(57)【要約】  陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることを含む、クロストリジウム神経毒を精製するための方法であって、接触工程は、少なくともpH7.3で実施され、陽イオン交換樹脂を、前記クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させるステップは、クロストリジウム神経毒の単鎖形態から二鎖形態への変換の前に起こる。また、本発明によって得ることができる、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有する緩衝液、精製中間体およびクロストリジウム神経毒の使用であって、クロストリジウム神経毒が、単鎖形態である使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることを含む、クロストリジウム神経毒を精製する方法であって、接触工程は、少なくともpH7.3で実施され、陽イオン交換樹脂を、前記クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させる前記ステップは、単鎖形態から二鎖形態への前記クロストリジウム神経毒の変換の前に起こる、方法。
【請求項２】
陽イオン交換樹脂からクロストリジウム神経毒を分離することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
分離されたクロストリジウム神経毒が、実質的に純粋な状態にある、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
陽イオン交換樹脂と会合されたクロストリジウム神経毒を含む精製中間体であって、前記精製中間体は、少なくともpH7.3のpH値を有し、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である、精製中間体。
【請求項５】
陽イオン交換樹脂から分離されたクロストリジウム神経毒を含む精製中間体であって、前記精製中間体は、少なくともpH7.3のpH値を有し、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である、精製中間体。
【請求項６】
pH値が、少なくとも約pH7.5(好ましくは、約pH7.6、好ましくは、少なくとも約pH7.7、より好ましくは、少なくとも約pH7.8)である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法または精製中間体。
【請求項７】
pH値が、約pH7.3から約pH9.5の間である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法または精製中間体。
【請求項８】
pH値が、約pH7.3から約pH8.0の間である、請求項1から5または7のいずれか一項に記載の方法または精製中間体。
【請求項９】
同一条件下で、前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIよりも-1pH単位を越えて低いpH値を使用することと比較した、クロストリジウム神経毒の結合及び/又は収率の増大のために、クロストリジウム神経毒を含む組成物を、陽イオン交換樹脂と接触させるための、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位であるか、またはそれよりも高いpH値を有する緩衝液の使用であって、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である、使用。
【請求項１０】
pH値が、少なくとも前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIである(好ましくは、少なくとも約0.2pH単位超える、より好ましくは、少なくとも0.5pH単位超える)、請求項9に記載の使用。
【請求項１１】
pH値が、前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIを約0.2から約1.5pH単位の間超える、請求項9に記載の使用。
【請求項１２】
pH値が、前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIを約0.2から約1.0pH単位の間超える、請求項9から11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることが、第1の精製ステップ(例えば、第1のクロマトグラフィー精製ステップ)である、請求項1から3または6から12のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１４】
精製が、1つ以上のさらなるステップを含む、請求項1から3または6から13のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１５】
1以上のさらなるステップが、クロストリジウム神経毒を含む組成物を、1つ以上のさらなる樹脂と接触させることを含む、請求項14に記載の方法または使用。
【請求項１６】
1つ以上のさらなるステップが、ボツリヌス神経毒を単鎖形態から二鎖形態に変換することを含む、請求項14または15に記載の方法または使用。
【請求項１７】
組成物中に含まれる総クロストリジウム神経毒の少なくとも35％(好ましくは、少なくとも40％、50％ 60％、70％または80％)が、陽イオン交換樹脂と会合する、請求項1から3または6から16のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記の請求項のいずれか一項に記載の方法または使用によって得ることができる、及び/又は請求項4から8のいずれか一項に記載の精製中間体から単離される、クロストリジウム神経毒。
【請求項１９】
実質的に純粋な状態である、請求項18に記載のクロストリジウム神経毒。
【請求項２０】
クロストリジウム神経毒が、クロストリジウム・ボツリヌス(Clostridia botulinum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridia tetani)、クロストリジウム・バラティ(Clostridia baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)からなる群から選択される1つ以上である、前記の請求項のいずれか一項に記載の、方法、使用、クロストリジウム神経毒または精製中間体。
【請求項２１】
クロストリジウム神経毒が、ボツリヌス神経毒(BoNT)、好ましくは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gからなる群から選択される1つ以上のBoNTである、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法、使用、クロストリジウム神経毒または精製中間体。
【請求項２２】
BoNTが、陽イオン性BoNTである、請求項21に記載の方法、使用、クロストリジウム神経毒または精製中間体。
【請求項２３】
実施例および図面を参照して実質的に本明細書において記載されるような、方法、使用、クロストリジウム神経毒または精製中間体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム神経毒を精製する方法、当該方法によって得られた緩衝液、精製中間体およびクロストリジウム神経毒の使用及び本明細書に記載する用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム属中の細菌は、高度に強力な、特定のタンパク質毒素を産生し、それらが送達されるニューロンおよびその他の細胞を毒し得る。このようなクロストリジウム毒素の例として、C.テタニ(tetani)によって産生される神経毒(TeNT)、およびC.ボツリヌス(botulinum)血清型A〜Gによって産生される神経毒(BoNT)ならびにC.バラティ(baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)によって産生されるものが挙げられる。
【０００３】
クロストリジウム神経毒の中には、既知の最も強力な毒素がいくつかある。例として、ボツリヌス神経毒は、血清型に応じて0.5〜5ng/kgの範囲のマウスの半致死量(LD50)値を有する。破傷風毒素およびボツリヌス毒素の両方とも、冒されたニューロンの機能、具体的には、神経伝達物質の放出を阻害することによって作用する。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部で作用し、末梢神経系においてコリン作動性伝達を阻害するが、破傷風毒素は、中枢神経系において作用する。
【０００４】
自然界では、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、これがタンパク質切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に連結される2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置する活性化部位と呼ばれることが多い特定の切断部位で起こる。毒素の活性形態は、この二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。H鎖は、N末端転位置成分(HNドメイン)およびC末端標的化成分(HCドメイン)を含む。切断部位は、L鎖および転位置ドメイン構成成分の間に位置する。HCドメインのその標的ニューロンとの結合および結合した毒素のエンドソームを介した細胞中への内部移行後に、HNドメインは、L鎖をエンドソーム膜を横断してサイトゾル中に転位置させ、L鎖が、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
【０００５】
非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシン)として知られる細胞内輸送タンパク質をタンパク分解性に切断することによって作用する-Gerald K (2002年)「Cell and Molecular Biology」(第4版) John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。頭字語SNAREは、用語Soluble NSF Attachment Receptor(可溶性NSF結合受容体)(ここで、NSFは、N-ethylmaleimide-Sensitive Factor(N-エチルマレイミド感受性因子)を意味する)に由来する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞融合に、従って、細胞からの小胞輸送による分子の分泌に不可欠である。プロテアーゼ機能は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質に対して高い基質特異性を示す。したがって、非細胞傷害性プロテアーゼは、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、標的細胞からの細胞性分泌を阻害可能である。クロストリジウム神経毒のL鎖プロテアーゼは、SNAREタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼである。
【０００６】
SNAREタンパク質の遍在性を考慮して、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム神経毒は、広範囲の治療において成功裏に使用されてきた。
【０００７】
例として、いくつかの治療的および美容的または審美的適用においてニューロン伝達を阻害するための、ボツリヌス神経毒(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gならびに破傷風神経毒(TeNT)などのクロストリジウム神経毒の使用を記載するWilliam J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004)を参照する-例えば、市販のボツリヌス毒素製品は、顔面痙縮、上肢痙縮、下肢痙縮、頸部ジストニア、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、腋窩の発汗過多、慢性片頭痛、神経因性排尿筋過活動、眉間の皴および重度の外眼角の皴を含む適応症の治療薬として現在承認されている。さらに、神経筋疾患を治療するための(US6,872,397を参照のこと)、子宮障害を治療するための(US2004/0175399を参照のこと)、潰瘍および胃食道逆流症を治療するための(US2004/0086531を参照のこと)、ジストニアを治療するための(US6,319,505を参照のこと)、眼の障害を治療するための(US2004/0234532を参照のこと)、眼瞼痙攣を治療するための(US2004/0151740を参照のこと)、斜視を治療するための(US2004/0126396を参照のこと)、疼痛を治療するための(US6,869,610、US6,641,820、US6,464,986およびUS6,113,915を参照のこと)、線維筋痛症を治療するための(US6,623,742、US2004/0062776を参照のこと)、腰痛を治療するための(US2004/0037852を参照のこと)、筋肉傷害を治療するための(US6,423,319を参照のこと)、副鼻腔炎性頭痛を治療するための(US6,838,434を参照のこと)、緊張型頭痛を治療するための(US6,776,992を参照のこと)、頭痛を治療するための(US6,458,365を参照のこと)、片頭痛を低減するための(US5,714,469を参照のこと)、心血管疾患を治療するための(US6,767,544を参照のこと)、パーキンソン病などの神経疾患を治療するための(US6,620,415、US6,306,403を参照のこと)、精神神経疾患を治療するための(US2004/0180061、US2003/0211121を参照のこと)、内分泌障害を治療するための(US6,827,931を参照のこと)、甲状腺障害を治療するための(US6,740,321を参照のこと)、コリン作動性に影響された汗腺障害を治療するための(US6,683,049を参照のこと)、糖尿病を治療するための(US6,337,075、US6,416,765を参照のこと)、膵臓障害を治療するための(US6,261,572、US6,143,306を参照のこと)、骨腫瘍などの癌を治療するための(US6,565,870、US6,368,605、US6,139,845、US2005/0031648を参照のこと)、耳の障害を治療するための(US6,358,926、US6,265,379を参照のこと)、胃腸筋障害およびその他の平滑筋機能障害などの自律神経障害を治療するための(US5,437,291を参照のこと)、皮膚細胞増殖性障害と関連する皮膚病変の治療のための(US5,670,484を参照のこと)、神経因性炎症性障害の管理のための(US6,063,768を参照のこと)、脱毛の低減および毛髪成長の刺激のための(US6,299,893を参照のこと)、下向きに曲がった口を治療するための(US6,358,917を参照のこと)、食欲を低減するための(US2004/40253274を参照のこと)、歯科治療および処置のための(US2004/0115139を参照のこと)、神経筋疾患および状態を治療するための(US2002/0010138を参照のこと)、種々の障害および状態および付随する疼痛を治療するための(US2004/0013692を参照のこと)、喘息およびCOPDなどの粘液分泌亢進に起因する状態を治療するための(WO00/10598を参照のこと)および炎症、内分泌状態、外分泌状態、免疫学的状態、心血管状態、骨の状態などの非ニューロン状態を治療するための(WO01/21213を参照のこと)クロストリジウム神経毒療法が記載さ��ている。上記の刊行物のすべては、その全文が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００８】
ヒトおよびその他の哺乳動物の治療的および美容的処置におけるクロストリジウム神経毒(例えば、BoNTおよびTeNT)などの非細胞傷害性プロテアーゼの使用は、これらの毒素の特性から恩恵を受け得る広がり続ける範囲の疾患および病気に拡大すると予測される。
【０００９】
