(57)【要約】  本発明は、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体、それらの産生方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体であって、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の一価抗原結合部位、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の一価抗原結合部位、及びＢＢＢ−Ｒに特異的な第３の一価抗原結合部位を含む、三重特異性抗体。
【請求項２】
第３の抗原結合部位のＢＢＢ−Ｒが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される、請求項１に記載の三重特異性抗体。
【請求項３】
第３の抗原結合部位がトランスフェリン受容体に特異的である、請求項１又は２に記載の三重特異性抗体。
【請求項４】
第３の抗原結合部位が、配列番号２０２、２０３及び／又は２０４のアミノ酸配列内に含まれるトランスフェリン受容体のエピトープに特異的に結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項５】
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合することができる第１のＦａｂ分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合することができる第２のＦａｂ分子を含み、ここで第１のＦａｂ分子の可変軽鎖の配列が第２のＦａｂ分子の可変軽鎖の配列と同一である、請求項１から４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項６】
（ａ）
配列番号５５、配列番号５８、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号７７、配列番号１５、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５６、配列番号５９、及び配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖、及び
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖
（ｃ）第１及び第２の軽鎖の可変軽鎖が、配列番号８９、配列番号９０、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第１及び第２の軽鎖
を含む、請求項５に記載の三重特異性抗体。
【請求項７】
配列番号５４のアミノ酸配列を含む２つの可変軽鎖、配列番号６４、配列番号７０、及び配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、並びに配列番号９２及び配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖を含む、請求項５に記載の三重特異性抗体。
【請求項８】
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合することができる第１のＦａｂ分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合することができる第２のＦａｂ分子を含み、ここで少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、請求項１から４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項９】
第１のＦａｂ分子が、
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、
第２のＦａｂ分子が、
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項８に記載の三重特異性抗体。
【請求項１０】
第１のＦａｂ分子が、
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含み、第２のＦａｂ分子が、
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１０４、配列番号１０３、及び配列番号１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項８に記載の三重特異性抗体。
【請求項１１】
第１のＦａｂ分子が、
配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、第２のＦａｂ分子が、配列番号１０５のアミノ酸配列及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８又は９に記載の三重特異性抗体。
【請求項１２】
ＢＢＢ−Ｒに特異的な第３の抗原結合部位が、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである、請求項１から１１の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項１３】
ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂが、第１及び第２の抗原結合部位を含むＩｇＧ分子のＮ末端に連結される、請求項１２に記載の三重特異性抗体。
【請求項１４】
ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂが、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＣ末端に連結される、請求項１２に記載の三重特異性抗体。
【請求項１５】
第３の抗原結合部位が、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８８、配列番号２０６又は配列番号１７４の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項１６】
第３の抗原結合部位が、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項１７】
第３の抗原結合部位が、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又はそのヒト化バージョンを含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項１８】
第３の抗原結合部位が、配列番号１９２又は配列番号２０５のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項１９】
第３の抗原結合部位が、配列番号１８０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８２の重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１８３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８５の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項２０】
第３の抗原結合部位が、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号１６７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又はそのヒト化バージョンを含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項２１】
第３の抗原結合部位が、配列番号９２、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、又は配列番号２００のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２０８、又は配列番号２０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項２２】
請求項１から２１の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
がんの治療のための、請求項１から２１の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項２４】
がんの治療における使用のための、請求項１から２１の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項２５】
医薬として使用のための、請求項１から２１の何れか一項に記載の三重特異性抗体。
【請求項２６】
医薬の製造における、請求項１から２１の何れか一項に記載の三重特異性抗体の使用。
【請求項２７】
医薬ががんの治療のためである、請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
がんが脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんである、請求項２３に記載の治療又は請求項２４から２６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２９】
請求項１から２１の何れか一項に記載の三重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む、核酸配列。
【請求項３０】
請求項１から２１の何れか一項に記載の三重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む、核酸配列。
【請求項３１】
請求項２９及び／又は請求項３０の何れか一項に記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む、原核又は真核宿主細胞。
【請求項３３】
抗体が産生されるように請求項３２に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項３４】
特に前述の実施例を参照とした本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体、それらの産生方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍関連抗原に特異的な抗体は、健常な細胞及び組織を損傷させずに残しつつ、腫瘍細胞の選択的破壊を媒介するため、がん治療における有用なアプローチである。抗体などの大きな分子による中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼすがんの治療は、大部分が不透過性の血液脳関門（ＢＢＢ）によって脳の浸透が著しく制限されるため、依然として困難である。過去の研究は、血流中を循環するＩｇＧの非常に小さな割合（約０．１％）がＢＢＢを通過してＣＮＳに入ることを示しており（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)、ここでは抗体のＣＮＳ濃度は強い作用を可能にするには不十分である可能性がある。この障害を克服するための多くの戦略の中には、脳毛細血管内皮において発現される内因性受容体のトランスサイトーシス輸送経路を利用することである。モノクローナル抗体のような組換えタンパク質は、大分子の脳への受容体媒介送達を可能にするために、これらの受容体に対して設計されている。しかしながら、血液への逆方向トランスサイトーシスを最小限に抑えつつ脳への取り込みを最大にする戦略、及び治療薬投薬後の蓄積の程度は未だ解明されていない。更に、ＢＢＢを通過する抗体が薬力学的に機能的であるか否かは不明である。
【０００３】
受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、及び生存の重要なメディエーターである。受容体ファミリーは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐｌ８５”ｅ”）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む４つの異なるメンバーを含む。ＨＥＲ２は、膜貫通型表面結合受容体チロシンキナーゼであり、通常、細胞増殖及び分化をもたらすシグナル伝達経路に関与する。ＨＥＲ２は、乳がん患者の約４分の１で過剰発現していることが判明したため、乳がんの治療のための有望な標的である（Bange et al, 2001, Nature Medicine 7:548）。
【０００４】
マウスモノクローナル抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現するがん細胞においてＨＥＲ２を特異的に標的とし、一方生理学的レベルのＨＥＲ２を発現する細胞には影響を及ぼさない。ヒト化（４Ｄ５）モノクローナル抗体（ｈｕ４Ｄ５）は、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、米国特許第５８２１３３７号）として商業的に知られており、１９９８年後半にＦＤＡの販売承認を得た。
【０００５】
ハーセプチンは、ＨＥＲ２陽性乳がんの治療のために開発された最初のモノクローナル抗体であり、ＨＥＲ２陰性乳がんを有する患者と同じように患者の生存期間を増加させる。ハーセプチン治療の前に、ＨＥＲ２陽性乳がんと診断された患者では、ＨＥＲ２陰性疾患を有する患者と比較して、より短い生存転帰が予想された。ＣＬＥＯＰＡＴＲＡ試験では、ハーセプチンと化学療法とを組み合わせたパージェタ（ＰＥＲＪＥＴＡ）は、この攻撃性疾患を有する患者においてハーセプチンよりも更に長い生存期間を示している。
【０００６】
ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡＴＭ、ｒｈｕＭａｂ  ２Ｃ４、米国特許第７８６２８１７号）は、ヒト化モノクローナル抗体であり、これは腫瘍増殖及び生存において役割を果たすと考えられるプロセスである、ＨＥＲ２受容体が細胞の表面上の他のＨＥＲ受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４）と対形成（二量体化）するのを特異的に防止するように設計されている。パージェタ、ハーセプチン、及び化学療法の組み合わせは、ＨＥＲシグナル伝達経路のより包括的な遮断を提供すると考えられている。パージェタは、ＨＥＲ２陽性の転移性又は局所再発性の切除不能乳がんを有する成人患者においてハーセプチン（トラスツズマブ）及びドセタキセルと組み合わせて承認され、２０１３年９月に術前乳がん治療のためのＦＤＡ承認を取得した。ペルツズマブは、二量体化に必須のＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するが、トラスツズマブはＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに結合する。
【０００７】
Li et al (Cancer Research. 2013) は、トラスツズマブ耐性を克服するＥｒｂＢ２に対する二重特異性二価抗体を記載している。そこに記載されている二重特異性二価抗体は、天然のトラスツズマブ及びペルツズマブの配列に基づいている。
【０００８】
中枢神経系（ＣＮＳ）転移は、ＨＥＲ２陽性転移性乳がん（ＭＢＣ）の患者の半数にまで観察され、改善された全身治療により生存期間が延長されるため、発生率が上昇し続ける可能性がある。がん細胞の増殖を停止させるためにＨＥＲ２を特異的にブロックする薬物は、ＨＥＲ２標的療法と呼ばれている。これらの薬物の例には、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ）、及び一般にＴ−ＤＭ１と呼ばれるトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ）が含まれる。これらの薬物の幾つかは、化学療法と併用することができる。残念なことに、これらの薬物は通常、身体の残りの部分に到達することができるようには容易に脳に到達することができず、ラパチニブは例外である可能性がある。従って、がんが脳に広がると、それは通常、手術及び／又は放射線療法で治療される。放射線療法に基づくアプローチは効果的であるが、潜在的な短期及び長期の毒性があり、患者はしばしば悪化する。既存の全身療法に対するＣＮＳの応答は一般的に貧弱であり、ＨＥＲ２陽性ＭＢＣにおけるＣＮＳ転移のために承認された治療はなく、大きな満たされていない要求が存在する。
【０００９】
驚くべきことに、本出願の発明者らは、天然型のトラスツズマブ及びＰｅｒｔｕｚｕｍａｂの配列を最適化し、これらの最適化された変異体を血液脳関門受容体（ＢＢＢＲ）を標的とする第３のバインダーと組み合わせることにより、単一特異性抗体ｒｈｕＭａｂ  ２Ｃ４とｈｕ  ４Ｄ５の組み合わせと比較して改善された特性を有する機能分子が得られることを見出した。従って、新しい三重特異的フォーマットは、当該技術分野で周知の二重特異性ＨＥＲ２抗体の優れた特徴と、古典的な単一特異性ＨＥＲ２抗体及び特異的ＣＮＳ標的化の利点とを組み合わせる：本発明の新規三重特異性抗体は、２つの異なるＨＥＲ２エピトープに対して一価であり、二価親抗体と同じアビディティー効果をもたらし、ＢＢＢＲ結合部分を介してＣＮＳを特異的に標的とする。対照的に、４価抗体は細胞上のＨＥＲ２に対するそれらのアビディティーが異なる場合がある。新規三重特異性ＨＥＲ２抗体のアビディティー効果は、ＨＥＲ２及び／又はＡＤＣＣの阻害が所望され得ない正常組織又は心臓組織などの低いＨＥＲ２発現を伴う細胞型に対して優れた安全性ウインドウをもたらし得る。
【００１０】
本発明の一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体が提供され、Ｆａｂ断片の１つがクロスオーバーＦａｂ断片によって置換されたＩｇＧ分子を含む。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、国際公開第２００９０８０２５２号、国際公開第２００９０８０２５３号、国際公開第２００９０８０２５１号、国際公開第２００９０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されている。天然型トラスツズマブ配列は、自発的化学修飾に対する抗体ＣＤＲの安定性を改善するために、それらのＣＤＲにおいて最適化されており、得られた配列は誤った対合を避けるためにフレームワークに移植され、ＨＥＲ２に特異的に結合する非常に強力な三重特異性抗体を生じ；最終的にそれらは従来の親Ｈｅｒ２抗体に匹敵する高収率で、かつごく低割合の副生成物で生産することができる。ペルツズマブ及びトラスツズマブの両方が同等のフレームワーク領域に基づくという事実に起因する軽鎖の鎖誤対合は、完全に新規な抗体フレームワークにＣＤＲを移植することによって克服されている。
【００１１】
本発明の別の態様では、ＨＥＲ２の２つの結合部分が、親トラスツズマブ軽鎖及びペルツズマブ軽鎖のコンセンサスに基づいて同一の軽鎖を含み、かつ対応するペルツズマブ重鎖が再構築されている、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体が提供される。このいわゆる「共通軽鎖」の原理の使用、すなわち１つの軽鎖を共有するが別個の特異性を有する２つのバインダーを組み合わせることは、軽鎖の誤対合を防止し、この特定の場合には親抗体のエピトープ特異性を保持する。結果として、産生中に副産物が少なくなり、高収率で三重特異性抗原結合分子の均質な調製を促進する。驚くべきことに、本発明者らは、一価の共通軽鎖フォーマットの二重特異性ＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブエピトープに対して増加した親和性を有し、親抗体の組み合わせと比較して、細胞増殖、及び細胞依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導に対して優れた阻害効果を示すことを見出した。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、最適な治療モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の機能にとって非常に重要であり、化学療法治療後でさえも完全に保存されている。しかしながら、この活性は幾つかの抗体によって生じるが、それらの全てではない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体であって、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の一価抗原結合部位、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の一価抗原結合部位、及びＢＢＢ−Ｒに特異的な第３の一価抗原結合部位を含む三重特異性抗体に関する。一態様では、第３の抗原結合部位のＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。一態様では、第３の抗原結合部位はトランスフェリン受容体に特異的である。一態様では、第３の抗原結合部位は、配列番号２０２，２０３及び／又は２０４のアミノ酸配列内に含まれるトランスフェリン受容体のエピトープに特異的に結合する。
【００１３】
一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合することができる第１のＦａｂ分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合することができる第２のＦａｂ分子を含み、ここで第１のＦａｂ分子の可変軽鎖の配列は第２のＦａｂ分子の可変軽鎖の配列と同一である。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、（ａ）配列番号５５、配列番号５８、及び配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号７７、配列番号１５、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６又は配列番号５９及び配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む第１の重鎖；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む第２の重鎖；及び（ｃ）第１及び第２の軽鎖を含み、ここで第１及び第２の軽鎖の可変軽鎖は、配列番号８９、配列番号９０、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む２つの可変軽鎖、配列番号６４、配列番号７０、及び配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、並びに配列番号９２及び配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合することができる第１のＦａｂ分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合することができる第２のＦａｂ分子を含み、ここで少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む第１のＦａｂ分子、並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む第２のＦａｂ分子を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む第１のＦａｂ分子、並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１０４、配列番号１０３、及び配列番号１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む第２のＦａｂ分子を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む第１のＦａｂ分子、並びに配列番号１０５のアミノ酸配列及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第２のＦａｂ分子を含む一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂから選択されるＢＢＢ−Ｒに特異的な第３の抗原結合部位を含む。一態様では、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂは、第１及び第２の抗原結合部位を含むＩｇＧ分子のＮ末端に連結される。一態様では、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂは、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＣ末端に連結される。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８８、配列番号２０６又は配列番号１７４の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む第３の抗原結合部位を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む第３の抗原結合部位を含む。
【００１４】
一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又はそのヒト化バージョンを含む第３の抗原結合部位を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１９２又は配列番号２０５のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号１９３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む第３の抗原結合部位を含む。
【００１５】
一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１８０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８２の重鎖ＣＤＲ３；並びに配列番号１８３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８５の軽鎖ＣＤＲ３を含む第３の抗原結合部位を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号１６７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又はそのヒト化バージョンを含む第３の抗原結合部位を含む。一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、又は配列番号２００のアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２０８、又は配列番号２０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む第３の抗原結合部位を含む。
【００１６】
一態様では、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体は、減少した親和性をもたらすＣＤＲにおける配列改変を含む第３の抗原結合部位を含む。
第２の目的において、本発明は、本発明の三重特異性抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００１７】
第３の目的において、本発明は、がんの治療のための本発明の三重特異性抗体に関する。別の実施態様では、医薬としての三重特異性抗体の使用が提供される。好ましくは、前記使用はがんの治療のためである。一態様において、前記がんは脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんである。
【００１８】
更なる目的において、本発明は、本発明の三重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の三重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核又は真核宿主細胞に関する。更に、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む抗体を産生する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の模式図。抗体は、各抗原結合部位について二価であり、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２受容体において２つの異なるパラトープに結合することができる（抗原１＝トラスツズマブ特異性、すなわちＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶ；抗原２＝ＨＥＲ２のペルツズマブ特異性細胞外ドメインＩＩ）（Ａ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＨ−ＶＬの順序で重鎖とＮ末端で融合している（ＴｖＡＢ１２：配列番号１２３及び１２４）。（Ｂ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ−ＶＨの順序で軽鎖とＮ末端で融合している（ＴｖＡＢ１３、配列番号１２５及び１２６）。（Ｃ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ−ＶＨの順序で軽鎖とＣ末端で融合している（ＴｖＡＢ１６：配列番号１２７及び１２８、ＴｖＡＢ２０：配列番号１３１及び１３２）。（Ｄ）：単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ−ＶＨの順序で重鎖とＮ末端で融合している（ＴｖＡＢ１７：配列番号１２９及び１３０）。
【図２】２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の精製。（Ａ）：２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのＴｖＡｂ１２（配列番号１２３及び１２４）のサイズ排除精製。（Ｂ）：サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＲ＝非還元性、Ｒ＝還元性条件）からの主ピーク画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析。
【図３】２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の精製。（Ａ）：２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのＴｖＡｂ１６（配列番号１２７及び１２８）のサイズ排除精製。（Ｂ）：サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＲ＝非還元性、Ｒ＝還元性条件）からの主ピーク画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析。
【図４】２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の精製。（Ａ）：２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）のサイズ排除精製。主生成物のピークには「１」と表示される。（Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＲ＝非還元性、Ｒ＝還元性条件）からの主ピーク画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析。
【図５】４０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０の緩衝液中で、４０℃で１、２、又は３ヶ月間試料をインキュベートした後のＳＰＲ法（ＰｒｏｔｅＯｎ装置）によって測定したトラスツズマブ変異体のオフレート（Ｏｆｆ−ｒａｔｅ）。変異体のオフレートは、調査期間にわたって変化しない。「６０２」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異。
【図６】４０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、異なるｐＨで、４０℃で１、２、又は３ヶ月間試料をインキュベートした後のＳＰＲ法（ＰｒｏｔｅＯｎ装置）によって測定したトラスツズマブ変異体のオフレート（Ｏｆｆ−ｒａｔｅ）。Ｎ３０Ｓ変異体のオフレートは非常に遅く、従って高度の不確実性を含んでいる。「６０２」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異、「Ｎ３０Ｔ」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｔ変異、「Ｎ３０Ｓ」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｓ変異。（Ａ）：ｐＨ５．０、（Ｂ）：ｐＨ６．０、（Ｃ）：ｐＨ７．４。
【図７】ＫＰＬ−４細胞へのストレス後のトラスツズマブ及びトラスツズマブ安定化変異体の結合。トラスツズマブ及び３つの異なる安定化トラスツズマブ変異体を、４０℃で異なるｐＨ値を有する緩衝液中で１、２及び３月間インキュベートした。ストレスを受けた抗体を、フローサイトメトリーによりＫＰＬ−４細胞への結合について時点０での抗体と比較して試験した。「６０２」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異、「Ｎ３０Ｔ」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｔ変異、「Ｎ３０Ｓ」：重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＮ３０Ｓ変異。
【図８】ＫＰＬ−４細胞へのストレス後のトラスツズマブ及びトラスツズマブ安定化変異体の結合。トラスツズマブ及び２つの安定化変異体ＧＡ６０２（重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異）及びＧＡ６０３（重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異並びにＦｃＲＮ変異Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ）を緩衝液１（４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）又は緩衝液２（２．４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中、４０℃で１，２及び３ヶ月間インキュベートした。ストレスを受けた抗体を、フローサイトメトリーによるＫＰＬ−４細胞への結合について時点０での抗体と比較して試験した。
【図９】ＫＰＬ−４細胞に対するストレス後のトラスツズマブ、ＧＡ６０２、及びＧＡ６０３によるＡＤＣＣ誘導。トラスツズマブ及び２つの安定化変異体ＧＡ６０２（重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異）及びＧＡ６０３（重鎖におけるＤ９８Ｅ変異及び軽鎖におけるＴ３１Ｖ変異並びにＦｃＲＮ変異Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ）を緩衝液１（４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）又は緩衝液２（２．４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中、４０℃で１，２及び３ヶ月間インキュベートした。ストレスを受けた抗体を、ＫＰＬ−４細胞における４時間後のＡＤＣＣ誘導について時点０での抗体と比較して試験した。
【図１０】１＋１フォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の模式図。（Ａ）：単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）ベースの分子（Ｂ）：クロスオーバーＦａｂ（ｘＦａｂ）ベースの分子。
【図１１】ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＰｅｒの精製（配列番号１０９、１１０、９６、８６）。（Ａ）：還元及び非還元条件下での精製抗体分子を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）：精製されたＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＰｅｒのＨＰ−ＳＥＣ分析。
【図１２】抗体分子の完全性及び純度を評価する、Ｑ−ＴＯＦ質量分析法によるＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａ（上、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２）及びＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧ（下、配列番号１０９、１１０、１１１、１１２）のスペクトルの比較。
【図１３】ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイで測定したインキュベーションの５日後の非糖鎖操作型ＨＥＲ２  ＣｒｏｓｓＭａｂ（配列番号１１９，１２０，１２１，１２２）による増殖阻害。（Ａ）ＢＴ４７４細胞（Ｂ）Ｎ８７細胞。
【図１４】（Ａ）ＫＰＬ−４、（Ｂ）Ｔ４７Ｄ及び（Ｃ）Ｃａｌｕ−３を標的細胞として用いて異なるＨＥＲ２特異的抗体によって誘導されたＡＤＣＣ（Ｅ：Ｔ＝２５：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、インキュベーション時間４時間）。「ＨＥＲ２  ｃｒｏｓｓｍａｂ  ｗｔ」配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、非糖鎖操作型；「ＨＥＲ２  ｃｒｏｓｓｍａｂ  ｇ２」：配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、糖鎖操作型。
【図１５】Ｃａｌｕ３非小細胞肺がん異種移植における異なる抗Ｈｅｒ２抗体の抗腫瘍活性（実験：ＢｉｓｐｅｃＨｅｒ２＿ＰＺ＿Ｃａｌｕ３＿００１）。Ｃａｌｕ３異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは腹腔内に（ｉ．ｐ．）指示された投与量で週に１回７週間投与された。ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）を対照として使用した。エンドポイント（８５日目）での中央値に基づいた統計的分析は、ゾレアと比較して、二重特異性ＨＥＲ２抗体は腫瘍増殖を８７．５％（ｓ）；ＯｍｎｉＥ（配列番号１４５，１４６）は４３．７％（ｎ．ｓ．）；Ｃｒｏｓｓｍａｂ＿００３（配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、非糖鎖操作型）は９２．１％（ｓ．）；ＴｖＡｂ１２（配列番号１２３及び１２４）は５９．８％（ｎ．ｓ．）及びＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）は１２．６％（ｎ．ｓ．）抑制したことを明らかにした。腫瘍増殖曲線は、平均＋／−ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝８）。
【図１６】ＫＰＬ−４乳がん異種移植における異なる抗Ｈｅｒ２抗体の抗腫瘍活性（実験：Ｂｉｓｐｅｃ．Ｈｅｒ２＿ＰＺ＿ＫＰＬ−４＿００２）。ＫＰＬ−４異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは腹腔内に（ｉ．ｐ．）指示された投与量で週に１回５週間投与された。ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体Ｘｏｌａｉｒを対照として使用した。エンドポイント（５９日目）での中央値に基づいた統計的分析は、ゾレアと比較して、二重特異性ＨＥＲ２抗体は腫瘍増殖を１２０．８％（ｓ）；Ｃｒｏｓｓｍａｂ＿００３（配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、非糖鎖操作型）は１２０．６％（ｓ．）；ＴｖＡｂ１２（配列番号１２３及び１２４）は７０．１％（ｓ．）；ＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）は８３．４％（ｓ．）抑制したことを明らかにした。ＯｍｎｉＥ（配列番号１４５，１４６）は、腫瘍増殖に対して有意な効果を有さなかった。腫瘍増殖曲線は、平均＋／−ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝９）。
【図１７】ＫＰＬ−４乳がん異種移植片における抗Ｈｅｒ２＿００５ｃｒｏｓｓｍａｂ抗体（配列番号１１９，１２０，１２１，１２２、非糖鎖操作型）の抗腫瘍活性（実験：Ｂｉｓｐｅｃ．Ｈｅｒ２＿ＰＺ＿ＫＰＬ−４＿００３）。ＫＰＬ−４異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは腹腔内に（ｉ．ｐ．）１週間に１回、１〜２０ｍｇ／ｋｇのｃｒｏｓｓｍａｂの漸増用量を５週間投与された。ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）を対照として使用した。エンドポイント（７０日目）での中央値に基づく統計分析は、ゾレアと比較して、二重特異性ＨＥＲ２抗体は１２１．８％（ｓ．）腫瘍増殖を抑制した；Ｈｅｒ２  ｃｒｏｓｓｍａｂ＿００５は、１ｍｇ／ｋｇの投与量で２５．１％（ｎ．ｓ．）腫瘍増殖を抑制し；５ｍｇ／ｋｇで１１２．３％（ｓ．）；１０ｍｇ／ｋｇで１０９．５％（ｓ．）及び２０ｍｇ／ｋｇで１２１．８％（ｓ．）抑制したことを明らかにした。腫瘍増殖曲線は、平均＋／−ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝１０）。
【図１８】ＫＰＬ−４乳がん異種移植における異なる抗Ｈｅｒ２抗体の抗腫瘍活性（実験：Ｂｉｓｐｅｃ．Ｈｅｒ２＿ＰＺ＿ＫＰＬ−４＿００９）。ＫＰＬ−４異種移植片腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスは腹腔内に（ｉ．ｐ．）異なる化合物を週に１回４週間投与された。ヒトＩｇＥを標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）を対照として使用した。エンドポイント（７０日目）での中央値に基づく統計分析は、ゾレアと比較して、二重特異性ＨＥＲ２抗体（それぞれ５ｍｇ／ｋｇで投与）は、腫瘍増殖を８３．２％（ｓ．）抑制し、かつ両方ともそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの用量では１０９．５％（ｓ．）抑制したことを明らかにした。２つの異なる投与量（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で与えられたＴｖＡｂ  １６（配列番号１２７及び１２８）は、有意な抗腫瘍効果を有さなかった。５ｍｇ／ｋｇの投与量でのＴｖＡｂ２０（配列番号１３１及び１３２）は、腫瘍増殖を７５．３％（ｓ．）及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量で５９．８％（ｎ．ｓ．）抑制した。腫瘍増殖曲線は、平均＋／−ＳＥＭとして示される（各群においてｎ＝１０）。
【図１９】最初のペルツズマブ／トラスツズマブハイブリッド軽鎖のＳＰＲ分析。ペルツズマブ、トラスツズマブ、及びトラスツズマブＬＣＤＲ３領域のアミノ酸残基を有する初期のペルツズマブハイブリッドＬＣとの配列組み合わせのＳＰＲに基づく動態分析。滑らかな線は、１対１の相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。ＰｅｒｔｕｚｕｍａｂＴｒａｓＬ３：配列番号２６、ペルツズマブＴｒａｓ  Ｙ９１Ｈ：配列番号２８。
【図２０】新たに同定された共通軽鎖ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）、配列番号５４と組み合わせたペルツズマブＨＣ及びトラスツズマブＨＣのＳＰＲ分析。示されるのは異なる濃度での両方の抗体のＨｅｒ２への結合である。滑らかな線は、１対１の相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図２１】ファージディスプレイによって同定された親和性成熟ペルツズマブクローンの特徴づけ。同定された親和性成熟クローンのＳＰＲ分析。示されるのは異なる濃度での細菌ＦａｂのＨｅｒ２への結合である。滑らかな線は、１対１の相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。Ｂ２：配列番号６６、Ｄ１：配列番号６２、Ｅ１：配列番号６８、Ｃ８：配列番号７２、Ｇ２：配列番号７０、Ａ１：配列番号７４．
【図２２】共通の軽鎖を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体の模式図。
【図２３】共通の軽鎖を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体の精製及び分析的特徴づけ。精製方法は、親和性工程（プロテインＡ）、続くサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含んでいた。最終生成物を分析し、分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム）によって特徴づけた。（Ａ）：Ｄ１ｄｅｒ（配列番号６４）を含む、（Ｂ）：Ｇ２（配列番号７０）を含む、（Ｃ）：Ｅ１（配列番号６８）を含む。
【図２４】Ｈｅｒ２ノックアウト変異体のＳＰＲ分析。両方のノックアウト変異体に結合するトラスツズマブ及びペルツズマブのセンサーグラムが示されている。滑らかな線は、１対１の相互作用モデルに対するデータのグローバルフィットを表す。
【図２５】ＫＰＬ−４細胞への共通の軽鎖クローン変異体との二重特異性ＨＥＲ２抗体の結合。指示された抗体の濃度を増加させてＫＰＬ−４細胞を染色した。抗体をＦＩＴＣ標識抗ヒト二次抗体で検出し、蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｇ２／２」：配列番号７０、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｅ１／１」：配列番号６８、５４、９２；「ＧＡ ６０４」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図２６】共通の軽鎖クローン変異体を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体によるＢＴ４７４細胞、Ｎ８７細胞、及びＳｋＢｒ３細胞の増殖阻害。ＢＴ４７４（Ａ）細胞、Ｎ８７（Ｂ）細胞、及びＳｋＢｒ３（Ｃ）細胞を、３つの異なるＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体で処置した。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びそれらの組み合わせが含まれた。５日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて増殖阻害を測定した。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｇ２／２」：配列番号７０、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｅ１／１」：配列番号６８、５４、９２；「ＧＡ ６０４」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図２７】共通の軽鎖クローン変異体を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体によるＫＰＬ−４細胞及びＭＤＡ−ＭＢ  ２３１の死滅。（Ａ）ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ  ２５：１）を用いたＫＰＬ−４細胞の抗体依存性死滅を、４時間後にＬＤＨ放出を測定することによって測定した。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ  ５：１）による抗体依存性死滅を、２４時間後にＬＤＨ放出を測定することによって決定した。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｇ２／２」：配列番号７０、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｅ１／１」：配列番号６８、５４、９２；「ＧＡ ６０４」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図２８】共通の軽鎖クローン変異体を有する二重特異性ＨＥＲ２抗体によるＢＴ４７４細胞の増殖阻害。ＢＴ４７４細胞を異なるＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体で処置した。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びそれらの組み合わせが含まれた。６日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて増殖阻害を測定した。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図２９】ＢＴ−４７４細胞におけるＨｅｒ２抗体のＣ１ｑ結合。ＢＴ４７４細胞を３つのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体とともにインキュベートした。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びそれらの組み合わせが含まれた。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図３０】ＢＴ−４７４細胞におけるＣＤＣ活性化（ＬＤＨ放出）。ＢＴ４７４細胞を３つのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体とともにインキュベートした。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びそれらの組み合わせが含まれた。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図３１】ＢＴ−４７４細胞のＣＤＣ媒介死滅（ＡＣＥＡ）。ＢＴ４７４細胞を３つのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体とともにインキュベートした。対照として、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びそれらの組み合わせが含まれた。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ」：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【図３２】二重特異性抗体のインビボ活性。異なるＨｅｒ２二重特異性分子（１０ｍｇ／ｋｇ）での処置後のマウス異種移植モデルにおける腫瘍体積を、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び両者の組み合わせによる処置と比較した。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ」：配列番号６４、５４、９２。「対照」：ゾレア、非Ｈｅｒ２結合抗体。
