(57)【要約】  真正で適応性のある体外微小循環モデルは、ゲルマトリックスに添加された天然の微小血管から成熟された天然の適応性のある微小血管系と、ゲルマトリックス中の犠牲成型により形成された内皮細胞ライニングされたかん流チャネルの３−Ｄプリントネットワークを統合することによってもたらされる。体外微小循環によって示される応答性血管適応は、生理学的に関連している。医薬用途、血管機構、および微小血管−実質的相互作用研究、ならびに組織工学用途のための血管新生戦略のための作成方法、装置、モデルおよび研究プラットフォームも開示される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な微小循環を備えた体外血管かん流装置において、
ゲルマトリックスを含む支持構造体と、
マイクロ流体内皮細胞でライニングされたチャネルで製作されたネットワークであって、入口チャネル、出口チャネル、および前記入口チャネルを前記出口チャネルに接続する少なくとも１つのクロスチャネルを含み、前記クロスチャネルは少なくとも部分的に前記ゲルマトリックス内に配置された、ネットワークと、
前記ネットワークと流体連通する入口ポート、および前記ネットワークと流体連通する出口ポートと、
新生血管系であって、前記ゲルマトリックスに組み込まれて成熟コンディションにさらされる無傷の天然微小血管に由来する、新生血管系と、を備え、
前記ネットワークは前記新生血管系と血管連通して適応性微小循環を形成する、体外血管かん流装置。
【請求項２】
筐体をさらに備えた、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記筐体が、アクリル、スチレンおよびカーボネートポリマーから選択される生体適合性プラスチックポリマーを含むハウジングを含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記ゲルマトリックスが、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記無傷の天然微小血管が脂肪組織から由来する、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記血管連通は、内皮細胞でライニングされたチャネルの前記ネットワークからのかん流駆動発芽、および少なくとも２つの発芽と前記新生血管系との間の吻合から形成される、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートは、前記筐体の外部で接近する、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
前記入口チャネルおよび前記少なくとも１つのクロスチャネルは、約１．１：１と約５：１との間の断面直径比を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
かん流時に前記クロスチャネル間に血流力学勾配が形成されるように、異なる断面直径を有する少なくとも２つのクロスチャネルを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１０】
前記入口ポートを通して前記ネットワークと動作可能に連通する外部かん流制御システムをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
「適応可能」は、少なくとも１つのかん流駆動の血流力または刺激に応じて、血管分化および／または陽性の血管リモデリングを受ける能力を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの血流力は、血管内圧およびせん断応力のうちの１つ以上である、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
生体細胞をさらに含み、前記細胞は、前記ゲルマトリックスを装着し、１つまたは複数の組織型に由来する、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記細胞が全て同じ組織型に由来する、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記ゲルマトリックスが、少なくとも２つのセクションを含み、各セクションに異なる組織型の細胞が装着された、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記生体細胞がヒト細胞を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１７】
前記生体細胞が、正常細胞、異常細胞、幹細胞、内皮細胞、間質細胞、上皮細胞、神経細胞、結合細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、腫瘍細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋細胞、脳細胞、腎細胞、および患者特有の細胞の１つまたは複数から選択される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
「適応可能」は、前記生体細胞によって提供される少なくとも１つのきっかけに応じて、血管リモデリングを受ける能力を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのきっかけが、かん流によって送達される薬剤に応じて、前記生体細胞によって提供される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
安定した適応可能な体外微小循環システムの製造方法において、
ａ）犠牲材料を用いて重合マトリックスゲル上にチャネルのネットワークを成型するステップであって、前記ネットワークは、少なくとも１つのかん流入口および流入チャネル、少なくとも１つのかん流出口および流出チャネル、および１つまたは複数のクロスチャネルを形成するように成型され、各クロスチャネルは流入チャネルおよび流出チャネルの両方と連通している、ステップと、
ｂ）無傷の天然微小血管の分離を重合性マトリックス内に組み込むステップと、
ｃ）ステップｂ）からの重合性マトリックスを成型チャネルの前記ネットワーク上に分配し、前記マトリックスを重合させて、成型チャネルの前記ネットワークおよび前記無傷の天然微小血管の両方を備えた連続重合ゲルマトリックスを形成するステップと、
ｄ）前記天然微小血管の分離物から新生血管系の自発成長を促進するのに適した条件下で前記ゲルマトリックスを培養するステップであって、前記培養は、選択的にステップｃ）の前または後に実行される、ステップと、
ｅ）前記成型ネットワークから前記犠牲材料を洗い流して、成型されたチャネルのネットワークを生じさせるステップと、
ｆ）成型された前記チャネルを内皮細胞でライニングして、内皮細胞がライニングされたチャネルの連続的なネットワークを形成するステップと、
ｇ）内皮細胞でライニングされたチャネルの前記ネットワークを、１つまたは複数の前記クロスチャネルから内皮発芽を誘導するのに十分なかん流液を有するかん流と、少なくとも２つの芽と前記新生血管系との間の吻合とにさらして、安定した適応可能な微小循環システムを形成するステップとを含む製造方法。
【請求項２１】
ｈ）前記微小循環システムを通るかん流液のかん流を調節することによって、前記微小循環を所望の循環外形に適合させるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記犠牲材料が熱可逆性プルロニックヒドロゲルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記かん流液は、血管由来の培養媒体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記「成型」するステップは、熱可逆性ヒドロゲルを含むバイオインクを３−Ｄバイオプリンティングすることによって達成され、完全に大気温度で実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記「分配」するステップは、ゲル化可能なマトリックスに懸濁された物無傷の天然微小血管の分離物を含むバイオインクを３−Ｄバイオプリンティングすることによって達成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記さらすステップ（ｇ）は、外部かん流制御を介して達成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記さらすステップ（ｇ）は、内皮の発芽を誘発するのに十分な前記少なくとも１つの入口チャネルと前記１つまたは複数のクロスチャネルとの間にせん断応力を付与するために、かん流血流力学を画定するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
付与されたせん断応力が１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の重合マトリックスゲルがチャンバ内に入れられ、ステップ（ｇ）に続いて、蓋が前記チャンバを覆って配置されてハウジングを形成し、前記ハウジングは、前記入口ポートおよび前記出口ポートを前記外部かん流制御装置に接続できるように構成された、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
全てのステップが単一の作業手順で達成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１３に記載の体外血管かん流装置を備えた、医薬品スクリーニング装置において、前記生体細胞が標的実質細胞を含む、医薬品スクリーニング装置。
【請求項３２】
前記標的実質細胞が、腎臓細胞、肝臓細胞、および心臓細胞のうちの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載のスクリーニング装置。
【請求項３３】
請求項３１に記載の装置を使用して標的薬剤の効能のために推定医薬品をスクリーニングする方法において、（１）制御かん流液と、（２）少なくとも１つの推定薬剤を含む試験かん流液とを配合し、適応微小循環を（１）でかん流し、適応微小循環を（２）でかん流し、その結果を比較して薬効を判定する、スクリーニング装置。
【請求項３４】
