(57)【要約】本明細書では、対象の心血管疾患及び／または神経変性疾患を診断するための方法及びマーカーが提供される。本方法は、診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、及びかかる対象から採取した生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの量を検出することを含む。【選択図】図６
2018524575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において疾患状態を診断するための方法であって、
前記対象から生物学的試料を採取すること、及び
前記対象から採取した前記生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの量を検出すること
を含み、
基準値に対する前記シトルリン化タンパク質または前記シトルリン化ペプチドのレベルの変化が、前記対象における前記疾患状態のリスクの増加を示す、前記方法。
【請求項２】
前記シトルリン化タンパク質または前記シトルリン化ペプチドが前記基準値に対して増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患状態が、慢性神経変性疾患、後天的脳損傷、心血管疾患、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記心血管疾患が虚血性心疾患または特発性心筋症である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記慢性神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の認知症、パーキンソン病（ＰＤ）及びＰＤ関連疾患、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはこれらの組み合わせである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記後天的脳損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、脳疾患、腫瘍、出血、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記シトルリン化タンパク質または前記シトルリン化ペプチドが分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記シトルリン化タンパク質または前記シトルリン化ペプチドが分泌されない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患状態が心血管疾患であり、前記シトルリン化ペプチドが、
2018524575.tif 000052
もしくはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上であるか、またはそれと少なくとも８０％が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患状態がＡＬＳであり、前記シトルリン化ペプチドが、
2018524575.tif 000053
もしくはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上であるか、またはそれと少なくとも８０％が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患状態が慢性神経変性疾患であり、前記シトルリン化ペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０４もしくはこれらの組み合わせに示される配列を有するペプチドのいずれか１つ以上と同一であるか、またはそれと８０％が同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患状態が後天的脳損傷であり、前記シトルリン化ペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４７もしくはこれらの組み合わせに示される配列を有するペプチドのいずれか１つ以上であるか、またはそれと８０％が同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、組織生検材料またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記シトルリン化タンパク質または前記シトルリン化ペプチドのレベルが、質量分析、高分解能質量分析、タンデム型質量分析、結合試験、免疫学的検査、抗体結合もしくは免疫組織化学を用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
心血管疾患、慢性神経疾患、後天的脳損傷、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上と診断された前記対象に対し、治療を指示することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療が、治療的ライフスタイル変更、治療薬、外科的治療、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記シトルリン化タンパク質または前記シトルリン化ペプチドの存在が、前記慢性神経変性疾患、後天的脳損傷、またはこれらの組み合わせの発症中の自己抗体の生成を示す、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の陳述
本発明は、国立衛生研究所から助成金第ＨＬ１１２５８６−０１号及び第ＨＨＳＮ２６８２０１００００３２Ｃ号を受け、政府の支援により行われたものである。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
本明細書の全ての出版物は、個々の出版物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれるよう指示された場合と同程度に参照により組み込まれる。以下の説明は、本発明の理解に有用である可能性がある情報を含む。これは、本明細書で提供されるいかなる情報も先行技術であるもしくは本願で請求される発明に関連していると認めるものではなく、または具体的もしくは黙示的に参照されるいかなる出版物も先行技術であることを認めるものではない。
【０００３】
シトルリン化、すなわち酵素ファミリーペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニンのシトルリンへの転換を含む不可逆的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、いくつかの疾患に関連している。シトルリン化は全身性のプロセスであるように思われ、シトルリン化タンパク質を標的とする自己抗体は関節リウマチ（ＲＡ）に対してかなり特異的であり、他の自己免疫状態において時折認められるが、健常なヒトで認められることはまれである。本発明者らの以前の研究において、シトルリン化タンパク質抗原に対する自己抗体の高値がＲＡ患者の心筋層で認められた。ＰＡＤは、心筋細胞、常在炎症細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞で検出された。
【０００４】
シトルリン化によって、分子量がわずかに増加（＋０．９８４Ｄａ）するが、アルギニン残基の正に荷電したグアニジン基がシトルリンアミノ酸の電荷中性のウレイド基に転換される。アルギニンからシトルリンへの電荷の喪失は、タンパク質の構造、タンパク質分解感受性、タンパク質−タンパク質相互作用及び細胞内情報伝達に劇的な結果を生じ得る。シトルリン化は、タンパク質の構造及び機能に重大な変化をもたらすことがあるため、シトルリン化及びＰＡＤ酵素が多くの慢性疾患で認められることは驚くことではない。さらに、アルギニンからシトルリンへの転換は、比較的高い細胞内カルシウム濃度でＣａ２＋に依存する形で触媒される。細胞内可溶質及び核細胞質のカルシウム濃度は比較的低いため、ＰＡＤは標準状態で不活性であるはずである。しかしながら、ＰＡＤは、細胞外環境からのカルシウムイオンの流入及び細胞内のカルシウム貯蔵部位からの放出によりカルシウム濃度が上昇すると、損傷して瀕死状態にある細胞において活性化する。
【０００５】
心筋層でシトルリン化される実際のタンパク質は、ｉ）心筋のシトルリン化タンパク質が循環自己抗体に対する免疫ターゲットであるかどうか、ｉｉ）心筋のシトルリン化タンパク質がそれ自体自己免疫反応を誘発し得るかどうか、ｉｉｉ）心筋のシトルリン化タンパク質が心臓の構造または機能への表現型修飾に直接介在するかどうか同様、解明されていない。心不全（ＨＦ）において心臓の収縮性及び構造の変化をもたらす心筋タンパク質のＰＴＭについては先例がある。筋節タンパク質のリン酸化、酸化、アセチル化は、ＨＦを伴う収縮能力の低下及び有害な心臓の再構成をもたらすタンパク質への構造的変化を生じる。しかしながら、心筋タンパク質のシトルリン化が同様の役割を果たすかどうかは解明されていない。
【０００６】
神経変性疾患に関する健康情報の枠組みには、脳（中枢神経系の頭蓋内要素から成る）に影響する病的状態としても定義される脳疾患が含まれることがある。これには、大脳皮質、頭蓋内白質、大脳基底核、視床、視床下部、脳幹、小脳（ＭｅＳＨの定義）などがある（ただし、これらに限定されない）。神経変性疾患の家族歴がある全ての個人が識別可能な遺伝子変異を有するわけではないことに留意することが重要である。これは、原因である遺伝子がまだ特定されていないこと、またはこの疾患が実際は遺伝子の変異によるものではないことが理由である可能性がある。
【０００７】
シトルリン化されたタンパク質及び修飾されたアミノ酸残基の特定は課題であった。本願において、発明者らは、心血管疾患及び神経変性疾患のマーカーとして作用し得る修飾アミノ酸残基を示すシトルリン化タンパク質及びペプチドの例を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
要旨
以下の実施形態及びその態様は、代表的かつ実例であることを意図するシステム、組成物、及び方法と併せて説明及び解説するが、範囲を限定するものではない。
【０００９】
本明細書では、心血管疾患を診断及び予測する方法を提供する。本方法は、心血管疾患の診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、及びかかる対象から採取した生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの量を検出することを含む。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示す。一実施形態において、シトルリン化レベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示すシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの基準値に対する上昇である。別の実施形態において、シトルリン化レベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示すシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベル基準値に対する低下である。代表的な実施形態において、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅに示す１つ以上のシトルリン化タンパク質またはペプチドの存在は、心血管疾患リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅに示すシトルリン化タンパク質またはペプチドのレベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、レベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示す表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅに示すタンパク質またはペプチドのシトルリン化レベルの上昇である。代表的な実施形態において、レベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示す表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅに示すタンパク質またはペプチドのシトルリン化レベルの低下である。いくつかの実施形態において、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅに示すいくつかのペプチドのシトルリン化レベルの上昇、及び表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅに示すいくつかのペプチドのシトルリン化レベルの低下は、心血管疾患リスクの増加を示す。様々な実施形態において、シトルリン化は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ及び／または表１Ｅにおいて「Ｄｅａ」と表示されるアルギニン残基で生じる。代表的な実施形態において、心血管疾患は、虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）、特発性筋疾患（ＩＤＣＭ）またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である。
【００１０】
本明細書では、それを必要とする対象において心血管疾患を治療する方法も提供する。この方法は、本明細書において説明される方法によって心血管疾患を診断すること、及び心血管疾患と診断された対象に対し、その対象の心血管疾患を治療するため有効量の治療薬を投与することを含む。代表的な実施形態において、心血管疾患は、虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）、特発性筋疾患（ＩＤＣＭ）またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である。
【００１１】
本明細書では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断及び／または予測する方法を提供する。本方法は、ＡＬＳの診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、及びその対象から採取した生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドを検出することを含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在はＡＬＳリスクの増加を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、ＡＬＳリスクの増加を示す。一実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの増加は、ＡＬＳリスクの増加を示す。別の実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの低下は、ＡＬＳリスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表２に示すシトルリン化ペプチドの存在はＡＬＳを示す。代表的な実施形態において、表２、３または４に示す1つ以上のシトルリン化ペプチドの存在はＡＬＳリスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表２，３または４に示すシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、ＡＬＳリスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表２、表３、または表４に示すペプチドのシトルリン化の量の変化は、神経変性疾患リスクの増加を示す。様々な実施形態において、シトルリン化は、表２、表３または表４で「Ｄｅａ」と表示されるアルギニン残基で生じる。
【００１２】
本明細書では、それを必要とする対象においてＡＬＳを治療する方法も提供する。この方法は、本明細書で説明する方法によってＡＬＳを診断すること、及びＡＬＳと診断された対象に対し、その対象のＡＬＳを治療するため有効量の治療薬を投与することを含む。
【００１３】
本明細書では、慢性神経変性疾患を診断及び／または予測する方法を提供する。本方法は、慢性神経変性疾患の診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、及びかかる対象から採取した生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドを検出することを含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は慢性神経変性疾患リスクの増加を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、慢性神経変性疾患リスクの増加を示す。一実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの増加は、慢性神経変性疾患リスクの増加を示す。別の実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの低下は、慢性神経変性疾患リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表５Ａ〜５Ｂに示す１つ以上のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、神経変性疾患リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、シトルリン化レベルの変化は、慢性神経変性疾患リスクの増加を示す表５Ａ〜５Ｂに示す１つ以上のペプチドまたはタンパク質のシトルリン化レベルの上昇である。代表的な実施形態において、シトルリン化レベルの変化は、慢性神経変性疾患リスクの増加を示す表５Ａ〜５Ｂに示す１つ以上のペプチドまたはタンパク質のシトルリン化レベルの低下である。いくつかの実施形態において、表５Ａ〜５Ｂに示すいくつかのペプチドのシトルリン化レベルの上昇、及び表５Ａ〜５Ｂに示すいくつかのペプチドのシトルリン化の低下は、慢性神経変性疾患リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、神経変性疾患の例としては、後天的脳損傷、慢性神経変性疾患であるアルツハイマー病、パーキンソン病、レヴィ小体認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、脊髄性筋萎縮症、プリオン病、多発性硬化症、脳卒中、退化性神経疾患、脳炎、脊髄性筋萎縮症、及び／またはクロイツフェルト・ヤコブ病などがあるが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書では、それを必要とする対象において慢性神経変性疾患を治療する方法も提供する。この方法は、本明細書で説明する方法によって慢性神経変性疾患を診断すること、及び慢性神経変性疾患と診断された対象に対し、その対象の慢性神経変性疾患を治療するため有効量の治療薬を投与することを含む。代表的な実施形態において、神経変性疾患の例としては、後天的脳損傷、慢性神経変性疾患であるアルツハイマー病、パーキンソン病、レヴィ小体認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、脊髄性筋萎縮症、プリオン病、多発性硬化症、脳卒中、退化性神経疾患、脳炎、脊髄性筋萎縮症、及び／またはクロイツフェルト・ヤコブ病などがあるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書では、後天的脳損傷を診断及び／または予測する方法を提供する。本方法は、後天的脳損傷の診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、及びかかる対象から採取した生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドを検出することを含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は後天的脳損傷リスクの増加を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、後天的脳損傷リスクの増加を示す。一実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの増加は、後天的脳損傷リスクの増加を示す。別の実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの低下は、後天的脳損傷リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表６Ａ〜６Ｂに示す１つ以上のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は、後天的脳損傷リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表６Ａ〜６Ｂに示す１つ以上のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、後天的脳損傷リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、シトルリン化レベルの変化は、後天的脳損傷リスクの増加を示す表６Ａ〜６Ｂに示す１つ以上のペプチドまたはタンパク質のレベルの上昇である。代表的な実施形態において、シトルリン化レベルの変化は、後天的脳損傷リスクの増加を示す表６Ａ〜６Ｂに示す１つ以上のペプチドまたはタンパク質のシトルリン化レベルの低下である。いくつかの実施形態において、表６Ａ〜６Ｂに示すいくつかのペプチドのシトルリン化レベルの上昇、及び表６Ａ〜６Ｂに示すいくつかのペプチドのシトルリン化の低下は、後天的脳損傷リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、後天的脳損傷には、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、脳疾患、腫瘍、出血、及び他の種類の後天的に得た脳損傷が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書では、それを必要とする対象において後天的脳損傷を治療する方法も提供する。この方法は、本明細書で説明する方法によって後天的脳損傷を診断すること、及び後天的脳損傷と診断された対象に対し、その対象の後天的脳損傷を治療するため有効量の治療薬を投与することを含む。代表的な実施形態において、後天的脳損傷には、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、脳疾患、腫瘍、出血、及び他の種類の後天的に得た脳損傷が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
