(57)【要約】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及びそれらを使用する方法を提供する。本発明は、例えば、細胞のゲノム修飾のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を提供する。本発明が提供する複合体を使用する方法により、修飾の効率が高まり、細胞生存率が増加し及び／または細胞におけるＨＤＲのＮＨＥＪに対する割合が増加することになる。これらの複合体及び方法は、治療目的で使用することができ、たとえば、細胞の変異の修正に使用することができ、ここで該変異は疾患または障害に関連している。【選択図】図１０
2018518181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作製する方法であって、Ｔ細胞前駆細胞の集団に、
ａ．前記Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、
ｂ．超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記ｇＲＮＡの前記第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、前記標的ＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含む複合体を導入することを含み、
前記複合体は、相同組換え型修復（ＨＤＲ）及び前記第３のヌクレオチド配列の前記標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下で前記Ｔ細胞前駆細胞に導入されて、前記ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する、前記方法。
【請求項２】
前記細胞は、造血幹細胞及び多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、請求項１〜請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドを含んでいる、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記全体的に正の電荷は、約＋５〜約＋４０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１〜請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する＋３６ＧＦＰである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１〜約１．５：１：１である、請求項１〜請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞前駆細胞集団における相同組換え型修復の非相同末端結合に対する割合は、少なくとも約０．５である、請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体は、ヌクレオポレーションにより前記細胞に導入される、請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞前駆細胞集団の少なくとも５％がＨＤＲにより修飾されて、前記ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する、請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を単離することを含んでいる、請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を培養することを含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾済みＴ細胞前駆細胞は、増殖条件下で培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞を、前記修飾済みＴ細胞前駆細胞が前記ＣＡＲを発現するＴ細胞へと分化するのを促進するような条件下で培養することを含んでいる、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象の癌を治療する方法であって、請求項１〜請求項１８のいずれかに記載の方法により入手した細胞を前記対象に移植することを含んでいる、前記方法。
【請求項２０】
前記移植は自家移植である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作製するための複合体であって、
ａ．前記Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、
ｂ．超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、前記ｇＲＮＡの前記第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、前記組換え部位特異的ヌクレアーゼと、
ｃ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、前記標的ＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸配列とを含んでいる、前記複合体。
【請求項２２】
前記超荷電タンパク質は、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結されている、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記超荷電タンパク質に機能的に連結されている前記組換え部位特異的ヌクレアーゼは、さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結されているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドを含んでいる、請求項２１または請求項２２のいずれかに記載の複合体。
【請求項２４】
前記超荷電タンパク質は、その対応する未修飾タンパク質よりも大きい全体的に正の電荷を有している、請求項２１〜請求項２３のいずれかに記載の複合体。
【請求項２５】
前記全体的に正の電荷は、約＋５〜約＋４０である、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項２１〜請求項２５のいずれかに記載の複合体。
【請求項２７】
前記超荷電タンパク質は、超正電荷を有する＋３６ＧＦＰである、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項２１〜請求項２７のいずれかに記載の複合体。
【請求項２９】
ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１〜約１．５：１：１である、請求項２１〜請求項２８のいずれかに記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年６月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／１８１，１４５号の利益を主張し、その全文を参照により本明細書に援用するものである。
【背景技術】
【０００２】
クラスター化した等間隔でスペーサ―が入っている短い回文型リピート配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム）が、哺乳類細胞の所望のゲノム部位の遺伝子編集に用いられている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム内の標的部位にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体化することで、標的ゲノム部位に導く。こうして二本鎖切断を生じさせ、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）か、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ修復テンプレートによるゲノムＤＮＡの相同組換え型修復（ＨＤＲ）のいずれかを開始する。しかし、ＨＤＲによるゲノム部位の修復は効率がよくない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書では、血液系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するための複合体及び方法を提供する。本明細書では、腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作る方法を提供し、該方法は、Ｔ細胞前駆細胞の集団に複合体を導入することを含んでおり、該複合体は、（ａ）Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、ｇＲＮＡの第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる、組換え部位特異的ヌクレアーゼと、（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナー核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列とを含んでおり、該複合体は、相同組換え型修復（ＨＤＲ）及び第３のヌクレオチド配列の標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下でＴ細胞前駆細胞に導入されて、ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する。該方法はさらに、修飾済みＴ細胞前駆細胞において高細胞生存率を提供する。また、腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作るための複合体も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ患者ｉＰＳＣのインビトロの分化は、ＳＣＩＤの表現型を再現することを示す図である。図１Ａ及び図１Ｂは、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーの図である。ＪＡＫ３  ＷＴ  ｉＰＳＣ（コントロール）及びＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）をＯＰ９ストローマ細胞上でＣＤ３４＋細胞へと分化させ、続いてＯＰ９−ＤＬ４単層上でＴ細胞へと分化させた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣからのＴ細胞への分化は、コントロールと比較して不存在であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞もＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞も観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブル陽性（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングル陽性（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングル陽性（ＳＰ）Ｔ細胞も検出されなかった（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｔ細胞系列特定化の初期の事象を制御する主要遺伝子の転写物に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨの発現に対し相対的に示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ患者ｉＰＳＣのインビトロの分化は、ＳＣＩＤの表現型を再現することを示す図である。図１Ａ及び図１Ｂは、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーの図である。ＪＡＫ３  ＷＴ  ｉＰＳＣ（コントロール）及びＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）をＯＰ９ストローマ細胞上でＣＤ３４＋細胞へと分化させ、続いてＯＰ９−ＤＬ４単層上でＴ細胞へと分化させた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣからのＴ細胞への分化は、コントロールと比較して不存在であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞もＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞も観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブル陽性（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングル陽性（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングル陽性（ＳＰ）Ｔ細胞も検出されなかった（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｔ細胞系列特定化の初期の事象を制御する主要遺伝子の転写物に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨの発現に対し相対的に示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ患者ｉＰＳＣのインビトロの分化は、ＳＣＩＤの表現型を再現することを示す図である。図１Ａ及び図１Ｂは、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーの図である。ＪＡＫ３  ＷＴ  ｉＰＳＣ（コントロール）及びＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）をＯＰ９ストローマ細胞上でＣＤ３４＋細胞へと分化させ、続いてＯＰ９−ＤＬ４単層上でＴ細胞へと分化させた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣからのＴ細胞への分化は、コントロールと比較して不存在であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞もＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞も観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブル陽性（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングル陽性（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングル陽性（ＳＰ）Ｔ細胞も検出されなかった（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｔ細胞系列特定化の初期の事象を制御する主要遺伝子の転写物に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨの発現に対し相対的に示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＢＣＬ２が部分的には、ＪＡＫ３欠損のインビトロで誘導した細胞のＴ細胞発生障害を救済することを示す図である。図２Ａは、ＪＡＫ３  ＷＴコントロールと比較してのＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のアポトーシスを示す図である。アネクシンＶ陽性細胞をＴ細胞誘導１０日目（ＴＤ１０）及び１７日目（ＴＤ１７）に分析した。４つの独立した実験をコントロールＪＡＫ３  ＷＴ細胞（コントロール）を用いて実施し、５つの独立した実験をＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）を用いて実施した（＊Ｐ＜０．００５）。図２Ｂは、ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）及びＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）からの２つの株（１及び２）の、抗アポトーシスＢＣＬ２及びアポトーシス促進ＢＡＸの発現に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である（ＮＤは、（有意ではないＪＡＫ３  ｑＰＣＲシグナルのため）未測定）。ＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨの発現に対し相対的に示す。図２Ｃは、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）の発生ならびにＤＰ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）からＳＰ（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）へのＴ細胞成熟に及ぼす影響を評価するための、ＢＣＬ２−２Ａ−ＧＦＰレンチウイルスにより形質導入されたＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーの図である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＢＣＬ２が部分的には、ＪＡＫ３欠損のインビトロで誘導した細胞のＴ細胞発生障害を救済することを示す図である。図２Ａは、ＪＡＫ３  ＷＴコントロールと比較してのＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のアポトーシスを示す図である。アネクシンＶ陽性細胞をＴ細胞誘導１０日目（ＴＤ１０）及び１７日目（ＴＤ１７）に分析した。