(57)【要約】  ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼの新規のファミリー、関連するガイドＲＮＡおよび標的配列、ならびにゲノム編集および他の適用におけるそれらの使用が、本明細書に開示される。
2018532402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの１つ以上の場所で標的ＤＮＡを標的化、編集、修飾、または操作する方法において、
ｉ）異種Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸を前記細胞に導入することと、
ｉｉ）ａ）単一の異種ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはこれをコード化するＤＮＡを導入することであって、前記ｇＲＮＡは、１つ以上のｃｒＲＮＡまたは１つ以上の中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡをコード化する前駆体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）を含み、各ガイドＲＮＡは、最低でも、５から３の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートはステムループ構造を含み、前記スペーサーは、前記標的ＤＮＡの標的配列に相補的なＤＮＡ標的セグメントを含む、ことと、
ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡに１つ以上の切断部を作るか、または別様に前記標的ＤＮＡを標的化もしくは操作することであって、ＤＮＡ開裂は、Ｃｐｆ１ポリペプチドＤＮａｓｅによって媒介される、ことと、
を含み、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、その処理形態または未処理形態において前記ｇＲＮＡによって前記標的ＤＮＡに導かれる、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
ｇＲＮＡは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮａｓｅ活性によって、少なくとも１つのリピートおよび少なくとも１つのスペーサーをそれぞれが含む１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと開裂される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
ｇＲＮＡは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドを前記標的ＤＮＡの２つ以上の別個の部位に導く１つ以上のリピート‐スペーサーを含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記標的ＤＮＡの各切断部は、二本鎖であり、５’オーバーハングを含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記５’オーバーハングは、５つのヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、
少なくとも２つの５’オーバーハングが作られ、前記５’オーバーハングのそれぞれが、互いに非相同または非相補的であり、異種開裂部位の再結合またはリアニールにより引き起こされる染色体転座の可能性を減少させる、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
前記標的ＤＮＡの前記切断部を、前記細胞に存在する内因性のＤＮＡポリメラーゼ修復メカニズムによって修復させることをさらに含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
相同組換え修復によって前記標的ＤＮＡの編集を可能にする条件下でドナーＤＮＡ配列を導入することをさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、モノマーとして発現される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、約１５３ｋＤａの計算された分子量または約１８７ｋＤａの見かけの分子量を有する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡ開裂ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを有する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドの前記ＲＮａｓｅ活性は、前記リピート‐スペーサーアレイの前記リピート内でｇＲＮＡを開裂する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記アレイの前記ステムループ構造の４ヌクレオチド上流でｇＲＮＡを開裂する、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮａｓｅ活性は、Ｍｇ２＋を必要とする、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、
前記ｇＲＮＡは、開裂され、１つ以上の中間ｃｒＲＮＡへと処理され、前記中間ｃｒＲＮＡは、その後、１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと処理される、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮａｓｅ活性は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋を必要とする、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記標的ＤＮＡのＰＡＭ配列を認識し、前記ＰＡＭ配列は、非標的鎖上のｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の上流の５’−ＹＴＮ−３’（ＹはＴまたはＣ）である、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
前記ｇＲＮＡは、前記スペーサーの５’末端に位置する、８ヌクレオチドのシード配列を有し、前記標的ＤＮＡ上の前記ＰＡＭ配列の近位にある、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、
Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記ＰＡＭ配列の約２０ヌクレオチド上流で前記標的ＤＮＡを開裂する、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、
Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡに相補的な標的鎖上の前記ＰＡＭ配列のちょうど２２塩基対上流、かつｃｒＲＮＡに非相補的な非標的鎖上の前記ＰＡＭ配列の１７塩基対下流で前記ＤＮＡを開裂する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法において、
前記ｇＲＮＡは、前記ステムループの上流にいくつかのヌクレオチドを含み、それによって、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮａｓｅ活性を高める、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ａ）ＲＮａｓｅ活性を低下もしくは排除すると共に、ＤＮａｓｅ活性を維持するか、またはｂ）ＤＮａｓｅ活性を低下もしくは排除すると共に、ＲＮａｓｅ活性を維持するために、突然変異する、方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基の修飾は、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３、Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、Ｄ１２２７、Ｅ１０２８、Ｈ９２２、およびＹ９２５からなる群から選択される、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ａ）前記標的ＤＮＡの、他方のＤＮＡ鎖を除いて一方のみのＤＮＡ鎖の開裂を減少させ、ｂ）ＲＮＡ安定性を増大させ、かつ／またはｃ）ＤＮＡ結合を増大させるために、突然変異する、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、変化したＣｐｆ１エンドリボヌクレアーゼ活性またはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、中間ｃｒＲＮＡ、もしくは成熟ｃｒＲＮＡの関連した半減期を有し、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、およびＦ８７３からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、実質的に減少または改良されたエンドリボヌクレアーゼ活性またはＤＮＡへの結合親和性なしに、変化するかまたは無効となったＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を備え、かつＤ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がなく、Ｍｇ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少または改良されず、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、およびＤ１２２７からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がなく、Ｍｇ２＋の存在下で非標的鎖のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少し、アミノ酸残基Ｅ１０２８に突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下で標的鎖のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少し、Ｍｇ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少または改良されず、Ｈ９２２およびＹ９２５から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法において、
前記細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、または動物細胞である、方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドおよび前記ｇＲＮＡは、前記ポリペプチドおよび前記ｇＲＮＡをコード化する同じかまたは異なる組み換え型ベクターによって前記細胞に導入される、方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２、プレボテラ・アルベンシス、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス、スミセラ種ＳＣＡＤＣ、フラボバクテリウム種３１６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４からなる群から選択される種に由来する、方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法において、
ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間ｃｒＲＮＡは、Ｃｐｆ１ポリペプチドによって成熟ｃｒＲＮＡへと処理され、それによって、前記成熟ｃｒＲＮＡは、容易に前記Ｃｐｆ１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を導くのに利用可能となる、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドによる処理の結果として、前記成熟ｃｒＲＮＡとより容易に合成される、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはそのＤＮＡ発現構造体内部で１つ以上のｃｒＲＮＡ配列に５’または３’で組み込まれた異種配列をさらに含む前記ｇＲＮＡから、１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡを開裂、単離、または精製することができる、方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法において、
異種配列は、安定性、半減期、その発現レベル、または前記Ｃｐｆ１ポリペプチドもしくは標的ＤＮＡとの相互作用のタイミング、または当技術分野で既知の任意の他の物理的もしくは生化学的特徴を修飾するために、ｇＲＮＡに組み込まれる、方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法において、
前記ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列内部の２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡ配列の差異的調節をもたらすように修飾される、方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはｇＲＮＡ部分は、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、その温度感受性の変異体、またはエンドヌクレアーゼ活性を有する別のポリペプチドに結合され、それによって、１つ以上のＤＮＡ標的に導かれる、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、
二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼと結合した前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、（ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコード化された）前記単一のｇＲＮＡと共に、１つのプロモーターの制御下で、前記細胞に導入され、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記ステムループ構造の上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂して、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡを生成する、方法。
【請求項４０】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはｇＲＮＡ部分は、ｇＲＮＡによって前記標的ＤＮＡ上の１つ以上の部位に導かれるように、一本鎖または二本鎖ＤＮＡドナーテンプレートに結合され、それによって外来性ＤＮＡ配列の相同組換えを促進する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、
前記ドナーテンプレートは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドによって前記ｇＲＮＡから開裂され、それにより、相同組換えまたは相同組換え修復を促進する、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法において、
前記ドナーテンプレートは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドが中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを遊離させるためにｇＲＮＡを開裂する間、ｇＲＮＡに結合したままである、方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドまたは前記ｇＲＮＡは、転写活性因子もしくは抑制因子、またはエピジェネティック修飾因子に結合されて、１つ以上のＤＮＡ標的部位を検出するか、または前記部位に関連するシグナル伝達または発現を調節する、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法において、
前記エピジェネティック修飾因子は、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、またはデアセチラーゼである、方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の方法において、
前記標的ＤＮＡは、二本鎖標的であり、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのヘテロ二重鎖に対してエンドヌクレアーゼ活性を持たないか、または低いエンドヌクレアーゼ活性を有する、方法。
【請求項４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは細胞中で標的ＤＮＡを標的化、編集、修飾、または操作するシステムにおいて、
組成物は、Ｃｐｆ１ポリペプチドをコード化もしくは提供する異種ベクターと、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは１つ以上の中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種ガイド核酸と、を含み、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡは、最低でも、５’から３’の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートは、ステムループ構造を含み、前記スペーサーは、ＤＮＡ標的セグメントを含む、システム。
【請求項４７】
請求項４６に記載のシステムにおいて、
前記システムは、Ｍｇ２＋もしくはＣａ２＋、またはその両方を提供する緩衝液をさらに含む、システム。
【請求項４８】
請求項４６に記載のシステムにおいて、
ガイド核酸は、前記ステムループ構造の近位に８ヌクレオチドのシード配列を有し、前記シード配列は、前記標的ＤＮＡの配列に十分に相補的である、システム。
【請求項４９】
請求項４８に記載のシステムにおいて、
前記標的ＤＮＡの相補的な配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流にあり、前記ＰＡＭ配列は、「非標的」鎖上に位置する５’−ＹＴＮ−３’（ＹはＴまたはＣ）である、システム。
【請求項５０】
請求項４６に記載のシステムにおいて、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、突然変異する、システム。
【請求項５１】
請求項５０に記載のシステムにおいて、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドの突然変異は、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３、Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、Ｄ１２２７、Ｅ１０２８、Ｈ９２２、およびＹ９２５からなる群から選択される、システム。
【請求項５２】
請求項４６に記載のシステムにおいて、
前記システムは、相同組換え修復によって標的ＤＮＡ配列を編集するためのドナーＤＮＡ配列をさらに含む、システム。
【請求項５３】
請求項４６に記載のシステムにおいて、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２、プレボテラ・アルベンシス、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス、スミセラ種ＳＣＡＤＣ、フラボバクテリウム種３１６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４からなる群から選択される種に由来する、システム。
【請求項５４】
細胞の１つ以上の場所でＤＮＡを編集または修飾するための組成物において、
ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、もしくはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸、および／または、
ｉｉ）少なくとも１つのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡｓまたは中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸（ｇＲＮＡ）、
から本質的になり、
各ガイドＲＮＡは、最低でも、５’から３’の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートはステムループ構造を含み、前記スペーサーは、標的ＤＮＡの標的配列に相補的なＤＮＡ標的セグメントを含む、組成物。
【請求項５５】
細胞の複数の場所でＤＮＡを編集または修飾するための請求項５４に記載の組成物において、
ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、もしくはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸、および／または、
ｉｉ）ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは２つ以上の中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸（ｇＲＮＡ）、
から本質的になり、
各ガイドＲＮＡは、最低でも、５’から３’の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートはステムループ構造を含み、前記スペーサーは、標的ＤＮＡの標的配列に相補的なＤＮＡ標的セグメントを含む、組成物。
【請求項５６】
請求項５４に記載の組成物において、
前記組成物は、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドドナーテンプレートをさらに含む、組成物。
【請求項５７】
請求項５５に記載の組成物において、
ガイドＲＮＡは、ドナーテンプレート核酸に結合される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１５年９月２４日出願の米国特許出願第６２／２３２，３８１号、２０１５年１１月２５日出願の米国特許出願第６２／２６０，０５９号、２０１５年１２月１日出願の米国特許出願第６２／２６１，４５１号、２０１５年１２月１１日出願の米国特許出願第６２／２６６，１５５号、２０１６年２月１８日出願の米国特許出願第６２／２９６，８９５号、２０１６年４月１８日出願の米国特許出願第６２／３２４，３０９号の利益を主張するものである。これらの関連出願の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。これらの関連出願の開示と本出願との間に矛盾がある範囲において、本出願の開示が支配するものとする。
【０００２】
〔配列表の参照〕
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１６年９月２１日に作成された、このＡＳＣＩＩコピーは、０１１６３３９＿００００７＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが１４８，８０８バイトである。
【０００３】
〔分野〕
ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼの新しいファミリー、関連するガイドＲＮＡおよび標的配列、ならびにゲノム編集および他の適用におけるそれらの使用が、本明細書に開示される。
【０００４】
〔背景〕
エンドヌクレアーゼ、例えば亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびリボヌクレアーゼは、ゲノム標的化、ゲノム編集、遺伝子サイレンシング、転写調節、組み換え促進、および他の分子生物学的手法のための部位特異的ヌクレアーゼとして利用されてきた。ゲノム標的化のための強力なテクノロジーへと既に進化しているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、新規のヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの供給源を提供する。
【０００５】
ＷＯ２０１３／１７６７２２に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）のＲＮＡガイドＤＮＡ標的化原理を用いたゲノム編集は、この数年にわたって、広く活用されている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの３つのタイプ（タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ）が、これまでに説明されており、４つ目がつい最近特定された（タイプＶ）。ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの大抵の使用は、タイプＩＩのシステムで行われてきた。細菌性のタイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムによりもたらされる主な利点は、プログラム可能ＤＮＡ干渉のための最小要件：カスタマイズ可能な二重ＲＮＡ構造によってガイドされる、エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９にある。化膿性連鎖球菌の元のタイプＩＩのシステムで最初に証明されているように、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、Ｃａｓ９の存在下でのＲＮａｓｅ  ＩＩＩによるＲＮＡの共成熟（co-maturation）、およびＣａｓ９による侵入的ＤＮＡの開裂（invading DNA cleavage）の両方に必須である、二重ＲＮＡを形成する前駆体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）の不変リピート（invariable repeats）に結合する。連鎖球菌において証明されるように、成熟した活性化ｔｒａｃｒＲＮＡと標的化ｃｒＲＮＡとの間に形成された二重鎖によりガイドされるＣａｓ９は、部位特異的な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を、侵入する同種ＤＮＡに導入する。Ｃａｓ９は、（ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に相補的であると定義される）標的鎖を開裂するＨＮＨヌクレアーゼドメインおよび非標的鎖を開裂するＲｕｖＣ様ドメインを使用するマルチドメイン酵素であり、選択的モチーフ不活化により、ｄｓＤＮＡを開裂するＣａｓ９をニッカーゼへと転換することを可能にする。ＤＮＡ開裂の特異性は、２つのパラメータ：プロトスペーサー配列を標的化するｃｒＲＮＡの可変のスペーサー由来配列（プロトスペーサーは、ｃｒＲＮＡのスペーサーに相補的であるＤＮＡ標的上の配列として定義される）、および非標的ＤＮＡ鎖上のプロトスペーサーのすぐ下流に位置する、短配列、すなわちプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、によって決定される。
【０００６】
これまで、複数の種からのＲＮＡガイドＣａｓ９は、ゲノム操作のためのツールとして説明されてきた。研究では、ＲＮＡガイドＣａｓ９が、ヒト細胞、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫、植物、酵母、および細菌、ならびにさまざまな他の種において、有効なゲノム編集ツールとして使用され得ることが証明されてきた。このシステムは用途が広く、単に複数のガイドＲＮＡを使用することでゲノムのいくつかの部位を同時に編集するようにＣａｓ９をプログラムすることにより、複合的なゲノム工学を可能にする。Ｃａｓ９のニッカーゼへの転換は、変異原活性を減少させた哺乳類ゲノムで相同組換え修復を促進することが示されている。さらに、Ｃａｓ９触媒不活性突然変異体のＤＮＡ結合活性は、ＲＮＡプログラム可能な転写サイレンシングおよび活性化デバイスを作り出すのに活用されてきた。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの３つの主要なタイプの説明に続き、第４のタイプが最近特定され、ここでは、我々は、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓと呼ばれる、新たなタイプのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼを説明する。明確にするために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓのこの呼称は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼであるＣｐｆ１を含む。
【０００８】
本発明は、既知のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼとは異なる特徴および機能性を有する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼの新規のファミリーを提供し、よって、これまでは存在しなかったゲノム編集のためのさらなる機会を提供するものである。
【０００９】
〔概要〕
本発明は、ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼの新しいファミリー、関連するガイドＲＮＡおよび標的配列、ならびにゲノム編集におけるそれらの使用に関する。
【００１０】
細菌および古細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ獲得免疫は、成熟したＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の産生および侵入核酸への干渉のための、一組の別個のタンパク質を必要とする。Ｃｐｆ１およびそのオルソログは、前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）プロセシングおよび標的ＤＮＡのｃｒＲＮＡプログラム可能開裂において二重のエンドリボヌクレアーゼ−エンドヌクレアーゼ活性を有する単一酵素ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（single enzyme CRISPR-associated proteins）の新規のファミリーであり、ＲＮＡプログラム可能ゲノム編集に使用され得る。
【００１１】
タイプＶ−ＡのＣｐｆ１は、ｃｒＲＮＡ生合成および干渉における二重ヌクレアーゼ（dual-nuclease）である。Ｃｐｆ１は、リピート内に形成されたヘアピン構造の上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂し、第１の中間ｃｒＲＮＡを生成し、これらは、ｃｒＲＮＡを成熟させるようにさらに処理される（前処理基質および処理基質核酸のいずれも、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ぶ）。「ガイドＲＮＡ」は、成熟ｃｒＲＮＡ、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで成熟ｃｒＲＮＡへと処理されることのできる、その任意の人為的に作られた前処理形態である。成熟リピート‐スペーサーｃｒＲＮＡによりガイドされるＣｐｆ１は、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断をもたらし、５’オーバーハングを生成する。Ｃｐｆ１のＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分解活性は、ｃｒＲＮＡリピートのヘアピンの配列特異的および構造特異的な認識を必要とする。Ｃｐｆ１によるＤＮＡ開裂は、（非標的鎖上のｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の上流の５’−ＹＴＮ−３’（ＹはＴもしくはＣ）としても定義される（図３Ｄおよび図１３Ｃ））標的ＤＮＡ鎖上の二本鎖５’−ＮＡＲ−３’（Ｎは任意のヌクレオチドであり；Ｒはプリン塩基（ＧもしくはＡ）である）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在によって決まる。ＰＡＭに近位の８ヌクレオチドのシード配列が決定された。Ｃｐｆ１は、両方のヌクレアーゼ反応に別個の活性ドメインを使用し、マグネシウムまたはカルシウムの存在下で核酸を開裂する。これは、二重のエンドリボヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性を持つ酵素の新しいファミリーを表し、タイプＶ−Ａが既述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの最小のもの（most minimal）を構成することを証明している。さらに、この酵素の新しいファミリーは、ＲＮＡプログラム可能ゲノム編集に使用され得る。一態様では、ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または細胞内で標的化、編集、または操作する方法が本明細書で提供され、この方法は、異種Ｃｐｆ１ポリペプチド、および１つ以上のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）または中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸とＤＮＡを接触させることを含み、各ＲＮＡは、５’から３’の方向に最低限のリピート‐スペーサーアレイ（例えば、１組のリピート‐スペーサー要素を有するアレイ、およびスペーサー‐リピートアレイを含む）を含み、リピートは、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸は、規定長さが、Ｃａｓ９に必要とされる対応するガイドＲＮＡより短い。
【００１２】
別の態様では、細胞中でＤＮＡを標的化、編集、または操作するシステムが本明細書で提供され、これは、Ｃｐｆ１ポリペプチドをコード化もしくは提供する異種ベクターと、１つ以上のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）または中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸と、を含み、各ＲＮＡは、５’から３’の方向に最低限のリピート‐スペーサーアレイを含み、リピートは、ステムループ構造を含む。
【００１３】
別様の事項が示されるか、または文脈から得られる場合を除き、リピート‐スペーサーアレイという用語は、複数のリピート‐スペーサー単位を含むアレイだけでなく、単一のリピート‐スペーサー単位も指す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、モノマーである。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは約１８７ｋＤａの見かけの分子量を有する。いくつかの実施形態では、酵素は、細胞内で組換えにより発現した場合、および／または例えばニッケルアフィニティーもしくは他の適切な精製技術によって精製された後は、モノマーである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡ開裂ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮＡ開裂ドメインは、リピート‐スペーサーアレイのリピート内で、ステムループの４ヌクレオチド上流で、１つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間ｃｒＲＮＡそれぞれを開裂する（図２Ａ〜図２Ｂ）。中間またはｐｒｅ−ＲＮＡは、他の酵素によって開裂されるか、またはトリミングされ得る。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮＡ開裂ドメインは、ステムループ構造の４ヌクレオチド上流で１つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間ｃｒＲＮＡそれぞれを開裂する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮＡ開裂ドメインは、Ｍｇ２＋の存在下ではより高い活性レベルで、また、Ｃａ２＋の存在下ではさらに高いレベルで、１つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間ｃｒＲＮＡを、開裂する。注目すべきは、二価イオンなしでの一部のＲＮＡプロセシングは、効率がより低くても達成され得ることである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間ｃｒＲＮＡは、開裂され、１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと処理される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ開裂ドメインをガイドする。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ開裂ドメインは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋のいずれかの存在下でＤＮＡを開裂することができる。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｍｇ２＋の存在下で、またはやや好ましくないことにはＣａ２＋の存在下で、ＲＮＡを開裂することができる。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ開裂ドメインは、５ヌクレオチドの５’オーバーハングを産生する互い違いの切断によってＤＮＡを開裂する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ開裂ドメインは、非標的鎖上のｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の上流の５’−ＹＴＮ−３’（ＹはＴもしくはＣ）、または標的鎖のｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の下流の５’−ＮＡＲ−３’であるＤＮＡにおけるＰＡＭ配列を認識し、これには、標的鎖のｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の下流の５’−ＮＡＧ−３’である、ＤＮＡのＰＡＭ配列が特に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ開裂ドメインは、ＰＡＭの近位に８ヌクレオチドのシード配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮＡ開裂ドメインは、ＤＮＡを、ＰＡＭ配列の約２０ヌクレオチド上流で開裂する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡに相補的な標的鎖上のＰＡＭ配列のちょうど２２塩基対上流で、かつｃｒＲＮＡに非相補的な非標的鎖上のＰＡＭ配列の１７塩基対下流で、ＤＮＡを開裂する（図２）。別の態様では、１つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡもしくは中間ＲＮＡを含む１つ以上の異種核酸と共に、Ｃｐｆ１ポリペプチド、またはＣｐｆ１をコード化するか、もしくはポリペプチドを提供する異種ベクターを組み合わせることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは細胞内でＤＮＡを標的化、編集、または操作する際に、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ活性を改善させる方法が本明細書で提供され、活性の改善は、成熟形態のｃｒＲＮＡより長い形態のｃｒＲＮＡ、例えば中間形態のｃｒＲＮＡを用いることによって得られる。例えば図１１に示すように（第４レーン対第３および第６レーンを参照）、より大きいｃｒＲＮＡをＣｐｆ１で処理すると、Ｃｐｆ１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を高めることができる（図１１の第４レーン対第３および第６レーンを参照）。
【００２０】
別の態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性の調節の不存在下でエンドリボヌクレアーゼ活性を調節し、かつ／またはエンドリボヌクレアーゼ活性の調節の不存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を調節するか、またはマグネシウムもしくはカルシウムなどの特異的二価陽イオンの存在下もしくは不存在下でヌクレアーゼ活性を調節し、かつ／または他方のＤＮＡ鎖を除いて一方のみのＤＮＡ鎖の開裂を調節し、かつ／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼによって、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３、Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、Ｄ１２２７、Ｅ１０２８、Ｈ９２２、およびＹ９２５（図３）からなる群から選択されるＣｐｆ１ポリペプチドの特定のアミノ酸残基の突然変異もしくは修飾によって、例えばこれらのアミノ酸残基のうちの任意の１つをアラニン（Ａ）で置換することによって、ＲＮＡ安定性もしくは半減期、および／もしくはＤＮＡ結合を調節する方法が、本明細書で提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、変化したＣｐｆ１エンドリボヌクレアーゼ活性またはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、中間ｃｒＲＮＡ、もしくは成熟ｃｒＲＮＡの関連した半減期を有し、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、およびＦ８７３、例えば、Ｈ８４３Ａ、Ｋ８５２Ａ、Ｋ８６９Ａ、およびＦ８７３Ａからなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、実質的に減少または改良されたエンドリボヌクレアーゼ活性またはＤＮＡへの結合親和性なしに、変化するかまたは無効となったＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を備え、Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５、例えば、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、およびＤ１２５５Ａからなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである。このような修飾により、転写調節、活性化、または抑制を目的としたＣｐｆ１の配列特異的なＤＮＡ標的化；メチル化、脱メチル化、アセチル化、または脱アセチル化によるエピジェネティック修飾またはクロマチン修飾、または当技術分野で既知のＤＮＡ結合性タンパク質の任意の他の修飾、が可能となり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がなく、Ｍｇ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少または改良されず、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、およびＤ１２２７、例えば、Ｅ９２０Ａ、Ｙ１０２４Ａ、およびＤ１２２７Ａからなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がなく、Ｍｇ２＋の存在下で非標的鎖のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少し、アミノ酸残基Ｅ１０２８、例えばＥ１０２８Ａに突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下で標的鎖のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少し、Ｍｇ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少または改良されず、Ｈ９２２およびＹ９２５、例えばＨ９２２ＡおよびＹ９２５Ａから選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、または動物細胞である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドおよび単一の異種核酸は、ポリペプチドおよび核酸をコード化する同じかまたは異なる組み換え型ベクターによって細胞に導入される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド、核酸、またはポリペプチドおよび核酸の両方をコード化する核酸が、修飾される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、方法またはシステムは、ドナーＤＮＡ配列を追加することをさらに含み、標的ＤＮＡ配列は、相同組換え修復によって編集される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに物理的に結合される。
【００３０】
別の態様では、ＲＮＡおよびＤＮＡのｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはヘテロ二重鎖に対する活性を有することなく、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖標的ＤＮＡを修飾または編集する方法が、本明細書で提供される。
【００３１】
別の態様では、細胞の複数の場所でＤＮＡを編集または修飾する方法が、本明細書で提供され、この方法は、ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸を細胞に導入することと；ｉｉ）ＲＮＡとしての、もしくはＤＮＡとしてコード化された、２つ以上のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）を含む単一の異種核酸を、１つのプロモーターの制御下で、細胞に導入することと、から本質的になり、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、リピート‐スペーサーアレイまたはリピート‐スペーサーを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含み、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ステムループ構造の上流で２つ以上ののｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂して、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡを生成し、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡは、２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと処理され、２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡはそれぞれ、Ｃｐｆ１ポリペプチドをガイドして、２つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）をＤＮＡ中にもたらす。例えば、Ｃｐｆ１の１つの利点は、いくつかのリピート‐スペーサー単位を含むただ１つのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを導入するのが可能なことであり、この導入の際、ＤＮＡ上のいくつかの異なる配列を標的化する、活性のあるリピート‐スペーサー単位へと、Ｃｐｆ１によって処理される。
【００３２】
別の態様では、細胞の複数の場所でＤＮＡを編集または修飾する方法が、本明細書で提供され、この方法は、ｉ）エンドリボヌクレアーゼ活性が減少したある形態のＣｐｆ１を、ポリペプチドまたはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸として、細胞に導入することと；ｉｉ）ＲＮＡとしての、もしくはＤＮＡとしてコード化された、２つ以上のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）、中間ｃｒＲＮＡもしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸を、１つ以上のプロモーターの制御下で導入することと、から本質的になり、各ｃｒＲＮＡは、リピート‐スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含み、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、単一の異種核酸の１つ以上のスペーサー配列によって導かれるとおりに、エンドリボヌクレアーゼ活性が減少しているか、または存在せず、無傷のエンドヌクレアーゼ活性を有する、単一の異種ＲＮＡの１つ以上の領域に結合する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、単一の異種核酸のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列は、特定の場所、向き、配列で、または特異的化学結合によって、互いに結合されて、異なるｃｒＲＮＡ配列により特定される部位のそれぞれでＣｐｆ１のエンドヌクレアーゼ活性を導くか、または別様に調節する。
【００３４】
別の態様では、細胞の複数の場所でＤＮＡの構造または機能を編集または修飾する一般的方法の例が本明細書で提供され、この方法は、ｉ）Ｃｐｆ１などのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを、ポリペプチドまたはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコード化する核酸として、細胞に導入することと；ｉｉ）ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコード化された、２つ以上のガイドＲＮＡを含むかもしくはコード化する単一の異種核酸を、１つ以上のプロモーターの制御下で導入することと、から本質的になり、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの活性または機能は、単一の異種核酸のガイドＲＮＡ配列によって導かれる。
【００３５】
方法のいくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸は、例えばコドン最適化された、修飾核酸である。
【００３６】
方法のいくつかの実施形態では、単一の異種核酸は、修飾核酸である。
【００３７】
方法のいくつかの実施形態では、方法は、細胞にポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに物理的に結合される。
【００３８】
方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡは、相同組換え修復、非相同末端結合、またはマイクロホモロジー媒介末端結合のいずれかによってＤＳＢで修復される。
【００３９】
方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ＤＮＡの欠失、挿入、または置換のいずれかによって２つ以上のＤＳＢそれぞれにおいて修正される。
【００４０】
さらに別の態様では、細胞の複数の場所で遺伝子を編集する組成物が、本明細書で提供され、この組成物は、ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸と；ｉｉ）細胞内に１つのプロモーターの制御下で、ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコード化された、２つ以上のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）を含む単一の異種核酸と、から本質的になり、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡはリピート‐スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含む。
【００４１】
組成物のいくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸は、例えばコドン最適化された、修飾核酸である。
【００４２】
組成物のいくつかの実施形態では、単一の異種核酸は、修飾核酸である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリヌクレオチドドナーテンプレートをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに物理的に結合される。
【００４４】
別の態様では、Ｃｐｆ１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を導くために適切な局所環境で成熟ｃｒＲＮＡを利用可能にするように、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをＣｐｆ１ポリペプチドによってｃｒＲＮＡへと処理する方法が、本明細書で提供される。
【００４５】
方法のいくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、局所環境で成熟ｃｒＲＮＡとより容易に合成され、そのため、ｃｒＲＮＡが局所環境でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡから同じＣｐｆ１ポリペプチドで処理された結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を導くのに、より容易に利用可能となる。
【００４６】
方法のいくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ発現構造体内部で異種配列が１つ以上のｃｒＲＮＡ配列に５’または３’で組み込まれている、修飾ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド配列から１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡ配列を開裂、単離、または精製するのに使用される。異種配列は、安定性、半減期、発現レベルもしくはタイミング、Ｃｐｆ１ポリペプチドもしくは標的ＤＮＡ配列との相互作用、または当技術分野で既知の任意の他の物理的もしくは生化学的特徴を修飾するために、組み込まれ得る。
【００４７】
方法のいくつかの実施形態では、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列は、安定性、半減期、発現レベルもしくはタイミング、Ｃｐｆ１ポリペプチドもしくは標的ＤＮＡ配列との相互作用、または当技術分野で既知の任意の他の物理的もしくは生化学的特徴を差別的に修飾するために、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列内部の２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡ配列の差異的調節をもたらすように修飾される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチド（またはその核酸でコード化された変異体）は、機能、活性、動特性、半減期などといった所望のその特徴を改善するために修飾される。そのような修飾の１つの非限定的な例は、Ｃｐｆ１の「開裂ドメイン」を、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９からのＲｕｖＣドメインなど、異なるヌクレアーゼからの相同もしくは異種開裂ドメインで置換することである。
【００４９】
一態様では、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法が、本明細書で提供され、この方法は、１つ以上のｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、無傷の、または部分的もしくは完全に欠陥のあるＣｐｆ１ポリペプチドまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ部分を、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼに結合させてエンドヌクレアーゼ開裂を導くことを含む。別の実施形態では、ＦＯＫ１ヌクレアーゼシステムは、ニッカーゼまたは温度感受性の突然変異体、または当技術分野で既知の任意の他の変異体である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼと結合したＣｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコード化された、２つ以上のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）を含む単一の異種核酸と共に、１つのプロモーターの制御下で、細胞に導入され、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、リピート‐スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含み、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ステムループ構造の上流で２つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂して、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡを生成する。
【００５１】
一態様では、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法が、本明細書で提供され、この方法は、１つ以上のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、無傷の、または部分的もしくは完全に欠陥のあるＣｐｆ１ポリペプチドまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、中間ｃｒＲＮＡ、成熟ｃｒＲＮＡ部分、もしくはｇＲＮＡ（まとめてｃｒＲＮＡと呼ぶ）を、ドナーの一本鎖または二本鎖ＤＮＡドナーテンプレートに結合して外来性ＤＮＡ配列の相同組換えを促進することを含む。
【００５２】
さらに別の態様では、相同組換えまたは相同組換え修復のため、遺伝子編集の特異的部位に、ＤＮＡテンプレートを導く方法が、本明細書で提供される。これに関して、一本鎖または二本鎖のＤＮＡテンプレートが、化学的に、または当技術分野で既知の他の手段によって、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに結合される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに結合されたままであるが、他の実施例では、Ｃｐｆ１は、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡを開裂し、ＤＮＡテンプレートを解放して、相同組換えを可能にするか、または促進する。
【００５３】
さらに別の態様では、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法が、本明細書で提供され、この方法は、１つ以上のｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、無傷の、または部分的もしくは完全に欠陥のあるＣｐｆ１ポリペプチドまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ部分を、転写活性因子もしくは抑制因子、またはメチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、もしくはデアセチラーゼなどのエピジェネティック修飾因子に結合させるか、あるいは、シグナル伝達または検出することを含み、このすべての態様は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムについて既に説明されている。
【００５４】
別の態様では、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに結合されたポリヌクレオチドドナーテンプレートを含む組成物が、本明細書で提供される。
【００５５】
細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法は、１つ以上のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡを、ドナー一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドドナーテンプレートに結合させることを含み、ドナーテンプレートは、Ｃｐｆ１ポリペプチドによってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡから開裂され、それにより、ドナーテンプレートによる相同組換え修復を促進する。
【００５６】
さらに別の態様では、細胞のＲＮＡを標的化または操作する方法が、本明細書で提供され、この方法は、エンドリボヌクレアーゼ活性が不足しているＣｐｆ１ポリペプチドを、検出、分子間相互作用、翻訳の活性化、修飾、または当技術分野で既知の任意の他の操作のため、機能性タンパク質成分に結合させることを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１は、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２、プレボテラ・アルベンシス、アシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス、スミセラ種（Smithella sp.）ＳＣＡＤＣ、フラボバクテリウム種３１６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン（Bacteroidetes oral taxon）２７４からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】ＭＵＳＣＬＥによって行った、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２（Ｆｎｏ）（ｇｉ：１１８４９６６１５）、プレボテラ・アルベンシスＭ３８４（Ｐａｌ）（ｇｉ：６４０５５７４４７）、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６（Ａｓｐ）（ｇｉ：５４５６１２２３２）、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２（Ｅｅｌ）（ｇｉ：５４７４７９７８９）、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス（Ｂｆｉ）（ｇｉ：６５２９６３００４）、スミセラ種ＳＣＡＤＣ（Ｓｓｐ）（ｇｉ：７３９５２６０８５）、フラボバクテリウム種３１６（Ｆｓｐ）（ｇｉ：８００９４３１６７）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｃｒ）（ｇｉ：７３９００８５４９）、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４（Ｂｏｒ）（ｇｉ：４９６５０９５５９）のＣｐｆ１のアミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す。フランシセラ‐ノビシダのＣｐｆ１のアミノ酸残基８００〜１３００に対応するＣ‐末端領域のみが、ＪａｌＶｉｅｗによって可視化される。保存残基が太字で示されている。ＲＮＡプロセシング（Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３）およびＤＮＡ標的化（Ｄ９１７、Ｅ９２０、Ｈ９２２、Ｙ９２５、Ｅ１００６、Ｙ１０２４、Ｅ１０２８、Ｄ１２２７、Ｄ１２５５）に関与する残基は、アステリスクにより示されている。図１Ａは、アラインメントの第１の部分を示す。アラインメントは、Ｆｎｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の残基８００〜１３００、Ｐａｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の残基７４４〜１２５３、Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の残基７５７〜１３０７、Ｅｅｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の残基７２２〜１２８２、Ｂｆｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の残基７１４〜１２３１、Ｓｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の残基７４５〜１２５０、Ｆｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６９〜１２７３、Ｐｃｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６１〜１２６０、Ｂｏｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の残基７４８〜１２６２にある。
【図１Ｂ】ＭＵＳＣＬＥによって行った、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２（Ｆｎｏ）（ｇｉ：１１８４９６６１５）、プレボテラ・アルベンシスＭ３８４（Ｐａｌ）（ｇｉ：６４０５５７４４７）、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６（Ａｓｐ）（ｇｉ：５４５６１２２３２）、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２（Ｅｅｌ）（ｇｉ：５４７４７９７８９）、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス（Ｂｆｉ）（ｇｉ：６５２９６３００４）、スミセラ種ＳＣＡＤＣ（Ｓｓｐ）（ｇｉ：７３９５２６０８５）、フラボバクテリウム種３１６（Ｆｓｐ）（ｇｉ：８００９４３１６７）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｃｒ）（ｇｉ：７３９００８５４９）、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４（Ｂｏｒ）（ｇｉ：４９６５０９５５９）のＣｐｆ１のアミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す。フランシセラ‐ノビシダのＣｐｆ１のアミノ酸残基８００〜１３００に対応するＣ‐末端領域のみが、ＪａｌＶｉｅｗによって可視化される。保存残基が太字で示されている。ＲＮＡプロセシング（Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３）およびＤＮＡ標的化（Ｄ９１７、Ｅ９２０、Ｈ９２２、Ｙ９２５、Ｅ１００６、Ｙ１０２４、Ｅ１０２８、Ｄ１２２７、Ｄ１２５５）に関与する残基は、アステリスクにより示されている。図１Ｂは、アラインメントの第２の部分を示す。アラインメントは、Ｆｎｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の残基８００〜１３００、Ｐａｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の残基７４４〜１２５３、Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の残基７５７〜１３０７、Ｅｅｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の残基７２２〜１２８２、Ｂｆｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の残基７１４〜１２３１、Ｓｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の残基７４５〜１２５０、Ｆｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６９〜１２７３、Ｐｃｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６１〜１２６０、Ｂｏｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の残基７４８〜１２６２にある。
【図１Ｃ】ＭＵＳＣＬＥによって行った、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２（Ｆｎｏ）（ｇｉ：１１８４９６６１５）、プレボテラ・アルベンシスＭ３８４（Ｐａｌ）（ｇｉ：６４０５５７４４７）、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６（Ａｓｐ）（ｇｉ：５４５６１２２３２）、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２（Ｅｅｌ）（ｇｉ：５４７４７９７８９）、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス（Ｂｆｉ）（ｇｉ：６５２９６３００４）、スミセラ種ＳＣＡＤＣ（Ｓｓｐ）（ｇｉ：７３９５２６０８５）、フラボバクテリウム種３１６（Ｆｓｐ）（ｇｉ：８００９４３１６７）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｃｒ）（ｇｉ：７３９００８５４９）、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４（Ｂｏｒ）（ｇｉ：４９６５０９５５９）のＣｐｆ１のアミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す。フランシセラ‐ノビシダのＣｐｆ１のアミノ酸残基８００〜１３００に対応するＣ‐末端領域のみが、ＪａｌＶｉｅｗによって可視化される。保存残基が太字で示されている。ＲＮＡプロセシング（Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３）およびＤＮＡ標的化（Ｄ９１７、Ｅ９２０、Ｈ９２２、Ｙ９２５、Ｅ１００６、Ｙ１０２４、Ｅ１０２８、Ｄ１２２７、Ｄ１２５５）に関与する残基は、アステリスクにより示されている。図１Ｃは、アラインメントの第３の部分を示す。アラインメントは、Ｆｎｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の残基８００〜１３００、Ｐａｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の残基７４４〜１２５３、Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の残基７５７〜１３０７、Ｅｅｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の残基７２２〜１２８２、Ｂｆｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の残基７１４〜１２３１、Ｓｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の残基７４５〜１２５０、Ｆｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６９〜１２７３、Ｐｃｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６１〜１２６０、Ｂｏｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の残基７４８〜１２６２にある。
