(57)【要約】本発明は、一般に、ＨＩＶの治療または予防のための免疫化および免疫療法に関する。特に、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の濃縮に関する。ある特定の実施形態では、開示される組成物および方法は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞をさらに増強するための療法を組み込むことができる。療法的免疫化戦略および方法、ならびに非常に有効な療法用レンチウイルス、およびＨＩＶを阻害し、特定の標的の発現を減少または変化させることができる他のベクターが、本明細書において開示される。
2018524335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染を治療する方法であって、
（ａ）ＨＩＶ感染の治療を必要とする対象を識別するステップ；
（ｂ）ＨＩＶワクチンの治療有効量で前記対象を免疫化するステップ；
（ｃ）前記対象からリンパ球を取り出し、そして末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップ；
（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、前記ＰＢＭＣを治療有効量のＨＩＶワクチンと接触させるステップ；
（ｅ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムを前記ＰＢＭＣに形質導入するステップ；
（ｆ）前記形質導入されたＰＢＭＣを約１〜約３５日間培養するステップ；および
（ｇ）前記形質導入されたＰＢＭＣを前記対象に注入するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）が同じＨＩＶワクチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）が異なるＨＩＶワクチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記形質導入されたＰＢＭＣを前記対象に注入する前に、前記対象がｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていた、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記形質導入されたＰＢＭＣを前記対象に注入する前に、前記対象がシクロホスファミド前治療を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とする前記スモールＲＮＡ分子が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、またはＩＮＳを対象とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記形質導入されたＰＢＭＣが前記対象に注入される前に、前記形質導入されたＰＢＭＣが約１〜約１０日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードする、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞に形質導入するためのウイルスベクター。
【請求項１０】
レンチウイルスである、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
ベクター内ベクターシステム（vector-in-vector system）である、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とする前記スモールＲＮＡ分子が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、またはＩＮＳを対象とする、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の数を決定するステップを含む、ＨＩＶ＋対象が機能的に治癒しているか否かを決定するためのバイオアッセイであって、前記療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の数が、請求項１に記載の治療の後の特定の時間後に閾値を上回る場合に、前記対象が機能的に治癒している、バイオアッセイ。
【請求項１４】
前記閾値が、約１×１０８個の、療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療の後の特定の前記時間が約３０〜約６０日間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療の後の特定の前記時間が約１２〜約２６週間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＩＶ＋対象におけるＨＩＶの機能的治癒を達成する方法であって、
（ａ）ＨＩＶ＋である対象を識別するステップ；
（ｂ）ＨＩＶワクチンの治療有効量で前記対象を免疫化するステップ；
（ｃ）前記対象からリンパ球を取り出し、そして末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップ；
（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、前記ＰＢＭＣを治療有効量のＨＩＶワクチンと接触させるステップ；
（ｅ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムを用いて前記ＰＢＭＣに形質導入するステップ；
（ｆ）前記形質導入されたＰＢＭＣを、約１〜約２１日間、培養するステップ；および
（ｇ）前記形質導入されたＰＢＭＣを前記対象に注入するステップであって、前記ＨＩＶ＋対象は機能的治癒を達成する、ステップ
を含む方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）が、同じＨＩＶワクチンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）が、異なるＨＩＶワクチンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記形質導入されたＰＢＭＣを前記対象に注入する前に、前記対象がｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていた、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記形質導入されたＰＢＭＣを前記対象に注入する前に、前記対象がシクロホスファミド前治療を受ける、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とする前記スモールＲＮＡ分子が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、またはＩＮＳを対象とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記形質導入されたＰＢＭＣが前記対象に注入される前に、前記形質導入されたＰＢＭＣが約１〜約７日間、培養される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年７月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１９０，１３９号に基づく優先権の利益を主張しており、その開示は詳細に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ＨＩＶの治療および予防のための免疫化および免疫療法の分野に関する。特に、開示された治療および予防の方法は、ウイルスベクターの投与ならびに遺伝子および他の療法用または診断用組成物の送達のためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗レトロウイルス併用療法（Combination antiretroviraltherapy；ｃＡＲＴ）（高活性抗レトロウイルス療法（Highly ActiveAntiretroviral Therapy）またはＨＡＡＲＴとしても公知である）は、ＨＩＶ−１複製を制限し、疾患の進行を遅らせるが、薬物毒性および薬剤耐性ウイルスの出現は、ＨＩＶ感染者における長期間制御に対する課題である。さらに、伝統的な抗レトロウイルス療法は、ＡＩＤＳの発症または死亡を遅らせることに成功しているが、機能的治癒法を提供するには至っていない。代替的な治療戦略が明らかに必要である。
【０００４】
ＨＩＶ複製を制限するために、通常は不十分ではあるが、免疫システムが主要な役割を有することを示す新たなデータによって、ＨＩＶ感染に対する免疫療法への強い関心が誘起されてきている。細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）機能の維持に重要なウイルス特異的Ｔヘルパー細胞が、役割を有すると思われる。ウイルス血症もまた中和抗体の影響を受けるが、ＨＩＶ感染においては一般的に規模が小さく、ｉｎ  ｖｉｖｏで進化するウイルス変異体に追いつかない。
【０００５】
これらのデータは、まとめると、ＨＩＶ特異的細胞性免疫応答の強度および幅の増加が、いわゆるＨＩＶ免疫療法を介して臨床的利益をもたらし得ることを示している。ＨＩＶに対するワクチンを試験する研究はいくつかあったが、現在までのところ成功は限定的である。さらに、遺伝子治療技術を利用することによってＨＩＶ免疫療法を増強する関心はこれまであったが、他の免疫療法アプローチと同様に、成功は限定的である。ＨＩＶ特異的免疫療法または遺伝子治療を行うそのような方法の１つとして、特別に設計されたウイルスベクターによるものがあり得る。
【０００６】
特定のウイルスエンベロープ−宿主細胞受容体相互作用および遺伝子発現についてのウイルス機構の故に、標的細胞に遺伝子を形質導入するためにウイルスベクターを使用することができる。結果として、ウイルスベクターは、全Ｔ細胞または他の免疫細胞ならびに胚、受精卵、単離された組織試料、ｉｎ  ｓｉｔｕの組織標的、および培養細胞を含む多くの異なる細胞型への遺伝子の移入のためのビヒクルとして使用されてきている。細胞内に外来遺伝子または改変遺伝子を導入および発現する能力は、遺伝子治療、誘導多能性幹細胞の体細胞再プログラミング、および様々な型の免疫療法のような療法介入に有用である。
【０００７】
遺伝子治療は、ウイルスベクターの使用を含み得る新しい療法を創造する可能性を有する生物医学研究の最も成熟した領域の１つである。療法に利用可能な幅広い種類の潜在的な遺伝子を考慮すると、感染性疾患および非感染性疾患を治療する手段としての遺伝子治療の将来性を実現するためには、これらの遺伝子を送達する効率的な手段が必要である。マウスレトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルス）、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスを含むいくつかのウイルスシステムが療法用遺伝子移入ベクターとして開発されている。
【０００８】
組織指向性、ウイルス調製物の安定性、発現の安定性および制御、ゲノムパッケージング能力、および構築物依存性ベクター安定性を含む、ウイルスベクターを開発する際に考慮しなければならない多くの因子がある。さらに、ウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ応用は、ウイルス構造タンパク質および／または形質導入遺伝子産物に対する宿主免疫応答によってしばしば制限される。
【０００９】
したがって、毒性および安全性は、対象の治療のためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるウイルスベクターにとって克服されなければならない重要なハードルである。遺伝子送達ビヒクルまたは療法用遺伝子産物に対する宿主免疫応答に関連する問題を抱えた、ヒトにおける遺伝子治療応用の数多くの歴史的例が存在する。１つまたは複数の療法遺伝子と共にいくつかのウイルス遺伝子を同時形質導入するウイルスベクター（例えばアデノウイルス）は特に問題である。
【００１０】
レンチウイルスベクターは一般に細胞傷害性を誘導せず、強力な宿主免疫応答を誘発しないが、いくつかの免疫刺激遺伝子産物を有するＨＩＶ−１のようないくつかのレンチウイルスベクターは、細胞毒性を引き起こし、ｉｎ  ｖｉｖｏで強い免疫応答を誘導する可能性がある。しかしながら、これは、形質導入後に複数のウイルス遺伝子をコードしないレンチウイルス由来の形質導入ベクターにとっては問題ではないかもしれない。もちろん、臨床的に有用な免疫応答を引き起こすであろうタンパク質をコードすることがベクターの目的であることもあるので、このことが必ずしも当てはまるわけではないだろう。
【００１１】
レンチウイルスベクターの使用に関する他の重要な問題は、いくつかの細胞傷害性ウイルスタンパク質への曝露の際に起こり得る細胞病原性の問題である。特定のＨＩＶ−１タンパク質への曝露は、細胞死またはＴ細胞における機能不応答性を誘導するかもしれない。同様に、組換えによる複製コンピテントな毒性ウイルスを生成する可能性が、しばしば問題となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
明らかに、ＨＩＶの治療の改善が必要とされており、本発明はこの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
療法的免疫化戦略および方法、ならびに非常に有効な療法用レンチウイルス、およびＨＩＶを阻害し、特定の標的の発現を減少または変化させることができる他のベクターが、本明細書において開示される。開示された発明の方法および組成物は、ＨＩＶの機能的治癒を達成するために有用である。より具体的には、本発明には、患者の療法的免疫化、患者のＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激、濃縮されたＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏレンチウイルス形質導入、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養、および濃縮された遺伝子改変細胞の再注入を最適に組み合わせたＨＩＶの機能的治癒のための方法が含まれる。さらに、本発明には、治療効力を測定するためのバイオアッセイ、療法薬投与の連続的変化、ＨＡＡＲＴの離脱後のモニタリング期間、および機能的ＨＩＶ治癒の診断の方法が含まれる。
【００１４】
一態様では、開示される発明は、ＨＩＶ感染を治療する方法であって、（ａ）ＨＩＶ感染の治療を必要とする対象を識別するステップ；（ｂ）ＨＩＶワクチンの治療有効量で対象を免疫化するステップ；（ｃ）対象からリンパ球を取り出し、そして末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells；ＰＢＭＣ）を精製するステップ；（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＢＭＣを治療有効量のＨＩＶワクチン（ステップ（ｂ）で使用したＨＩＶワクチンと同じであっても異なっていてもよい）で接触させるステップ；（ｅ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムを用いてＰＢＭＣに形質導入するステップ；（ｆ）形質導入されたＰＢＭＣを約１〜約２１または約３５日間（または、例えば約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５日のような、これらのパラメーターの間の任意の時間枠）まで、培養するステップ、および（ｇ）形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入するステップを含む方法に関する。