４つの独立した実験をコントロールＪＡＫ３  ＷＴ細胞（コントロール）を用いて実施し、５つの独立した実験をＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）を用いて実施した（＊Ｐ＜０．００５）。図２Ｂは、ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）及びＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）からの２つの株（１及び２）の、抗アポトーシスＢＣＬ２及びアポトーシス促進ＢＡＸの発現に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である（ＮＤは、（有意ではないＪＡＫ３  ｑＰＣＲシグナルのため）未測定）。ＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨの発現に対し相対的に示す。図２Ｃは、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）の発生ならびにＤＰ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）からＳＰ（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）へのＴ細胞成熟に及ぼす影響を評価するための、ＢＣＬ２−２Ａ−ＧＦＰレンチウイルスにより形質導入されたＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーの図である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＢＣＬ２が部分的には、ＪＡＫ３欠損のインビトロで誘導した細胞のＴ細胞発生障害を救済することを示す図である。図２Ａは、ＪＡＫ３  ＷＴコントロールと比較してのＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のアポトーシスを示す図である。アネクシンＶ陽性細胞をＴ細胞誘導１０日目（ＴＤ１０）及び１７日目（ＴＤ１７）に分析した。４つの独立した実験をコントロールＪＡＫ３  ＷＴ細胞（コントロール）を用いて実施し、５つの独立した実験をＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）を用いて実施した（＊Ｐ＜０．００５）。図２Ｂは、ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）及びＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）からの２つの株（１及び２）の、抗アポトーシスＢＣＬ２及びアポトーシス促進ＢＡＸの発現に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である（ＮＤは、（有意ではないＪＡＫ３  ｑＰＣＲシグナルのため）未測定）。ＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨの発現に対し相対的に示す。図２Ｃは、ＮＫ細胞（ＣＤ１６＋５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）の発生ならびにＤＰ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）からＳＰ（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）へのＴ細胞成熟に及ぼす影響を評価するための、ＢＣＬ２−２Ａ−ＧＦＰレンチウイルスにより形質導入されたＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーの図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ変異の修正を強化したことを示す図である。図３Ａは、ＪＡＫ３ローカスでの二本鎖切断を誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び相同型修復のためのテンプレートを用いたゲノム修飾の戦略を説明する図である。上側の線はＪＡＫ３遺伝子の構造を表す。中白のボックスはエキソンを表す。アステリスク記号はＣ１８３７Ｔ変異を表す。矢印はガイドＲＮＡを表す。図３Ｂの上側は、相同組換えを示すＰＣＲ分析の図である。５’及び３’分析用のプライマーを示す。（左下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３  ｍＲＮＡの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。（右下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３タンパク質の発現を示すウエスターンブロット分析の図である。図３Ｃは、ガイドＲＮＡの標的化効率の要約を提供している。（図３Ｄは）親ＪＡＫ３  ｉＰＳＣ（左）、ヘテロ接合修正済みｉＰＳＣ（中央）、及びホモ接合修正済みｉＰＳＣ（右）からのＰＣＲ増幅産物のＳａｎｇｅｒ配列決定の図である。２つのヘテロ接合クローンはｇＲＮＡ２＋野生型Ｃａｓ９で修正し、ホモ接合クローンはｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２＋ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）で修正した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ変異の修正を強化したことを示す図である。図３Ａは、ＪＡＫ３ローカスでの二本鎖切断を誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び相同型修復のためのテンプレートを用いたゲノム修飾の戦略を説明する図である。上側の線はＪＡＫ３遺伝子の構造を表す。中白のボックスはエキソンを表す。アステリスク記号はＣ１８３７Ｔ変異を表す。矢印はガイドＲＮＡを表す。図３Ｂの上側は、相同組換えを示すＰＣＲ分析の図である。５’及び３’分析用のプライマーを示す。（左下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３  ｍＲＮＡの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。（右下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３タンパク質の発現を示すウエスターンブロット分析の図である。図３Ｃは、ガイドＲＮＡの標的化効率の要約を提供している。（図３Ｄは）親ＪＡＫ３  ｉＰＳＣ（左）、ヘテロ接合修正済みｉＰＳＣ（中央）、及びホモ接合修正済みｉＰＳＣ（右）からのＰＣＲ増幅産物のＳａｎｇｅｒ配列決定の図である。２つのヘテロ接合クローンはｇＲＮＡ２＋野生型Ｃａｓ９で修正し、ホモ接合クローンはｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２＋ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）で修正した。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ変異の修正を強化したことを示す図である。図３Ａは、ＪＡＫ３ローカスでの二本鎖切断を誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び相同型修復のためのテンプレートを用いたゲノム修飾の戦略を説明する図である。上側の線はＪＡＫ３遺伝子の構造を表す。中白のボックスはエキソンを表す。アステリスク記号はＣ１８３７Ｔ変異を表す。矢印はガイドＲＮＡを表す。図３Ｂの上側は、相同組換えを示すＰＣＲ分析の図である。５’及び３’分析用のプライマーを示す。（左下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３  ｍＲＮＡの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。（右下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３タンパク質の発現を示すウエスターンブロット分析の図である。図３Ｃは、ガイドＲＮＡの標的化効率の要約を提供している。（図３Ｄは）親ＪＡＫ３  ｉＰＳＣ（左）、ヘテロ接合修正済みｉＰＳＣ（中央）、及びホモ接合修正済みｉＰＳＣ（右）からのＰＣＲ増幅産物のＳａｎｇｅｒ配列決定の図である。２つのヘテロ接合クローンはｇＲＮＡ２＋野生型Ｃａｓ９で修正し、ホモ接合クローンはｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２＋ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）で修正した。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ変異の修正を強化したことを示す図である。図３Ａは、ＪＡＫ３ローカスでの二本鎖切断を誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び相同型修復のためのテンプレートを用いたゲノム修飾の戦略を説明する図である。上側の線はＪＡＫ３遺伝子の構造を表す。中白のボックスはエキソンを表す。アステリスク記号はＣ１８３７Ｔ変異を表す。矢印はガイドＲＮＡを表す。図３Ｂの上側は、相同組換えを示すＰＣＲ分析の図である。５’及び３’分析用のプライマーを示す。（左下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３  ｍＲＮＡの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。（右下は）ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ）、及び修正済み（ＪＡＫ３修正済み）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３タンパク質の発現を示すウエスターンブロット分析の図である。図３Ｃは、ガイドＲＮＡの標的化効率の要約を提供している。（図３Ｄは）親ＪＡＫ３  ｉＰＳＣ（左）、ヘテロ接合修正済みｉＰＳＣ（中央）、及びホモ接合修正済みｉＰＳＣ（右）からのＰＣＲ増幅産物のＳａｎｇｅｒ配列決定の図である。２つのヘテロ接合クローンはｇＲＮＡ２＋野生型Ｃａｓ９で修正し、ホモ接合クローンはｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２＋ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）で修正した。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＪＡＫ３修正済み患者ｉＰＳＣのインビトロの分化により、成熟Ｔ細胞の表現型及び機能的特徴をもつＴ細胞が生産されることを示す図である。図４Ａは、ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール、ｎ＝３）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ、ｎ＝５）、及びＪＡＫ３修正済み（ＪＡＫ３修正済み、ｎ＝６）Ｔ細胞におけるＴ細胞発生マーカーの発現を示す図である。細胞を記載の抗体で染色し、Ｔ細胞誘導１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目（ＴＤ１４、２１、２８、及び３５）にフローサイトメトリー分析した。図４Ｂは、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβの分析の図である。多様なレパートリーのＴＣＲ  Ｖβが、修正済みＳＣＩＤ患者ｉＰＳＣ由来のＴ細胞に表れている。図４Ｃは、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞におけるＴ細胞の活性化を示すフローサイトメトリーの図である。ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）及びＪＡＫ３修正済みｉＰＳＣにそれぞれ由来するＴ細胞を抗ＣＤ３／２８ビーズで３日間刺激してから、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の分析を行った。データはＣＤ３＋集団でゲーティングした。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＪＡＫ３修正済み患者ｉＰＳＣのインビトロの分化により、成熟Ｔ細胞の表現型及び機能的特徴をもつＴ細胞が生産されることを示す図である。図４Ａは、ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール、ｎ＝３）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ、ｎ＝５）、及びＪＡＫ３修正済み（ＪＡＫ３修正済み、ｎ＝６）Ｔ細胞におけるＴ細胞発生マーカーの発現を示す図である。細胞を記載の抗体で染色し、Ｔ細胞誘導１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目（ＴＤ１４、２１、２８、及び３５）にフローサイトメトリー分析した。図４Ｂは、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβの分析の図である。多様なレパートリーのＴＣＲ  Ｖβが、修正済みＳＣＩＤ患者ｉＰＳＣ由来のＴ細胞に表れている。図４Ｃは、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞におけるＴ細胞の活性化を示すフローサイトメトリーの図である。ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）及びＪＡＫ３修正済みｉＰＳＣにそれぞれ由来するＴ細胞を抗ＣＤ３／２８ビーズで３日間刺激してから、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の分析を行った。データはＣＤ３＋集団でゲーティングした。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＪＡＫ３修正済み患者ｉＰＳＣのインビトロの分化により、成熟Ｔ細胞の表現型及び機能的特徴をもつＴ細胞が生産されることを示す図である。図４Ａは、ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール、ｎ＝３）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ、ｎ＝５）、及びＪＡＫ３修正済み（ＪＡＫ３修正済み、ｎ＝６）Ｔ細胞におけるＴ細胞発生マーカーの発現を示す図である。細胞を記載の抗体で染色し、Ｔ細胞誘導１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目（ＴＤ１４、２１、２８、及び３５）にフローサイトメトリー分析した。図４Ｂは、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβの分析の図である。多様なレパートリーのＴＣＲ  Ｖβが、修正済みＳＣＩＤ患者ｉＰＳＣ由来のＴ細胞に表れている。図４Ｃは、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞におけるＴ細胞の活性化を示すフローサイトメトリーの図である。ＪＡＫ３  ＷＴ（コントロール）及びＪＡＫ３修正済みｉＰＳＣにそれぞれ由来するＴ細胞を抗ＣＤ３／２８ビーズで３日間刺激してから、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の分析を行った。データはＣＤ３＋集団でゲーティングした。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ヒト骨髄ストローマ細胞（ｈＭＳＣ）との共培養による、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋ＨＳＣのインビトロの生成を示す図である。ヒトｉＰＳＣをｈＭＳＣ上で１８日間培養してから造血マーカーＣＤ３４及びＣＤ４３について分析した（図Ａ）。ＣＤ３４＋細胞をビーズで精製し、Ｔ細胞に（図Ｂ）、赤血球細胞及び骨髄細胞に（図Ｃ）分化させた。Ｔ細胞を生成するために、精製ＣＤ３４＋細胞をＯＰ９−ＤＬ４細胞上で３〜４週間プレート培養した。赤血球細胞及び骨髄細胞を生成するためのＣＦＣアッセイでは、精製ＣＤ３４＋細胞をメーカーのプロトコルにしたがってＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３４  Ｃｌａｓｓｉｃ培地でプレート培養した。これらのデータは、ｈＭＳＣ上での共培養後、ｈｉＰＳＣを高効率で多能性ＨＳＣに分化させることができることを示している。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞をｈＭＳＣ−ＤＬ４と一緒に培養することによるＴ細胞のインビトロの生成を示す図である。ＣＤ７＋Ｔ前駆細胞を生成するために、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞をｈＭＳＣ−ＤＬ４上で３〜４週間共培養した（図６Ａ）。図６ＡのＣＤ７＋細胞を磁気ビーズで精製しＯＰ９−ＤＬ４上で共培養すると、完全成熟ＣＤ４＋／ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＴＣＲ−αβ＋細胞が１０日以内に生産された（図Ｂ及び図Ｃ）。これらのデータは、ｈＭＳＣ−ＤＬ４上での共培養後、ｈｉＰＳＣを高効率でＣＤ７＋リンパ系前駆細胞に分化させることができることを示している。
