(57)【要約】  対象者、例えば癌を有する対象者を階層化し治療するための方法、キット及び組成物が本明細書に提供される。幾つかの例では、本方法には、放射標識重鎖抗体由来の放射標識重鎖可変ドメイン(VHH)又はその機能的断片の、スクリーニング剤及び治療剤の両方としての使用が含まれる。幾つかの例では、VHH又はその機能的断片は、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する対象者を、該対象者において、スクリーニング線量の重鎖抗体由来の放射標識重鎖可変ドメイン(VHH)又はその機能的断片が検出されることに基いて、治療について選定し；
該対象者に、治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片を投与すること
を含んでなり、前記VHH又はその機能的断片は、癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合し、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている、癌治療法。
【請求項２】
スクリーニング線量を前記対象者に投与し、対象者の選択前に、該対象者の腫瘍部位における放射標識VHH又はその機能的断片の存在を検出すること
を更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
放射標識VHH又はその機能的断片の存在の検出が前記対象者を撮像することを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
撮像法が、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴造影法のような非核造影法と組み合わされていてもよい、γカメラ撮像法、例えば平面γカメラ撮像法、単光子放出コンピュータ断層法又は陽電子放出断層法である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
放射性同位体がヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186又はレニウム-188である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
放射性同位体がリンカーを介してVHH又はその機能的断片に付着している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
VHH又はその機能的断片がN-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]-SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で放射標識されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
スクリーニング線量が約37MBq〜約370MBqであり、治療線量が約370MBq〜約18500MBqである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
放射標識VHH又はその機能的断片がHER2に特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
放射標識VHH又はその機能的断片が、競合アッセイを用いて測定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))ともモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))とも競合しない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
放射標識VHH又はその機能的断片が、
配列番号１を有するCDR1領域と配列番号２を有するCDR2領域と配列番号３を有するCDR3領域、及び、
配列番号４を有するCDR1領域と配列番号５を有するCDR2領域と配列番号６を有するCDR3領域
を含む群より選択される１つのCDR組合せを含んでなる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
放射標識VHH又はその機能的断片が
配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
放射標識VHH又はその機能的断片が配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と同一である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スクリーニング線量及び治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片が各々独立して対象者に静脈内、腹腔内又は髄腔内投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
放射標識VHH又はその機能的断片が一価形式で存在する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
放射標識VHH又はその機能的断片がシステイン含有タグ、好ましくはGGCタグを含まない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
放射標識VHH又はその機能的断片が寿命の延長をされていない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
放射標識VHH又はその機能的断片がタグ付加されていない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
癌が固形腫瘍である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
癌が血液学的癌である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、多発性骨髄腫又はリンパ腫である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合する、スクリーニング線量の放射標識VHH又はその機能的断片と、
治療線量の前記放射標識VHH又はその機能的断片
を含んでなり、前記VHH又はその機能的断片はγ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている、キット。
【請求項２３】
放射性同位体がヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186又はレニウム-188である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
放射性同位体がリンカーを介してVHH又はその機能的断片に付着している、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
VHH又はその機能的断片がN-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]-SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で放射標識されている、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
スクリーニング線量が約37MBq〜約370MBqであり、治療線量が約370MBq〜約18500MBqである、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
放射標識VHH又はその機能的断片がHER2に特異的に結合する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
放射標識VHH又はその機能的断片が、競合アッセイを用いて測定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))ともモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))とも競合しない、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
放射標識VHH又はその機能的断片が、
配列番号１を有するCDR1領域と配列番号２を有するCDR2領域と配列番号３を有するCDR3領域、及び、
配列番号４を有するCDR1領域と配列番号５を有するCDR2領域と配列番号６を有するCDR3領域
を含む群より選択される１つのCDR組合せを含んでなる、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
放射標識VHH又はその機能的断片が配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
放射標識VHH又はその機能的断片が配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と同一である、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
スクリーニング線量及び治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片が各々独立して対象者への静脈内、腹腔内又は髄腔内投与用に製剤化されている、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
放射標識VHH又はその機能的断片が一価形式で存在する、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
放射標識VHH又はその機能的断片がシステイン含有タグ、好ましくはGGCタグを含まない、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
放射標識VHH又はその機能的断片が寿命の延長をされていない、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
放射標識VHH又はその機能的断片がタグ付加されていない、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
癌治療に使用するための、癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合し、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている重鎖抗体由来の放射標識重鎖可変ドメイン(VHH)又はその機能的断片であって、
癌を有する対象者が、スクリーニング線量の放射標識VHH又はその機能的断片の該対象者における検出に基いて治療について選択され、
その後、放射標識VHH又はその機能的断片が「治療線量」で選択された対象者に投与される、VHH又はその機能的断片。
【請求項３８】
放射標識VHH又はその機能的断片が対象者にスクリーニング線量で投与され、対象者の選択前に該対象者の腫瘍部位で検出される、請求項３７に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項３９】
放射標識VHH又はその機能的断片の検出が前記対象者を撮像することを含んでなる、請求項３８に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４０】
撮像法が、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴造影法のような非核造影法と組み合わされていてもよい、γカメラ撮像法、例えば平面γカメラ撮像法、単光子放出コンピュータ断層法又は陽電子放出断層法である、請求項３９に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４１】
放射性同位体がヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186又はレニウム-188である、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４２】
放射性同位体がリンカーを介してVHH又はその機能的断片に付着している、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４３】
VHH又はその機能的断片がN-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]-SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で放射標識されている、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４４】
スクリーニング線量が約37MBq〜約370MBqであり、治療線量が約370MBq〜約18500MBqである、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４５】
HER2に特異的に結合する、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４６】
競合アッセイを用いて測定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))ともモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))とも競合しない、請求項４５に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４７】
配列番号１を有するCDR1領域と配列番号２を有するCDR2領域と配列番号３を有するCDR3領域、及び、
配列番号４を有するCDR1領域と配列番号５を有するCDR2領域と配列番号６を有するCDR3領域
を含む群より選択される１つのCDR組合せを含んでなる、請求項４５又は４６に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４８】
配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項４９】
配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と同一である、請求項４８に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５０】
スクリーニング線量及び治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片が各々独立して対象者に静脈内、腹腔内又は髄腔内投与される、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５１】
一価形式で存在する、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５２】
システイン含有タグ、好ましくはGGCタグを含まない、請求項３７〜５１のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５３】
寿命の延長をされていない、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５４】
タグ付加されていない、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５５】
癌が固形腫瘍である、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５６】
癌が血液学的癌である、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【請求項５７】
癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、多発性骨髄腫又はリンパ腫である、請求項３７〜５４のいずれか１項に記載の使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、放射標識抗体断片及び治療のための対象者の階層化についてのその使用の分野に関する。具体的には、本開示は、癌治療のための対象者の階層化に用いる放射標識抗体断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
癌治療の成功は、異なる個体における癌の異質性に一部起因して、未だに困難なままである。治療成功確率を向上させるため、特定の癌治療に応答する蓋然性が高い対象者の選択方法を開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
幾つかの態様において、本開示は、スクリーニング線量及び治療線量の放射標識された抗体断片(例えば、重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン(本明細書において「VHH」とも呼ぶ))を利用して、治療について対象者を選択した後、選択した対象者を治療する方法、キット及び組成物を提供する。幾つかの実施形態では、スクリーニング線量を用いて、放射標識抗体断片が対象者の癌細胞又は固形腫瘍に結合可能であることを決定することにより、当該患者は、治療線量の放射標識抗体断片での治療の候補であることが示される。理論に拘束されることを望まないが、本放射標識抗体断片のスクリーニング剤及び治療薬の両方として用いることにより、該スクリーニング剤を用いて治療について選択された対象者は該治療薬に応答する蓋然性が増大すると考えられる。
【０００４】
幾つかの態様において、本開示は、癌の治療方法を提供し、該方法は、
スクリーニング線量の重鎖抗体由来の放射標識重鎖可変ドメイン(VHH)又はその機能的断片の対象者における検出に基いて、癌を有する対象者を治療について選択し；
該対象者に、治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片を投与すること
を含んでなり、前記VHH又はその機能的断片は、癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合し、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている。幾つかの実施形態では、当該方法は、
スクリーニング線量を前記対象者に投与し、対象者の選択前に、該対象者の腫瘍部位における放射標識VHH又はその機能的断片の存在を検出することを
を更に含んでなる。
【０００５】
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片の存在の検出は、対象者を撮像することを含んでなる。幾つかの実施形態では、撮像法は、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴造影法のような非核造影法と組み合わされていてもよい、γカメラ撮像法(例えば、平面γカメラ撮像法)、単光子放出コンピュータ断層法又は陽電子放出断層法である。
本明細書に記載の方法のいずれかの幾つかの実施形態では、放射性同位体はヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186又はレニウム-188である。
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射性同位体はリンカーを介してVHH又はその機能的断片に付着している。
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、VHH又はその機能的断片はN-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]-SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で放射標識されている。
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は37MBq〜370MBqであり、治療線量は370MBq〜18500MBqである。
【０００６】
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片はHER2に特異的に結合する。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、競合アッセイを用いて測定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))ともモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))とも競合しない。
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、
配列番号１を有するCDR1領域と配列番号２を有するCDR2領域と配列番号３を有するCDR3領域、及び
配列番号４を有するCDR1領域と配列番号５を有するCDR2領域と配列番号６を有するCDR3領域
を含む群より選択される１つのCDR組合せを含んでなる。
【０００７】
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と同一である。
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量及び治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片は各々独立して対象者に静脈内、腹腔内又は髄腔内投与される。
【０００８】
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は一価形式で存在する。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片はシステイン含有タグ、好ましくはGGCタグを含まない。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は寿命の延長をされていない。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片はタグ付加されていない。
本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、癌は血液学的癌である。本明細書に記載のいずれかの方法の幾つかの実施形態では、癌は乳癌、卵巣癌、胃癌、多発性骨髄腫又はリンパ腫である。
【０００９】
本開示の他の態様は、キットに関し、該キットは
癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合する、スクリーニング線量の放射標識VHH又はその機能的断片と、
治療線量の前記放射標識VHH又はその機能的断片
を含んでなり、前記VHH又はその機能的断片はγ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている。
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射性同位体はヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186又はレニウム-188である。
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射性同位体はリンカーを介してVHH又はその機能的断片に付着している。
【００１０】
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、VHH又はその機能的断片はN-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]-SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で放射標識されている。
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は37MBq〜370MBqであり、治療線量は370MBq〜18500MBqである。
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片はHER2に特異的に結合する。本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、競合アッセイを用いて測定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))ともモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))とも競合しない。
【００１１】
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、
配列番号１を有するCDR1領域と配列番号２を有するCDR2領域と配列番号３を有するCDR3領域、及び
配列番号４を有するCDR1領域と配列番号５を有するCDR2領域と配列番号６を有するCDR3領域
を含む群より選択される１つのCDR組合せを含んでなる。
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する。本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と同一である。
【００１２】
