(57)【要約】  次々に連結した少なくとも六個の可変ドメインを有するポリペプチド鎖中に組み込まれたダイアボディ単位を含む三重特異性抗体分子を開示する。ある特定の例では、二つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントは前記ダイアボディ単位に対して遠位に連結して、二つのさらなる抗原結合部位を提供する。
2018537415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二対の可変ドメインから構成されるダイアボディ単位を含む多価Ｆｖ抗体であって、一方の対がポリペプチド中で次々に連結した一対の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ−ＶＬ）であり、他方の対が、ポリペプチド中で次々に連結した一対の可変重鎖（ＶＨ−ＶＨ）であり、前記ＶＬ−ＶＬ対および前記ＶＨ−ＶＨ対が二つの抗原結合部位に会合し、少なくとも１対の可変ドメインが少なくとも四個の可変ドメインを含むポリペプチド中で少なくとも二つのさらなる可変ドメインに連結され、前記さらなる可変ドメインの一つが可変ドメイン対に対してＮ末端に位置し、前記他のさらなる可変ドメインが前記ポリペプチド中の可変ドメイン対に対してＣ末端に位置する、多価Ｆｖ抗体。
【請求項２】
前記Ｆｖ抗体が少なくとも四価である、請求項１に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項３】
前記ダイアボディ単位の前記ＶＬ−ＶＬ対および前記ＶＨ−ＶＨ対が二つの抗原結合部位に会合し、さらなるＮ末端に位置する可変ドメインが第三抗原結合部位に対応する可変ドメインと結合し、Ｃ末端に位置する可変ドメインが第四抗原結合部位に対応する可変ドメインと結合する、請求項２に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項４】
次々に連結された少なくとも六個の可変ドメインを有するポリペプチドを含み、前記ダイアボディ単位の可変ドメイン対（１、１ｃ、１０、１０ａ）が前記ポリペプチド中に組み入れられる、請求項２に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項５】
可変ドメインＶＬ−ＶＬの対および可変ドメインＶＨ−ＶＨの対中の二個の可変ドメインが１２以下のアミノ酸残基から構成されるペプチドリンカー（３、３ａ）によって連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項６】
前記抗体が七価または六価である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項７】
少なくとも六個の可変ドメインを有する前記ポリペプチドにおける前記ダイアボディ単位の二個の可変ドメインの前記対が、前記ポリペプチドの二個の可変ドメインの別の対と会合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項８】
前記ポリペプチド中の前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記対が、別のポリペプチドの別の可変ドメインの対と非共有的に会合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項９】
前記他のポリペプチドが少なくとも二個の可変ドメインを含む、請求項８に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１０】
少なくとも六個の可変ドメインを有する前記ポリペプチドが、そのＮ末端でｓｃＦｖ単位と、そのＣ末端でｓｃＦｖ単位とを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１１】
少なくとも六個の可変ドメインを有する前記ポリペプチドが、そのＮ末端で一本鎖ダイアボディ単位と、そのＣ末端で一本鎖ダイアボディ単位とを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１２】
前記Ｆｖ抗体分子が単一のポリペプチドから構成される、請求項１０に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１３】
前記Ｆｖ抗体分子が、１０の可変ドメインを含む第一ポリペプチドと、二個の可変ドメインを含む第二ポリペプチドと構成され、前記第一ポリペプチドが、前記Ｎ末端で一本鎖ダイアボディ単位と前記Ｃ末端で一本鎖ダイアボディ単位とを含み、前記第二ポリペプチドがダイアボディ単位に対する第一ポリペプチドと会合している、請求項１１に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ次々に連結された六個の可変ドメインを有し、第一および第二可変ドメインは前記Ｎ末端でｓｃＦｖ単位を形成し、前記Ｎ末端の前記ｓｃＦｖ単位は第三可変ドメインに対してＣ末端で連結され、前記第三可変ドメインは１２以下のアミノ酸残基から構成されるペプチドリンカーによって第四可変ドメインに連結され、前記第四可変ドメインは前記Ｃ末端でｓｃＦｖ単位に対してＣ末端で連結され、前記ｓｃＦｖ単位が第五および第六可変ドメインによって形成される、請求項８または９に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ次々に連結された八個の可変ドメインを有し、第一および第二可変ドメインがＮ末端でｓｃＦｖ単位を形成し、前記Ｎ末端での前記ｓｃＦｖ単位が第三可変ドメインに対してＣ末端で連結され、前記第三可変ドメインは１２以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーによって第四可変ドメインに連結され、前記第四可変ドメインが第五可変ドメインに対してＣ末端で連結され、前記第五可変ドメインが第六可変ドメインに対してＣ末端で１２以下のアミノ酸残基から構成されるリンカーによって連結され、前記第六可変ドメインはＣ末端でｓｃＦｖ単位に対してＣ末端で連結され、前記ｓｃＦｖ単位が第七および八個の可変ドメインによって形成される、請求項７に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１６】
前記可変軽鎖ドメイン対（ＶＬ−ＶＬ）が少なくとも四個の可変ドメインを含む第一ポリペプチドにおいて、Ｎ末端で別の可変ドメインに、そしてＣ末端で別の可変ドメインに連結され、前記可変重鎖対（ＶＨ−ＶＨ）が少なくとも四個の可変ドメインを含む第二ポリペプチドにおいて、Ｎ末端で別の可変ドメインに、そしてＣ末端で別の可変ドメインに連結されている、請求項１に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１７】
前記第一および前記第二ポリペプチドが六個の可変ドメインを含み、前記ポリペプチドの各々がＣ末端またはＮ末端にｓｃＦｖ単位を含む、請求項１６に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項１８】
前記ダイアボディ単位における前記可変ドメインが同じエピトープ特異性または異なるエピトープ特異性を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項１９】
前記Ｆｖ抗体分子が免疫エフェクター細胞上に存在する抗原に対して特異性を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項２０】
前記Ｆｖ抗体が、同じ種類の免疫エフェクター細胞に対する特異性を有する二つの抗原結合部位を含む、請求項１９に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項２１】
前記Ｆｖ抗体が腫瘍抗原に対する少なくとも一つの特異性を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項２２】
前記Ｆｖ抗体が二つの腫瘍抗原に対する特異性を含む、請求項２１に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項２３】
前記Ｆｖ抗体がウイルス抗原に対する少なくとも一つの特異性を含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体分子。
【請求項２４】
少なくとも六個の可変ドメインを有する前記ポリペプチドが少なくとも六個の可変ドメインを有する別のポリペプチドと結合している、請求項７に記載の多価Ｆｖ抗体。
【請求項２５】
薬剤として使用するための請求項１〜２４のいずれか１項に記載の多価Ｆｖ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価多重特異性Ｆｖ抗体誘導体、特にダイアボディ単位を含むＦｖ抗体分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体は、二つの異なる治療標的に関与するか、または二つの異なる機能を果たすために用いられる。そのような抗体を使用して、例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞を特定の標的細胞に動員することができる。様々な抗体フラグメントに基づく分子が、例えばがん治療において知られており、そして調査中である。
【０００３】
二重特異性抗体は抗体可変ドメインのみを使用して構築することができる。例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカー配列は、互いに折り重ねることができなくなり、分子内で対ごとに会合することができなくなる程度まで短くすることができる。そのような短いリンカー、例えば２〜１２残基は、モノマー一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）分子の前記形成を防止し、ダイマー「ダイアボディ」を形成する異なるポリペプチド鎖の相補性可変ドメイン間の分子間ＶＨ／ＶＬ対形成に有利に働く（非特許文献１（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  ６４４４−６４４８））。そのようなダイアボディを使用して、各々が一つの抗体からのＶＨドメインであって、短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに結合したものから構成される二つの一本鎖ポリペプチド融合産物の非共有的な会合によって得られる二重特異性抗体を構築することができる（またはその逆も同様）。
【０００４】
特許文献１（国際公開第２００３／０２５０１８号公報）は、四つの結合ドメインを有する同一の一本鎖ポリペプチドによって形成される構造を有する二重特異性抗原結合分子を開示している。各ポリペプチド鎖の末端部分のＶＨドメインおよびＶＬドメインは短いリンカーによって連結され、別のポリペプチド鎖の対応するＶＨおよびＶＬドメインと分子間会合し、その一方で、各ポリペプチド鎖の他のＶＨおよびＶＬドメインは同じ鎖内で互いに分子内結合し、その結果、抗原結合ｓｃＦｖ単位が得られる。そのような構築物はホモダイマーであり、すなわち、それらは対ごとに互いに会合する同一の一本鎖ポリペプチドから構成される。
【０００５】
さらに、がん細胞に対してより大きな選択性を可能にし、健常組織を温存し、結果として薬物ががん細胞の根絶に有効であり得る用量範囲や治療適用性を拡大する、二つの腫瘍抗原を標的とする三重特異性抗体が望ましい。例えば、一つの三重特異性抗体は二つの異なる腫瘍抗原を標的とするために使用することができ、そして第三の特異性があれば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に関与して細胞毒性効果を発揮する。
【０００６】
特許文献２（国際公開第２００９／００７１２４号公報）は、「トリプルボディ」として命名され、３つの異なる特異性（腫瘍マーカーについてのＣＤ１２３およびＣＤ３３、そしてＮＫ細胞上のＣＤ１６についての一つ）を有するタンデム配置の３つのｓｃＦｖフラグメントから構成される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の三重特異性融合を開示する。前記分子は、中心に位置する前記ｓｃＦｖでジスルフィド結合によってさらに安定化される。そのような分子はダブルポジティブな腫瘍細胞の二重標的化を可能にし、ＮＫ細胞上のＣＤ１６に一価で結合する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０２５０１８号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／００７１２４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  ６４４４−６４４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
多価多重特異性Ｆｖ抗体誘導体、特にダイアボディ単位を含むＦｖ抗体分子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、二つの抗原結合部位と会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）する二対の可変ドメインから構成されるダイアボディ単位を含む多価Ｆｖ抗体に関する。「抗原結合部位」は、一対のＶＨ／ＶＬドメインのＦｖ抗原結合部位、すなわち、ＶＨ／ＶＬ抗原結合部位、または単一ドメイン抗原結合部位、を意味する。可変ドメインの各対はポリペプチドにおいて次々に連結される。ダイアボディ単位は、一つのポリペプチドから構成される（一本鎖ダイアボディ単位）、または二つのポリペプチド（ダイアボディ単位）から構成される。少なくとも１対の可変ドメインは、前記ポリペプチドにおいて、この可変ドメイン対に対してＮ末端に位置し、そして別の可変ドメインに対してＣ末端に位置する別の可変ドメインに連結される。したがって、そのようなポリペプチドは次々に連結した少なくとも四個の可変ドメインを含み、この場合、次々に連結した二つの並列可変ドメインは前記ダイアボディ単位の一個の可変ドメイン対であり、一つのさらなる可変ドメインは前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に対してＮ末端に位置し、そして他方のさらなる可変ドメインは前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に対してＣ末端に位置する。前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に対してＮ末端に連結された前記可変ドメインは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインまたは可変重鎖（ＶＨ）ドメインであり得、また前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に対してＣ末端に連結された前記ドメインは、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）または可変重鎖ドメイン（ＶＨ）であり得る。そのようなポリペプチドは、次々に連結した少なくとも四個の可変ドメインを含むＦｖポリペプチドであり、すなわち、別の可変ドメインにＣ末端で連結された、前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に連結された、前記Ｎ末端に連結された可変ドメインである。特定の実施形態において、６、８、または１０の可変ドメインがそのようなＦｖポリペプチドにおいて次々に連結している。
【００１１】
多価Ｆｖ抗体は少なくとも四価であり、少なくとも四つの抗原結合部位を含む。したがって、前記少なくとも四個の可変ドメインのうちの二つが、二つの（第一および第二の）抗原結合部位に対する前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記他の対と結合する前記ダイアボディ単位の二つの並列可変ドメインの対である、少なくとも四個の可変ドメインを含む前記Ｆｖ抗体の前記Ｆｖポリペプチドは、さらなる（第三の）抗原結合部位に対応する可変ドメインと結合する前記Ｆｖポリペプチドの前記Ｎ末端で少なくともさらなる（第三の）可変ドメインと、さらなる（第四の）抗原結合部位に対応する可変ドメインと結合する前記Ｆｖポリペプチドの前記Ｃ末端で少なくともさらなる（第四の）可変ドメインとを有する。ある特定の実施形態において、前記多価Ｆｖ抗体の前記少なくとも四つの抗原結合部位は二つのＦｖポリペプチド間で形成され、他の実施形態では、前記少なくとも四つの抗原結合部位は単一のＦｖポリペプチドの分子内フォールディングによって形成される。
【００１２】
したがって、ある特定の実施形態において、同じポリペプチド内で前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に対してＮ末端およびＣ末端で連結した前記他の可変ドメインの各々はさらなる抗原結合部位の一部である。したがって、前記ダイアボディ単位の一個の可変ドメイン対（第一対）は、二つの抗原結合部位（第一および第二抗原結合部位）に対して前記ダイアボディ単位の前記他の可変ドメイン対（第二対）と結合し、そして前記さらなるＮ末端に位置する可変ドメインは、第三抗原結合部位に対応する可変ドメインと結合し、そして前記Ｃ末端に位置するさらなる可変ドメインは第四抗原結合部位に対応する可変ドメインと結合する。したがって、そのような多価Ｆｖ抗体は少なくとも四価である。ある特定の実施形態において、前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対のＮ末端および／またはＣ末端に連結された前記さらなる可変ドメインを含むこの抗原結合部位はｓｃＦｖ単位すなわち一本鎖ダイアボディ単位（ｓｃＤｂ）である。他の実施形態では、同じポリペプチド（第一ポリペプチド）において前記ダイアボディ単位の前記可変ドメイン対に対してＮ末端およびＣ末端に連結された前記さらなる可変ドメインは、前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記第二の（他の）対を含む別のポリペプチド（第二ポリペプチド）の対応するＶＨまたはＶＬドメインと結合し、それによって二つの（第一および第二）ポリペプチドの前記可変ドメイン間の別の二つのＶＨ／ＶＬ（第三および第四）抗原結合部位を形成する。
【００１３】
ある特定の実施形態において、前記ダイアボディ単位の前記二個の可変ドメイン対は、ポリペプチドにおいて次々に連結した可変軽鎖ドメイン対（ＶＬ−ＶＬ）およびポリペプチドにおいて次々に連結した可変重鎖対（ＶＨ−ＶＨ）であり、ＶＬ−ＶＬ対およびＶＨ−ＶＨ対は、二つのＶＬ／ＶＨ（第一および第二）抗原結合部位と結合する。
【００１４】
ある特定の実施形態において、前記多価抗体分子は、ダイアボディ単位、すなわち、次々に連結された少なくとも六個の可変ドメイン、例えば６、８または１０のドメインを有するポリペプチド鎖中に組み込まれた、前記ダイアボディ単位の可変ドメイン対を含む。
【００１５】
