(57)【要約】  本開示は、（ａ）アルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤および（ｂ）Ｂ−ＲＡＦ阻害剤を含む組合せ医薬、その組み合わせ調製物および医薬組成物、がんの治療または予防におけるそのような組合せの使用、ならびに、そのような組合せの治療有効量を投与することを含む、対象においてがんを治療または予防する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式（Ｉ）の構造を有する化合物
【化１】
2018525402.tif 000026
またはその薬学的に許容される塩と、
（ｂ）式（ＩＩ）の構造を有する化合物
【化２】
2018525402.tif 000027
またはその薬学的に許容される塩と
を含む、組合せ医薬。
【請求項２】
式（Ｉ）の構造を有する前記化合物および式（ＩＩ）の構造を有する前記化合物が、同じ製剤の中にある、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項３】
式（Ｉ）の構造を有する前記化合物および式（ＩＩ）の構造を有する前記化合物が、別々の製剤の中にある、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項４】
同時または順次投与のためのものである、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項５】
それを必要とする対象においてがんを治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項１から４のいずれか一項に記載の組合せ医薬を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記がんが固形腫瘍である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記がんが、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸癌、結腸直腸がん、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管（胆管癌を含む）、肝細胞、副腎、胃部、胃、神経膠腫、ＣＮＳ（神経膠芽腫、星状細胞腫、および上衣細胞腫を含む）、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頸部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸の良性または悪性腫瘍、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、巨核芽球性白血病、赤白血病、および骨髄球性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様化生を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、ならびにバレット腺癌からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記がんが、結腸直腸がんまたは黒色腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記がんが、切除不能または転移性黒色腫である、請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんが、Ｂ−ＲＡＦ突然変異、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、およびＰＩＫ３ＣＡ過剰発現のうちの１つまたは複数により特徴付けられる、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤による治療に対して抵抗性がある、または難治性である、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
がんの治療または予防における使用のための、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項１３】
がんの治療または予防のための医薬の調製における使用のための、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項１４】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１２または１３に記載の組合せ医薬。
【請求項１５】
前記がんが、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸癌、結腸直腸がん、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管（胆管癌を含む）、肝細胞、副腎、胃部、胃、神経膠腫、ＣＮＳ（神経膠芽腫、星状細胞腫、および上衣細胞腫を含む）、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頸部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸の良性または悪性腫瘍、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、巨核芽球性白血病、赤白血病、および骨髄球性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様化生を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、ならびにバレット腺癌からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の組合せ医薬。
【請求項１６】
前記がんが、結腸直腸がんまたは黒色腫である、請求項１２または１３に記載の組合せ医薬。
【請求項１７】
前記がんが、切除不能または転移性黒色腫である、請求項１２または１３に記載の組合せ医薬。
【請求項１８】
前記がんが、Ｂ−ＲＡＦ突然変異、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、およびＰＩＫ３ＣＡ過剰発現のうちの１つまたは複数により特徴付けられる、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項１９】
前記がんが、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤による治療に対して抵抗性がある、または難治性である、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項２０】
がんの治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１に記載の組合せ医薬の使用。
【請求項２１】
がんの治療または予防のための、請求項１に記載の組合せ医薬の使用。
【請求項２２】
（ａ）式（Ｉ）の構造を有する化合物
【化３】
2018525402.tif 000028
またはその薬学的に許容される塩と、
（ｂ）式（ＩＩ）の構造を有する化合物
【化４】
2018525402.tif 000029
またはその薬学的に許容される塩と
を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
１つまたは複数の添加剤を更に含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（ａ）アルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤および（ｂ）Ｂ−ＲＡＦ阻害剤を含む組合せ医薬、それを含む医薬組成物、ならびにアルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＢ−ＲＡＦ阻害剤の阻害が有益である状態、例えばがんの治療または予防における、そのような組合せおよび組成物の使用方法が、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、リン酸塩がイノシトール脂質のＤ−３’位に移動してホスホイノシトール−３−リン酸（ＰＩＰ）、ホスホイノシトール−３，４−二リン酸（ＰＩＰ２）、およびホスホイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）を産生させ、次にプレクストリン相同性、ＦＹＶＥ、Ｐｈｏｘ、および他のリン脂質結合ドメインを含有するタンパク質を、多くの場合に細胞膜にある様々なシグナル伝達複合体にドッキングさせることにより、シグナル伝達カスケードにおける第２のメッセンジャーとして作用するように触媒する、脂質キナーゼのファミリーを含む（Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem 70:535 (2001); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615 (2001)）。２つのクラス１  ＰＩ３Ｋのうち、クラス１Ａ  ＰＩ３Ｋは、ｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０α、ｐ８５β、またはｐ５５γでありうる調節サブユニットと構成的に会合する触媒性ｐ１１０サブユニット（α、β、δアイソフォーム）から構成されるヘテロ二量体である。クラス１Ｂサブクラスは、２つの調節サブユニットのｐ１０１またはｐ８４のうちの１つと会合する触媒性ｐ１１０γサブユニットから構成されるヘテロ二量体である、１つのファミリーメンバーを有する（Fruman et al., Annu Rev. Biochem. 67:481 (1998); Suire et al., Curr. Biol. 15:566 (2005)）。ｐ８５／５５／５０サブユニットのモジュラードメイン（modular domain）は、ホスホチロシン残基を、特定の配列の文脈において、活性化された受容体および細胞質チロシンキナーゼに結合し、クラス１Ａ  ＰＩ３Ｋの活性化および局在化をもたらす、Ｓｒｃ相同性（ＳＨ２）ドメインを含む。クラス１Ｂ  ＰＩ３Ｋは、多様なレパートリーのペプチドおよび非ペプチドリガンドに結合するＧタンパク質共役受容体によって、直接活性化される（Stephens et al., Cell 89:105 (1997)); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615-675 (2001)）。したがって、もたらされたクラスＩ  ＰＩ３Ｋのリン脂質産物は、上流の受容体を、増殖、生存、走化性、細胞輸送、運動性、代謝、炎症、およびアレルギー応答、転写、ならびに翻訳を含む下流の細胞活性と関連付ける（Cantley et al., Cell 64:281 (1991); Escobedo and Williams, Nature 335: 85 (1988); Fantl et al., Cell., 69: 413 (1992)）。
【０００３】
多くの場合において、ＰＩＰ２およびＰＩＰ３は、ウイルスがん遺伝子ｖ−Ａｋｔのヒト相同体の産物であるＡｋｔを、細胞膜へと動員し、そこで成長および生存にとって重要な多くの細胞内シグナル伝達経路の節点として作用する（Fantl et al., Cell 69:413-423(1992); Bader et al., Nature Rev. Cancer 5:921 (2005); Vivanco and Sawyer, Nature Rev. Cancer 2:489 (2002)）。多くの場合にＡｋｔ活性化を介して生存を増加させるＰＩ３Ｋの異常な調節は、ヒトがんにおいて最も一般的な事象の１つであり、複数のレベルにおいて生じることが示されている。イノシトール環の３’位でホスホイノシチドを脱リン酸化し、そうすることによってＰＩ３Ｋ活性を拮抗する腫瘍抑制遺伝子のＰＴＥＮは、様々な腫瘍において機能的に欠失している。他の腫瘍では、ｐ１１０αアイソフォームであるＰＩＫ３ＣＡの遺伝子、およびＡｋｔの遺伝子が増幅され、遺伝子産物のタンパク質発現が増加されることが、いくつかのヒトがんにおいて実証されている。
【０００４】
更に、ｐ８５−ｐ１１０複合体を上方調節するように機能するｐ８５αの突然変異および転位が、ヒトがんにおいて記載されている。最後に、下流シグナル伝達経路を活性化するＰＩＫ３ＣＡにおける体細胞ミスセンス突然変異が、多種多様なヒトがんにおいて著しく頻繁に記載されている（Kang at el., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:802 (2005); Samuels et al., Science 304:554 (2004); Samuels et al., Cancer Cell 7:561-573 (2005)）。これらの観察は、ホスホイノシトール−３キナーゼ、ならびにこのシグナル伝達経路の上流および下流構成成分の調節解除は、ヒトがんおよび増殖性疾患に関連する最も一般的な調節解除の１つである（Parsons et al., Nature 436:792 (2005); Hennessey at el., Nature Rev. Drug Disc. 4:988-1004 (2005)）。
【０００５】
