(57)【要約】本発明は、一般に、ヒトＣＤ３７に結合する抗体およびＣＤ３７に基づく治療法のための診断アッセイに関する。ＣＤ３７抗体およびその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１１０〜１３７の１つまたは複数を含むエピトープに結合することができる。ＣＤ３７抗体およびその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含むポリペプチドおよび／またはＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含むポリペプチドに結合することもできるが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチドを含む抗体と同じＣＤ３７エピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
配列番号９のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチドを含む抗体のＣＤ３７に対する結合を競合的に阻害する、ＣＤ３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
それぞれ配列番号３〜５の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ配列番号６〜８の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
それぞれ配列番号３〜５のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに配列番号６〜８のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、ＣＤ３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
配列番号９および１０のポリペプチド配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
前記ポリペプチド配列が、配列番号９および１０のポリペプチド配列と少なくとも９５％同一である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記ポリペプチド配列が、配列番号９および１０のポリペプチド配列と少なくとも９９％同一である、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
配列番号９および１０の配列のアミノ酸を含むポリペプチド配列を含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
配列番号９を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
配列番号１０を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記抗体が、組換えにより作製される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、またはヒトのものである、請求項１から１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
前記ヒト化抗体が、表面再構成されたものである、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
全長抗体である、請求項１から１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
抗原結合性断片である、請求項１から１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１８】
約０．５〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＣＤ３７に結合する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
約１．０ｎＭまたはより良いＫｄでヒトＣＤ３７に結合する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含むポリペプチドに結合する、請求項２から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含むポリペプチドに結合する、請求項２から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２２】
配列番号１５に示す配列に結合する、請求項２から２１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２３】
配列番号１６に示す配列に結合する、請求項２から２２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２４】
配列番号１７に示す配列に結合する、請求項２から２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２５】
ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含むポリペプチドに結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない、請求項２から２４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２６】
ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含むポリペプチドに結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない、請求項２から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２７】
配列番号１５のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない、請求項２から２６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２８】
配列番号１６のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない、請求項２から２７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２９】
配列番号１７のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない、請求項２から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３０】
ＣＤ３７のアミノ酸１１０〜１３７中の少なくとも１つのアミノ酸に結合する、請求項２から２９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３１】
結合親和性が、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって測定される、請求項１８から３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３２】
検出可能に標識されている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３３】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を産生する細胞。
【請求項３４】
単離されている、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、（ａ）請求項３３または３４に記載の細胞を培養するステップと；（ｂ）前記培養細胞から前記抗体またはその抗原結合性断片を単離するステップとを含む方法。
【請求項３６】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片ならびにＩＨＣ緩衝液、ＥＬＩＳＡ緩衝液およびＦＡＣＳ緩衝液からなる群から選択される緩衝液を含む組成物。
【請求項３７】
サンプル中のＣＤ３７発現を検出する方法であって、前記サンプルを請求項１から３２のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項３８】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、検出可能に標識されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標識が、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素標識、放射性標識、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子および磁気粒子からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標識が、酵素標識である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＣＤ３７発現が、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、細胞数測定、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイまたは免疫組織化学アッセイによって決定される、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＤ３７発現が、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイによって決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤によるがん治療の有効性を増大させるための方法であって、前記方法が、がんを有する対象に前記治療活性剤を投与するステップを含み、前記対象由来のがん性サンプルにおいてＣＤ３７の発現の増大が、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用して検出されている、方法。
【請求項４４】
抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤に応答する可能性が高いがんを同定するための方法であって、
ａ．前記がん由来細胞を含む生体サンプルを請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物と接触させるステップと；
ｂ．（ａ）の前記生体サンプルにおける、ＣＤ３７に対する前記抗体またはその抗原結合性断片の結合を検出するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）の前記結合にスコアを割り当てるステップであって、前記スコアが１つまたは複数の参照サンプルとの比較に基づいて割り当てられる、ステップと；
ｄ．ステップ（ｃ）における前記スコアを参照組織または細胞のスコアと比較するステップであって、正常もしくは低ＣＤ３７発現参照サンプルのスコアより大きい前記がんＣＤ３７レベルのスコアまたは高ＣＤ３７発現参照サンプルのスコアと等しいもしくはより大きい前記がんＣＤ３７レベルのスコアが、前記がんを抗ＣＤ３７抗体に応答する可能性が高いと同定する、ステップと
を含む方法。
【請求項４５】
がんを有する患者を処置する方法であって、
ａ．前記患者から得たがん性サンプル中のＣＤ３７発現の検出からＣＤ３７発現スコアを決定するステップであって、前記検出が、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用して実施される、ステップと；
ｂ．前記スコアが、前記患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、前記患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む前記治療活性剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
がんを有する患者を処置する方法であって、
ａ．前記患者から得たがん性サンプル中のＣＤ３７発現の検出からＣＤ３７発現スコアを決定するステップであって、前記検出が、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用して実施される、ステップと；
ｂ．前記スコアが、前記患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、前記患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む前記治療活性剤を投与するように保健医療提供者に指示するステップと
を含む方法。
【請求項４７】
がんを有する患者を処置する方法であって、
ａ．がんを有する患者から採取したがん性サンプルを提出して、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用するＣＤ３７発現の検出からＣＤ３７発現スコアを決定するステップと；
ｂ．前記スコアが、前記患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、前記患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む前記治療活性剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
がんを有する患者を処置する方法であって、
ａ．前記患者から得たがん性サンプル中のＣＤ３７発現を検出するステップであって、前記検出が、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用して実施される、ステップと；
ｂ．前記がん性サンプルのＣＤ３７発現スコアを決定するステップと；
ｃ．前記スコアが、前記患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、前記患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む前記治療活性剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
がんを抗ＣＤ３７活性がある薬剤による処置に感受性があると同定する方法であって、
ａ．請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用して前記がん由来がん性サンプル中のＣＤ３７発現のレベルを検出するステップであって、前記検出が、１つまたは複数の参照サンプルにおける染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７発現がん性サンプルにおける染色強度または染色均一性を区別する方法の使用を含むステップと；
ｂ．前記がん性サンプルのＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを決定するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）において決定した前記ＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを、少なくとも１つの参照サンプルにおいてＣＤ３７タンパク質発現を測定することによって決定した相対値と比較するステップであって、前記少なくとも１つの参照サンプルが、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤による処置に感受性がない組織、細胞もしくは細胞ペレットサンプルであり、前記相対値より高い、ステップ（ｂ）において決定した前記がん性サンプルのＣＤ３７染色強度スコアが、前記がんを前記治療活性剤による処置に感受性があると同定する、ステップと
を含む方法。
【請求項５０】
がんを抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤による処置に感受性があると同定する方法であって、
ａ．請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物を使用して前記がん由来がん性サンプル中のＣＤ３７発現のレベルを検出するステップであって、前記検出が、１つまたは複数の参照サンプルにおける染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７発現がん性サンプルにおける染色強度または染色均一性を区別する方法の使用を含むステップと；
ｂ．前記がん性サンプルのＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを決定するステップと；
ｃ．ステップ（ｂ）において決定した前記ＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを、少なくとも１つの参照サンプルにおいてＣＤ３７タンパク質発現を測定することによって決定した相対値と比較するステップであって、前記少なくとも１つの参照サンプルが、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤による処置に感受性がある組織、細胞もしくは細胞ペレットサンプルであり、前記相対値より大きいまたは等しい、ステップ（ｂ）において決定した前記がん性サンプルのＣＤ３７染色強度スコアが、前記がんを前記治療活性剤による処置に感受性があると同定する、ステップと
を含む方法。
【請求項５１】
前記がん性サンプルまたは生体サンプルを得た前記対象に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を投与するステップをさらに含む、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者のＣＤ３７レベルが、前記患者から得たがん性サンプルまたは生体サンプルにおいて検出される、請求項４３から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記がん性サンプルまたは生体サンプルが、体液抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液または脾臓調製物である、請求項４３から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記検出するステップが、免疫組織化学（ＩＨＣ）による、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＩＨＣが、ＣＤ３７発現の異なるレベルを区別することができる較正されたＩＨＣである、請求項４２または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＩＨＣによって、低ＣＤ３７発現、中ＣＤ３７発現または高ＣＤ３７発現を有するサンプルについての染色強度の範囲が得られる、請求項４２、５４または５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＩＨＣが、参照サンプルと比較してＣＤ３７発現がん性サンプルまたは生体サンプルにおける染色強度および染色均一性を区別する、請求項４２または５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩＨＣが、手作業で実施される、請求項４２または５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＩＨＣが、自動システムを使用して実施される、請求項４２または５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ＣＤ３７スコアが、前記ＩＨＣから決定される、請求項４２または５４から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出するステップが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記参照サンプルが、陽性参照サンプルまたは陰性参照サンプルである、請求項４４、４９または５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記参照サンプルが、細胞、細胞ペレットまたは組織を含む、請求項４４、４９、５０または５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片が、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素、放射性標識、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子および磁気粒子からなる群から選択される検出試薬をさらに含む、請求項４３から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記検出試薬が、酵素である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記がんが、ＣＤ３７陽性がんである、請求項４３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項４３から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記がんが、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、および成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンストレームマクログロブリン血症ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群から選択される、請求項４３から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＤ３７発現が、少なくとも１つの追加の抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を使用して検出される、請求項３７から６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記ＣＤ３７発現が、２つの抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を使用して測定される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの追加の抗体またはその抗原結合性断片が、検出薬剤を含む、請求項６９または７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記検出薬剤が、発色性検出薬剤、発蛍光性検出薬剤、酵素的検出薬剤または電気化学発光検出薬剤である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記検出薬剤が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも１つの追加の抗体またはその抗原結合性断片が、固体支持体に結合している、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも１つの追加の抗体またはその抗原結合性断片が、マイクロタイタープレートに結合している、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＥＬＩＳＡが、サンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項４１または６１に記載の方法。
【請求項７７】
前記治療活性剤が、ＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３を含む、請求項４３から７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記治療活性剤が、ＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３、マイタンシノイドＤＭ１および切断不能なＳＭＣＣリンカー（ＩＭＧＮ５２９）を含む抗体マイタンシノイドコンジュゲートである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
診断に使用するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項３６に記載の組成物および治療に使用するための抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を含む組合せ診断および医薬品キット。
【請求項８０】
前記検出抗体が、ＩＨＣによってＣＤ３７発現を検出することができる、請求項７９に記載の組合せ診断および医薬品キット。
【請求項８１】
前記検出抗体が、ＥＬＩＳＡによってＣＤ３７発現を検出することができる、請求項７９または８０に記載の組合せ診断および医薬品キット。
【請求項８２】
前記治療活性剤中の前記抗ＣＤ３７抗体が、細胞毒素にコンジュゲートされている、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の組合せ診断および医薬品キット。
【請求項８３】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、ＩＨＣ用の試薬および１つまたは複数の標準化された参照サンプルを含む診断キットであって、前記標準化された参照サンプルが、細胞、細胞ペレットまたはホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプルを含み、前記１つまたは複数の標準化され参照されたサンプルが、ＣＤ３７を発現しない、低ＣＤ３７発現、または高ＣＤ３７発現細胞、細胞ペレットまたは組織由来である、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／２１１，４５５号および２０１５年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／２１２，１８３号の優先権の利益を請求し、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本発明の分野は、一般に、ＣＤ３７に基づく治療法のための診断アッセイおよびキットならびにヒトＣＤ３７に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、先進国世界における主要な死亡原因の１つであり、米国だけで１年に１００００００人よりも多くの人々ががんと診断され、５００，０００人が死亡する。全体として、３人に１人より多くが、その生涯の間に何らかの形態のがんを発症することになると推定される。
【０００３】
ＧＰ５２−４０とも呼ばれる、白血球抗原ＣＤ３７（「ＣＤ３７」）、テトラスパニン−２６またはＴＳＰＡＮ２６は、テトラスパニンスーパーファミリーの膜貫通タンパク質である（Maeckerら、１９９７年、FASEB  J.、１１巻：４２８〜４４２頁）。それは、プレＢから末梢成熟Ｂ細胞期の間にＢ細胞において発現されるが、形質細胞への最終分化においては存在しない、４つの膜貫通ドメインを有する高度にグリコシル化されたタンパク質である。（Linkら、１９８７年、J  Pathol.、１５２巻：１２〜２１頁）。ＣＤ３７抗原は、Ｔ細胞、骨髄細胞および顆粒球においてわずかしか発現されない（Schwartz-Albiezら、１９８８年、J.  Immunol.、１４０巻（３号）９０５〜９１４頁）。しかしながら、ＣＤ３７は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を起こす悪性Ｂ細胞などにおいても発現される（Mooreら、１９８６年、J  Immunol.、１３７巻（９号）：３０１３〜８頁）。この発現プロファイルは、ＣＤ３７が、ＣＤ３７を発現するＢ細胞悪性腫瘍に対する有望な治療標的となることを示唆している。しかし、これらの治療法を最大限有効にするには、感度および特異性をもって、あるダイナミックレンジのＣＤ３７を検出できることが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Maeckerら、１９９７年、FASEB  J.、１１巻：４２８〜４４２頁
【非特許文献２】Linkら、１９８７年、J  Pathol.、１５２巻：１２〜２１頁
【非特許文献３】Schwartz-Albiezら、１９８８年、J.  Immunol.、１４０巻（３号）９０５〜９１４頁
【非特許文献４】Mooreら、１９８６年、J  Immunol.、１３７巻（９号）：３０１３〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
抗ＣＤ３７抗体およびその抗原結合性断片、ならびにＣＤ３７を検出し、ＣＤ３７によって媒介される疾患および障害（例えばがん）を診断し、抗ＣＤ３７治療の有効性をモニターし、患者を層別化するための方法が、全て本明細書に提供される。抗ＣＤ３７抗体およびその抗原結合性断片は、それらが、より特異的かつはっきりとした染色および核バックグラウンドがない染色を可能にするという点で特に有利である。ＣＤ３７抗体およびその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１１０〜１３７の１つまたは複数を含むエピトープに結合することができる。ＣＤ３７抗体およびその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含むポリペプチドおよび／またはＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含むポリペプチドに結合することもできるが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない。
【０００６】
一実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチドを含む抗体と同じＣＤ３７エピトープに特異的に結合する。
【０００７】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７に特異的に結合し、配列番号９のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチドを含む抗体のＣＤ３７に対する結合を競合的に阻害する。
【０００８】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ配列番号３〜５の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ配列番号６〜８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【０００９】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７に特異的に結合し、抗体またはその断片は、それぞれ配列番号３〜５の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに配列番号６〜８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００１０】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９および１０のポリペプチド配列と少なくとも９０％同一であるポリペプチド配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号９および１０のポリペプチド配列と少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号９および１０のポリペプチド配列と少なくとも９９％同一である。別の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号９および１０の配列のアミノ酸を含む。
【００１１】
別の態様において、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７に特異的に結合し、抗体またはその断片は、配列番号９を含む重鎖可変領域を含む。
【００１２】
別の態様において、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７に特異的に結合し、抗体またはその断片は、配列番号１０を含む重鎖可変領域を含む。
【００１３】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、組換えにより作製される。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、またはヒトのものである。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、表面再構成される。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、全長抗体である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原結合性断片である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結されたＦｖ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
【００１４】
