(57)【要約】  頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＮＳＣＣ）患者の予後の予測に役立つＤＮＡメチル化プロファイル、ならびにＨＮＳＣＣの治療において有用な治療用タンパク質および養子細胞組成物。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてインビボでの腫瘍のクリアランスを誘導する方法であって、対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導する単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質を含む薬学的組成物を、腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させ、結果として対象から腫瘍のクリアランスを誘導するのに十分な量で対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
腫瘍が、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸がん、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍のＣＸＣＬ１４発現が、非腫瘍組織と比べて少なくとも２分の１に減少している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が、ヒトパピローマウイルス陽性（ＨＰＶ＋）腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させるのに十分な量が、ＣＸＣＬ１および／またはＣＸＣＬ２を含むケモカインを減少させるのに十分なＣＸＣＬ１４の量である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
個体から生物学的試料を得ること、生物学的試料を分析して該試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質の存在または不在または量または活性を決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質の存在、不在、量、または活性に基づいて治療薬を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料が唾液試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個体から生物学的試料を得ること、生物学的試料を分析して該試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルを決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルに基づいて治療薬を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試料が唾液試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
個体から生物学的試料を得ること、生物学的試料を分析して該試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態を決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態に基づいて治療薬を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試料が唾液試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、ＨＰＶ＋腫瘍を有する対象の養子細胞移植治療に有用な組成物。
【請求項１３】
ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞が、免疫適合性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を得ること、およびＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を発生させるのに十分な条件下および時間で、該細胞をＣＸＣＬ１４タンパク質と接触させることを含む方法によって製造される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
対象へのＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を含む、ＨＰＶ＋腫瘍を有する対象を治療する方法。
【請求項１５】
腫瘍が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
最初に対象からの生物学的試料を分析して、
ａ．ＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在または不在または活性；
ｂ．ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル；および
ｃ．ＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化
からなる群より選択される該試料中のバイオマーカーを決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在、不在もしくは量もしくは活性、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化に基づいて、養子細胞移植治療を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料が唾液試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＸＣＬ１４タンパク質のレベルまたは活性が、野生型またはコントロールのタンパク質活性レベルより実質的に低いことが見出される場合に、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡレベルより実質的に低いことが見出される場合に、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルより実質的に高いことが見出される場合に、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
対象における扁平上皮癌の早期診断の方法であって、対象からの生物学的試料において、
ａ．ＣＸＣＬ１４遺伝子発現；
ｂ．ＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化；ならびに
ｃ．ＨＰＶ＋腫瘍中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤；ならびに
ｄ．所属リンパ節中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤
からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーを決定することを含む方法。
【請求項２２】
生物学的試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子発現が、対象患者におけるＨＰＶ＋腫瘍の診断を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
生物学的試料中のより高度なＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化が、対象患者におけるＨＰＶ＋腫瘍の診断を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的試料が、ＨＮＳＣＣ腫瘍試料であり、ＨＮＳＣＣ腫瘍中へのより高度なＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤が、対象におけるＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ腫瘍の診断を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的試料が唾液試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
扁平上皮癌が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＰＶ＋腫瘍患者における予後を決定する方法であって、患者からの生物学的試料において、
ａ．ＣＸＣＬ１４遺伝子発現；
ｂ．ＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化；ならびに
ｃ．ＨＰＶ＋腫瘍中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤；ならびに
ｄ．所属リンパ節中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤
からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーを決定することを含む、方法。
【請求項２８】
生物学的試料におけるＣＸＣＬ１４遺伝子発現が、ＨＰＶ＋腫瘍患者にとってのより良好な臨床成果の予測を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的試料におけるより高度なＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化が、ＨＰＶ＋腫瘍患者にとってのより悪い臨床成果の予測を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
生物学的試料が、ＨＮＳＣＣ腫瘍試料であり、ＨＮＳＣＣ腫瘍中へのより高度なＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤が、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者にとってのより良好な臨床成果の予測を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
生物学的試料が唾液試料である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＰＶ＋腫瘍が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ＨＰＶ＋腫瘍の進行に関するＨＰＶ＋腫瘍の患者の予後を決定するためのインビトロでの方法であって、
ａ．がん患者からの生物学的試料において、がんに対する患者の免疫応答の状態を示す少なくとも１種の生物学的マーカーを定量化する工程；および
ｂ．少なくとも１種の生物学的マーカーに関する工程ａ）において得られた値と、同じ生物学的マーカーに関する所定の基準値とを比較する工程であって、所定の基準値が、がんの進行の特定の予後および／またはＨＰＶ＋腫瘍の療法に対する応答と相関関係にある、工程；
を含む、方法。
【請求項３４】
工程ａ）が、生物学的試料における、ＣＸＣＬ１４タンパク質またはＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在または不在、ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル、およびＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態から選択される一つ又は複数の生物学的マーカーを定量化することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの生物学的マーカーが、患者の、
ｉ）Ｔステージ（Ｔ１−２対Ｔ３−４）および組織学的グレード（中分化、低分化、または未分化）；
ｉｉ）リンパ節転移（（Ｎ０−Ｎ２ａ対Ｎ２ｂ−Ｎ３）；および
ｉｉ）臨床成果（全生存、無増悪生存、および再発）
のうちの少なくとも１つと正または負に相関する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＰＶ＋腫瘍が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸がん、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器のがんである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
生物学的試料が唾液試料である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
対象からの生物学的試料における、ＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在または不在、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態を決定することにおいて有用な試薬を含むキット。
【請求項３９】
ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを含むＨＰＶ＋腫瘍を自然に除去する個体の能力を決定するための説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを含むＨＰＶ＋腫瘍を有する個体を治療するための説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導する単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質を含む薬学的組成物によって個体を治療するための説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導する単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質を含む薬学的組成物をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４３】
ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む養子細胞移植組成物によって個体を治療するための説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４４】
ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む養子細胞移植組成物をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４５】
患者におけるＨＮＳＣＣがんの診断またはその進行の予後を決定するための説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４６】
生物学的試料から得られる、ＣＸＣＬ１４タンパク質活性、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の不在またはレベルについて値を比較するために有用な基準値またはコントロール試料をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４７】
生物学的試料が唾液試料である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
時間経過における、対象からの試料におけるＣＸＣＬ１４タンパク質活性、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の存在、不在またはレベルの状態をモニターすることによって、薬物による対象の治療（アジュバントまたはネオアジュバント）の有効性をモニターするための説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４９】
試料が唾液試料である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
少なくともＣＸＣＬ１および／またはＣＸＣＬ２を含むケモカインを減少させることによって腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させることにより、哺乳動物においてインビボでのＨＰＶ陽性（ＨＰＶ＋）腫瘍のクリアランスを誘導する、修飾されたＣＸＣＬ１４タンパク質であって、ペグ化、アセチル化、グリコシル化、およびＦｃタンパク質への共有結合から選択される少なくとも１つの修飾によって修飾されたＣＸＣＬ１４を含む、タンパク質。
【請求項５１】
対象におけるインビボでの腫瘍のクリアランスを誘導する方法であって、対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導する単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質を含む薬学的組成物を、腫瘍微小環境における免疫応答を逆転させ、結果として対象から腫瘍のクリアランスを誘導するのに十分な量で対象に投与することを含む、方法。
【請求項５２】
腫瘍が、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍のＣＸＣＬ１４発現が、非腫瘍組織と比べて、少なくとも２分の１に減少している、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
腫瘍が、ヒトパピローマウイルス陽性（ＨＰＶ＋）腫瘍である、請求項５１から５３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５５】
腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させるのに十分な量が、ＣＸＣＬ１および／またはＣＸＣＬ２を含むケモカインを減少させるのに十分なＣＸＣＬ１４の量である、請求項５１から５４の何れか一項に記載の方法。
【請求項５６】
個体から生物学的試料を得ること、生物学的試料を分析して該試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質の存在または不在または量または活性を決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質の存在、不在、量、または活性に基づいて治療薬を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項５１から５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５７】
試料が唾液試料である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
個体から生物学的試料を得ること、生物学的試料を分析して該試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルを決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルに基づいて治療薬を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項５１から５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５９】
試料が唾液試料である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
個体から生物学的試料を得ること、生物学的試料を分析して該試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態を決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態に基づいて治療薬を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項５１から５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
試料が唾液試料である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、ＨＰＶ＋腫瘍を有する対象の養子細胞移植治療に有用な組成物。
【請求項６３】
ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞が、免疫適合性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を得ること、およびＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を発生させるのに十分な条件下および時間で、該細胞をＣＸＣＬ１４タンパク質と接触させることを含む方法によって製造される、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
対象へのＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を含む、ＨＰＶ＋腫瘍を有する対象を治療する方法。
【請求項６５】
腫瘍が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸がん、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器のがんである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
最初に対象からの生物学的試料を分析して、
ａ．ＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在または不在または活性；