【図２Ａ】Ｃｐｆ１がリピートステムループ構造の上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理することを示す。図２Ａでは、短形態のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（リピートスペーサー、完全長）からなる５’末端標識された６９ｎｔ長転写物が、単一のヌクレオチド分解ラダー（ＯＨ）（Ａｍｂｉｏｎ）を生じるアルカリ加水分解と、ＲＮａｓｅ  Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ）特異的開裂とを受けて、ＲＮＡ断片（Ｔ１）のサイズ決定を可能にした。１０分のタイムコースにわたり３７℃で、内部標識された６９ｎｔのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（２００ｎＭ）と共に、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でＣｐｆ１（１μＭ）をインキュベートすると、ステムループ構造の４ｎｔ上流での、リピート内におけるＣｐｆ１プロセシングが明らかになり、１９ｎｔリピート断片および５０ｎｔリピート‐スペーサーｃｒＲＮＡ断片をもたらす。
【図２Ｂ】（ＲＮＡｆｏｌｄ２９およびＶＡＲＮＡ  ３０を用いてモデル化した）ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡリピート構造の概略表示である。Ｃｐｆ１開裂部位は、三角形で示してある。
【図３Ａ】Ｃｐｆ１がＣａ２＋の存在下で５ｎｔの５’オーバーハングを生成するために５’−ＹＴＮ−３’ＰＡＭの遠位端部で特に標的ＤＮＡを開裂することを示す。図３Ａは、プラスミド開裂アッセイの結果を示す。スペーサー４または５を含むｃｒＲＮＡ（リピート‐スペーサー、処理済）（ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４またはｃｒＲＮＡ−ｓｐ５）でプログラムされたＣｐｆ１を使用して、Ｃａ２＋の不存在下または存在下でプロトスペーサー５を含むスーパーコイルプラスミドＤＮＡを標的化した。
【図３Ｂ】Ｃｐｆ１がＣａ２＋の存在下で５ｎｔの５’オーバーハングを生成するために５’−ＹＴＮ−３’ＰＡＭの遠位端部で特に標的ＤＮＡを開裂することを示す。図３Ｂは、オリゴヌクレオチド開裂アッセイの結果を示す。ｃｒＲＮＡ−ｓｐ４またはｃｒＲＮＡ−ｓｐ５でプログラムされたＣｐｆ１を使用して、Ｃａ２＋の不存在下または存在下でオリゴヌクレオチド二重鎖を標的化した。標的または非標的鎖は、基質二重鎖を形成するために、非標識相補鎖にアニールされる前に５’が放射標識された。
【図３Ｃ】Ｃｐｆ１がＣａ２＋の存在下で５ｎｔの５’オーバーハングを生成するために５’−ＹＴＮ−３’ＰＡＭの遠位端部で特に標的ＤＮＡを開裂することを示す。図３Ｃは、図３Ｂで使用されたオリゴヌクレオチド二重鎖、ならびに図３Ａおよび図３Ｂで使用されたｃｒＲＮＡ−ｓｐ５の構造の概略的表示を示す。図３Ｂで得られ、シークエンシング（図１３）により確認された断片に対応する開裂部位は、三角形で示されている。ＰＡＭ配列は、四角で印が付けられている。
【図３Ｄ】Ｃｐｆ１がＣａ２＋の存在下で５ｎｔの５’オーバーハングを生成するために５’−ＹＴＮ−３’ＰＡＭの遠位端部で特に標的ＤＮＡを開裂することを示す。図３Ｄは、Ｃｐｆ１のＰＡＭ決定を示す。プロトスペーサー５およびＰＡＭ１〜６を含むプラスミドＤＮＡ、またはプロトスペーサー５およびＰＡＭ１および７〜９を含む、５’が放射標識されたｄｓオリゴヌクレオチドは、１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下でｃｒＲＮＡ−ｓｐ５でプログラムされたＣｐｆ１による開裂を受けた（それぞれ上方パネルおよび下方パネル）。
【図３Ｅ】Ｃｐｆ１がＣａ２＋の存在下で５ｎｔの５’オーバーハングを生成するために５’−ＹＴＮ−３’ＰＡＭの遠位端部で特に標的ＤＮＡを開裂することを示す。図３Ｅは、シード配列決定実験の結果を示す。プロトスペーサー５および標的鎖に沿って単一または四重のミスマッチを含むプラスミドが、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でｃｒＲＮＡ−ｓｐ５でプログラムされたＣｐｆ１による開裂について試験された。標識：ｌｉ，線形；ｓｃ，スーパーコイル；Ｍ，１ｋｂラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。オリゴヌクレオチド開裂生成物のサイズは、ヌクレオチドで示される。図３Ｅの定量化を以下の表に示す。
【表１】
2018532402.tif 000003
【図４Ａ】Ｃｐｆ１がＲＮＡおよびＤＮＡ開裂のために２つの活性中心を含むことを示す。図４Ａでは、Ｃｐｆ１＿ｗｔ、Ｃｐｆ１＿Ｈ８４３Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｋ８５２Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｋ８６９Ａ、およびＣｐｆ１＿Ｆ８７３Ａが、ＤＮＡ開裂活性（上方パネル）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ開裂活性（中央パネル）、およびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＮＡプロセシング活性（下方パネル）について試験された。ＤＮＡ開裂は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー、完全長）によりプロトスペーサー５を含むプラスミドに対して行われた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ開裂は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で内部標識されたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（リピート‐スペーサー、完全長）に対して行われた。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡプロセシングは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（リピート‐スペーサー−リピート、完全長）のスペーサーを調べるノーザンブロット法によって分析された。
【図４Ｂ】Ｃｐｆ１がＲＮＡおよびＤＮＡ開裂のために２つの活性中心を含むことを示す。図４Ｂでは、Ｃｐｆ１＿ｗｔ、Ｃｐｆ１＿Ｄ９１７Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｅ１００６Ａ、およびＣｐｆ１＿Ｄ１２５５Ａが、ＤＮＡ開裂活性（上方パネル）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ開裂活性（下方パネル）について試験された。アッセイは、図４Ａで説明したように行われた。
【図４Ｃ】Ｃｐｆ１がＲＮＡおよびＤＮＡ開裂のために２つの活性中心を含むことを示す。図４Ｃは、プロトスペーサー５を含むｄｓオリゴヌクレオチド基質におけるＣｐｆ１＿Ｅ９２０Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｈ９２２Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｙ９２５Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｙ１０２４Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｅ１０２８Ａ、およびＣｐｆ１＿Ｄ１２２７ＡのＤＮＡ開裂活性を示す。標的または非標的鎖は、オリゴヌクレオチド二重鎖を形成するために、非標識相補鎖にアニールされる前に５’が放射標識された。開裂反応は、１０ｍＭのＣａＣｌ２（上方の２つのパネル）またはＭｇＣｌ２（下方の２つのパネル）の存在下で行われた。
【図４Ｄ】Ｃｐｆ１がＲＮＡおよびＤＮＡ開裂のために２つの活性中心を含むことを示す。図４Ｄは、Ｃｐｆ１のアミノ酸配列の概略的表示であり、ＲＮＡおよびＤＮＡ開裂のための活性ドメインは陰影付きである。突然変異アミノ酸が示されている；突然変異アミノ酸は、太字フォントで示すＤＮａｓｅモチーフで示されている。標識：ｌｉ，線形；ｓｃ，スーパーコイル。ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド開裂生成物およびノーザンブロット断片のサイズは、ヌクレオチドで示される。
【図５Ａ】フランシセラ‐ノビシダＵ１１２がリピート‐スペーサーで構成される短い成熟したタイプＶ−ＡのｃｒＲＮＡを発現することを示す。図５Ａは、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２におけるタイプＩＩ−Ｂ（ｃａｓ９）およびタイプＶ−Ａ（ｃｐｆ１）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の一定尺度に応じた表示を示す。Ｃａｓ遺伝子；推定上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロモーター；ＣＲＩＳＰＲリーダー配列；ＣＲＩＳＰＲリピート；ＣＲＩＳＰＲスペーサー；ｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｓｃａＲＮＡが、さまざまな要素として示されている。
【図５Ｂ】フランシセラ‐ノビシダＵ１１２がリピート‐スペーサーで構成される短い成熟したタイプＶ−ＡのｃｒＲＮＡを発現することを示す。図５Ｂでは、小ＲＮＡシークエンシングにより決定されるタイプＶ−ＡのｃｒＲＮＡの発現が、グレーの棒グラフで表されている。リードのカバレッジが括弧内に示され、各位置で始まり（５’末端）終わる（３’末端）リードが示されている（画像は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）から取り込まれた）。塩基対で、ＣＲＩＳＰＲアレイのゲノム座標およびサイズが示される。リーダー配列から最後のリピートまでのタイプＶ−ＡのＣＲＩＳＰＲアレイの配列が示される。黒い太字で大文字の配列は、イタリック体の小文字の配列であるスペーサーが後に続くリピートである。囲まれた配列は、小ＲＮＡシークエンシングにより検出された、成熟ｃｒＲＮＡに対応する。成熟ｃｒＲＮＡは、５’におけるリピートの一部および３’におけるスペーサーの一部から構成される。
【図６Ａ】ワイルドタイプのＣｐｆ１が溶解したモノマーとして精製されることを示す。アフィニティーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアのＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ）により精製されたフランシセラ‐ノビシダＵ１１２の組み換え型Ｃｐｆ１が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）に適用された。図６Ａでは、サイズ排除クロマトグラフィーにより得られたタンパク質サンプルが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）により分離され、クーマシー染色で可視化された。
【図６Ｂ】ワイルドタイプのＣｐｆ１が溶解したモノマーとして精製されることを示す。アフィニティーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアのＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ）により精製されたフランシセラ‐ノビシダＵ１１２の組み換え型Ｃｐｆ１が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）に適用された。図６Ｂは、ワイルドタイプのＣｐｆ１サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す。
【図６Ｃ】ワイルドタイプのＣｐｆ１が溶解したモノマーとして精製されることを示す。アフィニティーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアのＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ）により精製されたフランシセラ‐ノビシダＵ１１２の組み換え型Ｃｐｆ１が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）に適用された。図６Ｃは、既知の分子量を持つタンパク質の較正曲線を示す（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの分子量マーカーキット）。ピークの溶出体積（図６Ｂ）の較正曲線（図６Ｃ）との比較分析により、１８７ｋＤａのサイズが明らかとなり、これは、溶解したモノマー形態のＣｐｆ１を示す。
【図６Ｄ】ワイルドタイプのＣｐｆ１が溶解したモノマーとして精製されることを示す。アフィニティーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアのＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ）により精製されたフランシセラ‐ノビシダＵ１１２の組み換え型Ｃｐｆ１が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）に適用された。図６Ｄは、金属イオンアフィニティー精製（左側のパネル）および陽イオン交換クロマトグラフィー（右側のパネル）により得られたタンパク質溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図７Ａ】Ｃｐｆ１のエンドリボヌクレアーゼ溶解作用（endoribonucleolytic activity）が無傷のリピート配列の存在に依存していることを示す。図７Ａは、開裂アッセイの結果が、３７℃で３０分間、１μＭのＣｐｆ１で、異なるリピートおよびスペーサー配列変異体に対応する１００ｎＭの内部標識されたＲＮＡ構造体をインキュベートすることによって、行われたことを示す。開裂反応は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびホスホアイメージング（phosphorimaging）によって分析された。開裂生成物は、概略的に表され、サイズは、ヌクレオチドで表される。
【図７Ｂ】Ｃｐｆ１のエンドリボヌクレアーゼ溶解作用が無傷のリピート配列の存在に依存していることを示す。基質として使用されるＲＮＡの配列組成が図７Ｂに示されている。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄにより生成され、ＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて可視化された。Ｃｐｆ１は、完全長のリピート配列を含むＲＮＡテンプレートのみを開裂した。２つのリピートを含む基質は、２回開裂され、その結果、３つ以上の断片を生じたが、１つのリピートのみを有するＲＮＡの開裂は、２つの断片を結果として生じ、これは、決定された開裂部位に一致している（図２を参照）。
【図８】Ｃｐｆ１がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで処理することを示す。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをコード化するプラスミド、ならびにＣｐｆ１のワイルドタイプおよび変異体をコードする空ベクターまたは過剰発現ベクターと同時形質転換された大腸菌から抽出された全ＲＮＡのノーザンブロット分析。Ｃｐｆ１の発現は、ＩＰＴＧで誘発された（＋）か、または誘発されなかった（−）。ノーザンブロットは、試験されたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に対してプローブされた。Ｃｐｆ１の不存在下（空ベクターまたは誘導されていない）では、転写物の量が、Ｃｐｆ１の存在下と比べて減少し、これは、Ｃｐｆ１の結合によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの安定化を示す。Ｃｐｆ１の発現は、別個の処理された転写物を結果として生じ、Ｃｐｆ１＿Ｈ８４３Ａ、Ｃｐｆ１＿Ｋ８５２Ａ、およびＣｐｆ１＿Ｋ８６９Ａの発現は、いくつかのより多量の（higher）転写物を結果として生じた。Ｃｐｆ１＿Ｆ８７３Ａの発現は、ほとんど検出不能な処理された転写物を結果として生じた。
【図９Ａ】Ｃｐｆ１が、配列特異的および構造特異的なエンドリボヌクレアーゼであることを示す。変更リピート配列、破壊リピート構造（destroyed repeat structure）、リピート認識配列（ＲＲＳ）における単一ヌクレオチド交換（１〜４）、ならびにループおよびステムの変化したサイズを有する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（スペーサー５を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）のさまざまなリピート変異体のデザイン。ワイルドタイプのリピートの５’リピート領域が異なる変異体では示されていないことに注目されたい。より暗い影を付けた円は、突然変異または追加残基を強調している。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄにより生成され、ＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて可視化された。図９Ａは、以下のように生成された。ワイルドタイプのリピート配列、変更リピート配列、または破壊リピート構造を含む、内部標識されたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡｓが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得られた。５’末端標識ワイルドタイプ基質が、ＲＮＡ断片のサイズを決定するためにアルカリ加水分解ラダー（ＯＨ）およびＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物（Ｔ１）を生成するのに使用された（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｃｐｆ１は、ワイルドタイプのリピート配列を含むｐｒｅ−ｃｒＲＮＡテンプレートのみを開裂し、１９ｎｔの小さい５’リピート断片および５０ｎｔの中間ｃｒＲＮＡをもたらした。
【図９Ｂ】Ｃｐｆ１が、配列特異的および構造特異的なエンドリボヌクレアーゼであることを示す。変更リピート配列、破壊リピート構造、リピート認識配列（ＲＲＳ）における単一ヌクレオチド交換（１〜４）、ならびにループおよびステムの変化したサイズを有する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（スペーサー５を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）のさまざまなリピート変異体のデザイン。ワイルドタイプのリピートの５’リピート領域が異なる変異体では示されていないことに注目されたい。より暗い影を付けた円は、突然変異または追加残基を強調している。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄにより生成され、ＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて可視化された。図９Ｂは同様に生成され、４つのＲＲＳヌクレオチドの連続した単一突然変異（開裂部位から数えて１〜４）を有する基質が、Ｃｐｆ１によるプロセシングに関して試験された。最初の３つのヌクレオチドの変化は、Ｃｐｆ１介在性プロセシング対して耐性がなかったが、４つ目のヌクレオチドを変化させると、ワイルドタイプの基質と比べて低い効率で処理された基質がもたらされた。
【図９Ｃ】Ｃｐｆ１が、配列特異的および構造特異的なエンドリボヌクレアーゼであることを示す。変更リピート配列、破壊リピート構造、リピート認識配列（ＲＲＳ）における単一ヌクレオチド交換（１〜４）、ならびにループおよびステムの変化したサイズを有する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（スペーサー５を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）のさまざまなリピート変異体のデザイン。ワイルドタイプのリピートの５’リピート領域が異なる変異体では示されていないことに注目されたい。より暗い影を付けた円は、突然変異または追加残基を強調している。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄにより生成され、ＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて可視化された。図９Ｃは同様に生成され、リピートにおけるループの変化の影響が、ループに＋１または−１ヌクレオチドを含む基質で試験された。両方の基質は、Ｃｐｆ１によって処理された。＋１もしくは−１塩基対、または＋４塩基対を有するステムは、ステムの長さ要件を決定するのに使用された。Ｃｐｆ１は、試験された３つの基質のいずれも開裂しなかった。ＲＮＡ開裂反応は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下において３７℃で５分間、２００ｎＭのＲＮＡ変異体で１μＭのＣｐｆ１をインキュベートすることによって実行された。開裂生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびホスホアイメージングによって分析された。ＲＮＡ断片は、概略的に表され、断片サイズはヌクレオチドで示されている。
【図１０Ａ】Ｃｐｆ１のＤＮＡおよびＲＮＡ開裂活性が二価金属イオンに左右されることを示す。図１０Ａは、異なる濃度の二価金属イオン（ｍＭで示す）またはＥＤＴＡ（１０ｍＭ）が補充されたＫＧＢ中の、Ｃｐｆ１によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５のＲＮＡ開裂アッセイを示す。開裂生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され、ホスホアイメージングにより可視化された。ＲＮＡ断片は、概略的に表され、断片サイズはヌクレオチドで示されている。特異的ＲＮＡ開裂がＭｇＣｌ２の存在下で観察された。特異性の低い開裂が、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、およびＣｏＣｌ２で検出された。
【図１０Ｂ】Ｃｐｆ１のＤＮＡおよびＲＮＡ開裂活性が二価金属イオンに左右されることを示す。図１０Ｂは、異なる濃度の二価金属イオン（ｍＭで示す）が補充されたＫＧＢ緩衝液中でｃｒＲＮＡ−ｓｐ５でプログラムされたＣｐｆ１による、プロトスペーサー５を含むスーパーコイルプラスミドＤＮＡの開裂アッセイを示す。開裂生成物は、アガロースゲル電気泳動により分析され、ＥｔＢｒ染色により可視化された。ＤＮＡ開裂は、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の存在下で観察された。さらに特異的な開裂が、ＣａＣｌ２の存在下で観察された。ｌｉ、線形；ｓｃ、スーパーコイル；Ｍ、１ｋｂラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。図１０Ｂのデータの定量化は、以下の表で分かる。
【表２】
2018532402.tif 000004
以下は、Ｃｐｆ１のＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅモチーフ双方に関する、認識された基質、金属イオン依存状態、およびｃｒＲＮＡ要件の概要である。
−活性なし；＋残存活性；＋＋＋完全活性
【表３】
2018532402.tif 000005
【図１１Ａ】Ｃｐｆ１がＤＮＡを特異的に開裂するために無傷のリピート構造を有するｃｒＲＮＡを必要とすることを示す。図１１Ａは、１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下で異なるＲＮＡ構造体（１〜８）でプログラムされたＣｐｆ１による、プロトスペーサー５を含むスーパーコイルプラスミドＤＮＡの開裂アッセイを示す。開裂生成物は、アガロースゲル電気泳動により分析され、ＥｔＢｒ染色により可視化された。ｌｉ、線形；ｓｃ、スーパーコイル；Ｍ、１ｋｂラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
【図１１Ｂ】Ｃｐｆ１がＤＮＡを特異的に開裂するために無傷のリピート構造を有するｃｒＲＮＡを必要とすることを示す。図１１Ｂは、１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下でプロトスペーサー５を含む５’放射標識オリゴヌクレオチド二重鎖の開裂を示す。開裂生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、ホスホアイメージングにより可視化された。断片サイズはヌクレオチドで示されている。
【図１１Ｃ】Ｃｐｆ１がＤＮＡを特異的に開裂するために無傷のリピート構造を有するｃｒＲＮＡを必要とすることを示す。基質として使用されるＲＮＡの配列組成が、図１１Ｃに概略的に示されている。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄにより生成され、ＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて可視化された。完全長のリピートおよび標的に相補的なスペーサーを含むＲＮＡのみが、Ｃｐｆ１によるＤＮＡ開裂を媒介した。
【図１１Ｄ】Ｃｐｆ１がＤＮＡを特異的に開裂するために無傷のリピート構造を有するｃｒＲＮＡを必要とすることを示す。基質として使用されるＲＮＡの配列組成が、図１１Ｄに概略的に示されている。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄにより生成され、ＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて可視化された。完全長のリピートおよび標的に相補的なスペーサーを含むＲＮＡのみが、Ｃｐｆ１によるＤＮＡ開裂を媒介した。
【図１２Ａ】Ｃｐｆ１のＤＮＡおよびＲＮＡ結合試験を示す。図１２Ａは、ＲＮＡ１〜６（図１１を参照）によりプログラムされたＣｐｆ１による、プロトスペーサー５を含む５’放射標識ｄｓオリゴヌクレオチドの電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す。使用したタンパク質濃度は、８、５２、および５１２ｎＭであった。反応が、ネイティブＰＡＧＥおよびホスホアイメージングによって分析された。非結合および結合ＤＮＡが示されている。Ｃｐｆ１が完全なリピート配列を含むＲＮＡでプログラムされる場合に、より高いＤＮＡ結合親和性が観察された。
【図１２Ｂ】Ｃｐｆ１のＤＮＡおよびＲＮＡ結合試験を示す。図１２Ｂは、ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー５、完全長、ＲＮＡ４、図１１）と複合したワイルドタイプＣｐｆ１、Ｃｐｆ１（Ｄ９１７Ａ）、Ｃｐｆ１（Ｅ１００６Ａ）、およびＣｐｆ１（Ｄ１２５５Ａ）により標的化されたプロトスペーサー５を含む５’−放射標識二本鎖オリゴヌクレオチドのＥＭＳＡを示す。使用されたタンパク質濃度は、８、１６、３２、４２、５２、６４、７４、１２８、２５６ｎＭであった。反応は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動およびホスホアイメージングで分析された。非結合および結合ＤＮＡが示されている。ここで示す結果は、少なくとも３つの個々の実験を表している。結合および非結合ＤＮＡ画分が、定量化され、酵素濃度に対してプロットされ、非線形回帰分析によってフィットされた。計算されたＫｄ値（±標準偏差）は、５０±３ｎＭ（ワイルドタイプ）、４８±８ｎＭ（Ｄ９１７Ａ）、４０±８ｎＭ（Ｅ１００６Ａ）、５２±６ｎＭ（Ｄ１２５５Ａ）であった。ワイルドタイプと突然変異Ｃｐｆ１とでＲＮＡ介在性ＤＮＡ結合親和性に差はない。Ｅ１００６Ａでは減少したＫｄは、大きな負電荷アミノ酸の除去により説明することができ、これにより、Ｃｐｆ１のＤＮＡとの相互作用が促進され得る。
【図１２Ｃ】Ｃｐｆ１のＤＮＡおよびＲＮＡ結合試験を示す。図１２Ｃは、ワイルドタイプＣｐｆ１、Ｃｐｆ１（Ｈ８４３Ａ）、Ｃｐｆ１（Ｋ８５２Ａ）、Ｃｐｆ１（Ｋ８６９Ａ）、およびＣｐｆ１（Ｆ８７３Ａ）による、５’−放射標識ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー５、処理済、ＲＮＡ３、図６）のＥＭＳＡを示す。使用したタンパク質濃度は、２、４、８、１２、１６、２４、３２、４８、６４ｎＭであった。反応は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動およびホスホアイメージングにより分析された。非結合および結合ＲＮＡが示されている。少なくとも３つの個々の実験を表すものが示されている。結合および非結合ＲＮＡ画分が、定量化され、酵素濃度に対してプロットされ、非線形回帰分析によってフィットされた。計算されたＫｄ値（±標準偏差）は、１６±１ｎＭ（ワイルドタイプ）、１７±０．５ｎＭ（Ｈ８４３Ａ）、１２±１ｎＭ（Ｋ８５２Ａ）、１０±１ｎＭ（Ｋ８６９Ａ）、１７±１ｎＭ（Ｆ８７３Ａ）であった。ワイルドタイプと突然変異Ｃｐｆ１とでＲＮＡ結合親和性に差はない。
【図１３Ａ】Ｍｇ２＋の存在下でのｃｒＲＮＡでプログラムされたＣｐｆ１による標的ＤＮＡ開裂の分析を示す。図１３Ａは、Ｍｇ２＋の不存在下または存在下でのｃｒＲＮＡ−ｓｐ４またはｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー、処理済）でプログラムされたＣｐｆ１による、プロトスペーサー５を含むスーパーコイルプラスミドＤＮＡの開裂アッセイを示す。
【図１３Ｂ】Ｍｇ２＋の存在下でのｃｒＲＮＡでプログラムされたＣｐｆ１による標的ＤＮＡ開裂の分析を示す。図１３Ｂは、Ｍｇ２＋の存在下でのｃｒＲＮＡ−ｓｐ５でプログラムされたＣｐｆ１を用いたオリゴヌクレオチド開裂アッセイを示す。標的または非標的鎖のいずれかは、二重鎖基質を形成するために、非標識相補鎖にアニールされる前に５’が放射標識された。
【図１３Ｃ】Ｍｇ２＋の存在下でのｃｒＲＮＡでプログラムされたＣｐｆ１による標的ＤＮＡ開裂の分析を示す。図１３Ｃは、図１３Ａで得られた開裂生成物のシークエンシング分析を示す。シークエンシング反応の終点が開裂部位を示す。アデニンの改善された信号はシークエンシングのアーチファクトであることに注目されたい。
【図１３Ｄ】Ｍｇ２＋の存在下でのｃｒＲＮＡでプログラムされたＣｐｆ１による標的ＤＮＡ開裂の分析を示す。図１３Ｄは、Ｃｐｆ１のＰＡＭ決定を示す。プロトスペーサー５およびＰＡＭ１〜６を含むプラスミドＤＮＡ、またはプロトスペーサー５およびＰＡＭ１、７〜９を含む５’放射標識ｄｓオリゴヌクレオチドが、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー、完全長）によりプログラムされたＣｐｆ１による開裂を受けた（それぞれ上方および下方パネル）。ｌｉ、線形；ｓｃ、スーパーコイル；Ｍ，１ｋｂラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。オリゴヌクレオチド開裂生成物はヌクレオチドで示される。
【図１４Ａ】Ｃｐｆ１の処理活性がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに特異的であり、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡ介在性標的化が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡに対してのみ向けられていることを証明する。図１４Ａでは、Ｃｐｆ１処理活性は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＤＮＡに対して試験された。ワイルドタイプＣｐｆ１またはＣｐｆ１（Ｄ９１７Ａ）（１μＭ）は、３７℃で５分間、１０ｍＭのＭｇＣｌ２でＫＧＢ緩衝液中において、２００ｎＭの内部標識ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー５、完全長、ＲＮＡ４、図１１）、またはＲＮＡと同じ配列を有する５’−標識ｓｓＤＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＤＮＡ−ｓｐ５）構造体と共にインキュベートされた。ＤＮＡ構造体ではなくＲＮＡ構造体による、ワイルドタイプＣｐｆ１およびＤＮａｓｅ不活性突然変異体（Ｃｐｆ１（Ｄ９１７Ａ））のインキュベーションは、１９ｎｔのリピート断片および５０ｎｔの中間ｃｒＲＮＡという予測された開裂生成物を生じ、これは、Ｃｐｆ１の処理活性がＲＮＡに特異的であることを示す。
【図１４Ｂ】Ｃｐｆ１の処理活性がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに特異的であり、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡ介在性標的化が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡに対してのみ向けられていることを証明する。図１４Ｂは、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡ介在性ＤＮＡ開裂活性を示す。ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（リピート‐スペーサー５、完全長、ＲＮＡ４、１１）と複合したＣｐｆ１（１００ｎＭ）は、３７℃で１時間、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；上方パネル）またはＣａＣｌ２（１０ｍＭ；下方パネル）のいずれかでＫＧＢ緩衝液中において、１０ｎＭの５’−放射標識ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドと共にインキュベートされた。オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質は、試験されたｃｒＲＮＡにより標的化されたプロトスペーサー５の配列を含んだ。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドでは、５’−放射標識標的鎖は、アステリスク付きで示されている。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ基質のみが開裂され、これは、Ｃｐｆ１のｃｒＲＮＡ介在性開裂活性がＤＮＡ基質に向けられるのみであることを示す。しかしながら、ｓｓＤＮＡの開裂生成物は、ｄｓＤＮＡで予測または観察されたものとは異なる。開裂反応は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびホスホアイメージングにより分析された。ＲＮＡ開裂生成物は、概略的に示されている。ＲＮＡおよびＤＮＡ断片サイズは、ヌクレオチドで与えられる。
【００５９】
〔配列表の簡単な説明〕
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、フランシセラ−ノビシダＵ１１２由来の例証的なＣｐｆ１のコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）である。
【００６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１０は、ＭＵＳＣＬＥによって行った、以下のような複数の種：フランシセラ‐ノビシダＵ１１２（Ｆｎｏ）（ｇｉ：１１８４９６６１５）、プレボテラ・アルベンシスＭ３８４（Ｐａｌ）（ｇｉ：６４０５５７４４７）、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６（Ａｓｐ）（ｇｉ：５４５６１２２３２）、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２（Ｅｅｌ）（ｇｉ：５４７４７９７８９）、ブチリビブリオ−フィブリソルベンス（Ｂｆｉ）（ｇｉ：６５２９６３００４）、スミセラ種ＳＣＡＤＣ（Ｓｓｐ）（ｇｉ：７３９５２６０８５）、フラボバクテリウム種３１６（Ｆｓｐ）（ｇｉ：８００９４３１６７）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｃｒ）（ｇｉ：７３９００８５４９）、バクテロイデス門のオーラルタクソン２７４（Ｂｏｒ）（ｇｉ：４９６５０９５５９）由来のＣｐｆ１オルソログのアミノ酸配列である。（フランシセラ‐ノビシダＣｐｆ１のアミノ酸残基８００〜１３００に対応するＣ‐末端領域のみが、図１Ａ〜図１Ｃで可視化されている。さらに具体的には、アラインメントは、Ｆｎｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の残基８００〜１３００、Ｐａｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の残基７４４〜１２５３、Ａｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の残基７５７〜１３０７、Ｅｅｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の残基７２２〜１２８２、Ｂｆｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の残基７１４〜１２３１、Ｓｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の残基７４５〜１２５０、Ｆｓｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６９〜１２７３、Ｐｃｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の残基７６１〜１２６０、Ｂｏｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の残基７４８〜１２６２にある。
【００６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、図２Ｂに示す例示的なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡリピート−スペーサーアレイ構造体である。
【００６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３、１４は、図３Ｃに示す例示的な非標的ＤＮＡ、標的ＤＮＡ、および成熟ｃｒＲＮＡである。
【００６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、図５Ｂに示す例示的なＣＲＩＳＰＲアレイを提供する。
【００６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、１７、１８、１９は、図７で概略的に表される、さまざまなＣｐｆ１開裂生成物の構造を提供する。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０〜２６は、図９Ａ〜図９Ｃに示すように、変更リピート配列、破壊リピート構造、ＲＲＳにおける単一ヌクレオチド交換（１〜４）、ならびにループおよびステムの変化したサイズを有する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−ｓｐ５（スペーサー５を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）のさまざまなリピート変異体を表す。
【００６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４は、図１１Ｃ〜図１１Ｄに示すＲＮＡ構造体を提供する。
【００６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、３６、３７は、図１３Ｃに示すシークエンシング分析による配列である。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によりコード化されたＣｐｆ１のアミノ酸配列を提供する。
【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９〜４９は、抱合体で使用され得る例示的なタンパク質形質導入ドメインである。
【００７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０は、例示的な浸透性ペプチドである。
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１〜１７１は、この試験で使用するさまざまなオリゴヌクレオチドを表す。本発明は、詳細な説明でさらに詳しく述べるように、配列表に示す配列およびそれらの変異体のいずれかを含む。
【００７２】
〔詳細な説明〕
用語
本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、その技術的または科学的用語が本明細書で別様に定義されない限り、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つものである。
【００７３】
本明細書中互換的に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、のポリマー形態を指す。よって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然ヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、ポリマーを含むがこれらに限定されない。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的で、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ（oligos）」としても知られ、当技術分野で既知の方法によって遺伝子から単離されるか、または化学的に合成され得る。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、説明している実施形態に適用可能なものとして、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことを、理解されたい。
【００７４】
「ゲノムＤＮＡ」は、細菌、真菌、古細菌、植物、または動物のゲノムのＤＮＡを含むがこれらに制限されない、生物のゲノムのＤＮＡを指す。
【００７５】
ＤＮＡを「操作する」とは、一方の鎖を結合すること、一方の鎖に切り目を付けること、またはＤＮＡの両方の鎖を開裂する（すなわち切断する）ことを含み、あるいは、ＤＮＡ、またはＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾することを含む。ＤＮＡを操作することは、ＤＮＡによりコード化されるポリペプチドまたはＲＮＡの発現を抑制、活性化、または調節（増加または減少のいずれか）することができる。
【００７６】
「ステムループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチド（ループ部分）の領域により片側が連結された二本鎖（ステム部分）を形成することが知られているか、または予測される、ヌクレオチドの領域を含む、二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」および「折り畳み」構造もまた、ステムループ構造を指すために本明細書で使用される。このような構造は、当技術分野で周知であり、これらの用語は、当技術分野における既知の意味と一致して使用される。当技術分野で知られるように、ステムループ構造は、正確な塩基対合を必要としない。よって、ステムは、１つ以上の塩基ミスマッチを含み得る。あるいは、塩基対合は、正確であってもよい、すなわち、いかなるミスマッチも含まなくてもよい。
【００７７】
「ハイブリダイズ可能」もしくは「相補的な」もしくは「実質的に相補的な」により、温度および溶液のイオン強度の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、非共有結合する、すなわちワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成し、配列特異的な逆平行の形で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸が相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にする、ヌクレオチドの配列を核酸（例えばＲＮＡ）が含むことが意味される。当技術分野で既知のとおり、標準的なワトソン・クリック塩基対合は、アデニン（Ａ）がチミジン（Ｔ）と対合、アデニン（Ａ）がウラシル（Ｕ）と対合、およびグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対合したもの［ＤＮＡ、ＲＮＡ］を含む。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えばｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションについては、グアニン（Ｇ）がウラシル（Ｕ）と塩基対合することも当技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡのコドンと塩基対合するｔＲＮＡアンチコドンの状況において、遺伝コードの縮退（すなわち、重複）に部分的に責任がある。本開示の文脈では、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二本鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に対して相補的であり、逆もまた同様と考えられる。したがって、Ｇ／Ｕ塩基対がガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置で作られ得る場合、その位置は、非相補的とは考えられず、むしろ相補的であると考えられる。
【００７８】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)、特にその第１１章および表１１．１;ならびにSambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)において実例が挙げられている。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「厳密性（stringency）」が決まる。
【００７９】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、塩基間のミスマッチは可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、核酸の長さおよび相補性の程度という、当技術分野で周知の変数によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きくなるほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。相補性の区間が短い（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、もしくは１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）核酸間でのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置は重要になる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの１１．７〜１１．８）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例証的な最小長さは：少なくとも約１５ヌクレオチド；少なくとも約２０ヌクレオチド；少なくとも約２２ヌクレオチド；少なくとも約２５ヌクレオチド；および少なくとも約３０ヌクレオチドである）。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度が、相補性領域の長さおよび相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて調節され得ることを、認識するであろう。
【００８０】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるように、その標的核酸の配列に１００％相補的になる必要はないことが、当技術分野では理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができ、介在または隣接セグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えばループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチドは、それらが標的化される標的核酸配列内の標的領域に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の２０のヌクレオチドのうち１８が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする、アンチセンス核酸は、９０％の相補性を表す。この実施例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドとクラスター化するか、または相補的ヌクレオチドが組み入れられてよく、互いに、または相補的ヌクレオチドに隣接する必要はない。核酸内の核酸配列の特定の区間の間における相補性の割合は、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（ベーシックローカルアラインメントサーチツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）、またはスミス−ウォーターマンのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を用いる、デフォルト設定を用いた、Ｇａｐプログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州マディソン）を用いることによって、ルーチン的に決定され得る
【００８１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コードされたアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。
【００８２】
（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインに関して）本明細書で使用される「結合」は、高分子間（例えばタンパク質と核酸との間）の非共有結合性相互作用を指す。非共有結合性相互作用の状態にある間、高分子は、「関連する」または「相互作用する」または「結合する」と言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘは非共有の形で分子Ｙに結合することを意味する）。結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触する）必要はないが、結合相互作用のいくつかの部分は、配列特異的となり得る。結合相互作用は、一般的に１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満の、解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増大は、より低いＫｄと関連付けられる。「結合ドメイン」によって、別の分子に非共有結合することができるタンパク質ドメインが意味される。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質ドメイン結合タンパク質の場合、それ自体に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成し）、かつ／または、異なる１つまたは複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。
【００８３】
用語「保存アミノ酸置換」は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンからなり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり；酸性側鎖を有するアミノ酸群は、グルタメートおよびアスパルテートからなり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的な保存アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００８４】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対し、ある割合の「配列同一性」を有し、これは、整列されたときに、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであり、２つの配列を比較した場合に同じ相対位置にあることを意味する。配列同一性は、いくつかの異なる方法で決定され得る。配列同一性を決定するには、配列は、ワールド・ワイド・ウェブの、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ、ｅｂｉ．Ａｃ．Ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ、ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅを含むサイトで利用可能である、さまざまな方法およびコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）を用いて整列され得る［ＫＬ：ウェブサイトアドレスをチェックされたい］。例えば、Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10を参照のこと。当技術分野で標準的な配列アラインメントが、本発明に従って使用されて、別のＣｐｆ１オルソログのアミノ酸残基「に対応する」Ｃｐｆ１オルソログにおけるアミノ酸残基を決定する。他のＣｐｆ１オルソログのアミノ酸残基に対応するＣｐｆ１オルソログのアミノ酸残基は、配列のアラインメントにおいて同じ位置に現れる。
【００８５】
特定のＲＮＡを「コード化する」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコード化することができ、あるいは、ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ；「ノンコーディング」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコード化することができる。「タンパク質コード配列」、すなわち特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコード化する配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで、ｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ−末端）における開始コドンおよび３’末端（Ｃ−末端）における翻訳終止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列は、原核生物もしくは真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物もしくは真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に位置する。
【００８６】
本明細書で使用される「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコードまたは非コード配列の転写を開始することができる、ＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端が転写開始部位によって結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’方向）に延びている。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、常にではないが多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導型プロモーターを含むさまざまなプロモーターを使用して、本発明のさまざまなベクターを駆動することができる。
【００８７】
プロモーターは、構造的に活性なプロモーター（すなわち、構造的に活性／「オン」の状態にあるプロモーター）であってよく、誘導型プロモーターであってよく（すなわち、状態が活性／「オン」または不活性／「オフ」であるプロモーターは、外部刺激、例えば特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在により制御される）、空間的に制限されたプロモーターであってよく（すなわち、転写制御要素、エンハンサーなど）（例えば組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）、また、時間的に制限されたプロモーターであってよい（すなわち、プロモーターが、胚発生の特定の段階中、または生物学的プロセス、例えばマウスの毛包サイクルの特定の段階中に「オン」の状態または「オフ」の状態にある）。
【００８８】
適切なプロモーターは、ウイルスに由来してよく、したがってウイルスプロモーターと呼ぶことができるか、あるいは、原核生物または真核生物を含む、任意の生物に由来してよい。適切なプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動するのに使用され得る。例示的なプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）（Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)）、強化Ｕ６プロモーター（enhanced U6 promoter）（例えば、Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)）、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）など、を含むがこれらに限定されない。
【００８９】
誘導型プロモーターの例は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなどを含むがこれらに限定されない。したがって、誘導型プロモーターは、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲンレセプター；エストロゲンレセプター融合体；など、を含むがこれらに制限されない、分子により調節され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、多細胞生物において、プロモーターは、特定の細胞の一部が活性（すなわち、「オン」）である。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御要素、制御配列などと呼ばれてもよい。任意の好都合な空間的に制限されたプロモーターを使用でき、適切なプロモーターの選択（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンの一部での発現を駆動するプロモーター、生殖系列での発現を駆動するプロモーター、肺での発現を駆動するプロモーター、筋肉での発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞での発現を駆動するプロモーターなど）は、生物によって決まる。例えば、さまざまな空間的に制限されたプロモーターが、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウスなどで知られている。よって、空間的に制限されたプロモーターは、生物に応じて、広範な異なる組織および細胞型において部位特異的修飾ポリペプチドをコード化する核酸の発現を調節するのに使用され得る。いくつかの空間的に制限されたプロモーターは、時間的にも制限されており、プロモーターは、胚発生の特定の段階中、または生物学的プロセス（例えばマウスの毛包周期）の特定の段階中に「オン」の状態または「オフ」の状態にある。
【００９１】
例示目的で、空間的に制限されたプロモーターの例は、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなど、を含むがこれらに限定されない。ニューロン特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Chen et al. (1987) Cell 51:7-19；およびLlewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989;およびKaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652を参照）；エンケファリンプロモーター（例えば、Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ−α（ＣａｍＫＩＭ）プロモーター（例えば、Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250;およびCasanova et al. (2001) Genesis 31:37を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−ｐプロモーター（例えば、Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60を参照）；など、を含むがこれらに限定されない。
【００９２】
脂肪細胞特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えばヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領域（例えば、Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590；およびPavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797を参照）；グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knight et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:1476;およびSato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703を参照）；ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603）；レプチンプロモーター（例えば、Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:1013;およびChen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187を参照）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484;およびChakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408を参照）；アジプシンプロモーター（例えば、Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490を参照）；レジスチンプロモーター（例えば、Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522を参照）；など、を含むがこれらに限定されない。
【００９３】
心筋細胞特異的な空間的に制限されたプロモーターは、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖−２、αミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する制御配列を含むがこれらに限定されない。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617;およびSartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。
【００９４】
平滑筋特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Akyiirek et al. (2000) Mol. Med. 6:983；および米国特許第７，１６９，８７４号を参照）；ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎプロモーター（例えば、ＷＯ２００１／０１８０４８を参照）；α平滑筋アクチンプロモーター；などを含むがこれらに限定されない。例えば、２つのＣＡｒＧ要素が位置する、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、血管平滑筋細胞特異的発現を媒介することが示されている（例えば、Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859；およびMoessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425を参照）。
【００９５】
光受容体特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015）；網膜色素変性遺伝子プロモーター（上記のNicoud et al. (2007)）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（上記のNicoud et al. (2007)）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225）；など、を含むがこれらに限定されない。
【００９６】
本明細書中互換的に使用される用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御要素」、および「調節要素」は、非コード配列（例えばガイドＲＮＡ）またはコード配列（例えば部位特異的修飾ポリペプチド、もしくはＣｐｆ１ポリペプチド）の転写を提供および／または調節し、かつ／またはコード化ポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、ターミネーター、タンパク質分解信号などといった転写および翻訳制御配列を指す。
【００９７】
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用されるような、本明細書で使用される用語「天然に存在する」または「未修飾」は、自然界に見られる核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、自然界にある供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在し、研究室で人間により意図的に修飾されていない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００９８】
核酸またはポリペプチドに適用されるような、本明細書で使用される用語「キメラ（chimeric）」は、異なる供給源に由来する構造体により定められる２つの構成要素を指す。例えば、「キメラ」がキメラポリペプチド（例えば、キメラＣｐｆ１タンパク質）の文脈で使用される場合、キメラポリペプチドは、異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。キメラのポリペプチドは、修飾されるかまたは天然に存在するポリペプチド配列を含み得る（例えば、修飾もしくは未修飾Ｃｐｆ１タンパク質由来の第１のアミノ酸配列；およびＣｐｆ１タンパク質以外の第２のアミノ酸配列）。同様に、キメラポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの文脈における「キメラ」は、異なるコード領域に由来するヌクレオチド配列を含む（例えば、修飾もしくは未修飾Ｃｐｆ１タンパク質をコード化する第１のヌクレオチド配列；およびＣｐｆ１タンパク質以外のポリペプチドをコード化する第２のヌクレオチド配列）。
【００９９】
用語「キメラポリペプチド」は、天然に存在しない、例えば、人間の介入を通じた、アミノ配列の別の状況では分離された２つのセグメントの人為的組み合わせ（すなわち、「融合」）によって作られる、ポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドは、キメラポリペプチドである。いくつかのキメラポリペプチドは、「融合変異体」と呼ばれ得る。
【０１００】
本明細書で使用される「異種」は、天然核酸またはタンパク質それぞれに見られないヌクレオチドまたはペプチドを意味する。例えば、キメラＣｐｆ１タンパク質では、天然に存在する細菌性Ｃｐｆ１ポリペプチド（またはその変異体）のＲＮＡ結合ドメインは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃｐｆ１以外のタンパク質由来のポリペプチド配列または別の生物由来のポリペプチド配列）に融合され得る。異種ポリペプチドは、キメラＣｐｆ１タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示し得る。異種核酸は、キメラポリペプチドをコード化するキメラポリヌクレオチドを生成するために、（例えば遺伝子操作によって）天然に存在する核酸（またはその変異体）に結合され得る。別の実施例として、融合変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドでは、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドが、融合変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドによっても示される活性を示す、異種ポリペプチド（すなわち、Ｃｐｆ１以外のポリペプチド）に融合され得る。異種核酸は、融合変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを生成するために（例えば遺伝子操作によって）変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドに結合され得る。本明細書で使用される「異種」とは、天然の細胞ではない細胞におけるヌクレオチドまたはポリペプチドをさらに意味する。