【図７】ｈｉＰＳＣからのインビトロのγδＴ細胞の生成を示す図である。ヒトｉＰＳＣに、２Ａ−ＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片と連結した予め再編成したヒトＶ  γδ１  ｃＤＮＡを担持するレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。ＯＰ９と１８日間共培養した後、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を磁気ビーズで精製した。続いてこれらの細胞をＯＰ９−ＤＬ４細胞上でプレート培養してＴ細胞に分化させた。３２日目に細胞を採取し、Ｔ細胞表面マーカーをＦＡＣＳ分析した。ＧＦＰ＋集団は、Ｖδ１−２Ａ−ＧＦＰレンチウイルス形質導入細胞を表す。これらのＧＦＰ陽性細胞は高率（６６％）でＶδ１を発現した。ＧＦＰ陰性細胞は低率（１％）でＶδ１を発現した。これらの結果は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＶδＴ細胞は、遺伝子修飾されたｉＰＳＣから高効率に生産することができることを示している。腫瘍抗原に特異的な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＶδＴ細胞の生産は、多くの種類の癌に対する強力な細胞療法を提供する。
【図８】ガイドＲＮＡ、修飾済みＣａｓ９、及び一本鎖オリゴヌクレオチドドナー配列（ｓｓＯＤＮ）を含む修正複合体が、鎌状赤血球変異を修正できることを示す図である。複合体を鎌状赤血球ｉＰＳＣにヌクレオポレーションにより導入し、２日後にゲノムＤＮＡをデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析し配列決定した。細胞の６５％以上が少なくとも１つの修正済み遺伝子を含んでいた。結果は次のように確認された。修正複合体導入の２日後、細胞を培養皿でプレート培養し、４３の個別のｉＰＳＣコロニーを単離した。これらのコロニーからゲノムＤＮＡを単離し、ベータグロビン遺伝子の配列を決定した。６５％のコロニーが少なくとも１つの修正済みベータグロビン遺伝子を含んでいた（ＳがＡに修正されていた）。
【図９】患者の初代骨髄ＣＤ３４＋細胞に鎌状赤血球修正複合体（ｇＲＮＡ修飾済み組換えＣａｓ９−ｓｓＯＤＮ）を導入すると、鎌状赤血球変異を修正できることを示す図である。インビトロの分化の１２日後、ＤＮＡをデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析し配列決定した。ほぼ等量のベータＡｍＲＮＡとベータＳｍＲＮＡが観察された。
【図１０】図９の修正済み鎌状赤血球貧血患者ＣＤ３４＋細胞からインビトロで分化させた赤血球の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルの図であり、ＨｂＡ（正常ヘモグロビン）とＨｂＳ（鎌状赤血球変異を有するヘモグロビン）の比が約１：３であり、これは鎌状赤血球化を阻害し鎌状赤血球貧血を治療するのに十分である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本明細書では、細胞のゲノム修飾のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を提供する。本明細書で提供する複合体を使用する方法により、修飾の効率が高まり、細胞生存率が増加し及び／または細胞におけるＨＤＲのＮＨＥＪに対する割合が増加することになる。これらの複合体及び方法は、治療目的で使用することができ、たとえば、細胞の変異の修正に使用することができ、ここで該変異は疾患または障害に関連している。
【０００６】
本明細書では、細胞のゲノム内の変異を修正するための複合体を提供し、該複合体は、（ａ）細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列であって、該標的ＤＮＡは変異を含んでいる、第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、ガイドＲＮＡの第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる組換え部位特異的ヌクレアーゼと、（ｃ）標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズし、標的ＤＮＡに組み込まれて標的ＤＮＡ内の変異を修正する一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）とを含んでいる。
【０００７】
本明細書で説明するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と組換え部位特異的ヌクレアーゼとドナーヌクレオチドとを含む複合体は、自然には発生しないものである。しかし該複合体は、細胞を高効率かつ有効に修飾するのに必要な立体配置及び化学量を必要要素に与える。ｇＲＮＡ分子は部位特異的ヌクレアーゼに結合し、該ヌクレアーゼに標的ＤＮＡ内の特定箇所を狙わせる。ｇＲＮＡは、細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列であって、該標的ＤＮＡは変異を含んでいる、第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含んでいる。本明細書で説明する複合体は、１つまたは２つの別々のｇＲＮＡを含むことができる。したがって、ガイドＲＮＡという用語には、１つのガイドＲＮＡと２つのガイドＲＮＡの両方が含まれる。鎌状赤血球貧血関連の変異を修正するのに使用できるガイド配列の一例を本明細書ではＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号１）として示す。Ｃａｓ９との結合のためのステムループを含むガイド配列の一例を本明細書ではＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２）として提供する。なお、配列番号２の５’Ｇはインビトロ転写の際にＴ７により付加された。
【０００８】
本明細書で説明する複合体では、組換え部位特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡにガイドされる部位特異的ヌクレアーゼ、たとえば任意の細菌種由来のＣａｓタンパク質またはその機能的断片の場合がある。たとえば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的断片の場合がある。本明細書では、「Ｃａｓ９」という用語は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをコードする任意の細菌種に存在するＣａｓ９タンパク質またはその断片を意味する。たとえば、補足情報を含めＭａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ９：  ４６７−４７７  （２０１１）を参照されたい（その全文を参照により本明細書に援用する）。たとえば、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の場合がある。全長Ｃａｓ９はエンドヌクレアーゼであり、１つの認識ドメインと２つのヌクレアーゼドメインを含んでいる（それぞれＨＮＨとＲｕｖＣ）。アミノ酸配列では、ＨＮＨは直線的に連続するが、ＲｕｖＣは３つの領域に分かれており、認識ドメインの左側に１つ、認識ドメインの右側に他の２つがあって、ＨＮＨドメインに隣接している。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９は、Ｃａｓ９が認識するＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡとの相互作用によって、細胞のゲノム部位を標的とする。こうして二本鎖切断が生じ、この二本鎖切断は、標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズし標的ＤＮＡに組み込まれて標的ＤＮＡ内の変異を修正するドナーヌクレオチド、たとえばｓｓＯＤＮまたは二本鎖ＤＮＡコンストラクトによって、ＨＤＲにより修復される。
【０００９】
本明細書で提供する複合体では、ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０であり得る。たとえば、ｇＲＮＡと超荷電タンパク質に機能的に連結された部位特異的ヌクレアーゼとｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１、１．１：１：１、１：１：１．１５、１：１：１．２５、１：１：１．３０；１：１：１．３５；１：１：１．４０；１：１：１．５０、１．２：１：１、１．３：１：１．１．４：１：１、１．５：１：１、１．５：１：１．１５、１．５：１：１．２５、１．５：１：１．３５；１．５：１：１．４０、１．５：１：１．４５；１．５：１：１．５０；１．５：１：１．５５；１．５：１：１．６０；１．５：１：１．６５；１．５：１：１．７０；１．５：１：１．７５；１．５：１：１．８０；１．５：１：１．８５；１．５：１：１．９０；１．５：１：１．９５；１．５：１：２．０、またはこれらの比の間の任意の比であり得る。このようなモル比を有する複合体は、本明細書で説明する方法のどれにでも用いることができる。細胞または細胞集団に導入する前に複合体を調製する方法を実施例に示す。
【００１０】
本明細書では、超荷電タンパク質は超正電荷を有するタンパク質の場合があり、該タンパク質は全体的に正電荷を有しており、該電荷はその対応する未修飾タンパク質よりも大きい。たとえば、超正電荷を有するタンパク質は、約＋５〜約＋４０の全体的に正の電荷を有する、超正電荷を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の場合がある。たとえば、全体的に正の電荷は、約＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、＋２５、＋２６、＋２７、＋２８、＋２９、＋３０、＋３１、＋３２、＋３３、＋３４、＋３５、＋３６、＋３７、＋３８、＋３９、または＋４０の場合がある。
【００１１】
超荷電タンパク質は、ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結することができる。また、超荷電タンパク質はヌクレアーゼと結合させることができるが、この結合は必ずしも共有結合でなくてもよいものとする。超荷電タンパク質の一例は、超正電荷を有するＧＦＰ、たとえば＋３６ＧＦＰである。＋３６ＧＦＰは、Ｃａｓ９またはその機能的断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に機能的に連結することができる。たとえばＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  ＰＮＡＳ  １０６（１５）：  ６１１１−６１１６を参照されたい。Ｃａｓ９のカルボキシ末端に機能的に連結された＋３６ＧＦＰを含むポリペプチドの一例を本明細書では配列番号３として提供する。
【００１２】
ヌクレアーゼはまた、超荷電タンパク質及び１つ以上の正電荷を有するペプチドに機能的に連結されていてもよく、たとえば１つ以上のトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドがヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されていてもよい。たとえば、限定ではないが、超正電荷を有するタンパク質をヌクレアーゼのカルボキシ末端に機能的に連結し、１つ以上のＴＡＴペプチド（たとえば、１ＸＴＡＴ、２ＸＴＡＴ、３ＸＴＡＴ、４ＸＴＡＴなど）をヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結してもよい。ヌクレアーゼのアミノ末端に機能的に連結された１つのＴＡＴペプチドと、ヌクレアーゼのカルボキシ末端に機能的に連結された超正電荷を有するＧＦＰとを含むポリペプチドの一例を本明細書で配列番号４として提供する。配列番号３または配列番号４と少なくとも約７５％同一であるポリペプチド配列も提供する。たとえば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージのポリペプチド配列も提供する。
【００１３】
ヌクレアーゼはまた、超荷電タンパク質及び１つ以上の負電荷を有するペプチドに機能的に連結されていてもよく、たとえば約１０〜約２５アミノ酸長のたとえば配列番号５０の負電荷を有するペプチドが、部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に機能的に連結されていてもよい。たとえば限定ではないが、超正電荷を有するタンパク質をヌクレアーゼのカルボキシ末端に機能的に連結し、負電荷を有するペプチドを超正電荷を有するタンパク質のカルボキシ末端に機能的に連結してもよい。
【００１４】
本明細書全体で、組換えとは、２種のポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスである。相同組換え型修復（ＨＤＲ）は、たとえば細胞内で二本鎖切断の修復中に生じるＤＮＡ修復を指す。このプロセスにはヌクレオチド配列の相同性が必要であり、ドナー分子、たとえば一本鎖または二本鎖ヌクレオチド配列を標的ゲノム配列すなわち二本鎖切断を有するゲノム配列の修復のテンプレートとして用い、ドナーから標的ゲノム配列へと遺伝情報が移動することになる。相同組換え型修復の結果、標的ゲノム配列の配列が修飾される。たとえば、ＨＤＲの結果、標的ゲノム配列内に挿入、欠失、または変異を生じさせることができる。ドナーポリヌクレオチド配列の一部または全部を標的ＤＮＡに組み込むことができる。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分も、標的ＤＮＡに組み込まれるものとする。
【００１５】
本明細書全体で、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）とは、（修復をガイドするために相同配列を要する相同組換え型修復とは違って）相同テンプレートを必要とせず、二本鎖切断の末端同士を直接連結（ライゲーション）することでＤＮＡ内の二本鎖切断を修復することを意味する。
【００１６】
本明細書で提供する複合体及び方法は、標的ＤＮＡ内のあらゆる変異をＨＤＲによって修正するのに用いることができる。たとえば、限定ではないが、複合体は、（たとえば、機能喪失変異すなわちＳＮＰにより損なわれた標的ポリヌクレオチド配列の機能を回復するために）ゲノム内の特定部位の誤ったヌクレオチド配列を正しいヌクレオチド配列で置換するのに用いることができる。このような変異は、たとえば自己免疫障害、遺伝疾患、血液障害、Ｔ細胞障害、一遺伝子性障害、癌、神経変性疾患、心血管疾患、または炎症性疾患などと関連している場合がある。たとえば、限定ではないが、本明細書で提供する複合体及び方法は、鎌状赤血球疾患に関連する変異（すなわちヘモグロビン遺伝子の変異、たとえば、ベータグロビン遺伝子のコドン６のＧＡＧからＧＴＧへの変異でグルタミン酸がバリンに置換される）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）（たとえば、ＪＡＫ３の変異）、ベータサラセミアまたはウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する変異の修正に用いることができる。
【００１７】
１つまたは複数の変異の修正は、１つ以上の複合体を用いて実施することができる。本明細書で提供する複合体及び方法はまた、修正や置換とは逆に、ゲノム内の特定部位に配列を挿入して欠失を修正するのに用いることもできる。本明細書で提供する複合体及び方法はまた、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞のゲノム内の特定部位に挿入し、その結果として該機能的ポリペプチドを細胞内で発現させるのに用いることもできる。この機能的ポリペプチドは、細胞に内在するポリペプチド（すなわち、普通は細胞が発現させる）でもよいし、細胞にとって外来性のポリペプチド（すなわち、普通は細胞が発現させない）でもよい。たとえば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列をＴ細胞前駆細胞のゲノムに挿入し、その結果として癌治療のための癌特異的Ｔ細胞を生成させることができる。別の例では、本明細書で提供する複合体及び方法は、細胞のゲノム内の特定部位で遺伝子の活性を阻害するのに用いることができる。たとえば、本明細書で提供する複合体及び方法は、ＨＩＶ感染の治療または予防するための配列をＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５受容体に挿入するのに用いることができる。
【００１８】
本明細書で提供する複合体は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比べて驚くべき高効率で標的ＤＮＡを修復または改変することができる。ある細胞集団における改変効率は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、またはそれ以上、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージであり得る。改変効率はまた、約８０％かそれ以上であり得る。したがって、本明細書では、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、またはそれ以上、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージが改変されている細胞集団も提供する。たとえば、鎌状赤血球疾患または別の障害に関連する変異が修正されている。鎌状赤血球疾患関連の変異を含む細胞集団に本明細書で説明するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を接触させ、その変異が細胞の約５％で修正された場合、修飾または改変の効率は約５％ということである。任意選択により、鎌状赤血球疾患関連の変異が細胞の約３０％、たとえば２７％、２８％、及び２９％などが修正された細胞集団は、鎌状赤血球疾患を有する対象への移植後、鎌状赤血球疾患を治療するのに十分である。任意選択により、鎌状赤血球疾患に関連する変異は、細胞集団の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージが修正される。