別の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、細胞によって作製される。別の実施形態では、細胞は単離される。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、（ａ）細胞を培養するステップと；（ｂ）培養細胞から抗体またはその抗原結合性断片を単離するステップとを含む方法が本明細書に提供される。
【００１５】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約０．５〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＣＤ３７に結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約１．０ｎＭまたはより良いＫｄでヒトＣＤ３７に結合する。
【００１６】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含む、それから本質的になるまたはそれからなるポリペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含む、それから本質的になるまたはそれからなるポリペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１５に示す配列に結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６に示す配列に結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１７に示す配列に結合する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含むポリペプチドに結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含むポリペプチドに結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない。
【００１７】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗体または抗原結合性断片は、配列番号１５のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１７のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３７のアミノ酸１１０〜１３７中の少なくとも１つのアミノ酸に結合する。
【００１８】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片の結合親和性は、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって測定される。
【００１９】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能に標識されている。別の実施形態では、標識は、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素標識、放射性標識、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子および磁気粒子からなる群から選択される。
【００２０】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片ならびにＩＨＣ緩衝液、ＥＬＩＳＡ緩衝液およびＦＡＣＳ緩衝液からなる群から選択される緩衝液を含む組成物が本明細書に提供される。
【００２１】
別の実施形態では、サンプルを本明細書に提供される抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物と接触させるステップを含む、サンプル中のＣＤ３７発現を検出する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能に標識されている。別の実施形態では、標識は、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素標識、放射性標識、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子および磁気粒子からなる群から選択される。別の実施形態では、標識は、酵素標識である。
【００２２】
別の実施形態では、ＣＤ３７発現は、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、細胞数測定、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイまたは免疫組織化学アッセイによって決定される。別の実施形態では、ＣＤ３７発現は、免疫組織化学アッセイによって決定される。
【００２３】
別の実施形態では、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤によるがん治療の有効性を増大させるための方法であって、前記方法が、がんを有する対象に治療活性剤を投与するステップを含み、対象由来のがん性サンプルにおいてＣＤ３７の発現の増大が、本明細書に提供される抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用して検出されている、方法が本明細書に提供される。
【００２４】
別の実施形態では、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤に応答する可能性が高いがんを同定するための方法であって、（ａ）がん由来細胞を含む生体サンプルを抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物と接触させるステップと；（ｂ）（ａ）の生体サンプルにおける、ＣＤ３７に対する抗体またはその抗原結合性断片の結合を検出するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の結合にスコアを割り当てるステップであって、スコアが１つまたは複数の参照サンプルとの比較に基づいて割り当てられる、ステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）におけるスコアを参照組織または細胞のスコアと比較するステップであって、正常もしくは低ＣＤ３７発現参照サンプルのスコアより大きいがんＣＤ３７レベルのスコアまたは高ＣＤ３７発現参照サンプルのスコアと等しいもしくはより大きいがんＣＤ３７レベルのスコアが、がんを抗ＣＤ３７抗体に応答する可能性が高いと同定する、ステップとを含む方法が本明細書に提供される。
【００２５】
別の実施形態では、がんを有する患者を処置する方法であって、（ａ）患者から得たがん性サンプル中のＣＤ３７発現の検出からＣＤ３７発現スコアを決定するステップであって、検出が、抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用して実施される、ステップと；（ｂ）スコアが、患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を投与するステップとを含む方法が本明細書に提供される。
【００２６】
別の実施形態では、がんを有する患者を処置する方法は、（ａ）患者から得たがん性サンプル中のＣＤ３７発現の検出からＣＤ３７発現スコアを決定するステップであって、検出が、抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用して実施される、ステップと；（ｂ）スコアが、患者、が治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を投与するように保健医療提供者に指示するステップとを含む。
【００２７】
別の実施形態では、がんを有する患者を処置する方法は、（ａ）がんを有する患者から採取したがん性サンプルを提出して、抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用するＣＤ３７発現の検出からＣＤ３７発現スコアを決定するステップと；（ｂ）スコアが、患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を投与するステップとを含む。
【００２８】
別の実施形態では、がんを有する患者を処置する方法は、（ａ）患者から得たがん性サンプル中のＣＤ３７発現を検出するステップであって、検出が、抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用して実施される、ステップと；（ｂ）がん性サンプルのＣＤ３７発現スコアを決定するステップと；（ｃ）スコアが、患者が、治療活性剤の投与から利益を得ることになることを示す場合に、患者に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を投与するステップとを含む。
【００２９】
別の実施形態では、がんを抗ＣＤ３７活性がある薬剤による処置に感受性があると同定する方法は、（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用してがん由来がん性サンプル中のＣＤ３７発現のレベルを検出するステップであって、検出が、１つまたは複数の参照サンプルにおける染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７発現がん性サンプルにおける染色強度または染色均一性を区別する方法の使用を含むステップと；（ｂ）がん性サンプルのＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを決定するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）において決定したＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを、少なくとも１つの参照サンプルにおいてＣＤ３７タンパク質発現を測定することによって決定した相対値と比較するステップであって、少なくとも１つの参照サンプルが、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤による処置に感受性がない組織、細胞もしくは細胞ペレットサンプルであり、相対値より高い、ステップ（ｂ）において決定したがん性サンプルのＣＤ３７染色強度スコアが、がんを治療活性剤による処置に感受性があると同定する、ステップとを含む。
【００３０】
別の実施形態では、がんを抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤による処置に感受性があると同定する方法は、（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を使用してがん由来がん性サンプル中のＣＤ３７発現のレベルを検出するステップであって、検出が、１つまたは複数の参照サンプルにおける染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７発現がん性サンプルにおける染色強度または染色均一性を区別する方法の使用を含むステップと；（ｂ）がん性サンプルのＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを決定するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）において決定したＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを、少なくとも１つの参照サンプルにおいてＣＤ３７タンパク質発現を測定することによって決定した相対値と比較するステップであって、少なくとも１つの参照サンプルが、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤による処置に感受性がある組織、細胞もしくは細胞ペレットサンプルであり、相対値より大きいまたは等しい、ステップ（ｂ）において決定したがん性サンプルのＣＤ３７染色強度スコアが、がんを治療活性剤による処置に感受性があると同定する、ステップとを含む。
【００３１】
別の実施形態では、方法は、がん性サンプルまたは生体サンプルを得た対象に抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、患者のＣＤ３７レベルは、患者から得たがん性サンプルまたは生体サンプルにおいて検出される。別の実施形態では、がん性サンプルまたは生体サンプルは、体液抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液または脾臓調製物である。別の実施形態では、検出するステップは、免疫組織化学（ＩＨＣ）による。別の実施形態では、ＩＨＣは、ＣＤ３７発現の異なるレベルを区別することができる較正されたＩＨＣである。別の実施形態では、ＩＨＣによって、低ＣＤ３７発現、中ＣＤ３７発現または高ＣＤ３７発現を有するサンプルについての染色強度の範囲が得られる。別の実施形態では、ＩＨＣは、参照サンプルと比較してＣＤ３７発現がん性サンプルまたは生体サンプルにおける染色強度および染色均一性を区別する。別の実施形態では、ＩＨＣは、手作業で実施される。別の実施形態では、ＩＨＣは、自動システムを使用して実施される。別の実施形態では、ＣＤ３７スコアは、ＩＨＣから決定される。別の実施形態では、検出するステップは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による。別の実施形態では、参照サンプルは、陽性参照サンプルまたは陰性参照サンプルである。別の実施形態では、参照サンプルは、細胞、細胞ペレットまたは組織を含む。
【００３２】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素、放射性標識、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子および磁気粒子からなる群から選択される検出試薬をさらに含む。別の実施形態では、検出試薬は、酵素である。
【００３３】
別の実施形態では、がんは、ＣＤ３７陽性がんである。別の実施形態では、がんは、白血病またはリンパ腫である。別の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、および成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンストレームマクログロブリン血症ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群から選択される。別の実施形態では、ＣＤ３７陽性がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫である。
【００３４】
別の実施形態では、ＣＤ３７発現は、少なくとも１つの追加の抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を使用して検出される。別の実施形態では、ＣＤ３７発現は、２つの抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を使用して測定される。別の実施形態では、少なくとも１つの追加の抗体またはその抗原結合性断片は、検出薬剤を含む。別の実施形態では、検出薬剤は、発色性検出薬剤、発蛍光性検出薬剤、酵素的検出薬剤または電気化学発光検出薬剤である。別の実施形態では、検出薬剤は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【００３５】
別の実施形態では、少なくとも１つの追加の抗体またはその抗原結合性断片は、固体支持体に結合している。別の実施形態では、少なくとも１つの追加の抗体またはその抗原結合性断片は、マイクロタイタープレートに結合している。
【００３６】
別の実施形態では、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。
【００３７】
別の実施形態では、治療活性剤は、ＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３を含む。別の実施形態では、治療活性剤は、ＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３、マイタンシノイドＤＭ１および切断不能なＳＭＣＣリンカー（ＩＭＧＮ５２９）を含む抗体マイタンシノイドコンジュゲートである。
【００３８】
別の実施形態では、キットは、診断に使用するための、本明細書に提供される抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物および治療に使用するための抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片を含む治療活性剤を含む組合せ診断および医薬品キットが本明細書に提供される。
【００３９】
別の実施形態では、検出抗体は、ＩＨＣによってＣＤ３７発現を検出することができる。別の実施形態では、検出抗体は、ＥＬＩＳＡによってＣＤ３７発現を検出することができる。
【００４０】
別の実施形態では、治療活性剤中の抗ＣＤ３７抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされている。
【００４１】
別の実施形態では、本明細書に提供される診断キットは、本明細書に提供される抗体、その抗原結合性断片、ＩＨＣ用の試薬および１つまたは複数の標準化された参照サンプルを含み、標準化された参照サンプルは、細胞、細胞ペレットまたはホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプルを含み、１つまたは複数の標準化され参照されたサンプルは、ＣＤ３７を発現しない、低ＣＤ３７発現、または高ＣＤ３７発現細胞、細胞ペレットまたは組織由来である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、Ｈｉｓタグに融合したヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２を含有するｈＣＤ３７−ＬＥＬ（大きな細胞外ループ）タンパク質（配列番号１５）での、マウスの免疫化により作製した抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニング結果を示す。図１Ａは、ハイブリドーマクローン１Ｂ１１からの上清は、未変性および変性条件下の両方で、ＣＤ３７抗原の多数の変形、ｈＣＤ３７−ＬＥＬ、ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡ（ＬＡＧＡは、Ｆｃ突然変異Ｇ２３６ＡおよびＰ２３８Ａを指す；配列番号１７；ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合したヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５を含有する）、およびｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｆｃ（細胞外ドメイン；配列番号１６；マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインに融合したヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５を含有する）に結合することを示す。図１Ｂは、２つのハイブリドーマサブクローン、１Ｂ１１−２および１Ｂ１１−２０からの上清は、未変性および変性条件下の両方で、ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡおよびｈＣＤ３７−ＬＥＬに結合することを示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、Ｈｉｓタグに融合したヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２を含有するｈＣＤ３７−ＬＥＬ（大きな細胞外ループ）タンパク質（配列番号１５）での、マウスの免疫化により作製した抗体についてのＥＬＩＳＡスクリーニング結果を示す。図１Ａは、ハイブリドーマクローン１Ｂ１１からの上清は、未変性および変性条件下の両方で、ＣＤ３７抗原の多数の変形、ｈＣＤ３７−ＬＥＬ、ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡ（ＬＡＧＡは、Ｆｃ突然変異Ｇ２３６ＡおよびＰ２３８Ａを指す；配列番号１７；ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合したヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５を含有する）、およびｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｆｃ（細胞外ドメイン；配列番号１６；マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインに融合したヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５を含有する）に結合することを示す。図１Ｂは、２つのハイブリドーマサブクローン、１Ｂ１１−２および１Ｂ１１−２０からの上清は、未変性および変性条件下の両方で、ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡおよびｈＣＤ３７−ＬＥＬに結合することを示す。
【００４３】
【図２】図２は、抗体１Ｂ１１−２は、参照抗ＣＤ３７抗体、ＮＣＬ−ＣＤ３７（クローンＣＴ１、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と比較して、未変性ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡおよびｈＣＤ３７−ＬＥＬタンパク質の両方に対して大いに改善された親和性で結合することを示す。
【００４４】
【図３】図３は、抗体１Ｂ１１−２は、ＮＣＬ−ＣＤ３７と比較して、変性ｈＣＤ３７−ＬＥＬタンパク質に対して大いに改善された親和性で結合することを示す。
【００４５】
【図４】図４は、抗体１Ｂ１１−２は、短縮型ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃタンパク質（Ｓ２は、ＣＤ３７の大きな細胞外ドメインの第２のセグメントを指す；アミノ酸１３８〜１７６を含有する；配列番号１８）に結合しないが、ＮＣＬ−ＣＤ３７は、このＣＤ３７タンパク質への結合を保持することを示す。
【００４６】
【図５】図５は、ＮＣＬ−ＣＤ３７マウスｍＡｂ（左）またはＣＤ３７  １Ｂ１１−２マウスｍＡｂ（右）のいずれかで染色した、ヒト正常扁桃の免疫組織化学画像を示す。矢印は、それぞれ、胚中心、外套帯（これらの両方がＣＤ３７陽性である）、および分子間領域（intermolecular  regions）（ＣＤ３７陰性）を示す。黒色矢印は、胚中心を；灰色矢印は、外套帯を示し（これらの両方がＣＤ３７陽性である）；ならびに白色矢印は、濾胞間領域（ＣＤ３７について陰性である）を示す。ＮＣＬ−ＣＤ３７抗体を使用すると、胚中心および外套帯（mantel  zone）の両方で核染色が存在する。１Ｂ１１−２抗体を使用すると、核染色は存在しない。
【００４７】
【図６】図６は、ＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（左パネル）または１Ｂ１１−２マウスｍＡｂ（右パネル）のいずれかを使用した、ヒト正常小腸（上部パネル）およびヒト正常膵臓（下部パネル）の免疫組織化学画像を示す。左パネル内の矢印は、ＮＣＬ−ＣＤ３７マウスｍＡｂを使用して得られた、パネート細胞（上部パネル、黒色矢印で示される）および膵島細胞（下部パネル、白色矢印で示される）における細胞質の赤みを示す。右パネル内の矢印は、この染色は、１Ｂ１１−２抗体を使用すると、対応する位置で観察されないことを示す。
【００４８】
【図７】図７は、ＮＣＬ−ＣＤ３７マウスｍＡｂ（左パネル）または１Ｂ１１−２マウスｍＡｂ（右パネル）のいずれかで染色した、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者組織（上部パネル）および濾胞性リンパ腫患者組織（下部パネル）の免疫組織化学画像を示す。１Ｂ１１−２マウスｍＡｂを使用すると、両方のがんタイプにおいて、より強く、より簡明な染色が見える。
【００４９】
【図８】図８は、１Ｂ１１−２マウスモノクローナル抗体を、市販されているマウスモノクローナル抗ＣＤ３７抗体（Ｌｅｉｃａ）と比較した、ＣＤ３７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）抗原へのＦｃ融合体の変性ＳＤＳ  ＰＡＧＥウェスタンブロットを示す。キロダルトン（ｋＤ）での分子量マーカーを、一次データとして、および右側模式図として示す。
【００５０】
【図９】図９は、１Ｂ１１−２マウスモノクローナル抗体により検出された、ＣＤ３７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）抗原へのＦｃ融合体の未変性ＰＡＧＥウェスタンブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本開示は、ヒトＣＤ３７を検出する方法を提供する。これらの方法は、ＣＤ３７の発現によって特徴付けられるがんの同定を可能にして、抗ＣＤ３７治療薬による処置の有効性を改善する。検出方法を使用して、患者を層別化し、治療有効性をモニターもしくは決定し、またはがんが抗ＣＤ３７治療に応答する可能性を決定することができる。検出方法は、臨床的に意味があるダイナミックレンジのＣＤ３７を検出することができる。ＣＤ３７検出方法（例えば、ＣＤ３７に対する免疫組織化学（ＩＨＣ））に有用な、抗体およびその抗原結合性断片など新規のＣＤ３７結合性ポリペプチドも開示される。本明細書に提供されるＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、より特異的かつはっきりとした核バックグラウンドがない染色を可能にする。ＣＤ３７結合剤は、ＣＤ３７のアミノ酸１１０〜１３７の１つまたは複数を含むエピトープに結合する。ＣＤ３７結合剤は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）を含むポリペプチドまたはＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）を含むポリペプチドにも結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５からなるポリペプチドに結合しない。関連ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ＣＤ３７結合剤を含む組成物ならびにＣＤ３７結合剤を作製する方法も提供される。
Ｉ．定義
【００５２】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現が、以下で定義される。
【００５３】
特に明記しない限り、本明細書では、用語「ＣＤ３７」とは、任意の天然のＣＤ３７のことを指す。ＣＤ３７は、ＧＰ５２−４０、白血球抗原ＣＤ３７およびテトラスパニン−２６とも呼ばれる。用語「ＣＤ３７」は、「全長」、プロセシングされていないＣＤ３７および細胞内でのプロセシングの結果得られる任意の形態のＣＤ３７を包含する。用語は、ＣＤ３７の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント、対立遺伝子バリアントおよびアイソフォームも包含する。本明細書に記述されるＣＤ３７ポリペプチドは、ヒト生体サンプルなど様々な供給源もしくは別の供給源から単離することができ、または組換えもしくは合成方法によって調製することができる。
【００５４】
用語、ＣＤ３７の「発現の増大」または「過剰発現」とは、上昇したレベルのＣＤ３７発現を含有するサンプルのことを指す。ＣＤ３７は、陰性もしくは低参照対照と比較してまたは同じ組織もしくは細胞型の健康もしくは無疾患サンプルと比較して、増大または過剰発現し得る。そのような発現の増大または過剰発現は、例えば、突然変異、遺伝子増幅、転写の増大、翻訳の増大、またはタンパク質安定性の増大によって引き起こされ得る。
【００５５】
一例において、ＣＤ３７発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定され、定義されたスコアを呈する較正された対照との比較によって染色強度スコアまたは染色均一性スコアが与えられる（例えば、強度が較正された対照のレベル３と同程度である場合に、強度スコア３が試験サンプルに与えられ、または強度が較正された対照のレベル２と同程度である場合に、強度２が試験サンプルに与えられる）。不均一または均一である染色均一性も、ＣＤ３７発現の増大の指標となる。染色強度および染色均一性スコアは、単独または併用して使用することができる（例えば、２ホモ、２ヘテロ、３ホモ、３ヘテロなど）。別の例において、ＣＤ３７発現の増大は、対照値（例えば、がんでないまたはＣＤ３７値の上昇がないがんである対象由来の生体サンプル、組織または細胞における発現レベル）と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも５倍の増大の検出によって決定することができる。別の例において、ＣＤ３７発現は、Ｈ−スコアを与えられる。Ｈ−スコアは、本明細書に提供される計算を使用して染色強度スコアを均一性スコアと組み合わせる。別の例において、ＣＤ３７発現は、少なくとも特定レベルの染色を有する細胞のパーセンテージを決定することによって測定される（例えば、少なくとも２５％の細胞が、少なくとも２のスコアを有し、または少なくとも７５％の細胞が、少なくとも２のスコアを有する）。
【００５６】
「参照サンプル」を使用して、本明細書に提供される方法で得られた結果を試験サンプルと相関させ、比較することができる。参照サンプルは、細胞（例えば、細胞株、細胞ペレット）または組織であることができる。「参照サンプル」中のＣＤ３７レベルは、ＣＤ３７の絶対もしくは相対量、量の範囲、最小および／もしくは最大量、平均量ならびに／または量の中央値であることができる。本明細書に提供される診断方法は、試験サンプル中のＣＤ３７の発現レベルと「参照値」との比較を含む。一部の実施形態では、参照値は、参照サンプル中のＣＤ３７の発現レベルである。参照値は、既定の値であることができ、試験サンプルと並列で検査される参照サンプル（例えば、対照生体サンプルまたは参照サンプル）から決定することもできる。参照値は、中央値もしくは平均のような単一のカットオフ値または信頼区間など値の範囲であることができる。参照値は、がんの素因がある個体、初期もしくは末期がんを有する個体、男性および／もしくは女性個体、またはがん治療を受けている個体など様々なサブグループの個体に対して確立することができる。陰性参照サンプルまたは値および陽性参照サンプルまたは値の例が、本明細書に記述される。
【００５７】
一部の実施形態では、参照サンプルは、健康な組織、特に、がんに罹患していない対応する組織またはＣＤ３７を過剰発現するがんに罹患していない対応する組織由来のサンプルである。この型の参照サンプルは、陰性対照サンプルまたは参照サンプルと呼ばれる。他の実施形態では、参照サンプルは、ＣＤ３７を発現する腫瘍由来のサンプルである。この型の参照サンプルは、陽性対照サンプルと呼ばれる。陽性対照サンプルは、ＣＤ３７発現のレベルと相関する型（ヘテロ対ホモ）、染色強度の度合（０、１、２、３）、Ｈ−スコア、および／または少なくとも特定のレベルの染色がある細胞のパーセントの比較指標として使用され得る。陽性対照比較サンプルは、較正された参照サンプルとも呼ばれる。低または非ＣＤ３７参照は、実施例において本明細書に記述され、脾臓の赤脾髄（例えば、単球および赤血球）、Ｔ細胞、およびヒト扁桃の濾胞間領域も含む。ＣＤ３７を発現している参照が、実施例において本明細書に記述され、脾臓の白脾髄（例えば、Ｂリンパ球および脾臓の辺縁帯）、ヒト扁桃の胚中心およびヒト扁桃の外套帯も含む。細胞株の場合、例示的な非発現細胞には、３００−１９細胞があり、発現細胞には、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、ＮａｍａｌｗａおよびＲＬ非ホジキンリンパ腫Ｂ細胞がある。別の陽性高ＣＤ３７参照は、ＣＤ３７で安定または一過性にトランスフェクトされた細胞株である（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００９３３９７号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１４９１７１に記載の３００．１９／ＣＤ３７、そのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。特定のがんに対するＣＤ３７の適当な陽性および陰性参照レベルは、１人または複数人の適当な対象におけるＣＤ３７のレベルを測定することによって決定することができ、そのような参照レベルは、対象の特定の集団に合うように調整されてもよい（例えば、比較が、ある特定の年齢の対象由来のサンプルにおけるＣＤ３７レベルとある特定の年齢群における特定の疾患状況、表現型またはその欠如に対する参照レベルの間で行われてもよいように、参照レベルは同年齢であることができる）。
【００５８】
本明細書では、「免疫組織化学」とは、例えば、細胞または組織を分析するために使用される組織化学的および免疫学的方法のことを指す。したがって、用語「免疫組織化学」、「免疫細胞化学」および「免疫化学」は、互換的に使用される。
【００５９】
