(57)【要約】本発明は、ガンマデルタＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを発現するＴ細胞を提供し、ここでＣＡＲは、抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；および共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含む；ここで細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原の抗原結合ドメインへの結合に続いて共刺激シグナルをＴ細胞に与える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンマデルタＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを発現するＴ細胞であって、前記ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン；
を含み、ここで前記細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原の前記抗原結合ドメインへの結合に続いて共刺激シグナルをＴ細胞に与える、Ｔ細胞。
【請求項２】
前記抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することができる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインが、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９またはＥＧＦＲに結合することができる、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ストークまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７−Ｒ、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
第１抗原の前記ガンマデルタＴＣＲへの結合がシグナル１の産生をもたらし、第２抗原の前記ＣＡＲの抗原結合ドメインへの結合がシグナル２の産生をもたらす、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記ＣＡＲが、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にスペーサードメイン、例えば、ＣＤ８ストークまたはＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記ガンマデルタＴＣＲが、リン酸化抗原；主要組織適合複合体クラスＩ鎖関連Ａ（ＭＩＣＡ）；主要組織適合複合体クラスＩ鎖関連Ｂ（ＭＩＣＢ）；ＮＫＧ２Ｄリガンド１−６（ＵＬＢＰ１−６）；ＣＤ１ｃ；ＣＤ１ｄ；内皮タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）；リポヘキサペプチド；フィコエリスリンまたはヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素に結合することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
ＣＡＲであって、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み；ここで前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、ＣＤ３内部ドメインを含まない、ＣＡＲ。
【請求項１１】
前記共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７−Ｒ、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）シグナル伝達ドメインから選択される、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
ＣＡＲであって、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み；ここで前記細胞内シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ。
【請求項１３】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３内部ドメインを含まない、請求項１２に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
請求項２〜９のいずれか一項で定めたＣＡＲである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項で定めたＣＡＲをコードする核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５で定めた核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはトランスポゾンである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１５に記載の核酸配列または請求項１６もしくは１７に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞の作製方法。
【請求項１９】
前記細胞がガンマデルタＴ細胞刺激剤で刺激される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ガンマデルタＴ細胞刺激剤が、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ＩＰＰ類似体；およびファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が被験体から単離された試料に由来する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１５に記載の核酸配列、または請求項１６もしくは１７に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患の治療方法。
【請求項２４】
ガンマデルタＴ細胞刺激剤を被験体に投与する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ガンマデルタＴ細胞刺激剤が、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ＩＰＰ類似体；およびファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法であって、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）請求項１５に記載の核酸または請求項１６もしくは１７に記載のベクターでの、細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与すること
を含む、方法。
【請求項２７】
疾患の治療および／または予防で用いるための、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項２９】
前記疾患が、がん、微生物感染またはウイルス感染である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法または請求項２４もしくは２５に記載の使用。
【請求項３０】
前記疾患ががんである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法または請求項２７もしくは２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法用Ｔ細胞に関する。特に、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫療法用ガンマデルタＴ細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
がん免疫療法のために開発されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメインを、エフェクター細胞に特異的なシグナル伝達ドメインと単一分子内で結び付ける。最もよく見られるＣＡＲシステムは、活性化シグナルをＴ細胞に与えるシグナル伝達ドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する抗原認識ドメインに関わる。
【０００３】
典型的には、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、抗原が抗原認識ドメインに結合した際に、細胞毒性、増殖および生存シグナルを与え、エフェクター細胞を活性化する（シグナル１および２）。
【０００４】
この技術の制限は、潜在的な「ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ−ｏｆｆ  ｔｕｍｏｕｒ毒性」である。この毒性は、正常組織上のＣＡＲによって認識される低レベルのがん関連抗原の認識によって引き起こされる。例えば、ＧＤ２は神経芽腫の標的であるが、神経にも発現する；ＰＳＭＡは前立腺がん細胞の標的であるが、正常な腎臓、肝臓および結腸細胞、ならびに脳の星状細胞にも見られる。この問題は、高度に選択的な標的が不足している固形腫瘍でより深刻である。
【０００５】
したがって、上記の問題に対処するがん免疫療法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７０５２９０６号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｖａｎｔｏｕｒｏｕｔ，Ｐ．＆Ｈａｙｄａｙ，Ａ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，８８−１００（２０１３）
【非特許文献２】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７
【非特許文献３】Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８
【非特許文献４】Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０
【非特許文献５】Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０
【非特許文献６】Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４７−４２５４
【非特許文献７】Ｐｈｉｌｉｐ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０１−５４５０２０
【非特許文献８】Ｓｉｅｇｅｒｓ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ１６７００（２０１１）
