(57)【要約】  Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害し得るチエノピロール化合物、並びにチエノピロール化合物を含む組成物及びキット、及びチエノピロール化合物を使用する方法を開示する。【選択図】なし
2018524334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、またはその塩であって：
2018524334.tif 000218
（Ｉ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；及び
Ｒ3及びＲ4は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記化合物、またはその塩。
【請求項２】
ｎが、１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記点線が、結合の存在を表し、Ｘが、ＣＨである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４】
Ａが、５員のヘテロアリール環である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ａが、チエニル環またはフラニル環である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ａが、フェニル環である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1が、水素、Ｃ1−Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及びアリールアルキルからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1が、水素、エチル、ｎ−ヘキシル、２−（２−メトキシエトキシ）エチル及びベンジルからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ1が、エチルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ2が、任意で置換されたアリールである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ2が、置換フェニルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ2が、Ｃ1−Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、及びヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つの置換基でフェニル置換される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ2が、１つのメチル基でフェニル置換される、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ3及びＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ3及びＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピロリジン、ピペリジン及びピペラジンからなる群から選択される、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピロリジン、未置換ピペリジン、１つの置換基で置換されたピペリジン、または１つの置換基で置換されたピペラジンからなる群から選択される、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ3が、水素である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ4が、未置換Ｃ1−Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、任意で置換されたフェニル、任意で置換されたＣ5−Ｃ6シクロアルキル、任意で置換されたＣ5−Ｃ6−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ4が、未置換であるかまたは１つの置換基で置換されるフェニルである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記置換基が、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル、及びＣ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ4−アルキルからなる群から選択される、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ4が、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル、Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、ヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、アミド、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、Ｃ1−Ｃ4−ジアルキルアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、Ｃ1−Ｃ4−アルキルカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキルアミド、及び任意で置換されたヘテロシクリルアミドからなる群から選択される１つの置換基で置換されるシクロヘキシルである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物が、式（Ｉａ）：
2018524334.tif 000219
（Ｉａ）
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
前記化合物が、式（Ｉｂ）を有し：
2018524334.tif 000220
（Ｉｂ）
式中：
Ｙが、−ＮＲaＲb及び−ＯＲcからなる群から選択され；
Ｒa及びＲbが、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；またはＲa及びＲbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
Ｒcは、水素及び任意で置換されたＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｙが、−ＯＲcである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒcが、水素及びメチルからなる群から選択される、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｙが、−ＮＲaＲbである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒa及びＲbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒa及びＲbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピペリジンである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピペリジン及び１つの置換基で置換されたピペリジンからなる群から選択される、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒaが、水素である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒbが、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒbが、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、ヒドロキシアルキル、任意で置換されたアミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホン酸−アルキル、スルホネート−アルキル、アルキルカルボニルアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキル、及び任意で置換された６員のヘテロシクリルからなる群から選択される、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
前記化合物が、以下の式（Ｉｂ’）
2018524334.tif 000221
（Ｉｂ’）
を有する、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
前記化合物が、
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−エチル−２−（５−（ピロリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
Ｎ−エチル−２−（５−（ピペリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
１−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−フェニル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
２−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）フェニル）酢酸エチル；
３−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）安息香酸メチル；
メチル−シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸；
６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸；
トランス−メチル−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
Ｎ−（トランス−４−（ブチルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（トランス−４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸；
Ｎ−（トランス−４−カルバモイルシクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸；
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸；
Ｎ−（トランス−４−（シクロヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ピペリジン−４−イルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（トランス−４−（（１−アセチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル；
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５（６）−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミドヒドロクロリド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
メチル−トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（カルボキシメチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オイック酸；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−シクロペンチル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−エチル−２−（５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
メチル−トランス−４−（４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
メチル−トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
４−（２−（ベンジル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル；
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸カリウム；
トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
トランス−４−（４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−カルバモイルフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド；
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；及び
トランス−４−（６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害方法。
【請求項３８】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害方法であって、
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを式（ＩＩ）の化合物：
2018524334.tif 000222
（ＩＩ）
と接触させることを含み、
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記方法。
【請求項４０】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）前記試料をセレンテラジン基質及び請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させること；及び
（ｂ）前記試料中の発光を検出すること、
を含み、
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
【請求項４２】
試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させること、前記試料は、
（ｘｖｉｉ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｖｉｉｉ）前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；及び
（ｂ）前記試料中の発光を検出すること、
を含み、
発光の検出が、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
【請求項４３】
前記試料を請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を前記セレンテラジン基質と接触させることを含む、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のタンパク質と第２のタンパク質が相互作用する場合、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第１の断片及び前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第２の断片が、前記セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させること、前記試料は：
（ｘｉｘ）生物発光ドナーであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｘ）蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；
（ｂ）前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出すること
を含む、前記方法。
【請求項４６】
前記試料が、細胞を含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
第１の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第１の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである；第２の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第２の融合タンパク質；セレンテラジン基質、及び請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物、を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
【請求項５１】
（ａ）請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物；及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
【請求項５２】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
セレンテラジン基質をさらに含む、請求項５１〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
発光アッセイを実施するための指示書をさらに含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）前記試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させること：
2018524334.tif 000223
（ＩＩ）
を含み、
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
（ｂ）前記試料中の発光を検出すること、
前記式（ＩＩ）の化合物が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
【請求項５６】
試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させること、
2018524334.tif 000224
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
前記試料が、
（ｘｘｉ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｘｉｉ）前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；及び
（ｂ）前記試料中の発光を検出すること
を含み、
発光の検出は、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
【請求項５７】
前記試料を式（ＩＩ）の前記化合物と接触させる前に、前記試料を前記セレンテラジン基質と接触させることを含む、請求項５５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１のタンパク質と第２のタンパク質が相互作用する場合、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第１の断片及び前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第２の断片が、前記セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させること、
2018524334.tif 000225
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
前記試料が、
（ｘｘｉｉｉ）生物発光ドナーであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｘｉｖ）蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；
（ｂ）前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出すること
を含む、前記方法。
【請求項６０】
前記試料が、細胞を含む、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、
第１の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第１の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである；第２の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第２の融合タンパク質；セレンテラジン基質、及び式（ＩＩ）の化合物、を含み、
2018524334.tif 000226
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
【請求項６５】
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
2018524334.tif 000227
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する；及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
【請求項６６】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
セレンテラジン基質をさらに含む、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
発光アッセイを実施するための指示書をさらに含む、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／１８４，７１４号、及び２０１５年８月１８日に出願された米国仮特許出願第号６２／２０６，５２５号の優先権を主張し、それらの内容全体を参照によって本明細書に引用したものとする。
【０００２】
本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害し得るチエノピロール化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
レポーター分子を日常的に使用して、生物学、生化学、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野で分子事象をモニターする。深海エビのトゲオキヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）から分泌されるルシフェラーゼに基づいたルシフェラーゼ類は、レポーター分子として使用してもよく、広範な基質特異性、高活性、及び高量子収量を含む有利な特徴を有することが示されている。ある特定の用途では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼからの発光シグナルを制御することがさらに有利であり得る。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物、またはその塩を提供し：
2018524334.tif 000003
（Ｉ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；及び
Ｒ3及びＲ4は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
【０００５】
一態様では、本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｂ’）、または（ＩＩ）の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させることを含む、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害方法を提供する。
【０００６】
一態様では、本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを式（ＩＩ）の化合物と接触させることを含む、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害方法を提供する：
2018524334.tif 000004
（ＩＩ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
【０００７】
一態様では、本開示は、試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｂ’）、または（ＩＩ）の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させること；及び
（ｂ）試料中の発光を検出すること
を含み、化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、方法を提供する。
【０００８】
一態様では、本開示は、試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｂ’）、または（ＩＩ）の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させること、試料は、
（ｉ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）試料中の発光を検出すること、
発光の検出が、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を示す、方法を提供する。
【０００９】
一態様では、本開示は、試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｂ’）、または（ＩＩ）の化合物などの本明細書に記載の化合物と接触させること、試料は、
（ｉｉｉ）生物発光ドナーであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｉｖ）蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド；
を含み、
（ｂ）生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出すること、を含む、方法を提供する。
【００１０】
一態様では、本開示は、第１の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第１の融合タンパク質、ここで生物発光ドナー分子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである；第２の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第２の融合タンパク質；セレンテラジン基質、及び式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｂ’）、または（ＩＩ）の化合物などの本明細書に記載の化合物、を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムを提供する。
【００１１】
一態様では、本開示は、
（ａ）式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｂ’）、または（ＩＩ）の化合物などの本明細書に記載の化合物；及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ
を含む、キットを提供する。
【００１２】
一態様では、本開示は、試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させることであって、
2018524334.tif 000005
（ＩＩ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、接触させることと、
（ｂ）試料中の発光を検出すること
を含み、
式（ＩＩ）の化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、方法を提供する。
【００１３】
一態様では、本開示は、試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させることであって、
2018524334.tif 000006
（ＩＩ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
試料は、
（ｖ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｖｉ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含む接触させること；及び
（ｂ）試料中の発光を検出すること
を含み、
発光の検出は、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を示す、方法を提供する。
【００１４】
一態様では、本開示は、試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させることであって、
2018524334.tif 000007
（ＩＩ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
試料は、
（ｖｉｉ）生物発光ドナーであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｖｉｉｉ）蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド；
を含む接触させること；
（ｂ）生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出することを含む、方法を提供する。
【００１５】
一態様では、本開示は、第１の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第１の融合タンパク質、ここで生物発光ドナー分子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである；第２の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第２の融合タンパク質；セレンテラジン基質、及び式（ＩＩ）の化合物、を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムを提供し、
2018524334.tif 000008
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
【００１６】
一態様では、本開示は、
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
2018524334.tif 000009
（ＩＩ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ
を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ及びＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイシステムを組み合わせる多重アッセイにおけるＪＲＷ−０００４によるＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）酵素の阻害を示す。
【図２】チエノピロール化合物ＪＲＷ−０００４、ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−０００６、ＪＲＷ−００４２、ＪＲＷ−０１３８、及びＪＲＷ−０１４７によるＮｌｕｃの阻害を示す。
【図３】チエノピロール化合物ＪＲＷ−０００４、ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−０００６、ＪＲＷ−００４２、ＪＲＷ−０１３８、及びＪＲＷ−０１４７が、ホタルルシフェラーゼ活性を阻害しないことを示す。
【図４Ａ−４Ｄ】チエノピロール化合物ＪＲＷ−０００４（図４Ａ及び４Ｂ）及びＷＺ１４１−８８（図４Ｃ及び４Ｄ）が、用量及び時間依存的にＮｌｕｃを阻害することを示す。
【図５Ａ−５Ｄ】チエノピロール化合物ＷＺ１４１−８６（図５Ａ及び５Ｂ）、ＷＺ１４１−７４（図５Ｃ）、及びＷＺ１４１−８４（図５Ｄ）が、用量及び時間依存的にＮｌｕｃを阻害することを示す。
【図６Ａ−６Ｃ】チエノピロール化合物ＷＺ１４１−８９（図６Ａ）、ＷＺ１４１−９０（図６Ｂ）、及びＷＺ１４１−９１（図６Ｃ）が、用量及び時間依存的にＮｌｕｃを阻害することを示す。
【図７Ａ−７Ｆ】β２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１３８（図７Ａ）、ＪＲＷ−０１４０（図７Ｂ）、ＪＲＷ−０１４２（図７Ｃ）、ＪＲＷ−０１４３（図７Ｄ）、ＪＲＷ−０１４５（図７Ｅ）、及びＪＲＷ−０１４７（図７Ｆ）の透過性を示す。
【図８Ａ−８Ｆ】β２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４８（図８Ａ）、ＪＲＷ−０１４９（図８Ｂ）、ＪＲＷ−０１５１（図８Ｃ）、ＪＲＷ−０１５２（図８Ｄ）、ＪＲＷ−００５１（図８Ｅ）、及びＪＲＷ−００４３（図８Ｆ）の透過性を示す。
【図９Ａ−９Ｆ】β２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−００４４（図９Ａ）、ＪＲＷ−００１３（図９Ｂ）、ＪＲＷ−００３４（図９Ｃ）、ＪＲＷ−００５２（図９Ｄ）、ＪＲＷ−０１１０（図９Ｅ）、及びＪＲＷ−０１８７（図９Ｆ）の透過性を示す。
【図１０Ａ−１０Ｆ】β２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１８８（図１０Ａ）、ＪＲＷ−０１９０（図１０Ｂ）、ＪＲＷ−０１９１（図１０Ｃ）、ＪＲＷ−０１９２（図１０Ｄ）、ＪＲＷ−０１９５（図１０Ｅ）、及びＪＲＷ−０１９７（図１０Ｆ）の透過性を示す。
【図１１Ａ−１１Ｃ】β２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１９８（図１１Ａ）、ＪＲＷ−０２００（図１１Ｂ）、及びＪＲＷ−０２０８（図１１Ｃ）の透過性を示す。
【図１２Ａ−１２Ｅ】細胞外ＢＲＥＴを阻害するチエノピロール化合物の能力を示す。図１２Ａは、疑似細胞外ＢＲＥＴアッセイ設計の概略図を示す。図１２Ｂ〜１２Ｅは、細胞外ＢＲＥＴアッセイを用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−００１３（図１２Ｂ）、ＪＲＷ−００５１（図１２Ｃ）、ＪＲＷ−０１４７（図１２Ｄ）、及びＪＲＷ−０１８７（図１２Ｅ）の化合物反応曲線を示す。
【図１３Ａ−１３Ｅ】細胞外ルシフェラーゼ活性を阻害し、細胞内ＢＲＥＴを高めるチエノピロール化合物の能力を示す。図１３Ａは、疑似細胞外Ｎｌｕｃアッセイ設計の概略図を示す。図１３Ｂ〜１３Ｅは、細胞外Ｎｌｕｃアッセイを用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−００１３（図１３Ｂ）、ＪＲＷ−００５１（図１３Ｃ）、ＪＲＷ−０１４７（図１３Ｄ）、及びＪＲＷ−０１８７（図１３Ｅ）の化合物反応曲線を示す。
【図１４】チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７、ＪＲＷ−００５１、及びＪＲＷ−０１３８の細胞透過性を示す。
【図１５Ａ−１５Ｃ】標的会合モデルにおけるチエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７の細胞不透過性を示す。図１５Ａは、ＳＲＣ−Ｎｌｕｃアッセイ設計の概略図を示す。図１５Ｂ〜１３Ｃは、ダサチニブ−ＤＹ６０７（図１５Ｂ）及びＪＲＷ−０１４７（図１５Ｃ）の化合物反応曲線を示す。
【図１６】チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７及びＪＲＷ−００１３の透過性を示す。
【図１７Ａ−１７Ｃ】β２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−００１３（図１７Ａ）、ＪＲＷ−０１４７（図１７Ｂ）、及びＪＲＷ−０３４４（図１７Ｃ）の透過性を示す。
【図１８Ａ−１８Ｃ】ジギトニン（図１８Ｂ）及びＤＭＳＯ（図１８Ｃ）と比較した、ＪＲＷ−０３４４（図１８Ａ）の細胞生存率及び毒性を示す。
【図１９】チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７、ＪＲＷ−０３４４、及びＪＲＷ−００１３の細胞透過性を示す。
【図２０Ａ−２０Ｃ】細胞外ルシフェラーゼ活性を阻害するチエノピロール化合物ＪＲＷ−０３４４の能力を示す。図２０Ａは、ＳＲＣ−Ｎｌｕｃアッセイ設計の概略図を示す。図２０Ｂ及び２０Ｃは、ＳＲＣ−Ｎｌｕｃアッセイ（図２０Ｂ）または細胞外Ｎｌｕｃアッセイ（図２０Ｃ）を用いた、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０３４４の化合物反応曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で開示されるのは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、例えば、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書では交換可能的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び「Ｎｌｕｃ酵素」とも呼ぶ）を選択的に阻害することができるチエノピロール化合物である。細胞から排泄される安定性及び可能性により、ある特定の用途ではＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光を抑制する選択的阻害剤を使用することが有利であり得る。例えば、多数の発光システムの時間多重化を伴う用途では、一度に１つの発光シグナルのみを測定及び／または検出できるように、システムごとに選択的阻害剤を有することが有益であり得る。さらに、いくつかのプレートベースアッセイでは、ある程度の量のルシフェラーゼが細胞から排泄され得る。細胞外阻害剤化合物は、排泄されたルシフェラーゼからの発光を選択的に抑制することができるため、ある特定のアッセイにおいて信号対雑音比の改善に役立ち得る。
【００１９】
本明細書に記載のチエノピロール化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの選択的阻害剤であることが発見されている。チエノピロール化合物は、ルシフェラーゼのセレンテラジン基質の結合と競合し得、細胞透過性及び細胞不透過性阻害剤の両方を生成するために改変することができる。
【００２０】
１．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は全て当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含み、本文書が規制するであろう。本明細書で記載されるものに類似するまたは同等の方法及び材料を本発明の実践及び試験で使用することができるけれども、好まれる方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は全てその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書で開示される材料、方法及び実施例は説明に役立つのみであって、限定を意図されるものではない。
【００２１】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｃａｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」及びそれらの変形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を除外しない、制約がない従来の語句、用語または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で別段明確に指示されない限り、複数形の言及を含む。本開示はまた、明白に言及されてもされなくても、本明細書で提示される実施形態及び要素を「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」、及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」する他の実施形態も熟考する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「置換基」または「適切な置換基」は、化学的に許容可能な官能基、例えば、本発明の化合物の活性を無効にしない部分を意味するように意図される。適切な置換基の説明に役立つ例としては、ハロ基、パーフルオロアルキル基、パーフルオロアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、ハロ基、オキソ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルコキシ基、ニトロ基、アジドアルキル基、スルホン酸基、アリールまたはヘテロアリール基、アリールオキシまたはヘテロアリールオキシ基、アラルキルまたはヘテロアラルキル基、アラルコキシまたはヘテロアラルコキシ基、ＨＯ−（Ｃ＝Ｏ）−基、複素環基、シクロアルキル基、アミノ基、アルキル−及びジアルキルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、ジアルキルアミノカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基等が挙げられるが、これらに限定されない。置換基は、追加の置換基によって置換され得る。置換基は、塩形態であってもよい（例えば、スルホン酸基は、スルホネート基の形態であってもよい。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」は、２〜１０の炭素を含有し、及び２つの水素の除去によって形成される少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルケニルの代表例としては、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、及び３−デセニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルケニル基は非置換であってもよく、または１つ以上の適切な置換基、好ましくは１〜３の、上記で定義されたような適切な置換基で置換されてもよい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシアルコキシ」は、本明細書で定義されるような別のアルコキシ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。アルコキシアルコキシの代表例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシメトキシ、２−エトキシエトキシ、２−メトキシエトキシ、及びメトキシメトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシアルコキシアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキレン基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシアルコキシ基を意味する。アルコキシアルコキシアルキルの代表例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシメトキシメチル、エトキシメトキシメチル、（２−メトキシエトキシ）メチル、及び２−（２−メトキシエトキシ）エチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。アルコキシアルキルの代表例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、２−エトキシエチル、２−メトキシエチル、及びメトキシメチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシカルボニル」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。アルコキシカルボニルの代表例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル及びｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシカルボニルアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキレン基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシカルボニル基を意味する。アルコキシカルボニルアルキルの代表例としては、エトキシカルボニルメチル、３−メトキシカルボニルプロピル、４−エトキシカルボニルブチル、及び２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、好ましくは１〜３０の炭素原子、１〜１２の炭素原子、１〜１０の炭素原子、１〜８の炭素原子、１〜６の炭素原子、または１〜４の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルを指す。用語「Ｃ1−Ｃ8アルキル」は、直鎖または分枝鎖の配置で１、２、３、４、５、６、７または８の炭素を有するアルキル基を含むように定義される。例えば、「Ｃ1−Ｃ8アルキル」には具体的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル）、ヘキシル（例えば、ｎ−ヘキシル）、ヘプチル（例えば、ｎ−ヘプチル）及びオクチル（例えば、ｎ−オクチル）が挙げられる。用語「Ｃ1−Ｃ6アルキル」は、直鎖または分枝鎖の配置で１、２、３、４、５または６の炭素を有するアルキル基を含むように定義される。例えば、「Ｃ1−Ｃ6アルキル」には具体的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル）、及びヘキシル（例えば、ｎ−ヘキシル）が挙げられる。用語「Ｃ1−Ｃ4−アルキル」は、直鎖または分枝鎖の配置で１、２、３、または４の炭素を有するアルキル基を含むように定義される。例えば、「Ｃ1−Ｃ4−アルキル」には具体的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。本発明のアルキル基は、非置換でもよく、または１つ以上の適切な置換基、好ましくは１〜３の上記で定義されたような適切な置換基で置換されてもよい。例えば、アルキル基は、１つ以上のハロ置換基で置換されて、ハロアルキル基を形成してもよく、または１つ以上のヒドロキシ置換基で置換されて、ヒドロキシアルキル基を形成してもよく、または１つ以上のアルコキシ基で置換されて、アルコキシアルキル基を形成してもよい。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルアミノ」は、本明細書で定義されるようなアミノ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルキルアミノの代表例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチル−アミノ及びｓｅｃ−ブチルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルアミノアルキル」は、本明細書で定義されるようなアミノアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルキルアミノアルキル基の代表例としては、メチルアミノエチル及びメチルアミノ−２−プロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルカルボニル」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルキルカルボニルの代表例としては、アセチル、１−オキソプロピル、２，２−ジメチル−１−オキソプロピル、１−オキソブチル、及び１−オキソペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルカルボニルアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキルカルボニル基を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルカルボニルアルキルアミド」は、本明細書で定義されるようなアルキルアミド基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキルカルボニル基を指す。
【００３６】
用語「アルキレン」は、１〜１０の炭素原子の飽和、直鎖または分岐鎖の炭化水素由来の二価基を意味する。アルキレンの代表例としては、−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）−、−Ｃ（ＣＨ3）2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2Ｃ（ＣＨ3）2−、及び−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の炭素を有し、及び１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。本発明のアルキニル基には、エチニル、プロピニル及びブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルキニル基は、非置換でもよく、または１つ以上の適切な置換基、好ましくは１〜３の、上記で定義されたような適切な置換基で置換されてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「アミド」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基（すなわち、−ＣＯＮＨ2）を介して親分子部分に付加される、アミノ基を指す。本明細書で使用される場合、用語「アルキルアミド」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される、アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を指す。アルキルアミドの代表例としては、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、エチルメチルアミノカルボニル、及びｎ−ヘキシルアミノカルボニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ」は、−ＮＨ2基を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「アミノアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、少なくとも１つの本明細書で定義されるようなアミノ基を指す。アミノアルキルの代表例としては、アミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、４−アミノブチル、５−アミノペンチル、及び６−アミノヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「アミノアルキルアミド」は、本明細書で定義されるようなアルキルアミド基を介して親分子部分に付加される、少なくとも１つの本明細書で定義されるようなアミノ基を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ保護基」は、保護基が結合する窒素原子上で化学反応が発生することを防ぐ部分を指す。また、アミノ保護基は、化学反応によって除去可能でなければならない。そのような基は、当該技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に具体的に記載されているようなものが含まれ、参照することでその全てを本書に取り入れることとする。適切なアミノ保護基としては、カルボベンジルオキシ（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5または−ＮＨ−Ｃｂｚ）；ｔ−ブチルオキシカルボニル（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）3または−ＮＨ−Ｂｏｃ）；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）、及びアリルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。（上記の各々では、−ＮＨ−は、保護されているアミノ基からの窒素を表す。）