参照する図面において、代表的な実施形態を説明する。本明細書で開示される実施形態及び図面は、限定するものではなく例証のためであるとみなすことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の様々な実施形態に従って、心臓のシトルリン化されたプロテオームを示す。有意のｐ値の群を有するシトルリン化タンパク質を（Ａ）細胞成分により及び（Ｂ）分子機能により示す。詳細は表１Ａ〜Ｆに見られる。（Ｃ）４〜１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて対照及びＨＦ患者（ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭ）から採取した心臓のシトルリン化タンパク質の検出。デンシトメトリー分析により、群間で有意な変化が無かったことが明らかとなった。
【図２】本発明の様々な実施形態に従って、ＰＡＤ２で処理した試料を用いた２ＤＥ  ＤＩＧＥ分析を示す。（Ａ）方法のセクションで述べるように、Ｃｙ２（内部対照）、Ｃｙ３（未処理）、及びＣｙ５（処理）で標識された試料。（Ｂ）ネットワークによって記述したタンパク質：収縮性及びエネルギー産生。虚血において上方及び下方制御されたシトルリン化タンパク質を既知のヒトタンパク質相互作用のヒトのＳＴＲＩＮＧデータベース上にマッピングした。赤、下方制御されたと示されたタンパク質、緑、上方制御されたタンパク質、及び青＝タンパク質−タンパク質相互作用の相手。以下の略語を用いた：ＦＬＮＣ：フィラミンＣ、ＬＤＢ３：ＬＩＭドメイン結合タンパク質３、ＭＹＢＰＣ：ミオシン結合タンパク質Ｃ、心臓型、ＭＹＯＺ２：ミオゼニン−２、ＴＮＮＩ３：トロポニンＩ、ＭＹＨ：ミオシン、ＣＲＹＡＢ：アルファクリスタリンＢ鎖、ＶＩＭ：ＡＴＰ合成酵素サブユニットアルファ、ＡＨＮＡＫ：神経芽細胞分化関連タンパク質、ＨＳＰ９０ＡＡ１：熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０−アルファ、ＨＳＰＤ１：６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、ＰＰＩＡ：ペプチジル−プロリルシス−トランス異性化酵素Ａ、ＦＡＢＰ３：脂肪酸結合タンパク質。
【図３】本発明の様々な実施形態に従って、アクチン結合試験を示す。Ａ）ＴＭ（０．５ｕＭ〜２ｕＭ）の濃度を増加させながら、Ｆ−アクチンまたはＢ）アクチン−ＨＭＭ及びＣ）ＴｎＩ（０．５ｕＭ〜２ｕＭ）と共に、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液中で培養した。ＴＭのＦ−アクチンへの結合を２５℃で３０分間行い、ＢｅｃｋｍａｎモデルＴＬ−１００．２にて２０℃、６０，０００ｒｐｍで２５分間超遠心分離した。ペレット及び上澄み液（未結合のタンパク質）の両方を分析した。代表的な銀染色ゲルが上澄み液とペレットのタンパク質組成を示す。３組のゲルをデンシトメトリーで分析した。それぞれのデータポイントは、その３組のゲルから得られた値の平均値（及び範囲）である。
【図４】様々な実施形態に従って、筋節タンパク質のシトルリン化、生化学的及び生理学的効果を示す。Ａ）シトルリン化Ｆ−アクチン及び／またはシトルリン化ＨＭＭによるアクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼ活性の制御を示す。Ｂ）ＴＭによるアクロミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼ活性の阻害を示す。ＡＴＰアーゼ活性はＴＭ濃度の関数として測定した。結果は、それぞれのＴＭ濃度でそれぞれのタンパク質についての４つの独立した実験の平均値である。試験条件：０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｆ−アクチン、０．０２ｍｇ／ｍｌ  ＨＭＭ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中０〜２．０ｕＭ  ＴＭ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＡＴＰ。ＰＡＤ２処理により筋フィラメントカルシウム感受性が低下した。Ｃ）未処理の対照群（３匹のマウスからのｎ＝８の筋細胞、グレーの丸）及びＰＡＤ２処理群（３匹のマウスからのｎ＝８の筋細胞、白丸）から膜透過処理した未処理の筋細胞についての力−カルシウムの関係を示す。Ｄ）２つの群間に最大カルシウム活性化力（Ｆｍａｘ）の差は無かった。Ｅ）ＰＡＤ２処理により、ＥＣ５０（５０％Ｆｍａｘを生じるのに必要なカルシウム）が有意に増加し（ｐ＝０．００９）、カルシウム感受性の低下が示唆された。Ｆ）ヒル計数（ｎＨ）はＰＡＤ２処理によって低下する傾向にあったが（パネルＣの曲線の急勾配を参照）、一方でその差は有意でなかった（ｐ＝０．３４）。
【図５】本発明の様々な実施形態に従って、Ａ、Ｂ）対照マウスから採取した心臓、Ｃ）マウスケラチノサイト及びＤ）リポ多糖で活性化されたマウスマクロファージ細胞株のＰＡＤアイソフォームの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＰＣＲ産物のＰＡＤ２は全ての種類の試料で見られ、ＰＡＤ４及びＰＡＤ１は心臓線維芽細胞、ケラチノサイト、マクロファージ細胞株で見られる。ＰＡＤ３は検出されていない。（分子量：ＰＡＤ１  ２８５ｂｐ、ＰＡＤ２  ３９０ｂｐ、ＰＡＤ３  ２００ｂｐ、ＰＡＤ４  ５５０ｂｐ）。
【図６】本発明の様々な実施形態に従って、心不全群、虚血群及びＩＤＣＭ群間で上方／下方制御されたシトルリン化タンパク質を示す。
【図７】本発明の様々な実施形態に従って、収縮性タンパク質のシトルリン化が制御機能の種々の態様に影響することがあることを示す。それによって、構造変化が引き起こされるか、あるいはアクチン活性化されたＰｉ放出及びＡＴＰアーゼサイクルの完成に必要であるコンフォメーションが安定化されることがある。
【図８】本発明の様々な実施形態に従って、神経変性疾患に係わるタンパク質のシトルリン化を確認するＳＷＡＴＨ−ＭＳ技術の利用を示す。
【図９】本発明の様々な実施形態に従って、シトルリン化スペクトルライブラリファイルを加工するための概略的なバイオインフォマティクスワークフローを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本明細書で引用される全ての参照は、その参照により全体が記載されているかのように組み込まれる。別途定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における普通の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２０１２）、Ｈｏｒｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２）、及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。抗体の調製方法を参照するには、以下を参照されたい。Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ２０１３）、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６  Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９、Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５８５，０８９（１９９６  Ｄｅｃ）、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，３３２（６１６２）：３２３−７。
【００２０】
当業者は、本明細書に記載のものと同様もしくは等価で、本発明の実施に使用し得る多くの方法及び物質を認識するであろう。本発明の他の特徴及び利点は、例として本発明の実施形態の様々な特徴を説明する添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。実際は、本発明は記載された方法及び物質に何ら限定されるものではない。便宜上、本明細書で、すなわち明細書、実施例及び添付された特許請求の範囲で使用される特定の用語をここにまとめる。
【００２１】
別途述べられていない限り、もしくは文脈から黙示的に示されない限り、以下の用語及び語句は以下で提供される意味を有する。別途明記されていない限り、もしくは文脈から明白でない限り、以下の用語及び語句は、その用語または語句が関連する技術分野で獲得した意味を除外しない。発明の範囲は請求項のみにより限定されるため、定義は特定の実施形態を説明するために提供するものであり、請求される発明を限定するものではない。別途定義されていない限り、本明細書で使用される技術語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の普通の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。
【００２２】
用語「マーカー」または「バイオマーカー」は本明細書において互換的に使用され、本発明における文脈において、対照群の対象（例えば、診断が陰性の対象、正常または健常の対象）から採取した比較試料の対照値、例えば代表値または平均値から成る対照値と比較して、特定の疾患または障害を有する患者から採取した試料に差次的に存在する、特定のシトルリン化されたアミノ酸残基または酵素自体、すなわちＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、またはＰＡＤ４（特定の特異的同一性または見かけの分子量の）を有するタンパク質またはペプチドのことをいう。バイオマーカーは、抗体または質量分析法により検出することができる特定のペプチドまたはタンパク質（表１〜１０）として測定することができる。いくつかの実施形態において、質量分析法もしくは他の分析結果、または多数の抗体を用いて多数のバイオマーカーを測定することができ、個々のバイオマーカー間の差、及び／または部分的もしくは完全な分析結果を用いて診断することができる。これは、酵素またはそれがシトルリン化したタンパク質を、単独または一緒に検出することを含むことができる。
【００２３】
用語「差次的に存在」または「レベルの変化」は、対照群の対象と比較して特定の疾患また障害を有する患者から採取された試料に存在するマーカーの量及び／または頻度の相違のことをいう。例えば、マーカーは、疾患または障害を有する患者の試料に対照値（例えば、対照群の対象の試料から測定された値）と比較して高値もしくは低値で存在することがあり得る。あるいは、マーカーは、対照群の対象と比較して患者の試料に、より高頻度もしくは低頻度で検出されることがあり得る。マーカーは、２つ以上の特定の修飾されたアミノ酸残基及び／または酵素自体の間の差異の比だけでなく、量、頻度、またはこれらの両方の観点で差次的に存在することができる。一実施形態において、本明細書に記載の修飾されたタンパク質及びペプチドの、未修飾のタンパク質及びペプチドに対する比の増加は、本明細書に記載の疾患のいずれか１つ以上の診断に役立つ。実施形態において、本明細書に記載のタンパク質及びペプチドのシトルリン化の増加は、本明細書に記載の修飾された（シトルリン化された）タンパク質及び／またはペプチドの、未修飾の（シトルリン化されていない）タンパク質及び／またはペプチドに対する比の増加のことをいう。一実施形態において、本明細書に記載の修飾されたタンパク質及びペプチドの、未修飾のタンパク質及びペプチドに対する比の低下は、本明細書に記載の疾患のいずれか１つ以上の診断に役立つ。実施形態において、本明細書に記載のタンパク質及びペプチドのシトルリン化の減少は、本明細書に記載の修飾された（シトルリン化された）タンパク質及び／またはペプチドの、未修飾の（シトルリン化されていない）タンパク質及び／またはペプチドに対する比の低下のことをいう。
【００２４】
マーカー、化合物、組成物、もしくは物質は、試料中のマーカー、化合物、組成物、または物質の量が別の試料中のマーカー、化合物、組成物、もしくは物質の量、もしくは対照値と統計的に有意に異なる場合、試料中に差次的に存在する。例えば、化合物は、それが他の試料（例えば、対照）に存在するより、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％多く、あるいは少なく存在する場合、またはそれがある試料で検出できて他の試料では検出できない場合、差次的に存在する。
【００２５】
また、あるいはさらに、マーカー、化合物、組成物、もしくは物質は、特定の疾患または障害を有する患者の試料のマーカーなどの検出頻度が、健常な個人から得た対照試料の検出頻度または対照値より統計的に有意に高いもしくは低い場合、試料間で差次的に存在する。例えば、ある組の試料で、他の組の試料より、バイオマーカーが少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％高頻度もしくは低頻度で検出される場合、バイオマーカーはその２組の試料間で差次的に存在する。上記の代表的な値にもかかわらず、マーカーが差次的に存在するかどうか判定する統計的な有意差を表すカットオフポイントなどを当業者が決定できることが期待される。
【００２６】
「診断」は、ある生理学的状態の存在または性質を特定することを意味し、特定の疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者を特定することを含む。診断方法は感度と選択性が異なる。診断分析の「感度」とは、検査結果が陽性の罹患個人の割合（「真陽性の割合」）である。検査で検出されない罹患個人は「偽陰性」である。病気ではなく検査結果が陰性の対象は「真陰性」である。診断分析の「選択性」は、１マイナス偽陽性率であり、ここで「偽陽性」率は検査結果が陽性で疾患が無い対象の比率と定義される。ある特定の診断方法がある状態の明確な診断ができないとしても、その方法が診断に役立つ陽性の兆候を提供できれば十分である。
【００２７】
用語「検出」、「検出する」などは、バイオマーカーを検出するまたは疾患または障害を検出する（例えば、陽性の検査結果が得られた場合）という文脈において使用される。後者の文脈においては、「検出する」と「診断する」は同義語と考えられる。
【００２８】
「を示す」または「のリスクがある」は、正常な対象と比較して、すなわち対照群、例えば患者集団と比較してリスクが高いことを意味するものとする。従って、特定のマーカーを有する対象は、特定の疾患または障害のリスクが高く、追加試験が必要であると確認される可能性がある。「リスクの増大」または「リスクの上昇」は、例えば対象が障害を有する確率の統計的に有意なあらゆる増加を意味する。そのリスクは、比較を行う対照群に対して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％高い。
【００２９】
マーカーの「試験量」は、試験される試料中のマーカーの量のことをいう。試験量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、信号の相対強度）のいずれかであることができる。
【００３０】
マーカーの「診断量」は、特定の疾患または障害の診断と一致する対象の試料中のマーカーの量のことをいう。診断量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、信号の相対強度）のいずれかであることができる。
【００３１】
マーカーの「対照量」は、試験のマーカー量と比較すべき任意の量または量の範囲であることができる。例えば、マーカーの対照量は、診断しようとする疾患または障害に罹患していない人のマーカーの量であることができる。対照量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、信号の相対強度）のいずれかであることができる。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」ならびに「タンパク質」は、本明細書においてα−アミノ酸残基、特に天然に存在するα−アミノ酸のポリマーに言及するのに互換的に用いられる。この用語は、天然由来のアミノ酸ポリマーに関してだけではなく、１つ以上のアミノ酸残基が相当する天然由来のアミノ酸の類似物もしくは模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。ポリペプチドは、例えば、糖質残基の付加による糖タンパク質の形成、リン酸化によるリンタンパク質の形成、及び多くの化学修飾（例えば、酸化、脱アミド化、アミド化、メチル化、ホルミル化、ヒドロキシメチル化、グアニジン化）に加え、分解、還元、または架橋により、修飾することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、タンパク質の未修飾の形態と修飾された形態の全てを含む。ペプチドは、シトルリン化された残基を有することがある、もしくはＰＡＤ酵素の一部である。
【００３３】
「検出可能な部分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、もしくは化学的方法により検出可能な組成物のことをいう。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通常使用されるような酵素）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子などがある。検出可能な部分はしばしば、例えば、放射性、色素生産性、または蛍光性の信号のような、試料中の結合した検出可能な部分の量を定量化するのに用いることができる測定可能な信号を発生する。この信号の定量は、例えば、シンチレーションの計数、デンシトメトリー、フローサイトメトリー、またはシトルリン化された可能性がある残基またはＰＡＤ酵素の一部を有する無傷のタンパク質またはペプチドの質量分析による直接分析（１つ以上のペプチドを評価することができる）によって実現できる。タンパク質またはペプチドの一部としてシトルリン化されたＡｒｇは、ＭＳもしくは化学的誘導体化により直接検知することができる。抗体やアプタマーを含むがこれらに限定されないあらゆる捕獲試薬を、本明細書に記載のシトルリン化ペプチドの検出に用いることができる。
【００３４】
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子（単数または複数）またはこれらのフラグメントによって実質的にコード化されたポリペプチドリガンドをいい、エピトープ（例えば抗原）と特異的に結合してこれを識別する。識別される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパならびにラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンならびにミュー重鎖定常領域遺伝子、及び種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって産生される十分に特性評価されたフラグメントとして存在する。これには、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’．ｓｕｂ．２のフラグメントが含まれる。本明細書で使用される用語「抗体」にはさらに、抗体全体の修飾により産生される抗体フラグメント、または新たに組み換えＤＮＡ法を用いて合成された抗体フラグメントのいずれかも含まれる。これにはさらに、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体も含まれる。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つ以上の重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むが、重鎖可変領域は含まない、免疫グロブリン重鎖の抗体の部分をいう。
【００３５】
「結合試験」は、バイオマーカーが抗体などの物質と結合することにより検出され、それにより検出工程が実施される生化学的検査を意味する。この検出工程には、放射性または蛍光性の標識などを含むことができる。この検査はバイオマーカーの固定化を含むことができ、溶液中で行ってもよい。さらに、シトルリン化された残基への化学結合は直接生じることもあり得る。
【００３６】
「免疫学的検査」は、抗原（例えば、マーカー）と特異的に結合する抗体を用いる検査である。免疫学的検査は、抗原を単離し、標的とし、かつ／または定量するため特定の抗体の特異的な結合特性を使用することが特徴である。
【００３７】
抗体に、「特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「と特異的に（もしくは選択的に）免疫反応性の」という語句は、タンパク質もしくはペプチドに言及する場合、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、所定の免疫学的検査の条件の下で、特定の抗体は、特定のタンパク質にバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、試料中に存在するその他のタンパク質には実質的に有意な量で結合しない。前述の条件での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される抗体を必要とする可能性がある。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するため、多様な様式の免疫学的検査を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫学的検査は、あるタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するためごく普通に用いられる（特異的免疫反応性の測定に用いることができる免疫学的検査の様式及び条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。
【００３８】
シトルリン化を検出するための方法は、シトルリン化されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の検出に用いられる質量分析法（ＭＳ）に基づいた方法をいう。この方法には、脱イミノ化がＡｒｇで生じた時の１Ｄａのニュートラルロス、未修飾のシトルリンからのイソシアン酸及びタンパク質のシトルリン化の検出の診断マーカーとして用いられるイソシアン酸イオンのニュートラルロス、２３８Ｄａまたは２３９Ｄａの化学修飾がＣｉｔ残基で生じる時の誘導体化（ペプチド及びタンパク質のレベルでモニターできる）、ビーズ／カラム／基質に固定化され、低ｐＨでシトルリン残基のウレイド基と排他的に反応するグリオキサール誘導体の特異的反応に基づくシトルリン化ペプチド（またはタンパク質）の濃縮が含まれるが、これらに限定されない。同様に、多重反応または選択的反応のモニタリングのようなターゲットメソッドを用いるＭＳは、直接修飾ペプチドの定量に用いることができる。いくつかの実施形態において、濃度が既知の標識化された（例えば、１５Ｎで標識化または付加的な安定同位体で化学的に標識された）ペプチドを試料に添加し、内在性の（非標識の）対応するペプチドと直接比較することで定量化が可能となる（内在ペプチドの同位体標識化ペプチドに対する比、または同位体標識化ペプチドの正確な量が既知の場合は絶対量に基づく）。
