(57)【要約】本発明は所定の時間枠内に危険シグナルを連続的に投与することを含む相乗的な方法でＩ型インターフェロン産生を呈する免疫応答を誘導するための方法に関する。本発明は特に免疫調節、免疫療法およびワクチン接種に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に第２組成物を第１組成物の投与後に投与することを含む、該対象において免疫反応を誘導するための方法であって、
第１組成物および第２組成物は各々（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含み、
相乗的な免疫反応が誘導される時間内に第１組成物および第２組成物が投与される、
該方法。
【請求項２】
該時間が約６時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該危険シグナルがＴｏｌｌ様受容体アゴニストであり、および／または該危険シグナルがＩ型インターフェロンを誘導する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストが、ＲＮＡを含む粒子（該ＲＮＡはカチオン性ポリマーまたは脂質またはカチオン性ポリマーおよび脂質の両方と会合（associate）する）；二本鎖ＲＮＡ；ＣｐＧモチーフを含む非メチル化ＤＮＡ；イミキモド；およびレシキモドからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該カチオン性ポリマーがプロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、およびヒストンからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該粒子がＲＮＡおよびプロタミンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該プロタミン−ＲＮＡ粒子が約１０ｎｍ〜約９９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約９０ｎｍ〜約１１０ｎｍのサイズを有するプロタミン−ＲＮＡナノ粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該プロタミン−ＲＮＡナノ粒子が約１６：１〜約１：２、約８：１〜約１：２、または約４：１〜約１：２のポリカチオン：ＲＮＡの質量比を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１組成物中および／または第２組成物中の該危険シグナルがプロタミン−ＲＮＡナノ粒子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該粒子中に含まれる該ＲＮＡがオリゴヌクレオチドまたはメッセンジャーＲＮＡである請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該粒子中に含まれる該ＲＮＡが、少なくとも１つのＵヌクレオチドまたは少なくとも１つのＧヌクレオチド、または少なくとも１つのＵヌクレオチドおよび少なくとも１つのＧヌクレオチドを含む、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該粒子中に含まれる該ＲＮＡが修飾ＲＮＡである、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該時間が約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、または約３０分である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該誘導される免疫反応が、第１組成物および第２組成物の両方の投与後に該対象から得られた血清中のＩ型インターフェロン発現において、該組成物の一方のみの投与と比較した、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍の増加として検出され、該Ｉ型インターフェロンは好ましくはインターフェロンαである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該誘導される免疫反応が、該組成物の一方のみの投与と比較して、第１組成物および第２組成物の両方の投与後に該対象から得られた血清中のＴＮＦα発現の増加および減少を示さない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第１組成物および／または第２組成物が抗原をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第１容器および第２容器を含むキットであって、
第１容器は（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含む第１組成物を含み；および
第２容器は（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含む第２組成物を含み；および
好ましくは該キットは相乗的な免疫反応が誘導される時間内に第１組成物および第２組成物が投与されるとの説明をさらに含む；
キット。
【請求項１８】
対象における免疫反応の誘導における使用のための第１組成物および第２組成物であって、
第２組成物は第１組成物の投与後に投与され、
第１組成物および第２組成物は各々（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含み、
相乗的な免疫反応が誘導される時間内に第１組成物および第２組成物が投与される、
第１組成物および第２組成物。
【請求項１９】
治療的使用のための第１組成物および第２組成物の使用であって、
第２組成物は第１組成物の投与後に投与され、
第１組成物および第２組成物は各々（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含み、
相乗的な免疫反応が誘導される時間内に第１組成物および第２組成物が投与される、
使用。
【請求項２０】
該治療的使用がガン治療である、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は危険シグナル（具体的にはプロタミンおよびＲＮＡを含む粒子）の２回の逐次投与を含む免疫応答を誘導するための方法、および当該方法を行うための手段に関する。本発明の方法は特に免疫調節およびワクチン接種に有用である。
【背景技術】
【０００２】
免疫細胞は「危険シグナル」と呼ばれる分子または複合体により受容体（例えばＴｏｌｌ様受容体または細胞質性受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ））の誘発を介して刺激されることができる。これらの危険シグナルの一つはＲＮＡである。それはＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ３およびＴＬＲ１３、ならびにＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ−５によって認識されることができる。特定の条件下（すなわち低塩）で、プロタミンとＲＮＡは細胞中でＲＮＡを送達することができるナノ粒子を作り出すことができ、免疫性受容体を刺激して、それにより、免疫細胞の活性化、すなわち細胞の成熟、およびサイトカインの分泌を誘導することがこれまでに示された（Rettig L. et al., 2010, Blood 115, 4533-4541およびＷＯ２００９／１４４２３０）。これらの粒子は、例えば形質細胞様樹状細胞またはＴＬＲ８に取り込まれたとき、または、例えば単球に取り込まれたとき、ＴＬＲ７を活性化することができる。
【０００３】
本発明はプロタミン−ＲＮＡ粒子（特に４５０ｎｍ未満のもの）は一度静脈内に注入されると中程度の免疫応答を誘導するという知見に基づく。しかしながら、６時間未満の時間範囲内でそれらが２回注入されると、例えばＩ型インターフェロン（特にインターフェロンα）の高産生に映し出されるように、強力な免疫応答を誘導する。注目すべきは、炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦα）はこの注射プロトコルによっては相乗的には誘導されない。我々はさらに、この相乗的なインターフェロンαの誘導はインターフェロン−α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）に依存することを見出した。加えて、我々は、当該ダブル注射プロトコルはマウスにおける株化腫瘍を治療することができるが、プロタミン−ＲＮＡ粒子の総投与量の単回注射では治療しないことを明かにした。加えて、別の危険シグナル（例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ３のリガンド）、イミキモド（ＴＬＲ７のリガンド）、またはＣｐＧ  ＤＮＡ（ＴＬＲ９のリガンド））の２時間後にプロタミン−ＲＮＡ粒子が注入されたとき、インビボにおける高いインターフェロンα誘導が見られる。したがって、プロタミン−ＲＮＡ粒子注射後の増強されたＩ型インターフェロン産生はプロタミン−ＲＮＡ粒子または別の危険シグナルの注射を用いる６時間未満内の前処置によって達成される。
【発明の概要】
【０００４】
第１の態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導するための方法に関し、当該方法は、
該対象に第１組成物の投与後に第２組成物を投与することを含み、
第１組成物および第２組成物は各々、（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含み、
第１組成物および第２組成物は相乗的な免疫応答を誘導する時間の範囲内に投与される。
【０００５】
１つの実施形態において、第１組成物および第２組成物がその時間の範囲内で投与される時の該時間は、約７時間、好ましくは約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、または約３０分である。１つの実施形態において、第２組成物は、第１組成物の投与から、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内に投与される。１つの実施形態において、第２組成物は第１組成物の投与から少なくとも１５分後、少なくとも３０分後、少なくとも１時間後、または少なくとも１．５時間後に投与される。１つの実施形態において、第２組成物は第１組成物の投与から０．５〜７時間後または１〜６時間後に投与される。
【０００６】
１つの実施形態において、危険シグナルはＴｏｌｌ様受容体アゴニストであり、および／または該危険シグナルはＩ型インターフェロンを誘導する。１つの実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストはＲＮＡ（一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを含む）；ＲＮＡを含む粒子（ここで該ＲＮＡはカチオン性ポリマーもしくは脂質、またはカチオン性ポリマーおよび脂質の両方と会合（associate）している）；ＣｐＧモチーフを含有する非メチル化ＤＮＡ；イミキモド；およびレシキモドからなる群から選択される。１つの実施形態において、該カチオン性ポリマーはプロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンおよびヒストンからなる群から選択される。１つの実施形態において、該粒子はＲＮＡおよびプロタミンを含む。１つの実施形態において、該プロタミン−ＲＮＡ粒子は約１０ｎｍ〜約９９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約９０ｎｍ〜約１１０ｎｍの範囲のサイズを有する。１つの実施形態において、該プロタミン−ＲＮＡナノ粒子はプロタミン：ＲＮＡの質量比が約１６：１〜約１：２、約８：１〜約１：２、または約４：１〜約１：２である。
【０００７】
第１組成物および第２組成物における危険シグナルは同一であっても異なってもよい。本発明の方法の１つの実施形態において、第１組成物および第２組成物における危険シグナルはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。本発明の方法の１つの実施形態において、第１組成物における危険シグナルはＴＬＲ３、７、８、９および／または１３アゴニストであり、かつ、第２組成物における危険シグナルはＴＬＲ７および／または８アゴニストである。本発明の方法の１つの実施形態において、第１および／または第２組成物における危険シグナルはプロタミン−ＲＮＡナノ粒子である。
【０００８】