【非特許文献９】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１４）
【非特許文献１０】Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；３；ｅ２７５７２
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞のＣＡＲを用いることにより、「ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ−ｏｆｆ  ｔｕｍｏｕｒ毒性」を低下させる機構を解明した。本明細書に記載のシステムでは、ＣＡＲを用いて、抗原がＣＡＲの抗原認識ドメインに結合した際に、共刺激シグナル（シグナル２）をγδＴ細胞に与える。このようにして、シグナル２は、ＣＡＲがその標的抗原に結合した際にのみ、Ｔ細胞に与えられる（図２Ａ）。γδＴ細胞活性化のためのシグナル１は、リン酸化抗原などの危険シグナルによって活性化される内因性ＴＣＲによって与えられる。
【０００９】
γδＴ細胞は、最適なエフェクター機能のために、シグナル１およびシグナル２の両方を必要とする。したがって、本システムでは、γδＴ細胞は、標的細胞が（ｉ）ＣＡＲによって認識される抗原を発現する場合；および（ｉｉ）内因性γδＴＣＲによって認識される危険シグナルを発現する場合にのみ、細胞毒性、増殖およびサイトカイン分泌について完全に活性化されることになる。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、ガンマデルタＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを発現するＴ細胞であって、ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み；ここで細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原の抗原結合ドメインへの結合に続いて共刺激シグナルをＴ細胞に与える、Ｔ細胞を提供する。
【００１１】
このように、第１抗原のγδＴＣＲへの結合はシグナル１の産生をもたらし、第２抗原のＣＡＲの抗原結合ドメインへの結合はシグナル２の産生をもたらす。
【００１２】
抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合することができ得る。
【００１３】
抗原結合ドメインは、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９またはＥＧＦＲに結合することができ得る。
【００１４】
細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７−Ｒ、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００１５】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ストークまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含み得る。
【００１６】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００１７】
ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインをさらに含み得る。
【００１８】
γδＴＣＲは、リン酸化抗原／ブチロフィリン３Ａ１複合体；主要組織適合複合体クラスＩ鎖関連Ａ（ＭＩＣＡ）；主要組織適合複合体クラスＩ鎖関連Ｂ（ＭＩＣＢ）；ＮＫＧ２Ｄリガンド１−６（ＵＬＢＰ１−６）；ＣＤ１ｃ；ＣＤ１ｄ；内皮タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）；リポヘキサペプチド；フィコエリスリンまたはヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素に結合することができ得る。
【００１９】
ＣＡＲは、以下のアミノ酸配列の１つを含み得る：
［配列番号１］（ａＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲ）
ＭＡＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＤＩＹＦＮＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＴＮＲＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＫＮＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＬＮＧＧＳＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＱＤＡＹＴＧＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＭＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＣＡＲＰＲＲＳＰＡＱＥＤＧＫＶＹＩＮＭＰＧＲＧ
［配列番号２］（ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲ）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＡＳＹＮＩＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＦＬＫＭＳＳＬＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＮＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＳＧＫＡＰＫＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＩＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＳＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＦＷＶＣＡＲＰＲＲＳＰＡＱＥＤＧＫＶＹＩＮＭＰＧＲＧ
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、ＣＡＲであって、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み；ここで細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含むがＣＤ３内部ドメインを含まない、ＣＡＲを提供する。
【００２１】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７−Ｒ、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）シグナル伝達ドメインから選択され得る。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、ＣＡＲであって、抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含み；ここで細胞内シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲを提供する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインからなり得るか、または本質的にそれからなり得る。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の第２の態様に記載のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３内部ドメインを含まない。
【００２４】
本発明の第２の態様に記載のＣＡＲは、本発明の第１の態様で定めたＣＡＲであり得る。
【００２５】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１または第２の態様で定めたＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００２６】
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様で定めた核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２７】
ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
【００２８】
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸配列または本発明の第４の態様に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、本発明の第１の態様に記載の細胞の作製方法に関する。
【００２９】
本方法は、細胞をガンマデルタＴ細胞刺激剤で刺激する工程を含み得る。
【００３０】
γδＴ細胞刺激剤は、例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ブロモヒドリンピロリン酸および（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸などのＩＰＰ類似体；ならびにアミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロネートまたはパミドロネート）などのファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤から選択され得る。
【００３１】
細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に記載の細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、本発明の第６の態様に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患の治療方法に関する。
【００３４】
本方法は、γδＴ細胞刺激剤を被験体に投与する工程を含み得る。
【００３５】
γδＴ細胞刺激剤は、例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ブロモヒドリンピロリン酸および（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸などのＩＰＰ類似体；ならびにアミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロネートまたはパミドロネート）などのファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤から選択され得る。
