(57)【要約】  本開示は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＬＧＧ）等のプロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の可溶性メディエーター調剤を含む組成物を、小児対象に投与することを含む、小児対象においてｉ）腸再生を促進する、ｉｉ）腸の成熟及び／又は順応を促進する、ｉｉｉ）腸バリア抵抗性を支持する、及び／又はｉｖ）腸バリア機能を保護する方法に関する。本発明の方法は、有利には、障害された腸バリア機能を有する個体に生菌培養物を導入することなく、ＬＧＧ可溶性メディエーターの腸保護の利益を提供する。いくつかの実施形態では、小児対象は障害された腸バリア機能、及び／又は短腸症候群を有する。本開示は、他の実施形態では、ＬＧＧ等のプロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の可溶性メディエーター調剤を含む組成物を小児対象に投与することを含む、小児対象において内臓痛を軽減する方法に関する。【選択図】図１Ａ
2018537434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）腸バリア再生を促進する、ｉｉ）腸バリア成熟及び／又は順応を促進する、ｉｉｉ）腸バリア抵抗性を支持する、及び／又はｉｖ）腸バリア機能を保護する方法であって、それらを必要とする小児対象において、
プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）バッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の可溶性メディエーター調剤を含む組成物を、前記小児対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記プロバイオティックがラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ（ＬＧＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小児対象が障害された腸バリア機能又は腸健全性の喪失を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記小児対象が短腸症候群又は壊死性腸炎を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記小児対象が乳児である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記小児対象が早期産児である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性メディエーター調剤が、（ａ）ＬＧＧを、バッチプロセスを使用する好適な培養培地での培養に供すること、（ｂ）前記バッチ培養プロセスの誘導期と静止期の間の後半に関して定義される培養工程の指数増殖期後期に培養上清を採取すること、（ｃ）任意に、５ｋＤａ又は６ｋＤａ超の分子量の構成要素を保持するように、前記上清から低分子量の構成要素を除去すること、（ｄ）０．２μｍの滅菌濾過によってあらゆる残留細胞を除去して前記可溶性メディエーター調剤を提供すること；（ｅ）前記組成物を得るように、前記可溶性メディエーター調剤から液体内容物を除去すること、
によって製造される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）が滅菌濾過による細菌細胞の除去を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記指数期後期が、前記バッチ培養プロセスの前記誘導期と前記静止期の間の後半４分の１部分に関して定義される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記バッチ培養がポリソルベートを欠く培養培地において行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、オレイン酸、アマニ油、オリーブオイル、ナタネ油、ヒマワリ油及びそれらの混合物からなる群から選択される原料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記バッチ培養がｐＨ５〜ｐＨ７で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が小児科栄養組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効量が、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１×１０4細胞〜約１×１０12細胞のプロバイオティック生菌当量である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
乳児において、ｉ）腸バリア再生を促進する、ｉｉ）腸バリア成熟を促進する、ｉｉｉ）腸バリア抵抗性を支持する、及び／又はｉｖ）腸バリア機能を保護する乳児用フォーミュラであって、
最大約７ｇ／１００ｋｃａｌの脂肪又は脂質と、
最大約５ｇ／１００ｋｃａｌのタンパク源又はタンパク当量の供給源と、
最大約２２ｇ／１００ｋｃａｌの炭水化物源と、
ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）バッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する可溶性メディエーター調剤と
を含む、乳児用フォーミュラ。
【請求項１６】
前記組成物が約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約１ｇ／１００ｋｃａｌのプレバイオティック組成物を更に含み、前記プレバイオティック組成物がポリデキストロース、ガラクトオリゴ糖、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ポリデキストロース及びガラクトオリゴ糖が、少なくとも約２０％の前記プレバイオティック組成物を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
アラキドン酸を更に含み、前記ＡＲＡとＤＨＡが約１：３〜９：１の範囲の重量比で存在する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
ラクトフェリンを更に含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
内臓痛感受性を軽減する方法であって、それを必要とする小児対象において、
プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の可溶性メディエーター調剤を含む組成物を前記小児対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記プロバイオティックがラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記小児対象が乳児である、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記小児対象が早期産児である、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記可溶性メディエーター調剤が、（ａ）ＬＧＧを、バッチプロセスを使用する好適な培養培地での培養に供すること、（ｂ）バッチ培養プロセスの誘導期と静止期の間の後半に関して定義される培養工程の指数増殖期後期に培養上清を採取すること、（ｃ）任意に、５ｋＤａ超又は６ｋＤａの分子量の構成要素を保持するように、前記上清から低分子量の構成要素を除去すること、（ｄ）０．２μｍの滅菌濾過によってあらゆる残留細胞を除去すること、（ｅ）前記組成物を得るように、前記可溶性メディエーター調剤から液体内容物を除去すること、
によって製造される、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記指数期後期が、前記バッチ培養プロセスの前記誘導期と前記静止期の間の後半４分の１部分に関して定義される、請求項７に記載の方法。
【請求項２６】
前記バッチ培養がポリソルベートを欠く培養培地において行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が、オレイン酸、アマニ油、オリーブオイル、ナタネ油、ヒマワリ油及びそれらの混合物からなる群から選択される原料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
前記バッチ培養がｐＨ５〜ｐＨ７で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が小児科栄養組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記有効量が１日当たり体重１ｋｇ当たり約１×１０4細胞〜約１×１０12細胞のプロバイオティック生菌当量である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、障害された及び／又は未熟な腸バリア機能及び／又は短腸症候群を有する乳児及び幼児において、腸再生を促進する、腸成熟を促進する、腸バリア抵抗性を支持する、及び／又は腸バリア機能を保護する組成物及び方法に関する。また本開示は、内臓痛の障害及び知覚を軽減する組成物及び方法に関する。より詳しくは、本開示は、プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）バッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する培養上清を含む組成物、及び該組成物を投与する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
腸バリア機能
栄養素の吸収を可能としながら、腸バリアは腸管腔中の潜在的に有害な物質からの保護を提供する。いくつかの機構は、腸の形態学的構造、全身及び局所的な炎症、腸内細菌移行及び腸抵抗性等の腸バリア機能に関与する。腸バリア健全性は、多くの自己免疫性疾患と同様に、腸の炎症、感染症、アレルギー感作の過程の間に損なわれ、又は妨害される場合がある。より具体的には、これらの機構は、感染症、先天性腸管奇形、壊死性腸炎（ＮＥＣ）及び短腸症候群（ＳＢＳ）を患う早期産児及び／又は低出生体重児において障害されている可能性がある。
【０００３】
ロタウイルス等の感染症、及び例えばセリアック病によって引き起こされる絨毛萎縮は、腸のバリア性の変更につながる場合がある。腸バリア機能の障害は、絨毛の高さの減少及びクリプト深度の増加を生じる可能性がある。機能する腸の量が食物及び液体の適切な消化及び吸収に必要な量未満に減少され、最終的には臨床的な栄養不足をもたらす場合、ＳＢＳは吸収不全状態として定義され、非経口栄養（ＰＮ）サポートを必要とする。一部の小児は、先天的に短腸を伴って誕生するのに対し、その他は、例えば壊死性腸炎の外科治療のため、外科的に短腸を獲得する。ＳＢＳは、早期産児における高い罹患率と共に、新生児、乳児及び幼児における腸の機能不全の主な原因である。腸の細菌の異常増殖及び細菌移行はＳＢＳの主な合併症であり、腸バリア機能の妨害によって引き起こされる。
【０００４】
動物及び臨床の研究によって示唆されるように、障害された腸バリア機能を有する乳児における腸細菌の異常増殖及び移行は、腸由来の感染症に関与する因子のみならず、リハビリテーションプロセスを更に損なう可能性もある。また、腸細菌の異常増殖及び移行は、腸の再生、成熟、分化及び上皮のはたらきを損なう可能性もある。前述の障害は吸収不良をもたらす可能性がある。また、腸の腸内細菌叢は、それらの代謝性、栄養、及び免疫の調節特性により、健康で無傷の腸バリアに寄与する。
【０００５】
プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）は、前述の原因のうちのいずれかにより障害された腸バリア機能を有する小児科患者において有用な場合がある。それにもかかわらず、障害された腸防御及び未熟な腸バリア機能を有する小児対象、特に早期産児に対する生存可能な細菌の投与は、菌血症のリスクのため適していない場合がある。さらに、存在可能なプロバイオティック材料から分泌される可溶性因子は、プロバイオティック細菌の有益な効果のうちのいくつかに関与し得る。したがって、ＳＢＳ又はＮＥＣ等の障害された／未熟な腸バリア機能を患う小児対象の腸管に生存可能な細菌を導入することなく、プロバイオティクスの利益を提供することが可能な組成物が必要とされている。
【０００６】
小児対象における内臓痛障害
生後初期の期間は、通常、ストレス低反応性（ｓｔｒｅｓｓ−ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）の期間であり、その間に著しいニューロンの生育及び髄鞘形成の相が存在する。この臨界期の間の食物不耐性、アレルギー性又は非アレルギー性の炎症、疝痛、炎症性腸症候群、及び感染症等のストレス性の症状の発現は、若齢期に開始する長期の永続的な影響を有する可能性がある。かかる影響として、内臓過敏及び腸の微生物相の多様性の減少が挙げられる。プロバイオティクスは内臓過敏を減少させるのに有用な可能性があるが、プロバイオティック可溶性メディエーターの効果についての情報を欠く。したがって、乳児及び小児、特に内臓感受性の増加を有する小児科群において内臓痛を軽減する組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
簡潔には、本開示は、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の可溶性メディエーター調剤を含む組成物を小児対象に投与することを含む、小児対象において、ｉ）腸再生を促進する、ｉｉ）腸成熟及び／又は順応を促進する、ｉｖ）腸バリア抵抗性を支持する、及び／又はｖ）腸バリア機能を保護する方法に関する。ある実施形態では、プロバイオティックはラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）である。本発明の方法は、有利には、腸バリア機能が障害された個体に対して、生菌培養物を導入することなく、ＬＧＧ等の生存可能なプロバイオティクスと同様の腸保護の利益を提供する。いくつかの実施形態では、小児対象は、障害された腸バリア機能、及び／又は短腸症候群、及び／又はＮＥＣを有する。より特定の実施形態では、小児対象は乳児又は早期産児である。
【０００８】
また、本開示は、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する可溶性メディエーター調剤を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、上記組成物は、最大約７ｇ／１００ｋｃａｌの脂肪又は脂質と、最大約５ｇ／１００ｋｃａｌのタンパク質源と、最大約２２ｇ／１００ｋｃａｌの炭水化物源と、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する可溶性メディエーター調剤とを含む、乳児においてｉ）腸再生を促進する、ｉｉ）腸成熟及び／又は順応を促進する、ｉｉｉ）腸バリア順応を促進する、ｉｖ）腸バリア抵抗性を支持する、及び／又はｖ）腸バリア機能を保護する、乳児用フォーミュラである。より特定の実施形態では、プロバイオティックはＬＧＧである。
【０００９】
本開示は、他の実施形態では、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の可溶性メディエーター調剤を含む組成物を小児対象に投与することを含む、小児対象の内臓痛を軽減する方法に関する。特定の実施形態では、プロバイオティックはラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）である。いくつかの実施形態では、小児対象は、内臓痛障害、炎症性腸症候群（ＩＢＳ）に起因する消化器の疼痛若しくは不快又は疝痛、食物の不耐性若しくはアレルギー（牛乳アレルギー等）による内臓の感受性の増加を有する。
【００１０】