ｂ．ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル；および
ｃ．ＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化
からなる群より選択される該試料中のバイオマーカーを決定すること、および該試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質活性、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の存在、不在もしくは量または活性に基づいて、養子細胞移植治療を投与するか否かを決定することをさらに含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
生物学的試料が唾液試料である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＣＸＣＬ１４タンパク質のレベルまたは活性が、野生型またはコントロールのタンパク質活性レベルより実質的に低いことが見出される場合に、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことをさらに含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡのレベルより実質的に低いことが見出される場合に、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことをさらに含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７０】
試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルより実質的に高いことが見出される場合に、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことをさらに含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７１】
対象における扁平上皮癌の早期診断の方法であって、対象からの生物学的試料において、
ａ．ＣＸＣＬ１４遺伝子発現；
ｂ．ＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化；ならびに
ｃ．ＨＰＶ＋腫瘍中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤；ならびに
ｄ．所属リンパ節中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤
からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーを決定することを含む方法。
【請求項７２】
生物学的試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子発現が、対象患者におけるＨＰＶ＋腫瘍の診断を示す、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
生物学的試料中のより高度なＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化が、対象患者におけるＨＰＶ＋腫瘍の診断を示す、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
生物学的試料が、ＨＮＳＣＣ腫瘍試料であり、ＨＮＳＣＣ生物学的試料中へのより高度なＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤が、対象におけるＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ腫瘍の診断を示す、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
生物学的試料が唾液試料である、請求項７１から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７６】
扁平上皮癌が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項７１から７５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７７】
腫瘍患者、例えばＨＰＶ＋腫瘍患者における予後を決定する方法であって、患者からの生物学的試料において、
ａ．ＣＸＣＬ１４遺伝子発現；
ｂ．ＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化；ならびに
ｃ．ＨＰＶ＋腫瘍中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤；ならびに
ｄ．所属リンパ節中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤
からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーを決定することを含む、方法。
【請求項７８】
生物学的試料におけるＣＸＣＬ１４遺伝子発現が、ＨＰＶ＋腫瘍患者にとっての良好な臨床成果の予測である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
生物学的試料におけるより高度なＣＸＣＬ１４遺伝子プロモーターのメチル化が、ＨＰＶ＋腫瘍患者にとってのより悪い臨床成果の予測である、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
生物学的試料が、ＨＮＳＣＣ腫瘍試料であり、ＨＮＳＣＣ腫瘍中へのより高度なＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤が、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者のより良好な臨床成果の予測である、請求項７７から７９の何れか一項に記載の方法。
【請求項８１】
生物学的試料が唾液試料である、請求項７７から７９の何れか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＨＰＶ＋腫瘍が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌である、請求項７７から８１の何れか一項に記載の方法。
【請求項８３】
ＨＰＶ＋腫瘍の進行に関するＨＰＶ＋腫瘍の患者の予後を決定するためのインビトロでの方法であって、
ａ．がん患者からの生物学的試料において、がんに対する患者の免疫応答の状態を示す少なくとも１種の生物学的マーカーを定量化する工程；および
ｂ．少なくとも１種の生物学的マーカーに関する工程ａ）において得られた値と、同じ生物学的マーカーに関する所定の基準値とを比較する工程であって、所定の基準値が、がんの進行の特定の予後および／またはＨＰＶ＋腫瘍の療法に対する応答と相関関係にある、工程
を含む、方法。
【請求項８４】
工程ａ）が、生物学的試料における、ＣＸＣＬ１４タンパク質またはＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在または不在、ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル、およびＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の状態から選択される一つ又は複数の生物学的マーカーを定量化することを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも１つの生物学的マーカーが、患者の、
ｉｉｉ）Ｔステージ（Ｔ１−２対Ｔ３−４）および組織学的グレード（中分化、低分化、または未分化）；
ｉｉ）リンパ節転移（（Ｎ０−Ｎ２ａ対Ｎ２ｂ−Ｎ３）；および
ｉｖ）臨床成果（全生存、無増悪生存、および再発）
のうちの少なくとも１つと正または負に相関する、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
ＨＰＶ＋腫瘍が、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸がん、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器のがんである、請求項８３から８５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８７】
生物学的試料が唾液試料である、請求項８３から８６の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ：ＮＩＨ）によって与えられた認可番号ＡＩ０９１９６８に基づく政府支援を用いて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、特にがん生物学の分野における、患者予後の予測因子としてのＤＮＡメチル化、ならびに頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＮＳＣＣ）の治療において有用な治療タンパク質および養子細胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
本開示の背景
ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）は、子宮頸癌および頭頸部癌（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：ＨＮＣ）を含む複数のヒトがんに原因として関連しており、結果として世界中で年間約５０万人の死亡を引き起こしている（１、２）。ＨＰＶ関連のがんの進行は、多段階プロセスであり、初期感染から数十年にわたる多くの分子変化の累積作用が、最終的に癌を引き起こす。性的に活発な女性の大部分がＨＰＶに感染するが、持続的ＨＰＶ感染症を確立して前癌病変を発生させるのは、そのうちの約１０−２０％のみである。これらの前癌病変のうち、浸潤癌へと進行するものはほんの一部である（４）。
【０００４】
ＨＰＶ関連の中咽頭扁平上皮癌（ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＮＳＣＣ）の発生率は、劇的に増加し続けており、２０２０年までに、おそらく米国および全世界の全てのＨＮＳＣＣ症例の大部分を占めると予想される。ＨＮＳＣＣが進行する数十年の間、ＨＰＶは存続し、宿主の監視機構を逃れ、継続的に宿主細胞の増殖および形質転換に寄与する。しかしながら、特に宿主の免疫との関連において、ＨＰＶによって誘起されるＨＮＳＣＣ疾患の進行の分子メカニズムについては、ほとんど知られていない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明者らは、ＣＸＣＬ１４が、ＨＰＶ陽性癌において劇的に下方制御されることを見出した。ＣＸＣＬ１４のＨＰＶ抑制は、ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７に依存しており、ＣＸＣＬ１４プロモーターにおける過剰メチル化に関連している。インビボ試験により、ネズミ科動物のＣＸＣＬ１４の再発現が、免疫応答性同系マウスにおけるＨＰＶ陽性腫瘍を除去し、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節においてＣＤ８＋Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の集団を著しく増加させることが明らかとなった。
【０００６】
したがって、本開示の一態様は、単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質である。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導する。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、哺乳動物において、インビボでの腫瘍クリアランスを誘導し得る。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、ＣＸＣＬ１および／またはＣＸＣＬ２を含むいくつかのケモカインの存在および／または効果を減少させることによって、腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させ得る。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、哺乳動物におけるインビボでのＨＰＶ陽性（ＨＰＶ＋）腫瘍のクリアランスを誘導し得る。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導することのインビボでの生物活性を維持しつつ、その長さ全体において、野生型ＣＸＣＬ１４タンパク質に対して少なくとも９２％の同一性または少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性である、単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質変異体であり得る。
【０００７】
単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、遺伝子組換えヒトＣＸＣＬ１４タンパク質を含む遺伝子組換えＣＸＣＬ１４タンパク質であり得る。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、修飾、例えば、Ｆｃタンパク質への共有結合など、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、および／またはナノ粒子、例えば、金属（例えば、金）ナノ粒子など、への結合を含む、修飾されたタンパク質でもあり得る。したがって、単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、ＩｇＧのＦｃドメインおよび／またはＩｇＧの重鎖および／またはＩｇＧの軽鎖に結合した融合タンパク質として、提供および／または投与され得る。ＣＸＣＬ１４−Ｆｃの融合ポリペプチド／タンパク質コンストラクトも、アセチル化またはペグ化によって修飾することができる。
【０００８】
別の態様において、本開示は、上記において説明される、その修飾コンストラクトまたは融合コンストラクトを含む単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、対象においてインビボでの腫瘍のクリアランスを誘導する方法であって、任意の単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または修飾されたその変形、あるいは本明細書において説明される薬学的組成物を、対象からＨＰＶ＋腫瘍のクリアランスを誘導するのに十分な量で対象に投与することを含む、方法を提供する。腫瘍のＣＸＣＬ１４発現は、非腫瘍組織またはコントロール組織と比べて、少なくとも２分の１、または３分の１、または４分の１に減少し得る。二者択一的にまたは追加的に、腫瘍のＣＸＣＬ１４発現は、非腫瘍組織またはコントロール組織と比べて、少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、またはそれ以上減少し得る。腫瘍は、ＨＰＶ＋腫瘍、例えば、ＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、または外陰、膣、陰茎、もしくは肛門の肛門性器の癌であり得る。
【００１０】
腫瘍を有する患者を治療するこれらの方法は、個体から生物学的試料を採取すること、試料を分析して、試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質の存在または不在、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡの転写レベル、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化を決定すること、および試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質の存在、不在もしくは量、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化に基づいて治療薬を投与するか否かを決定することを含み得る。本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または薬学的組成物は、ＣＸＣＬ１４タンパク質活性が野生型またはコントロールのタンパク質活性レベルより実質的に低いことが見出された場合に投与され得る。本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または薬学的組成物は、試料中のＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルが野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルより実質的に低いことが見出された場合に投与され得る。本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または薬学的組成物は、試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルが野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４遺伝子のメチル化のレベルより実質的に高いことが見出された場合に投与され得る。
【００１１】
本発明者らは、ＣＸＣＬ１４発現が腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）へのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤を増加させることも実証した。本発明者らは、ＣＸＣＬ１４発現性腫瘍細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞移動を刺激するが、マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞に対する効果は少ないことも示した。これらの結果は、ＣＸＣＬ１４が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ＴＭＥ）中へと動員することによって腫瘍クリアランスにおいて重要な役割を果たしていることを示している。
【００１２】
したがって、本開示の一態様は、ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、ＨＰＶ＋腫瘍を有する対象の養子細胞移植治療に有用な組成物である。ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、免疫適合性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞、およびＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を発生させるのに十分な条件下および時間で、細胞をＣＸＣＬ１４タンパク質と接触させることを含む方法によって生成され得、それにより、細胞が対象へと養子移植され得る。
【００１３】
本開示における関連態様は、対象にＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植を行うことによって、ＨＰＶ＋腫瘍を有する対象を治療する方法である。腫瘍は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣであり得る。本方法は、最初に、腫瘍試料を含む対象由来の生物学的試料を分析して、試料におけるＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在または不在またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化を決定すること、および試料におけるＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在、不在もしくは量、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化に基づいて、養子細胞移植治療を投与するか否かを決定することを含み得る。ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植は、ＣＸＣＬ１４タンパク質活性が、野生型またはコントロールのタンパク質活性レベルより実質的に低いことが見出される場合に投与され得る。ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植は、試料におけるＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡのレベルより実質的に低いことが見出される場合に投与され得る。ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子細胞移植は、試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルより実質的に高いことが見出される場合に投与され得る。
【００１４】
単純なＨＰＶ試験を超えて、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣにおける治療に患者を導くために利用可能な予測バイオマーカーはほとんどない。現在、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者は、ＨＰＶ患者より低い化学放射線適用量によって治療される。