前記ダイアボディ単位は、次々に連結された１対の二個の可変ドメインから構成され、したがって、これらのドメインは分子内で折り畳まれて機能的Ｆｖ単位、すなわち、ＶＨ／ＶＬ抗原結合単位とすることができず、その代わりに、次々に連結された二個の可変ドメインの別の対と結合して、二つの抗原結合部位を提供する二価ダイマー、すなわちダイアボディを形成する。可変軽鎖ドメイン対（ＶＬ−ＶＬ）を次々に連結し、可変重鎖ドメイン対（ＶＨ−ＶＨ）を次々に連結することによって、同じ種類のドメイン、すなわちＶＨ−ＶＨまたはＶＬ−ＶＬのために各対内の前記ドメインの分子内対形成が防止される。前記ダイアボディ単位の硬質かつコンパクトな構造は、前記多価抗体の前記製造、正しいフォールディングを促進し、前記抗体の前記安定性を増大させる。そのようなダイアボディ単位は、二つの非共有結合したＶＨおよびＶＬドメインによって前記抗体分子内に二つのＶＨ／ＶＬ抗原結合部位を生成し、このことは、さらにコンパクトな分子をもたらすので、前記抗体分子の前記安定性にとって有利である。ある特定の実施形態において、二個の可変ドメインの前記対は短いリンカーによって連結される。
【００１６】
ある特定の例では、二つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが前記ダイアボディ単位に対して遠位に結合して、二つのさらなるＶＨ／ＶＬ抗原結合部位を提供する（図１および２）。したがって、そのような多価抗体分子は少なくとも四つの抗原結合部位、すなわち前記ダイアボディ単位による二つと、前記二つのｓｃＦｖ単位による二つを提供するので、少なくとも四価である。遠位に位置するｓｃＦｖフラグメントの各々は、前記ポリペプチド内でＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順で配置されていてもよい。
【００１７】
そのような四価抗体分子は四価、五価または六価三重特異性抗体を生成するために有利である。これらの新規三重特異性抗体は、例えば、免疫エフェクター細胞を動員して標的細胞、例えば腫瘍細胞、またはウイルス感染した細胞を殺滅するために使用することができる。本発明によるそのような三重特異性抗体は少なくとも四価であるので、それらは三価三重特異性一本鎖フラグメントと比較して増加した機能活性を提供する。本発明の三重特異性四価抗体は、前記四つの結合部位のうちの二つによって前記標的細胞ならびに前記免疫エフェクター細胞の両方に二価的に結合する。例えば、前記標的細胞に対する二価結合は、前記３つの抗原特異性のうちの二つが前記標的細胞の前記細胞表面上の二つの異なる抗原、例えば二つの異なる腫瘍抗原に対するものである場合、前記結合活性を増大させるだけでなく、前記標的化特異性も増大させる。一方、前記抗体が前記免疫エフェクター細胞に二価的に結合する場合、前記動員された免疫エフェクター細胞の前記細胞毒性効率を調節することができ、特に増大させることができる。他の例では、そのような三重特異性抗体は前記エフェクター細胞上の異なる抗原について二つの特異性と、腫瘍細胞、ニューロン、もしくはウイルス感染した細胞上の抗原に対する第三の特異性とを有し得るか、または成長因子、サイトカインもしくは他の非細胞結合リガンドのような可溶性タンパク質と結合し、最終的には中和し得る。
【００１８】
ある場合には、分子内対形成を防止する短いリンカーによって連結された前記ダイアボディ単位の前記可変ドメインはどちらも、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ−ＶＬ）または可変重鎖ドメイン（ＶＨ−ＶＨ）のいずれかである（図１および２）。この特定のドメイン配置は本発明による多重特異性多価抗体分子の正しいフォールディングを促進することが判明した。特に、四価、三重特異性または四重特異性Ｆｖ抗体分子について、３以上の異なる特異性の可変ドメインを有するＦｖ抗体分子の正しい結合を可能にするため、そして第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの正しいヘテロダイマー化のかわりに単一のポリペプチド（モノマー）内の正しくない結合または二つの同じＦｖポリペプチド間のホモダイマー化を防止するためにこの手段をとることができる（実施例２）。本発明者らは、３つの特異性の可変ドメインと二つの異なるポリペプチド間の正しい結合を得、三重特異性抗体分子中に、短いリンカーによって連結された二つの対応する可変軽ドメインの第二対と結合した短いリンカーによって連結した二つの可変重ドメインの第一対によって形成されたダイアボディ単位を導入することによって前記可変ドメインを提供する。したがって、前記ダイアボディ単位中のそのような可変ドメイン配置、すなわち、可変ドメインの前記第一ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬおよび可変ドメインの前記第二ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨは、四価三重特異性または四重特異性Ｆｖ抗体の前記正しい結合およびフォールディングを可能にする。本発明者らは、前記ダイアボディ単位または一本鎖ダイアボディ単位におけるそのようなＶＬ−ＶＬ／ＶＨ−ＶＨ配置が、次々にＦｖ抗体分子に連結した６超の可変ドメインを含む長いポリペプチドの前記正しいフォールディング（例えば、図１）または異なる長さを有する二つのポリペプチドの機能的ダイマーＦｖ抗体分子への前記正しいフォールディングおよびヘテロダイマー化を推し進めることを見出した（例えば、図２、５、６ａ、６ｂ）。
【００１９】
さらなる実施形態において、少なくとも一つの一本鎖ダイアボディ単位（ｓｃＤｂ）はダイアボディ単位に対して遠位に結合して、少なくとも一つのさらなる抗原結合部位を提供する。したがって、ダイアボディ単位の少なくとも一つのポリペプチドは前記ポリペプチド中の少なくとも一つのｓｃＤｂに連結された前記ダイアボディ単位の一つの前記可変ドメイン対を含む。例えば、二つのｓｃＤｂ単位は前記ダイアボディ単位に対して遠位に連結され、一本鎖ダイアボディ単位あたりさらに二つの抗原結合部位を提供する（図４および５）。したがって、そのような多価抗体分子は、少なくとも四つの抗原結合部位を提供するので、少なくとも四価である。そのような多価抗体は、少なくとも二つのｓｃＤｂ単位が前記ダイアボディ単位に連結されている実施形態では、四つの抗原結合部位を提供する前記二つの遠位に配向したｓｃＤｂ単位および前記ダイアボディ単位によって提供される二つの抗原結合部位のために、少なくとも六価である。前記遠位のｓｃＤｂ単位の各々において、前記可変ドメインは、前記ポリペプチドにおいてＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬの順で配置されていてもよい。
【００２０】
ある特定の実施形態において、前記ダイアボディ単位は、互いに結合した二つのポリペプチド上に配置された二個の可変ドメイン対からなり、それによって二つの抗原結合部位を形成し、そして前記二つのポリペプチドの各々は、前記ダイアボディ単位の二個の可変ドメイン対の各々に対して遠位に位置する少なくとも一つの他の一本鎖フラグメントおよび／または一本鎖ダイアボディフラグメントを含む。（図６Ａ、６ｂ、７、８ａおよび８ｂ）。したがって、そのような多価抗体分子は、少なくとも５つの抗原結合部位、前記ダイアボディ単位による二つの結合部位、前記ダイアボディ単位の可変ドメインの第一対に対してＮ末端およびＣ末端の前記二つのｓｃＦｖ単位またはｓｃＤｂ単位による少なくとも二つの結合部位および前記ダイアボディ単位の前記他のポリペプチドの前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記他の対に対してＮ末端またはＣ末端の少なくとも一つの結合部位を提供するので、少なくとも七価である。
【００２１】
ある場合には、本発明は、次々に連結した少なくとも六個の可変ドメインを含むポリペプチドを含む多価抗体分子に関し、ここで、前記少なくとも六個の可変ドメインの最初の二個の可変ドメインを含むダイアボディ単位は前記ポリペプチド中に組み込まれ、前記ダイアボディ単位の前記最初の二個の可変ドメインは、前記ダイアボディ単位の別の二個の可変ドメイン、すなわち第二の二個の可変ドメインと結合して、二つの抗原結合部位を形成する。前記第二の二個の可変ドメインは、前記最初の二個の可変ドメインを有する同じポリペプチド中に位置し得るか、または前記第一ポリペプチドと結合した別の第二ポリペプチド中に位置し得る。前記ダイアボディ単位によって提供される前記二つの抗原結合部位は、前記第一可変ドメインと第二可変ドメインとの間で形成され、前記第一対の可変ドメインの各可変ドメインは、可変ドメインの前記第二対の別の可変ドメインと抗原結合部位を形成する。したがって、前記ダイアボディ単位は、前記第一および第二の二個の可変ドメインによって形成され、前記二個の可変ドメインは、分子内対形成を防止するために、前記第一ならびに前記第二の二個の可変ドメイン中で短いペプチドリンカーによって連結されている。
【００２２】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、次々に連結された少なくとも六個の可変ドメインを有する、すなわち含む、ポリペプチドを含む多価抗体分子に関し、前記ポリペプチドの二個の可変ドメインは分子内対形成を防止するペプチドリンカーによって連結され、前記二個の可変ドメインは分子内対形成を防止するペプチドリンカーによって連結された別の二つの対応する可変ドメインと結合し、前記四個の可変ドメインは前記四個の可変ドメイン間で二つの抗原結合部位を形成する。例えば、そのような抗体はＦｖ抗体であり、特に四価三重特異性Ｆｖ抗体である。
【００２３】
抗体分子は多価である、すなわち、複数の抗原結合部位を有する。四つの抗原結合部位を有する場合は四価であり、５つの抗原結合部位を有する場合は五価であり、そして六つの抗原結合部位を有する場合は六価である。「四価」は、四つのＦｖ抗原結合部位を含む抗体分子、特に四つのＦｖ抗原結合部位から構成される抗体分子を指し、Ｆｖ抗原結合部位の各々は互いに結合した同じ抗原エピトープ特異性の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有するＶＨ／ＶＬ対を含む。したがって、そのような四価抗体分子は少なくとも８つの可変抗体ドメイン、すなわち四つの可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび四つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。四価抗原結合分子は少なくとも８つの抗体可変ドメインを含むので、その分子量は１００ｋＤａ超であり、この結果、三価三重特異性一本鎖Ｆｖ分子と比較してそのような分子の半減期は長くなる。
【００２４】
ある場合には、前記抗体分子は多重特異性であり、すなわち、異なる抗原エピトープに対する特異性を有する。ある場合には、前記抗体分子は三重特異性である。
【００２５】
三重特異性四価抗体分子は、第一抗原エピトープに対する特異性を有する抗原結合部位、第二抗原エピトープに対する特異性を有する抗原結合部位および第三抗原エピトープに対する特異性を有する二つの抗原結合部位を含む。したがって、そのような三重特異性四価抗体分子は、３つの異なる抗原エピトープについて異なる特異性を有する、すなわち、含む。例えば、そのような抗原結合分子は、第一抗原エピトープに対する特異性を有する第一抗原結合部位、第二抗原エピトープに対する特異性を有する第二抗原結合部位、第三抗原エピトープに対する特異性を有する第三および第四抗原結合部位を含む。五価三重特異性抗体分子は、第一抗原エピトープに対する特異性を有する二つの抗原結合部位、第二抗原エピトープに対する特異性を有する二つの抗原結合部位および第三抗原エピトープに対する特異性を有する一つの抗原結合部位を含む。あるいは、五価三重特異性抗体分子は、第一抗原エピトープに対する３つの抗原結合部位ならびに第二および第三抗原エピトープの各々に対する一つの抗原結合部位を含み得る。六価三重特異性抗体分子は、ある特定の実施形態において、３つの抗原エピトープの各々についての二つの抗原結合部位、または３つの抗原エピトープの各々についての１〜３つの抗原結合部位を含む。
【００２６】
ある場合には、前記抗体分子はＦｖ抗体分子である。「Ｆｖ抗体」とは、可変（Ｖ）抗体ドメインだけを含むが、定常抗体領域またはそのフラグメントのない免疫グロブリンのＦｖ誘導体を指す。各可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）は、対応する可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と結合して、Ｆｖ抗原結合部位（ＶＨ／ＶＬ抗原結合部位）を形成する。前記可変抗体ドメインはペプチドリンカーまたはペプチド結合によって互いに連結されて、融合ポリペプチドとなる。本発明による前記Ｆｖ抗体、すなわち抗原結合分子は、単一のポリペプチドまたはマルチマーポリペプチドのモノマーであり得る。マルチマー抗原結合分子、すなわちＦｖ抗体、特に多価Ｆｖ抗体は、例えば、二つのポリペプチドを有するダイマー、３つのポリペプチドを有するトリマーまたは四つのポリペプチドを有するテトラマーであり得る。ダイマーは、異なるアミノ酸組成を有する二つのポリペプチドから構成される場合はヘテロダイマーであり、二つの同じポリペプチドから構成される場合はホモダイマーである。
【００２７】
「ポリペプチド」という語は、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。前記ポリペプチドは、好ましくは分岐していない一本鎖融合タンパク質である。前記ポリペプチド内で、前記抗体可変（Ｆｖ）ドメインは次々に連結される。「Ｆｖポリペプチド」は、抗体可変（Ｆｖ）ドメインが次々に連結した融合ポリペプチドを意味する。前記ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に加えて連続したアミノ酸残基を有していてもよい。例えば、前記ポリペプチドは、Ｔａｇ配列を、好ましくはＣ末端で含んでいてもよく、これは前記ポリペプチドの精製ならびに検出に有用であり得る。Ｔａｇ配列の例は、Ｈｉｓタグ、例えば六つのＨｉｓ残基から構成されるＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、例えばＤＹＫＤＤＤＤＫオクタペプチド（配列番号３８）またはＳＴＲＥＰ（登録商標）ＩＩタグ、例えばＷＳＨＰＱＦＥＫオクタペプチド（配列番号３９））、またはＣタグ、例えばＥＰＥＡテトラペプチド（配列番号４０）である。マルチマー抗原結合分子に関して、異なるＴａｇ配列を異なるポリペプチドについて使用することができ、例えば前記ダイマー分子の前記第一ポリペプチドに対してＨｉｓタグを、そして前記第二ポリペプチドに対してＦＬＡＧタグを使用できる。ある特定の実施形態において、前記ポリペプチドは、前記抗原結合部位を提供する可変ドメインおよびさらなる定常抗体ドメイン、例えばＣＬ、ＣＨおよび／またはＦｃ−ドメインを含んでもよい。例えば、そのような実施形態は、少なくとも一つの定常抗体ドメイン、例えばＦｃドメインに融合したＦｖポリペプチドまたはＦｖ抗体を含んでもよい。さらなる実施形態において、前記可変ドメインを含む前記ポリペプチドは別の作用物質、例えば毒素、免疫調節剤またはシグナル発生剤と連結されていてもよい。
【００２８】
「リンカー」とは、一方のドメインの前記Ｃ末端と前記他方の並置ドメインの前記Ｎ末端との間の前記ポリペプチドにおける二つの並置可変ドメインを結合するか、またはその逆のペプチドを指す。アミノ酸組成に関して、ペプチドは、Ｆｖ抗原結合部位、すなわちＶＨ／ＶＬ抗原結合部位の形成を妨害しないように、また多重特異性分子、例えば三重特異性分子のマルチマー化、例えばダイマー化を妨害しないように選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基を含むリンカーは、概して、プロテアーゼ耐性を提供する。いくつかの実施形態では、（Ｇ２Ｓ）Ｘペプチドリンカーが使用され、式中、例えばｘ＝１〜２０であり、例えば（Ｇ２Ｓ）、（Ｇ２Ｓ）２、（Ｇ２Ｓ）３、（Ｇ２Ｓ）４、（Ｇ２Ｓ）５、（Ｇ２Ｓ）６、（Ｇ２Ｓ）７または（Ｇ２Ｓ）８であるか、または（Ｇ３Ｓ）Ｘペプチドリンカーが使用され、式中、例えばｘ＝１〜１５であるか、または（Ｇ４Ｓ）Ｘペプチドリンカーが使用され、式中、例えばｘ＝１〜１０、好ましくは１〜６である。前記リンカーの前記アミノ酸配列は、例えばファージディスプレイ法によって最適化して前記抗原結合および前記ポリペプチドの産生収率を改善することができる。
【００２９】
前記リンカーの長さは、前記抗原結合ポリペプチドダイマーの柔軟性に影響を及ぼす。前記抗原結合ポリペプチドダイマーの所望の柔軟性は、前記標的抗原密度および前記標的抗原のアクセシビリティ、すなわち前記標的抗原上のエピトープに依存する。リンカーが長いほど、より活性な抗原結合部位を有するより柔軟な抗原結合ポリペプチドが得られる。ダイマー抗原結合ポリペプチドの形成に対するリンカー長さの影響は、例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１２１７−１２２６；Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １７：３５７−３６６および国際特許公開第９４／１３８０４号パンフレットで記載されている。
【００３０】