更に別の実施形態では、本開示は、最大約７ｇ／１００ｋｃａｌの脂肪又は脂質と、最大約５ｇ／１００ｋｃａｌのタンパク質源と、最大２２ｇ／１００ｋｃａｌの炭水化物源と、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する可溶性メディエーター調剤とを含む、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する可溶性メディエーター調剤を含む、小児対象において内臓痛を軽減する組成物を提供する。より特定の実施形態では、プロバイオティックはＬＧＧである。
【００１１】
先の全般的な記載及び以下の詳細な記載は、いずれも本開示の実施形態を提示し、特許請求の範囲に記載されるように、本開示の性質及び本質を理解するために概要又は構成を提供することが意図されると理解される。上記記載は、特許請求の範囲に記載される主題の原理及び操作を説明する役割を果たす。本開示のその他の及び更なる特徴及び利点は、以下の開示を読むことにより当業者に容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＳＢＳのモデルを使用してラットの腸形態学に対する効果を実証する６つの各実験群に関する回腸試料の画像である。画像は、これらの６つの治療群間で絨毛高さ及びクリプト深度の差を実証する。図１（Ａ）は、ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤Ａによる治療である。
【図１Ｂ】可溶性メディエーター調剤Ｂによる治療
【図１Ｃ】細菌培養培地による治療
【図１Ｄ】生存可能なＬＧＧによる治療
【図１Ｅ】対照ＳＢＳによる治療
【図１Ｆ】シャムによる治療
【図２Ａ】６つの治療群間のタイトジャンクションタンパク質の平均発現のグラフである（図２（Ａ）：オクルディン）。６つの治療群は次の通りであった。１：シャム、２：ＳＢＳ、３：ＳＢＳ＋可溶性メディエーター調剤Ａ、４：ＳＢＳ＋可溶性メディエーター調剤Ｂ、５：ＳＢＳ＋ＢＣＭ、６：ＳＢＳ＋ＬＧＧ。
【図２Ｂ】ＺＯ−１
【図２Ｃ】クローディン−１
【図２Ｄ】クローディン−４
【図３Ａ】６つの実験群全てにおける腸のバリア透過性及び抵抗性の測定値を表すグラフである（２Ａ：血清ＦＤ−４０レベル）。６つの実験群は次を含む。１：シャム、２：ＳＢＳ、群３：ＳＢＳ＋可溶性メディエーター調剤Ａ、４：ＳＢＳ＋可溶性メディエーター調剤Ｂ、５：ＳＢＳ＋ＢＣＭ、６：ＳＢＳ＋ＬＧＧ。値は平均±ｓｄである。種々の上付き文字を伴う平均は統計学的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【図３Ｂ】血清エンドトキシンレベル
【図３Ｃ】血清ＧＬＰ−２
【図３Ｄ】回腸内容物のｓＩｇＡレベル
【図４Ａ】飲料水の補足及び初期のライフストレスが、体重増加に影響しなかったことを実証するグラフである。（ＮＳ−母体分離されていない；ＭＳ−母体分離された）。
【図４Ｂ】飲料水の補足及び初期のライフストレスが、食物摂取量に影響しなかったことを実証するグラフである。
【図４Ｃ】飲料水の補足及び初期のライフストレスが、液体摂取量に影響しなかったことを実証するグラフである。
【図５】可溶性メディエーター調剤（可溶性メディエーター調剤Ｂ）が初期のライフストレスによって誘導される内臓痛過敏性を改善することを示すグラフである。値は平均±ｓｄ、（*）ｐ＝３４対ＮＳ−水；（＃）ｐ＝０．０３対ＭＳ−水である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ここでは本開示の実施形態に対して詳細な言及を行い、それらの１以上の実施例を下記本明細書に述べる。各実施例は、本開示の栄養組成物の説明として提供され、限定ではない。実際、本開示の範囲から逸脱することなく、本開示の教示に対して様々な修飾及び変形を行うことができることは当業者に明らかであろう。例えば、一の実施形態の一部として例証される又は記載される特徴は、更なる実施形態を得るために別の実施形態と共に使用され得る。
【００１４】
したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲に含まれるかかる修飾及び変形を包含することが意図される。本開示の他の目的、特徴及び態様は、以下の詳細な説明に開示されるか、又はそれらより明らかである。本考察が例示的な実施形態の記載に過ぎず、本開示のより広い態様を限定するものとして意図されないことが当業者によって理解される。
【００１５】
本開示は、概して、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する培養上清を含む組成物を投与することを含む、小児対象においてｉ）腸再生を促進する、ｉｉ）腸成熟及び／又は順応を促進する、ｉｉｉ）腸抵抗性を支持する、及び／又はｉｖ）腸バリア機能を保護する方法に関する。さらに本開示は、小児対象におけるｉ）腸再生の促進、ｉｉ）腸成熟及び／又は順応の促進、ｉｉｉ）腸バリア抵抗性の支持、及び／又はｉｖ）腸バリア機能を保護における使用に対する、培養上清、より詳しくはＬＧＧ等のプロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する可溶性メディエーター調剤を含む組成物に関する。
【００１６】
他の実施形態では、本開示は、プロバイオティックバッチ培養プロセスの指数増殖期後期に由来する有効量の培養上清を含む組成物を小児対象に投与することを含む、小児対象の内臓痛を軽減する方法を提供する。特定の実施形態では、プロバイオティックはＬＧＧである。いくつかの実施形態では、小児対象は内臓感受性の増加を有し、再発性消化器痛、疝痛、炎症性腸症候群（ＩＢＳ）、食物の不耐性又はアレルギー（牛乳アレルギー等）を患う。
【００１７】
「栄養組成物」は、少なくとも対象の栄養要求の一部を満たす物質又は製剤を意味する。「栄養（複数の場合がある）」、「栄養製剤（複数の場合がある））」、「腸の栄養（複数の場合がある）」及び「栄養サプリメント（複数の場合がある）」の用語は、本開示を通して栄養組成物（複数の場合がある）の非限定的な例として使用される。さらに、「栄養組成物（複数の場合がある）」は、腸用フォーミュラ、経口フォーミュラ、乳児用フォーミュラ、小児対象用フォーミュラ、小児用フォーミュラ、グローイングアップミルク（ｇｒｏｗｉｎｇ−ｕｐ  ｍｉｌｋ）、及び／又は成人用フォーミュラの液体、粉末、ゲル、ペースト、固体、濃縮物、懸濁液、若しくは即時使用可能な形態、を指す。
【００１８】
「腸の」の用語は、胃腸又は消化管を通って又はその内部で送達可能であることを意味する。「経腸投与」は、経口栄養、胃内栄養、経幽門投与、又は消化管への任意の他の投与を含む。「投与」は、「経腸投与」より広く、非経口投与又は物質が対象の身体へと摂取される任意の他の投与経路を含む。
【００１９】
「小児対象」は、１３歳以下のヒトを意味する。いくつかの実施形態では、小児対象は、誕生から８歳のヒト対象を指す。他の実施形態では、小児対象は、１歳〜６歳のヒト対象を指す。更なる実施形態では、小児対象は、６歳〜１２歳のヒト対象を指す。「小児対象」の用語は、以下に記載されるように乳児（早期産又は満期産）及び／又は小児を指す場合がある。
【００２０】
「乳児」は、誕生から１歳以下の年齢の範囲のヒト対象を意味し、０ヶ月〜１２ヶ月に補正した年齢の乳児を含む。「補正した年齢」句は、該乳児が早期産で産まれた時間の量を減じた該乳児の暦年齢を意味する。したがって、乳児が満期産まで保持されていた場合、補正年齢が該乳児の年齢である。乳児の用語は、低出生体重児、極低出生体重児、超低出生体重児、及び早期産児を含む。「早期」は、妊娠３７週目が終わる前に生まれた乳児を意味する。「後期早産」は、妊娠３４週目〜３６週目の間に生まれた乳児を意味する。「満期」は、妊娠３７週目が終わった後に生まれた乳児を意味する。「低出生体重児」は、重さ２５００グラム未満（およそ５ポンド、８オンス）で生まれた乳児を意味する。「極低出生体重児」は、重さ１５００グラム未満（およそ３ポンド、４オンス）で生まれた乳児を意味する。「超低出生体重児」は、重さ１０００グラム未満（およそ２ポンド、３オンス）で生まれた乳児を意味する。
【００２１】
「小児」は、１２ヶ月齢〜１３歳の年齢の範囲の対象を意味する。いくつかの実施形態では、小児は１歳〜１２歳の対象である。他の実施形態では、「小児達」又は「小児」の用語は、１歳〜約６歳、又は約７歳〜約１２歳の対象を指す。他の実施形態では、「小児達」又は「小児」の用語は、１２ヶ月齢〜約１３歳の年齢の任意の範囲を指す。
【００２２】
「小児用栄養製品」は、少なくとも子どもの栄養要求の一部を満たす組成物を指す。グローイングアップミルクは、小児用栄養製品の例である。
【００２３】
「加水分解度」の用語は、ペプチド結合が加水分解法によって破壊される程度を指す。
【００２４】
「部分加水分解」の用語は、０％超であるが約５０％未満の加水分解の程度を有することを意味する。
【００２５】
「広範囲に加水分解された」の用語は、約５０％以上の加水分解の程度を有することを意味する。
【００２６】
「乳児用フォーミュラ」は、少なくとも乳児の栄養要求の一部を満たす組成物を意味する。アメリカ合衆国では、乳児用フォーミュラの含有量は、２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．ｓｅｃｔｉｏｎ１００、１０６及び１０７で述べられる連邦規則によって指示される。これらの規則は、ヒト母乳の栄養及びその他の特性を模するため主要栄養素、ビタミン、ミネラル及び他の成分レベルを定義する。
【００２７】
「グローイングアップミルク」の用語は、約１歳〜約６歳の年齢の小児の正常な成長及び発達を支持するため、種々の食事の一部として使用されることが意図される幅広いカテゴリーの栄養組成物を指す。
【００２８】
「乳系（Ｍｉｌｋ−ｂａｓｅｄ）」は、哺乳動物の乳腺から抜き取られた又は抽出された少なくとも１つの成分を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、乳系栄養組成物は、飼育された有蹄動物、反芻動物、若しくは他の哺乳動物、又は任意のそれらの組み合わせに由来する乳の成分を含む。さらに、いくつかの実施形態では、乳系は、ウシのカゼイン、ホエイ、ラクトース又はそれらの任意の組み合わせを含むことを意味する。さらに、「乳系栄養組成物」は、当該技術において知られている任意の乳由来又は乳系の製品を含む任意の組成物を指す場合がある。
【００２９】
「栄養的に完全な（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」は、本質的に全ての要求される１日量のビタミン、ミネラル、及び／又はタンパク質、炭水化物及び脂質と組み合わせた微量元素を供給する、唯一の栄養供給源として使用され得る組成物を意味する。実際、「栄養的に完全な」は、対象の正常な成長及び発達を支持するのに必要な適切な量の炭水化物、脂質、必須脂肪酸、タンパク質、必須アミノ酸、条件付き必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及びエネルギーを提供する栄養組成物を記載する。
【００３０】
したがって、早期産児に対して「栄養的に完全な」栄養組成物は、定義によって、早期産児の成長に必要な質的及び量的に適切な量の炭水化物、脂質、必須脂肪酸、タンパク質、必須アミノ酸、条件付き必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及びエネルギーを提供する。
【００３１】
満期産児に対して「栄養的に完全な」栄養組成物は、定義によって、満期産児の成長に必要な質的及び量的に適切な量の全ての炭水化物、脂質、必須脂肪酸、タンパク質、必須アミノ酸、条件付き必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及びエネルギーを提供する。
【００３２】
小児に対して「栄養的に完全」である栄養組成物は、定義によって、小児の成長に必要な、質的及び量的に適切な量の全ての炭水化物、脂質、必須脂肪酸、タンパク質、必須アミノ酸、条件付き必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及びエネルギーを提供する。
【００３３】
栄養素に適用される「必須」の用語は、身体によって正常な成長及び健康維持に十分な量を合成することができないため、食事によって供給されなければならない任意の栄養素を指す。栄養素に適用される「条件付き必須」の用語は、内因性の合成が生じるのに適切な量の前駆化合物が身体に対して利用不可能である場合の条件下で、その栄養素が食事によって供給されなければならないことを意味する。
【００３４】
「プレバイオティック」は、消化管において、宿主の健康を改善し得る１又は限られた数の細菌の生育及び／又は活性を選択的に賦活することによって宿主に有利に作用する消化できない食物原料を意味する。
【００３５】
本明細書で使用される「非ヒト由来ラクトフェリン」は、ヒト母乳以外の起源によって産生される又は得られるラクトフェリンを意味する。例えば、本開示における使用に対するラクトフェリンは、非ヒトラクトフェリンと同様に、遺伝子組み換え生体によって産生されたヒトラクトフェリンを含む。本明細書で使用される「生体」の用語は、動物、植物、菌類又は微生物等の任意の連続する生物系を指す。例示的な非ヒト起源ラクトフェリンとしてウシラクトフェリンが挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用される「非ヒトラクトフェリン」はヒトラクトフェリンのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列のラクトフェリンを意味する。
【００３７】
本明細書で使用される全てのパーセンテージ、部及び比率は、別段の定めがない限り、製剤の合計重量による。
【００３８】
「１日当たり」投与されると指定される全ての量は、２４時間の間に投与される１単位用量で、２食分で、又は２用量又は２食分以上で送達されると考えられ得る。
【００３９】
本開示の栄養組成物は、残りの栄養組成物がなおも本明細書に記載される要求される原料又は特徴を全て含んでいる限り、本明細書に記載されるいかなる任意の原料又は選択される原料も実質的に含まなくてもよい。この情況において、また別段の定めがない限り、「実質的に含まない」の用語は、選択される組成が機能的な量未満、典型的には０．１重量％未満の任意の原料を含んでもよいこと、また０重量パーセントのかかる任意の又は選択される原料を含むことを意味する。
【００４０】
本開示の特異な性質又は限定に対する全ての参照は、別段の指示がない限り、又は参照される文脈によって明らかにその逆を意味することがない限り、対応する複数の性質又は限定を含むものとし、またその逆も同様とする。
【００４１】
別段の指示がない限り、又は組み合わせが参照される文脈によって明らかにその逆を意味することがない限り、本明細書で使用される方法又は処理工程の全ての組み合わせを任意の順序で行うことができる。
【００４２】
本開示の方法、及びその成分を含む組成物は、本明細書に記載される或いは栄養組成物に有用である追加の若しくは任意の原料と同様に、本明細書に記載される実施形態の必須要素及び限定を含んでもよい、それらからなってもよい、又は本質的にそれらからなってもよい。
【００４３】
本明細書で使用される「約」の用語は、任意の範囲の終点（複数の場合がある）として指定される両方の数を指すと解釈されるべきである。或る範囲に対するいかなる参照も、その範囲内の任意の部分集合に対する支持を提供するものとすべきである。
【００４４】
「プロバイオティック」は、宿主の健康に有益な効果を及ぼす病原性の低い又は病原性のない微生物を意味する。「不活性化されたプロバイオティック」の用語は、参照されるプロバイオティックの代謝活性又は生殖能力が減少又は破壊されたプロバイオティックを意味する。しかしながら、「不活性化されたプロバイオティック」は、細胞レベルで、細胞に関連するその細胞構造又は他の構造、例えばエキソポリサッカライド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、並びにその生物学的グリコール−タンパク質及びＤＮＡ／ＲＮＡ構造の少なくとも一部をまだ保持する。本明細書で使用される「不活性化された」の用語は、「生存不能な」と同義語である。
【００４５】
