(57)【要約】  本発明は、２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するように５’末端を介して連結されている２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物を用いて、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を調節するのに有用な化合物、組成物、および方法に向けられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するように５’末端を介して連結されている２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチド化合物であって、各オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号９５または配列番号９６の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０ヌクレオチドを含む、前記化合物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが同じ配列を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、それぞれ独立して、１５〜２５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
各オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、独立して、その全長にわたり、配列番号９５の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
各オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、独立して、その全長にわたり、配列番号９６の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
各オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
各オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
各オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含み、配列番号９５を有するその標的部位と少なくとも８０％相補的である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
各オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含み、配列番号９６を有するその標的部位と少なくとも８０％相補的である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１１】
２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するように５’末端を介して連結されている２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチド化合物であって、前記オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４から選択される配列を含む、前記化合物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが同じ配列を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するように５’末端を介して連結されている２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチド化合物であって、前記オリゴヌクレオチドが、独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１から選択される配列を含む、前記化合物。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが同じ配列を含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１７】
１つもしくは複数のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害性物質、化学療法剤、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
１つもしくは複数のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害性物質、化学療法剤、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
１つもしくは複数のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害性物質、化学療法剤、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の少なくとも１つの化合物と細胞を接触させるステップを含む、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害するための方法。
【請求項２１】
細胞を、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の化合物と接触させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１に記載の少なくとも１つの化合物と細胞を接触させるステップを含む、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害するための方法。
【請求項２３】
細胞を、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の化合物と接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の少なくとも１つの化合物と細胞を接触させるステップを含む、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害するための方法。
【請求項２５】
細胞を、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の化合物と接触させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物を投与するステップを含む、それを必要とする個体におけるＮＬＲＰ３に関連した疾患、障害、または状態の処置のための方法。
【請求項２７】
請求項１１に記載の化合物を投与するステップを含む、それを必要とする個体におけるＮＬＲＰ３に関連した疾患、障害、または状態の処置のための方法。
【請求項２８】
請求項１４に記載の化合物を投与するステップを含む、それを必要とする個体におけるＮＬＲＰ３に関連した疾患、障害、または状態の処置のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]この出願は、２０１５年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２５０，７９６号の利益を主張し、その仮特許出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
[0002]本発明は、ＮＬＲファミリー、パイリンドメイン含有３（ｐｙｒｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３）（ＮＬＲＰ３；ＣＩＡＳ１としても知られている）遺伝子発現の阻害のための、またはＮＬＲＰ３遺伝子発現の阻害に応答する疾患および／もしくは状態を診断、処置、および／もしくは防止するための化合物、組成物、および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]ＮＬＲＰ３遺伝子は、ＮＬＲ（ヌクレオチド結合ドメインおよびロイシンリッチリピート含有ファミリー）と呼ばれる遺伝子のファミリーに属する。ＮＬＲタンパク質は、免疫系に関与し、傷害、毒素、または微生物による侵入に対する免疫系の応答を開始し、かつ制御するのを助ける。これらのタンパク質は、特定の分子を認識し、活性化し、免疫系の要素を作動させるのを助けることにより応答する。
【０００４】
[0004]ＮＬＲＰ３遺伝子は、主に白血球および軟骨形成細胞（軟骨細胞）に見出されるクリオピリンと呼ばれるタンパク質の生成に関する命令を与える。クリオピリンは、細菌粒子、アスベスト、シリカ、および尿酸結晶などの化学物質、ならびに傷害細胞により放出された化合物を認識する。
【０００５】
[0005]いったん活性化されたならば、クリオピリン分子群は、他のタンパク質と共に集合して、炎症プロセスに関与するインフラマソームと呼ばれる構造になる。免疫系が、シグナル伝達分子および白血球を傷害または疾患の部位へ送って、侵入した微生物と戦い、組織修復を促進する時、炎症が起こる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]ＮＬＲＰ３遺伝子における変異は、家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、慢性乳児神経皮膚関節（ＣＩＮＣＡ）症候群、および新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）に関連している。ＮＬＲＰ３はまた、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）の発症機序に結びつけられている。したがって、ＮＬＲＰ３の発現の低下から、またはＮＬＲＰ３活性の調節から恩恵を受けるだろう、疾患または障害の処置の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
[0007]本発明は、２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するように５’末端を介して連結されている２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物（「ＧＳＯ」）を用いて、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を調節するのに有用な化合物、組成物、および方法に向けられる。本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を効果的に阻害し、または減少させる。
【０００８】
[0008]ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節するための方法、化合物、および組成物が本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節するのに有用な化合物は遺伝子サイレンシング化合物である。
【０００９】
[0009]ある特定の実施形態において、調節は細胞または組織において起こり得る。ある特定の実施形態において、細胞または組織は動物内である。ある特定の実施形態において、動物はヒトである。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡレベルが低下する。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３タンパク質レベルが低下する。そのような低下は、時間依存性様式で、または用量依存性様式で起こり得る。
【００１０】
[0010]疾患、障害、および状態を防止し、処置し、および改善するのに有用な方法、化合物、および組成物もまた提供される。
[0011]ある特定の実施形態において、処置の方法は、それを必要としている個体に、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現遺伝子サイレンシング化合物または組成物を投与するステップを含む。
【００１１】
[0012]本発明の前述のおよび他の目的、特徴および利点は、添付の図面で図示されるように、以下に示す本発明の好ましい実施形態のより具体的な説明から明らかであり、図面において類似の参照符合は、様々な図面にわたり同じ部品を指す。図面は、必ずしも一定の縮尺であるとは限らず、それより、本発明の原理を説明することに重きを置く。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】[0013]細胞に基づいたアッセイにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯのスクリーニング結果を描く図である。
【図２】[0014]マウスＪ７７４細胞株における例示的なＧＳＯによるｍＮＬＲＰ３のサイレンシングを描く図である。
【図３】[0015]図３Ａは、例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯがマウスＪ７７４細胞においてＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡ発現を用量依存的にサイレンシングすることを示す図である。図３Ｂは、例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯがマウスＪ７７４細胞においてＮＬＲＰ３タンパク質レベルを用量依存的にサイレンシングすることを示す図である。