１つの実施形態において、該ＲＮＡはオリゴヌクレオチドまたはメッセンジャーＲＮＡである。１つの実施形態において、該ＲＮＡは少なくとも１つのＵヌクレオチドまたは少なくとも１つのＧヌクレオチド、または少なくとも１つのＵヌクレオチドおよび少なくとも１つのＧヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、該ＲＮＡは修飾ＲＮＡである。
【０００９】
本発明の方法の１つの実施形態において、該誘導される免疫応答が、第１組成物および第２組成物の投与（逐次投与）の対象から得られた血清中のＩ型インターフェロン発現（該Ｉ型インターフェロンは好ましくはインターフェロンαである）において、これら組成物の一方のみの投与と比較して、および／または、両組成物の同時投与と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍の増加として検出される。
【００１０】
本発明の方法の１つの実施形態において、該誘導される免疫応答は第１組成物および第２組成物（逐次投与）の両方の投与後の対象から得られた血清中に、両組成物の同時投与と比較して、ＴＮＦα発現の増加または減少を示さない。
【００１１】
１つの実施形態において、第２組成物は組換えまたは精製インターフェロンの注射の後に続く。
【００１２】
本発明の方法の１つの実施形態において、第１組成物および／または第２組成物は抗原をさらに含む。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は第１容器および第２容器を含むキットに関し、
第１容器は（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含む第１組成物を含有し；および第２容器は（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含む第２組成物を含有し、および
好ましくは該キットは第１組成物および第２組成物が、相乗的な免疫応答が誘導される時間の範囲内に投与されるという指示をさらに含む。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は対象における免疫応答の誘導における使用のための第１組成物および第２組成物に関し、第２組成物は第１組成物の投与後に投与され、第１組成物および第２組成物は各々（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含み、第１組成物および第２組成物は、相乗的な免疫応答が誘導される時間の範囲内に投与される。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は治療的使用のための第１組成物および第２組成物の使用に関し、第２組成物は第１組成物の投与後に投与され、第１組成物および第２組成物は各々（ｉ）危険シグナル；および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含み、第１組成物および第２組成物は、相乗的な免疫応答が誘導される時間の範囲内に投与される。１つの実施形態において、該治療的使用はがんの治療である。
【００１６】
本発明のキット、本発明の使用のための第１組成物および第２組成物、および本発明の使用の実施形態は、本発明の方法のために本明細書に記載した通りである。
【００１７】
本明細書に記載される組成物は医薬組成物であることができ、希釈剤、および／または賦形剤を適宜含んでもよい。該組成物は少なくとも１つのアジュバント（例えばオイルおよび／または少なくとも１つの抗原）をさらに含んでもよい。
【００１８】
適当な細胞の接触または対象への投与の後、本明細書に記載の危険シグナル（例えばプロタミン−ＲＮＡ粒子）はインターフェロンαを誘導することができる。従って、本発明は免疫システムを刺激するのに有用であり、当該免疫システムの刺激は、好ましくはＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ３の１つまたはそれ以上、好ましくはＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の刺激を伴う。
【００１９】
第１組成物および／または第２組成物の投与は、静脈内、皮下、筋肉内または腫瘍内であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の他の目的、利点および新規な特徴は下記の詳細な説明を添付の図面と合わせて考慮されることで明らかになるであろう。
【図１】プロタミン−ＲＮＡ粒子のダブル注射はＩ型インターフェロンの相乗的な産生を誘導するが、ＴＮＦαは誘導しない。  ＲＮＡ（蛍ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ）およびプロタミンを純水で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１００μｇのＲＮＡ（２００μＬ）を１００μｇのプロタミンＩＰＥＸ（２００μＬ）と混合し、およそ１００ｎｍの粒子を得た。４０％グルコースを最終５％グルコースに達するように加え、５％グルコースを、最終の注射可能溶液が１０μｇのＲＮＡ（および１０μｇのプロタミン）を７０μＬ中に含むように加えた。マウスに７０μＬを静脈内投与し、６時間（「６ｈ  ｄｅｌａｙ」）または５時間（「５ｈ  ｄｅｌａｙ」）または４時間（「４ｈ  ｄｅｌａｙ」）または２時間（「２ｈ  ｄｅｌａｙ」）後に再び、７０μＬのプロタミン−ＲＮＡを投与した。血清を第２注射から３時間後に採取した。コントロールとして、マウスに１４０μＬのプロタミン−ＲＮＡ溶液を静脈内投与（１回）をした（「単回注射」）。ネガティブコントロールとして、マウスに１００μＬのグルコース５％（「Ｇｌｕｃｏｓｅ  ５％）を静脈内投与した。コントロールマウスに関し、血清を注射３時間後に採取した。３マウス／群。インターフェロンαを、血清中、Ｖｅｒｉｋｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ）を用いて測定し、ＴＮＦαをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果は、１０μｇのＲＮＡをプロタミン粒子（１０μｇのプロタミン）に含むものの２回の注射は、第２注射が第１注射から２時間後または４時間後になされたとき、２０μｇのＲＮＡをプロタミン粒子（２０μｇのプロタミン）に含むものの１回の注射と比べて、数倍のインターフェロンαをインビボでを誘導することを示した。注射間が６時間を超えると、インターフェロンαの誘導に対して相乗的な効果は提供されない。血清中のＴＮＦαでは相乗効果はなく：ＴＮＦαの誘導については、２０μｇのＲＮＡを含むプロタミン粒子（２０μｇのプロタミン）の単回注射は、１０μｇのＲＮＡのプロタミン粒子（１０μｇのプロタミン）を２回注射（２時間または４時間または５時間または６時間をあける）する場合と比較して、実際により効果的である。
【図２】Ｉ型インターフェロンの誘導については、ダブル注射相乗効果はインターフェロン（アルファおよびベータ）受容体１（ＩＦＮＡＲ１）に依存する。  ＲＮＡ（蛍ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ）およびプロタミンを純水を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１００μｇのＲＮＡ（２００μＬ）を１００μｇのプロタミンＩＰＥＸ（２００μＬ）と混合し、それによりおよそ１００ｎｍの粒子を得た。４０％グルコースを最終５％グルコースとなるように加え、５％グルコースを、最終の注射可能溶液が１０μｇのＲＮＡ（および１０μｇのプロタミン）を７０μＬ中に含むように加えた。野生型（「ＢＡＬＢ／ｃ」、３動物）またはＩＦＮＡＲ１  ＫＯ（「ＩＦＮＡＲ  ＫＯ」、２動物）マウスに７０μＬを静脈内に投与し、２時間後に、再び７０μＬのプロタミン−ＲＮＡを静脈内投与した。血清を第２注射から３時間後に採取した。ネガティブコントロールとして、我々は無処理マウス「Ｕｎｉｎｊｅｃｔｅｄ」の血清を使用した。インターフェロンαを血清中Ｖｅｒｉｋｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ）を用いて測定し、ＴＮＦαをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果は２回注射法によるインビボでのインターフェロンαの相乗的な誘導はＩＦＮＡＲ１を必要とすることを示し：当該相乗効果はＩＦＮＡＲ１  ＫＯマウスでは見られないことを示す。従って、ＩＦＮＡＲ１を介するフィードバックループにより、第１プロタミン−ＲＮＡ粒子注射は免疫システムを増感させ、第２注射に対して強力に応答させる。
【図３】イミキモドおよびＣｐＧ  ＤＮＡは後続の注射のプロタミン−ＲＮＡ粒子に対して敏感にさせることができる。  ＤＮＡオリゴヌクレオチド「ＣｐＧ  １５８５」（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（これはマウスＴＬＲ９アゴニストである）を０．５μｇ／マイクロリットル（ＰＢＳ）に希釈した。イミキモド（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を０．１マイクログラム／マイクロリットル（ＰＢＳ）に希釈した。ＲＮＡ（蛍ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ）およびプロタミンを純水を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１００μｇのＲＮＡ（２００μＬ）を１００μｇのプロタミンＩＰＥＸ（２００μＬ）と混合して、およそ１００ｎｍ粒子を得た。４０％グルコースを最終５％グルコースとなるように加え、５％グルコースを、最終の注射可能溶液が１０μｇのＲＮＡ（および１０μｇのプロタミン）を７０μＬ中に含むように加えた。  マウスに１００μＬのＣｐＧ（５０μｇのＤＮＡ「ＣｐＧ（２ｈ）ＰＲ１１」）または１００μＬのイミキモド（１０μｇのイミキモド「Ｉｍｉ（２ｈ）ＰＲ１１」）または７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ粒子（１０μｇのＲＮＡ「ＰＲ１１（２ｈ）ＰＲ１１」）を静脈内投与し、２時間後に全てのマウスに７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ（１０μｇのＲＮＡ）を静脈内投与した。各群３マウス。血清をこの２回目の注射から３時間後に採取した。コントロールとして、マウスに１００μＬのＣｐＧ（５０μｇ「ＣｐＧ  ａｌｏｎｅ」）または１００μＬのイミキモド（１０μｇ「Ｉｍｉ  ａｌｏｎｅ」）または７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ粒子（１０μｇのＲＮＡ「ＰＲ１１  ａｌｏｎｅ」）を静脈内投与した。各群３マウス。血清を注射から３時間後に採取した。インターフェロンαを血清中Ｖｅｒｉｋｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ）を用いて測定した。結果はＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ  ＤＮＡ）またはＴＬＲ７アゴニスト（イミキモド）の注射は免疫システムを増感させることができ、プロタミン−ＲＮＡ粒子の注射後にはプロタミン−ＲＮＡ単独の単回注射と比較して多量のインターフェロンαが産生されることを示す。
【図４】二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は後続の注射のプロタミン−ＲＮＡに対して敏感にさせることができる。  二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（これはマウスＴＬＲ３アゴニストである）を０．０２μｇ／マイクロリットル（ＰＢＳ）に希釈した。一本鎖ＲＮＡ（蛍ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ）およびプロタミンを純水を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１００μｇのｍＲＮＡ（２００μＬ）を１００μｇのプロタミンＩＰＥＸ（２００μＬ）と混合して、およそ１００ｎｍの粒子を得た。４０％グルコースを最終５％グルコースとなるように加え、５％グルコースを、最終の注射可能溶液が１０μｇのＲＮＡ（および１０μｇのプロタミン）を７０μＬ中に含むように加えた。  マウスに１００μＬのｄｓＲＮＡ（２μｇのｄｓＲＮＡ「ｄｓＲＮＡ（２ｈ）ＰＲ１１」）または７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ（１０μｇのＲＮＡ「ＰＲ１１（２ｈ）ＰＲ１１」）を静脈内投与し、２時間後に、全てのマウスに７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ（１０μｇのＲＮＡ）を静脈内投与した。各群３マウス。血清を第２注射から３時間後に採取した。コントロールとして、マウスに１００μＬのｄｓＲＮＡ（２μｇの「ｄｓＲＮＡ  ａｌｏｎｅ」）または７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ（１０μｇのＲＮＡ「ＰＲ１１  ａｌｏｎｅ」）を静脈内投与し、血清を注射から５時間後または３時間後にそれぞれ採取した。インターフェロンαを血清中、Ｖｅｒｉｋｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ）を用いて測定した。