当該技術分野で知られている任意のプロバイオティックを使用してもよい。特定の実施形態では、プロバイオティックは、任意のラクトバチルス種、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５３１０３）、ビフィドバクテリウム種、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６（ＢＬ９９９、ＡＴＣＣ：ＢＡＡ−９９９）、ビフィドバクテリウム・ロングムＡＨ１２０６（ＮＣＩＭＢ：４１３８２）、ビフィドバクテリウム・ブレヴェＡＨ１２０５（ＮＣＩＭＢ：４１３８７）、ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４（ＮＣＩＭＢ：４１００３）、及びビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２（ＤＳＭ  Ｎｏ．１０１４０）、又はそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。
【００４６】
特定の実施形態では、プロバイオティックは、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ラクトバチルスＧ．Ｇ．、株ＡＴＣＣ  ５３１０３）である。ＬＧＧは、健康なヒト対象の糞便試料から単離された細菌である。ＬＧＧはプロバイオティックとして広く認識される。これは、参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｇｏｒｂａｃｈらに対する米国特許第５，０３２，３９９号に開示された。ＬＧＧは、ほとんどの抗生物質に対して耐性ではなく、酸及び胆汁の存在下で安定であり、ヒト腸管の粘膜細胞に貪欲に付着する。ＬＧＧはほとんどの個体で１日間〜３日間存続し、対象の３０％で最長７日間存続する。そのコロニー形成能力に加えて、ＬＧＧは粘膜免疫応答にも有益に作用する。ＬＧＧは、アクセッション番号ＡＴＣＣ  ５３１０３の下の寄託当局であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託される。
【００４７】
理論に束縛されることを望むものではないが、プロバイオティックのバッチ培養に由来する培養上清、また特定の実施形態ではＬＧＧは、特に腸バリア機能が障害された対象において腸バリア機能を促進すると考えられる。さらに、腸バリア機能に対する有益な効果は、ＬＧＧのバッチ培養の指数（又は「対数」）期の後期に培養培地中に放出される成分の混合物（タンパク質様物質を含み、おそらくは（エクソ）多糖物質を含む）に起因し得ると考えられる。該組成物は以下「可溶性メディエーター調剤」と呼ばれる。
【００４８】
他の実施形態では、本発明の可溶性メディエーター調剤は、小児科集団において、内臓痛障害（反復性腹痛、ＩＢＳ又は疝痛）による又は食事に由来する不耐性及び牛乳アレルギーによる内臓過敏及び腹部不快感の測定可能な減少をもたらすであろうと考えられる。更なる実施形態では、本発明の可溶性メディエーター調剤は、学習能力の増加及び記憶の改善をもたらすであろうと考えられる。
【００４９】
本開示の可溶性メディエーター調剤を、以下に記載される通りに作製することができる。さらに、ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤の作製は、いずれも参照によりその全体が援用される、米国特許出願公開第２０１３０２５１８２９号及び米国出願公開第２０１１０２１７４０２号に記載される。細菌のバッチ培養で認識される段階は、当業者に知られている。これらは、「誘導」期、「対数」期（「対数」期又は「指数」期）、「静止」期及び「死滅」期（又は「対数衰退」期）である。生菌が存在する全ての相において、細菌は培地から栄養素を代謝し、また培養培地中に物質を分泌する（及ぼす（ｅｘｅｒｔ）、放出する）。増殖段階の所与の時間点での分泌物の組成は、一般に予測可能ではない。
【００５０】
本開示は更に、プロバイオティック可溶性メディエーター調剤を作製するプロセスに関する。好ましい実施形態では、本開示による及び／又はその実施形態による組成物は、（ａ）バッチプロセスを使用する好適な培養培地中での培養にＬＧＧ等のプロバイオティックを供する工程、（ｂ）培養工程の指数増殖期後期に培養上清を採取する工程であって、指数増殖期後期がバッチ培養プロセスの誘導期と静止期の間の後半時間に関して定義される工程、（ｃ）任意に、５キロダルトン（ｋＤａ）〜６（ｋＤａ）超の分子量の構成要素を保持するように、上清から低分子量構成要素を除去する工程、（ｄ）０．２２μｍの滅菌濾過を使用してあらゆる残留細胞を除去し、可溶性メディエーター調剤を提供する工程、（ｅ）上記組成物を得るように、可溶性メディエーター調剤から内容物を除去する工程、を含むプロセスによって入手可能である。
【００５１】
特定の実施形態では、分泌物は指数期後期から採取される。指数期後期は、指数期中期の後に起こる（指数期の期間の半分の時間（ｈａｌｆｔｉｍｅ）であり、したがって、誘導期と静止期の間の後半の時間である指数期後期を指す）。特に、「指数期後期」の用語は、ＬＧＧバッチ培養プロセスの誘導期と静止期の間の後半４分の１部分の時間を指して本明細書で使用される。本開示の及びその実施形態の好ましい実施形態では、培養上清の採取は、指数期の期間の７５％〜８５％の時点、最も好ましくは指数期において約５／６の時間が経過した時点である。
【００５２】
「培養（cultivation）」又は「培養すること（culturing）」の用語は、好適な培地上又は培地中での微生物、この場合ＬＧＧの増殖を指す。かかる培養培地は様々な種類であってもよく、特に、当該技術分野において通例の液体ブロスである。好ましいブロスは、例えば乳酸桿菌の培養に一般に使用されるＭＲＳブロスである。ＭＲＳブロスは、一般に豊富な栄養基礎培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂａｓｅ）と同様に、乳酸桿菌に対して特殊な増殖因子として作用することが知られているポリソルベート、酢酸塩、マグネシウム及びマンガンを含む。典型的な組成物は以下を含む（ｇ／リットル単位の量）：カゼインに由来するペプトン１０．０；肉抽出物８．０；酵母抽出物４．０；Ｄ（＋）−グルコース２０．０；リン酸水素二カリウム２．０；Ｔｗｅｅｎ（商標）８０  １．０；クエン酸三アンモニウム２．０；酢酸ナトリウム５．０；硫酸マグネシウム０．２；硫酸マンガン０．０４。
【００５３】
特定の実施形態では、培養上清は乳児用フォーミュラ又は他の栄養組成物に組み込まれる。分泌された細菌生成物の採取は、望ましくない成分を容易に培養培地から奪うことができないという問題を引き起こす。これは、具体的には、乳児用フォーミュラ又は臨床栄養等の比較的脆弱な対象に対する栄養製品に関する。培養上清に由来する特定成分を最初に単離し、精製した後、栄養製品に適用される場合、この問題は起こらない。しかしながら、より完全な培養上清を利用することが望ましい。これは、プロバイオティック（例えばＬＧＧ）の本来の作用をよりよく反映する組成物を提供する役割を果たす。
【００５４】
したがって、ＬＧＧ培養から採取される組成物は、かかるフォーミュラにおいて、望ましくない又は一般的には許容可能ではない（培養培地中に存在し得る）成分を含まないことが保証されることが望ましい。ＭＲＳブロス中に通常存在するポリソルベートに関して、細菌の培養用培地は、例えばポリエトキシル化ソルビタン及びオレイン酸（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０等のＴｗｅｅｎ（商標）ポリソルベートとして典型的に入手可能）に基づき、乳化非イオン界面活性剤を含んでもよい。これらの界面活性剤は食品、例えばアイスクリームでしばしば見られ、一般に安全と認められるが、全ての管轄において望ましくないとされ、又は更には乳児用フォーミュラ又は臨床栄養等、比較的脆弱な対象に対する栄養製品における使用については許容可能ではないとされる。
【００５５】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の好ましい培養培地は、Ｔｗｅｅｎ  ８０等のポリソルベートを欠く。本開示及び／又はその実施形態の好ましい実施形態では、培養培地は、オレイン酸、アマニ油、オリーブ油、ナタネ油、ヒマワリ油、及びそれらの混合物からなる群から選択される油性原料を含んでもよい。ポリソルベート界面活性剤の存在が本質的に又は完全に回避される場合、油性原料の十分な利益が達成されると理解される。
【００５６】
より詳しくは、特定の実施形態では、ＭＲＳ培地はポリソルベートを欠く。また好ましくは、培地は、前述の１以上の油に加えて、ペプトン（典型的に０ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、特に０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ）、肉抽出物（典型的に０ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ、特に０．１ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（典型的には４ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌ）、Ｄ（＋）グルコース（典型的には２０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌ）、リン酸水素二カリウム（典型的には２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム三水和物（典型的に４ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ）、クエン酸三アンモニウム（典型的には２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（典型的には０．２ｇ／Ｌ〜０．４ｇ／Ｌ）、及び／又は硫酸第一マンガン四水和物（典型的には０．０５ｇ／Ｌ〜０．０８ｇ／Ｌ）を含む。
【００５７】
培養は、一般に２０℃〜４５℃、より詳しくは３５℃〜４０℃、より詳しくは３７℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、培養物は、ｐＨ５〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ６のｐＨ等の中性ｐＨを有する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、培養上清を採取するための培養中の、すなわち、前述の指数期後期における時間点を、例えばＯＤ６００ｎｍ及びグルコース濃度に基づいて決定することができる。ＯＤ６００は、培養培地中の細菌濃度と直接関連する既知の密度測定法である６００ｎｍでの光学密度を指す。
【００５９】
培養上清を、細菌培養物からの培養上清の分離のための任意の既知の技術によって採取することができる。かかる技術は、当該技術分野技術において知られており、例えば遠心分離、濾過、沈澱等が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＬＧＧ細胞は０．２２μｍの濾過滅菌を使用して培養上清から除去される。このように得られたプロバイオティック可溶性メディエーター調剤を直ちに使用してもよく、又は将来の使用のため保管してもよい。後者の場合、該調剤を一般には冷蔵する、凍結する、又は凍結乾燥する。該調剤を、所望に応じて濃縮又は希釈してもよい。
【００６０】
可溶性メディエーター調剤は、アミノ酸、オリゴペプチド及びポリペプチド、並びに様々な分子量のタンパク質の混合物を含むと考えられる。上記組成物は、多糖構造及び／又はヌクレオチドを含むと考えられる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性メディエーター調剤はより低分子量、一般に６ｋＤａ未満、又は更には５ｋＤａ未満の成分を除外する。これら及び他の実施形態では、可溶性メディエーター調剤は乳酸及び／又は乳酸塩を含まない。これらのより低分子量の成分を、例えば、濾過又はカラムクロマトグラフィーによって除去してもよい。いくつかの実施形態では、５ｋＤａ超の構成要素を保持するため、５ｋＤａ膜による限外濾過に培養上清を供する。他の実施形態では、６ｋＤａ超の構成要素を保持するため、カラムクロマトグラフィーを使用して培養上清を脱塩する。
【００６２】
本開示の可溶性メディエーター調剤は、小児対象への投与のため様々な方法で製剤化され得る。例えば、可溶性メディエーター調剤を、そのまま経口投与用カプセル剤に、若しくは飲料等の液体栄養組成物に組み込むことができ、又は更なる使用の前に加工されてもよい。一般的にはかかる加工は、一般に、上清の液体の連続相から化合物を分離することを含む。これは、噴霧乾燥又は凍結乾燥（真空凍結乾燥）等の乾燥法によって行われることが好ましい。噴霧乾燥法の好ましい実施形態では、噴霧乾燥の前に担体材料、例えばマルトデキストリンＤＥ２９を添加する。
【００６３】
本開示のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤等のプロバイオティック細菌可溶性メディエーター調剤は、腸バリア再生、腸バリアの成熟及び／又は順応、腸バリア抵抗性、及び／又は腸バリア機能を促進することにより、有利には腸バリア増強活性を持つ。したがって、本発明のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤は、短腸症候群又はＮＥＣ等の障害された腸バリア機能を有する対象、特に小児対象の治療に特に有用な可能性がある。可溶性メディエーター調剤は、障害された腸バリア機能及び／又は短腸症候群を有する乳児及び未熟児に特に有用な場合がある。
【００６４】
また、本開示のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤等のプロバイオティック細菌可溶性メディエーター調剤は、消化器痛、食物不耐性、アレルギー性又は非アレルギー性の炎症、疝痛、ＩＢＳ、及び感染を経験する対象、特に小児対象において有利に内臓痛感受性を軽減する。
【００６５】
本開示の可溶性メディエーター調剤に腸バリア又は内臓痛感受性に対するその有益な効果を発揮させるため、それらを必要とする対象によって可溶性メディエーター調剤は消化される。可溶性メディエーター調剤の投与の形態は重要ではない。いくつかの実施形態では、上記組成物は、錠剤、丸剤、カプセル封入、カプレット剤、ゲルキャップ剤、カプセル剤、オイルドロップ、又はサッシェによって対象に投与される。別の実施形態では、上記組成物は、糖、脂肪又は多糖内にカプセル封入される。
【００６６】
他の実施形態では、可溶性メディエーター調剤はフォローオンフォーミュラ、グローイングアップミルク、飲料、ミルク、ヨーグルト、果汁、果実系飲料、チュアブル錠、クッキー、クラッカー又は粉ミルク等の小児用栄養製品等の栄養組成物に組み込まれる。他の実施形態では、上記製品は、乳児用フォーミュラ又は人乳強化剤等の乳児の栄養製品であってもよい。可溶性メディエーター調剤が栄養組成物に組み込まれる場合、上記調剤は、いくつかの実施形態では、組み込みに先立って噴霧乾燥又は凍結乾燥される。
【００６７】
別々の剤形又は栄養製品によって添加されるかどうかにかかわらず、本開示のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤は、一般に腸再生の促進、腸成熟及び／又は順応の促進、腸バリア抵抗性の改善、及び／又は腸バリア機能の保護に有効な量で投与される。有効量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり１×１０4細胞〜約１×１０12細胞当量のプロバイオティック生菌が好ましく、１日当たり体重１ｋｇ当たり１０8細胞〜１０9細胞等量のプロバイオティック生菌がより好ましい。他の実施形態では、細胞当量の量は、１００ｋｃａｌ当たり約１×１０4〜１．５×１０10細胞当量のプロバイオティック（複数の場合がある）で変化し得る。いくつかの実施形態では、プロバイオティック細胞当量の量は、栄養組成物１００ｋｃａｌ当たり約１×１０6細胞〜約１×１０9細胞当量のプロバイオティック（複数の場合がある）であってもよい。特定の他の実施形態では、プロバイオティック細胞当量の量は、栄養組成物１００ｋｃａｌ当たり約１×１０7細胞〜約１×１０8細胞当量のプロバイオティック（複数の場合がある）であってもよい。細胞当量は、更なる加工のため上清を分離する前のＬＧＧ培養の終点におけるＬＧＧ細胞の数に基づく。
【００６８】
一の実施形態では、可溶性メディエーター調剤は、（ａ）バッチプロセスを使用する好適な培養培地での培養にＬＧＧ等のプロバイオティックを供する工程、（ｂ）培養工程の指数増殖期後期に培養上清を採取する工程であって、指数増殖期後期はバッチ培養プロセスの誘導期と静止期の間の後半に関して定義される工程、（ｃ）任意に、５キロダルトン（ｋＤａ）〜６ｋＤａ超の分子量の構成要素を保持するように、上清から低分子量の構成要素を除去する工程、（ｄ）０．２２μｍの濾過滅菌を使用して細胞を除去する工程、（ｅ）上記組成物を得るように、可溶性メディエーター調剤から液体内容物を除去する工程、を含むプロセスによって入手可能である。
