(57)【要約】  本明細書において、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、前記微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされており、コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーにコンジュゲート化された分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、ここで、結合対の前記の第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、コンジュゲート化された分析物特異的結合剤を通じて、コーティングされた微粒子に分析物が結合し、結合対を通じて結合している分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そして微粒子に結合した分析物を測定する工程を含む、前記方法を報告する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、該微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされ
ａ）コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、
ここで、結合対の該第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、該分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、該分析物特異的結合剤を通じて、該コーティングされた微粒子に分析物が結合する
ｂ）結合対を通じて結合している分析物を含む該微粒子および該分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そして
ｃ）微粒子に結合した分析物を測定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記微粒子が直径５０ｎｍ〜２０μｍである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微粒子が常磁性であり、そして工程１（ｂ）の分離が磁力による、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記分析物特異的結合剤が少なくとも５０アミノ酸のポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記分析物特異的結合剤が最大１０，０００アミノ酸のポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記分析物特異的結合剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記分析物を競合アッセイ形式で測定する、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記分析物をサンドイッチアッセイ形式で測定する、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
微粒子に結合した分析物の前記測定が、電気化学発光標識の使用に基づく、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
結合対の前記の第一のパートナーが、それぞれ、アビジンおよび／またはストレプトアビジン、およびＦｉｍＧより選択され、そして結合対の前記の第二のパートナーが、それぞれ、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、およびＤｓＦより選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
結合対の前記の第一のパートナーがアビジンおよび／またはストレプトアビジンであり、そして結合対の前記の第二のパートナーがビオチンである、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
結合対の第二のパートナーに結合した前記のコンジュゲート化特異的結合剤が、組成物中に含まれ、前記組成物中、分析物特異的結合剤に結合した結合対の第二のパートナー間の平均モル比が１．１またはそれより大きい、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、少なくとも、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、および該結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤を含むキットであって、ここで結合対の該第二のパートナーが１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて該分析物特異的結合剤に結合している、前記キット。
【請求項１４】
結合対の前記の第一のパートナーがアビジンまたはストレプトアビジンであり、そして結合対の前記の第二のパートナーがビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンより選択される、請求項１３のキット。
【請求項１５】
別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、検出可能に標識された第二の分析物特異的結合剤をさらに含む、請求項１３または１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、前記微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされ、コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合することを含む、ここで、結合対の前記の第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、分析物特異的結合剤を通じて、コーティングされた微粒子に分析物が結合し、結合対を通じて結合している分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そして微粒子に結合した分析物を測定する工程を含む、前記方法に関する。
【発明の概要】
【０００２】
発明の背景
生化学的および生物学的試料において、関心対象の分析物の検出および定量化のため、多くの方法および系が開発されてきている。微量の微生物、薬剤、ホルモン、ウイルス、抗体、核酸および他のタンパク質を測定可能な方法および系は、研究者および臨床医にとって非常に価値がある。
【０００３】
多くのアッセイ法は、試料から関心対象の特定のターゲット分子を捕捉し、そしてターゲット分子の決定を可能にするために、分析物特異的結合剤を利用する。
当該技術分野のかなりのものが、結合反応、例えば抗原−抗体反応、核酸ハイブリダイゼーション技術、およびタンパク質−リガンド系に基づいて開発されてきている。多くの生化学的および生物学的結合系において、高い度合いの特異性によって、研究および診断において、多くの価値あるアッセイ法および系が導かれてきている。典型的には、関心対象の分析物の存在は、１またはそれより多い分析物特異的結合剤に付着した、観察可能な「標識」の存在または非存在によって示される。
【０００４】
アッセイ感度は、主に、非特異的結合現象によって限定される。したがって、主な困難は、非常に高感度であり、そして同時に、例えば探査されている試料液によって引き起こされる、高いバックグラウンドシグナルを本質的に被らないアッセイ技術を考案することである。非特異的結合は、典型的には、バックグラウンドシグナル増加、不正確な検出、およびより高い（より劣った）検出限界につながる。特に、非特異的結合は、複雑な生物学的マトリックス、例えばヒト血漿または血清試料を試料液として用いる場合に、さらにより困難になる。
【０００５】
近年、（例えば超常磁性）微粒子の使用に基づく、より正確で、そして高感度なアッセイが開発されてきている。特に、こうした粒子に基づくアッセイにおいて、非特異的シグナルへの重要な寄与は、粒子間相互作用および／または粒子−表面相互作用から生じる。
【０００６】
ＵＳ  ５，２１２，０６３は、ビオチン・コンジュゲートを利用したイムノアッセイによって、遊離ビオチンを含有する体液中の分析物の検出のためのプロセスを開示する。該文書は、コアからなり、そしてビオチンに関する複数の結合部位を有するポリマー、および被覆として、少なくとも一層のタンパク質を含有する、ポリマー微粒子に言及する。
【０００７】
ＷＯ  ２０１３／００１４４７は、シェル構造を含むコーティングを有する、あらかじめコーティングされた微粒子を記載し、ここで、前記シェル構造は、１またはそれより多いアフィニティ分子（すなわち分析物特異的結合剤）を含む第一の層、およびさらに、第一の層にカップリングした第二の層を含み、そして前記の第一および第二の層は、メッシュを形成する非アフィンスペーサー分子を含み、前記の１またはそれより多いアフィニティ分子は、コーティング構造内に包埋され、そして前記メッシュは、非特異的分子に対する立体障害を生じる。こうした特別に処理された／コーティングされた微粒子を用いて、非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを減少させることも可能である。
【０００８】
しかし、最も進歩したアッセイもなお、検出下限（ＬＯＤ）または測定範囲またはその両方のいずれかを損なう、非特異的結合障害をかなりのレベルで示す。試験開発者はしばしば、アッセイ感度、測定範囲およびアッセイ特異性の間で妥協しなければならない。同時に、試験は、迅速、高感度、定量的、正確、そしてさらに費用効率的である必要がある。さらに、試験を行おうとするプラットホームは、使用が容易で信頼性がある必要がある。
【０００９】
シグナル対バックグラウンド・ノイズ比を増加させることによって、アッセイを、そしてしたがってアッセイ感度を改善することが常に望ましい。アッセイのシグナルを増加させるとまた、装置にもいくつかの利点があり、これには：ｉ）より低い感受性の（そしてより安価な）検出系があればよく；ｉｉ）価値ある試料がより少量あればよく；ｉｉｉ）装置類を小型化して、より小さい装置および／または小さい領域で同時に多くのアッセイを実行するデバイスが可能になりうることが含まれる。
【００１０】
しかし、特に粒子に基づくアッセイにおいて、非特異的シグナルに対する重要な寄与は、粒子間相互作用および粒子−表面相互作用から生じる。
したがって、粒子に基づくアッセイ法を改善するための新規構造および方法を設計する必要がある。非常に多数の検出アッセイにおいて、限定要因である微粒子への非特異的結合および微粒子のクラスター形成を回避することへの強い要望がある。
【００１１】
驚くべきことに、現在、一方では結合対の１つのメンバーに、そして他方では分析物特異的結合剤に結合する、１２〜３０のポリエチレングリコール単位を含むリンカー分子が、微粒子が結合対の他方のメンバーでコーティングされている、微粒子に基づく結合アッセイにおいて、非常に好適に使用可能であることが見出されている。
【００１２】
発明の概要
