(57)【要約】  肺癌を検出するための尿検査のためのバイオマーカーパネルは、ＤＭＡ、Ｃ５：１、Ｃ１０：１、ＡＤＭＡ、Ｃ５−ＯＨ、ＳＤＭＡ、およびキヌレニン、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルは、バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、Ｃ１０：２、ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０、およびＰＣ  ａｅ  Ｃ４４：５；ならびにｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌を検出するための尿検査のためのバイオマーカーパネルであって、前記バイオマーカーパネルが、ＤＭＡ、Ｃ５：１、Ｃ１０：１、ＡＤＭＡ、Ｃ５−ＯＨ、ＳＤＭＡ、およびキヌレニン、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する、バイオマーカーパネル。
【請求項２】
肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルであって、前記バイオマーカーパネルが、バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、Ｃ１０：２、ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０、およびＰＣ  ａｅ  Ｃ４４：５；ならびにｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する、バイオマーカーパネル。
【請求項３】
肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルであって、前記バイオマーカーパネルが、バリン、Ｃ１０：２、ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４４：５、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する、バイオマーカーパネル。
【請求項４】
後期肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルであって、前記バイオマーカーパネルが、バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、Ｃ１０：２、およびｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する、バイオマーカーパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアミン代謝産物およびその他の代謝産物を測定することにより、癌を検出する方法、特に、肺癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミン経路は、癌細胞において有意に上方制御されていることが実証されている。スペルミジン／スペルミンＮ1−アセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）は、この経路における重要な酵素として認識されており、すべての哺乳類細胞において高度に制御されている。ＳＳＡＴは、正常組織においては非常に低濃度で存在しているが、癌細胞においてはかなりより高いレベルで存在している。それゆえ、ＳＳＡＴの細胞レベルが上昇すると、その酵素活性の測定値は、癌の存在および重症度と相関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
尿および血清におけるポリアミン代謝産物およびその他の代謝産物を測定することにより、肺癌を検出する方法が提供される。
【０００４】
肺癌を検出するための尿検査のためのバイオマーカーパネルもまた提供され、ここで、バイオマーカーパネルは、ＤＭＡ、Ｃ５：１、Ｃ１０：１、ＡＤＭＡ、Ｃ５−ＯＨ、ＳＤＭＡ、およびキヌレニン、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【０００５】
肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルがさらに提供され、ここで、バイオマーカーパネルは、バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、Ｃ１０：２、ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０、およびＰＣ  ａｅ  Ｃ４４：５；ならびにｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【０００６】
肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルがさらにまた提供され、ここで、バイオマーカーパネルは、バリン、Ｃ１０：２、ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４４：５、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【０００７】
後期肺癌を検出するための血清検査のためのパネルがさらにまた提供され、バイオマーカーパネルは、バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、Ｃ１０：２、およびｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【０００８】
本発明は、以下の、添付の図面を参照して単に例示的にのみ与えられるその実施形態の記載からより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、健康患者および癌患者における代謝産物の濃度を示す箱ひげ図である；
【図２】図２は、尿試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）プロットである；
【図３】図３は、尿代謝産物を識別する重要度が高い順での投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析プロット順位である；
【図４】図４は、図３に示される尿試料のＶＩＰ分析からの７つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析である；
【図５】図５は、血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）プロットである；
【図６】図６は、血清代謝産物を識別する重要度が高い順での投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析プロット順位である；
【図７】図７は、図６に示される血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）である；
【図８】図８は、時間Ｔ１における血清試料中の個々の代謝産物の一変量分析を示す表である；
【図９】図９は、時間Ｔ２における血清試料中の個々の代謝産物の一変量分析を示す表である；
【図１０】図１０は、時間Ｔ１における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す主成分分析（ＰＣＡ）プロットである；
【図１１】図１１は、時間Ｔ１における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す３次元主成分分析（ＰＣＡ）プロットである；
