(57)【要約】  本発明は、レトロウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１））中の標的配列を、特異的に切断する組成物及び方法に関する。上記組成物は、（i）Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、および、（ii）ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列、をコードしている核酸を含み得る。上記組成物は、ＨＩＶに感染している被験体、または感染するリスクのある被検体の細胞に送達することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に用いられる組成物であって、
Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む、少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物。
【請求項２】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＤＮＡを不活性化する方法であって、
Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む、少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物で、当該宿主細胞を処理する工程と、
上記プロウイルスＤＮＡを不活性化する工程と、を含む、方法。
【請求項８】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の 標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に用いられるレンチウイルス発現ベクター組成物であって、
Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸と、を含み、
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、少なくとも１つのレンチウイルス発現ベクターに含まれ、
上記少なくとも１つのレンチウイルス発現ベクターは、宿主細胞内において、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡの発現を誘導する、レンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項１４】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項１５】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項１６】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項１７】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項１８】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の 標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項１９】
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、単一のレンチウイルス発現ベクターに含まれる、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項２０】
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、別々のレンチウイルス発現ベクターに含まれる、請求項１３に記載のレンチウイルス発現ベクター組成物。
【請求項２１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に潜伏感染したエクスビボ培養された宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを取り除く方法であって、
ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞の集団を得る工程であって、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡが当該宿主細胞のゲノムに組み込まれている、工程と、
上記宿主細胞をエクスビボで培養する工程と、
Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと、上記プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、を含む、組成物で、上記宿主細胞を処理する工程と、
上記プロウイルスＤＮＡを上記宿主細胞のゲノムから取り除く工程と、を含む、方法。
【請求項２２】
上記宿主細胞の集団を得る工程は、ヒト宿主細胞を得る工程としてさらに定義される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記宿主細胞の集団を得る工程は、ヒト末梢血単核細胞の集団、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得る工程としてさらに定義される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の 標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
上記処理する工程は、上記潜伏感染したＴ細胞中に、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に潜伏感染されている患者を処置する方法であって、
上記患者から、潜伏感染したＴ細胞を含む集団を得る工程であって、当該Ｔ細胞のゲノムにプロウイルスＨＩＶのＤＮＡが組み込まれている、工程と、
上記潜伏感染したＴ細胞をエクスビボで培養する工程と、
上記潜伏感染したＴ細胞を、Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む組成物で処理する工程であって、当該少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む、工程と、
上記組み込まれたプロウイルスＨＩＶのＤＮＡを上記Ｔ細胞のゲノムから除去する工程と、
ＨＩＶ除去済みＴ細胞集団を産生する工程と、
上記ＨＩＶ除去済みＴ細胞集団を上記患者に注入する工程と、
上記患者を処置する工程と、
を含む、方法。
【請求項３１】
上記潜伏感染したＴ細胞を含む集団を得る工程は、ヒト末梢血単核細胞の集団を得る工程、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得る工程としてさらに定義される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
上記処理する工程は、上記潜伏感染したＴ細胞中に、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡを発現する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染のリスクがある患者のＴ細胞のＨＩＶ感染を防ぐ方法であって、
患者がＨＩＶ感染のリスクがあると判定する工程と、
上記ＨＩＶ感染のリスクがある患者のＴ細胞を、有効量の発現ベクター組成物に暴露する工程であって、当該発現ベクター組成物は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、ＨＩＶ１  ＤＮＡのＬＴＲ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸とを含む、工程と、
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡを上記Ｔ細胞中に安定して発現させる工程と、
上記Ｔ細胞のＨＩＶ感染を防ぐ工程と、
を含む、方法。
【請求項３９】
上記Ｔ細胞を暴露する工程は、上記Ｔ細胞をインビボで暴露する工程としてさらに定義される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記Ｔ細胞を暴露する工程は、上記Ｔ細胞をエクスビボで暴露する工程としてさらに定義され、上記安定して発現させる工程のあとに、上記Ｔ細胞を上記患者に注入する工程を行う、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
上記発現ベクター組成物はレンチウイルスベクター組成物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳類の被検体の細胞中に組み込まれたＨＩＶ‐１  ＤＮＡの根絶のための薬学的組成物であって、
Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、プロウイルスＨＩＶ‐１  ＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、を含み、
上記各単離核酸配列は、少なくとも１つの発現ベクターに含まれている、薬学的組成物。
【請求項４８】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の 標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
上記発現ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
ＨＩＶ‐１に感染した哺乳類の被検体を治療する方法であって、
哺乳類の被検体がＨＩＶ‐１に感染していると判定する工程と、
上記被検体に、請求項４７に記載の薬学的組成物を有効量、投与する工程と、
上記被検体に対し、ＨＩＶ‐１感染の治療を行う工程と、
を含む方法。
【請求項５５】
ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸、および／または、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの単離核酸であって、
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、少なくとも１つの発現ベクターに含まれ、
上記少なくとも１つの発現ベクターは、宿主細胞内において、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡの発現を誘導する、単離核酸。
【請求項５６】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項５７】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項５８】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項５９】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項６０】
上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の 標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項６１】
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、単一のレンチウイルス発現ベクターに含まれる、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項６２】
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、別々の発現ベクターに含まれる、請求項５５に記載の単離核酸配列。
【請求項６３】
ＨＩＶ‐１感染の処置または予防用キットであって、
Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列とを含む、一定量の組成物であって、上記１つ以上のｇＲＮＡのそれぞれは、ＨＩＶ‐１プロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む、組成物と、
パッケージ材料、使用上の注意書きを含む添付文書、滅菌液、注射器、および滅菌容器から成る群から選ばれる１つ以上の品物と、
を含む、キット。
【請求項６４】
上記１つ以上のｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
上記少なくとも１つの単離核酸配列は、表現ベクターに含まれている、請求項６３に記載のキット。
【請求項６６】
上記発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせのいずれか１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する１つ以上の核酸配列を含む、単離核酸配列。
【請求項６８】
配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせのいずれか１つ以上を含む、単離核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府に後援された研究についての陳述）
本発明は、国立保健研究所によってKamel Khalili（P30MH092177）、Wenhui Hu（R01NS087971）、およびWenhui HuとKamel Khalili (R01 NS087971)に与えられた助成のもとに合衆国政府の支援によってなされた。合衆国政府は本発明に対して特定の権利を有しうる。
【０００２】
本発明は、レトロウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１））中の標的配列を、特異的に切断する組成物及び方法に関する。上記組成物は、（i）Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、および、（ii）ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列、をコードしている核酸を含み得る。上記組成物は、ＨＩＶに感染している被験体、または感染するリスクのある被検体の細胞に送達することができる。
【背景技術】
【０００３】
ＡＩＤＳは大きな公衆衛生問題であり続けている。世界中で三千五百万人を超える人々がＨＩＶ‐１に感染しており、一年に二百万人超という一様な比率で新たな感染が続いているからである。抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）は事実上すべてのＨＩＶ‐１患者のウイルス血症を効果的に抑え、一次宿主細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）を部分的に回復させるが、潜伏感染したＴ細胞からＨＩＶ‐１を取り除くことはできない（Gandhi, et al., PLoS Med 7, e1000321(2010); Palella et al., N Engl JMed 338, 853-860 (1998)）。潜伏感染したＣＤ４＋Ｔ細胞において、組み込みプロウイルスＤＮＡのコピーは休止状態であり続けるが、Ｔ細胞が活性化されると当該組み込みプロウイルスＤＮＡのコピーも再活性化されて複製能力を有するウイルスを産生しうる。その結果、抗レトロウイルス治療が中断すると、ウイルスは急速に回復する（Chun, et al., Nature 387, 183-188 (1997); Chun, et al., Proc NatlAcad Sci USA 100, 1908-1913 (2003), Finzi, et al., Science 278, 1295-1300(1997); Hermankova, et al., J Virol 77, 7388-7392 (2003); Siliciano, et al.,Nat Med 9, 727-728 (2003); Wong, et al., Science 278, 1291-1295 (1997)）。したがって、ＨＩＶ‐１に感染した人の大部分は、ＡＲＴに非常に良好に反応する者でさえ、ＨＩＶ‐１感染リザーバ細胞が残り続けることにより、一生、ＡＲＴを続けなければならない。潜伏期間中、ＨＩＶ感染細胞はほとんど又はまったくウイルスタンパク質を産生せず、それによって、ウイルスの細胞変性効果を避け、宿主の免疫システムによって除去されることを逃れる。休眠ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞のコンパートメント（compartment）（Bruner, et al., TrendsMicrobiol. 23, 192-203 (2015)）は、もっとも目立つ潜伏感染細胞のプールだと思われるので、当該コンパートメントは、潜伏ＨＩＶ‐１感染の根絶を目指す研究の最重要点である。
【０００４】
この細胞集団からＨＩＶ‐１を根絶する最近の試みは、主に、「ショックアンドキル」アプローチを用いてきた。これは、ＣＤ４＋記憶Ｔ中でＨＩＶの再活性化を誘導することで、細胞融解又は宿主免疫反応によるウイルス産生細胞の除去のトリガを引けるかもしれないという理論的根拠によるものである。例えば、クロマチン構造の後生的な改変が、ウイルスの再活性化を確立するのに重要である。その結果、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及びボリノスタット（ＳＡＨＡ）によってヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を制限することで、細胞株中の潜伏ウイルスが再活性化された（Quivy,et al., J Virol 76, 11091-11093 (2002); Pearson, et al., J Virol 82,12291-12303 (2008); Friedman, et al., J Virol 85, 9078-9089 (2011)）。したがって、ボリノスタット、バルプロ酸、パノビノスタット、およびロミデプシンを含む他のＨＤＡＣｉが、エクスビボでテストされ、一番うまく行った場合には、ウイルス血症が一時的に増した（Archin, et al., Nature 487, 482-485 (2012); Blazkova, et al., J.Infect. Dis 206, 765-769 (2012)）。同様に、タンパク質キナーゼＣ作用薬は、ＨＩＶを単独で、又はＨＤＡＣｉと組み合わせて、強力に再活性化できる（Laird, et al., J Clin Invest, 125, 1901-1912 (2015); Bullen, et al.,Nature Med 20:425-429 (2014)）。しかし、このアプローチにはいくつもの制限がある。ｉ）このリザーバにあるＨＩＶゲノムの大部分は機能しないので、組み込まれたプロウイルスのすべてが複製能力のあるウイルスを産生できるわけではない（Ho, et al., Cell 155, 540-551 (2013)）。ｉｉ）休眠ＣＤ４＋Ｔ細胞ＨＩＶ‐１リザーバから再活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の総数は、ウイルス増殖アッセイを行った結果、ＰＣＲに基づくアッセイで検出された感染細胞の数よりずっと少ないことが判明している。これは、このリザーバ中のすべての細胞が再活性化されるわけではないことを示唆する（Eriksson, et al., PLoS Pathog 9, e1003174(2013)）。ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の免疫反応は、再活性化した感染細胞を除去するのに十分なほど強くない（Shan, et al., Immunity 36, 491-501 (2012)）。ｉｖ）感染していないＴ細胞はＨＩＶ感染から守られておらず、そのためウイルスが回復する可能性がある。
【０００５】
ClusteredRegularly Interspaced ShortPalindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連の９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼシステムが、イースト菌、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、カエノラブディティス・エレガンス、及びマウスを含む広範囲の生物のゲノム編集に広く役立つことが示され、いくつもの研究所で、ヒトの疾病に向けた広範囲のインビボ及びインビトロの研究に多用されてきた（Di Carlo et al., Nucl Acids Res 41:4336-4346 (2013); Gratz et al.,Genetics 194,1029-1035 (2013); Hwang et al., Nature Biotech 31, 227-229,(2013); Wang et al., 2013; Hu, et al., Proc Natl Acad Sci USA 111, 11461-11466(2014)）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの中で、遺伝子編集複合体が集められる。各複合体は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ｇＲＮＡはＣａｓ９を誘導して、標的配列を含むプロウイルスＤＮＡ鎖と結合し当該プロウイルスＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集複合体は、１つ以上の突然変異をウイルスＤＮＡに導入する。
【０００６】
最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが改良されて、ＨＩＶ‐１の長い末端反復（ＬＴＲ）配列内に位置する特定のＤＮＡ配列の認識を可能にしている（Hu, et al., Proc Natl Acad Sci USA 111, 11461-11466 (2014); Khaliliet al., J Neurovirol 21, 310-321 (2015)）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が媒介する治療能力の現在のレパートリーを広げて、潜伏感染した患者のＴ細胞から組み込まれたＨＩＶ‐１ＤＮＡを根絶する能力や、感染のリスクがある患者のＴ細胞にＨＩＶ‐１感染への抵抗力を誘導する能力を含ませる必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に対する治療法には、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＨＩＶ陽性細胞中のプロウイルスゲノムを直接取り除く方法があり、この方法は、宿主にもたらす害が、あったとしても限定的である。実施形態において、本発明は、レトロウイルス感染、特にヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ‐１の治療及び予防用の組成物及び方法を提供する。上記組成物及び方法は、Ｃａｓ９及び少なくとも１つのｇＲＮＡを用い、これらが形成する複合体が、宿主Ｔ細胞のゲノム中のプロウイルスＨＩＶを不活性化し、多くの場合は根絶する。好ましい実施形態では、少なくとも２つのｇＲＮＡが含まれ、それぞれのｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを、ＨＩＶゲノムのＬＴＲ中の別々の標的部位に向ける。
【０００８】
具体的には、本発明は、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に用いられるＣａｓ９／ｇＲＮＡ組成物を提供する。本発明はまた、上記Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ組成物を用いて宿主細胞中のプロウイルスＨＩＶのＤＮＡを不活性化する方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化するための、Ｃａｓ９および少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを提供する。
【００１０】
本発明はまた、ＨＩＶに潜伏感染したＴ細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを除去するエクスビボの方法を提供する。当該方法は、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞の集団、例えばＡＩＤＳ患者の一次Ｔ細胞を得る工程と、上記宿主細胞をエクスビボで培養する工程と、上記宿主細胞をＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡで処理する工程と、上記プロウイルスＤＮＡを上記宿主細胞のゲノムから取り除く工程と、を含む。
【００１１】
本発明はさらに、Ｔ細胞がＨＩＶに潜伏感染されている患者を処置する方法を提供する。当該方法は、上述したエクスビボ処置方法の各工程を実行する工程と、ＨＩＶ除去済みＴ細胞集団を産生する工程と、上記ＨＩＶ除去済みＴ細胞集団を上記患者に戻す工程と、を含む。
【００１２】
本発明はまた、哺乳類の被検体の細胞中に組み込まれたＨＩＶのＤＮＡを不活性化する薬学的Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ組成物を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、上述した薬学的組成物の有効量を投与することにより、ＨＩＶに感染した哺乳類の被検体を処置する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＨＩＶ感染のリスクがある患者のＴ細胞がＨＩＶに感染するのを予防する方法を提供する。当該方法は、患者のＴ細胞中でのＣａｓ９およびｇＲＮＡの安定的な発現を、エクスビボまたはインビトロで確立する工程を含む。
【００１５】
本発明はまた、ＨＩＶ感染を処置または予防する上述の方法の適用を容易にするキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、ＰＭＡ／ＴＳＡ処置した、潜伏感染ヒトＴ細胞株において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がＨＩＶ‐１発現を取り除くことを示す。図１Ａ：上部は、長い末端反復（ＬＴＲ）の位置、ＬＴＲ間にあるさまざまなウイルス遺伝子、およびレポーターｄ２ＥＧＦＰの位置をハイライト表示した、組み込みＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの構造組織の概略図である。図１Ａの下部は、５’ＬＴＲと、編集に用いられる標的領域Ａ（ｇＲＮＡ  Ａ）と標的領域Ｂ（ｇＲＮＡ  Ｂ）のヌクレオチド配列と、さまざまな転写因子を結合するモチーフとを示す図である。＋１における矢印は転写開始部位を示す。図１Ｂは、ＰＭＡ／ＴＳＡ処置前後のＣＤ４＋Ｔ細胞のＥＧＦＰフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡画像のゲート図である。これは、ＰＭＡ／ＴＳＡに誘導された潜伏ウイルスの再活性化が、Ｃａｓ９のみを発現しているコントロールの細胞では生じるが、Ｃａｓ９とｇＲＮＡ両方を発現している細胞では生じないことを示す。図１Ｃ：Ｃａｓ９±ｇＲＮＡを発現しているプラスミドでトランスフェクトされた細胞における、ｇＲＮＡ  Ａ、ｇＲＮＡ  Ｂ、およびβアクチンＲＮＡの、ＲＴ‐ＰＣＲに基づく検出。βアクチンは、ＲＮＡのローディングコントロールである。図１Ｄ：コントロールの細胞およびＨＩＶ‐１／ＥＧＦＰ発現が小さくなった細胞におけるウェスタンブロット分析によるＣａｓ９タンパク質の検出。βチューブリンを、タンパク質のローディングコントロールとして用いた。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、ウイルスのＬＴＲを標的とするＣａｓ９／ｇＲＮＡによる、宿主Ｔ細胞ゲノムからの組み込みＨＩＶ‐１ＤＮＡの除去を示す。図２Ａ：ＤＮＡ分析は、４９７‐ヌクレオチド増幅産物と５０４‐ヌクレオチド増幅産物が検出されたことを示しており、これらはそれぞれ、コントロールの細胞におけるＨＩＶ‐１のＬＴＲと、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをともに発現する細胞におけるＨＩＶ‐１のＬＴＲとに対応している。ＲＲＥおよびβアクチンに対応する増幅産物の位置を示す。図２Ｂ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９処置細胞から得た増幅ＬＴＲ  ＤＮＡのヌクレオチド組成、および、ウイルスゲノムのさまざまな領域のＰＣＲ増幅に用いられたプライマーの位置。５’ＬＴＲと３’ＬＴＲのＢモチーフ間に位置するウイルスＤＮＡ断片の除去後の７つのヌクレオチドのインデル変異の組み込みを示す。ｇＲＮＡ  Ｂのシード配列を黒でハイライト表示する。図２Ｃおよび２Ｄ：染色体１（図２Ｃ）および染色体１６（図２Ｄ）におけるＨＩＶ‐１組み込み部位を示す。両図とも、ウイルスＤＮＡの挿入によって割り込まれた細胞遺伝子に由来し、特定のプライマー（Ｐ１およびＰ２）によって増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ分析の結果を示す。アガロースゲル上に見られる主なＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングに基づいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９処置前の全長組み込みＨＩＶ‐１ＤＮＡを含む染色体、および、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ処置後に残っているＬＴＲのＤＮＡ配列を含む染色体の図を示す。図２Ｃおよび２Ｄ中のアスタリスクは、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲ内でＡ標的またはＢ標的が用いられた際の、ウイルスＤＮＡの完全な除去を示すマイナーなＤＮＡバンドを示す。
