(57)【要約】  本発明は、新規融合ポリペプチド及びその使用に関する。特に、本発明は、ネポウイルスに由来するコンジュゲートされたコートタンパク質、かかるタンパク質を用いて作製されるウイルス様粒子、及びそれらの使用に関する。本発明の粒子は、目的の分子を露出させ、且つ/又は閉じ込めることができ、医薬、農業又は獣医学領域等の様々な分野において有用性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含むウイルス様粒子。
【請求項２】
化合物が、コートタンパク質に、コートタンパク質のC末端及び/又はN末端において共有結合によってコンジュゲートされる、請求項1に記載の粒子。
【請求項３】
化合物が、コートタンパク質に、リガンド媒介性結合によってコンジュゲートされる、請求項1に記載の粒子。
【請求項４】
化合物が、コートタンパク質に、抗コートタンパク質抗体又は抗体誘導体によってコンジュゲートされる、請求項3に記載の粒子。
【請求項５】
抗体誘導体が、ナノボディ又はscFvである、請求項4に記載の粒子。
【請求項６】
C末端において化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質及びN末端において化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質の混合物を含む、請求項1又は2に記載の粒子。
【請求項７】
コートタンパク質のN末端にコンジュゲートされた閉じ込め化合物、及び粒子の表面に、抗体媒介性結合によってコンジュゲートされた露出化合物を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項８】
核酸を含まない、請求項1から7のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項９】
ネポウイルスがGFLVである、請求項1から8のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１０】
コートタンパク質が、配列番号1又は配列番号1に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%同一性を有する配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１１】
化合物が、治療用、診断用若しくは画像化用作用剤、又はタグ、好ましくはポリペプチド又はペプチドである、請求項1から10のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１２】
好ましくはコートタンパク質のC末端又はN末端において、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含む分子。
【請求項１３】
請求項1から11のいずれか一項に記載の1つ又は複数のウイルス様粒子又は請求項12に記載の分子を含む医薬組成物。
【請求項１４】
ウイルス様粒子を産生するための、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質の使用。
【請求項１５】
ウイルス様粒子を産生する方法であって、(i)任意選択で化合物にコンジュゲートされるネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、(ii)前記タンパク質を、単独で又は他のタンパク質と混合して、ウイルス様粒子へと集合させる工程とを含む方法。
【請求項１６】
(iii)好ましくは非共有結合的なリガンド媒介性結合によって、反応性又は活性基をウイルス様粒子に付加する工程を更に含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
(i)任意選択で第1の化合物にN末端でコンジュゲートされるネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、
(ii)前記タンパク質を、単独で又は他のタンパク質と混合して、ウイルス様粒子へと集合させる工程と、
(iii)(ii)の粒子を、少なくとも1つの第2の化合物に、前記第2の化合物にコンジュゲートされる抗コート抗体又はその誘導体を使用して、抗体媒介性結合によってカップリングする工程と
を含む、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
請求項12に記載の分子をコードする核酸分子。
【請求項１９】
請求項18に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項18に記載の核酸又は請求項19に記載のベクターを含有する組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規融合ポリペプチド及びその使用に関する。特に、本発明は、ネポウイルスに由来するコンジュゲートされたコートタンパク質、かかるタンパク質を用いて作製されるウイルス様粒子、及びそれらの使用に関する。本発明の粒子は、目的の分子を露出させ、且つ/又は閉じ込めることができ、医薬、農業又は獣医学領域等の様々な分野において有用性がある。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスカプシド由来タンパク質から作製されるウイルス様粒子(「VLP」)の使用及び抗原を送達又は露出するためのその使用が、当技術分野で示されてきた。
【０００３】
例えば、VLPは、レトロウイルス又はAAV等の動物ウイルスから作製されている。しかしながら、かかるVLPは、複雑な構造を要し、必ずしも産生するのに利便性がよいとは限らない。
【０００４】
植物ウイルスに由来するVLPについてもまた、記載されている。例えば、Sainsbury等(Annual Review of Phytopathology 2010 48:437〜455頁)は、ササゲモザイク(Cowpea Mosaic)ウイルスからのVLPの産生について報告している。しかしながら、かかる構築物は、2つの別個のサブユニット(L及びS)の同時発現及び集合又は前駆体ポリペプチド及びプロテアーゼの発現を要し、生じるVLPが、正確にフォールディング及び産生するのを困難にさせる。
【０００５】
Denis等(Virology 363(2007)59〜68頁)は、短いHCVウイルスエピトープを露出するためにパパイヤモザイク(Papaya mosaic)ウイルスのカプシドタンパク質を使用している。同様に、Natilla及びHammond(Journal of Virological Methods 178(2011)209〜215頁)は、短い(8つのアミノ酸)ペプチドにコンジュゲートされたトウモロコシラヤドフィノ(Maize Rayado Fino)ウイルスのカプシドタンパク質からVLPを調製している。トマトブッシースタント(Tomato Bushy stunt)ウイルス(Kumar等  2009、Virology 388、185〜190頁)、ジャガイモ(Potato)ウイルスY(Kalnciema等  2012 Molecular Biotechnology 52 2、129頁)又はアーチチョークモトルクリンクル(Artichoke mottle crinkle)ウイルス(Arcangeli等  Journal of Biomolecular Structure and Dynamics Volume 32、Issue 4、2014)を用いた他の例が報告された。
【０００６】
しかしながら、これらの構築物それぞれにおいて、生じるVLPは、一般に小分子のみのカップリングを可能にし、且つ/又は別個のサブユニットの集合を要し、且つ/又はVLPの外面へのペプチドの露出のみを可能にし、且つ/又は核酸を含むか、若しくは核酸を含まない、正二十面体ではない大きな繊維状のVLP構造を生成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2015/110601号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sainsbury等(Annual Review of Phytopathology 2010 48:437〜455頁)
【非特許文献２】Denis等(Virology 363(2007)59〜68頁)
【非特許文献３】Natilla及びHammond(Journal of Virological Methods 178(2011)209〜215頁)
【非特許文献４】Kumar等  2009、Virology 388、185〜190頁
【非特許文献５】Kalnciema等  2012 Molecular Biotechnology 52 2、129頁
【非特許文献６】http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp
【非特許文献７】www.gimp.org
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、改善され且つ予期せぬ特性を有する、ネポウイルスに由来する新規融合分子及びVLPを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ネポウイルスコートタンパク質に由来する融合分子及びVLP並びにそれらの使用に関する。本発明は、ネポウイルスのコートタンパク質が、安定なVLPを産生するのに使用され得ることを示す。本発明は更に、ネポウイルスコートタンパク質が、VLPを形成するその能力を喪失することなく、大きな外来化合物の、そのN及び/又はC末端への融合を可能にする非常に万能なタンパク質であることを示す。更に、本発明は、コートタンパク質のC末端での化合物の融合が、VLPの表面上での化合物の露出をもたらす一方で、N末端へ融合された化合物が、VLPへのその内部移行を引き起こし、化合物を抗体へ近付きにくくさせること(「ケージング」)を示す。したがって、2つの別個の特性:表面露出及び/又は目的の化合物の内部移行による保護(ケージング)を有するVLPを産生することが可能である。更に、VLPは、単一のタイプのコートタンパク質で産生され、サイズが非常に小さく、構造が簡素であり、核酸を含まない。同様に、及び好適には、ネポウイルスのコートタンパク質は、VLPへと集合させるそれらの能力を喪失することなく、非常に大きなタンパク質(200個超のアミノ酸)に融合させてもよい。本発明者等の知る限りでは、同時にこれらのタンパク質全てを有するウイルスタンパク質は、当技術分野で記載されていない。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ネポウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれからなるウイルス様粒子に属する。
【００１２】
本発明の更なる目的は、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれからなるウイルス様粒子に属する。コンジュゲーションは、共有結合的(例えば、遺伝的融合又は化学的カップリングによる)及び/又は非共有結合的(例えば、リガンド媒介性結合による)であり得る。
【００１３】
本発明の別の目的は、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれからなる分子に属する。
【００１４】
本発明の別の目的は、上記で規定される1つ又は複数のコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質或いは1つ又は複数のウイルス様粒子を含む医薬組成物に属する。
【００１５】
本発明はまた、ウイルス様粒子を作製するためのネポウイルスコートタンパク質の使用に関する。
【００１６】
本発明はまた、上記で規定される分子を産生する方法であって、ネポウイルスタンパク質を供給する工程と、前記タンパク質を化合物にコンジュゲートする工程とを含む方法を提供する。特定の実施形態では、その方法は、前記コンジュゲートされた分子をコードする核酸構築物を供給する工程と、宿主細胞又はin vitroでの発現系において前記核酸を発現させる工程とを含む。
【００１７】
本発明はまた、ウイルス様粒子を産生する方法であって、ネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、前記タンパク質を、ウイルス様粒子へと集合させる工程とを含む方法を提供する。特定の実施形態では、その方法は、目的の化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、かかるコンジュゲートされたタンパク質(場合によっては、他のコートタンパク質との混合物で)を使用して、ウイルス様粒子を作製する工程とを含む。或いは、又は更に、その方法は、反応性若しくは活性基をウイルス様粒子に付加する工程、或いは産生若しくは集合中にウイルス様粒子において反応性又は活性基を組み込む工程を更に含む。
【００１８】
本発明はまた、化合物を対象へ送達するためのネポウイルスコートタンパク質の使用に関する。
【００１９】
本発明の更なる目的は、目的の化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質をコードする核酸分子、かかる核酸を含むベクター、並びにそれを含有する宿主細胞を含む。
【００２０】
本発明は、例えば、ヒト又は獣医学的用途で、並びに研究用途で、例えばワクチン、アジュバント、薬物又は画像化用作用剤を産生するために医薬産業において幅広い有用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】pEAQベクターT-DNA領域及びそれに由来する構築物の略図。右の境界(RB)から左の境界(LB)へ伸長するT-DNA領域のバックボーンを、灰色の色合いで表す。目的のオープンリーディングフレーム(ORF)は、カリフラワーモザイク(Cauliflower mosaic)ウイルス35Sプロモーター(P35S)の制御下にあるササゲモザイクウイルス非翻訳領域(CPMV UTR)の配列によって隣接される。自然ブドウファンリーフ(Grapevine fanleaf)ウイルス(GFLV)コートタンパク質(CP)並びにそのTagREF-及びEGFP-タグ付け変異体を、概略的に示すようにGatewayクローニングによって導入した。L1は、7アミノ酸Gly3-Ser-Gly3リンカー配列に相当する。L2は、Gateway組換えから生じる15アミノ酸リンカー配列に相当する。発現されたタンパク質の完全アミノ酸配列は、文書の最後に提供する(配列)。P19:トンブスウイルス(Tombusvirus)P19サイレンシング抑制因子。NPTII:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子。
【図２】N.ベンサミアナ(N. benthamiana)の葉におけるGFLV CPの一過性の発現は、VLP産生を引き起こす。(a)アグロインフィルトレーションの7日後又は感染の14日後のN.ベンサミアナの葉におけるGFLV CPの発現は、検出用の抗GFLV抗体及びアルカリホスファターゼに対する基質としてのパラニトロフェニルリン酸を使用して、DAS-ELISAによって決定した。バーは、各条件に関して3つの異なる葉を用いて得られる平均吸光度を表す。エラーバーは、95%信頼区間に相当する。試料は、O.D.405nmが、少なくとも3倍分、健常な対照試料の平均値を超えた場合に陽性(+)とみなした。(b)DAS-ELISAによって分析されるのと同じ抽出物で実施した観察から得られるISEM顕微鏡写真。およそ30nmの粒子(矢頭)が、GFLV感染及びCP発現試料においてのみ検出された。スケールバー:100nm。