前記制御かん流液は、薬剤を含まないか、または既知の薬効を有する少なくとも１つの薬剤を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的実質細胞が心臓細胞を含み、前記推定薬剤が、心臓リモデリングを調節する有効性についてスクリーニングされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
体外血管かん流装置のシステムにおいて、直列または並列またはそれらの組み合わせでかん流可能に組み立てられる、請求項１３に記載の少なくとも２つの装置を含む、システム。
【請求項３７】
各装置は、異なる組織タイプに由来する生体細胞を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
生理学的に関連するかん流状態で安定した適合性微小循環を備えた、体外血管かん流装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
この出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて２０１５年６月６日に出願された米国仮出願番号６２／１８８，８０３号、および２０１６年１月１５日に出願された米国仮出願第６２／２７９０１９号の全ての開示を参照によりここに含む。
技術分野
技術分野は、高処理能力の積極的に適用可能な、薬学的スクリーニング／試験、組織および器官の作製、および移植、毒性スクリーニングの分野において、および刺激および状態の多様性に対する脈管構造の応答を調べるための特定の用途を有する、体外かん流微小循環装置を使用した生物医学的調査に広く関連する。
【背景技術】
【０００２】
有効な組織の作製は、組織構築物への統合された血管系の組み込みに依存する。脈管構造そのものは、独特であるが異なる生物学的要求を有する複雑な多細胞系である。単一の血管レベルでは、一般の構造は、壁が異なる細胞層から構成されている管を必要とし、その各々は血管に構造的および機能的特性を付与する。しかしながら、単一の血管は、血管ネットワークに組み込まれた場合にのみ組織かん流に効果的に寄与する。いずれかの血管ネットワークは、下流の分配および組織界面血管（微小血管系）に血液を送達および排出する、流出させる流入および流出する血管（動脈および静脈）を必要とする。
【０００３】
機能的で適応性のある微小循環を体外で確立および維持する能力は、幅広い生物医学的領域に著しく影響を与える可能性がある。組織置換の構築に関する事実上すべての議論において、組織構築物に組み込まれた微小脈管構造を有することの決定的な重要性が強調されている。細胞分析プラットフォームでは、標的柔組織細胞と組み合わせたかん流血管系の存在は、柔組織細胞のみを有する場合よりも分析の有用性を改善すると考えられる。機能的で適応性のある微小循環を有する体外でかん流された微小血管系モデルは、流れが血管形成にどのように影響するか、および微小血管壁およびネットワークのリモデリングの根底にある機構などの、微小血管形態および機能のメカニズムの研究を可能にする。創薬、血管疾患メカニクスの研究、および環境化学的毒性はすべて、生理学的微小循環機能および適応性を完全に再現する体外かん流微小血管系の開発により恩恵を受ける可能性のある分野である。
【０００４】
正式には、微小循環は、微小血管系を通る血液循環系である。重要なことに、有効な循環を支援することができる微小血管系は、流入（細動脈）、交換（毛細血管）および流出（小静脈）経路を形成するネットワークトポロジーを生成する異種血管タイプの適切に配置された階層ツリーからなる。ネットワークを構成する個々の微小血管は、内皮細胞だけでなく、様々な壁細胞から構成された複雑な構造であり、これらはすべて安定した適応可能な微小血管を形成するために必要である。様々な血流力学的きっかけに応じてネットワーク全体が適応して適切に再構築する能力は、全ての微小血管系に固有の必要な恒常的な活動であり、部分的に血流力を正常化するための血管の努力を反映すると考えられている（以下、「抵抗に基づく適応」と呼ぶ）。この能力は、内皮細胞の健康および機能の重要な決定因子である。従って、理想的な体外微小循環は、これらのコア微小血管活動を再現するために必要とされる全ての血管細胞からなるかん流された微小血管系である。
【０００５】
現在の技術革新の重要な目標は、真に適応可能な体外微小循環の生成である。生理学的に適切な割合の三次元組織を作り、維持するためには、ヒトの血管のネットワークが必要である。血管のようなかん流回路を作製するための初期の戦略の１つは、血管細胞を有する微小血管のような寸法（通常、直径６〜２００μｍ）の予め形成されたチャネルをライニングすることを含む。これらの「マイクロチャネル」を形成するための一般的なアプローチは、標準的なソフトリソグラフィーを用いて血管適合性マトリックスを２次元または３−Ｄチャネルに成形し、続いて内皮細胞（および場合によっては壁細胞）を並べる。この一般的な戦略は、マイクロ流体ベースの「血管が新生された」システムの一部として主に平行に内皮化されたチャネルを形成するために首尾よく使用されている。しかしながら、多くの点で、形成された「血管」は、固定されたネットワークトポロジーにおる固定された微小血管の寸法を有するチャネルのライニングされた壁だけである。（例えば、Ｓｔｒｏｏｃｋらの米国特許第８，６６３，６２５号参照。）結果として、（例えば、バイオチップ用途におけるような）内皮細胞でライニングされたかん流回路から利益を得る用途において有用であるが、このような血管系は、血流力学的変化および実質的要件に適応する能力が限られている。
【０００６】
近年、研究者のチームは代謝的に応答し適応性のある「生き生きとして活動的」な体外でかん流されたヒト毛細血管網を開発したと主張している。（「ジョージ」としてここで集合的に参照される、Ｇｅｏｒｇｅらにより２０１２年４月５日発行され、「Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅｓ  Ｐｅｒｆｕｓｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ」と題されたＵＳＳＮ  １３／２５３８２０、および、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｖｏｌ．１９、２０１３  ｐ１−８。）ジョージによれば、このシステムは、「毛細血管」を連続的なネットワークに自己集合させ、続いて隣接する流体チャネルと吻合して生理的流れおよびせん断速度でかん流可能な「生き生きとして活動的な」体外微小循環を形成するマトリックス、細胞、血管新生刺激をもたらす。しかしながら、ジョージの体外微小循環は、本来の真正微量循環ではない。ジョージ研究室では、播種された微小組織を介してマイクロ流体チャネルを互いに接続した細胞チューブに集められた培養された単一細胞を利用した。ジョージは、細胞管を「血管」と呼んでおり、管が再び向きを変えて吻合することを実証している。この程度まで、それらは毛細血管と異ならないが、複雑な、多細胞性の、多層性構造の天然細動脈または小静脈を有しておらず、したがって適切な抵抗に基づく適応または真の微小血管機能を示さない。
【０００７】
「微小循環」は、一般に形態学的に受け取られ、直径が１５０μｍ未満のすべての血管、すなわち、いくつかの小動脈、細動脈、毛細血管、および小静脈を包含する。各タイプの血管の複雑さおよび血液動態反応は独特である。毛細血管は、一般に、最も単純な血管であり、その直径は４〜１２μｍであり、その壁は、内皮細胞のみから構成され、各内皮細胞は、チューブの形態で巻かれ、毛細血管の１つのセグメントを構成する。一方、細動脈および小静脈は、多層体、複合体、細動脈であり、特に、抵抗に基づく適応的リモデリングに大きく関与する、より厚い筋原層を含む。各タイプの血管は、血行動態に異なって応答し、天然の微小循環には、必然的に３つのタイプすべてから構成される微小血管のネットワークが含まれる。体外での微小循環は、真に適応可能にするために、少なくともこれらの機能性を繰り返さなければならない。非常に多くの場合、ジョージの手順は未熟毛細血管のネットワークをもたらす。
【０００８】
確立された微小循環の原則は、未熟で機能不全の微小血管ネットワークは、適切なネットワークアーキテクチャ／局所解剖学を確立するために必要な要素が所定の位置にないため、最終的に単一の大きな口径の微小血管に分解されると言われている。微小循環術の技術者は、これを一般的に「シャント問題」と呼んでいる（Ｐｒｉｅｓら。Ｔｈｅ  ｓｈｕｎｔ  ｐｒｏｂｌｅｍ：ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｕｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌ．１０，  ２０１０年８月、５８７〜５９３頁）。
【０００９】
興味深いことに、単一のより大きな管のための微小血管系のこの還元的消失は、生理学的な流れパラメータに応じたジョージの「微小循環」によって示され、体外の「微小循環」が適応可能であるという証拠として提示された。微小循環適応の通常の部分は、実際にネットワークから無関係な新生血管を削除する能力である。しかし、この「剪定」の過多は、微小血管の希薄（毛細血管床の消失）をもたらし、機能不全の微小循環を反映する。ジョージの新生血管系には、血流力学的な力の変化に応じて血管の形態／直径を適応させる筋原性層である天然の壁層を有する血管は含まれていなかった。この能力がない場合、血管が損傷し、剪定が引き起こされる。微小循環適合性およびリモデリングは、様々な増殖因子、血流力学的力および血管健康状態の複雑で完全に理解されていない相互作用に依存する動的プロセスである。適応性のある正の外向きのリモデリングは、刺激およびストレスに対する反応性および代償性応答である。不適応性の内向きの収縮性のリモデリングは、最終的に、微小血管の狭小化および消失、およびその結果生じる微小循環の希薄をもたらす。ジョージは適応としての観察された希薄化の特徴付けにおいて技術的に正解であるが、微小循環の当業者はこの適応が不適切であり、限定された調査有用性の機能不全の不安定な体外の「微小循環」を反映することを認識する。
【００１０】
真に機能的な生理学的新血管形成を再現するためには、新しい血管要素の生成以上のものが必要である。生理学的血管形成には、血管誘導および血管吻合、血管成熟、剪定、Ａ−Ｖ規格、ネットワークパターン形成、構造適合、腸重積症、および微小血管安定化が必要である。新生血管リモデリングおよび適応のための付随する能力がなければ、単純で特殊でない血管セグメントのネットワークは、機能不全の微小循環を引き起こす。
