(57)【要約】本発明の方法は、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療のための、例えば、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）のためのＡＢＣＤ１をコードする核酸配列の送達を包含する。
2018537124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養下で増殖する形質移入産生細胞中のアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクタータイターを増加させる方法であって、
ｉ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列を前記細胞とインキュベートするステップ、および
ｉｉ）ＡＢＣＤ１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター）を前記細胞中に形質移入するステップ
を含み、前記ＡＡＶ９ベクターから発現されるＡＢＣＤ１ｍＲＮＡの量を減少させ、それにより細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター収量を参照標準と比較して約１倍〜約５０倍だけ増加させる方法。
【請求項２】
ＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な前記核酸配列が、干渉ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、またはそれらの組合せを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記参照標準が、ＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列とインキュベートしなかった産生細胞からの細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター収量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療が必要とされる対象におけるＸ連鎖性副腎白質ジストロフィーを治療する方法であって、請求項１に記載の産生細胞から得られた精製ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクターを含む組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項７】
精製ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクターを含む前記組成物を、髄腔内投与により前記対象を投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療が必要とされる対象におけるＸ連鎖性副腎白質ジストロフィーを治療する方法であって、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記対象に投与することを含み、前記ベクターを髄腔内投与により前記対象に投与する方法。
【請求項９】
前記髄腔内投与が、浸透圧ポンプにより媒介される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ベクターの用量が、約１×１０１３ＧＣ〜約１０×１０１３ＧＣである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）を有する対象にＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）を提供する方法であって、ＡＢＣＤ１をコードするベクターを前記対象に投与することを含み、前記ベクターを髄腔内投与により前記対象に投与し、中枢神経系中の前記ベクターからのＡＢＣＤ１発現は、末梢器官中の前記ベクターからのＡＢＣＤ１発現よりも少ない方法。
【請求項１３】
前記中枢神経系中の前記ベクターからのＡＢＣＤ１発現が、Ｘ−ＡＬＤを有さない未治療対象の中枢神経系中のＡＢＣＤ１の発現よりも約３倍多い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
末梢器官中の前記ベクターからの前記ＡＢＣＤ１発現が、Ｘ−ＡＬＤを有さない未治療対象の末梢器官中のＡＢＣＤ１の発現よりも約９０％少ない、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２５１，２０８号明細書および２０１６年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３００，６９１号明細書の利益を主張する。上記出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金番号Ｒ２１ＮＳ０８１３７４−０１およびＲ０１ＮＳ０７２４４６−０１により支援を受けた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
進行性遺伝障害のＸ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）は、分解のためのペルオキシソーム中へのＣｏＡ活性化超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の輸送を担うペルオキシソームＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣＤ１）をコードするＡＢＣＤ１遺伝子中の突然変異により引き起こされ、脳および副腎皮質の血漿および組織中の高レベルの飽和超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積をもたらす。症状は、小児期または成人期において始まり得る。成人ＡＬＤ患者は、典型的には、衰弱性神経障害の副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）を２０歳代で発症する（Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．２０１２；７：５１）。Ａｂｃｄ１−／−マウスは、ＡＭＮと類似する表現型を発症し、冒された後根神経節ニューロン（ＤＲＧ）に起因して脊髄の軸索変性および末梢ニューロパチーが顕在化する（Ｐｕｊｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１：４９９−５０５）。ヒトＡＢＣＤ１遺伝子の送達のための組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ９）ベクターを使用するインビトロおよびインビボでの中枢神経系細胞の伝達が、既に報告された。残念ながら、幼若マウスにおける静脈内送達は、トランス遺伝子の過剰発現に起因して心毒性を伴う。Ｘ−ＡＬＤまたはＡＭＮを罹患する患者における非毒性レベルのＡＢＣＤ１を提供する送達系が非常に望まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の他の特徴部および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかである。したがって、本発明の他の態様は以下の開示において記載され、本発明の範囲内である。
【０００５】
一態様において、本発明は、培養下で増殖する形質移入産生細胞中のアデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクタータイターを増加させる方法であって、ｉ）ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列を細胞とインキュベートするステップ、およびｉｉ）ＡＢＣＤ１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター）を細胞中に形質移入するステップを含み、ＡＡＶ９ベクターから発現されるＡＢＣＤ１ｍＲＮＡの量を減少させ、それにより細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター収量を参照標準と比較して約１倍〜約５０倍だけ増加させる方法を提供する。
【０００６】
一実施形態において、ＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列は、干渉ＲＮＡである。
【０００７】
別の実施形態において、干渉ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。
【０００８】
さらに別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７またはそれらの組合せを含む。