下記に提示されている式（Ｉ）の２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体が、有益な薬理学的特性を有すること、および例えばＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）を阻害することが見出された。特に、これらの化合物は、好ましくは、ベータおよび／またはデルタおよび／またはガンマサブタイプよりもＰＩ３Ｋアルファに対する改善された選択性を示す。したがって式（Ｉ）の化合物は、例えば、ＰＩ３キナーゼに依存する疾患（特に、ＰＩ３Ｋアルファに依存する、例えば、ＰＩ３Ｋアルファの過剰発現もしくは増幅を示すもの、またはＰＩＫ３ＣＡの体細胞突然変異を示すもの）、とりわけ腫瘍疾患および白血病などの増殖性疾患の治療における使用に適している。
【０００６】
更に、これらの組成物は、好ましく、改善された代謝安定性を示し、したがって低減されたクリアランスを示し、改善された薬物動態プロファイルをもたらす。
【０００７】
様々なＲａｓ  ＧＴＰアーゼおよびＢ−ＲＡＦキナーゼにおける突然変異は、ＭＡＰＫ経路の持続的および構成的活性化をもたらし、最終的に細胞分裂および生存の増加をもたらしうることが確認されている。この結果、これらの突然変異は、広範囲のヒトがんの確立、発生、および進行と強く関連している。シグナル伝達におけるＲａｆキナーゼ、具体的にはＢ−ＲＡＦの生物学的な役割は、Davies, H., et al., Nature (2002) 9:1-6; Garnett, M.J. & Marais, R., Cancer Cell (2004) 6:313-319; Zebisch, A. & Troppmair, J., Cell. Mol. Life Sci. (2006) 63:1314-1330; Midgley, R.S. & Kerr, D.J., Crit. Rev. Onc/Hematol. (2002) 44:109-120; Smith, R.A., et al., Curr. Top. Med. Chem. (2006) 6:1071-1089およびDownward, J., Nat. Rev. Cancer (2003) 3:11-22に記載されている。
【０００８】
ＭＡＰＫ経路シグナル伝達を活性化するＢ−ＲＡＦキナーゼの天然に生じる突然変異が、大きなパーセンテージでヒト黒色腫（Davies (2002)上記）および甲状腺がん（Cohen et al J. Nat. Cancer Inst. (2003) 95(8) 625-627およびKimura et al Cancer Res. (2003) 63(7) 1454-1457）において、ならびに低いが、依然として有意な頻度で以下において見出された。
【０００９】
バレット腺癌（Garnett et al., Cancer Cell (2004) 6 313-319およびSommerer et al Oncogene (2004) 23(2) 554-558）、胆道癌（Zebisch et al., Cell. Mol. Life Sci. (2006) 63 1314-1330）、乳がん（Davies (2002)上記）、子宮頸がん（Moreno-Bueno et al Clin. Cancer Res. (2006) 12(12) 3865-3866）、胆管癌（Tannapfel et al Gut (2003) 52(5) 706-712）、神経膠芽腫、星状細胞腫および上衣細胞腫などの原発性ＣＮＳ腫瘍を含む中枢神経系腫瘍（Knobbe et al Acta Neuropathol. (Berl.) (2004) 108(6) 467-470, Davies (2002)上記およびGarnett et al., Cancer Cell (2004)上記）、ならびに二次性ＣＮＳ腫瘍（すなわち、中枢神経系の外部に由来する腫瘍の中枢神経系への転移）、大腸結腸癌を含む結腸直腸がん（Yuen et al Cancer Res. (2002) 62(22) 6451-6455, Davies (2002)上記およびZebisch et al., Cell. Mol. Life Sci. (2006））、胃がん（Lee et al Oncogene (2003) 22(44) 6942-6945）、頭頸部扁平上皮癌を含む頭頸部癌（Cohen et al J. Nat. Cancer Inst. (2003) 95(8) 625-627およびWeber et al Oncogene (2003) 22(30) 4757-4759）、白血病を含む血液がん（Garnett et al., Cancer Cell (2004)上記）、特に急性リンパ芽球性白血病（Garnett et al., Cancer Cell (2004)上記およびGustafsson et al Leukemia (2005) 19(2) 310-312）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）(Lee et al Leukemia (2004) 18(1) 170-172およびChristiansen et al Leukemia (2005) 19(12) 2232-2240）、骨髄異形成症候群（Christiansen et al Leukemia (2005)上記）および慢性骨髄性白血病（Mizuchi et al Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 326(3) 645-651）、ホジキンリンパ腫（Figl et al Arch. Dermatol. (2007) 143(4) 495-499）、非ホジキンリンパ腫（Lee et al Br. J. Cancer (2003) 89(10) 1958-1960）、巨核芽球性白血病（Eychene et al Oncogene (1995) 10(6) 1159-1165）および多発性骨髄腫（Ng et al Br. J. Haematol. (2003) 123(4) 637-645）、肝細胞癌（Garnett et al., Cancer Cell (2004））、小細胞肺がん（Pardo et al EMBO J. (2006) 25(13) 3078-3088)および非小細胞肺がん（Davies (2002)上記）を含む肺がん（Brose et al Cancer Res. (2002) 62(23) 6997-7000, Cohen et al J. Nat. Cancer Inst. (2003)上記およびDavies (2002)上記）、卵巣がん（Russell & McCluggage J. Pathol. (2004) 203(2) 617-619およびDavies (2002)上記）、子宮内膜がん（Garnett et al., Cancer Cell (2004)上記およびMoreno-Bueno et al Clin. Cancer Res. (2006)上記）、膵がん（Ishimura et al Cancer Lett. (2003) 199(2) 169-173）、下垂体腺腫（De Martino et al J. Endocrinol. Invest. (2007) 30(1) RC1-3）、前立腺がん（Cho et al Int. J. Cancer (2006) 119(8) 1858-1862）、腎がん（Nagy et al Int. J. Cancer (2003) 106(6) 980-981）、肉腫（Davies (2002)上記）、ならびに皮膚がん（Rodriguez-Viciana et al Science (2006) 311(5765) 1287-1290およびDavies (2002)上記）。ｃ−Ｒａｆの過剰発現は、ＡＭＬ（Zebisch et al., Cancer Res. (2006) 66(7) 3401-3408およびZebisch (Cell. Mol. Life Sci. (2006)）、ならびに赤白血病（Zebisch et la., Cell. Mol. Life Sci. (2006)）に関連付けられている。
【００１０】
これらのがんにおいてＲａｆファミリーキナーゼが果たした役割によって、ならびにＢ−ＲＡＦキナーゼ活性の阻害を選択的に標的にするものを含む一連の前臨床および治療剤による予備的研究によって（King A.J., et al., (2006) Cancer Res. 66:11100-11105）、１つまたは複数のＲａｆファミリーキナーゼの阻害剤が、Ｒａｆキナーゼに関連するがんの治療に有用であることが一般に受け入れられている。
【００１１】
多くのがん、特に、Ｂ−ＲＡＦ突然変異、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、および／またはＰＩＫ３ＣＡ過剰発現を有するものは、例えば、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤による治療を受け入れやすい。しかし、特定の場合において、がんは選択された治療薬に対して抵抗性を取得し、最終的には治療に対して難治性になる。
【００１２】
がん患者には多数の治療選択肢があるにもかかわらず、有効で安全な治療剤の必要性、および組合せ療法におけるそれらの優先的な使用の必要性が、依然として存在する。特に、がん、とりわけ現行の療法に対して抵抗性がある、および／または難治性であるがんを治療または予防する有効な方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１３】
アルファ−アイソフォーム特異的ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤およびＢ−ＲＡＦ阻害剤を含む組合せ医薬が、本明細書において提供される。
【００１４】
１つの態様において、
（ａ）式（Ｉ）の構造を有する化合物
【００１５】
【化１】
2018525402.tif 000002
【００１６】
（本明細書において「化合物（Ｉ）」もしくは「化合物Ａ」とも呼ばれる）
またはその薬学的に許容される塩と、
（ｂ）式（ＩＩ）の構造を有する化合物
【００１７】
【化２】
2018525402.tif 000003
【００１８】
（本明細書において「化合物（ＩＩ）」もしくは「化合物Ｂ」とも呼ばれる）
またはその薬学的に許容される塩と
を含む組合せ医薬が、本明細書において提供される。
【００１９】
式（Ｉ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩と、式（ＩＩ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩との組合せは、本明細書において「本発明の組合せ」とも呼ばれる。
【００２０】
本発明の組合せの１つの実施形態において、式（Ｉ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩と、式（ＩＩ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩は、同じ製剤の中にある。別の実施形態において、式（Ｉ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、および式（ＩＩ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩は、別々の製剤の中にある。
【００２１】
更なる実施形態において、本発明の組合せは、同時または順次投与のためのものである。
【００２２】
別の態様では、それを必要とする対象においてがんを治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明の組合せを対象に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００２３】
その方法の１つの実施形態において、がんは固形腫瘍である。
【００２４】
別の実施形態において、がんは、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸がん、結腸直腸癌、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管（胆管癌を含む）、肝細胞、副腎、胃部（stomach）、胃（gastric）、神経膠腫、ＣＮＳ（神経膠芽腫、星状細胞腫、および上衣細胞腫を含む）、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頸部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸の良性または悪性腫瘍、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、巨核芽球性白血病、赤白血病、および骨髄球性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様化生を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、ならびにバレット腺癌からなる群から選択される。
【００２５】
別の実施形態において、がんは、結腸直腸がんまたは黒色腫である。
【００２６】
別の実施形態において、がんは、切除不能または転移性黒色腫である。
【００２７】
別の実施形態において、がんは、Ｂ−ＲＡＦ突然変異、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、およびＰＩＫ３ＣＡ過剰発現のうちの１つまたは複数により特徴付けられる。
【００２８】