【図５】プロタミン−ＲＮＡ粒子のダブル注射スケジュールは株化腫瘍を治療するために必要である。  １本鎖ＲＮＡ（蛍ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ）およびプロタミンを純水を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。５００μｇのｍＲＮＡ（１０００μＬ）を５００μｇのプロタミンＩＰＥＸ（１０００μＬ）と混合し、およそ１００ｎｍの粒子を得た。４０％グルコースを最終５％グルコースとなるように加え、５％グルコースを、最終の注射可能溶液が１０μｇのＲＮＡ（および１０μｇのプロタミン）を７０μＬ中に含むように加えた。  Ｄａｙ０に、マウスに１００万のＣＴ２６／ルシフェラーゼ細胞（蛍ルシフェラーゼを発現するマウス結腸腫瘍細胞株）を静脈内投与した。Ｄａｙ３およびＤａｙ１０に、マウスに１４０μＬのプロタミン−ＲＮＡ粒子（２０μｇのＲＮＡ「１回注射」）、または７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ（１０μｇのＲＮＡ「ＰＲ１１（２ｈ）ＰＲ１１」）を２時間内に２回（「２回注射」）を静脈内投与した。また別のマウス群にＤａｙ３および１０に１００μＬの５％グルコースを投与した。時間と共に、マウスにより（肺で増殖している腫瘍細胞により）放出されたルシフェラーゼシグナルをインビボ画像システムを用いて定量した。各群１０マウス。結果は、抗ガン性免疫を刺激し、かつ、腫瘍増殖の阻害を得るためには、ダブル注射スケジュール（６時間未満内の２回注射）が必要であることを示す。
【００２１】
本発明の詳細な説明
下記において、定義は提供され、本発明の全ての態様に適用される。
【００２２】
本発明は以下に詳細に記載されるが、本発明は本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬限定されず、これらは変えることができると理解される。本明細書に記載される専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないと理解される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２３】
以下に本発明の要素は記載される。これらの要素は特定の実施形態とともに列記されるが、しかしながら、それらはあらゆる方法で組み合わされて更なる実施形態を作り出すことができると理解されるべきである。様々に記載された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記載された実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。本明細書は明確に記載された実施形態とあらゆる開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポートし包含すると理解されるべきである。さらに、コンテキストが別途示されていない限り、本願において記載された全ての要素のどんな並び替えおよび組み合わせも、開示されていると考えられるべきである。
【００２４】
好ましくは、本明細書で使用される用語は”A multilingual glossary of biotechnological terms:（IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds.,（1995）Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されるとおりに定義される。
【００２５】
本発明の実施は、別途示されない限り、当該分野の文献で説明される生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いるであろう（ｃｆ．例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）。
【００２６】
明細書および下記の請求の範囲を通して、コンテキストが別途必要としない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、およびその変形（例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は記載されるメンバー、整数または工程、または複数のメンバー、整数または工程の群の包含（他のメンバー、整数または工程、または複数のメンバー、複数の整数または複数の工程の群の除外ではなく）を暗示する、すなわち、発明の対象は記載されるメンバー、整数または工程、または複数のメンバー、複数の整数または複数の工程の群の包含に存在すると理解されるであろう（いくつかの実施形態では他のメンバー、整数または工程、または複数のメンバー、複数の整数または複数の工程の群は除外されているかもしれないが）。本発明を記載するコンテキストにおいて（特に請求項のコンテキストにおいて）使用される用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の言及は、本願に別途指示されない限りまたはコンテキストと明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本願における値の範囲の記載はその範囲内にある各別々の値を個別に言及する省略表現および方法として単に機能することが意図される。別途指示がない限り、各個別の値は本願に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本願に記載される全ての方法は、別途指示がない限りまたはコンテキストと明確に矛盾しない限り、適切な順番で実行することができる。本願に提供されるありとあらゆる例、または例示の記載（例えば「ｓｕｃｈ  ａｓ」）の使用は、本発明をよりよく説明することを単に意図し、別途クレームされている本発明の範囲の限定を提起するものではない。本願明細書に無い記載は本発明の実行に必須であるクレームの要素はないと解釈されるべきである。
【００２８】
いくつかの文献が本明細書において引用されている。本願で引用されている文献は各々（特許、特許出願、科学的公開、製造者の仕様書、説明書等を全て含む）、上記であろうと下記であろうと、その全ては引用することによって本願に組み込まれる。本発明が先行発明を理由に当該開示に先行する資格はないとの承認と解釈されるものは何も無い。
【００２９】
プロタミンとＲＮＡを混合すると粒子は自然に生じ、それらの粒子の平均サイズは、プロタミンおよびＲＮＡをフォームレートするためにそれらを混合する前に使用した溶液中の試薬濃度および塩濃度に依存して約５０ｎｍ〜１０００ｎｍ超えることができる。これらの粒子は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８のようなＴｏｌｌ様受容体を刺激し、それにより、例えばインターフェロンαまたはＴＮＦαのようなサイトカインの産生の測定によってモニターすることができる、免疫活性化を誘導する。本発明者は、驚くべきことに、動物に静脈内注射された場合、該粒子が一定時間（例えば６時間未満）内に２回注入されない限り、血清中で検出可能なインターフェロンαの誘導が中程度であることを見出した。この増強されたインターフェロンα産生を、以下において「相乗的」と称する。他のサイトカイン（例えばＴＮＦα）を見たとき相乗的効果は検出されない：  なぜなら多くのＴＮＦαがプロタミン−ＲＮＡ粒子のシングルまたはダブル（６時間以内）注射によって誘導される。
【００３０】
別の方法として、本発明に従って、当該相乗的効果を得るために、プロタミン−ＲＮＡ粒子以外の危険シグナル、特にＴＬＲアゴニストを、プロタミン−ＲＮＡ粒子の代わりにまたはこれと組み合わせて使用することができる。例えば、ＴＬＲ３（ｄｓＲＮＡ）またはＴＬＲ９（ＣｐＧ  ＤＮＡ）またはＴＬＲ７（イミキモド）リガンドの注射は、後続の（２時間後になされる）プロタミン−ＲＮＡナノ粒子注射により誘導されるインターフェロンα産生を高める。危険シグナルの注射の代わりに、組換えまたは精製インターフェロンを、相乗的効果を得るためにプロタミン−ＲＮＡ粒子の前に注射することができると仮定することもできる。
【００３１】
当該複数の注射は相乗的なインターフェロンα産生を誘導するので、本願に記載の組成物に（特に該プロタミン−ＲＮＡ粒子に）会合されうる（associated）（添加されうるまたは結合されうる（added or linked））抗原に対する相乗的な適応免疫を誘導することも予想される。
【００３２】
用語「免疫応答」は、好ましくは疾患から守る生物内の応答を意味する。免疫応答は予防的および／または治療的であり得る。本発明によれば、「誘導される免疫応答」はインターフェロンαレベルの高まりに反映されうる。
【００３３】
「免疫応答を誘導する」とは免疫応答を誘導する前には免疫応答は無かったことを意味しうるが、免疫応答を誘導する前にはある程度の免疫応答があり、免疫応答の誘導後には前記免疫応答が増強していることもまた意味しうる。従って、「免疫応答を誘導する」には、「免疫応答を増強する」が含まれる。好ましくは、対象において免疫応答を誘導した後に、該対象は疾患（たとえばガン疾患）が発生することから保護されているか、または該疾患症状が免疫応答を誘導することにより改善されている。
【００３４】
本発明によれば、２つの組成物の逐次投与に関する用語「相乗的な免疫応答」は、当該２つの組成物の逐次投与に起因する免疫応答が、該２つの組成物の一方のみを投与した場合と比較しておよび／または両組成物を同時投与した場合と比較して、より強いという事実を意味する。
【００３５】
本発明による用語「危険シグナル」は、一般的に、免疫細胞（例えば樹状細胞（ＤＣ））を活性化することができ、それ故、免疫応答（自然免疫応答および適応免疫応答を含む）を開始または誘導することができる、物質または事象に関する。より具体的には、当該用語は感染および／または組織損傷および細胞ストレスの間に放出される分子に関する。用語「危険シグナル」には病原体に関連するか（病原体関連分子パターン；ＰＡＭＰ）、または組織傷害から直接的に生じるか（損傷関連分子パターン；ＤＡＭＰ）、または免疫活性化の増幅器として活性化された免疫細胞から分泌された分子種、組織損傷およびＤＡＭＰの放出および組織定常状態における撹乱（これらに限定されないが例えば、低酸素、酸性度、またはオスモル濃度（osmolarity）の変化、および代謝ストレス）を誘導することによって直接的にまたは間接的に免疫細胞を活性化する可能性を有する無機物質および人工の技術（例えば、ナノ物質）が含まれる。
【００３６】
「病原体関連分子パターン」または「ＰＡＭＰ」という用語は、免疫細胞（例えばＤＣ）を活性化することができる、リポ多糖類（ＬＰＳ）、フラゲリン、ペプチドグリカン、および通常ウイルスと関連する核酸（例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または非メチル化ＣｐＧモチーフ）のような、バクテリア、ウイルス、または他の微生物に共通する分子構造に関する。これらの分子は、免疫細胞および非免疫細胞の両方で発現されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のようなパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される。
【００３７】
用語「損傷関連分子パターン」または「ＤＡＭＰ」は、通常細胞内部に含まれていて、免疫システムからは隠され、および組織が損傷すると遊離する、内因性分子構造に関する。例として、ＡＴＰ、ＨＳＰ、およびＨＭＧＢ１が挙げられる。これらの分子はＰＲＲを含む多くの受容体によって認識され、感染の無い場合に炎症反応および免疫応答を誘導することができる。
【００３８】
危険シグナルとして、ＰＡＭＰＳのような外因性危険シグナルおよび内因性危険シグナルが挙げられる。内因性危険シグナルには、一次性内因性危険シグナルおよび二次性内因性危険シグナルが含まれる。
