(57)【要約】  本開示は、単離されたナイーブ型多能性幹細胞ならびにそれを発生させ、培養する方法及び組成物を提供する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイーブ型多能性幹細胞の誘導方法であって、有効量のリゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニストを含む培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養し、それにより、前記プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させることを含む、方法。
【請求項２】
ナイーブ型多能性幹細胞の、そのナイーブ状態での維持方法であって、有効量のＬＰＡＲのアゴニストを含む培養培地中で前記ナイーブ型多能性幹細胞を培養することを含む、方法。
【請求項３】
前記培地が、有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地が、有効量のシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＴＡＴ３活性化因子が、白血病抑制因子（ＬＩＦ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＰＡＲのアゴニストが、１−オレオイル−２−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオネート（ＯＭＰＴ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量の前記ＬＰＡＲのアゴニストが、約１０ｎＭ〜約５μＭである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記酸化防止剤が、ｎ−アセチルシステインである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地が、有効量のＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地が、有効量のアクチビンＡ、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナイーブ型多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚盤胞、誘導多能性幹細胞、及び体細胞からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナイーブ型多能性幹細胞が、ヒト細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
フィブロネクチン層またはラミニン層上で前記プライム型多能性幹細胞及び／またはナイーブ型多能性幹細胞を培養することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライム型多能性幹細胞が、１０日未満で前記ナイーブ型多能性幹細胞に復帰する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライム型多能性幹細胞が、少なくとも１つの外因性リプログラミング因子、少なくとも１つの外因性ＲＮＡ、またはこれらの両方を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの外因性リプログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、またはＬｉｎ２８である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの外因性ＲＮＡが、ｐ５３またはＬｉｎ２８の発現を下方調節する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ある一定期間の間、低酸素条件下で前記プライム型多能性幹細胞及び／または前記ナイーブ型多能性幹細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法により調製された、単離されたナイーブ型多能性幹細胞。
【請求項２１】
前記ナイーブ型多能性幹細胞が、Ｘ染色体不活性化特異的転写産物（ＸＩＳＴ）を発現する、請求項２０に記載の単離されたナイーブ型多能性幹細胞。
【請求項２２】
単離されたナイーブ型多能性幹細胞と、有効量のＬＰＡＲのアゴニストと、を含む、組成物。
【請求項２３】
有効量のＢＭＰ、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの１つ以上をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
有効量のＳＴＡＴ３活性化因子をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＳＴＡＴ３活性化因子が、白血病抑制因子（ＬＩＦ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＬＰＡＲのアゴニストが、ＯＭＰＴ、ＬＰＡ、またはこれらの組み合わせである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＬＰＡＲのアゴニストが、約１０ｎＭ〜約５μＭの濃度で前記培地中に存在する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記酸化防止剤が、ｎ−アセチルシステインである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
有効量のＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３１】
有効量のアクチビンＡ、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３２】
前記単離されたナイーブ型多能性幹細胞の少なくとも一部が、少なくとも１つの外因性リプログラミング因子、少なくとも１つの外因性ＲＮＡ、またはこれらの両方を発現するように改変されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのリプログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、またはＬｉｎ２８である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのＲＮＡが、ｐ５３またはＬｉｎ２８の発現を下方調節する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ナイーブ型多能性幹細胞が、低酸素条件下で培養される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３６】
１０ｎＭ〜約１０μＭのＬＰＡＲのアゴニストを含む、細胞培養培地。
【請求項３７】
前記細胞培養培地が、有効量のＢＭＰ、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３６に記載の細胞培養培地。
【請求項３８】
前記細胞培養培地が、有効量のＳＴＡＴ３活性化因子をさらに含む、請求項３６に記載の細胞培養培地。
【請求項３９】
前記ＳＴＡＴ３活性化因子が、ＬＩＦである、請求項３８に記載の細胞培養培地。
【請求項４０】
前記ＬＰＡＲのアゴニストが、ＯＭＰＴ、ＬＰＡ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３６に記載の細胞培養培地。
【請求項４１】
前記ＬＰＡＲのアゴニストが、約１０ｎＭ〜約５μＭの濃度で前記培地中に存在する、請求項３６に記載の細胞培養培地。
【請求項４２】
前記酸化防止剤が、ｎ−アセチルシステインである、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４３】
前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４４】
前記細胞培養培地が、有効量のＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項３６に記載の細胞培養培地。
【請求項４５】
ｂＦＧＦと、アクチビンＡまたはトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）のうちの１つ以上と、を含む、プライム型多能性幹細胞を培養するための細胞培養培地。
【請求項４６】
ナイーブ型多能性幹細胞の誘導方法であって、培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養することを含み、前記培養培地が、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせを実質的に含まない、方法。
【請求項４７】
単離されたプライム型多能性幹細胞であって、前記単離されたプライム型多能性幹細胞が、ＬＰＡＲのアゴニストを含む培地の存在下でインキュベートされ、前記プライム型ヒト多能性幹細胞が、インキュベーション中またはインキュベーション後に、ナイーブ型多能性幹細胞に復帰される、単離されたプライム型多能性幹細胞。
【請求項４８】
前記培地が、有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、酸化防止剤、脱メチル化酵素、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記培地が、有効量のＳＴＡＴ３活性化因子をさらに含む、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５０】
前記ＳＴＡＴ３活性化因子が、ＬＩＦである、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
前記ＬＰＡＲが、ＬＰＡＲ１である、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５２】
前記ＬＰＡＲのアゴニストが、ＯＭＰＴ、ＬＰＡ、またはこれらの組み合わせである、請求項４８に記載の細胞。
【請求項５３】
前記酸化防止剤が、ｎ−アセチルシステインである、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５４】
前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５５】
前記培養培地が、有効量のＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項４８に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１５年５月５日に出願された、米国仮出願第６２／１５７，４１１号、及び２０１５年１１月１６日に出願された、米国仮出願第６２／２５５，９９０号に対する優先権を主張し、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれ、依拠する。
【０００２】
成人のあらゆる細胞型に分化する多能性幹細胞の能力は、多くの疾患及び障害の治療にこれらの細胞及び多能性幹細胞由来の細胞の使用に関して大きな期待を生み出した。未解決の問題の１つは、「ナイーブ」状態として知られるより未分化な状態でこれらの細胞を発生させ、培養する能力である。これらのナイーブ型多能性幹細胞は、ナイーブ状態がエピジェニックな抑制マーカーの除去及び多能性マーカーの上方調節に関連し、より少ない系譜及びエピジェニックな制限を有する細胞をもたらすため、少なくとも部分的に、再生医療における使用に最も適切であると考えられる。したがって、本開示は、ナイーブ状態にある多能性幹細胞を復帰及び維持するための新規方法ならびに細胞培養培地を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ナイーブ状態及びプライム状態の２つの異なる多能性幹細胞（ＰＳＣ）の状態が、特定されている。これらの多能性状態は、分子特徴及び細胞特徴により区別することができる。ナイーブ型ＰＳＣは、とりわけ、活性なＸ染色体状態、より弛緩したクロマチン、及びＬｉｆ／Ｓｔａｔ３に応答した自己再生などの特性を呈する。一方、プライム型ＰＳＣは、とりわけ、不活性なＸ染色体、より凝縮したクロマチン、及びＬｉｆ／Ｓｔａｔ３に対する応答の欠如などの特性を呈する。ナイーブ型ＰＳＣは内部細胞塊由来の幹細胞に非常に似ており、一方、プライム型ＰＳＣは外胚葉由来の細胞に非常に似ていると考えられる。特に、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むヒトＰＳＣは、外胚葉幹細胞（ＥｐｉＳＣ）と分子特性及び機能特性を共有する。細胞培養条件は、ＰＳＣに影響を及ぼし、ＰＳＣ、特にヒトＰＳＣに、よりプライム型のＰＳＣ状態に特有の特徴を呈させる。ナイーブ型及びプライム型の両方の細胞は、３つ全ての胚葉に分化できるが、ナイーブ型細胞は、プライム型細胞よりも効率的にインビボ発達に寄与する。
【０００４】
真の「ナイーブ」状態がヒトＰＳＣに存在するかどうか、及びＰＳＣを復帰させ、ナイーブ状態を維持するための好適な培養技術が開発されるかどうかは未だ究明されていない。最近の試みにもかかわらず、ナイーブ型ＰＳＣを誘導する方法及び培地は自己再生を維持できない、染色体の安定性を保存できない、かつ／または効率が悪いかのいずれかである。ナイーブ型ＰＳＣを誘導するための強固な既知組成系は未だ得られていない。かかる系は、これらの細胞の治療可能性の劇的な増加をもたらす可能性が高い。したがって、ナイーブ型ＰＳＣの誘導及び維持のための改善された方法及び培地の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、薬剤の特定のカクテルが基本培地を補足し、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰でき、部分的に、有効量のリゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニストを含む培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養し、それにより、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させることを含む、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導する方法を目的とする発見を前提とする。
【０００６】
他の態様では、本開示は、有効量のＬＰＡＲのアゴニストを含む培養培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞をそのナイーブ状態に維持するための方法を提供する。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書において開示され、記載される方法のいずれかにより調製された、単離されたナイーブ型多能性幹細胞を提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、ＬＰＡＲのアゴニストを含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させるための細胞培養培地を提供し、このプライム型多能性幹細胞は、インキュベーション中またはインキュベーション後にナイーブ型多能性幹細胞に復帰される。いくつかの態様では、本開示は、１０ｎＭ〜約１０μＭのＬＰＡＲのアゴニストを含む細胞培養培地を提供する。また他の態様では、本開示は、ｂＦＧＦを含み、基本培地にアクチビンＡ及びＴＧＦ−βのうちの１つ以上をさらに含む、プライム型多能性幹細胞を培養するための細胞培養培地を提供する。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、単離されたプライム型多能性幹細胞を提供し、この単離されたプライム型多能性幹細胞は、ＬＰＡＲのアゴニストを含む組成物の存在下でインキュベートされ、このプライム型多能性幹細胞は、インキュベーション中またはインキュベーション後に、ナイーブ型多能性幹細胞に復帰される。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、有効量のＬＰＡＲのアゴニスト中でこの単離されたナイーブ型多能性幹細胞を培養することを含む方法によって調製された、単離されたナイーブ型多能性幹細胞を提供し、このプライム型多能性幹細胞は、インキュベーション中またはインキュベーション後に、ナイーブ型多能性幹細胞に復帰される。別の態様では、本開示は、単離されたナイーブ型多能性幹細胞と、有効量のＬＰＡＲのアゴニストとを含む組成物を提供する。
【００１１】
一実施形態では、培地は、有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの１つ以上をさらに含む。他の実施形態では、培地は、脱メチル化酵素、酸化防止剤、及びＬＰＡＲのアゴニストを含む。また他の実施形態では、培地は、有効量の脱メチル化酵素及びＬＰＡＲのアゴニストを含む。
【００１２】
一実施形態では、培地は、有効量のＳＴＡＴ３活性化因子、例えば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲは、ＬＰＡＲ１、ＬＰＡＲ２、ＬＰＡＲ３、ＬＰＡＲ４、ＬＰＡＲ５、及びＬＰＡＲ６からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ＬＰＡＲはＬＰＡＲ１である。いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストはＯＭＰＴである。他の実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストは、約１０ｎＭ〜約１０μＭの濃度で培地中に存在する。他の実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストは、５μＭ未満の濃度で培地中に存在する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、酸化防止剤は、ｎ−アセチルシステインである。いくつかの実施形態では、脱メチル化酵素は、アスコルビン酸である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、培養培地は、有効量のＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、培養培地は、有効量のアクチビンＡ、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、ｂＦＧＦ、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞は、胚性幹細胞、胚盤胞、誘導多能性幹細胞、及び体細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞は、ヒト細胞である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、単離されたナイーブ型多能性幹細胞の少なくとも一部は、少なくとも１つの外因性リプログラミング因子、少なくとも１つの外因性ＲＮＡ、またはこれらの両方を発現するように改変されている。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの外因性リプログラミング因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、またはＬｉｎ２８である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡは、ｐ５３またはＬｉｎ２８の発現を下方調節する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、プライム型多能性幹細胞及び／またはナイーブ型多能性幹細胞は、低酸素状態にある。他の実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞またはプライム型多能性幹細胞は、ある一定期間の間、低酸素条件下で培養される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、プライム型多能性幹細胞及び／またはナイーブ型多能性幹細胞は、フィブロネクチン層またはラミニン層上で培養される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、プライム型多能性幹細胞は、１０日未満でナイーブ型多能性幹細胞に復帰する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、約１０％超のプライム型多能性幹細胞がナイーブ型多能性幹細胞に復帰する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞は、ＸＩＳＴを発現した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マウス外胚葉幹細胞（ｍＥｐｉＳＣｓ）におけるＸ染色体不活性化状態に影響を及ぼす培養条件を示す。（Ａ）３つの異なる培養条件下のＸｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣの細胞形態（位相差、ＰＣ）及びＧＦＰ発現（ＧＦＰ）を示す細胞像。Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣは、アクチビンＡ及びｂＦＧＦ（ＡｃｔＡ＋ＦＧＦ）を含有する培地中で維持され、ＧＦＰ陰性（ＸａＸｉ）である。Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣが、ＬＩＦと、ＭＡＰＫ及びＧＳＫ３ｂ（ＬＩＦ＋２ｉ）用の２つの化学阻害剤とを含有する培地、またはＳＮＬフィーダー細胞（ＳＮＬ−ＣＭ）で条件付けされた培地に移された後、Ｘｉ−ＧＦＰ陰性ｍＥｐｉＳＣのうちのいくつかは８日以内にＧＦＰ陽性（ＸａＸａ）になる。（Ｂ）パネルＡの３つの異なる培地中のＧＦＰ陽性クラスターの数を示す棒グラフ。（Ｃ）（Ａ）のＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）発現を示すＦＡＣＳドットプロット。ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の％（右上）はプロットにおいて拡大される。（Ｄ）示される異なる培養条件下のＧＦＰ陽性クラスターの相対数を示す棒グラフ。条件付けされていない培地（非ＣＭ）中のＧＦＰクラスターの数は１に設定される。「Ｊａｋｉ」はＪａｋキナーゼ阻害剤を示し、「ＭＥＦ−ＣＭ」はＭＥＦフィーダー細胞で条件付けされた培地を示す。（Ｅ）ＥＬＩＳＡで定量化されたＭＥＦ−ＣＭ及びＳＮＬ−ＣＭ中のＬＩＦの濃度を示す棒グラフ。（Ｄ）においてＬＩＦ＋２ｉ、非ＣＭ＋ＬＩＦ、及びＭＥＦ−ＣＭ＋ＬＩＦに使用された組換えＬＩＦの濃度も定量化され、ＬＩＦとして示される。ＭＥＦ−ＣＭ中のＬＩＦは、ＥＬＩＳＡにより検出不可能なレベルである。（Ｆ）示される培地条件下でのＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）の発現を示すＦＡＣＳドットプロット。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊はｐ＜０．０５を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差である。