【００１５】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）は同じＨＩＶワクチンを利用する一方で、他の実施形態では、ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）は異なるＨＩＶワクチンを利用する。一部の実施形態では、患者は、ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）を必要としないことがある。したがって、一部の実施形態では、開示された方法は、ステップ（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）、またはそれらのいくつかの組合せのみを含み得る。
【００１６】
一部の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入する前に、対象はｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていた。一部の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入する前に、対象はシクロホスファミド前治療を受けている。
【００１７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、またはＩＮＳを対象とする。
【００１８】
一部の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入する前に、形質導入されたＰＢＭＣは、約１〜約７または約１０日間（または、例えば約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０日間のような、これらのパラメーターの間の任意の時間枠）まで培養される。
【００１９】
別の態様では、開示される発明は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞に形質導入するためのウイルスベクターに関するものであり、ここで、ウイルスベクターは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするものである。
【００２０】
一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスであるが、他の実施形態では、ベクターはＤＮＡプラスミド、アデノ随伴ウイルス、または遺伝子送達のための他の組み込みまたは非組み込みベクターシステムである。
【００２１】
一部の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、またはＩＮＳを対象とする。
【００２２】
別の態様では、開示される発明は、ＨＩＶ＋対象が機能的に治癒しているか否かを決定するためのバイオアッセイに関する。そのようなバイオアッセイには、療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の数を決定するステップが含まれ、療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の数が、開示された方法に従った治療後の特定の時間後に閾値を上回る場合に、対象は機能的に治癒している。
【００２３】
一部の実施形態では、閾値は、約１×１０８個の、療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞であるが、閾値はこの値より高くまたは低く決定されてもよい。
【００２４】
一部の実施形態では、治療後の特定の時間は約３０〜約６０日（またはこれら２つの値の間の任意の時間枠）であり、他の実施形態では、治療後の特定の時間は約１２〜約２６週間（またはこれらの２つの値の間の任意の時間枠）である。
【００２５】
さらに別の態様では、開示された発明は、ＨＩＶ＋対象におけるＨＩＶの機能的治癒を達成する方法に関する。方法は：（ａ）ＨＩＶ＋である対象を識別するステップ；（ｂ）ＨＩＶワクチンの治療有効量で対象を免疫化するステップ；（ｃ）対象からリンパ球を取り出し、そして末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップ；（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＢＭＣを治療有効量のＨＩＶワクチンと接触させるステップ；（ｅ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達システムを用いてＰＢＭＣに形質導入するステップ；（ｆ）形質導入されたＰＢＭＣを、約１〜約２１日または３５日間まで（またはこれらの値の間の任意の時間枠）培養するステップ；および（ｇ）形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入するステップであって、ＨＩＶ＋対象は機能的治癒を達成する、ステップを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）は同じＨＩＶワクチンを含む一方で、他の実施形態では、ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）は異なるＨＩＶワクチンを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、対象は、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入する前に、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていた。一部の実施形態では、対象は、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入する前に、Ｔ細胞生着を改善するために、シクロホスファミド前治療または代替条件付け療法を受ける。
【００２８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、またはＩＮＳを対象とする。
【００２９】
一部の実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入する前に、形質導入されたＰＢＭＣを約１〜約７または約１２日間まで（または、これらの２つの値の間の任意の時間枠、または本明細書に記載の他の期間）培養する。
【００３０】
前述の一般的な記載ならびに以下の図面の簡単な説明および発明を実施するための形態は、例示的かつ説明的であり、特許請求する本発明のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、および新規な特徴は、以下の図面の簡単な説明および発明を実施するための形態から当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ワクチン接種、ＰＢＭＣおよびＣＤ４  Ｔ細胞を得るための細胞収集、成長サイトカイン（インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−６、インターロイキン−７およびインターロイキン−２３を含むが、これらに限定されない）の支援の存在下でのワクチン免疫原ならびに／またはＣＤ３／ＣＤ２８刺激および／もしくは分裂促進因子刺激を用いて刺激した後のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞培養物、抗ＨＩＶ遺伝子構築物を送達するためのレンチウイルス形質導入、形質導入された細胞の短期間培養、および元の対象へ注入し戻すことを取り込んだ、可能な臨床療法のフローチャート図を示す。
【００３２】
【図２】図２は、遺伝子治療を使用してどのようにＣＤ４  Ｔ細胞が変化して、他の細胞が感染するのを防ぐか、またはウイルス複製を防ぐかを示す。
【００３３】
【図３】図３は、例示的な療法用レンチウイルス構築物の概略を示す。療法用レンチウイルス構築物は、プロモーター領域、調節ＲＮＡの標的化、および調節ＲＮＡの型に対して代替配列を置換し得る。さらに、レンチウイルス粒子をパッケージングするために使用されるプラスミドは、生産の要求に応じて変更することができる。
【００３４】
【図４】図４は、例示的なベクター配列を示す。プロモーターおよびｍｉＲクラスターのポジティブ（ゲノム）鎖配列は、ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ株の拡散を阻害するために開発された。下線で示されていない配列は、このｍｉＲクラスターのために最良に選択された転写のＥＦ−１アルファプロモーターを含む。下線で示した配列は、ｍｉＲ３０  ＣＣＲ５（ＣＣＲ５  ｍＲＮＡにリダイレクトする天然のヒトｍｉＲ３０の改変）、ｍｉＲ２１  Ｖｉｆ（Ｖｉｆ  ＲＮＡ配列へのリダイレクト）およびｍｉＲ１８５  Ｔａｔ（Ｔａｔ  ＲＮＡ配列へのリダイレクト）からなるｍｉＲクラスターを示す。下線で示されていない、より小さなフォントの配列は、各々のｍｉＲＮＡ構築物についてのオリゴヌクレオチドプライマーに組み込まれた制限エンドヌクレアーゼ切断部位である。
【００３５】
【図５】図５は、実験ベクターによるＣＣＲ５のノックダウンが、ＡＧＴｃ１２０細胞におけるＲ５指向性ＨＩＶ感染を防ぐことを示す。パネル（Ａ）は、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを含むか、または含まないＡＧＴｃ１２０細胞におけるＣＣＲ５発現を示す。パネル（Ｂ）は、ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現していたＨＩＶ  ＢａＬウイルスストックによる感染に対する形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞の感受性を示す。
【００３６】
【図６】図６は、ＡＧＴ１０３が、ＨＩＶ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞内のＴａｔタンパク質発現の発現を減少させることを示す。
【００３７】
【図７】図７は、ＡＧＴ１０３が、全長ＨＩＶ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞内のＶｉｆタンパク質発現のレベルを減少させることを示す。細胞は非処理であるか（左レーンおよび中央レーン）またはＡＧＴ１０３を用いて形質導入した（左レーン）ものである。
【００３８】
【図８ＡＢ】図８は、ＨＩＶ特異的ＡＧＴ１０３形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞について高度に濃縮したＣＤ４＋  Ｔ細胞集団の生成を示す。パネル（Ａ）は、ＨＩＶに対する療法ワクチン接種がＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布に最小限の影響しか及ぼさないことを示す。重要なＣＤ４  Ｔ細胞集団は、これらの分析フローサイトメトリードットプロットの左上四分儀に示され、ワクチン接種系列の後、全Ｔ細胞の５２％から５７％に変化する。これらは代表的なデータである。パネル（Ｂ）は、＋／−インターロイキン−２／インターロイキン−１２または＋／−インターロイキン−７／インターロイキン−１５培地内で１２日間培養されたＨＩＶ療法ワクチン試験の参加者からの末梢血単核細胞のＣＤ３＋集団におけるＣＤ４およびＣＤ８の発現を示す。ＨＩＶ−１の全ｐ５５  Ｇａｇタンパク質（ＪＰＴ  ＰｅｐＭｉｘ）をＴ細胞刺激のためのエピトープペプチドの供給源として代表する重複ペプチドで、いくつかの培養物を刺激した。パネル（Ｃ）は、ＰｅｐＭｉｘおよびインターロイキン−２／インターロイキン−１２の組合せが、抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の最適な増殖をもたらすことを示す。上のパネルは、ＰｅｐＭｉｘに曝露されたワクチン接種後の検体におけるサイトカイン（インターフェロン−ガンマ）分泌細胞の増加を示す。パネル（Ｄ）は、ＨＩＶのための機能的治癒の一部として患者に注入するためのＨＩＶ特異的およびＨＩＶ耐性ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞を産生することができる抗原増殖したＣＤ４  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３形質導入を示す。上のパネルは、培養物中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団を分析した結果を含む。ｘ軸は、個々の細胞にＡＧＴ１０３が形質導入されたことを示す緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発光である。
【図８ＣＤ】図８は、ＨＩＶ特異的ＡＧＴ１０３形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞について高度に濃縮したＣＤ４＋  Ｔ細胞集団の生成を示す。パネル（Ａ）は、ＨＩＶに対する療法ワクチン接種がＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布に最小限の影響しか及ぼさないことを示す。重要なＣＤ４  Ｔ細胞集団は、これらの分析フローサイトメトリードットプロットの左上四分儀に示され、ワクチン接種系列の後、全Ｔ細胞の５２％から５７％に変化する。これらは代表的なデータである。パネル（Ｂ）は、＋／−インターロイキン−２／インターロイキン−１２または＋／−インターロイキン−７／インターロイキン−１５培地内で１２日間培養されたＨＩＶ療法ワクチン試験の参加者からの末梢血単核細胞のＣＤ３＋集団におけるＣＤ４およびＣＤ８の発現を示す。ＨＩＶ−１の全ｐ５５  Ｇａｇタンパク質（ＪＰＴ  ＰｅｐＭｉｘ）をＴ細胞刺激のためのエピトープペプチドの供給源として代表する重複ペプチドで、いくつかの培養物を刺激した。パネル（Ｃ）は、ＰｅｐＭｉｘおよびインターロイキン−２／インターロイキン−１２の組合せが、抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の最適な増殖をもたらすことを示す。上のパネルは、ＰｅｐＭｉｘに曝露されたワクチン接種後の検体におけるサイトカイン（インターフェロン−ガンマ）分泌細胞の増加を示す。パネル（Ｄ）は、ＨＩＶのための機能的治癒の一部として患者に注入するためのＨＩＶ特異的およびＨＩＶ耐性ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞を産生することができる抗原増殖したＣＤ４  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３形質導入を示す。上のパネルは、培養物中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団を分析した結果を含む。ｘ軸は、個々の細胞にＡＧＴ１０３が形質導入されたことを示す緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発光である。
【００３９】
