(57)【要約】  ハイブリドーマ細胞株は、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する。これらの抗体は、様々な方法において使用することができる。一部の態様において、抗−ＡＰＯＢＥＣ３抗体は、基板に固定されてよい。別の態様において、本開示は、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に特異的に結合する抗体を作製するハイブリドーマ細胞株により作製される抗体をコードしている核酸配列を含むベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数のＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質が、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３により作製される、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
アミノ酸配列の配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４の少なくとも１つを含む、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
アミノ酸配列の配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、又は配列番号２８の少なくとも１つを含む、請求項１、２又は１０のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、並びにここで該軽鎖が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらにここで該第一の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１）が、アミノ酸配列ＱＳＶＹＮＮＮＤ（配列番号２９）、ＱＳＬＹＲＮＫＮ（配列番号３２）、ＱＮＩＹＳＮ（配列番号３５）、ＱＳＶＹＮＮＫＮ（配列番号３８）、ＨＳＶＹＮＮＮＷ（配列番号４０）、ＱＳＶＹＫＮＫＮ（配列番号４２）、又はＥＳＶＦＫＫＮＷ（配列番号４４）の少なくとも１つを含む、請求項１又は２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、並びにここで該軽鎖が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらにここで該第二の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ２）が、アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号３０）、ＹＡＳ（配列番号３３）、又はＧＡＳ（配列番号３６）の少なくとも１つを含む、請求項１、２、又は１２のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、並びにここで該軽鎖が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらにここで該第三の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ３）が、アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＤＤＶＤＴＣＡ（配列番号３１）、ＱＧＥＦＳＣＳＳＡＤＣＦＡ（配列番号３４）、ＱＳＹＶＹＳＳＳＴＡＤＴ（配列番号３７）、ＬＧＥＦＹＣＳＳＩＤＣＬＶ（配列番号３９）、ＱＧＧＹＳＳＧＤＧＩＡ（配列番号４１）、ＬＧＥＦＳＣＨＳＶＤＣＬＡ（配列番号４３）、又はＡＧＡＦＤＧＮＩＹＰ（配列番号４５）の少なくとも１つを含む、請求項１、２、１２、又は１３のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、並びにここで該重鎖が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらにここで該第一の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１）が、アミノ酸配列ＧＦＤＦＳＳ（配列番号４６）、ＧＦＳＦＳＲＧ（配列番号４９）、ＧＦＳＦＳＤＧ（配列番号５２）、ＧＦＳＬＳＳ（配列番号５５）、又はＧＦＳＩＳＳ（配列番号６１）の少なくとも１つを含む、請求項１、２、又は１２〜１４のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、並びにここで該重鎖が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらにここで該第二の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ２）が、アミノ酸配列ＹＩＤＰＶＦＧ（配列番号４７）、ＤＭＮＩＩＡＤ（配列番号５０）、ＣＩＹＤＡＳＧ（配列番号５３）、ＦＩＮＳＤＮ（配列番号５６）、ＩＩＳＳＳＧ（配列番号：５９）、又はＳＩＳＳＧＧ（配列番号６２）の少なくとも１つを含む、請求項１、２、又は１２〜１５のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、並びにここで該重鎖が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらにここで該第三の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ３）が、アミノ酸配列ＦＣＡＲＳＴ（配列番号４８）、ＦＣＶＳＧＳ（配列番号５１）、ＦＣＶＫＴＤ（配列番号５４）、ＦＣＡＴＹＲ（配列番号５７）、ＦＣＡＲＥＧ（配列番号６０）、又はＦＣＧＳ（配列番号６３）の少なくとも１つを含む、請求項１、２、又は１２〜１６のいずれか記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７記載の抗体のいずれかを使用する方法。
【請求項１９】
前記抗体を研究試薬として使用することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体を、診断試験及び予後試験の少なくとも１種のために使用することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質の１又は複数の発現を検出することをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）の発現を検出することをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法（ＩＢ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、免疫蛍光顕微鏡（ＩＦ）、及びフローサイトメトリー（ＦＬＯＷ）の少なくとも１つを実行することをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
抗体の作製方法であって：
ＷＹＫＦＤＥＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＹＬＭＤ（配列番号６４）及びＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号６５）の少なくとも１つで、宿主動物を、免疫化する工程；並びに
ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーの１又は複数のメンバーに対する抗体を作製する細胞を収集する工程：を含む、方法。
【請求項２５】
前記ＷＹＫＦＤＥＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＹＬＭＤ（配列番号６４）及びＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号６５）の両方で、宿主動物を免疫化することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
基板に固定された、請求項１〜１７のいずれか記載のモノクローナル抗体を含む装置。
【請求項２７】
ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７。
【請求項２８】
ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９。
【請求項２９】
ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５。
【請求項３０】
ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９。
【請求項３１】
ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２。
【請求項３２】
ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９。
【請求項３３】
ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３。
【請求項３４】
ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９、及びハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３の少なくとも１つにより作製された抗体をコードしている核酸配列を発現しているベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／１８６，１０９号の優先権を主張するものであり、この仮出願は引用により本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
配列表
本出願は、サイズ７２キロバイトで２０１６年６月２３日に作成された、「２０１６−０６−２３−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介し、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）へ電子的に提出された配列表を含む。この配列表に含まれる情報は、引用により本明細書中に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＡＰＯＢＥＣ３Ｂは、癌変異誘発に関与している抗ウイルス酵素である。ＡＰＯＢＥＣ３Ｂは、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリー中の７種のヒトシチジンデアミナーゼの１種である。Ａ３ファミリーは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（Ａ３Ｃ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（Ａ３Ｄ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（Ａ３Ｆ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（Ａ３Ｈ）を含む。
【発明の概要】
【０００４】
要約
