(57)【要約】本開示は、概して、肺癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、線維癌、神経膠腫、及び黒色腫、ならびにこれらの転移などの癌の治療または癌疾患の再発予防のための、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の阻害物質及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害物質を使用する併用療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療または癌の再発予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の阻害物質及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害物質を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、ＴＧＦβ３に対する親和性よりも高い親和性でＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、ＴＧＦβ３の活性を中和するよりも大幅にＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の活性を中和する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＧＦβ抗体が、１０−６Ｍ以下のＫｄの親和性でＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、
（ａ）配列番号１３、１９、及び２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するそれらの変異型と、
（ｂ）配列番号１４、２０、及び２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するそれらの変異型と、
（ｃ）配列番号１５、２１、及び２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するそれらの変異型と、
（ｄ）配列番号１６、２２、及び２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するそれらの変異型と、
（ｅ）配列番号１７、２３、及び２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するそれらの変異型と、
（ｆ）配列番号１８、２４、及び３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するそれらの変異型と
を含む抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、配列番号２、６、及び１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号４、８、及び１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、
ａ）配列番号２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｂ）配列番号２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｃ）配列番号２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｄ）配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｅ）配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｆ）配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と
を含む抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、
ａ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｂ）配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｃ）配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｄ）配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｅ）配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｆ）配列番号１８に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と
を含む抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、
ｇ）配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｈ）配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｉ）配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｊ）配列番号２２に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｋ）配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と、
ｌ）配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型と
を含む抗体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域アミノ酸配列が配列番号１０に記載されており、かつ前記軽鎖可変領域アミノ酸配列が配列番号１２に記載されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域アミノ酸配列が配列番号２に記載されており、かつ前記軽鎖可変領域アミノ酸配列が配列番号４に記載されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域アミノ酸配列が配列番号６に記載されており、かつ前記軽鎖可変領域アミノ酸配列が配列番号８に記載されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が重鎖定常領域を更に含み、前記重鎖定常領域が、修飾または未修飾のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＤ−１阻害物質が、ＰＤ−１に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＧＦβ阻害物質が抗体であり、かつ前記ＰＤ−１阻害物質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、線維性癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、びまん性内因性橋膠腫、再発性小児脳新生物腎細胞癌（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｎｅｏｐｌａｓｍ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、明細胞型転移性腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、第ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、第ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫、第ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、寛解期の成人急性骨髄性白血病；Ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１を伴う成人急性骨髄性白血病；ｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１を伴う成人急性骨髄性白血病；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）；ＲＵＮＸ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１を伴う成人急性骨髄性白血病；ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）；ＭＬＬＴ３−ＭＬＬを伴う成人急性骨髄性白血病；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）；ＰＭＬ−ＲＡＲＡを伴う成人急性前骨髄球性白血病；アルキル化剤関連急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、リクター症候群；ワルデンストレームマクログロブリン血症、成人神経膠芽腫；成人神経膠肉腫、再発性神経膠芽腫、再発性小児横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽腫；再発性骨肉腫、結腸直腸癌、ＭＳＩ陽性結腸直腸癌；ＭＳＩ陰性結腸直腸癌、上咽頭非角化癌；再発性上咽頭未分化癌、子宮頸部腺癌；子宮頚部腺扁平上皮癌；子宮頸部扁平上皮癌；再発性子宮頸癌；第ＩＶＡ期子宮頸癌；第ＩＶＢ期子宮頸癌、肛門管扁平上皮癌；転移性肛門管癌；再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌；癌腫、頭頸部の扁平上皮細胞、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、進行ＧＩ癌、胃腺癌；胃食道接合部腺癌、骨新生物、軟部組織肉腫；骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌；第ＩＩＩ期メルケル細胞癌；第ＩＶ期メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、及び再発性菌状息肉症、ならびにセザリー症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、皮膚癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が、Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）癌遺伝子に変異を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が、ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）癌遺伝子に変異を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）癌遺伝子に変異を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、前記ＲＡＳ癌遺伝子に変異を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌及び結腸直腸癌、脳の低悪性度神経膠腫、浸潤性乳癌、多形神経膠芽腫、黒色腫、甲状腺、直腸腺癌、腎臓癌、腎癌、肝臓癌、急性骨髄性白血病、胃腺癌、食道腺癌、子宮体部類内膜癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、口腔癌、大腸癌、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象における腫瘍の大きさまたは腫瘍負荷を減少させることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象における転移を減少させることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍の大きさが２０％以上減少する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＤ−１阻害物質及び前記ＴＧＦβ阻害物質が、薬学的組成物に製剤化される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記阻害物質が、同じ組成物中に存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記阻害物質が、別個の組成物中に存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記阻害物質が同時投与される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記阻害物質が、別々の時間にまたは連続的に投与される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与によって、阻害物質療法を受けた対象において癌の再発が予防される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与によって、腫瘍におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数が増加し、かつ／またはＮＫ細胞の細胞溶解活性が向上する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与によって、腫瘍における調節性Ｔ細胞の数が減少し、かつ／または調節性Ｔ細胞機能が阻害される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与によって、腫瘍における細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数が増加し、かつ／またはＣＴＬ機能が増強される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与によって、腫瘍における２型樹状細胞（ＤＣ２）の数が増加する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記阻害物質が、１日１回、週に１回、週に２回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、または２ヶ月に１回投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与され、かつ前記ＰＤ−１阻害物質が、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与によって、腫瘍における調節性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率が増加する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍における調節性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率を増加させるための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の阻害物質及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害物質を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年４月３日出願の米国仮特許出願第６２／１４３，０１６号及び２０１５年７月１３日出願の米国仮特許出願第６２／１９１，７９７号の優先的利益を主張し、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により認められた補助金番号Ｒ２１ＣＡ１６４７７２及びＵ０１ＣＡ０８４２４４による政府の援助を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下のように特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、参照によりその全体が組み込まれる：２０１６年４月１日に作成された、「４９３４３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の１７，１０７バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１つ。
【０００４】
発明の分野
本開示は、概して、それを必要とする対象に、治療有効量の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の阻害物質及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害物質を投与することを含む、癌の治療または癌の再発予防のための併用療法に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
癌免疫療法は、免疫系を活性化して、腫瘍退縮及び疾患の安定化を誘導する方法を指す（Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４８０，７３７８：４８０−９（２０１１））。ある特定の負の免疫調節因子（免疫チェックポイント）に対して指向される抗体療法は、いくつかの癌の種類において抗腫瘍治療として成功することを示した（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：９，（２０１５））。
【０００６】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーは、哺乳動物において見出される３つの別個のアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３）からなる。ＴＧＦβタンパク質は、細胞増殖性、炎症性、及び心血管状態を含む疾患状態に影響を及ぼす、複数の遺伝子応答を活性化及び調節する。ＴＧＦβは、本来は正常な線維芽細胞を足場非依存性成長が可能な細胞へと形質転換するその能力にちなんで名づけられた多機能性サイトカインである。ＴＧＦβ分子は主に造血細胞及び腫瘍細胞により産生され、様々な正常及び新生物組織源の両方から細胞の成長及び分化を調節する、すなわち、刺激または阻害することができ（Ｓｐｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：５３２  （１９８６））、様々な間質細胞の形成及び拡大を刺激する。
【０００７】
ＴＧＦβは、細胞増殖及び分化、胚発生、細胞外基質形成、骨発生、創傷治癒、造血、ならびに免疫及び炎症応答などの、多くの増殖及び非増殖細胞プロセスに関与することが知られている。例えば、Ｐｉｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３６：３０−３７（１９８６）、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１：２０３−２１８（１９８９）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｐｏｒｎ，ｐｐ４１９−４７２  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｅｄｓ  Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ＆Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９０）、Ｍａｓｓａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：５９７−６４６（１９９０）、Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１：７３８−７４５（１９９９）を参照されたい。また、ＴＧＦβは腸粘膜の疾患の治療及び予防に使用される（ＷＯ２００１／２４８１３）。ＴＧＦβは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）阻害（Ｒａｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：９９１，１９８７）、Ｅｓｐｅｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：２３１２，１９８８）、Ｂ細胞リンパ球生成及びカッパ軽鎖発現の低下（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１２９０，１９８７）、造血の負の調節（Ｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７２：１５０４，１９８８）、腫瘍細胞に対するＨＬＡ−ＤＲ発現の下方調節（Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：４２１７，１９８８）、及びＢ細胞成長因子に応答する抗原活性化Ｂリンパ球増殖の阻害（Ｐｅｔｉｔ−Ｋｏｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１１１，１９８８）を含む、様々な免疫細胞型に対する強い免疫抑制作用を有することも知られている。米国特許第７，５２７，７９１号も参照されたい。
【０００８】
癌におけるＴＧＦβアイソフォームの発現は複雑であり、特定の癌において異なる役割を有するＴＧＦβアイソフォームの異なる組み合わせにより変化する。ＴＧＦβ分子は腫瘍抑制因子及び腫瘍プロモーターの両方として作用し得る。例えば、動物におけるＴＧＦβシグナル伝達の欠失または下方調節は、乳癌、腸癌、膵臓癌、結腸癌、及び扁平上皮癌の増加をもたらす場合があり、ＴＧＦβの存在が腫瘍進行の阻止または遅らせるのに重要であることを示す（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２２０−２７，２０１０）。しかしながら、ＴＧＦβの過剰発現は発癌促進性であることが知られており、発現の増加が多くの腫瘍型において検出される（Ｙａｎｇら、上記）。
【０００９】
ＴＧＦβに対する抗体は、米国特許第７，５２７，７９１号、同第７，９２７，５９３号、同第７，４９４，６５１号、同第７，３６９，１１１号、同第７，１５１，１６９号、同第６，４９２，４９７号、同第６，４１９，９２８号、同第６，０９０，３８３号、同第５，７８３，１８５号、同第５，７７２，９９８号、同第５，５７１，７１４号、及び同第７，７２３，４８６号、ならびに同第８，５６９，４６２号に記載されている。
【００１０】
分化抗原群２７９（ＣＤ２７９）としても知られるプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ上に発現される細胞表面共阻害受容体であり、免疫チェックポイント阻害の構成成分である（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，２３（３）：７０４，（１９９４）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．，２３６：２１９，（２０１０））。ＰＤ−１は、その２つのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１としても知られる、ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）（Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３３：  ９，（２０１５））と相互作用するときにＴ細胞の活性を制限する。ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との相互作用は、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生、及び細胞傷害性活性を低減する（Ｆｒｅｅｍａｎ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９２：１０２７−３４，（２０００）、Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１２５７−６６，（２００３））。
【００１１】
最近、２つのモノクローナル抗体がＰＤ−１免疫療法の阻害のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．）は転移性黒色腫における使用に承認され、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、転移性黒色腫及び転移性扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における使用に承認されている。これらの抗体の両方はＰＤ−１受容体に結合し、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とのその相互作用を遮断する。
【００１２】
ＰＤ−Ｌ１の阻害物質は、膀胱癌、頭頸部癌、及び胃腸癌における固形腫瘍の阻害に有効であることも示されている（Ｈｅｒｂｓｔ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３１：３０００（２０１３）、Ｈｅｅｒｙ  ＣＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，３０６４（２０１４）、Ｐｏｗｌｅｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，３２：５ｓ，５０１１（２０１４）、Ｓｅｇａｌ  ＮＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，３００２（２０１４））。
【００１３】
ＰＤ−１に対する抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，６１７，５４６号、同第８，００８，４４９号、同第８，７４１，２９５号、同第８，５５２，１５４号、同第８，３５４，５０９号、同第８，７７９，１０５号、同第７，５６３，８６９号、同第８，２８７，８５６号、同第８，９２７，６９７号、同第８，０８８，９０５号、同第７，５９５，０４８号、同第８，１６８，１７９号、同第６，８０８，７１０号、同第７，９４３，７４３号、同第８，２４６，９５５号、及び同第８，２１７，１４９号に記載されている。
【００１４】
癌の設定において、免疫抑制の複数の機序が、免疫療法が有効となることを妨げる可能性がある。時として、腫瘍は、単剤免疫療法に対して抵抗性であり、わずかな割合の癌が完全に応答するのみである。したがって、免疫療法薬の組み合わせの使用が最適な患者応答におそらく必要とされる（Ｈｏｄｉ  ＦＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９０：３４１−６８，２００６、Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３３：９，２０１５）。
【００１５】
最近、免疫チェックポイントタンパク質ＣＴＬＡ−４の阻害と組み合わせたＴＧＦβ阻害が黒色腫の腫瘍成長及び転移の抑制に有効であることが示された（Ｈａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２：５ｓ，２０１４）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４の阻害物質を使用する併用免疫療法アプローチが現在評価されている（Ｓｚｎｏｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，２０１４、Ｗｏｌｃｈｏｋ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３６９：１２２−１３３，２０１３、Ｃａｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，２０１４、及びＰｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３３：９，（２０１５）において概説される）。研究は、ＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβが腫瘍保有宿主において能動免疫に対する細胞応答の抑制に関与するモノクローナル抗体の組み合わせを使用した、ＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβの同時遮断後の腫瘍を排出するリンパ節からのエフェクターＴ細胞におけるＩＦＮγの相乗的上方調節を記載している（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６８：１３，２００８）。
【発明の概要】
【００１６】
本開示は、概して、併用療法においてＴＧＦβ及びＰＤ−１の阻害物質を使用する、癌を治療するためまたは癌の再発を予防するための材料及び方法に関する。ＴＧＦβの阻害は、ケモカイン分泌及び炎症を刺激することが示された一方で、ＰＤ−１遮断は免疫阻害機序を抑制することを示した。本明細書に示されるデータは、ＴＧＦβの阻害物質が、特にＰＤ−１の阻害物質と共に投与された場合、癌のマウスモデルにおいて腫瘍退縮を誘発することを示す。
【００１７】
様々な実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の阻害物質及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害物質を投与することを含む、癌の治療または癌の再発予防のための方法を提供する。
【００１８】
様々な実施形態では、本方法は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に結合する抗体の使用を想定する。いくつかの実施形態では、抗体はＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の活性をＴＧＦβ３よりも大幅に中和する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の抗体中和は、ＴＧＦβ３の中和よりも少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％超強い。本明細書において想定される例示的な中和アッセイとしては、インターロイキン−１１放出アッセイ及びＨＴ−２細胞増殖アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ＴＧＦβ活性アッセイは、本明細書に開示される抗体が１つのＴＧＦβアイソフォームを優先的に阻害するかを決定するために実施され得、ｐＳＭＡＤリン酸化アッセイまたはｒｈＬＡＰ結合アッセイを含む。更なる実施形態では、抗体は、ＴＧＦβと比較して、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２に関して、より低いＩＣ５０（すなわち、より良好な結合、より大きい効力）を有する。
【００１９】
様々な実施形態では、本方法は、重鎖相補性決定リピート（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＤＲ）である、配列番号１３、１９、及び２５に記載のＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するその変異型、配列番号１４、２０、及び２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するその変異型、配列番号１５、２１、及び２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するその変異型、配列番号１６、２２、及び２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するその変異型、配列番号１７、２３、及び２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するその変異型、ならびに配列番号１８、２４、及び３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するその変異型を含むＴＧＦβ、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に結合する抗体の使用を想定する。いくつかの実施形態では、本方法で有用な抗体は、配列番号２、６、及び１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むことが想定される。関連実施形態では、抗体は、配列番号２、６、及び１０に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