【０１０１】
用語「同種（cognate）」は、自然界において通常相互作用または共存する２つの生体分子を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される「組み換え（Recombinant）」は、特定の核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはベクターが、自然分類系に見られる内因性の核酸と識別可能な構造的なコードまたは非コード配列を有する構造体を生じる、クローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または連結反応の工程のさまざまな組み合わせの生成物であることを意味する。ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片から、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞または無細胞の転写および翻訳系に含まれる組み換え転写単位から発現されることができる合成核酸を提供することができる。関連配列を含むゲノムＤＮＡは、組み換え型遺伝子または転写単位の形成にも使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’に位置してよく、このような配列は、コーディング領域の操作または発現を妨げず、また、実際、さまざまなメカニズムによって所望の生成物の生成を調節するように作用し得る（以下の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。あるいは、翻訳されていないＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ）をコード化するＤＮＡ配列は、組み換え型と考えることもできる。よって、例えば、用語「組み換え型」核酸は、天然に存在しない、例えば、人間の介入を通じた、配列の別の状況では分離された２つのセグメントの人為的組み合わせによって作られるものを指す。この人為的組み合わせは、化学的合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人為的操作によって、例えば遺伝子操作技術によって、しばしば達成される。これは、通常、コドンを、同じアミノ酸、保存アミノ酸、または非保存アミノ酸をコード化するコドンで置き換えるために行われる。あるいは、これは、所望の機能の組み合わせを生成するように所望の機能の核酸セグメントを共に接合するために行われる。この人為的組み合わせは、化学的合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人為的操作によって、例えば遺伝子操作技術によって、しばしば達成される。組み換え型ポリヌクレオチドがポリペプチドをコード化する場合、コード化されたポリペプチドの配列は、天然に存在するもの（「ワイルドタイプ」）であり得るか、または、天然に存在する配列の変異体（例えば突然変異体）であり得る。よって、用語「組み換え型」ポリペプチドは、必ずしも、配列が天然に存在しないポリペプチドを指すわけではない。代わりに、「組み換え型」ポリペプチドは、組み換え型ＤＮＡ配列によってコード化されるが、このポリペプチドの配列は、天然に存在するもの（「ワイルドタイプ」）であっても、または天然に存在しないもの（例えば、変異体、突然変異体など）であってもよい。よって、「組み換え型」ポリペプチドは、人間の介入の結果であるが、天然に存在するアミノ酸配列であってよい。用語「天然に存在しない」は、化学的に修飾されるかまたは変異した分子を含め、天然に存在する対応物とは著しく異なる分子を含む。
【０１０３】
「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント、すなわち、「インサート」が付着して、付着セグメントの複製を細胞にもたらすことができる。
【０１０４】
「発現カセット」は、プロモーターに動作可能に結合されるＤＮＡコード配列を含む。「動作可能に結合される」とは、そのように説明された構成要素が意図される形で機能することができるような関係にある、並置を指す。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがその転写または発現に影響する場合に、コード配列に動作可能に結合される。用語「組み換え型発現ベクター」または「ＤＮＡ構造体」は、ベクターおよび少なくとも１つのインサートを含むＤＮＡ分子を指すように、本明細書では互換的に使用される。組み換え型発現ベクターは、通常、インサートを発現および／もしくは伝搬する目的で、または他の組み換え型ヌクレオチド配列の構成のために、生成される。核酸は、プロモーター配列に動作可能に結合されてもされなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に動作可能に結合されてもされなくてもよい。
【０１０５】
細胞は、外来性ＤＮＡが細胞の内側に導入されている場合、その外来性ＤＮＡ、例えば組み換え型発現ベクターによって、「遺伝子組み換えされている」か、または「形質転換されている」か、または「遺伝子導入されている」。外来性ＤＮＡの存在によって、永続的または一時的な遺伝子変化が生じる。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに統合され（共有結合され）てもされなくてもよい。
【０１０６】
原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム性要素上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定して形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、染色体複製を通じて娘細胞により遺伝で受け継がれるように染色体に組み込まれているものである。この安定性は、真核生物細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞群を含む細胞株またはクローンを確立する能力によって証明される。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通祖先に由来する細胞群である。「細胞株」は、何代にもわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定成長することができる初代細胞のクローンである。
【０１０７】
遺伝子組み換え（「形質転換」とも呼ばれる）の適切な方法は、例えば、ウイルスもしくはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入法、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023を参照）などを含む。
【０１０８】
遺伝子組み換え方法の選択は、一般的に、形質転換されている細胞の型および形質転換が起こっている環境（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ）に左右される。これらの方法に関する一般的な議論は、Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995に見ることができる。
【０１０９】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの真核生物細胞、原核生物細胞（例えば、細菌もしくは古細菌の細胞）、または単細胞の存在物として培養された多細胞生物（例えば細胞株）由来の細胞を表し、真核生物または原核生物細胞は、核酸のレシピエントとして使用され得るか、または使用されていて、核酸により形質転換されている原細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然な、偶発的な、または意図的な突然変異により、形態、または元の親（original parent）としてのゲノムもしくは全ＤＮＡ補体が、必ずしも完全に同一でなくてもよいことが、理解される。「組み換え型宿主細胞」（「遺伝子組み換えされた宿主細胞」とも呼ばれる）は、異種核酸、例えば発現ベクターが導入されている宿主細胞である。例えば、細菌宿主細胞は、外来性核酸（例えばプラスミドもしくは組み換え型発現ベクター）の適切な細菌宿主細胞への導入による、遺伝子組み換えされた細菌宿主細胞であり、真核生物宿主細胞は、外来性核酸の適切な真核生物宿主細胞への導入による、遺伝子組み換えされた真核生物宿主細胞（例えば、哺乳類の生殖細胞）である。
【０１１０】
本明細書で使用される「標的ＤＮＡ」は、「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮＡポリヌクレオチドである。用語「標的部位」、「標的配列」、「標的プロトスペーサーＤＮＡ」、または「プロトスペーサー様配列」は、結合に十分な条件が存在すれば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を指すように、本明細書では互換的に使用される。例えば、標的ＤＮＡ内の標的部位（もしくは標的配列）５’−ＧＡＧＣＡＴＡＴＣ−３’が、ＲＮＡ配列５’−ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ−３’によって標的化される（または、それによって結合されるか、それとハイブリダイズするか、またはそれに対し相補的である）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞内に通常存在する生理学的条件を含む。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば無細胞系における条件）は、当技術分野で既知である；例えば上記のSambrookを参照。ガイドＲＮＡに相補的でガイドＲＮＡとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ばれ、「相補鎖」に相補的である（したがってガイドＲＮＡに相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖（noncomplementary strand)」または「非相補鎖(non-complementary strand)」と呼ばれる。「部位特異的修飾ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合の部位特異的なポリペプチド」または「ＲＮＡ結合の部位特異的修飾ポリペプチド」または「部位特異的なポリペプチド」により、ＲＮＡを結合し、特定のＤＮＡ配列に対して標的化されたポリペプチドを意味する。本明細書に記載するような、部位特異的修飾ポリペプチドは、それが結合されるＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列に対して標的化される。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に結合するか、これとハイブリダイズするか、またはこれに相補的である配列を含み、それにより、結合ポリペプチドを、標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定の場所に標的化する。「開裂」により、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を意味する。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むがこれらに制限されないさまざまな方法により開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの別個の一本鎖開裂事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成を生じ得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む複合体が、標的とされた二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
【０１１１】
「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ開裂のためのヌクレオチド鎖切断の触媒活性を有する酵素を意味するように、本明細書中で互換的に使用される。
【０１１２】
ヌクレアーゼの「開裂ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイン」により、ＤＮＡ開裂のための触媒活性を有するヌクレアーゼ内部のポリペプチド配列またはドメインを意味する。開裂ドメインは、一本鎖ポリペプチドに含まれてよく、あるいは、開裂活性は、２つ（または３つ以上の）ポリペプチドの会合により生じ得る。単一のヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内部におけるアミノ酸の２つ以上の単離された区間からなり得る。
【０１１３】
「部位特異的なポリペプチド」または「ＲＮＡ結合の部位特異的なポリペプチド」または「ＲＮＡ結合の部位特異的なポリペプチド」によって、ＲＮＡを結合し、特定のＤＮＡ配列に標的化されるポリペプチドを意味する。本明細書に記載される部位特異的なポリペプチドは、それが結合されるＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列に標的化される。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的である配列を含み、それにより、結合ポリペプチドを標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定の場所に標的化する。
【０１１４】
部位特異的修飾ポリペプチドに結合し、そのポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の場所に標的化するＲＮＡ分子は、本明細書中、「ガイドＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡポリヌクレオチド」と呼ばれる（本明細書中、「ガイドＲＮＡ」もしくは「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント、すなわち「ＤＮＡ標的セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含む。「セグメント」によって、分子のセグメント／セクション／領域、例えばＲＮＡ内のヌクレオチドの連続した区間を意味する。例証的な非限定的実施例として、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、長さが４０塩基対であるＲＮＡ分子の塩基対５〜２０を含み得；ＤＮＡ標的セグメントは、長さが４０塩基対であるＲＮＡ分子の塩基対２１〜４０を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈で別段定めのない限り、特定の総塩基対数に限定されず、所与のＲＮＡ分子からの任意の特定の塩基対数に限定されず、複合体内部の別々の分子の特定の数に限定されず、また、任意の全長のものであり、かつ他の分子への相補性を有する領域を含んでも含まなくてもよい、ＲＮＡ分子の領域を含み得る。
【０１１５】
ＤＮＡ標的セグメント（または「ＤＮＡ標的配列」）は、本明細書では「プロトスペーサー様」配列として示される標的ＤＮＡ（標的ＤＮＡの相補鎖）内部の特定の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する。部位特異的修飾ポリペプチドがＣｐｆ１、またはＣｐｆ１関連ポリペプチド（以下でさらに詳細に説明する）である場合、標的ＤＮＡの部位特異的開裂は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる）の両方によって決定された場所で起こる。
【０１１６】
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（double stranded RNA duplex）（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するために互いにハイブリダイズするヌクレオチドの２つの相補的区間を、一部に含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸；部位特異的なポリペプチドをコード化する核酸など）は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾されるかまたは調節された安定性；細胞内標的化；例えば蛍光標識の追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する、修飾体または配列を含む。非限定的な例は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス性を可能にする）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する修飾体または配列；追跡を提供する修飾体または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を促進する部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を提供する修飾体または配列；およびそれらの組み合わせを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、前述した特徴のいずれかを提供する追加のセグメントを、５’または３’末端に含む。例えば、適切な第３のセグメントは、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス性を可能にする）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する配列；追跡を提供する修飾体または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を促進する部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を提供する修飾体または配列；およびそれらの組み合わせを含み得る。
【０１１９】
ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチド（すなわち、部位特異的なポリペプチド）は、複合体を形成する（すなわち、非共有結合性相互作用により結合する）。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことにより、複合体に標的の特異性を提供する。複合体の部位特異的修飾ポリペプチドは、部位特異的活性を提供する。言い換えれば、部位特異的修飾ポリペプチドは、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合により、標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体の核酸内の標的配列；染色体外の核酸、例えば、エピソーム核酸、ミニサークルなどの中の標的配列；ミトコンドリア核酸内の標的配列；葉緑体核酸内の標的配列；プラスミド内の標的配列など）にガイドされる。
【０１２０】
ＲＮＡアプタマーは、当技術分野で既知であり、一般的に、リボスイッチの合成版である。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は、それらが一部をなすＲＮＡ分子の構造の誘導調節（したがって、特定の配列の利用可能性）を提供する合成および天然の核酸配列の両方を包含するように、本明細書中で互換的に使用される。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の薬剤（例えば小分子）に特異的に結合する、特定の構造（例えばヘアピン）に折り畳まれる配列を含む。薬剤の結合により、ＲＮＡの折り畳みに構造変化が生じ、これにより、アプタマーが一部をなす核酸の特徴が変化する。非限定的な例としては：（ｉ）アプタマーを有する活性因子−ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤により結合されない限り、同種のターゲッター−ＲＮＡに結合できない場合があり；（ｉｉ）アプタマーを有するターゲッター−ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤により結合されない限り、同種の活性因子−ＲＮＡに結合できない場合があり；（ｉｉｉ）異なる薬剤に結合する異なるアプタマーをそれぞれが含む、ターゲッター−ＲＮＡおよび活性因子−ＲＮＡは、両方の薬剤が存在しない限り、互いに結合できない場合がある。これらの例により示すように、２分子ガイドＲＮＡは、誘導可能であるように設計され得る。
【０１２１】
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば：Nakamura et al., Genes Cells. 2012 May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron. 2012 Apr 15;34(1):1-11;およびLiberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012 May-Jun;3(3):369-84において見ることができ、これらはすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
用語「幹細胞」は、自己複製し、分化細胞型を生成する能力を有する、細胞（例えば植物の幹細胞、脊椎動物の幹細胞）を指すよう本明細書で使用される（Morrison et al. (1997) Cell 88:287-298を参照）。細胞の個体発生論の文脈では、形容詞「分化した（differentiated）」、または「分化する（differentiating）」は、相対的な用語である。「分化細胞」は、比較される細胞よりも発生経路を下ってきた細胞である。よって、多能性幹細胞（以下で説明する）は、系統が制限された前駆細胞（例えば中胚葉幹細胞）へと分化することができ、これは次に、さらに制限された細胞（例えばニューロン前駆体）へと分化することができ、これは、末期細胞（すなわち、最終分化細胞、例えばニューロン、心筋細胞など）へと分化することができ、これは、ある組織型において特徴的な役割を果たし、かつ、さらに増殖する能力を有していてもいなくてもよい。幹細胞は、特異的マーカー（例えばタンパク質、ＲＮＡなど）の存在および特異的マーカーの不存在の両方を特徴とすることができる。幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ双方での機能アッセイ、特に、幹細胞が複数の分化子孫を生じる能力に関するアッセイによって、識別されることもできる。
【０１２３】
目的の幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、生物のすべての細胞型を生成することができる幹細胞を意味するように本明細書で使用される。したがって、ＰＳＣは、生物のすべての胚葉（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じることができる。多能性細胞は、テラトーマを形成し、かつ生体の外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織に貢献することができる。植物の多能性幹細胞は、植物のすべての細胞型（例えば根、茎、葉などの細胞）を生じることができる。
【０１２４】
動物のＰＳＣは、多くのさまざまな方法で導かれ得る。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、胚の内細胞塊に由来する（Thomson et. al, Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7）が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞に由来する（Takahashi et. al, Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72; Takahashi et. al, Nat Protoc. 2007;2(12):3081-9; Yu et. al, Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov 20）。用語ＰＳＣは、それらの起源にかかわらず多能性幹細胞を指すので、用語ＰＳＣは、ＥＳＣおよびｉＰＳＣという用語、ならびにＰＳＣの別の例である胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）という用語を包含する。ＰＳＣは、樹立細胞株の形態であり得るか、一次胚組織から直接得ることができるか、あるいは、体細胞から導くことができる。ＰＳＣは、本明細書に記載する方法の標的細胞となり得る。
【０１２５】
「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）により、胚から、典型的には胚盤胞の内細胞塊から、単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ株は、ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されており、例えばｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，  Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ病院−ソウル大学校）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（サンフランシスコにあるカリフォルニア大学）；Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  （ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））がある。目的の幹細胞は、アカゲザルの幹細胞およびマーモセットの幹細胞など、他の霊長類の動物由来の胚性幹細胞も含む。幹細胞は、任意の哺乳類種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類の動物などから得ることができる（Thomson et al. (1998) Science 282:1145; Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844; Thomson et al. (1996) Biol. Reprod. 55:254; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）。培養下では、ＥＳＣは、典型的には、大きな核−細胞質比、明確な境界、および顕著な核小体を有する平坦なコロニーとして成長する。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ−１を発現しない。ＥＳＣを生成し特徴づける方法の例は、例えば米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、および米国特許第６，２００，８０６号に見ることができ、これらの開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。未分化形態のｈＥＳＣを増殖させる方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、ＷＯ０３／０２０９２０に記載されている。「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」によって、生殖細胞および／または生殖細胞前駆体、例えば始原生殖細胞、すなわち、精子および卵になるであろう細胞に由来するＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、前述したように胚性幹細胞に類似の特性を有すると考えられる。ＥＧ細胞を生成し特徴づける方法の例は、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号；Matsui, Y., et al., (1992) Cell 70:841; Shamblott, M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113; Shamblott, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726；およびKoshimizu, U., et al. (1996) Development, 122:1235に見ることができ、これらの開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」によって、ＰＳＣでない細胞（すなわち、ＰＳＣに対して分化した細胞）に由来するＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、最終分化細胞を含む複数の異なる細胞型に由来し得る。ｉＰＳＣは、大きな核−細胞質比、明確な境界、および顕著な核を有する平坦なコロニーとして成長する、ＥＳ細胞様形態を有する。さらに、ｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴ、ｚｆｐ４２を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の１つ以上の重要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳＣを生成し特徴づける方法の例は、例えば、米国特許出願公開のＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９０１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、ＵＳ２００９０３０４６４６に見ることができ、これらの開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。一般的に、ｉＰＳＣを生成するには、体細胞は、多能性幹細胞となるよう体細胞を再プログラミングするために当技術分野で既知の再プログラム化因子（例えばＯｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）を与えられる。
【０１２７】
「体細胞」によって、実験的操作の不存在下で通常は生物中のすべての細胞型を生じさせない、生物中の任意の細胞を意味する。言い換えれば、体細胞は、十分に分化しているので、体の３つすべての胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞を自然に生成しない、細胞である。例えば、体細胞は、ニューロンおよび神経前駆体の両方を含み、神経前駆体は、中枢神経系のすべてまたは一部の細胞型を自然に生じることができ得るが、中胚葉または内胚葉系統の細胞を生じることができない。
【０１２８】
「有糸分裂細胞」によって、有糸分裂を受ける細胞を意味する。有糸分裂は、真核生物細胞がその核内の染色体を２つの別々の核における２つの同一の組に分離する、プロセスである。一般的には、このすぐ後に細胞質分裂が続き、これにより、核、細胞質、細胞小器官、および細胞膜が、これらの細胞成分のほぼ等しい持ち分（shares）を含む２つの細胞へと分割される。
【０１２９】
「有糸分裂後細胞」により、有糸分裂から出てきた細胞を意味し、すなわち、これは「静止して」おり、すなわち、もはや分割を受けない。この静止状態は一時的、すなわち、可逆的であってよく、あるいは、永続的であってよい。
【０１３０】
「減数分裂細胞」によって、減数分裂を受けている細胞を意味する。減数分裂は、細胞が配偶子または胞子を生成する目的でその核物質を分割する、プロセスである。有糸分裂とは異なり、減数分裂では、染色体は、染色体間で遺伝物質を入れ替える、組み換え工程を受ける。さらに、減数分裂の結果は、有糸分裂から生成される２つの（遺伝的に同一の）二倍体細胞と比べて、４つの（遺伝的に独特の）一倍体細胞である。
【０１３１】
「組み換え」によって、遺伝情報を２つのポリヌクレオチド間で交換するプロセスを意味する。本明細書で使用される「相同組換え修復（ＨＤＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、特殊形態のＤＮＡ修復を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同関係を必要とし、「ドナー」分子を、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）のテンプレート修復に使用し、かつ、ドナーから標的への遺伝情報の移動を引き起こす。相同組換え修復は、ドナーポリヌクレオチドが標的分子とは異なり、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ＤＮＡに組み込まれている場合には、標的分子の配列の変質を生じ得る（例えば、挿入、欠失、突然変異）。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的ＤＮＡに組み込まれる。
【０１３２】
「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）」により、（修復をガイドするために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同テンプレートを必要としない、互いに対する切断末端の直接連結反応による、ＤＮＡの二本鎖切断の修復を意味する。ＮＨＥＪは、二本鎖切断部位の近くに、ヌクレオチド配列の喪失（欠失）をしばしば生じる。
【０１３３】
用語「治療」、「治療する」などは、一般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。この効果は、疾患またはその症候を完全にまたは部分的に防ぐ点で予防的であり得、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因する悪影響の部分的または完全な治癒の点で、治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における疾患または症候の任意の治療を包含し、（ａ）疾患または症候を取得する傾向があり得るが、まだその疾患または症候があると診断されてはいない被験体で疾患または症候が起こるのを防ぐこと；（ｂ）疾患または症候を予防すること、すなわち、その発症を阻止すること；あるいは（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の寛解を引き起こすこと、を含む。治療薬は、疾患または障害の発症前、発症中、または発症後に投与され得る。進行中の疾患の治療は、その治療が患者の望ましくない臨床症候を安定化させるかまたは軽減する場合に、特に興味深い。このような治療は、罹患組織における機能が完全に失われる前に行われるのが望ましい。治療法は、疾患の症候的段階中に、場合によっては疾患の症候的段階後に、施されるのが望ましい。
【０１３４】
用語「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書中で互換的に使用され、診断、治療、または治療法が望まれる任意の哺乳動物被験体、特に人間を指す。
【０１３５】
分子および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harboor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997）；およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)などの標準的なテキストで見ることができ、これらの開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる．
【０１３６】
値の範囲が与えられる場合、途中の各値は、その範囲の上限および下限と、その規定範囲内の任意の他の規定値もしくは途中の値との間で、文脈上明白に他の事柄を指す場合を除き下限の１の位の１０分の１まで、本発明に包含されることが理解される。その規定範囲内の任意の特に排除される限界を仮定して、これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲内に独立して含まれ得、また、本発明にも包含される。規定範囲がそれらの限界のうちの一方または両方を含む場合、それら含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。
【０１３７】
語句「から本質的になる（consisting essentially of）」は、システムの特定の１つもしくは複数の活性成分でないか、または、分子の特定の１つもしくは複数の活性部分でない、任意のものを排除することを本明細書では意味する。
【０１３８】
ある範囲は、本明細書では、用語「約」を前に置く数値により表される。用語「約」は、これが前に置かれた正確な数、ならびに、この用語が前に置かれた数に近いか、またはほぼその数である数を文字上で支持するために本明細書で使用される。ある数が、特に列挙された数に近いか、ほぼその数であるかどうかを判断する際、近いか、または近似する、列挙されていない数は、それが提示される文脈において、特に列挙された数の実質的な等価物を与える数であり得る。
【０１３９】
明確にするために、別の実施形態の文脈で記載される、本発明のある特徴は、単一の実施形態と組み合わせて提供され得ることが、認識される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈で記載される、本発明のさまざまな特徴は、別々に、または任意の適切な部分的組合せで提供されてもよい。本発明に属する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって特に包含されており、組み合わせがいずれも個々にかつ明白に開示されたかのように、本明細書で開示される。さらに、さまざまな実施形態およびその要素のすべての部分的組合せも、本発明によって特に包含されており、そのような部分的組合せがいずれも個々にかつ明白に開示されたかのように、本明細書で開示される。
【０１４０】
ゲノム編集
ゲノム編集は、一般的に、好ましくは正確なまたは所定の方法で、ゲノムのヌクレオチド配列を修飾するプロセスを指す。本明細書に記載するゲノム編集の方法の例は、ゲノム内の正確な標的場所でＤＮＡを切断するために部位特異的なヌクレアーゼを用い、それによって、ゲノム内の特定の場所に二本鎖または一本鎖ＤＮＡ切断部を作る方法を含む。このような切断部は、Cox et al., Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015)において最近検討されたように、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの天然の内因性細胞プロセスによって修復され得、通常修復されている。ＮＨＥＪは、遺伝子発現を妨害または強化し得るヌクレオチド配列の喪失または追加によることもある、二本鎖切断により生じたＤＮＡ末端を直接結合する。ＨＤＲは、定められたＤＮＡ配列を切断点で挿入するためのテンプレートとして、相同配列またはドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体など、内因性ゲノム内にあってよい。あるいは、ドナーは、ヌクレアーゼで開裂した遺伝子座との相同関係が高い領域を有するが、開裂した標的遺伝子座に組み込まれ得る欠失を含む追加の配列または配列変化も含み得る、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外来性核酸であってよい。第３の修復メカニズムは、「代替ＮＨＥＪ」とも呼ばれるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり、小さい欠失および挿入が開裂部位で起こり得る点で、遺伝的結果がＮＨＥＪと類似している。ＭＭＥＪは、より望ましいＤＮＡ末端結合修復結果につながるようにＤＮＡ切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を利用し、最近の報告では、このプロセスの分子メカニズムがさらに解明されてきている；例えば、Cho and Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kent et al., Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015); Mateos-Gomez et al., Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldi et al., Nature 528, 258-62 (2015)を参照。場合によっては、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、起こり得る修復結果を予測することも可能となり得る。
【０１４１】
これらのゲノム編集メカニズムはそれぞれ、所望のゲノム変化を作り出すために使用され得る。ゲノム編集プロセスにおける第１の工程は、目的とする突然変異の部位にできるだけ近い標的遺伝子座に典型的には１つまたは２つのＤＮＡ切断部を作ることである。これは、本明細書で説明および例示するように部位特異的なポリペプチドを使用することにより達成され得る。
【０１４２】
部位特異的なポリペプチドは、二本鎖切断または一本鎖切断を核酸（例えばゲノムＤＮＡ）に導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性のＤＮＡ修復経路（例えば、相同依存性修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同のテンプレートを必要とせずに、開裂した標的核酸を修復することができる。これは、標的核酸の開裂の部位に小さい欠失または挿入（インデル）を生じる場合があり、また、遺伝子発現の中断または変化につながる場合がある。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、またはドナーが利用可能な場合に、起こり得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸開裂部位に隣接する配列に相同である配列を含む。姉妹染色分体は、一般的に、修復テンプレートとして細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的で、修復テンプレートは、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外来性核酸としてしばしば供給される。外来性ドナーテンプレートでは、追加の核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（単一塩基の変化もしくは欠失など）を、相同の隣接領域間に導入することが一般的であるので、追加または変化した核酸配列も、標的遺伝子座に組み込まれるようになる。ＭＭＥＪは、小さい欠失および挿入が開裂部位で起こり得る点でＮＨＥＪに類似した遺伝的結果を生じる。ＭＭＥＪは、望ましい末端結合ＤＮＡ修復結果につながるように開裂部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を利用する。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能となり得る。
【０１４３】
よって、場合によっては、相同組み換えを用いて、外来性ポリヌクレオチド配列を標的核酸開裂部位に挿入する。外来性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチドと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的核酸開裂部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外来性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸開裂部位に天然に存在しない配列である。
【０１４４】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、変化、組み込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子標識、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子中断、転座および／または遺伝子突然変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡの欠失を引き起こすプロセスおよび非天然核酸をゲノムＤＮＡに統合するプロセスは、ゲノム編集の例である。
【０１４５】
Ａ．ガイドＲＮＡ
Ｃｐｆ１のさらに詳細な説明については、以下のセクションＢおよび本明細書の他の部分を参照のこと。
【０１４６】
本開示は、関連するポリペプチド（例えば部位特異的修飾ポリペプチド）の活性を標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に導く、ガイドＲＮＡを提供する。ガイドＲＮＡは：第１のセグメント（本明細書では、「ＤＮＡ標的セグメント」もしくは「ＤＮＡ標的配列」とも呼ばれる）と、第２のセグメント（本明細書では、「タンパク質結合セグメント」もしくは「タンパク質結合配列」とも呼ばれる）と、を含む。いずれのセグメントも概して以下で説明する。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとしても知られており、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに由来する。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡより長くてよいが、長くなくてもよい。
【０１４７】
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、標的ＤＮＡ内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。言い換えれば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的セグメントのヌクレオチド配列は、さまざまであってよく、ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとが相互作用するであろう、標的ＤＮＡ内部の場所を決定する。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、標的ＤＮＡ内部の任意の所望の配列にハイブリダイズするために（例えば遺伝子操作によって）修飾され得る。
【０１４８】
ＤＮＡ標的セグメントは、約２０ヌクレオチド〜約２２ヌクレオチドの長さを有し得る。場合によっては、標的ＤＮＡの標的配列に相補的である、ＤＮＡ標的セグメントのＤＮＡ標的配列は、長さが２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、または２２ヌクレオチドである。
【０１４９】
ＤＮＡ標的セグメントのＤＮＡ標的配列と標的ＤＮＡの標的配列との相補性の割合は、２０〜２２ヌクレオチドにわたって、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であってよい。
【０１５０】
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する。ガイドＲＮＡは、前述したＤＮＡ標的セグメントを介して、結合ポリペプチドを標的ＤＮＡ内部の特異的ヌクレオチド配列へガイドする。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つの区間を含む。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）、すなわち、ステムループ構造を形成するためにハイブリダイズする。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、長さが約２０（例えば１９）ヌクレオチドであり、約４ヌクレオチドの短配列と、約１２ヌクレオチドのリピートステムループと、から構成されている。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂アッセイは、Ｃｐｆ１が完全長リピート‐スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理し、１９ｎｔのリピート断片、および５０ｎｔのリピート‐スペーサーｃｒＲＮＡ中間物を生じることを示す（図２）。完全長リピート配列を有するＲＮＡのみが処理され、これは、ＲＮＡ開裂活性がリピート依存性であることを示している（図７）。観察された開裂部位は、ＲＮＡ−ｓｅｑによって得られたデータと十分一致している（図５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたｃｒＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで非特異的メカニズムにより５’および３’末端でさらなる処理を受ける中間形態を表す。Ｃｐｆ１は、ステムループの４ヌクレオチド上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する（図１）。開裂部位は、それぞれのリピートのヘアピンを認識する、多くのＣａｓ６酵素およびＣａｓ５ｄを連想させる。しかしながら、Ｃｐｆ１は、ステムループの基部において直接開裂せず、構造がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理する唯一の要件ではないことを示唆している。誘発性の大腸菌異種系を用いるノーザンブロット分析は、Ｃｐｆ１発現時のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの処理（図８）の結果、予測されるＲＮＡ断片を生じることも示す。Ｃｐｆ１処理の成功におけるリピートおよびそのヘアピン構造の重要性を調べるため、我々は、ステムループ構造を維持する変更リピート配列、または非構造化リピートをもたらす突然変異体を有するＲＮＡを設計した。無傷のリピートを含むワイルドタイプＲＮＡ基質とは対照的に、突然変異したＲＮＡのいずれも、Ｃｐｆ１により開裂されなかった（図９）。我々は、開裂部位とステムループとの間（リピート認識配列（ＲＲＳ）と呼ばれる領域）の単一ヌクレオチド突然変異体、または異なるサイズのループおよびステム領域を有するリピート変異体を更に設計した（図９）。ＲＲＳの単一ヌクレオチド突然変異体は、Ｃｐｆ１によって開裂されなかったか、またはわずかに開裂されただけであった、リピート変異体を生じ（図９）、ステムと開裂部位との間のこれらの残基が、基質を処理する上で役割を有することを示している。これは、ＲＲＳが折り返されてステムループと接触する、Ｃｐｆ１と複合したｃｒＲＮＡの別個の二次構造によって説明することができる。リピート構造のループ領域における変化は、より短いループで開裂活性の減少を引き起こしたが、ループ長さの増加は、開裂に影響しなかった（図９）。ｃｒＲＮＡのステムループに対するＣｐｆ１の広範な接触は、ステム構造の変化が開裂不可能な基質を生じる理由を説明することができる。これらの結果は、Ｃｐｆ１による認識のために長さおよび配列が特異的なステムループ構造の要件を強調している。よって、リピート開裂反応は、非常に配列依存性および構造依存性である。
【０１５２】
したがって、いくつかの実施形態では、天然に存在しないガイドＲＮＡが、Ｃｐｆ１を二本鎖ＤＮＡ上の標的部位に標的化するように構成され、ｇＲＮＡは、少なくとも６９ｎｔの長さであるが、１００ｎｔ以下である。ガイドＲＮＡは、Ｃｐｆ１を二本鎖ＤＮＡ上の標的部位に標的化するように構成され得、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１によってリピートのステムループの上流の４ｎｔにおいて開裂され、かつ／またはリピート断片（例えば約１９ｎｔ）および４２〜４４ｎｔの長さである成熟形態のｃｒＲＮＡを生成することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、４２〜４４ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１を二本鎖ＤＮＡ上の標的部位に標的化するように構成され、リピート‐スペーサー−リピートから本質的になる。
【０１５３】
本発明のｇＲＮＡをコード化する核酸、およびそのような核酸を含むベクターも、本明細書で提供される。
【０１５４】
Ｂ．Ｃｐｆ１
新たなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアレイから発現された小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）の検出により、これまで識別されているすべてのｃａｓ遺伝子とは別個である、Ｃｐｆ１と呼ばれるｃａｓ遺伝子（以前の命名はＦｎｏ）と関連する新しいシステムの発見がもたらされた。図５Ａを参照。タイプＶ−ＡのＣＲＩＳＰＲアレイは、３６ｎｔのリピート配列により分離される一連の９つのスペーサー配列を含む。成熟ＲＮＡは、タイプＩおよびＩＩＩシステムのリピート‐スペーサー組成と類似しているが、タイプＩＩシステムのスペーサー−リピート組成とは別個である、５’におけるリピート配列と３’におけるスペーサー配列とから構成されている。タイプＩシステムと同様に、リピートは、リピートの３’末端に位置するヘアピン構造を形成する。抗ＣＲＩＳＰＲリピートの存在もｔｒａｃｒＲＮＡホモログの発現も、フランシセラ‐ノビシダのタイプＶ−Ａ遺伝子座の近くで検出することができず、これは、Ｃｐｆ１が既に説明されたメカニズムと比べ、別モードのｃｒＲＮＡ生合成を用いることを示している。
【０１５５】
Ｃｐｆ１が、タイプＶ−Ａシステムにおけるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセシングで単一のエフェクター酵素として作用するかどうかが調べられた。組み換え型のフランシセラ‐ノビシダＣｐｆ１タンパク質が、過剰発現し、精製され、生化学的に特徴づけられた。ガイドＲＮＡを結合する、天然に存在する部位特異的修飾ポリペプチドは、これによって、標的ＤＮＡ内の特定の配列に向けられ、標的ＤＮＡを開裂して、二本鎖切断を生じる。フランシセラＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に提示されている。このヌクレオチド配列によってコード化された、対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８として提供される。部位特異的修飾ポリペプチドは、３つの部分、すなわちＲＮＡ結合部分、ＲＮａｓｅ活性部分、およびＤＮａｓｅ活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ結合部分；（ｉｉ）部位特異的な酵素活性（例えばＲＮＡ開裂に対する活性）を示す活性部分であって、酵素活性の部位は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピートにより形成されたパリンドロームヘアピン構造によって決定され、４ｎｔ上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂し、ヘアピンの基部は、（例えばリピート‐スペーサー（５’−３’）で構成される）ｃｒＲＮＡの中間形態を生じる、活性部分；（ｉｉｉ）部位特異的な酵素活性（例えばＤＮＡ開裂に対する活性）を示す活性部分であって、酵素活性の部位は、ガイドＲＮＡによって決定される、活性部分、を含む。
【０１５６】
Ｃｐｆ１は、理論上の分子量が１５３ｋＤａのモノマーである。組み換え型フランシセラ‐ノビシダＣｐｆ１タンパク質が、過剰発現し、精製された。タンパク質のオリゴマー状態を決定するためにサイズ排除クロマトグラフィーが行われた。データの分析により、１８７ｋＤａの見かけの分子量が明らかとなり、これは、Ｃｐｆ１がモノマーであることを示す。モノマーの性質は、標的ＤＮＡに結合して開裂するためにガイドｃｒＲＮＡと複合体を形成するＣｐｆ１と一致しており、これは、活性タンパク質が他者によって報告されているとおりダイマーである場合、縦列のＤＮＡ標的部位、あるいは、ＤＮＡの上下の鎖を標的化する２つの異なるｃｒＲＮＡ、がおそらく必要とされるためである。
【０１５７】
Ｃｐｆ１は、リピートのレベルでｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する。すべてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと同じように、ｃｒＲＮＡの成熟は、いくつかのシステムでは追加の処理／トリミング事象を受けるｃｒＲＮＡの中間形態の形成をもたらす、リピートのレベルで起こる第１の開裂によって生じる。Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１と単一のＲＮＡとの複合体であるｃｒＲＮＡが第２のＲＮＡ（タイプＩＩのＣａｓ９システムに必要とされるｔｒａｃｒＲＮＡなど）の存在なしにＤＮＡを開裂し得る点で、タイプＩＩシステムとは根本的に異なる。Ｃｐｆ１は、過剰発現し、精製され、ｃｒＲＮＡのさまざまな前駆体形態と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂アッセイに使用された。完全長リピート配列を有するＲＮＡのみが処理され、これは、Ｃｐｆ１のＲＮＡ開裂活性がリピート依存性であることを示す。誘発性の大腸菌異種系を用いるノーザンブロット分析も、Ｃｐｆ１発現時のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの処理を示した。
【０１５８】
Ｃｐｆ１は、ステムループの４ヌクレオチド上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する。これは、それぞれのリピートのヘアピンを認識する、多くのＣａｓ６酵素およびＣａｓ５ｄを連想させる。しかしながら、Ｃｐｆ１は、ステムループの基部において直接開裂せず、構造がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理する唯一の要件ではないことを示唆している。ステムループ構造を維持する変更リピート配列、または非構造化リピートをもたらす突然変異体を有するＲＮＡが、設計された。無傷のリピートを含むワイルドタイプＲＮＡ基質とは対照的に、突然変異したＲＮＡのいずれも、Ｃｐｆ１により開裂されず、このことは、リピート開裂反応が配列依存性および構造依存性であることを示す。
【０１５９】
Ｃｐｆ１は、金属イオン依存性エンドリボヌクレアーゼである。さまざまな二価金属イオンが、ＲＮＡ開裂アッセイで試験された。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセシングにおけるＣｐｆ１の活性は、Ｍｇ２＋が反応に加えられたときに、最も良かった。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋の補充も、開裂を媒介したが、Ｍｇ２＋で観察される特異性のレベルには届かなかった。これは、Ｃａｓ６酵素（タイプＩおよびＩＩＩ）またはＣａｓ５ｄ（タイプＩ−Ｃ）のイオン非依存性反応とは対照的である。これは、Ｃｐｆ１が配列および構造特異的な形でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する金属依存性エンドリボヌクレアーゼである、新規のｃｒＲＮＡ生合成メカニズムを強調する。したがって、Ｃｐｆ１は、タンパク質が曝露されるカルシウムおよび／またはマグネシウムの相対レベルを変えることによって、「イオン的に調節され（ionically modulated）」得る。
【０１６０】
Ｃｐｆ１は、部位特異的にｄｓＤＮＡをを開裂するためにｃｒＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼとしても作用する。標的に相補的なｃｒＲＮＡのみが、Ｃｐｆ１のＤＮＡ開裂を媒介した。この活性に対するＲＮＡの要件をさらに分析するため、さまざまな構造を含むいくつかのＲＮＡが構築された。無傷のステムループを有するＲＮＡのみが、Ｃｐｆ１のＤＮＡ開裂活性を媒介することができた。
【０１６１】
ＤＮＡ開裂は、金属イオン依存性でもある。注目すべきことには、本明細書における研究は、Ｃａｓ９における活性を媒介することが示されたＭｇ２＋およびＭｎ２＋に加えて、Ｃｐｆ１は、Ｃａ２＋の存在下でもＤＮＡを開裂し得ることを示す。Ｍｇ２＋またはＣａ２＋での開裂における潜在的な差を調べるため、ＤＮＡ開裂反応が、これらのイオンのうちのいずれかの存在下で行われた。髄膜炎菌由来のＣａｓ９のＨＮＨモチーフがＣａ２＋依存性であることを示す最近の発表とは対照的に、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋の存在下での、Ｃｐｆ１の標的または非標的鎖開裂の効率における著しい差は観察されなかった。これは、両方のＤＮＡ鎖を開裂する原因となり、かつＭｇ２＋ならびにＣａ２＋イオンを配位結合させ得る、Ｃｐｆ１におけるただ１つの触媒モチーフの存在を示している。
【０１６２】
Ｃｐｆ１は、５ｎｔの５’オーバーハングを生じる互い違いの切断によってＤＮＡを開裂する。放射標識された標的または非標的鎖を有するオリゴヌクレオチド二重鎖を用いた開裂反応により、異なるサイズの生成物が生成され、これは、５ｎｔの５’オーバーハングを生じるＣｐｆ１による互い違いの切断を示した、プラスミド開裂生成物のシークエンシングによって確認された。
【０１６３】
Ｃ．プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
フランシセラ‐ノビシダＵ１１２のタイプＶ−ＡのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの２つの予測プロトスペーサー配列を整列させることで、プロトスペーサーの上流の非標的鎖に位置する保存５’−ＴＴＡ−３’配列が明らかとなった。潜在的なＰＡＭを検証するため、プロトスペーサー５が、５’−ＣＴＧ−３’配列をもたらすその隣接領域なしで、クローン化された。両方のプラスミドが、Ｃｐｆ１によって等しく十分に開裂され、これは、この配列における第２の位置が重要であることを示している（図３ｄ、図１４ｄ）。３つすべてのヌクレオチドの突然変異生成に続いてＤＮＡ開裂分析が行われたことで、Ｃｐｆ１は、非標的鎖上のｃｒＲＮＡ−相補的ＤＮＡ配列の上流に５’−ＹＴＮ−３’として定められるＰＡＭを認識することが示される。この結果は、Zetsche et al. (Cell, 2015, 163:759-771)によって報告されている既に報告済の５’−ＴＴＮ−３’ＰＡＭをさらに詳しく説明する。ＰＡＭ認識の鎖特異性を分析するため、両方の鎖にＡＡＮまたはＴＴＮのいずれかを有するオリゴヌクレオチド基質が設計された。これらの基質は、Ｃｐｆ１によって開裂されず、これは、ＰＡＭが二本鎖である必要があり、また、両方の鎖上でおそらく認識されることを示している（図３Ｄ、下方パネル）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡに対する、天然に存在しないガイドＲＮＡを提供し、このｇＲＮＡは、リピート（ステムループ構造を含む）とスペーサーとを含み、スペーサーは、標的ＤＮＡの非標的鎖上の５’−ＹＴＮ−３’を補完するように上流に直接隣接した配列に相補的な（または、非標的鎖上の５’−ＹＴＮ−３’のすぐ下流の配列と同一の）配列を含む。
【０１６４】
Ｃｐｆ１は、ＰＡＭの近位に８ヌクレオチドのシード配列を有する。タイプＩおよびＩＩシステムの干渉中、プロトスペーサーの最初の８〜１０ｎｔは、安定したＲループの形成を可能にするのに極めて重要である。この配列は、シード配列と呼ばれる。タイプＩＩの開裂は、プロトスペーサー内部のＰＡＭの３ｂｐ上流で起こる。対照的に、Ｃｐｆ１のＰＡＭおよび開裂部位は、プロトスペーサーのそれぞれ反対の側に位置する。シード配列の長さを分析するために、標的配列に沿ってスペーサーとプロトスペーサーとの間に単一のミスマッチを有するプラスミドが構築された。Ｃｐｆ１は、ＰＡＭの近位側における最初の８ヌクレオチド内のミスマッチに敏感であるが、４つの連続したミスマッチは許容されない。さらに、Ｃｐｆ１は、比較的程度は低いが、開裂部位（ＰＡＭ遠位側の位置１〜４）周辺でのミスマッチに感受性を示す。これらの結果は、ＰＡＭの近位のわずか３〜５ヌクレオチドのシード配列を示す既に公開されたデータに対して相違していて、標的配列の塩基含量のように、特異性に影響を及ぼす他の因子が存在し得ることを示している。これらの結果は、Ｃｐｆ１がＣａｓ９と同じように、まずＰＡＭを認識し、次にＤＮＡ標的に対するｃｒＲＮＡ相補性を試験することを示している。標的部位周辺のミスマッチは、触媒残基の正しい位置づけを妨げ、したがって開裂活性を減少させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、天然に存在しないガイドＲＮＡを提供し、このガイドＲＮＡは、１つ以上の突然変異体をスペーサーにおけるＰＡＭ近位の８ｎｔ以内に、３以下の連続突然変異体を、および／またはＰＡＭ遠位部位の１〜４ｎｔに有する。
【０１６５】
理論によって拘束されることを望むものではないが、ＤＮＡ標的化の作用のメカニズムは、以下の活動のうちの１つ以上を含み得ると考えられる。ｃｒＲＮＡガイドＣｐｆ１は、標的ＤＮＡをスクリーニングしてＰＡＭを特定する。ｃｒＲＮＡのスペーサー配列と標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー配列との間で塩基対合が起こると、Ｒループが、ｃｒＲＮＡ鎖対合と並行して形成され得る。Ｃｐｆ１は、５’オーバーハング二本鎖（ｄｓ）切断を、標的ＤＮＡに、標的鎖上ではＰＡＭから２０〜２２ヌクレオチド、非標的鎖上ではＰＡＭから１５〜１７ｎｔの、定められた距離で導入する。Ｃｐｆ１は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに結合するとその配座を動的に修飾し、標的ＤＮＡの結合時および開裂反応中にｃｒＲＮＡに関連付けられることが予測されている。Ｃｐｆ１の核酸分解活性は、ｃｒＲＮＡリピートにより形成されたヘアピン構造への、および標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接（ＰＡＭ）モチーフへの、ヌクレアーゼの配列特異的かつ構造依存性の結合を必要とする。
【０１６６】
Ｃｐｆ１は、ＲＮＡおよびＤＮＡ開裂の二重活性を含み、各ヌクレアーゼ反応に別個の活性ドメインを用いる。活性モチーフを決定するため、Ｃｐｆ１アミノ酸配列に沿った保存残基の突然変異生成が行われた。残基Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３のアラニン置換は、ＤＮＡ開裂活性に対して影響を及ぼさなかったが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ開裂活性の減少を示した。スプリットＲｕｖＣモチーフにおけるＤ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５の突然変異生成は、ＤＮＡ開裂活性の喪失を生じたが、Ｃｐｆ１のＲＮＡプロセシング活性には影響を及ぼさず、また、ＤＮＡ標的への結合親和性にも影響しなかった。図４Ｄおよび図１３Ｂを参照。活性モチーフを決定するため、Ｃｐｆ１アミノ酸配列に沿った保存残基の突然変異生成が行われた。図４Ｄは、２つの触媒活性のうちの１つに影響を与える、突然変異した残基について要約している。残基Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３のアラニン置換は、ＤＮＡ開裂活性に対して影響を及ぼさなかった（図４Ａ、上方パネル）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ開裂活性の減少を示した（図４Ａ、中央パネル）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡプロセシングにそれらが関与することをさらに確認するため、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（リピート‐スペーサー−リピート）およびＣｐｆ１またはその変異体を共発現する異種大腸菌アッセイをセットアップした。ノーザンブロット分析が、誘導発現後に抽出された全ＲＮＡで行われた（図４Ａ、下方パネル）。Ｃｐｆ１の存在下では、ｃｒＲＮＡは、分解から保護され、したがって、より豊富であったように思われる。Ｃｐｆ１＿ｗｔの発現により、約６５ｎｔの別個のバンドが生成され、これは、リピート内部での２つの開裂事象により形成された、成熟ｃｒＲＮＡに対応している。Ｃｐｆ１＿Ｈ８４３Ａの存在下では、このバンドは存在しなかった；しかしながら、２つの追加の、より長い転写物が、この突然変異体による変化した処理により現れ、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏで既に見られている（図４Ａ、中央パネル）。突然変異体Ｋ８５２ＡおよびＫ８６９Ａも、ワイルドタイプと比べて強度は低いものの、より長いサイズの２つの生成物に加えて、６５ｎｔの断片の生成を示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、これらの突然変異体は、ほとんどＲＮＡプロセシングを示さなかった。Ｃｐｆ１（Ｋ８５２Ａ）およびＣｐｆ１（Ｋ８６９Ａ）でのＲＮＡ結合実験（図１２Ｃ）は、ワイルドタイプのＣｐｆ１よりわずかに高いＲＮＡに対する親和性を示しており、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された開裂生成物を説明することができる。これらのＣｐｆ１突然変異体の残留活性は、処理されたＲＮＡを生じ、これは、タンパク質に対してよりきつく結合される可能性があり、したがって、分解からより良く保護される。Ｃｐｆ１（Ｆ８７３Ａ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ開裂活性を減少させ、これはｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができなかった。前述した残基の突然変異体は、ＲＮＡ結合に悪影響を与えておらず（図１２Ｃ）、これは、Ｃｐｆ１の特定された残基が、潜在的にＲＮＡ開裂の原因であることを示している。ラクノスピラ科の（Lachnospiraceae）細菌性Ｃｐｆ１の共結晶構造の分析により、特定された残基が処理された��ｒＲＮＡの５’に近接して位置することが明らかとなった（Dong et al. (2016) Nature, 532(7600):522-6）。スプリットＲｕｖＣモチーフにおけるＤ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５の突然変異生成は、ＤＮＡ開裂活性の損失を生じた（図４Ｄ、上方パネル）（Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759-771も参照）が、Ｃｐｆ１のＲＮＡプロセシング活性には影響を及ぼさなかったし（図４Ｂ、下方パネル）、ＤＮＡ標的への結合親和性にも影響を与えなかった（図１２Ｂ）。
【０１６７】