全身の神経学的効果を避けるために、多数のクロストリジウム神経毒療法は、所与の標的部位(標的組織など)へのクロストリジウム神経毒治療薬の直接投与を利用する。この方法でクロストリジウム神経毒ベースの治療薬を投与する場合の問題は、投与部位から離れた周囲組織または全身循環中への毒素の広がりである。標的組織から離れた毒素の拡散は、極端な場合には、命を脅かすものとなり得る望ましくない副作用の原因になると考えられる。これは、高い用量、濃度および注射容量でクロストリジウム神経毒治療薬(BoNT治療薬など)を使用する場合に特に懸念され得る。市販のBoNT/A治療薬について報告されているこの問題と関連する有害作用として、無力症、全身性筋肉低下、複視、眼瞼下垂、嚥下障害、発声障害、構音障害、尿失禁および呼吸困難が挙げられる。嚥下および呼吸困難は、命を脅かすものである場合もあり、毒素効果の広がりと関連する死亡が報告されている。これらの問題は、改変クロストリジウム神経毒の等電点(pI)を増大する少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む改変クロストリジウム神経毒を提供したWO2015/004461 A1(参照により本明細書に取り込まれる)において対処され、解決されている。
【００１０】
クロストリジウム神経毒を精製する方法は、当技術分野で提供されている。WO2006/096163 A1(参照により本明細書に取り込まれる)では、安定化非毒性タンパク質と複合体形成したボツリヌス神経毒A型を精製するためのクロマトグラフィープロセスおよび系を教示している。WO2006/096163 A1では、仕上げカラム(finishing column)(すなわち、ボツリヌス神経毒A型複合体が、1つ以上の以前のカラムにすでに付されており、実質的に純粋な状態である場合に使用されるカラム)としての陽イオン交換カラムの使用を含む複数のクロマトグラフィープロセスを教示している。WO2006/096163 A1において、ボツリヌス神経毒A型複合体と結合し、それを用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを実施する場合に、極めて低いpH値(例えば、pH4.0)を使用することが教示されている。
【００１１】
しかし、クロストリジウム神経毒(特に、複合体形成していないクロストリジウム神経毒)を精製するための、好ましくは、より少ない(及び/又は随意により、より効率的な)ステップでのクロストリジウム神経毒の精製を促進する、改善されたプロセス及び/又は改善された収率を提供する、最適化され、増強された技術が、依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2006/096163 A1
【発明の概要】
【００１３】
第1の態様によれば、本発明は、クロストリジウム神経毒を精製する方法であって、陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることを含む方法を提供し、接触工程は、少なくともpH7.3で実施され、陽イオン交換樹脂を、前記クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させる前記ステップは、単鎖形態から二鎖形態への前記クロストリジウム神経毒の変換の前に起こる。
【００１４】
第2の態様では、陽イオン交換樹脂と会合されたクロストリジウム神経毒を含む精製中間体を提供し、精製中間体は、少なくともpH7.3のpH値を有し、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である。
【００１５】
第3の態様では、陽イオン交換樹脂から分離されたクロストリジウム神経毒を提供し、精製中間体は、少なくともpH7.3のpH値を有し、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である。
【００１６】
第4の態様では、本発明は、同一条件下で、前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIよりも-1pH単位を越えて低いpH値を使用することと比較した、クロストリジウム神経毒の結合及び/又は収率の増大のために、クロストリジウム神経毒を含む組成物を陽イオン交換樹脂と接触させるための、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有する緩衝液の使用を提供し、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である。
【００１７】
第5の態様では、前記の請求項のいずれか一項の方法または使用によって得ることができる、及び/又は本発明の精製中間体から単離されたクロストリジウム神経毒を提供する。
【００１８】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して単に例としてここで説明する:
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、種々のpHでの陽イオン交換樹脂でのrBoNT/A1捕獲を示す図である。エンドネガティブ(endonegative)rBoNT/A1の大腸菌(E.coli)可溶化液を、pH6.0(パネルAおよびB)、pH7.5(パネルCおよびD)またはpH8.0(パネルEおよびF)に緩衝液交換した。可溶化液を、Hi-Trap SP-HP上にロードし、洗浄し、pH(パネルA)またはNaCl(パネルB〜F)勾配のいずれかを用いて溶出した。SDS-PAGEによって画分F5〜F16を解析し、BoNT/Aは、各パネルでアスタリスク(*)で示されている。
【図２】図2は、種々のpHでの陽イオン交換樹脂での陽イオン性rBoNT/A1捕獲を示す図である。エンドネガティブ(endonegative)陽イオン性rBoNT/A1の大腸菌(E.coli)可溶化液を、pH6.0(パネルAおよびB)、pH7.5(パネルCおよびD)またはpH8.0(パネルEおよびF)に緩衝液交換した。可溶化液を、Hi-Trap SP-HP上にロードし、洗浄し、pH(パネルA)またはNaCl(パネルB〜F)勾配のいずれかを用いて溶出した。関連画分をSDS-PAGEによって解析し、BoNT/Aは、各パネルでアスタリスク(*)で示されている。
【図３】図3は、陽イオン性BoNT/A1(例えば、天然BoNT/A1と比較した場合に増大した等電点を有するBoNT/A1)ヌクレオチド配列(配列番号1)を示す図である。
【図４】図4は、陽イオン性rBoNT/A1ポリペプチド配列(配列番号2)を示す図である。
【図５】図5は、rBoNT/A1ヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。
【図６】図6は、rBoNT/A1ポリペプチド配列(配列番号4)を示す図である。
【図７】図7は、陽イオン性BoNT/A、「CatHN_v1」、ヌクレオチド配列(配列番号5)を示す図である。
【図８】図8は、陽イオン性BoNT/A、「CatHN_v1」、ポリペプチド配列(配列番号6)を示す図である。
【図９】図9は、陽イオン性BoNT/A、「CatHN_v2」、ヌクレオチド配列(配列番号7)を示す図である。
【図１０】図10は、陽イオン性BoNT/A、「CatHN_v2」、ポリペプチド配列(配列番号8)を示す図である。
【図１１】図11は、陽イオン性BoNT/A、「CatHN_v3」、ヌクレオチド配列(配列番号9)を示す図である。
【図１２】図12は、陽イオン性BoNT/A、「CatHN_v3」、ポリペプチド配列(配列番号10)を示す図である。
【図１３】図13は、陽イオン性BoNT/E軽鎖、「CatLC」、ヌクレオチド配列(配列番号11)を示す図である。
【図１４】図14は、陽イオン性BoNT/E軽鎖、「CatLC」、ポリペプチド配列(配列番号12)を示す図である。
【図１５】図15は、BoNT/A1ヌクレオチド配列(配列番号13)を示す図である。
【図１６】図16は、BoNT/A1ポリペプチド配列(配列番号14)を示す図である。
【図１７】図17は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-A」、ヌクレオチド配列(配列番号15)を示す図である。
【図１８】図18は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-A」、ポリペプチド配列(配列番号16)を示す図である。
【図１９】図19は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-B」、ヌクレオチド配列(配列番号17)を示す図である。
【図２０】図20は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-B」、ポリペプチド配列(配列番号18)を示す図である。
【図２１】図21は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-C」、ヌクレオチド配列(配列番号19)を示す図である。
【図２２】図22は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-C」、ポリペプチド配列(配列番号20)を示す図である。
【図２３】図23は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-D」、ヌクレオチド配列(配列番号21)を示す図である。
【図２４】図24は、陽イオン性BoNT/A1、「Cat-D」、ポリペプチド配列(配列番号22)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の独創性に富んだ知見は、クロストリジウム神経毒は、少なくともpH7.3で陽イオン交換残基と会合するということである。これは、当技術分野では、高度に予期しないことであり、支配的な見識に反するものであり、陽イオン交換クロマトグラフィーの際に、精製されているタンパク質のpIよりも十分に低いpH値を使用することを教示する。
【００２１】
本発明者らはまた、驚くべきことに、前記クロストリジウム神経毒の算出された等電点(pI)の-1pH単位またはそれより高いpH値を有する緩衝液の使用が、異なるpH条件下での同様の使用と比較した場合に結合及び/又は収率を増大することを見出した。
【００２２】
したがって、一実施形態では、クロストリジウム神経毒を精製するための方法であって、陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることを含む方法を提供し、接触工程は、少なくともpH7.3で実施され、陽イオン交換樹脂を前記クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させる前記ステップは、単鎖形態から二鎖形態への前記クロストリジウム神経毒の変換の前に起こる。
【００２３】
一実施形態では、接触工程は、少なくとも約pH7.3で実施され得る。接触工程は、適宜、少なくとも約pH7.4または少なくともpH7.5で実施され得る。
【００２４】
接触工程は、適宜、少なくとも約pH7.6または少なくとも約pH7.7で実施され得る。
【００２５】
接触工程は、適宜、少なくとも約pH7.8または少なくとも約pH7.9で実施され得る。
【００２６】
接触工程は、適宜、少なくとも約pH8.0で実施され得る。
【００２７】
別の実施形態では、接触工程は、少なくとも約pH7.3〜約pH9.5で実施され得る。接触工程は、適宜、約pH7.5〜約pH9.0の間または約pH7.5〜約pH8.5の間のpH値で実施され得る。
【００２８】
接触工程は、適宜、約pH7.5のpH値で実施され得る。
【００２９】
接触工程は、適宜、約pH8.0のpH値で実施され得る。
【００３０】
用語「精製」とは、本明細書において、好ましくは、クロストリジウム神経毒でない混入物を含まないクロストリジウム神経毒を得る目的で、クロストリジウム神経毒を含む組成物中に存在し得る1つ以上の前記クロストリジウム神経毒でない混入物を除去することを意味する。言い換えれば、用語「精製すること」は、特に断りのない限り、絶対精製というよりも精製の程度を指すものとする。したがって、用語「精製すること」は、少なくとも5％(適宜、少なくとも10％または20％)のクロストリジウム神経毒でない混入物を除去することを指し得る。適宜、「精製すること」は、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％の混入物を除去することを指し得る。
【００３１】
別の実施形態では、同一条件下で、前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIよりも-1pH単位を越えて低いpH値を使用することと比較した、クロストリジウム神経毒の結合及び/又は収率の増大のために、クロストリジウム神経毒を含む組成物を、陽イオン交換樹脂と接触させるための、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位であるか、またはそれよりも高いpH値を有する緩衝液の使用を提供し、前記クロストリジウム神経毒は、単鎖形態である。
【００３２】
用語「クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位を超える、またはより高い」とは、本明細書において、クロストリジウム神経毒の算出されたpIより-1pH単位低いものよりも高いpHを意味する。例えば、この用語は、-0.5、+0.5、+1pH単位などを包含する。例として、クロストリジウム神経毒が、8.0のpIを有する場合には、-1pH単位を超えるまたはより高いpHは、pH7.0を超えるpH、例えばpH8.0、pH9.0などを意味する。
【００３３】
用語「前記クロストリジウム神経毒の算出されたpIより-1pH単位を超えて低い」とは、本明細書において、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位より低いpHを意味する。例えば、この用語は、-2pH単位などを包含する。例として、クロストリジウム神経毒が、8.0のpIを有する場合には、-1pH単位を越えて低いpH値は、pH7.0未満のpH、例えばpH6.0、pH5.0などを意味する。
【００３４】
本発明において使用するための陽イオン交換樹脂は、クロストリジウム神経毒と会合可能な任意の種類の陽イオン交換樹脂であり得る。一実施形態では、陽イオン交換樹脂は、強陽イオン交換樹脂、弱陽イオン交換樹脂またはそれらの組合せであり得る。
【００３５】
陽イオン交換樹脂は、適宜、強陽イオン交換樹脂であり得る。
【００３６】
強陽イオン交換体の限定されない例として、SPセファロースHP(SP Sepharose HP)、SPセファロースFF(SP Sepharose FF)(両方ともGE Healthcare、UKから入手可能)、ムスタングS(Mustang S)、Sセラミック(S Ceramic)、ハイパーD(HyperD)(登録商標)F、アクロディスク・ムスタングS(Acrodisc with Mustang S)、アクロプレップ・ムスタングS(AcroPrep with Mustang S)及び/又はアクロセップ・SセラミックハイパーD(AcroSep with S Ceramic HyperD)(登録商標)F(それらのすべては(特に断りのない限り)、Pall Corporation、25 Harbor Park Drive、Port Washington、NY11050、USAから市販されている)が挙げられる。
【００３７】
好ましい実施形態では、陽イオン交換樹脂は、スルホン酸を含む強陽イオン交換樹脂であり得る。
【００３８】
一実施形態では、陽イオン交換樹脂は、SPセファロースHP樹脂及び/又はSPセファロースFF樹脂(すべてGE Healthcare、UKから市販されている)であり得る。
【００３９】
弱陽イオン交換体の限定されない例として、CMセラミックハイパーD(CM Ceramic HyperD)(登録商標)F、アクロセップ・CMセラミック(AcroSep with CM Ceramic)及び/又はハイパーD(HyperD)(登録商標)F(それらのすべては、Pall Corporation、25 Harbor Park Drive、Port Washington、NY11050、USAから市販されている)が挙げられる。
【００４０】
一実施形態では、弱陽イオン交換樹脂は、カルボキシメチルを含む樹脂であり得る。
【００４１】
一実施形態では、混合モード樹脂が使用され得る。混合モード樹脂は、イオン相互作用によって標的タンパク質と相互作用し、1つ以上の官能基を用いて増強され得る(例えば、水素結合、疎水性およびファンデルワールス相互作用による相互作用をもたらす)帯電リガンドを使用し得る。したがって、一実施形態では、混合モード樹脂は、イオン交換樹脂および疎水性相互作用樹脂として機能し得る。混合モード樹脂は、適宜、陽イオン交換樹脂(適宜、弱陽イオン交換樹脂)および疎水性相互作用樹脂として機能し得る。
【００４２】