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、スクリーニング線量及び治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片は各々独立して対象者への静脈内、腹腔内又は髄腔内投与用に製剤化されている。
本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は一価形式で存在する。本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片はシステイン含有タグ、好ましくはGGCタグを含まない。本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は寿命の延長をされていない。本明細書に記載のいずれかのキットの幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片はタグ付加されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
「
【図１】タグ付加されていない一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの治療効果を示す。動物(群あたりn=6/7)を、タグ付加されていない一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(「131I-SGMIB-2Rs15d nb」)の週１回の注射で処置し、対照群の動物には、ビヒクル溶液(「ビヒクル溶液」)又はタグ付加されていない一価[131I]SGMIB標識非標的化対照VHH(「131I-SGMIB-non-targeting nb」)で処置した。動物を、体重減少が20％を超えるか又は腫瘍容積が１cm3を超えたときに安楽死させた。異なる群における動物の生存率を示す。
【図２】25℃のPBS中での144時間までの及び37℃のヒト血清中での168時間までの[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(CAM-VHH1)の安定性。96％を超える活性が、PBS中でインキュベートしながらの72時間後にタンパク質画分中に見出され、約95％がヒト血清中でインキュベートしながらの24時間後に見出された。
【図３】[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(CAM-VHH1)のHER2発現腫瘍細胞及びHER2発現がブロックされた腫瘍細胞に対する特異的結合。データは平均±SDで示した(n=6)。
【図４】HER2発現腫瘍細胞に対する[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(CAM-VHH1)の結合親和性。データは平均±SDとして示し(n=3)、4.74±0.4nMのKDを得た。
【図５】HER2発現腫瘍細胞における[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(CAM-VHH1)の内在化プロフィール。データは、時点０、１、２、４、６及び24時間での平均±SDとして示す(n=3)。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明を説明する前に、本発明が本明細書で開示した特定の方法及び実験条件に制限されないこと(そのような方法及び条件は変化し得るので)を理解すべきである。また、本明細書に用いた用語は、特定の実施形態の説明という目的のためだけであり、制限する意図はなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることを理解すべきである。
更に、本発明の実施には、特に示さない限り、先行技術に含まれる従来の分子及び細胞生物学的並びに免疫学的技法を用いる。このような技法は当業者に周知であり、文献に十分に説明されている。Ausubelら編，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)(全ての追補版を含む)、MR Green及びJ. SambrookによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual (第４版)並びにHarlowら，Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013，第２版)を参照。
【００１５】
Ｉ．定義
本明細書に別段の定義をしない限り、本明細書に用いる科学用語及び技術用語は、当業者が通常に理解する意味を有するものとする。万一、潜在的な多義性があれば、本明細書に示した定義が、いかなる辞書又は外部定義にも優先する。文脈がそうでないことを示していない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。「又は」は、別段の言及がない限り、「及び/又は」の意味で用いる。用語「含む」は非制限的に用いる。
一般に本明細書に記載する細胞培養、組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関して用いる命名法は、当該分野において周知なものであり、普通に用いられる。本明細書に提供した方法及び技法は、一般に、別段の記載がなければ、当該分野において周知である従来の方法に従って、また、本明細書を通じて引用され、議論される種々の概説書及びより具体的な参考文献に記載されているように、行われる。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当該分野において普通になされているように又は本明細書に記載したように、行われる。本明細書に記載した分析化学、合成有機化学並びに医学及び薬学化学に関して用いる命名法、及びこれらの実験手順及び技法は、当該分野において周知なものであり、普通に用いられる。化学合成、化学分析、製剤調製、処方及び送達、並びに患者の治療には、標準的技法を用いる。
本開示をより容易に理解し得るように、選択した用語を下記に定義する。
【００１６】
本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「an」及び「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、単数形及び複数形の指示対象を含む。
用語「含む(comprising)」、「含む(comprise)」及び「含む(comprised of)」は、本明細書で用いる場合、「含む(including)、「含む(include)」、「含有する(containing)」又は「含有する(contain)」と同義であり、包括的又は開放式であり、更なる記載されていないメンバー、要素又は方法工程を排除しない。
終点による数値範囲の言及は、それぞれの範囲内に包摂される全ての数及び分数並びに言及される終点を含む。
パラメータ、量、時間などの測定可能な値に言及する場合の用語「約」は、本明細書で用いる場合、特定される値のそして特定される値からの±10％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、更により好ましくは±0.1％以下の変動を包含する(そのように変動することが開示される発明において適切である限り)ことを意味する。修飾語「約」が言及する値は、その数値自体が具体的に開示されており、その数値自体が好ましいものとして開示されていると理解される。
【００１７】
本明細書で用いる場合、アミノ酸残基は、それらの正式名称又は標準的な三文字若しくは一文字アミノ酸コードのいずれかにより示される。
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」及び「アミノ酸配列」は交換可能に用いられ、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む、任意の長さのアミノ酸の重合形態のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」は交換可能に用いられ、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はそれらのアナログのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態のことをいう。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してよく、既知又は未知の任意の機能を行い得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、制御領域、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマーを含む。核酸分子は直鎖状又は環状であり得る。
【００１８】
本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、少なくとも、同じ又は異なる分類群からの２つの高分子間、特に２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド間の二次構造的類似性であって、系統が共通することに起因する類似性のことをいう。よって、用語「ホモログ」は、二次構造的類似性、場合によっては三次構造的類似性を有するように関連する高分子のことをいう。２つ又は３つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、幾つかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性(のパーセンテージ)」は、当業者に公知の方法を用いて、例えば、第２のヌクレオチド配列の対応する位置のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドの数を、第１のヌクレオチド配列の全ヌクレオチド数で除し、100％を乗じることによるか、又はNCBI Blastのような配列アラインメントのための公知のコンピュータアルゴリズムを用いることにより算出し得る。幾つかの実施形態では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定するに際し、当業者は所謂「保存的」アミノ酸置換を考慮し得る。ここで、「保存的」アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸残基が類似する化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられるが、ポリペプチドの機能、活性又はその他の生物学的特性にはほとんど又は本質的に全く影響しないアミノ酸置換として説明できる。可能な保存的アミノ酸置換は当業者に明らかである。アミノ酸配列及び核酸配列は、全長にわたって100％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」と言える。
【００１９】
用語「親和性」は、本明細書で用いる場合、ポリペプチド、特に免疫グロブリン(例えば抗体)又は免疫グロブリン断片(例えばVHH)が、抗原とポリペプチドとの平衡を両者の結合により形成される複合体の存在へ向かってシフトするように抗原と結合する程度のことをいう。よって、例えば、抗原及び抗体(例えば、抗体断片)を比較的等しい濃度で組み合わせると、親和性が高い抗体(例えば、抗体断片)は、生じる複合体の濃度が高くなる方向へ平衡をシフトさせるように、利用可能な抗原と結合する。解離定数は、タンパク質結合ドメインと抗原標的との間の親和性を記述するために一般的に用いられる。典型的には、解離定数は、10-5Ｍより低い。幾つかの実施形態では、解離定数は、10-6Ｍより低く、より好ましくは10-7Ｍより低く、最も好ましくは10-8Ｍより低く、例えば10-9Ｍより低い。
用語「特異的に結合する」及び「特異的結合」は、本明細書で用いる場合、一般に、ポリペプチド、特に免疫グロブリン(例えば抗体)又は免疫グロブリン断片(例えばVHH又はその機能的断片)が、異なる抗原の均質混合物中に存在する特定の抗原と優先的に結合する能力のことを言う。或る種の実施形態では、特異的結合相互作用は、試料中の所望の抗原と非所望の抗原とを識別し、幾つかの実施形態では、所望の抗原と約10〜100倍以上(例えば約1000倍以上又は10,000倍以上)の非所望の抗原とを識別する。
【００２０】
したがって、本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)は、特定標的(又はその少なくとも一部分若しくは断片)に対する親和性及び/又は特異性を有し、及び/又は特定標的(又はその少なくとも一部分若しくは断片)を特異的に指向する場合、当該特定標的と「特異的に結合する」といえる。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)は、第２の興味対象の標的抗原と結合する親和性よりも少なくとも５倍、例えば少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍、好ましくは少なくとも1000倍高い親和性で第１の興味対象の標的抗原と結合する場合、「第２の興味対象の標的抗原とは対照的に第１の興味対象の標的抗原に特異的」であるといえる。したがって、或る種の実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列は、第２の興味対象の標的抗原とは対照的に第１の興味対象の標的抗原に「特異的」であるといえる場合、第１の興味対象の標的抗原とは特異的に結合する(本明細書で定義するとおり)が、第２の興味対象の標的抗原とは結合しなくてもよい。
【００２１】
本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)の「特異性」は、親和性及び/又はアビディティーに基づいて決定することができる。本明細書で開示するアミノ酸配列の「親和性」は、該アミノ酸配列とそれが結合する興味対象の標的タンパク質との解離平衡定数で表される。KD値が低いほど、本明細書で開示するアミノ酸配列とそれが結合する興味対象の標的タンパク質との間の結合強度がより強い。或いは、親和性は、1/KDに相当する親和性定数(KA)を用いて表すこともできる。本明細書で開示するアミノ酸配列の結合親和性は、具体的な興味対象の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の様式で決定することができる。本明細書で開示するアミノ酸配列の「アビディティー」は、該アミノ酸配列と適切な興味対象の標的タンパク質との間の結合強度の尺度である。アビディティーは、興味対象の標的タンパク質の結合部位と本明細書で開示するアミノ酸配列の結合部位との間の親和性と、該アミノ酸配列に存在する該当する結合部位の数との両方に関係する。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列は、興味対象の標的タンパク質と、約１マイクロモル(１μM)以下、好ましくは約１ナノモル(１nM)以下の解離定数(KD)[すなわち、約1,000,000/モル(106Ｍ-1、１E6/Ｍ)以上、好ましくは1,000,000,000/モル(109Ｍ-1、１E9/Ｍ)以上の結合定数(KA)]で結合する。約１ミリモルより大きいKD値は、一般に、非結合又は非特異的結合を示すとみなされる。KDは、kOn(モル-1秒-1又はＭ-1ｓ-1で表示)と呼ばれる複合体の結合速度定数に対する、kOff(秒-1又はｓ-1で表示)と呼ばれる複合体の解離速度定数の比として表すことも可能であることが当該分野で公知である。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列は、興味対象の標的タンパク質と、0.1〜0.0001ｓ-1の範囲のkOff及び/又は1,000〜1,000,000Ｍ-1ｓ-1の範囲のkOnで結合する。結合親和性、kOff及びkOn速度は、当業者に公知の手段又は方法、例えばELISA法、等温滴定型熱量測定、表面プラズモン共鳴、蛍光活性化細胞ソーティング分析などにより決定し得る。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列、特に抗体断片、例えばVHHは、それが産生される宿主細胞及び/又は培地から抽出又は精製された場合、本明細書で用いるように「本質的に単離された(形態)」であるとみなす。
本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)に関して、該アミノ酸配列に存在する「結合領域」、「結合部位」又は「相互作用部位」との用語は、本明細書において、該アミノ酸配列に存在する特定の部位、部分、ドメイン又はアミノ酸残基ストレッチであって、標的分子との結合を担うものを意味する。幾つかの実施形態では、このような結合領域は、本明細書で開示するアミノ酸配列の特定のアミノ酸残基であって、標的分子と接触するものから本質的になる。
【００２３】
本明細書において交換可能に用いられる用語「(との)競合」、「交差阻止」、「交差結合」及び「交差阻害」は、一般に、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイ又はインビボアッセイを用いて測定したとき、本明細書で開示する他のアミノ酸配列と興味対象の標的タンパク質との結合に干渉し得る本明細書で開示するアミノ酸配列、特に抗体断片、例えばVHHをいう。よって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列を用いる「競合」、「交差阻止」、「交差結合」及び「交差阻害」は、本明細書で開示する別のアミノ酸配列と興味対象の標的タンパク質との結合に干渉又は競合することにより、適切なインビトロ、細胞又はインビボアッセイを用いて測定したとき、「交差阻止」する本明細書で開示するアミノ酸配列を用いない場合の本明細書で開示する別のアミノ酸配列と興味対象の標的タンパク質との結合と比較して、結合が少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、例えば少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、又はそれ以上低減されることを意味してもよい。
本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)は、２つの異なる興味対象の標的タンパク質の両方に(本明細書で定義するとおり)特異的である場合、該２つの異なる興味対象の標的タンパク質に対して「交差反応性」を示すといえる。
【００２４】
本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH)又はその機能的断片の２つ又は３つ以上の結合部位の全てが、興味対象の標的の同じ部位、決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基ストレッチを指向するか又はそれと特異的に結合する場合、該アミノ酸配列は、「二価」(該アミノ酸配列の結合部位が２つの場合)、又は多価(該アミノ酸配列の結合部位が３つ以上の場合)、例えば三価であるという。
本明細書で用いる場合、抗体断片(例えばVHH又はその機能的断片)に言及する場合の用語「一価」は、単量体形態の抗体断片をいう。一価抗体断片は結合部位を唯１つ含む。これに関連して、抗体断片(例えばVHH又はその機能的断片)の結合部位は、興味対象の標的の特定の部位、決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基ストレッチを指向するか又はそれと特異的に結合する、抗体断片の１つ又は２つ以上の「相補性決定領域」又は「CDR」を包含する。
本明細書で用いる場合、抗体断片(例えばVHH又はその機能的断片)に言及する場合の用語「タグ付加されていない」は、外来ポリペプチド配列を含まない(例えば、本明細書に記載するように放射性同位体で標識されたVHH配列又はその断片のみを含む)抗体断片をいう。例示的な外来ポリペプチド配列としては、カルボキシ末端ポリペプチドタグ、例えばHisタグ、システイン含有タグ(例えばGGCタグ)及び/又はMycタグが挙げられる。
【００２５】
本明細書で開示するアミノ酸配列、特に抗体断片、例えばVHHに言及する場合の用語「二重特異的」は、ａ)本明細書で開示するアミノ酸配列の２つ又は３つ以上の結合部位が同じ興味対象の標的を指向するか又はそれに特異的に結合するが、その標的の同じ部位、決定基、部分、ドメイン又はアミノ酸残基ストレッチに結合しない(すなわち、異なるものと結合する)こと、或いはｂ)本明細書で開示するアミノ酸配列の２つ又は３つ以上の結合部位が異なる興味対象の標的分子を指向するか又はそれと特異的に結合することのいずれかを意味し、本明細書で開示するアミノ酸配列は「二重特異的」(アミノ酸配列の結合部位が２つの場合)又は多重特異的(アミノ酸配列の結合部位が３つ以上の場合)であるといえる。用語「多重特異的」は、本明細書で開示するアミノ酸配列に３つ以上の結合部位が存在する場合に用いられる。
幾つかの実施形態では、「二重特異的」アミノ酸配列若しくは抗体断片(例えば「二重特異的」VHH)又は「多重特異的」アミノ酸配列若しくは抗体断片(例えば「多重特異的」VHH)は、本明細書で用いる場合、それぞれ２つ又は少なくとも２つの結合部位を含む本明細書で開示するアミノ酸配列、特に抗体断片、例えばVHHであって、これら２以上の結合部位が異なる結合特異性を有するアミノ酸配列を意味する。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列、特に抗体断片、例えばVHHは、それぞれ２つの又は３つ以上の異なる結合領域が同じ単量体アミノ酸配列に存在する場合、「二重特異的」又は「多重特異的」であるとみなされる。
【００２６】
本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)の「半減期」は、一般に、該アミノ酸配列のインビボ血清濃度が50％低減するに必要な時間として定義することができる。本明細書で開示するアミノ酸配列のインビボ半減期は、当業者に公知の任意の様式、例えば薬物動態分析により決定することができる。当業者に明らかなように、半減期は、t1/2-アルファ、t1/2-ベータ及び曲線下面積(AUC)のようなパラメータを用いて表すことができる。インビボ半減期の増加は、一般に、t1/2-アルファ、t1/2-ベータ及び曲線下面積(AUC)のうちの１つ又は２つ以上、好ましくは３つ全ての増加を特徴とする。
本明細書で開示する抗体断片(例えばVHH又はその機能的断片)に言及する場合の用語「寿命の延長がされた」は、半減期を延長するように抗体断片が改変されていることをいうために用いられる。抗体及び抗体断片の半減期を延長するための方策は、当該分野において周知であり、例えば、限定されないが、半減期を延長する１又は２以上の基又は部分、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗体Fc断片又は抗原結合抗体断片標的化血清タンパク質(例えば血清アルブミン)との(化学的又は他の)連結を含む。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「阻害」、「低減」及び/又は「妨害」は、興味対象の標的抗原と特異的に結合して、該標的抗原とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、低減及び/又は妨害する本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)(の使用)をいうことがある。用語「阻害」、「低減」及び/又は「妨害」は、興味対象の標的抗原と特異的に結合し、適切なインビトロ、細胞又はインビボアッセイを用いて測定したとき、該標的抗原の生物学的活性を阻害、低減及び/又は妨害する本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)(の使用)をいうこともある。したがって、「阻害」、「低減」及び/又は「妨害」は、興味対象の標的抗原と特異的に結合して、該標的抗原が関与する１又は２以上の生物学的又は生理学的機構、効果、応答、機能経路又は活性を阻害、低減及び/又は妨害する本明細書で開示するアミノ酸配列(の使用)をいうこともある。本明細書で開示するアミノ酸配列のアンタゴニストとしての作用は、興味対象の標的抗原に応じて、当該分野において公知である任意の適切な様式で及び/又は任意の適切な(インビトロ、通常は細胞又はインビボ)アッセイを用いて決定してよい。
【００２８】