本開示は、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に特異的に結合する抗体を説明する。一部の実施態様において、本抗体は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的に結合することができる。
【０００５】
一部の実施態様において、本抗体は、モノクローナル抗体であることができる。これらの実施態様の一部において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７により作製される。他の実施態様において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９により作製される。他の実施態様において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５により作製される。他の実施態様において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９により作製される。他の実施態様において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２により作製される。他の実施態様において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９により作製される。他の実施態様において、本モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３により作製される。
【０００６】
一部の実施態様において、本抗体は、アミノ酸配列の配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、又は配列番号：１４の少なくとも１つを含むことができる。
【０００７】
一部の実施態様において、本抗体は、アミノ酸配列の配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、又は配列番号:28の少なくとも1つを含むことができる。
【０００８】
一部の実施態様において、本モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含むことができ、ここで該軽鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらに該第一の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、アミノ酸配列ＱＳＶＹＮＮＮＤ（配列番号：２９）、ＱＳＬＹＲＮＫＮ（配列番号：３２）、ＱＮＩＹＳＮ（配列番号：３５）、ＱＳＶＹＮＮＫＮ（配列番号：３８）、ＨＳＶＹＮＮＮＷ（配列番号：４０）、ＱＳＶＹＫＮＫＮ（配列番号：４２）、又はＥＳＶＦＫＫＮＷ（配列番号：４４）の少なくとも１つを含む。
【０００９】
一部の実施態様において、本モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで該軽鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらに該第二の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号：３０）、ＹＡＳ（配列番号：３３）、又はＧＡＳ（配列番号：３６）の少なくとも１つを含む。
【００１０】
一部の実施態様において、本モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで該軽鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらに該第三の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、アミノ酸配列ＬＧＳＹＤＤＤＶＤＴＣＡ（配列番号：３１）、ＱＧＥＦＳＣＳＳＡＤＣＦＡ（配列番号：３４）、ＱＳＹＶＹＳＳＳＴＡＤＴ（配列番号：３７）、ＬＧＥＦＹＣＳＳＩＤＣＬＶ（配列番号：３９）、ＱＧＧＹＳＳＧＤＧＩＡ（配列番号：４１）、ＬＧＥＦＳＣＨＳＶＤＣＬＡ（配列番号：４３）、又はＡＧＡＦＤＧＮＩＹＰ（配列番号：４５）の少なくとも１つを含む。
【００１１】
一部の実施態様において、本モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで該重鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらに該第一の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、アミノ酸配列ＧＦＤＦＳＳ（配列番号：４６）、ＧＦＳＦＳＲＧ（配列番号：４９）、ＧＦＳＦＳＤＧ（配列番号：５２）、ＧＦＳＬＳＳ（配列番号：５５）、又はＧＦＳＩＳＳ（配列番号：６１）の少なくとも１つを含む。
【００１２】
一部の実施態様において、本モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで該重鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらに該第二の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、アミノ酸配列ＹＩＤＰＶＦＧ（配列番号：４７）、ＤＭＮＩＩＡＤ（配列番号：５０）、ＣＩＹＤＡＳＧ（配列番号：５３）、ＦＩＮＳＤＮ（配列番号：５６）、ＩＩＳＳＳＧ（配列番号：５９）、又はＳＩＳＳＧＧ（配列番号：６２）の少なくとも１つを含む。
【００１３】
一部の実施態様において、本モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで該重鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、並びにさらに該第三の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、アミノ酸配列ＦＣＡＲＳＴ（配列番号：４８）、ＦＣＶＳＧＳ（配列番号：５１）、ＦＣＶＫＴＤ（配列番号：５４）、ＦＣＡＴＹＲ（配列番号：５７）、ＦＣＡＲＥＧ（配列番号：６０）、又はＦＣＧＳ（配列番号：６３）の少なくとも１つを含む。
【００１４】
別の態様において、本開示は、先に要約した抗体のいずれかの使用に関与する方法を説明する。これらの方法の一部は、本抗体を研究試薬として使用することに関する。他の方法は、本抗体を、診断試験及び予後試験の少なくとも１つのために抗体を使用することに関する。
【００１５】
一部の実施態様において、本方法は、１又は複数のＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質の発現を検出することを含むことができる。これらの実施態様の一部において、本方法は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）の発現を検出することを含むことができる。
【００１６】
一部の実施態様において、本方法は、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法（ＩＢ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、免疫蛍光顕微鏡（ＩＦ）、及びフローサイトメトリー（ＦＬＯＷ）の少なくとも１つを実行することを含むことができる。
【００１７】
別の態様において、本開示は、抗体を作製する方法を説明する。一般に、本方法は、ＷＹＫＦＤＥＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＹＬＭＤ（配列番号：６４）及びＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号：６５）の少なくとも１つで、宿主動物を、免疫化すること；並びに、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーの１又は複数のメンバーに特異的に結合する抗体を作製する細胞を収集すること：を含む。一部の実施態様において、本方法は、ＷＹＫＦＤＥＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＹＬＭＤ（配列番号：６４）及びＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号：６５）の両方で、宿主動物を免疫化することを含むことができる。
【００１８】
別の態様において、本開示は、基板に固定された、先に要約された抗体のいずれかの実施態様を含む装置を説明する。
【００１９】
別の態様において、本開示は、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に特異的に結合する抗体を作製するハイブリドーマ細胞株を説明する。
【００２０】
別の態様において、本開示は、ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に特異的に結合する抗体を作製するハイブリドーマ細胞株により作製された抗体をコードしている核酸配列を含むベクターを説明する。
【００２１】
本明細書で使用される「抗体」及び「抗体類」（免疫グロブリン）は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体調製物、少なくとも２種の完全な抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単ドメイン抗体、ドメイン抗体、非限定的にＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）2断片を含む抗体断片、所望の生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド−結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ(intrabody)、又は先のいずれかのエピトープ−結合断片の少なくとも１種を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫活性断片、すなわち、抗原−結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであることができる。
【００２２】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた、先に規定した抗体を指し、すなわち、その集団に含まれた個々の抗体は、少量で存在し得る可能性がある天然に生じる突然変異以外は、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異性があり、単独の抗原性部位に対し方向づけられている。さらに、典型的には異なる抗原決定基（エピトープ）に対し方向づけられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単独の抗原決定基に対し方向づけられている。それらの特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリン産生細胞により夾雑されていない不死化ハイブリドーマ細胞により合成される点で、それらは利点がある。或いは、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体をコードしている重鎖及び軽鎖遺伝子により、安定して又は一過性にトランスフェクションされた細胞により作製され得る。修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均質な集団から得られるような、先に規定した抗体の特徴を示し、いずれか特定の方法により抗体の操作を必要とするように解釈されるものではない。用語「モノクローナル」は、本明細書において、それにより抗体が操作された方法ではなく、任意の真核細胞、原核細胞、又はファージのクローンを含む、細胞のクローン性集団から誘導される、先に規定した抗体を指すように使用される。