【図３３】ＨＥＲ２及びトランスフェリン受容体に特異的な三重特異性抗体のＨＥＲ２＋ＢＴ４７４．Ｍ１細胞へのＦＡＣＳ結合。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−８Ｄ３」（配列番号１６５，１６３，１６１）及び「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−８Ｄ３」（配列番号１６８，１６９，１６１）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにトランスフェリン受容体に特異的な三重特異性三価抗体である。陽性対照：「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ＬＡＬＡ」（配列番号１７０，１６９，１６１）及び「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ」（配列番号１７１，１６３，１６１）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な二重特異性二価抗体である。陰性対照「ｐＴＡＵ−８Ｄ３」は、トランスフェリン受容体及びｐＴａｕ（配列番号２１０，２１１，２１２）に特異的な二重特異性抗体である。
【図３４】ＨＥＲ２及びトランスフェリン受容体に特異的な三重特異性抗体のトランスフェリン受容体発現（ＴｆＲ＋）ＢＡＦ３細胞へのＦＡＣＳ結合。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−８Ｄ３」（配列番号１６５，１６３，１６１）及び「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−８Ｄ３」（配列番号１６８，１６９，１６１）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにトランスフェリン受容体に特異的な三重特異性三価抗体である。陽性対照：「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ＬＡＬＡ」（配列番号１７０，１６９，１６１）及び「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ」（配列番号１７１，１６３，１６１）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な二重特異性二価抗体である。陽性対照「ｐＴＡＵ−８Ｄ３」は、トランスフェリン受容体及びｐＴａｕ（配列番号２１０，２１１，２１２）に特異的な二重特異性抗体である。
【図３５】ＨＥＲ２及びトランスフェリン受容体に特異的な三重特異性抗体の増殖阻害アッセイ。「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−８Ｄ３」（配列番号１６５，１６３，１６１）及び「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−８Ｄ３」（配列番号１６８，１６９，１６１）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにトランスフェリン受容体に特異的な三重特異性三価抗体である。陽性対照：「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ＬＡＬＡ」（配列番号１７０，１６９，１６１）及び「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ」（配列番号１７１，１６３，１６１）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な二重特異性二価抗体である。陰性対照「ｐＴＡＵ−８Ｄ３」は、トランスフェリン受容体及びｐＴａｕ（配列番号２１０，２１１，２１２）に特異的な二重特異性抗体である。
【図３６】血管境界から腫瘍組織へのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）＋／−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）の浸透。最も近い腫瘍血管からの距離の関数としての腫瘍組織中の平均抗体シグナルは、脳シャトル（ＢＳ）が脳腫瘍へのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇの浸透を増加させることを示している。
【００２０】
発明の実施態様の詳細な記載
Ｉ．定義
本開示を通して、用語「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２受容体」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、及び「ＨＥＲ２」は互換的に使用され、他に示されない限り、天然配列ＥｒｂＢ２ヒトポリペプチド、又はその機能的誘導体を指す。「ｂｅｒ２」、「ｅｒｂＢ２」、及び「ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２」は対応するヒト遺伝子を指す。
【００２１】
本明細書において、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」又は「ＨＥＲ２  ＥＣＤ」は、その断片を含め、細胞の外側にあって、細胞膜に係留されているか、又は循環しているＨＥＲ２のドメインを指す。ＨＥＲ２のアミノ酸配列を国際公開第２０１３０５５８７４号の図１に示す。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、４つのドメイン、すなわち：「ドメインＩ」（約１〜１９５のアミノ酸残基；国際公開第２０１３０５５８７４号の配列番号１）、「ドメインＩＩ」（約１９６〜３１９のアミノ酸残基；国際公開第２０１３０５５８７４号の配列番号２）、「ドメインＩＩＩ」（約３２０〜４８８のアミノ酸残基：国際公開第２０１３０５５８７４号の配列番号３）、及び「ドメインＩＶ」（約４８９〜６３０のアミノ酸残基；国際公開第２０１３０５５８７４号の配列番号４）（シグナルペプチドなしの残基番号付け）を含む。Garrett et al. Mol. Cell. 11 : 495-505 (2003), Cho et al. Nature All : 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)、及びPlowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)、並びに国際公開第２０１３０５５８７４号の図１を参照。
【００２２】
「ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位」とは、「エピトープ２Ｃ４」とも表される、ペルツズマブ（組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４）としても知られている）のエピトープを指す。「エピトープ２Ｃ４」は、マウス抗体２Ｃ４及びペルツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である（例えば国際公開第２０１３０５５８７４号を参照）。本質的に２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような常套的なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。好ましくは、抗体は、ＨＥＲ２に対する２Ｃ４の結合を約５０％以上ブロックする。あるいは、抗体が本質的にＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価するためにエピトープマッピングを行うことができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２．２Ｃ４の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ（国際公開第２０１３０５５８７４号の配列番号２）からの残基を含み、ペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ（国際公開第２０１３０５５８７４号のそれぞれ配列番号１、２、及び３）の接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００２３】
「ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位」は、「エピトープ４Ｄ５」とも表されるトラスツズマブのエピトープを指す。「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接し、ＨＥＲ２のドメインＩＶ（国際公開第２０１３０５５８７４号の配列番号４）の中にある。本質的に４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような常套的なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体が本質的にＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、約５２９の残基〜約６２５の残基（ＨＥＲ２  ＥＣＤを含み、シグナルペプチドを含む残基番号付け）の領域内の任意の一又は複数の残基）に結合するかどうかを評価するためにエピトープマッピングを行うことができる。
【００２４】
「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、脳毛細血管内皮形質膜内のタイトジャンクションによって形成される、末梢循環と脳及び脊髄との間の生理学的関門をいい、尿素（６０ダルトン）などの非常に小さな分子であっても脳内への分子の輸送を制限する密着関門を作り出す。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液−脊髄関門、及び網膜内の血液−網膜関門は、ＣＮＳ内の近接する毛細血管関門であり、本明細書ではまとめて血液脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢはまた、関門が毛細血管内皮細胞よりもむしろ上衣細胞から構成される血液−ＣＳＦ関門（脈絡叢）も包含する。
【００２５】
用語「血液脳関門受容体」又は「ＢＢＢ−Ｒ」は、ＢＢＢを通過して分子を輸送することができ、外因性投与分子を輸送するために使用することができる、脳内皮細胞上に発現される細胞外膜結合受容体タンパク質を指す。ＢＢＢ−Ｒの例には、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含むがこれらに限定されない低密度リポタンパク質受容体、並びにヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が含まれる。特定の一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒはトランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体及び／又はカニクイザルトランスフェリン受容体である。用語「トランスフェリン受容体」又は「ＴｆＲ」は、脊椎動物における鉄摂取に関与する２つのジスルフィド結合サブユニット（それぞれ約９０，０００の見かけの分子量）からなる膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００）を指す。一実施態様では、本明細書中のＴｆＲは、Schneider et al. Nature 311 : 675 - 678 (1984)に記載のアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲである。ＴｆＲは受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）を媒介する。
【００２６】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００２７】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、以下で説明される。
【００２８】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の改変があり、かかる改変が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
【００２９】
「親和性減少」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の改変があり、かかる改変が抗原に対する抗体の親和性の減少をもたらす抗体を指す。減少した親和性は、脳におけるＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的に結合する三重特異性抗体の曝露に有利である。
【００３０】
「二重特異性ＨＥＲ２抗体」及び「ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体」という用語は交換可能に使用され、抗体がＨＥＲ２を発現する細胞を標的化することにおいて診断及び／又は治療剤として有用であるように、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方においてＨＥＲ２と十分な親和性で結合することができる二重特異性抗体を指す。一実施態様では、細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方においてＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体の無関係な非ＨＥＲ２タンパク質への結合の程度は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイ（例えばＢｉａｃｏｒｅ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定されるように、ＨＥＲ２に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００３１】
「ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体」及び「ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体」という用語は交換可能に使用され、抗体がＨＥＲ２を発現するＣＮＳ細胞を標的化することにおいて診断及び／又は治療剤として有用であるように、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方においてＨＥＲ２と、並びにＢＢＢ−Ｒと十分な親和性で結合することができる三重特異性抗体を指す。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方でＨＥＲ２と、並びにＢＢＢ−Ｒとに特異的に結合する三重特異性抗体の無関係な非ＨＥＲ２又は非ＢＢＢ−Ｒタンパク質への結合の程度は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイ（例えばＢｉａｃｏｒｅ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定されるように、ＨＥＲ２又はＢＢＢ−Ｒに対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、三重特異性抗体のＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する抗原結合部位は、好ましくはＳＰＲによって測定されるように、ＢＢＢ−Ｒについて０．０７〜０．００５ １／ｓのオフレートを有する。
【００３２】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば三重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)に記載される。更に、抗体断片は、ＶＨドメイン（すなわち、ＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと構築することが可能である）又はＶＬドメイン（すなわち、ＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと構築することが可能である）の特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。可変領域又は定常領域の何れかの交換のために、前記Ｆａｂ断片は、「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも呼ばれる。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の三重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００３５】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序の１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、及びｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けに従って可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。用語「Ｎ末端」は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を意味する。用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を意味する。
【００３６】
「融合した」又は「連結した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「リンカー」は、ペプチドリンカーを指し、好ましくは、少なくとも５アミノ酸、好ましくは５〜１００アミノ酸、より好ましくは１０〜５０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり、かつ（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５、又は６、ｍ＝０、１、２、又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４、又は５であり、ｍ＝０、１、２、又は３）、好ましくはｘ＝４及びｎ＝２又は３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。
【００３８】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖と２つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割当てることができ、それらのうちの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された２つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
【００３９】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００４０】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００４１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来し、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される抗体を指す。ウサギ可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、その定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生成するために元の抗体のものから修飾又は変更されているものである。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当該技術分野で周知の一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び第５２０４２４４号を参照。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「細胞傷害性剤」とは、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、かつ／又は細胞死若しくは細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物には、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤が含まれる。
【００４３】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００４４】
本明細書において使用される「操作する（engineer）、操作された（engineered）、操作（engineering）」などの用語は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組み合わせが含まれる。
【００４５】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾のあらゆる組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち、一のアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置換が含まれる。アミノ酸変異体は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。遺伝子操作以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用であり得ると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
【００４６】
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【００４７】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２（「第１のサブユニット」）及びＩｇＧ  ＣＨ３（『第２のサブユニット』）定常ドメインを含む。
【００４８】
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合結合によるホモ二量体の形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一であり得る。幾つかの実施態様では、結合を促す修飾は、Ｆｃドメイン内におけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００４９】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００５０】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「完全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００５１】
用語「宿主細胞、宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。
【００５２】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。本発明によるキメラ抗体及びヒト化抗体についても言及したように、本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」はまた、本発明による特性を生成するために定常領域において、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチ」、すなわち、Ｆｃ部分の変化又は変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって修飾された抗体を含む。
【００５３】
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、或いは宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体など、組換え手段により調製、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体を含むことが意図される。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態の可変領域及び定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異に供されている。従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、かつそれらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないであろう配列である。
【００５４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００５５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、その定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生成するために元の抗体のものから修飾又は変更されているものである。
【００５６】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及して何れかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、何れの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
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【００５７】
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超えた実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」システムを任意の可変領域配列に明白に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００５８】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００５９】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００６０】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００６１】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％以上又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００６２】
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００６３】
「ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする一又は複数の核酸分子（又はその断片）を指し、それは、単一のベクター内又は別々のベクター内のそのような核酸分子及び宿主細胞内の一又は複数の場所に存在するそのような核酸分子を含む。
【００６４】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【００６５】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００６６】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの１つに割り当てることができる。
【００６７】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００６８】
「実質的な交差反応性がない」とは、分子（例えば、抗体）は、特にその標的抗原と比較したとき、分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原と密接に関連する抗原）を認識しないか、又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に約１０％未満〜約５％未満が結合する場合があり、又は実際の標的抗原とは異なる前記抗原に、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満からなる量で結合する場合があり、好ましくは約２％、１％、又は０．５％未満の量で、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の量で実際の標的抗原とは異なる抗原に結合する場合がある。
【００６９】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。
【００７０】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて完全に一致するとされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【００７１】
用語「薬学的製剤」は、その中に含有されている活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
【００７２】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的製剤の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が含まれる。
【００７３】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【００７４】
用語「がん」及び「がん性」は、典型的には、制御されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は説明する。
【００７５】
「ＨＥＲ受容体過剰発現又は増幅」を有するがん細胞は、同じ組織型の非がん細胞と比較して有意に高いレベルのＨＥＲ受容体タンパク質又は遺伝子を有するがん細胞である。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によって、又は転写若しくは翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＨＥＲ受容体の過剰発現又は増幅は、診断アッセイ又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するＨＥＲタンパク質の増加したレベルを評価することによって（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣを介して）決定され得る。あるいは、又は更に、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開第９８／４５４７９号を参照）及び発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ； Tanner et al., Am. J. Pathol. 157(5): 1467-1472 (2000); Bella et al., J. Clin. Oncol. 26: (May 20 suppl; abstr 22147) (2008)を参照）を含むｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、サザンブロッティング、又は定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を介して細胞内のＨＥＲをコードする核酸のレベルを測定することができる。血清などの生物学的液体中の脱落抗原（例えば、ＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、ＨＥＲ受容体の過剰発現又は増幅を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開された国際公開第９１／０５２６４号；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５４０１６３８号；及びSias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)を参照）。上記アッセイとは別に、様々なインビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば放射性同位元素で任意に標識された抗体に曝露することができ、かつ患者の細胞への抗体の結合を、例えば放射能の外部走査によって、又は以前に抗体に曝露された患者から採取された生検を分析することによって評価することができる。
【００７６】
「ＨＥＲ２陽性」がんは、ＨＥＲ２のレベルが通常よりも高いがん細胞を含む。ＨＥＲ２陽性がんの例には、ＨＥＲ２陽性乳がん、ＨＥＲ２陽性胃がん及びＨＥＲ２陽性卵巣がんが含まれる。任意選択的に、ＨＥＲ２陽性がんは、２＋又は３＋の免疫組織化学（ＩＨＣ）スコア及び／又は＞２．０のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅比を有する。
【００７７】
「転移性」がんとは、身体のある部分（例えば、乳房）から身体の別の部分に広がっているがんを指す。「脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がん」とは、身体の一部（例えば、乳房）から中枢神経系（ＣＮＳ）に広がっているＨＥＲ２陽性がんを指す。用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、ある特定の抗原に結合する複数の抗体を、その抗原に特異的に結合するある一つの抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を定義する。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００７９】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である．本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。
【００８０】
本開示による「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープ、すなわちＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的である。本明細書で使用される用語「二重特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の異なるエピトープに結合する少なくとも２つの結合部位を有する抗体を意味する。
【００８１】
本開示による「三重特異性抗体」は、３つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープ、すなわち、ＨＥＲ２細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ、並びにＢＢＢ−Ｒに特異的である。本明細書で使用される用語「三重特異性」抗体は、それぞれが異なるエピトープに結合する少なくとも３つの結合部位を有する抗体を意味する。
【００８２】
三重特異性抗体はまた、ＨＥＲ２及び／又はＢＢＢ−Ｒを発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化するために使用され得る。三重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【００８３】
本出願で使用される用語「価（ｖａｌｅｎｔ）」は、抗体分子中の特定の数の結合部位の存在を示す。従って、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗体分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。本発明の三重特異性抗体は、少なくとも「三価」であり、「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）であり得る。
【００８４】
本発明の抗体は３つの結合部位を有し、三重特異性である。すなわち、抗体は、３つ以上の結合部位が存在する（すなわち、抗体が多価である）場合でさえ、三重特異性であり得る。本発明の三重特異性抗体は、例えば、多価単鎖抗体、ダイアボディー及びトリアボディー、並びに完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体であって、更なる抗原結合部位（例えば、単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ）２）が一又は複数のペプチドリンカーを介して連結されているものを含む。抗体は、単一の種からの完全長であり得るか、又はキメラ化又はヒト化であり得る。
【００８５】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００８６】
本出願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は互換的に用いられ、全てのそのような名称は子孫を含む。従って、用語「トランスフェクタント」及び「トランスフェクトされた細胞」は、初代の対象細胞と、導入回数に関係なく、これに由来する培養物とを含む。意図的な変異又は意図しない変異に起因して、全ての子孫がＤＮＡ含量において正確に同一でない場合があることも理解される。元々の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【００８８】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、以下で説明される。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「結合」又は「特異的結合」は、インビトロアッセイにおいて、好ましくは表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）において、抗原のエピトープに対する抗体の結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。結合又は特異的結合とは、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【００９０】
抗体のＨＥＲ２又はＢＢＢ−Ｒへの結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって調べることができる。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。
【００９１】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、かつ特定の実施態様では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合された抗原の領域である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、特に接頭辞「糖鎖（glyco）」を伴う「操作する（engineer）、操作された（engineered）、操作（engineering）」という用語、並びに「グリコシル化工学（glycosylation engineering）」という用語は、天然に生じる若しくは組換えによるポリペプチド又はその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと考えられる。グリコシル化操作には、細胞内で発現される糖タンパク質のグリコシル化の改変を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝操作が含まれる。更に、グリコシル化操作には、グリコシル化に対する変異及び細胞環境の影響が含まれる。一実施態様では、グリコシル化操作はグリコシルトランスフェラーゼ活性の改変である。特定の実施態様では、操作はグルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の変化をもたらす。
【００９３】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体に基づく。本発明の抗体は、例えば、がん、特に脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんの治療又は診断のために有用である。一実施態様では、三重特異性抗体は、ペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高い程度で補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する。１つのそのような実施態様では、三重特異性抗体の補体依存性細胞傷害は、ＬＤＨアッセイ又は補体アッセイによって決定され、同じアッセイによって決定されるように、ペルツズマブ及びトラスツズマブの組み合わせの補体依存性細胞傷害と比較される。一実施態様では、補体依存性細胞傷害は、がん細胞、好ましくは乳がん細胞に対してインビトロで測定される。
【００９４】
Ａ．ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体に有用な例示的なＢＢＢ−Ｒバインダー
本発明の一態様では、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体が提供され、ここで抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合する第１の一価抗原結合部位、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合する第２の一価抗原結合部位、及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【００９５】
一実施態様では、第３の抗原結合部位のＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、及びヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。１つの好ましい実施態様では、第３の抗原結合部位はトランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に特異的である。
【００９６】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号２０２、２０３、又は２０４のアミノ酸配列内に含まれるトランスフェリン受容体のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を含む三重特異性抗体を提供する。
【００９７】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖；
及び
（ａ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【００９８】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖を含む三重特異性抗体を提供する。
【００９９】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖に由来するヒト化重鎖可変ドメインを含む三重特異性抗体を提供する。
【０１００】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖；
及び
（ａ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１０１】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖を含む三重特異性抗体を提供する。
【０１０２】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖に由来するヒト化重鎖可変ドメインを含む三重特異性抗体を提供する。
【０１０３】
一実施態様では、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合する一価抗原結合部位は、脳曝露の改善のために更に最適化される。この目的のために、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合する抗原結合部位の親和性は、そのアミノ酸配列に特定の変異を導入することによって減少する。
【０１０４】
平衡解離定数（ＫＤ）は、分子相互作用を記述するために一般的に用いられる。これは、相互に２分子の相互作用強度（例えば、親和性）の尺度として使用される。従って、ＫＤ値は、二分子相互作用の強度の尺度である。
しかしながら、ＫＤ値それ自体は、分子相互作用の動力学を記述せず、すなわち、Ｋｄ値から、一方では、２つの分子がどれくらい速く互いに結合するか（会合速度定数又は「オンレート（on rate）」）、他方では、分子がいかに速く解離するか（解離速度定数又は「オフレート（off-rate）」）推測することはできないそれらのＫＤ値によってのみ二分子相互作用を特徴づけることは、ＫＤ値はそれらの比であるため、同一のＫＤ値は極めて異なる（異なる桁の大きさ）のオンレートとオフレートにより構成され得るという事実を無視している。オンレート及びオフレートは、分子の結合挙動を特徴づけるために重要である。オフレートは特に重要である、なぜならこれは、例えば、その抗原に対する抗体の結合時間を特徴づけるからである。長い解離速度は、形成された錯体の遅い解離と相関するが、短い解離速度は迅速な解離と相関する。
【０１０５】