【０００９】
さらに別の実施形態において、参照標準は、ＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列とインキュベートしなかった産生細胞からの細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター収量を含む。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療が必要とされる対象におけるＸ連鎖性副腎白質ジストロフィーを治療する方法であって、参照標準と比較して増加したＡＡＶ９ベクタータイターを有する産生細胞から得られた精製ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
一実施形態において、精製ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクターを含む組成物を、髄腔内投与により対象に投与する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療が必要とされる対象におけるＸ連鎖性副腎白質ジストロフィーを治療する方法であって、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターを髄腔内投与により対象に投与する方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、髄腔内投与は、浸透圧ポンプにより媒介される。
【００１４】
別の実施形態において、ベクターの用量は、０．５×１０１１ＧＣである。
【００１５】
さらに別の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）を有する対象にＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）を提供する方法であって、ＡＢＣＤ１をコードするベクターを対象に投与することを含み、前記ベクターを髄腔内投与により対象に投与し、中枢神経系中の前記ベクターからのＡＢＣＤ１発現は、末梢器官中の前記ベクターからのＡＢＣＤ１発現よりも少ない方法を提供する。
【００１７】
一実施形態において、髄腔内投与は、浸透圧ポンプにより媒介される。
【００１８】
別の実施形態において、ベクターの用量は、約１×ｌ０１３ＧＣ〜約１０×ｌ０１３ＧＣである。
【００１９】
さらに別の実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００２０】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され；当分野において公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は説明にすぎず、限定的なものではない。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、参照により全体として組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が定義を含め優先される。
【００２１】
以下の詳細な説明は例として挙げられるが、本発明を記載されるある実施形態に限定するものではなく、参照により本明細書に組み込まれる添付の図面とともに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡとインキュベートした形質移入２９３Ｔ細胞からの改善されたＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクタータイターを示す。
【図２】ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡプールとインキュベートしたＡＡＶ−ＡＢＣＤ１形質移入細胞中の低減したＡＢＣＤ１タンパク質を示す。
【図３】細胞溶解物および馴化培地中の両方におけるＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡとインキュベートした形質移入２９３Ｔ細胞からの改善されたＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクタータイターを示す。
【図４】２分間にわたる髄腔内ボーラス送達後のｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の分布を示す。
【図５】２４時間にわたるｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の髄腔内ポンプ注入後のｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の分布を示す。
【図６】ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の低用量（０．５×ｌ０１１ｇｃ）のボーラスおよびポンプ送達を示す。
【図７】ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１のポンプ注入と比較した、ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１のボーラス注射２週間後の末梢器官（ＣＮＳ外）にわたるＡＢＣＤ１の多い発現を示す。
【図８】ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１のベクターマップを示す。
【図９】様々な器官にわたる内在性ＡＢＣＤ１の分布を示す。
【図１０】様々な器官にわたる内在性ＡＢＣＤ１の分布を示す。
【図１１】Ａｂｃｄ１−／−マウスにおけるＩＴポンプ後のＡＢＣＤ１の発現を示す。
【図１２】Ａｂｃｄ１−／−マウスにおけるＩＴポンプ後のＡＢＣＤ１の発現を示す。
【図１３】ＩＴポンプおよびＰＴボーラス注射１５日後の脊髄Ｃ２６：０レベルを示す。
【図１４】ＡＡＶ９−ｈＡＢＣＤ１のＩＴポンプ送達後の様々な細胞タイプにおけるＡＢＣＤ１発現を示す。ＳＣ：脊髄；ＤＲＧ：後根神経節；ＣＤ３１：内皮マーカー；ＧＦＡＰ：アストロサイトマーカー；ＩＢＡ１：ミクログリアマーカー；ＴＯＰＲＯ３：核対比染色；ＤＲＧは、ニューロン中で、およびより顕著にはニューロン周辺（サテライト細胞）で発現の斑紋パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。矛盾する場合、本出願が定義を含め優先される。
【００２４】
「対象」は、脊椎動物、例として、哺乳綱の任意のメンバー、例として、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園用、競技用または愛玩動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシおよび高等霊長類である。
【００２５】
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、Ｘ−ＡＬＤ、例えば、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、および／またはそれに伴う症状を軽減し、または改善することを指す。Ｘ−ＡＬＤまたはＡＭＮの治療は、それに伴う障害、病態または症状が完全に排除されることを要求しないことが認識されるが、除外されるものではない。
【００２６】
特に記載のない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される用語「約」は、当分野における通常の許容範囲内、例えば、平均から２標準偏差以内として理解される。「約」は、記述値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解される。特に文脈から明らかでない限り、本明細書において提供される全ての数値範囲は、約という用語により修飾される。
【００２７】
本明細書において使用される「発現の減少」は、本明細書に記載の方法に従ってＡＢＣＤ１をコードするベクターが投与された対象の中枢神経系中のＡＢＣＤ１遺伝子発現またはタンパク質発現の量よりも少なくとも約０．０５倍少ない（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、５、１０、２５、５０、１００、１０００、１０，０００倍以上少ない）、対象の末梢器官中のＡＢＣＤ１遺伝子発現またはタンパク質発現の量を指す。対象の末梢器官中のＡＢＣＤ１遺伝子発現またはタンパク質発現に関する「減少した」は、本明細書に記載の方法に従ってＡＢＣＤ１をコードするベクターが投与された対象の中枢神経系中のＡＢＣＤ１遺伝子発現またはタンパク質発現の量よりも少なくとも約５％少ない（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％）ことも意味する。量は、遺伝子発現またはタンパク質発現の量を測定するための当分野において公知の標準的方法に従って計測することができる。