【００１５】
ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者の大部分は、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ患者と比べて、従来の治療（手術および／または化学放射線療法）後に良好な予後を有する。しかしながら、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者におけるあるサブセットは、局所領域リンパ節への転移を示し、リンパ節転移のみでは、患者の生存率全体を５０％近くまで減少させ得、これが、リンパ節転移の状態をＨＮＳＣＣにおける最も重要な予後因子にしている。さらに、リンパ節転移を有するＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣのサブセットは、結節性疾患を有さないＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣよりも低い生存率の、芳しくない予後を有する（７０％対９３％）。
【００１６】
本発明者らは、ＣＸＣＬ１４タンパク質の顕著な減少およびＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化の増加を伴う、ＨＰＶ関連癌進行の際に特有のケモカイン変化が存在することを示した。さらに、本発明者らは、ＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化が、組織と同様に唾液において検出可能であることを示した。前に述べたように、ＣＸＣＬ１４発現は、腫瘍およびリンパ節においてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞集団を増加させることによって腫瘍細胞を除去する。
【００１７】
したがって、本開示の一態様は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者において免疫応答を決定し、臨床成果を予測するための予測マーカーとしての、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤の使用である。これらの方法において、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化は、腫瘍微小環境中へのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤に相関し得る。これらの方法において、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化は、リンパ節転移の無いＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者におけるより良好な臨床成果の予測を示し得る。
【００１８】
この態様は、癌の進行に対するＨＮＳＣＣ患者の予後のためのインビトロの方法であって、ａ）ＨＮＳＣＣ患者からの生物学的試料（腫瘍組織試料であり得る）において、癌に対する患者の免疫応答の状態を示す少なくとも１種の生物学的マーカーを定量化する工程；ならびにｂ）上記少なくとも１種の生物学的マーカーに関する工程ａ）において得られた値と、同じ生物学的マーカーに関する所定の基準値とを比較する工程であって、所定の基準値が、癌の進行の特定の予後および／または特定のＨＮＳＣＣ療法に対する応答と相関関係にある、工程；を含む方法を提供する。これらの方法において、工程ａ）は、生物学的試料における、ＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在もしくは不在またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化から選択される、一又は複数の生物学的マーカーを定量化することを含み得る。これらの方法において、ＣＸＣＬ１４発現および／またはプロモーターのメチル化および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍浸潤は、患者の以下：
ｉ）Ｔステージ（Ｔ１−２対Ｔ３−４）および組織学的グレード（中分化、低分化、または未分化）；
ｉｉ）リンパ節転移（（Ｎ０−Ｎ２ａ対Ｎ２ｂ−Ｎ３）；ならびに
ｉｉ）臨床成果（全生存、無増悪生存、および再発）
のうちの少なくとも１つと正または負に相関する。
【００１９】
本開示は、試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質活性、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の存在、不在またはレベルを決定するために有用なキットも提供する。本キットは、対象からの試料におけるＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在もしくは不在またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化を決定することにおいて有用な試薬を含み得る。本キットは、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを含むＨＰＶ＋腫瘍を自然に除去するための個体の能力を決定するための説明書を含み得る。本キットは、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを含むＨＰＶ＋腫瘍を有する個体を治療するための説明書を含み得る。本キットは、本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または薬学的組成物によって個体を治療するための説明書を含み得る。本キットは、本開示におけるＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む養子細胞移植組成物によって個体を治療するための説明書を含み得る。本キットは、患者におけるＨＮＳＣＣ癌の進行の予後を決定するための説明書もさらに含み得る。本キットは、生物学的試料から得られるＣＸＣＬ１４タンパク質活性の不在もしくはレベルまたはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化について値を比較するために有用な基準値またはコントロール試料もさらに含み得る。本キットは、時間経過における、対象からの試料におけるＣＸＣＬ１４タンパク質活性、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化の存在、不在またはレベルの状態をモニターすることによって、薬物による対象の治療（アジュバントまたはネオアジュバント）の有効性をモニターするための説明書もさらに含み得る。
【００２０】
この概要は、本発明の全内容および範囲を表すことを目的とするものではなく、そのように解釈されるべきでもない。さらに、本明細書において、「本開示」またはそれらの態様に対する言及は、本開示のある特定の実施態様を意味すると理解されるべきであり、必ずしも全ての実施態様を特定の説明に限定すると解釈されるべきでもない。本開示は、この概要ならびに添付の図面および実施態様の説明において様々なレベルの詳細さにおいて説明され、この概要に要素、成分などが含まれるか否かによって本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本開示のさらなる態様は、特に図面と一緒に読むことで、実施態様の説明がより容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＨＰＶ関連のがん進行の間におけるケモカイン発現の変化を示す。全ての既知のケモカインの遺伝子発現レベルを、示されるように、異なる疾患段階の１２８の子宮頸組織から分析した。
【図２】ＣＸＣＬ１４発現がＣｘＣａおよびＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ組織において下方制御されることを示す。ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ発現レベルを、１２８の子宮頸（Ａ）および４２のＨＮＳＣＣ（Ｂ；ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ、ｎ＝２６；ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ、ｎ＝１６）組織試料を使用して分析した。遺伝子発現における正規化された蛍光強度が、異常値（黒い正方形）に対してＴｕｋｅｙの方法を用いて、箱髭図において示されている。Ｐ値は、一方向ＡＮＯＶＡ分析（Ａ）またはスチューデントｔ−検定（Ｂ）によって、各推移の間またはＨＰＶ−とＨＰＶ＋ＨＮＣとの間において決定した。
【図３】ＣＸＣＬ１４発現がＨＰＶ＋ケラチン細胞において減少することを示す。全ＲＮＡを、示されたケラチン細胞系から抽出した。ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。データは、βアクチンによって正規化された相対表現（±ＳＤ）として示されている（Ａ−Ｃ）。（Ｄ）ＣＸＣＬ１４のＩＣＣを、ＣＸＣＬ１４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＮＩＫＳ細胞およびＮＩＫＳ−１６細胞によって実施した。
【図４】ＨＰＶ＋細胞におけるＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化を示す。ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩によって抽出し処理した。記載されるように（Ｓｏｎｇ  ２０１０）、ＭＳＰ（Ａ＆Ｃ）および重亜硫酸塩配列決定（Ｂ）を実施した。（Ｃ）  コントロールのＣＸＣＬ１４プロモーターおよび過剰メチル化されたＣＸＣＬ１４プロモーターのＭＳＰ産生物は、それぞれ、「Ｃ」および「Ｍ」として示される。
【図５】ＤＮＭＴ１がＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ（Ａ）およびＣｘＣａ進行（Ｂ）において上方制御することを示す。図１で説明されるように、４２の頭頚部癌（Ａ）および１２８の子宮頸（Ｂ）の組織試料を使用してＤＮＭＴ１のｍＲＮＡレベルを分析した。スチューデントｔ−検定によってＨＰＶ−とＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣとの間において、または一方向ＡＮＯＶＡ分析によって各推移の間において、Ｐ値を計算した。（Ｃ）ＲＴ−ｑＰＣＲによってＤＮＭＴ１のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。Ｐ値をスチューデントｔ−検定によって決定した。＊Ｐ＜０．００１であり、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図６】メチル化阻害剤によるＣＸＣＬ１４再発現を示す。６日間にわたって、１０μＭのデシタビンまたはビヒクルコントロールでＣａＳｋｉ細胞を処理した。それぞれ、全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲおよびＭＳＰを実施した。
【図７】マウス口腔上皮細胞におけるＣｘｃｌ１４発現およびプロモーターのメチル化を示す。全ＲＮＡをマウス表皮細胞系、ＭＯＥ／ｓｈＰＴＰＢＬ（ＨＰＶ−）およびＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７（ＨＰＶ＋）から抽出した。ＲＴ−ｑＰＣＲによってＣｘｃｌ１４  ｍＲＮＡレベルを測定した。スチューデントｔ−検定によってＰ値を計算した。ｐ＜０．０００２である。
【図８】Ｃｘｃｌ１４発現が、免疫応答性マウスのＨＰＶ＋腫瘍を除去するが、Ｒａｇ１−欠損マウスでは除去しないことを示す。Ｃｘｃｌ１４を発現する２つのＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞クローン（クローン８および１６）および１つのベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞クローンを、野生型（Ａ＆Ｂ）およびＲａｇ１−／−（Ｃ＆Ｄ）Ｂ６マウスの後右脇腹に注入した（ｎ＝１０、野生型の各郡；ｎ＝７、Ｒａｇ１−／の各郡）。（Ａ＆Ｃ）腫瘍増殖を、式：体積＝（幅）２×長さによって毎週決定した。カプラン・マイヤー推定量を使用して生存率を分析した。（Ｂ＆Ｄ）事象発生までの時間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ）を、２，５００ｍｍ３を超える腫瘍負荷である事象について、各郡（ベクターのみ、Ｃｘｃｌ１４−クローン８、Ｃｘｃｌ１４−クローン１６）に対して決定した。腫瘍に関連しない死亡を排除した。ログランク検定によってＰ値を決定した。
【図９】ＣＸＣＬ１４が腫瘍およびリンパ節においてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞集団を増加させることを示す。Ｃｘｃｌ１４（クローン＃８および＃１６）またはベクターを有するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を、Ｂ６マウスの右脇腹に注入した（ｎ＝３、各郡）。注入後２１日目に、腫瘍（Ａ）およびリンパ節（Ｂ）組織を採取した。フローサイトメトリーによって免疫細胞集団の割合を決定した。
【図１０】ＣＸＣＬ１４がＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の走化性を誘導することを示す。Ｃｘｃｌ１４またはベクターを有するＭＯＥ細胞を、トランスウエルの下部チャンバーにおいて培養した。脾細胞を上部チャンバーに加えた。１２時間のインキュベート後、下部チャンバーに移動した脾細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。
【図１１】ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子移植がＣｘｃｌ１４によって誘導されることを示す。
【図１２】リガンド−受容体複合体のＴｒｉＣＥＰＳ技術のワークフローを示す。
【図１３】ＣＸＣＲ７の下方制御およびプロモーターの過剰メチル化を示す。（Ａ）前に説明したように、マイクロアレイを実施した。示されているのは、相対蛍光強度に基づくｍＲＮＡ発現である。（Ｂ）（Ａ）としてＮＩＫＳ細胞の同じバッチからゲノムＤＮＡを抽出し、重亜硫酸塩反応によって変換して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０Ｋメチル化ビーズチップ上にハイブリダイズさせた。示されているのは、メチル化の変化率対ＮＩＫＳにおけるメチル化である。全ての試料を３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）にした。
【図１４】Ｃｘｃｌ１４がＲａｇ１／−マウスにおける骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を減少させることを示す。Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞クローン（８および１６）および１つのベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞クローンをＲａｇ１−／−マウスに注入した（ｎ＝４、各郡）。注入後２３日目に、腫瘍（Ａ）および脾臓（Ｂ）を採取し、ホモジナイズして、フローサイトメトリーによって分析した。抗ＭＨＣＩＩ抗体、抗Ｇｒ１抗体、および抗ＣＤ１１ｂ＋抗体を使用して、ＭＤＳＣ細胞の相対的存在量を決定した（Ａ＆Ｂ）。
【図１５】ＣＸＣＲ２リガンドの発現がＣｘＣａおよびＨＮＳＣＣ患者において上方制御されることを示す。１２８の子宮頸および５６の頭頸部組織試料を使用して、ＣＸＣＬ１／２およびＩＬ−８  ｍＲＮＡレベルを分析した。各郡からのｍＲＮＡ発現における正規化された蛍光強度が、異常値（黒い円）に対してＴｕｋｅｙの方法を用いて、箱髭図において示されている。Ｐ値を一方向ＡＮＯＶＡ分析によって決定した。
【図１６】Ｃｘｃｌ１４発現がＴｒｅｇ細胞を減少させることを示す。Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞クローン（８および１６）および１つのベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞クローンをＢ６マウスの後右脇腹注入した（ｎ＝３、各郡）。注入後２１日目に、脾臓を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。抗ＣＤ４抗体およびＣＤ２５抗体を使用して、Ｔｒｅｇ細胞の相対的存在量を決定した。
【図１７】患者の唾液試料中のＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化の検出を示す。ゲノムＤＮＡを唾液試料から抽出し、重亜硫酸塩によって処理した。図４において説明されるように、ＭＳＰを実施した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書において使用される場合、用語「約」は、列記された値の±１０％を意味する。
【００２３】
本明細書において使用される場合、単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）、精製した（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）などの用語は、必ずしも、本発明の細胞または分子の純度について言及しているわけではない。その代わりに、そのような用語は、それらの本来の環境から、またはそれらが生じた環境の構成要素から分離された細胞または分子について言及するものである。例えば、ヒトを含む生きている動物内に存在する、天然に存在する細胞または分子（例えば、ＤＮＡ分子、タンパク質など）は、単離されていない。しかしながら、同じ細胞または分子が、動物内の共存する材料の一部または全てから分離された場合、それらは単離されたとみなされる。さらなる例として、本発明によれば、個体から得られた血液の試料中に存在するタンパク質分子は、単離されているとみなされるであろう。「単離された」が細胞の純度を意味しないという概念に従い、さらなる精製工程を使用してそのような血液試料から得られたタンパク質分子も、「単離された」とみなされるであろうことは、理解されるべきである。さらに、本発明における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、例えば、その天然源（例えば、ヒト）から得ることができ、遺伝子組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができ、または化学的に合成することもできる。
【００２４】
「薬学的組成物」は、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化され、哺乳動物の疾患の治療のための治療計画の一部として政府の監督官庁の承認を得て製造または販売される、本発明のＣＸＣＬ１４タンパク質または誘導されたＴ細胞を含有する組成物を意味する。薬学的組成物は、例えば、単位投与形態での経口投与用（例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、ジェルキャップ剤、またはシロップ剤など）：局所投与用（例えば、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏として）；静脈内投与用（例えば、微粒子塞栓不含の滅菌溶液として、および静脈内用途にとって好適な溶媒系において）；または、本明細書において説明される任意の他の製剤へと、製剤化することができる。
【００２５】
「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書において説明されるＣＸＣＬ１４タンパク質および／または誘導されたＴ細胞以外の、患者において無毒性かつ非炎症性の特性を有する任意の原料成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）を意味する。賦形剤は、例えば、接着防止剤（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｉｄ）、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、塗膜形成剤（ｆｉｌｍ  ｆｏｒｍｅｒ）またはコーティング剤、香料、芳香剤、流動促進剤（フローエンハンサー）、潤滑剤、防腐剤、印刷用インキ、収着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和作用の水を含み得る。例示的賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋されたポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポピドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、セラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
【００２６】
