(57)【要約】  本発明は、リンパ腫及び白血病における抗ＣＳＦ−１Ｒ誘導性リンパ球増加症、及びヒトＣＤ２０に結合する抗体とのヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の併用療法に関する。【選択図】図５−２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導することにおける使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体。
【請求項２】
リンパ球増加症が、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
リンパ球増加症が、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ１９抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
リンパ球増加症が、ＣＤ２０を発現する循環白血病細胞を増加させる、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
リンパ球増加症が、ＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み；かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量が、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％であり；かつ配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトＣＤ２０に結合する抗体との併用における使用のためである、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体であって、該抗体が
ｉ）ＣＤ２０発現がんの治療における使用のため；又は
ｉｉ）Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のため；又は
ｉｉｉ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激することにおける使用のため；又は
ｉｖ）がんの進行を遅延させることにおける使用のため；又は
ｖ）がんに罹患している患者の生存期間を延長することにおける使用のためのものであり、
かつ、併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
かつ、併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、抗体。
【請求項１０】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量が、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％であり；かつ配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
マクロファージを標的化することによりＣＤ２０標的療法からの逃避を防止するための、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤と併用した抗ＣＤ２０抗体によってＣＤ２０発現がんを標的化する方法。
【請求項１３】
マクロファージが抗ＣＳＦ１Ｒ抗体により標的化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
かつ、併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、
実施態様１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量が、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％であり；かつ配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
リンパ腫及びリンパ性白血病の治療における使用のための、請求項１から１６の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項１８】
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における使用のための、請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項１９】
多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、又はホジキン病の治療における使用のための、請求項１から１８の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２０】
がん、リンパ腫及び白血病がＣＤ２０を発現した、請求項１から１９の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２１】
腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行を遅延させることにおける使用のための、請求項１から２０の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞活性化などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、請求項１から２１の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２３】
腫瘍転移の予防又は治療における使用のための、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２４】
炎症性疾患の治療における使用のための、請求項１から２３の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２５】
ヒトＣＳＦ−Ｒに結合する抗体及びヒトＣＤ２０に結合する抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１から２４の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２６】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び抗ＣＤ２０抗体併用療法に加えて、追加的化学療法剤及び／又は標的療法が施されない、請求項１から２５の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２７】
ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びヒトＣＤ２０に結合する抗体が同時に共投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２８】
ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びヒトＣＤ２０に結合する抗体が逐次的に共投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項２９】
抗ＣＤ２０抗体と併用した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体も投与される、請求項１から２８の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３０】
使用されるＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が、
−  配列番号７８の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８２の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８３の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ１２」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８４の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ３７」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８５の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８６の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ８９」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８７の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８８の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．５」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８９の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．８」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９０の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．３０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．３４」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９２の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ３７」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９３の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．４９」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９４の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．５１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９５の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．６２」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；及び
−  配列番号８０の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９６の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．８４」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）
からなる群から選択される可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３１】
ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、請求項２９に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３２】
ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が同時に共投与される、請求項２９から３１の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３３】
ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が逐次的に共投与される、請求項２９から３１の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３４】
抗ＣＤ２０抗体と併用した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ−１抗体も投与される、請求項１から３３の何れか一項に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３５】
ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−１に結合する抗体が同時に共投与される、請求項３４に記載の抗体、使用又は方法。
【請求項３６】
ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−１に結合する抗体が逐次的に共投与される、請求項３４に記載の抗体、使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ腫又は白血病のリンパ球増加症を誘導するのに有用なヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体に関する。本発明は更に、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する特異的抗体のヒトＣＤ２０に結合する特異的抗体との併用療法、及びマクロファージを標的化することによりＣＤ２０標的療法からの逃避を防止するための、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤と併用した抗ＣＤ２０抗体によってＣＤ２０発現がんを標的化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＣＳＦ−１Ｒ及びＣＳＦ−１Ｒ抗体
ヒトＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ；コロニー刺激因子１受容体；同義語：Ｍ−ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、Ｆｍｓプロトオンコジーン、ｃ−ｆｍｓ、配列番号６２）は１９８６年から知られている（Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280）。ＣＳＦ−１Ｒは増殖因子であり、ｃ−ｆｍｓがん原遺伝子によってコードされる（例えば、Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-167に概説される）。
【０００３】
ＣＳＦ−１Ｒは、ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子１、Ｍ−ＣＳＦ、マクロファージコロニー刺激因子とも呼ばれる）の受容体であり、このサイトカインの生物学的効果を媒介する（Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676）。コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）（ｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552に初めて記載された。この文献において、ＣＳＦ−１Ｒが、Ｃｂｌに結合することにより受容体の下方制御を調節する抑制性のチロシン９６９リン酸化の欠損を含むタンパク質のＣ末端鎖における変化に依存する、形質転換能を有することが示された（Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628）。最近、インターロイキン−３４（ＩＬ−３４）と命名されたＣＳＦ−１Ｒの第２のリガンドが同定された（Lin, H., et al, Science 320 (2008) 807-811）。
【０００４】
現在、ＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインに結合する２つのＣＳＦ−１Ｒリガンドが知られている。そのうち第１のリガンドは、ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子１、Ｍ−ＣＳＦとも呼ばれる、マクロファージ；配列番号８６）であり、ジスルフィドに結合したホモ二量体として細胞外に見出される（Stanley, E.R. et al., Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159; Stanley, E.R. et al., Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24）。第２のリガンドは、ＩＬ−３４（ヒトＩＬ−３４；配列番号８７）（Hume, D. A. , et al, Blood 119 (2012) 1810-1820）である。ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、マクロファージ系統（破骨細胞を含む）への、造血性前駆体細胞の分化、増殖、遊走、及び生存である。ＣＳＦ−１Ｒの活性化は、そのＣＳＦ−１ＲリガンドであるＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３４により媒介される。ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）のＣＳＦ−１Ｒに対する結合は、チロシンリン酸化によるキナーゼの活性化及びホモ二量体の形成を誘導する（Li, W. et al, EMBO Journal.10 (1991) 277-288; Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10）。
【０００５】
生物学的に活性のホモ二量体ＣＳＦ−１は、ＣＳＦ−１受容体の細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）のサブドメインＤ１からＤ３内でＣＳＦ−１Ｒに結合する。ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤは、５つの免疫グロブリン様サブドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）を含む。細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）のＤ４〜Ｄ５は、ＣＳＦ−１の結合に関与していない（Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359）。サブドメインＤ４は、二量体化に関与している（Yeung, Y-G., et al Molecular & Cellular Proteomics 2 (2003) 1143-1155; Pixley, F. J., et al., Trends Cell Biol. 14 (2004) 628-638）。
【０００６】
更なるシグナル伝達は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路にそれぞれ接続するＧｒｂ２及びＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットにより媒介される。これら２つの重要なシグナル伝達経路は、増殖、生存及びアポトーシスを調節することができる。ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化細胞内ドメインに結合する他のシグナル伝達分子は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＬＣｙ、及びＣｂｌ（Bourette, R.P. and Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166）を含む。
【０００７】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達は、骨リモデリング及び生殖器系において、免疫応答に生理的役割を有する。ＣＳＦ−１（Pollard, J.W., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61）又はＣＳＦ−１Ｒ（Dai, X.M., et al., Blood 99 (2002) 111-120）のノックアウト動物は、それぞれの細胞型において、ＣＳＦ−１Ｒのための役割と一致する、大理石骨病表現型、造血性表現型、組織マクロファージ表現型、及び生殖表現型を有することが示されている。
【０００８】
Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793 は、ＣＳＦ−１活性を阻害するＣＳＦ−１Ｒに対する幾つかの抗体に関する。Ashmun, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837は、ＣＳＦ−１Ｒ抗体に関する。Lenda, D., et al., Journal of Immunology 170 (2003) 3254-3262は、ＣＳＦ−１−欠乏マウスにおけるマクロファージ動員、増殖、及び活性化の低減が、腎臓の炎症の間の管状アポトーシスの減少を招くことに関連している。Kitaura, H., et al., Journal of Dental Research 87 (2008) 396-400は、歯の矯正移動を阻害する抗ＣＳＦ−１抗体に言及している。国際公開第２００１／０３０３８１号は、アンチセンスヌクレオチド及び抗体を含むＣＳＦ−１活性阻害剤に言及しているが、ＣＳＦ−１アンチセンスヌクレオチドを開示しているのみである。国際公開第２００４／０４５５３２号は、ＣＳＦ−１アンタゴニストによる腫瘍転移及び骨損失の予防と転移性がんの治療とに関連しており、アンタゴニスト抗ＣＳＦ−１−抗体として開示しているのみである。国際公開第２００５／０４６６５７号は、抗ＣＳＦ−１抗体による炎症性腸疾患の治療に関連している。米国特許出願公開第２００２／０１４１９９４号は、コロニー刺激因子の阻害剤に関連している。国際公開第２００６／０９６４８９号は、抗ＣＳＦ−１抗体による関節リウマチの治療に関連している。国際公開第２００９／０２６３０３号及び国際公開第２００９／１１２２４５号は、細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）のうち最初の３つのサブドメイン（Ｄ１〜Ｄ３）内においてＣＳＦ−１Ｒに結合する特定の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に関連している。国際公開第２０１１／１２３３８１（Ａ１）号は、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体に関連している。国際公開第２０１１／０７００２４号は、二量体化ドメイン（Ｄ４〜Ｄ５）内においてＣＳＦ−１Ｒに結合する特定の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に関連している。
【０００９】
ＣＤ２０及びＣＤ２０抗体
ＣＤ２０分子（ヒトＢリンパ球限定分化抗原又はＢｐ３５とも称される）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置する疎水性膜貫通タンパク質であり、詳しく記述されている（Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; and Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568）。ＣＤ２０は、９０％超のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）上で発現される（Anderson, K.C., et al., Blood 63 (1984) 1424-1433）が、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常形質細胞、又は他の正常組織上には見出されない（Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135 (1985) 973- 979)）。
【００１０】
ＣＤ２０結合の様式と生物活性が有意に異なる、２つの異なるタイプの抗ＣＤ２０抗体が存在する（Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743；及びCragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052）。例えばリツキシマブ（８５％以上のフコース量を有する非アフコシル化抗体）等のＩ型抗体は補体媒介性細胞傷害が強力である。
【００１１】
例えばトシツモマブ（Ｂ１）、１１Ｂ８、ＡＴ８０又はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体などのＩＩ型抗体は、同時のホスファチジルセリン曝露でカスパーゼ非依存性アポトーシスを介して標的細胞死を効率的に開始せしめる。
【００１２】
Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の共通の特徴を表１に要約する。
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【発明の概要】
【００１３】
本発明は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導することにおける使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関する。
【００１４】
本発明は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用に関する。
【００１５】
本発明は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量の投与を含む治療方法に関する。
【００１６】
一実施態様は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用である。
【００１７】
一実施態様では、リンパ球増加症は、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させる。
【００１８】
一実施態様では、リンパ球増加症は、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ１９抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする。
【００１９】
一実施態様では、リンパ球増加症は、ＣＤ２０を発現する循環白血病細胞を増加させる。
【００２０】
一実施態様では、リンパ球増加症は、ＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする。
【００２１】
本発明は更に、ヒトＣＳＦ−１Ｒと特異的に結合する抗体にも関し、ここで該抗体は、ヒトＣＤ２０に結合する抗体と併用して使用するためのものであり
ｉ）ＣＤ２０発現がんの治療における使用のため；又は
ｉｉ）Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のため；又は
ｉｉｉ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激することにおける使用のため；又は
ｉｖ）がんの進行を遅延させることにおける使用のため；又は
ｖ）がんに罹患している患者の生存期間を延長することにおける使用のためのものであり、
当該併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
かつ併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明は更に、マクロファージを標的化することによりＣＤ２０標的療法からの逃避を防止するための、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤と併用した抗ＣＤ２０抗体によってＣＤ２０発現がんを標的化する方法に関する。
【００２３】
一実施態様では、マクロファージは抗ＣＳＦ１Ｒ抗体により標的化される。
【００２４】
一実施態様では、このような方法において、併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
かつ併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。
【００２５】
一実施態様では、抗体は、がんの治療における使用のためのものである。
【００２６】
一つの好ましい実施態様では、抗体は、リンパ腫（好ましくは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病としてのＣＤ２０発現がんの治療における使用のためのものである。
【００２７】
一つの好ましい実施態様では、抗体は、骨髄腫の治療における使用のためのものである。
【００２８】
一つの好ましい実施態様では、抗体は、濾胞性リンパ腫の治療における使用のためのものである。
【００２９】
一つの好ましい実施態様では、抗体は、ホジキン病の治療における使用のためのものである。
【００３０】
一実施態様では、抗体は、腫瘍転移の予防又は治療における使用のためのものである。
【００３１】
一実施態様では、抗体は、炎症性疾患の治療における使用のためのものである。
【００３２】
一実施態様では、抗体は、腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行を遅延させることにおける使用のためのものである。
【００３３】
一実施態様では、抗体は、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである。
【００３４】
発明者らは、単球／マクロファージへの白血病細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ依存性を支持する一連の分子相互作用を見出した。本発明は、ＣＳＦ１Ｒ阻害は、特に骨髄における白血病細胞負荷を低減させ、循環ＣＤ２０＋白血病細胞を増加させ、従って、２つの異なる抗体、すなわち１つはＴＡＭを標的とし、他方は白血病細胞上のＣＤ２０分子を標的とする抗体の治療的組み合わせを示唆するという知見に関する。
【００３５】
本明細書に記載の特異的抗体のそのような併用療法は、ＣＳＦ−１Ｒ及びＣＤを標的とする治療法を必要とする患者のための利益を示す。本発明者らは、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体の投与が有意なリンパ球増加症を誘導し、これによりリンパ腫及び白血病は、抗ＣＤ２０及び／又は抗ＣＤ１９抗体治療に対してより感受性になることを見出した。更にそれらは、循環ＣＤ２０＋白血病細胞のマクロファージ枯渇に関連した増加が、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせるための治療機会を表すことを示している。ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋循環白血病細胞の増加した割合に基づいて、リンパ腫及び白血病、特にＣＤ２０発現リンパ腫及び白血病に罹患している患者に、特異的抗ＣＳＦ−１Ｒ及び抗ＣＤ２０抗体との有効な併用療法を施すことができる。より顕著なことに、抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂがＧＡ１０１に関連する場合、白血病細胞枯渇は有意に増加した。この観察は、２つの異なる抗体、すなわち１つはＴＡＭを標的とし、他方はＣＤ２０＋循環細胞を標的とする抗体の組み合わせに基づく治療の新規な戦略を示唆した。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ−ｂ】１ａ：Ｍ−ＣＳＦ又はＣＳＦ−１（リガンド１ｍｌ当たり１００ｎｇ）の共培養によりマクロファージに分化されたヒト単球。６日間にわたる分化後、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７を加えた。抗体処置の７日目に、ＣＴＧ生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）Ｐｒｏｍｅｇａ）において細胞生存率を測定した。％細胞生存率の算出：処置細胞由来のＲＬＵシグナルを、抗体を含まない未処置のコントロール由来のＲＬＵシグナルにより除した（ｎ＝４）。１ｂ：７日間にわたりＧＭ−ＣＳＦ（Ｍ１）又はＭ−ＣＳＦ（Ｍ２）によりマクロファージに分化されたヒト単球。間接蛍光分析により分析した表現型  −標識された抗ＣＤ１６３−ＰＥ、抗ＣＤ８０−ＰＥ、又は抗ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ／ＤＰ−Ｚｅｎｏｎ−Ａｌｅｘａ６４７による染色。各ヒストグラム内の数字は、平均蛍光強度比（ＭＲＦＩ）に対応する：選択された抗体で染色された細胞（空のヒストグラム）と対応するアイソタイプコントロール（陰性コントロール；灰色で満たされたヒストグラム）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の間の計算された比に対応する（平均±ＳＤ；ｎ≧５）。
【図２ａ−ｄ】カニクイザルにおいて、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７の異なる投与量を適用後の、ＣＳＦ−１のレベル。
【図３】ＴＡＭの存在下において、ＣＤ３及びＣＤ２８の活性化により誘導されるＴ細胞の増殖は抑制された：ＴＡＭをＭＣ３８腫瘍から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の存在下においてＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞に示された比で共培養した。Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥｌｏｗ分割細胞のビーズ定量化を用いて３日後に分析した。２つのうちの１つの代表的な実験を３重ウェルの平均＋ＳＥＭとして示す。
【図４】ＣＬＬ異種移植系における抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂの抗白血病効果。（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し（ｎ＝３、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝４、黒丸）、２７日目に死滅させた（Ａ）。ＳＰ（Ｂ）及びＢＭ（Ｃ）においてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す。ＢＭにおけるヒトＣＤ１９＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｄ）。ＳＰにおいてｈＣＤ１９＋細胞についてゲートされたヒトＣＤ１９＋細胞及びＡｎｎ−ＰＩ＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｅ）。データは３つのうちの１つの代表的な実験からのものである。統計解析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。（Ｆ−Ｇ−Ｈ−Ｉ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し（ｎ＝７、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝７、黒丸）、２７日目及び２９日目、最後のｍｏＡｂ注入後４８時間後及び９６時間後に死滅させた（Ｆ）。２７日目と２９日目に、ＳＰにおいてｈＣＤ１９＋細胞についてゲートされたヒトＣＤ１９＋細胞及びＡｎｎ−ＰＩ＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｇ）。２７日目にＳＰにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｈ）。２７日目にＳＰにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＳＦ１Ｒ＋マクロファージプールに対するＣＤ１１ｂ＋ ＭＲＣ１＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｉ）。データは２つのうちの１つの代表的な実験からのものである。統計解析：＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図Ｓ４も参照。
【図５】ＣＬＬ異種移植系における抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂの抗白血病効果及び生存への影響。（Ａ−Ｂ−Ｃ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し（ｎ＝３、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝４、黒丸）、２７日目に死滅させた（Ａ）。ＰＢにおけるｈＣＤ１９＋（Ｂ）細胞及びｈＣＤ１９＋ ＣＤ２０＋（Ｃ）細胞の割合の平均値をグラフに示す。データは２つのうちの１つの代表的な実験からのものである。統計学的に有意な差はスチューデントｔ検定を用いて計算された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１．（Ｄ−Ｅ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを未処置のまま放置し（ｎ＝１０、黒丸）、又は３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）（ｎ＝１１、白丸；＋１１日目、＋２５日目）；又は３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＤ２０  ｍｏＡｂ  ＧＡ１０１を腹腔内に（ｉ．ｐ．）（ｎ＝１０、青丸；＋１１日目、＋２５日目）；又は３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＤ２０  ｍｏＡｂ  ＧＡ１０１を腹腔内に（ｉ．ｐ．）（＋１１日目、＋２５日目）＋３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）（＋１８日目、＋３２日目）（ｎ＝１０、紫色の円）処置し、生存率をモニターした（Ｄ）。カプラン・マイヤー生存曲線が示され（Ｅ）、ログランク検定を用いて統計解析を行った。αＣＳＦ１Ｒ対コントロール：ｐ＝０．０１；αＣＤ２０対コントロール：ｐ＝０．００６；αＣＤ２０＋αＣＳＦ１Ｒ対コントロール：ｐ＜０．０００１；αＣＤ２０＋αＣＳＦ１Ｒ対αＣＤ２０：ｐ＝０．０５８５。