【図４】[0016]例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯがＪ７７４細胞においてＬＰＳプラスＡＴＰ誘導ＩＬ−１ｂ分泌を用量依存的に低下させることを示す図である。
【図５】[0017]例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯが、細胞に基づいたアッセイにおいてマウスＮＬＲＰ３遺伝子発現を特異的にサイレンシングすることを示す図である。
【図６】[0018]細胞に基づいたアッセイにおける例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯの用量反応曲線を描く図である。
【図７】[0019]図７Ａは、ＴＨＰ−１細胞における例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯの用量反応曲線を描く図である。図７Ｂは、ＴＨＰ−１細胞における例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯの用量反応曲線を描く図である。
【図８】[0020]図８Ａは、例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯがＴＨＰ−１細胞においてＬＰＳ／ＡＴＰ誘導サイトカイン分泌を阻害することを示す図である。図８Ｂは、例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯがＴＨＰ−１細胞においてＬＰＳ／ＡＴＰ誘導サイトカイン分泌を阻害することを示す図である。
【図９】[0021]ヒトＰＢＭＣにおける例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯの用量反応曲線を描く図である。
【図１０】[0022]図１０Ａは、例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯがヒトＰＢＭＣにおいてＬＰＳ／ＡＴＰ誘導サイトカイン分泌を阻害することを示す図である。図１０Ｂは、例示的なｈＮＬＲＰ３  ＧＳＯがヒトＰＢＭＣにおいてＬＰＳ／ＡＴＰ誘導サイトカイン分泌を阻害することを示す図である。
【図１１】[0023]図１１Ａは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱重量への効果を示す図である。図１１Ｂは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの尿ＩＬ−１βへの効果を示す図である。図１１Ｃは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの尿ＩＬ−１８への効果を示す図である。
【図１２】[0024]図１２Ａは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱インフラマソーム遺伝子発現への効果を示す図である。図１２Ｂは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱インフラマソーム遺伝子発現への効果を示す図である。図１２Ｃは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱インフラマソーム遺伝子発現への効果を示す図である。図１２Ｄは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱インフラマソーム遺伝子発現への効果を示す図である。
【図１３】[0025]間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱インフラマソーム遺伝子発現への効果を示す図である。
【図１４】[0026]間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱重量への効果を示す図である。
【図１５】[0027]図１５Ａは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの膀胱重量への効果を示す図である。図１５Ｂは、間質性膀胱炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの尿ＩＬ−１βへの効果を示す図である。
【図１６】[0028]図１６Ａは、実験的自己免疫性ぶどう膜炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの効果を示す図である。図１６Ｂは、実験的自己免疫性ぶどう膜炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの効果を示す図である。図１６Ｃは、実験的自己免疫性ぶどう膜炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの効果を示す図である。図１６Ｄは、実験的自己免疫性ぶどう膜炎の動物モデルにおける例示的なｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[0029]本発明は、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を下方制御するための遺伝子サイレンシング化合物の治療的および予防的使用に関する。そのような分子は、例えば、患者、対象、動物、または生物体において、ＮＬＲＰ３遺伝子発現の調節のための、またはＮＬＲＰ３遺伝子発現の調節に応答することができる疾患および／もしくは状態を処置および／もしくは防止するための組成物を提供することに有用である。
【００１４】
[0030]本発明の目的、本発明の様々な特徴、加えて、本発明自体は、添付の図面と共に読む時、以下の説明からより完全に理解され得、その説明において、以下の用語は、割り当てられた意味をもつ。特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載された、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して利用される命名法、ならびにそれらの手順および技術は、当技術分野においてよく知られ、かつ一般的に用いられているものである。標準技術は、化学合成および化学分析に用いられ得る。許可されている場合、全ての特許、出願、公開された出願、および他の刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などのデータベースから入手できる関連した配列情報、および本明細書における開示を通して参照された他のデータは、本明細書で論じられた文書の部分として、および全体として、参照により組み入れられる。
【００１５】
[0031]用語「２’−Ｏ−置換型」は、ペントース部分の２’位置の、１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含有する−Ｏ−低級アルキル基（例えば、限定されるものではないが、２’−Ｏ−メチル）での、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールもしくはアリル基での置換（このようなアルキル基、アリール基、またはアリル基は、非置換であってもよいし、または置換されていてもよい（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル、エトキシ、メトキシ、ハロ、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシル、またはアミノ基で置換されていてもよい））；またはヒドロキシル、アミノ、もしくはハロ基での置換であるが、２’−Ｈ基での置換ではない、置換を意味する。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端に４個もしくは５個の２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、および／またはその３’末端に４個もしくは５個の２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドを含む。
【００１６】
[0032]方向として用いられる場合の用語「３’」は、一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける、その同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域または位置から３’（そのヌクレオチドの３’末端の方へ）の領域または位置を指す。
【００１７】
[0033]用語「３’末端」は、一般的に、オリゴヌクレオチド要素の３’末端のヌクレオチドを指す。「３’末端で連結された２つ以上のオリゴヌクレオチド」は、一般的に、直接的に５’、３’、もしくは２’ヒドロキシル基を介して、または間接的に非ヌクレオチドリンカーを介してであり得る、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチド間の連結を指す。そのような連結はまた、ヌクレオシドを介してであり得、そのヌクレオシドの２’ヒドロキシル位置と３’ヒドロキシル位置の両方を利用する。そのような連結はまた、３’末端のヌクレオチドの官能化された糖または核酸塩基を利用し得る。
【００１８】
[0034]方向として用いられる場合の用語「５’」は、一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける、その同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域または位置から５’（そのヌクレオチドの５’末端の方へ）の領域または位置を指す。
【００１９】
[0035]用語「５’末端」は、一般的に、オリゴヌクレオチド要素の５’末端のヌクレオチドを指す。「５’末端で連結された２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、一般的に、直接的に５’、３’、もしくは２’ヒドロキシル基を介して、または間接的に非ヌクレオチドリンカーを介してであり得る、オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド間の連結を指す。そのような連結はまた、ヌクレオシドを介してであり得、そのヌクレオシドの２’ヒドロキシル位置と３’ヒドロキシル位置の両方を利用する。そのような連結はまた、５’末端のヌクレオチドの官能化された糖または核酸塩基を利用し得る。
【００２０】
[0036]用語「約」は一般的に、正確な数値が臨界的ではないことを意味する。したがって、１個または２個少ないヌクレオシド残基、または１個から数個までの追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドが、上記の実施形態のそれぞれの等価物として考慮される。
【００２１】
[0037]用語「アクセス可能な」は一般的に、本発明による化合物に関係する場合、分子の関連部分が、その化合物に対する意図された応答を誘発するのに必要な細胞要素により認識され得ることを意味する。
【００２２】
[0038]用語「アゴニスト」は一般的に、細胞の受容体と結合し、かつ応答を誘導する物質を指す。アゴニストは、リガンドなどの天然に存在する物質の作用を模倣する場合が多い。
【００２３】
[0039]用語「抗原」は一般的に、抗体により、またはＴ細胞抗原受容体により、認識され、かつ選択的に結合される物質を指す。抗原には、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、およびそれらの組合せが挙げられ得るが、それらに限定されない。抗原は、天然または合成であり得、一般的に、その抗原に特異的である免疫応答を誘導する。
【００２４】
[0040]「アンチセンス活性」は、遺伝子サイレンシング化合物のそれの標的核酸とのハイブリダイゼーションに起因しうる任意の検出可能または測定可能な活性を意味する。ある特定の実施形態において、アンチセンス活性は、そのような標的核酸によりコードされた標的核酸またはタンパク質の量または発現の減少である。
【００２５】
[0041]「遺伝子サイレンシング化合物」（本明細書で「ＧＳＯ」とも呼ばれる）は、２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するように５’末端を介して連結されている２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物を意味する。遺伝子サイレンシング化合物は、水素結合を通して標的核酸とのハイブリダイゼーションを受ける能力がある。本発明による遺伝子サイレンシング化合物には、天然に存在するヌクレオチド、修飾型ヌクレオチド、修飾型オリゴヌクレオチド、および／またはバックボーン修飾型オリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２６】
[0042]「アンチセンス阻害」は、標的核酸に相補的な遺伝子サイレンシング化合物の存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの、その遺伝子サイレンシング化合物の非存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較しての低下を意味する。
【００２７】