【００２３】
「抗原」及びその変形は、物質によりチャレンジされた対象において免疫応答を生じることが可能である任意の物質を指す。様々な実施態様において、抗原は、細胞性免疫応答、液性免疫応答、又は両方を生じ得る。好適な抗原は、合成又は天然であってよく、それらが天然に生じる場合は、内在性（例えば自己抗原）又は外来性であってよい。好適な抗原性物質は、ペプチド又はポリペプチド（ペプチド又はポリペプチドをコードしている、核酸、少なくともその一部を含む）；脂質；糖脂質；多糖；糖質；ポリヌクレオチド；プリオン；生存又は失活した細菌、ウイルス、真菌、又は寄生生物；並びに、細菌性、ウイルス性、真菌性、原虫性、腫瘍−由来の、又は生物体−由来の免疫原、毒素又はトキソイドを含むが、これらに限定されるものではない。抗原は、１又は複数のエピトープを含み得る。
【００２４】
「エピトープ」は、抗体に対し特異的結合を示す化学部分を指す。
【００２５】
「単離された」及びその変形は、その天然の環境から任意の程度で除去されている、ポリペプチドを指す。例えば、単離されたポリペプチドは、細胞から除去され、且つその天然の環境の他のポリペプチド、核酸、及び他の細胞の物質の多くが、最早存在しない、ポリペプチドである。用語「単離された」は、他の細胞成分が除去されるいずれか特定の程度を示唆しない。
【００２６】
「タンパク質」は、配列の長さに関わりなく２又はそれよりも多いアミノ酸残基の任意の配列、並びに２又はそれよりも多い個別に翻訳されたアミノ酸配列の任意の複合体を指す。タンパク質はまた、糖質、脂質、ヌクレオチド配列、又は糖質、脂質、及び／もしくはヌクレオチド配列の任意の組合せを含むように化学的に修飾されたアミノ酸配列を指す。本明細書において使用される「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、互換的に使用される。
【００２７】
「精製された」又はその変形は、特定の成分の存在が、未精製の出発物質に比べ、任意の程度まで濃厚化されている調製物を指す。精製は、例えば、調製物中の特定の成分の濃度の増加、特定の成分の第二の成分と比べた分子又は重量／重量比の増加など、任意の好適な用語で言及されてよい。
【００２８】
「特異的」及びその変形は、特定の標的に関する、任意の程度までの、示差的又は非全体的親和性を有することを指す。本明細書に使用される、ポリペプチドへ「特異的に結合する」ことができる抗体は、その抗体の合成を誘導した抗原のエピトープと相互作用する抗体、又は構造的に関連したエピトープと相互作用する抗体である。したがって抗体の説明において、用語「特異的」及び「特異的に結合する」は、抗体が、１つの又はただ１つの標的分子に結合することを暗示していないし又その必要もない。
【００２９】
語句「好ましい」及び「好ましく」は、ある状況下において、ある種の恩恵をもたらし得る本発明の実施態様を指す。しかし他の実施態様もまた、同じ状況又は他の状況の下で、好ましいことがある。さらに、１又は複数の好ましい実施態様の記述は、他の実施態様は有用でないことを暗示せず、本発明の範囲から他の実施態様を排除することを意図しない。
【００３０】
用語「含む」及びその変形は、これらの用語が本説明及び請求項において明らかにする限定的意味を有さない。
【００３１】
別に特定しない限りは、「ひとつ(a, an, the)」及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、且つ1つ又は１よりも多くを意味する。
【００３２】
同じく本明細書において、端点による数字範囲の記述は、その範囲内に包含される全ての数字を含む（例えば１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００３３】
個別の工程を含む本明細書に開示された任意の方法に関して、これらの工程は、任意の実行可能な順番で実施されてよい。並びに好適ならば、２又はそれよりも多い工程の任意の組合せが、同時に実施されてよい。
【００３４】
前述の本発明の要約は、各開示された実施態様又は本発明の全ての実行を説明することを意図するものではない。より特定の例示に従う説明は、実施態様を例証している。本出願を通じ数カ所において、指針が、実例のリストを通じて提供されているが、それらの実例は、様々な組合せで使用することができる。各場合において、引用されたリストは、代表的群としてのみ役立ち、排除的リストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ハイブリドーマクローン由来のｍＡｂ−含有上清のＥＬＩＳＡスクリーニングを示す。ハイブリドーマクローン（５２０６−２３５、５２１０−０８、５２１０−５５、５２１０−７６、５２１０−８７、５２１１−１１０、及び５２１０−１４２）由来の細胞培地上清は、標準ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ａ３Ｂｃｔｄ−ｍｙｃ−（ＨＩＳ）6精製タンパク質（Ａ３Ｂ−ＣＴＤ）への結合に関してアッセイした。結合は、抗−ウサギＨＲＰ二次抗体（１：５０００）により検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）により可視化し、並びに４５０ｎｍでの分光法により定量した。このアッセイにおける陰性対照は、抗−Ａ３Ｂを発現しないハイブリドーマクローン由来の無細胞培地上清であり、陽性対照は、ウサギ抗−Ａ３Ｇ抗体（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム１０２０１）であった。
【図２】図２は、個別のハイブリドーマクローン由来のｍＡｂ−含有上清のＥＬＩＳＡスクリーニングを示す。ハイブリドーマ単クローン（５２０６−２３５−０７、５２１０−０８−１５、５２１０−５５−１９、５２１０−７６−２９、５２１０−８７−１３、５２１１−１１０−１９、及び５２１１−１４２−１２）由来の無細胞上清は、標準ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ａ３Ｂ−ＣＴＤへの結合に関してアッセイした。結合は、抗−ウサギＨＲＰ二次抗体（１：５０００）により検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）により可視化し、並びに４５０ｎｍでの分光法により定量した。このアッセイにおける陰性対照は、抗−Ａ３Ｂを発現しないハイブリドーマクローン由来の無細胞培地上清であり、陽性対照は、ウサギ抗−Ａ３Ｇ抗体（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム１０２０１）であった。
【図３】図３は、７メンバーのＡＰＯＢＥＣ３ファミリーに対する各抗−Ａ３Ｂモノクローナル抗体の免疫ブロット法を示す。２９３Ｔ細胞由来の細胞溶解液を、各ＨＡ−タグ付けＡＰＯＢＥＣ３タンパク質（Ａ３Ａ−ＨＡ、Ａ３Ｂ−ＨＡ、Ａ３Ｃ−ＨＡ、Ａ３Ｄ−ＨＡ、Ａ３Ｆ−ＨＡ、Ａ３Ｇ−ＨＡ、Ａ３Ｈ−ＨＡ）、又は発現ベクター単独により一過性にトランスフェクションし、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。メンブレンは、各ハイブリドーマ細胞株（５２０６−２３５−０７、５２１０−０８−１５、５２１０−５５−１９、５２１０−７６−２９、５２１０−８７−１３、５２１１−１１０−１９、及び５２１１−１４２−１２）の１／３希釈物、抗−Ａ３Ｇ（６０１００、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社、シカゴ、ＩＬ）の１／１０００希釈物、抗−ＨＡ（Ｃ２９Ｆ４、ウサギｍＡｂ３７２４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ダンバース、ＭＡ）の１／１０００希釈物、又は抗−チューブリン（ＭＭＳ−４０７Ｒ、Ｃｏｖａｎｃｅ社、エメリービル、ＣＡ）の１／２０，０００希釈物由来の上清によりプロービングした。メンブレンをさらに、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を溶媒とする５０％Ｂｌｏｋ（ＷＢＡＶＤＰ００１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ダルムシュタット、独国）中の抗−ウサギＩｇＧ  ＩＲ８００ＣＷ（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ９２６−３２２１１、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、リンカーン、ＮＥ）の１／２０，０００又は抗−マウスＩｇＧ  ＩＲ８００ＣＷ（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ８２７−０８３６４、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、リンカーン、ＮＥ）の１／２０，０００を含む好適な二次抗体によりプロービングし、且つ画像を、ＬＩ−ＣＯＲイメージング（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、リンカーン、ＮＥ）を用い作製した。
【図４】図４は、抗−Ａ３Ｂハイブリドーマ上清により検出された、ＨｅＬａ細胞において過剰発現されたＡ３Ｂ−ＧＦＰの免疫蛍光測定を示す。ＨｅＬａ細胞は、６ウェルプレートにおいて、２５０，０００個／ウェルで播種した。細胞は、Ａ３Ｂ−ＧＦＰ構築体(Lackeyら、J. Mol. Bio. 2012; 419(5):301-14)の２００ｎｇによりトランスフェクションした。１６時間後、細胞を、８チャンバー式スライドにおいて、３０，０００個細胞／チャンバーで播種した。播種の２４時間後に、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１時間固定し、洗浄し、且つハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３、又はハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９由来の上清中で、室温で一晩インキュベーションした。細胞を、１×ＰＢＳで５回洗浄し、抗−ウサギ−ＴＲＩＴＣ（１：５００）（１１１０９５１４４、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ウェストグローブ、ＰＡ）中で３７℃で１時間インキュベーションし、その後２時間かけて室温に戻した。１×ＰＢＳで５回洗浄した後、核をヘキストにより室温で１５分間染色した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、スライドを、４℃で１×ＰＢＳ中に浸漬させて、貯蔵した。画像は、倍率６０×で、１秒のＴＲＩＴＣ露光時間で撮影し、（規準化するため）９００×９００ピクセルでトリミングし、１０％サイズまで縮小した。