Ｃｐｆ１突然変異体は、ＤＮＡ開裂における金属イオン依存性の差を示す。活性部位の残基に対するスクリーニングの間、反応に存在する金属イオンに応じて、いくつかの突然変異体でＤＮＡ開裂の著しい差が観察された。突然変異体Ｅ９２０Ａ、Ｙ１０２４Ａ、Ｄ１２２７Ａは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡ開裂を示さなかったが、Ｍｇ２＋が存在した場合にはワイルドタイプ活性を示した。残基Ｅ１０２８の突然変異により、Ｃａ２＋依存性開裂の損失も引き起こされ、Ｍｇ２＋の存在下で非標的鎖の開裂がさらに減少し、これは、非標的鎖開裂における関与を示す。対照的に、残基Ｈ９２２およびＹ９２５の突然変異は、Ｃａ２＋の存在下で標的鎖の開裂を劇的に減少させた。これらの突然変異体は、Ｍｇ２＋の存在下でワイルドタイプレベルのＤＮＡ開裂活性を示した。これは、Ｃａ２＋配位および標的鎖開裂における関与を示唆している。したがって、Ｃｐｆ１は、タンパク質が曝露されるカルシウムおよび／またはマグネシウムの相対レベルを変えることによって、「イオン的に調節され」得る。構造的修飾は、Ｃｐｆ１をさらに調節するためにも使用され得る。酵素活性に影響を及ぼす突然変異体を通じてＣｐｆ１のエンドヌクレアーゼ活性を不活化することにより、タンパク質は、ＤＮＡを開裂せずに配列特異的に結合するのにも使用され得る。
【０１６８】
２つのアスパルテート（Ｄ９１７、Ｄ１２５５）および１つのグルタメート（Ｅ１００６）が、Ｃｐｆ１の触媒部位を形成し、これは、他のＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨモチーフと十分一致している。これらの種類の触媒モチーフは、一般的にＤＮＡ開裂に２金属イオン機構を用いる。２金属イオン機構を有する酵素は、金属イオンの選択がより厳しく、大部分で、Ｍｇ２＋が好まれる。対照的に、ＨＮＨヌクレアーゼのように、開裂に１金属イオン機構を使用する酵素は、金属イオンの選択が、より柔軟になり得る。例えば、ＫｐｎＩは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡを高い正確さで開裂するが、Ｍｇ２＋の存在下ではさらに非特異的である。Ｃｐｆ１は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋イオンを使用する能力を有する２金属イオン触媒作用を使用する新しいタイプのＤＮＡヌクレアーゼを表すこともできる。
【０１６９】
Ｃｐｆ１は、ＲＮＡおよびＤＮＡに対する二重の核酸分解活性を有する酵素である。Ｃｐｆ１は、配列および構造依存性が高い形でＲＮＡを開裂し、また、生成されたガイドＲＮＡの存在下でのみ特異的ＤＮＡ開裂を行う酵素である。ＣＲＩＳＰＲ免疫の文脈では、タイプＶ−Ａは、これまで説明された最も効率の良いシステムであり、ｃｒＲＮＡを処理し、このＲＮＡを使用して侵入ＤＮＡを特異的に標的化するのに、ただ１つの酵素Ｃｐｆ１を使用する。Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１と単一のＲＮＡとの複合体であるｃｒＲＮＡが第２のＲＮＡ（タイプＩＩのＣａｓ９システムに必要とされるｔｒａｃｒＲＮＡなど）の存在なしにＤＮＡを開裂し得る点で、タイプＩＩシステムとは根本的に異なる。
【０１７０】
Ｃｐｆ１は、他のドメインおよび活性が導入されるキメラ結合タンパク質を形成するのにも使用され得る。実例として、ＦｏｋＩドメインは、触媒活性のエンドヌクレアーゼドメインを含有し得る、Ｃｐｆ１タンパク質に融合され得るか、または、ＦｏｋＩドメインは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼドメインを不活性にするように修飾されている、Ｃｐｆ１タンパク質に融合され得る。Ｃｐｆ１でキメラタンパク質を作るのに融合され得る他のドメインは、遺伝子配列の構造または活性を調節または修飾する、転写調節物質、エピジェネティック修飾因子、タグ、および他の標識もしくはイメージング剤、ヒストン、および／または当技術分野で既知の他のモダリティーを含む。
【０１７１】
配列に基づいて、ｃｒＲＮＡ形態のヘアピン構造へのＣｐｆ１の結合の構造的特異性に関して、Ｃｐｆ１オルソログは、例えば、タイプＩＩシステムで説明してきたように、本システムとの配列類似性に基づいて、特定され、特徴づけられ得る。例えば、Ｃｐｆ１のオルソログは、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２、プレボテラ・アルベンシス、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス、スミセラ種ＳＣＡＤＣ、フラボバクテリウム種３１６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、またはバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４を含む。
【０１７２】
例示的な部位特異的修飾ポリペプチド
本発明は、単離された、例えば精製された、天然に存在しないＣｐｆ１ポリペプチドを提供し、これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８の配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１０のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、以下の種：Ｆｎｏ、Ｆａｌ、Ａｓｐ、Ｅｅｌ、Ｂｆｉ、ＳＳｐ、Ｆｓｐ、ｃＰｃｒ、Ｂｃｒ、から選択された群から選択される。いくつかの実施形態では、このような部位特異的な（side-directed）修飾ポリペプチドは、ａ）標的化部位に結合する能力を有し、オプションとしてｂ）その活性を保持する。いくつかの実施形態では、保持されている活性は、エンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性である。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性がｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを、標的ＤＮＡへのＣｐｆ１の標的特異的結合を導く、成熟形態のｃｒＲＮＡへと処理することができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ活性は、ワイルドタイプと比べて変更される。本発明は、例えば、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、またはＦ８７３に突然変異体を含む、Ｃｐｆ１の精製もしくは単離されたＲＮａｓｅドメインも提供した。本発明は、例えば、Ｄ９１７、Ｅ１００６、および／またはＤ１２５５に突然変異体を含む、Ｃｐｆ１の精製もしくは単離されたＤＮａｓｅドメインをさらに提供する。本発明はまた、モノマー形態において活性な、突然変異したドメインまたはＣｐｆ１ポリペプチドを提供する。
【０１７４】
さらに、本発明は、Ｃｐｆ１ポリペプチド、その突然変異形態もしくは変化形態、またはそのヌクレアーゼ活性ドメインのうちの１つを含む、本発明の部位特異的修飾をコード化する単離されたＤＮＡを提供する。
【０１７５】
核酸修飾
いくつかの実施形態では、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾体を含み、これは、本明細書でさらに説明し、また当技術分野で既知であるように、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を高めるか、送達を変化させるか、宿主細胞における先天性免疫応答を低減するか、または他の向上のために、使用され得る。
【０１７６】
特定の実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムで使用され、この場合、細胞に導入される、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコード化するＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下で説明および例示するように、修飾され得る。このような修飾ポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムで使用され得る。
【０１７７】
このような用途を非限定的に例示する目的でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いると、ガイドＲＮＡの修飾体は、ガイドＲＮＡおよびＣｐｆ１などのＣａｓエンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集複合体の形成または安定性を高めるために使用され得る。ガイドＲＮＡの修飾体はまた、もしくは代わりに、例えばオンターゲットの活性を高めるために使用され得る、ゲノム内の標的配列とのゲノム編集複合体間の相互作用の開始、安定性、または動特性（kinetics）を高めるために使用され得る。ガイドＲＮＡの修飾体はまた、もしくは代わりに、特異性、例えば他の（オフターゲットの）部位における効果と比べて、オンターゲットの部位におけるゲノム編集の相対速度を高めるために使用され得る。
【０１７８】
修飾体はまた、もしくは代わりに、例えば細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対する抵抗を高め、それにより細胞中の半減期を増大させることによって、ガイドＲＮＡの安定性を増大させるために使用され得る。ガイドＲＮＡの半減期を高める修飾体は、Ｃｐｆ１などのＣａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集されるように細胞に導入される実施形態では特に有用となり得る。これは、エンドヌクレアーゼをコード化するＲＮＡと同時に導入されたガイドＲＮＡの半減期（half）を増大させることが、ガイドＲＮＡおよびコード化されたＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞内で共存する時間を増やすために使用され得るからである。
【０１７９】
修飾体はまた、もしくは代わりに、細胞に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を引き起こす可能性または程度を減少させるために使用され得る。以下で、および当技術分野で説明されるように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈で十分特徴づけられている、このような応答は、ＲＮＡの半減期の減少および／または免疫応答に関連するサイトカインもしくは他の因子の誘発と関連する傾向がある。
【０１８０】
１つ以上のタイプの修飾体も、細胞に導入されるＣｐｆ１などのエンドヌクレアーゼをコード化するＲＮＡにされることができ、（細胞に存在するＲＮａｓｅによる分解を減少させることなどにより）ＲＮＡの安定性を高める修飾体、結果として得られる生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を高める修飾体、および／または細胞に導入されたＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾体を含むが、これらに限定されない。
【０１８１】
前述したものおよび他のものなどの修飾体の組み合わせを同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの場合、例えば、１つ以上のタイプの修飾体が、ガイドＲＮＡ（前記に例示したものを含む）にされ得、かつ／または１つ以上のタイプの修飾体が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコード化するＲＮＡ（前記に例示したものを含む）にされ得る。
【０１８２】
実例として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに使用されるガイドＲＮＡ、または、より小さい他のＲＮＡは、化学的手段によって容易に合成され得、以下で例示するように、また当技術分野で説明されているように、いくつかの修飾体が容易に組み込まれることを可能にする。化学的合成処置は継続的に発展しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの処置によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長がおよそ１００ヌクレオチドを超えて著しく増大すると、さらに困難になる傾向がある。より大きい長さの化学的に修飾されたＲＮＡを生成するのに使用される１つのアプローチは、互いに連結される２つ以上の分子を産生することである。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコード化するものなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素によって、より容易に生成される。酵素によって産生されたＲＮＡで使用されるのに一般的に利用可能である修飾体のタイプは少ないが、以下でさらに、また当技術分野で説明されるように、例えば、安定性を高め、先天性免疫応答の可能性もしくは程度を減少させ、かつ／または他の属性を高めるのに使用され得る修飾体がまだあり、新しいタイプの修飾体が定期的に開発されている。
【０１８３】
さまざまなタイプの修飾体、特に、より小さい化学的に合成したＲＮＡと共によく使用されるものの実例として、修飾体は、糖の２’位置で修飾された１つ以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ修飾体は、ピリミジンのリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル修飾体、ＲＮＡの３’末端における塩基性残基または逆塩基（inverted base）を含む。このような修飾体は、オリゴヌクレオチドに定期的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが分かっている。
【０１８４】
いくつかのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾体は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドが、天然のオリゴヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に耐性を示すようにすることが分かっており、これらの修飾オリゴは、未修飾オリゴヌクレオチドより長い期間にわたり無傷で残存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、修飾骨格を含むもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合（intersugar linkages）または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間連鎖を含む。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特にＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ，−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）もしくはＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格；アミド骨格［De Mesmaeker et al., Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995)を参照］；モルホリノ骨格構造体（Summerton and Weller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格が、ポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合している。Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497を参照）を有するもの、である。リン含有結合は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、ならびに３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに標準の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、および、ヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’で結合される逆極性を有するもの、を含むがこれらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；５，６２５，０５０号を参照。
【０１８５】
モルホリノベースのオリゴマー化合物が、Braasch and David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, Volume 30, Issue 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Nasevicius et al., Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000)；および１９９１年７月２３日発行の米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。
【０１８６】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000)に記載されている。
【０１８７】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成された骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合したＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分を有する他のものを含む。それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；５，６７７，４３９号を参照。
【０１８８】
１つ以上の置換糖部分、例えば以下のうちの１つが、２’位置に含まれることもできる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ここでｎは、１〜約１０である；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリルもしくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター基；干渉物質；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基および同様の性質を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾体は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３。２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる）（Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）を含む。他の修飾体は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。類似の修飾体が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置、で作られることもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物を有することもできる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような１つのオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、かつ骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教示は、Nielsen et al, Science, 254: 1497-1500 (1991)に見ることができる。
【０１９０】
ガイドＲＮＡは、さらに、または代わりに、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾体または置換も含み得る。本明細書で使用される「未修飾」または「天然」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、天然核酸にまれにまたは一時的に見られるのみである核酸塩基、例えばヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野ではしばしば５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ（gentobiosyl HMC）、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp75-77 (1980); Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res. 15:4513 (1997)。当技術分野で既知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸の二重鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが分かっており（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、塩基置換の実施形態である。
【０１９１】
修飾核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル（pseudo-uracil））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン（methylquanine）および７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
【０１９２】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、‘The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering’, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition’, 1991, 30, page 613に開示されたもの、Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications’, pages 289- 302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993に開示されたものを含む。これらの核酸塩基のうち特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６および−Ｏ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾体と組み合わせられた場合は特に、核酸の二重鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増大させることが分かっており（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, ‘Antisense Research and Applications’, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、塩基置換の実施形態である。修飾核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６８１，９４１号；５，７５０，６９２号；５，７６３，５８８号；５，８３０，６５３号；６，００５，０９６号；および米国特許出願公開第２００３０１５８４０３号に記載されている。
【０１９３】
所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、前述した修飾体のうち２つ以上が、単一のオリゴヌクレオチドに、または、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内部にすら、組み込まれ得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１などのエンドヌクレアーゼをコード化するガイドＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ（もしくはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、もしくは細胞取り込みを高める１つ以上の部分または抱合体に化学的に結合される。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556 (1989)］；コール酸［Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992)およびManoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)］；チオコレステロール［Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)］；脂肪族鎖、例えばドデカンジオール（dodecandiol）またはウンデシル残基［Kabanov et al., FEBS Lett., 259: 327-330 (1990)およびSvinarchuk et al., Biochimie, 75: 49- 54 (1993)］；リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１、２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995) and Shea et al., Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973 (1995)］；アダマンタン酢酸［Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)］；パルミチル部分［(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237 (1995)］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937 (1996)］を含むが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号，５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号；５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号；５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号；５，６８８，９４１号も参照のこと。
【０１９５】
糖および他の部分は、タンパク質およびヌクレオチドを含む複合体、例えばカチオン性ポリソームおよびリポソーム、を特定の部位に標的化するのに使用され得る。例えば、肝細胞に向けられた移動は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介され得る；例えばHu, et al., Protein Pept Lett. 21(10):1025-30 (2014)を参照のこと。当技術分野で既知であり、規則的に開発された他のシステムは、本事例に用いられる生体分子および／またはその複合体を、目的の特定の標的細胞に標的化するのに使用され得る。
【０１９６】
これらの標的化部分または抱合体は、１級もしくは２級水酸基などの官能基に共有結合した抱合基を含み得る。本発明の抱合基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基を含む。典型的な抱合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料を含む。薬力学的性質を高める基は、本発明の観点から、取り込みを改善し、分解への抵抗を高め、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態特性を高める基は、本発明の観点から、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、もしくは排泄を改善する基を含む。代表的な抱合基は、参照によって本明細書に組み込まれる、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。抱合体部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、もしくはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、もしくはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号，５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号，５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号；５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号および５，６８８，９４１号を参照のこと。
【０１９７】
化学合成にあまり適しておらず、典型的には酵素合成により産生される、より長いポリヌクレオチドは、さまざまな手段により修飾されることもできる。このような修飾は、例えば、特定のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’もしくは３’末端での特定の配列もしくは他の部分の組み込み、および、他の修飾を含み得る。実例として、Ｃｐｆ１をコード化するｍＲＮＡは、長さがおよそ４ｋｂであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成され得る。ｍＲＮＡに対する修飾は、例えば（細胞での分解に対する抵抗を増大させることなどによって）その翻訳もしくは安定性を高めるため、または外来性ＲＮＡ、特に、Ｃｐｆ１をコード化するものなど、より長いＲＮＡの導入後にしばしば細胞に見られる先天性免疫応答をＲＮＡが誘発する傾向を減少させるために、適用され得る。
【０１９８】
ポリＡ尾部、５’キャップ類似体（例えばアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基の使用（Ｐｓｅｕｄｏ−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−トリリン酸（５−メチル−ＣＴＰ）もしくはＮ６−メチル−ＡＴＰなど）、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼでの処理など、多くのこのような修飾が当技術分野で説明されている。これらおよび他の修飾は、当技術分野で既知であり、ＲＮＡの新たな修飾が規則的に開発されている。
【０１９９】
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、および多くの他の会社を含め、修飾ＲＮＡの供給業者は多い。TriLinkが説明しているように、例えば、５−メチル−ＣＴＰは、ヌクレアーゼ安定性の増大、翻訳の増大、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡとの自然免疫受容体の相互作用の減少など、望ましい特徴を与えるのに使用され得る。５’−メチルシチジン−５’−トリリン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにＰｓｅｕｄｏ−ＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰは、以下で言及するKormann et al.およびWarren et al.による刊行物で説明されるように、培養下およびｉｎ  ｖｉｖｏで自然免疫刺激を減少させるとともに、翻訳を高めることも分かっている。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｖｏで送達される化学的に修飾されたｍＲＮＡは、治療効果の改善を達成するのに使用され得ることが、分かっている；例えばKormann et al., Nature Biotechnology 29, 154-157 (2011)を参照のこと。このような修飾は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を高め、かつ／またはその免疫原性を減少させるために、使用され得る。Ｐｓｅｕｄｏ−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、および５−メチル−Ｃなどの化学修飾を用いると、ウリジンおよびシチジン残基の４分の１のみを２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃでそれぞれ置換することで、マウスにおけるｍＲＮＡのトール様受容体（ＴＬＲ）媒介性認識が著しく減少することが分かった。したがって、自然免疫系の活性化を低減させることによって、これらの修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍＲＮＡの安定性および寿命を有効に増大させるために使用され得る；例えば上記のKormann et al.を参照のこと。
【０２０１】
先天性抗ウイルス反応を回避する（bypass）ように設計された修飾体を組み込む合成メッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化したヒト細胞を多能性に再プログラムし得ることも示されている。例えば、Warren, et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010)を参照。主要なリプログラミングタンパク質として作用する、このような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラミングする有効な手段となり得る。このような細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれ、５−メチル−ＣＴＰ、Ｐｓｅｕｄｏ−ＵＴＰ、およびアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込む、酵素合成したＲＮＡは、細胞の抗ウイルス反応を効果的に逃れるのに使用され得ることが分かった；例えば上述のWarren et al.を参照。
【０２０２】
当技術分野で説明されているポリヌクレオチドの他の修飾は、例えば、ポリＡ尾部の使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の追加、５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処理を含み、新たなアプローチが、規則的に開発されている。
【０２０３】
本明細書で使用される修飾ＲＮＡの生成に適用可能ないくつかの組成物および技術は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾に関連して開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の問題を呈する。それは、ｍＲＮＡ干渉による遺伝子発現抑制への効果が、一般的に一時的なものであり、反復投与が必要となり得るためである。さらに、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳類細胞は、しばしばウイルス感染の副生成物である、ｄｓＲＮＡを検出および中和するように進化した免疫応答を有する。よって、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ反応性キナーゼ）などの哺乳動物酵素、およびｄｓＲＮＡへの細胞反応を媒介し得る潜在的レチノイン酸誘導型遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにこのような分子に応じてサイトカインの誘導を生じ得るトール様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８など）がある；例えば、Angart et al., Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013); Kanasty et al., Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012); Burnett et al., Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011); Judge and MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008)によるレビュー；および本明細書に列挙される参考文献を参照。
【０２０４】
ＲＮＡ安定性を高め、先天性免疫応答を低減し、かつ／または本明細書に記載されるような、ヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用となり得る他の利点を達成するために、広範な修飾が開発および適用されてきた；例えば、Whitehead KA et al., Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione and Messere, Mini Rev Med Chem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskaya et al, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158-67 (2010); Deleavey et al., Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16:Unit 16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fucini et al., Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsen et al., Front Genet 3:154 (2012)によるレビューを参照。
【０２０５】
前述のとおり、修飾ＲＮＡのいくつかの供給業者があり、その多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された修飾体を専門にしている。文献で報告されたさまざまな発見に基づき、さまざまなアプローチが提案されている。例えば、Dharmaconは、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）での非架橋酸素の置換は、Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012)によって報告されるように、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗を改善するために広範に使用されてきたことに注目している。リボースの２’位置の修飾は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ抵抗を改善するとともに、二重鎖安定性（Ｔｍ）を高めることが報告されており、これは、免疫活性化からの保護をもたらすことも分かっている。小さく、耐容性良好である２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との、中程度のＰＳ骨格修飾との組み合わせは、Soutschek et al. Nature 432:173-178 (2004)により報告されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで適用される安定性の高いｓｉＲＮＡと関連しており；２’−Ｏ−メチル修飾体は、Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009)により報告されるように、安定性の改善に有効であると報告されている。先天性免疫応答の誘導の減少に関して、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで特定の配列を修飾することは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を減少させるとともに、一般的にサイレンシング活性を維持することが報告されている；例えば、Judge et al., Mol. Ther. 13:494-505 (2006)；およびCekaite et al., J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007)を参照。２−チオウラシル、擬ウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、Ｎ６−メチルアデノシンなどの追加の修飾は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８により媒介される免疫効果を最小限に抑えることも分かっている；例えば、Kariko, K. et al., Immunity 23:165-175 (2005)を参照。
【０２０６】
当技術分野で既知であり、市販されているように、細胞による送達および／または取り込みを高めるいくつかの抱合体が、本明細書で使用されるＲＮＡなどのポリヌクレオチドに適用され得、これには、例えば、コレステロール、トコフェロールおよび葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーが含まれる；例えば、Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013)によるレビュー、およびそこで引用される参考文献を参照。
【０２０７】
模倣物
核酸は、核酸模倣物であってよい。用語「模倣物」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間結合の両方が、非フラノース基で置換された、ポリヌクレオチドを含むことが意図されており、フラノース環のみの置換は、当技術分野では、糖代用（surrogate）とも呼ばれる。複素環式塩基部分または修飾複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような１つの核酸である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオチドは、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。
【０２０８】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている１つのポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物における骨格は、２つ以上の結合アミノエチルグリシン単位であり、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分ののアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製について説明した代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。
【０２０９】
研究されてきた別の種類のポリヌクレオチド模倣物は、モルホリノ環に付着した複素環式塩基を有する結合モルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸においてモルホリノモノマー単位を結合するいくつかの結合基が報告されている。非イオン性オリゴマー化合物をもたらすために、１種類の結合基が選択されている。非イオン性モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物であり、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を形成する可能性が低い（Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 45034510）。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。モノマーサブユニットを連結するさまざまな異なる結合基を有する、モルホリノ類のポリヌクレオチドにおけるさまざまな化合物が、調製されている。
【０２１０】
さらなる種類のポリヌクレオチド模倣物は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。通常ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に存在するフラノース環が、シクロヘキセニル環で置換されている。ＣｅＮＡ  ＤＭＴで保護されたホスホロアミダイトモノマーが、典型的なホスホロアミダイト化学現象に続くオリゴマー化合物合成のために調製および使用されてきた。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物およびＣｅＮＡで修飾された特異的位置を有するオリゴヌクレオチドが、調製および研究されてきた（Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 85958602を参照）。一般的に、ＤＮＡ鎖にＣｅＮＡモノマーを組み込むと、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性が増大する。ＣｅＮＡオリゴアデニレートが、天然の複合体と類似の安定性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ補体との複合体を形成した。天然核酸構造へのＣｅＮＡ構造の組み込みの研究は、簡単な配座の順応を進めることが、ＮＭＲ及び円偏光二色性によって示された。
【０２１１】
さらなる修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、ロックド核酸では、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に結合されることによって、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、これにより二環式糖部分を形成する。結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋する基であるメチレン（−ＣＨ２−）であってよく、ここで、ｎは１または２である（Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456）。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡを有する非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解（3’-exonucleolytic degradation）へ向かう安定性、および良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する、効力のある非毒性アンチセンスオリゴヌクレオチドが説明されている（Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638）。
【０２１２】
ＬＮＡモノマー、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、およびウラシルのオリゴマー化および核酸認識特性に加えて、それらの合成および調製が記載されている（Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630）。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６にも記載されている。
【０２１３】
修飾糖部分
核酸は、１つ以上の置換糖部分を含むこともできる。適切なポリヌクレオチドは：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択された糖置換基を含み、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。特に適切なのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の適切なポリヌクレオチドは：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基、および同様の特性を有する他の置換基から選択される、糖置換基を含む。適切な修飾は、−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥ）（Martin et al., Hely. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）としても知られる２’−メトキシエトキシ２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに適切な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、以下の実施例で説明するように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルもしくは２’−ＤＭＡＥＯＥとして当技術分野でも既知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０２１４】
他の適切な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、およびフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってよい。適切な２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾が、オリゴマー化合物上の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上もしくは２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置で行われてもよい。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有してもよい。
【０２１５】
塩基修飾および置換
核酸は、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される「未修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。さらなる修飾核酸塩基は、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇクランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）を含む。
【０２１６】
複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンと置き換えられたものを含むこともできる。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されたもの、を含む。これらの核酸塩基のうち特定のものは、オリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含み、これは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられた場合に、核酸の二重鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ高めることが示されており（Sanghvi et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、適切な塩基置換である。
【０２１７】
「相補的な」は、天然に存在するかもしくは天然に存在しない（例えば、前述したように修飾された）塩基（ヌクレオシド）もしくはその類似体を含む２つの配列間の、塩基の積み重ねおよび特異的水素結合による、対合の能力を指す。例えば、核酸の１つの位置における塩基が標的の対応する位置にある塩基と水素結合することができる場合、これらの塩基は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に対していかなる肯定的もしくは否定的な貢献も提供しない不活性な脱塩基スペーサーを含み得る。塩基対合は、標準のワトソン・クリック塩基対合および非ワトソン・クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合およびフーグスティーン塩基対合）の両方を含み得る。相補的塩基対合については、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）に相補的であり、３−ニトロピロールもしくは５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、もしくはＴにハイブリダイズすることができ、かつそれらに相補的とみなされることが、理解される。Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493およびLoakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043。イノシン（Ｉ）も、当技術分野ではユニバーサル塩基とみなされてきており、任意のＡ、Ｃ、Ｕ、もしくはＴに相補的とみなされる。Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267を参照のこと。
【０２１８】
抱合体
核酸の別の可能な修飾は、ポリヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める１つ以上の部分または抱合体を化学的に結合することを含む。これらの部分または抱合体は、１級または２級水酸基などの官能基に共有結合している抱合基を含み得る。抱合基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を高める基、オリゴマーの薬物動態特性を高める基を含むがこれらに限定されない。適切な抱合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料を含むがこれらに限定されない。薬力学的性質を高める基は、取り込みを改善し、分解への抵抗を高め、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態特性を高める基は、核酸の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基を含む。
【０２１９】
抱合体部分は、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 36513654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）を含むが、これらに限定されない。
【０２２０】
抱合体は、「タンパク質形質導入ドメイン」すなわちＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含み得、これは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜を横断するのを容易にする有機もしくは無機化合物を指すことができる。小さい極性分子から大きい高分子および／またはナノ粒子に及ぶ、別の分子に付着したＰＴＤは、分子が膜を横断する、例えば細胞外空間から細胞内空間、またはサイトゾルから細胞小器官内へ進むのを促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外来性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外来性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のカルボキシル末端に共有結合する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコード化するポリヌクレオチド、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドなど）に共有結合する。例示的なＰＴＤは、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞中に直接侵入するのに十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１０〜５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96）；ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737）；切断されたヒトカルシトニンペプチド（Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256）；ポリリシン（Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を含むがこれらに限定されない。例示的なＰＴＤは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含むが、これらに限定されない；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、以下：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）；およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）のいずれかを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）（Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381）である。ＡＣＰＰは、開裂可能なリンカーにより、適合するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９もしくは「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９もしくは「Ｒ９」）を含み、これにより、正味荷電がほぼゼロに減少し、それによって、接着および細胞への取り込みが抑制される。リンカーの開裂時、ポリアニオンが��出され、ポリアルギニンおよびその固有の付着性を局所的に明らかにし、よって、膜を横断するようＡＣＰＰを「活性化する」。
【０２２１】
ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化する核酸
本開示は、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコード化する核酸は、発現ベクター、例えば組み換え型発現ベクターである。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを接触させるか、または細胞（もしくは細胞集団）に、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにある。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにある。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組み換え型発現ベクター」である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、組み換え型発現ベクターは、ウイルス構造体、例えば、組み換え型アデノ随伴ウイルス構造体（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組み換え型アデノウイルス構造体、組み換え型レンチウイルス構造体、組み換え型レトロウイルス構造体などである。
【０２２４】
適切な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、以下に基づくウイルスベクター：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999;ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996；ＷＯ９３／０９２３９におけるSrivastava、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165；およびFlotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫（myeloproliferative sarcoma）ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）など、を含むがこれらに限定されない。
【０２２５】
多くの適切な発現ベクターが、当業者に知られており、その多くが市販されている。以下のベクターは、例として提供されるものである；真核生物宿主細胞に対して：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主細胞と適合性である限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構造型および誘導型プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、制御要素、例えばプロモーターなどの転写制御要素に動作可能に結合される。転写制御要素は、真核生物細胞、例えば哺乳類細胞；または原核生物細胞（例えば細菌もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能的となり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、原核生物および真核生物細胞の両方においてガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御要素に動作可能に結合される。
【０２２７】
適切な真核生物プロモーター（真核生物細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの末端反復配列（ＬＴＲ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉ由来のものを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者レベルの範囲内である。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含むこともできる。発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含み得る。発現ベクターは、部位特異的修飾ポリペプチドに融合し、その結果、キメラポリペプチドを生じるタンパク質タグ（例えば６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコード化するヌクレオチド配列も含み得る。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、誘導型プロモーターに動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、構造型プロモーターに動作可能に結合される。
【０２２９】
宿主細胞に核酸を導入する方法が、当技術分野で既知であり、任意の既知の方法を使用して、核酸（例えば、発現構造体）を細胞に導入することができる。適切な方法は、例えば、ウイルスもしくはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入法、ナノ粒子介在性核酸送達（例えばPanyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023）などを含む。
【０２３０】
キメラポリペプチド
本開示は、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドを提供する。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、（前述した）ガイドＲＮＡと相互作用する（たとえば、結合する）。ガイドＲＮＡは、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドを、標的ＤＮＡ内の標的配列（例えば、染色体の配列もしくは染色体外の配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など）にガイドする。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾し（例えば標的ＤＮＡの開裂もしくはメチル化）、かつ／または標的ＤＮＡと関連するポリペプチドを修飾する（例えばヒストン尾部のメチル化もしくはアセチル化）。
【０２３１】
キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾し（例えば、標的ＤＮＡの開裂もしくはメチル化）、かつ／または標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾する（例えば、ヒストン尾部のメチル化もしくはアセチル化）。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、本明細書では、「キメラの部位特異的なポリペプチド」または「キメラのＲＮＡ結合の部位特異的修飾ポリペプチド」とも呼ばれる。
【０２３２】
キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、ＲＮＡ結合部分および活性部分という２つの部分を含む。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、修飾および／または天然に存在するポリペプチド配列（例えば、修飾または未修飾Ｃｐｆ１タンパク質由来の第１のアミノ酸配列；およびＣｐｆ１タンパク質以外の第２のアミノ酸配列）を含み得る。
【０２３３】
ＲＮＡ結合部分
場合によっては、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、天然に存在するポリペプチドである。別の場合では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、天然に存在する分子ではない（修飾されている、例えば突然変異、欠失、挿入）。目的の天然に存在するＲＮＡ結合部分は、当技術分野で既知の部位特異的修飾ポリペプチドに由来する。例えば、図１は、部位特異的修飾ポリペプチドとして使用され得る、天然に存在するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。場合によっては、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、図１に示すポリペプチドのＲＮＡ結合部分に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３４】
活性部分
ＲＮＡ結合部分に加えて、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、「活性部分」を含む。いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、部位特異的修飾ポリペプチドの天然に存在する活性部分（例えばＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ）を含む。他の実施形態では、主題のキメラの部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、部位特異的修飾ポリペプチドの天然に存在する活性部分の修飾アミノ酸配列（例えば、置換、欠失、挿入）を含む。目的の天然に存在する活性部分は、当技術分野で既知の部位特異的修飾ポリペプチドに由来する。例えば、図１は、部位特異的修飾ポリペプチドとして使用され得る、天然に存在するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、可変であり、本明細書に開示する方法で有用となり得る、任意の異種ポリペプチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、図１の活性部分アミノ酸と少なくとも９０％同一であるＣｐｆ１オルソログの一部を含む。いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは：（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ結合部分；（ｉｉ）部位特異的な酵素活性（例えばＲＮＡ開裂に対する活性）を示す活性部分であって、酵素活性の部位が、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピートにより形成されたパリンドロームヘアピン構造によって決定され、ヘアピンの４ｎｔ上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂し、リピートスペーサー（５’−３’）で構成されるｃｒＲＮＡの中間形態を生じる、活性部分；ならびに（ｉｉｉ）部位特異的な酵素活性（例えばＤＮＡ開裂に対する活性）を示す活性部分であって、酵素活性の部位が、ガイドＲＮＡによって決定される、活性部分、を含む。
【０２３５】
例示的なキメラの部位特異的修飾ポリペプチド
いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、Ｃｐｆ１オルソログのうちのいずれかの修飾形態を含む、Ｃｐｆ１タンパク質の修飾形態を含む。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質の修飾形態は、Ｃｐｆ１タンパク質の天然に存在するヌクレアーゼ活性を減少させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、もしくは置換）を含む。例えば、場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質の修飾形態は、対応するワイルドタイプＣｐｆ１ポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。場合によっては、Ｃｐｆ１ポリペプチドの修飾形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。
【０２３６】
場合によっては、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、図１に対して、または、図１に記載するアミノ酸配列のうちいずれかの対応する部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、ＤＮＡ修飾活性および／または転写因子活性および／またはＤＮＡ関連ポリペプチド修飾活性を有する、異種ポリペプチドを含む。場合によっては、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を提供するＣｐｆ１ポリペプチドの一部に取って代わる。他の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、通常ヌクレアーゼ活性を提供するＣｐｆ１ポリペプチドの部分（その部分は、完全に活性であり得るか、もしくは代わりに、対応するワイルドタイプの活性の１００％未満を有するように修飾され得る）および異種ポリペプチドの両方を含む。言い換えれば、場合によっては、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、通常ヌクレアーゼ活性を提供するＣｐｆ１ポリペプチドの部分と異種ポリペプチドの両方を含む、融合ポリペプチドである。別の場合では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ポリペプチドの活性部分の修飾変異体（例えばアミノ酸変化、欠失、挿入）と異種ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドである。さらに別の場合では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、異種ポリペプチドと、天然に存在するかもしくは修飾された部位特異的修飾ポリペプチドのＲＮＡ結合部分を含む、融合ポリペプチドである。