【００３９】
一次性内因性危険シグナルは、通常、細胞内部に含まれるか、または不活性な形態で存在し、免疫システムから隠され、ほとんどが非免疫機能を果たす、内因性分子である。それらは組織損傷により放出され、ＰＲＲを含む多くの受容体を誘発することによってＤＣなどの免疫細胞を活性化することができる。例として、核酸、ＡＴＰ、ＡＤＰ、アデノシン、尿酸、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、high mobility group box タンパク質１（ＨＭＧＢ１）、Ｉ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解産物、ミトコンドリアＤＮＡ、Ｎ−ホルミルペプチド、酸性度、オスモル濃度および低酸素が挙げられる。
【００４０】
二次性内因性危険シグナルは、オートクリンおよびパラクリンな方法で自然および適応免疫活性化を媒介するために、活性化後に免疫細胞によって活発に分泌される内因性分子である。二次性内因性危険シグナルには、ＣＤ４０−Ｌおよびグラニュライシン等のリンパ球由来のＤＣ活性化因子、好中球由来アラーミン、およびＴＮＦ−α、Ｉ型ＩＦＮ、およびＨＭＧＢ１等の炎症促進性サイトカインが含まれる。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明による用語「危険シグナル」は、危険シグナルとして免疫システムによって認識される核酸（例えば非メチル化ＣＧ配列（ＣｐＧ）を含有するＤＮＡ、未修飾一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））に関する。細胞内区画に誤った場所に局在化したこのような核酸は、好ましくはエンドソーム常在Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）（例えばＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ３、これらはそれぞれ、関与すると、活性化シグナルを細胞に送達する）によって認識されることが好ましい。好ましい１つの実施形態において、本発明による用語「危険シグナル」は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を刺激するｓｓＲＮＡ、特にＵ残基および／またはＧ残基を含有するｓｓＲＮＡに関する。１つの特に好ましい実施形態において、本発明による用語「危険シグナル」はプロタミン粒子中に配合されたｓｓＲＮＡに関する。
【００４２】
本発明によれば、危険シグナルがペプチドまたはタンパク質であるとき、当該危険シグナルは、対象に核酸（例えば、該ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡであって、本願に記載されるような粒子中に適宜存在する）として、本対象の細胞内での該核酸の発現のために送達されうる。
【００４３】
本願に記載される該プロタミン−ＲＮＡ粒子は、インビトロでこれまでに実証されたとおり（Rettig et al, 2010）、インターフェロンαを誘導するのに最も効果的であるため、好ましくは４５０ｎｍ未満である。それらは、例えば５０ｍＭ未満の電解質を含有する溶液中にプロタミンおよびＲＮＡを希釈し、等張性の注射可能な形態にするために適宜糖含有溶液を用いてさらに希釈希釈することによって形成することができる。プロタミン−ＲＮＡ粒子は、例えばペグ化によってさらに修飾されていてもよい。プロタミン−ＲＮＡ粒子によって誘導されるインターフェロンαの産生は、おそらく、形質細胞様樹状細胞（インターフェロン−αを産生するのに最も強力な細胞型の１つ）において顕著に発現するほとんどのＴＬＲ７の誘発に依存する。免疫賦活性粒子を生成するために、ＲＮＡ分子は好ましくは少なくとも１０残基の長さであり、かつ、Ｕ残基を含有する。ＲＮＡに対するプロタミンの質量比は、好ましくは少なくとも０．５（好ましくは、ＲＮＡはプロタミンの最大２倍まで）である。好ましい実施形態において、この比は１以上（最も好ましくは、同質量の総ＲＮＡとプロタミンが、または総ＲＮＡよりも多いプロタミンが使用される）、２以上、４以上、および好ましくは最大１６、より好ましくは最大８である。
【００４４】
プロタミンをカチオン性剤（またはカチオン性ポリマー）として含有する本発明の粒子を調製するための好ましい方法は、
純水または低塩溶液（好ましくは５０ｍＭ未満の電解質）を使用しておよそ５ｍｇ／ｍｌ未満、よくて１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度にプロタミンおよびＲＮＡを希釈する工程、
該２つの溶液を混合する工程、および
次いで適宜最終処方物が５％糖を含有するように（すなわちおよそ３００ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度）糖含有溶液を加える工程、
を含む。
【００４５】
プロタミンをカチオン性剤として含有する本発明の粒子を調製するためのもう一つの好ましい方法は、
５％糖の塩フリーまたは低塩（好ましくは５０ｍＭ未満の電解質）溶液を用いて、およそ５ｍｇ／ｍｌ未満、よくて１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度にプロタミンおよびＲＮＡを希釈する工程、および
該２つの溶液を混合する工程（最終処方物は５％糖を含有する。すなわちオスモル濃度はおよそ３００ｍＯｓｍ／Ｌ）、
を含む。
【００４６】
本発明のコンテキストにおいて、用語「ＲＮＡ」はリボヌクレオチド残基を含み、好ましくはリボヌクレオチド残基により全体または実質的に構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、部分的または完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および組換え技術により生成されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡを含み、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により天然のＲＮＡとは違う修飾ＲＮＡを含む。該変更は、例えばＲＮＡの末端にまたは内部的に、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおいて、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのような非標準的なヌクレオチドを含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。
【００４７】
ＲＮＡは細胞から単離することができ、ＤＮＡ鋳型から作製することができ、または当技術分野で知られる方法を用いて化学的に合成することができる。好ましい実施形態において、ＲＮＡは、インビトロでＤＮＡ鋳型から合成される。１つの特に好ましい態様において、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写方法論は、当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。１つの特に好ましい態様において、ＲＮＡはインビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）である。
【００４８】
本発明によれば、「ＲＮＡ」にはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡが含まれる。
【００４９】
本発明によれば、好ましいＲＮＡは、６〜１００、好ましくは１０〜５０、特に１５〜３０または１５〜２０ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチド、または５０ヌクレオチドより大きい、好ましくは５０〜１０，０００、好ましくは１００〜５０００、特に２００〜３０００ヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【００５０】
本発明によれば、用語「ｍＲＮＡ」は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を用いて生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る「転写物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’−ＵＴＲを含む。本発明のコンテキストにおいて、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成され得る。
【００５１】
本発明によれば、「ｓｓＲＮＡ」は一本鎖ＲＮＡを意味し、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび他のｓｓＲＮＡを含む。ｓｓＲＮＡは、該ＲＮＡの一部が折り畳まれ、それ自身で対になって二重らせんを形成することを可能にする、自己相補的配列を含み得る。
【００５２】
本発明によれば、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、部分的にまたは完全に相補的な２つのストランドを有するＲＮＡである。該ストランドのサイズは、６ヌクレオチド〜１００００、好ましくは１０〜８０００、特に２００〜５０００、２００〜２０００、または２００〜１０００ヌクレオチドの範囲で多様であり得る。
【００５３】
本発明に適したＲＮＡ分子のための特定のリボヌクレオチド配列要件はない。しかしながら、所定のＲＮＡ配列が最良の生物学的活性を提供することを排除するものではない。
【００５４】
本発明によれば、必要に応じてＲＮＡの安定性を改変することができる。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡに対する安定化効果を有する１つ以上の修飾によって安定化され得る。
【００５５】
本発明に従って使用されるＲＮＡのコンテキストにおける「修飾」という用語は、ＲＮＡ中に天然には存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。
【００５６】
本発明の１つの実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップされていない５’−トリホスフェートを有さない。このようなキャップされていない５’−トリホスフェートの除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成することができる。
【００５７】
１つの実施形態において、用語「修飾」は、５’キャップまたは５’キャップアナログを有するＲＮＡを提供することに関する。用語「５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を意味し、一般に、普通でない５’〜５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。１つの実施形態において、このグアノシンは７位でメチル化される。「通常の５’キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡ５’キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明のコンテキストにおいて、用語「５’キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に似ており、結合すると（好ましくはインビボおよび／または細胞中で）ＲＮＡを安定化する能力を有するように改変された５’キャップアナログを含む。
【００５８】
５’キャップまたは５’キャップアナログを持つＲＮＡの提供は、該５’キャップまたは５’キャップアナログの存在下にＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により達成されうる。ここで該５’キャップは該生成されたＲＮＡストランドに同時転写的に組み込まれてもよく、または、ＲＮＡを例えばインビトロ転写によって生成し、および５’キャップをキャッピング酵素（例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素）を用いて転写後にＲＮＡに結合してもよい。
【００５９】
ＲＮＡはさらなる修飾を含んでいてもよい。例えば、本発明で使用される該ＲＮＡの更なる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）テールの伸長またはトランケーションであり得る。
