(57)【要約】ガンの処置のための方法において使用され得るウイルスが、本明細書で開示される。さらに具体的には、このウイルスは、有効な抗腫瘍免疫応答を誘導する、２つ以上の抗体を発現する。このウイルスはまた、診断方法でも用いられ得る。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において固形腫瘍を処置するための方法であって、前記腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、または前記腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞を前記対象に投与することを包含し、前記ウイルスは以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、または（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する、前記方法。
【請求項２】
前記ウイルスが腫瘍崩壊性ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍崩壊性ウイルスが、ワクシニアウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが複製コンピテントな腫瘍崩壊性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが、ＴＭＥを標的する２つ以上の抗体を発現する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記２つ以上の抗体が、以下：（ａ）血管形成及び／または血管新生を刺激するタンパク質に結合する抗体、（ｂ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／Ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４からなる群より選択される受容体チロシンキナーゼに結合する抗体、ならびに（ｃ）上皮−間葉相互作用の発達に関与するタンパク質に結合する抗体からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つ以上の抗体が、以下：血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、ならびに線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する抗体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスが、ＶＥＧＦに結合する抗体、ＥＧＦＲに結合する抗体、ならびにＦＡＰに結合する抗体を発現する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記２つ以上の抗体のうちの１つが、ＶＥＧＦに結合する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＶＥＧＦに結合する前記抗体がＧ６−３１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記２つ以上の抗体のうちの１つが、ＥＧＦＲに結合する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲに結合する前記抗体が抗ＥＧＦＲＶＨＨである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２つ以上の抗体のうちの１つが、ＦＡＰに結合する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ＦＡＰに結合する前記抗体がＭ０３６である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２つ以上の抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＥＧＦＲに結合する抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記２つ以上の抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記２つ以上の抗体が、ＥＧＦＲに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＶＡＣＶが、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
追加のガン治療を施すことをさらに包含する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記追加の癌治療が、以下：放射線療法、化学療法、免疫療法、光線療法、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍が、以下：神経膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍、及び黒色腫から選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが前記対象に静脈内送達される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスが腫瘍に直接的に静脈内送達されるか、または対象に対して腫瘍の領域内に送達される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、腫瘍内の細胞に感染し得る少なくとも１つの追加のウイルスを前記対象に提供することを包含し、前記少なくとも１つの追加のウイルスが以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質のうちの１つ以上を発現し、１つ以上の：（ｉ）ＴＭＥを標的する抗体または（ｉｉ）少なくとも１つの追加のウイルスによって発現される、ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質が、請求項１によって提供されるウイルスによって発現される前記抗体と比較して異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、少なくとも１つの追加のウイルスを前記対象に提供することを包含し、前記少なくとも１つの追加のウイルスが以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、または（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現し；前記少なくとも１つの追加のウイルスが：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、または（ｉｉｉ）請求項１によって提供されるウイルスによって発現されるものとは異なる、ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
固形腫瘍において細胞に感染し得る組み換えウイルスであって、以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、または（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する、前記組み換えウイルス。
【請求項２７】
腫瘍崩壊性ウイルスである、請求項２６に記載の組み換えウイルス。
【請求項２８】
前記腫瘍崩壊性ウイルスが、ワクシニアウイルスである、請求項２７に記載の組み換えウイルス。
【請求項２９】
複製コンピテントな腫瘍崩壊性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）である、請求項２８に記載の組み換えウイルス。
【請求項３０】
２つ以上の抗体を発現する、請求項２６に記載の組み換えウイルス。
【請求項３１】
前記２つ以上の抗体が、以下：（ｉ）血管形成及び／または血管新生を刺激するタンパク質に結合する抗体、（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／Ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４からなる群より選択される受容体チロシンキナーゼに結合する抗体、ならびに（ｉｉｉ）上皮−間葉相互作用の発達に関与するタンパク質に結合する抗体からなる群より選択される、請求項３０に記載の組み換えウイルス。
【請求項３２】
以下：血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する抗体からなる群より選択される２つ以上の抗体をコードする２つ以上の異種核酸を含む、請求項２６〜３１のいずれかに記載の組み換えウイルス。
【請求項３３】
前記２つ以上の抗体のうちの１つが、ＶＥＧＦに結合する抗体である、請求項３２に記載の組み換えウイルス。
【請求項３４】
ＶＥＧＦに結合する前記抗体がＧ６−３１である、請求項３３に記載の組み換えウイルス。
【請求項３５】
前記２つ以上の抗体のうちの１つが、ＥＧＦＲに結合する抗体である、請求項３２に記載の組み換えワクシニアウイルス。
【請求項３６】
ＥＧＦＲに結合する前記抗体が抗ＥＧＦＲＶＨＨである、請求項３５に記載の組み換えウイルス。
【請求項３７】
前記２つ以上の抗体のうちの１つが、ＦＡＰに結合する抗体である、請求項３２に記載の組み換えウイルス。
【請求項３８】
ＦＡＰに結合する前記抗体がＭ０３６である、請求項３７に記載の組み換えウイルス。
【請求項３９】
前記２つ以上の抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＥＧＦＲに結合する抗体を含む、請求項３２に記載の組み換えウイルス。
【請求項４０】
前記２つ以上の抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む、請求項３２に記載の組み換えウイルス。
【請求項４１】
前記２つ以上の抗体が、ＥＧＦＲに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む、請求項３２に記載の組み換えウイルス。
【請求項４２】
前記ＶＡＣＶが、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６から選択される、請求項２９に記載の組み換えウイルス。
【請求項４３】
リスター株である、請求項２６に記載の組み換えウイルス。
【請求項４４】
前記Ａ３４Ｒ遺伝子が、別のワクシニアウイルス株由来のＡ３４Ｒ遺伝子で置き換えられる、請求項２８に記載の組み換えウイルス。
【請求項４５】
前記Ａ３４Ｒ遺伝子が、ワクシニアＩＨＤ−Ｊ株由来のＡ３４Ｒ遺伝子で置き換えられる、請求項４４に記載の組み換えウイルス。
【請求項４６】
Ａ３５Ｒ遺伝子の欠失を含む、請求項２８に記載の組み換えウイルス。
【請求項４７】
診断用タンパク質または治療用タンパク質をコードする追加の異種核酸分子をさらに含む、請求項２６〜４６のいずれかに記載の組み換えウイルス。
【請求項４８】
前記追加の異種核酸分子が、診断用タンパク質をコードする、請求項４７に記載の組み換えウイルス。
【請求項４９】
前記診断用タンパク質が、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、鉄貯蔵分子、鉄輸送体、鉄受容体もしくは造影剤に結合するタンパク質、発色団、または検出され得る化合物もしくは検出可能リガンドのなかから選択される、請求項４８に記載の組み換えウイルス。
【請求項５０】
前記追加の異種核酸分子が、治療用タンパク質をコードする、請求項４７に記載の組み換えウイルス。
【請求項５１】
前記治療用タンパク質が、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節分子、抗原、単鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、血管形成阻害薬、生物学的毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害薬タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗癌ポリペプチド抗生物質及び組織因子の中から選択される、請求項５０に記載の組み換えウイルス。
【請求項５２】
請求項２６〜５１のいずれかに記載の組み換えウイルスを含む宿主細胞。
【請求項５３】
請求項２６〜５１のいずれかに記載の組み換えウイルスを含む腫瘍細胞。
【請求項５４】
請求項２６〜５１のいずれかに記載の組み換えウイルスを含むか、それによって感染される、哺乳動物生物体。
【請求項５５】
対象における腫瘍の処置のための請求項２６〜５１のいずれかに記載の組み換えワクシニアウイルスの使用。
【請求項５６】
対象における腫瘍の処置のための薬学的組成物の調製のための請求項２６〜５１のいずれかに記載の組み換えウイルスの使用。
【請求項５７】
前記薬学的組成物が、抗癌化合物をさらに含む、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、または腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞の使用であって、対象において固形腫瘍を処置するための方法では、前記腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、または前記腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞を前記対象に投与することを包含し、前記ウイルスが以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、ならびに（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、開示全体が参照により本明細書に援用される、２０１５年３月１８日出願の米国仮出願第６２／１３５，０９６号の恩典及びそれに対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、米国では心疾患に次ぐ２番目に多い死因である。米国では、ガンは、あらゆる死因のうち１／４を占める。１９９６〜２００３年に診断された全ての癌患者のうち５年相対生存率は６６％であり、１９７５〜１９７７年の５０％から上昇した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ（２００８））。極めて有効なガン処置を発見することは、ガン研究の主目的である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は概して、ヒトのガンの処置に関し、さらに具体的には、有効な抗腫瘍免疫応答を誘導するために組み合わせたいくつかの処置様式の使用に関する。