本発明の「サンプル」または「生体サンプル」は、特定の実施形態では、真核生物由来など生物起源である。一部の実施形態では、サンプルはヒトサンプルであるが、動物サンプルを本発明の実施に使用することもできる。本発明に使用するためのサンプルの非限定的な供給源には、例えば固形組織、生検吸引物、体液抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、表皮の外側切片、呼吸器、腸および尿生殖器管、涙、唾液、乳、腫瘍、器官、細胞培養物ならびに／または細胞培養構成要素がある。「がん性サンプル」は、がん性細胞を含有するサンプルである。本明細書に提供される方法は、利用可能な材料の量が少ない固形組織サンプルに有用であり得る。異なる型の細胞または組織を比較するステップと、疾患の存在および／もしくは型もしくは異常性を検出または決定するステップとを含むがこれに限定されない本明細書に提供される方法を使用して、ＣＤ３７の発現の態様またはサンプルの状況を調べることができる。
【００６０】
本明細書の目的の場合、組織サンプルの「切片」とは、組織サンプルの単一部または一片、例えば、組織サンプルから切り取った組織または細胞の薄片のことを指す。組織サンプルの複数の切片を採取し、本発明による分析に供してもよいと理解される。一部の場合において、組織の選択された部分または切片は、細胞の均一な集団を含む。他の場合において、選択された部分は、組織の領域、例えば、非限定的な例として内腔を含む。選択された部分は、例えば、１個の細胞もしくは２個の細胞と同程度に小さいことができ、または数千個もの細胞を表す可能性もある。ほとんどの場合において、細胞の採取は重要であり、本発明は、細胞成分の検出における使用について記述してきたが、本方法を使用して生物の非細胞成分（例えば、非限定的な例として血液中の可溶性成分）を検出することもできる。
【００６１】
本明細書では、用語「捕捉試薬」とは、適切な条件下で捕捉試薬−標的分子複合体をサンプルの残りから分離できるような、サンプル中の標的分子を結合し、捕捉することができる試薬のことを指す。一実施形態では、捕捉試薬は固定されている。一実施形態では、サンドイッチイムノアッセイにおける捕捉試薬は、標的抗原に対する抗体もしくはその抗原結合性断片または様々な抗体もしくはその抗原結合性断片の混合物である。
【００６２】
本明細書では、用語「検出可能な」抗体もしくはその抗原結合性断片とは、検出手段によって増幅される標識によって直接、または例えば、標識される別の抗体もしくはその抗原結合性断片によって間接的に検出できる抗体もしくはその抗原結合性断片のことを指す。直接標識の場合、抗体またはその抗原結合性断片は、一般に、いくつかの手段によって検出可能な部分にコンジュゲートされる。一実施形態では、検出可能な抗体またはその抗原結合性断片は、ビオチン化抗体またはその抗原結合性断片である。
【００６３】
本明細書では、用語「検出手段」とは、検出可能な抗体もしくはその抗原結合性断片の存在を検出するために使用される部分または技術のことを指し、マイクロタイタープレート上に捕捉された標識など固定された標識を増幅する検出薬剤を含む。一実施形態では、検出手段は、アビジンまたはストレプトアビジンなどの蛍光定量的検出薬剤である。
【００６４】
一般に、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」は、以下のステップを利用する：（１）マイクロタイタープレートを、捕捉抗体またはその抗原結合性断片でコーティングする；（２）サンプルを添加し、存在する任意の抗原を、捕捉抗体またはその抗原結合性断片に結合させる；（３）検出抗体またはその抗原結合性断片を添加し、抗原に結合させる；（４）酵素結合二次抗体またはその抗原結合性断片を添加し、検出抗体またはその抗原結合性断片に結合させる；および（５）基質を添加し、酵素によって検出可能な形態に変換する。
【００６５】
本明細書において使用される場合、単語「標識」とは、「標識」抗体を生成するように直接または間接的に抗体にコンジュゲートされる検出可能な化合物もしくは組成物のことを指す。標識は、それ自体によって検出可能であることができ（例えば放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素的標識の場合、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学変化を触媒することができる。
【００６６】
「相関する」または「相関している」は、何らかの方法で、第１の分析の成績および／または結果を第２の分析の成績および／または結果と比較することを意味する。例えば、第１の分析の結果を、第２の分析を遂行する際に使用してもよく、および／または、第１の分析の結果を使用して、第２の分析を実施すべきかどうか決定してもよく、および／または第１の分析の結果を第２の分析の結果と比較してもよい。一実施形態では、ＣＤ３７の発現の増大は、ＣＤ３７標的化抗がん治療の有効度の可能性の増大と相関する。
【００６７】
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域にある少なくとも１つの抗原認識部位によってタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質または前述の組合せなどの標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書では、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から生成される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物活性を呈する限り、他の任意の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、５つの主要なクラスの免疫グロブリン：それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれでもあり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構成を有する。抗体は、そのままであることも、または毒素、放射性同位元素など他の分子にコンジュゲートすることもできる。
【００６８】
用語「抗体断片」とは、インタクトな抗体の部分のことを指す。「抗原結合性断片」とは、抗原に結合するインタクトな抗体の部分のことを指す。抗原結合性断片は、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を含有することができる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、および一本鎖抗体があるが、これに限定されない。用語、抗体の「抗原結合性断片」に包含される抗体断片の例には、（それだけには限らないが）：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片（例えば、パパインによって消化された抗体は、３つの断片：２つの抗原結合Ｆａｂ断片および抗原を結合しない１つのＦｃ断片を生じる）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片（例えば、ペプシンによって消化された抗体は、２つの断片：二価の抗原結合Ｆ（ａｂ’）２断片および抗原を結合しないｐＦｃ’断片を生じる）、および関連するＦ（ａｂ’）一価単位；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片（すなわち、Ｆａｂに含まれる重鎖の部分）；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片ならびに関連するジスルフィド連結されたＦｖ；および（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ（ドメイン抗体）またはｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）断片（Wardら、Nature  ３４１巻：５４４〜５４６頁、１９８９年）がある。
【００６９】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、天然に存在しない抗体である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、天然の成分から精製される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、組換えにより作製される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ハイブリドーマによって作製される。
【００７０】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合するＣＤ３７などの抗原の生物活性を阻害もしくは減少させるものである。ある特定の実施形態では、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的もしくは完全に阻害する。望ましくは、生物活性は、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに１００％減少する。
【００７１】
用語「抗ＣＤ３７抗体」または「ＣＤ３７に結合する抗体」とは、抗体が、ＣＤ３７を標的とする診断および／または治療剤として有用であるような十分な親和性でＣＤ３７を結合できる抗体のことを指す。無関係な、ＣＤ３７ではないタンパク質に対する抗ＣＤ３７抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定されるＣＤ３７に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３７に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。抗ＣＤ３７抗体の例は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
「モノクローナル」抗体またはその抗原結合性断片とは、単一の抗原決定基もしくはエピトープの特異性の高い認識および結合に関係している均質な抗体または抗原結合性断片の集団のことを指す。これは、異なる抗原決定基を対象とする様々な抗体を一般に含むポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル」抗体またはその抗原結合性断片は、インタクトな全長モノクローナル抗体および抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル」抗体またはその抗原結合性断片とは、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物があるが、これに限定されない多くの様式によって作製されるそのような抗体およびその抗原結合性断片のことを指す。
【００７３】
用語「ヒト化」抗体またはその抗原結合性断片とは、特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、または最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するその断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体または抗原結合性断片の形態のことを指す。一般に、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Jonesら、１９８６年、Nature、３２１巻：５２２〜５２５頁；Riechmannら、１９８８年、Nature、３３２巻：３２３〜３２７頁；Verhoeyenら、１９８８年、Science、２３９巻：１５３４〜１５３６頁）。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種の抗体または断片中の対応する残基と置き換えられる。ヒト化抗体またはその抗原結合性断片を、Ｆｖフレームワーク領域および／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかにおける追加の残基の置換によってさらに修飾して、抗体またはその抗原結合性断片の特異性、親和性および／もしくは能力を洗練し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てを含有する可変ドメインの少なくとも１つ、一般には２つもしくは３つのうちの実質的に全てを含むことになるが、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも部分、一般にヒト免疫グロブリンのそれを含むこともできる。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号または第５，６３９，６４１号に記述されている。
【００７４】
本明細書において用語「一次」抗体またはその抗原結合性断片とは、サンプル中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片のことを指す。一次抗体またはその抗原結合性断片は、一般に、免疫組織化学手順において使用される第１抗体またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、一次抗体またはその抗原結合性断片は、免疫組織化学手順において使用される唯一の抗体またはその抗原結合性断片である。本明細書において用語「二次」抗体またはその抗原結合性断片とは、一次抗体またはその抗原結合性断片に特異的に結合し、それによって、もしその後に試薬を用いるならば、一次抗体またはその抗原結合性断片とその試薬との間にブリッジを形成する抗体またはその抗原結合性断片のことを指す。二次抗体またはその抗原結合性断片は、一般に、免疫組織化学手順において使用される第２抗体またはその抗原結合性断片である。本明細書において用語「三次」抗体とは、二次抗体またはその抗原結合性断片に特異的に結合し、それによって、もしその後に試薬を用いるならば、二次抗体またはその抗原結合性断片とその試薬との間にブリッジを形成する抗体またはその抗原結合性断片のことを指す。
【００７５】
抗体またはその抗原結合性断片の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域のいずれか単独もしくは組合せのことを指す。重鎖および軽鎖の各可変領域は、超可変領域とも呼ばれる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖にあるＣＤＲは、ＦＲによって極近傍に保持されており、他の鎖由来のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に関与する。ＣＤＲを決定するための技術は少なくとも２つある：（１）異種間配列変動に基づく手法（すなわち、Kabatら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、（第５版、１９９１年、National  Institutes  of  Health、Bethesda  Md.））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Al-lazikaniら（１９９７年）J.  Molec.  Biol.、２７３巻：９２７〜９４８頁））。加えて、これらの２つの手法の組合せを、当技術分野において時には使用して、ＣＤＲを決定する。
【００７６】
可変ドメイン（およそ、軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）中の残基を指す場合、Ｋａｂａｔ番号付け方式が一般に使用される（例えば、Kabatら、Sequences  of  Immunological  Interest.、第５版、Public  Health  Service、National  Institutes  of  Health、Bethesda、Md.（１９９１年））。
【００７７】
Kabatら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、第５版、Public  Health  Service、National  Institutes  of  Health、Bethesda、Md.（１９９１年）において、Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置の番号付けとは、抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付け方式のことを指す。この番号付け方式を使用して、実際の直線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮もしくはそれへの挿入に対応してより少ないもしくは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性の領域で「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と整列化することによって所与の抗体に対して決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに構造ループの位置について言及している（ChothiaおよびLesk、J.  Mol.  Biol.、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、Ｋａｂａｔ番号付け規則を使用して番号付けした場合、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置し；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了し；３５Ａだけが存在する場合、ループは３３で終了し；３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了するからである）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの折衷案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。
【表Ａ】
2018532699.tif 000003
【００７８】
用語「ヒト」抗体またはその抗原結合性断片とは、ヒトによって産生される抗体もしくはその抗原結合性断片、または当技術分野において公知の任意の技術を使用して作製される、ヒトによって産生される抗体もしくはその抗原結合性断片に対応するアミノ酸配列を有する抗体もしくはその抗原結合性断片を意味する。ヒト抗体またはその抗原結合性断片のこの定義は、インタクトなまたは全長抗体、その断片を含む。
【００７９】
用語「キメラ」抗体またはその抗原結合性断片とは、アミノ酸配列が２つまたはそれよりも多くの種から得られる抗体またはその抗原結合性断片のことを指す。一般に、軽ならびに重鎖両方の可変領域は、所望の特異性、親和性および能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）から得られる抗体またはその抗原結合性断片の可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種において免疫応答を誘発することを回避するために別の種（通常、ヒト）から得られる抗体またはその抗原結合性断片の配列と相同である。
【００８０】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、本明細書において互換的に使用され、特定の抗体またはその抗原結合性断片によって認識され、特異的にその結合を受け得る抗原の部分のことを指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、隣接するアミノ酸とタンパク質の三次フォールディングによって並置される隣接しないアミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、タンパク質変性を受けても一般に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、タンパク質変性により一般に失われる。エピトープは、固有の空間的コンフォメーションに少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を一般に含む。
【００８１】
「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合性相互作用の総計の強さのことを一般に指す。特に明記しない限り、本明細書では、「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有結合親和性のことを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって一般に表示することができる。親和性は、本明細書に記述されるものを含めた当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般にゆっくりと抗原を結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般により速く抗原を結合し、より長く結合し続ける傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が、当技術分野において公知であり、そのいずれも、本発明の目的に使用することができる。特定の例示的な実施形態が、次に記述される。
【００８２】
結合親和性のことを指すために本明細書において使用される場合「または、より良い」は、分子とその結合パートナーの間のより強い結合のことを指す。より強い結合を指すために本明細書において使用される場合「または、より良い」は、より小さいＫｄ値を表した。例えば、抗原に対して「０．６ｎＭまたはより良い」親和性を有する抗体では、抗原に対する抗体の親和性は、＜０．６ｎＭ、すなわち、０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭなど、または０．６ｎＭ未満の任意の値である。
【００８３】
前記値によって測定される生物学的特性（例えば、Ｋｄ値）の文脈の中で、本明細書では、フレーズ「実質的に類似」または「実質的に同じ」とは、当業者が、２値間の差異に生物学的および／または統計的有意性がほとんどもしくはまったくないとみなすことになるような２つの数値間（一般に、一方は本発明の抗体と関連し、他方は参照／比較抗体と関連する）での十分高い度合の類似性を意味する。前記２値間の差異は、参照／比較抗体に対する値に応じて約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満または約１０％未満である。
【００８４】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、天然には見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、もはや天然において見られる形態ではない度合に精製されたそれらを含む。一部の実施形態では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、実質的に純粋である。
【００８５】
本明細書では、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である材料のことを指す。
【００８６】
本明細書では、用語「イムノコンジュゲート」または「コンジュゲート」とは、細胞結合剤（すなわち、抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）に連結され、一般式：Ｃ−Ｌ−Ａにより定義される化合物またはその誘導体のことを指し、Ｃ＝細胞毒素、Ｌ＝リンカーおよびＡ＝細胞結合剤または抗ＣＤ３７抗体もしくはその抗原結合性断片である。イムノコンジュゲートは、逆順の一般式：Ａ−Ｌ−Ｃにより定義することもできる。
【００８７】
「リンカー」は、安定な共有結合性様式で、化合物、通常には、マイタンシノイドなどの薬物を抗ＣＤ３７抗体またはその断片などの細胞結合剤に連結することができる任意の化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性であり続ける条件で酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断およびジスルフィド結合切断に対して感受性もしくは実質的に抵抗性であり得る。適切なリンカーは当技術分野において周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸解離性基、光解離性基、ペプチダーゼ解離性基およびエステラーゼ解離性基がある。リンカーには、本明細書に記載され、当技術分野において公知の荷電しているリンカーおよびその親水性形態もある。
【００８８】
用語「がん」および「がん性」とは、細胞の集団が、制御されていない細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態のことを指すまたは記述する。がんの例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病があるが、これに限定されない。「がん」または「腫瘍形成性」疾患のより具体的な例には、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）などの成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低悪性度、中悪性度、高悪性度ＦＬを含めた濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、節性および脾型）、毛様細胞性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含めたＢ細胞リンパ腫がある。一部の実施形態では、がんは白血病またはリンパ腫である。
【００８９】
「腫瘍」および「新生物」とは、前がん性病変を含めた良性（非がん性）もしくは悪性（がん性）のいずれかの過剰な細胞成長または増殖の結果得られる任意の塊のことを指す。
【００９０】
用語「がん細胞」、「腫瘍細胞」および文法的に同等の物は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞と腫瘍形成性幹細胞（がん幹細胞）の両方を含む腫瘍または前がん性病変から得られる細胞の全集団のことを指す。本明細書では、用語「腫瘍細胞」は、新生および分化する能力を欠いている腫瘍細胞のことを単に指す場合、腫瘍細胞をがん幹細胞と区別するために用語「非腫瘍形成性」によって修飾されることになる。
【００９１】
用語「対象」とは、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物などを含むがそれには限らない、任意の動物（例えば、哺乳動物）のことを指し、特定の処置のレシピエントになる。一般に、ヒト対象に関して用語「対象」および「患者」は、本明細書において互換的に使用される。
【００９２】
「化学療法剤」は、作用機序にかかわらずがんの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤のクラスには、アルキル化剤、代謝拮抗物質、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、感光性物質およびキナーゼ阻害剤があるが、これに限定されない。化学療法剤には、「標的療法」および従来通りの化学療法に使用される化合物がある。
【００９３】
１つまたは複数のさらなる治療剤「と併用する」投与には、任意の順序での同時（並列）および連続投与がある。
【００９４】
用語「医薬製剤」とは、活性成分の生物活性を有効にするような形態の調製物のことを指し、その製剤は、製剤が投与されることになる対象にとって許容できないほど有毒ないかなる追加成分も含有しない。そのような製剤は無菌であり得る。
【００９５】
本明細書に開示する抗体、その抗原結合性断片またはイムノコンジュゲートの「有効量」は、特別に記載される目的を遂行するのに十分な量である。「有効量」は、記載される目的と関連して、経験的および日常の様式で決定することができる。
【００９６】
用語「治療有効量」とは、対象もしくは哺乳動物において疾患もしくは障害を「処置」するのに有効な抗体、その抗原結合性断片または他の薬物の量のことを指す。がんの場合、薬物の治療有効量は、がん細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度減速させ、ある特定の実施形態において停止させる）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度減速させ、ある特定の実施形態では、停止させる）；腫瘍成長をある程度阻害し；がんに関連する症状の１つまたは複数をある程度軽減し；および／または無増悪生存率（ＰＦＳ）、無疾患生存率（ＤＦＳ）もしくは総生存率（ＯＳ）の増大、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、もしくは一部の場合において、安定疾患（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）の低下、無増悪期間（ＴＴＰ）の減少、またはその任意の組合せなどの好ましい応答をもたらすことができる。本明細書における「処置」の定義を参照のこと。薬物が、存在するがん細胞の成長を防止するおよび／または死滅させ得る範囲で、それは細胞抑制性および／または細胞傷害性であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ３７レベルの増大を同定することにより、低下させた量のＣＤ３７標的治療薬を投与して、より高い投与量でみられるのと同じ治療効果を達成することが可能になる。「予防的有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の予防結果を達成するのに有効な量のことを指す。一般に、必ずしもそうではないが、予防用量は、疾患の初期より前またはその時点で対象に使用されるので、予防的有効量は、治療有効量より少なくなる。
【００９７】
用語「好ましく応答する」とは、対象において有益な状況を引き起こすことを一般に指す。がん処置に関しては、その用語は、対象に治療効果を提供することを指す。がんにおける陽性の治療効果は、いくつかの方法で測定することができる（W.A.  Weber、J.  Nucl.  Med.、５０巻：１Ｓ〜１０Ｓ頁（２００９年）を参照のこと）。例えば、腫瘍成長阻害、分子マーカー発現、血清マーカー発現および分子画像技術は全て、抗がん治療薬の治療有効性を評価するために使用することができる。腫瘍成長阻害に関しては、ＮＣＩ標準に従い、Ｔ／Ｃ≦４２％が、抗腫瘍活性の最小レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％は、高抗腫瘍活性レベルとみなされ、Ｔ／Ｃ（％）＝処置した腫瘍体積の中央値／対照の腫瘍体積の中央値×１００である。好ましい応答は、例えば、無増悪生存率（ＰＦＳ）、無疾患生存率（ＤＦＳ）もしくは総生存率（ＯＳ）の増大、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、もしくは一部の場合において、安定疾患（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）の低下、無増悪期間（ＴＴＰ）の減少、またはその任意の組合せによって評価することができる。
【００９８】
ＰＦＳ、ＤＦＳおよびＯＳは、新薬の認可のために国立がん研究所および米国食品医薬品局による標準設定によって測定できる。Johnsonら、（２００３年）J.  Clin.  Oncol.、２１巻（７号）：１４０４〜１４１１頁を参照のこと。
【００９９】
「無増悪生存率」（ＰＦＳ）とは、登録から疾患の増悪または死亡までの期間のことを指す。ＮＨＬ患者の場合、ＰＦＳは、悪性リンパ腫に関する国際統一化プロジェクトの改定応答基準に提供される標準を使用して測定することができる（Chesonら、J  Clin  Oncol.、２５巻：５７９〜８６頁（２００７年）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＬＬ患者の場合、ＰＦＳは、ＣＬＬ応答基準に関する国立がん研究所（ＮＣＩ）国際ワークショップに提供される標準を使用して測定することができる（Hallekら、Blood、１１１巻：５４４６〜５６頁（２００８年）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫患者の場合、ＰＦＳはＬｕｇａｎｏ分類標準を使用して測定することができる（Chesonら、J  Clin  Oncol.、３２巻：３０５９〜６８頁（２０１４年））。一般に、無増悪生存率とは、がんが悪化することなく患者が生存し続ける状況のことを指す。
【０１００】
「腫瘍増悪までの期間」（ＴＴＰ）は、登録から疾患の増悪までの期間と定義される。ＮＨＬ患者の場合、ＴＴＰは、悪性リンパ腫に関する国際統一化プロジェクトの改定応答基準に提供される標準を使用して測定することができる（Chesonら、J  Clin  Oncol.、２５巻：５７９〜８６頁（２００７年）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＬＬ患者の場合、ＴＴＰは、ＣＬＬ応答基準に関する国立がん研究所（ＮＣＩ）国際ワークショップに提供される標準を使用して測定することができる（Hallekら、Blood、１１１巻：５４４６〜５６頁（２００８年）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫患者の場合、ＴＴＰはＬｕｇａｎｏ分類標準を使用して測定することができる（Chesonら、J  Clin  Oncol.、３２巻：３０５９〜６８頁（２０１４年））。
【０１０１】
「完全応答」または「完全寛解」または「ＣＲ」は、処置に応じた腫瘍またはがんの全ての徴候の消滅を示す。これは、がんが治癒されたことを必ずしも意味しない。