混合モード樹脂の限定されない例として、Captoマルチモードレンジ(multimodal range)のクロマトグラフィーカラム(GE Healthcare、UKから市販されている)が挙げられる。
【００４３】
自然界では、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、タンパク質切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に連結される2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置する活性化部位と呼ばれることが多い特定の切断部位で起こる。毒素の活性形態は、この二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。H鎖は、N末端転位置成分(HNドメイン)およびC末端標的化成分(HCドメイン)を含む。切断部位は、L鎖および転位置ドメイン構成成分の間に位置する。HCドメインのその標的ニューロンとの結合および結合した毒素のエンドソームを介した細胞中への内部移行後に、HNドメインは、L鎖をエンドソーム膜を横断してサイトゾル中に転位置させ、L鎖が、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
【００４４】
多数の異なる種類のクロストリジウム神経毒が、本発明において使用するのに適している。したがって、本発明との関連で、用語「クロストリジウム神経毒」は、C.ボツリヌス(botulinum)(ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびG)、C.テタニ(tetani)(破傷風神経毒)、C.ブチリカム(butyricum)(ボツリヌス神経毒血清型E)およびC.バラティ(baratii)(ボツリヌス神経毒血清型F)によって産生される毒素ならびに修飾クロストリジウム神経毒または前記のいずれかに由来する誘導体を包含する。用語「クロストリジウム神経毒」はまた、天然に存在するボツリヌス神経毒ハイブリッド、モザイクおよびキメラも包含し得る。
【００４５】
これに関連して用いられる用語「モザイク」とは、別の種類のクロストリジウム神経毒(例えば、異なる血清型のクロストリジウム神経毒)に由来する少なくとも1つの機能的ドメインを含む天然に存在するクロストリジウム神経毒を指し、前記クロストリジウム神経毒は、前記の少なくとも1つの機能的ドメインを通常含まない。
【００４６】
したがって、一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、クロストリジウム・ボツリヌス(Clostridia botulinum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridia tetani)、クロストリジウム・バラティ(Clostridia baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)からなる群から選択される1つ以上のクロストリジウム属から得ることができる。
【００４７】
ボツリヌス神経毒(BoNT)は、いくつかのアクセサリータンパク質と複合体形成されたBoNT自体からなる大きなタンパク質複合体の形態でC.ボツリヌス(botulinum)によって産生される。現在のところ、8種の異なるクラスのボツリヌス神経毒、すなわち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、GおよびHがあり、そのすべては、同様の構造および作用様式を共有する。異なるBoNT血清型は、特異的中和抗血清による不活性化に基づいて区別でき、血清型によるこのような分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性百分率と相関関係がある。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸配列同一性百分率に基づいて異なるサブタイプにさらに分けられる。
【００４８】
BoNTは、全身循環に入った後、胃腸管において吸収され、コリン作動性神経末端のシナプス前膜と結合し、その神経伝達物質アセチルコリンの放出を妨げる。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/FおよびBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞結合膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C1、BoNT/AおよびBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/C1は、シンタキシンを切断する。
【００４９】
破傷風毒素は、C.テタニ(tetani)によって単一血清型で産生される。C.ブチリカム(butyricum)は、BoNT/Eを産生し、C.バラティ(baratii)は、BoNT/Fを産生する。
【００５０】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、TeNTであり得る。参照TeNT配列は、UniProtKB受託番号P04958を有する。
【００５１】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、ボツリヌス神経毒(BoNT)、好ましくは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gからなる群から選択される1つ以上のBoNTであり得る。
【００５２】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Aであり得る。参照BoNT/A配列は、UniProtKB受託番号P10845を有する。
【００５３】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Bであり得る。参照BoNT/B配列は、UniProtKB受託番号P10844を有する。
【００５４】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Cであり得る。参照BoNT/C1配列は、UniProtKB受託番号P18640を有する。
【００５５】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Dであり得る。参照BoNT/D配列は、UniProtKB受託番号P19321を有する。
【００５６】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Eであり得る。参照BoNT/E配列は、UniProtKB受託番号Q00496を有する。
【００５７】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Fであり得る。参照BoNT/F配列は、UniProtKB受託番号YP_001390123を有する。
【００５８】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Gであり得る。参照BoNT/G配列は、UniProtKB受託番号Q60393を有する。
【００５９】
用語「クロストリジウム神経毒」はまた、修飾クロストリジウム神経毒およびその誘導体を包含するものとし、以下に記載されるものを含むがそれに限定されない。修飾クロストリジウム神経毒または誘導体は、クロストリジウム神経毒の天然(非修飾)形態と比較して、修飾されている1個以上のアミノ酸を含有し得る、またはクロストリジウム神経毒の天然(非修飾)形態には存在しない1個以上の挿入されたアミノ酸を含有し得る、またはクロストリジウム神経毒の天然(非修飾)形態と比較して、欠失された1個以上のアミノ酸を有し得る。例として、修飾クロストリジウム神経毒は、天然(非修飾)クロストリジウム神経毒配列に対して、1つ以上のドメイン中に修飾されたアミノ酸配列を有し得る。このような修飾は、神経毒の機能面、例えば、生物活性または持続を修飾し得る。
【００６０】
修飾クロストリジウム神経毒は、WO2015/004461 A1において教示される修飾クロストリジウム神経毒(例えば、陽イオン性BoNT)であり得る。
【００６１】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Aであり得る。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Bであり得る。
【００６３】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Cであり得る。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Dであり得る。
【００６５】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Eであり得る。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Fであり得る。
【００６７】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、陽イオン性BoNT/Gであり得る。
【００６８】
陽イオン性BoNTは、その天然BoNT対応物よりも高い等電点を有するBoNTである。
【００６９】
修飾クロストリジウム神経毒は、重鎖のアミノ酸配列中に1つ以上の修飾を有し得(修飾HCドメインなど)、前記修飾重鎖は、天然(非修飾)クロストリジウム神経毒よりも高いまたは低い親和性で、標的神経細胞と結合する。HCドメイン中のこのような修飾は、標的神経細胞のガングリオシド受容体及び/又はタンパク質受容体との結合を変更する、HCドメインのガングリオシド結合部位中に、またはタンパク質(SV2またはシナプトタグミン)結合部位中に修飾する残基を含み得る。このような修飾クロストリジウム神経毒の例は、WO2006/027207およびWO2006/114308に記載されており、それらの両方ともその全文が参照により本明細書に取り込まれる。
【００７０】
修飾クロストリジウム神経毒は、軽鎖のアミノ酸配列中に1つ以上の修飾、例えば、修飾LCのSNAREタンパク質特異性を変更または修飾し得る基質結合または触媒ドメイン中の修飾を有し得る。このような修飾クロストリジウム神経毒の例は、WO2010/120766およびUS2011/0318385に記載されており、それらの両方ともその全文が参照により本明細書に取り込まれる。
【００７１】
修飾クロストリジウム神経毒は、修飾クロストリジウム神経毒の生物活性及び/又は生物学的持続を増大または低減する1つ以上の修飾を含み得る。例えば、修飾クロストリジウム神経毒は、ロイシン-またはチロシン-ベースのモチーフを含み得て、前記モチーフは、修飾クロストリジウム神経毒の生物活性及び/又は生物学的持続を増大または低減する。適したロイシン-ベースのモチーフとして、xDxxxLL、xExxxLL、xExxxILおよびxExxxLM(式中、xは任意のアミノ酸である)が挙げられる。適したチロシン-ベースのモチーフとして、Y-x-x-Hy(式中、Hyは疎水性アミノ酸である)が挙げられる。ロイシン-およびチロシン-ベースのモチーフを含む修飾クロストリジウム神経毒の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とするWO2002/08268に記載されている。
【００７２】
用語「クロストリジウム神経毒」は、ハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒を包含するものとする。ハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒は、ある種のクロストリジウム神経毒またはそのサブタイプに由来する軽鎖の少なくとも一部および別のクロストリジウム神経毒またはクロストリジウム神経毒サブタイプに由来する重鎖の少なくとも一部を含む。
【００７３】
一実施形態では、ハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒は、ある種のクロストリジウム神経毒サブタイプに由来する軽鎖全体および別のクロストリジウム神経毒サブタイプに由来する重鎖全体を含有し得る。別の実施形態では、キメラクロストリジウム神経毒は、ある種のクロストリジウム神経毒サブタイプの重鎖の一部(例えば、結合ドメイン)を含有し、重鎖の別の部分は、別のクロストリジウム神経毒サブタイプに由来し得る。同様にまたはあるいは、治療要素は、異なるクロストリジウム神経毒に由来する軽鎖部分を含み得る。このようなハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒は、例えば、このようなクロストリジウム神経毒の治療的有用性を、所与のクロストリジウム神経毒サブタイプに対して免疫学的に耐性である患者に、所与のクロストリジウム神経毒重鎖結合ドメインに対する平均より低い濃度の受容体を有し得る患者に、または膜もしくは小胞の毒素基質(例えば、SNAP-25、VAMPおよびシンタキシン)のプロテアーゼ耐性変異体を有する患者に送達する手段として有用である。ハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒は、US8,071,110に、およびGB1607901.4(まだ公開されていない)に記載されており、これらの刊行物は、その全文が参照により本明細書に取り込まれる。したがって、一実施形態では、本発明の方法または使用に従う精製のためのクロストリジウム神経毒は、改変クロストリジウム神経毒であり得て、適宜、改変ハイブリッドクロストリジウム神経毒または改変キメラクロストリジウム神経毒であり得る。
【００７４】
用語「クロストリジウム神経毒」は、再標的化されたクロストリジウム神経毒を包含するものとする。再標的化されたクロストリジウム神経毒では、クロストリジウム神経毒は、ターゲティング部分(TM)として知られる外因性リガンドを含むように修飾される。TMは、所望の標的細胞に対する結合特異性を提供するように選択され、再標的化プロセスの一部として、クロストリジウム神経毒の天然結合部分(例えば、HCドメインまたはHCCドメイン)が除去され得る。再標的化技術は、例えば、EP-B-0689459、WO1994/021300、EP-B-0939818、US6,461,617、US7,192,596、WO1998/007864、EP-B-0826051、US5,989,545、US6,395,513、US6,962,703、WO1996/033273、EP-B-0996468、US7,052,702、WO1999/017806、EP-B-1107794、US6,632,440、WO2000/010598、WO2001/21213、WO2006/059093、WO2000/62814、WO2000/04926、WO1993/15766、WO2000/61192およびWO1999/58571に記載されており、それらのすべては、その全文が参照により本明細書に取り込まれる。したがって、一実施形態では、本発明において使用するための改変クロストリジウム神経毒は、改変された再標的化されたクロストリジウム神経毒であり得る。
【００７５】
本発明はまた、非天然のプロテアーゼ切断部位を有するクロストリジウム神経毒(またはその使用)も包含する。このようなクロストリジウム神経毒では、天然プロテアーゼ切断部位(上記のような活性化部位としても知られる)は、そのクロストリジウム神経毒にとって天然ではないプロテアーゼ切断部位(すなわち、外因性切断部位)を用いて修飾または置換される。このような部位は、切断のための外因性プロテアーゼを必要とし、これが、切断事象のタイミングおよび位置に対する制御の改善を可能にする。クロストリジウム神経毒において使用され得る非天然のプロテアーゼ切断部位として、以下が挙げられる:
エンテロキナーゼ (DDDDK↓)
第Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓)
TEV(タバコエッチウイルス) (ENLYFQ↓G)
トロンビン (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)。
【００７６】
さらなるプロテアーゼ切断部位として、非細胞傷害性プロテアーゼによって、例えば、クロストリジウム神経毒の軽鎖によって切断される認識配列が挙げられる。これらとして、クロストリジウム神経毒の軽鎖などの非細胞傷害性プロテアーゼによって切断されるSNARE(例えば、SNAP-25、シンタキシン、VAMP)タンパク質認識配列が挙げられる。非天然のプロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム神経毒は、US7,132,259、EP1206554-B2およびUS2007/0166332に記載されており、それらのすべてはその全文が参照により本明細書に取り込まれる。また、自己切断配列であるインテインも、プロテアーゼ切断部位という用語によって包含される。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変更することによって制御可能である。