【００６０】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関連する。「半減期」は、分子の活性、量または数の半分を除去するのに必要な時間に関する。本発明のコンテキストにおいて、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性の指標である。
【００６１】
当然ながら、本発明にしたがって、ＲＮＡの安定性を低下させることが望ましい場合、上記のようなＲＮＡの安定性を増加させるエレメントの機能を妨げるようにＲＮＡを改変することができる。
【００６２】
１つの実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、特にｍＲＮＡである。本発明によれば、用語「ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ」は該ＲＮＡが、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳の工程の間に、アミノ酸の組み立てを指揮して、ペプチドまたはタンパク質を産生、すなわち発現することができることを意味する。好ましくは、本発明によるＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞の翻訳機構と相互作用することができる。
【００６３】
用語「発現」は、最も一般的な意味で本発明に従って使用され、ＲＮＡおよび／またはペプチドまたはタンパク質の産生（例えば転写および／または翻訳による）を含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。それは核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は一時的または安定的であり得る。
【００６４】
本発明のコンテキストにおいて、用語「転写」は、ＤＮＡ配列中の遺伝子コードがＲＮＡに転写されるプロセスに関する。続いて、ＲＮＡはタンパク質に翻訳されうる。本発明によれば、用語「転写」は、「インビトロ転写」を含み、この「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系で、好ましくは適切な細胞抽出物を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されるプロセスに関する。好ましくは、転写産物の生成のためにクローニングベクターが適用される。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明による用語「ベクター」に包含される。
【００６５】
本発明による用語「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡのストランドがアミノ酸配列の構築を指示してペプチドまたはタンパク質を作製する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。例えばＲＮＡと複合体を形成することによって、またはＲＮＡが封入または被包された小胞を形成することによって、該ＲＮＡが会合（associate）することができる物質またはビヒクル（好ましくは裸のＲＮＡと比較して該ＲＮＡの安定性の向上をもたらす）を、本願記載のＲＮＡと使用することが意図される。
【００６６】
本発明に有用な担体には、カチオン性脂質、リポソームおよびミセルなどの脂質含有担体、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミンなどのカチオンポリマー、およびナノ粒子が含まれる。
【００６７】
カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し得る。いずれのカチオン性脂質も、本発明に従って使用することができる。カチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーを用いて核酸を複合させ、いわゆるリポプレックス、ポリプレックスおよび／またはポリリポプレックスをそれぞれ形成させ得、これらの複合体は核酸を細胞に送達することが示されている。
【００６８】
リポソームは、しばしば、リン脂質のような小胞形成脂質の１つ以上の二重層を有し、薬物を被包することができる微視的な脂質小胞である。本発明のコンテキストにおいて様々なタイプのリポソームが使用されることができ、これらに限定されないが、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小型単層膜小胞（ＳＵＶ）、大型単層膜小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞（multivesicular）（ＭＶ）、および大型多小胞（ＬＭＶ）、ならびに当該技術分野で知られる他の２重層形態が挙げられる。リポソームのサイズおよびラメラリティーは調製方法に依存し、使用される小胞の種類の選択は好ましい投与様式に依存する。好ましい注射可能なリポソームは、直径が１０〜５００、２０〜４００、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１２０、５０〜１００、または５０〜９０ｎｍの範囲のものである。カチオン性リポソームは正に荷電した脂質から作られる構築物であり、負に荷電した核酸および細胞膜との良好な相互作用により、遺伝子治療においてますます使用されている。カチオン性リポソームはカチオン性リポプレックスとしても知られている。リポソームは、単層からなるミセルおよび逆ミセルと混同されるべきではない。当該脂質アセンブリは、安定剤と組み合わせてもよい。安定剤の非限定的な例として、コレステロールおよび類似の膜活性ステロール、ＰＥＧ化脂質などのリポポリマーが挙げられる。
【００６９】
リポソームの形成は自発的なプロセスではない。脂質小胞は、レシチンのようなリン脂質が水中に置かれ結果として１つの二重層またはそれぞれ水分子によって隔てられた一連の二重層を形成した時に、十分なエネルギーが供給されると、形成される。リポソームは、逆蒸発法（ＲＥＶ）、脱水−再水和法（ＤＲＶ）、超音波処理または他の適切な方法などの標準的な方法を用いて形成することができる。リポソームは、例えば、リン脂質を水中で超音波処理することによって作製することができる。低せん断速度は、多数の層を有する多重膜リポソームを作り出す。継続的な高せん断超音波処理は、より小さな単層膜リポソームを形成する傾向がある。この技術では、リポソームの内容物は、水相の内容物と同じである。超音波処理は、封入される薬物の構造にダメージを与える可能性があるため、一般的に、「ｇｒｏｓｓ」な調製方法と考えられている。押出法やＭｏｚａｆａｒｉ法などの新しい方法が、人使用のための材料の製造に採用されている。
【００７０】
リポソーム形成後、リポソームは、実質的に均質なサイズ範囲、典型的には約１０〜５００ｎｍの範囲のリポソームの集団を得るためにサイズ分類されることができる。
【００７１】
本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として好ましい。「プロタミン」という用語は、アルギニンが豊富であり、様々な動物（魚のような）の精子細胞中で体細胞性ヒストンに代わって特にＤＮＡと会合（associate）する、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質を指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性であり、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、主に加水分解されるとアルギニンを産出する、魚精子に見られるタンパク質を指す。精製された形態では、インスリンの長時間作用型製剤に用いられ、また、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。
【００７２】
本発明によれば、本願で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物源から得られたまたはに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列（そのフラグメントおよび前記アミノ酸配列またはそのフラグメントの多量体形態を含む）を含むことを意味する。さらに、この用語は、人工的であり、特定の目的のために特異的に設計され、天然源または生物源から単離できない（合成された）ポリペプチドを包含する。
【００７３】
本発明に従って使用されるプロタミンは、硫酸化プロタミンまたは塩酸プロタミンであり得る。好ましい実施形態において、本発明の粒子の製造に使用されるプロタミン源は、プロタミン  ５０００であり、これはプロタミンを等張性塩溶液中に１０ｍｇ／ｍｌ（５０００ヘパリン中和単位／ｍｌ）を超える濃度で含有し、上記の様に希釈される。
【００７４】
該粒子は好ましくは、プロタミン：ＲＮＡの重量比が１６：１〜１：２、好ましくは８：１〜１：２、より好ましくは４：１〜１：２である。
【００７５】
本願に記載される粒子の平均「サイズ」は、一般に、確立されたプロセスに従って調製される粒子の「設計サイズ」または意図されるサイズである。サイズは、平均直径または最大直径などの直接測定された寸法であってもよく、または濾過スクリーニングアッセイのような間接的アッセイによって決定されてもよい。粒子サイズの直接測定は、典型的には、動的光散乱（光散乱分光法とも呼ばれる）によって行われる。サイズのわずかな変化が製造プロセス中に生じるので、記載された測定値の４０％までの変動が許容され、および記載されたサイズすなわち５０ｎｍ〜９９０ｎｍまたは好ましくは５０ｎｍ〜４５０ｎｍの平均値内であると見なされる。あるいは、マイクロキャリアサイズは、濾過スクリーニングアッセイによって決定することができる。例えば、粒子の少なくとも９７％が記載されたサイズの「スクリーンタイプ」フィルターを通過する場合、粒子調製物は記載されたサイズよりも小さい。
【００７６】
プロタミン−ＲＮＡ粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングすることは、バイオアベイラビリティの向上、ひいてはナノ粒子の生物活性を高めるのに役立つ１つの方法である。
【００７７】
本発明の一実施形態によれば、本願に記載されるプロタミン−ＲＮＡ粒子などの粒子は、その外面に、選択的にまたは好んで、標的細胞集団に、および／または標的器官または組織に該粒子を送達することができる、標的剤またはリガンド（例えば抗体）を含む。例えば、リガンドを持つリポソームは、罹患細胞上に発現される受容体を標的とすることができる。このリガンド結合は、細胞への効率的な薬物摂取を促進し、有効性を増強する。探索された１つの標的化手段は、共有結合的にまたは静電的相互作用によって粒子表面に結合した抗体を使用する。
【００７８】
投与されたとき粒子が疾患関連抗原を発現する細胞を特徴とするおよび好ましくは該疾患関連抗原とそれらの細胞表面との会合（association）を特徴とする（例えば疾患関連抗原は膜貫通タンパク質である）疾患器官または組織に蓄積するように、リガンドが疾患関連抗原に結合しうる。疾患関連抗原は腫瘍関連抗原であってもよく、好ましくは腫瘍細胞などの疾患細胞の表面と会合し、および、好ましくは健常細胞の表面とは会合しない。好ましくは、部位特異的標的化のためのリガンドは、疾患関連抗原の細胞外部分に結合する。
【００７９】
本発明の一実施形態によれば、本願に記載されるプロタミン−ＲＮＡ粒子などの粒子は、適応免疫応答が誘発される抗原（例えば、ペプチド、タンパク質または糖）でコーティングされる。
【００８０】
一実施形態に従って、本発明は、プロタミン−ＲＮＡ粒子などの本願に記載される粒子または注入製剤に含まれる任意の他の成分（例えば、遊離ｍＲＮＡ）のサイトゾル（cytosole）への送達を有利にすることができるエンドソーム不安定化剤（ＥＤＡ）の使用を想定する。ＥＤＡは、例えば、ｐＨ反応剤（例えば特定のｐＨまたはｐＨ範囲に曝されたときに構造的コンホメーションを変化させ得る、ポリマーおよびペプチド）、光増感剤（光増感剤のエンドソーム不安定化活性は光に曝されることで引き起こされる）、または外的刺激（例えば超音波）であることができる。
【００８１】
本発明の「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合している２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６より多く、好ましくは２１以上であって、最大で好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０、特に１００個のアミノ酸を含む物質を意味する。用語「タンパク質」は、優先的には、大きなペプチド、好ましくは１００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを意味するが、一般に「ペプチド」および「タンパク質」という用語は同義語であり、本願では互換的に使用される。