関連実施形態では、抗体は、配列番号４、８、及び１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。更なる実施形態では、抗体は、配列番号４、８、及び１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。また別の実施形態では、抗体は、配列番号４、８、及び１２に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２１】
様々な実施形態では、本方法は、配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２２に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、ならびに配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型を含む、ＴＧＦβ３に対する親和性よりも高い親和性でＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２に結合する抗体の使用を想定する。
【００２２】
様々な実施形態では、本方法は、配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２２に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、ならびに配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型を含む、ＴＧＦβ３の活性を中和するよりも大幅にＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の活性を中和する抗体の使用を想定する。
【００２３】
一態様では、本方法は、（ａ）配列番号２５に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｂ）配列番号２６に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｃ）配列番号２７に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｄ）配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｅ）配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、ならびに（ｆ）配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型を含む、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３に結合する抗体の使用を想定する。
【００２４】
別の態様では、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｂ）配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｃ）配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｄ）配列番号１６に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、（ｅ）配列番号１７に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、ならびに（ｆ）配列番号１８に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型を含む。
【００２５】
様々な実施形態では、本方法に有用なＴＧＦβ阻害物質は、配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２２に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型、ならびに配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１個もしくは２個のアミノ酸が変更されているその変異型を含む抗体である。
【００２６】
関連実施形態では、本明細書に記載される抗体は、配列番号１０に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号１２に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２７】
関連実施形態では、本明細書に記載される抗体は、配列番号２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号４に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２８】
関連実施形態では、本明細書に記載される抗体は、配列番号６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号８に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本方法に有用な抗体は、重鎖定常領域を更に含み、この重鎖定常領域は、修飾または未修飾のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００３０】
一実施形態では、本明細書で使用される抗体は、該軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域を更に含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、修飾または未修飾のラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、これらの断片、またはこれらの組み合わせである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害物質は、発明を実施するための形態に開示されるモノクローナル抗体など、ＰＤ−１に結合する抗体であることが想定される。様々な実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１受容体の、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のうちの１つまたはその両方への結合を阻害または遮断する。
【００３２】
関連態様では、本開示は、上記のＴＧＦβモノクローナル抗体のうちの１つ以上と併用して使用されるＰＤ−１阻害物質の使用を記載する。
【００３３】
関連態様では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に想定される抗体または薬学的組成物を投与することを含む、癌の治療または癌の再発予防のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、癌は、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、線維性癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、びまん性内因性橋膠腫、再発性小児脳新生物腎細胞癌、明細胞型転移性腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、第ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、第ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫、第ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（自家幹細胞移植後のＤＬＢＣＬを含む）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、寛解期の成人急性骨髄性白血病；Ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＲＵＮＸ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１；ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＭＬＬＴ３−ＭＬＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）を伴う成人急性前骨髄球性白血病；ＰＭＬ−ＲＡＲＡ；アルキル化剤関連急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、リクター症候群；ワルデンストレームマクログロブリン血症、成人神経膠芽腫；成人神経膠肉腫、再発性神経膠芽腫、再発性小児横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽腫；再発性骨肉腫、結腸直腸癌、ＭＳＩ陽性結腸直腸癌；ＭＳＩ陰性結腸直腸癌、上咽頭非角化癌；再発性上咽頭未分化癌、子宮頸部腺癌；子宮頚部腺扁平上皮癌；子宮頸部扁平上皮癌；再発性子宮頸癌；第ＩＶＡ期子宮頸癌；第ＩＶＢ期子宮頸癌、肛門管扁平上皮癌；転移性肛門管癌；再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌；頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、進行ＧＩ癌、胃腺癌；胃食道接合部腺癌、骨新生物、軟部組織肉腫；骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌；第ＩＩＩ期メルケル細胞癌；第ＩＶ期メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、及び再発性菌状息肉症、ならびにセザリー症候群からなる群から選択される。
【００３４】
関連態様では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に想定される抗体または薬学的組成物を投与することを含む、癌の治療または癌の再発予防のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、皮膚癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される。
【００３５】
ある特定の実施形態では、癌は、Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）癌遺伝子に変異を有する。
【００３６】
ある特定の実施形態では、癌は、ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）癌遺伝子に変異を有する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、癌は、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）癌遺伝子に変異を有する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、癌はＲＡＳ癌遺伝子に変異を有する。
【００３９】
関連態様では、癌は、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌及び結腸直腸癌、脳の低悪性度神経膠腫、浸潤性乳癌、多形神経膠芽腫、黒色腫、甲状腺、直腸腺癌、腎臓癌、腎癌、肝臓癌、急性骨髄性白血病、胃腺癌、食道腺癌、子宮体部類内膜癌、膀胱癌、前立腺癌、口腔癌、大腸癌、及びリンパ腫からなる群から選択される。
【００４０】
本明細書の方法は、対象における腫瘍の大きさもしくは腫瘍負荷を減少させ、かつ／または対象における転移を減少させることが想定される。様々な実施形態では、本方法は腫瘍の大きさを１０％、２０％、３０％以上減少させる。様々な実施形態では、本方法は、腫瘍の大きさを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少させる。
【００４１】
本明細書の方法は、腫瘍負荷を減少させ、また癌が寛解に至ったら腫瘍の再発を低減または予防することも想定される。
【００４２】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に想定される抗体または薬学的組成物を投与することを含む、ＴＧＦβ及びＰＤ−１のシグナル伝達及び／もしくは発現に関連する疾患、状態、または障害の治療のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患、状態、または障害は癌の群から選択される。
【００４３】
本開示は、ＴＧＦβ阻害物質、ＰＤ−１阻害物質、及び薬学的に許容される担体を含む、無菌薬学的組成物を更に想定する。
【００４４】
本開示は、別個のＴＧＦβ阻害物質及び薬学的に許容される担体を含む、無菌薬学的組成物を更に想定する。
【００４５】
本開示は、別個のＰＤ−１阻害物質及び薬学的に許容される担体を含む、無菌薬学的組成物を更に想定する。
【００４６】
本開示の阻害物質、例えば抗体などは同じ製剤で同時に与えられ得ることが想定される。これらの阻害物質は別個の製剤で投与され、同時に投与されることが更に想定され、同時とは互いに３０分以内に与えられる薬剤を指す。第３の薬剤は阻害物質と共に同時に与えられ得ることが更に想定される。
【００４７】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に想定される抗体または薬学的組成物を投与するステップを含む、ＴＧＦβ及びＰＤ−１のシグナル伝達及び／もしくは発現に関連する疾患、状態、または障害の治療またはそれらの再発予防のための方法を提供し、投与によって、阻害物質療法を受けた対象における癌の再発が予防される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させる。様々な実施形態では、抗体または組成物はＮＫ細胞の細胞溶解活性を増加させる。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、ＮＫ細胞によるパーフォリン及びグランザイム産生を増加させる。
【００４９】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍における調節性Ｔ細胞の数を減少させ、かつ／または調節性Ｔ細胞機能を阻害する。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、免疫応答を下方調節する、または免疫応答の部位に移動するＴｒｅｇの能力を阻害する。
【００５０】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍における細胞傷害性Ｔ細胞の数を増加させ、かつ／またはＣＴＬ活性を強化する、例えば、ＣＴＬ活性をブーストする、増加させる、または促進する。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、ＣＴＬによるパーフォリン及びグランザイム産生を増加させ、ＣＴＬの細胞溶解活性を増加させる。
【００５１】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍における樹状細胞（ＤＣ）の数を増加させ、かつ／または樹状細胞の免疫寛容原性機能（例えば免疫寛容原性作用）を阻害する。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、ＣＤ８＋樹状細胞の免疫寛容原性作用を減少させる。
【００５２】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物の投与は、腫瘍における調節性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率を増加させる。
【００５３】
様々な実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の阻害物質及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害物質を投与することを含む、腫瘍における調節性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率を増加させるための方法を提供する。
【００５４】
様々な実施形態では、療法は、定期的に、例えば、１時間に１回、１日１回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回、またはより長い間隔で投与される。関連実施形態では、例示的治療において、ＴＧＦβ阻害物質は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与され、かつＰＤ−１阻害物質は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。これらの濃度は、単一投薬形態として、または複数用量として投与され得る。
【００５５】
様々な実施形態では、阻害物質は、第３の薬剤と共に投与される。一実施形態では、第３の薬剤は、細胞外基質分解タンパク質、線維化抑制剤、外科療法、化学療法（例えば、シスプラチン＋ペメトレキセド、カルボプラチン＋パクリタキセル）、細胞傷害性薬物（例えば、レナリドミド、デキサメタゾン）、または放射線療法からなる群から選択される（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７（１）：３９−４６（２０１５）、参照により本明細書に組み込まれる）。例示的な第３の薬剤は発明を実施するための形態により詳細に開示される。
【００５６】
ＴＧＦβ及びＰＤ−１のシグナル伝達ならびに／または発現に関連する、本明細書に記載される障害のうちのいずれかの治療のための、前述の抗体のうちのいずれかを含む組成物、もしくはＴＧＦβまたはＰＤ−１に結合する本開示の組成物、または薬剤の調製におけるその使用も想定される。任意選択で好適な使用説明書を含む、前述の抗体のうちのいずれかまたは組成物を含む注射器、例えば単一使用もしくは事前充填注射器、無菌密閉容器、例えば、バイアル、瓶、管、及び／またはキットもしくはパッケージも想定される。
【００５７】
本明細書に記載される各特徴もしくは実施形態または組み合わせは、非限定的であり、本発明の態様のうちのいずれかの図示的な例であり、そのため、本明細書に記載される、任意の他の特徴もしくは実施形態と組み合わせ可能、または組み合わせであることを意味することが理解される。例えば、特徴が「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「ある特定の実施形態」、「更なる実施形態」、「特定の例示的な実施形態」、及び／または「別の実施形態」などの用語で説明される場合、これらの種類の実施形態のそれぞれは、全ての可能な組み合わせを列記する必要なく、本明細書に記載される、任意の他の特徴と組み合わされるか、または特徴の組み合わせであることが意図される特徴の非限定的な例である。かかる特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のうちのいずれにも適用される。範囲内に入る値の例が開示される場合、これらの例のうちのいずれも範囲の可能なエンドポイントとして想定され、かかるエンドポイント間の任意の及び全ての数値が想定され、上限及び下限のエンドポインドの任意の及び全ての組み合わせが想定される。
【００５８】
一態様では、本方法に有用なＴＧＦβ抗体は、ＸＰＡ．４２．０８９、ＸＰＡ．４２．０６８、及びＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択される。ＸＰＡ．４２．０８９の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６及び８に記載される。ＸＰＡ．４２．０６８の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２及び４に記載され、かつＸＰＡ．４２．６８１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０及び１２に記載される。
【００５９】
一態様では、本方法に有用なＴＧＦβ抗体は、フレソリムマブ（ＧＣ１００８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｏｆｉ）であり、現在、第Ｉ相臨床試験中である（Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｍａｒ  １１；９（３）：ｅ９０３５３，２０１４；  Ａｋｈｕｒｓｔ  ａｎｄ  Ｈａｔａ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，１１：７９０−８１１，２０１２）。米国特許第７，７２３，４８６号を参照されたい。
【００６０】
一態様では、本方法に有用なＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、及びピディリズマブからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】ＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質の単剤及び併用療法による、同種移植片マウスモデルにおける腫瘍阻害を示す。図１Ａは、ｃＳＣＣ細胞を移植したマウスにおける腫瘍の長を示す。
【図１Ｂ】ＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質の単剤及び併用療法による、同種移植片マウスモデルにおける腫瘍阻害を示す。生細胞の割合として表されるＣＤ４５＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の量を示す。
【図１Ｃ】ＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質の単剤及び併用療法による、同種移植片マウスモデルにおける腫瘍阻害を示す。ＣＤ４５＋細胞の割合として表されるＣＤ４５＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の量を示す。
【図２】免疫療法に対する個々の腫瘍の異なる応答を示す。図１からのデータは、α−ＰＤ−１（図２Ａ）、α−ＴＧＦβ（図２Ｂ）、及び併用療法（図２Ｃ）に対する応答の範囲を示すために、「応答体」及び「進行体」に分類された。
【図３】免疫療法に対する個々の腫瘍の異なる応答を示す。図１からのデータは、対照（ｃｔｒｌ）（図３Ａ）、α−ＰＤ−１単剤療法（図３Ｂ）、α−ＴＧＦβ単剤療法（図３Ｃ）、ならびに組み合わせでのα−ＰＤ−１及びα−ＴＧＦβ（図３Ｄ）についての経時的な別個の腫瘍測定としてプロットされた。
【図４】生細胞の割合、及びＣＤ４５＋細胞の割合として表される、化学的に誘導された（ＤＭＢＡ−ＴＰＡ）皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）マウスの腫瘍である、ＣＤ４５＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍の腫瘍免疫型分類（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｉｎｇ）測定を示す。
【図５】同系ＦＶＢ／Ｎマウスにおける化学的に誘導された（ＤＭＢＡ／ＴＰＡ）Ｋｒａｓ駆動及びＨｒａｓ駆動（ＦＶＢ−６２、ＦＶＢ−８５、ＦＶＢ−１６６、ＦＶＢ−１６８、ＦＶＢ−１６９）及び遺伝的にイニシエートされた（ＧＥＭＭ）Ｋｒａｓ駆動ｃＳＣＣ細胞系（ＦＶＢ−１４２５、ＦＶＢ−１４２８）の１メガベース（ＭＢ）当たりの変異数、ならびにＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質の単剤療法及び併用療法に対する感受性を示す。
【図６Ａ】汎（ｐａｎ）特異的α−ＴＧＦβ１、２、３、及びα−ＰＤ１単剤療法ならびに併用療法に対する化学的に誘導されたＳＣＣ腫瘍細胞系ＦＶＢ−１６８の応答を示す。図６Ａは、示される療法に対する、疾患進行（腫瘍成長の継続）、完全応答（すなわち、癌腫成長の阻害／退縮）、または部分的応答を示す癌腫の割合を示す。
【図６Ｂ】汎特異的α−ＴＧＦβ１、２、３、及びα−ＰＤ１単剤療法ならびに併用療法に対する化学的に誘導されたＳＣＣ腫瘍細胞系ＦＶＢ−１６８の応答を示す。図６Ｂは、このモデルにおける汎特異的α−ＴＧＦβ１、２、３、及びα−ＰＤ１単剤療法及び併用療法に応答するマウスの生存率を示す。
【図６Ｃ】汎特異的α−ＴＧＦβ１、２、３、及びα−ＰＤ１単剤療法ならびに併用療法に対する化学的に誘導されたＳＣＣ腫瘍細胞系ＦＶＢ−１６８の応答を示す。図６Ｃは、汎特異的α−ＴＧＦβ１、２、３、及びＰＤ−１阻害物質の単剤療法ならびに併用療法による治療に応答する、及び応答しない（すなわち、癌腫成長の進行）腫瘍のＣＤ４５＋の割合及びＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇの比率として、免疫細胞マーカーであるＣＤ８＋エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４＋エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のレベルを示す。
【図７】ＴＧＦβ１、２特異的、汎特異的ＴＧＦβ１、２、３、及びＰＤ−１阻害物質の単剤及び併用療法による同種移植片マウスモデルにおける腫瘍阻害を示す。示される治療後０〜２５日にわたる腫瘍体積（ｍｍ３）として表される。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
本開示は癌の治療または癌の再発予防のための治療薬を提供する。本開示は、ＴＧＦβ及びＰＤ−１と相互作用し、それらの機能作用のうちの１つ以上、例えば、ＴＧＦβまたはＰＤ−１の結合パートナーを通したシグナル伝達などを阻害する分子または薬剤を提供する。本明細書に開示される組成物は、有利に、腫瘍における免疫細胞活性を調節する能力を有し、それにより、一態様では、腫瘍の成長に直接または間接的に影響を及ぼす細胞集団に影響を及ぼすことにより、癌を治療する方法を提供する。
【００６３】
定義
本明細書で使用される、「ＴＧＦβ」は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３を含むＴＧＦβのうちの任意の１つ以上のアイソフォームまたはそれらの変異型を指す。同様に、用語「ＴＧＦβ受容体」は、別途記載のない限り、少なくとも１つのＴＧＦβアイソフォームに結合する任意の受容体を指す。
【００６４】
本明細書で使用される、「プログラム細胞死タンパク質１」または「ＰＤ−１」は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の２つのリガンドに結合することによって媒介される免疫チェックポイント遮断に関与する細胞表面受容体を指す。そのリガンドに結合するＰＤ−１は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、及び細胞傷害活性を低減することが示された。
【００６５】
本明細書で使用される、抗標的抗体の「所望の生物学的活性」は、ＴＧＦβまたはＰＤ−１に結合し、それらの機能作用のうちの１つ以上を阻害する能力である。
【００６６】
本明細書で使用される、「状態」または「障害」は、本明細書に記載される標的阻害物質による標的活性の修飾が有益である「標的」に関連し、また高レベルの標的が障害の病態生理または障害の悪化に寄与する要因のいずれかの原因であることが示されたか、またはそれの疑いがある他の障害、加えて標的の調節が臨床徴候または症状の変化に関連する疾患及び他の障害も含む。かかる障害は、例えば、障害を患う対象の患部細胞もしくは組織において分泌された及び／もしくは細胞表面上の標的のレベルならびに／または修飾された標的シグナル伝達の増加により証明され得る。
【００６７】
ＴＧＦβを阻害する阻害物質、及びＰＤ−１を阻害する阻害物質、またはＴＧＦβ及びＰＤ−１の両方の阻害物質（例えば、本明細書に記載される抗体）により治療され得る例示的な疾患、状態、または障害は、癌、例えば、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、線維性癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、びまん性内因性橋膠腫、再発性小児脳新生物腎細胞癌（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｎｅｏｐｌａｓｍ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、明細胞型転移性腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、第ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、第ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫、第ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、寛解期の成人急性骨髄性白血病；Ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＲＵＮＸ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１；ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＭＬＬＴ３−ＭＬＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）を伴う成人急性前骨髄球性白血病；ＰＭＬ−ＲＡＲＡ；アルキル化剤関連急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、リクター症候群；ワルデンストレームマクログロブリン血症、成人神経膠芽腫；成人神経膠肉腫、再発性神経膠芽腫、再発性小児横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽腫；再発性骨肉腫、結腸直腸癌、ＭＳＩ陽性結腸直腸癌；ＭＳＩ陰性結腸直腸癌、上咽頭非角化癌；再発性上咽頭未分化癌、子宮頸部腺癌；子宮頚部腺扁平上皮癌；子宮頸部扁平上皮癌；再発性子宮頸癌；第ＩＶＡ期子宮頸癌；第ＩＶＢ期子宮頸癌、肛門管扁平上皮癌；転移性肛門管癌；再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌；癌腫、頭頸部の扁平上皮細胞、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、進行ＧＩ癌、胃腺癌；胃食道接合部腺癌、骨新生物、軟部組織肉腫；骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌；第ＩＩＩ期メルケル細胞癌；第ＩＶ期メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、及び再発性菌状息肉症、ならびにセザリー症候群などを含む。
【００６８】
「免疫グロブリン」または「未変性抗体」は四量体糖タンパク質である。天然に生じる免疫グロブリンにおいて、各四量体はポリペプチドの２つの同一対から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びエプシロン（ε）に分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして抗体のアイソフォームを定義する。軽鎖及び重鎖内で可変及び定常領域が約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０個超のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００６９】