【００６９】
また、本発明のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤は、ラクトフェリンと共に投与されてもよい。ラクトフェリンは、種に応じて１−４グリカンを含む約８０ｋＤの一本鎖ポリペプチドである。異なる種のラクトフェリンの３Ｄ構造は非常に類似するが同一ではない。各ラクトフェリンは、それぞれ分子のＮ末端部分とＣ末端部分を指す、Ｎ−ローブ及びＣ−ローブと呼ばれる２つの相同性のローブを含む。各ローブは、更に、第二鉄イオン（Ｆｅ3+）が（重）炭酸塩陰イオンと相乗的に協働して堅く結合する裂溝を形成する、２つのサブローブ又はドメインからなる。これらのドメインは、それぞれＮ１、Ｎ２、Ｃ１及びＣ２と呼ばれる。ラクトフェリンのＮ末端は、多くの重要な結合特性を担う強力な陽イオン性ペプチド領域を有する。ラクトフェリンは非常に高い等電点（約ｐＩ  ９）を有し、その陽イオン性の性質は、細菌性、ウイルス性、及び菌類の病原体に対して防御するその能力に主な役割を果たす。ラクトフェリンのＮ末端領域内にいくつかの陽イオン性アミノ酸残基のクラスタがあり、広範囲の微生物に対するラクトフェリンの生物学的活性を媒介する。例えば、ヒトラクトフェリンのＮ末端残基１〜残基４７（ウシラクトフェリンの１〜４８）は、ラクトフェリンの鉄非依存性の生物学的活性に決定的である。ヒトラクトフェリンでは、残基２〜残基５（ＲＲＲＲ）（配列番号１）及び残基２８〜残基３１（ＲＫＶＲ）（配列番号２）は、ラクトフェリンの抗菌活性に特に決定的なＮ末端中のアルギニンに富んだ陽イオンドメインである。Ｎ末端の類似領域がウシラクトフェリンに見られる（残基１７〜残基４２；ＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲＡＦＡ）（配列番号３）。
【００７０】
「Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｐｐ  ２７５−２８１（２００６））に記載されるように、異なる宿主種に由来するラクトフェリンは、それらのアミノ酸配列において異なってもよいが、内部のローブの末端領域の正に帯電したアミノ酸と共に、一般に比較的高い等電点を持つ。本開示における使用に適した非ヒトラクトフェリンとして、限定されないが、ヒトラクトフェリンのアミノ酸配列と少なくとも４８％の相同性を有するものが挙げられる。例えば、ウシラクトフェリン（「ｂＬＦ」）はヒトラクトフェリンのそれに対して約７０％の配列相同性を有するアミノ酸組成を有する。いくつかの実施形態では、非ヒトラクトフェリンは、ヒトラクトフェリンと少なくとも５５％の相同性、いくつかの実施形態では少なくとも６５％の相同性を有する。本開示における使用に対して許容可能な非ヒトラクトフェリンとして、限定されずに、ｂＬＦ、ブタラクトフェリン、ウマラクトフェリン、バッファローラクトフェリン、ヤギラクトフェリン、マウスラクトフェリン、及びラクダラクトフェリンが挙げられる。特定の実施形態では、ラクトフェリンはｂＬＦである。
【００７１】
一の実施形態では、ラクトフェリンは、約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約２００ｍｇ／１００Ｋｃａｌの範囲の量で栄養組成物中に存在する。特定の実施形態では、ラクトフェリンは、約１５ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約１００ｍｇ／１５０ｋｃａｌの範囲の量で存在する。更に別の実施形態では、特に栄養組成物が乳児用フォーミュラである場合、ラクトフェリンは、約６０ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約１５０ｍｇ／１００ｋｃａｌ、又は約６０ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約１００ｍｇ／１００ｋｃａｌの範囲の量で栄養組成物中に存在する。
【００７２】
特定の実施形態で使用されるｂＬＦは、全乳から単離される任意のｂＬＦであってもよく、及び／又は少ない体細胞数を有していてもよく、ここで、「少ない体細胞数」は、２００，０００細胞／ｍＬ未満の体細胞数を指す。例として、好適なｂＬＦは、ニュージーランド国モリンズビルのＴａｔｕａ  Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．から、オランダ国アーメルスフォールトのＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ  Ｄｏｍｏから、又はニュージーランド国オークランドのＦｏｎｔｅｒｒａ  Ｃｏ−Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｔｅｄから入手可能である。
【００７３】
本開示における使用に対するラクトフェリンは、例えば、非ヒト動物の乳から単離されてもよく、遺伝子修飾された生物によって産生されてもよい。例えば、その全体が参照により援用される米国特許第４，７９１，１９３号において、Ｏｋｏｎｏｇｉらは高純度でウシラクトフェリンを製造するプロセスを開示する。一般に、開示されるプロセスは３つの工程を含む。生乳材料を、最初に弱酸性陽イオン交換剤と接触させてラクトフェリンを吸収した後、非吸収物質を除去するために洗浄が行われる第２の工程が続く。ラクトフェリンを除去して精製されたウシラクトフェリンを製造する場合、脱着工程が続く。他の方法は、米国特許第７，３６８，１４１号、第５，８４９，８８５号、第５，９１９，９１３号、及び第５，８６１，４９１号に記載される工程を含んでもよく、それらの開示は、いずれもそれら全体が参照により援用される。
【００７４】
特定の実施形態では、本開示で利用されるラクトフェリンは、乳源（ｍｉｌｋ  ｓｏｕｒｃｅ）からタンパク質を単離するための拡張床吸着（「ＥＢＡ」）プロセスによって提供されてもよい。時に安定化流動床吸着とも呼ばれるＥＢＡは、粒状マトリクスを含む拡張床吸着カラムを確立すること、乳源を該マトリクスに適用すること、及び約０．３Ｍ〜約２．０Ｍの塩化ナトリウムを含む溶離バッファーによりマトリクスからラクトフェリンを溶出することを含む、ラクトフェリン等の乳タンパク質を乳源から単離するプロセスである。任意の哺乳動物の乳源を本発明のプロセスにおいて使用してもよいが、特定の実施形態では、乳源はウシ乳源である。乳源は、いくつかの実施形態では、全乳、脂肪減少乳（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆａｔ  ｍｉｌｋ）、スキムミルク、ホエイ、カゼイン、又はそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、上記プロセスは、粒状マトリクスを含む拡張床吸着カラムを確立する工程、マトリクスに乳源を適用する工程、及び約０．３Ｍ〜約２．０Ｍの塩化ナトリウムでマトリクスからラクトフェリンを溶出する工程を含む。他の実施形態では、ラクトフェリンは約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの塩化ナトリウムにより溶出されるが、更なる実施形態では、ラクトフェリンは約０．７Ｍ〜約０．９Ｍの塩化ナトリウムにより溶出される。
【００７５】
拡張床吸着カラムは、それらの開示が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，８１２，１３８号、第６，６２０，３２６号、及び第６，９７７，０４６号に記載されるもの等の当該技術で知られている任意のものであってもよい。いくつかの実施形態では、乳源は拡張モードのカラムに適用され、溶離は拡張モード又は充填モードのいずれかで行われる。特定の実施形態では、溶離は拡張モードで行われる。例えば、拡張モードにおける拡張比は、約１対約３、又は約１．３対約１．７であってもよい。ＥＢＡ技術は、それらの全体が参照により本明細書に援用される、国際特許出願公開第９２／００７９９号、国際特許出願公開第０２／１８２３７号、国際特許出願公開第９７／１７１３２号に更に記載される。
【００７６】
また、本開示の栄養組成物はＤＨＡを含む。ＤＨＡは、いくつかの実施形態では、約５ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約７５ｍｇ／１００ｋｃａｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約５０ｍｇ／１００ｋｃａｌの範囲の量で存在する。ＤＨＡはＬＣＰＵＦＡの任意の供給源から提供され得る。本発明の組成物の特定の実施形態において存在し得る他の好適なＬＣＰＵＦＡとして、限定されないが、α−リノール酸、γ−リノール酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びアラキドン酸（ＡＲＡ）が挙げられる。
【００７７】
一の実施形態、特に栄養組成物が乳児用フォーミュラである場合、栄養組成物はＤＨＡ及びＡＲＡの両方で補足される。この実施形態では、ＡＲＡ：ＤＨＡの重量比は、約１：３〜約９：１であってもよい。特定の実施形態では、ＡＲＡ：ＤＨＡ比は約１：２〜約４：１である。
【００７８】
栄養組成物は、当該技術分野で知られている標準的な技術を使用してＤＨＡ及び／又はＡＲＡを含む油で補足されてもよい。例えば、ＤＨＡ及びＡＲＡは、上記組成物中に通常存在するハイオレイックヒマワリ油等の等量の油を置換することにより組成物に添加されてもよい。別の例として、ＤＨＡ及びＡＲＡを含む油は、ＤＨＡ及びＡＲＡを含まない組成物中に通常存在する残りの脂肪ブレンド全体の等量を置換することによって該組成物に添加されてもよい。
【００７９】
ＤＨＡ及びＡＲＡの供給源は、存在する場合、海洋性油（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌ）、魚油、単細胞オイル、卵黄脂質及び脳脂質等の当該技術分野で知られている任意の供給源であってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＨＡ及びＡＲＡは、単細胞のＭａｒｔｅｋ油、ＤＨＡＳＣＯ（商標）及びＡＲＡＳＣＯ（商標）、又はその変形物から供給される。残りのＬＣＰＵＦＡ供給源が乳児に対していかなる実質的な有害作用ももたらさない限り、ＤＨＡ及びＡＲＡは天然形態であってもよい。代替的には、ＤＨＡ及びＡＲＡを精製された形態で使用してもよい。
【００８０】
一の実施形態では、ＤＨＡ及びＡＲＡの供給源は、それらの開示全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，３７４，５６７号、第５，５５０，１５６号、及び第５，３９７，５９１号に教示される単細胞オイルである。しかしながら、本開示はかかる油だけに制限されない。
【００８１】
また、栄養組成物は、特定の実施形態では、１以上のプレバイオティクス（プレバイオティック成分とも呼ばれる）を含み得る。プレバイオティクスは限定されないが、１又は限定的な数の有益な腸内細菌の生育及び／又は活性の選択的な賦活、摂取されたプロバイオティック微生物の生育及び／又は活性の賦活、腸病原体の選択的減少、並びに腸短鎖脂肪酸プロファイルに対する好都合な影響を含み得る、健康上の利益を発揮する。かかるプレバイオティクスは、かかる新たな供給源が現在知られているか、又は今後開発されるかにかかわらず、天然であっても、合成であってもよく、又は生物及び／又は植物の遺伝子操作によって開発されてもよい。本開示において有用なプレバイオティクスとして、オリゴ糖、多糖、並びにフルクトース、キシロース、ダイズ（ｓｏｙａ）、ガラクトース、グルコース及びマンノースを含む他のプレバイオティクスが挙げられ得る。
【００８２】
より具体的には、本開示において有用なプレバイオティクスとして、ポリデキストロース、ポリデキストロース粉末、ラクトース、ラクツロース、ラクトスクロ−ス、ラフィノース、グルコオリゴ糖、イヌリン、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ダイズオリゴ糖、ラクトスクロース、キシロオリゴ糖、キトオリゴ糖、マンノオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、シアリルオリゴ糖、フコオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、及びゲンチオオリゴ糖が挙げられ得る。
【００８３】
一の実施形態では、栄養組成物中に存在するプレバイオティクスの総量は、該組成物の約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌであってもよい。より好ましくは、栄養組成物中に存在するプレバイオティクスの総量は、該組成物の約２．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌであってもよい。いくつかの実施形態では、栄養組成物中に存在するプレバイオティクスの総量は、約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約１ｇ／１００ｋｃａｌであってもよい。特定の実施形態では、栄養組成物中に存在するプレバイオティクスの総量は、約０．３ｇ／１００ｋｃａｌ〜約０．７ｇ／１００ｋｃａｌであってもよい。さらに、栄養組成物は、ＰＤＸを含むプレバイオティック成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プレバイオティック成分は、少なくとも２０％重量／重量のＰＤＸ、ＧＯＳ又はそれらの混合物を含む。
【００８４】
栄養組成物中のＰＤＸの量は、一の実施形態では、約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約１ｇ／１００ｋｃａｌの範囲にあり得る。別の実施形態では、ポリデキストロースの量は、約０．２ｇ／１００ｋｃａｌ〜約０．６ｇ／１００ｋｃａｌの範囲にある。更に別の実施形態では、栄養組成物中のＰＤＸの量は、約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約０．５ｇ／１００ｋｃａｌであってもよい。
【００８５】
また、プレバイオティック成分は、いくつかの実施形態ではＧＯＳを含む。栄養組成物中のＧＯＳの量は、一の実施形態では、約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約１．０ｇ／１００ｋｃａｌであってもよい。別の実施形態では、栄養組成物中のＧＯＳの量は、約０．２ｇ／１００ｋｃａｌ〜約０．５ｇ／１００ｋｃａｌであってもよい。更に別の実施形態では、栄養組成物中のＧＯＳの量は、約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約０．５ｇ／１００ｋｃａｌであってもよい。
【００８６】
ＰＤＸ及びＧＯＳは腸−脳免疫軸（ｇｕｔ−ｂｒａｉｎ−ｉｍｍｕｎｅ  ａｘｉｓ）によって脳の発達に有益な効果を有することから、存在する場合、相乗的に作用して脳の発達、特にニューロンの成熟を増強すると更に考えられる。
【００８７】
本開示の栄養組成物は、少なくとも１つのタンパク質源を含んでもよい。タンパク質源は、当該技術分野において使用されるもののいずれか、例えば脱脂乳、ホエイタンパク質、カゼイン、ダイズタンパク質、加水分解されたタンパク質、アミノ酸等であってもよい。本開示の実施に有用なウシ乳タンパク質源として、限定されないが、乳タンパク質粉末、乳タンパク質濃縮物、乳タンパク質単離物、脱脂乳固体、脱脂乳、脱脂粉乳、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質単離物、ホエイタンパク質濃縮物、スイートホエイ、酸ホエイ、カゼイン、酸カゼイン、カゼイネート（例えばカゼイン酸ナトリウム、ナトリウムカゼインカルシウム、カゼインカルシウム）、及びそれら任意の組み合わせが挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、栄養組成物のタンパク質はインタクトタンパク質として提供される。他の実施形態では、タンパク質はインタクトタンパク質と加水分解されたタンパク質の両方の組み合わせとして提供される。特定の実施形態では、タンパク質は部分的に加水分解されてもよく、広範囲に加水分解されてもよい。更に他の実施形態では、タンパク質源はアミノ酸を含む。更に別の実施形態では、タンパク質源はグルタミン含有ペプチドで補足されてもよい。