【００３９】
用語「対象」、「患者」または「個人」は一般にヒトをいうが、本発明の方法はヒトに限定されず、他の動物（例えば、鳥類、爬虫類、両生類、哺乳類）、特にアルブミンが種間で相同であるため哺乳類において有用であろう。
【００４０】
「試料」は本明細書においてその最も広い意味で用いる。試料は、血液、血清、血漿、涙、眼房水ならびに硝子体液、脊髄液を含む体液、細胞もしくは組織調製物の可溶性画分、または細胞を増殖させた培地、または細胞もしくは組織から単離もしくは抽出された膜、ポリペプチド、または溶液中のペプチド、もしくは基質に結合したペプチド、細胞、組織、組織プリント、指紋、皮膚もしくは毛髪、これらのフラグメントならびに誘導体を含むことができる。被検試料は通常、血液、血漿、及び血清を含む血液製剤の誘導体を含む。
【００４１】
用語「特定のＰＡＤアイソフォームの調節」は、遺伝子療法、ｓｉＲＮＡ、既知のＰＡＤ阻害剤、または部位特異的突然変異誘発法を用いる内在性ＰＡＤアイソフォームの活性の増加または減少を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、通常長さが２から約３０残基の、もしくは約４０残基の、もしくは約５０残基の、もしくは約６０残基の、もしくは約７０残基の範囲のアミノ酸残基のポリマーをいう。特定の実施形態において、ペプチドの長さは、約２、３、４、５、７、９、１０、または１１残基から約６０、５０、４５、４０、４５、３０、２５、２０、または１５残基の範囲にある。特定の実施形態において、ペプチドの長さは、約８、９、１０、１１、または１２残基から約１５、２０、または２５残基の範囲にある。特定の実施形態において、ペプチドを含むアミノ酸残基は「Ｌ−型」アミノ酸残基であるが、様々な実施形態において「Ｄ」アミノ酸がペプチドに組み込まれることがあることが認められる。ペプチドには、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然由来のアミノ酸、及び天然由来のアミノ酸ポリマーの人工の化学的類似物であるアミノ酸ポリマーも含まれる。さらに、この用語は、ペプチド結合または他の「修飾された結合」で結合したアミノ酸に適用される（例えば、ペプチド結合がａ−エステル、ｆ３−エステル、チオアミド、ホスホンアミド、カルバメート、ヒドロキシル化などで置換される場合（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，（１９８３）Ｃｈｅｒｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：２６７−３５７を参照されたい）、アミドが飽和アミンで置換される場合（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＳｋｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４９６，５４２、及びＫａｌｔｅｎｂｒｏｎｎ  ｅｔａ／．，（１９９０）Ｐｐ．９６９−９７０  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．１１ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ＥＳＣＯＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓなどを参照されたい）。
【００４３】
シトルリン化（脱イミノ化とも呼ばれる）は、タンパク質内でのアミノ酸であるアルギニンのシトルリンへの変換を含むＰＡＤで触媒される翻訳後タンパク質修飾である。多くの自己免疫疾患の発生病理におけるシトルリン化タンパク質の関与は確立されている。例えば、タンパク質のシトルリン化は関節リウマチ（ＲＡ）の一因となる自己抗体の生成に直接関連している。しかしながら、ＰＡＤ活性化の正確な状況及び根本的な目的及び結果として生じる細胞内のタンパク質のシトルリン化は、完全には分かっていない。さらに、シトルリン化タンパク質を標的とする自己抗体の産生は、例えば、多発性硬化症、乾癬、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの他の多くの自己免疫疾患に係わっている。シトルリン化タンパク質及びタンパク質配列におけるシトルリン化部位についての知見から、これらのシトルリン化タンパク質の病原学的重要性及び機能についての非常に有益な情報を得ることができる。本明細書では、シトルリン化タンパク質及びペプチドを含む、心血管疾患及び神経変性疾患を予測する指標となる新規なバイオマーカーを提供する。
【００４４】
シトルリン化は、心疾患を検出するための（未修飾／非シトルリン化の）自己抗原の（修飾／シトルリン化された）自己抗原に対する比の検出または測定に用いることができる自己抗原と自己抗体の反応に関連している（バイオマーカーとしてのシトルリン化自己抗体／自己抗原）。さらに、シトルリン化自己抗体の検出は、リスクの層別因子として用いることができる。心不全（ＨＦ）の発症リスク及び心筋梗塞で死亡するリスクは年齢とともに増加する。シトルリン化は年齢と共に増加することが知られており、シトルリン化は心不全を予測する指標となる可能性がある。シトルリン化の原因であるＰＡＤ酵素を阻害すること（例えば、薬剤による阻害）は、治療標的となる可能性がある。
【００４５】
タンパク質のシトルリン化は、アルツハイマー病（ＡＤ）などの特定の神経変性疾患の発生病理における自己抗体の生成においてある役割を果たす。シトルリン化は、タンパク質内の全体的な電荷分布を変えて、三次構造を変える可能性があるため、これらのＰＡＤ発現細胞中の多くのシトルリン化タンパク質は、特にそれらが細胞から放出されそれにより免疫モニタリングに利用しやすくなる場合は、免疫原性を有する可能性のある非ネイティブ型のコンフォメーションをとる可能性がある。
【００４６】
シトルリン化は、神経変性疾患を検出するための（未修飾／非シトルリン化の）自己抗原の（修飾／シトルリン化された）自己抗原に対する比の検出または測定に用いることができる自己抗原と自己抗体の反応に関連している（バイオマーカーとしてのシトルリン化自己抗体／自己抗原）。シトルリン化は年齢と共に増加することが知られており、シトルリン化の増加は神経変性疾患を予測する指標となる可能性がある。シトルリン化の原因であるＰＡＤ酵素を阻害すること（例えば、薬剤による阻害）は、治療標的となる可能性がある。
【００４７】
ペプチジル−シトルリンの検出−他の方法との比較
現在のシトルリン化についての研究は、例えば、多発性硬化症及び関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患におけるその役割に集中している［Ｂａｋａ  Ｚ，ｅｔ    ａｌ．Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎｅ  ２０１２，７９：４３１−４３６、Ｄｅ  Ｃｅｕｌｅｎｅｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１２，１２：７５２−７６０］。これに関連して、タンパク質中のシトルリン化部位の正確な知見から、これらのシトルリン化タンパク質の病原学的重要性について非常に有益な情報が得られる。しかしながら、高処理量形式においてペプチドレベルでシトルリン化を正確に検出することができる技術はほとんど存在しない。
【００４８】
一般にＭＳによるＰＴＭの分析は困難な課題であり、以下のような局所的なペプチドの特性に対するＰＴＭの大きな影響に依存する：（ｉ）ＰＴＭによって誘発されたペプチドの分子量の質量シフト、（ｉｉ）修飾ペプチドの総数、（ｉｉｉ）ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析の間の修飾の安定性、及び（ｉｖ）ペプチドのイオン化効率に対する修飾の影響。シトルリン化は正規のアルギニン残基と比較して名目上０．９８０２ダルトンの質量増加をもたらすだけであることから、シトルリン化タンパク質／ペプチドを非ＰＴＭの形態と区別することが困難であるため、シトルリン化は複雑であり偽陽性を生じる傾向がある。通常適用されるショットガンタイプ液体クロマトグラフィタンデム型ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法は、このような場合に同様な質量増加（特に通常生じるグルタミンやアスパラギン残基の脱アミド化）をもたらす１３Ｃ同位体の誤認または他の修飾の誤認を引き起こす可能性がある自動データベーススクリーニングに依存する。１３Ｃ同位体はアルギニンのシトルリンへの変換（０．９８０２Ｄａ）よりわずかに大きい質量増（１．００３６Ｄａ）を引き起こすため、１３Ｃ同位体の誤認は十分小さい親イオンの質量許容差（＜５ｐｐｍ）を有するデータベースを検索することで防ぐことができる［Ｄｅ  Ｃｅｕｌｅｎｅｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１２，１２：７５２−７６０、Ｒａｉｊｍａｋｅｒｓ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２０１２，１４：Ｒ１１４］。しかし、脱アミド化は質量だけに基づいてシトルリン化と区別することができない。脱アミド化ではペプチドの荷電した残基の数は変化しないが（ＬＣ−ＭＳに用いられる酸性条件下）、一方でアルギニンのシトルリンへの変換では正電荷が中和される。シトルリン化は正電荷の消失をもたらし、それによってアルギニンの場合の１１．４１からシトルリンの場合の５．９１への等電点の移動が生じる。従って、シトルリン化によって非修飾及び／または脱アミノ化ペプチドと比較してペプチドの全体的な疎水性が増加するため保持時間の変化が生じるが、これはペプチドが脱アミノ化ではなくシトルリン化されたことの証拠である［Ｒａｉｊｍａｋｅｒｓ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２０１２，１４：Ｒ１１４．］。しかし、現在の方法では、複数の試料にわたって、シトルリン化ペプチドを、迅速に、一貫して、再現性良く、正確に、かつ高感度で検出し定量することは依然課題である。
【００４９】
シトルリン化標的タンパク質の検出の他の方策を超えるＳＷＡＴＨ  ＭＳの利点
タンパク質のシトルリン化の高処理分析に最も一般的に使用される質量分析法ベースの方法は、データ依存的分析（ＤＤＡ）である［ｔａｈｌ  ＤＣ，Ｓｅｔ  ａｌ．Ｄａｔａ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９６，７：５３２−５４０、Ｙａｔｅｓ  ＪＲ，３ｒｄ，Ｅｎｇ  ＪＫ，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ＡＬ，Ｓｃｈｉｅｌｔｚ  Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５，６７：１４２６−１４３６］。しかし、定量化の場合の確率的前駆体の選択及びＭＳ１イオン依存性により、包括性が妨げられる。数年前この限界を越えるため、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄのグループは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）と類似の標的法としてＳＷＡＴＨ  ＭＳを考案した。ＳＷＡＴＨ  ＭＳは、データ非依存的分析（ＤＩＡ）を標的化データ抽出と組み合わせる手法であり、これにより定量精度、再現性、ダイナミックレンジが同時に得られ、定量可能なペプチドの数が拡大する［Ｇｉｌｌｅｔ  ＬＣ１  ＮＰ  ＴＳ，Ｒｏｓｔ  Ｈ，Ｓｅｌｅｖｓｅｋ  Ｎ，Ｒｅｉｔｅｒ  Ｌ，  Ｂｏｎｎｅｒ  Ｒ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄａｔａ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＳ／ＭＳ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｄａｔａ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１２、Ｌｉｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｐｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ２０１３，１３：８１１−８２５］。高度にシトルリン化されたライブラリを作成することによって感度と定量精度が改善される。
【００５０】
心血管疾患
本明細書では心血管疾患を診断及び／または予測する方法を提供する。本方法は心血管疾患の診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、及びその対象から採取した生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの量を検出することを含む。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は心血管疾患のリスクの増加を示す。一実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの増加は、心血管疾患リスクの増加を示す。別の実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの低下は、心血管疾患リスクの増加を示す。代表的な実施形態において、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び／または１Ｅに示す１つ以上のタンパク質またはペプチドのシトルリン化レベルの変化は、心血管疾患リスクの増加を示す。いくつかの実施形態において、表１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び１Ｆにおいて「アップ」で示す表１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び１Ｆに示すタンパク質のシトルリン化の増加は心血管リスクの増加を示す。いくつかの実施形態において、表１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び１Ｆにおいて「ダウン」で示す表１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、及び１Ｆに示すタンパク質のシトルリン化の減少は心血管リスクの増加を示す。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００５１】
いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、虚血性心疾患の列（「Ｉ」）に「アップ」で示されているように、表１Ｃのタンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象は虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）を有するか、ＩＳＨＤリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、表１Ａのペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の存在またはシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＩＳＨＤを有するか、ＩＳＨＤリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、表１Ａのペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の非存在またはシトルリン化の減少が認められる場合は、その対象はＩＳＨＤを有するか、ＩＳＨＤリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、ＥＳ１タンパク質相同体、アコニテート水添加酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、デルタ−１−ピロリン−５−カルボキシレート脱水素酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ビメンチンもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、神経芽細胞分化関連タンパク質ＡＨＮＡＫもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、血清除去応答性タンパク質もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、エノイル−ＣｏＡ水添加酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、アコニテート水添加酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、またはこれらの組み合わせのうちいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められた場合は、その対象はＩＳＨＤを有するか、ＩＳＨＤリスクが高い。
【００５２】
いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、特発性心筋症（ＩＤＣＭ）の列（「ＩＤ」）に「アップ」で示されているように、表１Ｄのタンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＩＤＣＭを有するか、ＩＤＣＭリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、表１Ａのペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の存在またはシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＩＤＣＭを有するか、ＩＤＣＭリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、表１Ａのペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の非存在またはシトルリン化の減少が認められる場合は、その対象はＩＤＣＭを有するか、ＩＤＣＭリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、ＡＴＰ合成酵素サブユニットアルファもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ミオゼニン−２もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ＥＳ１タンパク質相同体もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、及び／またはこれらの組み合わせのうちいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＩＤＣＭを有するか、ＩＤＣＭリスクが高い。
【００５３】
いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、表１Ａ〜１Ｆに示すタンパク質またはペプチドのうちいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象は心血管疾患（ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭまたはＩＳＨＤとＩＤＣＭの両方）を有するかそのリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、ＡＴＰ合成酵素サブユニットアルファ、もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素、もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ＥＳ１タンパク質相同体もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、デルタ−１−ピロリン−５−カルボキシレート脱水素酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、エノイル−ＣｏＡ水添加酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、電位依存性アニオン選択チャネルプロテイン１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、アコニテート水添加酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ピルビン酸脱水素酵素Ｅ１コンポーネントサブユニットアルファ、体細胞型もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ビメンチンもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、三官能性酵素サブユニットベータもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ミオシン結合タンパク質Ｃ、心臓型もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、塩化物細胞内チャネルタンパク質４もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０−アルファもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、血清除去応答性タンパク質もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、アルコール脱水素酵素１Ｂもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、コハク酸脱水素酵素［ユビキノン］鉄−硫黄サブユニットもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、二重特異性タンパク質ホスファターゼ３もしくはそのシトルリン化されたフラグメント（表１Ｅ）のうちいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象は心血管疾患（ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭまたはＩＳＨＤとＩＤＣＭの両方）を有するか、そのリスクが高い。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、トロポニンＩ、アルファ−クリスタリンＢ鎖、ＡＴＰ合成酵素カップリングファクター６、ベータ−エノラーゼ、アデニル酸キナーゼイソ酵素Ｉまたはこれらの組み合わせ（表１Ｆ）のうちいずれか１つ以上にシトルリン化の減少が認められる場合は、その対象は心血管疾患（ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭまたはＩＳＨＤとＩＤＣＭの両方）を有するかそのリスクが高い。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００５４】