【図３Ａ−３Ｆ】ヒトT細胞中での、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡ  ＡおよびＢによるＨＩＶ‐１の２つのコピーの全プロウイルスの切除を示す全ゲノムシーケンシングの結果を示す。図３Ａおよび３Ｂ：ＢＷＡによりコールした、ＨＩＶ‐１ゲノム（ＫＭ３９００２６．１）に対するリードマッピングをIntegrative Genomics Viewで見たところ、Ｃａｓ９を発現するがｇＲＮＡは発現しないコントロールの細胞ではＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡ配列の存在を示した（図３Ａ）が、Ｃａｓ９とｇＲＮＡ  ＡおよびＢの両方を発現したＴ細胞ではＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡ配列がまったくないことを示した（図３Ｂ）。図３Ｃと３Ｄ：構造多型ＣＲＥＳＴ分析により、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂの切断後に示されたリードにより支持される、両ＬＴＲの５’末端および３’末端での２つの切断点が特定される。ＨＩＶ‐１ゲノム（ＫＭ３９００２６．１）に対するリードマッピングをIntegrative GenomicsView(IGV)で見た図を示す。図３Ｅ：ＣＲＥＳＴでコールした構造多型による９３８９部位(赤い矢じり)でのｇＲＮＡ（図３Ａ、３Ｂ）特異的切断点の特定。垂直な紫の線は、切断後の５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの残りが結合した地点を示す。図３Ｆ：正確な切断部位間のヌクレオチド(すなわち、ｇＲＮＡ  Ａによる標的Ａでの５’ＬＴＲのＰＡＭ（赤い矢印）からｇＲＮＡ  Ｂによる標的Ｂでの３’ＬＴＲまでの３つのヌクレオチド）の除去後のジャンクション部位（赤い矢じり）でのＤＮＡ配列の図。
【図４Ａ−４Ｅ】宿主遺伝子に対するＨＩＶ‐１対象遺伝子編集法の影響を示す。図４Ａ：細胞遺伝子ＲＳＢＮ１中でのＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの組み込み部位およびそれに隣接する遺伝子の位置をハイライト表示する染色体1の概略図である。図４Ｂ：Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによるウイルスＤＮＡの切除前後の、ウイルス組み込み部位に対してさまざまな近さに位置している遺伝子の発現。上記遺伝子の発現は、逆転写およびｑＰＣＲによって特定し、値をβアクチン転写で標準化した。図４Ｃ：染色体１６の１つのセグメントの線形構造組織図であり、ＭＳＲＢ１の位置、およびウイルスＤＮＡが挿入されたＭＳＲＢ１のエキソン２のＨＩＶ‐１ＤＮＡ組み込み部位およびヌクレオチド構造を示す。ＭＳＲＢ１付近のいくつかの細胞遺伝子を示す。図４Ｄ：ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲの結果であり、ＨＩＶ‐１ＤＮＡ根絶前後における、細胞内のＭＳＲＢ１の発現およびそれに隣接する遺伝子発現を示す。当該表は、５つの別々のコントロールおよび５つの別々のＨＩＶ‐１根絶単一細胞クローンから得られた各細胞遺伝子転写物の標的／参照元を示す。図４Ｅ：全ゲノムシーケンシングおよびバイオインフォマティック解釈によるオフターゲット評価。グラフィック図は、ＨＩＶ‐１ＤＮＡを切除されたＴ細胞中のフィルタをかけられたインデル部位に隣接する、増殖した３０、３００、および６００ｂｐ内の３〜７のヌクレオチドのミスマッチを有する、予測されたオフターゲット部位の位置を実証する。オフターゲット配列の横の数は１２００ｂｐ増殖配列のヌクレオチドを示す。ミスマッチなヌクレオチドは、ｇＲＮＡ  Ａオフターゲット部位（青）において緑でハイライト表示し、ｇＲＮＡ  Ｂオフターゲット部位(紫)においてオレンジでハイライト表示した。ＰＡＭ配列には赤の下線を引いた。注目すべきは、オフターゲットの位置は、インデルの位置から離れており、ＰＡＭからの予測された３番目のヌクレオチドでまったく変異を示さないことである。
【図５Ａ−５Ｅ】レンチウイルス（ＬＶ）媒介Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ送達は、ヒトＴ細胞におけるＨＩＶ‐１感染を抑制する。図５Ａ：ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂ、Ｃａｓ９、またはＣａｓ９とｇＲＮＡ  Ａ／Ｂの両方を発現するＬＶで処置された２Ｄ１０Ｔ細胞のＰＣＲ断片分析。ｇＲＮＡ  ＡおよびＢ間の１９０ｂｐの切除後の、全長増幅産物（４１７ｂｐ）、および、それより短いＤＮＡ断片（２２７ｂｐ）の位置を示す。２７０ｂｐのβアクチンＤＮＡ断片の増幅をコントロールとして示す。図５Ｂ：細胞を発現するＧＦＰ（ＨＩＶ‐１）およびＲＦＰ（Ｃａｓ９）の散布図の代表例であり、ＬＶ感染後、２Ｄ１０細胞の７２．９％がＣａｓ９を発現し、ＰＭＡ／ＴＳＡでの誘導後、Ｃａｓ９を発現した細胞のうちの４５％（３１．８％）を超える量の細胞（３１．８％）がＧＦＰ発現の徴候を示さず、ＨＩＶ‐１ＤＮＡが除去されたことを示した。図５Ｃ：一次ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるインビトロ感染実験の実験手順レイアウトである。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、新しく調製した抗体標識ＰＢＭＣから、負の選択により、磁性コラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上に単離し、その後、４８時間、抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８処置を行って活性化させ、続いて、６日間、ヒトｒＩＬ‐２媒介増幅を行った。次に、細胞をスピノキュレーションでＨＩＶ‐１に感染させ、２日後、レンチｇＲＮＡ  ＬＴＲ  Ａ／Ｂを有するまたは有さないレンチＣａｓ９を含むレンチウイルスカクテルで形質導入した。４日後、細胞の上澄みおよび細胞を収穫し、ＨＩＶ‐１の有無を分析した。図５Ｄ：バフィーコートから新たに単離したＰＢＭＣから調製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、「実験手順」の項に記載したようにＨＩＶ‐１ＪＲＦＬまたはＨＩＶ‐１ＮＬ４‐３に感染させ、ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲによってＨＩＶ‐１コピー数を判定し、βグロビン遺伝子コピー数で標準化した。ＬＶ-Ｃａｓ９／ｇＲＮＡが発現したものでは、ＬＶ-Ｃａｓ９を受けたものに比べ、感染から６日後、ＨＩＶ‐１ＪＲＦＬのコピー数が大きく減少（４８％）し、ＨＩＶ‐１ＮＬ４‐３ではさらにめざましい減少が見られた。図５Ｅ：ＬＶ-ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂの存在または不在下でＬＶ-Ｃａｓ９で処置したＨＩＶ‐１感染ＣＤ４＋Ｔ細胞から得たＬＴＲおよびβアクチンＤＮＡ(コントロール)のＰＣＲ分析。３９８ｂｐのＨＩＶ‐１  ＬＴＲおよび２７０ｂｐのβアクチン増幅産物の位置を示す。
【図６Ａ−６Ｆ】ＨＩＶ‐１感染患者の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ‐１複製の抑制を示す。図６Ａ：２人のＨＩＶ‐１感染ボランティアから得たＰＢＭＣを、ＬＶ-Ｃａｓ９またはＬＶ-Ｃａｓ９プラスＬＶ-ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂで処置し(「材料および方法」の項に記載)、ウイルスＤＮＡコピーをｑＰＣＲで判定した。図に見られるように、βグロビンＤＮＡでの標準化後、ウイルスコピー数のかなりの減少が検出された。図６Ｂ：ＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＩＬ‐２（２０Ｕ／ｍｌ）を含む培地で増殖させ、ＬＶ-Ｃａｓ９またはＬＶ-Ｃａｓ９プラスＬＶ-ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂに感染させ、それから、４日後、ｑＰＣＲによって、ウイルスＤＮＡコピー数を判定した。ＰＢＭＣと同様、ＬＶ-Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを受けた細胞では、ＬＶ-Ｃａｓ９を受けた細胞に比べて、ＨＩＶ‐１ＤＮＡのコピー数のめざましい減少が見られた。図６Ｃ：Ｃａｓ９またはＣａｓ９およびｇＲＮＡ  Ａ／Ｂを発現するレンチウイルスベクターでの処置後のＣＤ４＋Ｔ細胞を収穫し、ｐ２４  Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡによってウイルス複製を判定した。図６Ｄ：増殖するプライマー−３７４／＋４３によるレンチウイルス処置後の患者サンプルから単離したＤＮＡの分析。４１７個の予期された増幅産物の位置を示す。コントロールは、感染後６日目のＰＢＭＣ  ＨＩＶ‐１ＪＲＦＬから得たＬＴＲ  ＤＮＡの増幅を示す。図６Ｅ：ＬＴＲの−４１６から−１９までのプライマーの異なるセットを用いたウイルスＬＴＲのＰＣＲ増幅（図６Ｄに記載）。３９８ｂｐの増幅産物の位置を示す。図６Ｆ：患者２から得たＬＴＲ断片（図６Ｅに示す）のＴＡクローニングおよびシーケンシングにより、増幅ＤＮＡのうちいくつかで挿入、欠失、および単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）が見られた。上記アッセイは、ウイルスゲノムの外部に由来するプライマー（すなわち、組み込み部位に隣接するプライマー）を必要とする大規模なＤＮＡ除去は検出できないことに留意。
【図７Ａ】Ｃａｓ９またはＣａｓ９プラスｇＲＮＡのどちらか一方を発現するプラスミドでトランスフェクトしたいくつかの２Ｄ１０クローンのフローサイトメトリー評価を示す。+Ｃａｓ９／-ｇＲＮＡ細胞をＰＭＡ／ＴＳＡで処置すると、細胞の７１％〜８９％でＨＩＶ‐１発現（ＧＦＰ＋）が誘導された。その反対に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、上記処置に対して大きな反応を示さなかった（１％〜３％）。
【図７Ｂ】潜伏ＨＩＶ‐１ゲノムの根絶後、クローン２Ｄ１０細胞のいくつかでｇＲＮＡ  ＡおよびＢを検出するＲＴ‐ＰＣＲアッセイを行った結果を示す。βアクチンｍＲＮＡレベルを、全体におけるＲＮＡの調製およびＲＮＡのローディングのコントロールとした。Ｃ１１は、コントロール（＋Ｃａｓ９／−ｇＲＮＡ）細胞のＲＴ‐ＰＣＲを示す。
【図８Ａ−８Ｂ】ＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの組み込みコピーを含むヒトＴ細胞の全ゲノムシーケンシングおよびバイオインフォマティック分析を示す。図８Ａ：染色体１および１６上の、ヌクレオチドレベルでのＨＩＶ‐１組み込み部位の詳細を右側に示す。宿主染色体ＤＮＡ配列を赤で示し、組み込みＤＮＡ配列を黒で示す。４つの欠失したヌクレオチド（ＴＡＡＧ）に緑の下線を引く。ＨＩＶ‐１と関連する４つの染色体間転座（ＣＴＸ）を、構造多型のＣＲＥＳＴコーリングに基づいて特定する。図８Ｂ：ＮＣＢ１およびＢＬＡＳＴＩＮで分析した、染色体１および１６のグラフィック図は、ＨＩＶ‐１ゲノムと宿主染色体間の対応をハイライト表示する（ＬＴＲ、長い末端反復）。
【図９Ａ−９Ｂ】染色体１における、ＨＩＶ‐１ＤＮＡが組み込まれているＲＳＮＢ１内の領域を示す部分のＤＮＡシーケンシングの結果を示す。図９Ａ：ＰＡＭの位置、および、ｇＲＮＡ  ＡおよびＢに対応するＬＴＲ（ＬＴＲ  ＡおよびＢ）のヌクレオチド配列の位置をハイライト表示する。図９Ｂ：ＰＣＲ断片のＤＮＡシーケンシングであって、ＰＡＭの３ヌクレオチド下流での切断点の正確な位置および７つのヌクレオチドの挿入を示す。
【図１０Ａ】染色体１６における宿主ＤＮＡのＤＮＡシーケンシングであって、ＭＲＳＢ１遺伝子内のＨＩＶ‐１ＤＮＡの正確な組み込み部位、および、インデル変異のハイライト表示した領域を示す。
【図１０Ｂ】(ＬＴＲ  Ａ標的での)ｇＲＮＡ  Ａによる切断後の５’‐ＬＴＲ内の８つのヌクレオチドの挿入位置、および、（ＬＴＲ  Ｂ標的での）ｇＲＮＡ  Ｂによる切断時の３つのヌクレオチドの挿入位置を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】細胞アポトーシスにおけるＨＩＶ‐１根絶に対するＣａｓ９／ｇＲＮＡの影響の評価に用いられたアポトーシスアッセイの結果を示す。図１１Ｂは、Ｃａｓ９レンチウイルスのみに感染し、ｇＲＮＡには感染していない１４個のＴ細胞クローンに対して行ったアポトーシスアッセイの平均結果を示すバーグラフである。サンプルごとに実験を３回行い、データを平均および標準偏差として提示する。異なる色は、異なるアポトーシス段階で検出した細胞の平均パーセンテージを示す（グラフの下の表を参照）。図１１Ａの左パネルは、代表的なサンプルの結果を示す。図１１Ｂは、細胞をＣａｓ９レンチウイルスおよびｇＲＮＡレンチウイルスの両方に感染させることで前もってＨＩＶ‐１を根絶させておいたＴ細胞クローンに対して行った同じアポトーシスアッセイの結果を示すバーグラフである。図１１Ｂの左パネルは、代表的なサンプルの結果を示す。上記結果は、Ｃａｓ９に感染させたクローンと根絶させたクローンとのあいだに大きな違いがなく、ｇＲＮＡはアポトーシス細胞メカニズムには影響しないことを示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＨＩＶ‐１根絶用に開発されたＣａｓ９／ｇＲＮＡが細胞の生存に与える影響を調べるのに用いられた細胞生存アッセイの結果を示す。図１２Ａは、Ｃａｓ９レンチウイルスにのみ感染しｇＲＮＡには感染していない１４個のＴ細胞クローンに対して行った細胞生存アッセイの平均結果を示すバーグラフである。サンプルごとに実験を３回行い、データを平均および標準偏差として提示する。生存細胞および死亡細胞の平均パーセンテージをそれぞれ青と赤で示す。図１２Ａの左パネルは、それぞれのサンプルの結果を示す。図１２Ｂは、細胞にＣａｓ９レンチウイルスおよびｇＲＮＡレンチウイルスの両方を感染させることでＨＩＶ‐１を前もって根絶させておいたＴ細胞クローンに対して実施した同じ細胞生存アッセイの結果を示すバーグラフである。図１２Ｂの左パネルは、代表的なサンプルの結果を示す。上記結果は、Ｃａｓ９に感染させたクローンと根絶させたクローンとのあいだに大きな違いがなく、ｇＲＮＡレンチウイルスは細胞死を誘引しないことを示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】ＨＩＶ‐１の根絶のために開発されたＣａｓ９／ｇＲＮＡが細胞サイクルに与える影響を調べるのに用いられた細胞サイクルアッセイの結果を示す。図１３Ｂは、Ｃａｓ９レンチウイルスにのみ感染させｇＲＮＡには感染させていない１４個のＴ細胞クローンに対して行った細胞サイクルアッセイの平均結果を示すバーグラフである。サンプルごとに実験を３回行い、データを平均および標準偏差として提示する。異なる細胞サイクルフェーズで検出された細胞平均パーセンテージは異なる色で示す（バーグラフ下の表を参照）。図１３Ａの左パネルは、代表的なサンプルの結果を示す。図１３Ｂは、細胞にＣａｓ９レンチウイルスおよびｇＲＮＡレンチウイルスの両方を感染させることでＨＩＶ‐１を前もって根絶させておいたＴ細胞クローンに対して実施した同じ細胞サイクルアッセイの結果を示すバーグラフである。図１３Ｂの左パネルは、代表的なサンプルの結果を示す。上記結果は、Ｃａｓ９に感染させたクローンと根絶させたクローンとのあいだに大きな違いがなく、ｇＲＮＡレンチウイルスは細胞サイクルメカニズムに影響しないことを示す。
【図１４】染色体のカバー深度（左側座標）およびカバー率（右側座標）を示すグラフである。Ｘ軸は染色体数であり、左側Ｙ軸は各染色体の平均深度であり、右側Ｙ軸は各染色体でカバーされる画分である。
【図１５Ａ−１５Ｃ】ＨＩＶ‐１切除Ｔ細胞株の再感染防止を示す。図１５Ａ：ＨＩＶ‐１ゲノム除去後のいくつかの潜伏感染Ｔ細胞のＣａｓ９発現（上パネル）をウェスタンブロットで調べ、ｇＲＮＡ  Ｂの存在（中央パネル）をＲＴ‐ＰＣＲで調べた。αチューブリンおよびβアクチンの発現が、それぞれタンパク質とＲＮＡのローディングコントロールとなる。図１５Ｂ：Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡ発現を有するＴ細胞をＨＩＶ‐１で感染させた。感染後のさまざまな時期に、各時期におけるウイルス感染のレベルをフローサイトメトリーで判定した。各ケースのウイルス感染のレベルをフローサイトメトリーで判定した。図１５Ｃは、図１５Ｂに示す実験の定量値を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】患者由来の一次ＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞実験の結果を示す。図１６Ａ：ＡＲＴ治療中の４人のＨＩＶ‐１陽性患者の血液サンプルを、ＣＮＡＣ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｅ  １（テンプル大学、フィラデルフィア）によって得た。ＡＡ：アフリカ系。Ｈｉｓ：ヒスパニック系。図１６Ｂ：患者の血液サンプルに対する実験ワークフローの概略図。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、新しく調製した抗体標識ＰＢＭＣから、負の選択により、磁性コラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上に単離し、その後、４８時間、抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８処置を行って活性化させ、続いて、６日間、ヒトｒＩＬ‐２媒介増幅を行った。それと並行して、同じ血液サンプルから得たＰＢＭＣをＰＨＡ活性化し、同様にヒトｒＩＬ‐２で増殖した。次に、細胞を、レンチｇＲＮＡ  ＬＴＲ  Ａ／Ｂを有するまたは有さないレンチＣａｓ９を含むレンチウイルスカクテルで形質導入した。４日後、上澄みおよび細胞を収穫し、ＨＩＶ‐１の有無を分析した。図１６Ｃ：単離後のＣＤ４＋Ｔ細胞の純度を、ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ４抗体標識細胞のフローサイトメトリーで確認した。ＣＤ４欠失集団およびＣＤ４濃縮集団における単離後のＣＤ４陽性（ＧＦＰチャネル）細胞の代表的ヒストグラム。
【図１７】患者由来のＰＢＭＣにおけるＨＩＶ‐１レベルを示すグラフである。レンチウイルスＣａｓ９またはレンチウイルスＣａｓ９プラスレンチウイルスｇＲＮＡ  ＡおよびＢに感染後のケース３およびケース４から得たＰＢＭＣのｐ２４  ＥＬＩＳＡアッセイ。細胞を、抗ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ２８カバービーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で細胞対ビーズ比が２：２１となるように、あるいはＰＭＡ／ＴＳＡカクテル（ＰＭＡ  ２５ｎＭ／ＴＳＡ  ２５０ｎＭ）で、４８時間、処置し、それから、カウントし、上澄みのＧａｇ  ｐ２４を測定した。
【図１８Ａ−１８Ｄ】各サンプルにおけるヒトベータグロビン（図１８Ａ、１８Ｂ）およびＨＩＶ‐１  Ｇａｇ（図１８Ｃ、１８Ｄ）遺伝子コピー数の絶対的定量化に用いられる増幅プロットおよび標準カーブである。Ｕ１単球細胞株から得られたゲノムＤＮＡの連続希釈液を調製した。当該連続希釈液は、１０μｌ中１０５のゲノムコピー／反応に対応する３．３μg／ｍｌから、１０μｌ中１０５のゲノムコピー／反応に対応する０．３３ｎｇ／ｍｌまでであった。Ｕ１細胞は、染色体２およびＸに組み込まれたゲノムごとのＨＩＶ‐１プロウイルスの単一、全長コピーを２つ含み、当該コピーはベータグロビン遺伝子コピーに該当する（２倍体ゲノムにつき２つ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、すなわちＣａｓ９と、哺乳類のゲノムに組み込まれたＨＩＶプロウイルスＤＮＡの一本鎖上にある標的配列に相補的なガイドＲＮＡと、を含む、少なくとも１つの集合遺伝子編集複合体を含む。各遺伝子編集複合体は、標的配列内部のＤＮＡを切断することができ、それにより、プロウイルスゲノムを不活性化する欠失および他の変異を引き起こすことができる。好ましい実施形態では、上記ガイドＲＮＡは、ＨＩＶプロウイルスの２つのＬＴＲ領域のそれぞれに存在する標的配列に相補的である。ある実施形態では、上記ｇＲＮＡは、上記ＬＴＲのＵ３領域の部位に相補的である。他の実施形態では、上記ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ  Ａ（図１Ａで「ｇＲＮＡ  Ａ」と示された領域中の標的配列に相補的である）と、ｇＲＮＡ  Ｂ（図１Ａで「ｇＲＮＡ  Ｂ」と示された領域中の標的配列に相補的である）とを含む。好ましい実施形態では、ｇＲＮＡ  ＡおよびＢの両方の組み合わせはペア（「二本鎖」）を成している。
【００１８】
〔定義〕
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本発明を試験するための実施において、本明細書に記載のものと類似または同様の、任意の方法および材料を使用することができる。しかし、本明細書に記載の材料および方法を使用することが好ましい。本発明を説明および請求するにあたり、下記の用語を使用する。
【００１９】
本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を説明するという目的でのみ使用され、限定する意図は無いということも理解されたい。
【００２０】
本明細書にて使用される冠詞「a」および「an」は、当該冠詞の文法的目的語が１つまたは１つより多い（つまり、少なくとも１つである）ことを示す。例として、「an element（要素）」は１つの要素または１つより多い要素を意味する。したがって、「a cell（細胞）」という記載は、例えば、同じ種類の複数の細胞を含む。また、用語「含んでいる（including）」、「含む（includes）」、「有している（having）」、「有する（has）」、「共に（with）」、またはそれらの異形が、詳細な説明および／または請求項にて使用される範囲において、そのような用語は、「備えている（comprising）」という用語と同様に、包括的であることを意図している。
【００２１】
本明細書に使用されるとき、用語「備えている（comprising）」「備える（comprise）」または「備えられた（comprised）」およびそれらの変形は、関連する事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などの定義または記載された要素が、包括的またはオープンエンドであることを意味する。これらには追加の要素も認められるので、定義されたまたは記載された事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などは、その特定された要素（または、適宜、その同等物）を含み、他の要素が含まれてもよいことを示す。また、他の要素が含まれても、依然として、定義された事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などの範囲／定義にも該当することを示す。
【００２２】
本明細書において、測定可能な値（量や時間の長さなど）を指して使用される「約」は、特定された値の＋／−２０％、＋／−１０％、＋／−５％、＋／−１％、または＋／−０．１％の変動を包含することを意味する。これにより、変動値が、本開示の方法を実施するために適当であることを意味する。または、特に生物学的システムまたはプロセスにおいて、当該用語は、５倍以内のオーダー、および２倍以内のオーダーの値も意味し得る。本願および請求項にて特定の値が記載されている場合、特に断りのない限り、用語「約」は、特定の値にとって許容できる誤差の範囲以内であることを意味するものとする。
【００２３】
本明細書に使用されるとき、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の「根絶」という用語は、当該ウイルスが複製できず、ゲノムが欠失し、断片化され、劣化し、遺伝子的に不活性化され、又は、当該ウイルスから遺伝性を失わせあるいは当該ウイルスが他の任意の細胞又は対象に感染するのを妨げる他の任意の物理的、生物学的、化学的、又は構造的発現が生じ、その結果、当該ウイルスがインビボで一掃されることを意味する。場合によっては、ウイルスゲノムの断片が検出されるかもしれないが、当該ウイルスは複製又は感染などができない。
【００２４】
本明細書に使用されるとき、「有効量、有効な量(effective amount)」は、治療的または予防的に利益を提供する量を意味する。
【００２５】
「コードしている」とは、ポリヌクレオチド（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど）におけるヌクレオチドの特異的配列に固有の性質を指す。上記性質とは、（i）ヌクレオチドの定義された配列（つまり、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他の重合体および高分子の合成用テンプレートとして機能すること、ならびに、（ii）これに起因する生物学的性質、である。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的システム中でタンパク質を産生する場合には、当該遺伝子はタンパク質をコードしていると言える。コーディング鎖（自身のヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通例配列表に記載されている）、および非コーディング鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写用テンプレートとして用いられる）の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡの、タンパク質または他の産物をコードしている、と言うことができる。
【００２６】
用語「発現」は、本明細書に使用されるとき、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳（そのプロモーターによって駆動される）、として定義される。
【００２７】
「発現ベクター」とは、組み換えポリヌクレオチド（発現すべきヌクレオチド配列と当該発現すべきヌクレオチド配列が発現するように結合している、発現調節配列を有する）を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいし、または、インビトロ発現システム中に存在してもよい。発現ベクターは当該技術分野で知られているあらゆるものを含む。その例としては、組み換えポリヌクレオチドが組み込まれた、コスミド、プラスミド（例えば、そのままの、またはリポソームに格納された）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などが挙げられる。
【００２８】
