(57)【要約】  本発明に従い、抗薬物抗体を産生することを含む薬物治療に対する免疫反応を患う又は該免疫反応の影響を受けやすい哺乳動物を治療する方法であって、 (a) 該哺乳動物から得られた抗原提示細胞を、該薬物又はそのエピトープを含む断片の存在下、該抗原提示細胞中でIDOを誘導する薬剤でエクスビボ処理すること、及び(b) 該抗原提示細胞中でIDOが誘導された後、該細胞を該哺乳動物に戻し、それにより該薬物に対する免疫寛容を確立することを含む、前記方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗薬物抗体を産生することを含む薬物治療に対する免疫反応を患う又は該免疫反応の影響を受けやすい哺乳動物を治療する方法であって、 (a) 該哺乳動物から得られた抗原提示細胞を、該薬物又はそのエピトープを含む断片の存在下、該抗原提示細胞中でIDOを誘導する薬剤でエクスビボ処理すること、及び(b) 該抗原提示細胞中でIDOが誘導された後、該細胞を該哺乳動物に戻し、それにより該薬物に対する免疫寛容を確立することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記薬物が生物学的薬物である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記薬物がFVIIIである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記薬物が第IX因子である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
前記薬物が抗体である、請求項3記載の方法。
【請求項７】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記樹状細胞が骨髄由来樹状細胞、CD34+造血前駆細胞から生成した樹状細胞、又は末梢血単核細胞から生成した樹状細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記IDOを誘導する薬剤が、ゼブラリン又はその類似体若しくは塩である、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤がゼブラリンである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤がシチジン類似体（例えば、5-メチルシチジン、アザシチジン、又はデオキシアザシチジン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、バルプロ酸又はその塩（例えばバルプロ酸ナトリウム、トリコスタチンA、又はボリノスタット（SAHA））、ビタミンD3類似体（例えば、カルシトリオール）、インターフェロンγ類似体、その他のインターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンB1、又はインターフェロンτ）、toll様受容体リガンド（例えば、CpGを含むDNAオリゴヌクレオチド又はリポ多糖）、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン（例えば、組換えヒトゴナドトロピン（rhCG）又はプロラクチン）、プロスタグランジンE2類似体、IDO安定化因子（例えば、TGF-b又はIL-10）、可溶性CTLA4コンジュゲート（例えば、アバタセプトのようなCTLA4-Ig）、及び糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）から選択される、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
前記IDOを誘導する薬剤がアザシチジン及びデオキシアザシチジンから選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
IDOを誘導する2以上の薬剤が工程(a)で利用される、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
前記2以上の薬剤が(i) ゼブラリン及びIFN-γ、(ii) IFN-γ及びバルプロ酸、(iii) ゼブラリン、IFN-γ、及びバルプロ酸、(iv) ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）及びゼブラリン、(v) hCG及びIFN-γ、(vi) ゼブラリン及びIFN-A、(vii) ゼブラリン、IFN-γ及びIFN-A、(viii) ゼブラリン、IFN-γ及びTGF-β、並びに(ix) ゼブラリン、IFN-γ、IFN-A、及びTGF-βから選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物から得られた抗原提示細胞を、薬物又はそのエピトープを含む断片の存在下、該抗原提示細胞中でIDOを誘導する薬剤でエクスビボ処理することを含む方法により、細胞培養においてIDOを誘導する方法。
【請求項１６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物が、生物学的薬物である、請求項15又は16記載の方法。
【請求項１８】
前記薬物がFVIIIである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記薬物が抗体である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤がゼブラリン又はその類似体若しくは塩である、請求項15〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤がアザシチジン及びデオキシアザシチジンから選択される、請求項15〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
請求項15〜21のいずれか1項記載の方法によって得られた、IDOが誘導された抗原提示細胞。
【請求項２３】
抗薬物抗体を産生することを含む薬物治療に対する免疫反応を患う又は該免疫反応の影響を受けやすい哺乳動物を治療する方法であって、それにより、該方法に従って前記細胞を該哺乳動物に戻し、それにより該薬物に対する免疫寛容を確立する、該方法において使用するための請求項22記載の抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗薬物抗体、特に第VIII因子（FVIII）に対する抗体を産生する哺乳類対象を治療する方法に関する。具体的には、該方法はこの目的のために薬物抗原（例えばFVIII）の存在下、エクスビボでIDOを誘導する薬剤（例えばゼブラリン）により処理した自己由来抗原提示細胞（特に、樹状細胞）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（抗薬物抗体）
血友病A（HA）は、翻訳されたタンパク質の発現又は凝血原機能に干渉するFVIIIをコードするF8遺伝子における様々な変異により引き起こされるX染色体連鎖の出血性障害である。FVIIIは主に肝臓及び内皮血管床において発現する。血友病A患者は十分な凝血原活性を欠いているため、増加した罹患率及び死亡率を必然的に伴う出血症状及びそれらの続発症を起こしやすい。FVIIIのデータベースは現在5,472人の個人の事例報告に基づく2015個の特有のFVIIIバリアントを認定する。この点変異（66.5％）、欠失（23.2％）、及びその他（重複、多形、挿入、挿入欠失、及び複合体）の巨大な配列は、様々な臨床転帰をもたらす。急性的に（要求時に）又は予防的に、血漿由来又は組換えFVIIIのいずれかにより患者を治療することができる。