各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端（ＶＬ）に可変ドメイン、そしてそのもう一端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整合され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整合される。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）。
【００７０】
免疫グロブリン可変ドメインは、３つの超可変領域またはＣＤＲによって結合した比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を呈する。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖の両方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り付けは、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３，１９８９）の定義に従う。
【００７１】
抗体の超可変領域は、抗原結合に関与する抗体のＣＤＲのアミノ酸残基を指す。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基［例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）により説明される、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）］、及び／または超可変ループからのそれらの残基（例えば、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］により説明される、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３））を含む。ＣＤＲはまた、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番付（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）、これは、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおけるＣＤＲの位置を次のように記載する：ＣＤＲ１、およそ残基２７〜３８；ＣＤＲ２、およそ残基５６〜６５；及びＣＤＲ３、およそ残基１０５〜１１６（生殖系列）または残基１０５〜１１７（再編成）にも従って特定及び番付された。一実施形態では、ＣＤＲが、本明細書に開示されるものとほぼ類似する長さの抗体の重鎖または軽鎖の軽鎖可変ドメインにおいておよそ残基２６〜３１（Ｌ１）、４９〜５１（Ｌ２）及び８８〜９８（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいておよそ残基２６〜３３（Ｈ１）、５０〜５８（Ｈ２）、及び９７〜１１１（Ｈ３）に位置することを想定する。しかしながら、当業者は、特定の抗体の配列が特定される場合、ＣＤＲ残基の実際の位置が上述の推定残基とは異なり得ることを理解する。
【００７２】
フレームワークまたはＦＲ残基は、超可変領域の残基以外のそれらの可変ドメインの残基である。
【００７３】
本明細書で使用される、「重鎖可変領域」は、該抗体の重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、該抗体の重鎖の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含み得る。
【００７４】
本明細書で使用される、「軽鎖可変領域」は、該抗体の軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、該抗体の軽鎖の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含み得、これは抗体によりカッパまたはラムダのいずれかの軽鎖であってよい。
【００７５】
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、完全に組み立てられた抗体、四量体抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）、及び前述を含む組換えペプチドを含む。「免疫グロブリン」または「四量体抗体」は、それぞれ可変領域及び定常領域を含む、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる四量体糖タンパク質である。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により産生され得る。抗体断片または抗原結合部分は、抗体が所望の生物学的活性を保持する限り、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ＣＤＲグラフト抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖状抗体；キレート組換え抗体、トリボディもしくはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはその変異型もしくは誘導体、及び１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列など、ポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【００７６】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在し得る可能な天然に生じる変異を除き同一である集団から得られた抗体を指す。
【００７７】
本明細書で使用される、「抗体変異型」は、参照抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも１個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む抗体ポリペプチド配列を指す。変異型は未修飾抗体に対して実質的に相同であるか、または実質的に同一であってよい。
【００７８】
本明細書で使用される、「キメラ抗体」は、典型的には異なる種を起源とする２つの異なる抗体由来の配列（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を含む抗体を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒト及びゲッパ類の抗体断片、一般的にはヒト定常及びマウス可変領域を含む。
【００７９】
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原の生物学的機能を排除または大幅に低下させることができる抗体分子である。したがって、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達などの生物学的機能を排除または大幅に低下させることができる。
【００８０】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成成分から特定され、分離され、回収された抗体である。その天然環境の汚染物質構成成分は、抗体の診断的または治療的使用に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法により決定されたとき、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を上回るまで、（２）スピニングカップシーケネーターの使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）還元もしくは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでクーマシーブルー染色または好ましくは銀染色を用いて均質に精製される。抗体の天然環境のうちの少なくとも１つの構成成分が存在しないため、単離された抗体には組換え細胞内にインシツで抗体が含まれる。しかしながら通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００８１】
本明細書で使用される、「特異的に結合する」が、「標的特異的」である、標的に「特異的である」、または標的抗原と「免疫反応性」である抗体は、類似する抗原よりも大きい親和性で標的抗原に結合する抗体または抗体物質を指す。本開示の一態様では、標的結合ポリペプチド、またはその断片、変異型、もしくは誘導体は、他の、すなわち、非ヒト種の標的に対するその結合親和性と比較して、ヒト標的に対してより大きい親和性で結合するが、標的のオルソログを認識し、それに結合する結合ポリペプチドは提供される範囲内である。
【００８２】
例えば、その同族抗原に「特異的な」抗体またはその断片であるポリペプチドは、抗体の可変領域が検出可能な優先度で対象のポリペプチドを認識し、それに結合する（すなわち、局限的な配列同一性、相同性、またはファミリーメンバー間の類似性の存在の可能性にかかわらず、結合親和性における測定可能な相違により、対象のポリペプチドを同じファミリーの他の既知のポリペプチドと区別することができる）ことを示す。特定の抗体が抗体の可変領域の外側、特に分子の定常領域の配列との相互作用を通して、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技法において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａまたは他の抗体）とも相互作用し得ることが理解される。本開示の方法において使用する抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当該技術分野において周知であり、日常的に実践される。かかるアッセイの包括的な考察に関しては、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。本方法に使用する抗体は当該技術分野において既知の任意の方法を使用して産生することができる。
【００８３】
用語「エピトープ」は、抗原結合領域のうちの１つ以上で、選択的結合剤により認識され、結合されること可能な任意の分子のその部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、特定の３次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。本明細書で使用されるエピトープは隣接しているか、または隣接していなくてもよい。更に、エピトープは、それらが抗体を生成するのに使用されたエピトープと同一である３次元構造を含むが、抗体免疫応答を刺激するのに使用された標的に見られるアミノ酸残基を含まないか、またはそのいくつかしか含まないという点で模倣物（ミモトープ）であり得る。本明細書で使用される、ミモトープは、選択的結合剤により結合されたエピトープとは異なる抗原とは見なされず、選択的結合剤はエピトープ及びミモトープの同じ３次元構造を認識する。
【００８４】
本開示の抗体物質及びポリペプチドに関して使用されるとき、用語「誘導体」は、ヒトタンパク質において通常生じない、ユビキチン化、治療薬もしくは診断薬へのコンジュゲーション、標識（例えば、放射線核種または様々な酵素による）、ペグ化などの共有結合ポリマー結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、及びオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入もしくは置換などのかかる技法により化学的に修飾されたポリペプチドを指す。誘導体は本開示の未誘導体化分子の結合性質を保持する。
【００８５】
「検出可能な部分」または「標識」は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される）、ビオチン−ストレプトアバジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能であるハプテン及びタンパク質、または標的に配列相補性を有する核酸分子が含まれる。検出可能な部分は多くの場合、試料中の結合検出可能部分の量を定量するために使用され得る、放射性、発色性、または蛍光シグナルなどの測定可能なシグナルを生成する。
【００８６】
用語「治療有効量」は、本明細書において、治療される疾患の症状または徴候を寛解または軽減するのに有効である、本開示の標的特異的組成物の量を示すように使用される。
【００８７】
本明細書において、方法に関して使用される、用語「治療する」、「治療された」、「治療すること」、及び「治療」は、事象、疾患、または状態の臨床症状、症状発現、または進行を、一時的もしくは永久的にのいずれか、部分的もしくは完全にのいずれかで、排除する、低減する、抑制する、または寛解することを指す。かかる治療は有用であるのに絶対である必要はない。
【００８８】
本方法は、本明細書に記載の例示的配列のものを含み得る標的特異的抗体、その断片、変異型、及び誘導体、本明細書に列挙される標的特異的抗体を含む薬学的製剤の使用を提供する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り付けられ、これらはサブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構成は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のアイソタイプはＡＤＣＣ活性を有する。本明細書に開示される抗体は、定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプのうちのいずれかであってよい。
【００８９】
本方法に使用される抗体は、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下のＫｄの、１つ以上のＴＧＦβ及び／またはＰＤ−１抗原に対する結合親和性を呈し得る。かかる親和性は、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の使用（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器、製造業者により概説される一般手順を用いる）、１２５Ｉ標識された標的抗原を使用するラジオイムノアッセイ、または以下の実施例に記載のまたは当業者に既知の別の方法などによる、従来の技法を使用して容易に決定することができる。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）の方法により分析され得る。
【００９０】
ＫｉｎＥｘＡ速度論的除外アッセイもその抗原についての抗体の親和性を測定するのに有用である。ＫｉｎＥｘＡ技術は、液相と固相との間の結合事象ではなく、液相中の結合事象を測定する。加えて、結合事象を測定するための多くの方法が固定化または標識による少なくとも１つの反応体の修飾を必要とする一方で、ＫｉｎＥｘＡ方法は、研究中の分子の修飾を必要としない。ＫｉｎＥｘＡ方法は、現在利用可能な他の方法よりも広い範囲の結合定数の測定を可能にすると考えられる。ＫｉｎＥｘＡ装置についての更なる説明及び抗体特徴付けの操作は製造業者から入手可能であり（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）、公表文献、例えば、米国特許第６，６６４，１１４号及びＤａｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ２００４，  ２：６４７−６５７に見出すことができる。
【００９１】
形質転換成長因子β
ＴＧＦβは、成熟ＴＧＦβを産生するために分泌前に切断される約４００個のアミノ酸（ａａ）のプレプロタンパク質として合成されるジスルフィド結合した二量体である。「潜在関連ペプチド」（ＬＡＰ）として知られるＮ末端切断断片は、二量体との非共有結合を維持し、それによりＴＧＦβを不活性化する。インビボ単離されたＴＧＦβは、主に不活性な「潜在」形態で見出され、すなわち、ＬＡＰに関連する。潜在ＴＧＦβ複合体は、いくつかの方法で、例えば、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸／インスリン様成長因子ＩＩ受容体と呼ばれる細胞表面受容体への結合により活性化され得る。結合はＬＡＰ内のグリコシル化部位に結合したマンノース−６−リン酸残基を通して生じる。受容体への結合時にＴＧＦβがその成熟形態で放出される。次に、成熟活性ＴＧＦβは、自由にその受容体に結合し、その生物学的機能を発揮する。ＩＩ型ＴＧＦβ受容体の主なＴＧＦβ結合ドメインは、１９アミノ酸配列にマッピングされた（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２７５５，１９９６）。米国特許第７，８６７，４９６号及び第８，５６９，４６２号も参照されたい。
【００９２】
現在、ＴＧＦβの５つの既知のアイソフォーム（ＴＧＦβ１〜ＴＧＦβ５；ＴＧＦβ１〜３は哺乳類であり、ＴＧＦβ４はニワトリにおいて見出され、ＴＧＦβ５はカエルにおいて見出された）があり、それらの全ては互いに相同であり（６０〜８０％の同一性）、約２５ｋＤａのホモ二量体を形成し、共通のＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβ−ＲＩ、ＴＧＦβ−ＲＩＩ、ＴＧＦβ−ＲＩＩＢ、及びＴＧＦβ−ＲＩＩＩ）に作用する。ＴＧＦβならびにＴＧＦβ受容体の構造的及び機能的態様は当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｅｄｓ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，２００１を参照されたい）。ＴＧＦβは種間で十分に保存される。例えば、ラット及びヒト成熟ＴＧＦβ１のアミノ酸配列はほぼ同一である。米国特許第７，８６７，４９６号も参照されたい。
【００９３】
ＴＧＦβ１は、生物学的組織における創傷治癒のプロセスにおいて重要な役割を担う（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３３１，ｐ．１２８６，１９９４  ａｎｄ  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１９，ｐ．１０１７，１９９２）。創傷組織の部位で、炎症細胞及び線維芽細胞の浸潤、細胞外基質（ＥＣＭ）の産生及び血管新生、ならびに後の組織再生のための細胞成長などの生物学的反応は損傷組織を修復するために生じる。米国特許第７，５７９，１８６号も参照されたい。
【００９４】
ＴＧＦβ２欠損マウスは、心臓、肺、頭蓋顔面、肢、脊椎、眼、耳、及び泌尿生殖器障害を含む、顕著な発生障害を示す（Ｄｕｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  ２６７：６９８２−８，２００１）。ＴＧＦβ３欠損マウスは生後２４時間までにほぼ１００％の致死率を示す。これらのマウスは顕著な口蓋障害及び肺発生の遅延を示す（Ｄｕｎｋｅｒら、上記）。ＴＧＦβ２は、緑内障の発生（Ｌｕｔｈｅｎ−Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８１：１−４，２００５）、クローン病に関連する線維症（Ｖａｎ  Ａｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．１０：５５−６０，２００４）、創傷治癒、及び糖尿病性腎症（Ｐｏｈｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９２：７４６−５６，２００９）にも関連付けられた。
【００９５】
多くのヒト腫瘍（ｄｅＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３６７３（１９８７）、Ｋｕｐｐｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４２：５６２（１９８８））及び多くの腫瘍細胞系（Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：７０７（１９８７），Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：５９４（１９８８））がＴＧＦβを産生することが観察された。
【００９６】
癌におけるＴＧＦβアイソフォームの発現は複雑であり、特定の癌において異なる役割を有するＴＧＦβアイソフォームの異なる組み合わせにより変化する。例えば、米国特許第７，９２７，５９３号を参照されたい。例えば、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３は、卵巣癌及びその進行において、ＴＧＦβ２よりも大きな役割を担う可能性がある一方で、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の発現は、高悪性度軟骨肉腫の腫瘍においてＴＧＦβ３よりも高い。ヒト乳癌において、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３は高度に発現され、ＴＧＦβ３の発現は全生存に相関するように思われる、つまり、リンパ節転移及び陽性ＴＧＦβ３発現を有する患者は予後転帰が良好ではない。しかしながら、結腸癌において、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２はＴＧＦβ３よりも高度に発現され、癌ではない個体よりも大きい循環レベルで存在する。神経膠腫において、ＴＧＦβ２は細胞移動に重要である。
【００９７】
ＴＧＦβ抗体
本開示は、標的特異的抗体をコードするアミノ酸分子の使用を包含する。例示的な実施形態では、本開示の方法において有用な標的特異的抗体は、ヒトカッパ（κ）  またはヒトラムダ（λ）軽鎖もしくはそれに由来するアミノ酸配列、またはヒト重鎖もしくはそれに由来する配列、または単鎖、二量体、四量体、もしくは他の形態において重鎖及び軽鎖の両方を一緒に含み得る。いくつかの実施形態では、標的特異的免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖は異なるアミノ酸分子である。他の実施形態では、同じアミノ酸分子は標的特異的抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本方法において有用なＴＧＦβのヒト抗標的抗体のアミノ酸配列は、抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、及びＸＰＡ．４２．６８１（それぞれ、配列番号４、８、及び１２）、または、本明細書に記載される、ＣＤＲグラフトされた、修飾された、ヒト化、キメラ、もしくはヒトにより操作された抗体、もしくは任意の他の変異型を含むそれらの変異型の成熟（すなわち、シグナル配列を欠く）軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、前述の抗体のうちのいずれか１つの軽鎖のＣＤＲ１の始めからＣＤＲ３の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【００９９】
一実施形態では、標的特異的抗体は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、それらのそれぞれは、独立して、配列番号４、８、及び１２に記載のＶＬ領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号４、８、及び１２に記載のＶＨ領域をコードする核酸、または配列番号３、７、及び１１に記載のＶＬ領域をコードする核酸分子によってコードされる  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域から選択される。一実施形態では、Ｃｈｏｔｈｉａ番付に従って、軽鎖ＣＤＲ１はおよそ残基２４〜３４であり、ＣＤＲ２はおよそ残基５０〜５６であり、ＣＤＲ３はおよそ残基８９〜９７に至る。代替えの実施形態では、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番付に従って、重鎖ＣＤＲがおよそ残基２７〜３８（ＣＤＲ１）、およそ残基５６〜６５（ＣＤＲ２）、及びおよそ残基１０５〜１１６（生殖系列）  または残基１０５〜１１７（ＣＤＲ３）に位置することが想定される。一実施形態では、軽鎖ＣＤＲは、本明細書に開示されるものとほぼ類似する長さの抗体軽鎖の軽鎖可変ドメインにおいて、およそ残基２６〜３１（Ｌ１）、４９〜５１（Ｌ２）、及び８８〜９７（Ｌ３）に位置することが想定される。標的特異的抗体のポリペプチドは、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、及びＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択されるＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含み得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβのヒト標的特異的抗体は、それぞれ、配列番号２、６、及び１０に記載の抗体ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、及びＸＰＡ．４２．６８１またはそれらの変異型の成熟（すなわち、シグナル配列を欠く）重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、前述の抗体の重鎖のうちのいずれか１つのＣＤＲ１の始めからＣＤＲ３の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
一実施形態では、標的特異的抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含み、それらのそれぞれは、独立して、配列番号２、６、及び１０に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体、配列番号２、６、及び１０に記載のＶＨ領域をコードする核酸、または配列番号１、５、及び９に記載のＶＨ領域をコードする核酸分子によってコードされる  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域から選択される。標的特異的抗体は重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含み、それらのそれぞれが、独立して、配列番号２、６、及び１０に記載のＶＨ領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域から選択されることが更に想定される。一実施形態では、重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番付に従って位置し、ＣＤＲ１はおよそ残基２６〜３５であり、ＣＤＲ２はおよそ残基５０〜５８であり、ＣＤＲ３はおよそ残基９５〜１０２（または９５〜１１１、または９５〜１１８）に至る。代替えの実施形態では、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番付に従って、重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１がおよそ残基２７〜３８（ＣＤＲ１）、およそ残基５６〜６５（ＣＤＲ２）、及びおよそ残基１０５〜１１６（生殖系列）のＣＤＲ３または残基１０５〜１１７  ＣＤＲ３）に位置することが想定される。一実施形態では、重鎖ＣＤＲは、本明細書に開示されるものとほぼ類似する長さの抗体重鎖の重鎖可変ドメインにおいて、およそ残基２６〜３３（Ｈ１）、５０〜５８（Ｈ２）、及び９７〜１１１（Ｈ３）に位置することが想定される。標的特異的抗体のポリペプチドは、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、及びＸＰＡ．４２．６８１からなる群から選択されるＶＨ領域のアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含み得る。
【０１０２】
別の実施形態では、ＴＧＦβ抗体は、上記に開示される成熟軽鎖可変領域及び上記に開示される成熟重鎖可変領域を含み、任意選択で、対応して命名される重鎖もしくは軽鎖と、または任意選択で、異なる重鎖もしくは軽鎖と対合される。
【０１０３】
例示的な実施形態では、本開示は、それぞれ、配列番号１３、１９、及び２５；１４、２０、及び２６；１５、２１、及び２７、ならびに配列番号１６、２２、及び２８；１７、２３、及び２９；ならびに１８、２４、及び３０のうちのいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを保持し、任意選択で、かかるＣＤＲのうちのいずれかに１つまたは２つの変異、例えば、保存的もしくは非保存的置換を含み、任意選択で、対合されるモノクローナル抗体；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３の全て、または配列番号１３、１９、及び２５；１４、２０、及び２６；ならびに１５、２１、及び２７のうちのいずれか１つの重鎖可変領域を保持し、任意選択で、かかるＣＤＲのうちのいずれかに１つまたは２つの変異を含み、任意選択で、任意の好適な重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＥ、そのヒト配列、またはそのハイブリッドを更に含むモノクローナル抗体；ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の全て、または任意の１つの配列番号１６、２２、及び２８；１７、２３、及び２９；ならびに１８、２４、及び３０の軽鎖可変領域を保持し、任意選択で、かかるＣＤＲのうちのいずれかに１つまたは２つの変異を含み、任意選択で、任意の好適な軽鎖定常領域、例えばカッパもしくはラムダ軽鎖定常領域、そのヒト配列、またはそのハイブリッドを更に含むモノクローナル抗体の使用を想定する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本方法に有用な抗体は、３つ全ての軽鎖ＣＤＲ、３つ全ての重鎖ＣＤＲ、または軽鎖及び重鎖の６つ全てのＣＤＲを含む。いくつかの例示的な実施形態では、抗体からの２つの軽鎖ＣＤＲは異なる抗体の第３の軽鎖ＣＤＲと組み合わされてもよい。代替的に、１つの抗体からのＬＣＤＲ１は、特にＣＤＲが高度に相同である場合、異なる抗体からのＬＣＤＲ２及びまた別の抗体からのＬＣＤＲ３と組み合わされ得る。同様に、ある抗体からの２つの重鎖ＣＤＲが、異なる抗体からの第３の重鎖ＣＤＲと組み合わされ得るか、または特にＣＤＲが高度に相同である場合、１つの抗体からのＨＣＤＲ１が、異なる抗体からのＨＣＤＲ２及びまた別の抗体からのＨＣＤＲ３と組み合わされ得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本方法に有用な抗体は、配列番号２、６、及び１０に記載の重鎖可変領域に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列、及び／または配列番号４、８、及び１２に記載の軽鎖可変領域に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列アミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、本抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てを更に含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域に対して同一性率を有するアミノ酸配列は、軽鎖ＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つを含み得る。他の実施形態では、重鎖可変領域に対して同一性率を有するアミノ酸配列は、重鎖ＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つを含み得る。
【０１０６】
別の実施形態では、本方法に有用な抗体は、本明細書に記載される抗体配列の重鎖可変領域において、３つ全てのＨＣＤＲに対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、本ＣＤＲは配列番号１３、１９、及び２５；１４、２０、及び２６；ならびに１５、２１、及び２７に記載される。
【０１０７】
関連実施形態では、本方法に有用な抗体は、本明細書に記載される抗体配列の軽鎖可変領域において、３つ全てのＬＣＤＲに対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、本ＣＤＲは配列番号１６、２２、及び２８；１７、２３、及び２９；ならびに１８、２４、及び３０に記載される。