よって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH)又はその機能的断片を用いる「阻害」、「低減」及び/又は「妨害」は、適切なインビトロ、細胞又はインビボアッセイを用いて測定したとき、同一条件下であるが該アミノ酸配列を用いない同一アッセイにおいて興味対象の標的抗原の活性と比較して、興味対象の標的抗原とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、低減及び/若しくは妨害すること、又は興味対象の標的抗原の活性を阻害、低減及び/若しくは妨害すること、又は興味対象の標的抗原が関与する１若しくは２以上の生物学的若しくは生理学的機構、効果、応答、機能経路若しくは活性を阻害、低減及び/若しくは妨害することのいずれかを意味してもよく、その阻害、低減及び/又は妨害は、例えば、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、例えば少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％又はそれ以上の阻害、低減及び/又は妨害であってよい。更に、「阻害」、「低減」及び/又は「妨害」は、同一条件であるが本明細書で開示するアミノ酸配列の非存在下と比較して、１若しくは２以上の天然の結合パートナーに対する興味対象の標的抗原の親和性、アビディティー、特異性及び/若しくは選択性の低下を誘導すること、及び/又は興味対象の標的抗原が存在する培地若しくは環境における１若しくは２以上の条件(例えばpH、イオン強度、補因子の存在など)に対する興味対象の標的抗原の感受性の低下を誘導することを意味することもある。本発明に関して、「阻害」、「低減」及び/又は「妨害」は、興味対象の標的抗原の活性のアロステリック阻害、低減及び/又は妨害も含むことがある。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「亢進」、「増加」及び/又は「活性化」は、興味対象の標的タンパク質と特異的に結合して、該標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を亢進、増加及び/又は活性化する本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)(の使用)をいうことがある。用語「亢進」、「増加」及び/又は「活性化」は、興味対象の標的タンパク質と特異的に結合して、適切なインビトロ、細胞又はインビボアッセイを用いて測定するとき、該標的タンパク質の生物学的活性を亢進、増加及び/又は活性化する本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)(の使用)をいうこともある。したがって、「亢進」、「増加」及び/又は「活性化」は、興味対象の標的タンパク質と特異的に結合して、該標的タンパク質が関与する１又は２以上の生物学的又は生理学的機構、効果、応答、機能経路又は活性を亢進、増加及び/又は活性化する本明細書で開示するアミノ酸配列(の使用)をいうこともある。本明細書で開示するアミノ酸配列のアゴニストとしての作用は、興味対象の標的タンパク質に応じて、当該分野において公知である任意の適切な様式で及び/又は任意の適切な(インビトロ、通常は細胞又はインビボ)アッセイを用いて決定してよい。
【００３０】
本明細書で開示するアミノ酸配列(特に抗体断片、例えばVHH又はその機能的断片)の阻害若しくは拮抗活性又は亢進若しくは刺激活性は、可逆的又は不可逆的であってよいが、薬学的及び薬理学的用途のためには、典型的には、可逆的に生じる。
本明細書で用いる場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体並びにFab、F(ab)2、Fvのような断片及び親抗体の抗原結合機能を保持するその他の断片をいう。よって、抗体は、免疫グロブリン若しくは糖タンパク質、又はその断片若しくは部分、又は改変された免疫グロブリン様フレームワーク内に含まれる抗原結合部分を含む構築物、又は非免疫グロブリン様フレームワーク若しくは足場を含む構築物内に含まれる抗原結合部分をいうことがある。
本明細書で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種又は供給源に関して限定されず、抗体が作製される様式により限定されることも意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体及び抗体の抗原結合機能を保持する断片その他を包含する。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体を本発明において用いることができる。しかし、実際には、抗体は、モノクローナル抗体の作製に必要なハイブリッド細胞株又はハイブリドーマの生成に用いるラット又はマウス細胞株の入手可能性のため、典型的には、ラット又はマウス起源のものである。
【００３１】
本明細書で用いる場合、用語「ポリクローナル抗体」は、不均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。ポリクローナル抗体は、免疫動物又は選択されたヒトからのプールした血清にしばしば由来する。
「抗体の重鎖可変ドメイン又はその機能的断片」は、本明細書で用いる場合、(i)天然に軽鎖を有さない重鎖抗体の重鎖可変ドメイン(以下、VHHとも表記する)を意味し、これには、限定されないが、ラクダ科動物若しくはサメの重鎖抗体の重鎖可変ドメインが含まれ、又は(ii)従来型四本鎖抗体の重鎖可変ドメイン(以下、VHとも表記する)を意味し、これには、限定されないが、従来型四本鎖抗体の重鎖のラクダ化(下記で更に定義する)可変ドメイン(以下、ラクダ化VHとも表記する)、又はそれらの任意の機能的断片(例えば、限定されないが、腫瘍抗原又は癌細胞に存在する抗原との結合に特に適切であり、本明細書で開示するVHHに存在し、及び/又はVHHに組み込まれ得る(又は本明細書で開示するVHHのCDR配列に基づき、及び/若しくはCDR配列に由来し得る)１又は２以上のアミノ酸残基ストレッチ(すなわち小ペプチド)が含まれる。
【００３２】
下記で更に説明するように、抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列及び構造は、限定されないが、当該分野及び下記で「フレームワーク領域１」又は「FR1」；「フレームワーク領域２」又は「FR2」；「フレームワーク領域３」又は「FR3」；及び「フレームワーク領域４」又は「FR4」とそれぞれ呼ぶ４つのフレームワーク領域又は「FR」を含んでなり、これらフレームワーク領域の間に、当該分野で「相補性決定領域１」又は「CDR1」；「相補性決定領域２」又は「CDR2」；及び「相補性決定領域３」又は「CDR3」とそれぞれ呼ぶ３つの相補性決定領域又は「CDR」が割り込んでいるものとみなすこともできる。
本明細書で用いる場合、抗体に関する用語「相補性決定領域」又は「CDR」は、Ｈ鎖(重鎖)又はＬ鎖(軽鎖)の可変領域(それぞれVH及びVLとも略称する)をいい、抗原標的と特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む。これらCDR領域は、特定の抗原決定基構造についての抗体の基本的特異性を担っている。この領域は「超可変領域」ともいう。CDRは、可変領域内の不連続なアミノ酸ストレッチを表すが、重鎖及び軽鎖可変領域内でのこの重要なアミノ酸配列の位置は、種に関わらず、可変鎖のアミノ酸配列内で同様の位置であることが判明している。全ての正準抗体の可変重鎖及び軽鎖は、各々３つのCDR領域を有し、それぞれの軽鎖(Ｌ)及び重鎖(Ｈ)について、各々(L1、L2、L3、H1、H2、H3と称する)がその他のものと不連続である。
【００３３】
幾つかの実施形態では、下記で更に説明するように、抗体の重鎖可変ドメイン(VHH又はVHを含む)の全アミノ酸残基数は、110〜130の範囲であり得、好ましくは112〜115、最も好ましくは113である。しかし、抗体の重鎖可変ドメインの部分、断片又はアナログは、由来する抗体の元の重鎖可変ドメインの機能的活性(の少なくとも一部)及び/又は結合特異性(の少なくとも一部)を保持する限り、長さ及び/又はサイズに関して特に限定されない。由来する抗体の元の重鎖可変ドメインの機能的活性(の少なくとも一部)及び/又は結合特異性(の少なくとも一部)を保持する部分、断片又はアナログは、本明細書において、重鎖可変ドメインの「機能的断片」ともいう。
【００３４】
抗体の重鎖可変ドメイン(VHH又はVHを含む)の可変ドメインアミノ酸残基は、下記で言及するRiechmann及びMuyldermansの文献でラクダ科動物のVHHドメインに用いられているように(例えば同文献の図２を参照)、Kabatら(「Sequence of proteins of immunological interest」、US Public Health Services、NIH Bethesda, Md.、刊行物第91号)による重鎖可変ドメインの一般的番号付けに従って番号付ける。この番号付けに従えば、重鎖可変ドメインのFR1は１位〜30位のアミノ酸残基を含み、重鎖可変ドメインのCDR1は31位〜35位のアミノ酸残基を含み、重鎖可変ドメインのFR2は36位〜49位のアミノ酸残基を含み、重鎖可変ドメインのCDR2は50位〜65位のアミノ酸残基を含み、重鎖可変ドメインのFR3は66位〜94位のアミノ酸残基を含み、重鎖可変ドメインのCDR3は95位〜102位のアミノ酸残基を含み、重鎖可変ドメインのFR4は103位〜113位のアミノ酸残基を含む。この点について、VHHドメインについて当該分野で周知であるように、各CDR中の総アミノ酸残基数は変動することがあり、Kabatの番号付けにより示される総アミノ酸残基数に対応しないことがある(すなわち、実際の配列にKabatの番号付けに従う１又は２以上の位置が存在しないことがあり、又は実際の配列は、Kabatの番号付けにより許容される数より多いアミノ酸残基を含むことがある)ことに留意すべきである。このことは、一般に、Kabatに従う番号付けは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応することもしないこともあることを意味する。しかし、一般には、Kabatの番号付けに従えば、そしてCDR中のアミノ酸残基数に関わらず、Kabatの番号付けに従う１位はFR1の開始点に相当し、逆もそうであり、Kabatの番号付けに従う36位はFR2の開始点に相当し、逆もそうであり、Kabatの番号付けに従う66位はFR3の開始点に相当し、逆もそうであり、Kabatの番号付けに従う103位はFR4の開始点に相当し、逆もそうであるということができる。
【００３５】
重鎖可変ドメインのアミノ酸残基を番号付ける代替法は、Chothiaら(Nature 342, 877-883(1989))により記載される方法、いわゆる「AbM定義」及びいわゆる「コンタクト定義」である。しかし、本明細書、特許請求の範囲及び図面では、そうでないと示さない限り、Riechmann及びMuyldermansがVHHドメインに用いたようにKabatに従う番号付けに従う。
【００３６】
重鎖抗体及びその可変ドメインの一般的記載について、なかでも、一般的背景技術として挙げる以下の参考文献を参照する：Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079及びWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231及びWO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016及びWO 03/055527；Algonomics N.V.及びAblynx NVのWO 03/050531；National Research Council of CanadaによるWO 01/90190；Institute of AntibodiesによるWO 03/025020 (=EP 1 433 793);並びにAblynx NV によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551及びAblynx NVによる更に公開された特許出願；Hamers-Castermanら、Nature 1993年6月3日; 363 (6428): 446-8；Davies及びRiechmann、FEBS Lett. 1994年2月21日; 339(3): 285-90；Muyldermansら、Protein Eng. 1994年9月; 7(9): 1129-3；Davies及びRiechmann、Biotechnology (NY) 1995年5月; 13(5): 475-9；Gharoudiら、9th Forum of Applied Biotechnology、Med. Fac. Landbouw Univ. 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【００３７】
一般に、用語「重鎖可変ドメイン」は、本明細書で最も広義に用いられているように、特定の生物学的供給源又は特定の作製方法に限定されない。例えば、下記でより詳細に論じるように、本明細書で開示する重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン(すなわちVHH)は、(１)天然に存在する重鎖抗体のVHHドメインを単離することにより、(２)天然に存在するVHHドメインをコードするヌクレオチド配列の発現により、(３)任意の動物種、特に哺乳動物種、例えばヒトの天然に存在するVHドメインの(下記で説明するとおりの)「ラクダ化」により若しくはそのようなラクダ化VHドメインをコードする核酸の発現により、(４)Wardら(前出)に記載される「ドメイン抗体」又は「Dab」の「ラクダ化」により若しくはそのようなラクダ化VHドメインをコードする核酸の発現により、(５)タンパク質、ポリペプチド若しくは他のアミノ酸配列の製造のための合成若しくは半合成技術を用いて、(６)核酸合成技術を用いてVHHをコードする核酸を作製した後に、得られた核酸を発現させることにより、及び/又は(７)上記のものの任意の組み合わせにより得ることができる。上記を行うための適切な方法及び技法は、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば下記でより詳細に記載する方法及び技法を含む。
用語「有効量」は、本明細書で用いる場合、所望の１又は複数の結果を達成するために必要な量を意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「決定する(こと)」、「測定する(こと)」、「評価する(こと)」、「モニターする(こと)」、「検出する(こと)」及び「アッセイする(こと)」は、交換可能に用いられ、定量及び定性の両方の決定を含む。
本明細書で用いる場合、用語「治療」は、或る種の疾患及び/若しくは障害を予防及び/若しくは治療すること、或る種の疾患及び/若しくは障害の発症を予防すること、或る種の疾患及び/若しくは障害の進行を遅延若しくは逆転させること、或る種の疾患及び/若しくは障害に関連する１若しくは２以上の症状の発症を予防若しくは遅延させること、或る種の疾患及び/若しくは障害と関連する１若しくは２以上症状を低減若しくは軽減すること、或る種の疾患及び/若しくは障害の重篤度及び/若しくは持続期間を低減すること、並びに治療される対象若しくは患者にとって有益な本明細書で開示するアミノ酸配列の全般的な任意の予防若しくは治療効果を含む。
本明細書で用いる場合、用語「診断」、「予測」及び/又は「予後」は、本明細書で用いる場合、或る種の疾患及び/若しくは障害を診断、予測及び/若しくは予後予測することにより、或る種の疾患及び/若しくは障害の発症及び/若しくは存在を予測すること、並びに/又は或る種の疾患及び/若しくは障害の進行及び/若しくは期間を予測すること、並びに/又は或る種の疾患及び/若しくは障害に罹患した患者の治療に対する応答を予測することを含む。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍特異的抗原」、「腫瘍抗原」、「癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質」、「腫瘍特異的標的(タンパク質)」、「腫瘍関連抗原」は、本明細書において交換可能に用いられ、腫瘍細胞にのみ存在し、他のいずれの細胞にも存在しない任意のタンパク質、及び、幾らかの腫瘍細胞に存在し、幾らかの正常な健常細胞にも存在する任意のタンパク質を含む。腫瘍抗原の非限定的な例としては、組織分化抗原、変異タンパク質抗原、発癌ウイルス抗原、癌・精巣抗原及び血管又は間質特異的抗原が挙げられる。
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍細胞」又は「癌細胞」は、交換可能に用いられ、原発性又は転移性腫瘍病変に存在する細胞をいう。幾つかの実施形態では、腫瘍は、癌細胞のみからなるものではなく、癌化細胞と非癌化細胞との間に複雑な双方向相互作用が存在する器官様構造とみなされる。幾つかの実施形態では、癌化細胞の悪性能力は、間質(線維芽細胞、脂肪細胞、血液及びリンパ管からなり得、広範な免疫細胞が相当浸潤していることもある)からの適切な支持構造を必要とする。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は血液学的腫瘍細胞である。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は固形腫瘍細胞である。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「放射標識」アミノ酸配列、「放射標識」抗体断片又は「放射標識」VHHにおける用語「放射標識」は、そのアミノ酸配列構造に放射性核種を含むか、結合するか又は化学的に連結することにより標識されているアミノ酸配列、抗体断片又はVHHの放射性同位体標識をいう。本明細書で開示する放射標識抗体断片は、天然に存在するポリペプチドに由来することができ、或いは、その全体が人工的に設計されたものであり得る。放射標識されていてもよい天然に存在するポリペプチドの非限定的な例としては、重鎖抗体(hcAb)、例えば限定されないが、ラクダ科動物の重鎖抗体が挙げられる。
本明細書で用いる場合、用語「放射性核種」、「放射活性核種」、「放射性同位体」又は「放射活性同位体」は、本明細書において交換可能に用いられ、不安定な核を有する原子であって、その核内で又は内部転換を介して新たに創出された放射粒子に与えることができる過剰エネルギーにより特徴付けられる原子をいう。このプロセスの間に、放射性核種は、放射性崩壊を受け、ガンマ線及び/又は素粒子、例えばアルファ若しくはベータ粒子の放出をもたらす。これらの放出は電離放射線を構成する。放射性核種は、自然に生じるか、又は人工的に生成できる。幾つかの実施形態では、放射性同位体は、「γ放射体及びβ放射体」の両方であり、このことは、放射性同位体がガンマ(γ)線及びベータ(β)粒子の両方を放出することを意味する。
【００４１】
「癌」又は「腫瘍」により、原発腫瘍及び/又は転移(場所は問わず)、例えば、限定されないが、固形腫瘍若しくは血液学的癌、又は固形腫瘍若しくは血液学的癌の転移を意味する。幾つかの実施形態では、「固形腫瘍」は、離散した腫瘍塊を形成する腫瘍、例えば肉腫及び癌腫である。幾つかの実施形態では、「血液学的癌」は、血液細胞の癌、例えば白血病、リンパ腫又は骨髄腫である。幾つかの実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌、多発性骨髄腫又はリンパ腫である。
本明細書で用いる場合、用語「癌細胞」は、未制御の成長を伴い異常に(幾つかの実施形態においては、かつ無制限に)分裂及び再生し、離脱して身体の他の部分に移動でき、別の部位に定着できる(転移と呼ばれる)細胞をいう。
「病変」は、本明細書で用いる場合、損傷又は疾患に起因する体組織又は器官における任意の異常な変化をいうことができる。癌の分野における用語法では、病変は、典型的には、腫瘍をいう。
本明細書で用いる場合、「HER-2陽性(癌)病変」、「HER-2陽性(乳)癌」又は「HER-2陽性腫瘍」における用語「HER-2陽性」は、HER2遺伝子増幅又はHER2タンパク質過剰発現を特徴とするために正常な健常細胞と比較して異常に高いレベルのHER2遺伝子及び/又はHER2タンパク質を有する癌性又は悪性細胞又は組織をいう。HER-2陽性乳癌は、HER2遺伝子増幅又はHER2タンパク質過剰発現を特徴とする癌性乳細胞を特徴とする。乳癌の５症例のうちほぼ１症例で、癌細胞は、１又は２以上の遺伝子変異によるHER2遺伝子増幅を主な原因として、過剰のHER2を産生する。HER2遺伝子増幅によるHER2タンパク質レベルの上昇は、多くのタイプの癌で生じ得、よって乳癌に限定されない。
本明細書で用いる場合、「HER-2陰性(癌)病変」、「HER-2陰性(乳)癌」、「HER-2陰性腫瘍」、「HER-2陰性細胞」における用語「HER-2陰性」は、HER2遺伝子増幅又はHER2タンパク質過剰発現がないことによる正常レベルのHER2遺伝子及び/又はHER2タンパク質を特徴とする癌性若しくは悪性の細胞若しくは組織又は正常な健常細胞若しくは組織をいうことができる。
【００４２】
用語「インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)」は、本明細書で用いる場合、組織の部分若しくは切片において(インサイチュ)、又は組織が十分に小さい場合(例えば植物種子、ショウジョウバエ胚)には組織全体において(ホールマウントISH)、細胞において、及び循環腫瘍細胞(CTC)において特定のDNA若しくはRNA配列の位置決めをするために、標識した相補性DNA又はRNA鎖(すなわちプローブ)を用いるタイプのハイブリダイゼーションアッセイをいう。インサイチュハイブリダイゼーションは、組織切片中の個々の細胞内で特定のmRNA種を同定する強力な技法であり、生理学的プロセス及び疾患原因についての洞察を提供する。特に、インサイチュハイブリダイゼーションは、遺伝子の構成、調節及び機能を理解するための重要な工程である、染色体上又は組織内での特定の核酸配列の位置を明らかにするために用いられる。現在用いられている重要な技法は次のものを含む：オリゴヌクレオチド及びRNAプローブ(放射性標識及びハプテン標識)を用いるmRNAへのインサイチュハイブリダイゼーション；光学及び電子顕微鏡を用いる分析；ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーション；複数のRNA及びRNA＋タンパク質の二重検出；並びに染色体配列を検出するための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション。DNA ISHを用いて、染色体の構造を決定することができる。蛍光DNA ISH(FISH)は、例えば、医学的診断に用いて、染色体の完全性を評価することができる。RNA ISH(RNAインサイチュハイブリダイゼーション)を用いて、組織切片、細胞、ホールマウント及び循環腫瘍細胞(CTC)内のRNA(mRNA、lncRNA及びmiRNA)を測定し位置決めする。
【００４３】
用語「蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)」は、本明細書で用いる場合、染色体上の特定のDNA配列の有無の検出及び位置決めをするために用いるタイプのインサイチュハイブリダイゼーションアッセイをいう。FISHは、高度の配列相補性を示す染色体部分とのみ結合する蛍光プローブを用いる。蛍光顕微鏡を用いて、染色体のどこに蛍光プローブが結合したかを見出すことができる。FISHは、遺伝学的相談、医学及び種の同定に使用するDNA中の特異な特徴を見出すためにしばしば用いられる。FISHは、細胞、循環腫瘍細胞及び組織試料中の特定のRNA標的(mRNA、lncRNA及びmiRNA)を検出し位置決めするためにも用いることができる。この関係において、FISHは、細胞及び組織内の遺伝子発現の空間-時間的パターンを明らかにする助けとなり得る。
用語「免疫組織化学(IHC)」は、本明細書で用いる場合、生体組織の切片内で抗体が抗原に特異的に結合する原理を利用して、組織切片の細胞において抗原(例えばタンパク質)を検出するプロセスをいう。免疫組織化学的染色は、異常細胞、例えば癌性腫瘍に見出される異常細胞の診断に広く用いられる。IHCは、バイオマーカー及び生体組織の異なる部分で異なって発現するタンパク質の分布及び局在を理解するために基礎研究においても広く用いられる。
「トラスツズマブ」(商品名:HERCLON(登録商標)、Herceptin(登録商標))は、HER2/neuレセプターに干渉するモノクローナル抗体である。この主な用途は、或る種の乳癌の治療である。
「ペルツズマブ」又は「2C4」(商品名:PERJETA(登録商標))は、HER2、より具体的にはHER2のドメインIIに結合することにより、他のHERレセプターとHER2との二量体形成を阻害するモノクローナル抗体である。その主な用途は、HER2陽性乳癌の治療である。
【００４４】
用語「原発腫瘍」は、本明細書で用いる場合、腫瘍進行が開始し、進行して癌性腫塊を生じた解剖学的部位で成長中の腫瘍である。
用語「転移性病変」は、本明細書で用いる場合、元の場所から体内の他の部分に広がった悪性又は癌性の腫瘍をいう。交換可能に用い得る関連する医学用語として、「後期癌」、「進行癌」又は「転移性疾患」が挙げられる。転移性病変は、一般に治療不能と考えられているが、癌性細胞の拡散を抑え、おそらく個体の平均余命を延ばす処置はしばしば可能である。
転移は、体内で元の部位を超えた癌の拡散に関する用語である。よって、転移性病変は、原発腫瘍の原位置から離れた場所で見出される癌性腫瘍である。転移性腫瘍は、原発腫瘍から細胞が離脱して、リンパ系及び血流を介して体内の離れた部分に移動すると生じる。或いは、原腫瘍からの細胞は、近接する器官又は組織で新しい腫瘍の種となり得る。「転移性疾患」は、本明細書で用いる場合、後期癌をいい、癌細胞が原腫瘍の近傍のリンパ節に見出される場合にはステージIIIとされ、癌細胞が原発腫瘍部位を超えて体内の遠隔部分にまで移動した場合にはステージIVとされる癌の医学的分類のことをいう。転移性病変は脳、肺、肝臓又は骨で最も一般的に見出される。転移性癌を有する個体は、症状を経験することもしないこともあり、症状は、転移細胞が移転した領域と関連し得る。転移性病変が体内に存在すると、当該個体の癌は、ほとんどのタイプの癌について治療不能であるとみなされ得る。このことは、利用可能な治療法を用いて全ての存在する癌細胞を根絶することは極めて困難であることを意味する。この場合、治療目標は、腫瘍の成長を遅くし、可能な限り最高のクオリティー・オブ・ライフを維持し、当該個体の余命を可能な限り延ばすことになる。幾つかの場合では、転移性病変を有する個体は、症状管理に適切な治療により数年間生存可能である。