【０００３】
その免疫系が正常なFVIIIの特定の配列に対し完全には寛容にされていないため、著しい数の患者が投与されたFVIIIの活動を阻止する「阻害剤」と呼ばれる中和抗体を形成する。阻害剤の産生は現在血友病を有する患者において見られる最も重要な治療合併症である。
【０００４】
現在、いったん阻害剤が形成されると、根絶のために唯一実証された方法は、定期的なFVIIIの輸液を介した免疫寛容の誘導（ITI）であるが、この治療戦略は10〜20％の患者で失敗する。
【０００５】
抗薬物抗体の問題は、欠陥あるFVIIIを有する血友病患者に限定されない。抗薬物抗体は他の薬物で治療される対象において産生し得る。
【０００６】
FVIIIに対する免疫反応の第一工程は、抗原提示細胞（APC）によるFVIIIの認識であると考えられている。APCによるFVIIIのエンドサイトーシスに続き、FVIIIは小さなペプチドへとプロセシングされ、これは続いてFVIII特異的CD4+ T細胞への提示のために細胞表面のMHCクラスII分子に積載される。これらのT細胞の活性化には、APCによって提供される追加のシグナルが要求される。これらのシグナルはAPCの形質膜上のCD40、CD80、CD83、及びCD86などの分子と、T細胞上のCD28、CD154、及びCTLA-4との間の膜関連相互作用である。これらの相互作用と組合わせて、APCはIL-12又はIL-10などのサイトカインを介してT細胞にシグナルを伝える。シグナルの組合わせにより、活性化されたT細胞が分化する方向が決定される。Tヘルパー1（Th1）細胞は一般に細胞傷害免疫反応を誘導し、Th2細胞はB細胞介在性抗体反応を誘導し、制御性T細胞はB細胞及びT細胞の反応を抑制することにより免疫抑制/免疫寛容を誘導することができる。最終的に、これらのFVIII特異的T細胞はFVIII特異的B細胞を活性化させ、B細胞における免疫グロブリン遺伝子の親和性成熟及びクラススイッチを誘導することができる。結果として、抗FVIII抗体分泌形質細胞及び循環FVIII特異的記憶B細胞が生成され、これらはFVIIIへの再曝露に際し抗体を生産することができる。
【０００７】
（抗原提示細胞）
抗原提示細胞（APC）はその表面上で主要組織適合複合体（MHC）と複合体形成された外来抗原を表示する細胞であり；抗原提示細胞は、抗原をプロセシングし、これをT細胞に提示する。APCは2つのカテゴリ：プロフェッショナル及び非プロフェッショナルに分類される。プロフェッショナルAPCはMHCクラスII分子を発現するAPCである。主要な4つの類型のプロフェッショナルAPC：樹状細胞、マクロファージ、ある種のB細胞、及びある種の活性化上皮細胞が存在する。APCのT細胞との相互作用はリンパ節で起こり、APCは走化性効果によりリンパ節に導かれる。樹状細胞はいくつかの供給源、例えば骨髄（特に、造血骨髄前駆細胞）及び血液（特に、その一部は未成熟であり、かつCD34を発現する末梢血単核細胞）から単離し、成熟させることができる。環境（例えば、抑制活性を有するCD80/86、CD40、又はIDO1、PD-L1又はPD-L2などの共刺激因子の発現レベル）に依存して、リンパ節における樹状細胞及びT細胞の相互作用は免疫反応又は寛容反応をもたらし得る。従って、重要な相互作用には、IDO1を発現し、T細胞を制御性表現形をとるように誘導する免疫抑制性サイトカイン（例えば、IL-10及びTGF-β）を生産するDCが関係する。制御性T細胞はその特性においてエフェクターT細胞又はナイーブT細胞をその微小環境中で抑制するだけでなく、また未成熟DCを免疫原性DCではなく寛容原性DCへと分化を誘導し、それにより寛容原性ループ（tolerogenic loop）反応を引き起こす。
【０００８】
（IDO）
IDO1、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1は、トリプトファン分解の最初の律速段階を触媒するヘム含有酵素であり、実験動物及びヒトの両方において免疫寛容を誘導する重要な役割を有することが知られる。IDO1の重要な役割は、例えば哺乳動物の妊娠の間について明確に特定されている。IDO1のレベルは増加し、このようにして胎児に対する免疫寛容の誘導に不可欠となる。マウスにおけるIDO1の実験的阻害は、その母親と異なるMHC分子を発現する胎児の拒絶反応をもたらすことが示されている。
【０００９】
DC又は他の抗原提示細胞の細胞内で発現される場合、IDO1はT細胞反応を抑制することにより免疫寛容をもたらす生得の免疫調節因子として機能する。
【００１０】
（ゼブラリン）
ゼブラリンはDNAメチル化の有効な阻害剤である2-(1H)-ピリミジノン環を含むシチジン類似体である。ゼブラリンは非常に安定でpH 1.0のPBS中37℃でおよそ44時間の半減期、及びpH 7.0で〜508時間の半減期を有し、薬物の経口投与が可能である。実際、経口投与されたゼブラリンはヌードマウス中で成長したヒト膀胱腫瘍細胞においてサイレンシングされた高度メチル化p16遺伝子の脱メチル化及び再活性化を引き起こすことが示されている。また、ゼブラリンは高濃度では毒性であるものの、使用した濃度ではインビトロ及びインビボで細胞毒性が最小限であるようであった。ゼブラリンはIDOを誘導することが知られ、ゼブラリンによりIDOが上方調節される機構は、IDO1遺伝子の後成的な上方調節を介することが示唆されている。
【００１１】
WO2008/147283は、自己免疫性障害若しくは疾患、又は移植片若しくは治療用に遺伝子改変された細胞の免疫拒絶反応の治療用の医薬の製造のためのゼブラリンの使用を開示し、ここで該治療はIDOを誘導する。
【００１２】
WO2012/087234には、自己免疫性障害若しくは疾患、又は臓器、組織、正常細胞、若しくは治療用に遺伝子改変された細胞の免疫拒絶反応を患うことの治療のための、各々インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）を誘導する少なくとも2つの化合物を含む組成物が開示され、ここで該IDO誘導因子は異なる作用機序を有し、IDOレベルへの相乗的効果を誘発する。また、WO2012/087234には細胞培養においてIDOを誘導する方法であって、(a) 適当な培地中に単離細胞を提供する工程、(b) そのような組成物を追加する工程、(c) 該単離された細胞を該組成物にインキュベートする工程、(d) IDOが誘導された細胞培養物を得る工程を含む、前記方法が開示されている。また、WO2012/087234には自己免疫性障害若しくは疾患、又は臓器、組織、正常細胞、若しくは治療用に遺伝子改変された細胞の免疫拒絶反応を患うことを有する哺乳動物を治療する方法が開示され、ここで治療はIDOを誘導し、第一に治療される状態に関連する1以上の抗原の存在下、治療される哺乳動物又は別の哺乳動物に由来する細胞の、治療有効量のそのような組成物によるエクスビボでの処理と、それに続いて治療される哺乳動物に処理された細胞を移すことを含む。
【００１３】
Dhodapkarの文献（2001）は、未成熟DCの注射後のヒトにおけるエフェクターT細胞機能の抗原特異的阻害の報告である。
【００１４】
Giannoukakisの文献（2011）は、1型糖尿病患者における自己由来寛容原性DCの第I相（安全性）試験の報告である。