[0043]「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントとのハイブリダイゼーションを許容する核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００２８】
[0044]用語「生物学的不安定性」は一般的に、インビボで分解され、その後、不活性化される分子の能力を指す。オリゴヌクレオチドについて、そのような分解は、エキソヌクレアーゼ活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性の結果として生じ、エキソヌクレアーゼ活性はオリゴヌクレオチドの３’または５’末端からヌクレオチドを切断することを指し、エンドヌクレアーゼ活性は、オリゴヌクレオチドの末端以外の位置で、ホスホジエステル結合を切断することを指す。
【００２９】
[0045]用語「担体」は一般的に、薬学的製剤に用いられる、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソーム封入、または他の材料を包含する。担体、賦形剤、または希釈剤の特性が特定の適用のための投与経路に依存することは理解されているだろう。これらの材料を含有する薬学的に許容される製剤の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０に記載されている。
【００３０】
[0046]用語「共投与」または「共投与された」は一般的に、少なくとも２つの異なる物質の投与を指す。共投与は、少なくとも２つの異なる物質の、任意の順序で、単一用量かまたは分割用量のいずれかでの、同時の投与、加えて、最高数日間離れての時間的に間隔を置いた順序での投与を指す。
【００３１】
[0047]用語「と組み合わせて」は一般的に、本発明によるオリゴヌクレオチドに基づいた化合物、および患者を処置する過程においてその化合物の活性を無効にしない、疾患または状態を処置するのに有用な別の作用物質を投与することを意味する。そのような投与は、同時投与、加えて、数秒間から最高数日間まで離れて時間的に間隔を置いた順序を含む、任意の順序で行われ得る。そのような併用処置はまた、本発明による化合物および／または独立して、他の作用物質の単回より多い投与も含み得る。本発明による化合物および他の作用物質は、同じまたは異なる経路により得る。
【００３２】
[0048]用語「相補的な」は、第１の核酸の核酸塩基と第２の核酸の核酸塩基との間で対形成する能力を意味することを意図される。
[0049]「連続した核酸塩基」は、互いに直接隣接した核酸塩基を意味する。
【００３３】
[0050]用語「個体」または「対象」または「患者」は一般的に、ヒトなどの哺乳動物を指す。
[0051]「ＮＬＲＰ３核酸」は、ＮＬＲＰ３をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３核酸には、ＮＬＲＰ３をコードするＤＮＡ配列、ＮＬＲＰ３をコードするＤＮＡ（イントロンおよびエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）から転写されたＲＮＡ配列、ＮＬＲＰ３をコードするｍＲＮＡ配列が挙げられる。「ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡ」は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００３４】
[0052]「完全に相補的な」または「１００％相補的な」は、第１の核酸の各核酸塩基が第２の核酸における相補的な核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態において、第１の核酸がアンチセンス化合物であり、標的核酸が第２の核酸である。
【００３５】
[0053]「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸分子のアニーリングを意味する。ある特定の実施形態において、相補的な核酸分子は、アンチセンス化合物および標的核酸を含む。
【００３６】
[0054]「ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害すること」は、本発明による遺伝子サイレンシング化合物の非存在下でのＮＬＲＰ３の発現および／またはタンパク質レベルと比較した、本発明による遺伝子サイレンシング化合物の存在下でのＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡの発現および／またはタンパク質レベルの低下を意味する。
【００３７】
[0055]用語「直線的合成」は一般的に、オリゴヌクレオチドの一方の末端から開始し、他方の末端へ直線的に前進する合成を指す。直線的合成は、同一かまたは非同一（長さ、塩基組成、および／または組み込まれた化学修飾に関して）のいずれかの単量体単位のオリゴヌクレオチドへの取り込みも可能にする。
【００３８】
[0056]用語「哺乳動物」は、温血の脊椎動物を含むことを明確に意図され、それには、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛、乳牛、ブタ、ヒツジ、およびウサギが挙げられる。
【００３９】
[0057]用語「ヌクレオシド」は一般的に、糖、通常にはリボース、デオキシリボース、ペントース、アラビノース、またはヘキソース、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物を指す。
【００４０】
[0058]用語「ヌクレオチド」は一般的に、糖に付着したリン含有基を含むヌクレオシドを指す。
[0059]用語「修飾型ヌクレオシド」または「ヌクレオチド誘導体」は一般的に、修飾型複素環式塩基、修飾型糖部分、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオシドである。いくつかの実施形態において、修飾型ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体は、本明細書に記載されているように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明を目的として、修飾型ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体、ピリミジンもしくはプリン類似体または天然に存在しないピリミジンもしくはプリンは、交換可能に用いることができ、天然に存在しない塩基および／または天然に存在しない糖部分を含むヌクレオシドを指す。本発明を目的として、塩基は、それがグアニン、シトシン、アデニン、チミン、またはウラシルではない場合には非天然であるとみなされ、糖は、それがβ−リボ−フラノシドまたは２’−デオキシリボ−フラノシドではない場合には非天然であるとみなされる。
【００４１】
[0060]本明細書に用いられる場合、用語「修飾型オリゴヌクレオチド」は、それのヌクレオチドのうちの少なくとも２個が合成的連結、すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル連結以外の連結を介して共有結合しているオリゴヌクレオチドを記載し、５’ヌクレオチドリン酸が任意の数の化学基に置き換えられている。用語「修飾型オリゴヌクレオチド」はまた、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−ｂ−Ｄ−リボフラノシル核酸、アラビノース核酸、置換型アラビノース核酸、ヘキソース核酸、ペプチド核酸、モルホリノ、ならびに２’−Ｏ−置換型、５−メチルシトシン、および／または３’−Ｏ−置換型リボヌクレオチドなどの修飾型塩基および／または糖を含む少なくとも１個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００４２】
[0061]用語「核酸」は、ゲノム領域、またはそれから転写されたＲＮＡ分子を包含する。いくつかの実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。
[0062]用語「リンカー」は一般的に、糖、塩基、またはバックボーンを通して共有結合または非共有結合によってオリゴヌクレオチドに付着することができる任意の部分を指す。非共有結合は、非限定的に、静電気的相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、水素結合、およびそれらの組合せであり得る。そのような非共有結合の非限定的例には、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン塩基対形成、および塩基スタッキングが挙げられる。リンカーは２個以上のヌクレオシドを付着させるために用いることができ、またはオリゴヌクレオチドにおける５’および／もしくは３’末端ヌクレオチドに付着することができる。そのようなリンカーは、非ヌクレオチドリンカーかまたはヌクレオシドリンカーのいずれかであり得る。
【００４３】
[0063]用語「非ヌクレオチドリンカー」は一般的に、共有結合または非共有結合によってオリゴヌクレオチドに付着することができる、２個のヌクレオチド間の直接的な連結以外の、化学的部分を指す。好ましくは、そのような非ヌクレオチドリンカーは、長さが約２オングストロームから約２００オングストロームまでであり、シスまたはトランス配向のいずれでもよい。
【００４４】
[0064]用語「ヌクレオチド間連結」は一般的に、隣接したヌクレオシド間の、リン原子および荷電または中性の基からなる、糖を通して（例えば、３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’、５’−５’）の２個のヌクレオシドを接続するための化学的連結（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネート）を指す。
【００４５】
[0065]用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結されるヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指し、それは、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、合成もしくは天然のヌクレオチド、ホスホジエステルもしくは修飾型連結、天然塩基もしくは修飾型塩基、天然糖もしくは修飾型糖、またはこれらの要素の組合せを含み得る。ヌクレオシド単位は、ウイルス、細菌、細胞片、またはオリゴヌクレオチドに基づいた組成物（例えば、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）の一部であり得る。そのようなオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは、合成方法により作製される。ある特定の実施形態において、各ヌクレオシド単位は、複素環式塩基、およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換型ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−置換型アラビノース、２’−Ｏ−置換型アラビノース、またはヘキソースの糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多数の既知のヌクレオシド間連結のいずれかにより互いに連結することができる。そのようなヌクレオシド間連結には、非限定的に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連結が挙げられる。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１個または複数の立体特異的ヌクレオシド間連結（例えば、（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル連結）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書に用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、連結がリン酸基を含むか含まないかに関わらず、任意のそのようなヌクレオシド間連結を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図される。ある特定の例示的な実施形態において、これらのヌクレオシド間連結は、ホスホロジエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート連結、またはそれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結により連結されている。ホスホロチオエート連結は、ＲｐエナンチオマーとＳｐエナンチオマーの混合であり得、またはそれらは、Ｒｐ形またはＳｐ形のいずれかでの立体規則性または実質的に立体規則性であり得る（Ｉｙｅｒら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ６：１０５１〜１０５４参照）。ある特定の実施形態において、本発明のアンチセンス組成物内のオリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、１個または複数の２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−ｂ−Ｄ−リボフラノシル核酸を含有し、そのリボースは、２’炭素と４’炭素の間の結合で修飾されており、それにより、そのリボースが３’末端構造��コンフォメーションに固定される。