【図６】ＣＬＬマウスモデルの微小環境に対するマクロファージ標的化の影響。（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し（ｎ＝４、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝４、黒丸）、２７日目又は２９日目に死滅させた（Ａ）。ＰＢにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ＋細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｂ）。ＰＢにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ− ＳＳＣｈｉｇｈ好中球の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｃ）。ＰＢにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｇｒ１＋細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｄ）。データは２つのうちの１つの代表的な実験からのものである。ＰＢにおいて、ＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０ｌｏｗ細胞についてゲートされた単球Ｌｙ６Ｃ＋ Ｌｙ６Ｇ（Ｅ）及びＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０ｌｏｗ細胞についてゲートされた顆粒球Ｌｙ６Ｃｌｏｗ  Ｌｙ６Ｇｈｉｇｈ（Ｆ）の相対寄与の平均値をグラフに示す。統計解析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。（Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、６０μｌのｃｌｏｄｒｏｌｉｐを静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し（ｎ＝４、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝４、黒丸）、２６日目に死滅させた（Ａ）。ＰＢにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ− ＳＳＣｈｉｇｈ好中球の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｈ）。ＰＢにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｇｒ１＋細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｉ）。ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ− ＳＳＣｈｉｇｈ好中球の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｃ）。ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｇｒ１＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｋ）。データは２つのうちの１つの代表的な実験からのものである。統計解析：＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。（Ｌ−Ｍ−Ｎ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し（ｎ＝４、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝４、黒丸）、２７日目又は２９日目に死滅させた（Ａ）。ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｌ）。データは２つのうちの１つの代表的な実験からのものである。ＢＭにおいて、ＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０ｌｏｗ細胞についてゲートされた単球Ｌｙ６Ｃ＋ Ｌｙ６Ｇ−（Ｍ）及びＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０ｌｏｗ細胞についてゲートされた顆粒球Ｌｙ６Ｃｌｏｗ  Ｌｙ６Ｇｈｉｇｈ（Ｎ）の絶対数の平均値をグラフに示す。統計解析：＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。（Ｏ−Ｐ−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｕ）Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウス由来の白血病Ｂ細胞を腹腔内に移植したＣ５７ＢＬ／６マウスに、３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを腹腔内に（ｉ．ｐ．）処置し（＋１７日目、＋２３日目）（ｎ＝３、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝３、黒丸）、２６日目に死滅させた（Ｏ）。ＰＢにおけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラル及びＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ｎｅｇエフェクターメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｐ）。ＢＭ（Ｑ）及びＳＰ（Ｒ）におけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラル及びＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ｎｅｇエフェクターメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の絶対数の平均値をグラフに示す。細胞内のＩＦＮγ産生をフローサイトメトリーにより測定し、ＣＤ８＋ ＣＤ４４＋ ＩＦＮγ＋ Ｔ細胞の絶対数の平均値をグラフ（Ｓ）に示す。ＳＰにおけるＢ細胞プール全体に対するＣＤ１９＋ ＣＤ５＋細胞についてゲートされたＡｎｎ＋ ＰＩ−細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｔ）。ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｕ）。統計解析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。（Ｖ−Ｗ−Ｘ）Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウス由来の白血病Ｂ細胞を腹腔内に移植したＣ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｌのｃｌｏｄｒｏｌｉｐを腹腔内に（ｉ．ｐ．）処置し（１７日目に開始し、３日ごと）（ｎ＝４、白丸）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝４、黒丸）、２４日目に死滅させた（Ｖ）。ＳＰにおけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラル及びＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ｎｅｇエフェクターメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｗ）。ＳＰにおけるＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｘ）。
【図７】異種移植マウスのＢＭ微小環境：単球及びマクロファージ集団（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ）ＭＥＣ１を注入されない（ＵＮ、黒丸）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注入した（白丸）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、白血病の早期（ｎ＝３）及び後期（ｎ＝３）段階に死滅させ、フローサイトメトリーにより分析した（Ａ）。ＢＭにおけるｈＣＤ１９＋細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｂ）。ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｌ）。ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｄ）。ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたマクロファージプール全体（ＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋）に対するＣＤ１１ｂ＋ ＭＲＣ１＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｅ）。データは３つのうちの１つの代表的な実験からのものである。統計解析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。ＢＭにおけるＣＤ４５＋ ＣＤ１１ｂ＋プール全体に対するＣＤ８６＋ ＭＲＣ１＋細胞及びＣＳＦ１Ｒ＋ ＭＲＣ１＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｆ）。統計解析：＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
【図８】ＣＬＬ異種移植マウスからのＢＭ間質細胞によるサイトカイン産生。（Ａ−Ｂ−Ｃ）ＭＥＣ１を注入されない（ＵＮ、黒丸）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注入した（白丸）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、白血病の早期段階に死滅させ（ｎ＝５）、フローサイトメトリーにより分析した。細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリーにより測定した。左：ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされたＩＬ−１７ａを産生するＣＤ１１ｂ＋ Ｇｒ１＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す；右：ＢＭにおいてＣＤ４５＋についてゲートされた、ＩＬ−１７ａを産生するＣＤ１１ｂ＋ Ｇｒ１＋細胞のフローサイトメトリーの代表的なプロット（Ａ）。ＢＭにおいて（Ｂ）、左：ＩＬ−１７ａを産生する非造血ＣＤ４５−細胞の絶対数の平均値；右：ＩＬ−１７ａを産生する非造血ＣＤ４５−細胞のフローサイトメトリーの代表的なプロット。ＢＭにおいて（Ｃ）、左：ＩＬ−２を産生する非造血ＣＤ４５−細胞の絶対数の平均値；右：ＩＬ−２を産生する非造血ＣＤ４５−細胞のフローサイトメトリーの代表的なプロット。統計解析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。
【図９】異種移植マウスのＭＥＣ１白血病細胞及び単球／マクロファージのトランスクリプトーム解析（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスにＭＥＣ１細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注入し、年齢が一致した非移植Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスとともに白血病の早期段階で屠殺した（ｎ＝３／群）。磁気分離により精製したＢＭマウス単球／マクロファージからＲＮＡを単離し、イルミナ全ゲノム遺伝子発現直接ハイブリダイゼーションアッセイのために処理した。異種移植されたマウス及び非移植（ＵＮ）マウスからの単球／マクロファージ間の監視分析を行った。ヒートマップは、差次的に発現された遺伝子の階層的クラスタリングを表す（移植対非移植）（補正Ｐ値＜０．０５）。各遺伝子の発現レベルは、遺伝子の平均発現を差し引いた後、次いで全試料にわたって標準偏差で割ることによって標準化されている。Ｒｏｗ Ｚスコアとして示されるこのスケールされた発現値は、赤−青スケール色でプロットされ、赤色は高発現を示す。群間の遺伝子発現の差異は、以下のように機能的に分類された：核エフェクター、腫瘍抑制因子及び翻訳関連（Ａ）；細胞内機能（Ｂ）；膜／細胞外タンパク質（Ｃ）、アポトーシス関連（Ｄ）及び炎症メディエーター（Ｅ）。磁気分離により精製したＢＭ浸潤ヒトＣＤ１９＋ ＭＥＣ１細胞からＲＮＡを単離し、イルミナ全ゲノム遺伝子発現直接ハイブリダイゼーションアッセイのために処理した。異種移植されたＭＥＣ１細胞とｉｎ  ｖｉｔｒｏ前注入ＭＥＣ１細胞との間の監視分析を行った。ヒートマップは、差次的に発現された遺伝子の階層的クラスタリングを表す（異種移植対前注入）（補正Ｐ値＜０．０５）。単球／マクロファージ及びＢ細胞相互作用に関与する群間の遺伝子発現の差異が記載されている（Ｆ）。（Ｇ）ＭＥＣ１細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注入し、２１日目に屠殺したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウス（ｎ＝４、白丸）及び年齢が一致した非注入（ＵＮ）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウス（ｎ＝４、黒丸）をフローサイトメトリーにより分析した。左：ＳＰ、ＢＭ、及びＰＥにおける、ＣＤ４５＋についてゲートされたマクロファージプール全体（ＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋）に対するＣＤ１１ｂ＋ ＩＣＡＭ１＋細胞のフローサイトメトリーの代表的なプロット。右：ＳＰ、ＢＭ、及びＰＥにおける、ＣＤ４５＋についてゲートされたマクロファージプール全体（ＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋）に対するＣＤ１１ｂ＋ ＩＣＡＭ１＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０】トランスクリプトーム解析は、白血病細胞との単球／マクロファージクロストークの役割を示唆している（図９に関連）。（Ａ）非注入（ＵＮ）のＢＭ由来の単球／マクロファージにおけるＦｃｇｒ１、Ｓａａ３、Ｉｃａｍ１、Ｄｌｅｕ２、Ａｐｏｅ、Ｔｌｒ７の相対的なｍＲＮＡ発現、及びＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスはＭＥＣ１細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注入され、白血病の早期段階で屠殺された。発現はβ−アクチンレベルに規格化された。データは平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝３／群）。（Ｂ）白血病の早期段階で屠殺された異種移植Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウス（ｎ＝３／群）のＢＭ由来のＭＥＣ１  Ｂ細胞及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ前注入細胞におけるＣＣＬ２、ＣＥＢＰＢ、ＣＲ２、ＩＬ１０、ＩＬ２３Ｒ、ＡＤＡＭ１０、ＰＴＥＮ、ＲＮＡＳＥＴ２の相対的なｍＲＮＡ発現。発現はβ−アクチンレベルに規格化された。データは平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝３／群）。（Ｃ）１８人のＣＬＬ患者及び４人の健康なドナーから新鮮な末梢血試料を採取した。単球は、ＩＣＡＭ１の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ１４＋単球をＣＤ１４＋＋ ＣＤ１６−古典的単球、ＣＤ１４＋＋ ＣＤ１６＋中間型単球及びＣＤ１４＋ ＣＤ１６＋＋非古典的単球に細分した。ＣＤ１４についてゲートした単球集団に対するＩＣＡＭ１＋細胞の相対寄与の平均値±ＳＤをグラフに示す。（Ｄ−Ｅ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、−１日目から開始して３／４日ごとに、ＩＣＡＭ１遮断ｍｏＡｂクローンＹＮ１／１．７．４を２ｍｇ／Ｋｇ静脈内（ｉ．ｖ）注入して事前処置し（ｎ＝３、白い三角形）、又は未処置のまま放置し（ｎ＝３、黒丸）、フローサイトメトリーにより分析した（Ｄ）。ＰＢにおけるヒトＣＤ１９＋細胞の割合及びＢＭ、ＳＰ、及びＰＥにおけるヒトＣＤ１９＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｅ）。統計解析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。
【図１１】マクロファージ標的化による白血病細胞に誘導される細胞死の機序（Ａ）左：ＭＥＣ１細胞を、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐの濃度を増加させて（１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ）、ＰＢＳリポソーム（ｖ、１０００μＭ）とともに９６穴プレートに単独で蒔き（ｃ）、２４、４８及び７２時間後に発光アッセイを実施して、ＭＥＣ１細胞の薬物に対する感受性を評価した。右：ＭＥＣ１細胞を抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ  ＲＧ７１５５（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７  ＩｇＧ１アイソタイプ）（１〜１０μｇ／ｍｌ）とともに９６穴プレートに単独で蒔き（ｃ）、４８及び７２時間後に発光アッセイを実施して、ＭＥＣ１細胞の薬物に対する感受性を評価した。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｖｏ白血病細胞死のＴＮＦ依存性マクロファージ媒介性機序（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、−１日目から開始して３日ごとにｃｌｏｄｒｏｌｉｐを２００μｌ静脈内（ｉ．ｖ）注入して事前処置し（ｎ＝４、白丸）、又は処置せず（ｎ＝３、黒丸）、フローサイトメトリーにより分析した（Ａ）。ＳＰ、ＢＭ、ＰＢ、ＰＥにおけるヒトＣＤ１９＋細胞の割合の平均値をグラフに示す（Ｂ）。ＰＢにおいてＣＤ４５についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ＋細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す（Ｃ）。ＳＰ、ＢＭ、ＰＥ（Ｄ）、及びＰＢ（Ｅ）においてＣＤ４５＋についてゲートされたＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋細胞の絶対数又は割合の平均値をグラフに示す。ＳＰ、ＢＭ、ＰＥ（Ｆ）においてｈＣＤ１９＋細胞についてゲートされたＡｎｎ＋ ＰＩ＋細胞の相対寄与の平均値、及びＰＢ（Ｇ）においてｈＣＤ１９＋細胞についてゲートされたＡｎｎ−ＰＩ＋細胞の相対寄与の平均値をグラフに示す。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１．（Ｈ−Ｉ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、未処置のまま放置し（ｎ＝６、黒丸）、又は６０μｌのｃｌｏｄｒｏｌｉｐを静脈内（ｉ．ｖ）注入して処置し（＋１１日目、＋２５日目）（ｎ＝４、白丸）、又は６０μｌのｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（＋１１日目、＋２５日目）＋１０ｍｇ／Ｋｇのエタネルセプト（腹腔内（ｉ．ｐ．）、＋１０，＋１２，＋１５，＋１８，＋２１，＋２４日目）で処置し（ｎ＝６、赤い三角形）、２６日目に屠殺した（Ｈ）。ＢＭにおけるヒトＣＤ１９＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｄ）。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１．（Ｊ−Ｋ）静脈内に（ｉ．ｖ．）ＭＥＣ１を曝露した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、未処置のまま放置し（ｎ＝５、黒丸）、又は３０ｍｇ／ＫｇのＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内（ｉ．ｖ）注入して処置し（＋１１日目、＋２５日目）（ｎ＝７、白丸）、又は３０ｍｇ／ＫｇのＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ（＋１１日目、＋２５日目）＋１０ｍｇ／Ｋｇのエタネルセプト（腹腔内（ｉ．ｐ．）、＋１０，＋１２，＋１５，＋１８，＋２１，＋２４日目）で処置し（ｎ＝６、赤い三角形）、２９日目に死滅させた（Ｊ）。ＳＰにおけるヒトＣＤ１９＋細胞の絶対数の平均値をグラフに示す（Ｋ）。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５．
【図１３】ヒトにおける単球／マクロファージ及び白血病細胞（Ｇ）抗ＣＤ２０  ｍｏＡｂ  ＧＡ１０１を１０μｇ／ｍｌ、抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ  ＲＧ７１５５（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７  ＩｇＧ１アイソタイプ（１〜１０μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２０  ｍｏＡｂ  ＧＡ１０１１０μｇ／ｍｌ＋抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ  ＲＧ７１５５（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７  ＩｇＧ１アイソタイプ）（１〜１０μｇ／ｍｌ）による４８時間後のｈＣＤ１９＋ ＣＤ５＋（黒丸）及びｈＣＤ１４＋（白丸）の枯渇（ｎ＝４）を次式により算出した：１００−％残存細胞、ここで％残存細胞＝（処置試料における絶対数／未処置試料における絶対数）×１００。水平方向の棒は、スチューデントｔ検定の平均値（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）を表す。
【図１４】ＣＬＬ患者由来の初代白血病細胞に対するｃｌｏｄｒｏｌｉｐによって誘導された細胞死の機序（図１３に関連する）。（Ａ）６穴プレートに単独で（Ｃ、黒い棒）又は１０００μＭのｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（Ｃｌｏ、白い棒）とともに２４時間で（３回）蒔かれた、ＣＬＬ患者のＰＢＭＣからのネガティブ選択によって精製したヒト初代ＣＬＬ細胞におけるＦＡＳの相対的ｍＲＮＡ発現（ｎ＝３、Ｐｔ＃２４〜２６）。発現はβ−アクチンレベルに規格化された。データは平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝３／群）。統計学的に有意な差はスチューデントｔ検定を用いて計算された。＊ｐ＜０．０５．（Ｂ）６穴プレートに単独で（Ｃ、黒い棒）又は１０００μＭのｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（Ｃｌｏ、白い棒）とともに２４時間で（３回）蒔かれた、１人のＣＬＬ患者のＰＢＭＣからのネガティブ選択によって精製したヒト初代ＣＬＬ細胞におけるＴＮＦＲ１、ＦＡＤＤ、ＢＩＤ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の相対的ｍＲＮＡ発現。発現はβ−アクチンレベルに規格化された。データは平均値±ＳＤとして示される（ｎ＝３／群）。統計学的に有意な差はスチューデントｔ検定を用いて計算された。＊ｐ＜０．０５．（Ｃ）エタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）を含み（黒い棒）又は含まずに（白い棒）、１００μＭ、５００μＭ、１０００μＭのｃｌｏｄｒｏｌｉｐにより２４時間処置後のｈＣＤ１９＋ ＣＤ５＋枯渇（ｎ＝３）を次式により算出した：１００−％残存細胞、ここで％残存細胞＝（処置試料における絶対数／未処置試料における絶対数）×１００。＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。（Ｄ）遮断ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｍｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を含み（黒い棒）又は含まずに（白い棒）、１０００μＭのｃｌｏｄｒｏｌｉｐにより２４時間処置後のｈＣＤ１９＋ ＣＤ５＋枯渇（ｎ＝３）を次式により算出した：１００−％残存細胞、ここで％残存細胞＝（処置試料における絶対数／未処置試料における絶対数）×１００。＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
多くの腫瘍は、マクロファージを含む、顕著な免疫細胞浸潤物によって特徴付けられる。当初は、免疫細胞は、腫瘍に対する防御機構の一部であると考えられたが、最近のデータは、マクロファージを含む幾つかの免疫細胞集団は、実際には、腫瘍の進行を促進し得るという考えを支持している。マクロファージはその可塑性によって特徴付けられる。サイトカインの微小環境に応じて、マクロファージはいわゆるＭ１又はＭ２サブタイプを呈することができる。Ｍ２マクロファージは、腫瘍免疫の抑制に関与している。Ｍ２マクロファージは、増殖を援助するために腫瘍によって取り込まれる血管新生及び組織リモデリングといった組織修復機能にも重要な役割を果たしている。腫瘍を促進するＭ２マクロファージとは対照的に、Ｍ１マクロファージは、炎症性サイトカインの分泌及びそれらの抗原提示及び食作用への関与を介して抗腫瘍活性を呈する（Mantovani, A. et al., Curr. Opin. Immunol. 2 (2010) 231-237）。
【００３８】
コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）及びＩＬ−１０などの様々なサイトカインを分泌することにより、腫瘍細胞は、マクロファージを動員して、Ｍ２−サブタイプに成形することができるが、一方、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−γなどのサイトカインは、Ｍ１サブタイプにマクロファージをプログラムする。免疫組織化学を使用して、ＣＤ６８とＣＤ１６３を共発現するマクロファージ部分母集団（Ｍ２マクロファージについて濃縮され得る）と、ＣＤ６８＋／ＭＨＣ ＩＩ＋、又はＣＤ６８＋／ＣＤ８０＋免疫表現型を示すサブセット（Ｍ１マクロファージを含み得る）とを区別することが可能である。ＣＤ６８及びＣＤ１６３陽性マクロファージの細胞の形状、大きさ、及び空間分布は、例えば腫瘍と交差する基質及び重要な腫瘍領域におけるその優先的位置により、Ｍ２マクロファージの腫瘍を促進する役割に関する既文献の仮説と一致している。対照的に、ＣＤ６８＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋マクロファージは、遍在的に見られる。食作用におけるそれらの仮説的役割は、ＣＤ６８＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋のクラスターにより反映されるが、アポトーシス細胞及び壊死腫瘍領域に近いＣＤ１６３−免疫表現型には反映されない。
【００３９】
種々のマクロファージ部分母集団のサブタイプ及びマーカー発現は、それらの機能状態にリンクしている。Ｍ２マクロファージは腫瘍発生を：
ａ）ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦといった血管新生因子の分泌により血管新生を増進すること
ｂ）腫瘍細胞を血流に導き、転移性ニッチを構築するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、増殖因子及び遊走因子の分泌を介して転移形成を支援すること（Wyckoff, J. et al., Cancer Res. 67 (2007) 2649-2656）
ｃ）ＩＬ−４、Ｉｌ−１３、ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１０といった免疫抑制的サイトカインを分泌することにより免疫抑制的環境の構築に参画し、これにより制御性Ｔ細胞機能を調節すること
により支援することができる。反対に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、前臨床モデルにおいて腫瘍促進マクロファージの活性を増強することが示されている（Mantovani, A. et al., Eur. J. Cancer 40 (2004) 1660-1667; DeNardo, D. et al., Cancer Cell 16 (2009) 91-102）。
【００４０】
従って、複数の種類のがん（乳がん、卵巣がん、ホジキンリンパ腫など）では、Ｍ２サブタイプの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、予後不良に関連付けられている（Bingle, L. et al., J. Pathol. 3 (2002) 254-265; Orre, M., and Rogers, P.A., Gynecol. Oncol. 1 (1999) 47-50; Steidl, C. et al., N. Engl. J. Med. 10 2010 - 875 -885）。最近のデータは、腫瘍におけるＣＤ１６３陽性マクロファージ浸潤と腫瘍悪性度の相関を示している（Kawamura, K. et al., Pathol. Int. 59 (2009) 300-305）。患者の腫瘍から単離されたＴＡＭは、耐性表現型を有し、腫瘍細胞に対して細胞傷害性ではなかった（Mantovani, A. et al., Eur. J. Cancer 40 (2004) 1660-1667)。しかしながら、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下におけるＴＡＭの浸潤は、非小細胞肺がんにおける生存率の改善と相関し、従ってこの腫瘍型において更に顕著なＭ１マクロファージ浸潤を反映している（Kawai, O. et al., Cancer 6 (2008) 1387-1395）。
【００４１】
最近、マクロファージ及びＣＤ４陽性Ｔ細胞を多く含むが、含まれる細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の数は少ないいわゆる免疫シグネチャーが、乳がん患者における全生存（ＯＳ）の低下と相関し、独立の予後予測因子を表すことが示された（DeNardo, D. et al., Cancer Discovery 1 (2011) 54-67）。
【００４２】
Ｍ２マクロファージの腫瘍形成亢進機能を活発化するうえでのＣＳＦ−１の役割と一致して、希少肉腫又は局所侵襲性の結合組織腫瘍、例えばＣＳＦ−１遺伝子の転位置に一部起因する腱滑膜（Ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ）巨細胞腫（ＴＧＣＴ）及び色素性結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）における高いＣＳＦ−１発現は、ＣＳＦ−１の受容体、すなわち腫瘤の大部分を形成する腫瘍コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）を発現する単球及びマクロファージの蓄積に繋がる（West, R.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 (2006) 690-695）。これら腫瘍は、続いて遺伝子発現プロファイリングによりＣＳＦ−１依存性マクロファージシグネチャーを定義するために使用された。乳がん及び平滑筋肉腫患者の腫瘍において、このＣＳＦ−１応答遺伝子シグネチャーは、予後不良を予測する（Espinosa, I. et al., Am. J. Pathol. 6 (2009) 2347-2356; Beck, A. et al., Clin. Cancer Res. 3 (2009) 778-787）。
【００４３】
ＣＳＦ−１Ｒは、受容体チロシンキナーゼのクラスＩＩＩサブファミリーに属し、ｃ−ｆｍｓがん原遺伝子によりコードされる。ＣＳＦ−１又はＩＬ−３４の結合は、受容体の二量体化を誘導し、続いて下流のシグナル伝達カスケードの自己リン酸化及び活性化を誘導する。ＣＳＦ−１Ｒの活性化は、単球及びマクロファージの生存、増殖及び分化を調節する（Xiong, Y. et al., J. Biol. Chem. 286 (2011) 952-960）。
【００４４】
マクロファージと同じ造血性前駆体から得られる単球系統の細胞及び破骨細胞に加えて、ＣＳＦ−１Ｒ／ｃ−ｆｍｓは、複数のヒト上皮がん、例えば卵巣がん及び乳がんにより、平滑筋肉腫及びＴＧＣＴ／ＰＶＮＳに、マクロファージと比較して低い発現レベルであるものの、発現されることも分かっている。ＴＧＣＴ／ＰＶＮＳの場合、卵巣がん患者の血清及び腹水中におけるＣＳＦ−１、ＣＳＦ−１Ｒのリガンドのレベルの上昇が予後の不良に相関していた（Scholl, S. et al., Br. J. Cancer 62 (1994) 342-346; Price, F. et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 168 (1993) 520-527）。更に、ＣＳＦ  １Ｒの構造的に活性の変異型は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換することができ、これはがん遺伝子の特性の一つである（Chambers, S., Future Oncol 5 (2009) 1429-1440）。
【００４５】
前臨床モデルにより、腫瘍学の標的としてＣＳＦ−１Ｒのバリデーションが行われる。ＣＳＦ−１並びにＣＳＦ−１Ｒの活性の遮断により、ＴＡＭの動員が減少する。化学療法は腫瘍細胞におけるＣＳＦ−１の発現を増大させ、ＴＡＭ動員の強化に繋がる。パクリタキセルと組み合わせたＣＳＦ−１Ｒの遮断は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、自然発生乳がんの遺伝子組換えモデルにおける転移性負荷と腫瘍増殖の低減に繋がった。（DeNardo, D. et al., Cancer Discovery 1 (2011) 54-67）。
【００４６】
ヒトＣＳＦ−１Ｒ（ＣＳＦ−１受容体；同義語：Ｍ−ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、Ｆｍｓプロトオンコジーン、ｃ−ｆｍｓ、配列番号２２）は１９８６年から知られている（Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280）。ＣＳＦ−１Ｒは増殖因子であり、ｃ−ｆｍｓがん原遺伝子によってコードされる（例えば、Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-167に概説される）。
【００４７】
ＣＳＦ−１Ｒは、ＣＳＦ−１ＲリガンドＣＳＦ−１（マクロファージコロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦとも呼ばれる）（配列番号８６）及びＩＬ−３４（配列番号８７）の受容体であり、これらサイトカインの生物学的効果を媒介する（Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676; Lin, H., et al., Science 320 (2008) 807-811）。コロニー刺激因子−１受容体（ｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552に初めて記載された。この文献において、ＣＳＦ−１Ｒが、Ｃｂｌに結合することにより受容体の下方制御を調節する抑制性のチロシン９６９リン酸化の欠損を含むタンパク質のＣ末端鎖における変化に依存する変換能を有することが示された（Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628）。
【００４８】