ダイアボディ単位は前記抗体分子の前記ポリペプチドに組み入れられる。「ダイアボディ単位」は、二つのＶＬ／ＶＨ抗原結合部位に結合する二対の可変ドメインである第一対および第二対から構成される二価Ｆｖモジュールを意味する。可変ドメインの各対は、ポリペプチド中で次々に連結される。ある特定の実施形態において、前記二価Ｆｖモジュールは、二つの並置可変ドメインの第一および第二対から構成され、各対において、前記二個の可変ドメインは短いペプチドリンカーによって融合され、これは、前記短いリンカーによって結合された前記可変ドメイン間の分子内結合を排除する。可変ドメインの前記第一対を、前記二個の可変ドメイン対と二つのＦｖ抗原結合部位を形成するために可変ドメインの前記第二対と結合させる。したがって、前記二つのＦｖ抗原結合部位の各々は、可変ドメインの前記第一対の一個の可変ドメインと、可変ドメインの前記第二対の一個の可変ドメインとによって形成される。したがって、そのようなダイアボディ単位は、短いペプチドリンカー３，３ａによって直接結合しない二個の可変ドメインの少なくとも一つの抗原結合部位を含む（図１および２）。二対の並置可変ドメインは、二つの隔てられたポリペプチド上にあってダイマーダイアボディ単位を形成するか（図２、３、５〜８）または前記二対の並置可変ドメインは前記同じポリペプチド上にあって一本鎖ダイアボディ単位を形成する（図１、４）。可変ドメインの各対において、前記短いリンカー３、３ａは一個の可変ドメインの前記Ｃ末端を他の可変ドメインの前記Ｎ末端と結合するか、またはその逆である。各対において、前記可変ドメインは、ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、ＶＨ−ＶＨまたはＶＬ−ＶＬのように前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ配向されていてもよく、この場合、前記対の前記二個の可変ドメインは、異なる抗原エピトープ特異性または同じ抗原エピトープ特異性を有する。ある場合には、前記二個の可変ドメインは、前記対の一個の可変ドメインの前記Ｎ末端と他の可変ドメインの前記Ｃ末端との間でペプチド結合によって直接連結される。前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記第一および第二対の各々の前記二個の可変ドメインを結合する前記短いペプチドリンカーの長さは、前記リンカーによって結合された前記可変ドメイン間の分子内結合が除外されるようなものである。そのようなリンカーは「短い」、すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または約１２個のアミノ酸残基から構成される。０個のアミノ酸残基の場合、前記リンカーはペプチド結合である。そのような短いリンカーは、前記二対の可変ドメイン間の正しいダイマー化および二つのＦｖ抗原結合部位の形成に好都合である。前記リンカーを約１２以下のアミノ酸残基に短縮することで、概して、同じポリペプチド鎖の隣接するドメインが互いに相互作用するのを防止する。本発明の実施形態において、これらのリンカーは、約３〜約１２個、例えば５〜１０個、特に７〜９個の連続アミノ酸残基から構成される。前記リンカー長さは、前記ダイアボディ単位内の前記特定のドメインの配向に対して調節することができる。例えば、（Ｇ２Ｓ）２リンカーをダイアボディ単位のＶＨ−ＶＬ対もしくはＶＬ−ＶＨ対に対して使用することができ、そして（Ｇ２Ｓ）３リンカーをＶＨ−ＶＨ対もしくはＶＬ−ＶＬ対に対して使用することができ、あるいは（Ｇ２Ｓ）２リンカーをＶＨ−ＶＨ対に対して使用することができ、そして（Ｇ２Ｓ）３リンカーをＶＬ−ＶＬ対に対して使用することができる（またはその逆）。その上、原則として、前記対の前記可変抗体ドメイン間の１２を超えるアミノ酸残基を有するリンカーを有する二つのポリペプチドが互いに正しくダイマー化することが可能である（例えば、Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １７：３５７−３６６を参照のこと）。
【００３１】
ある特定の実施形態において、前記ダイアボディ単位は一本鎖ダイアボディ単位である（図１）。「一本鎖ダイアボディ単位」は、ｓｃＦｖ単位で使用され、次の段落で記載されている「長いリンカー」として定義されるような可変ドメインの前記第一および第二対の分子内結合を可能にする長いリンカーによって可変ドメインの第二対に結合される可変ドメインの第一対から構成される。例えば、そのような長いリンカーは、１２超、特に約１５〜約５０、好ましくは約１５〜約３５、特に約１５〜約２５の連続アミノ酸残基から構成され得る。
【００３２】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドにおいて次々に連結した前記一本鎖ダイアボディの前記ドメインは、前記一本鎖ダイアボディ単位の前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬの順で配列されていてもよい。
【００３３】
ある特定の実施形態において、本発明の前記抗体分子は、一本鎖ダイアボディ単位を含む単一のポリペプチドから構成される（図１、４）。特定の実施形態では、前記抗体分子は、ポリペプチドにおいて次々に連結した少なくとも３つの一本鎖ダイアボディ単位を含む（図４）。他の実施形態では、本発明の前記抗体分子は、ダイアボディ単位に遠位で連結された少なくとも一つの一本鎖ダイアボディ単位を含む（図５）。
【００３４】
「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）単位」は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）と可変重鎖ドメイン（ＶＨ）とから構成される単一のポリペプチドのフラグメントによって形成されるＦｖ抗原結合部位を意味する。前記可変ドメインは、前記ｓｃＦｖ単位の前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬとして配向されていてもよい。前記可変ドメインは、ペプチドリンカーによって、一個の可変ドメインのＣ末端と他の可変ドメインのＮ末端との間に接続されるか、または、その逆である。前記ペプチドリンカーは分子内のフォールディングおよび前記Ｆｖ抗原結合部位の形成のために、長くかつ柔軟性である（概して、約１２以上のアミノ酸残基から構成される）。さらなるアミノ酸残基はさらなる柔軟性を提供する。例えば、そのような長いリンカーは、１２超、特に約１５から約５０、好ましくは約１５〜約３５、特に約１５〜約２５の連続したアミノ酸残基から構成され得る。前記リンカーの長さは、前記ｓｃＦｖ単位内で前記Ｎ末端から前記Ｃ末端への特定のドメイン配向に調節することができる。例えば、（Ｇ２Ｓ）６リンカーをＶＨ−ＶＬｓｃＦｖ単位に使用することができ、そして（Ｇ２Ｓ）７リンカーをＶＬ−ＶＨｓｃＦｖ単位に使用することができる。
【００３５】
前記ｓｃＦｖ単位は、前記ｓｃＦｖ単位の可変ドメインと前記ダイアボディ単位の可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって前記ダイアボディ単位に接続される。前記ペプチドリンカーの長さは、並列可変ドメイン間の立体障害を回避するため、および、前記分子の安定性を維持するために選択され、そして例えば、５〜５０、特に５〜３５であり得、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の連続したアミノ酸残基を有する。
【００３６】
ある場合には、前記ダイアボディ単位は、前記フォールディングを促進し、前記抗体分子の前記安定性を改善するために、前記抗体分子内の中央に位置する。そのような場合、前記ダイアボディ単位はさらなる遠位の可変ドメインとＮ末端およびＣ末端で接続している。ある特定の実施形態において、前記ダイアボディ単位は、二つ（図１、２、８ａ、８ｂ）、３つ（図６ａ、６ｂ）または四つ（図７）のｓｃＦｖ単位と接続している。ある場合には、前記抗体分子、特に、三重特異性Ｆｖ抗体分子は少なくとも六個の可変ドメインを有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、前記Ｎ末端でｓｃＦｖ単位を、前記Ｃ末端でｓｃＦｖ単位を、そして、二つのｓｃＦｖ単位間に位置するダイアボディ単位の二個の可変ドメインの第一対を含む（図１および２）。前記ダイアボディ単位の二個の可変ドメインのこの第一対は、Ｆｖ抗原結合部位と会合しない。例えば、前記ダイアボディ単位がダイマーダイアボディ単位である場合、並置可変ドメインの前記第一対の前記二個の可変ドメインの各々は、さらなる可変ドメインに連結されている。特に、並置可変ドメインの第一対の前記二個の可変ドメインの各々は、ｓｃＦｖ単位のさらなる可変ドメインに連結される（図２）。さらなる例では、さらに、並置可変ドメインの第二対の可変ドメインの一方または両方をさらなる可変ドメインと連結させることができる（図６ａ、６ｂ、７）。前記ダイアボディ単位が一本鎖ダイアボディ単位である場合、並置可変ドメインの第一対はさらなる可変ドメインにＮ末端で連結し、並置可変ドメインの第二対はさらなる可変ドメインにＣ末端で連結する。特に、並置可変ドメインの第一対はｓｃＦｖ単位のさらなる可変ドメインにＮ末端で連結し、そして並置可変ドメインの第二対は別のｓｃＦｖ単位のさらなる可変ドメインにＣ末端で連結される（図１）。他の実施形態では、第一の一本鎖ダイアボディ単位の可変ドメインの第一対は、第二の一本鎖ダイアボディ単位のさらなる可変ドメインにＮ末端で連結し、そして、第一の一本鎖ダイアボディの可変ドメインの前記第二対は、第三の一本鎖ダイアボディ単位のさらなる可変ドメインにＣ末端で連結し、その結果、次々に連結した３つの一本鎖ダイアボディ単位を含むポリペプチドが得られる（図４）。さらなる例では、少なくとも一つのさらなる可変ドメインは並置可変ドメインの前記第一および前記第二対間に位置していてもよい。
【００３７】
前記ダイアボディ単位が一本鎖ダイアボディ単位であるいくつかの場合では、前記多価抗体は、このポリペプチドの他の二つの並置可変ドメイン、すなわち可変ドメインの前記第二対と結合した、２つの並置可変ドメイン対、すなわち並置可変ドメインの第一対を含む単一のポリペプチドから構成される（図１）。そのような抗体構造は、多重特異性、特に二重、三重、または四重特異的抗体を提供するために好ましい。ある特定の実施形態において、そのような多価、特に三重特異性Ｆｖ抗体は、前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ次々に連結した少なくとも八個の可変ドメイン、前記Ｎ末端でｓｃＦｖ単位を形成する第一および第二可変ドメインを有し、前記Ｎ末端の前記ｓｃＦｖ単位は、前記第三可変ドメインおよび前記第四可変ドメインを含むダイアボディ単位の可変ドメインの第一対の第三可変ドメインにＣ末端で連結し、前記第四可変ドメインは、第五および第六可変ドメインを含む前記ダイアボディ単位の可変ドメインの第二対の第五可変ドメインにＣ末端で連結し、前記第六可変ドメインは前記Ｃ末端でｓｃＦｖ単位の第七可変ドメインにＣ末端で連結し、そして前記ｓｃＦｖ単位は前記第七および第八可変ドメインによって形成される（図１）。前記可変ドメインは、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、例えば、以下の配向のうちの一つで配列していてもよい：ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ。特定の実施形態において、前記ダイアボディ単位の一個の可変ドメイン対はＶＨ−ＶＨの配向を有し、そして前記ダイアボディ単位の前記他の可変ドメイン対はＶＬ−ＶＬの配向を有する（図１）。
【００３８】
前記で説明した八個の可変ドメインを有する単一のポリペプチドから構成される抗体分子の四価実施形態は三重特異性抗体にとって好ましい。例えば、そのような三重特異性抗体は標的細胞、例えば腫瘍細胞に対する第一および第二抗原特異性を提供することができ、また免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に対する第三特異性を提供することができる。他の例では、そのような三重特異性抗体は、前記エフェクター細胞上の異なる抗原に対する二つの特異性と、腫瘍細胞上の抗原に対する第三の特異性とを有し得る。いくつかの実施形態において、前記二つの遠位ｓｃＦｖ単位は、前記標的細胞に対する第一および第二の特異性を有し得、前記二つのｓｃＦｖ単位間の前記ダイアボディ単位は免疫エフェクター細胞に対する特異性を有し得る；すなわち、前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一および前記第二可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第一特異性を有し；前記第三および前記第五可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対する前記第三の特異性を有し、前記第四および前記第六可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対する前記第三の特異性を有し、そして前記第七および前記第八可変ドメインは標的細胞に対する前記第二の特異性を有する（図１）。他の実施形態では、前記二つの遠位ｓｃＦｖ単位は前記免疫エフェクター細胞に対する特異性を有し得、そして前記ダイアボディ単位によって形成される前記二つの抗原結合部位は前記標的細胞に対する二つの異なる特異性を有し得る；すなわち、前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一および前記第二ならびに前記第七および第八可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有し、前記第三および前記第五可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第一特異性を有し、そして前記第四および前記第六可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第二特異性を有する。さらなる別の実施形態において、前記単一のポリペプチドは、８を超える可変ドメイン、例えば１０、１２またはそれ以上を含み得、また２を超えるｓｃＦｖ単位および／または１を超えるダイアボディ単位を含み得る。
【００３９】
さらなる実施形態において、一つのポリペプチドから構成される前記多価抗体分子は、次々に連結した３つの一本鎖ダイアボディ単位を含む（図４）。そのような抗体分子は、前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ次々に連結した少なくとも１２の可変ドメインを有する。特定の実施形態において、前記第二の一本鎖ダイアボディ単位の一個の可変ドメイン対はＶＨ−ＶＨの配向を有し、前記第二の一本鎖ダイアボディ単位の前記他の可変ドメイン対はＶＬ−ＶＬの配向を有する（図４）。そのような抗体分子は六価であり、１〜６の異なる抗原特異性、特に２または３の異なる抗原特異性の抗原結合部位を含み得る。
【００４０】
ある場合には、前記抗体分子、特にＦｖ抗体分子は、ダイマーダイアボディ単位の形式のダイアボディ単位を含む。そのような場合、前記抗体分子は二つのポリペプチドのダイマーであり、前記ダイアボディ単位の二つの並置可変ドメインの前記第一対は次々に連結した少なくとも六個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドに組み入れられ、並置可変ドメインの前記第一対は、第二ポリペプチド中の二つの並置可変ドメインの別の第二対と結合する。好ましくは、前記第一および第二ポリペプチドは非共有結合している（図２、３、５、６ａ、６ｂ、７、８ａおよび８ｂ８ｂ）。しかしながら、数例では、前記第一および第二ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または化学的リンカーによって共有結合していてもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記第一ポリペプチドは少なくとも六個の可変ドメインを含み、前記第二ポリペプチドは少なくとも二個の可変ドメインを含む（図２）。そのような実施形態において、前記第二ポリペプチドは前記ダイアボディ単位の一部であり、そして好ましくは、前記第一ポリペプチドに組み込まれた二つの並置可変ドメインの前記他の対と非共有的に結合している。前記第一ポリペプチド鎖が六個の可変ドメインから構成され、そして前記第二ポリペプチドが二個の可変ドメインから構成される実施形態では、前記可変ドメインは、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、例えば以下の配向で配置されていてもよい：ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ（第一ポリペプチド）およびＶＬ−ＶＬ（第二ポリペプチド）；ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ（第一ポリペプチド）およびＶＬ−ＶＬ（第二ポリペプチド）；ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ（第一ポリペプチド）およびＶＨ−ＶＨ（第二ポリペプチド）；ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ（第一ポリペプチド）およびＶＨ−ＶＨ（第二ポリペプチド）またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ（第一ポリペプチド）およびＶＨ−ＶＨ（第二ポリペプチド）。１対の二個の可変ドメインをＶＨ−ＶＨの配向で有し、そして前記二個の可変ドメインの前記他の対をＶＬ−ＶＬの配向で有するダイアボディ単位は、特に多重特異性、例えば三重特異性抗体分子の正しいフォールディングに好ましい。
【００４２】
前述のような少なくとも六個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドと少なくとも二個の可変ドメインを有する第二ポリペプチドとを含む抗体分子の四価実施形態は三重特異性抗体に好ましい。前記第一および前記第二ポリペプチドの異なるサイズのために、前記ポリペプチドは上清から容易に分離することができる。例えば、そのような三重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞に対する第一および第二特異性と、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に対する第三特異性を提供し得る。他の実施形態では、前記三重特異性抗体分子は第一および第二ウイルス抗原またはウイルス抗原エピトープに対する第一および第二特異性を提供し、そしてエフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に対する第三特異性を提供する。さらなる実施形態において、三重特異性抗体分子は、ウイルス抗原に対する第一特異性と、標的細胞上の抗原に対する第二特異性と、エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に対する第三特異性とを提供する。他の例では、そのような三重特異性抗体は、エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞またはＴ細胞に対する第一および第二特異性と、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の腫瘍抗原またはウイルス抗原に対する第三特異性とを有し得る。エフェクター細胞に対する前記第一および第二特異性は、同じ種類のエフェクター細胞上の同じ抗原の異なる抗原またはエピトープであり得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記第一ポリペプチドにおいて形成された前記二つの遠位ｓｃＦｖ単位は前記標的細胞に対する前記第一および第二特異性を有し得、そして前記二つのｓｃＦｖ単位間の、前記第一および第二ポリペプチドと形成された前記ダイアボディ単位は、免疫エフェクター細胞に対する特異性を有し得る；すなわち、前記第一ポリペプチドにおいて前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一および第二可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第一特異性を有し；前記第三および第四可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対する前記第三特異性を有し、前記第五および第六可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第二特異性を有し、そして前記第二ポリペプチドにおいて、前記第一および第二可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対する前記第三特異性を有する（図２）。他の実施形態では、六個の可変ドメインを有する前記第一ポリペプチドにおける前記二つの遠位ｓｃＦｖ単位は、前記免疫エフェクター細胞に対する特異性と、前記第一ポリペプチドの前記ダイアボディ単位によって形成された二つの抗原結合部位とを有し得、また第二ポリペプチドの前記二個の可変ドメインは前記標的細胞に対する二つの異なる特異性を有し得る；すなわち、前記第一ポリペプチドにおいて前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一および前記第二ならびに前記第五および前記第六可変ドメインは免疫エフェクター細胞に対する第三特異性を有し、前記第三可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第一特異性を有し、前記第四可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第二特異性を有し、そして前記第二ポリペプチドにおいて、前記第一可変ドメインは前記標的細胞の前記第二特異性に対する特異性を有し、前記第二可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第一特異性を有する。