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「アミノルシフェリン」は、（４Ｓ）−２−（６−アミノ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、またはこの分子の置換アナログを指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、単環式、二環式または三環式の芳香族ラジカルを意味する。アリール基の代表例としては、フェニル、ジヒドロインデニル、インデニル、ナフチル、ジヒドロナフタレニル及びテトラヒドロナフタレニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアリール基は、１つ以上の適切な置換基、好ましくは１〜５の、上記で定義されたような適切な置換基によって任意で置換されてもよい。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアリール基を指す。アリールアルキルの代表例としては、フェニルメチル（すなわち、ベンジル）及びフェニルエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「アリールカルボニル」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアリール基を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「生物発光」または「発光」は、酵素と光を生成する基質の間の反応の結果として生成された光のことを指し得る。そのような酵素（生物発光酵素）の例としては、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ、ホタルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓまたはＰｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ、コメツキムシルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、エクオリン発光タンパク質、オベリン発光タンパク質等が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「カルボニル」または「（Ｃ＝Ｏ）」（アルキルカルボニル、アルキル−（Ｃ＝Ｏ）−またはアルコキシカルボニルのような語句で使用されるような）は、アルキル基またはアミノ基（すなわち、アミド基）のような第２の部分への＞Ｃ＝Ｏ部分の結合を指す。アルコキシカルボニルアミノ（すなわち、アルコキシ（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）は、アルキルカルバメート基を指す。カルボニル基は、本明細書では（Ｃ＝Ｏ）としても同等に定義される。アルキルカルボニルアミノは、アセトアミドのような基を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「カルボキシ」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「カルボキシアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなカルボキシ基を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「カルボキシアルキルアミド」は、本明細書で定義されるようなアミド基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなカルボキシアルキル基を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「セレンテラジン基質」は、ルシフェラーゼ（例えば、海洋ルシフェラーゼ）のような種々の生物発光タンパク質によって作用すると発光するレポーター分子のクラスを指す。セレンテラジン基質には、セレンテラジン並びにそのアナログ及び誘導体を含む。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、任意で１または２の二重結合を含有する単環式、二環式または三環式の炭素環ラジカル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル及びビシクロ［５．２．０］ノナニル等）を指す。本発明のシクロアルキル基は、非置換でもよく、または１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜５の、上記で定義されたような適切な置換基で置換されてもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキルアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなシクロアルキル基を指す。シクロアルキルアルキルの代表例としては、シクロヘキシルメチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキルアミド」は、本明細書で定義されるようなアミド基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなシクロアルキル基を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「ジアルキルアミノ」は、本明細書で定義されるようなアミノ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるような、２つの独立して選択されたアルキル基を指す。ジアルキルアミノの代表例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ、及びＮ−イソプロピル−Ｎ−メチルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「ジアルキルアミノアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなジアルキルアミノ基を指す。ジアルキルアミノアルキルの代表例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル及びＮ，Ｎ−メチル（２−プロピル）アミノエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「ジアルキルアミノアルキルアミド」は、本明細書で定義されるようなアルキルアミド基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなジアルキルアミノ基を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードのラジカルを指す。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルコキシ」は、１、２、３または４のハロゲン原子によって置換された本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。ハロアルコキシの代表例としては、クロロメトキシ、２−フルオロエトキシ、トリフルオロメトキシ及びペンタフルオロエトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルキル」は、１、２、３または４のハロゲン原子によって置換された本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。ハロアルキルの代表例としては、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、２−クロロ−３−フルオロペンチル及び４，４，４−トリフルオロブチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、単環式のヘテロアリールまたは二環式のヘテロアリールを指す。単環式のヘテロアリールは、５員環または６員環である。５員環は、２つの二重結合を含有する。５員環は、ＯまたはＳから選択されるヘテロ原子を１つ；または１、２、３または４の窒素原子及び任意で酸素原子または硫黄原子を１つ含有してもよい。６員環は、３つの二重結合、及び１、２、３または４の窒素原子を含有する。単環式のヘテロアリールの代表例としては、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、１、３−オキサゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピロリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、１，３−チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、及びトリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールには、フェニルに融合された単環式ヘテロアリール、または単環式シクロアルキルに融合された単環式ヘテロアリール、または単環式シクロアルケニルに融合された単環式ヘテロアリール、または単環式ヘテロアリールに融合された単環式ヘテロアリール、または単環式の複素環に融合された単環式ヘテロアリールが挙げられる。二環式ヘテロアリールの代表例としては、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、６，７−ジヒドロ−ｌ，３−ベンゾチアゾリル、イミダゾ［ｌ，２−ａ］ピリジニル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル、チアゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル及び５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−５−イルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のヘテロアリール基は、非置換でもよく、または１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜５の、上記で定義されたような適切な置換基で置換されてもよい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなヘテロアリール基を指す。ヘテロアリールアルキルの代表例としては、フル−３−イルメチル、１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル、１Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル、１−（ピリジン−４−イル）エチル、ピリジン−３−イルメチル、６−クロロピリジン−３−イルメチル、ピリジン−４−イルメチル、（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）メチル、（６−（シアノ）ピリジン−３−イル）メチル、（２−（シアノ）ピリジン−４−イル）メチル、（５−（シアノ）ピリジン−２−イル）メチル、（２−（クロロ）ピリジン−４−イル）メチル、ピリミジン−５−イルメチル、２−（ピリミジン−２−イル）プロピル、チエン−２−イルメチル、及びチエン−３−イルメチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「複素環」または「ヘテロシクリル」は、単環式の複素環、二環式の複素環、または三環式の複素環を指す。単環式の複素環は、酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する３、４、５、６、７、または８員環である。３員環または４員環は、ゼロまたは１つの二重結合と酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子１つを含有する。５員環は、ゼロまたは１つの二重結合と酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択される１、２または３のヘテロ原子を含有する。６員環は、ゼロ、１または２の二重結合と酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択される１、２または３のヘテロ原子を含有する。７員環及び８員環は、ゼロ、１、２または３の二重結合と酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択される１、２または３のヘテロ原子を含有する。単環式の複素環の代表例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルフォリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ホスフィナン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルフォリニル、１，１−ジオキシドチオモルフォリニル（チオモルフォリンスルホン）、チオピラニル、トリチアニル及び２，５−ジオキソ−ピロリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式の複素環は、フェニル基に融合された単環式の複素環、または単環式シクロアルキルに融合された単環式の複素環、または単環式シクロアルケニルに融合された単環式の複素環、または単環式の複素環に融合された単環式の複素環、または環の隣接しない２つの原子が１、２、３または４の炭素原子のアルキレン架橋または２、３または４の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結される架橋された単環式の複素環の環系である。二環式の複素環の代表例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾチエニル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２−アザビシクロ［２．２．ｌ］ヘプト−２−イルを含む）、２，３−ジヒドロ−ｌＨ−インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、９−ホスファビシクロ［３．３．１］ノナン、８−ホスファビシクロ［３．２．１］オクタン、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式の複素環は、フェニル基に融合された二環式の複素環、または単環式シクロアルキルに融合された二環式の複素環、または単環式シクロアルケニルに融合された二環式の複素環、または単環式の複素環に融合された二環式の複素環、または二環式の環の隣接しない２つの原子が１、２、３または４の炭素原子のアルキレン架橋または２、３または４の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結される二環式の複素環によって例示される。三環式の複素環の例としては、オクタヒドロ−２，５−エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ−２Ｈ−２，５−メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ−ｌＨ−ｌ，４−メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ−アドマンタン（１−アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、オキサ−アダマンタン（２−オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）及び２，４，６−トリオキサ−８−ホスファトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の複素環基は、非置換でもよく、または１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜３の、上記で定義されたような適切な置換基で置換されてもよい。本発明の複素環基は、環に結合した１つ以上のオキソ基（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）基を含有してもよい。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロシクリルアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなヘテロシクリル基を指す。ヘテロシクリルアルキルの代表例としては、ピペリジン−４−イルメチル、ピペラジン−１−イルメチル、３−メチル−１−ピロリジン−１−イルブチル、（１Ｒ）−３−メチル−１−ピロリジン−１−イルブチル、（１Ｓ）−３−メチル−１−ピロリジン−１−イルブチル、及び３−モルフォリノプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロシクリルアミド」は、本明細書で定義されるようなアミド基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなヘテロシクリル基を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシアルコキシ」は、少なくとも１つのヒドロキシ基によって置換された、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。ヒドロキシアルコキシの代表例としては、ヒドロキシエトキシ及び２−ヒドロキシプロポキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、少なくとも１つのヒドロキシ基によって置換された、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。ヒドロキシアルキルの代表例としては、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシペンチル、４−ヒドロキシブチル、２−エチル−４−ヒドロキシヘプチル、３，４−ジヒドロキシブチル、及び５−ヒドロキシペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシアルキルアミド」は、アミド基に結合したヒドロキシアルキル基、例えば、−アミド−アルキル−ＯＨを指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシカルボニル」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される本明細書で定義されるようなヒドロキシ基を指す。
【００７２】
本明細書で交換可能に使用される用語「発光酵素」、「生物発光酵素」または「ルシフェラーゼ」は、生物発光で使用される酸化酵素のクラスを指し、酵素は、基質を与えられると光を生成し、発光する。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ基質を使用する天然に存在する、組換えのまたは変異体のルシフェラーゼであってもよい。ルシフェラーゼ基質は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体またはアナログ、プレルシフェリン誘導体またはアナログ、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体またはアナログであってもよい。発光酵素は、天然に存在するならば、生物から当業者によって容易に得られてもよい。発光酵素が、天然に存在するまたは組換えであるものまたは変異体の発光酵素であるならば、例えば、天然に存在する発光酵素のルシフェラーゼ−セレンテラジン反応またはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における活性を保持するものであるならば、それは、発光酵素をコードする核酸を発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等の培養物から容易に得ることができる。さらに、組換えの発光酵素または変異体の発光酵素は、ルシフェラーゼをコードする核酸を用いた試験管内の細胞遊離系に由来することができる。適切な発光酵素としては、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｉｄｅａ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ）、甲虫ルシフェラーゼ（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａなど）、刺胞動物（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、Ａｒｉｓｔｅｉｄａｅ、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒｉｄａｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｄａｅ、Ｓｅｒｇｅｓｔｉｄａｅ、Ｐａｓｉｐｈｅｉｄａｅ及びＴｈａｌａｓｓｏｃａｒｉｄｉｄａｅ十脚類ファミリーなどの海洋生物由来などの、生物発光十脚類由来のルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼなどのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａルシフェラーゼ及びＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａルシフェラーゼなどのＭｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ、Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉルシフェラーゼなどのＶａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ  ｘｉｐｈｉａｓルシフェラーゼなどの、カイアシ類のルシフェラーゼ、並びにＡｅｑｕｏｒｉｎなどの発光タンパク質、並びにそれらの変異体、組換え体、及び突然変異体が含まれる。
【００７３】
「発光反応混合物」は、発光酵素が光シグナル、すなわち、発光を生成するのを可能にするであろう物質を含有する。混合物はまた、酵素、例えば、ルシフェラーゼ酵素またはルシフェラーゼも含有してもよい。発光シグナルを生成するのに必要とされる物質及び特定の濃度及び／または量は、使用される発光酵素並びに実施されるアッセイの種類に応じて変化するであろう。適切なｐＨで反応を維持するための緩衝液、例えば、酵素活性を維持するのに役立つためのＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、還元剤、界面活性剤等のような添加剤を含む他の物質が溶液に添加されることが多いであろう。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「メチレンジオキシ」は、メチレンジオキシの酸素原子が２つの隣接する炭素原子を介して親分子部分に連結される−ＯＣＨ2Ｏ−基を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」及び「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ」は、交換可能に使用され、その野生型、変異体、及び突然変異体を含む、深海エビのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（例えば、配列番号１）から分泌されたルシフェラーゼを指す。例えば、適切なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ変異体は、米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号に記載されており、それら各々の内容全体を参照によって本明細書に引用したものとする。例示のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼとしては、例えば、配列番号２（本明細書では交換可能的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び「Ｎｌｕｃ酵素」とも呼ぶ）のものが挙げられる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「オキソ」は、結合相手が炭素原子である二重結合した酸素（＝Ｏ）ラジカルを指す。そのようなラジカルは、カルボニル基として考えることができる。
【００７７】
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸の配列を指す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８０以下のアミノ酸、または３５以下のアミノ酸、または１０以下のアミノ酸または５以下のアミノ酸を含有してもよい。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「レポーター部分」は、適した条件下で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する部分を意味し得る。例示のレポーター部分としては、蛍光団、発光分子、色素、放射性標識体、及びルシフェラーゼなどの酵素の基質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、例えば、レポーター部分が酵素の基質である場合、レポーター部分は、検出可能なシグナルを間接的に生成してもよい。基質と、酵素との反応が起き、蛍光または発光などの検出可能なシグナルが生成する。本明細書で使用される場合、用語「生物発光レポーター部分」は、ルシフェラーゼの基質である部分を指し得る。例えば、生物発光レポーター部分は、ルシフェリン、ルシフェリン前駆体、アミノルシフェリン、キノリル−ルシフェリン、ナフチルルシフェリン、フルオロルシフェリン、クロロルシフェリンなどのルシフェリン誘導体、ルシフェリン誘導体の前駆体、セレンテラジン、またはセレンテラジン誘導体もしくはフリマジンなどのセレンテラジンアナログであってもよい。生成した発光シグナルは、発光測定器を使用して検出してもよい。本明細書で使用される場合、用語「蛍光レポーター部分」は、蛍光を発する部分を意味し得る。例えば、蛍光レポーター部分は、クマリン、Ｒ１１０、フルオロセイン、ＤＤＡＯ、レゾルフィン、クレシルバイオレット、シリルキサンテン、またはカルボピロニンなどの蛍光団であってもよい。蛍光は、蛍光光度計を使用して検出してもよい。
【００７９】
多成分置換基に付けられる接頭辞は、それが先行する最初の成分に適用されるだけである。例えれば、用語「シクロアルキルアルキル」は、２つの成分：アルキルとシクロアルキルを含有する。従って、Ｃ1−Ｃ6シクロアルキルアルキルにおけるＣ1−Ｃ6接頭辞は、シクロアルキルアルキルのアルキル成分が１〜６の炭素原子を含有することを意味し；Ｃ1−Ｃ6接頭辞は、シクロアルキル成分を説明しない。さらに例えれば、用語「ハロ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル」は、ハロメチル、ハロエチル、ハロプロピル、ハロブチル、ハロペンチル、及びハロヘキシルを指す。さらに例えれば、ハロアルコキシアルキルにおける接頭辞「ハロ」は、アルコキシアルキル置換基のアルコキシ成分のみが１つ以上のハロゲンラジカルで置換されることを示す。ハロゲン置換がアルキル成分で生じるだけであるならば、置換基は代わりに「アルコキシハロアルキル」と記載されることになる。
【００８０】
置換基は、それが１つ以上の水素原子に結合される少なくとも１つの炭素原子または窒素原子を含むのであれは、「置換可能である」。従って、例えば、水素、ハロゲン、及びシアノは、この定義の範囲内に入らない。加えて、そのような原子を含有するヘテロシクリルにおける硫黄原子は、１または２のオキソ置換基で置換可能である。
【００８１】
置換基が「置換されている」と記載されるのであれば、非水素ラジカルは、置換基の炭素または窒素上の水素ラジカルの位置にある。従って、例えば、置換されたアルキル置換基は、少なくとも１つの非水素ラジカルがアルキル置換基の水素ラジカルの位置にあるアルキル置換基である。例えれば、モノフルオロアルキルは、フルオロラジカルで置換されたアルキルであり、ジフルオロアルキルは、２つのフルオロラジカルで置換されたアルキルである。置換基上で１を超える置換があるのならば、各非水素ラジカルは、同一であってもよいし、異なっていてもよいこと（特に言及されない限り）が認識されるべきである。
【００８２】
置換基が「非置換である」と言われる、または「置換された」または「任意で置換された」と言われない場合、置換基はどんな置換基も有さないことを意味する。置換基が「任意で置換されている」と記載されるのであれば、置換基は、（１）置換されていない、または（２）置換されているのいずれかである。置換基が特定の数までの非水素ラジカルによって任意で置換されていると記載されるのであれば、その置換基は、（１）置換されていない、または（２）非水素ラジカルの特定の数まで、または置換基上の置換可能な位置の最大数まで、いずれか少ない方で置換されてもよい。従って、例えば、置換基が３つまでの非水素ラジカルによって任意で置換されるヘテロアリールとして記載されるのであれば、そのときは、３未満の置換可能な位置を持つヘテロアリールが、そのヘテロアリールが置換可能な位置を有するのと同じ数までの非水素ラジカルによって任意で置換されることになる。例えれば、テトラゾリル（たった１つの置換可能な位置を有する）は、１つまでの非水素ラジカルによって任意で置換されることになる。さらに例えれば、アミノ窒素が２までの非水素ラジカルによって任意で置換されていると記載されるのであれば、そのときは、１級アミノ窒素は、２までの非水素ラジカルによって任意で置換されるであろう一方で、２級アミノ窒素は、最大で、たった１つの非水素ラジカルによって任意で置換されるであろう。
【００８３】
置換基が基から「独立して選択される」と記載されるのであれば、各置換基は、他とは独立して選択される。従って、各置換基は、他の置換基と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００８４】
本明細書での数範囲の記述では、同程度の精度を有するその間に介在するそれぞれの数が明確に企図される。例えば、６〜９の範囲に対して、数７及び８が、６及び９に加えて企図され、範囲６．０〜７．０に対して、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明確に企図される。
【００８５】
２．チエノピロール化合物
本明細書で提供されるのは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び／またはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ活性を阻害し得るチエノピロール化合物である。チエノピロール化合物は、式（Ｉ）の化合物及びその塩を含み：
2018524334.tif 000010
（Ｉ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；及び
Ｒ3及びＲ4は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、点線は、結合の存在を表し、Ｘは、ＣＨである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ａは、フェニル環である。いくつかの実施形態では、Ａは、５員のヘテロアリール環である。いくつかの実施形態では、Ａは、チエニル環である。いくつかの実施形態では、Ａは、フラニル環である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、水素、Ｃ1−Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及びアリールアルキルからなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ1は、水素、エチル、ｎ−ヘキシル、２−（２−メトキシエトキシ）エチル及びベンジルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、エチルである。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｒ2は、任意で置換されたアリールである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ2は、置換フェニルである。Ｒ2は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、及びヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つの置換基でフェニル置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、１つのメチル基でフェニル置換される（例えば、ｍ−トリル）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、Ｒ2は、任意で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、エチルであり、Ｒ2は、ｍ−トリルである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、Ｒ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する。いくつかの実施形態では、任意で置換された単環式の複素環は、任意で置換されたピロリジン、ピペリジン及びピペラジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、任意で置換された単環式の複素環は、未置換ピロリジン、未置換ピペリジン、１つの置換基で置換されたピペリジン（例えば、エトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル）、または１つの置換基で置換されたピペラジン（例えば、メチルなどのＣ1−Ｃ4アルキル）からなる群から選択される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、水素である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は、未置換Ｃ1−Ｃ8アルキル（例えば、メチル）、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）7−ＣＯＯＨ），Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）7−ＣＯＯＣＨ3）、任意で置換されたフェニル（以下）、任意で置換されたＣ5−Ｃ6シクロアルキル（例えば、未置換シクロペンチル、未置換シクロヘキシル、または置換シクロヘキシル）、任意で置換されたヘテロシクリル（例えば、未置換ピペリジニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、−ＣＯ−（ＣＨ2）4−ＣＯＯＣＨ3などのアルコキシカルボニルアルキルカルボニル、または−ＣＯ−（ＣＨ2）4−ＣＯＯＨなどのカルボキシアルキルカルボニルで置換されたピペリジニル）、任意で置換されたヘテロアリールアルキル（例えば、−ＣＨ2−ピリジルなどのピリジル−Ｃ1−Ｃ4−アルキル）、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキル（例えば、−（ＣＨ2）3−モルフォリノなどのモルフォリノ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル）からなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ4は、未置換であるかまたは、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3）及びＣ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ4−アルキル（例えば、−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3）からなる群から選択される置換基などの１つの置換基で置換されるフェニルである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3）、Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）3ＣＨ3または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）5ＣＨ3）、ヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）2ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＯＨ），アミド（すなわち、−ＣＯＮＨ2）、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＮＨ2）、Ｃ1−Ｃ4−ジアルキルアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）2Ｎ（ＣＨ3）2）、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）3ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）5ＣＯＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ），スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＳＯ3Ｈ),スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＳＯ3−）、Ｃ1−Ｃ4−アルキルカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）3ＣＯＯＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）5ＣＯＯＣＨ3または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）7ＣＯＯＣＨ3）、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−シクロヘキシル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−シクロヘキシル−ＣＯＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−シクロヘキシル−ＣＯＯＣＨ3）、及びヘテロシクリルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ピペリジニル、未置換またはメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアセチルで置換された）からなる群から選択される１つの置換基で置換されるシクロヘキシルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ4は、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＮＨ2）であり、アミノ基は、アミノ保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）で保護され、またはアミノ基はプロトン化され、塩（例えば、ヒドロクロリド塩）を形成し、またはアミノ基は、蛍光団（例えば、フルオロセイン）またはポリペプチド（例えば、−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐペプチド、末端でアセチル化されてもよい）でさらに官能化される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉａ）を有し：
2018524334.tif 000011
（Ｉａ）
式中、Ｒ3及びＲ4は、式（Ｉ）について上述された実施形態のいずれかで定義された通りである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉｂ）を有し：
2018524334.tif 000012
（Ｉｂ）
式中：
Ｙは、−ＮＲaＲb及び−ＯＲcからなる群から選択され；
Ｒa及びＲbは、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；またはＲa及びＲbは、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
Ｒcは、水素及び任意で置換されたＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、Ｙは、−ＯＲcである。いくつかの実施形態では、Ｒcは、水素及びメチルからなる群から選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、Ｙは、−ＮＲaＲbである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、Ｒaは、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒbは、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒbは、水素、未置換Ｃ1−Ｃ6アルキル（例えば、ｎ−ブチルまたはｎ−ヘキシル）、ヒドロキシアルキル（例えば、（ＣＨ2）2ＯＨまたは−（ＣＨ2）6ＯＨなどのヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル）、任意で置換されたアミノアルキル（例えば、−（ＣＨ2）6ＮＨ2などのアミノ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル）、ジアルキルアミノアルキル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）2Ｎ（ＣＨ3）2などのＣ1−Ｃ4−ジアルキルアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド）、カルボキシアルキル（例えば、−（ＣＨ2）3ＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）5ＣＯＯＨまたは−（ＣＨ2）7ＣＯＯＨなどのカルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル）、スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）6ＳＯ3Ｈ),スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）6ＳＯ3−）、アルキルカルボニルアルキル（例えば、−（ＣＨ2）3ＣＯＯＣＨ3、−（ＣＨ2）5ＣＯＯＣＨ3または−（ＣＨ2）7ＣＯＯＣＨ3などのＣ1−Ｃ4−アルキルカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド）、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキル（例えば、−シクロヘキシル、−シクロヘキシル−ＣＯＯＨまたは−シクロヘキシル−ＣＯＯＣＨ3）、及び任意で置換された６員のヘテロシクリル（例えば、未置換またはメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアセチルで置換された）からなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒbは、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）6ＮＨ2）であり、アミノ基は、アミノ保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）で保護され、またはアミノ基はプロトン化され、塩（例えば、ヒドロクロリド塩）を形成し、またはアミノ基は、蛍光団（例えば、フルオロセイン）またはポリペプチド（例えば、−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐペプチド、末端でアセチル化されてもよい）でさらに官能化される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｒa及びＲbは、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。いくつかの実施形態では、Ｒa及びＲbは、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する。いくつかの実施形態では、任意で置換された単環式の複素環は、任意で置換されたピペリジンである。いくつかの実施形態では、単環式の複素環は、未置換ピペリジン及び１つの置換基で置換されたピペリジンからなる群から選択される（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3などのカルボキシルまたはアルコキシカルボニル）。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、化合物は、以下の式（Ｉｂ’）を有し、
2018524334.tif 000013
（Ｉｂ’）
式中、Ｙは、式（Ｉｂ）について上述された実施形態のいずれかで定義された通りである。
【０１０３】
適切な化合物としては、以下のものが挙げられる：
【０１０４】
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１０５】
Ｎ−エチル−２−（５−（ピロリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
【０１０６】
Ｎ−エチル−２−（５−（ピペリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
【０１０７】
１−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル；
【０１０８】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−フェニル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１０９】
２−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）フェニル）酢酸エチル；
【０１１０】
３−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）安息香酸メチル；
【０１１１】
メチル−シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１１２】
８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸；
【０１１３】
６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸；
【０１１４】
トランス−メチル−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１１５】
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１１６】
Ｎ−（トランス−４−（ブチルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１１７】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１１８】
Ｎ−（トランス−４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１１９】
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸；
【０１２０】
Ｎ−（トランス−４−カルバモイルシクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１２１】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１２２】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル；
【０１２３】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル；
【０１２４】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
【０１２５】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸；
【０１２６】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸；
【０１２７】
Ｎ−（トランス−４−（シクロヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１２８】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１２９】
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル；
【０１３０】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ピペリジン−４−イルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１３１】
Ｎ−（トランス−４−（（１−アセチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１３２】
（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル；
【０１３３】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５（６）−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１３４】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミドヒドロクロリド；
【０１３５】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１３６】
メチル−トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１３７】
トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１３８】
（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（カルボキシメチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オイック酸；
【０１３９】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１４０】
Ｎ−シクロペンチル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１４１】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１４２】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１４３】
Ｎ−エチル−２−（５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
【０１４４】
４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
【０１４５】
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１４６】
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１４７】
メチル−トランス−４−（４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１４８】
４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
【０１４９】
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１５０】
メチル−トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１５１】
４−（２−（ベンジル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
【０１５２】
６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
【０１５３】
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル；
【０１５４】
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
【０１５５】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
【０１５６】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸カリウム；
【０１５７】
トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
【０１５８】
トランス−４−（４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１５９】
トランス−４−（４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６０】
トランス−４−（４−（２−（（３−カルバモイルフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６１】
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６２】
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６３】
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６４】
トランス−４−（４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６５】
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６６】
トランス−４−（４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６７】
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６８】
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１６９】