さらに本明細書では、心疾患の診断を必要とする対象から生物学的試料を採取すること、ペプチドに特異的に結合することができる抗体の有無を検出するために、その生物学的試料の検査にペプチドを用いること、そのペプチドに特異的に結合することができる抗体の存在が検出された場合に心血管疾患の存在を判定すること、及びそのペプチドに特異的に結合することができる抗体の存在が検出された場合に対象に心血管疾患の治療を指示することを含む方法も提供する。様々な実施形態において、ペプチドに特異的に結合することができる抗体の存在は、ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭ、心不全、またはこれらの組み合わせのうちいずれか１つ以上を示す。いくつかの実施形態において、ペプチドは、トロポニンＩ、ビメンチン、ミオシン−７のフラグメントまたはこれらの組み合わせである。様々な実施形態において、ペプチドはシトルリン化されている。代表的な実施形態において、ペプチドはアミノ酸配列
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を含むか、またはこれらのアミノ酸配列から成るか、あるいは本質的にこれらのアミノ酸配列から成る。代表的な実施形態において、対象から採取された試料のシトルリン化ペプチドのペプチド配列は、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、または６０％が表１Ａ〜１Ｆのいずれかに示すペプチドと同一である。代表的な実施形態において、対象から採取された試料のシトルリン化ペプチドのペプチド配列は、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、または６０％が、
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と同一である。様々な実施形態において、ペプチドの長さは試料中の抗体と結合するため最適化されている。様々な実施形態において、シトルリン化ペプチドは、質量分析、高分解能質量分析、タンデム型質量分析、結合試験、免疫学的検査、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動、ウエスタンブロット解析、ＳＷＡＴＨを含む質量分析におけるコンフォメーションを用いて検出される。
【００５５】
様々な実施形態において、この方法はさらに、心血管疾患と診断された対象に治療を指示することを含む。様々な実施形態において、治療には、治療的ライフスタイル変更、治療薬、外科的治療またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上などがあるが、これらに限定されない。代表的な実施形態において、ライフスタイル変更には、健康食、身体活動、体重管理、ストレス管理、禁煙またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上などがある。代表的な実施形態において、治療薬としては、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）、ベータ遮断薬、アルドステロン拮抗薬、強心配糖体、利尿薬、血管拡張薬、抗不整脈薬、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド、強心薬、抗凝固剤、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）酵素またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上などがある。代表的な実施形態において、外科的治療には、左室補助装置、心臓再同調療法（両心室ペーシング）、自動植込型除細動器、心室修復術、心臓移植、血管形成術、ステント、アテローム切除術、放射線療法、冠動脈バイパス移植術またはこれらの組み合わせの使用のいずれか１つ以上などがある。適切な治療は当業者にとっては明らかであろう。
【００５６】
本明細書で述べるプロセス、検査及び方法の様々な実施形態において、基準値は、例えば表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び／または１Ｆに示すシトルリン化タンパク質もしくはシトルリン化ペプチドのレベルの変化に基づいている。一実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、心筋細胞における変化である。別の実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、非心臓細胞における変化である。付加的な実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、任意の細胞における変化である。付加的な実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、任意の体液における変化である。いくつかの実施形態において、基準値は、心血管疾患を有していない対象の集団におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化の平均値または中央値である。他の実施形態において、基準値は、心血管疾患を有するが治療を受けており、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現を示さないか減少を示す対象の集団のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化の平均値または中央値である。付加的な実施形態において、基準値は、例えば、診断時、治療前、治療後またはこれらの組み合わせなど、異なる（例えば、より早期の）時点で対象から採取された試料におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルの変化である。いくつかの実施形態において、心血管疾患は、ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭ、心不全またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上である。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００５７】
様々な実施形態において、心血管疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質もしくはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、基準値と比較して少なくとも、または約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％高い。様々な実施形態において、心血管疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質もしくはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、基準値と比較して、少なくとも、または約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍もしくはこれらの組み合わせの倍数高い。
【００５８】
様々な実施形態において、心血管疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質もしくはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、基準値と比較して、少なくとも、または約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％低い。様々な実施形態において、心血管疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質もしくはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、基準値と比較して、少なくとも、または約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍もしくはこれらの組み合わせの倍数低い。
【００５９】
神経変性疾患
本明細書では、慢性神経変性疾患及び／または後天的脳損傷及び／または急性脳疾患を診断及び／または予測する方法を提供する。この方法は、診断を必要とする対象からの試料採取及び対象から採取された生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの検出を含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は、神経変性疾患を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、神経変性疾患及び／または後天的脳損傷及び／または急性脳疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの増加は、神経変性疾患及び／または後天的脳損傷及び／または急性脳疾患を示す。別の実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの減少は、神経変性疾患及び／または後天的脳損傷及び／または急性脳疾患を示す。代表的な実施形態において、表２〜１０に示す１つ以上のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、神経変性疾患を示す。代表的な実施形態において、表２〜１０に示す１つ以上のペプチドまたはタンパク質のシトルリン化の量の変化は、神経変性疾患を示す。いくつかの実施形態において、レベルの変化は、表２〜１０に示す１つ以上のシトルリン化ペプチドまたはシトルリン化タンパク質のレベルの上昇であり、慢性神経変性疾患を示す。いくつかの実施形態において、レベルの変化は、表２〜１０に示す１つ以上のシトルリン化ペプチドまたはシトルリン化タンパク質のレベルの減少であり、慢性神経変性疾患を示す。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００６０】
代表的な実施形態において、神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、レヴィ小体認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、脊髄性筋萎縮症、プリオン病、多発性硬化症、脳卒中、退化性神経疾患、脳炎、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはクロイツフェルト・ヤコブ病などがあるが、これらに限定されない。
【００６１】
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿または組織（組織生検材料）のいずれか１つ以上である。
【００６２】
様々な実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルは、質量分析、高分解能質量分析、タンデム型質量分析、結合試験、免疫学的検査、抗体結合もしくは免疫組織化学を用いて検出される。
【００６３】
本明細書では、それを必要とする対象においてＡＬＳを診断する方法を提供する。この方法は、診断を必要とする対象からの試料採取及び対象から採取された生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの検出を含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は、ＡＬＳを示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、ＡＬＳを示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの増加は、ＡＬＳを示す。一実施形態において、対象から採取された試料において、表２、表３、または表４のタンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＡＬＳを有するか、ＡＬＳを有するリスクが高い。別の実施形態において、対象から採取された試料において、
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のペプチドまたはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＡＬＳを有するか、ＡＬＳを有するリスクが高い。代表的な実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６〜３１４に示す配列を有するペプチド中のシトルリン化部位を表２に示す。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３８、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上に示す配列を有するペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＡＬＳを有するか、ＡＬＳを有するリスクが高い。代表的な実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５〜３３８に示す配列を有するペプチド中のシトルリン化部位を表３に示す。代表的な実施形態において、対象から採取された試料のシトルリン化ペプチドの配列のそれぞれは、少なくとも１００％、９５％、９０％、８０％、７０％、または６０％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６〜３３８のいずれかに示す配列と同一である。いくつかの実施形態において、対象から採取された試料において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３９〜４７４にいずれか１つ以上に示す配列を有するペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象はＡＬＳを有するか、ＡＬＳを有するリスクが高い。代表的な実施形態において、対象から採取された試料のペプチド配列のそれぞれは、少なくとも１００％、９５％、９０％、８０％、７０％、または６０％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３９〜４７４のいずれかに示す配列と同一である。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００６４】
本明細書では、それを必要とする対象において神経変性疾患を診断する方法を提供する。この方法は、診断を必要とする対象からの試料採取及び対象から採取された生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの検出を含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は、慢性神経変性疾患を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、慢性神経変性疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの増加は、慢性神経変性疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの減少は、慢性神経変性疾患を示す。一実施形態において、対象から採取された試料において、表５Ａのタンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は慢性神経変性疾患を有するか、慢性神経変性疾患を有するリスクが高い。いくつかの実施形態において、シトルリン化ペプチドは脳に特有のものである。いくつかの実施形態において、シトルリン化ペプチドは脳に特有のものではない。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５００、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上に示す配列（表５Ａ）を有するペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は慢性神経変性疾患を有するか、慢性神経変性疾患を有するリスクが高い。代表的な実施形態において、上記の配列番号に示す配列を有す���ペプチド中のシトルリン化部位を表５Ａに示す。代表的な実施形態において、対象から採取された試料のシトルリン化ペプチドの配列のそれぞれは、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、または６０％が表５Ａに示す配列と同一である。代表的な実施形態において、慢性神経変性疾患の診断に用いることができるペプチドは脳に特有のものであり、表５Ａに示す配列のいずれか１つ以上を含むか、これらの配列から成るか、もしくは本質的にこれらの配列から成る。代表的な実施形態において、慢性神経変性疾患の診断に用いることができるペプチドは脳に特有のものではなく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０１、５０２、５０３、５０６、またはこれらの組み合わせ（表５Ｂ）に示す配列から成るか、もしくは本質的にこれらの配列から成る。代表的な実施形態において、慢性神経変性疾患には、アルツハイマー病（ＡＤ）ならびに他の認知症、パーキンソン病（ＰＤ）ならびにＰＤ関連疾患、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上などがあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００６５】
本明細書では、それを必要とする対象における後天的脳損傷の診断方法を提供する。この方法は、診断を必要とする対象からの試料採取及び対象から採取された生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの検出を含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は後天的脳損傷を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、後天的脳損傷を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの増加は、後天的脳損傷を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの減少は、後天的脳損傷を示す。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４７、またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上で示す配列を有するペプチドの１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は後天的脳損傷を有するか、後天的脳損傷を有するリスクが高い。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、表６Ａ及び／または６Ｂに示す配列を有するペプチドのいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は後天的脳損傷を有するか、後天的脳損傷を有するリスクが高い。代表的な実施形態において、対象から採取された試料のシトルリン化ペプチドの配列のそれぞれは、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、または６０％が表６Ａ及び／または６Ｂのいずれかに示す配列と同一である。代表的な実施形態において、後天的脳損傷には、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、脳疾患、腫瘍、出血、及び他のあらゆる種類の後天��脳損傷が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００６６】