【００４４】
さらなる実施形態において、前記第一ポリペプチドは少なくとも六個の可変ドメインを含み、前記第二ポリペプチドは四つ（図６ａ、６ｂ）または六つ（図７）の可変ドメインを含む。そのような実施形態において、前記第一ポリペプチドは前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記第一対を含み、前記第二ポリペプチドは前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記第二対を含み、これらは、好ましくは互いに非共有結合し、それによって前記第一ポリペプチドと第二ポリペプチドとの間の二つの抗原結合部位を形成する。前記第一ポリペプチド鎖が六個の可変ドメインから構成され、前記第二ポリペプチドが四個の可変ドメインから構成される実施形態において、前記第二ポリペプチド中の前記ダイアボディ単位の前記並置可変ドメイン対は、ｓｃＦｖ単位と連結されて、前記第二ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにさらなる抗原結合部位を提供する（図６ａ、６ｂ）。そのような実施形態は五価であり、１〜５の異なる抗原特異性、特に２または３の異なる抗原特異性の抗原結合部位を含み得る。前記第一ポリペプチドにおいて配向ＶＨ−ＶＨで１対の前記二個の可変ドメインと、前記第二ポリペプチドにおいて配向ＶＬ−ＶＬで前記二個の可変ドメインの前記他の対とを有するダイアボディ単位は、多重特異性、例えば三重特異性抗体分子の前記正しいフォールディングに好ましい。
【００４５】
前記第一ポリペプチド鎖が六個の可変ドメインから構成され、前記第二ポリペプチドが四個の可変ドメインから構成される別の実施形態において、前記第二ポリペプチド中の前記ダイアボディ単位の前記並置可変ドメイン対はｓｃＦｖ単位にＮ末端およびＣ末端に連結され、二つのさらなる抗原結合部位を提供する（図７）。そのような実施形態は六価であり、１〜６の異なる抗原特異性、特に２または３の異なる抗原特異性の抗原結合部位を含み得る。特定の実施形態では、前記ダイアボディ単位は前記第一ポリペプチドにおいて配向ＶＨ−ＶＨで１対の可変ドメインと、第二ポリペプチドにおいて配向ＶＬ−ＶＬで可変ドメインの他の対とを有する。さらなる別の実施形態において、前記多価Ｆｖ抗体分子、例えば、三重特異性Ｆｖ抗体分子は複数のダイマーダイアボディ単位を含み得る。そのような別の実施形態において、前記第一ポリペプチドは少なくとも六個の可変ドメインを含み得、そして前記第二ポリペプチドは四つ（図３）または六つ（図８ａ、８ｂ）の可変ドメインを含み得る。前記第一ポリペプチドが少なくとも六個の可変ドメインを含み、前記第二ポリペプチドが四個の可変ドメインを含む実施形態において、前記第二ポリペプチドの前記四つの並置可変ドメインは、前記第一ポリペプチドに組み入れられた対応する四つの並置可変ドメインと結合し、それによって二つの並置ダイアボディ単位のタンデムを形成する。前記第一ポリペプチドの残りの少なくとも二つのさらなる可変ドメインは、前記タンデムダイアボディ単位から遠位に位置し、そしてｓｃＦｖ単位を形成する（図８ａ、９ｂ）。前記第一ポリペプチドが六個の可変ドメインを含み、前記第二ポリペプチドが六個の可変ドメインを含む他の実施形態では、前記第一ポリペプチドの前記六個の可変ドメインは前記第二ポリペプチドの対応する六個の可変ドメインと結合し、それによって３つの並置ダイアボディ単位を形成する（図３）。各ポリペプチドが六個の可変ドメインを含む、第一および第二ポリペプチドから構成される前記後者の実施形態は、ホモダイマーの形式で三重特異性抗体を提供できるという利点を有する、すなわち、二つの同一のポリペプチドが互いに結合し、前記３つの抗原特異性の各々について二価結合を提供する。
【００４６】
ある場合には、四価三重特異性Ｆｖ抗体は、タンデムダイアボディによって提供される。そのような三重特異性Ｆｖ抗体分子は、第一および第二ポリペプチドから構成され、各ポリペプチドは、次々に連結された四個の可変ドメインを含む。そのようなＦｖ抗体分子において、前記リンカー長さは、前記分子が自身の上に折り返すことができないように前記可変ドメインの分子内対形成を排除するが、別のポリペプチドの相補性ドメインと対を形成させられる、すなわち結合させるようなものである。前記ドメインは、このダイマー化の間に対応するＶＨおよびＶＬドメインが互いに結合するように配置される。分子間共有結合が存在しないにもかかわらず、前記ダイマーはいったん形成されると非常に安定であり、変わらないままであり、モノマー形態に戻らない。いくつかの実施形態において、前記三重特異性Ｆｖ抗体分子はダイマーダイアボディ単位を含み、１対の二つの並置可変ドメインは配向ＶＨ−ＶＨを有し、そして二つの並置可変ドメインの他の対は配向ＶＬ−ＶＬを有する。前記ダイアボディ単位における前記可変ドメインのそのような配向は、前記二つの三重特異性ポリペプチドの前記正確な結合を促進する。特に、そのような配向は、二つの異なるポリペプチドのヘテロダイマーであるので、タンデムダイアボディの形式の三重特異性Ｆｖ抗体分子を可能にする。したがって、そのような配向は、前記三重特異性タンデムダイアボディの前記正しいヘテロダイマー化を有利に可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、前記三重特異性Ｆｖ抗体分子はタンデムダイアボディである（図３）。そのような三重特異性タンデムダイアボディにおいて、前記第一および第二ポリペプチドの前記可変ドメインは、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、例えば、以下の配向で配列していてもよい：ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ（第一ポリペプチド）およびＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ（第二ポリペプチド）またはその逆（図３）。タンデムダイアボディの形式のそのような三重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞に対する第一および第二特異性、ならびに免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に対する第三特異性を提供し得る。他の例では、そのような三重特異性抗体は、前記エフェクター細胞上の異なる抗原に対する二つの特異性と、腫瘍細胞上の抗原に対する第三特異性とを有し得る。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドにおいて外側に位置する前記可変ドメインは、前記標的細胞に対して前記第一および前記第二特異性を有し得、そして外側に位置する可変ドメイン間の前記ポリペプチドにおいて中心に位置する二個の可変ドメインは、免疫エフェクター細胞に対して第三特異性を有する；すなわち、前記第一ポリペプチドにおいて前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一可変ドメインは前記標的細胞に対して第一特異性を有し；前記第二および第三可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有し、前記第四可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第二特異性を有し、そして前記第二ポリペプチドにおいて、前記第一可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第二特異性を有し、前記第二および前記第三可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有し、そして前記第四可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第一特異性を有する（図３）。他の実施形態では、前記ポリペプチドにおいて外側に位置する前記可変ドメインは、免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有し得、そして前記外側に位置する可変ドメイン間の前記ポリペプチドにおいて中心に位置する前記二個の可変ドメインは、前記標的細胞に対して前記第一および前記第二特異性を有し得る；すなわち、前記第一ポリペプチドにおいて前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三エピトープ特異性を有し；前記第二可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第一特異性を有し、前記第三可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第二特異性を有し、前記第四可変ドメインは、前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有し、そして前記第二ポリペプチドにおいて、前記第一可変ドメインは、前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有し、前記第二可変ドメインは、前記標的細胞に対して前記第二特異性を有し、前記第三可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第一特異性を有し、そして前記第四可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有する。他の実施形態では、前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有する前記可変ドメインは、前記抗体分子において側方に位置し；すなわち、前記第一ポリペプチドにおいて前記Ｎ末端から前記Ｃ末端へ、前記第一および前記第二可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対する前記第三特異性を有し；前記第三可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第一特異性を有し、前記第四可変ドメインは前記標的細胞に対して前記第二特異性を有し、そして前記第二ポリペプチドにおいて、前記第一可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第二特異性を有し、前記第二可変ドメインは前記標的細胞に対する前記第一特異性を有し、そして前記第三および第四可変ドメインは前記免疫エフェクター細胞に対して前記第三特異性を有する。
【００４７】
さらなる実施形態において、前記タンデムダイアボディは、少なくとも一つのさらなる抗原結合ドメインと、特に前記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の少なくとも一つのｓｃＦｖ単位に結合される。好ましい実施形態において、前記タンデムダイアボディは、ペプチドリンカーによって前記少なくとも一つのｓｃＦｖ単位に結合される。特にそのような抗体分子は第一および第二ポリペプチドから構成され、両ポリペプチドは、六個の可変ドメインから構成され、そして前記第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドの各々は、各ポリペプチドのＮ末端（図８ｂ）または各ポリペプチドのＣ末端（図８ａ）のいずれかにｓｃＦｖ単位を含む。そのような抗体分子は六価であり、１〜６の異なる抗原特異性、特に２または３の異なる抗原特異性の抗原結合部位を含み得る。特定の実施形態では、前記抗体分子内で中心に位置するダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチドにおいて前記配向ＶＨ−ＶＨで可変ドメインの１対と、前記第二ポリペプチドにおいて前記配向ＶＬ−ＶＬで可変ドメインの他の対とを有する。ある場合には、前記多価抗体分子、特に本明細書中で記載するＦｖ抗体分子は、少なくとも三重特異性で、少なくとも四価の抗体分子である。そのような抗体分子は、同じ抗原エピトープに対する特異性を有する少なくとも二つの抗原結合部位を含む。それにより、前記結合活性は増加する、すなわち、前記抗原エピトープと前記抗原結合分子との間の前記相互作用強度が増加する。三重特異性抗体分子の前記結合活性は、本発明の前記五価および六価実施形態によってさらに増加し得る。五価分子は、三重特異性抗体の３つのエピトープ特異性のうちの二つについて少なくとも二つの結合部位を提供することができ、そして六価実施形態は、前記３つのエピトープ特異性の各々について二つの抗原結合部位を提供し得る。別法として、前記多重特異性、すなわち、特異性の数は、四価、五価および六価実施形態によって増加し得る。例えば、前記抗体分子は四重特異性であり得る。より高い結合活性の利点は、相互作用の安定性と標的上の保持の増大である。例えば、前記標的がＴ細胞またはＮＫ細胞などの細胞毒性免疫エフェクター細胞である場合、前記結合活性が高いほど、前記抗体分子の細胞毒性の可能性が増大し得る。別の例では、前記標的が腫瘍細胞である場合、前記結合活性が高いほど、前記標的上での保持時間が改善され、標的からのオフ率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が減少する。
【００４８】
本発明のある実施形態では、前記三重特異性四価Ｆｖ抗体分子は、同じ種類の腫瘍細胞の二つの異なる抗原エピトープに対して特異的な第一および第二抗原結合部位と、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原エピトープに対して特異的な第三および第四抗原結合部位とを含む。そのような抗体分子は、特定の種類の腫瘍細胞に対する増大した特異性ならびに結合活性をもたらし、また前記免疫エフェクター細胞上の受容体を活性化または阻害するための増加した結合活性をもたらし、この結果、有利には、前記抗原結合分子の特異的細胞毒性の可能性が増大する。二つの異なる腫瘍抗原エピトープに対する前記結合は、標的化特異性の増加をもたらし、またオフターゲットな毒性を減少させることによって、治療濃度域の拡大をもたらす。したがって、本発明は多重特異性抗体分子を提供し、これは好ましくは、エピトープ特異性の少なくとも一つに対して少なくとも二つの抗原結合部位、例えば１、２または３つのエピトープ特異性、すなわち標的に対して二つの結合部位を提供するため、結合活性および／または生物学的活性を増加させた。
【００４９】
重要なことには、構造の複雑性にもかかわらず、そのような本発明による多重特異性抗体分子、例えば三重特異性多価、例えば四価抗体分子は安定である。
【００５０】
他の例では、そのような多重特異性抗体、例えば三重特異性抗体は、前記エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞またはＴ細胞上の異なる抗原について二つの特異性、および腫瘍細胞上の抗原について第三特異性を有し得る。
【００５１】
したがって、本発明による前記抗体分子は、免疫エフェクター細胞の細胞毒性の可能性を変更して腫瘍細胞または感染性因子、例えば、ウイルス感染した細胞を破壊するための異なる方法で利用することができる。いくつかの実施形態において、前記多重特異性、例えば三重特異性抗体分子は標的上の二つの異なる抗原エピトープに結合することができる。例えば、前記二つの異なるエピトープは、同じ抗原上にあって、エスケープ変異体を防止するか、もしくは有効性を増強するか、あるいは前記二つのエピトープは前記標的の二つの異なる抗原上にあり得る。他の実施形態では、前記三重特異性抗体分子は免疫エフェクター細胞上の二つの異なる抗原エピトープと結合し得る。例えば、第一抗原結合部位は、活性化受容体、例えばＣＤ１６、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ３に対する特異性を有し、そして第二抗原結合部位は、同時刺激受容体、例えばＣＤ１３７、ＯＸ−４０またはＣＤ２８に対する特異性を有する。別の例では、第一抗原結合部位はＣＤ１６またはＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、そして第二抗原結合部位はＮＫ細胞上の別の活性化受容体、例えばＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ、ＮＣＲｓ）に対する特異性を有する。
【００５２】
別の実施形態において、前記三重特異性抗体分子、特にＦｖ抗体分子は、腫瘍細胞上の抗原エピトープに対する特異性を有する第一抗原結合部位と、免疫エフェクター細胞上の抗原エピトープに対する特異性を有する第二抗原結合部位と、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、マイトジェンおよびアルブミンの群から選択される可溶性タンパク質上の抗原エピトープに対する特異性を有する第三抗原結合部位とを有する。そのような可溶性タンパク質の例は、ＩＬ−６、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ−Ａ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ヘレグリン、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ）−２およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
【００５３】
別の実施形態において、前記抗体分子は、１種類の細胞上に存在する抗原の抗原エピトープに対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、１以上の他の種類の細胞上の抗原エピトープの特異性を有する３つの抗原結合部位とを有する。
【００５４】