【００４５】
本明細書で用いる場合、対象内での放射線の「(算出平均)実効線量」は、身体の特定される全ての組織及び器官における等価線量の組織重み付けされた合計をいい、確率論的な健康リスク、すなわち当該身体部分に送達される電離放射線の癌誘発及び遺伝的影響の確率を表す。(算出平均)実効線量は、放射線のタイプ及び照射される各器官又は組織の性質を考慮する。(算出平均)実効線量は、国際放射線防護委員会(ICRP)が考案した国際的な放射線防護制度において、放射線防護における線量限界の中心量である。実効線量のSI単位はシーベルト(Sv)であり、１Svは１ジュール/キログラム(J/kg)である。この実効線量は、線量のICRP体系において、1991年に、以前の「実効線量当量」から置き換えられた。放射性医薬品を用いる手順については、実効線量は、典型的には、注入した単位活性あたりで表され、すなわちmSv/MBqで表される。そのため、個々の患者の実効線量は、MBqで表される注入した放射性医薬品の活性と、mSv/MBqで表される算出平均実効線量に依存する。
放射性医薬品の実効線量は、FDAにより2004年に承認されたOLINDA/EXM(登録商標)ソフトウェアを用いて算出される。OLINDA/EXM(登録商標)パーソナルコンピュータコードは、放射性医薬品の線量計算及び動力学モデリングを実行する(OLINDA/EXMは、器官レベルの内部線量評価/指数モデリング(Organ Level INternal Dose Assessment/EXponential Modeling)の略である)。OLINDA(登録商標)は、全身投与された放射性医薬品から、身体の異なる器官に対する放射線量を算出し、ユーザにより供給された生体動力学データについて回帰分析を行って、核医学薬物についての算出を支援する。この算出を用いて、核医学における診断及び治療用途での当該医薬品の使用リスク/利益の評価を行う。この技術は、内部線量界で広く受け入れられて用いられている、成人、子供、妊婦などについての幾つかの標準的な身体モデルを利用する。算出は、放射活性薬物を患者又は研究対象に与える場合に送達されるべき許容放射線量を研究する医薬業界の開発者、核医学専門家、教育者、取締者、研究者その他の者にとって有用である。
【００４６】
算出実効線量は、選択した標準身体モデル及び選択した排尿膀胱モデルに依存する。本明細書で示す値は、成人女性モデル及び１時間の排尿膀胱間隔を用いて算出したものである。
本明細書で用いる場合、「スクリーニング線量」又は「バイオマーカー線量」は、治療する対象者を選択するに十分な薬剤(例えば本明細書に記載した放射標識抗体断片)の線量、例えば、対象者の癌細胞又は固形腫瘍に結合することができ、その後、癌細胞又は固形腫瘍の位置で、例えば、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴撮像法のような非核造影法と任意に組み合わされていてもよい、γカメラ撮像法(例えば、平面γカメラ撮像法)、単光子放出コンピュータ断層法又は陽電子放出断層法を用いて対象者を撮像することにより、検出することができる線量である。幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は、治療的に有効でない線量である。幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は、本明細書に記載したような治療線量とは異なる(例えば、治療線量未満である)。
本明細書で用いる場合、「治療線量」は、治療を必要とする対象者(例えば、癌を有する対象者)の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％又は少なくとも50％で治療上有効である、薬剤(例えば本明細書に記載した放射標識抗体断片)の線量である。幾つかの実施形態では、治療線量は、本明細書に記載したスクリーニング線量より高い。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「対象者を撮像する(こと)」とは、本明細書に記載した放射標識抗体断片を検出することができるデバイスを用いて、対象者の１又は２以上の画像を取得することをいう。１又は２以上の画像は、当該画像を強調するため、コンピュータプログラム及び/又は当業者が(例えば、１又は２以上の画像のコントラスト又は明度を調整することにより)更に改変してもよい。本明細書に記載した放射標識抗体断片を検出することができる任意のデバイス、例えば、γカメラ撮像法(例えば、平面γカメラ撮像法)用、単光子放出コンピュータ断層法用若しくは陽電子放出断層法用のデバイス、又は核造影法と、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴造影法のような非核造影法とを組み合わせることができるデバイスの使用が企図される。例えば、このようなデバイスは、単光子放出コンピュータ断層法/コンピュータ断層法(SPECT/CT)用のデバイスであり得る。このようなデバイスは当該分野で公知であり、市販されている。
本明細書で用いる場合、用語「対象者」は、一般に、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ又はヒツジをいう。幾つかの実施形態では、対象者はヒト対象者である。幾つかの実施形態では、対象者は癌を有する対象者(例えば、癌を有するヒト対象者)である。癌を有する対象者を同定する方法としては、腫瘍抗原又は他の腫瘍バイオマーカーの検出、遺伝子検査、MRI、Ｘ線、PETスキャン、生検及びこれらの組合せが挙げられる。
本明細書で用いる場合、用語「リンカー」とは、或る分子を別の分子(例えば、放射性同位体を抗体断片(例えば、VHH又はその機能的断片))に付着させる部分をいう。リンカーは、化学リンカー、ヌクレオチドリンカー、ペプチドリンカー又はこれらの任意の組合せであってよい。
【００４８】
II．対象者の階層化及び治療のための方法及び組成物
１つの態様において、本開示は、例えば治療について対象者を選択した後、選択した対象者を治療するために、対象者を階層化し、治療する方法を提供する。
幾つかの実施形態では、本方法は、スクリーニング線量の(癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合する)放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)の対象者における検出に基いて、対象者(例えば、本明細書に記載する癌を有する対象者)を治療について選択し；該対象者に、治療線量の放射標識抗体断片を投与することを含んでなる。幾つかの実施形態では、放射標識抗体断片は、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されている。β放射体及びγ放射体の両方である適切な放射性同位体の例としては、例えば、ヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186及びレニウム-188が挙げられる。幾つかの実施形態では、放射性同位体はヨウ素-131である。
【００４９】
提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は、治療上有効でない線量である。提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は、本明細書に記載する治療線量未満である(例えば、本明細書に記載する治療線量の約10分の１未満、約20分の１未満、約30分の１未満、約40分の１未満、約50分の１未満、約100分の１未満、約200分の１未満、約300分の１未満、約400分の１未満、約500分の１未満若しくは約1000分の１未満であるか、又は本明細書に記載の治療線量より、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約120、少なくとも約130、少なくとも約140、少なくとも約150、少なくとも約160、少なくとも約170、少なくとも約180、少なくとも約190、少なくとも約200、少なくとも約210、少なくとも約220、少なくとも約230、少なくとも約240、少なくとも約250、少なくとも約260、少なくとも約270、少なくとも約280、少なくとも約290、少なくとも約300、少なくとも約320、少なくとも約340、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約400、少なくとも約450、少なくとも約500、少なくとも約1000、少なくとも約5000、少なくとも約10000、少なくとも約13000、少なくとも約15000、少なくとも約18000若しくは少なくとも約20000MBq小さい)。提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は、約10MBq〜約400MBq、約20MBq〜約400MBq、約30MBq〜約400MBq、約40MBq〜約400MBq、約50MBq〜約400MBq、約100MBq〜約400MBq、約200MBq〜約400MBq、約300MBq〜約400MBq、約10MBq〜約300MBq、約20MBq〜約300MBq、約30MBq〜約300MBq、約40MBq〜約300MBq、約50MBq〜約300MBq、約100MBq〜約300MBq又は約200MBq〜約300MBqである。提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量は約37MBq〜約370MBqである。本明細書に記載する任意のスクリーニング線量は、本明細書に記載する任意の治療線量と組合せ得ることを理解すべきである。
【００５０】
提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、治療線量は、本明細書に記載するスクリーニング線量より高い(例えば、本明細書に記載するスクリーニング線量より少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍若しくは少なくとも約1000倍高いか、又は本明細書に記載するスクリーニング線量より少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約120、少なくとも約130、少なくとも約140、少なくとも約150、少なくとも約160、少なくとも約170、少なくとも約180、少なくとも約190、少なくとも約200、少なくとも約210、少なくとも約220、少なくとも約230、少なくとも約240、少なくとも約250、少なくとも約260、少なくとも約270、少なくとも約280、少なくとも約290、少なくとも約300、少なくとも約320、少なくとも約340、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約400、少なくとも約450、少なくとも約500、少なくとも約1000、少なくとも約5000、少なくとも約10000、少なくとも約13000、少なくとも約15000、少なくとも約18000若しくは少なくとも約20000MBq高い)。提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、治療線量は、約300MBq〜約20000MBq、約400MBq〜約20000MBq、約500MBq〜約20000MBq、約1000MBq〜約20000MBq、約2000MBq〜約20000MBq、約3000MBq〜約20000MBq、約4000MBq〜約20000MBq、約5000MBq〜約20000MBq、約10000MBq〜約20000MBq、約5000MBq〜約20000MBq、約10000MBq〜約20000MBq、約300MBq〜約10000MBq、約400MBq〜約10000MBq、約500MBq〜約10000MBq、約1000MBq〜約10000MBq、約2000MBq〜約10000MBq、約3000MBq〜約10000MBq、約4000MBq〜約10000MBq又は約5000MBq〜約10000MBqである。提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、治療線量は約370MBq〜約18500MBqである。
用いる特定のスクリーニング線量及び治療線量は、幾つかの実施形態では、疾患の性質(例えば、腫瘍又は癌細胞のタイプ、グレード及びステージなど)及び対象者のタイプ(例えば、種、体質、年齢、性別、体重など)に依存し得る。
【００５１】
提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、本方法は、スクリーニング線量を対象者に投与すること、及び、対象者の選択前に、該対象者の腫瘍部位における放射標識VHH又はその機能的断片の存在を検出することを更に含んでなる。腫瘍部位は、例えば、固形腫瘍部位(例えば、対象者の１又は２以上の器官又は組織中)又は血液学的癌部位(例えば、対象者の循環系中又はその一部分中)であり得る。幾つかの実施形態では、スクリーニング線量の投与と検出は、少なくとも約１分間、少なくとも約５分間、少なくとも約10分間、少なくとも約20分間、少なくとも約30分間、少なくとも約40分間、少なくとも約50分間、少なくとも約１時間、少なくとも約1.5時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約２日間又は少なくとも約７日間離す。幾つかの実施形態では、スクリーニング線量の投与と検出は、約１時間〜約24時間離す。
提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片の存在の検出は、対象者の撮像を含んでなる。幾つかの実施形態では、撮像法は、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴造影法のような非核造影法と組み合わされていてもよい、γカメラ撮像法(例えば、平面γカメラ撮像法)、単光子放出コンピュータ断層法又は陽電子放出断層法である。特定の実施形態では、撮像法は、コンピュータ断層法と組み合わされた単光子放出コンピュータ断層法(SPECT/CT)である。
【００５２】
提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量及び治療線量は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも１月間、少なくとも約２月間又は少なくとも約６月間離して投与する。提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、スクリーニング線量及び治療線量は、約１日間〜約６月間離して(例えば、約１日間〜約２月間、約１日間〜約１月間又は約１日間〜約１週間離して)投与する。
提供するいずれかの本方法の幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2に特異的に結合する。HER2に特異的に結合する放射標識VHH又はその機能的断片が本明細書に更に記載される。
スクリーニング線量及び治療線量は、各々独立して、任意の適切な経路で、例えば、全身に、局所的又は局部的に投与され得る。例示的な経路としては、静脈内、腹腔内及び髄腔内投与が挙げられる。用いる特定の経路は、幾つかの実施形態では、疾患の性質(例えば、腫瘍又は癌細胞のタイプ、グレード、位置及びステージなど)及び対象者のタイプ(例えば、種、体質、年齢、性別、体重など)に依存し得る。
【００５３】
１つの尚更なる態様において、本明細書に記載の方法に用いる１又は２以上の組成物が提供される。本組成物は、本明細書で開示する放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)及び/又は本明細書で想定する核酸配列と、任意に、少なくとも１つの許容され得るキャリアとを含んでなる。幾つかの実施形態によれば、本組成物は、少なくとも１つの他の化合物を更に含んでなってもよい。幾つかの実施形態では、異なる量の本明細書で開示する放射標識抗体断片(例えば、異なる量の放射標識VHH又はその機能的断片)を有するスクリーニング用組成物及び治療用組成物が提供される。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する組成物は、医薬組成物である。
本医薬組成物は、本明細書に記載の方法(例えば、本明細書に記載する、対象者(例えば、ヒト対象者又は他の哺乳動物対象)を階層化し治療する方法)に用いることができる。
一般に、医薬使用のため、本明細書で開示する放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)は、少なくとも１つの本明細書に記載する放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)と、少なくとも１つの医薬的に許容され得るキャリア、希釈剤若しくは賦形剤及び/又はアジュバントと、任意に、１又は２以上の更なる医薬的に活性なポリペプチド及び/又は化合物とを含んでなる医薬調製物又は組成物として、製剤化されてもよい。このような製剤は、例えば、腹腔内、静脈内、髄腔内投与又は他の投与に適切であり得る。
注射又は注入に適切な医薬剤形は、滅菌の水性溶液若しくは分散体、又は、滅菌の注射用若しくは注入用溶液若しくは(任意にリポソーム中にカプセル化されていてもよい)分散体の即席調製に適合する活性成分を含む滅菌粉剤を含むことができる。最終剤形は、滅菌の流動体であり、製造及び貯蔵条件下で安定であるべきである。液体キャリア又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、非毒性グリセリルエステル及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は液状分散媒体であることができる。
【００５４】
幾つかの実施形態では、本開示は、10μg〜1000μgの量の本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片、具体的には約10μg〜約100μgの量、より具体的には約20μg〜約100μgの量、例えば、約50μgの量のVHH又はその機能的断片を提供する。幾つかの実施形態では、本開示は、10μg〜1000μgの量、具体的には約10μg〜約100μgの量、より具体的には約20μg〜約100μgの量、例えば約50μgの量の本明細書に記載するVHH又はその機能的断片を各々独立して有する本明細書に記載するスクリーニング線量及び治療線量を提供する。幾つかの実施形態では、本開示は、10μg〜1000μgの量、具体的には約10μg〜約100μgの量、より具体的には約20μg〜約100μgの量、例えば、約50μgの量の本明細書に記載するVHH又はその機能的断片を各々独立して有する本明細書に記載するスクリーニング線量及び治療線量を提供し、ここで、スクリーニング線量は、治療線量より低い比活性(例えば、同一又は類似する量(例えば、10又は100μg以内)のVHH又はその機能的断片について、より低い放射活性量)を有する。幾つかの実施形態では、本開示は、37MBq〜370MBqのスクリーニング線量の本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片を提供し、ここで、該線量中に存在するVHH又はその機能的断片の量は、10μg〜1000μg、具体的には約10μg〜約100μg、より具体的には約20μg〜約100μg、例えば約50μgである。幾つかの実施形態では、本開示は、370MBq〜18500MBqの治療線量の本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片を提供し、ここで、該線量中に存在するVHH又はその機能的断片の量は、10μg〜1000μg、具体的には約10μg〜約100μg、より具体的には約20μg〜約100μg、例えば約50μgである。
【００５５】
スクリーニング及び/又は治療線量は、好都合には、単回線量又は適切な間隔で投与される分割線量(この線量も更に分割し得る)で提供され得る。治療線量の投与レジメンは、長期間(例えば、少なくとも２週間、例えば数ヶ月又は数年)の処置又は日毎の処置を含み得る。幾つかの実施形態では、治療線量の投与レジメンは、１日１回から月１回まで、例えば、１日１回から隔週に１回まで(例えば限定されないが週１回)変えることができる。よって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示する医薬組成物は、１回又は数回(間欠的にも)、例えば数日間、数週間又は数ヶ月間投与してもよい。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)は、本明細書に記載の疾患及び障害の予防及び/又は治療に用いられているか又は用いることができる他の医薬的活性化合物又は成分との組合せで用いてもよい(結果として、相乗効果が得られても得られなくてもよい)。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH配列を含む本明細書で開示する放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)は、１又は２以上の治療用抗体又は治療用抗体断片と一緒に適用される。よって、幾つかの実施形態では、治療線量の本明細書で開示する放射標識抗体断片は、１又は２以上の治療用抗体又は治療用抗体断片を用いる定型の免疫療法と組み合わされる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH配列又はその機能的断片は、１又は２以上の治療用抗体又は治療用抗体断片を用いる組合せ療法又は組合せ治療方法に、例えば、限定されないが、トラスツマブ(Herceptin(登録商標))及び/又はペルツズマブ(Perjeta(登録商標))との組合せ治療に用いる。この２つの薬剤は、同時に投与する場合、一緒に単一の医薬調製物に製剤化してもよく、又は例えば溶解又は希釈して単一の注入液にすることにより、投与の直前に２つの異なる医薬調製物から混合してもよい。別の１つの実施形態では、この２つの薬剤は、別々に、すなわち、２つの独立の医薬組成物として投与される。
【００５６】
本開示はまた、記載する組合せに加えて投与される更なる薬剤の使用を包含する。これは、例えば、１又は２以上の更なる化学療法剤であり得る。また、これは、他のいずれかの薬剤の望まない副作用を防止、抑制又は寛解するために適用される１又は２以上の薬剤であり得る。例えば、白血球減少症又は好中球減少症の影響を寛解するために、白血球の増殖を刺激するサイトカインが適用されてもよい。
本明細書で開示する放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)及び該断片を含んでなる組成物の効力は、関与する具体的疾患又は障害に依存して、当該分野で公知であるか又は本明細書に記載した任意の適切なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ及び/又は動物モデル、又はこれらの任意の組合せを用いて試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルは、当業者に明確である。
【００５７】
III．放射標識抗体断片
１つの態様において、本開示は、対象者(例えば、癌を有する対象者)の階層化及びその後の治療に用いる、腫瘍抗原及び/又は癌細胞抗原を特異的に指向する放射標識抗体断片(例えば、VHH配列又はその機能的断片)を提供する。
本明細書で開示する放射標識抗体断片は、当該分野で公知であるか又は本明細書に記載されるの任意の方法を用いて作製することができる。例えば、本明細書で開示する放射標識抗体断片は、天然に存在するポリペプチドに由来することができ、或いは完全に人工的に設計可能である。このような天然に存在するポリペプチドの非限定的な例としては、重鎖抗体(hcAb)が挙げられ、例えば限定されないが、ラクダ科動物の重鎖抗体が含まれる。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン(すなわちVHH)は、単一ポリペプチド鎖からなり、翻訳後修飾されていない。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片は、先天又は適応免疫系に由来し、好ましくは先天又は適応免疫系のタンパク質に由来する。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHHは、４つのフレームワーク領域及び３つの相補性決定領域又はその任意の適切な断片(通常、相補性決定領域の少なくとも１つを形成する少なくとも幾つかのアミノ酸残基を含む)を含んでなる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHHは、高い収率で(好ましくは微生物の組換え発現系で)作製され、その後単離及び/又は精製される。
【００５８】