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７０】
４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
【０１７１】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
【０１７２】
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７３】
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７４】
トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７５】
トランス−４−（４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７６】
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７７】
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
【０１７８】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド；
【０１７９】
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
【０１８０】
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；及び
【０１８１】
トランス−４−（６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル。
【０１８２】
（１）塩形態
本明細書に記載のチエノピロール化合物は、塩の形態であってもよい。化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させて、従来の方法で親化合物を単離することによって再生してもよい。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解性などのある特定の物理的特性において、種々の塩形態とは異なるが、それ以外の場合、塩は、本開示の目的のため、化合物の親形態と等価である。
【０１８３】
例えば、化合物がアニオン性であるかまたはアニオン性であり得る官能基（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−であり得る）を有する場合、適切なカチオンを用いて塩を形成させ得る。適切な無機カチオンの例としては、Ｎａ+及びＫ+などのアルカリ金属イオン、Ｃａ2+及びＭｇ2+などのアルカリ土類カチオン、及び他のカチオンなどが挙げられるが、これらに限定されない。適切な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ4+）、及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ3Ｒ1+、ＮＨ2Ｒ2+、ＮＨＲ3+、ＮＲ4+）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミンから誘導されるもの、並びに、リシン及びアルギニンなどのアミノ酸である。
【０１８４】
化合物がカチオン性であるかまたはカチオン性であり得る官能基（例えば、−ＮＨ2は、−ＮＨ3+であり得る）を有する場合、適切なアニオンを用いて塩を形成させ得る。適切な無機アニオンの例としては、以下の無機酸：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
適切な有機アニオンの例としては、以下の有機酸：２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸から誘導されたものが挙げられるが、これらに限定されない。適切な高分子有機アニオンの例としては、以下の高分子酸：タンニン酸及びカルボキシメチルセルロースから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
特に断りのない限り、本明細書の特定のチエノピロール化合物への言及は、その塩の形態も含む。
【０１８７】
（２）異性体
ある特定のチエノピロール化合物は、１つ以上の特定の、幾何異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、エピマー、アトロピック、立体異性体、互変異性体、配座異性体、またはアノマーの形態、例えば、限定するものではないが、シス形及びトランス形；Ｅ形及びＺ形；ｃ形、ｔ形及びｒ形；エンド形及びエキソ形；Ｒ形、Ｓ形及びメソ形；Ｄ形及びＬ形；ｄ形及びｌ形；（＋）形及び（−）形；ケト形、エノール形及びエノラート形；シン形及びアンチ形；シンクリナル形及びアンチクリナル形；α形及びβ形；アキシアル形及びエクアトリアル形；舟形、いす型、ねじれ形、エンベロープ形、及び半いす形；並びに、それらの組合せなどがあるが、それらに限定されない。以下では、集合的に、「異性体（ｉｓｏｍｅｒ）」（または、「異性体形態（ｉｓｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍｓ）」）と称する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の立体異性体の鏡像異性的に豊富な異性体であってもよい。例えば、化合物は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の鏡像体過剰率を有し得る。本明細書で使用される場合、鏡像異性体は、分子構造が互いに鏡像の関係をもつ一対の化学化合物のいずれかを指す。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の化合物の調製物は、選択された立体化学、例えば、選択された立体中心に対応するＲまたはＳを有する化合物の異性体が豊富である。例えば、化合物は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の選択された立体中心の選択された立体化学を有する化合物に対応する純度を有する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、選択された立体化学、例えば、選択された立体中心でのＲまたはＳを有する構造または複数の構造が豊富である本明細書に開示の化合物の調製物を含む。例示的なＲ／Ｓ配置は、本明細書に記載の例で提供されるものであることができる。
【０１９１】
「豊富な調製物」は、本明細書で使用される場合、対象の化合物内の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の選択された立体中心の選択された立体配置が豊富である。例示的な選択された立体中心、及びその例示的な立体配置は、例えば、本明細書に記載される例において、本明細書で提供されるものから選択することができる。豊富なとは、例えば、その調製物が選択された立体中心の選択された立体化学を有する化合物分子が調製物中で少なくとも６０％であることを意味する。ある実施形態では、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。豊富なとは、対象分子のレベルを指し、特定されない限り、プロセス限定を暗示するものではない。
【０１９２】
チエノピロール化合物は、ラセミ形態であるいは立体特異的合成または分割のいずれかにより個々の鏡像異性体またはジアステレオマーとして調製してもよい。例えば、化合物は、光学活性塩基との塩形成、続く、分別結晶化及び遊離酸の再生による立体異性体の対の形成のような、標準的方法によりそれらの成分の鏡像異性体またはジアステレオマーに分割することができる。化合物は、立体異性体エステルまたはアミドの形成、続くクロマトグラフィー分離及びキラル補助剤の除去により分割してもよい。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを使用して分割してもよい。鏡像異性体は、リパーゼ酵素を用いた対応するエステルのラセミ体の速度論的分割から得てもよい。
【０１９３】
以下で互変異性型について論ずる場合を除き、構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）（または構造（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ））異性体（すなわち、単に空間的な原子の位置により異なるのではなく、原子間の結合が異なっている異性体）は、特に、本明細書で使用されている用語「異性体」から除外される。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ3への言及は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基、−ＣＨ2ＯＨへの参照として解釈されるべきではない。同様に、オルト−クロロフェニルへの参照は、その構造異性体であるメタ−クロロフェニルへの参照として解釈されるべきではない。しかしながら、構造の群への言及は、その群に属する構造的な異性体形態も含み得る（例えば、Ｃ3−アルキルまたはプロピルは、ｎ−プロピル及びイソプロピルを含み；Ｃ4−アルキルまたはブチルは、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−及びｔｅｒｔ−ブチルを含み；メトキシフェニルは、オルト−メトキシフェニル、メタ−メトキシフェニル、及びパラ−メトキシフェニルを含む）。
【０１９４】
上記の除外は、互変異性体、例えば、ケト形、エノール形、及びエノラート形（例えば、以下の互変異性体対：ケト／エノール、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ、及び、ニトロ／アシ−ニトロ）には適用されない。
【０１９５】
１つ以上の同位体の置換基を有する化合物は、用語「異性体」に含まれることを特に留意されたい。例えば、Ｈは、1Ｈ、2Ｈ（Ｄ）、及び3Ｈ（Ｔ）などのいずれの同位体形態で存在してもよく；Ｃは、12Ｃ、13Ｃ、及び14Ｃなどのいずれの同位体形態で存在してもよく；Ｏは、16Ｏ及び18Ｏなどのいずれの同位体形態で存在してもよく；その他同様である。
【０１９６】
３．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ
本発明のチエノピロール化合物を使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害し得る。チエノピロール化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を阻害し得る。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、または配列番号２のルシフェラーゼなどのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの変異体であってもよい。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ変異体は、米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号に記載されており、それら各々の内容全体を参照によって本明細書に引用したものとする。
【０１９７】
Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼの天然に存在する形態の成熟１９ｋＤａサブユニットのポリペプチド配列は、配列番号１で提供される。本明細書に記載の方法で使用することができる、合成Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの例示的なポリペプチド配列は、配列番号２で提供される（本明細書では交換可能的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び「Ｎｌｕｃ酵素」とも呼ぶ）。
【０１９８】
４．セレンテラジン基質
本発明のチエノピロール化合物を使用して、ルシフェラーゼへの結合からセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質と競合または干渉することによって、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。セレンテラジン基質は、ルシフェラーゼ及び他の生物発光タンパク質によって作用した場合に冷光を発するレポーター分子の群である。セレンテラジン基質の例としては、ＷＯ２００３／０４０１００、米国特許公開第２００８／０２４８５１１号、及び米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１１７６６７号に開示されたものに加えて、セレンテラジン；セレンテラジン誘導体及び／またはアナログ、例えば、２−フラニルルメチル−デオキシ−セレンテラジン（フリマジン）、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ビス−デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン−ｈｈ」）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、セレンテラジン−ｖ、及び２−メチル−セレンテラジン；プロセレンテラジン（すなわち、化合物をルシフェラーゼのための基質に変換する、非発光酵素のための基質ではない化合物）、キノンマスクされたセレンテラジン等が挙げられるが、これらに限定されない。セレンテラジン基質のさらなる例は、例えば、米国出願第２０１２／０１０７８４９号、米国出願第２０１３／０１３０２８９号、米国特許出願第１４／６０８，９１０号、及び米国特許出願第１４／６０９，３７２号に記載されており、それら各々を参照によって本明細書に引用したものとする。
【０１９９】
５．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害する方法
本開示のチエノピロール化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害する方法で使用され得る。本方法は、本明細書に開示のチエノピロール化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｂ’）の化合物）を、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現または含有する細胞と接触させることを含み得、本開示の化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。本開示のチエノピロール化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを用いて酵素の存在または活性を検出するために使用されるアッセイに使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ由来のシグナルを選択的に阻害し得る。試料、例えば、目的のタンパク質（例えば、酵素、結合パートナー、リガンド等）、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、またはＯＨラジカル、または１つ以上の条件、例えば、レドックス条件にて１つ以上の分子を検出するのにＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ及びセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質を採用する生物発光法にてそれらを使用してもよい。セレンテラジン基質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの基質として作用するが、特許請求されるチエノピロール化合物は、そのような抑制が望まれ得る実施形態では、例えば、複数の生物発光システムの時間多重化を伴う用途では、またはいくつかのプレートベース発光アッセイでは、ルシフェラーゼを阻害して、発光シグナルを選択的に抑制するように作用し得る。例えば、チエノピロール化合物を使用して、細胞内及び／または細胞外Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害し得る。
【０２００】
（１）チエノピロール化合物
上述のように、方法は、本明細書に開示のチエノピロール化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｂ’）の化合物）を、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する細胞と接触させることを含み得、本開示の化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｂ’）の化合物に加えて、本明細書に記載の方法で使用することができる化合物は、式（ＩＩ）の化合物またはその塩も含み：
2018524334.tif 000014
（ＩＩ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、点線は、結合の存在を表し、Ｘは、ＣＨである。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、Ａは、フェニル環である。いくつかの実施形態では、Ａは、５員のヘテロアリール環である。いくつかの実施形態では、Ａは、チエニル環である。いくつかの実施形態では、Ａは、フラニル環である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、水素、Ｃ1−Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及びアリールアルキルからなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ1は、水素、エチル、ｎ−ヘキシル、２−（２−メトキシエトキシ）エチル及びベンジルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、エチルである。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、Ｒ2は、任意で置換されたアリールである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ2は、置換フェニルである。Ｒ2は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、及びヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つの置換基でフェニル置換される。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、１つのメチル基でフェニル置換される（例えば、ｍ−トリル）。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、Ｒ2は、任意で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、エチルであり、Ｒ2は、ｍ−トリルである。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、Ｚは、−ＮＲ3Ｒ4である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、Ｒ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する。いくつかの実施形態では、任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピロリジン、ピペリジン及びピペラジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、任意で置換された単環式の複素環は、未置換ピロリジン、未置換ピペリジン、１つの置換基で置換されたピペリジン（例えば、エトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル）、または１つの置換基で置換されたピペラジン（例えば、メチルなどのＣ1−Ｃ4アルキル）からなる群から選択される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、水素である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は、未置換Ｃ1−Ｃ8アルキル（例えば、メチル）、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）7−ＣＯＯＨ），Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキル（例えば、−（ＣＨ2）7−ＣＯＯＣＨ3）、任意で置換されたフェニル（以下）、任意で置換されたＣ5−Ｃ6シクロアルキル（例えば、未置換シクロペンチル、未置換シクロヘキシル、または置換シクロヘキシル）、任意で置換されたヘテロシクリル（例えば、未置換ピペリジニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、−ＣＯ−（ＣＨ2）4−ＣＯＯＣＨ3などのアルコキシカルボニルアルキルカルボニル、または−ＣＯ−（ＣＨ2）4−ＣＯＯＨなどのカルボキシアルキルカルボニルで置換されたピペリジニル）、任意で置換されたヘテロアリールアルキル（例えば、−ＣＨ2−ピリジルなどのピリジル−Ｃ1−Ｃ4−アルキル）、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキル（例えば、−（ＣＨ2）3−モルフォリノなどのモルフォリノ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル）からなる群から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ4は、未置換であるかまたは、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3）及びＣ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ4−アルキル（例えば、−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3）からなる群から選択される置換基などの１つの置換基で置換されるフェニルである。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、Ｒ4は、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ3）、Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）3ＣＨ3または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）5ＣＨ3）、ヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）2ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＯＨ），アミド（すなわち、−ＣＯＮＨ2）、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＮＨ2）、Ｃ1−Ｃ4−ジアルキルアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）2Ｎ（ＣＨ3）2）、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）3ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）5ＣＯＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ），スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＳＯ3Ｈ),スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＳＯ3−）、Ｃ1−Ｃ4−アルキルカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）3ＣＯＯＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）5ＣＯＯＣＨ3または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）7ＣＯＯＣＨ3）、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−シクロヘキシル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−シクロヘキシル−ＣＯＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−シクロヘキシル−ＣＯＯＣＨ3）、及びヘテロシクリルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ピペリジニル、未置換またはメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアセチルで置換された）からなる群から選択される１つの置換基で置換されるシクロヘキシルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ4は、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）6ＮＨ2）であり、アミノ基は、アミノ保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）で保護され、またはアミノ基はプロトン化され、塩（例えば、ヒドロクロリド塩）を形成し、またはアミノ基は、蛍光団（例えば、フルオロセイン）またはポリペプチド（例えば、−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐペプチド、末端でアセチル化されてもよい）でさらに官能化される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、Ｚは、−ＯＲ5である。いくつかの実施形態では、Ｒ5は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ5は、任意で置換されたＣ1−Ｃ4アルキル（例えば、メチル）である。
【０２１３】
（２）細胞不透過性チエノピロール化合物の使用
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法は、試料（例えば、細胞）を細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞不透過性であるように改変される本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、本開示のチエノピロール化合物及び方法を使用して、ハイスループットスクリーニング操作アッセイフォーマットの初期輝度を構築した後に、細胞から排泄され得る任意のルシフェラーゼを選択的に阻害し、細胞の外側に発生し得る発光を選択的に阻害してもよい。そのような方法は、細胞内でより選択的なシグナルを提供し得る。細胞不透過性チエノピロール化合物の例としては、ＪＲＷ−００５１、ＪＲＷ−０１４７、及びＪＲＷ−０１８７が挙げられる。
【０２１４】
（３）細胞透過性チエノピロール化合物の使用
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の方法は、試料（例えば、細胞）を細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞透過性である本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、本開示のチエノピロール化合物は、細胞に侵入し、その中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを選択的に阻害することができる。そのような方法は、２つ以上のルシフェラーゼの使用を伴う多重アッセイにおいて有利であり、細胞内の別のルシフェラーゼからの発光を選択的に見るように、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼからの発光を阻害することができ得る。細胞透過性チエノピロール化合物の例としては、ＪＲＷ−００１３及びＪＲＷ−０１３８が挙げられる。
【０２１５】
（４）転写レポーターとの使用
本開示のチエノピロール化合物は、遺伝子転写レポーター系と共に使用されてもよい。特定の実施形態では、提供されるのは、試料におけるプロモーターの活性を測定する方法であって、その際、プロモーターは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼまたはその変異体をコードする遺伝子に操作可能に連結される。本方法は、（ａ）試料をセレンテラジン基質と接触させることと、（ｂ）試料の発光を測定することによってプロモーターの活性を決定することとを含み、その際、試料は、プロモーターを含む。本方法は、試料を本明細書に記載のチエノピロール化合物と接触させて、発光を選択的に阻害する工程をさらに含み得る。プロモーターは、翻訳融合または転写融合を介して遺伝子に操作可能に連結されてもよい。目的の生物経路は、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターを含む細胞を経路の誘導剤で処理することによって調べられてもよい。次いで、このプロモーター活性を測定し、モニターしてプロモーターの活性と当該経路の間の任意の相関を検討すると共に、遺伝子発現に関連する動態測定（例えば、誘導性、抑制及び活性化）を得てもよい。本明細書に記載のチエノピロール化合物を使用して、発光を選択的に阻害することができる。
【０２１６】
（５）多重化
本開示のチエノピロール化合物を使用して、他のルシフェラーゼ及びアッセイとの時間多重化に適用する際に、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害してもよい。いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼまたはその変異体は、異なる波長で発光する別の酵素（例えば、ルシフェラーゼ）、例えば、緑色ホタルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（例えば、Ｌｕｃ２；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）または赤色コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）と共に多重化してもよい。例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが機能的レポーターとして使用されるのであれば、そのときは、緑色ホタルルシフェラーゼまたは赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼを用いて、遺伝子調節に対する非特異的な効果を制御すればよく、またはトランスフェクション効率について基準化すればよい。いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼから生成される発光（およそ４６０ｎｍ）及び赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）から生成される発光（およそ６１０ｎｍ）は、波長識別フィルターを持つルミノメーターを用いて容易に分割することができ、同じ試料からの双方のシグナルの測定を可能にする。そのような実施形態では、本明細書に記載のチエノピロール化合物を使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを選択的に阻害することができ、その結果、他のルシフェラーゼからのシグナルを選択的に見ることができる。
【０２１７】
別の例では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを転写レポーターとして使用し、アッセイ試薬に含有される異なる波長で発光するルシフェラーゼと対合させればよい。別の例では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを１つ以上の追加のルシフェラーゼと共に使用してもよく、その際、各ルシフェラーゼの発光は、選択的な酵素阻害剤の使用を介して別々に測定されてもよい。例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの発光は、適当な基質と緩衝液の添加の際に測定されてもよく、適当な基質と緩衝液とＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼに対して選択的な１つ以上の本明細書に記載のチエノピロール化合物のその後の添加の際の第２のルシフェラーゼの測定が続いてもよい。別の例では、アッセイ試薬に含有されるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを細胞生理学の特定の態様、例えば、ＡＴＰを測定するのに使用して、細胞の生存率を推定してもよく、またはカスパーゼ活性を測定するのに使用して、細胞のアポトーシスを推定してもよい。
【０２１８】
（６）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）
本開示のチエノピロール化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが、リガンド−タンパク質及び／またはタンパク質−タンパク質の相互作用を検出するために使用される任意の方法で使用されてもよい。種々の実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを使用して、エネルギーをエネルギーアクセプターに移動させてもよい。そのような方法の１つは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である。ＢＲＥＴに関して、生物発光ドナーからの蛍光アクセプターへのエネルギー移動は、発光のスペクトル分布にてシフトを生じる。このエネルギー移動は、タンパク質−タンパク質またはリガンド−タンパク質の試験管内または生体内での相互作用のリアルタイムのモニタリングを可能にする。いくつかの実施形態では、ＢＲＥＴ法は、リガンド−タンパク質及び／またはタンパク質−タンパク質の相互作用のためのＮｌｕｃが介在する生物発光共鳴エネルギー移動（ＮａｎｏＢＲＥＴなど）アッセイであってもよい。ＮＡＮＯＢＲＥＴは、２つの異なる方法：１）ＨＡＬＯＴＡＧ及びＮｌｕｃベースの技術、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を用いてタンパク質−タンパク質及び／またはリガンド−タンパク質の相互作用を検出することが、増加したシグナルと低下したスペクトルの重複によって達成されてもよいこと；及び２）目的のタンパク質に融合されたＮｌｕｃルシフェラーゼと、蛍光トレーサーを用いて生細胞にてリガンド−受容体の相互作用を検出することを含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ＢＲＥＴ分析で使用される（すなわち、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）を用いて、２つの分子が互いに結合することが可能であるかどうか、または細胞にて同時局在することが可能であるかどうかを決定することができる。例えば、目的の分子または目的のタンパク質と組み合わせる生物発光ドナー分子として発光酵素を使用して、第１の融合タンパク質を創り出すことができる。種々の実施形態では、第１の融合タンパク質は、発光酵素と目的のタンパク質とを含有する。種々の実施形態では、発光酵素を含有する第１の融合タンパク質をＢＲＥＴ分析に使用して、細胞溶解物、無傷細胞及び生きている動物を含むが、これらに限定されない系にてタンパク質／タンパク質の相互作用を検出することができる。種々の実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧを蛍光アクセプター分子として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧを第２の目的タンパク質または発光酵素に融合することができる。例えば、発光酵素をＨＡＬＯＴＡＧに融合し、細胞または動物で発現させることができ、且つＨＡＬＯＴＡＧ  ＴＭＲリガンドなどの蛍光ＨＡＬＯＴＡＧリガンドで標識することができる。その後、細胞透過性発光酵素基質の存在下で融合物は励起され、蛍光を発することができる。いくつかの実施形態では、２、３の非限定例を挙げると、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含むがこれらに限定されない蛍光タンパク質または、フルオレセイン、ローダミン緑、オレゴン緑、もしくはアレクサ４８８を含む蛍光標識と組み合わせて発光酵素を用いてＢＲＥＴを実施してもよい。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、排泄されたＮｌｕｃからのシグナルを急冷することは、ＮａｎｏＢＲＥＴプレートアッセイを用いた場合に、信号対雑音比を改善することができる。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、細胞透過性チエノピロール化合物を使用して、細胞内ＢＲＥＴを阻害してもよい。ある特定の実施形態では、細胞不透過性チエノピロール化合物を使用して、細胞外ＢＲＥＴを阻害してもよい。ある特定の実施形態では、細胞不透過性チエノピロール化合物を標的会合モデルで使用してもよい。
【０２２２】
（７）生細胞または溶解型のためのタンパク質近接アッセイ
いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを循環置換型（ＣＰ）または直鎖開裂型（ＳＳ）の発光酵素融合タンパク質と共に用いて、タンパク質の近接を測定してもよい。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、プロテアーゼ基質のアミノ酸配列（例えば、ＴＥＶ）の挿入を介して置換され、または開裂されて、低い生物発光を生成する。不活性ルシフェラーゼを（例えば、遺伝子融合を介して）モニタータンパク質に繋げる。相互作用する可能性のあるタンパク質は、（例えば、遺伝子融合を介して）プロテアーゼ（例えば、ＴＥＶ）に繋がれる。２つのモニタータンパク質が相互作用する、または十分に近接する（例えば、構成的な相互作用、薬剤刺激または経路の応答を介して）と、発光酵素が切断されて、高い生物発光活性を生成する。その例が細胞または生化学アッセイにおいてタンパク質近接の測定に適用されてもよい。
【０２２３】
（８）タンパク質相補アッセイ
いくつかの実施形態では、本開示のチエノピロール化合物は、例えば、タンパク質相補アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなどのリガンド−タンパク質及びタンパク質−タンパク質の相互作用または近接性を検出する他の方法でそのようなルシフェラーゼを使用する場合に、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害するために使用してもよい。タンパク質相補アッセイ（ＰＣＡ）は、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。ＰＣＡは、互いに最接近させると機能的に活性のあるタンパク質に再構成することができる同じタンパク質、例えば、酵素の２つの断片を利用する。いくつかの実施形態では、ＮＡＮＯＢＩＴ（登録商標）技術（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、酵素の成分またはサブユニットの結合相互作用を介した発光酵素の再構成による分子の近接を検出してもよい。ＮＡＮＯＢＩＴは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ変異体、Ｎｌｕｃルシフェラーゼに由来する非発光性ペプチド（ＮＬＰｅｐ）及び非発光性ポリペプチド（ＮＬＰｏｌｙ）を利用する。ＮＬＰｅｐ及びＮＬＰｏｌｙは、目的タンパク質に融合される。目的タンパク質が相互作用するのであれば、ＮＬＰｅｐ及びＮＬＰｏｌｙが相互作用して、完全長のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ酵素を再構成する。
【０２２４】
例えば、分離に寛容な部位にて発光酵素を２つの断片に分離することができ、分離された発光酵素の各断片を相互作用すると考えられる目的ポリペプチドの対、例えば、ＦＫＢＰ及びＦＲＢの一方に融合することができる。２つの目的ポリペプチドが実際に相互作用するのであれば、例えば、発光酵素の断片はそのとき、互いに最接近して機能的で活性のある発光酵素を再構成する。いくつかの実施形態では、次いで、再構成された発光酵素の活性を検出し、測定することができる。いくつかの実施形態では、ｌａｃ−Ｚ（Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７２：１２５４−１２５７（１９７５））またはリボヌクレアーゼＳ（Ｌｅｖｉｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１３３３−１３３９（１９７６））に類似するさらに一般的な相補系にて分割発光酵素を使用することができる。いくつかの実施形態では、別の発光酵素断片（「Ｂ」と命名）と相補性であることが知られる発光酵素断片（「Ａ」）を標的タンパク質に融合することができ、断片Ｂを含有する細胞または細胞溶解物における発光を介して、得られる融合物をモニターすることができる。いくつかの実施形態では、断片Ｂの供給源は同一細胞であってもよく（例えば、断片Ｂの遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれるまたは細胞内での別のプラスミドに含有されるのであれば）、またはそれは別の細胞に由来する溶解物または精製タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、この同一の融合タンパク質（断片Ａ）は、固形支持体への付着が可能なＨＡＬＯＴＡＧなどのポリペプチドと断片Ｂとの間での融合を用いて捕捉または不動化されてもよい。いくつかの実施形態では、発光を用いて、上手くいった捕捉を明らかにすることができ、または捕捉された物質の量を定量することができる。
【０２２５】
（９）二量体化アッセイ
いくつかの実施形態では、本開示のチエノピロール化合物は、各結合相手、例えば、ＦＲＢ及びＦＫＢＰに融合される完全長の循環置換型発光酵素と共に使用され、タンパク質相補型アッセイで使用されてもよい。本明細書で開示の方法と従来のタンパク質相補性との間での重要な差異は、相補性はなかったが、むしろ、２つの完全長の酵素、例えば、循環置換型発光酵素の二量体化があったということである。
【０２２６】
簡単に言えば、低活性用に類似して構成された循環置換型のレポータータンパク質を融合タンパク質の相手の双方に融合する。例えば、各融合パートナーは、同一に構成された置換型レポーターに連結されてもよい。融合パートナーの相互作用によって置換型レポーターを最接近させ、それによってさらに高い活性を有するハイブリッドレポーターの再構成を可能にする。
【０２２７】
６．試料
本開示のチエノピロール化合物は、生物成分を含有する試料と共に使用してもよい。試料は細胞を含んでもよい。試料は、成分（無傷細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官、エキソソーム、及びそれらの混合物を含む）の異種混合物、または単一成分、または成分（例えば、天然のまたは合成のアミノ酸、核酸または糖質ポリマー、または脂質膜複合体）の同種群を含んでもよい。チエノピロール化合物は一般に、使用の濃度内で生細胞及び他の生物成分に対して非毒性であり得る。
【０２２８】
試料は、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理的流体（例えば、血液、血漿、尿、粘液、分泌物等）、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または細胞の精製分画（例えば、細胞亜分画）を含んでもよい。ある特定の実施形態では、試料は、細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、試料は、生細胞であってもよい。細胞は、真核細胞、例えば、酵母、鳥類、植物、昆虫の細胞、または、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギまたはブタの細胞を含むが、これらに限定されない哺乳類の細胞、または原核細胞、または２つ以上の異なる生物に由来する細胞、または細胞溶解物またはその上清であってもよい。細胞は、組換え技術を介して遺伝子操作されていなくてもよく（非組換え細胞）、または、組換えＤＮＡによって一時的にトランスフェクションされる、及び／またはそのゲノムが組換えＤＮＡによって安定的に増強される、または遺伝子を破壊するように、例えば、プロモーター、イントロンまたはオープンリーディングフレームを破壊するように、またはＤＮＡ断片の１つを別のもので置き換えるようにゲノムが修飾されている組換え細胞であってもよい。組換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡの断片は、本発明の方法によって検出される分子、検出される分子のレベルまたは活性を変化させる部分、及び／または分子のレベルまたは活性を変化させる分子または部分に無関係な遺伝子産物をコードしてもよい。細胞は、ルシフェラーゼを発現してもよいし、または発現しなくてもよい。細胞は、組換え技術を介して遺伝子操作されていてもよい。
【０２２９】
７．キット
開示されるのは、１つ以上の酵素（例えば、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ変異体ルシフェラーゼ）の存在または活性を測定するためのキットである。キットは、以下のもの：ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ変異体ルシフェラーゼ、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ変異体ルシフェラーゼを阻害し得る本発明の化合物または組成物、発光アッセイを実施するための指示書、及び反応緩衝液の１つ以上を含んでもよい。反応緩衝液は、非ルシフェラーゼ酵素反応及び発光酵素反応のために個々の製剤で存在してもよく、または単一工程アッセイのために単一製剤で存在してもよい。キットはまた、非ルシフェラーゼ酵素のための他の阻害剤、活性化剤、及び／または増強剤を含有してもよい。キットはまた、アッセイのための陽性対照及び／または陰性対照を含有してもよい。
【実施例】
【０２３０】
８．実施例
一般的合成手順Ａ：ジオキサン／水（４：１）中のエステル中間体（１当量）の溶液に、水酸化リチウム（５当量）を添加した。出発物質が消費されるまで、懸濁液を６０℃に加熱した（ＬＣＭＳまたはＴＬＣ分析によりモニターする）。反応混合物を冷却し、ｐＨ３までＨＣｌ（２Ｍ）で酸性化した。懸濁液を酢酸エチルと水の間に区分した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、所望の生成物を得た。
【０２３１】
一般的合成手順Ｂ：ジメチルホルムアミド中のカルボン酸中間体（１当量）の溶液に、必要なアミン（またはアミンヒドロクロリド）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（２当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２当量）及びジイソプロピルエチルアミン（３当量）を添加した。出発物質が消費されるまで、混合物を６０℃に加熱した（ＬＣＭＳまたはＴＬＣ分析によりモニターする）。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノールまたはヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、所望の生成物を得た。
【０２３２】
実施例１
式（Ｉａ）の化合物の一般的合成
式（Ｉａ）の化合物は、スキーム１に従って一般的に合成することができる。
スキーム１．
2018524334.tif 000015
２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＪＲＷ−０００３）
2018524334.tif 000016
【０２３３】
酢酸エチル（２５ｍＬ）中のＮ−エチル−３−メチルアニリン（２．０ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１２ｍＬ）を添加した。二相性溶液を０℃に冷却し、水酸化カリウム（２．４９ｇ、４４．４ｍｍｏｌ）を一度に添加した。２−クロロアセチルクロリド（２．５ｇ、１．８ｍＬ、２２．２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。混合物を１時間撹拌し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮し、モービル油として粗生成物（３．２ｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２１２［Ｍ＋Ｈ］+。
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０００４）
2018524334.tif 000017
【０２３４】
アセトニトリル（１００ｍＬ）中の２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（１４．８ｍｍｏｌ）の溶液に、４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（２．２８ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．０９ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）及び１８−クラウン−６（１６６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５時間加熱還流し、反応物を真空下で約２０ｍＬ容量に濃縮した。懸濁液を水で希釈し、濾過し、水で洗浄した。固体を真空下で乾燥させて、淡褐色固体として粗生成物（４．６ｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．５３（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４６−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３５−７．１１（ｍ，５Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．６７−３．５３（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．６，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５７［Ｍ＋Ｈ］+。
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＷＺ−１４１−７４）
2018524334.tif 000018
【０２３５】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（２．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（６７１ｍｇ、２８．０ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として所望の生成物（１．８ｇ、９３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １２．４５（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４４−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．１２（ｍ，４Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），３．７１−３．５４（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．０８−０．９４（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４３［Ｍ＋Ｈ］+。
実施例２
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０００６）
2018524334.tif 000019
【０２３６】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（７５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をシクロヘキシルアミン（４３ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として、所望の生成物（５０ｍｇ、５４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８３（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．４４−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０６（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７５−３．５２（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．８４−１．５１（ｍ，５Ｈ），１．３７−１．１７（ｍ，６Ｈ），１．０５−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２４［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR７．０２分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２５，２００。