個体、対象、および患者なる用語は、当技術分野においてよく認識されており、本明細書では、イヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、最も好ましくはヒトを含む哺乳動物を意味するために相互互換的に使用される。対象は、抗がん治療を必要とし得る。個体、対象、および患者なる用語は、それらによって、特定の年齢、性別、人種などを示すものではない。したがって、男女に関係なく任意の年齢の個体が、本開示に包含されることが意図される。同様に、本発明の方法は、例えば、コーカサス人（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、ヒスパニック系、ラテン系、アジア系、およびヨーロッパ人などを含む任意の人種に適用することができる。本発明のいくつかの実施態様では、そのような特性が重要である。そのような場合、重要な特性（年齢、性別、人種など）が示されるであろう。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果などの有益なまたは所望の結果を得るための手法である。有益なまたは所望の結果は、これらに限定されるわけではないが、一つ又は複数の症候または状態の緩和または改善；疾患、障害、または症状の減弱；疾患、障害、または症状の状態の安定化（すなわち、非悪化）；疾患、障害、または症状の拡大の防止；疾患、障害、または症状の進行の遅延または鈍化；疾患、障害、または症状の改善または緩和；ならびに検出可能か検出不可能かに関わらない寛解（部分的または全体的）を含み得る。疾患、障害、または症状を「緩和すること」は、治療を行わない場合の程度または経時変化と比べて、疾患、障害、または症状の程度および／または望ましくない臨床症状が、軽減されること、および／または進行の経時変化が鈍化されるかまたは延長されることを意味する。「がんを治療すること」、「がんを予防すること」、または「がんを阻害すること」は、腫瘍のサイズまたはがん細胞の数における減少を生じさせること、腫瘍のサイズの増加またはがん細胞増殖を鈍化または阻害すること、腫瘍または他のがんの消滅とその再発との間の無疾患生存時間を増加させること、腫瘍または他のがんの初期の発生または後続の発生を予防することまたはその可能性を減少させること、あるいは腫瘍または他のがんに関連する有害症候を減少させることを意味する。所望の実施態様において、治療を生き延びた腫瘍またはがん細胞の割合は、任意の標準的アッセイを使用して測定した場合に、腫瘍またはがん細胞の初期の数より少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％低い。望ましくは、本開示におけるペプチドまたは誘導された免疫細胞の投与によって誘導された、腫瘍またはがん細胞の数の減少は、非腫瘍または非がん細胞の数における減少の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍である。望ましくは、本開示の方法は、標準的方法を使用して決定した場合、腫瘍のサイズまたはがん細胞の数において、２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％の減少を結果として生じる。望ましくは、治療された対象の少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、または９５％が、腫瘍またはがんの全ての証拠が消滅する完全寛解を有する。望ましくは、腫瘍またはがんは、再発しないか、または５年間、１０年間、１５年間、または２０年間未満において再発しない。対象における疾患または状態（例えば、がん）を「予防的に治療すること」は、病徴が現れる前に、疾患または状態の発生（すなわち、発症）のリスクを減少させること、またはそれらの重篤度を低下させることを意味する。予防的処置は、疾患またはその症候が現れることを完全に予防し得るかまたは減少させ得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全な回復の観点において治療的であり得る。予防的処置は、疾患に罹り易くあり得るがまだ疾患または障害を有するとは診断されていない個体において、疾患または状態の発生を減少させることまたは予防すること（例えば、がんを予防すること）を含み得る。
【００２８】
本明細書において使用される場合、生物学的試料は、ＣＸＣＬ１４タンパク質の存在もしくは不在またはＣＸＣＬ１４遺伝子の発現レベルまたはメチル化状態について分析することができる、個体由来の任意の体液または組織を意味する。本開示の方法を実践するために使用することができる試料としては、血液試料、唾液試料、尿試料、涙試料、組織試料、および口腔スワブが挙げられる。ＤＮＡ抽出およびジェノタイピングにとって好ましい試料は、血液試料および頬側ぬぐい液試料である。そのような試料を得る方法も、当業者に既知である。試料が得られたら、ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡの存在、不在もしくはレベル、ＣＸＣＬ１４遺伝子のメチル化、またはＣＸＣＬ１４タンパク質を決定するために分析され得る。本明細書において使用される場合、用語「決定する」、「ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡのレベルを決定する」、「ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡおよびタンパク質の量を決定する」、「Ｃｘｃｌ１４遺伝子のメチル化状態を決定する」などは、試料中のＣＸＣＬ１４の存在または状態を検出または測定するために使用することができる任意の技術を包含することが意図される。この文脈において、ＣＸＣＬ１４は、被分析物の例である。そのような技術は、定性的または定量的な結果を与え得る。ＣＸＣＬ１４のレベルは、全ＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡおよびタンパク質を検出することによって、またはＣＸＣＬ１４の断片または分解生成物を検出することによって、決定することができる。
【００２９】
実施態様の説明
本開示は、患者におけるがんの予後のための新規の方法であって、がんに対する患者の適応免疫応答の存在またはレベルを示す、一つ又は複数の生物学的マーカーの検出および／または定量化に基づく方法を提供する。
【００３０】
驚くべきことに、ＨＰＶ＋癌、特にＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣに対するｉｎ  ｓｉｔｕ適応免疫応答の決定が、担がん患者の臨床成果を予測するためのパラメータとして使用できるということが、本開示により示された。
【００３１】
さらに、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化とＨＰＶ＋腫瘍発生および増殖との間の驚くべき相関は、対象の扁平上皮癌を診断する方法の有用性を実証している。これらの方法は、ＨＮＳＣＣ腫瘍の存在を診断するため、またはＨＮＳＣＣ腫瘍の予後を決定するための、対象から唾液試料を採取する非侵襲的診断方法において、特に有用である。唾液試料を含むそのような試料における過剰メチル化されたＣＸＣＬ１４のＤＮＡの検出は、最小限の侵襲的または非侵襲的試験による扁平上皮癌の早期検出にとって、特に有用である。
【００３２】
さらに、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化および／またはＣＤ８＋Ｔ腫瘍細胞とＮＫ腫瘍細胞浸潤との間の驚くべき相関は、ＣＸＣＬ１４タンパク質および／またはＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含有する組成物ならびにそれらを投与する方法の有用性を示している。
【００３３】
本開示は、対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導することにおいて有用な、単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質またはＣＸＣＬ１４タンパク質変異体を含有する薬学的組成物を提供する。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、哺乳動物のインビボでの腫瘍クリアランスを誘導し得る。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、哺乳動物におけるインビボでのＨＰＶ陽性（ＨＰＶ＋）腫瘍のクリアランスを誘導し得る。単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質は、対象において抗腫瘍性免疫応答を誘導することのインビボでの生物活性を維持しつつ、その長さ全体において、野生型ＣＸＣＬ１４タンパク質に対して少なくとも９２％の同一性または少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性である、単離されたＣＸＣＬ１４変異体であり得る。
【００３４】
ＣＸＣＬ１４のタンパク質変異体は、少なくとも７０の近接するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質であり得、この場合、少なくとも７０の近接するアミノ酸配列は、その長さ全体において、ＣＸＣＬ１４タンパク質の少なくとも７０の近接するアミノ酸配列に対して、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９８％の同一性である。２つのタンパク質または核酸分子の間の同一性のパーセントを決定する方法は、当業者に既知である。
【００３５】
そのようなＣＸＣＬ１４変異体に関して、アミノ酸配列における任意のタイプの改変は、変異体が、本明細書において説明される少なくとも１つのＣＸＣＬ１４タンパク質活性を維持する限り、許容される。そのような変異体の例としては、これらに限定されるわけではないが、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、およびそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、多くの場合、そのタンパク質の活性に著しい影響を及ぼすことなく、タンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から一つ又は複数のアミノ酸を除去することができることを当業者はよく理解する。同様に、多くの場合、タンパク質の活性に著しい影響を及ぼすことなく、タンパク質中に一つ又は複数のアミノ酸を挿入することができる。
【００３６】
言及したように、単離されたＣＸＣＬ１４変異体タンパク質は、野生型ＣＸＣＬ１４タンパク質と比べたときのアミノ酸置換も含み得る。タンパク質のサイトカイン活性が著しく影響されない限り、任意のアミノ酸置換が許容される。これに関して、アミノ酸をその物理特性に基づく群へと分類することができることは、当技術分野において理解される。そのような群の例としては、これらに限定されるわけではないが、荷電されたアミノ酸、非荷電のアミノ酸、非荷電の極性アミノ酸、および疎水性アミノ酸が挙げられる。置換を含む好ましい変異体は、そのアミノ酸が同じ群のアミノ酸で置換されているものである。そのような置換は、保存的置換と呼ばれる。
【００３７】
天然に存在する残基は、以下の共通の側鎖特性に基づくクラスに分類され得る：
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；ならびに
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００３８】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを伴い得る。好ましい実施態様において、そのような置換された残基をヒトＣＸタンパク質中へと導入することにより、本開示の治療方法において有用な活性変異体を形成することができる。
【００３９】
アミノ酸変化を為す場合、アミノ酸の疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および荷電特性に基づいて、疎水性指標が割り当てられている。疎水性指標は以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．５）；およびアルギニン（−４．５）。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する場合のアミノ酸の疎水性指標の重要性は、一般に当技術分野において理解されている（Kyteら,1982, J. Mol. Biol. 157:105-31）。ある特定のアミノ酸を類似の疎水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換してもよいこと、ならびに依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが知られている。疎水性指数に基づいて変化を為す場合、疎水性指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がよりいっそう特に好ましい。
【００４０】
類似のアミノ酸における置換は、特に、本発明の場合のように、それによって作製される生物学的機能的に同等のタンパク質またはペプチドが、免疫学的な実施態様での使用を目的とする場合、親水性に基づいて効果的に為すことができることも、当技術分野において理解される。タンパク質の最大局所平均親水性は、それらがその隣接するアミノ酸の親水性が基準となる場合、その免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。これらのアミノ酸の残基には以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいて変化を為す場合、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がよりいっそう特に好ましい。親水性に基づいて一次アミノ酸配列から抗原性を同定することもできる。
【００４１】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、当業者であれば、そのような置換が所望される時点において決定することができる。例えば、アミノ酸置換は、ＣＸＣＬ１４タンパク質における重要な残基を同定するために、または本明細書において説明されるＣＸＣＬ１４タンパク質の親和性を増加もしくは減少させるために、使用することができる。例示的アミノ酸置換を以下の表に示す。
2018532745.tif 000003
【００４２】
したがって、本開示のＣＸＣＬ１４タンパク質変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得、この場合、置換は、この表に示されるそれらの置換を含む保存的置換である。
【００４３】
別の態様において、本開示は、対象における疾患または障害を治療または予防的に治療する方法であって、対象に任意のＣＸＣＬ１４タンパク質またはＣＸＣＬ１４タンパク質変異体またはこれらのタンパク質を含む薬学的組成物を、疾患または障害を治療するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。疾患は、がん（例えば、ＨＮＳＣＣ）または他の腫瘍性疾患ならびに関連する合併症であり得る。これらの治療方法におけるＣＸＣＬ１４タンパク質の投与は、対象におけるインビボでのＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを含むＨＰＶ＋腫瘍のクリアランスを誘導し得る。
【００４４】
これらの治療方法は、最初に個体から生物学的試料を採取すること、および試料を分析して、試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在もしくは不在、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化を決定すること、および試料中のＣＸＣＬ１４タンパク質活性の存在、不在もしくは量、またはＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベル、またはＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化に基づいて、治療薬を投与するか否かを決定することを含み得る。本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質またはＣＸＣＬ１４タンパク質変異体または薬学的組成物は、ＣＸＣＬ１４タンパク質活性が、野生型またはコントロールのタンパク質活性レベルより実質的に低いことが見出される場合に投与され得る。本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または薬学的組成物は、試料におけるＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡ転写レベルが、野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４  ｍＲＮＡレベルより実質的に低いことが見出される場合に投与され得る。本開示における単離されたＣＸＣＬ１４タンパク質または薬学的組成物は、試料中のＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化のレベルが野生型またはコントロールのＣＸＣＬ１４遺伝子の過剰メチル化レベルより実質的に高いことが見出される場合に、投与され得る。
【００４５】
抗腫瘍性免疫応答におけるその役割から、ＣＸＣＬ１４は、本明細書において説明されるものならびに養子Ｔ細胞移植を含む、Ｔ細胞ベースの治療手法にとっての最適な標的である。したがって、本開示は、本開示のＣＸＣＬ１４ペプチドによってインビトロにおいて誘導された、または免疫原性ＣＸＣＬ１４ペプチドを発現するように変更された、ＣＤ８＋および／またはＮＫ細胞の対象（例えば、ＨＮＳＣＣ患者）への養子移植を伴う免疫治療プロトコールも提供する。選別していないまたは選別されたＴ細胞を使用する養子移植プロトコールは、当技術分野において既知であり（例えば、米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号および同第２０１０／０３１０５３４号を参照のこと；これらの文献は、出典明示により本明細書に援用される）、ならびに詳細には一つ又は複数の免疫原性ＣＸＣＬ１４ペプチドによって誘導されたＴ細胞を含む移植細胞集団による使用のために、本明細書における教示に従って変更してもよい。同様に、所望の核酸によってＴ細胞を形質移入／形質導入する方法が、所望の抗原特異性のＴ細胞を使用する養子移植手順を有するとして記載されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／００８７０２５号を参照されたい）（例えば、Schmittら, 2009 Hum. Gen. 20:1240;Dossettら, 2009 Mol. Ther. 17:742; Tillら, 2008 Blood 112:2261;Wangら, 2007 Hum. Gene Ther. 18:712;Kuballら, 2007 Blood 109:2331;US2011/0243972; US2011/0189141;Leenら, 2007 Ann. Rev. Immunol. 25:243を参照されたい）、それにより、本明細書における教示に基づいて、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘起ことができるＣＸＣＬ１４およびＣＸＣＬ１４誘導ペプチドを対象とするものを含むこれらの方法を、本開示の方法へと適合させることが想到される。したがって、本開示は、養子移植のこれらの方法での投与のための、そのようなＣＸＣＬ１４誘導Ｔ細胞を含む組成物も含む。これらの組成物は、治療的有効量のＣＸＣＬ１４誘導Ｔ細胞と、そのような誘導されたＴ細胞を維持しそれらの投与を必要とする対象に投与するのに十分な薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【００４６】
ある特定の現在開示される態様は、ＣＸＣＬ１４の過剰メチル化／下方制御に関連する状態を有することが疑われる対象またはそのような状態に影響を受けやすい対象または対象の細胞、組織、もしくは器官の予防的治療を含む。予防的治療は、ＣＸＣＬ１４の過剰メチル化／下方制御に関連するがん（例えば、ＨＮＳＣＣ）を有することが確認されている対象または対象の細胞、組織、または器官を治療するために採用されるレジメ（投薬およびスケジュール、ならびに免疫原性ＣＸＣＬ１４誘導ペプチドおよび／または他の治療薬、例えば、抗原提示細胞または養子移植されたＴ細胞など、の選択）と同じかまたは異なり得る。
【００４７】
本明細書に列記された各刊行物または特許は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
【００４８】
ここで概要的に説明される本開示は、本開示の実施態様のある特定の態様の単なる例示目的のために含められた以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。実施例は、本開示を限定することを目的としておらず、当業者であれば、上記の教示および下記の実施例から、他の技術および方法が特許請求の範囲を満たすことができ、ならびに権利請求される開示の範囲から逸脱することなく用いることができるということを理解するであろう。
【実施例】
【００４９】
これらの実施例は、抗腫瘍性免疫応答のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘導抑制のメカニズム、および頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）のための効果的な予測および治療戦略の開発を実証するものである。
【００５０】