具体的な実施形態によると、本開示は、腫瘍抗原又は癌細胞抗原(例えば限定されないが、HER2)との結合に特に適切な幾つかのアミノ酸残基ストレッチを提供する。これらアミノ酸残基ストレッチは、本明細書で開示するVHHに、特には該VHHの抗原結合部位(の一部)を形成するように存在し及び/又は組み込まれていてもよい。これらアミノ酸残基ストレッチは、最初、抗体のCDR配列として創出された(又は、本明細書で更に説明するように、そのようなCDR配列に基づき、及び/又は由来し得る)ので、本明細書において一般的に「CDR配列」(例えば、それぞれCDR1配列、CDR2配列及びCDR3配列)とも呼ばれる。しかし、本開示は、最も広義には、これらアミノ酸残基ストレッチにより、本明細書で開示する可変ドメインが腫瘍抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合するようになる限り、当該ストレッチが当該重鎖可変ドメイン中で有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意すべきである。よって、幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書で記載するCDR配列の組み合わせを含み、且つ、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的タンパク質を特異的に指向する、癌の階層化及び治療に用いる放射標識VHHに関する。
【００５９】
よって、非限定的な具体的実施形態では、本明細書で開示するVHHは、本明細書に記載するCDR1配列、CDR2配列及びCDR3配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHHは、本明細書に記載するCDR1配列、CDR2配列及びCDR3配列の少なくとも１つの組合せを含む少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなってもよい。
これらCDR配列組合せの１つを有する本明細書で開示する任意のVHH又はその断片は、好ましくは、腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と(本明細書で定義するとおり)特異的に結合することができる。幾つかの実施形態では、VHH又はその断片は、腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と、溶液中の解離定数(KD)が10-8Ｍ以下で特異的に結合する。特定の実施形態では、本明細書で開示するHER2に対するVHH又はその断片は、５nM以下、例えば１〜５nM、好ましくは２〜３nMの解離定数(KD)でHER2に特異的に結合することができるものである。
VHHの腫瘍抗原又は癌細胞抗原との特異的結合は、公知の任意の適切な様式で決定することができ、そのような様式としては、例えば、バイオパニング、スキャッチャード解析及び/又は競合結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫アッセイ(EIA)及びサンドイッチ競合アッセイ)並びに当該技術分野で公知の種々の変形が挙げられる。
【００６０】
更なる特定の実施形態では、本明細書で開示するVHH又はその断片は、
配列番号１を有するCDR1領域、配列番号２を有するCDR2領域及び配列番号３を有するCDR3領域、及び/又は
配列番号４を有するCDR1領域、配列番号５を有するCDR2領域及び配列番号６を有するCDR3領域
を含む群より選択される少なくとも１つのCDR配列組合せを含んでなる。
よって、特定の実施形態では、本開示は、(一般)構造：
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
(式中、FR1〜FR4は、それぞれフレームワーク領域１〜４をいい、CDR1〜CDR3は、それぞれ相補性決定領域１〜３をいい、これらは本明細書で更に定義されるとおりである)を有する重鎖抗体由来の重鎖可変ドメインを提供する。
配列番号７及び８(表１を参照)は、HER2に対して惹起された例示的重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００６１】
【表１】
2018532689.tif 000002
【００６２】
幾つかの実施形態では、本開示は、配列番号７若しくは８(表１を参照)の重鎖可変ドメイン又はそれらの機能的断片の少なくとも１つと少なくとも80％、少なくとも85％、例えば少なくとも90％若しくは少なくとも95％又は95％を超える配列同一性を有する、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的抗原を指向する放射標識VHH又はその断片を提供する。幾つかの実施形態では、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的抗原を指向する放射標識VHH又はその断片は、当該重鎖可変ドメイン又はその機能的断片をコードする核酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％若しくは少なくとも95％又は95％を超える配列同一性を有する核酸によりコードされる。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する重鎖可変ドメイン配列は、HER2と結合することができ及び/又はHER2を指向し、配列番号７又は８(表１を参照)の重鎖可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも90％のアミノ酸同一性を有するものである(ここで、アミノ酸同一性の程度の決定には、CDR配列を形成するアミノ酸残基を重視しない)。
これら配列番号７又は８の例示的重鎖可変ドメインにおいて、CDR配列(表２を参照)は、一般に、本明細書で更に定義されるとおりである。
【００６３】
【表２】
2018532689.tif 000003
【００６４】
本開示は、本明細書で開示するVHH又はその断片(又はこれらを発現するヌクレオチド配列)の起源についても、本明細書で開示するVHH若しくはその断片又はヌクレオチド配列を作製又は取得する(又は作製し若しくは取得した)方法に関しても限定されないことに留意されたい。よって、本明細書で開示するVHH又はその断片は、(任意の適切な種に由来する)天然に存在するアミノ酸配列又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であってよい。本開示の非限定的な具体的態様では、アミノ酸配列は、(任意の適切な種に由来する)天然に存在する免疫グロブリン配列又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列であり、これには、限定されないが、「ヒト化」免疫グロブリン配列(例えば、部分若しくは完全ヒト化マウス若しくはウサギ免疫グロブリン配列、特には、部分若しくは完全ヒト化VHH配列)、「ラクダ化」免疫グロブリン配列、並びに、(例えば、合成若しくはランダムの又は天然に存在する免疫グロブリン配列から出発する)親和性成熟、CDRグラフト化、張り合せ(veneering)、異なる免疫グロブリン配列に由来する断片の組み合わせ、オーバーラップするプライマーを用いるPCRアセンブリ及び免疫グロブリン配列を工学的に操作するための当業者に周知の類似の技法；又は上記のいずれかの任意の適切な組合せのような技法により得られた免疫グロブリン配列が含まれる。また、本明細書で開示するVHH又はその断片は、本明細書に更に説明するように適切にヒト化されて、本開示の１又は２以上の更なる(部分又は完全)ヒト化アミノ酸配列を提供してもよい。同様に、アミノ酸配列は、合成又は半合成の配列(例えば部分ヒト化配列)を含む場合、必要に応じて、本明細書で説明するように、更に適切にヒト化されて、本明細書で開示する１又は２以上の更なる(部分又は完全)ヒト化アミノ酸配列を提供してもよい。
【００６５】
幾つかの実施形態では、ヒト化アミノ酸配列は、ヒト化置換であり及び/又はヒト化置換に相当する少なくとも１つのアミノ酸残基が(特に、フレームワーク残基の少なくとも１つに)存在するアミノ酸配列であってよい。追加的に又は代替的に、天然に存在するVHH配列のフレームワーク領域の配列と１又は２以上の近縁ヒトVH配列の対応するフレームワーク配列との比較により、可能性がある他の有用なヒト化置換を突き止めることができる。その後、このようにして決定した１又は２以上の可能な有用ヒト化置換(又はその組合せ)を、前記VHH配列に(本明細書に更に説明するように、それ自体公知の任意の様式で)導入することができ、得られたヒト化VHH配列又はその機能的断片を、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル、並びに/又は他の所望の特性について試験することができる。このようにして、限定的な試行錯誤により、当業者は、他の適切なヒト化置換(又はその適切な組合せ)を決定することができる。
幾つかの実施形態では、VHH又はその機能的断片は、本明細書に記載されるように放射性同位体に連結されると、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片が指向する抗原を発現する腫瘍細胞若しくは癌細胞を死滅させるか、又はそのような腫瘍細胞若しくは癌細胞の成長及び/若しくは増殖を低減若しくは遅延させることができる。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片は、例えばβ放射体及びγ放射体の両方である放射標識で、放射標識される。本明細書で開示するVHH又はその機能的断片に連結させることができる、β放射体及びγ放射体の両方である適切な放射性同位体の例としては、例えば、ヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186及びレニウム-188が挙げられる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示した放射標識VHH又はその機能的断片はヨウ素-131で標識されている。
【００６６】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHHドメイン又はその機能的断片は、必要に応じて、１又は２以上のリンカーを介して１又は２以上の更なる基、部分又は残基と連結されていてよい。これら１又は２以上の更なる基、部分又は残基は、他の興味対象の標的との結合に働くことができる。このような更なる基、残基、部分及び/又は結合部位は、本明細書で開示する重鎖可変ドメインに更なる機能性をもたらしてももたらさなくてもよく、本明細書で開示する重鎖可変ドメインの特性を改変してもしなくてもよいことは明らかである。このような基、残基、部分又は結合単位は、例えば、生物学的に活性であり得る化学基であってもよい。
これら基、部分又は残基は、幾つかの実施形態では、重鎖可変ドメインにＮ又はＣ末端で、特にＣ末端で連結されている。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHHドメイン又はその機能的断片は、化学的に改変されていてもよい。例えば、そのような改変は、重鎖可変ドメインへの１又は２以上の官能基、残基又は部分の導入又は連結を含み得る。これら基、残基又は部分は、重鎖可変ドメインに１又は２以上の所望の特性又は機能を与え得る。そのような官能基の例は当業者に明らかである。
【００６７】
例えば、重鎖可変ドメインへのそのような官能基の導入又は連結は、重鎖可変ドメインの溶解性及び/若しくは安定性の増大、重鎖可変ドメインの毒性の低減、又は重鎖可変ドメインの望ましくない副作用の除去若しくは減弱、並びに/或いはその他の有利な特性をもたらすことができる。
特定の実施形態では、１又は２以上の基、残基、部分は、１又は２以上の適切なリンカー又はスペーサーを介して重鎖可変ドメインに連結される。
幾つかの実施形態では、１又は２以上の基、残基又は部分は、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片に、半減期の延長をもたらさない。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片は、寿命の延長をされていない。
幾つかの実施形態では、１又は２以上の基、残基又は部分は、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片の多量体化(例えば二量体化)を誘導しない。例えば、カルボキシ末端システイン含有タグ(例えばGCCタグ)を含むVHHは、単量体形態及び二量体形態の等量混合物を生じる(Pruszyskiら 2013 Nucl Med Biol. 40:52-59)。したがって、特定の実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片は、多量体化(例えば二量体化)を誘導するタグ、より具体的にはシステイン含有タグ、更により具体的にはGGCタグを含まない。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片は、Ｃ末端ポリペプチドタグ(例えばHisタグ及び/又はMycタグ)を含まない。幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片はタグ付加されていない。本明細書に記載するように、カルボキシ末端ポリペプチドタグを有さないVHHを用いる場合、ポリペプチドタグ(例えばHisタグ及びMyc-Hisタグ)が付加されたVHHと比較して、腎臓貯留が著しく低減することが示された。
【００６８】
腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合する本明細書で開示する放射標識VHHドメインは、一般に、(本明細書で更に説明するとおり)単量体形態であるが、特定の代替実施形態では、２又は３以上の本明細書で開示する放射標識VHHドメイン又はその機能的断片は、互いに連結されていてよく、又は相互接続されていてもよい。特定の実施形態では、２又は３以上のVHH又はその機能的断片は、１又は２以上の適切なリンカー又はスペーサーを介して互いに連結されている。本明細書で開示する異なるVHHの結合に用いる適切なスペーサー又はリンカーは、当業者に明らかであり、一般には、ペプチド及び/又はタンパク質を連結するために当該技術分野で用いられる任意のリンカー又はスペーサーであってよい。
幾つかの例示的な適切なリンカー又はスペーサーには、限定されないが、ポリペプチドリンカー、例えばグリシンリンカー、セリンリンカー、グリシン/セリン混合リンカー、グリシン-及びセリン-リッチリンカー若しくは主に極性ポリペプチド断片で構成されているリンカー、又はホモ若しくはヘテロ二官能性化学架橋化合物、例えばグルタルアルデヒド又は(必要に応じてPEGで間隔をあけた)マレイミド若しくはNHSエステルが含まれる。
例えば、ポリペプチドリンカー又はスペーサーは、１〜50アミノ酸、例えば１〜30、特に１〜10アミノ酸残基の長さを有する適切なアミノ酸配列であってよい。リンカーの長さ、可撓性の程度及び/又はその他の特性が重鎖可変ドメインの特性に幾らか影響し得ることは明らかである。このような影響を受け得る特性には、限定されないが、腫瘍標的又は癌細胞の標的に対する親和性、特異性又はアビディティーが含まれる。２又は３以上のリンカーを用いる場合、それらは同じでも異なってもよいことが明らかである。本開示との関係において及び本開示において、当業者は、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片の結合のための最適なリンカーを決定することができる。
【００６９】
IV．重鎖可変ドメインの機能的断片、アナログ、変異体、バリアント及び/又は誘導体
本開示は、本明細書で開示する放射標識VHHの断片、アナログ、変異体、バリアント及び/又は誘導体、並びに/或いは１又は２以上の当該断片、アナログ、変異体、バリアント及び/又は誘導体を含むか又はそれから本質的になるポリペプチドもまた包含する。本開示に従うこのような断片、アナログ、変異体、バリアント及び/又は誘導体は、一般に機能的である。幾つかの実施形態では、本開示に従うこのような断片、アナログ、変異体、バリアント及び/又は誘導体は、依然として、腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合できる場合、機能的であるとみなされる。
例えば、本開示は、腫瘍抗原又は癌抗原との結合に特に適する、本明細書で開示するVHHの幾つかのCDR配列を提供する。幾つかの実施形態では、CDR配列は、本明細書で開示するVHHの機能的断片とみなしてもよく、任意の適切な足場又は本明細書で開示するVHHに(特には、当該適切な足場タンパク質又はVHHの抗原結合部位又はその一部を形成するような様式で)存在し及び/又は組み込まれていてもよい。しかし、本開示は、最も広義には、これらCDR配列により、これら足場又は本明細書で開示するVHHが腫瘍抗原又は癌抗原と特異的に結合するようになる限り、当該CDR配列が足場又は本明細書で開示するVHH中で有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに注意されたい。
【００７０】
Ｖ．核酸配列、宿主及び宿主細胞
更なる態様において、本開示は、本明細書に記載する抗体断片(例えばVHH又はその機能的断片)をコードする核酸配列を提供する。これら核酸配列は、ベクターの形態であり得、又はゲノム、例えば細胞のゲノムに組み込まれていることもできる。本明細書で開示する核酸配列は、合成若しくは半合成の配列、ライブラリ(例えば発現ライブラリ)から単離されたヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを用いてPCRにより作製されたヌクレオチド配列、又は当該分野で公知のDNA合成法を用いて作製されたヌクレオチド配列であり得る。
本明細書で開示する核酸配列は、DNA又はRNAであってよく、例えば二本鎖DNAであってもよい。本明細書で開示する核酸配列は、宿主細胞又は宿主生物の形質転換に適切な形態、意図する宿主細胞のゲノムDNAへの組み込みに適切な形態、又は意図する宿主生物における独立の複製、維持及び/若しくは遺伝に適切な形態であり得る。例えば、本開示の核酸配列は、ベクターの形態、例えばプラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクター又はトランスポゾンの形態であってよい。幾つかの実施形態では、ベクターは、発現ベクター、例えばインビトロ及び/又はインビボで(例えば適切な宿主細胞、宿主生物及び/又は発現系において)発現をもたらすことができるベクターであってよい。
更なる態様において、本開示は、１又は２以上の本明細書で開示するアミノ酸配列を発現するか又は発現する能力を有する宿主又は宿主細胞を提供する。本開示のVHH配列、ポリペプチドの発現に適切な宿主又は宿主細胞の例は、当業者に明らかである。
【００７１】
VI．VHHドメインを含むポリペプチド
更なる態様において、本開示は、腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合する少なくとも１つの本開示のVHH配列を含むか又はそれから本質的になるポリペプチドを提供する。本開示のポリペプチドは、少なくとも１つの本明細書で開示するVHH又はその機能的断片と、必要に応じて、(場合により１又は２以上のリンカーを介して連結された)１又は２以上の更なる基、部分、残基とを含んでもよい。
幾つかの実施形態では、本開示は、単量体形態のVHHを含むポリペプチド及び医薬組成物、すなわち、ポリペプチド及び医薬組成物のインビボ半減期が可能な限り最小となるように唯１つのVHHドメインを含むポリペプチド及び医薬組成物を提供する。
代替の実施形態では、本開示は、二価(又は多価)又は二重特異性(又は多重特異性)ポリペプチドをもたらす２又は３以上の同一又は異なるVHHドメインを含むポリペプチド及び医薬組成物も提供する。
【００７２】
本明細書で開示するポリペプチドは、興味対象の他の標的又は標的タンパク質と結合するための１又は２以上の更なる基、部分又は残基を少なくとも含むことがある。このような更なる基、残基、部分及び/又は結合部位は、本明細書で開示するアミノ酸配列(及び/又はポリペプチド若しくはポリペプチドが存在する組成物)に更なる機能性をもたらしてももたらさなくてもよく、本明細書で開示するアミノ酸配列の特性を改変してもしなくてもよいことが明らかである。そのような基、残基、部分又は結合単位は、例えば、生物学的及び/又は薬理学的に活性であり得る化学基であってもよい。これら基、部分又は残基は、幾つかの実施形態では、本明細書で開示するアミノ酸配列とＮ又はＣ末端で連結されている。
幾つかの実施形態では、更なる基、部分又は残基は、ポリペプチドに半減期の延長をもたらさない。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書で開示するポリペプチドは、寿命の延長をされていない。
幾つかの実施形態では、更なる基、残基又は部分は、本明細書で開示するポリペプチドの多量体化(例えば二量体化)を誘導しない。したがって、特定の実施形態では、本明細書で開示するポリペプチドは、多量体化(例えば二量体化)を誘導するタグ、より具体的にはシステイン含有タグ、更により具体的にはGGCタグを含まない。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するポリペプチドは、Ｃ末端ポリペプチドタグ、例えばHisタグ及び/又はMycタグを含まない。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するポリペプチドは、タグ付加されていない。
【００７３】
本発明は、本開示のVHH配列若しくはその機能的断片、ポリペプチド又は組成物(又はそれらの発現に用いる本開示のヌクレオチド配列)の起源について限定されないことに留意されたい。更に、本開示は、本明細書で開示するVHH配列、ポリペプチド又はヌクレオチド配列が作製又は取得された方法についても限定されない。よって、本明細書で開示するアミノ酸配列は、合成又は半合成のアミノ酸配列、ポリペプチド又はタンパク質であってよい。
本開示が提供するアミノ酸配列、ポリペプチド及び組成物は、本質的に単離された形態(本明細書で定義するとおり)であることができ、又は少なくとも１つの本明細書で開示するアミノ酸配列を含むか若しくはそれから本質的になり得、１若しくは２以上の他の基、部分若しくは残基(全て、必要に応じて、１若しくは２以上の適切なリンカーにより連結されていてもよい)を必要に応じて更に含み得る本明細書で開示するポリペプチド若しくは組成物の一部を形成できる。
【００７４】
VII．標的タンパク質
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片は、固形腫瘍及び/又は癌細胞に存在する特定の標的タンパク質に対する親和性選択により得られる。特定の固形腫瘍抗原又は癌細胞に対する親和性選択による適切なポリペプチドの取得は、例えば、腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原に対する結合について、表面にVHHを発現する細胞(例えばバクテリオファージ)のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングすることにより行うことができる。例示的方法は、以下の非限定的な工程で提供される：ａ)腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子であって、可能性のある癌医薬の標的として知られている分子の単離溶液又は懸濁物を得る工程；ｂ)VHHライブラリのファージ又は他の細胞を前記タンパク質標的分子に対してバイオパニングする工程；ｃ)腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子に結合するファージ又は他の細胞を単離する工程；ｄ)結合する個々のファージ又は他の細胞から、VHH挿入物をコードするヌクレオチド配列を決定する工程；ｅ)組換えタンパク質発現を用いて、この配列に従う或る量のVHHを作製する工程；及びｆ)前記腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子についての前記VHHドメインの親和性を決定する工程；及び必要に応じてｇ)バイオアッセイにおいて、前記VHHの腫瘍殺傷又は抗癌活性を試験する工程。VHHと腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的分子との間の親和性を決定するために用いられ得る種々の方法には、例えばSambrookら(2001)、Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 第３版 Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されるような、当該技術において一般的なプラクティスである、例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)又は表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイが含まれる。幾つかの実施形態では、ポリペプチドとその標的分子との結合の解離定数は、10-5Ｍより低く、10-6Ｍより低く、10-7Ｍより低く、10-8Ｍより低く、例えば好ましくは10-9Ｍより低く、0.5×10-9Ｍより低く、例えば10-10Ｍより低い
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書で開示するVHHは、５×10-9Ｍ以下、例えば約１×10-9Ｍ〜約５×10-9Ｍの間、例えば約２×10-9Ｍ〜約３×10-9Ｍの間の解離定数で腫瘍抗原(例えば、HER2)と特異的に結合する。
