(57)【要約】特にリボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体）の細胞内への送達に有用な組成物及び方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される組成物及び方法は、リボ核タンパク質複合体の多能性細胞及びリンパ管細胞内への送達に特に有用である。【選択図】図２
2018532404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核タンパク質複合体と、脂質凝集体形成カチオン性脂質と、エンハンサ要素と、を含む、組成物。
【請求項２】
前記リボ核タンパク質複合体が、エンドヌクレアーゼと、リボ核酸とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であり、前記リボ核酸が、ガイドＲＮＡである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１０】
2018532404.tif 000024
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９が独立して、水素、ハロゲン、−ＣＹ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり、
Ｌ１及びＬ２が独立して、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）２−、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンであり、
ｌが、１〜８の整数であり、
Ｘ−が、アニオンであり、
Ｙが、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである、請求項１〜３の一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１１】
2018532404.tif 000025
式中、
ｎが、１〜６の整数である、請求項１〜４の一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１２】
2018532404.tif 000026
式中、
ｍが、１〜１０の整数であり、
ｏ及びｐが独立して、８〜３０の整数である、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１が、置換または非置換のヘテロアルキルである、請求項１〜６の一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記エンハンサ要素が、核局在化シグナル配列に共有結合されるポリアミン部分を含む、請求項１〜７の一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリアミン部分が、スペルミン部分である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリアミン部分が、複数のスペルミン部分である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリアミン部分が、前記エンハンサ要素のＮ末端に結合される、請求項８〜１０の一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記エンハンサ要素が、配列番号１〜配列番号４６の配列を含む、請求項１〜１１の一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記エンハンサ要素が、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む、請求項１〜１１の一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ドナー核酸をさらに含む、請求項１〜１３の一項に記載の組成物。
【請求項１５】
真核細胞をさらに含む、請求項１〜１４の一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記真核細胞が、多能性細胞、リンパ管細胞、または肝細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記多能性細胞が、誘導性多能性細胞または胚性幹細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リンパ管細胞が、Ｔ細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、細胞培養物をさらに含む、請求項１〜１８の一項に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞トランスフェクション組成物を形成する方法であって、
（ｉ）リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成することと、
（ｉｉ）脂質凝集体形成カチオン性脂質を前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成することと、を含む、方法。
【請求項２１】
ステップ（ｉ）の前記接触させることが、前記リボ核酸を前記エンドヌクレアーゼと接触させることにより、リボ核タンパク質を形成することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リボ核タンパク質が、前記エンハンサ要素と接触させられることにより、前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｉ）の前記接触させることが、
（ｉａ）前記リボ核酸を前記エンドヌクレアーゼと接触させることにより、リボ核タンパク質を形成することと、
（ｉｂ）前記リボ核タンパク質を前記エンハンサ要素と接触させることにより、前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成することと、を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体が、第１の槽内にあり、前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、第２の槽内にある、請求項２０または２３の一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体が、前記第２の槽内で前記脂質凝集体形成カチオン性脂質と接触させられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体が、前記第１の槽内で前記脂質凝集体形成カチオン性脂質と接触させられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｉ）の前記接触させることが、生理学的に許容される溶液中で行われる、請求項２０〜２６の一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｉｉ）の前記接触させることが、生理学的に許容される溶液中で行われる、請求項２０〜２７の一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記生理学的に許容される溶液が、細胞培養培地である、請求項２７または２８の一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であり、前記リボ核酸が、ガイドＲＮＡである、請求項２０〜２９の一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記リボ核酸が、ガイドＲＮＡである、請求項２０〜３０の一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１３】
2018532404.tif 000027
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９が独立して、水素、ハロゲン、−ＣＹ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり、
Ｌ１及びＬ２が独立して、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）２−、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンであり、
ｌが、１〜８の整数であり、
Ｘ−が、アニオンであり、
Ｙが、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである、請求項２０〜３１の一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１４】
2018532404.tif 000028
式中、
ｎが、１〜６の整数である、請求項２０〜３２の一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１５】
2018532404.tif 000029
式中、
ｍが、１〜１０の整数であり、
ｏ及びｐが独立して、８〜３０の整数である、請求項２０〜３３の一項に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ１が、置換または非置換のヘテロアルキルである、請求項３２〜２９の一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記エンハンサ要素が、核局在化シグナル配列に共有結合されるポリアミン部分を含む、請求項２０〜３５の一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリアミン部分が、スペルミン部分である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリアミン部分が、複数のスペルミン部分である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリアミン部分が、前記エンハンサ要素のＮ末端に結合される、請求項３６〜３８の一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記エンハンサ要素が、配列番号１〜配列番号４６の配列を含む、請求項２０〜３９の一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記エンハンサ要素が、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む、請求項２０〜４０の一項に記載の方法。
【請求項４２】
（ｉｉ）における前記接触させることの前に、前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体をドナー核酸と接触させることをさらに含む、請求項２０〜４１の一項に記載の方法。
【請求項４３】
細胞トランスフェクション組成物を形成する方法であって、
（ｉ）脂質凝集体形成カチオン性脂質を、第１の反応槽内で細胞培養培地と接触させることにより、脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を形成することと、
（ｉｉ）リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を、第２の反応槽内で接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成することと、
（ｉｉｉ）前記脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を、前記第２の反応槽内で前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成することと、を含む、方法。
【請求項４４】
細胞トランスフェクション組成物を形成する方法であって、
（ｉ）リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を、第１の反応槽内で接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成することと、
（ｉｉ）脂質凝集体形成カチオン性脂質を、第２の反応槽内で細胞培養培地と接触させることにより、脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を形成することと、
（ｉｉｉ）前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を、前記第２の反応槽内で前記脂質凝集体形成カチオン性脂質培地と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成することと、を含む、方法。
【請求項４５】
前記リボ核タンパク質複合体が、エンドヌクレアーゼと、リボ核酸とを含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であり、前記リボ核酸が、ガイドＲＮＡである、請求項４３〜４５の一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１６】
2018532404.tif 000030
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９が独立して、水素、ハロゲン、−ＣＹ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり、
Ｌ１及びＬ２が独立して、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）２−、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンであり、
ｌが、１〜８の整数であり、
Ｘ−が、アニオンであり、
Ｙが、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである、請求項４３〜４６の一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１７】
2018532404.tif 000031
式中、
ｎが、１〜６の整数である、請求項４３〜４７の一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記脂質凝集体形成カチオン性脂質が、以下の式の構造を有し、
【化１８】
2018532404.tif 000032
式中、
ｍが、１〜１０の整数であり、
ｏ及びｐが独立して、８〜３０の整数である、請求項４３〜４８の一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記エンハンサ要素が、核局在化シグナル配列に共有結合されるポリアミン部分を含む、請求項４３〜４９の一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリアミン部分が、スペルミン部分である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリアミン部分が、複数のスペルミン部分である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリアミン部分が、前記エンハンサ要素のＮ末端に結合される、請求項５０〜５２の一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記エンハンサ要素が、配列番号１〜配列番号４６の配列を含む、請求項４３〜５３の一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記エンハンサ要素が、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む、請求項４３〜５４の一項に記載の方法。
【請求項５６】
（ｉｉｉ）における前記接触させることの前に、前記リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体をドナー核酸と接触させることをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
真核細胞と、リボ核タンパク質複合体と、脂質凝集体形成カチオン性脂質と、エンハンサ要素と、を含む、インビトロ細胞培養物。
【請求項５８】
前記真核細胞が、多能性細胞、リンパ管細胞、または肝細胞である、請求項５７に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項５９】
前記多能性細胞が、誘導性多能性細胞または胚性幹細胞である、請求項５８に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項６０】
前記リンパ管細胞が、Ｔ細胞である、請求項５８に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項６１】
前記培養物が、約２０％〜約６０％コンフルエントである、請求項５７〜６０の一項に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項６２】
前記培養物が、約４０％未満コンフルエントである、請求項５７〜６１の一項に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項６３】
前記培養物が、約３０％コンフルエントである、請求項５７〜６２の一項に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項６４】
前記培養物が、約４０％コンフルエントである、請求項５７〜６３の一項に記載のインビトロ細胞培養物。
【請求項６５】
リボ核タンパク質複合体を細胞内にトランスフェクトする方法であって、細胞を請求項１〜１９の一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項６６】
前記接触させることの前に、請求項４３または請求項４４により記載されるような細胞トランスフェクション組成物を形成することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年１０月１４日出願の米国仮出願第６２／２４１，５５９号に対して３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとで優先権を主張し、これは、本出願を以って一般的に保有され、本明細書に完全に記載されるように、参照によりその全体が本明細書に明白に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願はここで、参照により、本出願と共に同時出願された電子配列表の資料を組み込む。電子配列表内の資料は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１０月１４日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＬＴ０１１００＿ＳＬ．ｔｘｔと名前を付けられ、サイズは２２，５４３バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ技術における最近の進歩により、研究者が細胞及び回路をインビボで効率的に操作できるようになっている。しかしながら、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのオフターゲット効果の可能性は、治療応用に関して大きな懸念事項を残す。最近、高編集効率及び低減されたオフターゲット効果に起因して、精製されたＣａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）の送達に対する注目が高まっている。Ｃａｓ９  ＲＮＰは、電気穿孔を介して哺乳動物細胞に送達され得るが、使用のし易さ、低コスト、及び高処理量システムに対する適合に起因して好ましい送達方法である脂質媒介トランスフェクションは、Ｃａｓ９  ＲＮＰの送達において非効率である。特に、多能性幹細胞及びリンパ管由来細胞は、脂質媒介方法論を使用するＣＡＳ９  ＲＮＰによるトランスフェクションに耐性がある。したがって、当技術分野において、これらの細胞内への核酸、タンパク質、及び／またはリボ核タンパク質の送達を可能にするトランスフェクション組成物及び方法が必要とされている。本明細書に提供される発明は、これら及び当技術分野における他の短所に対処する。
【発明の概要】
【０００４】
第１の態様において、リボ核タンパク質複合体と、脂質凝集体形成カチオン性脂質と、エンハンサ要素とを含む組成物が提供される。
【０００５】
別の態様において、細胞トランスフェクション組成物を形成する方法が提供される。本方法は、（ｉ）リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成するステップと、（ｉｉ）脂質凝集体形成カチオン性脂質をリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成するステップとを含む。
【０００６】
別の態様において、細胞トランスフェクション組成物を形成する方法が提供される。本方法は、（ｉ）脂質凝集体形成カチオン性脂質を、第１の反応槽内で細胞培養培地と接触させることにより、脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を形成するステップと、（ｉｉ）第２の反応槽内でリボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成するステップと、（ｉｉｉ）第２の反応槽内で脂質凝集体形成カチオン性脂質培地をリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成するステップとを含む。
【０００７】
別の態様において、細胞トランスフェクション組成物を形成する方法が提供される。本方法は、（ｉ）第１の反応槽内でリボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成するステップと、（ｉｉ）第２の反応槽内で脂質凝集体形成カチオン性脂質を細胞培養培地と接触させることにより、脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を形成するステップと、（ｉｉｉ）第２の反応槽内でリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を脂質凝集体形成カチオン性脂質培地と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成するステップとを含む。
【０００８】
別の態様において、真核細胞と、リボ核タンパク質複合体と、脂質凝集体形成カチオン性脂質と、エンハンサ要素とを含むインビトロ細胞培養物が提供される。
【０００９】
別の態様において、リボ核タンパク質複合体を細胞内にトランスフェクトする方法が提供される。本方法は、細胞を、実施形態を含む本明細書に提供される組成物と接触させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の識別９６ウェル形式で６つの異なる細胞株を使用して６０個超のトランスフェクション試薬をスクリーニングするために、体系的なＤＯＥ（実験計画）取り組みを使用した。方法の項を参照されたい。ゲノム切断効率を出力として使用した。ここで、４８個の試薬のみ（ｘ軸ビン）が、４つの異なる細胞株（Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＨｅｐＧ２）で示された。トランスフェクション試薬４７（矢印）は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を示す。細胞型の凡例：上から下のパネル：Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２。インデル％：「挿入及び欠失パーセント。」
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の識別９６ウェル形式で６つの異なる細胞株を使用して６０個超のトランスフェクション試薬をスクリーニングするために、体系的なＤＯＥ（実験計画）取り組みを使用した。方法の項を参照されたい。ゲノム切断効率を出力として使用した。ここで、４８個の試薬のみ（ｘ軸ビン）が、４つの異なる細胞株（Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＨｅｐＧ２）で示された。トランスフェクション試薬４７（矢印）は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を示す。細胞型の凡例：上から下のパネル：Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２。インデル％：「挿入及び欠失パーセント。」
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の識別９６ウェル形式で６つの異なる細胞株を使用して６０個超のトランスフェクション試薬をスクリーニングするために、体系的なＤＯＥ（実験計画）取り組みを使用した。方法の項を参照されたい。ゲノム切断効率を出力として使用した。ここで、４８個の試薬のみ（ｘ軸ビン）が、４つの異なる細胞株（Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＨｅｐＧ２）で示された。トランスフェクション試薬４７（矢印）は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を示す。細胞型の凡例：上から下のパネル：Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２。インデル％：「挿入及び欠失パーセント。」
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の識別９６ウェル形式で６つの異なる細胞株を使用して６０個超のトランスフェクション試薬をスクリーニングするために、体系的なＤＯＥ（実験計画）取り組みを使用した。方法の項を参照されたい。ゲノム切断効率を出力として使用した。ここで、４８個の試薬のみ（ｘ軸ビン）が、４つの異なる細胞株（Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＨｅｐＧ２）で示された。トランスフェクション試薬４７（矢印）は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を示す。細胞型の凡例：上から下のパネル：Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２。インデル％：「挿入及び欠失パーセント。」