【０００４】
本明細書では、いくつかの実施形態において、固形腫瘍を処置するための方法であって、この腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、またはこの腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞を対象に投与することを包含し、このウイルスは以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、または（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する、方法が開示されている。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは腫瘍崩壊性ウイルスである。いくつかの実施形態において、上記腫瘍崩壊性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、複製コンピテントな腫瘍崩壊性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）である。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、ＴＭＥを標的する２つ以上の抗体を発現する。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、以下からなる群より選択される：（ｉ）血管形成及び／または血管新生を刺激するタンパク質に結合する抗体、（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／Ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４からなる群より選択される受容体チロシンキナーゼに結合する抗体、ならびに（ｉｉｉ）上皮−間葉相互作用の発達に関与するタンパク質に結合する抗体。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、以下からなる群より選択される：血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する抗体。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＶＥＧＦに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦに結合する上記抗体は、Ｇ６−３１である。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＥＧＦＲに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲに結合する上記抗体は抗ＥＧＦＲＶＨＨである。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＦＡＰに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＦＡＰに結合する上記抗体はＭ０３６である。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＥＧＦＲに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＥＧＦＲに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記ＶＡＣＶは、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６から選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、追加のガン療法を施すことをさらに包含する。いくつかの実施形態において、追加のガン療法は、以下：放射線療法、化学療法、免疫療法、光線療法、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、腫瘍は：神経膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍、及び黒色腫から選択される。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは対象に静脈内に送達される。いくつかの実施形態において、このウイルスは、腫瘍に直接静脈内に送達されるか、または対象に対して腫瘍の領域内で送達される。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、腫瘍内の細胞に感染し得る少なくとも１つの追加のウイルスを上記対象に提供することを包含し、上記少ウイルスは以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質を発現し；ここで上記少なくとも１つの追加のウイルスが（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性タンパク質を発現するウイルスによって発現されるものとは異なる、（ｉ）ＴＭＥを標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質の１つ以上を発現する。
【０００５】
本明細書に於いて開示されるのは、いくつかの実施形態では、固形腫瘍において細胞に感染し得る組み換えウイルスであって、以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、または（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する、前記組み換えウイルスである。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは腫瘍崩壊性ウイルスである。いくつかの実施形態において、上記腫瘍崩壊性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、複製コンピテントな腫瘍崩壊性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）である。いくつかの実施形態では、上記ウイルスは、２つ以上の抗体を発現する。いくつかの実施形態では、この２つ以上の抗体は、以下からなる群より選択される：（ｉ）血管形成及び／または血管新生を刺激するタンパク質に結合する抗体、（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／Ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４からなる群より選択される受容体チロシンキナーゼに結合する抗体、ならびに（ｉｉｉ）上皮−間葉相互作用の発達に関与するタンパク質に結合する抗体。いくつかの実施形態では、上記ウイルスは、以下からなる群より選択される２つ以上の抗体をコードするかまたは発現する２つ以上の異種核酸を含む：血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、ならびに線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する抗体。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＶＥＧＦに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦに結合する上記抗体は、Ｇ６−３１である。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＥＧＦＲに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲに結合する上記抗体は抗ＥＧＦＲＶＨＨである。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＦＡＰに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＦＡＰに結合する上記抗体はＭ０３６である。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＥＧＦＲに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＥＧＦＲに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記ＶＡＣＶは、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６から選択される。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、リスター株である。いくつかの実施形態において、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、別のワクシニアウイルス株由来のＡ３４Ｒ遺伝子で置き換えられる。いくつかの実施形態において、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、ワクシニアＩＨＤ−Ｊ株由来のＡ３４Ｒ遺伝子で置き換えられる。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、Ａ３５Ｒ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、上記ウイルスは、診断用タンパク質または治療用タンパク質をコードする追加の異種核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記追加の異種核酸分子は、診断用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、上記診断用タンパク質は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、鉄貯蔵分子、鉄輸送体、鉄受容体もしくは造影剤に結合するタンパク質、発色団、または検出され得る化合物もしくは検出可能リガンドのなかから選択される。いくつかの実施形態では、上記追加の異種核酸分子は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、前記治療用タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節分子、抗原、単鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、血管形成阻害薬、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害薬タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗癌ポリペプチド抗生物質及び組織因子の中から選択される。
【０００６】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような組み換えウイルスを含む宿主細胞である。
【０００７】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような組み換えウイルスを含む腫瘍細胞である。
【０００８】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような組み換えウイルスを含むか、またはそれによって感染される哺乳動物生物体である。
【０００９】
本明細書にさらに開示されるのは、対象における腫瘍の処置のための、本明細書に開示されるような、組み換えワクシニアウイルスの使用である。
【００１０】
本明細書に開示されるのは、対象における腫瘍の処置のための薬学的組成物の調製のための、本明細書に開示されるような、ワクシニアウイルスの使用である。いくつかの実施形態では、上記医薬組成物は、抗癌化合物をさらに含む。
【００１１】
腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、または腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞の使用であって、対象において固形腫瘍を処置するための方法における使用もまた本明細書で開示され、この方法は、腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、または腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞を対象に投与することを包含し、ここでこのウイルスは以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体；（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の２つ以上のタンパク質、ならびに（ｉｉｉ）ＴＭＥを標的する少なくとも１つの抗体及びＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性の少なくとも１つのタンパク質を発現する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗体及び新規ＶＡＣＶの模式図を例示する。（ａ）抗−ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ、抗−ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂ（ＧＬＡＦ−２）、及び抗−ＦＡＰ  ｓｃＡｂ  （ＧＬＡＦ−５）構築物の模式図。（ｂ）新規な組み換えＶＡＣＶと、それに沿ったそれらの親のウイルスとのゲノム構造。ＧＬＶ−１ｈ４４２及びＧＬＶ−１ｈ２８２は、各々がＰＳＥＬプロモーターの制御下で、それぞれ抗−ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ及びＧＬＡＦ−５カセットによって、Ｊ２Ｒ遺伝子座でｌａｃＺ発現カセットを置き換えることによってＧＬＶ−１ｈ６８から誘導された。ＧＬＶ−１ｈ１６４は、ＰＳＥプロモーターの下で、ｈＮＥＴによって、Ｊ２Ｒ遺伝子座でｌａｃＺ発現カセットを置き換えること、及びＰＳＬプロモーターの下で、ＧＬＡＦ−２カセットによって、Ａ５６Ｒ遺伝子座でｇｕｓＡ発現カセットを置き換えることによってＧＬＶ−１ｈ６８から誘導された。ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６は、各々がＶＡＣＶ  ＰＳＥＬプロモーターの制御下で、それぞれ抗−ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ及びＧＬＡＦ−５カセットによって、Ｊ２Ｒ遺伝子座でｈＮＥＴ発現カセットを置き換えることによってＧＬＶ−１ｈ１６４から誘導された。全てのウイルスは、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子座でｒｕｃ−ｇｆｐ発現カセットを含む。ＰＳＥ、ＰＳＥＬ、ＰＳＬ、Ｐ１１、及びＰ７．５は、それぞれ、ＶＡＣＶ合成早期、合成早期／後期、合成後期、１１Ｋ、及び７．５Ｋのプロモーターである。