【０１０８】
更なる実施形態では、本方法に有用な抗体は、本明細書に記載される抗体配列の重鎖及び軽鎖可変領域において、６つ全てのＬＣＤＲに対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、本ＣＤＲは配列番号１３、１９、及び２５；１４、２０、及び２６；ならびに１５、２１、２７；１６、２２、及び２８；１７、２３、及び２９；ならびに１８、２４、及び３０に記載される。
【０１０９】
本明細書に記載される抗体は、抗体のＣＤＲ領域に１つまたは２つ以上のアミノ酸置換、例えば、非保存的もしくは保存的置換を有し得ることが想定される。
【０１１０】
関連実施形態では、フレームワークの残基が変更される。変更され得る重鎖フレームワーク領域は、重鎖ＣＤＲ残基を囲むＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、及びＨ−ＦＲ４と表記される領域内に位置し、変更され得る軽鎖フレームワーク領域の残基は、軽鎖ＣＤＲ残基を囲むＬ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、及びＬ−ＦＲ４と表記される領域内に位置する。フレームワーク領域内のアミノ酸は、例えば、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークにおいて特定される任意の好適なアミノ酸と置き換えられてもよい。
【０１１１】
例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３からなる群から選択されるＴＧＦβの少なくとも１つのアイソフォームを特異的に結合する。他の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、（ａ）ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３（「汎反応性抗体」または「汎結合抗体」）、（ｂ）ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２、（ｃ）ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３、ならびに（ｄ）ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３を特異的に結合する。例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＧＦβ抗体は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下（より低いとはより高い結合親和性を意味する）の親和性でＴＧＦβの少なくとも１つのアイソフォームに結合するか、または任意選択で、アイソフォームのうちの１つ以上に関して、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ  １０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下の親和性で、２つのＴＧＦβアイソフォーム、またはＴＧＦβ１、２、または３の全てに結合する。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＴＧＦβ３への結合と比較して、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高い親和性で（例えば、優先的にＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２に結合する）ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２に結合する。代替的に、本明細書に記載される抗体は、互いの３倍、５倍、または１０倍以内の親和性で、ＴＧＦβのアイソフォームであるＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３のそれぞれに結合する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の抗体中和は、ＴＧＦβ３の中和よりも少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％超強い。
【０１１３】
ＸＰＡ．４２．０８９の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６及び８に記載される。ＸＰＡ．４２．０６８の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２及び４に記載され、かつＸＰＡ．４２．６８１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０及び１２に記載される。
【０１１４】
抗体核酸
本開示は、本明細書及び配列表に記載される標的特異的抗体をコードし、任意選択で、本明細書に記載される抗体を組換えにより産生するため、または抗体の変異型を生成するための核酸分子の使用も包含する。いくつかの実施形態では、異なる核酸分子は標的特異的抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子は標的特異的抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする。一実施形態では、核酸は、本開示の標的特異的抗体、ならびに本明細書に記載される核酸によりコードされるポリペプチドのいずれかをコードする。
【０１１５】
本方法において使用するために想定される抗ＴＧＦβ抗体をコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、及び１１の配列を含む全ての核酸配列を含み、核酸は、本明細書に記載される抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、または本明細書に記載される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲをコードし、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１３〜３０に記載される、遺伝子コードの多様性に基づいた縮重コドン、加えて本明細書に記載される条件などの高度に厳密な条件下で、本明細書に記載される抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、または本明細書に記載される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲをコードする核酸配列とハイブリダイズし、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１３〜３０に記載される核酸を含む。
【０１１６】
アミノ酸類似体を含む変異型もしくは誘導体の親和性成熟または調製を含む、本発明の抗体及び抗原結合化合物の変異型及び誘導体の調製は、本明細書において更に詳細に記載される。例示的な変異型には、アミノ酸配列内の対応するアミノ酸の保存的もしくは非保存的置換、またはアミノ酸の、異なるヒト抗体配列の対応するアミノ酸との置き換えを含むものが含まれる。本明細書に開示される抗体の変異型及び断片は、本明細書に記載される、及び組換えタンパク質産生の分野に既知の方法を使用して行われる。
【０１１７】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）
分化抗原群２７９（ＣＤ２７９）としても知られるＰＤ−１は、２６８アミノ酸の膜タンパク質である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞調節因子タンパク質のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１（１１）：３８８７−９５，（１９９２））。ＰＤ−１は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ならびにマクロファージ上に発現される細胞表面共阻害受容体であり、免疫チェックポイント阻害の構成成分である（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，２３（３）：７０４，（１９９４）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．，２３６：２１９，（２０１０））。ＰＤ−１は、その２つのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１としても知られる、ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）と相互作用するときにＴ細胞の活性を制限する（Ｆｒｅｅｍａｎ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（７）：１０２７−３４，２０００、Ｌａｔｃｈｍａｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（３）：２６１−８，２００１、Ｐｏｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３３：９，２０１５）。ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との相互作用は、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生、及び細胞傷害性活性を低減する（Ｆｒｅｅｍａｎ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９２：１０２７−３４，（２０００）、Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１２５７−６６，（２００３））。
【０１１８】
ＰＤ−１抗体
ＰＤ−１に対する抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，６１７，５４６号、同第８，００８，４４９号、同第８，７４１，２９５号、同第８，５５２，１５４号、同第８，３５４，５０９号、同第８，７７９，１０５号、同第７，５６３，８６９号、同第８，２８７，８５６号、同第８，９２７，６９７号、同第８，０８８，９０５号、同第７，５９５，０４８号、同第８，１６８，１７９号、同第６，８０８，７１０号、同第７，９４３，７４３号、同第８，２４６，９５５号、及び第８，２１７，１４９号に記載されている。
【０１１９】
任意の既知の抗体が本方法に使用され得ることが想定される。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤ−１のマウスモノクローナル抗標的抗体が本方法に使用される。例えば、ＩｎＶｉｖｏ  ＭＡｂ  ａｎｔｉ  ｈ  ＰＤ−１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ，Ｃｌｏｎｅ：ＲＭＰ１−１４、カタログ番号ＢＥ０１４６）。抗ＰＤ−１抗体は、ヒト療法において有効であることが示されており、例えば、ヒト療法における使用が承認されている抗ＰＤ−１抗体であるペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．）及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を参照されたい。更なるＰＤ−１抗体、例えば、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ  Ｌｔｄ．）は、臨床開発中である。
【０１２０】
代替的に、ＰＤ−１に対する抗体は、ファージディスプレイ技術、ハイブリドーマ技術、トランスジェニックマウス技術などを含む、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される技法を使用して作製される。
【０１２１】
様々な実施形態では、ＴＧＦβ及びＰＤ−１タンパク質の両方に結合する二重特異性抗体は本方法に有用である。
【０１２２】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。同じまたは異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は一般的に、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向され得る。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、異なる特異性及び特性を有する他の免疫グロブリンにより汚染されていない均質な培養物で合成されるという点で利点である。
【０１２３】
モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７，１９７５）（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）により記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製され得る。モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１）及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）に記載される技法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。モノクローナル抗体を産生するための更なる方法は当業者には周知である。
【０１２４】
上記方法により産生されたものなどのモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び／または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離される。
【０１２５】
本開示の抗体は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載される抗体のより小さい抗原結合断片として使用され得ることが更に想定される。
【０１２６】
抗原断片
抗体断片は、インタクトな完全長抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、多特異性抗体断片、例えば、二重特異性、三重特異性等の抗体など（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）；ミニボディ；キレート組換え抗体；トリボディもしくはバイボディ；イントラボディ；ナノボディ；小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、及び抗体断片から形成された他のポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１２６−３６（２００５））を参照されたい。
【０１２７】
抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨドメインからなる一価の断片である「Ｆａｂ」断片、ならびに名前が容易に結晶化するその能力を反映する残留「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。ペプシン処理は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む２つの「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有するヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらし、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬドメインとの間に更に含み、その結果として、ＶＬ及びＶＨ領域が、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーを介して対合して一価分子を形成する、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をもたらす（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８，ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．ｌ  １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。Ｆｄ断片はＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる。
【０１２８】
更なる抗体断片は、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片を含む（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによりドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の抗体である（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３、及びＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照）。ダイアボディは二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１２９】
軽鎖を欠く機能性重鎖抗体は、コモリザメ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３，１９９５）、テンジクザメ（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３−２６，２００１）、及びラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びラマなどのラクダ科（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８，  １９９３、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３，１９９８）において天然に生じる。抗原結合部位は、これらの動物において単一ドメインのＶＨＨドメインに低減される。これらの抗体は重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する、すなわち、これらの機能性抗体は構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」とも称される）。ラクダ科動物のＶＨＨは、報告によれば、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２及びＩｇＧ３定常領域と組換えられる（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、上記）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨがヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む定常領域と組換えられる従来（Ｈ２Ｌ２）の抗体アイソタイプであるが、ラマＩｇＧ２及びＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインを欠き、軽鎖を含まない重鎖のみのアイソタイプである。ラクダ科動物のＶＨＨドメインは、高親和性で抗原に結合され（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性を有する（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，２００２）ことが分かった。古典的なＶＨのみの断片は可溶性形態での産生が困難であるが、溶解度及び特異的結合の改善は、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様であるように変更される場合に得ることができる。（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１：２５−３８を参照されたい。）ラクダ科動物の重鎖を有する抗体を生成するための方法は、例えば、米国特許公開第２００５／０１３６０４９号及び第２００５／００３７４２１号に記載されている。
【０１３０】
抗体重鎖の可変ドメインは分子量がわずか１５ｋＤａの最小の十分に機能的な抗原結合断片であり、この実体はナノボディと称される（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，２００４）。抗体ライブラリは、Ｃｏｎｒａｔｈら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：  ２８０７−１２，２００１）に記載される免疫化ヒトコブラクダから、またはＲｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（１）：１１１−２４（２００５）に記載される組換え方法を使用して生成することができる。
【０１３１】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）及び三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）及びＷｉｌｌｅｍｓら（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディに関して、ｓｃＦｖ分子は、ＶＬ−ＣＬ（Ｌ）及びＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖のうちの１つまたは両方に融合され、例えば、トリアボディを産生するためには、２つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合されるが、バイボディにおいては、１つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合される。
【０１３２】
ペプチドリンカー（ヒンジなし（ｈｉｎｇｅｌｅｓｓ））を介して、またはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合されたｓｃＦｖからなる「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−２３，２００４に記載されている。
【０１３３】
イントラボディは、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質機能を操作することができる単鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０、Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含むイントラボディは、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら（ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１，１９９５）及びＷｈｅｅｌｅｒら（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されるように産生され得る。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合される細胞透過性抗体である  Ｈｅｎｇら（Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）。
【０１３４】
標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が更に想定される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合される抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、及び米国特許公開第２００３／０１１８５９２号を参照されたい。
【０１３５】
共有結合または非共有結合のいずれかで、１つ以上のＣＤＲを分子内に組み込み、それをイムノアドヘシンにすることができる。イムノアドヘシンは、より大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込むことができるか、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合することができるか、または非共有結合的にＣＤＲを組み込むことができる。ＣＤＲはイムノアドヘシンが特異的に対象の特定の抗原に結合することを可能にする。
【０１３６】
よって、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つ、２つ、及び／または３つのＣＤＲ（例えば、単独もしくはタンデムでの単一のＣＤＲ、ＣＤＲの２、３、もしくは他の複数のリピート、または単独もしくはタンデムリピートでの２つもしくは３つのＣＤＲの組み合わせ、任意選択で、ＣＤＲもしくはリピート間にスペーサーアミノ酸配列を有する）を含む様々な組成物が当該技術分野において既知の技法により生成され得る。
【０１３７】
多特異性抗体
いくつかの実施形態では、同じまたは異なる分子の少なくとも２つの異なるエピトープに結合特異性を有する多特異性（例えば、二重特異性）抗標的抗体を生成することが望ましい場合がある。例示的な二重特異性抗体は、標的分子の２つの異なるエピトープに結合し得る。代替的に、ＴＧＦβ特異的抗体のアームはＰＤ−１に結合するアームと組み合わせられ得る。二重特異性抗体は、標的を発現するか、または標的を取り込む細胞に細胞傷害性薬物を限局するためにも使用され得る。これらの抗体は、標的結合アーム及び細胞傷害性薬物（例えば、サポリン、抗インターフェロン−６０ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射線同位元素ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。Ｓｐａｓｅｖｓｋａ  Ｉ，ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１４、Ｃａｒａｖｅｌｌａ  Ｊ  ａｎｄ  Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．，１４（４）５２０−５２８，  ２０１０の二重特異性抗体の方法及び治療利益の概説も参照されたい。
【０１３８】
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチによると、抗体分子対間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸鎖がより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。大きい側鎖と同一または類似する大きさの補償「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）と置き換えることによって第２の抗体分子の界面上に創出される。これにより、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物を上回ってヘテロ二量体の収率を増加させるための機序をもたらす。ＷＯ９６／２７０１１を参照されたい。
【０１３９】
二重特異性抗体は架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体のうちの一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の便利な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１４０】
二重特異性抗体を抗体断片から生成するための技法も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３，１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載する。近接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を阻止するために、これらの断片をジチオール錯化剤（ｄｉｔｈｉｏｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元する。次に、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンで還元することにより、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つをＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。また更なる実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収されたＦａｂ’−ＳＨ断片を化学的にインビトロで結合して、二重特異性抗体を形成することができる。（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
【０１４１】
Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子を記載する。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで指向された化学結合を受けて二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体及び正常なヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し、加えてヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１４２】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体断片を作製及び単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生された。（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体のホモ二量体はヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで再酸化されて抗体のヘテロ二量体を形成する。この方法は抗体のホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８，１９９３）により説明される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機序を提供した。
【０１４３】
断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーにより軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補性ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対合させられ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１４４】
代替的に、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５）に記載されるように産生された「直鎖状抗体」であってもよい。直鎖状抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ  −ＣＨ１−ＶＨ  −ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１４５】
更なる実施形態では、二重特異性抗体は、キレート組換え抗体（ＣＲＡｂ）であってもよい。キレート組換え抗体は、標的抗原の隣接する、及び重複しないエピトープを認識し、両エピトープに同時に結合するのに十分に柔軟である（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）。
【０１４６】
３つ以上の原子価を有する抗体も想定される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０，１９９１）。