微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、前記微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされ、ａ）コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、ここで、結合対の前記の第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、分析物特異的結合剤を通じて、コーティングされた微粒子に分析物が結合し、ｂ）結合対を通じて結合している分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そしてｃ）微粒子に結合した分析物を測定する工程を含む、前記方法を開示する。
【００１３】
別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、少なくとも、結合対の第一のメンバーでコーティングされた微粒子、およびこの結合対の第二のメンバーに結合した分析物特異的結合剤を含み、前記結合対の前記の第二のメンバーが１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて前記の分析物特異的結合剤に結合している、キットもまた開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】現状技術のリンカーを通じて、いくつかのビオチン部分（Ｂｉ）に結合し、そして異なるビーズ上のストレプトアビジン分子に結合する（ビーズを架橋する）、分析物特異的結合剤によって引き起こされるビーズ凝集の模式図。
【図２】１２〜３０の間のエチレングリコール単位を含むリンカーを通じて、いくつかのビオチン部分（Ｂｉ）に結合し、そして同じビーズ上のストレプトアビジン分子に結合する（ビーズを架橋する）、分析物特異的結合剤の使用による、ビーズ凝集非存在の模式図。
【図３】ビオチン化のため、ビオチン−ＤＤＳを用いた、実験ＨＣＶコア抗原アッセイで得られるような自動化ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）の測定（作業）電極上のビーズのパターン：上列の２つの図は、陰性または対照試料におけるビーズ分布に相当する。下列の２つの図は、ＨＣＶ陽性試料におけるビーズ分布に相当する。左側の２つの図は、モノビオチン化抗体を用いたビーズ分布に相当する。右側の２つの図は、コンジュゲート調製において、抗体あたり３．５当量のビオチン化試薬を用いることによって得られたコンジュゲート調製物を用いた、ビーズ分布に相当する。右側の図から明らかであるように、ビーズ分布は非常に不均等で／妨害されており、大部分のビーズは電極の左部分にある。
【図４】ビオチン化のため、ビオチン−ＰＥＧ２４−ＮＨＳを用いた、実験ＨＣＶコア抗原アッセイで得られるような自動化ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）の測定（作業）電極上のビーズのパターン：上列の２つの図は、陰性または対照試料におけるビーズ分布に相当する。下列の２つの図は、ＨＣＶ陽性試料におけるビーズ分布に相当する。左側の２つの図は、モノビオチン化抗体を用いたビーズ分布に相当する。右側の２つの図は、コンジュゲート調製において、抗体あたり５当量のビオチン化試薬を用いることによって得られたコンジュゲート調製物を用いた、ビーズ分布に相当する。抗体あたりのビオチン化試薬の比がこのように高くても、ビーズは、電極上で均一な分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１つの態様において、本開示は、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、前記微粒子が、結合対の第一のパートナーでコーティングされ、ａ）コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、ここで、結合対の前記の第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、分析物特異的結合剤を通じて、コーティングされた微粒子に分析物が結合する、ｂ）結合対を通じて結合している分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そしてｃ）微粒子に結合した分析物を測定する工程を含む、前記方法に関する。
【００１６】
粒子に基づく分析物特異的結合アッセイは、例えば、非常に多様な標識または検出技術を使用する、特定のネフェロ分析アッセイ、特定のラテックス凝集アッセイおよび多くの高感度サンドイッチ型アッセイにおいて広く用いられる。
【００１７】
「粒子」は、本明細書において、体積、質量または平均サイズなどの物理的特性に起因（ａｓｃｒｉｂｅ）しうる、小さい局在化物体を意味する。微粒子は、したがって、対称的、球形、本質的に球形または球状のものであってもよく、あるいは不規則な非対称的形状または型であってもよい。本発明によって想定される粒子のサイズは多様でありうる。１つの態様において、球状、例えばナノメートルおよびマイクロメートル範囲の直径を持つ微粒子を用いる。１つの態様において、本開示にしたがった方法で用いられる微粒子は、５０ナノメートル〜２０マイクロメートルの直径を有する。さらなる態様において、微粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍの直径を有する。１つの態様において、本開示にしたがった方法で用いられる微粒子は、２００ｎｍ〜５μｍまたは７５０ｎｍ〜５μｍの直径を有する。
【００１８】
本明細書において上に定義するような微粒子は、当業者に知られる任意の適切な材料を含むかまたはこうした材料からなるものであってよく、例えばこれらは、無機または有機材料を含むか、あるいはこれらからなるかまたは本質的になるものであってもよい。典型的には、これらは、金属もしくは金属合金、または有機材料を含むか、またはこれらからなるかもしくは本質的になるものであってよく、あるいは炭水化物要素を含むか、またはこれらからなるかもしくは本質的になるものであってもよい。微粒子の想定される材料の例には、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカおよび強磁性金属、合金または組成材料が含まれる。１つの態様において、微粒子は、磁気または強磁性金属、合金または組成である。さらなる態様において、材料は、特定の特性を有してもよく、そして例えば疎水性または親水性であってもよい。こうした微粒子は、典型的には水溶液中に分散しており、そして小さい陰性表面電荷を保持し、微粒子を分離したままにし、そして非特異的クラスター形成を回避する。
【００１９】
本発明の１つの態様において、微粒子は常磁性微粒子であり、そして本開示にしたがった測定法におけるこうした粒子の分離は、磁力によって促進される。磁力を適用して、常磁性または磁性粒子を溶液／懸濁物から引っ張り、そして望ましいように保持しながら、溶液／懸濁物の液体を除去することも可能であり、そして粒子を例えば洗浄することも可能である。
【００２０】
本発明にしたがった方法において用いられる微粒子は、特異的結合対の第一のメンバーでコーティングされる。
「結合対」は、本明細書において、高アフィニティで、すなわち１ナノモルアフィニティまたはそれより優れたアフィニティで、互いに結合する２つのパートナーからなる。結合対に関する態様は、例えば、受容体およびリガンド、ハプテンおよび抗ハプテン抗体、ならびに天然存在高アフィニティ結合対に基づく結合対からなる結合対である。
【００２１】
受容体−リガンド結合対の１つの例は、ステロイドホルモン受容体および対応するステロイドホルモンからなる対である。
本発明記載の方法に適した結合対の１つのタイプは、ハプテンおよび抗ハプテン抗体結合対である。ハプテンは、１００〜２０００ダルトン、好ましくは１５０〜１０００ダルトンの分子量の有機分子である。こうした小分子は、これをキャリアー分子にカップリングさせることで免疫原性を与えられることも可能であり、そして標準法にしたがって、抗ハプテン抗体を生成することも可能である。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド配糖体を含む群より選択可能である。これらの物質クラスの代表は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、およびストロファンチンである。別の適切なハプテンは、例えばフルオレセインである。
【００２２】
天然存在高アフィニティ結合対に基づく結合対の例は、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、およびアビジンまたはストレプトアビジン、ならびにＦｉｍＧおよびＤｓＦ結合対である。ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対は、当該技術分野に周知である。ＦｉｍＧ−ＤｓＦ結合対の基本的原理は、例えばＷＯ２０１２／０２８６９７に記載される。
【００２３】
１つの態様において、結合対は、ハプテンおよび抗ハプテン抗体、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＦｉｍＧおよびＤｓＦ、ならびに受容体およびリガンドより選択される。
【００２４】
１つの態様において、結合対は、ハプテンおよび抗ハプテン抗体およびビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、ＦｉｍＧおよびＤｓＦより選択される。
【００２５】
１つの態様において、結合対はビオチン（またはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン）およびアビジンまたはストレプトアビジンである。
【００２６】
１つの態様において、結合対は、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる。
１つの態様において、本発明にしたがった結合対は、１０ｋＤまたはそれより多い分子量を有するこうした結合対の第一のパートナー、および１ｋＤまたはそれより少ない分子量を有するこうした結合対の第二のパートナーからなる。上に示すように、１つの態様において、１０ｋＤまたはそれより多い分子量を有する、結合対の第一のパートナーは、本開示にしたがった方法で用いられる微粒子に結合する（該微粒子をコーティングする）。
【００２７】
１つの態様において、本開示にしたがった微粒子に基づく方法において、結合対の前記の第一のパートナーは、それぞれ、アビジンおよび／またはストレプトアビジン、およびＦｉｍＧより選択され、そして結合対の前記の第二のパートナーは、それぞれ、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、およびＤｓＦより選択される。
【００２８】
１つの態様において、本開示にしたがった微粒子に基づく方法において、結合対の前記の第一のパートナーはアビジンおよび／またはストレプトアビジンであり、そして結合対の前記の第二のパートナーはビオチンである。
【００２９】
本発明にしたがった方法において用いられる微粒子は、結合対の第一のパートナーで「コーティング」される。こうしたコーティングは、当該技術分野の方法にしたがって行われる。結合対の第一のパートナーは、吸着によって、共有結合によって、または両方の方法の組み合わせで、粒子表面に結合させることも可能である。微粒子を、場合によって、例えばウシ血清アルブミンのようなタンパク質とさらにインキュベーションして、他のアッセイ要素の非特異的結合を減少させることも可能である。当業者は、非特異的結合のこうした場合によるブロッキングのために用いられる方法をよく知っている。当該技術分野に用いられる用語法と一致して、こうしたコーティングおよびブロッキングされた微粒子もまた、単にコーティング微粒子と称される。