実施例３
Ｎ−エチル−２−（５−（ピロリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＪＲＷ−０００８）
2018524334.tif 000020
【０２３７】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（７５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をピロリジン（４３ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）と反応させて、オフホワイト固体として所望の生成物（７０ｍｇ、８１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．４５−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝５．２，１Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），３．７７−３．３２（ｍ，６Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．９１−１．７５（ｍ，４Ｈ），１．０６−０．９２（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３９６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．３％（ＡＵＣ），ＴR６．２４分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２１，７７３。
実施例４
Ｎ−エチル−２−（５−（ピペリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＪＲＷ−０００９）
2018524334.tif 000021
【０２３８】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（８０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をピペリジン（４０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）と反応させて、橙色ゴムとして所望の生成物（９０ｍｇ、９４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．５２−７．１３（ｍ，５Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝５．２，１Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），３．６８−３．４５（ｍ，６Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．６９−１．４２（ｍ，６Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１０［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．８％（ＡＵＣ），ＴR５．９１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８４ｎｍ，ε２４，５９８。
実施例５
１−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル（ＪＲＷ−００１２）
2018524334.tif 000022
【０２３９】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１２０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をピペリジン−４−カルボン酸エチル（１１０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１６０ｍｇ、９４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．４７−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．２９−７．１４（ｍ，３Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），４．２２（ｄ，Ｊ＝１３．２，２Ｈ），４．０６（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），３．６８−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．１８−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．５５（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．９０−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．６２−１．４８（ｍ，２Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝６．８，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR７．２５分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８６ｎｍ，ε２０，００９。
実施例６
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−フェニル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１４３）
2018524334.tif 000023
【０２４０】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をアニリン（１６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）と反応させて、泡として所望の生成物（３０ｍｇ、４９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ９．９３（ｓ，１Ｈ），７．７４−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．４９−７．１９（ｍ，９Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．０５（ｔ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），３．６７−３．５２（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．０６−０．９２（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ８５．４％（ＡＵＣ），ＴR６．０４分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax３０６ｎｍ，ε２７，３３０。
実施例７
２−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）フェニル）酢酸エチル（ＪＲＷ−０１５２）
2018524334.tif 000024
【０２４１】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（４−アミノフェニル）酢酸エチル（３１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１１１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（５６ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、橙色固体として所望の生成物（２８ｍｇ、３８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ９．９３（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），７．５０−７．１１（ｍ，９Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），４．０６（ｑ，Ｊ＝６．４  Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｓ、４Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝６．４，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．２％（ＡＵＣ），ＴR７．６１分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax３０８ｎｍ，ε３４，３５０。
実施例８
３−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）安息香酸メチル（ＪＲＷ−０１５１）
2018524334.tif 000025
【０２４２】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、３−アミノ安息香酸メチル（３３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１１１ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（５６ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、淡黄色固体として所望の生成物（３０ｍｇ、４３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １０．１５（ｓ，１Ｈ），８．４２−８．３８（ｍ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．６７−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．５６−７．１０（ｍ，８Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．６７−３．５５（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），０．９９（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．３％（ＡＵＣ），ＴR７．５２分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax３０９ｎｍ，ε３７，３０２。
実施例９
メチル−シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−００４１）
2018524334.tif 000026
【０２４３】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をシス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチルヒドロクロリド（１２７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１８６ｍｇ、８８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８２（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１６（ｍ，３Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．８５−３．７０（ｍ，１Ｈ），３．６８−３．５３（ｍ，５Ｈ），２．６３−２．５６（ｍ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．０８−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．４３（ｍ，６Ｈ），１．０８−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR７．１６分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，９９８。
実施例１０
６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（ＪＲＷ−０２６４）
2018524334.tif 000027
ステップ１．シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０２６１）
2018524334.tif 000028
【０２４４】
一般的な手順Ａに従って、メチル−シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（１６０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４０ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）と反応させて、淡褐色固体として粗生成物を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６８［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（ＪＲＷ−０２６２）
2018524334.tif 000029
【０２４５】
一般的な手順Ｂに従って、シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（６８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を６−アミノヘキサン酸メチルヒドロクロリド（４０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と反応させて、淡赤色泡として所望の生成物（６３ｍｇ、７２％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（ＪＲＷ−０２６４）
2018524334.tif 000030
【０２４６】
一般的な手順Ａに従って、６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（６０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）と反応させて、淡赤色泡として所望の生成物（５６ｍｇ、９５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９６（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．２，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１４（ｍ，４Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．９２−３．７４（ｍ，１Ｈ），３．６７−３．５６（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｄｄ，Ｊ＝６．８，１２．６，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２７−２．１０（ｍ，３Ｈ），１．９４−１．７９（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．３１（ｍ，８Ｈ），１．３０−１．１８（ｍ，２Ｈ），１．０６−０．９４（ｍ，３Ｈ）．；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５８１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．８％（ＡＵＣ），ＴR５．５０分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε１８，８７３。
実施例１１
８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸（ＪＲＷ−０１９８）
2018524334.tif 000031
ステップ１．８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸メチル（ＪＲＷ−０１９６）
2018524334.tif 000032
【０２４７】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を８−アミノオクタン酸メチルヒドロクロリド（４６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と反応させて、油として所望の生成物（７２ｍｇ、９９％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９８［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸（ＪＲＷ−０１９８）
2018524334.tif 000033
【０２４８】
一般的な手順Ａに従って、８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸メチル（７２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１７ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（４７ｍｇ、６７％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９１（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｔ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．４７−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｄｄ，Ｊ＝６．４、１２．８，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝７．３，２Ｈ），１．６０−１．４０（ｍ，４Ｈ），１．３６−１．１８（ｍ，６Ｈ），１．０８−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８４［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．４％（ＡＵＣ），ＴR５．４３分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，６２７。
実施例１２
６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸（ＪＲＷ−０２０８）
2018524334.tif 000034
ステップ１．ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０２０３）
2018524334.tif 000035
【０２４９】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（７５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を４−アミノピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６６ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１２０ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０２０４）
2018524334.tif 000036
【０２５０】
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。混合物をトルエンで希釈し、真空下で濃縮（３Ｘ）し、淡褐色油の粗生成物（１７０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（ＪＲＷ−０２０６）
2018524334.tif 000037
【０２５１】
０℃に冷却したジクロロメタン（５ｍＬ）中の４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、６−クロロ−６−オキソヘキサン酸メチル（４９ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１４７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を０℃で３０分間撹拌した。混合物をジクロロメタン及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色泡として所望の生成物（１００ｍｇ、７７％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ４．６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸（ＪＲＷ−０２０８）
2018524334.tif 000038
【０２５２】
一般的な手順Ａに従って、６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸メチル（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（２１ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（９８ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９６（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．４６−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０６（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．３９−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．０５−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．６８−３．５４（ｍ，２Ｈ），３．１７−３．００（ｍ，１Ｈ），２．７３−２．５７（ｍ，１Ｈ），２．４２−２．２５（ｍ，５Ｈ），２．２４−２．１２（ｍ，２Ｈ），１．８６−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．１１（ｍ，６Ｈ），１．０７−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．８％（ＡＵＣ），ＴR５．３０分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２３，０１５。
実施例１３
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（ＪＲＷ−０２６７）
2018524334.tif 000039
【０２５３】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１３３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を６−（トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（１１１ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１８０ｍｇ、７６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．０９（ｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．６６−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１６（ｍ，３Ｈ），７．１４−６．９９（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．６７−３．４６（ｍ，５Ｈ），３．０７−２．９２（ｍ，４Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝７．４，２Ｈ），２．０８−１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８３−１．６０（ｍ，４Ｈ），１．５６−１．１２（ｍ，１０Ｈ），１．０８−０．８０（ｍ，５Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６０９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．９５分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２０，０７８。
実施例１４
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（ＪＲＷ−０２６８）
2018524334.tif 000040
【０２５４】
一般的な手順Ａに従って、６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（１６５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（３２ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１１５ｍｇ、７１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９３（ｓ，１Ｈ），８．１４−８．０４（ｍ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．４６−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．１３−６．９８（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．６８−３．５３（ｍ，２Ｈ），３．０８−２．９２（ｍ，４Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝７．２，２Ｈ），２．０７−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．８０−１．６３（ｍ，４Ｈ），１．５４−１．１４（ｍ，１０Ｈ），１．０８−０．７９（ｍ，５Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９５［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．４４分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２５，６０４。
実施例１５
式（Ｉｂ）の化合物の一般的合成
【０２５５】
式（Ｉｂ）の化合物は、スキーム２に従って一般的に合成することができる。
スキーム２．
2018524334.tif 000041
実施例１６
トランス−メチル−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−００１３）
2018524334.tif 000042
【０２５６】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（８４ｍｇ  ０．４４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１０３ｍｇ、７３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８９（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．４６−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．４６（ｓ，６Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．３２−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．０３−１．７７（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．０６−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．０％（ＡＵＣ），ＴR７．７５分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２６，１００。
実施例１７
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−００３４）
2018524334.tif 000043
【０２５７】
一般的な手順Ａに従って、トランス−メチル−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（５０ｍｇ、９３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９９（ｓ，１Ｈ），７．９２−７．８４（ｍ，１Ｈ），７．４４−７．１９（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５２（ｍ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２２−２．０６（ｍ，１Ｈ），１．９８−１．７６（ｍ，４Ｈ），１．４７−１．２１（ｍ，４Ｈ），１．０８−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．４％（ＡＵＣ），ＴR５．８１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２９０ｎｍ，ε２６，５０２。
実施例１８
Ｎ−（トランス−４−（ブチルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−００４２）
2018524334.tif 000044
【０２５８】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をブチルアミン（９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（５０ｍｇ、８９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８２（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６５−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．４６−７．１１（ｍ，５Ｈ），７．０６−６．９８（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），３．６６−３．４５（ｍ，３Ｈ），２．９６（ｑ，Ｊ＝６．０  Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．０５−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．８５−１．６０（ｍ，４Ｈ），１．５０−１．１０（ｍ，９Ｈ），１．０２−０．９０（ｍ，３Ｈ），０．８０（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．６％（ＡＵＣ），ＴR６．５２分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２８，３６４。
実施例１９
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−００４３）
2018524334.tif 000045
【０２５９】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をエタノールアミン（７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（４８ｍｇ、８８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８６（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４５−７．１８（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．６０（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），３．７５−３．５４（ｍ，３Ｈ），３．３６（ｑ，Ｊ＝５．９，２Ｈ），３．０８（ｑ，Ｊ＝５．９，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１４−２．００（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．６９（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．１０（ｍ，４Ｈ），１．０８−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５１１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．７％（ＡＵＣ），ＴR６．５２分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２４，９６６。
実施例２０
Ｎ−（トランス−４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−００４４）
2018524334.tif 000046
【０２６０】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をエタノールアミン（１８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）と反応させて、淡赤色固体として所望の生成物（４５ｍｇ、７８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．４５−７．３５（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０５（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５４（ｍ，３Ｈ），３．１０（ｑ，Ｊ＝６．４，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝６．４，２Ｈ），２．１５−２．００（ｍ，７Ｈ），１．８８−１．６９１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５３−１．１９（ｍ，４Ｈ），１．０８−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５３８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．４％（ＡＵＣ），ＴR４．３１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２９，９８０。
実施例２１
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸（ＪＲＷ−００５１）
2018524334.tif 000047
ステップ１．４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸メチル（ＪＲＷ−００５０）
2018524334.tif 000048
【０２６１】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を４−アミノブタン酸メチル（１５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色ガラスとして粗生成物（８０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸（ＪＲＷ−００５１）
2018524334.tif 000049
【０２６２】
一般的な手順Ａに従って、４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸メチル（６０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１３ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（５５ｍｇ、９３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９７（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４０−７．２９（ｍ，２Ｈ），７．２７−７．１３（ｍ，３Ｈ），７．０７−７．００（ｍ，２Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），３．６８−３．４８（ｍ，３Ｈ），３．０３−２．９２（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．１４（ｔ，Ｊ＝７．３，２Ｈ），２．０６−１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８５−１．６４（ｍ，４Ｈ），１．６２−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．４７−１．１５（ｍ，４Ｈ），１．０５−０．８８（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．１７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２４，７１０。
実施例２２
Ｎ−（トランス−４−カルバモイルシクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−００５２）
2018524334.tif 000050
【０２６３】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をアンモニア（１．１ｍＬ、０．５Ｍ、０．２１ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（４５ｍｇ、９０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８２（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．４０−７．２９（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．０８（ｍ，４Ｈ），７．０６−６．９８（ｍ，２Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），３．６７−３．４９（ｍ，３Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．０３−１．９１（ｍ，１Ｈ），１．８２−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．４７−１．１４（ｍ，４Ｈ），１．０３−０．８８（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６７［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．１１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２５，２１３。
実施例２３
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１３８）
2018524334.tif 000051
【０２６４】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をヘキシルアミン（１３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（５０ｍｇ、８５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８８（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６７（ｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ），７．４５−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１８（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，３Ｈ），２．９９（ｄｄ，Ｊ＝６．５，１２．６，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１０−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．１６（ｍ，１２Ｈ），１．０８−０．９２（ｍ，３Ｈ），０．８８−０．７８（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．４％（ＡＵＣ），ＴR６．５４分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２９２ｎｍ，ε２９，５３５。
実施例２４
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル（ＪＲＷ−０１４０）
2018524334.tif 000052
【０２６５】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をピペリジン−４−カルボン酸エチル（２０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、透明な半固体として所望の生成物（６０ｍｇ、９２％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９２（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．４５−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１８（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０５（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝１２．７，１Ｈ），４．０５（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝１２．７，１Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．１８−３．０２（ｍ，１Ｈ），２．７６−２．５１（ｍ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．９３−１．６３（ｍ，６Ｈ），１．５６−１．２６（ｍ，６Ｈ），１．１６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），１．０７−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６０７［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．５％（ＡＵＣ），ＴR６．０１分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２９０ｎｍ，ε２９，３２５。
実施例２５
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（ＪＲＷ−０１４５）
2018524334.tif 000053
【０２６６】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を６−アミノヘキサン酸メチル（２３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（６０ｍｇ、９４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８８（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６８（ｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ），７．４４−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５０（ｍ，６Ｈ），２．９８（ｄｄ，Ｊ＝６．６，１２．５，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．４，２Ｈ），２．０８−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．８７−１．６７（ｍ，４Ｈ），１．５７−１．１５（ｍ，１０Ｈ），１．０５−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９５［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．４％（ＡＵＣ），ＴR６．２４分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２６，５５５。
実施例２６
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（ＪＲＷ−０１４７）
2018524334.tif 000054
【０２６７】
一般的な手順Ａに従って、６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル（５３ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（５０ｍｇ、９６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９８（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．７２−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１８（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．０４−２．９３（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），２．１０−１．９３（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６７（ｍ，４Ｈ），１．５５−１．１０（ｍ，１０Ｈ），１．０８−０．９２（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５８１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．４９分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２３，７３８。
実施例２７
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸（ＪＲＷ−０１８７）
2018524334.tif 000055
【０２６８】
一般的な手順Ａに従って、１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル（６０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１２ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（４５ｍｇ、７８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １２．２０（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１８（ｍ，３Ｈ），７．０８（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．２８−４．１５（ｍ，１Ｈ），３．９２−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．１５−３．００（ｍ，１Ｈ），２．７５−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．９２−１．６３（ｍ，７Ｈ），１．５６−１．２５（ｍ，７Ｈ），１．０８−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５７９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．５％（ＡＵＣ），ＴR４．４５分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２３，４７０。
実施例２８
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（ＪＲＷ−０１８８）
2018524334.tif 000056
ステップ１．８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸メチル（ＪＲＷ−０１８６）
2018524334.tif 000057
【０２６９】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を８−アミノオクタン酸メチル（２７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と反応させて、油として所望の生成物（５５ｍｇ、８２％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６２３［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（ＪＲＷ−０１８８）
2018524334.tif 000058
【０２７０】
一般的な手順Ａに従って、８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸メチル（５０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（９ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（４５ｍｇ、９２％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １１．９２（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．７０−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．１４（ｍ，５Ｈ），７．１０−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５４（ｍ，３Ｈ），３．０５−２．９３（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．２２−２．１２（ｍ，２Ｈ），２．１０−１．９８（ｍ，１Ｈ），１．９１−１．６６（ｍ，４Ｈ），１．５５−１．１０（ｍ、１４Ｈ），１．０８−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６０９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９６．９％（ＡＵＣ），ＴR４．９７分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２５，８２４。
実施例２９
Ｎ−（トランス−４−（シクロヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１９０）
2018524334.tif 000059
【０２７１】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をシクロヘキシルアミン（１６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（５５ｍｇ、９４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９５−７．８２（ｍ，１Ｈ），７．６６−７．１６（ｍ，６Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７６−３．４０（ｍ，４Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１１−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．６０（ｍ，８Ｈ），１．５９−０．９１（ｍ，１３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５４９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．５％（ＡＵＣ），ＴR５．９８分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２５，４０７。
実施例３０
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１９１）
2018524334.tif 000060
