(57)【要約】  チロシンキナーゼ阻害剤及びビグアニド化合物を投与することによって肉腫を治療する方法。腫瘍サンプルを得て、サンプルにおけるＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＭＬＨ１、ＰＲＫＤＣ、ＸＰＣ、ＡＰＥＸ１、ＥＲＣＣ５、ＭＭＳ１９又はＲＡＤ２３の遺伝子発現レベルを決定し、チロシンキナーゼ阻害剤及びビグアニド化合物を投与することによってユーイング肉腫ファミリーの腫瘍を治療する方法も記載する。さらに、ユーイングファミリー腫瘍を治療する医薬組成物を開示する。該組成物はチロシンキナーゼ阻害剤と、ビグアニド化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肉腫を治療する方法であって、肉腫を有する被験体に有効量の第１のチロシンキナーゼ阻害剤及び有効量の第１のビグアニド化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記第１のビグアニド化合物がメトホルミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、クレノラニブ又はソラフェニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤がイミタニブである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤とは異なる第２のチロシンキナーゼ阻害剤又は前記第１のビグアニド化合物とは異なる第２のビグアニド化合物を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキサート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード、四硝酸白金、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン、トポイソメラーゼ阻害剤及びそれらの組合せからなる群から選択される化学療法剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
癌がユーイング肉腫ファミリー腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ユーイングファミリー腫瘍を治療する方法であって、
被験体内のユーイングファミリー腫瘍から組織サンプルを得ることと、
前記サンプルにおいて所定の遺伝子発現レベルと比較したＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＭＬＨ１、ＰＲＫＤＣ、ＸＰＣ、ＡＰＥＸ１、ＥＲＣＣ５、ＭＭＳ１９及びＲＡＤ２３Ａから選択される遺伝子の発現レベルの上昇を決定することと、
前記被験体に有効量の第１のチロシンキナーゼ阻害剤及び有効量の第１のビグアニド化合物を投与することと、
を含む、方法。
【請求項９】
前記第１のビグアニド化合物がメトホルミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、クレノラニブ又はソラフェニブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤がイミタニブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤とは異なる第２のチロシンキナーゼ阻害剤又は前記第１のビグアニド化合物とは異なる第２のビグアニド化合物を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキサート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード、四硝酸白金、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン、トポイソメラーゼ阻害剤又はそれらの組合せからなる群から選択される化学療法剤を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記決定する工程を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
第１のチロシンキナーゼ阻害剤と、第１のビグアニド化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、ユーイングファミリー腫瘍を治療する医薬組成物。
【請求項１６】
前記第１のビグアニド化合物がメトホルミンである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、クレノラニブ又はソラフェニブである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記第１のチロシンキナーゼ阻害剤とは異なる第２のチロシンキナーゼ阻害剤又は前記第１のビグアニド化合物とは異なる第２のビグアニド化合物を更に含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
リポソーム、界面活性剤、ニオソーム、エソソーム、トランスフェロソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子又はそれらの組合せを更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