【００１５】
Nittbyの文献（2013）は、ゼブラリンがストレプトゾトシンで処置された糖尿病ラットにおける膵島同種移植体の長期生存を誘導することの報告である。
【００１６】
上記先行技術文献のいずれも、抗薬物抗体を産生する対象の治療を関心事としない。
【００１７】
本発明は先に言及したITIの従来法に反応しない対象を治療する方法のニーズに対処する。
【発明の概要】
【００１８】
（発明の概要）
本発明では、抗薬物抗体を産生することを含む薬物治療に対する免疫反応を患う又は該免疫反応の影響を受けやすい哺乳動物を治療する方法であって、(a) 該哺乳動物から得られた抗原提示細胞（APC）を、該薬物又はそのエピトープを含む断片の存在下、該APC中でIDOを誘導する薬剤でエクスビボ処理すること、及び(b) 該APC中でIDOが誘導された後、該細胞を該哺乳動物に戻し、それにより該薬物に対する免疫寛容を確立することを含む、前記方法が提供される。
【００１９】
また、本発明は薬物又はそのエピトープを含む断片の存在下、APCにおいてIDOを誘導する薬剤で哺乳動物から得られる該APCをエクスビボで処理することを含む方法により細胞培養においてIDOを誘導する方法、並びに該方法により得られるIDOが誘導されたAPCを提供する。
【００２０】
また、本発明は、抗薬物抗体を産生することを含む薬物治療に対する免疫反応を患う又は該免疫反応の影響を受けやすい哺乳動物を治療する方法であって、それにより、該方法に従って前記細胞を該哺乳動物に戻し、それにより該薬物に対する免疫寛容を確立する、前記方法において使用するための先に記載のAPCを提供する。
【００２１】
理論に限定されることなく、本発明の方法に従って、抗薬物抗体を産生した対象はAPCの表現形を寛容原性へと方向づける（skews）ゼブラリン（又は他のIDO誘導因子）によって処理された自己由来APCで処置される。これらの寛容原性APCはエクスビボで対応する薬物抗原により下処理され、該対象に戻される。APCはリンパ節及び脾臓へと移動し、そこで他の免疫細胞にその寛容原性効果を及ぼし（制御性T細胞及びB細胞の生成を含む）、ナイーブDCを寛容原性の分化へと方向づける制御性T細胞によって寛容原性ループが開始し、それにより薬物への寛容性が確立される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
（図面の簡単な説明）
【図１】インビトロで抗原オボアルブミンに反応するリンパ球増殖に対する様々な条件下で培養されたBMDCの抑制効果を示している（実施例1を参照されたい）。
【図２】インビトロで抗原オボアルブミンに反応するT細胞増殖に対する様々な条件下で培養されたBMDCの抑制効果を示している（実施例2を参照されたい）。
【図３】ゼブラリン及びPGE2とともに培養されたBMDCの皮下接種後の移動を示している（実施例3を参照されたい）。
【図４】様々な条件下で培養されたBMDCで処置された免疫化ラット由来のリンパ節細胞のインビトロでの再刺激に対する増殖反応を示している（実施例4を参照されたい）。
【図５】BMDCのゼブラリンによる処理が、FVIIIで下処理したCD4+ T細胞のインビトロでのFVIIIへの再刺激に対する増殖反応に対する抑制効果を増加させることを示している（実施例5を参照されたい）。
【図６】THP-1細胞におけるIDO1遺伝子の発現（mRNAレベル）に対するアザシチジンの効果を示している（実施例8を参照されたい）。
【図７】THP-1細胞におけるIDO1遺伝子の発現（mRNAレベル）に対するデオキシアザシチジンの効果を示している（実施例9を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書で使用される用語「インドールアミンジオキシゲナーゼ」又は「IDO」は、IDO1（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ、EC 1.13.11.52）又はIDO2（インドールアミン-ピロール2,3ジオキシゲナーゼ様1、EC 1.13.11.-）を意味し、これらはトリプトファンを異化することのできる2種の異なるタンパク質であり、APCによって発現され得る。
【００２４】
「ゼブラリン」は1-(β-D-リボフラノシル)-1,2-ジヒドロピリミジン-2-オン又は2-ピリミドン-1-β-D-リボシドとしても知られる2'-O-t-ブチルジメチルシリル-3'-O-[(ジイソプロピルアミノ)(2-シアノエトキシ)ホスフィノ]-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2(1H)-ピリミジノン-1-β-D-リボシドを意味する。
【００２５】
類似体は、親化合物と化学構造の異なる分子であり、例えば相同体（アルキル鎖の長さの違いのように、化学構造の増加分だけ異なる）、分子断片、1以上の官能基だけ異なる構造、イオン化における変化がある。構造類似体はしばしば定量的構造活性関係（QSAR）を使用して見いだされ、これにはレミントンの文献（「薬学の科学と実践（The Science and Practice of Pharmacology）」第19版、（1995）第28章）に開示されるもののような技術がある。
【００２６】
IDO誘導因子の組合わせの使用後に増加するIDOレベルの状況における用語「相乗効果」は、各々のIDO誘導因子を単独で使用した場合に達成されるIDOのレベルの和（通常、「相加効果」と称される和）よりも高い（好ましくは有意に高い）IDOレベルの増加を意味することが意図される。
【００２７】
（哺乳動物）
本発明に従う方法により治療され得る哺乳動物には、ヒト、飼育動物、及び家畜動物、特にヒトが挙げられる。飼育動物の例にはネコ及びイヌが挙げられる。家畜動物の例には、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヤギが挙げられる。
【００２８】
（APC）
本発明の方法における使用に適当なAPCは、IDO、特にIDO1を発現するAPCである。適当には、APCは例えば抗原特異的制御性T細胞又はB細胞を生成することにより、寛容原性ループを誘導することができる。
【００２９】
最も適当には、APCは骨髄由来樹状細胞（BMDC）、CD34+造血前駆細胞（特に末梢血中に存在するような）から生成された樹状細胞（DC）、又は末梢血単核細胞（PBMC）由来のDCのようなDCである。増殖することのできるDCが好ましい。末梢血単核細胞（PBMC）由来のDCを誘導し、適切な処理により増殖させることは可能なようである（例えば、Langsteinの文献、1999を参照されたい）。
【００３０】
本発明の別の態様において、APCはDCと共培養された間葉性幹細胞である。
【００３１】
（IDO誘導因子）
本発明に従う方法においてIDOを誘導する薬剤には、ゼブラリン又はその類似体若しくは塩がある。本発明に従うIDO誘導因子として使用することができるゼブラリンの類似体の例には、2'-デオキシゼブラリン、5-フルオロ-ゼブラリン、5-フルオロ-2'-デキシゼブラリン、5-クロロ-ゼブラリン、5-クロロ-2'-デキシゼブラリン、5-ブロモ-ゼブラリン、5-ブロモ-2'-デキシゼブラリン、5-ヨード-ゼブラリン、5-ヨード-2'-デキシゼブラリン、5-メチルピリミジン-2-オン、5-Me-2'-デオキシゼブラリン、又はそれらのモノ、ジ、若しくはトリリン酸塩がある。塩の例には、ゼブラリンと強有機酸又は強無機酸により形成され得る塩、例えばHBr塩及びHCl塩がある。