【００２８】
本明細書において使用される「ベクタータイターの増加」は、本明細書に記載の方法に従ってＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列とインキュベートしなかった産生細胞からのタイターの量よりも少なくとも約０．０５倍多い（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、５、１０、２５、５０、１００、１０００、１０，０００倍以上）、ＡＢＣＤ１をコードするベクターが形質移入された産生細胞からのタイターの量を指す。ＡＢＣＤ１をコードするベクターが形質移入された産生細胞からのタイターの量（ＡＡＶベクターの濃度、１ミリリットル当たりのゲノムコピー数で記載されることが多い）に関する「増加した」は、本明細書に記載の方法に従ってＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列とインキュベートしなかった産生細胞からのタイターの量よりも少なくとも約５％多い（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％）ことも意味する。量は、ＡＡＶゲノム、トランス遺伝子発現、またはタンパク質発現の量を測定するための当分野において公知の標準的方法に従って計測することができる。
【００２９】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の値の全てについての簡易表現と理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０（特に文脈が明らかに示さない限り、さらにそれらの分数）からなる群からの任意の数、数の組合せ、または下位範囲を含むと理解される。
【００３０】
本明細書において使用される用語「参照レベル」は、別の試験試料を比較する既知の試料におけるタイターのレベルを指す。参照レベルは、例えば、ＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列と、または対照アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡとインキュベートしなかった産生細胞から得ることができる。参照レベルは、例えば、Ｘ−ＡＬＤを有さない未治療対象から得ることができる。「未治療」は、ＡＢＣＤ１トランス遺伝子を発現するベクターの投与からの治療法の欠落を指す。
【００３１】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」および「有する」などは、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）、または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に米国法において帰属する意味を有し、この用語は非限定的であり、引用されるものの基礎または新規特徴が引用されるものよりも多くの存在により変化しない限り引用されるものよりも多くの存在を許容するが、従来技術の実施形態を除外する。
【００３２】
他の定義は、本開示全体にわたり文脈中に現れる。
【００３３】
組成物および方法
本発明の組成物および方法は、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）のための治療を提供する。Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーは、主として男性において生じ、主に神経系および副腎を冒すＡＢＣＤ１遺伝子中の突然変異により引き起こされる遺伝障害である。脳および脊髄のミエリンが劣化し（脱髄）、それが神経の機能的能力を低減させる。さらに、副腎の外層（副腎皮質）への損傷は、あるホルモンの不足を引き起こす（副腎皮質不全）。いくつかの区別されるタイプのＸ連鎖性副腎白質ジストロフィー、例として、小児大脳型、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）タイプ、およびアジソン病と呼ばれる型が存在する。本明細書において使用されるＸ−ＡＬＤは、ツェルウェーガースペクトル障害のペルオキシソーム生合成障害に属し、ＡＢＣＤ１中の突然変異に無関連の「新生児副腎白質ジストロフィー」を含まない。Ｘ−ＡＬＤまたはＡＭＮを有する対象を診断または同定する方法は当分野において公知であり、それとしては血漿超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）レベルの計測および／または遺伝子試験を挙げることができ；例えば、Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．２０１２；７：５１；Ａｕｂｏｕｒｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｕｓｓａｉｎ，Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ．２００３；５９  Ｓｕｐｐｌ  １：１０４−５；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００８  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７：Ｕｎｉｔ  １７．６；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＳＪ，Ｍｏｓｅｒ  ＡＢ，Ｒａｙｍｏｎｄ  ＧＶ．Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．１９９９  Ｍａｒ  ２６［Ｕｐｄａｔｅｄ  ２０１５  Ａｐｒ  ９］．Ｉｎ：Ｐａｇｏｎ  ＲＡ，Ａｄａｍ  ＭＰ，Ａｒｄｉｎｇｅｒ  ＨＨ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（登録商標）［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；１９９３−２０１６参照。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１３１５／）から利用可能である。
【００３４】
ＡＢＣＤ１遺伝子中の突然変異は、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーを引き起こす。ＡＢＣＤ１遺伝子は、ペルオキシソーム中への超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の輸送に関与する副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）をコードする。ＡＢＣＤ１遺伝子突然変異は、ＡＬＤＰの欠損をもたらす。このタンパク質が欠落している場合、ＶＬＣＦＡの輸送および後続の分解が妨げられ、体内の異常に高レベルのそれらの脂肪を引き起こす。ＶＬＣＦＡの蓄積は、副腎皮質およびミエリンに毒性であり得る。
【００３５】
遺伝子療法による遺伝子欠陥の補正は、実現可能な治療法を表す。ＣＮＳへのＡＢＣＤ１遺伝子の標的化特異的送達は、末梢器官における毒性を回避するために不可欠である。これは、例えば、髄腔内投与を介してＡＢＣＤ１をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することにより達成することができる。
【００３６】
ＡＢＣＤ１ｃＤＮＡおよびその発現タンパク質をコードする配列は周知であり、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００９０２２．２およびＮＰ＿００００２４．２において見出すことができる。
【００３７】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスであり、組換えウイルスベクター自体またはその誘導体を指すために使用することができる。この用語は、特に要求される場合を除き全ての亜型、血清型および偽型、ならびに天然存在および組換え形態を包含する。本明細書において使用される用語「血清型」は、その血清学的検査により同定され、それに基づき他のＡＡＶから区別されるＡＡＶを指し、例えば、ＡＡＶの１１個の血清型、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１１が存在し、この用語は、同一特性を有する偽型を包含する。これらの血清型の多くは、他のＡＡＶ血清型からのユニークな生物学的特性（例えば、細胞表面受容体結合、細胞内トラフィッキング）を有する。したがって、例えば、ＡＡＶ５血清型としては、ＡＡＶ５の生物学的特性を有するＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ５カプシドと、ＡＡＶ５に由来もせず、それから得られもせず、またはゲノムがキメラであるＡＡＶゲノムとを含む偽型ＡＡＶが挙げられる。