【図１２】図１２は、時間Ｔ１における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）プロットである；
【図１３】図１３は、時間Ｔ１における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す３次元部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）プロットである；
【図１４】図１４は、時間Ｔ１における血清代謝産物を識別する重要度が高い順での投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析プロット順位である；
【図１５】図１５は、図１４に示される血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析である；
【図１６】図１６は、時間Ｔ２における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す主成分分析（ＰＣＡ）プロットである；
【図１７】図１７は、時間Ｔ２における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す３次元主成分分析（ＰＣＡ）プロットである；
【図１８】図１８は、時間Ｔ２における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）プロットである；
【図１９】図１９は、時間Ｔ２における血清試料の分析に基づく対照患者と肺癌患者との間の分離を示す３次元部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）プロットである；
【図２０】図２０は、時間Ｔ２における血清代謝産物を識別する重要度が高い順での投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析プロット順位である；そして
【図２１】図２１は、図２０に示される血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
対照患者、初期癌患者、および後期癌患者からの血清試料を、ダイレクトインジェクション質量分析および逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの組合せを用いて分析した。オーストリア６０２０、インスブルック、エドゥアルト・ボーデム・ガッセ８（Ｅｄｕａｒｄ−Ｂｏｄｅｍ−Ｇａｓｓｅ  ８  ６０２０，Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ，Ａｕｓｔｒｉａ）のＢｉｏｃｒａｔｅｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧから得たＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットを、アメリカ合衆国９４４０４、カリフォルニア州、フォスターシティー、リンカーンセンタードライブ８５０（８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４４０４，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘから得たＡＰＩ４０００  ＱＴｒａｐ（登録商標）タンデム質量分析装置と組合せて用いて、アミノ酸、アシルカルニチン、生体アミン、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質および糖を含む１８０種類もの異なる内因性代謝産物の標的化同定および定量を行った。
【００１１】
使用した方法は、分析物の誘導体化および抽出と、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ペアを用いる選択的質量分析検出とを組み合わせるものである。同位体ラベルされた内部標準およびその他の内部標準は、代謝産物定量のためのＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットのプレートフィルターに組み込まれている。ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットは、シーリングテープを備えたフィルタープレートを有する９６ディープウェルプレートならびにプレートアッセイの準備に用いられる試薬および溶媒を含む。ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットにおける最初の１４のウェルは、１つのブランク、３つのゼロ試料、各ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットに備えられている、７つの標準および３つのクオリティコントロール試料用に使用した。すべての血清試料を、ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットのユーザーマニュアルに記載されているプロトコールを使用して、ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットによって分析した。
【００１２】
血清試料を氷上で解凍し、ボルテックスにかけ、２７５０×ｇで５分間４℃で遠心分離した。各血清試料の１０μＬを９６ウェルキットプレートの上側のフィルターの中央に載せ、窒素流中で乾燥させた。２０μＬの５％フェニルイソチオシアナート溶液を次いで誘導体化のために添加した。フィルタースポットを次いで再度エバポレーターを用いて乾燥させた。代謝産物の抽出を次いで５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する３００μＬのメタノールを添加することによって達成した。抽出液を９６ディープウェルプレートの下側へと遠心分離することによって得た。この後、ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットからのＭＳランニング溶媒による希釈工程を行った。
【００１３】
質量分析を、溶媒送達系を装備したＡＰＩ４０００  ＱＴｒａｐ（登録商標）タンデム質量分析装置にて行った。血清試料を質量分析装置へとダイレクトインジェクション（ＤＩ）方法または液体クロマトグラフィー方法のいずれかによって送達した。ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットに同梱のＢｉｏｃｒａｔｅｓ  ＭｅｔＩＱ（商標）ソフトウェアを用いて、試料登録から代謝産物濃度の自動化計算までのアッセーワークフロー全体を管理し、他のデータ分析プログラムへとデータをエクスポートした。標的化プロファイリングスキームを用いて、多重反応モニタリング、ニュートラルロス、およびプレカーサーイオンスキャンを使用して、定量的に既知の低分子代謝産物についてスクリーニングした。
【００１４】
第１研究
代謝産物を、１０名の対照患者および化学療法治療を受けている１２名の肺癌患者から採取した尿試料においてＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを用いて検出し、定量した。特に、以下の尿試料中のポリアミン経路代謝産物を検出し、定量した：スペルミジン、スペルミン、メチオニン、プトレシン、メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭｅ）、オルニチン、アルギニン、Ｎ−アセチルスペルミン、およびＮ−アセチルスペルミジン。
【００１５】