【０２７２】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を１−メチルピペリジン−４−アミン（１８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（４７ｍｇ、７８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．５０−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７５−３．３８（ｍ，４Ｈ），２．７３−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２２−１．９６（ｍ，５Ｈ），１．９６−１．５８（ｍ，８Ｈ），１．５３−１．１９（ｍ，６Ｈ），１．０８−０．９７（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６４［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．８％（ＡＵＣ），ＴR３．３５分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε３０，０５１。
実施例３１
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＪＲＷ−０１９２）
2018524334.tif 000061
【０２７３】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（８４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を４−アミノピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（１１５ｍｇ、９９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９３−７．８３（ｍ，１Ｈ），７．６８−７．５８（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．９６−３．４６（ｍ，６Ｈ），２．９３−２．７０（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．０９−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６０（ｍ，６Ｈ），１．５５−１．０８（ｍ，１５Ｈ），１．０６−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６５０［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．６％（ＡＵＣ），ＴR５．８７分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε３１，１２８。
実施例３２
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ピペリジン−４−イルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１９４）
2018524334.tif 000062
【０２７４】
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物をトルエンで希釈し、真空下で濃縮（３Ｘ）し、白色泡の粗生成物を得た（１５０ｍｇ）。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５０［Ｍ＋Ｈ］+。
実施例３３
Ｎ−（トランス−４−（（１−アセチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１９５）
2018524334.tif 000063
【０２７５】
０℃に冷却したジクロロメタン（５ｍＬ）中の４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ピペリジン−４−イルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（２５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１０４ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を撹拌し、一晩室温に温めた。混合物をジクロロメタン及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色固体として所望の生成物を得た（８４ｍｇ、８８％）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８７（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．４６−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１３−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．２２−４．０８（ｍ，１Ｈ），３．８１−３．５２（ｍ，５Ｈ），３．１５−３．００（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝１１．９，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１１−１．９４（ｍ，４Ｈ），１．９１−１．５９（ｍ，６Ｈ），１．５２−１．０９（ｍ，６Ｈ），１．０６−０．９１（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．８％（ＡＵＣ），ＴR４．０９分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２６，０３４。
実施例３４
（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＪＲＷ−０１９７）
2018524334.tif 000064
【０２７６】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（１１５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を（６−アミノヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１５０ｍｇ、９１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝５．１，１Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０６（ｍ，２Ｈ），６．７７−６．６８（ｍ，１Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５３（ｍ，３Ｈ），３．０３−２．９３（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．０、１２．６，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１２−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．１６（ｍ，２１Ｈ），１．０６−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６６６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．７％（ＡＵＣ），ＴR４．１１分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２１，６０８。
実施例３５
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５（６）−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０２００）
2018524334.tif 000065
ステップ１．Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１９９）
2018524334.tif 000066
【０２７７】
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で５時間撹拌した。混合物をトルエンで希釈し、真空下で濃縮（３Ｘ）し、透明油として粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６６［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５（６）−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０２００）
2018524334.tif 000067
【０２７８】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＮ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５（６）−カルボン酸［５（６）−ＦＡＭ−ＳＥ］（１０６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１４５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を酸性化し（０．１Ｍ  ＨＣｌ）、水で希釈し、３：１のＣＨＣｌ3／イソプロパノールで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、橙色固体として所望の生成物（１４５ｍｇ、６９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １０．１２（ｓ，２Ｈ），８．７８（ｔ，Ｊ＝５．５、１Ｈ、異性体Ａ）、８．６４（ｔ，Ｊ＝５．７、１Ｈ、異性体Ｂ）、８．４４（ｓ、１Ｈ、異性体Ａ）、８．２３（ｄｄ，Ｊ＝１．５、８．１、１Ｈ、異性体Ａ）、８．１５（ｄｄ，Ｊ＝１．３、８．１、１Ｈ、異性体Ｂ）、８．０５（ｄ，Ｊ＝８．１、１Ｈ、異性体Ｂ）、７．８７（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．７２−７．６０（ｍ，１Ｈ），７．４４−７．３２（ｍ，３Ｈ），７．３２−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．７０−６．６５（ｍ，２Ｈ），６．６１−６．４９（ｍ，４Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７０−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．３２−３．２３（ｍ，２Ｈ），３．２２−３．１２（ｍ，１Ｈ），３．０８−２．９１（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１１−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．８９−１．６５（ｍ，４Ｈ），１．６１−１．１６（ｍ，１１Ｈ），１．０６−０．９２（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９２５［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．１％（ＡＵＣ），ＴR６．１６、６．２６分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８４ｎｍ，ε３１，４１９。
実施例３６
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミドヒドロクロリド（ＪＲＷ−０２４１）
2018524334.tif 000068
【０２７９】
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１時間撹拌した。混合物をトルエンで希釈し、真空下で濃縮（３Ｘ）した。残渣をメタノールに溶解し、ＨＣｌ（２ｍＬ、エーテル中で１Ｍ）を添加した。溶液を蒸発して、白色固体の所望の生成物（９５ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．０２−７．６８（ｍ，５Ｈ），７．４５−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０５（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７４−３．５１（ｍ，３Ｈ），３．０１（ｄｄ，Ｊ＝６．５，１２．５，２Ｈ），２．７９−２．６６（ｍ，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１１−１．９７（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．５９−１．１７（ｍ，１２Ｈ），１．０２−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．０％（ＡＵＣ），ＴR４．４７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２３，２１３。
実施例３７
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０２４２）
2018524334.tif 000069
【０２８０】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を６−アミノヘキサン−１−オール（５６ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１６０ｍｇ、８８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８７（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），７．７３−７．５９（ｓ，１Ｈ），７．４８−７．１５（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０２（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．３５−４．２３（ｍ，１Ｈ），３．７３−３．５０（ｍ，３Ｈ），３．４３−３．３０（ｍ，２Ｈ），３．０５−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１０−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．６５（ｍ，４Ｈ），１．５５−１．１３（ｍ，１２Ｈ），１．０９−０．９０（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６７［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．４８分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２６，３５６。
実施例３８
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム（ＪＲＷ−０３４４）
2018524334.tif 000070
ステップ１．４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０３４２）
2018524334.tif 000071
【０２８１】
イミダゾール（３６ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１３８ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、及びヨウ素（１３４ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させた４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液で急冷した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって一部精製し、白色固体として粗生成物を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６７７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム（ＪＲＷ−０３４４）
2018524334.tif 000072
【０２８２】
エタノール（５ｍＬ）中の４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、亜硫酸ナトリウム（６６ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）及び水（３ｍＬ）を添加した。混合物を７５℃に２時間加熱した。反応物を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色固体として所望の生成物（１００ｍｇ、９０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．６７（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．４９−７．１７（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０５（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５４（ｍ，３Ｈ），３．０５−２．９３（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．２８（ｍ，５Ｈ），２．１２−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．６２−１．１４（ｍ，１２Ｈ），１．０５−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR４．５６分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２１，０７２。
実施例３９
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸カリウム（ＪＲＷ−０３４８）
2018524334.tif 000073
【０２８３】
水（２５ｍＬ）中の６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤｏｗＥｘ  ５０ＷＸ４（帯電したカリウム）を添加した。懸濁液を室温で１０分間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を凍結乾燥によって濃縮し、白色固体として所望の生成物（４８ｍｇ、９０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８３（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．４７−７．１５（ｍ，５Ｈ），７．１０−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７１−３．５４（ｍ，３Ｈ），３．０５−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．４１−２．３１（ｍ，５Ｈ），２．１５−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．７０（ｍ，４Ｈ），１．６１−１．１６（ｍ，１２Ｈ），１．０６−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR４．５５分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε１９，８１２。
実施例４０
メチル−トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０２４３）
2018524334.tif 000074
【０２８４】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（７５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチルヒドロクロリド（４６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（８９ｍｇ、９１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８６（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．４７−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１８（ｍ，３Ｈ），７．１１−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５３（ｍ，６Ｈ），３．５２−３．３５（ｍ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２９−２．１６（ｍ，１Ｈ），２．０８−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．９５−１．６５（ｍ，８Ｈ），１．５３−１．０６（ｍ，８Ｈ），１．０５−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６０７［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．７％（ＡＵＣ），ＴR６．２７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，１９２。
実施例４１
トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０２４５）
2018524334.tif 000075
【０２８５】
一般的な手順Ａに従って、メチル−トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（８０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１６ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（６６ｍｇ、８４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １２．００（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５２−３．３５（ｍ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１９−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．９４−１．６５（ｍ，８Ｈ），１．５１−１．０５（ｍ，８Ｈ），１．０５−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５９３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．４％（ＡＵＣ），ＴR５．５１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，９７６。
実施例４２
（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（カルボキシメチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オイック酸（ＪＲＷ−０２５１）
2018524334.tif 000076
ステップ１．ｔｅｒｔ−ブチル（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オエート（ＪＲＷ−０２４９）
2018524334.tif 000077
【０２８６】
一般的な手順Ｂに従って、（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アセトアミド−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタンアミド）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタンアミド）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（８１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＮ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミドヒドロクロリド（８５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として所望の生成物（１２５ｍｇ、７８％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１２２［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（カルボキシメチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オイック酸（ＪＲＷ−０２５１）
2018524334.tif 000078
【０２８７】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オエート（１２０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１８時間撹拌した。混合物をトルエンで希釈し、真空下で濃縮（３Ｘ）した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色固体として所望の生成物（６８ｍｇ、６６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １２．３１（ｓ，３Ｈ），８．４５−８．１８（ｍ，２Ｈ），７．９５−７．８３（ｍ，２Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．５２−７．１７（ｍ，６Ｈ），７．１１−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．５５−４．３５（ｍ，３Ｈ），３．７１−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．０６−２．９０（ｍ，４Ｈ），２．７５−２．６０（ｍ，３Ｈ），２．６０−２．４２（ｍ，４Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．０９−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．８９−１．６６（ｍ，７Ｈ），１．５３−１．１３（ｍ，１２Ｈ），１．０６−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９５３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９３．８％（ＡＵＣ），ＴR４．７４分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２４，４１７。
実施例４３
式（Ｉａ）の化合物の代替合成
【０２８８】
式（Ｉａ）の化合物は、スキーム３に従って一般的に合成することができる。
スキーム３．
2018524334.tif 000079
実施例４４
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ−１４１−８４）
2018524334.tif 000080
ステップ１．２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＷＺ−１４１−８２）
2018524334.tif 000081
【０２８９】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（０．４４ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（１．１６ｇ、３．８５ｍｏｌ）を１５ｍｌの塩化メチレン及び１５ｍｌのアセトニトリル中に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（０．９９６ｇ、７．７１ｍｍｏｌ）を室温でゆっくり添加し、及び得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を１００ｍｌの塩化メチレンで希釈し、３０％クエン酸で２回洗浄し、水で２回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。有機溶媒を３０ｍｌ溶液に濃縮した。さらに精製せずに、溶液の一部を次のステップで直接使用した。
ステップ２．４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ−１４１−８４）
2018524334.tif 000082
【０２９０】
上記の１０ｍｌの粗の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＷＺ１４１−８２）（１５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）に、メチルアミン（４０％）（０．５３ｇ、６．８３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒の除去後、溶離液としてヘプタン／酢酸エチルを用いて、化合物をフラッシュカラムによって精製し、定量的収率で所望の生成物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ  ７．５−６．８（ｍ，７Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７６（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｄ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｔ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ  ２５４ｎｍで９９．６％。
実施例４５
Ｎ−シクロペンチル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ−１４１−８８）
2018524334.tif 000083
【０２９１】
化合物ＷＺ１４１−８８は、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ１４１−８４）を調製するための同様の方法を使用して合成した。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９６（ｄ，１Ｈ），７．５−７．１（ｍ，６Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），４．６１（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ、ｂｒ，３Ｈ），１．９−１．４（ｍ，８Ｈ），１．００（ｔ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１０［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度  ２５４ｎｍで９９．１％。
実施例４６
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ−１４１−８９）
2018524334.tif 000084
【０２９２】
化合物ＷＺ１４１−８９は、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ１４１−８４）を調製するための同様の方法を使用して合成した。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．７９（ｔ，１Ｈ），８．４６（ｄ，２Ｈ），７．４５−７．０５（ｍ，８Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｄ，２Ｈ），３．５８（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｔ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４３３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度  ２５４ｎｍで９４．２％。
実施例４７
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ−１４１−９０）
2018524334.tif 000085
【０２９３】
化合物ＷＺ１４１−９０は、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ１４１−８４）を調製するための同様の方法を使用して合成した。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．１２（ｄ，２Ｈ），７．４−７．０（ｍ，６Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），３．７−３．４（ｍ，６Ｈ），３．４−３．２（ｍ，２Ｈ），２．４−２．２（ｓ，９Ｈ），１．７−１．５（ｍ，２Ｈ），１．１０（ｔ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度  ２５４ｎｍで９８．０％。
実施例４８
Ｎ−エチル−２−（５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＷＺ−１４１−９１）
2018524334.tif 000086
【０２９４】
化合物ＷＺ１４１−９１は、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＷＺ１４１−８４）を調製するための同様の方法を使用して合成した。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．４４（ｄ，１Ｈ），７．３−７．１（ｍ，３Ｈ），７．０３（ｄ，１Ｈ），６．２６（ｓ，１Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），３．７−３．５（ｍ，６Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｍ，４Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｔ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２５［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度  ２５４ｎｍで９６．０％。
実施例４９
式（Ｉｃ）の化合物の合成
【０２９５】
式（Ｉｃ）の化合物は、スキーム４に従って一般的に合成することができる。
スキーム４．
2018524334.tif 000087
実施例５０
４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−００７７）
2018524334.tif 000088
【０２９６】
アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２−クロロ−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（５００ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液に、４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（４１１ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３７６ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）及び１８−クラウン−６（３０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１．５時間加熱還流した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、淡褐色固体として所望の生成物（５３０ｍｇ、７１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １０．２１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．３７−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．２３（ｓ，１Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３２９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．６％（ＡＵＣ），ＴR６．３２分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２９，１７７。
実施例５１
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−００８１）
2018524334.tif 000089
ステップ１．４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−００８０）
2018524334.tif 000090
【０２９７】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１３０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４７ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）と反応させて、淡褐色固体として粗生成物を得た。
ステップ２．Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−００８１）
2018524334.tif 000091
【０２９８】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１２０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）をシクロヘキシルアミン（５６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（４７ｍｇ、３１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １０．１３（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．４３−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．２３−７．１０（ｍ，３Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），３．７５−３．５８（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），１．８５−１．５３（ｍ，５Ｈ），１．３５−１．００（ｍ，５Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３９６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９４．７％（ＡＵＣ），ＴR７．３４分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８５ｎｍ，ε２８，０６６。
実施例５２
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１０９）
2018524334.tif 000092
ステップ１．Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−３−メチルアニリン（ＪＲＷ−０１０１）
2018524334.tif 000093
【０２９９】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のｍ−トルイジン（１．０ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に、１−ブロモ−２−（２−メトキシエトキシ）エタン（０．８５ｇ、４．６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアミン（１．２ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１００℃に４時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、油として所望の生成物（６５０ｍｇ、６６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．０７（ｔ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），６．５２−６．４５（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｔ，Ｊ＝５．３，２Ｈ），３．６７−３．６２（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｔ，Ｊ＝５．３，２Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２１０［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．２−クロロ−Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＪＲＷ−０１０４）
2018524334.tif 000094
【０３００】
酢酸エチル（１５ｍＬ）中のＮ−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−３−メチルアニリン（６５０ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水（５ｍＬ）を添加した。二相性溶液を０℃に冷却し、水酸化カリウム（５２２ｍｇ、９．３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。２−クロロアセチルクロリド（５２６ｍｇ、４．７ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。混合物を２．５時間撹拌し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮し、淡赤色油として粗生成物（８３０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３４−７．２５（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．１５−７．０３（ｍ，２Ｈ），３．８９（ｔ，Ｊ＝５．８，２Ｈ），３．８３（ｓ，２Ｈ），３．６５（ｔ，Ｊ＝５．８，２Ｈ），３．６２−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．４６（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２８６［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０１０５）
2018524334.tif 000095
【０３０１】
アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２−クロロ−Ｎ−（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（８３０ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（４３８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４００ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）及び１８−クラウン−６（３２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１８時間加熱還流した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、濃厚な油として粗生成物（１．３ｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４３０［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ４．４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０１０７）
2018524334.tif 000096
【０３０２】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（２．４ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（２８７ｍｇ、１２．０ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（１．０ｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ５．Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１０９）
2018524334.tif 000097
【０３０３】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１２０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をシクロヘキシルアミン（４２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色ゴムとして所望の生成物（１２０ｍｇ、８３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９６−７．８５（ｍ，１Ｈ），７．４８−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．０７（ｍ，２Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．８２−３．６２（ｍ，３Ｈ），３．５６−３．３５（ｍ，６Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．９０−１．５４（ｍ，５Ｈ），１．４１−１．０４（ｍ，５Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９６．０％（ＡＵＣ），ＴR７．３８分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２５，４３４。
実施例５３
メチル−トランス−４−（４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０１１０）
2018524334.tif 000098
【０３０４】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１２０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（６８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色ゴムとして所望の生成物（１４０ｍｇ、８７％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９４（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．４６−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．１５−７．０４（ｍ，２Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），３．７８−３．６５（ｍ，３Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），３．５２−３．３５（ｍ，６Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．３４−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．０２−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．５３−１．２２（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．７％（ＡＵＣ），ＴR６．６０分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２３，５６７。
実施例５４
４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０１４２）
2018524334.tif 000099
ステップ１．２−クロロ−Ｎ−ヘキシル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＪＲＷ−０１４１）
2018524334.tif 000100
【０３０５】
酢酸エチル（１５ｍＬ）中のＮ−ヘキシル−３−メチルアニリン（５００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、水（５ｍＬ）を添加した。二相性溶液を０℃に冷却し、水酸化カリウム（４４０ｍｇ、７．８ｍｍｏｌ）を一度に添加した。２−クロロアセチルクロリド（４４２ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。混合物を１時間撹拌し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮し、淡赤色油として粗生成物（７３０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３２（ｔ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．２４−７．１７（ｍ，１Ｈ），７．０４−６．９７（ｍ，２Ｈ），３．８０（ｓ，２Ｈ），３．７４−３．６１（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．５９−１．４１（ｍ，２Ｈ），１．３７−１．１６（ｍ，６Ｈ），０．９２−０．８０（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２６８［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０１４２）
2018524334.tif 000101
【０３０６】
アセトニトリル（２０ｍＬ）中の２−クロロ−Ｎ−ヘキシル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（７００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（３９４ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３６１ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）及び１８−クラウン−６（２９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１８時間加熱還流した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色固体として所望の生成物（７８０ｍｇ、８６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．５３（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４１（ｔ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．３３−７．１１（ｍ，５Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．４８−１．３０（ｍ，２Ｈ），１．２８−１．１５（ｍ，６Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．１％（ＡＵＣ），ＴR７．１８分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２６，８４０。
実施例５５
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１４８）
2018524334.tif 000102
ステップ１．４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０１４９）
2018524334.tif 000103
【０３０７】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（３００ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（８７ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（３００ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３９９［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０１４８）
2018524334.tif 000104