【００８９】
別の実施形態では、タンパク質成分は広範囲に加水分解されたタンパク質を含む。更に別の実施形態では、栄養組成物のタンパク質成分は、食物アレルギーの発生を最小限にするために広範囲に加水分解されたタンパク質から本質的になる。更に別の実施形態では、タンパク質源はグルタミン含有ペプチドで補足されてもよい。
【００９０】
一部の人々はインタクトタンパク質、すなわちインタクト牛乳タンパク質又はインタクトダイズタンパク質単離物系フォーミュラ等に存在する全タンパク質にアレルギー又は感受性を呈する。タンパク質のアレルギー又は感受性を有するこれらの人々の多くは、加水分解されたタンパク質に耐容性を示すことができる。加水分解産物フォーミュラ（セミエレメンタルフォーミュラとも呼ばれる）は、加水分解されているか、又は短いペプチドフラグメント及びアミノ酸に分解され、その結果より容易に消化される、タンパク質を含む。タンパク質の感受性又はアレルギーを有する人々において、免疫系関連アレルギー又は感受性は、しばしば、皮膚、呼吸、又は嘔吐及び下痢等の胃腸症状をもたらす。インタクトタンパク質フォーミュラに反応を示す人々は、彼らの免疫系が加水分解されたタンパク質を、それらの症状を引き起こすインタクトタンパク質として認識しないことから、しばしば加水分解タンパク質フォーミュラには反応しない。
【００９１】
したがって、いくつかの実施形態では、栄養組成物のタンパク質成分は、牛乳に由来するタンパク質等の部分的に又は広範囲に加水分解されたいずれかのタンパク質を含む。アレルギー反応、不耐性及び感作を減少させる目的で、有害な症状を引き起こすタンパク質のうちのいくつか又は大部分を分解するため、加水分解されたタンパク質を酵素で処理してもよい。さらに、タンパク質を当該技術分野で知られている任意の方法によって加水分解してもよい。
【００９２】
「タンパク質加水分解物」又は「加水分解されたタンパク質（加水分解タンパク質）」の用語は、本明細書において同義的に使用され、加水分解度が約２０％〜約８０％、又は約３０％〜約８０％、更には約４０％〜約６０％であってもよい、加水分解されたタンパク質を指す。加水分解度はペプチド結合が加水分解法によって破壊される程度である。栄養組成物の加水分解されたタンパク質成分を特性評価する目的のため、タンパク質加水分解の程度は、選択された製剤のタンパク質成分のアミノ窒素対全窒素の比（ＡＮ／ＴＮ）を定量することにより、製剤技術分野の当業者によって容易に特定される。アミノ窒素成分はアミノ窒素含有量を特定するＵＳＰ滴定法によって定量されるのに対し、全窒素成分はケルダール法によって特定され、いずれも分析化学の分野の当業者によく知られている。
【００９３】
タンパク質中のペプチド結合が酵素加水分解によって破壊される場合、破壊された各ペプチド結合に対して１つのアミノ基が放出され、アミノ窒素の増加をもたらす。加水分解されていないタンパク質であっても、いくつかの露出したアミノ基を含むであろうことに留意すべきである。また、加水分解されたタンパク質は、それらが形成された加水分解されていないタンパク質とは異なった分子量分布を有する。加水分解されたタンパク質の機能的及び栄養的な特性は、種々のサイズのペプチドによって影響を受ける可能性がある。分子量プロファイルは、分子量（ダルトン単位）画分の特定の範囲の重量パーセントを一覧することにより通常与えられる（例えば２，０００ダルトン〜５，０００ダルトン、５，０００ダルトン超）。
【００９４】
先に言及されるように、全タンパク質又はインタクトタンパク質に感受性を示す人は、加水分解されたタンパク質を含む栄養フォーミュラの摂取により利益を得ることができる。かかる感受性の人は、特に低アレルギー性フォーミュラの摂取により利益を得る可能性がある。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本開示の栄養組成物は、添加されたラクトフェリン以外のインタクトタンパク質を実質的に含まない。この文脈において、「実質的に含まない」の用語は、本明細書において好ましい実施形態が、著しく低濃度のインタクトタンパク質を含むことから、フォーミュラを低アレルギー性とすることを意味する。本開示による栄養組成物が実質的にインタクトタンパク質を含まず、したがって低アレルギー性である程度は、アメリカ小児科学会の２０００年８月の年次報告書によって特定され、ここで、低アレルギー性フォーミュラは、適切な臨床研究において、前向き無作為化、二重盲検、プラセボ比較試験で与えられた場合に９５％の信頼度で確認された牛乳アレルギーの乳児又は小児達の９０％において反応を引き起こさないことを実証するものと定義される。
【００９６】
食物アレルギー及び／又は乳タンパク質アレルギーを有する乳児等の小児対象に対する別の選択肢は、アミノ酸に基づくタンパク質を含まない栄養組成物である。アミノ酸はタンパク質の基本構造の構築単位である。タンパク質を予め完全に消化することによってそれらの基本化学構造までタンパク質を破壊することは、アミノ酸系フォーミュラを利用可能な最も低アレルギー性の製剤とする。
【００９７】
特定の実施形態では、栄養組成物はタンパク質を含まず、タンパク質等量の供給源として（ラクトフェリンに加えて）遊離アミノ酸を含む。この実施形態では、アミノ酸は、限定されないが、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、カルニチン、タウリン及びそれらの混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は分枝鎖アミノ酸であってもよい。他の実施形態では、小さなアミノ酸ペプチドが栄養組成物のタンパク質成分として含まれてもよい。かかる小さなアミノ酸ペプチドは天然であってもよく、又は合成されてもよい。栄養組成物中の遊離アミノ酸の量は、約１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約５ｇ／１００ｋｃａｌで変化してもよい。一の実施形態では、遊離アミノ酸の１００％が５００ダルトン未満の分子量を有する。この実施形態では、栄養製剤は低アレルギー性である可能性がある。
【００９８】
栄養組成物の特定の実施形態では、タンパク質源のホエイ：カゼイン比はヒト母乳で見られるものに類似する。一の実施形態では、タンパク質源は、約４０％〜約８５％のホエイタンパク質、及び約１５％〜約６０％のカゼインを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、栄養組成物は、１００ｋｃａｌ当たり約１ｇ〜約７ｇのタンパク質、及び／又はタンパク質当量の供給源を含む。他の実施形態では、栄養組成物は、１００ｋｃａｌ当たり約３．５ｇ〜約４．５ｇのタンパク質、又はタンパク質当量を含む。
【０１００】
本開示の栄養組成物は、例えばワキシーコーンスターチ、もち米デンプン、コーンスターチ、米デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、小麦デンプン、又はそれらの任意の混合物等の天然の又は修飾されたデンプンを含んでもよい。一般に、一般的なコーンスターチが約２５％のアミロースを含むのに対し、ワキシーコーンスターチはほぼ全体的にアミロペクチンで構成される。一方、ジャガイモデンプンは、一般に約２０％のアミロースを含み、米デンプンは約２０：８０のアミロース：アミロペクチン比を含み、もち米デンプンはわずか約２％のアミロースを含む。さらに、タピオカデンプンは、一般に、約１５％〜約１８％のアミロースを含み、小麦デンプンはおよそ２５％のアミロース含有量を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、栄養組成物は、ゼラチン化された、及び／又は予めゼラチン化されたワキシーコーンスターチを含む。他の実施形態では、栄養組成物は、ゼラチン化された、及び／又は予めゼラチン化されたタピオカデンプンを含む。また、他のゼラチン化された又は予めゼラチン化された、米デンプン又はジャガイモデンプン等のデンプンを使用してもよい。
【０１０２】
さらに、いくつかの実施形態では、本開示の栄養組成物は、少なくとも１つのペクチン源を含む。ペクチンの供給源は、当該技術分野において知られている任意の種類又はグレードのペクチンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペクチンは５０％未満のエステル化度を有し、低メチル化（「ＬＭ」）ペクチンとして分類される。いくつかの実施形態では、ペクチンは５０％以上のエステル化度を有し、高エステル又は高メチル化（「ＨＭ」）ペクチンとして分類される。更に他の実施形態では、ペクチンは非常に低い（「ＶＬ」）ペクチンであり、およそ１５％未満のエステル化度を有する。さらに、本開示の栄養組成物は、ＬＭペクチン、ＨＭペクチン、ＶＬペクチン、又はそれらの任意の混合物を含んでもよい。上記栄養組成物は、水溶性ペクチンを含んでもよい。また、当該技術分野において知られているように、ペクチン溶液の溶解度及び粘度は、分子量、エステル化度、ペクチン調剤の濃度、並びにｐＨ及び対イオンの存在と関連する。
【０１０３】
本明細書における使用に対するペクチンは、典型的には８，０００ダルトン以上のピーク分子量を有する。本開示のペクチンは、８，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンの好ましいピーク分子量を有し、約１０，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンのピーク分子量がより好ましく、約１５，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトンのピーク分子量が最も好ましい。いくつかの実施形態では、本開示のペクチンは加水分解されたペクチンであってもよい。特定の実施形態では、栄養組成物は、インタクト又は非修飾ペクチンの分子量未満の分子量を有する加水分解されたペクチンを含む。分子量を減少するために当該技術分野において知られている任意の手段によって、本開示の加水分解されたペクチンを作製することができる。上記手段の例は、化学的加水分解、酵素加水分解及び機械的剪断である。分子量を減少させる好ましい手段は、高温でのアルカリ加水分解又は中性加水分解による。いくつかの実施形態では、栄養組成物は部分加水分解されたペクチンを含む。特定の実施形態では、部分加水分解されたペクチンは、インタクト又は非修飾ペクチン未満であるが３，３００ダルトン超の分子量を有する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、栄養組成物は、最大約２０％重量／重量のデンプンとペクチンの混合物を含む。いくつかの実施形態では、栄養組成物は最大約１９％デンプン及び最大約１％のペクチンを含む。他の実施形態では、栄養組成物は最大約１５％のデンプン及び最大約５％のペクチンを含む。更に別の実施形態では、栄養組成物は最大約１８％のデンプン及び最大約２％のペクチンを含む。いくつかの実施形態では、栄養組成物は約０．０５％重量／重量〜約２０％重量／重量のデンプンとペクチンの混合物を含む。他の実施形態は、約０．０５％重量／重量〜約１９％重量／重量のデンプンと、約０．０５％重量／重量〜約１％重量／重量のペクチンとを含む。さらに、栄養組成物は、約０．０５％重量／重量〜約１５％重量／重量のデンプンと、約０．０５％重量／重量〜約５％重量／重量のペクチンとを含んでもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、栄養組成物は、少なくとも１つの追加の炭水化物、すなわち前述のデンプン成分に加えて提供される炭水化物成分を含む。追加の炭水化物源は、例えばラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固体、マルトデキストリン、スクロース、デンプン、米シロップ固体等の当該技術において使用されるいずれであってもよい。栄養組成物中の追加の炭水化物成分の量は、典型的には約５ｇ／１００ｋｃａｌ〜約２５ｇ／１００ｋｃａｌで変化してもよい。いくつかの実施形態では、炭水化物の量は、約６ｇ／１００ｋｃａｌ〜約２２ｇ／１００ｋｃａｌである。他の実施形態では、炭水化物の量は、約１２ｇ／１００ｋｃａｌ〜約１４ｇ／１００ｋｃａｌである。いくつかの実施形態では、コーンシロップ固体が好ましい。さらに、加水分解された、部分加水分解された、及び／又は広範囲に加水分解された炭水化物は、それらの容易な消化性により栄養組成物への包含が望ましい場合がある。具体的には、加水分解された炭水化物はアレルギー性エピトープを含む可能性が低い。
【０１０６】
本明細書における使用に適した炭水化物材料の非限定的な例として、トウモロコシ、タピオカ、米又はジャガイモを供給源とする、加水分解された又はインタクトの、天然の又は化学修飾された、ワキシー（ｗａｘｙ）形態又は非ワキシー形態のデンプンが挙げられる。好適な炭水化物の非限定的な例として、加水分解されたコーンスターチ、マルトデキストリン、マルトース、コーンシロップ、デキストロース、コーンシロップ固体、グルコースとして特徴づけられる様々な加水分解されたデンプン、及び様々な他のグルコースポリマー、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。他の好適な炭水化物の非限定的な例として、スクロース、ラクトース、フルクトース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトオリゴ糖等の難消化性オリゴ糖としばしば呼ばれるもの、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０７】
本発明の組成物の特定の実施形態は、炭水化物源としてラクトースを含む。一の特定の実施形態では、栄養組成物の追加の炭水化物成分は１００％ラクトースで構成される。別の実施形態では、追加の炭水化物成分は約０％〜６０％のラクトースを含む。別の実施形態では、追加の炭水化物成分は約１５％〜５５％のラクトースを含む。更に別の実施形態では、追加の炭水化物成分は約２０％〜３０％のラクトースを含む。これらの実施形態では、残りの炭水化物源は、当該技術分野で知られている任意の炭水化物であってもよい。一の実施形態では、炭水化物成分は約２５％のラクトースと、約７５％のコーンシロップ固体とを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、栄養組成物はシアル酸を含む。シアル酸は、いずれもノイラミン酸の誘導体である、５０を超えるメンバーの９炭素糖のファミリーである。ヒトで発見された主なシアル酸ファミリーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸サブファミリーに由来する。シアル酸はウシ及びヤギ等の乳に見られる。哺乳動物では、ニューロンの細胞膜は、他の体細胞膜と比較して最も高濃度のシアル酸を有する。また、シアル酸残基は、ガングリオシドの成分である。
【０１０９】
上記栄養組成物に含まれる場合、シアル酸は、約０．５ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約４５ｍｇ／１００ｋｃａｌの量で存在してもよい。いくつかの実施形態では、シアル酸は約５ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約３０ｍｇ／１００ｋｃａｌの量で存在してもよい。更に他の実施形態では、シアル酸は約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約２５ｍｇ／１００ｋｃａｌの量で存在してもよい。
【０１１０】
本発明の栄養組成物は、β−グルカンの供給源を含んでもよい。グルカンは、多糖、具体的にはグルコースのポリマーであり、天然起源で、細菌、酵母、菌類、及び植物の細胞壁に見られる場合がある。ベータグルカン（β−グルカン）はそれら自体がグルコースポリマーの多様なサブセットであり、ベータ型グリコシド結合によって共に連結されて複合炭水化物を形成する、グルコース単量体の鎖で構成される。
【０１１１】
