(57)【要約】  コムギのLpx遺伝子の1つ以上に見出される一連の独立したヒト誘導非トランスジェニック変異；そのLpx遺伝子の1つ以上にこれらの変異を有するコムギ植物体；及びプールしたコムギ植物体及び/又は個々のコムギ植物体をスクリーニングすることによってLpxの類似の変異及び/又は追加の変異を作出及び発見する方法。本明細書に開示するコムギ植物体は、それらのゲノムに外来核酸を加えることなくリポキシゲナーゼ活性の低下を示す。加えて、本明細書に開示するコムギ植物体から製造される製品は、それらのゲノムに外来核酸を加えることなく酸化安定性の増強及び保存寿命の延長を示す。
2018518184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
B及びDゲノムの一方又は両方のLpx1遺伝子における1つ以上の変異を含むコムギ植物体であって、前記コムギ植物体由来の製粉穀粒が、野生型コムギ植物体由来の製粉穀粒と比較して、（a）延長された保存寿命；（b）増強された酸化安定性；（c）低下したLpx1タンパク質の生成；（d）前記Lpx1タンパク質の低下した活性；（e）低下したヘキサナール生成；（f）低下したピネリン酸生成；（g）低下した脂肪酸由来分解生成物；又は（h）改善された感覚的特徴、から成る群から選択される特性を有することを特徴とするコムギ植物体。
【請求項２】
前記Bゲノムにおいて1つ以上の変異を含む、請求項１に記載のコムギ植物体。
【請求項３】
前記Lpx1遺伝子が、Lpx-B1.2である、請求項２に記載のコムギ植物体。
【請求項４】
前記Lpx-B1.2遺伝子におけるBゲノムの変異が、配列番号:６のアミノ酸510位のトリプトファンから終止コドンへの変化（W510*）をもたらす、請求項３に記載のコムギ植物体。
【請求項５】
前記Dゲノムに1つ以上の変異を含む、請求項1に記載のコムギ植物体。
【請求項６】
前記Lpx1遺伝子が、Lpx-D1である、請求項5に記載のコムギ植物体。
【請求項７】
前記Lpx-D1遺伝子のDゲノムの変異が、配列番号:３のアミノ酸494位のトリプトファンから終止コドンへの変化（W494*）をもたらす、請求項６に記載のコムギ植物体。
【請求項８】
前記B及びDゲノムの両方に1つ以上の変異を含む、請求項1に記載のコムギ植物体。
【請求項９】
請求項1に記載のコムギ植物体に由来するコムギの穀粒。
【請求項１０】
請求項9に記載のコムギの穀粒を含む粉。
【請求項１１】
請求項1に記載のコムギ植物体の成分を含む食品。
【請求項１２】
請求項1に記載のコムギ植物体に由来するコムギ種子、植物部分又は前記の子孫。
【請求項１３】
B及びDゲノムの両方におけるLpx1遺伝子における1つ以上の変異を含むコムギ植物体であって、前記コムギ植物体由来の製粉穀粒が、野生型コムギ植物体の製粉穀粒と比較して、（a）延長した保存寿命；（b）増強した酸化安定性；（c）低下したLpx1タンパク質の生成；（d）前記Lpx1タンパク質の低下した活性；（e）低下したヘキサナール生成；（f）低下したピネリン酸生成；（g）低下した脂肪酸由来の分解生成物；又は（h）改善された感覚的特徴、から成る群から選択される特性を有することを特徴とするコムギ植物体。
【請求項１４】
前記Lpx-B1.2遺伝子のBゲノムの変異が、配列番号:６のアミノ酸510位のトリプトファンから終止コドンへの変化（W510*）をもたらす、請求項１３に記載のコムギ植物体。
【請求項１５】
前記Lpx-D1遺伝子のDゲノムの変異が、配列番号:３のアミノ酸494位のトリプトファンから終止コドンへの変化（W494*）をもたらす、請求項１３に記載のコムギ植物体。
【請求項１６】
請求項１３に記載のコムギ植物体に由来するコムギの穀粒。
【請求項１７】
請求項１６に記載のコムギの穀粒を含む粉。
【請求項１８】
請求項１３に記載のコムギ植物体の成分を含む食品。
【請求項１９】
請求項１３に記載のコムギ植物体に由来するコムギ種子、植物部分又は前記の子孫。
【請求項２０】
請求項１に記載のコムギ植物体の成分を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願62/182,299（2015年6月19日出願、当該出願は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に対し優先権を主張する。
（技術分野）
ある実施態様では、本開示は、1つ以上のリポキシゲナーゼ1（Lpx1）遺伝子における変異に関する。ある実施態様では、本開示は、コムギ及びコムギ植物体の1つ以上のLpx1遺伝子における人間によって誘導される（ヒト誘導）非トランスジェニック変異に関する。なお別の実施態様では、ヒト誘導非トランスジェニック変異はB又はDゲノムのLpx1遺伝子に存在する。
ある実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子の少なくとも1つにおける非トランスジェニック変異の結果として酸化安定性が増したコムギ種子及びコムギ粉を有するコムギ植物体に関する。別の実施態様では、本開示は、非トランスジェニック手段を利用してそのLpx1遺伝子の少なくとも1つに変異を有するコムギ植物体を作出する方法に関する。さらに別の実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子の少なくとも1つに変異を有するこれらコムギ植物体の種子から製造されるコムギ粉並びにコムギ系食品及び飲料製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギは世界の人口の大半にとって重要かつ戦略的穀草作物である。コムギは、約20億人（世界人口の36%）の最も重要な主食である。全世界で、コムギは、地球上で消費される炭水化物の55%近く及び食物カロリーの20%を提供する。コムギは、他のいずれの穀類作物（コメ、トウモロコシを含む）よりも作付け面積及び生産高で優り、したがって世界で最も重要な穀類作物である（前記は広範囲の気候条件にわたって栽培される）。分子マーカーを用いて遺伝学及びゲノム編成を理解することは、遺伝学及び植物育種の目的ために大いに重要である。
世界の主なコムギ生産領域は、中国、インド、米国、ロシア、フランス、オーストラリア、ドイツ、ウクライナ、カナダ、トルコ、パキスタン、アルゼンチン、カザフスタン及び英国である。今日まで栽培されてきた品種の大半はトリチクム・アエスチブムL.（Triticum aestivum L.）に属する（トリチクム・アエスチブムL.は普通パンコムギとして知られ、パン製造に重要である）。製造されるコムギ粉の最大部分がパン製造に用いられる。
パンコムギは六倍体であり、各細胞の核内にA、B及びDと称される3つの完全なゲノムを有する。これらゲノムの各々はヒトゲノムのサイズのほぼ2倍であり、およそ55億ヌクレオチドから成る。デュラムコムギ（マカロニコムギ又はパスタコムギ（トリチクム・デュルム（Triticum durum）又はトリチクム・チュルギデュム・デュルム亜種（Triticum turgidum subsp. durum）としても知られている）は、商業的に重要なコムギの主要な四倍体種であり、今日広く栽培されている。デュラムコムギは2つの完全なゲノム（A及びB）を有し、パスタの製造に広く用いられている。
【０００３】
コムギは広範囲に研究された植物であるが、いくつかの事例では新規な形質の開発は、今日の商業的コムギ栽培品種の限られた遺伝的多様性によって妨げられ、さらにパンコムギゲノムが典型的には各遺伝子の3つの機能的に過剰なコピー（同祖体と呼ばれる）を有するために、したがって単一(single)遺伝子の変化は、二倍体トウモロコシで見出されるような容易に目で見ることができる表現型を通常は全く生じない。パンコムギではしばしば、3つの同祖体全ての変化変種を遺伝的に合体させて、それらの影響を評価する必要がある。
全粒粉の保存寿命の改善は、世界人口の食糧要求の高まりを満たすために重要である。全粒製品は多くの健康上の利点、例えば慢性疾患（例えば冠動脈性心疾患、2型糖尿病及びいくつかのタイプの癌）のリスクの減少を提供する。全粒製品はまた、体重管理及び消化器官の健康の改善に役立ち得る。これらの健康上の利点にもかかわらず、米国の人口の95%以上が推奨される1日当たりの全粒許容量を下回る消費を示す。全粒製品の消費は、その脂質分画のリパーゼ、リポキシゲナーゼ及び他の酵素による加水分解性及び酸化性酸敗に対する感受性によって全粒粉で急速に生じる苦み及び異臭のために縮小する。酸化に対する安定性を改善することによる全粒粉及び全粒食品の保存寿命及び感覚的特徴の改善は、消費者の全粒製品の受け入れに良い影響を与えるであろう。
【０００４】
リポキシゲナーゼ（Lpx）、リノレート:酸素オキシドレダクターゼ；（EC 1.13.11.12）は非ヘム鉄含有ジオキシゲナーゼの一クラスに属し、前記は、1,4-cis,cisペンタジエン構造を含む多価不飽和脂肪酸の適性位置における特異的な二原子酸素添加を触媒して対応するヒドロペルオキシドを生成する。Lpxは多価不飽和脂肪酸の酸化を触媒する重要な酵素である。Lpxは、非ヘム鉄含有ジオキシゲナーゼであり、植物中で94から105kDaの範囲の分子質量を有するモノマータンパク質である。植物ゲノムには多くのLpx遺伝子が存在する。例えば、アラビドプシス（Arabidopsis）ゲノムは6つのLpx遺伝子を含み、コメゲノムは14のLpx遺伝子を含む。コムギ（前記はアラビドプシスより108倍大きく、コメより36倍大きいゲノムを有する）は、Lpx遺伝子についてまだ完全には特徴付けられていない。少なくとも3つの公知のコムギLpx遺伝子ファミリーがこれまでに特定された（各ファミリーは少なくとも1つの同祖体をA、B及びDゲノムに有する）。Lpx1及びLpx3は染色体4に存在し、Lpx2は染色体5に存在する。最近、リポキシゲナーゼ活性のための量的形質遺伝子座もまたデュラムコムギの染色体1Aで報告された。
植物では、リポキシゲナーゼ反応の生成物は、いくつかのプロセス（例えば栄養増殖、創傷、草食動物及び病原体の攻撃に対する応答、並びにまた発芽時の貯蔵脂質の固定）で役割を有することが示されている。コメでは、2つの異なる遺伝子（Lox1及びLox2）の二重変異体は（Lox3における単一変異ではなく）、無傷の穀粒の発芽及び安定性を42カ月にわたって改善した。
デュラムコムギでは、多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシド反応の中間状態で生成されるラジカルはカロテノイド色素の酸化を引き起こし、結果としてパスタ製品とって好ましい黄色の小麦粉色が失われる結果をもたらし得る。コムギリポキシゲナーゼは、それらの品種で黄色カロテノイドレベルを高めようと努めたおかげでデュラムコムギではすでに特徴付けられている。デュラムコムギLpxB1.1遺伝子の欠失対立遺伝子（Lpx-B1.1cと呼ばれる）は特に、パスタ製品の黄色の改善と密接に関係することが見出された。低リポキシゲナーゼ活性をもつデュラムコムギの系統はまた、登熟後期におけるLpx-3転写物レベルの減退を伴った。
【０００５】
LpxB1.1遺伝子に加えて、コムギのBゲノムはLpx1遺伝子の追加のコピーを有し、前記はLpx1.2又はLpx1.3のどちらかに存在する。デュラム及びパンコムギの両コムギで、AゲノムのLpx1遺伝子はLpxA1様（GenBank FJ518909）と呼ばれる偽遺伝子によってコードされる。デュラムコムギはDゲノムをもたないが、パンコムギのDゲノムのLpx1遺伝子もまた特定され、当該配列は最近GenBankに寄託された（KC679302）。
パンコムギでは、リパーゼ及びリポキシゲナーゼは脂質の分解で役割を有し、前記は栄養品質の低下、機能特性の低下及び感覚的許容性の低下を示すコムギ製品の一因となり得る。パンコムギのリポキシゲナーゼ活性はカロテノイドの分解及び栄養価の低下をもたらす。複数又は多重(multiple)のLpx遺伝子（Lpx1、2及び3）が全てコムギ穀粒で発現されるので（各々はA、B及びDゲノムに1つ以上の潜在的同祖体を有する）、1つの遺伝子又は遺伝子ファミリーの変化がパンコムギの全粒粉の酸化安定性にプラスの影響を与えるか否かは明確ではない。コムギゲノムのリポキシゲナーゼ遺伝子における変異は、コムギ粉及び前記に由来する製品の酸化安定性を高める潜在的な道を提供する。本明細書の開示は、Lpx1遺伝子の新規な対立遺伝子が全粒粉の貯蔵寿命を有意に改善することを示す。
【発明の概要】
【０００６】
ある実施態様では、本開示は1つ以上のリポキシゲナーゼ（Lpx1）遺伝子の変異に関する。ある実施態様では、本開示は、1つ以上のLpx1遺伝子の非トランスジェニック変異に関する。ある実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx1遺伝子に存在する。別の実施態様では、1つ以上の変異はDゲノムのLpx1遺伝子に存在する。
ある実施態様では、本開示は、Lpx遺伝子の複数の非トランスジェニック変異に関し、前記は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む。
ある実施態様では、本開示は、BゲノムのLpx-B1.2遺伝子の非トランスジェニック変異に関し、前記は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む。
ある実施態様では、本開示は、DゲノムのLpx-D1遺伝子の非トランスジェニック変異に関し、前記は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む。
別の実施態様では、本開示は、BゲノムのLpx-B1.2遺伝子の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10（ただし前記に限定されない）の変異を含む）、及びDゲノムのLpx-D1遺伝子の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
別の実施態様では、本開示は、野生型コムギの植物体、コムギの種子、コムギ植物体の部分、及び前記の子孫と比較してリポキシゲナーゼ活性が低下したコムギの植物体、コムギの種子、コムギ植物体の部分、及び前記の子孫に関する。
別の実施態様では、本開示は、野生型コムギの植物体、コムギの種子、コムギ植物体の部分、及び前記の子孫と比較して酸化安定性が増したコムギの植物体、コムギの種子、コムギ植物体の部分、及び前記の子孫に関する。
【０００７】
別の実施態様では、本発明は、野生型コムギの植物体と比較してリポキシゲナーゼ活性を減退させたコムギの植物体、コムギの種子、コムギ植物体の部分、及び前記の子孫に関し、ここで、当該リポキシゲナーゼ活性の減退は、コムギ植物体のLpx1遺伝子の1つ以上におけるヒト誘導非トランスジェニック変異によって引き起こされる。別の実施態様では、Lpx1酵素は減退活性を有する。
別の実施態様では、本開示は、1つ以上の変異Lpx1遺伝子を含む植物体とともに当該植物体の種子、花粉、植物部分及び子孫に関する。
別の実施態様では、本開示は、保存寿命が延長され感覚的な特徴が改善されたコムギの種子及び小麦粉に関し、前記は、1つ以上のLpx1遺伝子におけるヒト誘導非トランスジェニック変異によって引き起こされる減退Lpx1酵素活性を有する。
別の実施態様では、本開示は、1つ以上のLpx1遺伝子のヒト誘導非トランスジェニック変異によって引き起こされる減退Lpx1酵素活性を有するコムギの種子及び小麦粉を取り込んだ食物、飲料並びに食物及び飲料製品に関する。
別の実施態様では、本開示は、以下の工程によって作出される、野生型のコムギ植物体と比較して1つ以上のLpx1酵素の活性を減退させたコムギの植物体に関する：親コムギ植物体から植物材料を入手する工程、当該植物材料を変異原で処理することによって当該植物材料のLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーで少なくとも1つの変異を誘導して変異誘導植物材料（例えば種子又は花粉）を作出する工程、子孫コムギ植物体を分析してLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーで少なくとも1つの変異を検出する工程、Lpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーで少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体を選別して、場合によってLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーで少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体をLpx1遺伝子の異なるコピーで少なくとも1つの変異を有する他の子孫コムギ植物体と交配する工程、さらに、変異を有する子孫コムギ植物体を特定し場合によって変異を有する子孫コムギ植物体と変異を有する他の子孫コムギ植物体とを交配するサイクルを繰り返して、Lpx1酵素活性を減退させた子孫コムギ植物体を作出する工程。別の実施態様では、前記方法は、変異誘導植物材料を生長させるか又は前記を用いて子孫コムギ植物体を作出する工程を含む。
【０００８】
配列表の簡単な説明
添付の配列表に掲載する核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な略語文字を用いて示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、相補鎖は表示鎖を任意に参照することにより包含されるものと理解される。添付の配列表では以下にように示される：
配列番号:1は、リポキシゲナーゼ1、Dゲノム、Lpx-D1エクソン1−6のためのトリチクム・アエスチブム遺伝子を示す（3,863塩基対）。
配列番号:2は配列番号:1のLpx-D1コード配列を示す（2,586塩基対）。
配列番号:3は配列番号:2のLpx-D1タンパク質配列を示す（862アミノ酸）。
配列番号:4は、リポキシゲナーゼ1、Bゲノム、Lpx-B1.2エクソン1−7のためのトリチクム・アエスチブム遺伝子を示す（4,263塩基対）。
配列番号:5は配列番号:4のLpx-B1.2コード配列を示す（2,586塩基対）。
配列番号:6は配列番号:5のLpx-B1.2タンパク質配列を示す（862アミノ酸）。
配列番号:7−14は、Lpx-D1及びLpx-B1.2遺伝子配列内の有用な変異の特定に有用であることが証明された例示的な同祖体特異的プライマーを示す。
配列番号:15は、配列番号:1のためのLpx-D1プロモータ及び第一のエクソンを示す。
配列番号:16−17は、Lpx-D1プロモータ内の有用な変異の特定に有用であることが証明された例示的な同祖体特異的プライマーを示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】37℃の加速エージング時間経過における、酸敗の指標としての全粒粉のヘキサナール生成の増加を示す棒グラフである。
【図２】37℃の加速エージング時間経過における、新規なLpx-D1及びLpx-B1.2ｘLpx-D1対立遺伝子の改善された保存寿命を示す棒グラフである。
【図３】37℃の加速エージングの8週間経過における、複数の（multiple）Lpx-D1対立遺伝子について全粒粉の酸敗減退及び保存寿命の改善を示す棒グラフである。
【図４】37℃の加速エージングの8週間経過における、新規なLpx-D1及びLpx-B1.2/Lpx-D1対立遺伝子の減退した酸敗及び改善された保存寿命を示す棒グラフである。3組ずつの生物学的複製物をヘキサナールレベルについてアッセイ及び分析した。
【図５】37℃の加速エージングの12及び30週経過における（室温でそれぞれ10及び24カ月に相当する）、新規なLpx-D1及びLpx-B1.2ｘLpx-D1対立遺伝子について保存寿命の改善を示す棒グラフである。
【図６】Lpx-D1の新規な対立遺伝子を有する穀粒から製造されたエージング全粒粉における、苦み化合物（ピネリン酸）の減退を示す棒グラフである。
【図７】Lpx1の新規な対立遺伝子を有する穀粒から新しく製粉された全粒粉又はエージング全粒粉を用いたドウにおける、苦み化合物（ピネリン酸）の減退レベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本開示における数値範囲はおおよそであり、したがって特段の指示がなければ当該範囲の外側の数値を含むことができる。数値範囲は、1つの単数ずつ増加するそのより小さな値からより大きな値までの全数値（当該より小さな値及びより大きな値を含む）を含むが、ただし任意のより小さな値と任意のより大きな値との間は少なくとも2つの単数で分離されていることを条件とする。例として、構成に関する特性、物理的特性又は他の特性（例えば分子量、粘度など）が100から1,000である場合、全ての個々の値（例えば100、101、102など）及び下位範囲（例えば100から144，155から170，197から200など）は明確に含まれる。1未満の値を含むか又は1より大きい分数（例えば1.1、1.5など）を含む範囲については、1つの単数は適宜0.0001、0.001、0.01又は0.1であると考えられる。10未満の1桁の数字を含む範囲（例えば1から5）については、1つの単数は典型的には0.1であると考えられる。これらは、具体的に意図されるものの単なる例示であり、列挙されている最小値と最高値との間の全ての可能な組み合わせが、本開示で明瞭に記載されていると考えることができる。数値範囲は、特に混合物中の成分の相対量、並びに種々の温度及び当該方法で記載される他のパラメーターの範囲のために本開示で提供される。
本明細書で用いられるように、“対立遺伝子”という用語はある遺伝子のまた別の1つ以上の形態のいずれかであり、前記の全てが1つの形質又は特徴と関係を有する。二倍体細胞又は生物では、ある遺伝子の2つの対立遺伝子は一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。対立遺伝子は、個別のヌクレオチドの位置で親配列を示す“野生型”であっても、又は親配列以外の異なるヌクレオチドを示す“変異体”であってもよい。“ヘテロ接合性”という用語は、個別のヌクレオチドの位置で1つが野生型対立遺伝子であり1つが変異対立遺伝子であることを示し、“ホモ接合性”という用語は、個別のヌクレオチドの位置で2つが同じ対立遺伝子であることを示す。
【００１１】
本明細書で用いられるように、“変化する”、“増加する（increasing, increased）”、“減退する（reducing, reduced）”、“阻害される”などという用語は、相対的な用語、すなわち野生型又は無変化状態と比較した用語と考えられる。“タンパク質のレベル”は、個別のタンパク質（例えばLpx）の量を指し、前記は、当業界で任意の手段（例えばウェスタンブロット分析又は質量分析又は他の免疫学的手段）によって測定できる。“酵素活性のレベル”は、酵素アッセイで測定される個別の酵素の量を指す。酵素の活性レベルは変異体で変化するが、タンパク質そのものの発現レベル（量）は無変化であり得ることは理解されよう。逆に、タンパク質の量は変化するが、活性タンパク質が多少とも生成されるならば当該活性は同じままであり得よう。量及び活性の双方の減退もまた、例えば酵素をコードする遺伝子が不活化されるときには可能である。ある種の実施態様では、タンパク質又は活性のレベルの減退は、非改変コムギの内乳のタンパク質又は活性のレベルと比較して少なくとも10%、又は少なくとも20%、又は少なくとも30%、又は少なくとも40%、又は少なくとも50%、又は少なくとも60%、或いは少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%である。タンパク質又は酵素活性又は遺伝子発現のレベルの減退は、穀粒の生育の任意の段階で（特に登熟期に）又は穀粒生育から成熟までの全段階で起こり得る。