【図２】ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用する細胞トランスフェクションの一般的なプロトコルを描写する図式。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｉ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）のマスタ混合を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、及びＣａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体のインキュベーション時間は、従属変数であった。示された時点で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の分割量を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の分割量に添加し、示された時間の間インキュベートし、その後、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞それぞれに添加した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノム切断効率を判定した。図３Ａ〜３Ｃ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の安定性。図３Ｄ〜３Ｆ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）のＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）の安定性。図３Ｇ〜３Ｉ：Ａ５４９、ＨＥＫ２８３、及びＨｅｌａ細胞それぞれにおけるＣａｓ９ＲＮＰ及びＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体の安定性。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃ。トランスフェクション効率を調節する要因。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を介するＣａｓ９  ＲＮＰの送達。Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、及びＵ２ＯＳを、２つの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、次いで、０．２または０．４μｌのいずれかのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用して、４０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び８．５ｎｇのｇＲＮＡ（１Ｘ）、８０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び１７ｎｇのｇＲＮＡ（２Ｘ）、または１２０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び２５．５ｎｇのｇＲＮＡ（３Ｘ）のいずれかでトランスフェクトした。編集効率を、トランスフェクションの４８時間後に判定した。Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒを使用してインデルパーセンテージを判定し、ＪＭＰ１１ソフトウェアを使用して得られたデータを処理した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ（図４Ａ）の用量、細胞密度（図４Ｂ）、及びトランスフェクション試薬の量（図４Ｃ）によるインデル％のＡＮＯＶＡ（分散分析）分析を、６つの異なる細胞株にわたって行った。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃ。トランスフェクション効率を調節する要因。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を介するＣａｓ９  ＲＮＰの送達。Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、及びＵ２ＯＳを、２つの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、次いで、０．２または０．４μｌのいずれかのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用して、４０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び８．５ｎｇのｇＲＮＡ（１Ｘ）、８０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び１７ｎｇのｇＲＮＡ（２Ｘ）、または１２０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び２５．５ｎｇのｇＲＮＡ（３Ｘ）のいずれかでトランスフェクトした。編集効率を、トランスフェクションの４８時間後に判定した。Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒを使用してインデルパーセンテージを判定し、ＪＭＰ１１ソフトウェアを使用して得られたデータを処理した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ（図４Ａ）の用量、細胞密度（図４Ｂ）、及びトランスフェクション試薬の量（図４Ｃ）によるインデル％のＡＮＯＶＡ（分散分析）分析を、６つの異なる細胞株にわたって行った。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃ。トランスフェクション効率を調節する要因。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を介するＣａｓ９  ＲＮＰの送達。Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、及びＵ２ＯＳを、２つの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、次いで、０．２または０．４μｌのいずれかのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用して、４０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び８．５ｎｇのｇＲＮＡ（１Ｘ）、８０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び１７ｎｇのｇＲＮＡ（２Ｘ）、または１２０ｎｇのＣａｓ９タンパク質及び２５．５ｎｇのｇＲＮＡ（３Ｘ）のいずれかでトランスフェクトした。編集効率を、トランスフェクションの４８時間後に判定した。Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒを使用してインデルパーセンテージを判定し、ＪＭＰ１１ソフトウェアを使用して得られたデータを処理した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ（図４Ａ）の用量、細胞密度（図４Ｂ）、及びトランスフェクション試薬の量（図４Ｃ）によるインデル％のＡＮＯＶＡ（分散分析）分析を、６つの異なる細胞株にわたって行った。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用する細胞毒性。（図５Ａ）トランスフェクション前（０時間）及びトランスフェクションの４８時間後（４８時間）に、Ａ５４９、Ｈｅｌａ、及びヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）の形態を、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（商標）器具により調査した。（図５Ｂ）トランスフェクションの４８時間後に判定されたゲノム修飾効率を描写するヒストグラム。（図５Ｃ）細胞生存率を、トランスフェクション前（０時間）及びトランスフェクション後の４８時間後にトリパンブルーにより測定した。ヒストグラムビンの凡例：０時間（斜線）、４８時間（一色）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用する細胞毒性。（図５Ａ）トランスフェクション前（０時間）及びトランスフェクションの４８時間後（４８時間）に、Ａ５４９、Ｈｅｌａ、及びヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）の形態を、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（商標）器具により調査した。（図５Ｂ）トランスフェクションの４８時間後に判定されたゲノム修飾効率を描写するヒストグラム。（図５Ｃ）細胞生存率を、トランスフェクション前（０時間）及びトランスフェクション後の４８時間後にトリパンブルーにより測定した。ヒストグラムビンの凡例：０時間（斜線）、４８時間（一色）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃ。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用する細胞毒性。（図５Ａ）トランスフェクション前（０時間）及びトランスフェクションの４８時間後（４８時間）に、Ａ５４９、Ｈｅｌａ、及びヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）の形態を、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（商標）器具により調査した。（図５Ｂ）トランスフェクションの４８時間後に判定されたゲノム修飾効率を描写するヒストグラム。（図５Ｃ）細胞生存率を、トランスフェクション前（０時間）及びトランスフェクション後の４８時間後にトリパンブルーにより測定した。ヒストグラムビンの凡例：０時間（斜線）、４８時間（一色）。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びドナーＤＮＡの共送達。ＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの中に共トランスフェクトした（図６Ａ、６Ｂ）。代替的に、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を有する安定したＧｒｉｐＴｉｔｅ  ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３＊）細胞株内に共送達した（Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ）（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９プラスドナーＤＮＡ（Ｃａｓ９／Ｄ）の送達は、対照の役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリ分析及び遺伝的修飾アッセイにかけた。実験を三連で行った。図６Ｅ：凡例で示された条件下での相対パーセンテージを描写するヒストグラム。図６Ｆ：ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを描写するヒストグラム。ヒストグラムの凡例（左から右）：Ｎｅｇ、Ｃａｓ９／Ｄ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｆ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びドナーＤＮＡの共送達。ＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの中に共トランスフェクトした（図６Ａ、６Ｂ）。代替的に、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を有する安定したＧｒｉｐＴｉｔｅ  ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３＊）細胞株内に共送達した（Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ）（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９プラスドナーＤＮＡ（Ｃａｓ９／Ｄ）の送達は、対照の役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリ分析及び遺伝的修飾アッセイにかけた。実験を三連で行った。図６Ｅ：凡例で示された条件下での相対パーセンテージを描写するヒストグラム。図６Ｆ：ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを描写するヒストグラム。ヒストグラムの凡例（左から右）：Ｎｅｇ、Ｃａｓ９／Ｄ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｆ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びドナーＤＮＡの共送達。ＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの中に共トランスフェクトした（図６Ａ、６Ｂ）。代替的に、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を有する安定したＧｒｉｐＴｉｔｅ  ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３＊）細胞株内に共送達した（Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ）（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９プラスドナーＤＮＡ（Ｃａｓ９／Ｄ）の送達は、対照の役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリ分析及び遺伝的修飾アッセイにかけた。実験を三連で行った。図６Ｅ：凡例で示された条件下での相対パーセンテージを描写するヒストグラム。図６Ｆ：ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを描写するヒストグラム。ヒストグラムの凡例（左から右）：Ｎｅｇ、Ｃａｓ９／Ｄ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｆ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びドナーＤＮＡの共送達。ＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの中に共トランスフェクトした（図６Ａ、６Ｂ）。代替的に、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を有する安定したＧｒｉｐＴｉｔｅ  ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３＊）細胞株内に共送達した（Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ）（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９プラスドナーＤＮＡ（Ｃａｓ９／Ｄ）の送達は、対照の役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリ分析及び遺伝的修飾アッセイにかけた。実験を三連で行った。図６Ｅ：凡例で示された条件下での相対パーセンテージを描写するヒストグラム。図６Ｆ：ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを描写するヒストグラム。ヒストグラムの凡例（左から右）：Ｎｅｇ、Ｃａｓ９／Ｄ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｆ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びドナーＤＮＡの共送達。ＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの中に共トランスフェクトした（図６Ａ、６Ｂ）。代替的に、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を有する安定したＧｒｉｐＴｉｔｅ  ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３＊）細胞株内に共送達した（Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ）（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９プラスドナーＤＮＡ（Ｃａｓ９／Ｄ）の送達は、対照の役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリ分析及び遺伝的修飾アッセイにかけた。実験を三連で行った。図６Ｅ：凡例で示された条件下での相対パーセンテージを描写するヒストグラム。図６Ｆ：ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを描写するヒストグラム。ヒストグラムの凡例（左から右）：Ｎｅｇ、Ｃａｓ９／Ｄ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ。
【図６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆ。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びドナーＤＮＡの共送達。ＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの中に共トランスフェクトした（図６Ａ、６Ｂ）。代替的に、４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を有する安定したＧｒｉｐＴｉｔｅ  ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３＊）細胞株内に共送達した（Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ）（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９プラスドナーＤＮＡ（Ｃａｓ９／Ｄ）の送達は、対照の役割を果たした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をフローサイトメトリ分析及び遺伝的修飾アッセイにかけた。実験を三連で行った。図６Ｅ：凡例で示された条件下での相対パーセンテージを描写するヒストグラム。図６Ｆ：ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを描写するヒストグラム。ヒストグラムの凡例（左から右）：Ｎｅｇ、Ｃａｓ９／Ｄ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／Ｄ。
【図７】細胞操作におけるＣＲＩＳＰＲ技術を描写する図式。
【図８】Ｃａｓ９のために利用可能な送達形式を描写する図式。
【図９】脂質スクリーニング実験計画を描写する図式。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｆ。Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階を用いる、Ｈｅｌａ細胞（上方の列）及びＡ５４９細胞（下方の列）のための脂質スクリーニングの結果のヒストグラム。各ヒストグラムビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであった。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｆ。Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階を用いる、Ｈｅｌａ細胞（上方の列）及びＡ５４９細胞（下方の列）のための脂質スクリーニングの結果のヒストグラム。各ヒストグラムビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであった。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｆ。Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階を用いる、Ｈｅｌａ細胞（上方の列）及びＡ５４９細胞（下方の列）のための脂質スクリーニングの結果のヒストグラム。各ヒストグラムビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであった。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｆ。Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階を用いる、Ｈｅｌａ細胞（上方の列）及びＡ５４９細胞（下方の列）のための脂質スクリーニングの結果のヒストグラム。各ヒストグラムビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであった。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｆ。Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階を用いる、Ｈｅｌａ細胞（上方の列）及びＡ５４９細胞（下方の列）のための脂質スクリーニングの結果のヒストグラム。各ヒストグラムビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであった。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜１０Ｆ。Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階を用いる、Ｈｅｌａ細胞（上方の列）及びＡ５４９細胞（下方の列）のための脂質スクリーニングの結果のヒストグラム。各ヒストグラムビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであった。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドのためのトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラム。細胞株（左から右、上から下）：Ｕ２０Ｓ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＭＣＦ７。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドのためのトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラム。細胞株（左から右、上から下）：Ｕ２０Ｓ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＭＣＦ７。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドのためのトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラム。細胞株（左から右、上から下）：Ｕ２０Ｓ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＭＣＦ７。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドのためのトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラム。細胞株（左から右、上から下）：Ｕ２０Ｓ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＭＣＦ７。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドのためのトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラム。細胞株（左から右、上から下）：Ｕ２０Ｓ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＭＣＦ７。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドのためのトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラム。細胞株（左から右、上から下）：Ｕ２０Ｓ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＭＣＦ７。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。
【図１２】図は、Ｃａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの送達を増強したことを示す結果を描写する。細胞型のカラム（左から右の順番で）：Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨＥｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｕ２０Ｓ。Ｙ軸：ＧＣＤ％。各細胞型の結果が描写される（左から右）：Ｃａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬と組み合わされたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書で使用される略語は、化学的及び生物学的分野におけるそれらの従来の意味を有する。本明細書に記載される化学構造及び化学式は、化学的分野で既知の化学結合価の標準的なルールに従って構成される。
【００１２】
置換基が、左から右に記述されるそれらの従来の化学式により特定される場合、それらは、構造を右から左に記述することによる化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−と同等である。
【００１３】
「アルキル」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、別途記載されない限り、直線（すなわち、非分岐）もしくは分岐状鎖、またはそれらの組み合わせを意味し、これは、完全に飽和、一不飽和、または多価不飽和され得、指定された炭素原子の数（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１個〜１０個の炭素を意味する）を有する二価及び多原子価ラジカルを含み得る。アルキルは、未環化鎖である。飽和炭化水素ラジカルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、（シクロへキシル）メチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−へキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの相同体及び異性体などの基が含まれるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和のアルキル基の例には、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高次相同体及び異性体が含まれるが、これらに限定されない。アルコキシは、酸素リンカー（−Ｏ−）を介して分子の残りに結合されたアルキルである。
【００１４】
「アルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、別途記載されない限り、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示されるが、これに限定されないアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。典型的には、アルキル（または、アルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が好ましいであろう。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはアルキレン基である。
【００１５】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体または別の用語と組み合わせて、別途記載されない限り、安定した直線もしくは分岐状鎖、またはそれらの組み合わせを意味し、少なくとも１個の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなり、ここで、窒素及び硫黄原子は任意に、酸化され得、窒素ヘテロ原子は任意に、四級化され得る。ヘテロ原子（複数可）であるＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置でまたはアルキル基が分子の残りに結合される位置で置き換えられ得る。ヘテロアルキルは、未環化鎖である。例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び−ＣＮが含まれるが、これらに限定されない。最大２個のヘテロ原子は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３のように連続し得る。
【００１６】
同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、別途記載されない限り、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−により例示されるが、これらに限定されないヘテロアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子はまた、鎖末端（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）のいずれかまたはそれらの両方を占めることができる。なおもさらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の配向は、連結基の式が記述される方向により示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。上述されるように、本明細書で使用される場合、ヘテロアルキル基は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、及び／または−ＳＯ２Ｒ’などのヘテロ原子を通して分子の残りに結合される基を含む。「ヘテロアルキル」が列挙され、その後、−ＮＲ’Ｒ’’または同様のものなどの特定のヘテロアルキル基の列挙が続く場合、ヘテロアルキル及び−ＮＲ’Ｒ’’という用語が重複ではないか、または相互排他的でないことが理解されるであろう。むしろ、明確にするために特定のヘテロアルキル基が列挙される。よって、「ヘテロアルキル」という用語は、−ＮＲ’Ｒ’’または同様のものなどの特定のヘテロアルキル基を排除すると本明細書で解釈されるべきではない。