【図３】GFLV CPのN又はC末端へのTagREF(TR)の融合は、VLP形成と適合している。(a)GFLV CPサブユニットのリボン図及び(b)3Å分解能原子構造(PDBコード4V5T、Schellenberger等、2011)に従う粒子の表面陰付き断面図。CP N及びC末端の位置は、それぞれ赤色及び緑色で示す。五角形、三角形及び卵形は、それぞれ5回、3回及び2回の正十二面体対称軸を表す。断面における残基は、白色で表示される。(c)TR、CPTR又はTRCPを用いたアグロインフィルトレーションの7日後のN.ベンサミアナ粗製葉抽出物におけるGFLV CPの発現。抗GFLV抗体を使用して、DAS-ELIZAを実施して、試料は、O.D.405nmが、少なくとも3倍分、健常な対照試料の平均値を超えた場合に陽性(+)とみなした。バーは、各条件に関して3つの異なる葉を用いて得られる平均吸光度を表す。エラーバーは、95%信頼区間に相当する。(d)DAS-ELISAによって分析されるのと同じ抽出物で実施した観察から得られるISEM顕微鏡写真。矢頭は、CPTR及びTRCP浄化葉抽出物における抗GFLV抗体によって捕捉されるVLPを指す。スケールバー:100nm。
【図４】TR、CPTR又はTRCPを発現するアグロインフィルトレーションしたニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)の葉の落射蛍光マクロスコピー画像。励起及び放出に使用するフィルターは、下記の通りである:λex625〜655及びλem665〜715nm。スケールバー:300μm。
【図５】VLPの精製に関する更なる情報。(a)TRCP VLPの線形ショ糖勾配遠心分離後の鮮やかなピンク色のバンド。(b)線形ショ糖勾配におけるウイルス及びVLP富化画分の位置の略図。収集した2mL画分を1(勾配の最上部)から15(底部)まで番号付けする。RNA含有ビリオンを局在化させて、種々の画分のO.D.260値を測定した。VLP富化画分を半定量的ELISAによって同定した。
【図６】組換えVLPは、CP、CPTR又はTRCPを発現する葉から精製することができる。(a)最終的な超遠心分離段階でのCPTR(左パネル)及びTRCP(右パネル)精製から得られるピンク色のペレット。(b)溶液中の精製CP、CPTR又はTRCP。CPTR及びTRCP試料のピンク色に留意されたい。(c)SDS-Page後のGFLV、CP、CPTR又はTRCP精製粒子のクマシーブルー染色ゲル。GFLV粒子等価体6μgを各レーンにおいて分離させた。ゲル中の主要バンドを1〜8まで番号付けする。(d及びe)抗GFLV(d)又は抗TagREF(TR、e)抗体を使用したGFLV、CP、CPTR又はTRCP試料の相当するウェスタンブロット分析。GFLV粒子等価体0.05μgを各レーンで使用した。白色矢頭は、CPに関する予想サイズを有するバンドを示す。矢印は、それぞれ完全長TRCP及びCPTR融合に関する予想サイズを有するバンドを指す。黒色矢頭は、主要なTRCP又はCPTR切断型産物を指す。L:分子量マーカー。質量(kDa)は左に示す。
【図７】GFLV CPのN又はC末端に融合されたタンパク質は、それぞれ閉じ込められるか、又はVLPの外側表面へ露出される。精製GFLV(a、b、c)、CP VLP(d、e、f)、CPTR VLP(g、h、i)及びTRCP VLP(j、k、l)の電子顕微鏡写真。試料は、ネガティブ染色のみ用に(a、d、g、j)又は抗GFLV(b、e、h、k)若しくは抗TR(c、f、i、l)抗体及び装飾用の10nmコロイド金粒子にコンジュゲートされた抗ウサギ抗体を使用したISEM用に加工処理した。スケールバー:200nm。
【図８】VLPは、CPEG及びTRCPを同時発現するN.ベンサミアナの葉から精製することができる。イムノゴールド標識後の精製GFLV(a、b)、CPEG VLP(c、d)及びCPEG+TRCP VLP(e、f)の透過型電子顕微鏡写真。試料は、抗GFLV(a、c、e)又は抗EGFP(b、d、f)抗体及び10nmコロイド金粒子にコンジュゲートされた抗マウス抗体を使用して装飾した粒子を使用したISEM用に加工処理した。スケールバー:100nm。
【図９】ハイブリッドVLPは、CPEG及びTRCPの同時発現時に産生される。(a、b)ネイティブアガロースゲル電気泳動によって分離されるTRCP、CPEG又はCPEG+TRCP VLPの蛍光画像化。画像化は、G:box画像化システムを使用して、まずはTagRFPを検出するためにλex480〜540nmの励起及びλem590〜660nmの放出で(a)、次にEGFPを検出するためにλex450〜485nm及びλem510〜540nmで(b)順次行った。ゲル中の蛍光VLPは、空の矢頭によって示される。(c〜f)精製TRCP(c)、CPEG(d)、1:1の比の混合TRCP及びCPEG VLP(e)及び同時発現されるCPEG+TRCP(f)の単一粒子顕微鏡法画像。落射蛍光画像化は、EGFPを検出するためにλex455〜495nm-λem505〜555nmで、及びTagRFPを検出するためにλex532.5〜557.5-λem570〜640nmで順次行った。白色矢頭は、ハイブリッドVLPを指す。スケールバー:5μm。
【図１０】精製VLPは、核酸を含まない。(a及びb)クマシーブルー(a)及び臭化エチジウム染色(b)後にネイティブアガロースゲル電気泳動によって分離される精製GFLV及びCP、CPTR及びTRCP VLP。矢頭は、クロストークに相当するバンドを指す。(c)精製試料のO.D.260/O.D.280比。
【図１１】蛍光VLPの分子モデル。(a)C末端位置においてEGFPと融合された60個のCPを含むCPEG VLP。(b)N末端位置においてTRと融合された60個のCPを含むTRCP VLP。(c)C末端位置においてEGと、及びN末端位置においてTRと融合された60個のCPを含むTRCPEG VLP。VLPは全て、CPは青色で、EGFPは緑色で、TagRFPは赤色で、及びリンカーペプチドは黄色で、リボン表示において同じ配向性で表される。
【図１２】GFLV-Nb23複合体の2.8Å分解能クライオEM構造。a:GFLV外側表面上にシアンで示されるNb23とのGFLV-Nb23複合体のグローバル3D再構築。正二十面体の輪郭は、赤色三角形によって示される。Nb23は、ウイルスカプシドタンパク質(CP)と化学量論的な1:1の複合体を形成して、ビリオン1個当たり結合された60個のNb23を生じる。b:正二十面体面1つ当たり3つのCP及び3つのNb23を示す、適合原子モデルを用いたクライオEMマップの詳細な図。
【図１３】動的光散乱法(DLS)によって測定されるTRCP VLPのNb23媒介性装飾。グラフは、単独の(灰色の曲線)又はNb23(赤色の曲線)、Nb23GFP(青色の曲線)若しくはNb23:ALP(緑色の曲線)のいずれかで装飾された精製TRCP VLPの強度によるサイズ分布に相当する。粒子は全て、単分散性であり、TRCP VLPに関して32.0+/-2nm(平均値+/-SD、n=3)、Nb23で飽和させたVLPに関して37.8+/-2nm(平均値+/-SD、n=3)、Nb23:GFPで飽和させたVLPに関して43.8+/-2nm(平均値+/-SD、n=3)、及びNb23:ALPで飽和させたVLPに関して40.0+/-2nm(平均値+/-SD、n=3)の直径を有する。
【図１４】TRCP VLPは、Nb23及びNb23:GFPで装飾することができる。ネイティブアガロースゲル電気泳動及びクマシーブルー染色後のTRCP VLP。レーン1:Nb23単独。レーン2:Nb23で装飾されたTRCP VLP。レーン3: TRCP VLP単独。レーン4:Nb23:GFPで装飾されたTRCP VLP。レーン5:Nb23:GFP-又はNb23:GFP単独。装飾された場合のVLPの遊走におけるシフトに留意されたい(レーン2及びレーン4をレーン3と比較)。同様に、遊走が、複合体の分子量ではなく、複合体の正味の電荷に依存することにも留意されたい。
【図１５】RFP:CP由来のVLPの表面にあるNb23ALPの効率的な表示。ネイティブアガロースゲル電気泳動、クマシーブルー染色及びFastRed染色後のTRCP VLP。レーン1: TRCP VLP単独。レーン2:Nb23ALPで装飾されたTRCP VLP。レーン3:Nb23ALP単独。アルカリホスファターゼが、VLPへの結合時に機能的なままであることに留意されたい。
【図１６】Nb23GFPは、ウイルスカプシドタンパク質(CP)と化学量論的な1:1複合体を形成する。TRCP VLPを、増加量のNb23GFPの存在下でインキュベートして、ネイティブアガロースゲル電気泳動によって分離させた。GFLV CPとNb23:GFPとの間の分子比を各レーンの上に付与する。ゲルは、落射照明(左)及びクマシーブルー染色(右)下で画像化した。Nb23GFP分子の付加に比例するTRCP VLPの遊走における進行的なシフトに留意されたい。同様に、Nb23GFPで完全に装飾されたTRCP VLPが、黄色で出現する(レーン5及びレーン6)のに対して、TRCP VLPは赤色であり、Nb23GFPは緑色であることも留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ネポウイルスコートタンパク質に由来する融合分子及びVLP、並びにその使用に関する。特に、本発明は、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質、並びに前記化合物を露出させ、且つ/又は閉じ込める核酸を含まないウイルス様粒子を産生するためのその使用を提供する。本発明は、(i)自然ウイルスRNAのカプシド形成が回避され、(ii)第1の化合物(例えば、外来タンパク質又はペプチド)が表面露出され、且つ/又は(iii)第1の化合物と同じであり得るか、若しくは異なり得る第2の化合物(例えば、外来タンパク質又はペプチド)が、粒子の内側に閉じ込められ/保護されるような方法で、単一のネポウイルスコートタンパク質の集合によって粒子を産生することが可能であることを示す。これらのコンジュゲートされたタンパク質及びVLPを使用して、目的の任意の化合物を露出させてもよく、且つ/又は閉じ込めてもよく、医薬、農業又は獣医学領域等の様々な分野で有用性がある。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、ネポウイルスコートタンパク質を含むか、若しくはそれからなるか、又はそれから得ることが可能なウイルス様粒子に属する。
【００２４】
本発明の更なる目的は、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれから得ることが可能なウイルス様粒子である。コンジュゲーションは、共有結合的(例えば、遺伝的融合又は化学的カップリングによる)及び/又は非共有結合的(例えば、リガンド媒介性結合による)であり得る。
【００２５】
本発明の別の目的は、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれからなる分子に属する。
【００２６】
本発明の更なる目的は、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質の集合によって得ることが可能なウイルス様粒子である。
【００２７】
VLP
「ウイルス様粒子」又は「VLP」という用語は、より具体的には、コートタンパク質の集合によって本質的に作製される粒子を指す。VLPは通常、核酸を欠如しており、感染性ではない。本発明の好ましい未修飾VLPは、正二十面体である。また、未修飾形態において、それらは通常、50nm以下、通常20〜40nm、より好ましくは25〜35nm、例えば約30nmの直径を有する小さな粒子である。本発明は実際に、サイズが小さく、且つ構造が簡素である粒子の産生を本発明のネポウイルスコートタンパク質が引き起こすことを示す。かかる特徴は、本発明の更なる利点を表す。当然のことながら、VLPのサイズは、本出願で開示するように大きな化合物がコートタンパク質にコンジュゲートされる場合には変更され得る。
【００２８】
一実施形態では、本発明のVLPは、同じネポウイルスコートタンパク質(ホモVLP)、好ましくは化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質の幾つかのコピーで本質的に構成されるか、又はそれから得られる。
【００２９】
別の実施形態では、本発明のVLPは、別個のネポウイルスコートタンパク質の混合物で構成されるか、又はそれを含むか、又はそれから得られる(ヘテロVLP)。かかるヘテロVLPの例として、(i)ネポウイルスコートタンパク質及びその断片の混合物を含むVLP、又は(ii)コンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質及びコンジュゲートされていないネポウイルスコートタンパク質の混合物を含むVLPが挙げられる。
【００３０】
更なる実施形態では、本発明のVLPは、第1の化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質及び第2の化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質の混合物で構成されるか、又はそれを含むか、又はそれから得られる(ハイブリッドVLP)。好ましいハイブリッドVLPにおいて、それぞれ第1及び第2の化合物に融合された同じネポウイルスコートタンパク質の混合物が使用される。最も好ましいハイブリッドVLPは、第1の化合物にC末端でコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質及び第2の化合物にN末端でコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質の混合物を含むか、又はそれから得られる。第2の最も好ましいハイブリッドVLPは、ネポウイルスコートタンパク質及びリガンド媒介性コンジュゲーションによって粒子の表面にコンジュゲートされる露出化合物を含む。第3の最も好ましいハイブリッドVLPは、ネポウイルスコートタンパク質にN末端的にコンジュゲートされる閉じ込め化合物及びリガンド媒介性コンジュゲーションによって粒子の表面にコンジュゲートされる露出化合物を含む。
【００３１】
ヘテロVLP又はハイブリッドVLPにおいて、各種コートタンパク質間の比は多様であってもよく、必要性及び作動条件に従って、VLPの集合に影響を及ぼすことなく、当業者によって調節され得る。
【００３２】
本発明のVLPは、任意のネポウイルスコートタンパク質を使用して調製され得る。これに関して、「ネポウイルスコートタンパク質」という用語は、ネポウイルスに由来する、例えばネポウイルスから得られるか、又はネポウイルスのコートタンパク質の配列を有するか、又はネポウイルスのコートタンパク質の配列から設計される配列を有する任意のコート又はカプシドタンパク質又はポリペプチドを指す。コートタンパク質という用語は、組換えタンパク質、合成タンパク質、又は精製タンパク質を含む。コートタンパク質は、ネポウイルスのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよく、或いはタンパク質が、粒子へと集合する能力を保持する限りは、1つ若しくは幾つかのアミノ酸残基の突然変異、欠失及び/又は挿入等の構造的修飾を含有してもよい。
【００３３】
本発明は、任意のネポウイルスに由来するコートタンパク質を用いて実行され得る。特に、本発明は、国際ウイルス分類委員会(ICTV、http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp)によって規定されるGFLV、ArMV、CNSV、BRSV、GBLV、BRV、TRSV、CLRV、RpRSV又は任意の他のネポウイルスから選択されるネポウイルスに由来するコートタンパク質を使用し得る。別個のネポウイルスに由来するコートタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号1〜配列番号8として提供する。