【０２３７】
例えば、キメラのＣｐｆ１タンパク質では、天然に存在する（もしくは修飾された、例えば突然変異、欠失、挿入）Ｃｐｆ１ポリペプチドは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃｐｆ１以外のタンパク質由来のポリペプチド配列、もしくは別の生物由来のポリペプチド配列）に融合され得る。異種ポリペプチド配列は、キメラのＣｐｆ１タンパク質によっても示されるであろう活性（例えば酵素活性）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸配列は、（例えば遺伝子操作によって）別の核酸配列に結合されて、キメラのポリペプチドをコード化するキメラのヌクレオチド配列を生成することができる。いくつかの実施形態では、キメラのＣｐｆ１ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ポリペプチド（例えば、ワイルドタイプＣｐｆ１もしくはＣｐｆ１変異体、例えば、ヌクレアーゼ活性が減少もしくは不活性化したＣｐｆ１）を、細胞内局在（例えば、核に対して標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアに対して標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に対して標的化するための葉緑体局在化シグナル；小胞体保留シグナルなど）をもたらす異種配列と融合することによって、生成される。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡もしくは精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ＨＩＳタグ、例えば６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供し得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、安定性の上昇または低下をもたらし得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、（例えば、キメラのＣｐｆ１ポリペプチドが目的の別のタンパク質、例えばＤＮＡもしくはヒストン修飾タンパク質、転写因子もしくは転写抑制因子、リクルートタンパク質（recruiting protein）などに結合する能力を提供するために）結合ドメインを提供することができる。
【０２３８】
キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化する核酸
本開示は、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクター、例えば組み換え型発現ベクターである。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを接触させるか、または、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドを含む１つ以上の核酸を、細胞（もしくは細胞集団）に導入することを含む。キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組み換え型発現ベクター」である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、組み換え型発現ベクターは、ウイルス構造体、例えば組み換え型アデノ随伴ウイルス構造体（例えば米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組み換え型アデノウイルス構造体、組み換え型レンチウイルス構造体などである。
【０２４１】
適切な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、以下に基づくウイルスベクター：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996；ＷＯ９３／０９２３９におけるSrivastava、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165；およびFlotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et a1., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えばマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）など、を含むがこれらに限定されない。
【０２４２】
多くの適切な発現ベクターが、当業者に知られており、その多くが市販されている。以下のベクターは、例として提供されるものである；真核生物宿主細胞に対して：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主細胞と適合性である限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。
【０２４３】
利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構造型および誘導型プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、制御要素、例えばプロモーターなどの転写制御要素に動作可能に結合される。転写制御要素は、真核生物細胞、例えば哺乳類細胞；または原核生物細胞（例えば細菌もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能的となり得る。いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、原核生物および真核生物細胞の両方でキメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御要素に動作可能に結合される。
【０２４５】
適切な真核生物プロモーター（真核生物細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの末端反復配列（ＬＴＲ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉ由来のものを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者レベルの範囲内である。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含むこともできる。発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含み得る。発現ベクターは、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドに融合されるタンパク質タグ（例えば６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質など）など）をコード化するヌクレオチド配列も含み得る。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、誘導型プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなど）に動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）に動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、構造型プロモーターに動作可能に結合される。
【０２４７】
宿主細胞に核酸を導入する方法が、当技術分野で既知であり、任意の既知の方法を使用して、核酸（例えば、発現構造体）を幹細胞または前駆細胞に導入することができる。適切な方法は、例えば、ウイルスもしくはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入法、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: 50169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023を参照）などを含む。
【０２４８】
方法
本開示は、標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡ関連ポリペプチドを修飾する方法を提供する。一般的に、方法は、標的ＤＮＡを複合体（「標的化複合体」）と接触させることを含み、この複合体は、ガイドＲＮＡと、部位特異的修飾ポリペプチドと、を含む。
【０２４９】
前述のとおり、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドは複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。複合体の部位特異的修飾ポリペプチドは、部位特異的活性を提供する。いくつかの実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡを修飾し、例えば、ＤＮＡ開裂、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復などを引き起こす。他の実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡと関連する標的ポリペプチド（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）を修飾し、例えば、ヒストンのメチル化、ヒストンのアセチル化、ヒストンのユビキチン化などを引き起こす。標的ＤＮＡは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの裸のＤＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞中の染色体ＤＮＡ、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞中の染色体ＤＮＡなどであってよい。
【０２５０】
場合によっては、種々のＣｐｆ１タンパク質（すなわち、さまざまな種からのＣｐｆ１タンパク質）が、（例えば、種々のＰＡＭ配列選択性のため；酵素活性の増加または減少のため；細胞毒性のレベルの増加または減少のため；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断などの間のバランスを変えるために）種々のＣｐｆ１タンパク質のさまざまな酵素特徴を利用するため、提供されるさまざまな方法で使用されるのに有利となり得る。ガイドｃｒＲＮＡを処理する方法であって、この方法は、Ｃｐｆ１にガイドｃｒＲＮＡをより小さな断片に開裂させる条件下で、より長い形態のｃｒＲＮＡをＣｐｆ１ポリペプチドと接触させることを含み、断片のうちの少なくとも１つは、Ｃｐｆ１を標的部位に導くことができ、この方法は、Ｃａｓ９またはｔｒａｃｒＲＮＡの不存在下で行われる、方法。
【０２５１】
さまざまな種からのＣｐｆ１タンパク質は、標的ＤＮＡにおいて種々のＰＡＭ配列を必要とし得る。よって、最適な特定のＣｐｆ１タンパク質では、ＰＡＭ配列要件は、前述したＰＡＭ配列と異なっていてよい。
【０２５２】
Ｃｐｆ１オルソログの特徴を活用する、提供される例示的な方法は、以下を含む。
【０２５３】
ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを開裂して二本鎖切断を生じる。これらの切断は、その後、非相同末端結合および相同組換え修復という２つの方法のうちの１つで、細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、二本鎖切断は、切断末端の互いに対する直接的な連結反応によって修復される。したがって、新しい核酸物質はこの部位に挿入されないが、一部の核酸物質は失われている場合があり、欠失を生じる。相同組換え修復では、開裂した標的ＤＮＡ配列に対し相同関係を有するドナーポリヌクレオチドが、開裂した標的ＤＮＡ配列の修復用のテンプレートとして使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移動を生じる。したがって、新しい核酸物質が、その部位に挿入／複写され得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、ドナーポリヌクレオチドと接触する。場合によっては、ドナーポリヌクレオチドは、細胞に導入される。ＮＨＥＪおよび／または相同組換え修復による標的ＤＮＡの修飾は、例えば、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子標識、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子中断、遺伝子突然変異、配列置換などを引き起こす。したがって、部位特異的修飾ポリペプチドによるＤＮＡの開裂は、標的ＤＮＡ配列を開裂し、外因的に提供されたドナーポリヌクレオチドの不存在下で細胞に配列を修復させることによって、（例えば、細胞を感染しやすくする遺伝子（例えば、Ｔ細胞をＨＩＶ感染症にかかりやすくするＣＣＲＳもしくはＣＸＣＲ４遺伝子）を崩壊させるため、ニューロンにおいて疾患が引き起こすトリヌクレオチドリピート配列を除去するため、研究における疾患モデルとして遺伝子ノックアウトおよび突然変異体を作るなどのために）標的ＤＮＡ配列から核酸物質を欠失させるのに使用され得る。よって、この方法は、遺伝子をノックアウトする（転写に全く欠けるか、もしくは変化した転写を生じる）か、または遺伝物質を標的ＤＮＡ中の最適な遺伝子座に打ち込むのに使用され得る。
【０２５４】
あるいは、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドが、少なくとも標的ＤＮＡ配列に対して相同関係を有するセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列を有する細胞に同時に投与されると、主題の方法は、核酸物質を標的ＤＮＡ配列に加える、すなわち挿入もしくは置換し（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどをコード化する核酸を「打ち込み」）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質など）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧなど）を加え、調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化信号、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナルなど）を遺伝子に加え、核酸配列を修飾する（例えば突然変異を導入する）などのために使用され得る。したがって、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む複合体は、部位特異的、すなわち「標的化した」形でＤＮＡを修飾することが望ましい任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの適用、例えば疾患を治療するため、または抗ウイルス薬、抗病原薬（antipathogenic）、もしくは抗がん治療剤として、例えば遺伝子療法、農業における遺伝子組み換え生物の生成、治療、診断、もしくは調査目的での細胞によるタンパク質の大量生産、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠失もしくは置換に関する病原体の遺伝子の標的化など、で使用されるような遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子標識、配列置換などにおいて、有用である。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃｐｆ１タンパク質の修飾形態を含む。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質の修飾形態は、Ｃｐｆ１タンパク質の天然に存在するヌクレアーゼ活性を減少させるアミノ酸変化（例えば欠失、挿入、または置換）を含む。例えば、場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質の修飾形態は、対応するワイルドタイプＣｐｆ１ポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。場合によっては、Ｃｐｆ１ポリペプチドの修飾形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。部位特異的修飾ポリペプチドが実質的なヌクレアーゼ活性を有さないＣｐｆ１ポリペプチドの修飾形態である場合、「ｄＣｐｆ１」と呼ぶことができる。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、異種配列（例えば、融合）を含む。いくつかの実施形態では、異種配列は、部位特異的修飾ポリペプチドの細胞内局在（例えば、核に対して標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアに対して標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体に対して標的化するための葉緑体局在化シグナル；小胞体保留シグナルなど）を提供することができる。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡または精製を容易にするタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ｈｉｓタグ、例えば６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供し得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、安定性の上昇または低下をもたらし得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、コドン最適化され得る。このタイプの最適化は、当技術分野で既知であり、意図する宿主生物または細胞のコドン選択を模倣すると共に同じタンパク質をコード化するように外来ＤＮＡ（foreign-derived DNA）の突然変異を伴う。よって、コドンは変化するが、コード化されたタンパク質は変化しないままである。例えば、意図する標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドン最適化Ｃｐｆ１（もしくは変異体、例えば酵素的に不活性な変異体）が、適切な部位特異的修飾ポリペプチドであろう。任意の適切な部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、図１に記載する配列など、任意のＣｐｆ１）は、コドン最適化され得る。別の非限定的な例として、意図する宿主細胞がマウス細胞であった場合、マウスコドン最適化Ｃｐｆ１（もしくは変異体、例えば酵素的に不活性な変異体）が、適切な部位特異的修飾ポリペプチドであろう。コドン最適化は必須ではないが、許容可能であり、場合によっては好ましいかもしれない。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドは、細菌細胞における遺伝子発現を遮断するための誘導型システムとして使用される。場合によっては、適切なガイドＲＮＡおよび／または適切な部位特異的なポリペプチドをコード化する核酸は、標的細胞の染色体に組み込まれ、誘導型プロモーターの制御下にある。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的なポリペプチドが誘導されると、標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドの両方が存在し、複合体を形成する場合に、目的の場所（例えば、別個のプラスミド上の標的遺伝子）で開裂（または別様に修飾）される。したがって、場合によっては、細菌発現株が、（例えば、誘導型プロモーターの制御下で）細菌ゲノム内の適切な部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはプラスミド上の適切なガイドＲＮＡをコード化する核酸配列を含むように遺伝子操作で作り変えられ、（株に導入された別個のプラスミドから発現された）任意の標的化遺伝子の発現がガイドＲＮＡおよび部位特異的なポリペプチドの発現を誘導することによって制御され得る実験を可能にする。
【０２５９】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、二本鎖切断を導入する以外の方法で標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を有する。（例えば、酵素活性を有する異種ポリペプチドを部位特異的修飾ポリペプチドに融合させ、それによりキメラの部位特異的修飾ポリペプチドを生成することによって）標的ＤＮＡを修飾するのに使用され得る、目的の酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性を含むが、これらに限定されない。メチル化および脱メチル化は、当技術分野では重要なエピジェネティック遺伝子調節モードとして認識され、ＤＮＡ損傷および修復活性は、細胞生存のため、および環境ストレスに応じた適切なゲノム維持のために不可欠である。
【０２６０】
したがって、本明細書の方法は、標的ＤＮＡのエピジェネティック修飾における用途を見出し、所望の相補的な核酸配列をガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントへと遺伝子操作することによって標的ＤＮＡの任意の場所で標的ＤＮＡのエピジェネティック修飾を制御するように利用され得る。本明細書の方法は、標的ＤＮＡの任意の所望の場所におけるＤＮＡの意図的で制御された損傷における用途も見出す。本明細書の方法は、標的ＤＮＡ内部の任意の所望の場所におけるＤＮＡの配列特異的で制御された修復における用途も見出す。標的ＤＮＡにおける特定の場所に対しＤＮＡ修飾酵素活性を標的化する方法は、研究および臨床双方の適用における用途を見出す。
【０２６１】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡの転写を調節する活性を有する（例えば、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドの場合など）。場合によっては、転写を増大または減少させる能力を示す異種ポリペプチドを含むキメラの部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、転写活性因子もしくは転写抑制因子ポリペプチド）は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントによりガイドされる、標的ＤＮＡの特定の場所における標的ＤＮＡの転写を増大または減少させるのに使用される。転写調節活性を有するキメラの部位特異的修飾ポリペプチドを提供するためのソースポリペプチドの例は、光誘導型転写調節因子、小分子／薬剤反応性転写調節因子、転写因子、転写抑制因子、などを含むがこれらに限定されない。場合によっては、この方法は、標的化コーディングＲＮＡ（タンパク質コード化遺伝子）および／または標的化ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡなど）の発現を制御するのに使用される。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡと関連するポリペプチド（例えばヒストン）を修飾する酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性（すなわち、ユビキチン化活性）、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、または脱グリコシル化活性である。本明細書に列挙される酵素活性は、タンパク質への共有結合修飾を触媒する。このような修飾は、標的タンパク質の安定性または活性を変えることが当技術分野で既知である（例えば、キナーゼ活性によるリン酸化が、標的タンパク質に応じてタンパク質活性を刺激または抑制し得る）。タンパク質標的として特に目的とするのは、ヒストンである。ヒストンタンパク質は、ＤＮＡを結合し、ヌクレオソームとして知られる複合体を形成することが、当技術分野で既知である。ヒストンは、（例えば、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、リン酸化によって）修飾されて、周辺のＤＮＡにおける構造変化を誘発し、それにより、ＤＮＡの潜在的に大きい部分の、転写因子、ポリメラーゼなどといった相互作用因子へのアクセス性を制御することができる。単一のヒストンが、多くの異なる方法、および多くの異なる組み合わせで、修飾され得る（例えば、ヒストン３のリジン２７、Ｈ３Ｋ２７、のトリメチル化は、転写抑制のＤＮＡ領域と関連付けられるが、ヒストン３のリジン４、Ｈ３Ｋ４、のトリメチル化は、活性転写のＤＮＡ領域と関連付けられる）。よって、ヒストン修飾活性を有する部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡ構造の部位特異的制御における用途を見出し、標的ＤＮＡの選択領域におけるヒストン修飾パターンを変えるのに使用され得る。このような方法は、研究および臨床両方の適用における用途を見出す。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡが同時に使用されて、同じ標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡ上の異なる場所を同時に修飾する。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、同じ遺伝子または転写物または遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる関係のない遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる、しかし関係のある遺伝子座を標的化する。
【０２６３】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、タンパク質として直接提供される。１つの非限定的な例として、菌類（例えば酵母）は、スフェロプラスト形質転換を用いて外来性タンパク質および／または核酸により形質転換され得る（Kawai et al., Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec;1(6):395-403 : “Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism”；およびTanka et al., Nature. 2004 Mar 18;428(6980):323-8: “Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences”を参照。これらのいずれも、全体として参照によって本明細書に組み込まれる）。よって、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃｐｆ１）は、（ガイドＲＮＡをコード化する核酸を含むかもしくは含まない、またドナーポリヌクレオチドを含むかもしくは含まない）スフェロプラストに組み込まれ得、スフェロプラストは、中身を酵母細胞に導入するのに使用され得る。部位特異的修飾ポリペプチドは、任意の都合の良い方法により細胞に導入され（細胞に提供され）得、このような方法は、当業者に既知である。別の非限定的な例として、部位特異的修飾ポリペプチドは、（例えば、ガイドＲＮＡをコード化する核酸を含むかもしくは含まない、またドナーポリヌクレオチドを含むかもしくは含まない）細胞、例えばゼブラフィッシュ胚の細胞、受精マウス卵母細胞の前核などに直接注入され得る。
【０２６４】
目的の標的細胞
前述した適用のいくつかでは、方法は、（例えば、個体に再導入され得る遺伝子組み換え細胞を生成するため）ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで有糸分裂細胞または有糸分裂後細胞にＤＮＡ開裂、ＤＮＡ修飾、および／または転写調節を誘導するために利用され得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることによって特異性をもたらすので、開示される方法における目的の有糸分裂細胞および／または有糸分裂後細胞は、任意の生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞の真核生物の細胞、植物細胞、藻細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシスガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、クロレラピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、ヤツマタモク（Sargassum patens C. Agardh)など、真菌細胞（例えば酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、刺皮動物、線形動物など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞、霊長類動物由来の細胞、ヒト由来の細胞など）を含み得る。
【０２６５】
任意のタイプの細胞が、目的のものであってよい（例えば、幹細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；任意の段階における胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの胚細胞、例えば、１−細胞、２−細胞、４−細胞、８−細胞期などのゼブラフィッシュ胚など）。細胞は、樹立細胞株由来であってよく、あるいは、初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、導かれ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで限られた回数の培養の継代にわたり増殖する、すなわち分割することができる、細胞および細胞培養物を指すために、本明細書中で互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回、ただし危機的段階を超えない回数、継代されていてもよい培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０回未満の継代の間維持される。標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であり、あるいは、培養下で増殖される。
【０２６６】
細胞が初代細胞である場合、これらは、任意の都合の良い方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス（leukocytapheresis）、密度勾配分離などによって好都合に採取され得るが、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などといった組織由来の細胞は、生検で採取されるのが最も好都合である。適切な溶液が、採取した細胞の分散または懸濁に使用され得る。このような溶液は一般的には、好都合には、一般的に５〜２５ｍＭの低濃度の許容可能な緩衝液と共にウシ胎仔血清または他の天然に存在する要素が補充された、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液などであろう。好都合な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液などを含む。細胞はすぐに使用されてもよく、あるいは、長期間、保管、冷凍されて、解凍され、再利用可能とされてもよい。このような場合、細胞は、通常、１０％のＤＭＳＯ、５０％の血清、４０％の緩衝媒体、またはこのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般的に使用される何らかの他のこのような溶液中で凍結され、凍結した培養細胞を解凍するように一般的に当技術分野で既知の方法で解凍される。
【０２６７】
ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化する核酸
いくつかの実施形態では、方法は、標的ＤＮＡを接触させるか、または細胞（もしくは細胞集団）に、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコード化するヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を導入することを含む。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組み換え型発現ベクター」である。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、組み換え型発現ベクターは、ウイルス構造体、例えば、組み換え型アデノ随伴ウイルス構造体（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組み換え型アデノウイルス構造体、組み換え型レンチウイルス構造体などである。
【０２６９】
適切な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、以下に基づくウイルスベクター：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えばLi et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４、およびＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えばAli et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996；ＷＯ９３／０９２３９におけるSrivastava、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165；およびFlotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えばMiyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）など、を含むがこれらに限定されない。
【０２７０】
多くの適切な発現ベクターが、当業者に知られており、その多くが市販されている。以下のベクターは、例として提供されるものである；真核生物宿主細胞に対して：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主細胞と適合性である限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、制御要素、例えばプロモーターなどの転写制御要素に動作可能に結合される。転写制御要素は、真核生物細胞、例えば哺乳類細胞、または原核生物細胞（例えば細菌もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能的となり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、原核生物および真核生物細胞の両方においてガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御要素に動作可能に結合される。
【０２７２】
利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構造型および誘導型プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなど；前記を参照）（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドは、ＲＮＡとして提供され得る。このような場合、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するＲＮＡは、直接的化学合成により産生され得るか、または、ガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され得る。ＲＮＡをＤＮＡテンプレートから合成する方法は、当技術分野で周知である。場合によっては、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなど）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される。いったん合成されると、ＲＮＡは、標的ＤＮＡに直接接触し得るか、または核酸を細胞に導入するための周知の技術のいずれか（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクションなど）によって細胞に導入され得る。
【０２７４】
ガイドＲＮＡ（ＤＮＡもしくはＲＮＡとして導入される）および／または部位特異的修飾ポリペプチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡとして導入される）および／またはドナーポリヌクレオチドをコード化するヌクレオチドは、十分に開発されたトランスフェクション技術を用いて細胞に提供され得る；例えば、Angel and Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e 11756、およびＱｉａｇｅｎの市販のＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、Ｍｉｍｓ  ＢｉｏのＴｒａｎｓｌＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキットを参照。また、Beumer et al. (2008) Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS 105(50):19821-19826も参照。あるいは、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコード化する核酸は、ＤＮＡベクター上に提供され得る。核酸を標的細胞内に移動させるのに有用な、多くのベクター、例えばプラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルスなどが、利用可能である。核酸を含むベクターは、例えばプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどといったウイルスとして、エピソームに保持され得、または、相同組換えまたはランダムな組み込み、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどといったレトロウイルス由来のベクターを通じて、標的細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【０２７５】
ベクターは、細胞に直接提供され得る。言い換えれば、細胞は、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコード化する核酸を含むベクターと接触し、ベクターは、細胞によって取り込まれる。エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、およびリポフェクションを含む、プラスミドである核酸ベクターと細胞を接触させる方法は、当技術分野で周知である。ウイルスベクター送達のため、細胞は、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコード化する核酸を含むウイルス粒子と接触させられる。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本発明の方法に特に適切である。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥がある」、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における成長を必要とする。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するため、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドへとパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれるべき（エコトロピック、アンホトロピックまたはゼノトロピックな）異なるエンベロープタンパク質を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞についてウイルス粒子の特異性を決定する（マウスおよびラットでエコトロピック；ヒト、犬、およびマウスを含む大部分の哺乳類の細胞型でアンホトロピック；マウス細胞以外の大部分の哺乳類の細胞型でゼノトロピック）。適切なパッケージング細胞株は、細胞が、パッケージングされたウイルス粒子によって標的化されるのを確実にするために使用され得る。再プログラム化因子をコード化する核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞株に導入し、パッケージング株によって生成されたウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知である。核酸は、直接マイクロインジェクション（例えばＲＮＡのゼブラフィッシュ胚への注入）によっても導入され得る。
【０２７６】
ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコード化する核酸を細胞に提供するのに使用されるベクターは、典型的には、目的の核酸の発現、すなわち転写活性化を駆動するための適切なプロモーターを含む。言い換えれば、目的の核酸は、プロモーターに動作可能に結合される。これは、普遍的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−１３−アクチンプロモーター、または誘導型プロモーター、例えば特定の細胞集団で活性であるか、もしくはテトラサイクリンなどの薬剤の存在に反応するプロモーター、を含み得る。転写活性化によって、転写が標的細胞において基礎レベルを超えて少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、さらに一般的には少なくとも約１０００倍だけ、増大されることが意図されている。さらに、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを細胞に提供するのに使用されるベクターは、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を特定するように、標的細胞における選択可能なマーカーをコード化する核酸配列を含み得る。
【０２７７】
ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはキメラの部位特異的修飾ポリペプチドは、代わりに、ＤＮＡに接触するのに使用されるか、またはＲＮＡとして細胞に導入され得る。ＲＮＡを細胞に導入する方法は、当技術分野で既知であり、例えば、直接注入、トランスフェクション、またはＤＮＡの導入に使用される任意の他の方法を含み得る。部位特異的修飾ポリペプチドは、代わりに、ポリペプチドとして細胞に提供され得る。このようなポリペプチドは、オプションとして、生成物の溶解性を高めるポリペプチドドメインに融合され得る。このドメインは、ＴＥＶプロテアーゼにより開裂された、定められたプロテアーゼ開裂部位、例えばＴＥＶ配列を通じて、ポリペプチドに結合され得る。リンカーはまた、１つ以上のフレキシブル配列、例えば１〜１０のグリシン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の開裂は、例えば、０．５〜２Ｍの尿素の存在下、溶解性を高めるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在下などで、生成物の溶解性を維持する緩衝液中で行われる。目的のドメインは、エンドソーム溶解性（endosomolytic）ドメイン、例えばインフルエンザＨＡドメイン；および産生を助ける他のポリペプチド、例えばＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなどを含む。ポリペプチドは、安定性改善のために調合され得る。例えば、ペプチドは、ペグ化され得、ポリエチレノキシ基（polyethyleneoxy group）は、血流中での寿命を延ばす。
【０２７８】
さらに、または代わりに、部位特異的修飾ポリペプチドは、細胞による取り込みを促進するためにポリペプチド浸透性ドメイン（polypeptide permeant domain）に融合され得る。いくつかの浸透性ドメインは、当技術分野で既知であり、ペプチド、ペプチド模倣物、および非ペプチド担体を含む、本発明の非組み込み型（non-integrating）ポリペプチドに使用され得る。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）を含む、ペネトラチンと呼ばれる、キイロショウジョウバエ転写因子アンテナペディア（Antennapaedia）の第３のαヘリックスに由来することができる。別の実施例として、浸透性ペプチドは、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得る、ＨＩＶ−１ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含む。他の浸透性ドメインは、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンなどを含む。（例えば、Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 Apr; 4(2): 87-9 and 446；およびWender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8；転座ペプチドおよびペプトイドの教示のため参照によって特に本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号；２００３００８３２５６号；２００３００３２５９３号；２００３００２２８３１号を参照。）ノナアルギニン（Ｒ９）配列は、特徴づけられている、より効率的なＰＴＤの１つである（Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002）。融合が行われる部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌または結合特徴を最適化するために選択され得る。最適な部位は、日常的な実験によって決定される。
【０２７９】
部位特異的修飾ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または真核生物細胞によって、または原核生物細胞によって産生され得、アンフォールディング、例えば熱変性、ＤＴＴ還元などによってさらに処理され得、また、当技術分野で既知の方法を使用して、さらにリフォールディングされ得る。
【０２８０】
一次配列を変化させない目的の修飾は、ポリペプチドの化学誘導体化、例えば、アクリル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化などを含む。グリコシル化の修飾体、例えば、合成および処理中またはさらなる処理工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを変えることにより、例えば哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素など、グリコシル化に影響する酵素にポリペプチドを暴露することによって、作られるものも、含まれる。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列も含まれる。
【０２８１】
タンパク質分解への抵抗を改善するか、標的配列特異性を変化させるか、溶解特性を最適化するか、タンパク質活性（例えば転写調節活性、酵素活性など）を変えるか、または治療薬としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術および合成化学を用いて修飾されている、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドも本発明に含まれる。このようなポリペプチドの類似体は、天然に存在するＬ−アミノ酸以外、例えばＤ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸の残基を含むものを含む。Ｄ−アミノ酸は、アミノ酸残基の一部またはすべてについて置換され得る。部位特異的修飾ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって、当技術分野で知られるような従来的方法を用いて、調製され得る。さまざまな市販の合成器具、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどの自動合成器、が利用可能である。合成器を使用することにより、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸で置換され得る。特定の配列および調製方法は、利便性、経済学、必要な純度などによって決定される。
【０２８２】
所望の場合、さまざまな基が、合成中または発現中にペプチドに導入され得、これにより、他の分子または表面への結合が可能となる。よって、システインは、チオエーテル、金属イオン複合体に結合するためのヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基などを作るのに使用され得る。
【０２８３】
部位特異的修飾ポリペプチドは、組み換え型合成の従来的方法に従って単離および精製されることもできる。ライセートが、発現宿主から調製され得、ライセートは、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて、精製され得る。大部分では、使用される組成物は、生成物の調製およびその精製の方法に関連する汚染物質との関連で、所望の生成物の少なくとも２０重量％、さらに一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、また治療目的では、一般的には少なくとも約９９．５重量％を構成する。通常、このパーセンテージは、総タンパク量に基づく。ＤＮＡ開裂および組み換え、または標的ＤＮＡへの任意の所望の修飾、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチドへの任意の所望の修飾を誘導するには、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、それらが核酸として導入されてもポリペプチドとして導入されても、約３０分〜約２４時間、例えば１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分〜約２４時間のうちの任意の他の時間にわたって、細胞に提供され、これは、ほぼ毎日から４日ごとの頻度、例えば１．５日ごと、２日ごと、３日ごと、またはほぼ毎日から約４日ごとのうちの任意の他の頻度で繰り返すことができる。薬品は、１回以上、例えば１回、２回、３回、または４回以上細胞に提供され得、細胞は、各接触事象後ある程度の時間、例えば１６〜２４時間、その薬品でインキュベートされ、その後、培地を新しい培地と取り換えて、細胞をさらに培養する。２つ以上の異なる標的化複合体が細胞に提供される場合（例えば、同じかまたは異なる標的ＤＮＡ内部の異なる配列に相補的である２つの異なるガイドＲＮＡ）、複合体は、同時に（例えば２つのポリペプチドおよび／または核酸として）提供されるか、または同時に送達され得る。あるいは、これらは連続して提供され得、例えば、標的化複合体が最初に提供され、その後、第２の標的化複合体が続くなどであるか、またはその逆であってもよい。
【０２８４】
典型的には、有効量のガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドが、標的ＤＮＡまたは細胞に提供されて、標的の修飾を誘導する。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量は、陰性対照、例えば空ベクターまたは無関係のポリペプチドと接触した細胞と比べて、２つの相同配列間で観察される標的の修飾の量の２倍以上の増加を誘導する量である。すなわち、有効量または用量のガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ領域で観察される標的の修飾の量の２倍の増加、３倍の増加、４倍以上の増加、場合によっては、観察される組み換え量の５倍の増加、６倍以上の増加、ときに７倍または８倍以上の増加、例えば、観察される組み換え量の１０倍、５０倍または１００倍以上の増加、場合によっては、２００倍、５００倍、７００倍、または１０００倍以上の増加、例えば５０００倍、または１０，０００倍の増加を誘導する。標的の修飾の量は、任意の好都合な方法で測定され得る。例えば、組換えされると活性レポーターをコード化する核酸を再構成するリピート配列に隣接するガイドＲＮＡの標的化セグメント（標的化配列）に対して相補的配列を含むサイレントレポーター構造体は、細胞に同時遺伝子導入され得、レポータータンパク質の量は、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドと接触した後、例えばガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドと接触してから２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間以上経過した後で評価される。別の、より感受性のアッセイとして、例えば、標的ＤＮＡ配列を含む目的のゲノムＤＮＡ領域での組み換えの程度は、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドと接触した後、例えばガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドと接触してから２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間以上経過した後で、その領域のＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによって評価され得る。
【０２８５】
細胞のガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドとの接触は、任意の培地で、また細胞の生存を促進する任意の培養条件下で起こり得る。例えば、細胞は、ウシ胎仔血清または熱失活ヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された、好都合である任意の適切な栄養培地、例えばイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０中に懸濁され得る。培養物は、細胞が反応性である増殖因子を含み得る。本明細書で定義される増殖因子は、膜貫通受容体への特異的効果を通じて、培養下で、または無傷組織において、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。細胞の生存を促進する条件は、典型的には非相同末端結合および相同組換え修復を許容する。ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列に挿入することが望ましい適用では、挿入されるべきドナー配列を含むポリヌクレオチドも、細胞に提供される。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」によって、部位特異的修飾ポリペプチドにより誘導される、開裂部位において挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、開裂部位のゲノム配列に対して十分な相同関係、例えば開裂部位に隣接する、例えば開裂部位の約５０塩基以下、例えば約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内であるか、または開裂部位にすぐ隣接する、ヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同関係を含んで、ドナーポリヌクレオチドと、それが相同関係を有するゲノム配列との間の相同組換え修復を支援する。ドナーとゲノム配列との間の配列相同関係の約２５、５０、１００、または２００ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド超（または、１０〜２００ヌクレオチドの間、もしくはそれ以上の任意の整数値）が、相同組換え修復を支援する。ドナー配列は、任意の長さ、例えば１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上などであってよい。
【０２８６】
ドナー配列は、典型的には、それが置換するゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同組換え修復を支援するのに十分な相同関係が存在する限り、ゲノム配列に対する少なくとも１つ以上の一塩基変化、挿入、欠失、逆位または転位を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、相同関係の２つの領域に隣接する非相同配列を含み、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同組換え修復は、標的領域での非相同配列の挿入を生じる。ドナー配列は、目的のＤＮＡ領域に相同でなく、目的のＤＮＡ領域に挿入されることが意図されていない配列を含むベクター骨格を含むこともできる。一般的に、ドナー配列の相同領域は、組み換えが所望されるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％の任意の値の配列同一性が存在し得る。ドナー配列は、ゲノム配列と比べて特定の配列差、例えば制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬剤抵抗遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これは、開裂部位でのドナー配列の挿入の成功を評価するのに使用され得、または場合によっては、他の目的で（例えば標的ゲノム遺伝子座での発現を知らせるために）使用され得る。場合によっては、コーディング領域に位置する場合、このようなヌクレオチド配列差は、アミノ酸配列を変化させず、またはサイレントなアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響しない変化）を起こす。あるいは、これらの配列差は、マーカー配列を除去するために後で活性化され得る、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などといった隣接組み換え配列を含み得る。
【０２８７】
ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。線形または円形の形態で細胞に導入され得る。線形の形態で導入される場合、ドナー配列の端部は、当業者に既知の方法で（例えばエキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線形分子の３’末端に追加され、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、１端部または両端部に連結される。例えば、Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889を参照。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護する追加の方法は、末端アミノ基の追加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、および０−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用を含むがこれらに限定されない。線形ドナー配列の末端を保護する代わりとして、配列の追加の長さが、組み換えに影響を及ぼさずに分解され得る相同関係領域の外側に含まれ得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質抵抗をコード化する遺伝子など、追加の配列を有するベクター分子の一部として、細胞に導入され得る。さらに、ドナー配列は、裸核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの物質と複合された核酸として導入され得るか、または、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコード化する核酸について前述したように、ウイルス（例えばアデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
【０２８８】
前述した方法に続いて、目的のＤＮＡ領域は、ｅｘ  ｖｉｖｏで開裂および修飾され、すなわち、「遺伝子組み換えされる」ことができる。いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーが目的のＤＮＡ領域に挿入されている場合、細胞集団は、遺伝子組み換え細胞を残りの集団から分離することによって、遺伝子組み換えを含むものが富化されることができる。この強化の前は、「遺伝子組み換え」細胞は、細胞集団の約１％以上（例えば、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、または２０％以上）を構成するだけであり得る。「遺伝子組み換え」細胞の分離は、使用される選択可能なマーカーに適切な任意の好都合な分離技術により達成され得る。例えば、蛍光マーカーが挿入されている場合、細胞は、蛍光活性化細胞分類によって分離され得るが、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、アフィニティー分離技術、例えば磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに付着した親和性試薬での「パニング」、または他の好都合な技術によって、不均一集団から分離され得る。正確な分離をもたらす技術は、さまざまなな程度の精巧さ、例えば複数のカラーチャネル、低角および鈍角光散乱検出チャンル（low angle and obtuse light scattering detecting channels）、インピーダンスチャネルなどを有し得る、蛍光活性化セルソーターを含む。細胞は、死細胞に関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることにより、死細胞に対して選択され得る。遺伝子組み換え細胞の生存能力に過度に有害でない任意の技術を利用することができる。修飾ＤＮＡを含む細胞が高度に富化された細胞組成物は、このようにして達成される。「高度に富化された」は、遺伝子組み換え細胞が細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、細胞組成物の約９５％以上、または９８％以上であることを意味する。言い換えれば、組成物は遺伝子組み換え細胞の実質的に純粋な組成物であってよい。
【０２８９】
本明細書に記載される方法により産生された遺伝子組み換え細胞は、すぐに使用することができる。あるいは、細胞は、液体窒素温度で凍結されて、長期間保管されてよく、解凍されて、再使用が可能である。このような場合、細胞は、通常、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％の血清、４０％の緩衝培地、または細胞をそのような凍結温度で保存するのに当技術分野で一般的に使用されるような何らかの他のそのような溶液中で凍結され、凍結した培養細胞を解凍するための当技術分野で一般的に既知の方法で解凍される。
【０２９０】
遺伝子組み換え細胞は、さまざまな培養条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。細胞は、培養下で増殖される、すなわち、それらの増殖を促進する条件下で成長され得る。培養培地は、例えば寒天、メチルセルロースなどを含む、液体または半固体であってよい。細胞集団は、通常、ウシ胎仔血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０などの適切な栄養培地で懸濁され得る。培養物は、調節性Ｔ細胞が反応する増殖因子を含み得る。本明細書で定義される増殖因子は、膜貫通受容体への特異的効果を通じて、培養下で、または無傷組織において、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。
【０２９１】
このようにして遺伝子組み換えされた細胞は、例えば疾患を治療するため、または抗ウイルス性、抗病原性、もしくは抗ガン治療として、遺伝子療法などの目的で、農業で遺伝子組み換え生物を産生するために、または生物学的研究のために、被験体に移植され得る。被験体は、新生子、幼若体、または成体であってよい。特に目的とするのは、哺乳動物の被験体である。本発明の方法で治療され得る哺乳類種は、イヌおよびネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；など、ならびに霊長類の動物、特にヒトを含む。動物モデル、特に小型哺乳類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ目（例えばウサギ）など）を、実験的調査に使用することができる。
【０２９２】
細胞は、例えばそれらの増殖および／またはそれらが移植されている組織における構成を支援するため、単独で、または適切な基質もしくはマトリックスと共に、被験体に与えられ得る。通常、少なくとも１×１０３の細胞、例えば５×１０３の細胞、１×１０４の細胞、５×１０４の細胞、１×１０５の細胞、１×１０６の細胞またはそれ以上が投与される。細胞は、以下のルート：非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、または髄液中、のうちのいずれかによって被験体に導入され得る。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。局所送達、すなわち障害部位への送達の方法の例は、例えば髄腔内送達のためにオマヤレザバーを通じたもの（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２２，９８２号および５，３８５，５８２号を参照）；例えば関節内への、例えば注射器によるボーラス注射によるもの；例えば対流を用いた、例えばカニューレ挿入による持続点滴によるもの（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７０２５４８４２号を参照）；または細胞が可逆的に固定されているデバイスを植え込むことによるもの（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８００８１０６４号および２００９０１９６９０３号を参照）を含む。細胞は、遺伝子導入動物（例えば遺伝子導入マウス）を作り出す目的で、胚（例えば胚盤胞）に導入されてもよい。
【０２９３】
多重遺伝子編集（Multiplex Gene Editing）
よく研究されたタイプＩ、ＩＩ、、ＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、成熟ｃｒＲＮＡの産生および侵入核酸の干渉のため、１組の別個のＣａｓタンパク質を伴う。タイプＩおよびＩＩＩでは、Ｃａｓ６またはＣａｓ５ｄがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する。成熟ｃｒＲＮＡは次に、Ｃａｓタンパク質の複合体（タイプＩではＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３；タイプＩＩＩではＣｓｍまたはＣｍｒ）をガイドし、侵入ＤＮＡまたはＲＮＡを標的化および開裂する。タイプＩＩでは、ＲＮａｓｅＩＩＩは、Ｃａｓ９の存在下でｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対合したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する。成熟ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖はＣａｓ９をガイドして、標的ＤＮＡを開裂する。
【０２９４】
他方、タイプＶ−ＡのＣｐｆ１は、ｃｒＲＮＡ生合成および干渉における二重ヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、リピート内に形成されたヘアピン構造の４ｎｔ上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂し、中間ｃｒＲＮＡを生成する。成熟リピート‐スペーサーｃｒＲＮＡによりガイドされるＣｐｆ１は、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断をもたらす。よって、Ｃｐｆ１は、ＲＮＡを処理しＤＮＡを開裂するので、多重化を行うのに理想的なタンパク質である。
【０２９５】
多重化とは、ＤＮＡを複数回、複数の場所で編集することを意味する。
【０２９６】
Ｃａｓ９で多重化するために、例えば、外から供給されるか、または細胞またはシステム内部で内因的に独立して発現した、複数のガイドＲＮＡが必要である。しかしながらＣｐｆ１では、１つのプロモーターの制御下で１つのＣｐｆ１酵素と１つのリピート‐スペーサーアレイとを必要とするに過ぎない。Ｃｐｆ１はその後、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂し、単一ガイドＲＮＡを産生し、これは、その後、Ｃｐｆ１をゲノムに標的化することができる。ここに記載するシステムの１つの利点は、ガイドＲＮＡとも呼ばれるすべてのｃｒＲＮＡが同じ細胞に存在することであり、このことは、意図する多重編集の多く、大部分またはすべてが行われる細胞の割合を大幅に増やし、ただ１つのまたは限られた数の意図する多重編集事象が起こる細胞の割合を大幅に減らす。さらに、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ内のｃｒＲＮＡ要素の場所および構造は、Ｃｐｆ１のエンドヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす。したがって、リピート‐スペーサーであるかスペーサー−リピートであるかに関係なく、構造、リピートの長さもしくは場所、ステムループの性質、異種ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ分子のｃｒＲＮＡ配列に対する化学修飾、その間の介在配列もしくは化学構造、または順序、または他の要因は、異種ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのｃｒＲＮＡスペーサー配列によって特定された部位のそれぞれでエンドヌクレアーゼ活性を修飾するように調節または操作され得ることが、ここでは企図される。