【００３２】
IDOを誘導するさらなる薬剤には、他のシチジン類似体（例えば、5-メチルシチジン、アザシチジン、又はデオキシアザシチジン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、バルプロ酸若しくはバルプロ酸ナトリウムのようなその塩、トリコスタチンA、又はボリノスタット（vorinostate）（SAHA））、ビタミンD3類似体（例えば、カルシトリオール）、インターフェロンγ類似体、その他のインターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンB1、又はインターフェロンτ）、toll様受容体リガンド（例えば、CpGを含むDNAオリゴヌクレオチド、又はリポ多糖）、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン（例えば、組換えヒトゴナドトロピン（rhCG）、又はプロラクチン）、プロスタグランジンE2類似体、IDO安定化因子（例えば、TGF-b又はIL-10）、可溶性CTLA4コンジュゲート（例えば、アバタセプトのようなCTLA4-Ig）、及び糖質コルチコイド（glycocorticoids）（例えば、デキサメタゾン）がある。従って、IDOを誘導する薬剤は、例えば、アザシチジン及びデオキシアザシチジンから選択され得る。
【００３３】
本発明の別の態様において、いずれもIDOを誘導する2種（又はそれ以上）の薬剤を利用することができる。特定の一実施態様において、2種のIDO誘導剤のうちの1つはゼブラリン又はその類似体若しくは塩である。適当には、該2種（又はそれ以上）の誘導因子は相乗効果を引き起こし、例えば、これら2種（又はそれ以上）のIDO誘導剤は、異なる作用機構を有する。該IDO誘導因子は、ゼブラリン又はその類似体若しくは塩、他のシチジン類似体（例えば、5-メチルシチジン、アザシチジン、又はデオキシアザシチジン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、バルプロ酸若しくはバルプロ酸ナトリウムのようなその塩、トリコスタチンA、又はボリノスタット（SAHA））、ビタミンD3類似体（例えば、カルシトリオール）、インターフェロンγ類似体、その他のインターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンB1、又はインターフェロンτ）、toll様受容体リガンド（例えば、CpGを含むDNAオリゴヌクレオチド、又はリポ多糖）、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン（例えば、組換えヒトゴナドトロピン（rhCG）、又はプロラクチン）、プロスタグランジンE2類似体、IDO安定化因子（例えば、TGF-b又はIL-10）、可溶性CTLA4コンジュゲート（例えば、アバタセプトのようなCTLA4-Ig）、及び糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）からなる群から選択される。言及され得る具体的な組合わせには、(i) ゼブラリン及びIFN-γ、(ii) IFN-γ及びバルプロ酸、(iii) ゼブラリン、IFN-γ、及びバルプロ酸、(iv) ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）及びゼブラリン、(v) hCG及びIFN-γ、(vi) ゼブラリン及びIFN-A、(vii) ゼブラリン、IFN-γ、及びIFN-A、(viii) ゼブラリン、IFN-γ、及びTGF-β、並びに(ix) ゼブラリン、IFN-γ、IFN-A、及びTGF-βがある。IDOを誘導する2以上の薬剤を、最適効果に適当となるように、細胞に同時に、逐次的に、又は分離して（適当な時間の分離をもって）投与することができる。
【００３４】
（哺乳動物からのAPCの取得）
本発明に従い、DCのようなAPCは最初に哺乳動物から得る。1つの適当な方法は、未成熟PBMCを血漿交換により収集することである（任意に標準的な用量の組換えG-CSFにより未成熟細胞を移動させた後に）。もう1つの適当な方法は、赤血球の溶解後に低密度単球を分離するためのNycodenz遠心分離法を使用することである。増殖するDCの集団を得るため、抗CD34 MAb（Dynal Biotech, Oslo, Norway）に結合された磁気ビーズを用いてPBMCから未成熟CD34+細胞を精製することができる。CD34+細胞の純度はフローサイトメトリーにより確認することができる。精製されたCD34+細胞は典型的に、GM-CSF及びIL-4での処理によりDCへと分化する。従って、典型的にCD34+細胞は、組織培養フラスコ（Nunc, Roskilde, Denmark）中10％自己由来血漿、2 mM l-グルタミン（JHR）、20〜100 ng/ml GM-CSF 200-1000 U/m、IL-4（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を含み、任意に5〜20 ng/ml IL10及び50 ng/ml Flt-3L（R&D Systems）と一緒にしたCellGro無血清培地又はRPMI培地にて1x105 細胞/mlで培養する。また、細胞はウシ胎仔血清又はヒト血清ABで培養してもよい。培養は加湿した5％ CO2雰囲気中37℃で14日間維持することができる。細胞増殖が起こったら、細胞培養培地及びサイトカインを補充する（例えば、およそ4日ごとに）。
【００３５】
ある環境においては、BMDCを対象の骨から単離することが可能である。DC細胞分化を誘導することができ、CD34+細胞について先に記載の通りに細胞は増殖した。
【００３６】
（IDO誘導因子（複数可）及び抗原へのエクスビボ曝露）
第12日〜14日に、未成熟DCをIDO誘導因子又はその組合わせ（例えばゼブラリン）を、薬物に対応する抗原調製物と一緒にしたものに曝露することができる。IDO誘導を最適にするために、IDO誘導因子（又は組合わせ）の濃度及び曝露の長さを選択することができる。1 μM〜1 mM、例えば50〜100 μMの濃度が、好例である。
【００３７】
IDO誘導因子又はその組合わせ（例えば、ゼブラリン）及び抗原調製物をDCに一緒に、又は別々に加えることができる。
【００３８】
患者への細胞の投与に際しDCのリンパ節への適切な移動が実現されるようにするために、細胞を典型的にプロスタグランジンE2（1〜10 μMの濃度で）でおよそ24時間処理し、要求される走化性受容体を誘導する。
【００３９】
第15日〜17日に、DCを回収し、培地中に浮遊させ、使用のために解放されるまで液体窒素中で凍結保存してもよい。
【００４０】
典型的に、使用前に品質管理工程が実施されるものとする。品質管理は生存能力、無菌性及び内毒素、並びにIDO1の発現についての試験を含むべきである。さらに、PD-L1、PD-L2、走化性受容体CCR7の発現、共刺激因子CD80/CD86、CD40、及びMHC-IIの発現レベルが考慮されるべきである。これらの物質の発現レベルはDCが寛容原性であることの指標である。
【００４１】
（対象への細胞の投与）
細胞は、様々な経路、例えば、静脈内、皮下、又は皮内により哺乳動物へと投与して戻すことができる。細胞を含む培地は適当にはヒトアルブミンを細胞保護タンパク質として含んでいる。典型的には1〜10回の用量の3〜10×106細胞/用量の量を、週に1回から2週に1回の間隔で投与する。処置は、所望の寛容性が実現されるまで延長することができる。