【００３４】
特定の実施形態では、ネポウイルスコートタンパク質は、配列番号1〜配列番号8のいずれかの全て又は一部を含み、VLPへと集合することが可能なポリペプチドである。配列の「一部」は、好ましくは当該配列の少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更に好ましくは少なくとも90%、95%又はそれ以上の連続的な部分を指す。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明における使用のためのネポウイルスコートタンパク質は、GFLVに由来するコートタンパク質である。GFLV-F13(Viry等  1993)、又はGFLV-GHu(Vigne等、2004)等のGFLVの幾つかの株が当技術分野で記載されており、利用可能である。特定の例として、本発明は、F13等のGFLVの任意の株に由来するネポウイルスコートタンパク質を使用する。
【００３６】
最も好ましい実施形態では、本発明における使用のためのネポウイルスコートタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、若しくは配列番号1に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。アミノ酸配列に関する「同一性」という用語は、本明細書中で使用する場合、2つのアミノ酸配列(配列間にギャップなし)間の一致の度合いを指す。換言すると、2つのアミノ酸配列が等価な位置で同じアミノ酸を有する程度であり、パーセントで表す。同一性%は、BLAST、FASTA等などの公知のコンピュータープログラムによって決定することができる。
【００３７】
コートタンパク質の特定の例は、配列番号1を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００３８】
コートタンパク質の別の特定の例は、配列番号1のアミノ酸2〜505を含むか、又はそれらからなるタンパク質である。
【００３９】
コートタンパク質の別の特定の例は、配列番号1のアミノ酸1〜504又は2〜504を含むか、又はそれらからなるタンパク質である。
【００４０】
コートタンパク質の別の特定の例は、配列番号1のアミノ酸1〜503又は2〜503を含むか、又はそれらからなるタンパク質である。
【００４１】
コートタンパク質の別の例は、1〜5個のアミノ酸置換を有する配列番号1を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４２】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号2のアミノ酸配列、若しくは配列番号2に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号2を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４３】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号3のアミノ酸配列、若しくは配列番号3に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号3を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４４】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号4のアミノ酸配列、若しくは配列番号4に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号4を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４５】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号5のアミノ酸配列、若しくは配列番号5に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号5を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４６】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号6のアミノ酸配列、若しくは配列番号6に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号6を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４７】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号7のアミノ酸配列、若しくは配列番号7に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号7を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４８】
本発明における使用のためのコートタンパク質の更なる特定の例は、配列番号8のアミノ酸配列、若しくは配列番号8に対して少なくとも90%同一性を有する配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。コートタンパク質の特定の例は、N末端メチオニン残基を有するか、若しくは有さない、配列番号8を含むか、又はそれからなるタンパク質である。
【００４９】
タンパク質は、組換え技術(即ち、細胞又はin vitroでの系における発現)によって、合成、精製、又はそれらの組合せによって調製され得る。これに関して、タンパク質は、植物細胞における、植物体における、細菌における(例えば、大腸菌(E. coli)における)、又は他の真核細胞における発現によって産生され得る。或いは、発現は、in vitroでの系において実施されてもよい。また、タンパク質は、それらの安定性を改善するように修飾されてもよい。特に、コートタンパク質は、例えば、メチレン(-CH2-)又はリン酸(-PO2-)基、第2級アミン(-NH-)又は酸素(-O-)、アルファ-アザペプチド、アルファ-アルキルペプチド、N-アルキルペプチド、ホスホンアミデート、デプシペプチド、ヒドロキシメチレン、ヒドロキシエチレン、ジヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチルアミン、レトロインベルソな(retro-inverso)ペプチド、エステル、ホスフィン酸、ホスフィニック(phosphinics)、ホスホンアミド等の挿入等の1つ又は複数のペプチド模倣結合を含有し得る。
【００５０】
ネポウイルスコートタンパク質は、それ自体、本発明のVLPを産生するように使用され得る。また、これまでに論述されるように、本発明は、ネポウイルスコートタンパク質が、VLPへと集合するそれらの能力を喪失することなく、大きな化合物にコンジュゲートされてもよいことを示す。更に、コンジュゲーション戦略は、化合物の露出/閉じ込めの制御を可能にする。更に、タンパク質の、VLPへと集合する能力に影響を及ぼすことなく、非常に大きな化合物をコンジュゲートさせることができる(例えば、それは、コートタンパク質自体の大きさの少なくとも50%に相当し得る)。
【００５１】
したがって、本発明の目的はまた、化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質に属する。
【００５２】
コンジュゲーションは、共有結合的であってもよく、若しくはそうでなくてもよく、直接的であってもよく、若しくはそうでなくてもよく(即ち、リンカーを介して)、且つ/又は化学的、酵素的若しくは遺伝的であってもよい。更に、コンジュゲーションは、末端及び/又は側方カップリングを伴ってもよい。また、本発明のコンジュゲートされたコートタンパク質は、1つ又は幾つかのコンジュゲートされた化合物を含み得る。
【００５３】
コンジュゲーションは、コートタンパク質及び化合物の化学的な性質並びに妨害を考慮して、結合の任意の許容される手段によって実行することができる。したがって、これに関して、カップリングは、生理学的媒質中で、若しくは細胞内で、切断可能な、又は切断不可能な1つ又は複数の共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性結合又はファンデルワールス結合によって実施することができる。
【００５４】
更に、カップリングは、コートタンパク質の任意の反応性基で実施することができる一方で、続くVLPにおける反応性基の近付きやすさを考慮すべきである。これに関して、本発明者等は、コートタンパク質のN末端及び/又はC末端でのカップリングが、コートタンパク質の、粒子を形成する能力に影響を及ぼさないことを発見した。したがって、かかる末端カップリングは、本発明にとって最も好ましい。更に、驚くべきことに、本発明者等は、ネポウイルスコートタンパク質のC末端での化合物の融合が、コンジュゲートを用いて調製される粒子の表面上での化合物の露出をもたらす一方で、N末端に融合された化合物が、VLPへその内部移行を引き起こし、化合物を、抗体に近付きにくくさせること(「ケージング」)」を発見した。したがって、化合物のタイプのカップリング戦略を調節すること、また2つの別個の特性:目的の化合物の表面露出及び内部移行による保護(ケージング)を有するVLPを産生することが可能である。
【００５５】
第1の好ましい実施形態では、コンジュゲーションは、最も好ましくはコートタンパク質のN末端及び/又はC末端で、コートタンパク質へのカップリングによって、通常、遺伝的融合によって(即ち、遺伝的融合としてのネポウイルスコートタンパク質及び化合物をコードする核酸構築物の適切な系における発現によって)得られる。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明は、N末端で、化合物(TRCP)にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質に関する。かかるコンジュゲートの典型的な構造は、化合物-(リンカー)n-コートであり、n=0又は1である。N末端でのコンジュゲーションは、より好ましくは、コートタンパク質の第1のN末端アミノ酸でのコンジュゲーションを含む。本発明は実際に、配列番号1のアミノ酸Met1での、又は配列番号1のアミノ酸2〜505を含むコートタンパク質若しくはその変異体のアミノ酸Gly1でのコンジュゲーションが、VLPを形成することができ、且つVLPの内側に、コンジュゲートされた化合物を閉じ込めることができる分子を生成することができることを示す。
【００５７】
別の特定の実施形態では、本発明は、C末端で、化合物(CPTR)にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質に関する。かかるコンジュゲートの典型的な構造は、コート-(リンカー)n-化合物であり、n=0又は1である。C末端でのコンジュゲーションは、より好ましくは、タンパク質の最後の3つのC末端アミノ酸のいずれかでのコンジュゲーションを含む。本発明は実際に、配列番号1のアミノ酸Phe503、Pro504若しくはVal505又はそれらの変異体でのコンジュゲーションが、VLPを形成することができ、且つVLPの外側に、コンジュゲートされた化合物を露出することができる分子を生成することができることを示す。より好ましくは、C末端コンジュゲーションはコートタンパク質の最後のC末端アミノ酸残基のコンジュゲーションを伴う。
【００５８】
化合物は、コートタンパク質に直接的に、又はリンカーを用いて間接的にカップリングされ得る。共有結合的な化学的カップリングの手段として、例えば、例えばアルキル、アリール、ペプチド又はカルボキシル基を含有する二官能性又は多官能性作用物質の使用が挙げられる。リンカーの例として、例えば、G3S、G3SG3、又はDPAFLYKVVRSFGPA(配列番号13)等の任意の天然アミノ酸又はペプチド配列が挙げられる。
【００５９】
好ましい実施形態では、化合物は、直接的に、又はリンカーを介して、コートタンパク質に共有結合される。
【００６０】
更に好ましい実施形態では、化合物及びコートタンパク質は、直接的に、又はリンカーを介して、ペプチド結合によって連結される。
【００６１】
代替的な好ましい実施形態において、コンジュゲーションは、粒子への(典型的に、非共有結合的な)リガンド媒介性結合によって得られる。コンジュゲーションのかかる様式は、粒子の表面上での化合物の効率的な露出を可能にする。かかる様式はまた、遺伝的なカップリングを用いて組み合わせて、ハイブリッドVLPを産生してもよい。
【００６２】
かかる実施形態では、化合物は、粒子集合後に、VLPに反応性又は活性基を付加することによって、粒子にコンジュゲートされる。活性な基は、リガンドに連結させることができ、リガンドは、粒子を結合させて、結合を引き起こす。
【００６３】
リガンドは、親和性によってコートタンパク質を結合する任意の分子であり得る。適切なリガンドの例として、例えば、抗コートタンパク質抗体、又は抗原特異性を保持するその誘導体が挙げられる。かかる抗体の例として、モノクローナル抗体、ナノボディ(例えば、ラクダ科動物に見られる単鎖のみの免疫グロブリンの構造に由来する)、単鎖抗体(即ち、ScFv又はVNAR断片)、二重特異性抗体等が挙げられるが、限定されない。
【００６４】
ナノボディ(又はVHH、Hamers-Casterman等、1993)という用語は、本質的に4つのFRドメイン(フレームワーク領域に関する)によって分離される3つのCDR(相補性決定領域CDR1、CDR2及びCDR3)からなり、且つ軽鎖又は定常ドメインを本質的に欠如している単鎖ポリペプチドを指す。「ナノボディ(複数)」、「ナノボディ(単数)」、「VHH」、「VHH抗体断片」又は「単一ドメイン抗体」は、交換可能に使用される。ナノボディは通常、下記構造を有する:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。好ましくは、本発明のナノボディは、組換え又は化学的な技術によって産生される合成分子である。ナノボディは、高いエピトープ特異性及び親和性を提示する。それらは、従来のIgG分子よりも約10倍小さい。それらは、単鎖ポリペプチドであり、非常に安定であり、極度のpH及び温度条件に抵抗する。更に、それらは、プロテアーゼの作用に対して抵抗し得る。
【００６５】
本発明で使用することができるナノボディの具体例は、ナノボディNb126、Nb101、Nb23、Nbp75及びNbp71であり、それらは、国際公開第2015/110601号に記載されている。
【００６６】
これらのナノボディのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号14〜配列番号18として記載している。
【００６７】
特定実施形態では、本発明で使用するナノボディは、配列番号14〜配列番号18、それらに対して少なくとも80%配列同一性、好ましくはそれらに対して少なくとも90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する配列のいずれかから選択される配列を含む。
【００６８】
更に、本発明における使用に適したナノボディは、配列番号14〜配列番号18のいずれかのナノボディとして、同じ抗原又は抗原性ドメイン又はエピトープを結合するナノボディである。
【００６９】