【０２９７】
本発明の追加の態様は、５’オーバーハングを開裂末端に残すように二本鎖ＤＮＡを開裂するＣｐｆ１または他のタイプＶ−Ａのエンドヌクレアーゼのとの関連で、多重編集に由来する。各開裂部位は、独自のｇＲＮＡ配列によって導かれる。したがって、結果として得られる５’オーバーハングは、開裂部位を特定する特定のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡに相対的に独自かつ特異的である５ヌクレオチドの配列である。５’オーバーハングの相対的な独自性は、４ｅ５であるか、または１０２４開裂部位ごとに１回起こると予測される（ゲノムにおけるヌクレオチドのランダム変動を前提として）。２つ以上のｇＲＮＡ（もしくはｃｒＲＮＡの２つ以上のｇＲＮＡ配列）が多重編集に使用される環境では、結果として得られる５’オーバーハング配列は、染色体転座の形成で生じるように、異種末端ではなく、意図されるパートナー開裂部位（partner cleavage sites）でリアニールする可能性が高い。したがって、Ｃｐｆ１の使用は、多重編集中、複数の遺伝子座での遺伝子中断を改善し、染色体転座の発生を減少させるための、多重ゲノム編集の好適な方法となり得る。特定の細胞型が内因性の一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を含み得ることが理解され、５’一本鎖ＤＮＡオーバーハングは、部分的または完全に開裂され得、その結果、５’オーバーハングがないか、または部分的な５’オーバーハングを生じる。非相同の５’オーバーハング配列の存在または活性を調節する一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性のこのシステムまたは他の細胞システムは、異種末端結合および結果として得られる染色体転座の可能性を減少させるため、例えば生理学的または薬理学的手段または他の手段によって、操作または利用され得る、動力学的または生理学的特徴を有し得ることが、予測される。
【０２９８】
多重化方法の非限定的な例は、細胞の複数の場所で遺伝子を編集する方法であり、これは、ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはａＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸を細胞に導入することと；ｉｉ）ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコード化された１つ以上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸を、１つのプロモーターの制御下で細胞に導入することと、から本質的になり、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、リピート‐スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含み、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ステムループ構造の上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂して、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡを生成し、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡは、２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと処理され、２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡはそれぞれ、Ｃｐｆ１ポリペプチドをガイドして、２つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）をＤＮＡ内に生じる。例えば、この方法は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含み得る。１つ以上のポリヌクレオチドドナーテンプレートは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに結合され得る。ＤＮＡは、相同組換え修復、非相同末端結合、またはマイクロホモロジー媒介末端結合、または他の生物学的プロセスによって２つ以上のＤＳＢそれぞれにおいて修復される。ＤＮＡは、ＤＮＡの欠失、挿入、または置換によって２つ以上のＤＳＢそれぞれにおいて補正される。あるいは、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼまたは１つ以上の他の生物活性部分に融合されたＤＮａｓｅ欠乏Ｃｐｆ１ポリペプチドを使用して、部位特異的に生物学的プロセスに影響を及ぼす場合、修飾Ｃｐｆ１ポリペプチドは、単一の異種ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、または単一の異種核酸を１つのプロモーターの制御下で同時投与することによってＤＮＡの特定の部位に導かれ得る。
【０２９９】
多重化組成物の例は、細胞の複数の場所で遺伝子を編集する組成物であり、これは、ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはａＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸と；ｉｉ）細胞内に１つのプロモーターの制御下でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸と、から本質的になり、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、リピート‐スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含む。組成物は、１つ以上のポリヌクレオチドドナーテンプレートをさらに含み得る。１つ以上のポリヌクレオチドドナーテンプレートは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに結合され得る。
【０３００】
本発明の追加の態様は、５’オーバーハングを開裂末端に残すように二本鎖ＤＮＡを開裂するＣｐｆ１または他のタイプＶ−Ａのエンドヌクレアーゼのとの関連で、多重編集に由来する。各開裂部位は、後でＣｐｆ１によってｇＲＮＡへと処理される、ＣＲＩＳＰＲアレイ（ｐｒｅ  ｃｒＲＮＡ）内の独自のｇＲＮＡ配列または独自の配列によって導かれる。したがって、結果として得られる５’オーバーハングは、開裂部位を特定する特定のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡに相対的に独自かつ特異的である５ヌクレオチドの配列である。５’オーバーハングの相対的な独自性は、４の５乗であるか、または言い換えれば、１０２４開裂部位ごとに１回起こると予測される（ゲノムにおけるヌクレオチドのランダム変動を前提として）。２つ以上のｇＲＮＡ（もしくはｃｒＲＮＡの２つ以上のｇＲＮＡ配列）が多重編集に使用される環境では、結果として得られる５’オーバーハング配列は、染色体転座の形成で生じるような、異種末端ではなく、元のパートナー開裂部位でリアニールする可能性が高い。したがって、Ｃｐｆ１の使用は、多重編集中、複数の遺伝子座での遺伝子中断を改善し、染色体転座の発生を減少させるための、多重ゲノム編集の好適な方法となり得る。特定の細胞型が内因性の一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を含み得ることが理解され、５’一本鎖ＤＮＡオーバーハングは、部分的または完全に開裂され得、その結果、５’オーバーハングがないか、または部分的な５’オーバーハングを生じる。非相同の５’オーバーハング配列の存在または活性を調節する一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性のこのシステムまたは他の細胞システムは、異種末端結合および結果として得られる染色体転座の可能性を減少させるため、例えば生理学的または薬理学的手段または他の手段によって、操作または利用され得る、動力学的または生理学的特徴を有し得ることが、予測される。
【０３０１】
追加の方法
本発明は、成熟ｃｒＲＮＡを、Ｃｐｆ１  ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を導くのに利用可能とするように、Ｃｐｆ１ポリペプチドによってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡへと処理する方法を含む。方法のいくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、成熟ｃｒＲＮＡとより容易に合成され、そのため、このｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡからの同じＣｐｆ１ポリペプチドで処理された結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を導くのに容易に利用可能となる。方法のいくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ発現構造体内部で異種配列が１つ以上のｃｒＲＮＡ配列に５’または３’で組み込まれている、修飾ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド配列から１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡを開裂、単離、または精製することができる。方法のいくつかの実施形態では、異種配列は、安定性、半減期、発現レベルもしくはタイミング、Ｃｐｆ１ポリペプチドもしくは標的ＤＮＡ配列との相互作用、または当技術分野で既知の任意の他の物理的もしくは生化学的特徴を修飾するために、組み込まれ得る。方法のいくつかの実施形態では、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列は、安定性、半減期、発現レベルもしくはタイミング、Ｃｐｆ１ポリペプチドもしくは標的ＤＮＡ配列との相互作用、または任意の他の物理的もしくは生化学的特徴を別様に修飾するために、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列内部の２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡ配列の差異的調節をもたらすように修飾される。
【０３０２】
本発明は、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法を含み、この方法は、１つ以上のｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、無傷の、または部分的もしくは完全に欠陥のあるＣｐｆ１ポリペプチドまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ部分を、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼに結合させてエンドヌクレアーゼ開裂を導くことを含む。いくつかの実施形態では、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼと結合されたＣｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡとしてのまたはＤＮＡとしてコード化された異種ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと共に、１つのプロモーターの制御下で細胞に導入され、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、リピート‐スペーサーアレイを含み、スペーサーは、ＤＮＡの標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートはステムループ構造を含み、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、リピートのステムループ構造の上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂して、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡを生成する。
【０３０３】
本発明は、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法を含み、この方法は、１つ以上のｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、無傷の、または部分的もしくは完全に欠陥のあるＣｐｆ１ポリペプチドまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ部分を、ドナーの一本鎖または二本鎖ＤＮＡドナーテンプレートに結合して外来性ＤＮＡ配列の相同組換えを促進することを含む。
【０３０４】
また、本発明は、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法を含み、この方法は、１つ以上のｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、無傷の、または部分的もしくは完全に欠陥のあるＣｐｆ１ポリペプチドまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ部分を、転写活性因子もしくは抑制因子、またはメチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、もしくはデアセチラーゼなどの後成的な修飾因子に結合させるか、あるいは、シグナル伝達または検出して、発現またはシグナル伝達、検出または活性化の調節を容易にすることを含む。
【０３０５】
本発明は、遺伝子編集の特異的部位に、ポリヌクレオチドドナーテンプレートを導く方法を含み、この方法は、ポリヌクレオチドドナーテンプレートをｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに結合させることを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、二本鎖である。ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、イオン結合、共有結合、または化学的リンカーなどの当技術分野で既知の任意の手段によって、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに結合され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドドナーテンプレートは、ｃｒＲＮＡに結合されたままであるか、またはガイドＲＮＡ内にとどまる。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡを開裂し、そのため、ポリヌクレオチドドナーテンプレートを遊離させて、相同組換え修復を促進する。本発明は、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡに結合されたポリヌクレオチドドナーテンプレートを含む組成物も含む。
【０３０６】
本発明はまた、細胞のＤＮＡを標的化、編集、または操作する方法を含み、この方法は、１つ以上のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ分子によって１つ以上の特異的ＤＮＡ標的部位に導かれるように、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡをドナー一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドドナーテンプレートに結合させることを含み、このため、ドナーテンプレートは、Ｃｐｆ１ポリペプチドによってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡから開裂され、よって、ドナーテンプレートによる相同組換え修復を促進する。
【０３０７】
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはＣｐｆ１ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当技術分野で既知のウイルス性または非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。
【０３０８】
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正電荷ペプチド、小分子ＲＮＡ−抱合体、アプタマー−ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ−融合タンパク質複合体を含むがこれらに制限されない、非ウイルス性送達ビヒクルによって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルが、Peer and Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011)に記載されている（これは、他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達ビヒクルに焦点を当てている）。
【０３０９】
組み換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、送達に使用され得る。送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能を含む、パッケージされるＡＡＶゲノムが細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当技術分野では標準的である。ｒＡＡＶの生成は、以下の成分が単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と表示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、ｒＡＡＶゲノムに存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組み換え型ウイルスが引き出され得る任意のＡＡＶセロタイプ由来であってよく、また、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲとは異なるＡＡＶセロタイプ由来であってよく、ＡＡＶセロタイプＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、およびＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに制限されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
【表４】
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【０３１０】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生成のための必要な成分をすべて安定的に発現する細胞株を作り出すことである。例えば、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がないｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、および選択可能なマーカー、例えばネオマイシン抵抗遺伝子、は、細胞のゲノムに一体化される。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（GC tailing）（Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081）、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含む合成リンカーの追加（Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73）などの処置によって、または直接的な平滑末端ライゲーション（Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666）によって、細菌プラスミドに導入されてきた。パッケージング細胞株にはその後、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスが侵入する。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大量生産に適していることである。適切な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
【０３１１】
ｒＡＡＶ生成の一般的原理は、例えば、以下で検討されている：Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539；およびMuzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129。さまざまなアプローチが、以下に記載されている：Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988)；およびLebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；米国特許第６，２５８，５９５号。
【０３１２】
ＡＡＶベクターセロタイプは、標的細胞型に適合され得る。例えば、以下の例示的な細胞型が、とりわけ示されたＡＡＶセロタイプによって形質導入される。
【表５】
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【０３１３】
被験体への治療薬の投与回数は、さまざまであってよい。被験体への遺伝子組み換え細胞の導入は、単発現象であってよいが、状況によっては、このような治療薬は、限られた期間にわたる改善を誘発し、継続する一連の反復治療を必要とする場合がある。他の状況では、効果が観察される前に、遺伝子組み換え細胞の複数回投与が必要とされ得る。厳密なプロトコルは、疾患または状態、疾患の病期、および治療されている個別の被験体のパラメータによって決まる。
【０３１４】
本開示の他の態様では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、やはり、例えば疾患を治療するため、または抗ウイルス性、抗病原性、もしくは抗ガン治療として、遺伝子療法などの目的で、農業における遺伝子組み換え生物の産生のため、または生物学的研究のために、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞ＤＮＡを修飾するのに使用される。これらのｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、個体に直接投与される。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、ペプチド、小分子および核酸を被験体に投与するための当技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれかによって、投与され得る。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、さまざまな製剤に組み込まれ得る。さらに具体的には、本発明のガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な薬学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせることによって、薬学的組成物へと調剤され得る。
【０３１５】
薬学的製剤は、薬学的に許容可能なビヒクル中に存在する、１つ以上のガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドを含む組成物である。「薬学的に許容可能なビヒクル」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている、ヒトなどの哺乳類に使用される薬局方に記載された、ビヒクルであってよい。用語「ビヒクル」は、本発明の化合物が哺乳類への投与のために一緒に調剤される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指す。このような薬学的ビヒクルは、脂質、例えばリポソーム、例えば、リポソームデンドリマー；ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ごま油など、食塩水といった、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油などの液体；アラビアゴム、ゼラチン、でんぷんのり、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などであってよい。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を使用することができる。薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射、吸入剤、ゲル、ミクロスフェア、エアロゾルなど、固体、半固体、液体またはガスの形態の製剤へと調剤され得る。したがって、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの投与は、経口、舌下、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内などの投与を含む、さまざまな方法で達成され得る。活性薬剤は、投与後全身性となってよく、または、局所投与、壁内投与の使用、もしくは植え込み部位で活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって、局所化され得る。活性薬剤は、即時活性のために調剤され得るか、または、持続放出のために調剤され得る。
【０３１６】
一部の状況、特に中枢神経系の状況では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬剤を調剤する必要があり得る。ＢＢＢを通じた薬剤送達の１つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエンなどの浸透手段によって、またはブラジキニンなどの血管作動性物質の使用により生化学的に、ＢＢＢを破壊することを伴う。脳腫瘍に特異的な薬剤を標的化するためにＢＢＢ開放を用いる可能性も、オプションである。ＢＢＢ破壊薬は、本発明の治療組成物が血管内注射により投与される場合に、その組成物と同時投与され得る。ＢＢＢを経由する他の戦略は、カベオリン１媒介経細胞輸送、グルコースおよびアミノ酸担体などの担体介在性トランスポーター、インスリンもしくはトランスフェリンのための受容体介在性経細胞輸送、ならびにｐ−グリコタンパク質などの能動流出トランスポーターを含む、内因性の輸送システムの使用を伴い得る。能動輸送部分は、血管の内皮壁を横切る輸送を促進するために本発明で使用される治療化合物に接合され得る。あるいは、ＢＢＢの後ろでの治療薬の薬剤送達は、局所送達によるもの、例えば髄腔内送達によるもの、例えばオマヤレザバーを通じたもの（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２２，９８２号および５３８５５８２号を参照）；ボーラス注射によるもの、例えば注射器によるもの、例えば硝子体内的または頭蓋内的なもの；持続注入によるもの、例えばカニューレ挿入によるもの、例えば対流によるもの（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７０２５４８４２号を参照）；または薬剤が可逆的に付着している装置を植え込むことによるもの（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８００８１０６４号および２００９０１９６９０３号を参照）であってよい。
【０３１７】
典型的には、有効量のガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドが提供される。ｅｘ  ｖｉｖｏの方法について前述したように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量は、陰性対照、例えば空ベクターまたは無関係のポリペプチドと接触した細胞と比べて、２つの相同配列間で観察される組み換え量の２倍以上の増加を誘導する量である。組み換え量は、例えば前述したような、また当技術分野で知られるような、任意の好都合な方法によって測定され得る。投与されるガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効用量の計算は、当業者の技能の範囲内であり、当業者にとっては慣例であろう。投与される最終的な量は、投与経路によって決まり、また、治療される疾患または状態の性質によって決まる。
【０３１８】
特定の患者に与えられる有効量は、さまざまな要因によって決まり、そのいくつかは、患者ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じ、病状の進行を停止または逆転させるために患者に投与する治療薬の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データ、およびその薬剤について利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体への最大安全用量を決定することができる。例えば、治療組成物が投与されている流体（body of fluid）が多ければ、静脈内投与用量は、髄腔内投与用量より多くなり得る。同様に、身体から素早く除去される組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、または反復用量で、投与され得る。通常の技術を使用すれば、有能な臨床医は、日常の臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。
【０３１９】
薬物に含めるため、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な商業的供給源から得ることができる。一般的な提案として、用量当たりの、非経口で投与されるガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの薬学的に有効な総量は、用量反応曲線により測定され得る範囲内にある。
【０３２０】
ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療薬、すなわち、治療的投与に使用されるガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドの調剤は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌ろ過膜（例えば、０．２μｍの膜）を通したろ過によって、容易に達成される。治療組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有するコンテナ、例えば、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルの中に入れられる。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療薬は、単位用量または多用量コンテナ、例えば、密封されたアンプルまたはバイアル内に、水溶液として、または再構成される凍結乾燥製剤として、保管され得る。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬバイアルに、化合物の無菌ろ過１％（ｗ／ｖ）水溶液を５ｍＬ入れ、結果として得られた混合物を凍結乾燥する。輸液は、静菌性の注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することにより、準備される。
【０３２１】
薬学的組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒトに投与するための薬学的組成物を調剤するのに一般的に用いられるビヒクルとして定義される、希釈剤の薬学的に許容可能な非毒性担体を含み得る。希釈剤は、組み合わせ物の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝用水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス液である。さらに、薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物はまた、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤、湿潤剤、および洗剤など、生理学的条件に近づけるために追加の物質を含み得る。
【０３２２】
組成物はまた、例えば抗酸化物質などの、さまざまな安定剤のいずれかを含み得る。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を高めるか、または薬理学的特性を別様に高める（例えば、ポリペプチドの半減期を増大する、その毒性を低減する、可溶性または取り込みを高める）さまざまな周知の化合物と合成され得る。そのような修飾または合成物質の例は、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩を含む。組成物の核酸またはポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ属性を高める分子とも合成され得る。そのような分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質を含む。
【０３２３】
さまざまなタイプの投与に適切な製剤に関するさらなるガイダンスを、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)で見ることができる。薬剤送達の方法に関する寸評については、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照。
【０３２４】
薬学的組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。活性成分の毒性および治療効果は、細胞培養および／または実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定され得、これは、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定することを含む。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きい治療指数を示す治療が好ましい。
【０３２５】
細胞培養および／または動物実験から得られるデータは、ヒトに対するさまざまな投薬量を処方するのに使用され得る。活性成分の投薬量は、典型的には、毒性の低いＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。薬学的組成物を調剤するのに使用される成分は、好ましくは純度が高いものであり、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）グレード、一般的に少なくとも分析グレード、さらに典型的には少なくとも薬学グレード）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用が意図される組成物は、通常無菌である。所与の化合物が使用前に合成されなければならない範囲で、結果として生じる生成物は、典型的には、合成または精製プロセス中に存在し得る、あらゆる潜在的に毒性の物質、特にあらゆるエンドトキシンを実質的に含まない。非経口投与のための組成物は、やはり無菌であり、実質的に等張で、ＧＭＰ条件下で作られる。
【０３２６】
特定の患者に与えられる治療組成物の有効量は、さまざまな要因によって決まり、その要因のいくつかは、患者ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じ、病状の進行を停止または逆転させるために患者に投与する治療薬の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データ、およびその薬剤について利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体への最大安全用量を決定することができる。例えば、治療組成物が投与されている流体が多ければ、静脈内投与用量は、髄腔内投与用量より多くなり得る。同様に、身体から素早く除去される組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、または反復用量で、投与され得る。通常の技術を使用すれば、有能な臨床医は、日常の臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。
【０３２７】
遺伝子組み換え宿主細胞
本開示は、単離された遺伝子組み換え宿主細胞を含む、遺伝子組み換え宿主細胞を提供し、遺伝子組み換え宿主細胞は、以下を含む（以下により遺伝子組み換えされている）：１）外来性ガイドＲＮＡ；２）ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸；３）外来性の部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾すなわち突然変異した、または変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１；など）；４）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸；または５）これらの任意の組み合わせ。遺伝子組み換え細胞は、宿主細胞を、例えば：１）外来性ガイドＲＮＡ；２）ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸；３）外来性の部位特異的修飾ポリペプチド；４）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸；または５）これらの任意の組み合わせで遺伝子組み換えすることによって生成される。
【０３２８】
標的細胞となるのに適したすべての細胞は、遺伝子組み換え宿主細胞となるのにも適している。例えば、目的の遺伝子組み換え宿主細胞は、任意の生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞の真核生物生物の細胞、植物細胞、藻細胞、例えばボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシスガディタナ、クロレラピレノイドサ、ヤツマタモクなど、真菌細胞（例えば酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えばショウジョウバエ、刺胞動物、刺皮動物、線形動物など）の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）の細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、ヒト以外の霊長類の動物、ヒトなど）の細胞であってよい。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾すなわち突然変異した、または変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１；など）で、遺伝子組み換えされている。遺伝子組み換え宿主細胞のＤＮＡは、細胞にガイドＲＮＡ（または、修飾されるゲノムの場所／配列を決定する、ガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡ）およびオプションとしてドナー核酸を導入することによって、修飾のために標的化され得る。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、誘導型プロモーター（例えばヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなど）に動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）に動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、構造型プロモーターに動作可能に結合される。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、原核生物細胞であるか、または原核生物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、細菌細胞であるか、または細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、古細菌細胞であるか、または古細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、真核生物細胞であるか、または真核生物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、植物細胞であるか、または植物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、動物細胞であるか、または動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、無脊椎動物細胞であるか、または無脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、脊椎動物細胞であるか、または脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、哺乳類細胞であるか、または哺乳類細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、齧歯類細胞であるか、または齧歯類細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する。
【０３３１】
本開示は、遺伝子組み換え細胞の子孫をさらに提供し、子孫は、それが由来する遺伝子組み換え細胞と同じ外来性核酸またはポリペプチドを含み得る。本開示は、遺伝子組み換え宿主細胞を含む組成物をさらに提供する。
【０３３２】
遺伝子組み換え幹細胞および遺伝子組み換え前駆細胞
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、遺伝子組み換え幹細胞または前駆細胞である。適切な宿主細胞は、例えば幹細胞（成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞など）および前駆細胞（例えば心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）を含む。適切な宿主細胞は、例えば齧歯類の幹細胞、齧歯類の前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞などを含む、哺乳類の幹細胞および前駆細胞を含む。適切な宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ宿主細胞、例えば単離された宿主細胞を含む。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、外来性ガイドＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、外来性の部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾すなわち突然変異した、または変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１；など）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、１）ガイドＲＮＡおよび２）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸を含む。
【０３３４】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、図１の配列のいずれか、または少なくとも１００、１５０、２００、３００、３５０、４００、もしくは５００アミノ酸長である、その活性部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、活性部分は、ＲＮａｓｅドメインである。他の実施形態では、活性部分は、ＤＮａｓｅドメインである。
【０３３５】
組成物
本開示は、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的修飾ポリペプチドを含む組成物を提供する。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、キメラのポリペプチドである。組成物は、本開示の方法、例えば、標的ＤＮＡの部位特異的修飾のための方法；標的ＤＮＡに関連するポリペプチドの部位特異的修飾のための方法などを実行するのに有用である。
【０３３６】
ガイドＲＮＡを含む組成物
本開示は、ガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。組成物は、ガイドＲＮＡに加えて：塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ＭＥＳナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗剤など；ヌクレアーゼ阻害剤；などのうちの１つ以上を含み得る。例えば、場合によっては、組成物は、ガイドＲＮＡと、核酸を安定させるための緩衝液と、を含む。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、組成物中に存在するガイドＲＮＡは、純粋であり、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％超純粋であり、「純度（％）」は、ガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡの産生中に存在し得る他の高分子、または汚染物質を、列挙したパーセントだけ含まないことを意味する。
【０３３８】
キメラのポリペプチドを含む組成物
本開示は、キメラのポリペプチドを含む組成物を提供する。組成物は、ガイドＲＮＡに加えて：塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳなど；可溶化剤；洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗剤など；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えばジチオスレイトール）などのうちの１つ以上を含み得る。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、組成物中に存在するキメラのポリペプチドは、純粋であり、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％超純粋であり、「純度（％）」は、部位特異的修飾ポリペプチドが、キメラのポリペプチドの産生中に存在し得る他のタンパク質、他の高分子、または汚染物質を、列挙したパーセントだけ含まないことを意味する。
【０３４０】
ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む組成物
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡまたはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチド；およびｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドを含む、組成物を提供する。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドである。他の場合では、部位特異的修飾ポリペプチドは、天然に存在する部位特異的修飾ポリペプチドである。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を示す。他の場合では、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾する酵素活性を示す。さらに他の場合では、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡの転写を調節する。
【０３４１】
本開示は、（ｉ）前述したようなガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドであって、ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）部位特異的な酵素活性を示す活性部分と、を含む、部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドと、を含み、酵素活性の部位はガイドＲＮＡによって決定される、組成物を提供する。
【０３４２】
場合によっては、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡであって、ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ガイドＲＮＡと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）部位特異的な酵素活性を示す活性部分と、を含む、部位特異的修飾ポリペプチドと、を含み、酵素活性の部位はガイドＲＮＡによって決定される。
【０３４３】
他の実施形態では、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドであって、ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）部位特異的な酵素活性を示す活性部分と、を含む、ポリヌクレオチドと、を含み、酵素活性の部位はガイドＲＮＡによって決定される。
【０３４４】
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドであって、ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）標的ＤＮＡの転写を調節する活性部分と、を含む、部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドと、を含み、標的ＤＮＡ内部の転写が調節された部位は、ガイドＲＮＡによって決定される、組成物を提供する。
【０３４５】
例えば、場合によっては、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡであって、ガイドＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ガイドＲＮＡと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）標的ＤＮＡの転写を調節する活性部分と、を含む、部位特異的修飾ポリペプチドと、を含み、標的ＤＮＡ内部の転写が調節された部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。
【０３４６】
別の実施例として、場合によっては、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドであって、ガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ＤＮＡポリヌクレオチドと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）標的ＤＮＡの転写を調節する活性部分と、を含む、ポリヌクレオチドと、を含み、標的ＤＮＡ内部の転写が調節された部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。組成物は、ｉ）ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチド；およびｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドに加えて、：塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳなど；可溶化剤；洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗剤など；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えばジチオスレイトール）などのうちの１つ以上を含み得る。
【０３４７】
場合によっては、組成物の成分は、個々に純粋であり、例えば成分はそれぞれ、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも９９％純粋である。場合によっては、組成物の個々の成分は、組成物に加えられる前に純粋である。
【０３４８】
例えば、いくつかの実施形態では、組成物中に存在する部位特異的修飾ポリペプチドは純粋であり、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％超純粋であり、「純度（％）」は、部位特異的修飾ポリペプチドが、部位特異的修飾ポリペプチドの産生中に存在し得る他のタンパク質（例えば部位特異的修飾ポリペプチド以外のタンパク質）、他の高分子、または汚染物質を、列挙したパーセントだけ含まないことを意味する。
【０３４９】
キット
本開示は、方法を実行するためのキットを提供する。キットは、部位特異的修飾ポリペプチド；部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含む核酸；ガイドＲＮＡ；ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸、のうちの１つ以上を含み得る。キットは、部位特異的修飾ポリペプチド；部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含む核酸；ガイドＲＮＡ；ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸、のうちの２つ以上を含む複合体を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、部位特異的修飾ポリペプチド、またはこれをコード化するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは：（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分；および（ｂ）標的ＤＮＡ内部で転写を調節する活性部分を含み、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内部で転写が調節された部位を決定する。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、ヌクレアーゼ活性の減少または不活化を示す。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドを含む。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、キットは、部位特異的修飾ポリペプチド、またはこれをコード化するポリヌクレオチドと、部位特異的修飾ポリペプチドを再構成および／または希釈する試薬と、を含む。他の実施形態では、キットは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含む核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含む核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）と；部位特異的修飾ポリペプチドを再構成および／または希釈する試薬と、を含む。
【０３５１】
部位特異的修飾ポリペプチド、またはこれをコード化するポリヌクレオチドを含むキットは、１つ以上の追加の試薬をさらに含んでよく、このような追加の試薬は、部位特異的修飾ポリペプチドを細胞に導入する緩衝液；洗浄緩衝液；コントロール試薬；コントロール発現ベクターもしくはＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡから部位特異的修飾ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するための試薬など、から選択され得る。場合によっては、キットに含まれる部位特異的修飾ポリペプチドは、前述したように、キメラの部位特異的修飾ポリペプチドである。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、キットは、ガイドＲＮＡ、またはこれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドを含み、ガイドＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡ、またはこれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドであって、ガイドＲＮＡは、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ガイドＲＮＡ、またはこれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドと；（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはこれをコード化するポリヌクレオチドであって、部位特異的修飾ポリペプチドは、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）部位特異的な酵素活性を示す活性部分と、を含む、部位特異的修飾ポリペプチド、またはこれをコード化するポリヌクレオチドと、を含み、酵素活性の部位はガイドＲＮＡによって決定される。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドの活性部分は、酵素活性を示さない（例えば突然変異によって、不活化ヌクレアーゼを含む）。場合によっては、キットは、ガイドＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドを含む。他の場合では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸と；（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む。別の実施例として、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドであって、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するＤＮＡポリヌクレオチドと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドであって、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）標的ＤＮＡ内部で転写を調節する活性部分と、を含む、部位特異的修飾ポリペプチド、またはそれをコード化するポリヌクレオチドと、を含んでよく、標的ＤＮＡ内部の転写が調節された部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。場合によっては、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡ；および部位特異的修飾ポリペプチドを含む。他の場合では、キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸と；（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸と、を含む。本開示は、（１）組み換え型発現ベクターであって、（ｉ）ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡが（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）部位特異的な酵素活性を示す活性部分と、を含む、ヌクレオチド配列と、を含み、酵素活性の部位はガイドＲＮＡによって決定される、組み換え型発現ベクターと、（２）発現ベクターを再構成および／または希釈するための試薬と、を含むキットを提供する。
【０３５３】
本開示は、（１）組み換え型発現ベクターであって、（ｉ）ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡが（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；（ｂ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であって、部位特異的修飾ポリペプチドが、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）標的ＤＮＡの転写を調節する活性部分と、を含む、ヌクレオチド配列と、を含み、標的ＤＮＡ内部の転写が調節された部位は、ガイドＲＮＡによって決定される、組み換え型発現ベクターと、（２）組み換え型発現ベクターを再構成および／または希釈するための試薬と、を含むキットを提供する。
【０３５４】
本開示は、（１）組み換え型発現ベクターであって、（ｉ）標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと、（ｉｉ）部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を含む、組み換え型発現ベクターと、（２）組み換え型発現ベクターを再構成および／または希釈するための試薬と、を含むキットを提供する。キットのいくつかの実施形態では、キットは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む組み換え型発現ベクターを含み、部位特異的修飾ポリペプチドは、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）部位特異的な酵素活性を示す活性部分と、を含み、酵素活性の部位はガイドＲＮＡによって決定される。このキットの他の実施形態では、キットは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む組み換え型発現ベクターを含み、部位特異的修飾ポリペプチドは、（ａ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；（ｂ）標的ＤＮＡの転写を調節する活性部分と、を含み、標的ＤＮＡ内部の転写が調節された部位は、ガイドＲＮＡによって決定される。
【０３５５】
前述したキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、単一分子ガイドＲＮＡを含む。前述したキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、２つ以上の単一分子ガイドＲＮＡを含む。前述したキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（例えば２つ以上のガイドＲＮＡを含む）は、アレイ（例えば、ＲＮＡ分子のアレイ、ガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡ分子のアレイなど）として提供され得る。このようなキットは、例えば、部位特異的修飾ポリペプチドを含む前述した遺伝子組み換え宿主細胞と共に使用されるのに、有用となり得る。前述したキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、所望の遺伝子組み換えを行うためにドナーポリヌクレオチドをさらに含む。キットの構成要素は、別々の容器に入れられてよく、または１つの容器において組み合わせられ得る。
【０３５６】
場合によっては、キットは、ワイルドタイプＣｐｆ１に比べて低いエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す１つ以上の変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをさらに含む。
【０３５７】
場合によっては、キットは、ワイルドタイプＣｐｆ１に比べて低いエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸をさらに含む。
【０３５８】
前述したキットのうちのいずれかは、１つ以上の追加の試薬をさらに含んでよく、このような追加の試薬は、希釈緩衝液；再構成溶液；洗浄緩衝液；コントロール試薬；コントロール発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡから部位特異的修飾ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するための試薬などから選択され得る。
【０３５９】
前述した構成要素に加え、キットは、方法を実践するためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含み得る。方法を実践するための説明書は、一般的に適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどといった基板に印刷されてよい。したがって、説明書は、パッケージインサートとして、キットまたはその構成要素のコンテナの表示の中に（すなわち、パッケージまたはサブパッケージと関連して）などで、キット内に存在し得る。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書は、キットに存在せず、例えばインターネットを介して、離れた供給源から説明書を入手する手段が、提供される。この実施形態の例は、説明書を見ることができ、かつ／または説明書をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含む、キットである。説明書と同様に、この説明書を入手する手段は、適切な基板に記録されている。
【０３６０】
ヒト以外の遺伝子組み換え生物
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）で遺伝子組み換えされている。このような細胞が真核生物の単細胞生物である場合、修飾された細胞は、遺伝子組み換え生物と考えられ得る。いくつかの実施形態では、ヒト以外の遺伝子組み換え生物は、Ｃｐｆ１トランスジェニック多細胞生物である。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換えされたヒト以外の宿主細胞（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸、例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１などで遺伝子組み換えされている細胞）は、遺伝子組み換えされたヒト以外の生物（例えば、マウス、魚、カエル、ハエ、虫など）を生成することができる。例えば、遺伝子組み換え宿主細胞が多能性幹細胞（すなわち、ＰＳＣ）または生殖細胞（例えば精子、卵子など）である場合、遺伝子組み換え生物全体は、遺伝子組み換え宿主細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、遺伝子組み換え生物を生じることができる、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかの、多能性幹細胞（例えばＥＳＣ、ｉＰＳＣ、多能性植物幹細胞など）または生殖細胞（例えば精子細胞、卵子など）である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、脊椎動物のＰＳＣ（例えばＥＳＣ、ｉＰＳＣなど）であり、（例えば、ＰＳＣを胚盤胞に注入して、非キメラの／非モザイクの遺伝子組み換え生物を生成するように後で結合され得る、キメラの／モザイクの動物を産生すること；植物の場合には接ぎ木をすることなどによって）遺伝子組み換え生物を生成するのに使用される。本明細書に記載される方法を含む、遺伝子組み換え生物を産生するための任意の好都合な方法／プロトコルは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）を含む遺伝子組み換え宿主細胞を産生するのに適切である。遺伝子組み換え生物を産生する方法は、当技術分野で既知である。例えば、Cho et al., Curr Protoc Cell Biol. 2009 Mar; Chapter 19:Unit 19.11: Generation of transgenic mice; Gama et al., Brain Struct Funct. 2010 Mar; 214(2-3):91-109. Epub 2009 Nov 25: Animal transgenesis: an overview; Husaini et al., GM Crops. 2011 Jun-Dec;2(3):150-62. Epub 2011 Jun 1: Approaches for gene targeting and targeted gene expression in plantsを参照。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本発明の方法のための標的細胞を含み、よって、標的細胞の供給源と考えることができる。例えば、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）を含む遺伝子組み換え細胞が、遺伝子組み換え生物を生成するのに使用される場合、遺伝子組み換え生物の細胞は、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）を含む。そのようないくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物の１つまたは複数の細胞のＤＮＡは、その１つまたは複数の細胞にガイドＲＮＡ（もしくはガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡ）、およびオプションとしてドナー核酸、を導入することによって修飾のために標的化され得る。例えば、ガイドＲＮＡ（もしくはガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡ）を遺伝子組み換え生物の細胞（例えば、脳細胞、腸細胞、腎細胞、肺細胞、血液細胞など）のサブセットに導入することで、そのような細胞のＤＮＡを修飾の標的とすることができ、そのゲノム場所は、導入されたガイドＲＮＡのＤＮＡ標的配列によって決まる。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え生物は、本発明の方法のための標的細胞の供給源である。例えば、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）で遺伝子組み換えされた細胞を含む遺伝子組み換え生物は、遺伝子組み換え細胞、例えばＰＳＣ（例えばＥＳＣ、ｉＰＳＣ、精子、卵子など）、ニューロン、前駆細胞、心筋細胞などの供給源を提供することができる。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え細胞は、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）を含むＰＳＣである。したがって、ＰＳＣは、ＰＳＣのＤＮＡがＰＳＣにガイドＲＮＡ（もしくはガイドＲＮＡをコード化するＤＮＡ）、およびオプションとしてドナー核酸を導入することにより修飾の標的とされ得るように、標的細胞であってよく、修飾のゲノム場所は、導入されるガイドＲＮＡのＤＮＡ標的配列によって決まる。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、遺伝子組み換え生物由来のＰＳＣのＤＮＡを修飾する（例えば、任意の所望のゲノム場所を欠失させ、かつ／または置換する）のに使用され得る。このような修飾ＰＳＣは、（ｉ）部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）および（ｉｉ）ＰＳＣに導入されたＤＮＡ修飾体の両方を有する生物を生成するために使用され得る。