ＣＳＦ−１Ｒは、一本鎖の膜貫通型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫを含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフのファミリーのメンバーであり、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における５つの反復Ｉｇ様サブドメインＤ１〜Ｄ５によって特徴付けられる（Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359）。ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ−１Ｒ−ＥＣＤ）（配列番号６４）は、５つ全ての細胞外Ｉｇ様サブドメインＤ１〜Ｄ５を含む。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４（配列番号６４）は、細胞外Ｉｇ様サブドメインＤ１〜Ｄ３及びＤ５を含むが、Ｄ４サブドメインを欠いている。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ１〜Ｄ３（配列番号６６）は、それぞれのサブドメインＤ１〜Ｄ３を含む。配列はシグナルペプチドなしで列挙される：ＭＧＳＧＰＧＶＬＬＬ  ＬＬＶＡＴＡＷＨＧＱ  Ｇ（配列番号６７）。ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片Ｄ４〜Ｄ３（配列番号８５）は、それぞれのサブドメインＤ４〜Ｄ３を含む。
【００４９】
現在、ＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインに結合する２つのＣＳＦ−１Ｒリガンドが知られている。そのうち第１のリガンドは、ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子１、Ｍ−ＣＳＦとも呼ばれる、マクロファージ；ヒトＣＳＦ−１、配列番号８６）であり、ジスルフィドに結合したホモダイマーとして細胞外に見出される（Stanley, E.R. et al., Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159; Stanley, E.R. et al., Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24）。第２のリガンドは、ＩＬ−３４（ヒトＩＬ−３４；配列番号８７）（Hume, D. A. , et al, Blood 119 (2012) 1810-1820）である。従って、一実施態様では、用語「ＣＳＦ−１Ｒリガンド」はヒトＣＳＦ−１（配列番号８６）及び／又はヒトＩＬ−３４（配列番号８７）を指す。
【００５０】
実験のために、ヒトＣＳＦ−１の活性１４９アミノ酸（ａａ）断片（配列番号８６のａａ３３〜１８１）が使用される。ヒトＣＳＦ−１のこの活性の１４９ａａ断片（配列番号８６のａａ３３−１８１）は、ＣＳＦ−１の３つの主要形態全てに含まれており、ＣＳＦ−１Ｒへの結合を媒介するために十分である（Hume, D. A. , et al, Blood 119 (2012) 1810-1820）。
【００５１】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、マクロファージ系統（破骨細胞を含む）への、造血性前駆体細胞の分化、増殖、遊走、及び生存である。ＣＳＦ−１Ｒの活性化は、そのＣＳＦ−１ＲリガンドであるＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３４により媒介される。ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）のＣＳＦ−１Ｒに対する結合は、チロシンリン酸化によるキナーゼの活性化及びホモ二量体の形成を誘導する（Li, W. et al, EMBO Journal.10 (1991) 277-288; Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 1997 - 4 -10）。
【００５２】
細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメインは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、幹細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｋｉｔ）及びｆｉｎｓ様サイトカイン受容体（ＦＬＴ３）を含む他の関連ＲＴＫクラスＩＩＩファミリーメンバー中にも存在する特殊な挿入ドメインにより中断される。増殖因子受容体のこのファミリーは構造的相同性を有するが、異なる組織特異的機能を有する。
【００５３】
ＣＳＦ−１Ｒは、単球系統の細胞上と、メスの生殖器系及び胎盤において主に発現される。加えて、ＣＳＦ−１Ｒの発現は、皮膚のランゲルハンス細胞、平滑筋細胞のサブセット（Inaba, T., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699）、Ｂ細胞（Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378）及びミクログリア（Sawada, M., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124）においても報告されている。変異ヒトＣＳＦ−１Ｒ（（配列番号２３）を有する細胞は、リガンド刺激とは無関係に増殖することが知られている。
【００５４】
本明細書で使用される「ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合」又は「ヒトＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合」又は「ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する」又は「抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８モル／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９モル／ｌ以下の結合親和性でヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に特異的結合する抗体に言及する。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ−ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。従って、本明細書で使用される「ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０−８モル／ｌ〜１．０ｘ１０−１３モル／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０−９モル／ｌ〜１．０ｘ１０−１３モル／ｌ）の結合親和性でヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００５５】
ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５としても知られ；配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ１１８３６を特徴とする）は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球に位置する約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である（Valentine, M.A. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568）。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られている、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンのスプライス境界により特徴づけられ、造血細胞及び非リンパ系組織の中に固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ−細胞の形質細胞への発生及び分化において役割を果たすＢ−リンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーはファミリーメンバーのクラスター内の１１ｑ１２に局在する。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする２つの転写変異体を生じる。
【００５６】
「ＣＤ２０」及び「ＣＤ２０抗原」という用語はここでは互換的に使用され、細胞により天然に発現されるか、又はＣＤ２０遺伝子を形質移入した細胞で発現されるヒトＣＤ２０の任意の変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含む。本発明の抗体のＣＤ２０抗原への結合は、ＣＤ２０の不活性化によるＣＤ２０発現細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現する細胞の死滅は、以下の機序の一又は複数により生じ得る：細胞死／アポトーシス誘導、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ。
【００５７】
当該技術分野で認識されているように、ＣＤ２０の同義語は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５、及びＬＦ５を含む。
【００５８】
本発明による用語「抗ＣＤ２０抗体」は、ＣＤ２０抗原に特異的に結合する抗体である。抗ＣＤ２０抗原への抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性に応じて、抗ＣＤ２０抗体の２つの型（Ｉ型及びＩＩ型抗ＣＤ２０抗体）がCragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052により区別され得る。表２を参照のこと。
2018525339.tif 000004
【００５９】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例は、例えば、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開第２００５／０４４８５９号に開示のキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号に開示）及びＡＴ８０  ＩｇＧ１を含む。典型的には、ＩｇＧ１アイソタイプのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、特徴的なＣＤＣ特性を示す。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのＩ型抗体と比較して減少したＣＤＣ（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）を有している。
【００６０】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例は、例えば、リツキシマブ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（国際公開第２００５／１０３０８１号に開示）、２Ｆ２  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号及び同第２００５／１０３０８１号に開示）及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０５６３１２号に開示）を含む。
【００６１】
「リツキシマブ」抗体（参照抗体；Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラヒトガンマ１マウス定常ドメイン含有モノクローナル抗体である。このキメラ抗体は、ヒトガンマ１定常ドメインを含み、１９９８年４月１７日に発行され、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に譲渡された米国特許第５７３６１３７号（Ａｎｄｅｒｓｏｎら）での「Ｃ２Ｂ８」という名称で特定される。リツキシマブは、再発性又は難治性の低悪性度又は濾胞性のＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療に対して承認されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用機序研究は、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈することを示している（Reff、M.E.、et. al.,Blood 83(1994)435-445）。加えて、リツキシマブは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて有意な活性を呈する。リツキシマブはアフコシル化されていない。
2018525339.tif 000005
【００６２】
本明細書で使用される「ヒトＣＤ２０に結合」又は「ヒトＣＤ２０に特異的に結合」又は「ヒトＣＤ２０に結合する」又は「抗ＣＤ２０抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８モル／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９モル／ｌ以下の結合親和性でヒトＣＤ２０抗原に特異的結合する抗体に言及する。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ−ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。従って、本明細書で使用される「ヒトＣＤ２０に結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０−８モル／ｌ〜１．０ｘ１０−１３モル／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０−９モル／ｌ〜１．０ｘ１０−１３モル／ｌ）の結合親和性でヒトＣＤ２０抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００６３】
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、以下からなる群より選択される；ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２  、及びｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１。
【００６４】
これらの抗体は、国際公開第２０１１／０７００２４号に記載されており、本明細書に記載のように以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とする。
2018525339.tif 000006
【００６５】
一つの好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７（ＶＨ、配列番号３９；ＶＬ、配列番号４０）である。
【００６６】
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＤ２０に結合する抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【００６７】
用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとのキメラ化及びその後のヒト化によって、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139参照）から得られた、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されているようなヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指す（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号参照）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号で詳細に開示されている。
【００６８】
一実施態様において、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号６９から配列番号７５の群から選択される重鎖の可変領域（ＶＨ）を有する（国際公開第２００５／０４４８５９及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１及びＢ−ＨＬ１３）。一実施態様では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号７６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）を有する（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）。
【００６９】
これらの抗体は、本明細書に記載のように以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とする。
2018525339.tif 000007
【００７０】
一つの好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＤ２０に結合する抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６／Ｂ−ＫＶ１（配列番号７１の重鎖の可変領域（ＶＨ）（Ｂ−ＨＨ６）及び配列番号７６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）（Ｂ−ＫＶ１）を含む）から選択される。
【００７１】
更に一実施態様では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体である。
【００７２】
本発明によれば、そのようなアフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、 Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号に記載の手順に従って、Ｆｃ領域において糖鎖操作（ＧＥ）されている。一実施態様では、アフコシル化糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１はＢ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥである。このような糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有しており、好ましくは、フコース残基のレベルが低下している。一実施態様では、フコースの量はＡｓｎ２９７においてオリゴ糖の総量の６０％以下である（フコースの量は、一実施態様では４０％から６０％であり、別の実施態様では５０％以下であり、更に別の実施態様では３０％以下である）。別の実施態様では、Ｆｃ領域のオリゴ糖は好ましくは二分されている。こうした糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は増加したＡＤＣＣを有している。
【００７３】
一つの好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＤ２０に結合する抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６／Ｂ−ＫＶ１（配列番号７１の重鎖の可変領域（ＶＨ）（Ｂ−ＨＨ６）及び配列番号７６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）（Ｂ−ＫＶ１）を含む）から選択され、かつＦｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量は、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％である。
【００７４】
本発明によるアフコシル化抗ＣＤ２０抗体は、フコースを低減させていない抗ＣＤ２０抗体とは異なり、増加した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有している。
【００７５】
「増加した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有するアフコシル化抗ＣＤ２０抗体」は、該用語がここで定義されるように、当業者に周知の任意の適切な方法により決定される増加したＡＤＣＣを有するアフコシル化抗ＣＤ２０抗体を意味する。一つの許容されるｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイは、次の通りである：
１）該アッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する；
２）該アッセイは、エフェクター細胞として、無作為に選択された健常なドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）該アッセイは、次のプロトコールに従って実施される：
ｉ）標準的な密度遠心分離手順を使用してＰＢＭＣを単離し、５ｘ１０６細胞／ｍｌでＲＰＭＩ細胞培養培地に懸濁させる；
ｉｉ）標準的な組織培養法により標的細胞を増殖させ、生存率が９０％を越える指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で二回洗浄し、１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地に再懸濁させる；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記最終的な標的細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、細胞培地において４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌへ連続的に希釈し、得られた抗体溶液５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレートの標的細胞に加え、上記全濃度範囲をカバーする種々の抗体濃度を三重に試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールに対して、標識された標的細胞を含むプレート中の更なる３つのウェルに、抗体溶液（上記のｉｖ項）に代えて、５０マイクロリットルの非イオン性洗浄剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）の２％（ＶＮ）水溶液を添加する；
ｖｉ）自然放出（ＳＰ）コントロールに対して、標識された標的細胞を含むプレート中の更なる３つのウェルに、抗体溶液（上記のｉｖ項）に代えて、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を添加する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを５０ｘｇで１分間遠心分離し、１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）エフェクター：標的細胞の比率が２５：１となるように各ウェルに５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記のｉ項）を添加して、該プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４時間インキュベーター内に配置する；
ｉｘ）各ウェルから無細胞の上清を回収し、ガンマカウンターを使用して、実験的に放出された放射能（ＥＲ）を定量する；
ｘ）特異的溶解の百分率を、各抗体濃度について、式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００［式中、ＥＲはその抗体濃度について定量された平均放射活性（上記ｉｘ項参照）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記Ｖ項参照）について定量された平均放射活性（上記ｉｘ項参照）であり、ＳＲはＳＲコントロール（上記ｖｉ項参照）について定量された平均放射活性（上記ｉｘ項参照）である］に従って計算する。
４）「増加したＡＤＣＣ」は、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大百分率の増加、及び／又は上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大百分率の半分を達成するのに必要な抗体濃度の低下の何れかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、上記アッセイで測定され、当該技術分野において当業者に知られている同じ標準的な生産、精製、製剤化及び保存の方法を使用して同じ型の宿主細胞により産生された同じ抗体によって媒介されるものであるがＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞により産生されたものではないＡＤＣＣと比較したものである。
【００７６】
前記「増加したＡＤＣＣ」は前記抗体の糖鎖操作により得ることができ、これは、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び米国特許第６６０２６８４号に記載されているように、そのオリゴ糖成分を操作することによりモノクローナル抗体の前記の天然の細胞媒介性エフェクター機能を亢進させることを意味する。
【００７７】
用語「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」は、補体存在下での本発明の抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解を意味する。ＣＤＣは、好ましくは、補体の存在下での本発明の抗ＣＤ２０抗体を用いたＣＤ２０発現細胞の調製物の処理により測定される。ＣＤＣは、抗体が、１００ｎＭの濃度で４時間後に２０％以上の腫瘍細胞の溶解（細胞死）を誘導する場合に見出される。該アッセイは好ましくは、５１Ｃｒ又はＥｕ標識腫瘍細胞で、放出された５１Ｃｒ又はＥｕの測定により実施される。コントロールは、補体を含むが抗体を含まない腫瘍標的細胞のインキュベーションを含む。
【００７８】
用語「アフコシル化抗体」は、減少したレベルのフコース残基を有するＡｓｎ２９７においてＦｃ領域内の改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体を指す。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化二分岐複合型オリゴ糖グリコシル化としてＡｓｎ２９７で生じ、２個までのＧａｌ残基で終結する。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α１，６又はα１，３）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207に記載されている。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞中で組換え的に発現される抗体は、通常、少なくとも８５％の量がＡｓｎ２９７においてフコシル化されている。本明細書で使用されるアフコシル化抗体という用語は、そのグリコシル化パターンにフコースを有さない抗体を含むものと理解されたい。抗体中の典型的なグリコシル化残基位置はＥＵ番号付けシステムによる２９７位のアスパラギン（「Ａｓｎ２９７」）であることが一般に知られている。
【００７９】
「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、通常、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を指す場合に使用される（例えば、出典明示により本明細書に援用されるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)で報告されたＥＵインデックス）。
【００８０】
よって、本発明のアフコシル化抗体は、Ａｓｎ２９７においてフコースの量がオリゴ糖（糖類）の総量の６０％以下である（これはＡｓｎ２９７においてＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも４０％以上がアフコシル化されていることを意味する）ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体を意味する。一実施態様では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７においてＦｃ領域のオリゴ糖の４０％から６０％である。別の実施態様では、フコースの量はＡｓｎ２９７においてＦｃ領域のオリゴ糖の５０％以下であり、更に別の実施態様では３０％以下である。本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定され、平均値として算出される、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖（糖類）（例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物及び高マンノース構造物）の合計に対するＡｓｎ２９７におけるオリゴ糖（糖類）鎖内の前記オリゴ糖（フコース）の量を意味する（フコースの量を決定する詳しい手順については、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号を参照のこと）。更に、一実施態様ではＦｃ領域のオリゴ糖は二分されている。本発明によるアフコシル化抗体は、Ｆｃ領域におけるオリゴ糖を部分的にフコシル化するのに十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一の核酸を発現するように操作された糖修飾宿主細胞において発現させることができる。一実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。或いは、米国特許第６９４６２９２号に従って宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を低下させるか又は消失させて、糖修飾した宿主細胞を産生させることもできる。抗体フコシル化の量は、例えば発酵条件（例えば発酵時間）によって、又は異なったフコシル化量の少なくとも２種の抗体を組み合わせることによって、予め決定することができる。このようなアフコシル化抗体及び各糖鎖工学法は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号、国際公開第２０００／０６１７３９号に記載されている。こうした糖鎖操作抗体は増加したＡＤＤＣを有している。本発明によるアフコシル化抗体を生じせしめる他の糖鎖工学法は、例えばNiwa, R.. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem, 278 (2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号又は米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に記載されている。
【００８１】
従って、本発明の一態様は、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒ抗体と併用でのがんの治療のための、Ａｓｎ２９７においてオリゴ糖（糖類）の総量の６０％以下のフコース量を有する、ＣＤ２０に特異的に結合するＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体である。本発明の別の態様は、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒ抗体と併用でのがんの治療用医薬の製造のための、Ａｓｎ２９７においてオリゴ糖（糖類）の総量の６０％以下のフコース量を有する、ＣＤ２０に特異的に結合するＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体の使用である。一実施態様では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７においてオリゴ糖（糖類）の総量の６０％から２０％である。一実施態様では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７においてオリゴ糖（糖類）の総量の６０％から４０％である。一実施態様では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７においてオリゴ糖（糖類）の総量の０％である。
【００８２】
本発明の一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；かつ
当該併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。
【００８３】
一実施態様では、当該併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
及び
当該併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。
【００８４】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるヒトＣＳＦ−１Ｒ又はＣＤ２０のタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を通常有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者との結合は失われるが、後者との結合は失われない点において区別される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」（軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインの対の各々を意味する。可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート高次構造をとり、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりその三次元構造に保持され、もう一方の鎖に由来するＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、それ故、本発明の更なる目的を提供する。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書で定義している超可変可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を定義する。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８８】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシアルファ−アミノ酸の群を意味する。
【００８９】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知であり、抗体のパパイン切断に基づいて定められる用語である。抗体又は免疫グロブリンは、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのクラスに分類され、これらのうち幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分類されることがある。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）並びにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分に規定された結合部位により引き起こされる。そのような結合部位は当該技術分野で既知であり、例えば、Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R.及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0 307 434に記載されている。そのような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ＡのＥＵインデックスに従い番号付け、下記参照）である。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、補体活性化並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、一方ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００９０】
一実施態様において、本発明による抗体はヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の他の全ての部分を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスの変異Ｆｃ部分（一実施態様ではＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラスの変異Ｆｃ部分（一実施態様ではＳ２２８Ｐに変異を有する）の何れかであるＦｃ部分を指す。好ましい一実施態様では、ヒト重鎖定常領域は配列番号５８（ヒトＩｇＧ１サブクラス）であり、別の好ましい実施態様ではヒト重鎖定常領域は配列番号５９（変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス）であり、別の好ましい実施態様ではヒト重鎖定常領域は配列番号６０（ヒトＩｇＧ４サブクラス）であり、別の好ましい実施態様ではヒト重鎖定常領域は配列番号６１（変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラス）である。一実施態様では、前記抗体は、低下した又は最少のエフェクター機能を有する。一実施態様では、最少のエフェクター機能は、エフェクターレス（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ）Ｆｃ変異に起因する。一実施態様では、エフェクターレスＦｃ変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。一実施態様では、エフェクターレスＦｃ変異は、抗体の各々について、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ及びＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む（からなる）群から互いに独立して選択される。