【０３０８】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をシクロヘキシルアミン（１５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（６０ｍｇ、９９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．４６−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０６（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７５−３．６０（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｔ，Ｊ＝６．７，２Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．８４−１．５２（ｍ，５Ｈ），１．４３−１．０４（ｍ，１３Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８０［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．１％（ＡＵＣ），ＴR８．６２分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，５４４。
実施例５６
メチル−トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０１４９）
2018524334.tif 000105
【０３０９】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（２４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（６５ｍｇ、９６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９１（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．０６（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．７５−３．４７（ｍ，６Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．３１−２．２０（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．１０（ｍ，１２Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５３８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９９．８％（ＡＵＣ），ＴR８．１７分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２６，５０９。
実施例５７
トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０２６０）
2018524334.tif 000106
【０３１０】
一般的な手順Ａに従って、メチル−トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（５８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１３ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（５５ｍｇ、９７％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １２．０３（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．４６−７．１７（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０６（ｍ，２Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７４−３．４８（ｍ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．１９−２．０５（ｍ，１Ｈ），２．００−１．７７（ｍ，４Ｈ），１．４８−１．０９（ｍ，１２Ｈ），０．８８−０．７７（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２４［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR７．４２分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，２４０。
実施例５８
４−（２−（ベンジル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＷＺ−１４１−８６）
2018524334.tif 000107
ステップ１．Ｎ−ベンジル−２−クロロ−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（ＷＺ−１４１−８５）
2018524334.tif 000108
【０３１１】
５０ｍｌの塩化メチレン中のＮ−ベンジル−３−メチルアニリン（１．３５ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．７６１ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃での２−クロロアセチルクロリド（０．７７２ｇ、０．７７２ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌した後、室温で一晩撹拌した。混合物を１００ｍｌの塩化メチレンで希釈し、水で３回洗浄し、有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒の除去後、溶媒としてヘプタン及び酢酸エチルを用いて、化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、７４％の収率で黄色味がかった生成物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2）δ  ７．６−６．７（ｍ，９Ｈ），４．８９（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２７４［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（ベンジル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＷＺ−１４１−８６）
2018524334.tif 000109
【０３１２】
５０ｍｌのアセトニトリル中のＮ−ベンジル−２−クロロ−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（１．３６ｇ、４．９７ｍｍｏｌ）、４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（０．６ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（０．２６２ｇ、０．９９３ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（０．９１５ｇ、６．６２ｍｍｏｌ）の混合物を一晩加熱還流した。冷却時、大部分の溶媒を真空下で除去し、残渣を塩化メチレン（１００ｍｌ）中に溶解させて、水で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒の除去後、溶媒としてヘプタン及び酢酸エチルを用いて、化合物をフラッシュカラムによって精製し、９５％の収率で青白い生成物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．５７（ｓ，１Ｈ），７．４−７．１（ｍ，1１Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度  ２５４ｎｍで９４．３％。
スキーム５．
2018524334.tif 000110
実施例５９
トランス−４−（４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３１８）
2018524334.tif 000111
ステップ１．４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０２７７）
2018524334.tif 000112
【０３１３】
アセトニトリル（３０ｍＬ）中の４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１．４ｇ、７．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１．２８ｇ、９．２８ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（１０２ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、及び２−ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．８１ｇ、９．２８ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７５℃に１８時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、淡黄色固体として所望の生成物（２．１ｇ、９１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３４（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝０．７，１Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝０．７，５．４，１Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９６［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（ＪＲＷ−０２８８）
2018524334.tif 000113
【０３１４】
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１．９２ｇ、６．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加した。溶液を室温で４時間撹拌した後、混合物を濃縮した。トルエンを残渣に添加し、濃縮して、白色固体として粗生成物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３８（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２４０［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０２９４）
2018524334.tif 000114
【０３１５】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−エチルアニリン（１０１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１０８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を７５℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色固体として所望の生成物（８６ｍｇ、６０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．５７−７．２１（ｍ，６Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．８７−３．６８（ｍ，５Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４３［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ４．４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−３０９）
2018524334.tif 000115
【０３１６】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（８６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（３０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）と反応させて、淡褐色固体として粗生成物（８２ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３２９［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ５．トランス−４−（４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３１８）
2018524334.tif 000116
【０３１７】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（８０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（５６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（８１ｍｇ、７１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８９（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．６０−７．２８（ｍ，６Ｈ），７．０４−７．１３（ｍ，２Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５２（ｍ，５Ｈ），２．３１−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．０３−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５０−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．０７−０．９３（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．７％（ＡＵＣ），ＴR６．５１分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２８，２７４。
実施例６０
トランス−４−（４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２１）
2018524334.tif 000117
ステップ１．２−クロロ−Ｎ−（３−シアノフェニル）−Ｎ−エチルアセトアミド（ＪＲＷ−０３１３）
2018524334.tif 000118
【０３１８】
酢酸エチル（７ｍＬ）中の３−（エチルアミノ）ベンゾニトリル（６０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、水（３ｍＬ）を添加した。二相性溶液を０℃に冷却し、水酸化カリウム（６９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。２−クロロアセチルクロリド（６９ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。混合物を２時間撹拌し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮し、油として粗生成物（９８ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．８１−７．４２（ｍ，４Ｈ），３．８４−３．７０（ｍ，４Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２２３［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３１６）
2018524334.tif 000119
【０３１９】
アセトニトリル（５ｍＬ）中の４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（６８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（６２ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）、及び２−クロロ−Ｎ−（３−シアノフェニル）−Ｎ−エチルアセトアミド（９８ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７５℃に１８時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色泡として所望の生成物（９４ｍｇ、６８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．７１−７．６２（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），３．８７−３．７０（ｍ，５Ｈ），１．１４（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６８［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３１９−１）及び４−（２−（（３−カルバモイルフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３１９−２）
2018524334.tif 000120
【０３２０】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（９０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１２ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）と反応させた。２つの生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって分離し、白色固体としてニトリル（６１ｍｇ）及びアミド（３１ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５４［Ｍ＋Ｈ］+及びｍ／ｚ  ３７２［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ４．トランス−４−（４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２１）
2018524334.tif 000121
【０３２１】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（５６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（６８ｍｇ、８１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．０２−７．５９（ｍ，５Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．１７−７．０３（ｍ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．７７−３．５５（ｍ，６Ｈ），２．３２−２．１８（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．７９（ｍ，４Ｈ），１．５４−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．１０−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．３％（ＡＵＣ），ＴR６．１２分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２６，８０２。
実施例６１
トランス−４−（４−（２−（（３−カルバモイルフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２２）
2018524334.tif 000122
【０３２２】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（（３−カルバモイルフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（１９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（３３ｍｇ、８０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．０５（ｓ，１Ｈ），７．９７−７．８３（ｍ，３Ｈ），７．７２−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．１２−７．０５（ｍ，２Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），３．７５−３．５４（ｍ，６Ｈ），２．３２−２．１８（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．７９（ｍ，４Ｈ），１．５３−１．２２（ｍ，４Ｈ），１．１０−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５１１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．２％（ＡＵＣ），ＴR４．８１分；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２８，２２３。
実施例６２
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２６）
2018524334.tif 000123
ステップ１．４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０２９８）
2018524334.tif 000124
【０３２３】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，３−ジエチルアニリン（９４ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、橙色の泡として所望の生成物（１０７ｍｇ、６９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３８（ｔ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．３１−７．２０（ｍ，２Ｈ），７．１７−７．１０（ｍ，３Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），３．８４−３．６７（ｍ，５Ｈ），２．７１（ｑ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．６，３Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３２３）
2018524334.tif 000125
【０３２４】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１９ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（１００ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２６）
2018524334.tif 000126
【０３２５】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（６５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１０５ｍｇ、７５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９０（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．５１−７．１９（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７４−３．５４（ｍ，５Ｈ），２．７３−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．３２−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．０１−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．１４（ｍ，７Ｈ），１．０８−０．９５（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．６％（ＡＵＣ），ＴR７．３７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２７，３４３。
実施例６３
４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０４２９）
2018524334.tif 000127
ステップ１．トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０４２７）
2018524334.tif 000128
【０３２６】
一般的な手順Ａに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（９８０ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１４２ｍｇ、５．９３ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（１．０ｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０４２９）
2018524334.tif 000129
【０３２７】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（２００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を６−アミノヘキサン−１−オール（７３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色の泡として所望の生成物（２００ｍｇ、８３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ），７．４６−７．１８（ｍ，５Ｈ），７．１１−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝５．２，１Ｈ），３．７２−３．５５（ｍ，３Ｈ），３．４０−３．３２（ｍ，２Ｈ），３．０５−２．９５（ｍ，２Ｈ），２．７２−２．６２（ｍ，２Ｈ），２．１０−１．９７（ｍ，１Ｈ），１．８９−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．５３−１．１４（ｍ，１５Ｈ），１．０１（ｔ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５８１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．８５分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２５，１６５。
実施例６４
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム（ＪＲＷ−０４３２）
2018524334.tif 000130
ステップ１．４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０４３１）
2018524334.tif 000131
【０３２８】
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のイミダゾール（６０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２３０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、及びヨウ素（２２３ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１０分間撹拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させた４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（１７０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液で急冷した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって一部精製し、白色固体として粗生成物を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６９１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム（ＪＲＷ−０４３２）
2018524334.tif 000132
【０３２９】
エタノール（１０ｍＬ）中の４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、亜硫酸ナトリウム（１８４ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）及び水（１０ｍＬ）を添加した。混合物を７５℃に３．５時間加熱した。反応物を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色固体として所望の生成物（２０５ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８８（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．６８（ｔ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．４８−７．１９（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７１−３．５５（ｍ，３Ｈ），３．０４−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．７４−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．３２（ｍ，２Ｈ），２．１１−１．９７（ｍ，１Ｈ），１．８８−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．６２−１．１４（ｍ，１５Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６４５［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．０７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε１８，２７６。
実施例６５
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２７）
2018524334.tif 000133
ステップ１．４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０２９９）
2018524334.tif 000134
【０３３０】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（９４ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、橙色の泡として所望の生成物（９７ｍｇ、６２％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３７（ｔ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．１５（ｓ，１Ｈ），６．９９−６．８４（ｍ，３Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．８３−３．６９（ｍ，５Ｈ），１．１４（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７３［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３２４）
2018524334.tif 000135
【０３３１】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（９５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１８ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（８８ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５９［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２７）
2018524334.tif 000136
【０３３２】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（８８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（４８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（７８ｍｇ、６３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９０（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．５０−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．１６−６．９１（ｍ，５Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７５−３．５３（ｍ，６Ｈ），２．３３−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．０１−１．７７（ｍ，４Ｈ），１．５０−１．２２（ｍ，４Ｈ），１．０８−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９６．４％（ＡＵＣ），ＴR６．６９分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２８，６７１。
実施例６６
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３０）
2018524334.tif 000137
ステップ１．４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３００）
2018524334.tif 000138
【０３３３】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−エチル−２−メチルアニリン（８４ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色泡として所望の生成物（７２ｍｇ、４８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．４３−７．２１（ｍ，５Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），５．０２（ｄ，Ｊ＝１６．９，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝１６．９，１Ｈ），４．１５（ｄｑ，Ｊ＝７．１、１４．２，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｄｑ，Ｊ＝７．１，１４．２，１Ｈ），１．１４（ｔ，Ｊ＝７．１，４Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３２８）
2018524334.tif 000139
【０３３４】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（７０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（２３ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（６９ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４３［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３０）
2018524334.tif 000140
【０３３５】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（６９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（４６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（７７ｍｇ、７９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９１（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．４９−７．２９（ｍ，５Ｈ），７．１１−６．９８（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｄ，Ｊ＝１６．７，１Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝１６．７，１Ｈ），４．０６−３．９０（ｍ，１Ｈ），３．７２−３．５３（ｍ，４Ｈ），３．１４−２．９９（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．３１−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．００−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．１４（ｍ，４Ｈ），０．９９（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９２．３％（ＡＵＣ），ＴR６．９７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２９，４６８。
実施例６７
トランス−４−（４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３１）
2018524334.tif 000141
ステップ１．４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３０１）
2018524334.tif 000142
【０３３６】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、６−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（９２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色泡として所望の生成物（１４０ｍｇ、９０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３１（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），７．０８−６．９６（ｍ，３Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），５．３９（ｓ，２Ｈ），３．８６−３．７４（ｍ，５Ｈ），２．８２−２．６６（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．０５−１．８９（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３２９）
2018524334.tif 000143
【０３３７】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４２ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）と反応させて、橙色固体として粗生成物（１２０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３１）
2018524334.tif 000144
【０３３８】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（９２ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（１３０ｍｇ、６７％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８９（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．０８−６．８８（ｍ，２Ｈ），５．４４（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５３（ｍ，６Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６．６，２Ｈ），２．３３−２．１６（ｍ，４Ｈ），２．００−１．７４（ｍ，６Ｈ），１．５０−１．２０（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９４［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．９％（ＡＵＣ），ＴR７．１６分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８７ｎｍ，ε２６，０２７。
実施例６８
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３４）
2018524334.tif 000145
ステップ１．４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３１４）
2018524334.tif 000146
【０３３９】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−エチル−４−メチルアニリン（６８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１８時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色泡として所望の生成物（１２０ｍｇ、８０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３３−７．１８（ｍ，５Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｑ，Ｊ＝７．２，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３３２）
2018524334.tif 000147
【０３４０】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１２０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（１０９ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４３［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３４）
2018524334.tif 000148
【０３４１】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１０９ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（７４ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１３１ｍｇ、８５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８８（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．４１−７．２５（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．４８（ｓ，６Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．３１−２．１９（ｓ，１Ｈ），２．０１−１．７７（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．１９（ｍ，４Ｈ），１．０５−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．０％（ＡＵＣ），ＴR７．０４分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２７，４９０。
実施例６９
トランス−４−（４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３５）
2018524334.tif 000149
ステップ１．４−（２−（（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３２０）
2018524334.tif 000150
【０３４２】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１５０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の溶液に、４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−Ｎ−エチルアニリン（１６６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４７７ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（２４３ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に３０分間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、淡黄色の泡として所望の生成物（１６５ｍｇ、５４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３１（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ），７．２３−７．１１（ｍ，３Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝５．３，１Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５５（ｍ，５Ｈ），０．９９（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．００（ｓ，６Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０３３３）
2018524334.tif 000151
【０３４３】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１６５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（１１０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５９［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３３５）
2018524334.tif 000152
【０３４４】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１１０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（７１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（１６９ｍｇ、９１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８９（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．５２−７．３１（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０５（ｍ，２Ｈ），５．３０−５．２１（ｍ，１Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），４．５４（ｄ，Ｊ＝５．６，２Ｈ），３．７４−３．５１（ｍ，６Ｈ），２．３２−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．００−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．２１（ｍ，４Ｈ），１．０５−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．７％（ＡＵＣ），ＴR５．１３分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８８ｎｍ，ε２４，１０３。
実施例７０
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６０）
2018524334.tif 000153
ステップ１．４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４５４）
2018524334.tif 000154
【０３４５】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１１０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−エチル−３−イソプロピルアニリン（１１２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３５０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１７８ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１．５時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、淡橙色油として所望の生成物（１４７ｍｇ、８３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．４５−７．３４（ｍ，１Ｈ），７．３１−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．２０−７．１１（ｍ，３Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），３．８３−３．７１（ｍ，５Ｈ），３．０５−２．８７（ｍ，１Ｈ），１．３５−１．２５（ｍ，６Ｈ），１．１８−１．０９（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０４５７）
2018524334.tif 000155
【０３４６】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１４５ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４５ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）と反応させて、淡褐色固体として粗生成物（１３４ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６０）
2018524334.tif 000156
【０３４７】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（１０２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（１３５ｍｇ、７５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９１（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．４８−７．３３（ｍ，３Ｈ），７．３２−７．１９（ｍ，２Ｈ），７．１２−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．５２（ｍ，６Ｈ），３．０４−２．８７（ｍ，１Ｈ），２．３３−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．００−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．１８（ｍ，１０Ｈ），１．０８−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５１０［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９８．８％（ＡＵＣ），ＴR７．６１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２３，９３３。
実施例７１
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６１）
2018524334.tif 000157
ステップ１．４−（２−（（３−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４５５）
2018524334.tif 000158