本明細書で用いられるように、アミノ酸又は核酸配列の“同一性”及び“類似性”は、比較される2つの配列間の最適な全体的アラインメントから決定される。最適な全体的アラインメントは、例えばNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いて達成される。配列はまた、当業界で公知のアルゴリズム（CLUSTAL Vアルゴリズム又はBLASTN若しくはBLAST2配列プログラムが含まれるが、ただしこれらに限定されない）を用いてアラインメントできる。
“同一性”は、第一のポリペプチド又はポリヌクレオチドの個別の位置のアミノ酸又はヌクレオチドが、第二のポリペプチド又はポリヌクレオチド（第一のポリペプチド又はポリヌクレオチドと全体的に最適にアラインメントされている）の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと同一であることを意味する。同一性とは対照的に、“類似性”は保存的置換のアミノ酸を包含する。“保存的”置換は、Blosum62置換マトリックスで正のスコアを有する任意の置換である（Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）。
【００１２】
“配列Aは配列Bとn%類似する”と言えば、配列Aと配列Bとの間で最適な全体的アラインメントにある位置のn%が、同一の残基又はヌクレオチド及び保存的置換から成ることを意味する。“配列Aは配列Bとn%同一である”と言えば、配列Aと配列Bとの間で最適な全体的アラインメントにある位置のn%が同一の残基又はヌクレオチドから成ることを意味する。
本明細書で用いられるように、“保存寿命の延長”は、製品が販売可能又は使用可能である期間の延長を指す。例えば、製粉業者は、米国では一般的に全粒粉の製粉後に‘消費期限’のスタンプを押す。典型的な‘消費期限’は4カ月である。“保存寿命の延長”は消費期限を引き延ばすであろう。
本明細書で用いられるように、“植物”という用語は、未成熟又は成熟全植物に対応するものを含み、前記には種子又は穀粒又は葯が除去された植物が含まれる。植物を生じる種子又は胚もまた植物とみなされる。
本明細書で用いられるように、“植物部分”という用語は、植物のプロトプラスト、コムギの植物体を再生できる植物細胞の組織培養、植物カルス、植物塊、及び植物体又は植物の部分で無傷である植物細胞（例えば胚、花粉、胚珠、果皮、種子、花、小筒花、頭花、とげ、葉、根、根冠、葯など）を含む。
本明細書で用いられるように、“ポリペプチド”という用語は、互いにペプチド結合又は改変ペプチド結合によって結合した2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。“ポリペプチド”は、短い鎖（一般的にはペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと称される）及び長い鎖（一般的にはタンパク質と称される）の両方を指す。ポリペプチドは、20の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。“ポリペプチド”は、天然のプロセス（例えばプロセッシング及び他の翻訳後修飾）によって改変されたものだけでなく化学的な改変技術によって改変されたものもまた含む。そのような改変は、基礎的な成書及びより詳細にはモノグラフだけでなく豊富な研究論文にも詳しく記載されてあり、当業界で周知である。同じタイプの改変が1つの与えられたポリペプチドのいくつかの部位に同程度に又は種々の程度に存在し得ることは理解されるであろう。
【００１３】
本明細書で用いられるように、“Lpx1誘導体”は、Lpx1タンパク質/ペプチド/ポリペプチド配列であって、全Lpx1タンパク質/ペプチド/ポリペプチド配列の生物学的活性と比較して実質的に減退した生物学的活性を有するものを指す。換言すれば、前記用語は、減退Lpx1酵素性活性を有する改変Lpx1タンパク質のポリペプチドを指す。“Lpx1誘導体”という用語は、改変Lpx1タンパク質/ペプチドの“フラグメント”又は“化学的誘導体”を包含する。
本明細書で用いられるように、 “ポリヌクレオチド”という用語は一般的に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボブクレオチドを指し、前記は非改変RNA又はDNAであっても改変RNA又はDNAであってもよい。前記の定義には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域、又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物のDNA、cDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物のRNA、DNA及びRNAを含むハイブリッド分子（一本鎖又はより典型的には二本鎖若しくは三本鎖領域、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るハイブリッド分子）。“ポリヌクレオチド”という用語はまた、短いヌクレオチド又はフラグメント（しばしば“オリゴヌクレオチド”と称される）を包含し、前記は変異誘導のために100%同一というわけではないが、それにもかかわらず同じアミノ酸配列をコードする。
【００１４】
本明細書で用いられる“減退又は非機能性フラグメント”は、全核酸配列のコードするタンパク質と比較して、減退した生物学的活性を有するLpx1タンパク質をコードする核酸配列を指す。換言すれば、前記用語は、本発明のLpx1ポリペプチドをコードする能力を実質的に維持するが、コードされたLpx1ポリペプチドは減退活性を有する核酸又はそのフラグメントを指す。
本明細書で用いられる“フラグメント”という用語はポリヌクレオチド配列を指し、前記は、人工的に（例えば化学的合成によって）又は天然の生成物を制限エンドヌクレアーゼ若しくは機械的せん断を用いて複数の断片に切断することによって構築された対象核酸の単離された部分、又はPCR、DNAポリメラーゼ若しくは任意の当業界で周知の他の重合技術によって合成されるか、又は当業者に周知の組換え核酸技術によって宿主細胞で発現された核酸の部分である。
本開示のポリヌクレオチドに関しては、“単離ポリヌクレオチド”という用語が時に用いられる。DNAに適用されるときは、前記用語はDNA分子を指し、前記DNA分子は、それが由来した生物に天然に存在するゲノムで前記DNA分子の（5’及び3’方向で）直前に連続する配列から分離される。例えば、“単離ポリヌクレオチド”はPCRフラグメントを含むことができる。別の実施態様では、“単離ポリヌクレオチド”はベクター（例えばプラスミド又はウイルスベクター）に挿入されたDNA分子、又は原核細胞若しくは真核細胞のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含むことができる。“単離ポリヌクレオチド分子”はまたcDNA分子を含むことができる。
【００１５】
コムギはトリチクム属の種の任意の植物と定義され、前記種は商業的に栽培され、例えば以下が含まれる：トリチクム・アエスチブムL.・アエスチブム亜種（Triticum aestivum L. ssp. aestivum）（普通コムギ又はパンコムギ）、トリチクム・アエスチブムの他の亜種、トリチクム・チュルギデュムL.・デュルム亜種（デュラムコムギ（マカロニコムギ又はパスタコムギとしても知られている））、トリチクム・モノコックムL.・モノコックム亜種（Triticum monococcum L. ssp. monococcum）（栽培型ヒトツブコムギ又はスペルトコムギ（small spelt））、トリチクム・チモフェービ・チモフェービ亜種（Triticum timopheevi ssp. timopheevi）、トリチクム・チュルギデュムL.・ジコッコン亜種（Triticum turgidum L. ssp. dicoccon）（栽培型エンマーコムギ）、及びトリチクム・チュルギデュムの他の亜種（Feldman）。コムギは、AABBDD型ゲノムを有する六倍体コムギでもAABB型ゲノムを有する四倍体コムギでもよい。コムギの遺伝的多様性はある種の近縁種（ライムギ及びオオムギを含む）にハイブリダイゼーションによって伝達されたので、本開示はまたそのようにして形成されたハイブリッド種を含む。前記ハイブリッド種にはライコムギが含まれ、前記はパンコムギとライムギのハイブリッドである。ある実施態様では、コムギはトリチクム・アエスチブム種及び好ましくはアエスチブム亜種である。また別には、変異又はトランスジーンはトリチクム・アエスチブムからデュラムコムギに容易に伝達することができるので、コムギは好ましくはトリチクム・チュルギデュムL.・デュルム亜種である。
ある実施態様では、本開示は1つ以上のLpx1遺伝子の非トランスジェニック変異に関する。別の実施態様では、本開示は、コムギ植物体ゲノムに外来核酸を含まない野生型コムギの種子と比較して、種子がLpx1活性の低下を示すコムギの植物体について記載する。さらに別の実施態様では、本開示は、コムギ植物体ゲノムに外来核酸を含まない野生型コムギの種子と比較して、種子が酸化安定性の増強を示すコムギの植物体について記載する。さらに別の実施態様では、本開示は、コムギ植物体ゲノムに外来核酸を含まない野生型コムギの種子と比較して、種子が保存寿命の延長を示すコムギの植物体について記載する。
なお別の実施態様では、本開示は、1つ以上のLpx1遺伝子における一連の独立したヒト誘導非トランスジェニック変異；それらの変異をその少なくとも1つのLpx1遺伝子に有するコムギの植物体；及びコムギの少なくとも1つのLpx1遺伝子に同様な及び/又は追加の変異を作出し特定する方法に関する。加えて、本開示は、外来核酸をその植物体ゲノムに含まない野生型コムギの種子と比較して、種子が、Lpx1活性の低下及び/又は酸化安定性の増強及び/又は保存寿命の延長を示すコムギの植物体に関する。
【００１６】
I．Lpx1変異
A．Lpx1遺伝子
ある実施態様では、本開示は、プロモータを含むLpx1遺伝子の1つ以上の非トランスジェニック変異に関する。別の実施態様では、本発明はLpx1遺伝子の1つ以上の変異に関する。ある実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
別の実施態様では、Lpx1遺伝子は、表1、2及び3に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異及び同祖体における対応する変異並びに前記の組み合わせを含むことができる。
別の実施態様では、本開示は、本明細書に開示する1つ以上の非トランスジェニック変異に対応する、対応同祖体のLpx1遺伝子における変異に関する。例示すれば、DゲノムのLpx-D1遺伝子で特定された変異は、B及び/又はAゲノムのLpx1遺伝子で有益な変異であり得る。同祖体の変異は正確な位置に存在しないことがあることは当業者には理解されるであろう。
異なるコムギ品種にはLpx1遺伝子の遺伝子配列に天然の多様性が存在することは当業者には理解される。
本発明者らは、コムギの植物体の酸化安定性を達成するためには、Lpx1遺伝子機能を減退させる変異が所望されると考えた。好ましい変異には、ミスセンス及びナンセンス変化（1つ以上のLpx1タンパク質の翻訳物をメッセンジャーRNAから未成熟切断する変異を含む）、例えばLpx1メッセンジャーRNAのコード領域内に終止コドンを作出する変異が含まれる。そのような変異は、挿入、欠失、反復配列、スプライス接合部変異、改変オープンリーディングフレーム（ORF）及び点変異を含む。いくつかの終止コドン変異は他の終止コドン変異より有効である。なぜならば、全ての終止コドン変異が同じ程度にリポキシゲナーゼ活性を減退させるわけではないからである。
さらに別の実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx-B1.2遺伝子に存在する。さらに別の実施態様では、1つ以上の変異はDゲノムのLpx-D1遺伝子に存在する。別の実施態様では、1つ以上の変異は、B及びDゲノムのLpx-B1.2及びLpx-D1遺伝子に存在する。
【００１７】
1．Bゲノム
ある実施態様では、本開示は、BゲノムのLpx遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。ある実施態様では、1つ以上の非トランスジェニック変異は、BゲノムのLpx遺伝子の両対立遺伝子に存在する。別の実施態様では、非トランスジェニック変異は、BゲノムのLpx遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx-B1.1a遺伝子に存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-B1.1a遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
ある実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx-B1.1b遺伝子に存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-B1.1b遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
ある実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx-B1.1c遺伝子に存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-B1.1c遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
ある実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx-B1.2遺伝子に存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-B1.2遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
ある実施態様では、1つ以上の変異はBゲノムのLpx-B1.3遺伝子に存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-B1.3遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
表1、2及び3に特定する以下の変異は、本明細書に開示する多様な実施態様にしたがって作出及び特定した変異の例示である。それらは限定ではなく例証として提供される。下記の変異は単なる例示であること、及び類似する変異もまた包含されることは理解されるべきである。
表1の1つの例示的変異はG2982Aであり、前記は、Lpx-B1.2、配列番号:4の配列でその位置にしたがって特定されるヌクレオチド2982位でグアニンからアデニンへの変化をもたらす。この変異は、Lpx-B1.2の発現タンパク質（配列番号:6）のその位置にしたがって特定されるアミノ酸510位でトリプトファンから終止（*）コドンへの変化（W510*）をもたらす。
表1は、コムギの品種エクスプレス（Express）のBゲノムのLpx-B1.2で作出及び特定された変異の例を提供する。ヌクレオチド及びアミノ酸の変化は、それぞれ配列番号:4及び6におけるそれらの位置にしたがって特定される。接合性は、当該変異がM2植物体でヘテロ接合性（Het）又はホモ接合性（Hom）のどちらであるかを示す。
【００１８】
表1：BゲノムのLpx-B1.2遺伝子の代表的な変異
【００１９】
2018518184.tif 000003
【００２０】
ある実施態様では、本開示は、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、配列番号:4に対応するBゲノムのLpx-B1.2遺伝子のポリヌクレオチドに関する。別の実施態様では、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号:4と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性を有する。なお別の実施態様では、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号:4と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える類似性を有する。
さらに別の実施態様では、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドはLpx-B1.2タンパク質をコードし、ここで、Lpx-B1.2タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:6と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性を有する。さらに別の実施態様では、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドはLpx-B1.2タンパク質をコードし、ここで、Lpx-B1.2タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:6と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える類似性を有する。
【００２１】
2．Dゲノム
ある実施態様では、本開示は、DゲノムのLpx-D1遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。ある実施態様では、1つ以上の非トランスジェニック変異は、DゲノムのLpx-D1遺伝子の両対立遺伝子に存在する。別の実施態様では、非トランスジェニック変異は、DゲノムのLpx-D1遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、1つ以上の変異はDゲノムのLpx-D1遺伝子に存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-D1遺伝子の複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
表2の1つの例示的変異はG2629Aであり、前記は、Lpx-D1、配列番号:1の配列でその位置にしたがって特定されるヌクレオチド2629位でグアニンからアデニンへの変化をもたらす。この変異は、Lpx-D1の発現タンパク質（配列番号:3）でその位置にしたがって特定されるアミノ酸494位でトリプトファンから終止（*）コドンへの変化（W494*）をもたらす。
表2は、コムギの品種エクスプレスのDゲノムのLpx-D1で作出及び特定された変異の代表的な例を提供する。ヌクレオチド及びアミノ酸の変化は、それぞれ配列番号:1及び3におけるそれらの位置にしたがって特定される。接合性は、当該変異がM2植物体でヘテロ接合性（Het）又はホモ接合性（Hom）のどちらであるかを示す。
【００２２】
表2：DゲノムのLpx-D1遺伝子の代表的な変異
【００２３】
2018518184.tif 000004
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【００２４】
ある実施態様では、本開示は、DゲノムのLpxプロモータの複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。ある実施態様では、1つ以上の非トランスジェニック変異は、DゲノムのLpx-D1プロモータの両対立遺伝子に存在する。別の実施態様では、非トランスジェニック変異は、DゲノムのLpx-D1プロモータの両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、1つ以上の変異はDゲノムのLpx-D1プロモータに存在する。ある実施態様では、本開示は、Lpx-D1プロモータの複数の非トランスジェニック変異（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び10を超える（ただし前記に限定されない）変異を含む）に関する。
表3は、コムギの品種エクスプレスのDゲノムのLpx-D1プロモータで作出及び特定された変異の代表的な例を提供する。ヌクレオチドの変化は、配列番号:15のそれらの位置にしたがって特定される。接合性は、当該変異がM2植物体でヘテロ接合性（Het）又はホモ接合性（Hom）のどちらであるかを示す。
【００２５】
表3：DゲノムのLpx-D1プロモータの代表的な変異
【００２６】
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【００２７】
ある実施態様では、本発明は、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、配列番号:1に対応するDゲノムのLpx1遺伝子のポリヌクレオチドに関する。別の実施態様では、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号:1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性を有する。なお別の実施態様では、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号:1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える類似性を有する。
さらに別の実施態様では、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドはLpx-D1タンパク質をコードし、ここで、Lpx-D1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:3と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性を有する。さらに別の実施態様では、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドはLpx-D1タンパク質をコードし、ここで、Lpx-D1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:3と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える類似性を有する。
さらに別の実施態様では、本発明は、表3に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、配列番号:15に対応するDゲノムのLpx-D1プロモータのポリヌクレオチドに関する。別の実施態様では、表3に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号:15と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性を有する。なお別の実施態様では、表3に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号:15と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える類似性を有する。
【００２８】
B．Lpx1タンパク質