【００９１】
一実施態様では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧクラスの（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスの）抗体である。
【００９２】
好ましい一実施態様では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体である。一実施態様では、本明細書に記載されるのは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様では、本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体である。
【００９３】
一実施態様では、本明細書に記載の抗体は、定常鎖がヒト起源のものであることを特徴とする。そのような定常鎖は、当該技術分野でよく知られており、例えばＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．により記載されている（例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号５７のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００９４】
本発明は、患者に対して治療的有効量の本発明による抗体を投与することを特徴とする、治療法を必要とする患者の治療のための方法を含む。
【００９５】
本発明は、記載される治療法のための、本発明による抗体の使用を含む。
【００９６】
本発明の好ましい一実施態様は、「ＣＳＦ−１Ｒ媒介性疾患」の治療における使用のための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体、又は「ＣＳＦ−１Ｒ媒介性疾患」の治療における医薬の製造のための使用のための本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体であり、これについて以下に記載することができる：
【００９７】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達が腫瘍増殖及び転移に関与していると思われる３つの異なる機序が存在する。１つ目は、ＣＳＦリガンド及び受容体の発現が、メスの生殖器系（乳房、卵巣、子宮内膜、子宮頸部）に発生する腫瘍細胞に見られたことであり（Scholl, S.M., et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 120-126; Kacinski, B.M., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 71-74; Ngan, H.Y., et al., Eur. J. Cancer 35 (1999) 1546-1550; Kirma, N., et al., Cancer Res 67 (2007) 1918-1926）、この発現は、乳がんの異種移植片の増殖並びに乳がん患者の予後不良と関連付けられた。２つの点突然変異が、ある研究において試験された約１０〜２０％の急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病及び脊髄形成異常症患者のＣＳＦ−１Ｒに見られ、変異の１つは受容体の代謝回転を妨害することが見出された（Ridge, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87 (1990) 1377-1380）。しかしながら、その後の研究で変異の発生は確認されなかった（Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470）。変異は、肝細胞がん（Yang, D.H., et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3 (2004) 86-89）及び特発性脊髄線維症（Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 2003 - 464 -470）の幾つかの症例でも見出された。最近、骨髄単芽球性白血病患者に由来するＧＤＭ−１細胞株において、ＣＳＦ−１ＲにおけるＹ５７１Ｄ変異が同定された（Chase, A., et al., Leukemia 23 (2009) 358-364）。
【００９８】
２つ目の機序は、破骨細胞形成、骨吸収及び骨溶解性骨病変を誘発する、骨の転移部位のＭ−ＣＳＦ／ＣＳＦ−１Ｒによるシグナル伝達の遮断に基づいている。乳がん、多発性骨髄腫及び肺がんは、骨に転移して骨溶解性骨疾患を引き起こし、骨格の合併症を招くことが分かっているがんの例である。腫瘍細胞及び間質によって放出されるＭ−ＣＳＦは、核内因子カッパ−Ｂリガンド−ＲＡＮＫＬの受容体活性化因子と共に、造血性骨髄単球前駆体の、成熟破骨細胞への分化を誘導する。この過程の間に、Ｍ−ＣＳＦは、破骨細胞に生存シグナルを与えることにより許容因子として作用する（Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 257-263）。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体による破骨細胞の分化及び成熟の間のＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害は、溶骨性疾患とそれに関連する転移性疾患の骨格関連事象とを引き起こす、破骨細胞の不均衡な活性を防ぐと思われる。乳がん、肺がん及び多発性骨髄腫が、典型的に溶骨性病変に繋がるのに対し、前立腺がんにおける骨への転移は、当初は造骨性の外観を有し、骨形成活性の増大により、正常な骨の典型的な層状組織とは異なる「線維性骨」を生じる。疾患の進行中、骨の病変は大量の溶骨性成分と骨吸収の高い血清レベルとを呈し、再吸収抑制療法が有用であることが示唆される。ビスホスホネートは、溶骨性病変の形成を阻害することが示されており、ホルモン不応性転移性前立腺がんを有する男性においてのみ骨格関連事象の数を減少させたが、この時点で造骨性病変に対するそれらの効果には議論の余地があり、ビスホスホネートは今日まで骨転移又はホルモン応答性前立腺がんの防止において有益にはなっていない。混合型溶骨性／造骨性前立腺がんにおける骨吸収抑制剤の効果は、臨床において依然として研究中である（Choueiri, M.B., et al., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 601-609; Vessella, R.L. and Corey, E., Clin. Cancer Res. 12 (20 Pt 2) (2006) 6285s-6290s）。
【００９９】
３つ目の機序は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん及び子宮頸がんの固形腫瘍に見出される腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が予後不良と相関しているという最近の知見に基づいている（Bingle, L., et al., J. Pathol. 196 (2002) 254-265; Pollard, J.W., Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 71-78）。マクロファージは、Ｍ−ＣＳＦ及び他のケモカインにより腫瘍に動員される。するとマクロファージは、血管新生因子、プロテアーゼ、並びに他の増殖因子及びサイトカインの分泌を介して腫瘍の進行に寄与することができ、ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害により遮断され得る。最近、Ｚｉｎｓらにより（Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）若しくはＭ−ＣＳＦのｓｉＲＮＡ、又はそれらの両方の発現が、それぞれのｓｉＲＮＡの腫瘍内注入後に、マウス異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を３４％から５０％低減することが示された。ヒトＳＷ６２０細胞により分泌されるＴＮＦアルファを標的とするｓｉＲＮＡは、マウスＭ−ＣＳＦレベルを低下させ、腫瘍内のマクロファージを減少させた。加えて、Ｍ−ＣＳＦに向けられた抗原結合断片によるＭＣＦ７腫瘍異種移植は、化学療法剤と組み合わせて施したとき、確かに４０％の腫瘍増殖を阻害し、化学療法剤に対する耐性を逆転させ、マウスの生存率を改善した（Paulus, P., et al., Cancer Res. 66 (2006) 4349-4356）。
【０１００】
ＴＡＭは、慢性炎症とがんの間の新たなリンクの一例にすぎない。多くの慢性疾患ががんのリスクの上昇と関連しており、がんは慢性炎症部位に生じ、炎症の化学伝達物質は多くのがんに見出されることから、炎症とがんの間のリンクの更なる証拠が存在し；炎症の細胞伝達物質又は化学伝達物質の欠失は実験的ながんの発生を阻害し、抗炎症剤の長期使用は幾つかのがんのリスクを低下させる。がんへのリンクは、多数の炎症状態について存在し、中でもヘリコバクターピロリは、胃がんにつながる胃炎、膀胱がんにつながる住血吸虫症、カポジ肉腫につながるＨＨＶＸ、卵巣がんにつながる子宮内膜症、及び前立腺がんにつながる前立腺炎を、それぞれ誘発した（Balkwill, F., et al., Cancer Cell 7 (2005) 211-217）。マクロファージは、慢性炎症において重要な細胞であり、それらの微小環境に様々に反応する。機能的状態の連続において両極と考えられる二つのマクロファージが存在する。Ｍ１マクロファージは１型の反応に関与している。これら反応には、微生物生成物による活性化とその結果として生じる病原性微生物の死が含まれ、これにより反応性の酸素中間体が生じる。両極の他端はＭ２マクロファージであり、これは、細胞増殖を促進し、炎症及び適応免疫を調整し、組織のリモデリング、血管新生及び修復を促進する２型の反応に関与している（Mantovani, A., et al., Trends Immunol. 25 (2004) 677-686）。確立された腫瘍形成に帰結する慢性炎症は、通常Ｍ２マクロファージに関連している。炎症反応を媒介する極めて重要なサイトカインはＴＮＦアルファであり、その名の通り高用量で抗腫瘍免疫及び出血性壊死を刺激することができるだけでなく、最近になって、腫瘍細胞により発現されて腫瘍プロモーターとして働くことが見出された（Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045; Balkwill, F., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 409-416）。腫瘍に対するマクロファージの特異的役割は、それらの機能及び特定の主要種類への関連性を含め、更なる解明が待たれている。
【０１０１】
従って、本発明の一実施態様は、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体と併用してがんの治療に使用するための、本明細書に記載されるＣＳＦ−１Ｒ抗体である。
【０１０２】
本発明の実施態様の詳細な説明
一実施態様では、本発明は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導することにおける使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関する。
【０１０３】
本明細書で使用される「リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症」は、リンパ腫又は白血病に罹患している／罹患した（ａｆｆｌｉｃｔｅｄ）患者の末梢血における循環白血病細胞の絶対的又は相対的な増加を指す。一実施態様では、リンパ球増加症は、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させる。一つの好ましい実施態様では、リンパ球増加症は、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させる（Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al. Response assessment in chronic lymphocytic leukemia treated with novel agents causing an increase of peripheral blood lymphocytes. Blood. Epub June 4, 2012も参照）。そのようなリンパ球増加症の例は、例えば下記に記載され、そこでは抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂの２回の投与（図６Ａ）は、有意なリンパ球増加（図６Ｂ）、浸潤した組織から末梢血（ＰＢ）への治療関連のコンパートメントシフトを誘導した。同様のリンパ球増加症は、ＢＣＲシグナル伝達を標的とする薬剤（例えば、イブルチニブ）によるＣＬＬ患者についても記載されているが（Byrd et al., N Engl J Med. 2013 Jul 4;369(1):32-42）、ＣＳＦ−１Ｒ標的薬剤についてはこれまでは見られなかった。
【０１０４】
更なる実施態様では、本発明は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用に関する。
【０１０５】
別の実施態様では、本発明は治療の方法に関し、該方法は、リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加を誘導するためのＣＳＦ−１Ｒに結合する有効量の抗体の投与を含むか、又はリンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加を誘導するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用を含む。
【０１０６】
本発明は更に、本明細書で先に記載される抗体、使用又は方法に関し、ここでリンパ球増加症は、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させる。更なる実施態様では、本発明は本明細書で先に記載される抗体、使用又は方法に関し、ここでリンパ球増加症は、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ１９抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする。
【０１０７】
本発明はまた、先の実施態様の何れかによる抗体、使用又は方法に関し、ここでリンパ球増加症は、ＣＤ２０を発現する循環白血病細胞を増加させ、特に、リンパ球増加症は、ＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする。
【０１０８】
別の実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体とＣＤ２０に結合する抗体との共投与を含む併用療法に関する。併用療法は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
に適用可能である。本発明の一実施態様では、細胞性免疫応答の刺激は、がんの治療中に生じる。
【０１０９】
一実施態様では、ｄ）に示すように細胞性免疫応答を刺激することは、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を刺激するか、又はマクロファージの活性を刺激することを包含する。
【０１１０】
前記併用療法を適用することは、がんに罹患している治療された個体におけるＣＳＦ−１Ｒに基づくがん療法を改善するために強力であることが示されている。本発明者らは、ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、がんを治療するためのＣＤ２０抗体の有効性を増強し、腫瘍の進行を遅延させ、又はがん、例えばリンパ腫又は白血病に罹患した患者の生存期間を延長することを見出した。がんの進行の遅延、並びにより長い全生存期間は、患者にとって大きな利益を表す。
【０１１１】
使用のための抗体
本発明の一態様は、本発明による併用療法における使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、又はＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関する。
【０１１２】
使用のための抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体
一実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関し、ここで該抗体は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
における使用のための、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法で投与される。
【０１１３】
一実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関し、ここで該抗体は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること
における使用のための、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法で投与される。
【０１１４】
一実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関し、ここで該抗体は、がんの治療における使用のための、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法で投与される。一実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体に関し、ここで該抗体は、がんに罹患している患者の生存期間を延長することにおける使用のための、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法で投与される。
【０１１５】
使用のための抗ＣＤ２０抗体
一実施態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合する抗体に関し、ここで該抗体は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
における使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法で投与される。本発明の一実施態様では、細胞性免疫応答の刺激は、がんの治療中に生じる。
【０１１６】
一実施態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合する抗体に関し、ここで該抗体は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること
における使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法で投与される。
【０１１７】
一実施態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合する抗体に関し、ここで該抗体は、がんの治療における使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法で投与される。一実施態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合する抗体に関し、ここで該抗体は、がんに罹患している患者の生存期間を延長することにおける使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法で投与される。
【０１１８】
治療の方法
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のための方法に関し、
ここで該方法は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量と、ＣＤ２０に結合する抗体の有効量とを、それを必要とする患者に投与する工程を含む。
【０１１９】
一実施態様では、本発明は
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること
のための方法に関し、
ここで該方法は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量と、ＣＤ２０に結合する抗体の有効量とを、それを必要とする患者に投与する工程を含む。
【０１２０】
一実施態様では、本発明はがんを治療するための方法に関し、ここで該方法は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量と、ＣＤ２０に結合する抗体の有効量とを、それを必要とする患者に投与する工程を含む。一実施態様では、本発明はがんに罹患している患者の生存期間を延長するための方法に関し、ここで該方法は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量と、ＣＤ２０に結合する抗体の有効量とを、それを必要とする患者に投与する工程を含む。
【０１２１】
医薬の製造のための抗体の使用
本発明の一態様は、本発明による併用療法における使用のための医薬の製造における使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、又はＣＤ２０に結合する抗体に関する。
【０１２２】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の使用
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用に関し、
ここで該抗体はＣＤ２０に結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１２３】
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること
のための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用に関し、
ここで該抗体は、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１２４】
一実施態様では、本発明は、がんを治療するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用に関し、ここで該抗体はＣＤ２０に結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。一実施態様では、本発明は、がんに罹患している患者の生存期間を延長するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用に関し、ここで該抗体はＣＤ２０に結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１２５】
抗ＣＤ２０抗体の使用
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のための医薬の製造のための、ＣＤ２０に結合する抗体の使用に関し、
ここで該抗体はＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１２６】
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること
のための医薬の製造のための、ＣＤ２０に結合する抗体の使用に関し、
ここで該抗体はＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１２７】
一実施態様では、本発明は、がんを治療するための医薬の製造のための、ＣＤ２０に結合する抗体の使用に関し、ここで該抗体はＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。一実施態様では、本発明は、がんに罹患している患者の生存期間を延長するための医薬の製造のための、ＣＤ２０に結合する抗体の使用に関し、ここで該抗体はＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１２８】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び抗ＣＤ２０抗体の使用
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体の使用に関する。
【０１２９】
一実施態様では、本発明は、
ａ）がんを治療すること、
ｂ）がんの進行を遅延させること、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長すること
のための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体の使用に関する。
【０１３０】
一実施態様では、本発明は、がんを治療するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体の使用に関し、ここで該抗体はＣＤ２０に結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。一実施態様では、本発明は、がんに罹患している患者の生存期間を延長するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体の使用に関し、ここで該抗体はＣＤ２０に結合する抗体との併用療法において投与するためのものである。
【０１３１】
製造品
本発明の一態様は、容器、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体又はＣＤ２０に結合する抗体を含む容器内の組成物、及び本発明による併用療法において、それぞれの抗体を投与することを、その組成物の使用者に指示する添付文書を含む製造品に関する。
【０１３２】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を含む製造品
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）
ａ）がんの治療において、
ｂ）がんの進行を遅延させるために、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のために、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、
ここでＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の投与は、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法においてである。
【０１３３】
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）
ａ）がんの治療において、
ｂ）がんの進行を遅延させるために、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、
ＣＤ２０に結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、
ここでＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の投与は、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法においてである。
【０１３４】
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）がんの治療において、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、ここでＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の投与は、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法においてである。一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、ここでＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の投与は、ＣＤ２０に結合する抗体との併用療法においてである。
【０１３５】
抗ＣＤ２０抗体を含む製造品
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＤ２０に結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）
ａ）がんの治療において、
ｂ）がんの進行を遅延させるために、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のために、ＣＤ２０に結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、
ここでＣＤ２０に結合する抗体の投与は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法においてである。
【０１３６】
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＤ２０に結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）
ａ）がんの治療において、
ｂ）がんの進行を遅延させるために、又は
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、
ＣＤ２０に結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、
ここでＣＤ２０に結合する抗体の投与は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法においてである。
【０１３７】
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＤ２０に結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）がんの治療において、ＣＤ２０に結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、ここでＣＤ２０に結合する抗体の投与は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法においてである。一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＤ２０に結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、ＣＤ２０に結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関し、ここでＰＤ−１に結合する抗体の投与は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体との併用療法においてである。
【０１３８】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び抗ＣＤ２０抗体を含む製造品
一実施態様では、本発明は、（ａ）容器、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｂ）容器、ＣＤ２０に結合する抗体を含む容器内の組成物、及び（ｃ）
ａ）がんの治療において、
ｂ）がんの進行を遅延させるために、
ｃ）がんに罹患している患者の生存期間を延長するために、又は
ｄ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激すること
のために、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体を患者に投与するように組成物の使用者に指示する添付文書に関する。
【０１３９】
薬学的組成物
一実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体を含み、各抗体が薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される薬学的組成物に関する。
【０１４０】
前記薬学的組成物の一実施態様では、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体は、別個に製剤化される。前記薬学的組成物の別の実施態様では、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びＣＤ２０に結合する抗体は、一緒に製剤化される。
【０１４１】
薬学的組成物の製造方法
一実施態様では、本発明は、（ａ）ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を薬学的に許容される担体と製剤化すること、及び（ｂ）ＣＤ２０に結合する抗体を薬学的に許容される担体と別個に製剤化することを含む、薬学的組成物の製造方法に関する。
【０１４２】
一実施態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体をＣＤ２０に結合する抗体と一緒に製剤化することを含む、薬学的組成物の製造方法に関する。
【０１４３】
上記実施態様で用いた特異的抗体
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、以下からなる群より選択される；ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２、及びｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１。
【０１４４】
これらの抗体は、国際公開第２０１１／０７００２４号に記載されており、本明細書に記載のように以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とする。
2018525339.tif 000008
【０１４５】
一つの好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７（ＶＨ、配列番号３９；ＶＬ、配列番号４０）である。
【０１４６】
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＤ２０に結合する抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【０１４７】
用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとのキメラ化及びその後のヒト化によって、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139を参照）から得られた、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されているようなヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指す（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号参照）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号で詳細に開示されている。
【０１４８】
一実施態様において、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号６９から配列番号７５の群から選択される重鎖の可変領域（ＶＨ）を有する（国際公開第２００５／０４４８５９及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１及びＢ−ＨＬ１３）。一実施態様では、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号７６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）を有する（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号のＢ−ＫＶ１）。
【０１４９】
これらの抗体は、本明細書に記載のように以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とする。
2018525339.tif 000009
【０１５０】
一つの好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＤ２０に結合する抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６／Ｂ−ＫＶ１（配列番号７１の重鎖の可変領域（ＶＨ）（Ｂ−ＨＨ６）及び配列番号７６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）（Ｂ−ＫＶ１）を含む）から選択される。
【０１５１】
更に一実施態様では、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体である。
【０１５２】