長期持続（すなわち、より少ない頻度での投与が必要）又はテーラーメイド（例えば、周囲の条件に依存する）相互作用を有するためには、オフレートは実験的に決定されなければならない。オフレートを予測することはほとんど不可能に近いため、これは更に重要である。更に、オフレートと結合親和性との間の相関は、上に概説したように乏しい。例えば、ＫＤ値がオンレートとオフレートの比率であるという事実のために、弱いバインダーがその標的に長く結合されたままであっても、タイトなバインダーは迅速に解離することができる。
【０１０６】
本明細書では、適切なＢＢＢシャトリングを確実にするために一定範囲内にあるヒトトランスフェリン受容体への結合についてオフレートを有する新規ヒト化及び親和性減少抗トランスフェリン受容体バインダーが開示されている。この範囲は、一端はカニクイザルトランスフェリン受容体に対する表面プラズモン共鳴によって決定されたマウス抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１（国際公開第９３／１０８１９号）のオフレートによって、もう一方の端はそのオフレートの５％（すなわち、２０倍遅い解離）によって定義されることが見出されている。一実施態様では、ヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）及びカニクイザルトランスフェリン受容体（ｃｙＴｆＲ）に特異的に結合する一価抗原結合部位は、カニクイザルトランスフェリン受容体についての表面プラズモン共鳴によって０．１ １／ｓと０．００５ １／ｓの間で決定されるオフレートを有する。一実施態様では、オフレートは、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５及び０ｎＭで決定される。一実施態様では、オフレートは、ビオチン表面を有する表面プラズモン共鳴チップ、及び１０μＬ／分の流速で、２５０ｍＭ塩化ナトリウムを補充した１ｘＰＢＳのランニングバッファーを使用して決定される。一実施態様では、会合を１８０秒間モニターし、解離を６００秒間モニターする。一実施態様では、オフレートはＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００で決定される。一実施態様では、オフレートは０．０８ １／ｓと０．００８ １／ｓの間である。全ての態様のうちの一実施態様では、オフレートは２５℃で決定される。
【０１０７】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖に由来するヒト化、親和性減少軽鎖可変ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖に由来するヒト化、親和性減少重鎖可変ドメインを含む三重特異性抗体を提供する。
【０１０８】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖に由来するヒト化、親和性減少軽鎖可変ドメイン、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖に由来するヒト化、親和性減少重鎖可変ドメインを含む三重特異性抗体を提供する。
【０１０９】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１８８、配列番号２０６、又は配列番号１７４の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖；
及び
（ａ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖；
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１１０】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、配列番号１９３又は配列番号２０５のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む重鎖を含む三重特異性抗体を提供する。
【０１１１】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、又は配列番号２００の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、及び配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２０８、又は配列番号２０９の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む三重特異性抗体を提供する。
【０１１２】
一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体に結合された１つの単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）を含み、ここでｓｃＦａｂはＩｇＧ抗体の重鎖の１つのＦｃ部分のＣ末端に直接又はリンカーによって結合される。別の実施態様では、ｓｃＦａｂは、ＩｇＧ抗体のＮ末端に、例えば可変軽鎖又は重鎖のＮ末端に結合される。一実施態様では、ｓｃＦａｂは、リンカーによりＩｇＧ抗体のＮ末端に結合される。
【０１１３】
一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体に結合された１つの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、ここでｓｃＦｖはＩｇＧ抗体の重鎖の１つのＦｃ部分のＣ末端に直接又はリンカーによって結合される。別の実施態様では、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ抗体のＮ末端に、例えば可変軽鎖又は重鎖のＮ末端に結合される。一実施態様では、ｓｃＦｖは、リンカーによりＩｇＧ抗体のＮ末端に結合される。
【０１１４】
一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体に結合された１つのクロスオーバーＦａｂ断片を含み、ここでクロスオーバーＦａｂ断片はＩｇＧ抗体の重鎖の１つのＦｃ部分のＣ末端に直接又はリンカーによって結合される。別の実施態様では、クロスオーバーＦａｂ断片は、ＩｇＧ抗体のＮ末端に、例えば可変軽鎖又は重鎖のＮ末端に結合される。一実施態様では、クロスオーバーＦａｂ断片は、リンカーによりＩｇＧ抗体のＮ末端に結合される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、国際公開第２００９０８０２５２号、国際公開第２００９０８０２５３号、国際公開第２００９０８０２５１号、国際公開第２００９０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されている。
【０１１５】
一実施態様では、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体に結合された１つのＦａｂ断片を含み、ここでＦａｂ断片はＩｇＧ抗体の重鎖の１つのＦｃ部分のＣ末端に直接又はリンカーによって結合される。別の実施態様では、Ｆａｂ断片は、ＩｇＧ抗体のＮ末端に、例えば可変軽鎖又は重鎖のＮ末端に結合される。一実施態様では、Ｆａｂ断片は、リンカーによりＩｇＧ抗体のＮ末端に結合される。
【０１１６】
用語「リンカー」は、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位を、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体に共有結合させる化学的リンカー又はペプチドリンカーを示す。
【０１１７】
ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸残基を含む単鎖ペプチドリンカーを使用することができる。特定の実施態様では、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。特定の他の実施態様では、一又は複数のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。他の実施態様では、リンカーは化学的リンカーである。特定の実施態様では、リンカーは、少なくとも２５個のアミノ酸残基の長さ、１つの好ましい実施態様では、３２〜５０個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を有する単鎖ペプチドリンカーである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎリンカーであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９、又は１０）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７、又は８）であり、一実施態様ではｘ＝４、ｎ＝６、又は７であり、好ましい実施態様ではｘ＝４、ｎ＝７である。一実施態様では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）４である。一実施態様では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。
【０１１８】
コンジュゲーションは、様々な化学的リンカーを用いて行うことができる。例えば、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体に結合され得る。リンカーは、脳への送達時に、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０１１９】
共有結合は直接的であってもリンカーを介していてもよい。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、ポリペプチド融合物の構築による（すなわち、遺伝子融合による）。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位の２つの部分のうちの１つにある反応性基とＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体にある対応する基又はアクセプターとの間の共有結合の形成によるものである。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、適切な条件下でコンジュゲートされる他の分子との共有結合を形成する反応性基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含むように、コンジュゲートされる２つの分子のうちの１つの修飾（すなわち、遺伝子改変）によるものである。コンジュゲーションは、様々なリンカーを用いて行うこともできる。例えば、ＢＢＢ−Ｒ抗原結合部位及び完全長ＩｇＧ抗体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用してコンジュゲートされ得る。ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを使用することもできる。特定のそのような実施態様では、アミノ酸残基は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。特定の他のそのような実施態様では、一又は複数のアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。リンカーは、脳への送達時に、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶに特異的な抗原結合部位を含む完全長ＩｇＧ抗体の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。このセクションに概説されるＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する上記に開示される抗原結合部位は、ＨＥＲ２及びＢＢＲ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体の一部である。ＨＥＲ２の抗原結合部位並びにＨＥＲ２バインダーの抗体フォーマットは、下記のセクションＩＩＢ及びＩＩＣに記載されている。
【０１２０】
Ｂ．共通の軽鎖を有し、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する例示的な三重特異性抗体
本発明の一態様では、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体が提供され、ここで抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合する第１の一価抗原結合部位、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合する第２の一価抗原結合部位、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＨＥＲ２に特異的に結合する両方の結合部分（すなわち、抗原結合部位）が、腫瘍細胞増殖の阻害に関して親の単一特異性抗体の有効性を保持し、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに対する親和性が増大している共通の軽鎖を共有する三重特異性抗体を作製した。ハイブリッド軽鎖の共通のＣＤＲは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶの両方に対する結合特異性を保持しなければならないので、両方の親抗体の結合特性を保持する共通の軽鎖を有する三重特異性分子の生成は単純ではない。このいわゆる「共通軽鎖」の原理の使用、すなわち１つの軽鎖を共有するが別個の特異性を有する２つのバインダーを組み合わせることは、軽鎖の誤対合を防止し、この特定の場合には親抗体のエピトープ特異性を保持する。結果として、産生中に副産物が少なくなり、高収率でＨＥＲ２三重特異性抗原結合分子の均質な調製を促進する。ペルツズマブの重鎖は更に最適化され、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに対する親和性に関してより強力な分子を生じた。更に、トラスツズマブ重鎖は、ＣＤＲに特定の変異を導入することによって安定化されている。得られた分子は、親ペルツズマブ及びトラスツズマブ単一特異性抗体よりも優れており、更にそのＢＢＢ−Ｒ結合部分を介してＣＮＳを標的とする。一価の共通軽鎖フォーマットの三重特異性ＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブエピトープに対して増加した親和性を有し、親抗体の組み合わせと比較して、細胞増殖に対して優れた阻害効果を示す。
【０１２１】
一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合することができる第１のＦａｂ分子、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合することができる第２のＦａｂ分子を含むを含む三重特異性抗体であって、第１のＦａｂ分子の可変軽鎖の配列は、第２のＦａｂ分子の可変軽鎖の配列と同一であり（すなわち、第１及び第２のＦａｂ分子は共通の軽鎖を含む）；及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、第３の一価抗原結合部位はＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体が提供される。
【０１２２】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖；
及び
（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む第１及び第２の軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１２３】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖；
及び
（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む第１及び第２の軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１２４】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖；
及び
（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む第１及び第２の軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１２５】
一実施態様では、上記実施態様の何れかの第２の重鎖は、ＣＤＲに対するより高い化学的安定性を付与し、ストレス条件下でＨＥＲ２への結合の保持をもたらす、アミノ酸配列における少なくとも１つの修飾を有する。本明細書において有用な修飾は、例えば、Ｄ９８Ｅ、Ｄ９８Ｎ、Ｄ９８Ｔ、Ｇ９９Ａ、又はＧ９９Ｓである。驚くべきことに、本発明者らは、ＣＤＲの幾つかの修飾は、分子の安定性を改善するだけでなく、ＨＥＲ２への結合親和性も改善することを見出した。
【０１２６】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖；
及び
（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む第１及び第２の軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１２７】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖；
及び
（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む第１及び第２の軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１２８】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第１の重鎖；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む第２の重鎖；
及び
（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む第１及び第２の軽鎖
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及びＩＶ並びにＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体を提供する。
【０１２９】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列（すなわち、共通の軽鎖）を含む２つの可変軽鎖、配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖、並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１３０】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列（すなわち、共通の軽鎖）を含む２つの可変軽鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖、並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１３１】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列（すなわち、共通の軽鎖）を含む２つの可変軽鎖、配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖、並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１３２】
一実施態様では、上記実施態様の何れかの第２の重鎖は、ＣＤＲに対する安定性及び標的への結合を付与する、アミノ酸配列における少なくとも１つの修飾、例えばＤ９８Ｅ、Ｄ９８Ｎ、Ｄ９８Ｔ、Ｇ９９Ａ、又はＧ９９Ｓを有する。
【０１３３】
従って、一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列（すなわち、共通の軽鎖）を含む２つの可変軽鎖、配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖、並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１３４】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列（すなわち、共通の軽鎖）を含む２つの可変軽鎖、配列番号７０のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖、並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１３５】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列（すなわち、共通の軽鎖）を含む２つの可変軽鎖、配列番号６８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第１の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第２の重鎖、並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１３６】
一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖定常領域を含む。
【０１３７】
一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖定常領域を含む。
【０１３８】
別の実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖定常領域を含む。
【０１３９】
別の実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖定常領域を含む。
【０１４０】
一実施態様では、配列番号１６５、１６３、及び１６１を含む三重特異性抗体が提供される。
【０１４１】
一実施態様では、配列番号１６８、１６９、及び１６１を含む三重特異性抗体が提供される。
【０１４２】
一実施態様では、上記実施態様の何れかの三重特異性抗体は、以下のセクションＤに概説されるように、ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾を含む。
【０１４３】
Ｃ．クロスオーバーＦａｂ断片を含む、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する例示的な三重特異性抗体
一実施態様では、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体が提供され、ここで抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的に結合する第１の一価抗原結合部位、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合する第２の一価抗原結合部位、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。本発明の発明者らは、ＨＥＲ２に対する結合部分（すなわち、抗原結合部位）の１つがクロスオーバーＦａｂ断片である第２の三重特異性抗体フォーマットを作製した。本発明の一態様では、Ｆａｂ断片の１つがクロスオーバーＦａｂ断片によって置換されたＩｇＧ分子を含む三重特異性抗体が提供される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、国際公開第２００９０８０２５２号、国際公開第２００９０８０２５３号、国際公開第２００９０８０２５１号、国際公開第２００９０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されている。天然型トラスツズマブ配列は、安定性及び親和性を改善するために可変重鎖及び可変軽鎖の両方のＣＤＲに修飾を導入することによって最適化されており、得られた配列は三重特異性分子中の軽鎖の誤った対合を避けるためにフレームワークに移植され、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒを標的とする非常に強力な三重特異性抗体を生じ、これは高収率で、かつごく低割合の副生成物で生産することができる。加えて、それは、それぞれの親抗体の組み合わせと比較して、腫瘍細胞増殖の優れた阻害を示す。
【０１４４】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位；
及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位を含む三重特異性抗体を提供する。
【０１４５】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位；及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位；並びに上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１４６】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位、及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位を含む三重特異性抗体を提供する。
【０１４７】
一実施態様では、三重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位；及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位；並びに上記のセクションＩＩ  Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１４８】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位、及び
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１０４、配列番号１０３、及び配列番号１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位を含む三重特異性抗体を提供する。
【０１４９】
一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖定常領域を含む。
【０１５０】
一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖定常領域を含み、ここで、Ｃ末端リジンは除去されている。
【０１５１】
一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖定常領域を含む。
【０１５２】
一実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖定常領域を含み、ここで、Ｃ末端リジンは除去されている。
【０１５３】
別の実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖定常領域を含む。
【０１５４】
別の実施態様では、本発明の三重特異性抗体は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖定常領域を含む。
【０１５５】
一実施態様では、配列番号１０９、１１０、１１１、及び１１２を含む三重特異性抗体が提供される。
【０１５６】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、
（ここで、少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換され）、及び
上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位
を含む。
【０１５７】
このセクションに記載される三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに対しては１価であり、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに対しては一価である。可変領域又は定常領域の何れかの交換のために、上記Ｆａｂ断片は、「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも呼ばれる。
【０１５８】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第２の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、（ここで、少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される）、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、及び
上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位
を含む。
【０１５９】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、（ここで、少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される）、及び
上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位
を含む。
【０１６０】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、（ここで、Ｆａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される）；
及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位
を含む。
【０１６１】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、
Ｆｃドメイン、
ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、
及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含む１つのＦａｂ断片、（ここで、重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される）、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位
を含む。
【０１６２】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、２つのＦａｂ断片がＮ末端に融合されたＦｃドメイン、（ここで、少なくとも１つのＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される）、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。一実施態様では、２つのＦａｂ断片は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合される。一実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片、及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０１６３】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、（ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される）、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１６４】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、（ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される）、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される。
【０１６５】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、（ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される）、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される。
【０１６６】
一実施態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な１つの結合部位及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な１つの結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子、（ここで、ＩｇＧ分子の一方のアーム（Ｆａｂ断片）の完全なＶＨ−ＣＨ１及びＶＬ−ＣＬドメインが交換される）、及び上記のセクションＩＩ Ａに概説されるように、ＢＢＢ−Ｒに特異的に結合する第３の一価抗原結合部位を含む。
【０１６７】
これは、Ｆａｂ断片の少なくとも１つが、軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合されることを意味する。一実施態様では、他のＦａｂ断片は、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合される。一実施態様では、両方のＦａｂ断片は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合される。
【０１６８】
一実施態様では、上記実施態様の何れかの三重特異性抗体は、以下のセクションＤに概説されるように、ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾を含む。
【０１６９】
Ｄ．ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明のＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合された異なる抗原結合部分を含み、従って、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には、２つの同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドの幾つかの可能な組み合わせを導く．組換え産生における本発明の抗体の収率及び純度を改善するためには、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインに導入することが有利であろう。
【０１７０】
従って、特定の実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１７１】
特定の実施態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。
【０１７２】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。大きいアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの界面において、隆起と同一又は類似のサイズの代償空洞が作製される。
【０１７３】
従って、特定の実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、これにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起を生成し、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、これにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が配置可能である、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する。
【０１７４】
隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、又はペプチド合成によって作製することができる。特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
【０１７５】
更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体を更に安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１７６】
別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば国際公開第２００９／０８９００４号に記載される静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体化は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面における一又は複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基による置換を含む。
【０１７７】
一実施態様では、上記実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第１の抗原結合部位、及びＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第２の抗原結合部位、並びにＢＢＢ−Ｒに特異的な一価の第３の抗原結合部位を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量化モジュールを含み、かつ第２の重鎖のＦｃ部分は第２の二量化モジュールを含み、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量化を可能にする免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含む。
【０１７８】
更に好ましい実施態様では、ノブ・イントゥー・ホール技術に従って、第１の二量化モジュールはノブを含み、かつ第２の二量化モジュールはホールを含む（Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2,Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)を参照）。
【０１７９】
Ｅ．核酸配列、ベクター、及び方法
本発明は更に、本明細書に記載される、ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）又はその断片に結合する三重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の三重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドは、三重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、二つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して機能的三重特異性抗体を形成し得る。例えば、Ｆａｂ断片の軽鎖部分は、Ｆａｂ断片の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット、及び任意選択的に別のＦａｂ断片（の部分）を含む三重特異性抗体の部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合してＦａｂ断片を形成するであろう。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの１つと、任意選択的に一又は複数のＦａｂ断片（の一部）とを含む、そこで提供される三重特異性抗体の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの他方と、任意選択的にＦａｂ断片（の一部）とを含む、そこで提供される三重特異性抗体の部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成するであろう。
【０１８０】
一実施態様では、本発明は、配列番号６３、６７、及び６９に示される第１の可変重鎖配列をコードする配列を含む、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。一実施態様では、本発明は、配列番号９１及び１３３に示される第２の可変重鎖配列をコードする配列を含む、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。一実施態様では、本発明は、配列番号５３に示される可変軽鎖配列をコードする配列を含む、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１８１】
別の実施態様では、本発明は、配列番号８３、８５、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、６３、６７、６９、５３、２１、及び２３に示されるポリヌクレオチド配列をコードする配列を含む、三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１８２】
別の実施態様では、本発明は、配列番号６３，６７、及び６９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である第１の可変重鎖配列をコードする配列を含む、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１８３】
別の実施態様では、本発明は、配列番号９１及び１３３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である第２の可変重鎖配列をコードする配列を含む、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１８４】
別の実施態様では、本発明は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変軽鎖配列をコードする配列を含む、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１８５】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０１８６】
更なる目的において、本発明は、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核又は真核宿主細胞に関する。更に、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む抗体の製造方法が提供される。
【０１８７】
Ｆ．Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾
一態様では、上記の実施態様の何れかに記載のＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体は、Ｆｃ部分が修飾された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含む。改変されたＦｃ部分は、野生型Ｆｃ部分と比較して、Ｆｃγ受容体に対して低減した結合親和性を有する。
【０１８８】
本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各々のサブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０１８９】
本発明による一実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８でのアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ番号付け）、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減少させる（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更に特定の実施態様では、Ｆｃはヒトである。
【０１９０】
Ｆｃドメインは、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比に寄与する長い血清半減期を含む、本発明の三重特異性抗体に好ましい薬物動態学的特性を付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対しての、本発明の三重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。従って、特定の実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す。１つのそのような実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）は、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％を示し、かつ／又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）と比較して、エフェクター機能の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示す。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌のうちの一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）が、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）の約７０％を超える、具体的には約８０％を超える、より具体的には約９０％を超えるＦｃＲｎへの結合親和性を示すときに達成される。
【０１９１】
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、改変されていないＦｃドメインと比較して低減した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる複数のアミノ酸変異が存在する一実施態様では、これらアミノ酸変異の組み合わせにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１にまで低減する。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体は、操作されていないＦｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体と比較して、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。幾つかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）がＦｃドメインの操作されていない形態（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を示すときに達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体は、そのような親和性の約８０％を超える、更には約９０％を超える親和性を示し得る。特定の実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較してエフェクター機能が低減するように操作される。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細��に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低減のうちの一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低減はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０１９２】
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、更にＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４、及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載のように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に無効にする。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３はまた、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などその特性を決定する方法も記載されている。