【００１７】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自体でまたは他の用語と組み合わせて、別途記載されない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環式バーションを意味する。シクロアルキル及びヘテロアルキルは、芳香族ではない。加えて、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りに結合される位置を占めることができる。シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例には、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが含まれるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルキレン」は、単独でまたは別の置換基の一部としてそれぞれ、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。
【００１８】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それら自体でまたは別の置換基の一部として、別途記載されない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
「アシル」という用語は、別途記載されない限り、−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここで、Ｒは、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。
【００２０】
「アリール」という用語は、別途記載されない限り、多価不飽和芳香族炭化水素置換基を意味し、これは、１つに融合（すなわち、融合環アリール）または共有連結される単一の環または複数の環（好ましくは１〜３つの環）であり得る。融合環アリールは、融合される環のうちの少なくとも１つがアリール環である１つに融合される複数の環を指す。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１個〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または、環）を指し、ここで、窒素及び硫黄原子は任意に、酸化され、窒素原子（複数可）は任意に、四級化される。よって、「ヘテロアリール」という用語は、融合環ヘテロアリール基を含む（すなわち、融合環のうちの少なくとも１つがヘテロ芳香族環である場合、１つに融合される複数の環）。５，６融合環ヘテロアリレンは、１つに融合される２つの環を指し、ここで、一方の環は５つのメンバを有し、他方の環は６つのメンバを有し、少なくとも１つの環はヘテロアリール環である。同様に、６，６−融合環ヘテロアリレンは、一１つに融合される２つの環を指し、ここで、一方の環は６つのメンバを有し、他方の環は６つのメンバを有し、少なくとも１つの環はヘテロアリール環である。さらに、６，５融合環ヘテロアリレンは、１つに融合される２つの環を指し、ここで、一方の環は６つのメンバを有し、他方の環は５つのメンバを有し、少なくとも１つの環はヘテロアリール環である。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を通して分子の残りに結合され得る。アリール及びヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルが含まれる。上述されるアリール及びヘテロアリール環系の各々の置換基は、以下に記載される許容可能な置換基の群から選択される。「アリレン」及び「ヘテロアリレン」は、単独でまたは別の置換基の一部としてそれぞれ、アリール及びヘテロアリールに由来する二価ラジカルを意味する。
【００２１】
簡潔にするために、「アリール」という用語は、他の用語と組み合わせて使用されるとき（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記で定義されるようなアリール及びヘテロアリール環の両方を含む。よって、「アリールアルキル」という用語は、ラジカルを含むことを意味し、ここで、アリール基は、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）により置き換えられているアルキル基を含むアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に結合される。
【００２２】
「オキソ」という用語は、本明細書で使用される場合、炭素原子に二重結合される酸素を意味する。
【００２３】
「アルキルスルホニル」という用語は、本明細書で使用される場合、式−Ｓ（Ｏ２）−Ｒ’を有する部分を意味し、式中、Ｒ’は、上記で定義されるようなアルキル基である。Ｒ’は、特定の数の炭素を有し得る（例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキルスルホニル」）。
【００２４】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、及び「ヘテロアリール」）の各々は、示されたラジカルの置換及び非置換の形態の両方を含む。
【００２５】
アルキル及びヘテロアルキルラジカルの置換基（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称される基を含む）は、ゼロから（２ｍ’＋１）までの範囲の数で、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、及び−ＮＯ２から選択されるが、これらに限定されない多様な基のうちの１つ以上であり得、式中、ｍ’は、かかるラジカル内の炭素原子の合計数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’は各々好ましくは、独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（例えば、１〜３つのハロゲンで置換されるアリール）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本明細書に開示される化合物が１つを超えるＲ基を含むとき、例えば、Ｒ基の各々は独立して、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基であるとして選択されるが、これは、これらのうちの１つを超える基が存在する場合である。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合されるとき、それらは、窒素原子と組み合わされて、４−、５−、６−、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むが、これらに限定されない。置換基の上記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの、水素基以外の基に結合される炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。
【００２６】
アルキルラジカルに関して記載される置換基に類似して、アリール及びヘテロアリール基の置換基は変化し、かつ、ゼロから芳香環系上のオープン原子価の合計数までの範囲の数で、例えば、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’は好ましくは、独立して、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、及び置換または非置換のヘテロアリールから選択される。本明細書に開示される化合物が１つを超えるＲ基を含むとき、例えば、Ｒ基の各々は独立して、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基であるとして選択されるが、これは、これらのうちの１つを超える基が存在する場合である。
【００２７】
２つ以上の置換基は任意に結合されて、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を形成し得る。かかるいわゆる環形成置換基は典型的には、必須ではないが、環式基部構造に結合されることが見い出される。実施形態において、環形成置換基は、基部構造の隣接するメンバに結合される。例えば、環式基部構造の隣接するメンバに結合される２つの環形成置換基は、融合環構造を形成する。別の実施形態において、環形成置換基は、基部構造の単一のメンバに結合される。例えば、環式基部構造の単一のメンバに結合される２つの環形成置換基は、スピロ環式構造を形成する。さらに別の実施形態において、環形成置換基は、基部構造の隣接しないメンバに結合される。
【００２８】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは任意に、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の環を形成し得、式中、Ｔ及びＵは独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−、または単一の結合であり、ｑは、０〜３の整数である。代替的に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは任意に、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられ得、式中、Ａ及びＢは独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−、または単一の結合であり、ｒは、１〜４の整数である。そのように形成された新しい環の単一の結合のうちの１つは任意に、二重結合で置き換えられ得る。代替的に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは任意に、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ’−（Ｃ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基で置き換えられ得、式中、ｓ及びｄは独立して、０〜３の整数であり、Ｘ’は、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ’’’は好ましくは、独立して、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、及び置換または非置換のヘテロアリールから選択される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（複数可）、リン（Ｐ）、及びシリコン（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００３０】
「置換基」は、本明細書で使用される場合、以下の部分から選択される基を意味する：
（Ａ）−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換のアルキル、非置換のヘテロアルキル、非置換のシクロアルキル、非置換のヘテロシクロアルキル、非置換のアリール、非置換のヘテロアリール、ならびに
（Ｂ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換されるアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリール、
（ｉ）オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、ハロゲン、非置換のアルキル、非置換のヘテロアルキル、非置換のシクロアルキル、非置換のヘテロシクロアルキル、非置換のアリール、非置換のヘテロアリール、ならびに
（ｉｉ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換されるアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリール、
（ａ）オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、ハロゲン、非置換のアルキル、非置換のヘテロアルキル、非置換のシクロアルキル、非置換のヘテロシクロアルキル、非置換のアリール、非置換のヘテロアリール、ならびに
（ｂ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換されるアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリール：オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、ハロゲン、非置換のアルキル、非置換のヘテロアルキル、非置換のシクロアルキル、非置換のヘテロシクロアルキル、非置換のアリール、及び非置換のヘテロアリール。
【００３１】
「サイズ限定置換基（ｓｉｚｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「サイズ限定置換基（ｓｉｚｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書で使用される場合、「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」に関して上述される全ての置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）から選択される基を意味し、ここで、各置換または非置換のアルキルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルは、置換または非置換の２〜２０員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルは、置換または非置換のＣ４〜Ｃ８シクロアルキルであり、各置換または非置換のヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の４〜８員ヘテロシクロアルキルである。
【００３２】
「低級置換基（ｌｏｗｅｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「低級置換基（  ｌｏｗｅｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書で使用される場合、「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」に関して上述される全ての置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）から選択される基を意味し、ここで、各置換または非置換のアルキルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ８アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルは、置換または非置換の２〜８員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルは、置換または非置換のＣ５〜Ｃ７シクロアルキルであり、各置換または非置換のヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の５〜７員ヘテロシクロアルキルである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書における化合物内で記載される各置換基は、少なくとも１つの置換基で置換される。より具体的には、いくつかの実施形態において、本明細書における化合物内で記載される、各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリレン、及び／または置換ヘテロアリレンは、少なくとも１つの置換基で置換される。他の実施形態において、これらの基うちの少なくとも１つまたは全ては、少なくとも１つのサイズ限定置換基で置換される。他の実施形態において、これらの基のうちの少なくとも１つまたは全ては、少なくとも１つの低級置換基で置換される。
【００３４】
本明細書における化合物の他の実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルであり得、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の２〜２０員ヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３〜８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０アリールであり、かつ／または各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５〜１０員ヘテロアリールである。本明細書における化合物のいくつかの実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキレンは、置換もしくは非置換の２〜２０員ヘテロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ８シクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換もしくは非置換の３〜８員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のアリレンは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０アリレンであり、かつ／または各置換もしくは非置換のヘテロアリレンは、置換もしくは非置換の５〜１０員ヘテロアリレンである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８アルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の２〜８員ヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換もしくは非置換のアリールは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０アリールであり、かつ／または各置換もしくは非置換のヘテロアリールは、置換もしくは非置換の５〜９員ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、各置換もしくは非置換のアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ８アルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキレンは、置換もしくは非置換の２〜８員ヘテロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキレンは、置換もしくは非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換もしくは非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のアリレンは、置換もしくは非置換のＣ６〜Ｃ１０アリレンであり、かつ／または各置換もしくは非置換のヘテロアリレンは、置換もしくは非置換の５〜９員ヘテロアリレンである。いくつかの実施形態において、本化合物は、本明細書に記載される化学種である。
【００３６】
「ａ」または「ａｎ」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上を意味する。加えて、「［名詞］で置換される」という句は、本明細書で使用される場合、特定の基が、指定の置換基のいずれか１つ以上またはそれらの全てで置換され得ることを意味する。例えば、アルキル基またはヘテロアリール基などの基が「非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、または非置換の２〜２０員ヘテロアルキルで置換される」場合、基は、１つ以上の非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、及び／または１つ以上の非置換の２〜２０員ヘテロアルキルを含有し得る。さらに、部分がＲ置換基で置換される場合、基は、「Ｒ置換された」と称され得る。部分がＲ置換される場合、部分は、少なくとも１つのＲ置換基で置換され、各Ｒ置換基は任意に、異なる。
【００３７】
本発明の化合物の説明は、当業者に既知の化学結合の原理により限定される。したがって、基がいくつかの置換基のうちの１つ以上により置換され得る場合、かかる置換は、化学結合の原理に遵守し、本質的に不安定ではなく、かつ／または水性、中性、及びいくつかの既知の生理学的条件などの周囲条件下で不安定になる可能性が高いとして当業者に既知であるであろう化合物を提供するように選択される。例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、当業者に既知の化学結合の原理に遵守して、環ヘテロ原子を介して分子の残りに結合されることにより、本質的に不安定な化合物を回避する。
【００３８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照されたい。本明細書に記載されるものと類似するかまたは同等である任意の方法、デバイス、及び材料が、本発明の実践において使用され得る。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用されるある特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定することを意味しない。
【００３９】
「核酸」は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖形態のいずれか、またはそれらの補体におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの線状配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は典型的には、ポリヌクレオチドの単一の単位、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾されたバーションであり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、一本及び二本鎖ＤＮＡ、一本及び二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、ならびに一本及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。核酸は、線状または分岐であり得る。例えば、核酸は、ヌクレオチドの線状鎖であり得るか、または核酸は、例えば、核酸がヌクレオチドの１つ以上のアームまたは分岐を含むように分岐状であり得る。任意に、分岐状核酸は反復的に分岐されて、デンドリマーなどのより高次の構造が形成される。
【００４０】
ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）主鎖を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用により、別の分子、例えば、核酸またはポリペプチドと反応することができる任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用によりタンパク質またはポリペプチド上でアミオ酸（ａｍｉｏ  ａｃｉｄ）と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。
【００４１】
この用語は、既知のヌクレオチドアナログまたは修飾された主鎖残基もしくは連結部を含有する核酸も包含し、これは、合成され、自然発生し、かつ自然には発生せず、参照の核酸と類似の結合特性を有し、参照のヌクレオチドと類似の様式で代謝される。かかるアナログの例には、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）としても既知）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホネート、ホウ素ホスホネート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト連結部（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、ならびにペプチド核酸主鎖及び連結部を含むリン酸ジエステル誘導体が限定されることなく含まれる。他のアナログ核酸には、米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ，ｅｄｓ．に記載されているものを含む正の主鎖、非イオン主鎖、修飾された糖、及び非リボース主鎖（例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴまたはロックト核酸（ＬＮＡ））を有するものが含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の１つの定義内に含まれる。リボース−リン酸塩主鎖の修飾は、多様な理由、例えば、生理環境においてかかる分子の安定性及び半減期を増加するために、またはバイオチップ上のプローブとして行われ得る。自然発生する核酸とアナログとの混合物が作製され得るか、代替的に、異なる核酸アナログの混合物、ならびに自然発生する核酸とアナログとの混合物が作製され得る。実施形態において、ＤＮＡ内のヌクレオチド間連結部は、リン酸ジエステル、リン酸ジエステル誘導体、または両方の組み合わせである。
【００４２】
核酸は、非特異的配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「非特異的配列」という用語は、任意の他の核酸配列に対して相補的になるようには考案されてないか、または部分的にのみ相補的である一連の残基を含有する核酸配列を指す。例として、非特異的核酸配列は、細胞または生物と接触させられるとき、抑制核酸として機能しない核酸残基の配列である。「抑制核酸」は、標的核酸（例えば、タンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡ）に結合すること、及び標的核酸の転写（例えば、ＤＮＡからのｍＲＮＡ）を低減することもしくは標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を低減すること、または転写スプライシング（例えば、一本鎖モルホリノオリゴ）を改変することができる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログのポリマー）である。
【００４３】
「標識核酸またはオリゴヌクレオチド」は、核酸に結合される検出可能な標識の存在を検出することにより核酸の存在が検出され得るように、リンカーもしくは化学結合を通して共有結合的にまたはイオン性、ファンデルワールス、静電気的、もしくは水素結合を通して非共有結合的に、標識に結合されるものである。代替的に、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンなどの高親和性相互作用を使用する方法は、一対の結合パートナのうちの一方が他方に結合する場合、同じ結果を達成し得る。実施形態において、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー主鎖は、本明細書に開示され、当技術分野において一般的に既知の検出可能な標識を含む。
【００４４】