【００７７】
本発明はまた、「破壊性切断部位」を含むクロストリジウム神経毒の使用も包含する。前記クロストリジウム神経毒では、非天然のプロテアーゼ切断部位は、選択された位置でクロストリジウム神経毒中に組み込まれ、その結果、前記部位での切断は、クロストリジウム神経毒の活性を低減するか、または不活性化する。破壊性プロテアーゼ切断部位は、クロストリジウム神経毒が、投与後に、非標的位置に移動する事象において、局所プロテアーゼによる切断に対して感受性であり得る。適した非天然のプロテアーゼ切断部位として、上記のものが挙げられる。破壊性切断部位を含むクロストリジウム神経毒は、WO2010/094905およびWO2002/044199に記載されており、それらの両方ともその全文が参照により本明細書に取り込まれる。
【００７８】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、PEG化され得る-これは、安定性、例えば、軽鎖成分の作用期間を増大するのに役立ち得る。PEG化は、軽鎖が、BoNT/A、BまたはC1プロテアーゼを含む場合に特に好ましい。PEG化は、PEGの、軽鎖成分のN末端への付加を含むことが好ましい。例として、軽鎖のN末端は、同一であっても異なっていてもよい1つ以上のアミノ酸(例えば、システイン)残基を用いて伸長され得る。前記アミノ酸残基のうち1個以上は、それに付着している(例えば、共有結合によって付着している)その自身のPEG分子を有し得る。この技術の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とするWO2007/104567に記載されている。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、天然に存在するクロストリジウム神経毒複合体中に存在する複合体形成タンパク質を含まない場合がある。
【００８０】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも65％もしくは70％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００８１】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００８２】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも85％もしくは90％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００８３】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも95％もしくは99％配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００８４】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも65％もしくは70％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００８５】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００８６】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも85％もしくは90％配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００８７】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００８８】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号3、配列番号13を含む核酸またはそれらと少なくとも65％もしくは70％配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００８９】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号3、配列番号13を含む核酸またはそれらと少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００９０】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号3、配列番号13を含む核酸またはそれらと少なくとも85％もしくは90％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００９１】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号3、配列番号13を含む核酸またはそれらと少なくとも95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる。
【００９２】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号4、配列番号14として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも65％もしくは70％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００９３】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号4、配列番号14として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００９４】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号4、配列番号14として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも85％もしくは90％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００９５】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号4、配列番号14として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００９６】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも65％もしくは70％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【００９７】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【００９８】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも85％もしくは90％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【００９９】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21を含む核酸またはそれらと少なくとも95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸を発現させることによって得ることができる陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【０１００】
別の実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも65％もしくは70％の配列同一性を有する核酸を含む陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【０１０１】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有する核酸を含む陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【０１０２】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも85％もしくは90％の配列同一性を有する核酸を含む陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【０１０３】
本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、適宜、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22として示されるポリペプチド配列またはそれらと少なくとも95％もしくは99％の配列同一性を有する核酸を含む陽イオン性クロストリジウム神経毒であり得る。
【０１０４】
2種以上の核酸またはアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、配列によって共有される同一位置の数の関数である。したがって、同一性％は、ヌクレオチド/アミノ酸の総数によって除され、100が乗じられた、同一ヌクレオチド/アミノ酸の数として算出され得る。配列同一性％の算出はまた、2種以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さも考慮し得る。2種以上の配列間の配列比較および同一性パーセントの決定を、当業者によく知られるBLASTなどの特定の数学的アルゴリズムを使用して実施できる。
【０１０５】
用語「クロストリジウム神経毒を含む組成物」とは、任意の調製状態の任意のこのような組成物を指す。
【０１０６】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒を含む組成物は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得る。クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、少なくとも約pH7.4またはpH7.5であるpH値を有し得る。
【０１０７】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、少なくとも約pH7.6または少なくとも約pH7.7であるpH値を有し得る。
【０１０８】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、少なくとも約pH7.8または少なくとも約pH7.9であるpH値を有し得る。
【０１０９】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、少なくとも約pH8.0であるpH値を有し得る。
【０１１０】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒を含む組成物は、約pH7.3から約pH9.5の間のpHを有し得る。クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、約pH7.5から約pH9.0の間または約pH7.5から約pH8.5の間のpHを有し得る。
【０１１１】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、約pH7.5のpH値を有し得る。
【０１１２】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、約pH8.0のpH値を有し得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、クロストリジウム神経毒を含む組成物は、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点の-1pH単位である、またはそれより高いpH値を有し得る。
【０１１４】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点の-0.5pH単位である、またはそれより高いpH値を有し得る。
【０１１５】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、少なくともそれに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点であるpH値を有し得る。
【０１１６】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点を少なくとも約0.2pI単位または少なくとも約0.5pH単位超えるpH値を有し得る。
【０１１７】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒を含む組成物は、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点より約-1pH単位低いpH値から、算出された等電点を約2pH単位超えるpH値の間であるpH値を有し得る。
【０１１８】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点より約-0.5pH単位低いpH値から、算出された等電点を約1.5pH単位超えるpH値の間であるpH値を有し得る。
【０１１９】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、およそそれに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点であるpH値から、算出された等電点を約2pH単位超えるpH値の間であるpH値を有し得る。
【０１２０】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、適宜、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点を約0.2pH超えるpH値から、算出された等電点を約1.5pH単位超えるpH値の間であるpH値を有し得る。
【０１２１】
クロストリジウム神経毒を含む組成物は、好ましくは、それに含まれるクロストリジウム神経毒の算出された等電点を約0.5pH超えるpH値から、算出された等電点を約1.5pH単位超えるpH値の間であるpH値を有し得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、「クロストリジウム神経毒を含む組成物」は、細胞不含抽出物及び/又は細胞可溶化液であり得る。用語「細胞不含抽出物」とは、抽出物が、抽出物の総容量あたり約5％未満の細胞、より好ましくは、約1％または0.1％未満の細胞を含むことを意味する。
【０１２３】
細胞不含抽出物及び/又は細胞可溶化液は、クロストリジウム神経毒をコードするヌクレオチド配列、例えば、本明細書におけるヌクレオチド配列のうち1つ以上を発現する宿主細胞から得ることができる。一実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞であり得る。
【０１２４】
細胞可溶化液は、細胞ペーストの溶解後に得ることができる。細胞ペーストは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して溶解され得る。例えば、細胞可溶化液は、適宜、少なくとも1つのヌクレアーゼ(例えば、Sigma-Aldrichから市販されるBenzonase(登録商標))の存在下で音波処理を使用して達成され得る。
【０１２５】
細胞可溶化液の調製後に、前記細胞可溶化液は、緩衝液交換され得る。これは、当業者に公知の任意の適した方法論を使用して実施され得る。例えば、これは、脱塩カラムまたは適当な透析膜および緩衝液を用いる透析を使用して実施され得る。適した脱塩カラムの例として、Econo-Pac 10DG脱塩カラム(Bio-Radから市販されている)を挙げることができる。
【０１２６】