なお別の実施態様では、本開示は、野生型Lpx1タンパク質と比較して1つ以上の変異を有するタンパク質を生じる、Lpx1遺伝子の1つ以上の非トランスジェニック変異に関する（上記Lpx1変異と題したセクションで考察）。ある実施態様では、トランスジェニック変異には表3に挙げた変異、同祖体における対応する変異、前記の組み合わせが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、本開示は、Lpx1タンパク質の生成を阻害するLpx1遺伝子又はプロモータにおける1つ以上の非トランスジェニック変異に関する。いくつかの実施態様では、Lpx1遺伝子又はプロモータの変異はLpx1タンパク質の発現を減退させる。他の実施態様では、Lpx1遺伝子又はプロモータの変異は不安定な機能又は減退機能を有するLpx1タンパク質を生じる。別の実施態様では、非トランスジェニック変異には表3に挙げた変異、同祖体における対応する変異及び前記の組み合わせが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２９】
1．Lpx1タンパク質の発現レベル
別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx1タンパク質の発現レベルは、野生型Lpx1タンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
なお別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx-D1タンパク質の発現レベルは、野生型Lpx-D1タンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1aタンパク質の発現レベルは、野生型Lpx-B1.1aタンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1bタンパク質の発現レベルは、野生型Lpx-B1.1bタンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1cタンパク質の発現レベルは、野生型Lpx-B1.1cタンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.2タンパク質の発現レベルは、野生型Lpx-B1.2タンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.3タンパク質の発現レベルは、野生型Lpx-B1.3タンパク質の発現レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、及び95−99%に減退する。
【００３０】
2．Lpx1タンパク質の活性
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpxタンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx1タンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx1タンパク質は、野生型Lpx1タンパク質と比較して、活性がないか又はゼロ活性を有する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx1タンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-D1遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-D1タンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-D1タンパク質は、野生型Lpx-D1タンパク質と比較して、活性がないか又はゼロ活性を有する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-D1遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-D1タンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
【００３１】
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1a遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.1aタンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1aタンパク質は、野生型Lpx-B1.1aタンパク質と比較して、活性がないか又はゼロ活性を有する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1a遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.1aタンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1b遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx1タンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1bタンパク質は、野生型Lpx-B1.1bタンパク質と比較して、活性がないか又はゼロ活性を有する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1b遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.1bタンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
【００３２】
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1c遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.1cタンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.1c遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.1cタンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.2遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.2タンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.2遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.2タンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.3遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.3タンパク質の活性レベルの0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて減退する。
なお別の実施態様では、本明細書で開示する1つ以上の変異を有するLpx-B1.3遺伝子のLpx1タンパク質のリポキシゲナーゼ活性は、野生型Lpx-B1.3タンパク質の活性レベルの1−10%、又は10−30%、又は30−50%、又は50−70%、又は70−80%、又は80−90%、又は90−95%である。
【００３３】
C．酸化安定性/保存寿命延長
なお別の実施態様では、本開示は、保存寿命の延長をもたらす、Lpx1遺伝子における1つ以上の非トランスジェニック変異に関する（上記のLpx1変異と題したセクションで考察）。なお別の実施態様では、本開示はLpx1遺伝子の1つ以上の非トランスジェニック変異に関し（上記のLpx1変異と題したセクションで考察）、前記は、野生型コムギの穀粒と比較して1つ以上のLpx1変異を有するコムギの穀粒から製造された小麦粉の酸化安定性の増強をもたらす。ある実施態様では、非トランスジェニック変異には、表1−3に挙げた変異、同祖体における対応する変異及び前記の組み合わせが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
なお別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上のLpx1変異を有するコムギの穀粒から製造された全粒粉の保存寿命は、全粒粉の典型的な保存寿命より延長される。製粉業者は、米国では一般的に全粒粉の製粉後の消費期限を3−9か月とスタンプを押すが、この保存寿命は高い貯蔵温度及び湿度により1−3カ月短くなり得る。保存寿命は、小麦粉及び前記から製造される製品の感覚的な特徴（最終製品の色、風味、手触り、香り、できばえ又は全体的な好ましさを含む）によって決定され得る。素材間の相違の判定には熟練検査員を用いることができる。
なお別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉の保存寿命は、野生型穀粒から製造される全粒粉の保存寿命と比較して1−9カ月、又は2−10カ月、又は3−11カ月、又は4−12カ月、又は5−13カ月、又は6−14カ月、又は7−15カ月、又は8−16カ月、又は9−17カ月、又は10−18カ月、又は11−19カ月、又は12−20カ月、又は13−21カ月、又は14−22カ月、又は15−23カ月、又は16−24カ月に延長される。
なお別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉の保存寿命は、野生型穀粒から製造される全粒粉の保存寿命と比較して1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、12カ月、13カ月、14カ月、15カ月、16カ月、17カ月、18カ月、19カ月、20カ月、21カ月、22カ月、23カ月、24カ月、25カ月、26カ月、27カ月、28カ月、29カ月、30カ月又は30カ月を超えて延長される。
【００３４】
なお別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造された全粒粉の酸化安定性は、脂肪酸分解生成物（製品の匂い又は風味に影響を与え得る）の生成の低下により高められる。如何なる特定の理論にも拘束されないが、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉の酸化安定性は、脂肪酸の分解生成物の生成の低下により高められる。
なお別の実施態様では、とりわけ脂肪酸の分解生成物（ヘキサナール又はノネナール又はトリヒドロキシデカン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない）の生成は、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉で低下する。
さらに別の実施態様では、脂肪酸の分解生成物（ヘキサナール又はノネナール又はトリヒドロキシデカン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない）の生成は、野生型穀粒から製造される全粒粉の脂肪酸分解生成物の生成と比較して、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉で0−1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%及び99%を超えて低下する。
別の実施態様では、脂肪酸の分解生成物（ヘキサナール又はノネナール又はトリヒドロキシデカン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない）の生成は、野生型穀粒から製造される全粒粉の脂肪酸分解生成物の生成と比較して、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉で1%から5%、又は10%から15%、又は15%から20%、又は20%から25%、又は25%から30%、又は30%から35%、又は35%から40%、又は40%から45%、又は45%から50%、又は50%から55%、又は55%から60%、又は65%から70%、又は70%から75%、又は75%から80%、又は80%から85%、又は85%から90%、又は90%から95%、又は95%から99%、又は99%を超えて低下する。
【００３５】
別の実施態様では、脂肪酸の分解生成物（ヘキサナール又はノネナール又はトリヒドロキシデカン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない）の生成は、野生型穀粒から製造される全粒粉の脂肪酸分解生成物の生成と比較して、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉で少なくとも5%、又は少なくとも10%、又は少なくとも15%、又は少なくとも20%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも75%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%低下する。
別の実施態様では、トリヒドロキシデカン酸（ピネリン酸）の生成は、野生型穀粒から製造される全粒粉のピネリン酸の生成と比較して、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉又はドウ又はパン又は他の製品で1%から5%、又は5%から10%、又は10%から15%、又は15%から20%、又は20%から25%、又は25%から30%、又は30%から35%、又は35%から40%、又は40%から45%、又は45%から50%、又は50%から55%、又は55%から60%、又は65%から70%、又は70%から75%、又は75%から80%、又は80%から85%、又は85%から90%、又は90%から95%、又は95%から99%、又は99%を超えて低下する。
別の実施態様では、トリヒドロキシデカン酸（ピネリン酸）の生成は、野生型穀粒から製造される全粒粉のピネリン酸の生成と比較して、本明細書に開示する1つ以上の変異を有するコムギの穀粒から製造される全粒粉又はドウ又はパン又は他の製品で少なくとも5%、又は少なくとも10%、又は少なくとも15%、又は少なくとも20%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも75%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%低下する。
【００３６】
III.トランスジーン
ある実施態様では、本開示は、ポリヌクレオチドをコードするトランスジーンを含むトランスジェニック植物に関し、前記ポリヌクレオチドは、Lpx1遺伝子の発現及び/又はLpx1タンパク質の活性をダウンレギュレートする。そのようなポリヌクレオチドの例には、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、人工ミクロRNA又は二本鎖RNA分子が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ある実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子の発現及び/又はLpx1タンパク質の活性を減退させるトランスジーンを含むコムギに関し、ここで前記コムギの穀粒は、野生型植物の穀粒と比較して酸化安定性の増強又は貯蔵寿命の延長を有する。
A．アンチセンスポリヌクレオチド
“アンチセンスポリヌクレオチド”という用語は、DNA若しくはRNA又は前記の組み合わせであって、Lpx1をコードする特定のmRNAの少なくとも一部分と相補性であり、かつ転写後事象（例えばmRNA翻訳）に干渉できる分子を指すと理解されるであろう。
植物のアンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするであろう。本明細書で用いられるように、“生理学的条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド”という用語は、当該ポリヌクレオチド（完全に又は部分的に一本鎖）がタンパク質をコードするmRNAと少なくとも二本鎖ポリヌクレオチドを形成できることを意味する。
アンチセンス分子は、構造遺伝子に一致する配列又は遺伝子発現若しくはスプライシング事象で制御を達成する配列を含むことができる。例えば、アンチセンス配列は、Lpx1の標的とされるコード領域又はそれらの5’非翻訳領域（UTR）又は3’UTR又は前記の組み合わせと一致し得る。アンチセンス配列は、標的遺伝子のイントロン配列（転写中又は転写後にスプライシングで除去され得る）、好ましくはエクソン配列とのみ部分的に相補的であることができる。一般的にUTRがより高度な多様性を有することを考えれば、これらの領域を標的とすることは遺伝子阻害でより強い特異性を提供する。
アンチセンス配列の長さは、連続する少なくとも19ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100、200、500又は1000ヌクレオチドであるべきである。完全な遺伝子転写物と相補的な完全長配列を用いることができる。当該長さは最も好ましくは100−2000ヌクレオチドである。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも90%、より好ましくは95−100%であるべきである。アンチセンスRNA分子はもちろん無関係な配列を含むことができ、前記配列は当該分子を安定化させる機能を有することができる。
【００３７】
B．触媒ポリヌクレオチド
触媒ポリヌクレオチド/核酸という用語は、DNA分子若しくはDNA含有分子（当業界では“デオキシリボザイム”としても知られている）又はRNA若しくはRNA含有分子（当業界では“リボザイム”としても知られている）を指し、前記は異なる基質を特異的に認識し、この基質の化学的改変を触媒する。触媒核酸の核酸塩基はA、C、G、T塩基（及びRNAについてはU）であり得る。
典型的には、触媒核酸は、標的核酸の特異的な認識のためのアンチセンス配列及び核酸切断酵素活性（本明細書では“触媒ドメイン”とも称する）を含む。
本明細書で開示する植物のリボザイム及びリボザイムをコードするDNAは当業界で周知の方法を用いて化学的に合成できる。リボザイムはまた、RNAポリメラーゼプロモータ（例えばT7 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼのためのプロモータ）に作動できるように連結されたDNA分子（転写に際してRNA分子を生じる）から調製できる。ベクターがまたDNA分子に作動できるように連結されたRNAポリメラーゼプロモータを含むときには、RNAポリメラーゼ及びヌクレオチドと一緒にインキュベートしてリボザイムをin vitroで生成できる。別々の実施態様で、DNAを発現カセット又は転写カセットに挿入することができる。合成後に、リボザイムを安定化させ当該リボザイムをRNaseに対して耐性にする能力を有するDNA分子に連結することによって、RNA分子を改変できる。
本明細書に記載するアンチセンスポリヌクレオチドに関しては、触媒ポリヌクレオチドはまた標的核酸分子（例えばLpx1をコードするmRNA）と“生理学的条件下”（すなわち植物細胞内の条件下）でハイブリダイズする能力を有するべきである。
【００３８】
C．RNA干渉
RNA干渉（RNAi）は、個別のタンパク質の生成を特異的に阻害するために特に有用である。この技術は、問題の遺伝子又はその部分のmRNAと本質的に同一の配列を含むdsRNAの存在を必要とする。便利には、dsRNAは、組換えベクター又は宿主細胞で単一プロモータから生成することができる。この場合、センス及びアンチセンス配列は無関係の配列によってフランキングされ、前記無関係の配列は、センス配列とアンチセンス配列とをハイブリダイズさせることができ、ループ構造を形成する無関係の配列を有するdsRNAを形成する。本発明に適切なdsRNA分子の設計及び生成は十分に当業者の技量内にあり、特に一考すればWO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029、及びWO 01/34815がある。
一例では、不活化されるべき標的遺伝子と相同性を有する少なくとも部分的に二本鎖（二重体）RNA生成物の合成を指令するDNAが導入される。したがって、DNAはセンス及びアンチセンス配列の両方を含み、前記はRNAに転写されたときにハイブリダイズして二本鎖RNA領域を形成できる。好ましい実施態様では、センス及びアンチセンス配列はスペーサー領域によって分離され、前記スペーサー領域はRNAに転写されたときにスプライスにより除去されるイントロンを含む。前記編成はより高効率の遺伝子サイレンシングをもたらすことが示された。二本鎖領域は1つ又は2つのRNA分子を含むことができ、前記は1つ又は2つのDNA領域から転写される。二本鎖分子の存在は、二本鎖RNA及び標的植物遺伝子由来の相同なRNA転写物の両方を破壊する内因性植物システムの応答を始動させ、標的遺伝子の活性を効率的に減退させ又は除去すると考えられる。
ハイブリダイズするセンス及びアンチセンス配列の長さは、連続する各々少なくとも19ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30又は50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100、200、500又は1000ヌクレオチドであるべきである。完全な遺伝子転写物と一致する完全長配列を用いることができる。最も好ましくは、長さは100−2000ヌクレオチドである。標的転写物に対するセンス及びアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95−100%であるべきである。RNA分子はもちろん、当該分子の安定化のために機能し得る無関係の配列を含むことができる。RNA分子は、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIプロモータの制御下で発現され得る。後者の例にはtRNA又はsnRNAプロモータが含まれる。
ある実施態様では、小さな干渉RNA（“siRNA”）分子は、標的mRNAの連続する約19−21ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、標的mRNA配列はジヌクレオチドAAで開始し、約30−70%（好ましくは30−60%、より好ましくは40−60%、より好ましくは約45−55%）のGC含量を含み、さらに当該mRNAが導入されるオオムギのゲノムの標的以外のいずれのヌクレオチド配列とも高パーセンテージの同一性をもたない（例えば標準的なBLAST検索で決定される）。
【００３９】
D．ミクロRNA
ミクロRNA調節は、遺伝子調節のために進化したRNAサイレンシング経路の明確に特殊化された分枝であり、一般的RNAi/転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）から分岐した。ミクロRNAは特殊なクラスの小RNAで、特徴的な倒置リピート内で組織化された遺伝子様エレメントとしてコードされる。転写されるとき、ミクロRNAはステム-ループ型前駆体RNAを生じ、前記前駆体からミクロRNAは続いてプロセッシングされる。ミクロRNAは典型的には長さが約21ヌクレオチドである。遊離されたmiRNAは、配列特異的遺伝子抑制を示すアルゴノートタンパク質の特定のサブセットを含むRISC様複合体に取り込まれる。
E．コサプレッション