【０１４７】
キメラ抗体及びヒト化抗体
キメラ抗体またはヒト化抗体は、ヒトにおいて、親非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体よりも免疫原性が低いため、それらはアナフィラキシーのリスクが大幅に低いヒトの治療に使用することができる。
【０１４８】
非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されるキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の標準的な手順を使用して生成することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８４１−６８５５（１９８４）及びＢｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６，（１９８４）を参照）。
【０１４９】
ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク及び定常領域上にグラフトする（当該技術分野において、「ＣＤＲグラフト」によるヒト化と称されるプロセス）、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えにより、それらをヒト様表面で「覆う」（当該技術分野において、「ベニヤリング」と称されるプロセス）、または代替的に（３）抗原結合またはタンパク質折り畳みのいずれかに有害作用をもたらす可能性がないが、ヒト環境において免疫原性を低減する可能性があると決定された位置でヒトアミノ酸を置換する（例えば、ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標））ことを含む、様々な方法により達成され得る。本開示において、ヒト化抗体は「ヒト化」、「ベニヤリング」、及び「ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ（商標）」抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７（１９９４）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許第５，７６６，８８６号、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４，１９９４、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６（１９９４）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）、及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：７７３−７８３（１９９１）に開示されており、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤＲグラフト技法は本分野において既知であり、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８））を参照されたい。
【０１５０】
トランスジェニック動物によるヒト抗体
タンパク質を標的とするヒト抗体は、内在性免疫グロブリンを産生せず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されるトランスジェニック動物を使用して産生することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座の不活性化により、動物が機能性内在性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示する。ＷＯ９１／００９０６も免疫原に対する免疫応答を高めることができるトランスジェニック非霊長類哺乳類宿主を開示しており、抗体は霊長類の定常及び／または可変領域を有し、遺伝子座をコードする内在性免疫グロブリンは置換されるか、または不活性化される。ＷＯ９６／３０４９８及び米国特許第６，０９１，００１号は、定常もしくは可変領域の全てまたは一部を置き換えて、修飾された抗体分子を形成するなど、哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子座を修飾するための、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化内在性Ｉｇ遺伝子座及び機能性ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳類宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内在性重鎖を欠き、１つ以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスの作製方法を開示している。米国特許第６，１１４，５９８号  第６，６５７，１０３号、及び第６，８３３，２６８号、Ｇｒｅｅｎ  ＬＬ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１（１），７４−８４，  ２０１４、Ｌｅｅ  ＥＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：３５６−３６３，２０１４、Ｌｅｅ  ＥＣ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  Ｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，９０１：１３７−４８，２０１２）も参照されたい。
【０１５１】
上述のトランスジェニック動物を使用することにより、免疫応答が選択された抗原分子に産生され得、抗体産生細胞が動物から除去され、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得る。免疫プロトコル、アジュバントなどは当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるトランスジェニックマウスの免疫化に使用される。この刊行物は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、及び破傷風毒素を含む様々な抗原分子に対するモノクローナル抗体を開示する。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的作用を阻害または中和する能力に関して試験され得る。ＷＯ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫化したトランスジェニックマウスの免疫細胞に由来するＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が好中球のＩＬ−８誘導機能を遮断したことを開示する。トランスジェニック動物を免疫化するために使用された抗原に特異性を有するヒトモノクローナル抗体も、ＷＯ９６／３４０９６及び米国特許出願第２００３／０１９４４０４号、ならびに米国特許出願第２００３／００３１６６７号に開示される。
【０１５２】
モノクローナル抗体を作製するのに有用な更なるトランスジェニック動物は、米国特許第５，７７０，４２９号及びＦｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６））に記載されるＭｅｄａｒｅｘ  ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商法）を含み、これは、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖をコードする再配列されていないヒト抗体遺伝子からの遺伝子配列を含む。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の免疫化は、標的タンパク質に対する完全なヒトモノクローナル抗体の産生を可能にする。
【０１５３】
また、Ｉｓｈｉｄａら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２  （２００２））は、メガベースの大きさのヒトＤＮＡのセグメントを含み、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座全体を組み込むＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（ＴＣＭＯＵＳＥ（商標））を説明する。    ＴＣＭＯＵＳＥ（商標）は、ＩｇＧのサブクラス全て（ＩｇＧ１〜Ｇ４）を含む、ｈＩｇの十分に多様なレパートリーを有する。様々なヒト抗原でのＴＣＭＯＵＳＥ（商標）の免疫化は、ヒト抗体を含む抗体応答をもたらす。
【０１５４】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）、及び米国特許第．５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号、ならびに米国特許公開第２００２／０１９９２１３も参照されたい。米国特許公開第２００３／００９２１２５号は、所望のエピトープに対して動物の免疫応答を偏向するための方法を説明する。ヒト抗体はインビトロ活性化Ｂ細胞によっても生成され得る（米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照）。
【０１５５】
ディスプレイ技術からのヒト抗体
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術の開発、及び糸状バクテリオファージの表面上へのコードされた抗体断片のディスプレイは、ヒト抗体を直接作製するための手段をもたらした。ファージ技術により産生された抗体は、細菌において抗原結合断片、通常ＦｖまたはＦａｂ断片として産生され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は２つの戦略のうちの１つによって導入され得る。断片は、例えば、哺乳類細胞における発現のために完全抗体内に、またはエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片内に操作され得る。
【０１５６】
例として、ファージディスプレイ技術に使用するための抗体のライブラリの調製方法の１つは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を標的抗原またはその抗原部分で免疫化して、免疫応答を創出するステップと、免疫化動物から抗体産生細胞を抽出するステップと、抽出した細胞からＲＮＡを単離するステップと、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生するステップと、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅するステップと、抗体がファージ上に発現されるようにｃＤＮＡをファージディスプレイベクター内に挿入するステップとを含む。本開示の組換え標的特異的抗体はこの方法で得ることができる。
【０１５７】
別の例では、抗体産生細胞を非免疫化動物から抽出し、抽出した細胞からＲＮＡを単離し、逆転写してｃＤＮＡを産生し、これを、プライマーを使用して増幅し、抗体がファージ上で発現されるようにファージディスプレイベクター内に挿入する。ファージディスプレイプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上への抗体レパートリーのディスプレイ、及び最適な抗原へのそれらの結合による後のファージ選択を通して免疫選択を模倣する。かかる技法の１つはＷＯ９９／１０４９４に記載され、これには、このようなアプローチを使用したＭＰＬ及びｍｓｋ受容体の高親和性及び機能性アゴニスト抗体の単離が記載される。本開示の抗体は、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製された、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリ、好ましくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることにより単離され得る。かかるライブラリの調製及びスクリーニング方法は当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい。ファージディスプレイライブラリを生成するためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ．ＴＭ．ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用され得る他の方法及び試薬も存在する（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、ＫａｎｇらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９、ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１、ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号、ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号、ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７、及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２を参照されたい。
【０１５８】
一実施形態では、所望の特性を有する標的抗原に特異的なヒト抗体を単離するために、ヒトＶＨ及びＶＬライブラリをスクリーニングして、所望の特異性を有する抗体断片を選択する。この方法に使用される抗体ライブラリは、好ましくは、本明細書及び当該技術分野において（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））、及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓら（ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（１９９３））記載されるように調製及びスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリは、好ましくは、抗原として標的タンパク質を使用してスクリーニングされる。
【０１５９】
代替的に、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲにより別個にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリにおいて無作為に組み換えられ、これは次いで特定の抗原への結合に関して選択され得る。Ｆａｂ断片はファージ表面上に発現される、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に結合される。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂコード配列を同時に選択し、これは続いて増幅され得る。パニングと呼ばれる手順である数回の抗原結合及び再増幅により、抗原に特異的なＦａｂが富化され、最終的に単離される。
【０１６０】
１９９４年に、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体のヒト化のためのアプローチが説明された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のファイージディスプレイ技法の力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）を参照）。これに関して、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片をヒト軽鎖ライブラリと組み合わせてディスプレイすることができ、次に、得られたハイブリッドＦａｂライブラリを抗原と共に選択することができる。マウスＦｄ断片は、それにより、選択を誘導するためのテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖をヒトＦｄ断片ライブラリと組み合わせる。得られたライブラリの選択は完全なヒトＦａｂをもたらす。
【０１６１】
ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を導くための様々な手順が説明されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）を参照されたい）。特に、ファージディスプレイライブラリに由来する抗体のインビトロ選択及び進化は強力なツールとなった（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）、米国特許公開第．２００２／０００４２１５及びＷＯ９２／０１０４７、米国特許公開第２００３／０１９０３１７号、ならびに米国特許第６，０５４，２８７号及び第５，８７７，２９３号を参照されたい。
【０１６２】
Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：１８７−１９３（２００２）及び米国特許公開第２００３／００４４７７２（２００３年３月６日発行）は、固体支持体上に候補結合分子を固定化することを伴う方法である、捕獲リフト（ｃａｐｔｕｒｅ  ｌｉｆｔ）により、ファージ発現抗体ライブラリまたは他の結合分子をスクリーニングするための方法を記載している。
【０１６３】
Ｆｖ断片は、ファージタンパク質融合物（例えば、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩとの）として発現される１本の鎖と可溶性断片として発現される相補鎖との会合により、ファージの表面上にディスプレイされる。ファージはクラスＩファージ：ｆｄ，Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、ｌｋｅ、ＺＪ／Ｚ、Ｆｆのうちの１つ、ならびにクラスＩＩファージ：Ｘｆ、Ｐｆ１、及びＰｆ３のうちの１つなど、糸状ファージであり得ることが想定される。ファージは、Ｍ１３もしくはｆｄ、またはそれらの誘導体であり得る。
【０１６４】
初期のヒトＶＬ及びＶＨセグメントが選択されたら、初期に選択したＶＬ及びＶＨセグメントの異なる対が標的結合に関してスクリーニングされる「ミックス・アンド・マッチ」実験を行い、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択する。加えて、抗体の質を更に改善するために、天然免疫応答中に抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異プロセスに類似するプロセスにおいて、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬ及びＶＨセグメントを、好ましくはＶＨ及び／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域のうちのいずれか内で無作為に変異させることができる。このインビトロ親和性成熟は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーを使用してＶＬ及びＶＨ領域を増幅することにより達成され得、このプライマーには、結果としてのＰＣＲ産物が、無作為変異がＶＨ及び／またはＶＬ  ＣＤＲ３領域内に導入されたＶＬ及びＶＨセグメントをコードするように、ある特定の位置に４個のヌクレオチド塩基の無作為混合物が添加されている。これらの無作為に変異されたＶＬ及びＶＨセグメントは標的抗原への結合に関して再度スクリーニングされ得る。
【０１６５】
標的特異的抗体をスクリーニングし、それを組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリから単離した後、選択した抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組換えＤＮＡ技法により他の発現ベクターにサブクローン化することができる。所望する場合、以下に記載されるように、核酸を更に操作して、本開示の他の抗体形態を創出することができる。本明細書に記載されるように、コンビナトリアルライブラリのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現するために、抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクター内にクローン化し、哺乳類宿主細胞内に導入する。
【０１６６】
ファージディスプレイ方法は細菌または宿主細胞のミューテーター株において実施され得ることが想定される。ミューテーター株は、宿主細胞内で複製されたＤＮＡをその親ＤＮＡに対して変異させる遺伝子欠陥を有する宿主細胞である。例示的なミューテーターはＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５及びＮＲ９０４６  ｍｕｔ  Ｔ１である。
【０１６７】
ファージディスプレイ方法はヘルパーファージを使用して実施され得ることも想定される。これは、欠陥ファージゲノムを含む細胞を感染させるために使用され、欠陥を補うように機能するファージである。欠陥ファージゲノムは、遺伝子配列をコードするある機能が除去されたファージミドまたはファージであってもよい。ヘルパーファージの例は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩ  ｎｏ．３、及びカプシドタンパク質に融合された結合分子をディスプレイまたはコードするファージである。
【０１６８】
抗体は、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーが他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリを感染させるために使用され、得られた２鎖特異的結合メンバーが本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイ技法に従って選択される、ＷＯ９２／０１０４７に開示される階層的二重コンビナトリアルアプローチを使用するファージディスプレイスクリーニング方法を介しても生成される。この技法はＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））にも開示されている。
【０１６９】
酵母、微生物、及び哺乳類細胞の表面上へのペプチドのディスプレイ方法は、抗原特異的抗体を特定するためにも使用されている。例えば、米国特許第５，３４８，８６７号、同第５，７２３，２８７号、同第６，６９９，６５８号、Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：３９５−９９（２００１）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２１（１）４５−５２  （２００３）、Ｓｕｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４（２００６）を参照されたい。抗体ライブラリは、凝集素などの酵母タンパク質に結合されてもよく、免疫系においてＢ細胞により抗体の細胞表面ディスプレイを効果的に模倣する。
【０１７０】
ファージディスプレイ方法に加えて、抗体は、リボソームディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイを含む、インビトロディスプレイ方法及び微生物細胞ディスプレイを使用して単離され得る（Ａｍｓｔｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４００−０５（２００１））。リボソームディスプレイを使用するポリペプチドの選択は、Ｈａｎｅｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：４９３７−４９４２（１９９７））及びＫａｗａｓａｋｉに対して発行された米国特許第５，６４３，７６８号及び第５，６５８，７５４号に記載されている。リボソームディスプレイは抗体の迅速な大規模の変異分析にも有用である。選択的変異誘発アプローチもリボソームディスプレイ技法を使用して選択され得る向上した活性を有する抗体の産生方法を提供する。
【０１７１】
アミノ酸配列変異型
抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、及び／または６つのＣＤＲを含む修飾されたポリペプチド組成物が生成され得、ＣＤＲは標的分子に対して増加した特異性または親和性をもたらすように変更される。抗体のＣＤＲ内の部位は典型的には、例えば、最初に保存的選択肢（例えば、非同一疎水性アミノ酸に置換された疎水性アミノ酸）、次により異なる選択肢（例えば、帯電しているアミノ酸に置換された疎水性アミノ酸）と置換することにより、順次に修飾され、次に欠失または挿入が標的部位で行われ得る。例えば、ＣＤＲを囲む保存的フレームワーク配列を使用して、これらのコンセンサス配列に相補的なＰＣＲプライマーを生成して、プライマー領域間に位置する抗原特異的ＣＤＲ配列を増幅する。ヌクレオチド及びポリペプチド配列をクローン化し、発現させるための技法は当該技術分野において十分に確立されている［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい］。増幅したＣＤＲ配列は適切なプラスミドに連結される。１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、及び／または６つのクローン化されたＣＤＲを含むプラスミドは、任意選択で、ＣＤＲに結合した領域をコードする追加のポリペプチドを含む。
【０１７２】
修飾は、以下により詳細に記載される保存的または非保存的アミノ酸置換により行うことができる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸の範囲である。変化は、組換ＤＮＡ技法を使用して抗体ポリペプチド分子におけるアミノ酸の置換を系統的に作製し、活性に関して得られた組換え変異型をアッセイすることにより導入され得る。核酸の変更は、異なる種からの核酸（可変位置）、または高度に保存された領域（定常領域）において異なる部位で行われ得る。本開示に有用な抗体配列の変更方法及び抗体ポリペプチド組成物の発現方法は当該技術分野において説明されている。例えば、米国特許第８，５６９，４６２号を参照されたい。
【０１７３】
本明細書で使用される、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１７４】
別の種類の変異型は、アミノ酸置換変異型である。これらの変異型は、抗体分子が除去され、異なる残基がその場所に挿入される、少なくとも１個のアミノ酸残基を有する。超可変またはＣＤＲ領域もしくはフレームワーク領域のいずれか内での置換変異誘発が想定される。保存的置換はアミノ酸をそのクラスの別のメンバーに置き換えることを伴う。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーに置き換えることを伴う。
【０１７５】
保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の類似性に基づき行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）が含まれ、正の電荷をもつ（塩基性）アミノ酸には、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が含まれ、負の電荷をもつ（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が含まれる。
【０１７６】
抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止するために、一般的にセリンで置換され得る。逆に、その安定性を改善するために（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）、システイン結合が抗体に付加され得る。
【０１７７】
グリコシル化の変更
親抗体に対して修飾されたグリコシル化パターン、例えば、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を有する抗体変異型も産生され得る。
【０１７８】
抗体のグリコシル化は典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかの存在が潜在的なグリコシル化部位を創出する。したがって、Ｎ−結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列がこれらのトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することにより、抗体に付加され得る。Ｏ−結合グリコシル化は、Ｎ−アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースの糖類のうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も好ましくはセリンもしくはスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る。Ｏ−結合グリコシル化部位は、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に挿入するか、または置換することにより抗体に付加され得る。
【０１７９】
Ｆｃグリカンは、ＩｇＧのＦｃ受容体及びＣ１ｑへの結合に影響を及ぼし、したがって、ＩｇＧエフェクター機能に重要である。修飾されたＦｃグリカン及び変更されたエフェクター機能を有する抗体変異型が産生され得る。例えば、シアル酸、コアフコース、２等分Ｎ−アセチルグルコサミン、及びマンノース残基などの修飾された末端糖を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体への変更された結合及び変更されたＡＤＣＣ活性を有し得る。更なる例では、修飾された末端ガラクトース残基を有する抗体は、Ｃ１ｑへの変更された結合及び変更されたＣＤＣ活性を有し得る（Ｒａｊｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７１−７８（２００８）。
【０１８０】
向上したＡＤＣＣ活性を呈する、フコシル化が不在の、または低減されたフコシル化を有する抗体分子も本方法の使用に想定される。これを達成するための様々な方法が当該技術分野において既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合により媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７でのＮ−結合グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示された。非フコシル化抗体は、増加した親和性でこの受容体に結合し、天然のフコシル化抗体よりも効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能を誘発する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされたＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、１００倍増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−２２（２００４））。類似する作用は、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ処理を通して、フコシル化経路におけるこのまたは他の酵素の活性を減少させる、酵素をノックアウトするために細胞系を操作する、または選択的グリコシル化阻害物質と共に培養することにより達成され得る（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３−２３（１９８９））。いくつかの宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞系は、低フコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する。（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０（２００２）、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３（２００３））。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞における組換えによる抗体の産生を通した、２等分炭水化物のレベルの増加は、ＡＤＣＣ活性を増加することも特定された（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−８０（１９９９））。２つのフコース残基のうちの１つのみの不在がＡＤＣＣ活性の増加に十分であり得ることが予測された（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９３：８５１−６１（２００６））。