【図２】ＴＭＥを標的するウイルス発現の個々の治療抗体が、Ａ５４９及びＤＵ１４５腫瘍異種移植片モデルにおけるウイルス療法を有意に増強することを例証する。（ａ）ＧＬＶ−１ｈ１６４から発現されたＶＥＧＦを標的する抗体は、ウイルス療法を有意に増強した。Ａ５４９異種移植片腫瘍を保有するマウス（ｎ≧７）を、ウイルス単独、アバスチン単独、ＰＢＳ単独またはウイルスをアバスチンと組み合わせて用いて処置した。腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、単一用量のウイルス（２×１０６ｐｆｕ／マウス）を、静脈内に（ｉ．ｖ．）与えた。アバスチンを、１０ｄｐｉで開始して、５週間の間、週に２回、５ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与した。矢印は、アバスチン処置の開始及び終わりを示す。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群とＧＬＶ−１ｈ１６４群（黒）と、及びＧＬＶ−１ｈ６８＋アバスチン群（白抜き）との比較を示す。αＶは、抗ＶＥＧＦを示す。（ｂ）ＧＬＶ−１ｈ４４２から発現されたＥＧＦＲを標的する抗体は、ウイルス療法を有意に増強した。Ａ５４９異種移植片腫瘍を保有するマウス（ｎ≧７）を、ウイルス単独、エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）単独、ＰＢＳ単独またはウイルスをアバスチンと組み合わせて用いて処置した。腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、単一用量のウイルス（２×１０６ｐｆｕ／マウス）を、ｉ．ｖ．で与えた。エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）を、１０ｄｐｉで開始して、５週間の間、週に２回、３ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ投与した。矢印は、エルビタックス処置の開始及び終わりを示す。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群とＧＬＶ−１ｈ４４２群との比較を示す。αＥは、抗ＥＧＦＲを示す。（ｃ）ＧＬＶ−１ｈ２８２から発現されたＦＡＰを標的する抗体は、ウイルス療法を有意に増強した。腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、Ａ５４９異種移植片腫瘍を保有するマウス（ｎ≧７）に、単一用量のＧＬＶ−１ｈ６８またはＧＬＶ−１ｈ２８２（２×１０６ｐｆｕ／マウス）を、ｉ．ｖ．で注射した。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群とＧＬＶ−１ｈ２８２群との比較を示す。αＦは、抗ＦＡＰを示す。（ｄ）腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、ＤＵ１４５腫瘍保有マウス（ｎ＝５）に、各々のＶＡＣＶ株（２×１０６ｐｆｕ／マウス）を、ｉ．ｖ．で注射し、その後毎週腫瘍容積をモニターした。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群と、ＧＬＶ−１ｈ１６４群（黒）、ＧＬＶ−１ｈ２８２群（白抜き）、及びＧＬＶ−１ｈ４４２群（灰色）との比較を示す。
【図３】ＴＭＥにおいてＶＥＧＦ、ＥＧＦＰ及びＦＡＰを標的する腫瘍内で発現される抗体の影響を例証する。（ａ）ＤＵ１４５腫瘍中の腫瘍脈管構造に対するウイルス処置の影響（ｎ＝３）。切片を、ＣＤ３１発現について染色した（赤色）。ＧＦＰ発現（緑色）は、ウイルス感染を示す。（ｂ）１つのスライドあたり８つの重複しない顕微鏡視野でＣＤ３１＋血管をカウントすることによって、血管の定量的解析を行った。統計学的解析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）ＤＵ１４５腫瘍中の細胞増殖に対するウイルス処置の影響（ｎ＝３）。切片を、Ｋｉ６７発現について染色した（赤色）。ＧＦＰ発現（緑色）は、ウイルス感染を示す。目盛りのバーは、ａ、ｃ、では１ｍｍに相当する。（ｄ）１つのスライドあたり８つの重複しない顕微鏡視野でＫｉ６７＋細胞をカウントすることによって、細胞増殖の定量的解析を行った。統計学的解析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）ウイルス複製及び間質新生（ｓｔｒｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ）の免疫組織学的特徴付け。ホルマリン固定及びパラフィン包埋の腫瘍組織（１群あたりｎ＝４〜５）を５μｍの切片に切断して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。隣接する切片をＶＡＣＶに関しては抗Ａ２７、血管に関しては抗ＣＤ３１、及びＦＡＰ＋間質細胞に関しては抗ＦＡＰを用いて染色した。（ｆ）棒グラフは、感染エリアまたは未感染エリアにおけるＣＤ３１＋細胞及びＦＡＰ＋間質培養の平均数を示す。１つの腫瘍あたり５つの重複のない顕微鏡視野（１００×の倍率）におけるＣＤ３１＋及びＦＡＰ＋間質培養物をカウントした。統計学的解析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
【図４】ＦａＤｕ腫瘍増殖が、抗ＦＡＰ  ｓｃａｂを発現するＧＬＶ−１ｈ２８２によって有意に阻害された方法を例証する。しかし、ＦａＤｕ腫瘍は、ＧＬＶ−１ｈ６８による処置に応答しなかった。
【図５】各々の組み換えＶＡＣＶが、意図した抗体をどのように発現したかを例証する。
【図６】２つの抗体の発現が、ウイルス複製の有効性に負の影響を示さなかったことを例証する。ウイルス複製アッセイは、Ａ５４９細胞において、０．０１という感染多重度（ＭＯＩ）で行った。
【図７】ＴＭＥを標的する、ウイルスで発現された２つの治療抗体が、ウイルス療法をさらに改善することを例証する。（ａ）Ａ５４９腫瘍保有ヌードマウスにおけるＧＬＶ−１ｈ４４４の治療効果の増強。マウス（ｎ≧７）を、ウイルス単独、アバスタチン＋エルビタックス、ＰＢＳ単独、またはウイルスを用い、アバスチンとエルビタックスと組み合わせて処置した。腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、単一用量のウイルス（２×１０６ｐｆｕ／マウス）を、ｉ．ｖ．で与えた。アバスタチン及びエルビタックスを、１０ｄｐｉで開始して、５週間の間、週に２回、それぞれ５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ投与した。矢印は、アバスタチン及びエルビタックス処置の開始及び終わりを示す。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群と、ＧＬＶ−１ｈ４４４群（黒）、ＧＬＶ−１ｈ６８＋アバスチン＋エルビタックス群（白抜き）及びＰＢＳ＋アバスタチン＋エルビタックス群（灰色）との比較を示す。（ｂ）Ａ５４９腫瘍保有ヌードマウスにおいてＧＬＶ−１ｈ４４６をその親のウイルスと比較した治療効果の増強。腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、各ＶＡＣＶ株を単独で、２×１０６ｐｆｕ／マウスという用量で、マウス（ｎ≧７）にｉ．ｖ．で注射した。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群とＧＬＶ−１ｈ４４６群（黒）との比較を示す。（ｃ）ＤＵ１４５腫瘍保有マウスにおいてＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６をその親のウイルスと比較した治療効果の増強。腫瘍容積が４５０ｍｍ３に達した時に、各ＶＡＣＶ株を単独で、２×１０６ｐｆｕ／マウスという用量で、マウス（ｎ＝５）にｉ．ｖ．で注射した。統計学的解析は、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。星印は、ＧＬＶ−１ｈ６８群とＧＬＶ−１ｈ４４４群（黒）と、及びＧＬＶ−１ｈ４４６群（白抜き）との比較を示す。（ｄ−ｆ）ＶＡＣＶ処置後のＡ５４９腫瘍を保有するマウスにおける、マウス血清中の抗体及び腫瘍容積の変化の検出。血液サンプルを、７、２１及び３５ｄｐｉで後眼窩から採集した。マウス血清における抗体の濃度は、プレコーティングしたＦＡＰ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦプレートを用いてＥＬＩＳＡによって決定した。腫瘍を、デジタルのカリパスで測定した。統計学的解析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図８】Ａ５４９腫瘍を保有する個々のマウスの腫瘍増殖曲線を例証する。
【図９】標準のウイルスプラークアッセイで決定した、１４ｄｐｉでのＡ５４９腫瘍保有マウスにおける種々の臓器及び腫瘍中のウイルスの生体分布を例証する。
【図１０】マウスにおける抗体発現性ＶＡＣＶ投与の可能性のある有害効果の評価を例証する。アセスメントは、処置の経過にわたって正味の体重の変化を評価することによって行った。Ａ５４９及びＤＵ１４５の両方の腫瘍異種移植片モデルで、平均の正味の体重における有意な変化は、処置群または対象群のいずれでも観察されなかった。
【図１１】ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６によるウイルスの発現した２つの抗体が、腫瘍における細胞増殖の抑制に寄与することを例証する。（ａ）ＤＵ１４５腫瘍中のＶＡＣＶによる細胞増殖の抑制（ｎ＝３）。ＧＦＰ発現（緑色）は、ウイルス感染を示す。細胞増殖は、抗Ｋｉ６７抗体を用いた染色（赤色）によって検査した。（ｂ、ｃ）１つのスライドあたり８つの重複しない顕微鏡視野においてＫｉ６７＋細胞をカウントすることによって、未感染または感染した領域での細胞増殖の定量的解析を行った。統計学的解析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
【図１２】ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６によるウイルスの発現した２つの抗体が、腫瘍における血管形成の抑制に寄与することを例証する。（ａ）ＤＵ１４５腫瘍中のＶＡＣＶによる腫瘍血管系の低減（ｎ＝３）。切片を、ＣＤ３１抗体を用いて染色した（赤色）。ＧＦＰ発現（緑色）は、ウイルス感染を示す。（ｂ、ｃ）１つのスライドあたり８つの重複しない顕微鏡視野において、ＣＤ３１＋細胞をカウントすることによって、未感染または感染した領域での血管の定量的解析を行った。統計学的解析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。目盛りのバーは、ａ、ｄでは１ｍｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
過去３０年にわたる抗癌処置における長足の進歩にもかかわらず、ガンは、世界中で主な死因のままである。ガンの増殖及び転移における腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の重要な役割を見落としているということが、完全に有効なガンの処置がまだ見つけられていないという理由の１つかもしれない。腫瘍の間質における血管形成及び細胞の過剰増殖は、ガンの増殖を支持するだけでなく、例えば、転移における、ガンの発達にも寄与する。
【００１４】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）などのＴＭＥ内の因子は、ガンの発症及び発達に重大な役割を果たす。ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲの高レベルの発現は、乳癌、結腸癌、肺癌、頭頸部癌、及び他のガンを有する患者での劣った予後予測と相関する。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）は、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２００４年に、転移性の結腸癌及び引き続いて他の転移性癌の処置について承認された。やはり２００４年に、抗ＥＧＦＲのｍＡｂであるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）も、転移性結腸癌の処置についてＦＤＡによって承認された。しかし、アバスチン及びエルビタックスの臨床的な有効性は、循環に由来するｍＡｂの腫瘍浸透が劣ること及び急速なクリアランスにおそらく起因していくぶん限られたものであり、頻繁な間隔及び長期間にわたって高用量の投与を必要とし、治療の費用もかなりかさむことになっていた。
【００１５】
現在のｍＡｂ治療の薬力学的特性及びＴＭＥを標的する追加の機能の特定における改善は、かなり有益であろう。例えば、Ｇ６−３１は、アバスチンよりも動物モデルにおいて、より良好な親和性及び向上した治療有効性を有する、ファージディスプレイライブラリーに由来する改善された抗ＶＥＧＦ抗体である。腫瘍浸透を改善するために、ラマ由来のＥＧＦＲに対する１５ｋＤａの単一ドメイン抗体が、最近開発された（抗ＥＧＦＲＶＨＨと呼ばれる）。このラマのナノボディは、マウスでは非免疫原性であって、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックし、それによって、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し、特定の腫瘍標的化を示すことが証明された。抗ＥＧＦＲＶＨＨは、分子画像化及び治療適用のために用いられる。高度に保存されたタンパク質であるＦＡＰ（セプラーゼとしても公知）は、特に侵襲性の癌の間質で豊富に発現される。高レベルのＦＡＰ発現は、ガンの進行と関連している。種交差反応性ＦＡＰ特異的単鎖抗体（ｓｃＡｂ）であるＭ０３６は、連続ファージディスプレイによって単離され、種々のヒト癌腫の間質細胞及びヒト腫瘍異種移植片中のマウス宿主間質上のＦＡＰに結合することが示された。Ｍ０３６の治療能力は、まだ評価されなかった。
【００１６】