【００３６】
本方法は、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）本発明の第３の態様に記載の核酸試料または本発明の第４の態様に記載のベクターでの、細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与すること
を含み得る。
【００３７】
第８の態様では、本発明は、疾患の治療で用いるための、本発明の第６の態様に記載の医薬組成物に関する。
【００３８】
第９の態様では、本発明は、疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第１の態様に記載の細胞の使用に関する。
【００３９】
本明細書に記載の疾患は、がん、微生物感染またはウイルス感染であり得る。
【００４０】
本発明は、したがって、内因性γδＴＣＲに結合することができる（したがって、産生シグナル１を刺激する）第１抗原と、ＣＡＲに結合することができる（したがって、産生シグナル２を刺激する）第２抗原とを発現する標的細胞によってのみ完全に活性化され、それゆえ、標的細胞を殺傷することができるγδＴ細胞を提供する。
【００４１】
本発明のγδＴ細胞は、したがって、望ましくない「ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ−ｏｆｆ  ｔｕｍｏｕｒ」効果を低下させるのに有用である。特に、低レベルのＴＡＡを発現する正常細胞は、内因性γδＴＣＲによって認識される危険シグナルを発現せず、したがってγδＴ細胞の完全な活性化に必要なシグナル１を与えないため、本発明のγδＴ細胞を活性化しない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】標的細胞の殺傷をもたらすγδＴ細胞の完全な活性化に必要なシグナル伝達の図である。Ａ）およびＢ）γδＴＣＲまたは共受容体のみを介するシグナル伝達は、γδＴ細胞の完全な活性化をもたらさない。Ｃ）γδＴＣＲと共受容体シグナル伝達との組合せは、γδＴ細胞の完全な活性化をもたらす。
【図２−１】本発明のγδＴ細胞の説明図である。Ａ）標的細胞によるγδＴ細胞の正常な活性化。Ｂ）がん細胞によって分泌される可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドによるシグナル２の遮断は、γδＴ細胞の完全な活性化を妨げる。
【図２−２】本発明のγδＴ細胞の説明図である。Ｃ）形質転換細胞による本発明のγδＴ細胞の完全な活性化。Ｄ）正常な健常細胞は、内因性γδＴ細胞受容体によって認識される危険シグナルを発現せず、本発明のγδＴ細胞を完全には活性化しない。
【図３】本発明において使用され得る例示的なＣＡＲの例を示す図である。
【図４】γδＴ細胞のγδＴＣＲ（Ｖδ２）とＧＤ２−ＤＡＰ１０  ＣＡＲ（Ｆｃ、ＣＤ２０マーカーおよびＣＤ３４マーカー）との同時発現を例示するための代表的なフローサイトメトリードットプロットである。
【図５】ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲで形質導入されたＶδ２γδＴ細胞によるＧＤ２＋細胞株ＬＡＮ１およびＴＣ７１の殺傷を示す図である。（Ａ）ＧＤ２＋神経芽腫細胞株ＬＡＮ１の有意な殺傷は、ＣＡＲ形質導入細胞が使用された場合にのみ見られ、非形質導入（ＮＴ）Ｖδ２がエフェクターとして使用された場合には見られない。（Ｂ）ＧＤ２＋ユーイング肉腫細胞株ＴＣ７１に対する、リン酸化抗原産生を増加させる２４時間のゾレドロン酸ばく露と組み合わせた場合のａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲの相加効果。（Ｃ）細胞ストレスに応答してγδＴＣＲによって与えられるシグナル１を欠損するαβＴ細胞へのＣＡＲの添加は、Ｖδ２＋γδＴ細胞におけるＣＡＲの効果とは異なり、細胞毒性に対する効果はない。これは、ＣＡＲシグナル単独ではＴ細胞活性化に不十分であることを示している。エラーバーは、３〜６人の独立したドナーのＳＥＭを示す。
【図６】ＧＤ２＋細胞株ＬＡＮ１の殺傷およびＧＤ２−細胞株ＳＫＮＳＨの非殺傷を示す図である。エラーバーは、３〜６人の独立したドナーのＳＥＭを示す。
【図７】長期共培養後のＣＡＲ発現の保存およびＧＤ２特異的増殖を示す図である。（Ａ）形質導入の２４日後に共培養を開始した（Ｄ０と表示）。ＣＡＲ（Ｙ軸）およびＴＣＲＶδ２（Ｘ軸）の存在についての細胞の連続分析を、照射されたＧＤ２＋（ＬＡＮ１）およびＧＤ２−（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）神経芽腫細胞の存在下で行った。３人のドナーのうちの１人からの代表的なデータが示されている。（Ｂ）ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０形質導入Ｖδ２＋細胞の増殖は、照射されたＧＤ２＋標的細胞の存在下でのみ見られた（グラフ表示、ｎ＝３の独立したドナー、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図８】ＡＭＬ細胞株（Ｎｏｍｏｌ、Ｓｈ１およびＭＶ４；１１）および単離されたばかりの単球のＣＤ３３発現についてのフローサイトメトリー染色は同等である。
【図９】Ａ）ａＣＤ３３−ＤＡＰ１０形質導入Ｖδ２細胞は、ＺＯＬの非存在下で単球を温存するが、ａＣＤ３３−ＣＤ２８ｚ形質導入Ｖδ２細胞はそうではない。Ｂ）ａＣＤ３３−ＤＡＰ１０形質導入Ｖδ２細胞は、ＡＭＬをＮＴＶδ２細胞よりも良好に殺傷するが、単球は温存する。エラーバーは、３人の独立したドナーのＳＥＭを示す。
【図１０−１】抗ＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲの核酸およびアミノ酸配列
【図１０−２】抗ＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲの核酸およびアミノ酸配列
【図１１−１】抗ＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲの核酸およびアミノ酸配列
【図１１−２】抗ＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲの核酸およびアミノ酸配列
【図１２】ａＣＤ３３−ＤＡＰ１０形質導入Ｖδ２細胞は造血幹細胞を温存するが、ａＣＤ３３−ＣＤ２８ｚ形質導入Ｖδ２細胞はそうではない。正常ヒト骨髄を、提示のＣＡＲ  Ｔ細胞と共に一晩培養した。生存している造血幹細胞を、軟寒天中の骨髄コロニー形成によってアッセイした。データは、３人の独立したドナーからの形質導入Ｖδ２細胞を用いて得る。
【図１３−１】「共刺激のみ」のＣＡＲおよびＶγ９ｖδ２ＴＣＲの架橋差は、サイトカイン応答差を導く。上；実験設計の模式図。ビオチン化ビーズは、（Ａ）抗体なし／無関係な抗体、または（Ｂ）ＴＣＲ（抗ＣＤ３）もしくはＣＡＲ（ＣＡＲのスペーサー領域に結合する抗Ｉｇ）のいずれかに結合する抗体でコーティングされ；Ｃ）架橋後、細胞内サイトカイン分泌を利用して活性化を測定する。対照として、刺激性抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用する。
【図１３−２】「共刺激のみ」のＣＡＲおよびＶγ９ｖδ２ＴＣＲの架橋差は、サイトカイン応答差を導く。左下：代表的なＦＡＣＳプロット；右下：架橋に対するサイトカイン応答は、「共刺激のみ」のＣＡＲ架橋はＴＮＦ−α応答をもたらすが、インターフェロンガンマおよびＴＮＦ−αの両方を含む完全応答には追加のＴＣＲ関与が必要であることを示す。データは、５人のドナーの平均＋／−ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
γδＴ細胞
Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）構成成分に基づいて２つのグループに分けられる。ＴＣＲヘテロ二量体は、９５％のＴ細胞ではα鎖およびβ鎖からなる。これらは、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを介して外来抗原を認識し、適応免疫に必須のものである。
【００４４】
５％のＴ細胞はγ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを有する。γδＴＣＲはＭＨＣ非拘束性であり、腫瘍によって発現される細胞ストレスのマーカーを検出する。
【００４５】
γδＴ細胞は病原体および形質転換細胞をＨＬＡ非拘束的に認識する。それらは、細胞ストレスのマーカー（例えば、形質転換細胞によってメバロン酸塩生合成経路の副産物として放出されるリン酸化抗原）に応答する。γδＴ細胞は、特に抗体オプソニン化標的細胞の存在下で、先天性細胞毒性機能および抗原提示能力の両方を示す。
【００４６】
γδＴ細胞は、「リンパ球ストレス監視」を担当し、すなわち、クローン性増殖もしくはｄｅ  ｎｏｖｏ分化の必要性なしに、感染または非微生物ストレスを即座に感知して応答することに関与している。
【００４７】
γδＴ細胞の活性化は、刺激シグナルと阻害シグナルとのバランスによって調節される。それらは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＩＣＢ、およびＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリーの様々なメンバーなどのＮＫＧ２Ｄとしても知られる活性化受容体キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＫＬＲＫ１）のＭＨＣ関連リガンドと組み合わせたγδＴＣＲリガンド（例えばリン酸化抗原）によって活性化される。
【００４８】
γδ細胞は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）も発現し、それらは賦活性または阻害性のいずれかであり、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質尾部、１（ＫＩＲ２ＤＬ１）およびキラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質尾部、１（ＫＩＲ３ＤＬ１）が含まれる。
【００４９】
標的細胞の効果的な殺傷をもたらすγδＴ細胞の完全な活性化には、産生シグナル１およびシグナル２の生成が必要である（図１および２Ａ）。
【００５０】
γδＴ細胞は、形質転換細胞または感染細胞上に存在する危険シグナル抗原からＴ細胞活性化のシグナル１を引き出す。これらの危険シグナル抗原は、γδＴＣＲによって認識される。γδＴ細胞に対するＴ細胞活性化のシグナル２は、一般に、形質転換細胞または感染細胞上に存在する危険シグナル分子（ＭＩＣＡなど）によっても誘導される。シグナル２は、例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体およびＤＡＰ１０を介して形質導入され得る（図２Ａ）。
【００５１】