【図９−１】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−２】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−３】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−４】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−５】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−６】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−７】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【図９−８】図９は、開示されたベクターに組み込まれてもよいＨＩＶ複製を制限することが公知である様々な例示的な細胞エレメントの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
好適な実施形態の詳細な説明
機能的治癒を達成するためにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患を治療および／または予防するための方法および組成物が、本明細書において開示される。機能的治癒は、ｃＡＲＴの必要性を低減または排除し、補助療法の支援を必要とする場合としない場合がある、開示された治療および方法から生じる状態として定義される。本発明の方法には、以下に記載されるレンチウイルス、非組み込みレンチウイルス、および関連ウイルスベクター技術を組み込むことによる遺伝子送達が含まれる。
【００４１】
療法用ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、免疫療法、およびＨＩＶ感染のための機能的治癒を達成するための戦略におけるそれらの使用の方法が、本明細書において開示される。一般的な戦略は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の画分を濃縮する目的で、ＨＡＡＲＴの毎日の投与によるウイルス血症の安定な抑制を有するＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶに対する強力な免疫応答を生成することを意図したワクチンによる最初の療法的免疫を含むことができる。（１）末梢白血球を白血球アフェレーシスによって単離するか、またはＰＢＭＣを静脈血から精製するステップ、（２）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＨＩＶワクチンタンパク質でＣＤ４  Ｔ細胞を再刺激するステップ、（３）療法用レンチウイルス形質導入、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞培養を行うステップ、および（４）元のドナーへ再注入し戻すステップが、これに続く。
【００４２】
主に、防御的遺伝子改変を有する十分な数のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を得ることができなかったために、ＨＩＶの治癒を達成するためのこれまでの努力が及ばなかった。この値が臨界閾値を下回ると、抗レトロウイルス療法を取り辞めることによりＨＩＶ再発が招かれ、続いてＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が急速に破壊され、その後も以前の遺伝子治療にもかかわらず疾患の進行の再開となる。本明細書に記載の戦略における療法的免疫化を使用し、ＨＩＶを阻害することができる非常に有効な療法用レンチウイルスを提供することにより、ＨＩＶの機能的治癒を達成するための新たな戦略が開発された。
【００４３】
レンチウイルスベクターおよび非組み込み、エピソーム性複製ウイルスベクターを含む、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を増強するための新規なウイルスベクターならびにそれらを使用する方法もまた、本明細書において開示される。本発明のようなエピソーム性複製ベクターは、パポバウイルス科（例えばウシパピローマウイルスまたはＢＰＶ）またはヘルペスウイルス科（例えばエプスタインバールウイルス（Epstein Barr Virus）またはＥＢＶ）またはヘパドナウイルス科（例えばＢ型肝炎ウイルスまたはＨＢＶ）のようなウイルス由来のウイルス成分を含むことができる。これらのウイルス由来のエピソーム性複製ベクターは、複製オリジンおよび少なくとも１つのウイルストランス作用因子、例えば、ＢＰＶの場合はＥ１、ＥＢＶの場合はＥＢＮＡ−１もしくはＨＢＶポリメラーゼのような開始タンパク質、またはアデノウイルスの末端結合タンパク質を含むことができる。エピソーム複製のプロセスは、典型的には、宿主細胞複製機構およびウイルストランス作用因子の両方を組み込む。
Ｉ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
【００４４】
ＨＩＶは、ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレトロウイルスである。ＡＩＤＳは、免疫システムの進行性の不全により、生命を脅かす日和見感染症およびがんが猛威を振るう状態である。治療なくしては、ＨＩＶ感染後の平均生存期間は、ＨＩＶサブタイプに依存して９〜１１年と推測される。ＨＩＶ感染は、血液、精液、膣液、前射精液、唾液、涙液、リンパ液もしくは脳脊髄液、または母乳を含むがそれらに限定されない体液の移入によって起きる。ＨＩＶは、感染した個体内に、遊離ウイルス粒子および感染した免疫細胞内の両方として、存在し得る。
【００４５】
ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞のようなヒト免疫システムの生体細胞に感染するが、指向性はＨＩＶサブタイプ内で様々である可能性がある。ＨＩＶ感染に特異的に感受性であり得る免疫細胞には、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ感染は、未感染バイスタンダー細胞のアポトーシス、感染細胞の直接的なウイルス死滅、および感染細胞を認識するＣＤ８細胞傷害性リンパ球による感染ＣＤ４＋  Ｔ細胞の死滅を含むが、これに限定されない数多くのメカニズムにより、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベルの低下をもたらす。ＣＤ４＋  Ｔ細胞数が臨界レベル以下に低下すると、細胞性免疫が失われ、身体が日和見感染症およびがんに、進行性で、より感受性となる。
【００４６】
構造的に、ＨＩＶは他の多くのレトロウイルスとは異なる。ＲＮＡゲノムは、１９個のタンパク質をコードする、少なくとも７つの構造的ランドマーク（ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳ）および少なくとも９つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、時にはｔａｔ、ｅｎｖ、およびｒｅｖの融合物である１０番目のｔｅｖ）からなる。これらの遺伝子の３つのｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖには、新しいウイルス粒子の構造タンパク質を作るために必要な情報が含まれている。
【００４７】
ＨＩＶは主にＣＤ４  Ｔ細胞において複製し、宿主免疫を低下させる細胞破壊または調節不全を引き起こす。ＨＩＶは、統合プロウイルスとして感染を確立し、特定の細胞におけるウイルス発現が、その細胞に影響を及ぼす細胞病理のレベルまたは宿主免疫システムによる検出のレベル以下にまで低下する、潜伏感染状態に移行する可能性があるため、ＨＩＶは治療が困難であり、長期間の高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の後でさえも根絶されていない。生存期間はＨＡＡＲＴによって延長される可能性があるが、ほとんどの場合、ＨＩＶ感染は致命的な疾患を引き起こす。
【００４８】
ＨＩＶとの戦いにおける主な目標は、疾患を治癒するための戦略を開発することである。延長されたＨＡＡＲＴはこの目標の達成には至っていないので、研究者は代替手順に目を向けている。（感染が起きた後にワクチンを使用する）療法的免疫化による宿主免疫を改善するための初期の努力は、わずかな程度であるかまたはインパクトがなかった。同様に、治療の強化は中程度のインパクトであるかまたはインパクトがなかった。
【００４９】
遺伝子治療を用いることで、いくらかの進歩がみられたが、ポジティブな結果は孤発性であり、宿主細胞のウイルス浸透に重要な役割を果たすＣＣＲ５（ケモカイン受容体）をコードする遺伝子の１つまたは両方の対立遺伝子に欠損を有するまれなヒトの間でのみ見出された。しかしながら、多くの研究者は、遺伝子治療が最終的にＨＩＶ治癒を達成するための最高の将来性を持っていると楽観的である。
【００５０】
本明細書に開示されるように、本発明の方法および組成物は、身体からのすべてのＨＩＶの完全な根絶を含んでもよいかまたは含まないでもよい機能的治癒を達成することができる。機能的治癒は、以前にＨＡＡＲＴを必要としていたＨＩＶ＋個体が、低いまたは検出不可能なウイルス複製とともに生存し、より低いまたは断続的な用量のＨＡＡＲＴを使用しているか、または潜在的にＨＡＡＲＴを完全に中止することができる、状況または状態として定義される。本明細書で使用されるように、機能的治癒は、低レベルのウイルス複製を維持し、疾患の進行を遅らせるかまたは排除するために、補助療法を必要とする可能性がなお、あるかもしれない。機能的治癒の可能な予後は、すべての再発の可能性を防ぐためのＨＩＶの最終的な根絶である。
【００５１】
機能的治癒を達成するための主な障害は、ＨＩＶ自体の基本的な生物学に存する。ウイルス感染は、すべての免疫機能にとって重要なＣＤ４  Ｔ細胞を欠失させる。最も重要なことに、ＨＩＶ感染およびＣＤ４  Ｔ細胞の枯渇は、個々の細胞の活性化を必要とする。活性化とは、再編成されたＴ細胞受容体を使用して病原体または他の分子を認識する個々のＣＤ４  Ｔ細胞クローンに特異的な機構である。
【００５２】
ＨＩＶの場合、感染は、ウイルスにそれほど特異的でない他のＴ細胞の前に、ＨＩＶに特異的なＴ細胞の集団を活性化させ、結果的に枯渇させ、ウイルスに対する免疫システムの防御を効率的に無能化する。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答の能力は、長期間のＨＡＡＲＴ中に再構築される；しかしながら、ＨＡＡＲＴが中断されると、反復性ウイルス感染はプロセスを反復し、再びウイルス特異的細胞を欠失させ、疾患の進行の時計をリセットする。
【００５３】
明らかに、機能的治癒は、十分なＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が保護されて、ＨＡＡＲＴが中断されたら宿主の自然免疫がＨＩＶに対抗して制御するようになる場合にのみ可能である。一実施形態では、本発明は、ＨＩＶ疾患の機能的治癒を提供するための遺伝子治療の有効性を改善するための方法および組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、機能的治癒を提供するために、ＨＩＶに対する宿主免疫を増強するための方法および組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、機能的治癒を達成するために、患者のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮するための方法および組成物を提供する。
【００５４】
本発明の一実施形態では、治療は、対象のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、約１５００％、約２０００％、約２５００％、約３０００％、約３５００％、約４０００％、約４５００％、約５０００％、約５５００％、約６０００％、約６５００％、約７０００％、約７５００％、約８０００％、約８５００％、約９０００％、約９５００％、約１００００％、約１１０００％、約１２０００％、約１３０００％、約１４０００％、約１５０００％、約１６０００％、約１７０００％、約１８０００％、約１９０００％、約２００００％、約２５０００％、約３００００％、約３５０００％、約４００００％、約４５０００％、約５００００％、約５５０００％、約６００００％、約６５０００％、約７００００％、約７５０００％、約８００００％、約８５０００％、約９００００％、約９５０００％、約１０００００％またはその間の任意の値、濃縮する結果となる。
ＩＩ．遺伝子治療
【００５５】
ウイルスベクターは、疾患の療法または予防の目的ために宿主細胞に遺伝子構築物を送達するために使用される。
【００５６】
遺伝子構築物は、機能的遺伝子または既存の欠陥を修正または補完する遺伝子の一部、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンス、短いホモロジーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡまたはその他を含む調節ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、および疾患状態を変化させるために重要な細胞因子について競合するように設計されたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列を含むことができるが、それらに限定されない。遺伝子治療は、特定の疾患の治療または緩和を提供するために、これらの療法用遺伝子構築物を標的細胞に送達することを含む。
【００５７】
ＨＩＶ疾患の治療において遺伝子治療を利用する努力は複数行われてきているが、これまでのところ、結果は貧弱である。ＣＣＲ５遺伝子の自発的欠失（ＣＣＲ５ｄｅｌｔａ３２として公知である対立遺伝子）を有するまれなＨＩＶ患者において、少数の治療成功が得られた。
【００５８】
レンチウイルスにより送達されたヌクレアーゼまたは遺伝子欠失／修飾のための他の機構を使用して、ＣＣＲ５の全体的発現を低下させ、および／またはＨＩＶ複製を低下させるのを助けることができる。レンチウイルスがＣＣＲ５ｄｅｌｔａ３２の遺伝的背景を有する患者に投与された場合にこの疾患の治療に成功したことを報じる研究が、少なくとも１つある。しかしながら、これは成功のわずか一例に過ぎず、ＣＣＲ５ｄｅｌｔａ３２遺伝子型を持たない多くの他の患者はうまく治療されていない。その結果、個々のウイルスベクター構築物の性能および機能的ＨＩＶ治癒を達成するための戦略によるベクターの使用の改善の両方の点で、ＨＩＶに対するウイルス遺伝子治療の性能を改善する実質的な必要性がある。
【００５９】
例えば、いくつかの既存の療法は、細胞をＨＩＶ感染に対して抵抗性にする試みにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼに依存して、ＣＣＲ５の一部を欠失させる。しかしながら、最適な治療の後でさえも、Ｔ細胞の３０％だけがヌクレアーゼによって改変されるのみであり、改変されたもののうち、全ＣＤ４  Ｔ細胞集団のわずか１０％がＨＩＶ感染を予防するように改変されただけであった。対照的に、開示された方法は、レンチウイルス導入遺伝子を保有する実質的にすべての細胞で、ＨＩＶ感染を可能にするのに必要なレベル未満までＣＣＲ５発現が減少する結果となる。
【００６０】