【００３８】
「ＡＡＶベクター」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞に送達すべきトランス遺伝子）を含む場合、それは「ｒＡＡＶ（組換えＡＡＶ）」と称することができる。ＡＡＶ「カプシドタンパク質」としては、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質、ならびにＡＡＶゲノムを構造的およびまたは機能的にパッケージングし得、野生型ＡＡＶにより用いられる受容体と異なり得る少なくとも１つの特異的細胞受容体に結合するＡＡＶカプシドタンパク質の改変形態が挙げられる。改変ＡＡＶカプシドタンパク質としては、キメラＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶの２つ以上の血清型からのアミノ酸配列を有するもの、例えば、ＡＡＶ２からのカプシドタンパク質の一部に融合または結合しているＡＡＶ５からのカプシドタンパク質の一部から形成されるカプシドタンパク質、およびＡＡＶカプシドタンパク質に融合または結合しているタグまたは他の検出可能な非ＡＡＶカプシドペプチドまたはタンパク質を有するＡＡＶカプシドタンパク質が挙げられ、例えば、トランスフェリン受容体に結合する抗体分子の一部をＡＡＶ−２カプシドタンパク質に組換え融合させることができる。
【００３９】
ＡＡＶを産生し得る細胞は、当分野において公知であり、それとしては、限定されるものではないが、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【００４０】
ある実施形態において、高いタイターのＡＡＶを産生する方法を利用してＡＢＣＤ１の投与を最大化することができる。培養下で増殖する形質移入産生細胞を、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列とインキュベートし、ｉｉ）ＡＢＣＤ１をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター）を細胞中に形質移入することができる。ＡＡＶベクターから発現されるＡＢＣＤ１ｍＲＮＡの量を減少させ、それにより細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ−ＡＢＣＤ１ベクター収量を参照標準と比較して約１倍〜約５０倍だけ増加させる。ある実施形態において、細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ−ＡＢＣＤ１ベクター収量を、約４倍だけ増加させる。ベクタータイターは、当分野において周知の方法に従って測定することができる。典型的には、これは、ドットブロットまたは定量的ＰＣＲを使用して実施してＡＡＶゲノムを計測する。一般に、ＡＡＶベクター収量は、細胞溶解物から、および培地からの約１×１０１０ゲノムコピー／ｍｌ（ｇｃ／ｍｌ）〜約１×ｌ０１６ｇｃ／ｍｌであり得る。
【００４１】
具体的な実施形態において、参照標準は、ＡＢＣＤ１をコードするｍＲＮＡに相補的な核酸配列とインキュベートしなかった産生細胞からの細胞溶解物および／または培地中のＡＡＶ−ＡＢＣＤ１ベクター収量を含む。
【００４２】
これは、例えば、ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することにより達成することができる。本発明の方法の実施において使用され、ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに相補的な他の核酸配列は、ＡＢＣＤ１の転写後プロセシングを阻害するもの、例えば、干渉ＲＮＡ、例として、限定されるものではないが、ｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、またはアンタゴｍｉｒであり得る。
【００４３】
ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡをコードする配列は周知であり、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００３３．３において見出すことができる。
【００４４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合し、転写、翻訳、またはスプライシングのレベルにおいて発現を停止させることによりＤＮＡまたはＲＮＡ標的の発現を遮断するように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でＡＢＣＤ１ｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計される相補的核酸配列である。したがって、標的に十分に相補的な、すなわち、十分にハイブリダイズし、所望の効果を付与するために十分な特異性を有するオリゴヌクレオチドが選択される。
【００４５】
本発明に関して、ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソンクリック型、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。本明細書において使用される相補的は、２つのヌクレオチド間で正確に対合する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置におけるヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一位置におけるヌクレオチドと水素結合し得、この場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置において互いに相補的であるとみなされる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分子中の十分数の対応位置が互いと水素結合し得るヌクレオチドにより占有される場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定的および特異的結合がオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ標的間で生じるような十分な相補性または正確な対合の程度を示すために使用される用語である。
【００４６】
当分野において、相補的核酸配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的核酸のものに１００％相補的である必要はないことが理解される。本発明の相補的核酸配列は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのその配列の結合がその標的ＤＮＡまたはＲＮＡの通常の機能を干渉して活性損失を引き起こし、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的治療の場合には生理学的条件下で、およびインビトロアッセイの場合にはそのアッセイが好適なストリンジェンシー条件下で実施される条件下で、非標的配列への配列の非特異的結合を回避するために十分な相補性の程度が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは、約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの不存在下で得ることができる一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは、少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは、少なくとも約３７℃、最も好ましくは、少なくとも約４２℃の温度が挙げられる。変動する追加のパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度およびキャリアＤＮＡの包含または排除は、当業者に周知である。種々のレベルのストリンジェンシーは、それらの種々の条件を必要に応じて組み合わせることにより達成される。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および１％のＳＤＳ中で３０℃において行う。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中で３７℃において行う。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中で４２℃において行う。これらの条件に対する有用な変動は、当業者に容易に明らかとなる。