本発明によれば、そのようなアフコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第９９／１５４３４２号に記載の手順に従って、Ｆｃ領域において糖鎖操作（ＧＥ）されている。一実施態様では、アフコシル化糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１はＢ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥである。このような糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有しており、好ましくは、フコース残基のレベルが低下している。一実施態様では、フコースの量はＡｓｎ２９７においてオリゴ糖の総量の６０％以下である（フコースの量は、一実施態様では４０％から６０％であり、別の実施態様では５０％以下であり、更に別の実施態様では３０％以下である）。別の実施態様では、Ｆｃ領域のオリゴ糖は好ましくは二分されている。こうした糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は増加したＡＤＣＣを有している。
【０１５３】
一つの好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＤ２０に結合する抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＨＨ６／Ｂ−ＫＶ１（配列番号７１の重鎖の可変領域（ＶＨ）（Ｂ−ＨＨ６）及び配列番号７６の軽鎖の可変領域（ＶＬ）（Ｂ−ＫＶ１）を含む）から選択され、かつＦｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量は、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％である。
【０１５４】
本明細書で使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（任意の、上記がんの難治性型、又は上記がんの一又は複数の組み合わせを含む）であり得る。一つの好ましい実施態様では、がんはリンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病を指す。このようなリンパ腫及びリンパ性白血病は、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺性Ｂ細胞性リンパ腫を含む）、ｆ）ヘアリー細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病を含む。
【０１５５】
別の好ましい実施態様では、がんという用語は、がん細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す「ＣＤ２０発現がん」を指す。別の好ましい実施態様では、本明細書において使用される「ＣＤ２０発現がん」は好ましくは、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病を指す。このようなリンパ腫及びリンパ球性白血病は、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫及び非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺性Ｂ細胞性リンパ腫を含む）、ｆ）ヘアリー細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ｈ）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病を含む。
【０１５６】
別の好ましい実施態様では、ＣＤ２０発現がんはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の実施態様では、ＣＤ２０発現がんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、又は原発性中枢神経系リンパ腫である。
【０１５７】
一つの好ましい実施態様では、がん又はＣＤ２０発現がんはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。別の好ましい実施態様では、がん又はＣＤ２０発現がんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫である。一つの好ましい実施態様では、がん又はＣＤ２０発現がんはホジキン病である。
【０１５８】
関節リウマチ、乾癬性関節炎及び炎症性関節炎は、それらがマクロファージ成分及び様々な程度の骨破壊からなるという点で、それ自体がＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達阻害剤の潜在的な適応症である（Ritchlin, C.T., et al., J. Clin. Invest. 111 (2003) 821-831）。変形性関節症及び関節リウマチは、結合組織中におけるマクロファージの蓄積と骨液中へのマクロファージの浸潤により引き起こされる炎症性自己免疫疾患であり、少なくとも部分的にＭ−ＣＳＦにより媒介される。Campbell, I., K., et al., J. Leukoc. Biol. 68 (2000) 144-150は、Ｍ−ＣＳＦがｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト関節組織細胞（軟骨細胞、滑膜線維芽細胞）により産生されて、関節リウマチ患者の骨液中に見られることを実証した。これは、Ｍ−ＣＳＦが骨膜組織の増殖と、疾患の病因に関連付けられるマクロファージの浸潤に寄与することを示唆している。ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害は、関節中のマクロファージの数を制御し、関連する骨破壊による痛みを和らげると考えられる。有害作用を最小化し、これら症状におけるＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の影響を更に理解するために、１つの方法は、無数の他のキナーゼ、例えばＲａｆキナーゼを標的とすることなくＣＳＦ−１Ｒを特異的に阻害することである。
【０１５９】
従って、本発明の別の実施態様は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、炎症性関節炎、及び炎症の治療における使用のための、上記アミノ酸配列（複数）及びアミノ酸配列によって特徴付けられる抗ＣＤ２０抗体と併用される、上記アミノ酸配列（複数）及びアミノ酸配列によって特徴づけられるＣＳＦ−１Ｒ抗体である。
【０１６０】
本発明は、がんの治療のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体と、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる抗ＣＤ２０抗体との併用療法を含む。
【０１６１】
本発明は、腫瘍転移の予防又は治療のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体と、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる抗ＣＤ２０抗体との併用療法を含む。
【０１６２】
本発明は、炎症性疾患の治療のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体と、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる抗ＣＤ２０抗体との併用療法を含む。
【０１６３】
本発明は、腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行を遅延させることにおける使用のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体と、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる抗ＣＤ２０抗体との併用療法を含む。
【０１６４】
本発明は、Ｔ細胞活性化などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体と、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられる抗ＣＤ２０抗体との併用療法を含む。
【０１６５】
本発明は、抗ＣＤ２０抗体を併用するがんの治療のための、あるいは本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用するがんの治療のための医薬の製造のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１６６】
本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用する腫瘍転移の予防又は治療のための、あるいは本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用する腫瘍転移の予防又は治療のための医薬の製造のための、上記アミノ酸及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１６７】
本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用する炎症性疾患の治療のための、あるいは本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用する炎症性疾患の治療のための医薬の製造のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１６８】
本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用する腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行を遅延させることにおける使用のための、あるいは本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用する腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行を遅延させることにおける使用のための医薬の製造のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１６９】
本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用するＴ細胞活性化などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、あるいは本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体を併用するＴ細胞活性化などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための医薬の製造のための、上記アミノ酸配列及びアミノ酸配列断片によって特徴付けられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の使用を含む。
【０１７０】
本発明の一好ましい実施態様では、上記の併用療法及び異なる疾患の医学的使用に用いられるヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体は、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；かつ
かかる併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体は、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。
【０１７１】
本明細書に記載の抗体は、好ましくは組換え手段により産生される。そのような方法は当該技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は、その細胞から（上清から又は細胞溶解後に）回収される。
【０１７２】
抗体の組換え産生は、当該技術分野で周知であり、例えば総説Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880に記載がある。
【０１７３】
抗体は、細胞全体に、細胞溶解物に、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。精製は、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知のその他の技術を含む標準的な技術により除去するために実施される。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。
【０１７４】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ  ２９３）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83、及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。
【０１７５】
本発明による重鎖及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列、及び転写終結配列と組み合わされて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖発現コンストラクト及び軽鎖発現コンストラクトを単一のベクターに組み込み、宿主細胞にコトランスフェクション、連続トランスフェクション又は別々のトランスフェクションを行い、次いでその宿主細胞を融合させて、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。
【０１７６】
原核生物に適切な制御配列は、例えばプロモーター、任意選択的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【０１７７】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、その核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作動可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されているならば、コード配列に作動可能に連結されている。通常、「作動可能に連結」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続していて、かつリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１７８】
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーといった一般的な免疫グロブリン精製手順により、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての機能を果たし得る。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に挿入し、次いでこれらの発現ベクターを、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞内にトランスフェトし、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は互換的に用いられ、全てのそのような名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代の対象細胞と、導入回数に関係なく、これに由来する培養物とを含む。また、全ての子孫が、計画的な又は意図しない突然変異の影響で、ＤＮＡ量において正確に同一であるわけではない。元々の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【０１８０】
別の態様において、本発明は、組成物、例えば薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合部分のうちの一つ又はそれらの組み合わせを含有する薬学的組成物を提供する。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収／再吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、注射又は注入に適している。
【０１８２】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られている多様な方法により投与され得る。当業者により認識されているように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化するものである。
【０１８３】
薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液若しくは分散液の調製用の滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。水の他に、担体は、例えば等張緩衝生理食塩水とすることができる。
【０１８４】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１８５】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく（有効量）、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために、多様であってよい。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、使用される特定の組成物と併用で用いられる他の薬物、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、及び既往歴、並びに医学の技術分野において周知である同様の要因を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。
【０１８６】
用語「治療方法」又はこれと同義の用語は、例えばがんに適用される場合、患者におけるがん細胞の数を減少若しくは消滅させるように、又はがんの症状を緩和するように設計された手順又は一連の行為を指す。がん又は他の増殖性疾患の「治療方法」は、がん細胞若しくは他の疾患が実際に取り除かれること、細胞の数若しくは疾患が実際に低減されること、又はがん若しくは他の疾患の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味するとは限らない。がんを治療する方法はしばしば、成功の可能性が低くても実施されるが、患者の病歴及び推定余命を考慮すると、それでも全体的に有利な作用過程を誘導するとみなされている。
【０１８７】
用語「と組み合わせて投与される（administered in combination with）」又は「共投与（co-administration）」、「共投与する（co-administering）」又は「併用療法（combination therapy）」又は「併用療法（combination treatment）」は、例えば別個の製剤／用法としての（又は単一製剤／適用としての）、本明細書に記載される抗ＣＳＦ−１Ｒと、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体との投与に言及する。共投与は、同時であっても、又は任意の順序で逐次的であってもよいが、両方（又は全て）の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間があることが好ましい。前記抗体及び前記更なる薬剤は、同時に又は逐次的に（例えば静脈内（ｉ．ｖ．）連続的注入により）投与される。両方の治療剤が逐次的に共投与されるとき、用量は、２回の別々の投与に分けて同日に投与されるか、又は薬剤の一方が１日目に投与され、２番目が２〜７日目に、好ましくは２〜４日目に共投与される。このように、一実施態様では、用語「逐次的に」は、第１の成分の用量から７日以内を、好ましくは第１の成分の用量から４日以内を意味し；用語「同時に」は同じ時点でということを意味する。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体の維持量に関する用語「共投与」は、治療周期（例えば毎週）が両方の薬物にとって適切である場合は、維持量が同時に共投与され得ることを意味する。あるいは更なる薬剤は、例えば１日から３日毎に投与され、前記抗体は毎週投与される。あるいは、維持量は、１日以内又は７日以内に、逐次的に共投与される。
【０１８８】
抗体が、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医により求められる、組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発するであろう各化合物の量又は併用量である「治療的に有効な量」（又は単に「有効量」））で患者に投与されることは自明である。
【０１８９】
共投与の量及び共投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（人種、性別、年齢、体重など）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重症度に依存する。前記抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び更なる薬剤は、単回で、又は一連の治療にわたって、例えば同日又は後日、患者に対して適切に共投与される。
【０１９０】
疾患の種類及び重度に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の前記抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体が、患者に対する両薬物の共投与の最初の候補投薬量である。本発明は、がん、特に結腸がん、肺がん又は膵臓がんに罹患した患者の治療のための、本発明による抗体の使用を含む。
【０１９１】
疾患の種類及び重度に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の前記抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体が、患者に対する両薬物の共投与の最初の候補投薬量である。本発明は、がん、特に結腸がん、肺がん又は膵臓がんに罹患した患者の治療のための、本発明による抗体の使用を含む。
【０１９２】
抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、化学療法剤又は標的療法を施すことができる。
【０１９３】
一実施態様では、そのような追加の化学療法剤は、本明細書に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び本明細書に記載の抗ＣＤ２０抗体と共に投与することができ、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤を含む抗新生物剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）等のニトロソ尿素）；テモダール（Ｔｅｍｏｄａｌ）（ＴＭ）（テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ））、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルテレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファンなどのアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン；葉酸アナログ、例えばメトトレキサート及びトリメトレキサート、ピリミジンアナログ、例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、プリンアナログ、例えば６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａ．ｒｈｏ．ｔｏｐｕｒｉｎｅ）、６−チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｍｎｅ）、アザチオプリン、Ｔ−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）を含む代謝拮抗薬；抗有糸分裂薬、例えばパクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む天然物；ピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン；酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ；生体応答修飾物質、例えばインターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ；白金配位錯体、例えばオキサリプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチン、アントラセンジオン、例えばミトキサントロン、置換尿素、例えばヒドロキシウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えばミトタン（ｏ、ｐ−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドを含む様々な薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えばプレドニゾンとその等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；ジェムザール（ＴＭ）（ゲムシタビン）、プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロンアセテート及び酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；テストステロンプロピオナート及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド；並びに非ステロイド性抗アンドロゲン、例えばフルタミドを含む。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えばビダーザ）及び転写抑制解除（ＡＴＲＡ）療法を含むがこれらに限定されないエピジェネティックなメカニズムを標的とする療法も、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばパクリタキセル（タキソール））、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ））、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、及び他の多種キナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、並びにビンブラスチンからなる群より選択される。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばタキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えアブラキサン及びオパキシオ）からなる群より選択される。一実施態様では、追加的化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。
【０１９４】
追加的化学療法剤との併用療法の特定の例は、例えば、乳がんの治療のためのタキサン（例えばドセタキセル又はパクリタキセル）又は修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン）、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（アバスチン）を用いる療法；卵巣がんのためのカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は修飾されたドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ又はドキシル）），又はトポテカン（ハイカムチン）を用いる療法；腎臓がんの治療のための多種キナーゼ阻害剤、ＭＫＩ、（スーテント、ネクサバール又は７０６）、及び／又はドキソルビシンを用いる療法；扁平上皮癌の治療のためのオキサリプラチン、シスプラチン、及び／又は放射線を用いる療法；肺がんの治療のためのタキソール及び／又はカルボプラチンを用いる療法を含む。
【０１９５】
従って、一実施態様では、追加的化学療法剤は、乳がんの治療のためのタキサン（ドセタキセル又はパクリタキセル又は修飾されたパクリタキセル（アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブからなる群より選択される。
【０１９６】
ＣＳＦ−１Ｒ抗体／ＣＤ２０抗体併用療法の一実施態様では、化学療法剤又は標的療法は施されない。
【０１９７】
本発明は、このような疾患に罹患した患者の治療のための方法も含む。
【０１９８】
抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、標的療法を施すこともできる。
【０１９９】
抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ１抗体を投与することもできる。
【０２００】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路
Ｔ細胞活性化を調節する重要な負の共刺激シグナルは、プログラム死−１受容体（ＰＤ−１）（ＣＤ２７９）、及びそのリガンド結合パートナーＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４；配列番号８８）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）によって提供される。ＰＤ−１の負の調節の役割は、自己免疫を生じさせる傾向のあるＰＤ−１のノックアウト（Ｐｄｃｄ１−／−）によって明らかになった。Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)。ＰＤ−１はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に関連するが、ホモ二量体化を可能にする膜近位システインを欠いている。ＰＤ−１の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシン−ベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含む。ＰＤ−１はＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２にのみ結合する。Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999); Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)。
【０２０１】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化された単球及び樹状細胞（ＤＣ）上に発現し得る。ＰＤ−１は、活性化されているが刺激されてはいないヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄によって発現される。これは、ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４のもっと制限された発現とは対照的である。Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)。活性化されたヒトＴ細胞からクローニングされた、少なくとも４つのＰＤ−１変異体が存在し、それには（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２及び３又は（ｉｖ）エクソン２〜４を欠く転写物が含まれる。Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)。ＰＤ−１Δｅｘ３を例外として、全ての変異体は、静止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中において完全長ＰＤ−１と同様のレベルで発現される。全ての変異体の発現は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によるヒトＴ細胞の活性化により有意に誘導された。ＰＤ−１Δｅｘ３変異体は、膜貫通ドメインを欠き、自己免疫において重要な役割を果たす可溶型ＣＴＬＡ−４に類似している。Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)。この変異体は、関節リウマチの患者の滑液及び血清中において濃縮されている。Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)。
【０２０２】
２つのＰＤ−１リガンドは、その発現パターンが異なる。ＰＤ−Ｌ１は、マウスＴ細胞及びＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞及び骨髄由来肥満細胞で恒常的に発現される。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)。ＰＤ−Ｌ１は、広い範囲の非造血細胞（例えば、角膜細胞、肺細胞、血管上皮細胞、肝臓非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤のシンシチウム栄養芽層、ケラチノサイトなど）に発現され［Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)］、活性化後複数の細胞型において上方制御される。Ｉ型及びＩＩ型両方のインターフェロンＩＦＮがＰＤ−Ｌ１を上方制御する。Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)。細胞株におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＭＥＫが阻害される場合、減少する。Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ＪＡＫ２はまた、ＰＤ−Ｌ１の誘導に関与している。Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びＡｋｔシグナル伝達を修飾する細胞性ホスファターゼであるホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）の欠損又は阻害は、がんにおける転写後のＰＤ−Ｌ１発現を増加させた。Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)。
【０２０３】
ＰＤ−Ｌ２の発現はＰＤ−Ｌ１よりも制限されている。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、及び骨髄由来のマスト細胞に誘導的に発現される。ＰＤ−Ｌ２は、静止腹膜Ｂ１細胞の約半分から三分の二にも発現されるが、一般的なＢ２ Ｂ細胞には発現されない。Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)。ＰＤ−Ｌ２＋ Ｂ１細胞は、ホスファチジルコリンに結合し、細菌抗原に対する自然免疫応答にとって重要であり得る。ＩＦＮ−ガンマによるＰＤ−Ｌ２の誘導は、部分的にＮＦ−κＢに依存する。Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)。ＰＤ−Ｌ２はまた、ＧＭ−ＣＦ、ＩＬ−４及びＩＦＮ−ガンマによって単球及びマクロファージに誘導され得る。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003)。
【０２０４】
ＰＤ−１シグナル伝達は、典型的には、細胞増殖よりもサイトカイン産生に大きな影響を有し、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−２産生に有意な影響を有する。ＰＤ−１が媒介する抑制性シグナル伝達も、ＴＣＲシグナル伝達の強度に依存しており、低レベルのＴＣＲ刺激においてより大きな阻害が送達される。このような低減は、ＣＤ２８による共刺激により［Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)］又はＩＬ−２の存在により［Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)］克服され得る。
【０２０５】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によるシグナル伝達が二方向性であるという証拠が蓄積されている。すなわち、ＴＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達の調節に加えて、シグナル伝達は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を発現する細胞に戻るようにも送達される。ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を有する患者から単離された天然のヒトＰＤ−Ｌ２抗体による樹状細胞の処置は、ＭＨＣ ＩＩ又はＢ７共刺激分子を上方制御することが見出されなかったが、そのような細胞は、より多量の炎症誘発性サイトカイン、特にＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−６を産生し、Ｔ細胞の増殖を刺激した。Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)。また、この抗体によるマウスの治療は、（１）移植されたｂ１６メラノーマに対する耐性を亢進させ、腫瘍特異的ＣＴＬを急速に誘導し（Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)）；（２）アレルギー性喘息のマウスモデルにおける気道炎症性疾患の発症を阻止した（Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)）。
【０２０６】