【００８２】
本発明によれば、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質をコードし得る。したがって、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含み得る。例えば、ＲＮＡは抗原または薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質（例えば免疫学的に活性な化合物（好ましくは抗原ではない））をコードして発現しうる。この点において、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まり停止コドンで終わる一続きのコドンの連続である。
【００８３】
「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、ペプチドまたはタンパク質の発現が有益（例えば疾患または障害の症状を改善するのに有益）である対象の治療に使用することができるペプチドまたはタンパク質を含む。例えば薬学的に活性なタンパク質は、通常はタンパク質を発現しないかまたはタンパク質を過って発現する細胞において、タンパク質発現を置換または増強することができ、例えば、薬学的に活性なタンパク質は望ましいタンパク質を提供することによって変異を相殺することができる。さらに、「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、対象において有益な結果を生み出すことができ、例えば、感染性疾患に対して対象をワクチン接種するタンパク質を産生するために使用され得る。好ましくは、「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、治療上有効な量で対象に投与された場合に、対象の状態または疾患状態に対してポジティブなまたは有利な効果を有する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治癒的または緩和的な特性を有し、疾患または障害の１以上の症状の発症を寛解、軽減、緩和、逆行、遅延させるために、その重症度を和らげるために投与され得る。薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、予防的特性を有してもよく、疾患の発症を遅らせるために、またはそのような疾患または病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。用語「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性なフラグメントを指すこともできる。それはまた、ペプチドまたはタンパク質の薬学的に活性な類似体を含むことができる。用語「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」には、抗原であるペプチドおよびタンパク質が含まれ、すなわち、ペプチドまたはタンパク質は、治療的または部分的または完全に防御的であり得る、対象における免疫応答を誘発する。
【００８４】
薬学的に活性なタンパク質の例には、これらに限定されないが例えば、サイトカインおよび免疫学的活性化合物のような免疫系タンパク質（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレクチン（seletin）、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合複合体抗原、細菌性、寄生性、またはウイルス性抗原のような免疫学的に活性な抗原、アレルゲン、自己抗原、抗体）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン等）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、成長因子（例えば、上皮成長因子、神経成長因子、インスリン様成長因子など）、成長因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解性、ステロイド産生（steriodogenic）酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、脱メチル化酵素、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクロム、アデニル酸シクラーゼまたはグアニル酸シクラーゼ（guanylaste cyclase）、ノイラミニダーゼ（neuramidase）など）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質など）、転写および翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、ミオシンなど）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、ヴォン・ヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または改変第ＶＩＩＩ因子、抗凝固薬等が挙げられる。
【００８５】
１つの実施形態において、本発明の薬学的に活性なタンパク質は、リンパ系ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくはＴ細胞の発生、プライミング、増殖、分化および／または生存に関与、好ましくは誘導または増強するサイトカインである。１つの実施形態において、サイトカインはインターロイキンである。１つの実施形態において、本発明の薬学的に活性なタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１からなる群から選択されるインターロイキンである。
【００８６】
「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導および／または抑制する、サイトカイン生合成を誘導および／または抑制する、および／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することによって、体液性免疫を変化させることにより、免疫応答を変化させる化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、強力な免疫賦活性活性（これらに限定されないが、例えば抗ウイルス活性および抗腫瘍活性）を有し、免疫応答の他の局面をダウンレギュレートすることもできる（例えば該免疫応答をＴＨ２免疫応答からそらす、これは広範囲のＴＨ２媒介疾患の治療に有用である）。免疫学的に活性な化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。
【００８７】
１つの実施形態において、疾患関連抗原のような抗原をコードするＲＮＡは、特に当該抗原に関わる疾患を有する哺乳動物を治療することが望まれる場合、哺乳動物に投与される。該ＲＮＡは、哺乳動物の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、または他の細胞）に取り込まれることが好ましい。該ＲＮＡの抗原性翻訳産物が形成され、該産物がＴ細胞による識別のために細胞の表面上に提示される。１つの実施形態において、当該抗原またはその任意の進行によって作られた産物が、ＭＨＣ分子の状況下で、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞により識別されて活性化を引き起こすために細胞表面に提示される。
【００８８】
本発明のコンテキストにおいて、用語「塩」および「電解質」は交換可能に使用され、水中でそれぞれの対イオンに少なくとも部分的に解離する化合物を意味する。
【００８９】
本発明によれば、用語「ｍＭ電解質」は、ＲＮＡ原液を再懸濁または希釈するために使用される溶液中のおよびプロタミン原液を希釈するために使用される溶液中の全電解質（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４等の無機塩、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｈｅｐｅｓ等の塩）の合計濃度１０−３ｍｏｌ／Ｌを意味する。
【００９０】
一旦本発明の粒子が形成されると、粒子を調製するために使用される特定の塩（または電解質）の濃度条件は、それ以上維持される必要はないことに留意されるべきである。従って、該粒子はさらに処理されることが、例えば、最終的に遠心分離により回収され、および媒体、好ましくは医薬的に許容される賦形剤、ビヒクルおよび／または希釈剤中、特に等張性の媒体（例えば生理食塩水、リンガー液または乳酸リンゲル溶液）中に希釈、溶解、分散されることができる。
【００９１】
インターフェロンは、抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調節活性を特徴とする重要なサイトカインである。インターフェロンは、制御される細胞の表面のインターフェロン受容体に結合することで、細胞内の遺伝子の転写を変更および調節するタンパク質であり、それにより当該細胞内でのウイルス複製は防止される。インターフェロンは、２つのタイプに分類することができる。ＩＦＮ−γは唯一のＩＩ型インターフェロンであり；他はすべてＩ型インターフェロンである。Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンは遺伝子構造（ＩＩ型インターフェロン遺伝子は３つのエキソンを有し；Ｉ型は１つ）、染色体位置（ヒトにおいては、ＩＩ型は染色体−１２にあり；Ｉ型インターフェロン遺伝子は連結していて染色体−９にある）、およびそれらが産生される組織のタイプ（Ｉ型インターフェロンは広範囲に合成され、ＩＩ型はリンパ球による）が異なる。Ｉ型インターフェロンは細胞受容体への結合を互いに競合的に阻害するが、ＩＩ型インターフェロンは異なる受容体を持つ。本発明によれば、用語「インターフェロン」または「ＩＦＮ」は、好ましくはＩ型インターフェロン、特にＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ベータに関する。
【００９２】
本発明は、特定の疾患状態において、特に慢性疾患（例えばガンまたは感染性疾患、特に持続性ウイルス感染症）の場合に、免疫を刺激する、活性化する、または強化するために有用である。したがって、本発明の方法は、前記疾患状態の治療に有用である。本発明の方法は、インターフェロン、特にインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βの産生を誘導するのにまたはそのレベルを高めるのに特に適している。したがって、本発明の方法は、インターフェロンアルファ治療および／またはインターフェロンベータ治療を補うために、または対象においてインターフェロンアルファおよび／またはインターフェロンベータを増加させるために使用され得る。
【００９３】
本発明によれば、用語「疾患」はガン疾患を含む任意の病理学的状態を指す。ガン（医学用語：悪性新生物）は、一群の細胞が制御不能な増殖（正常限度を超える分裂）、浸潤（隣接組織への侵入および破壊）、および時には転移（リンパまたは血液を介した、体内の他の場所への拡散）を示す、疾患のクラスである。ガンのこれらの３つの悪性特性は、自己限定的であり、浸潤または転移しない良性腫瘍とそれらを区別する。大部分のガンは、腫瘍、すなわち、細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖によって形成される腫脹または病変を形成するが、白血病のように、そうでないものもある。本発明において用語「ガン」には白血病、セミノーマ、メラノーマ、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸ガン、子宮内膜ガン、腎ガン、副腎ガン、甲状腺ガン、血液がん、皮膚ガン、脳のガン、子宮頸ガン、腸ガン、肝ガン、大腸ガン、胃ガン、腸ガン、頭頸部ガン、胃腸ガン、リンパ節ガン、食道ガン、結腸直腸ガン、膵ガン、耳、鼻、咽頭（ＥＮＴ）ガン、乳ガン、前立腺ガン、子宮ガン、卵巣ガンおよび肺ガン、およびそれらの転移が含まれる。その例は、肺ガン、乳ガン（mamma carcinomas）、前立腺ガン、結腸ガン、腎細胞ガン、子宮頸ガン、または上記のガンタイプまたは腫瘍の転移である。本発明のガンという用語はまた、ガン転移を含む。
【００９４】