利用できる別の分子生物学的アプローチはコサプレッションである。コサプレッションのメカニズムはあまり理解されていないが、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を必要とすると考えられ、その関係でアンチセンスサプレッションの多くの例と非常に類似し得る。コサプレッションは、遺伝子又はそのフラグメントの余分なコピーをその発現のためのプロモータに対してセンス方向で植物に導入することを必要とする。当該センスフラグメントのサイズ、標的遺伝子領域に対するその一致度、及び標的遺伝子に対する配列同一性の程度は上記に記載したアンチセンス配列と同様である。いくつかの事例では、遺伝子配列の追加されたコピーは標的の植物遺伝子の発現に干渉する。コサプレッションを実施する方法についてはWO 97/20936及びEP 0465572が参照される。
【００４０】
IV．ゲノム編集
ある実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子の発現を減退及び/又はLpx1タンパク質の活性を減退させた植物に関し、ここでLpx1遺伝子発現の減退及び/又はLpx1タンパク質活性の減退はゲノム編集によって達成される。
ある実施態様では、本開示はゲノム編集されたLpx1遺伝子を有するコムギ植物体に関し、ここで当該コムギ植物体の穀粒は野生型植物の穀粒と比較して酸化安定性が増しているか、又は保存寿命が延長している。
ゲノム編集又は操作ヌクレアーゼによるゲノム編集（GEEN）は、人工的に操作されたヌクレアーゼ又は“分子ハサミ”を用いてDNAを挿入し、置換し、又はゲノムから除去する遺伝子操作の一タイプである。前記ヌクレアーゼは、特異的な二本鎖ブレーク（DSB）をゲノムの所望の位置に作り出し、細胞の内因性メカニズムを利用して、相同性組換え（HR）及び非相同末端結合（NHEJ）の天然のプロセスによって当該誘導ブレークを修復する。これまでのところ以下の4つの主要な操作ヌクレアーゼファミリーが用いられている：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Cas系、及び再操作ホーミングエンドヌクレアーゼを有する操作メガヌクレアーゼ。
【００４１】
A．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、ジンクフィンガー結合ドメインをDNA切断ドメインと融合することによって作製される人工の制限酵素である。ジンクフィンガードメインを操作して、所望される特定のDNA配列を標的とすることができ、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼは複雑なゲノム内の固有配列を標的とすることができる。内因性DNA修復機構を利用することによって、これらの試薬を用いて高等生物のゲノムを正確に変異させることができる。
ZFNは、FokI制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと融合させた操作されたジンクフィンガーDNA結合ドメインから成る。ZFNを用いて特異的なDNA配列に二本鎖ブレーク（DSB）を誘導することができ、したがって外因性鋳型による部位特異的相同組換えを容易にすることができる。外因性鋳型は当該ゲノムに導入されるべき配列を含む。
ジンクフィンガードメインの操作のために公開されている方法には以下が含まれる：（1）コンテクスト依存アッセンブリー（CoDA）、（2）オリゴマー化プールエンジニアリング（OPEN）、及び（3）モジュールアッセンブリー。
ある実施態様では、本開示は、ZFNを用いるLpx1遺伝子の発現減退及び/又はLpx1タンパク質の活性減退に関する。
B．転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
TALENは配列特異的エンドヌクレアーゼであり、転写活性因子様エフェクター（TALE）及びFokIエンドヌクレアーゼから成る。TALEはDNA結合タンパク質であり、34アミノ酸のタンデムリピートユニットをもつ高度に保存された中心領域を有する。各リピートユニットの塩基優先性は、リピート可変性二残基（RVD）と呼ばれる2つのアミノ酸残基によって決定される（RVDは標的DNAの1つの特異的ヌクレオチドを認識する）。DNA結合リピートユニットのアレーを特異的なDNA配列を標的とするためにカスタマイズすることができる。ZFNと同様に、ゲノム中の標的とされる特異的配列上での2つのTALENのダイマー化はDSBのFokI依存性導入をもたらし、相同性誘導修復（HDR）及び非相同末端結合（NHEJ）修復メカニズムを促進する。
ある実施態様では、本開示は、TALENを用いるLpx1遺伝子の発現減退及び/又はLpx1タンパク質の活性減退に関する。
【００４２】
C．CRISPR/Cas系
クラスターを形成する規則的に間隙が配置された短パリンドロームリピート（CRISPR）II型系は、ゲノム編集のためのRNAガイド付きエンドヌクレアーゼ技術である。この系には2つの別個の成分、（1）ガイドRNA及び（2）エンドヌクレアーゼ（本事例ではCRISPR結合（Cas）ヌクレアーゼ、Cas9）が存在する。
ガイドRNAは、内因細菌性crRNA及びtracrRNAが単一のキメラガイドRNA（gRNA）転写物に一体化されたものである。gRNAは、crRNAの標的誘導特異性とtracrRNAの折り畳み特性とを単一転写物で一体化する。gRNA及びCas9が細胞で発現されると、ゲノムの標的配列は改変されるか又は永久的に破壊される。
gRNA/Cas9複合体は、gRNA配列とゲノムDNA中の標的配列に対する相補性との間の塩基対形成によって標的配列に動員される。Cas9の首尾よい結合のために、ゲノム標的配列はまた、標的配列の直ぐ後に正確なプロトスペーサー近傍モチーフ（PAM）配列を含む必要がある。gRNA/Cas9複合体の結合はCas9をゲノム標的配列に局在させ、したがって野生型Cas9はDNAの両鎖を切断して二本鎖ブレーク（DSB）を生じることができる。Cas9はPAM配列の3−4ヌクレオチド上流を切断するであろう。DSBは以下の2つの一般的な修復経路の1つを介して修復され得る：（1）NHEJ DNA修復経路又は（2）HDR経路。NHEJ修復経路はしばしばDBS部位に挿入/欠失（InDel）をもたらし、前記はフレームシフト及び/又は未成熟終止コドンを生じて標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）を効果的に破壊することができる。
HDR経路は修復鋳型の存在を必要とする（修復鋳型はDSBの固定に用いられる）。HDRは修復鋳型配列を切断標的配列に忠実にコピーする。特異的なヌクレオチド変化は、修復鋳型とともにHDRを用いることによって標的遺伝子に導入できる。
ある実施態様では、本開示は、CRISPR/cas9系を用いるLpx1遺伝子の発現減退及び/又はLpx1タンパク質の活性減退に関する。
【００４３】
D．再操作ホーミングヌクレアーゼを有するメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（12から40塩基対の二本鎖DNA配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである（結果として一般的にこの部位はいずれのゲノムでも一度しか生じない）。例えば、I-SceIメガヌクレアーゼによって認識される18塩基対配列は、1回偶然に見いだされるためには平均してヒトゲノムサイズの20倍のゲノムを要求する（ただし単一変異を有する配列はヒトサイズゲノムに付き約3回生じる）。したがって、メガヌクレアーゼは天然に存在するもっとも特異的な制限酵素と考えられる。
メガヌクレアーゼの中では、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼは、ここ15年の間にゲノム研究及びゲノム操作のための重要なツールとなった。それらの認識配列をタンパク質操作により改変することによって、標的とされる配列を変化させることができる。
ある実施態様では、本開示は、再操作ホーミングエンドヌクレアーゼを有するメガヌクレアーゼを用いるLpx1遺伝子の発現減退及び/又はLpx1タンパク質の活性減退に関する。
【００４４】
V．コムギの栽培品種
ある実施態様では、少なくとも1つのLpx遺伝子を有する二倍体、倍数体、四倍体又は六倍体のコムギの栽培品種を用いることができる。別の実施態様では、コムギはトリチクム・アエスチブムである。
ある実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてLpx遺伝子に変異を作出できる。ある実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてAゲノムのLpx-D1遺伝子に変異を作出できる。別の実施態様では、コムギの任意の栽培品種を用いてLpx-B1.1a遺伝子に変異を作出できる。別の実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてLpx-B1.1b遺伝子に変異を作出できる。別の実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてLpx-B1.1c遺伝子に変異を作出できる。別の実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてLpx-B1.2遺伝子に変異を作出できる。別の実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてLpx-B1.3遺伝子に変異を作出できる。別の実施態様では、任意のコムギ栽培品種を用いてLpx-A1遺伝子に変異を作出できる。
ある実施態様では、系統として任意のコムギ栽培品種を用いてLpx変異を交配し種々の栽培品種を作出できる。
別の実施態様では、少なくとも1つのLpx遺伝子を有する任意のコムギ栽培品種を用いることができ、前記には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：硬質赤色春小麦、硬質白色小麦、デュラム小麦、軟質白色春小麦、軟質白色冬小麦、硬質赤色冬小麦、普通小麦、スペルト小麦、エンマー小麦、パスタ小麦、及びツルギデュム小麦。
【００４５】
ある実施態様では、硬質赤色春小麦には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ブルシーエ（Bullseye）、カバーネット（Cabernet）、カルローホ（Cal Rojo）、ハンク（Hank）、ジョーキン（Joaquin）、ケルス（Kelse）、ラリアット（Lariat）、ラシック（Lassik）、マルベック（Malbec）、ミカ（Mika）、PR 1404、レッドウィング（Redwing）、サミット515（Summit 515）、SY 314、トリプルIV、ウルトラ、WB-パトロン、WB-ロックランド（WB-Rockland）、イェコーラロホ（Yecora Rojo）、アコード（Accord）、エイム（Aim）、アンザ（Anza）、ベーカー（Baker）、ベスハシタ（Beth Hashita）、ボーナス（Bonus）、ボラー（Borah）、ブリム（Brim）、ブルークス（Brooks）、バックプロント（Buck Pronto）、ブット86（Butte 86）、カバリア（Cavalier）、チャレンジャー、チーフ（Chief）、シアノT79（Ciano T79）、コルサ（Colusa）、コンパニオン、コッパー（Copper）、キュヤマ（Cuyama）、ダッシュ12（Dash 12）、エルドン（Eldon）、エナノ（Enano）、エクスプレス（Express）、エクスプレッソ（Expresso）、ジェファーソン（Jefferson）、ジェネロF81（Genero F81）、グランジン（Grandin）、ヘレナ554（Helena 554）、ホーリス（Hollis）、イムリスT79（Imuris T79）、イニア66R（Inia 66R）、ジェローム（Jerome）、カーン（Kern）、レン（Len）、マーシャル（Marshall）、マッケイ（McKay）、ノーマッド（Nomad）、ノースウェスト10（Northwest 10）、オスロ（Oslo）、ペーボンF76（Pavon F76）、ペガサス、ピッティク62（Pitic 62）、ポコレッド（Poco Red）、パウエル（Powell）、プロブランド711（Probrand 711）、プロブランド751、プロブランド771、プロブランド775、プロブレッド（Probred）、プロインタケギュエイ（Prointa Queguay）、プロインタキンタル（Prointa Quintal）、リッチ（Rich）、RSI 5、サジッタリオ（Sagittario）、スカーレット、サーラ（Serra）、シャスタ（Shasta）、ソラーノ（Solano）、スピルマン（Spillman）、スプライト（Sprite）、スタンダー（Stander）、ステラー（Stellar）、ストア（Stoa）、サクセス、サミット、サンスター2、サンスターキング、タジニア（Tadinia）、タミー（Tammy）、タノリ71（Tanori 71）、タラ2000（Tara 2000）、テンポ（Tempo）、テシアT79（Tesia T79）、トピック、UIウィンチェスター（UI Winchester）、バンス（Vance）、バンダル（Vandal）、W444、ワンパム（Wampum）、ワレッド（Wared）、WB-フジオン（WB-Fuzion）、ウエストブレッド906R（Westbred 906R）、ウエストブレッド911、ウエストブレッド926、ウエストブレッド936、ウエストブレッドディスカバリー、ウエストブレッドランボー（Westbred Rambo）、ヨーロー（Yolo）、及びゼケ（Zeke）。
【００４６】
別の実施態様では、硬質白色小麦には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ブランカフェルト（Blanca Fuerte）、ブランカグランド515（Blanca Grande 515）、ブランカロイアル（Blanca Royale）、クリアーホワイト（Clear White）、パットウィン（Patwin）、パットウィン515、WB-クリスタロ（WB-Cristallo）、WB-パロマ（WB-Paloma）、WB-パーラ（WB-Perla）、アルタブランカ（Alta Blanca）ブランカグランド、デラーノ（Delano）、ゴールデンスパイク（Golden Spike）、ID377S、クラシック（Klasic）、ロクサ（Lochsa）、ロロ（Lolo）、メイコン（Macon）、オーチス（Otis）、フェニックス（Phoenix）、ピマ77（Pima 77）、プラタ（Plata）、プリスチン（Pristine）、ラモーナ50（Ramona 50）、シエータセロス66（Siete Cerros 66）、バイオレット、及びウィンサム（Winsome）。
なお別の実施態様では、デュラム小麦には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：クラウン（Crown）、デザートキング（Desert King）、デザートキングHP、デュラキング（Duraking）、フォルテッシモ（Fortissimo）、ハバス（Havasu）、クロノス（Kronos）、マエストラル（Maestrale）、ノルマノ（Normanno）、オリタ（Orita）、プラチナム、Q-Max、RSI 59、サラゴラ（Saragolla）、タンゴ（Tango）、ティパイ（Tipai）、トッパー（Topper）、ユートピア（Utopia）、ボラント（Volante）、WB-ミード（WB-Mead）、ウエストモア（Westmore）、アルデンテ（Aldente）、アルデュラ（Aldura）、アルター84（Altar 84）、アルバ（Aruba）、ビッテルン（Bittern）、ブラバデュア（Bravadur）、キャンデュラ（Candura）、コルテズ（Cortez）、デラックス（Deluxe）、デザートタイタン（Desert Titan）、デュレックス（Durex）、デュルフォート（Durfort）、エディ（Eddie）、ジャーメインス5003D（Germains 5003D）、インペリアル（Imperial）、コーファ（Kofa）、レバント（Levante）、マット（Matt）、ミード（Mead）、メキシカリ75（Mexicali 75）、ミノス（Minos）、モドク（Modoc）、モホーク（Mohawk）、ヌデュラ（Nudura）、オコチロ（Ocotillo）、プロデュラ（Produra）、レーバ（Reva）、リア（Ria）、セプター（Septre）、スカイ（Sky）、タクナ（Tacna）、タイタン（Titan）、トランプ（Trump）、ウォード（Ward）、ウエストブレッド803、ウエストブレッド881、ウエストブレッド883、ウエストブレッド1000D、ウエストブレッドレーカー（Westbred Laker）、ウエストブレッドターボ（Westbred Turbo）、及びヤバロス79（Yavaros 79）。
【００４７】
別の実施態様では、軟質白色春小麦には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アルポワ（Alpowa）、アルチュラス（Alturas）、ベーブ（Babe）、ディバ（Diva）、JD、ニューダークウィン（New Dirkwin）、ニック（Nick）、ツウィン（Twin）、フゥイット（Whit）、ブランカ（Blanca）、ブリス（Bliss）、カローワ（Calorwa）、センテニアル（Centennial）、チャリス（Challis）、ダークウィン（Dirkwin）、エデン（Eden）、エドワール（Edwall）、フィールダー（Fielder）、フィールドウィン（Fieldwin）、ジュビリー（Jubilee）、ルイーズ（Louise）、オーウェン（Owens）、ペナワワ（Penawawa）、ポメレール（Pomerelle）、スターリング（Sterling）、サンスタープロミス（Sunstar Promise）、スーパーダークウィン（Super Dirkwin）、トレジャー（Treasure）、UIカタルドー（UI Cataldo）、UIプチット（UI Pettit）、アークィー（Urquie）、バンナ（Vanna）、ウォデュエル（Waduel）、ウィデュエル94（Waduel 94）、ワカンズ（Wakanz）、ワラデー（Walladay）、ワワイ（Wawawai）、ホワイトバード（Whitebird）、及びザック（Zak）。
なお別の実施態様では、軟質白色冬小麦には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：APバドガー（AP Badger）、APレガシー（AP Legacy）、ブランデージ96（Brundage 96）、ブルーノー（Bruneau）、カーラ（Cara）、ゲッツェ（Goetze）、リージオン（Legion）、メリー（Mary）、スキルス（Skiles）、ステファンス（Stephens）、SYオベーション（SY Ovation）、タッブス（Tubbs）、WB-ジャンクション（WB-Junction）、WB-528）、キセルファー（Xerpha）、ヤムヒル（Yamhill）、バービー（Barbee）、バシン（Basin）、ビタールート（Bitterroot）、ブルエール（Bruehl）、カスタン（Castan）、チャッカー（Chukar）、コーダ（Coda）、ドウズ（Daws）、エドウィン（Edwin）、エルタン（Eltan）、ファーロ（Faro）、フィンチ（Finch）、フーテ（Foote）、ジーン（Gene）、ヒル81（Hill 81）、ヒラー（Hiller）、ヒュバード（Hubbard）、ヒアック（Hyak）、ヒスロップ（Hyslop）、アイダホ587、クモール（Kmor）、ランバート（Lambert）、リリュージェイン（Lewjain）、マックバイカー（MacVicar）、マドセン（Madsen）、マルコーム（Malcolm）、マサミ（Masami）、マックデルミド（McDermid）、モロ（Moro）、ヌガインス（Nugaines）、ORCF-101、ORCF-102、ORCF-103、ロッド（Rod）、ローデ（Rohde）、ルーロ（Rulo）、シモン（Simon）、サリュート（Salute）、テンプル（Temple）、トレス（Tres）、タッブス06（Tubbs 06）、UICF-ブランデージ（UICF-Brundage）、 WB-523、及びウェザーフォード。
【００４８】
別の実施態様では、硬質赤色冬小麦には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アンドリュース（Andrews）、アーチャー（Archer）、バーチュム（Batum）、ブリザード（Blizzard）、ボンネビル（Bonneville）、バウンダリー（Boundary）、デクロ（Declo）、デロリス（Deloris）、フィンリー（Finley）、ガーランド（Garland）、ハットン（Hatton）、ホッフ（Hoff）、ロングホーン（Longhorn）、マンニング（Manning）、メリジアン（Meridian）、プロモントリ（Promontory）、ボーナ（Vona）、ワンサー（Wanser）、ウィンリッジ（Winridge）。
別の実施態様では、普通小麦（六倍体、脱穀不要）、トリチクム・アエスチブム・アエスチブム亜種には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ソノラ（Sonora）、ウィットウォルコーリング（Wit Wolkoring）、チダムブランクドマース（Chiddam Blanc De Mars）、インディア-ジャミュー（India-Jammu）、フォイシー（Foisy）。
なお別の実施態様では、スペルト小麦（六倍体、脱穀不要ではない）、トリチクム・アエスチブム・スペルタ亜種にはスパニッシュスペルト、スイススペルトが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
なお別の実施態様では、エンマー小麦（四倍体）、トリチクム・チュルギデュム・ジコックム亜種にはエチオピアンブルーチンゲ（Ethiopian Blue Tinge）が含まれるが、ただし前記に限定されない。
別の実施態様では、パスタ小麦（四倍体、脱穀不要）、トリチクム・チュルギデュム・デュルム亜種にはブルービアード（Blue Beard）、デュラム-イラク（Durum-Iraq）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
なお別の実施態様では、チュルギデュム小麦（四倍体、脱穀不要）、トリチクム・チュルギデュム・チュルギデュム亜種にはアクモリンカ（Akmolinka）、マパルチャ（Maparcha）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００４９】
ある実施態様では、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:15と実質的なパーセント同一性を有する少なくとも1つのLpx1遺伝子を有するコムギの栽培品種を、本明細書で開示する方法及び組成物とともに用いることができる。