【０１０２】
「部分応答」または「ＰＲ」とは、処置に応じた、１つまたは複数の腫瘍もしくは病変のサイズまたは体積または身体におけるがんの程度の低下のことを指す。
【０１０３】
「安定疾患」とは、増悪または再発がない疾患のことを指す。安定疾患では、部分応答とみなすのに十分な腫瘍収縮も進行性疾患とみなすのに十分な腫瘍増加もない。
【０１０４】
「進行性疾患」とは、さらに１つ新たな病変もしくは腫瘍が出現すること、および／または既存の標的ではない病変の明白な増悪のことを指す。進行性疾患とは、腫瘍の塊または拡大のいずれかの増加による、処置が始まって以降２０パーセントより大きい腫瘍成長のことを指すこともできる。
【０１０５】
「無疾患生存率」（ＤＦＳ）とは、患者が疾患なくあり続ける処置中および後の期間の長さのことを指す。
【０１０６】
「総生存率」（ＯＳ）とは、患者登録から死亡または生存が知られている最終日に削除されるまでの期間のことを指す。ＯＳは、無投薬または無処置の個体もしくは患者と比較した寿命の延長を含む。総生存率とは、患者が、例えば、診断または処置の時点から１年、５年など、定められた期間に生存し続ける状況のことを指す。
【０１０７】
「処置している」もしくは「処置」もしくは「処置する」または「軽減している」もしく「軽減する」などの用語は、診断された病態もしくは障害を治癒する、減速する、症状を軽くする、および／または増悪を停止させる治療措置のことを指す。したがって、処置を必要とする者は、障害を有するとすでに診断されているまたは疑われる者を含む。ある特定の実施形態では、患者が、がん細胞の数の減少または完全な非存在；腫瘍サイズの減少；例えば、軟組織および骨へのがんの拡大を含めた末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害または非存在；腫瘍転移の阻害または非存在；腫瘍成長の阻害または非存在；特定のがんに関連する１つまたは複数の症状の軽減；罹患率および死亡率の減少；生活の質の改善；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成性頻度または腫瘍形成性能力の減少；腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度の減少；非腫瘍形成性状況への腫瘍形成性細胞の分化；無増悪生存率（ＰＦＳ）、無疾患生存率（ＤＦＳ）もしくは総生存率（ＯＳ）の増大、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）の低下、無増悪期間（ＴＴＰ）の減少またはその任意の組合せのうち１つまたは複数を示す場合に、対象は本発明の方法によりがんを成功裏に「処置される」。
【０１０８】
予防的もしくは防止的措置とは、標的とした病態もしくは障害の発症を防止および／または遅らせる治療措置のことを指す。したがって、予防的または防止的措置を必要とする者は、障害を有する傾向がある者および障害を防止すべき者を含む。
【０１０９】
本明細書では、用語「保健医療提供者」とは、生きている対象、例えば、ヒト患者に直接接し、投与する個体または機関のことを指す。保健医療提供者の非限定的な例には、医師、看護師、技師、療法士、薬剤師、カウンセラー、代替医療開業医、医療施設、医院、病院、緊急治療室、クリニック、救急センター、代替医療クリニック／施設、ならびに総合医療、専門的な内科、外科および／または他の任意の型の処置、評価、維持、治療、投薬および／もしくは助言を含むがこれに限定されない、総合および／もしくは専門的な処置、評価、維持、治療、投薬、および／もしくは患者の健康状況の全てもしくは任意の部分に関して助言を提供する他の任意の実体がある。
【０１１０】
一部の態様において、保健医療提供者は治療を施し、または治療を施すように別の保健医療提供者に指示し、それによってがんを処置することができる。治療の「施術」は、本明細書では、対象に治療を処方することおよび対象に治療を届け、適用しまたは与えることを含む。保健医療提供者は、別の保健医療提供者または患者に実施もしくは指示して、以下の行為を実施することができる：サンプルを得る、サンプルを処理する、サンプルを提出する、サンプルを受け取る、サンプルを移す、サンプルを分析もしくは測定する、サンプルを定量化する、サンプルを分析／測定／定量化した後に得られる結果を提供する、サンプルを分析／測定／定量化した後に得られる結果を受け取る、１つまたは複数のサンプルを分析／測定／定量化した後に得られる結果を比較／スコア化する、１つまたは複数のサンプルからの比較／スコアを提供する、１つまたは複数のサンプルからの比較／スコアを得る、治療もしくは治療剤（例えば、ＣＤ３７結合剤）を投与する、治療の施術を開始する、治療の施術を中止する、治療の施術を継続する、治療の施術を一時的に中断する、投与される治療剤の量を増大させる、投与される治療剤の量を低下させる、治療剤の投与の量を継続する、治療剤の投与の頻度を増大させる、治療剤の投与の頻度を低下させる、治療剤について同じ服薬頻度を維持する、治療もしくは治療剤を少なくとも別の治療もしくは治療剤で置き換える、治療もしくは治療剤を少なくとも別の治療もしくは追加の治療剤と併用する。これらの行為は、コンピュータ実施される方法（例えば、ウェブサービスまたは独立型コンピュータシステムによる）を使用して保健医療提供者によって機械的に実施され得る。
【０１１１】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基および／もしくはそのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前後に加え得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションによるなど、ポリメラーゼ反応後にさらに修飾することができる。他の型の修飾には、例えば、「キャップ」、アナログによる１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば、荷電していない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート（phosphoamidates）、カルバメート（cabamates）など）および荷電している連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるヌクレオチド間の修飾、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン（ply-L-lysine）など）などペンダント部分を含有するヌクレオチド間の修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるヌクレオチド間の修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力がある金属など）を含有するヌクレオチド間の修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間の修飾、修飾連結（例えば、アルファ−アノマー核酸など）によるヌクレオチド間の修飾など、ならびに無修飾形態のポリヌクレオチドがある。さらに、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基を、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換え、標準的な保護基によって保護し、または活性化して追加のヌクレオチドに追加の連結を調製することができ、または固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化またはアミンもしくは炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルは、標準的な保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロもしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ−アノマー糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよびメチルリボシドなどの無塩基ヌクレオシドアナログを含めた当技術分野において一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもできる。１つまたは複数のリン酸ジエステル連結は、代わりの連結基によって置き換えることができる。これらの代わりの連結基には、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられ、各ＲまたはＲ’が、それぞれ独立にＨまたは任意選択でエーテル（−−Ｏ−−）連結を含有する置換もしく無置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキル（araldyl）である実施形態があるが、これに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての連結が、同一になる必要があるとは限らない。前の説明を、ＲＮＡおよびＤＮＡを含め本明細書において言及されるポリヌクレオチド全てに適用する。
【０１１２】
用語「ベクター」とは、宿主細胞において１つまたは複数の、目的の遺伝子もしくは配列を送達し、発現できる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン縮合剤と会合されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されているＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などある特定の真核細胞があるが、これに限定されない。
【０１１３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状または分枝状であることができ、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断され得る。用語は、天然のまたは介入によって修飾アミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、糖鎖形成、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは他の任意の操作または標識成分とのコンジュゲーションなどの修飾も包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、および当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義に含める。本発明のポリペプチドは抗体に基づくので、ある特定の実施形態では、ポリペプチドは一本鎖または関連鎖として存在し得ると理解される。一部の実施形態では、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在しない。一部の実施形態では、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、他の天然に存在する成分から精製される。一部の実施形態では、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、組換えにより作製される。
【０１１４】
２つまたはそれよりも多くの核酸もしくはポリペプチドの文脈において用語「同一」またはパーセント「同一性」とは、最大の一致のために比較、整列（必要に応じて、ギャップを導入する）した際に、同じまたは指定されたパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つまたはそれよりも多くの同じ配列もしくは部分配列のことを指し、配列同一性の一部としてどんな保存的アミノ酸置換も考慮しない。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用してまたは目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列の整列化を得るために使用できる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において公知である。配列整列化アルゴリズムのそのような非限定的な一例は、Karlinら、１９９０年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、８７巻：２２６４〜２２６８頁に記述され、Karlinら、１９９３年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、９０巻：５８７３〜５８７７頁において改変された、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれているアルゴリズムである（Altschulら、１９９１年、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁）。ある特定の実施形態では、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Altschulら、１９９７年、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁に記載の通り使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschulら、１９９６年、Methods  in  Enzymology、２６６巻：４６０〜４８０頁）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列を整列するのに使用できる別の一般公開されているソフトウェアプログラムである。ある特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアのＧＡＰプログラムを使用して（例えばＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップ加重４０、５０、６０、７０または９０および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用して）決定される。ある特定の代替の実施形態では、NeedlemanおよびWunsch（J.  Mol.  Biol.（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを組み込んだＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さ加重１、２、３、４、５を使用する）。あるいは、ある特定の実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、MyersおよびMiller（CABIOS、４巻：１１〜１７頁（１９８９年））のアルゴリズムを使用して決定される。例えば、パーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いてＰＡＭ１２０を使用して決定され得る。特定の整列化ソフトウェアによる最大の整列化のための適当なパラメータは、当業者によって決定され得る。ある特定の実施形態では、整列化ソフトウェアの初期設定パラメータが使用される。ある特定の実施形態では、第２の配列アミノ酸に対する第１のアミノ酸配列のパーセンテージでの同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、式中、Ｙは、第１および第２の配列の整列化において同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり（目視検査または特定の配列整列化プログラムによって整列される）、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は、第１の配列に対する第２の配列のパーセント同一性より長いことになる。
【０１１５】
非限定的な例として、任意の特定のポリヌクレオチドが、参照配列に対してある特定の、パーセンテージでの配列同一性（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、および一部の実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）を有するかどうかは、ある特定の実施形態では、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用して決定することができる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用のバージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１）。Ｂｅｓｔｆｉｔは、SmithおよびWaterman、Advances  in  Applied  Mathematics  ２巻：４８２〜４８９頁（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の相同性で最善の区分を見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列整列化プログラムを使用して、特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一かどうか決定する場合、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出され、参照配列におけるヌクレオチドの総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
【０１１６】
一部の実施形態では、本発明の２つの核酸またはポリペプチドが、実質的に同一であるということは、最大の一致について比較し、整列した場合に、配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視検査によって測定してそれらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、一部の実施形態において少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。ある特定の実施形態では、同一性は、長さが少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０残基もしくはその間の任意の整数値である配列の領域にわたって、または６０〜８０残基より長い領域、少なくとも約９０〜１００残基にわたって存在し、あるいは配列は、例えばヌクレオチド配列のコード領域など比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。
【０１１７】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は、保存的置換である。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、抗原、すなわちポリペプチドまたは抗体が結合するＣＤ３７に対するアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の結合を無効にしない。抗原結合性を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野において周知である（Brummellら、Biochem、３２巻：１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Kobayashiら、Protein  Eng.、１２巻（１０号）：８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびBurksら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９４巻：４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照のこと。）。
【０１１８】
本開示および請求項で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り、複数形を含む。
【０１１９】
実施形態が、言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」により本明細書に記述される場合はいつでも、別の用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」で記述される類似の実施形態も提供されるものと理解される。
【０１２０】
本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などのフレーズで使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」および「Ｂ」両方を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などのフレーズで使用される用語「および／または」は、以下の実施形態のそれぞれを包含することを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
ＩＩ．ＣＤ３７結合剤
【０１２１】
本開示は、ヒトＣＤ３７を特異的に結合する薬剤を提供する。これらの薬剤は、本明細書において、「ＣＤ３７結合剤」と称される。ある特定の実施形態では、ＣＤ３７結合剤は、抗体、その抗原結合性断片、イムノコンジュゲートまたはポリペプチドである。ヒトＣＤ３７の全長アミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、また配列番号１によって表されるように本明細書にそれぞれ提供される。
【０１２２】
ヒトＣＤ３７：
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR（配列番号１）
【０１２３】
ヒトＣＤ３７核酸配列：
atgtcagcccaggagagctgcctcagcctcatcaagtacttcctcttcgttttcaacctcttcttcttcgtcctcggcagcctgatcttctgcttcggcatctggatcctcattgacaagaccagcttcgtgtcctttgtgggcttggccttcgtgcctctgcagatctggtccaaagtcctggccatctcaggaatcttcaccatgggcatcgccctcctgggttgtgtgggggccctcaaggagctccgctgcctcctgggcctgtattttgggatgctgctgctcctgtttgccacacagatcaccctgggaatcctcatctccactcagcgggcccagctggagcgaagcttgcgggacgtcgtagagaaaaccatccaaaagtacggcaccaaccccgaggagaccgcggccgaggagagctgggactatgtgcagttccagctgcgctgctgcggctggcactacccgcaggactggttccaagtcctcatcctgagaggtaacgggtcggaggcgcaccgcgtgccctgctcctgctacaacttgtcggcgaccaacgactccacaatcctagataaggtgatcttgccccagctcagcaggcttggacacctggcgcggtccagacacagtgcagacatctgcgctgtccctgcagagagccacatctaccgcgagggctgcgcgcagggcctccagaagtggctgcacaacaaccttatttccatagtgggcatttgcctgggcgtcggcctactcgagctcgggttcatgacgctctcgatattcctgtgcagaaacctggaccacgtctacaaccggctcgctcgataccgt（配列番号２）
【０１２４】
したがって、一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤は、配列番号１のエピトープまたは配列番号２によってコードされるポリペプチドのエピトープに特異的に結合することができる。
【０１２５】
ＣＤ３７結合剤は、以下に提供される１Ｂ１１−２抗体の配列を有するＣＤ３７結合剤も含む。
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＨ−ＣＤＲ１
ＧＹＦＭＮ（配列番号３）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＨ−ＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号４）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＨ−ＣＤＲ２（ＡｂＭ）
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦ（配列番号３４）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＨ−ＣＤＲ３
ＲＧＩＶＡＳＳＲＦＦＤＶ（配列番号５）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＬ−ＣＤＲ１
ＫＡＳＱＧＶＳＮＤＶＤ（配列番号６）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＬ−ＣＤＲ２
ＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号７）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＬ−ＣＤＲ３
ＣＨＱＤＹＴＳＰＴ（配列番号８）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  重鎖可変領域（ＶＨ）
EVQLLQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVIQSHGKGLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSTTAHMELLSLTSEDSAVYYCGSRGIVASSRFFDVWGAGTSVIVSS（配列番号９）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  軽鎖可変領域（ＶＬ）
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQGVSNDVDWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFSISTVQAEDLAVYFCHQDYTSPTFGGGTKLEIKR（配列番号１０）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  完全長重鎖（ＨＣ）
EVQLLQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVIQSHGKGLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSTTAHMELLSLTSEDSAVYYCGSRGIVASSRFFDVWGAGTSVIVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（配列番号１１）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  完全長軽鎖
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQGVSNDVDWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFSISTVQAEDLAVYFCHQDYTSPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（配列番号１２）
【０１２６】
ＣＤ３７結合剤は、配列番号３〜８に提供される１Ｂ１１−２抗体の６つのＣＤＲ配列を含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）を含む。
【０１２７】
ＣＤ３７結合性分子は、ＣＤＲ１つ当たり最大４つ（すなわち、０、１、２、３または４つ）の保存的アミノ酸置換がある抗体１Ｂ１１−２のＣＤＲ（すなわち、配列番号３〜８）を含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）であることができる。ＣＤ３７結合性分子は、最大４つ（すなわち、０、１、２、３または４つ）の保存的アミノ酸置換がある抗体１Ｂ１１−２のＣＤＲ（すなわち、配列番号３〜８）を含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）であることができる。ＣＤ３７結合性分子は、（ｉ）ＣＤＲ１つ当たり最大４つ（すなわち、０、１、２、３または４つ）の保存的アミノ酸置換がある配列番号３、４、６および７のＣＤＲならびに（ｉｉ）配列番号５および８のＣＤＲを含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）であることができる。ＣＤ３７結合性分子は、（ｉ）最大４つ（すなわち、０、１、２、３または４つ）の保存的アミノ酸置換がある配列番号３、４、６および７のＣＤＲならびに（ｉｉ）配列番号５および８のＣＤＲを含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）であることができる。ＣＤ３７結合性分子は、（ｉ）ＣＤＲ１つ当たり最大４つ（すなわち、０、１、２、３または４つ）の保存的アミノ酸置換がある配列番号３、４および６〜８のＣＤＲならびに（ｉｉ）配列番号５のＣＤＲを含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）であることができる。ＣＤ３７結合性分子は、（ｉ）最大４つ（すなわち、０、１、２、３または４つ）の保存的アミノ酸置換がある配列番号３、４および６〜８のＣＤＲならびに（ｉｉ）配列番号５のＣＤＲを含むＣＤ３７結合剤（例えば、抗体およびその抗原結合性断片）であることができる。
【０１２８】
ポリペプチド、抗体およびその抗原結合性断片は、１Ｂ１１−２抗体の可変軽鎖、可変重鎖または可変軽鎖と可変重鎖の両方を含むことができる。（ａ）配列番号９と少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドおよび／または（ｂ）配列番号１０と少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドも提供される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合するマウス、キメラまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号９または１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換だけが配列番号９または１０と異なる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９５％同一の配列を含む可変重鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９６％同一の配列を含む可変重鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９８％同一の配列を含む可変重鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９９％同一の配列を含む可変重鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合するマウス、キメラまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号９とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換だけが配列番号９と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号９とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側のアミノ酸だけが配列番号９と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号９とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側の保存的アミノ酸置換だけが配列番号９と異なる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１０と少なくとも９５％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１０と少なくとも９６％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１０と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１０と少なくとも９８％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１０と少なくとも９９％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合するマウス、キメラまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換だけが配列番号１０と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側のアミノ酸だけが配列番号１０と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側の保存的アミノ酸置換だけが配列番号１０と異なる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９５％同一の配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０と少なくとも９５％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９６％同一の配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０と少なくとも９６％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９８％同一の配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０と少なくとも９８％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９と少なくとも９９％同一の配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０と少なくとも９９％同一の配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合するマウス、キメラまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号９および／または１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換だけが配列番号９および／または１０と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号９および／または１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側のアミノ酸だけが配列番号９および／または１０と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号９および／または１０とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側の保存的アミノ酸置換だけが配列番号９および／または１０と異なる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号９に示す配列を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号１０に示す配列を含む可変軽鎖ドメインを含む。