【００１９】
高効率で標的ＤＮＡを改変するのに加えて、本明細書で提供する複合体はまた、該複合体が接触する細胞集団におけるＨＤＲのＮＨＥＪに対する割合を増加させることができる。ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、約１０〜約０．５であり得る。たとえば、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、またはそれ以下、またはこれらの比率の間の任意の比率であり得る。高効率の修正、及びＨＤＲのＮＨＥＪに対する高い割合に加えて、修正済み細胞の細胞生存率は少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、またはそれらの間の任意のパーセンテージであり得る。
【００２０】
本明細書で説明する複合体を用いて、あらゆる細胞（複数可）を修飾または誘導することができる。細胞への複合体の導入は細胞周期に依存してもよいし独立していてもよい。特定の期たとえばＳ期の細胞の割合を増やすための細胞同調の方法が当業界で知られている。たとえばＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓ−ｐｈａｓｅ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，”  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  １９（５）：３４３−３４６  （１９９１）を参照されたい。当業者であれば、修飾する細胞型に応じて、細胞周期の同調が必要かどうかを容易に判断できる。
【００２１】
細胞（複数可）は真核細胞、たとえば哺乳類細胞の場合がある。細胞はまた、原核細胞または植物細胞の場合もある。細胞はヒト細胞の場合もある。細胞は微生物細胞、体細胞、幹細胞、前駆（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞または前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞の場合もある。前駆細胞は、たとえば、造血幹細胞のような多能性幹細胞または多能性幹細胞の場合がある。本明細書全体で、多能性細胞には人工多能性幹細胞も含まれる。人工多能性幹細胞を作る方法は当業界で知られており、実施例でも説明する。細胞はまた、ＣＤ３４＋細胞の場合もあり、任意選択により人工多能性幹細胞由来である。ＣＤ３４＋細胞は、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞、ＣＤ３４＋末梢血細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、及びＣＤ３４＋骨髄細胞からなる群より選択され得る。細胞はまた、初代細胞、たとえば初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞の場合もある。細胞は癌細胞ではない細胞、腫瘍細胞ではない細胞、または形質転換細胞ではない細胞である。細胞は、修正の前か後に、望ましくない遺伝特徴のエビデンスについてスクリーニングされる場合がある。さらに、本明細書で説明する複合体のいずれかを含む細胞を提供する。この細胞はインビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。
【００２２】
さらに、細胞集団における標的ＤＮＡの部位特異的な修飾の方法を提供し、該方法は、本明細書で説明する複合体のいずれかを細胞に導入することを含み、複合体は、相同組換え型修復（ＨＤＲ）、及びドナーヌクレオチドたとえばｓｓＯＤＮまたは二本鎖ヌクレオチドの配列の標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下で、細胞に導入される。複合体は、ヌクレオポレーションによって細胞に導入することができる。ヌクレオポレーションの方法は当業界で知られている。たとえばＭａａｓｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，  ＮＫＬ，  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：  １３３−１４０  （２００４）及びＡｌｕｉｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４（２）：  ４５４−４６１  （２００６）（これらの全文を参照により本明細書に援用する）を参照されたい。
【００２３】
本明細書で提供する方法のいくつかでは、ドナーヌクレオチド、たとえばｓｓＯＤＮまたは二本鎖ヌクレオチドの配列は標的ＤＮＡに組み込まれ、該標的ＤＮＡ内の変異を修正する。本明細書で提供する方法では、細胞集団におけるＨＤＲのＮＨＥＪに対する割合は、他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９送達方法よりも高くなる。ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、約１０〜約０．５であり得る。たとえば、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、またはそれ以下、またはこれらの比率の間の任意の比率であり得る。本明細書で提供する方法では、ＨＤＲによる改変効率は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、またはそれ以上、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージであり得る。ＨＤＲによる改変効率はまた、約８０％かそれ以上であり得る。たとえば、鎌状赤血球疾患関連の変異を含む細胞集団に本明細書で説明するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を接触させ、その変異が細胞の約５％で修正された場合、ＨＤＲによる改変効率は約５％である。細胞集団は障害をもつ対象から、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、またはそれ以上、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージの細胞が、障害に関連する変異を修正するＨＤＲを受けるように、入手することができる。場合によっては、対象からの細胞の８０％超が障害に関連する変異を修正するＨＤＲを受ける。本明細書で説明する方法では、複合体の導入後、約５０％〜９９％の細胞が生存する。たとえば、複合体の導入後、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％よりも高い、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージの修正済み細胞が生存する。
【００２４】
さらに、対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の変異に関連する疾患を治療する方法を提供し、該方法は（ａ）該対象から入手した細胞集団に、（１）細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列であって、該標的ＤＮＡは変異を含むヘモグロビン遺伝子である、第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（２）超荷電タンパクに機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、ガイドＲＮＡの第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる組換え部位特異的ヌクレアーゼと、（３）標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズし標的ＤＮＡに組み込まれてヘモグロビン遺伝子内の変異を修正する一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）とを含む複合体を導入することと、（ｂ）修正済み細胞を対象に移植することとを含んでいる。
【００２５】
対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の変異、たとえば鎌状赤血球貧血に関連する疾患を治療する方法では、鎌状赤血球貧血を有する対象は、任意選択により、輸血に依存している対象か、または少なくとも１つの無症状梗塞がある対象であり得る。対象はまた、生後約１２か月未満、１１か月未満、１０か月未満、９か月未満、８か月未満、７か月未満、６か月未満、５か月未満、４か月未満、３か月未満、２か月未満、または１か月未満であり得る。乳児は鎌状赤血球疾患のスクリーニングを定期的に受けるので、疾患の症状が出る前に治療を始めることもできる。本明細書で提供する方法はさらに、障害たとえば鎌状赤血球疾患のある対象を診断することも含む場合がある。
【００２６】
上述したように、細胞は、疾患を有する対象または血縁ドナーから入手することができる。たとえば、骨髄細胞を対象から入手または採取することができる。骨髄採取では、骨の柔らかい中心部の髄に針を刺して幹細胞を収集する。骨髄は、たとえば対象の骨盤や胸骨から採取することができる。約５００ｍｌ〜約１リットルの骨髄が対象から入手され得る。
【００２７】
本明細書で提供するどの方法でも、細胞（複数可）は真核細胞、たとえばヒト細胞の場合がある。細胞は、微生物細胞、幹細胞、前駆細胞の場合がある。前駆細胞は、たとえば多能性幹細胞または造血幹細胞の場合がある。本明細書全体で、多能性細胞には、人工多能性幹細胞が含まれる。人工多能性幹細胞を作る方法は当業界で知られており、実施例でも説明する。細胞はまた、ＣＤ３４＋細胞の場合もある。ＣＤ３４＋細胞は、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞、ＣＤ３４＋末梢血細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、及びＣＤ３４＋骨髄細胞からなる群より選択され得る。細胞はまた、初代細胞、たとえば初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞の場合もある。細胞は、癌細胞ではない細胞、腫瘍細胞ではない細胞、または形質転換細胞ではない細胞である。細胞は、インビトロまたはエクスビボであり得る。細胞はまた、製薬上許容される組成物に含まれる場合もある。
【００２８】
本明細書で提供する方法はさらに、ＨＤＲ修正された細胞を培養することを含む場合がある。たとえば、細胞は、増殖条件下で、または修正済み細胞のＴ細胞への分化を促進する条件下で培養される場合がある。たとえば、限定ではないが、本明細書で提供する方法により、人工多能性幹細胞でＨＤＲにより変異が修正された後、修正済み細胞をヒト骨髄ストローマ細胞と共培養して、ＣＤ３４＋細胞を生成することができる。次に、このＣＤ３４＋細胞がＴ細胞へと分化する条件下で、ＣＤ３４＋細胞を培養することができる。
【００２９】
本明細書で提供する方法はさらに、適切な修正、他の変異、またはＮＥＪについて、修正済み細胞を移植前にスクリーニングすることを含む場合がある。任意選択により、細胞をスクリーニングして、１つ以上の修正がある細胞を検出してもよい。
【００３０】
本明細書で提供する方法では、細胞は、修飾後、たとえばＨＤＲによる変異の修正後、対象に移植することができる。細胞は、分化したまたはしていない状態で対象に移植することができる。たとえば、修飾済み造血幹細胞（ＨＳＣ）を骨髄移植で投与することができ、該ＨＳＣを対象の体内で分化させて成熟させる場合がある。あるいは、移植前に、修飾済み細胞を所望の細胞集団へと分化させる場合もある。
【００３１】
本明細書では、細胞を対象に移植、導入、または投与することは、細胞を対象の体内に配置することを指す。たとえば、本明細書で説明する方法により標的ＤＮＡ配列が修正または修飾されている本明細書で説明する細胞を、適切な経路で対象に移植して、少なくとも部分的には移植細胞を所望の部位に局在させることができる。細胞は所望の部位に直接移植することもできるし、あるいは任意の適切な経路で対象体内の所望の場所に送達し、そこで移植細胞の少なくとも一部は生存しているように、投与することもできる。たとえば、細胞は、静脈内注入により全身投与することができる。対象に投与した後の細胞の生存期間は、数時間と短いものから、たとえば２４時間、数日、数年と長いものまであり得る。
【００３２】
エクスビボの方法では、細胞は自家細胞、すなわち細胞内の標的ＤＮＡの修飾を必要とする対象から採った細胞（すなわち、ドナーとレシピエントは同一個体）の場合がある。本明細書で説明するように、修飾は、たとえば変異の修正、タンパク質の活性を阻害する配列の挿入、またはタンパク質の発現を増加させる配列の挿入、たとえば癌細胞の標的化に用いることができるキメラ抗原受容体をコードする配列の挿入であってもよい。自家細胞は、細胞の拒絶をもたらすような免疫反応を回避するために用いることができる。換言すると、自家細胞を使用するときは、ドナーとレシピエントは同一対象である。あるいは、細胞は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、たとえばドナーから採った、好ましくは近縁ドナーから採った細胞の場合がある。第２の対象は同じかまたは異なる種の対象であり得る。一般に、細胞がドナーの細胞である場合、移植後の拒絶の確率を低下させるため及び／または免疫抑制治療の必要性を低下させるために、レシピエントと十分に免疫適合性があるドナーの細胞である。細胞は、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）供給源から、すなわちレシピエントまたはレシピエントの種と十分に免疫適合性があるように遺伝子操作された非ヒト哺乳類から入手することもできる。本明細書で説明する障害を治療する方法はいずれも、さらに、１種以上の免疫抑制剤を対象に投与することを含む場合がある。
【００３３】
移植が含まれる方法では、対象は、任意選択により、本明細書で説明するいずれかの細胞を移植する前に、骨髄破壊治療を受ける。骨髄破壊治療には、１回以上の用量（線量）の化学療法、放射線療法、またはその両方の投与が含まれる場合があり、その結果として正常な骨髄細胞が相当または完全に枯渇する。別の例では、対象は、下位骨髄破壊療法を受けることもあり、これには１回以上の用量（線量）の化学療法、放射線療法、またはその両方の投与が含まれる場合があり、その結果として正常な骨髄細胞が一部枯渇する。細胞はまた、非破壊的化学療法を受けた対象に移植される場合もある。たとえば、細胞は、ブスルファン、フルダラビン及び／またはトレオスルファンで治療されている対象に移植される場合もある。
【００３４】
移植が含まれる方法では、有効用量または有効量の修正済み細胞が対象に投与される。有効量及び有効用量という用語は、交換可能に用いられる。有効量という用語は、所望の生理学的応答を得るのに必要な任意の量として定義される。いくつかの方法では、修正済み細胞約１Ｘ１０６〜約７Ｘ１０６個／ｋｇが投与される場合があるが、この量は関連する障害によって変わる場合がある。Ｔｈｅ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ細胞を投与する有効量及びスケジュールは経験的に決定することができ、当業者であればそういった決定ができる。投与される用量の範囲は、所望の効果（たとえば疾患の治療、たとえば鎌状赤血球貧血の治療）が十分に得られるほどである。用量は、望ましくない交差反応やアナフィラキシー反応などの非常に有害な副作用が起きるほど多くてはいけない。一般に、用量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または治療計画に他の薬物が含まれるかどうかなどによって異なるが、当業者であれば決定できる。用量は、何らかの禁忌症がある場合、各医師によって調節される場合もある。用量は様々であり得、剤は、必要に応じて１日または２日以上にわたって１日１回以上投与される場合がある。
【００３５】
本明細書全体で、対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳類（たとえばヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）の場合がある。この用語は特定の年齢や性別を指すものではない。したがって、雌雄に関係なく新生児から成体までの対象を網羅するものとする。本明細書では、患者または対象は交換可能に用いることができ、障害を有するかまたは発症するリスクがある対象を指すことができる。患者または対象という用語にはヒト及び動物対象が含まれる。
【００３６】
本明細書では、治療（する）（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｔｒｅａｔ、またはｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、たとえば鎌状赤血球疾患などの障害の１つ以上の影響または障害の１つ以上の症状を、対象の免疫応答を誘発することによって軽減する方法を指す。したがって、本開示の方法では、治療は鎌状赤血球疾患及び他の障害の重症度を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％軽減することを指すことができる。たとえば、鎌状赤血球疾患を治療する方法は、コントロールと比較して、対象の炎症の１つ以上の症状に１０％の軽減があれば、治療とみなされる。したがって、軽減は、何もしていないまたはコントロールのレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間のあらゆる百分比の軽減であり得る。治療は、必ずしも障害または障害の症状の治癒または完全な消失を指すとは限らないものとする。
【００３７】