開示される方法の目的のために、遺伝子治療には、親和性が増強されたＴ細胞受容体、ＣＤ４  Ｔ細胞上の（または代替的にＣＤ８  Ｔ細胞上の）キメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞死を避けるためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５−アルファ複合体、テザリン（tetherin；ＢＳＴ２）、および哺乳類細胞におけるＨＩＶ複製を減少させることができるものと識別された類似のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現の増加を含むことができるが、それらに限定されない。
【００６１】
例えば、一部の実施形態では、開示されるベクターは、下の表１に見出される制限エレメントを含み得るが、それらに限定されない。これらの例示的な制限エレメントの配列は、図９にさらに開示されている。
【表１】
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ＩＩＩ．免疫療法
【００６２】
歴史的に、ワクチンは、天然痘、ポリオ、麻疹、黄熱病を含む、致命的な感染性疾患に対する頼りになる武器であった。残念ながら、現在のところ、ＨＩＶについては承認されているワクチンはない。ＨＩＶウイルスは、免疫システムを回避する独特の手段を持っており、人体はそれに対して有効な免疫応答を実装することができないようである。その結果、科学者はＨＩＶに対する保護を提供するために何が必要であるかを明確に把握していない。
【００６３】
しかしながら、免疫療法は、従来のワクチン接種アプローチによっては以前に対処できなかった解決法を提供し得る。生物学的療法とも呼ばれる免疫療法は、感染症またはがんと戦うための身体の自然防御を強化するために設計された治療の一型である。それは、免疫システムの機能を改善、標的化、または回復させるために、身体あるいは実験室のいずれかにおいて作られた材料を使用する。
【００６４】
開示された発明の一部の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的で、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の集団を濃縮させるために、免疫療法アプローチを使用することができる。開示された発明の一部の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的で、宿主の免疫細胞に形質導入するために、組み込みまたは非組み込みのレンチウイルスベクターを使用することができる。本発明のさらに別の実施形態では、宿主の免疫応答を増加させるための適切なビヒクルおよび／または生物学的もしくは化学的アジュバントと組み合わせた、死滅粒子、ウイルス様粒子、ＨＩＶペプチドまたはペプチド断片、組換えウイルスベクター、組換え細菌ベクター、精製サブユニットまたはプラスミドＤＮＡを含むがこれらに限定されないＨＩＶタンパク質を含むワクチンは、ウイルス特異的Ｔ細胞または抗体の集団を濃縮するために使用することができ、ならびにこれらの方法は、レンチウイルスまたは他のウイルスベクターを使用したＨＩＶ標的遺伝子治療の使用によってさらに増強され得る。
ＩＶ．本発明による方法
【００６５】
一態様では、開示される発明は、ＨＩＶ疾患の機能的治癒を達成するためにウイルスベクターを使用する方法を提供する。この方法はさらに、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を濃縮させるための免疫療法、続く、必要に応じてＨＩＶの阻害剤ならびにＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４を送達するためのレンチウイルス形質導入を含む。
【００６６】
一実施形態では、本方法は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を濃縮するための方法としての療法的免疫化を含む。療法的免疫化には、精製タンパク質、不活性化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに免疫化のための方法を含むことができる。
【００６７】
療法用ワクチンは、治療が行われている地理的領域の支配的なウイルス型を表すタンパク質配列を有する１つまたは複数のＨＩＶタンパク質を含むことができる。療法的ワクチンには、精製タンパク質、不活性化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに免疫化のための方法が含まれ得る。ワクチン接種は、当該分野で公知の標準的な方法に従って投与することができ、ＨＩＶ患者は、免疫化の期間およびその後のレンチウイルス形質導入を含むｅｘ  ｖｉｖｏリンパ球培養の間に抗レトロウイルス療法を続けることができる。
【００６８】
一部の実施形態では、ＨＩＶ＋患者をＨＩＶワクチンで免疫化して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を約２、約２５、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、約１２５０、または約１５００倍（またはこれらの値の間の任意の量）増加させることができる。ワクチンは、ワクチン送達システムとして使用される、開示されたレンチウイルス、他のウイルスベクターまたは他の細菌ベクターを含む、臨床的に利用されるかまたは実験的なＨＩＶワクチンであってもよい。例えば、開示されるベクターは、ＨＩＶ  ＶＬＰを発現する組換えウシ型弱毒結核菌ワクチン（Bacille Calmette Guerin；ＢＣＧ）株を含んでもよい。ＢＣＧは結核に対するヒトワクチンとしての使用のために弱毒化されたマイコバクテリウム・ボビス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）である。別の実施形態では、ベクターは、中和抗体のより高い力価を誘導するためにウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードすることができる。別の実施形態では、ベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｔｅｖならびにＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳを含むがこれらに限定されないＨＩＶに関連するペプチドまたはペプチド断片をコードすることができる。代替的には、開示された方法で使用されるＨＩＶワクチンは、精製タンパク質、不活性化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはサイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバントを含んでもよい。
【００６９】
一実施形態では、本方法は、精製タンパク質、不活性化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、および再刺激のための方法を使用して、療法ワクチン接種により以前に免疫化された人または患者からのＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激を含む。ｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために使用されるものと同じワクチンまたは免疫刺激化合物を使用して実施され得るか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために使用されるものとは異なるワクチンまたは免疫刺激化合物を使用して実施され得る。さらに、一部の実施形態では、個体がＨＩＶタンパク質に対して十分に高い抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有する場合、患者は、以前の療法ワクチン接種またはＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激を必要としないことがある。これらの実施形態では、そのような患者は、機能的治癒を達成するために、開示されたウイルスベクターの投与のみを必要とすることがある。
【００７０】
例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、白血球アフェレーシスによって得られ、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理され、１×１０１０個のＣＤ４  Ｔ細胞を得ることができ、その約０．１％、約１％、約５％または約１０％または約３０％は、抗原応答の点でＨＩＶ特異的であり、かつ開示されたレンチウイルスベクターによって送達される療法用導入遺伝子を有することによりＨＩＶ耐性である。代替的には、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、または約１×１０１２個のＣＤ４  Ｔ細胞を再刺激のために単離することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏにおける再刺激のために、任意の適切な量のＣＤ４  Ｔ細胞を単離することができる。
【００７１】
単離されたＣＤ４  Ｔ細胞は、以前の療法用ワクチン接種に存在する抗原を含み得る、ＨＩＶワクチン抗原による再刺激を通して、適切な培地中で培養することができる。逆転写酵素、プロテアーゼまたはインテグラーゼの阻害剤を含む抗レトロウイルス療法薬は、長期のｅｘ  ｖｉｖｏでの培養中のウイルス再出現を防ぐために添加することができる。ＣＤ４  Ｔ細胞再刺激は、培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を濃縮するために使用される。同じ手順を、精製によって得られた末梢血単核細胞を有する少量の血液量を使用して、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を識別し、この亜集団の頻度を測定する分析目的にもまた使用することができる。
【００７２】
ＰＢＭＣ画分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために以前に使用されたワクチンの成分と一致または相補的なＨＩＶタンパク質と細胞を接触させることによって、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞について濃縮され得る。ｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の相対頻度を約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約２００倍増加させることができる。
【００７３】
本方法はさらに、ｅｘ  ｖｉｖｏでのレンチウイルス形質導入および培養を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの療法的免疫化およびｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激を組み合わせることを含む。
【００７４】
したがって、一実施形態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞について濃縮された再刺激されたＰＢＭＣ画分は、療法用抗ＨＩＶレンチウイルスまたは他のベクターを用いて形質導入され、約１〜約２１日または約３５日まで、培養物中に保持された。代替的には、細胞は、約１〜約１８日間、約１〜約１５日間、約１〜約１２日間、約１〜約９日間、または約３〜約７日間培養され得る。したがって、形質導入された細胞は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日間、培養されてもよい。
【００７５】
形質導入された細胞が十分に培養されると、形質導入されたＣＤ４  Ｔ細胞が元の患者に注入し、戻される。注入は、当該技術分野において公知の様々な機械および方法を使用して実施することができる。一部の実施形態では、注入は、再移植の効率を高めるために、シクロホスファミドまたは同様の化合物での前治療を伴ってもよい。
【００７６】
一部の実施形態では、ＣＣＲ５標的療法は、治療プロセスを通して継続して、対象の抗レトロウイルス療法レジメンに加えられてもよい。ＣＣＲ５標的療法の例としては、マラビロク（Maraviroc；ＣＣＲ５アンタゴニスト）またはラパマイシン（Rapamycin；ＣＣＲ５を低下させる免疫抑制剤）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗レトロウイルス療法は中止され、対象はウイルスのリバウンドについて試験されることができる。リバウンドが起こらない場合、アジュバント療法もまた取り除くことができ、対象はウイルスのリバウンドについて再び試験されることができる。
【００７７】
ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを含めた抗レトロウイルス療法を減少させたか、または伴わないものであって、約２６週間のアジュバント療法を減少させたか、または伴わない継続的なウイルス抑制は、ＨＩＶの機能的治癒と考えることができる。機能的治癒の他の定義は、本明細書に記載されている。
【００７８】
開示された方法で使用されるレンチウイルスベクターおよび他のベクターは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの目的の遺伝子をコードし得る。ＨＩＶ標的遺伝子治療の多様性および治療可能性を考慮すると、本発明のウイルスベクターは、（ｉ）感染性疾患に関連する抗原または感染性病原体により産生された毒素に対する抗体、（ｉｉ）免疫細胞の増殖または機能に必要で、ＨＩＶおよび他の慢性または急性のヒトウイルスまたは細菌病原体で遭遇する免疫調節不全のための療法であり得る、インターロイキンを含むサイトカイン、（ｉｉｉ）ＣＤ８抑制因子を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＨＩＶの増殖を抑制する因子、（ｉｖ）ケモカイン受容体ＣＣＲ５の突然変異もしくは欠失、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の突然変異もしくは欠失、またはケモカイン受容体ＣＸＣＲ５の突然変異もしくは欠失、（ｖ）ＨＩＶに関連する特異的受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、（ｖｉ）ＨＩＶに関連する特異的受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対する低分子干渉ＲＮＡ、または（ｖｉｉ）ＨＩＶまたはＡＩＤＳを治療するために使用され得る様々な他の療法的に有用な配列を含むがそれらに限定されない遺伝子または核酸配列をコードしてもよい。
【００７９】
開示された方法において使用することができるＨＩＶ標的化遺伝子治療のさらなる例は、親和性が増強されたＴ細胞受容体、ＣＤ４  Ｔ細胞上の（または代替的にはＣＤ８  Ｔ細胞上の）キメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞死を避けるためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ  １、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５−アルファ複合体、テザリン（ＢＳＴ２）、および哺乳類細胞におけるＨＩＶ複製を減少させることができるものと識別された類似のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現の増加を含むことができるが、それらに限定されない。