免疫検出を回避する手段として、がん細胞は、γδＴ細胞のシグナル２を効果的に遮断する可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドを頻繁に分泌し、したがってその活性化を防ぎ、腫瘍の浸潤を促進する（図２Ｂ）。
【００５２】
第１の態様では、本発明は、γδＴＣＲとＣＡＲとを発現するＴ細胞を提供し、ここでＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルをＴ細胞へ与える。
【００５３】
したがって、γδＴＣＲおよびＣＡＲの構成は、各受容体に結合した際に、γδＴＣＲがシグナル１を与え、ＣＡＲがシグナル２をそれぞれ与えるというものである。
【００５４】
本明細書で使用される共刺激シグナルは、完全γδＴ細胞活性化に必要とされるシグナル２と同義である。
【００５５】
このようにして、本発明の第１の態様のγδＴ細胞はようやく完全に活性化され、γδＴＣＲに結合することができる（したがって、産生シグナル１を刺激する）第１抗原、およびＣＡＲと結合することができる（したがって、産生シグナル２を刺激する）第２抗原を発現する標的細胞を殺傷することができる（図２Ｃ）。
【００５６】
γδＴＣＲへの抗原結合がない場合、シグナル１は生成されず、完全なγδＴ細胞活性化は得られない。言い換えれば、γδＴＣＲへの抗原結合がない場合、γδＴ細胞は標的細胞を殺傷するように刺激されない（図２Ｄ）。
【００５７】
ＣＡＲへの抗原結合がない場合、シグナル２は生成されず、完全なγδＴ細胞活性化は得らない。言い換えれば、ＣＡＲへの抗原結合がない場合、γδＴ細胞は標的細胞を殺傷するように刺激されない。
【００５８】
本発明のγδＴ細胞は、任意のγδＴＣＲを発現し得る。γδＴＣＲリガンドの例は、当該分野で知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【００５９】
例として、本発明の細胞によって発現されるγδＴＣＲは、リン酸化抗原（例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ブロモヒドリンピロリン酸（ＢｒＨＰＰ）および（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ））；主要組織適合複合体クラスＩ鎖関連Ａ（ＭＩＣＡ）；主要組織適合複合体クラスＩ鎖関連Ｂ（ＭＩＣＢ）；ＮＫＧ２Ｄリガンド１−６（ＵＬＢＰ１−６）；ＣＤ１ｃ；ＣＤ１ｄ；内皮タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）；リポヘキサペプチド；フィコエリスリンまたはヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素を認識し得る。
【００６０】
本発明の細胞の１つの利点は、（ｉ）特定の抗原に結合する抗原結合ドメインおよび（ｉｉ）特定の共刺激内部ドメインを含むＣＡＲを含むことである。このように、本発明の細胞は、ＣＡＲによって結合され得る抗原を含む環境において活性化する傾向がより大きくなるが、なぜなら、ＣＡＲによる抗原の結合がもたらすのは、共刺激内部ドメインを介するシグナル伝達およびシグナル２産生であるためである。例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＴＡＡに特異的である場合、ＣＡＲによって与えられる共刺激シグナルに起因してＴＡＡが発現される腫瘍環境では、本発明の細胞が活性化する傾向は増大することになる。
【００６１】
キメラ抗原受容体
本発明のＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。
【００６２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する改変受容体である。典型的なＣＡＲでは、モノクローナル抗体の特異性がＴ細胞に移植される。ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移植され得る。このようにして、養子細胞移植用の多数のがん特異的Ｔ細胞を生成することができる。このアプローチの第Ｉ相臨床試験は、有効性を示す。
【００６３】
ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、通常、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達内部ドメインに融合される。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、それを発現するＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。
【００６４】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分に由来する内部ドメインを有していた。結果的に、これらの第１世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、これは同種標的細胞のＴ細胞殺傷を引き起こすのに十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して増殖および生存させることはできなかった。この制限を克服するために、複合内部ドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分の、ＣＤ３ζの細胞内部分への融合は、抗原認識後に活性化シグナルと共刺激シグナルとを同時に伝達することができる第２世代受容体をもたらす。最もよく使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、最も強力な共刺激シグナル  −すなわちＴ細胞増殖を引き起こす免疫学的シグナル２を供給する。密接に関連し、生存シグナルを伝達するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリー内部ドメインを含むいくつかの受容体も記載されてきた。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができる内部ドメインを持つさらに強力な第３世代ＣＡＲが、現在では記載されている。
【００６５】
本発明のγδＴ細胞は、標的抗原が結合した際に、シグナル２をγδＴ細胞に伝達する共刺激シグナル伝達内部ドメインを含むＣＡＲを含む。
【００６６】
本発明のＴ細胞のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞内部で発現される場合、新生タンパク質が小胞体およびその後それが発現されている細胞の表面に向けられるように、シグナルペプチドを含み得る。
【００６７】
シグナルペプチドのコアは、単一アルファヘリックスを形成する傾向がある疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、短い正の電荷を帯びたアミノ酸のストレッチから始まることができ、これは転座中のポリペプチドの適切な位相を強化するのに役立つ。シグナルペプチドの末端には、典型的にはシグナルペプチダーゼによって認識され切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後のいずれかで切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは特異的プロテアーゼにより消化される。
【００６８】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。
【００６９】
シグナルペプチドは、配列番号６、７もしくは８、または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸突然変異（挿入、置換または付加）を有するその変異体を含み得るが、但し、そのシグナルペプチドが依然としてＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすように機能することを条件とする。
【００７０】
［配列番号６］
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＧ
【００７１】
配列番号６のシグナルペプチドは、小型で高効率である。それは、末端グリシンの後に約９５％の切断を与えると予測され、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去を与える。
【００７２】
［配列番号７］
ＭＳＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【００７３】
配列番号７のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
【００７４】
［配列番号８］
ＭＡＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ
【００７５】
配列番号８のシグナルペプチドは、ＣＤ８に由来する。
【００７６】
共刺激細胞内シグナルドメイン
細胞内ドメイン／内部ドメインは、典型的なＣＡＲのシグナル伝達部位である。
【００７７】
本発明のγδＴ細胞は、標的抗原が結合した際に、シグナル２をγδＴ細胞に伝達する共刺激シグナル伝達内部ドメインを含むＣＡＲを含む。したがって、本発明のγδＴ細胞は、標的抗原が結合した際に、シグナル１をγδＴ細胞に伝達しないＣＡＲを含む。
【００７８】
Ｔ細胞共刺激受容体は、活性化閾値を低下させ、Ｔ細胞アネルギーを防ぎ、Ｔ細胞機能を増強する定性的および定量的変化を誘導することが知られている。
【００７９】
多くのγδＴ細胞の共受容体が当技術分野で知られている。これらの受容体の１つ以上を介した産生シグナル伝達は、γδＴ細胞の完全な活性化と標的細胞殺傷とをもたらすことができる。
【００８０】
本発明のγδＴ細胞は、ＣＡＲの抗原結合ドメインへの抗原の結合がγδＴ細胞において産生シグナル２シグナル伝達を生じるように、γδＴ細胞共受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００８１】
細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＤＡＰ１０、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７−Ｒ、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００８２】
細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００８３】
ＤＡＰ１０は、ＮＫＧ２Ｄ受容体と会合するシグナル伝達サブユニットである（図１を参照）。それは、ＮＫＧ２Ｄの排他的結合パートナーおよびシグナル伝達中間体であり、脂質キナーゼカスケードを誘発するＹｘｘＭ活性化モチーフを含有する。
【００８４】
ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列の例を以下に示す：
【００８５】
［配列番号３］
ＣＡＲＰＲＲＳＰＡＱＥＤＧＫＶＹＩＮＭＰＧＲＧ