「エフェクター細胞」は、細胞毒性、食作用、抗原提示またはサイトカイン放出を刺激または誘導し得る前記免疫系の細胞である。そのようなエフェクター細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、γδ（ｇｄ）Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）および抗原提示細胞であるが、これらに限定されるものではない。エフェクター細胞に対する好適な特異性の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２８および前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＣＤ１３４（ＯＸ４０）の他の成分；ＮＫ細胞については、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＮＫｐ８０、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ、ＮＣＲｓ；顆粒球については、ＣＤ１８、ＣＤ６４およびＣＤ８９；単球およびマクロファージについては、ＣＤ１８、ＣＤ３２、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ８９およびマンノース受容体；樹状細胞については、ＣＤ６４およびマンノース受容体；ならびにＣＤ３５が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のある特定の実施形態において、それらのエフェクター細胞の特異性、すなわち、細胞表面分子は、多重特異性、例えば三重特異性抗体分子をそのような細胞表面分子に対して結合させて細胞死滅を媒介し、それによって細胞溶解またはアポトーシスを誘導するために適している。
【００５５】
ＣＤ３抗原は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体の成分である。エフェクター細胞に対する特異性がＣＤ３である場合では、本発明による前記抗原結合分子のＣＤ３に対する前記結合によって、Ｔ細胞の前記細胞毒性活性が誘発される。前記抗体分子を、ＣＤ３および標的細胞、例えば腫瘍細胞に対して結合させることによって、前記標的細胞の細胞溶解を誘導することができる。
【００５６】
前記ＣＤ１６Ａ（ＦｘγＲＩＩＩＡ）抗原は、ＮＫ細胞の前記表面上で発現される受容体である。ＮＫ細胞は、固有の細胞溶解活性を有し、本発明の前記抗体分子のＣＤ１６またはＣＤ１６Ａに対する結合によって、前記標的に対するＮＫ細胞の前記細胞毒性活性を誘導することができる。
【００５７】
標的の例は、可溶性剤、細胞上の抗原、例えばデング熱ウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ由来のウイルスもしくは細菌抗原などの感染性因子、またはウイルスおよび細菌の侵入を促進する細胞上の抗原または抗原を提示する細胞、例えばニューロン、またはＩＬ−２／ＩＬ２Ｒなどの自己免疫標的、自己免疫マーカーもしくは自己免疫抗原を有する細胞または腫瘍細胞上の抗原である。前記抗原結合部位の少なくとも一つがエフェクター細胞に対する特異性を有する実施形態において、前記標的は、前記エフェクター細胞が、各生物学的応答、例えば免疫応答を誘導または誘発するように変更されるべき腫瘍細胞であり得る。
【００５８】
腫瘍細胞に対する好適な特異性は、前記各腫瘍細胞上の腫瘍抗原および細胞表面抗原、例えば特異的腫瘍マーカーであり得る。「腫瘍抗原」という語は、本明細書中で用いられる場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）を含む。「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、本明細書中で用いられる場合、腫瘍細胞上に存在し、また胎仔期中（腫瘍胎児抗原）の正常細胞上に存在し、そして誕生後に選択された器官中に存在するが、腫瘍細胞上よりもはるかに低い濃度であるが存在するタンパク質を指す。ＴＡＡはまた、腫瘍細胞の近傍で前記間質中にも存在し得るが、体内の他の箇所の前記間質ではより少量で発現され得る。対照的に、「腫瘍特異性抗原」（ＴＳＡ）という語は、腫瘍細胞によって発現されるタンパク質を指す。「細胞表面抗原」という語は、細胞の前記表面上の抗体によって認識され得る分子任意の抗原またはそのフラグメントを指す。
【００５９】
腫瘍細胞に対する特異性の例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ２００、ＣＤ２６７、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムゼン・フリードライヒ（ＴＦ）抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ｇｐＡ３３、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒα、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩ、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体およびＩｇＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
前記腫瘍特異性がＣＤ１９抗原に対するものである、本発明による抗体分子は、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法のために使用できる。なぜなら、ＣＤ１９抗原がリンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）から非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）までの実質的にすべてのＢ系列悪性腫瘍上で発現されるからである。
【００６１】
前記腫瘍特異性がＣＤ３０に対するものである本発明による抗体分子は、ホジキン病およびＴ細胞リンパ腫の治療で特に有用であり得る。
【００６２】
前記腫瘍特異性が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ変位体に対するものである本発明による抗体分子を、神経膠腫、胸部、卵巣、前立腺、肺、頭頸部の腫瘍；肝疾患、例えば、肝細胞癌、肝硬変または慢性肝炎の治療で使用することができる。
【００６３】
体内での本発明による前記抗体分子の血清半減期を増加させるために、前記抗体分子は、所望により、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合、またはペグ化、シアル化、パシル化（ｐａｓｙｌａｔｅｄ）もしくはグリコシル化させてもよい（例えば、Ｓｔｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８３：７８０４−７８１２を参照）。いくつかの実施形態において、前記抗体分子は少なくとも三重特異性であり、少なくとも一つ、例えば一つまたは二つの、アルブミン、例えばＨＳＡに対する特異性を有する抗原結合部位を含む。そのような少なくとも三重特異性抗体分子は、例えば、四価、五価または六価抗体分子であり得る。
【００６４】
標的細胞またはエフェクター細胞上のエピトープに対する特異性を有する可変ドメインは、関心対象の抗原に対して特異的である可変フラグメント（Ｆｖ）を選択することによって得ることができる。これは、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによるか、またはハイブリドーマ技術によって達成することができる。例えば、ヒトｓｃＦｖ配列のＩｇＭに基づくファージディスプレイライブラリーを数ラウンドのインビトロ選択に供して、前記所望の抗原に対して特異的であるバインダーについて濃縮することができる。選択されたｓｃＦｖｓの親和性は、親和性成熟によってさらに増加させることができる。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも一つ、好ましくは全部の抗体可変ドメインは、完全ヒト、ヒト化またはキメラドメインである。ヒト化抗体は、確立した方法、例えばＣＤＲグラフティング（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ；Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．  ＩＩ  Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照）によって産生することができる。したがって、当業者は、抗原結合分子および可変ドメインのヒト化または完全にヒト形を、非ヒト源から、例えばネズミまたは非霊長類源から、ヒト免疫系において前記免疫原性を減少させ、前記抗原結合分子の前記性能を改善するために当該技術分野で公知の標準的分子生物学的手法を用いて容易に作製することができる。本発明の好ましい実施形態において、すべての抗体可変ドメインはヒト化または完全にヒトであり、最も好ましくは、本発明による前記抗体分子はヒト化または完全にヒトである。「完全にヒト」という語は、本明細書中で用いられる場合、前記可変ドメインの前記アミノ酸配列および前記ポリペプチド中の前記可変ドメインを連結する前記ペプチドが、ヒト起源であるかまたはヒトにおいて見出すことができることを意味する。本発明のある特定の実施形態において、前記可変ドメインはヒトまたはヒト化であり得るが、前記抗体可変ドメインを連結する前記ペプチドはそうではない。
【００６６】
当業者は、過度の負担なしに、確立した技術および当該技術分野で公知の標準的方法によって本明細書中で記載する前記抗体分子を容易に構築し得ることができるであろう。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）  Ｎ．Ｙ．；  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｗａｌｋｅｒ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  （２００２）；  ｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ；  Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．  ＩＩ  Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．）；  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ／  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｏｌａｎｄ  Ｅ．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  （２０１０））を参照。
【００６７】
本明細書中で記載する実施形態のいずれか一つによる抗体分子は、抗体分子を形成する前記個々のポリペプチド鎖をコード化するポリヌクレオチドを発現することによって産生することができる。したがって、本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で上述するような抗体分子の前記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００６８】
前記ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法によって、例えばペプチドリンカーによって隔てられているか、または前記ポリペプチドのペプチド結合によって直接連結されている前記抗体可変ドメインをコード化する前記遺伝子を組み合わせて、好適なプロモーター、および場合によって好適な転写ターミネータに機能的に連結された遺伝的構築物にし、そしてそれを細菌または他の適切な発現系、例えばＣＨＯ細胞中で発現させることによって、構築することができる。用いられる前記ベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。前記プロモーターは、前記各宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を行うように選択される。
【００６９】
前記ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入することができ、これは本発明のさらなる実施形態である。これらの組換えベクターは、当業者に周知の方法にしたがって構築することができる。
【００７０】
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、本発明の前記ポリペプチド鎖をコード化する前記ポリヌクレオチドを含み、発現することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現用の発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（ＬｅＧａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  （２００４）  ２８５（ｌ）：１１１−２７）であるかまたは哺乳動物細胞における前記発現についてはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００７１】
したがって、本明細書中で記載する前記抗体分子は、本明細書中で上述するポリペプチドをコード化するベクターを宿主細胞に導入し、そして前記ポリペプチドが発現される条件下で前記宿主細胞を培養することによって産生することができ、単離することができ、そして場合によってはさらに精製することができる。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書中で上述した前記抗体分子と少なくとも一つのさらなる成分とを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【００７３】
さらなる実施形態において、前記抗体分子は薬剤または診断として使用するためのものである。特に、前記抗体分子は免疫療法で使用するためのものである。例えば、前記抗体分子は腫瘍、ウイルス性または神経変性疾患の治療で使用するためのものである。したがって、本発明は、免疫療法により個体を治療する方法をさらに含み、特に個体は、腫瘍、ウイルス性または神経変性疾患から選択される疾患を患っており、前記方法は、本発明による前記抗体分子を投与するステップを含む。
【００７４】
本発明は、前記抗体分子、特に、本明細書中で上述する抗体分子と少なくとも一つのさらなる成分とを含む組成物を有効量で対象、例えば患者に、癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、慢性リパ球性白血病）の前記治療のために投与する方法をさらに提供する。本発明による前記抗原結合分子は薬剤として使用するためのものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８まで前記配向ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨで次々に連結された８の可変ドメインを有する単一のポリペプチドから構成される四価三重特異性Ｆｖ抗原結合分子を示す。そのようなドメイン配向は一例にすぎず、前述のような他の配置が可能である。二つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）単位２が前記ペプチドリンカー５によって一本鎖ダイアボディ単位１に遠位で結合し、一つのｓｃＦｖ単位２の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインがＣ末端でペプチドリンカー５によって前記ダイアボディ単位１の可変ドメインの前記第一対の可変重鎖（ＶＨ）ドメインの前記Ｎ末端に連結されている。前記ｓｃＦｖ単位２の前記ＶＬは長いペプチドリンカー４によって前記ｓｃＦｖ単位の前記ＶＨとＮ末端で連結されている。可変ドメインの前記第一対の前記ＶＨは、短いペプチドリンカー３によって可変ドメインの前記第一対の別のＶＨドメインに連結されている。可変ドメインの前記第一対はＣ末端で長いペプチドリンカー４により前記ダイアボディの可変ドメインの前記第二対の前記Ｎ末端と連結され、これらはどちらもＶＬドメインである。可変ドメインの前記第二対の前記二つのＶＬドメインは短いペプチドリンカー３によって連結されている。前記ダイアボディの可変ドメインの前記第二対は、前記ポリペプチドの前記Ｃ末端で位置する別のｓｃＦｖ単位２のＶＬドメインの前記Ｎ末端とＣ末端で結合している。前記ポリペプチドの前記Ｃ末端での前記ｓｃＦｖ単位２は、ＶＨドメインと長いリンカー４によって連結した前記ＶＬドメインから構成される。前記二つのｓｃＦｖｓ単位２は、異なる特異性を有する抗原結合部位を有し、前記ダイアボディ単位１は前記同じ特異性に対する二つの抗原結合部位を有する。
【図２】図２は、配向ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨで第一ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８へ次々に連結した六個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドと、配向ＶＬ−ＶＬで第二ポリペプチドの前記Ｎ末端７ａから前記Ｃ末端８ａへ次々に連結した二個の可変ドメインを有する第二ポリペプチドとから構成される四価三重特異性Ｆｖ抗原結合分子を示す。そのようなドメイン配向は一例にすぎず、前述のような他の配置が可能である。前記Ｆｖ抗原結合分子は、前記第二ポリペプチド中で二個の可変ドメインの第二対と会合した第一ポリペプチド中に組み入れられた二個の可変ドメインの第一対によって形成されたダイマーダイアボディ単位１を含む。前記第一ポリペプチド中に組み入れられた二個の可変ドメインの前記第一対の前記二個の可変ドメインの各々が、ｓｃＦｖ単位２に連結されている。前記ｓｃＦｖ単位２の各々において、前記可変ドメインは長いペプチドリンカー４によって連結されている。前記Ｎ末端ｓｃＦｖ単位２は、前記ダイアボディ単位１の可変ドメインの前記第一対の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。この可変ドメインの第一対は、短いペプチドリンカー３によって連結された二つのＶＨドメインから構成されている。前記ダイアボディ単位１の可変ドメインの前記第一対は、前記第一ポリペプチドの前記Ｃ末端に位置するｓｃＦｖ単位２の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。前記二つのｓｃＦｖ単位２は異なる特異性を有する抗原結合部位を有し、前記ダイアボディ単位１は前記同じ特異性の二つの抗原結合部位を有する。
【図３】図３は、非共有結合したヘテロダイマーを形成する第一および第二ポリペプチドから構成される三重特異性タンデムダイアボディの形式の四価三重特異性Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記タンデムダイアボディは、前記第一ポリペプチド中の一対の中心に位置するＶＨ−ＶＨドメインと前記第二ポリペプチド中の一対の中心に位置するＶＬ−ＶＬドメインによって形成されたダイマーダイアボディ単位１を含む。前記第一および第二ポリペプチド中の前記可変ドメインは、前記第一ポリペプチドにおいて前記配向ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬで前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８まで、そして前記第二ポリペプチドにおいて前記配向ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨで前記Ｎ末端７ａから前記Ｃ末端８ａまで短いペプチドリンカー３、３ａによって次々に連結されている。前記Ｎ末端およびＣ末端に位置する可変ドメインは、前記Ｎ末端および前記Ｃ末端で異なる特異性を有する抗原結合部位を有し、そして前記中心のダイアボディ単位１は前記同じ特異性に対する二つの抗原結合部位を有する。