【００３０】
結合対の第一のパートナーの分子は、微粒子上にごく近接して存在し、この結合対の第二のパートナーに、多くの近傍の結合部位を提供する。大部分の現実的／ルーチン適用のため、結合対の第一のパートナーは、飽和濃度で微粒子にコーティングされ、最適コーティング密度を生じる。当業者が認識するように、コーティング密度は、望ましい場合、結合対の第一のパートナーの最適以下の濃度を用いることによって減少させうる。結合対の第一のパートナーの最適以下の濃度がコーティングに用いられる場合、当業者は、結合対の第二のパートナーに分析物特異的結合剤を結合させるために用いられるリンカーの長さにマッチするように、平均コーティング密度を選択するであろう。一般的な条件において：コーティングされた微粒子上の結合対の第一のパートナーの分子間の平均的な距離は、結合対の第二のパートナーに分析物特異的結合剤を結合させるために用いられるリンカーの長さの最大二倍であろう。距離は、これによって、１つの分子の中心から別の分子の中心までである。例えば：ポリエチレングリコール単位の平均の長さは、約０．３８ｎｍである。したがって、１２  ＰＥＧ単位を有するリンカーは、長さ約４．５ｎｍを有する。同じ微粒子上で、結合対の第二のパートナーの分子が、前記結合対の第一のパートナーに結合することを可能にするためには、粒子上の結合対の第一のパートナーの分子間の平均距離は、９ｎｍまたはそれ未満であろう。１つの態様において、結合対の第一のパートナー分子の平均距離は、９ｎｍまたはそれ未満である。１つの態様において、結合対の第一のパートナー分子の平均距離は、それぞれ、９ｎｍまたは８ｎｍである。１つの態様において、結合対の第一のパートナーの飽和濃度でコーティングされた微粒子を用いる。
【００３１】
「分析物」または「関心対象の分析物」または「ターゲット分子」は、分析物特異的結合剤によって結合可能な任意の分子であることも可能である。１つの態様において、本発明の文脈の分析物は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、ペプチド、タンパク質、薬剤分子、ホルモンまたはビタミンである。１つの態様において、本発明の文脈の分析物は、ペプチド、タンパク質、薬剤分子、ホルモンまたはビタミンである。
【００３２】
本開示にしたがった方法において、分析物の特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための方法で、液体試料が使用可能である。試料は、分析物を含むことが知られていてもよいし、または分析物を含むと推測されてもよい。１つの態様において、本開示にしたがった方法で用いられるｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための試料は、全血、血清、血漿、髄液（ｌｉｑｕｏｒ）、尿または唾液より選択される体液である。１つの態様において、分析物を含むと推測されるかまたは含む試料は、血清、血漿または髄液である。１つの態様において、分析物を含むと推測されるかまたは含む試料は、血清または血漿である。
【００３３】
本開示にしたがった分析物の測定のための方法は、分析物特異的結合剤を利用する。用語「分析物特異的結合剤」は、関心対象の分析物に特異的に結合する分子を指す。本開示の意味における分析物特異的結合剤は、典型的には、分析物（他の用語は、関心対象の分析物；ターゲット分子）に結合可能な結合または捕捉分子を含む。１つの態様において、分析物特異的結合剤は、対応するターゲット分子、すなわち分析物に対して、少なくとも１０７ｌ／ｍｏｌのアフィニティを有する。他の態様において、分析物特異的結合剤は、そのターゲット分子に対して、１０８ｌ／ｍｏｌまたはさらに１０９ｌ／ｍｏｌのアフィニティを有する。当業者が認識するであろうように、用語「特異的」は、試料中に存在する他の生体分子が、分析物に特異的な結合剤に有意に結合しないことを示すために用いられる。いくつかの態様において、ターゲット分子以外の生体分子に結合するレベルは、ターゲット分子のアフィニティのわずか１０％、より好ましくはわずか５％またはそれ未満である結合アフィニティを生じる。１つの態様において、分析物以外の他の分子に対する結合アフィニティは測定不能である。１つの態様において、分析物特異的結合剤は、アフィニティならびに特異性両方に対する最低基準以上を満たすであろう。
【００３４】
１つの態様において、分析物特異的結合剤は、アプタマー、ペプチドアプタマー、タンパク質、オリゴヌクレオチド、および分子インプリンティングポリマーからなる群より選択される。
【００３５】
分析物特異的結合剤の文脈で用いられる「アプタマー」は、短い核酸分子、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡまたはＡＮＡ分子、あるいは分析物に結合可能な当業者に知られる任意の他の適切な核酸形式であってもよい。
【００３６】
ペプチドアプタマーは、特定のアミノ酸配列を含むタンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）またはペプチド（単数または複数）に特異的に結合可能なアプタマーである。典型的には、ペプチドアプタマーは、例えば１０〜２０アミノ酸を含む、ペプチドループを有する。本開示の背景において、ペプチドアプタマーは、特定の態様において、足場構造に一端または両端が付着していてもよい。足場構造は、任意の分子、好ましくはタンパク質、例えば優れた溶解特性を有するタンパク質であってもよい。適切な足場分子は、当業者に知られるであろう。適切な足場分子の例は、それぞれ、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａ、およびＦｋｐＡまたはＳｌｙＤシャペロンに基づく。アプタマー・ペプチドループは、好ましくは、足場分子の還元活性部位内に挿入されてもよい。あるいは、スタフィロコッカス・プロテインＡおよびそのドメインおよびこれらのドメインの誘導体、例えばプロテインＺまたはリポカリンをペプチドアプタマーとして用いてもよい。
【００３７】
核酸またはペプチドアプタマーは、当業者に知られる任意の適切な方法にしたがって、例えばＰＣＲまたは分子合成アプローチまたは酵母２ハイブリッドアプローチを通じて、生成可能である。
【００３８】
「ペプチド」は、分析物特異的結合剤の文脈で用いた場合、２〜４９アミノ酸、アミノ酸誘導体またはその混合物のストレッチを含むかまたはあるいはこうしたストレッチからなることも可能である。ペプチドは、直鎖、分枝鎖、環状鎖またはその混合物であってもよい。ペプチド性分析物特異的結合剤はまた、本明細書において上に定義するような足場構造に付着していてもよい。
【００３９】
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、分析物特異的結合剤の文脈で用いた場合、約５０より多いアミノ酸、アミノ酸誘導体またはその混合物のストレッチを含むかまたはあるいはこうしたストレッチからなることも可能である。タンパク質は、直鎖、分枝鎖、および環状型であってもよいし、またはこれらの型の混合物で構成されてもよい。
【００４０】
１つの態様において、分析物特異的結合剤は、少なくとも５０アミノ酸のポリペプチドである。理論において、分析物特異的結合剤のポリペプチドの長さに上限はないが、１つの態様において、ポリペプチドは最大１０，０００アミノ酸を有するであろう。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」は、分析物特異的結合剤の文脈で用いた場合、１０〜１２０ヌクレオチド、または１２〜６０、または１５〜４０ヌクレオチドのストレッチを含むかまたはあるいはこうしたストレッチからなることも可能である。
【００４２】
オリゴヌクレオチド分析物特異的結合剤は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、あるいは両方の混合物であることも可能である。
用語「分子インプリンティングポリマー」は、本明細書において、その後、抽出される分子の存在下で形成され、後に相補的空洞（インプリント）を残すポリマーを指す。典型的には、分子インプリンティングポリマーは、元来の分子に対する特定の化学的アフィニティを示す。分子インプリンティングポリマーは、当業者に知られる任意の適切なポリマー性単位で構成されることも可能である。その産生のための技術には、バルク、沈殿物、エマルジョン、懸濁物、分散物、ゲル化、多工程膨張重合および階層的インプリンティング法などの重合技術が含まれる。
【００４３】
「抗体」は、分析物特異的結合剤の文脈で用いた場合、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分（断片）、すなわち抗体または分析物に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。本発明にしたがった方法で用いられる免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。抗体は、認識し、または特異的に結合するポリペプチドのエピトープ（単数または複数）または部分（単数または複数）の観点から、記載または明記可能である。特異的エピトープおよび抗体とのその相互作用が、当業者に知られるであろう。
【００４４】
用語「分析物特異的結合」は、抗体の背景で用いた際、分析物上のエピトープへの抗体の免疫特異的結合を指す。分析物上のエピトープを通じた抗体の分析物特異的結合の概念は、当業者には十分に明らかである。
【００４５】
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、少なくとも２つの異なる抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および望ましい生物学的活性を示す限り、抗体断片を含む。また、抗体は、本開示の意味において、１またはそれより多い他のタンパク質またはペプチドと抗体の共有または非共有会合によって形成される、より大きい融合分子の一部であってもよい。
【００４６】
「単離」抗体は、同定され、そして分離され、そして／または天然環境の構成要素から回収されているものである。その天然環境の混入構成要素は、抗体に関する研究、診断または療法的使用に干渉するであろう物質であり、そしてこれには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれうる。いくつかの態様において、抗体は、抗体重量の９５％より高くまで精製され、そしていくつかの態様において、例えばクーマシーブルーまたは銀染色を用いて、還元または非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される際、９９％より高くまで精製される。
【００４７】
免疫グロブリンＧクラスの抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリン・アイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に空間を空けられた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そしてもう一方の端に定常ドメインを有する；軽鎖定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、そして軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。
【００４８】