β−１，３−グルカンは、例えば酵母、キノコ、細菌、藻類又は穀類から精製された炭水化物ポリマーである。（Ｓｔｏｎｅ  ＢＡ，Ｃｌａｒｋｅ  ＡＥ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ（１−３）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ；１９９３．）β−１，３−グルカンの化学構造は、β−１，３−グルカンの供給源に依存する。さらに、溶解度、一次構造、分子量及び分岐等の様々な生理化学的パラメーターが、β−１，３−グルカンの生物学的活性に役割を果たす。（Ｙａｄｏｍａｅ  Ｔ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｂｅｔａ−１，３−ｇｌｕｃａｎｓ．Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ．２０００；１２０：４１３−４３１．）
【０１１２】
β−１，３−グルカンは、様々な植物、酵母、菌類、及び細菌の細胞壁に見られるβ−１，６−グルコース側鎖を有する又はそれを有しない、天然の多糖である。β−１，３；１，６−グルカンは、（１，６）位（複数の場合がある）に付着した側鎖を有する（１，３）連結を伴うグルコース単位を含むものである。β−１，３；１，６−グルカンは、この骨格から伸びるβ−１，６−連結グルコース分岐鎖とのβ−１，３結合によって連結される直鎖グルコース単位の骨格を含む、構造共通性を共有する不均質な一群のグルコースポリマーである。これは現在記載されるβ−グルカンのクラスに関する基本構造であるが、いくつかの変形が存在し得る。例えば特定の酵母β−グルカンは、β（１，６）分岐鎖から伸びるβ（１，３）分岐の追加の領域を有し、それらの各構造に更なる複雑性を付与する。
【０１１３】
パン酵母であるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するβ−グルカンは、１位と６位に付着したグルコースの側鎖を有する、１位と３位で接続されたＤ−グルコース分子の鎖で構成される。酵母由来β−グルカンは、一般には６個〜８個のグルコース単位の長さのβ−１，６側鎖が散在する、β−１，３骨格を有するグルコース単位の直鎖の一般構造を有する、不溶性で繊維様の複合糖である。より具体的には、パン酵母に由来するβ−グルカンは、ポリ（１，６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１，３）−β−Ｄ−グルコピラノースである。
【０１１４】
さらにβ−グルカンは十分耐容性であり、小児対象において過剰なガス、腹部膨満、膨張、又は下痢を生じない又は引き起こさない。乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は別の小児用栄養製品等の小児対象に対する栄養組成物へのβ−グルカンの添加は、病原体の侵入に対する抵抗性を増加させることによって対象の免疫反応を改善し、したがって、全体的な健康を維持する又は改善する。
【０１１５】
本開示の栄養組成物は、β−グルカンを含む。いくつかの実施形態では、β−グルカンはβ−１，３；１，６−グルカンである。いくつかの実施形態では、β−１，３；１，６−グルカンはパン酵母に由来する。栄養組成物は、全グルカン粒子β−グルカン、粒状β−グルカン、ＰＧＧ−グルカン（ポリ−１，６−β−Ｄ−グルコピラノシル−１，３−β−Ｄ−グルコピラノース）又はそれらの任意の混合物を含んでもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、上記組成物中に存在するβ−グルカンの量は、組成物１００ｇ当たり約０．０１０ｇ〜約０．０８０ｇである。他の実施形態では、栄養組成物は、一食分当たり約１０ｍｇ〜約３０ｍｇのβ−グルカンを含む。別の実施形態では、栄養組成物は、一食分８液量オンス（２３６．６ｍｌ）当たり約５ｍｇ〜約３０ｍｇのβ−グルカンを含む。他の実施形態では、栄養組成物は、１日当たり約１５ｍｇ〜約９０ｍｇのβ−グルカンを提供するのに十分な量のβ−グルカンを含む。栄養組成物は、１日を通して対象に送達される標的量のβ−グルカンに達するように、複数用量で送達されてもよい。いくつかの実施形態では、栄養組成物中のβ−グルカンの量は、１００ｋｃａｌ当たり約３ｍｇ〜約１７ｍｇである。別の実施形態では、β−グルカンの量は１００ｋｃａｌ当たり約６ｍｇ〜約１７ｍｇである。
【０１１７】
イノシトールの栄養補足が、用量依存的な方法でオリゴデンドロサイトの生存及び増殖を促進する実現可能で有効なアプローチを表し、結果としてオリゴデンドロサイト前駆細胞数の一貫した増加をもたらすことがわかった。イノシトールによる栄養補足は、それによって脳発達に対する根本的な利益へと変換される、増強された発生的な髄鞘形成に対する利益を提供する。機能的な髄鞘形成の重要性を考慮すれば、イノシトールの栄養補足は、脳の発達及び健康を増強することにより小児対象に対して有益である。さらに、イノシトールの甘味は、小児科の消費者に対する嗜好性の点から更なる利点を提供する。
【０１１８】
そのため、特定の実施形態では、イノシトールは、少なくとも約４ｍｇ／１００ｋｃａｌのレベルで本開示の栄養組成物中に存在し、他の実施形態では、イノシトールは、約７０ｍｇ／１００ｋｃａｌ以下のレベルで存在すべきである。更に別の実施形態では、栄養組成物は約５ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約６５ｍｇ／１００ｋｃａｌのレベルでイノシトールを含む。更なる実施形態では、イノシトールは約７ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約５０ｍｇ／１００ｋｃａｌのレベルで栄養組成物中に存在する。さらに、イノシトールは外来イノシトール、又は生得的なイノシトールとして存在してもよい。実施形態では、イノシトールの主な画分（すなわち、少なくとも４０％）は、外来イノシトールである。特定の実施形態では、外来イノシトール対生得的なイノシトールの比率は、少なくとも５０：５０である；他の実施形態では、外来イノシトール対生得的なイノシトールの比率は少なくとも６０：４０である。
【０１１９】
また、１以上のビタミン及び／又はミネラルが、対象の１日栄養要求量を供給するのに十分な量で栄養組成物に添加されてもよい。ビタミン及びミネラルの要求量は、例えば小児の年齢によって異なるであろうことは、当業者によって理解される。例えば、乳児は、１歳〜１３歳の小児とは異なるビタミン及びミネラルの要求量を有する場合がある。したがって、上記実施形態は、栄養組成物を特定の年齢集団に限定するものではなく、むしろ許容可能なビタミン及びミネラルの成分の範囲を提供することを意図するものである。
【０１２０】
任意に、栄養組成物は、限定されないが、１以上の以下のビタミン又はその誘導体を含み得る：ビタミンＢ1（チアミン、チアミンピロホスフェート、ＴＰＰ、チアミン三リン酸、ＴＴＰ、硝酸チアミン、チアミン硝酸塩）、ビタミンＢ2（リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮ、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＦＡＤ、ラクトフラビン、オボフラビン）、ビタミンＢ3（ナイアシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ナイアシンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤ、ニコチン酸モノヌクレオチド、ＮｉｃＭＮ、ピリジン−３−カルボキシル酸）、ビタミンＢ3−前駆体トリプトファン、ビタミンＢ6（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン塩酸塩）、パントテン酸（パントテナート、パンテノール）、葉酸塩（葉酸、フォラシン、プテロイルグルタミン酸）、ビタミンＢ12（コバラミン、メチルコバラミン、デオキシアデノシルコバラミン、シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバラミン）、ビオチン、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＡ（レチノール、レチニルアセテート、レチニルパルミテート、他の長鎖脂肪酸を有するレチニルエステル、レチナール、レチノイン酸、レチノールエステル）、ビタミンＤ（カルシフェロール、コレカルシフェロール、ビタミンＤ3、１，２５，−ジヒドロキシビタミンＤ）、ビタミンＥ（α−トコフェロール、α−酢酸トコフェロール、α−コハク酸トコフェロール、α−ニコチン酸トコフェロール、α−トコフェロール）、ビタミンＫ（ビタミンＫ1、フィロキノン、ナフトキノン、ビタミンＫ2、メナキノン−７、ビタミンＫ3、メナキノン−４、メナジオン、メナキノン−８、メナキノン８Ｈ、メナキノン−９、メナキノン９Ｈ、メナキノン−１０、メナキノン−１１、メナキノン−１２、メナキノン−１３）、コリン、イノシトール、β−カロチン、及びそれらの任意の組み合わせ。
【０１２１】
さらに、任意に栄養組成物は、限定されないが、以下の１以上のミネラル又はその誘導体を含んでもよい：ホウ素、カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、塩化物、クロム、塩化クロム、ピコリン酸クロム、銅、硫酸銅（ｃｏｐｐｅｒ  ｓｕｌｆａｔｅ）、グルコン酸銅、硫酸銅（ｃｕｐｒｉｃ  ｓｕｌｆａｔｅ）、フッ化物、鉄、カルボニル鉄、第二鉄、フマル酸第一鉄、正リン酸第二鉄、鉄粉（ｉｒｏｎ  ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）、多糖鉄（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｒｏｎ）、ヨウ化物、ヨウ素、マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、リン酸カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、セレン、硫黄、ナトリウム、ドクサートナトリウム、塩化ナトリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜鉛、酸化亜鉛、硫酸亜鉛、及びそれらの混合物。ミネラル化合物の非限定的で例示的な誘導体として、任意のミネラル化合物の塩、アルカリ塩、エステル、及びキレートが挙げられる。
【０１２２】
栄養組成物に、リン酸カルシウム、カルシウムグリセロールリン酸、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、及び亜セレン酸ナトリウム等の塩の形態で、ミネラルを添加してもよい。当該技術分野において知られているように、追加のビタミン及びミネラルを添加してもよい。
【０１２３】
一の実施形態では、栄養組成物は、一食分のビタミンＡ、ビタミンＣ及びビタミンＥ、亜鉛、鉄、ヨウ素、セレン及びコリン当たり、任意の所与の国の最大食事推薦量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ）の約１０％〜約５０％、又は一群の国々の平均食事推薦量の約１０％〜約５０％を含んでもよい。別の実施形態では、小児用栄養組成物は、一食分のビタミンＢ当たり、任意の所与の国の最大食事推薦量の約１０％〜３０％、又は一群の国々の平均食事推薦量の約１０％〜３０％を供給してもよい。更に別の実施形態では、小児用栄養製品中のビタミンＤ、カルシウム、マグネシウム、リン及びカリウムのレベルは、乳で見られる基準値に対応してもよい。他の実施形態では、小児用栄養組成物中の他の栄養素は、一食分当たり、任意の所与の国の最大食事推薦量の約２０％、又は一群の国々の平均食事推薦量の約２０％で存在してもよい。
【０１２４】
本開示の栄養組成物は、任意に次の香料、すなわち限定されないが、風味を付けた抽出物、揮発油、ココア又はチョコレート香料、ピーナッツバター香料、クッキークラム、バニラ、又は任意の商業的に入手可能な香料を含む、１以上の香料を含んでもよい。有用な香料の例として、限定されないが、純アニス抽出物、代用バナナ抽出物、代用チェリー抽出物、チョコレート抽出物、純レモン抽出物、純オレンジ抽出物、純ペパーミント抽出物、ハチミツ、代用パイナップル抽出物、代用ラム抽出物、代用イチゴ抽出物、若しくはバニラ抽出物；又はバーム剤油、ベイ油、ベルガモット油、セダーウッド油、チェリー油、シナモン油、チョウジ油、若しくはペパーミント油等の揮発油；ピーナッツバター、チョコレート香料、バニラクッキークラム、バタースコッチ、タフィー、及びそれらの混合物が挙げられる。香料の量は、使用される香料に応じて大きく変化する場合がある。当該術分野において知られているように、香味料の種類及び量を選択することができる。
【０１２５】
本開示の栄養組成物は、任意に、最終製品の安定性のため添加されることがある、１以上の乳化剤を含んでもよい。好適な乳化剤の例として、限定されないが、レシチン（例えば卵又はダイズに由来する）、アルファラクトアルブミン、及び／又はモノ−及びジ−グリセリド、並びにそれらの混合物が挙げられる。他の乳化剤は当業者に容易に明らかであり、好適な乳化剤（複数の場合がある）の選択は、部分的に製剤及び最終製品に依存する。
【０１２６】
また、本開示の栄養組成物は、製品の保存期間を延長するため、任意に１以上の防腐剤を含んでもよい。好適な防腐剤として、限定されないが、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、カルシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、及びそれらの混合物が挙げられる。
【０１２７】
本開示の栄養組成物は、任意に１以上の安定剤を含んでもよい。本開示の栄養組成物の実施に使用される好適な安定剤として、限定されないが、アラビアゴム、ガティガム（ｇｕｍ  ｇｈａｔｔｉ）、カラヤガム、トラガカントゴム、アガー、ファーセレラン、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、ペクチン、低メトキシルペクチン、ゼラチン、微結晶性セルロース、ＣＭＣ（ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、メチルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ＤＡＴＥＭ（モノ−及びジ−グリセリドのジアセチル酒石酸エステル）、デキストラン、カラギーナン、及びそれらの混合物が挙げられる。
【０１２８】
開示される栄養組成物（複数の場合がある）は、粉末、ゲル、懸濁液、ペースト、固体、液体、液体濃縮物、再構成可能な粉乳代用品又は即時使用可能な製品等の当該技術分野において知られている任意の形態で提供されてもよい。栄養組成物は、特定の実施形態では、栄養サプリメント、小児用栄養製品、乳児用フォーミュラ、人乳強化剤、グローイングアップミルク、又は乳児若しくは小児対象に対して設計された任意の他の栄養組成物を含む。本開示の栄養組成物は、例えば、食品、飲料、錠剤、カプセル剤、及び粉末を含む、例えば経口摂取用の健康促進物質を含む。さらに、本開示の栄養組成物は、特定のカロリー含有量に標準化されてもよく、該組成物は、即時使用可能な製品として提供されてもよく、又は濃縮形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、５μｍ〜１５００μｍの範囲、より好ましくは１０μｍ〜３００μｍの範囲の粒子径を有する粉末形態である。
【０１２９】
栄養組成物が即時使用可能な製品の形態である場合、栄養組成物のオスモル濃度は約１００ｍＯｓｍ／水ｋｇ〜約１１００ｍＯｓｍ／水ｋｇ、より典型的には約２００ｍＯｓｍ／水ｋｇ〜約７００ｍＯｓｍ／水ｋｇであってもよい。
【０１３０】
本開示の栄養組成物に適した脂肪又は脂質の供給源は、限定されないが、動物起源、例えば乳脂肪、バター、バター脂肪、卵黄脂質；魚油、海洋性油（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌｓ）、単細胞オイル等の海洋起源；トウモロコシ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、ダイズ油、パームオレイン油、ヤシ油、ハイオレイックヒマワリ油、マツヨイグサ油、ナタネ油、オリーブ油、アマニ（ｆｌａｘｓｅｅｄ）（アマニ（ｌｉｎｓｅｅｄ））油、綿実油、ハイオレイックサフラワー油、パームステアリン、パーム核油、麦芽油等の野菜油及び植物油；中鎖脂肪酸油、並びに脂肪酸のエマルジョン及びエステル；並びにそれらの任意の組み合わせを含む、任意の既知のものであってもよく、当該技術分野において使用されるものであってもよい。
【０１３１】