「プローブ」または「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、試料に対する特定のハイブリダイゼーションが検出され得る１つ以上の核酸フラグメントであると定義される。プローブまたはプライマーは、それが使用されるであろう特定の技法に応じて任意の長さのものであり得る。例えば、ＰＣＲプライマーは概して、長さ１０〜４０のヌクレオチドであるが一方で、例えば、サザンブロットのための核酸プローブは、長さ１００超のヌクレオチドであり得る。プローブは、標的または試料へのその結合が検出され得るように、以下に記載されるように未標識または標識され得る。プローブは、１つ以上の特定の（事前選択）部分の染色体、例えば、１つ以上のクローン、単離された全染色体もしくは染色体フラグメント、またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物の集合体からの核酸の源から生成され得る。標的素子上に固定化された核酸の長さ及び複合性は、本発明にとって重大ではない。当業者は、これらの要因を調整して、最適なハイブリダイゼーション及び所定のハイブリダイゼーション手順のためのシグナル生成を提供し得、かつ異なる遺伝子または遺伝子位置間で必要とされる解決策を提供し得る。
【００４５】
プローブは、配列にある場合、固体面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、融合シリカスライド）上で固定化される単離核酸でもあり得る。いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、ＷＯ９６／１７９５８に記載されているような核酸の配列のメンバであり得る。高密度配列を生成することができる技法も、この目的のために使用され得る（以下の参照されたい；例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ７６７−７７３、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４、Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０８７−１０９２、Ｋｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１２０−１２４、米国特許第５，１４３，８５４号）。
【００４６】
「相補的な」または「相補性」という語は、ポリヌクレオチド中の核酸が第２のポリヌクレオチド中の別の核酸との塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔは、配列Ｔ−Ｃ−Ａに対して相補的である。相補性は、いくつかの核酸のみが塩基対に従って一致する部分的か、または全ての核酸が塩基対に従って一致する完全であり得る。
【００４７】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用されるとき、核酸またはタンパク質が、それが自然状態で関連付けられる他の細胞構成成分を本質的に含まないことを表す。それは、例えば、均質状態であり得、乾燥または水溶液の状態であり得る。純度及び均質性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して判定される。調製物中に存在する主要種であるタンパク質は、実質的に精製される。
【００４８】
「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中の本質的に１つのバンドを上昇させることを表す。いくつかの実施形態において、核酸またはタンパク質は、少なくとも５０％純粋、任意に少なくとも６５％純粋、任意に少なくとも７５％純粋、任意に少なくとも８５％純粋、任意に少なくとも９５％純粋、及び任意に少なくとも９９％純粋である。
【００４９】
「単離された」という用語は、細胞または試料細胞も指すことができる。単離された細胞または試料細胞は、それらがそれらの天然状態であるときか、またはそれらがそれらの天然状態から最初に除去されるとき、細胞を通常伴う多くの構成成分を実質的に含まない単一の細胞型である。ある特定の実施形態において、単離された細胞試料は、細胞を所望の状態に維持するために必要とされるその自然状態からのそれらの構成成分を保持する。いくつかの実施形態において、単離された（例えば、精製された、分離された）細胞または単離された細胞だけが、実質的に試料中の細胞型である細胞である。精製された細胞試料は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１種類の細胞を含有し得る。単離された細胞試料は、細胞マーカの使用または細胞マーカを組み合わせて使用することにより得ることができ、そのいずれかは、未精製の細胞試料中の１つの細胞型に対して固有である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞分別機の使用により単離される。いくつかの実施形態において、細胞タンパク質に対する抗体は、細胞を単離するために使用される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、原子または分子の間の会合を指す。会合は、直接的または間接的であり得る。例えば、本明細書に提供される第１の部分（例えば、ポリアミン部分）と第２の部分（ペプチド部分）との間のコンジュゲートは、例えば共有結合により直接的であり得るか、または、例えば非共有結合（例えば、静電気的相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子−双極子、双極子−誘導性双極子、ロンドン分散）、環集積（パイ効果）、疎水性相互作用など）により間接的であり得る。実施形態において、コンジュゲートは、求核性置換（例えば、アミン及びアルコールのアシルハロゲン化物、活性エステルとの反応）、求電子性置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素及び炭素−ヘテロ原子への複数結合の付加（例えば、マイケル反応、ディールスアルダー付加）を含むが、これらに限定されないコンジュゲート化学を使用して形成される。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＦｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２で考察されている。実施形態において、第１の部分（例えば、ポリアミン部分）は、第１の部分（例えば、ポリアミン部分）の構成成分と第２の部分（ペプチド部分）の構成成分との間の非共有結合性化学反応により、第２の部分（ペプチド部分）に非共有結合される。他の実施形態において、第１の部分（例えば、ポリアミン部分）は、本明細書に記載されるように、１つ以上の反応性部分、例えば、共有結合性反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）を含む。他の実施形態において、第１の部分（例えば、ポリアミン部分）は、本明細書に記載されるように、１つ以上の反応性部分、例えば、共有結合性反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）を有するリンカーを含む。他の実施形態において、第２の部分（ペプチド部分）は、本明細書に記載されるように、１つ以上の反応性部分、例えば、共有結合性反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）を含む。他の実施形態において、第２の部分（ペプチド部分）は、本明細書に記載されるように、１つ以上の反応性部分、例えば、共有結合性反応性部分（例えば、アルキン、アジド、マレイミド、またはチオール反応性部分）を有するリンカーを含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、規定値を含む値の範囲を意味し、当業者は、規定値と合理的に類似すると見なすであろう。実施形態において、「約」という用語は、当技術分野において概して許容可能な測定値を使用して標準偏差の範囲内を意味する。実施形態において、約は、規定値の＋／−１０％に及ぶ範囲を意味する。実施形態において、約は、規定値を意味する。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用され、ここで、ポリマーは、アミノ酸から構成されない部分にコンジュゲートされ得る。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然発生するアミノ酸の人工的な化学的模倣体（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｉｍｅｔｉｃ）であるアミノ酸ポリマー、ならびに自然発生するアミノ酸ポリマー及び自然発生しないアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、マクロ環式ペプチド、非ペプチド官能価、ペプチド模倣体、ポリアミド、及びマクロラクタムで修飾されているペプチドに適用される。「融合タンパク質」は、単一の部分として組み換え発現される２つ以上の分離タンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
【００５３】
「ペプチジル」及び「ペプチジル部分」という用語は、一価のペプチドを意味する。
【００５４】
「アミノ酸」という用語は、自然発生する及び合成のアミノ酸、ならびに自然発生するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣体を指す。自然発生するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、自然発生するアミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合されるα炭素を指す。かかるアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、自然発生するアミノ酸と同じ塩基化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、自然発生するアミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物を指す。「自然発生しないアミノ酸」及び「非自然アミノ酸」という用語は、自然では見ることがないアミノ酸アナログ、合成アミノ酸、及びアミノ酸模倣体を指す。
【００５５】
アミノ酸は、それらの一般的に既知の３文字の記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨される１文字の記号により本明細書で称され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に許容される単一文字コードにより称され得る。
【００５６】
アミノ酸またはヌクレオチド塩基「位置」は、Ｎ末端（または、５’−端）に対するその位置に基づいて、参照の配列内の各アミノ酸（または、ヌクレオチド塩基）を順に識別する数字により表される。最適な整列を判定するときに検討されるべき欠失、挿入、切断、融合に起因して、一般的に、Ｎ末端から単に数えることにより判定される試験配列内のアミノ酸残基数は、必ずしも参照配列内のその対応する位置の数と同じである必要はない。例えば、変異体が整列した参照配列に対して欠失を有する場合、欠失の部位で参照配列内の位置に対応する変異体内にアミノ酸は存在しないであろう。整列した参照配列内に挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列内で番号付けされたアミノ酸位置に対応しないであろう。切断または融合の場合、対応する配列内のアミノ酸に一切対応しない参照配列または整列した配列内のいずれかにアミノ酸の伸展が存在し得る。
【００５７】
「〜に関連して番号付けされた」または「〜に対応する」という用語は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用されるとき、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときに特定される参照配列の残基の番号付けを指す。
【００５８】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、記載される対応するコドンのいずれかに改変され得る。かかる核酸変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書における全ての核酸配列も、全ての想定される核酸のサイレント変異を説明する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンのためだけのコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンのためだけのコドンであるＴＧＧを除く）が修飾されて、機能的に同一の分子がもたらされ得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現生成物に対しては各記載される配列内に潜在するが、実際のプローブ配列に対しては潜在しない。
【００５９】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列内で単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を改変、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、改変が化学的に類似するアミノ酸でアミノ酸を置換することをもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知されている。かかる保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体、及び対立遺伝子への付加であり、それらを排除しない。
【００６０】
以下の８個の基は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（複数可）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【００６１】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することにより判定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に関して、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較すると、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内で発生する位置の数を判定して、一致する位置の数を出し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の合計数で除算し、その結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを出すことにより計算される。
【００６２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手動整列及び目視検査により測定された場合、比較ウィンドウにわたる最大対応性に対して比較及び整列されるとき、同じであるか、または同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、例えば、本発明の全ポリペプチド配列または本発明のポリペプチドの個々のドメインの特定の領域にわたって６０％の同一性、任意に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性）、または指定された領域を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。次いで、かかる配列は、「実質的に同一」と言われる。この定義は、試験配列の補体も指す。任意に、同一性は、少なくとも長さ約５０のヌクレオチドにおける領域にわたって、またはより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００６３】
配列比較に関して、典型的には、１つの配列は、試験配列と比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列は、コンピュータに入力され、部分配列座標が指定され、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、または代替的なパラメータが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００６４】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、例えば、完全長配列、または２０〜６００、約５０〜約２００、もしくは約１００〜約１５０のアミノ酸またはヌクレオチドからなる群から選択される連続した位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後に、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。比較のための配列の整列の方法は、当技術分野において周知されている。比較のための最適な配列の整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索の方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または手動整列及び目視検査（以下を参照されたい；例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５増刊））により実施され得る。
【００６５】
配列同一性及び配列類似性パーセントを判定するのに好適であるアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センタ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、高スコアリング配列ペア（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒｓ）（ＨＳＰ）を、問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において、長さＷの短いワードを識別することにより最初に識別することを伴い、それらは、データベース配列において同じ長さの１つのワードと整列させたときに、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのどちらかである。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、（上記参照））。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見い出すために検索の開始用のシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積整列スコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致する残基の対のためのリワードスコア；常に＞０）及びＮ（一致しない残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリクスが累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの延長は停止され、それは：累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下し；累積スコアがゼロ以下に進み、１つ以上の負のスコアリング残基整列の蓄積に起因し；または、いずれかの配列の端に達したときである。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を判定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルト値として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルト値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２のスコアリングマトリクス（以下を参照されたい；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５）、５０の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【００６６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（以下を参照されたい；例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率〔Ｐ（Ｎ）〕であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対するテスト核酸の比較として、最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似すると見なされる。
【００６７】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して発生した抗体に免疫学的に交差反応性であることである。よって、ポリペプチドは典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってだけで異なる場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子またはそれらの補体が厳しい条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーが配列を増幅するために使用され得ることである。
【００６８】
「接触すること」は、その単純な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの固有の種（例えば、生体分子または細胞を含む化学化合物）が反応するか、相互作用するか、または物理的に接触するように十分に近位することを可能にするプロセスを指す。しかしながら、得られる反応生成物が、添加した試薬間の反応からか、または反応混合物中で生成され得る、添加した試薬のうちの１つ以上からの中間物から直接生成され得ることを理解されたい。実施形態において、接触させることは、例えば、本明細書に記載されるようなリボ核酸がエンドヌクレアーゼ及びエンハンサ要素と相互作用することを可能にすることを含む。
【００６９】
「対照」試料または値は、試験試料との比較のための参照、通常、既知である参照としての役割を果たす試料を指す。例えば、試験試料は、試験条件、例えば、試験化合物の存在下で採取され、既知の条件、例えば、試験化合物の不在下（陰性対照）、または既知の化合物の存在下（陽性対照）の試料と比較され得る。対照は、いくつかの試験または結果から収集した平均値も表し得る。当業者は、対照が任意の数のパラメータの評価のために考案され得ることを認識するであろう。例えば、対照は、薬理データ（例えば、半減期）または治療的尺度（例えば、副作用の比較）に基づいて、治療的利益を比較するために案出され得る。当業者は、どの標準的な対照が所定の状況において最も適切であるかを理解し、標準的な対照値との比較に基づいて、データを分析することができるであろう。標準的な対照はまた、データの有意性（例えば、統計的有意性）を判定するのに有価である。例えば、所定のパラメータに関する値が、標準的な対照において幅広く変動する場合、試験試料中の変化は、有意であるとは見なされない。
【００７０】
「標識化」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的な手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテン及びタンパク質、または例えば、放射性標識を、ペプチドもしくは標的ペプチドと特異的に反応する抗体に組み込むことにより検出可能になり得る他の物資が含まれる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載される方法を使用する、当技術分野において既知の、抗体を標識にコンシュゲートするための任意の適切な方法が用いられる。
【００７１】
「標識タンパク質またはポリペプチド」は、標識タンパク質またはポリペプチドに結合される標識の存在を検出することにより標識タンパク質またはポリペプチドの存在が検出され得るように、リンカーもしくは化学結合を通して共有結合的にまたはイオン性、ファンデルワールス、静電気的、もしくは水素結合を通して非共有結合的に、標識に結合されるものである。代替的に、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンなどの高親和性相互作用を使用する方法は、一対の結合パートナのうちの一方が他方に結合する場合、同じ結果を達成し得る。
【００７２】
「生物学的試料」または「試料」は、対象または患者から得られるか、またはそれらに由来する材料を指す。生物学的試料は、生検及び検死試料などの組織の切片、ならびに組織学的の目的のために採取された凍結切片を含む。かかる試料は、血液及び血液分画または生成物（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など）などの体液、唾液、組織、培養細胞（例えば、初代培養物、外植片、及び形質転換細胞）便、尿、滑液、関節組織、滑液組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などを含む。生物学的試料は典型的には、霊長類、例えば、チンパンジーもしくはヒト、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギなどの哺乳動物；または鳥類；爬虫類；または魚類などの真核生物から得られる。
【００７３】
「細胞」は、本明細書で使用される場合、代謝、またはそのゲノムＤＮＡを保存もしくは複写するのに十分な他の機能を行う細胞を指す。細胞は、例えば、無傷の膜の存在、特定の色素による染色、子孫を生成する能力、または配偶子の場合、第２の配偶子と組み合わせて、生存能力のある子孫を生成する能力を含む、当技術分野において周知の方法により識別され得る。細胞は、原核細胞及び真核細胞を含み得る。原核細胞は、細菌を含むが、これに限定されない。真核細胞は、酵母細胞、ならびに植物及び動物、例えば、哺乳動物、昆虫（例えば、スポドプテラ属）、及びヒト細胞に由来する細胞を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
「幹細胞」は、有糸分裂細胞分裂による自己複製の能力、及び組織または臓器への分化の可能性を特徴とする細胞である。とりわけ哺乳動物幹細胞の中でも、胚性幹細胞及び体性幹細胞が区別され得る。胚性幹細胞は、胚盤胞に属し、胚性組織を生じさせる一方で、体性幹細胞は、組織再生及び修復のために成体組織に属する。
【００７５】
「多能性の」または「多能性」という用語は、適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）からの細胞系譜に関連付けられる特徴を合わせて呈する細胞型への分化を行い得る子孫を生じさせる能力を有する細胞を指す。多能性幹細胞は、胎児、出生後、または成体生物の組織に寄与し得る。生後８〜１２週のＳＣＩＤマウスの奇形腫を形成する能力などの、標準的な技術許容試験が、細胞集団の多能性を確立するために使用され得る。しかしながら、多様な多能性幹細胞の特徴の識別も、多能性細胞を識別するために使用され得る。
【００７６】
「多能性幹細胞の特徴」は、他の細胞から多能性幹細胞を区別する細胞の特徴を指す。分子マーカのある特定の組み合わせの発現性または非発現性は、多能性幹細胞の特徴の例である。より具体的には、ヒト多能性幹細胞は、以下の非限定的なリストからのマーカのうちの少なくともいくつか、及び任意にそれらの全てを発現させ得る：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＵＴＦ−１、Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｒｅｘ１、及びＮａｎｏｇ。多能性幹細胞に関連付けられる細胞形態もまた、多能性幹細胞の特徴である。
【００７７】
「誘導性多能性幹細胞」、「ｉＰＳ」などという用語は、非多能性細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞を指す。「非多能性細胞」は、多能性幹細胞よりも自己複製及び分化する効力が劣る細胞であり得る。より劣る効力の細胞は、成体幹細胞、組織特異的前駆細胞、初代細胞、または二次細胞であり得るが、これらに限定されない。
【００７８】
「自己複製」は、細胞が分裂し、親細胞の自己複製特徴を有する少なくとも１つの娘細胞を生成する能力を指す。第２の娘細胞は、特定の分化経路にコミットし得る。例えば、自己複製造血幹細胞は分裂し得、骨髄またはリンパ球経路における分化にコミットする１つの娘幹細胞及び別の娘細胞を形成し得る。コミット前駆細胞は典型的には、自己複製能力を失っており、細胞分裂すると、より分化された（すなわち、制限された）表現型を示す２つの娘細胞を生成する。非自己複製細胞は、細胞分裂を行って娘細胞を生成する細胞を指し、どの細胞も、親細胞型の可能性のある分化を有さないが、代わりに分化した娘細胞を生成する。