抗体「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは、一般的に、抗体の最も可変性の部分であり、そして抗原結合部位を含有する。
【００４９】
用語「可変」は、抗体の中の配列において、可変ドメインの特定の部分が大規模に異なり、そして特定の抗原に対する特定の抗体各々の結合および特異性において用いられるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。これは、軽鎖および重鎖可変ドメイン両方において、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに濃縮されている。可変ドメインのより保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、大部分ベータシート立体配置を採用する４つのＦＲ領域を含み、ＦＲ領域は３つのＨＶＲによって連結され、ＨＶＲはループ連結を形成し、そしていくつかの場合、ベータシート構造の一部を形成している。各鎖中のＨＶＲは、ＦＲ領域によってともに近接して保持され、そして他の鎖由来のＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  メリーランド州ベセスダ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、多様なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与を示す。
【００５０】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに別個のタイプの１つに割り当て可能である。
【００５１】
本発明にしたがった方法で用いられる抗体は、任意の動物起源であってもよい。１つの態様において、抗体は、ヒト、ネズミ（例えばマウスおよびラット）、ロバ、サル、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ抗体である。
【００５２】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当て可能である。５つの主なクラスのヒト免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分割可能である。免疫グロブリンの異なるクラスに対する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知であり、そして一般的に、例えばＡｂｂａｓら，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第４版（Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｃｏ．（２０００））に記載される。抗体は、抗体と１またはそれより多い他のタンパク質またはペプチドの共有または非共有会合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。
【００５３】
用語「全長抗体」、「損なわれていない抗体」、および「全抗体」は、本明細書において、交換可能に用いられ、以下に定義するような抗体断片ではない、実質的に損なわれていない型の抗体を指す。該用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を含む抗体を指す。
【００５４】
「抗体断片」は、損なわれていない抗体の部分を含み、好ましくは、その抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；一本鎖抗体分子；ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２；ディアボディ；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００５５】
抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、およびその名前が容易に結晶化する能力を反映する、残りの「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原組み合わせ部位を有し、そしてなお抗原を架橋することが可能である、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００５６】
Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖可変ドメインを含有し、そしてまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１またはそれより多いシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加される点がＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が、未結合チオール基を所持するＦａｂ’を指す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、その間にヒンジ・システインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られる。
【００５７】
「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。１つの態様において、二鎖Ｆｖ種は、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインが緊密に非共有会合している二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二鎖Ｆｖ種（ｓｃ（Ｆｖ）２）におけるものと類似の「二量体」構造で会合可能であるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されうる。この立体配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体表面上の抗原結合部位を定義する。総合すると、６つのＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）は、全結合部位より低いアフィニティではあるが、抗原を認識しそしてこれに結合する能力を有する。
【００５８】
用語「ディアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対形成するよう強いられ、そして２つの抗原結合部位を生成する。ディアボディは二価または二重特異性であってもよい。ディアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４０９７；  ＷＯ  １９９３／０１１６１；  Ｈｕｄｓｏｎら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載される。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４（２００３）に記載される。
【００５９】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在する可能性がある、ありうる突然変異、例えば天然存在突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性が、別個の抗体の混合物ではないことを示す。特定の態様において、こうしたモノクローナル抗体には、典型的には、ターゲットに結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、ここでターゲット結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの、単一のターゲット結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールからの、ユニークなクローンの選択であってもよい。選択されるターゲット結合配列をさらに改変して、例えばターゲットに対するアフィニティを改善し、ターゲット結合配列をヒト化し、細胞培養における産生を改善し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を減少させ、多重特異性抗体を生成する等が可能であり、そして改変されたターゲット結合配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定要因（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していない点が好都合である。
【００６０】
修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の性質を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするようには見なされない。例えば、本発明にしたがって用いようとするモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−９７（１９７５）；  Ｈｏｎｇｏら，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，  １４（３）：２５３−２６０（１９９５），  Ｈａｒｌｏｗら，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版  １９８８）；  Ｈａｅｍｍｅｒｌｉｎｇら，  ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ中  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；  Ｍａｒｋｓら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９２）；  Ｓｉｄｈｕら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；  Ｌｅｅら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照されたい）、および動物において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部またはすべてを有する、ヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ  １９９８／２４８９３；  ＷＯ  １９９６／３４０９６；  ＷＯ  １９９６／３３７３５；  ＷＯ  １９９１／１０７４１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；  Ｍａｒｋｓら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：８４５−８５１（１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）を含む、多様な技術によって作製可能である。
【００６１】