【００８０】
一部の実施形態では、患者は、本発明の方法に従って治療されている間に同時にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていてもよい。他の実施形態では、患者は、本発明の方法に従って治療される前または後に、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けてもよい。一部の実施形態では、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴは、本発明の方法に従った治療を通して維持され、患者は血液中のＨＩＶウイルス負荷についておよび血液中のレンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度についてモニターされてもよい。好ましくは、本発明の方法に従って治療される前にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けている患者は、本発明の方法に従った治療の後にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを中止または減少することができる。
【００８１】
有効性の目的のために、遺伝子治療効果についての新規の代用マーカーである形質導入されたＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を、セクションＶＩにおいてより詳細に議論されるように決定してもよい。
Ｖ．本発明による組成物
【００８２】
一態様では、開示される発明は、感受性細胞のＨＩＶ浸透を阻害するために遺伝子構築物を送達することができるレンチウイルスベクターを提供する。例えば、１つの作用メカニズムは、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のｍＲＮＡレベルを減少させること、したがって、感受性細胞へのウイルス侵入の速度を減少させることである。
【００８３】
代替的には、開示されるレンチウイルスベクターは、入ってくるＨＩＶゲノムＲＮＡの安定性を減少させることによって、ＤＮＡおよびＨＩＶ感染細胞の形成を阻害することができてもよい。さらに別の実施形態では、開示されたレンチウイルスベクターは、潜伏感染細胞からのＨＩＶ産生を阻止することができ、その作用メカニズムは、短い相同性、低分子干渉性または他の調節ＲＮＡ種を含む阻害性ＲＮＡの作用により、ウイルスＲＮＡ配列の不安定性を引き起こすことである。
【００８４】
本出願で開示される療法上のレンチウイルスは、一般に、２つの型の遺伝子カーゴ（geneticcargo）のうちの少なくとも１つを含む。第１に、レンチウイルスは、感受性細胞のＨＩＶ浸透にとって重要なケモカイン受容体ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡの発現を指示する遺伝子エレメントをコードしてもよい。第２の型の遺伝子カーゴは、逆転写、ＲＮＡスプライシング、タンパク質を産生するＲＮＡ翻訳、または粒子産生および感染蔓延のためのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングを阻止する目的で、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子を発現することができる構築物を含む。例示的な構造を図３に図示する。
【００８５】
図３に示すように、例示的な構築物は、多数のセクションまたは構成要素を含むことができる。例えば、一実施形態では、例示的なＬＶ構築物は、以下のセクションまたは構成要素を含み得る：
・ＲＳＶ    −  ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma virus）末端反復配列；
・５’ＬＴＲ    −  染色体組み込み後にベクターの複製を阻止するために切断され得るＨＩＶ末端反復配列の一部；
・Ｐｓｉ    −  パッケージング中にベクターＲＮＡゲノムをウイルス粒子に取り込むことを可能にするパッケージングシグナル；
・ＲＲＥ    −  Ｒｅｖ反応性エレメントは、ＲＮＡを核から細胞の細胞質に移動することによって導入遺伝子からの発現を改善するために添加することができる；
・ｃ  ＰＰＴ    −  宿主細胞の染色体に導入遺伝子を組み込む前に、第２鎖ＤＮＡ合成を促進するポリプリントラクト（Poly purine tract）；
・プロモーター    −  プロモーターとは、マイクロＲＮＡクラスター（または構築物の他の遺伝子エレメント）を発現するために、組み込まれた導入遺伝子からＲＮＡ転写を開始するものであり、一部の実施形態では、ベクターはＥＦ−１プロモーターを使用してもよい；
・Ａｎｔｉ−ＣＣＲ５    −  宿主細胞因子ＣＣＲ５のメッセンジャーＲＮＡを標的として、細胞表面上の発現を減少させるマイクロＲＮＡ；
・Ａｎｔｉ−Ｒｅｖ／Ｔａｔ    −  ＨＩＶ  Ｒｅｖコーディング領域とＴａｔコーディング領域の間の接合部にあるＨＩＶゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを標的とするマイクロＲＮＡであり、時にはｍｉＲＮＡ  Ｔａｔと称されるか、またはこの出願において同様の記載が与えられる；
・Ａｎｔｉ−Ｖｉｆ    −  Ｖｉｆコーディング領域内のＨＩＶゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを標的とするマイクロＲＮＡ；
・ＷＰＲＥ    −  ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（woodchuckhepatitis virus post-transcriptional regulatory element）は、核のＲＮＡ輸送を促進するために使用することができる追加のベクター構成成分である；および
・ｄｅｌｔａＵ３  ３’ＬＴＲ    −  ベクターの安全性を改善するためにＵ３領域の一部が欠失している、ＨＩＶ  ３−プライム末端反復配列の改変バージョン。
当業者であれば、上記の構成成分は単なる例であり、そのような構成成分は、構築物がＨＩＶ遺伝子の発現を阻止し、感染の蔓延を減少させることができる限り、他のエレメントで再編成され、置換され、さもなければ改変され得ることを、認識し得る。
【００８６】
本発明のベクターは、上に議論した遺伝子カーゴの型（すなわち、遺伝子の発現を導く遺伝子エレメントまたは翻訳もしくは転写を阻止することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡのようなスモールＲＮＡ）の一方または両方を含んでもよく、本発明のベクターはまた、ＨＩＶの治療または診断の目的のためにさらなる有用な産物をコードしてもよい。例えば、一部の実施形態では、これらのベクターはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子改変細胞を選択的に維持する目的で、ベクターまたは抗生物質耐性遺伝子を追跡する目的で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしてもよい。
【００８７】
開示されるベクターに組み込まれる遺伝子エレメントの組合せは、特に限定されない。例えば、ベクターは、１個のスモールＲＮＡ、２個のスモールＲＮＡ、３個のスモールＲＮＡ、４個のスモールＲＮＡ、５個のスモールＲＮＡ、６個のスモールＲＮＡ、７個のスモールＲＮＡ、８個のスモールＲＮＡ、９個のスモールＲＮＡ、または１０個のスモールＲＮＡをコードしてもよい。そのようなベクターは、ＨＩＶの発現および感染を阻止するために、スモールＲＮＡと協調して機能する他の遺伝子エレメントを、さらにコードしてもよい。
【００８８】
当業者は、療法用レンチウイルスが、プロモーター領域、調節ＲＮＡの標的化、および調節ＲＮＡの型に対して代替配列を置換し得ることを理解し得る。さらに、本発明の療法用レンチウイルスは、レンチウイルス粒子をパッケージングするために使用されるプラスミド内に改変を含んでもよい；これらの改変は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける産生のレベルを増加させるために必要となる。
【００８９】
一部の実施形態では、開示される方法において使用されるベクターは、ＤＮＡプラスミド、アデノ随伴ウイルス、または遺伝子送達のための他の組み込みまたは非組み込みベクターシステムであってもよい。
ＶＩ．バイオアッセイ
【００９０】
一態様では、本発明は、機能的治癒を達成するためのＨＩＶ治療の成功を決定するためのバイオアッセイを含む。これらのアッセイは、患者における形質導入されたＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を測定することによって、開示された免疫化および治療の方法の有効性を測定するための方法を提供し得る。ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、増殖するか、細胞表面マーカーの組成を改変させるか、リン酸化を含むシグナル伝達経路を誘導するか、あるいはサイトカイン、ケモカイン、カスパーゼ、リン酸化シグナル伝達分子または他の細胞質および／もしくは核構成成分であり得る特異的マーカータンパク質を発現するため、認識できる。特異的応答ＣＤ４  Ｔ細胞は、例えば、フローサイトメトリーソーティング、磁気ビーズ分離または抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞単離についての他の認識された方法を使用して、ＨＩＶ特異的細胞の選別を可能にする、標識モノクローナル抗体またはｍＲＮＡ配列の特異的ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅を使用して、認識される。単離したＣＤ４  Ｔ細胞を試験して、統合療法用レンチウイルスを有する細胞の頻度を決定する。ＨＩＶに対する応答性および統合療法用レンチウイルスの存在を確認するための質量分析法、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡまたは抗体染色と組み合わせた、個々の細胞のマイクロ流体分離を含む、単一細胞試験法もまた、使用してもよい。
【００９１】
したがって、一実施形態では、本発明による治療（例えば、（ａ）免疫化、（ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏリンパ球培養；（ｃ）精製タンパク質、不活性化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクルによる再刺激；および（ｄ）濃縮され形質導入されたＴ細胞の注入）の適用の後、治療の有効性を決定するために患者を次いで、アッセイしてもよい。体内の標的Ｔ細胞の閾値は、機能的治癒を測定するために、例えば、約１×１０８個の、療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞として確立してもよい。細胞の閾値の値は、全身の内容を指す。それは直接測定することはできないが、代わりに標準的な補正を使用して血液ＣＤ４  Ｔ細胞数から外挿してもよい。例えば、組織中にＣＤ４  Ｔ細胞の９０％が存在し、血液中には１０％しか見つからないと仮定することは、当該技術分野では一般的である。
【００９２】
代替的には、閾値は、患者の体内において、約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０９、または約１×１０１０個のＣＤ４  Ｔ細胞であってもよい。
【００９３】
療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、例えば、ただし限定されることのない、フローサイトメトリー、細胞選別、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡクローニング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはＱ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＳＨ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ハイスループット配列決定、ＲＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプライマー伸長、または当該技術分野で公知の他の方法のような任意の適切な方法を使用して決定することができる。
【００９４】
遺伝的改変を有する抗原特異的Ｔ細胞を規定するための方法は、当該技術分野において公知である。しかしながら、有効性の標準的な尺度として、識別するＨＩＶ特異的Ｔ細胞を統合または非統合遺伝子治療構築物と組み合わせるこのような方法を利用することは、ＨＩＶ治療の分野における新しい概念である。
ＶＩＩ．用量および剤形
【００９５】
開示された方法および組成物は、疾患の様々な段階の間にＨＩＶ＋患者を治療するために使用することができる。したがって、投薬レジメンは、患者の状態および投与の方法に基づいて変化し得る。
【００９６】
一実施形態では、最初のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のためのＨＩＶ特異的ワクチンは、様々な用量で、必要とする対象に投与され得る。一般に、筋肉内注射によって送達されるワクチンは、約１０μｇ〜約３００μｇ、約２５μｇ〜約２７５μｇ、約５０μｇ〜約２５０μｇ、約７５μｇ〜約２２５、または約１００μｇ〜約２００μｇのＨＩＶタンパク質、あるいは不活性化されたウイルス粒子、ウイルス様粒子、もしくは組換えシステムからの精製ウイルスタンパク質から調製されたか、またはウイルス調製物から精製された全ウイルスタンパク質を含む。組換えウイルスまたは細菌ベクターは、記載されたいかなるルートによって投与されてもよい。筋肉内ワクチンは、約１μｇ〜約１００μｇ、約１０μｇ〜約９０μｇ、約２０μｇ〜約８０μｇ、約３０μｇ〜約７０μｇ、約４０μｇ〜約６０μｇまたは約５０μｇの適切なアジュバント分子を含み、注射用量あたり０．１〜５ｍｌの容量の油、生理食塩水、緩衝液または水に懸濁され、可溶性またはエマルション調製物であってもよい。いくつかのウイルスベクター化または細菌性ベクター化ワクチン、融合タンパク質、リポソーム製剤または同様の調製物を含む、口腔、直腸、頬、生殖器粘膜または鼻腔内に送達されるワクチンは、より多量のウイルスタンパク質およびアジュバントを含んでもよい。経皮、真皮下または皮下ワクチンは、経口、直腸または鼻腔内送達ワクチンにより類似したタンパク質およびアジュバントの量を利用する。最初の免疫化に対する応答に依存して、ワクチン接種は、送達のための同じまたは代替的なルートを使用して、１〜５回繰り返してもよい。間隔は、免疫化間で２〜２４週間であってもよい。ワクチン接種に対する免疫応答は、血清、血漿、膣分泌物、直腸分泌物、唾液または気管支肺胞洗浄液中のＨＩＶ特異的抗体を、ＥＬＩＳＡまたは同様の方法を使用して試験することによって測定される。細胞性免疫応答は、ワクチン抗原を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激、続いて細胞内サイトカイン蓄積の染色、次いで、フローサイトメトリーまたはリンパ球増殖、リン酸化シグナル伝達タンパク質の発現または細胞表面活性化マーカーの変化を含む同様の方法によって試験される。投薬の上限は、個々の患者に基づいて決定されてもよく、個々の製品または製品ロットの毒性／安全性プロファイルに依存し得る。
