を受ける個体に安全であることを意味する。該担体は、活性成分の希釈剤、媒体、添加物またはマトリクスであり得る。組成物は、さらに、滑沢剤、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、防腐剤、甘味剤および風味剤を含み得る。本発明の組成物は、患者への投与後、活性成分の急速な、連続的または遅延放出の効果を提供し得る。
【００８３】
本発明により、該組成物の形態は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、パケット剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁液剤、ローション剤、液剤、シロップ剤、軟および硬ゼラチンカプセル剤、坐薬、滅菌注射液剤および包装された粉末剤であり得る。
【００８４】
本発明の組成物は、経口、非経腸(例えば筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内)、経皮、坐薬および鼻腔内方法のような任意の生理学的に許容される経路で送達し得る。非経腸投与に関して、好ましくは無菌水溶液の形を使用し、これは、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースのような他の物質を含み得る。無菌条件下での適切な非経腸組成物の製造は、当業者に周知の標準薬理学的技術により達成でき、他の独創的労務は必要ない。
【００８５】
ある実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、臓器、例えば肝臓または腎臓における傷害の予防または処置に使用でき、これは、過量の治療剤(例えばアセトアミノフェン)またはアルコール、化学剤、生体分子またはこれらの臓器において毒性効果を生じ得る何らかの物質への暴露が原因であり得る。
【００８６】
具体的に、肝臓における傷害は、肝機能または肝臓タンパク質の含量異常に至る、肝細胞または組織の傷害、損傷または喪失を含み得る。ある実施態様において、ここに記載する肝傷害は、症状発症から例えば１２週間未満、特に６週間未満の発症から比較的急な肝傷害を意味する急性肝傷害である。ある実施態様において、急性肝傷害を有する患者は、慢性肝疾患の背景はない。
【００８７】
具体的に、腎臓における傷害は、腎機能異常に至る、腎細胞または組織の傷害、損傷または喪失を含み得る。このような腎傷害は、例えば、糸球体濾過速度低下、尿量減少、血清クレアチニン増加、血清シスタチンＣ増加などにより同定され得る。ある実施態様において、ここに記載する腎傷害は、急激なまたは迅速な、例えば、１４日以内、好ましくは７日以内、より好ましくは７２時間以内およびなおさらに好ましくは４８時間以内の、腎臓濾過機能減少を意味し得る、急性腎傷害である。
【００８８】
ある特定の実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、ＮＡＰＱＩ(Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン)が原因の望ましくない状態の予防または処置が可能である。
【００８９】
それ故に、本発明は、対象におけるＮＡＰＱＩ(Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン)が原因の望ましくない状態の予防または処置用医薬製造のための、式(Ｉ)の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明はまた対象に、望ましくない状態の予防または処置に有効な量で式(Ｉ)の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるＮＡＰＱＩ(Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン)が原因の望ましくない状態を予防または処置する方法も提供する。
【００９０】
III. 本発明の化合物と他の活性剤の組み合わせ使用
本発明の化合物および／またはその代謝物を、例えば、相乗効果を提供するために、１以上の付加的活性剤、特にＰ４５０阻害として作用するおよび／または抗肝毒性活性を提供するものおよび／または抗脂肪肝活性を有するものと組み合わせて投与できる。
【００９１】
Ｐ４５０阻害に作用するある活性剤(“第一活性剤”と称する)は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０８７０４９号(ＵＳＳＮ１４／４４１,３１７、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる)に記載される。特定のこのようなＰ４５０阻害の具体例は、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(Ｔｗｅｅｎ  ２０)、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム二水和物、Ｂｒｉｊ  ３５、サッカリン、マンニトール、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ４０、スクラロース、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ１００、クロスカルメロースナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、メントール、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化デンプン、Ｄｅｘｔｒａｔｅｓ  ＮＦ水和、クエン酸、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ａｅｒｏｓｉｌ  ２００、Ｍｙｒｊ  ５２、ソルビン酸、レモン油、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、アセスルファムカリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース一水和物、マルトデキストリン、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｂｒｉｊ  ７６、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ４０００、ＰＥＧ  ８０００、Ｓｐａｎ  ６０、安息香酸ナトリウム、ヒドロキシエチルメチルセルロース、メチルセルロース、Ｓｐａｎ  ８０、シクラミン酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、鉄朱、グリセリンモノステアレート、ＣｏポビドンＫ２８、デンプンアセテート、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ３０、ＰＥＧ  ２０００およびＮ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
ある実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物と組み合わせて使用する１以上の第一活性剤は、リン酸二カルシウム二水和物、メントール、マンニトール、スクラロース、Ｎ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００９３】
抗脂肪肝活性を有するある活性剤(“第二活性剤”と称する)はＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７８０３９号に記載され、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる。抗脂肪肝活性を有する活性剤の具体例は、(ii)ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、鉄朱、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリン、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンペロール、ウルソール酸、シリビニン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペレチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クェルシトリン、バイカレインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第二活性剤を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