その他の実施形態では、「クロストリジウム神経毒を含む組成物」は、1以上の事前精製ステップ(すなわち、組成物を得ることに先立って実施される精製ステップ)から得ることができる(例えば、得られた)組成物であり得る。事前精製ステップは、当技術分野で公知の任意の精製ステップ、好ましくは、クロストリジウム神経毒を精製するために適していると知られる精製ステップであり得る。事前精製ステップは、クロマトグラフィー精製ステップ、沈殿ベースの精製ステップ(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)および結晶化精製ステップからなる群から選択される1つ以上であり得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明に従う方法及び/又は使用は、陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させる第1の精製ステップ(例えば、第1のクロマトグラフィーステップ)を含み得る。
【０１２８】
その他の実施形態では、方法及び/又は使用は、1つ以上の精製ステップを含み得る。1つ以上の精製ステップは、陽イオン交換残基を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させる前または後に実施され得る。1以上の精製ステップは、適宜、陽イオン交換残基を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させた後に実施され得る。
【０１２９】
1つ以上の精製ステップは、クロマトグラフィー精製ステップおよび沈殿ベースの精製ステップ(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)からなる群から選択され得る。
【０１３０】
用語「クロマトグラフィー精製ステップ」とは、本明細書において、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換または陰イオン交換クロマトグラフィー)、混合モードクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーからなる群から選択される1つ以上を指し得る。
【０１３１】
一実施形態では、クロマトグラフィー精製ステップは、混合モードクロマトグラフィーの使用、適宜、ヒドロキシアパタイト樹脂の使用を含み得る。ヒドロキシアパタイト樹脂は、適宜、ヒドロキシアパタイトI及び/又はヒドロキシアパタイトII樹脂であり得る。このような樹脂は、市販されている(例えば、GE Healthcare、UKから)。
【０１３２】
別の実施形態では、クロマトグラフィー精製ステップは、陽イオン交換クロマトグラフィーであり得る。陽イオン交換クロマトグラフィーは、強陽イオン交換樹脂及び/又は弱陽イオン交換樹脂の使用を含み得る。
【０１３３】
強陽イオン交換樹脂は、適宜、スルホン酸を含む樹脂であり得る。
【０１３４】
弱陽イオン交換樹脂は、適宜、カルボキシメチルを含む樹脂であり得る。
【０１３５】
別の実施形態では、クロマトグラフィー精製ステップは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。陰イオン交換クロマトグラフィーは、強陰イオン交換樹脂及び/又は弱陰イオン交換樹脂の使用を含み得る。
【０１３６】
強陰イオン交換樹脂の例として、四級アンモニウムを含むもの、例えば、Mustang(登録商標)Q、Q Ceramic HyperD(登録商標)F、Acrodisc(登録商標)・Mustang Q、AcroPrepTM・Mustang Q、AcroSep(商標)・Q Ceramic HyperD(登録商標)F、QおよびS HyperCel及び/又はHyperCel STAR AX(それらのすべては、Pall Corporation、25 Harbor Park Drive、Port Washington、NY11050、USAから市販されている)が挙げられる。
【０１３７】
弱陰イオン交換樹脂の例として、カルボキシメチルを含むもの、例えば、CM Ceramic HyperD(登録商標)F、AcroSep・CM Ceramic及び/又はHyperD(登録商標)F(それらのすべては、Pall Corporation、25 Harbor Park Drive、Port Washington、NY11050、USAから市販されている)が挙げられる。
【０１３８】
クロマトグラフィー精製ステップがゲルろ過ステップである実施形態では、樹脂は、Superdex200樹脂(GE Healthcare UKから市販されている)であることが適している。
【０１３９】
クロマトグラフィー精製ステップが疎水性相互作用ステップである実施形態では、適宜、樹脂は、フェニルFF樹脂、オクチルFF樹脂及び/又はブチルFF樹脂(GE Healthcare UKから市販されている)であり得る。
【０１４０】
クロマトグラフィー精製ステップがアフィニティークロマトグラフィーステップである実施形態では、適宜、グルタチオン樹脂、ストレプトアビジン樹脂、ビオチン樹脂、キレート化金属樹脂、デキストリンセファロース樹脂およびIgG樹脂(GE Healthcare UKから市販されている)から選択され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー精製ステップは、抗体アフィニティークロマトグラフィーステップであり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、ボツリヌス神経毒を単鎖形態から二鎖形態に変換するステップ(活性化ステップ)を含み得る。クロストリジウム神経毒を活性化することは、クロストリジウム神経毒を陽イオン交換樹脂と接触させた後に実施されることが適している。より好ましくは、活性化ステップは、クロストリジウム神経毒が、陽イオン交換樹脂から分離された後に実施され得る。
【０１４３】
クロストリジウム神経毒は、適したプロテアーゼが、クロストリジウム神経毒のポリペプチド配列を切断し得る条件下で、クロストリジウム神経毒を、適したプロテアーゼと接触させること(随意により、インキュベートすること)によって活性化され得る。
【０１４４】
一実施形態では、適したプロテアーゼは、クロストリジウム神経毒ポリペプチド配列を、それが活性化されるように切断することが可能なエンドプロテアーゼであり得る。
【０１４５】
一実施形態では、本発明に従って使用するためのエンドプロテアーゼは、Lys-Cプロテアーゼであり得る。適したLys-Cプロテアーゼは、両方とも参照により本明細書に取り込まれるWO2014/079495及び/又はWO2014/080206において教示されるものであり得る。
【０１４６】
Lys-Cプロテアーゼは、任意の適した供給源から得ることができる、またLife Technologies Ltd、UKから市販されている。
【０１４７】
より好ましい実施形態では、本発明の方法及び/又は使用は、あるいは及び/又はさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含み得る。
【０１４８】
したがって、好ましい実施形態では、Lys-Cおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するクロストリジウム神経毒の活性化をさらに含む(またはさらにからなる)本発明の方法及び/又は使用を提供する。
【０１４９】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、好ましくは、ブチルセファロース樹脂、フェニルセファロース樹脂およびオクチルセファロース樹脂からなる群から選択される1つ以上の使用を含み得る。
【０１５０】
本発明は、陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることを含む。
【０１５１】
用語「接触させること」は、陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させる工程を指す場合には、陽イオン交換樹脂のクロストリジウム神経毒との会合を促進するための任意の公知の方法を包含するものとする。例えば、接触工程は、適した条件下で、陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物とともに適した時間インキュベートすることによって実施され得る。適したインキュベーション条件は、タンパク質安定性を増強するため、及び/又は活性の維持のために選択される、撹拌の存在または適当な温度を含み得る。
【０１５２】
一実施形態では、接触工程は、クロストリジウム神経毒を含む組成物を、陽イオン交換樹脂を含むカラムに適用することによって実施され得る。接触は、適宜、自動または半自動プロセスを使用することによって、例えば、自動化液体クロマトグラフィー(例えば、高速タンパク質液体クロマトグラフィー)のために設計されたシステムを使用することによって実施され得る。
【０１５３】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒を含む組成物は、陽イオン交換樹脂と混合され得る。前記混合は、適宜、結合を促進するために適当な温度及び/又は時間でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、混合物は、撹拌されてもよい。その他の実施形態では、精製カラムが、混合物から調製され、従来の液体クロマトグラフィー技術(例えば、洗浄及び/又は溶出を含む)に付され得る。
【０１５４】
一実施形態では、「会合(association)」は、適宜、電荷ベースの相互作用または会合であり得る。「会合」は、適宜、1つ以上の洗浄緩衝液に対してクロストリジウム神経毒と会合された陽イオン交換樹脂を曝露することに抵抗可能な相互作用であり得る。用語「洗浄緩衝液」とは、不要な混入物タンパク質(適宜、クロストリジウム神経毒ではないタンパク質)の、陽イオン交換樹脂との結合の破壊において使用するための当業者によって調製される1つ以上の緩衝液を指す。通常、洗浄緩衝液は、クロストリジウム神経毒の、陽イオン交換樹脂との結合を大幅に破壊することなく、不要な混入物タンパク質(適宜、クロストリジウム神経毒ではないタンパク質)の、陽イオン交換樹脂との結合を破壊するために十分にストリンジェントであるように調製され得る。
【０１５５】
本発明において、少なくとも約pH7.3のpHを有する緩衝液が使用され得る。本発明において、少なくとも約pH7.5のpHを有する緩衝液が使用されることが適している。
【０１５６】
妥当なpHの溶液は、当業者に公知であり、任意の適した緩衝剤を用いて調製することができる。一実施形態では、緩衝液は、Bis-Tris(プロパン)、Bis-Tris(メタン)、Tris、HEPESまたはクエン酸リン酸を含み得る。緩衝液は、適宜、Bis-Tris(プロパン)を含み得る。当業者は任意の適したモル濃度の緩衝液を選択することができる。モル濃度は、適宜、約50mMであり得る。
【０１５７】
一実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、少なくとも約pH7.3(適宜、少なくとも約pH7.4またはpH7.5)であるpH値を有し得る。
【０１５８】
本発明において使用するための緩衝液は、適宜、少なくとも約pH7.6または少なくとも約pH7.7であるpH値を有し得る。
【０１５９】
本発明において使用するための緩衝液は、適宜、少なくとも約pH7.8または少なくとも約pH7.9であるpH値を有し得る。
【０１６０】
本発明において使用するための緩衝液は、適宜、少なくとも約pH8.0であるpH値を有し得る。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、約pH7.3から約pH9.5の間のpHを有し得る。本発明において使用するための緩衝液は、適宜、約pH7.5から約pH9.0の間または約pH7.5から約pH8.5の間のpHを有し得る。
【０１６２】
本発明において使用するための緩衝液は、適宜、約pH7.5のpH値を有し得る。
【０１６３】
本発明において使用するための緩衝液は、適宜、約pH8.0のpH値を有し得る。
【０１６４】
本発明の使用は、クロストリジウム神経毒(例えば、前記使用の対象であるクロストリジウム神経毒)の算出された等電点の-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有する緩衝液の使用を含む。
【０１６５】
言及されるpH値は、陽イオン交換樹脂がクロストリジウム神経毒を含む組成物と接触される場合に測定されるpH値、例えば、陽イオン交換体およびクロストリジウム神経毒を含む組成物の混合物を含む溶液のpH値であり得る。
【０１６６】
本発明はまた、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位またはそれより高いpH値を有する緩衝液の使用を含み得る。
【０１６７】
妥当なpHの溶液は、当業者に公知であり、任意の適した緩衝剤を用いて調製することができる。一実施形態では、緩衝液は、Bis-Tris(プロパン)、Bis-Tris(メタン)、Tris、HEPESまたはクエン酸リン酸を含み得る。緩衝液は、適宜、Bis-Tris(プロパン)を含み得る。当業者は任意の適したモル濃度の緩衝液を選択することができる。モル濃度は、適宜、約50mMであり得る。
【０１６８】
本発明において使用するためのpH値は、適宜、クロストリジウム神経毒の算出された等電点の-0.5pH単位であるか、またはそれより高いpH値であり得る。
【０１６９】
一実施形態では、本発明において使用するためのpH値は、少なくともクロストリジウム神経毒の算出された等電点であり得る。
【０１７０】
pH値は、適宜、クロストリジウム神経毒の算出された等電点を少なくとも約0.2pI単位または少なくとも約0.5pH単位超えるものであり得る。
【０１７１】
一実施形態では、pH値は、クロストリジウム神経毒の算出された等電点を約-1pH単位下回るものから、算出された等電点を約2pH単位上回るものの間であり得る。
【０１７２】
pH値は、適宜、クロストリジウム神経毒の算出された等電点を約-0.5pH単位下回るものから、算出された等電点を約1.5pH単位上回るものの間であり得る。
【０１７３】
pH値は、適宜、ほぼクロストリジウム神経毒の算出された等電点から、算出された等電点を約2pH単位上回るものの間であり得る。
【０１７４】
pH値は、適宜、クロストリジウム神経毒の算出された等電点を約0.2pH単位上回るものから、算出された等電点を約1.5pH単位上回るものの間であり得る。
【０１７５】
pH値は、好ましくは、クロストリジウム神経毒の算出された等電点を約0.5pH単位上回るものから、算出された等電点を約1.5pH単位上回るものの間であり得る。
【０１７６】
一実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、少なくとも約pH5.0、適宜、少なくとも約pH6.0のpH値を有し得る。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、少なくとも約pH6.5、少なくとも約pH7.0または少なくとも約pH7.5のpH値を有し得る。
【０１７８】
本発明において使用するための緩衝液は、好ましくは、少なくとも約pH8.0のpH値を有し得る。
【０１７９】
一実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、約pH5.0から約pH9.5の間、適宜、約pH6.0から約pH9.5の間のpH値を有し得る。
【０１８０】
本発明において使用するための緩衝液は、適宜、約pH5.0から約pH9.0の間、適宜、約pH6.0から約pH9.0の間のpH値を有し得る。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、約pH6.5から約pH8.5の間、適宜、約pH7.0から約pH8.0の間のpH値を有し得る。
【０１８２】
一実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、約pH6.0、適宜、約pH6.5または約pH7.0のpH値を有し得る。
【０１８３】
別の実施形態では、本発明において使用するための緩衝液は、約pH7.5のpH値を有し得る。
【０１８４】
本発明において使用するための緩衝液は、好ましくは、約pH8.0のpH値を有し得る。
【０１８５】
等電点(pI)は、所与のタンパク質の特定の特性である。当技術分野では周知であるように、タンパク質は、アミノ酸(タンパク質中で、アミノ酸残基とも呼ばれる)の特定の配列から作られている。20種の標準セットの各アミノ酸は、異なる側鎖(またはR基)を有し、タンパク質中の各アミノ酸残基は、電荷および疎水性などの異なる化学特性を示すことを意味する。これらの特性は、温度およびpHなどの周囲の化学環境によって影響を受け得る。タンパク質の全体的な化学的特徴は、これらの種々の因子の合計に応じて変わる。
【０１８６】
特定のアミノ酸残基(以下に詳述される)は、周囲のpHに応じて電荷を提示し得るイオン化できる側鎖を有する。このような側鎖が、所与のpHで帯電されるか否かは、関係するイオン化できる部分のpKaに応じて変わり、pKaは、コンジュゲート塩基に由来する特定の水素イオンの酸解離定数(Ka)の負の対数である。