本明細書では、それを必要とする対象において慢性脳疾患を診断する方法を提供する。この方法は、診断を必要とする対象からの試料採取及び対象から採取された生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの検出を含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は、慢性脳疾患を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、慢性脳疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの増加は、慢性脳疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの減少は、慢性脳疾患を示す。一実施形態において、対象から採取された試料において、表７の分泌タンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は慢性脳疾患を有するか、慢性脳疾患を有するリスクが高い。一実施形態において、対象から採取された試料において、表８の非分泌タンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は慢性脳疾患を有するか、慢性脳疾患を有するリスクが高い。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、シンタキシン結合タンパク質１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ヒストンＨ４もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、細胞質ダイニン１重鎖１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ダイナミン−１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ガンマ−エノラーゼもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、エンドプラスミン前駆体もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１２Ａもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、セリン／スレオニン−タンパク質ホスファターゼＰＰ１−アルファ触媒サブユニットもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、カレルティキュリン前駆体もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、コロニン−１Ａもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、電子伝達フラビンタンパク質サブユニットベータもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ヘモグロビンサブユニットベータもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ３もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１２もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、６０Ｓリポソームタンパク質Ｌ４もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、６０Ｓ酸性リポソームタンパク質Ｐ２もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、セプチン−７もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、アラニン−ｔＲＮＡリガーゼ、細胞質もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、もしくはこれらの組み合わせから選択された分泌タンパク質の１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は慢性脳疾患を有するか、慢性脳疾患を有するリスクが高い。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、シナプシン−１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、アコニテート水添加酵素もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、コンプレキシン−１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、コンプレキシン−２もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、バンド４．１様タンパク質３もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、シナプシン−２もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ＡＰ２関連タンパク質キナーゼ１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、アルファ−アデュシンもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ＡＰ−２コンプレックスサブユニットベータもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼＤＣＬＫ１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、グルタミナーゼ腎臓アイソフォームもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、イソシトレート脱水素酵素［ＮＡＤ］サブユニットアルファもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、セリン／スレオニン−タンパク質ホスファターゼ２Ｂ触媒サブユニットアルファアイソフォームもしくはそのシトルリン化されたフラグメント、もしくはこれらの組み合わせから選択された非分泌タンパク質の１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は慢性脳疾患を有するか、慢性脳疾患を有するリスクが高い。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００６７】
本明細書では、それを必要とする対象において急性脳疾患を診断する方法を提供する。この方法は、診断を必要とする対象からの試料採取及び対象から採取された生物学的試料中のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの検出を含む。いくつかの実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの存在は、急性脳疾患を示す。いくつかの実施形態において、基準値に対するシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、急性慢性脳疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの増加は、急性脳疾患を示す。一実施形態において、基準値に対するタンパク質のシトルリン化またはペプチドのシトルリン化のレベルの減少は、急性脳疾患を示す。一実施形態において、対象から採取された試料において、表９の分泌タンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は急性脳疾患を有するか、急性脳疾患を有するリスクが高い。一実施形態において、対象から採取された試料において、表１０の非分泌タンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は急性脳疾患を有するか、急性脳疾患を有するリスクが高い。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、カリン関連ＮＥＤＤ８解離タンパク質１もしくはそのシトルリン化されたフラグメント、ペルオキシレドキシン−５もしくはそのシトルリン化されたフラグメントまたはそれらの組み合わせから選択された分泌タンパク質のいずれか１つ以上にシトルリン化の変化が認められる場合は、その対象は急性脳疾患を有するか、急性脳疾患を有するリスクが高い。さらなる実施形態において、対象から採取された試料において、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｏ）サブユニットガンマ−３前駆体もしくはそのシトルリン化されたフラグメントにシトルリン化の増加が認められる場合は、その対象は急性脳疾患を有するか、急性脳疾患を有するリスクが高い。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００６８】
本明細書では、それを必要とする対象において神経変性疾患を治療する方法も提供する。この方法は、本明細書で説明する方法によって神経変性疾患を診断すること、神経変性疾患と診断された対象に対し、その対象の神経変性疾患を治療するため有効量の治療薬を投与することを含む。代表的な実施形態において、神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、レヴィ小体認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、脊髄性筋萎縮症、プリオン病、多発性硬化症、脳卒中、退化性神経疾患、脳炎、またはクロイツフェルト・ヤコブ病などがあるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、治療には、治療的ライフスタイル変更、治療薬、外科的治療またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上などがあるが、これらに限定されない。代表的な実施形態において、ライフスタイル変更には、健康食、身体活動、体重管理、ストレス管理、禁煙またはこれらの組み合わせのいずれか１つ以上などがある。
【００６９】
代表的な実施形態において、アルツハイマー病の治療薬としては、コリネステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンなど）、メマンチン（ナメンダ）、ビタミンＥ、代替療法（例えば、カプリン酸及びココナッツ油、コンサーンズ、コエンザイムＱ１０、コーラルカルシウム、イチョウ、フペルジンＡ、オメガ−３脂肪酸、ホスファチジルセリン、トラミプロサート）、またはその組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。適切な治療及び投薬量は当業者にとっては明らかであろう。
【００７０】
代表的な実施形態において、パーキンソン病の治療薬には、カルビドパ／レボドパ、ドーパミン拮抗剤、モノアミン酸化酵素阻害剤、抗コリン薬、手術、ライフスタイル変更、代替療法（例えば、抗酸化剤のビタミンＣ及びＥ、地中海食、カルシウム及びビタミンＤ、コエンザイムＱ１０、葉酸塩（葉酸）、ショウガ（ショウキョウ）、イチョウ、緑茶ポリフェノール（ＧＴＰ）、オオアザミ（マリアアザミ）、セントジョーンズワート（セイヨウオトギリソウ）、ビタミンＢ１２）またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。適切な治療及び投薬量は当業者にとっては明らかであろう。
【００７１】
代表的な実施形態において、ハンチントン病の治療法には、治療薬及び精神療法、言語療法、理学療法、作業療法またはこれらの組み合わせなどの療法などがある。ハンチントン病の代表的な治療剤には、テトラベナジン（ゼナジン）、抗精神病薬、（例えばハロペリドール（ハルドール）など）、アマンタジン、レベチラセタム（ケプラ）、クロナゼパム（クロノピン）またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。適切な治療及び投薬量は当業者にとっては明らかであろう。
【００７２】
代表的な実施形態において、運動失調の治療薬には、リルゾール、抗グルタミン酸作動薬、ニコチン受容体拮抗薬、セトロニン作動療法、ＧＡＢＡ作動療法、コリン作動療法、チャネル安定化療法（例えば、炭酸脱水酵素阻害剤など）、インスリン様成長因子、サプリメント（例えば、ビタミンＥなど）またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。適切な治療及び投薬量は当業者にとっては明らかであろう。
【００７３】
代表的な実施形態において、脊髄性筋萎縮症の治療法には、正しい食生活、治療薬及び精神療法、言語療法、理学療法、作業療法またはこれらの組み合わせなどの療法などがある。脊髄性筋萎縮症の治療薬には、例えば、バクロフェン、チザニジン、ならびにベンゾジアゼピンなどの痙縮を緩和する筋弛緩薬、顎の痙攣や流涎症を治療するボツリヌス毒素、アミトリプチリン、唾液過剰を治療するグリコピロレート及びアトロピンもしくは唾液腺へのボツリヌス毒素注射、抑鬱症を治療する抗鬱薬などがあるが、これらに限られない。適切な治療及び投薬量は当業者にとっては明らかであろう。
【００７４】
代表的な実施形態において、プリオン病の治療薬には、キナクリン、ペントサン、ポリ硫酸塩（ＰＰＳ）、四環性化合物またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書に記載のプロセス、検査及び方法の様々な実施形態において、基準値は、例えば、表２〜１０に示すシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化に基づく。一実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、神経細胞における変化である。別の実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、非神経細胞における変化である。付加的な実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、任意の細胞における変化である。付加的な実施形態において、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドのレベルの変化は、任意の体液における変化である。いくつかの実施形態において、基準値は、神経変性疾患を有していない対象の集団におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルの平均値または中央値である。他の実施形態において、基準値は、神経変性疾患を有するが治療を受けており、シトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現を示さないか減少を示す対象の集団のシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルの平均値または中央値である。付加的な実施形態において、基準値は、例えば、神経変性疾患の診断時、神経変性疾患の治療前、神経変性疾患の治療後またはこれらの組み合わせなど、異なる（例えば、より早期の）時点で対象から採取された試料におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルである。代表的な実施形態において、神経変性疾患には、ＡＬＳ、アルツハイマー病、脳卒中、慢性脳疾患、急性脳疾患またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、シトルリン化の変化は、本明細書で定義される「差次的に存在する」シトルリン化のことをいう。
【００７６】
様々な実施形態において、神経変性疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルは、基準値と比較して、少なくとも、もしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％高い。様々な実施形態において、神経変性疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルは、基準値と比較して、少なくとも、もしくは約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍またはこれらの組み合わせの倍数高い。代表的な実施形態において、神経変性疾患には、ＡＬＳ、アルツハイマー病、脳卒中、慢性脳疾患、急性脳疾患またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。
【００７７】
様々な実施形態において、神経変性疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルは、基準値と比較して、少なくとも、もしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低い。様々な実施形態において、神経変性疾患を有しているか、もしくは有していると疑われる対象におけるシトルリン化タンパク質またはシトルリン化ペプチドの発現レベルは、基準値と比較して、少なくとも、もしくは約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍またはこれらの組み合わせの倍数低い。代表的な実施形態において、神経変性疾患には、ＡＬＳ、アルツハイマー病、脳卒中、慢性脳疾患、急性脳疾患またはこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００７８】
実施例１：実験方法
試薬及び材料
以下の試薬を入手した：ウサギ骨格筋ＰＡＤカクテル（ＰＡＤ）（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）、ＰＡＤ２（Ｓｉｇｍａ）、ヘビーメロミオシン（ＨＭＭ）、トロポミオシン（ＴＭ）（Ｓｉｇｍａ）、Ｆ−アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｉｎｃ）、心臓トロポニン（ＴｎＩ）（Ａｂｃａｍ）、抗修飾シトルリン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、配列決定グレードＬｙｓ−Ｃタンパク質分解酵素（ＷＡＫＯ）、及びタンパク質分解酵素阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ）。
【００７９】
ヒト心臓組織
左心室組織試料はインフォームドコンセント後に現地の倫理委員会の承認を得て、オーストラリア、シドニー大学のＣｒｉｓ  Ｄｏｓ  Ｒｅｍｅｄｉｏｓから入手した。試料は、以前記載されたように、心臓移植術の際にＨＦ患者（虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）及び特発性心筋症（ＩＤＣＭ）、それぞれｎ＝１０）及び非不全ドナー心臓（ｎ＝１０）から採取した［Ｚｈａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１２，１２６：１８２８−１８３７］。
【００８０】
マウス心臓組織及び新生仔筋細胞
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）（５日齢の新生仔マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を入手した。動物試験は、ジョンズ・ホプキンズ大学動物実験委員会の承認を受け、規定されたＮＩＨ指針に従った。簡潔には、初代培養心室筋細胞を新生仔マウスから単離した。コラゲナーゼ消化単離筋細胞を、Ｃａ２＋濃度を増大させながらバッファー中でインキュベートし、最終濃度をＭＥＭ培地と同様の１．２ｍＭ  Ｃａ２＋とした。細胞を、ラミニンをコートした６ウェルのプレートまたは６０ｍｍのシャーレに２５，０００桿状筋細胞／ｍｌで播種した。５％ＣＯ２で３７℃で１時間インキュベートした後、培地を交換して付着していない細胞を除去した。
【００８１】
タンパク質抽出及びＳＷＡＴＨ  ＭＳ
インシークエンスプロトコルを用いて、心臓を筋フィラメントリッチの画分と細胞質基質リッチの画分とに分画した［Ｋａｎｅ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｔｉｓｓｕｅ：ｔｈｅ“ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ”ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７，３５７：８７−９０］。亜画分からのタンパク質抽出及びＬｙｓＣペプチドの生成は、濾過補助試料調製（ＦＡＳＰ）プロトコル［２４］を用いて行った。必要な場合、組み換えタンパク質またはインシークエンス画分をＰＡＤのカクテルと１：２０の比で、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２中、３７℃で２時間インキュベートした。消化前に５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止した。ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ６６００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）を、ペプチドのスペクトルイオンライブラリを構築するためのデータ依存性取得とそれぞれの個別試料の分析のためのＳＷＡＴＨ−ＭＳ（データ依存性取得）の両方に用いた。生データをＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）ソフトウェア５．０で検索してスペクトルイオンライブラリを作成した。個々のＳＷＡＴＨ−ＭＳのランを、筋フィラメントリッチの画分と細胞質基質リッチの画分の両方について、ＰＡＤ（プラス及びマイナスＰＡＤ）の存在下もしくは非存在下で作成されたスペクトルライブラリとマッチングした。（データ補遺を参照されたい）。
【００８２】
シトルリン化試料の作製
組み換えタンパク質及びインシークエンスから得た画分を、ＰＡＤ２と１：２０の比で、作業バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中３７℃で２時間インキュベートした。５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止した。
【００８３】
ペプチド、タンパク質、及びシトルリン化残基の統計的確認：合格基準
データ補遺に記載のワークフローを用いてバイオインフォマティクス分析を行った。本試験で用いるペプチドの正規化はｉＲＴペプチド保持時間に基づいたものであり、［Ｅｓｃｈｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｉｎｇ  ｉＲＴ，ａ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１２，１２：１１１１−１１２１］、正規化された値を下流の分析に用いた。アンサンブルタンパク質ＩＤ登録番号を、それらの関連するコード化アンサンブル遺伝子のエントリーに戻ってマッピングした。データの解析及びマイニングはｉＰｒｏＸｐｒｅｓｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｏｒｇ／ｉｐｒｏｘｐｒｅｓｓ２）［Ｎａｔａｌｅ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１４，４２：Ｄ４１５−４２１］及びＣｙｔｏｓｃａｐｅ［Ｓａｉｔｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｖｅｌ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  ｐｌｕｇｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２，９：１０６９−１０７６］を用いて行った。それぞれのペプチドについてのクラスカル・ワリス検定（ノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡ）を用いてｐ値を算出した。生化学的変化の有意性は、全ての対データに関し差異についてのｔ検定（ｐ≦０．０５）を行って判定した。特に明記していない限り、全ての生化学的検査は３回繰り返した。
【００８４】
シトルリン化についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロット
１：２０００希釈の抗シトルリン（修飾）抗体を１ＤＥウエスタンブロット（データ補遺を参照）に用いた。