本明細書のモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する一方、鎖（単数または複数）の残りが、別の種由来の抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する、「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、こうした抗体の断片が含まれる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，  ＰＮＡＳ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば関心対象の抗原でマカクザル（ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｎｋｅｙ）を免疫することによって産生される抗体から得られる、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれる。
【００６２】
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。１つの態様において、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、アフィニティ、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに精錬するために行われうる。一般的に、ヒト化抗体は、すべてのまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてすべてのまたは実質的にすべてのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合によって、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｊｏｎｅｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：１０５−１１５（１９９８）；  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；  ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：４２８−４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号を参照されたい。
【００６３】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を所持し、そして／または本明細書に開示するようなヒト抗体を作製するための技術いずれかを用いて作製されているものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野に知られる多様な技術を用いて産生可能である。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：３８１（１９９２）；  Ｍａｒｋｓら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１（１９９１）。やはりヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能であるのは、Ｃｏｌｅら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．７７（１９８５）；  Ｂｏｅｒｎｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される方法である。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ５：３６８−７４（２００１）もまた参照されたい。抗原曝露に反応してこうした抗体を産生するよう修飾されているが、内因性遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物、例えば免疫ゼノマウスに抗原を投与することによって、ヒト抗体を調製してもよい（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関しては、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を通じて生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  １０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照されたい。
【００６４】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、本明細書において、配列中において超可変性であり、そして／または構造的に定義されるループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。天然抗体において、Ｈ３およびＬ３は、６つのＨＶＲで最大の多様性を示し、そしてＨ３は特に抗体に細かい特異性を与えることにおいてユニークな役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕら  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）；  ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中  ２４８：１−２５（Ｌｏ監修，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー州トトワ，  ２００３）を参照されたい。実際、重鎖のみからなる天然存在ラクダ科抗体は、軽鎖の非存在下で機能性であり、そして安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）およびＳｈｅｒｉｆｆら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００６５】
いくつかのＨＶＲ描写が用いられ、そして本明細書に含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列変動に基づき、そして最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  メリーランド州ベセスダ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、そうではなく、構造ループの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の妥協に相当し、そしてＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲ各々の残基を以下に示す。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
ＨＶＲは、以下のような「拡張ＨＶＲ」を含んでもよい：ＶＬにおいて、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびに、ＶＨにおいて、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、および９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの拡張ＨＶＲ定義各々に関して、Ｋａｂａｔら、上記にしたがって番号付けされる。
【００６８】
表現「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位番号付け」およびその変形は、Ｋａｂａｔら、上記における抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに関して用いられる番号付け系を指す。この番号付け系を用いると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはこれらへの挿入に対応する、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含有することも可能である。例えば、重鎖可変ドメインには、Ｈ２の残基５２の後に、単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔにしたがった残基５２ａ）が、そして重鎖ＦＲ残基８２の後に、挿入される残基（例えばＫａｂａｔにしたがった残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ等）が含まれることも可能である。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列と抗体配列の相同性領域での整列によって、所定の抗体に関して決定可能である。
【００６９】
本明細書に開示するように、結合対の第二のパートナーを、１２〜３０エチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、分析物特異的結合剤に結合させる。
【００７０】
用語「リンカー」は、第一の部分を、第二の部分またはさらなる部分にコンジュゲート化（連結）するために使用可能な、二重官能性または多重官能性部分を示す。２つの反応性官能部分を有するリンカーを用いて、互いに結合した第一および第二の部分を含むコンジュゲートを好適に調製可能である。こうしたコンジュゲートにおいて、２つの部分は、このリンカーを「通じて」結合される。当業者に明らかであるように、こうしたコンジュゲートにおいて、リンカーの官能部分は、結合の一部として存在し、そして未反応官能部分として存在するわけではない。
【００７１】
理論によって束縛されることは望ましくないが、１２〜３０のエチレングリコール単位を含むリンカーが、本明細書に開示する驚くべき知見に重要であると考えられる。分析物測定のための微粒子に基づくアッセイに関する先行技術において、短いＰＥＧ含有リンカー分子のみが真剣に考慮される。ＵＳ  ５，５２１，３１９は、生体分子のビオチン化に非常に有用であることが証明された新規試薬を開示する。リンカーの長さは、短く、すなわち最大で酸化エチレン５単位、好ましくは酸化エチレンわずか１〜３単位、そして最も好ましくはこうした単位２つと解説されている。この解説とは対照的に、現在、驚くべきことに、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、１２〜３０の間の酸化エチレン単位（＝ＰＥＧ  １２〜３０）を含む、長いリンカー分子が、結合対の第二のメンバー、例えばビオチンを分析物特異的剤とカップリングさせるために用いた際に好適であることが見出された。
【００７２】
ＰＥＧリンカーを通じて、ターゲット分子にビオチンを連結するかまたはカップリングするための適切な試薬は、例えば式Ｉ
【００７３】
【化１】
2018525637.tif 000003
【００７４】
にしたがった試薬である。
認識されるであろうように、式Ｉの（ｎ）は、エチレングリコール単位の数に関する。好ましくは、ｎは１２〜３０である。
【００７５】
本発明の方法は、非常に多様な形式で構築可能である。こうした形式には、サンドイッチアッセイおよび競合的結合アッセイなどの当該技術分野に知られる形式が含まれる（例えば、以下の参考文献を参照されたい：Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｃ．監修，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：ベルリン  １９９２；  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｗｉｌｄ，  Ｄ．監修，  Ｓｔａｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク  １９９４；  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇ．Ｈ．およびＭａｎａｋ，  Ｍ．Ｍ．  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，  第２版，  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．：ロンドン，  １９９３；  Ｔｉｅｔｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第２版，  Ｂｕｒｔｉｓら監修，  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．：フィラデルフィア，  １９９４）。