【０１８１】
変更されたエフェクター機能を有する変異型
本方法に使用するための抗体の他の修飾が想定される。一態様では、例えば、癌の治療における抗体の有効性を強化するために、エフェクター機能に対して本明細書に使用される抗体を修飾することが望ましい場合がある。エフェクター機能を修飾するための１つの方法は、システイン残基をＦｃ領域に導入してもよく、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にさせることを教示する。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能ならびに／または増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら（Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２））及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２））を参照されたい。強化された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３））に記載されるように、ヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製することもできる。代替的に、２重Ｆｃ領域を有し、それにより、強化された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を設計することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９））を参照されたい。加えて、ＣＤＲ内の配列が抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘発することができることを示した。保存的置換は抗体に結合活性を保持させるが、望ましくないＴ細胞応答を誘発するその能力を失わせることができる。
【０１８２】
本開示のある特定の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増加させるために、インタクトな抗体ではなく、抗体断片を使用することが望ましい場合がある。この場合、例えば、多糖類ポリマーを含むＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーなどの分子を抗体断片に付加して半減期を増加させることにより、その血清半減期を増加させるために抗体断片を修飾することが望ましい場合がある。
【０１８３】
サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの任意の１つ以上のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に移動される領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの３つ以上の残基が移動される。尚より好ましくは、エピトープは、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧの）のＣＨ２ドメインから取られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域、または２つ以上のかかる領域に移動される。代替的に、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、抗体断片のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、またはその両方に移動される。
【０１８４】
したがって、本開示の抗体は、ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾または除去され、かつ／またはｍｅｔがＮ−末端で付加され、かつ／またはＮ−末端の２０個のアミノ酸のうちの１つ以上が除去され、かつ／またはＣ１ｑ結合部位などの補体と相互作用する領域が除去され、かつ／またはＡＤＣＣ部位が除去される変異型を含むＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持する、ヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはこれらの変異型を含み得る［例えば、Ｓａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３−９（１９９２）を参照されたい］。
【０１８５】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全てのヒトＦｃ受容体への結合に関与するＩｇＧ１残基がヒンジに近位のＣＨ２ドメインに位置し、次の２つのカテゴリーに入ることを報告した：１）全てのＦｃＲと直接相互作用し得る位置には、Ｌｅｕ２３４−Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、及びＰｒｏ３２９（及びおそらくＡｓｐ２６５）が含まれる、２）炭水化物の性質または位置に影響を及ぼす位置には、Ａｓｐ２６５及びＡｓｎ２９７が含まれる。Ｆｃ受容体ＩＩへの結合に影響を及ぼす更なるＩｇＧ１残基は以下の通りである：（最大作用）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、及び（作用がより小さい）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、及びＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ、及びＤ２７０Ａは結合を低減した。全てのＦｃＲに関して上記で特定された残基に加えて、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合を４０％以上低減した更なるＩｇＧ１残基は以下の通りである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８、及びＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡへの結合を改善した変異型には、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、及びＡ３３９Ｔが含まれる。Ｌｙｓ４１４はＦｃＲＩＩＡ及びＦｃＲＩＩＢの結合において４０％の低減、Ａｒｇ４１６はＦｃＲＩＩＡ及びＦｃＲＩＩＩＡの結合において３０％の低減、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡに対して３０％、ＦｃＲＩＩＢに対して４０％の低減、Ｌｙｓ３６０はＦｃＲＩＩＩＡに対して２３％の改善を示した。ＩｇＧ１のＦｃ領域において、特定のＦｃγ受容体（Ｒ）への結合のみを改善したか、または同時にＦｃγＲのうちの１種類への結合を改善し、別の種類への結合を低減した、いくつかの位置が見出されたことを記載した、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｒｅｓｔａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０，２００１）も参照されたい。次に、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を改善した選択されたＩｇＧ１変異型がインビトロ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて試験され、末梢血単核球細胞またはナチュラルキラー細胞のいずれかが使用された場合、ＡＤＣＣの強化を示した。
【０１８６】
例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９４，５５１号は、アミノ酸位置３２９、３３１、または３２２（Ｋａｂａｔ番付を使用）でヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に変異を含む、変更されたエフェクター機能を有する変異型を記載しており、そのうちのいくつかはＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の低減を示す。別の例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３７，０５６号は、アミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９（Ｋａｂａｔ番付を使用）でヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に変異を含む、変更されたエフェクターまたはＦｃγ受容体結合を有する変異型を記載しており、そのうちのいくつかはＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の低減に関連する受容体結合プロファイルを示す。これらのうち、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７、または３２９での変異はＦｃＲＩへの結合を低減すると述べられ、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８、または４３９での変異はＦｃＲＩＩへの結合を低減すると述べられ、アミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５、または４３７での変異はＦｃＲＩＩＩへの結合を低減すると述べられている。
【０１８７】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２４，８２１号は、マウス抗体のＣｌｑ結合活性が重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０、または３２２を変異させることにより変更され得、残基２９７（Ａｓｎ）を置き換えることによって溶解活性の除去をもたらすことを報告している。
【０１８８】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００４／０１３２１０１号は、アミノ酸位置２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８、もしくは３３２（Ｋａｂａｔ番付を使用）、または位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、もしくは３３２（Ｋａｂａｔ番付を使用）で変異を有する変異型を記載しており、そのうち、位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、または３３２での変異はＡＤＣＣ活性を低減するか、またはＦｃγ受容体への結合を低減し得る。
【０１８９】
共有結合修飾
共有結合修飾を含む抗体も本方法の使用に想定される。それらは、適切な場合、化学合成により、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。抗体の共有結合修飾の他の種類は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ−もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子内に導入される。
【０１９０】
最も一般的に、システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメリクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０１９１】
他の修飾は、プロリン及びリジンのヒスチジル、リジニル、アルギニル、チロシル、グルタミニル、及びアスパラギニルヒドロキシル化を含む。かかる修飾を行うための方法は、参照により本明細書に援用より本明細書に組み込まれる米国特許第８，９２６，９７６号及び当該技術分野においてに開示されている。
【０１９２】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、式中、Ｒ及びＲ’が、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０１９３】
他の修飾は、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルもしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１９４】
共有結合修飾の他の種類は、グリコシドの抗体への化学的または酵素的結合を伴う。これらの手順は、それらがＮ−またはＯ−結合グリコシル化のグリコシル化能力を有する宿主細胞において抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用される結合モードにより、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプロファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１））に記載されている。
【０１９５】
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価の化合物に曝露することを必要とする。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大半のまたは全ての糖が切断されるが、抗体はインタクトのままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７））及びＥｄｇｅら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１））により説明される。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）により説明されるように、様々なエンド−及びエキソグルコシダーゼを使用することにより達成することができる。
【０１９６】
抗体の共有結合修飾の別の種類は、抗体を、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランなどの多糖類ポリマーのうちの１つに結合することを含む。かかる方法は当該技術分野において既知である。
【０１９７】
誘導体
上述のように、抗体物質及びポリペプチドに関して使用されるとき、誘導体は、ユビキチン化、標識（例えば、放射線核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化などの共有結合ポリマー結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、及びオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入もしくは置換などの技法により化学的に修飾されたポリペプチドを指す。本明細書に開示される抗体の誘導体は治療薬としても有用であり、本明細書の方法に使用され得る。
【０１９８】
コンジュゲートした部分は、共有結合により、またはイオン、ファン・デル・ワールス、もしくは水素結合を通してのいずれか、例えば、放射性ヌクレオチドまたはストレプトアビジンにより認識されるビオチンカヌクレオチドの組み込みにより、抗体物質に組み込まれるか、またはそれに結合され得る。
【０１９９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を抗体物質に結合して、より長いインビボ半減期をもたらすことができる。ＰＥＧ基は、任意の便利な分子量のものであってよく、直鎖状または分岐状であってよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約２キロダルトン（「ｋＤ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は一般的に、抗体物質上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）に対するＰＥＧ部分上の天然または操作された反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を通したアシル化または還元アルキル化を介して、本開示の抗体物質に結合される。ＰＥＧ部分の抗体物質への付加は、当該技術分野において周知の技法を使用して実施され得る。例えば、国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号及び米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。
【０２００】
抗体物質のＰＥＧとの連結は通常水相中で行われ、逆相分析ＨＰＬＣにより容易に監視することができる。ＰＥＧ化物質は分取ＨＰＬＣにより精製され、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、及びレーザー脱離質量分析により特徴付けされる。
【０２０１】
抗体コンジュゲート
抗体は、その「裸」もしくは未コンジュゲート形態で投与され得るか、または他の治療薬もしくは診断薬に直接コンジュゲートされ得るか、またはかかる他の治療薬もしくは診断薬を含む担体ポリマーに間接的にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、化学療法薬、薬物、成長阻害性物質、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害性薬物にコンジュゲートされる。好適な化学療法薬には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンが含まれる（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）上記）。好適な毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素；リシンなどの植物毒素；ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−８１（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３．７８６−９１（２００２））、マイタンシノイド（ＥＰ  １３９１２１３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−２３（１９９６））、アウリスタチン（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−８４（２００３）、及びカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８（１９９８）、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３））などの小分子毒素が含まれる。抗体−薬物コンジュゲート及び方法は、Ｄｕｃｒｙ  Ｌ，ｍＡｂｓ．６（１），２０１４及びＳｈｅｎ  ＷＣ，ＡＡＰＳ．，１７：３−７，２０１５に概説されている。
【０２０２】
抗体は、放射性同位元素、親和性標識（ビオチン、アビジン等）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）蛍光もしくは発光または生物発光標識（ＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子などの使用を通して検出可能に標識され得る。かかる標識を達成するための手順は当該技術分野において周知であり、例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）、Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）、Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照されたい。
【０２０３】
抗体部分のコンジュゲーションは米国特許第６，３０６，３９３号に記載される。一般的な技法も、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）、及びＳｈｉｈらの米国特許第５，０５７，３１３号に記載される。この一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体構成成分を、少なくとも１つのアミン機能を有し、複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素アデンド（ｂｏｒｏｎ  ａｄｄｅｎｄｓ）、または他の治療薬を負荷される担体ポリマーと反応させることを伴う。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）結合が得られ、これは最終コンジュゲートを形成するために二級アミンに還元することにより安定化され得る。
【０２０４】
担体ポリマーは、例えば、アミノデキストランまたは少なくとも５０個のアミノ酸残基のポリペプチドであり得る。薬物または他の薬剤を担体ポリマーにコンジュゲートするための様々な技法が当該技術分野において既知である。ポリペプチド担体がアミノデキストランの代わりに使用され得るが、ポリペプチド担体は鎖に少なくとも５０個のアミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００個のアミノ酸残基を有するべきである。アミノ酸の少なくともいくつかはリジン残基またはグルタメートもしくはアスパルテート残基であるべきである。リジン残基のペンダントアミンならびにグルタミン及びアスパルテートのペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素アデンド、または他の治療薬を結合するのに便利である。結果としての充填された担体及びコンジュゲートに望ましい溶解性を付与するのに好適なポリペプチド担体の例としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、ならびにこれらのアミノ酸とその他、例えば、セリンとの混合ポリマーが挙げられる。抗体がコンジュゲートされ得る薬剤の例としては、本明細書に記載される細胞傷害性薬物または化学療法薬のいずれかが挙げられる。
【０２０５】
代替的に、コンジュゲート抗体は、抗体の構成成分を治療薬と直接コンジュゲートすることにより調製され得る。一般的な手順は、治療薬が酸化された抗体の構成成分に直接結合されることを除き、コンジュゲーションの間接的方法に類似する。例えば、抗体のカルボキシレート部分は半減期を延長するためにポリエチレングリコールに結合され得る。
【０２０６】
代替的に、治療薬は、ジスルフィド結合の形成を介して、またはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二機能性架橋剤を使用して、還元抗体の構成成分のヒンジ領域に結合され得る。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４（１９９４）。かかるコンジュゲーションのための一般的な技法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルエルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）など、様々な二機能性タンパク質結合剤が当該技術分野において既知である。
【０２０７】
抗体融合タンパク質
組換え分子が１つ以上の抗体の構成成分及び毒素または化学療法薬を含む抗体−毒素融合タンパク質の作製方法も当業者に既知である。例えば、抗体−シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ融合タンパク質が、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１）、Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２）、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）、Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）、Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０（１９９６）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）、及びＳｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）により説明された。ジフテリア毒素部分を含む抗体−毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）、及びＶａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）により記載された。Ｄｅｏｎａｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５）は、ＲＮａｓｅ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載し、一方、Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３  （１９９４）は、ＤＮａｓｅ  Ｉ構成成分を含む抗体−毒素融合タンパク質を産生した。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ．，Ａｐｒ．２−６，１９９５，Ｐａｒｔ  １，ＢＩＯＴ００５の抗体−毒素融合タンパク質において、ゲロニンが毒素部分として使用された。更なる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン−Ａを含む抗体−毒素融合タンパク質を報告した。
【０２０８】
かかる融合タンパク質の調製に好適に採用される毒素の例示は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素である。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６）及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４）を参照されたい。他の好適な毒素が当業者に既知である。
【０２０９】
本開示の抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を活性抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートすることにより、ＡＤＥＰＴにおいても使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
【０２１０】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素構成成分は、プロドラッグをより活性な細胞傷害性形態に変換するような方法でプロドラッグに対して作用することが可能な任意の酵素を含む。
【０２１１】
本開示に有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモリン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（カテプシンＢ及びＬなど）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用なα−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離型薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにそれらのアミン窒素で、それぞれ、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を遊離型薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されない。代替的に、当該技術分野においてアブザイムとしてとしても知られる酵素活性を有する抗体は、本開示のプロドラッグを遊離型活性薬物に変換するために使用され得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照されたい。抗体−アブザイムコンジュゲートは、アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するために、本明細書に記載されるように調製され得る。
【０２１２】
上記の酵素は、上述のヘテロ二機能性架橋試薬を使用するなど、当該技術分野において周知の技法により抗体に共有結合され得る。代替的に、本開示の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した、本開示の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該技術分野において周知である組換えＤＮＡ技法を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照されたい）。
【０２１３】
抗体の組換え産生
本明細書に記載される抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）単離及び配列決定され得る。通常、これは、抗体をコードするＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）をクローン化することを必要とする。クローン化及び配列決定は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な技法を使用して実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９４）を参照されたい）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２１４】
配列決定は、標準的な技法を使用して実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ及びＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７を参照されたい、参照により本明細書に組み込まれる）。クローン化した核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子及びｃＤＮＡの公表配列と比較することにより、当業者は、配列決定される領域により、（ｉ）免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列セグメントの使用、ならびに（ｉｉ）Ｎ−領域付加及び体細胞変異のプロセスにより生じる配列を含む、重鎖及び軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の供給源の１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄである。
【０２１５】
単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に配置することができ、次にこれを、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内に形質移入して、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換え産生は当該技術分野において周知である。
【０２１６】
代替的な実施形態では、対象の免疫グロブリンのアミノ酸配列はタンパク質を直接配列決定することにより決定され得る。好適なヌクレオチド配列のコードは普遍的コドン表に従い設計され得る。