幾つかの実施形態では、腫瘍特異的抗原又は癌細胞特異的抗原は、それぞれ腫瘍細胞又は癌細胞の表面に特異的に存在し又は特異的及び/若しくは豊富に発現する分子であり、幾つかの実施形態においては、正常な健常細胞の表面には存在しないか又は比較的低濃度若しくは密度でのみ存在し若しくは発現する分子である。幾つかの実施形態では、これらの腫瘍特異的又は癌細胞特異的抗原が本明細書で開示する放射標識VHH又は機能的断片と結合する場合、該抗原が発現する対応の腫瘍又は癌細胞は、放射毒性の機序により死滅するか、又はその成長が少なくとも停止、阻害若しくは低減する。
適切な腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的分子は、当業者にとって、現存する文献又は特許データベースから容易に入手可能であり、このような分子としては、限定されないが、変異に起因して異常な構造を有する腫瘍細胞で生成される任意のタンパク質が含まれ、ras及びp53遺伝子の異常産物、組織分化抗原、変異タンパク質抗原、発癌ウイルス抗原、癌・精巣抗原、癌胎児性抗原及び血管又は間質特異的抗原が含まれる。特異的腫瘍抗原の例としては、限定されないが、CTAG1B、MAGEA1、酵素チロシナーゼ、アルファフェトタンパク質(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、EBV及びHPV、異常構造の細胞表面糖脂質及び糖タンパク質及びHER2、EGFR並びにそれらのバリアントが含まれる。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又は機能的断片は、HER2に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又は機能的断片は、HER2に特異的に結合し、本明細書に記載する方法に用いられる。
【００７６】
或る種の非限定的な実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、適切な競合アッセイを用いて決定されるように、HER2のトラスツズマブ(Herceptin(登録商標))結合部位とは異なるHER2の結合部位に特異的に結合し、及び/又はHER2への結合に関してHerceptin(登録商標)と競合しない。
幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2のドメインIVとは異なる(すなわち、HER2のドメインIVではない)HER2の結合部位に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2のドメインIVのＣ末端とは異なる(すなわち、HER2のドメインIVのＣ末端ではない)HER2の結合部位に特異的に結合する。
幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、適切な競合アッセイを用いて決定したとき、HER2への結合に関して、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))と競合しない。
【００７７】
幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2のPerjeta(登録商標)(ペルツズマブ)結合部位とは異なるHER2の結合部位に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2のドメインIIとは異なる(すなわち、HER2のドメインIIではない)HER2の結合部位に特異的に結合する。
幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、適切な競合アッセイを用いて決定したとき、HER2への結合に関して、モノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))と競合しない。
幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、適切な競合アッセイを用いて決定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))及びモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))と競合しない。更なる実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2のトラスツズマブ(Herceptin(登録商標))及びペルツズマブ(Perjeta(登録商標))結合部位とは異なるHER2の結合部位に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、放射標識VHH又はその機能的断片は、HER2のドメインIV(例えば、HER2のドメインIVのＣ末端)及びHER2のドメインIIとは異なる(すなわち、それらでない)HER2の結合部位に特異的に結合する。
抗原標的化(例えばHER2標的化)放射標識VHH又はその機能的断片が同じ抗原を標的する結合剤(例えば、モノクローナル抗体)と競合するか否かを決定するに適切な競合アッセイは、限定されないが、インビボ競合アッセイであってよい。インビボ競合アッセイでは、放射標識VHH又はその機能的断片の生体内分布を、放射標識VHH又はその機能的断片のみを投与した試験動物と、放射標識VHH又はその機能的断片の投与前に該結合剤で前処理した試験動物とで比較し、実質的に同じ生体内分布プロフィールは、放射標識VHH又はその機能的断片が標的抗原への結合に関して該結合剤と競合しないことを示す。
【００７８】
本明細書の開示に基づいて、幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片、ポリペプチド及び組成物は、原則、全ての形態の腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原に特異的に結合することが理解される。しかし、本明細書で開示するVHH若しくはその機能的断片、ポリペプチド又は組成物は、獣医学目的を意図される場合、一般に、治療を意図する種に由来する全ての形態の腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原に特異的に結合するか、又は治療すべき種に由来する全ての形態の腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原と少なくとも交差反応性である。したがって、或る１つの対象種に由来する全ての形態の抗原に特異的に結合するVHH又はその機能的断片、ポリペプチド及び組成物は、１又は２以上のその他の種に由来する全ての形態の抗原と交差反応性を示しても示さなくてもよい。幾つかの実施形態では、ヒト又は動物における使用のためのアミノ酸配列の開発に関しては、研究及び実験室試験における使用のために処置されるべき種とは別の種に由来する形態の腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原に結合するVHH配列が開発されてもよい。
幾つかの実施形態では、本開示のVHH又はその機能的断片、ポリペプチド及び組成物は、腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原の天然に存在する又は合成の幾つかのアナログ、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分又は断片に結合することも期待される。幾つかの実施形態では、本開示のVHH又はその機能的断片、ポリペプチド及び組成物は、当該VHH又はその機能的断片、ポリペプチド及び組成物が結合する抗原の結合部位又はドメインを含む腫瘍特異的抗原及び/又は癌細胞特異的抗原のアナログ、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分又は断片に少なくとも結合することも期待される。
【００７９】
HER2に特異的に結合するVHH又はその機能的断片を本開示が提供する特定の実施形態では、本明細書で開示するVHHが単量体形態のHER2とのみ結合できるか、又は多量体形態のHER2とのみ結合できるか、又は単量体及び多量体の両形態のHER2と結合できることが本発明の範囲内である。幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH又はその機能的断片は、本明細書で開示するVHHが多量体形態と結合する親和性及び特異性と同じであるか又は異なる(すなわち、より高い又はより低い)親和性及び/又は特異性で単量体形態のHER2と結合してもよい。
幾つかの実施形態では、HER2が他のタンパク質又はポリペプチド(例えば、他のERBBレセプター)と会合して(例えば、複数のサブユニットを有する)タンパク質複合体を形成する(ヘテロ二量体化とも呼ぶ)場合、本明細書で開示するVHHは非会合状態のHER2に結合可能であり、又は会合状態のHER2に結合可能であり、又は両方に結合可能であることが、本発明の範囲内である。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示するVHH配列は、当業者に明らかなように、生物学的及び/又は治療的観点から最も妥当な形態のHER2(単量体形態、多量体形態及び会合形態を含む)に少なくとも結合する。
本明細書で開示する実施形態の範囲を逸脱することなく、適切な等価物を用いて、本明細書に記載の方法を他の適切な変法に改変及び順応させ得ることは、当業者に容易に理解される。ここまで、特定の実施形態について詳細に記載してきたが、下記の実施例を参照することにより、より明確に理解できる。なお、実施例は、単に本発明の説明のために記載されているのであり、本発明を限定するためのものではない。
【００８０】
VIII．抗体断片及び医薬組成物の作製及び製造
本開示は更に、本明細書に記載する抗体断片(例えば、VHH又はその機能的断片)を作製又は創出する方法を提供する。本開示はまた、本明細書に記載する抗体断片(例えば、VHH又はその機能的断片)をコードする核酸、並びに、本明細書に記載する抗体断片(例えば、VHH又はその機能的断片)を含んでなる宿主細胞、製品及び組成物を作製する方法を提供する。このような方法の幾つかの非限定的例を本明細書に記載する。
【００８１】
当業者に明らかであるように、本明細書で開示する重鎖可変ドメイン配列を作製する１つの例示的方法は、一般に、下記の工程を含んでなる：
(ａ)本明細書で開示する重鎖可変ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列又は該重鎖可変ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクター若しくは遺伝子構築物を発現させる工程、
(ｂ)必要に応じて、重鎖可変ドメイン配列を単離及び/又は精製する工程。
【００８２】
本明細書で構想する特定の実施形態では、腫瘍特異的又は癌細胞特異的重鎖可変ドメイン配列は、VHH配列のランダムライブラリの作製及び腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的タンパク質と特異的に結合可能なVHH配列についての該ライブラリのスクリーニングを含む方法により得ることができる。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する重鎖可変ドメイン配列を作製する方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ)VHHドメインのアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ)前記アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的と結合可能であり、及び/又は腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的に関して親和性を有するアミノ酸配列についてスクリーニングする工程と、
ｃ)腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的と結合可能であり、及び/又は腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的に関して親和性を有するアミノ酸配列を単離する工程。
【００８３】
このような方法では、VHH配列のセット、コレクション又はライブラリは、アミノ酸配列の任意の適切なセット、コレクション又はライブラリであってよい。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、免疫グロブリン断片配列(本明細書で記載するとおり)のセット、コレクション又はライブラリ、例えば免疫グロブリン断片配列の未処理のセット、コレクション又はライブラリ；免疫グロブリン断片配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ；及び/或いは親和性成熟に供した、免疫グロブリン断片配列のセット、コレクション又はライブラリであってよい。
この方法の特定の実施形態では、VHH配列のセット、コレクション又はライブラリは、免疫グロブリン断片配列の免疫性セット、コレクション又はライブラリ、例えば、腫瘍特異的若しくは癌細胞特異的標的、又はそれらに基づくか若しくはそれらに由来する適切な抗原決定基(例えば抗原性部分、断片、領域、ドメイン、ループ若しくはその他のエピトープ)で適切に免疫された哺乳動物に由来する免疫グロブリン断片配列の免疫性セット、コレクション又はライブラリであってよい。或る１つの特定の態様において、抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープであってよい。
上記の方法の幾つかの実施形態では、VHH配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばスクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は適切な微生物(例えば酵母)上に提示されていてよい。アミノ酸配列(のセット、コレクション又はライブラリ)を提示及びスクリーニングするための適切な方法、技術及び宿主生物は、例えば本明細書中の更なる開示に基づいて、当業者に明らかである。Hoogenboomの概説(Nature Biotechnology、23、9、1105-1116 (2005))も参照。
【００８４】
他の実施形態では、本明細書で開示する重鎖可変ドメイン配列を作製する方法は、少なくとも下記の工程を含んでなる：
ａ)VHHドメインアミノ酸配列を発現する細胞のコレクション又は試料を準備する工程と、
ｂ)前記細胞のコレクション又は試料を、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的と結合可能であり、及び/又は腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的について親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞についてスクリーニングする工程と、
ｃ)(ｉ)前記アミノ酸配列を単離するか、又は(ii)前記アミノ酸配列をコードする核酸配列を前記細胞から単離した後に前記アミノ酸配列を発現させる工程。
細胞のコレクション又は試料は、例えば、Ｂ細胞のコレクション又は試料であってよい。幾つかの実施形態では、本方法において、細胞の試料は、腫瘍特異的若しくは癌細胞特異的標的、又はそれらに基づくか若しくはそれらに由来する適切な抗原決定基(例えば抗原性部分、断片、領域、ドメイン、ループ若しくは他のそのエピトープ)で適切に免疫された哺乳動物に由来してもよい。或る１つの特定の実施形態では、抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープであってよい。
【００８５】
他の実施形態では、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的を指向する重鎖可変ドメイン配列を作製する方法は、少なくとも下記の工程を含んでなる：
ａ)VHHドメインアミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ)前記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的と結合可能であり、及び/又は腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的に関する親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列についてスクリーニングする工程と、
ｃ)前記核酸配列を単離した後に、前記アミノ酸配列を発現させる工程。
上記の方法の幾つかの実施形態では、アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えば、免疫グロブリン断片配列の未処理のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；免疫グロブリン断片配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；及び/或いは親和性成熟に供した、免疫グロブリン断片配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリであってよい。
【００８６】
幾つかの実施形態では、このような方法では、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、腫瘍特異的又は癌細胞特異的抗原(本明細書で定義するとおり)を指向するVHHドメインのセット、コレクション又はライブラリをコードする。
上記の方法の幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばスクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は適切な微生物(例えば酵母)上に提示されていてよい。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(のセット、コレクション又はライブラリ)を提示及びスクリーニングするための適切な方法、技術及び宿主生物は、例えば本明細書中の更なる開示に基づいて、当業者に明らかである。Hoogenboomの概説(Nature Biotechnology、23、9、1105-1116 (2005))も参照。
したがって、本開示は、上記の方法のいずれかにより、或いは、上記の方法の１つと、更に少なくとも、前記VHH配列のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する工程及び前記VHH配列を当該分野で公知の様式で、例えば適切な宿主細胞若しくは宿主生物での発現又は化学合成により発現又は合成する工程とを含む方法により取得可能であるか、又は取得されたVHH及びその機能的断片を提供する。
【００８７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載する抗体断片(例えば、VHH及び機能的断片)を作製する方法は、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的についての検出可能な結合親和性を有する少なくとも１つのVHHをアミノ酸配列ライブラリから単離する工程を更に含んでよい。
幾つかの実施形態では、この方法は、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的についての検出可能な結合親和性を有する少なくとも１つのVHH又はその機能的断片をコードする配列を増幅する工程を更に含んでよい。例えば、本明細書に記載する方法の選択工程から得られた特定のアミノ酸配列を提示するファージクローンを、宿主細菌の再感染及び増殖培地でのインキュベーションにより増幅してもよい。
【００８８】
幾つかの実施形態では、この方法は、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的と結合可能である１又は２以上のアミノ酸配列の配列を決定することを包含してよい。
アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリに含まれる重鎖可変ドメイン配列が適切な細胞又はファージ又は粒子上に提示される場合、前記細胞又はファージ又は粒子から、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を単離することが可能である。このようにして、選択されたアミノ酸配列ライブラリメンバーのヌクレオチド配列を、ルーチンの配列決定法により決定することができる。
更なる特定の実施形態では、本明細書で構想するVHH又はその機能的断片を作製する方法は、前記ヌクレオチド配列を、宿主生物において、適切な条件下で発現させ、所望のアミノ酸配列を取得する工程を含む。この工程は、当業者に公知の方法により行うことができる。
更に、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的についての検出可能な結合親和性を有する得られたVHH又は機能的断片は、可溶性タンパク質構築物として合成してよい(必要に応じてその配列を同定した後)。
【００８９】
例えば、上記の方法により取得され、取得可能であり又は選択されたVHH又は機能的断片は、当該技術で公知の組換え法又は化学合成法を用いて合成可能である。また、上記の方法により取得され、取得可能であり又は選択されたアミノ酸配列は、遺伝子工学技術により作製可能である。よって、幾つかの実施形態では、上記の方法により取得され、取得可能であり又は選択されたVHH又は機能的断片を合成する方法は、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的についての検出可能な結合親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸又はベクターで宿主細胞を形質転換又は感染させることを含んでよい。したがって、腫瘍特異的又は癌細胞特異的標的についての検出可能な結合親和性を有するVHH配列は、組換えDNA法により作製可能である。当該アミノ酸配列をコードするDNAは、従来の手順を用いて容易に合成可能である。一旦作製されると、該DNAを発現ベクターに導入することができ、次いで該ベクターで宿主細胞、例えば大腸菌(E. coli)又は任意の適切な発現系を形質転換又はトランスフェクションして、組換え宿主細胞中及び/又はこれら組換え宿主細胞が存在する培地中でアミノ酸配列の発現を得ることができる。
幾つかの実施形態では、適切な発現系を用いて発現ベクターから作製されるVHH又は機能的断片は、精製を容易にするため、例えばHisタグ又は他の配列タグで(典型的にはアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端の端にて)タグ付加されてもよい。
【００９０】
核酸又はベクターの宿主細胞への形質転換又はトランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び微粒子銃を含む、当業者に公知の種々の手段により達成し得る。
所望のVHH又はその機能的断片の発現に適切な宿主細胞は、インビトロ又はインビボに存在する任意の真核又は原核細胞(例えば細菌細胞、例えば大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞及び昆虫細胞)であってよい。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック植物又は動物中に位置してよい。
よって、本開示はまた、腫瘍又は癌細胞特異的抗原についての検出可能な親和性を有するVHH又はその機能的断片を作製する方法であって、当該VHH又はその機能的断片をコードする核酸配列又はベクターで宿主細胞を形質転換、トランスフェクト又は感染させ、適切な条件下でアミノ酸配列を発現させることを含んでなる方法も提供する。
【００９１】
幾つかの実施形態では、本開示は更に、本明細書で開示する医薬組成物を製造又は作製する方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも下記の工程を含んでなる、本明細書で開示する医薬組成物を作製する方法を提供する：
− 腫瘍又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合する少なくとも１つのVHH又はその機能的断片を取得する工程と、
− 前記VHH又はその機能的断片を医薬組成物に製剤化する工程。
これら方法の特定の実施形態では、腫瘍特異的又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合する少なくとも１つのVHH又はその機能的断片を取得する工程は：
(ａ)腫瘍特異的又は癌細胞特異的抗原と特異的に結合するVHH又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を発現させる工程と、必要に応じて
(ｂ)VHH又はその機能的断片を単離及び/又は精製する工程と
を含んでなる。
これら方法の他の具体的な実施形態では、腫瘍特異的又は癌細胞特異的タンパク質標的と特異的に結合する少なくとも１つのVHH又はその機能的断片を取得する工程は：
(ａ)VHHドメイン配列又はVHH配列の機能的断片のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