【００８６】
さらなる例示的な共刺激ドメインは、配列番号９〜１９として示される。
【００８７】
［配列番号９］（ＣＤ２８内部ドメイン）
ＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹ
【００８８】
［配列番号１０］（ＣＤ２７内部ドメイン）
ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ
【００８９】
［配列番号１１］（４１ＢＢ内部ドメイン）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
【００９０】
［配列番号１２］（ＯＸ４０内部ドメイン）
ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
【００９１】
［配列番号１３］（ＣＤ３０内部ドメイン）
ＨＲＲＡＣＲＫＲＩＲＱＫＬＨＬＣＹＰＶＱＴＳＱＰＫＬＥＬＶＤＳＲＰＲＲＳＳＴＱＬＲＳＧＡＳＶＴＥＰＶＡＥＥＲＧＬＭＳＱＰＬＭＥＴＣＨＳＶＧＡＡＹＬＥＳＬＰＬＱＤＡＳＰＡＧＧＰＳＳＰＲＤＬＰＥＰＲＶＳＴＥＨＴＮＮＫＩＥＫＩＹＩＭＫＡＤＴＶＩＶＧＴＶＫＡＥＬＰＥＧＲＧＬＡＧＰＡＥＰＥＬＥＥＥＬＥＡＤＨＴＰＨＹＰＥＱＥＴＥＰＰＬＧＳＣＳＤＶＭＬＳＶＥＥＥＧＫＥＤＰＬＰＴＡＡＳＧＫ
【００９２】
［配列番号１４］（ＩＬ２−Ｒ内部ドメイン）
ＴＷＱＲＲＱＲＫＳＲＲＴＩ
【００９３】
［配列番号１５］（ＩＬ７−Ｒ内部ドメイン）
ＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＬＥＥＳＥＫＱＲＬＧＧＤＶＱＳＰＮＣＰＳＥＤＶＶＩＴＰＥＳＦＧＲＤＳＳＬＴＣＬＡＧＮＶＳＡＣＤＡＰＩＬＳＳＳＲＳＬＤＣＲＥＳＧＫＮＧＰＨＶＹＱＤＬＬＬＳＬＧＴＴＮＳＴＬＰＰＰＦＳＬＱＳＧＩＬＴＬＮＰＶＡＱＧＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱ
【００９４】
［配列番号１６］（ＩＬ２１−Ｒ内部ドメイン）
ＳＬＫＴＨＰＬＷＲＬＷＫＫＩＷＡＶＰＳＰＥＲＦＦＭＰＬＹＫＧＣＳＧＤＦＫＫＷＶＧＡＰＦＴＧＳＳＬＥＬＧＰＷＳＰＥＶＰＳＴＬＥＶＹＳＣＨＰＰＲＳＰＡＫＲＬＱＬＴＥＬＱＥＰＡＥＬＶＥＳＤＧＶＰＫＰＳＦＷＰＴＡＱＮＳＧＧＳＡＹＳＥＥＲＤＲＰＹＧＬＶＳＩＤＴＶＴＶＬＤＡＥＧＰＣＴＷＰＣＳＣＥＤＤＧＹＰＡＬＤＬＤＡＧＬＥＰＳＰＧＬＥＤＰＬＬＤＡＧＴＴＶＬＳＣＧＣＶＳＡＧＳＰＧＬＧＧＰＬＧＳＬＬＤＲＬＫＰＰＬＡＤＧＥＤＷＡＧＧＬＰＷＧＧＲＳＰＧＧＶＳＥＳＥＡＧＳＰＬＡＧＬＤＭＤＴＦＤＳＧＦＶＧＳＤＣＳＳＰＶＥＣＤＦＴＳＰＧＤＥＧＰＰＲＳＹＬＲＱＷＶＶＩＰＰＰＬＳＳＰＧＰＱＡＳ
【００９５】
［配列番号１７］（ＮＫｐ３０内部ドメイン）
ＧＳＴＶＹＹＱＧＫＣＬＴＷＫＧＰＲＲＱＬＰＡＷＰＡＰＬＰＰＰＣＧＳＳＡＨＬＬＰＰＶＰＧＧ
【００９６】
［配列番号１８］（ＮＫｐ４４内部ドメイン）
ＷＷＧＤＩＷＷＫＴＭＭＥＬＲＳＬＤＴＱＫＡＴＣＨＬＱＱＶＴＤＬＰＷＴＳＶＳＳＰＶＥＲＥＩＬＹＨＴＶＡＲＴＫＩＳＤＤＤＤＥＨＴＬ
【００９７】
［配列番号１９］（ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）内部ドメイン）
ＮＲＲＲＲＲＥＲＲＤＬＦＴＥＳＷＤＴＱＫＡＰＮＮＹＲＳＰＩＳＴＳＱＰＴＮＱＳＭＤＤＴＲＥＤＩＹＶＮＹＰＴＦＳＲＲＰＫＴＲＶ
【００９８】
細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【００９９】
細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３もしくは９〜１９として示される配列またはその変異体を含み得る。
【０１００】
変異体は、配列番号３または９〜１９と少なくとも７５％の配列同一性を共有する配列を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０１】
変異体は、配列番号３または９〜１９と少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０２】
変異体は、配列番号３または９〜１９と少なくとも８５％の配列同一性を共有する配列を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０３】
変異体は、配列番号３または９〜１９と少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０４】
変異体は、配列番号３または９〜１９と少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０５】
変異体は、配列番号３または９〜１９と少なくとも９９％の配列同一性を共有する配列を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０６】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３として示される配列、または
配列番号３と少なくとも７５、８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性を共有するその変異体を含み得るが、但し、その配列が有効な共刺激シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１０７】
一実施形態では、内部ドメインはＣＤ３内部ドメインを含まない。例えば、内部ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖および／またはＣＤ３デルタ鎖を含まない。特定の実施形態では、内部ドメインはＣＤ３ゼータ内部ドメインを含まない。
【０１０８】
例示的なＣＤ３ゼータ内部ドメインは、配列番号２６として示される。
【０１０９】
［配列番号２６］（ＣＤ３ゼータ内部ドメイン）
ＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
【０１１０】
本明細書に記載のＣＤ３ゼータ内部ドメインは、配列番号２６または配列番号２６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するその変異体を含むか、またはそれからなっていてもよく、有効な膜貫通ドメイン／細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供する。
【０１１１】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部位である。抗体、抗体模倣体、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づく抗原結合ドメインを含む多くの抗原結合ドメインが当該分野で知られている。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）などの人工単一結合剤；またはＴ細胞受容体由来一本鎖を含み得る。
【０１１２】
抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体の可溶性リガンドであるタンパク質／ペプチド（例えば、サイトカインもしくはケモカインなどの可溶性ペプチド）；または膜に固定されたリガンドの細胞外ドメインもしくは結合対の一方が腫瘍細胞上に発現する受容体に基づくドメインを含み得る。
【０１１３】
例として、本明細書に記載の実施例は、ＧＤ２およびＣＤ３３にそれぞれ結合するＣＡＲに関する。
【０１１４】
抗原結合ドメインは、抗原の天然リガンドに基づき得る。
【０１１５】
抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリー由来の親和性ペプチドまたはｄｅ  ｎｏｖｏ設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。
【０１１６】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）
抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合し得る。
【０１１７】
広範囲にわたるＴＡＡが当該分野で知られており、本発明において使用されるＣＡＲは、任意のＴＡＡに特異的に結合することができる任意の抗原結合ドメインを含み得る。
【０１１８】
例として、本発明で使用するＣＡＲは、表１に記載のＴＡＡに特異的に結合することができ得る。
【０１１９】
【表１】
2018514204.tif 000002
【０１２０】
がん免疫療法におけるＴＡＡの標的化に関連する問題は、低レベルのＴＡＡが正常組織で発現され得ることである。例えば、ＧＤ２は神経芽腫ＴＡＡであるが、神経にも発現する；ＰＳＭＡは前立腺がんＴＡＡであるが、正常な腎臓、肝臓および結腸細胞、ならびに脳の星状細胞にも見られる。この問題は、高度に選択的な標的が不足している固形腫瘍でより深刻である。
【０１２１】
正常で健常な細胞でのＴＡＡの発現は、「ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ」副作用をもたらし得る。本発明のγδＴ細胞は、γδＴＣＲおよびＣＡＲの両方に対するリガンドを発現する細胞によってのみ活性化されるため、本発明はこれらの効果を軽減する。したがって、低レベルでＴＡＡを発現する正常で健常な細胞は、γδＴＣＲに結合することができる危険シグナル抗原を発現しないため、本発明のγδＴ細胞を活性化しない（図２Ｄ）。
【０１２２】
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９またはＥＧＦＲに結合することができ得る。
【０１２３】
ジシアロガングリオシド（ＧＤ２、例えばｐｕｂｃｈｅｍ：６４５０３４６により示される）は、主に細胞表面上に発現されるシアル酸含有スフィンゴ糖脂質である。この糖鎖抗原の機能は、完全には理解されていない；しかしながら、それは腫瘍細胞の細胞外マトリックスタンパク質への付着において重要な役割を果たすと考えられている。ＧＤ２は、神経芽細胞腫上に高密度に、均一に、ほぼ普遍的に発現する。正常組織では、ＧＤ２発現は、皮膚メラニン細胞、および末梢疼痛線維ミエリン鞘に主として限定される。ＣＮＳ内では、ＧＤ２は胚抗原であるように見えるが、散在性希突起膠細胞および後脳下垂体内で発現しているのがかすかに見られた。
【０１２４】
抗原結合ドメインは、配列番号２０として示される配列またはその変異体を含み得るが、但し、その変異体がＧＤ２に結合する能力を保持することを条件とする。
【０１２５】
［配列番号２０］
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＡＳＹＮＩＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＦＬＫＭＳＳＬＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＮＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＳＧＫＡＰＫＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＩＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＳ
【０１２６】
抗原結合ドメインは、配列番号２０として示される配列、または配列番号２０と少なくとも７５、８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性を共有するその変異体を含み得るが、但し、その変異体がＧＤ２に結合する能力を保持することを条件とする。
【０１２７】
ＣＤ３３（例えばＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８によって示される）は、細胞へのシアル酸依存性結合を媒介する骨髄単球由来細胞の推定接着分子である。これは、骨髄特異的であると通常考えられているが、一部のリンパ様細胞でも見ることができる。
【０１２８】
抗原結合ドメインは、配列番号２１として示される配列またはその変異体を含み得るが、但し、その変異体がＧＤ２に結合する能力を保持することを条件とする。
【０１２９】
［配列番号２１］
ＭＡＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＤＩＹＦＮＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＴＮＲＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＫＮＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＮＹＧＭＨＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＬＮＧＧＳＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＱＤＡＹＴＧＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＭ
【０１３０】
抗原結合ドメインは、配列番号２１として示される配列、または配列番号２１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９５または９９％の配列同一性を共有するその変異体を含み得るが、但し、その変異体がＧＤ２に結合する能力を保持することを条件とする。
【０１３１】
ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋｄの膜貫通糖タンパク質である（例えばＵｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１５３９１で示される）。ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化においてかなり早期に発現され、Ｂ細胞の形質細胞への分化の終わりに消失されるだけである。したがって、ＣＤ１９は、多発性骨髄腫以外の全てのＢ細胞悪性腫瘍で発現される。ＣＤ１９は、正常なＢ細胞コンパートメントによっても発現される。
【０１３２】
ＥＧＦＲ（例えばＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３で示される）は、ＥＧＦファミリーのリガンドに結合し、いくつかのシグナル伝達カスケードを活性化して細胞外キューを適切な細胞応答に変換する受容体チロシンキナーゼである。既知のリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦＡ／ＴＧＦ−アルファ、アンフィレグリン、エピゲン／ＥＰＧＮ、ＢＴＣ／ベータセルリン、エピレグリン／ＥＲＥＧおよびＨＢＥＧＦ／ヘパリン結合ＥＧＦが含まれる。ＥＧＦＲは、多くのがん細胞によって高レベルで発現される。しかしながら、それは正常で健常な細胞によっても発現される。
【０１３３】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結させ、抗原結合ドメインを内部ドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含み得る。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にし、結合を容易にする。
【０１３４】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ｌｇＧ１Ｆｃ領域、ｌｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替リンカー配列を含んでいてもよい。ヒトＩｇＧ１スペーサーを改変し、Ｆｃ結合モチーフを除去してもよい。
【０１３５】
これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を以下に示す：
【０１３６】
［配列番号２２］（ヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２ＣＨ３）
ＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤ
【０１３７】
［配列番号２３］（ヒトＣＤ８ストーク）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩ
【０１３８】
［配列番号２４］（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）
ＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＫＤＰＫ
【０１３９】
スペーサーは、配列番号２２〜２４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を共有する配列番号２２〜２４のいずれかの変異体であってもよく、配列番号９〜１１として示されるアミノ酸配列の機能的活性を保持する。
【０１４０】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。
【０１４１】
膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基を含むアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用して、本発明の膜貫通部位を供給することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を用いて当業者によって測定することができる。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち、膜にまたがるのに十分な長さの疎水アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列である場合、人工的に設計されたＴＭドメインも使用され得る（特許文献１は、合成膜貫通成分を記載する）。
【０１４２】
膜貫通ドメインは、任意のＩ型膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、疎水性ヘリックスを形成することが予測される合成配列であり得る。
【０１４３】
膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性を与えるＣＤ２８に由来し得る。
【０１４４】
膜貫通ドメインは、配列番号２５として示される配列を含み得る。
【０１４５】
［配列番号２５］（ＣＤ２８膜貫通ドメイン）
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
【０１４６】
核酸
本発明は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列をさらに提供する。
【０１４７】
核酸配列は、配列番号１または配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＣＡＲをコードすることができ得る。
【０１４８】
［配列番号４］（ａＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲ）
ＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＣＧＧＡＧＡＴＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＧＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＡＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＧＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＴＴＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＧＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＡ
【０１４９】
［配列番号５］（ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲ）
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＡ
【０１５０】
核酸配列は、配列番号１または２によってコードされるものと同じアミノ酸配列をコードし得るが、遺伝コードの縮重のために異なる核酸配列を有し得る。核酸配列は、配列番号４または配列番号５として示される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有し得るが、但し、それが本発明の第１の態様において定めたＣＡＲをコードすることを条件とする。
【０１５１】
変異体
配列比較は、目測で、またはより一般には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの公的および商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の配列同一性を計算することができる。
【０１５２】
配列同一性は、連続した配列にわたって計算されてもよく、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「非ギャップ」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップアライメントは、比較的短い数の残基（例えば、５０個未満の連続したアミノ酸）にわたってのみ行われる。
【０１５３】
これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、他の点では同一の配列対において、１つの挿入または欠失により、その後に続くアミノ酸残基がアラインメントから外され、そのためグローバルアライメントが行われた場合に％相同性の大幅な減少を潜在的に生じることが考慮されていない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、考えられる挿入および欠失を考慮に入れた最適アライメントを作成するように設計される。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所相同性を最大にすることによって達成される。