免疫調節剤、神経活性剤、抗炎症剤、抗高脂血症剤、ホルモン、受容体作動薬、受容体拮抗薬、抗感染症剤、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合フラグメント、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、補助因子、ステロイド、アンチセンス分子、抗高血圧剤、化学療法剤又はそれらの任意の組合せを更に含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１５年８月２４日付で出願された米国仮特許出願第６２／２０９，１９７号、及び２０１５年８月２５日付で出願された米国仮特許出願第６２／２０９，６４５号の利益を主張するものである。どちらの先行出願の内容も、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
ユーイングファミリーの腫瘍は、骨ユーイング腫瘍（「ユーイング肉腫」）、骨外性ユーイング腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）及びアスキン腫瘍（胸壁のＰＮＥＴ）を含む癌の群である。これらの腫瘍は、主に小児期から青年／若年成人期にかけて生じる侵攻性の悪性疾患である。ユーイングファミリー腫瘍の症例の８５％超が、２２番染色体上のＥＷＳ遺伝子と１１番染色体上のＦＬＩ１遺伝子とが融合する染色体転座に起因する。ＥＷＳ／ＦＬＩ融合タンパク質は、標的遺伝子の発現を変調することによりユーイングファミリーの腫瘍の発症機序において機能する。
【０００３】
ユーイングファミリーの腫瘍の中でも、ユーイング肉腫は小児及び若年成人が罹患する２番目に多い原発性骨癌であり、この年齢層で最もよく見られる軟部組織悪性疾患の１つでもある。
【０００４】
限局性ユーイング肉腫の治療の進歩にもかかわらず、ほぼ全ての患者が診断時に無症候性の転移性疾患を有する。転移性ユーイング肉腫の長期生存率は１０％未満である。
【０００５】
ドキソルビシンがこれらの腫瘍に対する現在の標準的な全身療法である。しかしながら、肉腫の僅か２０％しかこの薬物に反応を示さない。さらに、ドキソルビシンの臨床的有用性は重大な副作用、特に不可逆的心毒性によって限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ユーイングファミリー腫瘍の治療に効果的であり、厄介な心細胞毒性のない新たな治療剤に対し、満たされていない相当な医学的必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の満たされていない必要性を充足するために、肉腫を治療する方法が提供される。該方法は、肉腫を有する被験体に有効量のチロシンキナーゼ阻害剤及び有効量のビグアニド化合物を投与することによって行われる。
【０００８】
ユーイングファミリーの腫瘍を治療する方法も本明細書に開示する。該方法は、（ｉ）腫瘍サンプルを得ることと、（ｉｉ）サンプルにおいて所定の遺伝子発現レベルと比較したＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＭＬＨ１、ＰＲＫＤＣ、ＸＰＣ、ＡＰＥＸ１、ＥＲＣＣ５、ＭＭＳ１９又はＲＡＤ２３の遺伝子発現レベルの上昇を決定することと、（ｉｉｉ）被験体に有効量のチロシンキナーゼ阻害剤及び有効量のビグアニド化合物を投与することとを含む。
【０００９】
さらに、ユーイングファミリー腫瘍を治療する医薬組成物を開示する。該組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤と、ビグアニド化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
【００１０】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面及び以下の詳細な説明の両方に示す。本発明のその他の特徴、課題及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１１】
重要なことには、本明細書で引用された全ての参考資料は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【００１２】
以下の説明は、添付の図面について言及するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ビヒクル（ｃ）、１０ｍＭメトホルミン（ｍｅｔ）、５μＭイマチニブ（ｉｍａ）又は合わせた両方の薬物（ｉｍａ＋ｍｅｔ）で処理したＴＣ−３２ユーイング肉腫細胞における免疫蛍光染色によるγヒストンＨ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）レベルの定量化を示す棒グラフである。値は高倍率視野当たりのγ−Ｈ２ＡＸ陽性細胞の数として表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１Ｂ】ＴＣ−７１ユーイング肉腫細胞における免疫蛍光染色によるγ−Ｈ２ＡＸレベルの定量化を示す棒グラフである。処理及び値は上記図１Ａの説明文に記載した通りである。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ａ】未処理の（ｃ）、又は指定の時間にわたりメトホルミン（ｍｅｔ）、イマチニブ（ｉｍａ）若しくはその両方（ｉｍａ＋ｍｅｔ）で処理したＴＣ−３２細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸの相対発現を示す棒グラフである。値はウエスタンブロットによって決定された相対γ−Ｈ２ＡＸ発現である。薬物処理は上記図１Ａの説明文に記載した通りである。