【０１８７】
例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基は、側鎖カルボン酸基を有し、およそ4.1のpKa値を有する(正確なpKa値は、温度、イオン化できる基のイオン強度および微小環境に応じて変わり得る)。したがって、これらの側鎖は、7.4のpH(「生理学的pH」と呼ばれることが多い)で負電荷を示す。低pH値では、これらの側鎖は、プロトン化されるようになり、その電荷を失う。
【０１８８】
逆に、リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基は、窒素含有側鎖基を有し、およそ10〜12のpKa値を有する。したがって、これらの側鎖は、7.4のpHで正電荷を示す。高pH値では、これらの側鎖は、脱プロトン化されるようになり、その電荷を失う。
【０１８９】
したがって、タンパク質分子の全体的な(正味の)電荷は、タンパク質中に存在する酸性および塩基性残基の数(およびその表面露出度)に応じて、および周囲のpHに応じて変わる。周囲のpHを変更することは、タンパク質上の全体的な電荷を変更する。したがって、すべてのタンパク質について、正および負の電荷の数が等しく、タンパク質が、全体的な正味電荷を示さない所与のpHがある。この点は、等電点(pI)として知られている。等電点は、当業者が精通するタンパク質生化学における標準的な概念である。
【０１９０】
したがって、等電点(pI)は、タンパク質が、ゼロの正味電荷を示すpH値として定義される。pIの増大は、タンパク質がゼロの正味電荷を示すために、より高いpH値が必要であることを意味する。したがって、pIの増大は、所与のpHでのタンパク質の正味の正電荷の増大を表す。逆に、pIの減少は、タンパク質がゼロの正味電荷を示すために、より低いpH値が必要であることを意味する。したがって、pIの減少は、所与のpHでのタンパク質の正味の正電荷の減少を表す。
【０１９１】
タンパク質のpIを決定する方法は、当技術分野で公知であり、当業者にはよく知られている。例として、タンパク質のpIは、タンパク質中に存在する各アミノ酸の平均pKa値から算出できる(「算出されたpI」)。このような算出は、当技術分野で公知のコンピュータプログラムを使用して実施できる:pI値を算出するための好ましい例としてのコンピュータプログラムとして、Scripps Research Institute製のProtein CalculatorおよびExPASy製のCompute pI/MW Toolが挙げられる。異なる分子間のpI値の比較は、同一算出技術/プログラムを使用して行わなくてはならない。
【０１９２】
特に好ましい実施形態では、「算出されたpI」は、www.scripps.edu/~cdputnam/protcalcで入手可能なオンラインルーツである(その内容は参照により本明細書に取り込まれる)、Scripps Protein Calculator v3.4を使用して算出されたpIを指し得る。
【０１９３】
必要に応じて、タンパク質の算出されたpIは、等電点電気泳動の技術を使用して実験によって確認できる(「観察されたpI」)。この技術は、電気泳動を使用して、タンパク質をそのpIに従って分離する。等電点電気泳動は、通常、固定化されたpH勾配を有するゲルを使用して実施される。電場が印加されると、タンパク質は、ゼロの正味電荷を有するpHに到達するまで、pH勾配によって移動し、この点は、タンパク質のpIである。等電点電気泳動によって提供される結果は、通常、実際は比較的低分解能であり、従って、本発明者らは、算出されたpI(上記のような)によって提供される結果が使用するのにより適当であると考える。
【０１９４】
本明細書を通じて、「pI」は、別に記載されない限り「算出されたpI」を意味する。
【０１９５】
タンパク質のpIは、その表面上に呈される塩基性及び/又は酸性の基の数を変更することによって増大または減少させることができる。これは、タンパク質の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって達成できる。例えば、pIの増大は、酸性残基の数を減少させることによって、または塩基性残基の数を増大することによって提供することができる。このようなアミノ酸修飾を以下により詳細に論じる。
【０１９６】
例として、BoNT/A(配列番号14)の算出されたpIは、6.4である。WO2015/004461において教示される陽イオン性BoNT:Cat-A、Cat-BおよびCat-Cの、ならびにCat HN_v1、Cat HN_v2およびCat HN_v3の算出されたpIもまた、提供される。
【０１９７】
本発明において使用するためのpHの決定は、精製されているクロストリジウム毒素のpIを参照して達成される。例えば、精製の対象が、7.4の算出されたpIを有する陽イオン性rBoNT/A(配列番号2)である場合には、本発明において使用するためのpH値は、pH6.4以上である。同様に、7.3のpIを有する「Cat-A」(配列番号16)の場合には、本発明において使用するためのpH値は、約pH6.3以上である。
【０１９８】
【表１】
2018537412.tif 000002
【０１９９】
タンパク質中に見られる20種の標準アミノ酸は、表2に示されるとおりである。
【０２００】
【表２】
2018537412.tif 000003
【０２０１】
以下のアミノ酸は、荷電アミノ酸と考えられる:アスパラギン酸(負)、グルタミン酸(負)、アルギニン(正)およびリジン(正)。
【０２０２】
7.4のpHで、アスパラギン酸(pKa 3.1)およびグルタミン酸(pKa 4.1)の側鎖は、負電荷を有し、アルギニン(pKa 12.5)およびリジン(pKa 10.8)の側鎖は、正電荷を有する。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性アミノ酸残基と呼ばれる。アルギニンおよびリジンは、塩基性アミノ酸残基と呼ばれる。
【０２０３】
以下のアミノ酸は、非荷電、極性(水素結合において沈殿し得ることを意味する)アミノ酸と考えられる:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニンおよびトリプトファン。
【０２０４】
以下のアミノ酸は、非荷電、疎水性アミノ酸と考えられる:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリンおよびグリシン。
【０２０５】
本発明の方法及び/又は使用は、適宜、クロストリジウム神経毒の結合及び/又は収率の増大をもたらす。「結合及び/又は収率の増大」は、適宜、本発明の方法及び/又は使用を使用して得られた結合及び/又は収率の、本発明のものとは異なるpH値を利用するが、その他の点では同一である同様の方法及び/又は使用との比較によって調べることができる。
【０２０６】
本明細書においてこれに関連して使用される用語「結合」は、クロストリジウム神経毒の、陽イオン交換樹脂との会合を指す。結合されたクロストリジウム神経毒の濃度は、陽イオン交換樹脂との接触の前の出発組成物中のクロストリジウム神経毒の濃度および陽イオン交換樹脂と接触されていた溶液中に残存するクロストリジウム神経毒の濃度(あるとすれば)と比較することによって調べることができる。いくつかの実施形態では、出発組成物中のクロストリジウム神経毒の濃度は、陽イオン交換樹脂と会合しない組成物中のタンパク質に相当するフロースルー画分中のクロストリジウム神経毒の濃度と比較することができる。
【０２０７】
本発明の方法及び/又は使用は、組成物中に含まれる総クロストリジウム神経毒の少なくとも約50％の結合を達成できる。方法及び/又は使用は、適宜、組成物中に含まれる総クロストリジウム神経毒の少なくとも約60％または70％の結合を達成できる。
【０２０８】
方法及び/又は使用は、適宜、組成物中に含まれる総クロストリジウム神経毒の少なくとも約80％または90％の結合、好ましくは、少なくとも約95％、97％または99％の結合を達成できる。
【０２０９】
用語「収率」とは、本明細書において、本発明の方法及び/又は使用を実施した後に得られるクロストリジウム神経毒の量(例えば、濃度)を指す。いくつかの実施形態では、「収率」は、出発組成物中のクロストリジウム神経毒の量(例えば、濃度)を、陽イオン交換樹脂から溶出された画分中に存在するクロストリジウム神経毒の量(例えば、濃度)と比較することによって算出できる。
【０２１０】
本発明の方法及び/又は使用は、陽イオン交換残基からクロストリジウム神経毒を分離することをさらに含み得る。これは、本明細書においては、「溶出」と呼ばれ得る。分離は、適当な溶出緩衝液の使用によって達成できる。通常、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー)のためには、イオン交換樹脂(例えば、陽イオン交換樹脂)から結合されたタンパク質を置換する適当な濃度の適当な塩を含む緩衝液が設計される。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換樹脂と会合されたクロストリジウム神経毒は、溶出緩衝液に対して曝露され得る。適宜、陽イオン交換樹脂から任意の溶液が分離され得る。例えば、カラムを使用する場合には、1つ以上の画分を集めることができる。
【０２１２】
したがって、一実施形態では、溶出緩衝液中に含まれるクロストリジウム神経毒を提供する。
【０２１３】
別の実施形態では、溶出緩衝液中に含まれる精製中間体を提供する。
【０２１４】
なおさらなる実施形態では、溶出緩衝液中に含まれる本発明の方法及び/又は使用によって得ることができるクロストリジウム神経毒を提供する。
【０２１５】
一実施形態では、溶出緩衝液の勾配濃度が、クロストリジウム神経毒と会合された陽イオン交換樹脂に適用され得る。勾配は、所望の塩濃度(例えば、陽イオン交換樹脂からクロストリジウム神経毒が溶出する濃度よりも高い塩濃度)を有する溶出緩衝液を、異なる(例えば、より低い)塩濃度を有する1つ以上のさらなる緩衝液と混合することによって調製することができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換樹脂から分離されるクロストリジウム神経毒は、実質的に純粋な状態であり得る。
【０２１７】
用語「純粋な状態」とは、本明細書において、クロストリジウム神経毒が、クロストリジウム神経毒でない混入物(例えば、タンパク質混入物)を含まない状態を指すものとする。
【０２１８】
用語「実質的に純粋な」とは、本明細書において、所与の組成物において、クロストリジウム神経毒は、クロストリジウム神経毒でない混入物(例えば、タンパク質混入物)をほとんど含まず、総タンパク質濃度の少なくとも約85％、90％または95％を占めることを意味する。クロストリジウム神経毒は、適宜、総タンパク質濃度の少なくとも約97％、99％または99.9％を占める場合もある。
【０２１９】
したがって、本発明は、本発明の方法または使用によって得ることができる(例えば、得られる)クロストリジウム神経毒を提供する。クロストリジウム神経毒は、適宜、実質的に純粋なクロストリジウム神経毒であり得る。
【０２２０】
一実施形態では、本発明は、陽イオン交換樹脂と会合されたクロストリジウム神経毒を含む精製中間体を提供し、精製中間体は、少なくともpH7.3のpH値を有する。
【０２２１】
別の実施形態では、本発明は、陽イオン交換樹脂から分離されているクロストリジウム神経毒を含む精製中間体を提供し、精製中間体は、少なくともpH7.3のpH値を有する。
【０２２２】
一実施形態では、精製中間体は、少なくとも約pH7.3(適宜、少なくともpH7.4またはpH7.5)であるpH値を有し得る。
【０２２３】
精製中間体は、適宜、少なくとも約pH7.6または少なくとも約pH7.7であるpH値を有し得る。
【０２２４】
精製中間体は、適宜、少なくとも約pH7.8または少なくとも約pH7.9であるpH値を有し得る。
【０２２５】
精製中間体は、適宜、少なくとも約pH8.0であるpH値を有し得る。
【０２２６】
別の実施形態では、精製中間体は、約pH7.5から約pH9.5の間のpHを有し得る。精製中間体は、適宜、約pH7.5から約pH9.0の間または約pH7.5から約pH8.5の間のpHを有し得る。
【０２２７】
精製中間体は、適宜、約pH7.5のpH値を有し得る。
【０２２８】
精製中間体は、適宜、約pH8.0のpH値を有し得る。
【０２２９】
用語「精製中間体」とは、本明細書において、少なくとも1つの精製ステップに付された、または付されている途中であるが、当業者によって意図される精製ステップのすべてに付されていないクロストリジウム神経毒を指すものとする。いくつかの実施形態では、精製中間体は、実質的に純粋な状態であり得る。
【０２３０】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、本発明の精製中間体から得ることができる(例えば、得られる)ものであり得る。クロストリジウム神経毒は、適宜、実質的に純粋な状態であり得る。
【０２３１】
本発明の精製中間体及び/又はクロストリジウム神経毒は、代替法によって得ることができる精製中間体及び/又はクロストリジウム神経毒と、少なくとも、前記精製中間体及び/又はクロストリジウム神経毒が含まれる緩衝液のpH値によって区別することができる。
【０２３２】
言い換えれば、本発明の精製中間体及び/又はクロストリジウム神経毒が含まれる緩衝液は、少なくとも約pH7.3のpH値を有し得る。緩衝液は、少なくともpH7.3であるpH値を有し得て、陽イオン交換溶出緩衝液と一致する塩濃度をさらに含むことが適している。
【０２３３】
溶出緩衝液は、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2および(NH4)2SO4のうち1つ以上を含み得る。
【０２３４】
一実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約50mM NaClまたは少なくとも約100mM NaClを含み得る。
【０２３５】
別の実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約200mM NaClまたは少なくとも約300mM NaCl(適宜、少なくとも約400mM NaClまたは少なくとも約500mM NaCl)を含み得る。
【０２３６】
一実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約50mM KClまたは少なくとも約100mM KClを含み得る。
【０２３７】
別の実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約200mM KClまたは少なくとも約300mM KCl(適宜、少なくとも約400mM KClまたは少なくとも約500mM KCl)を含み得る。
【０２３８】
一実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約50mM CaCl2または少なくとも約100mM CaCl2を含み得る。
【０２３９】
別の実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約200mM CaCl2または少なくとも約300mM CaCl2(適宜、少なくとも約400mM CaCl2または少なくとも約500mM CaCl2)を含み得る。
【０２４０】
一実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約50mM MgCl2または少なくとも約100mM MgCl2を含み得る。
【０２４１】
別の実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約200mM MgCl2または少なくとも約300mM MgCl2(適宜、少なくとも約400mM MgCl2または少なくとも約500mM MgCl2)を含み得る。
【０２４２】
一実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約50mM (NH4)2SO4または少なくとも約100mM (NH4)2SO4を含み得る。
【０２４３】
別の実施形態では、このような緩衝液は、少なくとも約pH7.3であるpH値を有し得て、少なくとも約200mM (NH4)2SO4または少なくとも約300mM (NH4)2SO4(適宜、少なくとも約400mM (NH4)2SO4または少なくとも約500mM (NH4)2SO4)を含み得る。
【０２４４】
本発明において使用するための緩衝液は、好ましくは、50mM Bis-TrisプロパンpH8.0をさらに含み得る。
【０２４５】