複製コンピテントな腫瘍崩壊性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）ＧＬＶ−１ｈ６８は、単一用量の投与後、ヒト異種移植片ヌードマウスモデルにおいて腫瘍細胞に落ち着いて、複製して溶解する。さらに、組み換えＶＡＣＶは、ｓｃＡｂを含む機能的な導入遺伝子を発現するように遺伝子改変されてもよい。Ｇ６−３１の配列によって設計された、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂ  ＧＬＡＦ−１を発現するＶＡＣＶは、親のウイルスＧＬＶ−１ｈ６８と比較してマウスの抗癌治療有効性を有意に改善したことが以前に示された。この治療有効性はさらに、放射線療法と組み合わせて増強された。
【００１７】
したがって、新規なＴＭＥ標的化抗増殖性活性を発現する新規な組み換えＶＡＣＶは、ＦＡＰに対するｓｃＡｂ（ＧＬＶ−１ｈ２８２）及びＥＧＦＲに対する単一ドメイン抗体（ＧＬＶ−１ｈ４４２）をコードすることによって構築された。これらの個々の抗体を発現するＶＡＣＶは、異種移植片腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を有意に抑制し、これによって、ウイルスが発現した抗体の機能性及び治療活性が検証される。最終的に、ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲ（ＧＬＶ−１ｈ４４４）またはＶＥＧＦ及びＦＡＰ（ＧＬＶ−１ｈ４４６）を標的する、抗増殖性活性及び血管形成阻害活性の両方を有する２つの抗体をコードする追加の組み換えＶＡＣＶが作製された。ＴＭＥ標的化抗体を発現する新規なＶＡＣＶは、単一で、または組み合わせて、腫瘍崩壊性のウイルス療法の抗腫瘍有効性を有意に増強した。
【００１８】
さらに、２つの抗体発現性ＶＡＣＶである、ＧＬＶ−１ｈ４４４（抗−ＥＧＦＲ及び抗−ＶＥＧＦ）またはＧＬＶ−１ｈ４４６（抗−ＦＡＰ及び抗−ＶＥＧＦ）を用いるマウス中の腫瘍の処置は、驚くべきことに、アバスタチン（抗−ＶＥＧＦ）及びエルビタックス（抗−ＥＧＦＲ）の連続投与と組み合わせたＧＬＶ−１ｈ６８との併用処置よりも優れていた。ウイルスの発現した抗体の抗増殖性効果及び血管形成阻害効果はまた、ウイルスによって直接影響される領域を越えて腫瘍中で明白であって、これによって、ｓｃＡｂが、局所的に発現されながら、腫瘍浸透し得ることが実証される。したがって、本発明者らの結果によって、ＶＡＣＶを用いる腫瘍崩壊性ウイルス療法は、ＴＭＥを標的する抗増殖性活性及び血管形成阻害活性を有するウイルスコードされた抗体の同時発現によって有意に増強されたことが実証された。さらに、この増強された処置効果は、複製コンピテントな組み換えＶＡＣＶの単回投与によって達成された。
【００１９】
したがって、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、及びＦＡＰを標的する抗体を発現する新規な組み換えＶＡＣＶは、単独で、または組み合わせてのいずれかで、前臨床動物モデルにおいて腫瘍崩壊性ウイルス療法を有意に増強した。各々がｓｃＡｂを発現する、ＧＬＶ−１ｈ１６４、ＧＬＶ−１ｈ４４２、及びＧＬＶ−１ｈ２８２の治療有効性は、それらの親のウイルスＧＬＶ−１ｈ６８のものよりも有意によく、これによって、腫瘍崩壊性ウイルス療法が、ＶＥＧＦに対する個々の抗体のウイルス発現によって改善されて、血管形成を低減するか、ＥＧＦＲに対する個々の抗体のウイルス発現によって改善されて、細胞増殖を抑制するか、またはＦＡＰに対する個々の抗体のウイルス発現によって改善されて、血管形成を低減し、かつＭＳＣの補充を抑制し得ることが示される。さらに、この治療有効性は、１つのＶＡＣＶ株中で２つの抗体を発現することによってさらに増強された。ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲの両方を標的する抗体を発現するＧＬＶ−１ｈ４４４の治療有効性は、アバスチン及びエルビタックスを用いた併用処置の有効性よりも有意に優れており、またアバスタチン及びエルビタックスと組み合わせたＧＬＶ−１ｈ６８を用いる処置よりも優れていた。
【００２０】
腫瘍中でのＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ及びＦＡＰの高レベルの発現は、劣った予後予測と関連する。前臨床トライアルでの見込みのある結果にかかわらず、アバスタチン及びエルビタックスは、ごく限られた臨床有効性しか示さず、これは、部分的には、抗体の浸透が劣っていること及び腫瘍標的化の低さ、ならびに全身投与後の循環からの迅速なクリアランスのせいである。腫瘍崩壊性のＶＡＣＶは、腫瘍細胞を特異的に標的して破壊するだけでなく、コロニーになった腫瘍中の治療タンパク質の局所産生を媒介し、それによって、抗体療法の使用にともなう限界を回避する。抗体の連続的な存在が、１つまたは２つのいずれかの抗体を発現するＶＡＣＶで処置されたマウスの血清中で実証された。この抗体は、腫瘍が既に縮小を開始した時、ウイルスの注射後に、後期段階（３５ｄｐｉ）においてよりも早期段階（７及び２１ｄｐｉ）において高い量で検出された。さらに、抗ＦＡＰ（ＧＬＡＦ−５）及び抗ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ抗体は、それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ２８２及びＧＬＶ−１ｈ４４２で処置されたマウスの血清中では、ＧＬＶ−１ｈ１６４で処置されたマウスの血清中の抗ＶＥＧＦ（ＧＬＡＦ−２）抗体よりも、高い量で生じた。これは、腫瘍中でＧＬＶ−１ｈ１６４よりも高いウイルス力価のＧＬＶ−１ｈ２８２及びＧＬＶ−１ｈ４４２と一致していた。腫瘍中のＧＬＶ−１ｈ６８のウイルス力価は、ＧＬＶ−１ｈ１６４のウイルス力価よりも有意に高かったが（Ｐ＝０．０２）、ＧＬＶ−１ｈ１６４は、培養物中で、ＧＬＶ−１ｈ６８よりもわずかに早く複製し、これによって、ＧＬＡＦ−２の発現が、腫瘍中のウイルス複製を低下したことが示唆された。ＥＧＦＲまたはＦＡＰを標的する抗体の発現は、腫瘍中のウイルス複製に対して負の効果は有さなかった。
【００２１】
ガンの進行は、癌細胞の制御されない増殖に起因することが周知である。ＧＬＶ−１ｈ６８での処置は、腫瘍中の細胞増殖を抑制し、これはＶＡＣＶ感染の内因性の特性と一致する、感染された領域中のＫｉ６７＋細胞の数の劇的な低下において明らかであった。特に、抗ＥＧＦＲナノボディを発現する、ＧＬＶ−１ｈ４４２及びＧＬＶ−１ｈ４４４を用いた処置は、感染された領域だけでなく未感染の領域でもＫｉ６７＋細胞数を有意に低下し、これによって、感染された細胞から分泌された抗ＥＧＦＲナノボディが、未感染の領域に伝播し、ＥＧＦＲ＋細胞の増殖を抑制することが示唆される。抗ＶＥＧＦ抗体を発現するＧＬＶ−１ｈ１６４、または抗ＦＡＰ抗体を発現するＧＬＶ−１ｈ２８２を用いた処置は、腫瘍の感染された領域での増殖を有意に抑制したが、その効果はごくわずかであって、感染されなかった領域では、有意ではなかった。重要なことに、抗ＶＥＧＦ及び抗ＦＡＰの両方を発現するＧＬＶ−１ｈ４４６を用いた処置は、感染した領域及び未感染領域の両方で増殖を有意に抑制し、このことは、細胞増殖に対する２つの抗体発現の阻害性効果の追加を実証している。
【００２２】
ガンの増殖及び発達はまた、血管を通じた栄養素の連続的な供給も必要とする。血管密度（ＢＶＤ）の低下は、感染した領域で観察されたが、ＧＬＶ−１ｈ６８コロニー化腫瘍の未感染領域では観察されず、これによって、ＶＡＣＶ感染自体が腫瘍脈管構造の破壊につながり得ることが示唆される。抗ＶＥＧＦｓｃＡｂの発現は、感染された領域で血管破壊を増強しただけでなく、未感染の領域のＢＶＤにおいて有意な低下も生じた。したがって、抗ＥＧＦＲナノボディと同様、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂはまた、感染領域から未感染領域に伝播もし得る。ＦＡＰを標的する治療は、部分的には腫瘍血管形成の抑制を通じて腫瘍増殖を阻害する。ウイルスで発現された抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂは、ＦａＤｕ腫瘍異種移植片モデルの感染領域及び未感染領域の両方で、ならびにＤＵ１４５腫瘍異種移植片モデルの感染領域でＢＶＤを有意に低下させた。抗ＥＧＦＲナノボディの発現は、ＤＵ１４５腫瘍異種移植片モデルにおいて感染領域または未感染領域のいずれでもＢＶＤに有意に影響を及ぼさなかったが、ＥＧＦＲは腫瘍血管形成を促進すると報告された。
【００２３】
ＦＡＰは、腫瘍増殖を支持するガン関連の線維芽細胞（ＣＡＦ）によって発現されるマーカーの１つである。ＦＡＰ＋ＣＡＦのアブレーションは腫瘍増殖を抑制することが示されている。抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂを発現する、ＧＬＶ−１ｈ２８２を用いるＦａＤｕ腫瘍異種移植片を保有するマウスの処置は、ＧＬＶ−１ｈ６８を用いた処置と比較して腫瘍の感染領域及び未感染領域の両方でＦＡＰ＋細胞の数を大きく減少させた。ＦａＤｕ腫瘍細胞はＦＡＰを発現しないので、ＧＬＶ−１ｈ２８２の抗腫瘍効果の増強は、ガン細胞に対してよりもむしろ、ＣＡＦに対する影響に起因する可能性が高い。
【００２４】
このように、腫瘍崩壊性ＶＡＣＶ感染症そのものは、コロニー化された腫瘍の細胞増殖及び血管分布を大いに低下させた。これらの抗腫瘍効果は、組み換えＶＡＣＶ中で単独で、または組み合わせてのいずれかで、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、及びＦＡＰに対するｓｃＡｂの発現によって、有意に増強された。抗体（単数または複数）の同時発現の効果は、臨床抗体と組み合わせたＶＡＣＶによる処置と同程度であるかまたはそれよりも優れており、単回投与及び局所的な腫瘍内送達の利益を伴っていた。この治療効果は、感染した腫瘍細胞のウイルス崩壊性とＴＭＥの抗腫瘍改変とを組み合わせた。本発明者らの知る限り、これは、ＥＧＦＲ及びＦＡＰに対する、ウイルス発現の抗体が、単独で腫瘍崩壊性ウイルス療法を増強し、抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて、さらに抗腫瘍治療有効性を改善させたことを実証している最初の報告である。
【００２５】
定義
本明細書において用いる場合、対象としては、診断、スクリーニング、モニタリングまたは処置が考えられる任意の動物が挙げられる。動物としては、霊長類及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、この対象とは哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は、マウス、ウサギ、イヌまたはネコから選択される哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は霊長類である。例示的な霊長類は、ヒトである。患者とは、疾患状態に罹患しているか、または疾患状態が確認されるかもしくは、疾患状態のリスクが確認されている、対象、例えば哺乳動物、霊長類、ヒトまたは家畜対象を指す。
【００２６】
本明細書において用いる場合、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体等）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、二価特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）抗体、及び抗体フラグメント（例えば、単鎖、ナノボディなど）、を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ナノボディである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、及び二重特異性抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に言及される任意の抗体の実施形態は特異的に除外される。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「ウイルス」とは、ウイルスと呼ばれる任意の大きい群の実態を指す。ウイルスは、一般的には、遺伝物質のＲＮＡまたはＤＮＡコアを囲んでいるタンパク質外被を含むが、半透過性の膜ではなく、生きている細胞においてのみ増殖及び複製が可能である。本明細書に提供される方法での使用のためのウイルスとしては、限定するものではないが、ポックスウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、おたふく風邪ウイルス、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、レオウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ハンタウイルス、粘液腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス及び任意の植物または昆虫のウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に言及される任意のウイルスの実施形態は特異的に除外される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、当該分野で認識される意味にしたがって用いられる。これは、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされ得る核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクター粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を、生体外で、または生体内のいずれかで、細胞中に移入する目的のために用いてもよい。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、セムリキ森林熱ウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用される「血液学的悪性腫瘍」とは、血液及びリンパ系の腫瘍（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、悪性免疫増殖性疾患、多発性骨髄腫及び悪性形質細胞新生物、リンパ白血病、脊髄性白血病、急性または慢性のリンパ性白血病、単球の白血病、特定の細胞型の他の白血病、不特定細胞型の白血病、その他及び詳細不明のリンパ系、造血系及び関連組織の悪性新生物、例えば、びまん性大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫または皮膚Ｔ細胞リンパ腫）を指す。
【００３０】
組み換えウイルス及び使用方法