ある実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物と組み合わせて使用する１以上の第二活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、メントール、スクラロース、マンニトール、ソルビトール、サッカリン、グリセリン、安息香酸ナトリウム、鉄朱、アルファ化デンプン、シクラミン酸ナトリウム、ソルビン酸、レモン油、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ポンシリン、イソビテキシン、エリオジクチオール、エルゴステロール、β−ミルセン、ヒペロシド、(＋)−カテキン、ガランギン、モリン、シアドピチシン、ジジミン、ゴスシピン、ルテオリン−７−グルコシド、(＋)−タキシフォリン、トランス桂皮酸、ジオスミン、リナリン、キシリトール、ルテオリン、スウェルチアマリンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００９５】
ある実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物と組み合わせて使用する１以上の第二活性剤は、プエラリン、フロリジン、シネンセチン、(−)−エピガロカテキン、ケンペロール、ウルソール酸、シリビニン、(＋)−リモネン、ヘスペリジン、(−)−エピカテキン−３−ガレート、シリビン、ホルモノネチン、ミリスチン酸エチルエステル、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)、オウゴニン、ポビドンＫ−３０、プロトカテク酸、ウンベリフェロン、ヘスペレチン、ノルジヒドログアイヤレチン酸、ネオヘスペリジン、ナリンギン、(−)−エピカテキン、グリチルリチン、バイカリン、クェルシトリン、バイカレインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００９６】
ある実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物と組み合わせて使用する１以上の第二活性剤は、エリオジクチオール、マンニトール、メントール、スクラロース、サッカリンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００９７】
ある実施態様において、式(Ｉ)の本発明の化合物と組み合わせて使用する１以上の第二活性剤は、(１)サッカリンとマンニトールの組み合わせ、(２)メントールとマンニトールの組み合わせ、(３)スクラロースとマンニトールの組み合わせ、(４)エリオジクチオールとマンニトールの組み合わせ、(５)エリオジクチオールとスクラロースの組み合わせ、(６)メントール、マンニトールおよびエリオジクチオールの組み合わせおよび(７)スクラロース、マンニトールおよびエリオジクチオールの組み合わせからなる群から選択される。
【００９８】
具体的に、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩および１以上の付加的薬剤を同時にまたは逐次的に投与できる。
【００９９】
本発明において、式(Ｉ)の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩がＮＡＰＱＩ(Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン)が原因の望ましくない状態を予防または処置できることがさらに提供される。
【０１００】
特定の実施態様として、本発明は、式(Ｉ)の化合物および／またはその代謝物とＮ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)の組み合わせを提供する。本発明はまた対象にＮＡＣと式(Ｉ)の化合物および／またはその代謝物を組み合わせて投与することを含む、処置を必要とする対象におけるＮ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)を投与する方法も提供する。ある実施態様において、本発明の組み合わせまたは方法は、ＮＡＣが有効である疾患または障害の予防または処置に有効である。ある実施態様において、ＮＡＣにより処置または予防される疾患または障害は、ミオクローヌスてんかん、急性呼吸促迫症候群、重金属中毒、インフルエンザ感染、心疾患、シェーグレン症候群、慢性気管支炎、てんかん(ウンフェルリヒト・ルンドボルグ型)およびＨＩＶ感染からなる群から選択される。
【０１０１】
本発明を、さらに次の実施例により説明し、これは、限定ではなく証明の目的で提供する。
【実施例】
【０１０２】
実施例１:本発明の式１(化合物Ｆ)の化合物の合成
((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,５Ｒ,６Ｒ)−６−(((２Ｒ,５Ｒ)−２,５−ビス(クロロメチル)−３,４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル)オキシ)−３−クロロ−４,５−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル)メチル  ((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ)−２,３,４,５,６−ペンタヒドロキシヘキシル)  アジピン酸エステル(式１)(化合物Ｆ)の合成
式１(化合物Ｆ)の合成について合成戦略をスキーム１に示す。
【化８】
2018537517.tif 000010
ＨＭＤＳ＝ヘキサメチルジシラザン
ＴＭＳＯＴｆ＝トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート
ＴＢＡＦ＝フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＭＳ＝トリメチルシリル
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＭＦ＝Ｎ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＩＢＡＬ＝ジイソブチルアルミニウム
Ｂｎ＝ベンジルエーテル
【０１０３】
一般的方法
特に断らない限り、全ての化学物質は商業的供給源から得て、受領したまま使用した。
生成物のクロマトグラフィー精製は以下のようにして評価した：
【表２】
2018537517.tif 000011
【０１０４】
ＭＳ分析は以下の条件で行った:
質量スペクトロメーターセッティング:
【表３】
2018537517.tif 000012
【０１０５】
Ｂｒｕｋｅｒの標準パルスプログラムを用いる、ＭｅＯＨ−ｄ４(δＨ  ３.３０、δＣ  ４９.０)またはＣＤＣｌ３(δＨ  ７.２４、δＣ  ７７.０)中の、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−５００  ＮＭＲスペクトロメーター；ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ試験において、それぞれΔ＝１秒およびＪ＝１４０,８Hzであり、相関マップはスペクトルにつき５１２×１Ｋデータポイントから成り、それぞれは１６〜６４のトランジェントから成る。
【０１０６】
１.１  マンニトール(化合物(ｉ))から化合物(Ｂ)
１.１.１  マンニトール(化合物(ｉ))から化合物(ｉ)−１
【化９】