【図５】図５は、フローサイトメトリー（ＦＬＯＷ）による、２種の癌細胞株における内在性Ａ３Ｂの細胞内染色を示す。ＯＶＣＡＲ５細胞(Monksら、1991, J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766)及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３２、ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）を、対照ｓｈＲＮＡ又はＡ３Ｂ−特異的ｓｈＲＮＡのいずれかをコードしているレンチウイルスにより、形質導入した。薬物選択（ピューロマイシン）の後、細胞を、１％パラホルムアルデヒド中で固定し、冷メタノール中で透過処理した。次に細胞を、ウサギ抗−Ａ３Ｂ  ５２１０−８７−１３と共に、室温で１時間インキュベーションし、引き続き抗−ウサギＰＥ−コンジュゲート二次抗体と共に、暗所において室温で２０分間インキュベーションした。未結合の抗体を除去するために１回ＰＢＳ洗浄した後、細胞を、フローサイトメーター上で分析した。ｓｈＲＮＡにより枯渇された内在性Ａ３Ｂを伴う細胞は、有意に低い平均蛍光強度を有する。
【図６】図６は、フローサイトメトリー（ＦＬＯＷ）による、癌細胞株における外来性（トランスフェクションされた）Ａ３Ｇの細胞内染色を示す。ＳｕｐＴ１１細胞株は、ｐｃＤＮＡ３．１（ＳｕｐＴ１１＋ベクター）又はｐｃＤＮＡ３．１  Ａ３Ｇ−ＨＡ（ＳｕｐＴ１１＋Ａ３Ｇ−ＨＡ）により、安定してトランスフェクションされた。細胞を、１％パラホルムアルデヒド中で固定し、冷メタノール中で透過処理した。次に細胞を、ウサギ抗−Ａ３Ｂ  ５２１０−８７−１３又はウサギ抗−５２１１−１０−１９と共に、室温で１時間インキュベーションし、引き続き抗−ウサギＰＥ−コンジュゲート二次抗体と共に、暗所において室温で２０分間インキュベーションした。細胞を、フローサイトメーター上で分析した。
【図７】図７は、Ａ３Ｂ  ｓｈＲＮＡ又は対照ｓｈＲＮＡ(Burnら、2013, Nature 494(7437):366-370)で処理した、様々な癌細胞株における内在性Ａ３Ｂの検出を示す。（Ａ）様々な癌細胞株（子宮頸癌（ＤＯＴＣ２  ４５１０、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−７９２０、ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）、膀胱癌（Ｔ２４、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−４、ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）、乳癌（ＺＲ−７５−１、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５００、ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）、頭頸部扁平上皮癌（ＪＳＱ３、Weichselbaumら、1988, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 15:575-579)、及び卵巣癌（ＯＶＣＡＲ５、Monksら、1991, J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766))からの溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンへ移し、ＰＢＳを溶媒とする５％ミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で、抗−ヒトＡ３Ｂ  ｍＡｂ（５２１０−８７−１３）（１：５０）により免疫ブロットし、抗−ウサギＨＲＰ二次抗体により検出した。（Ｂ）骨肉腫（Ｕ−２  ＯＳ、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６、ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）細胞を、ｓｈ対照又はｓｈＡ３Ｂ構築体(Burnら、2013, Nature 494(7437):366-370)により形質導入し、８チャンバー式スライド中に、２０，０００個細胞／チャンバーで播種した。播種の２４時間後、細胞を、４％ＰＦＡ中で３０分間固定した。スライドを、一次抗体（５２１０−８７−１３、１：５希釈）と共に、室温で一晩インキュベーションした。１×ＰＢＳで５回洗浄した後、細胞を、抗−ウサギ（抗−Ｒｂ）ＴＲＩＴＣ（１：５００）中で、３７℃で１時間インキュベーションし、その後２時間かけて室温まで冷却した。１×ＰＢＳで５回洗浄した後、核をヘキスト色素により１５分間染色した。色素を除去し、細胞を、４℃で１×ＰＢＳ中に浸漬させて、貯蔵した。画像は、倍率６０×で、９００×９００ピクセルでトリミングし、１０％サイズまで縮小した。
【図８Ａ】図８Ａは、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ軽鎖配列のアラインメントを示す。（Ａ）ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−７由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８−１５由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：３）、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：４）；ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：５）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：６）、及びハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３由来のＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号：７）を含む、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ軽鎖ヌクレオチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。ペプチド番号は、当初の免疫化に使用されたペプチドを示し；Ａ３結合特異性は、右側に列挙している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ軽鎖配列のアラインメントを示す。（Ｂ）ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−７由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：８）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：９）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８−１５由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：１０）、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：１１）、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：１２）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：１３）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３由来のＩｇ軽鎖タンパク質配列（配列番号：１４）を含む、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ軽鎖タンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。このアラインメントは、フレームワーク（ＦＲ）ドメイン及び相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。同一のアミノ酸（＊）及び類似のアミノ酸（：）は、配列の下側に示している。ペプチド番号は、当初の免疫化に使用されたペプチドを示し；Ａ３結合特異性は、右側に列挙している。
【図９Ａ】図９Ａは、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ重鎖配列のアラインメントを示す。（Ａ）ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−７由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１５）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１６）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８−１５由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１７）、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１８）；ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：１９）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２０）、及びハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３由来のＩｇ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２１）を含む、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ重鎖ヌクレオチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。ペプチド番号は、当初の免疫化に使用されたペプチドを示し；Ａ３結合特異性は、右側に列挙している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ重鎖配列のアラインメントを示す。（Ｂ）ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−７由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２２）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２３）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８−１５由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２４）、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２５）、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２６）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２７）、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３由来のＩｇ重鎖タンパク質配列（配列番号：２８）を含む、抗−ヒトＡ３ＢハイブリドーマＩｇ重鎖タンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。このアラインメントは、フレームワーク（ＦＲ）ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）、多様性ドメイン（Ｄ）及び結合ドメイン（ＪＨ）を示す。同一のアミノ酸（＊）及び類似のアミノ酸（：）は、配列の下側に示し；Ａ３結合特異性は、右側に列挙している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