ネポウイルス及び/又は同族のコートタンパク質を結合する他のナノボディ又は抗体を産生することができる。抗体は、従来技術によって、同族のウイルス又はコートタンパク質又はそれらのエピトープ含有断片による哺乳動物の免疫化、続く抗体産生細胞の収集によって調製され得る。細胞を使用して、クローナル抗体を選択して、融合によってハイブリドーマを生成させてもよい。続いて、抗体の配列を決定して、組換え抗体、単鎖抗体、Mab、CDR等を産生するのに使用してもよい。抗コートタンパク質ナノボディは、例えば、同族のウイルス若しくはコートタンパク質若しくはエピトープ含有断片による、又は精製VLPによるラクダ科動物の免疫化によって生成され得る。前記ナノボディをコードするDNA分子を、当技術分野で周知の方法によって、決定又は単離又はクローニングすることができる。上記で規定される特定の配列を有するナノボディは、人工的な合成又は組換えDNA技術によって産生することができる。次に、ナノボディは、実施例に記載するように、VLPを結合し、且つ/又はNb126、Nb101、Nb23、Nbp75若しくはNbp71と競合するか、若しくはしないか(又は置換する)それらの能力に関して試験され得る。
【００７０】
本発明における使用のためのリガンドの別の例は、軟骨魚類の重鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体VNAR断片(IgNAR、「免疫グロブリン新規抗原受容体」)である。
【００７１】
化合物は、例えば、共有結合的又は非共有結合的なカップリングを引き起こす遺伝的融合、化学的カップリング、親和性タグ(Strepタグ又はPolyHisタグ等の)を介した親和性結合等の公知の技法によりリガンドに連結され得る。化合物がポリペプチドである場合、好ましい方法は、遺伝的融合又は化学的カップリングによるものであり、最も好ましくは、遺伝的融合によるものである。特定の実施形態では、化合物は、リガンドの末端で、最も好ましくは共有結合的に、例えば遺伝的融合又は化学的カップリングによって、リガンドにカップリングされる。かかるカップリングは、ウイルスコートタンパク質又は粒子へのリガンドの結合に実施的に影響を及ぼさないか、又はそれを防止しない。
【００７２】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ネポルイスコートタンパク質を含むか、又はそれから得ることが可能なウイルス様粒子に関し、ここで前記粒子は、リガンド媒介性結合によって、コートタンパク質にコンジュゲートされた少なくとも1つの目的の化合物を含む。かかる化合物は、粒子の表面で露出される。粒子は、同じか、又は別個のリガンドとのコンジュゲーションにより、その表面上に露出される幾つかの別個の化合物を有し得る。好ましい実施形態では、コンジュゲーションは、化合物にカップリングされる抗コートタンパク質抗体又はその誘導体を使用して、更に好ましくはナノボディを使用して実施される。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ネポウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれから得ることが可能なウイルス様粒子に関し、ここで前記粒子は、コートタンパク質のN末端にコンジュゲートされた閉じ込め化合物、及びリガンド媒介性結合によって、より好ましくは抗体媒介性結合によって、更に好ましくはナノボディ媒介性結合によって、粒子の表面にコンジュゲートされた露出化合物を含む。
【００７４】
更なる代替的な実施形態によれば、露出されたスルフヒドリル基(Cys)によるコンジュゲーション、化合物の続く結合のための粒子への親和性タグ(即ち、6ヒスチジン、Flagタグ、Strepタグ、SpyCatcher等)の結合、又はクリックケミストリーコンジュゲーションのためのVLP及び化合物への非天然アミノ酸の組込み等のVLPへの化学的なコンジュゲーションが意図され得る。
【００７５】
本発明はまた、上記で規定されるコンジュゲートされた分子を産生する方法であって、ネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、前記タンパク質を化合物にコンジュゲートする工程とを含む方法に関する。特定の実施形態では、ネポウイルスコートタンパク質を供給する工程は、宿主細胞又はin vitroでの発現系において、前記タンパク質をコードする核酸構築物を発現させる工程と、発現されたタンパク質を収集する工程とを含む。続いて、タンパク質は、化合物にコンジュゲートされてもよい。代替的な経路において、コンジュゲートされたタンパク質は、組換え融合核酸を使用して、直接発現される。これらに関して、特定の実施形態では、本発明は、上記で規定されるコンジュゲートされた分子を産生する方法であって、前記分子をコードする核酸構築物を供給する工程と、宿主細胞又はin vitroでの発現系において、前記核酸を発現させる工程とを含む方法に関する。組換え産生は、植物細胞等の任意の適切な宿主において、植物体において、細菌、酵母、昆虫において、又はin vitroでの転写系において実施され得る。発現されたコンジュゲートを収集して、任意の適切な培地又は状態において遊離分子として保管し得る。それはまた、VLPへと集合させてもよく、続いて、それを収集して、適切な条件下で保管することができる。
【００７６】
本発明の更なる目的はまた、上記で規定される分子をコードする核酸分子(例えば、DNA、RNA)、かかる核酸を含むベクター、及びかかる核酸又はベクターを含有する宿主細胞に属する。
【００７７】
本発明はまた、ウイルス様粒子を産生する方法を提供する。その方法は概して、(i)ネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、(ii)例えば、前記タンパク質をウイルス様粒子へと集合させることによって、前記タンパク質を用いてVLPを形成する工程とを含む。典型的な実施形態では、コートタンパク質は、粒子への自己集合を可能にする条件下で維持される。かかる条件は、典型的には5〜9、より典型的には6〜8に含まれるpHでの、及び4℃〜50℃を含む温度、より好ましくはほぼ室温での溶液中を含む。
【００７８】
特定の実施形態では、その方法は、(i)目的の化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を供給する工程と、(ii)かかるコンジュゲートされたタンパク質(場合によっては、他のコートタンパク質との混合物で)を使用して、ウイルス様粒子を作製する工程とを含む。
【００７９】
ネポウイルスコートタンパク質は、人工的な合成、酵素的産生/集合、精製、及び/又は組換え技術によって供給され得る。これに関して、好ましい実施形態では、その方法は、
・好ましくは化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質をコードする核酸構築物を供給する工程と、
・宿主細胞又はin vitroでの発現系において、前記核酸を発現させる工程と、
・任意選択で、タンパク質を精製する工程と、
・発現され、任意選択で精製されたタンパク質からVLPを形成する工程と、
・VLPを収集又は精製する工程と
を含む。
【００８０】
特定の実施形態では、その方法は、VLPに反応性又は活性基を付加して、VLPに選択特性を付与する更なる工程を含む。活性基は、リガンドに連結させることができ、リガンドは、粒子を結合させて、結合を引き起こす。
【００８１】
別の特定の実施形態では、VLPを形成する工程は、反応性又は活性基の存在下で実施され、前記基をVLPへ組み込ませる。
【００８２】
更なる特定の実施形態では、本発明は、VLPを産生する方法であって、
・タグにコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質をコードする核酸構築物を供給する工程と、
・宿主細胞又はin vitroでの発現系において、前記核酸を発現させる工程と、
・任意選択で、タンパク質を精製する工程と、
・発現され、任意選択で精製されたタンパク質からVLPを形成する工程と、
・任意選択で、VLPを収集又は精製する工程と、
・VLPに、タグを結合する化合物を付加する工程と
を含む方法に関する。
【００８３】
上記方法において、組換え産生は、植物細胞等の任意の適切な宿主において、植物体において、細菌、酵母において、又はin vitroでの転写系において実施され得る。
【００８４】
VLPは、例えば、クロマトグラフィ、遠心分離等などの従来の技法によって収集及び精製され得る。VLPは、生理学的条件下で安定であるので、それらは、従来の技法に従って、溶液中に保管され得るか、又は凍結され得るか、又は凍結乾燥され得る。
【００８５】
化合物
本発明のコンジュゲート又はVLPにおける使用のための化合物は、治療用、診断用若しくは画像化用作用剤等の任意の目的の化合物であり得る。化合物はまた、タグであってもよく、適切な条件下で、コンジュゲートされたコートタンパク質又はVLPを前記作用剤に露出させることによって、任意の目的の作用剤の続く結合を可能にする。
【００８６】
特定の実施形態では、化合物は、小さな化学分子(例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、免疫調節薬、抗悪性腫瘍薬等)、ペプチド又はポリペプチド(サイトカイン、ホルモン、毒素、抗原等の)、タンパク質(酵素、抗体(ナノボディ等の)又は抗体の一部)、核酸(例えば、siRNA又はmiRNA)、又はマーカー(蛍光又は発光剤等の)等の生物学的に興味深い化学物質(chemical entity)である。
【００８７】
特定の実施形態では、化合物は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。かかるタイプの化合物を用いて、本発明のコンジュゲートは、遺伝的融合によって産生することができる。
【００８８】
かかる化合物の特定の例として、例えば、抗体若しくはナノボディ又はそれらの断片若しくは誘導体が挙げられる。これに関して、驚くべきことに、本発明は、ネポウイルスのコートタンパク質が、VLPへと集合するそれらの能力を喪失することなく、非常に大きなタンパク質(200個以上のアミノ酸)に融合され得ることを示す。したがって、本発明のコンジュゲートは、非常に大きなタンパク質を露出させるか、又は閉じ込めるのに使用され得る。
【００８９】
かかる化合物の他の例として、例えば、ペプチド又はタンパク質抗原が挙げられる。かかる化合物は通常、得られた粒子の表面でそれらの露出を可能にするように、C末端でコンジュゲートされる。このようにして、コンジュゲート又は得られたVLPは、抗原に対する免疫応答を誘導又は刺激するために、ワクチン又は免疫原性組成物として使用することができる。
【００９０】
C末端におけるコンジュゲーションの具体例は、非共有結合的(リガンド媒介性)コンジュゲーション、好ましくは少なくとも1つのナノボディとのコンジュゲーションである。
【００９１】
かかる化合物の別の例として、ガドリニウム、銀、金等などの金属又はトレーサー分子に対して親和性を有するペプチド又はタンパク質が挙げられる。
【００９２】
かかる化合物の別の例として、毒素、酵素又は毒性分子が挙げられ、それらは好ましくは、それらがそれらの標的組織に達する前に生物において露出されるべきではない。かかる毒性化合物の例として、例えば、カスパーゼ、シトシンデアミナーゼ及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼFcy及びFur、リボソーム不活性化タンパク質、並びに細菌及び植物毒素が挙げられ、それらは、真核細胞においてタンパク質合成を阻害することによって作用する。志賀及びリシンファミリーの毒素は、N-グリコシド切断によって60Sリボソームサブユニットを不活性化し、それは、28S rRNAの糖-リン酸バックボーンから特定のアデニン塩基を放出する。ファミリーのメンバーとして、志賀及び志賀様毒素、並びにI型(例えば、トリコサンチン及びルフィン(luffin))及びII型(例えば、リシン、アグルチニン及びアブリン)リボソーム不活性化タンパク質(RIP)が挙げられる。これらの毒素は全て、構造的に関連される。RIPは、それらの潜在的な使用のため、相当興味が持たれており、がんを治療するための免疫毒素として、モノクローナル抗体とコンジュゲートされている。更に、トリコサンチンは、HIV-1感染T細胞及びマクロファージに対して強力な活性を有することがわかっている。
【００９３】
かかる化合物の別の例は、細胞標的化リガンドを含む。かかる化合物は、細胞受容体若しくは構造への、特異的な又は標的化された結合を可能にし、したがって、好ましい標的細胞若しくは組織へのコンジュゲート又はVLPの標的化を可能にする。かかる標的化リガンドの例として、細胞表面受容体のリガンド、又は細胞表面タンパク質の受容体、又は抗体(ナノボディ等の)若しくはそれらの断片が挙げられる。
【００９４】
かかる化合物の別の例は、細胞透過性ペプチド及び形質導入ドメインを含む。かかる化合物は、細胞においてコンジュゲート又はVLPの内部移行を可能にする。かかるペプチドの例は、HIV-1のtatペプチドを含む。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、C末端で、標的化リガンドにコンジュゲートされ、N末端で、毒性化合物にコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質を含む。かかるコンジュゲートは、表面で露出される標的化リガンド及び閉じ込められた毒性化合物を有するVLPの形成を可能にする。
【００９６】
医薬組成物及び方法
本発明はまた、上記で規定される少なくとも1つのVLP、及び好ましくは1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００９７】
本発明はまた、上記で規定される少なくとも1つのコンジュゲートされたネポウイルスコートタンパク質、及び好ましくは1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００９８】
コートタンパク質に結合される化合物若しくは活性基の存在又は非存在に、及びその性質に応じて、本発明の組成物は、治療用組成物、ワクチン、アジュバント、診断用組成物、免疫原性組成物、研究試料等などの様々な有用性を有し得る。
【００９９】
本発明の組成物は好適には、薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤は、組成物の形態に応じて、任意の適切な且つ従来の賦形剤から選択することができる。特に、錠剤、丸剤、粉末又は顆粒等の固体組成物に関しては、組成物は、例えば、ラクトース、デキストロース、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含み得る。タルク又はステアリン酸等の潤滑剤、デンプン又はゼラチン等の結合剤、寒天等の崩壊剤、及び/又は甘味剤を、同様に組成物に更に添加してもよい。半固体組成物に関しては、賦形剤は、例えば、エマルジョン又は油状懸濁液であり得る。液体組成物、特に注射剤又は軟質カプセル中に含まれるものは、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、アルコール、油及びそれらの類似体等の希釈剤又は溶媒を含み得る。
【０１００】
本発明の組成物又はコンジュゲートは、非経口(例えば、皮下、静脈内又は筋内経路)、経口、直腸、眼内又は鼻内経路によるような任意の適切な経路によって投与することができるが、これらに限定されない。医薬組成物は通常、有効用量のVP又はコンジュゲート又は化合物、例えば、所定の条件及び投与スケジュールに関して治療効果を付与する任意の用量を含む。
【０１０１】
コートタンパク質にコンジュゲートされた化合物の性質に応じて、本発明のVLP及び組成物は、様々な病態を治療、防止、診断又は画像化するのに使用することができる。