【００１１】
移植のための微小循環の体内工学の場合、組織足場への内皮細胞単体（特にヒト内皮細胞）の組み込みが一度植え込まれると安定した微小血管系の形成を効果的にもたらさないことが、約２０年の研究によって立証された。設計されたシステムにおける追加の血管周囲細胞または前駆体、例えば平滑筋細胞、間葉平滑筋前駆細胞（例えば、１０Ｔ１／２細胞）、および／または組織間質細胞の存在は、血管新生を促進し、長期の微小血管安定性のために必要とされる。新しい安定微小血管セグメントが、血管形成（既存の血管からの新しい血管の形成）および血管新生（循環ネットワークの形成）を介して、マイクロ流体ネットワークに統合されることが以前に確立された。これは、おそらく、天然の微小血管構造を保持する、単離された無傷の微小血管セグメントの使用において最もよく強調されるであろう（Ｈｏｙｉｎｇらの、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌｓ．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ。１９９６；３２：４０９−４１９、その全開示は本明細書中に参考として援用される）を用いて、体内で成熟した機能的微小循環を迅速に形成する。Ｈｏｙｉｎｇらは後に、この微小血管構築物の移植に基づいた組織血管新生の実験モデルを開発し、特性決定した。このモデルは、受容者の宿主循環と急速に吻合し、生理学的血管形成、血管分化、およびネットワーク成熟を再現することが示された（Ｈｏｙｉｎｇらの、Ｒａｐｉｄ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ａｆｔｅｒ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ。２００４年５月；２４（５）：８９８−９０４、その全開示は本明細書中に参考として援用される）。これらの複合血管組織構築物中の脈管周囲細胞は新生血管形成に関連する複数の役割を果たすが、これらの細胞の重要な機能は新生血管安定性を維持することである。
【００１２】
生きた微小血管（例えば、細動脈、毛細血管、および小静脈）でかん流された体外の微小組織の成長を可能にする微小環境の作成は全く新しいパラダイムである。定義上、３−Ｄ組織は、２−Ｄ単層培養と比較して、栄養素および廃棄物の輸送の強化を必要とする。このような環境を作り出すための現状のアプローチには、１）輸送の様式としての分子拡散に依存しながら栄養素および廃棄物の濃度勾配を高めること、２）移流（強制対流）を強化するために組織内にマイクロチャネルを作り出すこと、および３）間質の流体の流れ、を含む。体内では、一旦溶質が毛細血管床を出ると、栄養素および廃棄物の拡散は輸送機構であり、一般に２５０μｍ未満の距離に限定される。輸送速度は、２点間の濃度差に比例し、距離に対して逆に関連する。したがって、酸素圧（間質組織の２０〜３０ｍｍＨｇと比較して室内空気は１６０ｍｍＨｇである）および他の栄養素（例えば、ブドウ糖）の濃度を単純に高めることによる、１〜１０ｍｍ程度の寸法を有する多数の３−Ｄ組織モデルが報告されている。明らかに、真に機能的で適応性のある微小循環の開発は、３−Ｄ組織および器官作製技術の進化における重要なステップである。
【００１３】
従って、移植時に機能的になる３−Ｄネットワークでの生体適合性微小血管を生成する能力は実証されているが、安定かつ適応可能な体外微小循環の開発はこれまで達成されていない。
【００１４】
安定して適切に適応可能であり、様々な下流の適用および継続的な調査の有効性のためのかん流または環境／栄養的操作を介して刺激／推定剤／力に供され得る、反復生理学的微小循環によって血管新生された体外かん流装置が今でも必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明者らは、犠牲的キャスティングおよびそれに続く内皮細胞によるライニングを介して、天然の無傷な微小血管系を用いて、かん流チャネルがプリントされたネットワークを統合することによって、機能的、安定的、および適切に適合する体外のかん流可能な微小循環を提供する。かん流条件下で、チャネルおよび天然の微小血管からの内皮の芽は、安定した微小循環を形成するようにを吻合する。得られた体外微小循環は、積極的に適応可能であり、組織工学のための微小血管の形態および機能、微小血管−柔組織相互作用、薬学的効果、および血管新生方策のメカニズムを調べるその後の研究を支持することができる。本明細書において用いられる「天然」は、生物から単離されたことを意味する。
【００１６】
一実施形態は、生理学的に関連するかん流状態で安定な適応性微小循環を含む血管新生体外かん流装置に関する。「適応可能」とは、血流力学的または環境的な刺激または状態に応じて、血管に適した適応的なリモデリングを経ることができることを意味する。「安定性」は、微小循環が、微小血管密度の自然発生的または不適切な減少を適切に適応させ、かつそれを経ないことを維持する能力を意味する。「生理学的に関連する状態」は、生きている生物学的条件を模倣するものである。
【００１７】
別の実施形態は、適応可能な微小循環を含む血管新生体外かん流装置１を提供し、該装置は、ゲルマトリックス３を含む支持構造２と、マイクロ流体内皮細胞がライニングされたチャネル４の作製されたネットワークとを含み、このネットワークは、入口チャネル５と、出口チャネル６と、入口チャネル５を出口チャネル６に接続する少なくとも１つのクロスチャネル７とであって、ゲルマトリックス３内に少なくとも部分的に配置された、クロスチャネル７と、ネットワーク４と流体連通する入口ポート８と、ネットワーク４と流体連通している出口ポート９と、新生血管１０であって、ゲルマトリックス３に組み込まれ、成熟条件に供された無傷の天然の微小血管１１に由来する、新生血管１０とを含み、ネットワーク４は、適応可能な微小循環を形成するために、新生血管１０と血管が繋がっている。いくつかの態様では、装置は、ゲルマトリックス３を占有し、１つまたは複数の組織タイプに由来する生きている細胞１６をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の装置の実施形態をシステム１７に組織化されて、装置を直列または並列またはそれらの組み合わせでかん流可能に組み立てられる。
【００１８】
別の実施形態は、安定した適応可能な体外の微小循環系の製造方法を対象としており、この方法は、ａ）少なくとも１つのかん流入口を形成するために、犠牲材料を用いて重合マトリックスゲル上にチャネルのネットワークを成型するステップてあって、ネットワークは、少なくとも１つのかん流入口ポートおよび入口チャネルと、少なくとも１つのかん流出口ポートおよび出口チャネルと、１つまたは複数のクロスチャネルとを含み、各クロスチャネルは、入口チャネルおよび出口チャネルの両方に連通している、ステップと、ｂ）無傷の天然微小血管の単離物を重合可能なマトリックス中に組み込むステップと、ｃ）ステップｂ）からの重合性マトリックスをキャストチャネルのネットワーク上に分配し、マトリックスを重合させてキャストチャネルのネットワークと無傷の天然性微小血管の両方を含む連続重合ゲルマトリックスを形成するステップと、ｄ）天然の微小血管単離物からの新生血管の自然発生的な成長を促進するのに適した条件下でゲルマトリックスをインキュベートするステップであって、インキュベートは、選択によりステップｃ）の前または後に行われる、ステップと、ｅ）成型ネットワークから犠牲材料を勢いよく流して、成形されたチャネルのネットワークを生じさせるステップと、ｆ）成形されたチャネルを内皮細胞でライニングして、内皮細胞がライニングされたチャネルの連続的なネットワークを形成するステップアップと、ｇ）内皮細胞でライニングされたネットワークにさらして、１つまたは複数のクロスチャネルからの内皮発芽を誘導するのに十分なかん流液でかん流し、少なくとも２つの芽と新生血管との間の吻合にさらし、それによって安定した適応可能な微小循環系を形成するステップとを含む。
【００１９】
他の実施形態は、生存細胞が標的実質細胞を含む、本発明の実施形態による血管新生体外かん流装置を含む医薬品スクリーニング装置に関する。本発明に係る装置の実施形態を用いた標的実質細胞推定のための薬剤の有効性をスクリーニングするための方法は、（１）制御かん流液、および（２）少なくとも１つの推定薬剤を含む試験かん流液、を配合するステップと、適応微小循環を（１）でかん流するステップと、適応微小循環を（２）でかん流するステップと、薬効を判定するためにその結果を比較するステップとを含む。
【００２０】
これらのおよび他の実施形態は、以下の図面および詳細な説明を参照することによって、明確になり、より容易に理解されるであろう。それにもかかわらず、図および詳細な説明は、例示的な目的のための特定の実施形態を開示するものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の全範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙＢｏｔ（商標）プラットフォーム上の３−Ｄプリンティング用に設定された、組織構造情報モデリング（ＴＳＩＭ）ソフトウェアで生成された体外かん流モジュール（ＩＰＭ）静的モデルを示すユーザーインターフェース。
【図２】ＴＳＩＭソフトウェアで生成された、ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙＢｏｔ（商標）プラットフォームでの３−Ｄプリンティング用に設定されたクロスチャネルによって画定されたゲルマトリックスのセクションの生体細胞と組織が装着されたＩＰＭを示すユーザーインターフェイス。
【図３】ＴＳＩＭソフトウェアで生成された、ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙＢｏｔ（商標）プラットフォーム上の３−Ｄプリンティング用に設定されたゲルマトリックス中の生体細胞と一体化した無傷の微小血管を示すＩＰＭを示すユーザーインターフェース。
【図４】内皮ライニングされたクロスチャネルおよび微小血管からの発芽の誘発を示す図。
【図５】制御されたかん流条件下での自己形成血管新生を示す図。
【図６】内皮細胞でライニングされたチャネルと芽の間の吻合を伴う微小血管との間の管腔の連続性の確立を示す図。
【図７】ゲルマトリックス中の生体細胞にかん流液を供給する成熟新生血管（微小循環）の図。