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２Ｂ】指定の時間にわたりメトホルミン、イマチニブ又はその両方で処理したＴＣ−７１細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸの相対発現を示す棒グラフである。値及び薬物処理は上記図２Ａの説明文に記載した通りである。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３Ａ】ＴＣ−３２細胞腫瘍を担持するマウスの処理日数に対する生物発光のプロットである。マウスは以下のように処理した：ビヒクル（ビヒクル）、１５０ｍｇ／ｋｇメトホルミン（ｍｅｔ）、５０ｍｇ／ｋｇイマチニブ（ｉｍａ）、及び同じ用量のメトホルミン＋イマチニブ（ｉｍａ＋ｍｅｔ）。値はマウス１匹当たりの毎秒の光子数である。エラーバーは標準偏差を表す。
【図３Ｂ】ＴＣ−７１細胞腫瘍を担持するマウスの処理日数に対する生物発光のプロットである。処理は上記図３Ａの説明文に記載した通りである。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４Ａ】ＴＣ−３２細胞腫瘍を担持するマウスから得られる腫瘍組織におけるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）陽性細胞の数によって表されるアポトーシスのレベルを示す棒グラフである。マウスは上記図３Ａの説明文に記載した通りに処理した。値は高倍率視野当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の数として表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４Ｂ】ＴＣ−７１細胞腫瘍を担持するマウスから得られる腫瘍組織におけるアポトーシスのレベルを示す棒グラフである。マウスは上記図３Ａの説明文に記載した通りに処理した。値は高倍率視野当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞の数として表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上述したように、本発明は、癌を治療する方法を含む。該方法は、肉腫を有する被験体に有効量のチロシンキナーゼ阻害剤及び有効量のビグアニド化合物を投与することを含む。
【００１５】
チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、クレノラニブ又はソラフェニブであり得る。特定の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブである。
【００１６】
ビグアニド化合物はプログアニル、クロルプログアニル又はメトホルミンであり得るが、これらに限定されない。特定の方法では、ビグアニド化合物はメトホルミンである。
【００１７】
特定の例では、上記の方法は２つの異なるチロシンキナーゼ阻害剤を投与することも含む。２つの異なるチロシンキナーゼ阻害剤は、例えばイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、クレノラニブ及びソラフェニブから選ばれ得る。
【００１８】
別の例では、上記方法は２つの異なるビグアニド化合物を投与することを含む。例示的な方法はプログアニル、クロルプログアニル及びメトホルミンから選択される２つの異なるビグアニド化合物を投与することを含む。
【００１９】
上記方法は上記で論考したチロシンキナーゼ阻害剤とは異なる化学療法剤を投与することを更に含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤及びビグアニド化合物と共に投与することができる例示的な化学療法剤はシクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキサート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード、四硝酸白金（platin tetranitrate）、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン及びトポイソメラーゼ阻害剤である。これらの化学療法剤の組合せを投与することもできる。
【００２０】
チロシンキナーゼ阻害剤及びビグアニド化合物の投与と併せて腫瘍組織を電離放射線に曝露することも上記方法の範囲内である。
【００２１】
上記方法はユーイングファミリー腫瘍の治療に特に効果的である。かかる腫瘍の例は骨ユーイング腫瘍、骨外性ユーイング腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍及びアスキン腫瘍である。
【００２２】
ユーイングファミリー腫瘍の治療に効果的な第２の方法を開示する。
【００２３】
上記方法はユーイングファミリー腫瘍から組織サンプルを得ることを含む。組織サンプルは当該技術分野で既知の技法、例えば針生検によって得ることができる。
【００２４】
遺伝子発現レベルを、サンプルにおいて所定の遺伝子発現レベルと比較して上昇していると決定する。理論に束縛されるものではないが、ユーイングファミリー腫瘍における特異的遺伝子の発現が、良好な臨床転帰を有する他のユーイングファミリー腫瘍患者における同じ遺伝子の発現レベルと比較して上昇している場合に、患者は不良な臨床転帰を有すると考えられている。以下の実施例６を参照されたい。不良な臨床転帰は死亡、転移、３年以内の再発（3 year recurrence）及び５年以内の再発である。
【００２５】