【００７９】
成体幹細胞は、胚性発達後に個体内で見られる未分化細胞である。成体幹細胞は、細胞分裂により増殖して、死滅細胞を補充し、損傷組織を再生する。成体幹細胞は分裂し、それ自体の似た別の細胞を形成するか、またはより分化された細胞を形成する能力を有する。成体幹細胞がＲｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、またはＳｏｘ２などの多能性マーカの発現に関連付けられるとしても、それらは、多能性幹細胞が３つ全ての胚葉の細胞型に分化する能力を有さない。成体幹細胞は自己複製し、固有の細胞型の子孫を生成する限定された能力を有する。成体幹細胞には、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、または神経幹細胞が含まれ得る。組織特異的前駆体は、特定の臓器または組織への分化にコミットされる自己複製の可能性を欠く細胞を指す。初代細胞は、卵細胞、精子細胞、及び幹細胞とは別に成体または胎児生物の任意の細胞を含む。有用な初代細胞の例には、皮膚細胞、骨細胞、血液細胞、内臓の細胞、及び結合組織の細胞が含まれるが、これらに限定されない。二次細胞は初代細胞を由来とし、長期生存インビトロ細胞培養物に対して不死化されている。
【００８０】
「遺伝子」という用語は、タンパク質の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、それは、コード領域（リーダ及びトレーラ）前後の領域、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。リーダ、トレーラ、ならびにイントロンは、遺伝子の転写及び翻訳中に必要である調節素子を含む。さらに、「タンパク質遺伝子生成物」は、特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。
【００８１】
「発現」または「発現される」という語は、遺伝子に関して本明細書で使用される場合、その遺伝子の転写及び／または翻訳生成物を意味する。細胞内のＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、または細胞により生成されたそのＤＮＡによりコードされたタンパク質の量のいずれかに基づいて判定され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１８．１−１８．８８）。
【００８２】
トランスフェクト遺伝子の発現は、細胞内で一過性的または安定して発生し得る。「一過性発現」の間、トランスフェクト遺伝子は、細胞分裂中に娘細胞に移入されない。その発現はトランスフェクト細胞に制限されるため、遺伝子の発現は、時間の経過と共に失われる。対照的に、遺伝子が選択有利性をトランスフェクト細胞に付与する別の遺伝子と共に共トランスフェクトされるとき、トランスフェクト遺伝子の安定した発現が発生し得る。かかる選択有利性は、細胞に現れるある特定の毒素に対する抵抗であり得る。
【００８３】
「プラスミド」という用語は、遺伝子の発現に必要な遺伝子及び／または調節素子をコードする核酸分子を指す。プラスミドからの遺伝子の発現は、インシスまたはイントランスで発生し得る。遺伝子がインシスで発現される場合、遺伝子及び調節素子は、同じプラスミドによりコードされる。イントランスでの発現は、遺伝子及び調節素子が分離プラスミドによりコードされる場合の例を指す。
【００８４】
「エピソーム」という用語は、細胞内のプラスミドの染色体外状態を指す。エピソームプラスミドは染色体ＤＮＡの部分ではなく、それらを独立して複写する核酸分子である。
【００８５】
「外因性の」という用語は、所定の細胞または生物外を源とする分子または物質（例えば、核酸またはタンパク質）を指す。反対に、「内因性の」という用語は、所定の細胞または生物に対して自生であるか、それらを源とする分子または物質を指す。
【００８６】
「ベクター」は、核酸であり、これは、別の核酸を細胞に輸送することができる。ベクターは、それが適切な環境で存在するときに、ベクターにより運ばれる１つ以上の遺伝子によりコードされるタンパク質（複数可）を直接発現することができる。
【００８７】
「細胞培養物」は、生物外に属する細胞のインビトロ集団である。細胞培養物は、細胞バンクもしくは動物から単離された初代細胞、またはこれらの源のうちの１つを由来とし、インビトロ培養物中で長期間不死化される二次細胞から確立され得る。
【００８８】
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトすること」、または「形質導入すること」という用語は互換的に使用され得、核酸分子及び／またはタンパク質を細胞に導入するプロセスとして定義される。核酸は、非ウィルスまたはウィルスに基づいた方法を使用して細胞に導入され得る。核酸分子は、完全タンパク質またはそれらの機能部分をコードする配列であり得る。典型的には、タンパク質発現に必要な素子（例えば、プロモータ、転写開始部位など）を含む核酸ベクター。トランスフェクションの非ウィルス方法は、送達系としてウィルスＤＮＡまたはウィルス粒子を使用せずに核酸分子を細胞に導入する任意の適切な方法を含む。典型的な非ウィルストランスフェクション方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）、及び電気穿孔が含まれる。ウィルス系方法に関して、任意の有用なウィルスベクターが本明細書に記載される方法において使用され得る。ウィルスベクターの例には、レトロウィルス、アデノウィルス、レンチウィルス、及びアデノ随伴ウィルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、核酸分子は、当技術分野で周知の標準的な手順に従ってレトロウィルスベクターを使用して細胞内に導入される。用語「トランスフェクション」または「形質導入」は、外部環境から細胞内にタンパク質を導入することも指す。典型的には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を横断することができるペプチドまたはタンパク質の、目的のタンパク質への結合に依存する。例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１−４及びＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４：１１９−２０を参照されたい。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語は、生理的条件下で相対的に安定した複合体（例えば、リボ核タンパク質及びエンハンサ要素）を形成する２つの分子を指す。
【００９０】
リガンド（例えば、抗体）がタンパク質（抗原）に結合するかどうか、及び／またはタンパク質へのリガンドの親和性を判定するための方法が、当技術分野において既知である。例えば、リガンドのタンパク質への結合は、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などであるが、これらに限定されない多様な技法を使用して検出及び／または定量化され得る。
【００９１】
リガンドの免疫特異的結合及び交差反応性を分析するために使用され得る免疫アッセイには、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、及び蛍光免疫アッセイなどの技法を使用する競合及び非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。かかるアッセイは、当技術分野において慣例的であり、周知されている。
【００９２】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によりコードされるポリペプチド、または抗原に特異的に結合し、それを認識するそれらの機能性フラグメントを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、及びｍｕ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類分けされる。重鎖は、ガンマ、ｍｕ、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類分けされ、同様に、それぞれ免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥとして定義される。
【００９３】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を定義する。「可変重鎖」、「ＶＨ」、または「ＶＨ」という用語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂを含む免疫グロブリン重鎖の可変領域を指すが、一方で「可変軽鎖」、「ＶＬ」、または「ＶＬ」という用語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂを含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００９４】
抗体機能性フラグメントの例には、完全抗体分子、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’、及びそれらの任意の組み合わせ、または標的抗原に結合することができる免疫グロブリンペプチドの任意の他の機能的部分が含まれるが、これらに限定されない（以下を参照されたい；例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，４ｔｈ  ｅｄ．２００１）。当業者により理解されるように、多様な抗体フラグメントは、多様な方法、例えば、ペプシンなどの酵素を用いた無傷抗体の消化、またはデノボ合成により得ることができる。抗体フラグメントはしばしば、化学的に、または組み換えＤＮＡ方法論を使用することにより新規に合成される。よって、抗体という用語は、本明細書で使用される場合、全抗体の修飾により生成された抗体フラグメント、または組み換えＤＮＡ方法論（例えば、一本鎖Ｆｖ）を使用して新規に合成されたもの、またはファージディスプレイライブラリを使用して識別されたものを含む（以下を参照されたい；例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２）。「抗体」という用語は、二価分子または二重特異性分子、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディも含む。二価分子及び二重特異性分子は、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７、Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１５７９、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＰＮＡＳ．ＵＳＡ９０：６４４４、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：７８１、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４０２６、及びＭｃＣａｒｔｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：３０１に記載されている。
【００９５】
本明細書に記載される特異的タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）ン関して、指定のタンパク質は、タンパク質の自然発生形態、またはタンパク質転写因子活性（例えば、天然タンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以内の活性）を維持する変異体もしくは相同体のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、変異体または相同体は、自然発生形態と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、５０、１００、１５０、または２００の連続したアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態において、タンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照により識別されるようなタンパク質である。他の実施形態において、タンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照により識別されるようなタンパク質、またはそれらの機能性フラグメントもしくは相同体である。
【００９６】
よって、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」、「Ｃａｓ９」、または「Ｃａｓ９タンパク質」は、本明細書で言及される場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの組み換え形態もしくは自然発生形態、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ酵素活性（例えば、Ｃａｓ９と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以内の活性）を維持するそれらの変異体もしくは相同体のいずれかを含む。いくつかの態様において、変異体または相同体は、自然発生Ｃａｓ９タンパク質と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、５０、１００、１５０、または２００の連続したアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２により識別されるタンパク質、またはそれらと実質的な同一性を有する変異体もしくは相同体と実質的に同一である。Ｃａｓ９は、当技術分野において「ニッカーゼ」としても既知のタンパク質を指す。実施形態において、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスタ化された短鎖反復回文配列）（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）核酸配列に結合する。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、原核核酸配列である．
【００９７】
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、以下に詳述されるように、脂肪、ワックス、ステロイド、コレステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、カチオン性脂質またはアニオン性脂質、誘導体化脂質などを含み得る脂質分子を指す。
【００９８】
好適なリン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホエタノールアミン（ｐｈｏｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（トランスＤＯＰＥ）、ならびにカルジオリピンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ＤＯＰＥである。他の実施形態において、リン脂質は、ＤＳＰＣである。タマゴＰＣ、心臓エキス、脳エキス、肝臓エキス、及びダイズＰＣなどの脂質エキスも、本発明において有用である。いくつかの実施形態において、ダイズＰＣには、ヒドロダイズＰＣ（ＨＳＰＣ）が含まれ得る。ある特定の実施形態において、脂質には、ペグ化脂質などの誘導体化脂質が含まれ得る。誘導体化脂質には、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、コレステロール−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ポリグリセリン、または当技術分野において一般的に既知の他の誘導体が含まれ得る。
【００９９】
カチオン性脂質は、生理学的条件下で正荷電官能基を含有する。カチオン性脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３，ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、及びＮ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
脂質は、ミセル膜、単層膜、及び二重層膜を形成し得る。脂質は、リポソームまたは脂質凝集体に自己形成化し得る。
【０１０１】
「脂質凝集体形成カチオン性脂質」などの用語は、普通及び通常の意味で、脂質凝集体の形成を容易にし得る正味正荷電脂質を指す。「脂質凝集体」という用語は、より高次の構造（例えば、二次、三次、または四次構造）を形成する複数の脂質、または脂質型を含む脂質構造を指す。脂質凝集体の非限定的な例には、リポソーム、単一ラメラベシクル、多重ラメラベシクル、ミセル、アモルファス凝集体などが含まれる。本発明の脂質凝集体は、カチオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、またはアニオン性脂質を含む任意の好適な脂質を含有し得る。実施形態において、脂質凝集体は、カチオン性脂質またはカチオン性脂質型を含む。実施形態において、脂質凝集体は、カチオン性脂質、または非カチオン性（例えば、中性）脂質と組み合わされたカチオン性脂質型、または非カチオン性脂質型を含む。実施形態において、脂質凝集体は、正味の正電荷を有する。実施形態において、脂質凝集体は、カチオン性脂質及び中性脂質を含む。実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、米国特許第８，７８５，２００号に記載されているようなカチオン性脂質であり、これは、参照により及び全ての目的のために組み込まれる。
【０１０２】
実施形態において、脂質凝集体は、単一の脂質を含む。実施形態において、脂質凝集体は、複数の異なる脂質を含む。脂質凝集体が複数の異なる脂質を含む場合、脂質凝集体は、脂質ブレンドを含み得る．本明細書に提供されるような「脂質ブレンド」は、複数の脂質型の混合物である。実施形態において、脂質ブレンドは、第１の脂質型、第２の脂質型、または第３の脂質型を含む。第１、第２、及び第３の脂質型は独立して、異なり得る（例えば、カチオン性脂質及び非カチオン性脂質）。したがって、当業者は、「脂質」及び「脂質型（複数可）」という用語が同じ意味を有し、かつ互換的に使用され得ることをすぐに認識するであろう。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、脂質二重層により囲まれる任意のコンパートメントを包含する。リポソームという用語は、単一の脂質二重層からなり、概して、約２０〜約４００ｎｍの範囲の直径を有する単一ラメラベシクルを含む。リポソームは、およそ１μｍ〜およそ１０μｍの範囲の直径を有する多重ラメラでもあり得る。多重ラメラリポソームは、次第に小さくなるサイズで１つの単一ラメラベシクルがもう１つの内側に入った単一ラメラベシクルを形成するいくつかの（２〜１００のいずれか）単一ラメラベシクルから構成され得、水層により分離された同心リン脂質球の多重ラメラ構造を形成する。代替的に、多重ラメラリポソームは、大きなリポソームの中の脂質の多くのより小さな非同心球から構成され得る。実施形態において、リポソームは、多重ラメラベシクル（ＭＬＶ）、大きな単一ラメラベシクル（ＬＵＶ）、及び小さな単一ラメラベシクル（ＳＵＶ）を含む。本発明のリポソームは、カチオン性脂質、双性イオン性脂質、中性脂質、またはアニオン性脂質を含む任意の好適な脂質を含有し得る。
【０１０４】
本明細書に提供されるような「核局在化シグナル配列」または「ＮＬＳ」という用語は、ＮＬＳが、核輸送による細胞核への移入のために結合されるペプチドまたはタンパク質を識別するポリペプチド配列または複数のポリペプチド配列を指す。ＮＬＳは、タンパク質表面上で曝露される正荷電アミノ酸残基（例えば、リジンまたはアルギニン）の１つ以上の短配列を含み得る。実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７）を含む。実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７）を有する。
【０１０５】
組成物
特に、リボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）を、高効率で細胞内に送達するための組成物及び方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される組成物及び方法は、リボ核タンパク質複合体を多能性幹細胞及びリンパ球細胞内に送達する上で驚くほど効果的である。本明細書に提供される組成物は、リボ核タンパク質複合体と、脂質凝集体形成カチオン性脂質と、エンハンサ要素とを含む。
【０１０６】
本明細書に提供されるような「リボ核タンパク質複合体」または「リボ核タンパク質粒子」は、核タンパク質及びリボ核酸を含む複合体または粒子を指す。本明細書に提供されるような「核タンパク質」は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を結合することができるタンパク質を指す。核タンパク質がリボ核酸に結合する場合、それは、「リボ核タンパク質」と称される。リボ核タンパク質と、リボ核酸との間の相互作用は、例えば共有結合により直接的であり得るか、または、例えば非共有結合（例えば、静電気的相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子−双極子、双極子−誘導性双極子、ロンドン分散）、環集積（パイ効果）、疎水性相互作用など）により間接的であり得る。実施形態において、リボ核タンパク質は、リボ核酸に非共有結合的に結合されるＲＮＡ結合モチーフを含む。例えば、ＲＮＡ結合モチーフ内の正荷電芳香族アミノ酸残基（例えば、リジン残基）は、ＲＮＡの負の核酸リン酸塩主鎖との静電気的相互作用を形成することにより、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。リボ核タンパク質の非限定的な例には、リボソーム、テロメラーゼ、ＲＮＡｓｅＰ、ｈｎＲＮＰ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、及び核内低分子ＲＮＰ（ｓｎＲＮＰ）が含まれる。リボ核タンパク質は、酵素であり得る。実施形態において、リボ核タンパク質は、エンドヌクレアーゼである。よって、実施形態において、リボ核タンパク質複合体は、エンドヌクレアーゼ及びリボ核酸を含む。実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９である。
【０１０７】
実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９は、リボ核酸に結合されることにより、リボ核タンパク質複合体を形成する。実施形態において、リボ核酸は、ガイドＲＮＡである。よって、実施形態において、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり、リボ核酸は、ガイドＲＮＡである。本明細書に提供されるような「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、核タンパク質に結合することにより、リボ核タンパク質複合体を形成することができるリボヌクレオチド配列を指す。実施形態において、ガイドＲＮＡは、１つ以上のＲＮＡ分子を含む。実施形態において、ｇＲＮＡは、標的部位に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。相補的なヌクレオチド配列は、リボ核タンパク質複合体の該標的部位への結合を媒介することにより、リボ核タンパク質複合体の配列特異性を提供し得る。よって、実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的核酸に対して相補的である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的核酸配列に結合する。実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列に対して相補的である。実施形態において、ガイドＲＮＡの補体は、標的核酸に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。本明細書に提供されるような標的核酸配列は、細胞により発現される核酸配列である。実施形態において、標的核酸配列は、外因性核酸配列である。実施形態において、標的核酸配列は、内因性核酸配列である。実施形態において、標的核酸配列は、細胞遺伝子の部分を形成する。よって、実施形態において、ガイドＲＮＡは、細胞遺伝子またはそれらのフラグメントに対して相補的である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的核酸配列に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、細胞遺伝子の配列に対して約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、細胞遺伝子配列に結合する。
【０１０８】
実施形態において、ガイドＲＮＡは、一本鎖のリボ核酸である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、長さ約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個以上の核酸残基である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、長さ約１０〜約３０個の核酸残基である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、長さ約２０個の核酸残基である。実施形態において、ガイドＲＮＡ酸の長さは、少なくとも長さ約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の核酸残基または糖残基であり得る。実施形態において、ガイドＲＮＡは、長さ５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、５〜７５、１０〜７５、１５〜７５、２０〜７５、２５〜７５、３０〜７５、３５〜７５、４０〜７５、４５〜７５、５０〜７５、５５〜７５、６０〜７５、６５〜７５、７０〜７５、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、５５〜１００、６０〜１００、６５〜１００、７０〜１００、７５〜１００、８０〜１００、８５〜１００、９０〜１００、９５〜１００個以上の残基である。実施形態において、ガイドＲＮＡは、長さ１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、または１０〜５０個の残基である。
【０１０９】
本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載されるような脂質凝集体形成カチオン性脂質を含む。実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有する。
【化１】
2018532404.tif 000003
式（Ｉ）に関して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は独立して、水素、ハロゲン、−ＣＹ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。Ｌ１及びＬ２は独立して、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−，−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）２−、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンである。ｌは、１〜８の整数である。Ｘ−は、アニオンであり、Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１１０】
実施形態において、Ｒ１は、水素、または置換もしくは非置換のヘテロアルキルである。実施形態において、Ｒ１は、置換または非置換のヘテロアルキルである。実施形態において、Ｒ１は、置換のヘテロアルキルである。実施形態において、Ｒ１は、非置換の２〜８員ヘテロアルキルである。実施形態において、Ｒ１は、非置換の２〜６員ヘテロアルキルである。実施形態において、Ｒ１は、非置換の４員ヘテロアルキルである。実施形態において、Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ３＋である。実施形態において、Ｒ１は、水素である。