本発明で治療可能なガンの例として、悪性黒色腫、あらゆるタイプの癌腫（結腸、腎臓細胞、膀胱、前立腺、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガンなど）、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、神経膠腫、ミエローマ等が挙げられる。
【００９５】
悪性黒色腫は深刻な種類の皮膚ガンである。これは、メラノサイトと呼ばれる色素細胞の無秩序な増殖によるものである。
【００９６】
本発明によれば、「癌腫」は上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。このグループは、乳癌、前立腺癌、肺癌および大腸癌の一般的な形態を含む、最も一般的なガンを表す。
【００９７】
リンパ腫および白血病は、造血（血液形成）細胞に由来する悪性腫瘍である。
【００９８】
肉腫は、胚性中胚葉から発達する多数の組織のうちの１つにおけるトランスフォーム細胞から生じる癌である。したがって、肉腫には、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、および造血組織の腫瘍が含まれる。
【００９９】
芽細胞腫瘍または芽腫は、未成熟または胚組織に似た腫瘍（通常は悪性）である。これらの腫瘍の多くは小児において最も一般的である。
【０１００】
神経膠腫は、脳や脊髄で始まる腫瘍の一種である。それはグリア細胞から生じるので、神経膠腫と呼ばれる。神経膠腫の最も一般的な部位は脳である。
【０１０１】
「転移」とは、元の部位から身体の別の部位への癌細胞の伝播を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、該細胞外マトリクスの浸潤、内皮基底膜を通過しての体腔および血管への浸透、およびその後、血液で運搬された後の標的器官への浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち二次腫瘍または転移腫瘍の増殖は、血管新生に依存する。腫瘍転移は、原発腫瘍の除去後でさえもしばしば起こり、これは、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発揮するためかもしれない。１つの実施形態において、本発明による用語「転移」は、原発腫瘍および局所リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
【０１０２】
本発明で治療可能な感染症の例には、ウイルス性感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水疱）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱、デング熱等、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、出血性感染性疾患（マールブルグウイルスまたはエボラウイルス））；細菌性感染性疾患（例えばレジオネラ症（レジオネラ）、胃潰瘍（ヘリコバクター）、コレラ（ビブリオ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ブドウ球菌、サルモネラ、または連鎖球菌（ｔｅｔａｎｕｓ）による感染）；原虫病原体による感染（例えばマラリア、睡眠病、リーシュマニア症；トキソプラズマ症、すなわちマラリア原虫、トリパノソーマ、リーシュマニアおよびトキソプラズマによる感染）；または真菌感染（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジスまたはカンジダ・アルビカンスによる感染）が挙げられる。
【０１０３】
本発明は、アレルギーの治療にも有用である。
【０１０４】
本発明の方法はまた、本発明に従って使用される組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に投与され得る他の治療剤と組み合わせて使用されても良い。このような治療剤として、ガン患者のための化学療法剤、例えばゲムシタビン、エトポフォス、シスプラチン、カルボプラチン、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤または抗細菌剤が挙げられる。
【０１０５】
特に、本発明は、免疫療法剤、好ましくは標的化された、すなわち特異的な免疫反応を誘導するか、または達成する免疫療法剤と組み合わせて使用されることもできる。このような免疫療法剤として、疾患関連抗原に対する剤（例えば、疾患関連抗原または疾患関連抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する治療的抗体または剤）が挙がれる。有用な免疫療法剤として、疾患関連抗原または疾患関連抗原を発現する細胞対するＢ細胞またはＴ細胞応答を誘導するタンパク質またはペプチドが挙げられる。これらのタンパク質またはペプチドは、疾患関連抗原またはその１以上のフラグメントの配列に本質的に対応するかまたは同一である配列を含み得る。１つの実施形態において、該タンパク質またはペプチドは、疾患関連抗原に由来するＭＨＣ提示ペプチドの配列を含む。該タンパク質またはペプチドを投与する代わりに、該タンパク質またはペプチドをコードする核酸（好ましくはｍＲＮＡ）を投与することも可能である。したがって、本発明は、抗原またはそのフラグメントをコードする適切な核酸分子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を対象に導入することによって免疫応答が刺激される遺伝子ワクチン接種に使用され得る。このｍＲＮＡは本願に記載の免疫賦活性粒子内に存在してもよく、免疫賦活性ＲＮＡまたは他のＲＮＡであってもよい。
【０１０６】
１つの実施形態において、疾患関連抗原は腫瘍関連抗原である。この実施形態では、本発明は、ガンまたはガン転移の治療に有用であり得る。好ましくは、罹患器官または組織は、疾患関連抗原を発現しているおよび／または疾患関連抗原とその表面との会合（association）を特徴とするガン細胞などの、罹患細胞を特徴とする。インタクトなまたは実質的にインタクトな腫瘍関連抗原またはそのフラグメント（例えばクラスＩＭＨＣおよびクラスＩＩＭＨＣペプチド、または核酸（特にそのような抗原またはフラグメントをコードするｍＲＮＡ））による免疫化は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ型を誘発することを可能にし、それにより、ガン細胞を溶解することができるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞を刺激する。そのような免疫化はまた、該腫瘍関連抗原に対する抗体の産生をもたらす体液性免疫応答（Ｂ細胞応答）を誘発しうる。さらに、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、直接、またはインビトロで腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸によるトランスフェクションによってＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを負荷し、患者に投与されることができる。
【０１０７】
本発明によれば、腫瘍関連抗原は、好ましくは、腫瘍またはガンならびに腫瘍またはガン細胞によって、タイプおよび／または発現レベルに関して特徴的な任意の抗原を含む。１つの実施形態において、用語「腫瘍関連抗原」は正常な状態（すなわち健常者において）では、限られた数の器官および／または組織で、または特別な発生段階で、特異的に発現（例えば、腫瘍関連抗原は、正常な状態では胃組織（好ましくは胃粘膜）、生殖器（例えば精巣）、絨毛性組織（例えば胎盤）、または生殖系細胞）において特異的に発現しうる）され、かつ、１以上の腫瘍またはガン組織で発現または異常発現しているタンパク質に関する。このコンテキストにおいて、「限られた数の」は、好ましくは、３以下、より好ましくは２または１以下を意味する。本発明のコンテキストにおいて腫瘍関連抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原（すなわち正常な状態では特定の分化段階で特定の細胞型で特異的に発現するタンパク質）、ガン／精巣抗原（すなわち正常な状態では精巣および時々胎盤で特異的に発現するタンパク質）、および生殖細胞系特異的抗原が含まれる。本発明のコンテキストにおいて、腫瘍関連抗原は、好ましくは、ガン細胞の細胞表面と会合（associate）しており、好ましくは正常組織では発現しないか、またはまれにしか発現しない。好ましくは、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原の異常な発現は、ガン細胞を同定する。本発明のコンテキストにおいて、対象（例えばガン疾患に罹患している患者）においてガン細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、好ましくは前記対象における自己タンパク質である。好ましい実施形態において、本発明のコンテキストにおける腫瘍関連抗原は、正常な状態で非必須である組織または器官（すなわち免疫システムによってダメージを与えられたとき、損傷された場合に死に至らない組織または器官）において、または免疫システムではほとんどまたはまったく到達できない身体の器官または構造体において、特異的に発現される。腫瘍関連抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍関連抗原と、ガン組織で発現される腫瘍関連抗原または腫瘍組織で見られ得る変異との間で一致しうる。好ましくは、腫瘍関連抗原は、それが発現されるガン細胞によって、ＭＨＣ分子のコンテキストにおいて提示される。
【０１０８】
腫瘍免疫療法において、特に腫瘍ワクチン接種において標的構造として本発明により企図される腫瘍関連抗原の基準を理想的に満たす分化抗原の例は、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質である。これらの分化抗原は、種々の起源の腫瘍において発現され、その選択的発現（毒性関連正常組織における発現なし）および原形質膜への局在化のために、抗体媒介性ガン免疫療法に関連する標的構造として特に適している。
【０１０９】
本発明において有用であり得る抗原のさらなる例は、野生型または変異のｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ベータ−ｃａｔｅｎｉｎ／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ  ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０ｍｉｎｏｒ  ＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１である。
【０１１０】
本発明に従って使用される組成物は、プロタミン−ＲＮＡ粒子などの危険シグナルおよび少なくとも１つの抗原、例えば上述のような抗原またはその免疫原性フラグメント、または核酸（特にその抗原またはフラグメントをコードするｍＲＮＡ）を含むワクチンの形態を取ることができる。
【０１１１】
「抗原」は、抗体の形成および／または細胞性免疫応答の活性化を引き起こし得る任意の構造を意味すると理解されるべきである。抗原の例は、ポリペプチド、タンパク質、細胞、細胞抽出物、炭水化物／多糖、多糖複合体、脂質および糖脂質である。これらの抗原は、腫瘍抗原またはウイルス、細菌、真菌および原生動物の抗原またはアレルゲンであり得る。また、用語「抗原」には、抗原性となり−および形質転換（例えば、該分子において中程度に、体タンパク質の完成により）を介してのみ感作する二次物質として誘導体化された抗原、および原子団（例えば、イソシアネート、ジアゾニウム塩）の人工的な取り込みを通じて新しい恒常的特異性を示す合成抗原が含まれる。抗原は、適切な担体に結合したハプテンの形態で投与されうる。適切な担体は当業者に知られており、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ハプテンは、従来技術でよく知られている方法、例えば、ポリペプチド担体の場合はＬｙｓ残基へのアミド結合を介して、担体に結合しうる。該抗原はまた、プロタミン−ＲＮＡ粒子上にコーティングされてもよい。
【０１１２】
「治療する」とは、疾患を予防または排除するために本願に記載の化合物または組成物を対象に投与することを意味し、対象の腫瘍サイズまたは腫瘍の数を減少させる；対象の疾患を停止または遅延させる；対象における新たな疾患の発症を阻害または遅延させる；現在疾患に罹っているか、またはこれまでに疾患に罹ったことがある対象の症状および／または再発の頻度または重症度を減少させる；および／または対象の寿命を延ばす、すなわち増加することが含まれる。
【０１１３】