【０３４８】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１２０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−Ｎ−エチルアニリン（２００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３８１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１９４ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１．５時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、無色油として所望の生成物（１５６ｍｇ、６３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３１（ｔ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．２４−７．１７（ｍ，１Ｈ），７．１８−７．０６（ｍ，３Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝５．２，１Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），３．７１−３．５４（ｍ，５Ｈ），０．９９（ｔ，Ｊ＝６．９，３Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．００（ｓ，６Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０４５８）
2018524334.tif 000159
【０３４９】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（（３−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１５６ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（３８ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５９［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６１）
2018524334.tif 000160
【０３５０】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（１２１ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１２６ｍｇ、６０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９０（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．５４−７．２７（ｍ，５Ｈ），７．１３−７．０３（ｍ，２Ｈ），５．３３−５．２４（ｓ，１Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝５．５，２Ｈ），３．７３−３．５２（ｍ，６Ｈ），２．３１−２．１８（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５３−１．２１（ｍ，４Ｈ），１．０７−０．９４（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９８［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．２％（ＡＵＣ），ＴR５．２３分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２５，８５６。
実施例７２
トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６６）
2018524334.tif 000161
【０３５１】
ＴＨＦ（５ｍＬ）中の四臭化炭素（３３３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（２６３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のトランス−４−（４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で４８時間撹拌した。混合物をＤＣＭで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色固体として所望の生成物（１１ｍｇ、２０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９４−７．８６（ｍ，１Ｈ），７．７２−７．３０（ｍ，５Ｈ），７．１９−６．９７（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｓ，２Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ），３．７６−３．４９（ｍ，６Ｈ），２．３７−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．０５−１．７５（ｍ，４Ｈ），１．５５−１．１９（ｍ，４Ｈ），１．１０−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５６２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ８７．２％（ＡＵＣ），ＴR６．９６分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２０，６４８。
実施例７３
トランス−４−（４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４７８）
2018524334.tif 000162
ステップ１．４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４７５）
2018524334.tif 000163
【０３５２】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１１５ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ１−エチル−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルベンゼン−１，３−ジアミン（１１８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３６５ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１８６ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に１時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、黄色固体として所望の生成物（１５２ｍｇ、８２％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３５−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．１４（ｓ，１Ｈ），６．８５−６．６０（ｍ，４Ｈ），５．０５（ｓ，３Ｈ），３．８９−３．６１（ｍ，５Ｈ），３．０２（ｓ，６Ｈ），１．２９−０．９７（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８６［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０４７６）
2018524334.tif 000164
【０３５３】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１６０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（５０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）と反応させて、淡緑色固体として粗生成物（１３０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７２［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４７８）
2018524334.tif 000165
【０３５４】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（１０２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）と反応させて、オフホワイト固体として所望の生成物（１３２ｍｇ、７４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９１（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．２８（ｔ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．１１−７．０４（ｍ，２Ｈ），６．８６−６．６５（ｍ，３Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．７４−３．５１（ｍ，６Ｈ），２．９５（ｓ，６Ｈ），２．３２−２．１９（ｓ，１Ｈ），２．０１−１．７９（ｍ，４Ｈ），１．４９−１．２５（ｍ，４Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５１１［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．８％（ＡＵＣ），ＴR５．２１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε２９，９０９。
実施例７４
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０５０８）
2018524334.tif 000166
ステップ１．４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０５０２）
2018524334.tif 000167
【０３５５】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−エチル−３−イソブチルアニリン（８９ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８５℃に４時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、濃厚な油として所望の生成物（１２８ｍｇ、７７％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３８（ｔ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．２１−７．１３（ｍ，３Ｈ），７．１３−７．０９（ｍ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝４．８，１Ｈ），４．９５（ｓ，２Ｈ），３．８４−３．６９（ｍ，５Ｈ），２．５４（ｄ，Ｊ＝７．２，２Ｈ），１．９８−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝６．１、６Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３９９［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０５０５）
2018524334.tif 000168
【０３５６】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（３６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色固体として粗生成物（１２５ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０５０８）
2018524334.tif 000169
【０３５７】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１２０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（９０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として所望の生成物（１３０ｍｇ、８０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．９０（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．４７−７．１３（ｍ，５Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，６Ｈ），２．５７−２．４６（ｍ，２Ｈ），２．３２−２．１９（ｍ，１Ｈ），２．００−１．７９（ｍ，５Ｈ），１．５０−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．０６−０．９４（ｍ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．６，６Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２４［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR６．７３分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８９ｎｍ，ε１９，１１５。
スキーム６．
2018524334.tif 000170
実施例７５
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３５５）
2018524334.tif 000171
ステップ１．１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３４９）
2018524334.tif 000172
【０３５８】
アセトニトリル（５ｍＬ）中の１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（１００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（９４ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、及び２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（１２０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７５℃に１８時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色固体として所望の生成物（１０８ｍｇ、５４％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．６５（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．４４−７．０７（ｍ，８Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．７８−３．６８（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（ＪＲＷ−０３５３）
2018524334.tif 000173
【０３５９】
一般的な手順Ａに従って、１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（１０８ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（３７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（１０３ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３３７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３５５）
2018524334.tif 000174
【０３６０】
一般的な手順Ｂに従って、１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（１０３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（７１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１３３ｍｇ、９１％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７６［Ｍ＋Ｈ］+。
実施例７６
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４２４）
2018524334.tif 000175
ステップ１．２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−エチルフェニル）アセトアミド（ＪＲＷ−０４１３）
2018524334.tif 000176
【０３６１】
酢酸エチル（３０ｍＬ）中のＮ−エチル−３−エチルアニリン（０．９７ｇ、６．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１０ｍＬ）を添加した。二相性溶液を０℃に冷却し、及び水酸化カリウム（１．０９ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。２−クロロアセチルクロリド（１．１０ｇ、０．７６ｍＬ、９．７５ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。混合物を１時間撹拌し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮し、モービル油として粗生成物（１．５４ｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２２６［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４１６）
2018524334.tif 000177
【０３６２】
アセトニトリル（２０ｍＬ）中の１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（５８２ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（５５１ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（４４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−エチルフェニル）アセトアミド（７５０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７５℃に１８時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、淡褐色固体として所望の生成物（０．７４ｇ、６１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．６５（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．５０−７．０７（ｍ，８Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８２−３．６９（ｍ，４Ｈ），２．７８−２．６３（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．１８−１．０６（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（ＪＲＷ−０４１９）
2018524334.tif 000178
【０３６３】
一般的な手順Ａに従って、１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（７４０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（２４３ｍｇ、１０．１ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（６９０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５０［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ４．トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４２４）
2018524334.tif 000179
【０３６４】
一般的な手順Ｂに従って、１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（６９０ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（４５７ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（７６０ｍｇ、７９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．２０（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），７．５１−７．１３（ｍ，６Ｈ），７．１３−７．０２（ｍ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．７７−３．５４（ｍ，６Ｈ），２．６９（ｄ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），２．３３−２．２１（ｍ，１Ｈ），２．０２−１．８１（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．３０（ｍ，４Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝７．６，３Ｈ），１．０８−０．９５（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９０［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR７．５６分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２９１ｎｍ，ε１５，７３７。
実施例７７
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０４３０）
2018524334.tif 000180
ステップ１．トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０４２８）
2018524334.tif 000181
【０３６５】
一般的な手順Ａに従って、トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（７２０ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（１０５ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（６８０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７６［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０４３０）
2018524334.tif 000182
【０３６６】
一般的な手順Ｂに従って、トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（２００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を６−アミノヘキサン−１−オール（７４ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色の泡として所望の生成物（２１８ｍｇ、７９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．１７（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．６９−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．５０−７．１４（ｍ，６Ｈ），７．１３−７．０２（ｍ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝５．２，１Ｈ），３．７７−３．５２（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝６．４、１１．７，２Ｈ），３．０５−２．９５（ｍ，２Ｈ），２．７４−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．１３−１．９７（ｍ，１Ｈ），１．９１−１．６９（ｍ，４Ｈ），１．５４−１．１５（ｍ，１５Ｈ），１．０９−０．９３（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５７５［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR６．１２分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２９１ｎｍ，ε１７，２４３。
実施例７８
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム（ＪＲＷ−０４３４）
2018524334.tif 000183
ステップ１．１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０４３３）
2018524334.tif 000184
【０３６７】
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のイミダゾール（６６ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２５４ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、及びヨウ素（２４６ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１０分間撹拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させた１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（１８６ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液で急冷した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって一部精製し、白色固体として粗生成物を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６８５［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム（ＪＲＷ−０４３４）
2018524334.tif 000185
【０３６８】
エタノール（１０ｍＬ）中の１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（０．３２ｍｍｏｌ）の溶液に、亜硫酸ナトリウム（２０３ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及び水（１０ｍＬ）を添加した。混合物を７５℃に２時間加熱した。反応物を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール）によって精製し、白色固体として所望の生成物（１９０ｍｇ、８９％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ８．２１（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．５１−７．１４（ｍ，６Ｈ），７．１２−７．０３（ｍ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．７６−３．５３（ｍ，３Ｈ），３．００（ｄｄ，Ｊ＝６．６、１２．７，２Ｈ），２．７６−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．３９−２．３２（ｍ，２Ｈ），２．１２−１．９９（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．７０（ｍ，４Ｈ），１．６１−１．１４（ｍ，１５Ｈ），１．０８−０．９５（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR５．０７分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２９１ｎｍ，ε１５，８００。
実施例７９
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３５９）
2018524334.tif 000186
ステップ１．１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３５１）
2018524334.tif 000187
【０３６９】
アセトニトリル（５ｍＬ）中の６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（１１６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（９４ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、及び２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（１２０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７０℃に２日間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色固体として所望の生成物（１５５ｍｇ、７２％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．５１（ｄ，Ｊ＝８．７，１Ｈ），７．４１−７．３１（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．０８（ｍ，４Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７，１Ｈ），６．６２−６．５５（ｍ，１Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．８１−３．６８（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），１．１８−１．０９（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（ＪＲＷ−０３５７）
2018524334.tif 000188
【０３７０】
一般的な手順Ａに従って、１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチル（１５０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（４７ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３５９）
2018524334.tif 000189
【０３７１】
一般的な手順Ｂに従って、１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（９５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１６３ｍｇ、７８％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５０６［Ｍ＋Ｈ］+。
実施例８０
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−３６０）
2018524334.tif 000190
ステップ１．４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０３５２）
2018524334.tif 000191
【０３７２】
アセトニトリル（５ｍＬ）中の４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（９４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（９４ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、及び２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（１２０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７０℃に２日間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色固体として所望の生成物（１６６ｍｇ、８６％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．４７（ｄ，Ｊ＝２．２，１Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．２４−７．１７（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．８１−６．７８（ｍ，１Ｈ），６．３８−６．３６（ｍ，１Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），３．８５−３．６７（ｍ，５Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−３５８）
2018524334.tif 000192
【０３７３】
一般的な手順Ａに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１６０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（５６ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３２７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−３６０）
2018524334.tif 000193
【０３７４】
一般的な手順Ｂに従って、４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（１０６ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（１７８ｍｇ、８３％）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６６［Ｍ＋Ｈ］+。
実施例８１
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４５６）
2018524334.tif 000194
ステップ１．１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４５０）
2018524334.tif 000195
【０３７５】
アセトニトリル（２０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチル（２９５ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（３９１ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（３１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、及び２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（５００ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７５℃に１８時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、透明油として所望の生成物（５３０ｍｇ、７５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３５（ｔ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），７．２４−７．１０（ｍ，３Ｈ），６．９３（ｄｄ，Ｊ＝１．８，３．９，１Ｈ），６．７８−６．７０（ｍ，１Ｈ），６．１３（ｄｄ，Ｊ＝２．６，３．９，１Ｈ），４．７７（ｓ，２Ｈ），３．８５−３．６１（ｍ，６Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（ＪＲＷ−０４５３）
2018524334.tif 000196
【０３７６】
一般的な手順Ａに従って、１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチル（５３０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（２１１ｍｇ、８．８２ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（４７５ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２８７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４５６）
2018524334.tif 000197
【０３７７】
一般的な手順Ｂに従って、１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（４７５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（４８２ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）と反応させて、白色泡として所望の生成物（５０５ｍｇ、７１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．６２（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．４１−７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２６−７．１２（ｍ，３Ｈ），６．８２−６．６７（ｍ，２Ｈ），５．９４（ｄｄ，Ｊ＝２．６、３．８，１Ｈ），４．７７（ｓ，２Ｈ），３．６７−３．５４（ｍ，６Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．２９−２．１８（ｓ，１Ｈ），１．９８−１．７４（ｍ，４Ｈ），１．４８−１．２６（ｍ，４Ｈ），１．０９−０．９２（ｍ，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ９７．５％（ＡＵＣ），ＴR６．０５分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２６４ｎｍ，ε１１，９７８。
実施例８２
トランス−４−（６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６３）
2018524334.tif 000198
ステップ１．６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４５９）
2018524334.tif 000199
【０３７８】
アセトニトリル（１０ｍＬ）中の６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（１７１ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１５７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６エーテル（１３ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）、及び２−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド（２００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を７５℃に１８時間加熱した。混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その後、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘプタン／酢酸エチル）によって精製し、白色固体として所望の生成物（２６０ｍｇ、７７％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ  ７．３７（ｔ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．２５−７．０９（ｍ，４Ｈ），６．９９−６．９５（ｍ，１Ｈ），６．９１−６．８５（ｍ，１Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），３．９２−３．６４（ｍ，５Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｔ，Ｊ＝７．２、４Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５７［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ２．６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０４６２）
2018524334.tif 000200
【０３７９】
一般的な手順Ａに従って、６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル（２６０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム（８７ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）と反応させて、白色固体として粗生成物（２４０ｍｇ）を得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３４２［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップ３．トランス−４−（６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（ＪＲＷ−０４６３）
2018524334.tif 000201
【０３８０】
一般的な手順Ｂに従って、６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（２４０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をトランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸メチル（２０３ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）と反応させて、淡黄色の泡として所望の生成物（３２０ｍｇ、９５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  ７．８８（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．１４（ｍ，３Ｈ），７．１１−６．９５（ｍ，３Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，６Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｓ，１Ｈ），２．０２−１．７６（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．２０（ｍ，４Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４８２［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ＞９９％（ＡＵＣ），ＴR７．０１分；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２８７ｎｍ，ε１２，８９４。
【０３８１】
実施例８３
Ｎｌｕｃルシフェラーゼの阻害
Ｋ５６２を、２０００細胞／ウェルで、２０μＬのＲＰＭＩ培地中のＣｏｒｎｉｎｇ  ３７０７アッセイプレートのウェルにプレートし、一晩インキュベートした。トレイル滴定を１０μＬのＲＰＭＩ培地中で調製し、細胞に添加した。その後、１０μＬの４×ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）ＭＴ細胞生存率試薬（ＲＴＣＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または培地（対照）のいずれかを各ウェルに添加した。反応物を種々の時点で３７℃／５％ＣＯ2にてインキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を測定した。５時間で、４０μＬのＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）３／７検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、２００μＭのＪＲＷ−０００４の有無に関わらず添加した。反応物を２時間室温（ＲＴ）でインキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を測定した。図１は、ＪＲＷ−０００４が、ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）ＭＴ細胞生存率試薬中でＮｌｕｃ酵素を阻害するため、ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）アッセイとＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイを組み合わせる多重化において、ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイウインドウを回復することができることを示す。
【０３８２】
実施例８４
精製されたＮｌｕｃルシフェラーゼの阻害
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０アッセイプレートでは、精製されたＮｌｕｃ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、２０ｍＭのＤＴＴ、及びＤＴＴによる還元時にＮｌｕｃ基質に変換されるＮｌｕｃ  Ｐｒｏ基質（米国特許公開第２０１３／０１３０２８９号に記載されるＰＢＩ−４４４２）を添加した。その後、ＪＲＷ−０００４、ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−０００６、ＪＲＷ−００４２、ＪＲＷ−０１３８、及びＪＲＷ−０１４７の化合物滴定を行った（ＰＢＳ中で１：２の段階希釈、１１ポイント＋阻害剤無しの対照、２００μＭで開始し；反応中で１００μＭの最終濃度）。化合物滴定をアッセイプレートのウェルに等しい容量で添加した。反応物を室温で２時間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０３を用いて、半最大阻害（チエノピロール化合物）濃度（ＩＣ50）を判断した。図２は、全ての化合物が、精製されたＮｌｕｃ酵素を阻害することができることを示す。
【０３８３】
実施例８５
Ｎｌｕｃルシフェラーゼの阻害の特異性
以下の実施例は、Ｎｌｕｃルシフェラーゼ活性対ホタルルシフェラーゼ活性、例えば、ＵＬＴＲＡＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼを阻害するための本開示のチエノピロール化合物ＪＲＷ−０００４、ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−０００６、ＪＲＷ−００４２、ＪＲＷ−０１３８、及びＪＲＷ−０１４７の特異性について述べる。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０アッセイプレートでは、ルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｖ８６５／８５９）中に１μＭのルシフェリンを含有する溶液をアッセイウェルに添加した。その後、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０００４、ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−０００６、ＪＲＷ−００４２、ＪＲＷ−０１３８、及びＪＲＷ−０１４７の等しい容量の滴定をウェルに添加した。反応物を室温で２時間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を測定した。図３は、チエノピロール化合物が、ホタルルシフェラーゼ活性を阻害しなかったことを示す。
【０３８４】
実施例８６
多重化を可能にするチエノピロール化合物
以下の実施例は、Ｎｌｕｃルシフェラーゼと別のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼを利用するアッセイの多重化を可能にするための本発明のチエノピロール化合物の使用について述べる。
【０３８５】
Ａ）Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０アッセイプレートでは、ＭＣＦ７細胞を、２０μＬの細胞培養培地（０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン及び１０％ウシ胎児血清で補充したＥＭＥＭ）中で１，０００細胞／ウェルでプレートし、一晩インキュベートした。培地中の１０μＬの４×ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）ＭＴ細胞生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または１０μＬ培地のみを細胞に添加した。培地中の１０μＬの４０μＭスタウロスポリンまたは１０μＬ培地のみ（対照）を細胞に添加した。細胞をインキュベートし、カスパーゼ活性化を試薬添加５．５時間後にモニターした。カスパーゼ活性化をモニターするため、４０μＬのＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）３／７アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、そのままで（カスパーゼ）または２００μＭのＪＲＷ−０００４、ＪＲＷ−００１３、またはＪＲＷ−００４２と共にのいずれかで添加した。反応物を室温でインキュベートし、試薬添加１時間１０分後にＴｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を測定した。
【０３８６】
表１は、化合物が、ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）（ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）を含有する培地）との多重化におけるＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）からのバックグラウンド発光を阻害することを示す。培地のみの中のＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）試薬から生成されたシグナルと、ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）試薬を含有する培地中で生成されたシグナルを比較した場合、シグナルは、多重反応でより高い。化合物は、Ｎｌｕｃ酵素を阻害し、ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）試薬からのバックグラウンド発光を減少させる。
表１
2018524334.tif 000202
【０３８７】
Ｂ）Ａ５４９細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０プレート（ｎ−４）のウェルに２０μＬのＦ１２Ｋ培地中の１，０００細胞／ウェルでプレートし、一晩インキュベートした。その後、ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）ＭＴ細胞生存率アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を２０μＬ培地中の２倍溶液としてウェルに添加した。反応物を１時間インキュベートした。ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）３／７アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中のＪＲＷ−００１３またはＪＲＷ−０１４７の４０μＬの滴定を２倍濃度で添加した。反応物を室温でインキュベートし、発光を１時間で判断した。
【０３８８】
表２は、これらの化合物が、ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイとの多重化におけるＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）ＭＴ細胞生存率アッセイにおいてＮｌｕｃ酵素を用量依存的に阻害することができることを示す。
表２
2018524334.tif 000203
【０３８９】
実施例８７