「単離された」とは、天然状態から変化したか、または取り去られたことを意味する。例えば、動物の生体中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共在物質から部分的または完全に分離した同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離核酸または単離タンパク質は、実質的に純化された形態で存在してもよく、または、天然状態でない環境（例えば宿主細胞など）に存在してもよい。
【００２９】
「単離核酸」は、自然発生状態において隣接する配列から単離した、核酸セグメントまたはフラグメントを指す。つまり、通常ならば上記フラグメントが隣接している配列（つまり、上記フラグメントが自然発生するゲノムにおいて、当該フラグメントに隣接している配列）から取り除かれた、ＤＮＡフラグメントである。当該用語は、通常は核酸を伴う他の成分（つまり、通常は細胞中において核酸を伴う、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、当該用語は、例えば、（i）ベクターに組み込まれた組み換えＤＮＡ、（ii）自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに組み込まれた組み換えＤＮＡ、または（iii）原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組み換えＤＮＡ、または（iv）他の配列から独立した単離分子（つまり、ｃＤＮＡまたは、ＰＣＲもしくは制限酵素消化によって作製されたゲノムフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメント）としての組み換えＤＮＡ、を含む。また、追加のポリペプチド配列をコードしている、ハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡ；相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；天然および／または修飾されたモノマーまたはリンケージ（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換形態およびαアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアート、およびメチルホスホナートなども含む）の、直鎖状または環状のオリゴマーまたは重合体も含まれる。
【００３０】
核酸配列は「キメラ」であり得る。つまり、異なる領域から構成され得る。本発明の文脈において、「キメラ」化合物は、２つ以上の化学領域（例えば、ＤＮＡ領域、ＲＮＡ領域、ＰＮＡ領域など）を含む、オリゴヌクレオチドである。化学領域のそれぞれは、少なくとも１つのモノマーユニット（つまり、ヌクレオチド）から構成されている。これらの配列は、一般的に少なくとも１つの領域を含み、上記配列は、１つ以上の所望の性質を示すように修飾されている。
【００３１】
用語「標的核酸」配列は、核酸（多くの場合、生体試料に由来する）を指し、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズされるようになっている。標的核酸は、標的に向けられている、対応するオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的な配列を有する。標的核酸という用語は、オリゴヌクレオチドが向けられている、より大きな核酸の特異的部分配列または配列全体（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）を意味し得る。使用される意味の違いは、文脈から明白である。
【００３２】
本発明の文脈において、通常の核酸塩基について、以下の略語が使用される：「Ａ」はアデノシンを意味し、「Ｃ」はシトシンを意味し、「Ｇ」はグアノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味し、「Ｕ」はウリジンを意味する。
【００３３】
特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンの関係にあり、同じアミノ酸配列をコードしている、全てのヌクレオチド配列を含む。「タンパク質またはＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列」という語は、上記タンパク質をコードしているヌクレオチド配列のいくつかのバージョンがイントロンを含みうる程度に、イントロンを含んでもよい。
【００３４】
免疫原性組成物の「非経口的」投与は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内(intrasternal)への、注射または注入技術を含む。
【００３５】
「患者」または「個体」または「被検体」という用語は、本明細書中において互換的に用いられ、治療される哺乳類の被検体を意味し、ヒト患者であることが好ましい。場合によっては、本発明の方法は、実験動物、獣医学への応用、および疾患動物モデル（マウス、ラット、ハムスターを含む齧歯類、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されない）の開発に供される。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの鎖を指し、「核酸」としても知られている。本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドは、本分野において利用可能な任意の手段によって得られる全ての核酸配列を含み、天然核酸および合成核酸の両方を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を意味する。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を必須に含み、タンパク質の配列またはペプチドの配列に含まれ得るアミノ酸の最大数は限定されない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を有する、任意のペプチドまたはタンパク質を含んでいる。本明細書に使用されるとき、当該用語は、短鎖（本発明の分野において、例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーを、通常は指す）、および、長鎖（本発明の分野において、多数の種類があるタンパク質を一般的に指す）、の両方を意味する。その中でも「ポリペプチド」は、例えば、生物活性のあるフラグメント、実質的に相同的なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３８】
「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」という用語は、外来性の核酸が、宿主細胞に移動または導入されるプロセスを意味する。「トランスフェクション」細胞または「形質転換」細胞または「形質導入」細胞とは、外来性の核酸と共にト
ランスフェクション、形質転換、または形質導入された細胞である。トランスフェクション細胞／形質転換細胞／形質導入細胞は、一次被検体細胞およびその子孫を含む。
【００３９】
「処置」は、病気の病状または症候の進行を妨げるまたは変える目的をもって行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置および予防的または防止的方策の両方を指す。「処置」は、緩和ケアとして特定されてもよい。処置が必要な者としては、既に病気を患っている者、および、病気を防ぎたい者が挙げられる。したがって、状態、病気または異常を「処置すること（treating）」またはその「処置（treatment）」は、（１）状態、病気もしくは異常に苦しむか、または、かかりやすくなっているが未だ当該状態、病気もしくは異常の臨床学的もしくは準臨床学的症候を経験もしくは顕示していないヒトまたは他の哺乳類において進行する当該状態、病気または異常の臨床学的症候の出現を防ぐことまたは遅らせること；（２）当該状態、病気または異常を阻害すること、すなわち、疾患の進行もしくはその再発（持続処置の場合）またはその少なくとも１つの臨床学的もしくは準臨床学的症候を抑えること、低減すること、または遅らせること；または（３）疾患を軽減すること、すなわち、当該状態、病気もしくは異常またはその臨床学的もしくは準臨床学的症候の少なくとも１つの退行を起こすこと、を含んでいる。処置される個体への利益は、統計学的に有意であるか、または、患者もしくは医師が少なくとも認知できる。
【００４０】
「ベクター」とは、単離核酸を含む物質の組成物であり、細胞の内部に単離核酸を送達するのに使用することができる。ベクターの例としては、線状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。当該用語は、核酸の細胞への移動を促進する、非プラスミド化合物および非ウイルス性化合物（例えば、ポリリシン化合物およびリポソームなど）を含むとも解釈される。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
用語「パーセント配列同一性」、または、「配列同一性」を有する、とは、任意のクエリ配列と対象配列との間の、同一性の程度を意味する。
【００４２】
用語「外来性」は、核酸またはポリペプチドが組み換え核酸コンストラクトの一部であるか、もしくは組み換え核酸コンストラクトにコードされていること、または、核酸またはポリペプチドがその自然環境にはないことを指す。例えば、外来性の核酸とは、ある種から別の種へ導入される配列（つまり、異種核酸）であり得る。典型的には、そのような外来性の核酸は、組み換え核酸コンストラクトを介して別の種へと導入される。外来性の核酸は、ある生物に固有の配列であって、その生物の細胞に再導入された配列であってもよい。外来性の核酸と結合した非天然配列（例えば、組み換え核酸コンストラクトにおいて、ネイティブ配列に隣接する非ネイティブ制御配列）の存在により、ネイティブ配列を含む外来性の核酸は、しばしば天然に存在する配列と区別されることがある。さらに、安定して形質転換された外来性の核酸は、一般的に、ネイティブ配列の位置とは別の位置に組み込まれる。
【００４３】
「薬学的に許容できる」（または「薬理学的に許容できる」）という用語は、動物またはヒトに適宜投与されたときに、有害反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を起こさない、分子的実体および組成物を意味する。本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容できる物質の媒体として使用され得る、溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤、等張性薬剤、および吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤、などの全てを含む。
【００４４】
任意のアミノ酸配列について、スイスプロットまたはＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号によって具体的に言及する場合、当該配列は参照によって本開示に援用される。シグナルペプチドの特定、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、プロモーター配列、および翻訳開始点などの寄託番号に関連する情報も、参照により全て本開示に援用される。
【００４５】
遺伝子：本明細書に記載の全ての遺伝子、遺伝子の名称、および遺伝子産物は、本明細書に記載の組成物および方法が適用可能な任意の種に由来する相同体に対応することが、意図される。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、本開示はただの例示を意図しているに過ぎず、文脈から明示されていると取れる場合を除き、限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子産物に関しては、他の種に由来する、相同および／またはオーソロガスな遺伝子および遺伝子産物を包含することを意図している。
【００４６】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な様態を、範囲の形式で示すことができる。範囲の型式による記載は、単に便宜および簡潔さのためのものであることを理解されたい。また、このような記載は、本発明の範囲における変更できない限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、具体的に開示された全ての取り得る部分範囲も含むと考えられるべきである。例えば、「１から６」という範囲の記載は、その範囲内の個々の数値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６）だけでなく、具体的に開示された部分範囲（１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６など）も含むと考えられるべきである。このことは、範囲の広さを問わず適用される。
【００４７】
組成物
本明細書に記載の組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）をコードしている核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＨＩＶの標的配列に相補的な１つ以上のガイドＲＮＡもコードされていてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に用いられる組成物であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む、少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む組成物が提供される。ある実施形態では、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む。他の実施形態では、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む標的核酸配列に相補的な少なくとも１つの核酸配列を含む。ある実施形態では、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせの１つ以上と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１から６６、そのフラグメント、変異体、バリアント、またはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００４８】
さらに他の実施形態では、上記少なくとも１つのｇＲＮＡは、プロウイルスＤＮＡ中の 標的配列の配列番号１に相補的な、若しくは標的配列の配列番号２に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ａ、または、プロウイルスＤＮＡ中の標的配列の配列番号３に相補的な、若しくは標的配列の配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡ  Ｂ、または、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせ、から選ばれる。
【００４９】
上記単離核酸は、ベクターによってコードされてもよいし、下記に詳述するように１つ以上の送達ビヒクルおよび製剤に含まれてもよい。
【００５０】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導変異がプロウイルスを不活性化するメカニズムは異なりうる。例えば、上記変異はプロウイルス複製およびウイルスゲノム発現に影響しうる。上記変異は１つ以上の欠失を含みうる。上記欠失のサイズは、単一のヌクレオチドの塩基対から約１００００個の塩基対まで変わり得る。いくつかの実施形態では、上記欠失は、上記プロウイルス配列のすべてまたはほぼすべてを含みうる。いくつかの実施形態では、上記欠失は、上記プロウイルスを根絶し得る。上記変異は、１つ以上の挿入、すなわち、１つ以上のヌクレオチド塩基対を上記プロウイルス配列に加えることを含みうる。上記挿入された配列のサイズは、例えば、約１塩基対から約３００ヌクレオチド塩基対まで変わってよい。上記変異は、１つ以上の点変異、すなわち、１個のヌクレオチドの他のヌクレオチドとの交換を含みうる。使い得る点変異は、機能的な結果を有するもの、例えば、アミノ酸コドンを終止コドンに変換する結果となる変異、あるいは、非機能的なタンパク質を産生する結果となる変異である。
【００５１】
３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが特定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー（以前に経験した可動因子に相補的な配列）を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写およびプロセシングを経て、成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）となる。Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、切断標的のＤＮＡに対して強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、（i）成熟ｃｒＲＮＡ（約２０塩基対（ｂｐ）の固有の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を有する）、および（ii）トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（前駆体ｃｒＲＮＡの、リボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングのためのガイドとして機能する）によって誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡのスペーサーと標的ＤＮＡの相補的な配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的な塩基対合を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡへ誘導する。Ｃａｓ９はトリヌクレオチド（ＮＧＧ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、切断箇所（ＰＡＭからの３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別々に発現してもよい。または、合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工的に融合された小型ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成して、天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖と同様に作用させてもよい。そのようなｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡのように、（i）合成してもよいし、（ii）ＲＮＡを直接トランスフェクションするために、インビトロで転写してもよいし、または、（iii）Ｕ６もしくはＨ１をプロモーターとするＲＮＡ発現ベクターによって発現させてもよい。しかしながら、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現するシステムのものよりも低い。
【００５２】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであってもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Streptococcus pyogenesの配列と、同一のヌクレオチド配列を有してもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種に由来する配列であってもよく、例えば、他のStreptococcus sp.（thermophilesなど）に由来してもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、下記に挙げる他の種に由来するものであってもよいが、これらに限定されない：Nocardiopsis dassonvillei、Streptomycespristinaespiralis、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces roseum、Alicyclobacillusacidocaldarius、Bacillus pseudomycoides、Bacillus selenitireducens、Exiguobacteriumsibiricum、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus salivarius、Microscilla marina、Burkholderiales bacterium、Polaromonasnaphthalenivorans、Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、Cyanothece sp.、Microcystis aeruginosa、Synechococcus sp.、Acetohalobium arabaticum、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatusdesulforudis、Clostridium botulinum、Clostridium difficle、Finegoldia magna、Natranaerobius thermophilus、Pelotomaculumthermopropionicum、Acidithiobacillus caldus、Acidithiobacillus ferrooxidans、Allochromatiumvinosum、Marinobacter sp.、Nitrosococcushalophilus、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacterracemifer、Methanohalobium evestigatum、Anabaena variabilis、Nodularia spumigena、Nostoc sp.、Arthrospira maxima、Arthrospira platensis、Arthrospirasp.、Lyngbya sp.、Microcoleus chthonoplastes、Oscillatoria sp.、Petrotoga mobilis、Thermosipho africanus、またはAcaryochlorismarina、Psuedomona aeruginosa、Escherichiacoli。または、配列が決定された他の細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物も、本明細書に記載の実施形態において利用されるＣａｓ９配列の起源となり得る。
【００５３】
野生型Streptococcus pyogenesのＣａｓ９配列は、修飾されていてもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの好ましい例は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Streptococcus pyrogenes配列と同一のヌクレオチド配列を有してよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種（例えば他のStreptococcus species）に由来する配列でもよい。当該他のStreptococcusspeciesとしては、Thermophilus; Psuedomona aeruginosa、Escherichia coli、または他の配列が決まった細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物が挙げられる。あるいは、野生型Streptococcus pyrogenes のＣａｓ９配列は修飾されてもよい。核酸配列は、哺乳動物細胞における能率的な発現のために、コドン最適化（つまり、「ヒト化」）されていてよい。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、以下のＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号である発現ベクターのいずれかによってコードされている、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列であってもよい：ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５。別の場合として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、市販のベクター（例えば、Addgene(Cambridge, MA)製のＰＸ３３０またはＰＸ２６０など）内に含まれる配列であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、以下のいずれかのＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列の、バリアントまたはフラグメントであるアミノ酸配列を有してもよい：ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５。または、ＰＸ３３０もしくはＰＸ２６０（Addgene, Cambridge, MA）のＣａｓ９アミノ酸配列の、バリアントまたはフラグメントであるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５４】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は変異配列でありうる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストランド特異的切断に関与している、保存されたＨＮＨおよびＲｕｖＣドメイン内で変異可能である。他の例では、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸塩からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）が、一本鎖切断を得るためにＤＮＡを切断するよりも切れ目を入れることを許容し、そしてその後のＨＤＲを通じた優先的修理は、オフターゲットの二本鎖の切断からの不要なインデル変異の頻度を潜在的に減らすことができる。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物学的に活性なバリアントをコードしているように、修飾されてもよい。これらのバリアントは、例えば、１つ以上の変異（例えば、付加変異、欠失変異、もしくは置換変異、またはそのような変異の組み合わせ）を含むという点で、野生型Ｃａｓ９とは異なっているアミノ酸配列を有していてもよいし、または含んでいてもよい。１つ以上の置換変異は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）であってもよい。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して、少なくとも５０％または約５０％の配列同一性（例えば、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有していてもよい。保存的アミノ酸置換は、一般的に、以下の群の中における置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。Ｃａｓ９アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基であってもよい。天然アミノ酸残基は、遺伝暗号によって天然にコードされたものに加えて、標準的でないアミノ酸（例えば、Ｌ型ではなくＤ型のアミノ酸）も含む。本発明のペプチドは、標準的な残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基も含んでもよい（例えば、ピロリジンをリジンの代わりに使用してもよく、セレノシステインをシステインの代わりに使用してもよい）。非天然アミノ酸残基は、天然に存在しないが、アミノ酸の基本式に合致するものであり、ペプチドに組み込まれることができる。これらには、Ｄ−アロイソロイシン（（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル吉草酸）およびＬ−シクロペンチルグリシン（（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸）が含まれる。他の例は、教科書またはワールドワイドウェブで調べることができる（現在カリフォルニア工科大学が運営しているサイトでは、機能タンパク質に正常に組み込まれた非天然アミノ酸の構造が公開されている）。