例証的実施態様の詳細な説明
本開示は、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂにおける、シチジンデアミナーゼに結合する抗体；かかる抗体を作製するハイブリドーマ；並びに、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーのメンバー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂに結合する抗体の製造方法を説明している。ＡＰＯＢＥＣ３Ｂは、癌変異誘発に関与している抗ウイルス酵素であり、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーにおけるシチジンデアミナーゼのファミリーの一員である。ＡＰＯＢＥＣ３Ｂは、精製が困難なタンパク質であり、この欠点及び関連するＡＰＯＢＥＣ３ファミリーメンバーとのその相同性は、これまでＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的な抗体の開発を困難にしてきた。本明細書記載の抗体は、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂの酵素の研究のために価値のある試薬を提供する。
【００３７】
本開示はまた、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーの１又は複数のメンバー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂへ特異的に結合する抗体を作製する方法を説明している。一実施態様は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的に結合する抗体の作製のために、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的なエピトープを使用する方法である。
【００３８】
本開示はさらに、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーの１又は複数のメンバー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂへ特異的に結合する抗体を使用する方法を説明している。
【００３９】
ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に結合する抗体
一部の実施態様において、本明細書記載の抗体は、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーのメンバー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂへ結合する。一部の実施態様において、これらの抗体は、例えば、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）などを含むヒトＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質を含む、霊長類ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質に結合する。
【００４０】
一実施態様において、ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーのメンバー、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂに結合する抗体は、以下のハイブリドーマの１又は複数により作製された抗体の重鎖及び軽鎖に存在する１又は複数の配列を有することができる：５２０６−２３５−０７、５２１０−７６−２９、５２１０−０８−１５、５２１１−１１０−１９、５２１１−１４２−１２、５２１０−５５−１９、及び５２１０−８７−１３。各ハイブリドーマの軽鎖に関するアミノ酸配列は、各々、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、及び配列番号：１４として同定されている。各ハイブリドーマの重鎖に関するアミノ酸配列は、各々、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、及び配列番号：２８として同定されている。
【００４１】
一部の実施態様において、本抗体は、以下のハイブリドーマの１又は複数により作製された抗体の重鎖及び軽鎖に存在する１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む：５２０６−２３５−０７、５２１０−７６−２９、５２１０−０８−１５、５２１１−１１０−１９、５２１１−１４２−１２、５２１０−５５−１９、及び５２１０−８７−１３（図８Ｂ及び９Ｂ）。抗体は、同じハイブリドーマ及び／又は異なるハイブリドーマにより作製される抗体の重鎖及び軽鎖に存在するＣＤＲを含んでよい。
【００４２】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＱＳＶＹＮＮＮＤ（配列番号：２９）（ＣＤＲ１）、ＲＡＳ（配列番号：３０）（ＣＤＲ２）、及び／又はＬＧＳＹＤＤＤＶＤＴＣＡ（配列番号：３１）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４３】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＱＳＬＹＲＮＫＮ（配列番号：３２）（ＣＤＲ１）、ＹＡＳ（配列番号：３３）（ＣＤＲ２）、及び／又はＱＧＥＦＳＣＳＳＡＤＣＦＡ（配列番号：３４）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４４】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＱＮＩＹＳＮ（配列番号：３５）（ＣＤＲ１）、ＧＡＳ（配列番号：３６）（ＣＤＲ２）、及び／又はＱＳＹＶＹＳＳＳＴＡＤＴ（配列番号：３７）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４５】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＱＳＶＹＮＮＫＮ（配列番号：３８）（ＣＤＲ１）、ＧＡＳ（配列番号：３６）（ＣＤＲ２）、及び／又はＬＧＥＦＹＣＳＳＩＤＣＬＶ（配列番号：３９）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４６】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＨＳＶＹＮＮＮＷ（配列番号：４０）（ＣＤＲ１）、ＧＡＳ（配列番号：３６）（ＣＤＲ２）、及び／又はＱＧＧＹＳＳＧＤＧＩＡ（配列番号：４１）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４７】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＱＳＶＹＫＮＫＮ（配列番号：４２）（ＣＤＲ１）、ＧＡＳ（配列番号：３６）（ＣＤＲ２）、及び／又はＬＧＥＦＳＣＨＳＶＤＣＬＡ（配列番号：４３）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４８】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＥＳＶＦＫＫＮＷ（配列番号：４４）（ＣＤＲ１）、ＧＡＳ（配列番号：３６）（ＣＤＲ２）、及び／又はＡＧＡＦＤＧＮＩＹＰ（配列番号：４５）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３により作製される抗体の軽鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００４９】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＤＦＳＳ（配列番号：４６）（ＣＤＲ１）、ＹＩＤＰＶＦＧ（配列番号：４７）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＡＲＳＴ（配列番号：４８）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５０】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＲＧ（配列番号：４９）（ＣＤＲ１）、ＤＭＮＩＩＡＤ（配列番号：５０）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＶＳＧＳ（配列番号：５１）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５１】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＳＦＳＤＧ（配列番号：５２）（ＣＤＲ１）、ＣＩＹＤＡＳＧ（配列番号：５３）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＶＫＴＤ（配列番号：５４）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５２】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳ（配列番号：５５）（ＣＤＲ１）、ＦＩＮＳＤＮ（配列番号：５６）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＡＴＹＲ（配列番号：５７）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５３】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳ（配列番号：５５）（ＣＤＲ１）、ＩＩＳＳＳＧ（配列番号：５９）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＡＲＥＧ（配列番号：６０）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５４】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＳＩＳＳ（配列番号：６１）（ＣＤＲ１）、ＳＩＳＳＧＧ（配列番号：６２）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＧＳ（配列番号：６３）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５５】