【００７６】
本開示にしたがった方法において、分析物を測定する。当業者が容易に認識するであろうように、微粒子に結合した分析物の測定は、通常、適切なアッセイ構成要素上の標識によって所持されるかまたは生成されるシグナルを測定し、そして分析物に関する標準曲線から分析物の濃度を計算し、すなわちそれによって分析物を測定することによって行われる。標識が通常付着するアッセイ構成要素は、第二の分析物特異的結合剤（サンドイッチ型アッセイ）であるか、またはアッセイは、標識分析物および試料中の分析物の間の競合を利用するかいずれかである。標識を測定する前に、標識アッセイ構成要素部分を含む微粒子を、微粒子に結合していない標識アッセイ構成要素部分から分離する。
【００７７】
１つの態様において、本開示の方法をサンドイッチアッセイ形式で実施する。
典型的なサンドイッチアッセイ形式には、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、分析物を含むと推測されるかまたは含む試料、ここで、結合対の前記の第二のパートナーは、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合している、および検出可能に標識された第二の分析物特異的結合剤を混合する工程が含まれる。当業者には明らかであるように、これらの構成要素は、微粒子に、分析物を通じて検出可能に標識された分析物特異的結合剤、結合対の第二のパートナー（に結合した）分析物特異的結合剤および結合対の第一のパートナーが結合するために十分な期間、混合され、そしてインキュベーションされる。１つの態様において、洗浄工程を伴わないサンドイッチアッセイでは、こうした混合／インキュベーションは、単一の反応容器中で行われる。４つの成分（それぞれ、コーティングされた微粒子、試料、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および検出可能に標識された分析物特異的結合剤）を添加し、そして混合する順序は重要ではない。１つの態様において、洗浄工程を伴うサンドイッチアッセイでは、結合対の第一のメンバーでコーティングされた微粒子、試料、および結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤の添加および混合は、単一反応容器で行われる。この最初の（分析物捕捉）工程後、検出可能に標識された分析物特異的結合剤を添加する前に、分析物が結合している微粒子を洗浄する。最初の３つの成分（それぞれ、コーティングされた微粒子、試料および結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤）を添加し、そして混合する順序は重要ではない。
【００７８】
サンドイッチ型アッセイ形式では、１つの態様において、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および検出可能に標識された分析物特異的結合剤は、それぞれ、各々、異なるおよび重複しないエピトープで分析物に結合する。
【００７９】
１つの態様において、本開示の方法を競合アッセイ形式で実施する。
典型的な競合アッセイ形式には、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、分析物を含むと推測されるかまたは含む試料、ここで、結合対の前記の第二のパートナーは、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合している、および検出可能に標識されるある量の分析物を混合する工程が含まれる。当業者には明らかであるように、これらの構成要素は、試料中の分析物による競合後、結合対の第二のパートナー（に結合した）分析物特異的結合剤を通じて、微粒子に結合可能である検出可能に標識された分析物の分画、および微粒子にコーティングされた結合対の第一のパートナーが結合するために十分な期間、混合され、そしてインキュベーションされる。
【００８０】
分析物特異的結合剤または分析物を標識するための方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（２００３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｂｒｉｎｋｌｅｙ（１９９２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：２；  Ｇａｒｍａｎ，  （１９９７）  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ロンドン；  Ｍｅａｎｓ（１９９０）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １：２；  Ｇｌａｚｅｒら  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｔ．  Ｓ．  ＷｏｒｋおよびＥ．  Ｗｏｒｋ監修）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ニューヨーク；  Ｌｕｎｄｂｌａｄ，  Ｒ．  Ｌ．およびＮｏｙｅｓ，  Ｃ．  Ｍ．（１９８４）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．  ＩおよびＩＩ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク；  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，  Ｇ．（１９８５）  ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｈ．  Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ監修，  Ｗａｌｔｅｒ  ＤｅＧｒｕｙｔｅｒ，  ベルリンおよびニューヨーク；ならびにＷｏｎｇ（１９９１）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  フロリダ州ボカラトン）；  ＤｅＬｅｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，  Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  １０（２００４）  １１４９−１１５５；  Ｌｅｗｉｓら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １２（２００１）  ３２０−３２４；  Ｌｉら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３（２００２）  １１０−１１５；  Ｍｉｅｒら  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １６（２００５）  ２４０−２３７に豊富に記載されている。
【００８１】
用語「検出可能に標識される」は、直接または間接的に検出可能な標識を含む。
間接的に検出可能な標識は、例えばハプテンでの標識、および直接検出可能な標識を所持する抗ハプテン抗体によるこうしたハプテン化化合物の検出、または酵素での標識、および適切な色素基質の変換を生じる対応する酵素活性によるこうした酵素の検出を指す。多様な酵素−基質標識が入手可能であるか、または開示されている（例えばＵＳ  ４，２７５，１４９を参照されたい）。該酵素は、一般的に色素原基質の化学的改変を触媒し、多様な技術を用いてこれを測定可能である。例えば、酵素は、基質中の色変化を触媒可能であり、これは分光光度的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光または化学発光を改変してもよい。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起され、そして次いで、（例えば化学発光計を用いて）測定可能な光を放出可能であるか、またはエネルギーを蛍光アクセプターに供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えばホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；  ＵＳ  ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、（３−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばユリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素をポリペプチドにコンジュゲート化させる技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．中（Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  ＩＴ  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ監修），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  ７３（１９８１）  １４７−１６６に記載される。
【００８２】
酵素−基質組み合わせの例（ＵＳ  ４，２７５，１４９；  ＵＳ  ４，３１８，９８０）には、例えば：セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と基質としての過酸化水素、ここで過酸化水素は、色素前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのリン酸パラ−ニトロフェニル；ならびに３−Ｄ−ガラクトシダーゼ（３−Ｄ−Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−（３−Ｄ−ガラクトシド）または蛍光原基質４−メチルウンベリフェリル−（３−Ｄ−ガラクトシド）が含まれる。
【００８３】
直接検出可能な標識は、検出可能シグナルを提供するか、または第二の標識と相互作用して、第一または第二の標識によって提供される検出可能シグナルを修飾する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を生じるか、いずれかである。標識、例えば蛍光色素および発光（化学発光および電気化学発光を含む）色素（Ｂｒｉｇｇｓら  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，”  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．  １（１９９７）１０５１−１０５８）は、検出可能なシグナルを提供し、そして一般的に標識に適用可能である。１つの態様において、検出可能標識は、検出可能シグナルを提供するかまたは提供するよう誘導可能な標識、すなわち、それぞれ蛍光標識、化学発光標識または電気化学発光標識を指す。