【００４２】
（抗原）
薬物に対応する抗原調製物は、薬物を全体として、又は部分として含むことができ、該部分は、そのエピトープを含む断片を含む。一般的に、精製抗原を使用するものとする。適当には、薬物に対応する抗原調製物は、対象に投与されている薬物と可能な限りよく似ている。FVIIIの場合、この目的に適当な様々な組換え薬物が利用可能であり、商品ReFacto AF、NovoSeven、Helixate NexGen、Kogenate Bayer、Advate、NovoEight、Nuwiq、Beriate、Beriate P、Feiba、Haemoctin、Hemofil、Monoclate-P、Octanate [LV]、Optivate、及びRecombinateがある。
【００４３】
（免疫反応及び本発明の方法の使用）
一般的に、本発明の方法は、免疫反応を引き起こすことができる任意の薬物、例えば任意の生物学的薬物、例えばタンパク質薬物に対する抗薬物抗体を産生することを含む該反応を起こす哺乳動物対象の治療に適当である。
【００４４】
タンパク質薬物の例には、血液因子（FVIII又は第IX因子を含む）、ホルモン（インスリン及びEPOを含む）、成長因子（EGF、IGF、KGF、HGF、及びFGFを含む）、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、酵素などがある。さらなる例には、GCSF及び類似体、例えばフィルグラスチム及びそのペグ化型（例えばペグフィルグラスチム）、及びインターフェロン（例えば、インターフェロンβ-1a）がある。本発明の好ましい一態様において、薬物はFVIIIである。本発明の別の態様において、薬物は第IX因子である。
【００４５】
生物学的薬物は、多糖成分を含み得る。
【００４６】
生物学的薬物のさらなる例には、操作されたタンパク質（例えば、融合タンパク質及びキメラタンパク質）及び組換えタンパク質がある。一部の実施態様において、薬物は抗体とすることができる。薬物は、例えばモノクローナル抗体、例えばヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体とすることができる。また、薬物は免疫グロブリンの断片を含むタンパク質構築物とすることができる。抗体の用語は、抗体-薬物コンジュゲート及び抗体-ナノ粒子コンジュゲート、並びにペグ化類似体を含む。一部の実施態様において、抗体は単一軽鎖抗体又はVHHを含むドメイン抗体とすることができる。薬物は、インタクトな軽鎖免疫グロブリン、又は少なくとも可変ドメイン及び少なくとも軽鎖定常領域の一部を含むその断片、又はScFvからなり得る。薬物は重鎖免疫グロブリンを含まなくてもよい。抗体は、抗TNF-αモノクローナル抗体、例えば、REMICADE（商標）（インフリキシマブ）、ENBREL（商標）（エタネルセプト）、HUMIRA（商標）（アダリムマブ）、CIMZIA（登録商標）（セルトリズマブペゴル）、SIMPONI（登録商標）（ゴリムマブ; CNTO 148）、及び抗VEGF抗体（例えば、AVASTIN（商標）（ベバシズマブ）、及びLUCENTIS（商標）（ラニビズマブ）を含む。さらなる例には、HERCEPTIN（商標）（トラスツズマブ）、RITUXAN（商標）（リツキシマブ）、及びSOLIRIS（商標）（エクリズマブ）がある。
【００４７】
本発明の方法は、出血障害（血友病A及びB；それぞれFVIII及び第IX因子の欠損）、成長因子欠損（EGF、IGF、KGF、HGF、FGFなどの欠損）、ホルモン欠損（インスリン、EPOの欠損）、酵素補充療法並びに炎症性及び自己免疫性障害（抗TNF-αモノクローナル抗体）などのいくつかの薬物治療状況における抗薬物抗体の産生を含む薬物に対する免疫反応を起こす哺乳動物対象の治療に適当である。
【００４８】
臨床開発における生物学的タンパク質治療薬及び承認された製品の詳細なリストは、100を超える疾患を標的とした907の生物製剤の詳細を与える2013年PhARMA報告書「生物製剤」http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/biologics2013.pdfに開示されている。この文書はその全体が引用により組み込まれている。本発明は治療される対象において免疫反応が起こるこれらの並びに他の生物学的治療薬に対して使用できると考えられる。
【００４９】
（利点）
本発明は、少なくとも一部の実施態様において、1以上の次の利点を提供すると期待される：
・薬物に対する免疫寛容の上昇、又は例えば血中の低下した抗薬物抗体レベルによって測定される薬物に対する免疫不寛容の低下の成功；
・個別対象に適応する薬物に対する目的に合わせた反応。例えば、各々の血友病A患者は、自身のFVIIIの欠陥及びHLAなどの他の遺伝的特質に基づいてネイティブのFVIIIに対し特有の反応を有する。従って、本発明の自家移植のアプローチは対象のAPCが寛容原性となることを保証することができる；
・要求される濃度で低毒性である良性の効果；
・治療レジームの開始に続く有用な寛容性の達成までの相当に速い時間。
【実施例】
【００５０】
（実施例）
（材料及び方法）
（免疫化に使用するためのDCの調製）
ルイスラットを安楽死させ、大腿骨及び脛骨を摘出する。これらの骨を続いて70％エタノールに1分間浸漬することにより滅菌する。これらの骨の両端を滅菌したハサミで切断し、骨髄を流し出し、20ゲージの針を備えた5 mlのシリンジを用いてBMDC培地（2％ v/v標準ルイスラット血清、10 mM HEPES、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、及び50 μM 2-メルカプトエタノールを補充したRPMI 1640）に浮遊させる。BMDC培地での1回の洗浄後、赤血球を溶解し、続いて骨髄細胞をBMDC培地で2回洗浄し、70-μmのセルストレイナーを通過させる。
【００５１】
骨髄細胞（3.5×106）をT25細胞培養フラスコ内の組換えラット（rr）GM-CSF（5 ng/ml） 及びrrIL-4（5 ng/ml）を補充した5 ml BMDC培地中37℃、5％ CO2で培養する。第3日に各フラスコにrrGM-CSF（5 ng/ml）及びrrIL-4 （5 ng/ml）を補充した5 ml BMDC培地を追加する。第5日に、培地及び非接着細胞を吸引し、rrGM-CSF（5 ng/ml）、rrIL-4（5 ng/ml）、及びゼブラリン（50 μM）を含む5 mlの新鮮なBMDC培地に交換する。また、ここでrrIL-10（5 ng/ml）を加えてもよい。第7日に、フラスコを穏やかにタップし、又は洗い流すことにより塊ごとに増殖する非接着細胞及び半接着細胞を回収し、遠心分離してrrGM-CSF（2.5 ng/ml）及びゼブラリン（50 μM）のみを含む新鮮なBMDC培地に分散させ、新しいT25培養フラスコ中で継代培養する（2〜3.5×106/5 ml）。第7日に半接着BMDCから非接着BMDCを分離する場合（実施例5）、非接着BMDCを継代培養の開始後3〜4時間で回収し、新しいT75培養フラスコに移す。第8日に、プロスタグランジンE2（PGE2）（1〜3 μM）をこのフラスコに加えてもよい（ケモカイン受容体7（CCR7）の上方調節のため。それによりBMDCがリンパ節に移動することが可能となる）。また、フラスコに抗原を追加することによりBMDCに抗原をパルスすることができる。第9日に、フラスコを穏やかにタップし、又は洗い流すことにより細胞を回収する。ラットに接種することとなっている細胞は、続いてPBS中で徹底的に洗浄する（2〜3回）。洗浄後、細胞（1〜5×106）を0.2 ml PBS中に再懸濁し、ラットの大腿部に皮下接種する。インビトロ増殖反応アッセイで試験することとなっているBMDCは、培養物に加える前に20 Gyで放射線照射する。