【００８５】
２次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）
プロテオミクスデータの独立検証は、以前の報告通り、蛍光２ＤＥゲル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ、ｐＩレンジ及びＳＤＳ  ＰＡＧＥレンジ）を用いて行った［Ｍａｔｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８，３３：１２−１７］。ＰＡＤ２による試料の処理を用いて、修飾タンパク質内の特定のアルギニン残基からグアニジノ基を除去し、処理後のタンパク質の電荷の変化に基づいてシトルリン化タンパク質を同定することができる（データ補遺を参照）。
【００８６】
膜透過筋細胞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取した左心室組織を液体窒素で急速冷凍し、−８０℃で保存した。分析のため、記載されたように組織を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びタンパク質分解酵素阻害薬ならびにホスファターゼ阻害薬の存在下で均質化した［Ｋｉｒｋ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｓａｒｃｏｍｅｒｅ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＧＳＫ−３ｂｅｔａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４，１：１２９−３８］。筋細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いずに洗浄して界面活性剤を除去し、分離バッファーに再分散した。ＰＡＤ２を１０ｍＭ  Ｃａ２＋及び５０ｍＭ  ＤＴＴ中、３７℃で６０分間活性化した。次いで、ＰＡＤ２で処理した筋細胞を１：１０希釈の活性化ＰＡＤ２に、分離バッファー中、室温で３０分間曝露した。その後、筋細胞を、力変換器及びモーターアームに装着された直径１５０μｍのミニューシアピン（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）の先端にシリコーンで接着した。筋節長をビデオカメラ（Ｉｍｐｅｒｘ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）でモニターし、Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  Ｖｉｄｅｏ  Ｓａｒｃｏｍｅｒｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）によって算出した。筋細胞の筋節長は２．１μｍに設定した。筋細胞の完全な活性化は実験の開始時及び終了時に発生し、記載されるように、＞１０％のランダウンがあった場合は筋細胞を廃棄した［Ｋｉｒｋ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｓａｒｃｏｍｅｒｅ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＧＳＫ−３ｂｅｔａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４，  １：１２９−３８］。
【００８７】
ＡＴＰアーゼの活性
ＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性は、以前記載された３回の独立した実験において分析した［Ｗｈｉｔｅ  ＨＤ．Ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８２，８５：６９８−７０８、Ｔａｕｈａｔａ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｍｙｏｓｉｎ−Ｖａ  ｔｏ  Ｆ−ａｃｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＡＴＰ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１，２７６：３９８１２−３９８１８］。１回目の実験は、シトルリン化もしくは非シトルリン化ＨＭＭ及び／またはＦ−アクチンを用い、一定のＨＭＭ及びＦ−アクチン濃度で行った。２回目は、ＴＭ濃度（シトルリン化または非シトルリン化）を上げてＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性を測定した。３回目の実験のＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性は、シトルリン化または非シトルリン化ＴｎＩを用い、一定のＨＭＭ、Ｆ−アクチン、及びＴＭ濃度で測定した。それぞれの実験は、３重反復かつ３回の別個の時点で行った。
【００８８】
アクチン結合実験
種々の濃度のシトルリン化タンパク質及び非シトルリン化ＨＭＭ、ＴＭ、及び／またはＴｎＩをＦ−アクチンに添加し、遠心分離して結合の程度を測定した。ペレット及び上澄み液を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて分析し、以前記載されたように、それぞれのタンパク質の量をデンシトメトリーによって定量した［Ｓｋｏｒｚｅｗｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９，２：２３７−２４３、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｍｙｏｓｉｎ−Ｖ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６，２７１：１７５６１−１７５６９］。それぞれの試験は３重反復で行った。
【００８９】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
製造元のプロトコルに従い、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いてマウス新生仔心筋細胞から全ｍＲＮＡを抽出した。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造元の指示に従って生成した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４、及びβ−アクチンに特異的なプライマーを用いて行った。ＰＣＲ生成物を、１．８％アガロースゲル上で電気泳動によって分離しＵＶ光で可視化した。それぞれの試験は２重反復で行った。
【００９０】
１Ｄ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット
製造元の指示に従い、ウェルあたり１０ｕｇのタンパク質を、１２ウェルの４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて１Ｄ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜の上にブロットした。ブロットされた膜をダイレクトブルーで染色して画像を走査した後、修飾試薬［１体積の１％ジアセチルモノキシム／０．５％アンチピリン／１Ｎ  酢酸、及び２体積の０．０２５％  ＦｅＣｌ３を含有する８５％Ｈ３ＰＯ４／９８％Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ（２０／２５／５５）の混合物］と、遮光下で３７℃で一晩インキュベートした。膜をブロッキングし、１：２０００の抗修飾シトルリン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて４℃で一晩プロービングし、その後洗浄して、二次抗体（ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ、１：１００００希釈）と共に１時間インキュベートした。結合した抗体は、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の説明の通り化学発光基質によって可視化した。現像時に、フィルムをＥｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  １００００  ＸＬスキャナー（Ｅｐｓｏｎ，ＵＳ）でスキャンし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍツールにインポートした。スチューデントのｔ検定を用いて群間の統計的な差異を判定した。ｐ値＜０．０５の場合に統計的に有意と考えた。
【００９１】
試料の脱イミノ化、Ｃｙ標識、２−ＤＥ分離
重量が約１５０ｍｇの心臓の試料を先に述べたように亜分画した。各画分の脱イミノ化のため、全体積１００ｕＬの２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／２０ｍＭ  ＣａＣｌ２中で、１．５ｍｇの細菌性ＰＡＤ２で処理した。同一量の各試料を酵素が無いこと以外は同一の条件で処理した。試料を５０℃で２時間インキュベートした後、ＤＩＧＥ標識バッファー（７Ｍ  尿素／２Ｍ  チオ尿素／４％ＣＨＡＰＳ／３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５）と混合し最終濃度７０ｕｇ／１１０ｕＬとした。Ｃｙ染料を添加し（３２００ｐｍｏｌ／４００ｍｇアリコート）、アリコートを室温、暗所で３０分間インキュベートした。染料４００ｐｍｏｌあたり１ｍＬの１０ｍＭ  リジンを添加して反応を停止した。プールした標準物質をＣｙ２で標識し、ＰＡＤ２で処理していない試料をＣｙ３で標識し、さらにＰＡＤ２で処理した試料をＣｙ５で標識した。上記のように標識されたプールした標準物質、試料＋ＰＡＤ２及び試料−ＰＡＤ２のアリコート１５０ｕｇを混ぜ合わせ、ＩＥＦバッファー（７Ｍ  尿素／２Ｍ  チオ尿素／４％ＣＨＡＰＳ／１％  ＤＴＴ／１％  ３−１０両性電解質）で希釈し最終体積３５０ｕＬとした。調製した試料を１８ｃｍの固定化リニアｐＨ勾配（４〜７）ストリップ（ＩＰＧ，ＢｉｏＲａｄ）に塗布し、２０℃で１２時間能動的再水和を行った。等電点分画電気泳動（ＩＥＦ）のために、バイオラッドプロテアンＩＥＦ細胞を２０℃において以下の条件で用いた：ステップ１：目標電圧２００Ｖで１時間、ステップ２：目標電圧５００Ｖで１時間ランピング、ステップ３：目標電圧５００Ｖで１時間、ステップ４：目標電圧１０００Ｖで１時間ランピング、ステップ５：目標電圧１０００Ｖで２時間、ステップ６：目標電圧１０００Ｖで２時間ランピング、ステップ７：５００００Ｖ／時間（約６時間）。ＩＥＦ後、製造元の指示に従ってストリップを平衡化した。次いで、１０％ゲルを用いて２−ＤＥの２次元目を実施し、一定電圧（８０Ｖ）で３０〜６０分間、その後一定電圧（２００Ｖ、２００ｍＡ）で６時間電気泳動した。ＤＩＧＥゲルをＴｙｐｈｏｏｎ９４１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、差次的に発現したタンパク質が変色して見える種々の発光波長でスキャンした。分取用ゲルを銀染色で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０でスキャンした。
【００９２】
画像分析
スモールゲルはＥｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  １００００  ＸＬ（Ｅｐｓｏｎ  Ａｍｅｒｉｃａ）を用いてスキャンし、ラージゲルはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてスキャンした。差次的に発現したタンパク質を（ＰＡＤ２で処理した場合と処理していない場合との比較で）、スポットの検出、マッチング、及び分析のためにＬｕｄｅｓｉ  ＲＥＤＦＩＮ解析を用いて同定した（Ｌｕｄｅｓｉ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｄｅｓｉ．ｃｏｍ）。Ｌｕｄｅｓｉ  ＲＥＤＦＩＮ解析は、差次的インゲル解析（ＤＩＡ）と、その後の生物学的差異分析（ＢＶＡ）の２ステップで行った。ＤＩＡはＣｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５についての蛍光強度からタンパク質の体積を定量し、比Ｃｙ３／Ｃｙ２（内部標準に対する非ＰＡＤ２処理の比）及びＣｙ５／Ｃｙ２（内部標準に対するＰＡＤ２処理の比）を算出する。その後、値を画像ごとのタンパク質の量は同一であるという過程に基づいて正規化する。２−ＤＥゲルの画像をＲＥＤＦＩＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｄｅｓｉ．ｃｏｍ）でスチューデントのｔ検定を用いて解析し群間の統計的な差を判定した。ｐ値＜０．０５の場合に統計的に有意と考えた。次いで、対象のスポットをゲルから切除し、脱色してトリプシンでインゲル消化した。消化された試料を、以下に述べるようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。  
【００９３】
インゲルタンパク質消化及びペプチドの同定
短くしたピペットを用いて対象のスポットをゲルから摘出し、小さなエッペンドルフチューブに入れ、３０ｍＭ  フェリシアン化カリウム及び１００ｍＭ  チオ硫酸ナトリウムを用いて脱色した。再蒸留水でさらに洗浄後ゲルプラグを乾燥して還元及びアルキル化試薬中で直接再水和した後、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ  ８．８溶液中で０．１  μｇ／μｌ  トリプシン（トリプシンウルトラグレード配列決定グレード、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）で消化した。消化は氷上で１時間行い、次いで余分な溶液を除去してゲルプラグを１００ｕｌの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３に浸し、３７℃で一晩インキュベートした。ペプチドをＺｉｐＴｉｐで脱塩し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００ナノＬＣシステムと連動するＬＴＱイオントラップＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【００９４】
質量分析
それぞれのヒト心臓を、インシークエンスプロトコルを用いて筋フィラメントリッチの画分と細胞質基質リッチの画分に分画した［Ｋａｎｅ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｔｉｓｓｕｅ：ｔｈｅ“ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ”ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００，３５７：８７−９０］。タンパク質抽出物を、ＬｙｓＣ（１：２０）で消化する前に、濾過補助試料調製（ＦＡＳＰ）プロトコル（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ／２２６３５６／ＦＡＳＰ）を用いて変性、還元、アルキル化した。外来性の内部保持時間標準をそれぞれのペプチド画分に添加した（ＩＲＴ、会社及び参照［Ｅｓｃｈｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｉｎｇ  ｉＲＴ，ａ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１２，１２：１１１１−１１２１］）。シトルリン化プロテオームの深さの最大化を行うため、ＰＡＤカクテルを用いて心組織溶解質のインビトロでのシトルリン化を行った後、ＬｙｓＣでタンパク質消化を行った。スペクトルイオンライブラリをＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ６６００  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦでのデータ依存性取得によって構築し、生データをＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ５．０で検索しスペクトルイオンライブラリを作成した。それぞれの個人から採取した２つの画分を、順次６６００  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦでのデータ依存解析（ＳＷＡＴＨ−ＭＳ）を用いて分析した。ペプチドのデータに高信頼度のシトルリン化ペプチド／スペクトル割り当て（＞９５％信頼度）が少なくとも１つ含まれ、マッピングされるタンパク質の信頼度が＞９５％の場合、ペプチドのデータをさらなる分析のために保持した。リバースヒューマンデータベースの検索から得られたペプチド及びタンパク質プロフェットの閾値、すなわち反転したヒトのデータベースから得られた本試験についての全体的な誤発見率は、ペプチドとタンパク質のレベルでそれぞれ約＜０．１％であると見積もられた。重要なことには、標的としたプロテオームの実験についての正確な感度と選択性を規定するため、それぞれのシトルリン化ペプチドの転移を選択して検証した。各ウインドウについて２０ｍｓのドウェル時間を有する２００個の可変ＳＷＡＴＨウインドウを用いて、４００〜１２５０ｍ／ｚの範囲のＳＷＡＴＨ−ＭＳフラグメントイオンマップを（内因性試料から）作成した。ＤＤＡ及びＳＷＡＴＨの実験の場合、ソースの条件は以下の通りである。スプレー電圧を２．４ｋＶに設定し、ソースガスを５に設定し、カーテンガスを３０に設定し、インターフェースヒーター温度を８０に設定し、及びデクラスタリング電位を１００に設定した。ＤＤＡの測定におけるＭＳ２の実験については転がり衝突エネルギーを用いた。ＤＤＡとＳＷＡＴＨの測定のいずれの場合も、ペプチドを、ｅｋｓｐｅｒｔ（商標）ｃＨｉＰＬＣ及びｅｋｓｐｅｒｔ（商標）ｎａｎｏＬＣ  ４００オートサンプラーを装備したＥｋｓｉｇｅｎｔ  ｅｋ��ｐｅｒｔ（商標）４１５  ｎａｎｏＬＣを用いて分離した。試料を、１００％溶媒Ａ（０．１％ギ酸水溶液）中、流速２μＬ／分で１０分間トラップカラム（ｎａｎｏ  ｃＨｉＰＬＣ  Ｔｒａｐ  ２００μｍ×０．５ｍｍ  ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８−ＣＬ  ３μｍ  １２０Å）に投入し、次いで、ｎａｎｏ  ｃＨｉＰＬＣ  ７５μｍｘ１５ｃｍ  ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８−ＣＬ  ３μｍ  １２０Åカラムを用い、流速３００ｎＬ／分、直線勾配５〜３５％の溶媒Ｂ（０．１％のギ酸のアセトニトリル溶液）で１２０分間、３５〜８５％の溶媒Ｂで２分間、８５％に保持して５分間、その後５％Ｂで再平衡化１７分間の条件でそれらを分離した。
【００９５】
検証されたシトルリン化スペクトルイオンライブラリの構築
イオンライブラリに存在する非修飾（非シトルリン化）の形態を有するペプチドとシトルリン化された形態を有するペプチドとのペア間の保持時間（ＲＴ）の差、及びＮ／Ｑ脱イミノ化された形態を有するペプチドとシトルリン化された形態を有するペプチドの間のＲＴの差に基づいて、検証されたシトルリン化ペプチドイオンライブラリを構築した。本発明者らのデータによると、同一のペプチド配列の非修飾の形態とシトルリン化された形態との間のＲＴの差（他にいかなる修飾も無い場合）は平均１０分で、シトルリン化ペプチドの方がより長い保持時間を有していたが、これに対してＮ／Ｑ脱イミノ化では平均で約２．５分のＲＴのシフトが生じたことが観察された。従って、ペアの非修飾形態またはペアのＮ／Ｑ脱イミノ化形態を有するシトルリン化ペプチド配列で、ＲＴ差が５分より大きいものはイオンライブラリにおいて選択されたトランジションイオンを変更しなかった。ＲＴ差がペア間で５分未満のシトルリン化ペプチドの場合、または標準物質として使用される非修飾形態が無い場合は、シトルリン化ペプチドを非修飾またはＮ／Ｑ脱イミノ化形態と明確に区別できると思われるトランジションイオンをマニュアルで選択し、シトルリン化部位を明確に区別できないあらゆるトランジションをイオンライブラリから除外した。このペプチドのサブセットの場合、シトルリン化ペプチドをライブラリに組み込むには固有のトランジションが５つ必要であった。各タンパク質について検証されたシトルリン化ペプチドに加え、最大１０個の非修飾ペプチドが、全タンパク質の定量化のライブラリに組み込まれた。
【００９６】
ＳＷＡＴＨデータの分析
検証されたイオンライブラリをＰｅａｋＶｉｅｗ  ２．１版にインポートし、ＳＷＡＴＨファイルをＳＷＡＴＨ  ｍｉｃｒｏａｐｐ  ２．０版にロードした。抽出の設定は以下の通りである：タンパク質あたりペプチド３０個、ペプチドあたりトランジション５個、９５％ペプチド信頼度カットオフ、ＦＤＲ閾値１％、ＸＩＣ抽出ウインドウ５分及び許容差０．０５Ｄａ。
【００９７】
共沈降試験
実質的に先に記載された通りに５μＭ  Ｆ−アクチンとのＴＭの共沈降（０〜２ｕＭ）によって結合試験を行い、次の修正を加えて行った。［Ｓｋｏｒｚｅｗｓｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２００９，２：２３７−２４３］。ＴＭ単独の結合は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１００ｍＭ  ＮａＣｌで分析した。全ての試験化合物を混合した後、確実に定常状態とするため試料を室温で約０．５時間インキュベートした。タンパク質混合物をＢｅｃｋｍａｎ  ｒｏｔｏｒ  ＴＬＡ  １００．２にて６０，０００ｒｐｍで２５分間超遠心した。ペレット中のタンパク質の組成及び上澄み液に残存する遊離ＴＭの量を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クマシーブルーで染色したゲルをスキャンし定量した。ペレット化したＦ−アクチンのＳＤＳゲルのバンドの強度は同様であった。アクチンに結合したＴＭは、飽和に達した最大の比に対して正規化されたＴＭ／アクチンのバンド強度の比として算出した。未結合ＴＭの濃度は、上澄み液に残存するＴＭのバンド強度から算出した。
【００９８】
ミオシンＨＭＭに誘発されるＦ−アクチンへのＴＭの結合
Ｆ−アクチン（５μＭ）及びＴＭ（１μＭ、シトルリン化または対照）を、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ  ７．０中で、ＨＭＭ（０〜３．５μＭ）と混合した。この混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いでＴＬＡ−１００．２ローターにて１５℃、６０，０００ｒｐｍで２５分遠心分離した。ペレットに沈殿したタンパク質の組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びデンシトメトリーで分析した［Ｓｌｉｗｉｎｓｋａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｈｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．２００８，４：１３４１−］。