本明細書で開示されるのは、いくつかの実施形態において、固形腫瘍を処置するための方法であって、この方法には、この腫瘍中の細胞に感染し得る組み換えウイルス、またはこの腫瘍中の細胞に感染し得るウイルスを含む細胞を対象に提供することを包含し、ここでこのウイルスは以下のうちの２つ以上を発現する：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは腫瘍崩壊性ウイルスである。いくつかの実施形態において、上記腫瘍崩壊性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、上記ウイルスは、複製コンピテントな腫瘍崩壊性ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）である。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、追加のウイルスを上記対象に提供することを包含し、ここで上記ウイルスは以下：（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質を発現し、ここで上記少なくとも１つの追加のウイルスが、（ｉ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質を発現するウイルスによって発現されるものとは異なる、（ｉ）ＴＭＥを標的する抗体または（ｉｉ）ＴＭＥを標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質のうちの１つ以上を発現する。
【００３１】
したがって、本明細書では、治療用途及び診断用途のためのウイルスが提供され、これには組み換えワクシニアウイルスが挙げられ、このウイルスは、異種核酸分子を含み、この分子は、少なくとも２つの治療用遺伝子生成物（すなわち、以下の２つ以上：（ｉ）腫瘍微小環境を標的する抗体または（ｉｉ）腫瘍微小環境を標的する刺激性もしくは阻害性のタンパク質）をコードする。このような治療用遺伝子産物は、任意の適切なプロモーター（例えば、ワクシニアプロモーター、例えば、ワクシニア早期プロモーター、ワクシニア中期プロモーター、ワクシニア早期／後期プロモーター及びワクシニア後期プロモーター）に対して作動可能に連結され得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を標的する２つ以上の抗体は、以下からなる群より選択される：（ｉ）血管形成及び／または血管新生を刺激するタンパク質に結合する抗体、（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／Ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４（Ｅｒｂファミリー）からなる群より選択される受容体チロシンキナーゼに結合する抗体、ならびに（ｉｉｉ）上皮−間葉相互作用の発達に関与するタンパク質に結合する抗体。血管形成及び／または血管新生を刺激する例示的なタンパク質としては、パラクリン因子（例としては、アンジオゲニン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及びトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）及びインテグリンが挙げられる。上皮間葉移行の発達に関与するタンパク質としては、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＨＳＰ４７、コラーゲン１、コラーゲン２、ビメンチンＦＳＰ１、ＤＤＲ２、Ｎ−カドヘリン、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＴｗｉｓ、ＯＢ−カドヘリン、インテグリン類、シンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ）−１、ＦＳＰ−１、ベータカテニン、フィブロネクチン、ラミニン５、ＺＥＢ１、ＬＥＦ−１、Ｅｔｓ−１、ＦＯＸＣ２及びグースコイド（Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗体としては、ＶＥＧＦに特異的な抗体、アンジオゲニン、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、またはインテグリン（例えば、αＶβ３、αＶβ５またはα５β１）が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体としては、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３またはＨｅｒ４に特異的な抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体としては、ＦＡＰ、ＨＳＰ４７、コラーゲン１、コラーゲン２、ビメンチンＦＳＰ１、ＤＤＲ２、Ｎ−カドヘリン、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＴｗｉｓ、ＯＢ−カドヘリン、インテグリン類、シンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ）−１、ＦＳＰ−１、ベータカテニン、フィブロネクチン、ラミニン５、ＺＥＢ１、ＬＥＦ−１、Ｅｔｓ−１、ＦＯＸＣ２またはグースコイドに特異的な抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、この段落に列挙される抗原の実施形態のいずれかは具体的に除外される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、以下からなる群より選択される：血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する抗体。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＶＥＧＦに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦに結合する上記抗体は、Ｇ６−３１である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦに結合する上記抗体は以下から選択される：４Ｇ３、ａｂ５２９１７、ａｂ６８３３４、ａｂ４６１５４、Ａ−２０、ＯＴＩ４Ｅ３、Ａｂ−３．、ＳＰ２８．ベバシズマブ、ラニブズマブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、ポナチニブ、アキシチニブ及びアフリベルセプト、ならびにこれらの抗体のいずれかと同じエピトープに結合し得る抗体。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＥＧＦＲに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲに結合する上記抗体は抗ＥＧＦＲＶＨＨである。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲに結合する上記抗体は：セツキシマブ、マツブマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ザルツムマブ、５２８、ＳＣ−０３、ＤＲ８．３、ＤＨ８．３、Ｌ８Ａ４、Ｙ１０、ＩＣＲ６２、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２０００、ＭＭ−１５１、Ｓｙｍ００４、ｍＡＢ８０６、及びこれらのいずれかの抗体と同じエピトープに結合し得る抗体から選択される。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体のうちの１つは、ＦＡＰに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＦＡＰに結合する上記抗体はＭ０３６である。いくつかの実施形態において、ＦＡＰに結合する抗体は、ａｂ５４６５１、ｖＦ１９、ＥＳＣ１１、ＥＳＣ１４、Ｆ１１−２４、ＳＳ−１３、Ｄ３９４、ＭＡｂクローン４２７８１９、Ｍ０５、Ｍ０２、Ｍ０１、ＬＳ−Ｃ３４８８０７、２Ｆ２．及びこれらの抗体のいずれかと同じエピトープに結合し得る抗体である。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＥＧＦＲに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の抗体は、ＥＧＦＲに結合する抗体、及びＦＡＰに結合する抗体を含む。いくつかの実施形態において、この段落に列挙される任意の特定の抗体、またはこの段落に列挙される特定の抗体と同じエピトープに結合する抗体は、具体的に除外される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される発明は、ＶＥＧＦに対する抗体を発現するが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２／Ｃ−ｎｅｕ、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４（Ｅｒｂファミリー）からなる群より選択される受容体チロシンキナーゼに結合する抗体もタンパク質も発現せず、かつ上皮−間葉相互作用の発達に関与するタンパク質に結合する抗体もタンパク質も発現しないウイルスは包含しない。
【００３５】
例示的な腫瘍崩壊性ウイルスとしては、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、レオウイルス、はしかウイルス、シンビスウイルス、インフルエンザウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス及びアデノウイルスが挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるウイルスは、弱毒化される。ウイルスを弱毒化するための技術は、当該技術分野において公知である。
【００３７】
本明細書に提供される例示的なウイルスとしては、改変赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、及びＦ１４．５Ｌ遺伝子を含む組み換えワクシニアウイルスが挙げられ、この改変のうちの１つ以上が、ＨＡ遺伝子座、ＴＫ遺伝子座、またはＦ１４．５Ｌ遺伝子座への異種の非コード核酸分子の挿入を含む。このようなウイルスでは、機能的なＨＡ、ＴＫ及びＦ１４．５Ｌポリペプチドは発現されない。
【００３８】
治療用及び診断用の使用のための本明細書で提供される例示的なウイルスにはまた、ウエスタンリザーブ（ＷＲ）、コペンハーゲン、タシケント、ティアンタン（Ｔｉａｎ  Ｔａｎ）、リスター、ワイエス（Ｗｙｅｔｈ）、ＩＨＤ−Ｊ、及びＩＨＤ−Ｗ、ブライトン、アンカラ、ＭＶＡ、大連（Ｄａｉｒｅｎ）Ｉ、ＬＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、ＬＩＶＰ、ＷＲ  ６５−１６、コンノート、ニューヨーク市衛生局も挙げられる。本明細書に記載される方法における使用のための本明細書に記載されるＬＩＶＰワクシニアウイルスとしては、ＧＬＶ−１ｈ２２、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｉ６９、ＧＬＶ−１ｈ７０、ＧＬＶ−１ｈ７１、ＧＬＶ−１ｈ７２、ＧＬＶ−１ｈ７３、ＧＬＶ−１ｈ７５、ＧＬＶ−１ｈ８１、ＧＬＶ−１ｈ８２、ＧＬＶ−１ｈ８３、ＧＬＶ−１ｈ８４、ＧＬＶ−１ｈ８５、ＧＬＶ−１ｈ８６、ＧＬＶ−１ｊ８７、ＧＬＶ−１ｊ８８、ＧＬＶ−１ｊ８９、ＧＬＶ−１ｈ９０、ＧＬＶ−１ｈ９１、ＧＬＶ−１ｈ９２、ＧＬＶ−１ｈ９６、ＧＬＶ−１ｈ９７、ＧＬＶ−１ｈ９８、ＧＬＶ−１ｈ１０４、ＧＬＶ−１ｈ１０５、ＧＬＶ−１ｈ１０６が挙げられる。本明細書に記載される方法における使用のための本明細書に提供される例示的なＬＩＶＰワクシニアウイルスとしては、ＧＬＶ−１ｈ１０７、ＧＬＶ−１ｈ１０８及びＧＬＶ−１ｈ１０９が挙げられる。いくつかの実施形態では、記載される方法での使用のためのウイルスは、ＧＬＶ−１ｈ１０７、ＧＬＶ−１ｈ１０８及びＧＬＶ−１ｈ１０９から選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、特許請求されるウイルスは、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６から選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、治療及び診断の使用のための本明細書に提供されるウイルスとしては、検出可能なタンパク質、または検出可能シグナルを誘導し得るタンパク質をコードする異種核酸分子を含む組み換えワクシニアウイルスが挙げられる。このようなタンパク質の例としては、ルシフェラーゼ、例えば、コメツキムシルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはＲＦＰ、または造影剤に結合し得るタンパク質、発色団、または検出され得る化合物もしくはリガンド、例えば、トランスフェリン受容体またはフェリチンがある。本明細書に提供されるのは、特許請求される組み換えリスター株ワクシニアウイルスであり、これは、コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＧ９９）及びＲＦＰ（例えば、ＧＬＶ−１ｈ８４）をコードする。
【００４１】
本明細書に提供されるのは、治療用途及び診断用途のためのウイルスであり、これには、遺伝子産物がピコルナウイルス２Ａエレメントに連結される、２つ以上の診断または治療用の遺伝子産物をコードする異種核酸分子が含まれる。本明細書に記載される１つの実施例では、組み換えワクシニアウイルスは、異種核酸分子を含み、この核酸分子は、第二の異種核酸分子に対してピコルナウイルス２Ａエレメントによって連結されるＣＢＧ９９をコードし、この第二の異種核酸分子は、ＲＦＰ（例えば、ＧＬＶ−１ｈ８４）をコードする。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、別のワクシニアウイルス株由来のＡ３４Ｒ遺伝子によるＡ３４Ｒ遺伝子の置き換えを含む、治療用及び診断用の使用のための組み換えワクシニアウイルスである。本明細書に提供されるのは、特許請求されるリスター株ワクシニアウイルスであり、上記Ａ３４Ｒ遺伝子は、ワクシニアＩＨＤ−Ｊ株（例えば、ＧＬＶ−１  ｉ６９）由来のＡ３４Ｒ遺伝子で置き換えられる。このような置換は、ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープのウイルス（ＥＥＶ）の形態を増大し、中和抗体に対するウイルスの抵抗を増大する。
【００４３】
本明細書に記載されるのは、Ａ３５Ｒ遺伝子の欠失を含む、治療用及び診断用の使用のための組み換えワクシニアウイルスである。