【００４６】
[0066]用語「ペプチド」は一般的に、ペプチドがハプテンであるかどうかに関わらず、生物学的応答、例えば、抗体産生またはサイトカイン活性に影響するのに十分な長さおよび組成をもつアミノ酸のオリゴマーまたはポリマーを指す。用語「ペプチド」は、修飾型アミノ酸（天然に存在するかしないかに関わらない）を含み得、そのような修飾には、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化（lipidization）、およびメチル化が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４７】
[0067]用語「薬学的に許容される」は、本発明による化合物の有効性、または本発明による化合物の生物学的活性に干渉しない非毒性材料を意味する。
[0068]用語「生理学的に許容される」は、細胞、細胞培養物、組織、または生物体などの生物学的系と適合性である非毒性材料を指す。好ましくは、生物学的系は、哺乳動物、特にヒトなどの生きている生物体である。
【００４８】
[0069]用語「予防的有効量」は一般的に、望ましくない生物学的効果の発生を防止し、または低下させるのに十分な量を指す。
[0070]「部分」は、核酸の既定数の連続した（すなわち、連結した）核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態において、部分は、標的核酸の限定数の連続した核酸塩基である。ある特定の実施形態において、部分は、アンチセンス化合物の限定数の連続した核酸塩基である。
【００４９】
[0071]「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖とハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを意味する。
[0072]「特異的にハイブリダイズ可能な」は、所望の効果を誘導するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の十分な相補性の程度を有し、同時に、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイおよび治療的処置の場合における生理学的条件下で非標的核酸に最小効果を示し、または全く効果を示さない、遺伝子サイレンシング化合物を指す。
【００５０】
[0073]「ターゲティング」または「ターゲティングされる」は、標的核酸と特異的にハイブリダイズし、かつ所望の効果を誘導するだろう、遺伝子サイレンシング化合物の設計および選択のプロセスを意味する。
【００５１】
[0074]「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ｍＲＮＡ」、および「標的ＲＮＡ転写物」は全て、遺伝子サイレンシング化合物によりターゲティングされ得る核酸を指す。
[0075]「標的セグメント」は、遺伝子サイレンシング化合物がターゲティングされる標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
【００５２】
[0076]用語「治療的有効量」または「薬学的有効量」は一般的に、有益な結果などの所望の生物学的効果に影響するのに十分な量を指し、その所望の生物学的効果には、非限定的に、疾患または障害の兆候または症状の防止、減少、改善、または排除が挙げられる。したがって、薬学的組成物または方法の各活性要素の総量は、有意義な患者への利益、例えば、限定されるものではないが、免疫刺激により特徴づけられる慢性状態の治癒を示すのに十分である。したがって、「薬学的有効量」は、それが投与されることになっている状況に依存する。薬学的有効量は、１回または複数回の予防的または治療的投与で投与され得る。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、その用語はその成分のみを指す。併用に適用される場合、その用語は、併用投与が連続的か同時かに関わらず、治療効果を生じる活性成分の組み合わされた量を指す。
【００５３】
[0077]用語「処置」は一般的に、症状の軽減、または疾患進行を遅らせ、もしくは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図されたアプローチを指す。
【００５４】
[0078]用語「遺伝子発現」は一般的に、遺伝子からの情報が、タンパク質であり得る機能性遺伝子産物の合成に用いられるプロセスを指す。その過程は、転写、ＲＮＡスプライシング、翻訳、およびタンパク質の翻訳後修飾に関わり得、ｍＲＮＡ、ｐｒｅＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、およびタンパク質合成のための他の鋳型を含み得る。
【００５５】
[0079]ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害するための方法、化合物、および組成物が提供される。ある特定の実施形態において、その化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖もしくは一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、または遺伝子サイレンシング化合物である。
【００５６】
[0080]本明細書に用いられる場合、本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、５’末端で連結された２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、その化合物は、２つ以上のアクセス可能な３’末端を有する。本発明のオリゴヌクレオチドに基づいた化合物の一般的な構造は、以下の式Ｉによって記載され得る：
３’−Ｎｎ．．．Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４−５’−Ｘ−５’−Ｎ８Ｎ７Ｎ６Ｎ５．．．Ｎｍ−３’（式Ｉ）
式中、Ｘは、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり、各存在におけるＮ１〜Ｎ８は、独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、各存在におけるＮｍおよびＮｎは、独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、ｍおよびｎは、独立して、０から約４０までの数である。
【００５７】
[0081]オリゴヌクレオチド要素の５’末端における連結は、その他のオリゴヌクレオチド連結から独立しており、直接的に５’、３’、または２’ヒドロキシル基を介して、あるいは間接的に、非ヌクレオチドリンカー、またはヌクレオシドの２’もしくは３’のいずれかのヒドロキシル位置を利用するヌクレオシドを介してであり得る。連結はまた、５’末端ヌクレオチドの官能化された糖または核酸塩基を利用し得る。
【００５８】
[0082]ある特定の実施形態において、ヒトＮＬＲＰ３核酸にターゲティングされる遺伝子サイレンシング化合物が提供される。ある特定の実施形態において、ヒトＮＬＲＰ３核酸は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００４８９５．４（本明細書において、配列番号９５として組み入れられる）に示された配列である。
【００５９】
【化１−１】
2018537528.tif 000002
【００６０】
【化１−２】
2018537528.tif 000003
【００６１】
[0083]ある特定の実施形態において、マウスＮＬＲＰ３核酸にターゲティングされる遺伝子サイレンシング化合物が提供される。ある特定の実施形態において、マウスＮＬＲＰ３核酸は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿１４５８２７．３（本明細書において、配列番号９６として組み入れられる）に示された配列である。
【００６２】
【化２−１】
2018537528.tif 000004
【００６３】
【化２−２】
2018537528.tif 000005
【００６４】
[0084]ある特定の実施形態は、それぞれが独立して、配列番号９５の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０ヌクレオチドからなる、２つのオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物を提供する。ある特定の実施形態は、それぞれが独立して、配列番号９５の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１５〜２５ヌクレオチドからなる、２つのオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態は、配列番号９５の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１８〜２１ヌクレオチドからなる修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物の２つのオリゴヌクレオチド、それぞれは、独立して、配列番号９５の等しい長さの部分と相補的な少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、または少なくとも１９個の連続した核酸塩基を含む。
【００６５】
[0085]ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物の２つのオリゴヌクレオチド、それぞれは、独立して、配列番号９５の等しい長さの部分と相補的な少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、または少なくとも２３個の連続した核酸塩基を含む。
【００６６】
[0086]ある特定の実施形態は、それぞれが独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなる部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物を提供する。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９５と少なくとも８０％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９５と少なくとも８５％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９５と少なくとも９０％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９５と少なくとも９５％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６７】
[0087]ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、独立して、それの全長にわたり、配列番号９５の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、独立して、その全長にわたり、配列番号９５の核酸塩基配列と少なくとも９５％相補的である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、その全長にわたり、配列番号９５と少なくとも９９％相補的である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、その全長にわたり、配列番号９５の核酸塩基配列と１００％相補的である。
【００６８】
[0088]ある特定の実施形態は、それぞれが独立して、配列番号９６の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０ヌクレオチドからなる、２つのオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物を提供する。ある特定の実施形態は、それぞれが独立して、配列番号９６の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１５〜２５ヌクレオチドからなる、２つのオリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態は、配列番号９６の等しい長さの部分と相補的な少なくとも１２個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する１８〜２１ヌクレオチドからなる修飾型オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物の２つのオリゴヌクレオチド、それぞれは、独立して、配列番号９６の等しい長さの部分と相補的な少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、または少なくとも２１個の連続した核酸塩基を含む。
【００６９】
[0089]ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物の２つのオリゴヌクレオチド、それぞれは、独立して、配列番号９６の等しい長さの部分と相補的な少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、または少なくとも２３個の連続した核酸塩基を含む。