(ｂ)VHHドメイン配列又はその機能的断片の前記セット、コレクション又はライブラリを、腫瘍抗原と特異的に結合し、及び/又は腫瘍抗原に対する親和性を有する配列についてスクリーニングする工程と、必要に応じて
(ｃ)腫瘍特異的若しくは癌細胞特異的抗原と特異的に結合し、及び/又は腫瘍特異的若しくは癌細胞特異的抗原に対する親和性を有するVHH配列又はその機能的断片の配列を単離する工程と
を含んでなる。
【００９２】
IX．抗体断片の放射標識
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する抗体断片(例えば、VHH又はその機能的断片)は、放射性核種(本明細書で「放射性同位体」とも呼ばれる)に連結又は結合(例えば化学的に結合)している。幾つかの実施形態では、放射性核種はβ放射体及びγ放射体の両方である。本明細書で開示するVHH又はその機能的断片に連結することができるβ放射体及びγ放射体の両方である適切な放射性核種の例としては、例えば、ヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186及びレニウム-188が挙げられる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示した放射標識VHH又はその機能的断片は、ヨウ素-131で標識されている。
タンパク質(例えば、VHH又はその機能的断片)に放射性核種を組み込むために利用可能な種々の放射標識ストラテジが存在する。放射化学の技術の選択は、主に、用いる放射性核種に依存する。ヨウ素の放射活性同位体は、求電子性置換により直接又はコンジュゲーションにより間接的に分子に組み込まれる能力を有する。他方、放射活性金属は、キレート化剤との錯体形成により標識されてもよい。多くの金属性放射性核種は、キレート化剤と安定錯体を形成する能力を有することにより、タンパク質(例えば、VHH又はその機能的断片)とのコンジュゲーションが可能である。
【００９３】
一般に、タンパク質の放射ヨウ素標識には２つの基本的アプローチが存在する。１つのアプローチは、チロシン及びヒスチジン残基での求電子性置換を用いる直接タンパク質標識である。放射性ヨウ素は、インサイチュで酸化されて、求電子物質*I+を生じる。これは、クロラミンＴ、Iodogen(登録商標)及びＮ-ハロスクシンイミドのような酸化剤を用いて行われる。生じた求電子性物質は、アミノ酸チロシンの電子リッチな芳香環を攻撃して、σ錯体を形成する。この置換は、σ錯体を安定化する電子供与性ヒドロキシル基に起因してチロシンで行われる。タンパク質の標識は穏やかな条件下で起こる必要があるので、チロシンへのヨウ素の付着が適切である。この方法は穏やかな条件下で行われ、その条件はタンパク質の標識に最適である。しかし、この方法は、タンパク質がアクセス可能なチロシン又はヒスチジン残基を含む場合にのみ可能である。
コンジュゲーション(例えばリンカーを用いるもの)によるタンパク質の間接的ヨウ素化が代替法である。このアプローチでは、ヨウ素は、タンパク質における放射ヨウ素標識及び組込みの両方を可能にする２つの官能基を含む補欠分子族の適用により組み込まれる。放射ヨウ素標識に用いられる種々の補欠分子族(例えば、N-スクシンイミジル5-[*1]ヨード-3-ピリジンカルボキシル([131I]SIPC)及びN-スクシンイミジル-3-[*I]-ヨードベンゾエート([*I]SIB))が存在する。両活性エステルとも、タンパク質のアミノ基とコンジュゲートし、高いインビボ安定性を示す。芳香基のアシル化用の別の例示の補欠分子族は、N-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]SGMIB)である。
【００９４】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する放射標識VHH又はその機能的断片は、N-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で標識されている。
放射線療法の詳細なプロトコールは、専門家が容易に利用可能である(例えば、Cancer Radiotherapy: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine)、Huddart RA編、Human Press 2002を参照)。
【００９５】
Ｘ．キット
幾つかの態様において、本開示は、キット、例えば本明細書に記載の方法を実施するキットを提供する。幾つかの実施形態では、本キットは、スクリーニング線量の本明細書に記載の放射標識抗体断片(例えば、放射標識VHH又はその機能的断片)及び治療線量の該放射標識抗体断片を含んでなる。スクリーニング線量及び治療線量は本明細書に記載されている。いずれかのキットの幾つかの実施形態では、抗体断片は、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体(例えば、ヨウ素-131)で放射標識されている。適切な放射性同位体は本明細書に記載されている。
いずれかのキットの幾つかの実施形態では、キットは、スクリーニング線量及び治療線量の注入用の１又は２以上の手段を更に含んでなる。幾つかの実施形態では、スクリーニング線量及び治療線量は、各々が１つの注入手段に個別に収容されている。幾つかの実施形態では、注入手段はシリンジである。いずれかのキットの幾つかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法(例えば、本明細書に記載する対象を階層化し治療する方法)を実施するための指示書を更に含んでなる。指示書は、適切な任意の形態であり得、例えば、印刷物の形態(例えば、紙又はラミネート加工された同封物又はラベル)又は電気的形態(例えば、ディスク又はUSBスティック)であり得る。
【００９６】
XI. 他の例示的な態様
本開示の他の非制限的な態様を下記に示す。
態様１：癌治療に用いるための、癌細胞又は固形腫瘍に存在する標的タンパク質に特異的に結合する放射標識された重鎖抗体由来重鎖可変ドメイン(VHH)又はその機能的断片であって、癌を有する対象者が、治療について、スクリーニング線量の放射標識VHH又はその機能的断片の対象者における検出に基いて選択され、その後放射標識VHH又はその機能的断片が、選択された対象者に「治療線量」で投与される、γ放射体及びβ放射体の両方である放射性同位体で放射標識されているVHH又はその機能的断片。
態様２：前記対象者にスクリーニング線量で投与され、対象者の選択前に、該対象者の腫瘍部位における存在が検出される、態様１に従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様３：検出が前記対象者の撮像を含んでなる、態様２に従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【００９７】
態様４：撮像法が、Ｘ線造影法、コンピュータ断層法及び/又は磁気共鳴造影法のような非核造影法と組み合わされていてもよい、γカメラ撮像法、例えば平面γカメラ撮像法、単光子放出コンピュータ断層法又は陽電子放出断層法である、態様３に従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様５：放射性同位体がヨウ素-131、ルテニウム-177、イットリウム-90、銅-67、レニウム-186又はレニウム-188である、態様１〜４のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様６：放射性同位体がリンカーを介してVHH又はその機能的断片に付着している、態様１〜５のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様７：N-スクシンイミジル-4-グアニジノメチル-3-[I-131]ヨードベンゾエート([I-131]-SGMIB)又はその適切な誘導体若しくはバリアントを用いてヨウ素-131で放射標識されている、態様１〜６のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様８：スクリーニング線量が37MBq〜370MBqであり、治療線量が370MBq〜18500MBqである、態様１〜７のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【００９８】
態様９：HER2に特異的に結合する、態様１〜７のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様10：競合アッセイを用いて測定したとき、HER2への結合について、モノクローナル抗体トラスツマブ(Herceptin(登録商標))ともモノクローナル抗体ペルツズマブ(Perjeta(登録商標))とも競合しない、態様９に従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様11：配列番号１を有するCDR1領域と配列番号２を有するCDR2領域と配列番号３を有するCDR3領域、及び、配列番号４を有するCDR1領域と配列番号５を有するCDR2領域と配列番号６を有するCDR3領域  を含む群より選択される１つのCDR組合せを含んでなる、態様９又は10に従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様12：配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、態様９〜11のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様13：配列番号７及び８のアミノ酸配列の少なくとも一方と同一である、態様12に従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【００９９】
態様14：スクリーニング線量及び治療線量の放射標識VHH又はその機能的断片が各々独立して対象者に静脈内、腹腔内又は髄腔内投与される、態様１〜13のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様15：一価形式で存在する、態様１〜14のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様16：システイン含有タグ、好ましくはGGCタグを含まない、態様１〜15のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様17：寿命の延長をされていない、態様１〜16のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様18：タグ付加されていない、態様１〜17のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様19：癌が固形腫瘍である、態様１〜18のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様20: 癌が血液学的癌である、態様１〜18のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
態様21: 癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、多発性骨髄腫又はリンパ腫である、態様１〜18のいずれか１つに従う使用のための放射標識VHH又はその機能的断片。
【実施例】
【０１００】
下記の実施例により本発明を更に説明するが、実施例は更なる限定として解釈されるべきではない。
実施例１：抗HER2 VHHのヨウ素-131放射標識
放射化学的手順
VHHの放射ヨウ素標識の確立された手順を以下のように行った：必要量の[I*]ヨウ化ナトリウムを、全てクロロホルムに溶解した３％(v/v)酢酸、30％(v/v) tert-ブチルヒドロペルオキシド及びN-スクシンイミジル4-[N1,N2-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル) グアニジノメチル]-3-(トリメチルスタニル)ベンゾエートの混合物に移した。撹拌しながら、混合物を室温にて50分間インキュベートした。その後、[I*]SGMIB-BisBocを、酢酸エチル/ヘキサングラジエントを用いて順相HPLCで精製した。脱保護は、室温にてトリフルオロ酢酸と15分間インキュベートすることにより達成した。最後に、脱保護[I*]SGMIBを、100μgの抗HER2 VHH配列とホウ酸塩緩衝液pH8.5中で室温にて20分間反応させた。Hisタグ付加[131I]SGMIB-二価(2Rb17c-2Rb17c)、Hisタグ付加[131I]SGMIB-一価(2Rb17c)及びHisタグ付加[131I]SGMIB-一価(2Rs15d) VHHを、PBSで平衡化したPD-10カラムで精製した。
品質管理
品質管理は、インスタント薄層クロマトグラフィー(iTLC)により、PBS、pH7.4で泳動するシリカゲル含浸グラスマイクロファイバーストリップ(Varian、Lake Forest、CA、USA)を用いて行った。並行して、ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマー逆相カラム(PLRP-S 300Å、５μm、250/4mm、Agilent、Diegem、Belgium)を用いる分析的放射性HPLCを行った。水中0.1％ TFAとアセトニトリルとの混合物を以下のプロトコールで用いた：１ml/分の流速にて、０〜５分 25％アセトニトリル；５〜７分 25〜34％アセトニトリル；７〜10分 75〜100％アセトニトリル；10〜25分 100％アセトニトリル。
【０１０１】
実施例２：抗HER2 VHHのリチウム-177放射標識
VHHへの1B4M-DTPA及びCHX-A''-DTPAのコンジュゲーション
３タイプのＣ末端アミノ酸タグを有する抗HER2 VHH 2Rs15d、2Rb17c及び1R136bを作製した：タグ付加されていない(VHH)、Hisタグ(VHH-HHHHHH(配列番号９))及びMyc-Hisタグ(VHH-AAAEQKLISEEDLNGAA-HHHHHH(配列番号10))。10倍モル過剰の二官能性キレーター1B4M-DTP(177Lu用)を、600μlの0.05Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)中でVHHのリジンの遊離εアミノ基に、RTにて３時間コンジュゲートさせた。混合物のpHをpH7.0に低下させてコンジュゲーション反応をクエンチした。Superdex 75 10/30(GE Healthcare)において0.1Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pH7.0)中でVHH-キレーターを精製した。ESI-Q-ToF-MS(Waters, Micromass)をポジティブモードで用いて平均のコンジュゲーション度を評価した。
177Lu-DTPA-VHHの調製
以前の記載(20)のようにVHHを177Luで標識した。キャリアーフリーの177LuはITG(Garching, Germany)から塩化物溶液として入手した(比活性3000GBq/mg)。必要量の177Luを、金属不含0.1Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)を含む試験バイアルに、最終容量が200μlに達するように加えた。次いで、25〜100μgのVHH-DTPA(１mg/mL)を加え、RTにて30分間インキュベートした。放射標識VHH溶液を、使い捨てNap-5ゲル濾過カラム(GE Healthcare)で精製し、0.22μmフィルターに通した。放射化学的純度は、移動相として0.2Ｍクエン酸を用いるiTLCを利用して、分析的放射性HPLC又は放射性SECのいずれかで評価した。放射性HPLCは、ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマー逆相カラム(PLRP-S 300Å，５μm，250/4mm，Agilent，Diegem，Belgium)を用いて行った。ここで、H2O中0.1％ TFAとACNとの混合物を次のグラジエントを有する溶出液として用いた：流速１ml/分で、０〜５分 25％ ACN；５〜７分 25〜34％ ACN；７〜10分 75〜100％ ACN；10〜25分 100％ ACN。放射性SECは、Superdex 75 5/150GLにおいて、PBSを移動相として用いて流速0.3mL/分で行った。
【０１０２】
実施例３：
C57bl/6マウスにおける一価の寿命を延長されていない非タグ付加[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの血液クリアランス
材料及び方法
６匹の正常雄性C57bl/6マウスを用いて、血液クリアランスを評価した。各動物は、2500kBqの非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d (約４μg)の静脈内注射を受けた。血液試料は、注射の２、５、10、15、20、40、60及び120及び180分後にマイクロキャピラリーを用いて採取した。結果は、全血液量あたりの注入活性のパーセンテージ(％ IA/TBV)で表した。全血液量は、全体重の７％と推定した。血液半減期は、GraphPad Prismを用いて二相非線形回帰フィッティングにより決定した。
結果
非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dは、二相血液曲線に従って排除された。初期の迅速なウォッシュアウト相の算出半減期は、約1.93分であった。60分後に、血中で２％ IA/TBV(全血液量あたりの注入活性のパーセンテージ)以下が測定された。
【０１０３】
実施例４：
HER2+腫瘍異種移植マウスにおける一価の寿命を延長されていない非タグ付加[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布及び線量測定並びに成人女性における放射線量推定
材料及び方法
雌性６週齢CRL:Nu-FoxNInu無胸腺マウスの背中に、60日間継続放出17-β-エストラジオールペレット(0.72mg、Innovative Research of America: Sarasota、FL、USA)を移植し、その１日後に腫瘍を移植した。50％ Matrigel(BD Biosciences、Bedford、MA、USA)中のHER2+ BT474/M1ヒト乳癌細胞(10×106)を、右側腹部に皮下注射し、容積が250〜350mm3に達するまで成長させた。
非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布プロフィールを決定した。動物(n=3)に、1185kBqの非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(2.0μg)を注射した。注射の１、３、６、24、48、72、96、120、144時間後に、マウスを過剰量のハロタンで安楽死させ、解剖し、器官を採取した。興味対象の組織を秤量し、γカウンタで131I放射活性について注射標準物質とともにカウントした(表１)。得られたデータ(％ IA/gで表す)を用いて、対応する腫瘍対健常組織比を算出した(表２)。
【０１０４】
更に、非タグ付加一価131I-SGMIB-抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布値を、線量算出に用いた(表３)。値を時間積分して、グラム組織あたりの貯留時間を得た。簡潔には、０時間〜144時間の積分を、台形法を用いて行った。次に、吸収線量を算出した。吸収線量の算出において、131IのＳ値は、インターネット上に公開されているRADARファントム(Unit Density Spheres)から得た。１ｇの球体のＳ値(0.0000304Gy.Kg/MBq.s)を概して用いて、全ての器官線量を算出した。この単純化した線量算出は、131I減衰における低エネルギーβ粒子が局所吸収され、光子その他の透過性放射線の貢献の程度は低いという事実(このことは、マウスの異なる器官間のクロストークは無視できることを意味する)により動機付けられる。
成人女性における器官吸収線量の推定は、マウスにおける種々の時点での非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布データを、１時間の排尿膀胱間隔を用いるOLINDAソフトウェアを利用して成人女性ファントムに外挿することにより行った(表４)。算出は、時間-活性曲線に基づいて、器官における崩壊数を決定した。器官の線量及び実効線量は、種々の器官について適切な重み付け因子を用いて算出した。
【０１０５】
結果
非常に高い腫瘍対健常組織比が達成され(表２)、このことにより、健常組織における非常に低い取り込み(よって低い毒性)が強調される。非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを用いて観察した場合のこの程度の腫瘍対組織比は、他の放射性免疫生物学的物質について、これまで公表されていない。具体的には、この比は、5F7GGCと呼ばれるHER2標的システインタグ付加VHH(Pruszynskiら、2014；J. Nucl. Med. 55(4)：650-656)と比較して有意に高かった。腫瘍 対 肺、心臓、肝臓、腎臓、胃、脾臓、筋肉及び血液の比は全て、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dのものが１及び24時間の時点で5F7GGC VHHのものに対して有意に高かった。非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dについて、腎臓における非常に低い取込値が見出されたことは、特に驚くべきことであった。この腎臓取込値は、5F7GGC VHHについて報告されたものよりも更に低かった。
【０１０６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１０７】
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１０８】
腎臓の放射線吸収線量の算出のためにPruszynskiらに記載されたものと同じ方法を用い、そして％ IA/g組織の値(表１)に基づいて、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dについて835.96cGy/mCiの値が得られ(表３)、これは、5F7GGC VHHについてPruszynskiらの線量測定データに基づいて得られる値の半分以下であった。また、肝臓、脾臓、肺、胃及び血液に対しても、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dについて非常に低い値が観察された。
非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dについて得られた値(835.96cGy/mCi)は、Hisタグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dについて腎臓に吸収された線量 (1055cGy/mCi)より驚くほど低かった。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
成人女性についての放射線量推定値は、マウスにおける非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布データからOLINDA 1.0ソフトウェアを用いて算出した。算出は時間-活性曲線に基づき、20のソース器官における崩壊数を決定した。器官線量、実効線量及び実効線量当量は、種々の器官について適切な重み付け因子を用いて算出した。表４は、算出した器官吸収線量をまとめたものである。実効線量は、0.0273mSv/MBqと推定した。
【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
実施例５：HER2+腫瘍異種移植マウスにおけるトラスツズマブ及び/又はペルツズマブとの競合での非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布
非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの体内分布プロフィールを、HER2+腫瘍異種移植マウスにおいて、トラスツズマブ、ペルツズマブ又は両方の組合せでの前処置後に評価した。トラスツズマブ(商品名：Herclon(登録商標)、Herceptin(登録商標))及びペルツズマブ(商品名：Perjeta(登録商標))は、HER2/neuレセプターに干渉するモノクローナル抗体である。これらの主な用途は、或る種の乳癌の治療である。
材料及び方法
雌性６週齢CRL:Nu-FoxNInu無胸腺マウスの背中に、60日間継続放出17-β-エストラジオールペレット(0.72mg、Innovative Research of America: Sarasota、FL、USA)を移植し、その１日後に腫瘍を移植した。50％ Matrigel(BD Biosciences、Bedford、MA、USA)中のHER2+ BT474/M1ヒト乳癌細胞(５×106)を、右側腹部に皮下注射し、容積が150〜250mm3に達するまで成長させた。非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの投与の72時間前に、動物(n=3)を100Ｍ過剰の抗HER2 mAbで前処置した。次いで、マウスに、1185kBqの非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(5.0μg)を投与した。注射の１時間後、マウスを過剰量のハロタンで安楽死させ、解剖し、器官を採取した。興味対象の組織を秤量し、γカウンタで131I放射活性について注射標準物質とともにカウントした。結果は、グラム組織あたりのパーセンテージ注入活性(％ IA/g)として表した。