【００４４】
本明細書に記載されるのは、治療用タンパク質、検出可能なタンパク質、または検出可能シグナルを誘導し得るタンパク質をコードする１つ以上の追加の異種核酸分子の付加によってさらに改変され得る、治療用及び診断用の使用のための組み換えワクシニアウイルスである。このようなタンパク質の例として、ルシフェラーゼ、例えば、コメツキムシルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはＲＦＰ、または造影剤に結合し得るタンパク質、発色団、または検出され得る化合物もしくはリガンド、例えば、トランスフェリン受容体またはフェリチンがある。いくつかの実施形態において、上記診断用タンパク質は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、鉄貯蔵分子、鉄輸送体、鉄受容体もしくは造影剤に結合するタンパク質、発色団、または検出され得る化合物もしくは検出可能リガンドのなかから選択される。
【００４５】
またこのような方法に含まれるのは、治療用遺伝子産物、例えば、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節分子、単鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、生物学的毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、抗癌ポリペプチド抗生物質、血管形成阻害剤、または組織因子をコードする異種核酸分子の挿入である。例示的な抗原としては、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌の抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌の抗原、原生動物の抗原、寄生生物抗原及び分裂促進因子が挙げられる。治療用タンパク質、検出可能なタンパク質、または検出可能シグナルを誘導し得るタンパク質をコードする１つ以上の追加の異種核酸分子は、ワクシニアウイルスプロモーターなどのプロモーターに対して作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節分子、抗原、単鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、血管形成阻害薬、生物学的毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害薬タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗癌ポリペプチド抗生物質及び組織因子の中から選択される。
【００４６】
本明細書に提供されるのは、特許請求される組み換えウイルスを含む宿主細胞である。例示的な宿主細胞は、特許請求されるような組み換えウイルスを含む腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、培養物中の哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、培養物中のヒト細胞株である。
【００４７】
また本明細書に開示されるのは、特許請求されるような組み換えウイルスを含むか、またはそれによって感染される哺乳動物生物体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物生物体は、マウス、ラット、ウサギ、またはサルである。
【００４８】
本明細書に提供されるのは、特許請求される組み換えウイルス及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。この組成物は、意図された使用、例えば治療、診断法またはその両方、及び投与経路に適切な量または濃度のウイルスを含む。本明細書に提供されるのは、局所投与または全身投与のために処方されたこのような薬学的組成物である。本明細書に提供されるのは、２つ以上のウイルスを含む薬学的組成物である。本明細書に提供されるのは、天然痘ワクチンのようなワクチンとしての投与のために処方される薬学的組成物である。
【００４９】
本明細書に提供されるのは、ヒト対象または動物対象などの対象での腫瘍、ガンまたは転移を処置するための使用のための薬学的組成物である。この薬学的組成物の投与は、腫瘍の増殖を停止させるかもしくは遅延させるか、腫瘍容積を低下させるか、または腫瘍を対象から排除させる。
【００５０】
本明細書に開示する方法及び薬学的組成物は、任意の固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍を処置するために用いてもよい。本明細書で開示される方法によって処置され得る腫瘍としては、限定するものではないが、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、癌腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、ＣＮＳ癌、神経膠腫、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌及び直腸癌、結合組織癌、消化系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、及び泌尿器系の癌、例えば、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小膠細胞腫、神経芽細胞腫、骨巨細胞腫、口腔新生物、線維肉腫、骨肉腫及び横紋筋肉腫、生殖扁平上皮癌、可移植性性器腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管外皮細胞腫、組織球腫、緑色腫瘍、顆粒球肉腫、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮癌、血管肉腫、肋膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副腎癌、口腔乳頭腫症、血管内皮腫、膀胱腺腫、小胞リンパ腫、腸のリンパ肉腫、線維肉腫及び肺扁平上皮癌、白血病、血管外皮細胞腫、眼性腫瘍形成、包皮線維肉腫、潰瘍性扁平上皮癌、包皮癌腫、結合組織腫瘍形成、肥満細胞腫、肝臓癌、リンパ腫、肺腺腫症、肺肉腫、ラウス肉腫、細網内皮症、線維肉腫、腎芽腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ白血症、網膜芽腫、肝臓腫瘍形成、リンパ肉腫、形質細胞様白血病、浮き袋肉腫（魚の）、乾酪性リンパ節炎、肺癌、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫及び胃腺癌が挙げられる。いくつかの実施形態において、腫瘍は以下から選択される：神経膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍、及び黒色腫。
【００５１】
本明細書に提供される薬学的組成物は、全身に、静脈内に、動脈内に、腫瘍内に、内視鏡的に、病巣内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、肺胞内に、関節内に、胸膜内に、経皮的に、皮下に、口腔に、非経口的に、鼻腔内に、気管内に、吸入によって、頭蓋内に、前立腺内に、硝子体内に、局所に、眼に、経膣的に、または直腸に投与されてもよい。
【００５２】
本明細書に提供される薬学的組成物は、シドホビル、シドホビルのアルコキシアルキルエステル類、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ガンシクロビル、アシクロビル及びＳＴ−２６などの抗ウイルス剤とともに投与されてもよいが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される薬学的組成物及び抗癌剤を含む、特許請求される組み合わせである。本明細書で提供される組み合わせでの使用のための例示的な抗癌剤としては、限定するものではないが、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、感光剤、毒素、抗癌抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管形成抑制剤、シグナル伝達調節因子、代謝拮抗物質、抗癌ワクチン、抗癌オリゴペプチド、有糸分裂抑制薬タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗癌抗体、抗癌抗生物質、免疫療法剤、温熱または温熱療法、バクテリア、放射線療法またはそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書に提供される組み合わせでの使用のための例示的な化学療法化合物としては、限定するものではないが、アルキル化剤、例えば、本明細書に提供される他の化学療法化合物の中でも、白金配位錯体が挙げられる。例示的な白金配位錯体としては、限定するものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＤＷＡ２１１４Ｒ、ＮＫ１２１、ＩＳ  ３  ２９５及び２５４−Ｓが挙げられる。
【００５４】
本明細書で提供されるのは、特許請求されるウイルス、及び抗癌剤、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、感光剤、毒素、抗癌抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管形成抑制剤、シグナル伝達調節因子、代謝拮抗物質、抗癌ワクチン、抗癌オリゴペプチド、有糸分裂抑制薬タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗癌抗体、抗癌抗生物質、免疫療法剤、温熱もしくは温熱療法、または細菌の組み合わせである。本明細書で提供されるのは、特許請求されるウイルス、ならびに抗癌剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせである。
【００５５】
本明細書に提供されるのは、特許請求される組み合わせであって、上記化合物及びウイルスが２つの組成物中で別々に処方される組み合わせである。本明細書に提供されるのは、特許請求される組み合わせであって、上記化合物及びウイルスが単一の組成物として処方される組み合わせである。
【００５６】
本明細書に提供されるのは、腫瘍、癌または転移の処置における使用のための本明細書で特許請求されるウイルスである。また本明細書に提供されるのは、腫瘍、癌または転移の処置のための薬学的組成物の調製のための本明細書で特許請求されるウイルスの使用である。
【００５７】
本明細書に提供されるのは、本明細書に特許請求される薬学的組成物または組み合わせ、及び任意にガンの処置を目的とするその投与のための説明書を備えるキットである。
【００５８】
本明細書に提供されるのは、本明細書で特許請求される組み換えワクシニアウイルスを含む、天然痘ワクチンのようなワクチンである。さらに、本明細書に提供されるのは、免疫応答を生じるための対象に対する天然痘ワクチンのようなワクチンとしての投与のための本明細書で特許請求される組み換えワクシニアウイルスである。
【００５９】
いくつかの実施形態では本明細書に開示されるのは、腫瘍をその後の処置方式に感作させる方法である。いくつかの実施形態による技術の感作部分は、本明細書に記載されるアプローチのいずれかを用いて行ってもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、その後の処置様式は、以下からなる群より選択される：放射線療法、化学療法、免疫療法、光線療法、またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、腫瘍を感作することは、対象に対して照射を施すことを包含する。いくつかの実施形態において、照射は、電離放射線である。一実施形態では、この感作は、局所腫瘍照射、例えば、高線量小分割放射線療法（ＨＤＨＲＴ）で達成される。
【００６１】
電離放射線は、腫瘍微小環境を改変し、免疫媒介性腫瘍拒絶を容易にする有意な能力を有する。具体的には、放射線は、異常な腫瘍血管の再構築、及び血管細胞接着分子（例えば、ＶＣＡＭ−１）及びケモカイン分泌（例えば、ＣＸＣＬ１６）の上方制御を誘導することができ、それによって、腫瘍への有効なＴ細胞の浸潤が生じる。放射線の他の重要な効果としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＮＫＧ２Ｄリガンド、及びＦａｓ／ＣＤ９５の上方制御が挙げられ、これによって、癌細胞に対するＴ細胞の結合及び殺傷が増強される。しかし、これらの有意な免疫原性効果にかかわらず、放射線自体は、腫瘍根絶をもたらすのに持続性かつ強力な抗腫瘍免疫応答を誘導するのには不十分である。
【００６２】
放射線療法としては、限定するものではないが、光線力学的療法、放射性核種、放射免疫療法及び陽子ビーム処置が挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、後続の処置様式は、化学療法化合物の投与を包含する。化学療法化合物としては、限定するものではないが、白金；白金類似体（例えば、白金配位錯体）、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＤＷＡ２１１４Ｒ、ＮＫ１２１、ＩＳ  ３  ２９５及び２５４−Ｓ；アントラセンジオン；ビンブラスチン；アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン及び；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチルアメラミン、例としては、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル（ｃｈｉｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体類、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；置換尿素；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；抗癌多糖類；ポリサッカライド−Ｋ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’ ’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；シトシンアラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル及びドキセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ＸＥＬＯＤＡ；イバンドロナート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類；カペシタビン；メチルヒドラジン誘導体類；エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）；スニチニブリンゴ酸（ＳＵＴＥＮＴ）；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、この定義に含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）；副腎皮質抑制剤；及び抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体である。本明細書で用いられ得るこのような化学療法化合物としては、一般的な全身性の化学療法において化合物の使用が毒性によって阻害される化合物が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、後続の処置様式は、以下から選択される：局所の腫瘍照射、サイトカイン注射、抗体注射、ならびにサイトカイン及び／またはケモカインを分泌している幹細胞の注射。