コムギの栽培品種に関して本明細書で用いられる、“実質的パーセント同一性”は、実質的に類似のタンパク質をコードするために、遺伝子のDNA配列が配列番号:1、2、4及び5とヌクレオチドレベルで十分に類似して、栽培品種間の対立遺伝子の相違（或いはまた別のmRNAスプライシング）を許容することを意味する。本発明のある実施態様にしたがえば、“実質的なパーセント同一性”は、Lpx1遺伝子と配列番号:1、2、4及び5との間のコード領域のパーセント同一性が約85%と低いときにもあり得るが、ただし当該遺伝子の保存領域のパーセント同一性はもっと高いことを条件とする（例えば少なくとも約90%）。好ましくは、コード領域のパーセント同一性は85−90%、より好ましくは90−95%、最適には前記は95%を超える。したがって、当業者は、本発明の範囲及び意図を逸脱することなく、商業的に人気の高いコムギ栽培品種又はLpx1変異コムギを作出するために所望される特別な特徴を有するコムギの栽培品種を利用することを所望できる。また別に、当業者は、本発明の1つ以上のLpx1遺伝子内の変異についてスクリーニングを容易にするために、多形性が少ない小麦栽培品種（例えば同系交配栽培品種）を利用することを所望できる。
【００５０】
VI．Lpx1変異を特定する代表的な方法
本明細書に開示するLpx1変異及びコムギ植物体を作出及び特定するために、TILINGとして知られる方法を利用した。以下を参照されたい：McCallum et al., Nature Biotechnology 18:455-457, 2000；McCallum et al., Plant Physiology, 123:439-442, 2000；米国公開広報20040053236号；及び米国特許5,994,075号（前記のいずれも参照により本明細書に含まれる）。基本的なTILINGの方法論では、植物の材料（例えば種子）が化学的変異誘導に付される（前記は種子細胞のゲノム内に一連の変異を作出する）。変異が誘導された種子を成熟M1植物体に生長させ、自家受粉させる。得られたM2植物体のDNAサンプルをプールし、続いて問題の遺伝子の変異についてスクリーニングする。いったん問題の遺伝子で変異が特定されたら、当該変異を保持するM2植物体の種子を成熟M3植物体に生長させ、問題の遺伝子の当該変異に随伴する表現型の特徴についてスクリーニングする。
六倍体栽培品種エクスプレスを用いた。
ある実施態様では、コムギの種子を変異させ、続いてM1植物体に生長させる。続いてM1植物体を自家受粉させ、M1植物体の種子をM2植物体に生長させる。続いて前記植物体をLx1遺伝子座の変異についてスクリーニングする。本発明のまた別の実施態様にしたがってM1植物体を変異についてスクリーニングすることは可能であるが、M2植物体をスクリーニングすることの1つの利点は、全ての体細胞変異が生殖細胞系列変異と一致するということである。
【００５１】
多様なコムギ植物体材料（種子、花粉、植物組織又は植物細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない）を変異させて、本明細書に開示するLpx変異コムギ植物体を作出できることは当業者には理解されるであろう。しかしながら、植物のDNAを変異についてスクリーニングするとき、変異誘導する植物材料のタイプが影響を与えることがある。例えば、変異誘導されていない植物体の受粉前に花粉を変異誘導に付したとき、当該受粉から生じた種子はM1植物体に生長する。M1植物体の各細胞は前記花粉で生じた変異を含み、したがってM2世代まで待機する代わりに、これらのM1植物体を続いてLpx1変異についてスクリーニングすることができる。
主として点変異並びに欠失、挿入、転換及び/又は転移を生じる変異原（例えば化学的変異原又は照射）を用いて、変異を作出することができる。本発明の方法に合致する変異原には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：メタンスルホン酸エチル（EMS）、スルホン酸メチルメタン（MMS）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、トリエチルメラミン（TEM）、N-メチル-N-ニトロソウレア（MNU）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロサミン、N-メチル-N’-ニトロ-ニトロソグアニジン（MNNG）、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12ジメチル-ベンズ(a)アントラセン（DMBA）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン（DEO）、ジエポキシブタン（DEB）など）、2-メトキシ-6-クロロ-9[3-(エチル-2-クロロ-エチル)アミノプロピルアミノ]アクリジンジヒドロクロリド（ICR-170）、ホルムアルデヒド、高速中性子、及びガンマ線照射。変異原によって直接惹起されたものではない可能性があるLpx1遺伝子の偶発的変異もまた特定することができる。
【００５２】
発現又は活性をアップレギュレート又はダウンレギュレートさせるために、他の方法（例えばゲノム編集）を用いて、標的遺伝子の配列（そのプロモータを含む）を変化させることもまた可能である。これらの方法は当業者には公知であり、それらの方法にはとりわけCRISPR、Talen、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びmiRNAが含まれる。例えばXiongらによるこれらの方法の概論を参照されたい：Xiong et al., Horticulture Research 2:15019, 2015。
現在公知であるか又は以下で考案する適切な任意の植物DNA調製方法を、Lpx1変異スクリーニング用コムギ植物体DNA調製に用いることができる。例えば、以下を参照されたい：Chen & Ronald, Plant Molecular Biology Reporter 17:53-57, 1999；Stewart and Via, Bio Techniques 14:748-749, 1993。加えて、この目的のために設計されたいくつかの市販のキットを利用することができる（Qiagen（Valencia, CA）及びQbiogene（Carlsbad, CA）のキットが含まれる）。
ある実施態様では、変異誘導された植物組織から発生した植物の全集団の1つ以上のLpx1遺伝子における変異のスクリーニングを促進するために、個々のコムギ植物体から調製されたDNAがプールされる。プールされる群のサイズは、用いるスクリーニング方法の感度に左右され得る。好ましくは、コムギ植物体の2つ以上の個体群がプールされる。
別の実施態様では、DNAサンプルをプールした後で、当該プールはLpx1配列特異的増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR））に付される。PCRの概略については以下を参照されたい：PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, Gelfand, Sninsky, and White, eds.), Academic Press, San Diego, 1990。
Lpx1遺伝子座又はこれらの遺伝子座の直近配列に特異的な任意のプライマーを利用して、当該プールしたDNAサンプル内のLpx1配列を増幅することができる。好ましくは、プライマーは有用な変異が最も生じやすいLpx1遺伝子座の領域を増幅するように設計される。最も好ましくは、プライマーは1つ以上のLpx1遺伝子のエクソン領域を検出するために設計される。加えて、個別のゲノムにおける点変異のスクリーニングを容易にするために、プライマーが公知の多形性部位を標的とするゲノム特異的プライマーを設計することが好ましい。
ある実施態様では、プライマーはLpx-D1及びLpx-B1.2 DNA配列（配列番号:1、2、4、5及び15）に基づいて設計される。Lpx1配列内の有用な変異の特定に有用であることが立証された例示的プライマー（配列番号:7−14、16および17）は表4に示される。これらのプライマーはまた、本明細書に添付した配列表で詳述される。
【００５３】
表4：例示的TILINGプライマー
【００５４】
2018518184.tif 000012
別の実施態様では、PCR増幅生成物は、野生型と変異配列との間のヌクレオチドの相違を特定する任意の方法を用いてLpx1変異についてスクリーニングできる。これらの方法には例えば以下が含まれ得るが、ただしそれらに限定されない：配列決定、変性高速液体クロマトグラフィー（dHPLC）、定常型変性キャピラリー電気泳動（CDCE）、温度勾配キャピラリー電気泳動（TGCE）（Li et al., Electrophoresis 23(10):1499-1511, 2002）、又は酵素切断による断片化（例えばColbertら（Colbert et al., Plant Physiology 126:480-484, 2001）が記載した高処理方法で用いられるもの）。好ましくは、PCR増幅生成物は、野生型配列と変異体配列間のヘテロ二重体のミスマッチを優先的に切断するエンドヌクレアーゼとインキュベートされる。
別の実施態様では、切断生成物は自動化配列決定ゲル装置を用いて電気泳動され、ゲル画像は標準的な市販の画像処理プログラムの支援によって分析される。
【００５５】
なお別の実施態様では、いったん変異Lpx1遺伝子配列を有するM2植物体が特定されたら、当該変異を分析して、Lpx1酵素の発現、翻訳及び/又は活性における当該変異の影響を決定する。ある実施態様では、変異を含むPCRフラグメントの配列が標準的な配列決定技術を用いて決定され、全体的なLpx1配列に対して正確な変異位置が決定される。バイオインフォマティクスツールを用いて各変異を評価し、タンパク質機能に対する影響（すなわち完全に容認できる変異から機能消失を引き起こす変異まで）を予測する。バイオインフォマティクスツールには例えば以下が含まれる：SIFT（容認可能から容認不能を区分する（Sorting Intolerant from Tolerant；Ng and Henikoff, Nucleic Acids Research 31:3812-3814, 2003））、PSSM（位置特異的スコアリングマトリックス（Position-Specific Scoring Matrix；Henikoff and Henikoff, Computer Applications in the Biosciences 12:135-143, 1996））及びPARSESNP（Taylor and Greene, Nucleic Acids Research 31:3808-3811, 2003）。例えば0.05未満のSIFTスコア及びPSSMスコアの大きな変化（例えば大雑把に10以上）は、タンパク質機能に有害な影響を有する可能性がある変異を示す。これらのプログラムには予測性があることが知られているが、当該予測結果が常に正確であるとは限らないことを当業者は理解している。
別の実施態様では、M2植物体における変異の最初の査定が、当該変異が有用な性質を有しかつLpx1遺伝子内の有用な位置にあることを示す場合、当該変異を含むコムギ植物体の更なる表現型分析を続けることができる。六倍体コムギでは、A、B及びDゲノムの各々の変異を表現型の検出前に一体化させる必要がある。四倍体コムギでは、A及びBゲノムの変異を一体化させる。加えて、変異含有植物は2回以上戻し交配するか又は異系交配して、いずれの世代のバックグラウンド変異も排除することができる。続いて、戻し交配又は異系交配植物を自家受粉又は交配して、Lpx1変異についてホモ接合の植物を作出できる。
これらのホモ接合Lpx1変異体植物のいくつかの物理的特徴を査定して、当該変異が、望ましくない負の影響（例えば種子収量の顕著な減退）をもたらすことなくコムギ植物体で有用な表現型変化をもたらすか否かが決定される。
【００５６】
VII．コムギ植物体の作製方法
別の実施態様では、本開示は、酸化安定性が増したコムギ植物体の作製方法に関する。別の実施態様では、本発明は、保存寿命が延長されたコムギ植物体の作製方法に関する。
別の実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子変異を野生型植物と異系交配する方法に関する。
別の実施態様では、本開示は、酸化安定性が増したコムギ植物体及び保存寿命が延長した前記コムギ植物体の穀粒から製品を製造する方法に関する。なお別の実施態様では、本発明は、野生型コムギの植物体と比較して、1つ以上のLpx1酵素の活性が減退したコムギ植物体を作製する方法に関する。
ある実施態様では、前記方法は以下の工程を含む：親コムギ植物体の植物材料又は植物部分のLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーで少なくとも1つの非トランスジェニック変異を誘導する工程；前記変異誘導植物材料を生長させるか又は用いて、子孫コムギ植物体を作製する工程；前記変異誘導植物材料及び/又は子孫コムギ植物体を分析して、Lpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーで少なくとも1つの変異を検出する工程；及びLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーに少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体を選別する工程。
別の実施態様では、前記方法はさらに、Lpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーに少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体をLpx1遺伝子の異なるコピーに少なくとも1つの変異を有する他の子孫コムギ植物体と交配する工程を含む。変異を有する子孫コムギ植物体を特定し、前記子孫コムギ植物体を他の子孫コムギ植物体（変異を有する）と交配するプロセスを反復して、Lpx1酵素活性が減退した子孫コムギ植物体を作製することができる。
別の実施態様では、当該コムギ植物体のPpx1タンパク質の活性レベルは、野生型植物のLpx1タンパク質の活性レベルの0−2%、2−5%、5−7%、7−10%、10−15%、15−20%、20−25%、25−30%、30−35%、35−40%、40−45%、45−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、90−95%、又は95−99%に減退する。
【００５７】
A．2つ以上のゲノムのLpx1遺伝子に1つ以上の変異を有するコムギ植物体を作製する方法
さらに別の実施態様では、本開示は以下の工程を含むコムギ植物体を作製する方法に関する：Lpx1遺伝子に変異を含む親コムギ植物体の植物材料のLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーに少なくとも1つの非トランスジェニック変異を誘導する工程；前記変異誘導植物材料を生長させるか又は用いて子孫コムギ植物体を作製する工程；及びLpx1遺伝子の少なくとも2つのコピーに少なくとも1つの変異を有する子孫小麦植物体を選別する工程。例えば親コムギ植物体はDゲノムのLpx-D1遺伝子に1つの変異を有することができる。選別子孫コムギ植物体は、DゲノムのLpx-D1遺伝子に変異を有し、さらにBゲノムのLpx1遺伝子に1つ以上の変異を有することができる。前記の例は明確にするために単に提供され、本明細書に開示する方法を制限するべきではない。
なお別の実施態様では、本発明は以下の工程を含むコムギ植物体を作製する方法に関する：2つのLpx1遺伝子に少なくとも1つの変異を含む親コムギ植物体の植物材料のLpx1遺伝子の少なくとも1つのコピーに少なくとも1つの非トランスジェニック変異を誘導する工程；前記変異誘導植物材料を生長させるか又は用いて子孫コムギ植物体を作製する工程；及びLpx1遺伝子の3つのコピーで少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体を選別する工程。この実施態様では、A、B及びDゲノムのLpx1遺伝子に少なくとも1つの変異が存在するであろう。
別の実施態様では、本開示は以下の工程を含むコムギ植物体の作製方法に関する：第一のLpx1遺伝子に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を有する第一の植物を、第二のLpx1遺伝子に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を有する第二の植物と交配する工程；及びLpx1遺伝子の少なくとも2つのコピーに少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体を選別する工程。
別の実施態様では、本開示は以下の工程を含むコムギ植物体を作製する方法に関する：第一及び第二のLpx1遺伝子に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を有する第一の植物を、第三のLpx1遺伝子に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を有する第二の植物と交配する工程；及びLpx1遺伝子の3つのコピーの全てに少なくとも1つの変異を有する子孫コムギ植物体を選別する工程。この実施態様では、A、B及びDゲノムのLpx1遺伝子に少なくとも1つの変異が存在するであろう。
【００５８】
VIII．コムギ植物体、コムギ種子及びコムギ植物体の部分
ある実施態様では、本明細書に開示する方法にしたがってコムギ植物体が作製される。別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、1つのLpx1遺伝子に1つ以上の変異を有する。別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、複数のLpx1遺伝子に1つ以上の変異を有する。
別の実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含むコムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分に関する。別の実施態様では、本開示は、2つのゲノムの各々のLpx1遺伝子に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を含むコムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分に関する。さらに別の実施態様では、本開示は、3つのゲノムの各々のLpx1遺伝子に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を含むコムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分に関する．
ある実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、AゲノムのLpx1遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異は、AゲノムのLpx1遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、BゲノムのLpx1遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異は、BゲノムのLpx1遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、DゲノムのLpx1遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異は、DゲノムのLpx1遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
【００５９】
別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:4と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
さらに別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、Lpx1タンパク質をコードする、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、当該Lpx1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:6と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有する。
別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:4と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
さらに別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、Lpx1タンパク質をコードする1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、当該Lpx1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:6と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有する。
別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
さらに別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、Lpx1タンパク質をコードする、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、当該Lpx1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、さらに配列番号:3と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有する。
別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:2と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
さらに別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、Lpx1タンパク質をコードする1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、当該Lpx1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、さらに配列番号:3と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有する。
別の実施態様では、コムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分は、Lpx1遺伝子の1つ以上の変異（表1−3に列挙した1つ以上の変異が含まれるが、ただしこれらに限定されない）及びホモローグの対応する変異を有する。あるコムギ植物体、コムギ種子又はコムギ植物体の部分を作出することができ、前記は、表1、2及び3に開示する変異（ただしこれらに限定されない）を含む本明細書に開示する変異の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26以上とともに対応するホモローグの変異を有することができる。