また、Ｔ細胞障害に関連する変異を修正する方法も提供し、該方法は、Ｔ細胞障害を有する対象から入手した細胞集団に（ａ）細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列であって、該標的ＤＮＡはＴ細胞障害に関連する変異を含んでいる、第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）超荷電タンパクに機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、ｇＲＮＡの第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、Ｔ細胞障害に関連する変異を含む標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して標的ＤＮＡ内に二本鎖切断を生じさせる組換え部位特異的ヌクレアーゼと、（ｃ）標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズし、標的ＤＮＡに組み込まれてＴ細胞障害に関連する変異を修正する第３のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）とを含む複合体を導入することを含み、該複合体は相同組換え型修復（ＨＤＲ）を許容する条件下で細胞に導入されて、Ｔ細胞障害に関連する変異を修正する。
【００３８】
本明細書で提供する方法では、Ｔ細胞障害に関連する変異を含む標的ＤＮＡは、Ｔリンパ球の発生に関連するタンパク質をコードする標的ＤＮＡの場合がある。たとえば、標的ＤＮＡは、ＪＡＫ３をコードする場合がある。そのような修正済み細胞は、たとえばＳＣＩＤの治療に用いることができる。
【００３９】
細胞のゲノム内の変異の修正に加えて、本明細書で提供する複合体及び方法は、細胞のゲノム内の特定部位に機能的ポリペプチドを挿入し、その結果として該細胞に該ポリペプチドを発現させるのに用いることもできる。ポリペプチドは、細胞内または細胞表面に発現することができる。
【００４０】
また、腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作る方法も提供し、該方法は、Ｔ細胞前駆細胞の集団に（ａ）Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内の標的ＤＮＡにハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列と、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列とを含むガイド（ｇＲＮＡ）と、（ｂ）超荷電タンパク質に機能的に連結された組換え部位特異的ヌクレアーゼであって、ｇＲＮＡの第２のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、標的ＤＮＡに特異的に結合し切断して二本鎖切断を生じさせる組換え部位特異的ヌクレアーゼと、（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列と、標的ＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリダイズする第４のヌクレオチド配列とを含むドナーヌクレオチド配列とを含む複合体を導入することを含み、該複合体は相同組換え型修復（ＨＤＲ）、及び第３のヌクレオチド配列の標的ＤＮＡへの組込みを許容する条件下でＴ細胞前駆細胞に導入されて、ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞を形成する。
【００４１】
Ｔ細胞前駆細胞は、癌を有する対象から入手することができる。上述したように、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、約１０〜約０．５であり得る。たとえばＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、またはこれらの比率の間の任意の比率であり得る。本明細書で提供する方法では、ＨＤＲによる改変効率は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージであり得る。ＨＤＲによる改変効率はまた、約８０％かそれ以上であり得る。たとえば、本明細書で説明する方法を用いて、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、たとえばＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が細胞の約５％に挿入された場合、ＨＤＲによる改変効率は約５％である。細胞集団は、癌を有する対象から、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージの細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を挿入しＣＡＲを発現する細胞を形成するＨＤＲを受けるように、入手することができる。場合によっては、対象からの細胞の８０％超が、障害に関連する変異を修正するＨＤＲを受ける。
【００４２】
ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞は、癌を有する対象に移植することができる。本明細書では、癌は、異常細胞の急速かつ抑制されない増殖として特徴づけられる疾患である。癌細胞は、局所で広がる場合もあるし、または血流やリンパ系により体内の他の部分に広がる場合もある。癌の例としては、限定ではないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。ＣＡＲを発現する修飾済みＴ細胞前駆細胞は、抗原結合ドメインが対応する抗原に結合すると、抗腫瘍免疫を示す。
【００４３】
本開示の方法及び組成物に使用することができる、それらと一緒に使用することができる、それらの調製に使用することができる、またはそれらの製品である、材料、組成物、及び成分を開示する。本明細書ではこれら及び他の材料を開示するが、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループなどを開示する際、これらの化合物の各々様々な個別の及び集団の組合せ及び変更が具体的に言及され明白に開示されていなくても、本明細書ではそれぞれを具体的に意図し説明しているものと考えられる。たとえば、ある方法が開示され、論じられ、該方法を含めていくつかの分子に加えられ得るいくつかの修飾が論じられる場合、該方法の可能な各々すべての組合せ及び変更ならびに修飾は、特に断らない限り、具体的に意図されている。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組合せも具体的に意図され開示されている。この概念は、限定ではないが、本開示の組成物を用いる方法のステップを含め、本開示のあらゆる態様に当てはまる。したがって、実施が可能な様々な追加のステップがある場合、それら追加のステップの各々が本開示のあらゆる具体的な方法ステップまたはそれらの組合せと一緒に実施することができ、そのような組合せまたは組合せのサブセットはそれぞれが具体的に意図されていると考えられ、したがって開示されているとみなされるべきである。
【００４４】
本明細書で引用する出版（発表）物及び引用されているものは、すべて参照により本明細書に具体的に援用する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換によるＳＣＩＤの修正
ＪａｎｕｓファミリーのキナーゼＪＡＫ３遺伝子の変異は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）の原因となる。ヒトＪＡＫ３欠損の特徴は、循環Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の不存在と、数は正常だが機能不良であるＢ細胞（Ｔ−Ｂ＋ＮＫ−）である。本明細書で示すように、ＳＣＩＤ患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びＴ細胞インビトロ分化システムにより、ＪＡＫ３欠損細胞の初期のＴ細胞の発生が完全に阻害されることが明らかになった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換による新型ＪＡＫ３変異の修正により、広範なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパートリーを有する成熟Ｔ細胞集団の生成を含む正常なＴ細胞発生が回復する。修正済み細胞の全ゲノム配列決定によると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲットの修飾はないことが示されている。したがって、本明細書では、ヒトリンパ球新生を研究する新規のアプローチ、及び免疫不全を有するヒトにおける遺伝子置換療法の方法を提供する。
【００４６】
同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植は、今のところ唯一確立されているＳＣＩＤ治療法であるが、免疫回復が遅く、移植片対宿主疾患のリスクがあり、危険性もかなり高い。レトロウイルスを基にした遺伝子療法による治療が、Ｘ連鎖性ＳＣＩＤに有効であると実証されている。しかし、レトロウイルス遺伝子療法では、挿入変異の重篤な有害作用が観察されている。最近の臨床試験では自己不活化レンチウイルスベクターが有効に使用されているが、全面的な安全性について長期フォローアップが必要である。
【００４７】
本明細書では、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導し、疾患の原因となる変異をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体による遺伝子置換によって修正する代替治療戦略を提供する。これらの修正済みｉＰＳＣは、疾患治療のため、任意選択により患者への移植用の造血前駆細胞に分化させることもできる（Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｉｎ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：  １９２０−１９２３  （２００７））。本明細書で示すように、ＪＡＫ３欠損ヒトＴ細胞の分化は、初期の発生段階で阻害される。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換によるヒトＪＡＫ３変異の修正により、初期のＴ細胞前駆細胞の分化潜在力が回復することも明らかになった。これらの修正済み前駆細胞は、ＮＫ細胞及び広範なレパートリーのＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現する成熟Ｔ細胞集団を生産する能力がある。これらの研究から、ヒトＳＣＩＤ患者の免疫不全の機構を決定し、障害の薬理的及び遺伝的療法を試験するための強力なシステムが樹立される。
【００４８】
患者情報
ヘルシンキ宣言にしたがい機関審査委員会の承認を得た試験に男性患者が登録された。免疫不全に関する家族病歴は陰性であった。この患者は生後８か月の間、体重がなかなか増加せず、下痢をし、再発性細気管支炎もあって、たびたび入院した。生後８か月で重症の呼吸促迫及び鵞口瘡で入院した。気管支肺胞洗浄の気管支鏡検査で、細菌生物（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，  Ｈ  ｆｌｕ，  Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びウイルス生物（呼吸器多核体ウイルス）が判明した。免疫評価で重度の低ガンマグロブリン血症が判明し、ＩｇＥ＜３、ＩｇＡ＜４、ＩｇＧ＝２９、ＩｇＭ＝２６であった。末梢血の免疫表現型決定によると、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞は完全に不存在だったが、Ｂ細胞は存在していた（Ｂ細胞の絶対数＝８７５）。マイトジェン検査では、コンカナバリンＡ、ポークウィード・マイトジェン、及びフィトヘマグルチニンＡに対し完全に無応答であることが判明した。遺伝子検査によると、ホモ接合のＪＡＫ３遺伝子のエキソン１４におけるＣ＞Ｔヌクレオチド置換により、アミノ酸の６１３番目の位置でアルギニンコドン（ＣＧＡ）がストップコドン（ＴＧＡ）で置換されており、ＳＣＩＤの診断が裏付けられた。これは、このＪＡＫ３バリアント（ｒｓ１４９３１６１５７）をＳＣＩＤの臨床事例と結びつける初の報告である。この患者は、低強度の条件適合非近縁骨髄移植を受け、現在は治療を中止して２年になるが免疫は完全に再構成され、元気に暮らしている。
【００４９】
ヒトｉＰＳＣのリプログラミング及び特徴
ｉＰＳＣ誘導のため、５ｘ１０４個の初代ケラチノサイトを６ウェルプレートの１つのウェルに播種した。その翌日、ケラチノサイトを１ｍＬのウイルス上清液及び最終濃度４μｇ／ｍＬのポリブレンを含有する１ｍＬのヒトケラチノサイト培地で形質導入した。このケラチノサイトに８００ｘｇで４５分間スピンフェクトした（１日目）。この形質導入手順を翌日も繰り返した。３日目に新鮮なヒトケラチノサイト培地に換えて、細胞をさらに２日培養した。５日目にケラチノサイトをトリプシン処理し、マイトマイシンＣで処理したマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を予め播種した１０ｃｍの皿に移し、ヒトケラチノサイト培地で培養した。７日目にヒトＥＳ培地に換え、同じ皿で３〜４週間継続して細胞を培養した。ＥＳ培地は毎日取り換えた。ｉＰＳＣコロニーとなるものが２〜３週間で見えてきた。これらのコロニーを個別に選抜してＭＥＦで増殖させて分析した。組み込まれているレンチウイルス配列及び多シストロン配列を除去するために、ｉＰＳＣをＣｒｅ発現アデノウイルス（ｒＡｄ−Ｃｒｅ−ＩＥ）に感染させた。個々のコロニーを選抜し、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）配列がＣｒｅ媒介によって除去されたかどうかを、プライマーｇｃｔａａｔｔｃａｃｔｃｃｃａａａｇａａｇａｃａａｇ（配列番号５）及びｃｔｔｃａｇｃａａｇｃｃｇａｇｔｃｃｔｇ（配列番号６）を用いてＰＣＲで検証した。
【００５０】
ＯＰ９共培養によるＣＤ３４＋細胞及びＴ細胞の作製
手順は以前に説明されている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｂｒｏａｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，  ｅ９７３３５  （２０１４））。この方法は、以下の修飾で用いられた。６ウェルプレートの１つのウェル中のｈｉＰＳＣ培養物を、Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｏｈｎｕｋｉ  Ｍ，  “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：  Ｕｎｉｔ  ４Ａ  ２  （２００９））で説明されているようにＣＴＫ溶液で処理して、小さい細胞塊を作った。次にこの細胞塊を、１０％ＦＢＳ、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００μＭモノ−チオグリセロールを含有するα−ＭＥＭベースの培地中、２日目のＯＰ９細胞を予め播種した１０ｃｍプレートに移した。培地は１日おきに取り換え、細胞を継代なしで１８日間培養した。共培養１８日後、細胞を解離液（α−ＭＥＭ培地中０．１５％コラゲナーゼＩＶ及び０．０１５％ヒアルロニダーゼ）で約３０分かけて処理し、さらに３０分０．２５％トリプシンで処理して採取した。次いでＣＤ３４＋細胞を抗ＣＤ３４＋磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、独国ベルギッシュグラートバッハ）で精製した。Ｔ細胞に分化させるため、これらのＣＤ３４＋細胞をＯＰ９−ＤＬ４細胞上でプレート培養し、２０％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ  ｈＦｌｔ３−Ｌ、５ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−７、及び１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＳＣＦを含有するα−ＭＥＭ培地で培養した。培地は１日おきに取り換え、細胞を４日おきに新しいＯＰ９−ＤＬ４プレートに移した。
【００５１】
Ｔ細胞の刺激
インビトロでｈｉＰＳＣから誘導したＴ細胞をＣＤ３／２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）と一緒にメーカーのプロトコルにしたがって３日間インキュベーションして刺激した後に、先述されている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）ようにフローサイトメトリー分析した。
【００５２】
フローサイトメトリー
細胞を採取し洗ってから、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カリフォルニア州サンノゼ）で分析した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）で細胞表面を染色して死細胞を排除した。アポトーシスアッセイは、まず、採取した細胞を細胞表面抗体で３０分かけて染色した。１ＸＰＢＳで一度洗った後、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）及びＰＩを含有する１００μＬのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）に細胞を再懸濁させ、１５分間インキュベーションした後、ＰＩと一緒に４００μＬのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを加えた。特に断らない限り、抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手したものである：ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５−５、クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＳＫ３）、ＣＤ７（ＡＰＣ、ＢＶ５１０、クローンＭ−Ｔ７０１）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７、クローンＳＫ１）、ＣＤ１６（ＰＥ、クローンＢ７３．１）、ＣＤ２５（ＦＩＴＣ、クローン２Ａ３）、ＣＤ３４（ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＷＭ５９）、ＣＤ４３（ＰＥ、クローン１Ｇ１０）、ＣＤ５６−ＰＥ（クローンＭＹ３１）、ＣＤ６９（ＦＩＴＣ、クローンＬ７８）、ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ（クローン１Ｄ１１）、ＴＣＲ−αβ（ＦＩＴＣ、ＰＥ、クローンＴ１０Ｂ９．１Ａ−３１）、ＴＣＲ−Ｖδ１−ＦＩＴＣ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ、クローンＴＳ８．２）、ＴＣＲ−Ｖδ２−ＰＥ（クローンＢ６）、ＴＣＲＶγ９−ＦＩＴＣ（クローンＢ３）、ＴＮＦ−α−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＭＡＢ１１）、Ｂｅｔａ  Ｍａｒｋ  ＴＣＲ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ジョージア州アトランタ）。