本発明者らの研究は、ＨＰＶ陽性（ＨＰＶ＋）癌において、多くの炎症誘発性ケモナインが上方制御されるのに対し、ケモカインＣＸＣＬ１４は著しく下方制御されることを明らかにした。ＣＸＣＬ１４は、皮膚細胞によって構成的に分泌されたおよそ９．５ｋＤのタンパク質であり、潜在的腫瘍抑制因子であり、免疫細胞の補充および活性化を調節する。患者組織および培養したケラチノサイトを使用することにより、本発明者らは、ＣＸＣＬ１４の下方制御が、ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７によって誘導されるＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化に関連していることを見出した。驚くべきことに、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４発現の回復は、免疫応答性同系マウスにおいて腫瘍を除去するが、Ｒａｇ１欠損マウスでは除去しない。ＣＸＣＬ１４発現を有するマウスは、腫瘍組織および腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）において、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の劇的な増加を示した。本発明者らは、ＣＸＣＬ１４が、インビトロにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の走化性を誘導することも見出した。対照的に、ＣＸＣＬ１４を再発現するマウスの腫瘍および脾臓において骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）が減少する。ＭＤＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される抗腫瘍性免疫を抑制し、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞移動を妨げる。ＭＤＳＣは、ＨＮＳＣＣ患者において豊富であり、疾患の重篤度に相関する。ＭＤＳＣは、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ２と結合するＣＸＣＲ２を介して腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内へと浸潤する。したがって、ＨＰＶによるＣＸＣＬ１４下方制御は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞応答を誘発し損なうことによって、ならびにＴＭＥ中へのＭＤＳＣ浸潤を誘導することによって、ＨＮＳＣＣ発生を促し、ケモカイン発現およびＴＭＥにおける免疫細胞浸潤は、ＨＮＳＣＣ患者の臨床結果に相関する。
【００５１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、頭頚部癌（ＨＮＳＣＣ）の〜２５％を含む全てのヒトがんの５％に原因として関連している、高度に蔓延している病原菌である。疫学的研究は、１９８８年から２００４年の間に、ＨＰＶ陽性（ＨＰＶ＋）中咽頭扁平上皮癌（ＯＰＳＣＣ）における２２５％の集団レベルの増加を示しており、ＨＰＶ＋ＯＰＳＣＣは、おそらく、２０２０年までに米国における全てのＨＮＳＣＣの大部分を占めるであろう。ここ十年にわたるＨＰＶ＋ＯＰＳＣＣの蔓延におけるこの急増は、ＨＮＳＣＣのこの特定のサブタイプに対する標準治療療法を向上させる必要性を増している。
【００５２】
ＦＤＡに承認された予防的ＨＰＶワクチンは、いくつかの高リスクのＨＰＶタイプによる感染症を効果的に予防する。しかしながら、これらのワクチンは、全ての高リスクＨＰＶを網羅するわけではなく、その高コストは、ワクチンを最も必要とする世界の地域でのそれらの利用性を著しく制限する。米国でさえ、ＨＰＶワクチンの適用範囲は失望するほど低く、男性の若者の１０％未満を示す。これらのワクチンには治療効果が無く、したがって、今後十年で浸潤がんを生じ得る既存のＨＰＶ感染症に対して効果が無いであろう。現在の研究では、性的に活動的な男性および女性の約５０％にＨＰＶが蔓延していることが分かっている。したがって、ＨＰＶ感染個体を予測および治療するための新たなツールの早急な開発が必要とされている。
【００５３】
外科手術、放射線治療、および化学療法を含む現在の療法は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣの治療において有効であるが、患者は、治療による深刻な続発症に対処しなければならず、これは、医療および社会的ケアシステムからの多大な支援を必要とする。ＨＮＳＣＣにおける現在の化学放射線療法に関連する有毒性は、口腔粘膜炎、激痛、および咀嚼困難を含む著しい局所的および全身性の症状を含み得、それらは、しばしば、嚥下障害および栄養チューブ依存を生じる。疲労、苦痛、睡眠障害、および眠気は、一般的な追加的症状であり、症状の重篤度は、一般的に、治療期間と共に増加する。逆に、いくつかのＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣは、療法に対してあまり反応せず、悪性の転移性腫瘍へと進行し、これは、ＨＰＶ陰性（ＨＰＶ−）ＨＮＳＣＣと比べて、多器官へと広がりやすい。
【００５４】
がん細胞による免疫異常調節のより良好な理解に基づくＨＮＳＣＣ免疫療法の新規の指針は、治療関連の罹患率を大いに減少させるであろう。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣに対する好結果の患者治療法を開発するために、ＨＰＶがどのように宿主の免疫応答を抑制するかについての深い理解が不可欠である。本発明者らは、動物モデル、患者データ、および腫瘍試料から得られたそれらの理解を、ケモカイン調節によるＨＰＶ寛容のメカニズムを明らかにするために適用する。これらの研究は、免疫寛容の基本的メカニズムの理解を広げ、ならびにこの新興の疾患の管理のための予測的および治療的戦略につながる。
【００５５】
これらの研究は、口腔上皮における局所免疫監視のための重要なコミュニケーターとしてのＣＸＣＬ１４の役割についての新たな機構的理解につながり、ＣＸＣＬ１４によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の評価により、抗腫瘍性免疫応答の新たな機能を明らかにする。ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子移植によって、免疫抑制性ＨＮＳＣＣの管理において使用することができる治療ツールを同定することができる。ＨＮＳＣＣにおけるケモカイン発現がＭＤＳＣに浸潤することによって免疫抑制性ＴＭＥを作り出すための新たなメカニズムを同定することで、免疫抑制を逆転させるための別の有効な免疫チェックポイントを発見することができる。ケモカイン発現と腫瘍細胞および所属リンパ節への免疫細胞浸潤とに関連するＨＮＳＣＣの臨床成果および患者の生存率は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣの予測マーカーとしてケモカインを使用することができるか否かを示しており、これは、ＨＮＳＣＣ患者における抗腫瘍性免疫応答を高めるためのこの経路を活性化するための薬物設計に役立ち得る。さらに、ＣＸＣＬ１４が小さな可溶性ペプチドであることから、遺伝子組換えＣＸＣＬ１４は、新規の治療薬として使用することができる。
【００５６】
持続的感染の間にウイルスの腫瘍性遺伝子がどのように浸潤および転移を引き起こすかについての現在の知識は、膨大である。しかしながら、癌進行の間に免疫寛容を可能にするウイルス関連のメカニズムはよく理解されていない。本発明者らの以前の研究は、抗腫瘍性免疫応答を誘導するＣＸＣＬ１４が、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣにおいて、ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７によって抑制されることを明らかにした。ＣＸＣＬ１４発現は、インビボでの腫瘍クリアランスにとって十分であるので、〜９．５ｋＤの分泌タンパク質であるＣＸＣＬ１４は、癌免疫療法において薬物としてまたはアジュバントとして使用することができるであろう。さらに、ＣＸＣＬ１４による腫瘍クリアランスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤に関連している。したがって、ＣＸＣＬ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の養子移植は、癌免疫療法のための別の手法として使用され得る。最終的に、ＣＸＣＬ１４発現は、免疫抑制性ＴＭＥを引き起こすことが知られているＭＤＳＣの浸潤を減少さる。したがって、ＭＤＳＣを誘導するＣＸＣＲ２を標的とすることは、ＴＭＥにおける抗腫瘍性免疫応答を高めるための標的として使用され得る。
【００５７】
ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化および免疫細胞プロファイルは、ＨＮＳＣＣ患者のための予測バイオマーカーとして使用することができる。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者は、より良好な全体的予後を示すが、それらの２０−３０％は、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣと比べて、所属リンパ節への転移においてより高い率を示す。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣの予後に対する最大の難関の１つは、疾患の段階を測定して成果を予測するための有用なバイオマーカーの欠如である。最近の研究は、免疫プロファイルが、ＴＮＭ分類よりも、より強力な生存の予測因子であるかもしれないことを示唆している。したがって、抗腫瘍性免疫応答を列挙するＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを確立するための努力が国際的に為されている。ケモカインは、容易に検出することができる小さな分泌タンパク質である。免疫細胞浸潤および免疫抑制の状態は、正確なインジケーターおよび臨床成果の予測因子であることが示されている。さらに、本発明者らは、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者の唾液試料中においてＣＸＣＬ１４プロモーターのメチル化を検出し、それは、ＣＸＣＬ１４の状態を検出するための有用な非侵襲的方法となる可能性がある。ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化、免疫細胞プロファイル、および臨床成果の間の相関関係を決定するための研究は、ＨＮＳＣＣ患者に対する革新的な予測ツールを開発するであろう。
【００５８】
免疫不全マウスによる異種移植モデルは、ヒトがんを研究するための有用なツールとして役に立つ一方で、抗腫瘍性免疫応答を研究するのは実現可能ではない。免疫応答性同系マウスモデルを使用して、遺伝的に変更可能な同系ＨＮＳＣＣ細胞を使用する完全な免疫系による抗腫瘍性免疫応答を調査し、それにより、ＨＮＳＣＣ進行における免疫応答を研究するための適切で柔軟なインビボシステムを提供する。本発明者らは、ＣＤ８＋およびＮＫ細胞上においてＣＸＣＬ１４受容体を同定するために、革新的な受容体−リガンド捕捉技術であるＴｒｉＣＥＰＳも使用する。バイオテクノロジーの最近の進歩にもかかわらず、極めて少量の発現および非溶解性により、細胞表面の受容体を同定するのは依然として困難である。ＴｒｉＣＥＰＳ技術は、ＣＸＣＬ１４受容体を明らかにすることができるだけでなく、受容体の同定において広く使用することができる強力なツールとしても役立つ。さらに、同定されたＣＸＣＬ１４受容体は、ＣＸＣＬ１４を不足するＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者において抗腫瘍性免疫応答を高めるために、小分子／ペプチドアゴニストによって標的化される。
【００５９】
本発明者らの以前の研究は、ＨＰＶ＋およびＨＰＶ−ＨＮＳＣＣが分子的に異なることを実証した。がんゲノムプロジェクトは、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣが、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣと比べてはるかに少ない変異遺伝子を含むことも文献に残しており、ＨＰＶがＨＮＳＣＣ発生において重要で独特な役割を果たしていることを示唆している。
【００６０】
実施例１：  ＨＰＶ＋およびＨＰＶ−癌を比較する、８４の新鮮な凍結されたヒト子宮頸および頭部／頸部組織標本のグローバルな遺伝子発現プロファイルの分析
以前の結果は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣとＨＰＶ−ＨＮＳＣＣからの子宮頸癌（ＣｘＣａ）との区別を可能にする顕著なＨＰＶ−特異的遺伝子発現シグネチャーを明らかにした。これらの研究結果は、ＨＰＶがＨＰＶ関連癌の発生において極めて重要な役割を果たしていることを明確に示している。本発明者らはさらに、正常な上皮、早期および後期の前癌状態の上皮性病変、ならびに扁平上皮癌を含む、異なる疾患段階の１２８の子宮頸組織標本の包括的遺伝子発現プロファイルについて分析した。結果は、上皮癌に対して侵襲的な最終転移において多数の遺伝子発現変化を結果として生じる一連の分子変化を明らかにした。ＨＰＶ関連のがん進行の間の局所微小環境でのＨＰＶによる免疫調節を理解するために、本発明者らは、がん進行の異なる段階の２１８のヒト頭部／頸部および子宮頸の組織試料からの遺伝子発現データセットを使用して、全てのケモカイン発現変化を分析した。多くの炎症性ケモカイン、例えば、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ２など、が大きく上方制御されたのに対し、ＣＸＣＬ１４発現は、正常な試料およびＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ試料と比較した場合、ＨＰＶ＋がんにおいて劇的に下方制御された（図１および２）。ＣＸＣＬ１４は、細胞浸潤／移動および宿主免疫応答を調節する潜在的腫瘍抑制因子であると考えられる比較的新しいケモカインであるＨＰＶがＣＸＣＬ１４発現を減少させるメカニズムをより良く理解するために、本発明者らは、逆転写酵素−定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して、インビトロでのケラチノサイト培養モデルでのＣＸＣＬ１４発現を分析した。ＨＰＶ持続的感染を再現するために、本発明者らは、正常な不死化ケラチン細胞系であるＮＩＫＳと、それぞれＨＰＶ１６、１８、３１のゲノムを含むその誘導体であるＮＩＫＳ−１６、−１８、および−３１とを使用した。
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【００６１】
早期、後期、および癌性の子宮頚部病変を模倣するために、本発明者らは、子宮頸部上皮内癌１（ＣＩＮ１）患者から得られたＷ１２Ｅ細胞株およびその誘導体、組み込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ＨＰＶ１６ゲノムを有するＷ１２Ｇ、および形質転換細胞株Ｗ１２ＧＰＸＹを使用した。組織試料から得られた結果に一致して、ＣＸＣＬ１４レベルは、ＣｘＣａの進行中に連続的に減少し、ＨＰＶ１６Ｅ７発現に対して強力な逆相関を示した（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、ＣＸＣＬ１４発現は、高リスクＨＰＶ１６、１８、または３１ゲノムを担持する正常なケラチノサイトにおいて明確に下方制御される（図３Ｃ）。興味深いことに、ＣＸＣＬ１４発現の減少は、腫瘍性遺伝子Ｅ７発現の無いＨＰＶ１６ゲノムを含むＮＩＫＳ−１６ΔＥ７細胞では観察されなかった（図３Ｃ）。本発明者らはさらに、免疫細胞化学（ＩＣＣ）を使用して、ＣＸＣＬ１４タンパク質発現が、ＨＰＶ−ケラチノサイト、ＮＩＫＳ細胞と比べて、ＮＩＫＳ−１６細胞において無効化されることを確認した（図３Ｄ）。これらの結果は、ＣＸＣＬ１４の下方制御がＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７によって媒介されることを示している。
【００６２】
実施例２：  ＨＰＶ＋細胞におけるＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化
以前の研究では、ＣＸＣＬ１４発現が、プロモーターの過剰メチル化によって抑制され得ることが分かった。ＣＸＣＬ１４発現の減少がプロモーターの過剰メチル化に関連するか否かを決定するために、本発明者らは、ＮＩＫＳおよびＷ１２細胞株を使用して、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を実施した。ＣＸＣＬ１４プロモーターのメチル化は、ＣＸＣＬ１４発現に逆相関し、ＨＰＶ＋ケラチノサイトおよびＨＮＳＣＣ細胞では、ＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化が著しく増加する（図４）。ＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化は、ＮＩＫＳ−１６ΔＥ７細胞では見られない。これらの結果は、ＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化が、高リスクＨＰＶによって誘導され、癌進行中に蓄積されることを示唆している。以前の研究では、ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７が、ＤＮＭＴ１のメチルトランスフェラーゼ活性を活性化することが分かった。さらに、多くの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングが、ＨＰＶ＋細胞およびＣｘＣａにおいて示された。本発明者らのデータも、ＤＮＭＴ１発現が、特にＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ、ＣｘＣａ、ならびにＮＩＫＳ−１６およびＷ１２細胞において増加することを示していた（図５Ａ−５Ｃ）。しかしながら、ＨＰＶ１６Ｅ７除去は、ＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡの発現レベルを部分的に減少させた（図５Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＨＰＶ１６腫瘍性タンパク質Ｅ７が、ＨＰＶ関連のがん進行の間に、ＤＮＭＴ１発現のレベルの増加に貢献することを示している。さらに、ＤＮＭＴ阻害剤デシタビンによる治療は、ＣｘＣａ細胞におけるＣＸＣＬ１４発現を回復させる（図６）。これらの結果は、プロモーターの過剰メチルによるＣＸＣＬ１４サイレンシングが、ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７によって媒介されることを示している。
【００６３】
実施例３：  ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４再発現が適応免疫によって腫瘍を除去する：
ＣＸＣＬ１４は、ヒトＣＸＣＬ１４とマウスＣｘｃｌ１４との間において９８％の相同性を示す、進化的に保存されたケモカインである。ＣＸＣＬ１４がインビボでの腫瘍増殖に影響を及ぼすか否かを決定するために、本発明者らは、免疫応答性同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて腫瘍を形成する、マウスの口咽頭上皮細胞（ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７）を研究した。ヒト細胞系および患者組織と同じく、ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞は、同系ＨＰＶ−ＭＯＥ細胞と比べて著しく少ないＣｘｃｌ１４を発現することが見出され、過剰にメチル化されたＣｘｃｌ１４プロモーターを有することが示された（図７）。ＣＸＣＬ１４の腫瘍抑制因子機能を試験するために、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１４のそれらの生理的レベルを再発現したＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞系を樹立した。際立って、Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入されたＢ６マウスの大部分が、腫瘍を除去し、その一方で、コントロールのＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入された全てのマウスは、２１日以内に腫瘍負荷によって死亡した（図８Ａ）。しかしながら、野生型Ｂ６マウスとは対照的に、Ｃｘｃｌ１４を再発現したＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入された全てのＲａｇ１−欠損（Ｒａｇ１−／−）Ｂ６マウスは、注入後３２日以内に腫瘍負荷によって死亡した（図８Ｂ）。これらの結果は、ＣＸＣＬ１４媒介性腫瘍クリアランスが、適応免疫応答を必要とすることを示している。Ｃｘｃｌ１４発現によって調節される免疫細胞浸潤を特徴付けるために、本発明者らは、コントロールまたはＣｘｃｌ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞の注入後２１日において、腫瘍組織、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）、および野生型Ｂ６マウスから採取した脾臓における様々な免疫細胞を分析した。データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合が、ベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入された野生型Ｂ６マウスと比べた場合、Ｃｘｃｌ１４を再発現したＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を移植した野生型Ｂ６マウスの腫瘍組織およびＴＤＬＮにおいて増加することを示していた（図９）。対照的に、骨髄由来の抑制細胞（ＭＤＳＣ）および制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、Ｃｘｃｌ１４発現によって著しく減少した。これらの結果は、ＣＸＣＬ１４発現は、インビボにおいて移植されたＨＮＳＣＣを除去するための適応免疫応答の誘起にとって、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞が重要であることを示唆している。ＣＸＣＬ１４がＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の直接走化性を誘導するか否かを試験するために、本発明者らは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムを使用してインビトロ移動アッセイを実施した。興味深いことに、Ｃｘｃｌ１４発現性ＨＮＳＣＣ細胞へのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の移動は、ベクター含有ＨＮＳＣＣ細胞と比べて、３−４倍高められた（図１０）。