ガイドＲＮＡ配列：本発明の組成物および方法は、ＨＩＶにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードしている配列を含んでもよい。ＨＩＶの遺伝的変異は、すでに記載した複数のグループおよびサブタイプにおいて反映される。ＨＩＶ配列のコレクションは、ロスアラモスＨＩＶデータベースおよび一覧表（つまり、配列データベースウェブサイト：hitp://www.hiv.lani.gov）にまとめられている。本発明の方法および組成物は、上述の様々なグループ、サブタイプ、および組み換え流行株のうち、任意のＨＩＶに適用可能である。これらには、例えば、ＨＩＶ−１メジャーグループ（グループＭとも称される）およびマイナーグループ（グループＮ、０、およびＰ）、さらに、以下の任意のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、および、Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＨＩＶのグループ（例えば、以下の任意のグループＮ、０、およびＰがあるが、これらに限定されない）も挙げられる。
【００５５】
ガイドＲＮＡは、コーディングまたは非コーディング配列（つまり、標的配列）に好意的な配列(sequence complimentary to)であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ＨＩＶの長い末端反復（ＬＴＲ）領域に相補的な配列であってもよい。
【００５６】
実施例の項に記載した実験は、Ｔリンパ細胞および一次ヒト細胞を本発明のＣａｓ９およびｇＲＮＡ組成物で処置することで、組み込まれたＨＩＶ‐１プロウイルスを、もっとも一般的にはプロウイルスゲノムを根絶することによって、不活性化することを示す。全ゲノムシーケンシングと包括的なバイオインフォマティクス分析から、通常の宿主ＤＮＡに対する遺伝毒性が除かれたとの結果を得た。
【００５７】
したがって、本発明は、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に用いられる組成物を含む。上記組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的な少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む。本発明はまた、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＨＩＶのＤＮＡを不活性化する方法を含む。上記方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的な少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む、組成物で、当該宿主細胞を処置する工程を含む。上記組成物および上記方法の両方に対して、好ましいｇＲＮＡとしてｇＲＮＡ  ＡやｇＲＮＡ  Ｂが挙げられ、あるいは、もっとも好ましいものとして、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせが挙げられる。
【００５８】
ｇＲＮＡは、約２０塩基対（ｂｐ）の特有の標的配列（「スペーサー」と称する）を含む成熟ｃｒＲＮＡと、前ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ介在処理用のガイドとして働くトランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含みうる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補配列（「プロトスペーサー」としても知られる）間の相補塩基対を介して、Ｃａｓ９を当該標的ＤＮＡへ誘導する。本発明では、上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現してもよいし、合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して１つの人工融合ｇＲＮＡに加工して天然のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を真似てもよい。そのようなｇＲＮＡは、合成してもよいし、インビトロで転写して直接ＲＮＡトランスフェクションを行ってもよいし、例えば、Ｕ６またはＨ１にプロモートされるＲＮＡ発現ベクターから発現してもよい。ｇＲＮＡが標的ＤＮＡ配列に相補的であると記載される場合、当該標的ＤＮＡ配列に実際に相補的であるのは当該ｇＲＮＡのスペーサー配列であると理解されたい。
【００５９】
ひとたびｇＲＮＡによって標的配列にガイドされると、Ｃａｓ９はトリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識して切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定する。
【００６０】
ＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）領域は、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域に細分される。ＬＴＲは遺伝子発現に必要なシグナルをすべて含んでおり、宿主細胞のゲノム内へのプロウイルスの組み込みに関与している。例えば、基本プロモーターまたはコアプロモーター、コアエンハンサー、および調節領域がＵ３内にあり、転写促進反応因子がＲ内にある。ＨＩＶ−１において、Ｕ５領域はいくつかのサブ領域、例えば、転写活性化に関与するＴＡＲまたはトランス作用反応因子や、二量化およびゲノムパッケージングに関与するＰｏｌｙＡや、ＰＢＳまたはプライマー結合部位や、Ｐｓｉまたはパッケージングシグナルや、ＤＩＳまたは二量体開始部位を含む。
【００６１】
本発明の好ましいｇＲＮＡは、ＨＩＶ−１ＬＴＲのＵ３領域中の標的配列にそれぞれ相補的である。ｇＲＮＡ  Ａは、２つの標的配列
AGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTT（配列番号１）または
ATCAGATATCCACTGACCTT（配列番号２）
のどちらかに相補的な任意のｇＲＮＡでよい。
【００６２】
ｇＲＮＡ  Ｂは、２つの標的配列
AGCTCGATGTCAGCAGTTCTTGAAGTACTC（配列番号３）または
CAGCAGTTCTTGAAGTACTC （配列番号４）
のどちらかに相補的な任意のｇＲＮＡでよい。
【００６３】
配列番号１および３は３０ｂｐのｇＲＮＡであり、実施例の項で詳述される実験で用いられ、リンパ球宿主細胞中でのｇＲＮＡの安定的な発現が達成された。配列番号２および４は省略された２０ｂｐのｇＲＮＡであり、レンチウイルスベクターの構築に用いられた。本発明のｇＲＮＡはまた、ＨＩＶ−１のＬＴＲの一方の側のＰＡＭ配列を含みうる。ただし、ＰＡＭ配列は、実施例で報告したｇＲＮＡには含まれない。ＰＡＭ配列を含む例示的なｇＲＮＡ  Ａは、AGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTTTGG（配列番号５）である。ＰＡＭ配列を含む例示的なｇＲＮＡ  Ｂは、AGCTCGATGTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG（配列番号６）である。
【００６４】
本発明のｇＲＮＡ配列は、標的配列のセンスまたはアンチセンス鎖のどちらかに相補的でありうる。それらは、標的配列に相補的な、または、相補的でない、さらなる５’および／または３’配列を含みうる。それらは、標的配列に対して１００％未満相補的、例えば７５％相補的でありうる。ｇＲＮＡ配列は、１つ以上の異なる配列の組み合わせ、例えば多重配列として用いうる。多重配列としては、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上の異なるガイドＲＮＡの組み合わせを挙げることができる。実施例１および２で開示された実験において、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの両方を用いる二重の「二か所の切断（two cut）」法は、ウイルスの不活性化およびＨＩＶ−１の２つのＬＴＲそれぞれにおけるＣａｓ９によって誘導された切断間の配列の根絶に特に効果的だとわかった。
【００６５】
（改変された核酸配列または突然変異した核酸配列）
いくつかの実施形態において、核酸配列はいずれも、ネイティブな核酸配列から（例えば、突然変異、欠失、置換、核酸塩基の改変、骨格の改変などによって）改変または誘導され得る。核酸配列は、ベクター、遺伝子編集剤、ｇＲＮＡなどを含んでいる。本発明で想像されるいくつかの改変された核酸配列の例は、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖内結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖内結合）を含有する改変された核酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、改変されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を備えるもの、およびヘテロ原子骨格、CH2--NH--O--CH2、CH、--N(CH3)--O--CH2 [メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2およびO--N(CH3)--CH2--CH2骨格（ここで、ネイティブなホスホジエステル骨格はO--P--O--CHと表される）を備えるものを含んでいる。De Mesmaeker etal. Acc. Chem. Res. 1995, 28:366-374によって開示されているアミド骨格も、本書において具体化される。いくつかの実施形態において、モルホリノ骨格構造を有する核酸配列（Summerton and Weller, U.S. Pat. No. 5,034,506）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格に置き換えられており、核酸塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している）を有する核酸配列（Nielsen et al. Science 1991, 254, 1497）。核酸配列はまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。核酸配列はまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチル等の糖疑似体を有し得る。
【００６６】
核酸配列はまた、追加的に、または代替的に、核酸塩基（しばしば当該分野において単に「塩基」と呼ばれる）の改変または置換を含み得る。本書において使用されるとき、「改変されていない」または「天然の」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含んでいる。改変された核酸塩基は、天然の核酸において稀にまたは一過的にしか見出されない核酸塩基（例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン（特には５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、しばしば当該分野において５−Ｍｅ−Ｃとも呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ）、ならびに合成核酸塩基（例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニンおよび２，６−ジアミノプリン））を含んでいる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co.,SanFrancisco, 1980, pp75-77; Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res. 1987,15:4513。当該分野で知られている「遍在的な」塩基（例えば、イノシン）も含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Researchand Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。
【００６７】
本発明の核酸配列の別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性または細胞吸収を向上させる１つ以上の部分または共役を、核酸配列と化学結合させることを含む。そのような部分としては、脂質部分（コレステロール部分、コレステリル部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1994, 4, 1053）等）、チオエステル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306；Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533））、脂肪鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111；Kabanov et al. FEBS Lett. 1990, 259, 327；Svinarchuket al. Biochimie 1993, 75, 49））、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−rac−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート（Manoharan et al.Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651；Shea et al. Nucl.Acids Res. 1990, 18, 3777））、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharanet al. Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651）が挙げられるが、これらに限定されない。所定の核酸配列における全ての位置について均一に改変されている必要はなく、実際、２つ以上の前述の改変が１つの核酸配列中に組み込まれていてもよいし、核酸配列内の１つのヌクレオシド内において組み込まれていてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、１つ以上の改変された核酸塩基を含むよう操作される。例えば、ＲＮＡ分子の公知の改変は、例えば、Genes VI, Chapter 9 (“Interpreting the Genetic Code”), Lewis,ed.(1997, Oxford University Press, New York)、およびModificationand Editing of RNA, Grosjean and Benne, eds. (1998, ASM Press, Washington DC)において見出すことができる。改変されたＲＮＡ成分としては、以下が挙げられる：２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４−２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；５−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−ホルミルシチジン；２’−Ｏ−メチル−５−ホルマイルシチジン；３−メチルシチジン；２−チオシチジン；リシジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；４−チオウリジン；リボシルチミン；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メトキシウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；５−カルボキシメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−チオウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２’−メチルアデノシン；２−メチルアデノシン；Ｎ６Ｎメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；２メチルチオ−Ｎ６Ｎイソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；Ｎ６−（グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）；イノシン；２’Ｏ−メチルイノシン；１−メチルイノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）；７−メチルグアノシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；ワイオシン；メチルワイオシン；修飾中ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；クエオシン；エポキシクエオシン；ガラクトシル−クエオシン；マンノシル−クエオシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アラカエオシン［７−ホルムアミド−７−デアザグアノシンとも呼ばれる］；および７−アミノメチル−７−デアザグアノシン。
【００６９】
本発明の単離された核酸分子は、標準的な技術によって作製することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が、本書に記載されているヌクレオチド配列を含んでいる単離された核酸を得るために使用され得る。様々なＰＣＲ法が、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。概して、対象領域の末端またはその先の領域の配列情報を用いて、増幅すべきテンプレートの逆側の鎖と配列が同一または類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。様々なＰＣＲ戦略も利用することができ、これによって、部位特異的ヌクレオチド配列修飾をテンプレート核酸に導入できる。
【００７０】
単離核酸は、１つの核酸分子として化学合成されてもよいし（例えば、ホスホラミダイト法を用いた、３’から５’方向の自動ＤＮＡ合成を用いて）、または一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成されてもよい。例えば、１つ以上の長鎖オリゴヌクレオチド対（例えば、５０超〜１００ヌクレオチド）を、目的の配列を有するように合成してもよい。上記合成においては、それぞれのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングされたときに二本鎖となる領域を形成するような、相補的な短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を有している。ＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドの伸長に使用され、その結果、各オリゴヌクレオチド対につき１つの二本鎖核酸分子が得られる。そして、この二本鎖核酸分子は、ベクター内にライゲーションされ得る。
【００７１】
２つの核酸またはそれらがコードしているポリペプチドは、互いにある程度の同一性を有するものとして記載され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびその生物活性を有するバリアントは、ある程度の同一性を示すものとして記載され得る。短いＣａｓ９配列をProtein Information Research（ＰＩＲ）のサイト（pir.georgetown.edu）に入力すれば、アラインメントを組み立てられる。続けて、ＮＣＢＩのウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/blast）で、Basic LocalAlignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）のアルゴリズム"short nearlyidentical sequences"を用いて分析を行うことができる。
【００７２】
Ｃａｓ９とのパーセント配列同一性を判定することが可能である。特定されたバリアントは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとして利用されてもよいし、および／または、その薬学的組成物としての有効性を分析されてもよい。天然のＣａｓ９をクエリ配列とし、Ｃａｓ９タンパク質のフラグメントを対象配列としてもよい。同様に、Ｃａｓ９タンパク質のフラグメントをクエリ配列とし、その生物活性を有するバリアントを対象配列としてもよい。配列同一性を判定するために、クエリ核酸配列またはクエリアミノ酸配列を、コンピュータプログラムClustalW（バージョン１．８３、標準のパラメータ）を用いて、それぞれ１つ以上の対象核酸配列または対象アミノ酸配列と整列させてもよい。これにより、核酸配列またはタンパク質配列の全長にわたるアラインメントが得られる（グローバル・アラインメント）。Chenna et al., Nucleic Acids Res. 31:3497-3500, 2003を参照せよ。
【００７３】
組み換えコンストラクトおよび送達ビヒクル：薬学的組成物に含まれる発現ベクターの例としては、プラスミドベクターやレンチウイルスベクターが挙げられるが、本発明はこれらのベクターに限定されるものではない。広範囲な宿主／発現ベクターの組み合わせを用いて、本明細書に記載する核酸配列を発現してよい。適切な発現ベクターとしては、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルス由来のプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられるが、それらに限定されるものではない。Novagen (Madison, WI)、Clontech (Palo Alto,CA)、Stratagene (La Jolla, CA)、および Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA)のような企業から、さまざまなベクターおよび発現システムが販売されている。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選別が可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）に対する抵抗性などの、殺生物剤抵抗性を与えることができる。発現ベクターは、発現するポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計された、タグ配列を含んでもよい。タグ配列（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）配列など）は、一般的に、コードされているポリペプチドと融合した状態で発現する。そのようなタグは、ポリペプチド中のどの場所に挿入されてもよい（カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかをも含む）。ベクターは、複製開始点、足場付着領域（ＳＡＲ）、調節領域なども含んでもよい。「調節領域」という用語は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写産物または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を意味する。調節領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導要素、タンパク質結合配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、およびイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。「操作可能に結合している」という用語は、調節領域および転写される配列が、当該配列が配列の転写または翻訳に影響を及ぼすように、核酸中に位置していることを意味する。例えば、コーディング配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始点は、一般的に、プロモーターから１〜約５０ヌクレオチドだけ下流に位置する。しかしながら、プロモーターは翻訳開始点から約５，０００ヌクレオチドも上流に位置してもよく、または、転写開始点から約２，０００ヌクレオチドも上流に位置してもよい。プロモーターは、一般的に、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターは、少なくとも１つの制御要素（エンハンサー配列、上流要素、または上流活性化領域（ＵＡＲ）など）も含み得る。含まれるプロモーターは、いくつかの要因に合わせて選択される。当該要因としては、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、ならびに細胞または組織優先的な発現が挙げられるが、これらに��定されない。コーディング配列に関連するプロモーターおよび他の調節領域を、適宜選択および配置することによりコーディング配列の発現を調節することは、当業者にとっては通常の事項である。
【００７４】
必要に応じて、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ送達ビヒクル（カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなど）と共に使用されてもよい。リポソームの調製、標的化、および内容物の送達の手順としては、Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques,6:682 (1988)を参照。また、Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989)およびMaurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)も参照。
【００７５】
実施例の項に記載された実験において、レンチウイルスベクターは、本発明のＣａｓ９およびｇＲＮＡをヒトＴリンパ球株内に発現するのに効果的であることが判明した。また、レンチウイルスベクターは、本発明のＣａｓ９およびｇＲＮＡをヒトＴ細胞（ＨＩＶ‐１＋患者に由来するＴ細胞を含む）の１次培養内に発現するのに効果的であることが初めて判明した。ＨＩＶ＋患者に由来する１次Ｔ細胞において、レンチウイルスで送達されたＣａｓ９およびｇＲＮＡのＡとＢの複合的な発現により、ウイルスのコピー数とウイルスのタンパク質発現とが大幅に減った。このことは、従来の遺伝子編集技術に対して、ＨＩＶ＋患者の治療が決定的に前進したことを示す。
【００７６】
したがって、本発明は、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化するレンチウイルスベクター組成物を含む。上記組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡのＬＴＲ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離核酸と、を含み、上記複数の単離核酸は少なくとも１つのレンチウイルス発現ベクターに含まれている。上記レンチウイルス発現ベクターは、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡの宿主細胞中での発現を誘導する。
【００７７】
上記単離核酸のすべてを単一のレンチウイルス発現ベクターに含ませてもよく、あるいは上記核酸はレンチウイルスベクターの任意の適切な組み合わせに細分してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを第１のレンチウイルス発現ベクターに含ませることができ、第１のｇＲＮＡを第２のレンチウイルス発現ベクターに含ませることができ、第２のｇＲＮＡを第３のレンチウイルス発現ベクターに含ませることができる。複数の発現ベクターが用いられる場合、それらのすべてがレンチウイルスベクターである必要はない。