【００２７】
【図２】アクチビンＡ及びｂＦＧＦがＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化を抑制することを示す。（Ａ）ＥＬＩＳＡで定量化されたＭＥＦ−ＣＭ及びＳＮＬ−ＣＭ中のアクチビンＡの濃度を示す棒グラフ。（Ｂ）示される異なる培養条件下のＧＦＰ陽性クラスターの相対数を示す棒グラフ。（Ｃ）及び（Ｄ）示される異なる培養条件下でのＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）の発現を示すＦＡＣＳドットプロット。（Ｄ）において、「ＡｃｔＲ」は組換えアクチビンＡ受容体タンパク質複合体を示し、「対照」は対照タンパク質を示す。（Ｅ）Ｘｉ再活性化についてのアクチビンＡシグナル伝達経路のスキーム。（Ｆ）及び（Ｇ）示される異なる培養条件下でのＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）の発現を示すＦＡＣＳドットプロット。（Ｆ）において、「ＳＢ」は、Ｓｍａｄ２／３活性化の化学阻害剤であるＳＢ４３１５４２を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差である。
【００２８】
【図３】アスコルビン酸及びＬＰＡがＸｉ再活性化を増強することを示す。（Ａ）図１及び２に使用された異なる培養培地における構成成分を示す表。「ＡＡ」はアスコルビン酸を示し、「脂質」はノックアウト血清置換における脂質混合物を示す。（Ｂ）示される異なる培養条件下でのＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）の発現を示すＦＡＣＳドットプロット。（Ｃ）示される各培養条件下のＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の％での倍率変化を示す棒グラフ。ＬＩＦ条件下のＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の割合は１に設定される。（Ｄ）示される異なる培養条件下でのＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）の発現を示すＦＡＣＳドットプロット。「Ｋｉ」は、ＬＰＡＲ１及びＬＰＡＲ３の競合阻害剤であるＫｉ１６４２５を示す。（Ｅ）示される各培養条件下のＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の％での倍率変化を示す棒グラフ。Ｋｉ１６４２５なしのＬＩＦまたはＬＩＦ＋ＬＰＡ条件下のＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の割合は１に設定される。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊はｐ＜０．０５を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差である。
【００２９】
【図４】ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＯＭＰＴ（ＬＢＡＯ）の組み合わせが効率的にＸｉを再活性化し、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に転換することを示す。（Ａ）ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＯＭＰＴ（ＬＢＡＯ）を含有する培地におけるＧＦＰ（ｘ軸）及びＣＤ３１（ｙ軸）の発現を示すＦＡＣＳドットプロット。（Ｂ）細胞をＬＩＦ＋２ｉ培地に移すことにより、（Ａ）に示される培地から選択されたＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞を示すＦＡＣＳドットプロット。未染色（左）及び染色した試料（右）を示す。（Ｃ）ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞におけるＡｔｒｘ及びＴｓｉｘについてのＲＮＡ  ＦＩＳＨ。両遺伝子について２つの新生核内フォーカスを呈する細胞の％が挿入される。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色される。（Ｄ）ｍＥＳＣｓ  Ｅ１４、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞及び親Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにおける、Ｇａｐｄｈに対する多能性及び分化マーカーの発現レベルを示す棒グラフ。分析された遺伝子は図の上に示される。ｙ軸は対数スケールでの遺伝子の発現レベルを示す。（Ｅ）マウスの発達に対する、注入されたＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の寄与を示す胚の画像。ＧＦＰ陽性胚（下）は、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞がマウスの発達に寄与できることを示す。上の胚はＧＦＰ陰性であるため、陰性対照として機能する。（Ｆ）ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞または親Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣの胚盤胞注入により得られた高度にキメラのマウスの％を示す棒グラフ。１０匹のマウスを得、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の胚盤胞注入後に分析し、一方で、３０匹のマウスを得、親Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣについて分析した。Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣ注入によってキメラは得られなかった。（Ｇ）ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞を注入した胚盤胞の生殖系列伝達を示すＦ１新生仔の写真。薄い毛色の仔は生殖系列伝達を示す。
【００３０】
【図５】ＬＢＡＯがナイーブ型多能性に向かって転写因子を編成することを示す。（Ａ）ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＯＭＰＴ（ＬＢＡＯ）を含有する培地における転換の経時変化中の転写因子Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｐｒｄｍ１４及びＮａｎｏｇの発現レベルを示す線グラフ。示される発現レベルは、親Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣ（一番左のレーン：ＥｐｉＳＣ）または経時変化の示される時間点（２日目〜６日目）のＧａｐｄｈの発現レベルに対するものである。（Ｂ）転換の経時変化中（２日目〜７日目）のＧＦＰ＋ＣＤ３１＋（二重）、ＧＦＰ＋（ＧＦＰ単一）、及びＣＤ３１＋細胞（ＣＤ３１単一）の％を示す線グラフ。（Ｃ）示される培地（グラフの下）におけるある１日のＫｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＮａｎｏｇの相対発現レベルを示す棒グラフ。アクチビンＡ及びｂＦＧＦ（ＡｃｔＡ＋ＦＧＦ）を含有する培地中の発現レベルは１に設定される。「基本」はＡｃｔＡ＋ＦＧＦ及びＬＢＡＯと同じ基本培地を示すが、いずれの追加の構成成分を添加していないものである。（Ｄ）グラフの下に示される培地中で培養された、ＧＦＰ＋細胞及び転写因子Ｋｌｆ２（青）、Ｋｌｆ４、Ｐｒｄｍ１４、及びＮａｎｏｇの発現レベルの％での倍率変化を示す棒グラフ。ＬＢＡＯ培地におけるＧＦＰ＋細胞及び転写因子の発現レベルの％は１に設定される。（Ｅ）目的の遺伝子のノックダウン６日後、ＬＢＡＯ培地中で培養されたＧＦＰ＋細胞の％での倍率変化を示す棒グラフ。ＭＯＣＫベクター導入後のＧＦＰ＋細胞の％は１に設定される。目的の遺伝子のそれぞれを標的とし、Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣに導入されたｓｈＲＮＡベクターは、棒グラフの下に示される。（Ｆ）ＬＢＡＯ培地中で、６日間（Ｆ）で試験されたｓｈＲＮＡ発現細胞（ヒートマップの上）において分析された遺伝子（ヒートマップの左）の相対発現レベルを示すヒートマップ。ＧＦＰ  ｓｈＲＮＡ発現細胞における発現レベルは１に設定される。発現レベルインジケータはヒートマップの右側に示される。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊はｐ＜０．０５を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差である。
【００３１】
【図６】プライム型ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）がＬＰＡ含有培地においてナイーブ型ＰＳＣに特有の細胞に転換されることを示す。（Ａ）プライム培地及びＬＰＡ含有培地（復帰培地）におけるｈｉＰＳＣのコロニー形態の比較。（ｂ）復帰培地中で成長したヒトｉＰＳＣは、ＮＡＮＯＧ（左上のパネル）及びＤＮＡ（右上のパネル）に対して抗体で染色された。陰性対照は下のパネルに示される。
【００３２】
【図７】脂質含有培地中で培養されたとき、非組み込みエピソームベクターでリプログラミングされたプライム型ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）がナイーブ型ＰＳＣに特有の細胞に転換されることを示す。パネルは、脂質不含の対照培地と比較したときの、ＯＭＰＴまたはＯＭＰＴ＋ＬＰＡ含有培地における組み込みなしのｈｉＰＳＣのコロニー形成の代表的な画像を示す。脂質含有培地中での培養は、ｈｉＰＳＣを、ナイーブ型ＰＳＣに特有の細胞に転換する。
【００３３】
【図８】様々な条件のＬＰＡ及びＯＭＰＴ中で培養されたプライム型ＰＳＣの細胞形態を示す。細胞毒性は、１０ｎＭまで低い濃度のＬＰＡで観察されたが、高濃度のＯＭＰＴ（１００ｎＭ及び５００ｎＭ）では、毒性はほとんどまたは全く観察されなかった。
【００３４】
【図９】ヒトナイーブ型多能性幹細胞対プライム型多能性幹細胞におけるナイーブ型多能性幹細胞マーカー発現を示す。ナイーブ型細胞は、プライム型細胞と比較して、高レベルのＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＫＬＦ４を発現した（プライム型細胞に関してのＮＡＮＯＧ及びＫＬＦ１７データは示さない）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、制限することが意図されないことも理解されたい。
【００３６】
本開示の発明を実施するための形態は、単に読者の便宜のために様々な節に分けられ、任意の節に見出される開示は別の節において見出される開示と組み合わされ得る。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料が本発明の実践または試験においても使用され得るが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が関連して言及される方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により組み込まれる。
【００３７】
全ての数値指定、例えば、範囲を含む、ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量は、適切な場合、０．１または１．０ずつ（＋）または（−）変動される近似である。常に明確に記述されるわけではないが、全ての数値指定は用語「約」が先行することを理解されたい。常に明確に記述されるわけではないが、本明細書に記載される試薬は単に例示であり、かかるものの等価物が当該技術分野で既知であることも理解されたい。
【００３８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、［ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈に明確に示されない限り、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「多能性幹細胞（ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の多能性幹細胞を含む。
【００３９】
Ｉ．定義
本明細書で使用されるとき、以下の用語は以下の意味を有する。
「約」という用語は、数値指定、例えば、範囲を含む、温度、時間、量、濃度などの前に使用されるとき、（＋）または（−）１０％、５％、または１％変動し得る近似を示す。
【００４０】
また、本明細書で使用されるとき、「及び／または」は、関連する列記される項目のうちの１つ以上の任意の及び全ての可能な組み合わせを指し、かつ包含し、ならびに代替え（「または」）で解釈されるとき、組み合わせを欠く。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「アゴニスト」という用語は、薬剤を指し、その存在は、受容体についての天然に生じるリガンドの存在に起因する活性と同じである受容体の活性をもたらす。リゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニストは、ＬＰＡＲに結合し、その受容体に特有の生理学的または薬理学的応答を開始できる。
【００４２】
「含むこと（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物、例えば、細胞培養培地及び方法が列挙される要素を含むが、他を除外しないことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用されるとき、「本質的にからなる」は、記述される目的のための組み合わせに対する任意の本質的な意義をもつ他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本質的に本明細書に定義される要素からなる組成物は、主張する発明の基本的及び新規特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しない。「からなる」は、微量元素を超える他の成分及び実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの接続句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００４３】
「幹細胞」という用語は、未分化のまたは部分的に分化された状態にあり、自己再生及び分化した子孫を発生させる能力を有する細胞を指す。自己再生は、幹細胞の能力が、増殖し、かかる幹細胞をより多く生じさせる一方で、その発達可能性（すなわち、全能性、多能性、複能性等）を維持することと定義される。「体性幹細胞」という用語は、本明細書において、胎性、若年性、及び成人組織を含む、非胚性組織由来の任意の幹細胞を指すように使用される。体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、及び心筋を含む、多種多様な成人組織から単離されている。例示的な天然に生じる体性幹細胞としては、間葉系幹細胞及び造血系幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、胚性幹細胞であってもよい。本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」は、受精後であるが、妊娠の最終時点前に形成された組織由来の幹細胞を指し、前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織、または妊娠中のいずれかの時点、必ずではないが、典型的には、およそ妊娠１０〜１２週前に取られた胎性組織を含む。最も頻繁には、胚性幹細胞は、初期の胚または胚盤胞由来の全能性細胞である。胚性幹細胞は、限定されないが、ヒト組織を含む好適な組織から、または確立された胚性細胞系から直接得られ得る。
【００４４】