【０１３３】
ポリペプチドは、本明細書に記述される個々の軽鎖または重鎖のうち１つを含むことができる。抗体およびポリペプチドは、軽鎖と重鎖を両方含むこともできる。抗体１Ｂ１１−２の軽鎖および重鎖配列は、配列番号１１および１２に提供される。
【０１３４】
（ａ）配列番号１１と少なくとも約９０％配列同一性を有するポリペプチド；および／または（ｂ）配列番号１２と少なくとも約９０％配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドも提供される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１または１２と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％もしくは少なくとも約９９％配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがってある特定の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）配列番号１１と少なくとも約９５％配列同一性を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号１２と少なくとも約９５％配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチド；および／または（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ３７を特異的に結合するマウス、キメラまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号１１および／または１２とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換だけが配列番号１１および／または１２と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号１１および／または１２とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側のアミノ酸だけが配列番号１１および／または１２と異なる。ある特定の実施形態では、配列番号１１および／または１２とある特定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドは、ＣＤＲの外側の保存的アミノ酸置換だけが配列番号１１および／または１２と異なる。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号９に示す配列を含む可変重鎖および配列番号１０に示す配列を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片と同じエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、ＣＤ３７に対する配列番号９に示す配列を含む可変重鎖および配列番号１０に示す配列を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片の結合を競合的に阻害する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、ＣＤ３７に対する配列番号９に示す配列を含む可変重鎖および配列番号１０に示す配列を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片の結合を競合的に阻害し、配列番号９に示す配列を含む可変重鎖および配列番号１０に示す配列を含む可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、本明細書に提供される以下のＣＤ３７抗原配列に結合するおよび／または結合しない。
ＣＤ３７抗原配列
ｈＣＤ３７−ＬＥＬ（下線を引いたＣＤ３７  ＡＡ１０７〜２４２）
TMELLISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH（配列番号１５）
ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｆｃ（下線を引いたｈＣＤ３７  ＡＡ１０７〜２３５）
GPEFLISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（配列番号１６）
ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡ（下線を引いたｈＣＤ３７  ＡＡ１０７〜２３５）
GPEFLISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQGSDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１７）
ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃ（二重下線を引いたｈＣＤ３７  ＡＡ１０７〜１０９および下線を引いたＡＡ１３８〜２３５）
GPEFLISAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK（配列番号１８）
ｈＣＤ３７（ＡＡ  １０７−２３５）
LISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQ（配列番号１９）
ｈＣＤ３７（ＡＡ  １０７−２４２）
LISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNL(配列番号２０)
ｈＣＤ３７（ＡＡ  １０７−１０９および１３８−２３５）
LISAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQ（配列番号２１）
【０１３７】
一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）はＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）はＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）に結合する。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１５に示す配列に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１６に示す配列に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１７に示す配列に結合する。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号２０）に結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５に結合しない。一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１９）に結合するが、ＣＤ３７のアミノ酸１３８〜２３５に結合しない。
【０１４０】
一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１５のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない。一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１６のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない。一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１７のポリペプチドに結合するが、配列番号１８のポリペプチドに結合しない。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）は、配列番号１の１１０〜１３７中の少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合する。アミノ酸１１０〜１３７は、ＣＤ３７の大きな細胞外ドメインの第１の区分（「Ｓ１」）である。
【０１４２】
抗原に対する抗体の親和性または結合力は、当技術分野において周知の任意の適切な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または反応速度論（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）を使用して実験的に決定され得る。直接結合アッセイおよび競合結合アッセイ形式が、容易に利用できる。（例えばFundamental  Immunology、Paul,  W.  E.編、Raven  Press:  New  York、N.Y.（１９８４年）中の、Berzofskyら、「Antibody-Antigen  Interactions」；Kuby、Janis  Immunology、W.  H.  FreemanおよびCompany：New  York、N.Y.（１９９２年）；ならびに本明細書に記述される方法を参照のこと）。特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）下で測定される場合、変動し得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤまたはＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、抗体および抗原の標準溶液ならびに当技術分野において公知の本明細書に記述される緩衝液など標準化した緩衝液で行われる。
【０１４３】
一態様において、結合アッセイは、表面にＣＤ３７抗原を発現している細胞に対するフローサイトメトリーを使用して実施することができる。例えば、３００−１９細胞などのＣＤ３７陽性細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％正常ヤギ血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地）１００μＬ中でサンプル当たり１×１０５個細胞を使用して様々な濃度の抗ＣＤ３７抗体とインキュベートすることができる。
【０１４４】
次いで、細胞を、ペレット化し、洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲートしたヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手できるものなど、ＦＡＣＳ緩衝液中に６μｇ／ｍＬ）１００μＬと１時間インキュベートすることができる。細胞を、次いで再ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ  ２００μＬに再懸濁する。サンプルを、例えば、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターをＨＴＳマルチウエルサンプラーと一緒に使用して取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏを使用して分析することができる（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ製である）。各サンプルに対して、ＦＬ１に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を出力し、抗体濃度に対して片対数プロットで描画して、結合曲線を生成することができる。シグモイド用量反応曲線を結合曲線に適合させ、ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などのプログラムを初期設定パラメータで使用して算出する。ＥＣ５０値は、各抗体に対する見かけの解離定数「Ｋｄ」または「ＫＤ」の尺度として使用できる。
【０１４５】
モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein（１９７５年）Nature  ２５６巻：４９５頁に記述されるものなどのハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を免疫して、リンパ球による免疫した抗原に特異的に結合することになる抗体の産生を誘発する。リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫することもできる。免疫化後に、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して適切な骨髄腫細胞株と融合し、それによってその後融合していないリンパ球および骨髄腫細胞から選択することができるハイブリドーマ細胞を得る。例えば、免疫沈降、免疫ブロット法によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される、選択した抗原を特異的対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法（Goding、Monoclonal  Antibodies：Principles  and  Practice、Academic  Press、１９８６年）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養でまたは動物において腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏでその後増殖させることができる。モノクローナル抗体は、培養培地または腹水からその後精製することができる。
【０１４６】
あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換えＤＮＡ方法を使用して作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲなどにより成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は、従来通りの手順を使用して決定される。重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターにその後クローニングされ、そのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、モノクローナル抗体が宿主細胞によって生成される。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片を、記述されている所望の種のＣＤＲを発現しているファージディスプレイライブラリーから単離することができる（McCaffertyら、１９９０年、Nature、３４８巻：５５２〜５５４頁；Clacksonら、１９９１年、Nature、３５２巻：６２４〜６２８頁；およびMarksら、１９９１年、J.  Mol.  Biol.、２２２巻：５８１〜５９７頁）。
【０１４７】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを組換えＤＮＡ技術を使用していくつかの異なる様式でさらに修飾して、別の抗体を生成することができる。一部の実施形態では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽および重鎖の定常ドメインを、１）例えば、ヒト抗体のその領域と置換してキメラ抗体を生成するまたは２）非免疫グロブリンポリペプチドと置換して融合抗体を生成することができる。一部の実施形態では、定常領域を短縮または除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成する。可変領域の部位指定または高密度突然変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【０１４８】
一部の実施形態では、ヒトＣＤ３７に対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、表面再構成された抗体（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。
【０１４９】
ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して直接調製することができる。標的抗原を対象とする抗体を産生するｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫したまたは免疫した個体から単離した不死化ヒトＢリンパ球を生成することができる（例えば、Coleら、Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy、Alan  R.  Liss、７７頁（１９８５年）；Boemerら、１９９１年、J.  Immunol.、１４７巻（１号）：８６〜９５頁；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと）。また、例えば、Vaughanら、１９９６年、Nat.  Biotech.、１４巻：３０９〜３１４頁、Sheetsら、１９９８年、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.、９５巻：６１５７〜６１６２頁、HoogenboomおよびWinter、１９９１年、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：３８１頁、およびMarksら、１９９１年、J.  Mol.  Biol.、２２２巻：５８１頁）に記述されるように、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択することができ、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する。生成の技術および抗体ファージライブラリーの使用については、米国特許第５，９６９，１０８号、第６，１７２，１９７号、第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号；第６，５４４，７３１号；第６，５５５，３１３号；第６，５８２，９１５号；第６，５９３，０８１号；第６，３００，０６４号；第６，６５３，０６８号；第６，７０６，４８４号；および第７，２６４，９６３号；およびRotheら、２００７年、J.  Mol.  Bio.、doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018にも記述されている（そのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）。親和性成熟戦略およびチェーンシャッフリング戦略（Marksら、１９９２年、Bio/Technology  １０巻：７７９〜７８３頁、その全体が参照により組み込まれる）は当技術分野において公知であり、それを利用して高親和性ヒト抗体を生成することができる。
【０１５０】
ヒト化抗体は、内在性免疫グロブリン産生がない場合に免疫化に応じてヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるヒト免疫グロブリン座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作製することもできる。本手法は、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号に記述されている。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増大する抗体断片が提供される。抗体断片を産生するための様々な技術が公知である。伝統的に、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化から得られる（例えばMorimotoら、１９９３年、Journal  of  Biochemical  and  Biophysical  Methods  ２４巻：１０７〜１１７頁；Brennanら、１９８５年、Science、２２９巻：８１頁）。ある特定の実施形態では、抗体断片は組換えにより作製される。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞中で発現させ、そこから分泌させることができ、したがって、これらの断片の大量産生が可能になる。そのような抗体断片を、上述の抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体断片は、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の通り直鎖状抗体であることもでき、例えば、単一特異的または二重特異的であることができる。抗体断片を産生するための他の技術は、熟練した技術者には明らかであろう。
【０１５２】
本発明によると、技術を、ＣＤ３７に特異的な一本鎖抗体の産生に適合させることができる（米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。加えて、本方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（Huseら、Science  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年））に適合させて、ＣＤ３７に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、もしくは誘導体、断片、アナログまたはそのホモログの迅速で、有効な同定を可能にすることができる。（ａ）抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂ断片、（ｃ）パパインおよび還元剤による抗体分子の処理によって生成されるＦａｂ断片、（ｄ）Ｆｖ断片を含むがそれだけには限らない抗体断片は、当技術分野における技術によって作製することができる。
【０１５３】
本開示の目的の場合、修飾抗体は、抗体の、ヒトＣＤ３７のポリペプチドとの会合を提供する任意の型の可変領域を含み得ると理解されるべきである。この点で、可変領域は、任意の型の哺乳動物を含むまたはそれから得ることができる。したがって、修飾抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカクなど）またはルピナス起源であることができる。一部の実施形態では、修飾免疫グロブリンの可変および定常領域の両方が、ヒトである。他の実施形態では、適合する抗体の可変領域（通常、非ヒト供給源から得られる）を操作または特別に調整して、分子の結合特性を改善することができる。この点で、本発明において有用な可変領域を、ヒト化する、さもなければ取り込んだアミノ酸配列を含めることによって改変することができる。一部の実施形態では、修飾抗体の可変領域は、非ヒト（例えば、マウス）であることができ、修飾抗体の定常領域は、ヒトであることができる。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、１つまたは複数のＣＤＲの少なくとも部分的な置き換えによって、必要に応じてフレームワーク領域の部分的な置き換えおよび配列変化によって改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が得られる抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体から得ることができるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、おそらく異なる種由来の抗体から得ることになると想定される。必ずしも全てのＣＤＲをドナー可変領域からの完全なＣＤＲと置き換えて、一方の可変ドメインの抗原結合能を他方へ移す必要はない。むしろ、一部の場合において、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すだけでよい。
【０１５５】
可変領域の変更にもかかわらず、当業者は、本発明の修飾抗体が、所望の生化学的特性を得るために１つまたは複数の定常領域ドメインの少なくとも一部分が削除、さもなければ改変されている抗体（例えば、全長抗体またはその免疫反応性断片）を含み得ると認識しているはずである。一部の実施形態では、修飾抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含むことになる。定常領域に対する修飾は、１つまたは複数のドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の追加、欠失もしくは置換を含むことができる。すなわち、本明細書に開示される修飾抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の１つもしくは複数および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に変更もしくは修飾を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のドメインが、部分的または全体に削除されている修飾された定常領域が企図される。一部の実施形態では、修飾抗体は、ドメイン削除された構築物またはバリアントを含むことになり、ＣＨ２ドメイン全体が除去されている（ΔＣＨ２構築物）。一部の実施形態では、省かれた定常領域ドメインは、通常はなくなった定常領域によって付与される分子柔軟性をいくらか与える短いアミノ酸スペーサー（例えば１０残基）によって置き換えられることになる。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、定常領域の修飾を使用して、ジスルフィド連結もしくはオリゴ糖部分を排除することができ、抗原特異性または抗体柔軟性の増大により局在性の向上が可能になる。定常領域に対する修飾は、十分に当業者の範囲にある周知の生化学または分子操作技術を使用して容易に作製することができる。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、修飾抗体を操作して、それぞれの修飾抗体のヒンジ領域にＣＨ３ドメインを直接融合させ得ることに留意されたい。他の構築物において、ヒンジ領域と修飾ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの間にペプチドスペーサーを提供することが望ましい場合がある。例えば、適合する構築物を発現させることもでき、ＣＨ２ドメインを削除し、残ったＣＨ３ドメイン（修飾されているまたは無修飾）を、５〜２０アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に接続する。例えば、そのようなスペーサーを付加して、定常ドメインの調節エレメントが自由で接近可能なままであること、またはヒンジ領域が柔軟なままであることを確実にすることができる。
【０１５８】
本開示は、本明細書に示すマウス、キメラ、ヒト化、ヒト抗体またはその抗体断片に実質的に相同であるバリアントおよび同等物をさらに包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、すなわち類似のアミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸の置換を含有することができる。例えば、保存的置換とは、例えば１つの酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による、１つの塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸によるまたは１つの中性アミノ酸の別の中性アミノ酸によるなど、あるアミノ酸の同じ一般クラスの別のアミノ酸による置換のことを指す。保存的アミノ酸置換によって意図されることは、当技術分野において周知である。
【０１５９】
本開示のポリペプチドは、ヒトＣＤ３７に対する抗体もしくはその断片を含む組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであることができる。本発明のいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に著しい効果なしに変動され得ることは、当技術分野において認識されることになる。したがって、本発明は、実質的な活性を示す、またはＣＤ３７タンパク質に対する抗体もしくはその断片の領域を含むポリペプチドの変形をさらに含む。そのような変異体には、欠失、挿入、逆位、反復および型置換がある。
【０１６０】
本明細書に記述される単離されたポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって作製することができる。そのような方法は、タンパク質直接合成方法から単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、適切な形質転換された宿主においてその配列を発現させることまで多岐にわたる。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することによる組換え技術を使用して構築される。任意選択で、配列を部位特異的突然変異誘発によって突然変異させて、その機能的アナログを提供することができる。例えば、Zoellerら、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.  USA  ８１巻：５６６２〜５０６６頁（１９８４年）および米国特許第４，５８８，５８５号を参照のこと。
【０１６１】
一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学合成によって構築されることになる。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、目的の組換えポリペプチドが産生されることになる宿主細胞において有利に働くコドンを選択して設計することができる。標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを、合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、その後ライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、相補的組立てのための５’または３’突出を一般に含有する。
【０１６２】