【０３６５】
部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）は、（例えば核酸がランダムに宿主細胞ゲノムに統合される場合）未知のプロモーターの制御下にある（すなわち、未知のプロモーターに動作可能に結合される）ことができ、または既知のプロモーターの制御下にある（すなわち、既知のプロモーターに動作可能に結合される）ことができる。適切な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであってよく、構造的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導型プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなど）、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）などを含み得る。
【０３６６】
遺伝子組み換え生物（例えば、細胞が、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列、例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１などを含む生物）は、例えば、植物；藻類；無脊椎動物（例えば刺胞動物、刺皮動物、虫、ハエなど）；脊椎動物（例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、フグ、金魚など）、両生類（例えば、サンショウウオ、カエルなど）、爬虫類、鳥類、哺乳類など）；有蹄類（例えば、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシなど）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）；ウサギ目（例えば、ウサギ）；などを含む任意の生物であってよい。
【０３６７】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜１０のいずれかに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３６８】
トランスジェニックなヒト以外の動物
前述したように、いくつかの実施形態では、核酸（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列、例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）または組み換え型発現ベクターは、部位特異的修飾ポリペプチドを産生する遺伝子導入動物を生成するために導入遺伝子として使用される。よって、本開示は、トランスジェニックなヒト以外の動物をさらに提供し、この動物は、前述したように、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸、例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など、を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニックなヒト以外の動物のゲノムは、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニックなヒト以外の動物は、遺伝子組み換えのホモ接合体である。いくつかの実施形態では、トランスジェニックなヒト以外の動物は、遺伝子組み換えのヘテロ接合体である。いくつかの実施形態では、トランスジェニックなヒト以外の動物は、脊椎動物、例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚など）、両生類（カエル、サンショウウオなど）、鳥類（例えば、ひよこ、七面鳥など）、爬虫類（例えば、蛇、トカゲなど）、哺乳類（例えば、有蹄類、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど；ウサギ類（例えばウサギ）；齧歯類（例えば、ラット、マウス）；ヒト以外の霊長類の動物など）などである。
【０３６９】
部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む外来性核酸（例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）は、（例えば核酸がランダムに宿主細胞ゲノムに統合される場合）未知のプロモーターの制御下にある（すなわち、未知のプロモーターに動作可能に結合される）ことができ、または既知のプロモーターの制御下にある（すなわち、既知のプロモーターに動作可能に結合される）ことができる。適切な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであってよく、構造的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導型プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなど）、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）などを含み得る。
【０３７０】
トランスジェニック植物
前述したように、いくつかの実施形態では、核酸（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列、例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）または組み換え型発現ベクターは、部位特異的修飾ポリペプチドを産生するトランスジェニック植物を生成するために導入遺伝子として使用される。よって、本開示は、トランスジェニック植物をさらに提供し、この植物は、前述したように、部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸、例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など、を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物のゲノムは、核酸を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子組み換えのホモ接合体である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子組み換えのヘテロ接合体である。
【０３７１】
外来性核酸を植物細胞に導入する方法は、当技術分野で周知である。このような植物細胞は、前記で定義したように、「形質転換されている」とみなされる。適切な方法は、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、トランスフェクション、接合、原形質融合、エレクトロポレーション、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、炭化ケイ素ホイスカテクノロジー、アグロバクテリウムによる形質転換などを含む。方法の選択は、一般的に、形質転換されている細胞型、および形質転換が行われている環境（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ）によって決まる。土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンスに基づく形質転換方法は、外来性核酸分子を維管束植物に導入するのに特に有用である。アグロバクテリウムのワイルドタイプ形態は、宿主植物での腫瘍形成性のクラウンゴール成長の生成を導くＴｉ（腫瘍誘発性）プラスミドを含む。Ｔｉプラスミドの腫瘍誘発性Ｔ−ＤＮＡ領域の、植物ゲノムへの移動は、Ｔｉプラスミドにコード化されたビルレンス遺伝子、ならびに移動される領域の端を示す１組のダイレクトＤＮＡリピートであるＴ−ＤＮＡボーダーを必要とする。アグロバクテリウムベースのベクターは、Ｔｉプラスミドの修飾形態であり、腫瘍誘発性機能が、植物宿主に導入される目的の核酸配列によって置換されている。
【０３７２】
アグロバクテリウム介在性形質転換は、一般的に共挿入ベクター（cointegrate vectors）またはバイナリーベクターシステムを使用し、Ｔｉプラスミドの成分が、アグロバクテリウム宿主に永続的に存在しかつビルレンス遺伝子を有するヘルパーベクターと、Ｔ−ＤＮＡ配列によって境界された目的の遺伝子を含むシャトルベクターとの間で、分割される。さまざまなバイナリーベクターが当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から市販されている。例えば、葉組織、根片、子葉下、幹断片または塊茎などの培養された植物細胞または損傷組織でアグロバクテリウムを共培養する方法も、当技術分野で周知である。例えば、Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993)を参照。
【０３７３】
ミクロ投射体介在性形質転換（Microprojectile-mediated transformation）も、トランスジェニック植物の産生に使用され得る。この方法は、最初にKlein et al. (Nature 327:70-73 (1987))によって説明されたものだが、塩化カルシウム、スペルミジンまたはポリエチレングリコールでの沈殿によって所望の核酸分子でコーティングされた、金またはタングステンなどのミクロ投射体（microprojectiles）に依存している。ミクロ投射体粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＤ−１０００（Ｂｉｏｒａｄ；カリフォルニア州ハーキュリーズ）などの装置を用いて高速で被子植物組織内へと加速される。
【０３７４】
核酸は、核酸が、例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏプロトコルを介して、植物細胞に入ることができるようにして、植物に導入され得る。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」によって、核酸が、例えば浸入によって植物の生体に投与されることが意味される。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」によって、細胞または外植片が植物の外側で修飾され、その後そのような細胞または器官が、植物へと再生されることが意味される。植物細胞の安定した形質転換のため、またはトランスジェニック植物の確立のために適切ないくつかのベクターが説明され、それには、Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press、およびGelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishersに記載されたものが含まれる。具体的な実施例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するもの、ならびにHerrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl Acid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642により開示されたものを含む。あるいは、非Ｔｉベクターが、遊離ＤＮＡ送達技術を用いることによって植物および細胞中にＤＮＡを移動させるのに使用され得る。これらの方法を用いることによって、トランスジェニック植物、例えば小麦、米（Christou (1991） Bio/ Technology 9:957-9 and 4462）およびトウモロコシ（Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618）が産生され得る。未成熟な胚もまた、パーティクルガンを用いることによる直接ＤＮＡ送達技術のため（Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48）およびアグロバクテリウム介在性ＤＮＡ転移のため（Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750）の単子葉植物の良好な標的組織となり得る。ＤＮＡを葉緑体に導入するための例示的な方法は、微粒子銃照射（biolistic bombardment）、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、およびマイクロインジェクション（Daniell et al. Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al. Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000; O’Neill et al. Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al. Nat. Biotechnol 17: 906-909；米国特許第５，４５１，５１３号、５，５４５，８１７号、５，５４５，８１８号、および５，５７６，１９８号；国際公開ＷＯ９５／１６７８３；ならびにBoynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993)、およびMcBride et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)）である。微粒子銃照射、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、およびマイクロインジェクションの方法に適切な任意のベクターは、葉緑体形質転換のための標的化ベクターとして適切であろう。任意の二本鎖ＤＮＡベクターは、導入の方法がアグロバクテリウムを利用しない場合は特に、形質転換ベクターとして使用され得る。
【０３７５】
遺伝子組み換えされ得る植物は、穀類、飼料作物、果物、野菜、油料種子作物、ヤシ、森林、およびブドウを含む。修飾され得る植物の具体的な例は以下のとおりである：トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、莢豌豆、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、たばこ、小麦、大麦、オート麦、じゃがいも、ダイズ豆、綿、カーネーション、モロコシ、ハウチワマメ、および米。
【０３７６】
形質転換された植物細胞、組織、植物、および形質転換された植物細胞を含む生成物も、本開示によって提供される。形質転換された細胞、及び組織、およびそれを含む生成物の特徴は、ゲノムに統合された核酸の存在、および、部位特異的修飾ポリペプチド、例えば天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１などの植物細胞による生成である。本発明の組み換え型植物細胞は、組み換え型細胞の集団として、または組織、種子、全植物、幹、果実、葉、根、花、幹、塊茎、穀類、動物飼料、植物の畑（field）などとして、有用である。
【０３７７】
部位特異的修飾ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、天然に存在するＣｐｆ１；修飾された、すなわち、突然変異したかまたは変異体のＣｐｆ１；キメラのＣｐｆ１など）は、（例えば核酸がランダムに宿主細胞ゲノムに統合される場合）未知のプロモーターの制御下にある（すなわち、未知のプロモーターに動作可能に結合される）ことができ、または既知のプロモーターの制御下にある（すなわち、既知のプロモーターに動作可能に結合される）ことができる。適切な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであってよく、構造的に活性なプロモーター、誘導型プロモーター、空間的に制限されたおよび／または時間的に制限されたプロモーターなどを含み得る。
【０３７８】
本開示は、宿主細胞における標的核酸の転写を調節する方法を提供する。この方法は、一般的に、標的核酸を、酵素的に不活性なＣｐｆ１ポリペプチドおよびガイドＲＮＡと接触させることを含む。方法は、さまざまな適用で有用であり、それら適用も提供される。
【０３７９】
本開示の転写調節方法は、ＲＮＡｉを伴う方法の欠点のうちのいくつかを克服する。本開示の転写調節方法は、研究用途、創薬（例えば、ハイスループット・スクリーニング）、標的検証（target validation）、工業用途（例えば、作物工学（crop engineering）；微生物工学（microbial engineering）など）、診断用途、治療用途、および撮像技術を含む広範な適用に、用途が見出される。
【０３８０】
転写を調節する方法
本開示は、宿主細胞における標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する方法を提供する。この方法は、一般的に、ａ）宿主細胞に：ｉ）ガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸；およびｉｉ）変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチド（「変異体のＣｐｆ１ポリペプチド」）、または変異体のＣｐｆ１ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を、導入することを含み、変異体のＣｐｆ１ポリペプチドは、低いエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す。
【０３８１】
ガイドＲＮＡ（本明細書では「ガイドＲＮＡ」；または「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）は、ｉ）標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；ｉｉ）部位特異的なポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと、ｉｉｉ）転写ターミネーターと、を含む。標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントは、本明細書では「標的化セグメント」と呼ばれる。部位特異的なポリペプチドと相互作用する第２のセグメントは、本明細書では「タンパク質結合配列」または「ｄＣｐｆ１結合ヘアピン」または「ｄＣｐｆ１ハンドル」とも呼ばれる。「セグメント」によって、分子のセグメント／セクション／領域、例えばＲＮＡ内のヌクレオチドの隣接区間、を意味する。「セグメント」の定義は、特定の文脈で特に別様に定めのない限り、特定の数の総塩基対に限られず、任意の全長であるＲＮＡ分子の領域を含んでよく、また、他の分子に相補性を有する領域を含んでも含まなくてもよい。変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と；低いエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す活性部分と、を含む。
【０３８２】
ガイドＲＮＡおよび変異体のＣｐｆ１ポリペプチドは、宿主細胞に複合体を形成し、複合体は、宿主細胞内の標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する。
【０３８３】
場合によっては、本開示の転写調節方法は、宿主細胞内の標的核酸の選択的な調節（例えば、減少または増加）を提供する。例えば、標的核酸の転写の「選択的な」減少は、ガイドＲＮＡ／変異体のＣｐｆ１ポリペプチド複合体の不存在下での標的核酸の転写レベルと比べ、標的核酸の転写を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％超だけ減少させる。標的核酸の転写の選択的な減少は、標的核酸の転写を減少させるが、非標的核酸の転写を実質的に減少させず、例えば、非標的核酸の転写は、たとえあったとしても、ガイドＲＮＡ／変異体のＣｐｆ１ポリペプチド複合体の不存在下での非標的核酸の転写レベルと比べ、１０％未満だけ減少する。
【０３８４】
転写の増加
標的ＤＮＡの「選択的な」転写の増加は、ガイドＲＮＡ／変異体のＣｐｆ１ポリペプチド複合体の不存在下での標的ＤＮＡの転写レベルと比べ、少なくとも約１．１倍（例えば、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍）だけ、標的ＤＮＡの転写を増加させ得る。標的ＤＮＡの転写の選択的な増加は、標的ＤＮＡの転写を増加させるが、非標的ＤＮＡの転写を実質的に増加させず、例えば非標的ＤＮＡの転写は、あったとしても、ガイドＲＮＡ／変異体のＣｐｆ１ポリペプチド複合体の不存在下での非標的ＤＮＡの転写レベルと比べ、約５倍未満（例えば、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍未満、約１．２倍未満、または約１．１倍未満）だけ増加する。
【０３８５】
非限定的な例として、転写の増加は、ｄＣｐｆ１を異種配列に融合させることにより、達成され得る。適切な融合パートナーは、標的ＤＮＡに、または標的ＤＮＡと関連するポリペプチド（例えば、ヒストンもしくは他のＤＮＡ結合タンパク質）に直接作用することによって、転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。適切な融合パートナーは、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０３８６】
追加の適切な融合パートナーは、標的核酸の転写の増加を直接提供するポリペプチド（例えば、転写活性因子またはその断片、転写活性因子を補充するタンパク質またはその断片、小分子／薬剤反応性転写調節因子など）含むがこれらに限定されない。
【０３８７】
原核生物における転写を増加するためにｄＣｐｆ１融合タンパク質を使用する方法の非限定的な例は、細菌ワンハイブリッド（Ｂ１Ｈ）またはツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムの修飾を含む。Ｂ１Ｈシステムでは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）は、細菌転写活性化ドメイン（ＡＤ、例えば、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰａ）のαサブユニット）に融合される。よって、ｄＣｐｆ１は、ＡＤを含む異種配列に融合され得る。ｄＣｐｆ１融合タンパク質がプロモーターの上流領域に到達する（ガイドＲＮＡによってそこに標的化される）と、ｄＣｐｆ１融合タンパク質のＡＤ（例えばＲＮＡＰａ）は、ＲＮＡＰホロ酵素を補充し、転写活性化をもたらす。Ｂ２Ｈシステムでは、ＢＤは、ＡＤに直接融合されず、代わりに、それらの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用（例えばＧＡＬ１１Ｐ−ＧＡＬ４相互作用）によって媒介される。方法で使用されるこのようなシステムを修飾するため、ｄＣｐｆ１は、タンパク質−タンパク質相互作用をもたらす第１のタンパク質配列（例えば酵母ＧＡＬ１１Ｐおよび／またはＧＡＬ４タンパク質）に融合され得、ＲＮＡａは、タンパク質−タンパク質相互作用を完了させる第２のタンパク質配列（例えばＧＡＬ１１ＰがｄＣｐｆ１に融合される場合はＧＡＬ４、ＧＡＬ４がｄＣｐｆ１に融合される場合はＧＡＬ１１Ｐ、など）に融合され得る。ＧＡＬ１１ＰとＧＡＬ４との間の結合親和性は、結合および転写の点火速度（binding and transcription firing rate）の効率を増大させる。
【０３８８】
真核生物における転写を増加するためにｄＣｐｆ１融合タンパク質を使用する方法の非限定的な例は、活性化ドメイン（ＡＤ）（例えばＧＡＬ４、ヘルペスウイルス活性化タンパク質ＶＰ１６またはＶＰ６４、ヒト核因子ＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニットなど）へのｄＣｐｆ１の融合を含む。システムを誘導型にするため、ｄＣｐｆ１融合タンパク質の発現は、誘導型プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦなど）によって制御され得る。ガイドＲＮＡは、既知の転写応答要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、標的ＤＮＡの発現を制御することができることが疑われる未知または既知の官能基の配列などを標的化するように設計され得る。
【０３８９】
追加の融合パートナー
転写の増加または減少を達成するための融合パートナーの非限定的な例は、転写活性因子および転写抑制因子ドメイン（例えば、Ｋｒｉｉｐｐｅｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）など）を含むがこれらに限定されない。このようないくつかの場合、ｄＣｐｆ１融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによって、標的ＤＮＡの特定の場所（すなわち、配列）に標的化され、遺伝子座特異的調節を及ぼし、例えば、ＲＮＡポリメラーゼが（選択的に転写活性因子の機能を抑制する）プロモーターに結合するのを阻止し、かつ／または局所的なクロマチン状態を変更する（例えば、標的ＤＮＡを修飾するかまたは標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾する融合配列が使用される場合）。場合によっては、変化は一時的である（例えば転写抑制または活性化）。場合によっては、変化は遺伝する（例えば、エピジェネティック修飾が標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡに関連するタンパク質、例えばヌクレオゾームヒストン、に対して行われる場合）。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、異種配列は、ｄＣｐｆ１ポリペプチドのＣ−末端に融合され得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、ｄＣｐｆ１ポリペプチドのＮ−末端に融合され得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、ｄＣｐｆ１ポリペプチドの内側部分（すなわち、Ｎ−またはＣ−末端以外の部分）に融合され得る。
【０３９１】
ｄＣｐｆ１融合タンパク質を使用する方法の生物学的影響は、任意の好都合な方法（例えば、遺伝子発現アッセイ；クロマチンベースのアッセイ、例えばクロマチン免疫沈殿（ＣｈｉＰ）、クロマチンｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（ＣｉＡ）など）によって検出され得る。
【０３９２】
場合によっては、方法は、２つ以上の異なるガイドＲＮＡの使用を伴う。例えば、２つの異なるガイドＲＮＡが、単一の宿主細胞で使用され得、２つの異なるガイドＲＮＡは、同じ標的核酸の２つの異なる標的配列を標的化する。
【０３９３】
よって、例えば、転写調節方法は、宿主細胞に、第２のガイドＲＮＡ、または第２のガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を導入することをさらに含んでよく、第２のガイドＲＮＡは、ｉ）標的ＤＮＡの第２の標的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；ｉｉ）部位特異的なポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと；ｉｉｉ）転写ターミネーターと、を含む。場合によっては、同じ標的核酸の２つの異なる標的配列を標的化する２つの異なるガイドＲＮＡの使用は、標的核酸の転写における調節の増加（例えば減少または増加）をもたらす。
【０３９４】
別の実施例として、２つの異なるガイドＲＮＡは、単一の宿主細胞で使用され得、２つの異なるガイドＲＮＡが、２つの異なる標的核酸を標的化する。よって、例えば、転写調節方法は、宿主細胞に第２のガイドＲＮＡ、または第２のガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を導入することをさらに含み、第２のガイドＲＮＡは、ｉ）少なくとも第２の標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと；ｉｉ）部位特異的なポリペプチドと相互作用する第２のセグメントと；ｉｉｉ）転写ターミネーターと、を含む。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、例えば単一分子ガイドＲＮＡ；ドナーポリヌクレオチド；部位特異的修飾ポリペプチドをコード化する核酸など）は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾されるかまたは調節された安定性；細胞内標的；追跡、例えば蛍光標識；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす、修飾体または配列を含む。非限定的な例は、５’キャップ（例えば７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列またはアプタマー配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス性を可能にする）；ターミネーター配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列）；ＲＮＡを細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾体または配列；追跡をもたらす修飾体または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を容易にする部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位をもたらす修飾体または配列；ならびにそれらの組み合わせを含む。
【０３９６】
ＤＮＡ標的セグメント
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（または「ＤＮＡ標的配列」）は、標的ＤＮＡ内部の特定の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む（標的ＤＮＡの相補鎖）。
【０３９７】
言い換えれば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的な形で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的セグメントのヌクレオチド配列は、さまざまであってよく、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する、標的ＤＮＡ内部の場所を決定する。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするために（例えば遺伝子操作によって）修飾され得る。
【０３９８】
安定性制御配列（例えば転写ターミネーターセグメント）
安定性制御配列は、ＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ）の安定性に影響を及ぼす。適切な安定性制御配列の１つの例は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）である。ガイドＲＮＡの転写ターミネーターセグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの全長を有し得る。例えば、転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。
【０３９９】
場合によっては、転写終結配列は、真核生物細胞において機能的なものである。場合によっては、転写終結配列は、原核生物細胞において機能的なものである。
【０４００】
安定性制御配列（例えば転写終結セグメント、または安定性の増加をもたらすガイドＲＮＡの任意のセグメント）に含まれ得るヌクレオチド配列は、例えば、ρ非依存性ｔｒｐ終結部位を含む。
【０４０１】
追加の配列
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、５’または３’末端のいずれかに少なくとも１つの追加セグメントを含む。例えば、適切な追加セグメントは、５’キャップ（例えば７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス性を可能にする）；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡をもたらす修飾体または配列（例えば、蛍光分子への直接接合、蛍光検出を容易にする部分への接合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位をもたらす修飾体または配列；増大した安定性、減少した安定性、かつ／または制御可能な安定性を提供する修飾体または配列；ならびにそれらの組み合わせを含み得る。
【０４０２】
複数の同時ガイドＲＮＡ
いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡの異なる場所での転写を同時に調節するために同じ細胞内で同時に使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、同じ遺伝子または転写物または遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる無関係の遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なるが関連する遺伝子座を標的化する。
【０４０３】
ガイドＲＮＡは小さく頑丈であるので、同じ発現ベクター上に同時に存在でき、かつ所望される場合は、同じ転写制御下にあってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の（例えば３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、または５０以上）のガイドＲＮＡが、（同じかまたは異なるベクターから）標的細胞において同時に発現される。場合によっては、複数のガイドＲＮＡは、ターゲッターＲＮＡの天然に存在するＣＲＩＳＰＲアレイを模倣するアレイにおいてコード化され得る。標的化セグメントは、約３０ヌクレオチド長の配列としてコード化され（約１６〜約１００ｎｔであってよく）、ＣＲＩＳＰＲリピート配列によって分離される。アレイは、ＲＮＡをコード化するＤＮＡによって、またはＲＮＡとして細胞に導入され得る。
【０４０４】
複数のガイドＲＮＡを発現させるため、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼにより媒介される人工ＲＮＡプロセシングシステムを使用し得る。例えば、複数のガイドＲＮＡは、（例えばＵ６プロモーターから発現された）前駆体転写物上で縦列アレイへと連結され得、また、Ｃｓｙ４特異的ＲＮＡ配列により分離され得る。共発現したＣｓｙ４タンパク質は、前駆体転写物を複数のガイドＲＮＡへと開裂する。ＲＮＡプロセシングシステムを使用する利点は、第一に、複数のプロモーターを使用する必要がないこと；第二に、すべてのガイドＲＮＡが前駆体転写物から処理されているので、それらの濃度が類似のｄＣｐｆ１結合に対して標準化されること、を含む。
【０４０５】
Ｃｓｙ４は、緑膿菌という細菌に由来する小型のエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）タンパク質である。Ｃｓｙ４は、最小の１７ｂｐのＲＮＡヘアピンを特に認識し、迅速（＜１分）で効率の高い（＞９９．９％）ＲＮＡ開裂を示す。大部分のＲＮａｓｅとは異なり、開裂したＲＮＡ断片は、安定し、機能的に活性のままである。Ｃｓｙ４に基づくＲＮＡ開裂は、人工ＲＮＡプロセシングシステムへと別の目的のために作り変えられ得る。このシステムでは、１７ｂｐのＲＮＡヘアピンは、単一のプロモーターから前駆体転写物として転写される複数のＲＮＡ断片間に挿入される。Ｃｓｙ４の共発現は、個々のＲＮＡ断片を生成する上で有効である。
【０４０６】
部位特異的なポリペプチド
前述のとおり、ガイドＲＮＡおよび変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことによって複合体に標的特異性を提供する。変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。例えば、本開示の転写調節方法で使用するのに適切な変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、ワイルドタイプＣｐｆ１ポリペプチド、例えば図１に記載するアミノ酸配列を含むワイルドタイプＣｐｆ１ポリペプチドのエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性の、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または、約０．１％未満を示す。いくつかの実施形態では、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、実質的に検出可能なエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を有さない。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドが低い触媒活性を有する場合、ポリペプチドは、依然として、ガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的な形で標的ＤＮＡに結合することができる（依然としてガイドＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列にガイドされるため）。
【０４０７】
場合によっては、適切な変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、図１に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４０８】
場合によっては、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖を開裂し得るが、標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂する能力が低い、ニッカーゼである。
【０４０９】
場合によっては、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂し得るが、標的ＤＮＡの相補鎖を開裂する能力が低い、ニッカーゼである。
【０４１０】
場合によっては、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の双方を開裂する能力が低い。例えば、アラニン置換が企図される。
【０４１１】
場合によっては、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、融合ポリペプチド（「変異体のＣｐｆ１融合ポリペプチド」）、すなわち、ｉ）変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドと；ｉｉ）共有結合した異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも呼ばれる）と、を含む融合ポリペプチドである。
【０４１２】
異種ポリペプチドは、変異体のＣｐｆ１融合ポリペプチドによっても示される活性（例えば酵素活性）（例えばメチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示すことができる。異種核酸配列は、キメラのポリペプチドをコード化するキメラのヌクレオチド配列を生成するために、（例えば遺伝子操作によって）別の核酸配列に結合され得る。いくつかの実施形態では、変異体のＣｐｆ１融合ポリペプチドは、細胞内局在をもたらす異種配列と変異体のＣｐｆ１ポリペプチドを融合することによって生成される（すなわち、異種配列は、細胞内局在配列、例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル；小胞体保留シグナルなどである）。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡および／または精製を容易にするためのタグを提供し得る（すなわち、異種配列は検出可能な標識である）（例えば、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）。いくつかの実施形態では、異種配列は、安定性の増加または減少をもたらし得る（すなわち、異種配列は、安定性制御ペプチド、例えば、場合によっては制御可能であるデグロンである（例えば、温度感受性または薬剤制御可能なデグロン配列、以下を参照）。いくつかの実施形態では、異種配列は、標的ＤＮＡからの転写の増加または減少をもたらし得る（すなわち、異種配列は、転写調節配列、例えば転写因子／活性因子またはその断片、転写因子／活性因子を補充するタンパク質またはその断片、転写抑制因子またはその断片、転写抑制因子を補充するタンパク質またはその断片、小分子／薬剤反応性転写調節因子などである）。いくつかの実施形態では、異種配列は、結合ドメインをもたらし得る（すなわち、異種配列は、例えば、キメラのｄＣｐｆ１ポリペプチドが目的の別のタンパク質、例えばＤＮＡもしくはヒストン修飾タンパク質、転写因子もしくは転写抑制因子、補充タンパク質（recruiting protein）などに結合する能力を提供するため、タンパク質結合配列である）。
【０４１３】
安定性の増加または減少をもたらす適切な融合パートナーは、デグロン配列を含むがこれらに限定されない。デグロンは、それらが一部をなすタンパク質の安定性を制御するアミノ酸配列であることが、当業者によって容易に理解される。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、少なくとも部分的にはデグロン配列によって制御される。場合によっては、適切なデグロンは、実験制御とは無関係にデグロンがタンパク質安定性に影響を及ぼすような構造である（すなわち、デグロンは、薬剤誘導型、温度誘導型などではない）。場合によっては、デグロンは、制御可能な安定性を有する変異体のＣｐｆ１ポリペプチドを提供し、変異体のＣｐｆ１ポリペプチドは、所望の条件に応じて、「オン」になり（すなわち、安定し）、または「オフ」になる（すなわち、不安定であり、分解される）ことができる。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、変異体のＣｐｆ１ポリペプチドは、閾値温度（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃など）より下で機能的であり得る（すなわち、「オン」で、安定している）が、閾値温度より上では非機能的である（すなわち、「オフ」で、分解される）。別の実施例として、デグロンが薬剤誘導型デグロンである場合、薬剤の存在または不存在は、タンパク質を「オフ」（すなわち、不安定な）状態から「オン」（すなわち、安定した）状態へと切り替え、またはこの逆に切り替えることができる。例示的な薬剤誘導型デグロンは、ＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性は、デグロンに結合する小分子の存在または不存在によって制御される。
【０４１４】
適切なデグロンの例は、Ｓｈｉｅｌｄ−１、ＤＨＦＲ、オーキシンおよび／または温度によって制御されるデグロンを含むがこれらに限定されない。適切なデグロンの非限定的な例は、当技術分野で既知である（例えば、Dohmen et al., Science, 1994. 263(5151): p. 1273-1276: Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants; Schoeber et al., Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Jan;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 channels using Shield-1 ; Chu et al., Bioorg Med Chem Lett. 2008 Nov 15;18(22):5941-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains ; Kanemaki, Pflugers Arch. 2012 Dec 28: Frontiers of protein expression control with conditional degrons; Yang et al., Mol Cell. 2012 Nov 30;48(4):487-8: Titivated for destruction: the methyl degron; Barbour et al., Biosci Rep. 2013 Jan 18;33(1).: Characterization of the bipartite degron that regulates ubiquitin-independent degradation of thymidylate synthase;およびGreussing et al., J Vis Exp. 2012 Nov 10;(69): Monitoring of ubiquitin-proteasome activity in living cells using a Degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)-based reporter protein；これらはすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【０４１５】
例示的なデグロン配列は、細胞および動物の両方で、十分に特徴づけられ、試験されている。よって、Ｃｐｆ１をデグロン配列に融合させると、「調節可能」かつ「誘導型」のＣｐｆ１ポリペプチドが産生される。本明細書に記載する融合パートナーのいずれも、任意の望ましい組み合わせで使用され得る。この点を説明する非限定的な一例として、Ｃｐｆ１融合タンパク質は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、および標的ＤＮＡの転写を増加させる転写活性因子配列を含み得る。さらに、Ｃｐｆ１融合タンパク質で使用され得る融合パートナーの数は、制限されていない。場合によっては、Ｃｐｆ１融合タンパク質は、１つ以上の（例えば２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、または５つ以上の）異種配列を含む。
【０４１６】
適切な融合パートナーは、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性をもたらすポリペプチドを含むがこれらに限定されず、前述の活性のいずれも、ＤＮＡを直接修飾すること（例えば、ＤＮＡのメチル化）またはＤＮＡ関連ポリペプチドを修飾すること（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）を目的とし得る。さらなる適切な融合パートナーは、境界要素（例えばＣＴＣＦ）、周辺補充（periphery recruitment）を提供するタンパク質およびその断片（例えばＬａｍｉｎ  Ａ、Ｌａｍｉｎ  Ｂなど）、およびタンパク質ドッキング要素（例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１など）を含むがこれらに限定されない。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、コドン最適化され得る。このタイプの最適化は、当技術分野で既知であり、外来由来のＤＮＡの突然変異を伴って、意図される宿主生物または細胞のコドン選択を模倣するとともに、同じタンパク質をコード化する。よって、コドンは、変化するが、コード化されたタンパク質は、変化しないままである。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドン最適化ｄＣｐｆ１（またはｄＣｐｆ１変異体）が適切な部位特異的修飾ポリペプチドとなるであろう。別の非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞であった場合、マウスコドン最適化Ｃｐｆ１（または変異体、例えば酵素的に不活性な変異体）が適切なＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドとなるであろう。コドン最適化は必須ではないが、許容可能であり、場合によっては好ましいかもしれない。
【０４１８】
ポリアデニル化信号は、意図される宿主における発現を最適化するために選択されることもできる。
【０４１９】
宿主細胞
転写を調節する本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで有糸分裂細胞または有糸分裂後細胞に転写調節を誘導するために使用され得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることによって特異性をもたらすので、有糸分裂細胞および／または有糸分裂後細胞は、さまざまな宿主細胞のいずれであってもよく、適切な宿主細胞は、細菌細胞；古細菌細胞；単細胞の真核生物生物；植物細胞；藻細胞、例えばボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシスガディタナ、クロレラピレノイドサ、ヤツマタモクなど；真菌細胞；動物細胞；無脊椎動物（例えば、昆虫、刺胞動物、刺皮動物、線形動物など）由来の細胞；真核生物寄生生物（例えば、マラリア原虫、例えば熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium fakiparum）；蠕虫類など）；脊椎動物（例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞；哺乳類細胞、例えば齧歯類細胞、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類の動物細胞など、を含むがこれらに限定されない。適切な宿主細胞は、天然に存在する細胞；遺伝子組み換え細胞（例えば、研究室で、例えば「人の手」によって遺伝子組み換えされた細胞）；および任意の方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞を含む。場合によっては、宿主細胞は単離される。
【０４２０】
任意のタイプの細胞が、目的のものであってよい（例えば、幹細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；任意の段階の胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ胚細胞、例えば、１−細胞、２−細胞、４−細胞、８−細胞などの段階のゼブラフィッシュ胚など）。細胞は、樹立細胞株由来であってよく、または、初代細胞であってよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、被験体に由来しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで限られた回数の培養の継代にわたり増殖する、すなわち、分割することができる、細胞および細胞培養物を指すために、本明細書中で互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回、ただし危機的段階を超えない回数、継代されていてもよい培養物を含む。初代細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０回未満の継代の間維持される。標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であり、あるいは、培養下で増殖される。
【０４２１】
細胞が初代細胞である場合、このような細胞は、任意の都合の良い方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって好都合に採取され得るが、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などといった組織からの細胞は、生検で採取されるのが最も好都合である。適切な溶液が、採取した細胞の分散または懸濁に使用され得る。このような溶液は一般的には、好都合には、一般的に低濃度、例えば５〜２５ｍＭの許容可能な緩衝液と共にウシ胎仔血清または他の天然に存在する要素が補充された、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液などであろう。好都合な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液などを含む。細胞はすぐに使用されてもよく、あるいは、長期間、保管、冷凍されて、解凍され、再利用可能とされてもよい。このような場合、細胞は、通常、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％の血清、４０％の緩衝媒体、またはこのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般的に使用されるいくつかの他のこのような溶液中で凍結され、凍結した培養細胞を解凍するように一般的に当技術分野で既知の方法で解凍される。
【０４２２】
宿主細胞への核酸の導入
ガイドＲＮＡ、またはそれをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸は、さまざまな周知の方法のいずれかによって、宿主細胞に導入され得る。同様に、方法が、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することを含む場合、このような核酸は、さまざまな周知の方法のいずれかによって、宿主細胞に導入され得る。
【０４２３】
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で既知であり、任意の既知の方法を使用して、核酸（例えば発現構造体）を幹細胞または前駆細胞に導入することができる。適切な方法は、例えばウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入法、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: 50169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023）などを含む。
【０４２４】
核酸
本開示は、ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。場合によっては、核酸は、変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列も含む。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、方法は、宿主細胞（または宿主細胞集団）に、ガイドＲＮＡおよび／または変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞はｉｎ  ｖｉｖｏである。ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ガイドＲＮＡおよび／または部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組み換え型発現ベクター」である。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、組み換え型発現ベクターは、ウイルス構造体、例えば組み換え型アデノ随伴ウイルス構造体（例えば米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組み換え型アデノウイルス構造体、組み換え型レンチウイルス構造体、組み換え型レトロウイルス構造体などである。適切な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、以下に基づくウイルスベクター：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えばLi et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al.,Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al.,Gene Ther 4:683-690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; ＷＯ９３／０９２３９におけるSrivastava、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165；およびFlotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）など、を含むがこれらに限定されない。
【０４２７】
多くの適切な発現ベクターが、当業者に知られており、その多くが市販されている。以下のベクターは、例として提供されるものである；真核生物宿主細胞に対して：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主細胞と適合性である限り、任意の他のベクターが使用されてもよい。
【０４２８】
利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構造型および誘導型プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照）。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に動作可能に結合される。転写制御要素は、真核生物細胞、例えば哺乳類細胞；または原核生物細胞（例えば細菌または古細菌細胞）のいずれかで機能的となり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、原核生物および真核生物細胞の両方においてガイドＲＮＡおよび／または変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御要素に動作可能に結合される。
【０４３０】
プロモーターは、構造的に活性なプロモーター（すなわち、構造的に活性／「オン」の状態にあるプロモーター）であってよく、誘導型プロモーターであってよく（すなわち、状態が活性／「オン」または不活性／「オフ」であるプロモーターは、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在により制御される）、空間的に制限されたプロモーターであってよく（すなわち、転写制御要素、エンハンサーなど）（例えば組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）、時間的に制限されたプロモーターであってよい（すなわち、プロモーターは、胚発生の特定の段階中、または生物学的プロセス、例えばマウスの毛包サイクルの特定の段階中に「オン」の状態または「オフ」の状態にある）。
【０４３１】
適切なプロモーターは、ウイルスに由来してよく、したがってウイルスプロモーターと呼ぶことができるか、あるいは、原核生物または真核生物を含む、任意の生物に由来してよい。適切なプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動するのに使用され得る。例示的なプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）（Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)）、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)）、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）など、を含むがこれらに限定されない。
【０４３２】
誘導型プロモーターの例は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター（例えばＴｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦなど）、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲンレセプター調節プロモーターなどを含むがこれらに限定されない。したがって、誘導型プロモーターは、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲンレセプター；エストロゲンレセプター融合体；など、を含むがこれらに制限されない、分子により調節され得る。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、多細胞生物において、プロモーターは、特定の細胞の一部が活性（すなわち、「オン」）である。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御要素、制御配列などと呼ばれてもよい。任意の好都合な空間的に制限されたプロモーターを使用でき、適切なプロモーターの選択（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンの一部での発現を駆動するプロモーター、生殖系列での発現を駆動するプロモーター、肺での発現を駆動するプロモーター、筋肉での発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞での発現を駆動するプロモーターなど）は、生物によって決まる。例えば、さまざまな空間的に制限されたプロモーターが、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウスなどで知られている。よって、空間的に制限されたプロモーターは、生物に応じて、広範な異なる組織および細胞型において部位特異的ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節するのに使用され得る。いくつかの空間的に制限されたプロモーターは、時間的にも制限されており、プロモーターは、胚発生の特定の段階中、または生物学的プロセス（例えばマウスの毛包周期）の特定の段階中に「オン」の状態または「オフ」の状態にある。
【０４３４】
例示目的で、空間的に制限されたプロモーターの例は、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなど、を含むがこれらに限定されない。ニューロン特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Chen et al. (1987) Cell 51:7-19；およびLlewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Oh et al. (2009) Gene Ther 16:437;Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res. 16:274;Boundy et al. (1998) J. Neurosci. 18:9989；およびKaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652を参照）；エンケファリンプロモーター（例えば、Comb et al. (1988) EMBO J. 17:3793-3805を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ−α（ＣａｍＫＩＩａ）プロモーター（例えば、Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250；およびCasanova et al. (2001) Genesis 31:37を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−０プロモーター（例えば、Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60を参照）；など、を含むがこれらに限定されない。
【０４３５】
脂肪細胞特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えばヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領域（例えば、Tozzo et al. (1997) Endocrinol. 138:1604;Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590；およびPavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797を参照）；グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knight et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:1476;およびSato et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:15703を参照）；ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603）；レプチンプロモーター（例えば、Mason et al. (1998) Endocrinol. 139:1013;およびChen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 262:187を参照）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484；およびChakrabarti (2010) Endocrinol. 151:2408を参照）；アジプシンプロモーター（例えば、Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490を参照）；レジスチンプロモーター（例えば、Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol. 17:1522を参照）；など、を含むがこれらに限定されない。
【０４３６】
心筋細胞特異的な空間的に制限されたプロモーターは、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖−２、αミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する制御配列を含むがこれらに限定されない。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617；およびSartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。
【０４３７】
平滑筋特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Akyiirek et al. (2000) Mol. Med. 6:983；および米国特許第７，１６９，８７４号を参照）；ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎプロモーター（例えばＷＯ２００１／０１８０４８を参照）；α平滑筋アクチンプロモーター；などを含むがこれらに限定されない。例えば、２つのＣＡｒＧ要素が位置する、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、血管平滑筋細胞特異的発現を媒介することが示されている（例えば、Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol. 132, 849-859；およびMoessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425を参照）。
【０４３８】
光受容体特異的な空間的に制限されたプロモーターは、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015）；網膜色素変性遺伝子プロモーター（上記のNicoud et al. (2007)）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（上記のNicoud et al. (2007)）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225）；など、を含むがこれらに限定されない。
【０４３９】
ライブラリー
本開示は、ガイドＲＮＡのライブラリーを提供する。本開示は、ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチドを含む核酸のライブラリーを提供する。ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチドを含む核酸のライブラリーは、ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチドを含む組み換え型発現ベクターのライブラリーを含み得る。
【０４４０】
ライブラリーは、約１０の個々のメンバーから約１０１３の個々のメンバーを含んでよく；例えば、ライブラリーは、約１０の個々のメンバーから約１０２の個々のメンバー、約１０２の個々のメンバーから約１０３の個々のメンバー、約１０３の個々のメンバーから約１０５の個々のメンバー、約１０５の個々のメンバーから約１０７の個々のメンバー、約１０７の個々のメンバーから約１０９の個々のメンバー、または約１０９の個々のメンバーから約１０１２の個々のメンバーを含み得る。
【０４４１】
ライブラリーの「個々のメンバー」は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントのヌクレオチド配列がライブラリーの他のメンバーとは異なる。よって、例えば、ライブラリーの個々のメンバーそれぞれが、ライブラリーの他のすべてのメンバーと同じかまたは実質的に同じ、タンパク質結合セグメントのヌクレオチド配列を含んでよく；ライブラリーの他のすべてのメンバーと同じかまたは実質的に同じ、転写終結セグメントのヌクレオチド配列を含み得るが、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントのヌクレオチド配列が、ライブラリーの他のメンバーとは異なる。このように、ライブラリーは、異なる標的核酸に結合するメンバーを含み得る。
【０４４２】
使用
本開示による転写を調節する方法は、さまざまな適用に用途が見出され、それら適用も提供される。適用には、研究用途；診断用途；工業用途；および治療用途が含まれる。
【０４４３】
研究用途は、例えば下流遺伝子の発生、代謝、発現などに対する、標的核酸の転写を減少または増大させる影響を決定することを含む。