【０１０２】
これに関して、本発明は、医薬としての使用のための上記で規定されるVLP又はコンジュゲートに関する。
【０１０３】
本発明は、ワクチンとしての使用のための上記で規定されるVLP又はコンジュゲートに関する。
【０１０４】
本発明は、アジュバント又は免疫調節薬としての使用のための上記で規定されるVLPに関する。実際に、例えばコンジュゲートされていないネポウイルスコートタンパク質から調製される本発明のVLPが、哺乳動物において免疫応答を刺激するために適切なアジュバント又は免疫調節性組成物として使用されてもよい。
【０１０５】
本発明は、診断剤としての使用のための上記で規定されるVLP又はコンジュゲートに関する。
【０１０６】
本発明は、トレーサーとしての使用のための上記で規定されるVLP又はコンジュゲートに関する。
【０１０７】
本発明はまた、in vivoで化合物の露出を低減させるためのネポウイルスコートタンパク質の使用に関する。
【０１０８】
本発明はまた、in vivoで化合物の露出を改善するためのネポウイルスコートタンパク質の使用に関する。
【０１０９】
本発明の更なる態様及び利点を、下記の実験項に開示し、それらは、実例とみなされるべきである。
【実施例】
【０１１０】
A.実験手順
バイナリープラスミドの構築
GFLV-CPF13、TagRFP及びEGFPに関するコード配列を、それぞれ鋳型としてpVec2ABC(Viry等、1993;Schellenberger等、2010;Vigne等、2013)、pTagRFP-C(Evrogen社、ロシア)及びpEGFP-N1(Clontech社、カリフォルニア)を使用して、製造業者の指示書に従ってPhusionハイフィデリティDNAポリメラーゼを使用したPCR(New England Biolabs社、Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ)によって増幅させた。それぞれTagRFPとのGFLV-CPF13のN又はC末端融合に相当する翻訳融合TRCP及びCPTRは、鋳型としての上述のPCR産物及びGly3-Ser-Gly3ペプチドリンカー配列をコードする重複プライマーを使用した重複PCR(Ho等、1989)によって得られた。attB隣接CP、TR、CPTR及びTRCP PCR産物を、Gateway組換えによって、pDONR/Zeoエントリーベクター(Invitrogen社、Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ)へクローニングして、更にpEAQ-HT-DEST1バイナリープラスミド(Sainsbury等、2009)へ組換えた。CPEG(ここで、GFLV-CPF13のC末端がEGFPに融合されている)に関して、停止コドンを欠如しているCPコード配列を含有するpDONR(商標)/Zeoベクターを、attR2組換え部位の下流のEGFPコード配列(Clontech社、カリフォルニア)の導入によるpEAQ-HT-DEST1ベクターに由来するホームメイドGateway発現ベクター(Sainsbury等、2009)における組換えによるクローニングに使用した。組換えは、GFLV-CPF13のC末端残基と、EGFPとの間にDPAFLYKVVRSFGPAリンカーペプチドの導入をもたらした(図1及び配列表)。ナノボディ由来の構築物の配列は、国際公開第2015/110601号に見出すことができる。
【０１１１】
植物材料、ウイルス感染及びウイルス様粒子産生
C.キノア(C. quinoa)及びN.ベンサミアナ植物を、22/18℃(昼/夜)温度の温室で成長させた。pMV13+pVecAcc65I2ABC感染材料に由来するGFLV-CPF13感染粗製樹液(Schellenberger等、2010)を使用して、多数の3週齢のC.キノア植物に機械的に接種した。植物を、接種の14日後に収穫して、ウイルス精製に使用した。N.ベンサミアナの機械的接種に関して、3週齢の植物に、精製GFLV-CPF13を接種した。VLPは、N.ベンサミアナの葉のアグロインフィルトレーション後に一過性の発現によって産生された。バイナリープラスミドは、エレクトロポレーションによって導入されて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株GV3101::pMP90において維持された。培養液は、適切な抗生物質を有するルリア-ベルターニ培地中で安定な相に成長させ、ペレット化して、続いて、単独で又は同時発現に関しては1:1の比で、600nmで最終的な光学密度0.5になるように、滅菌水中に再懸濁させた。2mlのプラスチックシリンジを用いて、懸濁液を4週齢のN.ベンサミアナの葉に浸潤させた。健常な、感染した、及びアグロインフィルトレーションしたN.ベンサミアナ植物を、21/18℃(昼/夜)の温度設定を有する14/10光周期(4800lx)で設定した成長チャンバー中に維持し、7日後に葉を収穫した。
【０１１２】
アグロインフィルトレーションした葉の観察
蛍光タンパク質の可視化は、アグロインフィルトレーションの5日後に実現させた。AxioZoom V16マクロスコープ(Zeiss社、ドイツ)を用いて、EGFP画像化に関しては450〜490nm及び500〜550nm及びTagRFP可視化に関しては625〜655nm及び665〜715nmの励起及び放出波長フィルターを使用して、葉を画像化した。画像は、ImageJ(Schneider等、2012)及びGNU Image Manipulation Program(GIMP、www.gimp.org)ソフトウェアを使用して加工処理した。
【０１１３】
DAS-ELISA
健常な、感染した、及びアグロインフィルトレーションした葉を、HEPES 100mM pH8中で1:5のw/v比で粉砕して、3000gで5分間浄化した。GFLV又はVLP検出は、製造業者の指示書に従って市販のDAS-ELISAキット(Bioreba社、スイス)を使用して実施した。簡潔に述べると、プレートを、1:1000希釈でコーティング緩衝液中に希釈したポリクローナル抗GFLV抗体でコーティングして、浄化抽出物とともにインキュベートした後、コンジュゲート緩衝液中での1:1000希釈のアルカリホスファターゼにカップリングさせた抗GFLVモノクローナル抗体を添加した。DAS-ELISA手順の各工程間で、3回の洗浄を行った。検出は、アルカリ媒質中で黄色い水溶性反応産物を生じる基質としてパラニトロフェニルリン酸を使用して実現させた。Titertek Multican MCC/340リーダー(Labsystems社、フランス)を用いて、405nmでの吸光度を測定した。吸光度値が、基質インキュベーション期間後に、少なくとも3倍分、対照試料を超える場合、試料を陽性であるとみなした。
【０１１４】
ネガティブ染色、イムノキャプチャー及び免疫吸着電子顕微鏡法(ISEM)
健常な、感染した、及びアグロインフィルトレーションした葉を、100mM pH8 HEPES緩衝液中で粉砕して、3000gで5分間の遠心分離によって浄化して、簡素なネガティブ染色用、イムノキャプチャー用、又はISEM用に加工処理した。全てのグリッドに関して、ネガティブ染色は、90秒間の1%モリブデン酸アンモニウム溶液とのインキュベーションによって、炭素コーティングしたFormvar(Electron Microscopy Science社、ペンシルベニア)で覆った300メッシュのニッケルグリッド上で実施した。浄化樹液で実施したイムノキャプチャーに関して、グリッドは、1:100希釈のポリクローナル抗体(Bioreba社、スイス)を用いてコーティングし、植物抽出物とともに、4℃で2時間インキュベートして、HEPES 25mM pH8緩衝液中で洗浄して、最終的にネガティブ染色用に加工処理した。精製CP、CPTR及びTRCP VLPに関するISEMに関して、グリッドは、0.05mg/mL濃度でGFLVに対するホームメイドモノクローナル抗体を用いてコーティングし、VLPとともに、室温で1時間インキュベートした。22.5mM HEPES pH8中の2%w/vのBSA、10%v/vの正常ヤギ血清、0.05%のTriton-X100でブロックした後、グリッドを更に、1:100希釈の抗GFLV(Bioreba社、スイス)又は0.01mg/mL濃度の抗TRポリクローナル抗体(Evrogen社、ロシア)のいずれかとともに、室温で1時間インキュベートした。イムノゴールド標識は、1:50希釈の10nmコロイド金粒子にコンジュゲートされた抗ウサギ抗体(British Biocell International社、ウェールズ)を使用して実施した。25mM pH8 HEPES緩衝液を用いた洗浄は、全ての工程間で行った。精製CPRG及びCPRG+TRCP VLP上に関するISEMは、GFLVに対するポリクローナル抗体(Bioreba社、スイス)を捕捉用に使用し、またGFLVに対するホームメイドモノクローナル抗体ミックス又はモノクローナル抗EG抗体(Roche、ドイツ)のいずれかを検出に用いたことを除いて、類似した様式で実施した。最終的に、イムノゴールド標識は、10nmコロイド金粒子にコンジュゲートされた抗マウス抗体(British Biocell International社、ウェールズ)を使用して実施した。観察は、Philips EM208透過型電子顕微鏡を使用して実現させた。フィルムベースの写真は、Kodak Electron Image Films SO-163(Electron Microscopy Science社、ペンシルベニア)へ獲得され、適応した化学物質(Electron Microscopy Science社、ペンシルベニア)を用いて顕色させた。最終的に、写真をスキャンして、デジタル電子顕微鏡画像を得て、GNU Image Manipulation Program(GIMP、www.gimp.org)を使用して加工処理した。
【０１１５】
GFLV-CP構造表示及び分析
CPサブユニット及びカプシド表示は、UCSF Chimeraパッケージ(Pettersen等、2004)を用いて、これまでに3Å分解したGFLV-F13原子構造(PDB ID:4V5T、Schellenberger、Sauter等、2011)を使用して行った。CPサブユニット末端の近付きやすさのデータは、VIPERdb(Carrillo-Tripp等、2009)を使用して得られた。
【０１１６】
ウイルス及びウイルス様粒子精製
GFLV-CPF13ウイルス粒子は、Schellenberger等、2011に従ってC.キノア(C. quinoa)感染植物から精製した。VLPは、同じ実験手順に倣って、アグロインフィルトレーションしたN.ベンサミアナの葉から精製されたが、但し、最終的な不連続ショ糖勾配は省略した。簡潔に述べると、最低350グラムの葉を抽出緩衝液中で粉砕して、濾過して、ベントナイトともにインキュベートして、最終的に、1900gで15分間の遠心分離によって浄化した。続いて、PEG-20000及び塩化ナトリウムを添加することによって、VLPを浄化粗製樹液から沈殿させた。ショ糖クッション上での遠心分離、続くショ糖密度勾配分別によって、混入している要素を除去した。2ml画分を収集して、そこから、1:500、1:5000及び1:10000希釈でのアリコートを、半定量的DAS-ELISAアッセイ用に加工処理して、290,000gで2時間の最終的な超遠心分離前に、更にプールしたVLP富化画分を同定した。HEPES 25mM pH8中の再懸濁後に、VLPアリコートを、標準物質としてGFLV-CPF13ウイルス粒子を使用して定量的DAS-ELISAアッセイ(Vigne等、2013)による定量化用に希釈した。
【０１１７】
SDS-Page電気泳動、ウェスタンブロット及び質量分析
SDS-Page分析用に、各精製試料からのGFLV-粒子等価体6μgを、8%アクリルアミドゲル上で分離させて、Instant Blue(Expedeon社、イギリス)を使用して、クマシーブルーで染色した。質量分析用に、目的のSD-Pageバンドを切除して、タンパク質を脱染させて、還元して、アルキル化して、一晩トリプシンで消化して、キモトリプシンで消化して、最終的にnanoU3000(Dionex社、Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ)-ESI-MicroTOFQII(Bruker社、マサチューセッツ)でnanoLC-MSMS分析用に加工処理した。質量分析データは、Mascot(Matrix Science Limited社、イギリス)及びProteinscape(Bruker社、マサチューセッツ)を活用して分析した。ウェスタン分析に関して、各試料0.05μgを8%アクリルアミドゲル上で分解させて、変性させたタンパク質を、Immobilon PVDF膜上へ電気泳動転写した。膜を、1:1000希釈のウサギポリクローナル抗GFLV抗体又は1:5000希釈の市販のポリクローナル抗TR抗体(Evrogen社、ロシア)のいずれかとともにインキュベートした。タンパク質は、1:12500希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ(Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ)及びLumi-Light溶液(Roche社、ドイツ)とのインキュベーション後に、化学発光により明らかになった。画像は、G:Box画像化システム(Syngene社、イギリス)を用いて取得し、GeneTools(Syngene社、イギリス)を用いて分析し、最終的に、GIMP(www.gimp.org)を用いて加工処理した。
【０１１８】
単一粒子落射蛍光顕微鏡法
Orca Flash4.0カメラ(Hamamatsu社、日本)及びSpectra X線エンジン(Lumencor社、オレゴン)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡Axio Abserver Z1(Zeiss社、ドイツ)での画像化時に個々のスポットを得るために、TRCP、CPEG又はCPEG+TRCP試料からの精製粒子をHEPES 25mM pH8で希釈した。励起及び放出波長フィルターは、EGFPに関しては455〜495nm及び505〜555nm、並びにTagREFに関しては532.5〜557.5nm及び570〜640nmであった。画像は最終的に、ImageJ(Schneider等、2012)及びGIMPソフトウェア(www.gimp.org)を使用して加工処理した。
【０１１９】
ネイティブアガロースゲル電気泳動
精製ビリオン及びVLPのネイティブゲル電気泳動は、8.0〜9.0の範囲のpHで、0.5×トリス酢酸EDTA(TAE)又はトリス酢酸(TA)緩衝液中で1%w/vアガロースゲルにおいて行った。核酸検出用に、ウイルス粒子又はVLP 5μgを、0.1μg/mLでEtBrを補充したローディング緩衝液(10%v/vグリセロール、HEPES 25mM pH8)中に希釈した。電気泳動分離後、まず、EtBrで予め染色したゲルを、302nm励起源及び放出のための520〜640nmバンドパスフィルターを備えたGel Docシステム(Bio-rad、カリフォルニア)を使用して、核酸含有量用に加工処理した。第2の工程では、これまでに言及したように、ゲルをクマシーブルー染色用に加工処理した。
【０１２０】
ネイティブゲルの蛍光画像化に関して、精製VLP試料3μgをローディング緩衝液中に希釈して、EtBrの非存在下で、ネイティブゲル電気泳動を実施した。画像化は、EGFP可視化用に、450〜485nm励起LEDモジュール及び放出のための510〜540nmバンドパスフィルターを備えたG:Box画像化システム(Syngene社、イギリス)を用いて行った。TR励起は、480〜540nmLEDモジュールを用いて実現させ、蛍光放出は、590〜660nmバンドパスフィルターによるフィルタリング後に収集した。FastRed染色に関して、製造業者の指示書に従って(Sigma)、1mM MgCl2の存在下で、FastRed溶液中でインキュベートした。