【図４】図４は、前記ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８へ次々に連結した１２の可変ドメインを有する単一のポリペプチドから構成される六価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記ドメイン配向は一例にすぎず、並置可変ドメインの各対について表示された他の配置が可能である。二つの一本鎖ダイアボディ単位１ａ、１ｂは前記ペプチドリンカー５によって一本鎖ダイアボディ単位１ｃに遠位で結合し、一つの一本鎖ダイアボディ単位１ａの可変ドメインはダイアボディ単位１ｃの可変ドメインの第一対の可変ドメインのＮ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結され、前記一本鎖ダイアボディ単位１ｂの可変ドメインは、一本鎖ダイアボディ単位１ｃの可変ドメインの前記第二対の前記Ｃ末端にリンカー５によってＮ末端で連結されている。前記３つの一本鎖ダイアボディ単位１ａ、１ｂ、１ｃの各々の可変ドメインの前記第一および第二対は長いペプチドリンカー４によって互いに連結されている。前記一本鎖ダイアボディ単位１ａ、１ｂ、１ｃの各々において、可変ドメインの前記第一対の前記可変ドメインの一つは、前記可変ドメインの第一対の前記他の可変ドメインに短いペプチドリンカー３によって連結され、そして可変ドメインの前記第二対の前記二個の可変ドメインは短いペプチドリンカー３によって連結されている。
【図５】図５は、前記第一ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８へ次々に連結した十個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドと、前記第二ポリペプチドの前記Ｎ末端７ａから前記Ｃ末端８ａへ次々に連結した二個の可変ドメインを有する第二ポリペプチドとから構成された六価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記図中の前記特定のドメイン配向は一例にすぎず、前記並置可変ドメイン対の各々について表示された前記他の配置が可能である。前記Ｆｖ抗原結合分子は、前記第二ポリペプチド中の二個の可変ドメインの第二対と結合した前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの第一対によって形成されたダイマーダイアボディ単位１０を含む。前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの前記第一対の前記二個の可変ドメインの各々は、一本鎖ダイアボディ単位１ａ、１ｂに連結されている。前記一本鎖ダイアボディ単位１ａ、１ｂの各々において、前記二対の並置可変ドメインは長いペプチドリンカー４によって連結されている。前記Ｎ末端一本鎖ダイアボディ単位１ａは、前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第一対の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。この可変ドメインの第一対は、短いペプチドリンカー３によって連結された二つのＶＨドメインから構成される。前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第一対は、前記第一ポリペプチドの前記Ｃ末端に位置する一本鎖ダイアボディ単位１ｂの前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。
【図６ａ】図６は、前記第一ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８へ次々と連結された六個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドと、前記第二ポリペプチドの前記Ｎ末端７ａから前記Ｃ末端８ａへ次々と連結された四個の可変ドメインを有する第二ポリペプチドとから構成される五価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記ドメイン配向は一例にすぎず、前記図面で示されるような可変ドメインの並置対の各々について他の配置が可能である。前記Ｆｖ抗原結合分子は、前記第二ポリペプチドにおいて二個の可変ドメインの第二対と結合した前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの第一対によって形成されるダイマーダイアボディ単位１０を含む。前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの前記第一対の二個の可変ドメインの各々は、ｓｃＦｖ単位２に連結されている。前記ｓｃＦｖ単位２の各々において、前記可変ドメインは長いペプチドリンカー４によって連結されている。前記Ｎ末端ｓｃＦｖ単位２は、前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第一対の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。この可変ドメインの第一対は、短いペプチドリンカー３によって連結された二個の可変ドメインから構成される。前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第一対は、前記第一ポリペプチドの前記Ｃ末端に位置するｓｃＦｖ単位２の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。Ａ）四個の可変ドメインを含む前記第二ポリペプチドは、ｓｃＦｖ単位２とＣ末端で連結された前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第二対から構成され、そしてＢ）四個の可変ドメインを含む前記第二ポリペプチドは、Ｎ末端でｓｃＦｖ単位２と連結された前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第二対から構成される。
【図６ｂ】図６は、前記第一ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８へ次々と連結された六個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドと、前記第二ポリペプチドの前記Ｎ末端７ａから前記Ｃ末端８ａへ次々と連結された四個の可変ドメインを有する第二ポリペプチドとから構成される五価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記ドメイン配向は一例にすぎず、前記図面で示されるような可変ドメインの並置対の各々について他の配置が可能である。前記Ｆｖ抗原結合分子は、前記第二ポリペプチドにおいて二個の可変ドメインの第二対と結合した前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの第一対によって形成されるダイマーダイアボディ単位１０を含む。前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの前記第一対の二個の可変ドメインの各々は、ｓｃＦｖ単位２に連結されている。前記ｓｃＦｖ単位２の各々において、前記可変ドメインは長いペプチドリンカー４によって連結されている。前記Ｎ末端ｓｃＦｖ単位２は、前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第一対の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。この可変ドメインの第一対は、短いペプチドリンカー３によって連結された二個の可変ドメインから構成される。前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第一対は、前記第一ポリペプチドの前記Ｃ末端に位置するｓｃＦｖ単位２の前記Ｎ末端にペプチドリンカー５によってＣ末端で連結されている。Ａ）四個の可変ドメインを含む前記第二ポリペプチドは、ｓｃＦｖ単位２とＣ末端で連結された前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第二対から構成され、そしてＢ）四個の可変ドメインを含む前記第二ポリペプチドは、Ｎ末端でｓｃＦｖ単位２と連結された前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインの前記第二対から構成される。
【図７】図７は、前記第一ポリペプチドの前記Ｎ末端７から前記Ｃ末端８へ次々と連結した六個の可変ドメインを有する第一ポリペプチドと、前記第二ポリペプチドの前記Ｎ末端７ａから前記Ｃ末端８ａへ次々に連結した六個の可変ドメインを有する第二ポリペプチドとから構成される六価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記ドメイン配向は一例にすぎず、前記図中に表示するような可変ドメインの各並置対について他の配置が可能である。前記Ｆｖ抗原結合分子は、前記第二ポリペプチドにおける二個の可変ドメインの第二対と結合した前記第一ポリペプチドの二個の可変ドメインの第一対によって形成されるダイマーダイアボディ単位１０を含む。前記ダイアボディ単位１０の前記可変ドメインの各々は、前記第一および第二ポリペプチドにおいてｓｃＦｖ単位２に連結されている。前記ｓｃＦｖ単位２の各々において、前記可変ドメインは長いペプチドリンカー４によって連結されている。四つのｓｃＦｖ単位２の各々は、前記ダイアボディ単位１０の可変ドメインにペプチドリンカー５によって連結されている。この可変ドメインの第一対は、短いペプチドリンカー３によって連結された二個の可変ドメインから構成され、前記ダイアボディ単位の可変ドメインの前記第二対は、短いリンカー３ａによって連結された二個の可変ドメインから構成される。
【図８ａ】図８は、非共有結合したダイマーを形成する第一および第二ポリペプチドから構成されるタンデムダイアボディ単位を含む六価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記タンデムダイアボディは、前記第一ポリペプチドにおいて中心に位置する一対の可変ドメインと第二ポリペプチドにおいて中心に位置する一対の可変ドメインとによって形成されるダイマーダイアボディ単位１０ａを含む。第一および第二ポリペプチド中の可変ドメインは、各ポリペプチドにおいてＮ末端７からＣ末端８へ短いペプチドリンカー３、３ａによって次々に連結されている。前記ドメイン配向は一例にすぎず、前記図に表示されるような可変ドメインの各並置対について他の配置が可能である。前記第一および第二ポリペプチドの各々は、前記タンデムダイアボディ単位にリンカー５によって連結されたｓｃＦｖ単位２を含む。Ａ）第一および第二ポリペプチドのＣ末端で連結したｓｃＦｖ単位２。Ｂ）第一および第二ポリペプチドのＮ末端で連結したｓｃＦｖ単位２。
【図８ｂ】図８は、非共有結合したダイマーを形成する第一および第二ポリペプチドから構成されるタンデムダイアボディ単位を含む六価Ｆｖ抗原結合分子を示す。前記タンデムダイアボディは、前記第一ポリペプチドにおいて中心に位置する一対の可変ドメインと第二ポリペプチドにおいて中心に位置する一対の可変ドメインとによって形成されるダイマーダイアボディ単位１０ａを含む。第一および第二ポリペプチド中の可変ドメインは、各ポリペプチドにおいてＮ末端７からＣ末端８へ短いペプチドリンカー３、３ａによって次々に連結されている。前記ドメイン配向は一例にすぎず、前記図に表示されるような可変ドメインの各並置対について他の配置が可能である。前記第一および第二ポリペプチドの各々は、前記タンデムダイアボディ単位にリンカー５によって連結されたｓｃＦｖ単位２を含む。Ａ）第一および第二ポリペプチドのＣ末端で連結したｓｃＦｖ単位２。Ｂ）第一および第二ポリペプチドのＮ末端で連結したｓｃＦｖ単位２。
【図９ａ】図９は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される（矢印）、ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図９ｂ】図９は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される（矢印）、ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図９ｃ】図９は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される（矢印）、ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図１０ａ】図１０は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＩＭＡＣ精製を示す：ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２およびｄ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図１０ｂ】図１０は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＩＭＡＣ精製を示す：ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２およびｄ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図１０ｃ】図１０は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＩＭＡＣ精製を示す：ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２およびｄ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図１０ｄ】図１０は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＩＭＡＣ精製を示す：ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０、ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびｃ）およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２およびｄ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９。
【図１１Ａ】図１１は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される。Ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１、Ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２、Ｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３およびＤ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４。
【図１１Ｂ】図１１は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される。Ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１、Ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２、Ｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３およびＤ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４。
【図１１Ｃ】図１１は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される。Ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１、Ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２、Ｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３およびＤ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４。
【図１１Ｄ】図１１は、ａＴｒｉＦｌｅｘ産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。長いポリペプチドおよび短いポリペプチドは充分に発現される。Ａ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１、Ｂ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２、Ｃ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３およびＤ）ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４。
【図１２】図１２は、三重特異性抗体分子のシングルポジティブまたはダブルポジティブな細胞株への結合を示す。シングルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０−ＲａｊｉおよびＣＤ１９−／ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞ならびにダブルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０＋ＭＥＣ−１を三重特異性抗体分子の逐次希釈で染色し、そして細胞表面結合抗体をｍＡｂ抗Ｈｉｓによって、続いてＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧによって検出した。フローサイトメトリーによって測定した平均蛍光強度を使用して、非線形回帰によってＫＤ値を算出した。三重特異性抗体分子のＫＤ値を２回の独立した実験で測定した。