遺伝子発現レベルの上昇はβ細胞骨格アクチン（ＡＣＴＢ）、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質（ＭＬＨ１）、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＰＲＫＤＣ）、色素性乾皮症相補群Ｃ（ＸＰＣ）、ＡＰＥＸヌクレアーゼ多機能ＤＮＡ修復酵素（ＡＰＥＸ１）、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ−５（ＥＲＣＣ５）、ヌクレオチド除去修復ホモログＭＭＳ１９（ＭＭＳ１９）及びＵＶ除去修復タンパク質ＲＡＤ２３ホモログＡ（ＲＡＤ２３Ａ）の１つ以上について決定する。
【００２６】
一例では、遺伝子発現レベルの上昇はｍＲＮＡレベルを定量的ポリメラーゼ連鎖反応により測定することによって決定する。別の例では、遺伝子発現レベルは遺伝子発現マイクロアレイへのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションによって決定する。更に別の例では、遺伝子発現レベルはタンパク質レベルを免疫測定法により測定することによって測定する。
【００２７】
上記方法はチロシンキナーゼ阻害剤及びビグアニド化合物を投与することを含む。適切なチロシンキナーゼ阻害剤及びビグアニド化合物は上に記載している。特定の方法では、チロシンキナーゼ阻害剤はイミタニブ（imitanib）であり、ビグアニド化合物はメトホルミンである。
【００２８】
さらに、２つの異なるチロシンキナーゼ阻害剤又は２つの異なるビグアニド化合物を投与することが本方法の範囲内である。
【００２９】
上記方法は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキサート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、ナイトロジェンマスタード、サルファマスタード、四硝酸白金、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン及びトポイソメラーゼ阻害剤から選択される１つ以上の化学療法剤を投与することも含み得る。
【００３０】
ユーイングファミリー腫瘍を治療する医薬組成物が提供される。該組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤と、ビグアニド化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
【００３１】
例示的なチロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、クレノラニブ及びソラフェニブである。
【００３２】
メトホルミンが組成物中に含まれ得るビグアニド化合物の１つである。ビグアニド化合物はプログアニル又はクロルプログアニルであってもよい。
【００３３】
特定の実施形態では、医薬組成物は２つの異なるチロシンキナーゼ阻害剤又は２つの異なるビグアニド化合物を含む。
【００３４】
薬物送達を容易にするために、医薬組成物はリポソーム、界面活性剤、ニオソーム（niosome）、エソソーム（ethosome）、トランスフェロソーム（transferosome）、リン脂質、スフィンゴソーム（sphingosome）、ナノ粒子、マイクロ粒子等の送達剤、又はこれらの送達剤の組合せを更に含有し得る。
【００３５】
別の例では、医薬組成物は、免疫調節剤、神経活性剤、抗炎症剤、抗高脂血症剤、ホルモン、受容体作動薬、受容体拮抗薬、抗感染症剤、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合フラグメント、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、補助因子、ステロイド、アンチセンス分子、抗高血圧剤、及びチロシンキナーゼ阻害剤とは異なる化学療法剤の１つ以上も含む。
【００３６】
更なる詳細がなくても、当業者であれば、本開示を十二分に利用することができるものと考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単に説明のためだけとして解釈されるべきであり、如何なる場合にも決してその開示以外の部分を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：腫瘍細胞生存能力に対するメトホルミン及びイマチニブの効果
腫瘍細胞生存能力に対するメトホルミン及びイマチニブの組み合わせ効果を２つのユーイングファミリー腫瘍細胞株、すなわちＴＣ−３２及びＴＣ−７１について検査した。ＴＣ−３２細胞株は新たに診断された１７歳のＰＮＥＴ患者に由来し、ＴＣ−７１細胞株は２２歳のユーイング肉腫患者における化学療法後に再発した腫瘍に由来するものであった。May et al. 2013, PloS One, 8(12):e80060を参照されたい。どちらの細胞株も上述のＥＷＳ／ＦＬＩ遺伝子融合を有する。ＥＷＳ／ＦＬＩ遺伝子融合を有しない乳癌骨転移細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｂｏ、及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を対照として使用した。
【００３８】
細胞を１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン酸塩、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地中、３７℃の加湿雰囲気において５％ＣＯ２中で培養した。細胞とウェル表面及び培地容量との比率は全実験で一定に保った。