別の実施形態において、がんは、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤による治療に対して抵抗性がある、または難治性である。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の組合せは、がんの治療または予防における使用のためのものである。
【００３０】
別の実施形態において、本発明の組合せは、がんの治療または予防のための医薬の調製における使用のためのものである。
【００３１】
１つの態様では、がんの治療または予防のための医薬の製造における本発明の組合せの使用が、本明細書において提供される。
【００３２】
別の態様では、がんの治療または予防のための本発明の組合せの使用が、本明細書において提供される。
【００３３】
１つの態様では、本発明の組合せを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００３４】
１つの実施形態において、医薬組成物は１つまたは複数の添加剤（excipient）を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】７個のＢＲＡＦ突然変異結腸直腸がん細胞系に対する、化合物Ａ（ＢＹＬ７１９とも呼ばれる）および化合物Ｂ（ダブラフェニブとも呼ばれる）、ならびに化合物Ａと化合物Ｂの組合せの用量応答曲線を示す図である。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の治療希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比べた、処理後の細胞計数を示す。濃い破線（strong dashed line）は、処理開始前（「ベースライン」）の細胞数を示す。
【図２】７個のＢＲＡＦ突然変異結腸直腸がん細胞系の２４時間、４８時間、および７２時間後（異なるモノクロ階調）における、化合物Ａ（ＢＹＬ７１９とも呼ばれる）および化合物Ｂ（ダブラフェニブとも呼ばれる）、ならびに化合物Ａと化合物Ｂの組合せの最大カスパーゼ３／７誘発を示す図である。ｘ軸は、処理を示し、ｙ軸は、各処理において見られた最大カスパーゼ３／７誘発（細胞の％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
アルファ−アイソフォーム特異的ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤およびＢ−ＲＡＦ阻害剤を含む組合せ医薬が、本明細書において提供される。具体的には、
（ａ）式（Ｉ）の構造を有する化合物
【００３７】
【化３】
2018525402.tif 000004
【００３８】
またはその薬学的に許容される塩と、
（ｂ）式（ＩＩ）の構造を有する化合物
【００３９】
【化４】
2018525402.tif 000005
【００４０】
またはその薬学的に許容される塩と
を含む組合せ医薬が、本明細書において提供される。
【００４１】
本明細書において提供される組合せ医薬は、特に、がんの治療または予防における使用のためのものである。
【００４２】
本明細書において使用される特定の用語が、下記に記載される。本発明の化合物は、標準的な命名法の使用により記載される。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４３】
用語「組合せ（combination）」、「治療的組合せ（therapeutic combination）」、または「組合せ医薬（pharmaceutical combination）」は、本明細書において使用されるとき、１つの単位剤形の固定された組合せ、もしくは固定されていない組合せ、または２つ以上の治療剤が、同時に、もしくはある時間間隔の範囲内で、とりわけこの時間間隔が、組合せ相手（combination partner）が協調的な、例えば相乗的な効果を示すことを可能にする範囲内で別々に、独立して投与されうる組合せ投与のためのキットの一部を指す。
【００４４】
用語「組合せ療法（combination therapy）」は、本開示に記載されている治療状態または障害を治療する、２つ以上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、活性成分の固定比を有する単一製剤、または各活性成分が別々の製剤（例えば、カプセル剤、および／もしくは静注製剤）などの、実質的に同時の方法によるこれらの治療剤の共投与を包含する。加えて、そのような投与は、ほぼ同時または異なる時点での、順次的な、または別々の方法による、それぞれの種類の治療剤の使用も包含する。活性成分が単一製剤または別々の製剤で投与されるかにかかわらず、薬物は、同じ治療過程の一部として同じ患者に投与される。いずれの場合においても、治療レジメンは、本明細書に記載されている状態または障害の治療に有益な効果を提供する。
【００４５】
用語「アルファ−アイソフォーム特異的ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤」、「アルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤」、「アルファ−アイソフォーム選択的ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤」、および「アルファ−アイソフォーム選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、本明細書において使用されるとき、ベータ、および／またはデルタ、および／またはガンマサブタイプよりもアルファ−アイソフォームＰＩ３Ｋの少なくとも１つの活性を選択的に標的にする、減少する、または阻害する化合物を指す。例示的なアルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、国際ＰＣＴ出願国際公開第２０１０／０２９０８２号パンフレットに開示されており、これはその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００４６】
用語「Ｂ−ＲＡＦ阻害剤」は、本明細書において使用されるとき、Ｂ−ＲＡＦの少なくとも１つの活性を選択的に標的にする、減少する、または阻害する化合物を指す。
【００４７】
用語「医薬組成物」は、哺乳動物が冒されている特定の疾患または状態を予防または治療するため、対象に、例えば哺乳動物またはヒトに投与される、少なくとも１つの治療剤を含有する混合物または溶液を指すことが本明細書において定義される。
【００４８】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書において使用されるとき、健全な医療判断の範囲内において、妥当な利益／危険比に見合うように、過剰な毒性、刺激アレルギー応答、および他の問題のある合併症を有することなく、温血動物、例えば哺乳動物またはヒトの組織との接触に適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００４９】
用語「固定された組合せ（fixed combination）」、「固定用量」、および「単一製剤」は、本明細書において使用されるとき、両方の治療剤の、がんの治療または予防に共同で治療的に有効な量を患者に送達するように製剤化された単一の担体もしくはビヒクル、または剤形を指す。単一ビヒクルは、それぞれの薬剤の量を、任意の薬学的に許容される担体または添加剤と共に送達するように設計される。一部の実施形態において、ビヒクルは、錠剤、カプセル剤、丸剤、またはパッチ剤である。他の実施形態において、ビヒクルは、溶液剤または懸濁剤である。
【００５０】
用語「固定されていない組合せ」、「キットの一部」、および「別々の製剤」は、活性成分、すなわち化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）が、両方とも別々の実体として、特定の時間制限なしで同時に、同時発生的に、または順次に患者に投与されることを意味し、そのような投与は、２つの化合物の治療効果レベルを、それを必要とする患者の身体にもたらす。後者は、カクテル療法、例えば３つ以上の活性成分の投与にも当てはまる。
【００５１】
用語「単位用量」は、治療される患者に、１つの剤形により両方の薬剤を一緒に同時投与することを意味するために、本明細書において使用される。一部の実施形態において、単位用量は単一製剤である。ある特定の実施形態において、単位用量は、各ビヒクルが有効量の少なくとも１つの薬剤を薬学的に許容される担体および添加剤と共に含むように、１つまたは複数のビヒクルを含む。一部の実施形態において、単位用量は、患者に同時に投与される、１つまたは複数の錠剤、カプセル剤、丸剤、注射剤、注入剤、パッチ剤などである。
【００５２】
「経口剤形」は、経口投与用に処方または意図された単位投与量形態を含む。
【００５３】
用語「治療する」または「治療」は、本明細書において使用されるとき、対象の少なくとも１つの症状を軽減、低減、もしくは緩和する、または疾患の進行を遅延させる治療を含む。例えば、治療は、障害の１つ、もしくはいつかの症状の減少、またはがんなどの障害の完全な消滅でありうる。本開示の意味の範囲内において、用語「治療する」は、発症を阻止すること、遅延すること（すなわち、疾患の臨床症状前の期間）、および／または疾患が発生もしくは悪化する危険性を低減することも意味する。用語「保護する」は、対象において、例えば哺乳動物またはヒトにおいて、疾患の発生、継続、または増悪を予防する、遅延する、もしくは治療する、または適切であれば、それら全てを行うことを意味するため、本明細書において使用される。用語「予防する」、「予防すること」、または「予防」は、本明細書において使用されるとき、予防される状態、疾患、または障害に関連する、または起因する少なくとも１つの症状を予防することを含む。
【００５４】
用語、治療剤の組合せの「薬学的有効量」、「治療有効量」、または「臨床有効量」は、組合せにより治療される障害のベースラインの臨床的に観察可能な兆候および症状に対して、観察可能な、または臨床的に有意な改善をもたらすのに十分な量である。
【００５５】
用語「共同治療活性」また「共同治療効果」は、本明細書において使用されるとき、治療される温血動物、とりわけヒトにおいて依然として（好ましくは、相乗的に）相互作用（共同治療効果）を示すことを選択するような時間間隔で（経時的にずれた方法で、とりわけ特定の順番で）治療剤を別々に与えることができることを意味する。このことが当てはまるかは、とりわけ、両方の化合物が治療されるヒトの血液中に少なくとも特定の時間間隔にわたって存在することを示す、化合物の血中レベルを追跡することによって、決定することができる。
【００５６】
用語「対象」または「患者」は、本明細書において使用されるとき、がん、またはがんに直接的もしくは間接的に関与する任意の障害を患う、または罹患する可能性がある動物を含むことが意図される。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、類人猿、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および遺伝子導入非ヒト動物が挙げられる。１つの実施形態において、対象は、ヒト、例えば、がんを患っている、患う危険性のある、または患う潜在的な可能性があるヒトである。
【００５７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、特に示されない限り、開放型の非限定的な意味において本明細書に使用される。
【００５８】
本発明を記載する文脈における（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに同様の参照は、本明細書において特に指示のない限り、または文脈により明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。複数形態が化合物、塩などに使用される場合、これは、単一の化合物、塩なども意味すると解釈される。
【００５９】
用語「約」または「およそ」は、関連する対象分野に知識をもつ人物によって一般的に理解されるが、特定の条件下では、所定の値または範囲の２０％以内、１０％以内、または５％以内を意味することができる。あるいは、とりわけ生物系において、用語「約」は、所定の値の約対数（すなわち、桁）の範囲内、または二倍以内を意味する。
【００６０】
本明細書において使用されるとき、ＰＩ３Ｋ阻害剤の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（式（Ｉ）の構造を有する化合物であり、本明細書において「化合物（Ｉ）」または「化合物Ａ」または「ＢＹＬ７１９」とも呼ばれる）は、クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋのアルファ（α）−アイソフォームを強力および選択的に標的にする特異的２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体化合物であり、以下の化学構造を有する。
【００６１】
【化５】
2018525402.tif 000006
【００６２】
便宜上、化合物およびその塩の群は、集合的に化合物（Ｉ）と呼ばれ、化合物（Ｉ）への参照は、選択肢において任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を指すことを意味する。
【００６３】
化合物（Ｉ）およびその薬学的に許容される塩は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１０／０２９０８２号パンフレットに記載されており、これは、その全体が参照として本明細書に組み込まれ、その調製方法は、例えばその実施例１５に記載されている。化合物（Ｉ）の調製は、本明細書の実施例１にも記載されている。好ましくは、化合物（Ｉ）は遊離塩基形態である。