【図８】かん流液の流れ、生体細胞および／または組織型が装着されたゲルマトリックス部分内の適応可能な新生血管の流れを示す、３−Ｄプリンティング可能なＶＩＰＭ実施形態のユーザーインターフェース。
【図９】（生きた上皮細胞が装着された）腎臓ＩＰＭと直列な（生きた肝細胞が装着された）肝臓のＩＰＭを示す図。
【図１０】（生きた上皮細胞を移植したもの）腎臓と直列な（生きた肝細胞を装着した）肝臓ＶＩＰＭを示す図。
【図１１Ａ】内包された血管新生体外かん流モジュールの別の実施形態（ラダースタイル）を示す図
【図１１Ｂ】ＥＣにライニングされたチャネルからの芽と新生血管からの芽との間の接合を拡大して管腔の連続性を形成する。
【図１２Ａ】プリントされる例示的なチャネルシステムのデジタルプロトタイプを示す図。
【図１２Ｂ】プルロニックゲルを用いた３−Ｄプリンティングプロトタイプを示す図。
【図１２Ｃ】１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）のせん断応力を示すＴＳＩＭソフトウェアを使用して生成された特定のモデルのＣＡＤシミュレーションを示す図である。
【図１３Ａ】３−Ｄコラーゲン（暗い矢印）で培養された、単離された微小血管。
【図１３Ｂ】微小血管からの新生血管（白抜きの矢印）の発芽（暗い矢印）。
【図１３Ｃ】７日間で連続的な新生血管系が形成された。
【図１３Ｄ】移植後、画一的な微小循環が形成された（宿主循環を介したインク流し込みによって強調される）。
【図１４Ａ】ＥＣ−ライニングされたチャネル由来の芽（緑）と微小血管由来の芽（赤）との間の自然発生的な吻合を示す顕微鏡写真である。
【図１４Ｂ】Ａの吻合のときの拡大図である。
【図１４Ｃ】チャネルネットワークおよび新生血管を結合する吻合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
真正の自然の微小循環を体外で再現することにより、広範囲の研究（微小血管生物学）、臨床（再生医療）および商業（血管新生組織模倣物）活動が可能になる。限定されたリモデリング能力を有する細胞がライニングされたチャネルとは対照的に、真の微小循環は、周囲の実質とのかん流の必要性を適合させ、組織機能と一体化するように適合する。一般に、本開示は、「下流」の自然の自己形成新生血管にマイクロ流体プラットフォームで血管に接続された内皮細胞ライニングチャネルのネットワークを有する血管新生体外かん流装置を提供する。天然の新生血管は、単離された無傷の微小血管からの血管新生によって派生され、重合可能な生物学的ゲル内に形成される。新生血管は、かん流由来の血行力学的きっかけに応じて、自然発生的に真正な微小循環に成熟する。細胞でライニングされたチャネルネットワークは、外部のマイクロ流体制御システムに接続され、自然の新生血管に必要なかん流を提供し、その成熟を機能的で適応性のある体外微小循環に駆動および制御する。
【００２３】
したがって、本発明の実施形態は、生理学的に関連するかん流状態で安定な適応可能な微小循環を含む血管新生体外かん流装置、その装置の製造方法、および下流の用途に関する。
【００２４】
慣例により、天然の微小血管および／または血管新生微小循環を含まない体外かん流モジュールは、本明細書では「ＩＰＭ」と呼ばれるが、自然の微小血管および／または新血管微小循環を含む体外かん流モジュールは、本明細書では「ＶＩＰＭ」と呼ぶことができる。
【００２５】
マクロ血管および微小血管は血管壁の構造に大きな違いを示します。これらの構造的相違は、壁の組成の相違も反映する。すべての血管は内皮細胞（ＥＣ）の単一単層によってライニングされているが、血管壁の追加の層を構成する細胞の数およびタイプはかなり変化する。例えば、導管動脈は、平滑筋および間質細胞、エラスチンシート、および細胞外マトリックスの複数の周辺層を含む。微小血管は、細胞数がかなり少なく、マトリックス質量も少なく、壁細胞タイプの多くは特殊化されている。さらに、壁細胞層は細動脈のより筋肉質な、円周方向の平滑筋細胞から毛細血管のまばらに覆われた筋肉様の周皮細胞への表現型の連続体を表す。本研究者は、無傷の自然の微小血管を利用して新生血管系の形成をシードために、この天然の複雑さを利用する。
【００２６】
脈管構造の作製に一般的に使用される細胞ビルディングブロックは、様々な内皮細胞または内皮細胞前駆体（ＨＵＶＥＣが頻繁に使用されるが）および平滑筋細胞、周皮細胞、および間葉平滑筋前駆体などの壁／脈管周囲細胞を含む。内皮細胞（ＥＣ）に関しては、ＥＣの起源が重要であるとは思われない。導管ＥＣは微小血管に組み立てることができ、微小血管ＥＣは導管内の管腔内ライニングを確立することができる。内皮細胞（または内皮前駆細胞）は、初期の血管およびネットワーク構造を確立するために必要かつ十分である。最初の血管形成において必須ではないが、壁細胞の包含は、部分的に、未成熟血管を安定化することによって血管構築を容易にする。製造戦略の多くは、特に微小血管のために、３−Ｄ環境でより容易に起こる、血管に自己組織化するこれらの血管細胞の内因性の能力に依存する。この自己組織化能力は、内皮細胞に特異的な同型接着分子を介して細胞が同様の細胞と積極的に凝集するより一般的な挙動を反映すると思われる。また、血管製造における課題をかなり低減する。個々の細胞を血管壁内の特定の位置に配置する必要はないので、血管アセンブリおよびネットワーク形成が所定のパターン内で自発的に起こることを期待して、細胞を単純にパターニングする役割は軽減される。
【００２７】
犠牲的な３−Ｄプリンティングは、組織構築かん流のための内皮化されたマイクロ流体チャネルを形成するための比較的新しいアプローチを意味する。この技術は、チャネルを形成するための犠牲材料の使用を含む。正しいトポロジーでプリンティングされて、マトリックスに囲まれた後、これらの材料はシステムから流し出されて開いた導管を残し、続いて血管細胞で浄化される。ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙＢｏｔ（商標）３−Ｄプリンティングおよびロボットシステム（ケンタッキー州ルイビルのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣ）を使用して、天然の微小血管由来新生血管を外部かん流源に接続する手段として、犠牲的キャスティングアプローチを使用して、内皮細胞でライニングされたチャネルを作製する。犠牲チャネルを有する体外かん流モジュール（ＩＰＭ）は、チャネルを洗い流して、チャネル（犠牲材料の除去後に開放される）の壁および／または周囲のマトリックスの両方に目的の細胞を加えることによって、かん流可能で複雑な細胞ベースのアッセイの範囲を可能にするプラットフォームとして機能することができる。
【００２８】
近年、所望の微小血管ネットワークの成型物を形成するために硬化してガラスになる炭水化物溶液を直接分配することによって、チャネルは３−Ｄマトリックスで予め形成されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳら。「Ｒａｐｉｄ  ｃａｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ。  ２０１２  ９月；  １１（９）：７６８−７４、その全開示はこの参照により本明細書中に組み込まれる）。次いで、ガラスは溶解され、血管細胞で播種されて、かん流可能な血管細胞でライニングされたチャネルネットワークを形成される。正しいトポロジーで成型されてマトリックスによって包囲されると、これらの物質はその後システムから洗い出されて開いた導管を残し、続いて血管細胞で浄化される。この同じ犠牲的なアプローチを使用して、チャネル形成材料としてコラーゲンマトリックス中に配置されたパターン化プルロニックヒドロゲルを使用して移植可能な微小血管ネットワークを形成した。Ｈｏｏｐｅｒ  ＲＣらの「Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｍｉｃｒｏａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．  ２０１４  ５月１９日参照、その全開示は本明細書中に引用により援用される。この最も最近のアプローチでは、予め構築された微小血管系を、供給動脈および静脈への吻合付属物を介して宿主循環に組み込まれ、それによって、製造された血管系の即座のかん流をもたらす。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、適応微小循環を含む血管新生体外かん流装置１が提供される。この装置は、ゲルマトリックス３を含む支持構造体２と、マイクロ流体内皮細胞がライニングされたチャネル４の作製されたネットワークであって、入口チャネル５、出口チャネル６、および入口チャネル５を出口チャネル６に接続する少なくとも１つのクロスチャネル７を含み、クロスチャネル７はゲルマトリックス３内に少なくとも部分的に配置された、ネットワークと、ネットワーク４と流体連通する入口ポート８と、ネットワーク４と流体連通している出口ポート９と、新生血管系１０とを備え、この新生血管系は、ゲルマトリックス３に組み込まれ、成熟条件に供される無傷の天然微小血管１１に由来し、ネットワーク４は、新生血管１０と血管連通して適応性微小循環を形成する。いくつかの実施形態では、装置１は、筐体１２をさらに備えるが、装置１は、より一時的な性質のものとして構成されてもよく、または調査目的または観測目的のために筐体なしで取り付けられてもよい。筐体１２は、任意の適切な材料、例えば、プラスチック、から製造することができる。いくつかの実施形態では、筐体１２は剛性を有する透明な外側シェルを含む。装置を密封システムとして提供することが望ましく、筐体は、オープンシステムまたは密封システムのいずれかの装置により単一の作業手順でのバイオプリントによって直接製造することができる。特定の態様では、筐体は蓋を含むことができる。非常に特定の実施形態では、筐体は生体適合性プラスチックハウジングを備え、より具体的な実施形態では、プラスチックは透明プラスチックを含む。さらに特定の実施形態では、プラスチックは、アクリル、スチレン、およびカーボネートポリマープラスチックから選択され、非常に特定の実施形態では、プラスチックは透明ポリアクリレートを含む。特定の好適なブランドのポリアクリレートの非限定的な例としは、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ、Ｌｕｃｉｔｅ、Ｐｅｒｓｐｅｘ、Ｏｒｏｇｌａｓｓ、Ｏｐｔｉｘ、およびＡｌｔｕｇｌａｓｓのポリアクリレートプラスチックが含まれる。
【００３０】