別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を含むコムギの種子は、野生型コムギの種子に匹敵する速度で発芽する。さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を含むコムギの種子は、野生型コムギの種子に匹敵する物理的特徴（サイズ、重量、長さを含むが、ただしこれらに限定されない）を有する。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する1つ以上の変異を含むコムギの植物体は、野生型コムギの植物体に匹敵する稔性を有する。
【００６１】
IX．穀粒、粉及びデンプン
別の実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含むコムギの穀粒、粉又はデンプンに関する。別の実施態様では、本発明は胚を含むコムギの穀粒に関し、ここで、当該胚は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。
別の実施態様では、コムギの穀粒、粉又はデンプンは、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異（表1−3に挙げた変異を含むが、ただしこれらに限定されない）及びホモローグの対応する変異を含む。
さらに別の実施態様では、本開示は、1つ、2つ又は3つのゲノムのLpx1に少なくとも1つの非トランスジェニック変異を含むコムギの穀粒又は粉に関する。
さらに別の実施態様では、本発明は、Lpx-D1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含むコムギの穀粒、粉又はデンプンに関する。別の実施態様では、非トランスジェニック変異はDゲノムのLpx-D1遺伝子の両方の対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギの穀粒、粉又はデンプンは、BゲノムのLpx-B1.1a遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異はBゲノムのPlx-B1.1a遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギの穀粒、粉又はデンプンは、BゲノムのLpx-B1.1b遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異はBゲノムのLpx-B1.1b遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギの穀粒、粉又はデンプンは、BゲノムのLpx-B1.1c遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異はBゲノムのLpx-B1.1c遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギの穀粒、粉又はデンプンは、BゲノムのLpx-B1.2遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異はBゲノムのLpx-B1.2遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
ある実施態様では、コムギの穀粒、粉又はデンプンは、BゲノムのLpx-B1.3遺伝子の両方の対立遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を含む。別の実施態様では、非トランスジェニック変異はBゲノムのLpx-B1.3遺伝子の両対立遺伝子で同一である。
【００６２】
ある実施態様では、本開示は、表3に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:15と一致するDゲノムのLpx-D1プロモータのポリヌクレオチドを含むコムギの穀粒、小麦粉又はデンプンに関する。別の実施態様では、コムギの穀粒又は小麦粉は、表3に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:15と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
ある実施態様では、本開示は、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:1と一致するDゲノムのLpx-D1遺伝子のポリヌクレオチドを含むコムギの穀粒、小麦粉又はデンプンに関する。別の実施態様では、コムギの穀粒又は小麦粉は、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:1と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
さらに別の実施態様では、コムギの穀粒、小麦粉又はデンプンは、Lpx1タンパク質をコードする、表2に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、当該Lpx1タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:3と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有する。
ある実施態様では、本開示は、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:4と一致するBゲノムのLpx-B1.2遺伝子のポリヌクレオチドを含むコムギの穀粒、小麦粉又はデンプンに関する。別の実施態様では、コムギの穀粒又は小麦粉は、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有し、さらに配列番号:4と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有するポリヌクレオチドを含む。
さらに別の実施態様では、コムギの穀粒、小麦粉又はデンプンは、Lpx-B1.2タンパク質をコードする、表1に挙げた1つ以上の非トランスジェニック変異を有するポリヌクレオチドを含み、ここで、当該Lpx-B1.2タンパク質は1つ以上の非トランスジェニック変異を含み、配列番号:6と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99%を超える同一性或いは類似性を有する。
【００６３】
さらに別の実施態様では、本開示は、野生型コムギの穀粒又は粉と比較して、内乳並びに減退したLpx1遺伝子の遺伝子発現レベル、活性又は発現レベル及び活性を含むコムギの穀粒又は粉に関する。
なお別の実施態様では、本開示は、野生型コムギの穀粒又は粉と比較して保存寿命の延長を示す、Lpx1遺伝子の1つ以上の変異を有するコムギの穀粒又は粉に関する。別の実施態様では、Lpx1遺伝子の1つ以上の変異を有するコムギの穀粒又は粉は、野生型穀粒又は粉と比較して25−30%、30−35%、35−40%、45−50%、50−55%、55-60%、60-65%、65−70%、70−75%、75−80%、80−85%、85−90%、90−95%及び95%を超える保存寿命の延長を示す。
なお別の実施態様では、本開示は、野生型コムギの穀粒又は粉と比較して保存寿命の延長を示す、Lpx-D1遺伝子に1つ以上の変異を有するコムギの穀粒又は粉に関する。別の実施態様では、Lpx-D1遺伝子に1つ以上の変異を有するコムギの穀粒又は粉は、野生型穀粒又は粉と比較して25−30%、30−35%、35−40%、45−50%、50−55%、55-60%、60-65%、65−70%、70−75%、75−80%、80−85%、85−90%、90−95%及び95%を超える保存寿命の延長を示す。
なお別の実施態様では、本開示は、野生型コムギの穀粒又は粉と比較して保存寿命の延長を示す、Lpx-D1及びLpx-B1.2遺伝子に1つ以上の変異を有するコムギの穀粒又は粉に関する。別の実施態様では、Lpx-D1及びLpx-B1.2遺伝子に1つ以上の変異を有するコムギの穀粒又は粉は、野生型穀粒又は粉と比較して25−30%、30−35%、35−40%、45−50%、50−55%、55-60%、60-65%、65−70%、70−75%、75−80%、80−85%、85−90%、90−95%及び95%を超える保存寿命の延長を示す。
【００６４】
X．食品
ある実施態様では、本開示は、上記で述べた穀粒又は粉から製造される粉又は他の製品に向けられる。別の実施態様では、当該粉、粗分画又は精製デンプンは食品の成分であり得る。
当該食品には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：ベーグル、ビスケット、パン、バン、クロワッサン、ダンプリング、イングリッシュマッフィン、マッフィン、ピタ、速成パン、冷蔵/冷凍ドウ製品、生パン、ベイクドビーンズ、ブリトー、チリ、タコス、タマル、トルティーヤ、ポットパイ、調理済みシリアル、調理済み食品、スタッフィング、電子レンジ対応食品、ブラウニー、ケーキ、チーズケーキ、コーヒーケーキ、クッキー、デザート、ペストリー、菓子パン、棒状菓子、パイ生地、パイ詰め物、ベビーフード、ベーキングミックス、ころも用生地、パン粉、グレービーミックス、肉増量剤、肉代用物、シーズニングミックス、スープミックス、グレービー、ルー、サラダドレッシング、スープ、サワークリーム、麺、パスタ、ラーメン麺、焼きそば麺、中華麺、アイスクリーム混合品、アイスクリームバー、アイスクリームコーン、アイスクリームサンドイッチ、クラッカー、クルトン、ドーナツ、エッグロール、押出し菓子、果実穀粒棒菓子、電子レンジ対応スナック製品、栄養食バー、パンケーキ、半焼き（pan-baked）ベーカリ製品、プレッツェル、プディング、グラノーラ系製品、スナックチップ、スナックフード、スナックミックス、ワッフル、ピザ生地、動物用食品又はペットフード。
ある実施態様では、粉は全粒粉である（例えばウルトラファイン製粉全粒粉（例えばウルトラファイン製粉全粒小麦粉））。ある実施態様では、全粒粉は、精製粉成分（例えば精製小麦粉又は精製粉）及び粗分画（例えばウルトラファイン製粉粗分画）を含む。精製小麦粉は、例えば清浄小麦のすり潰し及びふるい分けによって調製される粉であり得る。食品医薬品局（FDA）は、精製小麦粉のカテゴリーに入るように粉が一定の粒子サイズ標準に適合することを要求する。精製小麦粉の粒子サイズは、“212マイクロメートル（U.S. Wire 70）”と称される金網の開口部を超えない開口部を有する布を98%以上が通過する粉とされる。
【００６５】
別の実施態様では、粗分画はふすま及び胚芽の少なくとも1つを含む。例えば、胚芽はコムギの穀粒中に見いだされる胚植物体である。胚芽は、脂質、線維、ビタミン、タンパク質、ミネラル、及び植物栄養素（例えばフラボノイド）を含む。ふすまはいくつかの細胞層を含み、顕著な量の脂質、線維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及び植物栄養素（例えばフラボノイド）を含むことができる。
例えば、本発明の粗分画又は全粒粉又は精製粉を種々の量で用いて、ベークド製品、スナック製品及び食品中の精製粉又は全粒粉を置き換えることができる。消費者の手作りベークド品で使用するために、全粒粉（すなわちウルトラファイン製粉全粒粉）もまた直に消費者に販売できる。例示的実施態様では、全粒粉の粒状化プロフィールは、全粒粉の重量で粒子の98%が212ミクロンメートル未満であるというものである。
別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉は栄養サプリメントの成分であり得る。栄養サプリメントは、食事に添加される1つ以上の成分（典型的にはビタミン、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、酵素、抗酸化剤、ハーブ、香辛料、プロバイオティクス及び線維を含む）を含む製品であり得る。
さらに別の実施態様では、栄養サプリメントは、個体の全体的健康を促進する公知の任意の栄養成分を含むことができる。前記成分には例えば、ビタミン、ミネラル、他の線維成分、脂肪酸、抗酸化剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ルテイン、リボース、オメガ-3脂肪酸、及び/又は他の栄養成分が含まれるが、ただし前記に限定されない。本発明の内乳の高い栄養素含有量のために、個体に膨大な利益を与える多くの用途が存在し得る。前記には、線維及び他の必須栄養素のデリバリー、消化機能及び健康の増進、体重管理、血糖管理、心臓の健康、糖尿病リスクの軽減、潜在的関節炎リスクの軽減、及び個体の全体的健康及び安寧が含まれる。
さらに別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉は食事用サプリメントの成分であり得る。連邦規則集は食事用サプリメントを以下が意図される製品と定義する：食事を補充し1つ以上の食事成分（ビタミン、ミネラル、ハーブ、植物由来物質、アミノ酸、及び他の物質又はそれらに構成成分を含む）を含み、ピル、カプセル、錠剤又は液体として口から摂取され、前面に食事用サプリメントであると標識されている。
【００６６】
なお別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉は線維サプリメント又はその成分であり得る。線維サプリメントは以下の形態（ただしそれらに限定されない）でデリバーできる：即席飲料ミックス、調合済み飲料、栄養バー、ウェファース、クッキー、クラッカー、ゲルショット、チューイング物、かみ砕くことができる錠剤及びピル。ある実施態様では、香料添加シェーク又は麦芽系飲料の形で繊維サプリメントがデリバリーされる。
別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉を消化サプリメントの成分として加えることができる。全粒粉又は粗分画又は精製粉は、消化サプリメント単独物又は1つ以上のプレバイオティック化合物及び/又はプロバイオティック生物と組み合わせた消化サプリメントの成分であってもよい。プレバイオティック化合物は非消化性食物成分であり、前記は、限られた数の腸内微生物の増殖及び/又は活性を選択的に刺激することによって宿主に有益な影響を与えることができる。本発明の範囲内のプレバイオティック化合物の例にはオリゴ糖及びイヌリンが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
プロバイオティクスは微生物であり、適量を投与されたときに宿主に健康上の利益を与える。プロバイオティック生物には、ラクトバシルス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリア属（Bifidobacteria）、エシェリキア属（Escherichia）、クロストリジウム属（Clostridium）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、及びサッカロミセス属（Saccharomyces）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
なお別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉を機能食の成分として含むことができる。食品技術研究所は機能食を、基礎栄養物を超える健康上の利益を提供する食物及び食物成分と定義する。前記には、一般的食物、補強、濃縮又は強化食物、及び食事用サプリメントが含まれる。全粒粉又は粗分画又は精製粉は、多くのビタミン及びミネラルを含み、高い酸素ラジカル吸収能を有し、線維が豊富であって、機能食での使用又は機能食としての使用のためにそれらを理想的に適合させる。
【００６７】
別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉を医療食で用いることができる。医療食は、医師の監督下で全体的に消費又は投与するように処方された食品と定義され、医療食は、周知された科学的原理に基づきそのための弁別的な栄養上の要請が医学的査定によって確立された疾患又は症状の固有の食養生を意図する。全粒粉又は粗分画又は精製粉の栄養的内容及び抗酸化性能は、医療食としてのそれらの使用を理想的なものにする。
なお別の実施態様では、全粒粉又は粗分画又は精製粉はまた医薬として使用できる。全粒粉又は粗分画又は精製粉は線維が多く非常に微細な粒状を有し、そのため医薬の担体としての使用に適している。
さらに別の実施態様では、栄養サプリメント、食事用サプリメント又は消化サプリメントとしての全粒粉又は粗分画又は精製粉のデリバリーは、全粒粉又は粗分画が単一成分又は多くの栄養成分の1つであるデリバリーメカニズムを介することが意図される。例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：即席飲料ミックス、調合済み飲料、栄養バー、ウェファース、クッキー、クラッカー、ゲルショット、カプセル及びチューイング物。
なお別の実施態様では、製粉プロセスを用いてマルチ小麦粉又はマルチ穀粒粗分画を製造できる。ある実施態様では、あるタイプのコムギ由来のふすま及び胚芽をすり潰し、別のタイプのコムギのすり潰した内乳又は全粒小麦粉とブレンドすることができる。また別には、あるタイプの穀粒のふすま及び胚芽をすり潰し、別のタイプの穀粒のすり潰した内乳又は全粒粉とブレンドすることができる。
さらに別の実施態様では、第一のタイプのコムギ又は穀粒のふすま及び胚芽を第二のタイプのコムギ又は穀粒のふすま及び胚芽とブレンドして、マルチ穀粒粗分画を製造することができる。本発明は、1つ以上の穀粒のふすま、胚芽、内乳、及び全粒粉の1つ以上の任意の組み合わせの混合を包含する。このマルチ穀粒、マルチ小麦戦略を用いて、顧客の注文の粉を製造し、複数のタイプの穀粒又はコムギの品質及び栄養的内容を利用することができる。
【００６８】
本発明の全粒粉は多様な製粉プロセスを介して製造できる。ある例示的プロセスは、穀粒の内乳、ふすま及び胚芽を別々の流れに分離することなく単一の流れで穀粒をすり潰す工程を含む。清浄で水を加えられた穀粒は、第一のパッサージグラインダー（例えばハンマーミル、ローラーミル、ピンミル、衝撃ミル、ディスクミル、空気摩擦ミル、ギャップミルなど）に送られる。
すり潰された後、穀粒は排出されふるい分け装置に送られる。すり潰された粒子をふるい分けるために当業界で公知の任意のふるい分け装置を用いることができる。ふるい分け装置の仕切り板を通過した材料は本発明の全粒粉であり、更なる処理を必要としない。仕切り板上に残留する材料は第二分画と称される。第二分画は追加の粒子低減を必要とする。したがって前記第二分画は第二のパッサージグラインダーに送ることができる。
すり潰した後、第二分画を第二のふるい分け装置に送ることができる。第二のふるい分け装置の仕切り板を通過した材料は全粒粉である。仕切り板に残留する材料は第四分画と称され、粒子サイズの低減のために更なる処理を必要とする。第二のふるい分け装置の仕切り板上の第四分画は、更なる処理のためにフィードバックループを介して第一のパッサージグラインダー又は第二のパッサージグラインダーのどちらかに戻される。
本発明の全粒粉、粗分画、精製デンプン及び/又は穀粒製品を、当業界で公知の多数の製粉プロセスによって製造し得ることは意図されている。
【００６９】
XI．植物育種
別の実施態様では、本開示は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ植物体及び植物体部分を用いる植物育種の方法に向けられる。
そのような実施態様の1つは、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種を別のコムギの品種と交配して、F1植物の第一世代集団を形成する方法である。この方法によって作製される第一世代F1植物の集団はまた本発明の実施態様である。F1植物のこの第一世代集団は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種の本質的に完全な対立遺伝子セットを含む。当業者は育種家のための成書又は分子的方法を利用して、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種を用いて作製された個別のF1植物体を特定することができ、そのような個々の植物体のいずれも本発明に包含される。これらの実施態様はまた、第一世代のF1植物を作製するために、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種のトランスジェニック変換又は戻し交配変換の使用を含む。
別の実施態様では、本発明は子孫コムギ植物体を育成する方法に関する。子孫コムギ植物体を育成する方法は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種を第二のコムギ植物体と交配する工程及び育種方法を実施する工程を含む。Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種から誘導される系統を作製する具体的な方法は以下の通りである。
【００７０】
当業者は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種を別のコムギの品種（例えばエリート品種）と交配するであろう。この交配から得られるF1種子を生長させて同種集団が形成されるであろう。F1種子は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種に由来する対立遺伝子の1セット、及び他方のコムギ品種に由来する対立遺伝子の1セットを含むであろう。
F1ゲノムは、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種の50%及び他方のエリート品種の50%で構成されるであろう。F1種子を生長させてF2種子が形成されるであろう。F1種子を自家受粉させるか、又は別のコムギ栽培品種と交配させることができよう。
平均して、F2種子は、その対立遺伝子の50%をLpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種に、50%を他方のコムギ品種に由来するであろう。しかしながら、集団の多様な個々の植物体は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種に由来する対立遺伝子をより高いパーセンテージで有するであろう（Wang J. and R. Bernardo, 2000, Crop Sci. 40:659-665；及びBernardo, R. and A. L. Kahler, 2001, Theor. Appl. Genet. 102:986-992）。
F2種子を生長させ、目視観察及び/又は形質の測定及び/又はマーカー補助選別に基づいて植物の選別が実施されるであろう。Lpx1遺伝子誘導形質で1つ以上の非トランスジェニック変異を有する所望のコムギ品種の1つ以上を提示するLpx1遺伝子誘導子孫で1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種が選別され、各植物体は別々に採集されるであろう。各植物体のこのF3種子を個々の畝で生長させて自家受粉させる。続いて選別した畝又は畝の植物体を収穫し個々に脱穀する。繰り返せば、選別は、目視観察及び/又は植物体の所望の形質の測定に基づくであろう（例えばLpx1遺伝子誘導形質に1つ以上の非トランスジェニック変異を有する所望のコムギ品種の1つ以上）。
【００７１】