組立てられたら（合成、部位指定突然変異誘発または別の方法による）、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターへと挿入され、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適当な発現制御配列に作動的に連結されることになる。適当な組立ては、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピングおよび適切な宿主における生物活性ポリペプチドの発現によって確認することができる。当技術分野において周知の通り、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るには、遺伝子は、選択された発現宿主において機能的である転写および翻訳発現制御配列に作動的に連結されなければならない。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、組換え発現ベクターを使用して、ヒトＣＤ３７に対する抗体またはその断片をコードするＤＮＡを増幅し、発現させる。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子から得られる適切な転写もしくは翻訳調節エレメントに作動的に連結されており、抗ＣＤ３７抗体またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成もしくはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は、（１）遺伝的エレメントもしくは遺伝子発現において調節性の役割を有するエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、（３）以下に詳細に記載される適切な転写および翻訳開始ならびに終結配列の組立てを一般に含む。そのような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含むことができる。宿主内で複製する能力は、通常複製起点によってもたらされ、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を追加で組み込むことができる。それらが互いに機能的に関係する場合、ＤＮＡ領域は作動的に連結されている。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡが、ポリペプチドのＤＮＡに作動的に連結され；配列の転写を制御する場合、プロモーターが、コード配列に作動的に連結され；または翻訳できるように配置される場合、リボゾーム結合部位がコード配列に作動的に連結される。酵母発現系に使用するために意図される構造エレメントには、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列がある。あるいは、組換えタンパク質が、リーダーまたは輸送配列なしに発現される場合、Ｎ末端メチオニン残基を含むことができる。その後この残基を、発現された組換えタンパク質から任意選択で切断して、最終産物を得ることができる。
【０１６４】
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択によって決まることになる。様々な発現宿主／ベクターの組合せを、利用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターがある。細菌宿主に有用な発現ベクターには、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体を含めたＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来プラスミドなど、公知の細菌プラスミド、Ｍ１３および線状一本鎖ＤＮＡファージなど、より広宿主域のプラスミドがある。
【０１６５】
適当なプロモーターの制御下でＣＤ３７結合性ポリペプチドまたは抗体（または、抗原として使用するＣＤ３７タンパク質）の発現用として適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、昆虫またはより高等な真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えばＥ．ｃｏｌｉまたは桿菌がある。より高等な真核細胞には、下記の哺乳動物起源の樹立細胞株がある。無細胞翻訳系を利用する可能性もある。細菌、真菌、酵母ならびに哺乳動物の細胞宿主で使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、Pouwelsら（Cloning  Vectors:  A  Laboratory  Manual、Elsevier、N.Y.、１９８５年）に記述されており、関連する開示は参照によりここで本明細書に組み込まれる。抗体産生を含めたタンパク質産生の方法に関する追加の情報は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号および第６，６６０，５０１号ならびに国際特許出願公開ＷＯ  ０４００９８２３号に見出すができ、そのそれぞれは、その全体が参照によりここで本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現するために有利に利用される。そのようなタンパク質は、一般に正しくフォールドされ、適切に修飾され、完全に機能的なので、哺乳動物細胞において組換えタンパク質の発現を実施することができる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、Gluzman（Cell  ２３巻：１７５頁、１９８１年）によって記述されているサル腎腎臓細胞のＣＯＳ−７株、ならびに例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株を含め、適当なベクターを発現することができる他の細胞株がある。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、発現しようとする遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサーなどの非転写エレメント、および他の５’または３’隣接非転写配列、ならびに必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位および転写終結配列などの５’または３’非翻訳配列を含むことができる。昆虫細胞における異種タンパク質産生のためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers、Bio/Technology  ６巻：４７頁（１９８８年）に概説されている。
【０１６７】
形質転換された宿主によって産生されるタンパク質は、任意の適切な方法によって精製され得る。そのような標準的な方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解があり、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技術による。タンパク質にヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグを付けて、適当な親和性カラムを通すことによって簡単に精製できるようにすることができる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ線結晶学などの技術を使用して物理的に特徴付けることもできる。
【０１６８】
例えば、培養培地に組換えタンパク質を分泌する系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して初めに濃縮することができる。濃縮ステップ後、濃縮物を、適切な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質を利用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において一般的に利用される他の型であることができる。あるいは、陽イオン交換ステップを利用することができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスがある。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用する１つまたは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを利用して、ＣＤ３７結合剤をさらに精製することができる。前述の精製ステップのいくつかまたは全てを様々な組合せで利用して、均質な組換えタンパク質を得ることもできる。
【０１６９】
細菌培養において産生された組換えタンパク質は、例えば、細胞ペレットからの最初の抽出に続き、１回または複数回の濃縮、塩析、水溶性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップに利用することができる。組換えタンパク質の発現に利用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕または細胞溶解剤の使用を含めた任意の簡便な方法によって破壊することができる。
【０１７０】
抗体および他のタンパク質を精製するための当技術分野において公知の方法には、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号、第２００８／０１７７０４８号および第２００９／０１８７００５号に記述されているものもあり、そのそれぞれは、その全体が参照によりここで本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
【０１７１】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３７に特異的に結合するポリペプチドまたはかかるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明は、ヒトＣＤ３７に対する抗体をコードするか、またはかかる抗体の断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態で、またはＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含み、二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、または１つもしくは複数の内在性イントロンを欠くＤＮＡである。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、天然に存在しない。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、組換えにより作製される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
【０１７３】
本開示は、配列番号３〜１１からなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３〜５のポリペプチドをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６〜８のポリペプチドをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３〜５および配列番号６〜８のポリペプチドをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３〜８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号３〜５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号６〜８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号３〜５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、および配列番号６〜８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、および配列番号１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７６】
本開示はさらに、配列番号１３および１４で示される配列から選択される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＨ核酸配列
gaggttcaactgctgcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcatttactggctactttatgaactgggtgatacagagccatggaaagggccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgataccttctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctctaccacagcccacatggagctcctgagcctgacatctgaggactctgccgtctattattgtggatcccgggggatagtggcttcctctaggttcttcgatgtctggggcgcagggacctcggtcatcgtctcctcagccaaaacgacac（配列番号１３）
ｍｕＣＤ３７−１Ｂ１１−２  ＶＬ核酸配列
agtattgtgatgacccagactcccaaattcctgcttgtatcagcaggagacagggttaccataacctgcaaggccagtcagggtgtgagtaatgatgtagattggtaccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctacactggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcagcatcagcactgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcaccaggattatacctctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgat（配列番号１４）
【０１７７】
また、配列番号１３および１４のいずれか１つに対する少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが提供される。
【０１７８】
また、配列番号１３に対して少なくとも約９０％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９０％同一であるポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９５％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９５％同一であるポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９６％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９６％同一であるポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９７％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９７％同一であるポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９８％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９８％同一であるポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチドを含む、組成物が提供される。
【０１７９】
また、配列番号１３に対して少なくとも約９０％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９０％同一であるポリヌクレオチドを含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９５％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９５％同一であるポリヌクレオチドを含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９６％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９６％同一であるポリヌクレオチドを含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９７％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９７％同一であるポリヌクレオチドを含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９８％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９８％同一であるポリヌクレオチドを含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。また、配列番号１３に対して少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチド、および配列番号１４に対して少なくとも約９９％同一であるポリヌクレオチドを含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。
【０１８０】
また、配列番号１３で示されるポリヌクレオチド配列、および配列番号１４で示されるポリヌクレオチド配列を含むベクター（複数化）を含む組成物が提供される。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に、同じリーディングフレームで融合させた成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドは、前タンパク質であり、宿主細胞によりリーダー配列を切断されてポリペプチドの成熟形態を形成し得る。また、ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質および追加の５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、タンパク質の不活性形態である。プロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残る。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えばコードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に、同じリーディングフレームで融合させた成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、細菌宿主の場合には、マーカー配列は、マーカーに融合させた成熟ポリペプチドの精製を提供するためのｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサ−ヒスチジンタグであってもよいか、または哺乳動物宿主（例えばＣＯＳ−７細胞）が使用される場合、マーカー配列は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。
【０１８３】
本開示はさらに、例えば断片、アナログ、および誘導体をコードする、本明細書で上に説明するポリヌクレオチドのバリアントに関する。
【０１８４】
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、または両方における変化を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失を生成する変化を含有するが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない。一部の実施形態では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重のためのサイレント置換により作製される。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由のために、例えば特定の宿主についてコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンを細菌宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉにとって好ましいコドンに変える）ために作製され得る。
【０１８５】
また、本明細書で説明するポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞が提供される。
ＩＶ．生体サンプル
【０１８６】
生体サンプルは多くの場合、固定液で固定される。アルデヒド固定液、例えばホルマリン（ホルムアルデヒド）およびグルタルアルデヒドが典型的に使用される。また、他の固定技術、例えばアルコール浸漬（BattiforaおよびKopinski、J.  Histochem.  Cytochem.（１９８６年）３４巻：１０９５頁）を使用して固定した組織サンプルは好適である。また、使用されるサンプルは、パラフィンに包埋され得る。一部の実施形態では、サンプルは、ホルマリン固定、かつパラフィン包埋される（ＦＦＰＥ）。別の実施形態では、ＦＦＰＥブロックは、ＦＦＰＥコアサンプルのための特定のエリア（複数可）を選択するために、分析のための１つまたは複数の部分を選択する前にヘマトキシリンおよびエオシン染色される。これらの微粒子標本から組織ブロックを調製する方法は、以前の様々な予後因子のＩＨＣ研究で使用されており、および／または当業者に周知である（例えばAbbondanzoら、Am  J  Clin  Pathol.、１９９０年５月、９３巻（５号）：６９８〜７０２頁；Allredら、Arch  Surg.、１９９０年１月、１２５巻（１号）：１０７〜１３頁を参照のこと）。
【０１８７】
簡潔に説明すると、任意のインタクトな器官または組織を、かなり小さい片に切断し、様々な固定液（例えばホルマリン、アルコールなど）中で、組織が「固定」されるまで様々な期間インキュベートしてもよい。サンプルは、身体から外科的に除去された事実上任意のインタクトな組織であり得る。サンプルを、病理組織学検査室で日常的に使用される設備に適合する適度に小さい片（複数可）に切断してもよい。切断された片のサイズは典型的に、数ミリメートル〜数センチメートルの範囲である。また、生体サンプルは、体液抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、およびまたは脾臓調製物であってもよい。
Ｖ．ＣＤ３７発現および治療的有効性の相関
【０１８８】
抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号で提供される。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートは、ＩＭＧＮ５２９である。ＩＭＧＮ５２９は、ｈｕＣＤ３７−３抗体（配列番号２２〜２７により表されるＣＤＲ、配列番号２８のＶＨ、および配列番号２９のＶＬを含む）、ＳＭＣＣリンカー、およびＤＭ１マイタンシノイドを含有する。ｈｕＣＤ３７−３抗体の配列を、以下に示す。
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＨ−ＣＤＲ１：ＴＳＧＶＳ（配列番号２２）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＨ−ＣＤＲ２：ＶＩＷＧＤＧＳＴＮ（配列番号２３）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＨ−ＣＤＲ３：ＧＧＹＳＬＡＨ（配列番号２４）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＡＳＥＮＩＲＳＮＬＡ（配列番号２５）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＬ−ＣＤＲ２：ＶＡＴＮＬＡＤ（配列番号２６）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＬ−ＣＤＲ３：ＱＨＹＷＧＴＴＷＴ（配列番号２７）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＨ  ｖ．１．０：
QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSS（配列番号２８）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＨ  ｖ．１．１：
QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSS（配列番号３２）
ｈｕＣＤ３７−３  ＶＬ：
DIQMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYQQKPGKSPKLLVNVATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQPEDFGTYYCQHYWGTTWTFGQGTKLEIKR（配列番号２９）
ｈｕＣＤ３７−３重鎖（ＨＣ）ｖ．１．０：
QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号３０）
ｈｕＣＤ３７−３重鎖（ＨＣ）ｖ．１．１：
QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号３３）
ｈｕＣＤ３７−３軽鎖（ＬＣ）：
DIQMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYQQKPGKSPKLLVNVATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQPEDFGTYYCQHYWGTTWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３１）
【０１８９】
ある特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、２０１０年２月１８日に１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたＡＴＣＣ寄託名ＰＴＡ−１０６６４のハイブリドーマから作製したＣＤ３７抗体、またはその抗原結合性断片を含有し得る。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＴＡ−１０６６４のハイブリドーマから作製した抗体のＶＨ−ＣＤＲおよびＶＬ−ＣＤＲを含む。
【０１９０】
ＩＭＧＮ５２９は現在、白血病およびリンパ腫を処置するために臨床開発中である。ＩＭＧＮ５２９を投与する方法は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／７１０，３５４号（公開番号第２０１５／０３４３０７７号）、およびStathisら、「Preliminary  Findings  from  a  phase  I,  multi-center,  open-label  study  of  the  anti-CD37  antibody-drug  conjugate  (ADC),  IMGN529,  in  adult  patients  with  relapsed  or  refractory  non-Hodgkin  Lymphoma  (NHL)」、要約番号８５２６、ASCO  Annual  Meeting（２０１４年）で提供される。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、本開示は、特に、例えばＩＨＣにおいて、あるダイナミックレンジのＣＤ３７発現レベルを検出することができる本明細書で提供される抗体およびその抗原結合性断片を使用して、対象におけるＣＤ３７の発現レベルの上昇のためにＣＤ３７標的治療に有利に応答する可能性が高い対象を同定するための方法を提供する。
【０１９２】
患者サンプルの評価および異種移植片モデルを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に対する相関は、処置に対してより応答する可能性が高い対象を選択するための発現分析力を示す。ＩＨＣは、腫瘍細胞上のＣＤ３７発現についてのスコア：０（発現なし）〜３（非常に高レベルの発現）を提供する。ＣＤ３７発現について１、２、または３（または２もしくは３）のスコアを有するサンプルは、ＣＤ３７イムノコンジュゲートの臨床的に意味がある用量においてＣＤ３７標的抗がん治療に応答する高い可能性を有する（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ  ２０１３／１４９１７１を参照のこと）。したがって、ＣＤ３７スコアの上昇を有する個体の同定は、臨床的に意味がある投与量に応答し得る個体を同定することを補助し得る。さらに、ＣＤ３７のより均一なレベルの発現は、治療的利益とのより優れた相関を提供する。したがって、均質な染色均一性、または染色の増大と不均質な染色均一性との組合せは、ＣＤ３７発現の増大を示し得る。例えば、２を超えるヘテロのスコアは、ＣＤ３７治療剤での処置の患者選択基準として使用することができる。加えて、患者選択基準は、染色強度（例えば１、２、または３）および均一性（例えば不均質または均質（表３を参照のこと））の両方を反映する特定のレベルで膜ＣＤ３７を発現することが見られる、サンプル中の細胞のパーセンテージに基づいてもよい。例えば、サンプルは、例えば細胞の少なくとも２５％が少なくとも２もしくはそれより強くＣＤ３７陽性染色されること、または細胞の少なくとも７５％が２もしくはそれより強くＣＤ３７陽性染色されるとして特徴付けられ得る。別の例では、サンプルは、例えば細胞の少なくとも２５％が少なくとも３のＣＤ３７陽性染色されること、または細胞の少なくとも７５％が３でＣＤ３７陽性染色されるとして特徴付けられ得る。別の例では、ＣＤ３７発現は、Ｈスコアを与えられる。加えて、ＣＤ３７の免疫学的検出（免疫組織化学による）は、Ｈスコアを使用してスコア化することができる。Ｈスコアは、本明細書で提供される計算を使用して、染色強度スコアを均一性スコアと組み合わせる。以下により詳細に説明するように、Ｈスコアは、１〜３００の範囲であり得る。
【０１９３】
また、ＣＤ３７発現分析は、低レベルのＣＤ３７標的抗がん治療（「低用量治療」）が、抗腫瘍応答をもたらすのに有効であり得る患者を同定するために使用することができる。当技術分野で理解されているように、化合物は一般的に、所望の治療応答を達成する最も少ない投与量で投与される。これは具体的には、臨床的な、および多くの場合所望されない副作用を引き起こす治療薬にとって重要である。ＣＤ３７発現レベルの上昇を有する対象を認識する能力は、ＣＤ３７標的治療薬の投与量の潜在的な最小化を可能にし、したがって副作用の可能性を減少させ、一方で治療的有効性を維持する。
ＶＩ．免疫検出法
【０１９４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば抗体およびその抗原結合性断片）を、免疫検出法で使用して、ＣＤ３７の発現増大または過剰発現を有する、サンプルおよび／または対象を同定することができる。免疫検出法は、いくつかを挙げると、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。
【０１９５】
一般的には、免疫検出法は、ＣＤ３７を含む疑いがあるサンプルを得ることと、サンプルを免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で第１のＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）と接触させることとを含む。
【０１９６】
抗原検出の点で、分析される生体サンプルは、ＣＤ３７を検出することが望ましい任意のサンプル、例えば体液抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、組織切片もしくは標本、ホモジナイズした組織抽出物、生検吸引液、細胞、分離および／もしくは精製形態のＣＤ３７含有組成物、または任意の生体体液であってもよい。一部の実施形態では、血液、血漿、もしくはリンパサンプル、または抽出物が使用される。
【０１９７】
選択された生体サンプルを、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下で、および十分な期間、ＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）と接触させることは一般的に、ＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）をサンプルに添加すること、およびＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）が、存在する任意のＣＤ３７と免疫複合体を形成する、すなわち、これに結合するのに十分長い期間、混合物をインキュベートすることの問題である。この時間後、サンプル、例えば組織切片もしくは体液抽出物、ＥＬＩＳＡプレート、またはウェスタンブロットを一般的に洗浄して、任意の非特異的に結合したＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）を除去し、一次免疫複合体内に特異的に結合したＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）のみが検出されることを可能にする。
【０１９８】