【００８４】
本開示にしたがった１つの態様において、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイは、化学発光または電気化学発光標識および対応する光検出系を利用する。標識によって産生される光を測定し、そしてこれは直接または間接的に分析物の存在または量を示す。
【００８５】
電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイは、関心対象の分析物の存在および濃度の、高感度で、そして正確な測定を提供する。こうした技術は、適切な化学的環境において、電気化学的に酸化または還元された際、発光するように誘導可能である標識または他の反応物質を用いる。こうした電気化学発光は、特定の時点で、そして特定の方式で、作業電極上に課された電圧によって誘発される。標識から生じる光を測定し、そしてこれは、分析物の存在または量を示す。こうしたＥＣＬ技術のより完全な説明に関しては、米国特許第５，２２１，６０５号、米国特許第５，５９１，５８１号、米国特許第５，５９７，９１０号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９０／０５２９６号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９２／１４１３９号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９０／０５３０１号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／２４６９０号、ＰＣＴ公開出願第ＵＳ９５／０３１９０、ＰＣＴ出願ＵＳ９７／１６９４２号、ＰＣＴ公開出願第ＵＳ９６／０６７６３号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９５／０８６４４号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／０６９４６号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／３３４１１号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ８７／０６７０６号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／３９５３４号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／４１１７５号、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／４０９７８号、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６５３および米国特許出願第０８／４３７，３４８号（米国特許第５，６７９，５１９号）を参照されたい。ＫｎｉｇｈｔらによるＥＣＬの分析適用の１９９４年の概説（Ａｎａｌｙｓｔ，  １９９４，  １１９：８７９−８９０）および該文献に引用される参考文献もまた参照されたい。１つの態様において、本明細書記載の方法は、電気化学標識を用いて実施される。
【００８６】
上述のように、電気化学発光は、特定の時点および特定の方式で、作業電極に課された電圧によって誘発される。先行技術で詳細に言及されないのは、作業電極上の微粒子の分布が、アッセイ品質に対して大きな影響を有するという事実である。微粒子の間により多くの凝集物が存在すれば、経験則として、１またはそれより多いアッセイ特徴の品質がより低下する。凝集した粒子は、しばしば、測定間変動のより高い係数、より高いバックグラウンドシグナルおよび／またはアッセイ感度低下を導く。
【００８７】
容易に想像されうるように、結合対の第二のパートナーに結合し、そして分析物特異的結合剤の分子あたり、２まはたそれより多い第二の結合パートナー分子を含む、分析物特異的結合剤の使用は、結合対の第一のパートナー（の多くの分子）でコーティングされた微粒子の凝集を容易に導きうる。したがって、先行技術において、１分子の分析物特異的結合剤および１分子の結合対の第二パートナーの分子からなるコンジュゲートを産生する、多くの試みがなされてきた。こうした１：１コンジュゲートを得るために適した方法は、例えば、ＵＳ  ６，３９１，５７１に記載される。
【００８８】
部位特異的タンパク質標識、特にタンパク質の部位特異的モノ標識のための最も重要な最近のアプローチの１つは、酵素反応を通じて、これらのタンパク質の特定の部位内に、生体直交性（ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）官能性を取り込むことである。「タンパク質の酵素標識」に関する最近の概説に関しては、Ｍ．  Ｒａｓｈｉｄｉａｎら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４（２０１３）１２７７−１２９４を参照されたい。この概説に含まれる部位特異的コンジュゲート化に用いられる酵素には、ホルミルグリシン生成酵素、シアリルトランスフェラーゼ、ホスホパンテチエニルトランスフェラーゼ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾、ソータギング（ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）、トランスグルタミナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ビオチンリガーゼ、リポ酸リガーゼ、およびＮ−ミリストイルトランスフェラーゼが含まれる。
【００８９】
驚くべきことに、実施例セクション全体に示すように、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、結合対の第二のパートナーの単一の分子に結合させた分析物特異的結合剤、例えばモノビオチン化抗体は、変動係数ならびにシグナル対ノイズ比の両方に関して、非常に優れたアッセイ性能を導く。
【００９０】
さらに、結合対の第二のパートナーが１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて分析物特異的結合剤に結合している、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤を使用すると、モノビオチン化、または標準的カップリング化学反応の使用によって得られる１：１化学量論より高いコンジュゲートの除去は必要でないようである。予期されるように、１：１化学量論より高いコンジュゲートを含むコンジュゲート調製物は、ビーズ凝集を導く傾向がある。しかし、この効果は、結合対の第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合している場合、１：１化学量論より高い場合であっても、はるかにより見えにくく、明白でない。
【００９１】
この理論に束縛されることは望ましくないが、ありうる説明は、これらの比較的長く、そして柔軟なＰＥＧリンカーによって、結合対の第二のパートナーの多くが、存在し、そしてコーティングされた微粒子の近くにあるこうした結合対の第一のパートナーの結合部位に迅速に結合することが可能になることでありうる。対照的に、分析物特異的結合剤上の結合対のいくつかの第二のパートナーは、同じ微粒子上の別の第一の結合パートナーに結合するには短すぎるリンカーを有し、そしてむしろ、第二の微粒子上の適切な第一の結合パートナーを見つける傾向がある可能性があり、それによって、明らかにビーズ凝集の傾向が促進される。図１および２は、この理論を模式的に例示する試みである。
【００９２】
結合対の第二のパートナーでの「過剰標識」を回避するため、現在までの標準化学反応は、比較的低い比の分析物特異的結合剤および結合対の第二のメンバーを使用しなければならない。平均で、コンジュゲート調製の１：１化学量論を達成するため、通常、結合対の第二のパートナー（例えばビオチン化試薬中のビオチン）は、分析物特異的結合剤（例えば抗体）より１．３倍過剰で用いられる。こうした１．３対１のカップリング条件では、生じるコンジュゲート調製物は、約３７％の非コンジュゲート化抗体；約３７％のモノビオチン化抗体を含むが、また、それぞれ、１８％、６％および２％の二重、三重または三重を超えるビオチン化抗体も含む。通常、１：１コンジュゲートに相当する分画は、商業的イムノアッセイにおいて最適結果を達成するためには精製が必要である。
【００９３】
対照的に、結合対の第二のパートナーを、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記の分析物特異的結合剤に結合する場合、より高いモル比で、結合対のカップリング／結合しようとする第二のメンバーを伴う場合であっても、標準的カップリング化学反応が使用可能であり、そして１：１コンジュゲートを含む分画の単離は必要ではない。明らかであるように、これは、本明細書に開示する方法におけるこうしたコンジュゲートの性能に加えて、こうしたコンジュゲート産生において非常に好適である。
【００９４】
１つの態様において、本開示は、組成物中に含まれる結合対の第二のパートナーに結合したコンジュゲート化特異的結合剤であって、前記組成物において、分析物特異的結合剤に結合した結合対の第二のパートナー間の平均モル比が１．１またはそれより高い、前記結合剤に関する。
【００９５】
１つの態様において、本開示は、組成物中に含まれる結合対の第二のパートナーに結合したコンジュゲート化特異的結合剤であって、前記組成物において、分析物特異的結合剤に結合した結合対の第二のパートナー間の平均モル比が１．１〜１０の間である、前記結合剤に関する。
【００９６】
１つの態様において、本開示は、組成物中に含まれる結合対の第二のパートナーに結合したコンジュゲート化特異的結合剤であって、前記組成物において、分析物特異的結合剤に結合した結合対の第二のパートナー間の平均モル比が１．２〜６の間である、前記結合剤に関する。
【００９７】
１つの態様において、本開示は、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイにおいて、分析物を測定するための方法であって、前記微粒子は、結合対の第一のパートナーでコーティングされ、ａ）コーティングされた微粒子、結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、および分析物を含むと推測されるかまたは含む試料を混合し、ここで結合対の前記の第二のパートナーが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合しており、それによって、分析物特異的結合剤を通じて、コーティングされた微粒子に分析物が結合し、そして結合対の第二のパートナーに結合した前記コンジュゲート化特異的結合剤が組成物中に含まれる、ここで、組成物中、分析物特異的結合剤に結合した結合対の第二のパートナー間の平均モル比が１．１またはそれより高い、ｂ）結合対を通じて結合している分析物を含む微粒子および分析物特異的結合剤を、混合物から分離し、そしてｃ）微粒子に結合した分析物を測定する工程を含む、前記方法に関する。
【００９８】