【００９７】
免疫化は、１回、２回、３回、または繰り返しで行われてもよい。例えば、ＨＩＶ免疫化のための薬剤は、週１回、隔週に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、隔月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１年に１回、１８ヶ月に１回、２年に１回、３６ヶ月に１回、または３年に１回、必要な対象に投与されてもよい。
【００９８】
免疫化は、ＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖および濃縮の前に、少なくとも１回行われるであろうし、ｅｘ  ｖｉｖｏでのリンパ球の培養／再刺激および注入後は、１回、２回、３回、またはそれ以上の回数で、免疫化を行ってもよい。
【００９９】
一実施形態では、免疫化のためのＨＩＶワクチンは、医薬組成物として投与される。一実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、臨床応用のための幅広く様々な経鼻、経肺、経口、局所、または非経口剤形で製剤化することができる。各々の剤形は、様々な崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤のような希釈剤または他の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物はまた、注射用に製剤化することもできる。
【０１００】
免疫化の目的のためのＨＩＶワクチン組成物は、鼻腔内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、大槽内、腹腔内）、肺内、膣内、部位的投与、局所投与、乱刺後の局所投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、または頬側もしくは鼻スプレー製剤を介してなどの任意の薬学的に許容される方法を使用して投与することができる。
【０１０１】
さらに、ＨＩＶワクチン組成物は、固体剤形、錠剤、丸薬、ロゼンジ、カプセル、液体分散液、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、および懸濁液などの、任意の薬学的に許容される剤形に製剤化されることができる。さらに、組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはそれらの任意の組合せであってもよい。さらに、組成物は、経皮送達システムであってもよい。
【０１０２】
別の実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形で製剤化することができ、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤または丸薬であり得る。さらに別の実施形態では、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、乳糖、微結晶セルロースまたはゼラチンのような、１つまたは複数の賦形剤を含むことができる。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含むことができる。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出または改変放出形態であり得る。改変放出剤形には、制御放出または持続放出、腸内放出などが含まれる。改変放出剤形において使用される賦形剤は、当業者に一般的に公知である。
【０１０３】
さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬的組成物は、舌下または頬側の剤形として製剤化することができる。そのような剤形は、頬と歯茎との間に位置した舌下および頬側錠剤の下で投与される、舌下錠剤または溶液組成物を含む。
【０１０４】
なおさらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、鼻用剤形として製剤化することができる。そのような本発明の剤形は、経鼻送達のための溶液、懸濁液およびゲル組成物を含む。
【０１０５】
一実施形態では、医薬組成物は、懸濁液、エマルションまたはシロップのような経口投与用の液体剤形で製剤化することができる。他の実施形態では、液体剤形は、水および流動パラフィンのような一般的に使用される単純希釈剤に加えて、保湿剤、甘味料、芳香剤または防腐剤のような様々な賦形剤を含むことができる。特定の実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む組成物またはその薬学的に許容される塩は、小児患者への投与に適するように製剤化することができる。
【０１０６】
一実施形態では、医薬組成物は、滅菌水溶液、懸濁液、エマルション、非水性溶液または坐剤などの非経口投与のための剤形で製剤化することができる。他の実施形態では、非水性溶液または懸濁液は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、またはオレイン酸エチルのような注射可能なエステルを含むことができる。坐剤のベースとして、ウィテプソール（witepsol）、マクロゴール（macrogol）、ツイーン６１（tween 61）、カカオ油、ラウリン油またはグリセリン化ゼラチンを使用することができる。
【０１０７】
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および形態、排泄速度、および疾患の重篤度に依存して変化し得る。
【０１０８】
再刺激の目的のために、リンパ球、ＰＢＭＣおよび／またはＣＤ４  Ｔ細胞を患者から取り出し、再刺激および培養のために単離する。単離された細胞は、免疫化に使用されたものと同じＨＩＶワクチンもしくは活性化剤または異なるＨＩＶワクチンもしくは活性化剤と接触させてもよい。一実施形態では、単離された細胞は、培養物中の約１０６個の細胞（または任意の他の適切な量）あたり約１０ｎｇ〜５μｇのＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触される。より具体的には、単離された細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり、約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約３００ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約６００ｎｇ、約７００ｎｇ、約８００ｎｇ、約９００ｎｇ、約１μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約２．５μｇ、約３μｇ、約３．５μｇ、約４μｇ、約４．５μｇ、または約５μｇのＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触させてもよい。
【０１０９】
活性化剤またはワクチンは、一般に、各々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養に１回使用されるが、約１５〜約３５日の間隔の後に繰り返してもよい。例えば、繰り返しの投薬は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日で行ってもよい。
【０１１０】
濃縮され、再刺激された細胞の形質導入のために、細胞は、レンチウイルスベクターまたはセクションＶおよび図３に開示される他の公知のベクターシステムを用いて形質導入されてもよい。形質導入される細胞は、培養中の標的細胞（または任意の他の適切な量）あたり、（レンチウイルスベクターを含む培養液のＲＴ−ＰＣＲアッセイにより測定された）約１〜１，０００個のウイルスゲノムと接触させてもよい。レンチウイルスの形質導入は、培養中の標的細胞あたり、１〜１，０００個のウイルスゲノムの同じ範囲を使用して、１〜５回繰り返してもよい。
ＶＩＩＩ．定義
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、使用される文脈に依存してある程度変化し得る。使用される文脈を考慮しても、当業者に明確ではない用語の使用がある場合には、「約」は特定の用語のプラスまたはマイナス１０％を意味し得る。
【０１１２】
「治療」は、疾患状態を標的とし、これと闘う、すなわち疾患状態を改善または予防することを意図する。したがって、特定の治療は、標的とされる疾患状態および医薬療法および療法アプローチの現在または将来の状態に依存し得る。治療は関連する毒性を有する可能性がある。
【０１１３】
活性剤の「投与」または「投与する」という用語は、本発明の活性剤を、治療の必要な対象に療法上有用な形態で治療有効量をその個体の体内に導入することができる形態で、提供することを意味すると理解されるべきである。
【０１１４】
「治療有効量」という用語は、受けている不快、傷害、疾患、または状態に苦しんでいる患者に見られる症状、進行または合併症の発症を治療または予防するのに適切な組成物における、および適切な剤形における、本発明の活性剤の十分な量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重篤度、および治療される対象の年齢、体重などに依存して変化し得る。治療有効量は、例えば、投与経路、対象の状態、ならびに当業者によって理解される他の因子を含む、多くの要因のいずれかに依存して変化し得る。
【０１１５】
「治療」または「治療する」という用語は、一般に、治療される対象の自然経過を変える試みにおける介入のことを指し、予防のためにかまたは臨床病理の経過の間のいずれかに実施することができる。望ましい効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症状を緩和すること、疾患の任意の直接的もしくは間接的な病理学的帰結を抑制、減少または阻害させること、疾患状態を改善または軽減させること、および寛解または予後の向上を引き起こすことを含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
「機能的治癒」という用語は、以前にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを必要としていたＨＩＶ＋個体が、ｃＡＲＴもしくはＨＡＡＲＴのより低い用量、断続的用量または投薬中止を使用して、ウイルス複製が低いまたは検出不可能な形で生存することができる状況または状態を指す。個体は、低いレベルのウイルス複製を維持し疾患の進行を遅くするかまたは排除するための補助療法を依然として必要としていても、「機能的に治癒した」と言われ得る。機能的治癒の可能性のある結果としては、すべての再発の可能性を防ぐためのＨＩＶの最終的な撲滅がある。
【０１１７】
「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＨＩＶ特異的免疫応答を誘発することを意図した免疫原とビヒクルとアジュバントを包含する。ワクチンは、ＨＩＶであってもよい精製された不活性化ウイルス粒子もしくは不活性化ウイルス粒子全体、またはＨＩＶタンパク質、タンパク質断片またはペプチド、糖タンパク質断片もしくは糖ペプチドを発現することができる組換えウイルスベクター、組換え細菌ベクターに加えて、細胞をＨＩＶタンパク質、特定の免疫を誘発することができる糖タンパク質またはタンパク質断片を産生するように誘導することができるプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。代替的には、形質導入の前にＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮する目的のために、または、レンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、Ｔ細胞受容体特異的抗体、分裂促進因子、スーパー抗原および他の化学的または生物学的刺激を含む免疫刺激のための特定の方法を使用して、樹状、ＴもしくはＢ細胞を活性化することができる。活性化物質は、可溶性、ポリマー性集合体、リポソームまたはエンドソームベースのまたは連結されたビーズであってもよい。インターロイキン−２、６、７、１２、１５、２３または他を含むサイトカインを添加して、刺激に対する細胞応答を改善し、ならびに／または培養および形質導入間隔を通じてＣＤ４  Ｔ細胞の生存を改善することができる。
【０１１８】
「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「発現」、「発現した」または「コードする」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシング、または他の形態の転写後修飾もしくは翻訳後修飾を含み得る。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「スモールＲＮＡ」とは、一般に長さ約２００ヌクレオチド未満またはそれ未満であり、サイレンシング（silencing）または干渉機能を持つコーディングされないＲＮＡのことを指す。他の実施形態では、スモールＲＮＡは、長さ約１７５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１００ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約７５ヌクレオチドもしくはそれ未満である。そのようなＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本開示の「スモールＲＮＡ」は、一般に、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊をもたらす経路を介して、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害またはノックダウンすることが可能であるべきである。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明を説明するために与えられる。しかしながら、本発明は、これらの実施例において記載された特定の条件または詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書で参照されるすべての刊行物は、参照により具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
ＨＩＶの治療のための臨床研究
スクリーニングおよびインフォームドコンセント。ウイルス負荷の抑制が安定した、抗レトロウイルス併用療法（ｃＡＲＴ）を受けた特定のＨＩＶ＋参加者が選択され参加する。
【０１２３】
療法用ＨＩＶワクチンによる免疫化。既にＩＮＤ状態であり、ＨＩＶ＋参加者を含む臨床試験に使用されているワクチンが参加者に投与される。このステップは、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の相対頻度をおよそ１，０００倍増加させ得る。
【０１２４】
次に、白血球アフェレーシスによって血液リンパ球を取り出し、さらに精製して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分とする。代替的には、細胞は、カラムまたは密度勾配法によって静脈血から精製してもよい。
【０１２５】