「全能性」という用語は、身体におけるあらゆる組織または細胞型、ならびに胎盤などの胚外組織を生じさせることができる幹細胞を指す。「多能性」幹細胞は、身体におけるあらゆる細胞型を生じさせることができる。より小さいまたは限られた数の異なる細胞型を生じさせることができる幹細胞は、一般に、「複能性」と称される。したがって、全能性細胞は、全てではないが、大半の胎児発達に必要な組織を生じさせることができる多能性細胞に分化する。多能性細胞は、特定の機能を有する細胞を生じさせることに深く関与する複能性細胞へのさらなる分化を経る。例えば、複能性造血系幹細胞は、血液中に、赤血球、白血球、及び血小板を生じさせる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「多能性」という用語は、異なる条件下で、３つ全ての生殖細胞層（すなわち、内胚葉（例えば、内臓組織）、中胚葉（例えば、血液、筋肉、及び血管）、及び外胚葉（例えば、皮膚及び神経）に特有の細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、主に、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して、３つ全ての胚葉に分化するそれらの能力を特徴とする。多能性は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）マーカーの発現によっても証明されるが、多能性の好ましい試験は、例えば、インビトロ分化アッセイにより３つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力の実証である。多能性の２つの相、つまり、ナイーブ状態及びプライム状態が存在し得る。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、多能性幹細胞に関して「ナイーブ状態」という用語は、典型的には、とりわけ、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ２、及びＫｌｆ４を発現する、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３または２ｉ（ＥＲＫｉ／ＧＳＫｉ）のいずれかに応答して自己再生する、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して分化する、ＸａＸａ  Ｘ染色体状態を呈する、の特徴により特定される細胞を指す。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（６）：４８７−４９２。ナイーブ型細胞は、プライム型細胞よりも効率的にインビボ発達に寄与し、したがって、再生医療により適切な細胞型であると考えられることが提案される。ナイーブ状態は、時折、基底状態と称される。幹細胞に関して、「ナイーブ様」という用語は、ナイーブ状態の特徴のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。場合によっては、ナイーブ様幹細胞は、ナイーブ幹細胞によって発現されるよりも低い程度で、ナイーブ状態の少なくとも１つの特徴を発現する。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、多能性幹細胞に関して「プライム状態」という用語は、典型的には、とりわけ、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇを発現する、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３に応答しない、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して自己再生する、ＸａＸｉ  Ｘ染色体活性化状態を呈する、の特徴により特定される細胞を指す。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（６）：４８７−４９２。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、細胞に関して「単離された」という用語は、少なくとも部分的に、細胞が天然に生じる環境とは異なる環境にある細胞を指し、例えば、細胞が多細胞生物において天然に生じ、細胞が多細胞生物から取り除かれる場合、細胞は単離される。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離される細胞である。当業者には明らかであるように、天然に生じないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質は、その天然に生じる対応物からそれらを区別するための「単離」を必要としない。
【００４９】
「誘導多能性幹細胞」という用語は、その一般的な意味を有するものとし、多能性の少なくとも１つの特徴を呈するようにリプログラミングされた分化した哺乳類体細胞（例えば、皮膚などの成人体細胞）も指すものとする。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、レトロウイルス、レンチウイルス、エピソーム、小分子、または改変されたＲＮＡなど、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して誘導され得る。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−８７２、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０８（１９）：７８３８−７８４３，Ｓｅｌｌ，Ｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３．Ｐｒｉｎｔ．Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７（５）：６１８−６３０を参照されたい。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）」及び「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、互換的に使用され、細胞（例えば、幹細胞）の成長を支持するために使用される固体または液体の物質を指す。好ましくは、本明細書で使用される培養培地は、幹細胞を未分化状態に維持することができる液体物質を指す。培養培地は、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えばサイトカインなど、成長因子、及びホルモンなどの成分の組み合わせを含む水系培地であってもよく、これらの全ては細胞増殖に必要であり、幹細胞を未分化状態に維持することができる。例えば、培養培地は、例えば、本明細書でさらに記載されるように、必要な添加物で補足されたＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）などの合成基本培地であってもよい。いくつかの実施形態では、培養培地は、幹細胞と使用するために特別に配合された培養培地、例えば、ｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）またはＳｔｅｍＦｉｔ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、培養培地の混合物であってもよい。好ましくは、本開示の培養培地に含まれる全ての成分は、実質的に純粋であり、組織培養グレードである。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉａ）」及び「基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）」は、互換的に使用され、添加物を含まない培養培地を指す。基本培地は、異なる基本培地の混合物を含み得る。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「その等価物」という用語は、同一もしくは類似の機能及び／または同一もしくは類似の成分を有する薬剤を指す。その等価物は、当業者により代替えの薬剤として使用される場合がある。例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地のその等価物は、ＮｅｕｒａｌＱ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）であり得る。その等価物はまた、市販の培地の手製版であってもよい。例えば、ＤＭＥＭ−Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘの等価物は、２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（またはＧｌｕｔａｍａｘ）、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１２００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを混合することにより作製され得る。
【００５３】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤または化合物（例えば、ＢＭＰ４、ＬＰＡＲのアゴニストである外因性ＲＮＡ）の量である。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬量であり得る。これらのパラメータの決定は十分に当該技術分野の範囲内である。これらの検討事項ならびに効果的な配合及び投与手順は当該技術分野で周知であり、標準的な教本に記載されている。
【００５４】
ＩＩ．細胞
本発明は、薬剤の特定のカクテルが基本培地を補足し、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞（ＰＳＣ）に復帰できるという発見に基づく。
【００５５】
本発明のＰＳＣは、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）、胚盤胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または体細胞を含む、あらゆる多能性幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞は、ＥＳＣ、ＥＧＣ、胚盤胞、ｉＰＳＣ、または体細胞からなる群から選択される。他の実施形態では、プライム型多能性幹細胞は、ＥＳＣ、ＥＧＣ、胚盤胞、ｉＰＳＣ、または体細胞からなる群から選択される。
【００５６】
本発明のＰＳＣは、哺乳動物、好ましくはヒトに由来し得るが、非ヒト霊長類、ネズミ（すなわち、マウス及びラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等を含み、またこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＳＣはヒトＰＳＣである。
【００５７】
ＥＳＣは当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、ＥＳＣは、胚盤胞段階または外胚葉段階の胚から単離され得る。ＥＳＣは、マウス（Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７：３３１−３３９）、ラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８−２９２）、非ヒト霊長類（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４−７８４８）、及びヒト（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９１）：１１４５−１１４７）を含むが、これらに限定されない、多くの種から得られている。ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）は、典型的には、ヒトインビトロ受精（ＩＶＦ）胚の残り、または廃棄されたものから得られるが、任意の利用可能な源から、及び当該技術分野で既知の任意の方法により得ることができる。例えば、いくつかの方法は、ＩＶＦプロセス中に胚から単一細胞を取り出すことを伴う。Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２（２）：１１３−１１７。本方法は、胚を同時に破壊することなく、ｈＥＳＣ系の発生を可能にする。多くの市販のｈＥＳＣが利用可能であり、本開示の実施形態に従って使用され得ることも理解されたい。市販の胚性幹細胞系の非限定的な例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＣＨＢ−４、ＣＨＢ−５、ＣＨＢ−６、ＣＨＢ−８、ＣＨＢ−９、ＣＨＢ−１０、ＣＨＢ−１１、ＣＨＢ−１２、ＨＵＥＳ  １、ＨＵＥＳ  ２、ＨＵＥＳ  ３、ＨＵＥＳ  ４、ＨＵＥＳ  ５、ＨＵＥＳ  ６、ＨＵＥＳ  ７、ＨＵＥＳ  ８、ＨＵＥＳ  ９、ＨＵＥＳ  １０、ＨＵＥＳ  １１、ＨＵＥＳ  １２、ＨＵＥＳ  １３、ＨＵＥＳ  １４、ＨＵＥＳ  １５、ＨＵＥＳ  １６、ＨＵＥＳ  １７、ＨＵＥＳ  １８、ＨＵＥＳ  １９、ＨＵＥＳ  ２０、ＨＵＥＳ  ２１、ＨＵＥＳ  ２２、ＨＵＥＳ  ２３、ＨＵＥＳ  ２４、ＨＵＥＳ  ２５、ＨＵＥＳ  ２６、ＨＵＥＳ  ２７、ＨＵＥＳ  ２８、ＣｙＴ４９、ＲＵＥＳ３、ＷＡ０１、ＵＣＳＦ４、ＮＹＵＥＳ１、ＮＹＵＥＳ２、ＮＹＵＥＳ３、ＮＹＵＥＳ４、ＮＹＵＥＳ５、ＮＹＵＥＳ６、ＮＹＵＥＳ７、ＵＣＬＡ  １、ＵＣＬＡ  ２、ＵＣＬＡ  ３、ＷＡ０７７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）、ＷＡ１５、ＨＵＥＳ  ６２、ＨＵＥＳ  ６３、ＨＵＥＳ  ６４、ＣＴ１、ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、ＭＡ１３５、Ｅｎｅａｖｏｕｒ−２、ＷＩＢＲ１、ＷＩＢＲ２、ＷＩＢＲ３、ＷＩＢＲ４、ＷＩＢＲ５、ＷＩＢＲ６、ＨＵＥＳ  ４５、Ｓｈｅｆ  ３、Ｓｈｅｆ  ６、ＢＪＮｈｅｍ１９、ＢＪＮｈｅｍ２０、ＳＡ００１、ＳＡ００１、ＵＣＬＡ  １０、ＵＣＬＡ  １７、ＵＣＬＡ  １８、ＨＳ３４６、ＨＳ４２０、ＮＹＵＥＳ１２、ＫＣＬ０２３、ＫＣＬ０３１、ＵＭ６３−１、ＵＭ７７−２、ＣＳＣ１４、ＨＵＥＳ  ７４、及びＵＭ２５−２である。
【００５８】
胚性生殖細胞（ＥＧＣ）は、特別な条件下で、ＥＳＣと類似する特性を取得する生殖細胞（生殖子）に由来する。ＥＳＣと同様、ＥＧＣはインビトロで多能性であるが、ＥＧＣはインビボで多能性であることがまだ示されていない。ＥＧＣは、当該技術分野で周知の技法を使用して、胎児から得られる原始的な生殖細胞から調製される。Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１。
【００５９】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４などの因子の発現を促進するために、遺伝的操作（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、エピソーム）、タンパク質、改変されたＲＮＡ、または化学的操作のいずれかにより、多くの型の体細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、上皮細胞）から発生され得る（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−６７６、Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １（１）：３９−４９、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２）。
【００６０】
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、単離されたナイーブ型ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣなど）を提供する。ナイーブ型ＰＳＣは、とりわけ、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ２、及びＫｌｆ４を発現する、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３または２ｉ（ＥＲＫｉ／ＧＳＫｉ）のいずれかに応答して自己再生する、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して分化する、ＸａＸａ  Ｘ染色体活性化状態を呈する、の特徴のうちの少なくともいくつかを有すると特定され得る。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（６）：４８７−４９２、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７：１５５−１６８。いくつかの実施形態では、ナイーブ型ＰＳＣに典型的な少なくとも１つの特徴が明示的に除外される。
【００６１】
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、単離されたプライム型ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣなど）を提供する。プライム型ＰＳＣは、とりわけ、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇを発現する、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３に応答しない、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して自己再生する、ＸａＸｉ  Ｘ染色体活性化状態を呈する、の特徴のうちの少なくともいくつかを有すると特定され得る。Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（６）：４８７−４９２、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７：１５５−１６８。いくつかの実施形態では、プライム型ＰＳＣに典型的な少なくとも１つの特徴が明示的に除外される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示のＰＳＣは遺伝的に改変される。好ましい実施形態では、ＰＳＣは、ＭＥＫ、ＧＳＫ３、ＰＫＣ、またはこれらの任意の組み合わせを阻害するように改変されていない。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本開示のナイーブ型及び／またはプライム型ＰＳＣは、少なくとも１つの外因性リプログラミング因子、少なくとも１つの外因性ＲＮＡ、またはこれらの両方を発現する。外因性リプログラミング因子は、当業者に既知の任意のリプログラミング因子であり得る。リプログラミング因子の非限定的な例としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、及びＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、ベクター、例えば、エピソームベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはセンダイウイルスベクターにより発現される。いくつかの実施形態では、外因性ＲＮＡは、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び改変されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であってもよい。外因性ＲＮＡは、当業者に既知の任意の標的に結合し得る。標的の非限定的な例としては、ｐ５３、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ２、Ｐｒｄｍ１４、及びＮａｎｏｇが挙げられる。いくつかの実施形態では、外因性ＲＮＡは、ｐ５３またはＬｉｎ２８の発現を下方調節する。好ましい一実施形態では、ナイーブ型及び／またはプライム型細胞は、少なくとも１つの外因性リプログラミング因子を発現するように改変されていない。
【００６４】
本開示のプライム型及びナイーブ型ＰＳＣは、以下に詳細に記載される、培地及び条件の任意の組み合わせで、または方法のいずれかにより培養され得る。
【００６５】
ＩＩＩ．細胞培養培地及び培養条件
復帰培地