【００５３】
ベクターの作製
多シストロン性ＯＳＫＭベクターが以前に説明されている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  “ｈｉｔ  ａｎｄ  ｒｕｎ”  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２７：  １０４２−１０４９  （２００９））。Ｌｅｎｔｉ−ｈＤＬ４−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドが、ＰＣＲ増幅ヒトＤＬ４  ｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、コロラド州ラファイエット）、ＩＲＥＳ断片（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及びｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡを、ＥＦ１αプロモーターを含んでいるレンチウイルスベクター（ｐＤＬ１７１）にクローニングすることによって作製された。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社、マウンテンビュー）を用いて実施した。
【００５４】
ＣＲＩＳＰＲプラスミドを作製するために、ｇＲＮＡオリゴを設計してＺｈａｎｇ  ｌａｂプロトコル（Ａｄｄｇｅｎｅ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）にしたがいｐＸ３３０及びｐＸ３３５プラスミドに導入した。ＪＡＫ３修復プラスミドを作製するために、野生型ヒトゲノムＤＮＡをＪＡＫ３プライマーセット（５’アーム：ｇｔｃｇａｃｇｔｃｇａｃｇｃｔｃａｇｔｇａａｇｃｔｇａａｇｔａｔｔｃｃｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔａｃ（配列番号７）及びａｔｔｔａａａｔｃｃｔｃｃｃｃｔｃｇａａｃｃｃｔｔａｃｃａａａｃｔｃｃｔａｔｇｃａｔａｃｔａｃａｇ（配列番頭８）；３’アーム：ｔｔａａｔｔａａｔｔａａｔｔａｇｃａｔｔｔｔａｇｇｔｔｃａｇｇｔｔｇｔｇａｇａａｃａｃｔａｇａａｇａｇａａｃａａｇｔｃａ（配列番号９）及びｇｔａｔａｃｇｔａｔａｃｇｃａｔａｃｃｔｇｇａｇａｇｇｇｇａｃａａｇｇｔｃｔｔｇａｇａｔｇｃｇａｇｇｇｔ（配列番号１０）を用いてＰＣＲ増幅した。酵素消化（５’アーム：ＳａｌＩ及びＳｗａＩ；３’アーム：ＰａｃＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ）の後、ＰＣＲ産物をＬｏｘＰ−ＰＧＫ−Ｎｅｏ−ＬｏｘＰ断片を含むプラスミドにクローニングした。この試験で使用したオリゴは全てＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ社、アイオワ州コーラルビル）により合成した。ＢＣＬ２レンチウイルスプラスミドを作製するために、プライマーセット（フォワード：ａｇｃｃａｃｃｔｔａａｔｔａａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｃｇｃａｃｇｃｔｇｇｇａｇａａｃｇｇｇｇｔａｃｇａｔａ（配列番号１１）及びリバース：ｔａａｃａｇａｇａｇａａｇｔｔｃｇｔｇｇｃｔｃｃｇｇａｔｃｃｃｔｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａｔａｇｇｃａｃｃｃａｇｇｇｔｇａｔ（配列番号１２））を用いてヒトＢＣＬ２  ｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）断片を増幅した。この産物をＰＣＲで２Ａ配列によりＧＦＰと連結し、ｐＤＬ１７１ベクターにクローニングした。ｇＲＮＡ−Ｆ１  ｃａｃｃＧＴＧ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡ（配列番号１３）ｇＲＮＡ−Ｒ１  ａａａｃＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＡＣ（配列番号１４）ｇＲＮＡ−Ｆ２  ｃａｃｃｇＡＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＣ（配列番号１４）ｇＲＮＡ−Ｒ２  ａａａｃＧＧＣ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＴＴｃ（配列番号１５）ｇＲＮＡ−Ｆ３  ｃａｃｃｇＣＡＧ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＧＣ（配列番号１６）ｇＲＮＡ−Ｒ３  ａａａｃＧＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＴＧｃ（配列番号１７）ｇＲＮＡ−Ｆ４  ｃａｃｃｇＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＡＴ（配列番号１８）ｇＲＮＡ−Ｒ４  ａａａｃＡＴＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  Ｃａｃ（配列番号１９）ｇＲＮＡ−Ｆ５  ｃａｃｃＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＧＡ（配列番号２０）ｇＲＮＡ−Ｒ５  ａａａｃＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣ（配列番号２１）ｇＲＮＡ−Ｆ６  ｃａｃｃＧＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  ＣＡ（配列番号２２）ｇＲＮＡ−Ｒ６  ａａａｃＴＧＡ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＣ（配列��号２３）。
【００５５】
細胞培養
ｉＰＳＣを、１Ｘ非必須アミノ酸、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシン、１ＸＬ−グルタミン（すべてニューヨーク州コーニングのＭｅｄｉａｔｅｃｈ社から入手）、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２−βＭＥ（Ｓｉｇｍａ社）、及び５〜１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が添加されたＤＭＥＭ  Ｆ−１２からなるＥＳ細胞培地中、マイトマイシンＣで処理したＥ１４．５  ＣＦ−１胚由来ＭＥＦ上で培養した。ヒト初代ケラチノサイトをＤｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｋ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、メリーランド州フレデリック）中で培養した。ＯＰ９細胞はＡＴＣＣから購入し、２０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ培地で増殖させた。ｈＤＬ４及びｍＣｈｅｒｒｙを含むレンチウイルスを用いてＯＰ９細胞に形質導入することによってＯＰ９−ＤＬ４細胞を樹立した。
【００５６】
ウイルスの生産
レンチウイルスを調製するために、１０μｇのレンチウイルスベクター、２．５μｇのエンベローププラスミド（ｐＭＤＧ）、及び７．５μｇのパッキングプラスミド（ｐＣＭＢＶｄＲ８．９．１）をＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットリー、またはＰｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）により５ｘ１０６個の２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、ウイルス含有上清液を回収して０．４５μｍフィルターを通した。
【００５７】
遺伝子標的化
ｉＰＳＣを５分間０．２５％トリプシンで処理して単一細胞懸濁物を生成した。１ＸＰＢＳで２回洗った後、１００万〜２００万個の細胞を５μｇのＪＡＫ３修復プラスミド及び５μｇのｐＸ３３０−ＪＡＫ３またはｐＸ３３５−ＪＡＫ３プラスミドと混合してヌクレオフェクションし（Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、プログラムＡ−０２３、Ｌｏｎｚａ社、ジョージア州アルファレッタ）、ＭＥＦ上でプレート培養した。２〜４日後、薬物耐性コロニーを選択するため３０μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するｈＥＳ培地をプレートに加えた。これらのコロニーを３〜４週間後に選抜し、ゲノムＤＮＡを抽出するために増殖させた。ＰＣＲ遺伝子型解析では、５’プライマーセット（ｔｇｃｔａａａｇｃｇｃａｔｇｃｔｃｃａｇａｃｔ（配列番号２４）及びｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｃａｇｇｇｔｃｇｇｃｔ（配列番号２５）及び３’プライマーセット（ｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｃａｔｔａｔｇｇｃａｇ（配列番号２６）及びｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇ（配列番号２７））を用いた。Ｎｅｏ選択マーカーを除去するために、ｈｉＰＳＣをＣｒｅ発現アデノウイルス（ｒＡｄ−Ｃｒｅ−ＩＥ）に感染させた。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲ
インビトロで誘導した細胞からＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて全ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をメーカーの指示にしたがい使用して、０．５〜２μｇの全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示にしたがい使用した。ｑＰＣＲで用いたプライマーセットはＧＡＰＤＨ（Ｆ：ａｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｔｔｔｇａｃｇｃｔ（配列番号２８）、Ｒ：ｔｃｃｃｃｔｃｔｔｃａａｇｇｇｔｃｔａｃａｔｇ（配列番号２９））；ＰＵ．１（Ｆ：ｇｔｇｃａａａａｔｇｇａａｇｇｇｔｔｔｃ（配列番号３０）、Ｒ：ｇｇａｇｃｔｃｃｇｔｇａａｇｔｔｇｔｔｃ（配列番号３１））；ＧＡＴＡ３（Ｆ：ｔｇｔｔｔｃｃｔｔｔｃａｃｔｇｇｃｃａｃａ（配列番号３２）、Ｒ：ａａｃｇｇｃａａｃｔｇｇｔｇａａｃｇｇｔａ（配列番号３３））；ＢＣＬ１１Ｂ（Ｆ：ｇｇｃｇａｔｇｃｃａｇａａｔａｇａｔｇｃｃｇ（配列番号３４）、Ｒ：ｃｃａｇｇｃｃａｃｔｔｇｇｃｔｃｃｔｃｔａｔｃｔｃｃａｇａ（配列番号３５））；ＲＡＧ１（Ｆ：ｃｃｔｔａｃｔｇｔｔｇａｇａｃｔｇｃａａｔａｔｃｃ（配列番号３６）、Ｒ：ｃｔｇａａｇｔｃｃｃａｇｔａｔａｔａｃｔｔｃａｃａｃ（配列番号３７））；ＲＡＧ２（Ｆ：ｃｃｃａｇａａｇｃａｇｔａａｔａａｔｃａｔｃｇａｇ（配列番号３８）、Ｒ：ａｔｇｔｇｇｇａｔｇｔａｇｔａｇａｔｃｔｔｇｃ（配列番号３９））；ｐＴａ（Ｆ：ｇｇｇｔｃｔｔａｃｃｔｃａｇｃａｇｔｔａｃ（配列番号４０）、Ｒ：ｃｃｔｃａｃａｃａｇｔｇｔｇａｃｇｃａｇ（配列番号４１））；ＢＣＬ２（Ｆ：ｇａｃｔｇａｇｔａｃｃｔｇａａｃｃｇｇｃ（配列番号４２）、Ｒ：ｇｇｇｃｃａａａｃｔｇａｇｃａｇａｇｔｃ（配列番号４３））；ＢＡＸ（Ｆ：ａａｇａｃｃａｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇａｃ（配列番号４４）、Ｒ：ｇｔａａｇａａａａａｔｇｃｃｃａｃｇｔｃ（配列番号４５））；及びＪＡＫ３（Ｆ：ａｇｔｃａｇａｃｇｔｃｔｇｇａｇｃｔｔｃ（配列番号４６）、Ｒ：ｇｔｇａｇｃａｇｔｇａａｇｇｃａｔｇａｇｔｃ（配列番号４７））であった。全ての値をＧＡＰＤＨ発現に対し標準化した。
【００５９】
全ゲノム配列決定及び分析
ｉＰＳＣからのＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２  Ｆｏｃｕｓｅｄ−ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒによりせん断した。マイクロチューブに入れた試料１３０μＬを、周波数掃引モードでデューティーサイクル１０％、強度４、２００サイクル／バーストで、４０秒サイクルに２回供した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるＤＮＡチップ（ＤＮＡ  １０００  Ｋｉｔ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州サンタクララ）の分析によると、平均断片サイズは４００ｂｐであった。ライブラリの調製は、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ＃Ｅ７３７０）を用いて実施し、ライブラリの最終濃度をＫＡＰＡ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＫ４８３５；ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、マサチューセッツ州ウィルミントン）及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｑＰＣＲで決定した。配列決定クラスターは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｖ３−  ｃＢｏｔ−  ＨＳ（ＰＥ−４０１−３００１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢｏｔを用いてフローセルで生成した。ＷＧＳをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＳＢＳ  Ｋｉｔ  ｖ３−ＨＳ−２００サイクル（ＦＣ−４０１−３００１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００アップグレードを用いて実施し、生物情報学的分析用に２ｘ１００のシングルインデックスのペアエンドリードを生成した。候補のオフターゲット部位を、ＥＭＢＯＳＳ  ｆｕｚｚｎｕｃソフトウェア（ｖ６．６．０．０）（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＥＭＢＯＳＳ：  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ：  ＴＩＧ  １６：  ２７６−２７７  （２０００））を用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイド配列をｈｇ１９基準ゲノムとアラインメントし、また最大３つのミスマッチを許容することによって、特定した。第１のガイド配列（ＧＴＧＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＣＡ）（配列番号４８）については１１９３部位を、第２のガイド配列（ＡＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＣ）（配列番号４９）については２５７部位を予測した。各試料についてのＷＧＳの全リードをＢＷＡ（ｖ０．７．５ａ）ｍｅｍアルゴリズム（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，  “Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，”  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：  ５８９−５９５  （２０１０））を用いてｈｇ１９基準ゲノムにマッピングし、重複リードはＰｉｃａｒｄツール（ｖ１．１００）（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）により除去した。部分的（ローカル）リアラインメントと塩基クオリティ再較正はＧＡＴＫ（ｖ２．７−２）（ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ：  ａ  Ｍａｐ���ｅｄｕｃｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ，”  Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：  １２９７−１３０３  （２０１０））を用いた。ＧＡＴＫ  ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを用いてＳＮＶとｉｎｄｅｌとをコールした。さらに、ＧＡＴＫ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓの説明にしたがいＳＮＶとｉｎｄｅｌを別々に再較正し、クオリティー・フィルターを適用した。４つのｉＰＳＣ試料の全てに共通する基準ゲノムからのバリアントはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット分析から除外した。除外されなかったバリアントはＢｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ２．１７．０）（Ｑｕｉｎｌａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  “ＢＥＤＴｏｏｌｓ：  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，”  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：  ８４１−８４２  （２０１０））を用いてスクリーニングして、これらが候補オフターゲット部位に該当するかどうかを決定した。分析によると、これらのバリアントはどれもオフターゲット部位に存在せず、これらの変異はランダムに蓄積したことが示唆された。次に、低アレル頻度（＜１％、ｄｂＳＮＰ  １３８）の機能的バリアント全て（除外されたもの及び除外されなかったもの）をＡＮＮＯＶＡＲソフトウェア・パッケージにより注釈付けし、ＨＧＭＤ及びＣｌｉｎＶａｒ（ｖ２０１４０９０２）中の疾患との既知の関連についてスクリーニングした。さらに、高ＣＡＤＤスコア（ＣＡＤＤ＞＝２０）でヒットしたもの全てを、ＧＷＡＳ  Ｃａｔａｌｏｇ及びＣＯＳＭＩＣ（ｖ７０）を用いて複合疾患との関連についてもスクリーニングした。確認されている疾患関連のバリアントは、照会したデータベース内には見当たらなかった。特筆すべきは、ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ（ｐ．Ｒ６１３Ｘ）変異も疾患との関連は確認されなかったが、ＳＮＰ（ｒｓ１４９３１６１５７）は、ＧＥＲＰスコアが３．８５、ＣＡＤＤスコア（ＣＡＤＤ  ｐｈｒｅｄ様スコア）が３８と、かなり有害（ｄｅｌｅｔｅｒｉｕｓ）であると予測されることである。したがって、ＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔバリアントが初めてＳＣＩＤの臨床事例と関連づけられた。