特定の実施形態では、装置は、少なくとも１つの入口ポート８および少なくとも１つの出口ポート９を備えて構成され、すべてのポートが筐体１２の外部からアクセスされる。外部かん流制御システム１５は、入口および／または出口ポート８／９を介してネットワーク４と動作可能に連通することができる。特定の実施形態では、作動連通は入口ポート８を介して行われる。
【００３１】
特定の実施形態によれば、ゲルマトリックス３は、生物学的成長を維持する任意の適切な重合性ゲルを含む。より特定の実施形態では、ゲルは生物学的ゲルから選択される。非限定的な例としては、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、およびそれらの組み合わせが含まれる。非常に特定の実施形態では、ゲルマトリックスはコラーゲンゲルマトリックスである。いくつかの特定の実施形態では、無傷の天然微小血管は、脂肪、脳、膵島、および大網の１つまたは複数に由来する。非常に特定の実施形態では、無傷な天然微小血管１１は脂肪組織に由来し、さらにより具体的な実施形態では、無傷な天然微小血管はヒト脂肪組織に由来する。
【００３２】
内皮細胞にライニングされたチャネル４から新生血管１０へのかん流は、チャネル４および新生血管１０の両方からの内皮細胞芽１４との間の吻合１３を介して起こり、これによりチャネル４と新生血管１０との間の管腔の連続性が確立される。この未成熟新生血管系のその後の成熟は、制御された圧力またはシステムを横切る流れによって駆動される。機能的微小循環として機能するのは、チャネルネットワークによって供給された、この天然微小血管由来の微小血管系である。したがって、必要な血管連絡および管腔の連続性は、内皮細胞がライニングされたチャネル４のネットワークからのかん流駆動発芽および少なくとも２つの芽１４と新生血管１０との間の吻合１３から形成される。血管新生は、少なくとも１つのかん流駆動血行動態力または刺激に応じて血管分化および／または陽性血管リモデリングを受ける能力を示す場合、本開示に従って「適応可能」である。血管内圧およびせん断応力は、例えば、未成熟新生血管の静脈または細動脈への分化を駆動するように調節することができ、後者は一般に小径の抵抗血管を構成し、新生血管系を真正の適応微小循環に成熟させる。したがって、本発明の適応的微小循環の局面は、適応的な新生血管系から成熟させる。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、ゲルマトリックス３は、１つまたは複数の組織タイプに由来する生体細胞１６で満たされてもよい。一態様では、生存細胞をＩＰＭまたはＶＩＰＭでプリンティングし、様々な制御実験の下で研究することができる。顕微鏡スライドをセル構造に組み込んで、ＩＰＭダイナミクスのリアルタイムビューを可能にすることができる。ゲルマトリックス３は、１つの組織タイプ１８、または複数の組織タイプからの細胞で占められてもよく、またはマトリックスが少なくとも２つのセクション１７に分割され、各セクションがネットワーク４の少なくとも１つのクロスチャネル７と整列し、別個の組織タイプの細胞で占められる。非常に特定の実施形態では、生体細胞はヒトである。研究または薬物設計の必要性によれば、適切な生体細胞は、正常細胞、異常細胞、幹細胞、内皮細胞、間質細胞、上皮細胞、神経細胞、結合細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、腫瘍細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、脳細胞、腎臓細胞、および患者特有の細胞を含むが、これらに限定されない。これらのカテゴリーの細胞は相互に排他的ではなく、互いに実質的に重なり合っていても、または互いに包含していてもよいことが理解される。ゲルマトリックス３が生存細胞１６によって占められている場合、細胞は、体外微小循環における血管リモデリングを促進するきっかけをもたらし得る。
【００３４】
特定の一実施形態では、かん流流体は、特定の組織に由来する細胞に標的効果を有する推定医薬品を含む。効果の測定基準は、作用物質の存在に対する体外微小循環による適応するまたは不適応な応答の測定を含み得る。別の特定の実施形態では、かん流パラメータは、高血圧のような生理病理を再現するように定義され得、かん流液は、推定医薬品を含み得る。いくつかの実施形態によれば、生体細胞は、微小組織構築物の形態で提供され得る。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、ＩＰＭまたはＶＩＰＭは、標的実質細胞を含む生体細胞で占められた医薬品スクリーニング装置として構成される。特定の実施形態では、標的実質細胞は、腎臓細胞、肝細胞、および心臓細胞の１つ以上を含む。非常に特定の実施形態では、標的実質細胞は心臓細胞を含み、心臓リモデリングを調節する有効性について推定薬剤がスクリーニングされる。
【００３６】
標的医薬効力についての推定医薬品をスクリーニングするための方法も考えられる。いくつかの方法の実施形態によれば、（１）制御かん流液が処方され、（２）少なくとも１つの推定薬剤を含む試験かん流液が処方される。体外で適応可能な微小循環を対照かん流液でかん流され、同一または異なる体外適応性微小循環のいずれかが試験かん流液でかん流される。結果が比較されて薬効が決定される。「制御」かん流液は、薬剤を含まなくてもよく、または既知の薬効の薬剤を含んでいてもよい。
【００３７】
特定の実施形態では、１つまたは複数のＩＰＭおよびＶＩＰＭ（モジュールおよび装置という用語は、ＩＰＭおよびＶＩＰＭの実施形態を論じるときに交換可能に使用される）がリンクされてもよい。特定の実施形態では、２つ以上のモジュール／装置が、閉ループシステムにおいて同期してリンクされる。装置はまた、調査の必要性に基づいてリンケージ構成で組み立てられてもよく、直列または並列でまたはそれらの組み合わせでかん流可能に連結されてもよい。非常に特定の実施形態では、リンケージの各装置は、異なる組織タイプに由来する生体細胞を含む。例えば、図９および図１０は、肝臓ＩＰＭから腎臓ＩＰＭへの同期かん流可能な流れを例示する。
【００３８】
いくつかの特定の実施形態では、本発明によるＩＰＭおよびＶＩＰＭ装置は、特定の細胞構築物または細胞構成物の組み合わせの受注設計（ＥＴＯ）による顧客仕様、または、細胞構成物またはＶＩＰＭと特定の細胞構成物との並列および／または直列の統合による組み合わせから設計および構成されてもよい。これには、３−Ｄプリンティングされて組み立てられた内蔵型ＶＩＰＭアセンブリ、ウェルプレートに組み込まれたＶＩＰＭアセンブリ、および顕微鏡スライドにプリントされたＶＩＰＭアセンブリ等が含まれるが、これらに限定されない。下流の用途には、例えば、薬物の試験および発見への適用が含まれる。
【００３９】
他の特定の実施形態によれば、ＶＩＰＭ装置は、材料のキットおよび指示手順として提供されてもよい。エンドユーザーは、製造および組み立てのために、３−Ｄプリンタおよびロボットアセンブリプラットフォーム（適切なプラットフォームはＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙＢｏｔ（商標）ブランドのケンタッキー州ルイビルのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である）を所有または獲得することができる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態は、血流力学的および実質的なきっかけに適合することができる体外微小循環構造物を製造するための方法に関する。一般に、マイクロ流体プラットフォーム（図１）内の「下流」の天然の自己形成微小血管系との血管連絡における血管細胞がライニングされたチャネルのネットワークが構築される。血管新生チャネルネットワークは、外部マイクロ流体かん流支持体をより小さい内径の天然微小血管系に接続するのに役立つ。単離された無傷の微小血管由来のこの天然微小血管系は、完全に機能し適応性のある成熟微小循環を生成する。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、ａ）犠牲材料を用いて重合マトリックスゲル上にチャネルネットワークを成型するステップであって、前記ネットワークは、少なくとも１つのかん流入口および流入チャネル、少なくとも１つのかん流出口および流出チャネル、および１つまたは複数のクロスチャネルを形成するように成型され、各クロスチャネルは流入チャネルおよび流出チャネルの両方と連通している、ステップと、ｂ）無傷の天然微小血管の分離を重合性マトリックス内に組み込むステップと、ｃ）ステップｂ）からの重合性マトリックスを成型チャネルの前記ネットワーク上に分配し、前記マトリックスを重合させて、成型チャネルの前記ネットワークおよび前記無傷の天然微小血管の両方を備えた連続重合ゲルマトリックスを形成するステップと、ｄ）前記天然微小血管の分離物から新生血管系の自発成長を促進するのに適した条件下で前記ゲルマトリックスを培養するステップであって、前記培養は、選択的にステップｃ）の前または後に実行される、ステップと、ｅ）前記成型ネットワークから前記犠牲材料を洗い流して、形作られたチャネルのネットワークを生じさせるステップと、ｆ）形作られた前記チャネルを内皮細胞でライニングして、内皮細胞がライニングされたチャネルの連続的なネットワークを形成するステップと、ｇ）内皮細胞でライニングされたチャネルの前記ネットワークを、１つまたは複数の前記クロスチャネルから内皮発芽を誘導するのに十分なかん流液を有するかん流と、少なくとも２つの芽と前記新生血管系との間の吻合とにさらして、安定した適応可能な微小循環システムを形成する。特定の実施形態では、この方法はさらに微小循環システムを通るかん流液のかん流を調節することによって、微小循環を所望の循環外形に適合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、成型するステップは、熱可逆性ヒドロゲルを含むバイオインクを３−Ｄバイオプリンティングすることによって達成され、「分配するステップは、ゲル化可能なマトリックスに懸濁された無傷の天然微小血管の分離物を含むバイオインクを３−Ｄバイオプリンティングすることによって達成される。いくつかの実施形態では、さらすステップ（ｇ）は、内皮の発芽を誘発するのに十分な前記少なくとも１つの入口チャネルと前記１つまたは複数のクロスチャネルとの間にせん断応力を付与するために、かん流血行動態を画定するステップを含み、例えば、付与されたせん断応力が１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）以上である。