2018537517.tif 000013
【０１０７】
Ａｒ雰囲気下、室温で、Ｄ−マンニトール(２５ｇ、０.１３７ｍｏｌ)のＤＭＦ(２５０mL)溶液にベンズアルデヒド(３０mL、０.３４５mmol)を添加した。０℃で混合物に濃硫酸(１０mL)を滴下した。室温まで徐々に昇温した後、混合物を３日間撹拌した。その後混合物を十分に撹拌している氷水(２５０mL)およびｎ−ヘキサン(２００mL)に注いだ。混合物を室温まで昇温した後、沈殿をろ過しｎ−ヘキサンで洗浄した。沈殿をクロロホルム中で懸濁し、十分に撹拌しながら１５分間還流下で加熱した。混合物が室温に達したとき、不溶の沈殿を回収し、ＥｔＯＨから再結晶して所望の生成物を白色固体(９.８６ｇ、２０％)として得た。Ｒｆ＝０.４５(ＥＡ／Ｈｅｘ＝１／１)。
【０１０８】
１.１.２  化合物(ｉ)−１から化合物(ｉ)−２
【化１０】
2018537517.tif 000014
Ａｒ雰囲気下、室温で、１,３,４,６−ジベンジリデン(１０ｇ、２７.９mmol)のＤＭＦ(１００mL)溶液に臭化ベンジル(７.９６mL、６６.９６ｍmmol)を添加した。混合物を０℃に冷却し、その後６０％  ＮａＨ(２.６８ｇ、６６.９６mmol)を数分間かけて添加した。徐々に室温まで昇温した後、混合物を一夜撹拌した。その後、反応物を水(滴下)でクエンチし、ＮａＨＣＯ３(ａｑ)およびジクロロメタンで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をカラムシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物(１０.３９ｇ、６９％)を得た。Ｒｆ＝０.２(ＥＡ／Ｈｅｘ＝１／６)。
【０１０９】
１.１.３  化合物(ｉ)−２から化合物(Ｂ)
【化１１】
2018537517.tif 000015
２,５−ジベンジル−１,３,４,６−ジベンジリデン(１.５ｇ、２.７８mmol)のトルエン(１２.５mL)溶液を−１８℃(氷塩浴)に冷却した。１.２Ｍ  ＤＩＢＡＬ(１８.５mL、２２.３mmol)を滴下添加し、室温まで昇温した。１.５時間後、反応物を０℃に冷却し、その後ＭｅＯＨおよび１５％ＫＯＨ(ａｑ)によりクエンチした。混合物をＤＣＭで抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をカラムシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物(７０９mg、４７％)を得た。Ｒｆ＝０.１(ＥＡ／ＨＥＸ＝１／５)。
【０１１０】
１.２  スクラロース(化合物(ｉｉ))から化合物(Ｄ)
１.２.１  化合物(ｉｉ)から化合物(ｉｉ)−１
【化１２】
2018537517.tif 000016
スクラロース(１ｇ、２.５mmol)のＤＣＭ(１０mL)溶液に、ＨＭＤＳ(２.６mL、１２.５７mmol)およびＴＭＳＯＴｆ(４５μＬ、０.２５mmol)を添加した。反応物を室温で一夜撹拌した。反応物を真空中で濃縮し、綿を通してヘキサンにより洗浄した。濾液を再び真空下で濃縮し、生成物(１.９ｇ、定量的)を定量的に得た。Ｒｆ＝０.９(ＥＡ／ＨＥＸ＝１／８)。
【０１１１】
１.２.２  化合物(ｉｉ)−１から化合物(Ｄ)
【化１３】
2018537517.tif 000017
ペンタＴＭＳスクラロース(５ｇ、６.６mmol)のピリジン(１５０mL)溶液に０.１Ｍ  ピリジン−ＴｓＣｌ溶液(６.６mL)を添加し、フラスコを開放したまま３日間撹拌した。反応物を真空中で濃縮し、カラムシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の化合物(１.４ｇ、３０％)を得た。Ｒｆ＝０.５(ＥＡ／ＨＥＸ＝１／８)。
【０１１２】
１.３  ６−オキソ−６−((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ)−２,３,４−トリス(ベンジルオキシ)−４−(２−フェニル−１,３−ジオキソラン−４−イル)ブトキシ)ヘキサン酸(化合物(Ｃ))の合成
【化１４】
2018537517.tif 000018
火炎乾燥した丸底フラスコで、０℃で化合物Ａ(１６５mg、１当量)をＤＣＭ(５mL)に溶解し、その後これにピリジン(０.２mL)およびＤＭＡＰ(５０mg)を添加した。反応混合物をその後１０分間撹拌し、化合物Ｂ(５９mg、１.５当量)を添加した。その後混合物を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の完了を確認した。反応混合物を減圧下、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた。粗製の化合物をカラムクロマトグラフィーによりさらに精製し、無色油状物質(１３６mg、６７％)として所望の化合物を得た。
【０１１３】
１.４  ((２Ｒ,３Ｓ,４Ｒ,５Ｒ,６Ｒ)−６−(((２Ｒ,５Ｒ)−２,５−ビス(クロロメチル)−３,４−ビス((トリメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン−２−イル)オキシ)−３−クロロ−４,５−ビス((トリメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル)メチル  ((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ)−２,３,４−トリス(ベンジルオキシ)−４−(２−フェニル−１,３−ジオキソラン−４−イル)ブチル)  アジピン酸エステルの合成
【化１５】
2018537517.tif 000019
氷冷した化合物Ｃ(１００mg、１.０当量)のＤＣＭ溶液に、ＤＣＣ(３５mg、１.１５当量)を添加し、１０分間撹拌した。その後これに化合物Ｄ(１１２mg、１.２当量)およびＤＭＡＰ(５mg、０.２５当量触媒量)を添加した。反応混合物を室温まで昇温し、４時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の完了を確認した。反応混合物を減圧下、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた。その後粗製の化合物を中性シリカゲルおよび１％のトリエチルアミンを含むヘキサン中５〜１５％  酢酸エチルを溶離剤として用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色油状物(８４mg、４２％)として所望の化合物Ｅを得た。
【０１１４】
１.５  ((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ,５Ｒ,６Ｒ)−６−(((２Ｒ,５Ｒ)−２,５−ビス(クロロメチル)−３,４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル)オキシ)−３−クロロ−４,５−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル)メチル  ((２Ｒ,３Ｒ,４Ｒ)−２,３,４,５,６−ペンタヒドロキシヘキシル)アジピン酸エステル(化合物Ｆ)の合成
【化１６】
2018537517.tif 000020
火炎乾燥した一口丸底フラスコで、化合物Ｅ(５００mg、１当量)を乾燥ＭｅＯＨ(２０mL)に溶解し、その後溶液を窒素ガスで脱気した(窒素ガスシリンジを溶液の深部に入れて、窒素を１５分間パージした)。その後１０％  Ｐｄ−Ｃ(２００mg、３３％  ｗ／ｗ)を反応混合物へ注意深く添加した。最後に、反応混合物を水素風船圧下で６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の完了を確認した。反応混合物をその後セライトで濾過し、セライトを乾燥メタノールで洗浄した。濾液を減圧下、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させた。最終化合物をその後高真空下で保持し、所望の最終化合物Ｆを無色半固体または白色固体(１９０mg、７３％)として得た。化合物Ｆの構造を高分解能分光測光法および１３Ｃ  ＮＭＲで特定した。