【０２１７】
抗体の組換え産生に関して、それをコードする核酸が単離され、更なるクローン化（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成成分は一般的に、当該技術分野において既知であり、記載される、シグナル配列、複製起源、１つ以上の選択的マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローン化または発現するための好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、またはより高等な真核生物細胞である。この目的のための好適な原核生物には、グラム陰性もしくはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）などのエンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、大腸菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）及び赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば、１９８９年４月１２日に公表されたＤＤ  ２６６，７１０に開示されるＢ．リケニフォルミス  ４１  Ｐ）、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などのシュードモナスが含まれる。１つの好ましい大腸菌クローン化宿主は、大腸菌  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌  Ｂ、大腸菌  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及び大腸菌  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の株が適している。これらの例は限定するものではなく、例示である。
【０２１９】
原核生物に加えて、糸状真菌類または酵母などの真核微生物が抗体コードベクターに好適なクローン化または発現宿主である。下等真核宿主微生物の中でも、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母が最も一般的に使用される。しかしながら、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッカラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラウム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マリキアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など、ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ）（ＥＰ  １８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リージア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに糸状真菌類、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）など、のようないくつかの他の属、種、及び株が一般的に利用可能であり、本明細書において有用である。
【０２２０】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの、多くのバキュロウイルス株及び変異型、ならびに宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が特定された。例えば、オウトグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）  ＮＰＶのＬ−１変異型及びカイコ  ＮＰＶのＢｍ−５株など、形質移入のための様々なウイルス株が公的に利用可能であり、かかるウイルスは、本開示に従う本明細書のウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために使用することができる。
【０２２１】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコ、アオウキクサ、及び他の植物細胞の植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。
【０２２２】
有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系；ヒト胚性腎臓系（懸濁培養において成長させるためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ、（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚部癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２２３】
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローン化ベクターで形質移入されるか、もしくは形質移入され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて修飾された従来の栄養培地中で培養される。加えて、新規ベクター及び選択的マーカーによって分離された複数の転写単位のコピーを形質移入された細胞系は、標的に結合する抗体の発現に特に有用であり、好ましい。
【０２２４】
組換え技法を使用する場合、抗体は、微生物培養物からのものを含む、ペリプラズム空間において細胞内に産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかの粒子状壊死細胞片が、例えば遠心分離または限外濾過により除去される。Ｂｅｔｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３，１９８８；ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４５７−４６１（１９９３）は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。［（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）も参照されたい］。
【０２２５】
微生物または哺乳類の細胞から調製された抗体の構成成分は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカチオンまたはトリ交換クロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得るが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は種及び抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３）。プロテインＧは全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合される基質は最も多くはアガロースであるが、他の基質も利用可能である。制御多孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定した基質では、アガロースで達成されるよりも速い流速及び短い処理時間が可能となる。抗体がＣＨ  ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー  アニオンもしくはカチオン交換樹脂上のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技法も回収される抗体により利用可能である。
【０２２６】
スクリーニング方法
有効な治療薬は顕著な毒性がない効果的な薬剤を特定することに依存する。当該技術分野において既知の方法により、結合親和性について抗体がスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット、放射線標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる分画、共沈降、架橋、ＥＬＩＳＡなどを使用することができ、これらは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載される。
【０２２７】
ＴＧＦβ及び抗ＴＧＦβ抗体の生物学的活性の中和を評価するための方法は当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７，８６７，４９６号を参照されたい。インビトロバイオアッセイの例には、（１）ＥＧＦの存在下、軟寒天中でのＮＲＫ細胞のコロニー形成の誘導（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：５３３９−５３４３）、（２）軟骨性表現型を発現する原始的間葉細胞の分化誘導（Ｓｅｙｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：２２６７−２２７１）、（３）Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３８：７９−８６）及びＢＢＣ−１サル腎臓細胞（Ｈｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５９８９−５９９２）の成長の阻害、（４）Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細胞の有糸分裂誘発の阻害（Ｗｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１６３３−１６３６）、（５）ラットＬ６筋芽細胞の分化の阻害（Ｆｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１６５０９−１６５１３）、（６）フィブロネクチン産生の測定（Ｗｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，７１：１００３−１０１４）、（７）ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合されたプラスミノーゲン活性化因子阻害因子Ｉ（ＰＡＩ−１）プロモーターの誘導（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６：２７６−２８４）、（８）サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２：６１−７１）、及び（９）Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３（２４）：４３５５−４３５９に記載される細胞アッセイが含まれる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の抗体中和は、ＴＧＦβ３の中和よりも少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％超強い。
【０２２９】
ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ抗体による）の生物学的活性及び中和を評価するための更なる方法が当該技術分野において既知である。例えば、中和は、中和アッセイにより測定され、ＩＣ５０値として表現され得る。ＩＣ５０値は、第２の分子または細胞活性の最大生物学的応答の半分の阻害を誘発するのに必要な分子の濃度を決定することにより、所与の分子について計算され得る。ＩＣ５０が低いほど、分子が所望のタンパク質活性を阻害する効力が大きい。本明細書において想定される例示的な中和アッセイには、インターロイキン−１１放出アッセイ及びＨＴ−２／ＩＬ−４細胞増殖アッセイが含まれるが、これらに限定されない。加えて、ＴＧＦβ活性アッセイは、抗体が１つのＴＧＦβアイソフォームを優先的に阻害するかを決定するために実施され得、ｐＳＭＡＤリン酸化アッセイまたはｒｈＬＡＰ結合アッセイを含む。
【０２３０】
ＰＤ−１阻害物質及び抗ＰＤ−１抗体の生物学的活性の中和を評価するための方法は当該技術分野において既知である。例えば、中和は、中和アッセイにより測定され、ＩＣ５０値として表現され得る。ＩＣ５０値は、第２の分子または細胞活性の最大生物学的応答の半分の阻害を誘発するのに必要な分子の濃度を決定することにより、所与の分子について計算され得る。ＩＣ５０が低いほど、分子が所望のタンパク質活性を阻害する効力が大きい。本明細書において想定される例示的な中和アッセイには、ヒトＴ細胞におけるＴ細胞応答を促進するＰＤ−１抗体の能力の測定、ＩＦＮγ放出アッセイ、またはインターロイキン−２分泌アッセイ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．，２（９）：８４６−５６（２０１４）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
併用療法
本開示のＴＧＦβ阻害物質はＰＤ−１を阻害する第２の薬剤と共に投与され、併用は本明細書に記載される疾患または障害を治療するのに有用である。ＴＧＦβ及びＰＤ−１を阻害するために抗体を使用する場合では、２つ以上のＴＧＦβ抗体またはＰＤ−１抗体がそれぞれの標的抗原への結合に有効である場合、標的抗原の異なるエピトープに対する及び／またはＴＧＦβもしくはＰＤ−１の異なるアイソフォームに優先的に結合する２つ以上の抗体は、３つまたは４つ以上一緒の抗体の組み合わせがＴＧＦβ及びＰＤ−１の阻害物質で治療される状態もしくは障害に対して尚も更に改善された有効性をもたらすように混合され得ることが想定される。本発明の１つ以上の抗体を含む組成物は、ＴＧＦβまたはＰＤ−１のいずれかの標的ポリペプチドに関連する状態もしくは障害に罹患する、またはそれに罹患し易い個人もしくは哺乳動物に投与され得る。
【０２３２】
２つの治療薬の同時投与は、薬剤がそれらの治療作用を発揮している間の期間が重複している限り、薬剤が同時にまたは同じ経路で投与される必要はない。異なる日または週の投与のように、同時または逐次投与が想定される。
【０２３３】
第３の薬剤もＴＧＦβの阻害物質及び阻害物質ＰＤ−１と共に使用することができる。第３の薬剤は、サイトカイン、成長因子、他の標的抗原に対する他の阻害物質及び抗体、例えば、ＣＴＬＡ−４に対する抗体であるイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体であるベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＥＧＦＲに作用するチロシンキナーゼ阻害物質であるエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、経口Ｂｃｒ−Ａｂｌチロソンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｏｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ）阻害物質であるダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＩＬ−２１、ペグ化ＩＦＮ−α２ｂ、チロシンキナーゼ阻害物質であるアキシチニブ（ＩＮＬＹＴＡ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、及びＭＥＫ阻害物質であるトラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）などの他の治療薬であり得る（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７（１）：３９−４６（２０１５）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２３４】
いくつかの癌の場合のように、特に黒色腫において、癌がＶ６００変異陽性である場合（Ａｓｃｉｅｒｔｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，１０：８５，２０１２）、第３の薬剤はＢＲＡＦ阻害物質、例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブであることも想定される。
【０２３５】
本開示の阻害物質、例えば抗体などは同じ製剤で同時に与えられ得ることが想定される。これらの阻害物質は別個の製剤で投与され、同時に投与されることが更に想定され、同時とは互いに３０分以内に与えられる薬剤を指す。第３の薬剤は阻害物質と共に同時に与えられ得ることが更に想定される。
【０２３６】
別の態様では、ＴＧＦβまたはＰＤ−１阻害物質は、他の阻害物質組成物を投与する前に投与される。投与前は、他の阻害物質での治療１週間前から他の阻害物質の投与３０分前までの範囲内の阻害物質の投与を指す。阻害物質は別の阻害物質組成物の投与後に投与されることが更に想定される。後続投与は、抗体治療３０分後から抗体投与１週間後までの投与を説明することを意味する。第３の薬剤はＴＧＦβ阻害物質またはＰＤ−１阻害物質のいずれかの前にこの様式で投与され得ることが更に想定される。
【０２３７】
適切な場合、他の補助療法が施され得ることが更に想定される。例えば、適切な場合、患者は、外科療法、化学療法、細胞傷害性薬物、光線力学療法、または放射線療法も施され得る。
【０２３８】
本明細書の阻害物質または抗体が第３の薬剤と組み合わせて投与される場合、例えば、第３の薬剤がサイトカインもしくは成長因子、または化学療法薬である場合、投与は放射線療法薬または放射線療法の使用を含むことも更に想定される。抗体組成物と組み合わせて施される放射線療法は、治療する医師により決定されるように、及び典型的には癌を治療する患者に与えられる線量で施される。
【０２３９】
細胞傷害性薬物は、細胞の機能を阻害もしくは阻止する、及び／または細胞の破壊をもたらす物質を指す。本用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、及びＲｅ１８６）、化学療法薬、毒素、例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、または合成毒素など、あるいはこれらの断片を含むことが意図される。非細胞傷害性薬物は、細胞の機能を阻害もしくは阻止しない、及び／または細胞の破壊をもたらさない物質を指す。非細胞傷害性薬物は、細胞傷害性であるように活性化され得る薬剤を含み得る。非細胞傷害性薬物は、ビーズ、リポソーム、基質、または粒子（例えば、米国特許公開第２００３／００２８０７１号及び第２００３／００３２９９５号を参照されたい、参照により本明細書に組み込まれる）を含み得る。このような薬剤は、本開示による抗体とコンジュゲート、結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）、結合（ｌｉｎｋｅｄ）、または会合され得る。
【０２４０】
本開示の抗体との使用に想定される化学療法薬は表Ｉに列記されるものを含むが、これらに限定されない。
【０２４１】
【表１】
2018518454.tif 000002
2018518454.tif 000003
2018518454.tif 000004
【０２４２】
障害の治療
別の実施形態では、本明細書に記載の阻害物質の種類のいずれかが本方法に使用され得る。例示的な実施形態では、標的特異的抗体は、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体である。別の例示的な実施形態では、標的はヒトであり、患者はヒト患者である。代替的に、患者は、標的特異的抗体が交差反応する標的タンパク質を発現する哺乳動物であってもよい。抗体は、抗体が獣医目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして交差反応する標的タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物（すなわち、霊長類）に投与され得る。かかる動物モデルは、本開示の標的特異的抗体の治療有効性を評価するのに有用であり得る（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｌｍａｉｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ．，４（９）ａ０１３６２３，２０１４）。
【０２４３】
一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載される阻害物質のうちの１つもしくはその両方を含むＴＧＦβ阻害物質及びＰＤ−１阻害物質、または薬学的組成物を投与することを含む、癌の治療または癌の再発予防のための方法を提供する。
【０２４４】
ＴＧＦβ及びＰＤ−１の阻害物質（例えば、本明細書に記載される抗体）により治療され得る例示的な状態または障害は、癌、例えば、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、線維性癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、びまん性内因性橋膠腫、再発性小児脳新生物腎細胞癌、明細胞型転移性腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、第ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、第ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、第ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫、第ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、寛解期の成人急性骨髄性白血病；Ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＲＵＮＸ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１；ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＭＬＬＴ３−ＭＬＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）を伴う成人急性前骨髄球性白血病；ＰＭＬ−ＲＡＲＡ；アルキル化剤関連急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、リクター症候群；ワルデンストレームマクログロブリン血症、成人神経膠芽腫；成人神経膠肉腫、再発性神経膠芽腫、再発性小児横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽腫；再発性骨肉腫、結腸直腸癌、ＭＳＩ陽性結腸直腸癌；ＭＳＩ陰性結腸直腸癌、上咽頭非角化癌；再発性上咽頭未分化癌、子宮頸部腺癌；子宮頚部腺扁平上皮癌；子宮頸部扁平上皮癌；再発性子宮頸癌；第ＩＶＡ期子宮頸癌；第ＩＶＢ期子宮頸癌、肛門管扁平上皮癌；転移性肛門管癌；再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌；癌腫、頭頸部の扁平上皮細胞、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、進行ＧＩ癌、胃腺癌；胃食道接合部腺癌、骨新生物、軟部組織肉腫；骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌；第ＩＩＩ期メルケル細胞癌；第ＩＶ期メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、及び再発性菌状息肉症、ならびにセザリー症候群などを含む。
【０２４５】
本発明による抗体の組み合わせにより治療され得る例示的な癌には、肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の腺管癌及び結腸直腸癌、脳の低悪性度神経膠腫、浸潤性乳癌、多形神経膠芽腫、黒色腫、甲状腺、直腸腺癌、腎臓癌、腎癌、肝臓癌、急性骨髄性白血病、胃腺癌、食道腺癌、子宮体部類内膜癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、口腔癌、大腸癌、及びリンパ腫などの癌が含まれる。
【０２４６】
多くのヒト腫瘍（ｄｅＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３６７３（１９８７）、Ｋｕｐｐｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４２：５６２（１９８８））及び多くの腫瘍細胞系（Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：７０７（１９８７），Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：５９４（１９８８））がＴＧＦβを産生することが観察され、これらの腫瘍に関して正常な免疫監視を逃れる機序の可能性を示唆する。
【０２４７】
癌におけるＴＧＦβアイソフォームの発現は複雑であり、特定の癌において異なる役割を有するＴＧＦβアイソフォームの異なる組み合わせにより変化する。ＴＧＦβ分子は腫瘍抑制因子及び腫瘍プロモーターの両方として作用し得る。例えば、動物におけるＴＧＦβシグナル伝達の欠失または下方調節は、乳癌、腸癌、膵臓癌、結腸癌、及び扁平上皮癌の増加をもたらす場合があり、ＴＧＦβの存在が腫瘍進行の阻止または緩徐に重要であることを示す（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２２０−２７，２０１０）。しかしながら、ＴＧＦβの過剰発現は発癌促進性であることが知られており、発現の増加が多くの腫瘍型において検出される（Ｙａｎｇら、上記）。
【０２４８】
更なる複雑性が米国特許第７，９２７，５９３号にも開示される。例えば、異なるＴＧＦβアイソフォームが異なる種類の癌により関連するように思われる。ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３は、卵巣癌及びその進行において、ＴＧＦβ２よりも大きな役割を担う可能性がある一方で、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の発現は、高悪性度軟骨肉腫の腫瘍においてＴＧＦβ３よりも高い。ヒト乳癌において、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３は高度に発現され、ＴＧＦβ３の発現は全生存に相関する一方で、リンパ節転移及び陽性ＴＧＦβ３発現を有する患者は予後転帰が良好ではない。しかしながら、結腸癌において、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２はＴＧＦβ３よりも高度に発現され、癌ではない個体よりも大きい循環レベルで存在する。神経膠腫において、ＴＧＦβ２は細胞移動に重要である。
【０２４９】
免疫細胞の腫瘍部位への浸潤は腫瘍成長に対する一般的な寄与因子であるように思われる。これらの免疫細胞の浸潤は、腫瘍を排除するのを補助する有益な作用を有し得るが、腫瘍抗原に対する耐性を可能にする有害作用でもあり得る。ＴＧＦβが腫瘍における免疫細胞のレベルに影響を及ぼし得ることが示された（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２２０−２７，２０１０、Ｆｌａｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：５５４−５６７，２０１０、Ｎａｇａｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １９：７７−９１，２０１０）。例えば、ＴＧＦβは、体から腫瘍を排除するために腫瘍を浸潤するナチュラルキラー細胞を抑制する。ＴＧＦβは、腫瘍の排除を補助する細胞型である、細胞傷害性Ｔ細胞及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性も抑制する（Ｙａｎｇ、上記）。ＴＧＦβは、例えば、免疫応答を促進するための損傷部位への移動及び抗原への提示を阻害することにより、樹状細胞活性の調節にも役割を担う。樹状細胞はＴＧＦβ及び分泌ＴＧＦβの両方に関与する。例えば、樹状細胞は、腫瘍に浸潤し、細胞を取り込み、  ＴＧＦβを分泌し、調節性Ｔ細胞を活性化し、これは次いで腫瘍排除を阻止し得る（Ｆｌａｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。加えて、骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）は、腫瘍進行中に拡大する骨髄由来細胞である。ＭＤＳＣは、Ｔ細胞の増殖を阻害し、樹状細胞の成熟を抑制し、ナチュラルキラー細胞の活性を阻害し、それにより、細胞が免疫応答を逃れるのを補助する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：２４０−４９，２００９）。ＴＧＦβがナチュラルキラー細胞の活性の阻害に対するＭＤＳＣの作用に寄与することが示された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１２４：２６２１−３３，２００９）。これらの免疫プロセスのそれぞれにおける様々なＴＧＦβアイソフォームの役割は明らかではない。ＴＧＦβアイソフォームを選択的に標的とし、様々な程度でそれらを阻害することは、腫瘍と戦い排除するための宿主の免疫応答を調節することに役立ち得る。
【０２５０】
本明細書の方法は、対象における腫瘍の大きさもしくは腫瘍負荷を減少させ、かつ／または対象における転移を減少させることが想定される。様々な実施形態では、本方法は腫瘍の大きさを１０％、２０％、３０％以上減少させる。様々な実施形態では、本方法は、腫瘍の大きさを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少させる。
【０２５１】
本明細書の方法は、腫瘍負荷を減少させ、また癌が寛解に至ったら腫瘍の再発を低減または予防することも想定される。
【０２５２】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍における免疫細胞を調節する。いくつかの実施形態では、本明細書のＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増加させ、かつ／またはＮＫ細胞の細胞溶解活性を増加させる。様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、腫瘍における調節性Ｔ細胞の数を減少させ、かつ／または調節性Ｔ細胞機能を阻害する。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、免疫応答を下方調節する、または免疫応答の部位に移動するＴｒｅｇの能力を阻害する。
【０２５３】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍における細胞傷害性Ｔ細胞の数を増加させ、かつ／またはＣＴＬ活性を強化する、例えば、ＣＴＬ活性をブーストする、増加させる、または促進する。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、ＣＴＬによるパーフォリン及びグランザイム産生を増加させ、ＣＴＬの細胞溶解活性を増加させる。
【０２５４】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ抗体及び／もしくはＰＤ−１抗体、ならびにこれらの組み合わせ、または組成物は、腫瘍における樹状細胞（ＤＣ）の数を増加させ、かつ／または樹状細胞の免疫寛容原性機能（例えば免疫寛容原性作用）を阻害する。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または組成物は、ＣＤ８＋樹状細胞の免疫寛容原性作用を減少させる。
【０２５５】
様々な実施形態では、本明細書に記載されるＴＧＦβ、ＸＰＡ．４２．０６８、ＸＰＡ．４２．０８９、もしくはＸＰＡ．４２．６８１の抗体のいずれか、またはこれらの変異型は上述の免疫活性のうちの１つ以上を調節する。
【０２５６】
一実施形態では、癌の治療を必要とする動物における該治療は、有効量のＴＧＦβの阻害物質及びＰＤ−１の阻害物質、または本明細書に記載の阻害物質を含む組成物を動物に投与することを含む。阻害物質はＴＧＦβ抗体及びＰＤ−１抗体であることが想定される。