【図１３】図１３は、シングルポジティブまたはダブルポジティブな標的細胞株上での三重特異性抗体分子の細胞毒性活性を示す。４ｈカルセイン放出細胞毒性アッセイは、シングルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０−ＲａｊｉおよびＣＤ１９−／ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞ならびにダブルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０＋ＭＥＣ−１標的細胞上で、濃縮ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用し、前記表示した三重特異性抗体分子の逐次希釈物の存在下で実施した。溶解した標的細胞から放出された前記蛍光カルセインを使用して、抗体介在性標的細胞溶解および非線形回帰によるＥＣ５０値の測定のためのシグモイド用量応答曲線のモデル化を計算した。ａＴｒｉＦｌｅｘ構築物のＥＣ５０値を２回の独立した実験で測定し、プロットした。
【実施例】
【００７６】
下記実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに説明する。
【００７７】
実施例１
三重特異性Ｆｖ抗原結合分子をコード化するＤＮＡ発現構築物のクローニング
ＣＨＯ細胞における三重特異性構築物の発現のために、全分子のコーディング配列をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター由来の適宜修飾した哺乳動物発現系中に単一遺伝子または二重遺伝子構築物としてクローンした。二プロモーターベクターを二遺伝子構築物（ヘテロダイマー三重特異性構築物）の前記クローニングおよび前記発現のために使用した。前記三重特異性一遺伝子構築物のために、前記正常なｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ発現ベクターを使用した。手短に言うと、異なるリンカー（長いリンカーおよび短いリンカー）によって隔てられたＶＨおよびＶＬドメインをコード化する遺伝子配列をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成し、サブクローニングした。前記結果として得られる構築物を異なる制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰａｃＩ）によって消化するか、または異なるＶＨ／ＶＬエフェクターおよび標的結合ドメインを対応するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。その後、前記異なる重複ＤＮＡ−フラグメントおよび前記直線化骨格２プロモーターベクターまたはｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターを一回の等温反応でＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙによってあわせまとめる。すべての発現構築物は、それぞれ抗体分泌および精製を促進するために、Ｎ末端シグナルペプチドのコーディング配列および前記第一遺伝子カセットのＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグまたは前記第二遺伝子カセットのＣ末端ＦＬＡＧタグを含むように設計された。全構築物の配列は、プライマー対遺伝子カセット１について５’−ＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧ−３’および５’−ＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＴＴＧ−３’または遺伝子カセット２について５’−ＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣ−３’および５’−ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＧ−３’を使用するＧＡＴＣ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００７８】
宿主細胞培養
Ｆｌｐ−ｌｎＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞の誘導体（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ、１９６８）を、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを追加したハムのＦ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ中で培養した。接着細胞を０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡで分離させ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供された標準的細胞培養プロトコルにしたがって継代培養した。
【００７９】
懸濁液中での成長に適合させるために、細胞を組織培養フラスコからはがし、無血清ＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯ培地中に入れ、その後、振盪フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２および１２０ｒｐｍでインキュベーションした。懸濁液適応Ｆｌｐ−ｌｎＣＨＯ宿主細胞の前記培養のための前記標準培地は、Ｌ−グルタミン、ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを追加したＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯであった。懸濁液適合細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む培地中で凍結保存し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用したＭｙｃｏｐｌａｓｍａについての試験で陰性を示した。
【００８０】
安定にトランスフェクトされた細胞プールの生成
分泌された単一遺伝子または二重遺伝子三重特異性抗体を安定して発現する組換えＦｌｐ−ｌｎＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合宿主細胞のトランスフェクションによって生成した。このために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する関心対象の前記タンパク質（ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ）および前記Ｆｌｐリコンビナーゼ（ｐＯＧ４４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をコード化する発現プラスミド（２．５μｇ）との同時導入の一日前にＺｅｏｃｉｎを含まない標準培地中に細胞を入れた。簡単に言うと、ベクターＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を１：３（μｇ／μｇ）のＤＮＡ：ＰＥＩ比にて合計１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地中で混合し、１０分間インキュベートした後、１ｍＬのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に懸濁させた２・１０６Ｆｌｐ−ｌｎＣＨＯ細胞に添加した。２４時間インキュベーション後、培養物をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中に０．１・１０６生存細胞／ｍＬの密度で希釈し、Ｔ７５培養フラスコ中に播種した後、５００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂを添加することによって、安定にトランスフェクトされた細胞に関する選択を開始した。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的ＤＮＡ組換えによる前記組込みＦＲＴ部位での前記Ｆｌｐ−ｌｎＣＨＯ細胞のゲノム中への前記発現構築物の挿入を媒介する（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９１）。選択の間、生存細胞密度を１週間に２回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地中に０．１・１０６生存細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁させた。組換えタンパク質産物を安定して発現する細胞プールを選択の２〜３週間後に回収し、この時点で細胞を振盪フラスコ中の標準的培養培地に移した。分泌された組換えタンパク質の発現を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）技術を使用する細胞培養上清のタンパク質ゲル電気泳動によって確認した。安定な細胞プールを、５０％ＰｒｏＦｒｅｅｚｅ（Ｌｏｎｚａ）および７．５％ＤＭＳＯを含む培地中で凍結保存した。
【００８１】
流加ＣＨＯ細胞懸濁培養における組換えタンパク質の産生
組換えタンパク質を、前記細胞培養上清中への分泌によって安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日の流加培養で産生した。このために、三重特異性抗体を安定して発現する細胞プールを、気体透過性キャップを備えたポリカーボネート製三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の標準的培養培地中６・１０５細胞／ｍＬの出発密度で播種し、そして３７℃および５％ＣＯ２にて１４０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。流加培養中、培地に４０ｍＬ／ＬのＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および４ｍＬ／ＬのＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を第０日（開始日）に追加し、３、５、および７日に二倍量を追加した。細胞培養上清を典型的には＞７５％の培養生存率で１０日後に回収した。サンプルを供給前に産生培養物から一日おきに集め、細胞密度および生存力を評価した。採取日に、細胞培養上清をさらに使用する前に、遠心分離およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する真空ろ過（０．２２μｍ）によって清澄化した。
【００８２】
三重特異性Ｆｖ抗体の精製
三重特異性抗体を清澄化したＣＨＯ細胞培養上清から、ＩＭＡＣおよび分取ＳＥＣを含む２ステップ手順で精製した。必要ならば、第三のクロマトグラフィーステップ（ＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィー）をさらなるポリッシングのために適用した。ＩＭＡＣのために、前記清澄化上清をＨｉｓＴｒａｐ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。Ｔｒｉｓ／ＮａＣＩ緩衝液ｐＨ７．５で洗浄した後、それぞれ１５ｍＭ、１２５ｍＭ、および５００ｍＭイミダゾールを使用する３段階勾配でタンパク質を溶出させた。フラクションの前記純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容される純度を示すフラクションをプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅカラムを用いる分取ゲルろ過に供した。ＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーは、数例ではさらなるポリッシングのためであった。したがって、前記タンパク質を前記ＦＬＡＧアフィニティーカラムにかけ、ＰＢＳで洗浄し、グリシン／ＨＣｌ緩衝液をｐＨ３．５で使用して溶出させた。精製した三重特異性抗体を含む溶出液フラクションをプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０に対して透析し、限外ろ過によって約１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度まで濃縮した。前記最終サンプルの純度および均一性（約９０％）を、還元および／または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続いてＨｉｓタグならびにＦＬＡＧタグ特異的抗体を用いたイムノブロッティング、ならびに分析的ＳＥ−ＨＰＬＣによって評価した。精製タンパク質をさらに使用するまでアリコートとして−８０℃にて保存した。
【００８３】
実施例３に記載する三重特異性Ｆｖ抗体分子の生物物理学的データの例；ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１（実施例３ａ））、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２（実施例３ｂ））、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３（実施例３ｃ））およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４（実施例３ｄ）を表１に示す。フラクションの前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥＳを図１１に示す：すべての三重特異性四価Ｆｖ抗体分子はドメイン順、例えばＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１）またはＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２）に関係なく、許容される力価で発現された。前記三重特異性四価Ｆｖ抗体分子の熱および保存安定性は非常に有効で同等である。
【００８４】
【表１】
2018537415.tif 000003
【００８５】
実施例２
前記ダイアボディ単位の異なるドメイン順を有する三重特異性抗体分子の産生
図２による前記形式の四つの異なるＦｖ抗体分子を実施例１で記載したように構築し、これらは前記ダイアボディ単位において前記二対の可変ドメインの異なるドメイン配置を有する（Ｎ→Ｃ末端）。前記ダイアボディ単位の前記可変ドメインを、下表では太字で示す。
【００８６】
2018537415.tif 000004
【００８７】
2018537415.tif 000005
【００８８】
2018537415.tif 000006
【００８９】
2018537415.tif 000007
【００９０】
前記Ｆｖ抗体分子は、ＣＨＯ細胞において発現され、産生細胞培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、前記長いポリペプチド１と前記短いポリペプチド２とが変性条件下で、充分に発現され、独立したバンドとして泳動することを示す（図９ａ、９ｂ、９ｃ）。
【００９１】
実施例１で記載するような単一のＩＭＡＣステップによる精製の後、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０について７６％の純度が達成され（図１０ａ）、そしてａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２について７８％の純度が達成された（図１０ｃ）。したがって、ＶＬ−ＶＬ／ＶＨ−ＶＨダイアボディ単位（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４０）またはＶＨ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＬダイアボディ単位（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１４２）を有する多重特異性Ｆｖ抗体分子は有意な高い割合の正しく折りたたまれたＦｖ抗体分子を示す。しかしながら、いくつかの重複する分子種が得られ、ヘテロダイマー抗体分子は、それらのダイアボディ単位内で交互のドメイン順ＶＨ−ＶＬ／ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨ／ＶＬ−ＶＨ；をそれぞれ有するａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３８およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１３９から分離可能ではなかった（図１０ｂ、１０ｄ）。したがって、前記ダイアボディ単位中の前記可変ドメインの前記ＶＬ−ＶＬ／ＶＨ−ＶＨ配向は前記二つの異なるポリペプチド１および２を互いに結合させ、そしてヘテロダイマー化させて四価三重特異性抗体分子とする。
【００９２】
実施例３
抗ＣＤ１６Ａ、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３０抗体可変ドメインを含む以下の多価抗体分子を産生した。
【００９３】
リンカー：
以下のペプチドリンカーを前記実施例で使用した：
ｓｃＦｖ単位中のリンカー（４）：ＶＨ−ＶＬについて（Ｇ２Ｓ）６、ＶＬ−ＶＨについて（Ｇ２Ｓ）７
ダイアボディ単位中のリンカー（３、３ａ）：（Ｇ２Ｓ）３
ｓｃＦｖ単位をダイアボディ単位と結合させるリンカー（５）：（Ｇ２Ｓ）３
【００９４】
ａ）六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および二個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される、ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する四価三重特異性Ｆｖ抗体分子（図２に示すａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対とによって形成され、これによりポリペプチド１とポリペプチド２との正しいヘテロダイマー化を保証する。
【００９５】
2018537415.tif 000008
【００９６】
ｂ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および二個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される四価三重特異性Ｆｖ抗体（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対と、前記第二ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対とによって形成される。
【００９７】
2018537415.tif 000009
【００９８】