【００４７】
ほとんどの用途について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもストリンジェンシーが変動する。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度により、および温度により定義することができる。上記のとおり、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることにより、または温度を増加させることにより増加させることができる。例えば、洗浄ステップについてのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、および最も好ましくは、約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄ステップについてのストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約２５℃の、より好ましくは、少なくとも約４２℃の、いっそうより好ましくは、少なくとも約６８℃の温度が挙げられる。好ましい実施形態において、洗浄ステップは、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中で２５℃において行う。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中で４２℃において行う。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中で６８℃において行う。これらの条件に対する追加の変動は、当業者に容易に明らかとなる。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００４８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも８０％の配列相補性を含むことが好ましく、さらにそれらは、９０％の配列相補性を含むことが好ましく、それらが標的化される標的核酸配列内の標的領域に対して９５％の配列相補性を含むことがいっそうより好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２０個の核酸塩基の１８個が相補的であり、したがって、標的領域に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を表す。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物の相補性パーセントは、ベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用して定型的に測定することができる。ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡにハイブリダイズする本発明のアンチセンスおよび他の化合物は実験を介して同定され、それらの化合物の代表的な配列は、本発明の好ましい実施形態として本明細書において以下に同定される。
【００４９】
別の実施形態において、ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに相補的な核酸配列は、干渉ＲＮＡ、例として、限定されるものではないが、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。干渉ＲＮＡとしては、限定されるものではないが、小分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）および小分子ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）が挙げられる。干渉ＲＮＡを構築する方法は、当分野において周知である。例えば、干渉ＲＮＡは、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である２つの別個のオリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ、そのアンチセンスおよびセンス鎖は自己相補的であり（すなわち、それぞれの鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；例えば、アンチセンス鎖およびセンス鎖がデュプレックスまたは二本鎖構造を形成する場合）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部（すなわち、不所望な遺伝子）中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは、干渉ＲＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースリンカーにより結合される単一オリゴヌクレオチドからアセンブルされる。干渉ＲＮＡは、デュプレックス、非対称デュプレックス、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有し、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであり得、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。干渉は、２つ以上のループ構造と、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドをインビボまたはインビトロのいずれかでプロセシングしてＲＮＡ干渉を媒介し得る活性ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる。
【００５０】
本発明のある実施形態において、干渉ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域およびループ領域を有する自己相補的ＲＮＡ分子をコードする。このようなＲＮＡ分子は、発現時、所望の「ヘアピン」構造を形成し、本明細書において「ｓｈＲＮＡ」と称される。ループ領域は、一般に、約２〜約１０ヌクレオチド長である。好ましい実施形態において、ループ領域は、約６〜約９ヌクレオチド長である。本発明の１つのそのような実施形態において、センス領域およびアンチセンス領域は、約１５〜約２０ヌクレオチド長である。転写後プロセシング後、小分子ヘアピンＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーである酵素Ｄｉｃｅｒにより媒介される開裂イベントによりｓｉＲＮＡに変換される。次いで、ｓｉＲＮＡは、それが相同性を共有する遺伝子の発現を阻害し得る。詳細については、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３，（２００２）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，５００−５０５，（２００２）；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４９７−５００，（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，５０５−５０８，（２００２）；Ｓｕｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ，９９（６），５５１５−５５２０，（２００２）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，（２００２）参照。
【００５１】
ｓｉＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ開裂反応は、高度に配列特異的である。一般に、標的遺伝子（すなわち、ＡＢＣＤ１）の一部と同一のヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡが、阻害に好ましい。しかしながら、本発明を実施するためにｓｉＲＮＡおよび標的遺伝子間の１００％の配列同一性は要求されない。したがって、本発明は、遺伝子変異、株多型、または進化多様性に起因して予測され得る配列変動を許容し得る利点を有する。例えば、標的配列に対して挿入、欠失、および単一点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが見出されている。あるいは、ヌクレオチドアナログ置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列が阻害に有効であり得る。
【００５２】