【０４４４】
ハイスループットゲノム分析は、転写調節方法を用いて実行され得、この方法では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントのみを変化させる必要があるものの、タンパク質結合セグメントおよび転写終結セグメントは、（場合によっては）一定に保たれ得る。ゲノム分析に使用される複数の核酸を含むライブラリー（例えばライブラリー）は、ガイドＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列に動作可能に結合されるプロモーターを含み、ここで、各核酸は、共通のタンパク質結合セグメント、異なるＤＮＡ標的セグメント、および共通の転写終結セグメントを含む。チップは、５×１０４超の独自のガイドＲＮＡを含み得る。適用は、大規模表現型検査、遺伝子と機能のマッピング、およびメタゲノム分析を含む。
【０４４５】
本明細書に開示する方法は、代謝工学の分野に用途が見出される。本明細書に開示するように、適切なガイドＲＮＡを設計することによって、転写レベルが有効かつ予測どおりに制御され得るので、代謝経路（例えば生合成経路）の活性は、目的の代謝経路内部での特定の酵素のレベルを（例えば転写の増加または減少によって）制御することによって、正確に制御および調節され得る。目的の代謝経路は、化学物質（ファインケミカル、燃料（fuel）、抗生物質、毒素、アゴニスト、アンタゴニストなど）および／または薬剤生成に用いられるものを含む。
【０４４６】
目的の生合成経路は、（１）メバロン酸経路（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路）（アセチル−ＣｏＡを、テルペノイド／イソプレノイドを含む広範な生体分子の生合成に使用される、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換する）、（２）非メバロン酸経路（すなわち、「２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−ホスフェート／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸経路」または「ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路」または「ＤＸＰ経路」）（代わりに、メバロン酸経路への代替経路を介してピルビン酸塩およびグリセルアルデヒド３−リン酸をＤＭＡＰＰおよびＩＰＰに変換することによって、やはりＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生する）、（３）ポリケタイド合成経路（さまざまなポリケタイドシンターゼ酵素を介してさまざまなポリケタイドを産生する。ポリケタイドは、抗がん剤治療に使用される、天然に存在する小分子を含み（例えば、テトラサイクリン、およびマクロライド）、工業的に重要なポリケタイドは、ラパマイシン（免疫抑制剤）、エリスロマイシン（抗生物質）、ロバスタチン（抗コレステロール薬）、およびエポチロンＢ（抗がん剤）を含む）、（４）脂肪酸合成経路、（５）ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸‐７−リン酸）合成経路、（６）潜在的なバイオ燃料（短鎖アルコールおよびアルカン、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪アルコール、イソプレノイドなど）を産生する経路などを含むがこれらに限定されない。
【０４４７】
ネットワークおよびカスケード
本明細書に開示する方法は、制御の統合ネットワーク（すなわち、１つまたは複数のカスケード）を設計するのに使用され得る。例えば、ガイドＲＮＡ／変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、別のＤＮＡ標的ＲＮＡまたは別の変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドの発現を制御する（すなわち、調節する、例えば増加、減少させる）のに使用され得る。例えば、第１のガイドＲＮＡは、第１の変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドとは異なる機能（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性など）を有する第２のキメラのｄＣｐｆ１ポリペプチドの転写の調節を標的化するように設計され得る。さらに、（例えば異なる種に由来する）異なるｄＣｐｆ１タンパク質が、異なるＣｐｆ１ハンドル（すなわち、タンパク質結合セグメント）を必要とし得るので、第２のキメラのｄＣｐｆ１ポリペプチドは、前記の第１のｄＣｐｆ１ポリペプチドとは異なる種に由来し得る。よって、場合によっては、第２のキメラのｄＣｐｆ１ポリペプチドは、第１のガイドＲＮＡと相互作用できないように選択され得る。他の場合には、第２のキメラのｄＣｐｆ１ポリペプチドは、第１のガイドＲＮＡ相互作用しないように選択され得る。このようないくつかの場合、２つ（またはそれ以上の）ｄＣｐｆ１タンパク質の活性は、（例えばポリペプチドが反対の活性を有する場合）匹敵することができ、または（例えばポリペプチドが類似または相乗的な活性を有する場合）相乗作用を示し得る。同様に、前述のとおり、ネットワークにおける複合体（すなわち、ガイドＲＮＡ／ｄＣｐｆ１ポリペプチド）のいずれかは、他のガイドＲＮＡまたはｄＣｐｆ１ポリペプチドを制御するように設計され得る。ガイドＲＮＡおよび変異体のＣｐｆ１部位特異的ポリペプチドは、任意の所望のＤＮＡ配列に標的化され得るので、本明細書に記載される方法は、任意の所望の標的の発現を制御および調節するのに使用され得る。設計され得る統合ネットワーク（すなわち、相互作用のカスケード）は、非常に単純なものから非常に複雑なものまでさまざまであり、また、制限がない。
【０４４８】
２つ以上の成分（例えば、ガイドＲＮＡまたはｄＣｐｆ１ポリペプチド）がそれぞれ、別のガイドＲＮＡ／ｄＣｐｆ１ポリペプチド複合体の調節管理下にあるネットワークでは、ネットワークの１つの成分の発現レベルは、ネットワークの別の成分の発現のレベルに影響を及ぼし得る（例えば、発現を増加または減少させ得る）。このメカニズムを通じて、１つの成分の発現は、同じネットワークの異なる成分の発現に影響を及ぼし得、ネットワークは、他の成分の発現を増大させる成分と、他の成分の発現を減少させる成分との混合物を含み得る。当業者には容易に理解されるように、１つの成分の発現レベルが１つ以上の異なる成分の発現レベルに影響を及ぼし得る、前述の例は、例証的な目的のものであり、制限的なものではない。さらに何層にも重なる複雑性は、１つ以上の成分が操作可能（すなわち、実験制御、例えば温度制御；薬剤制御、すなわち、薬剤誘導型制御；光制御下にあるなど）となるように（前述のとおり）修飾された場合に、ネットワークにオプションとして導入され得る。
【０４４９】
非限定的な一例として、第１のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡのプロモーターに結合することができ、これにより、標的の治療／代謝遺伝子の発現が制御される。このような場合、第１のガイドＲＮＡの条件付きの発現は、治療／代謝遺伝子を間接的に活性化する。このタイプのＲＮＡカスケードは、例えば、抑制因子を活性因子に容易に変換するのに、有用であり、標的遺伝子の発現の論理または変遷過程（dynamics）を制御するのに使用され得る。
【０４５０】
転写調節方法は、創薬および標的検証にも使用され得る。
【０４５１】
本発明のさまざまな態様は、以下の材料および方法を利用し、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【０４５２】
〔実施例〕
Ｃｐｆ１は、ＲＮＡ開裂活性およびＤＮＡ開裂活性両方を有する単一のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。
【０４５３】
細胞内ヒト病原体であるフランシセラ‐ノビシダＵ１１２は、小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）シークエンシングによって先に分析された。２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座から発現したｓＲＮＡが特定された（図５）。タイプＩＩ−Ｂの遺伝子座に加え、タイプＩＩのシステムの最小構造に似た、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座から発現したｓＲＮＡが検出されたが、ｃａｓ９遺伝子を欠いていた。ｃａｓ１−ｃａｓ２−ｃａｓ４遺伝子の上流に位置するＦＴＮ＿１３９７が、既知のＣａｓタンパク質からの、配列が異なるタンパク質をコード化するｃａｓ遺伝子として特定され、後でｃｐｆ１（パスツレラ、フランシセラのｃａｓ遺伝子）と命名された。このシステムは、近年、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのクラス２に属する、タイプＶ−Ａのシステムとして分類された。タイプＶのＣＲＩＳＰＲアレイは、３６ｎｔのリピート配列により分離された一連の９のスペーサー配列を含んだ。成熟ＲＮＡは、タイプＩおよびＩＩＩのシステムのリピート‐スペーサー組成と同じように、５’のリピート配列および３’のスペーサー配列から構成されたが、タイプＩＩのシステムのスペーサー−リピート組成とは異なっていた（図５）。タイプＩのシステムと同じように、リピートは、そのリピートの３’末端に位置するヘアピン構造を形成した。抗ＣＲＩＳＰＲリピートの存在もｔｒａｃｒＲＮＡホモログの発現も、フランシセラ‐ノビシダのタイプＶ−Ａの遺伝子座の近くでは検出することができず、これは、Ｃｐｆ１が既に説明されたメカニズムと比べて、別個のｃｒＲＮＡ生合成モードを用いたことを示す。ＣＲＩＳＰＲアレイ内からのより短いｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ断片の可能な転写は、タイプＩＩ−Ｃのシステムについて既に報告されているように、検出不可であった。
【０４５４】
次に、Ｃｐｆ１が、タイプＶ−Ａのシステムでのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセシングにおいて単一のエフェクター酵素として作用し得るかどうかを調べた。組み換え型フランシセラ‐ノビシダＣｐｆ１タンパク質は、過剰発現し、精製された。サイズ排除クロマトグラフィーが、タンパク質のオリゴマー状態を決定するために行われた。近年報告された、溶液中のＣｐｆ１二量体の形成とは対照的に、我々のデータの分析では、１８７ｋＤａの分子量が明らかとなり（図６）、これは、Ｃｐｆ１がモノマーであることを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂アッセイは、Ｃｐｆ１が完全長のリピート‐スペーサーからなるＲＮＡを処理し、１９ｎｔのリピート断片および５０ｎｔのリピート‐スペーサーｃｒＲＮＡをもたらしたことを示す（図１）。完全長のリピート配列を有するＲＮＡのみが処理され、これは、Ｃｐｆ１のＲＮＡ開裂活性がリピート依存性であることを示す（図６）。誘導型大腸菌異種システムを使用するノーザンブロット分析はまた、Ｃｐｆ１発現時のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの処理を説明し（図８）、その結果、予想されたＲＮＡ断片を得た。Ｃｐｆ１は、ステムループの４ヌクレオチド上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂した（図２）。これは、それぞれのリピートのヘアピンを認識する、多くのＣａｓ６酵素およびＣａｓ５ｄを連想させた。しかしながら、Ｃｐｆ１は、ステムループの基部において直接開裂せず、構造がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理する唯一の要件ではないことを示唆した。ステムループ構造を維持する変更リピート配列、または非構造化リピートをもたらす突然変異体を有するＲＮＡを設計された。無傷のリピートを含むワイルドタイプＲＮＡ基質とは対照的に、突然変異したＲＮＡのいずれも、Ｃｐｆ１によって開裂されておらず（図９）、リピート開裂反応が配列および構造依存性であることを示している。
【０４５５】
Ｃｐｆ１処理活性のイオン依存性を決定するため、さまざまな二価金属イオンがＲＮＡ開裂アッセイで試験された。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセシングにおけるＣｐｆ１の活性は、Ｍｇ２＋が反応に加えられた場合に最も良かった（図１０Ａ）。Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋の補充も、開裂を媒介したが、Ｍｇ２＋で観察される特異性のレベルには届かなかった。これは、Ｃａｓ６酵素（タイプＩおよびＩＩＩ）またはＣａｓ５ｄ（タイプＩ−Ｃ）のイオン非依存性反応とは対照的であった。よって、この研究は、Ｃｐｆ１が配列および構造特異的な形でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する金属依存性エンドリボヌクレアーゼである、新規のｃｒＲＮＡ生合成メカニズムを強調する。生物情報学的分析では、タイプＶ−ＡがタイプＩＩのシステムの原型となるバージョンであり得、また、転位事象を通じてタイプＩのシステムから発展し得ることが示される。成熟ｃｒＲＮＡのリピート‐スペーサー組成およびヘアピン構造の要件と共に、Ｃｐｆ１がタイプＶ−Ａのシステムのエンドリボヌクレアーゼとして機能するという発見は、この仮説を裏付ける証拠を与える。
【０４５６】
最小のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部として、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９と同様に、ＤＮＡ干渉の原因であると思われる。我々および他者によって近年報告されたように、Ｃｐｆ１は、ｄｓＤＮＡを部位特異的に開裂するためにｃｒＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼとして作用する。スペーサー４またはスペーサー５を含むｃｒＲＮＡを用いた、プロトスペーサー５を含むオリゴヌクレオチドおよびプラスミドに対するＣｐｆ１のＤＮＡ開裂特異性が調べられた。標的に相補的なｃｒＲＮＡのみが、Ｃｐｆ１  ＤＮＡ開裂を媒介した（図３Ａおよび図３Ｂ）。この活性のＲＮＡ要件をさらに分析するため、さまざまな構造を含むいくつかのＲＮＡが構成された（ＲＮＡ１〜８、図１１）。無傷のステムループを有するＲＮＡのみが、Ｃｐｆ１  ＤＮＡ開裂活性を媒介することができた（ＲＮＡ３〜７、図１１Ａおよび図１１Ｂ）。驚くべきことに、スペーサー−リピート構造を有するＲＮＡも、開裂活性を媒介したが、ワイルドタイプより効率は低かった。Ｃｐｆ１のＲＮＡプロセシング活性は、リピート配列に大きく依存した（図９）が、同様のＲＮＡは、残留ＤＮＡ開裂活性をもたらした（ＲＮＡ７、図１１）。これは、リピートの３’末端ヌクレオチドによるものと思われ、これは、突然変異しておらず、重要であると近年報告されている。Ｃｐｆ１はｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理することができるので、完全長のリピート‐スペーサーを有するＲＮＡ（ＲＮＡ４およびＲＮＡ６、図９）が成熟ｃｒＲＮＡ形態と同様の開裂活性を媒介したことは驚くにはあたらない。完全長のリピート‐スペーサーを含むＲＮＡは、Ｃｐｆ１の最も効果的なＤＮＡ結合およびヌクレアーゼ活性を生じた（ＲＮＡ４をＲＮＡ３およびＲＮＡ６と比較のこと。図１２Ａおよび図１１Ｂ）。ｃｒＲＮＡの処理済み形態（ＲＮＡ３、図１１）は、２ｎｔ短い５’末端をもたらした（図２）Ｃｐｆ１の正確なＲＮＡプロセシングが分かる前に、ｓＲＮＡシークエンシング結果（図５）に基づいて構成された。ＲＮＡ６の処理（リピート‐スペーサー−リピート、図１１）は、処理されたリピート−完全長スペーサー−１９ｎｔリピートを含むＲＮＡをもたらした。いずれのＲＮＡも、完全なＤＮＡ標的化活性を媒介するように結合時にＣｐｆ１の理想的な配座変化は生じなかったと思われる。最も良い結合活性は、ＲＮＡ４が使用された場合に達成された（図１２Ａ）。したがって、ＲＮＡ４は、さらなる特徴づけのために選択された。
【０４５７】
スプリットＲｕｖＣモチーフが、Ｃｐｆ１のＤＮＡ開裂活性の原因であると報告された。ＤＮＡ開裂の金属イオン依存状態を調べた。注目すべきことには、Ｃａｓ９の活性を媒介することが示されたＭｇ２＋およびＭｎ２＋に加えて、Ｃｐｆ１は、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡを開裂したことが観察された（図１０Ｂ）。Ｍｇ２＋またはＣａ２＋による開裂の潜在的な違いを調べるため、これらのイオンいずれかの存在下で（図３、図１３）、ＤＮＡ開裂反応が行われた。髄膜炎菌からのＣａｓ９のＨＮＨモチーフがＣａ２＋依存性であることを示す最近の刊行物とは対照的に、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋の存在下で（図３Ｂ；図１３Ｂ）、Ｃｐｆ１の標的または非標的鎖開裂有効性の著しい差は観察されなかった。このことは、両方のＤＮＡ鎖の開裂の原因であり、かつＭｇ２＋ならびにＣａ２＋イオンを調和させ得るＣｐｆ１におけるただ１つの触媒モチーフの存在を示した。
【０４５８】
放射標識標的または非標的鎖のいずれかを有するオリゴヌクレオチド二重鎖を用いた開裂反応によって、異なるサイズの生成物が生じた（図３Ｂ、図１３Ｂ）。この観察は、プラスミド開裂生成物のシークエンシングによって確認され（図１３Ａおよび図１３Ｃ）、これは、近年報告されたように、Ｃｐｆ１による互い違いの切断が５ｎｔの５’オーバーハングを生じることを示したものである。
【０４５９】
フランシセラ‐ノビシダＵ１１２のタイプＶ−ＡのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの２つの予測プロトスペーサー配列を整列させることで、プロトスペーサーの上流で非標的鎖に位置する保存５’−ＴＴＡ−３’配列が明らかとなった。潜在的なＰＡＭを検証するため、プロトスペーサー５が、５’−ＣＴＧ−３’配列をもたらすその隣接領域なしで、クローン化された。両方のプラスミドは、Ｃｐｆ１によって等しく十分に開裂され、これは、この配列における第２の位置が重要であることを示している（図３ｄ、図１４ｄ）。３つすべてのヌクレオチドの突然変異生成に続いてＤＮＡ開裂分析が行われたことで、Ｃｐｆ１は非標的鎖上のｃｒＲＮＡ−相補的ＤＮＡ配列の上流に５’−ＹＴＮ−３’として定められるＰＡＭを認識することが示される。この結果は、Zetsche et al.（Cell, 2015, 163:759-771）によって報告されている既に報告済みの５’−ＴＴＮ−３’ＰＡＭをさらに詳しく説明する。ＰＡＭ認識の鎖特異性を分析するため、両方の鎖にＡＡＮまたはＴＴＮのいずれかを有するオリゴヌクレオチド基質が設計された。これらの基質は、Ｃｐｆ１によって開裂されず、これは、ＰＡＭが二本鎖である必要があり、また、両方の鎖上でおそらく認識されることを示している（図３Ｄ、下方パネル）。Ｃｐｆ１は、ＰＡＭの近位に８ヌクレオチドのシード配列を有する。タイプＩおよびＩＩのシステムの干渉中、プロトスペーサーの最初の８〜１０ｎｔは、安定したＲループの形成を可能にするのに極めて重要である。この配列はシード配列と呼ばれる。タイプＩＩの開裂は、プロトスペーサー内部のＰＡＭの３ｂｐ上流で起こる。対照的に、Ｃｐｆ１のＰＡＭおよび開裂部位は、プロトスペーサーのそれぞれ反対の側に位置する。シード配列の長さを分析するため、標的配列に沿ってスペーサーとプロトスペーサーとの間に単一ミスマッチを有するプラスミドが構築された。Ｃｐｆ１は、ＰＡＭの近位側における最初の８ヌクレオチド内のミスマッチに敏感であるが、４つの連続したミスマッチは許容されない。さらに、Ｃｐｆ１は、比較的程度は低いが、開裂部位（ＰＡＭ遠位部位の位置１〜４）周辺でのミスマッチに対して感受性を示す。これらの結果は、ＰＡＭ近位のわずか３〜５ヌクレオチドのシード配列を示す既に公開されたデータに対して相違していて、標的配列の塩基含量のように、特異性に影響を及ぼす他の因子が存在し得ることを示す。これらの結果は、Ｃｐｆ１が、Ｃａｓ９と同様に、最初にＰＡＭを認識し、その後、ＤＮＡ標的に対するｃｒＲＮＡ相補性を試験することを示す。標的部位周辺のミスマッチは、触媒残基の正しい位置づけを妨げ、したがって開裂活性を減少させる場合がある。
【０４６０】
Ｃｐｆ１は、ＲＮＡおよびＤＮＡ開裂の二重活性を含み、各ヌクレアーゼ反応に別個の活性ドメインを用いる。活性モチーフを決定するため、Ｃｐｆ１アミノ酸配列に沿った保存残基の突然変異生成が行われた。残基Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３のアラニン置換は、ＤＮＡ開裂活性に影響を及ぼさなかったが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ開裂活性の減少を示した。スプリットＲｕｖＣモチーフにおけるＤ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５の突然変異生成は、ＤＮＡ開裂活性の損失を生じたが、Ｃｐｆ１のＲＮＡプロセシング活性に影響せず、ＤＮＡ標的への結合親和性に対しても影響を及ぼさなかった。図４Ｄおよび図１３Ｂを参照。活性モチーフを決定するため、Ｃｐｆ１アミノ酸配列に沿った保存残基の突然変異生成が行われた。図４Ｄは、２つの触媒活性のうちの１つに影響を与える、突然変異した残基について要約している。残基Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３のアラニン置換は、ＤＮＡ開裂活性に影響を与えない（図４Ａ、上方パネル）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ開裂活性の減少を示した（図４Ａ、中央パネル）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡプロセシングへの関与をさらに確認するため、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（リピート‐スペーサー−リピート）およびＣｐｆ１またはその変異体を共発現する異種大腸菌アッセイをセットアップした。ノーザンブロット分析が、誘導発現後に抽出された全ＲＮＡで行われた（図４Ａ、下方パネル）。Ｃｐｆ１の存在下では、ｃｒＲＮＡは分解から保護されており、したがってより豊富にあったように思われた。Ｃｐｆ１＿ｗｔの発現は、約６５ｎｔの別個のバンドの生成を生じ、これは、リピート内での２つの開裂事象により形成された成熟ｃｒＲＮＡに対応する。Ｃｐｆ１＿Ｈ８４３Ａの存在下では、このバンドは、存在しなかった；しかしながら、２つの追加の、より長い転写物が、この突然変異体による変化した処理により現れ、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏで既に見られている（図４Ａ、中央パネル）。突然変異体Ｋ８５２ＡおよびＫ８６９Ａも、ワイルドタイプと比べて強度は低いものの、より長いサイズの２つの生成物に加えて、６５ｎｔの断片の生成を示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、これらの突然変異体は、ほとんどＲＮＡプロセシングを示さなかった。Ｃｐｆ１（Ｋ８５２Ａ）およびＣｐｆ１（Ｋ８６９Ａ）（図１２Ｃ）でのＲＮＡ結合実験は、ワイルドタイプのＣｐｆ１より、ＲＮＡについてわずかに高い親和性を示し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察される開裂生成物を説明し得る。これらのＣｐｆ１突然変異体の残留活性は、処理されたＲＮＡを産生し、これは、タンパク質に対してよりきつく結合される可能性があり、したがって、分解からさらによく保護される。Ｃｐｆ１（Ｆ８７３Ａ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡ開裂活性を低下させ、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出できなかった。前述した残基の突然変異体は、ＲＮＡ結合に悪影響を及ぼさず（図１２Ｃ）、Ｃｐｆ１の特定された残基が潜在的にはＲＮＡ開裂の原因であることを示す。ラクノスピラ科の細菌性Ｃｐｆ１の共結晶構造の分析により、特定された残基が処理されたｃｒＲＮＡの５’に近接して位置することが明らかとなった（Dong et al. (2016) Nature, 532(7600):522-6）。ス��リットＲｕｖＣモチーフにおけるＤ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５の突然変異生成は、ＤＮＡ開裂活性の損失を生じた（図４Ｄ、上方パネル）（Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759-771も参照）が、Ｃｐｆ１のＲＮＡプロセシング活性には影響を及ぼさなかったし（図４Ｂ、下方パネル）、ＤＮＡ標的への結合親和性にも影響を与えなかった（図１２Ｂ）。
【０４６１】
Ｃｐｆ１突然変異体は、ＤＮＡ開裂における金属イオン依存性の差を示す。活性部位の残基に対するスクリーニングの間、反応に存在する金属イオンに応じて、いくつかの突然変異体でＤＮＡ開裂の著しい差が観察された。突然変異体Ｅ９２０Ａ、Ｙ１０２４Ａ、Ｄ１２２７Ａは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡ開裂を示さなかったが、Ｍｇ２＋が存在した場合にはワイルドタイプ活性を示した。残基Ｅ１０２８の突然変異により、Ｃａ２＋依存性開裂の損失も引き起こされ、Ｍｇ２＋の存在下で非標的鎖の開裂がさらに減少し、これは、非標的鎖開裂における関与を示す。対照的に、残基Ｈ９２２およびＹ９２５の突然変異は、Ｃａ２＋の存在下で標的鎖の開裂を劇的に減少させた。これらの突然変異体は、Ｍｇ２＋の存在下でワイルドタイプレベルのＤＮＡ開裂活性を示した。これは、Ｃａ２＋配位および標的鎖開裂における関与を示唆している。したがって、Ｃｐｆ１は、タンパク質が曝露されるカルシウムおよび／またはマグネシウムの相対レベルを変えることによって、「イオン的に調節され」得る。構造的修飾は、Ｃｐｆ１をさらに調節するためにも使用され得る。酵素活性に影響を及ぼす突然変異体を通じてＣｐｆ１のエンドヌクレアーゼ活性を不活化することにより、タンパク質は、ＤＮＡを開裂せずに配列特異的に結合するのにも使用され得る。
【０４６２】
２つのアスパルテート（Ｄ９１７、Ｄ１２５５）および１つのグルタメート（Ｅ１００６）が、Ｃｐｆ１の触媒部位を形成し、これは、他のＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨモチーフと十分一致している。これらの種類の触媒モチーフは、一般的にＤＮＡ開裂に２金属イオン機構を用いる。２金属イオン機構を有する酵素は、金属イオンの選択がより厳しく、大部分で、Ｍｇ２＋が好まれる。対照的に、ＨＮＨヌクレアーゼのように、開裂に１金属イオン機構を使用する酵素は、金属イオンの選択が、より柔軟になり得る。例えば、ＫｐｎＩは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡを高い正確さで開裂するが、Ｍｇ２＋の存在下ではさらに非特異的である。Ｃｐｆ１は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋イオンを使用する能力を有する２金属イオン触媒作用を使用する新しいタイプのＤＮＡヌクレアーゼを表すこともできる。
【０４６３】
Ｃｐｆ１は、ＲＮＡおよびＤＮＡに対する二重の核酸分解活性を有する酵素である。Ｃｐｆ１は、配列および構造依存性が高い形でＲＮＡを開裂し、また、生成されたガイドＲＮＡの存在下でのみ特異的ＤＮＡ開裂を行う酵素である。ＣＲＩＳＰＲ免疫の文脈では、タイプＶ−Ａは、これまで説明された最も効率の良いシステムであり、ｃｒＲＮＡを処理し、このＲＮＡを使用して侵入ＤＮＡを特異的に標的化するのに、ただ１つの酵素Ｃｐｆ１を使用する。Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１と単一のＲＮＡの複合体であるｃｒＲＮＡが第２のＲＮＡ（タイプＩＩのＣａｓ９システムに必要とされるｔｒａｃｒＲＮＡなど）の存在なしにＤＮＡを開裂し得る点で、タイプＩＩのシステムとは根本的に異なる。ＣＲＩＳＰＲ免疫の文脈では、タイプＶ−Ａは、これまで説明された最も効率の良いシステムであり、ｃｒＲＮＡを処理し、このＲＮＡを使用して侵入ＤＮＡを特異的に標的化するのに、ただ１つの酵素Ｃｐｆ１を使用する。
【０４６４】
材料および方法
小ＲＮＡシークエンシング
この研究で使用されるフランシセラ‐ノビシダＵ１１２の小ＲＮＡシークエンシングデータ（表１）は、予め得られていた。手短に言えば、中対数期（mid-logarithmic phase）まで増殖したフランシセラ‐ノビシダＵ１１２のタバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理したＲＮＡｓのｃＤＮＡライブラリーが、ＳｃｒｉｐｔＭｉｎｅｒ（商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）を用いて準備され、Ｖｉｅｎｎａ  ＢｉｏｃｅｎｔｅｒのＣａｍｐｕｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ  ＧｍｂＨ  （ＣＳＦ）  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  （ＮＧＳ）  Ｕｎｉｔで配列を決定された。アダプタ除去および品質調整（quality trimming）後、Ｂｏｗｔｉｅを用いてリード数（reads）を、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２ゲノムにマッピングした（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００８６０１、マップされたリード数４８２０５）。リードのカバレッジは、ＢＥＤＴｏｏｌｓ（バージョン２．１５．０．）を用いて計算され、正規化されたｗｉｇｇｌｅファイルが、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／）を用いて作成および可視化された。
【０４６５】
組み換え型Ｃｐｆ１の産生および精製
ｃｐｆ１（ＦＴＮ＿１３９７）遺伝子は、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２のゲノムＤＮＡから増幅され、発現ベクターｐＥＴ−１６ｂへとクローン化されて、Ｎ−末端６ｘＨｉｓタグでのＣｐｆ１の発現を促進した（表２および表３）。大腸菌（ＮｉＣｏ２１  （ＤＥ３））内でのタンパク質の産生については、過剰発現プラスミドを含む細胞が、３７℃で増殖させられて、０．６〜０．８のＯＤ６００ｎｍに到達した。発現は、０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を加えることで誘発され、培養物は、１８℃で一晩さらにインキュベートされた。採取後、細胞ペレットは、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、５００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のトリトンＸ−１００）で再懸濁されて、その後、６分間音波処理（０．５秒パルス）し、細胞破砕した。ライセートは、遠心分離（４７８００ｇ、３０分、４℃）によって除去され、上澄みが、滴下カラム（drop column）のＮｉ−ＮＴＡ−セファロース樹脂に適用された。１０ｍＬの溶解緩衝液と、その後の１０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、３００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール）での洗浄工程後、タンパク質は、溶出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＫＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、０．１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶出された。溶出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、クマシーブルー染色された。Ｃｐｆ１を含む画分が、ＦＰＬＣ  Ａｋｔａ精製システム（ＧＥヘルスケア）を用いて陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ［ＧＥヘルスケア］）のためにプールされ、Ｃｐｆ１が、塩化カリウム（１００〜１０００ｍＭのＫＣｌ）の直線勾配で溶出された。ピーク画分が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色で分析された。Ｃｐｆ１を含む画分は、プールされ、平衡化した（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＫＣｌ）ｐｒｅｐｇｒａｄｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）に直接適用され、ＦＰＬＣにより精製された後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色で分析された。カラムの分子量キャリブレーションが、製造者のプロトコルに記載されるように分子量マーカーを用いて実行された（Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。タンパク質は、透析緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＫＣｌ、５０％のグリセロール）に対して透析され、使用されるまで−２０℃で保管された。
【０４６６】
Ｃｐｆ１の部位特異的突然変異生成
Ｃｐｆ１の部位特異的突然変異のためのオリゴヌクレオチド（表３）が、ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎツールを用いて設計され、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって産生された。２つの個別のＰＣＲが行われて、所望の突然変異体を得た。手短に言うと、ワイルドタイプｃｐｆ１を含むベクターは、順方向または逆方向のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅプライマーのいずれかを含む２つの反応で増幅された。初期の増幅後、２つの反応は合わせられて、第２のＰＣＲが行われた。ＰＣＲの後、テンプレートプラスミドが、ＤｐｎＩ（３時間、３７℃）で分解され、化学的に適格性があるＤＨ５−α細胞へと形質転換された。プラスミドは、製造業者の説明書に従ってプラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて準備された。突然変異生成の成功は、シークエンシング（ＳｅｑＬａｂ）により確認された。
【０４６７】
本研究で使用されるＲＮＡの生成
本研究で使用される小ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従ってＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７−Ｆｌａｓｈキット（Ｂｉｏｚｙｍ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成された。手短に言えば、所望の配列（表３）およびＴ７−プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドが、相補的Ｔ７−プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション生成物は、その後、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７−Ｆｌａｓｈキット（Ｂｉｏｚｙｍ）に従って転写反応のためのテンプレートとして使用された。内部標識されたＲＮＡを得るため、［α−３２Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｈａｒｔｍａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に加えられた。末端標識ＲＮＡを生成するため、非標識転写物が、３７℃で３０分間Ｆａｓｔ−ＡＰホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で脱リン酸化され、その後、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製された。脱リン酸化されたＲＮＡはその後、製造業者の説明書に従って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いて標識された。産生されたＲＮＡは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８Ｍの尿素；１Ｘ  ＴＢＥ；１０％のポリアクリルアミド）を用いて分離された。（放射能標識されたＲＮＡでは）オートラジオグラフィースクリーンまたは（非標識ＲＮＡでは）エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色に短時間曝露した後、ＲＮＡのそれぞれのバンドが、切除された。ＲＮＡの溶出は、５００μＬのＲＮＡ溶出緩衝液（２５０ｍＭのＮａＯＡｃ；２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．５］；１ｍＭのＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］；０．２５％のＳＤＳ）中でのゲル切片のインキュベーションおよび氷上での一晩のインキュベーションによって達成された。溶出後、ＲＮＡは、２倍容のエタノール（ＥｔＯＨ１００％；冷たい）および１／１００グリコーゲンで−２０℃で１時間沈殿させられた。７０％のＥｔＯＨで洗浄した後、空気乾燥ペレットが、Ｈ２Ｏｍｑに再懸濁された。
【０４６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ開裂アッセイ
示された濃度のＣｐｆ１およびさまざまなＲＮＡ基質を用いたＲＮＡ開裂アッセイは、１０ｍＭのＭｇＣｌ２が補充されたＫＧＢ緩衝液（１００ｍＭのグルタミン酸カリウム、２５ｍＭのＴｒｉｓ／酢酸［ｐＨ７．５］、５００μＭの２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）において３７℃で最終容積１０μＬで実行された。別様に示されていなければ、反応は、２μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）の添加によって１０分後に停止され、その後、３７℃で１０分間インキュベーションして、タンパク質分解を達成した。２Ｘのローディング染料（１０Ｍの尿素、１．５ｍＭのＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）を添加した後、試料は、１２％の変性ポリアクリルアミドゲル上に載せられ、１２．５Ｖ／ｃｍで３時間１Ｘ  ＴＢＥ中に通された。このシークエンシングゲルでは、試料は、１０％の変性ポリアクリルアミドゲル上に載せる前に沈殿された。ゲル電気泳動は、４０Ｗで３．５時間実行された。可視化は、ホスホアイメージング（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９０００  Ｆｕｊｉ）によって達成された。
【０４６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡプロセシング
Ｃｐｆ１によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡプロセシングを調べるため、異種システムが大腸菌において設計された。Ｔ７−プロモーターおよびＴ７−ターミネーターの制御下でリピート‐スペーサー−リピート構造を含むｃｒＲＮＡをコード化するＤＮＡ断片が、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥａｇＩを用いてｐＡＣＹＣ１８４へとクローン化され、ｐＥＣ１６９０をもたらした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、このプラスミドおよびワイルドタイプまたは突然変異Ｃｐｆ１の過剰発現ベクターで同時形質転換された。空の発現ベクターｐＥＴ−１６ｂは、陰性対照として役立った。細菌細胞は、０．１ｍＭのＩＰＴＧの存在または不存在下で３７℃で増殖され、初期対数期（０．４のＯＤ６００ｎｍ）に達した。ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、その後、先に説明したようにノーザンブロット分析を行って、抽出された。手短に言えば、ＲＮＡは、１０％のポリアクリルアミドゲルを変性させると（８Ｍの尿素、１Ｘ  ＴＢＥ）分離され、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋、ＧＥヘルスケア）上でセミドライブロッティングによって移動された。化学的架橋は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）で、６０℃で１時間行われた。オリゴヌクレオチドは、前述したように［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で放射能標識され、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製された。プローブのハイブリダイゼーションは、４２℃で一晩インキュベーションすることによって、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（ＧＥヘルスケア）中で行われた。放射能信号（radioactive signal）は、ホスホアイメージングを用いて可視化された。
【０４７０】
ＤＮＡ基質の生成
Ｃｐｆ１の標的開裂部位を見つけるため、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２のタイプＶのＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列が、ＢＬＡＳＴによって分析された。スペーサー４およびスペーサー５の潜在的な標的が、ＣＤＳ：ＡＥＥ２６３０８．１とＣＤＳ：ＡＥＥ２６３０７．１との間の遺伝子間領域と、ＣＤＳ：ＡＥＥ２６３０１．１とのそれぞれに位置する、フランシセラ‐ノビシダ３５２３において特定された。４２ｂｐ上流および下流を含むスペーサー５に相補的な配列を含む標的プロトスペーサーが、ＨｉｎｄＩＩＩオーバーハングを有する二本鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドとして合成された。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続いて、断片は、ＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＵＣ１９へとクローン化され、プラスミドｐＥＣ１６６４（プロトスペーサー５＋隣接領域）をもたらした。隣接領域のない同じプロトスペーサー配列が、ｐＵＣ１９へとクローン化され、ｐＥＣ１６８８（プロトスペーサー５）をもたらした。ＰＡＭを識別するため、突然変異生成は、部位特異的突然変異生成のための説明したプロトコルをｐＥＣ１６８８に適用することによって、実行された。プラスミド調製は、製造業者の説明書に従ってＭｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われ、ＤＮＡの完全性が、シークエンシング（ＳｅｑＬａｂ）によって確認された。プロトスペーサーを含むオリゴヌクレオチド（表ｘｘ）が、Ｓｉｇｍａで注文され、放射能標識前にハイブリダイズされた。あるいは、一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドが、相補的な非標識オリゴヌクレオチドで標識およびハイブリダイズされた。５’末端標識反応は、製造業者の説明書に従って［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（５０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて実行された。標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製された。
【０４７１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ開裂アッセイ
プラスミドＤＮＡ開裂アッセイは、１０ｍＭのＭｇＣｌ２または１０ｍＭのＣａＣｌ２が補充されたＫＧＢ中で、３７℃で１５分間、１００ｎＭのＣｐｆ１を２００ｎＭのＲＮＡで事前にインキュベートすることによって実行された。１０ｎＭのプラスミドＤＮＡが、反応に加えられて、１０μＬの最終容積をもたらし、３７℃で１時間さらにインキュベートされた。反応は、１μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）の添加および３７℃での５分間のインキュベーションによって停止した。反応を分離する前に、３μＬの５Ｘ  ＤＮＡ添加液（２５０ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のＳＤＳ、２５％のグリセロール、０．０１％のブロモフェノールブルー）が添加され、試料は、０．８％のアガロースゲル（１Ｘ  ＴＡＥ）上に載せられた。開裂生成物は、ＥｔＢｒ染色によって可視化された。放射能標識された基質を用いた開裂アッセイでは、５ｎＭの５’標識ｄｓオリゴヌクレオチドが、Ｃｐｆ１とＲＮＡとの事前形成された複合体に添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。プロテイナーゼＫ処置後、１０μＬの２Ｘ変性添加液（９５％のホルムアミド、０．０２５％のＳＤＳ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のブロモフェノールブルー）が添加された。予測される開裂生成物のサイズのオリゴヌクレオチドは、前述したように５’放射標識され、等しい容積の２Ｘ変性添加液と混合され、サイズマーカーとして役立った。９５℃で５分間インキュベーションした後、試料は、１２％の変性ポリアクリルアミドゲル上に載せられ、１４Ｖ／ｃｍで７０分間、１Ｘ  ＴＢＥに通された。開裂は、ホスホアイメージングを用いて可視化された。
【０４７２】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡ用の基質が、前述したように生成された。結合反応のため、Ｃｐｆ１は、２モル過剰のｃｒＲＮＡを含む結合緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ、５０％のグリセロール）中で事前にインキュベートされた。３７℃で１５分経過した後、１ｎＭの標識されたＤＮＡ基質が添加された。次に、タンパク質−ＤＮＡ複合体を非結合ＤＮＡから分離するために、試料が０．５Ｘ  ＴＢＥに通される未変性の５％ポリアクリルアミドゲル上に載せられる前に、反応が、３７℃で１時間行われた。ゲルは、オートラジオグラフィーフィルム上で一晩さらされ、ホスホアイメージングによって可視化された。
【０４７３】
Ｃｐｆ１オルソログの複数配列アラインメント
Ｃｐｆ１オルソログの配列は、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２のＣｐｆ１をクエリとして用いてＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴサーチによって得られた。５２のオルソログ配列の複数配列アラインメントが、ＭＵＳＣＬＥを用いて生成された。配列のうち９つのアラインメントが、Ｊａｌｖｉｅｗで可視化された。
【０４７４】
以下の表は、研究に使用された、株（表１）、プラスミド（表２）、オリゴヌクレオチド（表３）のリストを示す。
【表６】
2018532402.tif 000008
【表７】
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【表８−１】
2018532402.tif 000010
【表９−２】
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【表１０−３】
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【表１１−４】
2018532402.tif 000013
【表１２−５】
2018532402.tif 000014
【０４７５】
本発明は、特定の実施形態に関して説明してきたが、変形および改変が当業者に想到されることが理解される。したがって、特許請求の範囲に現れる制限のみが、本発明に課されるべきである。
【０４７６】
本明細書で引用されたすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許それぞれが参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれ、かつ刊行物が関連して列挙された方法および／または材料を開示および説明するために、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日に先立つその開示のためのものであり、先行発明によるそのような刊行物に先行する権利を本発明が有さないことの承認と解釈されるべきではない。さらに、提供される公表日は実際の公表日と異なる場合があり、実際の公表日は、独立して確認する必要がある場合がある。
【０４７７】
〔実施の態様〕
（１）  細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの１つ以上の場所で標的ＤＮＡを標的化、編集、修飾、または操作する方法において、
ｉ）異種Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸を前記細胞に導入することと、
ｉｉ）ａ）単一の異種ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはこれをコード化するＤＮＡを導入することであって、前記ｇＲＮＡは、１つ以上のｃｒＲＮＡまたは１つ以上の中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡをコード化する前駆体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）を含み、各ガイドＲＮＡは、最低でも、５から３の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートはステムループ構造を含み、前記スペーサーは、前記標的ＤＮＡの標的配列に相補的なＤＮＡ標的セグメントを含む、ことと、
ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡに１つ以上の切断部を作るか、または別様に前記標的ＤＮＡを標的化もしくは操作することであって、ＤＮＡ開裂は、Ｃｐｆ１ポリペプチドＤＮａｓｅによって媒介される、ことと、
を含み、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、その処理形態または未処理形態において前記ｇＲＮＡによって前記標的ＤＮＡに導かれる、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
ｇＲＮＡは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮａｓｅ活性によって、少なくとも１つのリピートおよび少なくとも１つのスペーサーをそれぞれが含む１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと開裂される、方法。
（３）  実施態様１に記載の方法において、
ｇＲＮＡは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドを前記標的ＤＮＡの２つ以上の別個の部位に導く１つ以上のリピート‐スペーサーを含む、方法。
（４）  実施態様１に記載の方法において、
前記標的ＤＮＡの各切断部は、二本鎖であり、５’オーバーハングを含む、方法。
（５）  実施態様４に記載の方法において、
前記５’オーバーハングは、５つのヌクレオチドを含む、方法。
【０４７８】
（６）  実施態様４に記載の方法において、
少なくとも２つの５’オーバーハングが作られ、前記５’オーバーハングのそれぞれが、互いに非相同または非相補的であり、異種開裂部位の再結合またはリアニールにより引き起こされる染色体転座の可能性を減少させる、方法。
（７）  実施態様１に記載の方法において、
前記標的ＤＮＡの前記切断部を、前記細胞に存在する内因性のＤＮＡポリメラーゼ修復メカニズムによって修復させることをさらに含む、方法。
（８）  実施態様１に記載の方法において、
相同組換え修復によって前記標的ＤＮＡの編集を可能にする条件下でドナーＤＮＡ配列を導入することをさらに含む、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、モノマーとして発現される、方法。
（１０）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、約１５３ｋＤａの計算された分子量または約１８７ｋＤａの見かけの分子量を有する、方法。
【０４７９】
（１１）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ＲＮＡ開裂ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを有する、方法。
（１２）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドの前記ＲＮａｓｅ活性は、前記リピート‐スペーサーアレイの前記リピート内でｇＲＮＡを開裂する、方法。
（１３）  実施態様１２に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記アレイの前記ステムループ構造の４ヌクレオチド上流でｇＲＮＡを開裂する、方法。
（１４）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＲＮａｓｅ活性は、Ｍｇ２＋を必要とする、方法。
（１５）  実施態様１に記載の方法において、
前記ｇＲＮＡは、開裂され、１つ以上の中間ｃｒＲＮＡへと処理され、前記中間ｃｒＲＮＡは、その後、１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡへと処理される、方法。
【０４８０】
（１６）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮａｓｅ活性は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋を必要とする、方法。
（１７）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記標的ＤＮＡのＰＡＭ配列を認識し、前記ＰＡＭ配列は、非標的鎖上のｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列の上流の５’−ＹＴＮ−３’（ＹはＴまたはＣ）である、方法。
（１８）  実施態様１７に記載の方法において、
前記ｇＲＮＡは、前記スペーサーの５’末端に位置する、８ヌクレオチドのシード配列を有し、前記標的ＤＮＡ上の前記ＰＡＭ配列の近位にある、方法。
（１９）  実施態様１７に記載の方法において、
Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記ＰＡＭ配列の約２０ヌクレオチド上流で前記標的ＤＮＡを開裂する、方法。
（２０）  実施態様１７に記載の方法において、
Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡに相補的な標的鎖上の前記ＰＡＭ配列のちょうど２２塩基対上流、かつｃｒＲＮＡに非相補的な非標的鎖上の前記ＰＡＭ配列の１７塩基対下流で前記ＤＮＡを開裂する、方法。
【０４８１】
（２１）  実施態様１に記載の方法において、
前記ｇＲＮＡは、前記ステムループの上流にいくつかのヌクレオチドを含み、それによって、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドのＤＮａｓｅ活性を高める、方法。
（２２）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ａ）ＲＮａｓｅ活性を低下もしくは排除すると共に、ＤＮａｓｅ活性を維持するか、またはｂ）ＤＮａｓｅ活性を低下もしくは排除すると共に、ＲＮａｓｅ活性を維持するために、突然変異する、方法。
（２３）  実施態様１７に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドにおける特定のアミノ酸残基の修飾は、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３、Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、Ｄ１２２７、Ｅ１０２８、Ｈ９２２、およびＹ９２５からなる群から選択される、方法。
（２４）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ａ）前記標的ＤＮＡの、他方のＤＮＡ鎖を除いて一方のみのＤＮＡ鎖の開裂を減少させ、ｂ）ＲＮＡ安定性を増大させ、かつ／またはｃ）ＤＮＡ結合を増大させるために、突然変異する、方法。
（２５）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、変化したＣｐｆ１エンドリボヌクレアーゼ活性またはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、中間ｃｒＲＮＡ、もしくは成熟ｃｒＲＮＡの関連した半減期を有し、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、およびＦ８７３からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
【０４８２】
（２６）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、実質的に減少または改良されたエンドリボヌクレアーゼ活性またはＤＮＡへの結合親和性なしに、変化するかまたは無効となったＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を備え、かつＤ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
（２７）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がなく、Ｍｇ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少または改良されず、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、およびＤ１２２７からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
（２８）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性がなく、Ｍｇ２＋の存在下で非標的鎖のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少し、アミノ酸残基Ｅ１０２８に突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
（２９）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ｃａ２＋の存在下で標的鎖のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少し、Ｍｇ２＋の存在下でＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が実質的に減少または改良されず、Ｈ９２２およびＹ９２５から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の突然変異体を有する、突然変異ポリペプチドである、方法。
（３０）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、または動物細胞である、方法。
【０４８３】
（３１）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドおよび前記ｇＲＮＡは、前記ポリペプチドおよび前記ｇＲＮＡをコード化する同じかまたは異なる組み換え型ベクターによって前記細胞に導入される、方法。
（３２）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２、プレボテラ・アルベンシス、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス、スミセラ種ＳＣＡＤＣ、フラボバクテリウム種３１６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４からなる群から選択される種に由来する、方法。
（３３）  実施態様１に記載の方法において、
ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間ｃｒＲＮＡは、Ｃｐｆ１ポリペプチドによって成熟ｃｒＲＮＡへと処理され、それによって、前記成熟ｃｒＲＮＡは、容易に前記Ｃｐｆ１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を導くのに利用可能となる、方法。
（３４）  実施態様３３に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドによる処理の結果として、前記成熟ｃｒＲＮＡとより容易に合成される、方法。
（３５）  実施態様３４に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはそのＤＮＡ発現構造体内部で１つ以上のｃｒＲＮＡ配列に５’または３’で組み込まれた異種配列をさらに含む前記ｇＲＮＡから、１つ以上の成熟ｃｒＲＮＡを開裂、単離、または精製することができる、方法。
【０４８４】
（３６）  実施態様１に記載の方法において、
異種配列は、安定性、半減期、その発現レベル、または前記Ｃｐｆ１ポリペプチドもしくは標的ＤＮＡとの相互作用のタイミング、または当技術分野で既知の任意の他の物理的もしくは生化学的特徴を修飾するために、ｇＲＮＡに組み込まれる、方法。
（３７）  実施態様１に記載の方法において、
前記ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列内部の２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡ配列の差異的調節をもたらすように修飾される、方法。
（３８）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはｇＲＮＡ部分は、二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、その温度感受性の変異体、またはエンドヌクレアーゼ活性を有する別のポリペプチドに結合され、それによって、１つ以上のＤＮＡ標的に導かれる、方法。
（３９）  実施態様３８に記載の方法において、
二量体型ＦＯＫ１ヌクレアーゼと結合した前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、（ＲＮＡとしての、またはＤＮＡとしてコード化された）前記単一のｇＲＮＡと共に、１つのプロモーターの制御下で、前記細胞に導入され、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、前記ステムループ構造の上流でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂して、２つ以上の中間ｃｒＲＮＡを生成する、方法。
（４０）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはｇＲＮＡ部分は、ｇＲＮＡによって前記標的ＤＮＡ上の１つ以上の部位に導かれるように、一本鎖または二本鎖ＤＮＡドナーテンプレートに結合され、それによって外来性ＤＮＡ配列の相同組換えを促進する、方法。
【０４８５】
（４１）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ドナーテンプレートは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドによって前記ｇＲＮＡから開裂され、それにより、相同組換えまたは相同組換え修復を促進する、方法。
（４２）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ドナーテンプレートは、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドが中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを遊離させるためにｇＲＮＡを開裂する間、ｇＲＮＡに結合したままである、方法。
（４３）  実施態様１に記載の方法において、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドまたは前記ｇＲＮＡは、転写活性因子もしくは抑制因子、またはエピジェネティック修飾因子に結合されて、１つ以上のＤＮＡ標的部位を検出するか、または前記部位に関連するシグナル伝達または発現を調節する、方法。
（４４）  実施態様４３に記載の方法において、
前記エピジェネティック修飾因子は、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、またはデアセチラーゼである、方法。
（４５）  実施態様１に記載の方法において、
前記標的ＤＮＡは、二本鎖標的であり、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのヘテロ二重鎖に対してエンドヌクレアーゼ活性を持たないか、または低いエンドヌクレアーゼ活性を有する、方法。
【０４８６】
（４６）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは細胞中で標的ＤＮＡを標的化、編集、修飾、または操作するシステムにおいて、
組成物は、Ｃｐｆ１ポリペプチドをコード化もしくは提供する異種ベクターと、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは１つ以上の中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種ガイド核酸と、を含み、各ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡは、最低でも、５’から３’の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートは、ステムループ構造を含み、前記スペーサーは、ＤＮＡ標的セグメントを含む、システム。
（４７）  実施態様４６に記載のシステムにおいて、
前記システムは、Ｍｇ２＋もしくはＣａ２＋、またはその両方を提供する緩衝液をさらに含む、システム。
（４８）  実施態様４６に記載のシステムにおいて、
ガイド核酸は、前記ステムループ構造の近位に８ヌクレオチドのシード配列を有し、前記シード配列は、前記標的ＤＮＡの配列に十分に相補的である、システム。
（４９）  実施態様４８に記載のシステムにおいて、
前記標的ＤＮＡの相補的な配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流にあり、前記ＰＡＭ配列は、「非標的」鎖上に位置する５’−ＹＴＮ−３’（ＹはＴまたはＣ）である、システム。
（５０）  実施態様４６に記載のシステムにおいて、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、突然変異する、システム。
【０４８７】
（５１）  実施態様５０に記載のシステムにおいて、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドの突然変異は、Ｈ８４３、Ｋ８５２、Ｋ８６９、Ｆ８７３、Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｄ１２５５、Ｅ９２０、Ｙ１０２４、Ｄ１２２７、Ｅ１０２８、Ｈ９２２、およびＹ９２５からなる群から選択される、システム。
（５２）  実施態様４６に記載のシステムにおいて、
前記システムは、相同組換え修復によって標的ＤＮＡ配列を編集するためのドナーＤＮＡ配列をさらに含む、システム。
（５３）  実施態様４６に記載のシステムにおいて、
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、フランシセラ‐ノビシダＵ１１２、プレボテラ・アルベンシス、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６、ユーバクテリウム・エリジェンスＣＡＧ：７２、ブチリビブリオ‐フィブリソルベンス、スミセラ種ＳＣＡＤＣ、フラボバクテリウム種３１６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス、およびバクテロイデス門のオーラルタクソン２７４からなる群から選択される種に由来する、システム。
（５４）  細胞の１つ以上の場所でＤＮＡを編集または修飾するための組成物において、
ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、もしくはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸、および／または、
ｉｉ）少なくとも１つのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡｓまたは中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸（ｇＲＮＡ）、
から本質的になり、
各ガイドＲＮＡは、最低でも、５’から３’の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートはステムループ構造を含み、前記スペーサーは、標的ＤＮＡの標的配列に相補的なＤＮＡ標的セグメントを含む、組成物。
（５５）  細胞の複数の場所でＤＮＡを編集または修飾するための実施態様５４に記載の組成物において、
ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、もしくはＣｐｆ１ポリペプチドをコード化する核酸、および／または、
ｉｉ）ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡまたは２つ以上の中間もしくは成熟ｃｒＲＮＡを含む単一の異種核酸（ｇＲＮＡ）、
から本質的になり、
各ガイドＲＮＡは、最低でも、５’から３’の方向にリピート‐スペーサーを含み、前記リピートはステムループ構造を含み、前記スペーサーは、標的ＤＮＡの標的配列に相補的なＤＮＡ標的セグメントを含む、組成物。
【０４８８】
（５６）  実施態様５４に記載の組成物において、
前記組成物は、ｉｉｉ）ポリヌクレオチドドナーテンプレートをさらに含む、組成物。
（５７）  実施態様５５に記載の組成物において、
ガイドＲＮＡは、ドナーテンプレート核酸に結合される、組成物。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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