【００５２】
実施例1〜4において、オボアルブミン（OVA）は、モデル抗原として使用した。
【００５３】
実施例5において、第VIII因子（FVIII）を抗原として使用した。
【００５４】
（抑制効果の評価のためのインビトロ増殖反応アッセイ）
ルイスラットを尾の付け根に完全フロイントアジュバント中に乳化された100 μg OVAで1回免疫化し（実施例1〜4）、又は150 IU/kg組換えヒトFVIIIで2週間の間隔を空けて2回免疫した（実施例5）。鼠径部リンパ節を免疫化後7日の免疫化ラットから単離した。標準的な増殖反応アッセイを全リンパ節細胞集団を用いて（実施例1及び4）（100000/ウェル）、又は刺激因子としての放射線照射（20 Gy）した同系のDC（10000/ウェル（実施例2）又は5000/ウェル（実施例5））と一緒にした単離CD4+ T細胞（50000/ウェル）を用いて全容量150 μl/ウェル（10％ v/v 熱非働化ウシ胎仔血清、10 mM HEPES、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、及び50 μM 2-メルカプトエタノールを補充したRPMI 1640）で96ウェルプレート中で実施した。CD4+ T細胞（≧98％純度）を生成させるため、リンパ節細胞を抗体カクテルで染色し、CD4+ T細胞を磁気ビーズを用いたネガティブ選択により単離した。同系のルイスDCを生成させるため、ナイーブ脾細胞を単離し、赤血球を溶解させた後14.5％ Nycodenz上で遠心分離した。低密度脾細胞は勾配の界面から単離され、これらからOX62+ DCが磁気ビーズを用いたポジティブ選択により単離された。下処理されたリンパ球を培養物にOVA（100 μg/ml）（実施例1〜4）又はFVIII（1 μg/ml）（実施例5）を加えることにより刺激した。陰性対照は、培地のみ（OVAもFVIIIもなし）で構成した。
【００５５】
37℃、5％ CO2で3日間置いた後、培養物に最後の8時間にわたって0.5 μCiの[3H]チミジンをパルスした。続いて細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、T細胞増殖の基準としての[3H]チミジン取り込みを標準的なシンチレーション手順を用いて測定した。実験は3又は6回の反復で実施し、結果をカウント/分（cpm）±標準偏差（SD）で表した。
【００５６】
増殖反応に対するBMDCの抑制効果を評価するため、放射線照射した（20 Gy）BMDC（10000/ウェル（実施例1及び2）又は5000/ウェル（実施例5））を増殖反応アッセイに加えた。
【００５７】
BMDCはT細胞の増殖に対し強い抑制効果を有する酵素、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）を発現する。BMDCにおけるiNOSの発現は、活性化されて増殖しているT細胞から放出されるインターフェロンγによって誘導される。本発明者らは本発明者らの実験におけるiNOSの抑制効果に主たる関心は抱かない。実は、この抑制効果は極めて強力であるがために、本発明者らは酵素的iNOS活性をiNOSの選択的阻害剤であるL-NIL（N6-(1-イミノエチル)-L-リシン二塩酸塩）を加えることによって遮断し、抑制がiNOS活性によるもののみでないことを保証しなければならない。
【００５８】
（THP-1細胞におけるIDO1の誘導）
THP-1細胞を適切な数のT75フラスコから回収した。細胞をビルケルチャンバ中で計数し、0.4％トリパンブルーで染色した。各実験のための適切な数の細胞を、新しいチューブに移し、1200 rpm、室温（RT）で5分遠心分離した。上清を廃棄し、5％ FBSを含む新鮮なRPMIを加えて2×105細胞/mLの細胞濃度を得た。化合物を6ウェルプレート中の5つの分離したウェルに加え、細胞を加えた後に5つの異なる最終濃度が得られるようにした。対照は、6ウェルプレート中の細胞が加えられた1つのウェルに加えた。ウェル当たり1×106細胞を播種し、ウェル当たりの全容量が5 mLとなるようにした。細胞を37℃、5％ CO2で96時間インキュベートした。96時間後、アッセイを停止して細胞をRNAの単離のために溶解させた。
【００５９】
（RNA抽出及びRT-qPCRによる遺伝子発現の定量化）
RNA RNeasy Mini抽出キット（Qiagen）を使用し、製造業者の説明書に従って、全RNAをTHP-1細胞から抽出した。SuperScript（登録商標）VILO（商標）RT-キット（Thermo Fisher）を使用して1 μgの全RNAをcDNAへと逆転写し、qPCRを実施した。ヒトIDO1遺伝子の増幅に使用したプライマーは、
【化１】
2018510216.tif 000002
であった。ヒトHPRT1に対する内在基準遺伝子の増幅に使用したプライマーは、
【化２】
2018510216.tif 000003
であった。簡潔に記載すると、RT-qPCRは20 μlの反応液中で実施し、これは10 μl PowerUp SYBR Greenマスターミックス、0.5 μMの各プライマー、4 μlのIDO1増幅用希釈cDNA、及び1.5 μlのHPRT1増幅用希釈cDNAで構成された。iCycler iQリアルタイム検出システム（Stratagene, Mx3000P, La Jolla, CA, USA）を使用し、以下の熱プロファイル： 50℃で2分のUDGインキュベーションに続いて95℃で5分の変性、それに続いて45サイクルの94℃で15秒、58℃で30秒、及び60℃で30秒の熱サイクル及びPCR産物のリアルタイム検出を実施した。増幅後、融解曲線分析を実施した。RT-qPCR実験は常に3連で実行した。IDO1はΔCt法を使用して、2つのHPRT1基準遺伝子の幾何平均に対し正規化した。群内比較はΔΔCt法を使用して、1つの対照試料に対して正規化した。
【００６０】
（実施例1―ゼブラリンとともに培養したBMDCは（PGE2あり又はなしで）インビトロでリンパ節細胞の増殖反応を抑制する）
ラットを尾の付け根に完全フロイントアジュバント中に乳化された100 μg OVAで免疫化した。免疫化から7日後、鼠径部リンパ節を単離した。リンパ節細胞（LN細胞、全リンパ節集団）を96ウェルプレート中で培養し（100000/ウェル）、ゼブラリン（50 μM）とともに培養された放射線照射（20 Gy）を受けたBMDC（10000/ウェル）を加えて、又は加えずに、PGE2を加えて、又は加えずに、3日間にわたってOVA（100 μg/ml）で再刺激をするか、又は無刺激とした（対照、OVAなし）。抑制効果がiNOS活性によるもののみでないことを保証するため、iNOS阻害剤L-NIL（0.01 mg/ml）を一部のウェルに加えた。37℃、5％ CO2で3日置いた後、培養物に最後の8時間にわたって0.5 μCiの[3H]チミジンをパルスした。
【００６１】
結果を6連ウェルの平均±SDとして表す（図1）。
【００６２】