【０１９３】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。従って、幾つかの実施態様では、本発明の三重特異性抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低減させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、Ｌ２３５の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
特定の実施態様では、天然型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。
【０１９５】
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７の位置におけるアミノ酸置換、具体的にはアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）酸によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む。本明細書及びＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二つ以上における置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１９６】
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１９７】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化三重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０１９８】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の三重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【０１９９】
幾つかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低減するように操作されている幾つかの実施態様では、前記エフェクター機能の低減はＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、本発明の三重特異性抗体がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行される。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。
【０２００】
以下のセクションは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメイン修飾を含む本発明の三重特異性抗体の好ましい実施態様を記載する。
【０２０１】
Ｇ．抗体変異体
特定の実施態様では、上記のものに加えて、本明細書に提供される三重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、三重特異性抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる場合がある。三重特異性抗体のアミノ酸配列変異体は、三重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終コンストラクトに到達させることができる。
【０２０２】
１．ａ）置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表Ｂに「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表Ｂに「例示的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスに関連して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０２０３】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０２０４】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴うこととなる。
【０２０５】
１つのタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる研究のために選択された得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作成することができる。簡潔には、一又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２０６】
ＨＶＲにおいて、例えば抗体親和性を改善するために、改変（例えば、置換）を行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向のアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定され得る。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０２０７】
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で発生し得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えばここで提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは不変であるか、又は僅か１個、２個又は３個のアミノ酸置換を含むかの何れかである。
【０２０８】
変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。代わりに、又は加えて、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０２０９】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０２１０】
２．グリコシル化変異体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、三重特異性抗体がグリコシル化される程度を上昇又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一又は複数のグリコシル化部位が作成され又は除かれるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０２１１】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合する糖を変えることができる。哺乳類細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって一般に結合される分枝鎖の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。幾つかの実施態様では、本発明の三重特異性抗体におけるオリゴ糖の改変が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。
【０２１２】
一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠いた糖鎖構造を有する三重特異性抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体のフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に結合している全ての糖構造の合計（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に位置し得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させる場合がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、同第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、同第２００２／０１６４３２８号、同第２００４／００９３６２１号、同第２００４／０１３２１４０号、同第２００４／０１１０７０４号、同第２００４／０１１０２８２号、同第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、同第２００５／０３５５８６号、同第２００５／０３５７７８号、同第２００５／０５３７４２号、同第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例は、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)、Ｐｒｅｓｔａ、Ｌの米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、及びＡｄａｍｓらの国際公開第２００４／０５６３１２号（特に実施例１１））及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)、Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)、及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０２１３】
二分オリゴ糖を伴う三重特異性抗体変異体が更に提供され、例えば、そこでは、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている。このような三重特異性抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善する場合がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載されている。
【０２１４】
３．システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、抗体の一又は複数の残基が三重特異性残基で置換されているシステイン操作三重特異性抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基が三重特異性抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを作るために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちの何れか一又は複数がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるように生成され得る。
【０２１５】
Ｈ．組換え方法及び組成物
本発明の三重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、三重特異性抗体（又は断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離し、配列決定することができる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに三重特異性抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、三重特異性抗体（断片）（すなわちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、最終タンパク質中に翻訳後又は翻訳と同時に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の三重特異性抗体（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２１６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、三重特異性抗体の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の三重特異性抗体又はその断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２１７】
後の精製を促進するため（例えば、ヒスチジンタグ）、又は三重特異性抗体の標識を補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする三重特異性抗体（断片）の末端に含まれ得る。
【０２１８】
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一つのそのような実施態様では、宿主細胞は、本発明の三重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の三重特異性抗体又はその断片を生成するように操作され得る何れかの種類の細胞系を指す。三重特異性抗体の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の三重特異性抗体を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）���バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０２１９】
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖の何れかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように抗体鎖の他方をも発現するように操作することができる。
【０２２０】
一実施態様では、本発明による三重特異性抗体を産生する方法が提供され、ここでは、本明細書で提供されるような三重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を三重特異性抗体の発現に適した条件下で培養し、三重特異性抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
【０２２１】
三重特異性抗体の成分は、互いに遺伝的に融合される。三重特異性抗体は、その成分が互いに直接又はリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。三重特異性抗体の異なる構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合物の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むための付加的な配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を含めることができる。
【０２２２】
特定の実施態様では、三重特異性抗体の一部を形成するＦａｂ断片は、少なくとも抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に産生されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２２３】
抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域の任意の動物種を、本発明の三重特異性抗体に使用することができる。本発明において有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。三重特異性抗体がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製され得る（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (「ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植」を記述する); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述する); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記述する);及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記述する)に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野において周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、かつそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして、抗体断片を提示する。
【０２２４】
特定の実施態様では、本発明において有用なＦａｂ断片は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２４３，４５３号に開示された方法に従って、結合親和性が増強するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明の三重特異性抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００システムにおいて分析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、又は可変ドメインを同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」に詳細に示されている。例示的な競合アッセイでは、固定化抗原が、抗原に結合する第一の標識抗体と、抗原への結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第二の抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第一の標識抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体が、抗原への結合について第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２２５】
本明細書で記載のように調製される三重特異性抗体は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、三重特異性抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の三重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、基本的に実施例に記載されるように三重特異性抗体を単離するために使用することができる。三重特異性抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定することができる。
【０２２６】
Ｉ．アッセイ
本明細書で提供されるＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体が同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられ得る。
【０２２７】
１．親和性アッセイ
ＨＥＲ２及び血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する三重特異性抗体の親和性を、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。あるいは、そこにおいて提供される三重特異性抗体のＨＥＲ２及び／又はＢＢＢ−Ｒへの結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞系を用いて評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明であって例示的な実施態様は、以下及び下記の実施例に記載される。
【０２２８】
一実施態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２２９】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との間の相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ付き組換えＦｃ受容体をＣＭ５チップ上に固定した抗Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって捕捉し、三重特異性コンストラクトを分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するように５μｌ／分の流量で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。続いて、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。動態測定のために、三重特異性コンストラクトの４倍段階希釈液（５００ｎＭと４０００ｎＭの間の範囲）をＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）に２５℃、流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
【０２３０】
標的抗原に対する親和性を決定するために、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化ＣＭ５センサーチップ表面上に固定化された抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって三重特異性コンストラクトを捕捉する。結合タンパク質の最終量は約１２０００ＲＵである。三重特異的コンストラクトを３００ｎＭで９０秒間捕捉する。標的抗原を、流速３０μｌ／分で２５０〜１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過させる。解離を１８０秒間モニターする。バルク屈折率の差は、基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正する。定常状態応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングにより解離定数ＫＤを導出した。結合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。
【０２３１】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本発明の三重特異性抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。
【０２３２】
別の態様では、ＨＥＲ２への結合について特異的な抗ＨＥＲ２と競合する抗体を同定するために、競合アッセイを使用することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗体は、特定の抗ＨＥＲ２抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。別の態様では、ＢＢＢ−Ｒ２への結合について特異的な抗ＢＢＢ−Ｒと競合する抗体を同定するために、競合アッセイを使用することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗体は、特定の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」に詳細に示されている。更なる方法については、実施例のセクションで説明する。
【０２３３】
３．活性のアッセイ
一態様では、生物活性を有するＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性は、例えば、ＤＮＡ断片化、アポトーシスの誘導、及び標的細胞の溶解を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでそのような生物活性を有する抗体もまた提供される。一実施態様では、前記活性は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘導である。一実施態様では、前記三重特異性抗体は、ペルツズマブ又はトラスツズマブ単独よりも高い程度にまでＣＤＣを誘導する。一実施態様では、前記三重特異性抗体は、ペルツズマブ又はトラスツズマブ単独よりも少なくとも約１０倍、約２０倍、又は約３０倍高い程度でＣＤＣを誘導する。別の実施態様では、前記三重特異性抗体は、ペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高い程度にまでＣＤＣを誘導する。別の実施態様では、前記三重特異性抗体は、ペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも約３０％、４０％、５０％、若しくは６０％、又は少なくとも３０％〜７０％、又は少なくとも４０％〜６０％高い程度にまでＣＤＣを誘導する。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイは、非熱処理血清又は市販の補体画分を用いて行うことができる（例えば、Lazar, G. A. et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006)を参照）。標的細胞死滅は、Alamar Blue (Lazar, G. A. et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006), Idusogie, E. E. et al. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J. Immunol. 166, 2571-2575 (2001))、CellTiter-Glo(例えば、Zhao, X. et al. Targeting C-type lectin-like molecule-1 for antibody-mediated immunotherapy in acute myeloid leukemia. Haematologica 95, 71-78 (2009)を参照）、ＬＤＨ放出（例えば、Konishi, E., Kitai, Y. & Kondo, T. Utilization of complement-dependent cytotoxicity to measure low levels of antibodies: application to nonstructural protein 1 in a model of Japanese encephalitis virus. Clin. Vaccine Immunol. 15, 88-94 (2008)及びこれに開示される実施例を参照）、又はカルセイン−ＡＭ放出などの幾つかの細胞生存性試薬によって評価することができる。幾つかの実施態様では、ＣＤＣの誘導の程度は、細胞抗原に結合した本発明の抗体に対する補体タンパク質Ｃ１ｑの結合を測定するＬＤＨ放出アッセイ又は補体アッセイによって決定される。次いで、三重特異性抗体のＣＤＣ誘導が、同じ細胞株及び同じそれぞれの抗体濃度を用いて、同じアッセイにおいてアッセイされるＣＤＣ誘導についての全ての値を用いて、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブ単独、又はペルツズマブ若しくはトラスツズマブの組み合わせの何れかのＣＤＣ誘導と比較する。マイクロタイタープレートで実施する場合、三重特異性抗体及び対照（ペルツズマブ若しくはトラスツズマブ単独、又はペルツズマブとトラスツズマブの組み合わせの何れか）のＣＤＣを誘導する能力が、好ましくは同じアッセイを用いて同じマイクロタイタープレートで測定される。例示的なアッセイが、例えば実施例１８又は１９に開示されている。一実施態様では、ＣＤＣの前記誘導は、がん細胞、例えば乳がん細胞において決定される。
【０２３４】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、そのような生物活性について試験される。細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いる）は、当該技術分野において周知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するためのアッセイは、全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／０６５５４０号（その中の実施例１を参照）にも記載されている。
【０２３５】
Ｊ．薬学的製剤
本明細書に記載されるＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのような三重特異性抗体を一又は複数の任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに一般に非毒性であり、限定されないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の付加的グリコサミノグリカナーゼ（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎａｓｅ）と組み合わせられる。
【０２３６】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２３７】
本明細書における製剤は、また、治療を受けている特定の適応症のために必要な一を越える活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含んでいてもよい。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２３８】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２３９】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０２４０】
インビボ投与のために使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２４１】
Ｋ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供されるＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の何れも、治療的方法において使用され得る。
【０２４２】
一態様において、医薬としての使用のためのＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体が提供される。更なる態様において、がんの治療における使用のためのＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体が提供される。特定の実施態様では、治療の方法における使用のためのＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法における使用のための、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体を提供する。１つのこのような実施態様では、本方法は、例えば、以下に記載されるような少なくとも１つの付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２４３】
更なる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製におけるＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためである。一実施態様では、前記がんは脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんである。更なる実施態様では、医薬は、がんを有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためのものである。１つのこのような実施態様では、本方法は、例えば、以下に記載されるような少なくとも１つの付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２４４】
更なる態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の有効量をがんを有する個体に投与することを含む。１つのこのような実施態様では、本方法は、例えば、以下に記載されるような少なくとも１つの付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２４５】
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかにおける使用のための、本明細書で提供されるＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供されるＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の何れか、及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供されるＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の何れかと、少なくとも１つの付加的治療剤とを、例えば後述するように含む。
【０２４６】
本発明の三重特異性抗体は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が所望される場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２４７】
本発明の三重特異性抗体は、良好な医療行為に合致した様式で処方され、用量決定され、投与されるであろう。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医療従事者に既知の他の要因を含む。三重特異性抗体は、必要ではないが場合によっては、問題となる障害の予防又は治療に現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の要因に依存する。これらは、ここに記載されたものと同じ投薬量及び投与経路で、又はここに記載された投薬量の約１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、一般に使用される。
【０２４８】
疾患の予防又は治療では、本発明の三重特異性抗体の適切な投薬量は、治療されるべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、三重特異性抗体を予防目的か治療目的の何れで投与するか、以前の治療法、患者の臨床履歴及び三重特異性抗体に対する応答、及び担当医の裁量に依存するであろう。三重特異性抗体は、一回で、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の三重特異性抗体が患者への投与のための初期候補投与量となり得る。一つの典型的な一日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が生じるまで一般に持続されるであろう。一つの例示的な三重特異性抗体の投与量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量が患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が三重特異性抗体の約２から約２０用量、又は例えば約６用量を受けるように）投与され得る。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２４９】
上記の製剤又は治療方法の何れかを、本発明のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施してもよいことが理解される。
【０２５０】
Ｌ．製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製造品は、容器、及び容器表面の若しくは容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、病態の治療、予防、及び／又は診断にそれ自体で又は他の組成物との併用で効果的である組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の三重特異性抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の三重特異性抗体を含む組成物である組成物がそこに収容された第一の容器と；（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物である組成物がそこに収容された第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物を特定の症状を治療するために使用することができることを示す添付文書を更に含み得る。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
【０２５１】
上記の製造品の何れかを、本発明のＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが理解される。
【０２５２】
Ｍ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、本明細書において一又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）又は放射性同位体にコンジュゲートしたＨＥＲ２及びＢＢＢ−Ｒに特異的な三重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０２５３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、その中の抗体が、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号、及び欧州特許（ＥＰ）第０４２５２３５号を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分であるＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号、第５７８０５８８号、及び第７４９８２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号、及び第５８７７２９６号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006);Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006);Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005);Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000);Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002);King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（larotaxel）、テセタキセル（tesetaxel）、及びオルタタキセル（ortataxel）；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む（ただし、これらに限定されない）一又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０２５４】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）を含む（ただし、これらに限定されない）酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
【０２５５】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含む。
【０２５６】
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダート  ＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載のようにして調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０２５７】
本明細書に記載のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されるものではないが、市販（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより）のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）等の架橋試薬を用いて調製したものが特に考えられる。
【実施例】
【０２５８】
ＩＩＩ．以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２５９】
前述の発明は理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に包含される。
【０２６０】
実施例１：材料及び方法
他に記載がない限り、以下の一般的な方法が適用されている：
【０２６１】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。
【０２６２】
ＤＮＡ及びタンパク質の配列解析並びに配列データ管理
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E., A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付けに従って番号が付けられている(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242）。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びインフォマックスのＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅスイートバージョン８．０が、配列の作成、マッピング、分析、注釈、及びイラストレーションに使用された。
【０２６３】
ＤＮＡ配列決定
ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った二本鎖配列決定によってＤＮＡ配列を決定した。
【０２６４】
実施例２：２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の生成。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって調製された。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、ｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２６５】
発現プラスミドの構築
以下の発現ベクターを、全ての重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドの構築に使用した。ベクターは、以下の要素で構成されている：
−  選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点
−  大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
【０２６６】
重鎖又は軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子は遺伝子合成により調製され、上記のようにｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。可変重鎖コンストラクトは、固有の制限部位を用いて方向性クローニングによって構築された。可変軽鎖コンストラクトは、ＶＬ及びＣＬを含む遺伝子合成として発注され、固有の制限部位を用いて方向性クローニングによって構築された。最終的な発現ベクターは、大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（ミニプレップ）、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを１５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（マキシプレップ）、配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２６７】
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
組換え免疫グロブリン変異体は、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。小規模試験発現のため、０．５×１０６のＨＥＫ２９３Ｆ細胞／ｍｌの３０ｍｌをトランスフェクションの一日前に播種した。翌日、プラスミドＤＮＡ（培養体積のｍｌ当たり１μｇのＤＮＡ）が、１．２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と混合され、続いて、４０μｌの２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）が添加された。混合物を室温で１５分間インキュベートし、細胞に滴下した。トランスフェクションの一日後、各フラスコに、３００μｌのＬ−グルタミン（２００ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びｆｅｅｄ７（Ｌ−アスパラギン、アミノ酸、微量元素、ＨｙＰｅｐ１５１０、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、エタノールアミン、微量元素、Ｄ−グルコース、ＲＰＭＩを含まないフリースタイル培地を含む）の６００μｌが供給された。トランスフェクションの三日後、細胞濃度、培地中の細胞濃度、生存能力及びグルコース濃度を、自動化された細胞生存率分析器（Ｖｉ−ＣＥＬＬＴＭ  ＸＲ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びグルコースメーター（Ａｃｃｕ−ＣＨＥＫ（登録商標）Ｓｅｎｓｏｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。加えて、各フラスコに、Ｌ−グルタミンを３００μｌ、供給した非必須アミノ酸溶液（ＰＡＮＴＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を３００μｌ、ピルビン酸ナトリウムを３００μｌ（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｆｅｅｄ７を１．２ｍｌ及びグルコース（Ｄ−（＋）−グルコース溶液４５％、シグマ）を５ｇ／Ｌ、供給した。最後に、トランスフェクションの６日後、抗体は、周囲温度で１５分間、Ｘ３Ｒ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ（Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）で３５００ｒｐｍで遠心分離により回収し、上清を滅菌Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターユニット（０．２２ｍｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ  ＰＥＳメンブラン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を通して濾過し、更に使用するまで−２０℃で保存した。５Ｌまでの大規模なトランスフェクションは、直線的にスケーリングされた。
【０２６８】
二重特異性抗体及び対照抗体の精製
二重特異性抗体は、プロテインＡ−セファロースＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡＨＰ（５ｍｌ）カラムに適用した。非結合タンパク質は、平衡緩衝液を用いて洗浄した。抗体及び抗体変異体は、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ２．８で溶出し、タンパク質を含む画分は、０．１ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．５で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、アミコンウルトラ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３ｍｌの体積まで濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化した、スーパーデックス２００  ＨｉＬｏａｄ  １２０ｍｌ  １６／６０又は２６／６０ゲル濾過カラムにロードした。５％未満の高分子量凝集体を含有する精製二重特異性抗体及び対照抗体を含む画分がプールされ、−８０℃で１．０ｍｇ／ｍｌの一定分量として保存した。