樹状細胞（「ＤＣ」）への逆シグナル伝達の更なる証拠は、可溶性ＰＤ−１（Ｉｇ定常領域に融合したＰＤ−１  ＥＣドメイン−「ｓ−ＰＤ−１」）と共に培養された骨髄由来のＤＣの研究により得られたものである。Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)。このｓＰＤ−１は、抗ＰＤ−１の投与により可逆的に、ＤＣ活性化を阻害し、ＩＬ−１０産生を増加させた。
【０２０７】
更に、幾つかの研究では、ＰＤ−１とは無関係な、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対する受容体を示している。Ｂ７．１は、既にＰＤ−Ｌ１の結合パートナーとして同定されている。Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)。化学的架橋の研究は、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７．１がそれらのＩｇＶ様ドメインを介して相互作用し得ることを示唆している。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞への阻害シグナルを誘導することができる。Ｂ７．１によるＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ１のライゲーション又はＰＤ−Ｌ１によるＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのＢ７．１のライゲーションは、阻害シグナルを送達する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３＋Ｂ７．１でコーティングされたビーズにより刺激したとき、増殖及びサイトカイン産生の減少を示す。Ｂ７．１の受容体の全て（すなわち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１）を欠くＴ細胞では、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生はもはや抗ＣＤ３＋Ｂ７．１コーティングビーズによって阻害されない。これは、Ｂ７．１が、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の非存在下においてＴ細胞上のＰＤ−Ｌ１により特異的に作用することを示唆している。同様に、ＰＤ−１を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３＋ＰＤ−Ｌ１コーティングビーズの存在下において刺激したとき、増殖とサイトカイン産生の減少を示した。これは、Ｔ細胞上でのＢ７．１に対するＰＤ−Ｌ１ライゲーションの阻害効果を実証するものである。Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１の既知の受容体の全てを欠くとき（すなわち、ＰＤ−１とＢ７．１が存在しないとき）、Ｔ細胞増殖は、もはや抗ＣＤ３＋ＰＤ−Ｌ１コーディングビーズによって損なわれなかった。従って、ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７．１又はＰＤ−１の何れかを介して、Ｔ細胞に対し抑制効果を発揮することができる。
【０２０８】
Ｂ７．１とＰＤ−Ｌ１との間の直接的相互作用は、共刺激に関する現在の理解は不十分であり、Ｔ細胞上におけるこれら分子の発現に対する重要性を過小評価していることを示唆する。ＰＤ−Ｌ１−／−Ｔ細胞の研究は、Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞のサイトカイン産生を下方制御できることを示している。Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)。ＰＤ−Ｌ１とＢ７．１の両方がＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージに発現されることから、これら細胞型においてＢ７．１とＰＤ−Ｌ１とが方向性相互作用を有している可能性がある。加えて、非造血細胞上のＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７．１並びにＰＤ−１と相互作用することができ、それらの調節にＰＤ−Ｌ１が関与しているかという疑問を投げかけている。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害効果についての１つの可能な説明は、Ｔ細胞ＰＤ−Ｌ１がＡＰＣ  Ｂ７．１をＣＤ２８との相互作用から捕捉又は分離し得ることである。
【０２０９】
結果として、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１、Ｂ７．１又はこれらの両方と相互作用することをブロックすることにより、ＰＤ−Ｌ１が負の共刺激シグナルをＴ細胞及び他の抗原提示細胞に送ることを防ぐことを含むＰＤ−Ｌ１によるシグナル伝達の拮抗作用は、感染症（例えば、急性及び慢性）に対する免疫性及び腫瘍免疫を亢進させると思われる。加えて、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の他の成分のアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体と組み合わせることができる。
【０２１０】
Ｅμ−ＴＣＬ１  ＣＬＬマウスモデルにおける老化関連免疫欠如との関連でＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１媒介性ＣＤ８  Ｔ細胞機能障害の機序が、McClanahan F, et al, .Blood. 2015 May 15. blood-2015-02-626754 (Epub ahead of print- PMID: 25979947)に記載されている。 McClanahan F, et al , Blood. 2015 Mar 23.( pii: blood-2015-01-622936)は、ＰＤ−Ｌ１チェックポイントの遮断が慢性リンパ性白血病のマウスモデルにおける免疫機能障害及び白血病発症を予防することを言及している。
【０２１１】
用語「ヒトＰＤ−Ｌ１」は、ヒトタンパク質ＰＤ−Ｌ１（配列番号９７、典型的にはＰＤ−１シグナル伝達）を指す。本明細書で使用される「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する」又は「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８モル／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９モル／ｌ以下の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的結合する抗体に言及する。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ−ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。従って、本明細書で使用される「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０−８モル／ｌ〜１．０ｘ１０−１３モル／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０−９モル／ｌ〜１．０ｘ１０−１３モル／ｌ）の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【０２１２】
一つの好ましい実施態様では、抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ１抗体を投与することもできる。
【０２１３】
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体）は、以下からなる群より選択される。２４３．５５．Ｓ７０、２４３．５５．Ｈ１、２４３．５５．Ｈ１２、２４３．５５．Ｈ３７、２４３．５５．Ｈ７０、２４３．５５．Ｈ８９、２４３．５５．Ｓ１、２４３．５５．５、２４３．５５．８、２４３．５５．３０、２４３．５５．３４、２４３．５５．Ｓ３７、２４３．５５．４９、２４３．５５．５１、２４３．５５．６２、及び２４３．５５．８４。
【０２１４】
これらの抗体は、国際公開第２０１０／７７６３４号（配列は、国際公開第２０１０／７７６３４号の図１１に示されている）に記載されており、本明細書に記載のように以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とする。
2018525339.tif 000010
【０２１５】
本発明の一実施態様では、本発明の併用療法において使用されるＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、以下の群から選択される可変ドメインのアミノ酸配列を含む：
−  配列番号７８の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８２の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８３の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ１２」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８４の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ３７」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８５の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８６の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ８９」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８７の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８８の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．５」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８９の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．８」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９０の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．３０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．３４」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９２の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ３７」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９３の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．４９」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９４の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．５１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９５の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．６２」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；及び
−  配列番号８０の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９６の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．８４」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
【０２１６】
本発明の一つの好ましい実施態様では、本発明による併用療法において使用されるＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、以下の可変ドメインアミノ酸配列：配列番号７８の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）を含む。
【０２１７】
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体）は、アテゾリズマブ（ＣＡＳ番号：１３８０７２３−４４−３）である。本発明の一つの好ましい実施態様では、本発明による併用療法において使用されるＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、アテゾリズマブの可変重鎖ドメインＶＨ及び可変軽鎖ドメインＶＬの可変ドメインアミノ酸配列（ＣＡＳ番号：１３８０７２３−４４−３）を含む。
【０２１８】
一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ１抗体を投与することもできる。本発明の一実施態様では、本発明による併用療法において使用されるＰＤ−１に結合する抗体は、ヒトＰＤ−１に結合する。
【０２１９】
本発明の一つの実施態様では、本発明による併用療法において使用されるＰＤ−１に結合する抗体は、以下の可変ドメインアミノ酸配列：配列番号９８の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９９の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−１＞ニボルマブのＶＨ及びＶＬドメインに対応する）を含む。
【０２２０】
本発明の一つの実施態様では、本発明による併用療法において使用されるＰＤ−１に結合する抗体は、以下の可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１００の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号１０１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−１＞ペムブロリズマブのＶＨ及びＶＬドメインに対応する）を含む。
【０２２１】
別の好ましい実施態様では、抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＣＤ２０抗体を投与することもできる。
【０２２２】
イブルチニブ（１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］ピペリジン−１−イル］プロパ−２−エン−１−オン）（ＵＳＡＮ、［１］はＰＣＩ−３２７６５としても知られており、イムブルビカの名前で市販されている）は、Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とする抗がん剤である。
【０２２３】
従って、一実施態様では、上記の方法及び医学的使用（特異的ＣＳＦ１Ｒ抗体及びＣＤ２０抗体を用いる）における抗ＣＤ２０抗体と併用される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、併用のためにイブチニブが投与され、及び／又は使用される。（トリプルコンボ（ｔｒｉｐｌｅ  ｃｏｍｂｏ））
【０２２４】
本発明は、薬学的に許容される担体と併せた本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造のための方法と、そのような方法のための本発明による抗体の使用を更に提供する。
【０２２５】
本発明は、がんに罹患した患者の治療のための、好ましくは薬学的に許容される担体と併せた、医薬品の製造のための有効量での本発明による抗体の使用を更に提供する。
【０２２６】
本発明はまた、がんに罹患した患者の治療のための、好ましくは薬学的に許容される担体と併せた、医薬品の製造のための有効量での本発明による抗体の使用を提供する。
【０２２７】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順で改変がなされ得る。
【０２２８】
配列の説明
配列番号１  重鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号２  重鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号３  重鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号４  軽鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号５  軽鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号６  軽鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号７  重鎖可変ドメイン、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号８  軽鎖可変ドメイン、Ｍａｂ  ２Ｆ１１
配列番号９  重鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１０  重鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１１  重鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１２  軽鎖ＣＤＲ３、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１３  軽鎖ＣＤＲ２、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１４  軽鎖ＣＤＲ１、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１５  重鎖可変ドメイン、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１６  軽鎖可変ドメイン、Ｍａｂ  ２Ｅ１０
配列番号１７  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号１８  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号１９  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２０  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２１  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２２  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２３  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２４  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１
配列番号２５  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２６  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２７  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２８  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号２９  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３０  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３１  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３２  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８
配列番号３３  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３４  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３５  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３６  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３７  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３８  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号３９  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号４０  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７
配列番号４１  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４２  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４３  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４４  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４５  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４６  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４７  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４８  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２
配列番号４９  重鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５０  重鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５１  重鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５２  軽鎖ＣＤＲ３、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５３  軽鎖ＣＤＲ２、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５４  軽鎖ＣＤＲ１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５５  重鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５６  軽鎖可変ドメイン、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｇ１
配列番号５７  ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号５８  ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号５９  Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａで変異したＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号６０  ＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号６１  Ｓ２２８Ｐで変異したＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号６２  ヒト野生型ＣＳＦ−１Ｒ（ｗｔ  ＣＳＦ−１Ｒ）（シグナル配列を含む）
配列番号６３  ヒト変異体ＣＳＦ−１Ｒ  Ｌ３０１Ｓ  Ｙ９６９Ｆ（シグナル配列を含む）
配列番号６４  ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ドメインＤ１〜Ｄ５）
配列番号６５  ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４
配列番号６６  ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ドメインＤ１〜Ｄ３
配列番号６７  シグナルペプチド
配列番号６８  プライマー
配列番号６９  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＨ２
配列番号７０  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＨ３
配列番号７１  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＨ６
配列番号７２  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＨ８
配列番号７３  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＬ８
配列番号７４  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＬ１１
配列番号７５  重鎖可変ドメイン、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＨＬ１３
配列番号７６  軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１変異体Ｂ−ＫＶ１
配列番号７７  ヒトＣＤ２０
配列番号７８  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１の可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号７９  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体２の可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号８０  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体３の可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号８１  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８２  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体２の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８３  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体３の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８４  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体４の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８５  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体５の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８６  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体６の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８７  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体７の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８８  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体８の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号８９  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体９の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９０  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１０の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９１  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１１の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９２  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１２の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９３  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１３の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９４  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１４の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９５  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１５の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９６  ＜ＰＤ−Ｌ１＞  ２４３．５５変異体１６の可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号９７  ヒトプログラム死リガンド１
配列番号９８  ＜ＰＤ−１＞ニボルマブの可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号９９  ＜ＰＤ−１＞ニボルマブの可変軽鎖ドメインＶＬ
配列番号１００  ＜ＰＤ−１＞ペムブロリズマブの可変重鎖ドメインＶＨ
配列番号１０１  ＜ＰＤ−１＞ペムブロリズマブの可変軽鎖ドメインＶＬ
【０２２９】
本発明の特定の実施態様を以下に記載する。
１．  リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導することにおける使用のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体。
【０２３０】
２．  リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体。
【０２３１】
３．  リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量の投与を含む治療方法
【０２３２】
４．  リンパ腫又は白血病における白血病細胞のリンパ球増加症を誘導するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用。
【０２３３】
５．  リンパ球増加症が、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させる、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２３４】
６．  リンパ球増加症が、末梢血中のＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ１９抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２３５】
７．  リンパ球増加症が、ＣＤ２０を発現する循環白血病細胞を増加させる、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２３６】
８．  リンパ球増加症が、ＣＤ２０発現循環白血病細胞の割合を増加させ、リンパ腫又は白血病を抗ＣＤ２０抗体による治療に感受性にする、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２３７】
９．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み；かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２３８】
１０．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２３９】
１１．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量が、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％であり；かつ配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２４０】
１２．  Ａ）ヒトＣＤ２０に結合する抗体との併用における使用のためである、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体；又は
Ｂ）ヒトＣＤ２０に結合する抗体と併用のための、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用；又は
Ｃ）ヒトＣＤ２０に結合する抗体との併用における使用のためである、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の有効量の投与を含む治療方法；又は
Ｄ）ヒトＣＤ２０に結合する抗体との併用における使用のための医薬の製造のためのヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体の使用であって、
ここで、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）及びＤ）に記載の抗体、使用又は方法が、
ｉ）ＣＤ２０発現がんの治療における使用のため；又は
ｉｉ）Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のため；又は
ｉｉｉ）細胞性免疫応答を刺激すること、特に細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激すること、Ｔ細胞活性を刺激すること、又はマクロファージ活性を刺激することにおける使用のため；又は
ｉｖ）がんの進行を遅延させることにおける使用のため；又は
ｖ）がんに罹患している患者の生存期間を延長することにおける使用のためのものであり、
かつ、併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
かつ併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、
実施態様１５又は１６に記載の方法。
【０２４１】
１３．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、実施態様１２に記載の抗体、使用又は方法。
【０２４２】
１４．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量が、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％であり；かつ配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
実施態様１２に記載の抗体、使用又は方法。
【０２４３】
１５．  マクロファージを標的化することによりＣＤ２０標的療法からの逃避を防止するための、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤と併用した抗ＣＤ２０抗体によってＣＤ２０発現がんを標的化する方法。
【０２４４】
１６．  マクロファージが抗ＣＳＦ１Ｒ抗体により標的化される、実施態様１５に記載の方法。
【０２４５】
１７．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
ａ）配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし；
かつ、併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
ａ）配列番号６９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号７０の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）配列番号７２の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）配列番号７３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）配列番号７４の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）配列番号７５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、