結果は、インビトロで1：10の比率で加えた場合、規定された抗原オボアルブミンに対する免疫リンパ節細胞の増殖反応が完全に抑制されたことを示している。PGE2存在下でのDCの培養によってはこの効果は低下しない。iNOS阻害剤L-NILの存在下でリンパ節細胞の反応が限定された増加をすることに基づくと、加えられたDCの効果の小規模なごく一部のみが、他の環境ではインビトロでTリンパ球の反応性を強く一過的に抑制できることが知られている酵素iNOSの発現に起因するようである。結果は生成されたDCがインビトロでタンパク質抗原に対するリンパ節細胞の反応を阻害する能力をまさに示すことを確証する。
【００６３】
（実施例2―ゼブラリンとともに培養されたBMDCは（PGE2の存在下、非存在下で）インビトロでT細胞の増殖反応を抑制する）
ラットを尾の付け根に完全フロイントアジュバント中に乳化された100 μg OVAで免疫化した。免疫化から7日後、CD4+ T細胞を鼠径部リンパ節から単離した。また、CD4+ T細胞（50000/ウェル）をOX62+ DC（未処置対照ルイスラットの脾臓から単離したもの）（10000/ウェル）と96ウェルプレート中で共培養し、ゼブラリン（50 μM）とともに培養されたBMDC（10000/ウェル）を加えて、又は加えずに、PGE2を加えて、又は加えずに、3日間にわたってOVA（100 μg/ml）で再刺激をするか、又は無刺激とした（対照、OVAなし）。抑制効果がiNOS活性によるもののみでないことを保証するため、iNOS阻害剤L-NIL（0.01 mg/ml）を一部のウェルに加えた。37℃、5％ CO2で3日置いた後、培養物に最後の8時間にわたって0.5 μCiの[3H]チミジンをパルスした。
【００６４】
結果を6連ウェルの平均±SDとして表す（図2）。
【００６５】
これらの結果は、混合されたDCが、実に純粋なCD4+ Tリンパ球（≧98％、Bリンパ球又は非リンパ球細胞の混入は最小限である）の反応を抑制することができることを示している。これらのT細胞は細胞溶解性エフェクター細胞による免疫反応の遂行、及び抗体産生を遂行する抗体産生B細胞の援助において中心的な役割を有するため、これらのT細胞を阻害することは特に重要である。このインビトロ実験において、ある種の活性化脾臓OX62+ DCが加えられ、純粋なTリンパ球に抗原提示しなくてはならないことに留意されたい。本発明者らの抑制性DCはこの事例においてこれらの活性化DCの活動を抑制する。
【００６６】
（実施例3―ゼブラリン及びPGE2とともに培養されたBMDCは皮下接種後に流入領域リンパ節へと移動する）
ラットを尾の付け根に完全フロイントアジュバント中に乳化された100 μg OVAで免疫化した。5日後、ラットの大腿部にゼブラリン（50 μM）及びPGE2とともに培養した2×106個のCFSEで染色されたBMDCを皮下接種した。鼠径部リンパ節をBMDCの接種後72時間で単離し、低密度リンパ節細胞を密度遠心分離により単離した。単離低密度細胞由来の試料をCFSE陽性BMDCの検出についてFACSCaliburで分析した。
【００６７】
結果を図3に示す。
【００６８】
寛容原性DCのインビボ効果についての重要な特徴は、それらが接種領域から流出してリンパ節へと移動することが可能となるのに要求される受容体を示していることである。この種の主要受容体（CCR7）の発現を増強することは、DCをPGE2処理することの役割である。これらの結果は抑制性DCが実に流出領域リンパ節へと移動することを示している。
【００６９】
（実施例4―ゼブラリンとともに（PGE2を加えて、又は加えずに）培養したBMDCで処置された免疫化ラット由来のリンパ節細胞はインビトロで再刺激に対し低下した増殖反応を表す。）
ラットを尾の付け根に完全フロイントアジュバント中に乳化された100 μg OVAで免疫した。同時に、ラットの一部には大腿部への皮下接種によりゼブラリン（50 μM）とともに培養された（PGE2を加えて、又は加えずに）2×106個のBMDCを与えた。免疫化から7日後、鼠径部リンパ節を単離した。リンパ節細胞（LN細胞、全リンパ節集団）を96ウェルプレート中で培養し（100000/ウェル）OVA（100 μg/ml）で3日間再刺激した。抑制効果がiNOS活性によるもののみでないことを保証するために、iNOS阻害剤L-NIL（0.01 mg/ml）を一部のウェルに加えた。37℃、5％ CO2で3日間置いた後、培養物に最後の8時間にわたって0.5 μCiの[3H]チミジンをパルスした。
【００７０】
結果を6連ウェルの平均±SDとして表す（図4）。
【００７１】
これらのインビボの結果は、DCが免疫化と同時に、しかしながら異なる部位に接種されても同じリンパ節へと流出し、これらのDCはリンパ節リンパ球の反応性を阻害することを示している。阻害効果はiNOS活性に起因しなかった。
【００７２】
（実施例5―ゼブラリンによるBMDCの処理はインビトロでFVIIIにより下処理されたCD4+ T細胞のFVIIIによる再刺激への増殖反応に対する抑制効果を増加させる）
ラットを尾の付け根への1 μg LPSと混ぜ合わせた150 IU/kgヒトFVIII（Advate）の皮下投与により、2週間の間隔を空けて2回免疫化した。免疫化から7日後、CD4+ T細胞を鼠径部流出領域リンパ節から単離した。CD4+ T細胞（50000/ウェル）をOX62+ DC（未処置対照ルイスラットの脾臓から単離したもの）（5000/ウェル）とともに96ウェルプレート中で共培養し、3日間にわたってゼブラリンを加えて（「Zeb」）（50 μM）、又は加えずに培養した半接着BMDC（「Semiadh」）又は非接着BMDC（「Nonadh」）を1:100（BMDC：T細胞、500 BMDC/ウェル）又は1:10（BMDC：T細胞、5000 BMDC/ウェル）の比で加えて、又は加えずにFVIII （Advate、1 μg/ml）で再刺激するか、又は無刺激とした。記録された抑制効果がiNOS活性によるもののみでないことを保証するために、iNOS阻害剤L-NIL（0.01 mg/ml）を一部のウェルに加えた。37℃、5％ CO2で3日間置いた後、培養物に最後の8時間にわたって0.5 μCiの[3H]チミジンをパルスした。
【００７３】
結果をパーセント刺激指標として表す。刺激指標（FVIIIで刺激された増殖反応を無刺激時の増殖反応で除したもの）を各々の試料について計算した。BMDCを加えていないウェルについての刺激指標を100％とみなした。結果を3連ウェルの平均±SDとして表す（図5）。
【００７４】
これらの結果は実に、混ぜ合わされたDCがFVIIIで下処理されたCD4+ Tリンパ球（Bリンパ球又は非リンパ球細胞の混入は最小限として）のインビトロでのFVIIIによる再刺激に対する増殖反応を抑制することができることを示している。また、これらの結果はゼブラリンによるDCの処理が、これらの抑制効果を増加させることを示している。
【００７５】
（実施例6―インビトロで誘導されたIDO1を発現する樹状細胞の静脈内伝達による、ヒトFVIIIで免疫化されたラットにおいて誘導される免疫反応の抑制）
成体ラットから骨髄細胞を回収した後、これらの細胞をGM-CSF及びIL-4の存在下培養することにより、未成熟樹状細胞への分化を誘導する。IDO1を発現する寛容原性ラット樹状細胞を、未成熟樹状細胞のゼブラリン単独での処理、又はIFN-γ及びゼブラリン若しくは他のIDO誘導因子（IFN-α、バルプロ酸、TGF-β）の組合わせでの処理により、インビトロで生成させる。
【００７６】