【０１５４】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、同じ数の同一アミノ酸について、できるだけ少ないギャップの配列アラインメント  −２つの比較した配列間の類似性が高いことを反映する−  が、多くのギャップを持つスコアよりも高いスコアを達成するようにする。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内のそれぞれ後続の残基に対してより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、ギャップのより少ない最適化アライメントを作成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することを可能にする。しかしながら、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する際は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用する際、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップについては−１２、それぞれの延長については−４である。
【０１５５】
最大％配列同一性の計算は、したがって、ギャップペナルティを考慮に入れ、最適アライメントの作成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（非特許文献２）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（非特許文献３を参照）、ＦＡＳＴＡ（非特許文献４）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方が、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（非特許文献５を参照）。しかしながら、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【０１５６】
最終的な配列同一性は同一性の観点から測定することができるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、ａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｔｈｉｎｇ対比較に基づくものではない。代わりに、化学類似性または進化距離に基づいて各対での比較にスコアを割り当てるスケーリングされた類似性スコアマトリックスが通常使用される。一般的に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス  −ＢＬＡＳＴプログラム一式のデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、公開デフォルト値か、提供された場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（詳細については、ユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージでは公開デフォルト値を使用するか、または他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【０１５７】
ソフトウェアが最適アラインメントを作成すると、％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的にはこれを配列比較の一部として行い、数値結果を与える。
【０１５８】
本発明による用語「変異体」は、配列からのまたは配列への１つ（もしくはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換、欠失または付加を含むが、但し、得られるアミノ酸配列が未修飾配列と実質的に同じ活性を保持することを条件とする。
【０１５９】
保守的置換は、例えば以下の表に従って行うことができる。第２列の同じブロック内のアミノ酸、好ましくは第３列の同じ行内のアミノ酸が、互いに置換され得る：
【０１６０】
【表２】
2018514204.tif 000003
【０１６１】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解されるであろう。さらに、当業者は、型通りの技術を用いて、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行ない、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させ得ることが理解されるべきである。
【０１６２】
本明細書に記載の核酸配列またはアミノ酸配列は、本明細書に示すような核酸配列またはアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、または本質的にそれからなり得る。
【０１６３】
ベクター
本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターも提供する。そのようなベクターは、核酸配列を宿主細胞に導入し、それが本発明の第１の態様の分子を発現および産生するように使用され得る。
【０１６４】
ベクターは、例えば、プラスミド、またはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。
【０１６５】
ベクターは、Ｔ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができ得る。
【０１６６】
ベクターは、ｉＣａｓｐ９またはＲＱＲ８などの自殺遺伝子をコードする核酸配列も含み得る。
【０１６７】
自殺遺伝子は、許容できない毒性に直面して、Ｔ細胞などの養子移植細胞の選択的破壊を可能にする遺伝的にコードされた機構である。
【０１６８】
カスパーゼ９の活性化は細胞アポトーシスをもたらす。カスパーゼ９の背後にある活性化機構は、ｉＣａｓｐ９分子によって活用された。カスパーゼ９が活性化するために必要なことは、カスパーゼ９がホモ二量体化するためのエネルギー障壁を乗り越えることのみである。ホモ二量体は構造変化を起こし、二量体対の一方のタンパク質分解ドメインが活性化する。生理学的には、これはカスパーゼ９のＣＡＲＤドメインのＡＰＡＦ−１への結合によって起こる。ｉＣａｓｐ９において、ＡＰＡＦ−１ドメインは、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）に選択的に結合するように変異した修飾ＦＫＢＰ１２で置換されている。ＣＩＤの存在は、ホモ二量体化および活性化をもたらす。ｉＣａｓｐ９は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合した修飾ヒトカスパーゼ９に基づく（非特許文献６）。それは、ＡＰ１９０３として知られている小分子ＣＩＤの存在下での条件付二量体化を可能にする。
【０１６９】
ＲＱＲ８の発現は、Ｔ細胞を抗ＣＤ２０抗体リツキシマブに対して反応しやすくするが、完全長ＣＤ２０分子よりも小型である（非特許文献７）。
【０１７０】
医薬組成物
本発明は、本発明のベクターまたはＣＡＲ発現Ｔ細胞を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、および場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物と一緒に含有する医薬組成物にも関する。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
【０１７１】
方法
本発明は、本発明の核酸配列またはベクターを細胞に導入する工程を含む、本発明の細胞の作製方法にも関する。
【０１７２】
本発明のＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の設定において、または無縁ドナー（第三者）からの末梢血のいずれかから、ｅｘ  ｖｉｖｏで作製され得る。あるいは、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。これらの場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つにより、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０１７３】
本方法は、細胞をγδＴ細胞刺激剤で刺激することをさらに含み得る。本明細書中で使用される「γδＴ細胞刺激剤」は、細胞の混合出発集団からγδＴ細胞の増殖および／または生存を選択的に刺激する任意の薬剤を指す。
【０１７４】
したがって、得られた細胞集団は、細胞の出発集団と比較して増加したγδＴ細胞数  −例えば、特定のγδＴＣＲ受容体を発現する特定のγδＴ細胞−  で濃縮される。
【０１７５】
本発明に従って産生されたγδＴ細胞集団は、γδＴ細胞、例えば特定のγδＴＣＲ受容体を発現する特定のγδＴ細胞で濃縮され得る。すなわち、本発明に従って産生されるγδＴ細胞集団は、γδＴ細胞数が増加することになる。例えば、本発明のγδＴ細胞集団は、被験体から単離された試料中のγδＴ細胞と比較して、特定のγδＴＣＲ受容体を発現するγδＴ細胞数が増加することになる。換言すると、γδＴ細胞のパーセンテージまたは割合は増加することになるという点で、γδＴ細胞集団の組成は、「未変性」Ｔ細胞集団（すなわち、本明細書に記載の増殖工程を受けていない集団）の組成とは異なる。
【０１７６】
本発明のγδＴ細胞集団は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％のγδＴ細胞を有し得る。
【０１７７】
本発明のγδＴ細胞集団は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％の、
特定のγδＴＣＲ受容体を発現するγδＴ細胞を有し得る。
【０１７８】
例として、γδＴ細胞刺激剤は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ＩＰＰ類似体（例えば、ブロモヒドリンピロリン酸もしくは（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸）；ファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤またはゾレドロネートもしくはパミドロネートなどのアミノビスホスホネートであり得る。
【０１７９】
γδＴ細胞刺激剤は、一般的なＴ細胞分裂促進因子、例えばＩＬ−２などの分裂促進性サイトカインと組み合わせて使用され得る。
【０１８０】