本開示の栄養組成物は、最小栄養補給、部分栄養補給、又は総栄養補給を提供してもよい。該組成物は、栄養サプリメント又は代用食であってもよい。該組成物は、栄養的には完全であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。一の実施形態では、本開示の栄養組成物は栄養的に完全であり、好適な種類及び量の脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン及びミネラルを含む。脂質又は脂肪の量は、典型的には約１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約７ｇ／１００ｋｃａｌで変化し得る。タンパク質の量は、典型的には約１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約７ｇ／１００ｋｃａｌで変化し得る。炭水化物の量は、典型的には約６ｇ／１００ｋｃａｌ〜約２２ｇ／１００ｋｃａｌで変化し得る。
【０１３２】
一の実施形態では、本開示の栄養組成物（複数の場合がある）は、有効量のコリンを含む。コリンは細胞の正常な機能に必須の栄養素である。コリンは、膜リン脂質に対する前駆物質であり、記憶保持に関与する神経伝達物質であるアセチルコリンの合成及び放出を加速する。さらに、この理論又は任意の他の理論に束縛されることを望むものではないが、食事由来のコリン及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は相乗的に作用してホスファチジルコリンの生合成を促進し、したがって、ヒト対象においてシナプス形成の促進を支援すると考えられる。さらに、コリン及びＤＨＡは、確立されたシナプス結合の維持に重要である、樹状突起棘形成を促進する相乗効果を示す場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の栄養組成物（複数の場合がある）は、一食分８液量オンス（２３６．６ｍＬ）当たり約２０ｍｇ〜一食分８液量オンス（２３６．６ｍＬ）当たり約１００ｍｇである、有効量のコリンを含む。
【０１３３】
さらに、いくつかの実施形態では、栄養組成物は栄養的に完全であって、好適な種類及び量の脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン及びミネラルを含み、対象の唯一の栄養供給源となる。実際に、栄養組成物は、任意に、対象に多くの栄養学的及び生理学的な利益を提供し得る、任意の数のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸、プロバイオティクス及び／又はそれらの代謝副産物、プレバイオティクス、炭水化物、及び任意の他の栄養素、又は他の化合物を含んでもよい。さらに、本開示の栄養組成物は、香味料、風味増強剤、甘味料、色素、ビタミン、ミネラル、治療用成分、機能性食品原料、食品原料、配合剤、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１３４】
ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤又はＬＧＧ可溶性メディエーター調剤を含む栄養組成物は、対象の腸管に直接放出されてもよい。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、腸に直接放出される。いくつかの実施形態では、上記組成物は、医師の監督の下において、腸内で消費又は投与されるように製剤化されてもよく、承認された科学原理に基づく特別な栄養要求量が医学的評価によって確立される、セリアック病、及び／又は食物アレルギー等の疾患又は状態の特定の食事管理が意図されてもよい。
【０１３５】
本開示の栄養組成物は、本明細書に具体的に掲載される栄養素を含む組成物に限定されない。対象において栄養要求を満たす目的で及び／又は栄養状態を最適化するため、組成物の一部として、任意の栄養素が送達され得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、誕生から満期妊娠と一致する時まで栄養組成物を乳児に送達してもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも約３ヶ月の補正年齢まで乳児に栄養組成物を送達してもよい。別の実施形態では、十分な腸バリア機能を達成するのに必要な長さに亘り、栄養組成物を対象に送達してもよい。更に別の実施形態では、誕生から少なくとも約６ヶ月の補正年齢まで乳児に栄養組成物を送達してもよい。更に別の実施形態では、誕生から少なくとも約１年の補正年齢まで乳児に栄養組成物を送達してもよい。
【０１３７】
本開示の栄養組成物は、特定のカロリーの含有量に標準化されてもよく、即時使用可能な製品として提供されてもよく、又は濃縮形態で提供されてもよい。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示の栄養組成物はグローイングアップミルクである。グローイングアップミルクは、１歳を超える（典型的には１歳〜３歳、４歳〜６歳、又は１歳〜６歳）小児用に意図された強化牛乳系飲料である。グローイングアップミルクは、病人用特別食でなく、また特定の栄養不足に対処するための食事の置き換え又は補足として意図されるものではない。代わりに、グローイングアップミルクは、小児が全て必須ビタミン及びミネラル、主要栄養素と健康促進特性が意図される非必須栄養素等の追加の機能性の食事由来の成分の連続的で毎日の摂取を達成する追加の保険を提供するように多様な食事に対する補完としてはたらく意図を持って設計される。
【０１３９】
本開示による栄養組成物の正確な組成は、地方規制及び目的の集団の食事摂取情報に応じて市場によって変化し得る。いくつかの実施形態では、本開示による栄養組成物は、全乳又はスキムミルク等の乳タンパク質源と、所望の知覚特性を達成するため添加される糖及び甘味料と、追加のビタミン及びミネラルとからなる。脂肪組成は、典型的には乳原材料に由来する。総タンパクを人乳、牛乳の総タンパク質、又はより低い値と一致するように標的化することができる。総炭水化物は、通常、許容可能な味覚を達成するのに可能な限り少量のスクロース又はフルクトース等の追加の糖として提供されるように標的化される。典型的には、地域の牛乳の栄養寄与率と一致するレベルでビタミンＡ、カルシウム及びビタミンＤを添加する。或いは、いくつかの実施形態では、一食分当たりおよそ２０％の食事摂取基準（ＤＲＩ：ｄｉｅｔａｒｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔａｋｅ）又は２０％のデイリーバリュー（ＤＶ：Ｄａｉｌｙ  Ｖａｌｕｅ）を提供するレベルでビタミン及びミネラルを添加してもよい。さらに、栄養値は、意図される集団の明らかにされた栄養上の要求、原料寄与率及び地方の規制に応じて市場間で変化し得る。
【０１４０】
特定の実施形態では、栄養組成物は低アレルギー性である。他の実施形態では、栄養組成物は清浄（ｋｏｓｈｅｒ）である。更なる実施形態では、栄養組成物は非遺伝子組み換え製品である。一の実施形態では、栄養製剤はスクロースを含まない。また、栄養組成物はラクトースを含まなくてもよい。他の実施形態では、栄養組成物はいかなる中鎖脂肪酸油も含まない。いくつかの実施形態では、カラギーナンは上記組成物中に存在しない。他の実施形態では、栄養組成物はいずれのガムも含まない。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、上記開示は、本開示による複数の異なる栄養組成物を含む、乳児又は小児等の小児対象に対する段階的な栄養食物摂取レジメンに関する。各栄養組成物は、加水分解タンパク質と、少なくとも１つの予めゼラチン化されたデンプンと、少なくとも１つのペクチンとを含む。また、特定の実施形態では、上記食物摂取レジメンの栄養組成物は、長鎖多価不飽和脂肪酸の供給源、少なくとも１つのプレバイオティック、鉄源、β−グルカンの供給源、ビタミン又はミネラル、ルテイン、ゼアキサンチン、又は上に記載される任意の他の成分を含んでもよい。本明細書に記載される栄養組成物は、１日当たり１回投与されてもよく、又は一日を通して数回の投与が行われてもよい。
【０１４２】
実施例は、本開示の栄養組成物のいくつかの実施形態を説明するために提供されるが、それらに対していかなる限定とも解釈されるべきでない。本明細書の特許請求の範囲に含まれる他の実施形態は、明細書を考慮して、又は本明細書に開示される栄養組成物若しくは方法の実施より当業者に明らかとなるであろう。実施例と共に、明細書は、実施例に続く特許請求の範囲によって示される開示の範囲及び趣旨と共に、説明に過ぎないとされることが意図される。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１］
実施例１：腸バリア機能に対するＳＢＳモデル
動物
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、上海支社（中国、上海）から、体重およそ１５０ｇ〜２００ｇの５週齢〜６週齢の４８匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを得た。ラットを個々のケージに収容し、実験を開始する前に、一定温度（２２±２℃）で１２時間の明暗サイクルの下、自由飲水及び自由摂食（Ｍ０１−Ｆ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．ＬＴＤ）で３日間〜５日間順化させた。実験プロトコルは、中国の上海実験動物協会のガイドラインに従った。
【０１４４】
実験計画
４８匹ラットを無作為にラット各８匹の６つの次の実験群に分けた：シャム群（再吻合による腸離断（ｂｏｗｅｌ  ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）を経たラット）、ＳＢＳ群（広範な小腸切除と、毎日水１ｍＬの胃管投与を経たラット）、ＳＢＳ＋ＬＥＧ可溶性メディエーター調剤Ａ群（広範な小腸切除と、カラムクロマトグラフィーによって脱塩されたＬＧＧ可溶性メディエーターによる補足を経たラット）、ＳＢＳ＋ＬＥＧ可溶性メディエーター調剤Ｂ群（広範な小腸切除と、限外濾過によって脱塩されたＬＧＧ可溶性メディエーターによる補足を経たラット）、ＳＢＳ＋ＢＣＭ群（広範な小腸切除と、ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤Ｂと同様に処理された非馴化細菌培養培地による補足を経たラット）、及びＳＢＳ＋ＬＧＧ群（広範な小腸切除と、生存可能なＬＧＧによる補足を経たラット）。
【０１４５】
可溶性メディエーター調剤のＡ又はＢを、毎日、胃管投与により水中５×１０8ＣＦＵ  ＬＧＧ当量の投薬量で与えた。生きているＬＧＧを、２日目〜１４日目に亘り毎朝、１ｍＬ温水中５×１０8ＣＦＵ／日の投薬量で各ラットに胃内の胃管投与によって与えた。細菌培養培地（ＢＣＭ）を希釈し、可溶性メディエーター調剤と同じ方法で胃管投与した。シャム及びＳＢＳのラットの両方に毎日１ｍＬの水を胃管投与した。全てのラットは、実験室固形飼料及び水を自由に摂取可能であった。ラットを１５日間モニターし、１５日目に犠牲にした。各ラットの体重を週に二回測定した。
【０１４６】
手術手順
実験の１２時間前にラットを絶食させたが、水へのフリーアクセスは可能とした。３３ｍｇ／体重ｋｇ〜４０ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与されたペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｍＬ）の腹腔内注射による麻酔下で、全ての手術手順を行った。無菌技術により、正中切開を使用して開腹した。シャム手術を、回盲部に対して５ｃｍ近位の回腸の単純な横切開及び再吻合によって行った。切除された動物は、トライツ靭帯に対して５ｃｍ遠位から回盲弁に対して１０ｃｍ近位の７５％〜８０％の小腸切除を経た。５−０バイクリル（ｖｉｃｒｙｌ）の結節縫合を使用して全ての吻合を行った。腹部の閉鎖の前に、温かい０．９％生理食塩水２ｍＬの腹腔内注射でラットを蘇生した。回復後、ラットを一晩、自由飲水とし、その後、規則的な食餌に戻した。１５日目にペントバルビタール（７５ｍｇ／ｋｇ）の腹膜腔内注射によって全てのラットを犠牲にした。
【０１４７】
２．４  形態学的評価及び順応評価。
粘膜の構造。小腸試験片を最初に冷たい通常の生理食塩水で濯いだ後、１０％中性緩衝ホルマリン（ｐＨ＝７．２）中で直ちに固定した。７２時間の固定後に、組織を配向エッジ（ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｅｄｇｅ）上でパラフィンワックスに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシン染色のため５μｍ厚の切片を作製した。分析システムを使用して、縦断切片において絨毛高さ及びクリプト深度を特定した。各試料中の１０の十分垂直方向に向いた絨毛及びクリプトにおいて絨毛高さ及びクリプト深度を測定した。接眼マイクロメーターを使用して、クリプト開口から絨毛上部までの絨毛高さ、及びクリプト底部からその開口までのクリプト深度を特定した。
【０１４８】
上皮細胞増殖及びアポトーシス。
Ｉｎ  Ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ドイツ国マンハイムのＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して腸上皮細胞のアポトーシスを分析するため、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ビオチン化ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）染色を行った。アポトーシスを１つの絨毛当たりのアポトーシスマーカーに対して陽性の上皮細胞の数として表した。腸の上皮細胞増殖を、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対する免疫組織化学染色によって評価した。増殖の指数を、各スライドにおける１つのクリプト当たりの増殖性細胞核抗原陽性細胞の数として表した。血清ＧＬＰ−２レベルを酵素免疫アッセイキット（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって測定した。
【０１４９】
全身及び局所的な炎症
下大静脈からの血液１ｍｌを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）試験（中国廈門市のＣｈｉｎｅｓｅ  ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ  ｃｒａｂ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｒｐ）を使用して、ＥＵ／ｍｌとして表されるエンドトキシンの血清レベルを検出した。ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎｌｉｎｅ）を使用してｐｇ／ｍｌで表されるＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−６の血清レベルを検出した。管腔内容物を回腸から除去した後、１００ｍｇの回腸試料を最初に１ｍＬのＰＢＳでホモジナイズし、その後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡキットを使用するサイトカイン試験のため上清を更に収集した。
【０１５０】
腸内細菌移行
動物を殺した後、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、肝臓及び脾臓の試料をホモジナイズし、その後、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を更に収集し、続いてＱＩＡｍｐ  ＤＮＡキットを使用してゲノム抽出を行った。Ｅ．コリベータ−ガラクトシダーゼ隣接領域に対する配列特異的プライマーを使用するＰＣＲを使用してＥ．コリを検出した。
（プライマー：Ｆ：Ｆ５’−ＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＡ−３’；
Ｒ：Ｆ５’−ＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＣＧＡＴＡＧＡＧＡＴＴＣＧＧＧ−３’）。
【０１５１】
腸バリア機能