【００３９】
メトホルミン塩酸塩及びメシル酸イマチニブをSigma Aldrichから購入し、使用前に０．１％ＤＭＳＯ中に溶解した。
【００４０】
ＴＣ−３２、ＴＣ−７１、ＭＢ２３１−Ｂｏ及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１．５×１０４個の細胞の密度で別個にプレーティングした。細胞をメトホルミン、イマチニブ又は０．１％ＤＭＳＯで２４時間処理し、続いてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ試薬（Promega）を添加した。処理した細胞をＩＶＩＳ２００システム（Xenogen Corporation，Alameda，CA）により生物発光イメージング機能を用いて撮像した。３つの動的生物発光取得値の平均を５分以内に得た。関心領域をウェルから自動的に抜き出し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．５０．１により定量化した。データを、ブランクウェルのバックグラウンド光子束を引いた総光子束放出に基づいて分析した。各データ点について６つの複製ウェルを用いる３回の独立実験を行った。結果を下記表１に示す。
【００４１】
【表１】
2018525413.tif 000003
【００４２】
実施例２：腫瘍細胞生存能力に対するメトホルミン及びイマチニブの組み合わせ効果
異なる比率でのメトホルミン及びイマチニブの混合物の効果を、実施例１に記載の細胞生存能力アッセイを用いて試験した。
【００４３】
併用指数（ＣＩ）は、併用効果を決定するための単一薬物の用量応答を説明するものである。Chou and Talalay 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55を参照されたい。ＣＩを算出するための方程式は以下の通りである：
ＣＩ＝Ｄ１／Ｄｘ１＋Ｄ２／Ｄｘ２
【００４４】
本方程式では、Ｄ１及びＤ２はｘ％の効果を単独で有するために必要とされる化合物１及び化合物２の用量を指し、Ｄｘ１及びＤｘ２は組合せでｘ％の効果を有するために必要とされるそれぞれの化合物の用量である。
【００４５】
ＣＩを、メトホルミン及びイマチニブの組合せを上述の細胞生存能力アッセイにおいて異なる濃度比で試験することによって得られたデータから算出した。これら２つの薬物の相互作用をＣＩ＞１．１と規定される拮抗的、０．９＜ＣＩ＜１．１と規定される相加的、ＣＩ＜０．９と規定される相乗的、ＣＩ＜０．３と規定される強く相乗的と特徴付けた。
【００４６】
結果を下記表２に示す。
【００４７】
【表２】
2018525413.tif 000004
【００４８】
１：２０００（５μＭ：１０ｍＭ）の濃度比のイマチニブ及びメトホルミンは、ＴＣ−３２細胞の死滅において強く相乗作用した（ＣＩ＜０．３）。５μＭ及び１０ｍＭの濃度はそれぞれ、ＴＣ−３２細胞に対する単剤としてのイマチニブのＥＤ５０（４４．４０μＭ）の１１％、メトホルミンのＥＤ５０（１１．７６ｍＭ）の８５％に相当する。
【００４９】
イマチニブ及びメトホルミンの相乗効果が、ＴＣ−７１細胞に対して試験した濃度比の殆ど全てで観察された。最も強い相乗作用は、１：２０００（５μＭ：１０ｍＭ）及び１：３０００（５μＭ：１５ｍＭ）のイマチニブ：メトホルミン濃度比で見られた。５μＭのイマチニブ濃度は、ＴＣ−７１細胞に対する単剤としてのこの薬物のＥＤ５０（２３．６９μＭ）の２２％である。メトホルミンについては、１０ｍＭはＴＣ−７１細胞に対する単剤としてのメトホルミンのＥＤ５０（１１．５９ｍＭ）の８５％、１５ｍＭは１２５％である。
【００５０】
イマチニブ及びメトホルミンは単剤として又は組合せで、ＴＣ−３２及びＴＣ−７１細胞について試験した同じ用量でＭＢ２３１−Ｂｏ癌細胞及び３Ｔ３線維芽細胞に対していかなる細胞毒性も示さなかった。
【００５１】
実施例３：腫瘍細胞におけるＤＮＡ損傷に対するイマチニブ及びメトホルミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
ＤＮＡ二本鎖切断の存在のマーカーであるγヒストンＨ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）のレベルを、培養したＴＣ−３２細胞及びＴＣ−７１細胞において免疫蛍光染色及び抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体を用いるウエスタンブロット分析によって定量化した。細胞を、実施例１で上記したように１時間、６時間及び１２時間（ウエスタンブロット分析）又は２４時間（免疫蛍光研究）処理した。
【００５２】
図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ及び図２Ｂに示す結果から、イマチニブ及びメトホルミンの組合せがいずれかの薬物単独と比較して顕著に高いＤＮＡ損傷を誘導することが示された。
【００５３】
例えば、免疫蛍光染色によって測定されたＴＣ−３２細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸ発現のレベルは、イマチニブ及びメトホルミンの両方での細胞の処理後にイマチニブ又はメトホルミンでの処理と比較して２倍高かった。図１Ａを参照されたい。同様に、ＴＣ−７１細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸ発現も、イマチニブ及びメトホルミンの両方での細胞の処理後にイマチニブ又はメトホルミンでの処理と比較して上昇した。図１Ｂを参照されたい。