さらに別の実施形態において、ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに相補的な核酸配列は、アンタゴｍｉｒである。アンタゴｍｉｒは、マイクロＲＮＡを標的化する一本鎖、二本鎖、部分二本鎖およびヘアピン構造化学修飾オリゴヌクレオチドである。好ましくは、本発明において特記されるアンタゴｍｉｒとしては、約１０〜２５ヌクレオチド、好ましくは、約１５〜２０ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするために十分に相補的なヌクレオチド配列が挙げられる。
【００５３】
ある実施形態において、アンタゴｍｉｒは、ＲＮアーゼ保護および薬理学的特性についての種々の改変、例えば、向上した組織および細胞取り込みを保有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、糖の完全２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格および３’末端におけるコレステロール部分を有する点で通常のＲＮＡと異なり得る。ホスホロチオエート改変はＲＮアーゼ活性に対する保護を提供し、その新油性は向上した組織取り込みに寄与する。好ましい実施形態において、アンタゴｍｉｒは、６つのホスホロチオエート骨格改変を含み；２つのホスホロチオエートが５’末端に局在し、４つが３’末端に局在する。本発明のアンタゴｍｉｒは、その長さまたはそうでなければアンタゴｍｉｒを構成するヌクレオチドの数に関して改変することもできる。
【００５４】
本発明を実施するために使用される核酸配列は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドに関係なく、種々の資源から単離し、遺伝子操作し、増幅させ、および／または組換え発現させ／組換え生成することができる。組換え核酸配列は、個々に単離し、またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系、例として、例えば、インビトロ、細菌、真菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を使用することができる。
【００５５】
本発明の核酸配列は、送達ベクター中に挿入し、そのベクター（例えば、ＡＡＶベクター）内の転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ベクター構築物の生成は、当分野において周知の任意の好適な遺伝子操作技術、例として、限定されるものではないが、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（１９８９））、Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．（１９９７））および“ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））に記載のＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡシーケンシングの標準的技術を使用して達成することができる。当業者に明らかなとおり、種々の好適なベクターが細胞中への本発明の核酸の移行に利用可能である。核酸を送達するための適切なベクターの選択および細胞中への選択された発現ベクターの挿入のための条件の最適化は、過度の実験を必要とせずに当業者の技能の範囲内である。ウイルスベクターは、パッケージング細胞中の組換えウイルスの産生のための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、ウイルス骨格、例として、限定されるものではないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスまたはアルファウイルスをベースとして構築することができる。本発明の核酸を発現し得る組換えベクターは、本明細書に記載のとおり送達することができ、標的細胞中で留まる（例えば、安定形質転換体）。
【００５６】
本発明を実施するために使用される核酸配列は、例えば、Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載のとおり周知の化学合成技術によりインビトロ合成することができる。
【００５７】
本発明の核酸配列は、例えば、改変、例えば、ヌクレオチド改変の取り込みによる核酸分解に対して安定化させることができる。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’または３’末端における少なくとも第１、第２、または第３のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートを含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含み得る。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み得、一部の実施形態において、ヌクレオチドの全ては、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００５８】
本発明を実施するために使用される核酸の操作の技術、例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、クレノウポリメラーゼを使用するランダムプライマー標識、ニック翻訳、増幅）、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなどは、科学および特許文献に十分に記載されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＰＲＯＢＥＳ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）参照。
【００５９】
静脈内（ＩＶ）または脳室内（ＩＣＶ）投与により提供されるＡＢＣＤ１ベクター投与は、近年、心毒性を引き起こすことが決定されている。髄腔内投与は、脊柱管のくも膜下腔中への所望の薬剤の注射を含み、それによりその薬剤を脳脊髄液（ＣＳＦ）中に提供する投与の経路である。髄腔内投与を使用すると、中枢神経系内のベクターからのＡＢＣＤ１発現は、末梢器官、例えば、心臓内のベクターからのＡＢＣＤ１発現よりも少ない。末梢器官中の過剰なＡＢＣＤ１発現は毒性をもたらし得、したがって、ＡＢＣＤ１ベクターの髄腔内投与は、Ｘ−ＡＬＤのため、例えば、ＡＭＮのための治療の改善された方法を含む。
【００６０】
一部の実施形態において、髄腔内投与は、ポンプを介する。ポンプは、外科的に埋め込まれた浸透圧ポンプであり得る。ある実施形態において、浸透圧ポンプを脊柱管のくも膜下腔中に埋め込んで髄腔内投与を容易にする。
【００６１】
ある実施形態において、ヒト対象は、約１×１０１３ＧＣ〜約１０×１０１３ＧＣの量のＡＢＣＤ１を含む髄腔内送達ベクター（例えば、ＡＡＶ９）の１回の治療を約２４時間の期間にわたり受ける。
【００６２】
ＡＡＶ９−ｈＡＢＣＤ１の低速連続的髄腔内注入は、浸透圧駆動ポンプ、例えば、ＤＵＲＯＳ（登録商標）インプラント、ＡＬＺＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用することによりヒトにスケールアップすることができる。例えば、Ｊ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｃｕｌｗｅｌｌ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ＤＵＲＯＳ（登録商標）ｉｍｐｌａｎｔ，ｉｎ：Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅ，Ｊ．Ｈａｄｇｒａｆｔ，Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００８，ｐｐ．１４３−１４９も参照。
【００６３】
浸透圧送達デバイスおよびその構成部品は、例えば、米国特許第５，６０９，８８５号明細書；同第５，７２８，３９６号明細書；同第５，９８５，３０５号明細書；同第５，９９７，５２７号明細書；同第６，１１３，９３８号明細書；同第６，１３２，４２０号明細書；同第６，１５６，３３１号明細書；同第６，２１７，９０６号明細書；同第６，２６１，５８４号明細書；同第６，２７０，７８７号明細書；同第６，２８７，２９５号明細書；同第６，３７５，９７８号明細書；同第６，３９５，２９２号明細書；同第６，５０８，８０８号明細書；同第６，５４４，２５２号明細書；同第６，６３５，２６８号明細書；同第６，６８２，５２２号明細書；同第６，９２３，８００号明細書；同第６，９３９，５５６号明細書；同第６，９７６，９８１号明細書；同第６，９９７，９２２号明細書；同第７，０１４，６３６号明細書；同第７，２０７，９８２号明細書；同第７，１１２，３３５号明細書；同第７，１６３，６８８号明細書；米国特許出願公開第２００５−０１７５７０１号明細書、同第２００７−０２８１０２４号明細書、および同第２００８−００９１１７６号明細書に記載されている。