実施態様１５又は１６に記載の方法。
【０２４６】
１８．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、
配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
実施態様１５又は１６に記載の方法。
【０２４７】
１９．
併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体が、
配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
併用療法において使用される、ヒトＣＤ２０に結合する抗体が、Ｆｃ領域において改変されたグリコシル化パターンを有するＩｇＧ１アイソタイプのアフコシル化抗体であり、ここで、フコース含有オリゴ糖の量が、Ａｓｎ２９７におけるオリゴ糖の総量の４０％から６０％であり；かつ配列番号７１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号７６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
実施態様１５又は１６に記載の方法。
【０２４８】
２０．  リンパ腫及びリンパ性白血病の治療における使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２４９】
２１．  Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５０】
２２．  多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、又はホジキン病の治療における使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５１】
２３．  がん、リンパ腫及び白血病がＣＤ２０を発現した、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５２】
２４．  腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行を遅延させることにおける使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５３】
２５．  Ｔ細胞活性化などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５４】
２６．  腫瘍転移の予防又は治療における使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５５】
２７．  炎症性疾患の治療における使用のための、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５６】
２８．  ヒトＣＳＦ−Ｒに結合する抗体及びヒトＣＤ２０に結合する抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５７】
２９．  抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び抗ＣＤ２０抗体併用療法に加えて、追加的化学療法剤及び／又は標的療法が施されない、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５８】
３０．  ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びヒトＣＤ２０に結合する抗体が同時に共投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２５９】
３１．  ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体及びヒトＣＤ２０に結合する抗体が逐次的に共投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６０】
３２．  抗ＣＤ２０抗体と併用した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体も投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６１】
３３．
使用されるＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が、
−  配列番号７８の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８２の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８３の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ１２」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８４の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ３７」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８５の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ７０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８６の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｈ８９」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８７の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８８の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．５」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号８９の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．８」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９０の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．３０」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．３４」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９２の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．Ｓ３７」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９３の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．４９」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９４の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．５１」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；
−  配列番号７９の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９５の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．６２」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）；及び
−  配列番号８０の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９６の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−Ｌ１＞「２４３．５５．８４」のＶＨ及びＶＬドメインに対応する）
からなる群から選択される可変ドメインアミノ酸配列を含む、実施態様３２に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６２】
３４．  ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、実施態様３２に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６３】
３５．  ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が同時に共投与される、実施態様３２から３４の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６４】
３６．  ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体が逐次的に共投与される、実施態様３２から３４の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６５】
３７．  抗ＣＤ２０抗体と併用した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、抗ＰＤ−１抗体も投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６６】
３８．  ＰＤ−１に結合する抗体が、以下の可変ドメインアミノ酸配列：
配列番号９８の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号９９の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−１＞ニボルマブのＶＨ及びＶＬドメインに対応する）を含む、実施態様３７に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６７】
３９．  ＰＤ−１に結合する抗体が、以下の可変ドメインアミノ酸配列：
配列番号１００の可変重鎖ドメインＶＨ及び配列番号１０１の可変軽鎖ドメインＶＬ（本明細書に開示される＜ＰＤ−１＞ペムブロリズマブのＶＨ及びＶＬドメインに対応する）を含む、実施態様３８に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６８】
４０．  ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−１に結合する抗体が同時に共投与される、実施態様３７から３９に記載の抗体、使用又は方法。
【０２６９】
４１．  ＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、及びヒトＰＤ−１に結合する抗体が逐次的に共投与される、実施態様３７から３９に記載の抗体、使用又は方法。
【０２７０】
４２．  抗ＣＤ２０抗体と併用した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体に加えて、イブルチニブも投与される、先の実施態様の何れか一に記載の抗体、使用又は方法。
【０２７１】
実験手順
マウス
全てのマウスを、特定の病原体のない動物施設に収容して飼育し、サンラファエル科学研究所機関倫理委員会（San Raffaele Scientific Institute Institutional Ethical Committee）の承認を得て、欧州連合のガイドラインに従って処置した。ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスは、ＣＩＥＡ及びＴａｃｏｎｉｃによって快く提供され、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスは、Ｂｙｒｄ博士によって快く提供され、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給された。
【０２７２】
細胞及び試薬
ヒト一次試料は、ヘルシンキ宣言に従って、サンラファエル科学研究所（San Raffaele Scientific Institute (Milan, Italy)）の機関倫理委員会により承認された（プロトコルＶＩＶＩ−ＣＬＬ）インフォームドコンセントを受けた後にＲＡＩステージ０−１  ＣＬＬ患者から得られた。ＭＥＣ１  ＣＬＬ細胞株をＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＭＳＺ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清及びゲンタマイシン（１５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ＣｌｏｄＬｌｉｐ及びリン酸緩衝液（ＰＢＳ）リポソームはＣｌｏｄＬｉｐ  Ｂ．Ｖ．から購入した。抗マウスＣＳＦ１Ｒ抗体２Ｇ２及び抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体ｈｕＭａｂ  ２Ｆ１１−２ｅ  ７は、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。抗ヒトＣＤ２０  ＧＡ１０１（糖鎖操作ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＢＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ、フコースの量は４０〜６０％）は、スイスのＳｃｈｌｉｅｒｅｎのＲｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅによって提供された。
【０２７３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
異種移植研究のために、８週齢のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、０．１ｍＬの生理食塩水中の１０ｘ１０６個のＭＥＣ１細胞を２７ゲージの針を介して静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）に曝露した。実験に応じて、マウスにｃｌｏｄｒｏｌｉｐ、抗マウスＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ、抗ヒトＣＤ２０  ＧＡ１０１  ｍｏＡｂを注射した。トランスジェニック移植研究のために、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、白血病の雄Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスの脾臓から精製した１０×１０６個の細胞を腹腔内に（ｉ．ｐ．）１６回曝露した（０日目）。実験に応じて、マウスを、異なる用量及びスケジュールで、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ又は抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂで処置した。
【０２７４】
マウス細胞調製物
ＰＢ、ＰＥ、ＳＰ、及び大腿骨をマウスから収集し、細胞を単離した。ＢＭ、ＰＥ、ＳＰ及びＰＢ試料からの赤血球を、塩化アンモニウム溶液（ＡＣＫ）溶解緩衝液（ＮＨ４Ｃｌ  ０，１５Ｍ、ＫＨＣＯ３  １０ｍＭ、Ｎａ２ＥＤＴＡ  ０，１ｍＭ、ｐＨ７．２〜７．４）中で室温で５分間インキュベートすることによって溶解させた。結晶化可能断片（Ｆｃ）受容体を、室温で１０分間Ｆｃブロック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロックした後、ＰＢ、ＢＭ、ＰＥ、ＳＰからの細胞を下記の抗体で染色し（４℃で１５分）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００フローサイトメーターを用いて分析した。細胞内サイトカインの検出については、下記を参照のこと。絶対数は、細胞の割合に、大腿骨から洗い流された脾細胞、腹腔細胞又はＢＭ細胞の総数を掛けることによって得られた（図７（紙の図１）Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅを除く。ここでは絶対数は、大腿骨及び脛骨の両方から洗い流された全ＢＭ細胞を指す）。
【０２７５】
マウス細胞フローサイトメトリー
表現型解析は以下の抗体を用いて行われた：ＰＥ−Ｃｙ７又はＰＥラット抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ５（５３−７．３）、ＰＥ−Ｃｙ７ラット抗マウスＣＤ１９（１Ｄ３）、ＡＰＣ又はＦＩＴＣラット抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、ＦＩＴＣラット抗マウスＣＤ２０６（ＭＲ５Ｄ３）、ＦＩＴＣハムスター抗マウスＣＤ５４（３Ｅ２）、ＰＥラット抗マウスＣＤ８６（ＧＬ１）、ＦＩＴＣ又はＰＥ−Ｃｙ７ラット抗マウスＣＤ８（５３−６．７）、ＦＩＴＣラット抗マウスＣＤ４４（ＩＭ７）、ＰＥラット抗マウスＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＰＥ−Ｃｙ７ラット抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＡＰＣラット抗マウスＣＤ２５（ＰＣ６１）、ＦＩＴＣラット抗マウスＧｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシス検出キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより得られたもの）；ＦＩＴＣラット抗マウスカッパ（１８７．１）、ＰＥラット抗マウスラムダ（ＪＣ５−１）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒによって購入されたもの）；ＰＥ抗マウスＦ４／８０（ＢＭ８）、ＦＩＴＣラット抗マウスＬｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＡＰＣラット抗マウスＬｙ６Ｇ（１Ａ８）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄによって得られたもの）；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって購入されたＡＰＣ抗マウスＣＳＦ１Ｒ（ＡＦＳ９８）；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃによって購入されたＰＥラット抗マウスＣＳＦ１Ｒ（６０４Ｂ５  ２Ｅ１１）。
【０２７６】
細胞内サイトカイン検出
ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＦＮγの検出のために、脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでイオノマイシン及びブレフェルジンＡで刺激し、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４４、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ８及びＡＰＣ抗マウスＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。間質細胞におけるＩＬ１７ａ及びＩＬ２の検出のために、細胞表面を抗ＣＤ４５、抗Ｇｒ１、抗ＣＤ１１ｂで標識し、細胞を洗浄し、固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ−Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって購入されたＰＥ抗マウスＩＬ１７ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）又はビオチン−ストレプトアビジン−ＰＥ抗マウスＩＬ２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）で標識した。
【０２７７】
ＣＬＬ試料からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養及び細胞枯渇アッセイ
未治療のＣＬＬ患者からの新鮮なＰＢＭＣを培養培地中３×１０６細胞／ｍｌで三重で播種し、ＰｆｉｚｅｒからのＴＮＦ−αアンタゴニストであるエタネルセプト（１０μｇ／ｍｌ）又はＡｄｉｐｏｇｅｎ  ＡＧからの抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ヒト、１μｇ／ｍｌ）ｍｏＡｂ（ＨＳ２０１）の存在下又は非存在下で、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ又はＰＢＳリポソーム（１００、５００、１０００μＭ）で３０分間及び２４時処置した。ＣＳＦ１Ｒ阻害研究のために、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣを抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ（１〜１０μｇ／ｍｌ）又は抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ＋抗ＣＤ２０  ｍｏＡｂ  ＧＡ１０１（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処置した。処置された試料中の残存する白血病性ＣＤ１９＋ＣＤ５＋又はＣＤ１４＋細胞の特定の割合は、（処置試料中の絶対数／コントロール試料中の絶対数）×１００として計算された。各条件について、残存細胞の絶対数を総生存細胞数（トリパンブルー排除決定）×生存細胞の％（フローサイトメトリー決定）として計算した。次に、特定の細胞枯渇を以下のように計算した：１００−％特定の残存細胞（{Laprevotte, 2013 #46}に記載される）。
【０２７８】
遺伝子発現プロファイリング解析
マウスＢＭ由来のｈＣＤ１９−細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｍａｇｎｅｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＥａｓｙｓｅｐネガティブ選択単球濃縮キットを製造者の指示に従って用いて、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、前駆細胞、顆粒球及び赤血球の枯渇により単球／マクロファージが二次濃縮された。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡ抽出を行った。２００ナノグラムの全ＲＮＡサンプルを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ−Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、厳密に製造者のプロトコルに準拠して処理した。続いて、ビオチン標識したｃＲＮＡをＭｏｕｓｅＷＧ−６  ｖ２．０  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（約４５，０００転写物のプローブを含む）又はＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  ＢｅａｄＣｈｉｐ（約４７，０００転写物のプローブを含む）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））で１６時間ハイブリダイズし、続いてＣｙ３染色した。ハイブリダイゼーション後、ＢｅａｄＣｈｉｐは洗浄され、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）コンジュゲート染色プロトコールを受けた。ＢｅａｄＣｈｉｐが処理されると、それをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒでスキャンした。簡潔には、アレイをＢｅａｄＳｃａｎ装置でスキャンし、蛍光強度を抽出し、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてまとめられて、要約された蛍光測定のセットを得た。
【０２７９】
統計解析
統計解析は、スチューデント検定を使用して行った。データは平均値±ＳＤとして表され、成長曲線の比較は、Ｐが０．０５未満について統計的に有意であると考えられた。生存曲線の比較を、ログランク検定を用いて行った。
【０２８０】
マウスの遺伝子型解析
以前に記載されたように{Bertilaccio, 2011 #1}、ＰＣＲベースのスクリーニングアッセイによって、ＥＴＣ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスをｈＴＣＬ１導入遺伝子について遺伝子型解析した。
【０２８１】
異種移植研究
記載されたように{Bertilaccio, 2011 #1}、８週齢のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、０．１ｍＬの生理食塩水中の１０ｘ１０６個のＭＥＣ１細胞を２７ゲージの針を介して静脈内（ｉ．ｖ．）に曝露した（０日目）。幾つかの実験において、マウスは白血病曝露の−１日目で開始して３日ごとにｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（２００μｌ）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射され、又はコントロールとしてＰＢＳリポソーム（２００μｌ）を注射された。実験に応じて、マウスを体重について週１回モニターし、白血病の早期段階（１８〜２１日目、７回のクロドロストリップ注射）又は白血病の後期段階（２８〜３１日目、５回のクロドロストリップ注射）で死滅させた。ＰＥ、ＰＢ、ＳＰ、及び大腿骨ＢＭを分析した。選択された実験において、ＢＭ細胞を、白血病細胞及び単球／マクロファージの磁気分離のためにマウス大腿骨から洗い流した。前臨床実験では、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスにｓ．ｃ．０．１ｍＬの生理食塩水中の１０ｘ１０６個のＭＥＣ１細胞を左脇腹に皮下曝露した（０日目）。皮下腫瘍を有するマウスが触診可能な腫瘍排出腋窩ＬＮ（ＴＤＡＬ）を発症すると、マウスにＴＤＡＬ部位にｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（６０μｌ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射し（＋３９、＋４５、＋５２、＋５６、＋６０、＋６３、＋６６日目）、又はコントロールとしてＰＢＳリポソーム（６０μｌ）を注射した。体重、腫瘍及びＬＮ増殖（キャリパーにより３つの垂直直径を測定）についてマウスを週に１回モニタリングし、倫理指針に従って不必要な苦痛と不快感を避けるために、臨床的な徴候及び症状に達する前に平均ＬＮ体積が１０００ｍｍ３又はそれ以上に達したときに死滅させた。前臨床目的のために、１０×１０６個のＭＥＣ１細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）に移植した（０日目）Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスは、白血病曝露の１１日目に開始してｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（６０μｌ）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、そして２６〜３２日目に屠殺し（隔週のｃｌｏｄｒｏｌｉｐ注射後、２週間の治療；２回のｃｌｏｄｒｏｌｉｐ注射後、隔週）又は生存をモニターした（２回のｃｌｏｄｒｏｌｉｐ注射後、隔週）。ｉｎ  ｖｉｖｏＣＳＦ１Ｒ阻害研究のために、異種移植マウスは、＋１１日目、＋２５日目に抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、２７〜２９日目に屠殺した。生存実験のために、異種移植マウスを、＋１１日目、＋２５日目に抗ＣＳＦ１Ｒ又はＧＡ１０１  ｍｏＡｂ（モノクローナル抗体）を単剤又は組み合わせて静脈内（ｉ．ｖ）注射した。機能的研究のために、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ又は抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂの何れかを（＋１１日目、＋２５日目に）静脈内（ｉ．ｖ．）注射した異種移植マウスに、エタネルセプト（Ｐｆｉｚｅｒ、１０ｍｇ／Ｋｇ）腹腔内に（ｉ．ｐ．）反復投与し、それぞれ２６日目又は２９日目に死滅させた。１つの実験では、異種移植マウスを、２ｍｇ／Ｋｇの抗ＩＣＡＭ１遮断ｍｏＡｂ（ＹＮ１／１．７．４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を−１日目から開始して３／４日毎に前処置し、＋１９日目に死滅させた。トランスジェニック試験の８週齢の同系免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、ＥａｓｙＳｅｐマウスＢ細胞濃縮キットによって、白血病雄Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニ���クマウスの脾臓から精製された１０×１０６個の細胞を腹腔内に（ｉ．ｐ．）曝露した（０日目）。移植されたＣＤ１９＋ ＣＤ５＋ Ｉｇｋ＋細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した。マウスは白血病曝露の−１日目で開始して３日ごとにｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（２００μｌ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射され（−１、＋２、＋５、＋８、＋１１、＋１４、＋１８日目）、又はコントロールとしてＰＢＳリポソーム（２００μｌ）を注射された。前臨床試験では、移植マウスに、白血病曝露の＋１６日目又は＋１７日目に開始して３／４日毎にｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（５０μｌ）を投与し、又はコントロールとしてＰＢＳリポソーム（５０μｌ）を投与した。マウスを、ＰＢ試料のフローサイトメトリー分析によって体重及び白血病の発生について毎週モニターし、２４〜２８日目に死滅させた。ＰＥ、ＰＢ、及び器官（ＳＰ、ＬＮ、大腿骨ＢＭ）を分析した。ｉｎ  ｖｉｖｏＣＳＦ１Ｒ阻害研究のために、移植マウスに３０ｍｇ／Ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを腹腔内に（ｉ．ｐ．）処置し（＋１７日目、＋２３日目）、上記のようにモニターした。
【実施例】
【０２８２】
実施例１
ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞におけるＣＳＦ−１誘導性ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害
完全長ＣＳＦ−１Ｒの発現ベクターを用いてレトロウイルス性に感染させた、４．５ｘ１０３個のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、ＤＭＥＭ（ＰＡＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５−０１１）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７５１３）、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１０％のＦＫＳ（ＰＡＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１５−６４９）及び１００μｇ／ｍｌのＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３３［１０ｍｇ／ｍｌ］）において、培養密度に達するまで培養した。その後、細胞を、亜セレン酸ナトリウム［５ｎｇ／ｍｌ］（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ９１３３）、トランスフェリン［１０μｇ／ｍｌ］（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ８１５８）、ＢＳＡ［４００μｇ／ｍｌ］（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７３５０７８）、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７５１３）、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３６０）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１１１４０−０３５）、２−メルカプトエタノール［０，０５ｍＭ］（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ７５２２）、１００μｇ／ｍｌ及びＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３３）を補った無血清ＤＭＥＭ培地（ＰＡＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１５−０１１）で洗浄し、３０μｌの同培地において１６時間インキュベートして、受容体を上方制御した。１０μｌの希釈抗ＣＳＲ−１Ｒ抗体を１．５時間かけて細胞に加えた。次いで細胞を、１０μｌの１００ｎｇ／ｍｌのｈｕ  ＣＳＦ−１（ヒトＣＳＦ−１の活性な１４９ａａ断片（配列番号８６のａａ３３−１８１）；Ｂｉｏｍｏｌ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６０５３０）で５分間刺激した。インキュベーション後、上清を除去し、細胞を、８０μｌの氷冷ＰＢＳで二回洗浄し、５０μｌの新規に調製した氷冷溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）／１ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＥＧＴＡ／１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／緩衝液１０ｍｌにつき１個のプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ８３６ １７０）／１０μｌ／ｍｌのホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−２８５０、１００ｘＳｔｏｃｋ）／１０μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤１（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−５７２６、１００ｘＳｔｏｃｋ）／１ＭのＮａＦ１０μｌ／ｍｌ）を加えた。氷上に３０分置いた後、プレートを、プレートシェーカーで３分間勢いよく振とうし、次いで１０分間２２００ｒｐｍで遠心分離した（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ １０）。
【０２８３】
細胞溶解物中のリン酸化した全ＣＳＦ−１受容体の存在をＥｌｉｓａにより分析した。リン酸化した受容体の検出のために、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹＣ３２６８−２）を、供給者の指示に従って使用した。全ＣＳＦ−１Ｒの検出のために、キットに含まれる捕捉抗体を用いて１０μｌの溶解物をプレートに固定化した。その後、１：７５０に希釈したビオチン化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ＢＡＦ３２９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、１：１０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを加えた。６０分後、プレートを、新規に調製したＡＢＴＳ（登録商標）溶液を用いて発光させ、吸光度を検出した。データを、抗体を含まない陽性コントロールの％及びリン酸／発現された全受容体の比の値として算出した。陰性コントロールは、Ｍ−ＣＳＦ−１を加えないものと定義した。リガンド−受容体の相互作用を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ  ＳＣ  ２−４Ａ５（Santa Cruz Biotechnology, US, see also Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793）を、参照コントロールとして使用した。
2018525339.tif 000011
【０２８４】
実施例２
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下での、３Ｄ培養におけるＮＩＨ３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）