特に、「疾患の治療」という用語は、治癒、持続時間の短縮、進行または悪化の改善、予防、減速または抑制、または疾患またはその症状の発症の予防もしくは遅延を含む。
【０１１４】
用語「免疫療法」は、好ましくは特異的免疫反応および／または免疫エフェクター機能を伴う治療に関する。
【０１１５】
用語「免疫化」または「ワクチン接種」は、治療上または予防上の理由で対象を治療するプロセスを記載する。
【０１１６】
用語「対象」は、哺乳動物に関する。例えば、本発明のコンテキストにおいて哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、飼われている動物（例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなど）、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモットなど）ならびに動物園の動物のような捕獲された動物が挙げられる。本願で使用される”対象”にはまたヒトが含まれる。
【０１１７】
本明細書に記載される組成物は、好ましくは滅菌され、有効量の有効成分（特に本願に記載の粒子などの危険シグナル）、および任意に、所望の反応または所望の効果を生じるための治療剤および抗原等の本願で記載された追加の剤を含む。
【０１１８】
本願に記載の組成物は、モンタニド（Montanide）（登録商標）のような油を含有するエマルジョンとして処方することができる。
【０１１９】
本願に記載の組成物は、抗ＣＴＬ−Ａ４または抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１などのさらなる免疫調節剤または抗ＣＤ２５抗体またはシクロホスファミドなどの抗制御性Ｔ細胞薬も含むことができる。有効性を増加、好ましくは免疫刺激の相乗効果を達成するために、本明細書に記載の組成物は１つ以上のアジュバントのような免疫増強物質を補充して一緒に投与することができ、また本明細書に記載の組成物は１つ以上の免疫増強物質を含んでいてもよい。
【０１２０】
用語「アジュバント」は、免疫応答を延長または増強または促進する化合物に関する。この点において、様々なタイプのアジュバントに応じて、様々なメカニズムが可能である。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物、例えば、リポ多糖またはＣＤ４０リガンドは適切なアジュバントの第１クラスを形成する。一般に、「危険シグナル」（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）またはサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦなど）のタイプの免疫システムに影響を及ぼす剤は、免疫応答が制御された方法で強化されることおよび／または影響されることを可能にするアジュバントとして使用することができる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡおよびイミキモド／レシキモドこのコンテキストで使用することができる。特に好ましいアジュバントは、サイトカイン（例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカイン）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦα、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−α、または成長因子（例えばｈＧＨ）である。さらに既知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたはオイル（例えば（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）（登録商標））、最も好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１である。リポペプチド（例えばＰａｍ３Ｃｙｓ）も、本発明での使用に適している。
【０１２１】
本願に記載の組成物は、通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製することができる。該組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形態であってもよい。
【０１２２】
本明細書に記載の組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含み得、これらの全ては好ましくは医薬的に許容されるものである。用語「医薬的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【０１２３】
医薬的に許容されない塩は、医薬的に許容される塩を調製するために使用することができ、本発明に含まれる。この種の医薬的に許容される塩は、非限定的な方法で、以下の酸から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものを含む。医薬的に許容される塩はまた、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製されうる。
【０１２４】
本発明で使用するのに適した緩衝物質として、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸が挙げられる。
【０１２５】
本発明での使用に適した防腐剤として、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが挙げられる。
【０１２６】
注射用処方物は、乳酸リンゲルのような医薬的に許容される賦形剤を含むことができる。
【０１２７】
「担体」という用語は、適用を容易にする、増強する、または可能にするために活性成分がその中で組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、用語「担体」はまた、患者への投与に適している、１つ以上の適合性のある固体または液体の賦形剤、希釈剤またはカプセル化物質を含む。
【０１２８】
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。
【０１２９】
本願で使用される場合、用語「賦形剤」は、本願に記載の組成物中に存在してもよい、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、着香剤、または着色剤のような、活性成分でないあらゆる物質を意味することを意図する。
【０１３０】
本願に記載の剤および組成物は、任意の従来の経路、例えば、注射または注入を含む非経口投与によって投与されうる。投与は、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内である。
【０１３１】
非経口投与に適した組成物は、通常、活性化合物の滅菌した水性または非水性調製物を含み、好ましくはレシピエントの血液と等張である。適合する担体および溶媒の例は、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常、滅菌した固定油が溶液または懸濁液媒体として使用される。
【０１３２】
本願に記載の剤および組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、所望の反応または所望の効果を単独でまたはさらなる用量と一緒に達成する量を意味する。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、該所望の反応は、好ましくは、疾患過程の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に、疾患の進行を中断または逆行させることを含む。疾患または状態の治療における該所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。
【０１３３】
本願に記載される剤または組成物の有効量は、治療される症状、疾患の重症度、該患者の個人的なパラメーター（年齢、生理学的状態、サイズおよび体重、治療の期間、付随する治療のタイプ（もしあれば）、特定の投与の経路、および同様の因子が挙げられる）に依存する。従って、本願に記載の剤の投与量はこのような様々なパラメーターに依存しうる。患者における反応が初期投与量では不十分である場合、より高い用量（または異なるより局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）が使用されうる。
【０１３４】
下記の実施例は本発明の好ましい実施形態を説明することを意図するものであって、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：プロタミン−ＲＮＡ粒子のダブル注射によるＩ型インターフェロン（ＴＮＦαではなく）の相乗的な産生。
ＲＮＡを合成し精製する。ついで生成物を凍結乾燥し、０．５ｍｇ／ｍｌで純水に再懸濁させる。プロタミンＩＰＥＸ  ５０００を純水で２８倍に希釈し、およそ０．５ｍｇ／ｍｌの低塩のプロタミンの溶液を得る。１体積のＲＮＡを１体積のプロタミンと混合する。直ちに強力に混合する（例えばピペットでのアップダウンやボルテックス）。当該処方物を１０分間室温に置き、ついで適量の４０％グルコースで最終濃度５％グルコースとなるようにさらに希釈する。溶液を、ＲＮＡ（およびプロタミンの）濃度が１０μｇ／７０μＬになるように、５％グルコースでさらに希釈する。マウスに、１４０μＬのプロタミン−ＲＮＡ溶液の静脈内注射を１回行うか、または７０μＬの該溶液の静脈内注射を２回（２または４または５または６時間あけて）行う。
それらの条件において、図１に示すとおり、当該２回の注射が２または４時間あけて（最大５時間あけて）行われたときに、インターフェロンα（ＴＮＦαではなく）の相乗的な産生が該（最終）注射から３時間後に採取した血清中に検出される。
【０１３６】
実施例２：インターフェロンα受容体１に対する依存性
実施例１と同一のプロタミン−ＲＮＡの処方物を用いて、７０μＬの静脈内投与を２時間あけて行い、第２注射から３時間後に血清を採取するダブル注射スケジュールにより、図２に示すとおり、インターフェロンαの相乗的な産生はＩＦＮＡＲに依存すると見られる（それはＩＦＮＡＲ−１欠損マウスでは認められない）。このことは精製または組換えＩ型インターフェロンと同様に機能性生物（機能性Ｉ型インターフェロン受容体を有する）におけるＩ型インターフェロンのインデューサー（弱くとも）は当該生物を（インターフェロン産生の観点から）プロタミン−ＲＮＡ粒子の第２注射に対して強く反応するように感作させることができることを示唆する。
【０１３７】
実施例３：危険シグナルは後続のプロタミン−ＲＮＡ粒子注射に対して感作させることができる。
実施例１の７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ粒子は、同量のプロタミン−ＲＮＡ粒子の第１注射、または他の危険シグナル：例えば非メチル化ＤＮＡ（「ＣｐＧ  ＯＤＮ」）またはイミキモド（図３において両方）またはｄｓＲＮＡ（図４）；の注射の２時間後にそれらが投与されたとき、強力に（相乗的に）インターフェロン産生を誘導する。したがって、相乗的なＩ型インターフェロン産生を得るために、プロタミン−ＲＮＡ粒子はもう一つの危険シグナルの後に（または前に）注射されることができる。
【０１３８】
実施例４：プロタミン−ＲＮＡ粒子のダブル注射スケジュールを用いる株化腫瘍の治癒
図５に示すとおり、株化肺転移を有するマウスは、「相乗的」注射プロトコル（２回、２時間あけて、実施例１のとおりに製造された７０μＬのプロタミン−ＲＮＡ粒子の静脈内注射）を２サイクル（１週間あけて）行って治療した場合には、腫瘍形成の遅延を示した。「バルク」プロトコル（実施例１の１４０μＬのプロタミン−ＲＮＡ粒子の１回静脈内注射）２サイクル（１週間あけて）行って治療した場合には示さなかった。従って、プロタミン−ＲＮＡ粒子による効果的な抗ガン性免疫を引き起こすためには数時間（６未満）のダブル注射スケジュールが必要である。
【０１３９】
上記の説明および実施例は、単に本発明を説明するために記載され、限定されることを意図するものではない。本発明の精神および本質を組み込む開示された実施形態の変形は当業者に起こりうるため、本発明はクレームの範囲にある全てのバリエーションおよびその同等を含むものと広く解釈されるべきである。さらに、本願が引用する全ての文献の教示および開示は、参照することによりその全ては明確に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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