【０１２１】
モデリング
GFLV(PDBid 4V5T)、EG(PDBid 1GFL)及びTR(PDBid 3M22)の結晶構造を使用して、CPEG、TRCP又はTRCPEG VLPをモデリングした。キメラCPは、リンカー及び相当するFP配列を、それぞれVLPの外側及び内側を指すCPの遊離C及びN末端に付加することによって、Modeller(Eswar等、2006)を用いて創出した。完全カプシドは、PyMOLにおいて正二十面体対称を使用して再構成させた(The PyMOL Molecular Graphics System社、バージョン1.7.4、Schrodinger、LLC)。TRCPカプシドにおけるFPの位置は、Coot(Emsley等、2010)を使用して立体衝突を回避するように調節した。
【０１２２】
動的光散乱法(DLS)。
単独の、又はNb23に、Nb23:EGFPに若しくはNb23:ALPに対して複合体形成したTRCP VLPの平均粒径及び多分散性を、Zetasizer NanoZS(Malvern)及びNanostar(Wyatt)を使用してDLSによって推定した。3つの独立したウイルス及びTris緩衝液(50mM Tris、100mM NaCl、pH8.3)中の0.1mg/mlでのウイルスを用いたタンパク質調製物、0.2mg/mlのNb23、0.5mg/mlのNb23:EGFP及び1mg/mlのNb23:ALPを使用して、5回の連続測定を行った。散乱強度を20℃で記録して、データを、それぞれDTSソフトウェア(バージョン6.01)又はDYMAMICS(バージョン7.1.8.93)で加工処理した、粒子は全て、単分散性であった。
【０１２３】
B-結果
1.GFLVコートタンパク質は、ウイルス様粒子へと自己集合する
GFLVコートタンパク質(CP)の、植物体においてVLPを産生する能力に対処するために、GFCV単離体F13のCPをコードする配列(配列番号1、N末端メチオニンを伴わない)を、pEAQ-HT-DEST1バイナリーベクター(Sainsbury等、2009)において導入し(図1)、アグロインフィルトレーション時のニコチアナ・ベンサミアナの葉における一過性の発現に使用した。試料は、陽性対照として接種後14日目(dpi)のGFLV-F13感染植物からのN.ベンサミアナの葉を、及び陰性対照として7dpiのpEAQ-HT-DEST1駆動TagRFP(TR、Merzlyak等、2007)のアグロインフィルトレーションした葉及び健常な葉を使用した、アグロインフィルトレーション後7日目(dpi)の直接的な二重抗体サンドイッチELISA(DAS-ELISA)によって分析した。CP発現及びGFLV感染試料の両方において、強力な陽性シグナルが検出されたが、TR浸潤又は健常な葉材料由来の抽出では検出されなかった(図2a)。一過的に発現されたCPの、VLPへと自己集合する能力を試験するために、同じ葉抽出物を、捕捉抗体としてDAS-ELISAにおけるコーティングに使用したのと同じポリクローナル抗体を使用したグリッド上でのイムノキャプチャー後に透過型電子顕微鏡法(TEM)によって更に分析した。ネガティブ染色した材料の観察(図2b)により、CP発現試料において直径約30nmの正二十面体粒子の存在が明らかになったが、TR浸潤又は健常な陰性対照では明らかではなかった(図2b)。グリッド上では非常に豊富ではないが、CP発現粗試料で見られる正二重面体粒子は、同一の条件下で観察されるGFLV-F13粒子と非常に類似している(図2b)。これにより、GFCV CPが、N.ベンサミアナにおける一過性の発現時に、VLPへと自己集合することが可能であることが示される。
【０１２４】
2.GFLV CPは、外来タンパク質へのそのN又はC末端の融合時に、VLPへと集合するその能力を維持する
GFLV原子構造(Schellenberger等、2011b)の分析により、GFLV CPアミノ末端残基Gly1及び3つのカルボキシ末端残基Phe502、Pro503及びVal504は、ウイルスカプシドに最終的な四次構造に寄与せず、それぞれGFLV粒子の内側及び外側表面で露出されることが明らかとなる(図3a及び図3b)。これに関して、両端を、追加の残基の付加及びCPの、カプシドを形成する能力のそれらの影響に関して試験した。この仮説を試験するために、TRへのN又はC末端CP融合物を産生し、それぞれ、これ以降TRCP(配列番号10)及びCPTR(配列番号9)と名付けた(図1)。融合物はともに、CPドメインとTRドメインとの間に可撓性を維持するために、Gly3-Ser-Gly3リンカーペプチド(図1)を含んでおり(Zilian及びMaiss、2011)、N.ベンサミアナの葉において一過的に発現された。試料は、5dpaでのTR発現に関しては、落射蛍光マクロスコピーによって(図4)、並びに2日後に、CP発現に関してはDAS-ELIS(図3c)及びVLPに関してはTEM(図3d)によって分析した。TR蛍光が、全ての試料において観察され(図4)、種々のタンパク質の適正な発現を示唆するのに対して、CPは、DAS-ELISA(図3c)によってCPTR及びTRCP粗製抽出物においてのみ検出され、それは、TEM(図3d)時に見られるようなVLPの存在と相関した。これらの結果により、GFLV CPは、TRへのそのN又はC末端の融合時にVLPを形成するその能力を保持することが示唆される。
【０１２５】
本発明者等の結果を確認するために、またかかるVLPの生化学特性に対する洞察を獲得するために、N.ベンサミアナの葉における大規模な産生を実行して、続いて、プロテアーゼ阻害剤の非存在下での浄化工程及び超遠心分離工程を含む標準的なGFLV精製手順を使用して精製を行った(方法を参照)。並行して、GFLV-CPF13ビリオンを、14dpiに感染C.キノアの葉から精製した。線形ショ糖勾配後に、鮮明なピンク色のバンドが、TRCP勾配において(図5a)、並びに淡いピンク色のバンドが、CPTR勾配において(図示していない)観察されたが、感染試料では観察されなかった(図示していない)。2mLのショ糖勾配画分を収集して、VLPにおいて富化されたものを、半定量的DAS-ELISAによって同定した。真正GFLV粒子は、画分8〜10では勾配の底部に向かって沈降したのに対して、他の粒子(CP、CPTR及びTRCP)は、それぞれ、より軽い画分3〜5、4〜6及び6〜8に位置した(図5b)。これは、これまでの報告に一致しており、感染植物から精製した空のGFLV粒子は、自然RNA含有ビリオンよりも低い密度を示す(Quacquarelli等、1976)。DAS-ELISA陽性画分を更にプールして、超遠心分離によって最終濃度に加工処理した。注目すべきことに、ピンク色のペレットは、TRCP及びCPTR試料の両方において観察された(図6a)。精製材料の最終濃度(図6b)は、標準物質として精製GFLV-CPF13ビリオンを使用して定量的DAS-ELISAによって決定した。収量は、3回の精製に関して新鮮な葉1kg当たりGFLV粒子等価体386〜445μgの範囲であり、それは、感染N.ベンサミアナからのGFLV精製収量と同じ桁である(Schellenberger、Demangeat等、2011)。
【０１２６】
それらの品質及び純度を評価するために、精製試料を、SDS-PAGE後のクマシーブルー染色(図6c)、抗GFLV又は抗TR抗体を使用した免疫ブロッティング(図6d及び図6e)及び質量分析(データは示していない)によって分析した。クマシーブルー染色に関して、各試料の粒子等価体6μgを、SDS変性ゲル上に載せた。VLPの精製と一致して、観察される質量57kDa及びGFLVのCPと共遊走する1つの主要タンパク質(算出質量56kDa)が、CPを発現する葉から精製された試料中に存在した(図6c、バンド1及びバンド2)。CPTR及びTRCP試料に関して、プロファイルは、より複雑であり、およそ87、73及び57kDaの観察される分子量の3つの主要なタンパク質が検出された(図6c、CPTRに関してはバンド3〜バンド5、及びTRCPに関してはバンド6〜バンド8)が、反比例して、TRCPに関しては、より大きな産物が最も大量であり、より短いものが最も少量であり(それぞれ、各々の存在量およそ69%、24%及び7%)、CPTRに関しては反対であった(それぞれ、およそ2%、35%及び63%)。抗GFLV抗体を用いた免疫ブロッティング時に、CPTR試料中に存在するより短い産物(図6c、バンド5)は、はっきりと明らかになっており(図6d)、バンド5が、GFLVのCPに相当し、おそらくCPTRの切断産物を表すことを強力に示唆する(図6d)。TRCP試料では、より大きな産物（図6c、バンド6）は、明らかに抗GFLV抗体と免疫反応した(図6d)。このバンドが、TRCPのほぼ予想サイズ(算出質量:82.8kDa)であることを考慮すると、本発明者等の結果により、完全TRCPが、精製TRCP試料中に存在する主要タンパク質であることが示唆される。したがって、バンド6はまた、抗TR抗体による免疫検出時に強力なシグナルを付与した(図6e)。抗TR抗体はまた、免疫反応したが、CPTR試料中に存在するより大きな産物を用いた場合(バンド3)、またCPTR及びTRCP試料中に観察される73kDaの切断型産物を用いた場合(図6e)には弱く免疫反応した。まとめると、本発明者等の結果により、精製TRCP及びCPTR試料中に存在する主要タンパク質は、GFCV CPに由来し、したがってVLPを表す可能性が高いことが示唆される。
【０１２７】
精製産物の組成物に対する洞察を獲得するために、クマシー染色したバンドを、質量分析に付して、分析したバンド全てに関して、ほぼ完全なCPを網羅するペプチドの同定をもたらした(図6C、データは示していない)。TRに相当するペプチドは、バンド3、バンド4、バンド6及びバンド7に関してのみ観察され、CPTR又はTRCPタンパク質のほぼ完全な適用範囲は、バンド3及び6に厳密に制限された。バンド4及びバンド7に相当する73kDaの産物は、TPのほんの部分的な適用範囲を示し、したがって、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で実行される精製プロセス中のタンパク質分解におそらく起因して、CPTR又はTRCPの切断型バージョンを表す。まとめると、本発明者等の結果により、完全長キメラタンパク質CPTR又はTRCPは、標準的なウイルス精製手順に倣って精製することができ、したがって、VLP産生と完全に適合していることが実証される。それらはまた、CPTR融合が、おそらく、それぞれN若しくはC末端融合時のVLPの内部又は外部表面に対するTRの種々の配向性の結果として、TRCPよりも不安定であることを明らかにしている。
【０１２８】
3.N及びC末端CP融合物は、それぞれVLPの内部又は外部に向かって配向される。
N及びC末端CP融合物の配向性に対する洞察を獲得するために、VLPを、ネガティブ染色及び免疫吸着電子顕微鏡法分析に更に付した。予想通り、ニッケルグリッド上への精製材料の直接的なコーティング、続くネガティブ染色により、GFLV粒子(図7a)に明らかに類似する試料全てにおいて多数のVLPの存在が明らかとなった(図7d、図7g及び図7j)。かかる条件下で、CP及びCPTR粒子は、GFLV-ビリオン(図7a)に類似して、高電子密度であると思われた(図7d及び図7g)。対比して、TRCP粒子は、粒子の内側密度を増加して、且つ重金属に対する浸透性を減少する可能性が高いTRCP VLPの内部に向かうTRの配向性(図7a及び図7b)をおそらく反映して、電子密度は低かった(図7j)。これらの仮説を検証するために、抗GFLV(図7b、図7e、図7h及び図7k)又は抗TR抗体(図7c、図7f、図7i及び図7l)を用いて装飾アッセイを実施した。精製粒子は全て、予想通りに抗GFLV抗体で標識された(図7b、図7e、図7h及び図7k)のに対して、CPTR粒子のみが、CPTR粒子に対するTRCP中に存在する完全長キメラタンパク質の有意に大きな比率(図6)にもかかわらず、抗TR抗体で装飾された(図7i)。これにより、CPTR及びTRCPはともに、構造物の点では異なるVLP形成と適合していることが明らかに実証される。CPTR VLPにおいて、TRは、抗TR抗体に近付きやすく、粒子の外側表面に対するタンパク質の露出を強調している。対比して、TRCP VLPにおいて、TRは全体的に、粒子の内側のTRの閉じ込めの最も可能性が高い結果として、抗TR抗体に近付きにくい。おそらく最も需要なことに、本発明者等の結果はまた、GFLV CPが、タンパク質の、VLPへと自己集合する能力を変更させることなく、それ自体の長さの50%を表す蛍光タンパク質と同程度大きな外来タンパク質の融合に適合し得ることも明確に示す。
【０１２９】
4.ハイブリッドVLPを産生することができる
本発明者等の結果を考慮して、本発明者等は次に、N及びC末端CP融合物の同時発現時のGFLV CPの、ハイブリッドVLPを形成する能力を試験した。それを行うために、EGFPを、レポータータンパク質として選択し、図1に示すように、CP N末端に融合させた(構築物CPEG、配列番号11)。前述するように、アグロインフィルトレーションしたN.ベンサミアナの葉を発現アッセイに使用し、VLPの精製は、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で実行した。CPEGを発現する葉を陰性対照として使用し、CPEG及びTRCPを同時発現する葉(CPEG+TRCP)と比較した。本発明者等のこれまでの結果に従って、CPEG VLPを精製して、CPTR VLPと同じ線形ショ糖勾配画分に位置することができる(図5b)。同時発現されるCPEG及びTRCPはまた、線形ショ糖勾配においてCPEG VLPと共沈降するDAS-ELISA免疫反応性材料の精製を可能にした(図5b)。ISEM分析により、CPEG及びCPEG+TRCP試料の両方においてVLPの存在が確認され、それは、VLPの外部表面に対するEGFPの予想露出と十分一致して、抗GFLV及び抗EGFP抗体の両方と明らかに免疫反応した(図8)。TRが、CP N末端への融合時にISEMにおいて抗体へ近付きにくいことを考慮して、本発明者等は、ネイティブアガロースゲル上での電気泳動によって分離されるVLPの蛍光画像化によって、EGFP及びTagRFPの存在を更に評価した(図9)。かかる条件下で、特定の遊走プロファイルを有する別個のバンドが、TRCP、CPEG及びCPEG+TRCP試料において検出され、TRCP VLPは、赤色チャネル(λ(励起)480〜540/λ(放出)590〜660nm、図9a)においてのみ、CPEG VLPは、緑色チャネル(λ(励起)450〜485/λ(放出)510〜540nm、図9b)おいてのみ可視性であり、CPEG+TRCP VLPは、ハイブリッド粒子に関して予想される通り、両方のチャネルで放出する(図9a及び図9b、空の矢頭)。
【０１３０】
真正ハイブリッドVLPの産生、したがって緑色及び赤色で同時に放出する粒子の存在を確認するために、精製試料を、落射蛍光電子顕微鏡法による単一粒子画像化用に更に加工処理した。このようにして、赤色チャネルにおいてのみ放出する個々のスポットとして出現する多数のTRCP VLPが観察された(図9c)。同様に、緑色チャネルにおいてのみ放出し、CPEG VLPに相当する個々のスポットもまた検出されたが、精製CPEG VLP試料における完全長タンパク質の低い存在量(図6c)をおそらく反映して、より低密度で検出された(図9d)。重要なことに、別々に精製したCPEG及びTRCP VLPのミックスは、常に専ら赤色又は緑色のいずれかである個々のVLPの観察をもたらした(図9e)。対比して、黄色い粒子が、CPEG+TRCP VLPにおいて明らかに検出された(図9f、黒色矢頭)。まとめると、本発明者等の結果は、GFLV CPが、ハイブリッドVLPの産生と完全に適合しており、ここでは蛍光タンパク質と同程度大きな外因性タンパク質が同時に、CPのN又はC末端のいずれかへのそれらの融合まで、外側表面に露出されて、個々のVLPの内側管腔において閉じ込められ得ることを実証する。