【００６５】
処置方式の管理
本発明の併用療法で使用される、本明細書に開示される組み換えウイルスを含む、本明細書に開示される処置様式の各々の有効投与量は、用いられる特定の処置、化合物、または薬学的組成物、投与の方式、処置される疾患、及び処置されている疾患の重症度に応じて変化してもよい。したがって、本発明による処置の投薬レジメンは、投与の経路、ならびに患者の腎機能及び肝機能を含む様々な要因に従って選択される。当該技術分野における通常の技術の医師、臨床家または獣医であれば、疾患を予防するか、疾患に対抗するか、または疾患の進行を停止させるのに必要な単一の活性成分の有効量を容易に決定及び処方することができる。毒性を生じることなく有効性を生じる範囲内で活性成分の濃度を達成するのに最適の精度には、標的部位に対する活性成分のアベイラビリティの反応速度論に基づいたレジメンが必要である。
【００６６】
本明細書に開示される関連の処置を含む、薬学的組成物を調製する方法は、当該技術分野では公知であり、当該技術分野から、公知の標準的引用文献、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０）から明らかになる。
【実施例】
【００６７】
実施例１−材料及び方法
細胞株
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞ＣＶ−１、ヒト肺癌Ａ５４９、下咽頭癌細胞株ＦａＤｕ、及びヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。ＣＶ−１細胞はＤＭＥＭ中で培養し；Ａ５４９細胞はＲＰＭＩ  １６４０中で培養し；ＦａＤｕ及びＤＵ１４５は、イーグル最小必須培地中で培養した。全ての培地には、１０％ウシ胎児血清（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を補充した。
【００６８】
プラスミドの構築及び抗体の発現
親の三重変異体ＶＡＣＶ  ＧＬＶ−１ｈ６８は、以前の説明のとおり構築した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：１００３８−１００４６）。要するに、これは、それぞれＬＩＶＰウイルスゲノムのＦ１４．５Ｌ、Ｊ２Ｒ及びＡ５６Ｒ遺伝子座に組み込まれた、レニラルシフェラーゼ−Ａｅｑｕｏｒｅａ  ＧＦＰ融合タンパク質（ＲＵＣ−ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ならびにβ−グルクロニダーゼをコードする３つの外来の遺伝子発現カセットを含む。ＧＬＡＦ−５の配列は、以前の説明とおり設計し（Ｆｒｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１２９１５−１２９２０）、ＧＥＮＥＡＲＴ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって合成した。ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ（ｇａｃ  ｔａｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｇａｃ  ａａｇ）を、抗−ＥＧＦＲＶＨＨのＣ末端コード領域に付加して、抗−ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧを得た。ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＣＲ−ＴＫ−Ｐ＿ＳＥＬのＳａｌ  Ｉ及び  Ｐａｃ  Ｉ部位にクローニングして、プラスミドｐＣＲ−ＴＫ−Ｐ＿ＳＥＬ（ＧＬＡＦ−５）及びｐＣＲ−ＴＫ−Ｐ＿ＳＥＬ（抗−ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ）を得て、これを二重逆数交差を介して、ＧＬＶ−１ｈ６８中でＪ２Ｒ遺伝子座中への相同組み換えに用い、それによって、それぞれＧＬＶ−１ｈ２８２及びＧＬＶ−１ｈ４４２を得た。ＧＬＶ−１ｈ４４６及びＧＬＶ−１ｈ４４４は、同じプラスミド及びＧＬＶ−１ｈ１６４を親のウイルスとして用いて同様に生成した。組み換えＶＡＣＶの配列を確認した。全てのＶＡＣＶは、ＣＶ−１細胞中で増殖し、標準的なプロトコールによってスクロース勾配を介して精製した。
【００６９】
抗体の発現の検出のために、細胞サンプルを、１のＭＯＩで各々のＶＡＣＶ株を用いて感染させた２４時間後に回収して、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。以下の抗体を用いた：ＦＬＡＧ  ｔａｇの検出のための抗−ＤＤＤＤＫ抗体（Ａｂｃａｍ）、ｓｃＡｂの検出のためのカスタムメイドの抗体Ｇ６、及びＶＡＣＶの膜タンパク質の検出のための抗Ａ２７抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００７０】
マウス血清中の抗体の濃度は、以前の説明のとおり（Ｆｒｅｎｔｚｅｎら、上記で引用）、市販の組み換えヒトＥＧＦＲ（Ａｂｎｏｖａ）、ＦＡＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、及びＶＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、標準的なＥＬＩＳＡアッセイで決定した。
【００７１】
ウイルス複製アッセイ
細胞を、０．０１のＭＯＩでＶＡＣＶに感染させ、そのサンプルを、感染後の各時点で三連で回収した。
【００７２】
動物試験
５〜６週齢の雄ヌードマウス（Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス）を、Ｈａｒｌａｎ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）から購入して、Ｅｘｐｌｏｒａ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が承認したプロトコールの下で取り扱い、維持した。１×１０６個のＦａＤｕ、５×１０６個のＡ５４９、または１×１０７個のＤＵ１４５細胞を、マウスの右後肢に皮下移植した。腫瘍容積は、デジタルキャリパーを用いて三次元で毎週測定し、（（長さ×幅×（高さ−５））／２）として算出して、体重を毎週測定した。腫瘍（１ｃｃあたり１ｇの腫瘍密度とみなす）の重量から各時点で総体重を減算することによって、各々の動物の正味の体重を算出した。正味の体重における変化のパーセントは、特定の時点での各々の動物の正味の体重と処置の直前のその正味の体重との間の相違を、処置の直前の正味の体重で割ってパーセンテージとして表したものであった。腫瘍容積が約４５０ｍｍ３に達した時に、各々のＶＡＣＶ株の単一用量の２×１０６ｐｆｕ／マウス（別段特定しない限り）を含む１００μｌのＰＢＳを、後眼窩注射によって投与した。１００マイクロリットルのＰＢＳを、陰性対照として注射した。
【００７３】
治療用抗体を用いる処置のために、マウスに、１０ｄｐｉで開始して５週間の間、１週間に２回、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ）及び／またはエルビタックス（３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００７４】
腫瘍及び臓器を切り出して、ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてホモジナイズした。ウイルス力価は、ＣＶ−１細胞中で標準のプラークアッセイによって決定した。
【００７５】
組織学的解析
ＦａＤｕ腫瘍を切り出してパラフィン包埋し、その後標準的な脱水の過程を行った。腫瘍サンプルを５μｍの切片に切断して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。その切片を脱ろうして、抗原賦活は、クエン酸ナトリウム緩衝液中で行った。以下の抗体を用いた：抗ＦＡＰ（Ａｂｃａｍ）及び抗Ａ２７Ｌ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ビオチン化二次抗体（ヤギ抗ウサギ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、検出は、Ｖｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬及びＶｅｃｔｏｒ  ＩｍｍＰａｃｔ  ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行った。
【００７６】
ＤＵ１４５腫瘍は、３６ｄｐｉで切り出し、続いてパラホルムアルデヒド固定し、次いで１００μｍの切片に切り出した。血管及び細胞増殖は、それぞれ、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出した。
【００７７】
腫瘍切片の試験は、デジタル電化結合素子カメラ（Ｌｅｉｃａ）を装備したＭＺ１６ＦＡ蛍光実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で行った。デジタル画像（１，３００〜１，０３０ピクセルの画像）を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７．０ソフトウェアを用いて処理した。
【００７８】
統計解析
動物の群間の統計学的有意差は、対応のない両側スチューデントｔ検定（Ｅｘｃｅｌ  ２００３；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）またはＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳにおいて一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて解析した。ｐ値＜０．０５を有意と見なした。
【００７９】
実施例２−ＥＧＦＲ及びＦＡＰを標的する個々の抗体をコードする組み換えＶＡＣＶの構築
ＶＡＣＶ（ＧＬＶ−１ｈ１０８（引用文献２９）及びＧＬＶ−１ｈ１６４（Ｂｕｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １３３：２９８９−２９９９）によって発現される抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂ（ＧＬＡＦ−１またはＧＬＡＦ−２）は、いくつかのヒト腫瘍異種移植片モデルで腫瘍増殖を有意に低下し、ＴＭＥにおける血管分布に対して阻害性の効果により「アバスチン様の作用方式」を呈したことが以前に示されている。ＥＧＦＲ及びＦＡＰは、腫瘍の発症及び発達の調節に関与するＴＭＥ中の他の重要な因子である。腫瘍崩壊性ウイルス療法の治療効果に対する、ＥＧＦＲ及びＦＡＰを標的する抗体の効果を評価するために、２つの新規な組み換えＶＡＣＶを、抗ＥＧＦＲナノボディ（抗ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ）発現カセットで、または抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂ（ＧＬＡＦ−５）発現カセットで、両方ともＶＡＣＶ合成早期／後期（ＰＳＥＬ）プロモーターの制御下において、ＧＬＶ−１ｈ６８のＪ２Ｒ遺伝子座で、ｌａｃＺ発現カセットを置き換えることによって構築し、それにより、それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ４４２及びＧＬＶ−１ｈ２８２を得た（図１ａ、図１ｂ）。
【００８０】
実施例３−ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、及びＦＡＰを標的する、ウイルス発現の抗体は、ウイルス療法を有意に増強する
抗ＶＥＧＦ、抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂ、または抗ＥＧＦＲナノボディをコードするＶＡＣＶ株を用いた処置の抗腫瘍効果をマウスで検討した。ＶＡＣＶ株またはＰＢＳ（リン酸干渉化生理食塩水）を、種々のヒト腫瘍異種移植片を保有するマウス中に、マウス１匹あたり２×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）の単回用量で後眼窩に注射した。アバスチンまたはエルビタックスを、ウイルス注射後１０日で開始して、５週間の間、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、１週間に２回マウスに投与した（図２ａ〜図２ｃに矢印で示すとおり）。Ａ５４９異種移植片モデル（ｎ≧７）（図２ａ、ｂ）では、ＰＢＳ処理した腫瘍は、マウスが過剰な腫瘍負荷で屠殺されなければならなくなるまで、連続的な増殖を示した。ＧＬＶ−ｈ１６８を用いて処置したマウスでは腫瘍の代表的な三段階の増殖パターンが観察された（上記で引用されたＺｈａｎｇら）。腫瘍容積は、開始時にＰＢＳ処置群を超えており、続いて有意な腫瘍増殖が停止し、次いで連続的に腫瘍が縮小した。アバスチン単独で処置したマウスは、ＰＢＳと比較して腫瘍容積の低下を示したが、腫瘍増殖は継続していた（図２ａ）。アバスチンと組み合わせたＧＬＶ−１ｈ６８を用いた処置は、いずれかの処置単独よりも有効性の改善を生じたが、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂを発現するＧＬＶ−１ｈ１６４の治療効果は、アバスチンと組み合わせたＧＬＶ−１ｈ６８の治療効果と同程度であった。エルビタックスと組み合わせたＧＬＶ−１ｈ６８を用いた処置は、エルビタックス投与期間中、ＧＬＶ−１ｈ６８単独での処置よりも腫瘍を小さくしたが、腫瘍容積は、エルビタックスを用いた処置を中止した後、一時的にリバウンドした（図２ｂ）。対照的に、抗ＥＧＦＲナノボディを発現するＧＬＶ−１ｈ４４２を用いて処置したマウスでの腫瘍増殖は、ＧＬＶ−１ｈ６８で処置したマウスでの増殖よりも一貫して遅く、腫瘍容積のリバウンドは観察されなかった。さらに、抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂを発現するＧＬＶ−１ｈ２８２を用いたマウスの処置はまた、ＧＬＶ−１ｈ６８を用いた処置よりも有意に小さい腫瘍容積を示した（図２ｃ）。したがって、ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、各々が治療抗体を発現する、ＧＬＶ−１ｈ１６４、ＧＬＶ−１ｈ４４２、またはＧＬＶ−１ｈ２８２を用いたマウスの処置で、Ａ５４９腫瘍増殖に対する治療効果の増強が観察された。さらに、この効果は、治療抗体単独での処置よりも優れており、治療抗体及びＧＬＶ−１ｈ６８の併用処置と同程度であるか、またはそれより優れていた。同様の治療効果がまた、ＤＵ１４５腫瘍異種移植片を保有するマウスでも観察された（ｎ＝５）（図２ｄ）。