【００６４】
実施例４：  ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ細胞における回復されたＣＸＣＬ１４発現が、抗腫瘍性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞応答を促進するか否かの決定
ＨＰＶに感染している個体の９０パーセントまでが、その生涯において、いかなる関与も無しに、１−２年以内にそれらのＨＰＶ感染症を除去するであろう。最近の動物実験では、ほとんどの免疫応答性マウスが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能によってマウスパピローマウイルス感染症から保護され、ＨＰＶ関連腫瘍を発生しないことが分かった。これらの研究成果は、宿主適応性免疫応答が、概して、ＨＰＶ感染症の排除において有効であり、結果として疾患の進行を防ぐことを示唆している。最近、ＨＮＳＣＣを含む多くのがんが、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイントをブロックすることにより、固有の免疫機能によって除去することができることが示唆されている。これらの結果は、がん患者の免疫抑制を逆転させることが、がん治療のための有望な戦略であることを示している。以前の研究では、ＣｘＣａ患者におけるＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が激しく損なわれること、ならびに上皮におけるＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７発現が、インビボでの細胞傷害性Ｔ細胞応答を減少させることによって免疫抑制を誘起することを示した。これらの免疫エフェクター細胞応答は腫瘍細胞を除去するためにも重要であるので、おそらく、ＨＰＶによって誘起される免疫抑制は、腫瘍細胞の免疫回復に貢献すると思われる。しかしながら、持続的感染および癌進行の間、ＨＰＶが抗ウイルス性および抗腫瘍性免疫応答を回避するための分子メカニズムについては、ほとんど知られていない。
【００６５】
最近、本発明者らは、Ｅ７関連プロモーターの過剰メチル化の結果として、ＣＸＣＬ１４がＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣにおいて劇的に下方制御されることを見出した（図１−３）。ＣＸＣＬ１４がインビボでの腫瘍増殖に影響を及ぼすか否かを決定するために、本発明者らは、免疫応答性同系マウスにおいて腫瘍を形成するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を有するＨＮＳＣＣマウスを用いた。ＣＸＣＬ１４の腫瘍抑制因子機能を試験するために、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１４の生理的レベルを再発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞系を樹立した。本発明者らの研究は、Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入された野生型Ｂ６マウスが、インビボにおいて腫瘍の大部分を除去し、その一方で、親ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入された全てのマウスは、腫瘍負荷によって死亡したことを明らかにした（図８Ａ）。さらに、ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞におけるＣｘｃｌ１４再発現は、腫瘍およびＴＤＬＮ中へのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤を増加させる（図９）。興味深いことに、Ｃｘｃｌ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入されたＲａｇ１−／−マウスでは、腫瘍増殖の遅延が見られた。しかしながら、全てのマウスは、最終的に、それらの腫瘍負荷により死亡した（図８Ｂ）。次に、本発明者らは、ＴｒａｎｓｗｅｌｌシステムおよびＢ６マウスから単離された脾細胞を使用して、ＣＸＣＬ１４が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の走化性を直接誘導するか否かを決定した。結果は、ＣＸＣＬ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞移動を刺激するが、マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞に対してはほとんど影響しないことを示した（図１０）。これらの結果は、ＣＸＣＬ１４が、ＴＭＥ中へＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を補充することによって、腫瘍クリアランスにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している。
【００６６】
以前の研究では、腫瘍を退行させるために、ＮＫ細胞活性化が、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答にとって必要であることが分かった。これらの研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方が、Ｃｘｃｌ１４媒介性ＨＮＳＣＣクリアランスのために重要であることも示唆している。したがって、ＣＸＣＬ１４によって誘導されたＣＤ８＋およびＮＫ細胞は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを除去するために必要であり、十分であると思われる。
【００６７】
各研究における患者および実験動物の数は、仮説駆動型検定力分析に基づいて決定した。患者および実験動物の両方の数は、初期実験において観察された差に基づいて調節する。
【００６８】
ＨＮＳＣＣを除去するために、ＣＸＣＬ１４媒介性適応的抗腫瘍免疫応答にＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が必要であるか否かを試験するために、詳細には、本発明者らは、インビボにおいてＢ６マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を枯渇させる。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の枯渇ために、それぞれ、抗マウスＣＤ８αおよび抗マウスＮＫ１．１抗体を使用する。６週齢から８週齢の野生型Ｂ６マウスに、特異的抗体を腹腔内注入する。特異的細胞の枯渇は、脾臓およびリンパ節から単離した細胞を使用して、フローサイトメトリーにより、治療の２４時間後に評価する。コントロールマウスには、アイソタイプのＩｇＧ抗体を注入する。ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を枯渇したマウスに対し、口腔領域または右脇腹に、ＣＸＣＬ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入する（１×１０５細胞）。以前に確立された技術を使用して、毎週、腫瘍体積を測定する。何れかの寸法において腫瘍サイズが１．５ｃｍを超えたとき、マウスを安楽死させる。逆に、２か月間の間、測定可能な腫瘍が検出されない場合、マウスは腫瘍を有さないとみなす。あるいは、ルシフェラーゼレポーターによるインビボでのマイクロＣＴ撮像を使用して、腫瘍増殖および転移をモニターする。本発明者らは、Ｒａｇ１−／−マウスと同様に、マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の何れかを枯渇させることにより、ＣＸＣＬ１４発現があっても腫瘍増殖が示されると予想する（図８Ｃ）。ＮＫ細胞は、先天的免疫応答と適応的免疫応答との間の重要なリンクとして示唆されている。これらの実験は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による場合と同様に、ＨＮＳＣＣを除去するために、ＮＫ細胞がＣＸＣＬ１４媒介性適応的抗腫瘍性免疫応答に必要であるか否かを明らかにする。
【００６９】
以前の研究では、マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の枯渇の有効性が示されたが、残りの細胞のごく一部が抗腫瘍性免疫応答を示し得ることも可能である。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、ＣＸＣＬ１４媒介性腫瘍抑制にとって必要であるか否かをさらに調べるために、本発明者らは、ノックアウトマウスを使用する。Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を、Ｂ６バックグラウンドを有するＣＤ８α欠損マウスおよびＮＫｐ４６欠損マウスに注入し、腫瘍増殖／転移およびマウスの生存をモニターする。事象成果までの時間配分（例えば、生存時間）を、カプラン・マイヤー曲線によって要約し、ログランク検定を使用して群間において比較し、ハザード比を使用して要約する。ポアソンカウントのＡＮＯＶＡを使用して、群間において結節（転移）の数を比較する。腫瘍増殖を説明するために、ならびに研究の終了時点での腫瘍体積の比較のために、線形混合モデルを使用する。７匹のマウス／群により、群間での同等の増殖速度の試験は、およそ０．１５（増殖速度における標準化された差）の非常に小さなエフェクトサイズを検出する８０％の検定力を有する。保守的であるためおよび損失を考慮して、１０匹のマウス／群を使用する。
【００７０】
インビボにおいてＨＮＳＣＣを除去するためにＣｘｃｌ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が十分であるか否かを試験するために、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入したマウスから採取したＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の養子移植を実施する（図１１）。養子移植は、がん治療として好結果において使用されているので、養子移植は、ＨＮＳＣＣ患者を治療するための免疫治療ツールとして開発することができる。第一に、Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７を、Ｂ６ドナーマウスに注入し、注入から２１日後に脾臓およびＴＤＬＮを摘出する。それぞれ、マウスＣＤ８α＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞単離キットを使用して、磁性ビーズによって、脾細胞およびリンパ系細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を単離する。単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２を含む培養培地において１週間増殖させる。単離したＮＫ細胞を、ＩＬ−１５およびヒドロコーチゾンを含む培養培地において１０日間増殖させる。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を追跡するために、本発明者らは、レンチウイルスを使用して、緑色蛍光タンパク質遺伝子を形質導入する。ＣＸＣＬ１４発現の無いベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入して、腫瘍担持Ｂ６レシピエントマウスを調製する。注入後２０日から３０日で視認可能なサイズの腫瘍が形成されることが予想される。ドナーマウスから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、注入後２１日目に、腫瘍担持レシピエントマウスに移す。腫瘍担持レシピエントマウスの場合、本発明者らは、上記において説明した、Ｂ６野生型マウス、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞枯渇Ｂ６野生型マウス、およびＣＤ８α−欠損またはＮＫｐ４６欠損マウスを使用する。毎週、腫瘍体積を測定する。ベクターを含むＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入したマウスから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞をコントロールとして使用する。Ｃｘｃｌ１４誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、インビボにおいてＨＮＳＣＣを除去するのに十分である場合、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の養子移植によって十分な腫瘍抑制を認めるであろう。増殖および浸潤の増加にもかかわらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞がエフェクター機能を示さないことは可能である。例えば、タイプ１およびタイプ２のＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型は、大きく異なっている。同様に、以前の研究では、ＣＤ５６ｄｉｍ  ＮＫ細胞はキラー細胞であるが、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞エフェクター機能に対してより制御性効果を示すことが示された。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特徴を明確にすることは重要である。ＣＸＣＬ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入したマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特徴を明らかにするために、本発明者らは、最初に、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞におけるサイトカイン発現を分析する。ハイスループットＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰビーズテクノロジーを使用して、製造元のプロトコールに従って、タイプ１（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）およびタイプ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０）のサイトカイン、ならびに活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって発現された他の一般的サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、およびＭＩＰ−１β）に対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の溶解物をアッセイする。ＬｕｍｉｎｅｘアッセイのためのマルチプレックスおよびシングルプレックスビーズキットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手し、ＵＣＤがんセンターのフローサイトメトリーコア施設におけるＬｕｍｉｎｅｘ器具においてサイトカインｍＲＮＡ発現を分析する。ネガティブコントロールとして、ナイーブＢ６マウスおよびＣｘｃｌ１４発現の無いベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入したマウスからＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞も単離する。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してスチューデントｔ−検定により統計的分析を行う。選択されたサイトカインの発現をＥＬＩＳＡを使用して確認する。次に、本発明者らは、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定する。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ａｓｓａｙは、細胞溶解の際に放出される、安定なサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定する。簡潔に言えば、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、様々な比率において、標的細胞としてベクター含有ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞またはＣｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞と共にインキュベートする。上澄みを収集し、結合酵素アッセイを使用して細胞傷害活性を測定する。標的細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の細胞傷害活性を評価する。標的細胞のみをインキュベートとすることにより、突発性ＬＤＨ放出を測定し、標的細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって処理することにより、最大ＬＤＨ放出を決定する。本発明者らは、ポジティブコントロールとして、ＮＫ感応性ＹＡＣ−１細胞株およびＣＴ２６細胞株も使用する。酵素アッセイが十分に感応的でない場合、本発明者らは、標的細胞を標識するために［５１Ｃｒ］クロメートを使用することを検討し、５１Ｃｒの放出をγ−カウンターを使用して測定する。Ｃｘｃｌ１４の抗腫瘍性機能に基づき、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を有するマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞がタイプ１のサイトカインの産生および著しく増加した細胞傷害性を示すことを予想する。これらのアッセイは、臨床研究室においてヒト標本を試験するために適用することができる。
【００７１】
実施例５：  ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において発現するＣＸＣＬ１４結合受容体を同定する
比較的新しいケモカインであるため、ＣＸＣＬ１４の天然受容体はまだ同定されていない。ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４発現が、インビボでの腫瘍中へのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞浸潤を増加させ（図９）、インビトロでのＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の走化性を直接誘導するため（図１０）、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の両方がＣＸＣＬ１４シグナル伝達のための共通の受容体を発現する可能性が非常に高い。ＣＸＣＬ１４は、小さなペプチド分子であるため、そのまま薬物として使用できるであろうが、その受容体の同定は、受容体を標的化することによってアゴニストを開発するための選択肢を広げる。ケモカイン受容体は、それらのシグナル伝達を増強または阻害することによって免疫応答を調節するために、頻繁に標的化されてきた。したがって、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において発現したＣＸＣＬ１４結合受容体を同定する。
【００７２】