【００７８】
実施例２の結果も、エクスビボ培地中の潜伏感染Ｔ細胞を本発明のＣａｓ９およびｇＲＮＡ組成物に暴露することの効用を実証する。ｇＲＮＡ  ＡおよびｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせは、組み込みＨＩＶプロウイルスＤＮＡを最適に根絶することがわかった。この能力の１つの使用法は養子療法であって、患者のＨＩＶ感染細胞を本発明の組成物とともにエクスビボ培養し、ＨＩＶ除去細胞を患者に戻すものである。
【００７９】
本明細書では組み換えコンストラクトも提供され、細胞を形質転換するために用いることができる。組み換え核酸コンストラクトは、Ｃａｓ９をコードする核酸、および／または、本明細書に記載したＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸を含み、上記Ｃａｓ９および／または細胞内のＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現するのに適した調節領域に動作可能に結合している。多数の核酸により、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得ることが、理解されるであろう。遺伝コードの縮重が、当該技術分野でよく知られている。多くのアミノ酸では、１つより多いヌクレオチド・トリプレットが、アミノ酸のコドンとして機能している。例えば、特定の生物において最適な発現が得られるように、その生物にとって適切なコドンバイアス表を用いて、Ｃａｓ９をコードしている配列中のコドンを変更してもよい。
【００８０】
インビトロ系（培養細胞）およびインビボ系（動物および患者）のために、本明細書で具体化される分子と、いくつかの送達方法とを組み合わせて利用してもよい。一実施形態において、レンチウイルス性遺伝子送達システムを利用してもよい。そのようなシステムによって、幅広い親和性および大きなＤＮＡを挿入する余地を備えつつ、分裂細胞および非分裂細胞において、遺伝子が安定的に長期間存在することができる（Dull et al, J Virol, 72:8463-8471 1998）。一実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を送達方法として利用してもよい。ＡＡＶは非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスであり、インビトロ系およびインビボ系における治療的遺伝子の送達に、近年積極的に採用されている（Choi et al, Curr Gene Ther, 5:299-310, 2005）。
【００８１】
本明細書で具体化されたポリヌクレオチドのいずれかのインビトロ発現またはインビボ発現用のベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスＡｄ、ＡＡＶ、レンチウイルス、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびレトロウイルスなど）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびにポリヌクレオチドの宿主細胞への送達を媒介できる他の高分子複合体、が挙げられる。ベクターは、他の要素または機能性も備えてもよい。当該他の要素または機能性としては、（i）遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節するもの、または（ii）その他の有益な性質を標的細胞に与えるもの、が挙げられる。下記に詳細に記載・説明する通り、そのような他の要素としては、例えば、細胞に対する結合または標的化に影響を及ぼす要素（細胞型または組織特異的な結合を媒介する要素を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす要素；取り込み後、細胞内におけるポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす要素（核局在化を媒介する薬剤など）；および、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす要素、が挙げられる。そのような要素としてはまた、マーカーも含まれ得る。このようなマーカーには、ベクターによって送達された核酸を取り込み発現している細胞の検出または選別に使用できる、検出可能および／または選別可能なマーカーが挙げられる。上記の要素はベクターに本来備わっている性質として得られてもよく（結合および取り込みを媒介する要素または機能性を有する、特定のウイルスベクターの使用など）、または、上記の機能性が得られるようにベクターを修飾してもよい。他のベクターとしては、Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)に記載のものが挙げられる。そのようなベクターは、様々な種類が当該技術分野で知られており、一般的に入手可能である。「組み換えウイルスベクター」とは、１つ以上の異種遺伝子産物または配列を含んでいる、ウイルスベクターを意味する。多くのウイルスベクターは格納物に関して大きさの制約があるので、異種遺伝子産物または配列は、一般的に、ウイルスゲノムの１つ以上の部分を置換することによって導入される。そのようなウイルスは複製欠損性であることがあり、ウイルス複製およびカプシド形成に際して、欠失した機能をトランスに提供される必要がある（例えば、複製および／またはカプシド形成に必要な遺伝子産物を輸送する、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を用いて）。送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側に配置されている、改変ウイルスベクターも記載されている（例えば、Curiel, D T, et al. PNAS 88: 8850-8854, 1991を参照）。いくつかの実施形態では、上記ベクターは複製欠損性ベクターである。複製欠損性組み換えアデノウイルスベクターは、公知の技術によって作製することができる。Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992);Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992);およびRosenfeld, et al., Cell, 68:143-155 (1992)を参照。
【００８２】
また、発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ配列のセグメント、非染色体ＤＮＡ配列のセグメント、および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含んでもよい。好適なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌性プラスミドの誘導体（例えば、E. coliプラスミドであるｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド）；ファージＤＮＡ（例えば、ファージ１の多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９）、および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３）、および線維状一本鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（２μプラスミドなど）またはその誘導体、真核細胞において有用なベクター（昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなど）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから得られるベクター（ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミドなど）が挙げられる。
【００８３】
さらなるベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学複合体が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、Moloneyマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶ系ウイルスが挙げられる。あるＨＩＶ系ウイルスベクターは、少なくとも２つのベクターを含み、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノムから得られ、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルスから得られる。ＤＮＡウイルスベクターとしては、ポックスベクター（orthopoxベクターまたはavipoxベクターなど）、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクターなど）［Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al.,in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, OxfordEngland) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603(1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)］、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al.,Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004(1995)］、およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M.G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)］がある。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、発現産物を細胞内に生成できる一本鎖ＤＮＡ産生ベクターである。例えば、Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)を参照されたい。当該文献は参照によってその全文が本明細書に援用される。
【００８５】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ送達ビヒクル（カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなど）と共に使用されてもよい。リポソームの調製、標的化、および内容物の送達の手順としては、Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques,6:682 (1988)を参照。また、Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989)およびMaurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)も参照。
【００８６】
本発明のある実施形態では、非ウイルスベクターを用いてトランスフェクションを行ってよい。核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション法、ヌクレオフェクション法、マイクロインジェクション法、バイオリスティック法、ウイロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸共役、そのままのＤＮＡ、人工ビリオン、薬剤によるＤＮＡの取り込み強化が挙げられる。リポフェクション法は、例えば、合衆国特許番号５、０４９、３８６号、４、９４６、７８７号、および４、８９７、３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、TransfectamやLipofectin）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質は、Jesseeに付与された合衆国特許番号７、１６６、２９８号またはJesseに付与された合衆国特許番号６、８９０、５５４号に記載されており、そのそれぞれの内容が、参照によって援用される。送達は、細胞に対するものでもよいし（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）、標的組織に対するものでもよい（例えば、インビボ投与）。
【００８７】
合成ベクターは通常、カチオン性脂質またはポリマーに基づいている。当該カチオン性脂質またはポリマーは、マイナスに帯電した核酸と複合して、直径１００ｎｍのオーダーの粒子を形成する。上記複合体は、ヌクレアーゼによる分解から核酸を守る。さらに、細胞およびローカル送達方法は、適切な亜細胞コンパートメントにおける内在化、放出、および分配の必要性に対処しなければならない。全身性送達方法にはさらなるハードルがある。例えば、カチオン性送達ビヒクルの、血液構成成分との強力な相互作用や、細網内皮系による摂取や、腎臓による濾過や、対象の細胞に対するキャリアの毒性および標的能力である。カチオン性非ウイルスの表面を修飾することは、血液構成成分との相互作用を最小にし、細網内皮系による摂取を減らし、その毒性を減少させ、標的細胞との結合親和性を増すことができる。プラズマタンパク質の結合（オプソニン化とも呼ばれる）は、循環するナノ粒子をＲＥＳが認識する主要なメカニズムである。例えば、マクロファージ（肝臓のクッパー細胞など）は、スカベンジャー受容体を介して、オプソニン化ナノ粒子を認識する。
【００８８】
本発明の核酸配列は、被検体の適切な細胞へと送達され得る。これは、例えば、食細胞（マクロファージなど）による食作用に最適な大きさの、重合体送達ビヒクル、生分解性微粒子送達ビヒクル、またはマイクロカプセル送達ビヒクルを用いることで達成され得る。例えば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微粒子が使用され得る。ポリヌクレオチドはこれら微粒子内に格納され、マクロファージによって取り込まれて、細胞内で徐々に生分解される。これによって、ポリヌクレオチドが放出される。ポリヌクレオチドが放出されると、細胞内でＤＮＡが発現する。第２の種類の微粒子は細胞によって直接取り込まれず、主に核酸の徐放性保有体として機能する。上記核酸は、生分解を通じて微粒子から放出されたときのみ、細胞によって取り込まれる。したがって、これらの重合体粒子は、食作用を妨げるために、十分な大きさであるべきである（すなわち、５μｍより大きく、好ましくは２０μｍより大きい）。核酸を能動的に取り込む別の方法は、リポソーム（標準的な方法で調製される）を使用することである。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で組み込まれてもよいし、組織特異的抗体と共に組み込まれてもよい。当該組織特異的抗体としては、例えば、ＨＩＶ感染の一般的な潜伏感染保有体である細胞型（例えば、脳マクロファージ、小膠細胞、星状膠細胞、および腸関連リンパ系細胞）を標的にする抗体が挙げられる。あるいは、静電気力または共有結合力によってポリ−Ｌ−リジンに結合している、プラスミドまたは他のベクターから構成される分子複合体を調製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞の受容体に結合し得るリガンドに結合する。インビボでの発現を実現する別の手段では、「そのままのＤＮＡ」（すなわち、送達媒体を含まない）を、筋肉内、皮膚内または皮下の部位へ送達する。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／または上述したＨＩＶの標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードする配列を含む単離核酸配列をコードする。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ベクターの送達はエクソソームによって媒介されてもよい。エクソソームは、多くの細胞タイプによって放出される脂質ナノ小胞である。それらは、細胞間で核酸およびタンパク質を移送することにより細胞間コミュニケーションを媒介する。エクソソームは、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびエンドサイトーシス経路に由来するタンパク質を含む。エクソソームは、標的細胞によってエンドサイトーシス、融合、またはその両方で消化されうる。エクソソームを用いて核酸を特定の標的細胞に送達できる。
【００９０】
本発明の発現コンストラクトは、ナノクロー（Nanoclews）によって送達することもできる。ナノクローは繭状のＤＮＡナノ混合物である（Sun, et al., J. Am. Chem. Soc. 2014,136:14722-14725）。ナノクローは核酸を積んで、標的細胞によって消化されたり標的細胞の細胞質内へ放出されたりすることができる。ナノクローをコンストラクトし、それらに積み、放出分子を設計する方法は、Sun, et al. (Sun W, et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136:14722-14725;Sun W, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2015: 12029-12033.)に記載されている。
【００９１】
核酸およびベクターは、器具（例えば、カテーテル）の表面に適用されてもよく、またはポンプ、パッチ、または他の薬物送達装置内に含まれていてもよい。本明細書に記載の核酸およびベクターは単独で投与されてもよいし、薬学的に許容できる賦形剤または担体（例えば、生理的食塩水）の存在下において混合物として投与されてもよい。賦形剤または担体は、投与の方法および経路に基づいて選択される。好適な薬学的担体は、医薬製剤における使用のための医薬必需品と共に、当該分野においてよく知られた参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)およびUSP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formulary)に記載されている。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態では、リポソームを用いて細胞または組織へのトランスフェクションを行う。核酸のリポソーム製剤の薬理学的特性は、核酸がリポソーム二重層内に封入される程度によって主に決定される。封入された核酸は、ヌクレアーゼによる劣化から守られ、一方、リポソームの表面に単に結合しているだけのものは守られない。封入された核酸は、完全なリポソームによる延長された循環寿命と生体内分布を有するが、一方、表面に結合したものは、ひとたびリポソームから離れると、むき出しの核酸の薬理学的特性を有する。核酸は、従来のパッシブローディング（passive loading）の技術（例えば、エタノールドロップ法（ＳＡＬＰの場合）、逆相蒸着法、エタノール希釈法（ＳＮＡＬＰの場合））でリポソーム内に閉じ込めてよい。
【００９３】
リポソーム送達システムは、安定した製剤、改善された薬物動態学、および組織に対するある程度「受動的」または「生理学的」ターゲッティングを提供する。親水性物質および疎水性物質（例えば、化学療法をなしうる物質）を封入することが知られている。例えば、合衆国特許番号５、４６６、４６８号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ。合成脂質を含む、非経口で投与可能なリポソーム製剤を開示）や、合衆国特許番号５、５８０、５７１号（Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．。リン脂質に共役結合したヌクレオシドの類縁物質を開示）や、合衆国特許番号５、６２６、８６９号（Ｎｙｑｖｉｓｔ。薬学的活性部分がヘパリンまたはその断片である薬学的組成物であって、当該ヘパリンまたはその断片は、少なくとも１つの両親媒性および有極性の脂質化合物および少なくとも１つの無極性の脂質化合物とを含む特定の脂質システム中に含まれている、薬学的組成物を開示）を参照されたい。
【００９４】
リポソームおよびポリマーソームは、複数の溶液および化合物を含みうる。ある実施形態では、本発明の複合体は、ポリマーソームに結合しているか、ポリマーソーム中に封入されている。人工小胞の１つの集団として、ポリマーソームは溶液を含む小さな空洞の球であり、両親媒性合成ブロックコポリマーを用いて小胞膜を形成して生成されている。一般的なポリマーソームは、そのコアに水溶液を含み、傷つきやすい分子（例えば、薬品、酵素、他のタンパク質およびペプチド、ＤＮＡ断片およびＲＮＡ断片）を封入し守るのに役に立つ。ポリマーソーム膜は、封入した物質を外部の物質（例えば生体系にある物質）から単離する物理的な障壁を提供する。ポリマーソームは、周知の技術によって二重エマルションから生成できる。Lorenceau et al., 2005, Generation of Polymerosomes fromDouble-Emulsions, Langmuir 21(20):9183-6を参照されたい。当該文献は、引用により本明細書に援用される。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態において、非ウイルスベクターを修飾して、目標とする送達およびトランスフェクションを達成する。ＰＥＧ化（すなわち、表面をポリエチレングリコールで修飾すること）は、非ウイルスベクターのオプソニン化および凝固を減らし、細網内皮系による除去を最小にするのに用いられる主な方法であり、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の循環寿命が延長される。したがって、ＰＥＧ化されたナノ粒子は、「見えない」ナノ粒子としばしば呼ばれる。血液循環からすぐには除去されないナノ粒子は、感染細胞と遭遇する機会があるであろう。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態では、組織の特異な環境および外部の刺激に対応する、狙いを定めた制御放出システムが用いられる。金のナノロッドは、近赤外領域で強い吸収バンドを有し、吸収された光エネルギーはそれから金のナノロッドによって熱に変換される。いわゆる「光熱効果」である。近赤外線光は組織に深く浸透できるので、金のナノロッドの表面を核酸で修飾して制御された放出を行うことができる。修飾された金のナノロッドが近赤外線光で照射されると、光熱効果によって誘発された熱変性により、核酸が放出される。放出される核酸の量は、光照射のパワーと露出時間によって決まる。
【００９７】
組成物が核酸として投与されるかポリペプチドとして投与されるかに関わらず、組成物は、哺乳動物細胞による取り込みを促進するように製剤される。有用なベクターシステムおよび製剤は、上述したとおりである。いくつかの実施形態において、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、他のＤＮＡ送達方法（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、およびペルフルオロ薬液を使用した化学的トランスフェクションなど）も考えられる。同様に、物理的送達方法（エレクトロポーション法、マイクロインジェクション、弾道粒子、および「遺伝子銃」システムなど）も考えられる。
【００９８】
他の実施形態において、組成物は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベクターおよびｇＲＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクションされた細胞を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、エクスビボで適用することができる。つまり、被検体の細胞を体から取り出し、培養中に組成物で処置して、例えばＨＩＶ配列を切除し、処置された細胞を上記被検体の体に戻してもよい。細胞は、被検体の細胞であってもよく、または、ハプロタイプ適合細胞または細胞株であってもよい。複製を防止するために、細胞に放射線を照射してもよい。いくつかの実施形態において、細胞はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合細胞、自家移植細胞、細胞株、またはそれらの組み合わせである。他の実施形態において、細胞は幹細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞または人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））が挙げられる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多数の動物種から確立されてきた。これらの種類の多能性幹細胞は、再生医療用の細胞の、最も有用な供給源と考えられる。なぜなら、これらの細胞は、その多能性を保有しつつ活発に分裂する能力を維持しながら、適切な分化誘導によって、ほとんど全ての器官へと分化可能であるからである。特にｉＰＳ細胞は、自己由来の体細胞から確立することができる。したがって、胚を破壊することによって作製されるＥＳ細胞と比較して、倫理的および社会的問題を引き起こす可能性が低い。さらに、ｉＰＳ細胞は自己由来の細胞であるので、再生医療または移植療法において最大の障害となる、拒絶反応を回避することが可能になる。
【００９９】
形質導入された細胞が、確立された方法に従って再注入のために調製される。約２〜４週間の培養期間の後、細胞は１×１０６から１×１０１０の間の数になり得る。この点については、細胞の増殖特性は、患者間および細胞の種類間で変わる。形質導入された細胞の再注入前の約７２時間、表現型の分析および治療剤を発現している細胞のパーセンテージの分析のために一部が採取される。投与については、本発明の細胞は、細胞型のＬＤ５０ならびに患者の体重および全体的な健康に適用されるときの様々な濃度における細胞型の副作用によって決定される割合にて投与され得る。投与は１回投与または分割投与を介して達成され得る。成体幹細胞は、それらの産生を刺激し組織または空隙（骨髄または脂肪組織が挙げられるが、これらに限定されない）から出る、外因的に投与される因子を用いて集められてもよい。
【０１００】
したがって、本発明は、ＨＩＶに潜伏感染したエクスビボ培養された宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを取り除く方法を含む。プロウイルスＨＩＶのＤＮＡは宿主細胞ゲノムに組み込まれている。当該方法は、ＨＩＶに潜伏感染した宿主細胞の集団を得る工程と、上記宿主細胞をエクスビボで培養する工程と、上記宿主細胞を、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、上記プロウイルスＨＩＶのＤＮＡのＬＴＲ中の標的配列に相補的な少なくとも１つのｇＲＮＡとを含む組成物で処置する工程と、上記プロウイルスＤＮＡを上記宿主細胞ゲノムから取り除く工程と、を含む。同じ方法の工程は、次に示す追加の工程を加えるならば、潜伏感染した宿主細胞集団のドナーを処置するのにも有用である。当該追加の工程とは、ＨＩＶ除去済みＴ細胞集団を産生する工程と、上記ＨＩＶ除去済みＴ細胞集団を患者に注入する工程と、上記患者を処置する工程である。
【０１０１】
実施例の項に記載される、上述したレンチウイルス送達システムは、患者のＴ細胞または他の潜伏感染宿主細胞中のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡのエクスビボ形質導入に好ましいシステムである。あるいは、任意の適切な表現ベクターシステムを用いることができる。そうした任意の適切な表現ベクターシステムとしては、先に挙げたものがあるが、それらに限定されない。
【０１０２】
潜伏感染Ｔ細胞のエクスビボ処置に効果的だと証明された組成物及び方法は、１つ以上の適切な表現ベクターによって送達されるならば、インビボでも効果的である可能性が非常に高い。したがって、本発明は、哺乳類の被検体の細胞中に組み込まれたＨＩＶのＤＮＡの不活性化のための薬学的組成物であって、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、プロウイルスＨＩＶのＤＮＡのＬＴＲ中の標的配列に相補的な少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、を含む薬学的組成物を含む。好ましくは、ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂの組み合わせが含まれる。上記薬学的組成物は、上記各単離核酸配列がコードされる少なくとも１つの発現ベクターも含むことも好ましい。