【００８１】
実施例４−ＴＭＥに対するＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、及びＦＡＰを標的する、腫瘍内で発現された抗体の影響
腫瘍血管に対する、ウイルスの発現した抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂの効果を、ＶＡＣＶの注射後日数（ｄｐｉ）３６日で切り出したＤＵ１４５腫瘍で評価した。腫瘍切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を行って、腫瘍切片内のＣＤ３１＋血管をカウントすることによって決定した血管密度（ＢＶＤ）を評価した。ＶＡＣＶ感染は、ウイルスの発現したＧＦＰの影響によって示された（図３ａ）。ＶＡＣＶのコロニー形成は、ＰＢＳ処置腫瘍及び同じ腫瘍の未感染領域の両方と比較して、腫瘍の感染領域においてＢＶＤの劇的な低下を生じた（図３ｂ）。これは、ＧＬＶ−１ｈ６８処置腫瘍及びＧＬＶ−１ｈ１６４処置腫瘍の両方に関してあてはまった。しかし、ＧＬＶ−１ｈ６８処置した腫瘍の未感染の領域におけるＢＶＤは、ＰＢＳ処置した腫瘍でのＢＶＤと有意に異なることはなかった。対照的に、ＧＬＶ−１ｈ１６４を用いた処置は、ＧＬＶ−１ｈ６８処置した腫瘍と比較して、腫瘍の感染領域及び未感染領域においてＢＶＤを有意に低下した。したがって、ＶＡＣＶ感染は単独でＧＬＶ−１ｈ６８によって、腫瘍におけるＢＶＤを低下したが、その効果は感染の部位に限局され、一方で、ＶＡＣＶ感染及びＧＬＶ−１ｈ１６４による抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂの発現の組み合わせは、腫瘍の感染領域においてＢＶＤをさらに低下しただけでなく、未感染領域に対する効果も拡大した。
【００８２】
ＥＧＦＲの過剰発現は、制御されない細胞増殖をもたらすことが周知である。抗Ｋｉ６７を用いるＩＨＣ染色を行って、ウイルスの発現した抗ＥＧＦＲナノボディが腫瘍における細胞増殖を抑制したか否かを評価した。予想どおり、抗ＥＧＦＲナノボディを発現する、ＧＬＶ−１ｈ６８またはＧＬＶ−１ｈ４４２のいずれかを用いる腫瘍のコロニー形成は、ＰＢＳ処置した腫瘍と比較して感染された領域でＫｉ６７＋細胞の数を大きく低下した（図３ｃ）。興味深いことに、ＧＬＶ−１ｈ４４２処置した腫瘍の未感染領域におけるＫｉ６７＋細胞の数はまた、ＧＬＶ−１ｈ６８処置した腫瘍の未感染領域と比較して有意に低下された（図３ｄ）。これによって、ＧＬＶ−１ｈ４４２に感染された細胞から分泌された抗ＥＧＦＲナノボディはまた、未感染の細胞に対しても作用し、それらの増殖を低下することが示唆された。
【００８３】
ＦＡＰは、血管形成に関与する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）マーカーである。腫瘍内で発現された抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂの効果を、高レベルのＦＡＰを発現する、ＦａＤｕ腫瘍中でＦＡＰ＋細胞及びＣＤ３１＋細胞をカウントすることによって評価した。ＦａＤｕ腫瘍は、ＧＬＶ−１ｈ６８による処置に応答しなかったが、ＦａＤｕ腫瘍の増殖は、抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂを発現するＧＬＶ−１ｈ２８２によって有意に阻害された（図４）。ＧＬＶ−１ｈ６８コロニー形成腫瘍では、ＣＤ３１＋細胞及びＦＡＰ＋細胞の数は、感染された領域で大きく低下されたが、ＰＢＳ処置した腫瘍と比較して未感染領域では効果は観察されなかった（図３ｅ、ｆ）。対照的に、ＧＬＶ−１ｈ２８２処置した腫瘍におけるＣＤ３１＋細胞及びＦＡＰ＋細胞の数は、ＧＬＶ−１ｈ６８処置した腫瘍と比較して、感染領域及び未感染領域の両方で有意に低下した。
【００８４】
実施例５−ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲまたはＶＥＧＦ及びＦＡＰを標的する２つの抗体を発現する追加の新規な組み換えＶＡＣＶの構築
単一の抗体を発現するＶＡＣＶによる処置の陽性の効果に基づいて、ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲまたはＶＥＧＦ及びＦＡＰを標的する２つの抗体を発現する追加の新規な組み換えＶＡＣＶを構築した。抗ＥＧＦＲナノボディ（抗ＥＧＦＲＶＨＨＦＬＡＧ）または抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂ（ＧＬＡＦ−５）のための発現カセットを、抗ＶＥＧＦ（ＧＬＡＦ−２）発現カセットも含んだＧＬＶ−１ｈ１６４のＪ２Ｒ遺伝子座に挿入して、ヒトノルエピネフリン輸送体（ｈＮＥＴ）発現カセットを置き換えて、それによって、それぞれＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６を得た（図１ｂ）。新規な組み換えＶＡＣＶからの各々の抗体の発現を検証するために、Ａ５４９細胞を、新規なＶＡＣＶ株で感染させて、細胞溶解液をウエスタンブロットによって解析した。この結果によって、それぞれの抗体が、意図されたとおり各々のウイルスから発現されたことが示された（図５）。
【００８５】
実施例６−ウイルスの発現した２つの抗体は、ウイルス複製の有効性に対して負の効果を示さない
ウイルス複製アッセイは、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でＡ５４９細胞で行った（図６）。単一の抗体または２つの抗体を発現する組み換えＶＡＣＶは、感染後時間（ｈｏｕｒ  ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｈｐｉ）２４時間でＧＬＶ−１ｈ６８よりも有意に高い複製効率を示した。しかし、４８ｈｐｉまたは７２ｈｐｉでの複製効率に有意な相違はなかった。同様の結果が、ＤＵ１４５細胞で得られた。したがって、ＶＡＣＶでの２つの抗体の発現は、細胞培養物中でそれらの全体的な複製効率に対して負の影響は示さなかった。
【００８６】
実施例７−ＴＭＥを標的する、ウイルス発現の２つの抗体は、ウイルス療法をさらに改善する
ＴＭＥを標的する単一の抗体を発現する組み換えＶＡＣＶ由来の結果によって促されて、同じＶＡＣＶから発現された２つの抗体がウイルス療法をさらに改善するか否かを考慮して評価を行った。各々のＶＡＣＶ株の単一用量を、Ａ５４９腫瘍異種移植片を保有するマウスに注射した（図７ａ、ｂ）。対照の動物は、ＰＢＳまたはアバスチン及びエルビタックスの組み合わせを用いて処置した。１０ｄｐｉで開始した５週間にわたる１週間に２回のアバスチン及びエルビタックスを用いた処置は、抗体処置の期間中、腫瘍増殖を遅延したが、腫瘍増殖は、抗体処置の中止後に、再び生じた。驚くべきことに、２つの抗体を発現するＧＬＶ−１ｈ４４４またはＧＬＶ−１ｈ４４６で処置したマウスでの腫瘍は、実験期間中、最小限しか増殖しなかったことが示された。対照的に、単一の抗体を発現するＶＡＣＶで処置されたマウスでの腫瘍は、最初は、ＰＢＳで処置された腫瘍と同じくらい早く増殖するか、またはごくわずかに遅く増殖し、その後腫瘍増殖が有意に遅くなり、次いで腫瘍が縮小した。全体的に、２つの抗体を発現する、ＧＬＶ−１ｈ４４４またはＧＬＶ−１ｈ４４６で処置されたマウスでの腫瘍容積は、単一抗体を発現するＶＡＣＶで処置されたマウスでの腫瘍容積よりも少なかった。Ａ５４９腫瘍を保有する個々のマウスの腫瘍増殖曲線を図８に示す。同様のパターンの腫瘍増殖が、ＤＵ１４５腫瘍で得られた（図７ｃ）。
【００８７】
実施例８−ウイルス発現の抗体は、処置されたマウスの血清中で検出可能である
培養物中のウイルス感染した細胞中の抗体発現の確証後、腫瘍保有マウスにおける抗体の存在も検討した。血液サンプルを、同じマウスから、７、２１及び３５ｄｐｉで後眼窩から収集した。全てのサンプルを、ＦＡＰプレコーティングプレートを用いて抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂの存在について、ＥＧＦＲプレコーティングプレートを用いて抗ＥＧＦＲナノボディの存在について、かつＶＥＧＦプレコーティングプレートを用いて抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂの存在について試験した。全ての抗体は、３つ全ての時点で検出可能であった（図７ｄ〜ｆ）。ＧＬＡＦ−２の発現は、ＧＬＶ−１ｈ１６４処置した群における１４ｄｐｉでの腫瘍中の低いウイルス力価と一致して、７ｄｐｉ及び２１ｄｐｉでＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６（２つの抗体）を用いて処置したマウスにおいてよりも、ＧＬＶ−１ｈ１６４（単一抗体）で処置したマウスで低かった（図９）。それにもかかわらず、全ての場合に、早期段階（７日目及び２１日目）の抗体の発現は、低い腫瘍容積と一致し、後期段階（３５日）では、腫瘍縮小につながった。
【００８８】
実施例９−ウイルス発現の２つの抗体は、マウスにおいてウイルス分布及び毒性を変更しない
マウスにおける抗体発現性ＶＡＣＶの投与の潜在的な有害効果を、処置期間中の正味の体重の変化を評価することによって評価した。Ａ５４９及びＤＵ１４５の両方の腫瘍異種移植片モデルで、正味の平均体重の有意な変化は、処置群または対象群のいずれでも観察されなかった（図１０ａ−ｃ）。また、標準のウイルスプラークアッセイで決定したＡ５４９腫瘍保有マウスにおける１４ｄｐｉでの種々の臓器及び腫瘍中のウイルスの生体分布も評価した（図９）。有意なウイルス力価が全ての処置された腫瘍で検出され、他の臓器では力価も最小力価も検出されなかった。抗ＦＡＰ  ｓｃＡｂを発現するＧＬＶ−１ｈ２８２、及び抗ＥＧＦＲナノボディを発現するＧＬＶ−１ｈ４４２を用いて処置した腫瘍中のウイルス力価は、ＧＬＶ−１ｈ６８で処置した腫瘍においてよりも高かったが、統計学的に有意ではなく、一方で、腫瘍中で抗ＶＥＧＦ  ｓｃＡｂを発現するＧＬＶ−１ｈ１６４のウイルス力価は、他のウイルス株よりも有意に低かった（ＧＬＶ−１ｈ１６４対ＧＬＶ−１ｈ６８、Ｐ＝０．０２、及び対ＧＬＶ−１ｈ４４６、Ｐ＝０．０４）。
【００８９】
実施例１０−ＴＭＥに対する、ＶＥＧＦ及びＥＧＦＲまたはＶＥＧＦ及びＦＡＰを標的する、腫瘍内発現された２つの抗体の効果
ＴＭＥに対する２つのウイルス発現の抗体の影響を、抗Ｋｉ６７抗体及び抗ＣＤ３１抗体を用いて３６ｄｐｉで得た腫瘍切片を染色することにより、ＤＵ１４５腫瘍異種移植片において、細胞増殖及びＢＶＤを試験することによって評価した。ＶＡＣＶ感染は、ＧＦＰ蛍光によって確認した。増殖しているＫｉ６７＋細胞のＩＨＣ染色の代表的な画像を、図１１ａに示す。腫瘍の感染した領域では、Ｋｉ６７＋細胞は、ＧＬＶ−１ｈ６８を含むＶＡＣＶ株のいずれかを用いた処置後に有意に減少した（図１１ｃ）。ＶＡＣＶ処置した腫瘍の未感染領域では、Ｋｉ６７＋細胞は、単一の抗ＥＧＦＲナノボディ発現性ＶＡＣＶ、ＧＬＶ−１ｈ４４２、及び２つの抗体発現性ＶＡＣＶ、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６を用いた処置後にのみ有意に低下された（図１１ｂ）。
【００９０】
抗ＣＤ３１抗体で染色されたＤＵ１４５腫瘍切片の画像によって、腫瘍の感染された領域は、処置に用いられたＶＡＣＶにかかわらず、未感染領域と比較してＢＶＤを有意に低下したことが示された（図１２ａ〜ｃ）。ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、ＢＶＤの有意なさらなる低下が、抗ＶＥＧＦ抗体（ＧＬＡＦ−２）を発現するＶＡＣＶで、単独で、または他の抗体と組み合わせてのいずれかで観察された。予想どおり、抗ＥＧＦＲを発現するが、抗ＶＥＧＦは発現しないＧＬＶ−１ｈ４４２を用いて処置した腫瘍におけるＢＶＤは、ＧＬＶ−１ｈ６８で処置した腫瘍におけるＢＶＤと有意に異なることはなかったが、ＧＬＶ−１ｈ４４４及びＧＬＶ−１ｈ４４６で処置された感染領域は、ＢＶＤのさらなる低下を示した。
【００９１】
本明細書で引用した全ての刊行物は、参照により援用される。
【００９２】
本明細書に例示的に記載される開示は、本明細書に具体的に開示されない、なんらかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、包括的に、かつ限定されることなく読み取られるものとする。さらに、本明細書に使用される用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として用いられており、このような用語及び表現を使用する際、将来示され、かつ記載される任意の等価物、またはその一部を排除する意図はないが、ただし、種々の改変は、特許請求される開示の範囲内で実現可能であることが認識される。
【００９３】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に示される。
【図１】
2018510158.tif 000003
【図２Ａ】
2018510158.tif 000004
【図２Ｂ】
2018510158.tif 000005
【図２Ｃ】
2018510158.tif 000006
【図２Ｄ】
2018510158.tif 000007
【図３Ａ】
2018510158.tif 000008
【図３Ｂ】
2018510158.tif 000009
【図３Ｃ】
2018510158.tif 000010
【図３Ｄ】
2018510158.tif 000011
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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