一般的に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野で周知であり、多くのアプローチの適用を通して達成することができる。検出において用いるＣＤ３７結合剤（例えばＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）は、それ自体、検出可能な標識に連結してもよく、次いで、この標識を単に検出し、これにより組成物中の一次免疫複合体の量が決定されることを可能にする。あるいは、一次免疫複合体内に結合する第１のＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）は、第１のＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）に対する結合親和性を有する第２の結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）の手段により検出することができる。これらの場合、第２の結合剤は、検出可能な標識に連結してもよい。第２の結合剤がそれ自体、抗体またはその抗原結合性断片である場合、「二次」抗体またはその抗原結合性断片と呼ぶことができる。一次免疫複合体を、二次免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、および十分な期間、標識二次結合剤と接触させる。次いで、一般的に、二次免疫複合体を洗浄して、任意の非特異的に結合した標識二次結合剤を除去し、次いで、二次免疫複合体に残った標識を検出する。
【０１９９】
さらなる方法は、２ステップアプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。本明細書で説明するように、第１のＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）に対する結合親和性を有する第２の結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）を使用して、二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体を、ここでもまた、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下で、および十分な期間、第２の結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）に対する結合親和性を有する第３の結合剤と接触させる。第３の結合剤を、検出可能な標識に連結し、このようにして形成した三次免疫複合体の検出を可能にする。このシステムは、シグナル増幅が所望される場合、これを提供し得る。
【０２００】
別の実施形態では、ビオチン化ＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）を使用してＣＤ３７を検出し、次いで、第２の結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）を使用してビオチンを検出する。この方法では、試験するサンプルを、最初にビオチン化ＣＤ３７結合剤（例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片）を含む溶液中でインキュベートする。ＣＤ３７が存在する場合、結合剤の一部は、ＣＤ３７に結合して、ビオチン化ＣＤ３７結合剤−ＣＤ３７複合体を形成する。次いで、複合体を、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的ビオチン化ＤＮＡの連続溶液中でのインキュベーションにより、各ステップが抗体／抗原複合体に追加のビオチン部位を付加して、増幅する。好適なレベルの増幅が達成されるまで、増幅ステップを繰り返し、この時点でサンプルを、ビオチンに結合する第２の結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）を含む溶液中でインキュベートする。この第２の結合剤を、例えば色素原基質を使用する組織酵素学により抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用され得る酵素で、標識する。好適な増幅により、肉眼で見えるコンジュゲートを作製することができる。
【０２０１】
一部の実施形態では、免疫組織化学（ＩＨＣ）を、免疫学的検出のために使用する。ＩＨＣを使用して、サンプル中のＣＤ３７の検出を、サンプルをプローブ、例えば抗ＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片で標的化することにより達成することができる。プローブは、検出可能な標識に直接的もしくは間接的に連結することができるか、または検出可能な標識に直接的もしくは間接的に連結される別のプローブにより検出することができる。
【０２０２】
一部の実施形態では、ＩＨＣ、例えば較正されたＩＨＣは、タンパク質発現の異なるレベルを区別することができる。一部の実施形態では、ＩＨＣは、低ＣＤ３７、中ＣＤ３７、または高ＣＤ３７発現を有するサンプルの染色強度を区別することができる。
【０２０３】
一実施形態では、ＣＤ３７の免疫学的検出（免疫組織化学による）は、強度および均一性の両方についてスコア化される（染色された細胞−膜のみのパーセント）。強度についてのＣＤ３７発現の比較スケールは、０−陰性、０〜１−非常に弱い、１−弱い、１〜２−弱い〜中程度、２−中程度、２〜３−中程度〜強い、３−強い〜非常に強い、のように相関する。定量的に、スコア０は、染色が観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の１０％未満でしか観察されないことを表す。スコア１または１＋は、かすかな／わずかな感知できる膜染色が腫瘍細胞の１０％を超えて検出されることを表す。細胞は、それらの膜部分で染色されているのみである。スコア１および１＋は、相互変換可能に使用される。スコア２については、弱い〜中程度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。最後に、スコア３は、中程度〜強い完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超えて観察されることを表す。ＣＤ３７発現について０または１のスコアを有するサンプルは、ＣＤ３７発現の上昇を有しないとして特徴付けられ得、一方で、２または３のスコアを有するサンプルは、過剰発現しているか、またはＣＤ３７の上昇を有するとして特徴付けられ得る。別の実施形態では、本明細書で提供される抗体、その抗原結合性断片、またはポリペプチドを使用して、ＣＤ３７発現について０のスコアを有するサンプルは、ＣＤ３７発現の上昇を有しないとして特徴付けられ得、１のスコアを有するサンプルは、ＣＤ３７の発現の増大を有するとして特徴付けられ得、２または３のスコアを有するサンプルは、過剰発現しているか、またはＣＤ３７の上昇を有するとして特徴付けられ得る。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、対象から得られたサンプルの少なくとも２のスコアは、対象を、抗ＣＤ３７処置レジメン（例えばＩＭＧＮ５２９）での処置の候補者として同定する。ある特定の実施形態では、対象から得られたサンプルの少なくとも３のスコアは、対象を、抗ＣＤ３７処置レジメン（例えばＩＭＧＮ５２９）での処置の候補者として同定する。
【０２０５】
また、ＣＤ３７を過剰発現するサンプルは、細胞当たりの発現されたＣＤ３７分子のコピー数、または細胞当たりの結合抗体（ＡＢＣ）数に対応する免疫組織化学スコアにより等級付けすることができ、生化学的に決定することができる。
【０２０６】
ＣＤ３７均一性（細胞膜染色のパーセント）についての比較スケールは、以下の通りである：陰性＝０％；限局性＝＜２５％；不均質（ヘテロ）＝２５〜７５％；および均質（ホモ）＝＞７５％。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、対象から得られたサンプルの少なくとも２のヘテロのスコアは、対象を、抗ＣＤ３７処置レジメン（例えばＩＭＧＮ５２９）での処置の候補者として同定する。ある特定の実施形態では、対象から得られたサンプルの少なくとも２のホモのスコアは、対象を、抗ＣＤ３７処置レジメン（例えばＩＭＧＮ５２９）での処置の候補者として同定する。ある特定の実施形態では、対象から得られたサンプルの少なくとも３のヘテロのスコアは、対象を、抗ＣＤ３７処置レジメン（例えばＩＭＧＮ５２９）での処置の候補者として同定する。ある特定の実施形態では、対象から得られたサンプルの少なくとも３のホモのスコアは、対象を、抗ＣＤ３７処置レジメン（例えばＩＭＧＮ５２９）での処置の候補者として同定する。
【０２０８】
一実施形態では、ＣＤ３７の免疫学的検出（免疫組織化学による）は、Ｈスコアを使用してスコア化される。Ｈスコアは、染色強度スコア（例えば０〜３のスコア、０は染色なしを表し、３は強い染色を表す）を、膜染色について陽性である細胞のパーセンテージ（すなわち均一性）と組み合わせる。Ｈスコアは、以下のように計算することができる：
Ｈスコア＝［０＊（強度０で染色された細胞のパーセンテージ）］＋［１＊（強度１で染色された細胞のパーセンテージ）］＋［２＊（強度２で染色された細胞のパーセンテージ）］＋［３＊（強度３で染色された細胞のパーセンテージ）］。したがって、Ｈスコアは、０（細胞膜染色なし）〜３００（全ての細胞膜が強度３で染色されている）の範囲にあり得る。
【０２０９】
例として、がんを有する対象におけるＨスコアは、以下の通りであり得る：
Ｈスコア＝（強度０が７５％）＋（強度１が０％）＋（強度２が０％）＋（強度３が２５％）＝７５；または
Ｈスコア＝（強度０が０％）＋（強度１が７５％）＋（強度２が０％）＋（強度３が２５％）＝１５０。
別の例では、がんを有する対象におけるＨスコアは、以下の通りであり得る：
Ｈスコア＝（強度０が７５％）＋（強度１が０％）＋（強度２が２５％）＋（強度３が０％）＝５０；または
Ｈスコア＝（強度０が０％）＋（強度１が７５％）＋（強度２が２５％）＋（強度３が０％）＝１２５。
【０２１０】
一実施形態では、ＣＤ３７の免疫学的検出（免疫組織化学による）は、サンプルにわたる陽性パーセントおよび強度を使用してスコア化される。この実施形態では、抗ＣＤ３７処置レジメンでの処置についての選択は、染色強度（例えば１、２、または３）および均一性（例えば不均質または均質（表３を参照のこと））の両方を反映する特定のレベルで膜ＣＤ３７を発現することが見られる、サンプル中の細胞のパーセンテージに基づく。例えば、細胞の少なくとも２５％（すなわち、２５〜７５％または＞７５％）が３でＣＤ３７陽性染色されるサンプルは、「３ヘテロ」および「３ホモ」として、または集合的に「少なくとも２５％が３で陽性」として特徴付けることができる。
【０２１１】
ＩＨＣは、手作業で、または自動システムを使用して（例えば自動こし器を使用して）実施することができる。ＩＨＣは、細胞、細胞ペレット、組織、血液からの調製物、血漿、血清、またはリンパ液などについて実施することができる。一部の実施形態では、サンプルは、固定サンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、パラフィン包埋サンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、ホルマリン固定、かつパラフィン包埋したサンプルである。
【０２１２】
一部の実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、免疫学的検出のために使用される。ＥＬＩＳＡの根底にある方法論は、当技術分野で周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLequin  R、「Enzyme  immunoassay  (EIA)/enzyme-linked  immunosorbent  assay  (ELISA)」、Clin.  Chem.５１巻：２４１５〜２４１８頁（２００５年）を参照されたい。１つの例示的なＥＬＩＳＡでは、ＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）は、タンパク質親和性を示す選択された表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル上に固定される。次いで、ＣＤ３７を含有するか、または含有する疑いのある試験サンプル、例えば臨床サンプルを、ウェルに添加する。結合させ、非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄した後、結合したＣＤ３７を検出することができる。検出は一般的に、検出可能な標識に連結された、ＣＤ３７に特異的な第２抗体またはその抗原結合性断片の添加により達成される。この種類のＥＬＩＳＡは、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。また、検出は、第２抗体またはその抗原結合性断片の添加、続いて第２抗体またはその抗原結合性断片に対する結合親和性を有する第３抗体またはその抗原結合性断片の添加することにより、達成することができ、第３抗体またはその抗原結合性断片は検出可能な標識に連結されている。発色は、分光測定でモニターし、標準曲線に対する較正によりＣＤ３７の濃度に関連させることができる。別の例示的なＥＬＩＳＡでは、試験サンプルをウェル表面上に固定し、次いで、ＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）と接触させる。結合させ、非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄した後、結合したＣＤ３７を検出する。最初のＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）が検出可能な標識に連結する場合、免疫複合体は直接的に検出することができる。ここでもまた、免疫複合体は、第１の結合に対して結合親和性を有する第２の結合剤を使用して、第２の結合剤は検出可能な標識に連結して、検出することができる。試験サンプルが固定されている別のＥＬＩＳＡは、検出における競合の使用を含む。このＥＬＩＳＡでは、標識ＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）をウェルに添加し、ＣＤ３７に結合することを可能にし、それらの標識により検出する。次いで、サンプル中のＣＤ３７の量を、コーティングされたウェルとのインキュベーション前またはインキュベーション中に、サンプルを標識ＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）と混合することにより決定する。サンプル中のＣＤ３７の存在は、ウェルへの結合のために利用可能なＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）の量を低減させるように働き、したがって最終的なシグナルを低減させる。
【０２１３】
一実施形態では、ウェスタンブロットを、免疫学的検出のために使用する。ウェスタンブロットのために、タンパク質を細胞サンプルから抽出し、電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、膜（例えばニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）にブロットする。次いで、膜をＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）と接触させ、ＣＤ３７結合剤は、直接標識してもよく、またはさらに二次標識結合剤に供してもよい。検出は、例えばオートラジオグラフィー、比色反応、または化学発光によることができる。この方法は、基質の量の定量、および電気泳動中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示す膜上の相対的位置によるその種類の決定の両方を可能にする。
【０２１４】
一実施形態では、フローサイトメトリーを、免疫学的検出のために使用する。したがって、例えば、細胞当たりの結合抗体（ＡＢＣ）数を、フローサイトメトリーを使用して評価することができる。細胞当たりの結合抗ＣＤ３７抗体の数の多さは、高ＣＤ３７発現レベル、および抗ＣＤ３７抗体またはそのイムノコンジュゲートでの処置の影響を受けやすい可能性の高さを示し得る。
【０２１５】
一実施形態では、ＦＡＣＳを、免疫学的検出のために使用する。ＦＡＣＳ分析は、細胞膜上のＣＤ３７の検出を可能にする。簡潔に説明すると、ＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）を発蛍光団に連結し、検出を、各細胞が光線を通過する際に各細胞から放射された光波長を読むセルソーティング機によって実施する。この方法は、２つまたはそれよりも多い抗体を同時に用い得る。
ＶＩＩ．検出薬剤
【０２１６】
本明細書で提供されるＣＤ３７結合剤は、少なくとも１つの薬剤に連結して、検出コンジュゲートを形成することができる。加えて、本明細書で提供されるＣＤ３７結合剤は、少なくとも１つの薬剤に連結して検出コンジュゲートを形成する検出薬剤により検出することができる。検出分子および部分は、当技術分野で周知である。診断薬としての抗体分子の有効性を増大させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分を連結または共有結合的に結合または複合体化することは従来から行われている。かかる分子または部分は、少なくとも１つのレポーター分子であってもよいが、これに限定されない。レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされているレポーター分子の非限定的な例として、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子、および／またはリガンド、例えばビオチンが挙げられる。
【０２１７】
本発明で企図される抗体または抗原結合性断片検出コンジュゲートは、抗体または断片が、発色性基質との接触に際して着色生成物を生成する二次結合リガンドにおよび／または酵素（酵素タグ）に連結される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のための検出コンジュゲートを含む。本明細書で提供されるＣＤ３７抗体またはその抗原結合性断片は、例えばそれらはあるダイナミックレンジのＣＤ３７を検出することができるので、コンジュゲート法のために特に有用である。好適な酵素の例として、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、および／またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。一部の実施形態では、二次結合リガンドは、ビオチンならびに／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。
【０２１８】
酵素の場合、発色および測定される色の量は、存在するＣＤ３７の量の直接的な測定である。ＨＲＰが標識である場合、色は、基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して、例えば４５０ｎｍの吸光度で検出することができる。あるいは、ＨＲＰのための他の発色性基質、例えば３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）または２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）。ＴＭＢ、ＤＡＢ、およびＡＢＴＳなどの基質を、例えば、ＥＬＩＳＡを使用する免疫検出法で使用することができる。
【０２１９】
３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、ＨＲＰなどの酵素の基質であり、アルコールおよび他の有機溶媒中で非常に不溶性である褐色の最終生成物を生成する。また、ＤＡＢの酸化は重合を引き起こし、四酸化オスミウムと反応する能力をもたらし、したがってその染色強度および電子密度を増大させる。重合したＤＡＢの光学密度を強化するために使用されるいくつかの金属および方法のうち、硫化銀と組み合わせた塩化金は、最もうまくいくように見える。
【０２２０】
３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）は、ＨＲＰなどの酵素の基質であり、酸化に際して、アルコール可溶性である深紅色の最終生成物を形成する。それゆえ、ＡＥＣで処理した標本は、アルコールまたはアルコール溶液（例えばハリスヘマトキシリン）中に浸漬してはならない。その代わりに、水性対比染色および封入剤を使用するべきである。
【０２２１】
４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）は、ＨＲＰなどの酵素の基質であり、青色の最終生成物として沈殿する。ＣＮは、アルコールおよび他の有機溶媒中で可溶性であるので、標本は、脱水したり、アルコール対比染色に曝露したり、または有機溶媒を含有する封入剤と共にカバーガラスで覆ったりしてはならない。ＤＡＢとは異なって、ＣＮは、沈殿場所から拡散する傾向がある。
【０２２２】
ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩／ピロカテコール（Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬）は、ＨＲＰなどの酵素の基質であり、アルコールおよび他の有機溶媒中で不溶性である青黒色の反応生成物を与える。重合したＤＡＢのように、この反応生成物は、オスミウム化することができる。免疫ペルオキシダーゼ技術においてＨａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬で様々な結果が達成されている。
【０２２３】
化学発光基質、例えばＥＣＬを使用してもよい。ＥＣＬなどの基質は、例えばウェスタンブロッティングを使用する免疫検出法で使用することができる。
【０２２４】
結合剤（例えば抗体）コンジュゲートとしての使用に企図される例示的な蛍光標識として、例えば、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、フィコエリスリン、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、レノグラフィン（Renographin）、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびこれらの標識の誘導体（すなわち、ハロゲン化アナログ、コンジュゲートするためにイソチオシアネートまたは他のリンカーで改変したものなど）が挙げられる。例示的な放射性標識は、トリチウムである。
【０２２５】
また、アジド基を含有する分子は、低強度紫外線により生成する反応性ナイトレン中間体を通してタンパク質への共有結合的結合を形成するために使用することができる（PotterおよびHaley、１９８３年）。特に、プリンヌクレオチドの２−および８−アジドアナログは、粗細胞抽出物中でヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして使用されている（OwensおよびHaley、１９８７年；Athertonら、１９８５年）。また、２−および８−アジドヌクレオチドは、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており（Khatoonら、１９８９年；Kingら、１９８９年；およびDholakiaら、１９８９年）、抗体結合剤として使用することができる。
【０２２６】
本発明の他の実施形態では、ＣＤ３７結合剤（例えば抗体およびその抗原結合性断片）または二次結合剤を、核種、例えばトリチウムで放射性標識する。追加の実施形態では、ナノ金粒子（例えば約０．５ｎｍ〜４０ｎｍのサイズ）および／または量子ドット（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）が用いられる。
【０２２７】
一部の実施形態では、ＣＤ３７は、Ｏｐｔｉｖｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出試薬（Ｖｅｎｔａｎｎａカタログ番号７６０−７００）を使用して検出される。
【０２２８】
一部の実施形態では、ＣＤ３７は、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｕｌｔｒａ染色システムを使用して検出される。
【０２２９】
一部の実施形態では、ＣＤ３７は、Ｏｐｔｉｖｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出試薬（Ｖｅｎｔａｎｎａカタログ番号７６０−７００）を使用して、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｕｌｔｒａ染色システムを使用して検出される。
ＶＩＩＩ．組成物およびキット
【０２３０】
また、本明細書で開示される方法の実施における使用のための組成物およびキットが、本明細書で提供される。かかるキットは、容器を含んでもよく、容器の各々は、本発明の実施を支持するための、例えば１つもしくは複数のＣＤ３７結合剤（例えば抗体またはその抗原結合性断片）、緩衝液、および／または試薬を含む、方法で利用される様々な試薬（典型的に濃縮形態で）の１つまたは複数と、ＣＤ３７の検出のための器具とを有する。キットはさらに、ＣＤ３７結合剤に結合する第２の結合剤、および任意選択で、第２の結合剤に結合する第３の結合剤を含み得る。ＣＤ３７結合剤、第２の結合剤、もしくは第３の結合剤は、検出試薬に結合させ得るか、またはキットは、検出試薬をＣＤ３７結合剤、第２の結合剤、もしくは第３の結合剤にカップリングするための試薬を含み得る。また、本発明のリガンド検出法におけるキット構成成分を説明する標識もしくは指標、またはその一組の使用説明書は典型的に含まれ、説明書は、キットまたはその構成成分の添付文書および／または包装を伴い得る。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、キットは、ＣＤ３７に結合する第１抗体または抗原結合性断片、第１抗体または抗原結合性断片に結合する第２抗体または抗原結合性断片、第２抗体または抗原結合性断片に結合する第３抗体または抗原結合性断片を含み、第３抗体または抗原結合性断片は、検出試薬（例えば酵素タグ）、任意選択で検出試薬の基質（例えばＴＭＢ、ＤＡＢ、またはＡＢＴＳ）、および任意選択でＣＤ３７タンパク質またはＣＤ３７を含有する細胞サンプル（例えばパラフィン包埋サンプル）に連結される。キットはさらに、がんの処置のための治療剤、例えば抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを含み得る。
【０２３２】
一実施形態では、ＣＤ３７結合剤は、１Ｂ１１−２またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、ＣＤ３７結合剤は、１Ｂ１１−２と同じＣＤ３７エピトープに結合する抗体または抗原結合性断片である。一実施形態では、ＣＤ３７結合剤は、１Ｂ１１−２の６つのＣＤＲを含む抗体または抗原結合性断片である。一実施形態では、ＣＤ３７結合剤は、１Ｂ１１−２のＶＨおよびＶＬを含む抗体または抗原結合性断片である。
【０２３３】
一実施形態では、ＣＤ３７特異的抗体またはその抗原結合性断片は、約０．１〜約２０μｇ／ｍＬ、約０．１〜約１５μｇ／ｍＬ、約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、約０．５〜約２０μｇ／ｍＬ、約０．５〜約１５μｇ／ｍＬ、約０．５〜約１０μｇ／ｍＬ、約１〜約２０μｇ／ｍＬ、約１〜約１５μｇ／ｍＬ、約１〜約１０μｇ／ｍＬ、約２〜約２０μｇ／ｍＬ、約２〜約１５μｇ／ｍＬ、または約２〜約１０μｇ／ｍＬの濃度で含まれる。別の実施形態では、ＣＤ３７特異的抗体またはその抗原結合性断片は、約１．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬの濃度で含まれる。別の実施形態では、ＣＤ３７特異的抗体またはその抗原結合性断片は、約２μｇ／ｍＬの濃度で含まれる。別の実施形態では、ＣＤ３７特異的抗体またはその抗原結合性断片は、約１０μｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【０２３４】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約１〜約２０μｇ／ｍＬ、約１〜約１５μｇ／ｍＬ、約１〜約１０μｇ／ｍＬ、約２〜約２０μｇ／ｍＬ、約２〜約１５μｇ／ｍＬ、または約２〜約１０μｇ／ｍＬの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約１．５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約２μｇ／ｍＬの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約２．１μｇ／ｍＬの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約４．２μｇ／ｍＬの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約８．４μｇ／ｍＬの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約１０μｇ／ｍｌの最終濃度を達成するための希釈についての説明書を伴って、濃縮溶液で含まれる。また、キットは、ＣＤ３７発現の検出およびスコア化についての説明書を含み得る。また、キットは、対照または参照サンプルを含み得る。対照または参照サンプルの非限定的な例として、正常（正常対照）または腫瘍（陽性対照）サンプルに由来する細胞ペレットまたは組織培養細胞株が挙げられる。例示的な細胞株は、ＣＤ３７を発現する発現ベクターを安定的にまたは一過性にトランスフェクトした細胞株を含む。追加の例は、実施例で説明する細胞ペレットおよび組織サンプルを含む。陽性細胞株は、Ｄａｕｄｉ細胞（高発現）、Ｒａｍｏｓ細胞（中発現）、およびＮａｍａｌｗａ細胞（中〜低発現）を含む。ヒト扁桃は、胚中心および外套帯が高発現を示し、濾胞間領域が発現を示さないので、陽性および陰性対照組織の両方として働く。一部の実施形態では、対照または参照サンプルは、パラフィン包埋サンプルである。
【０２３５】
一部の実施形態では、キットは、（ａ）ヒトＣＤ３７に対するモノクローナル抗体から構成される捕捉試薬、および（ｂ）これもまたＣＤ３７モノクローナル抗体を含み得るが、またＣＤ３７に結合する検出可能な（標識または非標識）抗体を含んでもよい検出試薬、の基本要素を含む包装された組合せである。これらの基本要素は、本明細書で定義される。
【０２３６】
一実施形態では、キットはさらに、捕捉試薬のための固体支持体を含み、これは別々の要素として提供され得るか、またはこの上に捕捉試薬が既に固定されている。それゆえ、キット中の捕捉抗体は固体支持体上に固定され得るか、またはそれらは、キットと共に含まれるか、もしくはキットとは別々に提供される、かかる支持体上に固定されてもよい。
【０２３７】
一実施形態では、捕捉試薬で、マイクロタイタープレートをコーティングする。検出試薬は、直接検出される標識抗体、または異なる種で生じさせた非標識抗体に対する標識抗体により検出される非標識抗体であってもよい。標識が酵素である場合、キットは通常、酵素が必要とする基質および補因子を、標識が発蛍光団である場合、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を含む。検出試薬が非標識の場合、キットはさらに、例えば蛍光定量的検出形式での、例えば非標識抗体に対する標識抗体など、検出可能な抗体のための検出手段を含み得る。標識が酵素である場合、キットは通常、酵素が必要とする基質および補因子を、標識が発蛍光団である場合、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を、および標識がビオチンである場合、アビジン、例えばアビジン、ストレプトアビジン、またはＭＵＧを用いてＨＲＰもしくはβ−ガラクトシダーゼにコンジュゲートしたストレプトアビジンを含む。
【０２３８】
一実施形態では、捕捉試薬は、ＣＤ３７抗体１Ｂ１１−２、または抗体１Ｂ１１−２の配列を含む抗体である。一実施形態では、検出試薬は、ＣＤ３７抗体１Ｂ１１−２、または抗体１Ｂ１１−２の配列を含む抗体である。別の実施形態では、検出試薬ＣＤ３７抗体１Ｂ１１−２、または抗体１Ｂ１１−２の配列を含む抗体は、ビオチン化される。
【０２３９】
別の実施形態では、キットは、酵素、発蛍光団、放射活性標識、および発光団からなる群から選択される検出試薬をさらに含む。別の実施形態では、検出試薬は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群から選択される。
【０２４０】
また、キットは、アッセイを行うための説明書、および／または抗原標準物質としてのＣＤ３７タンパク質もしくはその断片（例えばＣＤ３７細胞外ドメイン、またはＧＰＩ連結ドメインの全てもしくは一部を有するＣＤ３７細胞外ドメイン）、ならびに他の添加物、例えば安定化剤、洗浄およびインキュベーション緩衝液などを含有し得る。一実施形態では、ＣＤ３７抗原標準物質は、本明細書の実施例で説明するＣＤ３７タンパク質である。また、キットは、ＣＤ３７発現の検出およびスコア化についての説明書を含み得る。
【０２４１】
キットの構成成分は、所定の比で提供してもよく、様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感度を最大限にする、試薬の溶液中の濃度を提供するために好適に変動する。特に、試薬は、賦形剤を含む、通常凍結乾燥されている乾燥粉末として提供してもよく、これは溶解に際して、試験するサンプルと合わせるのに適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。
【０２４２】