【０１０３】
本発明は、ＨＩＶに感染した哺乳類の被検体を処置する方法であって、哺乳類の被検体がＨＩＶに感染していると判定する工程と、上記被検体に、上述の薬学的組成物を有効量、投与する工程と、上記被検体に対し、ＨＩＶ感染の処置を行う工程と、を含む方法も含む。
【０１０４】
本発明に係る薬学的組成物は、当業者に周知のさまざまな方法で調製できる。例えば、上述した核酸およびベクターは、組織培地中の細胞に適用する、または患者または被験体に投与する組成物中で調製できる。これらの組成物は、薬学分野で周知の方法で調製でき、局所的治療と全身治療のいずれが望まれるかに応じて、さらに治療される部位に応じて、様々な経路で投与することができる。投与としては、局所投与（点眼および粘膜（鼻腔、膣、および直腸を含む）への送達を含む）、肺内投与（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送（噴霧器によるものを含む）による；気管内、鼻腔内、表皮、および経皮）、点眼投与、経口投与、または非経口投与が挙げられる。目への送達方法としては、（i）局所投与（点眼）、（ii）結膜下、眼周囲もしくは硝子体内への注射、または（iii）バルーンカテーテルもしくは手術により結膜嚢に配置された眼内挿入物による導入、が挙げられる。非経口投与としては、（i）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは注入、または（ii）頭蓋内投与（例えば、クモ膜下投与またはは脳室内投与）が挙げられる。非経口投与は、単回のボーラス投与の形態で行われてもよい。または、例えば、連続潅流ポンプによって行われてもよい。局所投与用の薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴薬、座薬、スプレー、液体、粉末、などが挙げられる。従来の薬学的担体（水系、粉末系または油系の基剤、増粘剤など）が、必要であるかまたは望ましい場合がある。
【０１０５】
本発明はまた、薬学的組成物を含み、当該薬学的組成物は、本明細書に記載の核酸およびベクターを有効成分として含み、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。「薬学的に許容できる」（または「薬理学的に許容できる」）という用語は、動物またはヒトに適宜投与されたときに、有害反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を起こさない、分子的実体および組成物を意味する。本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容できる物質の媒体として使用され得る、溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤、等張性薬剤、および吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤、などのいずれかおよび全てを含む。本発明の組成物を調製する際、当該有効成分は一般的に賦形剤と混合され、（i）賦形剤によって希釈されるか、または（ii）担体（例えば、カプセル、錠剤、小袋、紙包み、またはその他の容器の形態である）の中に封入される。賦形剤が希釈剤として機能する場合、当該賦形剤は、固体、半固体、または液体（例えば、生理食塩水）であってもよく、有効成分用のビヒクル、担体、または媒体としての役割を果たす。したがって、組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ、エアロゾル（固体または液体媒体中の）、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、ならびに無菌包装粉末の形態であり得る。当該技術分野で知られている通り、希釈剤の種類は、目的とする投与経路に合わせて変わり得る。得られる組成物は、追加の薬剤（防腐剤など）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、担体は、脂質系もしくは重合体系コロイドであるか、またはこれらを含んでもよい。いくつかの実施形態において、担体物質は、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルとして製剤された、コロイドであってもよい。上述の通り、担体物質はカプセルを形成してもよく、その材料は重合体系コロイドであってもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ナノ粒子として製剤されてもよい。当該ナノ粒子は、例えば、（i）ＤＮＡと複合体を形成している、高分子量の線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）からなるコアを有し、さらに当該コアが（ii）ポリエチレングリコールによって修飾された（ＰＥＧ化された）低分子量のＬＰＥＩからなるシェルによって覆われている、ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、上記組成物は、本明細書で具現化される組成物を封入したナノ粒子として調製してよい。Ｌ‐ＰＥＩは、インビボの遺伝子をさまざまな臓器（例えば、肺、脳、膵臓、網膜、膀胱）や腫瘍に効率的に送達するのに用いられてきた。Ｌ‐ＰＥＩは、核酸をインビトロおよびインビボで効率的に濃縮し、安定させ、送達することができる。
【０１０７】
核酸およびベクターは、器具（例えば、カテーテル）の表面に適用されてもよく、またはポンプ、パッチ、または他の薬物送達装置内に含まれていてもよい。本発明の核酸およびベクターは単独で投与されてもよいし、薬学的に許容できる賦形剤または担体（例えば、生理的食塩水）の存在下において混合物として投与されてもよい。賦形剤または担体は、投与の方法および経路に基づいて選択される。好適な薬学的担体は、医薬製剤における使用のための医薬必需品と共に、当該分野においてよく知られた参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)およびUSP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formulary)に記載されている。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、組成物は、Ｃａｓ９（またはバリアントＣａｓ９）をコードしている核酸および標的ＨＩＶに相補的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列を内包している、ナノ粒子として製剤されてもよい。または、これらの要素をコードするベクターを含んでもよい。あるいは、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび本発明の核酸組成物のうち１つ以上によってコードされるポリペプチドを内包しているナノ粒子として製剤されてもよい。
【０１０９】
ＨＩＶ感染の処置法において、被検体は、標準的な臨床テストを用いて特定することができる。当該標準的な臨床テストとしては、例えば、被検体の血清におけるＨＩＶ抗体またはＨＩＶポリペプチドｐ２４の存在を検出するイムノアッセイ、またはＨＩＶ核酸増幅分析が挙げられる。被験体に与えられる組成物の量であって、感染症の症状の完全解消、感染症の症状の重篤度の低減、または感染症の進行の減速をもたらす量を、治療上有効な量とみなす。本発明の方法は、投与量および投与計画を最適化するための監視工程に加えて、結果を予測する工程も含んでもよい。本発明のいくつかの方法において、まず患者が潜伏期のＨＩＶ感染症であるか否かを判定し、その後、本明細書に記載の１つ以上の組成物を用いて患者を処置するか否かを決定してもよい。
【０１１０】
本発明の組成物は、潜伏的な宿主細胞内で安定的に発現すると、ＨＩＶによる新たな感染を減らすか妨げる。例示的な方法及び結果を、実施例の項に開示する。したがって、本発明は、ＨＩＶ感染のリスクのある患者のＴ細胞のＨＩＶ感染を防ぐ方法を含む。上記方法は、患者がＨＩＶ感染のリスクがあると判定する工程と、上記患者のＴ細胞を、有効量の発現ベクター組成物に暴露する工程であって、当該発現ベクター組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、ＨＩＶ  ＤＮＡのＬＴＲ中の標的配列に相補的な少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離核酸とを含む、工程と、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび上記少なくとも１つのｇＲＮＡを上記Ｔ細胞中に安定して発現させる工程と、上記Ｔ細胞のＨＩＶ感染を防ぐ工程と、を含む。
【０１１１】
ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体としては、例えば、無防備な性交（つまり、コンドームを使用しない性行為を行った）現在性交渉のある個体；別の性感染症を患う現在性交渉のある個体；静脈内薬の使用者；または割礼を受けていない男性、が挙げられる。ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体としては、また、例えば、職業上ＨＩＶ感染した人々と接触することになる個体（例えば、医療関係者または初期対応者）が挙げられる。ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体としては、例えば、矯正施設の収容者、またはセックスワーカー（つまり、収入を得る仕事のために、または貨幣以外のもの（食物、薬物、または宿など）のために、性交を行う個体）が挙げられる。
【０１１２】
本発明はまた、ＨＩＶ感染を処置及び予防する上述の方法の適用を容易にするキットも含む。当該キットは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの単離核酸配列と、１つ以上のｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列とを含む、一定量の組成物を含む。上記ｇＲＮＡのそれぞれは、ＨＩＶプロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む。当該キットはまた、パッケージ材料、使用上の注意書きを含む添付文書、滅菌液、注射器、および滅菌容器から成る群から選ばれる１つ以上の品物も含む。ｇＲＮＡ  ＡとｇＲＮＡ  Ｂが好ましいｇＲＮＡである。１つの好ましい実施形態では、核酸配列は発現ベクター（例えば、実施例１に詳述したレンチウイルス発現ベクターシステム）中に含まれる。上記キットは、意図された用途に応じて、適切な安定剤、担体分子、人口香味料などを適宜含んでよい。
【実施例】
【０１１３】
［実施例１：材料および方法］
（細胞培養）
１．安定した細胞株。Ｊｕｒｋａｔ２Ｄ１０レポーター細胞株について以前に記載されている（Pearson,et al., J Virol 82, 12291-12303 (2008)）。当該細胞株を、１０％ＦＢＳとゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ培地で培養した。２×１０６個の細胞を、１０μｇのコントロールｐＸ２６０プラスミド、またはそれぞれ５μｇのｐＸ２６０  ＬＴＲ‐ＡおよびｐＸ２６０  ＬＴＲ‐Ｂプラスミド（Neon System, Invitrogen, 3 times 10ms/1350V impulse）とともに電気穿孔した。４８時間後、培地を、ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌを含む培地と交換した。１週間の淘汰後、ピューロマイシンを取り除き、細胞をもう１週間、増殖させた。次に、細胞を希釈して１０個／ｍｌの密度とし、９６ウェルプレート中で、５０μｌ／ウェルで培養した。２週間後、Guava EASYCYTEミニフローサイトメーターを用いて、単一の細胞クローンをスクリーニングしてＧＦＰ標識ＨＩＶ‐１レポーターの再活性化を調べた（１２時間、ＰＭＡ２５ｎＭ／ＴＳＡ２５０ｎＭでの処置）。反応しなかったクローンをさらに分析した。
２．一次ＣＤ４＋細胞の単離および増殖。軟膜および患者の血液サンプルを、ＣＮＡＣ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｉ  （テンプル大学医学部、フィラデルフィア）によって得た。Ficoll-Paque試薬を用いて、密度勾配遠心分離法によって、ヒト末梢血からＰＢＭＣを単離した。血／軟膜サンプルの量を、ＨＢＳＳ緩衝液を用いて３０ｍｌに調節し、１５ｍｌのFicoll-Paqueクッションの上に静かに積み重ね、３０分間、１５００ＲＰＭで遠心分離した。ＰＢＭＣ含有層を収集し、ＨＢＳＳ緩衝液で３回洗浄し、数を数えた。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞のさらなる単離を行った。細胞（１０７）をビオチン共役抗体カクテル（抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ２３５ａ、抗ＴＣＲγ/δ)で標識化し、それから、抗ビオチンおよび抗ＣＤ６１抗体を共役したＭｉｃｒｏＢｅａｄｓと混合し、ＭＡＣＳ  ＬＳカラムに分離した。ＣＤ４＋富化画分を表わすフロースルー非標識細胞を収集し、ＣＤ４‐ＦＩＴＣ  ＦＡＣＳ（９４〜９７％  ＣＤ４＋陽性、図１７参照）で純度を確認した。次に、製造者のプロトコルに従ってＴ細胞活性／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、細胞を増殖させた。すなわち、２．５×１０６個／ｍｌの細胞を、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８抗体で覆われたＭｉｃｒｏＢｅａｄｓと、細胞とビーズの比率が２：１となるように混合した。２日後、細胞をピペットで静かに取って塊をばらばらにし、ヒトｒＩＬ‐２を含む一定量の新鮮な増殖培地を加えた。培地は３日毎に交換した。一次細胞はすべて、１０％のＦＢＳとゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含み、ヒトｒＩＬ‐２を２０Ｕ／ｍｌの濃度（NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2from Dr. Maurice Gately (Hoffmann-La Roche Inc.））で補ったＲＰＭＩ中で増殖させた。ＡＩＤＳ患者のサンプルおよびインビトロ感染細胞を含むすべての手順は、ＢＬ２＋ラボで行った。
【０１１４】
（レンチウイルスの送達）
１．レンチウイルスコンストラクトのクローニング。
【０１１５】
ＬＴＲ標的ＡおよびＢを含む「オールインワン」のpX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLSH1-shorttracr-PGK-puro(Addgene 42229)ベクターについて以前に記載されている(Hu, et al., Proc NatlAcad Sci USA 111, 11461-11466 (2014))。一次細胞へのレンチウイルスの送達のため、ＬＴＲ標的ＡおよびＢ用のｇＲＮＡを発現するＤＮＡセグメントを２０ヌクレオチド（表Ｉ、セクション５）まで短縮し、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene 42230)のU6-chimeric-gRNA発現カセットにまずサブクローニングした。それから、全ｇＲＮＡ発現カセットを、Mlu1/BamH1 伸長プライマー（Ｔ５６０／Ｔ５６１。表Ｉ、セクション５参照）を用いてＰＣＲで増幅し、消化し、pKLV-U6gRNA(Bbs1)-PGKpuro2ABFP (Addgene 50946)のMlu1/BamH1部位に挿入した。
２．レンチウイルスのパッケージングと精製。
得られたpKLV-U6-LTRA/B-PGKpuro2ABFPを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にpMDLg/pRRE (Addgene 12251)、pRSV-Rev (Addgene 12253)、およびpCMV-VSV-G(Addgene 8454)と同時トランスフェクトすることによってレンチウイルス粒子にパッケージした。Ｃａｓ９をレンチウイルス粒子にパッケージするため、以下のベクターを用いた。pCW-Cas9 (Addgene 50661)、psPAX2 (Addgene12260)、および pCMV-VSV-G (Addgene 8454)。いくつかの実験では、pLV-EF1a-Cas9v1-T2A-RFPレンチウイルスを用いた（BiosettiaInc.）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣａＰＯ４沈殿法を用いて、クロロキン（５０μＭ）の存在下、パッケージングレンチウイルスベクター混合物と、３０μｇ全ＤＮＡ／２．５×１０６個／１００ｍｍ皿で、同時トランスフェクトした。翌日、培地を交換し、２４時間後および４８時間後、上澄みを集め、３０００ＲＰＭで１０分間澄まし、０．４５μｍで濾過し、超遠心分離（２時間、２５０００  ＲＰＭＩ、２０％スクロースクッション添加）で濃縮した。レンチウイルスのペレットを、一晩、静かにかき混ぜながらＨＢＳＳ中で再懸濁し、等分し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で力価測定した。ｐＣＷ‐Ｃａｓ９レンチウイルスをＦＬＡＧ免疫細胞染色を用いて力価測定し、pKLV-U6-LTR A/B-PGKpuro2ABFPレンチウイルスをＢＦＰ蛍光顕微鏡で力価測定した。
３．一次細胞のレンチウイルス形質導入。
形質導入の２４時間前に、増殖した培地を交換し、細胞を、抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティング磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）との、細胞／ビーズ比２：１での培養によって活性化した。翌日、２．５×１０５個の細胞を、１２．５×１０５ＩＵのｐＣＷ‐Ｃａｓ９レンチウイルスに感染させ、さらに２５×１０５ＩＵのｐＫＬＶ‐エンプティレンチウイルスまたは１２．５×１０５ＩＵの各ｐＫＬＶ‐ＬＴＲ標的ＡレンチウイルスおよびｐＫＬＶ‐ＬＴＲ標的Ｂレンチウイルス（合計ＭＯＩ  １５）に感染させた。細胞を２時間、２７００ＲＰＭで、３２℃で、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含む１５０μｌの接種材料中でスピノキュレートし、それから、再懸濁して４時間放置し、それから、１５０μｌの増殖した培地を加えた。翌日、細胞を、１ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄し、ヒトｒＩＬ‐２（２０Ｕ／ｍｌ）を含む増殖培地中で培養した。
【０１１６】
（ウイルスのアッセイと検出）
１．ウイルスのストック。
ＨＩＶ‐１に６日間、感染したＰＢＭＣの上澄みからＨＩＶ‐１ＪＲＦＬ未精製ストックを調製し、３０００ＲＰＭで１０分間澄まし、０．４５μｍで濾過した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にpNL4-3-EGFP-P2A-NefプラスミドをトランスフェクトしてHIV-1NL4-3-EGFPP2A-Nefレポーターウイルスを調製し、処理して、レンチウイルスのストックとした（上記参照）。ＨＩＶ‐１ＪＲＦＬをＧａｇ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡを用いて力価測定し、ＨＩＶ−１ＮＬ４‐３‐ＥＧＦＰ‐Ｐ２Ａ‐Ｎｅｆを感染ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰ‐ＦＡＣＳで力価測定した。
２．インビトロＨＩＶ‐１感染。
一次ＰＢＭＣから調製したＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、１週間増殖させてから、ＨＩＶ‐１に感染させた。感染は、未精製のＨＩＶ‐１ストックを用いて、３００ｎｇのＧａｇ  ｐ２４／１０６個／１ｍｌで、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含む無血清培地中で、２時間、２７００ＲＰＭで、３２℃でスピノキュレートにより行い、それから、再懸濁し、４時間放置し、続いて、ＰＢＳ中で３回洗浄し、最後に、ヒトｒＩＬ‐２（２０Ｕ／ｍｌ）を含む増殖培地で培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の感染の場合、細胞を活性化し、１週間増殖させてから、ＨＩＶ‐１に感染させた。Ｊｕｒｋａｔ２Ｄ１０細胞を、スピノキュレーションなしで、細胞を一晩、希釈したウイルスストックと、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下、一晩培養するだけで、再感染させた。
３．ＨＩＶ‐１ＤＮＡの検出および定量化。
【０１１７】
ゲノムＤＮＡを、細胞から、製造者のプロトコルに従ってNUCLEOSPINTissue kit (Macherey-Nagel)を用いて単離した。ＬＴＲ特異的ＰＣＲ（表Ｉ、セクション１参照）として、１００ｎｇの抽出ＤＮＡを、FAIL SAFE PCR kitおよび緩衝液Ｄ（Epicentre）を用いて、９８℃、５分、３０サイクル（９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）、７２℃で７分というＰＣＲ条件でＰＣＲに供し、２％アガロースゲル中に分離した。組み込み部位特異的ＰＣＲ（表Ｉ、セクション２参照）を、２５０ｎｇのゲノムＤＮＡに対して、長距離ＰＣＲキット（Qiagen）を用いて、９３℃３分、３５サイクル（９３℃１５秒、５５℃３０秒、６２℃７．５分）という条件で行った。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを精製して、ＴＡベクター（Invitrogen）にクローンし、サンガーシーケンシング（Genewiz）に送った。ＨＩＶ‐１のＤＮＡを、ＨＩＶ‐１Ｇａｇ遺伝子に特異的なＴＡＱＭＡＮｑＰＣＲを用い、細胞ベータ‐グロビン遺伝子を基準として定量化した（表Ｉ、セクション６参照）。ｑＰＣＲの前に、感染細胞からのゲノムＤＮＡを１０ｎｇ／μｌに希釈し、それから、反応／ウェルごとに５μｌ（＝５０ｎｇ）を取った。M. K. Liszewski et al., Methods, 47(4): 254-260 (2009)記載の単純化された手順に従ってプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて、反応混合物を調製した。基準は、Ｕ１細胞（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨ：Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｆｏｌｋｓｋａｒａｅｔａ  ＨＩＶ−１感染細胞（Ｕ１），Ｆｏｌｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８，８００−８０２（１９８７））のゲノムＤＮＡから調製した。これは、このゲノムＤＮＡが、二倍体ゲノムごとにＨＩＶ‐１プロウイルスの２つの単一コピーを含み、べータ‐グロビン遺伝子コピー数と同じだからである。Gag遺伝子に対するｑＰＣＲ条件:９８℃５分、４５サイクル（９８℃１５秒、６２℃３０秒で獲得)。べータ‐グロビン遺伝子に対するｑＰＣＲ条件：９８℃で５分、４５サイクル（９８℃で１５秒、６２℃３０秒で獲得、７２℃１分）。反応およびデータ分析は、LightCycler480(Roche)で行った。 
４．ｐ２４ＥＬＩＳＡ。感染細胞からの上澄みをｐ２４Ｇａｇ抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ABLInc.）に供して、感染レベルを定量化した。標準化のため、合計細胞数と上澄みの量を記録した。
【０１１８】
（宿主ゲノムの分析）
１．ゲノムＤＮＡの調製、全ゲノムのシーケンシング、およびバイオインフォマティクス分析。
単一のサブクローンコントロールＣ１１、およびペアレント２Ｄ１０Ｔ細胞から得た実験ＡＢ５の、標的切断効率およびＨＩＶ−１  ＥＧＦＰレポーター再活性化の機能抑制を確認した。製造者のプロトコルに従ってNUCLEOSPIN Tissue kit (Macherey-Nagel)を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをNovogene Bioinformatics Institute (novogene.com/en/) に提出して、ＷＧＳおよびバイオインフォマティクス分析を行った。つまり、ＤＮＡの質を１％アガロースゲルでさらに検証し、ＤＮＡの純度をNANOPHOTOMETER（登録商標）分光光度計(IMPLEN, CA, USA)を用いてチェックし、ＤＮＡの濃度をQUBIT（登録商標）DNA Assay Kit in QUBIT（登録商標）2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA)を用いて測定した。サンプルごとに合計量１．５μｇのＤＮＡを用いて、製造者の推奨に従ってTruseq Nano DNA HT Sample Preparation Kit (Illumina USA)を用いて、シーケンシングライブラリ生成を行い、インデックスコードを与えてシーケンスを各サンプルに属させた。ＤＮＡサンプルを、音波処理により３５０ｂｐのサイズに断片化し、それからＤＮＡ断片の末端を研磨し、Ａテールを付加し、全長アダプターとライゲーションしてイルミナシーケンシングし、さらにＰＣＲ増幅を行った。最後に、ＰＣＲ産物を精製し（AMPure XP system）、Agilent2100 Bioanalyzerによってライブラリのサイズ分布を分析し、リアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。インデックスコードを与えたサンプルのクラスタ化を、cBot Cluster Generation System上で、製造者の指示に従ってHiseqX HD PE Cluster Kit (Illumina)を用いて行った。クラスタの生成後、ライブラリ調製をIlluninaHiseq X Ten platform上でシーケンスし、ペアエンドリードを生成した。オリジナルの未加工データをベースコーリングによってシーケンスリードに変換し、ＦＡＳＴＱファイルに記録した。ＦＡＳＴＱファイルはシーケンス情報（リード）および対応するシーケンシング品質情報を含む。アダプターを有するリード(>１０のヌクレオチドが当該アダプターに並んでおり、ミスマッチは≦１０％となる)を除去後、未特定のヌクレオチドが≧１０％、phredクオリティ<５の塩基が>５０％、または推定PCR複製、コントロールサンプルの場合は合計で３４２．６７  Ｇｂのクリーンリード（平均１０９．２５ｘのカバレッジ)、ＡＢ５サンプルの場合は３６９．５５  Ｇｂ（１１２．７２ｘ）が、さらなるアセンブリのために保持された。Burrows-WheelerAligner(BWA)ソフトウェア(LiandDurbin,Bioinformatics25,1754-1760(2009))を用いて、ペアエンドのクリーンリードを参照ヒトゲノム(UCSChg19)およびHIV-1ゲノム(KM390026.1)にマッピングした。それから、PicardSamtools (LiH, et al. Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009); broadinstitute.github.io/picard/)、GATK(DePristo, Banks, et al. Nat Genetics 43, 491-498 (2011))、およびSamtools (Li, Handsaker et al. Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009))を用いて、複製を除去し、局所的再アライソメントを行い、塩基品質を再測定して、配列カバレッジおよび配列深度を計算するための最終的なＢＡＭファイルを生成した。候補のインデルを、Python、PyVCF(versionO.6.0)、およびPyFasta packages(versionO.5.0)を用いて、いくつかの基準に基づいてフィルタリングした。コントロール（Ｃ１１）と実験グループ（ＡＢ５）を比較することで、宿主ゲノムに対するＣａｓ９／ＬＴＲ‐ｇＲＮＡ（ＡＢ５グループ）の潜在的なオフターゲット効果に焦点を当てた。ＳＮＰはmuTect(Cibulskis,Lawrence,etal.NatBiotechnol31,213・219(2013))によって、インデルはStrelka(Saunders,Wong,etaL,Bioinformatics28,1811・1817(2012))によって、構造多型（ＳＶ）)はＣＲＥＳＴ(Wiang,Mullighan,eta1.NatMethods8,652・654(2011))によって検出した。ＡＢ５グループに特有のインデルの総数は３２３９９であり、公的データベース(dbSNP)(SherryWard,eta1.Nucl Acids Res 29,308-311(2001))およびヘテロ接合インデルによってフィルタリングした。それから、上述したインデル部位の３００ｂｐ（６００ｂｐ）上流から３００ｂｐ（６００ｂｐ）下流までの配列を抽出した(Hu, Kaminski, et al. Proc Natl Acad Sci USA 111, 11461-11466(2014); Veres, Gosis, et al. Cell Stem Cell 15, 27-30 (2014))。インデル部位の３００ｂｐ（６００ｂｐ）上流から３００ｂｐ（６００ｂｐ）下流までの配列を抽出し、それから、予測した潜在的なオフターゲット配列ＬＴＲ‐Ａ／Ｂ＋ＮＲＧと比較した。同様に、ＳＶ分析で、ＡＢ５グループ中に、４２の欠失と１０の挿入を検出し、±３００ｂｐ（６００ｂｐ）での抽出配列を予測したオフターゲット配列ＬＴＲ‐Ａ／Ｂ＋ＮＲＧと比較した。ＨＩＶ‐１の組み込み部位を判定するため、ＣＲＥＳＴ(Wang,Mullighan,etalNatMethods8,652-654(2011))を用いて、ＨＩＶ‐１ゲノムに関連したコントロールサンプルのＳＶを検出した。