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させ、かつ／またはＰＳＣをナイーブ状態に維持するための細胞培養培地を提供する。本明細書で使用されるとき、プライム型ＰＳＣをナイーブ型ＰＳＣに復帰させ、かつ／またはＰＳＣをナイーブ状態に維持するための細胞培養培地は、「復帰培地」と称され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地を含む。基本培地は、当業者に既知の任意の基本培地であり得る。基本培地は、異なる基本培地の混合物であり得る。基本培地は、商業源から購入されてもよい。いくつかの実施形態では、復帰培地の基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎ２補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｂ２７補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のうちの少なくとも１つ、またはこれらの等価物を含む。いくつかの実施形態では、復帰培地の基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎ２補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｂ２７補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ｍＴｅＳＲ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）もしくはＳｔｅｍＦｉｔ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）のそれぞれ、またはこれらの等価物を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、復帰培地の体積の約２５％〜約７５％で復帰培地中に存在する。好ましい実施形態では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、復帰培地の体積の約５０％で復帰培地中に存在する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地またはその等価物は、復帰培地の体積の約２５％〜約７５％で復帰培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地またはその等価物は、復帰培地の体積の約５０％で復帰培地中に存在する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｎ２補足物またはその等価物は、復帰培地の体積の約０．０００５％〜約０．０５％で復帰培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｎ２補足物またはその等価物は、復帰培地の体積の約０．００５％で復帰培地中に存在する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｂ２７補足物またはその等価物は、復帰培地の体積の約０．００１％〜約０．１％で復帰培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｂ２７補足物またはその等価物は、復帰培地の体積の約０．０１％で復帰培地中に存在する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖまたはその等価物は、復帰培地の体積の約０．００００７％〜約０．００７％で（７．５％溶液から）復帰培地中に存在する。好ましい実施形態では、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖまたはその等価物は、復帰培地の体積の約０．０００７％で（７．５％溶液から）復帰培地中に存在する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、復帰培地の体積の約０．０００５％〜約０．０５％で復帰培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、復帰培地の体積の約０．００５％で復帰培地中に存在する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地を含み、少なくとも１つの添加物（すなわち、薬剤）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの添加物は、例えば、リゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニスト、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脱メチル化酵素、ＳＴＡＴ３活性化因子、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、フォルスコリン、ＲＯＣＫ阻害剤、またはＪＮＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地を含み、リゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニスト、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脱メチル化酵素、ＳＴＡＴ３活性化因子、及び２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）のそれぞれをさらに含む。いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地を含み、リゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニスト、脱メチル化酵素、ＳＴＡＴ３活性化因子、及び２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）のそれぞれをさらに含む。いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地を含み、リゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニスト、脱メチル化酵素、ＳＴＡＴ３活性化因子、及びアクチビンＡ（及び／またはＴＧＦβ）のそれぞれをさらに含む。いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地を含み、リゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニスト、脱メチル化酵素、ＳＴＡＴ３活性化因子、アクチビンＡ（及び／またはＴＧＦβ）、及びｂＦＧＦのそれぞれをさらに含む。好ましい一実施形態では、復帰培地は基本培地（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ）、アクチビンＡ（及び／またはＴＧＦβ）、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＬＰＡＲ（例えば、ＯＭＰＴまたはＬＰＡ）、Ｎ−アセチルシステイン、ならびに任意選択で、ＬＩＦ及び／またはｂＦＧＦを含む。好ましい実施形態では、フォルスコリンは明示的に除外される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及びＬＰＡＲのアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲは、ＬＰＡＲ１、ＬＰＡＲ２、ＬＰＡＲ３、ＬＰＡＲ４、ＬＰＡＲ５、及びＬＰＡＲ６からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ＬＰＡＲはＬＰＡＲ１である。いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストは、約１０ｎＭ〜約５μＭの濃度で培地中に存在する。ＬＰＡＲのアゴニストが、少なくとも一部、Ｙｅｓ関連タンパク質（ＹＡＰ）転写因子を活性化することにより機能し得ることが企図される。したがって、ＹＡＰを他の小分子で活性化すること、またはＹＡＰを細胞質（例えば、Ｌａｔｓキナーゼ）に隔離する経路を阻害することも復帰培地に添加され得ることも企図される。ＹＡＰの活性化因子の非限定的な例としては、スフィンゴシン−１−ホスフェートが挙げられる。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １９（８）：９５５−９６２及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０：７８０−７９１）。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である。本開示のＬＰＡは、復帰培地中、例えば、約１０ｎＭ〜約１μＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約２００ｎＭ〜約１μＭ、約３００ｎＭ〜約１μＭ、約４００ｎＭ〜約１μＭ、約５００ｎＭ〜約１μＭ、約６００ｎＭ〜約１μＭ、約７００ｎＭ〜約１μＭ、約８００ｎＭ〜約１μＭ、約９００ｎＭ〜約１μＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約６０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約７０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約８０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約９０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９５０ｎＭ、または約１μＭの濃度であり得る。好ましい実施形態では、ＬＰＡの量は１０μＭ未満である。より好ましい実施形態では、ＬＰＡの量は５μＭ未満である。いくつかの実施形態では、ＬＰＡは復帰培地から明示的に除外される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストは、１−オレオイル−２−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオネート（ＯＭＰＴ）である。本開示のＯＭＰＴは、復帰培地中、例えば、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１．０μＭ〜約１０μＭ、約２．０μＭ〜約１０μＭ、約３．０μＭ〜約１０μＭ、約４．０μＭ〜約１０μＭ、約５．０μＭ〜約１０μＭ、約６．０μＭ〜約１０μＭ、約７．０μＭ〜約１０μＭ、約８．０μＭ〜約１０μＭ、約９．０μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約２．０μＭ、約３．０μＭ、約４．０μＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、または約１０μＭの濃度であり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＬＰＡＲのアゴニストは、ＬＰＡＲのうちの少なくとも２つのアゴニストの組み合わせである。一実施形態では、復帰培地は、ある量のＯＭＰＴ及びＬＰＡの組み合わせを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、及びＢＭＰ１５を含む。好ましい実施形態では、ＢＭＰはＢＭＰ４である。本開示のＢＭＰは、復帰培地中、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ〜約１２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ〜約１２ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ〜約１１ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、ＢＭＰは復帰培地から明示的に除外される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及び少なくとも１つの脱メチル化酵素、例えば、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸−２ホスフェート）を含む。本開示の脱メチル化酵素（例えば、アスコルビン酸）は、復帰培地中、例えば、約１μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ〜約９０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ〜約８０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約７０μｇ／ｍＬ、約５５μｇ／ｍＬ〜約６５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、または約１００μｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及び少なくとも１つの酸化防止剤、例えば、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含む。本開示の酸化防止剤は、復帰培地中、例えば、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約２．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約３．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約４．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約６．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約７．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約８．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約９．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、または約１０μＭの濃度であり得る。好ましい一実施形態では、酸化防止剤は、復帰培地中約２ｍＭの濃度である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及びＳＴＡＴ３活性化因子、例えば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む。本開示のＳＴＡＴ３（例えば、ＬＩＦ）は、復帰培地中、例えば、約１００単位〜約１０，０００単位、３００単位〜約５，０００単位、５００単位〜約４，０００単位、７００単位〜約３，０００単位、９００単位〜約２，０００単位、９５０単位〜約１，５００単位、約１００単位、約２００単位、約３００単位、約４００単位、約５００単位、約６００単位、約７００単位、約８００単位、約９００単位、約１，０００単位、約１，１００単位、約１，２００単位、約１，３００単位、約１，４００単位、約１，５００単位、約１，６００単位、約１，７００単位、約１，８００単位、約１，９００単位、約２，０００単位、約３，０００単位、約４，０００単位、約５，０００単位、約６，０００単位、約７，０００単位、約８，０００単位、約９，０００単位、または約１０，０００単位の濃度であり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及びベータ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含む。本開示の２−ＭＥ（１０００ｘ）は、復帰培地中、例えば、約０．０００１％〜約０．０１％の濃度であり得る。好ましい実施形態では、２−ＭＥは、復帰培地中約０．００１％の濃度である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地及びｂＦＧＦを含む。本開示のｂＦＧＦは、復帰培地中、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、または約２５ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、基本培地及びアクチビンＡを含む。本開示のアクチビンＡは、復帰培地中、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、復帰培地は基本培地及びＴＧＦ−βを含む。本開示のＴＧＦ−βは、復帰培地中、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約４ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約３ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、有効量のＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、復帰培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤（すなわち、ＭＥＫ阻害剤）、ＧＳＫ３β阻害剤、またはこれらの両方をさらに含む。復帰のためのＥＲＫ１／２阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の使用は、以前に、例えば、Ｇａｆｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ５０４（７４７９）：２８２−２８６、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２（６）：６６３−６７５、Ｖａｌａｍｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２（３）：３６６−３８１、Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１（１２）：４４８４−４４８９、Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５（４）：４７１−１８７に記載されている。ＭＥＫ阻害剤の非限定的な例としては、セルメチニブ（すなわち、ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、ＧＤＣ−０６２３、ＢＩ−８４７３２５、コビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＲＧ７４２０）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ビニメチニブ、ピマセルチブ、ＳＬ−３２７、ＢＩＸ０２１８８、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ−７３３、ホホノキオール、ＰＤ３１８０８８、及びレファメチニブが挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ、塩化リチウム、ＣＨＩＲ９８０１４、ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩ、３Ｆ８、及びＴＣＳ２００２が挙げられる。一実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ９８０５９である。別の実施形態では、ＧＳＫ３β阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。一実施形態では、復帰培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、またはこれらの両方を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、復帰培地は、実質的に培地を含まない、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、またはこれらの両方を実質的に含まない。