【０１１５】
実施例２:血液と(インビトロで)インキュベートしたときに代謝物を生成する、プロドラッグとしての化合物Ｆ
２.１  材料および方法
新鮮なヒト全血を薬物加水分解試験に使用した。薬物(１０mg、化合物Ｆ)を１mL溶液(２０％メタノール)に溶解した。薬物加水分解(ｎ＝３)を、浸透した水浴中、３７℃で恒温にした５０mLフラスコ中で、１.０mgの薬物を含む２０mLの新鮮な全血アリコート中で実施した。時間０で薬物を添加し、種々の時間でインキュベート後、血液サンプルを０.２５時間、０.５時間、０.３３時間、０.７５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間および２４時間で回収した。サンプルが得られたときに薬物の酵素加水分解をクエンチするために、血液サンプルを１mLのアセトニトリル溶液で使用した。血液中のプロドラッグおよびその関連代謝物、例えばＣ６−マンニトール、マンニトールおよびスクラロースを、イオンスプレー(ＥＳＩ)源を備えたAn API QTrap5500三重四重極質量スペクトロメーターにより決定した。ＥＳＩインターフェースは陰イオンモードで使用した。
【０１１６】
２.２  結果
ｍ／ｚ  ６８８.９→１８０.９の推移でプロドラッグを観測し、３９５→３５９の推移でスクラロースを観測し；ｍ／ｚ  ４５２.３→２７３.３の推移でマンニトールを観測し；３０９→１０１.１の推移でＣ６−マンニトールを観測した。全ての化合物を高分解能分光測光法および１３Ｃ  ＮＭＲにより特定した。Ｃ６−マンニトール(式(２))は次のものである。
2018537517.tif 000021
【０１１７】
血液中のプロドラッグの加水分解を、血液中のプロドラッグのインキュベート後の時間に対するプロドラッグ残量の割合および増加するスクラロース、マンニトールおよびＣ６−マンニトールの割合をプロットすることにより表した(図１)。結果は化合物Ｆがスクラロース、マンニトールおよびＣ６−マンニトールを含む代謝物に変化するプロドラッグとして作用することを示す。
【０１１８】
実施例３：ＳＤ(Sprague Dawley)ラットにおける薬物動態研究(インビボ)
３.１  材料および方法
３.６７mg／kg  ＢＷの用量でＳＤラットにプロドラッグを経口投与した。血液サンプルを０時間、０.５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間および２４時間の間隔でヘパリン処理したマイクロ遠心分離チューブに回収した。血液サンプルを８,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、血漿サンプルを直ちに得た。血漿サンプルをその後、使用するまで−８０℃で保存した。プロドラッグおよびその関連代謝物、例えばマンニトールおよびスクラロースについて、イオンスプレー(ＥＳＩ)源を備えたＡｎ  ＡＰＩ  ＱＴｒａｐ５５００  三重四重極質量スペクトロメーターにより分析した。ＥＳＩインターフェースは陰イオンモードで使用した。
【０１１９】
３.２  結果
ｍ／ｚ  ６８８.９→１８０.９の推移でプロドラッグを観測し、ｍ／ｚ  ３９５→３５９の推移でスクラロースを観測し；ｍ／ｚ  ４５２.３→２７３.３の推移でマンニトールを観測し；ｍ／ｚ  ３０９→１０１.１の推移でＣ６−マンニトールを観測した。
【０１２０】
図２および図３は、３.６７mg／kgのプロドラッグの単回経口投与を有するＳＤ−ラットにおけるプロドラッグおよびその関連代謝物、例えばマンニトールおよびスクラロースの時間曲線に対する血漿濃度をそれぞれ示す。結果は化合物Ｆがインビボで動物における投与後、スクラロース、マンニトールおよびＣ６−マンニトールを含む代謝物に変化するプロドラッグとして作用することを示す。
【０１２１】
実施例４：ＣＹＰ２Ｅ１阻害活性アッセイ
４.１  材料および方法
本実施例は、ＣＹＰ４５０アイソザイム阻害剤のインビトロスクリーニングのための、ヒト肝臓からのミクロソームの調製である。有効なヒト肝臓ＣＹＰ４５０アイソザイム阻害剤を試験した。ＣＹＰ４５０アイソザイム阻害剤を試験する原則は、異なる起源の肝臓から調製したミクロソームＣＹＰ４５０アイソザイムとその特異的基質であるクロルゾキサゾン(ＣＺＸ)との反応に基づく。試験サンプルの添加後、ベースラインとして対照群の６−ＯＨ−ＣＺＸの量を用いることにより試験サンプルのＣＹＰ４５０アイソザイム(ＣＹＰ２Ｅ１)阻害率を計算するため、ＣＹＰ４５０アイソザイム代謝産物標準６−ＯＨ−ＣＺＸ(６−ヒドロキシ−クロルゾキサゾン)の量を用いる。
【０１２２】
すべてのサンプルを３回試験した。阻害率を求めるため、各試験化合物を１μg／mL、２μg／mL、４μg／mLの３種類の異なる濃度に溶解した。試験化合物の存在下でのＣＹＰ２Ｅ１活性レベルを対照のインキュベーションと比較した。０.５mgのミクロソームタンパク質を含有する５００μＬの反応混合物を、３７℃で３０分間、ｐＨ７.４の５０mMリン酸緩衝液中、５mM ＭｇＣl２および１mM ＮＡＤＰＨの存在下、３２０μMのＣＺＸとインキュベートした。氷冷アセトニトリルで反応を停止し、４−ヒドロキシルトルブタミドを内部標準として加えた。有機相を蒸発乾固させ、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析(ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ)分析の前に、移動相(メタノール：水＝１：１)に再構成した。イオンスプレー(ＥＳＩ)源を備えたＡＰＩ３０００三重四重極質量分析計を用いて、ヒト肝ミクロソーム中の６−ＯＨ−ＣＺＸを測定した。ＥＳＩインターフェースは陽イオンモードで使用した。６−ＯＨ−ＣＺＸを、m/z ２８４.５→１８５.９の遷移でモニターした。
【０１２３】
結果の分析：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳから得られた検出シグナル値を、対照群をベースラインとして、すなわち対照群のＣＹＰ４５０アイソザイム阻害比を０％として、ＣＹＰ４５０アイソザイム代謝産物標準６−ヒドロキシ−クロルゾキサゾンの量(pmol)に変換する。試験化合物の存在下でのＣＹＰ４５０アイソザイム活性レベルを対照のインキュベーションと比較した。
【０１２４】
４.２  結果
ジエチルジチオカルバミン酸(ＤＤＴＣ)は、ＣＹＰ２Ｅ１のよく知られた阻害剤である。１００μMの濃度でのＤＤＴＣ処理は、ヒト肝臓ミクロソームにおけるＣＹＰ２Ｅ１の９０.９％の阻害をもたらした(ＣＹＰ２Ｅ１基質としてＣＺＸを用いて測定)。観察されたＤＤＴＣの阻害活性に基づいて、ＣＹＰ２Ｅ１阻害について４μg/mL、２μg/mLおよび１μg/mLの濃度で新規化合物(プロドラッグ)およびその関連代謝物を試験した。結果を表１にまとめる。
【表４】
2018537517.tif 000022
【０１２５】
ヒト肝臓ミクロソームで検出された試験化合物のＣＹＰ２Ｅ1阻害率を表１に示す。結果から、試験化合物(プロドラッグ(化合物Ｆ)およびその代謝産物(マンニトール、スクラロース、および保護基を有するＣ６−マンニトール(式Ｃ)を含む)がＰ４５０２Ｅ１阻害剤として有効であることが示されているが、なかでもプロドラッグの中間代謝産物(すなわち、保護基を有するＣ６−マンニトール、式Ｃ)の４μg/mLが最も優れた阻害効果(７０.３±２.８％)を示した。
【０１２６】
実施例５：アセトアミノフェン(ＡＰＡＰ)およびＣＣｌ4により誘発された肝傷害のアッセイ
５.１  材料および方法
５.１.１  試薬
すべての有機溶媒はＨＰＬＣグレードであり、Tedia(Fairfield, OH, USA)から購入する。ＡＰＡＰは、Sigma(St. Louis, MO, USA)から購入し、ガラクトース注射液は、Southern Photochemical Co.製で、注射用等張塩を含む緩衝液１Ｌにガラクトース(Sigma)４００ｇを溶解することによって調製される。
【０１２７】
５.１.２  動物