【００６４】
化合物（Ｉ）は、約１〜６．５ｍｇ／ｋｇの有効１日用量で成人または小児に経口投与されうる。化合物（Ｉ）は、単回用量により、または１日あたり４回までの分割用量により、約７０ｍｇ〜４５５ｍｇ、例えば、約２００〜４００ｍｇ、または約２４０ｍｇ〜４００ｍｇ、または約３００ｍｇ〜４００ｍｇ、または約３５０ｍｇ〜４００ｍｇの１日投与量で７０ｋｇの体重の成人に経口投与されうる。好ましくは、化合物（Ｉ）は、約３５０ｍｇ〜約４００ｍｇの１日投与量で７０ｋｇの体重の成人に投与される。
【００６５】
化合物（Ｉ）の塩は、好ましくは薬学的に許容される塩であり、適切な対イオン形成性の薬学的に許容される塩は、当該分野において公知である。
【００６６】
本明細書において使用されるとき、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤のＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド、またはその薬学的に許容される塩は、式（ＩＩ）の構造により表される化合物：
【００６７】
【化６】
2018525402.tif 000007
【００６８】
またはその薬学的に許容される塩である。化合物（ＩＩ）は、ダブラフェニブとしても公知である。便宜上、化合物およびその塩の群は、集合的に化合物（ＩＩ）と呼ばれ、化合物（ＩＩ）への参照は、選択肢において任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を指すことを意味する。
【００６９】
化合物（ＩＩ）は、その薬学的に許容される塩と共に、Ｂ−ＲＡＦ活性の阻害剤として、特にがんの治療において有用であることが、ＰＣＴ／ＵＳ０９／４２６８２において開示および主張されており、そこで化合物（ＩＩ）は、実施例５８ａ〜５８ｅによって具体的に表現されている。ＰＣＴ出願は、国際公開第２００９／１３７３９１号パンフレットとして２００９年１１月１２日に公開されており、参照として本明細書に組み込まれる。化合物（ＩＩ）は、実施例２に従って本明細書に記載されているように調製することができる。化合物（ＩＩ）は、経口投与することができる。
【００７０】
化合物（ＩＩ）は（非塩処理化／非溶媒和化化合物の重量に基づいて）、単回用量により、または１日にあたり４回までの分割用量により、組合せの一部として、約１０ｍｇ〜約６００ｍｇ、例えば、約３０ｍｇ〜約４００ｍｇまたは約１００ｍｇ〜約３００ｍｇから選択される１日投与量でヒトに投与することができる。好ましくは、化合物（ＩＩ）は、約３００ｍｇ、例えば１５０ｍｇの１日２回の１日投与量で７０ｋｇの体重の成人に投与される。
【００７１】
化合物（Ｉ）もしくは化合物（ＩＩ）を、または両方とも、遊離形態または薬学的に許容される塩形態によって投与することができる。「薬学的に許容される塩」は、本明細書において使用されるとき、特に指示のない限り、本発明の化合物に存在しうる酸性および塩基性基の塩を含む。性質上塩基性である本発明の化合物は、様々な無機および有機酸と多種多様な塩を形成することができる。本発明のそのような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩の調製に使用できる酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、薬学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、塩化物、クエン酸塩、フマル酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、および酒石酸塩を形成するものである。好ましくは、化合物（ＩＩ）はメシル酸塩の形態である。
【００７２】
特に指定のない限り、または文脈により明確に示されない限り、本明細書において提供される組合せ医薬に有用な治療剤への参照は、化合物の遊離塩基および化合物の全ての薬学的に許容される塩の両方を含む。
【００７３】
アルファ−アイソフォーム選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩と、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤の化合物（ＩＩ）またはその薬学的に許容される塩とを含む組合せ療法が、本明細書において提供される。組合せの投与は、単一製剤または単位剤形による組合せの投与、組合せの個別の薬剤の同時発生的であるが別々の投与、または組合せの個別の薬剤の任意の適切な経路による順次の投与を含む。組合せの個別の薬剤の投与量は、組合せにおいて、他の薬剤と比較して薬剤のうちの１つのより頻繁な投与を必要とする可能性がある。したがって、適切な投与を可能にするため、包装された医薬品は、薬剤の組合せを含有する１つまたは複数の剤形と、薬剤の組合せのうちの１つを含有するが、組合せの他の薬剤を含有しない１つまたは複数の剤形とを含有することができる。
【００７４】
本発明は、特に、がんを治療または予防する本発明の組合せに関する。１つの実施形態において、本発明の組合せは、がんの治療または予防のために使用され、有効量の式（Ｉ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、および有効量の式（ＩＩ）の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む組合せ療法を、対象に投与することを含む。好ましくは、これらの化合物は、組み合わされたとき、有益な効果を提供する治療有効投与量で投与される。投与は、別々、同時、または順次でありうる。
【００７５】
したがって１つの実施形態において、本発明の組合せは、がんの治療または予防における使用のためのものである。１つの実施形態において、組合せは、がんの治療における使用のためのものである。
【００７６】
また、がんの治療または予防のための本発明の組合せの使用が、本明細書において提供される。１つの実施形態において、組合せの使用は、がんの治療のためである。
【００７７】
１つの実施形態において、がんは固形腫瘍である。用語「固形腫瘍」は、とりわけ、黒色腫、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび一般的な胃腸管のがん、子宮頸がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、頭頸部がん、膀胱がん、または前立腺がんを意味する。本組合せは、固形腫瘍、また液性腫瘍の成長を阻害する。更に、腫瘍の種類および使用される特定の組合せに応じて、腫瘍体積の減少を得ることができる。本明細書に開示されている発明の組合せは、腫瘍の転移性拡散および微小転移の成長または発生を予防するためにも適している。本明細書に開示されている組合せは、不十分な予後の患者の治療に適しており、とりわけ、転移性黒色腫または結腸直腸がんを有するような不十分な予後の患者に適している。
【００７８】
本明細書において提供される組合せ医薬のいずれかによる別の実施形態において、がんは、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸癌、結腸直腸がん、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管（胆管癌を含む）、肝細胞、副腎、胃部、胃、神経膠腫、ＣＮＳ（神経膠芽腫、星状細胞腫、および上衣細胞腫を含む）、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頸部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸の良性または悪性腫瘍、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、巨核芽球性白血病、赤白血病、および骨髄球性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様化生を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、ならびにバレット腺癌から選択される。
【００７９】
別の実施形態において、がんは、結腸直腸がんまたは黒色腫である。
【００８０】
別の実施形態において、がんは、切除不能または転移性黒色腫である。
【００８１】
別の実施形態において、がんは、Ｂ−ＲＡＦ突然変異、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、およびＰＩＫ３ＣＡ過剰発現のうちの１つまたは複数により特徴付けられる。
【００８２】
別の実施形態において、がんは、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤による治療に対して抵抗性がある、または難治性である。
【００８３】
がんの性質は多因子性である。特定の状況下では、異なる作用機構を有する薬物を組み合わせることができる。しかし、異なる作用様式を有する治療剤の任意の組合せを考慮するだけでは、有利な効果を有する組合せをもたらすとは限らない。
【００８４】
本発明の組合せ医薬の投与は、有益な効果、例えば、症状の緩和、症状の進行の遅延、または症状の抑制に関する、例えば相乗的な治療効果のみならず、本発明の組合せに使用される薬学的治療剤の１つのみを適用する単剤療法と比較して、更に驚くべき有益な効果、例えば、少ない副作用、より長続きする応答、改善された生活の質、または罹患率の減少をもたらすこともできる。
【００８５】
更なる利益は、例えば、多くの場合に投与量が少量でありうるのはもちろん、少ない頻度でも適用されうるように、低い用量の治療剤の本発明の組合せを使用できること、または組合せ相手の１つの単独により観察される副作用の発生を減らすために使用できることである。このことは、治療される患者の希望および要求に合致している。
【００８６】
本発明の組合せが本明細書前記に記載された有益な効果をもたらすことは、確立された試験モデルによって示すことができる。当業者は、そのような有益な効果を実証するために、関連した試験モデルを選択することが十分に可能である。本発明の組合せの薬理学的活性は、例えば、臨床研究または動物モデルによって実証することができる。
【００８７】
１つまたは複数の成分の相乗的相互作用を決定するためには、効果におけるそれぞれの構成成分の最適な効果範囲および絶対用量範囲を、治療を必要とする患者への異なるｗ／ｗ比範囲および用量にわたる構成成分の投与により明確に測定することができる。ヒトでは、患者において臨床研究を実施する複雑さ、および費用が、相乗作用の一次モデルとしてのこの試験形態の使用を実用的でなくすることがある。しかし、特定の実験（例えば、実施例３を参照されたい）において相乗作用を観察することによって、他の種における効果を予測することができ、存在する動物モデルを使用して、相乗効果を更に定量化することができる。そのような研究の結果を使用して、有効用量比の範囲、ならびに絶対用量および血漿濃度を予測することもできる。
【００８８】
１つの実施形態では、本明細書において提供される組合せ、もしくは組成物は、または両方とも、相乗効果を示す。用語「相乗効果」は、本明細書において使用されるとき、例えば、化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩、および化合物（ＩＩ）などの２つの薬剤の効果を生じる作用、例えば、がんの症候性進行またはその症状を緩徐する作用を指し、これは、薬物それ自体をそれぞれ投与した効果を単に加算したものより大きい。相乗効果は、例えば、Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘ方程式（Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981))、Ｌｏｅｗｅ加算方程式（Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)）、および半有効方程式（Chou, T. C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)）などの適切な方法を使用して計算することができる。上記に参照されたそれぞれの方程式を実験データに適用して、薬物組合せの効果を評価するのに役立つ対応するグラフを生成することができる。上記に参照された方程式に関連した対応するグラフは、それぞれ、濃度効果曲線、アイソボログラム曲線、および組合せ指数曲線（combination index curve）である。相乗効果を示す追加的な方法は、帰無仮説の最高単剤モデル（highest single agent model）（ＨＳＡ）である（Berenbaum 1989）。ＨＳＡモデルにおける超過は、阻害標的間の機能的な繋がりを予測する（Lehar, Zimmermann et al. 2007, Lehar, Krueger et al. 2009）。この方法は、組合せの強度ｚＣの指標をもたらす（例えば、本発明の組合せのある特定の実施形態のｚＣスコアの表２を含む、実施例３を参照されたい）。
【００８９】
更なる実施形態において、本発明は、本発明の組合せを含む、ヒトへの投与のための相乗作用組合せを提供し、各構成成分の用量範囲は、適切な腫瘍モデルまたは臨床研究において示唆された相乗作用範囲に相当する。
【００９０】