【００６４】
ＤＵＲＯＳ（登録商標）送達デバイスは、典型的には、浸透圧駆動部、ピストン、および薬物配合物を含有する円筒状リザーバからなる。リザーバは、一端において速度制御透水膜によりキャップされ、他端において薬物配合物が薬物リザーバから放出される拡散モデレータによりキャップされる。ピストンは、浸透圧駆動部から薬物配合物を分離し、シール材を利用して浸透圧駆動部コンパートメント中の水が薬物リザーバに流入するのを防止する。拡散モデレータは、薬物配合物とともに、体液がオリフィスを通り薬物リザーバに流入するのを防止するように設計される。
【００６５】
ＤＵＲＯＳ（登録商標）デバイスは、浸透圧の原理に基づき治療薬剤を所定の速度において放出する。細胞外液は、半透過膜を通りＤＵＲＯＳ（登録商標）デバイスに、ピストンを低速で均等な送達速度において駆動させるように拡張する塩駆動部中に直接流入する。ピストンの運動により、薬物配合物が所定の剪断速度においてオリフィスまたは出口ポートを通り強制的に放出される。本発明の一実施形態において、ＤＵＲＯＳ（登録商標）デバイスのリザーバに、例えば、１×１０１１ｇｃのＡＡＶ９−ｈＡＢＣＤ１を含む本発明の懸濁液配合物をロードし、デバイスは、懸濁液配合物を対象に所定の治療有効送達速度において長期間にわたり送達し得る。
【００６６】
他の埋込可能な薬物送達デバイスを本発明の実施において使用することができ、それとしては一定の化合物流、調整可能な化合物流、またはプログラム可能な化合物流を提供するレギュレータタイプの埋込可能なポンプ、例えば、Ｃｏｄｍａｎ  ＆  Ｓｈｕｒｔｌｅｆｆ，Ｉｎｃ．（Ｒａｙｎｈａｍ，Ｍａｓｓ．）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、およびＴｒｉｃｕｍｅｄ  Ｍｅｄｉｎｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能なものを挙げることができる。
【００６７】
本発明の、およびその多くの利点のより良好な理解を提供する以下の説明としての非限定的な実施例により本発明をさらに記載する。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態および態様を説明する。本発明の主旨も範囲も変更せずに種々の改変、付加、置換などを実施することができ、そのような改変およびバリエーションが以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内に包含されることは関連分野の当業者に明らかである。以下の実施例は、決して本発明を限定するものではない。
【００６９】
実施例１：ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡの存在下のＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の産生は、形質移入２９３Ｔ細胞からのＡＡＶベクタータイターを改善する。
ＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の産生の間の多量の細胞死／細胞変性効果は既に観察されており、それらはおそらく産生細胞中のＡＢＣＤ１タンパク質の過剰発現に起因する。この毒性は、ＡＡＶベクター収量を低減させた。毒性を緩和し、ベクター収量を改善するため、ｓｉＲＮＡのプールを使用してＡＢＣＤＩｍＲＮＡを標的化した。
【００７０】
ＡＡＶパッキングを以下のとおり実施した。１〜１．５×１０７個の２９３Ｔ細胞を１５ｃｍプレート上にプレーティングし、一晩培養した。
【００７１】
【表１】
2018537124.tif 000003
【００７２】
２日目、形質移入ミックスを以下のとおり調製した。
【００７３】
【表２】
2018537124.tif 000004
【００７４】
チューブＡおよびチューブＢを、ボルテックスに１分間供しながら滴下して合わせた。ミックスを室温において２０分間インキュベートした。１５ｃｍプレート当たり１．５ｍｌのウイルスミックスを添加し、プレートの表面上で滴下分配した。プレートを傾けて均等に混合し、一晩インキュベートした。３日目、培地を２％のＦＢＳ  １％のｐ／ｓのＤＭＥＭと交換した。５日目、プレート培地容量の半量をそれぞれのプレートから除去した。残留培地を洗浄し、または細胞スクレーパを穏やかに使用することにより細胞をプレートから回収した。細胞を１３００ＲＰＭにおいて５分間回転沈降させた。上清を除去した。チューブの底部を軽打することにより細胞をほぐし、細胞のプレート当たり１ｍｌのＥＤＴＡ  ＰＢＳ中で再懸濁させ、１３００ＲＰＭにおいて５分間回転させた。細胞をプレート当たり１ｍｌの溶解緩衝液中で再懸濁させ、場合により−８０Ｃにおいて貯蔵した。勾配精製後、ウイルスをＰＢＳ中に緩衝液交換し、ｑＰＣＲにより定量し、実験に使用した。
【００７５】
２９３Ｔ細胞をプレーティングした日、細胞に、ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡのプールまたは非標的化対照ｓｉＲＮＡを形質移入した。別の対照は、ＡＢＣＤ１ｓｉＲＮＡの存在下でＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＧＦＰ）であった。翌日、両方の試料にＡＡＶプラスミドを形質移入してＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１を産生した。
【００７６】
ｓｉＲＮＡプロトコルは、複数のステップを有する：
１．５μＭのプール（２５％の４つのｓｉＲＮＡのそれぞれ）ｓｉＲＮＡ溶液を、１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または原液からの別の適切なＲＮアーゼフリー溶液中で調製する。
２．別個のチューブ中で、ｓｉＲＮＡ（チューブ１中１００ｕｌ）および適切なＤｈａｒｍａＦＥＣＴ形質移入試薬（チューブ２中３０ｕｌ）を、血清フリーＤＭＥＭ培地により２ｍｌ容量にそれぞれ希釈する。
３．それぞれのチューブの含有物を、上下に慎重にピペッティングすることにより穏やかに混合する。室温において５分間インキュベートする。
４．チューブ１の含有物をチューブ２に添加し、総容量４ｍｌとする。上下に慎重にピペッティングすることにより混合し、室温において２０分間インキュベートする。１２ｍｌの完全ＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ）をこの４ｍｌに添加する。
５．３．７５ｅ６個の細胞／ｍｌの濃度における完全培地中の４ｍｌの再懸濁２９３Ｔ細胞（合計１．５Ｅ７個の細胞）を、ステップ４からの１６ｍｌの形質移入混合物に添加する（２５ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度）。
６．１５ｃｍディッシュ中にプレーティングし、２４時間インキュベートする。
７．ＡＡＶプラスミドのリン酸カルシウム形質移入の１時間前に培地を１０％のＦＢＳの完全ＤＭＥＭに交換する。
８．標準的ＡＡＶ産生および精製プロトコルを進行させる。
【００７７】
形質移入３日後に細胞を回収し、溶解させ、ベクター収量（ゲノムコピー数）を以下のとおりｑＰＣＲにより測定した。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
ｑＰＣＲプロトコルは、複数のステップを有する：
１．ベクターを、ヌクレアーゼフリー水中で１：１００〜１：１０００に希釈し、ボルテックスに供する。ｑＰＣＲにおいて使用する。
２．プラスミド６７５．５（５９９９ｂｐ）をゲノムコピー数（ＧＣ）標準として使用する。１０７〜１０２ｇｃ／ｍＬから標準を作出する。
３．標準および試料をトリプリケートで計測するために十分多い量でマスターミックスを調製する。マスターミックスは、２ｕｌのＨ２Ｏ、１．２ｕｌのプライマーミックス（ＦおよびＲ＝５ｕｌのそれぞれの１００ｕｍの原液、９０ｕｌの水中）、１ｕｌのプライマーミックス（ＦおよびＲ＝６ｕｌのそれぞれの１００ｕｍの原液、８８ｕｌの水中）、０．８ｕｌのＴＭ  ＦＡＭプローブ２．５ｕＭ、１ｕｌのＴＭ  ＦＡＭプローブ２ｕＭ（４ｕｌの１００ｕＭの原液＋１９６ｕｌの水）、および５ｕｌのＴａｑＭａｎ  ＦａｓｔユニバーサルＰＣＲマスターミックス２×を含む。
４．混合し、プレートのウェル中９ｕｌでアリコート化する。
５．水中で希釈した１ｕｌのテンプレートを添加する。
６．ステージ１がサイクル数１、９５℃：２０秒を有し、ステージ２がサイクル数４０、９５℃：０３秒；６０℃：３０秒を有する熱サイクリングパラメータを有するように７５００装置をプログラムする。
７．データを分析する。標準についての傾きは、約−３．３であるべきである。