【０１１１】
実施形態において、Ｒ２は、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。実施形態において、Ｒ２は、水素である。
【０１１２】
実施形態において、Ｒ３及びＲ４は独立して、置換または非置換のアルキルである。実施形態において、Ｒ３及びＲ４は独立して、非置換のアルキルである。Ｒ３及びＲ４は独立して、非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルである。Ｒ３及びＲ４は独立して、非置換のＣ５〜Ｃ２０アルキルである。Ｒ３及びＲ４は独立して、非置換のＣ１０〜Ｃ２０アルキルである。Ｒ３は、非置換のＣ１４アルキルである。Ｒ４は、非置換のＣ１４アルキルである。
【０１１３】
実施形態において、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は独立して、水素、または置換もしくは非置換のアルキルである。実施形態において、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、水素である。
【０１１４】
実施形態において、Ｌ１は、置換または非置換のアルキレンである。実施形態において、Ｌ１は、非置換のアルキレンである。実施形態において、Ｌ１は、非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキレンである。実施形態において、Ｌ１は、非置換のＣ１〜Ｃ１５アルキレンである。実施形態において、Ｌ１は、非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキレンである。実施形態において、Ｌ１は、非置換のブチレンである。
【０１１５】
実施形態において、Ｌ２は、置換または非置換のアルキレンである。実施形態において、Ｌ２は、非置換のアルキレンである。実施形態において、Ｌ２は、非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキレンである。実施形態において、Ｌ２は、非置換のＣ１〜Ｃ１５アルキレンである。実施形態において、Ｌ２は、非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキレンである。実施形態において、Ｌ１は、メチレンである。
【０１１６】
実施形態において、ｌは、１、２、３、４、５、６、７、または８である。実施形態において、ｌは、１である。実施形態において、ｌは、２である。実施形態において、ｌは、３である。実施形態において、ｌは、４である。実施形態において、ｌは、５である。実施形態において、ｌは、６である。実施形態において、ｌは、７である。実施形態において、ｌは、８である。
【０１１７】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化２】
2018532404.tif 000004
式中、ｎは、１〜６の整数である。
【０１１８】
式（ＩＩ）の実施形態に関して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、上述されるように定義される。例えば、Ｒ１は非置換の４員ヘテロアルキルであり、Ｒ２は水素、または置換もしくは非置換のアルキルであり、Ｒ３及びＲ４は独立して、置換または非置換のアルキルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は水素であり、Ｌ１は置換または非置換のアルキレンである。実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、または６である。実施形態において、ｎは、１である。実施形態において、ｎは、２である。実施形態において、ｎは、３である。実施形態において、ｎは、４である。実施形態において、ｎは、５である。実施形態において、ｎは、６である。
【０１１９】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化３】
2018532404.tif 000005
式中、ｍは、１〜１０の整数であり、ｏ及びｐは独立して、８〜３０の整数である。式（ＩＩＩ）の実施形態に関して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、上述されるように定義される。例えば、Ｒ１は、非置換の４員ヘテロアルキルであり、Ｒ２は水素、または置換もしくは非置換のアルキルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は水素である。実施形態において、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。実施形態において、ｍは、１である。実施形態において、ｍは、２である。実施形態において、ｍは、３である。実施形態において、ｍは、４である。実施形態において、ｍは、５である。実施形態において、ｍは、６である。実施形態において、ｍは、７である。実施形態において、ｍは、８である。実施形態において、ｍは、９である。実施形態において、ｍは、１０である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、８である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、９である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１０である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１１である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１２である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１３である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１４である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１５である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１６である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１７である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１８である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、１９である。実施形態において、ｏ及びｐは独立して、２０である。
【０１２０】
本明細書に提供されるような「エンハンサ要素」という用語は、トランスフェクションを容易にすることにより、トランスフェクション効率を増加するペプチドを指す。したがって、核酸、ポリペプチド、またはそれらの複合体の細胞内へのトランスフェクション効率は、エンハンサ要素の存在下で、該エンハンサ要素の不在下でのトランスフェクション効率と比較してより高い。実施形態において、エンハンサ要素は、１つ以上のカチオン性部分を含むペプチドである。実施形態において、エンハンサ要素は、ペプチドである。実施形態において、１つ以上のカチオン性部分は、エンハンサ要素のＣ末端に結合される。実施形態において、１つ以上のカチオン性部分は、エンハンサ要素のＮ末端に結合される。エンハンサ要素は、核局在化シグナル配列に共有結合されるポリアミン部分を含み得る。本明細書に提供されるようなポリアミン部分は、一価のポリアミンである。実施形態において、ポリアミン部分は、スペルミン部分である。本明細書に提供されるような「スペルミン」という用語は、通常の意味で、ＣＡＳ登録番号７１−４４−３により識別される化合物を指す。実施形態において、ポリアミン部分は、スペルミンコアに共有結合される１つ以上の置換基を有するスペルミンのアナログである。実施形態において、ポリアミン部分は、複数のスペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、４つ以上のスペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、６つのスペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、エンハンサ要素のＮ末端に結合される。実施形態において、ポリアミン部分は、エンハンサ要素のＣ末端に結合される。
【０１２１】
実施形態において、エンハンサ要素は、１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む。本明細書に提供されるエンハンサ要素は、核酸、核タンパク質、またはリボ核タンパク質複合体を細胞内に送達する上で有用な任意のペプチドであり得る。例えば、本明細書に提供される発明に有用なエンハンサ要素は、米国特許第８，０５８，０６８号に開示されている任意のペプチドであり得、これは、参照により及び全ての目的のために組み込まれる。
【０１２２】
実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１〜配列番号４６の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１〜配列番号４６の配列であり、実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号５の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号６の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号７の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号８の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号９の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１０の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１１の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１２の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１３の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１４の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１５の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１６の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１７の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１８の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１９の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２０の配列を含む。
【０１２３】
実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２１の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２２の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２３の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２４の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２５の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２６の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２７の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２８の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号２９の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３０の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３１の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３２の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３３の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３４の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３５の配列を含む。
【０１２４】
実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３６の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３７の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３８の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号３９の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４０の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４１の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４２の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４３の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４４の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４５の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号４６の配列を含む。
【０１２５】
実施形態において、本組成物は、中性脂質をさらに含む。本明細書に提供されるような「中性脂質」は、実施形態を含む本明細書に提供される組成物のトランスフェクション効率をさらに増加することができる脂質を指す。したがって、リボ核タンパク質複合体、脂質凝集体形成カチオン性脂質、及びエンハンサ要素の細胞内へのトランスフェクション効率は、中性ペプチドの存在下で、該中性ペプチドの不在下でのトランスフェクション効率と比較してより高い。本発明で有用な中性脂質には、レシチン；ホスホチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）；ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミテオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスフィジルコリン）（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）、及びジステアロイルホスファチジルコリンなどのホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジル−グリセロール）、及びジステアロイルホスファチジルグリセロールなどのホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン；ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリンなどのホスファチジルセリン；ジホスファチジルグリセロール；脂肪酸エステル；グリセロールエステル；スフィンゴ脂質；カルドリピン（ｃａｒｄｏｌｉｐｉｎ）；セレブロシド；ならびにセラミド；ならびにそれらの混合物が限定されることなく含まれる。中性脂質は、コレステロール及び他の３．ベータ．ＯＨ−ステロールも含む。
【０１２６】
実施形態において、本組成物は、ドナー核酸をさらに含む。本明細書に提供されるようなドナー核酸は、標的核酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む核酸である。実施形態において、ドナー核酸は、標的核酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。実施形態において、ドナー核酸の補体は、標的核酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。実施形態において、ドナー配列は、ＰＣＲ増幅核酸配列を含む。実施形態において、ドナー核酸は、プラスミドに由来する。
【０１２７】
実施形態において、本組成物は、真核細胞をさらに含む。実施形態において、真核細胞は、多能性細胞、リンパ管細胞、または肝細胞である。実施形態において、真核細胞は、多能性細胞である。実施形態において、真核細胞は、リンパ管細胞である。実施形態において、真核細胞は、肝細胞である。実施形態において、多能性細胞は、誘導性多能性細胞または胚性幹細胞である。実施形態において、多能性細胞は、誘導性多能性細胞である。実施形態において、多能性細胞は、胚性幹細胞である。実施形態において、リンパ管細胞は、Ｔ細胞である。
【０１２８】
実施形態において、本組成物は、細胞培養物をさらに含む。本明細書に提供されるような細胞培養物は、適切な細胞栄養物を含み、インビトロで細胞を維持することができる環境を指す。この環境は、適切な槽（例えば、細胞培養皿）内の液体環境、固体環境、及び／または半固体環境（例えば、カンテン、ゲルなど）であり得る。細胞培養培地が用いられ得る。「細胞培養培地」は、本明細書で使用される場合、当技術分野における、その概して許容される意味に従って使用される。細胞培養培地（当技術分野及び本明細書において「培養物培地」とも称される）は、細胞の成長（例えば、分裂、分化、維持など）を支援するように考案された液体（例えば、成長因子、ミネラル、ビタミンなど）またはゲルを含む。実施形態において、実施形態を含む本明細書に提供される組成物は、生理学的に許容される溶液をさらに含む。本明細書に提供されるような「生理学的に許容される溶液」は、本明細書に提供される組成物がそれらの生物学的特性を失うことなく含有され得る任意の許容可能な水溶液（例えば、緩衝液）を指す。実施形態において、生理学的に許容される溶液は、細胞培養培地である。
【０１２９】
方法
本明細書に提供される方法は、リボ核タンパク質複合体の細胞（例えば、多能性細胞）内への効率的な送達に特に有用である。細胞トランスフェクション組成物を形成する方法は、リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成することを含む。本方法は、脂質凝集体形成カチオン性脂質をリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成することさらに含む。細胞トランスフェクション組成物は、予想外に高効率で細胞に送達される。
【０１３０】
リボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と接触させられることにより、リボ核タンパク質を形成し得る。次いで、リボ核タンパク質は、エンハンサ要素と接触させられることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成し得る。よって、実施形態において、リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させるステップは、リボ核酸をエンドヌクレアーゼと接触させることにより、リボ核タンパク質を形成することを含む。実施形態において、リボ核タンパク質は、エンハンサ要素と接触させられることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成する。実施形態において、リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させるステップは、リボ核酸をエンドヌクレアーゼと接触させることにより、リボ核タンパク質を形成するステップと、リボ核タンパク質をエンハンサ要素と接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成するステップとを含む。実施形態において、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体は、第１の槽内にあり、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、第２の槽内にある。実施形態において、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体は、第２の槽内で脂質凝集体形成カチオン性脂質と接触させられる。実施形態において、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体は、第１の槽内で脂質凝集体形成カチオン性脂質と接触させられる。実施形態において、リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることは、中性ペプチドを接触させることをさらに含む。
【０１３１】
上記で開示される細胞トランスフェクション組成物を形成する任意の方法に加えて、実施形態において、リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させるステップは、生理学的に許容される溶液中で行われる。実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質をリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させるステップは、生理学的に許容される溶液中で行われる。実施形態において、生理学的に許容される溶液は、細胞培養培地である。
【０１３２】
本明細書に提供される方法に関して、実施形態を含む上述される組成物（例えば、リボ核酸、エンドヌクレアーゼ、エンハンサ要素、脂質凝集体形成カチオン性脂質、ドナーＤＮＡ、中性脂質）のいずれかが使用され得る。よって、実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であり、リボ核酸は、ガイドＲＮＡである。実施形態において、リボ核酸は、ガイドＲＮＡである。
【０１３３】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化４】
2018532404.tif 000006
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は独立して、水素、ハロゲン、−ＣＹ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。Ｌ１及びＬ２は独立して、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−，−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）２−、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンである。ｌは、１〜８の整数である。Ｘ−は、アニオンである。Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１３４】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化５】
2018532404.tif 000007
式中、ｎは、１〜６の整数である。
【０１３５】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化６】
2018532404.tif 000008
式中、ｍは、１〜１０の整数であり、ｏ及びｐは独立して、８〜３０の整数である。
【０１３６】
実施形態において、Ｒ１は、置換または非置換のヘテロアルキルである。
【０１３７】
実施形態において、エンハンサ要素は、ペプチドである。実施形態において、エンハンサ要素は、核局在化シグナル配列に共有結合されるポリアミン部分を含む。実施形態において、ポリアミン部分は、スペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、複数のスペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、エンハンサ要素のＮ末端に結合される。実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１〜配列番号４６の配列を含み、実施形態において、エンハンサ要素は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む。
【０１３８】
上記で開示される方法に加えて、実施形態において、本方法は、脂質凝集体形成カチオン性脂質をリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させるステップの前に、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体をドナー核酸と接触させるステップをさらに含む。
【０１３９】
別の態様において、細胞トランスフェクション組成物を形成する方法が提供される。本方法は、（ｉ）脂質凝集体形成カチオン性脂質を、第１の反応槽内で細胞培養培地と接触させることにより、脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を形成するステップと、（ｉｉ）第２の反応槽内でリボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成するステップと、（ｉｉｉ）第２の反応槽内で脂質凝集体形成カチオン性脂質培地をリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成するステップとを含む。
【０１４０】
実施形態において、本方法は、ステップ（ｉｉｉ）における接触させることの前に、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体をドナー核酸と接触させることをさらに含む。
【０１４１】
別の態様において、細胞トランスフェクション組成物を形成する方法が提供される。本方法は、（ｉ）第１の反応槽内でリボ核酸、エンドヌクレアーゼ、及びエンハンサ要素を接触させることにより、リボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を形成するステップと、（ｉｉ）第２の反応槽内で脂質凝集体形成カチオン性脂質を細胞培養培地と接触させることにより、脂質凝集体形成カチオン性脂質培地を形成するステップと、（ｉｉｉ）第２の反応槽内でリボ核タンパク質−エンハンサ要素複合体を脂質凝集体形成カチオン性脂質培地と接触させることにより、細胞トランスフェクション組成物を形成するステップとを含む。
【０１４２】
上記で開示される細胞トランスフェクション組成物を形成する方法に加えて、実施形態において、リボ核タンパク質複合体は、エンドヌクレアーゼとリボ核酸とを含む。実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であり、リボ核酸は、ガイドＲＮＡである。
【０１４３】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化７】
2018532404.tif 000009
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は独立して、水素、ハロゲン、−ＣＹ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。Ｌ１及びＬ２は独立して、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−，−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）２−、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のヘテロアルキレンである。ｌは、１〜８の整数である。Ｘ−は、アニオンである。Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１４４】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化８】