以下の実施例は、化合物ＪＲＷ−０００４、ＷＺ１４１−８８、ＷＺ１４１−８６、ＷＺ１４１−７４、ＷＺ１４１−８４、ＷＺ１４１−８９、ＷＺ１４１−９０、及びＷＺ１４１−９１が、Ｎｌｕｃルシフェラーゼを阻害することを示す。ＤＴＴによる還元時にＮｌｕｃ基質に変換される、精製されたＮｌｕｃ及びＮｌｕｃプロ基質（ＵＳ２０１３／０１３０２８９に記載されるＰＢＩ−４４４２）の溶液をＰＢＳ緩衝液中でｐＨ７．５に調製した。１％のＴＥＲＧＩＴＯＬを含有する、ＰＢＳ中のＤＴＴのｐＨ７．５の４０ｍＭ溶液も調製した。次いで、ＤＴＴ及びＴＥＲＧＩＴＯＬを含有する、緩衝液中のチエノピロール化合物ＪＲＷ−０００４、ＷＺ１４１−８８、ＷＺ１４１−８６、ＷＺ１４１−７４、ＷＺ１４１−８４、ＷＺ１４１−８９、ＷＺ１４１−９０、及びＷＺ１４１−９１の滴定も調製した。等しい容量のＮｌｕｃ／前基質溶液を、アッセイプレートのウェル中のチエノピロール化合物滴定に添加した。反応物を室温でインキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を種々の時点で測定した（積分時間２００ｍｓ）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０３を用いて、ＩＣ50値を判断した。図４〜６は、試験した全ての化合物が、用量及び時間依存的にＮｌｕｃルシフェラーゼを阻害することを示す。
【０３９０】
実施例８８
細胞透過性
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物の透過性を示す。ＨＥＫ２９３またはＨｅＬａ細胞をβ２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ（Ｂ２ＡＲ−Ｎｌｕｃ）融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Ｎｌｕｃを細胞質的に固定し、配向させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を−／＋５０μｇ／ｍＬのジギトニンで処理し、生及び溶解シナリオをそれぞれ模倣した。その後、無傷細胞及び透過性細胞を、チエノピロール化合物の化合物反応曲線に最大２時間暴露させた。１０μＭのフリマジン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を添加し、発光を測定した。チエノピロール化合物（阻害剤）が透過性であった場合、生細胞及び透過性細胞の両方の用量反応曲線は重複した。しかしながら、チエノピロール化合物が不透過性であった場合、ＥＣ50は、透過性細胞と比較して、生細胞において右にシフトした。図７〜１１を参照されたい。
【０３９１】
実施例８９
細胞外ＢＲＥＴの阻害
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物が細胞外ＢＲＥＴを阻害する能力を示す。図１２Ａを参照されたい。ＨＥＫ２９３をＮｌｕｃ−ＨＤＡＣ６融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Ｎｌｕｃ−ＨＤＡＣ６を細胞の内側に配向させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＮＡＮＯＢＲＥＴ６１８リガンドで標識された１０ｎｇ／ｍＬの精製Ｎｌｕｃ−ＨＡＬＯＴＡＧで処理し、疑似細胞外ＢＲＥＴをシミュレートした。次いで、細胞をチエノピロール化合物ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−００５１、ＪＲＷ−０１４７、及びＪＲＷ−０１８７の化合物反応曲線に２時間暴露させた。その後、１０μＭのフリマジンを添加し、ＢＲＥＴ比６１０／４５０ｎｍを測定した。チエノピロール化合物、例えば、ＪＲＷ−００１３が透過性であった場合、ＢＲＥＴ比は、化合物用量反応曲線全体で一定のままであった。チエノピロール化合物、例えば、ＪＲＷ−００５１、ＪＲＷ−０１４７、またはＪＲＷ−０１８７が不透過性であった場合、ＢＲＥＴ比は、化合物用量反応曲線全体で減少し、細胞外ＢＲＥＴを阻害しながら細胞内Ｎｌｕｃシグナルを増強した。図１２Ｂ〜１２Ｅを参照されたい。
【０３９２】
実施例９０
細胞外ルシフェラーゼ活性の阻害、及び細胞内ＢＲＥＴの増強
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物が、細胞内ＢＲＥＴを増強しながら細胞外ルシフェラーゼ活性を阻害する能力を示す。図１３Ａを参照されたい。ＨＥＫ２９３をＮｌｕｃ−ＨＡＬＯＴＡＧ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Ｎｌｕｃ−ＨＡＬＯＴＡＧを細胞の内側に配向させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＮＡＮＯＢＲＥＴ６１８リガンドで標識し、特異的細胞内ＢＲＥＴをシミュレートした。その後、細胞を１０ｎｇ／ｍＬの精製Ｎｌｕｃで処理し、疑似細胞外発光をシミュレートした。細胞をチエノピロール化合物ＪＲＷ−００１３、ＪＲＷ−００５１、ＪＲＷ−０１４７、及びＪＲＷ−０１８７の化合物反応曲線に２時間暴露させた。１０μＭのフリマジンを添加し、ＢＲＥＴ比６１０／４５０ｎｍを測定した。阻害剤、例えば、ＪＲＷ−００１３が透過性であった場合、ＢＲＥＴ比は、化合物用量反応曲線全体で一定のままであった。阻害剤、例えば、ＪＲＷ−００５１、ＪＲＷ−０１４７、またはＪＲＷ−０１８７が不透過性であった場合、細胞内ＢＲＥＴ比は、疑似細胞外Ｎｌｕｃシグナルを阻害しながら化合物用量反応曲線全体で増強された。図１３Ｂ〜１３Ｆを参照されたい。
【０３９３】
実施例９１
生物発光イメージングによる細胞透過性
ＨｅＬａ細胞をβ２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ（Ｂ２ＡＲ−Ｎｌｕｃ；Ｃ末端Ｎｌｕｃ）またはＮｌｕｃ−β２アドレナリン受容体（Ｎｌｕｃ−Ｂ２ＡＲ；Ｎ末端Ｎｌｕｃ）融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Ｎｌｕｃを細胞内または細胞外にそれぞれ固定し、配向させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を−／＋３０μＭのチエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７、ＪＲＷ−００５１、及びＪＲＷ−０１３８で処理した。１０μＭのフリマジンを添加し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＬＶ２００上のイメージングによって発光を検出した。チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７及びＪＲＷ−００５１は、不透過性であり、細胞外Ｎｌｕｃを阻害し、細胞内Ｎｌｕｃを増強した。化合物ＪＲＷ−０１３８は、細胞透過性であり、細胞内及び細胞外Ｎｌｕｃの両方を阻害した。図１４を参照されたい。
【０３９４】
実施例９２
標的会合モデルにおける不透過性チエノピロール化合物の特徴付け
ＨＥＫ２９３細胞をＳｒｃ−Ｎｌｕｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトした。図１５Ａを参照されたい。トランスフェクションの２４時間後、細胞を−／＋５０μｇ／ｍＬのジギトニンで処理し、生及び溶解シナリオをそれぞれシミュレートした。無傷細胞及び透過性細胞を１μＭのダサチニブ−ＤＹ６０５トレーサー（不透過性）で標識し、細胞不透過性チエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７反応曲線で２時間処理した。１０μＭのフリマジンを添加し、ＢＲＥＴ比６１０／４５０ｎｍを記録した。図１５Ｂ〜１５Ｃは、ＪＲＷ−０１４７が、細胞残屑中のＢＲＥＴを阻害したが、細胞内部のＢＲＥＴを阻害しなかったことを示す。
【０３９５】
実施例９３
細胞透過性の時間的経過
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物の透過性を示す。ＨＥＫ２９３細胞をＮｌｕｃルシフェラーゼで一時的にトランスフェクトし、それを細胞質的に発現した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をチエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７またはＪＲＷ−００１３の化合物反応曲線に１０分間、３０分間、または１２０分間暴露させた。その後、１０μＭのフリマジンを添加し、発光を測定した。
【０３９６】
チエノピロール化合物（阻害剤）が透過性であった場合、化合物は、細胞に受動的に入り、ＪＲＷ−００１３（図１６）によって見られるように、ＮｌｕｃからのＲＬＵを時間に依存せずに用量依存的に減少させる。チエノピロール化合物（阻害剤）が不透過性であった場合、化合物は、細胞に能動的または受動的に入らず、ＪＲＷ−０１４７（図１６）によって見られるように、時間に依存しない用量依存的なＮｌｕｃからのＲＬＵの有意な変化は観察されなかった。
【０３９７】
実施例９４
Ｎｌｕｃへの化学的複合化または分子融合によるエンドサイトーシスの測定
抗体、タンパク質、受容体、薬物、薬物担体、ペプチド、糖類、脂肪酸、ナノ粒子、または他の生体分子は、Ｎｌｕｃに化学的に複合化または融合して、本明細書に記載の細胞不透過性チエノピロール化合物（阻害剤）と組み合わせてエンドサイトーシスを測定することができた。
【０３９８】
例えば、モノクローナル抗体（例えば、Ｎｌｕｃ−トラスツズマブ）は、ＳＫＢＲ３細胞の表面上に発現されたＨＥＲ２受容体に化学的に複合化し、結合することができた。細胞不透過性のＮｌｕｃ阻害剤を適用して、細胞外Ｎｌｕｃ−トラスツズマブを阻害することができた。セレンテラジン基質の添加時に、シグナルアッセイのゲインを使用して、能動的的／受動的に内在化されたトラスツズマブ−Ｎｌｕｃ−ＨＥＲ２受容体（Ｎｌｕｃに化学的に複合化した他の抗体、タンパク質、受容体、薬物、薬物担体、ペプチド、糖類、脂肪酸、ナノ粒子、または他の生体分子に拡張することができる）を動力学的に測定することができた。
【０３９９】
別の例では、Ｎｌｕｃ−ＧＰＣＲ（例えば、Ｎｌｕｃ−Ｂ２ＡＲ）は、哺乳類細胞に遺伝的に融合し、発現することができた。本明細書に記載の細胞不透過性のチエノピロール化合物（阻害剤）を適用して、細胞外または膜結合Ｎｌｕｃ−Ｂ２ＡＲを阻害することができた。セレンテラジン基質の添加時に、シグナルアッセイのゲインを使用して、能動的／受動的に内在化または再生されたＮｌｕｃ−ＧＰＣＲ（Ｎｌｕｃに遺伝的に融合した他のタンパク質または受容体に拡張することができる）を動力学的に測定することができた。
【０４００】
実施例９５
Ｎｌｕｃルシフェラーゼの阻害の特異性
以下の実施例は、Ｎｌｕｃルシフェラーゼ活性とホタルルシフェラーゼ活性、例えば、ＵＬＴＲＡＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼを阻害するための本開示のチエノピロール化合物ＪＲＷ−０２５１、ＪＲＷ−０３４４、及びＪＲＷ−０１４７の特異性について述べる。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０アッセイプレートでは、ルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｖ８６５／８５９）中に１μＭのルシフェリンを含有する溶液をアッセイウェルに添加した。その後、チエノピロール化合物ＪＲＷ−０２５１、ＪＲＷ−０３４４、及びＪＲＷ−０１４７の等しい容量滴定をウェルに添加した。反応物を室温で２時間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで発光を測定した。表３は、チエノピロール化合物が、ホタルルシフェラーゼ活性を阻害しなかったことを示す。
表３
2018524334.tif 000204
【０４０１】
実施例９６
多重化を可能にするチエノピロール化合物
以下の実施例は、Ｎｌｕｃルシフェラーゼと別のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼを利用するアッセイの多重化を可能にするための本発明のチエノピロール化合物の使用について述べる。
【０４０２】
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０アッセイプレートでは、１×ＲＥＡＬ−ＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）ＭＴ細胞生存率アッセイ試薬を４０μＬのＤＭＥＭ培地（ｎ＝３）中で調製し、一晩インキュベートした。次に、ＪＲＷ−０１４７またはＪＲＷ−０３４４（ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）３／７アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中の２×濃度）の４０μＬの滴定を添加した。反応物を室温でインキュベートし、１時間で発光を判断した。
【０４０３】
表４は、化合物が、ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイ（ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）試薬を含有する培地）との多重化におけるＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）アッセイからのバックグラウンド発光を阻害することを示す。化合物は、Ｎｌｕｃ酵素を阻害し、ＲＥＡＬＴＩＭＥ−ＧＬＯ（商標）試薬からのバックグラウンド発光を減少させる。
表４
2018524334.tif 000205
【０４０４】
実施例９７
細胞透過性
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物の透過性を示す。ＨＥＫ２９３をβ２アドレナリン受容体−Ｎｌｕｃ（Ｂ２ＡＲ−Ｎｌｕｃ）融合タンパク質で一時的にトランスフェクトし、Ｎｌｕｃ及びｐＧＥＭ−３ｚ担体ＤＮＡ（１：１００）を細胞質的に固定し、配向させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を−／＋５０μｇ／ｍＬのジギトニンで処理し、生及び溶解シナリオをそれぞれ模倣した。その後、無傷細胞及び透過性細胞を、チエノピロール化合物の化合物反応曲線に最大２時間暴露させた。１０μＭのフリマジン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を添加し、発光を測定した。チエノピロール化合物（阻害剤）が透過性であった場合、生細胞及び透過性細胞の両方の用量反応曲線は重複した。しかしながら、チエノピロール化合物が不透過性であった場合、ＥＣ５０は、透過性細胞と比較して、生細胞において右にシフトした。図１７Ａ〜１７Ｃは、ＪＲＷ−０１４７及びＪＲＷ−０３４４が、生細胞対溶解細胞において右にシフトしたＥＣ５０によって特徴付けられた細胞不透過性であることを示す。ＪＲＷ−００１３は、生細胞対溶解細胞において同様のＥＣ５０によって特徴付けられた細胞透過性対照として機能した。
【０４０５】
実施例９８
細胞生存率及び毒性
以下の実施例は、ＪＲＷ−０３４４の細胞生存率及び毒性を示す。ＨＥＫ２９３細胞を２０ｋ細胞／ウェルでプレートし、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ジギトニン（細胞死に対する陽性対照）、またはＪＲＷ−０３４４に１０分間／３０分間／１２０分間／２４０分間／または１８時間暴露させた。細胞Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を添加し、発光を測定した。図１８Ａ〜１８Ｃは、１８時間後に１００μＭまでビヒクルまたはＪＲＷ−０３４４の明らかな毒性は無かったことを示す。ジギトニン処理細胞は、２μｇ／ｍＬを超える濃度でほぼ完全な死を経験した。
【０４０６】
実施例９９
生物発光イメージングによる細胞透過性
ＨｅＬａ細胞をＮｌｕｃ−ＡＤＲＢ２（細胞外Ｎｌｕｃ）またはＡＤＲＢ２−Ｎｌｕｃ（細胞内Ｎｌｕｃ）で一時的にトランスフェクトし、Ｎｌｕｃを細胞内または細胞外にそれぞれ固定し、配向させた。トランスフェクション２４時間後、細胞を−／＋３０μＭのチエノピロール化合物ＪＲＷ−０１４７、ＪＲＷ−００１３、及びＪＲＷ−０３４４で処理した。１０μＭのフリマジンを添加し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＬＶ２００上のイメージングによって発光を検出した。ＤＭＳＯ（未処理）は、陰性対照として使用し、いずれかの配向でＮｌｕｃを阻害しなかった。ＪＲＷ−００１３は、細胞透過性の陽性対照であり、いずれかの配向でＮｌｕｃを阻害した。しかしながら、ＪＲＷ−０３４４またはＪＲＷ−０１４７は、Ｎｌｕｃが細胞外に配向される場合には典型的な環状構造を阻害するが、Ｎｌｕｃが細胞内に配向される場合には阻害しない。図１９を参照されたい。
【０４０７】
実施例１００
細胞外ルシフェラーゼ活性の阻害
以下の実施例は、本明細書に記載のチエノピロール化合物が、細胞内ＢＲＥＴを増強しながら細胞外ルシフェラーゼ活性を阻害する能力を示す。図２０Ａを参照されたい。ＨＥＫ２９３をＳＲＣ−ＮｌｕｃまたはＮｌｕｃ−ＨａｌｏＴａｇのいずれかで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２０ｋ／細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）のウェルにプレートした。１μＭの細胞不透過性トレーサーであるダサチニブ−ＤＹ６０５をＨＥＫ２９３  ＳＲＣ−Ｎｌｕｃ発現細胞に添加し、１００ｎＭの細胞透過性トレーサーであるＮａｎｏＢＲＥＴ−６１８をＮｌｕｃ−ＨａｌｏＴａｇ発現細胞に添加した。ＨＥＫ２９３  ＳＲＣ−Ｎｌｕｃ及びＮｌｕｃ−ＨａｌｏＴａｇ細胞の両方をＪＲＷ−０３４４の用量反応曲線に暴露させた。図２０Ａ〜２０Ｃは、ＪＲＷ−０３４４が、ＨＥＫ２９３  ＳＲＣ−Ｎｌｕｃ発現細胞中の細胞残屑ではＢＲＥＴを阻害したが、ＨＥＫ２９３  Ｎｌｕｃ−ＨａｌｏＴａｇ発現細胞では阻害しなかったことを示す。
【０４０８】
実施例１０１
阻害剤ＩＣ５０決定
以下の実施例は、本明細書に開示の化合物のＩＣ５０値を提供する。表５を参照されたい。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）酵素をＣＯ２独立培地＋１０％ＦＢＳ中の０．４ｎｇ／ｍｌに希釈し、検出試薬を作製した。次いで、各阻害剤の３×希釈系列を検出試薬で作製した。「阻害剤無し」対照も試料ごとに作製した。５０ｕｌの各阻害剤希釈物を、２０ｕＭのフリマジンを含有する５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ緩衝液と混合し（最終フリマジン濃度は、Ｋｍで１０ｕＭである）、発光を測定した。各試料を「阻害剤無し」対照に正規化した。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、ＩＣ５０値を決定した（ｌｏｇ［阻害剤］対正規化応答）。
表５
2018524334.tif 000206
2018524334.tif 000207
【０４０９】
上記の詳細な説明及び添付の実施例は、単なる例示であり、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものでないことは理解されよう。
【０４１０】
本開示の実施形態の様々な変更形態及び修正形態は、当業者には明らかであろう。これらだけに限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含めたこのような変更及び修正は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行ってもよい。
【０４１１】
完全性の理由により、本開示の種々の態様を以下の番号の条項で提示する：
【０４１２】
条項１．式（Ｉ）の化合物、またはその塩であって：
2018524334.tif 000208
（Ｉ）
式中：
点線は、結合の存在または不在を表し；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘは、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ａは、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；及び
Ｒ3及びＲ4は、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、化合物、またはその塩。
【０４１３】
条項２．ｎが、１である、条項１に記載の化合物。
【０４１４】
条項３．前記点線が、結合の存在を表し、Ｘが、ＣＨである、条項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
【０４１５】
条項４．Ａが、５員のヘテロアリール環である、条項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【０４１６】
条項５．Ａが、チエニル環またはフラニル環である、条項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【０４１７】
条項６．Ａが、フェニル環である、条項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【０４１８】
条項７．Ｒ1が、水素、Ｃ1−Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及びアリールアルキルからなる群から選択される、条項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【０４１９】
条項８．Ｒ1が、水素、エチル、ｎ−ヘキシル、２−（２−メトキシエトキシ）エチル及びベンジルからなる群から選択される、条項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２０】
条項９．Ｒ1が、エチルである、条項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２１】
条項１０．Ｒ2が、任意で置換されたアリールである、条項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２２】
条項１１．Ｒ2が、置換フェニルである、条項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２３】
条項１２．Ｒ2が、Ｃ1−Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、及びヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つの置換基でフェニル置換される、条項１１に記載の化合物。
【０４２４】
条項１３．Ｒ2が、１つのメチル基でフェニル置換される、条項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【０４２５】
条項１４．Ｒ3及びＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、条項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２６】
条項１５．Ｒ3及びＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する、条項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２７】
条項１６．任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピロリジン、ピペリジン及びピペラジンからなる群から選択される、条項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２８】
条項１７．任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピロリジン、未置換ピペリジン、１つの置換基で置換されたピペリジン、または１つの置換基で置換されたピペラジンからなる群から選択される、条項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【０４２９】
条項１８．Ｒ3が、水素である、条項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【０４３０】
条項１９．Ｒ4が、未置換Ｃ1−Ｃ8アルキル、、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、任意で置換されたフェニル、任意で置換されたＣ5−Ｃ6シクロアルキル、、任意で置換されたヘテロシクリル、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される、条項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【０４３１】
条項２０．Ｒ4が、未置換であるかまたは１つの置換基で置換されるフェニルである、条項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【０４３２】
条項２１．置換基が、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル、及びＣ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル−Ｃ1−Ｃ4−アルキルからなる群から選択される、条項２０に記載の化合物。
【０４３３】
条項２２．Ｒ4が、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル、Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、ヒドロキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、アミド、任意で置換されたアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、Ｃ1−Ｃ4−ジアルキルアミノ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、カルボキシ−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、スルホン酸−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、Ｃ1−Ｃ4−アルキルカルボニル−Ｃ1−Ｃ8−アルキルアミド、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキルアミド、及び任意で置換されたヘテロシクリルアミドからなる群から選択される１つの置換基で置換されるシクロヘキシルである、条項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【０４３４】
条項２３．化合物が、式（Ｉａ）：
2018524334.tif 000209
（Ｉａ）
を有する、条項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【０４３５】
条項２４．化合物が、式（Ｉｂ）を有し：
2018524334.tif 000210
（Ｉｂ）
式中：
Ｙが、−ＮＲaＲb及び−ＯＲcからなる群から選択され；
Ｒa及びＲbが、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され；またはＲa及びＲbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
Ｒcは、水素及び任意で置換されたＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から選択される、条項１〜２３のいずれか１項に記載の化合物。
【０４３６】
条項２５．Ｙが、−ＯＲcである、条項２４に記載の化合物。
【０４３７】
条項２６．Ｒcが、水素及びメチルからなる群から選択される、条項２４〜２５のいずれか１項に記載の化合物。
【０４３８】
条項２７．Ｙが、−ＮＲaＲbである、条項２４に記載の化合物。
【０４３９】
条項２８．Ｒa及びＲbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、条項２７に記載の化合物。
【０４４０】
条項２９．Ｒa及びＲbが、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された単環式の複素環を一緒に形成する、条項２７〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【０４４１】
条項３０．前記任意で置換された単環式の複素環が、任意で置換されたピペリジンである、条項２９に記載の化合物。
【０４４２】
条項３１．前記任意で置換された単環式の複素環が、未置換ピペリジン及び１つの置換基で置換されたピペリジンからなる群から選択される、条項２９〜３０のいずれか１項に記載の化合物。
【０４４３】
条項３２．Ｒaが、水素である、条項２７に記載の化合物。
【０４４４】
条項３３．Ｒbが、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び任意で置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、条項３２に記載の化合物。
【０４４５】
条項３４．Ｒbが、水素、Ｃ1−Ｃ6アルキル、ヒドロキシアルキル、任意で置換されたアミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホン酸−アルキル、スルホネート−アルキル、アルキルカルボニルアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ6−シクロアルキル、及び任意で置換された６員のヘテロシクリルからなる群から選択される、条項３１〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
【０４４６】
条項３５．前記化合物が、以下の式（Ｉｂ’）
2018524334.tif 000211
（Ｉｂ’）
を有する、条項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【０４４７】
条項３６．前記化合物が、
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−エチル−２−（５−（ピロリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
Ｎ−エチル−２−（５−（ピペリジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
１−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−フェニル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
２−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）フェニル）酢酸エチル；
３−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）安息香酸メチル；
メチル−シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
８−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）オクタン酸；
６−（４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）ピペリジン−１−イル）−６−オキソヘキサン酸；
トランス−メチル−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
Ｎ−（トランス−４−（ブチルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（トランス−４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ブタン酸；
Ｎ−（トランス−４−カルバモイルシクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチル；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸；
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸；
Ｎ−（トランス−４−（シクロヘキシルカルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（１−メチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（ピペリジン−４−イルカルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（トランス−４−（（１−アセチルピペリジン−４−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル；
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５（６）−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミドヒドロクロリド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
メチル−トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
トランス−４−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アセトアミド−１１，１４−ビス（カルボキシメチル）−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０，１３，１６−テトラオキソ−２，９，１２，１５−テトラアザノナデカン−１９−オイック酸；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−シクロペンチル−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−エチル−２−（５−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）−Ｎ−（ｍ−トリル）アセトアミド；
４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−オキソ−２−（ｍ−トリルアミノ）エチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
メチル−トランス−４−（４−（２−（（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
Ｎ−シクロヘキシル−４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
メチル−トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
４−（２−（ベンジル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸メチル；
６−（シス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸メチル；
６−（トランス−４−（（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸カリウム；
トランス−４−（４−（２−（ヘキシル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸；
トランス−４−（４−（２−（エチル（フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−シアノフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−カルバモイルフェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−メトキシフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｏ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（６−メチル−３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｐ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６−メトキシ−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド；
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソプロピルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（（３−（ジメチルアミノ）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（４−（２−（エチル（３−イソブチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド；
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウム；
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル；及び
トランス−４−（６−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル
からなる群から選択される、条項１〜３５のいずれか１項に記載の化合物。
【０４４８】
条項３７．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害方法。
【０４４９】
条項３８．前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、条項３７に記載の方法。
【０４５０】
条項３９．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害方法であって、
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを式（ＩＩ）の化合物：
2018524334.tif 000212
（ＩＩ）
と接触させることを含み、
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、前記方法。
【０４５１】
条項４０．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、条項３９に記載の方法。
【０４５２】
条項４１．試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させること；及び
（ｂ）試料中の発光を検出すること、
を含み、
条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
【０４５３】
条項４２．試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させること、ここで試料は、
（ｉｘ）前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘ）前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；及び
（ｂ）試料中の発光を検出すること、
を含み、
発光の検出が、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
【０４５４】
条項４３．試料を条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させる前に、試料をセレンテラジン基質と接触させることを含む、条項４１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０４５５】
条項４４．第１のタンパク質と第２のタンパク質が相互作用する場合、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及びＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片が、セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成する、条項４２に記載の方法。
【０４５６】
条項４５．試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物と接触させること、ここで試料は：
（ｘｉ）生物発光ドナーであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｉｉ）蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；
（ｂ）生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出すること
を含む、前記方法。
【０４５７】
条項４６．前記試料が、細胞を含む、条項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【０４５８】
条項４７．前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを含む、条項４６に記載の方法。
【０４５９】
条項４８．前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する、条項４６に記載の方法。
【０４６０】
条項４９．前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、条項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【０４６１】
条項５０．第１の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第１の融合タンパク質、ここで、生物発光ドナー分子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである；第２の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第２の融合タンパク質；セレンテラジン基質、及び条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物、を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
【０４６２】
条項５１．（ａ）条項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物；及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
【０４６３】
条項５２．前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、条項５１に記載のキット。
【０４６４】
条項５３．セレンテラジン基質をさらに含む、条項５１〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【０４６５】
条項５４．発光アッセイを実施するための指示書をさらに含む、条項５１〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【０４６６】
条項５５．試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）前記試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させること：
2018524334.tif 000213
（ＩＩ）
を含み、
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
（ｂ）試料中の発光を検出すること、
式（ＩＩ）の化合物が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の減少を引き起こす、前記方法。
【０４６７】
条項５６．試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させること、
2018524334.tif 000214
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
試料が、
（ｘｉｉｉ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｉｖ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；及び
（ｂ）前記試料中の発光を検出すること
を含み、
発光の前記検出は、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の間の相互作用を示す、前記方法。
【０４６８】
条項５７．前記試料を式（ＩＩ）の化合物と接触させる前に、試料をセレンテラジン基質と接触させることを含む、条項５５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【０４６９】
条項５８．前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質が相互作用する場合、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第１の断片及び前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第２の断片が、セレンテラジン基質に安定して結合することが可能な完全長酵素を再構成する、条項５７に記載の方法。
【０４７０】
条項５９．試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料をセレンテラジン基質及び式（ＩＩ）の化合物と接触させること、
2018524334.tif 000215
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、
前記試料が、
（ｘｖ）生物発光ドナーであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ及び第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド；及び
（ｘｖｉ）蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド
を含み；及び
（ｂ）前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターの相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出すること
を含む、前記方法。
【０４７１】
条項６０．前記試料が、細胞を含む、条項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【０４７２】
条項６１．前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを含む、条項６０に記載の方法。
【０４７３】
条項６２．前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する、条項６０に記載の方法。
【０４７４】
条項６３．前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジンアナログ、プロセレンテラジン、またはキノンマスクされたセレンテラジンである、条項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０４７５】
条項６４．生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、
第１の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第１の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである；第２の標的タンパク質及び蛍光アクセプター分子を含む第２の融合タンパク質；セレンテラジン基質、及び式（ＩＩ）の化合物、を含み、
2018524334.tif 000216
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成する、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
【０４７６】
条項６５．（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
2018524334.tif 000217
（ＩＩ）
式中：
点線が、結合の存在または不在を表し；
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｘが、ＣＨ、Ｎ、Ｏ、またはＳであり；
前記点線が結合の存在を表す場合、Ｘが、ＣＨまたはＮであり、前記点線が結合の不在を表す場合、Ｘが、ＯまたはＳであり；
Ａが、任意で置換されたフェニル環、または任意で置換された５または６員のヘテロアリール環であり；
Ｒ1及びＲ2が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたアルコキシアルキル及び任意で置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され；
Ｚが、−ＮＲ3Ｒ4及び−ＯＲ5からなる群から選択され；及び
Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が、各々独立して、水素、任意で置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意で置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたアリールアルキル、任意で置換されたヘテロアリール、任意で置換されたヘテロアリールアルキル、任意で置換されたヘテロシクリル、及び任意で置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択され；またはＲ3及びＲ4は、それらが結合している窒素原子と一緒に、任意で置換された環を一緒に形成し；及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ
を含む、キット。
【０４７７】
条項６６．前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、条項６５に記載のキット。
【０４７８】
条項６７．セレンテラジン基質をさらに含む、条項６５〜６６のいずれか１項に記載のキット。
【０４７９】
条項６８．発光アッセイを実施するための指示書をさらに含む、条項６５〜６７のいずれか１項に記載のキット。
付録
【０４８０】
配列番号１−天然の成熟Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼアミノ酸配列
ＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲ−ＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
【０４８１】
配列番号２−Ｎｌｕｃアミノ酸配列
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
【図１】
2018524334.tif 000228
【図２】
2018524334.tif 000229
【図３】
2018524334.tif 000230
【図４】
2018524334.tif 000231
【図５】
2018524334.tif 000232
【図６】
2018524334.tif 000233
【図７−１】
2018524334.tif 000234
【図７−２】
2018524334.tif 000235
【図７−３】
2018524334.tif 000236
【図８−１】
2018524334.tif 000237
【図８−２】
2018524334.tif 000238
【図８−３】
2018524334.tif 000239
【図９−１】
2018524334.tif 000240
【図９−２】
2018524334.tif 000241
【図９−３】
2018524334.tif 000242
【図１０−１】
2018524334.tif 000243
【図１０−２】
2018524334.tif 000244
【図１０−３】
2018524334.tif 000245
【図１１−１】
2018524334.tif 000246
【図１１−２】
2018524334.tif 000247
【図１２−１】
2018524334.tif 000248
【図１２−２】
2018524334.tif 000249
【図１２−３】
2018524334.tif 000250
【図１３−１】
2018524334.tif 000251
【図１３−２】
2018524334.tif 000252
【図１３−３】
2018524334.tif 000253
【図１４】
2018524334.tif 000254
【図１５】
2018524334.tif 000255
【図１６】
2018524334.tif 000256
【図１７−１】
2018524334.tif 000257
【図１７−２】
2018524334.tif 000258
【図１８−１】
2018524334.tif 000259
【図１８−２】
2018524334.tif 000260
【図１８−３】
2018524334.tif 000261
【図１９】
2018524334.tif 000262
【図２０】
2018524334.tif 000263
【配列表】
2018524334000001.app
【国際調査報告】
2018524334.tif 000264
2018524334.tif 000265
2018524334.tif 000266
2018524334.tif 000267