体重１７５〜２８０ｇの雄性ＳＤ(Sprague−Dawley)ラットを台湾の国立実験動物センター(ＮＬＡＣ)から購入した。本実験は、国家保健研究所の動物実験実施ガイドラインに従って実施され、すべてのラットを、昼１２時間／夜１２時間のサイクル下、空気／湿度管理環境に置き、水および食糧を制限なしに与えた。実験中は、通常の水供給を行いラットの体重を継続的にモニタリングした。
【０１２８】
５.１.３  処置
５.１.３.１  ＡＰＡＰによる肝傷害
マンニトールおよびスクラロースを用いて、ＡＰＡＰにより誘発される肝傷害の観点から動物試験(ラット)を実施した。
【０１２９】
正常対照(グループ１)では、動物にＡＰＡＰを与えなかった。ＡＰＡＰ誘発肝傷害の対照群(グループ２)では、動物にＡＰＡＰの単回用量(体重１kg当たり２,０００mg)を与えて肝毒性を誘導した。ＮＡＣによる陽性対照群(グループ３)では、動物にＡＰＡＰの単回用量(体重１kg当たり２,０００mg)与えて肝毒性を誘導し、４時間後に、経管栄養法による２４時間の治療期間(ＮＡＣの初回投与(体重１kgあたり１４０mg)およびＮＡＣの追加投与(体重１kgあたり７０mgを４時間毎に５回)を含む)を開始した。実験群(グループ４)では、ＡＰＡＰの単回用量(体重１kg当たり２,０００mg)を与えて肝毒性を誘導し、４時間後に、経管栄養法による２４時間の治療期間(以下のとおり本発明の成分を４時間毎に６回投与することを含む)を開始した：
(ａ)(グループ４.１)：２４時間にわたり、マンニトールを１匹あたり１００mg以下の用量で４時間毎に投与；
(ｂ)(グループ４.２)：２４時間にわたり、マンニトールをグループ４.１の２倍の用量で４時間毎に投与；
(ｃ)(グループ４.３)：２４時間にわたり、スクラロースを１匹あたり１００mg以下の用量で４時間毎に投与；
(ｄ)(グループ４.４)：２４時間にわたり、スクラロースをグループ４.３の２倍の用量で４時間毎に投与；
(ｅ)(グループ４.５)：２４時間にわたり、体重１kgあたり、グループ４.１の０.５倍の用量のマンニトールとグループ４.３の０.５倍の用量のスクラロースの組合せを４時間毎に投与；
(ｆ)(グループ４.６)：２４時間にわたり、グループ４.１の用量のマンニトールとグループ４.３の用量のスクラロースの組合せを４時間毎に投与；
(ｇ)(グループ４.７)：２４時間にわたり、グループ４.１の１.５倍の用量のマンニトールとグループ４.３の１.５倍の用量のスクラロースの組合せを４時間毎に投与；
(ｈ)(グループ４.８)：２４時間にわたり、グループ４.１の２倍用量のマンニトールとグループ４.３の２倍用量のスクラロースの組合せを４時間毎に投与；
(ｉ)(グループ４.９)：体重１kgあたり、１４０mgのＮＡＣの初回投与、および７０mgのＮＡＣ、グループ４.１の２倍用量のマンニトール、グループ４.３の２倍用量のスクラロースの組合せを４時間毎に５回追加投与。
【０１３０】
２４時間の処置期間後、ＡＳＴ／ＳＬＴアッセイのためラットの尾動脈から血液を採取した。次いで、ラットをＧＳＰ試験に付した。最後に、ラットを屠殺し組織学的分析を行った。
【０１３１】
５.１.３.２  ＣＣｌ4による肝傷害
本明細書に記載の活性成分からマンニトールおよびスクラロースを選択し、ＣＣｌ4により誘発される肝傷害の観点から動物試験(マウス)を実施した。
【０１３２】
正常対照では、動物に生理食塩水を腹腔内注射により投与した。ＣＣｌ4誘発肝傷害の対照群では、１０mL/kgのＣＣｌ4(トウモロコシ油中４０％)を動物に腹腔内注射して肝毒性を誘導した。実験群では、１０mL/kgのＣＣｌ4(トウモロコシ油中４０％)を動物に腹腔内注射して肝毒性を誘導し、４時間後に本発明の各種成分を経管栄養法により投与した。ＡＳＴ／ＡＬＴアッセイのため、本発明の成分を投与する前、あるいは本発明の成分の投与から２４時間後に、マウスから血液を採取した。最後に、２日目に動物を屠殺し、ＡＳＴ／ＡＬＴアッセイのため血液を採取し、組織学的分析を行った。
【０１３３】
一方、他の実験群のマウスに本発明の成分を１２週間与え、マウスをＧＳＰ試験に付した。
【０１３４】
５.１.４  血液サンプル
処置の完了後、エーテル麻酔下でラットを屠殺し、ラットの尾動脈から血液を採取し、ＥＤＴＡを含む試験管に入れた。血漿を４℃にて１３,０００で１５分間遠心分離し、単離した血漿をエッペンドルフチューブに分注し、−８０℃で保存した。
【０１３５】
５.１.５  生化学分析
血漿ＡＳＴおよびＡＬＴ活性を測定することにより肝傷害を定量化する。ＡＳＴおよびＡＬＴは、肝毒性の一般的な指標であり、Synchron LXi 725システム(Beckman Instruments、米国)を用いて測定される。
【０１３６】
５.１.６  光学顕微鏡
ラットを屠殺後、組織学的分析を行った。肝臓試料を１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定し、脱水してパラフィン包埋し、切片を５μｍの厚さに調製した後、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、過ヨウ素酸シッフ染色(ＰＡＳ)に付した。染色した切片を光学顕微鏡下で観察した。
【０１３７】
５.１.７  肝機能の定量試験
実験終了後、全てのラットをＧＳＰ試験に付した。ラットに０.４g/mLのＢＷガラクトース溶液０.５g/kgを３０秒以内に静脈内注射し、注射から５、１０、１５、３０、４５および６０分後に尾静脈から血液試料を採取した。比色分析用ガラクトース脱水素酵素を用いてガラクトースの濃度を定量し、試験濃度は５０〜１,０００μg/mLの範囲である。各濃度の１日における変動は、標準偏差および変動係数(ＣＶ)を用いて計算され、最大許容変動係数は１０％ＣＶであるが、日々の変動は、較正曲線の傾きと切片を比較することにより調べられる。ＧＳＰは、３０秒間の注射を停止してから６０秒後に得られた血中ガラクトース濃度である。
【０１３８】
５.１.８  統計分析
すべてのデータは平均±標準偏差(ＳＤ)で表し、結果はＡＮＯＶＡを使用して有意性を決定する。グループ間の有意差を確認するために、Social ScienceプログラムのStatistical Package(バージョン13、SPSS Inc.)を計算に使用し、グループ間の有意差を確認するため、多重比較ための最小有意差を調べる事後検定(post−hoc test)を行い、グループ間の平均の差は有意でｐ＜０.０５であった。
【０１３９】
５.２  結果
５.２.１  マンニトールおよびスクラロースおよび他の成分は、ＡＰＡＰによって誘発される肝傷害の治療に有効である
結果を表２に示す。
【表５】
2018537517.tif 000023
【表６】
2018537517.tif 000024
*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005: 実験群のAPAP対照との比較
【０１４０】
結果は、ＡＰＡＰ肝毒性群において肝傷害が生じていることを示している。対照的に、このような肝傷害や生存率は、マンニトールおよび／またはスクラロースの使用によって、用量依存的に改善され得る。特に、マンニトールとスクラロースの組み合わせは、相乗効果をもたらす；結果は正常対照の結果と類似しており、ＮＡＣによる標準治療の陽性対照よりも優れている。さらに、アエロジル２００、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、微結晶セルロースおよびポビドンＫ−３０等の他の成分は、肝傷害の治療に有効であり、ＮＡＣによる標準治療の陽性対照よりも優れている。
改善された結果は、対応する肝臓組織においても反映されている。
【０１４１】
組織学的分析の結果を図４に示す。ＡＰＡＰ肝毒性群のラットの肝組織切片は、中心静脈をとり囲む肝細胞が、空胞化と核の数の減少が肉眼で認められ壊れていることを示し、一部の肝細胞ではさらに壊死の徴候を示し、正常対照群のラットの肝細胞と比較して肝傷害がより深刻であった(図４Ｂ)。対照的に、対照群のラットの肝構造は正常であり、肝細胞は無傷で、空胞化もなく整然と配置されている(図４Ａ)。マンニトールおよび／またはスクラロースで処置した実験群の肝臓切片に関しては、肝細胞は、肉眼で核が認められ空胞化が少なく、比較的無傷である(図４Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ)。特に、マンニトールとスクラロースの組み合わせが最良の保護効果をもたらす(図４Ｇ)；結果は、ＮＡＣによる標準治療の陽性対照よりもさらに優れている(図４Ｃ)。