また、本明細書で説明する抗体または抗原結合性断片を含む組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、本明細書で説明する抗ＣＤ３７抗体または抗原結合性断片、および緩衝液、例えば検出アッセイ、例えばＩＨＣ、ＥＬＩＳＡ、またはＦＡＣＳで使用され得る緩衝液を含む。かかる緩衝液は当業者に公知であり、希釈液を含む。例として、ＩＨＣ緩衝液は、例えばカゼイン血清もしくはアルブミン（例えばウシ血清、ヤギ血清、またはＢＳＡ）、ＴｗｅｅｎもしくはＴｒｉｔｏｎ、ＰＢＳ、および／もしくはアジ化ナトリウム、またはこれらの任意の組合せを含有し得る。また、ＩＨＣ緩衝液は本明細書で提供され、当業者に公知である。また、ＥＬＩＳＡ緩衝液は、本明細書で提供され、当業者に公知である。ＥＬＩＳＡ緩衝液は、例えば血清もしくはアルブミン（例えばウシ血清、ヤギ血清、またはＢＳＡ）、脱脂粉乳、カゼイン、および／もしくはゼラチン、またはこれらの任意の組合せを含有し得る。ある特定のＦＡＣＳ緩衝液は、本明細書で、例えば実用的実施例で提供される。また、ＦＡＣＳ緩衝液は、例えば血清もしくはアルブミン（例えばウシ血清、ヤギ血清、またはＢＳＡ）、および／またはアジ化ナトリウムを含有し得る。また、ＦＡＣＳ緩衝液は、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および／もしくはＤＮＡ分解酵素、またはこれらの任意の組合せを含有し得る。
【０２４３】
本開示の実施形態はさらに、本開示のある特定の抗体の調製および本開示の抗体を使用するための方法を詳細に説明する、以下の非限定的な実施例を参照することにより定義することができる。材料および方法の両方に対する多くの改変が、本開示の範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者に明らかである。
【実施例】
【０２４４】
ＩＸ．実施例
本明細書で説明する実施例および実施形態は、単に例示の目的のためであること、ならびにこれに照らした様々な改変または変更が当技術分野において示唆され、本出願の趣旨および範囲内に含まれるべきであることが理解される。
（実施例１）
ＣＤ３７ハイブリドーマの生成
【０２４５】
免疫組織化学（ＩＨＣ）染色に好適な抗ヒトＣＤ３７モノクローナル抗体（本開示の抗体）を産生するハイブリドーマを、約４，８００個のハイブリドーマから選択した。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｅ．ｃｏｌｉ．において作製した組換えＣＤ３７抗原ｈＣＤ３７−ＬＥＬで免疫することにより、ハイブリドーマを作製した。この抗原は、精製を容易にするために３’末端に付加された６×Ｈｉｓタグを有する、ＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号１５）を含む。ＣＤ３７組換えタンパク質での免疫化は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）もしくは追加免疫のための不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）またはＭａｇｉｃマウスアジュバント（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に乳化したタンパク質の皮下注射により行った。一般的に、マウスを２週間隔で５回免疫し、その後、融合３日前に、免疫原の腹腔内注射による最終追加免疫を与えた。
【０２４６】
免疫した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス起源の脾臓細胞、およびマウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｐ３細胞）を使用して、全部で５つの独立した融合を行った。ＥＣＭ２００電気融合機（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して標準のプロトコールに従って、細胞融合を行った。各融合は、１，０００個を超えるハイブリドーマを産生した。
【０２４７】
これらのハイブリドーマにより産生された抗体を、ＣＤ３７抗原の様々な組換え変形を使用したＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、確認した。ｈＣＤ３７−ＬＥＬは、精製を容易にするために３’末端に付加された６×Ｈｉｓタグを有する、ヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２４２（配列番号１５）を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ．において作製した。ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡは、精製を容易にするために３’末端に付加されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する、ヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１７）を含み、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において作製した。ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｆｃは、精製を容易にするために３’末端に付加されたマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインを有する、ヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜２３５（配列番号１６）を含み、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において作製した。
【０２４８】
未変性条件については、組換えタンパク質を、５０ｍＭ重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に直接希釈した。変性条件については、組換えタンパク質を、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む１％ＳＤＳ中で６５℃にて３０分間インキュベートし、続いて１００ｍＭヨードアセトアミドと共に室温にて３０分間インキュベートし、その後、５０ｍＭ重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液中に希釈した。各組換えタンパク質を、４℃での一晩のインキュベーションにより、マイクロタイタープレート上に約２５〜１００ｎｇ／ウェルで固定した。
【０２４９】
プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で補完したＰＢＳで１回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補完したＰＢＳでブロックした。プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で補完したＰＢＳで３回洗浄し、ハイブリドーマ上清をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、上記のように３回洗浄し、ＨＲＰ標識したヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：５，０００で希釈した）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、ＨＲＰ基質ＴＭＢ（Ｂｉｏ−ＦＸ）を添加することにより、結合したＨＲＰをコンジュゲートした抗体を検出した。プレートを約１０分間インキュベートし、次いで、発色現像を停止溶液（Ｂｉｏ−ＦＸ）で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マルチプレートリーダーで各プレートについて測定した。クローン１Ｂ１１からのハイブリドーマ上清は、未変性および変性条件の両方について強い陽性ＥＬＩＳＡシグナルをもたらし（図１Ａを参照のこと）、サブクローニングのために選択した。クローン１Ｂ１１から２つのサブクローン：１Ｂ１１−２および１Ｂ１１−２０を得た。両方のサブクローンからのハイブリドーマ上清は、未変性および変性条件の両方について強い陽性ＥＬＩＳＡシグナルをもたらし（図１Ｂを参照のこと）、クローン１Ｂ１１−２をさらなる分析のために選択した。
（実施例２）
ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ３７抗体の特徴付け
【０２５０】
１Ｂ１１−２からの抗体を、標準のプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより販売されている抗ＣＤ３７抗体（製品コードＮＣＬ−ＣＤ３７）を比較のために使用した。抗ＣＤ３７抗体の結合を、抗原として使用される組換えＣＤ３７タンパク質でのＥＬＩＳＡにより調べた。各組換えタンパク質を、上に説明する未変性または変性条件のいずれかを使用して、重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、マイクロタイタープレート上に約２５〜１００ｎｇ／ウェルで固定した。プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で補完したＰＢＳで１回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補完したＰＢＳでブロックした。プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で補完したＰＢＳで３回洗浄し、精製した抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、上記のように３回洗浄し、ＨＲＰ標識したヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：５，０００で希釈した）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、ＨＲＰ基質ＴＭＢ（Ｂｉｏ−ＦＸ）を添加することにより、結合したＨＲＰをコンジュゲートした抗体を検出した。プレートを約１０分間インキュベートし、次いで、発色現像を停止溶液（Ｂｉｏ−ＦＸ）で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マルチプレートリーダーで各プレートについて測定した。未変性ｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡおよびｈＣＤ３７−ＬＥＬへの結合についての代表的な結果を図２に示す。抗体１Ｂ１１−２は、ＮＣＬ−ＣＤ３７と比較して、両方の未変性ＣＤ３７タンパク質に、大いに改善された親和性で結合する。変性ｈＣＤ３７−ＬＥＬタンパク質への結合についての結果を図３に示す。抗体１Ｂ１１−２は、ＮＣＬ−ＣＤ３７と比較して、変性ｈＣＤ３７−ＬＥＬタンパク質に、改善された親和性で結合する。
（実施例３）
抗原エピトープの特徴付け
【０２５１】
抗ＣＤ３７抗体の結合をさらに、上に説明する未変性条件下で、抗原として使用される組換えＣＤ３７タンパク質ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−ＦｃでのＥＬＩＳＡにより調べた（Ｓ２は、アミノ酸１３８〜１７６を含有する、ＣＤ３７の大きな細胞外ドメインの第２のセグメントを指す）。代表的な結果を図４に示す。ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃは、精製を容易にするために３’末端に付加されたマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインを有する、ヒトＣＤ３７のアミノ酸１０７〜１０９および１３８〜２３５（配列番号１８）を含み、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において作製した。抗体１Ｂ１１−２は、ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃに結合しない一方で、ＮＣＬ−ＣＤ３７は、このＣＤ３７タンパク質断片への結合を保持する。同様の結果が、ウェスタンブロット分析で見られた。
（実施例４）
抗ＣＤ３７抗体の免疫組織化学的評価
ＦＦＰＥ  ＣＤ３７  ＩＨＣ
【０２５２】
クローン１Ｂ１１−２からの精製抗体を、ＩＨＣにより、分析し、ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル抗体と比較した。分析は、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｔａｉｎｅｒ、ならびに表１で列挙される試薬および条件を使用して実施した。
【表１】
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【０２５３】
ホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞サンプル、正常組織、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者腫瘍生検、濾胞性リンパ腫患者腫瘍生検、および慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫患者腫瘍生検を含有するスライドを６０℃でベークし、Ｂｏｎｄ  Ｄｅｗａｘ溶液および１００％エタノールを使用して脱蝋した。Ｂｏｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  １（クエン酸緩衝液に基づくｐＨ６．０溶液）を使用した熱誘発エピトープ回復を２０分間実施し、内因性ペルオキシダーゼを過酸化水素で５分間ブロックした。スライドを、様々な濃度のＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．が作製した１Ｂ１１−２抗体、Ｌｅｉｃａ／Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  ＮＣＬ−ＣＤ３７抗体（クローンＣＴ１）、またはＬｅｉｃａ／Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  ｍｕＩｇＧ１対照抗体と共に１５分間インキュベートした。結合した抗体を、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅ検出システムと共にインキュベートすることにより検出した。抗体の適用後、スライドを、一次後試薬（ウサギ抗マウスＩｇＧ）と共に８分間、ポリマー（ヤギ抗ウサギポリマー）と共に８分間、およびＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩）と共に１０分間インキュベートした。これは、茶色シグナルをもたらした。スライドをヘマトキシリンで５分間対比染色した。
【０２５４】
ＦＦＰＥ正常脾臓および扁桃組織サンプルは、以下に概略するように、Ｍｅｒｃｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＡｒｄａｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られたヒト組織ブロックに由来した。ＦＦＰＥ細胞サンプルは、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）により供給されるＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ細胞株に由来し、Ｎａｍａｌｗａ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより供給された。５μｍに設定したミクロトームを使用して、サンプルの切片を含有するスライドを、ＦＦＰＥブロックから調製し、正帯電スライド上に載せた。これらのスライドを一晩空気乾燥し、その後染色した。ヒト正常組織アレイをＰａｎｔｏｍｉｃｓから購入し、非ホジキンリンパ腫組織マイクロアレイをＴｒｉＳｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣから購入した。
【表２】
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【０２５５】
ＣＤ３７染色強度および分布パターンを、対照ＩｇＧ染色（非特異的）に対してスコア化し、１Ｂ１１−２染色を、ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル抗体で観察された染色と比較した。強度を、０〜３のスケールでスコア化し、０＝染色なし、１＝弱い染色、２＝中程度の染色、および３＝強い染色であった。染色の均一性を、陰性（陽性染色を示す細胞がない）、限局性（細胞の２５％未満が染色されている）、不均質（細胞の２５〜７５％が染色されている）、および均質（細胞の７５％より多くが染色されている）としてスコア化した。染色強度およびスコア化スケールを、以下に説明する。全ての染色は、委員会認定病理学者が評価した。
【表３】
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ＦＦＰＥ  ＣＤ３７  ＩＨＣについての精製１Ｂ１１−２抗体の検証
【０２５６】
Ｌｅｉｃａ抗体希釈液（０．３５％  ＰｒｏＣｌｉｎ（商標）９５０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水、界面活性剤、およびタンパク質安定化剤）中に８．４μｇ／ｍＬ、４．２μｇ／ｍＬ、および２．１μｇ／ｍＬで希釈したクローン１Ｂ１１−２からの精製抗体を、ＣＤ３７陽性対照サンプル（ヒト正常扁桃、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、およびＮａｍａｌｗａ細胞）を染色するために使用した。抗体を、ＣＤ３７陽性サンプルにおける容認できる膜染色および特異性により測定される、ＣＤ３７特異性について評価した。また、このクローンを、同じＣＤ３７陽性ヒト組織および細胞を使用して、Ｌｅｉｃａ抗体希釈液中に４．２μｇ／ｍＬで希釈したＮＣＬ−ＣＤ３７マウスｍＡｂ（クローンＣＴ１）と比較した。ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７抗体は、ＣＤ３７陽性細胞ペレットの各々において容認できる膜染色を生じ、扁桃組織の胚中心および外套帯（両方ともＣＤ３７について陽性）においていくらかの低レベル核バックグラウンドを伴って容認できる膜染色を生じ、扁桃の濾胞間領域（ＣＤ３７陰性である）においては染色がなかった。１Ｂ１１−２は、ＣＤ３７陽性サンプルにおいて容認できる膜染色および優れた特異性を示し、核バックグラウンド染色を完全に欠くという追加の利点を有した（ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７マウスｍＡｂと比較した１Ｂ１１−２の画像について図５を参照のこと）。１Ｂ１１−２は、ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル抗体で観察されたパターンと同様のパターンの膜染色を生じたが、この膜染色は、ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７抗体により生じた膜染色より特異的かつより明確にはっきりとしていた。また、１Ｂ１１−２は扁桃の濾胞間領域（ＣＤ３７発現について陰性）では染色を生じなかったことに留意することが重要であり、このことは特異性の増大を示す。１Ｂ１１−２について、４．２μｇ／ｍＬの好適な染色濃度が実験的に決定された。
【０２５７】
また、Ｌｅｉｃａ抗体希釈液中に４．２μｇ／ｍＬで希釈した１Ｂ１１−２を、ヒト正常組織アレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓから購入した）およびヒト扁桃および脾臓組織を染色するために使用して、特異性を評価した。ここでもまた、１Ｂ１１−２を、同じ正常扁桃および脾臓組織ならびにヒト正常組織アレイについて、Ｌｅｉｃａ抗体希釈液中に４．２μｇ／ｍＬで希釈したＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル抗体と比較した。ほとんどの正常組織（扁桃および脾臓を除外する）において、ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル抗体は、散在性リンパ球細胞においてのみ染色を示し、組織の残りの部分は陰性であった。小腸のパネート細胞において、および膵臓の膵島細胞においていくらかの細胞質バックグラウンドの赤みが観察された（図６を参照のこと）。ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７抗体は、いくらかの低レベル核バックグラウンドを伴うにもかかわらず、ヒト正常扁桃の胚中心および外套帯において、ならびにヒト正常脾臓組織の辺縁帯において、容認できる膜染色を生じた。ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７抗体で、扁桃の濾胞間領域において、または脾臓の赤脾髄において染色は存在しなかった。１Ｂ１１−２は、ヒト正常扁桃の胚中心および外套帯において、ならびにヒト正常脾臓組織の辺縁帯において、容認できる膜染色を示し、残りの正常組織においては散在性リンパ球染色のみ、バックグラウンド染色は全くなかった（図６を参照のこと）。また、扁桃の濾胞間領域において、または脾臓の赤脾髄において染色はなかった。これらの結果は、１Ｂ１１−２は、染色感度、特異性、およびバックグラウンドの低減の点で有利であることを示し、これらの全ては、ＩＨＣアッセイの高品質の性能および分析に重要である。
（実施例５）
ヒト腫瘍サンプルを使用した１Ｂ１１−２  ＣＤ３７抗体のＩＨＣ評価
【０２５８】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｎ＝５２）、濾胞性リンパ腫（ｎ＝２０）、および慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ｎ＝８）を代表するヒト腫瘍サンプル（全て、ＴｒｉＳｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣから購入した非ホジキンリンパ腫組織マイクロアレイに含まれていた）を、１Ｂ１１−２抗体を使用したＩＨＣによりＣＤ３７発現について評価した。ＣＤ３７染色強度およびスコア分布を、以下の表４に要約する。図７は、１Ｂ１１−２抗体での、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫組織の染色の例を示す。これらの結果は、非ホジキンリンパ腫患者組織におけるＣＤ３７発現を評価するためのＩＨＣアッセイにおける使用のための、より特異的かつ高感度の抗体としての１Ｂ１１−２の利点を示す。
【表４】
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【０２５９】
１Ｂ１１−２抗体およびＮＣＬ−ＣＤ３７マウスモノクローナル（Ｌｅｉｃａ）抗体を、非ホジキンリンパ腫組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（ＴｒｉＳｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣから購入した）を使用して比較した。ＩＨＣアッセイ（ＣＤ３７アッセイ）においてＮＣＬ−ＣＤ３７抗体を使用して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫サンプルの２７％（５２個のうちの１４個）、濾胞性リンパ腫サンプルの８５％（２０個のうちの１７個）、および慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫サンプルの３７％（８個のうちの３個）は、最も高いカテゴリー（少なくとも２５％の腫瘍細胞でレベル３の染色強度、表５）にスコア化された。対照的に、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｘ自動スライド染色器上でＬｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅ検出キットを利用した、上に説明するＩＨＣアッセイにおける１Ｂ１１−２抗体は、増大した感度および特異性を有する染色を生じ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫サンプルの５９％（５２個のうちの３１個）、濾胞性リンパ腫サンプルの９５％（２０個のうちの１９個）、および慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫サンプルの１００％（８個のうちの８個）は、最も高いカテゴリー（少なくとも２５％の腫瘍細胞でレベル３の染色強度、表５）にスコア化される染色を生じた。また、１Ｂ１１−２抗体は、３個のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫サンプルにおいて低レベルのＣＤ３７発現を検出することができ、一方で、ＬｅｉｃａのＮＣＬ−ＣＤ３７抗体は、この低レベルの発現を検出することができなかった。これらの結果は、１Ｂ１１−２が、染色感度および特異性の点で有利であり、より大きなダイナミックレンジのＣＤ３７染色を生じることを示す。
【表５】
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（実施例６）
ドメインマッピング
変性ＳＤＳ  ＰＡＧＥウェスタンブロッティングによるドメインマッピング
【０２６０】
Ｆｃ融合ＣＤ３７−ＥＣＤの様々な調製物を認識する能力を、１Ｂ１１−２（左パネル）について、市販されている抗ＣＤ３７抗体（Ｌｅｉｃａ、右パネル）と直接比較して、変性ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続くウェスタンブロッティングで試験した。Ｆｃ融合ＣＤ３７−ＥＣＤ調製物を、７０ｍＭ  β−メルカプト−エタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中での１００℃で１０分間のインキュベーションにより変性させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、続いてＰＶＤＦ膜に電気泳動移行させた。膜を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂乳により、室温で１時間ブロックした。一次抗体を一晩適用し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗マウスＦ（ａｂ）２で室温にて１時間検出した。ブロットを、標準の手順に従って強化化学発光検出を使用して現像した。結果を図８に示す。Ｌｅｉｃａ抗体は全ての３つのＦｃ−ＣＤ３７  ＥＣＤ調製物を認識するが、本発明の１Ｂ１１−２抗体は、ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−ＦｃおよびｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡのみを認識し、ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃは認識しなかった。ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃ構築物は、ＣＤ３７  ＥＣＤのＳ１セグメント（アミノ酸１１０〜１３７）を欠いている。したがって、アミノ酸１１０〜１３７の領域は、１Ｂ１１−２によるエピトープ認識に重要であるが、Ｌｅｉｃａ抗体による認識には重要ではない。
未変性ＰＡＧＥウェスタンブロッティングによるドメインマッピング
【０２６１】
Ｆｃ融合ＣＤ３７−ＥＣＤの様々な調製物を認識する能力を、１Ｂ１１−２について、未変性ＰＡＧＥ、続くウェスタンブロッティングで試験した。Ｆｃ融合ＣＤ３７−ＥＣＤ調製物を、ＮａｔｉｖｅＰａｇｅサンプル緩衝液に入れロードし、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、続いてＰＶＤＦ膜に電気泳動移行させるか、またはクーマシーブリリアントブルーでゲル染色した。ＰＶＤＦ膜を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂乳により、室温で１時間ブロックした。一次抗体を一晩適用し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗マウスＦ（ａｂ）２で室温にて１時間検出した。ブロットを、標準の手順に従って強化化学発光検出を使用して現像した。結果を図９に示す。変性ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（図８）およびＥＬＩＳＡ実験（図４を参照のこと）からのデータと一致して、本発明の１Ｂ１１−２抗体は、ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−ＦｃおよびｈＣＤ３７−Ｆｃ−ＬＡＧＡのみを認識し、ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃは認識しなかった。これらのデータは、ＣＤ３７  ＥＣＤのＳ１セグメント（アミノ酸１１０〜１３７）またはその一部は、１Ｂ１１−２によるエピトープ認識に重要であることを示す（図９の左パネル）。クーマシーブリリアントブルーゲル染色（図９の右パネル）は、ｈＣＤ３７−ＥＣＤ−Ｓ２−Ｆｃタンパク質が１Ｂ１１−２による検出に十分な量で存在していたことを示す。
（実施例７）
抗ヒトＣＤ３７抗体のＶＬおよびＶＨ領域のクローニングおよび配列決定
【０２６２】
ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用して製造業者のプロトコールに従って、５×１０６細胞の上に説明する抗ヒトＣＤ３７ハイブリドーマ１Ｂ１１−２から、全細胞ＲＮＡを調製した。次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡからファーストストランドｃＤＮＡを合成した。
【０２６３】
ハイブリドーマ細胞に由来する抗体可変領域ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ手順は、Wangら（（２０００年）J  Immunol  Methods.２３３巻：１６７〜７７頁）、およびCoら（（１９９２年）J  Immunol.１４８巻：１１４９〜５４頁）で説明されている方法に基づいた。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）配列を、５’末端上の縮重プライマー、および３’末端上のマウスカッパーまたはＩｇＧ１定常領域のいずれかに特異的なプライマーにより増幅した。次いで、ＰＣＲ反応を１％低融点アガロースゲルで泳動させ、続いて３００〜４００ｂｐアンプリコンバンドを切り出し、これらを続いてＺｙｍｏ  ＤＮＡミニカラムを使用して精製した。精製アンプリコンを、両方向から可変領域ｃＤＮＡ配列を生成するために、ＰＣＲ反応の同じ５’および３’プライマーを利用した配列決定のためにＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓに送った。
【０２６４】
ＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用した縮重プライマーは、５’末端を変えるので、完全な可変領域ｃＤＮＡ配列を確証するために追加の配列決定を試みる必要があった。予備的な配列をＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）の検索クエリーに入力して、抗体配列が由来したマウス生殖細胞系配列を同定した。次いで、ＰＣＲプライマーをマウス抗体の生殖細胞系関連リーダー配列にアニールするように設計し、そのため、この新しいＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマーにより変更されていない完全な可変領域ｃＤＮＡ配列を生成し得る。ＰＣＲ反応、バンド精製、および配列決定は、上に説明するように実施した。
【０２６５】
抗ヒトＣＤ３７抗体について得られた可変領域ｃＤＮＡ配列を、生殖細胞系定常領域配列と組み合わせて、全長抗体ｃＤＮＡ配列を得た。次いで、重鎖および軽鎖の分子量を、ｃＤＮＡ配列の翻訳から計算し、精製マウス抗ヒトＣＤ３７抗体のＬＣ／ＭＳ分析により得られた分子量と比較した。マウス１Ｂ１１−２軽鎖および重鎖について観察された分子量は、予測した値と適合し、ｃＤＮＡ配列が正確であることを確認した。
【０２６６】
ＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を、それぞれ、表１および２に示す。ＶＨおよびＶＬ配列を、それぞれ、表３および４に示す。全長重鎖および軽鎖配列を、それぞれ、表５および６に示す。ＶＨおよびＶＬのポリヌクレオチド配列を、表８に示す。
【０２６７】
本明細書で引用する全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の両方を含む）は、各個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、または受託番号／データベース配列が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、全ての目的についてそれらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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