2018532404.tif 000010
式中、ｎは、１〜６の整数である。
【０１４５】
実施形態において、脂質凝集体形成カチオン性脂質は、以下の式の構造を有し、
【化９】
2018532404.tif 000011
式中、ｍは、１〜１０の整数であり、ｏ及びｐは独立して、８〜３０の整数である。
【０１４６】
実施形態において、エンハンサ要素は、ペプチドである。実施形態において、エンハンサ要素は、核局在化シグナル配列に共有結合されるポリアミン部分を含む。実施形態において、ポリアミン部分は、スペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、複数のスペルミン部分である。実施形態において、ポリアミン部分は、エンハンサ要素のＮ末端に結合される。
【０１４７】
上記で開示される細胞トランスフェクション組成物を形成する方法に加えて、実施形態において、エンハンサ要素は、配列番号１〜配列番号４６の配列を含む。実施形態において、エンハンサ要素は、少なくとも２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含む。
【０１４８】
別の態様において、真核細胞と、リボ核タンパク質複合体と、脂質凝集体形成カチオン性脂質と、エンハンサ要素とを含むインビトロ細胞培養物が提供される。
【０１４９】
実施形態において、真核細胞は、多能性細胞、リンパ管細胞、または肝細胞である。実施形態において、多能性細胞は、誘導性多能性細胞または胚性幹細胞である。実施形態において、リンパ管細胞は、Ｔ細胞である。実施形態において、培養物は、約２０％〜約６０％コンフルエント、例えば、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、またはさらに約６０％コンフルエントである。実施形態において、培養物は、約４０％未満コンフルエントである。実施形態において、培養物は、約３０％コンフルエントである。実施形態において、培養物は、約４０％コンフルエントである。実施形態において、細胞培養物の生存率は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％である。
【０１５０】
別の態様において、リボ核タンパク質複合体を細胞内にトランスフェクトする方法が提供される。本方法は、細胞を上記で開示されるような組成物と接触させることを含む。実施形態において、本方法は、接触させるステップの前に、上述されるような細胞トランスフェクション組成物を形成することを含む。
【実施例】
【０１５１】
実施例１．Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の効率的な送達のための新規のトランスフェクション試薬
ＣＲＩＳＰＲ技術における最近の進歩により、研究者が細胞及び回路をインビボで効率的に操作できるようになっている。しかしながら、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのオフターゲット効果の可能性は、治療応用に関して大きな懸念事項を残す。最近、高編集効率及び低減されたオフターゲット効果に起因して、精製されたＣａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）の送達に対する注目が高まっている。Ｃａｓ９  ＲＮＰは、相対的に高効率で電気穿孔を介して哺乳動物細胞に送達され得るが、使用のし易さ、低コスト、及び高処理量システムに対する適合に起因して、脂質媒介トランスフェクションが依然として人気である。体系的な取り組みを使用して、６つの一般的に使用される哺乳動物細胞株を使用して６０個超のトランスフェクション試薬をスクリーニングし、Ｃａｓ９  ＲＮＰを効率的に送達することができた新規の試薬（名称、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標））を識別した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）−媒介トランスフェクション条件を、２３個の粘着細胞株及び懸濁細胞株のセットを使用してさらに最適化し、トランスフェクトするのがより難しい細胞では電気穿孔も行った。結果は、トランスフェクション試薬及びＣａｓ９  ＲＮＰの量、ならびに細胞密度が、高効率なゲノム編集を達成する上で重要な要因であることを示した。さらに、ドナーＤＮＡを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を介してＣａｓ９ＲＮＰと共に共送達することができた。本明細書に記載される方法は、多様な細胞型の高処理量ゲノム修飾体をさらに容易にする。
【０１５２】
タンパク質の哺乳動物細胞内への効率的な送達に伴う主な課題は、細胞膜の乏しい透過性及び高選択性である。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用は、活性タンパク質の細胞内への送達を容易にすると示されている［１〜３］。ゲノム操作におけるＣＲＩＳＰＲシステムの最近の進歩により、プラスミドＤＮＡトランスフェクションと比較してオフターゲット効果の可能性がより低いことに起因して、精製されたＣａｓ９タンパク質の送達が魅力的になってきている［４〜６］。Ｃａｓ９  ＲＮＰは、電気穿孔を介して哺乳動物細胞に効率的に送達され得るが、それは、専門機器を必要とし、かつ処理量が相対的に低い。Ｃａｓ９  ＲＮＰの送達のための、ｉＴＯＰ（オスモサイトーシス及びプロパンベタインによる誘導性形質導入）という名前の方法などのいくつかの方法が最近報告されている。ｉＴＯＰは、形質導入化合物プロパンベタイン、トリガリングマクロピノサイトーシス取り込み、及び細胞外適用マクロ分子の細胞内放出と組み合わされたＮａＣｌ媒介高浸透圧性に基づく［７］。さらに、負に過荷電されたＧＦＰタンパク質に融合することか、またはアニオン性核酸に結合することにより、機能性タンパク質を、カチオン性脂質媒介トランスフェクションを介して哺乳動物細胞内に送達することができた。記載されるように、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００を使用してＵ２ＯＳ細胞内に送達されたＣａｓ９  ＲＮＰは、統合ＧＦＰレポータにおいて最大８０％の修飾効率をもたらし、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を使用してインビボでマウス内耳内に入り、聴覚細胞におけるＧＦＰ発現が２０％喪失した［５］。しかしながら、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００からの著しい毒性もＵ２ＯＳ細胞内で報告された。現在の研究において、スクリーニングすることにより新しいトランスフェクション試薬を識別し、次いで、２３個の異なる細胞株のセットを使用してトランスフェクションプロトコルを最適化した。
【０１５３】
材料及び方法
材料ＧＩＢＣＯ（登録商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ヒト神経幹細胞（Ｈ９−Ｄｅｒｉｖｅｄ）、ヒト表皮ケラチノサイト、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウスＥＳＣ、２９３ＦＴ細胞、ＨＵＶＥＣ、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＤＭＥＭ、非必須アミノ酸溶液、組み換えヒトＬＩＦ、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替品、マッコイ培地２００、ＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８（商標）培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＨＫＧＳキット、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＬＳＧＳキット、ＴＲＹＰＬＥ（商標）発現酵素、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地、ＦＬＵＯＲＯＢＲＩＴＥ（商標）ＤＭＥＭ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）、６０個のトランスフェクション試薬の集合体、ＪＵＭＰ−ＩＮ（商標）ＧＲＩＰＴＩＴＥ（商標）ＨＥＫ２９３細胞再標的キット、ＮＥＯＮ（商標）トランスフェクションシステムの１０μＬキット、ｐＪＴＩ  Ｒ４  ＥＸＰ  ＣＭＶ  ＥｍＧＦＰ  ｐＡ、ｐＥＦ１−ＥｍＧＦＰ、２％Ｅ−ＧＥＬ（登録商標）ＥＸアガロースゲル、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ  Ｔ７高収率転写キット、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）転写クリアアップキット、ＱＵＢＩＴ（登録商標）ＲＮＡ  ＢＲアッセイキット、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）ゲノム切断検出キット、及び精製ＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのものであった。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、３Ｔ３、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ−Ｓ、Ｎ２Ａ、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｕ２ＯＳ、ＨｅｐＧ２、ＳＣ−１、ＨＣＴ１１６、ＮＫ−９２、ＴＨＰ−１、及びＲａｊｉ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ｇＲＮＡテンプレートのワンポットＰＣＲアセンブリを介して合成し、続いてインビトロ転写を行った［６］。ゲノム遺伝子座の増幅のためのＣＲＩＳＰＲ標的配列及びプライマー配列が以下の表に記載される。
【表１ｓ】
2018532404.tif 000012
【０１５４】
細胞培養物．ＨＥＫ２９３、３Ｔ３、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｐＧ２、ＣＯＳ−７、Ｎ２Ａ、及びＡ５４９を、１０％ＦＢＳで補ったＤＭＥＭ培地中で成長させた。ＨＣＴ１１６及びＵ２ＯＳを、１０％ＦＢＳを含有するマッコイ培地中で培養し、ＣＨＯ細胞をＤＭＥＭ／Ｆ−１２プラス１０％ＦＢＳで維持した。ＨＵＶＥＣ細胞を、ＬＳＧＳで補った培地２００内で伝播した。ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）を、ＨＫＧＳで補ったＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地中で維持した。ＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＳＣ−１、ＴＨＰ−１、及びＲａｊｉ細胞を１０％ＦＢＳで補ったＲＰＭＩ培地中で成長させ、Ｋ５６２細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ培地中で維持した。ＮＫ９２細胞を、２５％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールで補ったＲＰＭＩ培地で成長させた。マウスＥＳＣを、１５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替品、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール、及び１０ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＬＩＦで補ったＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＤＭＥＭを使用してＭＥＦ支持細胞層で培養した。ＧＩＢＣＯ（登録商標）ｉＰＳＣ株を、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）マトリクスでコーティングした培養槽上のＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８（商標）培地中で維持し、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で調製した０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して継代培養した。全ての細胞を、５％に加湿されたＣＯ２インキュベータ内で３７℃でインキュベートした。
【０１５５】
体系的実験計画．トランスフェクション試薬のスクリーニンを、９６ウェル形式で実施した。トランスフェクションの前日に、６つの一般的に使用される細胞株であるＡ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨＥｐＧ２、ＭＣＦ−７、及びＵ２ＯＳを、１つのウェルあたり１０，０００〜２０，０００個の細胞の密度で、９６ウェルプレート内に播種した。トランスフェクションの当日、Ｃａｓ９タンパク質とＨＰＲＴ１  ｇＲＮＡとのマスタ混合をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で調製し、室温で５分間インキュベートしてＣａｓ９  ＲＮＰ複合体を形成した。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体の量を、１つのウェルあたり４０ｎｇのＣａｓ９及び８．５ｎｇのｇＲＮＡで一定に保った。一方で、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で同様に調製した各トランスフェクション試薬の量を、１つのウェルあたり０．１、０．２、０．４、及び０．６μｌに変化させた。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸは、対照としての役割を果たした。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で希釈したトランスフェクション試薬に添加した。混合物を室温で１０〜１５分間インキュベートして、Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びトランスフェクション試薬複合体を形成した後に細胞に添加した。４８時間インキュベーションして細胞を溶解し、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）ゲノム切断検出キットによりインデル（挿入及び欠失）のパーセンテージを測定した。次いで、ＪＭＰ  １１ソフトウェアを使用して実験データを分析した。
【０１５６】
２４ウェルプレート内での細胞トランスフェクション．トランスフェクションの前日、粘着細胞を、細胞密度がトランスフェクション時に３０〜７０％のコンフルエンスに達するように、５００μｌの成長培地中で１つのウェルあたり０．４〜１．５ｘ１０＾５個の細胞の密度で２４ウェルプレート上に播種した。トランスフェクションの当日、２５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）を１．５ｍｌの無菌エッペンチューブに添加し、続いて、５００ｎｇの組み換えＣａｓ９タンパク質及び１２５ｎｇのｇＲＮＡ（およそ１：１．２のモル比）を添加した。軽くボルテックスすることにより混合して、次いで、１μｌのＣａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬を、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを含有する溶液に添加した。軽くボルテックスした後に、混合物を室温で５分間インキュベートして、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体形成を可能にした。Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体は、室温で最大３時間安定した。ドナーＤＮＡの共送達に関して、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡまたは線状ＰＣＲフラグメントを、この時点でＣａｓ９  ＲＮＰ複合体に添加した。一方、２５μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）を分離無菌エッペンチューブに添加し、続いて、１．５μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を添加した。軽くボルテックスして、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）溶液を、室温でおよそ５分間インキュベートした。インキュベーションして、次いで、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）溶液に添加した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）溶液のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体への逆添加により、ある特定の細胞株の編集効率が減少したことが見い出された。混合して、試料を室温で１０〜１５分間インキュベートして、Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体を形成し、次いで、細胞に添加した。トランスフェクションの４８〜７２時間後において、細胞をＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）ゲノム切断検出キットを使用するゲノム修飾効率の分析のために採取した。代替的に、細胞をフローサイトメトリにより分析して、ＥｍＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを判定した。
【０１５７】
ｉＰＳ細胞株のトランスフェクションに関して、細胞をＴＲＹＰＬＥ（商標）で処理し、トランスフェクション時におよそ３０〜４０％のコンフルエンスをもたらす１つのウェルあたり４０，０００個の細胞の密度で、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）でコーティングした２４ウェルプレート上に播種した。代わりに、１マイクログラムのＣａｓ９タンパク質、２５０ｎｇのｇＲＮＡ、及び６μｌのＣａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬を使用して、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体を調製したが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬の量は、１．５μｌで一定に保った。トランスフェクションの約６時間後、トランスフェクション試薬を除去し、新鮮なＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８（商標）培地で置き換えた。トランスフェクションの４８時間後に細胞を分析した。
【０１５８】
ＭＣＦ−７及びＨｅｐＧ２細胞を使用して、「逆」トランスフェクションプロトコルを試験した。上述されるように、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬をそれぞれ、５００ｎｇのＣａｓ９タンパク質、１２５ｎｇのｇＲＮＡ、１μｌのＣａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬、及び１．５μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬を有する２つの分離チューブ内で調製した。次いで、Ｃａｓ９  ＲＮＰ溶液をＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）溶液に添加した。混合して、混合物を室温で１０〜１５分間インキュベートして、Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体を形成した。一方、ＭＣＦ−７及びＨｅｐＧ２細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）で剥離させて計数し、続いて、１つのウェルあたりそれぞれ２ｘ１０＾５及び１．０ｘ１０＾５個の細胞の密度で播種した。次いで、Ｃａｓ９  ＲＮＰ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）溶液を細胞懸濁液に直接添加し、４８〜７２時間インキュベートした後に分析した。
【０１５９】
ＮＥＯＮ（商標）電気穿孔に関して、粘着細胞を培養皿から剥離させて計数した。概して、１０μｌの反応あたり、１ｘ１０＾５個の粘着細胞または２ｘ１０＾５個の懸濁細胞を使用した。ＮＥＯＮ（商標）２４の最適化プロトコルに関して、２４μｇのＣａｓ９タンパク質及び６μｇのｇＲＮＡを１２０μｌの再懸濁緩衝液Ｒに添加し、続いて、混合し、室温で５分間インキュベートしてＣａｓ９  ＲＮＰ複合体を形成した。一方、２．４ｘ１０＾６個の粘着細胞または４．８ｘ１０＾６個の懸濁細胞を採取し、ＤＰＢＳで洗浄した。吸引後、細胞ペレットを１２０μｌの再懸濁緩衝液Ｒ中で再懸濁し、次いで、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体と混合した。ＮＥＯＮ（商標）２４最適化プロトコルのうちの１つを使用して、１０μｌの試料を電気穿孔のために採取した。電気穿孔した細胞を、０．５ｍｌの対応する成長培地を含む２４ウェルに直ちに移入し、４８時間インキュベートした後に分析した。最適化すると、より高用量のＣａｓ９  ＲＮＰ（例えば、１反応あたり２μｇのＣａｓ９タンパク質及び５００ｎｇのｇＲＮＡ）の使用により、切断効率をさらに増加することができた［６］。
【０１６０】
破壊ＥｍＧＦＰ安定細胞株の生成．ＥｍＧＦＰを発現させるＧＲＩＰＴＩＴＥ（商標）ＨＥＫ２９３安定細胞を、マニュアルに記載されるようにＪｕｍｐ−Ｉｎ（商標）システムを介して調製した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。破壊ＥｍＧＦＰ突然変異体安定細胞株を生成するために、１．５μｇのＣａｓ９タンパク質を、ＥｍＧＦＰレポータ遺伝子内の５’−ｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｔｔｃａｃｃｔａｃｇｇ−３’（配列番号６３）配列を標的とする３００μｇのｇＲＮＡに関連付け、次いで、電気穿孔により野生型ＥｍＧＦＰ細胞内にトランスフェクトし、続いて、希釈を限定してクローン細胞株を単離した。順方向プライマー５’−ａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇ−３’（配列番号６１）及び逆方向プライマー５’−ＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＣＣＣ−３’（表２ｓ）（配列番号６２）を使用して増幅した４００ｂｐの野生型ＰＣＲフラグメントを使用する相同組換えアッセイに関して、５’−ＣＴＴＣＡＣ−３’の欠失を有する安定破壊ＥｍＧＦＰ細胞株を選択した。ＥｍＧＦＰ機能の修復を、ＡＴＴＵＮＥ（登録商標）ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてフローサイトメトリ分析により判定した。
【表２ｓ】
2018532404.tif 000013
【０１６１】
結果
Ｃａｓ９  ＲＮＰの送達に最適なトランスフェクション試薬を識別するために、体系的な実験計画（ＤＯＥ）取り組みを使用して、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭＥＳＳＥＮＧＥＲＭＡＸ（商標）様試薬を含む６０個超のトランスフェクション試薬をスクリーニングした。最初のスクリーニングに関して、トランスフェクトするのが容易な３つの細胞株（ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、及びＵ２ＯＳ）及びトランスフェクトするのが難しい３つの細胞株（ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、及びＭＣＦ−７）を、固定量のＣａｓ９  ＲＮＰ及び４つの異なる用量のトランスフェクション試薬と共に選択した。トランスフェクションの４８時間後にゲノム切断アッセイを行った。全ての配合物の中でもとりわけ、２、３の配合物だけが、市場の現在のトランスフェクション試薬と同様に良好に、またはより良好に働き、１つの配合物（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標））が際立っていた。選択された実施例を図１Ａ〜１Ｄに示した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を識別して、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）との複合体化及びＣａｓ９  ＲＮＰのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）との複合体化の時間を調査し、各構成成分の添加及び混合の順番も決定した。最終プロトコルを図２に記載した。Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、及びＣａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地を含むチューブ＿１に順番に添加した。各添加の合間にボルテックスすることにより軽く混合することを実施した。図３Ａ〜３Ｃに示されるように、Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体は、ゲノム切断アッセイに基づいて、室温で最大３時間安定した状態を保った。一方、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を、チューブ＿２内のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で希釈した。希釈したＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）は、より長時間のインキュベーションにより切断効率が減少したことが見い出されたように、室温でおよそ１５分間だけ安定した（図３Ｄ〜３Ｆ）。図２のステップ２において、チューブ＿１内のＣａｓ９  ＲＮＰ複合体を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を含むチューブ＿２に添加した。チューブ＿２のチューブ＿１への逆添加により、ある特定の細胞株におけるゲノム編集効率が減少したことが見い出された（データ表示無し）。次いで、Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体を、室温で１０〜１５分間インキュベートした後に細胞に添加した。より長時間のインキュベーションにより、切断効率が減少した（図３Ｇ〜３Ｉ）。Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）複合体で細胞トランスフェクションをして、トランスフェクションの４８〜７２時間後にゲノム切断アッセイを行った。
【０１６２】
次に、トランスフェクション試薬の用量、Ｃａｓ９  ＲＮＰの量、及び細胞密度を変化させることによりトランスフェクション効率を左右する重要な要因を調査した。６つの一般的に使用される細胞株を、Ｃａｓ９  ＲＮＰの量を増加させながらトランスフェクトし、続いて、ゲノム切断アッセイを行った。分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、トランスフェクトした細胞中のインデル生成の効率がＣａｓ９  ＲＮＰ複合体の増加と共に増加したことを示した（図４Ａ）。９６ウェルプレート内の細胞をトランスフェクトするためのＣａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡの最適量は、１：１．２のモル比で、それぞれおよそ１２０ｎｇ及び２８ｎｇであった。細胞播種密度は、トランスフェクション効率を調節する上で重要な役割を果たす。図４Ｂに描写されるように、６つの異なる細胞株にわたる平均ゲノム修飾効率は、トランスフェクション当日に、８０％の細胞コンフルエンスよりも６０％の細胞コンフルエンスで著しくより高かった。さらに、効率は、より高い脂質用量よりも低い脂質用量でわずかにより高いが、違いは著しくない（図４Ｃ）。細胞継代培養及び解離などの他の要因も、細胞トランスフェクション及びインデル効率の毎日の変化に寄与した。