生長及び選別のプロセスは、Lpx1遺伝子誘導コムギ植物体に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するホモ接合性のコムギ品種が得られるまで任意の回数繰り返されるであろう。Lpx1遺伝子誘導コムギ植物体に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するホモ接合性コムギ品種は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種から誘導された所望の形質を含むであろう。前記のいくつかは、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種と交配された他方の最初のコムギ品種によって発現されてなかった可能性があり、さらに前記のいくつかは、両方のコムギ品種によって発現されていたが、今は当該1つのLpx1遺伝子又は複数のLpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種の発現レベルと同等又はそれよりも高いレベルであるだろう。
交配、自家受粉及び選別の育種プロセスを繰り返して、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種に由来するコムギの別の集団を作製することができる。前記は、Lpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギの品種に由来する遺伝子の平均25%を有するが、当該集団の多様な個々の植物体は、1つのLpx1遺伝子又は複数のLpx1遺伝子に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するコムギ品種に由来するそれらの対立遺伝子をはるかに高いパーセンテージで有するであろう。本発明の別の実施態様は、Lpx遺伝子誘導形質で1つ以上の非トランスジェニック変異を有する別のコムギと交配された、Lpx1遺伝子誘導コムギ植物体に1つ以上の非トランスジェニック変異を有するホモ接合性コムギ品種である。この育種プロセスは所望するかぎり何回でも繰り返すことができる。
【００７２】
以下の項目は、本明細書に開示する植物体、組成物及び方法をさらに記述する。
1．Lpx1遺伝子に変異を含むコムギ植物体であって、前記変異が、野生型コムギ植物体に由来する製品と比較して、前記コムギ植物体由来の製品が保存寿命の延長を有する一助となる、前記コムギ植物体。
2．Lpx1遺伝子に変異を含むコムギ植物体であって、前記変異が、野生型コムギ植物体の穀粒から製造された製品と比較して、前記植物体の穀粒から製造された製品におけるヘキサナール生成減退の一助となる、前記コムギ植物体。
3．さらに、少なくとも2つのゲノムに変異を含む、項目1又は2に記載のコムギ植物体。
4．さらに、野生型コムギ植物体と対比してLpx1タンパク質レベルの減退を含む、項目1又は2に記載のコムギ植物体。
5．さらに、野生型コムギ植物体と対比してLpx1酵素活性の減退を含む、項目1又は2に記載のコムギ植物体。
6．前記コムギ植物体由来の製品が、野生型コムギ植物体由来の製品と比較して酸化安定性の増強を有する、項目1又は2に記載のコムギ植物体。
7．DゲノムのLpx1遺伝子に変異を含むコムギ植物体であって、前記変異が、野生型コムギ植物体に由来する製品と比較して、前記コムギ植物体由来の製品が保存寿命の延長を有する一助となる、前記コムギ植物体。
8．DゲノムのLpx1遺伝子に変異を含むコムギ植物体であって、前記変異が、野生型コムギ植物体の穀粒から製造された製品と比較して、前記植物体の穀粒に由来する製品におけるヘキサナール生成減退の一助となる、前記コムギ植物体。
9．当該Lpx1遺伝子がLpx-D1である、項目7又は8に記載のコムギ植物体。
10．さらにBゲノムのLpx1遺伝子に変異を含む、項目7又は8に記載のコムギ植物体。
11．さらに、野生型コムギ植物体と対比してLpx1タンパク質レベルの減退を含む、項目7又は8に記載のコムギ植物体。
12．さらに、野生型コムギ植物体と対比してLpx1酵素活性の減退を含む、項目7又は8に記載のコムギ植物体。
13．前記コムギ植物体由来の製品が、野生型コムギ植物体由来の製品と比較して酸化安定性の増強を有する、項目7又は8に記載のコムギ植物体。
14．BゲノムのLpx1遺伝子に変異を含むコムギ植物体であって、前記変異が、野生型コムギ植物体に由来する製品と比較して、前記コムギ植物体に由来する製品が保存寿命の延長を有する一助となる、前記コムギ植物体。
15．BゲノムのLpx1遺伝子に変異を含むコムギ植物体であって、前記変異が、野生型コムギ植物体の穀粒に由来する製品と比較して、前記植物体の穀粒に由来する製品のヘキサナール生成減退の一助となる、前記コムギ植物体。
16．当該Lpx1遺伝子がLpx-B1.2である、項目14又は15に記載のコムギ植物体。
17．さらにDゲノムのLpx1遺伝子に変異を含む、項目14又は15に記載のコムギ植物体。
18．さらに、野生型コムギ植物体と対比してLpx1タンパク質レベルの減退を含む、項目14又は15に記載のコムギ植物体。
19．さらに、野生型コムギ植物体と対比してLpx1酵素活性の減退を含む、項目14又は15に記載のコムギ植物体。
20．前記コムギ植物体由来の製品が、野生型コムギ植物体由来の製品と比較して酸化安定性の増強を有する、項目14又は15に記載のコムギ植物体。
21．当該コムギ植物体が当該変異についてホモ接合性である、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体。
22．当該植物体がトリチクム・アエスチブム・アエスチブム亜種である、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体。
23．当該Lpx遺伝子の変異が少なくとも2つの異なるゲノムに存在する、2つ以上の変異を含むコムギ植物体。
24．脂肪酸分解生成物の全粒粉における生成が、野生型穀粒から製造される全粒粉と比較して低下する、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体の穀粒に由来する全粒粉。
25．脂肪酸の分解生成物の全粒粉における生成が、野生型穀粒から製造される全粒粉と比較して少なくとも5%、又は少なくとも10%、又は少なくとも15%、又は少なくとも20%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも75%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%低下する、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体の穀粒に由来する全粒粉。
26．ヘキサナール、trans-2-ノネナール若しくはトリヒドロキシデカン酸又は前記の組み合わせの全粒粉における生成が、野生型穀粒から製造される全粒粉と比較して少なくとも5%、又は少なくとも10%、又は少なくとも15%、又は少なくとも20%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも35%、又は少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも75%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%低下する、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体に由来する全粒粉。
27．全粒粉の保存寿命が、野生型穀粒から製造される全粒粉の保存寿命と比較して1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、12カ月、13カ月、14カ月、15カ月、16カ月、17カ月、18カ月、19カ月、20カ月、21カ月、22カ月、23カ月、24カ月、25カ月、26カ月、27カ月、28カ月、29カ月、30カ月又は30カ月を超えて延長される、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体の穀粒に由来する全粒粉。
28．Lpx1遺伝子に変異を含む穀粒の全粒粉であって、前記変異が、野生型コムギ植物体に由来する全粒粉と比較して全粒粉のヘキサナール生成減退の一助となる、前記全粒粉。
29．Lpx1遺伝子に変異を含む穀粒の全粒粉であって、前記変異が、野生型コムギ植物体に由来する全粒粉と比較して全粒粉の保存寿命の延長の一助となる、前記全粒粉。
30．Lpx1遺伝子に変異を含む穀粒の全粒粉であって、前記変異が、野生型コムギ植物体に由来する全粒粉と比較してより高温で保存される全粒粉の保存寿命の延長の一助となる、前記全粒粉。
31．コムギの穀粒から製造される全粒粉の保存寿命が、最終製品の色、風味、手触り、香り、できばえ又は全体的な好ましさを含む感覚的特徴によって決定されるときに改善される、先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体に由来する全粒粉。
32．当該変異が表1−10のいずれか1つに列挙される、先行する請求項のいずれかに記載のコムギの植物体。
33．先行する項目のいずれかに記載のコムギの植物体に由来するコムギ穀粒。
34．先行する項目のいずれかに記載のコムギの穀粒を含む粉。
35．先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体の成分を含む食品。
36．先行する項目のいずれかに記載のコムギ植物体に由来するコムギの種子、植物体部分又はその子孫。
37．本明細書に実質的に提示及び記載されたコムギ植物体。
38．本明細書に実質的提示及び記載された穀粒。
39．本明細書に実質的に提示及び記載されたコムギの種子、植物体部分又はその子孫。
40．B及びDゲノムの一方又は両方のLpx1遺伝子に1つ以上の変異を含むコムギ植物体であって、前記コムギ植物体の製粉穀粒が、野生型コムギ植物体の製粉穀粒と比較して、（a）保存寿命の延長；（b）酸化安定性の増強；（c）Lpx1タンパク質の生成低下；（d）Lpx1タンパク質の活性低下；（e）ヘキサナール生成の低下；（f）ピネリン酸生成の低下；（g）脂肪酸分解生成物の低下；又は（h）感覚的特徴の改善から成る群から選択される特性を有する、前記コムギ植物体。
41．B及びDゲノムの一方又は両方のLpx1遺伝子に1つ以上の変異を含むコムギ植物体であって、前記コムギ植物体の穀粒から製造される製品が、野生型コムギ植物体の穀粒から製造される製品と比較して、（a）保存寿命の延長；（b）酸化安定性の増強；（c）Lpx1タンパク質の生成低下；（d）Lpx1タンパク質の活性低下；（e）ヘキサナール生成の低下；（f）ピネリン酸生成の低下；（g）脂肪酸分解生成物の低下；又は（h）感覚的特徴の改善から成る群から選択される特性を有する、前記コムギ植物体。
42．表2に挙げた少なくとも1つの変異を有する配列番号:3のポリペプチドをコードするコード配列を含む、核酸。
43．表2の少なくとも1つの変異を有する配列番号:1又は2のコード配列を含む、核酸。
44．表1に挙げた少なくとも1つの変異を有する配列番号:6のポリペプチドをコードするコード配列を含む、核酸。
45．表1の少なくとも1つの変異を有する配列番号:4又は5のコード配列を含む、核酸。
【実施例１】
【００７３】
本実施例はLxp1の新規な対立遺伝子の同定を述べる。
変異原
本発明のある例示的実施態様にしたがい、六倍体栽培品種（トリチクム・アエスチブム）エクスプレスの種子をH2Oに真空浸潤した（約1,000種子/100mL H2Oで約4分間）。続いて種子を室温のドラフトチャンバー中のシェーカー（45rpm）に置いた。変異原メタンスルホン酸エチル（EMS）を前記水分吸収種子に最終濃度約0.75%から約1.2%（v/v）の範囲の濃度で添加した。18時間インキュベートした後、EMS溶液を新鮮なH2Oに4回置換えた。続いて種子を流水下で4−8時間洗浄した。最後に、変異誘導種子を鉢植え用土に植え付け（96/トレー）、室内で発芽させた。4から6週齢の植物を野外に移して完全成熟M1植物に生長させた。成熟M1植物を自家受粉させ、続いてM1植物の種子を収集し、M2植物を作出するために植え付けた。
A．DNA調製
どのM2植物がそれらのLpx1遺伝子座の1つ以上に変異を保持するかを特定するために、上記のように作出したM2植物からDNAを抽出及び調製した。M2植物のDNAは以下のQiagenキットによる方法及び試薬を用いて調製した（Qiagen(商標)（Valencia, CA）、DNeasy(商標)96Plant Kit）。ステンレス鋼ビーズを含む各サンプルチューブに約50mgの凍結植物サンプルを入れ、液体窒素中で凍結させ、Retsch(商標)ミキサーミルMM300を用い21.5Hzで2回（各回45秒）すり潰した。次に80℃の300μLの溶液AP1（緩衝液AP1、溶液DX及びRNAse（100mg/mL））を各サンプルに添加した。チューブを密閉し15秒間振盪し、つづいて簡単に5,200ｘgで遠心分離した。100μLの緩衝液P3の添加後、チューブを15秒間振盪した。サンプルを-20℃のフリーザーに少なくとも20分置いた。続いてサンプルを5,200ｘgで20分遠心分離した。フィルタープレートをテカンエボ（Tecan Evo）液体操作ロボットの真空ユニット上に置き、400μLの緩衝液AW1を各ウェルに添加した。上清の300μLアリコットを欠くウェルに添加した後、乾燥するまで真空を適用した。次に、650μLの緩衝液AW2をフィルタープレートの各ウェルに添加した。フィルタープレートを四角いウェルブロック上に置き5,200ｘg、20分遠心分離した。続いてフィルタープレートを新しいサンプルチューブセット上に置き、90μLの緩衝液AEを当該フィルターに適用した。室温で1分インキュベートし、続いて5,200ｘgで2分回転させた。90μLの緩衝液AEを追加して、前記工程を繰り返した。フィルタープレートを取り除き、プールされたろ液を含むチューブに蓋をした。続いて個々のサンプルのDNA濃度をタイリング（TILING）（のために5から10ng/μLに標準化するか、又は遺伝子型判定に用いるために標準化せずに維持した。
【００７４】
タイリング（Tilling）
M2コムギのDNAを2つの植物体個体の複数グループにプールした。当該プールの各個体のDNA濃度は約2ng/μLでプール全体の最終濃度は4ng/μLであった。続いてこのプールDNAサンプルの5μL（又は20ngのコムギDNA）をマイクロプレート上に並べ、遺伝子特異的PCRに付した。
以下を含む15μL体積でPCR増幅を実施した：20ngのプールDNA、0.75ｘ ExTaq緩衝液（Clonetech, Mountain View, CA）、1.1mMの追加MgCl2、0.3mM dNTP、0.3μMプライマー、0.009U Ex-Taq DNAポリメラーゼ（Clonetech, Mountain View, CA）、0.02単位DyNAzyme II DNAポリメラーゼ（Thermo Scientific）及び必要ならば0.33MポリマーエイドPCR強化剤（Sigma-Aldrich(商標)）。PCR増幅はMJ Research(商標)サーマルサイクラーを以下のように用いて実施した：95℃2分；8サイクルの“タッチダウンPCR”（94℃20秒、その後70−68℃30秒で開始しサイクル毎に1℃低下させるアニーリング工程、続いて1秒に付き0.5℃の温度上昇で72℃に、続いて72℃で1分間）； 94℃20秒、63又は65℃30秒、0.5℃/秒で72℃まで温度上昇、72℃1−2分間の25−45サイクル；72℃8分；98℃8分；80℃20秒；80℃7秒からサイクル毎に0.3℃低下を60サイクル。
【００７５】
PCR生成物（2−4μL）を96ウェルプレートで消化した。以下を含む3μLの溶液を前記PCR生成物に低下した：6mM HEPES [4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸]（pH7.0）、6mM MgCl2、6mM NaCl、0.012ｘ Triton(商標)X-100、0.03mg/mLウシ血清アルブミン、0.5ｘ T-ダイジェスト緩衝液（Advanced Analytical Technologies, Inc (AATI), Ames, IA）、各々0.912UのSurveyor(商標)エンドヌクレアーゼと強化剤（Transgenomic(商標), Inc）、及び0.5ｘ dsDNA切断酵素（AATI, Ames, IA）。消化反応物を45℃で45分間インキュベートした。Surveyor酵素の比活性は800U/μLであった（1Uは、37℃で1分間にpH8.5でせん断熱変性仔ウシ胸腺DNAから1ngの酸可溶性物質を生成するために必要な酵素量と製造業者によって定義された）。反応は、20μLの希釈緩衝液（AATI, Ames, IA）又は1ｘ TEの添加によって停止させた。反応物は、フラグメントアナライザーキャピラリー電気泳動系（Fragment AnalyzerTM（AATI, Ames, IA）Capillary Electrophoresis System）で泳動するまでフリーザーで保存した。サンプルは、変異検出キット（DNF-920-K1000T変異ディスカバリーキット（AATI, Ames, IA））を製造業者のプロトコルにしたがって用いフラグメントアナライザーで泳動した。
電気泳動後、PROSize(商標)2.0ソフト（AATI, Ames, IA）を用いてアッセイを分析した。ゲル画像は、96ウェル全てに共通のバックグラウンドバンドをもつ配列特異的パターンを示した。稀な事象(例えば変異)は、バックグラウンドパターンから突出する新規なバンドを生じる。問題の変異の指標となるバンドを有する植物は、野生型DNA混合プールの個々のメンバーをタイリングし、続いて配列決定することによって判定した。
【実施例２】
【００７６】
遺伝子型判定及びLpx1系統の育種
配列決定により確認した変異を保持する植物を上記のように生長させるか（例えば、バックグラウンド変異を除去するためにM2植物を戻し交配又は異系交配し、さらに変異についてホモ接合性の植物を作出するために自家受粉させることができよう）、又は異なる同祖体にLpx1変異を含む別の植物体と交配した。各世代で、新規な対立遺伝子はDNA抽出による植物材料で検証され、さらに遺伝子型が配列決定により又は対立遺伝子特異的KASP（競合的対立遺伝子特異的PCR）分子マーカー（LGC Genomics, Beverly, MA）（前記は問題の対立遺伝子について特別に開発された）の使用により判定された。
KASP遺伝型判定は、実施例1に記載したように若葉から抽出したDNAで実施された。各反応は総反応体積0.14μL中に以下から成っていた：0.14μLのKASPアッセイミックス（KASP High-Roxユニバーサル2ｘマスターミックス、LGC Genomics）、0.14μLのKASPアッセイミックス及び40−60ng DNA。続いて、反応混合物を96ウェル様式で以下の温度サイクル条件を用いてPCR増幅した：94℃で15分、続いて92℃で20秒の後61℃で60秒置き55℃に達するまでサイクル毎に0.6℃ずつ下降させる工程を10サイクル、続いて94℃で20秒の後55℃で60秒の工程を35−40サイクル、最後に8℃を測定まで維持。その後の反応物は、公知の遺伝子型（Applied Biosystems, Inc, Foster City, Ca, USA）をコントロールに用い、室温で7900 HTファストリアルタイムPCR系で判定した。
【実施例３】
【００７７】
リポキシゲナーゼ活性
成熟全粒のリポキシゲナーゼ活性を、（a）共役ジエン形成又は（b）比色アッセイの2つの方法のどちらかによって測定した。
A．方法1：共役ジエン形成によるリポキシゲナーゼ酵素活性
共役ジエン分析のためには、文献（Surrey, Plant Physiology 39: 65-70, 1964）に記載されたように、全粒小麦粉の総リポキシゲナーゼ活性を分光分析により測定した。このアッセイは、25℃における共役ジエンを含むリノール酸ヒドロペルオキシドの形成を測定する（ナノドロップ2000c分光分析器（NanoDrop 2000c Spectrophotometer；Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を234nmで用いる）。ミキサーミル300（Retsch GmbH, Haan, Germany）を20秒間、振動数22 1/sで用い、成熟種子から全粒粉を製粉した。200mgの全粒粉を1.5mLのリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH6.6）に懸濁した。この懸濁物を氷水浴で1時間インキュベートし、15分間隔で1分間ボルテックスし、4℃で2回（合計20分）、16,100ｘgで遠心分離した。遠心分離後、上清を粗酵素溶液として収集し、氷水浴に保存し、12時間以内に使用した。タンパク質濃度はブラッドフォード法（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）にしたがって決定した（製造業者の指示にしたがいウシ血清アルブミンを標準物質として用いた）。リノール酸基質溶液は以下から成っていた：50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.6）、2mMリノール酸（＞99%）（Sigma Chemical, St Louis, MO, USA）、及び0.2% Tween20（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）。前記を5−7個の脱酸素剤パケット（Oxyrase, Mansfield, OH, USA）を含む気密容器で保存し、基質の自己酸化を最小限にした。リノール酸ヒドロペルオキシド化反応は、0.1mgの粗酵素溶液を2mLのリノール酸基質溶液に25℃で添加することによって開始させた。反応を少なくとも0から3分間モニターした。結果をANOVAによる統計分析に付し、続いてInStatソフト（GraphPad, La Jolla, CA, USA）を用いてｔ検定を実施した。リポキシゲナーゼ活性1単位は、1分当たりタンパク質1mgにつき234nmで0.001の吸収増加と定義した。陰性コントロールサンプルを100℃で20分加熱処理して粗酵素を不活化することによって調製した。
【００７８】
B．方法2：比色アッセイによるリポキシゲナーゼ活性
全粒小麦粉中の総リポキシゲナーゼ活性はまた改変比色アッセイを用いて測定された。前記では、文献に記載されたように（Anton and Barret, Journal of Agriculture Food Chemistry 49: 32-37, 2001）、3-(ジ-メチルアミノ)安息香酸（DMAB）及び3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン（MBTH）の共役反応が用いられた。このアッセイは、ヘモグロビンの存在下でのMBTH及びDMABによるリノール酸ヒドロペルオキシドの生成物形成を測定する。ミキサーミル300（Retsch GmbH, Haan, Germany）を20秒間、振動数22 1/sで用い、成熟種子から全粒粉を製粉した。200mgの全粒粉を1.5mLのリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH6.6）に懸濁した。この懸濁物を氷水浴で1時間インキュベートし、15分間隔で1分間ボルテックスし、4℃で2回（合計20分）、16,100ｘgで遠心分離した。遠心分離後、上清を粗酵素溶液として収集し、氷水浴に保存し、12時間以内に使用した。タンパク質濃度はブラッドフォード法（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）にしたがって決定した（製造業者の指示にしたがいウシ血清アルブミンを標準物質として用いた）。DMAB-リノール酸基質溶液は以下から成っていた：20mMのDMAB、25mMのリノール酸（＞99%）を含む100μMリン酸ナトリウム（pH6.6）、及び0.1% Tween20。MBTH-ヘモグロビン溶液は以下から成っていた：