本抗体は、例えば、アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳ（配列番号：５５）（ＣＤＲ１）、ＳＩＳＳＧＧ（配列番号：６２）（ＣＤＲ２）、及び／又はＦＣＧＳ（配列番号：６３）（ＣＤＲ３）を含む、ハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３により作製される抗体の重鎖に存在する１又は複数のＣＤＲを含んでよい。
【００５６】
一部の実施態様において、ＡＰＯＢＥＣ３ファミリーの１つのファミリーメンバーに特異的に結合する抗体はまた、例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（Ａ３Ｃ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（Ａ３Ｄ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（Ａ３Ｆ）；ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）；及び／又は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（Ａ３Ｈ）を含む、ＡＰＯＢＥＣ３ファミリーの他のメンバーにも特異的に結合するであろう（図３）。例えば、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９、及びハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２由来の抗体は、Ａ３Ａ及びＡ３Ｂを認識し；ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７由来の抗体は、Ａ３Ｂ及びＡ３Ｆを認識し；ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９及びハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３由来の抗体は、Ａ３Ａ、Ａ３Ｂ、及びＡ３Ｇを認識することができる（図３、図８Ｂ、及び図９Ｂ）。
【００５７】
ＡＰＯＢＥＣ３タンパク質に結合する抗体の作製方法
１又は複数の実施態様において、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的なエピトープは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的に結合する抗体を作製するために使用することができる。例えば、Ａ３Ｂ残基１７１−１９４を表しているＷＹＫＦＤＥＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＹＬＭＤ（配列番号：６４）及び／又はＡ３Ｂ残基３５４−３８２を表しているＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号：６５）は、哺乳動物を免疫化し、抗体−産生細胞を作製するために使用することができる。宿主動物又はそれから培養された抗体−産生細胞の経路及びスケジュールは、一般に抗体の刺激及び産生に関する確立された従来の技術に沿うものである。宿主動物は、例えば、ウサギ、マウス、又はヒト対象もしくはそれから得られた抗体−産生細胞を含む任意の他の哺乳動物であってよい。一部の実施態様において、標的アミノ酸配列を含む抗原、エピトープ、又は断片は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、オボアルブミンなど、免疫化された種において免疫原性であるタンパク質にコンジュゲートされてよい。加えて、当業者は、ポリクローナル抗体、並びにモノクローナル抗体の精製及び濃縮に関する免疫学技術分野において共通の様々な技術を知っているであろう。
【００５８】
モノクローナル抗体の調製物もまた、当業者に周知である。例えば、Kohler及びMilstein、Nature 1975、256:495；Coliganら、第2.5.1-2.6.7節ｌ及び、Harlowら、「抗体及び実験マニュアル(ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL)」、726頁(Cold Spring Harbor Pub. 1988)を参照されたい。簡単には、モノクローナル抗体は、抗原を含有する組成物の、例えばマウス又はウサギを含む動物への注射；血清試料の分析による抗体産生の存在の証明；Ｂリンパ球を得るための、脾臓の摘出；ハイブリドーマを作製するための、Ｂリンパ球の骨髄腫細胞との融合；該ハイブリドーマのクローニング；該抗原に対する抗体を産生する陽性クローンの選択；及び、該ハイブリドーマ培養物からの抗体の単離により得ることができる。モノクローナル抗体は、様々な良く確立された技術により、ハイブリドーマ培養物から、単離及び精製されることができる。かかる単離技術は、プロテインＡセファロースによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００５９】
一部の実施態様において、抗体は、宿主細胞及び単離された細胞により産生されてよい。特定の実施態様において、細胞は、ハイブリドーマ細胞である。一部の追加の実施態様において、ハイブリドーマ細胞株は、５２０６−２３５−０７、５２１０−７６−２９、５２１０−０８−１５、５２１１−１１０−１９、５２１１−１４２−１２、５２１０−５５−１９、及び／又は５２１０−８７−１３である。
【００６０】
一部の実施態様において、抗体はまた、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を使用し（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され並びに配列決定されてよい。ハイブリドーマ細胞又はハイブリドーマ細胞株は、かかるＤＮＡの給源として働くことができる。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され、これは次に、例えば、２９３Ｆ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞へとトランスフェクションされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば相同配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによるか、又は非−免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有的に結合することにより、修飾されてよい。
【００６１】
一部の実施態様において、発現ベクターは、ハイブリドーマ細胞株５２０６−２３５−０７、ハイブリドーマ細胞株５２１０−７６−２９、ハイブリドーマ細胞株５２１０−０８−１５、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１１０−１９、ハイブリドーマ細胞株５２１１−１４２−１２、ハイブリドーマ細胞株５２１０−５５−１９、及び／又はハイブリドーマ細胞株５２１０−８７−１３により作製された抗体をコードしている核酸配列を含む。
【００６２】
抗体断片は、完全な抗体のタンパク質分解性加水分解によるか、又はその断片をコードしている核酸の発現により、調製することができる。抗体断片は、従来の方法による完全な抗体のペプシンもしくはパパインによる消化により得ることができる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ′）２を意味する５Ｓ断片を提供するための、ペプシンによる抗体の酵素的切断により作製され得る。この断片はさらに、チオール還元剤、及び任意にジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のブロック基を使用し切断され、３．５Ｓ  Ｆａｂ′一価断片を作製することができる。一部の場合において、ペプシンを使用する酵素的切断を使用し、２つの一価のＦａｂ′断片及びＦｃ断片を直接作製することができる。
【００６３】
一価の軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、更なる断片の切断、又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝的技術のような、抗体を切断する他の方法もまた、そのエピトープに結合する能力の一部を保持する（例えば選択的に結合する）断片を提供するために、使用することができる。
【００６４】
本明細書に提供される抗体は、実質的に純粋であることができる。抗体に言及して本明細書において使用される用語「実質的に純粋」とは、抗体が、それと天然に会合されている他のポリペプチド、脂質、糖質、及び核酸を実質的に含まないことを意味する。したがって実質的に純粋な抗体は、その天然の環境から取り除かれ、且つ少なくとも６０％純粋である、任意の抗体である。実質的に純粋な抗体は、少なくとも約６５％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約７５％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９９％純粋であることができる。
【００６５】
ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質に結合する抗体の使用方法
ＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーの１又は複数のメンバーに、特にＡＰＯＢＥＣ３Ｂに特異的に結合する抗体は、例えば、分子生物学、免疫学、及び／又は癌生物学のための研究試薬として、並びにＡＰＯＢＥＣ３Ｂ発現に関する、診断試験及び／又は予後試験のための臨床試薬として含む、多種多様な適用において使用することができる。抗体は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法（ＩＢ）、免疫沈降（ＩＰ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光測定（ＩＦ）、及び／又はフローサイトメトリーなどのために使用することができる。
【００６６】
アッセイは、定量的及び／又は定性的であることができ、且つ例えば、細胞内、細胞膜上、組織内、及び体液内を含む、様々な位置における、１又は複数のＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）ファミリーメンバーの発現を検出することができる。アッセイは、例えば、正常及び／又は異常なタンパク質発現のレベルを決定するために使用することができる。 
【００６７】
一部の実施態様において、装置は、１又は複数のＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質に特異的に結合する抗体を含むことができる。一部の実施態様において、装置は、１又は複数のＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）タンパク質に特異的に結合する１又は複数の抗体を、基板に固定することを含む。一部の実施態様において、抗体又は抗体類は、抗体マイクロアレイ、抗体チップ、及び／又はタンパク質チップの一部として基板上に固定されてよい。
【００６８】
本発明は、下記実施例により例示される。特定の実施例、物質、量、及び手順は、以下に説明するような本発明の範囲及び精神に従い、広範に解釈されるべきであることは理解されるべきである。
【実施例】
【００６９】
実施例
エピトープ選択