【０１３１】
5.GFLV VLPは、核酸を含まない
VLPの含有量を検査するために、ネイティブアガロースゲル電気泳動を実施して、ゲルを、タンパク質含有量に関してはクマシーブルーで(図10a)、又は核酸に関しては臭化エチジウム(EtBr)で(図10b)染色した。ネイティブアガロースゲルにおけるVLPの蛍光画像化時にすでに注目したように(図9a及び図9b)、CP、CPTR及びTRCP VLP並びに精製GFLVの遊走プロファイルは、おそらく各種粒子の正味の電荷、密度及び質量の差の結果として、有意に異なった(図10a)。おそらく粒子の外側表面で露出される場合のTagRFPの幾分不安定な性質に起因して、CPTR VLPは、他の試料を用いた場合に見られるような明確なバンドではなく、ゲル上にスメアを形成した(図10a)。EtBr染色後のUV照明下で、核酸は、GFLVビリオンにおいて明らかに検出され、CP VLPにおいては検出可能なレベルを下回り、かかる粒子が、このアッセイの検出の限界内では、核酸を含まないことを示唆した(図10b)。対比して、同一条件下で、CPTR及びTRCP VLPは、UV照明下で、おそらくわずかなTRタンパク質励起(Merzlyak等、2007)及び核酸の存在に対するものではないTR及び核酸スペクトルの完全な識別と不適合であるフィルターの使用の結果として、弱いシグナルを発生した(図10b、矢頭)。これに関して、精製ウイルスのみが、核酸の存在と適合している高いO.D.260/O.D.280値を引き起こした一方で、種々のVLP(CP、CPTR、TRCP、CPEG及びCPEG+TRCP)に関して測定されるものは、0.89〜1.07の範囲であり、それらの非常に低い含有量又は核酸を含まない含有量を示した(図10c)。
【０１３２】
6.GFLV CP由来のVLPは、最大120個のFPの同時カプシド形成及び露出と適合している
CPの遺伝的融合時にVLPにおいて組み込まれ得るFPの最大数を推定するために、本発明者等は、CPEG及びTRCP由来の粒子をモデリングした(実験手順を参照)。融合物はともに、VLPの形成と完全に適合していることがわかった(図11)。本発明者等のモデルに従って、ゲートウェイ由来のリンカーペプチドを含むCPEGは、みかけの直径48.5Åを有するVLPの形成を引き起こし、ここで、FPは、粒子外側表面で均等に分配され、浮遊している(図11a)。対比して、TRCPは、ビリオンの1つと同一の外径29.0Åを有するVLPの形成をもたらすが、そこで、FPは、粒子の内側にしっかりとパッケージングされた層を形成する(図11b)。本発明者等はまた、理論上のCP(1000個の残基)であるTRCPEG(配列番号19)をモデリングし、ここで両端が、FPに融合され(図11c)、少なくともin silicoで、GFLV CPは、FPの同時カプシド形成及び露出と適合していることを明らかにし、まとめると、VLP1個当たり120個のFPに相当した。かかるTRCPEG VLPの算出質量(6.69MDa)は、CPのみのVLPの算出質量(3.37MDa)のほぼ2倍である。
【０１３３】
7.ナノボディは、GFLV CP由来のVLPの表面での外来タンパク質の表示のための万能ツールである
国際公開第2015/110601号に記載されているNb23は、精製GFLV粒子に効率的に結合することができ、GFLV-Nb23複合体の構造を2.8Å分解での単一粒子クライオ電子顕微鏡法によって決定させることが可能である(図12;原子モデルのCryo-EMマップ及び座標は、pdb受託コード5FOJで寄託されている)。構造により、Nb23が、5倍軸の近傍でGFLVの表面にて結合することが明らかとなる(図12a及び図12b)。GFLV-Nb23再構築の外側等輪郭(isocontour)表面(図12a及び図12b)は、Nb23分子が、互いに十分離れて配置されて、ビリオン1個当たり、それらのうちの60個を結合させて、隣接CPを架橋することなく、完全な1:1の化学量論的な結合に達することが可能であることを示す。
【０１３４】
GFLV CP由来のVLPが、ウイルス粒子に類似して、Nb23の結合と適合しているかどうかを試験するために、動的光散乱法(dls)及びネイティブアガロースゲル電気泳動分析を実施した。dlsにより、TRCP VLP単独が、粒径32.0nm±2mm(平均値±SD)で単分散性である一方で、飽和濃度のNb23の存在下では、TRCP VLPの直径は、37.8±2nmに増加したことが明らかとなった(図13)。ネイティブゲル電気泳動により、TRCP VLPへのNb23の付加が、VLPの移動度の有意なシフトを誘導することが明らかとなり(図14レーン1〜レーン3)、本発明者等は、VLPへのNb23結合時に、各種粒子の正味の電荷密度及び質量の変化における結果と仮定する。まとめると、本発明者等の結果は、TPCR VLPが、Nb23で効率的に装飾することができることを実証する。それらはまた、Nb23エピトープが保存されることを明らかにし、TRCP VLP外側表面が、GFLV粒子の外側表面と構造的に同一であることを示唆する。
【０１３５】
VLPが、より大きな分子で装飾することができるかどうかを評価するために、TRCP VLPを、各モノマーに関しておよそ58kDaのホモ二量体タンパク質である、EGFP(27kDa)(配列番号20)に、又は細菌アルカリホスファターゼ(ALP)(配列番号21)に融合された精製Nb23の存在下でインキュベートして(Muller等、2011)、dls及びネイティブアガロースゲル電気泳動によって試験した。Nb23を用いた本発明者等のこれまでの結果と同様に、VLPのみかけの直径の有意な増加が、Nb23:GFP(43.8+/-2nm(平均値+/-SD、n=3))又はNb23ALP(40.0+/-2nm(平均値+/-SD、n=3))の存在下で観察された(図13)。本発明者等のdlsの結果によって示唆されるように、TRCP VLPへのNb23:GFP及びNb23ALPの効率的な結合と一致して、VLPの移動度における有意なシフトがまた、Nb23:GFP(図14レーン3〜レーン5)又はNb23ALP(図15)によるVLPの装飾時に観察された。これらの条件下で、ALPは、装飾されたVLPの特異的なFastRed染色によって見られるように、依然として酵素的に活性であった(図15)。
【０１３６】
最終的に、本発明者等は、VLP移動度におけるシフトが、増加量のNb23:GFPの付加時に徐々に増加したため、VLPへのNb23:GFP結合が飽和性であることを実証することができた(図16)。最大移動度シフトは、GFLV CPとNb23:GFPとの間のおよそ1:1の分子比で観察され、個々のVLP1個当たり最大60個のNb23:GFPの分子が結合され得ることを示唆した。蛍光画像化によるゲルの観察により、閉じ込められたTagRFP及び露出されたEGFPの両方が、依然として蛍光性であることが更に明らかとなり、Nb23媒介性結合活性が、後者のタンパク質の活性及び完全性に影響を及ぼさないことを実証した。
【０１３７】
まとめると、本発明者等の結果は、ナノボディが、GFLV CP由来のVLPの表面で外来タンパク質の効率的且つ迅速な表示を可能にすることを実証している。それらはまた、Nb23:GFP(42Kdaにほぼ等しい)及びNb23:ALP(そのモノマー形態では73Kdaにほぼ等しい)と同程度大きな分子が、活性を喪失することなく、VLPに結合することができることを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３８】
配列番号1:GFLVコートタンパク質アミノ酸配列
MGLAGRGVIYIPKDCQANRYLGTLNIRDMISDFKGVQYEKWITAGLVMPTFKIVIRLPANAFTGLTWVMSFDAYNRITSRITASADPVYTLSVPHWLIHHKLGTFSCEIDYGELCGHAMWFKSTTFESPRLHFTCLTGNNKELAADWQAVVELYAELEEATSFLGKPTLVFDPGVFNGKFQFLTCPPIFFDLTAVTALRSAGLTLGQVPMVGTTKVYNLNSTLVSCVLGMGGTVRGRVHICAPIFYSIVLWVVSEWNGTTMDWNELFKYPGVYVEEDGSFEVKIRSPYHRTPARLLAGQSQRDMSSLNFYAIAGPIAPSGETAQLPIVVQIDEIVRPDLSLPSFEDDYFVWVDFSEFTLDKEEIEIGSRFFDFTSNTCRVSMGENPFAAMIACHGLHSGVLDLKLQWSLNTEFGKSSGSVTITKLVGDKAMGLDGPSHVFAIQKLEGTTELLVGNFAGANPNTRFSLYSRWMAIKLDQAKSIKVLRVLCKPRPGFSFYGRTSFPV
配列番号2: TRSVコートタンパク質アミノ酸配列
MGGSWQEGTEAAYLGKVTCAKDAKGGTLLHTLDIIKECKSQNLLRYKEWQRQGFLHGKLRLRCFIPTNIFC
GHSMMCSLDAFGRYDSNVLGASFPVKLASLLPTEVISLADGPVVTWTFDIGRLCGHGLYYSEGAYARPKI
YFLVLSDNDVPAEADWQFTYQLLFEDHTFSNSFGAVPFITLPHIFNRLDIGYWRGPTEIDLTSTPAPNAY
RLLFGLSTVISGNMSTLNANQALLRFFQGSNGTLHGRIKKIGTALTTCSLLLSLRHKDASLTLETAYQRP
HYILADGQGAFSLPISTPHAATSFLEDMLRLEIFAIAGPFSPKDNKAKYQFMCYFDHIELVEGVPRTIAG
EQQFNWCSFRNFKIDDWKFEWPARLPDILDDKSEVLLRQHPLSLLISSTGFFTGRAIFVFQWGLNTTAGN
MKGSFSARLAFGKGVEEIEQTSTVQPLVGACEARIPVEFKTYTGYTTSGPPGSMEPYIYVRLTQAKLVDR
LSVNVILQEGFSFYGPSVKHFKKEVGTPSATLGTNNPVGRPPENVDTGGPGGQYAAALQAAQQAGKNPFG
RG
配列番号3: ArMVコートタンパク質アミノ酸配列
MGLAGRGSVQVPKDCQAGRYLKTLDLRDMVSGFSGIQYEKWITAGLVMPDFKVVIRYPANAFTGITWVMSF
DAYNRITSSITTTASPAYTLSVPHWLLHHKNGTTSCDIDYGELCGHAMWFNATTFESPKLHFTCLTGNNK
ELAADWEFVVELYAEFEAAKTFLGRPNFVYSADAFNGSFKFLTIPPLEYDLSTTSAYKSVSLLLGQTLID
GTHKVYNYNNTLLSYYLGIGGVVKGRVHICSPCTYGIVLRVVSEWNGVTNNWNQLFKYPGCYIGEDGNFE
IEIRSPYHRTPLRLLDAQAASAFTSTLNFYAISGPIAPSGETAKMPVVVQIDEIALPDLSVPSFPNDYFL
WVDFSAFTVDAEEYVIGSRFFDISSTTSTVHLGDNPFAHMIACHGLHHGILDLKLMWDLEGEFGKSSGGV
TITKLCGDKATGMDGASRVCALQNMGCETELYIGNFAGANPNSALSLYSRWLAIKLDKARSMKMLRILCK
PRGNFEFYGRTCFRV
配列番号4: TRSV2コートタンパク質アミノ酸配列
MAVTVVPDPTCCGTLSFKVPKDAKKGKHLGTFDIRQAIMEYGGLHSQEWCAKGIVNPTFTVRMHAPRNAFA
GLSIACTFDDYKRIDLPALGNECPPSEMFELPTKVFMLKDADVHEWQFNYGELTGHGLCNWANVVTQPTL
YFFVASTNQVTMAADWQCIVTMHVDMGPVIDRFELVPTMTWPIQLGDTFAIDRYYEAKEIKLDGSTSMLS
ISYNFGGPVKHSKKHAISYSRAVMSRNLGWSGTISGSVKSVSSLFCTASFVIFPWEHEAPPTLRQVLWGP
HQIMHGDGQFEIAIKTRLHSAATTEEGFGRLGILPLSGPIAPDAHVGSYEFIVHIDTWRPDSQVHPPMFS
SAELYNWFTLTNLKPDANTGVVNFDIPGYIHDFASKDATVTLASNPLSWLVAATGWHYGEVDLCISWPRS
KQAQAQEGSVSITTNYRDWGAYWQGQARIYDLRRTEAEIPIFLGSYAGATPSGALGKQNYVRISIVNAKD
IVALRVCLRPKSIKFWGRSATLF
配列番号5: CNSVコートタンパク質アミノ酸配列
MSAENFVFTQLITVPAASTKGNVLAGVDILANARTTMSGFYMRWLQKGYIDTNLKLICHLPRAPFAGMSFF
VLIDGTGYLAKDAPTSLNEEEILSYPLHLVTTSDVSSYEFVLDWHRYIGQVPFAEENAFLRPTLFLVACV
SSTLALSAKVEFYLEAQSVGEELPRTLAPSPVLSYPFQNSFLEDLDLFLPPKRLTLGERETTIIPLSFAK
SKKSGDAVLYSHAAARLAHFQGIGGVLHGVVYLVGSQLVASQSRISMWSKEQHIQHQAVNVHVDTDTGVA
FDLPIKDAFYASSVYGDSGAVIQVTCLCSPMSPNAIKAPFDMIFKIRGFTPDAPMCRTINFTQRFGWFAV
EPTTSTGAIKLKIWPVSNHLESEDMKVTGYTNAFLQMCQTSTMHFGSVIIHFSWTLFGGTTNAATAGGVV
TIAEGFGPEEENFRGHCRNLSIYEGRATVPLELGTFAGPTPLKKLDFKYRNWIRFTTPKGRNISSIFCAI
EVLPGFSFYGRTGSPRLSVVGTTVPPTADASTSNSQGGDMKILEINILLPWAGGEDEARVQDQAPLGLMF
LGIS
配列番号6: GBLVコートタンパク質アミノ酸配列
MGWCPKDATAGRVLEAINLREEIATGDNLVKYDWLAKGMIEPDMSVRLTVGQNPFVGISIGVCCDFSGRLA
QYYDGATAIPIEICNQLPNFVCPISERSVFVHKINMLLAGYNLFQTQKHFADPYILVYIIDTNTLSASDE
WGYTIELCVHSSVHTTQFARTPFLTLPGTFDGTLPLDLWRGPFSFKTGKSAPREERIGINFGSKRTYNSG
AKEFYSLPAAHIQLLQSVGGILHGSVIQTGSRAISCELYMILQPDKTANNLEQAVKLPGCRVPTGGGPFS
LRIQSAFLRSQIYETGVQLVIYALGGPLGAATISAPYQYMVHFSHITEEEGFVPRPIGTILEFNWATLAQ
LTLKDRFQIPARLSDLVIPGVSVHMRSNPLASIIGACGFFRGHVTFILQWSLNVEHVKPKTYMQVQTCVG
TFIPAPVKHSQILQSWVVPISQRFELRVPFDLVDYPGFNSSGGIGLDHMQPFIDIACGDFSQLEYFNINV
ELKPGFEIYGRSVTPLK
配列番号7: BRVコートタンパク質アミノ酸配列
MSGLVADTTLAFAKMYQCKKDAKAGHVLATIDIQECVFEDNRRVALDWLAHGLASFKYDLQLTVDSNPFVG
VTLGITVDAFDRLLPQISDEVIAVPLAFQLPTYLFPISKKGTFTQTIDFAAIAGYNFFPHVAAFGRPKII