【００８０】
収量は、ＡＡＶ９−ＧＦＰ試料を１００％に任意に設定し、他の２つの試料をこの値に対して正規化した相対タイターとして報告する。ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡプールの存在下のＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の産生は、ベクタータイター（および収量）を対照ｓｉＲＮＡと比較して約４倍だけ改善した（図１）。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
２９３Ｔ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ（図２、レーン１、２）、ＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡプール（図２、レーン３〜６）を形質移入し、または形質移入しなかった（図２、レーン７、「通常」は、２９３Ｔ細胞中のＡＢＣＤ１タンパク質の内在性レベルを指す）。翌日、ＡＡＶ−ＡＢＣＤ１プラスミド（図２、レーン１〜４）またはＡＡＶ−ＧＦＰプラスミド（図２、レーン５、６）を形質移入した。３日後、細胞溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ＡＢＣＤ１タンパク質についてのイムノブロットを実施してｓｉＲＮＡノックダウンを評価した。アクチンブロッティングをローディング対照のために実施した。８ｓおよび１ｓは、Ｘ線撮影用フィルムの８秒および１秒間の曝露をそれぞれ指す。ＡＢＣＤ１ｓｉＲＮＡは、対照ｓｉＲＮＡと比較して過剰発現ＡＢＣＤ１のレベルを低減させる。
【００８３】
２９３Ｔ細胞を形質移入のままとし（ｓｉＲＮＡなし）、またはそれに対照ｓｉＲＮＡもしくはＡＢＣＤ１ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡプールを形質移入した。翌日、細胞にＡＡＶプラスミドを形質移入してＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１を産生した。ＡＡＶプラスミドの形質移入３日後、ｑＰＣＲを実施して形質移入細胞の細胞溶解物中および培地中のベクターの量（ｇ．ｃ．）を測定した。細胞溶解物および培地中の両方でＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１ベクター収量の約３〜４倍の増加が観察された（図３）。
【００８４】
実施例２：副腎脊髄ニューロパチーのマウスモデルにおける浸透圧ポンプによるｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の髄腔内送達は、ＣＮＳへのより均一で広範な遺伝子送達をもたらす
自己相補的ＡＡＶ９ＧＦＰ（ｓｃＡＡＶ９ＧＦＰ）およびＡＢＣＤ１をコードするｒＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１）を、Ａｂｃｄ１−／−マウスに、２分間の持続時間にわたるボーラスにより、または２４時間の持続時間にわたる浸透圧ポンプにより髄腔内（ＩＴ）送達し、偽対照としてＰＢＳ注射を用いた。注射の２週間後、マウスを安楽死させ、マウスに４％のＰＦＡを灌流させた。次いで、組織を回収し、切片化し、免疫蛍光分析のために染色した。
【００８５】
浸透圧ポンプによりＩＴ送達されたｓｃＡＡＶ９−ＧＦＰは、ＣＮＳ関連細胞タイプおよびＤＲＧにわたる広範な発現を用量依存的にもたらした。脊髄およびＤＲＧは脳と比較して多い発現を有したが、ＧＦＰ発現は末梢器官（肝臓、心臓および副腎）中でも検出され、最大発現は３×１０１１ＧＣにおいて見られた。
【００８６】
ＡＢＣＤ１タンパク質の類似の分布パターンは、ｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１髄腔内ポンプ送達後に検出された。一般に、高用量（２×１０１１ＧＣおよび１×１０１１ＧＣ）は、低用量（０．５×１０１１ＧＣ）と比較してＣＮＳおよび末梢器官中での多い発現をもたらした。比較すると、２分間にわたる髄腔内ボーラス送達は胸部中の最大量のＡＢＣＤ１発現をもたらしたが、高用量（１×１０１１ｇｃ）でさえ、頸部および腰部においてより広範な送達をもたらさなかった（図４）。
【００８７】
特に、ＣＮＳにわたるＡＢＣＤ１の広範な発現は、０．５×１０１１ＧＣの低用量の直接髄腔内ボーラス注射後でさえ検出された（図５）。例えば、０．５×１０１１ＧＣボーラスおよびポンプ送達は、頸髄中のＡＢＣＤ１の類似発現を示す一方、心臓組織は、ボーラス注射後のより多い発現を実証した（図６）。ポンプにより送達される同一の用量は、ボーラス注射と比較して注射部位から離れた脳および脊髄中のより多い発現および末梢器官への比較的少ない漏出をもたらすことが結論付けられた（図７）。脳室内投与による０．５×１０１１ＧＣにおけるｒＡＡＶ９−ＡＢＣＤ１の送達は、脳中の局在化発現にもかかわらず、Ａｂｃｄ１−／−マウスにおける挙動改善をもたらす。したがって、概略された髄腔内ポンプ送達を使用してこの用量におけるいっそうより良好な性能を達成することができる。髄腔内ポンプを介して投与される１×１０１１ＧＣの用量において、中枢神経系中のＡＢＣＤ１発現は、Ｘ−ＡＬＤを有さない未治療対象（例えば、野生型）の中枢神経系中のＡＢＣＤ１の発現よりも約３倍多かった。重要なことに、末梢器官中のＡＢＣＤ１発現は、Ｘ−ＡＬＤを有さない未治療対象の末梢器官中のＡＢＣＤ１発現の発現よりも約９０％少なかった（図１１参照、ウエスタンブロットにおける様々な組織タイプ間のタンパク質発現を内在性野生型レベルに正規化した）。
【００８８】
まとめると、髄腔内浸透圧ポンプを介するｒＡＡＶ９媒介ＡＢＣＤ１遺伝子導入は、髄腔内ボーラス注射と比較してＣＮＳへのより均一で広範な遺伝子送達をもたらしつつ、全身循環中への漏出を低減させる。
【００８９】
実施例３：髄腔内浸透圧ポンプを介するｒＡＡＶ９媒介ＡＢＣＤ１遺伝子導入は、脊髄中のＣ２６：０レベルの低減をもたらす
Ｃ２６：０は、副腎脊髄ニューロパチーの生化学的特徴である。ＡＡＶ９遺伝子送達後の遊離超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の存在を評価するため、脂質分解分析を脊髄試料に対して実施した。Ｃ２６：０およびＣ２４：０の絶対値ならびにＣ２６：０／Ｃ２２：０の比を報告する。髄腔内浸透圧ポンプ（１×１０１１ｇｃ）を介するｒＡＡＶ９媒介ＡＢＣＤ１遺伝子導入は、脊髄中のＣ２６：０レベルの２０％低減をもたらすことが決定された（図１３）。髄腔内浸透圧ポンプ送達後のレベルは、髄腔内ボーラス送達後のものと同等であるが、全身漏出を回避する。
【００９０】
免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡イメージングをさらに実施した。組織切片イメージングのため、脊髄の切片（１６μｍ）を、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ）を使用して−２５℃において切断し、−８０℃において貯蔵した。切片をマウス抗ヒトＡＢＣＤ１抗体により染色し、次いでウサギ抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、ウサギ抗ＩＢＡ１（Ｗａｋｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）およびウサギ抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ）によりそれぞれ同時染色して細胞タイプを局在化させた。ＴＯＰＲＯ−３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、核対比染色のための蛍光色素として使用した。スライドを共焦点レーザー顕微鏡によりイメージングし、形質導入細胞を計数した。それぞれの細胞タイプのＡＢＣＤ１形質導入細胞の推定値を、２０倍および４０倍（ミクログリア）の倍率の画像で報告した。髄腔内浸透圧ポンプを介するｒＡＡＶ９媒介ＡＢＣＤ１遺伝子導入（１×１０１１ｇｃ）は、主として脊髄中のアストロサイト、内皮細胞およびいくつかのニューロンを標的化する（図１４）。後根神経節内で、それはサテライト細胞およびニューロンの両方を標的化する（図１４）。
【００９１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記説明は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2018537124.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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