別の態様では、（ａ）化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩、および（ｂ）化合物（ＩＩ）またはその薬学的に許容される塩を含む組合せ調製物または医薬組成物などの医薬組成物が、本明細書において提供される。１つの実施形態において、医薬組成物は１つまたは複数の添加剤を更に含む。更なる実施形態において、医薬組成物は１つまたは複数の薬学的に許容される添加剤を更に含む。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される添加剤」または「薬学的に許容される担体」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、被覆、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素など、ならびにこれらの組合せを含み、当業者には公知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。任意の従来の担体が活性成分と適合性がない場合を除いて、治療用または医薬組成物におけるその使用が考慮される。
【００９２】
この組成物において、組合せ相手は、任意の適切な経路によって同時発生的であるが、別々に投与される、または順次に投与される、単一製剤、または単位剤形により投与することができる。単位剤形は、また、固定された組合せでありうる。
【００９３】
組合せ相手の別々の投与のため、または固定された組合せ、すなわち本発明の組合せを含む単一ガレノス組成物による投与のための医薬組成物は、それ自体公知の方法で調製することができ、治療有効量の少なくとも１つの薬理学的に活性な組合せ相手を単独で、例えば上記に示されたように含む、または経腸もしくは非経口適用にとりわけ適している１つまたは複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、ヒトを含む哺乳動物（温血動物）への経口または直腸などの経腸投与、および非経口投与に適したものである。
【００９４】
医薬組成物は、約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％の治療剤を含有することができる。
【００９５】
経腸または非経口投与のための組合せ療法に適した医薬組成物は、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセル剤もしくは坐剤、またはアンプル剤などの単位剤形のものである。特に指示のない限り、これらはそれ自体公知の方法により、例えば、様々な従来の混合、微粉砕、直接圧縮、造粒、糖衣、溶解、凍結乾燥法、溶融造粒、または当業者に容易に理解される製作技術によって調製される。それぞれの剤形の個別の用量に含有される組合せ相手の単位含有量は、必要な有効量が複数の投与単位の投与により達成されうるので、それ自体有効量を構成する必要がないことが理解される。
【００９６】
１つの態様では、がんの治療または予防のための医薬の製造における本発明の組合せの使用が、本明細書において提供される。１つの実施形態において、組合せ医薬の使用は、がんを治療する医薬の製造のためである。
【００９７】
別の態様では、がんの治療または予防のための医薬の調製に使用される本発明の組合せが、本明細書において提供される。１つの実施形態において、組合せは、がんの治療のための医薬の調製における使用のためのものである。
【００９８】
本発明の組合せにおけるそれぞれの組合せ相手の治療有効量を、同時に、または順次に任意の順番で投与することができ、構成成分を、同じ製剤または別々の製剤により投与することができる。
【００９９】
本発明の組合せに用いられるそれぞれの組合せ相手の有効投与量は、用いられる特定の化合物または医薬組成物、投与様式、治療される状態、および治療される状態の重篤度に応じて変わりうる。したがって、本発明の組合せの投与量レジメンは、投与経路、ならびに患者の腎臓および肝臓機能を含む様々な要因によって選択される。
【０１００】
毒性を有することなく有効性を生じる本発明の組合せにおける組合せ相手（例えば、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ））の最適比、個別のおよび組合せた投与量、ならびに濃度は、標的部位へ治療剤利用能の動態学に基づいており、当業者に公知の方法を使用して決定される。
【０１０１】
それぞれの組合せ相手の有効投与量は、組合せにおける他の化合物と比較して、１つの化合物のより頻繁な投与を必要とする場合がある。したがって、適切な投与を可能にするため、包装された医薬品は、化合物の組合せを含有する１つまたは複数の剤形と、化合物の組合せのうちの１つを含有するが、組合せの他の化合物を含有しない１つまたは複数の剤形とを含有することができる。
【０１０２】
本発明の組合せに用いられる組合せ相手が、単剤として市販されている形態に適用されるとき、これらの投与量および投与様式は、本明細書に別段の記載がない場合は、それぞれの市販薬の添付文書に提供されている情報に従うことができる。
【０１０３】
がんを治療または予防するためのそれぞれの組合せ相手の最適投与量は、公知の方法を使用してそれぞれの個体のために経験的に決定することができ、疾患の進展の程度、個体の年齢、体重、身体全体の健康、性別および食事、投与の時間および経路、ならびに個体が服用している他の薬剤を含むが、これらに限定されない様々な要因によって左右される。最適投与量は、当該技術において周知である日常的な試験および手順を使用して確立することができる。
【０１０４】
担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができるそれぞれの組合せ相手の量は、治療される個体および特定の投与様式に応じて変わる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている薬剤の組合せを含有する単位剤形は、薬剤が単独で投与される場合に典型的に投与される量の、組合せにおけるそれぞれの薬剤を含有する。投与の頻度は、使用される化合物、および治療または予防される特定の状態に応じて変わりうる。治療または予防される状態に適したアッセイを使用して、治療有効性について患者を一般にモニターすることができ、このことは当業者に熟知されている。
【０１０５】
本発明は、がんの進行遅延または治療に使用するために、本発明の組合せを、同時、別々、またはその順次投与用の取り扱い説明書と一緒に治療剤として含む、商業的な包装を更に提供する。
【０１０６】
治療方法
それを必要とする対象においてがんを治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明の組合せ医薬、すなわち、
（ａ）式（Ｉ）の構造を有する化合物
【０１０７】
【化７】
2018525402.tif 000008
【０１０８】
またはその薬学的に許容される塩と、
（ｂ）式（ＩＩ）の構造を有する化合物
【０１０９】
【化８】
2018525402.tif 000009
【０１１０】
またはその薬学的に許容される塩と
を含む組合せ医薬を対象に投与する方法が、本明細書において提供される。
【０１１１】
１つの実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明の組合せを対象に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。更なる実施形態では、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の本発明の組合せを対象に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１１２】
本発明のいずれかの方法の１つの実施形態において、がんは固形腫瘍である。本方法は、固形腫瘍、また液性腫瘍の成長を阻害することができる。更に、腫瘍の種類および使用される特定の組合せに応じて、腫瘍体積の減少を得ることができる。本明細書に開示されている方法は、腫瘍の転移性拡散、および微小転移の成長または発生を予防するためにも適している。本明細書に開示されている方法は、不十分な予後の患者、とりわけ、転移性黒色腫または結腸直腸がんを有するような不十分な予後の患者の治療に適している。
【０１１３】
本明細書において提供される方法のいずれかによる別の実施形態において、がんは、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸癌、結腸直腸がん、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管（胆管癌を含む）、肝細胞、副腎、胃部、胃、神経膠腫、ＣＮＳ（神経膠芽腫、星状細胞腫、および上衣細胞腫を含む）、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頸部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸の良性または悪性腫瘍、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、巨核芽球性白血病、赤白血病、および骨髄球性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様化生を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、ならびにバレット腺癌から選択される。
【０１１４】
別の実施形態において、がんは、結腸直腸がんまたは黒色腫である。
【０１１５】
別の実施形態において、がんは、切除不能または転移性黒色腫である。
【０１１６】
別の実施形態において、がんは、Ｂ−ＲＡＦ突然変異、Ｂ−ＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、およびＰＩＫ３ＣＡ過剰発現のうちの１つまたは複数により特徴付けられる。
【０１１７】
別の実施形態において、がんは、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤による治療に対して抵抗性がある、または難治性である。
【０１１８】
本発明によってがんを治療または予防する方法は、共同で治療上有効である量、好ましくは相乗的に有効である量により、例えば、本明細書に記載されている量に対応する１日または断続的投与量により、同時に、または任意の順番で順次に、（ｉ）遊離または薬学的に許容される塩形態の薬剤（ａ）を投与すること、および（ｉｉ）遊離また薬学的に許容される塩形態の薬剤（ｂ）を投与することを含むことができる。本発明の組合せの個別の組み合わせ相手を、分割した、または単一の組み合わせ形態により、治療経過の間の異なる時間で別々に、または同時発生的に投与することができる。したがって本発明は、そのようなレジメンの同時または交互治療を全て包含すると理解されるべきであり、用語「投与する」は、そのように解釈されるべきである。
【０１１９】
以下の実施例は、上記に記載された本発明を例示しているが、本発明の範囲をいかようにも制限することを意図しない。本発明の組合せ医薬の有益な効果は、それ自体当業者に公知の他の試験モデルによって決定することもできる。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：
Ｉ．（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−｛［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イル］−アミド｝の合成
【０１２１】
【化９】
2018525402.tif 000010
【０１２２】
Ｅｔ３Ｎ（１．５４ｍＬ、１１．１ｍｍｏｌ、３当量）を、ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のイミダゾール−１−カルボン酸［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イル］−アミド（ステップ１．１）（１．２６ｇ、３．７ｍｍｏｌ）およびＬ−プロリンアミド（０．５４８ｇ、４．８ｍｍｏｌ、１．３当量）の溶液に、アルゴン雰囲気下で加える。反応混合物を室温で１４時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液の添加によりクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮する。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０→９４：６）により精製し、続いてＥｔ２Ｏ中ですり混ぜて、１．２２ｇの表題化合物をオフホワイトの固体として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：３８８．１［Ｍ＋Ｈ］＋；ｔＲ＝２．３５分（系１）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９：１）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 1.32 (s, 9 H) 1.75-1.95 (m, 3 H) 1.97 - 2.13 (m, 1 H) 2.39 (s, 3 H) 3.38-3.50 (m, 1 H) 3.52-3.65 (m., 1 H) 4.10-4.40 (m, 1 H) 6.94 (br. s., 1 H) 7.22 (d, 1 H) 7.30 - 7.48 (m, 2 H) 8.49 (d, 1 H) 10.87 (br. s., 1 H).