培養されたＰＢＭＣは、療法用ワクチン中の成分と一致または補完するＨＩＶタンパク質またはペプチドで刺激される（おそらく、その組成に依存して同じワクチンを使用する）。このステップは、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の相対頻度をおよそ１００倍増加させ得る。
【０１２６】
培養されたＰＢＭＣ細胞に、療法用レンチウイルスまたは他の開示されたベクター、例えば、ＣＣＲ５およびウイルス複製タンパク質の翻訳を干渉するためのスモールＲＮＡをコードするベクターを感染させる。形質導入後、細胞を培養物中で３〜７日維持する。
【０１２７】
形質導入されたＣＤ４  Ｔ細胞は元の参加者に注入し戻される。注入は、当該技術分野で公知の方法に従って実施することができる。これは、再移植の効率を高めるためにシクロホスファミドでの前処理を必要とすることがある。
【０１２８】
ｃＡＲＴを受けている参加者のために、ｃＡＲＴは期間中維持され得る。注入後、血液中のＨＩＶウイルス負荷および血液中のレンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度をモニターする。
【０１２９】
参加者が適格基準（血液および組織区画の総量に＞１０６、＞１０７、＞１０８個の、レンチウイルス形質導入、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を有することを含む）を満たす場合、彼らは有効性の研究に移ってよい。参加者が適格基準を満たしていない場合、同じプロトコールを使用して療法用レンチウイルスの２回目の投与を受けることができるようにしてもよい。
【０１３０】
さらなる研究およびバイオアッセイ。形質導入されたＴ細胞注入の３０〜６０日後に適格参加者のために、遺伝子治療の有効性を試験することを開始する。最初に、彼らの既存のｃＡＲＴレジメンにＣＣＲ５を標的とした治療法を加える。これは、Ｔ細胞上のＣＣＲ５受容体密度を低下させるＣＣＲ５遮断薬マラビロクまたは免疫抑制薬ラパマイシンであってもよい。療法用レンチウイルスもまたＣＣＲ５を標的とし、レンチウイルスとマラビロクまたはラパマイシンの併用効果は、ＨＩＶ複製を維持するのに必要なレベルよりも下にＣＣＲ５を低下させるはずである。
【０１３１】
マラビロクまたはラパマイシンを添加して２週間後に、ｃＡＲＴ療法を中止し、参加者のＨＩＶウイルスのリバウンドを念入りにモニターする。リバウンドした場合には、ｃＡＲＴは彼らの担当医によって再導入され、管理される。
【０１３２】
ＨＩＶウイルスがリバウンドしない場合、治療が中止されるまで、マラビロクまたはラパマイシンのステップダウンが２週間間隔で開始される。
【０１３３】
ウイルス血症が１２〜２６週間以内に戻らない場合、参加者がＨＩＶの機能的治癒を達成したことになる。
【０１３４】
ＨＩＶ特異的、レンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞の数を治療有効性（潜伏ＨＩＶ感染または他のマーカーを有する細胞の頻度を含む）に関連付ける値のデータベースは、他の遺伝子治療プロトコールを判定することができるゴールドスタンダードを確立し得る。
（実施例２）
抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発
【０１３５】
この実施例の目的は、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターを開発することであった。
【０１３６】
阻害性ＲＮＡデザイン：ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ケモカインＣ−Ｃモチーフ受容体５（ＣＣＲ５）（ＧＣ０３Ｐ０４６３７７）ｍＲＮＡの配列を使用して、ヒト細胞のＣＣＲ５レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探索した。潜在的ＲＮＡ干渉配列は、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒによって選択された候補から選んだ。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのすぐ３’側へ、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ構築物を使用して、細胞に形質導入し、特異的ｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを減少させるために最も強力なｓｈＲＮＡは、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にするために、マイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込んだ。マイクロＲＮＡ骨格はmirbase.org/から選択された。ＲＮＡ配列はまた、合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成され、レンチウイルスベクターを使用せずに直接細胞内に導入された。
【０１３７】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１  ８５ＵＳ＿ＢａＬ、受託番号ＡＹ７１３４０９）のＢａｌ株のゲノム配列を使用して、ヒト細胞におけるＨＩＶ複製レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探索した。配列相同性および経験に基づいて、ＨＩＶのＴａｔおよびＶｉｆ遺伝子の領域に探索の焦点を合わせたが、当業者はこれらの領域の使用が非限定的であり、他の潜在的な標的が選択され得ることを理解し得る。Ｇａｇまたはポリメラーゼ遺伝子の高保存領域は、これらの同配列がベクター製造に必要なパッケージングシステム相補性プラスミドに存在したため、ｓｈＲＮＡによって標的化することができなかった。ＣＣＲ５（ＮＭ  ０００５７９．３、ＮＭ  ００１１００１６８．１特異的ＲＮＡ）と同様に、潜在的なＨＩＶ特異的ＲＮＡ干渉配列は、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（broadinstitute.org/mai/public）が主催するＧｅｎｅ−ＥソフトウェアスイートからなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（rnadesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=6712627360706061801）によって選択された候補から選択された。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのすぐ３’側へ、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ構築物を使用して、細胞に形質導入し、特異的ｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを減少させるために最も強力なｓｈＲＮＡは、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にするために、マイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込んだ。
【０１３８】
ベクター構築：ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ  ｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチド配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ，ＬＬＣによって合成された。オーバーラップするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温まで冷却する間にアニールさせた。レンチウイルスベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで、３７℃で１時間、消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動で精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクター対オリゴ（３：１の比）を混合し、アニールさせ、ライゲーションした。ライゲーション反応はＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間実施した。２．５マイクロリットルのライゲーションミックスを２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテントバクテリア細胞に添加した。形質転換は、４２℃でのヒートショック後に達成された。アンピシリンを含有する寒天プレート上にバクテリア細胞を広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、精製し、ＬＢブロスで増殖させた。オリゴ配列の挿入をチェックするために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いて、収穫した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中のｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用されるプロモーターのための特異的プライマーを使用したＤＮＡ配列決定によって確認した。ＨＩＶ複製を制限することが公知である例示的なベクター配列および細胞エレメントは、それぞれ図４および９において見出すことができる。
【０１３９】
例えば、ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ遺伝子発現に対して最も高い活性を有するｓｈＲＮＡ配列を、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下でマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）クラスターに組み入れた。プロモーターおよびｍｉＲ配列を図４に示す。
【０１４０】
機能アッセイ：ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ  ｓｈＲＮＡ配列を含み、実験目的のために、ＣＭＶ即時型初期プロモーター（CMV Immediate Early Promoter）の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰと命名された個々のレンチウイルスベクターを、ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ発現をノックダウンする能力について試験した。ポリブレンの存在下または非存在下で、レンチウイルス粒子を哺乳動物細胞に形質導入した。細胞を２〜４日後に集めた；タンパク質およびＲＮＡをＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ発現について分析した。ウェスタンブロットアッセイまたは細胞を特異的蛍光抗体で標識すること（ＣＣＲ５アッセイ）によって、続いてＣＣＲ５特異的抗体またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを使用して改変および非改変細胞の蛍光を比較する分析フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルを試験した。
【０１４１】
レンチウイルスの試験の開始：１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０を使用して、Ｔ細胞培養培地を作製した。ＩＬ２  １００００ユニット／ｍｌ、ＩＬ１２  １μｇ／ｍｌ、ＩＬ７  １μｇ／ｍｌ、ＩＬ１５  １μｇ／ｍｌのサイトカインストックもまた、前もって調製した。
【０１４２】
レンチウイルスの形質導入の前に、感染性ウイルス力価を決定し、適切な感染多重度（ＭＯＩ）のために加えるウイルス量を計算するために使用した。
【０１４３】
０〜１２日目：抗原特異的濃縮：０日目に、凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃の培地１０ｍｌで１２００ｒｐｍにて１０分間洗浄し、３７℃の培地中で２×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。３７℃で５％ＣＯ２中に、２４ウェルプレート内で０．５ｍｌ／ウェルで細胞を培養した。最適刺激条件を定義するために、以下の表２に列挙される試薬の組合せで細胞を刺激した：
【表２】
2018524335.tif 000004
【０１４４】
最終濃度：ＩＬ２＝２０ユニット／ｍｌ、ＩＬ１２＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ７＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ１５＝１０ｎｇ／ｍｌ、ペプチド＝５μｇ／ｍｌ  個々のペプチド、ＭＶＡ  ＭＯＩ＝１。
【０１４５】
４および８日目に、０．５ｍｌの新鮮な培地および列挙された濃度（すべての濃度は培養物中の最終濃度を示す）でのサイトカインを刺激された細胞に添加した。
【０１４６】
１２〜２４日目：非特異的な増殖およびレンチウイルスの形質導入：１２日目に、刺激された細胞をピペットでプレートから取り出し、新鮮なＴ細胞培地に１×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。再懸濁した細胞をＴ２５培養フラスコに移し、製造業者の取扱説明書に従ってＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８および上に列挙したサイトカインで刺激した；フラスコを垂直位置でインキュベートした。
【０１４７】
１４日目に、ＡＧＴ  １０３／ＣＭＶ−ＧＦＰをＭＯＩ  ２０で加え、培養物をインキュベーターに２日間で戻した。この時点で、細胞をピペッティングにより回収し、１３００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって集め、同じ容量の新鮮な培地に再懸濁し、再び遠心分離して緩やかな細胞ペレットを形成した。その細胞ペレットを、前のステップで使用したのと同じサイトカインを含む新鮮な培地に、１ｍｌあたり０．５×１０６個の生存可能な細胞で再懸濁した。
【０１４８】
１４〜２３日目まで、２日ごとに細胞の数を評価し、細胞を新鮮な培地で０．５×１０６個／ｍ１に希釈した。サイトカインは毎回、添加された。
【０１４９】
２４日目に細胞を集め、ビーズを細胞から除去した。ビーズを除去するために、細胞を適切なチューブに移し、ソーティング・マグネット（sorting magnet）中に２分間置いた。細胞を含む上清を新しいチューブに移した。その後、新鮮な培地中で１日間、１ｘ１０６個／ｍｌで細胞を培養した。抗原特異的Ｔ細胞およびレンチウイルス形質導入細胞の頻度を決定するためにアッセイを実施した。
【０１５０】
起こり得るウイルスの増殖を阻止するために、刺激の初日および培養中の隔日にアンプレナビル（amprenavir；０．５ｎｇ／ｍｌ）を培養物に添加した。
【０１５１】