【０１６３】
次いで、最大２４個のウェルを量りにかけて、異なる種からの多様な粘着細胞及び懸濁細胞を含む２３個の細胞株のセットを試験した。トランスフェクション前、及びトランスフェクションの４８時間後に粘着細胞の形態を報告した。細胞のほとんどは、図５Ａに示される例で顕微鏡下では健康に見え、Ａ５４９、Ｈｅｌａ、及び表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）に関して、非常にわずかな浮遊死細胞がトランスフェクションの４８時間後に観察された。一方、これらの細胞株において良好なゲノム切断効率が観察された（図５Ｂ）。トリパンブルーを用いた細胞生存率アッセイは、生存細胞だけがトランスフェクション後に対照細胞と比較して適度に減少したことを示し、ＣＲＩＳＰＲｍａｘにより誘導された細胞毒性が相対的に低かったことを呈した（図５Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲｍａｘの低細胞毒性により、トランスフェクション効率を増加するように、はるかに低い細胞密度で細胞のトランスフェクトが促進された（表Ｉ及び表３ｓ）。例えば、Ｎ２Ａ、マウスＥＳＣ、及びｉＰＳＣはそれぞれ、トランスフェクション時に３５％、２５％、及び３０％のコンフルエンスに成長し（表３ｓ）、マウスＲｏｓａ２６及びヒトＨＰＲＴ１遺伝子座で７０％、７５％、及び５５％のゲノム編集効率を達成した（表１）。改善した効率はおそらく、低細胞密度でのトランスフェクション試薬の高い接触性に起因していた。しかしながら、最適な細胞密度は、細胞型に高く依存しており、実験で判定される必要があった。
【表１−１】
2018532404.tif 000014
【表１−２】
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【表３ｓ−１】
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【表３ｓ−２】
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【表３ｓ−３】
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【表４ｓ】
2018532404.tif 000019
【０１６４】
懸濁細胞、特に造血細胞は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を含む従来の脂質試薬によりトランスフェクトするのが困難であることが知られている。トランスフェクトするのが難しい細胞株の各々に関して、ＮＥＯＮ（商標）２４最適化プロトコル（表４ｓ）を使用してＣａｓ９  ＲＮＰの送達を試験した。例えば、電気穿孔を使用して、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、Ｋ５６２、及びＳＣ−１細胞において、ＨＰＲＴ１遺伝子座でそれぞれ９５％、９０％、及び５６％のインデル生成効率を達成した一方で、相対的に低いゲノム修飾効率が、これらの懸濁細胞株内でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用して観察された。
【０１６５】
癌細胞におけるＳＮＰ（単一のヌクレオチド多形体）訂正などの精密な遺伝子修飾は、生物医学的応用及び臨床応用において重要な態様である。概念実証に関して、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を使用して、Ｃａｓ９  ＲＮＰと共にＥｍＧＦＰを発現させるプラスミドＤＮＡのＨＣＴ１１６及びＨＥＫ２９３細胞内への共送達を試験した。フローサイトメトリ分析に基づいて、プラスミドＤＮＡは、ＨＣＴ１１６及びＨＥＫ２９３細胞内にそれぞれ、およそ７０％及び４０％の効率で共送達することができ（図６Ａ〜６Ｂ）、これは、ＥｍＧＦＰプラスミド単独でトランスフェクトされた対照よりわずかに低かった。しかしながら、Ｃａｓ９  ＲＮＰ及びプラスミドＤＮＡの両方でトランスフェクトされたＨＣＴ１１６及びＨＥＫ２９３細胞のそれぞれで、およそ６５％及び７２％のゲノム修飾効率が観察された。ゲノム内の遺伝子セグメントの精密な置き換えを調査するために、４００ｂｐのドナーＤＮＡフラグメントをＣａｓ９  ＲＮＰと共に、破壊されたＥｍＧＦＰ遺伝子を内部に保有する安定したＧＲＩＰＴＩＴＥ（商標）ＨＥＫ２９３細胞株内に共送達し、およそ１％の細胞がＥｍＧＦＰの機能を修復した（図６Ｃ〜６Ｄ）。相同組換えの低効率は大きな障害のままであり、完全に探求する必要がある。
【０１６６】
要約すると、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）は、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体の多様な細胞株への送達において、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）より強固であることが示された。使用のし易さ及び低毒性により、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）は、電気穿孔の適用可能性が低い高処理薬物スクリーニング及びゲノム編集をより容易にするであろう。
【０１６７】
参考文献（実施例１）
［１］Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｌａｎｇｅｌ，Ｋ．，Ｅｒｉｓｔｅ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ，Ｕｅ．（２０１４）Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，８（３）．１９７２−１９９４、［２］Ｅｒａｚｏ−Ｏｌｉｖｅｒａｓ，Ａ．，Ｎａｊｊａｒ，Ｋ．，Ｄａｙａｎｉ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｙ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｐｅｌｌｏｉｓ，Ｊ．Ｐ．（２０１４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１（８）：８６１−８６７、［３］Ｊｏ，Ｊ．，Ｈｏｎｇ，Ｓ．，Ｃｈｏｉ，Ｗ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｄ．Ｒ．（２０１４）Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＰＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．４：４３７８、［４］Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．（２０１４）Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２４，１０１２−１０１９、［５］Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｓｈｕ，Ｙ．，Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｅｓｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｕ，Ｊ．Ｈ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｙ．ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．（２０１５）  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３−８０、［６］Ｌｉａｎｇ，Ｘ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｊ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｚｏｕ，Ｙ．，Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ，Ｒ．，Ｓｒｉｄｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｊａｓｏｎ  Ｃａｒｔｅ，Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｒｏａｒｋ，Ｎ．，Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｒａｖｉｎｄｅｒ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｓｎｕｔ，Ｊ．Ｄ．（２０１５）Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０８：４４−５３、［７］Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ，Ｄ．Ｓ．，Ｐａｇｌｉｅｒｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒａｓ，Ａ．，Ｋａｒｔｈａｕｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．，Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｅｈｍａｎｎ，Ｈ．，Ｇｅｉｊｓｅｎ，Ｎ．（２０１５）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ．１６１（３）：６７４−６９０。
【０１６８】
実施例２．代表的なＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）トランスフェクションプロトコル−−ｉＰＳＣ（Ｅ８培養系、２４ウェルプレート形式
ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）トランスフェクションキット：ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）Ａ及びＢ．
【０１６９】
トランスフェクションプロトコル
０日目：トランスフェクションの前日細胞をＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）でコーティングした２４ウェルプレート内に、トランスフェクション時において３０％コンフルエントで播種する。
【０１７０】
１日目（午前）：トランスフェクションの当日この時点では細胞培地を変えない。以下の表の通りにＣａｓ９−ｇＲＮＡ／脂質複合体を調製する。
【表５】
2018532404.tif 000020
【０１７１】
チューブ１をＲＴで３〜５分間インキュベートする。チューブ１の混合物をチューブ２に添加（添加の順番が重要である）することにより、複合体を作製する。ボルテックス混合する。ＲＴで１５分インキュベートする。
【０１７２】
１５分のインキュベーション後、５０ｕｌの複合体を細胞に添加する。
【０１７３】
１日目（午後）：トランスフェクションの６時間後、１ｍｌの新鮮なｉＰＳＣ培養培地を置き換えることにより、細胞培地を変える。
【０１７４】
２日目：細胞を、３７℃のインキュベータ内でインキュベートする。
【０１７５】
３日目：トランスフェクションの４８時間後、細胞を５００ｕｌのＰＢＳで１回洗浄すること及び１００ｕｌの溶解緩衝液を添加することにより細胞を採取した後に、ＧＣＤ（ゲノム切断検出）アッセイを行う。
【０１７６】
実施例３．ＣＲＩＳＰＲ技術−細胞操作
図７は、細胞操作のためのＣＲＩＳＰＲ技術の図式表示を描写する。ＣＲＩＳＰＲ技術は、ヌクレアーゼを標的ＤＮＡにガイドするために短いＲＮＡフラグメントを使用する。標的切断の後、使用者は、ＤＮＡの除去、ＤＮＡの置き換え、及びＤＮＡの添加を含む選択肢も利用可能である。
【０１７７】
実施例４．ＣＲＩＳＰＲ−−Ｃａｓ９送達形式
図８は、多様なＣａｓ９送達形式の図式表示を描写する。例えば、レポータを有するベクターを使用する直接プラスミド組み込みが最も低い効率を有し、これは典型的には、約３週間のワークフローでもたらされることが観察される。ＭＥＳＳＥＮＧＥＲＭＡＸ（商標）方法論を用いることにより、より高い処理効率がもたらされ得、これは典型的には、１〜２週間のワークフローを必要とする。代替的に、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）は、高効率をもたらし得、これは典型的には、３〜４日のワークフローを必要とする。
【０１７８】
実施例５．脂質スクリーニング実験計画
図９は、脂質スクリーニングの実験計画の図式表示を描写する。典型的なスクリーニング実験は、９６ウェルプレート及び多様な一般的な細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨＥｐＧ２、ＭＣＦ−７、ｋ  Ａ５４９、及びＵ２０）を用いることができる。試薬用量範囲は、０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルであり得る。Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅ８ｎ／ｇＲＮＡは、４０ｎｇ  ＋８．５ｎｇ／ウェルであり得る。対照試薬は、ＬＦ３Ｋ及びＲＮＡｉＭａｘであり得る。トランスフェクションは、図９に描写されるように達成され得る。ＧＣＤアッセイは、トランスフェクションの４８時間後に実施され得る。
【０１７９】
実施例６．脂質ライブラリ−ＤＯＥ配合物
Ｘａ段階試薬は、ＬＦ３Ｋ試薬コア化合物に基づき、多様な異なる試薬配合物をもたらす。
【０１８０】
Ｘｂ段階試薬は、ＲＮＡｉＭＡＸ試薬コア化合物に基づき、多様な異なる試薬配合物をもたらす。
【０１８１】
Ｎ段階試薬は、ＭＥＳＳＥＮＧＥＲＭＡＸ（商標）の様であり、多様な異なる試薬配合物をもたらす。
【０１８２】
実施例７．脂質スクリーニング−Ｈｅｌａ、Ａ５４９細胞
図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｈｅｌａ細胞（図１０Ａ〜１０Ｃ）及びＡ５４９細胞（図１０Ｄ〜１０Ｆ）において、Ｘａ段階、Ｘｂ段階、及びＮ段階配合物を使用した脂質スクリーニング実験の結果を描写する。各ヒストグラムの各ビン内で、試薬用量は、（左から右の順番で）０．１、０．２、０．４、及び０．６ｕＬ／ウェルである。
【０１８３】
実施例８．トランスフェクションエンハンサ−−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチド
図１１Ａ〜１１Ｆは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡトランスフェクションにおけるペプチドに関するトランスフェクションエンハンサ実験の結果のヒストグラムを描写する。細胞株：Ｕ２０Ｓ（図１１Ａ）、ＨＥＫ２９３（図１１Ｂ）、ＨｅＬａ（図１１Ｃ）、ＨｅｐＧ２（図１１Ｄ）、Ａ５４９（図１１Ｅ）、ＭＣＦ７（図１１Ｆ）。全てのヒストグラムのＹ軸は、インデル％である。示された通りに脂質を添加した。記号「＋」は、Ｃａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬の添加を示す。Ｃａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬の添加により、全ての細胞型においてインデル％が著しく増強されたことが観察される。
【０１８４】
実施例９．Ｃａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬により増強されたＣａｓ９／ｇＲＮＡ送達
図１２は、Ｃａｓ９ＰＬＵＳ（商標）試薬と組み合わされたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬、及びＲＮＡｉＭＡＸのＡ５４９、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＨＥｐＧ２、ＭＣＦ７、及びＵ２０Ｓ細胞の実験の結果を描写する。この図は、組み合わせ実験におけるトランスフェクションの著しい増強を描写する。
【０１８５】
実施例１０．追加の細胞株におけるＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）
ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）方法論は、以下の表５Ａ及び５Ｂに列挙されるものを含む幅広い多様な細胞株で用いられ得る。
【表５Ａ】
2018532404.tif 000021
【表５Ｂ】
2018532404.tif 000022
【０１８６】
実施例１１．比較結果−ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）及びＲＮＡｉＭＡＸ
以下の表６は、細胞ＧＣＤに対するＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）及びＲＮＡｉＭＡＸ方法論に関する比較データを表にしたものである。細胞株：ＨＥＫ２９３、ＨＣＴ１１６、Ｕ２０Ｓ、Ｈｅｌａ、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＴＨＰ１（懸濁）、Ｋ５６２（懸濁）、Ｊｕｒｋａｔ（懸濁）、ｉＰＳＣ（Ｅ８培養系）、及びｍＥＳＣ。
【表６】
2018532404.tif 000023
【０１８７】
非公式の配列表．
ＣＧＹＧＧＧＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号１］。
【０１８８】
ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＧＲＧＤＳＰＣＧ［配列番号２］。
【０１８９】
ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＫＦＴＩＶＦ［配列番号３］。
【０１９０】
ＧＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−（すなわち、アミド連結部を通して結合されるスペルミン）で修飾される［配列番号４］。
【０１９１】
ＧＧＧＧＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−で修飾される［配列番号５］。
【０１９２】
ＧＧＲＧＤＭＦＧＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−で修飾される［配列番号６］。
【０１９３】
ＧＧＶＫＲＫＫＫＰＧＹＧＧＧＧＶＫＲＫＫＫＰＧＹＧＧ［配列番号７］。
【０１９４】
ＧＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−で修飾される［配列番号８］。
【０１９５】
ＧＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−で修飾される［配列番号９］。
【０１９６】
ＧＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（（ＣＨ２）４−ＮＨ−５−ＣＯ−Ｓｐ）−ＣＯ−で修飾される［配列番号１０］。
【０１９７】
ＧＫＦＴＩＶＦＤＤＤＤＤＤ［配列番号１１］。
【０１９８】
ＧＫＦＴＩＶＦＤＤＤＤＤＤＧ［配列番号１２］。
【０１９９】
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号１３］。
【０２００】
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＣＫＦＴＩＶＦ［配列番号１４］。
【０２０１】
ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＧＧＹＧＧＧＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号１５］。
【０２０２】
ＧＬＦＥＡＩＡＩＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号１６］。
【０２０３】
ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ［配列番号１７］。
【０２０４】
ＧＬＦＫＡＩＡＫＦＩＫＧＧＷＫＧＬＩＫＧ［配列番号１８］。
【０２０５】
ＧＲＧＤＳＰＣＧＧＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ［配列番号１９］。
【０２０６】
ＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号２０］。
【０２０７】
ＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＧＧＲＧＤＭＦＧＧ、ここで、Ｎ末端がＳｐ−５−ＣＯ−で修飾される［配列番号２１］。
【０２０８】
ＫＦＴＩＶＦ［配列番号２２］。
【０２０９】
ＫＦＴＩＶＦＧＧＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号２３］。
【０２１０】
ＫＦＴＴＩＶＦＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号２４］。
【０２１１】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ［配列番号２５］。
【０２１２】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＧＲＧＤＳＰ［配列番号２６］。
【０２１３】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＣＧＹＧＧＧＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＧＬＦＥＡＩＡＥＦ  ＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号２７］。
【０２１４】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＣＧＹＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＫＦＴＩＶＦ［配列番号２８］。
【０２１５】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号２９］。
【０２１６】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＲＧＤＳＰＣＧ［配列番号３０］。
【０２１７】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＫＦＴＩＶＦＤＤＤＤＤＤ［配列番号３１］。
【０２１８】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＫＦＴＩＶＦＤＤＤＤＤＤＧ［配列番号３２］。
【０２１９】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＣＫＦＴＩＶＦ［配列番号３３］。
【０２２０】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＧＧＹＧＧＧＧＧＧ  ＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号３４］。
【０２２１】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＦＴＩＶＦＧＧＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号３５］。
【０２２２】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＦＴＴＩＶＦＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号３６］。
【０２２３】
ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＳＳＤＤＥＡＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号３７］。
【０２２４】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号３８］。
【０２２５】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号３９］。
【０２２６】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＳＫＦＴＩＶＦ［配列番号４０］。
【０２２７】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＳＲＧＤＳＰＣ［配列番号４１］。
【０２２８】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ［配列番号４２］。
【０２２９】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号４３］。
【０２３０】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＫＦＴＩＶＦ［配列番号４４］。
【０２３１】
ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＲＧＤＳＰＣ［配列番号４５］。
【０２３２】
ＳＳＤＤＥＡＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＫＫＲＫＶＧＧ［配列番号４６］。
【図１Ａ】
2018532404.tif 000033
【図１Ｂ】
2018532404.tif 000034
【図１Ｃ】
2018532404.tif 000035
【図１Ｄ】
2018532404.tif 000036
【図２】
2018532404.tif 000037
【図３Ａ】
2018532404.tif 000038
【図３Ｂ】
2018532404.tif 000039
【図３Ｃ】
2018532404.tif 000040
【図３Ｄ】
2018532404.tif 000041
【図３Ｅ】
2018532404.tif 000042
【図３Ｆ】
2018532404.tif 000043
【図３Ｇ】
2018532404.tif 000044
【図３Ｈ】
2018532404.tif 000045
【図３Ｉ】
2018532404.tif 000046
【図４Ａ】
2018532404.tif 000047
【図４Ｂ】
2018532404.tif 000048
【図４Ｃ】
2018532404.tif 000049
【図５Ａ】
2018532404.tif 000050
【図５Ｂ】
2018532404.tif 000051
【図５Ｃ】
2018532404.tif 000052
【図６Ａ】
2018532404.tif 000053
【図６Ｂ】
2018532404.tif 000054
【図６Ｃ】
2018532404.tif 000055
【図６Ｄ】
2018532404.tif 000056
【図６Ｅ】
2018532404.tif 000057
【図６Ｆ】
2018532404.tif 000058
【図７】
2018532404.tif 000059
【図８】
2018532404.tif 000060
【図９】
2018532404.tif 000061
【図１０Ａ】
2018532404.tif 000062
【図１０Ｂ】
2018532404.tif 000063
【図１０Ｃ】
2018532404.tif 000064
【図１０Ｄ】
2018532404.tif 000065
【図１０Ｅ】
2018532404.tif 000066
【図１０Ｆ】
2018532404.tif 000067
【図１１Ａ】
2018532404.tif 000068
【図１１Ｂ】
2018532404.tif 000069
【図１１Ｃ】
2018532404.tif 000070
【図１１Ｄ】
2018532404.tif 000071
【図１１Ｅ】
2018532404.tif 000072
【図１１Ｆ】
2018532404.tif 000073
【図１２】
2018532404.tif 000074
【配列表】
2018532404000001.app
【国際調査報告】
2018532404.tif 000075
2018532404.tif 000076