10mMのMBTH及び0.1mg/mLウシヘモグロビン（Sigma Chemical, St Louis, MO, USA）。
リノール酸ヒドロペルオキシド化/DMAB-MBTHカプリング反応は、0.5mLのDMAB-リノール酸基質溶液を0.1mgの粗酵素溶液に添加することによって開始し、25℃20分間インキュベートした。20分後、0.5mLのMBTH-ヘモグロビン溶液を添加し、さらに10分間インキュベートした。反応は0.5mLのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（1%（w/v））を添加して停止させた。595nmの吸収値における発色を、ナノドロップ2000c分光分析器（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて測定した。InStatソフト（GraphPad, La Jolla, CA, USA）を用いて結果を統計分析に付した。リポキシゲナーゼ活性1単位は、タンパク質1mgにつき595nmにおける吸収値の100倍と定義した。陰性コントロールサンプルは100℃で20分加熱処理して粗酵素を不活化することによって調製した。
D若しくはBゲノム又は両ゲノムのLpx1-D1又はLpxB1.2に変異を有するホモ接合性コムギ植物体の穀粒をリポキシゲナーゼ活性について分析した。加えて、B又はDゲノムのLpx1に重大な変異（表1及び表2）を有すると特定した選別植物体を、他のゲノムのLpx1に重大な変異を含む他の植物体と交配した。これらの交配から生じた、新規な変異対立遺伝子を両ゲノムに有するホモ接合性植物体の穀粒もまたリポキシゲナーゼ活性について分析した。これらの交配から生じ、Lpx1変異について野生型対立遺伝子を有する兄弟植物体をそれらが利用可能であるときにはコントロールとして用いた。リポキシゲナーゼ活性について分析した変異対立遺伝子には、ミスセンス変異（SIFT及びPSSMスコアによってタンパク質機能に有害な影響を有すると予測された）とともに終止コドンの導入を生じる変異（末端短縮変異）又はスプライス接合部における変異が含まれた。表5はリポキシゲナーゼ活性について分析した変異系統の例を示す。
【００７９】
表5：Lpx-D1及び/又はLpx-B1.2に変異を有する代表的栽培品種
【００８０】
2018518184.tif 000013
【００８１】
Lpx-D1と称されるDゲノムのLpx1の変異のゲノム核酸における指定は、参照配列の配列番号:1の位置に対応する。Lpx-D1と称されるDゲノムのLpx1ポリペプチドのアミノ酸指定は、参照配列の配列番号:3のアミノ酸の位置に対応する。Lpx-B1.2と称されるBゲノムの2つLpx1遺伝子の1つの変異のゲノム核酸における指定は、参照配列の配列番号:4の位置に対応する。Lpx-B1.2と称されるBゲノムの2つのLpx1遺伝子の1つの変異におけるアミノ酸指定は、参照配列の配列番号:6のアミノ酸の位置に対応する。“Wt”は親の野生型対立遺伝子についてホモ接合性である材料を指し、“ホモ接合性”は、表示の変異体対立遺伝子についてホモ接合性である材料を指す。
表6：コムギ品種エクスプレスのLpx1の新規対立遺伝子のリポキシゲナーゼ活性
【００８２】
2018518184.tif 000014
【００８３】
表6は、Lpx-D1遺伝子、Lpx-B1.2遺伝子又は前記2つの組み合わせに新規な対立遺伝子を有する多様な系統のリポキシゲナーゼ活性の範囲を示す。
表7：コムギの多様な品種のリポキシゲナーゼ活性。活性は比色アッセイを用いて単位/mgタンパク質（+/-標準誤差）として表される。
【００８４】
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【００８５】
表7は、Lpx-D1遺伝子、Lpx-B1.2遺伝子又は前記2つの組み合わせにおける新規な対立遺伝子の多様な組み合わせで達成されたリポキシゲナーゼ活性の範囲を示す。表7はさらに、パンコムギの複数の品種のLpx-Bゲノムで利用可能な種々の対立遺伝子の組合せ範囲にもかかわらず、試験品種の全てがなお高レベルのリポキシゲナーゼ活性を成熟穀粒で有すること示している。世界中の多くの地域から得られる多数の追加品種の評価でも同じ結果が示されるであろう。
【実施例４】
【００８６】
Lpx1新規対立遺伝子の感覚的特徴における保存寿命の改善
保存寿命は、粉及び当該粉から製造される製品の感覚的特徴によって決定できる。前記には色、風味、手触り、香り、外観、できばえ、又は最終製品の全体的な好ましさが含まれる。ある実施態様では、熟練した検査員を用いて素材間の相違を査定することができる。
例えば、Lpx1小麦粉を多様な期間、多様な温度及び/又は湿度で保存し、検査員によって属性の中でとりわけ香り、色、風味、外観及び手触りの好ましさについて野生型の兄弟小麦粉及び/又は親小麦粉と比較することができる。粉から製品（例えばパン及びパン粉及びパイ皮）を製造し、属性の中でとりわけ香り、風味、外観又は手触りについて比較することもまた可能である。パン又は他の製品を多様な期間、多様な温度及び/又は湿度で保存し、検査員によって属性の中でとりわけ香り、色、風味、外観又は手触りの好ましさについて野生型の兄弟小麦粉及び/又は親小麦粉と比較することもまた可能である。
感覚的特徴の査定のために、他の方法もまた利用することができる。例えば、手触りは手触り分析装置によって測定できる。色は、ミノルタ（Minolta）彩度計試験によって測定できる。香り又は味に寄与する化合物は、液体又はガスクロマトグラフィー及び質量分析によって分析できる。
【実施例５】
【００８７】
Lpx1新規対立遺伝子の保存寿命の改善
リポキシゲナーゼによる脂質の酸化は、ヒドロペルオキシドを生じる（ヒドロペルオキシドはアルデヒド（例えばヘキサナール）を含む複数の化合物を生じる更なる分解の基質である）。サンプル中で生成されるヘキサナールのレベルを酸敗臭の測定値として用いることができる（Fritz and Gale, Hexanal as a measure of rancidity in low fat foods, JAOCS 54:225, 1977）。新規なリポキシゲナーゼ変異対立遺伝子の穀粒に由来する全粒粉の保存寿命を試験するために、全穀粒サンプルを製粉して、20週間まで種々の期間37℃で保存し、下記のようにヘキサナールレベルについて分析した。保存寿命の試験には、さらに長いインキュベーション期間及び別の温度及び湿度範囲を用いることができる。
【００８８】
方法：ヘキサナール分析
ミキサーミル300（Retsch GmbH, Haan, Germany）を20秒間、振動数22 1/sで用い、成熟種子から全粒粉を製粉し、密閉ポリエチレンバッグで保存した。小麦粉の加速エージングは、37℃の温度を用いパーシバルE30BC8（Percival E30BC8）（Percival Scientific Inc, Perry, Iowa, USA）で実施した。10gの小麦粉サンプルを37℃で1−16週間保存した。ヘキサナールレベルは、ガスクロマトグラフィーによる方法を用いてメダリオン研究所（Medallion Labs, Minneapolis, MN, USA）によって分析された。単位は百万分の一（ppm）で報告され検出の下方限界は＜0.3ppmで上方限界は50ppmである。
37℃で20週間までインキュベートした全粒粉の加速エージングの経時変化を、酸敗の指標としてヘキサナール生成について評価した。非変異誘導親品種エクスプレスの粉を、37℃でのインキュベーションから1、6、8、10、16及び20週間後に試験し、新しく製粉した粉サンプルのヘキサナールレベルと比較した。
図1に示すように、ヘキサナールレベルは、新しく製粉したサンプル及び1週間のサンプルで＜0.3ppmの検出限界未満であった。しかしながら、ヘキサナールレベルは、6週間から開始し20週間まで持続しつつ0.6ppmから1ppmまで増加する酸敗臭の進行を示した。シリアルについては、37℃で16週間のインキュベーションは、室温でほぼ1年の保存と同等であると推定される（Sewald and DeVries, Food product shelf life, Medallion Laboratories Analytical Progress, 2012；http://www.medlabs.com/Downloads/food_product_shelf_life_web.pdf）。
Lpx-D1(W494*)対立遺伝子についてホモ接合性のコムギ系統9（表6）並びにLpx-D1(W494*)及びLpx-B1.2(W510*)対立遺伝子の両方についてホモ接合性のコムギ系統22（表6）を、37℃で16週間まで保存した全粒粉でヘキサナール生成について試験した。加えて、これらの対立遺伝子についてホモ接合性野生型であり、同じ時期に生長させた兄弟系統をコントロール（野生型の兄弟）として用いた。同じ遺伝子型の2−6植物体から穀粒を集め、全時間経過に及ぶ分析のために十分な材料を供した。
図2に示すように、ヘキサナールレベルは、37℃のインキュベーションで6、8及び16週間で野生型兄弟において増加した。この結果は親の材料におけるヘキサナール生成と同様であった（図1）。対照的に、Lpx-D1(W494*)変異対立遺伝子についてホモ接合性の系統及びLpx-D1(W494*)＋Lpx-B1.2(W510*)変異対立遺伝子の両方についてホモ接合性の系統に由来する全粒粉サンプルでは、ヘキサナールレベルは＜0.3ppmの検出限界未満を維持した（図2の星印）。本明細書のこの開示は、リポキシゲナーゼ活性の減退を有するLpx-D1の新規な対立遺伝子は単独で及びLpx-B1.2の新規な対立遺伝子と一緒に、脂肪酸の分解生成物（例えばヘキサナール）の蓄積を減退させることによって、全粒粉の保存寿命を改善することを示している。Lpx1のまた別の対立遺伝子もまた保存寿命の改善に用いることができる。
【実施例６】
【００８９】
Lpx-D1プロモータ対立遺伝子を有するコムギ系統のリポキシゲナーゼ活性の変化
表8は、コムギ植物体品種エクスプレスのDゲノムのLpx-D1プロモータで作出及び特定された変異の追加例を提供する。ヌクレオチドの変化は、配列番号:15におけるそれらの位置にしたがって特定される。接合性は、M2植物体で変異がヘテロ接合性（Het）又はホモ接合性（Hom）であるか否かを示す。
表8：DゲノムのLpx-D1プロモータの追加される代表的な変異
【００９０】
2018518184.tif 000016
表9は、DゲノムのLpx-D1プロモータ領域に新規な対立遺伝子を有するコムギ系統で達成されたリポキシゲナーゼ活性の範囲を示す。当該変異のヌクレオチドの変化は配列番号:15の参照配列における位置に対応する。“Wt”は親の野生型対立遺伝子についてホモ接合性である材料を指し、“ホモ接合性”は表示の変異対立遺伝子についてホモ接合性である材料を指す。表9で、系統5のLpx-D1プロモータ対立遺伝子（G1538A）は、親品種及び他のLpx-D1プロモータ対立遺伝子と比較してリポキシゲナーゼ活性の減退を有する。
【００９１】
表9：コムギDゲノムのLpx1-D1プロモータの新規対立遺伝子のリポキシゲナーゼ活性
【００９２】
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【実施例７】
【００９３】
8週間加速エージング試験における複数のLpx-D1新規対立遺伝子よる保存寿命の改善
ヘキサナールは、酸敗臭の測定値として用いられる脂肪酸の分解生成物である。Lpx-D1に異なる対立遺伝子を有する植物体の穀粒を、実施例5に記載したように製粉し37℃で8週間加速エージングさせた後でヘキサナールレベルについて試験した。これらには、以下を含む表5の単一対立遺伝子コムギ系統が含まれる：Lpx-D1(W81*)対立遺伝子についてホモ接合性の系統1、Lpx-D1(P224S)対立遺伝子についてホモ接合性の系統6、Lpx-D1(P469L)対立遺伝子についてホモ接合性の系統8、Lpx-D1(W494*)対立遺伝子についてホモ接合性の系統9、Lpx-D1(スプライス接合部)対立遺伝子についてホモ接合性の系統7、Lpx-D1(R533Q)対立遺伝子についてホモ接合性の系統11、Lpx-D1 (P540S)についてホモ接合性の系統12、Lpx-D1(W635*)対立遺伝子についてホモ接合性の系統15、Lpx-D1(W666*)対立遺伝子についてホモ接合性の系統17、Lpx-D1(C696Y)対立遺伝子についてホモ接合性の系統18、及びLpx-D1(W789*)対立遺伝子についてホモ接合性の系統20。
加えて、親系統エクスプレス（親）並びに野生型対立遺伝子を有するコムギ系統8、9及び15（同じ時期に生長）由来の穀粒を製粉し、コントロール（野生型兄弟）として用いた。ヘキサナールレベルは、実施例5に記載したようにメダリオン研究所で測定された。図3に示したように、親系統及び野生型兄弟系統は全粒粉の8週間加速エージング後に高いヘキサナールレベルを有し、一方、全ての単一ホモ接合Lpx-D1系統はヘキサナールレベルの減退を有した。系統1、8、9、7、11、15、17、18及び20は検出レベル未満（＜0.3ppm）のヘキサナールレベルを有し、一方、系統6及び12はわずかに高いヘキサナールレベル（0.311及び0.351ppm）を有した。
さらに、新規なリポキシゲナーゼ変異体対立遺伝子の穀粒に由来する全粒粉の酸敗減退及び保存寿命延長を試験するために、実施例5に記載したように以下の系統を製粉した：Lpx-D1(W494*)対立遺伝子についてホモ接合性のコムギ系統9（表5）、及びLpx-D1(W494*)とLpx-B1.2(W510*)対立遺伝子の両方についてホモ接合性のコムギ系統22（表5）。加えて、ホモ接合性野生型対立遺伝子を有するコムギ系統9又は22の兄弟系統を製粉しコントロール（野生型兄弟）として用いた。実施例5に記載したように、トリプリケートの全粒粉生物学的反復物を8週間加速エージングに付し、ヘキサナールレベルを分析した。図4に示したように、系統9又は系統22のホモ接合対立遺伝子を有する植物体のエージング穀粒はコントロールよりも有意に低いヘキサナールレベルを有し（P＜0.05）、一方、コントロール系統はいずれもヘキサナール増加レベルを有した。
【実施例８】
【００９４】
室温の24カ月に匹敵するLpx1の新規な対立遺伝子による長期酸敗減退及び保存寿命の改善
新規なリポキシゲナーゼ変異体対立遺伝子の穀粒に由来する全粒粉の酸敗減退及び保存寿命延長をさらに試験するために、実施例5に記載したように、Lpx-D1(W494*)対立遺伝子についてホモ接合性のコムギ系統9（表5）、及びLpx-D1(W494*)とLpx-B1.2(W510*)対立遺伝子の両方についてホモ接合性のコムギ系統22（表5）を製粉した。加えて、ホモ接合性野生型の系統9又は22のどちらかの兄弟系統を同じ時期に生長させて製粉し、コントロール（野生型兄弟）として用いた。全粒粉を12又は30週間37℃で加速エージングに付した（前記はそれぞれ室温の概算10又は24カ月に匹敵する）。実施例5に記載したように、ヘキサナールレベルをメダリオン研究所で測定した。
図5に示したように、ヘキサナールレベルは、12週間エージングされた野生型兄弟で0.736ppmに増加した。対照的に、ヘキサナール値は、12週間エージングされたコムギ系統9及び22で＜0.3ppmの検出限界未満を維持した。さらに甚だしく対照的なことには、30週間エージングされたコムギ系統9のヘキサナール値は、1.08ppmにわずかに増加し、30週間エージングされたコムギ系統22のヘキサナール値は0.691ppmに増加しただけであった。このデータは、リポキシゲナーゼ活性の減退を有するLpx-D1の新規な対立遺伝子は単独で、及びLpx-B1.2の新規な対立遺伝子と一緒に全粒粉の保存寿命を顕著に改善することを示している。
【実施例９】
【００９５】
Lpx1の新規な対立遺伝子をもつ穀粒から製造された製粉全粒粉及びドウにおける苦み化合物の生成の減退
全小麦粉中の遊離リノール酸の酸化分解は、パン粉の苦味の主要な要因である（Bin and Peterson, Identification of bitter compounds in whole wheat bread crumb, Food Chemistry, 203:8-15, 2016）。苦み化合物、9,12,13-トリヒドロキシ-trans-10-オクタデセン酸（ピネリン酸）は、リポキシゲナーゼ酵素による過酸化反応時に生じる基質のエポキシ化の生成物であると考えられる（Gardner, Decomposition of linoleic acid hydroperoxides, JOAF 23:129-136, 1975）。新規な変異体対立遺伝子の穀粒から製造された粉及びドウの苦味の改善を測定するために、全穀粒サンプルを製粉し、37℃で6カ月間保存した（室温の19カ月に匹敵）。新鮮な全粒粉サンプルは分析直前に製粉した。粉及びドウの9,12,13-トリヒドロキシ-trans-10-オクタデセン酸（ピネリン酸）の定量は、超高速液体クロマトグラフィー連続質量分析（UPLC/MS/MS）を用いて風味研究教育センター（Flavor Research and Education Center；University of Minnesota）で実施された。
15mLの反応体積で、ブチル4-ヒドロキシベンゾエート（100mg/mL）を加えたエタノール-クロロホルムミックス（75:25 v/v）を用いて3gの粉を抽出した。デュープリケートの反応物を120rpmに設定したオービタル振盪テーブルで3時間インキュベートし、続いて10℃にて15分間8000rpmで遠心分離した。遠心分離後、上清を有機相から注意深く分離し、250mLの平底フラスコにプールして回転蒸発により濃縮した。残留物を4mLのメタノール（10%）で再溶解し、予め条件付けした500mgのC18カートリッジ（Supelco, Bellefonte, PA, USA）を用いて固相抽出に付した。続いて、各サンプルを2mLのメタノールで溶出させ、更なるクリーンアップのために0.20μmのナイロン注射筒フィルター（Millex, Billerica, CA, USA）でろ過した。
ドウは、12gの粉を7.2gのナノピュア水と混合して作製し、続いて20分静置してピネリン酸の適切な生成を担保した。続いてドウを重さで3つに分け、各部分を20mLのエタノール（75% v/v）（4-ヒドロキシベンゾエート（100ng/mL）内部標準を添加）に懸濁した。続いて、サンプルを120rpmに設定したオービタル振盪テーブル上で3時間インキュベートし、続いて10℃にて15分間8000rpmで遠心分離した。2mLの上清を予め条件付けした500mgのC18カートリッジ（Supelco, Bellefonte, PA, USA）を用いて固相抽出に付した。続いて、各サンプルを2mLのメタノールで溶出し、プールした混合物をさらに2mLのナノピュア水で希釈して質量分析時のサンプルのブレークスルーを防止した。
粉及びドウサンプルの注入物（2μL）は、25℃で保持した2.1mmｘ50mmのACQUITY UPLC BEH C18 1.7μmカラム（Waters, Milford, MA, USA）で分離された。MS条件は以下の通りであった：ESI陰性；脱溶媒和温度、500℃；ソース温度、120℃；キャピラリー電圧、2.7kV；脱溶媒和ガス700 L/hr；コーンガス、65L/hr。UPLC移動相は、二元溶媒系（水相として超音波処理ナノピュア水中の0.1%ギ酸（A）及び有機相のためにアセトニトリル中の0.1%ギ酸（B））を用い流速300μL/分で維持した。溶出勾配は、5%のB（0−1分）で開始し、直線的に50% Bまで増加（1−6分）、続いて100% Bに増加（6−8分）、100% Bで維持し（8−10分）、さらに5% Bで再平衡に付した。MS/MSイオン遷移及び衝突エネルギーは以下の通りであった：9,12,13-トリヒドロキシ-trans-10-オクタデセン酸、ESI-329-->211（15eV）；ブチル4ヒドロキシベンゾエート、ESI-193-->136（15ev）。
【００９６】
Lpx-D1(W494*)対立遺伝子についてホモ接合性のコムギ系統9（表5）及び系統9でLpx-D1対立遺伝子について野生型の兄弟系統から製粉した全粒粉を37℃で6カ月間エージングさせた。これらの系統から新しく製粉した材料もまた分析した。加えて、Lpx-D1(W494*)とLpx-B1.2(W510*)対立遺伝子についてホモ接合性のコムギ系統22（表5）、及びこれら対立遺伝子について野生型の兄弟系統から新しく製粉した材料もまた分析した。
図6に示したように、コムギ系統9及び22並びにそれらの野生型兄弟系統から製造された新鮮な全粒粉はおよそ5mg/kg粉のピネリン酸濃度を有した。6カ月間エージングさせた全粒粉では、ピネリン酸レベルは20mg/kg粉まで増加した。しかしながら、系統9は、同じ期間エージングさせた野生型兄弟と比較してピネリン酸形成が15%低下した。このデータは、Lpx-D1の新規な対立遺伝子はエージング全粒粉で苦み化合物の生成を有意に減退させることを示している。
Lpx1の新規な対立遺伝子の全粒製造ドウにおける苦み化合物生成の影響は図7に示されている。コムギ系統9の新鮮製粉全粒粉から製造されたドウは、野生型系統9の兄弟（3倍を超えるピネリン酸量（200mg/kgドウ）を有する）と比較して60mg/kgドウの低いピネリン酸濃度を有した。同様に、コムギ系統22の新鮮製粉全粒粉から製造されたドウは32mg/kgドウの低いピネリン酸濃度を有し、一方、野生型系統22の兄弟は10倍を超えるピネリン酸量（340mg/kgドウ）を有した。このデータは、Lpx-D1に新規な対立遺伝子を有しさらにLpx-B1.2に新規な対立遺伝子を一緒に有するコムギの全粒粉から製造されたドウは、全粒製品で見いだされる主要な苦み化合物の濃度を有意に減退させることを示している。
図7に示したように、6カ月間エージングさせたコムギ系統9の全粒粉から製造されたドウは、野生型兄弟系統（6倍を超える濃度（910mg/kgドウ）を有する）と比較して有意に減退したピネリン酸濃度（160mg/kgドウ）を有し、新規なLpx1対立遺伝子を含む粉の保存寿命の改善を示した。このデータは、Lpx-D1の新規な対立遺伝子を有するコムギのエージング全粒粉から製造されたドウは、全粒製品で見いだされる主要な苦み化合物の濃度を有意に減退させることを示している。
上記の例は本発明を例証するために提供され、その範囲を制限するものではない。本発明の他の変型も当業者には極めて明白であり、それらは添付の特許請求の範囲及び全てのそれらの等価物に包含される。上記の例は1つ以上のLpx遺伝子で変異を作出及び特定するためにTILING技術を用いたが、他の方法、例えば照準変異誘導（部位指定変異誘導、部位特異的変異誘導、オリゴヌクレオチド指定変異誘導又はゲノム編集としてもまた知られている）を用いて、コムギの1つ以上のLpx1遺伝子座で本明細書開示する有用な変異を作出し得ることは当業者には理解されよう（例えば以下を参照されたい：Zhang et al., PNAS 107(26):12028-12033, 2010；Saika et al., Plant Physiology 156:1269-1277, 2011）。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は参照によりその全体が本明細書に含まれる
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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