本発明に従い陽イオン交換残基から溶出する場合には、50mM Bis-TrisプロパンpH8.0を含む緩衝液を約0から約500mMの塩の溶出勾配と組み合わせて使用することができる。塩は、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2および(NH4)2SO4)からなる群から選択され得ることが適している(好ましくは、NaCl)。
【０２４６】
本発明の使用において使用するためのクロストリジウム神経毒の算出されたpIの-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有する緩衝液は、溶出緩衝液であり得る。溶出緩衝液は、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2および(NH4)2SO4のうち1つ以上を含み得る。
【０２４７】
一実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約50mM NaClまたは少なくとも約100mM NaClを含み得る。
【０２４８】
別の実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約200mM NaClまたは少なくとも約300mM NaCl(適宜、少なくとも約400mM NaClまたは少なくとも約500mM NaCl)を含み得る。
【０２４９】
一実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約50mM KClまたは少なくとも約100mM KClを含み得る。
【０２５０】
別の実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約200mM KClまたは少なくとも約300mM KCl(適宜、少なくとも約400mM KClまたは少なくとも約500mM KCl)を含み得る。
【０２５１】
一実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約50mM CaCl2または少なくとも約100mM CaCl2を含み得る。
【０２５２】
別の実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約200mM CaCl2または少なくとも約300mM CaCl2(適宜、少なくとも約400mM CaCl2または少なくとも約500mM CaCl2)を含み得る。
【０２５３】
一実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれより高いpH値を有し得て、少なくとも約50mM MgCl2または少なくとも約100mM MgCl2を含み得る。
【０２５４】
別の実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれよりも高いpH値を有し得て、少なくとも約200mM MgCl2または少なくとも約300mM MgCl2(適宜、少なくとも約400mM MgCl2または少なくとも約500mM MgCl2)を含み得る。
【０２５５】
一実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれよりも高いpH値を有し得て、少なくとも約50mM (NH4)2SO4または少なくとも約100mM (NH4)2SO4を含み得る。
【０２５６】
別の実施形態では、このような緩衝液は、クロストリジウム神経毒の算出されたpIの少なくとも-1pH単位であるか、またはそれよりも高いpH値を有し得て、少なくとも約200mM (NH4)2SO4または少なくとも約300mM (NH4)2SO4(適宜、少なくとも約400mM (NH4)2SO4または少なくとも約500mM (NH4)2SO4)を含み得る。
【０２５７】
本発明において使用するための緩衝液は、好ましくは、50mM Bis-TrisプロパンpH8.0をさらに含み得る。
【０２５８】
本発明に従う陽イオン交換残基から溶出する場合には、50mM Bis-TrisプロパンpH8.0を含む緩衝液を、約0から約500mMの塩の溶出勾配と組み合わせて使用することができる。塩は、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2および(NH4)2SO4からなる群から選択され得ることが適している(好ましくは、NaCl)。
【０２５９】
配列相同性
【０２６０】
制限するものではないが、グローバル法、ローカル法およびハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法などを含む種々の配列アラインメント法のいずれを使用しても、同一性パーセントを調べることができる。同一性パーセントを調べるプロトコールは、当業者の範囲内の常法である。グローバル法は、分子の最初から最後まで配列をアラインし、個々の残基対のスコアを合計することによって、またギャップペナルティーを課すことによって最良のアラインメントを調べる。限定されない方法として、例えば、CLUSTAL W(例えば、Julie D. Thompsonら、CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice、第22巻(22号)Nucleic Acids Research 4673-4680頁(1994年)を参照のこと);および反復性精密化(例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments、第264巻(4号)J.MoI.Biol.823-838頁(1996年)を参照のこと)、が挙げられる。ローカル法は、インプット配列のすべてによって共有される1つ以上の保存されたモチーフを同定することによって配列をアラインする。限定されない方法として、例えば、Match-box(例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans、Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences、第8巻(5号)CABIOS501-509頁(1992年)を参照のこと);Gibbs sampling(例えば、C. E. Lawrenceら、Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment、第262巻(5131号) Science 208-214頁(1993年)を参照のこと);Align-M(例えば、Ivo Van WaIIeら、Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences、第20巻(9号) Bioinfomatics: 1428-1435頁(2004年)を参照のこと)、が挙げられる。
【０２６１】
したがって、配列同一性パーセントは、従来法によって決定される。例えば、Altschulら、Bull. Math. Bio. 第48巻:603-16頁、1986年およびHenikoff and Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA第89巻:10915-19頁、1992年を参照のこと。手短には、2種のアミノ酸配列を、以下に示されるような、10のギャップオープニングペナルティー、1のギャップ伸長ペナルティーおよびHenikoff and Henikoff (同書)の「blosum 62」スコアリングマトリックスを使用してアラインメントスコアを最適化するようにアラインする(アミノ酸は、標準的な1文字コードによって示される)。
【０２６２】
【表Ａ】
2018537412.tif 000004
【０２６３】
次いで、同一性パーセントを、以下として算出する:
【数１】
2018537412.tif 000005
【０２６４】
実質的に、相同ポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有すると特性決定される。これらの変化は、保存的アミノ酸置換(以下を参照のこと)およびポリペプチドのフォールディングまたは活性に大幅に影響を及ぼさないその他の置換;通常、1〜約30個のアミノ酸の小さい欠失;および小さいアミノ-またはカルボキシル-末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約20〜25残基の小さいリンカーペプチドまたは親和性タグである小さなものであることが好ましい。
【０２６５】
【表Ｂ】
2018537412.tif 000006
【０２６６】
20種の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα-メチルセリンなど)が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸および非天然アミノ酸が、クロストリジウムポリペプチドアミノ酸残基と置換され得る。本発明のポリペプチドはまた、非天然発生のアミノ酸残基も含み得る。
【０２６７】
非天然発生のアミノ酸として、制限するものではないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシ-プロリン、N-メチルグリシン、アロ-トレオニン、メチル-トレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ-システイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニル-アラニン、4-アザフェニル-アラニンおよび4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。非天然発生のアミノ酸残基をタンパク質中に取り込むためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。例えば、ナンセンス突然変異が、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用して抑制されているin vitro系を使用することができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法は、当技術分野で公知である。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌(E.coli)S30抽出物および市販の酵素およびその他の試薬を含む無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製される。例えば、Robertsonら、J.Am.Chem.Soc.第113巻:2722頁、1991年;Ellmanら、Methods Enzymol.第202巻:301頁、1991年;Chungら、Science第259巻:806-9頁、1993年;およびChungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90巻:10145-9頁、1993年を参照のこと。第2の方法では、翻訳は、突然変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによってアフリカツメガエル卵母細胞において実施される(Turcattiら、J.Biol.Chem.第271巻:19991-8頁、1996年)。第3の方法内では、大腸菌(E.coli)細胞が置換されるべき天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下で、所望の非天然発生のアミノ酸(複数可)(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンまたは4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養される。非天然発生のアミノ酸が、その天然対応物の代わりにポリペプチド中に組み込まれる。Koideら、Biochem.第33巻:7470-6頁、1994年を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、in vitro化学修飾によって非天然発生の種に変換され得る。化学修飾は、部位特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに広げることができる(WynnおよびRichards、Protein Sci.第2巻:395-403頁、1993年)。
【０２６８】
限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、非天然発生のアミノ酸および非天然アミノ酸は、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。
【０２６９】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの当技術分野で公知の手順に従って同定され得る(CunninghamおよびWells、Science第244巻:1081-5頁、1989年)。生物学的相互作用部位はまた、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせた核磁気共鳴、結晶学、電子線回折または光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理解析によって決定できる。例えば、de Vosら、Science第255巻:306-12頁、1992年;Smithら、J.Mol.Biol.第224巻:899-904頁、1992年;Wlodaverら、FEBS Lett.第309巻:59-64頁、1992年を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、本発明のポリペプチドの関連構成成分(例えば、転位置またはプロテアーゼ構成成分)との相同性の解析から推測できる。
【０２７０】
Reidhaar-OlsonおよびSauer(Science第241巻:53-7頁、1988年)またはBowieおよびSauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第86巻:2152-6頁、1989年)によって開示されるものなどの突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を使用して、複数のアミノ酸置換を行い、試験することができる。手短には、これらの著者は、ポリペプチド中の2以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して各位置での許容できる置換の範囲を決定するための方法を開示している。使用できるその他の方法として、ファージディスプレイ(例えば、Lowmanら、Biochem.第30巻:10832-7頁、1991年;Ladnerら、米国特許第5,223,409号;Huse、WIPO公開WO92/06204)および領域特異的突然変異誘発(Derbyshireら、Gene第46巻:145頁、1986年;Nerら、DNA第7巻:127頁、1988年)が挙げられる。
【０２７１】
Reidhaar-OlsonおよびSauer(Science第241巻:53-7頁、1988年)またはBowieおよびSauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第86巻:2152-6頁、1989年)によって開示されるものなどの突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を使用して、複数のアミノ酸置換を行い、試験することができる。手短には、これらの著者は、ポリペプチド中の2以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して各位置での許容できる置換の範囲を決定するための方法を開示している。使用できるその他の方法として、ファージディスプレイ(例えば、Lowmanら、Biochem.第30巻:10832-7頁、1991年;Ladnerら、米国特許第5,223,409号;Huse、WIPO公開WO92/06204)および領域特異的突然変異誘発(Derbyshireら、Gene第46巻:145頁、1986年;Nerら、DNA第7巻:127頁、1988年)が挙げられる。
【０２７２】
利点
【０２７３】
前記の実施形態と一致して、クロストリジウム神経毒は、少なくともpH7.3のpH値で陽イオン交換樹脂と相互作用可能であるということは、本発明者らによる独創性に富んだ知見である。これは、このようなクロストリジウム神経毒は、その算出されたpIよりも高いpH値では、全体的に負の電荷を有すると考えられるので、予期しないことである(理論に捉われようとは思わないが)。したがって、正電荷を有するタンパク質と会合すると知られている陽イオン交換樹脂と相互作用可能であろうということは(特に、このような高い結合効率で)、高度に驚くべきことである。