【０２６９】
タンパク質の定量
タンパク質は、プレパックされたポロス（登録商標）ＡプロテインＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を装着し、自動化されたＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００システム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｉｄｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより定量した。全ての試料は緩衝液Ａ（０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４・［２Ｈ２Ｏ］、ｐＨ７．４）にロードされ、緩衝液Ｂ（０．１Ｍのクエン酸、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で溶出した。タンパク質濃度を決定するために、吸光係数１．６２を全ての試料に使用した。
【０２７０】
精製タンパク質の分析
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析された。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を、製造者の指示に従って使用した（４−２０％のトリスグリシン・ゲル）。二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量は、２５℃で２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０の泳動用緩衝液中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的サイズ排除カラムを使用して高性能ＳＥＣにより分析された。２５μｇのタンパク質が流速０．５ｍｌ／分でカラムに注入され、５０分間にわたり均一濃度で溶出された。還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）による酵素処理によるＮ−グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析法により検証された。
【０２７１】
分析用ＨＰＬＣ
抗体は、ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷゲル濾過カラム（７．５ｍｍ ＩＤｘ３０ｃｍ、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を装着したＡｇｉｌｅｎｔ１１００  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。１８μｌの溶出したタンパク質を緩衝液Ａ（３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中の０．０５ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４）中でカラムにロードし、サイズに基づいて分離した。
【０２７２】
還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
溶出したタンパク質の７μｌを２×試料緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と混合し、別の７μｌは１０％の還元剤（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む２×試料緩衝液と混合した。試料は１０分間、７０℃まで加熱し、プレキャストＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％ ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）上でロードした。ゲルは、２００Ｖで１２５ｍＡで４５分間流した。その後、ゲルは、ミリポア水で３回洗浄し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭ  ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ゲルを、ミリポア水で一晩脱色した。図１のａ）からｄ）は、２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の異なる変異体を模式的に示す。全ての二重特異性抗体は、それぞれの抗原結合部位に対して二価であり、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２受容体の異なる２つのパラトープに結合する（抗原１＝トラスツズマブ特異性；抗原２＝ペルツズマブ特異性）。本明細書中に記載の２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットの全ての二重特異性抗体は、非フレームワーク移植、非ＣＤＲ最適化、非糖鎖操作型であり、Ｆｃ部分に任意の変異を有しない。
【０２７３】
図２から４は、２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の変異体の例示的サイズ排除精製グラフ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び分析用ＨＰＬＣを示す。ＴｖＡＢ１７、ＴｖＡＢ１３及びハーセプチン−ｓｃＦｖ＿ＡからＥのデータは示されず；２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の全ての変異体は同じ品質で生成された。
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【０２７４】
実施例３：２＋２  ＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体による増殖阻害アッセイ。
細胞株
ＭＤＡ−ＭＢ１７５  ＶＩＩ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＬのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持された。細胞株の増殖は、標準的な細胞培養プロトコルに従った。
【０２７５】
増殖を阻害する二重特異性抗体の能力は、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩにおいて評価された。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５  ＶＩＩは、１０％ウシ胎児血清、２ｍＬのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養された。対数増殖期の細胞を分離し、計数し、２ｘ１０ｅ４細胞を９６ウェル細胞培養プレートのウェル当たり１００μＬの培地中に播種した。細胞はインキュベーター中で一晩維持され、翌日、培地で希釈された各抗体の１００μＬを細胞の希釈系列の形式で添加した。６日間の総インキュベーション時間の後、細胞増殖を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をアッセイにより評価した。アッセイを製造者によって推奨されるように行った。
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【０２７６】
実施例４：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ安定化
重鎖の位置９８でのアスパラギン酸異性化部位及び軽鎖の位置３０でのアスパラギンの脱アミド部位はトラスツズマブの安定性ホットスポットである。これら二つの位置は、抗体の抗原結合能力の安定性及び完全性に影響を与える。この問題は、コハク酸ナトリウム又はヒスチジン緩衝液の何れかを使用して凍結乾燥製剤を導入することによって克服された。安定性及び貯蔵半減期を増加させるために、我々は、それらの不安定性の既知の原因をアミノ酸又はより高度の固有の安定性を有するべきであるアミノ酸ストレッチにより置き換えることを意図した。私たちは、重鎖におけるＡｓｐ９８のＧｌｕによる置換、及び軽鎖におけるＡｓｎ３０のＳｅｒ並びにＴｈｒ３１のＶａｌによる置換を試験した。これらの変異は、Ｄ９８Ｅ、Ｎ３０Ｓ、及びＴ３１Ｖと略記される。Ｔ３１ＶはＮ３０の脱アミド化に直接影響を与えないが、アスパラギンのＣ末端側に隣接する残基がポリペプチド鎖の安定性に影響を与えるだろうと仮定された。
【０２７７】
抗体の試料は、３つの緩衝液：４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０、４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０、又は４０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４のうちの一つにおいて、４０℃で、１、２、又は３月の何れかの期間にわたってインキュベートされた。この期間中のタンパク質濃度は、常に１ｍｇ／ｍｌであった。指示した時点の後、試料が採取され、液体窒素中で衝撃凍結し（shock frozen）、その後更なる分析まで−８０℃で保存した。この分析は、ＰｒｏｔｅｏｎのＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）で行った。Ｈｅｒ２のおよそ７００ＲＵは、それぞれ、アミンカップリングを使用してＧＬＭチップの２つのチャネル上に固定化した（垂直方向）。トラスツズマブ変異体を、１００μｌ／分で水平方向で注入することにより、６つの異なる分析物濃度（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ）で二重に測定した。会合速度は、１８０秒間記録され、解離速度は６００秒間記録された。再生は、１５０μｌ／分で６０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。合計で４つの異なるトラスツズマブ変異体が測定された。最初の実験において（表３及び４）、非修飾トラスツズマブ及び変異体６０２（重鎖のＤ９８Ｅ及び軽鎖のＴ３１Ｖ）が試験された。２回目の実験において、非修飾トラスツズマブ及び変異体６０２（重鎖のＤ９８Ｅ及び軽鎖のＴ３１Ｖ）及び変異体ＶＨ：Ｄ９８Ｅ／ＶＬ：Ｎ３０Ｓ  ＶＨ：Ｄ９８Ｅ／ＶＬ：Ｎ３０Ｔが試験された（表５、６、７）。
【０２７８】
結果：
全ての変異体は、親トラスツズマブ分子として組換えＨＥＲ２抗原に対して同じ親和性を示す。４０℃でｐＨ５又はｐＨ６に曝露後、トラスツズマブは、オフレートが高められ、オンレートを変えずに維持することによって主に駆動され、〜５倍親和性を失った。変異体６０２は、ｐＨストレス前後にほとんど区別がつかないの親和性を示した。変異体Ｎ３０Ｓは、親トラスツズマブと比較して最初からより高い親和性を有し、ストレス状態の間ほぼ一定であった。Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｔ、又はＶ（ＶＬ）の何れかと一緒に変異体Ｄ９８Ｅ（ＶＨ）が更なる実験に使用された。結果は図５及び図６並びに以下の表に示される。
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【０２７９】
実施例５：ストレス後のトラスツズマブ及びトラスツズマブ安定化変異体のＫＬＰ−４細胞への結合
結合
ＫＰＬ−４細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。０．２Ｍｉｏ細胞を、９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体４０μｌに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために４℃で３０分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈した二次ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ＦＩＴＣ標識二次抗体１２μｌ中に再懸濁し（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−０９６−０９８）、４℃で３０分間再びインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁し、蛍光をＢＤ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定した。
【０２８０】
ＡＤＣＣ
標的細胞を回収し、洗浄し、カルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ＡＩＭＶ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３×１０４細胞／ウェルの濃度で蒔いた。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞（末梢血単核エフェクター細胞［ＰＢＭＣ］）の添加前に１０分間インキュベートした。エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞は、次いで、指示されたＥ：Ｔ比で３７℃で指示された時間インキュベートされた（全試料について三通り）。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いでホウ酸緩衝液で溶解した。カルセイン保持率はＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒで測定された。ＡＤＣＣは、以下の式を用いて計算された。
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【０２８１】
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、０％細胞毒性として定義され、最大放出（１％トリトンＸ−１００で溶解した標的細胞）は、１００％細胞毒性として定義された。三通りの各実験のＡＤＣＣの平均割合及び標準偏差が計算された。
【０２８２】
結果を図７から９に示す。
【０２８３】
実施例６：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂの生成及び誤対合の減少を達成するための新規ＬＣ０６ベースのフレームワークにおけるフレームワーク移植
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって調製された。ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重鎖又は軽鎖、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を有する「ノブ・イントゥー・ホール」抗体重鎖及び未修飾ＶＨドメインと組み合わせて、ＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を有する「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖、交差Ｃカッパドメイン又はｓｃＦａｂ抗体断片並びに未修飾抗体軽鎖又はＣＨ１ドメイン交換軽鎖をコードする遺伝子セグメントは特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ−ＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ）により隣接され、ｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。
【０２８４】
発現プラスミドの構築
全ての「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖並びに抗体軽鎖をコードする発現プラスミドの構築のために使用された発現ベクターは以下の要素を含む：
−  選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点
−  大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
−  固有のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位。
【０２８５】
ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重鎖又は軽鎖、未修飾ＶＨドメインを有する「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖、交差Ｃカッパドメイン又はｓｃＦａｂ抗体断片並びに未修飾抗体軽鎖又はＣＨ１ドメイン交換軽鎖は遺伝子合成により調製され、記載のようにｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。合成されたＤＮＡセグメント及び発現ベクターを保有するｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミドを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する精製された重鎖又は軽鎖、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖及び未修飾又はドメイン交換軽鎖をコードするＤＮＡセグメントは、次いで、単離された発現ベクターＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ／ＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片に連結され、最終発現ベクターが得られた。最終的な発現ベクターは、大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（ミニプレップ）、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを１５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（マキシプレップ）、配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２８６】
ＨＥＫ２９３細胞における二重特異性抗体の一過性発現
組換え二重特異性抗体は、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。簡単に説明すると、懸濁液ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３−Ｆ細胞を３７℃／８％ＣＯ２でＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地中で培養し、トランスフェクションの１日前に細胞を１×１０６生細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に播種した。トランスフェクションのために、ＤＮＡを、２９３−ＦｒｅｅＴＭ  トランスフェクション試薬（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）１６２．５μｌ、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖１及び２を１：１のプラスミド比でｓｃＦａｂをコードするＤＮＡのＮ末端付着を有する重鎖１２５μｇ、及び２５０ｍｌの最終トランスフェクション体積中１：１：１のモル比の軽鎖プラスミドＤＮＡを使用して１０ｍｌのダルベッコＰＢＳ（ＰＡＡ、Ａｕｓｔｒｉａ）中で調製した。Ｃｒｏｓｓ  Ｍａｂのトランスフェクションのために、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖１：未修飾軽鎖：Ｃカッパドメイン交換「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖２：ＣＨ１ドメイン交換軽鎖のプラスミド比１：１：１：１、１：１：１：２、１：１：１：４、１：１：１：８が調製された。ＣＨ１−ＶＬ軽鎖プラスミド比は、ＣＥ−ＳＤＳ及びＱ−ＴＯＦ分光法の組み合わせを用いて鎖対の最適化を評価するために、１倍、２倍、４倍及び８倍のモル比で使用した。抗体を含有する細胞培養上清は、トランスフェクション後７日目に３０分間１４０００×ｇでの遠心分離により回収し、無菌フィルター（０．２２μｍ）を通して濾過した。上清を精製まで−２０℃で保存した。得られた抗体の配列を以下の表８に示す。
【０２８７】
二重特異性＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体の糖鎖操作誘導体の調製
二重特異性＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体の糖鎖操作誘導体は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して哺乳動物抗体の重鎖及び軽鎖の発現ベクターを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をコトランスフェクトすることによって産生された。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされた。糖操作抗体の産生のために、細胞を融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のためのプラスミド及びマンノシダーゼＩＩ発現のための第二のプラスミドそれぞれでコトランスフェクトした。上記の材料と方法のセクションに記載したように、二重特異性抗体のプラスミド比が添加された。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になるときに形質移入した。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖで）（最終的には２５０／ｍｌのネオマイシン）を補填した約１４ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に７．５（から８）００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に３７℃で一晩置く。トランスフェクトされる各Ｔ７５フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液は、４７μｇの総プラスミドベクターＤＮＡ、２３５μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合し、４６９μｌの最終容積まで水を加えることにより調製された。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補填した約１２ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ７５フラスコに加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を約１２ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。馴化培地は、トランスフェクション後５から７日目に回収され、２１０〜３００＊ｇで５分間遠心分離し、０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過し（１２００ｒｐｍで５分間遠心分離、続いて４０００ｒｐｍで１０分間の２回目の遠心分離）し、４℃で保存した。
【０２８８】
糖操作抗体は精製され、非糖操作抗体について上述したように処方した。フコースの量を決定するために、下記のように、抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖を分析した。
【０２８９】
フレームワーク移植
原理：トラスツズマブ及びペルツズマブの同様のフレームワークは、軽鎖の誤対合を可能とする：トラスツズマブ及びペルツズマブの両方がＶＨＩＩＩ  ＶＬｋＩフレームワークを有し、従って、両方の重鎖に対する軽鎖界面親和性は同じである。
ｃｒｏｓｓＭａｂ  Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ二重特異性抗体において、軽鎖の誤対合を回避するために、「ＣｒｏｓｓＭａｂＸＰｅｒ  Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ」のトラスツズマブのフレームワークは、非関連抗体ＬＣ０６のフレームワークと交換された。トラスツズマブは、生殖系列ｈＶＨ３＿６６及びｈＶＫ１Ｄ＿３９に関連するが、抗体ＬＣ０６は生殖系列ｈＶｂａｓｅ＿ＶＨ１＿１、生殖系列ｈＶＬ＿３にそれぞれ対応する。ペルツズマブはｈＶＨ３＿２３及びｈＶＫ１Ｄ＿１３に関連し、トラスツズマブと比較して非常に類似したフレームワークシステムを示している。
【０２９０】
ＬＣ０６の両方の生殖系列アクセプターフレームワークは、トラスツズマブフレームワークとは異なり、特に、トラスツズマブカッパ軽鎖に比べＬＣ０６ラムダ軽鎖は異なる。トラスツズマブの抗体のＦａｂ結晶構造が重ね合わされ、フレームワークの互換性が構造的に評価されている。トラスツズマブ軽鎖のＣＤＲＩ、ＩＩ及びＩＩＩが、ＬＣ０６の新しいラムダフレームワークに移植された。含まれる変異は、Ｄ９８Ｅ及びＮ３０Ｓであり、Ｎ３０Ｓ改変によるＨｅｒ２細胞外ドメインに対する親和性の増加を理由として、Ｎ３０ＳがＴ３１Ｖのために使用された。ＣＤＲ移植によって引き起こされたＫｄの任意の減少は、Ｎ３０Ｓ変異の使用によって補正することができると考えられた。アクセプターフレームワークの一部順応が、それらの生物学的活性コンホメーションのＣＤＲを得るために必要であった；例えば、軽鎖のＫａｂａｔ位置７１でのＡ（ＬＣ０６ラムダ）はＦ（トラスツズマブカッパ）に復帰変異されている。ペルツズマブの元のＶＨＩＩＩ−ＶＬｋＩ（カッパＩファミリー）フレームワークが維持された。得られた二重特異性抗体は、「ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧ  Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ」として示され、配列は以下の表８に示される。
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【０２９１】
二重特異性抗体の精製
二重特異性抗体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ−セファロースＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）により細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、ｐＨ３．０で２５ｍＭのクエン酸ナトリウムにより溶出した。溶出したタンパク質画分をプールし、２Ｍトリス、ｐＨ９．０を用いて中和し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したスーパーデックス２００  ２６／６０  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。サイズ排除クロマトグラフィー画分をＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で分析し、二重特異性抗体を含有する画分をプールし、−８０℃で保存した。
【０２９２】
精製タンパク質の分析
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異性及び対照抗体の純度、完全性及び分子量は、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いて、ＣＥ−ＳＤＳにより分析した。５μｌのタンパク質溶液をＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔキットを使用して製造元の指示に従ってＣＥ−ＳＤＳ分析のために調製され、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｈｉｐを使用して、ＬａｂｃｈｉｐＧＸＩＩシステム上で分析した。データは、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸソフトウェアバージョン３．０．６１８．０を使用して分析した。二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量は、２５℃で２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０の泳動用緩衝液中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的サイズ排除カラムを使用して高性能ＳＥＣにより分析された。２５μｇのタンパク質が流速０．５ｍｌ／分でカラムに注入され、５０分間にわたり均一濃度で溶出された。
【０２９３】
質量分析法
還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）による酵素処理によるＮ−グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析法により検証された。重鎖及び軽鎖の誤対合の量も定量した。
【０２９４】
表面プラズモン共鳴
機器：
ビアコアＴ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ソフトウエア：ビアコア  Ｔ１００コントロール、バージョン  ２．０２／２．０３
ビアコア  Ｔ１００エバリュエーション、バージョン  ２．０２／２．０３
ビアコア  Ｂ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ）
ソフトウエア：ビアコア  Ｂ３０００コントロール、バージョン  ４．１．２
ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ、バージョン  ４．１．１
アッセイフォーマット  チップ：ＣＭ５−チップ
【０２９５】
＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞−分子の動力学定数及び得られた親和性は、「トラスツズマブ」−及び「ペルツズマブ」−機能性のそれぞれ両方について測定された。これら二つの機能は、アミン結合された親ＭＡｂ「トラスツズマブ」（ＦＣ１／２）又は「ペルツズマブ」（ＦＣ３／４）の何れかとのＨｅｒ２の事前複合体形成を経由して区別された。親ＭＡｂとＨｅｒ２の複合体形成は、Ｈｅｒ２  ＥＣＤの注入後に開始した。
【０２９６】
事前複合体化親Ｍａｂ「トラスツズマブ」／Ｈｅｒ２の結果、全ての「トラスツズマブ」−結合部位は飽和しているが、全ての「ペルツズマブ」−結合部位は利用可能であり、逆の場合も同じである。最後に、分析されるべき「＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞」−分子の結合は、毎回漸増濃度を用いる注入を介して測定された。観察された会合及び解離は、ラングミュア１：１結合モデルにより計算された。測定中Ｈｅｒ２の解離を最小限に抑えるために、動力学定数はＴ＝２５℃で測定された。
【０２９７】
捕捉分子のアミンカップリング
製造者の指示に従ったフローセル１から４の標準的なアミンカップリング：ＣＭ５チップ、Ｔ＝２５℃、泳動用緩衝液：ＨＢＳ−Ｎ緩衝液：ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化、８００ＲＵを目標；親Ａｂｓ「トラスツズマブ」又は「ペルツズマブ」は、カップリング緩衝液酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、ｃ＝２−３μｇ／ｍＬで希釈された；最後に、残りの活性化カルボキシル基は１Ｍエタノールアミンの注入によりブロックされた。
【０２９８】
（アミン結合された親のｍＡｂ「トラスツズマブ」又は「ペルツズマブ」の何れかを用いた）フローセル１及び３のチップ表面は、可能な緩衝液作用又は非特異的結合を補正するための基準対照表面として用いられた。
【０２９９】
２５℃での＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞分子の動力学的特性評価
泳動用緩衝液：ＰＢＳ
全ての試料は泳動用緩衝液＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで希釈した。
フローセル２と４におけるＨＥＲ２  ＥＣＤの捕捉：ｃ＝１００ｎＭ、流速５μＬ／分、時間１２０秒。
分析物試料：＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞−分子の標準的な濃度系列が５つの濃度（ｃ＝３００、１００、３３．３３、１１．１１及び３，７ｎＭ）で分析される。５０μｌ／分の流速で注入された。各濃度に対してシングルス、重複として１回；結合時間：１８０秒、解離時間：９００秒。
最終的な再生は、アミン結合Ｍａｂ「トラスツズマブ」に対して１０ｍＭのグリシン ｐＨ２．５、アミン結合Ｍａｂ「ペルツズマブ」に対して２５ｍＭのＮａＯＨ、接触時間は各６０秒、流速３０μｌ／分を用いて各サイクル後に行った。
動力学的パラメータは、二重基準（対照基準：Ｍａｂトラスツズマブ及びペルツズマブのそれぞれに対する分析物の結合；フローセル：１それぞれ３）を用いて算出し、濃度「０」は、ブランクとして使用した。計算は、「ラングミュア結合１：１」モデル、ＲＩ（屈折率）＝０を用いて行った。
【０３００】
結果：二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子の発現＆精製
上記の材料及び方法に記載される手順に従って、二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ２、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ１、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ２、ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＰｅｒ、ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａ及びＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧが発現され精製される。各分子において、ＶＨ及びＶＬの一部は、可変軽鎖における変異Ｔ３１Ｖ又はＮ３０Ｔ及び重鎖における変異Ｄ９８Ｅを有する最適化されたトラスツズマブ配列及びペルツズマブの親配列それぞれに基づいている。抗体の模式構造を図１０に示す。配列を上記表８に示す。
【０３０１】
＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子、ＯＡｓｃＦａｂ１  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ、ＯＡｓｃＦａｂ２  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ１  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ２  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ（全て糖鎖操作され、「ノブ・イントゥー・ホール」、Ｄ９８Ｅ及びＴ３１Ｖ変異を保有するトラスツズマブｓｃＦａｂを有する）、ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＰｅｒ  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａ  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ（両方とも糖鎖操作され「ノブ・イントゥー・ホール」、Ｄ９８Ｅ及びＴ３１Ｖ変異を保有するトラスツズマブｃｒｏｓｓ−Ｆａｂを有する、及びＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧ  Ｈｅｒ２  ＧｌｙＭａｂ（糖鎖操作され、「ノブ・イントゥー・ホール」、ＣＤＲ移植される、Ｄ９８Ｅ及びＴ３１Ｖ変異を保有するトラスツズマブｃｒｏｓｓ−Ｆａｂを有する）の発現はウェスタンブロッティング及びＨＰ−ＳＥＣによって確認された（図１１）。ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ２、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ１、ＯＡｓｃＦａｂＰｅｒ２、ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＰｅｒ、ＣｒｏｓｓＭａｂ  Ｘｔｒａ及びＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧの精製は、表９に示した収率をもたらした。全てのＯＡｓｃＦａｂコンストラクトは、精製後９０％未満の単量体を示し、これらの分子の純度の低下は、発現においてプラスミドの比を最適化することにより増加させることはできなかった（データ非表示）。ただし、発現におけるプラスミド鎖比の最適化は、以下に説明するようにＣｒｏｓｓＭａｂ抗体の精製後に存在する単量体画分を増加させることが判明した。
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【０３０２】
実施例７：二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子の発現＆精製、発現において使用されるプラスミド比の最適化
ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａ
上記の材料及び方法に記載される手順に従って、二重特異性、二価＜Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ＞抗体分子ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａは、１：１：１：１、１：１：１：２、１：１：１：４及び１：１：１：８のモルプラスミド比を用いて発現させ精製された。ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａの発現をウェスタンブロットで確認した。細胞培養上清のプロテインＡ精製後、コンストラクトは、１：１：１：１等モルプラスミド比で、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約７３％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；１１％がペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２×ペルツズマブ軽鎖を含み；９％が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；４％がペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合であり；３％が１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合であることを示した。
【０３０３】
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が２倍発現される１：１：１：２のプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約８１％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；１％がペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２×ペルツズマブ軽鎖を含み；１６％が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；ペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合は検出されず；１％が１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合であることを示した。
【０３０４】
交差トラスツズマブ軽鎖のモル比が４倍発現される１：１：１：４のプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約６４％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；ペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２ｘペルツズマブ軽鎖は検出されず、しかしペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす１２％の２ｘＸトラスツズマブ軽鎖が初めてこの比率で検出され；２４％が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；ペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合は検出されず；１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合は検出されないことを示した。
【０３０５】
交差トラスツズマブ軽鎖のモル比が８倍発現される１：１：１：８のプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約４５％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；ペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２ｘペルツズマブ軽鎖は検出されず、しかしペルツズマブ及びＸトラスツズマブ重鎖と対をなす２８％の２ｘＸトラスツズマブ軽鎖が初めてこの比率で検出され；２７％が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がＸトラスツズマブに由来する）インタクトなＸトラスツズマブ抗体であり；ペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合は検出されず；１ｘＸトラスツズマブ軽鎖及び１ｘペルツズマブ軽鎖とのＸトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合は検出されないことを示した。
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【０３０６】
ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＰｅｒ
細胞培養上清のプロテインＡ精製後、コンストラクトは、１：１：１：１等モルプラスミド比で、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約８５％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；２％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；１％が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体であり；１２％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖であることを示した。更なる種は検出されなかった。
【０３０７】
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が２倍発現される１：１：１：２のプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約８９％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；７％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体は検出されず；４％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖であることを示した。
【０３０８】
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が４倍発現される１：１：１：４のプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約７４％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；２５％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体は検出されず；１％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖であることを示した。
【０３０９】
交差トラスツズマブ軽鎖（ＸＨｅｒＬＣ）のモル比が８倍発現される１：１：１：８のプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約５２％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；４８％がＸペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす２×Ｘペルツズマブ軽鎖を含み；重鎖ホール−ホール会合の形成を有する（重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する）インタクトなトラスツズマブ抗体は検出されず；Ｘペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した２ｘトラスツズマブ軽鎖は検出されないことを示した。
【０３１０】
ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧ
細胞培養上清のプロテインＡ精製後、コンストラクトは、１：１：１等モルプラスミド比では、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって検出される場合、二重特異性抗体の約９５％が約１４８ｋＤａの推定分子量を有し；５％がＸＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ及びトラスツズマブ（ＨｅｒＣＤＲＧ）重鎖と対をなす２×ＸＰｅｒｔｕｚｕｍａｂの軽鎖を含むことを示した。
更なる種は検出されず、従って、プラスミド比の更なる最適化は行われなかった。副生成物のプロフィールを比較するために、抗体ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＨｅｒ及びＣｒｏｓｓＭａｂ−ＣＤＲＧに関して行われたＭＳスペクトルを図１２に見ることができる。
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【０３１１】
実施例８：両方の抗原に対する二重特異性抗体の同時結合
上記のように二重特異性抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅにより分析した。
別々のアッセイフォーマットでは、試料（ＣｒｏｓｓＭａｂＸＰｅｒ並びにＯＡｓｃＦａｂ１及びＯＡｓｃＦａｂ２について）は、トラスツズマブの機能並びにペルツズマブ特異性であることが証明された。ＣｒｏｓｓＭａｂＸＰｅｒは、陽性対照と同程度に動力学的定数及び得られた親和性を示した。トラスツズマブ媒介型結合についてのわずかに減少したｋａ−速度定数を除き、ＯＡｓｃＦａｂ１及びＯＡｓｃＦａｂ２は、陽性対照、すなわち親Ｍａｂと同程度に、動力学的定数及び得られた親和性を示した。
【０３１２】
陽性対照の一部の二価の結合は、ＣＭ５チップ上のリガンド密度に応じて、この例に示された二つの実験における解離速度定数の変化を引き起こす可能性がある。
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【０３１３】
実施例９：１＋１  Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭＡｂ及び糖鎖操作Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  Ｃｒｏｓｓｍａｂのインビトロでの評価
増殖阻害アッセイ
ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＨＥＲ２  ＣｒｏｓｓＭａｂ（ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａ  Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２）、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はトラスツズマブ／ペルツズマブの組み合わせの存在下で５日間のインキュベーション後、（Ａ）ＢＴ４７４及び（Ｂ）Ｎ８７細胞の代謝活性と増殖を測定するために使用した。染料の生物学的還元は、酸化型（青）の量を低減し、同時に蛍光中間体（赤）を増加させる。