【００６０】
受託コード
ＷＧＳデータに関しては、受託番号ＳＲＰ０５６１４９でＮＣＢＩ  ＳＲＡデータベースへのアクセスが可能である。
【００６１】
ＪＡＫ３欠損ヒトＴ細胞は低レベルのＢＣＬ２を発現し発生段階初期で死滅する
ホモ接合のＪＡＫ３遺伝子のエキソン１４におけるＣ＞Ｔヌクレオチド置換を有するＳＣＩＤ患者の皮膚ケラチノサイトからｉＰＳＣを生成した（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。この変異により、ＣＧＡコドン（６１３番目のアルギニン）がＴＧＡストップコドン（ｐ．Ｒ６１３Ｘ）で置き換えられる。上述したように、生後４か月の患者がＴ−Ｂ＋ＮＫ−臨床表現型であった。このＳＣＩＤ表現型がインビトロで再現可能かどうかを決定するために、患者特異的ｉＰＳＣからＴリンパ球への２ステップのＯＰ９及びＯＰ９−ＤＬ４システム（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）を用いての分化を試みた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣは正常ドナー由来のコントロールｉＰＳＣと同等の率で増殖し、これらのｉＰＳＣはＯＰ９ストローマ細胞の単層上で高効率でＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰ）へと分化した。しかし、ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋ＨＰをＯＰ９−ＤＬ４ストローマ単層上でプレート培養すると、Ｔ細胞分化はコントロールと比較して不存在であった（図１）。ＣＤ３＋Ｔ細胞もＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞も観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブル陽性（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングル陽性（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングル陽性（ＳＰ）Ｔ細胞も検出されなかった（図１Ｂ）。Ｊａｋ３ノックアウト（ＫＯ）マウスは、増殖性ＴＣＲの再編成前のＣＤ４−ＣＤ８−ダブル陰性（ＤＮ）段階で胸腺細胞の分化が阻害されるため胸腺が小さい。ヒトのＪＡＫ３変異を原因とする発生障害をさらに理解するために、ＪＡＫ３欠損細胞のＴ細胞分化系列決定及び成熟を正常ＪＡＫ３  ＷＴコントロールと比較して検定した。ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞をＯＰ９−ＤＬ４単層上でプレート培養し、細胞を採取して、Ｔ細胞誘導（ＴＤ）１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目にリンパ球マーカーについて分析した（図４Ａ）。正常コントロールでは、ＴＤ１４に１〜２Ｘ１０６個のＣＤ３４＋細胞から１．２Ｘ１０７個のＣＤ７＋細胞（リンパ系ゲートで計測した細胞の８４％）が生成された。Ｔ細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、及びＴＣＲαβをＴ細胞成熟後、順次検出した。ＴＤ３５には集団の５０％超がＣＤ８  ＳＰ細胞であった。ＪＡＫ３欠損細胞では、ＴＤ１４に１〜２Ｘ１０６個のＣＤ３４＋細胞から生成されたＣＤ７＋細胞は４．５Ｘ１０４個だけだった（リンパ系ゲートで計測した細胞の３８．９％）。ＣＤ７＋細胞の数は連続培養の間減少し、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβの発現は有意ではなかった。初期Ｔ細胞前駆細胞（ＥＴＰ）からＣＤ４−ＣＤ８−（ＤＮ）段階、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ＤＰ）段階への移行は、特定の転写因子の正確な活性化及び抑制によって導かれる。コントロール細胞では、ＰＵ．１のサイレンシング、ならびにＧＡＴＡ３及びＢＣＬ１１Ｂの誘導（図１Ｃ）が、これらの細胞が細胞Ｔ分化系列決定の開始へと進み（ＤＮ２からＤＮ３）、その後ＴＣＲ再編成が生じることを示唆している。一方、ＪＡＫ３欠損細胞では、ＰＵ．１が蓄積しＧＡＴＡ３及びＢＣＬ１１Ｂのレベルが低下する（図１Ｃ）。これらのデータから、ヒトＪＡＫ３欠損細胞のＤＮ２段階でのまたはその前の停止が示唆されるが、これはＪａｋ３  ＫＯマウスでＴ細胞が死滅する段階と類似している。興味深いことに、ヒトＪＡＫ３欠損細胞はＴＣＲ再編成を実施するのに十分なＲＡＧ１、ＲＡＧ２、及びＰＴＣＲＡを発現し得る（図１Ｃ）が、この重要な発生段階に至るまで細胞が生存しない。ＪＡＫ３欠損細胞のリンパ球発生におけるこのような重大な欠陥は、リンパ系前駆細胞の生存及び分化において重要な役割を果たすＩＬ−７シグナル伝達の不在で説明することができる。ＩＬ−７／ＪＡＫ３シグナル伝達は、アポトーシス制御因子のＢＣＬ２ファミリーを制御することにより胸腺細胞のホメオスタシスを維持している。Ｊａｋ３  ＫＯからの胸腺細胞と末梢Ｔ細胞は、一部には、アポトーシス促進因子ＢＡＸの選択的上昇、及び抗アポトーシス因子ＢＣＬ２の発現低下により、高アポトーシス指標を有する。同様に、これらの研究では、インビトロで誘導したヒトＪＡＫ３欠損細胞のアポトーシスは、コントロールと比較して、ＴＤ１０（９％対２．２％）及びＴＤ１７（７％対１．９％）時点の増加（図２Ａ）。この表現型と同様に、ＪＡＫ３欠損細胞ではコントロールと比較してＢＡＸレベルが増加し、ＢＣＬ２レベルが低下した（図２Ｂ）。γｃ欠損マウスでは、強制的にＢｃｌ２を発現させるとＴ細胞は救済されるが、Ｂ細胞やＮＫ細胞の発生は救済されない（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：  １５５−１６２  （１９９７））。Ｊａｋ３  ＫＯマウスにＢｃｌ２を発現するＪａｋ３  ＫＯ骨髄細胞を移植しても末梢Ｔ細胞数は改善する（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：  ６７８−６８９  （２００１））。ＢＣＬ２の過剰発現がヒトＪＡＫ３欠損細胞のＴ細胞発生障害を救済するかどうかを決定するために、インビトロで誘導されたＪＡＫ３欠損ＣＤ３４＋細胞に、ＥＦ１ａプロモーターによって誘導されたＢＣＬ２−２Ａ−ＧＦＰ多シストロンを含むレンチウイルスで形質導入した。形質導入後、ＣＤ３４＋細胞をＯＰ９−ＤＬ４単層上でプレート培養し、ＴＤ２８にＮＫ細胞及びＴ細胞のマーカーを検定した。ＧＦＰ−細胞（ＪＡＫ３−；低ＢＣＬ２）にもＧＦＰ＋細胞（ＪＡＫ３−；ＢＣＬ２＋）にもＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は見られなかった（図２Ｃ）。これらの知見は、ＢＣＬ２がＪＡＫ３欠損細胞のＤＮ段階で阻害物を放出したことを示唆している。興味深いことに、第２の発生停止がＤＰ段階で明らかになり、ＧＦＰ＋細胞ではＣＤ８＋ＣＤ４＋ＤＰ陽性細胞のさらなる分化は観察されなかった（図２Ｃ）。要約すると、上述した研究は、ヒトＳＣＩＤ表現型は患者由来ｉＰＳＣを用いてインビトロで再現できることを実証している。ＪＡＫ３欠損の結果、ＤＮ胸腺細胞で増殖障害が生じる。強制的なＢＣＬ２の発現によりＤＮ細胞の生存率が高まり、さらにＤＰ胸腺細胞へと分化する。ところが、ＤＰ胸腺細胞は、成熟してＳＰ  Ｔ細胞になることはできず、ＩＬ７／ＪＡＫ３シグナル伝達の不在がこの障害の原因となっている可能性がある。
【００６２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換による、ＳＣＩＤ  ｈｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３欠損の修正
ＪＡＫ３欠損ＳＣＩＤ患者の細胞で正常なＴ細胞発生が回復できるかどうかを決定するために、ｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３変異をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換により修正した。エキソン１４の上流及び下流のイントロン内の６つのガイドＲＮＡを、Ｃ１８３７Ｔ変異付近のｗｔＣａｓ９またはｎＣａｓ９を標的とするように設計し、遺伝子置換用に修正テンプレートを用いた（図３Ａ）。ｉＰＳＣに、Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９ニッカーゼ及びペアガイドＲＮＡを発現する２つのプラスミド、または野生型Ｃａｓ９及び単一ガイドＲＮＡを発現する１つのプラスミドを用いてヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後、細胞をＧ４１８含有培地で２週間培養した。個々のコロニーを選抜し、増殖させ、ＰＣＲで遺伝子型を決定した（図３Ｂの上段）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が媒介するＪＡＫ３遺伝子修正の効率を図３Ｃに示す。ＷＴ  Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＃１からの３クローン、ＷＴ  Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＃２からの３クローン、及びＣａｓ９ニッカーゼ＋ペアｇＲＮＡ＃１及び＃２からの６クローンをＳａｎｇｅｒ配列決定によりさらに検証した。配列決定された１２クローンのうち、２つのホモ接合修正済みクローン（Ｃａｓ９ニッカーゼ＋ペアｇＲＮＡ＃１及び＃２からの１クローン、ならびにＷＴ  Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＃１からの１クローン）及び１０のヘテロ接合修正済みクローンについて特定した（図３Ｄ）。ＪＡＫ３遺伝子発現の回復がＲＴ−ＰＣＲ（ＪＡＫ３  ｍＲＮＡ）（図３Ｂの左下パネル）及びウエスターンブロット（ＪＡＫ３タンパク質）（図３Ｂの右下）により示された。
【００６３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的ＪＡＫ３修正の特異性
オフターゲットなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ゲノム修飾の可能性が、このアプローチのヒト治療への応用に関する問題となっている。癌細胞株では、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによる比較的高レベルのオフターゲットな変異原性が記述されている。ヒトＳＣＩＤ  ｉＰＳＣにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的ＪＡＫ３修正の特異性を決定するために、遺伝子置換の前と後に全ゲノム配列決定を行った。修正済みの２つのヘテロ接合クローン及び１つのホモ接合クローンのゲノム配列を決定した。２つのヘテロ接合クローンはｇＲＮＡ＃２＋野生型Ｃａｓ９を用いて修正され、ホモ接合クローンはｇＲＮＡ＃１＋ｇＲＮＡ＃２＋ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）を用いて修正された。可能なオフターゲット部位を特定するために、２０塩基のＣＲＩＳＰＲガイド配列をヒト基準ゲノムにマッピングし、最高３つのミスマッチを許容した。次にこれらの部位を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的遺伝子置換後のｉＰＳＣ試料中のバリエーションについて分析した。修正済みの１つのホモ接合及び２つのヘテロ接合ｉＰＳＣ株のＷＧＳ分析によると、予測されたオフターゲット部位には変異は（ＳＮＶもｉｎｄｅｌも）導入されていないことが明らかになり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的遺伝子置換の高い特異性が示唆された。
【００６４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的ＪＡＫ３修正後のＴ細胞発生の回復
ＪＡＫ３遺伝子修正後にＴ細胞発生が回復するかどうかを決定するために、Ｔ細胞の分化系列決定及び成熟について検定した。Ｔ細胞分化は、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋Ｔ／ＮＫ決定（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）段階、ＣＤ７＋ＣＤ４＋ＣＤ８−未成熟のＳＰ段階、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ段階、そして最終的なＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲαβ成熟段階と、インビボで観察される各中間体を順次通過していく。成熟Ｔ細胞はポリクローナルであり、増殖し、マイトジェンに応答してサイトカインを分泌する。したがって、ＪＡＫ３修正済みｈｉＰＳＣを、ＯＰ９単層上で造血前駆細胞へと分化させ、ＣＤ３４＋細胞を抗ＣＤ３４磁気ビーズで陽性選択した。これらの細胞をＯＰ９−ＤＬ４単層上でプレート培養し、被接着細胞のリンパ球マーカーに関してＴＤ１４、２１、２８、及び３５に分析した（図４）。ＴＤ１４に、コントロール細胞と同様、１〜２Ｘ１０６個のＣＤ３４＋ＪＡＫ３修正済み細胞は４．７Ｘ１０６個のＣＤ７＋細胞へと分化した（リンパ系ゲートで計測した細胞の９１％）。さらにＴＤ２１、ＴＤ２８、及びＴＤ３５と分化した後、Ｔ細胞成熟マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲαβが潤沢に観察された（図４Ａ）。ＴＣＲ再編成がＪＡＫ３修正済みＴ細胞で再樹立されたかどうかを決定するために、フローサイトメトリーによりＴＣＲ  Ｖβタイピングを行った。これを図４Ｂに要約する。ＪＡＫ３修正済みＴ細胞は、発明者らが試験した（２５のうち１９の）すべてのＶβセグメントを発現した。したがって、広範なＴＣＲレパートリーが回復した。最後に、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞において、Ｔ細胞機能の代理となるＴＣＲシグナル伝達経路の完全性を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後の細胞表面活性化マーカーを測定して評価した。刺激後３日目、ＪＡＫ３修正済みＴ細胞ではＣＤ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の割合がコントロール細胞で観察された増加（０．０１％から３７．６％）と同様に、０．６８％から５９．７％に増加した（図４Ｃ）。これらのデータ及び上述の結果は、インビトロｉＰＳＣモデルシステムにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換によるＪＡＫ３  Ｃ１８３７Ｔ（ｐ．Ｒ６１３Ｘ）変異の修正によって、広範なＴＣＲレパートリーを有する、機能的な成熟Ｔ細胞集団を生産する能力のある正常なＴ細胞発生が回復することを明らかにするものである。
【００６５】