ＩＦＮ−ガンマについての細胞内サイトカイン染色により抗原特異的Ｔ細胞を調べる：ペプチド刺激後または１ｘ１０６細胞／ｍｌでのレンチウイルス形質導入後の培養細胞を培地単独（陰性対照）、Ｇａｇペプチド（５μｇ／ｍｌの個々のペプチド）、またはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ、陽性対照）で刺激した。４時間後、ＢＤ  ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ（商標）（１：１０００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して、ゴルジ輸送を遮断した。８時間後、細胞を洗浄し、製造業者の取扱説明書に従ってＢＤ  ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）キットを用いて、細胞外（ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体および細胞内（ＩＦＮ−ガンマ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で染色した。試料をＢＤ  ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）フローサイトメーターで分析した。適切なアイソタイプ適合抗体で標識された対照試料を各々の実験に含めた。データは、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。
【０１５２】
レンチウイルスの形質導入率は、ＧＦＰ＋細胞の頻度によって決定した。形質導入された抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の頻度によって決定される；ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の試験は対照として含まれる。
【０１５３】
これらの結果は、標的Ｔ細胞集団であるＣＤ４  Ｔ細胞に、ＨＩＶ特異的タンパク質の発現を特異的にノックダウンするようにデザインされたレンチウイルスを用いて形質導入することができ、したがって、ウイルスに対して免疫性であるＴ細胞の増殖可能な集団を生成することを示す。この例は、ＨＩＶ患者において機能的治癒を生じさせるために、開示されたレンチウイルス構築物をワクチン接種と組み合わせて使用することができることを示す概念の証明となる。
（実施例３）
実験的ベクターでのＣＣＲ５ノックダウン
【０１５４】
ＡＧＴｃ１２０は、大量のＣＤ４およびＣＣＲ５を安定して発現するＨｅｌａ細胞株である。ＬＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣＭＶ即時型初期プロモーターの制御下で発現される赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて、または用いずに、ＡＧＴｃ１２０を用いて形質導入した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質の遺伝子発現は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター）発現カセットによって制御された。ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙがＣＣＲ５、ＶｉｆおよびＴａｔに対する療法用ｍｉＲＮＡを発現した一方で、ＬＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターはマイクロＲＮＡクラスターを欠いていた。
【０１５５】
図５Ａに示すように、形質導入効率は＞９０％であった。７日後、細胞を集め、ＣＣＲ５に対する蛍光モノクローナル抗体で染色し、分析フローサイトメトリーに供した。ＣＣＲ５  ＡＰＣの平均蛍光強度（ｘ軸）に対してモードについて規格化した細胞数（ｙ軸）をプロットしたこれらのヒストグラムにおいて、アイソタイプ対照を灰色で示す。細胞表面ＣＣＲ５の染色後、レンチウイルス無しまたは対照レンチウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙマーカーのみを発現する）で処理した細胞は、ＣＣＲ５密度の変化を示さなかった一方で、ＡＧＴ１０３（右側のセクション）はＣＣＲ５染色強度をほぼアイソタイプ対照のレベルまで低下させた。７日後、細胞をＲ５指向性ＨＩＶレポーターウイルスＢａｌ−ＧＦＰを用いてまたは用いずに感染させた。３日後、細胞を集め、フローサイトメトリーにより分析した。９０％を超える細胞が形質導入された。ＡＧＴ１０３−ＣＭＶ／ＣＭＶｍＣｈｅｒｒｙは、形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞におけるＣＣＲ５発現を低下させ、対照ベクターで処理した細胞と比較してＲ５指向性ＨＩＶ感染を遮断した。
【０１５６】
図５Ｂは、ＨＩＶの感染に対してのトランスフェクトされたＡＧＴｃ１２０細胞の相対非感受性を示す。上のように、レンチウイルスベクターはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現し、またＨＩＶに感染した形質導入細胞（ＧＦＰを発現する）は、偽色フローサイトメトリードットプロットの右上四分儀に二重陽性細胞として現れる。ＨＩＶが存在しない場合（上パネル）、いかなる条件下においてもＧＦＰ＋細胞は存在しなかった。ＨＩＶ感染後（下パネル）、レンチウイルス形質導入の非存在下では５６％の細胞が感染し、ＬＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞では５３．６％の細胞が感染した。療法用ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを用いて細胞に形質導入した場合、０．８３％の細胞のみが二重陽性四分儀に現れ、このことはそれらが形質導入され、感染したことを示している。
【０１５７】
５３．６２（対照ベクターとの二重陽性細胞の割合）を０．８３（療法用ベクターとの二重陽性細胞の割合）で割ると、ＡＧＴ１０３がこの実験システムにおいてＨＩＶに対して６５倍を超える防御を提供したことが示される。
（実施例４）
ＡＧＴ１０３はＴａｔおよびＶｉｆの発現を減少させる
【０１５８】
例示的ベクターＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを細胞にトランスフェクトした。ＡＧＴ１０３および他の例示的ベクターは、以下の表３に定義される。
【表３】
2018524335.tif 000005
【０１５９】
Ｔリンパ芽球様細胞株（ＣＥＭ；ＣＣＲＦ−ＣＥＭ；アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関カタログ番号ＣＣＬ１１９）にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを用いて形質導入した。４８時間後、ウイルス配列全体をコードするＨＩＶ発現プラスミドを細胞にトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを細胞から抽出し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用してインタクトなＴａｔ配列のレベルについて試験した。インタクトなＴａｔ  ＲＮＡの相対発現レベルは、図６に示すように、対照レンチウイルスベクターの存在下でのおよそ８５０から、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰの存在下でのおよそ２００に減少し、＞４倍減少した。
【０１６０】
同様の実験において、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓２９３Ｔ；アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関カタログ番号ＣＲＬ−３２１６）細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを用いて形質導入し、その後、形質導入の７日後に、ＨＩＶ発現プラスミドを細胞にトランスフェクトした（対照はＨＩＶをトランスフェクトされていない）。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、アクチン（細胞のローディング対照）またはＨＩＶ  Ｖｉｆタンパク質に特異的な抗体を使用してウェスタンブロットにより分析した。図７に示すように、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰ（右レーン）の存在は、Ｖｉｆタンパク質発現レベルの劇的な低下を引き起こした。
（実施例５）
ＨＩＶ特異性について濃縮され、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを用いて形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の生成
【０１６１】
ＨＩＶに対する療法用ワクチン接種は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布に最小限の影響しか及ぼさなかった。図８Ａに示されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞集団は、分析フローサイトメトリードットプロットの左上四分儀に示され、ワクチン接種系列後、全Ｔ細胞の５２％から５７％に変化する。これらは代表的なデータである。
【０１６２】
ＨＩＶ療法用ワクチン試験における参加者からの末梢血単核細胞を、＋／−インターロイキン−２／インターロイキン−１２または＋／−インターロイキン−７／インターロイキン−１５の培地で１２日間培養した。Ｔ細胞刺激のためのエピトープペプチドの供給源として、ＨＩＶ−１の全ｐ５５  Ｇａｇタンパク質（ＪＰＴ  ＰｅｐＭｉｘ）を表す重複ペプチドで、いくつかの培養物を刺激した。これらのペプチドは、長さが１０〜２０アミノ酸であり、その長さの２０〜５０％が重複しており、ＨＩＶ−１  ＢａＬ株由来のＧａｇ前駆体タンパク質（ｐ５５）全体を表す。個々のペプチドの組成および配列は、主な循環ＨＩＶ配列の領域変動を補償するために、または詳細な配列情報がこの療法を受けている個々の患者に利用可能である場合に、調整することができる。培養終了時に、細胞を回収し、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクローナル抗体で染色し、ＣＤ３＋集団をゲートし、ここに表示した。ワクチン接種前または接種後のいずれかの試料についてのＰｅｐＭｉｘ刺激は培地対照と同様であり、このことは、ＰｅｐＭｉｘが細胞に対して有毒ではなく、ポリクローナル分裂促進因子としては作用しなかったことを示している。この分析の結果は図８Ｂに見出すことができる。
【０１６３】
ＰｅｐＭｉｘおよびインターロイキン−２／インターロイキン−１２は、抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の最適な増殖のために提供された。図８Ｃの上のパネルに示されるように、ＰｅｐＭｉｘに曝露されたワクチン接種後検体において、サイトカイン（インターフェロン−ガンマ）分泌細胞の増加があった。ワクチン接種前の試料において、抗原ペプチドへの曝露の結果として、サイトカイン分泌細胞が０．４３から０．６９％まで増加した。対照的に、ワクチン接種後の試料は、ペプチド刺激の結果として、全ＣＤ４  Ｔ細胞の０．６２から１．７６％までのサイトカイン分泌細胞の増加を示した。これらのデータは、ＨＩＶ抗原に対するＣＤ４  Ｔ細胞応答におけるワクチン接種の強い影響を実証する。
【０１６４】
最後に、抗原増殖したＣＤ４  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰ形質導入は、ＨＩＶに対する機能的治癒の一部として患者に注入するために必要とされるＨＩＶ特異的およびＨＩＶ耐性ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞を産生した（他の様々な態様および実施形態に応じて、ＡＧＴ１０３は単独で、またはさらなる追加のエレメントなしで使用されてもよい；例えば、臨床実施形態はＣＭＶ−ＧＦＰセグメントを含まなくてもよい）。図８Ｄの上のパネルは、培養物中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団を分析した結果を示す。図８Ｄのｘ軸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）放出を示しており、このことは、個々の細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰが形質導入されたことを示している。ワクチン接種後の試料において、両方のサイトカイン分泌であった全ＣＤ４  Ｔ細胞の１．１１％が回収され、このことは、細胞がＨＩＶ抗原に特異的に応答し、これらの細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰが形質導入されることを示している。これは、ＨＩＶの注入および機能的治癒を意図した標的細胞集団および臨床産物である。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養の抗原刺激およびその後のポリクローナル増殖期の間の細胞増殖の効率で、４×１０８個の抗原特異的な、レンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞を産生することができる。これは、細胞産生の標的を４倍超えており、およそ４０細胞／マイクロリットルの血液またはおよそ５．７％の全循環ＣＤ４  Ｔ細胞の抗原特異的およびＨＩＶ耐性ＣＤ４  Ｔ細胞の数を達成することができるであろう。
【０１６５】
下の表４は、開示されたベクターおよび方法を使用した、ＨＩＶ特異的およびＨＩＶ耐性ＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける産生の結果を示す。
【表４】
2018524335.tif 000006
【０１６６】
上に本発明の好ましい実施形態についていくつか説明し、具体的に例示してきたが、本発明はそのような実施形態に限定されることを意図していない。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変をそこに施してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018524335.tif 000013
【図８ＡＢ】
2018524335.tif 000014
【図８ＣＤ】
2018524335.tif 000015
【図９−１】
2018524335.tif 000016
【図９−２】
2018524335.tif 000017
【図９−３】
2018524335.tif 000018
【図９−４】
2018524335.tif 000019
【図９−５】
2018524335.tif 000020
【図９−６】
2018524335.tif 000021
【図９−７】
2018524335.tif 000022
【図９−８】
2018524335.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月26日(2018.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018524335000001.app
【国際調査報告】
2018524335.tif 000024
2018524335.tif 000025
2018524335.tif 000026