７種のヒトＡＰＯＢＥＣ３（Ａ３）酵素の完全タンパク質配列を、ＧｅｎＢａｎｋから得た：ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ２６４１７．１；ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＷ３１７４３．１；ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（Ａ３Ｃ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ１１７３９．１；ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（Ａ３Ｄ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＩＣ５７７３１．１；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（Ａ３Ｆ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３８７２０．１；ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３８７２２．１；ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（Ａ３Ｈ）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＫ７７７７４．１。
【００７０】
ＣｌｕｓｔａｌＷを使用し、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（Ａ３Ｂ）に独自の領域を同定した。２つの領域を、ペプチド免疫原の合成のために選択した。ペプチドは、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社（バーリンゲーム、ＣＡ）により合成した。ペプチド１０であるＷＹＫＦＤＥＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＹＬＭＤ（配列番号：６４）は、Ａ３Ｂ残基１７１−１９４を表す。ペプチド１２であるＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号：６５）は、Ａ３Ｂ残基３５４−３８２を表す。Ａ３Ｂに独自ではあるが、ファミリーメンバー間での広範な相同性は、不可避であり：ペプチド１０は、Ａ３Ｆと２０／２４残基を共有し、並びにペプチド１２は、Ａ３Ａと２７／２８残基及びＡ３Ｇと２５／２８残基を共有する（表１）。
【００７１】
【表１】
2018527895.tif 000002
【００７２】
免疫化及びハイブリドーマ作出
２匹のウサギを、各ペプチド免疫原（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社、バーリンゲーム、ＣＡと契約）により免疫化した。ウサギには、１０〜１２週間の過程で、ＫＬＨ−コンジュゲートしたペプチドを用い３回注射し、その後ＯＶＡ−コンジュゲートしたペプチドによりさらに２回注射した。ウサギからの被験採血物を、抗−Ａ３Ｂ発現について、免疫ブロット法（ＩＢ）により、スクリーニングした(Towbinら、Proc. Nat’l Acad. Sci. U S A. 1979; 76(9):4350-4)。
【００７３】
Ａ３−ＨＡタンパク質を発現した２９３Ｔ細胞からの溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を溶媒とする５０％ＢＬＯＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ダルムシュタット、独国）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中に、１／１０００希釈した被験採血物により免疫ブロットした。
【００７４】
この採血物を、Ａ３Ｂ−ＧＦＰタンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞の免疫蛍光顕微鏡（ＩＦ）により、さらにスクリーニングした。Ｈｅｌａ細胞は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、次に１×ＰＢＳを溶媒とする５％ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中のウサギ血清（１：２００）と共に、インキュベーションした。Ａ３Ｂ結合は、抗−ウサギ−ＴＲＩＴＣ（１：５００）により可視化した。
【００７５】
３匹の抗−Ａ３Ｂ陽性ウサギ（５２０６、５２１０、５２１１）を、Ｂ細胞単離及びハイブリドーマ作製のために脾臓を摘出する前に、最終免疫化ブーストのために選択した。選択されたウサギ由来のリンパ球による、４０×９６−ウェルプレートのハイブリドーマ融合は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社（バーリンゲーム、ＣＡ）により行った。ハイブリドーマ上清は、組換えＡ３Ｂｃｔｄ−ｍｙｃ−（ＨＩＳ）6精製タンパク質に対するＥＬＩＳＡスクリーニングにより、反応性抗−Ａ３Ｂ抗体についてスクリーニングした(Burnsら、2013, Nature 494(7437):366-370)。代表的データは、図１に示している。候補ハイブリドーマを、増殖した。
【００７６】
ハイブリドーマスクリーニング
免疫ブロット法
ＥＬＩＳＡ−陽性単クローンハイブリドーマ由来の培養培地上清を、免疫ブロット法によりスクリーニングした。Ａ３−ＨＡタンパク質を発現している２９３Ｔ細胞(Hultquistら、J. Virol. 2011; 85, 11220-34)由来の溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンへ移し、並びにＰＢＳを溶媒とする５０％ＢＬＯＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ダルムシュタット、独国）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中のハイブリドーマ細胞培地上清（１：３）により、免疫ブロットし、抗−ウサギＩｇＧ  ＩＲ８００ＣＷ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、リンカーン、ＮＥ）により検出し、ＬＩ−ＣＯＲイメージング（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、リンカーン、ＮＥ）により画像化した。代表的データは、図３に示している。
【００７７】
免疫蛍光測定法
ＥＬＩＳＡ−陽性単クローンハイブリドーマ由来の培養培地上清を、免疫蛍光顕微鏡によりスクリーニングした。蛍光Ａ３タンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、次に１×ＰＢＳを溶媒とする５％ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で細胞培地上清（１：５）とインキュベーションした。Ａ３Ｂ結合を、抗−ウサギ−ＴＲＩＴＣ（１：５００）により可視化した。代表的データを、図４に示している。
【００７８】
ハイブリドーマ増殖
最強の、最も特異的な抗−Ａ３Ｂ血清を発現している７種の単クローンハイブリドーマ（５２０６−２３５−０７、５２１０−０８−１５、５２１０−５５−１９、５２１０−７６−２９、５２１０−８７−１３、５２１１−１１０−１９、５２１１−１４２−１２）を、同定し、増殖させ、且つストックを凍結した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ
抗−Ａ３Ｂ  ｍＡｂを発現している純粋なハイブリドーマクローンを、Ａ３Ｂｃｔｄ−ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）6精製タンパク質に対するＥＬＩＳＡスクリーニングにより同定した(Burnsら、2013, Nature 494(7437):366-370)。Ａ３Ｂｃｔｄ−ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）6精製タンパク質（２０ｎｇ／ウェル）を、ポリスチレンプレートとの親水性及び疎水性相互作用を介して、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定した。各プレートを、３％ＢＳＡによりブロックし、次に該ハイブリドーマクローン由来の未希釈の細胞培地上清と共にインキュベーションした。結合を、抗−ウサギＨＲＰ二次抗体（１：５０００）により検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で可視化し、４５０ｎｍでの分光法により定量した。代表的データは、図２に示している。
【００８０】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）精製
７種の抗−ヒトＡ３Ｂハイブリドーマを、１Ｌまで増殖させ、次に無血清培地へ１週間交換した。この培地を、細胞を除去する遠心分離により透明化し、その後プロテインＡ（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ボカラトン、ＦＬ）上を通過させ、ＩｇＧに結合させた(Wilchekら、Methods Enzymol. 1984;104:3-55)。このモノクローナル抗体を、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）中で溶離し、ＰＢＳに対し透析し、アジド（０．０２％）を含むＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）中で凍結保存した。
【００８１】
癌細胞株における内在性Ａ３Ｂの免疫ブロット
抗−ヒトＡ３Ｂ  ５２１０−８７−１３を、Ａ３Ｂを発現している様々なヒト癌細胞株に対し、免疫ブロットした。様々な癌細胞株由来の溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンへ移し、ＰＢＳを溶媒とする５％ミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の抗−ヒトＡ３Ｂ  ｍＡｂ（５２１０−８７−１３）（１：５０）により免疫ブロットし、抗−ウサギＨＲＰ二次抗体により検出した。細胞がＡ３Ｂ  ｓｈＲＮＡで処理された場合に(Burnsら、2013, Nature 494(7437):366-370)、Ａ３Ｂの発現は、減少又は除去され、図５Ａに示されたようにＡ３Ｂ発現をノックダウンし、これはこのｍＡｂの特異性を明らかにしている。
【００８２】
内在性Ａ３Ｂの免疫蛍光顕微鏡
抗−ヒトＡ３Ｂ  ｍＡｂ（５２１０−８７−１３）を使用し、内在性Ａ３Ｂを検出した。Ｕ２ＯＳ細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、その後１×ＰＢＳ中の５％ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で抗−ヒトＡ３Ｂ  ｍＡｂ（５２１０−８７−１３）とインキュベーションした。Ａ３Ｂ結合は、抗−ウサギ−ＴＲＩＴＣ（１：５００）により可視化した。Ａ３Ｂの発現は、細胞が、Ａ３Ｂ  ｓｈＲＮＡで処理された場合に、減少又は除去され、これは図５Ｂに示したようにＡ３Ｂ発現をノックダウンした。
【００８３】