完全長野生型ＣＳＦ−１Ｒ（配列番号６２）又は変異ＣＳＦ−１Ｒ  Ｌ３０１Ｓ  Ｙ９６９Ｆ（配列番号６３）の発現ベクターによりレトロウイルス性に感染させたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、プラスチック表面への付着を防止するためにポリ−ＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ））をコーティングした皿の上で、２ｍＭのＬ−グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸、並びに１０％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補ったＤＭＥＭ高グルコース培地（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）中において培養した。細胞は、血清の代わりに５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、４００μｇ／ｍｌのＢＳＡ及び０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む培地中に播種される。１００ｎｇ／ｍｌのｈｕ  ＣＳＦ−１（ヒトＣＳＦ−１の活性１４９ａａ断片（配列番号８６のａａ３３−１８１）；Ｂｉｏｍｏｌ、ＤＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６０５３０）により処置したとき、ｗｔＣＳＦ−１Ｒ発現細胞は３次元的に成長する高密度スフェロイドを形成し、これは足場非依存性と呼ばれる特性である。これらのスフェロイドは、ｉｎ  ｓｉｔｕでの固形腫瘍の３次元構造及び組織に密接に類似している。変異型ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞は、ＣＳＦ−１リガンドとは独立してスフェロイドを形成することができる。本発明による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体１．２．ＳＭ（国際公開第２００９／０２６３０３号に記載のＣＳＦ−１Ｒ抗体に代わるリガンド）、ＣＸＩＩＧ６（国際公開第２００９／１１２２４５号に記載のＣＳＦ−１Ｒ抗体に代わるリガンド）、ヤギポリクローナル抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ａｂ１０６７６（ａｂｃａｍ）、及びＳＣ ２−４Ａ５（Santa Cruz Biotechnology, US、更にはSherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793を参照）及びＭａｂ  Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３２９１を調査した。参照コントロールＭａｂ  Ｒ＆Ｄ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３２９１は、変異型ＣＳＦ−１Ｒ組換え細胞の増殖を示さなかった。
【０２８５】
スフェロイド培養物を、３日間にわたり、異なる濃度の抗体の存在下でインキュベートし、ＩＣ３０（細胞生存率を３０パーセント阻害する濃度）を決定した。最大濃度は２０μｇ／ｍｌであった。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて、細胞のＡＴＰ含有量を測定することにより細胞生存率を検出した。
2018525339.tif 000012
【０２８６】
実施例３
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下でのヒトマクロファージ分化の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）
ヒト単球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ．−Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０２８）を用いて末梢血から単離した。濃縮した単球集団を、加湿雰囲気中、３７℃及び５％のＣＯ２で、１０％のＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．０１１−０９００１４Ｍ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０）及び１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ０７４ ４４０）を補った１００μｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ−Ｃａｔ．Ｎｏ．３１８７０）中において９６ウェルマイクロタイタープレートに播いた（２．５ｘ１０４細胞／ウェル）。１５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１を培地に添加すると、付着性マクロファージへの明確な分化が観察された。この分化は、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の添加によって阻害することができた。更に、単球の生存は影響を受け、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（ＣＴＧ）分析によって分析することができた。抗体処置による単球の生存の濃度依存的阻害から、ＩＣ５０を計算した（下記表参照）。
2018525339.tif 000013
【０２８７】
個別の試験シリーズにおいて、Ｍａｂ ２ Ｆ１１のヒト化バージョン、例えばｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２は、０．０７μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１）、０．０７μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８）、０．０４μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７）及び０．０９μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２）のＩＣ５０値を示した。
【０２８８】
実施例４
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下でのヒトマクロファージ分化の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）
ヒト単球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ．−Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０２８）を用いて末梢血から単離した。濃縮した単球集団を、加湿雰囲気中、３７℃及び５％のＣＯ２で、１０％のＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．０１１−０９００１４Ｍ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０）及び１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ０７４ ４４０）を補った１００μｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ−Ｃａｔ．Ｎｏ．３１８７０）中において９６ウェルマイクロタイタープレートに播いた（２．５ｘ１０４細胞／ウェル）。１５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１を培地に添加すると、接着性マクロファージへの明確な分化が観察された。この分化は、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の添加によって阻害することができた。更に、単球の生存は影響を受け、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（ＣＴＧ）分析によって分析することができた。抗体治療による単球生存率の濃度依存性の阻害に基づいて、ＩＣ５０を算出した。Ｍａｂ ２ Ｆ１１のヒト化バージョン、例えばｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７、ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２は、０．０７μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｃ１１）、０．０７μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｄ８）、０．０４μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７）及び０．０９μｇ／ｍｌ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｆ１２）のＩＣ５０値を示した。
【０２８９】
実施例５
抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体による処置下での、ヒトＭ１及びＭ２マクロファージ分化の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ）
ヒト単球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ．−Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０２８）を用いて末梢血から単離した。濃縮した単球集団を、加湿雰囲気中、３７℃及び５％のＣＯ２で、１０％のＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．０１１−０９００１４Ｍ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ−Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０）及び１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ０７４ ４４０）を補った１００μｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ−Ｃａｔ．Ｎｏ．３１８７０）中において９６ウェルマイクロタイタープレートに播いた（２．５ｘ１０４細胞／ウェル）。１００ｎｇ／ｍｌのｈｕＣＳＦ−１を培地に６日間添加すると、細長い形態を有する付着性Ｍ２マクロファージへの明確な分化が観察された。１００ｎｇ／ｍｌのｈｕＧＭ−ＣＳＦを６日間培地に添加すると、丸い形態の付着性Ｍ１マクロファージへの明確な分化が観察された。この分化は、フローサイトメトリーによって評価されるように、Ｍ２マクロファージについてはＣＤ１６３及びＭ１マクロファージについてはＣＤ８０又は高ＭＨＣクラスＩＩといった特定のマーカーの発現に関連していた。細胞をＰＢＳで洗浄し、付着があれば、ＰＢＳ中において（３７℃で２０分）５ｍＭのＥＤＴＡ溶液で除去した。次いで細胞をよく再懸濁し、染色緩衝液（ＰＢＳ中５％のＦＣＳ）で洗浄し、３００ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの染色緩衝液に再懸濁し、細胞をＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーで計数した。約１ｘ１０ｅ５個の細胞を、各ＦＡＣＳチューブに移し、３００ｘｇで５分間遠心分離し、染色緩衝液中に再懸濁した。Ｆｃγ受容体を、１μｇのヒトＩｇＧ／２，５ｘ１０ｅ４細胞（ＪＩＲ  Ｃａｔ．Ｎｏ．００９−０００−００３）と共に染色緩衝液中において２０分間氷上でインキュベートすることによりブロックした。次いで細胞を、ＣＤ８０及びＣＤ１６３検出のためには２，５ｘ１０ｅ４個の細胞当たり１，５μｌの抗体と、ＭＨＣクラスＩＩ検出のためには２，５ｘ１０ｅ４個の細胞当たり５μｌの抗体と、それぞれ混合した：ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ１６３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．５５６０１８）、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ８０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．５５７２２７）及びＡｌｅｘａ ６４７標識マウス抗ヒトＭＨＣクラスＩＩ（Ｄａｋｏ−Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０７７５）。Ａｌｅｘａ ６４７標識を、Ｚｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ ６４７マウスＩｇＧ標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｚ２５００８）を用いることにより抗体にコンジュゲートさせた。氷上での１時間のインキュベーションの後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ ＩＩで測定した。
【０２９０】
ＣＤ１６３の発現、ＣＤ８０の欠如及びＭＨＣクラスＩＩの低発現を特徴とするＭ２マクロファージの分化のみが、ヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７の添加により阻害可能であった。更に、Ｍ１マクロファージでなくＭ２マクロファージの生存は影響を受けており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（ＣＴＧ）分析によって分析することができた。７日間の抗体処置によるマクロファージの生存の濃度依存的阻害を図１ａに示す。フローサイトメトリーにより評価したＭ１及びＭ２マクロファージマーカーの発現を図１ｂに示す。
【０２９１】
実施例６
Ｍ２サブタイプ腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）とＴ細胞の関係−抗ＣＳＦ−Ｒ１抗体とＴ細胞結合剤の併用の理論的根拠
ＴＡＭとＴ細胞との間の機能的関係を調べるために、ＭＣ３８腫瘍からＴＡＭを単離し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と共培養した。
【０２９２】
ＴＡＭ抑制アッセイ
ＴＡＭを、２段階プロトコールを用いて、酵素消化後のＭＣ３８腫瘍の単細胞懸濁から濃縮した：単一細胞をＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ（クローンＭ１／７０）で染色し、抗ＦＩＴＣビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によってＭＡＣＳカラムで陽性に濃縮した。カラムから除去した後、抗ＦＩＴＣビーズを、製造者により提供される放出緩衝液プロトコルを用いて分離した。最後に、ＴＡＭ調製物から顆粒球細胞及び単球細胞を除去するために、抗Ｌｙ６Ｇ及び抗Ｌｙ６Ｃポジティブ選択ビーズを添加することによってＴＡＭを単離した。最終細胞純度を分析したところ、通常＞９０％であった。続いて、抗ＣＤ３でコーティングしたＵ底プレートにおいてＣＦＳＥで標識した全ＣＤ３＋ Ｔ細胞に対して指示された比率でＴＡＭを滴定し、可溶性抗ＣＤ２８を添加した。３日間のインキュベーションの後、細胞増殖は、前述のようにブランクのＳｐｈｅｒｏビーズを用いてＣＦＳＥｌｏｗ細胞から決定した（Hoves, S. et al. Monocyte-derived human macrophages mediate anergy in allogeneic T cells and induce regulatory T cells. J. Immunol. 177, 2691-2698 (2006)）。ＴＡＭの存在下では、ＣＤ３及びＣＤ２８の活性化によって誘導されるＴ細胞の増殖は抑制された。（図３参照）。
【０２９３】
実施例７
ＣＳＦ−１Ｒ阻害によるモノクローナル／マクロファージの標的化は、ＣＬＬにおける治療戦略として活用することができる
マクロファージ標的化の治療可能性を評価するために、我々は、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を阻害し、マクロファージの単球前駆体からの分化を阻止するモノクローナル抗体の抗白血病効果を調べた{Ries, 2014 #16}。ＭＥＣ１細胞を静脈内に（ｉ．ｖ．）移植したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスに抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを静脈内（ｉ．ｖ．）注射し（３０ｍｇ／ｋｇ、＋１１日目、＋２５日目）、最後のｍｏＡｂ注射の４８時間後の２７日目に屠殺した（図４Ａ）。マクロファージ枯渇（図４Ｂ−Ｃ）は、ＢＭ中の白血病Ｂ細胞の数を有意に減少させ（図４Ｄ）、ＳＰ中のＣＤ１９＋ ＡｎｎＶ−ＰＩ＋壊死性白血病細胞の出現を誘導した（図４Ｅ）。ＣＳＦ１Ｒの遮断がＳＰの疾患重症度を低下させることを確認するために、時間経過実験が行なわれ、ここでは最後のｍｏＡｂ注射の４８時間後及び９６時間後、それぞれ２７日目及び２９日目にマウスを屠殺した（図４Ｆ）。ＣＳＦ１Ｒの遮断は、疾患を安定化させ、経時的に脾臓白血病細胞の壊死を増加させることができた（図４Ｇ）。この抗白血病効果は、ＣＳＦ１Ｒ＋ ＭＲＣ１＋ Ｍ２様ＴＡＭの顕著かつ選択的な枯渇と関連していた（図４Ｈ−Ｉ）。既に固形腫瘍に示されているように{Ries, 2014 #16}、ＣＳＦ１Ｒの遮断は、単球枯渇と共に（図６Ａ−Ｂ）、単球（Ｌｙ６Ｃ＋）及び顆粒球（Ｌｙ６Ｇ＋）サブセットの両方を含むＳＳＣｈｉｇｈ好中球顆粒球（図Ｓ４Ｃ）及びＧｒ１＋骨髄細胞（図６Ｄ）のＰＢの相対的増加を誘導した（図６Ｅ−Ｆ）。注目すべきことに、この効果はｃｌｏｄｒｏｌｉｐでは観察されなかった（図６Ｇ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋ）。ＢＭにおいて、ＣＳＦ１Ｒ遮断は、ＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ＋（図６Ｌ）又はＬｙ６Ｃ＋（図６Ｍ−Ｎ）の何れかとして同定された単球を減少させた。Ｅμ−ＴＣＬ１  ｔｇ移植モデル（図６Ｏ）では、ＰＢ（図６Ｐ）、ＢＭ（図６Ｑ）及びＳＰ（図６Ｒ−Ｓ）におけるＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の顕著な増加が観察され、アポトーシス性白血病細胞の顕著な増加（図６Ｔ）及び脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の減少を伴っていた（図６Ｕ）。逆に、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐはＴ細胞に影響を与えなかった（図６Ｖ−Ｗ−Ｘ）。抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂの２回の投与（図５Ａ）は、疾患の進行に関連しないＢＣＲシグナル伝達を標的とする薬剤（例えば、イブルチニブ）を用いたＣＬＬ患者において既に見られた治療関連プロセスである、有意なリンパ球増加症を誘導した（図５Ｂ−Ｃ）（Byrd JC NEJM 2013）。ｍｏＡｂ処置がＣＤ１９＋ＣＤ２０＋循環白血病細胞の割合を増加させるので（図５Ｃ）、我々は、抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂを糖鎖操作されたＩＩ型ＣＤ２０  ｍｏＡｂ、ＧＡ１０１（Moessner E Blood、2010）と組み合わせることによって両面アプローチを試験した（図５Ｄ）。注目すべきことに、抗マウスＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂは、単剤としてマウスの生存に影響を与え（ｐ＝０．０１、αＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ対未処置）、組み合わせ設定において更に一層有意に影響を与えた（ｐ＜０．０００１、αＣＤ２０＋ αＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ対未処理）（図５Ｅ）。まとめると、これらの知見は、ＣＳＦ１Ｒ遮断がＣＬＬのマウスモデルにおいて治療上の利益をもたらすことを示している。更にそれらは、循環ＣＤ２０＋白血病細���のマクロファージ枯渇に関連した増加が、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせるための治療機会を表すことを示している。
【０２９４】
ＣＬＬ異種移植マウスにおけるＢＭ単球及びマクロファージの特徴づけ
我々は、単球／マクロファージがＢＭにおけるＣＬＬ増殖に影響を与えるかどうかを尋ねた。８週齢のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、ＭＥＣ１細胞（ＣＬＬ細胞株）｝を静脈内注射し（ｉ．ｖ．；０日目）{Stacchini, 1999 #50}、白血病の進行の早期段階（２１日目）又は顕性段階（３１日目）で（図７Ａ）、ＢＭ中のヒトＣＤ１９＋白血病細胞の割合がそれぞれ３３．８３±１５．０３及び８６±９．１３であったときに（図７Ｂ）死滅させた。我々は、早期白血病マウスと比較した場合、明らかな白血病性Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスのＢＭにおいて、より少ない数のＣＤ１１ｂ＋ ＣＳＦ１Ｒ＋単球及びＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋マクロファージを見出した（図７Ｃ〜Ｄ）。注目すべきことに、マクロファージマンノース受容体（ＭＲＣ１／ＣＤ２０６）、ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ８６を共発現するＣＤ１１ｂ＋細胞の存在量は、固形腫瘍の進行に関連する特徴である白血病の進行とともに増加した（図７Ｅ〜Ｆ）{De Palma, 2013 #48} (Noy & Pollard Immunity 2014)。
【０２９５】
次いで我々は、非注射マウスと比較して早期白血病を有するＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスのＢＭ微小環境の非白血病細胞におけるケモカイン、サイトカイン及び増殖因子の発現を評価した．異種移植されたマウスのＢＭ細胞は、磁性ビーズによってヒトＣＤ１９＋白血病細胞を枯渇させ、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲアレイ分析（ＲＴ２ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ）を行った。図７Ｇに示すように、白血病細胞の存在により、明確な炎症プロファイルが誘導された。我々は、Ｉｌ６、Ｃｄ４０ｌｇ、Ｉｌ２及びＩｌ１７ａなどの白血病増殖促進能力を有するサイトカインの有意な上方制御を観察した（Yan XJ Blood 2011）。Ｇｒ１＋骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が、ＩＬ−１７ａの供給源として同定され（図８Ａ）、非造血ＣＤ４５−細胞が、ＩＬ−１７ａ（図８Ｂ）及びＩＬ−２（図８Ｃ）タンパク質産生源として同定された。また、上方制御されるのは、免疫抑制活性を有するサイトカインであるＩｌ１０；単球／マクロファージ分化及び生存を促進するＣｓｆ１；Ｃｃｌ１、Ｃｃｌ３、及びＣｃｌ４などの種々のケモカイン／間質細胞走化性因子であった{De Palma, 2013 #48} (Noy & Pollard Immunity 2014)。そのようなサイトカイン／ケモカインのプロファイルは、白血病細胞増殖を促すＢＭ微小環境を示唆する。
【０２９６】
ＣＬＬ関連単球／マクロファージの分子プロフィールを特異的に特徴づけるために（図７Ｃ〜Ｄ）、２１日目（早期白血病）に屠殺されたＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの異種移植マウスのＢＭから単離された単球／マクロファージにおいて、全ゲノム転写プロファイル分析をイルミナハイブリダイゼーションシステムにより行った。
【０２９７】
年齢を適合させた非注射マウスと比較して、１６４の転写物（８４個の上方制御及び８０個の下方制御；全転写物の１．６％；調節されたＰ値＜０．０５）の調節を含む遺伝子調節の複雑なネットワークが白血病マウスの単球／マクロファージを識別した。図９Ａ−Ｅに示すように、差次的に発現された遺伝子を、炎症及び細胞内／細胞外機能を含む５つの推定上の機能的カテゴリーに編成した。並行して、我々は同じマウスから精製した白血病ＭＥＣ１細胞で起こる転写変化も分析した。特に関連するのは、ＮＯＴＣＨ１、ＢＩＲＣ３、及びＰＴＥＮ（図９Ｆ）のような、ＣＬＬ進行に関与する遺伝子に加えて、ＩＬ１０、ＲＮＡＳＥＴ２及びＣＣＬ２（強力な単球走化性因子（Noy&Pollard Immunity 2014）を含む単球／マクロファージ−白血病細胞のクロストークの存在を支持する遺伝子の差次的発現であった。我々はまた、ｑＰＣＲによって、マウス単球／マクロファージ（図１０Ａ）及びヒトＭＥＣ１細胞（図１０Ｂ）の両方において選択された遺伝子のパネルの差次的発現を確認した。Ｂ細胞接着、抗原提示及び活性化におけるその役割のために（Batista F Nat Rev Immunol 2009）、我々は、脾臓（ＳＰ）、ＢＭ又は腹腔浸出液（ＰＥ）からのマウスマクロファージ（図９Ｇ）及びＣＬＬ患者のヒト古典的単球（図１０Ｃ）の両方において、タンパク質レベルでのＩＣＡＭ１の上方制御を確認した。−１日目から３／４日毎に投与したＩＣＡＭ１遮断ｍｏＡｂを用いた異種移植研究（図１０Ｄ）は、その阻害が、ＰＢ、ＳＰ及びＰＥ中の白血病細胞の数を増加させたが、ＢＭでは増加させないことを実証し（図１０Ｅ）、従って、異なる組織におけるＩＣＡＭ１の上方の機能的関連性を示唆している。
【０２９８】
まとめると、これらの知見は、ＣＬＬ細胞がＢＭ微小環境を深く彫刻し、ＣＬＬ細胞単球／マクロファージ相互作用に関与する複数の遺伝子転写物の発現を調節することを示唆している。
【０２９９】
マクロファージの標的化によって誘導される白血病細胞死はＴＮＦに依存する
次のステップとして、我々は白血病細胞がマクロファージ標的化によってどのように影響されるかを評価した。Ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ及び抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ  ｍｏＡｂ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７）は、ＭＥＣ１細胞に対して行われた細胞傷害性アッセイによって示されるように、インビトロで白血病Ｂ細胞に対して直接毒性を有さない（図１１Ａ）。従って、我々は、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ及び抗ＣＳＦ１Ｒがｉｎ  ｖｉｖｏで白血病細胞死を誘導し得る代替の機構を検討した。この疑問に対処するために、ＭＥＣ１細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）移植したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスは、−１日目で開始して３日毎の（７回連続注射）静脈内への（ｉ．ｖ．）ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ注射によって、マクロファージを枯渇させ、最後の処置の１日後に屠殺した（図１２Ａ）。ｃｌｏｄｒｏｌｉｐによって誘導された白血病（図１２Ｂ）及び単球／マクロファージ（図１２Ｃ−Ｄ−Ｅ）細胞負荷の低減は、ＳＰ及びＢＭにおけるＣＤ１９＋ ＡｎｎＶ＋ Ｐｉ＋後期アポトーシス細胞及びＰＢ１９中のＣＤ１９＋ ＡｎｎＶ−ＰＩ＋壊死細胞の有意に増加した頻度によって示されるように（図１２Ｆ〜Ｇ）、全ての組織における白血病細胞のアポトーシスの誘導と平行していた。これらの結果は、抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ処置マウスのＳＰにおいて既に観察されたＣＤ１９＋ ＡｎｎＶ−ＰＩ＋壊死細胞の増加を確認した（図４Ｇ）。白血病Ｂ細胞と単球／マクロファージとの相互作用及びｃｌｏｄｒｏｌｉｐによる白血病Ｂ細胞アポトーシスの誘導もまた、時間経過実験で視覚化され、それによってＧＦＰ標識単球／マクロファージがｃｌｏｄｒｏｌｉｐの非存在下又は存在下でＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスからの白血病細胞に加えられた。興味深いことに、ＡｎｎＶ／ＰＩ染色及びフローサイトメトリー分析は、単球及びマクロファージの存在下でのみ、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐによる白血病細胞アポトーシスの誘導が起こることを示した（図１１Ｂ）。
【０３００】
ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ誘導性マクロファージ死滅を介して白血病細胞で誘導された細胞死経路を調べるために、我々は、移植されたＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスのＢＭからＣＤ１９＋ ＭＥＣ１細胞を精製し、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＲＯＳ、及びＦＡＳ／ＦＡＳＬ調節細胞死経路に関与する重要なエフェクター分子の発現を、ｑＰＣＲによりそのＲＮＡレベルで評価した。ＴＮＦ経路に関しては、ＴＮＦＲ１、ＦＡＤＤ、ＢＩＤ、ＢＡＸ及びＣＡＳＰ３の発現の上方制御が観察された（図Ｓ５Ｃ）。興味深いことに、我々はまた、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＡＩＦＭ１のレベルの上方制御を見出した（図Ｓ５Ｃ）。後者は、ＲＯＳ媒介性細胞死に関与している{Joza, 2009 #49}。
【０３０１】
マクロファージ標的化によって誘導された白血病細胞死の機序におけるＴＮＦの関与を確認するために（図１１Ｃ）、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ又はＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂの何れかで処置した異種移植Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスにおいて、可溶性ＴＮＦ受容体融合タンパク質であるエタネルセプト（Ｄｅｅｇ、２００２＃４４）を利用した。ＭＥＣ１細胞を静脈内に（ｉ．ｖ．）移植され、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（ｉ．ｖ．、＋１１日目、＋２５日目）及びエタネルセプト（ｉ．ｐ．、＋１０日目で開始）を注射したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスを、最後のｃｌｏｄｒｏｌｉｐ注射の２４時間後に屠殺した（図１２Ｈ）。エタネルセプトは、ＢＭにおけるｃｌｏｄｒｏｌｉｐ誘導性白血病細胞枯渇を軽減した（図１２Ｉ）。ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ（＋１１日目、＋２５日目）を静脈内に（ｉ．ｖ．）処置し、ｍｏＡｂの最後の注射の９６時間後に屠殺した異種移植マウスにおいて（図７Ｊ）、エタネルセプトによりｉｎ  ｖｉｖｏでＴＮＦ経路が遮断された場合、抗白血病効果はＳＰにおいて抑制された（図１２Ｋ）。
【０３０２】
更に、我々は、ＴＣＬ１移植システムにおいて遮断Ａｂ（クローンＫａｙ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用することにより、ＦＡＳ／ＦＡＳＬシグナル伝達を機能的に不活性化した。ＦＡＳＬの遮断は、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ（図１１Ｄ〜Ｅ〜Ｆ〜Ｇ）又はａＣＳＦ１Ｒ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７）で処置した移植マウスの白血病細胞枯渇を抑制しなかった（図１１Ｈ〜Ｉ〜Ｊ）。白血病Ｂ細胞をＦａｓＩ遺伝子のヌル機能突然変異を有するＦａｓＩｇｌｄマウスに移植することによって、同じｃｌｏｄｒｏｌｉｐの結果が確認された（図１１Ｅ−Ｆ−Ｇ）。
【０３０３】
これらの知見は、マクロファージ死滅が主にＴＮＦシグナル伝達の誘導を介して白血病細胞をアポトーシスに感作させると結論付ける。
【０３０４】
単球／マクロファージ死滅によるヒト初代ＣＬＬ細胞の標的化
最後に、我々はマウスモデルにおいて集められた関連する分子及び機能の情報をヒトの試料に適用した。最初に、ＣＬＬ患者からのＬＮ切片を免疫組織化学により分析し、増殖中心における増殖性（Ｋｉ６７＋）ＣＬＬ細胞へのＣＤ６８＋マクロファージの近接性を観察した（図１３Ａ）。次のステップとして、ヒト初代白血病細胞がｃｌｏｄｒｏｌｉｐにより影響を受け得るかどうかを評価した。Ｃｌｏｄｒｏｌｉｐは、ＭＥＣ１細胞（図１１Ａ）並びに精製されたヒト初代ＣＬＬ細胞（図１３Ｂ）に対して行われた細胞傷害性試験によって示されるように、白血病Ｂ細胞についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接毒性作用を有しなかった。しかしながら、ＣＬＬ患者の未分画末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（白血病及び正常造血細胞の両方を含む）を異なる用量のｃｌｏｄｒｏｌｉｐで処置した場合、我々は、処置の早くも３０分後（図１３Ｃ）及び更に顕著には２４時間後（図１３Ｄ）にＣＤ１４＋単球及び白血病Ｂ細胞の両方の顕著な枯渇を観察した。単球死滅によって誘導された大量の白血病細胞死を図１３Ｅに示す。単球を枯渇したＣＬＬ患者からのＰＢＭＣを播種することによって行われたＴｒａｎｓｗｅｌｌ実験は、ＣＬＬ死が必ずしも細胞−細胞接触によって誘導されるわけではないことを示した（図１３Ｆ）。次いで我々は、ヒト初代白血病細胞における細胞死の機序に関与する重要なエフェクター分子の発現を評価した。この目的のために、我々は、２４時間のｃｌｏｄｒｏｌｉｐ培養物及び未処置のコントロール培養物のＰＢＭＣからの白血病細胞を磁気ネガティブ選択により精製した。我々は、分析された全ての処置試料において、ＦＡＳの有意な上方制御を観察した（図１４Ａ、ｎ＝３）。ＦＡＳの他に、我々は、１人の患者の試料においてＴＮＦＲ１、ＦＡＤＤ、ＢＩＤ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の上方制御を観察しており（図１４Ｂ）、単球／マクロファージによって誘導されたヒト初代ＣＬＬ細胞死滅においても、幾つかの細胞死の経路（例えば、ＦＡＳ／ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ及びＴＮＦ）が関与している可能性が示唆される。
【０３０５】
白血病細胞死の機序におけるＴＮＦ及びＴＲＡＩＬの関与を調べるために、我々はエタネルセプト及び遮断抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｍｏＡｂ（Germano G CC 2013）を利用した。図１４Ｃ〜Ｄに示すように、４つの試料のうち３つにおいて、ＴＮＦ（図６Ｃ）及びＴＲＡＩＬシグナル伝達（図１４Ｄ）が遮断された場合、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐによって誘導された白血病細胞枯渇は低減した。ＣＬＬ患者からの初代細胞に対するマクロファージ標的化戦略の有効性を決定的に試験するために、ＰＢＭＣを抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７）で処置した（図１３Ｇ）。我々は、４８時間後にＣＤ１４＋単球及び白血病Ｂ細胞の関連する枯渇を観察した。より顕著なことに、抗ヒトＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂ（ｈＭａｂ  ２Ｆ１１−ｅ７）がＧＡ１０１に関連する場合、白血病細胞枯渇は有意に増加した（図１３Ｇ）。
【０３０６】
まとめると、これらの知見は、マクロファージ死滅がアポトーシスに対するＣＬＬ感受性を回復させるか、又はそれらの死を直接誘導することを示す。それらは更に、これらの発見を新規な併用療法に結び付ける根拠を裏付けている。
【０３０７】
アポトーシスの誘導又は単球分化の阻害によって新たなマクロファージの形成を防止することが知られている抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂに関する我々のデータは、通常ＣＳＦ１が単球の分化及び成熟を誘導する、とりわけＢＭニッチにおける単球／マクロファージに対する白血病クローンの依存を実証する{Ries, 2014 #16;MacDonald, 2010 #36}。単球／マクロファージ枯渇が抗白血病効果をもたらすという原則の証拠は、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐ死滅によって得られた。治療的に関連する抗ＣＳＦ１Ｒ  ｍｏＡｂで得られた結果は、ｃｌｏｄｒｏｌｉｐで得られた結果と同等であった。異なるマウスモデルにおいて、マクロファージ標的化はＣＬＬ細胞生着を損ない、更に興味深いことに顕著な抗白血病効果及びマウス生存の有意な改善と関連する。
【０３０８】
単球／マクロファージプールの枯渇は、白血病細胞のアポトーシスに従う。ｉｎ  ｖｉｖｏでの白血病細胞死を説明する分子機序は、ＴＮＦ経路の重要な分子のＲＮＡ上方制御を伴うようである。マクロファージ標的化は、ＴＮＦシグナル伝達の誘導を介して白血病細胞をアポトーシスに感作させ、ＴＮＦ依存性機構を介してそれらの死を誘発する。ヒト初代ＣＬＬ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの知見と、併用療法による異種移植マウスの生存改善は、この革新的戦略の強い可能性を裏付けた。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018525339.tif 000054
2018525339.tif 000055
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