【０１１９】
２．サーベイヤーアッセイ。
【０１２０】
６つの予測オフターゲット部位（表Ｉ、セクション１）からのＰＣＲ産物における変異の存在を、製造者のプロトコルに従ってSURVEYOR変異検出キット（Transgenomic）を用いてテストした。すなわち、ヘテロ接合ＰＣＲ産物を１０分間、９５℃で変性して、サーモサイクラーを用いて徐々に冷却した。次に、３００ｎｇのハイブリダイズしたＤＮＡ（９μｌ）を、０２５μｌのSURVEYORヌクレアーゼとともに、０．２５μｌSURVEYORエンハンサーＳおよび１５ｍＭのＭｇＣ１２Ｓの存在下、４時間、４２℃で消化に供した。それから、停止液を添加し、サンプルを２％アガロースゲル中に、未消化のコントロールとともに分離した。
【０１２１】
３．逆転写およびＰＣＲ。
【０１２２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞から、全ＲＮＡを、RNeasy kit (Qiagen)を用いて、オンカラムＤＮＡｓｅ  Ｉ  消化で抽出した。次に、０．５μｇのＲＮＡを用いてＭ‐ＭＬＶ逆転写反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行った。ｇＲＮＡ発現スクリーニングのため、特異的逆プライマー（pX260-crRNA-3’/R, 表Ｉ、セクション３）をＲＴ反応で用い、それに続いて、標的ＡまたはＢセンスオリゴを順プライマー（表Ｉ、セクション５）として用いた標準的ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。隣接する遺伝子をチェックするため、発現オリゴｄＴプライマーミックスをＲＴで用い、ｍＲＮＡ特異的プライマーペアおよびｂ‐アクチンを基準として用いて（表Ｉ，セクション４）、ｃＤＮＡをSYBERGREENリアルタイムＰＣＲ（Roche）に供した。
【０１２３】
（フローサイトメトリー）
Ｊｕｒｋａｔ２Ｄ１０細胞中のＧＦＰおよびＲＦＰ発現を生存細胞中でGuavaEASYCYTEミニフローサイトメトリー（Guava Technologies）を用いて定量化した。ＨＩＶ‐１レポーターウイルスの力価測定のために、感染から４８時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン処理し、洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドに１０分間固定し、それからＰＢＳで３回洗浄して、ＧＦＰ  ＦＡＣＳを分析した。一次Ｔ細胞中のＣＤ４発現を、ＣＤ４  Ｖ５  ＦＩＴＣ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による直接標識と、それに続くＦＡＣＳにより、チェックした。
【０１２４】
（アネキシンアッセイ）
Ｊｕｒｋａｔ細胞を洗浄し、カウントし、希釈して、ＰＢＳ中で１×１０５個／ｍｌの濃度とした。サンプルごとに、懸濁液中の１００μＬの細胞を１００μｌの室温のアネキシンＶ‐ＰＥ染色試薬（Ｇｕａｖａ  Ｎｅｘｉｎ試薬）と混合し、暗闇の中、２０分間、室温で培養した。培養後、Guava EasyCyteミニフローサイトメーターを用いてサンプルを得た。
【０１２５】
ヨウ化プロピジウム染色を用いて細胞の生存を調べた。懸濁液中の２００μｌの生存細胞に、ＰＩ溶液を添加して、最終的な濃度を１０μｇ／ｍｌとした。サンプルを暗闇の中で、５分間、室温で培養した。培養後、Guava EASYCYTEミニフローサイトメーターを用いてサンプルを得た。
【０１２６】
（細胞サイクル分析）
細胞を１×ＰＢＳで洗浄して、それから、２５０μｌの室温の１×ＰＢＳ中で再懸濁した。この懸濁液を１ｍｌの−２０℃の８８％エタノールに一滴ずつ添加し、エタノールの最終的な濃度を７０％とした。細胞を一晩で−２０℃に固定し、それから洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ溶液で、１×ＰＢＳ中で３０分間３７℃で培養した。それからサンプルを４℃に冷却し、Guava EASYCYTE ミニフローサイトメーターを用いて得た。
【０１２７】
（ウェスタンブロット、免疫細胞染色）
ＴＮＮ緩衝液（50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1%Nonidet P-40, 5mM EDTA pH 8, 1x 哺乳類細胞用プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ））中のＪｕｒｋａｔ細胞を氷上で３０分間、培養して、全細胞溶解物を調製した。それから、最高速度で１０分間、４℃でスピンしてあらかじめ澄ませた。５０μｇの溶解物を１×Ｌａｅｍｌｉ緩衝液中で変性し、トリス‐グリシン緩衝液中でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、続いて、ニトロセルロース膜（BioRad）に移した。上記膜は５％milk/PBST中で１時間ブロックされ、それから、マウス抗ｆｌａｇＭ２モノクローナル抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）またはマウス抗αチューブリンモノクローナル抗体（１：２０００）で培養した。ＰＢＳＴで洗浄後、上記膜を共役ヤギ抗マウス抗体（１：１００００）で１時間、室温で培養した。Odyssey赤外線撮像システム（LI-COR Biosciences）を用いて、上記膜をスキャンし分析した。細胞を４ウェルのチャンバ―スライドで培養し、翌日、４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間、固定した。３回洗浄した後、細胞を、０．１％ Triton X-100, 2% BSA/ PBS中で、マウス抗ｆｌａｇＭ２モノクローナル抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）とともに、室温で２時間、インキュベートした。３回洗浄した後、細胞をヤギ抗マウスＦＩＴＣ二次抗体（１：２００）とともにインキュベートし、それから、Hoechst 33258とともに５分、インキュベートした。ＰＢＳで３回すすいだ後、退色防止水性マウンティング培地（Ｂｉｏｍｅｄａ）で細胞をカバースリップし、Leica DMI6000B 蛍光顕微鏡で分析した。
【０１２８】
（統計的分析）
表記の±ＳＤは３つの実験によるものであり、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡおよびニューマン・コイルス多重比較検定により評価した。一般的に、ｐ値<０．０５または０．０１を統計的に有意と見なした。
【０１２９】
表１は、本研究で用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【０１３０】
【表１】
2018527943.tif 000002
2018527943.tif 000003
2018527943.tif 000004
実施例２：ヒトＴリンパ球細胞における潜伏ＨＩＶ‐１の再活性化を防ぐＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム。
【０１３１】
（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡは、ヒトＴ細胞における潜伏ＨＩＶ‐１のＨＩＶ‐１再活性化を防ぐ）
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがヒトＴリンパ球細胞株２Ｄ１０におけるＨＩＶ‐１ゲノムを取り除けるかどうか判定する目的で、初期実験を行った。これらの細胞は、シングルラウンドＨＩＶ‐１ＰＮＬ４‐３の組み込みコピーを含む。上記シングルラウンドＨＩＶ‐１ＰＮＬ４‐３のゲノムは、Ｇａｇ‐Ｐｏｌポリプロテインの大多数をコードする配列を欠いているが、全長５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲを含み、潜伏状態においてＮｅｆタンパク質に代わる、標識タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を含む（図１Ａ）。したがって、２Ｄ１０は、組み込まれたプロウイルスの均一な性質のため、ＨＩＶ‐１根絶の原理証明を最初に行うのに適した細胞株である。Ｃａｓ９を安定的に発現しているがｇＲＮＡを発現していない２Ｄ１０のクローン細胞を、炎症促進剤（例えば、ホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ））および／またはＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチン  Ａ（ＴＳＡ）で処置すると、ＨＩＶ‐１プロモーターの活性が非常に刺激され、処置された細胞の９０％超でウイルスタンパク質およびＧＦＰが生成され（図１Ｂ、左側のパネル）、ウイルスの潜伏および再活性化を研究するのに便利な細胞培養モデルを提供した。Ｃａｓ９をｇＲＮＡ  ＡおよびＢ（それぞれ、ＬＴＲ  Ｕ３領域のｎｔ‐２８７／−２５４（ｇＲＮＡ  Ａ）およびｎｔ‐１４６／−１１３（ｇＲＮＡ  Ｂ）（図１Ａ）にあるすべてのウイルス単離体の中でよく保存されている配列を標的とするよう設計されている）と同時発現することにより、ＰＭＡ／ＴＳＡ誘導ＧＦＰ産生が完全になくなった。これは、Ｃａｓ９発現プラスミドおよびｇＲＮＡ発現プラスミドの両方を発現しているＴ細胞の、あらかじめ選択された混合クローン集団におけるＨＩＶ‐１遺伝子の発現が阻害されたことを示す（図１Ｂ、右側のパネル）。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現は、それぞれＲＴ‐ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって検証された（図１Ｃ、１Ｄ）。ＨＩＶ‐１発現は、Ｃａｓ９発現プラスミドおよびｇＲＮＡ発現プラスミドの両方を発現している細胞から完全になくなった。これは、ランダムに選択されたＣａｓ９陽性のクローン細胞（ｇＲＮＡが発現しているものと発現していないもの）によるＧＦＰ産生のフローサイトメトリー検出によって示される（図７Ａ）。また、単一のｇＲＮＡ（ＡまたはＢ）のみを発現したクローンの多くでも、ＧＦＰ産生は効果的に阻害されたことがわかった。阻害のレベルは、ＡおよびＢ両方の同時発現によってもたらされたレベルと類似していた（図７Ｂ。図７Ａも参照）。これは、単一の構成でどちらかのｇＲＮＡが発現するなら、両方のＬＴＲの切断を開始でき、プロウイルスＤＮＡを根絶できることの証拠となる。
【０１３２】
（ヒトＴ細胞中のＨＩＶプロウイルスＤＮＡの組み込み部位および宿主細胞染色体からのウイルスＤＮＡの切除）
ＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡが組み込まれた部位を、２Ｄ１０細胞の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）によって検証した。構造多型（ＳＶ）のＣＲＥＳＴ（“clipping reveals structure”）コーリング（Wang,Mulligham, et al., Nat Methods 8, 652-654 (2011)）を用いて、宿主ゲノムにおけるプロウイルスＤＮＡ組み込みによって生じた切断点を調べ、ｈｇ１９ゲノムとＨＩＶ‐１ゲノムＫＭ３９００２６．１を、ＤＮＡ配列を読むための参照ゲノムとして用いた。ＨＩＶ‐１ＤＮＡに関係する４つの染色体内転座を特定し、ＣＴＸで表わした（図８Ａ、８Ｂ）。ＨＩＶ‐１  ５’  ＬＴＲ  Ｐ１６３．３：１９９１３８２とＨＩＶ‐１  ３’  ＬＴＲ  Ｐ６１３．３：１９９１３７８間の切断点を検出した。当該切断点は、メチオニンスルホキシド還元酵素Ｂ１  ＭＳＲＢ１遺伝子（ＮＭ＿０１３３２）のエキソン２をマッピングし、２Ｄ１０細胞中のプロウイルスに対してこれまでマッピングされた位置に対応する（Pearson, R. et al. J Virol 76, 11091-11093 (2002); Jadlowsky, J. K.et al. Mol Cell Biol 34, 1911-1928 (2014)）。さらに、Ｐ１３．２：１１４３３８３１５とＨＩＶ‐１  ５’  ＬＴＲのあいだに切断点があり、ＨＩＶ‐１  ３’  ＬＴＲとＰ１３．２：１１４３３８３２０のあいだに他の切断点がある染色体１に２つのＣＴＸをマッピングした。また、４つのヌクレオチドＴＡＡＧが、染色体１Ｐ１３．２中の２つの切断点間で欠失していた。以前はリンカー添加マッピングによって検出されなかった染色体１中のＨＩＶ‐１プロウイルスは、round spermatid basic protein 1 (RSBN1)遺伝子（NM_018364）の第２イントロン（114339984-114320431）に組み込まれていた。染色体１および１６中のＨＩＶ‐１ＤＮＡ組み込み部位の特定された共通配列の概略図を図８Ａと８Ｂに示す。
【０１３３】
ＬＴＲ  ＤＮＡの短距離増幅アッセイにより、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＡおよびＢ（図２Ａ）による処置後の、コントロール細胞中の予期された４９７‐ｂｐＤＮＡ断片および類似のサイズ（５０４ｂｐ）の第２のＤＮＡ断片が明らかになった。ＰＣＲ増幅産物の直接ＤＮＡシーケンシングの結果は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ処置細胞中の観察された５０４‐ｂｐＤＮＡ断片が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  Ｂによる切断後に残りの５’  ＬＴＲを残りの３’ＬＴＲに接合させることにより作られた（図２Ｂ）という証拠を提供した。クローン細胞の５’と３’の融合部位の接合部で、７個のヌクレオチドの挿入を有するインデル変異も検出された（図２Ｂ）。ウイルスゲノムの中央に位置する、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）に対応する２５７‐ｂｐ  ＰＣＲ増幅産物は欠けており、これは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  Ｂが、２つの末端反復間のＤＮＡ配列を除去したことを実証する（図２Ａ）。Ｃａｓ９を発現しているがｇＲＮＡを発現していない２Ｄ１０コントロール細胞を、ＲＳＢＮ１の第２イントロンに由来するプライマーのペアを用いて長距離ＰＣＲ分析することで、組み込まれたＨＩＶ‐１ゲノムに対応する６１３０‐ｂｐＤＮＡ断片およびその染色体１に由来する隣接するＤＮＡ配列の存在が実証された（図２Ｃ）。染色体１の他のコピーからの宿主細胞ＤＮＡ配列を表わす２６４‐ヌクレオチドＤＮＡ断片も存在していた（ゲルの底部に示す）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＡおよびＢで処置された細胞中、組み込まれたＨＩＶ‐１ゲノムに対応する６１３０個のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片が完全に欠けていた。その代わりに、ＰＣＲ増幅により、９０９個のヌクレオチドからなるより小さなＤＮＡ断片が産生された。増幅産物をシーケンシングすることにより、５’  ＬＴＲのＢ領域から３’  ＬＴＲのＢ領域に広がる組み込まれたウイルスＤＮＡが切除されたことが実証された（図９Ａ、９Ｂ）。さらに、他の染色体に由来する宿主ゲノムから増幅された２６４ヌクレオチドＤＮＡ断片が検出された（図２Ｃ）。
【０１３４】
ＭＳＲＢ１遺伝子の第２エキソンに対応するプライマーペアを用いた長距離ＰＣＲを用いて、染色体１６を調べてＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡが存在するかどうかを探り、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂ処置細胞における染色体１６の状態と比較した。その結果、染色体１６中のＨＩＶ‐１ゲノムの予期された５４６７‐ｂｐＤＮＡ断片およびそれに隣接する宿主ＤＮＡが欠けていることがわかった。その代わりに、より小さな７５９‐ｂｐのＤＮＡ断片が検出され、ｇＲＮＡ  Ａによる切断後の５’  ＬＴＲの残りのＵ３領域とｇＲＮＡ  Ｂによる切断時の３’  ＬＴＲの残りのＵ３領域との接合を反映した（図２Ｄ）。７５９‐ｂｐのＤＮＡ断片を直接シーケンシングすることで、ウイルスＤＮＡの切断部位が特定された（図１０Ａ、１０Ｂ）。より小さな１１０‐ｂｐのＤＮＡ断片が見つかったが、これは染色体１６の他のコピーに由来する宿主ＤＮＡを増幅して得られたものであった。これらの観察から、用いられた上記の遺伝子編集分子が、さまざまな染色体に散らばっているＨＩＶ‐１ゲノムの組み込みプロウイルスＤＮＡの多数のコピーを効果的に取り除くという強力な証拠が得られる。
【０１３５】
（宿主細胞からの、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ間のＨＩＶ‐１ＤＮＡ配列の除去および切断点の位置）
潜伏感染したＴ細胞からのＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの除去におけるＣａｓ９／ｇＲＮＡ処置に基づく遺伝子編集方法の有効性をさらに実証するために、コントロールおよびＨＩＶ‐１根絶細胞のＨＩＶ‐１ゲノム中の挿入／欠失（インデル）および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現を、GATK コーリング (Depristo, et al., Nat Genetics43, 491-498 (2011)) を用いて、参照ＨＩＶ‐１ＤＮＡ(GenBank accession#KM3900261)に対して分析した。図２Ａから図２Ｄに示す結果と一致して、全ゲノムシーケンシングからのリードは５’‐ＬＴＲおよび３’‐ＬＴＲにマッピングし、また、コントロール２Ｄ１０細胞のプロウイルスゲノムにマッピングした。このことは、ゲノムシーケンシングによるＨＩＶ‐１ＤＮＡのディープカバレッジの正確さおよび信頼性を支持する（図３Ａ）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ処置２Ｄ１０細胞では、integrated genomics view (IGV)により、３’ＬＴＲにマッピングするリードを有するＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡに対応する大きなＤＮＡ断片が完全に除去されたことがわかった（図３Ｂ）。上記２つのＬＴＲ間の全プロウイルスゲノムにマッピングするリードはすべて欠けており、宿主細胞中に組み込まれたＨＩＶ‐１ゲノムの両方のコピーが完全に取り除かれたこと、および、単一のクローン細胞におけるＣａｓ９／ｇＲＮＡ発現は１００％の遺伝子編集／除去を達成できること（おそらく、安定的に発現したＣａｓ９／ｇＲＮＡによるゲノム編集の繰り返しによる）を証明している。さらに、これらの結果は、ウイルスの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの切断およびウイルスゲノムの切除後、ウイルスＤＮＡは劣化する可能性が高く、そのため宿主ゲノムへの転位または再組み込みは生じないことを証明している。
【０１３６】
両方のＬＴＲをＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂ誘導で切断したあとの修復イベントを決定するために、ＨＩＶ‐１を切除した細胞のＤＮＡの構造多型（ＳＶ）のＢＷＡコーリング(Wang, et al., Nat Methods 8, 652-654 (2011))を用いて、大きな挿入および／または欠失の切断点を特定した。その結果から、１つの染色体から切除されたＨＩＶ‐１ＤＮＡは宿主ゲノムに挿入されず、かつ／または他の染色体上のプロウイルスＤＮＡの組み込みコピーに挿入されないことが実証された。これは、切除されたウイルスＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれるという可能性を排除する。しかしながら、ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込み部位に対応するＤＮＡ断片の欠失によって生じた３つの切断点が特定された。左側の1つの切断点は、ヌクレオチド６３６（＝ＨＩＶ：９７１０）における５’ＬＴＲの末端に位置し、１０個のリードで支持されていた。右側の1つの切断点は2つのパターンを示した。ＨＩＶ：９０７３（＝ＨＩＶ：−３）にあり、２Ｃ→Ｇと４Ｃ→Ｔの変換を有する６個のリードで支持されているパターンと、ＨＩＶ：９０７５（＝ＨＩＶ：−１）にあり、６３個のリードで支持されているパターンである（図３Ｃ、３Ｄ）。注目すべきは、これら２つの切断点は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲにおける、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＡまたはＢによる全プロウイルスＤＮＡの切除、およびそれに続く切断部位でのＤＮＡの正確な再結合後のＬＴＲの６３４個のヌクレオチドすべての存在を実際に反映しうることである。第三の切断点は、ヌクレオチド９３８９（＝ＨＩＶ：３１３）における３’ＬＴＲの中央に位置し、８７／１６１個のリードで支持されたＣの挿入と、６９／１６１個のリードで支持されたＣＴＡＡＧＴＴの挿入があった（図３Ｅ）。この切断点は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの部位ＡおよびＢでの切断後のＤＮＡの結合を示す（図３Ｆ）。
【０１３７】
（隣接する遺伝子発現上のＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの切除効果およびオフターゲット効果）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を媒介とする、ＲＳＢＮ１遺伝子からのＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの切除を調べた。ＲＳＢＮ１からのＲＮＡ産生のレベルおよびプロウイルス挿入部位に近接して位置する他の細胞遺伝子のいくつかを判定した（図４Ａ参照）。５つのコントロールおよび５つのＨＩＶ−１根絶単一細胞クローンにＲＴ−ＰＣＲを行った結果は、ＲＳＢＮ１の発現レベルには大きな影響はないことを示した。ただし、０．４倍未満の小さな変異が、隣接するＲＮＡのレベルで検出された（図４Ｂ）。これは、上記遺伝子編集方法のせいではないかもしれず、それらのタンパク質の発現全体には影響を与えないかもしれない。同様に、染色体１６からＨＩＶ‐１ゲノムを除去しても、組み込み部位（すなわち、ＭＳＲＢ１およびその周囲の遺伝子）の発現には大きな影響を与えなかった（図４Ｃ、４Ｄ）。細胞の健康に関するいくつかのパラメータ（細胞の生存、細胞サイクルの進行、およびアポトーシス）に基づいて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＡおよびＢによるＨＩＶ‐１の根絶後のいくつかのクローン細胞を用いて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＡおよびＢの影響を調べた。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＡおよびＢによるＨＩＶ‐１プロウイルスＤＮＡの根絶後、宿主細胞のバイタルサインに永続的で著しく有害な影響は見られなかった（図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ）。
【０１３８】
潜在的なオフターゲットの分析の範囲を広げるため、プロウイルスＨＩＶ‐１ＤＮＡの完全な根絶をもたらしたＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂシステムによる処置後の２Ｄ１０細胞の全ゲノムシーケンシングによって判明したインデルの結果を比較した。インデルコーリングの信頼性を高めるため、１００×カバレージにおける全ゲノムシーケンシングを求めたが、統計的な分析により、実際に達成された全カバレージは、コントロール細胞では１０９．３×、ＨＩＶ‐１根絶細胞では１１２．７×であることがわかった（表２）。カバレージレベルは各染色体ごとに異なり、染色体１では> 96xの範囲、染色体１６では> 110xの範囲だった（図１４）。ヒト（ｈｇ１９）ゲノムを参照シーケンスとして用い、コントロール（＋Ｃａｓ９／−ｇＲＮＡ）において１，３６１，３１１個のインデル（<５０ｂｐ挿入／欠失）を特定し、ＨＩＶ‐１根絶細胞において１，３５８，３９９個のインデル（<５０ｂｐ挿入／欠失）を特定した（表３）。また、コントロールにおいて３，９７３，０９８個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を特定し、ＨＩＶ‐１根絶細胞において３，９６１，３９５個の単一ヌクレオチド多型を特定した（表４）。コントロールとＨＩＶ‐１根絶細胞との比較バイオインフォマティクス分析により、異なるゲノム領域に散らばる、３２，３９９個の体細胞インデル（Strelkaでコールした小規模の挿入／欠失）、４６，６１４個の体細胞ＳＮＶ（ＭｕＴｅｃｔでコールした単一ヌクレオチド変異）、５２個のＳＶ（ＣＲＥＳＴでコールした、大規模のインデルを含む構造多型）を、後者の２つのグループ間に特定した（表５）。
公的データベースｄｂＳＮＰで見つかった小さなインデルを捨てた後、ＨＩＶ‐１根絶細胞において、３０，１５６個のインデルと４３，８５８個のＳＮＶが特定された。ヘテロ接合変異を除外して、この数は９８９個のインデルに減った。これらのフィルタリングされたインデルがＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂ編集システムによって生じた新たな変異であるかどうかを判定するため、フィルタリングされたインデルそれぞれに隣接する±３０ｂｐ、±３００ｂｐ、または±６００ｂｐの配列を抽出し、Ｂｌａｓｔｎ(e-value cutoff:1000)を用いて、それらを、０〜７個のミスマッチの配列類似性で予測された潜在的ｇＲＮＡオフターゲット宿主ゲノム部位、およびＨＩＶ‐１オンターゲット配列と比較した。ｇＲＮＡ  ＡおよびＢの標的に対するいかなるミスマッチもなく、フィルタリングされたインデルの抽出された６０、６００、および１２００ｂｐの配列の周囲には、いかなるオフターゲット部位も見つからなかった。抽出された６０ｂｐの配列のうち、ＰＡＭ  ＮＲＧ（１００％マッチである必要がある）からアラインメント長> 12ヌクレオチドで７つのミスマッチがあっても、オフターゲット部位は見つからなかった。抽出された６００ｂｐの配列のうち、ｇＲＮＡ  ＡまたはＢの標的に対して、３個のミスマッチを有するオフターゲット部位は見つからなかった。４〜７個のミスマッチの場合、ＰＡＭからアラインメント長２０ｂｐで６個のミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位がただ一つ見つかった。標的Ａについて、ＰＡＭから１２ｂｐのアラインメント長で３個のミスマッチを有する別の潜在的オフターゲット部位が見つかった。標的Ｂについて、ＰＡＭから１６ｂｐのアラインメント長で４個のミスマッチを有するさらに１つの潜在的オフターゲット部位が見つかった。３個のミスマッチの場合、抽出された１２００ｂｐの配列内で、標的Ａについてはオフターゲット部位は見つからなかったが、標的Ｂについては、ＰＡＭから１３ｂｐで２個のミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位が１つ見つかった。１２００ｂｐの配列に対して３〜７個のミスマッチという基準で、標的Ａについてはわずか６つの潜在的オフターゲット部位が、標的Ｂについては２つの潜在的オフターゲット部位が見つかった（図４Ｅ）。合わせると、これらのデータは、ＨＩＶ‐１ゲノムを切除した細胞中で、任意の潜在的なオフターゲット部位の標的ＡまたはＢから６０ｂｐ内にあるインデルは１つもないという強力な証拠を提供する。これは、７つまでのミスマッチを認める検索基準で予測していた通りである。検索する配列を６００または１２００ｂｐまで広げることにより、比較的まれなオフターゲット部位（さまざまな数のミスマッチおよびアライソメント長を有する）が特定された。ＰＡＭ  ＮＲＧに加えて最後の１２ｂｐシード配列まで完全にマッチしたため、６０〜１２００のＤＮＡ配列の検索領域内にあるインデルは１つもなかった。これらのデータを全体的に解釈すると、これらの細胞における先行するSurveyorアッセイの結果、および他の細胞タイプにおける先行するSurveyorアッセイの結果 (W Hu, et al. Proc Natl Acad Sci USA 111, 11461-11466 (2014))を裏付け、非常に厳格な分析によって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＨＩＶ‐１  ＤＮＡ切除システムが宿主Ｔ細胞ゲノムに対してオフターゲット効果をもたらすことはないと立証する。