ｃ）六個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第一ポリペプチド；および二個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第二ポリペプチドから構成されるＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する四価三重特異性Ｆｖ抗体（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対および前記第二ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対から形成される。
【００９９】
2018537415.tif 000010
【０１００】
ｄ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、そして六個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第一ポリペプチド；および二個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第二ポリペプチドから構成される四価三重特異性Ｆｖ抗体（ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対とによって形成される。
【０１０１】
2018537415.tif 000011
【０１０２】
ポリペプチド１（六個の可変ドメイン）およびポリペプチド２（二個の可変ドメイン）のサイズが異なるにもかかわらず、前記抗体分子ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は満足に発現できる。精製された抗体分子ａ）〜ｄ）の熱安定性ならびに保存安定性は非常に良好である。フローサイトメトリーにおいて、すべての構築物ａ）〜ｄ）は一次ＮＫ細胞、Ｒａｊｉ、Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＭＥＣ−１細胞株と結合する。
【０１０３】
ｅ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、四個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および四個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される図３で示されるような四価三重特異性Ｆｖ抗体（ＴｅＴｒｉｓＡｂ＿１）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対によって形成され、その配向は前記第一および第二ポリペプチドの正しいヘテロダイマー化を保証する。
【０１０４】
2018537415.tif 000012
【０１０５】
ｆ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、八個の可変ドメインとＣ末端にＨｉｓタグを有する単一のポリペプチドから構成される、図１に示すような四価三重特異性Ｆｖ抗体（ｓｃＴｒｉＦｌｅｘ＿２）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、同じポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメインの並置第二対と会合したＶＨ−ＶＨドメインの第一対によって形成される。前記ＶＨ−ＶＨ対は、前記リンカー（Ｇ２Ｓ）６によって前記ＶＬ−ＶＬ対と結合される。
【０１０６】
2018537415.tif 000013
【０１０７】
ｇ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および二個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される四価三重特異性Ｆｖ抗体分子（図２に示すとおり）。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対とによって形成され、これによってポリペプチド１およびポリペプチド２の正しいヘテロダイマー化を保証する。
【０１０８】
2018537415.tif 000014
【０１０９】
ｈ）六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および四個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する五価四重特異性Ｆｖ抗体分子（図６ａに示す通り）。ＣＤ１６Ａに対する二つの抗原結合部位を有するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対とによって形成され、これによってポリペプチド１とポリペプチド２との正しいヘテロダイマー化を保証する。
【０１１０】
2018537415.tif 000015
【０１１１】
ｉ）十個の可変ドメインおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有する第一ポリペプチド；および二個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成されるＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する六価三重特異性四重特異性Ｆｖ抗体分子（図５に示すとおり）。ＣＤ１６Ａに対する二つの抗原結合部位を有する中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対とによって形成され、これによってポリペプチド１およびポリペプチド２の正しいヘテロダイマー化を保証する。
【０１１２】
2018537415.tif 000016
【０１１３】
ｊ）六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および六個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成されるＣＤ３０、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する六価四重特異性Ｆｖ抗体分子（図７で示すとおり）。
【０１１４】
2018537415.tif 000017
【０１１５】
ｋ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および四個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される五価三重特異性Ｆｖ抗体分子（図６ｂに示すとおり）。ＣＤ１６Ａに対する二つの抗原結合部位を有する前記ダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対とによって形成され、これによってポリペプチド１とポリペプチド２との正しいヘテロダイマー化を保証する。
【０１１６】
2018537415.tif 000018
【０１１７】
ｌ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、四個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および四個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される、図３に示すような四価三重特異性Ｆｖ抗体。中心に位置するダイマーダイアボディ単位は、前記第一ポリペプチド中のＶＬ−ＶＬドメイン対と前記第二ポリペプチド中のＶＨ−ＶＨドメイン対とによって形成され、この配向は、前記第一および第二ポリペプチドの正しいヘテロダイマー化を保証する。
【０１１８】
2018537415.tif 000019
【０１１９】
ｍ）ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および六個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される、図８ａに示すような六価四重特異性Ｆｖ抗体。前記第一および第二ポリペプチドの各々はＣ末端にｓｃＦｖ単位を含む。
【０１２０】
2018537415.tif 000020
【０１２１】
ｎ）ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、六個の可変ドメインとＣ末端Ｈｉｓタグとを有する第一ポリペプチド；および六個の可変ドメインとＣ末端ＦＬＡＧタグとを有する第二ポリペプチドから構成される、図８ｂに示すような六価四重特異性Ｆｖ抗体。前記第一および第二ポリペプチドの各々はＮ末端でｓｃＦｖ単位を含む。
【０１２２】
2018537415.tif 000021
【０１２３】
ｏ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、八個の可変ドメインとＣ末端にＨｉｓタグとを有する単一のポリペプチドから構成される、図１に示すような四価三重特異性Ｆｖ抗体。中心に位置する一本鎖ダイアボディ単位は、前記同じポリペプチド中でＶＬ−ＶＬドメインの並置第二対と結合したＶＨ−ＶＨドメインの第一対によって形成される。ＶＨ−ＶＨ対は、前記リンカー（Ｇ２Ｓ）６によってＶＬ−ＶＬ対と結合される。
【０１２４】
2018537415.tif 000022
【０１２５】
ｐ）ＣＤ３０、ＣＤ１９およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、十二個の可変ドメインとＣ末端でＨｉｓタグとを有する単一のポリペプチドから構成される、図４で示される六価四価四価三重特異性Ｆｖ抗体（ｈｅｘａｖａｌｅｎｔｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）。前記ポリペプチドは次々に連結した三つの一本鎖ダイアボディ単位を含む。
【０１２６】
2018537415.tif 000023
【０１２７】
実施例４
三重特異性抗体分子が介在する細胞結合および細胞毒性活性の評価
試験手順：
細胞および細胞培養物
ＣＤ１９＋／ＣＤ３０＋ＭＥＣ−１（ＤＳＭＺ、ｃａｔ．：ＡＣＣ４９７）、ＣＤ１９＋／ＣＤ３０−Ｒａｊｉ（ＤＳＭＺ、ｃａｔ．：ＡＣＣ３１９）、およびＣＤ１９−／ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９（ＤＳＭＺ、ｃａｔ．：ＡＣＣ３１）細胞を、細胞株の供給業者によって推奨されるように、本明細書中で完全ＲＰＭＩ培地と称する、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ｃａｔ．：１０２７０−１０６）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｃａｔ：１５４０−１２２）、および２ｍＭのＬ−グルタミン（ｃａｔ：２５０３０−０２４；すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を追加したＲＰＭＩ１６４０（ｃａｔ．：２１８７５−０３４）またはＩＭＤＭ（ｃａｔ．：１２４４０−０５３）培地中で、標準的条件下で培養した。
【０１２８】
ＰＢＭＣを健常なボランティアのバフィーコート（Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から密度勾配遠心分離によって単離した。前記バフィーコートサンプルを２〜３倍体積のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．：１４１９０−１６９）で希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．：０７８６１）のクッション上に積層し、８００×ｇで２５分間室温にて途切れることなく遠心分離した。前記界面に位置するＰＢＭＣを集め、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＮＫ細胞の前記濃縮のために使用した。ＮＫ細胞を、前記ＰＢＭＣ集団から、無傷の（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ）ヒトＮＫ細胞の免疫磁気単離のためのＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．：１９０５５）および前記Ｂｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔを前記製造業者の指示にしたがって使用して濃縮した。
【０１２９】
細胞結合アッセイおよびフローサイトメトリー分析
前記表示した細胞株のアリコートを、２％の熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．：１０２７０−１０６）、０．１％のアジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ．：Ａ１４３０．０１００）を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．：１４１９０−１６９）中、Ｈｉｓタグ抗体の連続的希釈物１００μｌとともに４５分間氷上でインキュベートした。ＮＫ細胞の染色を、１ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒト抗体（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ．：ＰＺＮ−２４５１４４５）を追加したＦＡＣＳ緩衝液中で実施して、抗体のＦｃ受容体に対する結合をブロックした。
【０１３０】
ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、細胞に結合した抗体を１０μｇ／ｍＬの抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ１３／４５／３１−２（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ．：ＤＩＡ９１０−１ＭＧ）とそれに続いて１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、ｃａｔ．：１１５−０９５−０６２）で検出した。前記細胞を次に再度洗浄し、死んだ細胞を除去するために２μｇ／ｍＬのプロピジウムヨージド（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．：Ｐ４１７０）を含むＦＡＣＳ緩衝液０．２ｍＬ中に再懸濁させた。２〜５×１０３生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｋｒｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。細胞サンプルの平均蛍光強度を、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して算出した。二次および三次試薬単独で染色した前記細胞の蛍光強度値を差し引いた後、値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用する分析のために使用した。ＫＤの計算のために、１サイト結合（双曲線）の式を使用した。
【０１３１】
細胞毒性アッセイ
前記カルセイン放出細胞毒性アッセイのために、標的細胞を３０分間、ＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃にて１０μＭのカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．：Ｃ３１００ＭＰ）で標識し、洗浄し、そして１×１０４細胞を、９６ウェルマイクロプレートの各ウェル中で、エフェクター細胞とともに２００μｌの合計体積で、５：１のエフェクター対：標的（Ｅ：Ｔ）比にて、抗体濃度を増加させて蒔いた。３７℃にて加湿５％ＣＯ２雰囲気中で前記表示された時間インキュベーションした後、上清中に遊離されたカルセインの蛍光（Ｆ）を５２０ｎｍにてプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ、ｃａｔ．：１４２０−０１２）によって測定した。特異的細胞溶解を：［Ｆ（サンプル）−Ｆ（自発）］／［Ｆ（最高）−Ｆ（自発）］×１００％として算出した。Ｆ（自発）は、エフェクター細胞および抗体に非存在下で標的細胞から遊離された蛍光を表し、そしてＦ（最高）は、１％のＴｒｉｔｏｎ×１００（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ．：３０５１．２）の添加によって誘導された全細胞溶解後に遊離された蛍光を表す。回帰曲線を適合させてＥＣ５０を算出した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）。
【０１３２】
三重特異性抗体分子の活性
異なる配向で配列した同じ抗体可変ドメインを含む図２で示すような三重特異性抗体分子を表す、実施例３で記載する三重特異性抗体分子であるａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０１、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０２、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０３およびａＴｒｉＦｌｅｘ＿１０４の結合（実施例３ａ）、３ｂ）、３ｃ）および３ｄ）を参照のこと）を、シングルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０−ＲａｊｉおよびＣＤ１９−／ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞上で、またダブルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０＋ＭＥＣ−１細胞に対してフローサイトメトリーを使用して実証した。ＣＤ１９の解離定数は６〜６４ｎＭの範囲であり、ＣＤ３０については１６〜４５ｎＭであった（図１２）。ダブルポジティブなＭＥＣ−１細胞上で、９〜４７ｎＭの範囲内の解離定数が観察され、概して、シングルポジティブなＲａｊｉおよびＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞についてそれぞれ得られた前記データを裏付けた。
【０１３３】
細胞毒性アッセイにおいて、シングルポジティブなＣＤ３０＋／ＣＤ１９−Ｒａｊｉ上で８９〜５８０ｐＭおよびＣＤ１９−／ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９細胞上で１５５〜９５２ｐＭの範囲内のＥＣ５０値が観察された。ダブルポジティブなＣＤ１９＋／ＣＤ３０＋ＭＥＣ−１細胞上で、６７〜２３５ｐＭの範囲内のＥＣ５０値が観察され、活性の最高１１倍の改善を示した（図１３）。
【０１３４】
全体的に、三重特異性抗体分子は、この実験で試験した前記細胞株上で類似した活性を示したが、他の抗原対については、前記細胞表面上の抗原密度および幾何学の前記影響は、前記構築物の前記活性に対してより強い影響を及ぼし、シングルポジティブな細胞と比較して、ダブルポジティブな細胞上で見かけの親和性のより顕著な増加に至った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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