腸管透過性：フルオレセイン（イソチオシアネート−デキストラン−４０，０００ダルトン（ＦＤ−４０）（米国、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して腸管透過性を評価した。１５日目にラットに５ｍｇのＦＤ−４０を含む１ｍＬの水を胃管投与した。胃管投与の６時間後、１ｍｌの血液を上腸間膜静脈から収集し、１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。血漿試料を等容量のＰＢＳ中に希釈し、９６ウェルプレートに二通りで充填した。ＦＤ−４０濃度を蛍光分光光度計（励起４９０ｎｍ及び発光５２０ｎｍ）で測定した。
【０１５２】
腸内容物のｓＩｇＡレベル
回腸終端部まで１０ｃｍ以内の近位回腸から腸内容物を収集した。０．２ｇの試料を計量し、１ｍＬのＰＢＳ中でボルテックスして、４℃にて２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、上清を収集し、キットのプロトコル（米国、Ａｌｐｃｏ）に従ってＥＬＩＳＡによって特定した。
【０１５３】
タイトジャンクション発現
各動物の遠位回腸を収集し、氷冷生理食塩水を流し、腸間膜の境界に沿って開いた。腸バリア機能を調節することが知られている４つの重要なタイトジャンクションタンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングを使用して調べた。オクルディン、ＺＯ−１、クローディン−１及びクローディン−４のタンパク質のバンド強度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して定量し、アクチンに対して正規化された相対発現を使用した。
【０１５４】
統計学的分析
データを平均±ＳＤとして報告する。種々の栄養素の主効果を一元配置分散分析又はマン−ホイットニーＵ検定によって評価した。群間の差をフィッシャーの制約付最小有意差（ＬＳＤ）検定を使用して特定した。マン−ホイットニーＵ検定をノンパラメトリックデータに適用した。Ｗｉｎｄｏｗｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １７．０用統計ソフトウェアＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、米国イリノイ州シカゴ）を分析に使用し、ｐ＜０．０５を統計学的に有意と定義した。
【０１５５】
体重変化
全てのラットは本研究の開始から同様の体重を有した。腸切除後７日目及び１４日目の時点において５匹のＳＢＳラットの全てで、シャム群と比較して少ない体重が見られた。５つのＳＢＳ群のうち、全ての介入群は、ＳＢＳ群と比較して１４日目の時点で体重喪失を逆転した。ＳＢＳ−可溶性メディエーター調剤Ｂ及びＳＢＳ−ＢＣＭの動物の体重は、他のＳＢＳのラットより有意に高かった。さらに、治療群は、ＳＢＳの対照群と比較して有意に少ない体重減少を実証した。
【表１】
2018537434.tif 000003
【０１５６】
形態学的評価及び順応の評価
回腸の絨毛の高さ及びクリプト深度：シャムラットと比較して、全てのＳＢＳの動物は、小腸切除後の順応反応として、より大きな絨毛の高さ及びクリプト深度を有した。腸の形態学を図１に示す。
【表２】
2018537434.tif 000004
【０１５７】
上皮細胞増殖及びアポトーシス
群間のアポトーシス細胞数に差は検出されなかった。増殖に関して、クリプト１個当たりのＰＣＮＡ陽性細胞数によって標識されるように、全てのＳＢＳの群は、シャム群と比較して、より高い値を有する傾向があるが、有意差は、シャム群とＳＢＳ可溶性メディエーター調剤Ｂ群の間でのみ検出された。
【表３】
2018537434.tif 000005
【０１５８】
腸増殖因子−ＧＬＰ２レベル
全ての広範囲腸切除術群間で、ＳＢＳ−可溶性メディエーター調剤Ｂ及びＳＢＳ−ＢＣＭラットは、ＳＢＳの群（Ｐ＜０．０５）より増加したＧＬＰ−２レベルを示した。図３Ａを参照されたい。
【０１５９】
全身及び局所的な炎症
血清エンドトキシン
血清エンドトキシンレベルは、全ての広範囲腸切除群において、シャム群と比較して有意に増加した。（Ｐ＜０．０５）。全ての介入群は、ＳＢＳ群と比較して、より低いエンドトキシンレベルを示した（Ｐ＜０．０５）。図３Ｂを参照されたい。
【０１６０】
サイトカインレベル：６つの治療群におけるサイトカインレベルを表４に要約する。炎症性サイトカインは、全ての広範囲腸切除群においてシャム群と比較して有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤のＡ及びＢは、サイトカインレベルを有意に減少させた。
【表４】
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【０１６１】
腸内細菌移行
表５に要約されるように、ＳＢＳ群と比較して、各介入群では、近くの臓器への腸内細菌の移行は有意に少なかった。
【表５】
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【０１６２】
腸バリア機能
腸管透過性：血清ＦＤ−４０（フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン−４０，０００ダルトン）レベルは、シャム群と比較して、全ての広範囲腸切除術群において有意に増加された（Ｐ＜０．０５）。ＳＢＳの群と比較して、全ての介入群は腸管透過性の改善を示した。図３Ｃを参照されたい。
【０１６３】
腸バリア抵抗性機能
腸内容物のｓＩｇＡ：ｓＩｇＡレベルは、ＳＢＳ群と比較して、全ての介入群において有意に増加された（Ｐ＜０．０５）。ＳＢＳ可溶性メディエーター調剤Ｂは、ＳＢＳ−ＬＧＧ群より高いｓＩｇＡレベルを示した（Ｐ＜０．０５）。図３Ｄを参照されたい。
【０１６４】
結果の要約
ＳＢＳの群と比較して、広範な腸切除後のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤の経腸補足は、細菌移行の減少、腸の順応反応、また腸バリア抵抗性及び腸バリア機能の改善を支援する。
【０１６５】
ＳＢＳの群と比較した場合、ＳＢＳ可溶性メディエーター調剤ＡとＳＢＳ可溶性メディエーター調剤Ｂはいずれも、より良好な増量、順応、より低い炎症性サイトカインレベル及び腸管透過性、また、より少ない腸内細菌移行を示した。両群は、ほとんどの指標で同様の改善を示し、可溶性メディエーター調剤Ａと比較して可溶性メディエーター調剤Ｂは、タイトジャンクションタンパク質レベルのより良好な維持を示した。両ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤は、いくつかの指標においてＬＧＧより良好な結果を示した。
【０１６６】
［実施例２］
内臓痛研究
動物
雄性及び雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを英国Ｈａｒｌａｎから購入した。これらのラットをユニバーシティ・カレッジ・コークのバイオサイエンス研究所、前臨床研究施設において交配させ、続く子孫を以下の実験で使用した。得られた雌親及び同腹仔を１２時間明、１２時間暗のサイクル（明期０７００時間〜１９００時間）で温度及び湿度が管理された部屋の大きな飼育ケージに収容した。全ての実験は欧州実験動物保護指令２０１０／６３／ＥＥＣ、２０１２年Ｓ．Ｉ  Ｎｏ  ５４３の要件に従って行われ、ユニバーシティ・カレッジ・コークの動物実験倫理委員会によって承認された。
【０１６７】
実験計画
母体分離プロトコルを誕生時（ＰＮＤ０）に開始し、同腹仔を、母体分離を経験する、又は非分離対照として残すように無作為に割り当てた。
【０１６８】
ＰＮＤ０
母親及び子への不安をできるだけ少なくして子を数えた。この時期のハンドリングを最小限にとどめた。
【０１６９】
ＰＮＤ２
ＭＳに割り当てられた同腹仔をメインコロニー室から隣接する部屋へと移した。最初に母親をホームケージから移動し、より小さな維持ケージに入れた。これに続いて、同じ同腹仔による子全体を静かに小さなケージに入れた。母親をホームケージ及び子のいないメインコロニー室に戻した。母親からの音が子に聞こえないように、またその逆もないように、子を含むケージを隣接する部屋に残した。全ての部屋をメインコロニー室と同じ温度（２１℃±２℃）及び光条件に維持し、３時間の間３０℃〜３３℃に設定された温熱パッドに置いた。３時間の分離の後、母親を隣接する部屋へ再び運び、子をもとのホームケージに戻している間、一時的に維持ケージに入れた。この直後に母親を返した。
【０１７０】
非分離同腹仔を、週に１回行われる通例のケージ清掃を除いて、母親のホームケージに邪魔をせずに放置した。この母体分離手順をＰＮＤ２〜ＰＮＤ１２（包括的）に行った。分離の期間を毎日同じ時間に実施した。
【０１７１】
ＰＮＤ２１  離乳
雄性及び雌性の子孫を性別に基づいて分類した。ＭＳと非分離ＮＳの雄性ラットの両方をサプリメント実験に使用した。これを２つの連続するコホートで行った。各コホートについて、治療により、４８匹のラットを１つの治療当たり２ケージ、１ケージ当たりラット３匹に無作為に群飼育し、どの同腹仔も共に収容しなかった。サプリメント群を表１に記載する。子をＰＮＤ２１に雌親から離乳させるとすぐに、食餌及び水のサプリメントを開始した。２種類のＬＧＧ可溶性メディエーター調剤（Ａ及びＢ）、又は参照としての非馴化細菌培養培地（ＢＣＭ）を飲料水に補足した。１．３×１０8〜４．３×１０8の生存可能なＬＧＧ／動物／日の範囲に等量の用量を与えるため、研究を通してＰＮＤ  ８５まで可溶性メディエーター調剤を飲料水に補足した。内臓過敏性をＰＮＤ  ７９で評価した。体重を毎週、水分摂取量を毎日、食物摂取量を１週間に３回測定した。
【０１７２】
内臓感受性評価
結腸直腸膨満（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ）によって評価を行った。動物を２４時間絶食させた後、軽く麻酔をかけた。接続カテーテルを備えた６ｃｍのポリエチレンバルーンを肛門に対して１ｃｍ近位の遠位結腸に挿入した。変位を回避するため、カテーテルをテープで尾部に固定した。結腸直腸膨満を始める前に少なくとも１５分間麻酔から動物を回復させた。
【０１７３】
結腸直腸膨満の間、カスタマイズされた圧調節器を使用して、通気及び空気圧を管理した。使用される膨満パラダイムは、０ｍｍＨｇ〜８０ｍｍＨｇの昇圧相（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｐｈａｓｉｃ）膨張であった。最初の疼痛行動が示される時に熟練した観察者が閾値又は圧力について各ラットを採点した。治療群の概要を下記表６に提供する。
【表６】
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【０１７４】
生育及び摂取
全てのラットは、初期又は終期の身体の相違を示さなかった。初期の生命状態（ＮＳ又はＭＳ）又はサプリメントの飲用は、体重増加、食物摂取量、又は水分摂取量に影響しなかった（図４Ａ〜図４Ｃ）。
【０１７５】
内臓痛
母体分離によって誘導される初期の生命ストレスは、成年期で行われる結腸直腸膨満中のＮＳ動物と比較した場合、ラットにおいて痛覚の閾値を低下させた（ｐ＝０．０３４）。これは可溶性メディエーター調剤Ｂによって改善され、いかなるサプリメントも含まない水を飲むＭＳラットと比較した場合、結腸直腸膨満に対する痛覚閾値の増加（ｐ＝０．０３）を示した（図５）。
【０１７６】
［実施例３］
ＬＧＧ可溶性メディエーター調剤の作製
第１のＬＧＧバッチ発酵（２００Ｌ）の間、ＯＤ６００及びＣＦＵの特定、並びに更なる処理のため、１０Ｌの試料を３つの時間点（指数増殖期中期、指数増殖期後期及び静止期）で収集した。遠心分離によって懸濁液からバイオマスを除去した。これらの３つのサンプリング点に由来する上清を収集し、ＭＥＧ、ＬＥＧ、ＳＥＧとそれぞれラベル付けをして−２０℃で凍結させた。生物活性アッセイによれば、指数増殖期後期（ＬＥＧ）に収集した使用済み培養培地は、最も高いサイトカイン誘導を示した。指数増殖期後期のサンプリングは、およそ１５時間の発酵時間に相当する。また、発酵の間、ｐＨを維持するため対応するＯＤ値及び塩基取込みによって発酵をモニターした）。
【０１７７】
表７に記載される培養培地は、多量のバイオマスを生じる。
【表７】
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Ｔｗｅｅｎ  ８０の存在は、乳児用フォーミュラ等の比較的脆弱な対象に対する栄養製品における使用に望ましくない、更には許容可能ではないとされる。したがって、Ｔｗｅｅｎ  ８０を省略することができた、又は界面活性剤としてより多くの天然油若しくは脂肪酸によって置き換えられたかどうかを判定した。Ｔｗｅｅｎ  ８０を含まない培地におけるＬＧＧの生育は、Ｔｗｅｅｎを含む培地での生育に匹敵した。置き換えたいずれの油もより良好な生育を誘導しなかった。したがって、培養培地からＴｗｅｅｎ  ８０を除去することができたと結論付けられ、全ての更なる発酵に対する培地はもはやＴｗｅｅｎ８０を含まなかった。
【０１７８】
Ｔｗｅｅｎ  ８０（２）を添加せずに、類似する方法で第２の２００Ｌバッチ発酵を行った。約３０Ｌの使用済み培地試料を、バイオマスの除去後に指数増殖期後期において収集した。使用済み培地を脱塩し、滅菌濾過（０．２μｍ）して、凍結乾燥した。脱塩により、発酵中に産生された乳酸は除去され、この工程は、乳酸以外の細菌代謝産物の影響を評価することができ、材料の乾燥中に障害を回避することができるように含まれる。マイクロフィルトレーション（＝滅菌濾過）は、あらゆるインタクト細菌細胞の不在を保証する。真空凍結乾燥（＝凍結乾燥）は、液体から乾いた材料を得る選択肢である。
【０１７９】
脱塩バッファー及び方法の選択
カラムクロマトグラフィー（ＣＧ）又は限外濾過（ＵＦ）の２種類の異なる方法によって脱塩プロセスを行った。最初に、酢酸ナトリウムバッファーを両方のプロセス（２）に使用した。乳酸を含む低分子量の分子（ＣＧについては６ｋＤａ未満、ＵＦについては５ｋＤａ未満）を脱塩により除去した。更なる評価のため６ｋＤａ超及び５ｋＤａ超の画分をそれぞれ収集した。ＣＧカラム（６ｋＤａ超）から出てきた脱塩された液体を可溶性メディエーター調剤Ａとラベル付けした。ＵＦ（５ｋＤａ超）に由来する保持液を可溶性メディエーター調剤Ｂとラベル付けした。
【０１８０】
しかしながら、最終生成物中の残留酢酸ナトリウムは望ましくないと判断された。これは、培養培地又は脱塩プロセスに使用されるバッファー等の加工助剤に起因する残留酢酸ナトリウムを含む。最終調剤から酢酸ナトリウムの存在を回避するため、脱塩プロセスに対する代替バッファー、すなわちクエン酸カリウムが推奨された。２種類の異なるバッファーを使用する２種類の異なる脱塩プロトコルから得られる培養上清を標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験して、生物活性に対するプロセス変更の影響の予備的見識を得た。結果は、ＣＧ（可溶性メディエーター調剤Ａ）及びＵＦ（可溶性メディエーター調剤Ｂ）から得られた調剤により、同等のサイトカイン産生を示した。技術的な展望より、カラムクロマトグラフィーは大量の材料に適応するのが非常に難しいことから、アップスケールされた製造については、可溶性メディエーター調剤Ｂが可溶性メディエーター調剤Ａよりも好ましい。しかしながら、生物活性に関してよりよい理解を得るために現在は可能な限り両方の可溶性メディエーター調剤が前臨床での生物活性評価に含まれる。非臨床アッセイでの使用の前に、実験室規模で作製された脱塩培養上清を真空凍結乾燥（凍結乾燥）によって乾燥した。
【０１８１】
本開示の好ましい実施形態は、特定の用語、装置及び方法を使用して記載されるが、かかる記載は解説目的であるに過ぎない。使用される言葉は、限定ではなく説明の言葉である。下記の特許請求の範囲に述べられる本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく、当業者によって変化及び変形が行われ得ることが理解される。さらに、様々な実施形態の態様は全体又は一部において交換され得ることが理解されるべきである。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲は、本明細書に含まれる好ましい形の記載に限定されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2018537434.tif 000026
【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018537434.tif 000029
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