【００４２】
より具体的な実施形態では、マイクロ流体チャンバ内に熱可逆性ヒドロゲルの３−Ｄプリンティングを含む犠牲的成型方法を利用してマイクロチャネルネットワークを形成する。一旦プリントされると、プロトタイプのヒドロゲルネットワークは、体外で自発的に新生血管系を確立することができる血管形成性の単離された微小血管を含有する重合されていないコラーゲンで満たされる。コラーゲン重合の際に、プリントされたヒドロゲルは、微小血管含有コラーゲンを通って延びるネットワークチャネルを残してシステムから洗い流される。次いで、これらのチャネルに内皮細胞をライニングし、内皮細胞を規定のかん流条件を用いて周囲のコラーゲンに芽を出すように誘導する。チャネルから生じる内皮細胞芽は、微小血管に由来する相互接続された新生血管と吻合し、それにより、チャネルと天然の新生血管系との間の管腔の連続性を確立する。この未成熟新生血管系のその後の成熟は、制御された圧力またはシステムを横切る流れによって駆動される。これは、機能的な体外微小循環として機能するチャネルネットワークによって供給される、この天然の微小血管由来の微小血管系である。
【００４３】
単離された微小血管は自然発生的に血管新生を受けて新生血管を形成し、各新生血管と吻合して血管新生ネットワークを形成する。３−Ｄプリンティングと組み合わせた犠牲的キャスティングアプローチを使用して、内皮細胞がライニングされたチャネルのネットワークが、マイクロ流体プラットフォーム内の微小血管由来の新生血管系に非常に近似して確立される。マイクロ流体チャネルをライニングする内皮細胞の芽は、ゲルマトリックス／コラーゲン内の隣接する血管新生ネットワークと吻合し、それにより、新生血管系と連続したかん流経路を形成する。特定の実施形態では、プリントされたときに形状を保持するのに十分な粘度を有する（すなわちゲルである）が、次いで重合されたコラーゲンから洗い流すために溶解することができ（すなわちゾルである）、それによりチャネルを残すことのできる、ブレンドされた熱可逆性ヒドロゲル（ＮＩＰＡｍミクロゲルがドープされたプルロニック１２７）。内皮細胞の発芽および血管新生を、それぞれチャネルおよび天然の微小血管ネットワークにおいて操作することによって、吻合が促進され、誘導される。
【００４４】
新たに形成された微小血管系の成熟には、血流力学的な流れおよび圧力のきっかけが必要である。個々の微小血管の構造的改造を介して変化するかん流のニーズを満たすための組織における微小循環の適応は、これらの同様の血流力学的な力に依存する。構築された内皮細胞でライニングされたチャネルネットワークの単離された微小血管由来の天然の微小血管系へのかん流から生成された血流力学的きっかけは、機能的微小循環のトポロジーを変化させる。このことの意味は、異なるかん流の手順が、異なるトポロジーおよび特徴を有する微小循環をもたらす構造的適応を誘導することである。いくつかの実施形態によれば、マイクロ流体プラットフォーム内の血流力学的手順は、２部の血管系の成熟を促進するように調節される。実験には、計算流体力学モデリング、リアルタイム共焦点イメージング、血管形態計測、および血流力学測定を組み合わせて結果を評価する。かん流された体外微小血管ネットワークが確立され、体外微小循環における血流力学−血管ネットワークリモデリングの関係の探索が可能になる。重要なことには、成熟微小循環を駆動するのに必要な細胞型の全てが、微小血管単離物と共に存在する。
【００４５】
本発明の単離された微小血管システムの実施形態は、多数の血管形成方法を可能にし、科学的および翻訳上の課題に対する革新的な解決策を提供する。現在の研究者の知る限りでは、これは、天然の生理学的微小循環に対する機能的忠実度性を示すため、最初の真正な体外微小循環である。
【００４６】
血管新生、間質細胞および血管前駆体挙動、血管新生−組織生体力学、新生血管の挙動を評価するためのイメージング様式、血管形成後の微小血管の成熟およびパターニング、前臨床治療用途の研究のために、脂肪（ラット、マウス、およびヒト）から単離された無傷の微小血管が従来から利用されている。重要なことに、無傷の様々な直径の細動脈、毛細血管、および細静脈の異種の集まり（すなわち、天然の微小血管に存在するすべての必要な血管細胞が保持される）である微小血管単離物は、例えばコラーゲンゲル中で、培養した場合に約７日間にわたって、形成された管腔（または新生血管系）を有する未成熟新生血管の密接に相互接続されたネットワークを自然に生じさせる（図２）。本発明者らは以前に、体内に移植された場合に、この同じコラーゲン内の微小血管分離株が進行して成熟微小循環を形成することを示した（図２）。新生血管は、他の脈管構造（すなわち、宿主循環等）と自発的に吻合し、それによりインプラントのかん流をもたらす。驚くべきことに、本発明者らは、培養におけるこれらの新生血管の注意深く調節された血管内かん流が新生血管の熟成を促進し、体外で真の微小循環の誘導を可能にすることを立証した。
【００４７】
ヒドロゲル中のかん流可能な内皮化微小血管ネットワークのユーザに定義された形状を形成するための詳細な手順は、ＭｏｒｇａｎらのＦｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｖｏｌ．８、Ｎｏ．９  ２０１３、ｐｐ  １８２０−１８３６に記載されている。
【００４８】
３−Ｄプリンティング法は、本発明の装置の必要な微細構造および正確な配置要求のための理想的な製造手段をもたらすのに十分な進化を遂げている。定義された３−Ｄ構造における生体適合性ヒドロゲルの直接書き込み堆積の改良は、過去１０年間にわたって直接書き込みプリンタ技術と共同発展してきた。３−Ｄバイオプリンティングプラットフォームの精度および耐性の利点および作業流動性を利用して、犠牲的成型によってチャネルを製造する方法が知られている。（Ｍｉｌｌｅｒらの、Ｒａｐｉｄ  ｃａｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｅｔｅｎｄｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １１、７６８−７７４（２０１２）およびＬｅｗｉｓ、Ｊ．らの国際公開第ＷＯ２０１５０６９６１９Ａ１号）。前者によれば、マイクロチャネルは、軟質マトリックス内に所望の微小血管ネットワークの成型物を形成するためにガラス中に硬化する炭水化物シロップを直接分注することによって３−Ｄマトリックス中に予め形成されている。次いで、ガラスを溶解し、血管細胞で播種して、かん流可能な血管細胞にライニングされたマイクロチャネルネットワークを形成させる。正しいトポロジーで成型され、マトリックスによって包囲されると、これらの物質はその後システムから洗い流されて開いた導管を残し、続いて血管細胞で浄化される。しかし、この方法の１つの欠点は、シュガーシロップを加熱する必要性によって必要とされる作業手順の複雑さの増大である。この欠点は、メタクリル化ゼラチンを加熱して光硬化させることによる後者の方法と共通する。驚くべきことに、例えば、ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙＢｏｔ（商標）３−Ｄプリンティングシステムプラットフォーム（ケンタッキー州ルイビルのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣから入手可能）におけるプルロニックを犠牲材料として利用することによって、プリンタ上の特殊な加熱および冷却ツールを排除することができた。これは、フィブリンまたはコラーゲンゲルを使用することと組み合わせて、犠牲的チャネルを一定量の非重合性マトリックス（細胞なども含むこともできる）に直接プリンティングすることを可能にし、作業手順の複雑さを実質的に低減して製作の最初から最後まで単一の手順を可能にし、または、作製されたＩＰＭ／ＶＩＰＭ装置による結果のタイミングおよび制御された実験および生成／測定／分析を含む任意の下流のエンドポイントに適用され得る。特定の実施形態では、移植可能な微小血管ネットワークは、チャネル形成材料としてコラーゲンマトリックス中に配置されたパターン化されたプルロニックヒドロゲルを使用して形成される。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、天然の微小血管由来の新生血管を外部かん流源に接続するための手段として、犠牲的成型アプローチを使用して、内皮細胞がライニングされたチャネルを作製するために３−Ｄプリンティング溶液が使用される。
【００５０】
移植された新生血管系の血管内かん流は、その後の成熟および体外の微小循環の形成に重要である。通常、血管新生インプラントのように、血管新生から機能的微小循環への移行は、新生血管の機能的な血管タイプ（すなわち細動脈、毛細血管、および細静脈）への分化およびこれらの血管の血管樹への組織化を含む。ネットワーク成熟／リモデリングが起こる主な手段は、個々の血管セグメントの構造的適応によるものである。血行動態は、これらの構造変化を引き起こす重要な役割を果たす。したがって、体外システムにおける微小血管由来の新生血管構造のかん流は、新生血管および新生血管ネットワークを成熟させ、同時に、下流の用途のために安定した微小循環を確立する。
【００５１】
３−ＤコラーゲンＩゲルに埋め込まれた無傷の微小血管は、新生血管リモデリングに至る血管新生で始まる別個の血管相を介して進行することによって生きている宿主に移植されたときに新しい微小循環を生成することができ、続いて血管およびネットワークを血流に依存するように成熟させる（図３）。培養では、単離した微小血管は血管新生を経て血管新生ネットワークを形成するが（図２参照）、管腔のかん流がないため、さらに成熟はしない。驚くべきことに、定義されたかん流の際に、体外の新生血管ネットワークは、体内で起こるように、体外で成熟して微小循環を確立する。新生血管の平均直径は約１０μｍであり、これらの新生血管の管腔への流体の流れを外部のかん流システムから直接伝達することは困難である。しかし、内皮細胞でライニングされたマイクロ流体チャネルの構築されたネットワークを介して新生血管形成コラーゲン内で１〜２ミリメートルの直径から１ミリメートル未満の直径まで徐々に流路をステップダウンさせることによって、新生血管への規定されたかん流を確立することができる。
【００５２】