【００７０】
[0090]ある特定の実施形態は、それぞれが独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなる部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物を提供する。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９６と少なくとも８０％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９６と少なくとも８５％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９６と少なくとも９０％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれが独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１の少なくとも１２個の連続した核酸塩基からなり、かつ配列番号９６と少なくとも９５％相補的である部分を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００７１】
[0091]ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、独立して、その全長にわたり、配列番号９６の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、独立して、その全長にわたり、配列番号９６の核酸塩基配列と少なくとも９５％相補的である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、その全長にわたり、配列番号９６と少なくとも９９％相補的である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、その全長にわたり、配列番号９６の核酸塩基配列と１００％相補的である。
【００７２】
[0092]ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、独立して、４〜４４ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、独立して、１２〜３０ヌクレオチド長である。言い換えれば、オリゴヌクレオチドは、１２個から３０個までの連結された核酸塩基である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、独立して、１５〜２８個、１８〜２４個、１９〜２２個、または２０個の連結された核酸塩基からなる。ある特定のそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは、独立して、長さが８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、または上記の値の任意の２つによって定義される範囲の連結された核酸塩基からなる。
【００７３】
[0093]ある特定のそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは長さが１９個の連結された核酸塩基である。
[0094]ある特定の実施形態において、標的領域は、標的核酸の構造的に規定された領域である。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合部、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の規定された核酸領域を包含し得る。ＮＬＲＰ３についての構造的に規定された領域は、ＮＣＢＩなどの配列データベースから受託番号より入手することができ、そのような情報は、参照により本明細書に組み入れられる。ある特定の実施形態において、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位からその同じ標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含し得る。
【００７４】
[0095]ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物、またはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているような２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物、またはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物は、同じ標的のｍＲＮＡもしくはタンパク質発現を阻害することができ、または異なる標的のｍＲＮＡもしくはタンパク質発現を阻害することができる。
【００７５】
[0096]ある特定の実施形態において、本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または非ヌクレオシドリンカーを介して、５’−５’末端で連結された２つの同一または異なる配列を含む。同一の配列を含む本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、ワトソン・クリック水素結合相互作用により特異的なｍＲＮＡと結合し、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を阻害することができる。異なる配列を含む本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、１つまたは複数のｍＲＮＡ標的のうちの２つ以上の異なる領域と結合し、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を阻害することができる。そのような化合物は、標的ｍＲＮＡと相補的なヘテロヌクレオチド配列で構成され、ワトソン・クリック水素結合を通して安定な二重鎖構造を形成する。
【００７６】
[0097]遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のアクセス可能な３’末端が存在するようにそれらの５’末端を介して連結される。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、表１に列挙された非ヌクレオチドリンカーのうちの１つまたは複数を通して連結される。ある特定の実施形態において、表１に列挙された単一のリンカーは、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドを連結するために用いられる。ある特定の実施形態において、リンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨのグリセロールまたはグリセロール相同体などの小分子リンカーであり、式中、ｏおよびｐは独立して、１から約６まで、１から約４まで、または１から約３までの整数である。いくつかの他の実施形態において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのそのような誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中、ｍは、０から約１０まで、０から約６まで、２から約６まで、または２から約４までの整数である。代表的な非ヌクレオチドリンカーは表１に示されている。
【００７７】
【表１−１】
2018537528.tif 000006
【００７８】
【表１−２】
2018537528.tif 000007
【００７９】
【表１−３】
2018537528.tif 000008
【００８０】
【表１−４】
2018537528.tif 000009
【００８１】
【表１−５】
2018537528.tif 000010
【００８２】
[0098]いくつかの実施形態において、小分子リンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨのグリセロールまたはグリセロール相同体であり、式中、ｏおよびｐは独立して、１から約６まで、１から約４まで、または１から約３までの整数である。いくつかの他の実施形態において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのそのような誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中、ｍは、０から約１０まで、０から約６まで、２から約６まで、または２から約４までの整数である。
【００８３】
[0099]ある特定の実施形態において、本発明の遺伝子サイレンシング化合物のうちの２つ以上のオリゴヌクレオチドは、表２に示されているように連結され得る。
【００８４】
【表２】
2018537528.tif 000011
【００８５】
[00100]式ＩＩおよび／またはＶのある特定の実施形態において、Ｌはリンカーまたはヌクレオチド連結であり、ドメインＡおよび／またはドメインＢは、同じ標的ＲＮＡ配列または異なる標的ＲＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするように設計されているアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００８６】
[00101]式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのある特定の実施形態において、Ｌはリンカーであり、ドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣおよび／またはドメインＤは、同じ標的ＲＮＡ配列または異なる標的ＲＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするように設計されているアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例えば、一実施形態において、式ＩＩおよび／または式ＩＩＩのドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣは、同じ標的ＲＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするように設計されているアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この実施形態において、ドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣは、標的ＲＮＡ配列上の同じ領域、またはその同じ標的ＲＮＡ配列の異なる領域とハイブリダイズするように設計することができる。
【００８７】
[00102]本発明のこの態様のさらなる実施形態において、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、およびドメインＤは、独立して、ＲＮＡまたはＤＮＡに基づいたオリゴヌクレオチドである。この実施形態のある特定の態様において、そのオリゴヌクレオチドは、混合されたバックボーンオリゴヌクレオチドを含む。
【００８８】
[00103]別の実施形態において、ドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣおよび／またはドメインＤのうちの１つまたは複数は、１つの標的ＲＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするように設計されているアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、残りのドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣおよび／またはドメインＤのうちの１つまたは複数は、異なる標的ＲＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするように設計されているアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００８９】
[00104]別の実施形態において、ドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣおよび／またはドメインＤのうちの１つまたは複数は、そのドメインがｓｉＲＮＡ分子を含むように、相補的なＲＮＡに基づいたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする、ＲＮＡに基づいたオリゴヌクレオチドである。
【００９０】
[00105]本発明のこれらの遺伝子サイレンシング化合物は、手作業で、または自動シンセサイザーにより行うことができる、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学などの当技術分野で認識された方法により調製することができる。本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズするそれらの能力を損なうことなく、いくつかの方法で修飾され得る。そのような修飾には、そのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間連結が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸ヒドロキシル、アセトアミデート、もしくはカルボキシメチルエステル、またはこれらの組合せであること、および１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間の他のヌクレオチド間連結であって、その５’ヌクレオチドホスホジエステル連結が任意の数の化学基に置き換えられている、ヌクレオチド間連結が挙げられ得る。