重鎖及び軽鎖配列決定
２４０Ｅ−Ｗ融合パートナー由来のウサギハイブリドーマ株は、変動量の内在性Ｉｇ重鎖を発現する（米国特許第７，４２９，４８７号）。これは、該Ｉｇ軽鎖に関するＢリンパ球から選択されたＩｇ重鎖と競合し、所望のｍＡｂの低下した力価及び親和性を生じる。これらの抗−ヒトＡ３Ｂ  ｍＡｂの有効性を改善するために、Ｉｇ重鎖及び軽鎖遺伝子を、以下のように配列決定した。
【００８４】
ＲＮＡ精製
ハイブリドーマ細胞（１×１０7個細胞）を、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ．社、ヒルデン、独国）を通した遠心分離により剪断し、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎ．Ｖ．社、ヒルデン、独国）を用い精製した。
【００８５】
Ｉｇ軽鎖及び重鎖遺伝子の定常領域のｃＤＮＡ配列決定
前記ウサギハイブリドーマから精製したＲＮＡを、逆転写のための鋳型として使用し、オリゴ−ｄＴ（３’  ＲＡＣＥアダプターＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（配列番号：６６））からプライミングし、ｃＤＮＡを合成した。ウサギ免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖遺伝子の定常領域を、ウサギＩｇ重鎖又は軽鎖遺伝子定常領域に対する５’プライマー（Ｈｃ定常５’アウタープライマーＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号：６７）、Ｈｃ定常５’インナープライマーＧＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣ（配列番号：６８）、Ｉｇ  Ｌｃ  ５’アウタープライマーＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴ（配列番号：６９）、Ｉｇ  Ｌｃ  ５’インナープライマーＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣ（配列番号：７０））、及び３’  ＲＡＣＥプライマー（３’  ＲＡＣＥアウタープライマーＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ（配列番号：７１）、３’  ＲＡＣＥインナープライマーＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号：７２））を使用する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。このＤＮＡ産物を、ｐＪＥＴ１．２／ブラントベクター（ＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）に連結させ、且つ配列決定した。これらの軽鎖遺伝子のＤＮＡ配列及びタンパク質配列は、図８Ａ及び図８Ｂに示している。プライマー配列の統合リストについては、表２を参照されたい。
【００８６】
【表２】
2018527895.tif 000003
【００８７】
重鎖Ｉｇ遺伝子の可変領域のｃＤＮＡ配列決定
５’ＲＬＭ−ＲＡＣＥを、ＦＩＲＳＴＣＨＯＩＣＥ  ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）を用いて実行した(Maruyamaら、Gene. 1994; 138(1-2):171-4)。ＲＮＡを、ウシ小腸ホスファターゼにより処理し、分解されたｍＲＮＡからリン酸分子を除去した。次に、タバコ酸性ホスファターゼ処理は、完全長ｍＲＮＡからキャップを除去した。その後５’ＲＡＣＥアダプター（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ５’  ＲＡＣＥアダプターＧＣＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＧＡＡＵＧＡＡＣＡＣＵＧＣＧＵＵＵＧＣＵＧＧＣＵＵＵＧＡＵＧＡＡＡ（配列番号：７３））を、このｍＲＮＡに連結した。逆転写を実行し、ランダム六量体からプライミングし、ｃＤＮＡを合成した。ウサギＩｇ重鎖遺伝子の可変領域を、５’  ＲＡＣＥアダプターに対する５’入れ子式プライマー（５’  ＲＡＣＥアウタープライマーＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧ（配列番号：７４）、５’  ＲＡＣＥインナープライマーＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧ（配列番号：７５））、及びウサギＩｇ重鎖定常領域に対する３’入れ子式プライマー（Ｉｇ  Ｈｃ  ５’アウターリバースＧＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＴ（配列番号：７６）、Ｉｇ  Ｈｃ  ５’インナーリバースＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＣＣ（配列番号：７７）、Ｉｇ鎖アウター（リバース）ＣＣＧＧＧＡＧＧＴＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＣ（配列番号：７８）、Ｉｇ鎖インナー（リバース）ＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧ（配列番号：７９）、ＩｇＨｃ  ３’−Ｊｈ３／５リバースＣＲＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧ（配列番号：８０）、ＩｇＨｃ  ５’−Ｊｈ３／５リバースＣＣＣＣＡＧＲＧＡＴＣＣＡＡＣＣＲＲＴＣ（配列番号：８１））を使用する、２ラウンドのＰＣＲにより増幅した。このＤＮＡ産物を、ｐＪＥＴ１．２／ブラントベクター（ＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）にクローニングし、且つ配列決定した。これらの重鎖遺伝子のＤＮＡ配列及びタンパク質配列は、図９Ａ及び図９Ｂに示している。プライマー配列の統合リストについては、表２を参照されたい。
【００８８】
重鎖及び軽鎖サブクローニング
ウサギのハイブリドーマ重鎖及び軽鎖Ｉｇ遺伝子を、遺伝子特異的プライマー（Ｋｐｎ−５’  Ｉｇ  Ｌｃ  ｇａｇｇｔａｃｃＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＣＣ（配列番号：８２）、Ｘｈｏ−３’  Ｉｇ  Ｌｃ  ＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＡＧｃｔｃｇａｇａｃｇｃ（配列番号：８３）、５’−Ｎｈｅ１  Ｉｇ  Ｈｃ  ＣＡＧｇｃｔａｇｃａｃｃＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣ（配列番号：８４）、３’−Ｍｌｕ１  Ｉｇ  Ｈｃ  ｔａｇａｃｇｃｇｔＴＣＡｔｔｔａＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＧ（配列番号：８５））を使用し、ｐＪＥＴ１．２から、ＰＣＲにより増幅し、並びにｐｃＤＮＡ３．１＋真核細胞発現ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）へサブクローニングした。プライマー配列の統合リストについては、表２を参照されたい。
【００８９】
高力価ウサギ抗−ヒトＡ３Ｂ  ｍＡｂを発現するためのプロトコール
ウサギハイブリドーマ５２１０−８７−１３及び５２１１−１１０−１９に関する重鎖及び軽鎖Ｉｇ遺伝子を、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）において、２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、ＭＡ）へ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、ＰＥＩ：ＤＮＡ比３：１で使用し、トランスフェクションした。
【００９０】
培養培地１５０ｍＬを収集し、且つモノクローナル抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ボカラトン、ＦＬ）により精製した。これらのモノクローナル抗体を、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶離し、ＰＢＳに対し透析し、アジド（０．０２％）を含むＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）中で凍結保存した。モノクローナル抗体５２１０−８７−１３濃度１３μｇ／ｍＬ、５２１１−１１０−１９濃度３６μｇ／ｍＬ。
【００９１】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能なもの（例として、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑなどの、ヌクレオチド配列提出物、並びに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどの、アミノ酸配列提出物、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、引用により組み込まれている。本出願の開示と引用により本明細書中に組み込まれている任意の文書の開示の間に矛盾が存在する場合には、本出願の開示が支配することとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ示されている。それらからの不必要な限定はないと、理解されるべきである。本発明は、示され且つ説明されたまさにその詳細に限定されるものではなく、当業者に明らかな変形は、請求項により規定される本発明内に含まれるであろう。
【００９２】
別に指定しない限りは、本明細書及び請求項において使用される成分、分子量、及びそのようなものの量を表現している全ての数字は、用語「約」により全ての場合において修飾されていると理解されるべきである。したがって、その反対であることを別に指定しない限りは、本明細書及び請求項において言及される数字パラメータは、本発明により得ようとされる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。各数字パラメータは、少なくとも、請求項の範囲と同等の理論(doctrine)を限定することを企図するものとしてではなく、報告された有効数字の数字を考慮し、通常の丸め法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００９３】
本発明の広範な範囲を示す数字範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において示された数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし全ての数値は、それらの各試験測定値において認められる標準偏差から必ず生じる範囲を本質的に含む。
【００９４】
全ての見出しは、読者の便宜のためであり、そのように特定しない限りは、見出しの後の本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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