【０１２３】
ステップ１．１：イミダゾール−１−カルボン酸［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イル］−アミド
【０１２４】
【化１０】
2018525402.tif 000011
【０１２５】
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イルアミン（ステップ１．２）（１ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（０．９８４ｇ、６．０７ｍｍｏｌ、１．５当量）の混合物を還流下で４時間撹拌し、冷ます。得られた沈殿物を濾過により収集して、１．２６ｇの表題化合物を白色の固体として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：３４０．２［Ｍ−Ｈ］−；ｔＲ＝２．８５分（系１）。
【０１２６】
ステップ１．２：５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イルアミン
【０１２７】
【化１１】
2018525402.tif 000012
【０１２８】
Ｎ−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イル］−アセトアミド（ステップ１．３）（２ｇ、７ｍｍｏｌ）、ＨＣｌの６Ｎ水溶液（１０ｍＬ）、およびＥｔＯＨ（５０ｍＬ）の混合物を、８５℃で２時間撹拌し、冷却し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液の添加によりクエンチし、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）で抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮する。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０→９６：４）により精製して、１．２１ｇの表題化合物を黄色の固体として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：２４８．１［Ｍ＋Ｈ］＋；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９：１）。
【０１２９】
ステップ１．３：Ｎ−［５−（２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン−４−イル）−４−メチル−チアゾール−２−イル］−アセトアミド
【０１３０】
【化１２】
2018525402.tif 000013
【０１３１】
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の２−アセトアミド−４−メチルチアゾール（１．２ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１．１当量）、炭酸セシウム（４．５５ｇ、１４ｍｍｏｌ、２当量）、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィニウムテトラフルオロボレート（０．４０６ｇ、１．４ｍｍｏｌ、０．２当量）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．１５ｇ、０．７ｍｍｏｌ、０．１当量）、および４−ブロモ−２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン（ステップ１．４）（１．５ｇ、７ｍｍｏｌ）の混合物を、アルゴン雰囲気下、９０℃で１．５時間撹拌し、冷却し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液の添加によりクエンチし、セライドパッドで濾過する。濾液をＥｔＯＡｃで抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮する。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０→９７：３）により精製して、２．０２ｇの表題化合物を黄色の固体として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：２９０．１［Ｍ＋Ｈ］＋；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９：１）。
【０１３２】
ステップ１．４：４−ブロモ−２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピリジン
【０１３３】
【化１３】
2018525402.tif 000014
【０１３４】
２−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピリジン−４−オン（ステップ１．５）（４．２５ｇ、２８ｍｍｏｌ）およびＰＯＢｒ３（８．８８ｇ、３１ｍｍｏｌ、１．１当量）の混合物を１２０℃に加熱し、１５分間撹拌し、冷却し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液の添加によりクエンチし、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）で抽出する。有機相をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮する。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ、９５：５）により精製して、５．１８ｇの表題化合物を黄色の油状物として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：２１４．０／２１６．０［Ｍ＋Ｈ］＋；ｔＲ＝２．４９分（系１）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３５（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ、１：１）。
【０１３５】
ステップ１．５：２−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピリミジン−４−オン
【０１３６】
【化１４】
2018525402.tif 000015
【０１３７】
２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピラン−４−オン（ステップ１．６）（５．７４ｇ、３７．７ｍｍｏｌ）および水酸化アンモニウムの３０％水溶液（１００ｍＬ）の混合物を還流下で１時間撹拌し、冷却し、濃縮する。残留物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中ですり混ぜ、濾過する。濾液を濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３水溶液、９４：５：１→９２：７：１）により精製して、４．４６ｇの表題化合物を黄色の固体として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：１５２．０［Ｍ＋Ｈ］＋；ｔＲ＝１．４５分（系１）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９：１）。
【０１３８】
ステップ１．６：２−ｔｅｒｔ−ブチル−ピラン−４−オン
【０１３９】
【化１５】
2018525402.tif 000016
【０１４０】
ベンゼン（２５０ｍＬ）中の５−ヒドロキシ−１−メトキシ−６，６−ジメチル−ヘプタ−１，４−ジエン−３−オン（ステップ１．７）（６．８ｇ、３６．９ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（５．６５ｍＬ、７４ｍｍｏｌ、２当量）の混合物を室温で１４時間撹拌し、濃縮する。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ、１：０→７５：２５）による残留物の精製は、５．７４ｇの表題化合物を黄色の油状物としてもたらす。ＥＳＩ−ＭＳ：１５３．１［Ｍ＋Ｈ］＋；ｔＲ＝３．２１分（系１）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２２（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ、１：１）。
【０１４１】
ステップ１．７：５−ヒドロキシ−１−メトキシ−６，６−ジメチル−ヘプタ−１，４−ジエン−３−オン
【０１４２】
【化１６】
2018525402.tif 000017
【０１４３】
ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、１００ｍＬ、２当量）を、ＴＨＦ（４００ｍＬ）中の４−メトキシ−３−ブテン−２−オン（１０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ、２当量）の冷却（−７８℃）溶液に滴下添加する。−７８℃で３０分間撹拌した後、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の塩化ピバロイル（６．１２ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）の溶液を加える。得られた混合物を２時間かけて室温に温め、ＮＨ４Ｃｌの飽和溶液の添加によりクエンチする。ＴＨＦを真空下で除去する。濃縮混合物をＥｔ２Ｏで抽出する。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮する。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ、１：０→８５：１５）により精製して、６．８３ｇの表題化合物を黄色の油状物として得る。ＥＳＩ−ＭＳ：１８５．１［Ｍ＋Ｈ］＋；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８７（Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ、１：１）。
【０１４４】
ＩＩ．（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物（Ｉ）または化合物ＡまたはＢＹＬ７１９）の合成
表題化合物は、上記に記載された手順に類似しているが、以下の修正を伴って調製される。ステップ１．１では、反応混合物を還流下で１４時間撹拌する。ステップ１．２では、反応混合物を８５℃で１時間撹拌し、クエンチした後、ＥｔＯＡｃで抽出する。ステップ１．３では、反応混合物を１２０℃で２．５時間撹拌する。ステップ１．４では、反応混合物を８３℃で１時間撹拌し、クエンチした後、ＥｔＯＡｃで抽出する。ステップ１．５では、反応混合物を６５℃で１時間撹拌し、ＭｅＯＨ中でのすり混ぜは実施しない。ステップ１．６では、粗生成物を精製しない。ステップ１．７では、３，３，３−トリフルオロ−２，２−ジメチル−プロピオニルクロリドを使用する。
【０１４５】
表題化合物：ＥＳＩ−ＭＳ：４４２．０［Ｍ＋Ｈ］＋；ｔＲ＝３．０２分（系１）；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９：１）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 1.60 (s, 6 H) 1.70-1.95 (m, 3 H) 1.99 - 2.16 (m, 1 H) 2.40 (s, 3 H) 3.38 - 3.51 (m, 1 H) 3.51 - 3.69 (m, 1 H) 4.10-4.40 (m, 1 H) 6.95 (br. s., 1 H) 7.39 (d, 2 H) 7.53 (s, 1 H) 8.58 (d, 1 H) 10.93 (br. s., 1 H)
【０１４６】
代替的な手順において、表題化合物は、上記に記載された手順に類似しているが、以下の修正を伴って調製される。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドをＤＭＦの代わりに使用し、混合物を６５℃で２時間撹拌する。ステップ１．１では、クロロギ酸フェニル（ゆっくりと添加した）を１，１’−カルボニルジイミダゾールの代わりに使用し、反応を、Ｎ，Ｎ−ジエチル−イソプロピルアミンの存在下、ＴＨＦ中において室温で（１．５時間）実施する。ステップ１．２では、反応混合物を（還流下で）５時間撹拌しながら加熱し、クエンチした後、ＥｔＯＡｃで抽出する。ステップ１．３では、反応混合物を１００℃で２時間撹拌する。ステップ１．４では、反応を１．１当量のＰＯＢｒ３および１．１当量のトリプロピルアミンを使用してトルエン中で実施し、混合物を８０℃で２時間撹拌し、クエンチした後、ＥｔＯＡｃで抽出する。ステップ１．５では、反応混合物を６５℃で１時間撹拌し、ＭｅＯＨ中でのすり混ぜは実施しない。ステップ１．６では、トルエンをベンゼンの代わりに使用し、粗生成物を精製しない。ステップ１．７では、３，３，３−トリフルオロ−２，２−ジメチル−プロピオニルクロリドを使用する。
【０１４７】
実施例２：化合物（ＩＩ）（化合物Ｂ）の合成
方法１：化合物Ｂ（第１の結晶形）  −  Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【０１４８】
【化１７】
2018525402.tif 000018