【０３１４】
標的細胞を、回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、１×１０４細胞／ウェルの濃度で蒔いた。それぞれの抗体希釈液を添加する前に、細胞を細胞インキュベーター中で３時間インキュベートした。プレートを穏やかに振盪し、細胞インキュベーター中で５日間インキュベートした。
【０３１５】
２５μｌ／ウェルのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅをプレートに添加し、インキュベーター中で７時間インキュベートした。
【０３１６】
吸光度をＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０マルチラベルカウンターで５８４  ｎｍ及び６１２ｎｍでモニターした。
増殖阻害の割合を計算するために、非処理対照試料がアッセイに含められ、１００％増殖として定義された。三通りの各実験の平均割合及び増殖阻害が計算された。
結果を図１３に示す。
【０３１７】
ＡＤＣＣアッセイ
ＨＥＲ２  ＣｒｏｓｓＭａｂ（ＣｒｏｓｓＭａｂ−ＸＴｒａ  Ｈｅｒ２ＧｌｙＭａｂ、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２）、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はトラスツズマブ／ペルツズマブの組み合わせにより媒介されるＡＤＣＣは、ＫＰＬ−４（Ａ）、Ｔ４７Ｄ（Ｂ）及びＣａｌｕ−３（Ｃ）において評価された。
【０３１８】
標的細胞を回収し、洗浄し、ＡＩＭＶ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３×１０４細胞／ウェルの濃度で蒔いた。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞（末梢血単核エフェクター細胞［ＰＢＭＣ］）の添加前に１０分間インキュベートした。エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞は、次いで、２５：１のＥ：Ｔ比で３７℃で４時間インキュベートされた（全試料について三通り）。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。ＡＤＣＣは、以下の式を用いて計算された。
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【０３１９】
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、０％細胞毒性として定義され、最大放出（１％トリトンＸ−１００で溶解した標的細胞）は、１００％細胞毒性として定義された。三通りの各実験のＡＤＣＣの平均割合及び標準偏差が計算された。結果を図１４に示す。
【０３２０】
実施例１０：ＨＥＲ２  ＣｒｏｓｓＭａｂのインビボ特性評価：Ｃａｌｕ３肺がん及びＫＰＬ４乳がん異種移植片における腫瘍増殖に関するＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗体の効果  
インビトロ培養細胞−Ｃａｌｕ３
このヒト肺腺癌細胞株は、肺がんを有するヒト白人男性から樹立されている。細胞は、Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から入手し、ワーキング・セル・バンクのために社内で継代された。腫瘍細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で１０％ウシ胎児血清グルタミン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＲＰＭＩ培地（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で常套的に培養される。培養継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ １×（ＰＡＮ）を用いて行い、２回／週、分割する。細胞継代Ｐ６がインビトロ研究に使用される。
【０３２１】
インビトロ培養細胞−ＫＰＬ−４
このヒト乳がん細胞株は、炎症性皮膚転移を有する乳がん患者の悪性胸水から樹立されている。細胞は、Ｊ．Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ教授によって提供された（Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｋｕｒａｓｈｉｋｉ、Ｊａｐａｎ）。腫瘍細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で１０％ウシ胎児血清グルタミン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で常套的に培養される。培養継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ １×（ＰＡＮ）を用いて行い、２回／週、分割する。細胞継代Ｐ６がインビトロ研究に使用される。
【０３２２】
動物
雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ．−１７）マウス；年齢１０−１２週；体重１８〜２０ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）又は雌ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス；年齢８−１０週；体重＞２０ｇ（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）は、国際ガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明／１２時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、１週間動物施設の検疫部で収容される。継続的な健康管理が定期的に実施される。ダイエット食品（Ａｌｔｒｏｍｉｎ）及び水（ｐＨ２．５−３に酸性化）が自由に与えられる。実験的研究は地方政府によってレビューされ承認された；登録番号５５．２−１−５４−２５３１．２−３−０８  ＳＣＩＤベージュ同所性げっ歯類の乳がんモデル及び２１１−２５３１．２−１６／００。１．２．２皮下腫瘍モデル。
【０３２３】
腫瘍細胞の注入
注入の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＴｒｉＦｌａｓｋ）から回収され（トリプシン−ＥＤＴＡ）、５０ｍｌの培地に移され、１回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁される。ＰＢＳによる更なる洗浄工程及びろ過（セルストレイナー；Ｆａｌｃｏｎφ１００μｍ）の後に、最終の細胞力価を１．５ｘ１０８／ｍｌに調整する。腫瘍細胞懸濁液は、細胞凝集を避けるため移送ピペットを用いて慎重に混合される。麻酔は、プレインキュベーションチャンバー（プレクシグラス）、個々のマウスの鼻マスク（シリコン）及び可燃性又は爆発性でない麻酔化合物イソフルラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて小動物用のＳｔｅｐｈｅｎｓ吸入器を使用して閉鎖循環系で実行される。注入の２日前に、ＳＣＩＤベージュマウスの外被は剃毛される。Ｃａｌｕ３細胞の皮下注射のために、麻酔をかけた動物の皮膚は慎重に解剖学的鉗子で持ち上げられ、１００μｌの細胞懸濁液（＝５．０×１０ｅ６細胞）が動物の右脇腹に皮下注射される。細胞懸濁液は、幅広の注射針（０．４５×２５ｍｍ）を使用して、１．０ｍｌのツベルクリン注射器（Ｂｒａｕｎ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）に充填される。ＫＰＬ−４細胞（３×１０ｅ６細胞）は、各麻酔マウスの右の最後から２番目の鼠径部乳腺脂肪体に２０μｌの容量で同所注入される。同所性移植のため、細胞懸濁液は、ハミルトンマイクロシリンジ及び３０Ｇｘ１／２”針を用いて乳頭下の皮膚を介して注入される。
【０３２４】
モニタリング
動物は、副作用の臨床症状の検出のために毎日管理される。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週２回記録し、週２回腫瘍体積をキャリパーで測定する。腫瘍体積がＮＣＩプロトコルに従って算出された（腫瘍重量＝１／２ａｂ２、「ａ」及び「ｂ」は、それぞれ腫瘍の長径、短径である）。終了基準はクリティカルな腫瘍塊（上限１．７ｇ又はφ＞１．５ｃｍ）、ベースラインから２０％以上の体重減少、動物の腫瘍潰瘍又は悪い全身状態であった。動物に対する研究の除外基準が説明され、対応する「Ｔｉｅｒｖｅｒｓｕｃｈｓａｎｚｅｉｇｅ」で承認される。
【０３２５】
動物の治療
マウスは、腫瘍体積において、ＫＰＬ−４については平均が７０ｍｍ３、Ｃａｌｕ３については平均が１００ｍｍ３で無作為化された。マウスは、腹腔内に１０ｍｌ／ｋｇの量で週一回処置された。併用治療のために、トラスツズマブが最初に与えられ、その２４時間後にペルツズマブが与えられた。
結果は、表１４から１７及び図１５から１８に示される。
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【０３２６】
実施例１１：トラスツズマブ及びペルツズマブのための共通の軽鎖の生成
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子を、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号１５５、１５６、及び１５７は例示的リーダーペプチドを与える。
【０３２７】
抗原発現ベクターのクローニング
成熟チロシンキナーゼ型細胞表面受容体ＨＥＲ２（Ｈｅｒ２、ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０４６２６）のアミノ酸１から６２９をコードするＤＮＡ断片は、Ｎ末端リーダー配列を含有する哺乳動物レシピエントベクター中にフレームにクローニングされた。更に、コンストラクトは、Ｂｉｒ  Ａビオチンリガーゼとの同時発現中に特定のビオチン化を可能にするＣ末端ａｖｉタグ、及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に使用されるＨｉｓタグが含まれる（配列番号１及び２）。
【０３２８】
抗原の発現はＭＰＳＶプロモーターによって一般的に駆動され、転写は、ＣＤＳの下流に位置する合成ポリＡシグナル配列によって終結される。発現カセットに加えて、各ベクターは、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ発現細胞株における自律増殖のためのＥＢＶ  ｏｒｉＰ配列を含む。
【０３２９】
抗原及び抗体の産生及び精製
抗原及び抗体の両方は、ＥＢＶ由来のタンパク質ＥＢＮＡを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトされた。同時にコトランスフェクトしたビオチンリガーゼＢｉｒ  Ａをコードするプラスミドは、インビボでのａｖｉタグ特異的ビオチン化を可能とした。タンパク質は、次いで、プロテインＡ、続いてゲルろ過をカラムを用いて精製された。
【０３３０】
トラスツズマブ／ペルツズマブ共通の軽鎖の設計
トラスツズマブ及びペルツズマブのための共通の軽鎖（ＣＬＣ）の生成のために、個々の軽鎖（ＬＣ）を分析し、比較した。配列分析は、両方の可変ドメインが、同じ生殖系列配列に由来することを明らかにした。トラスツズマブの一般にＬＣＤＲ３が、具体的には残基Ｈ９１がＨｅｒ２の上トラスツズマブ特異的エピトープと特異的に相互作用することを考慮すると、トラスツズマブ／ペルツズマブのＣＬＣを作成する最初の試みは以下のようになされる：トラスツズマブの完全なＣＤＲ３領域又は残基Ｈ９１のみの何れかがペルツズマブのＬＣの対応する位置を置換した。その結果、ペルツズマブ由来ＬＣＤＲ１及び２をコードするがトラスツズマブ由来ＬＣＤＲ３のアミノ酸残基を保有するハイブリッドＬＣコンストラクトが作成された。得られたＣＬＣは、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」（配列番号２５として記載されている可変ドメインのＤＮＡ配列）又は「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」（配列番号２７）の何れかに命名され、トラスツズマブ又はペルツズマブＨＣの何れかと同時発現された。得られた４つの抗体（配列番号２２及び２６、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」；配列番号９２及び２６，「トラスツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」；配列番号２２及び２８、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」；配列番号９２及び２８、「トラスツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」）として記載されている可変ドメインのタンパク質配列は、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製され、Ｈｅｒ２に対する結合は、それぞれの親抗体（配列番号２２及び２４、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブＬＣ」；配列番号９２及び８２、「トラスツズマブＨＣ」ｘ「トラスツズマブＬＣ」）を用いてＳＰＲにより測定され、比較された。
【０３３１】
ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用したＳＰＲによる親和性決定
新規抗体鎖の組み合わせの親和性（ＫＤ）は、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴により測定した。最初の工程で、ｈｕＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を認識する抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｉ２１３６、ポリクローナルヤギ抗体）の６５００ＲＵがアミンカップリングによってＧＬＭチップの全６チャンネル上に固定化された（酢酸ナトリウムｐＨ４、３０μｌ／分、３００秒）（垂直方向）。
【０３３２】
各抗体を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で２μｇ／ｍｌに希釈し、その後、垂直方向において約４００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成するために３０μｌ／分で６０秒間注入された。Ｈｅｒ２の注入：ワンショット動態測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製されたＨｅｒ２の３倍希釈系列（３００と３．７ｎＭの間の可変濃度範囲）は、１８０秒の会合時間及び６００秒の解離時間を用いて、別々のチャネル１−５に沿って１００μｌ／分で同時に注入された。緩衝液（ＰＢＳＴ）が、参照するために「インライン」ブランクを提供するため、第６チャネルに沿って注入された。再生は、１００μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウエアの単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。
【０３３３】
予想されたように、両方の対照抗体であるトラスツズマブ及びペルツズマブは、低ナノモル又はサブ−ナノモル範囲での既知の親和性でＨｅｒ２を認識した。新たに設計された「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｙ９１Ｈ）ＬＣ」と組み合わせたペルツズマブＨＣの親和性はわずかに減少したが、トラスツズマブＨＣと組み合わせた同じ軽鎖は、いかなる検出可能な結合も得られなかった。これは、ペルツズマブＬＣにおける単一トラスツズマブ由来の点変異（Ｙ９１Ｈ）は、この鎖の組み合わせではＨｅｒ２に結合するには不十分であることを示している。これは、トラスツズマブＨＣと組み合わせると弱い結合をもたらしたが、ペルツズマブＨＣと共発現されると結合は減少したが明らかに目に見えた第二のＣＬＣ変異体「ペルツズマブＬＣ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）」とは対照的である。動力学的及び熱力学的測定の概要が図１９及び表１８に与えられる。この知見に基づいて、ＣＬＣ「ペルツズマブＬＣ（Ｔｒａｓｔ。Ｌ３）」は、ペルツズマブＨＣと同時発現される場合、親和性に可能な限り小さく影響を与えつつ、トラスツズマブＨＣと組み合わせてＨｅｒ２結合を回復させるために更に改変された。
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【０３３４】
実施例１２：共通の軽鎖の親和性向上
付加的トラスツズマブ特異的ＬＣＤＲ残基のペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣへの導入及び特性評価
以前のＳＰＲ測定の結果に基づいて、ペルツズマブＨＣと組み合わせて設計されたＣＬＣ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）ＬＣ」の結合は、減少したが依然として十分に検出可能な結合をもたらした。対照的に、トラスツズマブＨＣとのＣＬＣの共発現は、マイクロモル範囲で非常に弱い親和性をもたらし、親トラスツズマブ抗体と比較して有意に減少した。
【０３３５】
ＣＬＣの生成を更に進化させ、トラスツズマブＨＣとの組み合わせで結合を改善するために、ＬＣＤＲ１、２及び３並びにトラスツズマブに特異的であるフレームワーク３領域の付加的トラスツズマブ特異的アミノ酸が、以前に設計された「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）ＬＣ」の配列に個別に導入された（配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、及び５１として列挙された可変ドメインのＤＮＡ配列）。得られたコンストラクト（配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、及び５２として列挙された可変ドメインのタンパク質配列）は、トラスツズマブＨＣ（配列番号９２）又はペルツズマブＨＣ（配列番号２２）とともに共発現され、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製された。ＨＥＲ２に対する結合が測定され、それぞれの親抗体と比較された。
【０３３６】
ＳＰＲによる「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）ＬＣ」の変異体の親和性決定
新規抗体鎖の組み合わせの親和性（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴により測定され、前述のように実施された。動力学的及び熱力学的測定の概要が図１９に与えられる。
【０３３７】
興味深いことに、ペルツズマブと組み合わせた場合「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」における付加的単一変異の何れも有意には親和性に影響を与えず、その親和性は「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」に匹敵した。しかし、トラスツズマブＨＣとの「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」変異体の組み合わせは、有意な差を生じた。一方、ＬＣＤＲ３領域におけるペルツズマブ配列への復帰変異（Ｐ９４Ｙ及びＴ９６Ｙ）（配列番号５０及び５２として記載される可変ドメインのタンパク質配列）は完全にＨｅｒ２への結合を破壊し、ペルツズマブ特異的変異の導入（配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、及び４８）は、「トラスツズマブＨＣ」×「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」の最初の組み合わせと比較して同等又は改善された親和性を生じた。特に、変異Ｉ３１Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｙ５３Ｆ、及びＧ６６Ｒの導入は、結合に最も有意な改善につながった。
【０３３８】
「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」への最も重要なトラスツズマブ特異的残基の同時導入
上述の結合測定に基づいて、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」への４つの最適なトラスツズマブ特異的変異の導入を組み合わせた。何れかの個々の変異を含む可変ドメインのタンパク質配列は配列番号３６、４０、４２、及び４８として記載される。「四重変異」を含む鎖は、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」（配列番号５４）と命名した。
【０３３９】
ＳＰＲによる「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」の親和性決定
新規「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」を特性評価し、ペルツズマブＨＣ又はトラスツズマブＨＣの何れかと組み合わせた結合の親和性を決定するために、更にＳＰＲ実験を行った。新規抗体鎖の組み合わせの親和性（ＫＤ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて測定され、前述のように実施された。動力学的及び熱力学的測定の概要が図２０及び表２０に与えられる。前に導入され特性評価された個々の変異と同様に、ペルツズマブＨＣ及び「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」を含む抗体の親和性は、「ペルツズマブＨＣ」ｘ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）ＬＣ」の最初の鎖の組み合わせに比べて有意には低下しなかった。両方の鎖の組み合わせに対して、親和性は２６−３４ｎＭの範囲であった。興味深いことに、「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」との「トラスツズマブのＨＣ」の組み合わせは、Ｈｅｒ２に対する親和性の非常に強い改善につながる。更に、２００ｐＭのその親和性は、親抗体のトラスツズマブ（２．２ｎＭ）の測定された親和性よりも更に優れている。
トラスツズマブＨＣとの「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」の組み合わせはＨｅｒ２への結合を完全に回復させる（又はそれを超える）ことを考慮し、及びペルツズマブＨＣとの組み合わせはＨｅｒ２への結合を減少させるが抑制しないことを考慮すると、両方のＨｅｒ２特異性のためのＣＬＣとして「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」を使用し、ペルツズマブＨＣの親和性成熟によってペルツズマブ特異的エピトープへの結合を回復させることは明らかである。
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【０３４０】
実施例１３：ペルツズマブ重鎖の親和性成熟
ペルツズマブベースのＨ１／Ｈ３及びＨ２親和性成熟ライブラリーの作成
親和性成熟ペルツズマブ由来の重鎖の生成は、標準的なプロトコルを使用して、ファージディスプレイにより行った（Silacci et al, 2005）。
【０３４１】
「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」と一緒に発現され、改善された親和性を有するペルツズマブ由来のＨＣの生成のために、ＣＤＲ１及び３又はＣＤＲ２において無作為化された成熟ライブラリーが作成された。ペルツズマブＨＣ（配列番号２２）及び「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」（配列番号５４）の配列がファージミドにクローン化され、無作為化のための鋳型として使用した。ＣＤＲ１及び３で無作為化されたペルツズマブＨＣ親和性成熟ライブラリーの生成のために、３つの断片は、「オーバーラップ・エクステンションによるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって組み立てられ、ファージベクターにクローニングされた。以下のプライマーの組み合わせがライブラリー断片を生成するために使用された：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１４７）及びＡＭ＿ｏｍｎｉ＿Ｈ１＿ＴＮ−ｂａ（配列番号１４８）、断片２（ＲＪＨ１０８（ｏｍｎｉ＿３’Ｈ１＿ｆｏ）（配列番号１４９）及びＲＪＨ１０９（ｏｍｎｉ＿５’Ｈ３＿ｒｅ）（配列番号１５０）、及び断片３（ＡＭ＿ｏｍｎｉ＿Ｈ３＿ＴＮ＿ｆｏ（配列番号１５１）及びＲＪＨ９９（配列番号１５２）。完全長の無作為断片の十分な量を組み立てた後、それを同様に処理されたアクセプターファージミドベクターと一緒にＭｕｎＩ／ＮｈｅＩで消化した。Ｆａｂライブラリーインサートの６ｕｇが、ファージミドベクターの２４ｕｇと連結された。精製されたライゲーションは６０の形質転換のために使用され、６×１０ｅｘｐ９の形質転換体が得られた。ペルツズマブ親和性成熟ライブラリーを提示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製して選択に使用した。
【０３４２】
ＣＤＲ２−無作為化ペルツズマブＨＣ親和性成熟ライブラリーの生成は同様に行われたが、わずか２つの断片が生成され、組み立てられ、前と同様に同じ制限酵素を用いてファージミドにクローニングされた。以下のプライマーの組み合わせがライブラリー断片を生成するために使用された：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１４７）及びＲＪＨ１１０（ｏｍｎｉ＿５’Ｈ２＿ｂａ）（配列番号１５３）、及び断片２（ＡＭ＿ｏｍｎｉ＿ｈ２＿ＴＮ＿ｆｏ（配列番号１５４）及びＲＪＨ９９（配列番号１５２）。精製されたライゲーションは６０の形質転換のために使用され、４×１０ｅｘｐ９の形質転換体が得られた。ペルツズマブ親和性成熟ライブラリーを提示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製して選択に使用した。
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【０３４３】
親和性成熟ペルツズマブＨＣ−由来クローンの選択
ヒトＨｅｒ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する選択は、ＨＥＫ２９３で発現されたタンパク質を用いて行われた。抗原は、Ｎ末端のａｖｉタグを介してビオチンリガーゼＢｉｒ  Ａの共発現により酵素的にビオチン化された。パニングラウンドは、以下のパターンに従って溶液中で行われた：１．  １ｍｌの全容量で０．５時間１０ｎＭのビオチン化Ｈｅｒ２  ＥＣＤへ〜１０１２ファージミド粒子の結合、２．  １０分間、５．４×１０７ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加によるビオチン化Ｈｅｒ２  ＥＣＤ及び特異的に結合したファージ粒子の捕捉、３．  ５×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌのＰＢＳを用いたビーズの洗浄、４．  １０分間、１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡを添加することによるファージ粒子の溶出及び５００μｌの１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加することによる中和、５．  指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌の再感染、６．  ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染及び続いてその後の選択ラウンドに使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。選択は減少する濃度（２０ｘ１０−９Ｍから１ｘ１０−９Ｍ））を用いて３ラウンドにわたって実施された。ラウンド２及び３において、抗原：ファージ複合体の捕捉はストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラビジンプレートを用いて行った。また、ニュートラビジンプレートは２ｌのＰＢＳ中で３時間洗浄した。特異的バインダーは、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定された：ウェルあたり３０ｎＭのビオチン化Ｈｅｒ２  ＥＣＤ１００μｌがニュートラビジンプレート上にコーティングされた。Ｆａｂを含む細菌の上清が添加され、結合するＦａｂが抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して、Ｆｌａｇ・タグを介して検出された。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、９６ウェルフォーマットで、可溶性Ｆａｂ断片として細菌に発現させ、上清はＰｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６を用いてＳＰＲ分析による動力学的スクリーニング実験に供された。
【０３４４】
ＳＰＲによる親和性成熟ペルツズマブＨＣ変異体の親和性決定
新規ペルツズマブＨＣ変異体の親和性（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴によって測定された。第一工程において、ポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体の７０００ＲＵは、アミンカップリングによるＧＬＭチップの全６チャンネル上に固定化された（酢酸ナトリウムｐＨ４．５、３０μＬ／分、３００秒）（垂直方向）。
【０３４５】
各抗体含有細菌上清をろ過し、ＰＢＳで３倍に希釈し、次に垂直方向に１００から４００の間の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成するために３０μｌ／分で１８０秒間注入された。Ｈｅｒ２の注入：ワンショット動態測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製されたＨｅｒ２の２倍希釈系列（１００と６．２５ｎＭの間の可変濃度範囲）は、１８０秒の会合時間及び１０００秒の解離時間を用いて、別々のチャネル１−５に沿って１００μｌ／分で同時に注入された。緩衝液（ＰＢＳＴ）が、参照するために「インライン」ブランクを提供するため、第６チャネルに沿って注入された。再生は、１００μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウエアの単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。最も高い親和性定数を有するＦａｂを発現するクローンを同定し、対応するファージミドの重鎖を配列決定した。最高親和性のペルツズマブＨＣ変異体（配列番号６２、６６、６８、７０、７２、及び７４として記載される可変ドメインのタンパク質配列）の熱力学的測定は表２３及び図２１に要約される。
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【０３４６】
実施例１４：トラスツズマブ／ペルツズマブ二重特異性抗体の特性評価
ＣＬＣを有するトラスツズマブ／ペルツズマブ二重特異性抗Ｈｅｒ抗体の生成
次の工程では、親和性成熟ペルツズマブＨＣ並びにトラスツズマブＨＣは「ペルツズマブ（Ｔｒａｓ．Ｌ３）（ＱＭ）ＬＣ」と命名されるＣＬＣと組み合わせて二重特異性抗体のフォーマットで発現された。ＣＬＣを有するこのような二重特異性抗体の生成のために、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化がノブ・イントゥ・ホール技術の適用によって達成された。ペルツズマブの親和性成熟クローンＥ１及びＧ２の可変ドメイン（配列番号６８及び７０として記載される可変ドメインのタンパク質配列）並びにクローン「Ｄ１由来」（Ｄ１−ｄｅｒ）配列（配列番号６４）が、ドメインＣＨ３に「ホール」変異を含むヒトＩｇＧ１  ＨＣにクローニングされた。ＣＬＣを有する二重特異性抗体の概略が図２２に示される。親和性成熟クローン「Ｄ１−ｄｅｒ」は、クローンＤ１（配列番号６２）のＣＤＲ１及び３変異を他の選択されたクローンに見いだされた付加的ＣＤＲ２変異と組み合わせる。トラスツズマブＨＣの可変ドメイン（配列番号９２）はドメインＣＨ３に「ノブ」変異を保有するヒトＩｇＧ１  ＨＣにクローニングされた。「ハーセプチン」コンストラクトと呼ばれる、得られたコンストラクトは共発現され、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製された。３つ全ての二重特異性抗体の分析データの概要が図２３と表２４中のクローンに示される。
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【０３４７】
Ｈｅｒ２ノックアウト抗原変異体の生成
Ｈｅｒ２上の両方のエピトープのそれぞれに対する、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ二重特異性抗体の結合を分析し特性評価するために、Ｈｅｒ２のノックアウト変異体が設計された。これらの変異体では、２つの特異的エピトープの何れかは、それぞれの抗体鎖と相互作用するアミノ酸の変異によって除去された。
【０３４８】
発現及び精製のために、それぞれのＤＮＡ断片は、Ｎ末端リーダー配列及び溶解−及び精製タグとしての機能を果たすＣ末端ヒトＩｇＧ１  Ｆｃをコードする断片にインフレームで融合された。Ｆｃ断片のＣ末端のａｖｉタグはインビボでビオチン化させた。単量体型で抗原を発現するために、これらのＦｃ鎖は「ノブ」変異が含まれ（配列番号５及び６、Ｈｅｒ２  ＥＣＤ−Ｆｃ（ノブ）；配列番号７及び８、Ｈｅｒ２  ＥＣＤ（ペルツズマブＫＯ）−Ｆｃ（ノブ）；配列番号９及び１０、Ｈｅｒ２  ＥＣＤ（トラスツズマブＫＯ）−Ｆｃ（ノブ））、「Ｆｃ−ホール」カウンターパート（配列番号３及び４）と組み合わせて共発現させた。
【０３４９】
ＳＰＲによるＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ二重特異性抗体の親和性決定
ｈｅｒ２におけるそれらのエピトープの各々に対する新規二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）は、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＳＰＲにより測定した。最初の工程で、ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を認識するポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｉ２１３６）の１１０００ＲＵがアミンカップリングによってＧＬＭチップの全６チャンネル上に固定化された（酢酸ナトリウムｐＨ４、３０μｌ／分、３００秒）（垂直方向）。
【０３５０】
各抗体を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で２μｇ／ｍｌに希釈し、その後、垂直方向において約４００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成するために３０μｌ／分で６０秒間注入された。Ｈｅｒ２の注入：ワンショット動態測定のために、注入方向は水平方向に変更され、精製された一価Ｈｅｒ２−Ｆｃタンパク質コンストラクトの２倍希釈系列（１００と６．２５ｎＭの間の可変濃度範囲）は、１８０秒の会合時間及び６００秒の解離時間を用いて、別々のチャネル１−５に沿って１００μｌ／分で同時に注入された。緩衝液（ＰＢＳＴ）が、参照するために「インライン」ブランクを提供するため、第６チャネルに沿って注入された。再生は、１００μｌ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５及び５０ｍＭのＮａＯＨの２つのパルスによって行った（水平方向）。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによるＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウエアの単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。
【０３５１】
トラスツズマブ、ペルツズマブ並びに親和性成熟ペルツズマブＨＣ、トラスツズマブＨＣ、及びＣＬＣ「ペルツズマブ（Ｔｒａｓｔ．Ｌ３）（ＱＭ）」を含む３つの二重特異的Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇコンストラクトを含む全ての抗体が両方のＨｅｒ２ノックアウト変異体への結合について試験された。予想されたように、トラスツズマブ及びペルツズマブの両方とも、それぞれのＨｅｒ２のエピトープに予想される親和性で結合する。それらに対応するノックアウト変異体への結合は消失された（図２４）。これらの結果は、Ｈｅｒ２のノックアウトエピトープ変異体の使用は、二重特異性抗体の結合を切断させ、両特異性の個々の親和性を分析することを可能とすることを示している。
各ハーセプチンクローン変異体の個々のＫＤ値の決定は、０．６から１．８ｎＭの予想される範囲内のトラスツズマブのエピトープに対する一定の結合親和性を明らかにした。これとは対照的に、ペルツズマブのエピトープへの結合は、親和性成熟ペルツズマブＨＣに依存する。３つのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇクローン変異体のうち、クローン「Ｄ１−Ｄｅｒ」は最も高い親和性（０．１６ｎＭ）を有することが見出された。熱力学的データの概要を表２５に示す。要約すると、本実験では、我々が、ＣＬＣを有し、トラスツズマブ及びペルツズマブのエピトープに特異的な二重特異性抗体を生成することができたことを確認する。
【０３５２】
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇクローン変異体のＫＰＬ−４細胞への結合分析
ＫＰＬ−４細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。０．２Ｍｉｏ細胞を、９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体４０μｌに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために４℃で３０分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈した二次ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−０９６−０９８）１２μｌ中に再懸濁し、４℃で３０分間再びインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁し、蛍光をＢＤ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定した。結果を図２５に示す。
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【０３５３】
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ結合変異体により媒介される増殖阻害
標的細胞を、回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、５×１０３細胞／ウェルの濃度で播種した。それぞれの抗体希釈液を添加する前に、細胞を細胞インキュベーター中で４時間インキュベートした。プレートを穏やかに振盪し、細胞インキュベーター中で５日間インキュベートした。プレートを室温に平衡化され、新たに調製したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質１００μｌ／ウェルが各ウェルに添加された。発光はＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒで測定された。結果は、表２６及び図２６に示される。
【０３５４】
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇクローン媒介性抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
標的細胞を回収し、洗浄し、ＡＩＭＶ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３×１０４細胞／ウェルの濃度で蒔いた。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞（末梢血単核エフェクター細胞［ＰＢＭＣ］）の添加前に１０分間インキュベートした。エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞は、次いで、指示されたＥ：Ｔ比で３７℃で指示された時間インキュベートされた（全試料について三通り）。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。ＡＤＣＣは、以下の式を用いて計算された。
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【０３５５】
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、０％細胞毒性として定義され、最大放出（１％トリトンＸ−１００で溶解した標的細胞）は、１００％細胞毒性として定義された。三通りの各実験のＡＤＣＣの平均割合及び標準偏差が計算された。結果を図２７に示す。
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【０３５６】
実施例１５：増殖アッセイ
１ｘ１０４ＢＴ−４７４細胞／ウェルが、９６ウェル平底プレート中のＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で培養された。２４時間後、増殖培地を除去し、指示された抗体の滴定量が１００μｌの最終容量に添加された（培地中で予備混合された）。
培養物中の生存細胞の数を決定するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙが、代謝活性細胞の指標として現在のＡＴＰレベルを定量することによって行われた。このように、培養の６日後に、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号＃Ｇ７５７１）を細胞に添加し、２分間振り、溶解物の７５μｌが、別の９６ウェル平底タイタープレートに移された（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号＃３９１７）。更に混合した後、発光はＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｒｅａｄｅｒを使用して、製造者の指示に従って評価された。
【０３５７】
結果は、表２８及び図２８に示される。
【０３５８】
増殖アッセイでは、二重特異性Ｈｅｒ２抗体は、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブ単独又は組み合わせにおいてＢＴ−４７４細胞の増殖をより強力に阻害することが示された。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
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【０３５９】
実施例１６：Ｃ１ｑ  ＦＡＣＳ結合アッセイ
３ｘ１０５個のＢＴ−４７４細胞を氷上で指示抗体１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【０３６０】
３０分後、１０μｇ／ｍｌのＣ１ｑ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ１７４０）を添加し、更に２０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、市販のＰＥ標識抗Ｃ１ｑ抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ＣＬ７６１１ＰＥ−ＳＰ）を用いて対比染色した。更にインキュベーション（３０分間、氷）した後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩで分析した。
【０３６１】
結果は、図２９及び表２９に示される。このＣ１ｑのアッセイは、ＢＴ−４７４細胞上における組換え補体因子Ｃ１ｑの異なるＨｅｒ抗体への結合を示している。これは、最高のＣ１ｑ結合は、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせ、続いて２つのＣＬＣ二重特異性Ｈｅｒ２抗体により処置して得られたことが示された。Ｃｒｏｓｓｍａｂによる処置はわずかに上昇したＣ１ｑ結合のみが得られた。
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【０３６２】
実施例１７：仔ウサギ補体（ＢＲＣ）を用いたＬＤＨアッセイ
ＣＨＯ−Ｋ１  Ｎｘｒｅ１９細胞（ＩＬ１５ＲでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１）が、９６ウェル平底細胞培養プレート（ＮＵＮＣ、１００μＬ／ウェル）上に１０，０００細胞／ウェルで播種され、一晩培養された。ＩＬ１５−Ｆｃ融合ポリペプチドが添加され（５倍最終濃度の２５μＬ／ウェル）、１時間インキュベートされた。その後、仔ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＣＬ３４４１）の１バイアルをＡｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔの１ｍＬで再構成した。補体溶液は培地で希釈され、２５μＬがウェルに添加された。４時間後、プレートを２００ｇで遠心分離し、１００μＬ／ウェルが別の９６ウェル平底プレートに移された。その後、ＬＤＨ反応混合物（細胞傷害性検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１００μＬ添加した。３７℃で２０分のインキュベーション時間後、光学密度（ＯＤ）がＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅリーダーで４９２／６９０ｎｍで測定された。
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ＢＲＣは、低バックグラウンド毒性を有し、用量依存性補体毒性を示すことが分かる。
【０３６３】
実施例１８：ＢＴ−４７４細胞におけるＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性化（ＬＤＨ放出）
１ｘ１０４細胞／ウェルが、１５０μｌ中、３７℃で３０分間、指示された抗体の１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートされた。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【０３６４】
その後、５０μｌの仔ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＣＬ３４４１、バッチ番号６３１２）が添加され、更に２時間インキュベートされた。次いで、ｓ／ｎは移され、５０μｌのＬＤＨ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）と混合され、１５分間の更なるインキュベーション後、吸光度（Ｅｘ）はＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ  リーダーで４９０／６２０ｎｍで分析された。ＢＴ−４７４細胞に対する特異的抗体依存性毒性（ｎ＝４の平均＋／−ＳＤ）は以下のように計算された：
（Ｅｘ．試料−Ｅｘ．自発的溶解／Ｅｘ．最大溶解−自発的溶解）ｘ１００.