VYIVSDNDLPASDTWMCLVELHMTRLESSTLACSPTLVLPQAFGGDLPLDLWRGPYTFPLGGGTKRLSTS
LDIGTSTTTVSGWRTVSFPAAYALFLQGHGGSLVGEVVHTGSAAVSCALHLCISFGGAPPTLEEALVFPG
FRLPSGEGKFHIKVQTPYGRLSTLTPDCALYVYLAGGPIAVAPMSVPYQFCIHLERLVDDGAPPRTIGLI
REFNWATINNFKSDDITFAIPARLSDLVLTCGDVTMSTNPLALLIGSCGFFRGNLTVVLEWATFLKAGDK
EGTVQLTTCRGMINNVKGVRNAIQKKVVNLSLVGSVSRYLNVGDFTGFAQSGGQVGYDEIFLEFSTNKAK
QIRYLNINVELDENFELYGRTIIPLKNTAPAFASTSASAPNES
配列番号8: BRSVコートタンパク質アミノ酸配列
MAGGSYAFGETIELPATVTPGTVLAVFNIFDKIQETNTKVCSKWLEQGYVSQNLTAISHLAPNAFSGIAIW
YIFDAYGKIPGDVTTTFELEMARSFDPHVQVLRDVSTSTWVIDFHKICGQTLNFSGQGYCVPKIWVIAAS
TFQLARSTATKFRLEFYTRGEKLVRGLAEQPLSYPIEARHLTDLNLMLAPKQIAVGTYAMITFPVSLAAK
LQSTSGRTAYSYAAGLLSHFLGVGGTIHFVVRTTSSAFVTSKLRIALWGTVPETDQLAQMPHVDVEVNVD
ASLQIQSPFFSTANFGNSGSAFYVSTLCAPMAPETVETGSEYYIQIKGIEANPGLCREINYKQRFAWCLL
ECLDNSKASPIKVKIPSRIGNLSSKHVKVTNFVNALAILCATTGMHHGNCTIHFSWLWHPAELGKQLGRL
KFVQGMGINNEHIGDTMCYNSLSNTHSVPFQFGSFAGPITSGGKADEAENWIEIQSPDFSWVASLHVSIE
VHEGFKFYGRSAGPLTIPATVADVSAVSGS
配列番号9: CPTR
MGLAGRGVIYIPKDCQANRYLGTLNIRDMISDFKGVQYEKWITAGLVMPTFKIVIRLPANAFTGLTWVMSFDAYNRITSRITASADPVYTLSVPHWLIHHKLGTFSCEIDYGELCGHAMWFKSTTFESPRLHFTCLTGNNKELAADWQAVVELYAELEEATSFLGKPTLVFDPGVFNGKFQFLTCPPIFFDLTAVTALRSAGLTLGQVPMVGTTKVYNLNSTLVSCVLGMGGTVRGRVHICAPIFYSIVLWVVSEWNGTTMDWNELFKYPGVYVEEDGSFEVKIRSPYHRTPARLLAGQSQRDMSSLNFYAIAGPIAPSGETAQLPIVVQIDEIVRPDLSLPSFEDDYFVWVDFSEFTLDKEEIEIGSRFFDFTSNTCRVSMGENPFAAMIACHGLHSGVLDLKLQWSLNTEFGKSSGSVTITKLVGDKAMGLDGPSHVFAIQKLEGTTELLVGNFAGANPNTRFSLYSRWMAIKLDQAKSIKVLRVLCKPRPGFSFYGRTSFPVGGGSGGGMSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN
太字:リンカー
下線:コートタンパク質
配列番号10: TRCP
MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLNGGGSGGGGLAGRGVIYIPKDCQANRYLGTLNIRDMISDFKGVQYEKWITAGLVMPTFKIVIRLPANAFTGLTWVMSFDAYNRITSRITASADPVYTLSVPHWLIHHKLGTFSCEIDYGELCGHAMWFKSTTFESPRLHFTCLTGNNKELAADWQAVVELYAELEEATSFLGKPTLVFDPGVFNGKFQFLTCPPIFFDLTAVTALRSAGLTLGQVPMVGTTKVYNLNSTLVSCVLGMGGTVRGRVHICAPIFYSIVLWVVSEWNGTTMDWNELFKYPGVYVEEDGSFEVKIRSPYHRTPARLLAGQSQRDMSSLNFYAIAGPIAPSGETAQLPIVVQIDEIVRPDLSLPSFEDDYFVWVDFSEFTLDKEEIEIGSRFFDFTSNTCRVSMGENPFAAMIACHGLHSGVLDLKLQWSLNTEFGKSSGSVTITKLVGDKAMGLDGPSHVFAIQKLEGTTELLVGNFAGANPNTRFSLYSRWMAIKLDQAKSIKVLRVLCKPRPGFSFYGRTSFPV
太字:リンカー
下線:コートタンパク質
配列番号11: CPEG
MGLAGRGVIYIPKDCQANRYLGTLNIRDMISDFKGVQYEKWITAGLVMPTFKIVIRLPANAFTGLTWVMSFDAYNRITSRITASADPVYTLSVPHWLIHHKLGTFSCEIDYGELCGHAMWFKSTTFESPRLHFTCLTGNNKELAADWQAVVELYAELEEATSFLGKPTLVFDPGVFNGKFQFLTCPPIFFDLTAVTALRSAGLTLGQVPMVGTTKVYNLNSTLVSCVLGMGGTVRGRVHICAPIFYSIVLWVVSEWNGTTMDWNELFKYPGVYVEEDGSFEVKIRSPYHRTPARLLAGQSQRDMSSLNFYAIAGPIAPSGETAQLPIVVQIDEIVRPDLSLPSFEDDYFVWVDFSEFTLDKEEIEIGSRFFDFTSNTCRVSMGENPFAAMIACHGLHSGVLDLKLQWSLNTEFGKSSGSVTITKLVGDKAMGLDGPSHVFAIQKLEGTTELLVGNFAGANPNTRFSLYSRWMAIKLDQAKSIKVLRVLCKPRPGFSFYGRTSFPVDPAFLYKVVRSFGPAMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKTS
太字:リンカー
下線:コートタンパク質
配列番号12: TR
MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHN
配列番号13: LINKER
DPAFLYKVVRSFGPA
配列番号14: Nb126
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Gly Tyr
Leu Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
Ala Ala Ile Asn Ser Val Arg His Thr Thr Ser Tyr Ala Asn Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Asp Asn Met Met Tyr
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Ala Ala Ala Asp Ala Ile Gly Leu Ala Glu Tyr Trp Ser Thr Pro Thr
Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
Val Ser Ser
配列番号15: Nb101
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Gly Tyr
Leu Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
Ala Ala Ile Asn Ser Val Arg His Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Asp Asn Met Met Tyr
Leu Glu Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Ala Ala Ala Asp Ala Ile Gly Leu Ala Glu Tyr Trp Ser Thr Pro Thr
Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
Val Ser Ser
配列番号16: Nb23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
Ser Leu Arg Val Ala Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Gly Tyr
Leu Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
Ala Ala Ile Asn Ser Lys Arg His Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Asp Asn Ile Met Tyr
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Ala Ala Ala Asp Ala Ile Gly Leu Ala Glu Tyr Trp Ser Thr Pro Thr
Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
Val Ser Ser
配列番号17: Nb75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Glu Tyr Pro Ser Ser Ser Thr
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
Ala Ala Ile Asn Ser Val Arg His Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Asp Asn Met Met Tyr
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Ala Ala Ala Asp Ala Ile Gly Leu Ala Glu Tyr Trp Ser Thr Pro Thr
Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
Val Ser Ser
配列番号18: Nb71
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Asp Val Pro Glu Asn Gly
Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
Ala Ala Ile Asn Ser Val Arg His Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Asp Asn Met Met Tyr
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Ala Ala Ala Asp Ala Ile Gly Leu Ala Glu Tyr Trp Ser Thr Pro Thr
Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
Val Ser Ser
配列番号19: TRCPEG
MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFPSNGPVMQKKTLGWEANTEMLYPADGGLEGRSDMALKLVGGGHLICNFKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDHRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLNGGGSGGGGLAGRGVIYIPKDCQANRYLGTLNIRDMISDFKGVQYEKWITAGLVMPTFKIVIRLPANAFTGLTWVMSFDAYNRITSRITASADPVYTLSVPHWLIHHKLGTFSCEIDYGELCGHAMWFKSTTFESPRLHFTCLTGNNKELAADWQAVVELYAELEEATSFLGKPTLVFDPGVFNGKFQFLTCPPIFFDLTAVTALRSAGLTLGQVPMVGTTKVYNLNSTLVSCVLGMGGTVRGRVHICAPIFYSIVLWVVSEWNGTTMDWNELFKYPGVYVEEDGSFEVKIRSPYHRTPARLLAGQSQRDMSSLNFYAIAGPIAPSGETAQLPIVVQIDEIVRPDLSLPSFEDDYFVWVDFSEFTLDKEEIEIGSRFFDFTSNTCRVSMGENPFAAMIACHGLHSGVLDLKLQWSLNTEFGKSSGSVTITKLVGDKAMGLDGPSHVFAIQKLEGTTELLVGNFAGANPNTRFSLYSRWMAIKLDQAKSIKVLRVLCKPRPGFSFYGRTSFPVDPAFLYKVVRSFGPAMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKTS
タンパク質質量  111.52キロダルトン。太字は、GFLVのCP。
配列番号20: Nb23EGFP
QVQLQESGGGSVQVGGSLRVACAASGDTFSGYLAAWFRQAPGKGREGVAAINSKRHTTSYADSVKGRFTISKDNADNIMYLEMNSLKPEDTAIYYCAAADAIGLAEYWSTPTLSAARYKYWGQGTQVTVSSGGGSGGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKTSHHHHHH
太字は、EGFPの配列。下線:Nb23
配列番号21: Nb23ALP
QVQLQESGGGSVQVGGSLRVACAASGDTFSGYLAAWFRQAPGKGREGVAAINSKRHTTSYADSVKGRFTISKDNADNIMYLEMNSLKPEDTAIYYCAAADAIGLAEYWSTPTLSAARYKYWGQGTQVTVSSGGGSGGGVKQSTIALALLPLLFTPVTKARTPEMPLQTQATSREEPPRLPSKHRPGVKTQATSREEPPRLPSKHRPGVKTQATSREEPPRLPSKHRPGVKTQATSREEPPRLPSKHRPGVKTQATSLEVLENRAAQGDITAPGGARRLTGDQTAALRDSLSDKPAKNIILLIGDGMGDSEITAARNYAEGAGGFFKGIDALPLTGQYTHYALNKKTGKPDYVTDSAASATAWSTGVKTYNGALGVDIHEKDHPTILEMAKAAGLATGNVSTAELQDATPAALVAHVTSRKCYGPSATSEKCPGNALEKGGKGSITEQLLNARADVTLGGGAKTFAETATAGEWQGKTLREQAQARGYQLVSDAASLNSVTEANQQKPLLGLFADGNMPVRWLGPKATYHGNIDKPAVTCTPNPQRNDSVPTLAQMTDKAIELLSKNEKGFFLQVEGASIDKQDHAANPCGQIGETVDLDEAVQRALEFAKKEGNTLVIVTADHAHASQIVAPDTKAPGLTQALNTKDGAVMVMSYGNSEEDSQEHTGSQLRIAAYGPHAAHHHHHH
太字は、ALPの配列。下線:Nb23
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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