【０１４２】
５.２.２ マンニトールは、ＣＣｌ4によって誘発された肝傷害の治療に有効である
結果を表３に示す。
【表７】
2018537517.tif 000025
統計分析：AnovaおよびLSDテスト
***p < 0.005、**p < 0.01、*p < 0.05、実験群のCCl4 対照群との比較
【０１４３】
結果は、ＣＣｌ4対照群において肝傷害が生じていることを示している。対照的に、このような肝傷害は、マンニトールの使用によって改善され得る。
【０１４４】
実施例６：脂肪肝のアッセイ
６.１  材料及び方法
６.１.１  細胞株および細胞培養培地
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いて、脂肪含有量の減少における、マンニトールおよびスクラロースなどの本明細書に記載の種々の成分の活性を分析した。
【０１４５】
ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)を用いて、以下の実験を実施するためTable 4に示すＤＭＥＭ培地Ｎｏ.Ａ〜Ｆを調製した。
【表８】
2018537517.tif 000026
【０１４６】
ＤＭＥＭ培地Ｎｏ.Ａ〜Ｆは、２〜８℃で保存し、実験前に３７℃の水浴で温めた。
【０１４７】
６.１.２  細胞数および生存率試験
死細胞は０.４％のトリパンブルーを取り込んで色を有していた；他方、生細胞は、細胞膜が無傷のため色素を取り込まず色は透明であった。１００μＬの細胞懸濁液および同体積の０.４％トリパンブルーを均一に混合して混合物とした。混合物の一部(約２０μＬ)を血球計のチャンバー上の溝に加え、光学顕微鏡下で観察するためそれをカバースリップで覆った。生細胞は染色されず、死細胞は青色であった。
【０１４８】
６.１.３  ＨｅｐＧ２細胞株由来の脂肪肝細胞のオレイン酸誘導性形成
ＨｅｐＧ２細胞株(１５×１０６細胞)をＤＭＥＭ培地Ｎｏ.Ｂで培養し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ培地Ｎｏ.Ｃ(無血清培地)中で２４時間培養し、最後にＤＭＥＭ培地Ｎｏ.Ｄ(オレイン酸／アルブミン複合体を含む)でさらに４８時間培養して、ＨｅｐＧ２細胞株を誘導し脂肪肝細胞を形成させた。
【０１４９】
６.１.４  脂肪肝細胞の各群の処理
ＨｅｐＧ２細胞系を、以下の６つの群に分けた：(１)ブランク：無処理；(２)ＤＭＳＯ群：ブランク群の細胞をジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)で処理した；(３)対照群：オレイン酸で脂肪肝細胞の形成を誘導した；(４)ビヒクル群：オレイン酸で誘導した脂肪肝細胞をＤＭＳＯで処理した；(５)陽性対照：脂肪肝細胞をシリマリンで処理した；(６)試験群：脂肪肝細胞を本発明の各種化合物で処理した。
【０１５０】
６.１.５  細胞中のトリグリセリド(ＴＧ)の測定
７２時間のインキュベーション後、各群の処理細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで０.５ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡと共に３分間インキュベートした。その後、２mLのＰＢＳで細胞を掻き取り、遠心管に移し超音波で破砕した。細胞抽出物を２０μＬ取り、タンパク質含量を測定した。ＴＧは、市販の試薬の組合せ(Randox)を用いて行った。上記で得られたＴＧ含量をタンパク質含量で割って、細胞中のＴＧの相対含量を表す比を求めた。
【０１５１】
６.１.６  実験用動物
台湾保健省によって発表された「健康食品の肝臓保護および健康管理の有効性を評価するための方法」の説明書で推奨されているＢ６マウスを動物試験に選んだ。４匹以上のマウスを各群の予備試験に用い、１２匹以上のマウスを各群の確認試験に用いた。通常の明／暗サイクル(点灯午前７時〜午後７時、消灯午後７時〜午前７時)下、５５±１５％の相対湿度の動物室で２３±２℃にて飼育した、体重１８〜２３ｇの雄のマウスをBioLASCO(台北)から購入し、国防医学院の実験動物センターに収容した。動物実験は国立衛生研究所の動物実験の指針に従って実施した。マウスに通常の飼料を３〜５ｇ／日、水を無制限に１〜２週間与え、健康状態を調べた。マウスの体重は週１回記録した。
【０１５２】
６.１.７  動物のグループ分け
試験動物を、ブランク、高脂肪食対照(ＨＦＤ)、陽性対照(ＰＳ)および試験群に無作為に分けた。ブランクの動物には通常の飼料を与えた。ＨＦＤの動物には高脂肪飼料を与えた。ＰＳの動物には高脂肪飼料を与え、さらにシリマリン(５ｍg/kg／日)を管で補給した。試験群の動物には高脂肪飼料を与え、さらに試験化合物を管で補給した。
【０１５３】
６.１.８  試験方法
ブランクの動物には通常の飼料を１２週間普通に与えて飼育し、ＨＦＤ、ＰＳおよび試験群の動物には高脂肪飼料を１２週間普通に与えて飼育した。８週間摂食させた後、ブランクとＨＦＤの動物には、脱イオン水を１日１回、管で供給した；ＰＳの動物にはシリマリンを１日１回管で供給した；試験群の動物には試験化合物を１日１回、４週間または８週間にわたり与えた。
【０１５４】
試験前、試験の第８、第１２、および第１６週目に、血液を頬または心臓から採取した。試験の終了時に、すべてのマウスの体重を測定後、屠殺し、頬または心臓から同時に血液を採取した。マウスの血液検体を室温で１時間静置して凝固させた後、冷却遠心分離機で４℃にて、１５,７００×ｇで５分間遠心分離して血清を分離した。その後、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(ＡＳＴ)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)、トリグリセリド(ＴＧ)、総コレステロール(ＴＣＨＯ／ＴＣ)、低密度リポタンパク質コレステロール(ＬＤＬ−Ｃ)、および高密度リポタンパク質コレステロール(ＨＤＬ−Ｃ)を含む肝機能の生化学的指標を、自動血液生化学分析装置で検出した。
【０１５５】
さらに、屠殺したマウスの腹部から腹部脂肪および肝臓標本を採取し、脂肪および肝臓の重量を比較し、体重に対する肝臓重量の比を求めた。体積約１cm3の２つの組織ブロックを、肝臓の最も大きな右葉から切除し、１０％中性ホルマリン溶液中で固定した後、切片化のためにパラフィンで包埋した。組織病理学的観察のために切片をＨ＆Ｅ染色した。さらに、肝臓の残りを、保存と肝臓中のトリグリセリドおよび総コレステロール含有量の検出のために凍結した。さらに、臨床で用いられるその他肝機能の定量化に、米国ＦＤＡおよび台湾厚生省により認識され推奨されているガラクトース・シングルポイント法(Galactose Single Point Method)により各群の動物の肝機能を分析した。試験の終了時点で、動物１kgあたり０.５ｇのガラクトース(Ｇ.Ｓ.Ｐ.(登録商標)０.４ｇ/mL)を静脈内投与した。投与から１時間後、ろ紙を用いて全血約０.５ｍｌを採取し、マウスの肝機能を評価した。ＧＳＰの値が高いほど、それら肝機能は悪い(ＦＤＡ：“Guidance for Industry: Pharmacokinetics in Patients with Impaired. Hepatic Function−Study Design, Data Analysis and Impact on Dosing and. Labeling. 2003)。
【０１５６】
６.１.９  組織病理学的組織切片作製
試験の終了時に、全てのマウスを屠殺した。体積約１cm3の１つの組織ブロックを、肝臓の最も大きな右葉から切断し、１０％中性ホルマリンで固定した後、各種濃度のエタノール(３０％、５０％、７０％、９５％、９９.５％)およびキシレン中で脱水およびヒアリン化した。その後、キシレンを熱パラフィン溶液に置き換えた。最後に、組織をパラフィン溶液で包埋した。完成したパラフィン標本をミクロトームにより切断し、厚さ５μｍのパラフィン切片とした。切片をクリーンスライド上に貼り付け、３７℃で乾燥させ、次いでＨ＆Ｅ染色によって染色した。