Ｃｘｃｌ１４受容体を同定するために、本発明者らは、新規の受容体−リガンド捕捉技術であるＴｒｉＣＥＰＳを使用する。微小量および非溶解性のため、受容体の同定は、多くの場合、失敗する。ＴｒｉＣＥＰＳ技術は、受容体とリガンドの間の強力な架橋によって、これらの障害を克服する。簡潔に言えば、この技術は、以下の３つのアーム：リガンド（本発明者らの実験ではＣｘｃｌ１４）に結合した１つのアーム、グリコシル化された受容体への架橋のための保護されたヒドラジンを有する別のアーム、および結合した受容体を精製するためのビオチンタグを有する第三のアームを有するケモプロテオミクス性のメディエーターを使用する。液体クロマトグラフィーと、その後の定量的質量分析によって、相互作用パートナーを同定する（図１２）。本発明者らは、最初に、２９３Ｔ哺乳動物細胞系を使用してＣｘｃｌ１４を産生し、ＴｒａｎｓｗｅｌｌシステムにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞移動を使用して、精製されたＣｘｃｌ１４の活性を試験する（図１０）。本発明者らは、製造元のキットを使用して、Ｃｘｃｌ１４をＴｒｉＣＥＰＳに結合させ、ポジティブコントロールとしてインスリンおよびＣＤ２８抗体を使用してカップリング反応を確認する。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を、Ｃｘｃｌ１４を発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７を注入したマウスの脾臓から単離して培養する。ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、Ｃｘｃｌ１４をコンジュゲートしたＴｒｉＣＥＰＳと共にインキュベートする。カップリングバッファーによって架橋反応を実施し、間接的超音波処理によって細胞を溶解させ、膜タンパク質を単離してトリプシンによって消化させる。ＴｒｉＣＥＰＳを捕捉した細胞表面ペプチドを、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して精製する。精製したペプチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいて逆相クロマトグラフィーによって分離し、本発明者らのプロテオミクスコア施設において質量分析（ＭＳ）によって分析する。ポジティブコントロールとして、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１２と、Ｃｘｃｌ１４にも結合するその受容体Ｃｘｃｒ４とを使用する。ネガティブコントロールとして、本発明者らは、マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を使用し、その場合、移動は、Ｃｘｃｌ１４によって影響されない（図１０）。同定されたＣｘｃｌ１４受容体を確認するために、本発明者らは、同定された受容体に対して特異的な抗体を使用して免疫共沈降法を実施する。Ｃｘｃｌ１４が同定された受容体によってシグナル伝達を活性化するか否かを試験するために、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達アッセイを実施する。ケモカイン受容体は、細胞内ｃＡＭＰを増加または減少させるシグナルトランスダクションのための７−膜貫通構造を有する。本発明者らは、最初に、それぞれの同定されたＣｘｃｌ１４受容体を安定して発現する細胞株を調製する。ｃＡＭＰ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＧＰＣＲシグナル伝達活性を測定する。ルシフェラーゼベースのＧＰＣＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １０−ｐａｔｈｗａｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、��ｘｃｌ１４受容体の下流シグナル伝達をさらに調査する。同定された受容体のｓｈＲＮＡノックダウンを使用して、本発明者らは、インビボでの腫瘍増殖およびインビトロでの細胞移動を試験することによって、ＣＸＣＬ１４−受容体相互作用の機能を確認する。本発明者らは、スピアマンの相関関係を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞（またはＮＫ細胞）とＨＮＳＣＣ細胞の間の関係性を評価する。５０のサンプルサイズを想定する場合、関係性の無い５％有意水準での両側検定は、０．４０の中程度の相関関係を検出する〜８０％の検定力を有する。さらに、９５％の信頼区間は、試料の相関が０．３０を超え、ならびにそれらの区間の幅が０．５０未満の場合にはいつも、ゼロを除く。本発明者らは、ＣＸＣＲ７も使用し得るが、これは、ＣＸＣＲ４シグナル伝達を阻害するために、ＣＸＣＬ１４と同様の方法で機能する。ＨＰＶ腫瘍性タンパク質Ｅ７は、ＤＮＡメチル化を調整することによって宿主の遺伝子発現に影響を及ぼすため、本発明者らは、ヒトケラチン細胞系：ＮＩＫＳ、ＮＩＫＳ−１６、ＮＩＫＳ−１８、およびＮＩＫＳ−１６ΔＥ７、において、包括的なトランスクリプトーム／メチロームを分析した。この分析において、本発明者らは、ＣＸＣＲ７発現が著しく減少し、ＣＸＣＲ７プロモーターが、ＮＩＫＳおよびＮＩＫＳ−１６ΔＥ７細胞と比較して、ＮＩＫＳ−１６細胞およびＮＩＫＳ−１８細胞において過剰メチル化されることを見出した（図１３）。本発明者らは、上記において説明したのと同様の手法を使用して、ＣＸＣＲ７発現の回復が相乗的に腫瘍増殖を抑制するか否かを試験する。本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞に発現した一つ又は複数の受容体が、Ｃｘｃｌ４と相互作用して、活性化シグナルを伝達すると予想する。Ｃｘｃｌ１４受容体がＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞上において同定されない場合、本発明者らは、ＴｒｉＣＥＰＳ手順において脾細胞およびケラチノサイトの集団全体を使用する。受容体を同定するための代替方法として、本発明者らは、以前に説明したような、放射性同位体（［３５Ｓ］システインおよび［３５Ｓ］メチオニン）ベースの沈殿およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析も考慮する。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＣＸＣＬ１４受容体の同定は、ＣＸＣＬ１４機能を増大させることにより結果として抗腫瘍性免疫応答を高める、有用なツールの開発につながる。ＣＸＣＬ１４は、ＨＮＳＣＣ細胞を除去するためにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のエフェクター機能を高めるためのシグナル伝達のメカニズムを理解するためにも有用である。
【００７３】
実施例６：  ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４発現の回復が免疫抑制性微小環境を逆転させるか否かを決定する
腫瘍細胞を効率的に排除することができるＴ細胞およびＮＫ細胞エフェクター機能をがん発生が回避するためには、慢性的免疫抑制が必要である。がん進行の間、これらのエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は、多くの場合、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイントシグナル伝達によって抑制される。抗腫瘍性免疫応答を回避するための免疫抑制性ＴＭＥを作り出すほとんどのがん患者には、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４によるエフェクター細胞の抑制以外に、異なる免疫抑制性細胞が存在する。ＭＤＳＣは、ＴＭＥの免疫抑制性細胞ネットワークにおいて重要な役割を果たす。顆粒球ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗとして定義される、腫瘍を支援するＭＤＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される抗腫瘍性免疫を抑制し、腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞移動を妨げる。ＭＤＳＣ集団は、ＨＮＳＣＣ患者の腫瘍、ＴＤＬＮ、および末梢血に豊富であり、病期に相関する。最近のフェーズＩＩ臨床治験により、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害剤であるタダラフィルが、ＭＤＳＣを減少させ、ならびにＨＮＳＣＣ患者の抗腫瘍性免疫応答を回復させることが分かっている。これらの結果は、ＭＤＳＣが、ＨＮＳＣＣ患者の免疫抑制を作り出すための主要な免疫細胞であることを強く示唆している。
【００７４】
Ｃｘｃｌ１４発現は、腫瘍組織におけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤を増加させるが、その一方で、ＭＤＳＣは、空のベクターを含む細胞を注入したコントロールマウスと比較して、Ｃｘｃｌ１４を再発現するＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入したマウスの腫瘍および脾臓において著しく減少する（図１４）。ＭＤＳＣが、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を阻害することよって多くのがんにおいて免疫抑制性ＴＭＥを誘導すると仮定すると、本発明者らの結果は、Ｃｘｃｌ１４発現を有するマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合の増加が、ＴＭＥにおけるＣｘｃｌ１４媒介性ＭＤＳＣの減少によって引き起こされ得ることを示している。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２が、炎症部位への顆粒球の移動にとって最も重要である。最近の研究から、ＣＸＣＲ２も、がん発生のための腫瘍中へのＭＤＳＣ浸潤に必要であることが分かっている。さらに、ＣＸＣＲ２媒介性ＭＤＳＣ浸潤をブロックすることにより、抗ＰＤ１療法の有効性が高められる。この遺伝子発現データは、ＣＸＣＲ２リガンドのＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ２が、ＨＮＳＣＣにおいて非常に上方制御されることを示している（図１５）。これらの結果は、腫瘍細胞からのＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ２の発現が、ＭＤＳＣ増殖およびＴＭＥ中への走化性を誘導して免疫抑制微小環境を作り出し得ることを示唆している。別の研究から、ＣＸＣＬ１４が、ＩＬ−８に直接結合して、内皮細胞の走化性を抑制することが分かっている。したがって、おそらく、ＨＮＳＣＣ細胞によって産生されたＣＸＣＲ２リガンドは、ＴＭＥ中へＭＤＳＣを補充し、ＣＸＣＬ１４発現は、ＩＬ−８媒介性ＭＤＳＣ浸潤を妨げると思われる。したがって、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４発現が、Ｃｘｃｒ２媒介性ＭＤＳＣ増殖および浸潤を阻害することによって、免疫抑制微小環境を逆転させるということが確認される。これらの実験は、ＣＸＣＬ１４の下方制御がＴＭＥにおける免疫抑制を誘発する、新規のメカニズムを決定する。
【００７５】
実施例７：  ＣＸＣＬ１４発現がＨＮＳＣＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞応答のＭＤＳＣ媒介抑制を逆転させるか否かを決定する
ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣからのＭＤＳＣによるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞抑制のインビトロアッセイを実施するために、ＭＤＳＣの２つのサブセットである単球性ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈおよび顆粒球性ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ  ＭＤＳＣを有するマウスＧｒ−１＋顆粒球を使用する。両方のタイプのＭＤＳＣは、Ｔ細胞増殖を抑制し、Ｔ細胞アポトーシスを誘導するが、その一方で、顆粒球性ＭＤＳＣは、単球性ＭＤＳＣと比べて、ほとんど全ての腫瘍において支配的である。本発明者らの結果は、顆粒球性ＭＤＳＣが、Ｃｘｃｌ１４発現によって劇的に減少することも示した（図１４）。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する顆粒球性ＭＤＳＣの効果を決定するために、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖およびアポトーシスアッセイを実施する。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーターを使用して、顆粒球性ＭＤＳＣ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１ｈｉｇｈＬｙ６Ｃｌｏｗ）を、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣを担持する野生型Ｂ６マウスの脾臓から単離する（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ  ２０１４）。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞も精製し、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。精製されたＭＤＳＣの存在または不在におけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖を調べる。アポトーシス性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色を使用して検出する。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対するＭＤＳＣの効果をさらに調査するために、本発明者らは、サイトカイン発現レベル（タイプ１対タイプ２）を測定し、単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞傷害活性を決定する。ＭＤＳＣがＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の移動を阻害するか否かを試験するために、本発明者らは、図１０に示されるようなＴｒａｎｓｗｅｌｌシステムを使用してインビトロ細胞移動アッセイを実施する。
【００７６】
ＨＮＳＣＣにおける免疫抑制のためにＭＤＳＣが必要か否かを試験するために、本発明者らは、抗Ｌｙ６Ｇ抗体（クローン１Ａ８またはＲＢ６−８Ｃ５）を使用して、Ｂ６マウスにおいてＭＤＳＣを特異的に枯渇させる。抗体媒介性ＭＤＳＣ枯渇の代替手段として、本発明者らは、ゲムシタビンを使用するが、これは、Ｂ細胞およびＴ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージに影響を及ぼすことなく、腫瘍担持マウスにおいて、アポトーシスによりＭＤＳＣを選択的に排除する。ゲムシタビン処理は、メラノーマに対する養子Ｔ細胞療法でのＴ細胞増加および腫瘍縮小を示した。ＭＤＳＣ枯渇は、フローサイトメトリーによって確認する。ＭＤＳＣの枯渇したマウスに、Ｃｘｃｌ１４を発現しないＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を注入し、腫瘍増殖をモニターする。ＭＤＳＣが抗腫瘍性免疫応答の抑制にとって重要である場合、ＭＤＳＣの枯渇したマウスは、Ｃｘｃｌ１４発現と同様の腫瘍抑制を示すであろう。ＭＤＳＣ枯渇が免疫抑制性ＴＭＥを逆転させるか否かを調べるために、本発明者らは、マウスから腫瘍細胞を採取し、免疫組織学（ＩＨＣ）および１２色フローサイトメトリーパネルを使用して、浸潤した免疫細胞（Ｔ細胞のサブセット、マクロファージ／ＤＣ、好中球、およびＮＫ細胞）をプロファイルする。
【００７７】
Ｃｘｃｌ１４発現がＴＭＥにおけるＭＤＳＣ集団を減少させるメカニズムを明確にするために、本発明者らは、ＭＤＳＣにおけるＣｘｃｒ２シグナル伝達が、ＴＭＥ中へのＭＤＳＣの補充ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤の抑制にとって重要であるか否かを決定する。遺伝子コード化ＩＬ−８はマウスおよびラットに存在しない（Ｍｏｄｉ  １９９９）。しかしながら、機能的ＩＬ−８相同体であるＣｘｃｌ１およびＣｘｃｌ２は、受容体Ｃｘｃｒ２との相互作用により、ＭＤＳＣを含む顆粒球の走化性を誘導する。ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２の両方は、ヒトＨＮＳＣＣおよびＣｘＣａ患者組織において著しく増加する（図１５）。Ｃｘｃｒ２が、ＭＤＳＣの増殖およびＴＭＥ中への浸潤にとって必要であるか否かを決定するために、本発明者らは、Ｂ６バックグラウンドを有するＣｘｃｒ２欠損（Ｃｘｃｒ２−／−）マウスを使用する。Ｃｘｃｌ１４発現の無い同系ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を、Ｃｘｃｒ２−／−マウスに移植し、腫瘍増殖を、野生型Ｂ６マウスにおける腫瘍増殖と比較しながらモニターする。Ｃｘｃｒ２シグナル伝達が、ＭＤＳＣの免疫抑制機能にとって重要である場合、Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、野生型マウスと比べて、Ｃｘｃｌ１４発現なしに、腫瘍クリアランスまたは遅延された腫瘍増殖を示すであろう。本発明者らは、ＴＭＥ、ＴＤＬＮ、および脾臓中へのＭＤＳＣ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の浸潤も検出する。次に、本発明者らは、Ｃｘｃｒ２−／−マウスへのＣｘｃｌ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞の注入によって、Ｃｘｃｒ２ノックアウトおよびＣｘｃｌ１４発現の相乗効果を決定する。免疫抑制を誘導するのにＭＤＳＣが十分であるか否かを試験するために、腫瘍担持野生型Ｂ６マウスからＭＤＳＣを単離し、Ｃｘｃｒ２−／−マウスに移植する。ＭＤＳＣが、抗腫瘍性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を抑制するための重要な役割を果たす場合、ＭＤＳＣの養子移植は、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいて腫瘍増殖を高める。
【００７８】
Ｃｘｃｌ１またはＣｘｃｌ２が、免疫抑制性ＴＭＥを作りだすためにＭＤＳＣの走化性を誘導するか否かを決定するために、本発明者らは、ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞においてＣｘｃｌ１および／またはＣｘｃｌ２を過剰発現またはノックアウトさせる。レンチウイルス形質導入を使用して、マウスＣｘｃｌ１またはＣｘｃｌ２遺伝子をＣｘｃｌ１４発現性ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞内に送達する。Ｃｘｃｌ１／２およびＣｘｃｌ１４を発現する安定なＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞系をＢ６マウスに注入し、腫瘍増殖をモニターする。本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して、Ｃｘｃｌ１／２発現性細胞を有するマウスのＴＭＥおよびＴＤＬＮにおいて、ＭＤＳＣ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞も検出する。Ｃｘｃｌ１またはＣｘｃｌ２が、ＭＤＳＣの走化性および免疫抑制を誘導する場合、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１４発現があっても、腫瘍増殖は抑制されないと予想する。さらに、ＴＭＥおよびＴＤＬＮにおいて、ＭＤＳＣは増加し、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は減少する。次いで、レンチウイルスＣＲＩＳＰＲ系を使用しＣｘｃｌ１−またはＣｘｃｌ２−欠損ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を樹立し、野生型Ｂ６マウスに注入する。腫瘍増殖ならびにＭＤＳＣ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の浸潤を、上記において説明したように決定する。Ｃｘｃｌ１またはＣｘｃｌ２が、ＭＤＳＣ浸潤および腫瘍増殖にとって重要である場合、Ｃｘｃｌ１またはＣｘｃｌ２ノックアウトは、ＭＤＳＣ浸潤および腫瘍増殖を抑制し、ＴＭＥにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を増加させる。重複機能により、Ｃｘｃｌ１またはＣｘｃｌ２のどちらかのノックアウトでは、腫瘍抑制にとって十分でない場合、本発明者らは、Ｃｘｃｌ１およびＣｘｃｌ２の二重ノックアウトＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞を発生させる。Ｃｘｃｌ１／２のＣｘｃｌ１４阻害を確認するために、本発明者らは、ＭＤＳＣ移動がＣｘｃｌ１４によって阻害されるか否かをＴｒａｎｓｗｅｌｌシステムを使用して試験する。Ｃｘｃｌ１およびＣｘｃｌ２二重ノックアウトが、ＭＯＥ／Ｅ６Ｅ７細胞においてＣｘｃｌ１４発現と同様のレベルの腫瘍抑制を示す場合、結果は、Ｃｘｃｌ１４媒介性抗腫瘍性免疫応答の阻害にとって、Ｃｘｃｒ２シグナル伝達が主要な役割を果たしているということを示唆する。
【００７９】