【０２５７】
本開示の方法により治療可能な状態は好ましくは哺乳動物において生じる。哺乳動物は、例えば、ヒト及び他の霊長類、ならびにイヌ及びネコなどのペットまたはコンパニオン動物、ラット、マウス、及びウサギなどの実験動物、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びウシなどの家畜を含む。
【０２５８】
薬学的組成物の製剤化
阻害物質、例えば、本開示の抗体をヒトまたは試験動物に投与するために、阻害物質を１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物に製剤化することが好ましい。句「薬学的にまたは薬理学的に許容される」は、以下に記載されるように、当該技術分野において周知である経路を使用して投与されるとき、アレルギーまたは他の有害反応をもたらさない分子の実体及び組成物を指す。「薬学的に許容される担体」は、任意の及び全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。
【０２５９】
加えて、化合物は水または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。かかる溶媒和物も想定される。
【０２６０】
阻害物質は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻孔内、ならびに局所治療を所望する場合、病巣内投与を含む、任意の好適な手段により投与される。非経口注入には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下投与が含まれる。加えて、阻害物質は、特に抗体の用量を低下させながらパルス注入により好適に投与される。好ましくは、投薬は、一部投与が短期または長期にわたるかによって、注射により、最も好ましくは静脈内または皮下注射により与えられる。局所、特に経皮、経粘膜、直腸、経口、または局所投与を含む、例えば、所望の部位の近くに設置されたカテーテルを通した、他の投与方法も想定される。
【０２６１】
活性成分として本明細書に記載される阻害物質を含む本開示の薬学的組成物は、投与経路により、薬学的に許容される担体または添加剤を含み得る。かかる担体または添加剤の例としては、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加剤は、本開示の剤形によって、必要に応じて、上述のものまたはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【０２６２】
薬学的組成物の製剤化は選択される投与経路により変動する（例えば、溶液、エマルジョン）。投与される阻害物質、例えば、抗体を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体に調製され得る。溶液またはエマルジョンに関して、好適な担体は、例えば、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む、水性またはアルコール性／水性の溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含み得る。静脈内ビヒクルは、様々な添加剤、保存剤、または流体、栄養素、または電解質補充物を含み得る。
【０２６３】
様々な水性担体、例えば、無菌リン酸緩衝生理食塩水溶液、静菌水、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど、及び軽度の化学修飾を受ける、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど、安定性を強化するために他のタンパク質を含み得る。
【０２６４】
阻害物質の治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する阻害物質を任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０２６５】
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症の必要に応じて２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものも含み得る。かかる分子は、意図される目的に有効である量で、組み合わせで好適に存在する。
【０２６６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシエチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンにも封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【０２６７】
インビボ投与に使用される製剤は無菌ならなければならない。これは無菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２６８】
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに好適な賦形剤と混合した活性化合物を含み得る。かかる賦形剤は、懸濁剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガムであり、分散剤または湿潤剤は、天然に生じるリン脂質、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチル−エネオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから得られた部分エステルとの縮合産物、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から得られた部分エステルとの縮合産物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートも含み得る。
【０２６９】
本明細書に記載される抗体は貯蔵のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体で再構築される。この技法は従来の免疫グロブリンで有効であることが示されている。任意の好適な凍結乾燥及び再構築の技法が採用され得る。凍結乾燥及び再構築が様々な程度の抗体活性の消失をもたらし、使用レベルを調整して補われなければならない可能性があることを当業者は理解するであろう。
【０２７０】
本明細書に記載されるＴＧＦβ及びＰＤ−１抗体は共製剤として調製され、投与され得る。一態様では、抗体のうちの少なくとも２つが異なる抗原を認識し、それに結合する。別の態様では、複数の抗体のうちの少なくとも２つが同じ抗原の異なるエピトープを特異的に認識し、それに結合する。
【０２７１】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末及び顆粒は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤、及び１つ以上の保存剤と混合した活性化合物をもたらす。好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤は上記に既に記載したものにより例示される。
【０２７２】
これらの製剤における抗体の濃度は、例えば、約０．５重量％未満から、通常約１重量％もしくは少なくとも約１重量％から１５もしくは２０重量％ほどまで広く変動してもよく、主に、選択される特定の投与モードにより、液量、粘度などに基づき選択される。したがって、非経口注射のための典型的な薬学的組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水及び５０ｍｇの抗体を含むように構成され得る。静脈内注入のための典型的な組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液及び１５０ｍｇの抗体を含むように構成され得る。非経口投与用の組成物を調製するための実際の方法は当業者に既知であるか、または明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）により詳細に記載される。抗体の有効投薬量は、投与当たり１ｋｇの体重当たり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。
【０２７３】
薬学的組成物は、無菌の注射可能な水性、油性の懸濁液、分散液、または無菌注射可能溶液もしくは分散液の即時調製物用の無菌粉末の形態であり得る。懸濁液は、上述されたそれらの好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術に従い製剤化され得る。無菌の注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、植物油、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液を含む溶媒または分散媒であり得る。加えて、無菌固定油は従来溶媒または懸濁媒体として採用される。この目的に関して、合成のモノ−またはジグリセリドを含む、任意の無刺激の固定油が採用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。
【０２７４】
全ての場合において、形態は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度の流体でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。それは製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを使用することによってもたらされ得る。
【０２７５】
投与に有用な組成物は、それらの有効性を増加させるための取り込みまたは吸収強化剤と共に製剤化され得る。かかる強化剤は、例えば、サリチレート、グリココレート／リノレート、グリコレート、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプレートなどを含む。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２８２−１２８５（１９９６））及びＯｌｉｙａｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５２１−５４４（１９９３））を参照されたい。
【０２７６】
標的のその同族受容体もしくはリガンドへの結合、標的媒介シグナル伝達などを含む、標的活性を阻害するための使用を想定した抗体組成物。特に、組成物は、実質的に副作用がない濃度で阻害特性を呈し、したがって、長期的な治療プロトコルに有用である。例えば、抗体組成物と別のより毒性の細胞傷害性薬物との共投与は、治療される状態または障害の有益な阻害を達成し得る一方で、患者の毒性副作用を効果的に低減する。
【０２７７】
加えて、本開示における使用を想定した組成物の親水性及び疎水性の特性は十分にバランスが保たれ、それにより、インビトロ及び特にインビボ使用の両方のそれらの利用性を強化するが、かかるバランスを欠く他の組成物は実質的にあまり利用性がないものである。具体的に、本開示における使用が想定される組成物は、体内での吸収及び生物学的利用能を可能にする水性媒体において適切な溶解度を有し、また化合物が細胞膜を横断して推定作用部位に入ることを可能にする脂質において一定の溶解度も有する。したがって、それらが標的抗原活性部位に送達され得る際、想定される抗体組成物の有効性は最大である。
【０２７８】
投与及び投薬
一態様では、本開示の方法は薬学的組成物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は無菌組成物である。
【０２７９】
本開示の方法は、限定されないが、注射、経口摂取、経鼻、局所、経皮、非経口、吸入スプレー、膣、または直腸投与を含む、治療薬を直接または間接的に哺乳類対象に導入するための任意の医学的に容認される手段を使用して行われる。本明細書で使用される、用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、及び槽内注射、ならびにカテーテルまたは注入法を含む。皮内、乳房内、腹腔内、クモ膜下腔内、眼球後、肺内注射、及びまたは特定部位への外科移植も想定される。
【０２８０】
一実施形態では、投与は、製剤を内部的に送達することができる部位内への直接注射により、または持続送達もしくは持続放出機構を介して、癌の部位または治療が必要な患部組織に行われる。例えば、組成物の持続送達が可能な生分解性微小球もしくはカプセルまたは他の生分解性ポリマー構成（例えば、可溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）が、癌の部位付近またはその部位に移植される本開示の製剤に含まれ得る。
【０２８１】
治療用組成物はまた、複数部位で患者に送達され得る。複数投与は同時に提供され得るか、またはある期間にわたって投与され得る。ある特定の場合では、治療用組成物の連続流を提供することが有益である。定期的に、例えば、１時間に１回、１日１回、２日に１回、週２回、週３回、週に１回、隔週、３週間に１回、月に１回、またはより長い間隔で、追加療法を施すことができる。
【０２８２】
限定されないが化学療法薬を含む、本明細書に記載される第３の薬剤を伴う抗体組成物など、複数の薬剤の投与も本開示において想定される。
【０２８３】
所与の投薬量中の阻害物質または抗体組成物の量は、療法が施される個体の大きさならびに治療される障害の特性により変動し得る。例示的な治療において、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、または１０００ｍｇ／日を投与することが必要であり得る。これらの濃度は、単一投薬形態として、または複数用量として投与され得る。最初に動物にモデル、そして次に臨床試験における標準的な用量応答研究は、特定の疾患状態及び患者集団の最適な投薬量を明らかにする。
【０２８４】
所与の投薬量中のＴＧＦβ阻害物質及びＰＤ−１阻害物質の量が、療法が施される個体の大きさならびに治療される障害の特性により変動し得ることも本開示において想定される。両阻害物質組成物は、疾患の進行または許容できない毒性まで、１〜４週間毎に３０〜６０分にわたって静脈内注入として０．１〜１５ｍｇの範囲の用量で投与され得る。様々な具体化（ｅｍｂｏｄｉｅｓ）では、用量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０２８５】
投薬は、従来の治療薬が本開示の治療薬と組み合わせて投与される場合、修正され得ることも明らかである。
【０２８６】
キット
追加の態様として、本開示は、本開示の方法を実践するために化合物または組成物の使用を容易にする様式でパッケージされた１つ以上の化合物または組成物を含むキットを含む。一実施形態では、かかるキットは、密封された瓶もしくは管などの容器にパッケージされた、本明細書に記載される化合物または組成物（例えば、単独、または別の抗体もしくは第３の薬剤と組み合わせた標的特異的抗体を含む組成物）を含み、本方法の実践における化合物もしくは組成物の使用を記載するラベルが容器に貼付されるか、またはパッケージに含まれる。好ましくは、化合物または組成物は単位投薬形態でパッケージされる。キットは、特定の投与経路による組成物の投与に、またはスクリーニングアッセイの実践に好適なデバイスを更に含み得る。好ましくは、キットは阻害物質組成物の使用を記載するラベルを含む。
【０２８７】
本開示の追加の態様及び詳細は、以下の実施離から明らかであり、これらは制限するものではなく図示であることが意図される。
【実施例】
【０２８８】
実施例１．化学的に誘導された皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）のＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質併用療法
ＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質併用療法の作用を示すために、ＦＶＢマウスに化学的に誘導されたＫｒａｓＧ１３Ｃ駆動ｃＳＣＣ腫瘍系１６８（インビトロで≦２継代で培養された）を皮下注射した。腫瘍が約３〜５ｍｍの直径に達したら（移植後約２〜３週間）、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を介して、４日間隔で３回処置（マウスは０日目、４日目、及び８日目に注射された、アーム当たりｎ＝７）で、抗ＰＤ−１（α−ＰＤ−１）抗体単独（２５０μｇ，Ｃｌｏｎｅ：ＲＭＰ１−１４、カタログ番号：ＢＥ０１４６，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３（抗ＴＧＦβ）抗体（２００μｇ）単独、またはα−ＰＤ−１及び汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３抗体混合のいずれかで、マウスを処置した。続いて、腫瘍の大きさをキャリパーで測定した。α−ＰＤ−１単剤療法は、対照マウスと比較して、腫瘍の成長を阻害したが、腫瘍退縮は１２〜１４日後持続されなかった。α−ＰＤ−１単剤療法とは異なり、α−ＴＧＦβ単剤療法は強固で持続した活性を示した（＞１２〜１４日）。α−ＰＤ−１及びα−ＴＧＦβ単剤療法の両方が対応するＩｇＧ対照処置マウスと比較して腫瘍退縮を誘導したが、平均してα−ＰＤ−１及びα−ＴＧＦβの混合作用は、いずれかの試薬単独よりも大きかった（図１Ａ、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。腫瘍は、α−ＰＤ−１進行体または耐性（「ｒｅｓ」）、α−ＰＤ−１応答体または感受性（「ｓｅｎｓ」）、α−ＴＧＦβ応答体（ＴＧＦｂ）、及びα−ＰＤ−１／α−ＴＧＦβ併用応答体（ＰＤ−１  ＴＧＦｂ）に分けられた。これらの腫瘍における免疫細胞マーカーのレベルは、薬物に応答する腫瘍浸潤免疫細胞の集団の変化を評価するために、肝臓細胞の割合として、及びＣＤ４５＋細胞の割合として測定された。阻害物質で３度目の処置後、８日目にコホート当たり２〜３個の腫瘍において、ＣＤ４５＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定した（図１Ｂ及び１Ｃ）。上昇したＣＤ８＋細胞数は、α−ＴＧＦβ及びα−ＰＤ−１阻害物質応答性のバイオマーカーとして利用された。
【０２８９】
実施例２．免疫療法に対する個々の腫瘍の異なる応答
図１からのデータは、α−ＰＤ−１及び／またはα−ＴＧＦβ免疫療法に対する応答の範囲を示すために、「応答体」及び「進行体」に分けられた（図２）。α−ＴＧＦβ単剤療法ならびにα−ＰＤ１及びα−ＴＧＦβ併用療法の場合において、移植した腫瘍の退縮が７匹の処置マウスのうちの３匹において観察された。更に、α−ＰＤ１及びα−ＴＧＦβ処置の組み合わせでは、完全な腫瘍退縮が約５０％の場合において観察され、追加の薬物投薬なしで投薬４週間後に更なる腫瘍成長がなかった（すなわち、腫瘍の大きさにおける持続的な低減）。
【０２９０】
これらの結果は、α−ＴＧＦβ抗体及びα−ＰＤ−１抗体の組み合わせが単一抗体処置よりも腫瘍退縮の促進、及び意外にも、癌の再発阻止に有効であることを示す。
【０２９１】
実施例３．化学的に誘導された（ＤＭＢＡ−ＴＰＡ）皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）マウスにおけるα−ＴＧＦβ／α−ＰＤ−１併用療法による腫瘍の大きさの減少
同種移植片モデルの使用に加えて、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３  α−ＴＧＦβ／α−ＰＤ−１併用療法の抗腫瘍作用も直接的に化学的に誘導された発癌のマウス皮膚モデルを使用して評価された。ＤＭＢＡ−ＴＰＡ（１２−Ｏテトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート）誘導ｃＳＣＣモデルは十分に特徴付けされており（Ｂａｌｍａｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｓｙｍｐ．，２２：９７−１０８，１９９１、Ｂｕｒｎｓ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６（１２）：２３６３−９，１９９１、Ｙｕｓｐａ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ．，１（２）：１４７−５０，１９９６、Ｆｒａｍｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．３５３（１３７０）：８３９−４５，１９９８）、ヒト癌の研究または腫瘍同種移植片などのより単純なモデルから達成することができないであろう癌のイニシエーション及び進行の遺伝的及び分子機構を特定するために幅広く使用された。本モデルは、野生型マウスの腫瘍の＞９０％におけるＨｒａｓコドン６１のＤＭＢＡ変異によりイニシエートされる（Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，３２２（６０７４）：７８−８０，１９８６）。続く腫瘍プロモーターＴＰＡでの複数の隔週処置により、良性の前癌性乳頭腫の成長を刺激する。ある割合の乳頭腫が４〜１２ヶ月の期間にわたって癌に進行し、いくつかの場合では、それらの上皮細胞の特性の多くを失った高度に侵襲性の紡錘形腫瘍に進行する。
【０２９２】
ルシフェラーゼノックインマウス（ｐ１６（ＬＵＣ））の生物発光レポーター株を使用して、化学的に誘導されたｃＳＣＣの成長がα−ＰＤ１及びα−ＴＧＦβ抗体の組み合わせでマウスを処置する前及び処置した後に測定された。ｐ１６−ＬＵＣマウスは、Ｒａｓ駆動腫瘍細胞における腫瘍抑制因子であるｐ１６（ＩＮＫ４ａ）遺伝子の発現を示す。レポーターは、早期新生物事象により活性化され、ＩＶＩＳ光学撮像系を使用した、腫瘍の可視化及び腫瘍の大きさの測定を可能にする。
【０２９３】
３匹のマウスを、最初の週に２回ＤＭＢＡで、そして次の２０週間をＴＰＡで局所的に処置することによって腫瘍をイニシエートさせ、約３０週で癌腫の成長が観察された。癌腫の外科的切除は、ＤＭＢＡ処置による腫瘍イニシエーション３２週間後に行われた。マウスを撮像し、腫瘍の大きさを５回（外科的切除前：０週目、ならびに外科的切除後：８、１２、２１、及び２７週目）測定した。
【０２９４】
全てのマウスが約１５ｍｍの癌腫及び小さい肺転移（３×３ｍｍ）を有したときに、癌腫を切除し、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を介して、４日間隔で３回の処置で（マウスは８日目、１２日目、及び１６日目に注射された、ｎ＝３）、α−ＰＤ−１抗体（２５０μｇ，Ｃｌｏｎｅ：ＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）及びα−ＴＧＦβ抗体（２００μｇ）混合で、マウスを処置した。続いて腫瘍の大きさが発光撮像装置を使用して測定された。組み合わせでのα−ＰＤ−１及びα−ＴＧＦβ抗体処置は３匹全てのマウスにおいて腫瘍退縮をもたらした。
【０２９５】
マウスから切除された癌腫は、細胞マーカーＣＤ４５＋、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞について免役型分類され、阻害物質で３回目の処置後の腫瘍においてＦＡＣＳにより測定された。腫瘍は、α−ＰＤ−１進行体、α−ＰＤ−１応答体、α−ＴＧＦβ応答体、及びα−ＰＤ−１／α−ＴＧＦβ併用応答体に分けられた。これらの腫瘍における免疫細胞マーカーのレベルは、薬物に応答する腫瘍浸潤免疫細胞の集団の変化を評価するために、肝臓細胞の割合として、及びＣＤ４５＋細胞の割合として測定された（図４）。α−ＰＤ−１単独、α−ＴＧＦβ単独、及び組み合わせでのα−ＰＤ−１／α−ＴＧＦβでの処置に応答した腫瘍は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルの大幅な増加を示し、組み合わせでのα−ＰＤ−１／α−ＴＧＦβ応答性腫瘍は更に高いＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを示した。加えて、α−ＴＧＦβ単独及び組み合わせでのα−ＰＤ−１／α−ＴＧＦβ応答性腫瘍は、ＣＤ８＋Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）／Ｔ調節因子（Ｔｒｅｇ）ＣＤ４５＋細胞を示した。上昇したＣＤ８＋Ｔ細胞数は、α−ＴＧＦβ及びα−ＰＤ−１阻害物質応答性のバイオマーカーとして利用された。
【０２９６】
実施例４．最も大きい変異荷重を有する化学的に誘導されたＫｒａｓ駆動ＳＣＣ腫瘍はα−ＰＤ１及びα−ＴＧＦβの単剤療法及び併用療法に応答する
ＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質の単剤療法及び併用療法は、同系ＦＶＢ／Ｎマウスにおいて、化学的に誘導された（ＤＭＢＡ／ＴＰＡ）Ｋｒａｓ駆動及びＨｒａｓ駆動 対 遺伝的にイニシエートされた（ＧＥＭＭ）Ｋｒａｓ駆動ｃＳＣＣ細胞系を使用して評価された。化学的に誘導された腫瘍細胞系は、多くの場合、遺伝的に誘導された細胞系よりも多くの変異を有する。これらのより高い変異数は、ヒト腫瘍における変異数により近い（Ｗｅｓｔｃｏｔｔ  ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１７：４８９−９２，２０１５）。０日目に１回及び４日目に１回の２回、α−ＰＤ１単剤療法、α−ＴＧＦβ単剤療法、またはα−ＰＤ−１及びα−ＴＧＦβ抗体混合（または対照抗体）でマウスを処置し、６〜１０日目に腫瘍免疫型分類を行った、実施例１の段落［２８１］に記載される方法を使用して、次の化学的誘導された細胞系：ＦＶＢ−６２、ＦＶＢ−８５、ＦＶＢ−１６６、ＦＶＢ−１６８、ＦＶＢ−１６９を、ｃＳＣＣの次のＫｒａｓ駆動ＧＥＭＭイニシエートモデル：ＦＶＢ−１４２５、ＦＶＢ−１４２８と比較した。これらの実験の結果は、最も大きい変異荷重（すなわち、ＭＢ当たりの変異の数が大きく、これはよりヒト腫瘍を代表する）を保有することを示した化学的に誘導されたＫｒａｓ駆動ＳＣＣ腫瘍のみが、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＰＤ１の単剤療法ならびに併用療法に応答したことを示した（図５）。治療感受性の化学的に誘導されたＳＣＣ腫瘍細胞系は、ＫｒａｓＧ１３Ｒ変異を有するＦＶＢ−１６８及びＦＶＢ−１６９であった。
【０２９７】
化学的に誘導されたＳＣＣ腫瘍細胞系ＦＶＢ−１６８を使用して、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＰＤ１の単剤療法ならびに併用療法に対する応答が癌腫の低減を測定することにより評価され、部分的応答、完全応答、または進行性疾患として表された（図６Ａ、２回の独立した実験からのデータ）。汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＰＤ１の単剤療法は疾患進行を約４０〜５０％阻害した。いずれかの療法単独での間で疾患における顕著な相違は観察されなかった。しかしながら、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＰＤ１併用療法は、いずれかの汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３またはα−ＰＤ１の単剤療法と比較して、疾患進行の阻害が顕著により有効であることが分かった。汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＰＤ１併用療法は、対照動物と比較して、疾患進行において約９０％の低減をもたらし、良好な全生存に関連した（図６Ｂ）。
【０２９８】
腫瘍を、進行癌腫（すなわち、腫瘍が成長し続ける）または応答癌腫（すなわち、腫瘍成長が療法により阻害された）に分けた。これらの腫瘍における免疫細胞マーカーのレベルは、薬物に応答する腫瘍浸潤免疫細胞の集団の変化を評価するために、ＣＤ４５＋細胞の割合として測定された。α−ＰＤ１単剤療法、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３単剤療法、またはα−ＰＤ−１及び汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３混合（または対照抗体）で処置した６〜１０日後の間で、コホート当たりの腫瘍におけるＣＤ８＋エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４＋エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、及びＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇの比率を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定した。α−ＴＧＦβ及びα−ＰＤ−１の阻害はＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞の拡大をもたらした（図６Ｃ）。
【０２９９】
これらの結果は、ヒト腫瘍に類似する特性を有する腫瘍がＴＧＦβ及びＰＤ−１阻害物質の組み合わせでの処置に高度に応答性であり、併用療法が全体的な疾患の進行を低減することを示す。ＴＧＦβ／ＰＤ−１阻害物質併用療法は、腫瘍における細胞の免疫学的プロファイルもより好ましいエフェクターＴ細胞対調節性Ｔ細胞比（Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ）に変更する。
【０３００】
実施例５．同種移植片腫瘍モデルにおけるＴＧＦβ１，２特異的及び汎特異的ＴＧＦβ１，２，３抗体、ならびにα−ＰＤ−１併用療法の比較
ＴＧＦβ１，２及び３を遮断する抗体の作用をＴＧＦβ１，２のみを遮断する抗体の作用と比較するために、単剤療法として、またはＰＤ−１阻害物質併用療法のいずれかで、汎特異底α−ＴＧＦβ１，２，３及びＴＧＦβ１，２特異的抗体をＫｒａｓ駆動ＳＣＣの同種移植片モデルでアッセイした。
【０３０１】
ＦＶＢマウス（ｎ＝７０）にｃＳＣＣ腫瘍系Ｈｒａｓ１６８（１．２５ｘ１０４細胞）を皮下注射した。腫瘍が触知できるようになったら（直径約０．５ｃｍ、移植後約２週間）、類似する体重及び腫瘍の大きさのマウスを含む６つの実験アーム（アーム当たりｎ＝９〜１０）にマウスを分別した。投薬当たり２００μｇの汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３もしくはα−ＴＧＦβ１，２のいずれか、及び／または投薬当たり２５０μｇのα−ＰＤ−１、及び／または同じ濃度での対応する対照抗体で、０日目、４日目、及び８日目の３回の連続投薬でマウスを処置した。６つの実験アームは、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を介した、１）対照抗体、２）α−ＰＤ１、３）α−ＴＧＦβ１，２特異的、４）α−ＴＧＦβ１，２特異的及びα−ＰＤ−１混合、５）汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３、６）汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３抗体及びα−ＰＤ−１混合を含んだ。続いて腫瘍の大きさがキャリパーを使用して測定された。汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＴＧＦβ１，２単剤療法の両方が対照と比較して腫瘍成長を阻害し（すなわち、腫瘍の大きさを減少させた）、両方ともα−ＰＤ−１抗体単独よりも効果的であった。更に、汎特異的α−ＴＧＦβ１，２，３及びα−ＴＧＦβ１，２抗体の両方が、α−ＰＤ−１を用いた両単剤療法及び併用療法において互いに比較可能な抗腫瘍活性を示した（図７）。
【０３０２】
これらの結果は、ＴＧＦβ１，２，３アイソフォームまたはＴＧＦβ１，２アイソフォームのいずれかを遮断することができる抗体が、対象における腫瘍負荷の減少において、ＰＤ−１阻害物質との組み合わせで有効であることを示す。
【０３０３】
上記の図示的な実施例に記載されるように、本開示において多くの修正及び変形が当業者に生じることが予想される。したがって、添付の特許請求の範囲に記載されるかかる制限のみが本開示に課されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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