【００８７】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤は、当該技術分野で周知であり、市販されている。非限定的な例としては、Ｇｏ６９８３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｇｏ６９７６（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、塩化ケレリトリン（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、ＨＡ−１００二塩酸塩（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）が挙げられる。本開示のＰＫＣ阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）は、復帰培地中、例えば、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１．０μＭ〜約１０μＭ、約２．０μＭ〜約１０μＭ、約３．０μＭ〜約１０μＭ、約４．０μＭ〜約１０μＭ、約５．０μＭ〜約１０μＭ、約６．０μＭ〜約１０μＭ、約７．０μＭ〜約１０μＭ、約８．０μＭ〜約１０μＭ、約９．０μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約２．０μＭ、約３．０μＭ、約４．０μＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、または約１０μＭの濃度であり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、培地を含むアクチビンＡ阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）のうちの少なくとも１つをさらに含む。非限定的な例としては、ＳＢ−４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、フォリスタチン−３４４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＳＢ５２５３３４（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、ＳＢ５０５１２４（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）、及びＲｅｐＳｏｘ（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）が挙げられる。本開示のアクチビンＡ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはこれらの両方（例えば、ＳＢ−４３１５４２）は、復帰培地中、例えば、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１．０μＭ〜約１０μＭ、約２．０μＭ〜約１０μＭ、約３．０μＭ〜約１０μＭ、約４．０μＭ〜約１０μＭ、約５．０μＭ〜約１０μＭ、約６．０μＭ〜約１０μＭ、約７．０μＭ〜約１０μＭ、約８．０μＭ〜約１０μＭ、約９．０μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約２．０μＭ、約３．０μＭ、約４．０μＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、または約１０μＭの濃度であり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、復帰培地は、無血清、例えば、動物血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含まない。無血清培地は、とりわけ、血清アルブミン、成長因子、及びホルモンなどの未定義の非血清産物を依然として含有し得る。いくつかの実施形態では、復帰培地は既知組成である。既知組成培地は、培地の成分の全てが特定され、それらの正確な濃度が既知であることが必要である。既知組成培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含有しない。好ましい実施形態では、復帰培地は、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはその等価物などのいずれの血清置換も含有しない。
【００９０】
プライム培地
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、プライム型多能性幹細胞を培養するための細胞培養培地を提供する。本明細書で使用されるとき、プライム型ＰＳＣを培養するための細胞培養培地は、「プライム培地」と称され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、プライム培地は基本培地を含む。基本培地は、当業者に既知の任意の基本培地であり得る。基本培地は、異なる基本培地の混合物であり得る。基本培地は、商業源から購入されてもよい。いくつかの実施形態では、プライム培地の基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎ２補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｂ２７補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のうちの少なくとも１つ、またはこれらの等価物を含む。いくつかの実施形態では、プライム培地の基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎ２補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｂ２７補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のそれぞれ、またはこれらの等価物を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、プライム培地の体積の約２５％〜約７５％でプライム培地中に存在する。好ましい実施形態では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、プライム培地の体積の約５０％でプライム培地中に存在する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地またはその等価物は、プライム培地の体積の約２５％〜約７５％でプライム培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地またはその等価物は、プライム培地の体積の約５０％でプライム培地中に存在する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ｎ２補足物またはその等価物は、プライム培地の体積の約０．０００５％〜約０．０５％でプライム培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｎ２補足物またはその等価物は、プライム培地の体積の約０．００５％でプライム培地中に存在する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Ｂ２７補足物またはその等価物は、プライム培地の体積の約０．００１％〜約０．１％でプライム培地中に存在する。好ましい実施形態では、Ｂ２７補足物またはその等価物は、プライム培地の体積の約０．０１％でプライム培地中に存在する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖまたはその等価物は、プライム培地の体積の約０．００００７％〜約０．００７％で（７．５％溶液から）プライム培地中に存在する。好ましい実施形態では、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖまたはその等価物は、プライム培地の体積の約０．０００７％で（７．５％溶液から）プライム培地中に存在する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔａｍａｘまたはその等価物は、プライム培地の体積の約０．００００７％〜約０．００７％でプライム培地中に存在する。好ましい実施形態では、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖまたはその等価物は、プライム培地の体積の約０．０００７％でプライム培地中に存在する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、プライム培地は基本培地を含み、少なくとも１つの添加物をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの添加物は、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、またはトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）である。いくつかの実施形態では、プライム培地は、基本培地、ｂＦＧＦ、及びアクチビンＡを含む。いくつかの実施形態では、プライム培地は、基本培地、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦ−βを含む。いくつかの実施形態では、プライム培地は、基本培地、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ及びＴＧＦ−βを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、プライム培地は基本培地及びｂＦＧＦを含む。本開示のｂＦＧＦは、プライム培地中、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、または約２５ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、プライム培地は、基本培地及びアクチビンＡを含む。本開示のアクチビンＡは、プライム培地中、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、プライム培地は基本培地及びＴＧＦ−βを含む。本開示のＴＧＦ−βは、プライム培地中、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約４ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約３ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬの濃度であり得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、プライム培地は、基本培地及びベータ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含む。本開示の２−ＭＥ（１０００ｘ）は、プライム培地中、例えば、約０．０００１％〜約０．０１％の濃度であり得る。好ましい実施形態では、２−ＭＥは、プライム培地中約０．００１％の濃度である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、プライム培地は、無血清、例えば、動物血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含まない。無血清培地は、とりわけ、血清アルブミン、成長因子、及びホルモンなどの未定義の非血清産物を依然として含有し得る。いくつかの実施形態では、プライム培地は既知組成である。既知組成培地は、培地の成分の全てが特定され、それらの正確な濃度が既知であることが必要である。既知組成培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含有しない。好ましい実施形態では、プライム培地は、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはその等価物などのいずれの血清置換も含有しない。
【０１０４】
培養条件
本開示のプライム型ＰＳＣ及びナイーブ型ＰＳＣは、当該技術分野で既知の任意の条件下で培養され得る。例えば、任意の成長物質、例えば、とりわけ、フィーダー細胞（例えば、マウス胚性フィーダー（ＭＥＦ）及びマウスＬＩＦ及びネオマイシン耐性（ＳＮＬ）で形質転換されたマウス線維芽細胞ＳＴＯ細胞）、細胞外基質（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）ＢＭＥ  ＰａｔｈＣｌｅａｒ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標））、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−リジン、ポリ−オルニチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、またはラミニンが使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、フィブロネクチン層上で培養される。いくつかの実施形態では、ラミニンは、ラミニン−５１１、例えば、組換えラミニン−５１１）（ｉＭａｔｒｉｘ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）である。好ましい一実施形態では、細胞は、無フィーダー条件下で培養される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本開示のＰＳＣは、１〜２０％の酸素（Ｏ２）及び５％の二酸化炭素（ＣＯ２）の条件下で培養される。いくつかの実施形態では、本開示のＰＳＣは、低酸素条件下で（例えば、１０％未満のＯ２の存在下で）培養される。いくつかの実施形態では、本開示のＰＳＣは約３７℃で培養される。いくつかの実施形態では、本開示のＰＳＣは約３７℃、５％のＣＯ２、及び１０〜２０％のＯ２で培養される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞及び／またはプライム型多能性幹細胞は、ある一定期間の間、低酸素条件下で培養される。例えば、ナイーブ型多能性幹細胞及び／またはプライム型多能性幹細胞は、ある一定期間の間、正常酸素条件下（約２０％のＯ２）で培養された後、約５％のＯ２の低酸素条件に切り替えられてもよい。他の実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞及び／またはプライム型多能性幹細胞は、ある一定期間の間、正常酸素条件下で培養された後、低酸素条件に切り替えられ、ある一定期間の間、復帰培地中で培養されてもよい。他の実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞及び／またはプライム型多能性幹細胞は、ある一定期間の間、正常酸素条件下で培養された後、低酸素条件に切り替えられ、ある一定期間の間、復帰培地中で培養され、その後、復帰培地または従来の培養培地中のいずれかで、正常酸素条件に戻されてもよい。また他の実施形態では、ナイーブ型多能性幹細胞及び／またはプライム型多能性幹細胞は、ある一定期間の間、プライム培地中で、低酸素条件下で培養された後、低酸素条件を維持しながら、復帰培地中で培養されてもよい。
【０１０７】
ＩＶ．方法
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導する方法を提供する。一態様では、本開示は、有効量のリゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のアゴニストを含む培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養し、それにより、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させることを含む、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導するための方法を提供する。
【０１０８】
一態様では、本開示は、有効量のＬＰＡＲのアゴニストを含む培養培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞をそのナイーブ状態に維持するための方法を提供する。
【０１０９】
一態様では、本開示は、有効量のＬＰＡＲのアゴニスト（例えば、ＯＭＰＴ及び／またはＬＰＡ）、アクチビンＡ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ｎ−アセチルシステイン、及び任意選択でｂＦＧＦを含む培養培地（すなわち、基本培地（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ））中でプライム型多能性幹細胞を培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導するための方法を提供する。
【０１１０】
一態様では、本開示は、培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導するための方法を提供し、この培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、またはこれらの両方を実質的に含まない。
【０１１１】
いくつかの態様では、本開示は、ナイーブ型ＰＳＣを誘導するための方法を提供し、プライム型ＰＳＣは、原始的な生殖細胞に分化し、その後ナイーブ型多能性状態に安定する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、プライム型ＰＳＣは、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、プライム培地中で培養される。プライム培地は少なくとも一部ヘテロクロマチン形成を増強するように作用することが企図される。特に、プライム培地は、クロマチンを弛緩する因子の不在下で、クロマチンを凝縮するように作用する因子（例えば、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β）を含有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、プライム培地はナイーブ培地に交換される。プライム培地の全て、実質的に全て、または一部がナイーブ培地に交換され得るか、またはプライム培地とナイーブ培地の混合物がＰＳＣに添加され得る。例えば、プライム／ナイーブ培地の７５／２５、５０／５０、または２５／７５混合物を含む培地がＰＳＣに添加され得る。ＰＳＣは、任意の時間量、例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、プライム／ナイーブ混合培地中で培養され得る。プライム／ナイーブ混合培地の使用は、少なくとも一部、ＰＳＣクロマチンの弛緩を緩徐するように作用することにより復帰速度を緩徐させることが企図される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、プライム型ＰＳＣは、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間以上、ナイーブ培地中で培養される。ナイーブ培地は少なくとも一部ヘテロクロマチンを弛緩するように作用することが企図される。特に、ナイーブ培地は、クロマチンを弛緩するように作用する因子（例えば、ＬＰＡＲアゴニスト、ＢＭＰ）を含有し、いくつかの実施形態では、クロマチンを凝縮する因子（例えば、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β）の不在下でそれらを含有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣはプライム培地に播種される（例えば、２０，０００細胞／ウェルの６ウェルプレート）。細胞播種のおよそ２４時間後、プライム培地を除去し、復帰培地に交換される。復帰培地は、２４時間毎に交換される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、プライム型ＰＳＣは、プライム／ナイーブ混合培地またはナイーブ培地中のいずれかで培養されたとき、約２０日以内、約１５日以内、約１０日以内、約５日以内、または約３日以内にナイーブ型ＰＳＣに復帰する。いくつかの実施形態では、プライム型多能性幹細胞は、４０日、３０日、２０日、１５日、１０日、５日、または３日を超えない有効時間量の間培養される。好ましい実施形態では、時間量は１０日を超えない。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ナイーブ型ＰＳＣは、プライム培地または従来のＰＳＣ培地中のいずれかで培養され、ナイーブ型細胞に留まり得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、プライム型多能性幹細胞は、約２０日以内、約１５日以内、約１０日以内、約５日以内、または約３日以内にナイーブ型多能性幹細胞に復帰する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、約５％超、約１０％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７％超、約９９％超、または１００％のプライム型ＰＳＣがナイーブ型ＰＳＣに復帰する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ナイーブ型ＰＳＣは、約５回超の継代、約１０回超の継代、約１５回超の継代、約２０回超の継代、約３０回超の継代、約４０回超の継代、約５０回超の継代、約６０回超の継代、約７０回超の継代、または約８０回超の継代の間、正常な核型を維持する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ナイーブ型ＰＳＣは、約５回超の継代、約１０回超の継代、約１５回超の継代、約２０回超の継代、約３０回超の継代、約４０回超の継代、約５０回超の継代、約６０回超の継代、約７０回超の継代、または約８０回超の継代の間、正常な核型の、ナイーブ型、未分化、及び多能性状態に維持されることが可能である。
【０１２２】