内皮細胞にライニングされたマイクロ流体チャネルは、天然の微小血管由来の新生血管系への中間かん流経路として構成されている（図１参照）。チャネルネットワークは、多くの代替設計で構成することができる。それは、各ブランチのオーダーが２ｍｍから最終チャネル直径２００μｍまで減少する階層ツリーとして構成することができる。この配置は、直径が小さく、流量が少なく流出側に流れ出るチャネルの「遠位」セグメントに通じる流入側が存在するように複製される。チャネル直径における段階的な減少（および流出側での対応する増加）は、１）直径２００μｍまでの最小のチャネルセグメントは、天然の血管樹における栄養動脈に類似している、２）典型的なマイクロ流体流速については、最小セグメントで１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）までである、３）、各ブランチの直径は親チャネルの直径の３／５までである（ここでも元の血管樹に類似）。天然の新生血管（２００μｍチャネル）と吻合する内皮細胞芽を産生することを意図したセグメント中のチャネルは、チャネルとそれに接続されている新生血管との間で直径差（従って圧力降下）をあまり大きく生成しないように内径が十分に小さいことが望ましい。また、発芽を誘発するのに十分なチャネルをライニングする内皮細胞に流体せん断応力を発生させる直径である必要がある。内皮細胞がコラーゲンゲル表面をライニングした類似の配置では、内皮を横切る１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）の壁せん断応力が内皮細胞を発芽させてコラーゲンに侵入させた。これらの初期境界パラメータを単に入力することによってチャネルネットワークの３−Ｄモデルを生成するためのアルゴリズムが開発されている。このモデルを使用して、直接書き込みプリンタにネットワークを作成するよう指示する（図５）。
【００５３】
特定の実施形態によれば、入口チャネルおよび少なくとも１つのクロスチャネルは、約１．１：１と約５：１との間の断面直径比を有する。ネットワークは、異なる断面直径を有する少なくとも２つのクロスチャネルで構成されて、血流力学勾配が、かん流時にクロスチャネル間に形成されるようにすることができる。他の特定の実施形態では、ネットワークの構成は、微小循環にわたって生理学的抵抗パターンを複製することを意図している。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の実施形態の特定の特徴および態様を例示するものであり、特許請求の範囲によって規定される本発明の全範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
例
以下の実施例は、体外でかん流された天然の微小血管系の作製を記載する。
【００５５】
実施例１．
この実施例は、マイクロ流体チャンバ内の天然の微小血管由来の新生血管のネットワークに接続された内皮細胞がライニングされたチャネルのシステムの開発を説明する。非常に特殊なプリントされたチャネルネットワーク構成が図示されているが、代替の分岐的設計が特定の用途に採用されてもよい。さらに、より密接に生理学的脈管構造を模倣するために、丸みを帯びたチャネル接合部および不等なクロスチャネルを組み込んだ設計が考えられる。手順の詳細を提供するためにいくつかの学術刊行物が引用されており、すべての引用された刊行物の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、置換が予測可能な結果で経験的に検証されている代替の態様について言及されている。しかし、示された代替手段は、均等物の網羅的なものであると考えられるべきではない。
【００５６】
１．  ２４ウェルプレートのウェル内で、ＡＳＬＳ  ＴＳＩＭ（商標）ソフトウェア環境で所望のチャネルネットワークをプロトタイプ化され、各分岐順序は異なる直径を有する。この特定の例では、周囲の新生血管系との吻合を可能にすることを意図した、より小さい「遠位」チャネル（２００μｍまで）の供給チャネル（４００μｍまでのＯＤ）のかん流を支援する「ラダー」設計（図５）がプリントされる。
【００５７】
重合したコラーゲンの床（またはフィブリン；微小血管はいずれかの３−Ｄマトリックスで良好に増殖する）上に、所望のリザーバ／ポートを有するチャネルネットワークが、
ＰＢＳ（または軟質ＵＬＣ  ＮＩＰＡｍミクロゲルの高密度懸濁液；プルロニック（ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体ポリマー）は、室温およびより高温のゲルであり、１０〜１２℃未満のゾルであるが、ＵＬＣ  ｐＮＩＰＡｍミクロゲル（超低架橋ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、室温およびそれより低いときはゲル状（膨潤）であるが、３３℃より高いときに懸濁状態のナノ粒子（脱膨潤、ゾル状）である。重大なことには、いずれもプリンティング条件（室温）の温度のジェルであり、プリントされたときに形状を保持するのに十分な粘度を有する。）中の熱可逆性プルロニックＦ１２７を含む異なるカートリッジを用いて室温でプリントされ、（ケンタッキー州ルイビルのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な、１つのプリントで複数のカートリッジを利用することができる統合された独自のソフトウェア／プリンティング／ロボットプラットフォームを使用して）所望の直径に適合するサイズの針に嵌められる。調製された低温ｐＨ中和化された非重合コラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）（または、上述のように、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（ＣｈａｎｇらによるＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１０；１６（３）：７９５−８０５；ＮｕｎｅｓらによるＭｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ。２０１０；１７（７）：５５７−６７；ＮｕｎｅｓらＭｉｃｒｏｖａｓｃＲｅｓ．２０１０；７９（１）：１０−２０；ＥｄｇａｒらによるＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４；９（１）：ｅ８５１７８；ＮｕｎｅｓらによるＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．６（１１）：ｅ２７３３２）を含む無血清培地を用いて準備された約４０，０００個のヒト微小血管／ｍｌを含有する室温フィブリノゲン／トロンビン溶液（Ｓｔａｂｅｎｆｅｌｄｔ  ＳＥらのＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１２；３３（２）：５３５−４４）を使用し、最も狭いチャネルを含むチャネルネットワークのセグメントをカバーする目的で、３−Ｄプリンタを使用してプリントされたチャネルネットワーク上に分注される（図６；また、ＣＡＤ中の赤色チャネル、および図５のプリントされたネットワークにおける青色チャネル）。この配置は、成長しつつある新生血管および発芽内皮細胞を互いに近似して近づけさせる。ネットワークの残りは、微小血管無しのコラーゲンで覆われている。
【００５８】
２．  システム全体を３７℃で３０分以上加熱してコラーゲン（またはフィブリン）を重合させる。プルロニックチャネルを用いると、これはそれらをよりゲル様に固める。ＮＩＰＡｍミクロゲルを用いると、この脱膨化により、より流動的にし、従って、システムから洗い流すのが容易になる。プルロニック／コラーゲンの組み合わせを用いると、それらを４℃で置いて洗い流す必要がある（マイクロベッセルを冷却してもそれらを傷つけることはない）。
【００５９】
３．  一旦重合されると、マイクロ流体チャンバ（ウェル壁によって画定される）は、チャネルネットワークのプルロニックポートの各々と整列したアクセスポートを含む（ＰＤＭＳから先に構築された）カスタマイズされた蓋に嵌められる。
【００６０】
４．  かん流チューブを挿入し、蓋で密封する。次いで、ステージを４℃で１５分間冷却してプルロニックゲルを可溶化し（これは微小血管を傷つけることはない）、このプルロニックゲルは次に、コラーゲン中のプルロニックチャネルについて他の人によって示されたように（Ｈｏｏｐｅｒら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．  ２０１４）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を１つのポートを通して押して他のポートから出されて、システムから洗い流される。
【００６１】
５．  一旦洗い流されると、本特許チャネルを通してＭ１９９に２０％ｆｂｓ付加および内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）中の５×１０６／ｍｌの低中通過したＨＵＶＥＣ（または微小血管内皮細胞）の懸濁液を、本特許チャネルを通してかん流することによりチャネル壁は内皮化される。約２０μＬの細胞懸濁液が、１つのポートを介してチャネルネットワークに送達され、マイクロ流体力を介してネットワークに送達される。
【００６２】
６．  次いでシステムを６０分間インキュベートする。３７℃でＣＯ２インキュベータ中でのＥＣ付着を促進し、続いて５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２０ｎｇ／ｍｌヒトホロトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌインスリン、１７．１ｎｇ／ｍｌオレイン酸ナトリウム、および０．０２ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（Ｈｏｏｐｅｒら。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ、２０１４）を含むＭ１９９からなる無血清培地で（約０／０．１Ｐａ（０／１ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）の壁せん断応力を生じる）低流速でチャネルを通したかん流により３日間培養してチャネル壁上に完全な単層を確立した。
【００６３】