図１に示されるこの研究の結果は、４つの代謝産物、即ち、スペルミジン、オルニチン、アルギニンおよびメチオニンが、癌についての推定バイオマーカーとして同定されたことを示す。この研究からの結果は、癌患者および健康対象におけるポリアミンメタボロームの予備像を明らかにした。
【００１６】
第２研究
代謝産物を、１５名の対照患者および３１名の肺癌患者（７名の初期癌患者を含む）から採取した尿および血清試料において検出した。試料を、上記のようにダイレクトインジェクション質量分析（ＭＳ）および逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを組み合わせて用いて分析した。統計分析を、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃｏｍ）およびＲＯＣＣＥＴ（ｗｗｗ．ｒｏｃｃｅｔ．ｃａ）を用いて行った。
【００１７】
以下の代謝産物を、Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｌ８０ＩＤＱ（商標）キットを用いて同定し、定量した：
【００１８】
【表１】
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【００１９】
ＰＬＳ判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）の結果、図２に示されるように尿においては７つの代謝産物、図５に示されるように血清においては５つの代謝産物に基づいた、肺癌患者と対照患者との検出可能な分離がもたらされた。
【００２０】
非対称性および対称性形態における全ジメチルアルギニン（ＤＭＡ）、チグリルカルニチン（Ｃ５：１）、デセノイルカルニチン（Ｃ１０：１）、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、ヒドロキシバレリルカルニチン（Ｃ５−ＯＨ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、およびキヌレニンが、図３に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて肺癌を識別するための７つの最も重要な尿中代謝産物であるようである。尿試料のＶＩＰ分析からの７つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を、図４に示す。
【００２１】
バリン、デカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）、グリセロリン脂質（ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２；ＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０、およびＰＣ  ａｅ  Ｃ４４：５）が、図６に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて肺癌を識別するための５つの最も重要な血清代謝産物であるようである。血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を、図７に示す。
【００２２】
したがって、７つの推定尿中バイオマーカーおよび５つの推定血清バイオマーカーが肺癌の診断のために同定され、肺癌を検出するための尿検査または血清検査のためのバイオマーカーパネルにおいて使用され得る。
【００２３】
第３研究
代謝産物を、時間Ｔ１およびＴ２において２６名の後期肺癌患者および１５名の対照患者から採取した血清試料において検出した。特に、以下のポリアミン経路代謝産物を、時間Ｔ１およびＴ２における血清試料において検出し、定量した：バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、デカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）、グリセロリン脂質（ＰＣ  ａａ  Ｃ３２：２およびＰＣ  ａｅ  Ｃ３６：０）、ｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、メチルチオアデノシン、およびプトレシン。
【００２４】
試料を、上記のようにダイレクトインジェクション質量分析（ＭＳ）および逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを組み合わせて用いて分析した。統計分析を、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃｏｍ）およびＲＯＣＣＥＴ（ｗｗｗ．ｒｏｃｃｅｔ．ｃａ）を用いて行った。しかし、メチルチオアデノシンおよびプトレシンは、欠測率が５０％より高かったために分析から除外した。図８および図９は、残りの個々の代謝産物の時間（Ｔ１）および（Ｔ２）における一変量分析の結果をそれぞれ示す。
【００２５】
時間Ｔ１における主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）の結果、図１０から図１３に示されるように、血清における１１の代謝産物に基づいた、肺癌患者と対照患者との検出可能な分離がもたらされた。
【００２６】
全バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、ｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、およびデカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）が、図１４に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて後期肺癌を識別するための５つの最も重要な血清代謝産物であるようである。血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を図１５に示す。
【００２７】
時間Ｔ２における主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）の結果、図１６から図１９に示されるように、血清における１１の代謝産物に基づいた、肺癌患者と対照患者との検出可能な分離がもたらされた。
【００２８】
全バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、ｌｙｓｏＰＣ  ａ  Ｃ１８：２、およびデカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）がまた、図２０に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて後期肺癌を識別するための５つの最も重要な血清代謝産物であるようである。血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を図２１に示す。
【００２９】
したがって１１の推定血清バイオマーカーが、後期肺癌の診断のために同定され、肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルにおいて用いられ得る。
【００３０】
上記に提供された詳細の多くは単に例示的なものであり、以下の特許請求の範囲を参照して決定されるべき本発明の範囲を限定する意図のものではないことが、当業者により理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
2018523139.tif 000025
2018523139.tif 000026