【００９１】
[00106]本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間連結の組合せを含み得る。例えば、米国特許第５，１４９，７９７号は、メチルホスホネートまたはホスホラミデート隣接領域間に挿入されたホスホロチオエートコア領域を有する伝統的なキメラオリゴヌクレオチドを記載する。追加として、米国特許第５，６５２，３５６号は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートのうちの１つまたは複数の領域に隣接した１つまたは複数の非イオン性オリゴヌクレオチド領域（例えば、アルキルホスホネートおよび／またはホスホラミデートおよび／またはホスホトリエステルのヌクレオチド間連結）を含む「逆位」キメラオリゴヌクレオチドを記載する。修飾型ヌクレオチド間連結を有する様々な合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準方法により調製することができる。ある特定の実施形態において、ホスホロチオエート連結は、ＲｐおよびＳｐエナンチオマーの混合であり得、またはそれらは、Ｒｐ形またはＳｐ形のいずれかでの立体規則性または実質的に立体規則性になり得る。
【００９２】
[00107]本発明の遺伝子サイレンシング化合物の他の修飾には、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端における修飾が挙げられ、コレステロール、コレステリル、またはアミノ基間に様々な数の炭素残基を有するジアミン化合物などの、ヌクレオシド間リン酸連結の分子への付加、ならびに反対鎖、または関連酵素もしくはゲノムと結合する他のタンパク質を切断し、またはそれらと架橋する、末端リボース、デオキシリボース、およびリン酸の修飾が挙げられる。そのような修飾型オリゴヌクレオチドの例には、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−ｂ−Ｄ−リボフラノシル、またはリボースの代わりにアラビノース、または３’位置と５’位置の両方において、（３’位置において）ヒドロキシル基以外で、かつ（５’位置において）リン酸基以外の化学基に付着している糖を有する３’，５’−置換型オリゴヌクレオチドなどの、修飾型塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００９３】
[00108]本発明のオリゴヌクレオチドに基づいた化合物の糖への修飾の他の例には、リボース部分の２’位置への修飾が挙げられ、それには、１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含有する−Ｏ−アルキル基での、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリール基もしくは−Ｏ−アリル基での２’−Ｏ−置換型が挙げられるが、それらに限定されず、そのような−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アリール基、または−Ｏ−アリル基は、置換されていなくてもよいし、または、例えば、ハロ、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルバルコキシル、もしくはアミノ基で置換されていてもよい。これらの置換のいずれも、リボースの場合の天然２’−ヒドロキシル基、またはデオキシリボースの場合の２’Ｈ−を有する他の残基の存在を排除することを意図するものではない。
【００９４】
[00109]本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、１個または複数のリボヌクレオチドを含み得る。例えば、米国特許第５，６５２，３５５号は、ＤＮＡコア領域に隣接する２’−Ｏ−置換型リボヌクレオチドの領域を有する伝統的なハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示する。米国特許第５，６５２，３５６号は、２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域間にある２’−Ｏ−置換型（または２’ＯＨ、非置換型）ＲＮＡ領域を含むオリゴヌクレオチドを含む「逆位」ハイブリッドオリゴヌクレオチド、すなわち「伝統的な」ハイブリッドオリゴヌクレオチドに対して「反転した」構造を開示する。本発明の特に有用なオリゴヌクレオチドの非限定的例は、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端において２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを有し、少なくとも４個、およびいくつかの例示的実施形態においては５個の連続したヌクレオチドがそのように修飾されている。２’−Ｏ−アルキル化基の非限定的例には、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ブチル、および２’−Ｏ−メトキシ−エチルが挙げられる。
【００９５】
[00110]本発明のオリゴヌクレオチドに基づいた化合物は、便利には、実施例１にさらに記載された自動シンセサイザーおよびホスホラミダイトアプローチを用いて合成され得る。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドに基づいた化合物は、直線的合成アプローチにより合成される。
【００９６】
[00111]合成の代替様式は、合成が中央のリンカー部分から外側へ進む「パラレル合成」である。リンカーを付着した固体支持体が、米国特許第５，９１２，３３２号に記載されているように、パラレル合成に用いることができる。あるいは、万能型固体支持体（例えば、リン酸を付着した制御多孔性ガラスなど）を用いることができる。
【００９７】
[00112]本発明のオリゴヌクレオチドに基づいた化合物のパラレル合成は、直線的合成と比べて以下のいくつかの利点を有する：（１）パラレル合成は、同一の単量体単位の取り込みを可能にする；（２）直線的合成と違って、両方（または全部）の単量体単位が同時に合成され、それにより、合成ステップの数および合成に必要とされる時間が、単量体単位のそれと同じである；ならびに（３）合成ステップの減少が、最終の免疫調節性オリゴリボヌクレオチド産物の純度および収量を向上させる。
【００９８】
[00113]直線的合成かまたはパラレル合成のいずれかのプロトコールによる合成の終了時において、本発明のオリゴヌクレオチドに基づいた化合物は、便利には、修飾型ヌクレオシドが取り込まれている場合には、ホスホラミダイトの供給元により推奨されているように、濃縮アンモニア溶液で脱保護され得る。その生成物であるオリゴヌクレオチドベースの化合物は、好ましくは、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化、脱塩化、および透析により精製される。
【００９９】
[00114]ある特定の実施形態において、本発明による遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、下記の表３に示されたオリゴヌクレオチドの非限定的リストから選択される。表３に示されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）連結を有するが、ホスホロジエステル連結を含んでもよい。しかしながら、ホスホジエステルまたは非ホスホジエステル部分に基づいた他の連結が含まれ得ることを当業者は認識しているだろう。
【０１００】
【表３−１】
2018537528.tif 000012
【０１０１】
【表３−２】
2018537528.tif 000013
【０１０２】
【表３−３】
2018537528.tif 000014
【０１０３】
【表３−４】
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【０１０４】
【表３−５】
2018537528.tif 000016
【０１０５】
[00115]ヒトＮＬＲＰ３へ向けられたＧＳＯについての化合物名は、配列番号９５に描かれているようなオリゴヌクレオチド標的部位に基づいている。マウスＮＬＲＰ３へ向けられたＧＳＯについての化合物名は、配列番号９６のそれらの標的部位に基づいている。例えば、オリゴ＃１３の２つのコピーを含むＧＳＯ（例えば、３’−ＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴ−５’−Ｘ−５’−ＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣ−３’、式中、Ｘは非ヌクレオチドリンカーを表す）は、本明細書において、例えば、「９４３」、または「ｍ９４３」、または「ＧＳＯ  ９３４」、「ｍＧＳＯ−９３４」、または「ＧＳＯ−ｍ９３４」、または「ＮＬＲＰ−９３４」、または「ＧＳＯ  ＮＬＲＰ−９３４」と呼ばれる。追加として、オリゴ＃９３およびオリゴ＃９４などの２つの異なるオリゴヌクレオチドを含むＧＳＯ（例えば、３’−ＡＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡ−５’−Ｘ−５’−ＡＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧ−３’、式中、Ｘは非ヌクレオチドリンカーを表す）は、本明細書において、例えば、「４１０１／４２６５」、「ＧＳＯ  ４１０１／４２６５」、または「ＮＬＲＰ−４１０１／４２６５」、または「ＧＳＯ  ＮＬＲＰ−４１０１／４２６５」と呼ばれる。
【０１０６】
[00116]ある特定の実施形態は、表３に列挙されたオリゴヌクレオチドから独立して選択された２つのオリゴヌクレオチドを含む遺伝子サイレンシング化合物を提供する。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれ独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、もしくは９４、またはそれらの組合せの配列を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれ独立して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、もしくは４１、またはそれらの組合せの配列を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物は、それぞれ独立して、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、もしくは９４、またはそれらの組合せの配列を含む、２つのオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは、同じである。ある特定の実施形態において、遺伝子サイレンシング化合物のオリゴヌクレオチドは異なる。
【０１０７】
[00117]ある特定の実施形態において、本発明は、本発明による遺伝子サイレンシング化合物、および１つもしくは複数のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害性物質、化学療法剤（伝統的な化学療法と最新の標的療法の両方）、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子、またはそれらの組合せを含む組成物を提供する。
【０１０８】
[00118]ある特定の実施形態において、本発明は、細胞を本発明による遺伝子サイレンシング化合物と接触させるステップを含む、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、細胞を、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物と接触させることができる。
【０１０９】
[00119]ある特定の実施形態において、本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、ＮＬＲＰ３発現を阻害することが有益である疾患を処置し、および／または防止することに有用である。
【０１１０】
[00120]ある特定の実施形態はさらに、動物においてＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を低下させるために本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物または組成物を動物に投与するステップを含む、動物においてＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を低下させるための方法を提供する。ある特定の実施形態において、動物はヒトである。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の低下が、疾患を防止し、処置し、改善し、またはその進行を遅らせる。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物を投与することができる。
【０１１１】