【０２７４】
本発明のさらなる利点は、精製プロセスを通じて同一pHが維持され得るということである。言い換えれば、時間のかかる緩衝液変更の必要性(pH7.3未満のpH値が使用される同様の方法における)が低減され、及び/又は排除され、従って、効率及び/又は処理量を改善する。さらに、またはあるいは、精製プロセスを通じて同一pHを維持することは、有利なことに、クロストリジウム神経毒を含む組成物及び/又は精製中間体及び/又はクロストリジウム神経毒の物理的操作が軽減されることを意味する。
【０２７５】
陽イオン交換樹脂を、クロストリジウム神経毒を含む組成物と接触させることを含む使用であって、接触が、前記クロストリジウム神経毒の算出された等電点の-1pH単位またはそれより高いpHで起こる使用は、いくつかの改善された特性をもたらす。例えば、このような使用は、接触が前記クロストリジウム神経毒の算出された等電点の-1pH単位またはそれより高いpH値で起こらない同様の使用と比較した場合に、クロストリジウム神経毒の結合及び/又は収率の増大を達成する。
【０２７６】
理論に捉われようとは思わないが、示されたpH条件下でクロストリジウム神経毒および陽イオン交換カラムを接触させることによって、クロストリジウム神経毒の陽イオン交換カラムとの結合の増大が、組成物中に存在する混入物(例えば、タンパク質混入物)が結合し、したがって、クロストリジウム毒素と同時溶出することを防ぐと考えられる。
【０２７７】
クロストリジウム神経毒の陽イオン交換樹脂との結合の増強はまた、精製の効率を改善し、各精製と関連する収率の増大及び/又は費用の低減をもたらす。言い換えれば、あまり無駄の多くない及び/又はより経済的な精製プロセスが提供される。
【０２７８】
本発明の方法及び/又は使用は、有利なことに、治療及び/又は医薬において使用するのに適した等級のクロストリジウム神経毒を得るために、より少ない精製ステップが使用される必要があることを意味する。
【０２７９】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第20版、John Wiley and Sons、New York (1994年)およびHale & Marham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、NY (1991年)は、当業者に、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。
【０２８０】
本開示は、本明細書において開示される例示的方法および材料によって制限されず、本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数的範囲は、範囲を規定する数字を含む。特に断りのない限り、それぞれ、任意の核酸配列は、5’から3’方向に左から右に書かれており、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれている。
【０２８１】
本明細書において提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有することができる本開示の種々の態様または実施形態の制限ではない。したがって、直下に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより十分に定義される。
【０２８２】
アミノ酸は、アミノ酸の名称、三文字略語または一文字略語を使用して、本明細書において言及される。
【０２８３】
用語「タンパク質」とは、本明細書において、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む。
【０２８４】
本明細書において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び/又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０２８５】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において同義的に使用される。本開示および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の一文字および三文字コードが使用され得る。IUPACIUB合同委員会生化学命名法(Joint Commission on Biochemical Nomenclature)(JCBN)に準拠して定義されるようなアミノ酸の3文字コード。また、ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重のために2種以上のヌクレオチド配列によってコードされ得るということも理解される。
【０２８６】
用語のその他の定義は、本明細書を通じて現れ得る。例示的実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の実施形態に制限されず、そのようなものとして、当然、変わり得るということが理解される。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書において使用される技術用語は、単に、特定の実施形態を記載する目的のためであって、制限であるように意図されないということも理解されるべきである。
【０２８７】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の介在する値も各々、下限の単位の1/10まで、異なる旨を文脈が明確に示さない限り、具体的に開示されるということが理解される。明記された範囲中の任意の明記された値または介在する値と、その明記された範囲中の任意のその他の明記されたまたは介在する値の間のより小さい範囲は各々、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、範囲中に独立に含まれ得る、または排除され得て、両限界がより小さい範囲中に含まれない場合または両限界が含まれる場合もいずれも各範囲は、本開示内に包含され、当該明記された範囲において限界が具体的に排除されているかに従う。明記された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も、本開示中に含まれる。
【０２８８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(当該)(the)」は、文脈が別に明確に示さない限り、複数の言及を含むということは注記しなくてはならない。したがって、例えば、「1種のクロストリジウム神経毒」への言及は、複数のこのような候補薬剤を含み、「そのクロストリジウム神経毒」への言及は、1つ以上のクロストリジウム神経毒および当業者に公知のその等価物などへの言及を含む。
【０２８９】
本明細書において論じられる刊行物は、単に、本願の出願日の前のその開示のために提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付される特許請求の範囲の先行技術を構成するということの承認と解釈されるべきものはない。
【０２９０】
本発明を、単に例として、以下の図面および実施例を参照して以下に記載する。
【実施例】
【０２９１】
[実施例1] 宿主の培養および可溶性rBoNT/Aタンパク質の発現
【０２９２】
rBoNT/A DNA配列(配列番号1または3)を含有する発現ベクターを用いて形質転換されたBL21(DE3)細胞のシングルコロニーを使用して、30μg/mLのカナマイシンを補給した100mLの改変Terrific培養液(mTB)に播種した。この方法は、MicrobankTMビーズまたはグリセロールストック(10〜100μL)を使用して、フラスコに播種する場合に等しく適用可能となろう。培養物を、250回毎分で振盪しながら37℃で16時間インキュベートした。
【０２９３】
インキュベーション後、100mLの培養物のうち合計10mLを使用して、0.2％グルコサミンおよび30μg/mLのカナマイシンを補給した1LのmTBに播種した。0.5のOD600が到達されるまで、培養物を250回毎分で37℃でインキュベートした。この時点で、インキュベーション温度を16℃に低下させた。1時間後、1mM IPTGを用いて標的タンパク質の発現を誘導し、続いて、225回毎分で振盪しながら16℃で20時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を4000×g、4℃で20分間の遠心分離によって回収し、次いで、-20℃で保存した。
【０２９４】
[実施例2] 宿主細胞からのrBoNT/Aタンパク質の抽出
【０２９５】
細胞ペーストを室温で解凍し、細胞1グラムあたり3mLの50mM Bis-Tris pH6.0、50mM NaCl緩衝液中に再懸濁し、次いで、細胞懸濁液に10μLのBenzonase(登録商標)ヌクレアーゼを添加した。細胞を0〜4℃で、100W(30秒オンおよび45秒オフの10サイクル)での超音波処理によって溶解した。可溶化液を4000×g、4℃で1時間遠心分離して、清澄化された上清中の可溶性rBoNT/A(配列番号2または4)を得た。
【０２９６】
[実施例3] 標的rBoNT/Aタンパク質の捕獲
【０２９７】
Scripps Research Institute製のScripps Protein Calculator v3.4を使用して、一次タンパク質配列からrBoNT/Aタンパク質の特性を調べた(表3)。
【０２９８】
【表３】
2018537412.tif 000007
【０２９９】
算出されたpI値に基づいて、rBoNT/A(配列番号4)および陽イオン性rBoNT/A(配列番号2)は、それぞれ、緩衝液pH<6.5および<7.4で陽イオン交換(CEX)樹脂と結合するということが予測された。
【０３００】
[実施例4] 試験緩衝液への清澄化された可溶化液の脱塩
【０３０１】
可溶性rBoNT/A(配列番号2および4)を含有する清澄化された可溶化液を、等しい部分にわけ、Econo-Pac 10DG脱塩カラムを使用して、表4に列挙されるローディング緩衝液に緩衝液交換した。
【０３０２】
【表４】
2018537412.tif 000008
【０３０３】
緩衝液交換され清澄化された可溶化液を4℃で保存し、その後、HiTrap SP HPカラムにロードした。
【０３０４】
[実施例5] 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を使用するrBoNT/A(配列番号4)のCEXクロマトグラフィー捕獲ステップのための緩衝液スクリーニング
【０３０５】
可溶性rBoNT/A(配列番号4)を含有する緩衝液交換された可溶化液を、HiTrap SP HPカラム上にロードした。SDS-PAGEおよびデンシトメトリーによって、溶出された標的タンパク質の結合％および純度％を決定した。pHまたはNaCl直線勾配のいずれかを使用することによって、結合されたタンパク質の溶出が達成された(表5)。
【０３０６】
【表５】
2018537412.tif 000009
【０３０７】
図1(パネルA〜F)は、表5における条件を使用するSP HPセファロース樹脂との結合およびそれからの溶出後のrBoNT/A(配列番号4)溶出プロフィールのクマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。SDS-PAGEゲルの解析によって、溶出された標的タンパク質の純度％の推定が可能となった(表6)。
【０３０８】
【表６】
2018537412.tif 000010
【０３０９】
SDS-PAGEゲルの視覚的評価(図1)は、条件3〜6を用いた場合の溶出後の標的タンパク質のより多い回収を示し、これは、標的タンパク質の樹脂とのより多い初期結合を示唆する。
【０３１０】
[実施例6] 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を使用する陽イオン性rBoNT/A(配列番号2)のCEXクロマトグラフィー捕獲ステップのための緩衝液スクリーニング
【０３１１】
可溶性陽イオン性rBoNT/A(配列番号2)を含有する緩衝液交換された可溶化液を、HiTrap SP HPカラム上にロードした。SDS-PAGE解析によって、溶出された標的タンパク質の結合％および純度％を決定した。pHまたはNaCl直線勾配のいずれかを使用することによって、結合されたタンパク質の溶出が達成された(表5)。
【０３１２】
図2(パネルA〜F)は、表5における条件を使用するSP HPセファロース樹脂との結合およびそれからの溶出後の陽イオン性rBoNT/A(配列番号2)溶出プロフィールのクマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。SDS-PAGEゲルの解析によって、標的タンパク質の純度％およびSP HPセファロース樹脂との結合％の推定が可能となった(表7)。
【０３１３】
【表７】
2018537412.tif 000011
【０３１４】
SDS-PAGEゲルの評価(図2)は、pH6.0と比較して、pH7.5〜8.0で標的タンパク質のより大きな結合％および類似の純度％を示す。これは、標的タンパク質回収の全体的な増大と同じである。
【０３１５】
上記の明細書において記載されるすべての刊行物は、参照により本明細書に取り込まれる。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本発明の記載される方法および系の種々の改変および変法は、当業者に明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求されるような本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されてはならないということは理解されなくてはならない。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連する技術分野の当業者にとって明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【符号の説明】
【０３１６】
[図1、図2]
Panel: パネル
Loading buffer: ローディング緩衝液
Elution Gradient: 溶出勾配
Citrate phosphate buffer: クエン酸リン酸緩衝液
Bis-Tris methane: Bis-Trisメタン
Bis-Tris propane: Bis-Trisプロパン
pH 6.0 to pH7.5: pH 6.0乃至pH7.5
0 to 1M NaCl: 0乃至1M NaCl
MW Stds: MW標準
Lysate: 可溶化液
Flowthrough: フロースルー
Wash: 洗浄
[図2]
Insoluble fraction: 不溶性画分
Total protein: 全タンパク質
[図3〜24]
SEQ ID NO.: 配列番号
【図１−１】
2018537412.tif 000012
【図１−２】
2018537412.tif 000013
【図２−１】
2018537412.tif 000014
【図２−２】
2018537412.tif 000015
【図３】
2018537412.tif 000016
【図４】
2018537412.tif 000017
【図５】
2018537412.tif 000018
【図６】
2018537412.tif 000019
【図７】
2018537412.tif 000020
【図８】
2018537412.tif 000021
【図９】
2018537412.tif 000022
【図１０】
2018537412.tif 000023
【図１１】
2018537412.tif 000024
【図１２】
2018537412.tif 000025
【図１３】
2018537412.tif 000026
【図１４】
2018537412.tif 000027
【図１５】
2018537412.tif 000028
【図１６】
2018537412.tif 000029
【図１７】
2018537412.tif 000030
【図１８】
2018537412.tif 000031
【図１９】
2018537412.tif 000032
【図２０】
2018537412.tif 000033
【図２１】
2018537412.tif 000034
【図２２】
2018537412.tif 000035
【図２３】
2018537412.tif 000036
【図２４】
2018537412.tif 000037
【配列表】
2018537412000001.app
【国際調査報告】
2018537412.tif 000038
2018537412.tif 000039