成体ラットを、ヒトFVIIIに対する検出可能なT細胞及びB細胞免疫反応の両方を誘導することが知られる、1 μg LPSと混合した150 IU/kgヒトFVIIIで2週間の間隔を空けて静脈内に2回免疫化した。ラットの1群において、ヒトFVIIIを負荷したインビトロで生成した寛容原性同系DCの3回分の用量を、最後の免疫化から1週間後から始めて静脈内投与する。対照群のラットには同様に免疫化はするが、樹状細胞の静脈内伝達は施さない。ヒトFVIIIに対する抗体についてELISAにより、及びヒトFVIIIに抗するT細胞反応性についてT細胞増殖アッセイ（チミジン取り込みアッセイ）により、及びサイトカイン産生についてELISA（IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-γ、TNF-α、及びIL-6）により動物をモニタリングする。
【００７７】
3回の用量のIDO1発現樹状細胞は、インビトロでアッセイされるヒトFVIIIに対するT細胞反応を抑制し、またヒトFVIIIに対する抗体反応を抑制すると期待される。IFN-γ及びゼブラリン又は別のIDO1誘導因子の組合わせによる抑制効果は、IFN-γ及び各誘導因子の組合わせによるIDO1誘導に対する相乗効果のためにより強力となることが期待される。また、IFN-γによる樹状細胞におけるトリプトファンの高親和性トランスポーターの誘導（Bhutiaの文献、2015）は、この高親和性トランスポーターを発現できない免疫T細胞に対するより強力な抑制効果をもたらすはずである。
【００７８】
（実施例7―FVIII抗体（阻害剤）を産生した成人血友病A患者のT細胞の反応性に対するIDO1発現自己由来樹状細胞のインビトロ抑制効果の実証）
CD34+ PBMCをFVIIIに対する抗体（阻害剤）を産生した成人血友病A患者から単離する。細胞をSCF、Flt3Lを伴う培養によりインビトロで増殖させ、GM-CSF及びIL-4により未成熟DCへと分化させる。未成熟DCにFVIIIを負荷し、ゼブラリン（50 μM）単独、又はIFN-γ及びゼブラリン若しくはIFN-α、若しくはバルプロ酸、若しくはTGF-βそれぞれの組合わせに3日間曝露し、IDO1の発現及び寛容原性機能を誘導する。
【００７９】
生成された寛容原性DCの試験日に、自己由来CD4+ T細胞及び単球を末梢血液から別々に単離し、磁気ビーズ分離により精製する（≧95％）。FVIIIに対するインビトロでの患者のT細胞反応性を、50,000個のCD4+ T細胞を5,000個の単球の存在下で0、0.01、0.1、0.3、及び1 μg/mlの濃度のFVIIIに曝露し、FVIIIを提示することによりアッセイする。T細胞増殖反応を3〜6日のインキュベーション期間の最後の8時間の間の3H-チミジン取り込みにより測定する。培養培地へのサイトカインの放出（IL2、IL4、IL5、IL6、IL17、IFN-γ、TNF-α）をELISAでアッセイする。IDO1発現DCの影響によるT細胞のTregへの転換の誘導を、FOX-P3+ CD4+細胞の頻度及び数を決定することによりFACSにおいてアッセイする。
【００８０】
生成された寛容原性DCはCD4+ T細胞の増殖反応及びそのサイトカインの生産/放出を阻害すると期待される。Th2型サイトカインの強力な阻害の実証は、Th2の抑制を介したB細胞抗体反応の抑制効果のほぼ確実な機構を示唆し、DCがインビボで抗FVIII抗体の生産に対する抑制効果を有するはずであると予測するだろう。
【００８１】
（実施例8―THP-1細胞におけるアザシチジンによるIDO1の誘導）
「THP-1細胞におけるIDO1の誘導」の下での手順に従い、表1に記載の最終濃度を得た。
【００８２】
表1：5 mLウェル中の結晶性5-アザシチジンの最終濃度
【表１】
2018510216.tif 000004
【００８３】
先に記載の通りの以下のRNA抽出及びRT-qPRCによる遺伝子発現の定量化、試料1〜6を使用するIDO1遺伝子発現の誘導を調べた。
【００８４】
表2：IDO1の発現に対する5-アザシチジン試料の結果
【表２】
2018510216.tif 000005
【００８５】
図6においても結果が示される。結果は、5-アザシチジンは単独でIDO1の遺伝子発現を最大23倍増加させることを示唆している。IDO誘導の最も高いレベルは、1 μMの濃度の5-アザシチジンで観察された。
【００８６】
（実施例9―THP-1細胞におけるデオキシアザシチジンによるIDO1の誘導）
「THP-1細胞におけるIDO1の誘導」の下での手順に従い、表3に記載の最終濃度を得た。
【００８７】
表3：5 mLのウェルにおける5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）の最終濃度
【表３】
2018510216.tif 000006
【００８８】
先に記載の通りの以下のRNA抽出及びRT-qPRCによる遺伝子発現の定量化、試料7〜12を使用するIDO1遺伝子発現の誘導を調べた。
【００８９】
表4：IDO1発現に対するデシタビン試料の結果
【表４】
2018510216.tif 000007
【００９０】
結果は図7にも示す。結果は、5-アザ-2'-デオキシシチジン単独で、IDO1の遺伝子発現を最大101倍増加させることを示唆している。IDO誘導の最も高いレベルは10 μMの濃度のデシタビンで観察された。
【００９１】
（参考文献）
Dhodapkar, M. et al., J. Exp. Med., 2001, 193(2), 233-238
Giannoukakis, N. et al., Diabetes Care, 2011, 34, 2026-2032 
Nittby, H. et al., PLOS ONE, 2013, 8(8), 1-8 
Langstein, J. Blood, 1999, 94, 3161-3168
Bhutia, Y. et al., Biochim Biophys Acta, 2015, 1848, 453-462
【００９２】
（略語）
【表５】
2018510216.tif 000008
2018510216.tif 000009
【００９３】
本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通じて、文脈によりそうでないことが要求されない限り、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含むこと」のような変形は、明言される整数、工程、整数群、又は工程群の包括を意味するが、任意の他の整数、工程、整数群、又は工程群の除外を意味しないことが理解されよう。
【００９４】
本明細書で言及される全ての特許及び特許出願は、その全体が引用により組み込まれる。
【図１】
2018510216.tif 000010
【図２】
2018510216.tif 000011
【図３】
2018510216.tif 000012
【図４】
2018510216.tif 000013
【図５】
2018510216.tif 000014
【図６】
2018510216.tif 000015
【図７】
2018510216.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018510216000001.app
【国際調査報告】
2018510216.tif 000017
2018510216.tif 000018
2018510216.tif 000019
2018510216.tif 000020