[00121]ある特定の実施形態において、動物においてＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を低下させるために、本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物または組成物を動物に投与するステップを含む、疾患または障害を処置するための方法が提供される。ある特定の実施形態において、動物はヒトである。ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物を投与することができる。
【０１１２】
[00122]ある特定の実施形態において、それを必要とする個体におけるＮＬＲＰ３に関連した疾患、障害、および状態の処置、防止、または改善のための方法、化合物、および組成物が提供される。ＮＬＲＰ３に関連した疾患、障害、および状態の処置、防止、または改善のための薬物の調製のための方法および化合物もまた企図される。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物を投与することができる。
【０１１３】
[00123]ＮＬＲＰ３関連疾患、障害、および状態には、家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、慢性乳児神経皮膚関節（ＣＩＮＣＡ）症候群、新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）、多発性硬化症、関節リウマチ、痛風、アルツハイマー病、アレルギーおよび喘息、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、ＩＩ型糖尿病、ぶどう膜炎、高血圧、乾癬、肥満、慢性閉塞性肺疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、粘膜炎、パーキンソン病、石綿症、肝細胞腫、中皮腫、慢性腎臓病、シュニッツラー症候群、蜂巣炎、結膜炎、眼乾燥症候群、壊疽性膿皮症、ＰＡＰＡ症候群（化膿性関節炎、膿皮症、およびざ瘡）、ならびにＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の調節から利益を得るだろう任意の他の疾患、障害、または状態が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１４】
[00124]ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３関連疾患を処置し、防止し、または改善するのに用いられるＮＬＲＰ３遺伝子サイレンシング化合物が提供される。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３遺伝子サイレンシング化合物は、細胞、組織、または動物において、ＮＬＲＰ３  ｍＲＮＡおよび／またはＮＬＲＰ３タンパク質の発現を阻害する能力がある。
【０１１５】
[00125]ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物を動物に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＮＬＲＰ３の異なる領域をターゲティングする２つ以上の遺伝子サイレンシング化合物を投与することができる。
【０１１６】
[00126]疾患の処置、防止、または改善のための薬物の調製のための方法および遺伝子サイレンシング化合物もまた提供される。
[00127]ある特定の実施形態は、疾患を処置し、改善し、または防止するための薬物の製造における本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物の使用を提供する。
【０１１７】
[00128]ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているような追加の作用物質または治療との併用療法により、本明細書に記載されているような疾患を処置し、防止し、または改善するのに用いられる、本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物を提供する。作用物質または治療は、共投与し、または同時に投与することができる。
【０１１８】
[00129]ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているような追加の作用物質または治療との併用療法により、本明細書に記載されているような疾患を処置し、防止し、または改善するための薬剤の製造における、本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物の使用を提供する。作用物質または治療は、共投与し、または同時に投与することができる。
【０１１９】
[00130]ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているような追加の作用物質または治療をその後、投与される患者において、本明細書に記載されているような疾患を処置し、防止し、または改善するための薬剤の製造における、本明細書に記載されているような遺伝子サイレンシング化合物の使用を提供する。
【０１２０】
[00131]本発明による方法のいずれかにおいて、本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、単独で、および／または本発明による遺伝子サイレンシング化合物の遺伝子発現調節効果を減弱させない、疾患もしくは状態を処置し、もしくは防止するのに有用な任意の他の作用物質と組み合わせて、直接的な遺伝子発現調節効果を生じることにより様々に作用することができる。本発明による方法のいずれかにおいて、疾患または状態を処置し、または防止するのに有用な作用物質は、ワクチン、抗原、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、細胞傷害性物質、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ３および／もしくはＴＬＲ７のアンタゴニスト、ならびに／またはＴＬＲ８のアンタゴニスト、ならびに／またはＴＬＲ９のアンタゴニスト）、化学療法剤（伝統的な化学療法と最新の標的療法の両方）、標的療法剤、活性化細胞、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、アジュバント、および共刺激分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、または修飾型アミノ酸を含むペプチド）、またはそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、本発明による遺伝子サイレンシング化合物は、本発明によるオリゴヌクレオチドに基づいた化合物の遺伝子発現調節の特異性または大きさを増強するために、他の化合物（例えば、脂質またはリポソーム）と組み合わせて投与することができる。
【０１２１】
[00132]本発明による方法のいずれかにおいて、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、任意の適切な経路によることができ、その経路には、非限定的に、筋肉内、非経口、粘膜、経口、舌下、腫瘍内、経皮、局所的、吸入、髄腔内、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼薬もしくはうがい薬の形が挙げられる。本発明による方法のいずれかにおいて、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、眼、膀胱、肝臓、肺、腎臓、または肺などであるが、それらに限定されない組織または器官へ直接的であり得る。ある特定の実施形態において、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、筋肉内投与による。ある特定の実施形態において、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、粘膜投与による。ある特定の実施形態において、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、眼内投与による。ある特定の実施形態において、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、経口投与による。ある特定の実施形態において、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、直腸内投与による。ある特定の実施形態において、単独での、または任意の他の作用物質と組み合わせての本発明による遺伝子サイレンシング化合物の投与は、髄腔内投与による。
【０１２２】
[00133]本発明による遺伝子サイレンシング化合物の治療用組成物の投与は、有効量を用いる公知の手順を用い、かつ疾患の症状または代替マーカーを低下させるのに効果的な時間の間、行うことができる。例えば、疾患および／または障害を処置するための本発明による遺伝子サイレンシング化合物の有効量は、症状を軽減し、もしくは低下させ、または疾患および／もしくは障害を遅らせ、もしくは改善するのに必要なその量であり得る。遺伝子発現を調節する組成物を投与することに関して、本発明による遺伝子サイレンシング化合物の有効量は、本発明による遺伝子サイレンシング化合物の非存在下での遺伝子発現と比較して、所望の調節を達成するのに十分な量である。任意の特定の適用についての有効量は、処置されることになっている疾患もしくは状態、投与されることになっている特定の化合物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度のような因子に依存して変わり得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。
【０１２３】
[00134]全身投与される場合、その治療用組成物は、好ましくは、約０．０００１マイクロモル／Ｌから約１０マイクロモル／Ｌまでの本発明による遺伝子サイレンシング化合物の血中レベルに達するのに十分な用量で投与される。局所投与について、これよりはるかに低い濃度が有効であり得、かつはるかにより高い濃度が許容され得る。好ましくは、本発明による遺伝子サイレンシング化合物の総用量は、１人の患者あたり１日につき約０．００１ｍｇから１ｋｇ体重あたり１日につき約２００ｍｇまでの範囲である。ある特定の実施形態において、総用量は、毎日、週２回、または毎週、投与される１ｋｇ体重あたり０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．３２ｍｇ／ｋｇ、０．４８ｍｇ／ｋｇ、０．３２ｍｇ／ｋｇ、０．６４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の治療用組成物のうちの１つまたは複数の治療的有効量を個体へ、単一の処置エピソードとして、同時に、または順次、投与することが望ましくあり得る。
【０１２４】
[00135]本発明のこの態様による方法は、遺伝子発現のモデル研究に有用である。その方法はまた、ヒトまたは動物疾患の予防的または治療的処置にも有用である。例えば、その方法は、遺伝子発現阻害の小児科および獣医学的な適用に有用である。
【０１２５】
[00136]下記の実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態をさらに例証することを意図され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２６】
細胞培養条件および試薬：
[00137]細胞溶解バッファー、ＮＬＲＰ３抗体、およびα／β−チューブリン抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）製であった。抗ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）製であった。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬、Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー、およびＰＶＤＦ膜は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）製であり、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ  ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅキットはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製であった。ＲＮｅａｓｙキットおよびＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイおよびＰＣＲ試薬は、それぞれ、ＱｉａｇｅｎおよびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された。ＨｙＢｌｏｔ  ＣＬオートラジオグラフィフィルムはＤｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）から購入された。ヒトおよびマウスＩＬ−１８およびＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入された。ＡＴＰはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。全ての他の化学物質および試薬はいずれもＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。