γδＴ細胞を刺激する追加の方法は当該分野で知られており、例えば、コンカナバリンＡ（非特許文献８）、プラスチック上に固定化された抗γδＴＣＲ抗体；フィーダーとしての改変人工抗原提示細胞および抗γδＴＣＲ抗体でコーティングされた改変人工抗原提示細胞（非特許文献９）の使用が含まれる。
【０１８１】
治療方法
疾患の治療方法は、本発明のベクターまたはＴ細胞の治療的使用に関する。この点において、ベクターまたはＴ細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減させる、縮小させるもしくは改善するためにおよび／または疾患の進行を減速させる、縮小させるもしくは阻むために、既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。
【０１８２】
ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、患者自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の設定において、または無縁ドナー（第三者）からの末梢血のいずれかから、ｅｘ  ｖｉｖｏで作製され得る。あるいは、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。これらの場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つにより、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０１８３】
一実施形態では、γδＴ細胞を含む試料は、被験体から事前に単離されていてもよい。
【０１８４】
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、本明細書に記載の方法によって作製され得る。特に、疾患の治療方法で用いるＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入または本明細書に記載のような共刺激ＣＡＲをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡでのトランスフェクション、およびγδＴ細胞刺激剤を用いるγδＴ細胞の増殖の工程を含む方法によって生成され得る。
【０１８５】
γδＴ細胞刺激剤は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ＩＰＰ類似体（例えば、ブロモヒドリンピロリン酸もしくは（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸）；ファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤または、例えばゾレドロネートもしくはパミドロネートなどのアミノビスホスホネートであり得る。
【０１８６】
本発明のＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、例えば、がん、微生物感染およびウイルス感染を含む様々な疾患の治療に使用され得る。
【０１８７】
がんは、例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎臓細胞）、肺がん、脳腫瘍、黒色腫、白血病、リンパ腫、膵臓がん、前立腺がんまたは甲状腺がんであり得る。
【０１８８】
本発明の方法および使用は、追加の組成物と組み合わせて実施され得る。例えば、治療を受ける疾患ががんである場合、本発明の組成物は、化学療法および／または放射線療法などの追加のがん療法と組み合わせて投与され得る。
【０１８９】
本発明の組成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；ＩＰＰ類似体（例えば、ブロモヒドリンピロリン酸もしくは（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸）；ファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）阻害剤またはゾレドロネートもしくはパミドロネートなどのアミノビスホスホネートなどのγδＴ細胞刺激剤と組み合わせて投与され得る。
【０１９０】
特に、ゾレドロネートおよびパミドロネートは、Ｖδ２＋γδＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖のためにＩＬ−２と組み合わせて使用することができる。このアプローチを用いた多くの第Ｉ相臨床試験が存在する（非特許文献１０を参照）。
【０１９１】
「組み合わせて」は、本発明の組成物の投与前、投与と同時に、または投与後の、追加の療法またはγδＴ細胞刺激剤の適用を指し得る。
【０１９２】
ここで、本発明を実施例としてさらに説明するが、これは本発明を実施する際に当業者を援助するためのものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１９３】
（実施例１：共刺激ＣＡＲを発現するγδＴ細胞の生成）
健常ドナーの血液から、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離を用いてＰＢＭＣを抽出した。それらを、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２および５μＭゾレドロン酸を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で５日間培養した。
【０１９４】
５日後、それらを、マーカー遺伝子として作用し、リツキシマブ（αＣＤ２０）感受性自殺遺伝子も提供するＲＱＲ８に融合したＣＡＲ構築物を含むレトロウイルスで形質導入した。
【０１９５】
本明細書に記載の例示的なＣＡＲには、ａＧＤ２特異的ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１のＦｃ部分に基づくリンカー、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメインおよびＤＡＰ１０の内部ドメイン（図１０参照）が挙げられる。
【０１９６】
第２の例示的なＣＡＲには、ＣＤ３３特異的ｓｃＦｖ、ｌｇＧ１のＦｃ部分に基づくリンカー、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメインおよびＤＡＰ１０の内部ドメイン（図１１参照）が挙げられる。
【０１９７】
抗ＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲとγδＴ細胞の内因性ＴＣＲとの共発現が実証された（図４）。
【０１９８】
（実施例２：ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲで形質導入されたＶδ２γδＴ細胞によるＧＤ２＋細胞株ＬＡＮ１およびＴＣ７１の殺傷）
ＬＡＮ１およびＴＣ７１細胞系は共にＧＤ２を発現することが知られている。
【０１９９】
ＧＤ２＋神経芽腫細胞株ＬＡＮ１の有意な殺傷は、ＣＡＲ形質導入細胞を使用した場合にのみ見られ、非形質導入（ＮＴ）Ｖδ２細胞をエフェクターとして使用した場合には見られなかった（図５Ａ）。
【０２００】
ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲを２４時間ゾレドロン酸処理と組み合わせて使用した場合、ＧＤ２＋ユーイング肉腫細胞株ＴＣ７１に対する相加効果があった（図５Ｂ）。
【０２０１】
細胞ストレスに応答してγδＴＣＲによって与えられるシグナル１を欠損するαβＴ細胞へのＣＡＲの添加は、Ｖδ２＋γδＴ細胞におけるＣＡＲの効果とは異なり、細胞毒性に対して効果はなかった（図５Ｃ）。これは、ＣＡＲシグナル単独ではＴ細胞活性化には不十分であることを示している。
【０２０２】
γδＴ細胞におけるａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲの発現は、ＧＤ２陰性ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＧＤ２特異的殺傷をもたらさなかった（図６）。
【０２０３】
（実施例３：長期共培養およびＧＤ２特異的増殖後のＣＡＲ発現の保存）
形質導入の２４日後に共培養を開始し、照射されたＧＤ２＋（ＬＡＮ１）およびＧＤ２−（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）神経芽腫細胞（図７Ａ）の存在下で、ＣＡＲおよびＴＣＲＶδ２の存在についての細胞の連続分析を行った。
【０２０４】
ａＧＤ２−Ｆｃ−ＤＡＰ１０形質導入Ｖδ２＋細胞の増殖は、照射されたＧＤ２＋標的細胞の存在下でのみ見られた（図７Ｂ）。
【０２０５】
（実施例４：抗ＣＤ３３−ＤＡＰ１０  ＣＡＲを発現するγδＴ細胞による、ＣＤ３３＋単球ではなくＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞の特異的殺傷）
ＣＤ３３発現の等価レベルが、３つのＡＭＬ細胞株および単球において実証された（図８）。
【０２０６】
Ｖδ２γδＴ細胞を、抗ＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０または抗ＣＤ３３−Ｆｃ−ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ構築物のいずれかで形質導入した。
【０２０７】
抗ＣＤ３３−Ｆｃ−ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ構築物は、ＣＤ３３の存在下でシグナル１およびシグナル２を与える。抗ＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０は、ＣＤ３３の存在下でシグナル２を与える。
【０２０８】
ａＣＤ３３−ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ  ＣＡＲで形質導入された細胞は、いずれのＣＤ３３陽性細胞も殺傷し、健常単球を温存しなかった。ａＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲで形質導入された細胞は、単球を殺傷しない（図９Ａ）。
【０２０９】
非形質導入対照と比較して、ａＣＤ３３−Ｆｃ−ＤＡＰ１０  ＣＡＲで形質導入したＶδ２γδＴ細胞によるＡＭＬの殺傷の有意な増強はあったが、単球の殺傷の増強はなかった（図９Ｂ）。
【０２１０】
上記明細書で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法およびシステムの様々な修正形態および変形形態は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学、細胞免疫学または関連分野の当業者には明らかである本発明を実施するための記載の様式の様々な修正形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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