【０１４９】
Ｎ−｛３−［５−（２−クロロ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（１９６ｍｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）および７Ｍメタノール中アンモニア（８ｍｌ、５６．０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、密閉管において９０℃で２４時間加熱した。反応物をＤＣＭで希釈し、シリカゲルを加え、濃縮した。粗生成物を、１００％ＤＣＭ〜１：１［ＤＣＭ：（９：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）］で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけた。透明な画分を濃縮して、粗生成物を生じた。粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（両方とも０．１％のＴＦＡを伴うアセトニトリル：水の勾配）により再精製した。合わせた透明な画分を濃縮し、次にＤＣＭと飽和ＮａＨＣＯ３に分配した。ＤＣＭ層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。表題化合物のＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドを得た（９４ｍｇ、収率４７％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.83 (s, 1 H), 7.93 (d, J=5.2 Hz, 1 H), 7.55 - 7.70 (m, 1 H), 7.35 - 7.43 (m, 1 H), 7.31 (t, J=6.3 Hz, 1 H), 7.14 - 7.27 (m, 3 H), 6.70 (s, 2 H), 5.79 (d, J=5.13 Hz, 1 H), 1.35 (s, 9 H).ＭＳ（ＥＳＩ）：５１９．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１５０】
方法２：化合物Ｂ（代替的な結晶形）  −  Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
１９．６ｍｇのＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（米国特許ＰＣＴ出願第０９／４２６８２号明細書の実施例５８ａに従って調製することができる）を、２ｍＬのバイアル中において５００μＬの酢酸エチルと室温で合わせた。スラリーを０〜４０℃の温度サイクルに４８時間付した。得られたスラリーを室温に冷却し、固体を真空濾過により収集した。固体を、ラマン、ＰＸＲＤ、ＤＳＣ／ＴＧＡ分析により分析し、実施例５８ａ（米国特許ＰＣＴ出願第０９／４２６８２号明細書）によりもたらされる結晶形と異なる結晶形を示した。
【０１５１】
方法３：化合物Ｂ（代替的な結晶形、大きなバッチ）  −  Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【０１５２】
【化１８】
2018525402.tif 000019
【０１５３】
ステップＡ：メチル３−｛［（２，６−ジフルオロフェニル）スルホニル］アミノ｝−２−フルオロベンゾエート
【０１５４】
【化１９】
2018525402.tif 000020
【０１５５】
メチル３−アミノ−２−フルオロベンゾエート（５０ｇ、１当量）を反応器に投入し、続いてジクロロメタン（２５０ｍＬ、５容量）を投入した。内容物を撹拌し、約１５℃に冷却し、ピリジン（２６．２ｍＬ、１．１当量）を加えた。ピリジンを加えた後、反応器の内容物を約１５℃に調整し、２，６−ジフルオロベンゼンスルホニルクロリド（３９．７ｍＬ、１．０当量）の添加を添加漏斗により開始した。添加中の温度を＜２５℃に保持した。添加が完了した後、反応器の内容物を２０〜２５℃に温め、一晩保持した。酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、ジクロロメタンを蒸留により除去した。蒸留が完了すると、反応混合物を、もう一度酢酸エチル（５容量）で希釈し、濃縮した。反応混合物を酢酸エチル（１０容量）および水（４容量）で希釈し、内容物を、全ての固体が溶解するまで撹拌しながら、５０〜５５℃で加熱した。層を沈降させ、分離した。有機層を水（４容量）で希釈し、内容物を５０〜５５℃で２０〜３０分間加熱した。層を沈殿させ、次に分離し、酢酸エチル層を減圧下で約３容量に蒸発させた。酢酸エチル（５容量）を加え、再び減圧下で約３容量に蒸発させた。次にシクロヘキサン（９容量）を反応器に加え、内容物を３０分間加熱還流し、次に０℃に冷却した。固体を濾過し、シクロヘキサン（２×１００ｍＬ）ですすいだ。固体を一晩空気乾燥して、メチル３−｛［（２，６−ジフルオロフェニル）スルホニル］アミノ｝−２−フルオロベンゾエート（９４．１ｇ、９１％）を得た。
【０１５６】
ステップＢ：Ｎ−｛３−［（２−クロロ−４−ピリミジニル）アセチル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【０１５７】
【化２０】
2018525402.tif 000021
【０１５８】
上記のステップＡに従って一般的に調製されたメチル３−｛［（２，６−ジフルオロフェニル）スルホニル］アミノ｝−２−フルオロベンゾエート（４９０ｇ、１当量）を、ＴＨＦ（２．４５Ｌ、５容量）に溶解し、撹拌し、０〜３℃に冷却した。ＴＨＦ中の１Ｍのリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（５．２７Ｌ、３．７当量）の溶液を反応混合物に投入し、続いてＴＨＦ（２．４５Ｌ、５容量）中の２−クロロ−４−メチルピリミジン（２３８ｇ、１．３当量）を加えた。次に反応物を１時間撹拌した。反応物を４．５ＭのＨＣｌ（３．９２Ｌ、８容量）でクエンチした。水層（下側層）を除去し、廃棄した。有機層を減圧下で約２Ｌに濃縮した。ＩＰＡＣ（酢酸イソプロピル）（２．４５Ｌ）を反応混合物に加え、次にそれを約２Ｌに濃縮した。ＩＰＡＣ（０．５Ｌ）およびＭＴＢＥ（２．４５Ｌ）を加え、Ｎ２下で一晩撹拌した。固体を濾過した。固体および母濾液（mother filtrate）を一緒に戻して添加し、数時間撹拌した。固体を濾過し、ＭＴＢＥ（約５容量）で洗浄した。固体を真空オーブンの中に５０℃で一晩置いた。固体を真空オーブンにおいて３０℃で週末にかけて乾燥して、Ｎ−｛３−［（２−クロロ−４−ピリミジニル）アセチル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（４７９ｇ、７２％）を得た。
【０１５９】
ステップＣ：Ｎ−｛３−［５−（２−クロロ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
【０１６０】
【化２１】
2018525402.tif 000022
【０１６１】
反応容器に、Ｎ−｛３−［（２−クロロ−４−ピリミジニル）アセチル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（３０ｇ、１当量）、続いてジクロロメタン（３００ｍＬ）を投入した。反応スラリーを約１０℃に冷却し、Ｎ−ブロモスクシンイミド（「ＮＢＳ」）（１２．０９ｇ、１当量）を３つのほぼ等しい部分によって加え、それぞれの添加の間に１０〜１５分間撹拌した。ＮＢＳの最終添加の後、反応混合物を約２０℃に温め、４５分間撹拌した。次に水（５容量）を反応容器に加え、混合物を撹拌し、次に層を分離した。再び水（５容量）をジクロロメタン層に加え、混合物を撹拌し、層を分離した。ジクロロメタン層を約１２０ｍＬに濃縮した。酢酸エチル（７容量）を反応混合物に加え、約１２０ｍＬに濃縮した。次にジメチルアセトアミド（２７０ｍＬ）を反応混合物に加え、約１０℃に冷却した。２，２−ジメチルプロパンチオアミド（１．３ｇ、０．５当量）を２つの等しい部分により、反応器の内容物に加え、添加の間に約５分間撹拌した。反応物を２０〜２５℃に温めた。４５分後、容器の内容物を７５℃に加熱し、１．７５時間保持した。次に反応混合物を５℃に冷却し、温度を３０℃未満に保ちながら、水（２７０ｍｌ）をゆっくりと投入した。次に酢酸エチル（４容量）を投入し、混合物を撹拌し、層を分離した。再び酢酸エチル（７容量）を水層に投入し、内容物を撹拌し、分離した。再び酢酸エチル（７容量）を水層に投入し、内容物を撹拌し、分離した。有機層を合わせ、水（４容量）で４回洗浄し、２０〜２５℃で一晩撹拌した。次に有機層を熱および真空下で１２０ｍＬに濃縮した。次に容器の内容物を５０℃に加熱し、ヘプタン（１２０ｍＬ）をゆっくりと加えた。ヘプタンを加えた後、容器の内容物を加熱還流し、次に０℃に冷却し、約２時間保持した。固体を濾過し、ヘプタン（２×２容量）ですすいだ。次に固体生成物を真空下、３０℃で乾燥して、Ｎ−｛３−［５−（２−クロロ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（２８．８ｇ、８０％）を得た。
【０１６２】
ステップＤ：Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
１ガロン圧力反応器において、上記のステップＣに従って調製されたＮ−｛３−［５−（２−クロロ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（１２０ｇ）および水酸化アンモニウム（２８〜３０％、２．４Ｌ、２０容量）の混合物を密閉圧力反応器中で９８〜１０３℃に加熱し、この温度で２時間撹拌した。反応物を室温（２０℃）にゆっくりと冷却し、一晩撹拌した。固体を濾過し、最小量の母液で洗浄し、真空下で乾燥した。固体を、ＥｔＯＡｃ（１５容量）／水（２容量）の混合物に加え、加熱して、６０〜７０℃で溶解を完了させ、水層を除去し、廃棄した。ＥｔＯＡｃ層に水（１容量）を投入し、ＨＣｌ水溶液により約５．４〜５．５のｐＨに中和し、水（１容量）加えた。水相を６０〜７０℃で除去し、廃棄した。有機層を水（１容量）により６０〜７０℃で洗浄し、水層を除去し、廃棄した。有機層を６０℃で濾過し、３容量に濃縮した。ＥｔＯＡｃ（６容量）を混合物に投入し、７２℃で１０分間加熱および撹拌し、次に２０℃に冷却し、一晩撹拌した。ＥｔＯＡｃを真空蒸留により除去して、反応混合物を約３容量に濃縮した。反応混合物を約６５〜７０℃で約３０分間維持した。ヘプタンスラリー中の、上記の実施例５８ｂにおいて調製された（および実施例５８ｂの手順により調製された）ものと同じ結晶形を有する生成物の結晶を、投入した。ヘプタン（９容量）を６５〜７０℃でゆっくりと加えた。スラリーを６５〜７０℃で２〜３時間撹拌し、次に０〜５℃にゆっくりと冷却した。生成物を濾過し、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（３／１ｖ／ｖ、４容量）で洗浄し、真空下において４５℃で乾燥して、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（１０２．３ｇ、８８％）を得た。
【０１６３】
方法４：化合物Ｂ（メシル酸塩）  −  Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネート
【０１６４】
【化２２】
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【０１６５】
イソプロパノール（２ｍＬ）中のＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（２０４ｍｇ、０．３９３ｍｍｏｌ）の溶液に、メタンスルホン酸（０．１３１ｍＬ、０．３９３ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で３時間撹拌した。白色の沈殿物が形成され、スラリーを濾過し、ジエチルエーテルですすいで、表記生成物を白色の結晶質固体（２１０ｍｇ、収率８３％）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.85 (s, 1 H) 7.92 - 8.05 (m, 1 H) 7.56 - 7.72 (m, 1 H) 6.91 - 7.50 (m, 7 H) 5.83 - 5.98 (m, 1 H) 2.18 - 2.32 (m, 3 H) 1.36 (s, 9 H).ＭＳ（ＥＳＩ）：５２０．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６６】
方法５：化合物Ｂ（代替的なメシル酸塩の実施形態）  −  Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネート
Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（実施例５８ａにより調製することができる）（２．３７ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を、予備濾過アセトニトリル（５．２５容量、１２．４ｍＬ）と合わせた。Ｈ２Ｏ（０．７５当量、１．７８ｍＬ）中のメタンスルホン酸（mesic acid）（１．１当量、５．０２ｍｍｏｌ、０．４８ｇ）の予備濾過溶液を、２０℃で加えた。低い撹拌速度を維持しながら、得られた混合物の温度を５０〜６０℃に上昇させた。混合物の温度が５０〜６０に達すると、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネート（０．２容量の予備濾過アセトニトリルでスラリー化した１．０％ｗ／ｗ）の種スラリーを加え、混合物を、固体が沈殿するのを避けるのに十分な速度で撹拌しながら、５０〜６０℃で２時間熟成させた。次に混合物を０．２５℃／分で０〜５℃に冷却し、０〜５℃で６時間保持した。混合物を濾過し、湿潤ケーキを予備濾過アセトニトリルで２回洗浄した。第１の洗浄液は、１４．２ｍｌ（６容量）の予備濾過アセトニトリルから構成され、第２の洗浄液は９．５ｍｌ（４容量）の予備濾過アセトニトリルから構成された。湿潤固体を真空下、５０℃で乾燥して、２．３９ｇ（収率８５．１％）の生成物をもたらした。