【００５４】
別の例では、ウエスタンブロット分析によって測定されたγ−Ｈ２ＡＸのレベルは、イマチニブ＋メトホルミンで１２時間のＴＣ−３２細胞の処理後に、いずれかの薬物で個別の細胞の処理と比較して４倍高かった。図２Ａを参照されたい。この場合も、同様の結果がＴＣ−７１細胞の薬物処理後に得られた。図２Ｂを参照されたい。
【００５５】
実施例４：腫瘍成長に対するイマチニブ及びメトホルミンのｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＴＣ−３２及びＴＣ−７１異種移植片マウスモデルを用いて、イマチニブ及びメトホルミンの組合せの抗腫瘍効果を評価した。１０μＬのリン酸緩衝食塩水中の２×１０６個のＴＣ−３２又はＴＣ−７１細胞をマウスの腓腹筋に接種した。得られる腫瘍を薬物処理前に０．５ｃｍの最小直径に達するようにした。
【００５６】
最も一般的に使用されるメトホルミンの用量は５００ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日であり、０．００７ｍＭに相当する約１．１ｍｇ／Ｌの血漿レベルをもたらす。イマチニブは、成人患者において４００ｍｇ／日〜６００ｍｇ／日の用量で一般に投与され、１．７μＭに相当する約１０００ｎｇ／ｍＬの血中濃度をもたらす。マウスにおける等価用量は、Reagan-Shaw et al. 2008, FASEB J., 22(3):659-661に記載のように算出した。マウスにおけるメトホルミンの等価用量は２１０ｍｇ／ｋｇ〜４２０ｍｇ／ｋｇであり、イマチニブの等価用量は１６７ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇである。本研究では、組合せでの各薬物がより低用量で腫瘍細胞成長の相乗的阻害をもたらし得るという上記実施例２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果に基づき、３００ｍｇ／ｋｇ／日のメトホルミン用量及び５０ｍｇ／ｋｇ／日のイマチニブ用量を本初期動物研究に選択した。
【００５７】
薬物処理のためにマウスを１５匹の動物の４つの群に分け、以下のように処理した：（ｉ）ビヒクル、（ｉｉ）１日２回の強制経口投与による１５０ｍｇ／ｋｇのメトホルミン単独、（ｉｉｉ）１日１回の腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇのイマチニブ単独、及び（ｉｖ）イマチニブ及びメトホルミンの組合せ。メトホルミン及びイマチニブはどちらも投与前に無菌生理食塩水中に溶解した。薬物処理を２週間にわたって継続した。処理の開始から２１日目まで５日毎に非侵襲的生物発光イメージングを行い、腫瘍成長をモニタリングした。
【００５８】
結果から、ＴＣ−３２及びＴＣ−７１異種移植片マウスモデルの両方において、メトホルミン及びイマチニブの組合せが２週間の処理中に腫瘍成長をほぼ完全に抑制したことが示された。図３Ａ及び図３Ｂを参照されたい。さらに、これらの動物における腫瘍は、単一薬物群又はビヒクル群のマウスにおける腫瘍よりも顕著に遅く成長し続けた。同上を参照されたい。薬物の組合せについて急性又は慢性毒性は観察されなかった。
【００５９】
２１日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を解剖して病理学検査を行った。腫瘍組織を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いてアポトーシス細胞の存在について染色した。腫瘍断面のモンタージュ画像を、ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓ自動顕微鏡により１０倍対物レンズ下で得た。ＴＵＮＥＬ陽性染色細胞の数を単盲検法により手作業で計数した。
【００６０】
結果から、イマチニブ及びメトホルミンの組合せの投与が、ＴＣ−３２及びＴＣ−７１異種移植片マウスモデルの両方で腫瘍組織においていずれかの薬物単独と比較して３倍〜５倍多いアポトーシス細胞の数をもたらしたことが示される。図４Ａ及び図４Ｂをそれぞれ参照されたい。ＴＣ−３２細胞については、イマチニブ＋メトホルミンでの処理後に見られるＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は対照、メトホルミン単独及びイマチニブ単独よりも有意に高かった（それぞれｐ＝０．００２、ｐ＝０．０３１及びｐ＝０．０２５）。ＴＣ−７１細胞でも、イマチニブ＋メトホルミンでの処理後に見られるＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は対照、メトホルミン単独及びイマチニブ単独より有意に高かった（それぞれｐ＝０．００２、ｐ＝０．００６及びｐ＝０．０４３）。
【００６１】
実施例５：薬物で処理した腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイリング
イマチニブ及びイマチニブ／メトホルミンで処理したＴＣ−３２及びＴＣ−７１細胞における遺伝子発現を、SuperArray Bioscience Corporation（Frederick，MD USA）のヒトＤＮＡ損傷シグナル伝達経路ＲＴ２−ＰＣＲ  Ａｒｒａｙを用いて検査した。アレイにより、ＤＮＡ損傷及びＤＮＡ修復経路に関連する８４個の遺伝子のパネルの発現を検出する。ＲＮＡ量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子をアレイ上に含めた。得られるデータを以前に記載されているように分析した。Rodriguez et al. 2010, Breast Cancer Res. Treat., 123(1):189-196を参照されたい。