【０１２７】
[00138]マウスマクロファージ様細胞、Ｊ７７４Ａ．１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、１０％熱失活合成ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および抗生物質（１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンＧ／ストレプトマイシン）を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地中で培養した。全ての他の培養試薬は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入された。
【０１２８】
ＧＳＯ／脂質複合体の調製
[00139]全ての遺伝子サイレンシング実験について、抗生物質を含まない培地を用いた。一次スクリーニングについて、表４に示された例示的なＧＳＯを、５ｎＭおよび２５ｎＭ最終濃度でトランスフェクトし、一方、用量反応曲線実験について、ＧＳＯを、５０ｎＭまたは１００ｎＭから開始して段階的に希釈した。トランスフェクションについて、適切なＧＳＯ濃度を、培養培地（無血清）中かまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ中のいずれで調製し、使用直前にリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（最終濃度、３μｌ／ｍｌ）と混合し、室温で２０分間、インキュベートした。
【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
ＧＳＯで処置されたＪ７７４、ＴＨＰ−１、またはＰＢＭＣにおける遺伝子発現のモニタリング
[00141]遺伝子サイレンシングについて、Ｊ７７４細胞を、１２ウェル培養プレートにおいて０．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で一晩、プレーティングした。次の朝、培地を交換し、ＧＳＯ／脂質複合体を加え、細胞を３７℃で２４時間、インキュベートした。
【０１３１】
[00142]ＴＨＰ−１（１２ウェルプレート中、１００万細胞／ｍｌ）細胞を、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌ）で３時間、分化させ、洗浄し、ＲＰＭＩ完全培地中に再懸濁し、一晩、インキュベートした。次の日、ＧＳＯ／脂質複合体を加え、２４時間、インキュベートを継続した。
【０１３２】
[00143]６ウェル培養プレートにおける新鮮に単離されたヒトＰＢＭＣ（１０×１０６細胞／ｍｌ）を、ＧＳＯ／脂質と共に２４時間、インキュベートした。
[00144]実験の終了時、培地を除去し、ペレット化された細胞を溶解し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒキットを用いて、ホモジナイズした。
【０１３３】
ＲＮＡ分析
[00145]Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、製造元のプロトコールに従い、ＲＮＡを単離し、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キットを用いて逆転写した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲシステムにおいて、マウス（Ｍｍ００８４０９０４＿ｍｌ）またはヒト（Ｈｓ００９１８０８２＿ｍｌ）ＮＬＲＰ３に特異的なＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、生成されたｃＤＮＡにリアルタイムＰＣＲを実施した。試料における標的ｍＲＮＡレベルを、内因性対照としてペプチジルプロリルイソメラーゼＢ、ＰＰＩＢ（マウスおよびヒト、それぞれについて、Ｍｍ００４７８２９５＿ｍｌおよびＨｓ００１６８７１９＿ｍｌ）を用いて標準化した。発現データは、ＰＢＳ対照と比較した、ＧＳＯで処理された試料における、ＮＬＲＰ３の相対量かまたはｌｏｇ２ＦＣ（対照の倍数）のいずれかとして示されている。
【０１３４】
タンパク質発現のウェスタンブロッティングおよび定量
[00146]タンパク質発現のモニタリングについて、実験の終了時点で、細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤を含有する冷却ＰＢＳで洗浄し、その後、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解バッファー中に懸濁した。細胞を、氷上で１５分間、溶解し、短時間、超音波処理し、１４０００ｇで２０分間、遠心分離した。上清を新たなバイアルへ移し、さらなる使用まで−７０℃で保存した。試料中のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いるＢｒａｄｆｏｒｄの方法により測定した。試料（２０〜３０μｇ／レーン）を、１０％または４〜１５％勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｒｅａｄｙゲルを用いたゲル電気泳動に供し、ＰＶＤＦ膜上にウェスタンブロットした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０中５％脱脂乳における１時間のブロッキング後、その膜を、適切な一次抗体と共に一晩、インキュベートした。標識されたタンパク質を、ＨＲＰ連結二次抗体を用いる増強化学ルミネセンス方法により可視化し、Ｓｃｉｏｎ画像分析プログラム（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、ＭＤ）を用いて定量化した。ウェスタンブロットの再プロービングについて、ブロットをＰＢＳ中で洗浄し、ストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３０分間、インキュベートした。その後、それらを、ＰＢＳＴ中で、徹底的に洗浄し、上記のプロトコールを用いて、別の一次抗体でプロービングした。
【０１３５】
機能阻害研究
[00147]細胞のＧＳＯとの２４時間のインキュベーション後、培地を交換し、細胞を、リポ多糖（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間、プライミングし、ＡＴＰ（５ｍＭ）で１時間、刺激した。培養上清を、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βおよびＩＬ−１８分泌について分析した。細胞溶解物を、ＮＬＲＰ３についてのＲＮＡ単離および定量リアルタイムＰＣＲ分析のために処理した。
【０１３６】
間質性膀胱炎の動物モデルにおけるｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯ
１）皮下にＧＳＯで処置された急性ＣＹＰ−ＩＣモデル
[00148]ＰＢＳ中に希釈された２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）での腹腔内注射により、週齢７〜９週齢の雌ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の４つの群（ｎ＝１０）において間質性膀胱炎を誘発した。シクロホスファミド投与の１時間後、マウスを、異なる用量のＮＬＲＰ  ＧＳＯまたは媒体としてのＰＢＳの皮下注射により処置した。いかなる処置もない、同じ性別および週齢の５匹のナイーブＣＤ１マウスを対照として用いた。
【０１３７】
[00149]全てのマウスを、疾患誘発後２４時間目に、屠殺した。尿試料を収集し、後でのサイトカインアッセイのために−２０℃で保存した。膀胱を収集し、重量測定し、組織学的プロセスのために１０％中性緩衝ホルマリン中に保存し、または遺伝子発現分析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ中に保存した。結果は図１１〜図１３に示されている。
【０１３８】
２）皮下にＧＳＯで処置された慢性ＣＹＰ−ＩＣモデル
[00150]０日目、１日目、および３日目における１５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの腹腔内注射により、週齢７〜９週間の雌ＣＤ１マウスの２つの群（ｎ＝１０）において間質性膀胱炎を誘発した。シクロホスファミド投与の１日後、２日後、および３日後、マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＮＬＲＰ  ＧＳＯまたは媒体としてのＰＢＳの皮下注射により処置した。いかなる処置もない、同じ性別および週齢の５匹のナイーブＣＤ１マウスを対照として用いた。結果は図１４に示されている。
【０１３９】
３）ＧＳＯの膀胱内点滴注入で処置された急性ＣＹＰ−ＩＣモデル
[00151]ＰＢＳ中に希釈された２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの腹腔内注射により、週齢７〜９週間の雌ＣＤ１マウスの４つの群（ｎ＝５）において間質性膀胱炎を誘発した。シクロホスファミド投与の１時間後、マウスを、異なる用量のＮＬＲＰ  ＧＳＯまたは媒体としてのＰＢＳの膀胱内（ｉ．ｂ．）点滴注入により処置した。いかなる処置もない、同じ性別および週齢の５匹のナイーブＣＤ１マウスを対照として用いた。
【０１４０】
[00152]全てのマウスを、疾患誘発後２４時間目に、屠殺した。尿試料を収集し、後でのサイトカインアッセイのために−２０℃で保存した。膀胱を収集し、重量測定し、組織学のために１０％中性緩衝ホルマリン中に保存した。結果は図１５ＡおよびＢに示されている。
【０１４１】
実験的自己免疫性ぶどう膜炎の動物モデルにおけるｍＮＬＲＰ３  ＧＳＯ
[00153]実験的自己免疫性ぶどう膜炎を誘発するために、１０ｍｇ／ｍｌ濃度までマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｖｏｉｇｔ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＫＳ）を追加した完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｉｓ、ＭＯ）中１：１体積／体積で乳化した、１００μｇのＩＲＢＰ１６１〜１８０ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）および１ｍｇウシ眼ホモジネート（ＩｎＶｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を、週齢６〜７週間の雄Ｂ１０−ＲＩＩＩマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）の尾および２つの大腿部の付け根に注射した。最初の免疫化から４時間後、０．５μｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をマウスに腹腔内注射した。
【０１４２】
[00154]全てのマウスは、７日目に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中１：１体積／体積で乳化した、１００μｇのＩＲＢＰ／１ｍｇウシ眼ホモジネートの追加免疫を受けた。
【０１４３】
[00155]８日目、１０日目、および１３日目において、免疫化されたマウスを、１５ｍｇ／ｋｇのＮＬＲＰ  ＧＳＯまたは媒体としてのＰＢＳの皮下注射により処置した。いかなる処置もない、同じ性別および週齢の５匹のナイーブＢ１０．ＲＩＩＩマウスを対照として用いた。
【０１４４】
[00156]全てのマウスを、１４日目に、血液試料を収集した後、屠殺した。各マウスからの左眼を収集し、組織診断法のために１０％中性緩衝ホルマリン中に保存し、右眼を、遺伝子発現分析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ中に保存した。結果は図１６Ａ〜図１６Ｄに示されている。
【０１４５】
等価物
[00157]当業者は、単に日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載された特定の物質および手順との多数の等価物を認識し、または確認することができるだろう。例えば、オリゴヌクレオチドと重複するアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられ得る。そのような等価物は、この発明の範囲内であるとみなされ、以下の特許請求の範囲によって網羅される。
【０１４６】
[00158]この発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され、かつ記載されているが、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形および詳細の様々な変更がなされ得ることは当業者により理解されているだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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