本発明者の予備データは、ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４再発現が、インビボにおいてＭＤＳＣ浸潤を著しく減少させることを示した。免疫抑制の重要なメディエーターであるＭＤＳＣは、同系の炎症誘発性ケモカインであるＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ２の発現によって、腫瘍細胞からＴＭＥへと補充される。ＭＤＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を抑制するので、これらの結果は、ＨＮＳＣＣにおけるＭＤＳＣの免疫抑制的役割を明らかにするものであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＣＸＣＬ１４媒介性増加および腫瘍抑制を示している。しかし、ＭＤＳＣのみの枯渇は、免疫抑制性ＴＭＥを逆転させるには十分ではあり得ない。Ｔ細胞の部分母集団を表す、別の免疫抑制性細胞タイプであるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む様々な免疫細胞を抑制する。最近の研究は、セツキシマブ治療ＨＮＳＣＣ患者においてＴｒｅｇ細胞が増加し、ＮＫ細胞のエフェクター機能を抑制し、ならびに不十分な臨床成果と相関することを示している。本発明者の予備結果は、Ｃｘｃｌ１４を再発現する腫瘍を有するマウスの脾臓においてＴｒｅｇ細胞が著しく減少することも見出している（図１６）。したがって、本発明者らは、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ細胞におけるＣＸＣＬ１４発現が、Ｔｒｅｇ細胞増殖を抑制することによってＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の細胞傷害活性を回復させるか否かを調べ得る。
【００８０】
実施例８：  ＣＸＣＬ１４発現、免疫細胞浸潤、およびＨＮＳＣＣ患者の臨床成果の間の臨床的相関を明確にする
特定のがん療法に応じて患者を選択することは、効率的な治療にとっておそらく重要であろう。しかしながら、単純なＨＰＶ試験以上に、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣにおける患者治療を導くために利用可能な予測バイオマーカーはほとんどない。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者の大部分は、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ患者と比べて、従来の治療（手術および／または化学放射線療法）の後に良好な予後を有する。しかしながら、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者におけるあるサブセットは、局所領域リンパ節への転移を示す。リンパ節転移のみで、患者の生存率全体を５０％近くまで減少させ得るので、リンパ節転移の状態は、ＨＮＳＣＣにおける最も重要な予後因子の１つとみなされる。さらに、リンパ節転移を有するＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣのサブセットは、結節性疾患を有さないＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣよりも低い生存率の芳しくない予後を有する（７０％対９３％）。以前の研究では、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞が、結節性転移を防ぐために重要な役割を果たすが、その一方で、増加したＭＤＳＣは、乳癌患者における結節性転移と相関があることが見出された。
【００８１】
最近の研究により、免疫細胞およびサイトカインを強力な予測バイオマーカーとして使用することができることが分かっている。例えば、浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の総数は、乳癌、腎臓がん、大腸がん、皮膚癌、および胃癌における良好な患者生存と相関がある。対照的に、ＭＤＳＣは、膵臓がん、食道癌、胃癌、および皮膚癌における負の予測マーカーとみなされる。患者において、ＩＬ−８およびＩＦＮ−γを含むいくつかのサイトカインの発現レベルを測定することによって、臨床成果も予測され得ることが示唆されている。これらの研究成果は、抗腫瘍性免疫応答を列挙するＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを確立するための国際的な努力につながっており、それらは、ＴＮＭ分類より強力な生存の予測因子として示されている。したがって、免疫細胞浸潤およびケモカイン発現の検出および評価は、ＨＮＳＣＣ患者の臨床成果の予測において使用することができる、信頼できる予測マーカーであり得る。現在、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者は、ＨＰＶ患者より低い化学放射線適用量によって治療される。ＣＸＣＬ１４ｌｏｗＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者は選別され得、ならびにＣＸＣＬ１４ｈｉｇｈＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者よりも高適用量および／または長い治療／経過観察によって治療され得る。
【００８２】
本発明者らの以前の研究は、顕著なＣＸＣＬ１４の減少およびＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチル化の増加を伴うＨＰＶ関連のがん進行の間の特徴的なケモカイン変化を明らかにした（図１、２、および４）。ＣＸＣＬ１４プロモーターの過剰メチルは、唾液（図１７）ならびに組織（表２）において検出可能である。
【００８３】
表２．ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣにおけるＣＸＣＬ１４プロモーターのメチル化。ＣＸＣＬ１４プロモーターのメチル化は、２０のＨＰＶ−および１６のＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ組織試料からのゲノムＤＮＡを使用してＭＳＰによって決定した。過剰メチルのレベルは、ＭＳＰ生成物の帯域密度に基づいてスコア化した。
2018532745.tif 000005
【００８４】
ＣＸＣＬ１４発現が、腫瘍およびリンパ節においてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞集団を増加させることによって、腫瘍細胞を除去すると仮定すると（図８および９）、ＣＸＣＬ１４および免疫細胞は、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者の免疫応答を決定し、臨床成果を予測するための信頼できる予測マーカーとして使用することができる。したがって、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化は、ＴＭＥ中へのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤と相関があり、結節性転移の無いＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者におけるより良好な臨床成果の予測を示すことが、本発明者らにより示される。本発明者らは、ＨＮＳＣＣ臨床成果と、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化ならびに腫瘍組織および所属リンパ節中への免疫細胞浸潤との相関関係も証明する。ＣＸＣＬ１４および免疫細胞がＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣの予後のための基礎として使用される場合に結果として生じ得る臨床効果、恩恵、および任意の潜在的有害性を評価するために、続いて、無作為臨床試験の形態の多大な前向き（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）がんスクリーニング研究を行う。およそ１，０００のＨＮＳＣＣ患者の組織試料を収集した（隣接する正常な細胞および関連する患者の人口統計、ＨＰＶ状態、ならびに臨床成果と共に）。これらの試料の中で、約２５０の試料がＨＰＶ＋である。ＣＸＣＬ１４レベルが、ＴＭＥに浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数と相関するか否かを決定するために、本発明者らは、２００のＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者の組織、リンパ節、唾液、および血液の試料を検査する。組織学的には、この患者群ならびに３０の正常な対象における正常な遠隔粘膜組織（すなわち、扁桃摘出）をコントロールとして使用する。本発明者らは、比較群として５０のＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ患者も含ませる。現在または以前に喫煙経験のある患者は、パック年および喫煙期間によって階層化される。したがって、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ喫煙者は、患者のサブセット群として含まれる。
【００８５】
各試料のＨＰＶ状態は、ｐ１６  ＩＨＣおよびＨＰＶ  ＰＣＲ（１４の高リスク：１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８）によって確認する。本発明者らは、最初に、これらの組織試料におけるＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化レベルならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤を評価する。最終的な治療として化学放射線を受ける患者に対して、組織および外科的に解剖された所属リンパ節の両方、または細針吸引（ＦＮＡ）における結節試料において、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞集団を決定する。次に、本発明者らは、ＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤が、ｉ）Ｔステージ（Ｔ１−２対Ｔ３−４）および組織学的グレード（中分化、低分化、または未分化）；ｉｉ）リンパ節転移（（Ｎ０−Ｎ２ａ対Ｎ２ｂ−Ｎ３）；およびｉｉｉ）臨床成果（全生存、無増悪生存、および再発）、に、正または負に相関しているか否かを決定する。本発明者らは、この患者集団におけるＣＸＣＬ１４発現／プロモーターのメチル化ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞浸潤の性差について評価する。以前の研究に基づいて、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者の３年全生存率および３年無増悪生存率は、それぞれ、〜８０％および〜７０％である。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣの約４０％が、診断の時点で、Ｎ２ｂ−Ｎ３ステージのリンパ節転移を示す。監視および検査により、患者を５年間にわたって臨床的に経過を見守り、局所領域再発ならびに遠隔転移について評価するために定期的に撮像する（ＰＥＴ−ＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ）。この初期期間において再発または転移を有する患者を、５年間の無病期間が達成するまで追跡する。結果を、１００人の前向きＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者からの試料によって確認する。
【００８６】
本発明者らは、本発明者らのＲＴ−ｑＰＣＲ手順を使用して、ＨＮＳＣＣ組織試料におけるＣＸＣＬ１４のｍＲＭＡレベルを分析する（図３Ａ−３Ｃ）。事前にマッピングした組織切片から擦り取って準備した（マクロ解剖した（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ））上皮組織を準備する。組織が、以前のＨ＆Ｅ染色組織の評価に基づいて、８０％未満の正常な上皮または腫瘍細胞を有する場合、レーザー捕捉微細解剖を実施する。次に、本発明者らは、抗ＣＸＣＬ１４抗体によるＩＨＣを使用して、ＣＸＣＬ１４タンパク質レベルを測定する。予備的免疫染色法は、ＮＩＫＳ（ＨＰＶ−）細胞およびＮＩＫＳ−１６（ＨＰＶ＋）細胞におけるＣＸＣＬ１４タンパク質発現の間の明確な違いを示していた（図３Ｄ）。ＣＬＩＡ公認の研究所での今後の試験のために、本発明者らは、ポジティブおよびネガティブコントロールの精密な計画から開始する。ウェスタンブロットを使用して、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのために、１０のＣＸＣＬ１４陽性の正常な組織試料および１０のＣＸＣＬ１４陰性のＨＮＳＣＣ組織試料において、ＣＸＣＬ１４発現に対する約１０ｋＤの単一の帯域を検出する。本発明者らは、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を使用して、組織および唾液試料におけるＣＸＣＬ１４プロモーターのメチル化も分析する。ＣＬＩＡ公認の研究所での標準的試験では、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ細胞株（ＭＳＫ９２２およびＨＮ１１）および正常な口腔ケラチノサイトを、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用する。予備データは、高レベルのＣＸＣＬ１４メチル化は、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣよりもＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣにおいて、より頻繁に検出されることを示していた（表２）。しかしながら、４０％のＨＰＶ−ＨＮＳＣＣも、メチル化されたＣＸＣＬ１４を有する。したがって、本発明者らは、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣにおけるＣＸＣＬ１４のメチル化状態が、ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣと同様に、臨床成果に相関するか否かを決定する。
【００８７】
腫瘍およびリンパ節中へと浸潤したＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の総数を、それぞれ、抗ヒトＣＤ８αおよびＮＫｐ４６抗体によるＩＨＣを使用して評価する。さらに、本発明者らは、本発明者らがＣｘｃｌ１４発現性マウスにおいて減少するのを観察した、ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ細胞を含む免疫抑制細胞を検出する（図１４および１６）。ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ細胞を検出するために、本発明者らは、説明されるような二重ＩＨＣラベリングを実施する。全てのＩＨＣおよび画像分析を実施する。ＩＨＣ画像を、Ａｐｅｒｉｏスキャナーを使用して取り込み、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して分析する。確立された評価基準に従って、陽性細胞の数が自動的に定量化される。本発明者らはさらに、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して、患者の血液および／または結節試料におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＭＤＳＣ、およびＴｒｅｇ細胞も分析する。末梢単核球細胞（ＰＢＭＣ）を患者の血液試料から単離し、特有のフルオロフォアとコンジュゲートした抗体の本発明者らのパネルによるマルチカラーフローサイトメトリーを使用して分析する：好中球（Ｇｒ１ｈｉｇｈ）、ＤＣ（ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋）、マクロファージ（ＭＨＣＩＩ＋、Ｆ４／８０＋）、単球（Ｇｒ１ｍｉｄ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋）、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋）、およびＭＤＳＣ（ＭＨＣＩＩｌｏｗ、Ｇｒ１＋、ＣＤ１１ｂ＋）（改稿）。ＣＬＩＡ承認の研究所において浸潤した免疫細胞を確認するためのポジティブおよびネガティブコントロールに対して、本発明者らは、磁性ビーズ選択を使用してＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＭＤＳＣを単離し、ウェスタンブロットを使用して特異的マーカーを検出する。免疫染色の定量化を実施する。
【００８８】
バイオマーカー、主にＣＸＣＬ１４レベルならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数が、生存、再発、およびリンパ節転移と相関があるか否かを評価するために、第一段階では、多重比較のための調節なしで、バイオマーカーと患者の臨床的／人口統計的特徴との間の全ての対合を評価する。次いで、コックス比例ハザードモデルおよびロジスティック回帰モデルを使用して、個々のバイオマーカーと事象発生までの時間（ＯＳ、再発までの時間）、および二元（すなわち、転移または再発のＹ／Ｎ）成果との関係性を評価し、患者特性の間において交絡因子を調節する。これらの分析は、最終段階の情報を明らかにし、そこでは、潜在的予測因子として全てのバイオマーカーを考慮するような多変数コックスおよびロジスティック予測モデルを構築して、交絡因子を調節するために、赤池情報量規準（Ａｋａｉｋｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ：ＡＩＣ）が使用される。５％の有意水準でのコックスモデルにおける検定は、連続的な予測因子標（ＣＸＣＬ１４発現レベルまたは免疫細胞の数）における１ＳＤの増加に対する１．６０の調節されたハザード比、および５０−５０スプリットでの二元予測因子に対する２．５４の調節されたハザード比を検出するための８０％の検定力を有し、両方とも、モデルにおけるマーカーと他の予測因子との間における０．１０のＲ二乗、および研究全体での予測される２０％の進行または死亡を仮定する。最小の検出可能なハザード比はより小さく、イベント率はより大きい（０．３）。同様に、５％レベルでのロジスティック回帰モデルにおける検定は、連続的な予測因子における１ＳＤの増加に対して１．６９の調節されたオッズ比および５０−５０スプリットでの二元変数に対して２．５５の調節されたオッズ比を検出するための８０％の検定力を有し、両方とも、モデルにおける予測因子と他の予測因子との間において０．１０のＲ二乗を仮定する。ベースライン比率は０．２０に仮定する。全ての検定力計算は、２００の試料サイズに基づいた。
【００８９】
本発明者らの研究は、ＴＭＥにおける免疫応答が腫瘍クリアランスにとって重要であることを示したため、本発明者らは、ＣＸＣＬ１４レベルおよびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数が密接に相関し、ＣＸＣＬ１４プロモーターのメチル化状態は、より高い生存率と、再発および結節性転移のより低い比率とに逆相関すると予測する。しかし、ＣＸＣＬ１４レベルは、可変であり得、臨床成果との有意な相関関係に達するには十分でないかもしれない。この場合、本発明者らは、さらに、炎症誘発性ケモカイン（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２）の発現も分析する。さらに、血液中のタイプ１のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ７０）対タイプ２のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の分析によって、免疫応答の全身性変化ならびにＨＮＳＣＣ患者の臨床成果とのその相関関係が決定されると考えられる。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣの予後は、短期間では良好であり得るが、長期間では、患者は、再発し得るかまたは遠隔転移を有し得る。したがって、本発明者らは、後ろ向きデータ（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ）を使用して、長期予後を点検し、必要であれば、本発明者らは、５年にわたって前向き患者を経過観察する。さらに、いくつかのＨＰＶ−ＨＮＳＣＣも、プロモーターのメチル化によるＣＸＣＬ１４下方制御を示すため、本発明者らは、将来、この研究をＨＰＶ−ＨＮＳＣＣまで広げるであろう。ＩＨＣの定量化においてなんらかの制限が存在する場合、本発明者らは、免疫蛍光を使用し得る。
【００９０】
本発明の上述の実施例は、例示および説明目的のために提示されている。さらに、これらの実施例は、本明細書において開示される形態に本開示を限定することを目的とするものではない。その結果、本開示の説明の教示ならびに関連分野の技術および知識と同等の変更および修正も、本開示の範囲内である。本明細書において提供される実施例において説明される特定の実施態様は、本開示を実施するための最良の形態をさらに説明すること、ならびに当業者が本開示をそのような実施態様または他の実施態様において、本開示の特定の用途または使用法によって必要とされる様々な修正により、利用することができることを目的としている。以下に添付された請求の範囲は、従来技術により許容される程度まで、別の実施態様を含んでいると解釈されるよう、意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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