結果を図３０に示す。
【０３６５】
このＣＤＣアッセイは、仔ウサギ補体の存在下で、異なる抗Ｈｅｒ２抗体（フォーマット、組み合わせ）の処置の際の瀕死／死細胞のマーカーとしてのＬＤＨの放出を示す。
ここでは、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせは、ＣＤＣの有意な誘導をもたらしたが、親抗体単独ではもたらさなかった。驚くべきことに、両方のＣＬＣ  Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体はより優れたＣＤＣ作用を誘発したが、一方Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  Ｃｒｏｓｓｍａｂ処置は親抗体の組み合わせよりも効果の弱いＣＤＣ反応をもたらしている。
【０３６６】
実施例１９：ＢＴ−４７４細胞のＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）媒介性死滅（ＡＣＥＡ）
１ｘ１０４のＢＴ−４７４細胞／ウェルが９６ウェルのＥ−プレート（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）に播種され、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ装置中で一晩増殖された。増殖培地は除去され、細胞は、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）で一回洗浄された。５０μｌ／ウェルのＡＩＭ−Ｖ培地及びＡＩＭ−Ｖ中の５０μｌの抗体（３倍の最終濃度）が添加され、２０分間インキュベートされた。５０μｌの仔ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）が添加され、ＣｅｌｌＩｎｄｅｘ（ＣＩ；細胞の生存率についての代表として）が５分毎に測定された（曲線を参照）。以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  ｗｔ”：配列番号６４、５４、９２、「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒ  Ｇ２」：配列番号６４、５４、９２（糖鎖操作型変異体）「Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣｒｏｓｓＭａｂ」：配列番号１０９、１１０、１１１、１１２。
【０３６７】
特異的ＣＤＣは下記式により算出され、ここでＣＩは正規化されたセルインデックスである：
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【０３６８】
２つの代表時点において（反応開始後１時間及び２時間後）、特異的溶解（＝ＣＤＣ誘導細胞死）が算出され、図に示される（ｎ＝４の平均＋／ＳＥＭ）。
【０３６９】
結果は、図３１及び表３１に示される。このＣＤＣアッセイは、仔ウサギ補体の存在下で、異なる抗Ｈｅｒ２抗体（フォーマット、組み合わせ）による処置の際の瀕死／死細胞のマーカーとしてのセルインデックスの変化を示す。ここでは、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせは、ＣＤＣの有意な誘導をもたらしたが、親抗体単独ではもたらさなかった。驚くべきことに、両方のＣＬＣ  Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ変異体はより優れたＣＤＣ作用を誘発したが、一方Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  Ｃｒｏｓｓｍａｂ処置は親抗体の組み合わせよりも効果の弱いＣＤＣ反応をもたらしている。
【０３７０】
Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ  Ｄ１−ｄｅｒの優位性の一つの可能な理由は、トラスツズマブのエピトープに対するわずかに高い親和性並びにペルツズマブのエピトープに対する有意に高い親和性であり得る（表２５も参照）。
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【０３７１】
実施例２０：マウス異種移植研究
細胞株ＫＰＬ４
このヒト乳がん細胞株は、炎症性皮膚転移を有する乳がん患者の悪性胸水から樹立されている。細胞は、Ｊ．Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ教授によって提供された（Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｋｕｒａｓｈｉｋｉ、Ｊａｐａｎ）。腫瘍細胞は、５％ＣＯ２で水飽和大気中、３７℃で１０％ウシ胎児血清グルタミン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で常套的に培養された。培養継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ １×（ＰＡＮ）を用いて行われ、２回／週、分割された。細胞継代Ｐ６がインビトロ研究に使用された。
【０３７２】
マウス
雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ．−１７）マウス；年齢１０−１２週；体重１８〜２０ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）；体重＞２０ｇは、国際ガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明／１２時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、１週間動物施設の検疫部で収容された。継続的な健康管理が定期的に実施された。ダイエット食品（Ａｌｌｔｒｏｍｉｎ）及び水は自由に与えられた。実験的研究は、地方自治体によりレビューされ承認された。
【０３７３】
腫瘍細胞の注入
注入の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＴｒｉＦｌａｓｋ）から回収され（トリプシン−ＥＤＴＡ）、５０ｍｌの培地に移され、１回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁された。ＰＢＳによる更なる洗浄工程及びろ過（セルストレイナー；Ｆａｌｃｏｎφ１００μｍ）の後に、最終の細胞力価を１．５ｘ１０８／ｍｌに調整された。腫瘍細胞懸濁液は、細胞凝集を避けるため移送ピペットを用いて慎重に混合された。麻酔は、プレインキュベーションチャンバー（プレクシグラス）、個々のマウスの鼻マスク（シリコン）及び可燃性又は爆発性でない麻酔化合物イソフルラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて小動物用のＳｔｅｐｈｅｎｓ吸入器を使用して閉鎖循環系で実行された。注入の２日前に、ＳＣＩＤベージュマウスの外被は剃毛され、ＫＰＬ−４細胞（３×１０ｅ６細胞）は、各麻酔マウスの右の最後から２番目の鼠径部乳腺脂肪体に２０μｌの容量で（Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジ及び３０Ｇｘ１／２”針を使用して）同所注入された。細胞懸濁液が、乳頭下の皮膚を介して注入された。
【０３７４】
モニタリング
動物は、副作用の臨床症状の検出のために毎日管理された。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週２回記録し、週２回腫瘍体積をキャリパーで測定した。腫瘍体積は、ＮＣＩプロトコルに従って算出された（腫瘍重量＝１／２ａｂ２、「ａ」及び「ｂ」は、それぞれ腫瘍の長径、短径である）。終了基準はクリティカルな腫瘍塊（上限１．７ｇ又はφ＞１．５ｃｍ）、ベースラインから２０％以上の体重減少、動物の腫瘍潰瘍又は悪い全身状態であった。動物に対する研究の除外基準が説明され、対応する「Ｔｉｅｒｖｅｒｓｕｃｈｓａｎｚｅｉｇｅ」で承認される。
【０３７５】
処置
マウスは８０ｍｍ３の腫瘍体積について無作為化され、続いて腹腔内の１０ｍｌ／ｋｇの量で週一回処置された。併用治療のために、ハーセプチンが最初に与えられ、その２４時間後にパージェタが与えられた。
以下の二重特異性Ｈｅｒ２抗体が試験された：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ  ＣＬＣ−Ｄ１−ｄｅｒ：配列番号６４、５４、９２。結果を図３２に示す。
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【０３７６】
実施例２１：三価ＨＥＲ２（細胞外ドメインＩＶ）−ＨＥＲ２（細胞外ドメインＩＩ）−  トランスフェリン特異的抗体の生成
発現プラスミドの生成
所望のタンパク質は、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクションによって発現された。所望の遺伝子／タンパク質（例えば、抗体−Ｆａｂ多量体タンパク質）の発現のために、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
・イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
・マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（ＳＳ）、
・発現される遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖）、及び
・ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０３７７】
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本／標準哺乳動物発現プラスミドには以下が含まれる。
・Ｅ．ｃｏｌｉにおいてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
・Ｅ．ｃｏｌｉにおいてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
【０３７８】
以下の抗体＋／−ｓｃＦａｂタンパク質をコードする発現プラスミドを構築した：
１．ＢＢＢ−０５８０  三価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）
重鎖ノブ（ハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）（ＩｇＧ１）ノブＳＳ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＬ−Ｃｋ−（Ｇ４Ｓ）６−ＧＧ−ＶＨ−ＣＨ１）（Ｓｅｑ．２１８３２／配列番号１６５）
ノブハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖融合タンパク質の組成：
・  ＣＨ３ノブ変異Ｔ３６６及び付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＳ３５４Ｃ変異を含むＣ末端Ｌｙｓを有しないハーセプチン（Ｄ８９Ｅ）ヒトＩｇＧ１重鎖
・  グリシン−セリン−リンカー
・  マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Boado et al., 2009）
・  ヒトＣ−カッパ軽鎖
・  グリシン−セリン−リンカー
・  マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Boado et al., 2009）
・  ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１重鎖ドメイン
重鎖ホール（ペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）（ＩｇＧ１）ホールＳＳ（配列番号１６３）
ホールペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）重鎖タンパク質の組成：
・ＣＨ３ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｙ４０７Ｖ及びＬ３６８Ａ並びに付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＹ３４９Ｃ変異を含むペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）ヒトＩｇＧ１重鎖
軽鎖（ＣＬＣ−Ｈｅｒｃ  ｃｏｍｂｏ）（クローンＤ１−ｄｅｒ  配列番号１６１）
・  実施例１４を参照
【０３７９】
２．ＢＢＢ−０５８１  三価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）
重鎖ノブ（ハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）（ＩｇＧ１）ＬＡＬＡ−ＰＧノブＳＳ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＬ−Ｃｋ−（Ｇ４Ｓ）６−ＧＧ−ＶＨ−ＣＨ１）（Ｓｅｑ．２１８３４、配列番号１６８）
ノブハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）重鎖融合タンパク質の組成：
・  Ｃ末端Ｌｙｓを有しないハーセプチン（Ｄ８９Ｅ）ヒトＩｇＧ１重鎖であって：
−  免疫エフェクター細胞とのＦｃγ受容体媒介性相互作用並びに補体活性化を損なうＣＨ２変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ
−  ＣＨ３ノブ変異Ｔ３６６Ｗ及び付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＳ３５４Ｃ変異
を含むもの。
・  グリシン−セリン−リンカー
・  マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Boado et al., 2009）、配列番号１７８
・  ヒトＣ−カッパ軽鎖
・  グリシン−セリン−リンカー
・  マウス８Ｄ３抗トランスフェリン抗体の可変重鎖ドメイン（ＶＬ）変異体（Boado et al., 2009）、配列番号１７９
・  ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１重鎖ドメイン
重鎖ホール（ペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）（ＩｇＧ１）ＬＡＬＡ−ＰＧホールＳＳ（Ｓｅｑ．２１８３６、配列番号１６９）
ホールペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）重鎖タンパク質の組成：
・  ペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）ヒトＩｇＧ１重鎖であって：
−  免疫エフェクター細胞とのＦｃγ受容体媒介性相互作用並びに補体活性化を損なうＣＨ２変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ
−  ＣＨ３ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ並びに付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＹ３４９Ｃ
−  重鎖ホール−ホール二量体のタンパク質精製を避けるためのＣＨ３ホール変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ
を含むもの。
軽鎖（ＣＬＣ−Ｈｅｒｃ  ｃｏｍｂｏ）（クローンＤ１−ｄｅｒ  配列番号１６１）
・  実施例１４を参照
【０３８０】
３．ＢＢＢ−０５８２  二価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）（ＢＢＢ−Ｒバインダーを有しない対照分子）
重鎖ノブ（ハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）（ＩｇＧ１）ＬＡＬＡ−ＰＧ（Ｓｅｑ．２１８３５、配列番号１７０）
ノブハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）重鎖タンパク質の組成：
・  ハーセプチン（Ｄ８９Ｅ）ヒトＩｇＧ１重鎖であって：
−  免疫エフェクター細胞とのＦｃγ受容体媒介性相互作用並びに補体活性化を損なうＣＨ２変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ
−  ＣＨ３ノブ変異Ｔ３６６Ｗ及び付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＳ３５４Ｃ変異
を含むもの。
重鎖ホール（ペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）（ＩｇＧ１）ＬＡＬＡ−ＰＧホールＳＳ（Ｓｅｑ．２１８３６、配列番号１６３）
ホールペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）重鎖タンパク質の組成：
・  ペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）ヒトＩｇＧ１重鎖であって：
−  免疫エフェクター細胞とのＦｃγ受容体媒介性相互作用並びに補体活性化を損なうＣＨ２変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ
−  ＣＨ３ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ並びに付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＹ３４９Ｃ
−  重鎖ホール−ホール二量体のタンパク質精製を避けるためのＣＨ３ホール変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ
を含むもの。
軽鎖（ＣＬＣ−Ｈｅｒｃ  ｃｏｍｂｏ）（クローンＤ１−ｄｅｒ  配列番号１６１）
・  実施例１４を参照
【０３８１】
４．  Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＢＢＢ−Ｒバインダーを有しない対照分子）
重鎖ノブ（ハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）（ＩｇＧ１）（配列番号：１７１）
ノブハーセプチン（Ｄ９８Ｅ）重鎖タンパク質の組成：
・  ＣＨ３ノブ変異Ｔ３６６及び付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＳ３５４Ｃ変異を含むハーセプチン（Ｄ８９Ｅ）ヒトＩｇＧ１重鎖
重鎖ホール（ペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）（ＩｇＧ１）ホールＳＳ（Ｓｅｑ．２１８３６、配列番号１６３）
ホールペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）重鎖タンパク質の組成：
・  ＣＨ３ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ並びに付加的ジスルフィド架橋の形成のためのＹ３４９Ｃ変異を含むペルツズマブ（ａｆｆ．ｍａｔ．）ヒトＩｇＧ１重鎖
軽鎖（ＣＬＣ−Ｈｅｒｃ  ｃｏｍｂｏ）（クローンＤ１−ｄｅｒ  配列番号１６１）
・  実施例１４を参照
配列を表３６及び３７に示す。
参考文献：Boado RJ, Zhang Y, Wang Y, Pardridge WM. Engineering and expression of a chimeric transferrin receptor monoclonal antibody for blood-brain barrier delivery in the mouse. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1251-8。
【０３８２】
実施例２２：三価ＨＥＲ２（細胞外ドメインＩＶ）−ＨＥＲ２（細胞外ドメインＩＩ）−トランスフェリン特異的抗体及びＢＢＢ−Ｒバインダーを有しない対照分子の精製
抗体鎖は、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中で培養したＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞株２９３由来）の一過性トランスフェクションにより生成した。トランスフェクションのために、２９３−Ｆｒｅｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。抗体鎖は、三価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）ノブ及びホール重鎖、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ軽鎖又は二価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇノブ及びホール重鎖、並びにＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ軽鎖それぞれをコードする３つの異なるプラスミドから発現された。トランスフェクションのために、３つのプラスミドを、三価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）についてはプラスミド比２：１：１（ＬＣ：ＨＣノブ：ＨＣホール）で、三価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）及び二価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）についてはプラスミド比１：１：２（ＬＣ：ＨＣノブ：ＨＣホール）で、及び二価Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇについてはプラスミド比２：１：１（ＬＣ：ＨＣノブ：ＨＣホール）で使用した。トランスフェクションは、製造者の指示に定められる通りに行った。抗体含有細胞培養上清をトランスフェクションの７日後に回収した。上清を精製まで凍結保存した。
【０３８３】
タンパク質を濾過した細胞培養上清から精製した。上清をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。抗体の溶出は、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で行い、続いてサンプルをｐＨ６．５にすばやく中和した。凝集したタンパク質及び他の副生成物を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単量体抗体から分離した。完全に組み立てられた分子及び他の副産物の定量化のために、全ての単一画分を、分析用ＳＥＣ（ＭａｂＰａｃ  ＳＥＣ−１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びチップベースキャピラリー電気泳動システム（ＣＥ−ＳＤＳ、ＬａｂＣｈｉｐＧＸ、Ｃａｌｉｐｅｒ）で分析した。副産物を有しない単量体抗体画分をプールした。ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０分子量カットオフ）遠心濃縮器を用いて濃縮した後、タンパク質を−８０℃で保存した。最終生成物の解析評価は、ＵＶタンパク質測定、ＣＥ−ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、及びエンドトキシン測定によって行った。
【０３８４】
実施例２３：ＢＴ４７４−Ｍ１及びＢＡ／Ｆ３細胞に対するＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）及び対照抗体の結合分析
ＨＥＲ２＋ＢＴ４７４−Ｍ１及びＴｆＲ＋ＢＡ／Ｆ３細胞を、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）及びＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ対照分子の結合分析のための標的細胞として使用した。ＢＴ４７４−Ｍ１細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＬのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で維持し、ＢＡ／Ｆ３細胞を、ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−３中で維持した。細胞株の増殖は、標準的な細胞培養プロトコルに従った。
【０３８５】
ＢＴ４７４−Ｍ１及びＢＡ／Ｆ３細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。０．２Ｍｉｏ細胞を、９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを３５０×ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体１２０μｌに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために４℃で１時間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈したヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ＰＥ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−１１６−１７０）１００μｌ中に再懸濁し、４℃で３０分間再びインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液５０μｌに再懸濁し、蛍光をＢＤ  ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定した。結果を図３３及び３４に示す。全てのＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ抗体はＨＥＲ２＋ＢＴ４７４−Ｍ１細胞に特異的に結合し、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）融合タンパク質はＴｆＲ＋ＢＡ／Ｆ３細胞に結合する。
【０３８６】
実施例２４：三価ＨＥＲ２（細胞外ドメインＩＶ）−ＨＥＲ２（細胞外ドメインＩＩ）−トランスフェリン特異的抗体及びＨＥＲ２＋ＢＴ４７４−Ｍ１細胞に対するＢＢＢ−Ｒバインダーを有しない対照分子を用いた増殖阻害アッセイ
増殖を阻害するＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ分子の能力は、細胞株ＢＴ４７４−Ｍ１において評価された。対数増殖期の細胞を分離し、計数し、４ｘ１０３個の細胞を９６ウェル細胞培養プレートのウェル当たり６０μＬの培地中に播種した。細胞はインキュベーター中で一晩維持され、翌日、培地で希釈された各抗体の６０μＬを細胞の希釈系列の形式で添加した。５日間の総インキュベーション時間の後、細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙにより評価した。アッセイを製造者によって推奨されるように行った。
図３５は、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ＋／−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）分子とのインキュベーション後のＢＴ４７４−Ｍ１細胞増殖の阻害を示す。
2018522549.tif 000074
2018522549.tif 000075
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【０３８７】
実施例２５：一価抗ＴｆＲ抗体の特徴づけ
細胞ＥＬＩＳＡによるヒト及びカニクイザルＴｆＲ結合抗体の同定
ヒト及びカニクイザルＴｆＲを認識する抗体についてウサギＢ細胞又はマウスハイブリドーマ上清をスクリーニングするために、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた細胞ＥＬＩＳＡを使用した。ヒト又はカニクイザルＴｆＲ並びにネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼの発現カセットを含む発現プラスミドによりＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクトすることにより、安定なトランスフェクタントを得た。トランスフェクション後、細胞を５００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む増殖培地で希釈した。増殖するクローンの出現後、細胞を剥離し、ＭＥＭ−７５（Ａｂｃａｍ）又は１３Ｅ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びヒト又はカニクイザルＴｆＲに対するＰＥ標識二次抗体で染色し、高度に蛍光性の細胞を単一細胞として９６ウェルプレートウェル（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）に分類した。増殖の７日後、クローンを再びＴｆＲ発現について調べ、最良の発現クローンを細胞ＥＬＩＳＡ実験のために選択した。
【０３８８】
簡潔には、３８４ウェルプレートのウェル当たり１５，０００個の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。自動洗浄機（ＢＩＯＴＥＫ）を用いて上清を除去し、３０μＬの抗体含有上清を各ウェルに加え、続いて２４μＬの増殖培地を加えた。２時間のインキュベーションの後、ウェルを空にし、ＰＢＳ中０．０５％グルタルアルデヒド３０μＬを室温（ＲＴ）で４５分間加えた。ＰＢＳ／０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈した抗ウサギＨＲＰ又は抗マウスＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）３０μＬを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄し、ウェルあたり３０μＬのＴＭＢを用いてシグナルを生成し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０３８９】
抗ＴｆＲ抗体のクローニング及び発現
・  組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。
・  遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントをＧｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。あるいは、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、又はＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ−Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製した。
ＶドメインのＰＣＲ増幅
【０３９０】
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ８／９６  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０７０９．４，７４０６９８）を製造者のプロトコールに従って用いて、Ｂ細胞溶解物（ＲＬＴ緩衝液−Ｑｉａｇｅｎ−カタログ暗号７９２１６に再懸濁）から全ＲＮＡを調製した。６０μＬのＲＮＡｓｅフリー水でＲＮＡを溶出した。６μＬのＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １８０８０−４００）及びオリゴｄＴプライマーを製造者の指示に従って使用して逆転写反応によりｃＤＮＡを生成した。全ての工程は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ  Ｓｔａｒ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。４μＬのｃＤＮＡを使用して、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２３４４−０４０）を用いて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を、野生型ウサギＢ細胞の重鎖についてはｒｂＨＣ．ｕｐ及びｒｂＨＣ．ｄｏ、軽鎖についてはｒｂＬＣ．ｕｐ及びｒｂＬＣ．ｄｏのプライマー、並びにトランスジェニックウサギＢ細胞の軽鎖についてはＢｃＰＣＲ＿ＦＨＬＣ＿ｌｅａｄｅｒ．ｆｗ及びＢｃＰＣＲ＿ｈｕＣｋａｐｐａ．ｒｅｖのプライマーを用いて最終容量５０μＬで増幅した（以下の表を参照）。全てのフォワードプライマーはシグナルペプチド（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）に特異的であったのに対し、リバースプライマーは（ＶＨ及びＶＬそれぞれの）定常領域に特異的であった。ＲｂＶＨ＋ＲｂＶＬについてのＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間ホットスタート；９４℃で２０秒、７０℃で２０秒；６８℃で４５秒を３５サイクル、及び最後の伸長反応を６８℃で７分間。ＨｕＶＬのＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間ホットスタート；９４℃で２０秒、５２℃で２０秒；６８℃で４５秒を４０サイクル、及び最後の伸長反応を６８℃で７分間。
2018522549.tif 000080
【０３９１】
５０μＬのＰＣＲ溶液８μＬを４８  Ｅ−Ｇｅｌ  ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇ８００８−０２）に負荷した。ポジティブＰＣＲ反応物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を用いて製造者のプロトコールに従って洗浄し、５０μＬの溶出緩衝液で溶出させた。全ての洗浄工程は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ  Ｓｔａｒ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。
【０３９２】
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物をオーバーハングクローニング法によりｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした（RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256）。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーター及び３’ＧＨＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加えて、プラスミドはｐＵＣ１８由来の複製起点及びＥ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド増幅のためのアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。塩基性プラスミドの３つのバリアントを使用した：１つのプラスミドはＶＨ領域を受容するように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含むが、一方２つの付加的プラスミドはＶＬ領域を受容するためのウサギ又はヒトκＬＣ定常領域を含んでいた。
【０３９３】
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨインサートをコードする線状化発現プラスミドを、オーバーラッピングプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。
【０３９４】