【００９９】
ＨＭＭ−ＡＴＰアーゼ試験。この試験は、Ｗｈｉｔｅによる記述にいくつか修正を加えて行った［Ｗｈｉｔｅ  ＨＤ．Ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８２，８５：６９８−７０８］。全ての試験は、最終濃度をＦ−アクチン  ０．２ｍｇ／ｍｌ及びＨＭＭ  ０．０２ｍｇ／ｍｌとした３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５を含有するバッファー中２２℃で行った。存在する場合、非シトルリン化またはシトルリン化ＴＭをＦ−アクチンに加え、最終モル濃度を０〜２μＭ  ＴＭとした。ＨＭＭ−アクチン−ＴＭ−ＴｎＩ試験は上述したように、Ｆ−アクチン：ＴＭ：ＴｎＩのモル比それぞれ７：１：１で、シトルリン化されたＴｎＩまたはシトルリン化されていないＴｎＩを用いて行った。調整したアクト−Ｓ１システムの感度を評価するため、全ての検査を、カルシウムの存在下（０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）及び非存在下（２ｍＭ  ＥＧＴＡ）の両方を並行して行った。４ｍＭ  ＡＴＰを添加して全ての反応を開始した。遊離リン酸塩の量は、６５０ｎｍで熱量測定により測定した。全ての試験を線形範囲内で行い、それぞれの試験は３重反復で行った。
【０１００】
実施例２
心筋のシトルリン化タンパク質の同定
心臓のシトルリン化された標的を同定するため、ＳＷＡＴＨ−ＭＳ［３４］を用いて、ＩＳＨＤ群、ＩＤＣＭ群、非不全ドナー心臓群の３つの群（群あたり、ｎ＝１０）におけるシトルリノームを評価した。ＳＷＡＴＨ−ＭＳによりこの定量が可能となった。非不全対照群と比較して、５３か所のシトルリン化部位がＨＦにより変化した（ｐ＜０．０５）。これらを表１Ａに記載する。
【０１０１】
（表１Ａ）シトルリン化ペプチド配列を有するシトルリン化タンパク質（ｐ＝０．０５）の一覧。「Ｄｅａ」はシトルリン化または脱アミノ化である。「ＣＡＭ」はカルバミドメチル化である。シトルリン化タンパク質は細胞の成分でグループ化した。ＵＰ識別子＝ユニバーサルプロテイン（ＵＰ）リソースのタンパク質ＩＤ、ｐ＿ｋｗ＝クルスカル・ワリス検定のｐ値（統計値）。
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【０１０２】
表１Ｂは本試験で見出された全てのシトルリン化ペプチドを示す。これらは、転写ならびにクロマチン構造、細胞骨格ならびに収縮、細胞信号伝達プロセスならびに代謝の制御因子を含む多様な細胞機能を有するタンパク質である（図１）。
【０１０３】
（表１Ｂ）本試験で見出された全てのシトルリン化ペプチド。「Ｄｅａ」はシトルリン化または脱アミノ化である。「ＣＡＭ」はカルバミドメチル化である。
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【０１０４】
（表１Ｃ）健常対象群と虚血対象群、及び健常対象群とＩＤＣＭ対象群の比較における、上方制御または下方制御されるシトルリン化ペプチド。Ｉ：虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）、Ｉ／Ｎ＝虚血群と正常（健常）群の比較、ＩＤ＝特発性心筋症（ＩＤＣＭ）、ＩＤ／Ｎ＝ＩＤＣＭ群と対照（健常）群の比較。
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【０１０５】
（表１Ｄ）健常対象群と虚血対象群、及び健常対象群とＩＤＣＭ対象群の比較における、上方制御または下方制御されるシトルリン化ペプチド。Ｉ：虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）、Ｉ／Ｎ＝虚血群と正常（健常）群の比較、ＩＤ＝特発性心筋症（ＩＤＣＭ）、ＩＤ／Ｎ＝ＩＤＣＭ群と対照（健常）群の比較。
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【０１０６】
（表１Ｅ）Ｉ群及びＩＤ群の両方でアップであったタンパク質。Ｉ：虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）、Ｉ／Ｎ＝虚血群と正常（健常）群の比較、ＩＤ＝特発性心筋症（ＩＤＣＭ）、ＩＤ／Ｎ＝ＩＤＣＭ群と対照（健常）群の比較。
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【０１０７】
（表１Ｆ）Ｉ群及びＩＤ群の両方でダウンであったタンパク質。Ｉ：虚血性心疾患（ＩＳＨＤ）、Ｉ／Ｎ＝虚血群と正常（健常）群の比較、ＩＤ＝特発性心筋症（ＩＤＣＭ）、ＩＤ／Ｎ＝ＩＤＣＭ群と対照（健常）群の比較。
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【０１０８】
抗修飾シトルリン抗体を用いるＩＳＨＤ、ＩＤＣＭ及び非不全ドナーの心臓（ｎ＝１０／群）から採取した筋フィラメントリッチの画分及び高細胞質基質リッチの画分のウエスタンブロッティングにより、シトルリン化が細胞内タンパク質で生じることが確認された。ブロットあたりのバンド数またはバンド密度に関して、群間の全体的な免疫反応性に差は無かったが（図１Ｂ）、インゲル消化及びその後の免疫反応性のバンドの質量分析により、予想される分子量に主要な筋節タンパク質（例えば、ミオシン重鎖及び軽鎖、ならびにアクチン）が同定された。イムノ−１ＤＥによる定量的評価は、ゲルバンドの他のタンパク質の存在、及び質量分析を用いる直接的な部位特定評価の課題によって複雑になったことに留意しなければならない。
【０１０９】
多量に存在する筋節タンパク質のシトルリン化をさらに検証するため、ＤＩＧＥ  ２Ｄゲル電気泳動（ｐＨ４〜７、１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）を行った。ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭ及び非不全ドナーの心臓（ｎ＝４／群）の筋フィラメントリッチの画分及び高細胞質基質リッチの画分を、最大のシトルリン化を誘発するためＰＡＤ２で前処理し、マッチングする未処理試料と１：１の比で混合すると同時に２Ｄゲル電気泳動で分離した。アクチン、ＴＭ及びミオシン軽鎖などの筋節タンパク質が、ＰＡＤ２の異所的処理でシトルリン化されることが示された（図２）。
【０１１０】
修飾筋節タンパク質の生化学的評価
シトルリン化が筋節タンパク質の機能に影響を与えるかどうか試験するため、アクチン、ＨＭＭ、ＴＭ及びトロポニンを異所性ＰＡＤ２でシトルリン化し、次いでそれぞれの非修飾組み換えタンパク質と比較してシトルリン化がこれらの生化学的特性、構造特性、または酵素特性に影響するかどうか判定した。Ｆ−アクチンに対するシトルリン化ＨＭＭ、ＴＭもしくはＴＭ−ＴｎＩ、または未処理のＨＭＭ、ＴＭもしくはＴＭ−ＴｎＩの結合は、古典的な共沈降試験を用いて測定した（図３Ａ〜Ｃ）。アクチンのシトルリン化によってＦ−アクチン形成は変化せず、アクチンの９５％超が遠心分離でペレット化した。Ｆ−アクチンへのシトルリン化ＴＭの結合は非修飾のＴＭと比較して向上した（図３Ａ）。ＴＭ及びＨＭＭは、Ｆ−アクチンとの互いの結合に協同的に影響することがあり得るため［Ｇａｌｉｎｓｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｏｎ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２０１０，１０６：７０５−７１１］、Ｆ−アクチンへのＴＭ単独の結合が乏しいが、Ｆ−アクチンへのミオシン頭部の結合においては増大する条件の下で協同性について試験した［Ｅａｔｏｎ  ＢＬ．Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｆ−ａｃｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７６，１９２：１３３７−１３３９］。図３Ｂに示すように、低塩濃度においてシトルリン化ＴＭは、ＨＭＭ存在下でＦ−アクチンに結合することができた。
【０１１１】
ＴＭ存在下でのＦ−アクチンへの心臓ＴｎＩの結合は、Ｆ−アクチンとＴＭの存在下でシトルリン化ＴｎＩを共沈降することによって行うことができた。心臓ＴｎＩのシトルリン化形態と非シトルリン化形態のいずれもＦ−アクチンに等しくよく結合することが明らかになった（図３Ｃ）。
【０１１２】
ＨＭＭ−ＡＴＰアーゼ活性の阻害
筋節タンパク質のシトルリン化によるアクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼ活性の潜在的な修飾作用を検証するため、シトルリン化ＨＭＭ、Ｆ−アクチン及びＴＭの存在下で実験を行った。図４Ａに要約したデータから、シトルリン化ＨＭＭの存在下で（０．５μｍｏｌ／ＬのＨＭＭ及び７μｍｏｌ／ＬのＦ−アクチン）アクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性が０．３２±０．０１ｎｍｏｌ  Ｐｉから０．２２±０．００２ｎｍｏｌ  Ｐｉに低下し、３０％の酵素活性の低下に相当することが明らかとなった。対照的にＦ−アクチンのシトルリン化の場合は、アクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性が酵素活性で最大５５％向上した（図４Ａ）。Ｆ−アクチンとＨＭＭの両方をシトルリン化した場合は、ＡＴＰ加水分解の速度は対照群より大きい状態を維持した（０．３２±０．０１ｎｍｏｌ  Ｐｉに対し０．３６８±０．００５ｎｍｏｌ  Ｐｉ）。図４Ｂから、アクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性がＴＭのシトルリン化による影響を受けたことが明らかとなった。非シトルリン化ＴｎＩ及びシトルリン化ＴｎＩによってもたらされるアクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの阻害を比較した。ＨＭＭ−Ｆ−アクチン−ＴＭに非シトルリン化ＴｎＩを添加すると、３７℃におけるＡＴＰアーゼの比率が低下した。シトルリン化ＴｎＩは非シトルリン化ＴｎＩと同様に作用し、ＡＴＰアーゼの減少を引き起こしたが非シトルリン化の形態に対する有意差は無かった。
【０１１３】
ＰＡＤ２によって、除膜した筋細胞のカルシウム感受性が低下する
野生型Ｃ５７Ｂ１６雄マウスの左心室から単離し化学的に除膜した心筋細胞を様々な濃度のカルシウムに曝露した（群あたり３匹のマウスからｎ＝８の筋細胞を採取、図４Ｃ〜Ｆ）。ＰＡＤ２処理は、最大カルシウム活性化力（Ｆｍａｘ）とヒル係数（ｎＨ）のいずれにも影響しなかった。しかしながら、ＰＡＤ２は、力とカルシウムの関係においてＥＣ５０の増加またはカルシウム感受性の減少を示す右方向への移動を引き起こす（ｐ＝０．００９、図４Ｃ）。このことから、筋フィラメントタンパク質のシトルリン化によって機能喪失表現型が生じ、その細胞内カルシウムに応答する力を生じる能力が低下することが示唆される。
【０１１４】
ＰＡＤ  ｍＲＮＡ発現の分析
心筋層におけるＰＡＤアイソフォーム発現の細胞特異性を測定するため、単離した心筋細胞及び線維芽細胞においてネステッドＰＣＲによるアイソフォーム特異的プライマーを用いてｍＲＮＡ発現レベルを測定した（図５）。ＰＡＤ２は、心筋細胞及び心臓線維芽細胞の両方で発現する主要なアイソフォームであったが、線維芽細胞ではＰＡＤ１とＰＡＤ４のｍＲＮＡの顕著な発現も認められた。対照的に、ＰＡＤ３のｍＲＮＡは、試験したいずれの細胞型及び条件においても検出されなかった（図５、２００ｂｐにバンドが無いことに留意されたい、より詳細についてはオンラインの補遺を参照されたい）。
【０１１５】
実施例３
本発明者らの実験結果は、正常群及びＨＦ群の心筋層のシトルリン化タンパク質の特性を示す。分析によってシトルリン化がミトコンドリア及び筋節サブプロテオームにおいて増加することが明らかとなった。タンパク質のシトルリン化は広範な細胞に分布しているが（図１）、ミトコンドリア及び筋節サブプロテオームにおいて極めて多い。これら２つのサブプロテオームの間の密接な関係は、筋節のエネルギー要求性が高いことから予期されないことではない。シトルリン化は、ホスホリル化及びアセチル化と同様、協調して筋収縮タンパク質を制御する可能性があると推測した。興味深いことに、代謝経路／代謝に関与する複数の酵素は、虚血性群では上方制御されＩＤＣＭ群では下方制御された（図６）。心臓系におけるシトルリン化タンパク質−タンパク質相互作用のトポロジー及び機能アノテーションを理解するため、ＳＴＲＩＮＧデータベースを用いてタンパク質のネットワークを構築した（図２Ｂ）。全タンパク質ネットワークは、高スコアの相互作用の相手から構成される（ＳＴＲＩＮＧ関連信頼性スコア≧０．５、虚血性群／ＩＤＣＭ群と対照群の比較）。このサブネットワークの目視による解析から、シトルリン化タンパク質は互いに相互作用し、代謝ならびに呼吸鎖の標的、収縮及び情報伝達系に関与することが示された。シトルリン化の潜在的な機能的結果を理解するための最初の評価として、組み換え筋節タンパク質ＨＭＭ、Ｆ−アクチン、ＴＭ及びＴｎＩをモデルタンパク質として用いて、厚フィラメントと細フィラメントの機能を支配する相互作用について検討し、ＰＡＤ２で処理した単一の除膜筋細胞の収縮特性を測定した。
【０１１６】
ＴｎへのＣａ２＋依存性の転換によりアクチン表面でのＴＭの方位角の動きが変化し、この結果、ミオシン結合及び架橋異性化によって強力な結合、力生成状態、筋肉収縮を可能にする。低濃度の細胞内Ｃａ２＋ではＴｎ−ＴＭはアクチンのミオシン結合部位を立体的に遮断するが（遮断状態）、一方で高濃度のＣａ２＋の存在下ではＴｎ−ＴＭは移動してＦ−アクチンのミオシン結合部位を部分的に露出させる（閉鎖状態）。Ｃａ２＋存在下でのミオシン結合は十分な活性化に必要とされる。アクチンフィラメントのＴＭの正確な位置調整に影響するのは、ＴｎＴを経てＴＭに一部伝達されるＣａ２＋誘発性のＴｎＩのコンフォメーション変化（特にＴＭに沿って結合するＴ１領域）ならびにミオシン結合の組み合わせでもある。本発明者らのＭＳデータに基づくと、ミオシン、アクチン、ＴＭ、ＴｎＩ及びＴｎＴのシトルリン化部位は、これらの相互作用、従ってアクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼの活性及び収縮に影響する可能性がある領域にある。以下に、本明細書で提示される生化学的生理学的実験に基づいて潜在的な影響について概説する。
【０１１７】
第一に、固有のアクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼはシトルリン化によって阻害されるが、これはＦ−アクチンの存在下において、Ｆ−アクチンがシトルリン化されているかいないかにかかわらず克服された。シトルリン化Ｆ−アクチンは、ＨＭＭ酵素活性のより強力な調節物質であり、非修飾Ｆ−アクチンと比較してアクトミオシンＨＭＭ−ＡＴＰアーゼを５５％増加させた。このことから、Ｆ−アクチンのシトルリン化はアクチンフィラメントのコンフォメーションを変化させ、結合した時点でミオシンによるＡＴＰの加水分解の容易さを変化させることが示唆される。アクチン−ＨＭＭ相互作用はＴＭのシトルリン化によっても影響を受けた。シトルリン化ＴＭは、非シトルリン化ＴＭと比較してＦ−アクチンにより強固に結合した。これはＨＭＭの存在下においても認められた（遠心分離分析に基づく）。これは、非シトルリン化ＴＭと比較して、シトルリン化ＴＭ−アクチン−ＨＭＭ  ＡＴＰアーゼ活性の阻害と相関しており、シトルリン化ＴＭによってＨＭＭのアクチンフィラメントへの結合能力が変化することが示唆された（図７）。興味深いことに、遠心分離分析に基づくと、シトルリン化ＴｎＩは、非修飾タンパク質複合体と同様に、アクチン−ＴＭに強固に結合した。図３Ｃから、非修飾ＴｎＩ及び修飾ＴｎＩの＞９５％がペレットに存在していたことが明らかである。
【０１１８】
生化学的結果は、本発明者らの生理学的結果と関連しており、筋節タンパク質のシトルリン化によって除膜心筋細胞中のＣａ２＋感受性が低下したことを示した（図４Ｃ）。ＴｎＩにおいて、シトルリン化残基２０３を含むＣ末端残基１９１〜２１０は、主に、架橋環化を防止するＴＭのコンフォメーションの維持を担う。従って、ＴｎＩは遮断状態を促進するだけでなく、さらに閉鎖状態におけるＴＭの安定化に寄与する。マウスにおいては、心筋症の変異、Ｒ１９２ＨまたはＲ２０４Ｈ（これらは、ヒトの配列１９１または２０３と同等で、後者は上記のシトルリン化された残基と同一である）を有する心臓ＴｎＩはアクチン−ＴＭに対するＴｎの結合親和性を向上させる。おそらくこれは、ＴＭに沿って存在し、アクチン−ＴＭ−Ｔｎフィラメントの協同性に関与することが示されているＮ末端の尾部（ＴｎＴ１）にある残基７７におけるＴｎＴのシトルリン化によって増大する。さらに、アクチン−ＴＭ−ＴｎへのＣａ２＋またはミオシンの結合は、２番目のシトルリン化残基１６９の隣接するＴｎＩ残基１５１及び１８８をＦ−アクチンの外部領域から離れた位置に移動させることができる。このことは、ミオシンに対するＦ−アクチンの高親和性結合部位を露出させることができるＣａ２＋によるＴｎＩ−ＴＭへの方位角移動と一致する。厚フィラメントタンパク質（ＴＭ、ＭＨＣ、ＭｙＢＰ−Ｃ、ＥＬＣ、及びＲＬＣ）に生じる家族性の肥大性心筋症変異についての研究から、１つのアミノ酸側鎖の変化が心臓のモルフォロジー及び機能に多大な影響を与えることが明らかである。さらに、心不全における異常な収縮や緩和をもたらす因子には、結果としてエネルギーの生成、エネルギーの伝達及びエネルギーの利用の減少を生じる代謝経路の異常などがある。
【０１１９】
最後に、心臓におけるシトルリン化タンパク質の関与をより理解するためには、細胞特異性についての洞察力を得ることが重要である。過去に免疫組織学的分析によって得られたデータから、ＰＡＤ１〜３及び、ある程度であるがＰＡＤ６が、心筋細胞で検出され、ＰＡＤ２及び４は内皮細胞及び血管平滑筋細胞に見られたことが示された。本研究において、本発明者らは抗体や組織片に依存せず、むしろ単離したマウス心筋細胞及び心臓線維芽細胞のＰＡＤファミリーメンバーのｍＲＮＡ発現について調べた。データによると、ＰＡＤ２が主として心筋細胞及び心臓線維芽細胞の両方で発現したのに対して、ＰＡＤ１とＰＡＤ４のｍＲＮＡは心臓線維芽細胞における主要な形態であった。
【０１２０】
心臓におけるシトルリン化に関して過去に研究されていない役割について提示してきた。最終的に、大部分の筋節タンパク質のシトルリン化の同定及びそれらの生化学的特性の変化から、心臓の収縮性の新規なＰＴＭ制御が存在する可能性があることが示唆される。これらの残基のいくつかにおけるシトルリン化は、対照群と比較してＨＦを有する個人の心筋層で増大するため、シトルリン化がＨＦにおける収縮不全の減少においてある役割を果たす可能性があることが示唆される。
【０１２１】
実施例４：神経変性疾患におけるシトルリン化ペプチド
シトルリン化は、側鎖の酸化が特徴のアルギニン残基のＰＴＭである。この修飾は、アルギニンからシトルリンへの変換を生じるペプチジルアルギニンデイミナーゼ酵素（ＰＡＤ）によって触媒される。シトルリン化は、脱イミノ化としても知られ、正電荷が消失し水素結合能が低下した場合に生じて、最終的にタンパク質の化学構造の変化を引き起こす。この修飾は、例えばアポトーシスやエピジェネティクスにおける生理学的役割と、癌や中枢神経系の疾患における病理学的役割の両方を果たす［３］。さらに、抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）は、関節リウマチ（ＲＡ）患者の約６０％に存在しており、侵攻性疾患と予後不良に関連している［４、５］。ＲＡの遺伝学的研究により、１００を超える非ＨＬＡ遺伝子座における疾患を生じやすいＳＮＰが多数同定されてきた［６］。従って、シトルリン化、ＳＮＰ及び疾患を関連付ける研究によって、多くの病理学的障害に対する洞察を得ることができる。
【０１２２】
プロトコルの概説
このプロトコルの目的は、インビボのシトルリン化タンパク質／ペプチドの正確な検出を裏付けるシトルリン化試験ライブラリを構築することである。プロトコルは、試料調製、ＤＩＡモードにおける高品質のフラグメントイオンスペクトルの取得、スペクトルシトルリン化ライブラリの生成及び品質に基づくシトルリン化ペプチドをビニングするためのバイオインフォマティクスパイプラインを網羅する。さらに、ペプチドデータを既知データと新規データを比較してさらにアノテートし、疾患に関連するゲノム異常情報にリンクすることによって、巨大なデータセットを知識に翻訳するため追加のツールを開発した。
【０１２３】
材料
試薬：ウサギ骨格筋ＰＡＤカクテル（ＰＡＤ）（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）、配列決定グレードＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（ＷＡＫＯ）、ｉＲＴ保持時間ペプチド［１３］、ＦＡＳＰ（商標）タンパク質消化キット（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）。
【０１２４】
ヒト脳組織。ＮＩＨ  ＮｅｕｒｏＢｉｏＢａｎｋ（ＮＢＢ）から入手した上前頭回（ＳＦＧ）（ｎ＝１０）に相当する健常対照の死後ヒト脳組織。この事例には、神経疾患の病歴と神経病理学的診断のいずれも無かった。ヒトＡＬＳ運動皮質（ｎ＝１）及びＡＬＳ胸髄（ｎ＝４）、及び後頭葉から採取した相当する健常な試料（ｎ＝３）。マウスの脳：アルツハイマーのモデル（１．９月齢、ベータ−アミロイドのロット、記憶障害及び神経変性の発症、ｎ＝５。２．９月齢、正常／健常なマウス、記憶正常、ｎ＝５。３．２月齢、ベータ−アミロイド検出ほとんど無し乃至全く無し、及び記憶正常、ｎ＝２。４．２月齢、健常なマウス、ｎ＝２。）。脳卒中のマウス（中大脳動脈閉塞脳卒中、ｎ＝５、脳卒中発生箇所の左脳、右脳、相当する健常対照）。健常なマウス（ｎ＝５、脳、大動脈、骨格筋）。
【０１２５】
脳バッファーＡ：氷冷した低塩バッファー：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％スクロース、１０ｍＭ  ｂ−グリセロホスフェート、１０ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ  ピロリン酸４ナトリウム、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、１  ×  Ｒｏｃｈｅコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル）。
【０１２６】