【０１６７】
実施例３：ＢＲＡＦ突然変異結腸直腸がん細胞系におけるＰＩＫ３Ｃ阻害剤のＢＹＬ７１９（化合物Ａ）をＢＲＡＦ阻害剤のダブラフェニブ（化合物Ｂ）と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
化合物ＡおよびＢを１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）に２０ｍＭの濃度で溶解し、使用するまで−２０℃で保存した。化合物を薬物マスタープレート（drug master plate）（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８８８７６）に配列し、２０００×濃度で３倍に連続希釈（７ステップ）した。
【０１６８】
この研究に使用される結腸直腸がん細胞系を、商業的供給者のＡＴＣＣ、ＨＳＲＲＢ、およびＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（表１）から得て、培養し、処理した。全ての細胞系の培地には、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）を補充した。ＬＩＭ２４０５およびＬＩＭ２５５１の培地には、０．６μｇ／ｍＬのインスリン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｉ９２７８）、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｈ０１３５）、および１０μＭの１−チオグリセロール（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ６１４５）を追加的に補充した。
【０１６９】
【表１】
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【０１７０】
細胞系を、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーターで培養し、Ｔ−７５フラスコで拡大させた。全ての場合において、細胞は、凍結貯蔵物から解凍し、１：３希釈を使用して≧１継代で拡大させ、平板培養する前に、ＶｉＣｅｌｌ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、生存度について評価した。細胞系を分裂および拡大させるため、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用してフラスコから取り出した。Ｉｄｅｘｘ  Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）により実施されたＰＣＲ検出方法により決定され、ＳＮＰパネルの検出によって正確に確認されたように、全ての細胞系には、マイコプラズマ汚染がないことが決定された。
【０１７１】
細胞増殖に対する化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せの効果を試験するため、細胞を、透明底を有する黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）において、ウェル１つあたり５０μＬの培地に５００〜１２５０細胞／ウェルの細胞密度（表１）で平板培養し、３７度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞系１つあたり１つの３８４ウェルプレートを、処理を受けることなく（＝「ベースライン」）、顕微鏡検査法による細胞計数のために調製した（下記を参照されたい）。他の細胞プレートは、ＡＴＳ音響液体分配器（acoustic liquid dispenser）（ＥＣＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により薬物マスタープレートから２５ｎＬの２０００×化合物を移し、最終１×濃度をもたらすことによって処理した。化合物Ａを１３ｎＭ〜１０μＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｂを１．４ｎＭ〜１μＭの最終濃度範囲で使用した（１：３希釈の７段階）。化合物Ａと化合物Ｂの組合せでは、単剤をそれぞれの希釈において１：１の固定比で組み合わせて、７つの組み合わせ処理をもたらした。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１μＭの用量範囲の７ポイント１：２希釈系列）を、処理対照として移し、試験細胞系に有効性のない化合物を化合物Ａおよび化合物Ｂと組み合わせて、組み合わせ対照（より有効な単剤の有効性を超えない組合せ＝「非相互作用」組合せ）として使用した。化合物を添加した後、５０ｎＬの２ｍＭ  ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１０４２３）を、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）の使用により３回の複製のうちの１回に加えた。カスパーゼ３／７誘発を、処理により誘発されるアポトーシスの代理として測定した。細胞を倍加時間に応じて７２時間から９６時間処理し（表１）、カスパーゼ３／７活性化を、４×対物レンズおよびＦＩＴＣ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、顕微鏡検査法により２４時間毎に測定した。処理の最後に、細胞を顕微鏡検査法による細胞計数のために調製した。細胞を、ＰＢＳ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＭ−２２０）中の４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）、０．１２％ＴＸ−１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２２１４０）において、４５分間にわたって固定および透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、それらのＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｈ３５７０）により最終濃度４μｇ／ｍＬで３０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にプレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によりアルミニウムシール（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号  ０６６４４−００１）でヒートシールし、画像化するまで４℃で保存した。全ての細胞では、ウェル／処��毎に４×対物レンズおよびＤＡＰＩ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する蛍光顕微鏡検査法により単一画像を撮った。
【０１７２】
以前に記載された方法（Horn, Sandmann et al. 2011, Nat. Methods 8(4): 341-346）を適用し、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅ（Pau, Fuchs et al. 2010, Bioinformatics 26(7):979-981）を使用した後、画像を分析した。両方のチャンネルにおける対象物、ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＤＮＡの）およびＦＩＴＣ（カスパーゼ３／７の）を適応閾値化により別々にセグメント化し、計数した。カスパーゼ３／７陽性対象物の閾値は、陰性対照（ＤＭＳＯ）と陽性対照（スタウロスポリン）とを比較した後、細胞系１つ毎に手作業により確定した。ＤＮＡチャンネルにおいて対象物／核の１７の追加的特徴（形状および強度特徴）を分析することによって、細片／断片化核を確認した。このため、細胞系１つ毎に、陽性対照（スタウロスポリン）および陰性対照（ＤＭＳＯ）の追加的な特徴の分布を、手作業により比較した。条件によって差が生じうる特徴（例えば、ＤＭＳＯとスタウロスポリンとを比較した特徴測定分布におけるシフト）を、「生存」核の集団に対して「細片」集団を確定するために使用した。細片計数を、生の核計数から差し引いた。得られた核の数を細胞増殖の測度（「細胞計数」）として使用した。
【０１７３】
細胞増殖に対する化合物の効果を、陰性対照（ＤＭＳＯ）の細胞計数に対する処理細胞計数から計算し、図１では、ｙ軸に「正規化細胞計数」（＝「ｘｎｏｒｍ」）と示されている。相乗的組合せは、帰無仮説の最高単剤モデル（ＨＳＡ）（Berenbaum 1989）を使用して確認した。ＨＳＡモデルにおける超過は、阻害標的間の機能的な繋がりを予測する（Lehar, Zimmermann et al. 2007, Lehar, Krueger et al. 2009）。モデルの入力は、薬物用量毎の阻害値である。
Ｉ＝１−ｘｎｏｒｍ
Ｉ：阻害
ｘｎｏｒｍ：正規化細胞計数（３回の複製の中央値）
【０１７４】
組合せ処理の全ての用量点において、組合せの阻害と、２つの単剤のより強力な方の阻害との差を計算した（＝残差モデル）。高い阻害での組合せ効果が好ましいので、残差には、同じ用量点で観察された阻害を加重した。薬物組合せの全体的な組合せスコアＣは、全ての濃度の加重残差の合計である。
Ｃ＝Σ濃度（Ｉデータ＊（Ｉデータ−Ｉモデル））
Ｉデータ：測定阻害値
Ｉモデル：ＨＳＡ帰無仮説による阻害値
【０１７５】
堅牢な組合せｚスコア（ｚＣ）を、処理の組合せスコアＣと、非相互作用組合せの絶対偏差の中央値（ｍａｄ）との比として計算した。
ｚＣ＝Ｃ／ｍａｄ（Ｃゼロ）
Ｃゼロ：非相互作用組合せの組合せスコア
【０１７６】
ｚＣは、組合せの強さの指標である。
ｚＣ≧３：相乗作用
３＞ｚＣ≧２：弱い相乗作用
ｚＣ＜２：相乗作用なし
【０１７７】
ＩＣ５０は、ＤＭＳＯに対して５０％の細胞計数をもたらす化合物濃度である。ＩＣ５０の計算（表２を参照されたい）は、ＲのＤＲＣパッケージ（Ritz and Streibig January 2005, Journal of Statistical Software, “Bioassay analysis using R”, 12:5:1-22）を使用し、データに４パラメーター対数ロジスティック関数を当てはめて行った。
【０１７８】
アポトーシスに対する化合物の効果は、生の細胞計数（細片を差し引く前）と比べた、処理および時点毎の活性化カスパーゼ３／７を有する細胞のパーセンテージを計算することによって決定した（図２のｙ軸）。実験的に測定しなかった時点の細胞計数は、０日目および処理の最終日に対数変換細胞計数を線形モデルに当てはめる（指数細胞成長を推定する）回帰分析によって得た。
【０１７９】
ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤（ＢＹＬ７１９、化合物Ａ）およびＢＲＡＦ阻害剤（ダブラフェニブ、化合物Ｂ）の有効性を、合計で７つのＢＲＡＦ突然変異結腸直腸がん細胞系（３つはＰＩＫ３ＣＡでも突然変異があった）において、個別および組合せにより評価した（表１）。化合物Ａは、単剤として、マイクロモルのＩＣ５０値により、ＰＩＫ３ＣＡに突然変異を有する全ての細胞系の成長を特異的に阻害した（図１および表２）。化合物Ｂは、単剤として、ナノモルからマイクロモル未満のＩＣ５０値により、２つの細胞系（ＬＳ４１１Ｎ、ＯＵＭＳ−２３）を除いて全ての細胞系の成長を強力に阻害した（図１および表２）。組合せ処理は、１つの系（ＯＵＭＳ−２３）を除いて全ての系において、異なる強度で相乗的阻害を（ＨＳＡモデルに従って）引き起こした（表２）。組合せは、一般に、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有する細胞系においてより強力な効果を有した。組合せはまた、試験した細胞モデルにおいて異なる程度（図２）でアポトーシス誘発し（カスパーゼ３／７誘発の測定により評価）、最強の誘発は、ＬＳ４１１ＮおよびＬＩＭ２４０５において見られた。ＢＲＡＦ突然変異結腸直腸がんにおけるＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦを組合せた阻害は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療様式を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【０１８０】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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