精製されたＰＣＲ産物を、一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。反応を、ｄＣＴＰの添加により停止させた。
【０３９５】
次の工程では、プラスミド及びインサートを合わせ、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡとともにインキュベートした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを採取し、プラスミドの調製、制限分析、及びＤＮＡ配列決定により正しい組換えプラスミドについて試験した。
【０３９６】
抗体発現のために、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過的に同時トランスフェクトし、上清を１週間後に回収した。
【０３９７】
ウサギモノクローナル一価抗体発現用ベクターの作製
モノクローナル一価抗体としての選択された候補の組換え発現のために、全てのＶＨ鎖のウサギ定常領域が、ＣＨ３セグメントのノブ変異を囲むヒト定常領域に変換された。ウサギ野生型Ｂ細胞由来のＶＬ鎖については、ウサギＣカッパ定常領域をヒトに変換した。選択された候補のｃＤＮＡ４μＬを使用して、シグナルペプチドに特異的なフォワードプライマーと、ヒト定常領域（それぞれＶＨ及びＶＬの）に相同である重複配列（２０ｂｐ）を（３’末端で）有するＣＤＲ３−Ｊ領域に特異的なリバースプライマーを含む５０μＬの最終容量においてＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２３４４−０４０）を用いて、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。ＶＨ及びＶＬ鎖増幅のＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間ホットスタート；９４℃で２０秒、６８℃で２０秒；６８℃で４５秒を３５サイクル、及び最後の伸長反応を６８℃で７分間。
【０３９８】
ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物をオーバーハングクローニング法によりｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした（RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256）。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーター及び３’ＧＨＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加えて、プラスミドはｐＵＣ１８由来の複製起点及びＥ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド増幅のためのアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。塩基性プラスミドの２つのバリアントを使用した：１つのプラスミドは新規の増幅されたＶＨ鎖を受容するように設計されたヒトＩｇＧ定常領域を含み、２つめのプラスミドはＶＬ鎖を受容するためのヒトκＬＣ定常領域を含んでいた。
【０３９９】
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨインサートをコードする線状化発現プラスミドを、オーバーラッピングプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。
【０４００】
精製されたＰＣＲ産物を、一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。反応を、ｄＣＴＰの添加により停止させた。
【０４０１】
次の工程では、プラスミド及びインサートを合わせ、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡとともにインキュベートした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを採取し、プラスミドの調製、制限分析、及びＤＮＡ配列決定により正しい組換えプラスミドについて試験した。
【０４０２】
一価抗ＴｆＲ抗体の一過性発現
抗体は、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中で培養した、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞株２９３由来）中でインビボで生成された。トランスフェクションのために、「２９３−Ｆｒｅｅ」Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。上記の抗体及び抗体に基づく修飾分子を、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造者の指示に定められる通りに行った。組換えタンパク質含有細胞培養上清をトランスフェクションの７日後に回収した。上清を精製まで低温（例えば、−８０℃）で保存した。ヒト免疫グロブリンの、例えば、ＨＥＫ２９３細胞における組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられる。
【０４０３】
トランスサイトーシスアッセイのためのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞培養
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（Weksler, B. B. et al., FASEB J. 19 (2005), 1872-1874）のための培地及びサプリメントはＬｏｎｚａから入手した。２．５％ＦＢＳ、供給された成長因子の４分の１を含有するＥＢＭ２培地中でコラーゲンコートされたカバーガラス（顕微鏡）又はフラスコ上でｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（継代２６−２９）をコンフルエントになるまで培養し、供給されたヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、及びアスコルビン酸で完全に補完された。
【０４０４】
全てのトランスサイトーシスアッセイにおいて、高密度孔（１×１０８孔／ｃｍ２）のＰＥＴメンブレンフィルターインサート（０．４μｍ、１２ｍｍ直径）を１２ウェル細胞培養プレートに用いた。最適な培地容量は、頂端及び側底チャンバーそれぞれについて４００μＬ及び１６００μＬと計算された。フィルターインサートの頂端チャンバーをラット尾コラーゲンＩ（７．５μｇ／ｃｍ２）続いてフィブロネクチン（５μｇ／ｍＬ）を用いてコーティングし、それぞれ室温で１時間インキュベーションを続けた。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、コンフルエントな単層（約２×１０５細胞／ｃｍ２）まで１０〜１２日間ＥＭＢ２培地中で増殖させた。
【０４０５】
一価のトランスフェリン受容体特異的抗体のトランスサイトーシスアッセイ
全アッセイを、無血清ＥＢＭ２培地中で行った。細胞を含むフィルターインサートを、一価抗体（濃度：２．６７μｇ／ｍＬ）と３７℃で１時間インキュベートし、その後、頂端側及び側底側の培地全体を収集した。これらの値から、傍細胞フラックスを計算した。単層は、無血清培地で頂端側（４００μＬ）及び側底側（１６００μＬ）を各々３×３〜５分室温で洗浄された。未結合抗体の除去効率をモニターするために全ての洗浄物を収集した。予熱した培地を頂端チャンバーに添加し、フィルターを１６００μＬの予熱した培地を含む新鮮な１２ウェルプレート（１％ＢＳＡを含むＰＢＳで一晩ブロックした）に移した。この時点で、フィルター上の細胞を特異的抗体取り込みを決定するために５００μＬのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。残りのフィルターを３７℃でインキュベートし、試料を様々な時点で収集して、抗体の頂端側及び／又は側底側の放出を決定した．試料中の抗体の含有量を、非常に高感度のＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用いて定量した。各時点について、３つのフィルター細胞培養物からデータを生成した。
【０４０６】
トランスサイトーシスアッセイ後の高感度ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
全ての手順は、洗浄工程のために自動化された洗浄機を用いて室温で行った。３８４ウェルプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの抗ヒト／マウスＩｇＧ、Ｆｃγ特異的を３０μＬ／ウェルで２時間コーティングし、続いてヒト及びマウスＩｇＧアッセイのために１％ＢＳＡ又は１％ＣｒｏｔｅｉｎＣを含有するブロッキング緩衝液ＰＢＳ中で１時間インキュベートした。トランスサイトーシスアッセイからの連続希釈した試料及びトランスサイトーシスアッセイで使用した抗体の標準濃度をプレートに加え、２時間インキュベートした。４回洗浄後、ブロッキング緩衝液中の５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒト／マウス−Ｆ（ａｂ）２−ビオチン３０μＬ／ウェルを添加し、更に２時間インキュベートした。６回の洗浄後、５０ｎｇ／ｍＬ（ｈｕＩｇＧアッセイ）又は１００ｎｇ／ｍＬ（ｍＩｇＧアッセイ）のＰｏｌｙ−ＨＲＰ４０−ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ；１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中）を３０ｎｇ／ウェル添加し、３０分間インキュベートした。４回洗浄した後、３０μＬ／ウェルのＢＭ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによって免疫複合体を検出した。発光プレートリーダーを用いて発光シグナルを測定し、適合した標準曲線を用いて濃度を算出した。アッセイの感度は１０ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
【０４０７】
ウサギ抗トランスフェリン抗体クローン２／９９は、抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１のものに匹敵する特性を示した。これは、以下の表から見ることができる。表４０：抗体２／９９（配列番号１７８／１７９）の特徴づけ
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【０４０８】
マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体１２８．１（国際公開第９３／１０８１９号）を参考にした。トランスフェリン受容体バインダー２／９９は、トランスサイトーシス負荷が７０５ｐｇを示し、４時間後に１７０ｐｇ（＝負荷の２４％）を側底側区画に見出すことができ、２９４ｐｇ（＝負荷の４２％）を頂端区画に見出すことができる。
【０４０９】
トランスフェリン受容体バインダー４／９４は、トランスサイトーシス負荷が３５１０ｐｇを示し、４時間後に７４８ｐｇ（＝負荷の２１％）を側底側区画に見出すことができ、１５０３ｐｇ（＝負荷の４３％）を頂端区画に見出すことができる。
【０４１０】
実施例２６：ｈＴｆＲ変異体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング
ヒトとマウスのＴｆＲの間に有意な相同性（７７％同一性）があるにもかかわらず、両細胞間の良好な交差反応性を示す細胞外部分に対する抗体は知られていないという理論に基づいて、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）上のエピトープ領域を決定するために、表面に露出したアミノ酸のクラスターが整列したマウスＴｆＲ配列において異なるアミノ酸を有するｈＴｆＲ配列の位置に変異を導入した（下記の表参照）。対応する変異を有するプラスミドのクローニングは上記に記載されている。ヒトＴｆＲバインダーのそれらのエピトープへの結合をマッピングするために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を記載されるプラスミドで一過性にトランスフェクトし、細胞ＥＬＩＳＡで抗体結合を測定した。簡潔には、実験の１日前に、正常増殖培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）中において９６ウェルプレートの１ウェルあたり１０４個の細胞を蒔いた。他の日に、培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｓｅｒｕｍ−Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍに変更し、プレインキュベーションの３０分後に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１２００μＬ、プラスミドＤＮＡ１２μｇ及びＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）１２μＬの混合物１０μＬをウェルに添加した。細胞を３７℃／７．５％ＣＯ２で２日間インキュベートした後、培地を除去し、ＴｆＲ抗体を増殖培地中で１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で添加し、続いて４℃で２時間インキュベートした。その後、抗体溶液をＰＢＳ中の０．０５％グルタルアルデヒドで置き換え、細胞を室温で１５分間固定し、その後、ＰＢＳで２回洗浄し、室温で１．５時間、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＦｃ二次抗体（ＢｉｏＲａｄ；ＥＬＩＳＡブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）中１：２０００）とインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に１ウェルあたり５０μＬのＴＭＢを用いてシグナルを生成し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
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【０４１１】
実施例２７：ヒトＴｆＲ−抗体相互作用のための表面プラズモン共鳴に基づく結合アッセイ
結合実験は、抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９５８３−２５）で前処理したＣ１センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５−３５）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｂ  ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ベンダーのマニュアルに従って標準的なアミンカップリング化学手順を用いて実施した。
【０４１２】
動態測定のために、２５℃でリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で６０秒の接触時間及び１０μＬ／分の流速を適用して、試料抗体を固定化した。組換えＨｉｓ６タグ付きヒトトランスフェリン受容体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４７４−ＴＲ−０５０）を濃度を上げて適用し、シグナルをその時間にわたってモニターした。３０μＬ／分の流速で１５０秒の会合時間及び６００秒の解離時間の平均時間間隔を記録した。データを１：１結合モデル（ラングミュア等温線）を用いて適合させた。
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【０４１３】
実施例２８：ヒトＴｆＲ−抗体相互作用のための表面プラズモン共鳴に基づく結合アッセイ
結合実験は、抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９５８３−２５）で前処理したＣ１センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５−３５）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｂ  ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ベンダーのマニュアルに従って標準的なアミンカップリング化学手順を用いて実施した。
【０４１４】
動態測定のために、２５℃でリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で６０秒の接触時間及び１０μＬ／分の流速を適用して、試料抗体を固定化した。組換えＨｉｓ６タグ付きヒトトランスフェリン受容体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４７４−ＴＲ−０５０）を濃度を上げて適用し、シグナルをその時間にわたってモニターした。３０μＬ／分の流速で１５０秒の会合時間及び６００秒の解離時間の平均時間間隔を記録した。データを１：１結合モデル（ラングミュア等温線）を用いて適合させた。
【０４１５】
実施例２９：マウス及びウサギ抗トランスフェリン受容体抗体のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化
非ヒト抗トランスフェリン受容体抗体を以下のようにヒト化した：カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１クラスの非ヒト抗トランスフェリン受容体抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むコード配列及びアミノ酸配列の特徴づけに基づいて、対応するヒト化抗トランスフェリン受容体抗体が、クローン２９９についてのヒト生殖系列フレームワークＶＨ４＿３及びＶＫ１＿１０の組み合わせに基づく後方／前方変異をＣＤＲ移植することによって生成された。
【０４１６】
本明細書に報告されたクローン２／９９のヒト化抗体は、標準的なヒト化技術を適用することにより利用できなかった。意図された範囲内のトランスフェリン受容体結合解離速度を有するヒト化抗体を得るために、アミノ酸配列に非標準変異を導入することが必要とされた。これは、本明細書に報告されている抗体が、ヒト血液脳関門を通過して脳への治療的負荷としてＨＥＲ二重特異性抗体をシャトルするために開発されているので、特に重要である。
【０４１７】
適切かつ開発可能なヒト化抗体を得るためには、親ウサギ抗体の軽鎖中の２つのシステインアミノ酸残基をそれぞれプロリン及びアスパラギン酸残基で置換しなければならないことが見出された。既定のオフレート範囲内にあることに加えて、ウサギＣＤＲＬ３の中央に存在するセリン残基をアラニン残基で置換しなければならなかった。
【０４１８】
重鎖中の３つのアミノ酸残基６５、１００ｇ及び１０５（Ｋａｂａｔによる番号付け）を変化させることが有利であることが更に見出されている。
本明細書で使用される全ての番号付けは、Ｋａｂａｔ可変ドメイン番号付けスキームに基づいている。
【０４１９】
ヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）及びカニクイザルトランスフェリン受容体（ｃｙＴｆＲ）に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体が得られた。
【０４２０】
実施例３０：ヒト／カニクイザルＴｆＲ受容体親和性を決定する方法
この実施例では、解離挙動の比較のためのヒトトランスフェリン受容体親和性の決定方法が概説されている。
全ての分析について、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ２８−９２４２−３４  ＡＢ）を使用した。最初に、チップをＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００装置にドッキングすることによって再水和させた。その後、チップを泳動用緩衝液で一晩放置した。表面調製のために、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを泳動用緩衝液（０．２５ＭのＮａＣｌを補充した１ｘＰＢＳ）で１：１００に希釈した。この溶液を２μＬ／分の流速で３６０秒間フローセル１〜４に注入した。次に、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔで提供された再生溶液の３回の１分間注入でセンサー表面を調整した。これは、ドッキング手順のため、又は最初に、又は保存後に行わねばならない。１００ｎＭのヒト又はカニクイザルそれぞれのモノビオチン化トランスフェリン受容体溶液をフローセル２上に３０秒間、１０μＬ／分の流速で注入する必要がある。親和性決定のために、６つの濃度（５００，２５０，１２５，６２．５，３１．２５，１５．６２５及び０ｎＭ）の注入を適用した。それらを「ｈｕ−ＴｆＲ−フローセル」（例えば、上記で概説したように調製したフローセル２）に１８０秒の注入時間（会合）及び１０μＬ／分の流速で注入した。６００秒の解離段階の後、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ中に提供された再生溶液を用いて製造者の指示に従って表面を再生し、次のサイクルを実施した。
【０４２１】
動態データは、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて評価した。特に、異なるヒトトランスフェリン受容体バインダーの解離速度定数を、１：１ラングミュア結合モデルの適用後に考慮した。
【０４２２】
実施例３１：ヒト／カニクイザルトランスフェリン受容体解離のＢ４０００相対ランキング
製造者の指示に従って、ＣＡＰセンサーチップ（Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、シリーズＳ＃２８−９２０２−３４  ＧＥに提供）がＢＩＡｃｏｒｅ  Ｂ４０００システムに搭載され、正規化され、流体力学的に対処された。最初のサイクルで、ＣＡＰ試薬（キットに提供されている）を３００μｌ／分の流速でスポット１，２，４及び５にアドレスした。ヒトトランスフェリン受容体の捕捉は、流速１０μＬ／分及び接触時間３０秒でスポット１（ヒトトランスフェリン受容体−ビオチン化）及びスポット５（カニクイザルトランスフェリン受容体−ビオチン化）で行った。受容体を泳動用緩衝液（１ｘＰＢＳ＃２８９９５０８４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、０．２５ＭのＮａＣｌを補充）で５０ｎＭの濃度に希釈した。抗体は、３０ｎＬ／分の流速で１８０秒間、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び０ｎＭの濃度系列で全てのフローセルに注入した。解離時間は３００秒に設定した。ビオチンＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（流速１０μＬ／分で１２０秒）の再生溶液を利用して、ＣＡＰチップからの複合体全体の再生を行った。活性タンパク質濃度を制御するために、ビオチン化プロテインＡ（＃Ｐ２１６５−２ＭＧ、Ｓｉｇｍａ）を利用して、流速１０μＬ／分及び接触時間３０秒で第２のサイクルをスポット５において行った。この制御サイクルでは、スポット１は空のままであった。抗体及び再生は、サイクル１と同様に処理した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｂ４０００評価ソフトウェアを用いて、関連する動態データを計算した。ヒトトランスフェリン受容体からの解離は、１：１の解離適合を適用して決定されている。
【０４２３】
結果
マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体１２８．１（国際公開第９３／１０８１９号）を参考にした。ヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）及びカニクイザルトランスフェリン受容体（ｃｙＴｆＲ）に特異的に結合する新しいヒト化抗トランスフェリン受容体抗体は、カニクイザルトランスフェリン受容体に対する抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１のそれと等しいかそれよりも低い（すなわち高くても）ヒトトランスフェリン受容体に対するオフレートを有しており、それによりオフレートは、表面プラズモン共鳴によって決定され、０．１ １／ｓ〜０．００５ １／ｓの間であるヒトトランスフェリン受容体に対するオフレートで結合した。
【０４２４】
以下の表には、クローン２／９９のウサギ重鎖可変ドメインのヒト化変異体と組み合わせたクローン２／９９のウサギ軽鎖可変ドメインのヒト化変異体のオフレートが示されている。結合パートナーはヒトトランスフェリン受容体であった（２５℃で決定された）。
2018522549.tif 000084
2018522549.tif 000085
【０４２５】
ＶＨ２３−ＤＡＮＧとＶＬ０９−ＮＹＡ（配列番号１９３）との組み合わせを、ヒトトランスフェリン受容体への結合に関して、抗体１２８．１の特性をより密接に反映している結合部位を開発するための更なる操作（engineering）の出発点として選択した。以下の表において、ＶＨ２３−ＤＡＮＧ及びＶＬ９−ＮＹＡ（配列番号１９３）の異なる例示的な変異体、並びにヒトトランスフェリン受容体に対する異なる他の可変ドメインヒト化変異体のオフレートを比較して示す（２５℃で実施例３１に従って決定した）。
2018522549.tif 000086
【０４２６】
以下の表において、ＶＨ２３及びＶＬ９の異なる例示的な変異体の動態データを比較して示す（実施例３０に従って決定した）。
2018522549.tif 000087
【０４２７】
以下の表には、クローン４／９４のマウス重鎖可変ドメインのヒト化変異体と組み合わせたクローン４／９４のマウス軽鎖可変ドメインのヒト化変異体のオフレートが示されている。結合パートナーはヒトトランスフェリン受容体であった。
2018522549.tif 000088
【０４２８】
実施例３２：Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）のインビボ特徴づけ
Ｈｅｒ２を発現する頭蓋内腫瘍異種移植モデルを使用して、３Ｄ蛍光超顕微鏡法によって、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ−ｂｒａｉｎシャトルの脳腫瘍浸透をＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ単独と比較した。
【０４２９】
細胞株
ヒト乳がん細胞株ＢＴ４７４  Ｍ１を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＬのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。細胞株の増殖は、標準的な細胞培養プロトコルに従った。
【０４３０】
マウスにおける腫瘍細胞の頭蓋内移植
チャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から雌重症複合免疫不全無毛非近交系（ＳＨＯ）マウス（体重２０〜２７ｇ）を得て、実験開始時に７〜９週齢であった。マウスを１００ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射により麻酔した。頭皮を消毒し、脳の右半球の全体にわたって除去して頭蓋を露出させた。骨膜は骨スクレーパーによって除去された。次に、歯科用ドリルを用いて０．７ｍｍの直径の穿頭孔を正中線右２ｍｍとブレグマの前２ｍｍに穿孔した。次いで、マウスを小動物定位フレームに置き、ＢＴ−４７４  Ｍ１細胞懸濁液（３μｌ中５×１０５細胞）を２６ｓゲージ針を備えたハミルトンシリンジを用いて脳組織の３ｍｍの深さまで注射した。注射後、針をゆっくりと引き抜き、孔をシアノベニア組織接着剤で密封した。全ての動物実験は地方自治体の承認を受けた（ファイル番号５５．２−１−５４−２５３２．０−７６−１４、ドイツ国オーバーバイエルン政府）。
【０４３１】
物質の適用
腫瘍細胞移植の３０日後、解剖の６時間前、マウスにＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−ｓｃＦａｂ（８Ｄ３）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）又はＨｅｒｃｅｐｔａｒｇ（ＬＡＬＡ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（３．７５ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）を静脈内注射した。剖検の５分前に、マウスに１００μｇのレクチン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０溶液を静脈内注射し、エクスビボで血管の可視化を可能にした。物質は１５０μｌの容量で尾静脈を介して全身的に与えられた。
【０４３２】
脳の剖検、固定及び光学的クリアランス
マウスを頚椎脱臼により屠殺した。脳を外植し、暗所で室温で約１２時間、１０％緩衝ホルマリンに移し、その後、段階的テトラヒドロフラン系列で脱水した（５０％、７０％、８０％、１００％でそれぞれ９０分間、１００％で一晩、及び１００％で９０分間）。その後、検体が光学的に透明になるまで、脳をジベンジルエーテル中で２日間清澄化した。
【０４３３】
超顕微鏡法による脳の３Ｄイメージング
光学的に透明な試料を、Ｉｍａｇｅｒ  ３ＱＥカメラ（両方ともＬａＶｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃ）、２Ｍｖ  ＰＬＡＰＯ  ２ＶＣ対物レンズ（オリンパス）、Ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｎｕｕｍ白色光レーザー（ＳｕｐｅｒＫ  ＥＸＴＲＥＭＥ  ８０ｍＨｚ  ＶＩＳ；ＮＫＴ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を備えた市販の超顕微鏡に配置した。試料は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（励起範囲６５５／１５ｎｍ、発光範囲６８０／３０ｎｍ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（励起範囲７４７／３３ｎｍ、発光範囲７８６／２２ｎｍ）シグナル検出に適したフィルタ設定を有する５．１μｍ厚の仮想切片において０．６３の標準倍率で走査された。Ｔｉｆｆ生データは、ｄｉｃｏｍファイルに変換され、ＯｓｉｒｉＸソフトウェア（Ｐｉｘｍｅｏ）を使用して視覚化された。３Ｄ脳腫瘍関心領域（ＲＯＩ）は、レクチン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０染色で見られるカオス血管構造の寸法に従って定義された。決定された３Ｄ  ＲＯＩを３Ｄ再構成ｍａｂ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０データファイルにインポートし、脳腫瘍内の平均抗体蛍光シグナルを読み取った。
【０４３４】
最近接のレクチン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７染色血管からの異なる距離でのｍａｂ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０の異なる蛍光シグナル強度を定量した。これは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓの認知ネットワーク技術（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ルールセット（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ）として実装された一連の独自開発の画像解析アルゴリズムを用いて行われた。
【０４３５】
統計分析は、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ＋Ｓｉｄａｋの多重比較検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）によって実施した（図３６）。有意水準をアスタリスク（＊＊ ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１）で示す。全てのデータは平均±平均の標準誤差として提示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2018522549.tif 000090
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
2018522549.tif 000094
【図４】
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【図５】
2018522549.tif 000096
【図６Ａ】
2018522549.tif 000097
【図６Ｂ】
2018522549.tif 000098
【図６Ｃ】
2018522549.tif 000099
【図７Ａ】
2018522549.tif 000100
【図７Ｂ】
2018522549.tif 000101
【図８】
2018522549.tif 000102
【図９】
2018522549.tif 000103
【図１０】
2018522549.tif 000104
【図１１Ａ】
2018522549.tif 000105
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2018522549.tif 000108
【図１４Ａ】
2018522549.tif 000109
【図１４Ｂ】
2018522549.tif 000110
【図１４Ｃ】
2018522549.tif 000111
【図１５Ａ】
2018522549.tif 000112
【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
2018522549.tif 000115
【図１６Ｂ】
2018522549.tif 000116
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
2018522549.tif 000121
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
2018522549.tif 000124
【図２０】
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【図２１】
2018522549.tif 000126
【図２２】
2018522549.tif 000127
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
2018522549.tif 000132
【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2018522549.tif 000134
【図２６Ｃ】
2018522549.tif 000135
【図２７Ａ】
2018522549.tif 000136
【図２７Ｂ】
2018522549.tif 000137
【図２８】
2018522549.tif 000138
【図２９】
2018522549.tif 000139
【図３０】
2018522549.tif 000140
【図３１Ａ】
2018522549.tif 000141
【図３１Ｂ】
2018522549.tif 000142
【図３２】
2018522549.tif 000143
【図３３】
2018522549.tif 000144
【図３４】
2018522549.tif 000145
【図３５】
2018522549.tif 000146
【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018522549.tif 000149
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