脳バッファーＢ：１％Ｔｒｉｔｏｎ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％スクロース、１０ｍＭ  ｂ−グリセロホスフェート、１０ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ  ピロリン酸４ナトリウム、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、１  ×  Ｒｏｃｈｅコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル。
【０１２７】
ＰＡＤバッファー：０．１Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｕｇ／ｕｌ  アプロトニン、１０μｇ／ｕｌ  ロイペプチン、１０ｕｇ／ｕｌ  ペプスタチン。
【０１２８】
機器：Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ（ＭＭ４００）（Ｒｅｔｓｃｈ）、Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌジャー（＃２２．００８．０００５  Ｒｅｔｓｃｈ）及び７ｍｍステンレス鋼ボール（＃２２．４５５．０００８  Ｒｅｔｓｃｈ）、Ｒｅｆｒｉｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｂｅｎｃｈ−ｔｏｐ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｒ）（温度４℃及び２０℃）、ＴＬＡ  １００．２ローター付きＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＴｒｉｐｌｅＴｏｆ  ５６００＋質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）、ＴｒｉｐｌｅＴｏｆ  ６６００＋質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）、ｉＰｒｏＸｐｒｅｓｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｏｒｇ／ｉｐｒｏｘｐｒｅｓｓ２）［１４］、コンピュータ：マイクロソフト・ウィンドウズ７付属ＰＣ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、ＲＡＭ≧４ＧＢ、十分なハードディスクの空き容量（このプロトコルの場合の試験は≧４０ＧＢ）。
【０１２９】
ソフトウェア：マイクロソフト・ウィンドウズ７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、ＭＳエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  Ｐｌｕｇｉｎ  ＢｉＮＧＯ  バイオロジカル遺伝子オンコロジーツール（ｈｔｔｐ：／／ｂａｄｅｒｌａｂ．ｏｒｇ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐ／ＢｉｎｇｏＴｕｔｏｒｉａｌ）。
【０１３０】
装置セットアップ：スクリーンショットを含む各ソフトウェアのインストールの詳細説明は補助資料で提供する。
【０１３１】
方法：１．脳試料の調製。タイミング  ９０分から数日（試料数に依存）。２．組織を秤量し湿潤組織重量を記録する。３．組織を外科用メスまたは組織スライス刃を用いて小片に切断する。４．組織片を３体積（ｗ／ｖ）の氷冷バッファーＡに移す。５．組織を氷冷しながらホモジナイザーを用いて均一化する（単一の７ｍｍステンレス鋼ボールを用い２０Ｈｚで３０秒）。６．試料をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅでＴＬＡ１００．２ローターを用い３０８００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離する。７．上澄み液を清浄なチューブに移す。８．残りのペレットにバッファーＢを加え（組織とバッファーの比、１：３）、冷却したＭｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ４００にて３０Ｈｚで３０秒間均一化する。９．ＴＬＡ−１００．２ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて１００，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。１０．上澄み液を清浄なチューブに移しブラッドフォード法によってタンパク質濃度を測定する。
【０１３２】
タンパク質のシトルリン化：試験ライブラリに含まれている場合、ペプチドは標的とされたＭＳのみによって同定できる。特定の生物学的条件で発現するタンパク質を網羅するため、理論的に全生物学的空間を表すシトルリン化ペプチドのプールを作成する必要があった。ほとんどのＰＡＤアイソフォームは、核局在化シグナルを含み実際に少なくとも一部分が核に存在することが認められるＰＡＤ４を除いて、細胞質で排他的に発現する。従って、基質の特異性がＰＡＤのアイソフォーム間で異なると仮定するのが妥当であろう［１５、１６］。このプロセスにおける重要なステップは、接近可能なアルギニン残基の低シトルリン化を誘発するＰＡＤカクテルによる、プールした組織／試料（複数可）のインビトロでの処理である。（１）２００ｕｇの試料プールを得るため各画分の試料をプールする。（２）最大３０μｌのタンパク質プールを１５０μｌのＰＡＤバッファーと混合する。（３）ＰＡＤカクテル（カタログ番号Ｐ３１２−３７Ｃ）を重量（ｗ／ｗ）比１：２５の酵素／基質に加え、反応物を軽く揺らしながら３７℃で２時間インキュベートする。最終濃度５０ｍＭになるまでＥＤＴＡを加えてシトルリン化を停止する。（４）ＰＡＤカクテルの代わりに水を添加する以外は同様の方法で陰性対照を調製する。（５）使用するまで氷上に保存する。
【０１３３】
タンパク質消化。全試料を重量比１：３０の酵素／基質においてＬｙｓＣで消化するためＰｒｏｔｅｉｎ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＦＡＳＰプロテインタンパク質消化キットを用い、反応物を軽く揺らしながら３７℃で２０時間インキュベートした。
【０１３４】
ＳＷＡＴＨ−ＭＳデータの取得。ＳＷＡＴＨ−ＭＳマップの生成：ＤＤＡにおけるＴｒｉｐｌｅ−ＴＯＦ  ＭＳの分析及びＳＷＡＴＨモード。ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ６６００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）をデータ依存性取得に用いてペプチドのスペクトルイオンライブラリを構築し、さらに個々の試料の分析用にＳＷＡＴＨ−ＭＳ（データ依存性取得）にも用いた。生データをＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）ソフトウェア５．０で検索してスペクトルイオンライブラリを作成した。個々のＳＷＡＴＨ−ＭＳのランを、ＰＡＤ存在下もしくは非存在下（プラス及びマイナスＰＡＤ）で作成されたスペクトルライブラリに対してマッチングした。
【０１３５】
保存されたシトルリン化ペプチドの詳細な同定及び分析。脳卒中マウスモデル、アルツハイマーのマウス及び健常なマウスの脳に加え、マウス大動脈及びマウス骨格筋から得られたマウスのデータと等価なヒト相同性（配列が類似）を見出すため、ペプチドレベルについてブラストを行った。マッチングリストには、ｂｌａｓｔｐ−ｓｈｏｒｔでのトップヒットのみが含まれ、これはマウスとヒトの間のペプチド相同性の＞８０％が認められたことを意味する。ほとんどの場合において、トップヒットがアイソフォームであれば、他のアイソフォーム及び基準のタンパク質も保存された。図９に、シトルリン化されたスペクトルライブラリファイルを処理する概略的なバイオインフォマティクスのワークフローを示す。２つの異なるタイプの組織試料である心臓と脳を用いて提示する方法を開発した。ヒトの脳から生成した最終的なＳＷＡＴＨ試験ライブラリは３６０，２０２個のペプチド（特異ペプチド１６，２７５個）から構成される。バイオインフォマティクスパイプラインにより、信頼度が高く妥当なシトルリン化ペプチドと考えられる１，５３０個の特異ペプチドを抽出した（表１１）。１，５７１個の追加の特異ペプチドを潜在的に信頼度が高く妥当なシトルリン化ペプチドと特定し、残りの他のペプチドは信頼度の低いペプチドと考えた（表１１）。１個のペプチドは１個より多いシトルリン化されたＲを有する可能性があり、いくつかのペプチドが全長タンパク質上で正確にシトルリン化されたＲ部位を共有することに留意することが重要である。従って、特異ペプチドの数は特異的シトルリン化部位の数と同じではない。アウトプット１、２、及び３における特異的シトルリン化部位の総数（全長タンパク質上で）は２４１３である。
【０１３６】
（表１１）脳試料の場合の、脳試料のプラス及びマイナスＰＡＤ処理に関する出力ファイルの要約（使用した信頼度の閾値は０．９９５であった）（ＪＦ＿１５０４０２＿５６００−プラス／マイナスＰＡＤ）
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【０１３７】
シトルリン化ペプチドをベースにした４つの異なる出力ファイルにビニングした。出力１には、修飾ペプチドペプチドと非修飾ペプチドの間の保持時間のΔが＞５分である高信頼度のペプチド、及び信頼度スコア（ユーザーが入力）が含まれる。出力２及び３には、シトルリン化されたＲ残基を有するペプチドが含まれるが、データセットに非修飾ペプチドが認められず保持時間の差を計算する能力に限度があった。しかしながら、出力２の場合、Ｎ／Ｑ残基はシトルリン化されたＲ残基のいずれの側においても５個以内のアミノ酸に無いが、それに対し出力３においては、Ｎ／Ｑ残基はシトルリン化されたＲ残基のいずれの側においても５個以内のアミノ酸に存在する。出力４には、出力１〜３の基準に適合しなかったオリジナルファイルの全ペプチドが含まれる。
【０１３８】
本明細書では、段階的なプロトコルと、複合体の生物学的試料中のシトルリン化ペプチドの分析のための高品質試験ライブラリを生成する、統合されオープンに利用できるコンピュータによるパイプラインについて説明する。ペプチドの溶出プロファイルの信頼できる同定、及び近接するアイソバリック親質量許容差と結果を決めるバイオインフォマティクスパイプラインの間の識別を可能とする高分解能の飛行時間型質量分析計（＞３０，０００）を用いて、約６桁のダイナミックレンジにわたってシトルリン化ペプチドを同定することができ、相対量でそれらを定量した。
【０１３９】
現在、複合体試料のシトルリン化の分析に利用できる化学的、プロテオーム及び抗体に基づく手順がいくつかある［１５〜１７］。しかし、現在の方法では、複数の試料にわたって、シトルリン化ペプチドを、迅速に、一貫して、再現性良く、高精度で、かつ高感度で検出し定量することは依然課題である。ここで、修飾された部位が正確なシトルリン化タンパク質の存在と量について、系統的に試料セットに照会する新しい方策を提示する。これは、相対強度、クロマトグラフの一致のようなフラグメントイオンスペクトルライブラリ内の利用できる情報を用いて、ＤＩＡを用いて生成された完全なシトルリン化フラグメントイオンのマップを調べることから成る。
【０１４０】
本質的に、本発明者らのツールは、包括的なＳＷＡＴＨ  ＭＳシグナルマップ内の標的としたシトルリン化ペプチドと一意的に関連するピーク群を特定し、次いで標的としたシトルリン化ペプチドがバイオインフォマティクスパイプラインにおいて設定された規則に従って正確に同定された確率をコンピュータで計算する。シトルリン化試験の高品質なライブラリは、感度を上げるためＳＷＡＴＨ  ＭＳ及び同様な標的指向性のＭＳ法に必要な条件である。理想的には、この試験ライブラリのシトルリン化ペプチドは特定の研究の場合に対象となる全てのシトルリン化タンパク質、もしくはさらに全プロテオームをも網羅する。それが真であることを確実にするため、構築されたライブラリが基づくベースとされた試料をインビトロでＰＡＤカクテルによってシトルリン化する。このステップは、少量存在するシトルリン化タンパク質の検出を改善すると共に潜在的に新規な部位を網羅する助けとなる。
【０１４１】
ＳＷＡＴＨ（商標）−ＭＳがＰＴＭ分析に問題なく適用できることを示す。シトルリン化ペプチドの分析のため追加されたバイオインフォマティクスパイプラインは、分析を信頼性が高くロバストかつ迅速なものにする。本発明者らは、この方法が当分野におけるシトルリン化分析の評判を高め、近いうちにこのインビボでの翻訳後修飾の重要性を明確にするため非常に有益なものになると確信する。
【０１４２】
本明細書で述べるように、シトルリン化、すなわちペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）のファミリーによるアルギニンのシトルリンへの翻訳後（ＰＴＭ）変換は通常、プリオン病、多発性硬化症、及びアルツハイマー病などの神経変性疾患における異常な病理学的特徴に関係があるとされてきた。このＰＴＭが新規な診断薬または治療薬の標的となる可能性がある。従って、シトルリン化タンパク質及びそれらの修飾された残基を同定する明確で効率的な方法は極めて重要である。
【０１４３】
ＡＬＳ、すなわち筋萎縮性側索硬化症は、脳の神経細胞や脊髄に影響を与える進行性の神経変性疾患である。発明者らは、ＡＬＳ疾患におけるシトルリン化の役割について、臨床的に関連する可能性があるＰＴＭバイオマーカー（複数可）を特定することに集中して研究した。
【０１４４】
図８Ｂにシトルリン化されたイオンのライブラリの構築を図示する。図８Ｃに非修飾配列と比較したＲ［Ｄｅａ］及びＮ／Ｑ［Ｄｅａ］についてのΔＲＴを図示する。それぞれシトルリン化Ａｒｇを含むペプチドは非修飾ペプチドと比較して遅く溶出した（＞５分の差）。同じ傾向が、シトルリン化されたＲを有するペプチドとＮならびにＱ脱アミン化を有するペプチドの間で認められた。
【０１４５】
図８Ｆに示すように、グリア線維酸性タンパク質、グルコース−６−ホスフェート異性化酵素、ビメンチン、エンドフィリン−Ａ１、ミエリン塩基性タンパク質、デルタ−１−ピロリン−５−カルボキシレート脱水素酵素、ペルオキシレドキシン−５、ニューログラニン、二重特異性マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ１、チューブリン重合促進タンパク質ファミリーメンバー３、デルタ（３，５）−デルタ（２，４）−ジエノイル−ＣｏＡ異性化酵素、システイン及びグリシンリッチタンパク質１、細胞レチノイン酸結合タンパク質１ＧＭＰ還元酵素２及び／またはグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｏ）サブユニットガンマ−３のうちのいずれか１つ以上のシトルリン化の変化がＡＬＳを示す可能性がある。
【０１４６】
（表２）ＡＬＳのバイオマーカーとしてのシトルリン化ペプチド。これらのペプチドはＡＬＳを有する対象で検出されるが健常なヒトでは検出されない。「Ｄｅａ」はシトルリン化または脱アミノ化である。「ＣＡＭ」はカルバミドメチル化である。
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【０１４７】
（表３）ＡＬＳのバイオマーカーとしてのシトルリン化ペプチド（ヒト由来）。「Ｄｅａ」はシトルリン化または脱アミノ化である。「ＣＡＭ」はカルバミドメチル化である。
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【０１４８】
（表４）マウスの配列のヒトの配列へのマッチングに基づく、相関性のあるシトルリン化ＬｙｓＣペプチド。「Ｄｅａ」はシトルリン化または脱アミノ化である。「ＣＡＭ」はカルバミドメチル化である。
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【０１４９】
（表５Ａ）慢性神経変性疾患で認められるシトルリン化ペプチド。これらのシトルリン化ペプチドは脳に特有のものである。
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【０１５０】
（表５Ｂ）慢性神経変性疾患で認められるシトルリン化ペプチド。これらのシトルリン化ペプチドは脳に特有のものではない。
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【０１５１】
（表６Ａ）ヒトの脳の後天的脳損傷で検出されるシトルリン化ペプチド。これらのシトルリン化ペプチドは脳に特有のものである。
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【０１５２】
（表６Ｂ）ヒトの脳の後天的脳損傷で検出されるシトルリン化ペプチド。これらのシトルリン化ペプチドは脳に特有のものではない。
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【０１５３】
（表７）慢性脳損傷の分泌シトルリン化ヒトタンパク質
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【０１５４】
（表８）慢性脳損傷の非分泌シトルリン化ヒトタンパク質
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【０１５５】
（表９）急性脳損傷の分泌シトルリン化ヒトタンパク質
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【０１５６】
（表１０）急性脳損傷の非分泌シトルリン化ヒトタンパク質
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【０１５７】
実施例４の参照文献
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【０１５８】
上述した様々な方法及び技術は、本出願を実行する多数の方法を提供する。もちろん、必ずしも説明した全ての目的もしくは利点が、本明細書に記載の特定のいずれかの実施形態に従って達成できるわけではないことを理解すべきである。従って、例えば当業者は、この方法が、本明細書で教示される１つの利点もしくは一群の利点を、本明細書で教示もしくは示唆される他の目的もしくは利点を必ずしも達成することなく達成あるいは最適化する手法で実施できることを認めるであろう。本明細書では多様な選択肢を述べる。好ましい実施形態に特異的に１つの、またはもう１つの、もしくはいくつかの特徴を包含するものがある一方で、他の実施形態に特異的に１つの、またはもう１つの、もしくはいくつかの特徴を排除するものがあり、また一方でさらに他の実施形態に１つの、またはもう１つの、もしくはいくつかの長所を包含することによって特定の特徴を軽減するものがあるということを理解すべきである。
【０１５９】
さらに、熟練した技術者は、様々な実施形態から種々の特徴の適用性を認めるであろう。同様に、上述した様々な要素、特徴及びステップに加え、前記の要素、特徴またはステップのそれぞれに対する他の既知の同等物は、当分野の通常の熟練者によって様々な組み合わせで使用して、本明細書に記載の原則に従って方法を実行できる。多様な実施形態において、様々な要素、特徴、及びステップの中で、特異的に包含されるものもあれば、特異的に除外されるものもある。
【０１６０】
本出願を特定の実施形態及び実施例との関係において開示してきたが、本出願の実施形態は具体的に開示される実施形態を越え、当業者は、他の代わりになり得る実施形態及び／または利用及び修正ならびにそれらの同等物まで広がることを理解するであろう。
【０１６１】
本明細書では、発明者らにとって既知の本出願を実施するための最良の方法を含め、本出願のより好ましい実施形態を説明する。これらのより好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば当分野の通常の熟練者には明白になるであろう。熟練者は前述の変形を適宜使用でき、本出願は本明細書で具体的に述べられた方法とは異なる方法で実施することができるものと考える。従って、本出願の多くの実施形態は、適用法によって許可される、本明細書に添付の請求項に列挙される対象物の全ての修正物及び同等物を含む。さらに、本明細書において特に断りがない限り、もしくは文脈上明らかに矛盾していない限り、それらの全ての変形における上記の要素のいかなる組み合わせも本出願に包含される。
【０１６２】
本明細書で参照される全ての特許、特許出願、公開特許公報、及び、論文、書籍、仕様書、出版物、文書、物体及び／またはその類似物などの他の資料は、全ての目的のためそれらの全体がこの参照により組み込まれるが、本明細書と矛盾するもしくは対立する同一物、同一物のいずれか、または現在以降本明細書に関連する請求項の最も広い範囲に関して制限する影響を及ぼす可能性がある同一物のいずれかに関連するあらゆる出願経過を除く。例として、組み込まれた資料のいずれかと関連する説明、定義、及び／または用語の使用と本文書と関連するそれらとの間に不一致や対立がある場合は、本明細書における説明、定義及び／または用語の使用が優先されなければならない。
【０１６３】
本明細書で開示される出願の実施形態は、本出願の実施形態の原理の実例であることを理解すべきである。使用できる他の修正物が本出願の範囲内であることがあり得る。従って、例として、これに限定されないが、本出願の実施形態の代わりとなる構成を本明細書の教示に従って使用することができる。従って、本出願の実施形態は、正確に示され説明される実施形態に限定されない。
【０１６４】
本発明の様々な実施形態は先に「発明の詳細な説明」で説明されている。これらの説明では上述の実施形態が直接的に述べられているが、当業者は本明細書において示され説明される具体的な実施形態に対する修正及び／または変形を思いつく可能性があることを理解すべきである。この説明の範囲内にあるような修正もしくは変形は、いかなるものも同様にその中に含まれるものとする。特に述べていない場合、本明細書及び請求項の単語及び語句は、適用される分野（複数可）の通常の熟練者にとって普通かつ熟知した意味であるということが発明者の意図である。
【０１６５】
出願時に出願人にとって既知の前述の本発明の様々な実施形態に関する記述は、例示及び説明の目的で提示され意図されたものである。本説明は包括的でも本発明を開示される正確な形態に限定するものでもなく、上述の教示の下で多くの修正及び変形が可能である。説明される実施形態は、本発明の原理及び実用的応用を説明し、他の当業者が様々な実施形態において、予期される特定の用途に適するように様々に修正して本発明を利用できるようにすることに役立つ。従って、本発明は発明を実施するため開示された特定の実施形態に限定されないものとする。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態を示し説明してきたが、ここで教示されることに基づいて本発明やそのさらに広い態様から逸脱することなく変更や修正を行うことができ、そのため添付される請求項がその範囲内に全ての変更や修正を本発明の真の精神と範囲内にあるものとして包含することができるということは、当業者にとって明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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