【０１１３】
結果
結果を表５に示す。非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dのみを投与した動物群とHerceptin(登録商標)及び/又はPerjeta(登録商標)で前処置した動物群との間で腫瘍取込に有意差は観察されなかった。
よって、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dは、示したインビボ競合アッセイにより示されるように、HER2への結合についてモノクローナル抗体Herceptin(登録商標)及びPerjeta(登録商標)と競合しない。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
実施例６：HER2+腫瘍異種移植マウスにおける非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの治療効力
非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの治療効力は、HER2+腫瘍異種移植マウスにおける腫瘍成長を阻害する能力を測定することにより評価した。治療効力の特異性は、２つの対照：(１)非タグ付加一価[131I]SGMIB標識非標的化対照VHHの投与、及び(２)ビヒクル溶液PBSの投与を含めることにより評価した。
材料及び方法
19匹のCRL:Nu-FoxNInuマウスの右後肢に、50/50 Matrigel/細胞培養培地中の５×106のHER2+ BT474/M1腫瘍細胞を接種した。腫瘍を、ノギス測定により決定されるように50±30mm3まで成長させた。次に、動物を無作為に３つの処置群に分けた：処置群１(n=6)：非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d(250±50μCi/処置)、処置群２(n=6)：非タグ付加一価[131I]SGMIB標識非標的化対照VHH(250±50μCi/処置)、及び処置群３(n=7)：ビヒクル溶液。動物を５回処置した(週１回、５週間)。腫瘍容積及び動物体重を毎週測定した。腫瘍が１cm3に達するか又は＞20％の体重減少が観察されたとき動物を安楽死させた。150日後、結果を生存曲線にまとめ、その後統計分析を行った(ログランク(Mantel-Cox)検定)。
【０１１６】
結果
小さなHER2+ BT474/M1腫瘍(50±30mm3)を有するマウスに、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識非標的化対照VHH又はビヒクル溶液PBSのいずれかを静脈内注射した。PBS処置群(n=7)の全ての動物及び非タグ付加一価[131I]SGMIB標識非標的化対照VHHでの処置群(n=6)の１匹を除く全ての動物を、大きな腫瘍(＞１cm3)の発生により150日目に安楽死させた(図１)。両対照群間でイベントフリー生存率に統計学的有意差は観察されなかった。
対照的に、２つの対照動物群と比較して、非タグ付加一価[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dでの処置群において、腫瘍成長は有意に遅延した(図１)。更に、150日目まで、処置動物群の半分が腫瘍負荷を全く示さなかった。全体として、処置群の生存率は、PBS(Ｐ＜0.05)又は非タグ付加一価[131I]SGMIB標識非標的化対照VHH(Ｐ＜0.05)を投与した対照群と比較して有意に長かった。換言すれば、[131I]SGMIB標識抗HER2 2Rs15d VHHは、HER2タンパク質に結合すると、腫瘍成長の進行を減速させることができ、防止さえすることができる。この知見は、著しく驚くべきことである。なぜならば、治療効果には寿命延長及び多価性を必要すると一般に認識されているにもかかわらず、寿命を延長されていない放射標識非タグ付加一価VHHは、治療効果を有することが示されたからである。
【０１１７】
実施例７：スクリーニング線量及び治療線量の決定
ヨウ素-131標識VHHを患者にスクリーニング線量(例えば、185MBqまで)で投与して、癌病変に対する標的化及び健常組織における貯留を測定する。
この目的のため、全身平面γカメラ撮像法又は単光子放出コンピュータ断層法を、ヨウ素-131標識VHHの投与後１時間〜24時間行う。癌病変がヨウ素-131標識VHHの取込みを示す場合、該患者はヨウ素-131標識VHH治療の適格者である。スキャン結果に基づいて、当該患者の理想的な総治療線量を決定することができ、また、健常組織に対する毒性効果なしに投与し得る最小線量を決定することもできる。
(スキャンに基いて)癌病変における取込みが確証されると、第１の治療線量のヨウ素-131標識VHHを投与することができる。代表的な放射活性線量は1110〜5550MBqの範囲である。この線量は、効果的な癌治療に理想的な総線量を得るために必要な限り、週１回を基本として繰り返すことができる(ただし、代表的な治療回数は５〜６回である)。
【０１１８】
実施例８：健常ボランティア及び乳癌患者における[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの安全性、体内分布、放射線量測定及び腫瘍画像化能力を評価する第Ｉ相試験
ヒトで最初の、単一施設におけるオープンの非無作為化臨床試験を行う。本試験は、二部に分けて行う。
第Ｉ部は、健常ボランティアにおいて行い、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの安全性、体内分布及び放射線量測定を評価する。
第II部は、HER2+乳癌患者において行い、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの安全性及び体内分布並びに腫瘍取り込みを評価する。
健常ボランティア対象者及び患者の参加又は不参加の基準は次のとおりである。
本研究に参加する健常ボランティアは、インフォームドコンセントを提出し、試験期間中アルコール飲料を摂取せず、いかなる薬も使用しないことに同意し、血液パラメータが正常範囲内であり、少なくとも18歳である。
【０１１９】
妊娠対象者、授乳中の対象者、イオン化照射に職業的に曝されている対象者、臨床的に有意な疾患を有するか又は共存治療(避妊を除く)を有する対象者、甲状腺疾患を以前に有していた対象者、診断又は治療目的で２日以内に長半減期(＞７時間)の放射標識化合物を投与された対象者、ヨウ化カリウムによる甲状腺ブロックについて絶対的禁忌である対象者、肝臓異常(すなわち、ALT/ASTが正常値の２倍超；ビリルビンが正常値の1.5倍超)の対象者、腎機能異常(すなわち、＜50ml/分/1,73m2)の対象者、下痢を主症状とする胃腸疾患(CTCAE v4.0グレード３又は４)を最近(＜１週間)患った対象者、重篤な活動性の感染を有する対象者、(治験責任者の見解で対象者の安全を危うくするか又は試験医薬品の安全性評価に干渉するとされる)他の任意の生命に関わる病気又は臓器系不全を有する対象者、治験責任者と容易に意思疎通ができない対象者、本試験の要求に協力する可能性がない対象者、併存する疾患による死亡リスクが増大している対象者、本試験に既に参加した対象者及び抗-HER2 2Rs15dを用いた以前の試験に参加した対象者は、本試験に参加させない。
【０１２０】
本試験に参加する患者は、インフォームドコンセントを提出し、本研究期間中アルコール飲料を摂取せず、いかなる薬も使用しないことに同意し、少なくとも18歳であり、生検組織で免疫組織化学又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)により診断したときに、局所の、局所的に進行した又は転移のHER2+乳癌を有する。
妊娠患者、授乳中の患者、イオン化照射に職業的に曝されている患者、甲状腺疾患を以前に有していた患者、診断又は治療目的で最近２日以内に長半減期(＞７時間)の放射標識化合物を投与された患者、ヨウ化カリウムによる甲状腺ブロックについて絶対的禁忌である患者、肝臓異常(すなわち、ALT/ASTが正常値の２倍超；ビリルビンが正常値の1.5倍超)の患者、腎機能異常(すなわち、＜50ml/分/1,73m2)の患者、下痢を主症状とする胃腸疾患(CTCAE v4.0グレード３又は４)を最近(＜１週間)患った患者、重篤な活動性の感染を有する患者、(治験責任者の見解で患者を危うくするとされるか又は試験放射性医薬品の安全性評価に干渉する)他の任意の生命に関わる病気又は臓器系不全を有する患者、治験責任者と容易に意思疎通ができない患者、本研究の要求に協力する可能性がない患者、併存する疾患による死亡リスクが増大している患者、本研究に既に参加した患者及び抗-HER2 2Rs15dを用いた以前の試験に参加した患者は、本研究に本研究に参加させない。
【０１２１】
全ての健常対象者及び患者に、静脈又はポルタカスに挿入した静脈内ラインを介して、111±74MBqの放射活性を有する50±40μgの[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを、注入ポンプを用いて５±３分間以内に静脈内注射する。この製品は、健常ボランティアには、55±18MBqの放射活性で単回投与として投与する；HER2+乳癌患者では、この製品は、148±37MBqの放射活性で単回投与として投与する。
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d投与の24±６時間前から48±12時間後まで続けて、甲状腺ブロックのために、全ての健常対象者及び患者に130mgのヨウ化カリウムを１日１回経口投与する。
【０１２２】
安全性及び寛容性の結果測定
本試験期間中に対象者が経験した全ての有害事象に関するデータの収集及び評価により、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの寛容性及び安全性を評価する。
投与前に、対象者は、バイタルサイン(動脈圧及び脈拍)を含む理学的検査を受け、自由回答式非誘導的質問を用いて、合併症並びに一般的な身体的及び情動的状態の変化について質問される。加えて、投与５±10分後にバイタルサインをモニターする。健常対象者については投与4.5±１時間後に、HER2+乳癌患者については３±１時間後に２回目の理学的検査を行う。
血液学及び臨床化学のために、投与前及び投与24±４時間後に血液を採集する。ベースラインの臨床検査値からの臨床的に関連するいかなる変化も、それが不適切な取扱い、測定誤差その他の技術的原因に起因するものと合理的に推定できなければ、有害事象として記録する。
【０１２３】
加えて、活性測定のために、投与前並びに投与５±３分後、10±３分後、20±５分後、30±５分後、60±15分後、105±30分後、225±30分後、23.75±４時間後、71.75±４時間後に健常ボランティアから血液試料を採取して、血中における[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの時間-活性曲線を得る。全血及び血漿試料を自動ガンマウェルカウンタで既知の希釈率の適切な標準物質についてカウントし、崩壊及びバックグランド活性について補正後、注入活性のパーセンテージ(％IA)として表す。各ボランティアの血液量は、Nadlerの式及び対象者のヘマトクリットを用いて体重及び身長に従って推定する。
尿を健常ボランティアから投与60±15分後、225±30分後、23.75±４時間後及び71.75±４時間後に採取して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)により未代謝のものの割合を測定する。
投与０〜30±10分後に行うダイナミックスキャン及び投与40±10分後、120±30分後、240±30分後、24±４時間後及び72±４時間後に行う平面全身スキャンを利用して、ヒト体内分布を健常ボランティアについて評価する。
ヒト線量測定は、OLINDA/EXMソフトウェア1.0を用いて、種々の対象者の全身スキャンに基づく興味対象領域の測定値を利用して定量する。
【０１２４】
腫瘍標的化の結果測定
腫瘍標的化能力は、投与2.5±１時間後及び24.5±４時間後に行う患者のSPECT/CTスキャンに基いて、ポジティブ(高度、中度又は低度)又はネガティブとして視覚的にスコア付けする。単位量あたりの活性を定量する。
【０１２５】
実施例９：[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの非臨床毒性研究
材料及び方法
[127I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの非放射性参照材料として規定する。
Swiss Albinoマウスへの単一マイクロ用量の静脈内投与後に、[127I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの毒性プロフィールを評価した。単回用量の[127I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d製剤を性ごとに15匹のマウスからなる群(G2)に1.4mg/kgの用量で静脈内経路により投与した。1.4mg/kgの用量レベルは、EMEAのマイクロ投薬毒性ガイドライン(CPMP/ICH/286/95)により必要とされるヒトの予想用量の1000倍である。
同時進行のビヒクル対照群(G1)は、性別ごとに15匹のマウスからなり、この群にはビヒクル(リン酸緩衝化生理食塩水)のみを投与した。各マウスに投与した投薬量は６mL/kg体重であった。評価したパラメータは、臨床徴候、死亡率、体重及び摂食の変化、血液学及び臨床化学パラメータ、器官重量及び全体的病状であった。処置したマウスは、２日目(10マウス/性/群)及び15日目(残る５マウス/性/群)に犠牲にした。
【０１２６】
結果
試験項目に関連する死亡又は臨床徴候、体重変化、体重増加及び食物消費は、実験期間を通じて観察されなかった。試験項目に関連する血液学、臨床化学、末期絶食体重、器官重量/比及び全体的病状はなかった。
したがって、[127I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dのSwiss Albinoマウスへの1.4(±10％)mg/kg体重の用量レベルでの単回マイクロ用量静脈内投与は、試験条件下で毒性を引き起こさないと結論付けられる。
【０１２７】
実施例10：[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを用いる非臨床インビトロ研究
材料及び方法
PBS及びヒト血清中での[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの安定性
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中25℃で144時間インキュベートした。アリコートを０、１、48、72及び144時間に採取し、放射性HPLCで分析した。ヒト血清中の安定性は、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dをヒト血清と37℃で168時間インキュベートすることにより分析した。アリコートを０、３、24、48、72、96及び168時間に採取し、その後放射性SECで分析した。
HER2発現腫瘍細胞結合：特異性
HER2発現腫瘍細胞に対する[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの特異性を評価するため、細胞結合研究を行った。結合がレセプター特異的であることの証明のため、1000倍過剰の出発材料である非放射性抗HER2 VHH 2Rs15dを、対照実験のHER2+細胞に添加してHER2レセプターを飽和させた。
【０１２８】
HER2発現腫瘍細胞結合：親和性
HER2発現腫瘍細胞に対する[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの結合親和性を評価した。ここで、HER2発現腫瘍細胞を、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの０〜300nMの系列希釈物とインキュベートした。併行して、100倍過剰の非標識抗HER2 VHH 2Rs15dを添加して(HER2発現腫瘍細胞のブロック)、非特異結合を評価した。
HER2発現腫瘍細胞結合：内在化
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15の細胞貯留を種々の時点でHER2発現腫瘍細胞について評価した。細胞を25nMの[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15と37℃で０、１、２、４、６及び24時間インキュベートした。併行して、100倍過剰の非標識抗HER2 VHH1を添加して(HER2発現腫瘍細胞のブロック)、非特異結合を評価した。４つの画分を特徴付けた：上清画分、細胞膜結合画分、内在化画分、及び全細胞関連(膜結合＋内在化)画分。
【０１２９】
結果
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dは、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中25℃で少なくとも72時間安定であった(＞96％のインタクトな[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15d；図２)。ヒト血清中では、95％の[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dが24時間後に依然としてインタクトであり、168時間後の87％まで徐々に減少した(図２)。
結合特異性実験の結果から、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの結合はレセプター媒介性であり、レセプター飽和により妨げられ得ることが示された(図３)。
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dは、HER2発現腫瘍細胞に4.74±0.4nMの親和性で結合した(図４)。
24時間後、当初結合したインタクトな[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの約25％が、依然として腫瘍細胞と相互作用し、その半分が膜に結合し、半分が細胞内に内在化する(図５)。
【０１３０】
実施例11：[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの静脈内投与用製剤
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの製造
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの製造のため、先ず、放射ヨウ素標識剤N-スクシンイミジル 4-グアニジノメチル-3-131I-ヨードベンゾエート(131I-SGMIB)を合成した。
131I-SGMIBの放射性合成は、50マイクログラムのSGMIBスズ前駆体(SnMe3-BisBoc-SGMIB)の求電子性放射ヨード標識に続く、無水条件下での脱保護及びsemi-prep HPLCでの精製により行った。集めたHPLC画分を水で希釈した。中間生成物をtC18 Plusカートリッジで捕捉し、水でリンスし、酸性化エタノールで溶出させた。
【０１３１】
【化１】
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【０１３２】
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの合成又はコンジュゲーションは、基質として131I-SGMIB、求核試薬として抗HER2 VHH 2Rs15d(Innogenetics)を用いる室温での求核置換により行った。最適なコンジュゲーションを達成するため、Vivaspin遠心濃縮機を用いて、抗HER2 VHH 2Rs15dを先ずPBS緩衝液(pH7.4)から脱塩し、ホウ酸緩衝液(pH8.5)に溶解させた。コンジュゲーション後、反応混合物をPd-10カラムで精製した。
【０１３３】
【化２】
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【０１３４】
[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの製剤化
PD-10カラムから13mLの臨床緩衝液(PBS緩衝液)への[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの溶出後、放射活性量を測定した。精製及び希釈した[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを、クラスＣのバックグランドにおいてクラスＡの閉鎖型アイソレータ中でフィルター滅菌した。この充填及び滅菌濾過工程のため、製剤化品を製剤バイアルから分析バイアル(品質管理に使用)に、滅菌0.2μm Sartoriusフィルターを通して移し、その後分析バイアルから製品バイアルに、第２の滅菌0.2μm Sartoriusフィルターを通して移した。推力として真空ポンプを用いた。最後に、製品バイアルをラベルが付されたコンテナに移した。濾過プロセスの間セトルプレートは開放した。
濾過プロセスの間に用いる機材は、滅菌ニードル、長いニードルを備えた滅菌チューブ材、滅菌0.2μm Sartoriusフィルター及び空の滅菌密封バイアルであった。無菌組立法を用いて、滅菌ニードルをSartoriusフィルターに取り付けた。
製剤の組成を表６に示し、仕様を表７に示す。
【０１３５】
【表８】
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【０１３６】
【表９】
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【０１３７】
実施例12：[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを用いるインビボ画像化及び体内分布測定
４匹の雌性CRL:Nu-FoxNInuマウスに、60日間徐放エストロゲンペレットを移植し、その後、マウスの右後肢に、50/50 matrigel/細胞培養培地中の10×106のHER2+腫瘍細胞を接種した。腫瘍を、ノギス測定による450±200mm3まで成長させた。
次に、マウスの尾静脈に248±１μCiの[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dを静脈内注射し、続いて１、４及び24時間後にマイクロ-SPECT/CT撮像を行った。スキャンの間、動物を、２％イソフルラン(1.5L/分の酸素流)を用いて麻酔し、加温パッドを用いて保温した。マイクロ-SPECT/CT撮像はVector+/CT MILabsシステムを用いて行った。この実験のため、撮像は、PETコリメータ及び94のベッド位置のスパイラルスキャンモード(位置あたり19s)を用いて行った。CTについては、１位置のみの通常スキャンモードを用いた。得られたSPECTデータを0.6ボクセルサイズ、２サブセット及び７反復で再構築し、その後、画像を合成し、CTスキャンに基いて減衰について補正した。この画像を、医用画像データ分析ツール(AMIDE)及びOsiriXを用いて分析した。選択した器官及び組織における[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dの取込値を分析し、％注入活性(％IA)/ccとして表した。
【０１３８】
注射１時間後、最高率の[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dが膀胱で見出され、より少ない程度で腎臓及び腫瘍において見出された。４及び24時間後、腎臓での率は、24時間後に0.3％IA/ccを下回る値まで有意に低下した一方、腫瘍での低下は然程顕著でなかった(24時間後に依然として＞１％IA/cc)。24時間後、マイクロ-SPECT/CT画像上には腫瘍及び膀胱のみが観察された(データは示さず)。甲状腺については非常に低い取込値が記録された。このことは、本化合物の良好なインビボ安定性を示している。筋肉のような対照組織での極めて低い取込値は、結合の並外れた特異性を支持している。
【０１３９】
【表１０】
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得られた腫瘍 対 組織比は、エキソビボ体内分布測定(実施例４を参照)により得られた比と一致する。
【０１４０】
【表１１】
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結論として、[131I]SGMIB標識抗HER2 VHH 2Rs15dは、或る１つの同じ形式で、画像化及び治療の両方に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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