【０１５７】
６.１.１０  ヘマトキシリンおよびエオシン染色(Ｈ＆Ｅ)
肝組織切片をキシレン中で３０分間脱パラフィンした後、それぞれ９９.５％、９５％、７０％、５０％および３０％の水性エタノールでそれぞれ３０分間２回再水和した。蒸留水に１０分間浸漬して切片を染色することができた。切片を最初にヘマトキシリンに３０秒間浸漬して細胞核を染色し、次に蒸留水で数分間洗浄し、エオシンで２〜５分間染色し、再び蒸留水で数分間洗浄した。染色処理後、切片を５０％、７０％、９５％および１００％水性エタノールでそれぞれ３０秒間２回脱水し、キシレン中で２回ヒアリン化し、最後に封入剤で封入し保存した。
【０１５８】
６.１.１１  組織病理学的観察
進行中の肝傷害がある場合、肝細胞の病変、脂肪蓄積、壊死、または線維化を観察するため、肝組織をＨ＆Ｅ染色して肝脂肪蓄積の程度を評価した。すべての組織病理学的切片は、主観的観察におけるバイアスを排除するため肝臓の最も大きな右葉の同じ位置から切り取り、次いで病理学的染色に付した。病理学における半定量分析の評価に関しては、
試験デザインを知らずにすべての切片をスコア化(ＮＡＳスコア)し比較する二重盲検分析を行った医師または獣医病理学者によって確認しなければならなかった。最後に、各群の差異分析を統計的方法によって行った。
【０１５９】
６.１.１２  肝臓の抗酸化能力の分析
屠殺した動物から肝臓組織約０.１ｇを採取し、バイオマッシャーで１０分間遠心分離することによりホモジナイズした。ホモジナイズした組織に９倍量(ｗ／ｗ)の緩衝液(ｐＨ７.４、５０mmol/L Tris−ＨＣl、１８０mmol/L ＫＣl)を加え、ボルテックスミキサーでよく混合して使用した。得られた肝臓組織のホモジナイゼーション溶液試料を用いて、グルタチオンペルオキシダーゼ(ＧＰｘ)、グルタチオン(ＧＳＨ)、グルタチオンレダクターゼ(Ｇｒｄ)およびスーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ)含め、肝臓抗酸化系の各種メンバーを分析した。関連の分析方法は、例えば、台湾厚生省が発表した「健康食品の肝臓保護と健康管理の有効性を評価する方法」の草案などの公知の文献に見出すことができる。
【０１６０】
６.１.１３  統計分析
すべてのデータを平均±標準偏差(ＳＤ)で表した。試験結果の統計的有意差は、Social ScienceプログラムのStatistical Package(バージョン13、SPSS Inc.)を用いた一元配置分散分析(ＡＮＯＶＡ)の計算によって求めた。その後、グループ間の有意差を確認するため、事後検定(post−hoc test)において最小意差法を用いて多重比較を行った。グループ間の平均の差は、ｐ＜０.０５で有意であると判断される。
【０１６１】
６.２  結果
６.２.１  細胞実験
細胞実験では、陽性対照(シリマリン)において測定されたＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧ量減少の結果を表５に示した。
【表９】
2018537517.tif 000027
【０１６２】
一定濃度の試験化合物を用いて測定したＨｅｐＧ２脂肪細胞におけるＴＧ含量減少の結果を表６に示す。この結果から、被験化合物は、対照と比較して一定の試験濃度の条件下で、誘発されたＨｅｐＧ２細胞から形成された脂肪肝細胞において異なる程度のＴＧ含量低下効果を示したことが認められる。ＴＧの減少率(％)の計算式は次のとおりであった：
［１−(試験群のＴＧ含量−ブランクのＴＧ含量)／(オレイン酸誘導群のＴＧ含量−ブランクのＴＧ含量)］×１００％。
【０１６３】
【表１０】
2018537517.tif 000028
【表１１】
2018537517.tif 000029
【表１２】
2018537517.tif 000030
【０１６４】
【表１３】
2018537517.tif 000031
【０１６５】
【表１４】
2018537517.tif 000032
【０１６６】
【表１５】
2018537517.tif 000033
【０１６７】
６.２.２  動物実験
動物実験において、通常の餌を与えたブランクの動物を除き、脂肪肝を誘導するためにすべての動物を処置した。８週間後、元の餌に加えて、各群の動物に４または８週間種々の処置を与えた。ブランクおよびＨＦＤの動物は、脱イオン水を与えられ；ＰＳの動物は、シリマリンを与えられ；および試験群の動物は、プエラリン、フロリジン、エリオジクチオール、スクラロース、マンニトール、サッカリン、ヘスペリチン、メントール、およびそれらの組合せを含む、種々の試験化合物を与えられた。
【０１６８】
６.２.２.１  動物の体重、肝重量および体脂肪重量に対する影響ならびに試験化合物の安全性評価
動物実験の結果から、各群の動物の肝重量、体脂肪重量および体重増加を、表７−１および７−２に示す。
【０１６９】
【表１６】
2018537517.tif 000034
【０１７０】
【表１７】
2018537517.tif 000035
【０１７１】
結果から、脂肪肝が誘導された動物において腹部脂肪重量は増加したことが示された。別々に投与された試験化合物のうち、マンニトール、メントールおよびスクラロースは、動物において腹部脂肪重量を顕著に減少させることができた。
【０１７２】
さらに、試験化合物を投与した後、試験群の動物において異常状態は観察されなかった。試験中に動物は死亡しなかった。試験化合物により引き起こされる疾患または臨床的症状の発生は、試験後の屠殺動物の剖検から観察されなかった。したがって、試験化合物は安全であった。
【０１７３】
６.２.２.２  試験化合物は肝臓の脂質を減少させるのに有効である
図５は、肝門領域部付近(胆管、門脈、肝動脈を含む)の脂肪肝の肝細胞が多くの大きな小胞性脂肪滴で覆われた脂肪肝を示すように誘導され、肝細胞の肥大化が出現したマウスを示し、脂肪肝の動物モデルが誘導によりうまく確立されたことを示している。
複数の試験化合物が、４週間または８週間の投与後、動物肝臓における脂質減少の効果を示すことを動物実験の結果は示した。結果を表８−１および８−２に示した。
【０１７４】
【表１８】
2018537517.tif 000036
【０１７５】
【表１９】
2018537517.tif 000037
【０１７６】
脂肪肝が誘導されたマウスの肝臓においてＴＧおよびＴＣが増加したことを結果は示した。別々に投与された試験化合物のうち、ヘスペリチン、プエラリン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトール、メントールおよびスクラロースは、肝臓におけるＴＧを有意に減少させることができた。特に、肝臓ＴＧ含有量の約６７％低下の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、エリオジクチオールの４週間の処置後、達成した。さらに、ヘスペリチン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトール、メントール、スクラロースおよびサッカリンは、肝臓におけるＴＣを有意に減少させることができた。具体的には、肝臓ＴＣ含有量の約５６％低下の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、サッカリンの４週間の処置後、達成した。
【０１７７】
２つの試験化合物の組合せを投与したとき、サッカリンとマンニトールの組合せ、メントールとマンニトールの組合せ、スクラロースとマンニトールの組合せ、エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、またはエリオジクチオールとスクラロースの組合せは、肝臓ＴＧを顕著に減少させることができた。特に、肝臓ＴＧ含有量の約７７％低下の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、メントールとマンニトールの組合せの４週間の処置後、達成することができ；肝臓ＴＧ含有量の約７８％低下の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、エリオジクチオールとスクラロースの組合せの８週間の処置後、達成することができた。さらに、スクラロースとマンニトールの組合せ、エリオジクチオールとマンニトールの組合せ、またはエリオジクチオールとスクラロースの組合せは、肝臓ＴＣ含有量を顕著に減少させることができ、肝臓ＴＣ含有量の約７７％低下の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、エリオジクチオールとスクラロースの組合せの８週間の処置後、達成することができた。