ヒトでは、ＳＣＩＤ患者の末梢血中のリンパ球の表現型は十分に記述されているが、リンパ系分化決定と胸腺細胞発生の重要なステップの研究は実施が困難である。未治療のＳＣＩＤ患者の骨髄や胸腺細胞の検体を入手することが難しいのは、そういった病態が稀であるのと、乳児は通常、生存のためすぐにＨＳＣ移植を要するような命にかかわる炎症を示すためである。本明細書で説明するヒトＳＣＩＤの研究ストラテジーは、インビトロで患者特異的ｉＰＳＣから多数の造血前駆細胞を生産することができ、免疫不全の原因の機構を正確に突き止めることができ、こういった諸制限をバイパスするものである。本明細書では、ヒトＪＡＫ３欠損ＳＣＩＤにおけるＴ細胞発生は、ＣＤ４−ＣＤ８−（ＤＮ２）段階かまたはその前に完全に阻害されることが明らかになった。興味深いことに、強制的なＢＣＬ２の発現によりＤＮ細胞の生存率が高まり、さらにＤＰ胸腺細胞へと分化する。ところが、ＤＰ胸腺細胞は、成熟してＳＰ  Ｔ細胞になることはできず、ＩＬ７／ＪＡＫ３シグナル伝達の不在がこの障害の原因となっている可能性がある。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換によるヒトＪＡＫ３変異の修正により、初期のＴ細胞前駆細胞の分化潜在力が回復することも明らかになった。修正済み前駆細胞は、ＮＫ細胞及び広範なレパートリーのＴＣＲを発現する成熟Ｔ細胞集団を生産する能力がある。修正済みの１つのホモ接合及び２つのヘテロ接合ｉＰＳＣ株の全ゲノム配列決定分析からは、予測されたオフターゲット部位には変異は（ＳＮＶもｉｎｄｅｌも）導入されないことが明らかになり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９特異的遺伝子置換の高い特異性が示唆された。
【００６６】
本明細書で説明する方法では、ＣＤ３４＋ＨＳＣは、ヒト骨髄ストローマ幹（ｈＭＳＣ）細胞との共培養によりｈｉＰＳＣから生成することができる（図５を参照されたい）。患者特異的ｉＰＳＣからこの方法で生産されたＨＳＣは、遺伝子修正／修飾の後、患者に移植して戻して、鎌状赤血球疾患（ＳＣＤ）、ＳＣＩＤ、または癌などの疾患を治療できる。本明細書で説明する方法では、Ｔ細胞を、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞とｈＭＳＣ−ＤＬ４の共培養による、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞の培養により、生成することができる（図６を参照されたい）。患者特異的ｉＰＳＣからこの方法で生産されたＨＳＣは、遺伝子修正／修飾の後、患者に移植して戻して疾患を治療できる。Ｔ細胞はγδＴ細胞を含むことができる。図７に示すように、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するγδＴ細胞は、遺伝子修飾されたｉＰＳＣから高効率に生産できる。腫瘍抗原に特異的なＴＣＲを発現するγδＴ細胞の生産により、癌の細胞治療が提供される。
【００６７】
実施例２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で強化された遺伝子置換による、鎌状赤血球貧血に関連する変異の修正
ベクターの作製
Ｎ末端とＣ末端両方の核局在配列（ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓ）を有するヒトコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９を、ｐｘ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４２２３０）からＮ末端にＨｉｓ６−ＳＵＭＯタグが付いた修飾済みｐＥＴ−２８ｂ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）ベクターにＰＣＲでクローン化した。短いリンカーペプチド、次いで純電荷＋３６の超荷電ＧＦＰ、及び２３アミノ酸のインフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２バリアントペプチドＩＮＦ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ）（配列番号５０）を含む遺伝子ブロック・カセットをＥ．  ｃｏｌｉ用にコドン最適化し、合成し（ＩＤＴ  ＤＮＡ）、ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓのＣ末端と融合するようにクローン化した。ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ））（配列番号５１）をコードする配列も合成し（ＩＤＴ  ＤＮＡ）、ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓのＮ末端と融合するようにクローン化した。
【００６８】
タンパク質の過剰発現及び精製
ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｓｃＣａｓ９プラスミドをＥ．  ｃｏｌｉ株Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ビレリカ）にＬＢ培地中で形質転換させた。細胞を、３７℃で、６００ｎｍで光学密度０．６に達するまで増殖させた。タンパク質過剰発現の誘導は、０．５ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、シェーカー内で一晩１８℃で培養することにより、得られた。採取した細胞をＮｉ結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール及び０．２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に再懸濁させ、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３高圧ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ社）で溶解させた。最終濃度０．４％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を澄んだライセートに加えて、核酸を沈降させた。次いで、遠心分離後の上清液のタンパク質を硫酸アンモニウムで沈降させてＰＥＩを除去し、Ｎｉ結合バッファーに再溶解させた。タンパク質はまずＨｉｓＴｒａｐニッケル親和性カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で精製した後、一晩４℃でＳＵＭＯプロテアーゼＵｌｐ１により消化させた。次に、切断されたＨｉｓ−ＳＵＭＯタグを第２のＨｉｓＴｒａｐカラムにより除去した。しかしｓｃＣａｓ９タンパク質を含有するフローはＮａＣｌの最終濃度が０．５Ｍになるまで希釈し、ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．２ｍＭ  ＴＣＥＰを含むバッファーを用いて勾配溶出して精製した。溶出したｓｃＣａｓ９タンパク質を、サイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でゲルろ過バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．２ｍＭ  ＴＣＥＰ）中さらに精製し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により１００ｋＤａカットオフで濃縮した。濃縮したタンパク質はＵＶ分光光度計で定量化し、液体窒素で急速冷凍した。
【００６９】
ガイドＲＮＡの調製
ｓｇＲＮＡ転写のテンプレートＤＮＡを、Ｔ７プロモーター及びポリＡ配列を付加したプライマーセットを用いてＰＣＲで生成した。ｓｇＲＮＡは、Ｔ７  Ｒｉｂｏｍａｘ発現システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）をメーカーの使用説明にしたがって使用して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで転写された。転写されたＲＮＡをフェノールで精製し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿の後、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州オースティン）でカラム精製した。精製したｇＲＮＡをＵＶ分光光度計で定量化し、−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００７０】
一本鎖ＤＮＡドナー
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）ドナーを、以下に示すようにＩＤＴ  ＤＮＡにより合成した。
【表Ａ】
2018518181.tif 000003
【００７１】
細胞培養
ヒト鎌状赤血球貧血患者ｉＰＳＣを、皮膚線維芽細胞から誘導し、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するｍＴｅＳＲ（商標）１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ、バンクーバー）中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）上で維持した。
【００７２】
ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体の調製及びヌクレオフェクション
最終濃度１倍となるように１／１０倍体積の１０ｘＰＢＳをｓｇＲＮＡに加えた。ｓｇＲＮＡをＰＣＲサーモ・サイクラーで、温度を９５℃から４℃に徐々に下げながら、アニーリングした。アニーリング後、ｓｃＣａｓ９タンパク質をｓｇＲＮＡにタンパク質：ＲＮＡのモル比１：１．５で加え、全ての一過的な沈殿物がなくなるまでチューブを軽くはじいて素早く混合した。混合物を室温で１０分間、暗所でインキュベートした。次に、１モル比量のｓｓＯＤＮをこの混合物に加え、さらに１０分間暗所でインキュベートして、ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体を形成した。
【００７３】
ヌクレオフェクションの１日前、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で解離させて、１ｘ１０６個／ウェルの細胞を６ウェルプレートに１０μＭ  Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ−２７６３２）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と一緒に播種した。各実験で、単一細胞として５ｘ１０５個のｈｓｉＰＳＣを、栄養補充された１００μｌのＨｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（Ｌｏｎｚａ社）に再懸濁し、次いでｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体をこの細胞液と混合した。細胞は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩデバイス（Ｌｏｎｚａ社、スイス国バーゼル）を使用してプログラムＡ−０２３でヌクレオフェクションした。ＨＢＢゲノム修正の効率について、ヌクレオフェクションの２日後にｄｄＰＣＲで分析した。
【００７４】
ｄｄＰＣＲによる鎌状赤血球修正の検出
ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体をヌクレオフェクションした細胞を、ｐｒｅｐＧＥＭ組織ＤＮＡ抽出試薬（ＺｙＧＥＭ社、ニュージーランド国ハミルトン）をメーカーの使用説明にしたがって使用し、水で１：３に希釈して、溶解させた。２２μｌのｄｄＰＣＲ反応物中、１１μｌの２ｘｄｄＰＣＲ  ｍｉｘ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を各１ｕｌの５μＭ  アレル特異的ＦＡＭまたはＶＩＣ  Ｔａｑｍａｎプローブ（以下に示す）、各０．２μｌの１００μＭのフォワード及びリバースプライマー、ならびに８．６μｌの希釈ゲノムＤＮＡと混合した。ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）をメーカーの使用説明にしたがって使用して、液滴を生成した。次にこの反応混合物を９６ウェルのＰＣＲプレートに移し、標準サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）でＰＣＲを実施した。ＰＣＲのプログラムは、ステップ１：９５℃で１０分；ステップ２：９５℃で３０秒；ステップ３：５５℃で１分；ステップ２〜３を３９回繰り返す；ステップ４：９８℃で１０分；ステップ５：８℃ホールド、であった。ＰＣＲが終了すると、プレートをＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）で分析した。
【表Ｂ】
2018518181.tif 000004
【００７５】
上述したように、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、修飾済み組換えＣａｓ９タンパク質（ｍｒＣａｓ９）と、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）とを含む複合体を、ヒト幹細胞またはその誘導体に導入して、疾患の原因となっている一塩基変異を修正することができる。表１及び図８は、鎌状赤血球修正複合体（ｇＲＮＡ−ｍｒＣａｓ９−ｓｓＯＤＮ）を鎌状赤血球患者の皮膚細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に導入した結果を説明している。ｉＰＳＣは、実施例１で説明したようにして誘導した。修正複合体を鎌状赤血球ｉＰＳＣにヌクレオポレーションにより導入し、２日後にゲノムＤＮＡをデジタルＰＣＲで上記プライマーを用いて分析し、配列決定した。細胞の６５％以上が少なくとも１つの修正済み遺伝子を含んでいた。疾患の治療には１つの修正済み遺伝子で十分である。結果は次のように確認された。修正複合体導入の２日後、細胞を培養皿でプレート培養し、４３の個別のｉＰＳＣコロニーを単離した。これらのコロニーからゲノムＤＮＡを単離し、ベータグロビン遺伝子の配列を決定した。６５％のコロニーが少なくとも１つの修正済みベータグロビン遺伝子を含んでいた（ＳがＡに修正されていた）。
【表１】
2018518181.tif 000005
【００７６】
同様の試験を患者の初代骨髄ＣＤ３４＋細胞でも実施した。プロトコルは次のとおりであった。ＩＲＢ承認プロトコルにより鎌状赤血球貧血患者から骨髄を入手した。ＣＤ３４＋細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ３４＋ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、独国ベルギッシュグラートバッハ）で精製した。上記のように調製した複合体を細胞にヌクレオポレーションした。ヌクレオポレーション後、ｍｅｔｈｙｃｕｌｔ及びＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーでプレート培養した細胞を２週間後に選抜して、修正済みアレルについて分析した。表２及び図９は鎌状赤血球修正複合体（ｇＲＮＡ−ｍｒＣａｓ９−ｓｓＯＤＮ）を患者初代骨髄ＣＤ３４＋細胞に導入した結果を示す。インビトロの分化の１２日後、ＤＮＡをデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析し配列決定した。ほぼ等量のベータＡｍＲＮＡ及びベータＳｍＲＮＡが観察された（図９を参照されたい）。ヌクレオポレーションの直後、一部の細胞を赤血球分化培地で最高１８日まで培養し、除核赤血球をＨｂＡについて分析した。修正済み鎌状赤血球貧血患者ＣＤ３４＋細胞からインビトロで分化させた赤血球の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルが示すＨｂＡ（正常ヘモグロビン）とＨｂＳ（鎌状赤血球変異を有するヘモグロビン）の比は約１：３であり、これは鎌状赤血球化を阻害し疾患を治療するのに十分である（図１０を参照されたい）。
【００７７】
【表２】
2018518181.tif 000006
【００７８】
配列
配列番号１
TAACGGCAGACTTCTCCAC
配列番号２
GTAACGGCAGACTTCTCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
配列番号３
Ｃａｓ９超荷電ＧＦＰコンストラクト
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配列番号４
ＴＡＴ−Ｃａｓ９超荷電ＧＦＰコンストラクト
ygrkkrrqrrrppqaggsmdykdhdgdykdhdidykddddkmapkkkrkvgihgvpaadkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggdkrpaatkkagqakkkkgsgsngssgsaskgerlfrgkvpilvelkgdvnghkfsvrgkgkgdatrgkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypkhmkrhdffksampkgyvqertisfkkdgkyktraevkfegrtlvnriklkgrdfkekgnilghklrynfnshkvyitadkrkngikakfkirhnvkdgsvqladhyqqntpigrgpvllprnhylstrsklskdpkekrdhmvllefvtaagikhgrderykggsggsvdglfeaiegfiengwegmidgwyg
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2018518181.tif 000008
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2018518181.tif 000010
【図２Ｂ】
2018518181.tif 000011
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2018518181.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2018518181.tif 000015
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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