プライム型細胞がナイーブ型細胞に復帰されたかどうかを特定する、多くの方法が存在する。非限定的な例としては、とりわけ、多能性マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４）の発現レベル、ナイーブ状態マーカー（例えば、ＰＲＤＭ１４、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１））の発現、Ｘ染色体不活性化状態（ＸＣＩ）マーカー（例えば、Ａｒｔｘ、Ｔｓｉｘ）、キメラに組み込む能力、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３＋培養条件への応答、及びＦｇｆ／Ｅｒｋ＋培養条件への応答が挙げられる。多能性マーカー、ナイーブ状態マーカー等の発現レベルは、当業者に既知の任意の方法によって検出され得る。例えば、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーが膜結合及び細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ３１発現のレベルを検出するために使用され得る。免疫組織化学／免疫細胞化学は、細胞外及び細胞内マーカー、例えば多能性マーカー、ナイーブ状態マーカー、及びＸＣＩ状態マーカーのレベルを検出するために用いられ得る。加えて、多能性マーカー及びナイーブ状態マーカーの転写産物の発現も、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）またはリアルタイムｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）などの方法によって検出され得る。
【０１２３】
本開示の方法は、細胞形態の視覚的検査及び／または分化を示す細胞もしくは組織特異的マーカーの検査により決定され得るＰＳＣの分化についてＰＳＣをさらに監視することも企図する。例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及び性決定領域Ｙボックス１（Ｓｏｘ１）が一般的な外胚葉マーカーである。ブラキュリ及びグースコイドが一般的な初期中胚葉系譜マーカーである一方で、Ｓｏｘ１７ならびに膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）が一般的な内胚葉マーカーである。加えて、幹細胞集団内の細胞分化の程度は、段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）（ＳＳＥＡ−１またはＳＳＥＡ−４）、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１の発現レベルにより決定され得る。未分化ＰＳＣは、高レベルのＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１を発現し、発現は分化時に迅速に下方調節される。分化を評価するために一般的に使用される別のマーカーはアルカリホスファターゼである。
【０１２４】
Ｖ．リプログラミング
本開示の方法は、体細胞（例えば、線維芽細胞）のｉＰＳＣへのリプログラミング効率を改善するための、復帰培地、プライム培地、またはこれらの両方の使用も企図する。いくつかの実施形態では、復帰培地、プライム培地、またはこれらの両方を使用することにより、ｉＰＳＣを発生させるための従来の方法の因子を少なくできることが企図される。リプログラミングの方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−８７２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２（６）：５２５−５２８、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：１０１−１０６、Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１（３）：４５８−４６６を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、リプログラミング方法は、プライム培地中で行われ得る。他の実施形態では、リプログラミング方法は、ナイーブ培地中で行われ得る。また他の実施形態では、リプログラミング方法は、正常な線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳ）中で行われ得る。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子の導入後、細胞（例えば、線維芽細胞）がナイーブ培地に移され、培養される。いくつかの実施形態では、従来のリプログラミング方法と比較したとき、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍以上、リプログラミングの効率が増加する。いくつかの実施形態では、ナイーブ培地において誘導されたｉＰＳＣは、より未分化の表現型を呈し、例えば、高レベルの多能性因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ２、及びＫｌｆ４を発現する、Ｌｉｆ／Ｓｔａｔ３または２ｉ（ＥＲＫｉ／ＧＳＫｉ）のいずれかに応答して自己再生する、Ｆｇｆ／Ｅｒｋに応答して分化する、ＸａＸａ  Ｘ染色体状態を呈する。リプログラミングの効率は、クロマチンがより弛緩状態にあり、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、またはこれらの両方などの因子が不在であるため、従来の培養培地と比較したとき、ｉＰＳＣがナイーブ培地において誘導されるときに高いことが企図される。
【０１２６】
いくつかの態様では、上に開示及び記載される培地のいずれかを使用する方法のうちの任意の１つにより調製された、単離されたナイーブ型多能性幹細胞の集団を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ナイーブ型多能性幹細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【０１２７】
組成物は、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、ビヒクル、及び当業者に周知のかかる他の不活性剤を含み得る。薬学的調製物に一般的に用いられるビヒクル及び賦形剤としては、例えば、タルク、アラビアガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコール等が挙げられる。溶液は、水、またはエタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステルなどの生理学的適合性有機溶媒を使用して調製され得る。減菌等張生理食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水と混合したポリグリコール、リンゲル液等を含み得る非経口組成物は、従来の技法を使用して調製され得る。
【０１２８】
組成物は、防腐剤及び／または安定剤を含み得る。防腐剤の非限定的な例としては、メチル−、エチル−、プロピル−パラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル水銀塩、クロルヘキシジン、フェノール、３−クレゾール、四級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）、クロルブタノール、２−エトキシエタノール、及びイミドウレアが挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保護剤を含み得る。凍結保護剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、及びグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１３０】
ＶＩ．キット
また、（ａ）プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させるための細胞培養培地であって、この培地はＬＰＡＲのアゴニストを含む、細胞培養培地と、（ｂ）指示書と、を含むキットも開示される。いくつかの実施形態では、キットは、（ｂ）ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、単離されたナイーブ型多能性幹細胞をさらに含む。他の実施形態では、キットは、単離されたプライム型多能性幹細胞をさらに含む。
【０１３１】
キットの構成成分は、１つ以上のバイアルなど、１つのまたは異なる容器に収容され得る。細胞培養培地は、貯蔵寿命を増加させるために、液体または固体形態（例えば、凍結乾燥後）であり得る。液体形態の場合、構成成分は、貯蔵寿命を増加させる添加物を含み得る。
【０１３２】
様々な実施形態では、キットの使用に関する指示書は、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導するための、またはナイーブ型多能性幹細胞をそのナイーブ状態に維持するためのキットの構成成分を使用するための指示を含む。指示書は、培地及び多能性幹細胞（例えば、解凍及び／または培養）をどのように調製するか（例えば、濃縮培地の場合、希釈）に関する情報をさらに含み得る。
【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態をさらに図示することが意図される。実施例は、当業者に提供するために提案され、その範囲を制限することが意図されない。
【０１３４】
マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）はナイーブ型多能性を表し、一方、マウス外胚葉幹細胞（ｍＥｐｉＳＣ）ならびに大半のヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣ系はプライム型多能性を表す。プライム型及びナイーブ型の細胞は、それらのサイトカイン必要条件において異なる。これらの２つのクラスの細胞において機能する異なるシグナル伝達経路と一致して、ナイーブ型及びプライム型の細胞は、固有の遺伝子発現パターン及びエピジェニック特徴を呈する。プライム型とナイーブ型の幹細胞間で異なるエピジェニック特徴の１つはＸ染色体不活性化（ＸＣＩ）であり、これは、ＸＸ雌とＸＹ雄との間のＸ連鎖遺伝子量を等しくする哺乳類遺伝子量補正機構である。インビトロのナイーブ型マウス雌細胞は、２つの活性Ｘ染色体（Ｘａ）を有し、雌内部細胞塊のナイーブ型細胞のＸａ／Ｘａ状態を反映する。対照的に、プライム型細胞は、１つのＸａと、１つの不活性Ｘ（Ｘｉ）とを有し、ＥｐｉＳＣが由来する着床後の胚性外胚葉の細胞においてみられる１つのＸ染色体の転写サイレンシングを示す。
【０１３５】
サイトカイン、細胞外基質構成成分、及び小分子を含む培養条件は、多能性幹細胞のエピジェニック特徴に影響を及ぼし得る。例えば、マウスナイーブ型細胞は、ＬＩＦ含有培地中で維持され、アクチビンＡ及びｂＦＧＦ含有培地内に移すことにより、プライム型細胞に効率的に転換され得る。この遷移は、ＤＮＡメチル化パターンにおけるゲノム規模の変化を伴う。
【０１３６】
対照的に、プライム型細胞のナイーブ型細胞への転換は効率が悪い。ｍＥｐｉＳＣは、ＬＩＦ含有培地中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上でのいくつかの継代後にｍＥＳＣ様細胞に転換される。このＬＩＦ依存転換は、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及び／またはＰｒｄｍ１４の過剰発現によりブースト及び加速され得るが、転換効率は低い。プライム型細胞をナイーブ型細胞に転換する際の難しさは、遷移を阻害するエピジェニックバリアに起因し得、かつ／または適切なシグナル伝達分子が解明されていないことを示し得る。それらの広範な分化能のため、ナイーブ型多能性幹細胞は再生医療の重要な材料源である。ナイーブ型細胞を発生させるための多くの確立された方法は、低塑性プライム型幹細胞のナイーブ型多能性への転換を促進するために、遺伝子操作または化学阻害剤の使用を伴う。しかしながら、これらの非生理学的操作は、再生医療に適切ではない場合がある。
【０１３７】
培養条件がヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）におけるＸＣＩ状態に影響を与えることが以前に報告された（Ｔｏｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １１：９１−９９）。リプログラミングされ、ＳＮＬフィーダー細胞を発現するＬＩＦ上に維持されたヒトｉＰＳＣ系（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６２：１０７３−１０８５）は主にＸａＸａであり、一方、ＭＥＦフィーダー細胞上で誘導されたｈｉＰＳＣ系は主にＸａＸｉである。初期の継代ＸａＸｉ  ｈｉＰＳＣは、ＳＮＬフィーダー細胞上で数回分裂した後、ＸａＸａに転換される。ＳＮＬフィーダー細胞の培養条件がプライム状態からナイーブ状態への転換を促進する因子（ＬＩＦを含む）を含有するかどうかは決定されていない。
【０１３８】
実施例１．ｍＥｐｉＳＣにおけるＸ染色体不活性化状態に影響を及ぼす培養条件
体細胞リプログラミング中、ヒトＸｉはＳＮＬフィーダー細胞上でリプログラミングされたｈｉＰＳＣにおいて確実に再活性化される。この結果は、ＳＮＬフィーダー培養条件がＸｉ再活性化を誘導する因子を含有することを示唆する。まず、リプログラミング中のＸｉの促進された再活性化がＸａＸｉであるマウスＥｐｉＳＣのＸｉ再活性化も促進したかどうかを決定した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が異なる培地においてＸ染色体上に位置するＸ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣリポーター系の培養結果は、蛍光顕微鏡によりアッセイされた。Ｇｉｌｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １０（４）：５２５−４３９、Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６１（７２６８）：１２９２−１２９５。Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣは、Ａｚｉｍ  Ｓｕｒａｎｉ博士及びＳｉｑｉｎ  Ｂａｏ博士の好意により提供され、Ｎ２Ｂ２７基本培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、そして後に２０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）及び１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ））で補足されたＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＮｄｉｆｆ  ２２７培地）において、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）コーティングされたプレート（無フィーダー条件）上で慣例的に維持された。細胞は、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ））で剥離／掻爬及び解離された後、前の培養からの１：２０希釈で２〜３日毎に継代された。
【０１３９】
細胞は、フィブロネクチンコーティングされたプレート上で、無フィーダーｍＥｐｉＳＣ条件下（アクチビンＡ及びｂＦＧＦを含有するＮ２Ｂ２７培地）で培養されたとき、ＧＦＰ陰性のままである（図１、パネルＡ及びＢ）。細胞の分画は、フィブロネクチンコーティングされたプレート上の、無フィーダーｍＥＳＣ培地（ＬＩＦならびにＭＡＰＫ及びＧＳＫ３ｂ（ＬＩＦ＋２ｉ）の２つの化学阻害剤を含有するＮ２Ｂ２７）に移動されたとき、ＧＦＰ陽性となり（図１、パネルＡ及びＢ）、他のｍＥＳＣ培養条件下で培養されたこれらの細胞の挙動と類似する（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６１（７２６８）：１２９２−１２９５、Ｇｒｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６（３）：２１５−２２６）。フィブロネクチンコーティングされたプレート上のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）で補足され、ＳＮＬフィーダー（ＳＮＬ−ＣＭ）で条件付けされたＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭであるヒトＥＳＣ培地中で培養されたＸ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣは、ＧＦＰ陽性細胞の数において劇的な増加を呈した（図１、パネルＡ及びＢ）。
【０１４０】
これらの３つの培養条件下のＧＦＰ陽性細胞の比率をより定量的に評価するために、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いた。フローサイトメトリー分析に関して、Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣは、アキュターゼを含む単一細胞懸濁液に解離された。単一細胞を、アロフィコシアニンと複合したＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＭＥＣ１３．３／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ））またはＡＰＣで染色した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ＶＹＢ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して、染色した細胞を分析した。フローサイトメトリー分析により、５％を超える細胞がＳＮＬ−ＣＭにおいてＧＦＰ＋になり、一方、１％未満の細胞がＬＩＦ＋２ｉ培地においてＧＦＰ＋となったことが明らかになった（図１、パネルＣ）。ＬＩＦ＋２ｉ及びＳＮＬ−ＣＭにおいて、ＧＦＰ＋集団は、マウスナイーブ型多能性幹細胞のマーカーであるＣＤ３１＋でもあった（図１、パネルＣ）。したがって、これらの結果は、ＳＮＬ−ＣＭがＸ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにおいてＸｉを再活性するだけでなく、ＬＩＦ＋２ｉ培地よりも効率的にプライム型細胞をナイーブ型多能性幹細胞様細胞に復帰させることも示唆する。
【０１４１】
ヒトリプログラミング中、ＬＩＦはＸｉ再活性化に寄与した（Ｔｏｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １１：９１−９９）。したがって、ＬＩＦシグナル伝達がＸｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにおいてＸｉ再活性化に役割を果たすかどうかを調査した。まず、ＬＩＦ−ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を阻害するＪＡＫキナーゼ阻害剤の作用を検査した。ＪＡＫキナーゼ阻害剤の添加は、ＳＮＬ−ＣＭに出現したＧＦＰ＋クラスターの数を大幅に低減した（図１、パネルＤ）。次に、条件付けせずに（非ＣＭ）、ヒトＥＳＣ培地中でＸ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣを培養することにより、ＬＩＦを含有しない条件付けした培地を用いる作用を検査した。わずかなＧＦＰ＋細胞クラスターが非ＣＭに出現した（図１、パネルＤ）。ＳＮＬ−ＣＭでの量と比較可能な量のＬＩＦ（図１、パネルＥ）の、非ＣＭへの添加は、培養物中のＧＦＰ＋クラスター集団を大幅に増加させた（図１、パネルＤ）。まとめると、これらの結果は、ＬＩＦがｍＥｐｉＳＣにおいてＸｉの再活性化を促進することを示す。
【０１４２】
ＬＩＦがＬＩＦを発現しないマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＣＭ）により条件付けされた培地においてＸｉ再活性化を刺激し得るかどうかも検査された（図１、パネルＥ）。非ＣＭ＋ＬＩＦとは対照的に、ＭＥＦ−ＣＭ＋ＬＩＦは、効率的なＸｉ再活性化を支持しなかった（図１、パネルＤ）。フローサイトメトリー分析は、ＬＩＦのＭＥＦ−ＣＭへの添加が非ＣＭと同じ程度までＧＦＰ発現を誘導しないが、ＣＤ３１発現がＭＥＦ−ＣＭ＋ＬＩＦにおいて誘導されることも示した（図１、パネルＦ）。これらの結果は、ＣＤ３１の発現がＸ染色体不活性化状態に関連せず、ＭＥＦ−ＣＭがＸｉ再活性化においてＬＩＦ機能を相殺する因子を含有することを示唆する。
【０１４３】
実施例２．アクチビンＡ及びｂＦＧＦはＸｉ再活性化を抑制する。