【０１７８】
３つの試験化合物の組合せを投与したとき、メントールとマンニトールとエリオジクチオールの組合せまたはスクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せは、肝臓ＴＧを顕著に減少させることができた。特に、肝臓ＴＧ含有量の約７９％低下の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せの８週間の処置後、達成することができた。さらに、スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せは、肝臓ＴＣを顕著に減少させることができた。
【０１７９】
６.２.２.３  試験化合物は肝臓損傷を減少させるのに有効である
６.２.２.３.１  肝臓脂肪および肝組織の肝臓損傷の減少の効果
複数の試験化合物が、４週間の試験期間中の肝臓脂肪および肝組織損傷の低下という有効性を示すことを動物実験の結果は示した。図５は、脂肪肝を有する動物の肝組織損傷を示す。肝組織損傷には、肝門脈領域付近(胆管、門脈、肝動脈を含む)の肝細胞を覆う多くの大きな小胞性脂肪滴および肝細胞の肥大化が含まれた。比較により、シリマリン、メントール、エリオジクチオールまたはマンニトールによって４週間処置された後、肝組織切片において肝細胞内の大きな小胞性脂肪滴は、顕著に減少した。小さな破損した小滴の一部が、シリマリンで処置されたマウスでまだ観察されたが、メントール、エリオジクチオールまたはマンニトールで処置されたマウスの肝組織タイプは、ブランク群の動物のものに近く、これは軽度の脂肪性肝疾患を示している。さらに、ＮＡＳスコア付けの結果を表９に示した。
【０１８０】
【表２０】
2018537517.tif 000038
【０１８１】
ＮＡＳ(Nonalcoholic Fatty Liver Disease Activity Score)は、非アルコール性脂肪性肝疾患の活動性スコアを示し(Hepatology. 2005 Jun;41(6):1313-21)、脂肪症、小葉内炎症および肝細胞の肥大化の度合を包括的に評価した。スコア表を表１０に示した。より高いスコアは、重篤な肝臓損傷を示す。
【表２１】
2018537517.tif 000039
【０１８２】
脂肪肝が誘導されたマウスにおいて肝組織損傷が生じたこと(ＮＡＳの増加)を結果は示した。別々に投与された試験化合物のうち、エリオジクチオールおよびマンニトールは、肝臓損傷を顕著に減少させることができた。２つの試験化合物の組合せを投与したとき、メントールとマンニトールの組合せが優れた効果を達成したことは顕著である。肝臓損傷の出現はほとんどなかった。ＮＡＳは、ブランクのものと同一であった。
【０１８３】
６.２.２.３.２  肝機能不全の減少の効果
複数の試験化合物が、４週間または８週間の投与期間中の動物における肝機能不全の減少という有効性を示すことを動物実験の結果は示した。結果を表１１−１および表１１−２に示した。
【０１８４】
【表２２】
2018537517.tif 000040
【表２３】
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【０１８５】
【表２４】
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【０１８６】
ＡＬＴおよびＡＳＴは、肝臓の生化学的機能不全を反映する酵素指標として最も一般的に用いられる。通常の状況下では、これらの酵素は肝細胞に存在する。しかしながら、肝細胞が損傷を受けると、それらが漏れる。血清ＡＬＴ値およびＡＳＴ値の増加は、一般に肝臓の炎症および肝機能不全を反映する。
【０１８７】
脂肪肝が誘導された(ＡＬＴ値およびＡＳＴ値を上昇させている)動物が肝機能不全を患うことを結果は示した。別々に投与された試験化合物のうち、ヘスペリチン、プエラリン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトール、メントール、スクラロースおよびサッカリンのすべてが、ＡＬＴ値およびＡＳＴ値を顕著に減少させることができた。特に、ＡＬＴ値の約６４％低下(ｐ＜０.００５)およびＡＳＴ値の約６０％低下(ｐ＜０.００５)の優れた効果を、マンニトールの４週間の処置後、達成することができた。
【０１８８】
２つの試験化合物の組合せを投与したとき、メントールとマンニトールの組合せ、およびエリオジクチオールとスクラロースの組合せの両方が、ＡＬＴ値を顕著に減少させることができた。また、メントールとマンニトールの組合せ、スクラロースとマンニトールの組合せ、またはサッカリンとマンニトールの組合せは、ＡＳＴ値を顕著に減少させることができた。特に、ＡＬＴ値の約７６％低下(ｐ＜０.００５)およびＡＳＴ値の約６２％低下(ｐ＜０.００５)の優れた効果を、メントールとマンニトールの組合せの４週間の処置後、達成することができた。
【０１８９】
３つの試験化合物の組合せを投与したとき、スクラロースとマンニトールとエリオジクチオールの組合せは、ＡＬＴ値を有意に減少させることができた(ｐ＜０.００５)。
【０１９０】
６.２.２.４  試験化合物は肝臓の抗酸化活性を向上させることができる
複数の試験化合物が、４週間の試験期間中の動物における肝臓の抗酸化活性の向上という有効性を示すことを動物実験の結果は示した。結果を表１２−１および表１２−２に示した。
【０１９１】
【表２５】
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【０１９２】
【表２６】
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【０１９３】
Ｇｐｘ、ＧＳＨ、ＧｒｄおよびＳＯＤは、肝臓において酸化ストレスを減少させ、肝臓が酸化ストレスにより生じる損傷を受けるのを防ぎ得る肝臓の抗酸化系の一般的な構成要素である。Ｇｐｘ値、ＧＳＨ値、Ｇｒｄ値およびＳＯＤ値の増加は、肝臓がより良好な抗酸化活性を維持していることを示す。
【０１９４】
脂肪肝が誘導されたマウスの抗酸化活性が低下したことを結果は示した。別々に投与された試験化合物のうち、ヘスペリチン、プエラリン、エリオジクチオール、フロリジン、マンニトールおよびスクラロースのすべてが、抗酸化活性を顕著に向上させることができた。特に、Ｇｐｘ、ＧＳＨ、ＧｒｄおよびＳＯＤレベルの実質的な増加の優れた効果(ｐ＜０.００５)を、マンニトールの４週間の処置後、達成した。
【０１９５】
要約すると、マンニトールおよびスクラロースなどを含む試験した化合物は、肝臓の脂肪含有量を減少させること、肝臓損傷を減少させること、肝臓の抗酸化活性を向上させることができる。これらの化合物は、動物実験により安全であることが確認されており、そして、肝臓脂肪を減少させ、関連障害、例えば脂肪性肝疾患、急性および慢性アルコール性脂肪性肝疾患、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝疾患(ＮＡＦＬＤ)、急性および慢性アルコール性肝炎、急性および慢性非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性硬変、ならびにアルコール性硬変(ICD-9-CM Diagnosis Codes: 571.8, 571.0, 571.1, 571.2, 571.3, 571.4, 571.5, 571.9)を改善するための、健康食品または薬物に開発される可能性を有することが見出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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