【０１３９】
（ＨＩＶ‐１根絶細胞の、ＨＩＶ‐１による感染性）
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによってプロウイルスＤＮＡを取り除いたＴ細胞クローンをいくつか選択し、さまざまなレベルでＣａｓ９およびｇＲＮＡの発現を維持して、ＨＩＶ‐１による新たな感染の程度を調べた。図１５Ａに示すように、クローンＣ７はＣａｓ９を発現するがｇＲＮＡ  Ｂは発現しない。一方、クローンＡＢ８は検出できるレベルのＣａｓ９を示さないが、ｇＲＮＡ  Ｂを含んでいる。ｇＲＮＡ  Ｂを同量含み、Ｃａｓ９の発現レベルが異なる２つのさらなるクローンＡＢ９とＡＢ５を選択して再感染研究に供した。これらの細胞をＨＩＶ‐１ＮＬ４‐ｇｆｐに感染させ、続いてフローサイトメトリーによってウイルス複製を経時的に評価すると、Ｃａｓ９またはｇＲＮＡ  Ｂのどちらか一方のみを発現する細胞はＨＩＶ‐１に感染することがあり、これらの研究のあいだずっとウイルス複製を行った（感染後１８日目）（図１５Ｂ）。その反対に、Ｃａｓ９とｇＲＮＡ  Ｂの両方を発現する細胞は、ＨＩＶ‐１による感染に抵抗し、ウイルス複製をしなかった。より高いレベルでＣａｓ９を発現したＡＢ５は、Ｃａｓ９の発現が少ないＡＢ９よりも、ウイルス複製に対する抵抗力が高いとわかった（図１５Ａ、１５Ｂ）。図１５Ｃは、パネルＢに示す結果の定量値を要約したものである。当該結果は、Ｃａｓ９およびＬＴＲ対象ｇＲＮＡの両方が細胞内にあると、ＨＩＶ‐１による新たな感染に対してヒトＴ細胞の培養物を効果的に守ることができることを実証する。
【０１４０】
（レンチウイルスが媒介したＣａｓ９／ｇＲＮＡの送達がＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ‐１感染を抑える）
健康な個人から調製したＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ‐１感染をＣａｓ９／ｇＲＮＡが抑える能力を検査した。形質導入能力が高く毒性が低いことから、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現ＤＮＡを送達するのにレンチウイルスベクターを選んだ。ＬＶによる形質導入の結果、Ｃａｓ９とｇＲＮＡの両方を発現するＬＶによってＨＩＶ‐１  ＬＴＲ  ＤＮＡが効率的に切断されたが、Ｃａｓ９のみを発現するＬＶで形質導入されたコントロール細胞ではそうではなかった（図５Ａ）。注目すべきは、ｇＲＮＡはＬＶのＬＴＲを切断せず（ＬＶのＬＴＲはＵ３調節領域を有していない）、そのため、ＬＶゲノムの発現には影響を与えないことである。したがって、潜伏感染したＴ細胞にＬＶ‐Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで形質導入すると組み込みＨＩＶ‐１ゲノムの機能が不活性化されることが、フローサイトメトリー分析によりわかった（図５Ｂ）。また、一次細胞においてＣａｓ９／ｇＲＮＡと関連しているかもしれない細胞死の証拠は見つからず、図１１Ａおよび１１Ｂに示す観察を裏付けた。ＬＶによる編集分子の遺伝子送達の有効性がＴ細胞株において検証されたので、ＣＤ４＋Ｔ細胞の一次培養物をＨＩＶ‐１ＪＲＦＬまたはＨＩＶ‐１ＰＮＬ４−３に感染させ、それから、コントロールのＬＶ  Ｃａｓ９またはＬＶ  Ｃａｓ９にＬＶ  ｇＲＮＡを足したもののどちらかで形質導入した（図５Ｃ）。コントロールと比較して、ＬＶ  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで処置したＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＨＩＶ‐１のコピー数の実質的な減少が見られた（図５Ｄ）。ウイルスＤＮＡを増幅すると、コントロールの細胞中で予期された３９８ｂｐの増幅が見られ、ＣＤ４＋Ｔ細胞中、ＬＶ  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで形質導入した細胞には同様のサイズだが強度が少ないＤＮＡ断片が見られた（図５Ｅ）。
【０１４１】
レンチウイルス送達Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのＨＩＶ‐１ゲノム編集能力を、ＨＩＶ‐１ゲノムを含むＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞において評価した。当該ＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞は、テンプル大学病院エイズクリニックへの定期訪問中にＨＩＶ‐１＋患者から得たものである。この概念実証研究のため、まず、４人の患者（ＴＵＲ０００１からＴＵＲ０００４、ケース１からケース４）からＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を調製しようとした。当該４人の患者は、抗レトロウイルス治療を受けており、ウイルスロードアッセイとＣＤ４＋Ｔ細胞の割合に応じて、治療に対してさまざまな反応を示した（図１１Ａ）。ＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を調製するのに用いた手順、ＣＤ４＋Ｔ細胞の検査、およびレンチウイルス処置と細胞の取り入れのタイムラインを図１６Ｂに示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は、ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ４抗体のフローサイトメトリーで確認した（図１６Ｃ）。
【０１４２】
ＰＢＭＣをレンチウイルスＣａｓ９およびレンチウイルスＣａｓ９／ｇＲＮＡで形質導入した結果、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現している細胞集団のウイルスコピー数が、ケース１では８１％、ケース２では９１％、実質的に減少した（図６Ａ）。同様の結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入後にも得られ、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ両方を発現すると、Ｃａｓ９のみを発現するコントロールの細胞と比較して、ウイルスコピー数が、ケース１では＞９２％、ケース２では５６％、減少した（図６Ｂ）。βグロビンおよびＧａｇ遺伝子のコピー数の絶対定量化のための基準カーブと増幅プロットとを図１８Ａから１８Ｄに示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＧａｇ  ｐ２４遺伝子の産生を調べることにより、当該細胞にレンチウイルスＣａｓ９／ｇＲＮＡを一回形質導入するだけで、レンチウイルスＣａｓ９を形質導入した当該細胞に比べて、ウイルス複製が、ケース１（７１％）とケース２（６２％）で減少したことが確認された（図６Ｃ）。また、ケース３およびケース４から得られたＰＢＭＣにレンチウイルスでＣａｓ９／ｇＲＮＡを送達した後の、当該ＰＢＭＣにおけるＧａｇ  ｐ２４のレベルを調べた。この研究の結果、上記細胞に治療用レンチウイルスで形質導入した後、ＨＩＶ‐１  ｐ２４の産生が、ケース３で３９％、ケース４で５４％、減少したことがわかった（図１７）。
【０１４３】
次に、患者のサンプル中にＣａｓ９／ｇＲＮＡによって導入された変異の性質を、ウイルスＤＮＡを増幅しシーケンシングすることによって評価した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、−３７４／＋４３の範囲のプライマーを用いて、一次遺伝子増幅したが、ケース１ではいかなるバンドも検出しなかった。ケース２では、ｇＲＮＡ発現のないコントロールのサンプルにＤＮＡバンドが観察された（図６Ｄ）。この観察は、ケース１におけるＨＩＶ‐１ゲノム配列が、遺伝子増幅に用いられたプライマーの配列とは異なるかもしれないこと（図６Ｄ）を証明する。予期されたＤＮＡ断片が未処置の細胞で検出されたケース２において、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡにより導入された変異が、ＰＣＲプライマーによるＤＮＡシーケンスの認知を取り除き、ＤＮＡ増幅に干渉した可能性がある。ＬＴＲの異なる領域を認識するプライマーの代替的なセットを用いると、すべてのサンプル中で、予期された３９８ヌクレオチド増幅産物が産生された（図６Ｅ）。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによる処置後の２Ｄ１０細胞の結果（図２Ａに示す）と同様、ｇＲＮＡ発現の存在下で見られる３９７ヌクレオチドＤＮＡ断片のいくつかは、ＨＩＶ‐１コード配列全体の切除後のウイルスＬＴＲの残りの５’配列および３’配列が接合して生じた可能性がある。増幅産物のシーケンシングにより、予期された位置でのウイルスゲノムの編集に対するＣａｓ９／ｇＲＮＡの効果が実証され、ＬＴＲ内のＰＡＭ配列内にある、かつ／または当該配列に隣接するインデルおよび一塩基多様性（ＳＮＶ）変異の存在が示された（図６Ｆ）。
【０１４４】
表２はマッピング比およびカバレッジを示す。
【０１４５】
【表２】
2018527943.tif 000005
Total: クリーンリードの総数
Duplicate: 重複リードの数
Mapped: 参照ゲノムにマッピングしたリードの総数（パーセンテージ）
Properly mapped: 参照ゲノムにマッピングしたリードの数（方向が正しい場合）
PE mapped: 参照ゲノムにマッピングしたペアエンドリードの数（パーセンテージ）
SE mapped: 参照ゲノムにマッピングしたシングルエンドリードの数
With mate mapped to a different chr: 異なる染色体にマッピングしたメイトリードの数（パーセンテージ）
With mate mapped to a different chr(mapQ>=5): 異なる染色体にマッピングしたメイトリードの数（ＭＡＱ>５）
Average sequencing depth: 参照ゲノムにマッピングした平均シーケンシング深度
Coverage: ゲノムの配列カバレッジ
Coverage at least 4X: 全ゲノム塩基における深度>4Xの塩基のパーセンテージ
Coverage at least 10X: 全ゲノム塩基における深度>10Xの塩基のパーセンテージ
Coverage at least 20X: 全ゲノム塩基における深度>20Xの塩基のパーセンテージ
表３は、異なるゲノム領域における挿入／欠失（インデル）の分布を示す。
【０１４６】
【表３】
2018527943.tif 000006
サンプルの符号: サンプルの名称
CDS: エキソン領域中のインデルの数
frameshift_deletion: タンパク質コード配列中でフレームシフト変化を生じさせる１つ以上の欠失。欠失長は３の倍数ではない。
frameshift_insertion: タンパク質コード配列中でフレームシフト変化を生じさせる１つ以上の挿入。挿入長は３の倍数ではない。
nonframeshift_deletion: 非フレームシフト欠失。コードタンパク質のフレーム欠失を変えない。欠失長は３の倍数。
nonframeshift_insertion: 非フレームシフト挿入。コードタンパク質のフレーム欠失を変えない。欠失長は３の倍数。
stopgain: バリアント部位において終止コドンを即座に生成する、フレームシフト挿入／欠失、非フレームシフト挿入／欠失、またはブロック置換。
stoploss: バリアント部位において終止コドンを即座に除去する、フレームシフト挿入／欠失、非フレームシフト挿入／欠失、またはブロック置換。
unknown: 未知の機能（データベースファイルの遺伝子構造定義におけるさまざまなエラーに由来する）。
intronic: イントロン領域中のインデルの数
UTR3: ３’ＵＴＲ領域中のインデルの数
UTR5: ５’ＵＴＲ領域中のインデルの数
splicing: ４ｂｐのスプライシングジャンクション領域中のインデルの数
ncRNA_exonic: 非コードＲＮＡエキソン領域中のインデルの数
ncRNA_intronic: 非コードＲＮＡイントロン領域中のインデルの数
ncRNA_UTR3: 非コードＲＮＡの３’ＵＴＲ中のインデルの数
ncRNA_UTR5: 非コードＲＮＡの５’ＵＴＲ中のインデルの数
ncRNA_splicing: 非コードＲＮＡの４ｂｐのスプライシングジャンクションにおけるインデルの数
upstream: 転写開始領域の１ｋｂ上流領域におけるインデルの数
downstream: 転写終止領域の１ｋｂ下流領域におけるインデルの数
intergenic: 遺伝子間領域におけるインデルの数
Total: インデルの総数
表４は、異なるゲノム領域における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の分布を示す。
【０１４７】
【表４】
2018527943.tif 000007
サンプルの符号：サンプルの名称
CDS: エキソン領域中の体細胞ＳＮＰの数
synonymous_SNP: アミノ酸の変化を生じさせない単一のヌクレオチドの変化
missense_SNP: アミノ酸の変化を生じさせる単一のヌクレオチドの変化
stopgain: バリアント部位で終止コドンを即座に生成する非同義置換ＳＮＰ
stoploss: バリアント部位で終止コドンを即座に除去する非同義置換ＳＮＰ
unknown: 未知の機能（データベースファイルの遺伝子構造定義におけるさまざまなエラーに由来する）。
intronic: イントロン領域中の体細胞ＳＮＰの数
UTR3: ３’ＵＴＲ領域中の体細胞ＳＮＰの数
UTR5: ５’ＵＴＲ領域中の体細胞ＳＮＰの数
intergenic: 遺伝子間領域中の体細胞ＳＮＰの数
ncRNA_exonic: 非コードＲＮＡエキソン領域中の体細胞ＳＮＰの数
ncRNA_intronic: 非コードＲＮＡイントロン領域中の体細胞ＳＮＰの数
upstream:  転写開始領域の１ｋｂ上流領域における体細胞ＳＮＰの数
downstream: 転写終止領域の１ｋｂ下流領域における体細胞ＳＮＰの数
splicing: １０ｂｐスプライシングジャンクション領域における体細胞ＳＮＰの数
ncRNA_UTR3: 非コードＲＮＡの３’ＵＴＲにおける体細胞ＳＮＰの数
ncRNA_UTR5: 非コードＲＮＡの５’ＵＴＲにおける体細胞ＳＮＰの数
ncRNA_splicing: 非コードＲＮＡの１０ｂｐスプライシングジャンクションにおける体細胞ＳＮＰの数
Total: 体細胞ＳＮＰの総数
表５は、ＳＶＮ、インデル、およびＳＶのサマリーである。
【０１４８】
【表５】
2018527943.tif 000008
aSomaticInDels - Strelkaでコールした、コントロールの細胞株と比較した＋Ｃａｓ９／＋ｇＲＮＡでの特定のインデルを示す。
bSomaticSNVs - MuTectでコールした、コントロールの細胞株と比較した＋Ｃａｓ９／＋ｇＲＮＡでの特定のＳＮＶを示す。
cTotalSV - Crestでコールした、欠失および挿入のＳＶ型のみを含む。
dSomaticSVs - Crestでコールした、コントロールの細胞株と比較した＋Ｃａｓ９／＋ｇＲＮＡでの特定のＳＶ（欠失および挿入）を示す。
【０１４９】
検討
まとめると、上記の結果は、レンチウイルスで送達したＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂは、ＨＩＶ‐１感染患者から採取したＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞中のウイルスコピー数とタンパク質レベルを大きく減少させたことを示した。ＬＴＲ内に向けられたプライマーセットを用いたＰＣＲは、残りのウイルスＤＮＡ断片を増幅し、検出した。当該残りのウイルスＤＮＡ断片は、これらの細胞内で完全にはなくなっていなかったが、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによって影響され、ＰＡＭ配列近くにインデル変異を含んでいた。これらの所見は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、ＨＩＶ‐１患者のＰＢＭＣ中で有効な抗ウイルス活性を発揮したことを実証した。
【０１５０】
ＡＲＴ処置は感染患者からＨＩＶ‐１を根絶することができないので、患者は生涯にわたって処置を受けなければならない。本明細書に記載した新たな治療法は、永続的な寛解を達成する。そのため、患者は、ＡＲＴ処置を止めてそれに付随する費用を減らし、長期にわたる副作用の可能性を減らすことができる。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からＨＩＶ‐１の組み込みコピーを根絶した上記の開発されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、一次培養ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ‐１感染を防ぎ、ＨＩＶ‐１＋患者の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるエクスビボのウイルス複製を抑えた。上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術はまた、別の重要課題にも応えており、そのような遺伝子編集が、宿主ＤＮＡに遺伝毒性を引き起こすことなしに、または宿主細胞経路を介して破壊的な影響を引き出すことなしに、ウイルス複製を効果的に妨げるという証拠を提供する。本研究では、第１のステップとして、（ｉ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡが、ＨＩＶ‐１ＤＮＡの組み込みコピーのコード配列全体を、非常に深い全ゲノムシーケンシングを用いて取り除く能力を立証し、（ｉｉ）オフターゲット効果および細胞の生存に関するその安全性を調査するため、２Ｄ１０クローン細胞株をヒトＴ細胞潜伏モデルとして用いた。これらの目的が達成されたら、本研究は、一次細胞培養および患者のサンプルに注意を移し、実験室の環境で、ウイルスＤＮＡロードにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が影響を与える効率性を調べた。
【０１５１】
染色体中に散らばるウイルスＤＮＡの多数のコピーを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が編集したことがわかった。潜伏感染したＴ細胞を、Ｃａｓ９と、ＬＴＲ  Ｕ３領域中の特定のＤＮＡモチーフを認識するｇＲＮＡ  ＡおよびＢとを組み合わせたもので処置することで、２つのＬＴＲ間のウイルスＤＮＡ断片全体が効率的に取り除かれた。染色体１におけるＣａｓ９およびｇＲＮＡＢによる残りの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ切断部位、および染色体１６におけるＣａｓ９およびｇＲＮＡ  ＡおよびＢによる残りの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ切断部位が、ＰＡＭの正確に３ヌクレオチド上流に位置する部位において宿主ＤＮＡ修復によって接合された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９処置されたＨＩＶ‐１感染２Ｄ１０細胞をゲノムワイド評価すると、ＲＳＢＮ１の第２イントロンおよびＭＳＲＢ１遺伝子のエキソン２からウイルスＤＮＡの組み込みコピーが完全に切断されたことがはっきりと実証された。特異性および潜在的オフターゲット効果による悪影響に応じるため、前例のない詳しさのレベルで、包括的な分析を、全ゲノムシーケンシングとバイオインフォマティック分析によって行った。これらにより、コントロールの細胞のゲノムにおいて自然に生じる多くの変異、および、ｇＲＮＡ  ＡおよびＢによって媒介されたＨＩＶ‐１  ＤＮＡ根絶が明らかになった。発見された変異は、自然に生じるインデル、塩基の切除、塩基の置換を含み、それらはすべて、多かれ少なかれ、培地内で急速に増殖する細胞（Ｊｕｒｋａｔ２Ｄ１０細胞を含む）で予期されるものである。重要なのは、これらの変異のいずれも、遺伝子編集システムに由来するものではないというここでの発見である。なぜなら、任意のそのような変異部位の１２００個のヌクレオチドの中で、ｇＲＮＡ  ＡまたはＢと一致する配列はなかったからである。さらに、このＨＩＶ‐１ＤＮＡ切除法は、近位または遠位の細胞遺伝子に悪影響を及ぼさず、細胞の生存、細胞サイクルの進行、または増殖に何の影響も与えず、アポトーシスを引き起こしもしなかった。これにより、この翻訳フェーズにおいて、培養細胞で測られたすべてのインビトロ測定値に基づいて、その安全性を強力に支持した。Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの発現レベルは、数世代の継代培養のあと減少し、最後には消滅するが、Ｃａｓ９および単一のまたは複数のｇＲＮＡが存在する限り、細胞は新たなＨＩＶ‐１感染に対して守られ続けることがわかった。
【０１５２】
答えが得られた他の重要な翻訳実現性の疑問は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で媒介されたＨＩＶ‐１根絶は、もっとも関連のあるヒトおよび患者の標的細胞集団のＨＩＶ‐１感染を予防または抑えることができるかどうかということであった。ＨＩＶ‐１感染患者から得たＰＢＭＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞において、レンチウイルスで送達したＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂが、ウイルスコピー数およびタンパク質レベルを大きく減少させたことがわかった。ＬＴＲ内に向けられたプライマーセットを用いて、増幅され検出された残りのウイルスＤＮＡ断片は、これらの細胞内で完全になくなりはしなかったが、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの影響を受け、ＰＡＭ配列の近くにインデル変異を含んだ。これらの発見は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＨＩＶ‐１患者のＰＢＭＣ中で有効な抗ウイルス活性を発揮することを実証した。また、レンチウイルス送達を介してＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂを一次培養ヒトＣＤ４＋ＨＩＶ‐１ＪＲＦＬ‐またはＨＩＶ‐１ＮＬ４‐３‐感染Ｔ細胞に導入することで、ウイルスコピー数が大幅に減少することもわかった。これは、ＨＩＶ‐１に向けた、安定的に組み込まれたＣａｓ９およびｇＲＮＡ（現在用いられているｇＲＮＡ  ＡおよびＢとは区別される）が、細胞株のＨＩＶ‐１感染に抵抗力を与えたことを裏付ける。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は組み込みＤＮＡ配列およびエピソームＤＮＡ配列の両方を標的とすることができる（このことは、どちらの構成においてもさまざまなヒトウイルスおよびプラスミドＤＮＡを編集できる能力により証明される）ことを考えると、組み込まれたＨＩＶ−１ＤＮＡのみならず、組み込まれる前の浮遊している細胞間ＨＩＶ‐１ＤＮＡもＣａｓ９／ｇＲＮＡによって編集される可能性が高い。
【０１５３】
上述したように、これらの研究を進めるあいだ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による処置以前にＡＲＴは行わなかった。本研究の目標は、ウイルス感染の産生段階でのウイルス抑制の程度を判定することだったからである。大きなレベルの抑制が観察された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、宿主染色体中の機能的に活性化されたＨＩＶ‐１ＤＮＡの組み込みコピーの発現を効果的に不能としたという証拠を提供する。この考えは、染色体１および１６に組み込まれたＨＩＶ‐１の潜在コピーがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって効果的に取り除かれたという、２Ｄ１０  ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた観察によって支持される。結論として、本明細書に記載した発見は、ヒトＴ細胞において宿主組み込みＨＩＶ‐１のコード配列全体が根絶されたと包括的かつ決定的に示すものであり、これは、そのようなシステムが、患者のＴ細胞に向けたＨＩＶ‐１治療に翻訳可能であることを強く支持する。
【０１５４】
本発明は、例示を用いて記載してきた。用いられた用語は、限定のための語ではなく説明のための語であることを意図している。上記教示に照らして、本発明をさまざまに変形・変更可能であることは明らかである。したがって、本発明は、添付の請求項の範囲内であるならば、具体的に説明されたのとは異なるように実施しうることを理解されたい。
【図１Ａ】
2018527943.tif 000009
【図１Ｂ】
2018527943.tif 000010
【図１Ｃ】
2018527943.tif 000011
【図１Ｄ】
2018527943.tif 000012
【図２Ａ】
2018527943.tif 000013
【図２Ｂ】
2018527943.tif 000014
【図２Ｃ】
2018527943.tif 000015
【図２Ｄ】
2018527943.tif 000016
【図３Ａ】
2018527943.tif 000017
【図３Ｂ】
2018527943.tif 000018
【図３Ｃ】
2018527943.tif 000019
【図３Ｄ】
2018527943.tif 000020
【図３Ｅ】
2018527943.tif 000021
【図３Ｆ】
2018527943.tif 000022
【図４Ａ】
2018527943.tif 000023
【図４Ｂ】
2018527943.tif 000024
【図４Ｃ】
2018527943.tif 000025
【図４Ｄ】
2018527943.tif 000026
【図４Ｅ】
2018527943.tif 000027
【図５Ａ】
2018527943.tif 000028
【図５Ｂ】
2018527943.tif 000029
【図５Ｃ】
2018527943.tif 000030
【図５Ｄ】
2018527943.tif 000031
【図５Ｅ】
2018527943.tif 000032
【図６Ａ】
2018527943.tif 000033
【図６Ｂ】
2018527943.tif 000034
【図６Ｃ】
2018527943.tif 000035
【図６Ｄ】
2018527943.tif 000036
【図６Ｅ】
2018527943.tif 000037
【図６Ｆ】
2018527943.tif 000038
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【国際調査報告】
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