【００６２】
遺伝子発現を、イマチニブ又はイマチニブ＋メトホルミンで１２時間処理したＴＣ−３２細胞及びＴＣ−７１細胞において検査した。
【００６３】
ＴＣ−３２細胞では、９個の遺伝子の発現がイマチニブ処理によって顕著に上方調節され、同時にイマチニブ及びメトホルミンの組合せによって抑制された。この９個の遺伝子はＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＰＲＫＤＣ）、ＤＮＡリガーゼ４（ＬＩＧ４）、Ｎ−メチルプリン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＰＧ）、β細胞骨格アクチン（ＡＣＴＢ）、ＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼＮｅｉｌ２（ＮＥＩＬ２）、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質（ＭＬＨ１）、複製タンパク質Ａ３（ＲＰＡ３）、Ａｔａｘｉｎ  ３（ＡＴＸＮ３）、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ−５（ＥＲＣＣ５）である。これらの遺伝子はＤＮＡ修復遺伝子として機能し、２つの標準修復経路、すなわち非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるＤＮＡ二本鎖修復及び相同的組換え（ＨＲ）によるＤＮＡ二本鎖修復に関与する。
【００６４】
次にＴＣ−７１細胞を見てみると、イマチニブによって顕著に上方調節され、イマチニブ及びメトホルミンの組合せによって抑制される１１個の遺伝子がこれらの細胞において同定された。この１１個の遺伝子はヌクレオチド除去修復ホモログＭＭＳ１９（ＭＭＳ１９）、ＬＩＧ４、β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、複製因子Ｃ活性化因子１（ＲＦＣ１）、ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ２（ＰＡＲＰ２）、乳癌２、早発型（ＢＲＣＡ２）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、色素性乾皮症相補群Ｃ（ＸＰＣ）、ＵＶ除去修復タンパク質ＲＡＤ２３ホモログＡ（ＲＡＤ２３Ａ）、Ａ／Ｇ特異的アデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＵＴＹＨ）及びＡＰＥＸヌクレアーゼ多機能ＤＮＡ修復酵素（ＡＰＥＸ１）である。これらの遺伝子も上述と同じ２つの標準経路、すなわちＮＨＥＪ及びＨＲによるＤＮＡ二本鎖修復に多い。
【００６５】
特に、ＮＨＥＪによるＤＮＡ二本鎖切断修復に不可欠な遺伝子であるＬＩＧ４は、ＴＣ−３２細胞及びＴＣ−７１細胞の両方において同定された、イマチニブによって上方調節され、イマチニブ＋メトホルミンによって抑制される唯一の遺伝子であった。
【００６６】
理論に束縛されるものではないが、これらの結果から、細胞へのメトホルミンの添加がイマチニブによって誘導されるＤＮＡ損傷に応答して上昇したＤＮＡ内因性修復経路を阻害することが示唆される。ＤＮＡ損傷の誘導及びＤＮＡ修復の阻害に対するこの両方の薬物の複合効果かから、イマチニブ及びメトホルミンの相乗作用が説明され得る。
【００６７】
実施例６：遺伝子発現の上昇と臨床転帰との相関
実施例５で上記したＲＴ２−ＰＣＲアレイ研究において同定された１９個の高度に発現した遺伝子の臨床的関連性を、Ohaliの肉腫データセット（Ohali et al. 2004, Oncogene, 23(55):8997-9006）を用いて調査した。このデータセットは、２０個のユーイング肉腫サンプル（１４個の原発部位腫瘍及び６個の転移性サンプル）からの遺伝子発現情報、及び臨床転帰に関する対応する情報を含む。臨床転帰は死亡、転移及び再発を含むものとした。結果を下記表３に示す。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
結果から、検査した１９個の遺伝子のうち９個が、良好な予後を有する患者からのサンプルと比較して不良な予後を有する患者からのサンプルにおいて顕著に上方調節されていることが示された。
【００７０】
その他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴は、あらゆる組み合わせで組み合わされてよい。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的にかなう代替となる特徴によって置き換えられてよい。このように、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴のうちの単なる一例である。
【００７１】
上記詳細な説明から、当業者であれば、本発明の本質的な特性を容易に特定することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び条件に適合するために本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。このように、その他の実施形態も添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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