アクチビンＡ及びｂＦＧＦはｍＥｐｉＳＣにおいてプライム型多能性を維持するために必要であり、それらは、ＬＩＦ−媒介Ｘｉ再活性化を拮抗するＭＥＦ−ＣＭ活性の候補であり得ることを示唆する。前の実験で使用された全ての非ＣＭ培地はｂＦＧＦで補足されたため、最初の焦点はアクチビンＡの潜在的な役割に対してであった。示される培地中のＬＩＦ及びアクチビンＡの濃度はＥＬＩＳＡを使用して決定された。マウスＬＩＦが使用され、製造業者の指示に従い、ヒト／マウス／ラットアクチビンＡ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ））が使用された。ＭＥＦ−ＣＭは１１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有し、一方、ＳＮＬ−ＣＭはただ１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有することが分かった（図２、パネルＡ）。この因子がＸｉ再活性化に影響を与えるかどうかを検査するために、ＳＮＬ−ＣＭまたはＬＩＦを含有する非ＣＭを使用して、ＬＩＦ媒介Ｘｉ再活性化に対する外因性アクチビンＡの添加の作用を評価した。アクチビンＡの添加がＳＮＬ−ＣＭ及び非ＣＭ＋ＬＩＦの両方においてＧＦＰ＋クラスターの数を大幅に低減したことが分かった（図２、パネルＢ）。
【０１４４】
次に、ＦＡＣＳ分析を使用して、アクチビンＡがｍＥｐｉＳＣにおいてＬＩＦ媒介Ｘｉ再活性化を阻害し得るかどうかが問われた。ＬＩＦがｂＦＧＦ及びアクチビンＡを含有するｍＥｐｉＳＣに添加されたとき、顕著なＧＦＰ／ＣＤ３１二重陽性細胞は存在しなかった（図２、パネルＣ）。アクチビンＡがＬＩＦ含有培地から除去されたとき、ＧＦＰ／ＣＤ３１二重陽性細胞の増加が観察された。アクチビンＡ及びｂＦＧＦの除去はさらなる増加をもたらした。これらの結果は、アクチビンＡ及びｂＦＧＦの両方がＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化に対して負の作用を有することを示唆する。
【０１４５】
アクチビンＡがＭＥＦ−ＣＭにおけるＬＩＦ作用を相殺するかどうかを調査するために、アクチビンＡシグナル伝達が、アクチビンＡを隔離し、下流シグナル伝達経路を抑制するアクチビンＡ受容体複合体（ＡｃｔＲ複合体）で阻害された。ＭＥＦ−ＣＭにおけるＬＩＦの添加はＧＦＰ／ＣＤ３１二重陽性細胞を効率的に誘導しなかったが、培地におけるＡｃｔＲ複合体の添加（対照タンパク質ではない）は二重陽性細胞の％を増加させた（図２、パネルＤ）。ＬＩＦなしのＡｃｔＲ複合体の添加はＧＦＰを誘導せず図２、パネルＤ）、ＡｃｔＲ作用がＬＩＦ依存性であることを示す。したがって、アクチビンＡまたはそのファミリーメンバーは、ＭＥＦ−ＣＭにおいてＸｉ再活性化に対するＬＩＦ作用を減弱させる。
【０１４６】
ＳＭＡＤ２／３転写因子は、アクチビンＡの下流に位置し、このサイトカインの生物学的作用のうちのいくつかを媒介する（図２、パネルＥ）。ｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するために、Ｕ６誘導ＢｓｍｂＩ切断部位（ｃｕｔ  ｓｉｔｅ）のクローニングから発生させたｐｉｇｇｙＢａｃベクターに標的配列をクローニングした。元のレンチウイルス構築物は、Ｕ６−ＢｓｍｂＩ−ＣＮＫＢ領域がクローニングされたＭｏｈａｍｍａｄ  Ｍａｎｄｅｇａｒ博士の好意により提供された。ｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ配列にポリＴ３’及びＢｓｍｂＩ切断部位に固有の方向性特異的粘着末端を含有する、標的に対して２つの相補的オリゴヌクレオチドとして設計された。それぞれに関して、２つの相補的オリゴはアニーリングされ、その後、ＢｓｍｂＩ消化ピギーバックベクターに結合され、検証のために配列決定された。ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにトランスフェクトされた。トランスフェクションに関して、アクチビンＡ及びｂＦＧＦを含有する培地中のＤＮＡ（ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ発現ベクターと共にｓｈＲＮＡ発現ベクター）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとの混合物と共に、細胞をフィブロネクチンコーティングされたプレート上に播種した。トランスフェクションの２４時間後、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を含まない新しい培地を補充し、その後、２４時間毎に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、培地中１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｓｈＲＮＡ発現細胞の選択を行った。４〜５日の選択後、選択された細胞集団により転換が始まった。転換の終わりに、ＧＦＰ＋細胞の％を分析し、遺伝子発現分析のためのＲＮＡを抽出するために、ｍＫａｔｅ蛍光タンパク質を高度に発現した集団がＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＣＡ，ＵＳＡ））により選別された。
【０１４７】
ＳＭＡＤ２／３がＸｉ再活性化において役割を果たすかを検査するために、ＳＭＡＤ２／３活性化の化学阻害剤であるＳＢ４３１５４２を利用した。ＳＢ４３１５４２の添加がＬＩＦを含有するＭＥＦ−ＣＭにおいて二重陽性細胞の誘導を増強することが分かった（図２、パネルＦ）。ｓｈＲＮＡによるＳＭＡＤ２のノックダウンは阻害剤で細胞を処理するのと類似する作用を有した（データ示さず）。これらの結果は、アクチビンＡがＳＭＡＤ２／３転写因子を通してその負の作用をＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化に及ぼすことを示唆する。
【０１４８】
ｍＥｐｉＳＣ及びヒト多能性幹細胞におけるＳＭＡＤ２のノックダウンがＢＭＰシグナル伝達経路を活性化することが最近報告された（図２、パネルＥ）（Ｓａｋａｋｉ−Ｙｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（２５）：１８５４６−１８５６０）。したがって、次に、ＢＭＰがＸｉ再活性化を増強するかを検査した。Ｎ２Ｂ２７基本培地（ｂＦＧＦまたはアクチビンＡを含まないＥｐｉＳＣ培地）へのＢＭＰ４のみの添加は、ＧＦＰ／ＣＤ３１二重陽性細胞を誘導しなかった（データ示さず）。しかしながら、ＬＩＦを含有するＮ２Ｂ２７基本培地へのＢＭＰ４の添加は、ＬＩＦのみと比較して、二重陽性細胞の％を劇的に増加させた（図２、パネルＧ）。これらの結果は、アクチビンＡ−ＳＭＡＤ２／３軸がＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化を抑制し、可能な抑制機構の１つがＢＭＰシグナル伝達経路を抑止することによるであろうことを示唆する。
【０１４９】
実施例３．アスコルビン酸及びＬＰＡはＸｉ再活性化を増強する。
Ｘｉ再活性化を効率的に誘導しなかった培地とは対照的に、最大Ｘｉ再活性化を産生したＳＮＬ−ＣＭ及び非ＣＭ＋ＬＩＦの２つの培地は両方とも、アスコルビン酸及びＫＳＲからの脂質混合物を含有する（Ｇａｒｃｉａ−Ｇｏｎｚａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３（１）：ｅ１３８４）（図３、パネルＡ）。したがって、これらの小分子でＮ２Ｂ２７培地を補足することにより、アスコルビン酸及び脂質混合物がＸｉ再活性化を促進する能力を有するかどうかを検査した。アスコルビン酸だけでなく、脂質混合物の添加が、ＬＩＦのみと比較してＧＦＰ／ＣＤ３１二重陽性細胞の％を増加させたことが分かった（図３、パネルＣ）。したがって、両方の構成成分は、ＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化に対して正の作用を有する。
【０１５０】
ＫＳＲの脂質構成成分を評価するために、質量分析が使用された。リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）がＫＳＲのいくつかのバッチにおいて低量（およそ１０ｎＭ）で特定された（データ示さず）。したがって、ＬＰＡがＸｉ再活性化に影響を及ぼすかどうかを検査した。ＬＩＦ及びＫＳＲ脂質混合物のＮ２Ｂ２７への添加は、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の比率において、ＬＩＦのみよりも顕著に大きい増加をもたらした。脂質の単一源として、合成ＬＰＡ（Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１９６２−１１９６９）であるＬＰＡまたはＯＭＰＴを使用することにより、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞の％において類似する増加がもたらされ、ＬＰＡが脂質混合物の活性に対する主な寄与因子であることを示唆する（図３、パネルＢ及びＣ）。ＬＩＦを伴わないＬＰＡの添加もＧＦＰ＋細胞を誘導したが、ＬＩＦを伴う添加より効率的ではない（図３、パネルＣ）。したがって、ＬＰＡ及びＬＩＦはＸｉ再活性化を効率的に誘導するのに十分であると結論付けられた。
【０１５１】
ＬＰＡは６つのＬＰＡ受容体（ＬＰＡＲ）のファミリーを通してシグナルを伝達し、ＬＰＡＲ１−３がｍＥｐｉＳＣにおいて高度に発現されたと決定された（データ示さず）。ＯＭＰＴは主にＬＰＡＲ２及びＬＰＡＲ３を通してシグナルを伝達し、これらのＬＰＡＲがＬＰＡにとってＸｉ再活性化を媒介するのに十分であり得ることを示唆する。ＬＰＡＲ１／３競合化学阻害剤であるＫｉ１６４２５は、ＬＰＡＲ１及びＬＰＡＲ３の寄与を決定するために使用された。Ｋｉ１６４２５の添加がＬＩＦ＋ＬＰＡまたはＬＩＦのみを含有する培地において、ＧＦＰ＋細胞の％を大幅に低減することが分かった（図３、パネルＥ）。したがって、ＬＰＡが部分的にＬＰＡＲ１／３を通してＸｉ再活性化に影響を及ぼし、内因性ＬＰＡ−ＬＰＡＲ１／３シグナル伝達がＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化に関与すると結論付けられた。
【０１５２】
脂質シグナル伝達経路は、多能性の維持において重要なプレーヤーとなっている（Ｂｌａｕｋｗａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．３（１０７０）：１−１０、Ｇａｒｃｉａ−Ｇｏｎｚａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３（１）：ｅ１３８４、Ｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２４：１１０６−１１１８、Ｏｈｇｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １７：４４８−４６１）。意外にも、ここでのデータは、これらのシグナル伝達経路がプライム型をナイーブ型の多能性細胞に転換するためにも重要であることを示唆する。脂質ＬＰＡまたはＯＭＰＴの添加は転換を促進した。しかしながら、ＬＰＡＲ１／３の競合阻害剤が外因性ＬＰＡを含有しない培地における転換に影響を及与えたため、内因性脂質も役割を果たし得る。この結果は、脂質シグナル伝達とＬＩＦ経路との間の予期しないクロストークを示唆する。阻害剤及びノックダウン研究は、ＬＰＡＲ１が、おそらく、ＬＩＦシグナル伝達活性に影響を及ぼすことに加えて、ＮＡＮＯＧ発現を低減することにより、転換において顕著な役割を果たすことを示す。
【０１５３】
ＯＭＰＴは、ＬＰＡＲ２／３の特異的アゴニストである（Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１９６２−１１９６９）。しかしながら、ここで興味深いことに、ＬＰＡＲ３ではなくＬＰＡＲ１のノックダウンがＬＢＡＯによる転換を阻害したことが分かった。加えて、ＬＢＡＯ培地からＯＭＰＴを省くことにより、転換の効率の大幅な減少がもたらされたが、この減少は、他の因子のそれぞれが省かれたときにみられた減少よりも小さかった。したがって、ＯＭＰＴは、ＬＰＡＲ１を通した弱いシグナル伝達により転換を促進することであってよく、これは、これまで報告されていない、ＬＰＡＲ１に特異的なアゴニストが転換をさらに増強するであろうことを予測する。したがって、ＬＰＡＲに特異的なアゴニスト及びアンタゴニストの開発が多能性エクスビボの制御に有益であり、再生医療に寄与するであろう。
【０１５４】
実施例４．ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＯＭＰＴ（ＬＢＡＯ）の組み合わせは、Ｘｉを効率的に再活性化し、マウスプライム型ＰＳＣをナイーブ型ＰＳＣに転換する。
Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣをアキュターゼで単一細胞懸濁液中に解離し、転換実験を開始する１日前に、単一細胞を、２つの異なる細胞密度（２０，０００細胞または３，０００細胞／ウェルの６ウェルプレート）のアクチビンＡ及びｂＦＧＦ含有培地において、フィブロネクチンコーティングされたプレート上に播種した。播種の２４時間後、陰性対照として新しいプライム培地を補充するか、またはナイーブ培地に交換した。アッセイ培地を２４時間毎に交換し、ＧＦＰ蛍光を顕微鏡検査で８（２０，０００開始細胞）〜１３日（３，０００開始細胞）間毎日チェックした。
【０１５５】
ＬＰＡ及びＯＭＰＴの濃度を最適化するために、プライム型多能性幹細胞を様々な濃度のＬＰＡまたはＯＭＰＴで成長させた。図８に示されるように、高濃度（５０ｎＭ及び１００ｎＭ）で、ＬＰＡはプライム型多能性幹細胞に毒性であった。一方、１００ｎＭ及び５００ｎＭのＯＭＰＴ濃度の培地中で成長させたプライム型多能性幹細胞は、健康に見え、多能性幹細胞に特有のコロニー形態を維持した。
【０１５６】
ナイーブ型培地は、図４及び５において使用するために、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入するか、または社内で調製されたＮ２Ｂ２７基本培地中に１，０００単位のＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、６４μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎＭ〜１００ｎＭのＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ））、及び／または１００ｎＭ  ＯＭＰＴ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ））を含有した。社内Ｎ２Ｂ２７培地は、５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、５００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））、５ｍｌのＮ２補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））、１０ｍｌのＢ２７補足物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））、６６６μｌの７．５％ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））、及び５ｍｌのＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）／１リットルからなる。転換実験の終わりに、ＧＦＰ＋細胞クラスターを計数するか、またはフローサイトメトリーにより、転換効率を評価した。
【０１５７】
ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞を選択するために、６〜９日間ＬＢＡＯ培地中で培養した細胞を継代し、５０：５０のＬＢＡＯ／ＬＩＦ＋２ｉ培地において、ラミニン５１１またはｉＭａｔｒｉｘ（Ｎｉｐｐｉ／Ｉｗａｉ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）コーティングされたプレート上で培養した。次の日、培地をＬＩＦ＋２ｉ培地に交換した。培養条件下の２〜３回の継代内で、ほぼ純粋なＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞集団が得られた。
【０１５８】
上述の所見に基づき、アクチビンＡ及びｂＦＧＦの不在下のＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＬＰＡ（またはＯＭＰＴ）の混合がＸｉを強く再活性化するかを検査した。Ｎ２Ｂ２７培地におけるＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＬＰＡ（またはＯＭＰＴ）のそれぞれの添加がＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞を効率的に誘導したことが分かった（図４、パネルＡ）。平均して、１７．７±５．９％の細胞が８日目に二重陽性細胞になった。加えて、３２．１±８％及び２．８±２．１％を超える細胞がＣＤ３１及びＧＦＰ単一陽性細胞になった。
【０１５９】
次に、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞が細胞系として確立され得るかを検査した。実際、復帰された細胞培養物はＬＩＦ＋２ｉ培地中で良好に拡大し、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞系はコロニーを取り出すことなく容易に確立された（図４、パネルＢ）。プローブの調製及びＦＩＳＨ手順が説明された。簡潔に、ＦＩＳＨプローブは、製造業者の指示に従い、Ｂｉｏｐｒｉｍｅキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により調製された。ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞をアキュターゼを使用して採取し、単一細胞懸濁液を作製し、次に、単一細胞を８００ｒｐｍで３分間、Ｃｙｏｔｏｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ））を用いて、ガラススライド上でサイトスピンにかけた。サイトスピンされた試料を透過処理し、１０分間、４％ＰＦＡで固定し、４度少なくとも一晩、７０％ＥｔＯＨ中で保管した。次に、試料を８５〜１００％ＥｔＯＨにおいて脱水し、３７度で一晩、プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、試料を十分に洗浄し、その後、退色防止封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））と共にスライドガラス上に装填した。染色した試料を１００Ｘオイルレンズで顕微鏡的に検査した。１つの試料中２００を超える細胞が得られた。２つのＸ連鎖遺伝子ａｔｒｘ及びｔｓｉｘプローブとの蛍光Ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ほぼ全てのＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞が核においてａｔｒｘ及びｔｓｉｘの両方について２つの新生転写産物フォーカスを呈し、それらがＸａＸａであることを示唆する（図４、パネルＣ）。
【０１６０】
多能性マーカー及び分化遺伝子の発現を試験した。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））で精製し、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））で処理してゲノムＤＮＡ汚染を除去するか、ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ））で処理した。  製造業者の指示に従い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））及びランダム六量体プライマーを用いた逆転写反応に全ＲＮＡ（１００ｎｇ〜１μｇ）を使用した。分析した遺伝子の発現レベルを検査するために、ＴａｑＭａｎプローブ及びＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用した。復帰細胞系は多能性マーカー遺伝子を発現したが、ｍＥＳＣと類似するレベルで、分化マーカー遺伝子を抑止した（図４、パネルＤ）。
【０１６１】
ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞が多能性であったかどうかを決定するために、胚盤胞注入を行った。キメラを産生しなかった親Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣとは対照的に、ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞を注入された７０％の胚盤胞がキメラマウスを産生した（図４、パネルＥ）。胚盤胞注入及びＦ１マウス産生のプロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞またはｍＫａｔｅ発現Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣの単一細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得た胚盤胞に注入し、胎生期１４．５日目に胚のキメラ現象を検査するために、ＧＦＰまたはｍＫａｔｅ蛍光を使用した。高度にキメラのＦ０雌マウスをＣ５７ＢＬ／６雄マウスと交配させて、Ｆ１子孫を得た。この結果は、親Ｘ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣとは著しく対照的に、復帰された細胞が容易にコロニー形成し、高頻度でマウス胚に寄与することを示唆した。（図４、パネルＥ）。
【０１６２】
復帰された細胞の生殖系伝達も観察された（図４、パネルＦ）。まとめると、これらの結果は、復帰された細胞がＸａＸａであり、ナイーブ型多能性幹細胞と等しい分化能を有することを示唆する。したがって、構成成分の全てを含有する培地は、効率的に、Ｘｉを再活性化するだけでなく、プライム型細胞をナイーブ型細胞にも復帰させる。
【０１６３】
実施例５．ＬＢＡＯはナイーブ型多能性に向かって転写因子を編成する。
ナイーブ型多能性遺伝子発現パターンの確立時期を決定するために、逆転写及び定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して、主要な多能性転写因子ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＰＲＤＭ１４及びＮＡＮＯＧのＲＮＡレベルを検査した（Ｇｉｌｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １０（４）：４２５−４２９、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６（７）：１０６３−１０６９、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ  １３８（４）：７２２−７３７）。Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣをＬＢＡＯ培地中で培養し、培養の２日目から２４時間毎にＲＮＡの回収を始めた。ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＰＲＤＭ１４は、未処理のＸｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣと比較して強く上方調節されたが、それらの速度は異なった（図５、パネルＡ）。ＫＬＦ２及びＫＬＦ４は、２日目にほぼ最大レベルに達した（図５、パネルＡ）。ＰＲＤＭ１４は、２〜３日目まで誘導されず、４日目に最大レベルに達した（図５、パネルＡ）。対照的に、ＮＡＮＯＧは、Ｘｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにおいて高い発現を示し、ＬＢＡＯによる処理の２日目に一過性の減少を示した（図５、パネルＡ）。まとめると、これらのデータは、ＬＢＡＯ培地がＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＰＲＤＭ１４の発現を確実に誘導することを示す。ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞は５日目以降に出現するため（図（５、パネルＢ）、ナイーブ型多能性に関連する転写因子の発現は、ＣＤ３１＋ＧＦＰ＋細胞の出現に先行した。したがって、転写因子の誘導は、ナイーブ型多能性への転換に必須であり得る。
【０１６４】
ＬＩＦ、ＢＭＰ４、及びＬＰＡシグナル伝達の取得に加えて、ｍＥｐｉＳＣ培地からＬＢＡＯ培地への切り替えは、ｂＦＧＦ及びアクチビンＡ−ＳＭＡＤ２／３軸を通したシグナル伝達の損失を伴う。それが、初期の時間点でのＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＮＡＮＯＧの発現における変化を引き起こすシグナル伝達の獲得または損失であったかどうかを決定するために、任意の追加の因子を含まない（基本）Ｎ２Ｂ２７（ｍＥｐｉＳＣの基本培地及びＬＢＡＯ培地）に対する細胞の遷移の作用を検査した。培地交換２４時間後に、ＫＬＦ２及びＫＬＦ４は、ＬＢＡＯ及び基本条件下で、ＡｃｔＡ＋ｂＦＧＦ含有ｍＥｐｉＳＣ培地よりも高いレベルで発現されるが、ＮＡＮＯＧはそうではなかった（図５、パネルＣ）。ｍＥｐｉＳＣ培地からの外因性アクチビンＡ及びｂＦＧＦの除去はＫＬＦ２及びＫＬＦ４を誘導するのに十分であるため、これらの結果は、アクチビンＡ及びｂＦＧＦがｍＥｐｉＳＣにおいてＫＬＦ２及びＫＬＦ４の発現を抑制することを示唆する。
【０１６５】
Ｘｉの再活性化及びナイーブ型多能性転写因子発現の調節へのＬＢＡＯの各構成成分の寄与を決定するために、各構成成分の除去の作用を個々に評価した。６日目のＧＦＰ＋細胞の％ならびにＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、及びＰＲＤＭ１４の発現レベルが、ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、またはＯＭＰＴが除去されたときに決定された。ＧＦＰ＋細胞産生の効率と転写因子の再活性化との間に相関があった。ＬＩＦ（ＢＡＯ）なしでは、ＧＦＰ＋細胞はほぼ生じず、ＰＲＤＭ１４及びＫＬＦ２の誘導は実質的に低減され（図５、パネルＤ）、ナイーブ状態の確立または維持におけるＬＩＦの主要な役割と一致した。ＯＭＰＴ（ＬＢＡ）なしでは、ＧＦＰ＋細胞の比率においてわずかな減少があり、転写因子発現に顕著な変化はなかった。ＢＭＰ４（ＬＡＯ）またはアスコルビン酸（ＬＢＯ）の除去により、ＧＦＰ＋細胞産生の効率がＬＢＡＯレベルの４０％まで低減し、転写因子発現の作用が異なった（図５、パネルＤ）。ＰＲＤＭ１４発現は両条件下で低減されたが、ＬＢＯはＮＡＮＯＧ発現においてより劇的な減少を示した一方で、ＬＡＯはＫＬＦ４発現に関して最も影響を受けた。これらの結果は、各転写因子が、強固なＸｉ再活性化及びナイーブ型多能性と相関するＬＢＡＯ発現レベルを達成するために、構成成分の特定の組み合わせを必要とすることを示唆する。
【０１６６】
ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、またはＰＲＤＭ１４がナイーブ型細胞への転換に必要であるかどうかを調査するために、転写因子のそれぞれがＸｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにおいてｓｈＲＮＡで枯渇され、６日間、ＬＢＡＯ培地中でノックダウン細胞を培養した。ＧＦＰ及びＬＩＦシグナル伝達の下流に位置する転写因子ＳＴＡＴ３は対照として機能した。ＧＦＰ対するｓｈＲＮＡの発現はＧＦＰ蛍光の強度を１０倍低減するが、偽対照と比較して、ＧＦＰ＋細胞の％に影響を及ぼさなかった（図５、パネルＥ、データ示さず）。各因子のノックダウンは、ＧＦＰ＋細胞の比率において大幅な減少をもたらし（図５、パネルＥ）、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＰＲＤＭ１４がｍＥｐｉＳＣのナイーブ型細胞への効率的な転換に寄与することを示唆する。
【０１６７】
ＬＢＡＯ培養の６日目の遺伝子発現に対するＳＴＡＴ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、またはＰＲＤＭ１４ノックダウンの作用の検査は、ＳＴＡＴ３が残りの因子の上流に位置することを示唆する（図５、パネルＦ）。ＳＴＡＴ３ノックダウンは、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達の直接標的であるＳｏｃｓ３、及びＮＡＮＯＧを除く分析した全ての転写因子の発現を減少させ（図５、パネルＦ）、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の重要性と転写因子の調節を関連付ける。ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、またはＰＲＤＭ１４のノックダウンは、非常に類似する遺伝子発現の変化をもたらし、各因子の枯渇は、Ｓｔａｔ３またはＳｏｃｓ３に影響を及ぼすことなく他を大幅に減少させる（図５、パネルＦ）。まとめると、これらの結果は、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３経路がＫＬＦ２−ＫＬＦ４−ＰＲＤＭ１４回路の上流であり、ＬＩＦ−ＳＴＡＴ３経路と転写因子回路との間に強いフィードバックループが存在しないことを示唆する。
【０１６８】
阻害剤分析はＬＰＡＲ１／３と脂質シグナル伝達経路を関連付けた（図３、パネルＤ及びＥ）。これらの２つの受容体の相対的寄与を決定するために、各受容体がｓｈＲＮＡでＸｉ−ＧＦＰ  ｍＥｐｉＳＣにおいて枯渇され、細胞がＬＢＡＯ中で６日間培養された。意外にも、ＬＰＡＲ１の枯渇はＧＦＰ＋細胞において実質的な減少をもたらしたが、ＬＰＡＲ３の枯渇はそうではなかった（図５、パネルＥ）。加えて、ＬＰＡＲ１ノックダウン細胞は、ＳＴＡＴ３枯渇細胞と類似する遺伝子発現変化を呈し（図５、パネルＦ）、ＬＰＡＲ１シグナル伝達がＬＩＦ−ＳＴＡＴ３経路と交差することを示唆する。ＳＴＡＴ３ノックダウンはＬＰＡＲ１発現を減少させたため（図５、パネルＦ）、ＬＩＦと脂質シグナル伝達経路との間の正のフィードバックループは、ｍＥｐｉＳＣのナイーブ型細胞への転換に寄与し得る。
【０１６９】
まとめると、これらの結果は、ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）がＸｉ再活性化を誘導できる因子であるが、予想外にも、アクチビンＡ及びｂＦＧＦがＬＩＦ誘導Ｘｉ再活性化を減衰することを示す。ここで、プライム型ＰＳＣをナイーブ型ＰＳＣに効率的に転換できる混合物Ｘｉ再活性化因子を含有する新規外因性遺伝子を含まない系が開発された。この系を使用して、エピジェニック調節における脂質シグナル伝達の予期しない役割が発見され、シグナル伝達経路と細胞復帰中に機能する内因性ＫＬＦファミリー及びＰＲＤＭ１４転写因子との間の関係が明らかにされた。したがって、この系は、ナイーブ型多能性の確立に関与する内因性分子機構及び動的なエピジェニック変化を解明するまたとない機会を提供する。
【０１７０】
実施例６．ＬＩＦ、ＢＭＰ４、アスコルビン酸、及びＯＭＰＴ（ＬＢＡＯ）の組み合わせは、Ｘｉを効率的に再活性化し、ヒトプライム型ＰＳＣをナイーブ型ＰＳＣに転換する。
ヒトＨ９  ｈＥＳＣ及び雌ｉＰＳＣ（集合的に「ヒトＰＳＣ」と称される）は、７日間プライム培地中で培養され、培地は毎日交換される。翌日、プライム培地を復帰培地に交換する。ヒトＰＳＣを復帰培地中で１４日間培養する。１４日目までに、ヒトＰＳＣの一部は核においてａｔｒｘ及びｔｓｉｘの両方の２つの新規転写産物フォーカスを発現し、それらがＸａＸａであることを示唆することが企図される。加えて、復帰ヒトＰＳＣは多能性マーカー遺伝子を発現するが、ｍＥＳＣ中の分化マーカー遺伝子と類似するレベルで、それらを抑止することが企図される。最後に、Ｇａｆｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ５０４（７４７９）：２８２−２８６及びＴａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５８（６）：１２５４−１２６９に記載されるように、プライム型ヒトＰＳＣとは対照的に、ヒト−マウスキメラ胚は復帰ヒトＰＳＣのマウス胚盤胞への注入後に容易に得られることが企図される。
【０１７１】
実施例７．ナイーブ型誘導多能性幹細胞の発生
ヒト線維芽細胞は正常な線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳ）中で培養される。線維芽細胞の拡大後、線維芽細胞は、Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１（３）：４５８−４６６により記載される方法を使用して、エピソームリプログラミングベクターをヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｎｇ）することにより、ｉＰＳＣにリプログラミングされる。線維芽細胞培地におけるヌクレオフェクションの数日後、ヌクレオフェクトされた細胞をナイーブ培地に移し、３〜４週間培養する。線維芽細胞がナイーブ培地対従来の培地においてリプログラミング及び維持されるときに観察されたリプログラミング効率において１００倍増加することが企図される。加えて、ナイーブ培地において誘導されたｉＰＳＣはより未分化の表現型を呈することが企図される。これらのデータは、ＬＢＡＯが直接的なリプログラミングならびにナイーブ型ｉＰＳＣを効率的に誘導するブースターとして機能することを示唆する。
【０１７２】
実施例８．エピソームリプログラミング因子を含有する確立されたヒトｉＰＳＣからのナイーブ型誘導多能性幹細胞の発生
マウスＥＳＣ及びｉＰＳＣとは対照的に、大半のヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣは、ＸＣＩ状態、コロニー形態、ならびにＫＬＦ４、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３などのマーカー遺伝子発現によりアッセイされたとき、プライム状態にある。ＬＰＡ処理はマウス多能性細胞においてプライム状態からナイーブ状態への転換を刺激したため、次に、この生理活性脂質がヒト細胞においてナイーブ型多能性を促進し得るかどうかが決定された。ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）のための従来の培養方法は、線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）またはアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の成長培地への添加により多能性状態にｈｉＰＳＣを維持し、これらの因子の除去は分化をもたらす。
【０１７３】
ここで、ｐ５３に対するエピソームリプログラミング因子（Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｌ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、及びｓｈＲＮＡ（Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８（５）：４０９−４１２に記載されるように）は、ナイーブ状態にさらにリプログラミングするために、確立された、十分に特徴付けされたｈｉＰＳＣに導入された。ｈｉＰＳＣをラミニン−５１１上で平板培養し、ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βを含有するプライム培地中で、小さいコロニーに拡大させた。プライム培地を除去し、復帰培地１μＭ  ＯＭＰＴ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βを含まないＳｔｅｍＦｉｔ基本培地中１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦに交換した。意外にも、ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βが除去され、ＯＭＰＴ含有培地（復帰培地）がエピソームリプログラミング因子を含有するｈｉＰＳＣに添加されたとき、ナイーブ型多能性の特徴を有する細胞が観察された。これらのナイーブ様細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に特有の３次元ドーム型コロニーを形成し、プライム型ｈｉＰＳＣのコロニー形態とは非常に異なった。ＬＰＡ含有培地におけるナイーブ様細胞は、ＮＡＮＯＧを発現し続け、多能性が損なわれなかったことを示唆する（図６、パネルＡ及びＢ）。これらの結果は、ＬＰＡがヒト系においてナイーブ型多様性への転換も促進し得ることを示唆する。加えて、それらは、ＬＰＡ−ＬＰＡＲ−ＲＨＯシグナル伝達軸の調節がヒトナイーブ型多能性幹細胞を発生させ、維持するために使用され得るかどうかのさらなる調査の基盤を提供する。
【０１７４】
実施例９．リプログラミング因子を含まないｉＰＳＣからのナイーブ型誘導多能性幹細胞の発生
ヒトｉＰＳＣは、Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８（５）：４０９−４１２により記載される方法を使用して、ｐ５２に対してＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びｓｈＲＮＡを発現するエピソームベクターにより発生された。ＳｔｅｍＦｉｔ基本培地（またはｍＴｅＳＲ  ｏｒＥ８）にｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βを含有するプライム培地中でｈｉＰＳＣを成長させた。次に、プライム型ｈｉＰＳＣは復帰培地に切り替えられ、低酸素条件下で、ラミニン−５１１上で培養された。復帰培地は、様々な濃度の脂質（２μＭ  ＯＭＰＴ、１μＭ  ＯＭＰＴ、１μＭ  ＯＭＰＴ＋２０ｎＭ  ＬＰＡ、または脂質なし）と共に、ＳｔｅｍＦｉｔ基本培地に、１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦ、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１μＭ  ＰＤ０３２５９０１  ＭＥＫ阻害剤、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ３β阻害剤、及び２ｍＭ  Ｎ−アセチルシステインを含有した。５〜７日後、ナイーブ型多能性幹細胞に特有の３次元ドーム型コロニーが観察された。脂質（ＯＭＰＴまたはＯＭＰＴ／ＬＰＡ）の存在下で成長したヒトｉＰＳＣは、１ヶ月を超えて３次元ドーム型コロニーを維持し（およそ５回の継代）、一方、脂質の不在下で培養された対照細胞は、プライム型多能性幹細胞に特有の平坦なコロニーを呈した（図７）。ナイーブ型細胞は、ナイーブ型ヒト多能性幹細胞のＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ１７、及びＴＦＣＰ２Ｌ１マーカーも発現した（図９）。これらのデータは、追加のリプログラミング因子の不在下でさえ、脂質ＯＭＰＴ及びＬＰＡがプライム型ｈｉＰＳＣをナイーブ型ｈｉＰＳＣに復帰させ、ナイーブ型多能性状態を維持できることを示唆する。
【０１７５】
本発明は上記の実施形態と共に説明されてきたが、前述の説明及び実施例は図示のためであり、本発明の範囲を制限することが意図されないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点、及び修正は、本発明が属する当業者には明らかであろう。
【０１７６】
加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたは亜群メンバーに関して記載されることも認識するだろう。
【０１７７】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それぞれが個々に参照により組み込まれているかのように同じ程度まで、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【図１】
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【図２−０１】
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【図２−０２】
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【図３−０１】
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【図３−０２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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