７．  ４日目に、１μＭのＳ１Ｐをかん流液に加え、ＥＣ発芽を誘導するために最も狭いチャネルセグメントで１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）を生成するように流速を上げる（Ｋａｎｇら。ＡｍＪ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ。２００８；２９５（５）：Ｈ２０８７−Ｈ９７）。
【００６４】
８．  選択された時間に、システムを、ＦＩＴＣに結合したＵＥＡ−１レクチンでかん流してすべての内皮細胞にラベル付けし、続いて２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳでかん流して特性決定のためにシステムを固定する。
【００６５】
適切な温度変化の際に良好な洗い流し特性を有するプリンティングおよびコラーゲン重合の間に、剛性チャネルキャストを形成するために、ある範囲のプルロニックＦ１２７ヒドロゲル（１５，２０、および２８％ｗ／ｖ）が考慮される。Ｓ１Ｐおよび１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）は、チャネル壁からの内皮細胞の発芽を誘導する。新生血管は、最小培地中の単離された微小血管から自発的に発芽して成長する。いくつかの実施形態では、これを促進するために、血管新生因子に富む培地が使用される。本発明者らは、以前に、ちょうどチャネルを通る培養培地のかん流が微小血管による血管新生を支持するのに十分であることを実証した（Ｃｈａｎｇら。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１０；１６（３）：７９５−８０５）。ＨＵＶＥＣは、レンチウイルスを用いて構成的ＲＦＰレポーターカセットでトランスフェクトされる。微小血管は、選択的脂肪吸引手術後に廃棄されたヒト脂肪の脂肪吸引物から単離される。ＣｏｒＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（商標）マイクロ流体ポンプは、規定された流量でチャンバを連続的に流れるように使用されます。ＡＳＬＳ  ３−Ｄプリンタ（ケンタッキー州ルイビル）は、材料が混ざることなく、幅５０ミクロン、間隔２０ミクロンの狭い材料のラインをプリントすることができます。システム全体は、倒立顕微鏡を用いた相または落射蛍光顕微鏡法を介してすべての局面を視覚化することができるように設計されている。
【００６６】
評価および査定。
印刷されたチャネルキャストは、位相差顕微鏡法によって視認可能であり、また好ましくは、食用着色料または蛍光染料でドープすることができる。内皮化されたチャネルおよび新生血管系は、１０日間にわたってレポータを用いて落射蛍光および共焦点顕微鏡によって視覚化される。流路の接続性は、かん流システムを介して送達され、上記のように画像化された蛍光（遠赤色）デキストラン（３００万ＭＷ）を用いて評価される。特定の時点で、固定されたＶＩＰＭ全体が、ルイビル大学の顕微鏡検査コアを介して共焦点顕微鏡法によって検査される。全チャネルおよび新生血管の長さの密度は、内皮細胞の変化および新生血管の成長の程度を決定するために、チャネルの内皮細胞被覆を確立した後、４、７、または１０日後に取得したステッチングした共焦点画像スタックから測定する。さらに、新生血管長の密度の関数としての赤色（ＲＦＰ）／緑色（ＵＥＡ−１）ＥＣ−新生血管分岐部の数を数えて、吻合する頻度を評価する。
【００６７】
結果。
体外でかん流された新生血管系が生成される。脂肪および微小血管検査キットから単離した微小血管は、Ａｎｇｉｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。Ａｎｇｉｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．は、ルイビル大学との合意により、地元の形成外科医から脱識別され、廃棄された吸引脂肪を得る。予備研究では、新生血管の端部の吻合が多く、チャネルＥＣの新生血管の接続が比較的少ないことを示しています。しかしながら、本発明者らは、新生血管系の成熟を促進するためには、ほんの数回の吻合が必要であることを見つけ出した。これは、血管由来の新生血管自体がすでに相互に連結して連続した管腔のネットワークを形成しているためである。したがって、新生血管系の１つまたは２つのセグメントにかん流がいったん生じると、新生血管系全体に流れが直ちに分配され、成熟が開始される。播種された微小血管の密度および血管由来因子のかん流培地への添加は、必要に応じてより大きな発芽を誘導するように変化させることができる。最初の結果に基づいて、異なるチャネル構成が吻合の可能性に影響を及ぼし、クロスチャネル（遠位チャネル）の数を増加させると、吻合の可能性が増加する。流れ機構は、流入および流出経路設計の構成によって最適化することができる。最適な構成は、経験的に決定される。ＡＳＬＳ独自の統合ソフトウェア／プリンティング／ロボットプラットフォームにより、迅速な試作とテストが可能である。別のゲルおよびゲルブレンドが探究されている。いくつかの実施形態によれば、１０以下のプルロニックを含有するゼラチン／プルロニックが利用される。他の実施形態では、ゲルは、ＮＩＰＡＭミクロゲルがドーピングされたプルロニック（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）を含む。非常に特定の実施形態では、ゲルは、室温およびそれ以下ではゲル状（膨潤）であるが、３３℃以上で懸濁したナノ粒子（脱膨潤、ゾル状）である、柔らかいＵＬＣ  ＮＩＰＡｍミクロゲル（極低架橋ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミドナノ粒子））を含む（Ｂｒｏｗｎら。ＬＩＤ−１０．１０３８／ｎｍａｔ４０６６  ［ｄｏｉ］（１４７６−１１２２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）、およびＧａｎら。（０００２−７８６３（出版中））。重要なことに、両方とも室温でゲルであり、プリント時に形状を保持するのに十分な粘度を有する。
【００６８】
例２．この例は、規定されたかん流を介して連結された新生血管系を成熟させることによる微小循環の派生を例示する。
新生血管系は、いったんＥＣ−ライニングされたチャネルに接続されると、流量調整される。新生血管系を確立するために使用されるレジメンは、さらに２週間続けられる。最初のかん流手順は、チャネルネットワークの「遠位」部分において１Ｐａ（１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）の壁せん断応力を確立するが、新生血管系の進化がモニターされて、システム全体の圧力降下および／または流速において、新生血管の構造適応に影響を及ぼすことができ、成熟の程度に基づいて変化を適応させることを可能にする（ネットワーク全体のセグメントの直径の変化により評価される）。成熟微小循環を誘導するのに十分なかん流手順が決定される。確立された成熟微小循環が定量される。血行力学変数は系統的に変更され、所与のかん流パラメータセットに特有の微小血管ネットワークトポロジーを定義するための評価と組み合わせられる。
【００６９】
例３．以下の実施例は、２つの派生した新生血管系間のかん流駆動の吻合を説明する。
緑の内皮細胞（ｔｉｅ２：ＧＦＰトランスジェニックマウスに由来）を、ＲＦＰ発現トランスジェニックマウスから単離した微小血管由来の赤い新生血管（ｒｅｄ  ｎｅｏｖｅｓｓｅｌｓ）と共培養した。頻繁ではないが、結合した赤色および緑色の新生血管が観察され、２種の新生血管系間の吻合を示した（図４ａ、ｂ）。最初に、チャネルにライニングされている内皮細胞は、周囲のコラーゲンマトリックス中に芽を出すように誘導され、吻合に利用可能になる（図４ｃ）。重要なのは、単離した微小血管は単離後の管腔を維持するため、これらの「親」微小血管から成長する新生血管もまた管腔を有することである。このように、チャネルネットワークと新生血管（内皮細胞結合により結合された）を外部ポンプに接合することにより、新生血管をかん流させ、それにより、それを機能的微小循環に成熟させることが可能である。
【００７０】
評価と評価。
画像データは、微小血管系のトポロジー（微細血管の直径と配置）を判定するために使用される（これらのツリー（ｔｒｅｅ）は小さく、このマッピングを実行する時間と労力を制限する）。微小血管系内の赤色／緑色接合部の検査は、チャネル−血管吻合の範囲および部位（チャネルネットワーク内）を決定する。ツリーを通るかん流経路は、直径５μｍから２０μｍの大きさ（それぞれ異なる色）の範囲の蛍光ミクロスフェアトレーサ（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｔｒａｃｅｒｓ）を使用して評価され、微小血管系の異なるセグメントを通してかん流をマッピングする。培養期間の終了時に、ネットワークは収集され、公表された標準的な方法を用いて壁細胞（β−アクチン）およびＥＣ−ＥＣ接合（ＶＥ−カドヘリン）の存在について一括免疫染色を行う（Ｎｕｎｅｓら。ＭｉｃｒｏｖａｓｃＲｅｓ．２０１０；７９（１）：１０−２０）を成熟度の指標としている。
【００７１】
結果。
微小循環トポロジーに対する血流力の有意な影響は周知である（ＬｅＢｌａｎｃら。Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ。２０１２；１９（８）：６７６−９５）。体外微小循環のトポロジーは、圧力および流れの変化に応じて変化する。
【符号の説明】
【００７２】
図の参照を容易にするために、以下の符号が適用される。
１  体外かん流装置
２  支持構造
３  ゲルマトリックス
４  内皮細胞でライニングされたチャネルのネットワーク
５  入口チャネル
６  出口チャネル
７  クロスチャネル
８  入口ポート
９  出口ポート
１０  新生血管系
１１  微小血管
１２  筐体
１３  分号
１４  芽
１５  制御システム
１６  生態細胞
１７  セクション
１８  組織
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2018532371.tif 000016
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2018532371.tif 000019
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【国際調査報告】
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