１つの態様において、本発明は、別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、少なくとも、結合対の第一のパートナーでコーティングされた微粒子、および前記結合対の第二のパートナーに結合した分析物特異的結合剤を含み、結合対の前記の第二のパートナーが１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて前記の分析物特異的結合剤に結合している、キットに関する。
【００９９】
用語「単一の容器単位」は、Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）シリーズのような多くの自動化分析装置に関して、特定の分析物を測定するために必要な試薬が、「試薬パック」の形で、すなわち分析装置上にフィットし、そして関心対象の分析物の測定に必要な重要な試薬のすべてを、異なる区画中に含有する、１つの容器単位として、提供されるという事実に関する。
【０１００】
１つの態様において、本発明は、結合対の前記の第一のパートナーがアビジンまたはストレプトアビジンであり、そして前記結合対の前記の第二のパートナーがビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンより選択される、キットに関する。
【０１０１】
１つの態様において、本開示は、別個の容器中に、または単一の容器単位の分離された区画中に、少なくとも、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされている微粒子、およびビオチン化分析物特異的結合剤を含み、前記ビオチンが、１２〜３０のエチレングリコール単位（ＰＥＧ  １２〜３０）を含むリンカーを通じて、前記分析物特異的結合剤に結合している、キットに関する。
【０１０２】
以下の実施例、図および配列は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は、付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法において、修飾を実行可能であることが理解される。
【０１０３】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示および例のためにある程度詳細に記載されているが、説明および例は、本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。
【実施例】
【０１０４】
モノクローナル抗体は、本明細書において上に記載するような標準的ハイブリドーマ技術によって、または組換えＤＮＡ技術によって、調製される。
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９に記載されるように、標準法を用いて、ＤＮＡを操作した。製造者の指示にしたがって、分子生物学試薬を用いた。
【０１０５】
遺伝子およびオリゴヌクレオチド合成
Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（ドイツ・レーゲンスブルク）で、化学合成によって、望ましい遺伝子セグメントを調製した。増殖／増幅のため、合成された遺伝子断片を、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）プラスミド内にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、またはＰＣＲを通じて、短い合成ＤＮＡ断片を組み立てた。ｍｅｔａｂｉｏｎ  ＧｍｂＨ（ドイツ・プラネック−マルティンスリート）によって、それぞれのオリゴヌクレオチドを調製した。
【０１０６】
基本的／標準的哺乳動物発現プラスミドの説明
望ましい遺伝子／タンパク質（例えば全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはＮ末端にオリゴグリシンを含有するＦｃ鎖）を発現するため、以下の機能的要素を含む転写ユニットを用いる：
−イントロンＡを含むヒト・サイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）由来の極初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−ネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−発現させようとする遺伝子／タンパク質（例えば全長抗体重鎖）、および
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
【０１０７】
発現させようとする望ましい遺伝子を含む発現ユニット／カセットに加えて、基本的／標準哺乳動物発現プラスミドは
−大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
−大腸菌において、アンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
【０１０８】
タンパク質決定
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されたモル消光係数を用いて、または比色ＢＣＡ法を用いて、２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を決定することによって、精製ポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
【０１０９】
実施例１
活性化ビオチン化試薬の合成
広く用いられるリンカー、ビオチン−ＤＤＳのような現状技術の活性化ビオチン含有リンカー（ビオチン化試薬）の合成は、ＥＰ  ６３２  ８１０に開示される。
【０１１０】
ビオチン−ＰＥＧｎ−ＮＨＳ−ビオチン化試薬（ＣＡＳ番号３６５４４１−７１−０；ｎ＝酸化エチレン単位の数）を、ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨから得るか、または社内で合成した。ビオチン−ＰＥＧ〜１１０−ＮＨＳ（ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＭＷ  ５０００Ｄａ）をＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ（ドイツ）より購入した。
【０１１１】
デノボ合成において、酸化エチレン単位の別個の数の調節を、ＣｈｅｎおよびＢａｋｅｒ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９９，  ６４，  ６８４０−６８７３に記載される方法にしたがって、より短いＰＥＧ、例えばテトラエチレングリコールの段階的な伸長によって確実にした。
【０１１２】
第一の工程において、ビス−トリチル−ＰＥＧｎ  １が得られている（明らかであるように、ｎはエチレングリコール単位の数を示す）。
ジオキサン中の１Ｍ  ＨＣｌ中で、室温で１時間攪拌することによって、１の脱保護を行った。蒸発後、透明な溶液が得られるまで、残渣をメタノール中で還流し、そしてフラスコを４℃で一晩維持した。ろ過後、溶液をヘキサンで抽出し、メタノール性層を蒸発させ、そして乾燥させて、油またはワックスとしての対応するＰＥＧｎ−ジオール  ２を得た（コンシステンシーは、ＰＥＧの長さ／単位数（ｎ）に応じる）。
【０１１３】
次に、ＳｅｉｔｚおよびＫｕｎｚ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ６２，  ８１３−８２６にしたがって、アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルにＰＥＧｎ−ジオールをナトリウム触媒添加することによって、酸官能の導入を行った。この方式で化合物３を得る。
【０１１４】
塩化メチレン中のＨＯ−ＰＥＧｎ−ＣＯＯｔＢｕ  ３（１当量）およびトリエチルアミン（２．５当量）の溶液に、塩化メチルスルホニル（２当量）を１滴ずつ０℃で添加した。１時間攪拌した後、水性精製（ｗｏｒｋ−ｕｐ）および蒸発を続けた。
【０１１５】
ジメチルホルムアミド中、室温で２日間攪拌することによって、メシレート４（１当量）をＮａＮ３（２当量）と直接反応させた。固形物およびジメチルホルムアミドを除去した後、ジエチルエーテルおよびＮａ２ＣＯ３での水性精製を続けた。
【０１１６】
酢酸エチル／メタノール  １５／１中、シリカ上のカラムクロマトグラフィによって、未精製産物５を精製した。テトラヒドロフラン／水  ４／１中、トリフェニルホスフィン（１．１当量）と２４時間攪拌することによって、アジド５（１当量）の還元を行った。蒸発後、残渣を水に懸濁し、そして酢酸エチルで数回洗浄した。水層を蒸発させ、そして乾燥させて、無色油としてのアミン６を得た。
【０１１７】
水中の５％トリフルオロ酢酸で、ｔｅｒｔ−ブチルエステルの切断を行った。水での蒸発を数回行うことによって、アミノ−ＰＥＧｎ−酸  ７を得た。
ジメチルホルムアミド中のトリエチルアミン（４当量）と、対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル  ８（１．０５当量）を、室温で一晩カップリングすることによって、ビオチンを導入した。
【０１１８】
蒸発後、アセトニトリル／水中、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、未精製産物９を精製した。
最後に、塩化メチレン中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１当量）およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（１．１当量）との反応によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１０を形成した。反応完了後、塩化メチレンで反応混合物を希釈し、そして水で洗浄した。蒸発および乾燥によって、エチレンオキシド単位の数に応じて、それぞれ、油、ワックスまたは固体としての純粋なビオチン−ＰＥＧｎ−ＮＨＳ  １０を得た。
【０１１９】
【化２】
2018525637.tif 000004
【０１２０】
スキーム１  ビオチン−ＰＥＧ（ｎ）−ＮＨＳの合成
実施例２
抗体への、ビオチンおよびルテニウム部分それぞれのカップリング
当業者にはよく知られている現状技術の方法にしたがって、抗体を得て、そして精製した。
【０１２１】
カップリングのため、一般的に、抗体のリジンε−アミノ基を、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化化合物によってターゲティングした。１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、抗体を、それぞれ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチン化試薬およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ルテニウム標識試薬と反応させた。ビオチン化または標識試薬それぞれ／タンパク質（抗体）のモル比は、それぞれの抗体コンジュゲートに応じて、１．３：１〜５：１まで多様であった。反応緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌであった。反応を室温で３０分間行い、そしてＬ−リジンを最終濃度１０ｍＭまで添加することによって停止した。カップリング反応後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＩ  Ｌｏａｄ）に未精製抗体コンジュゲートを通過させることによって、または透析によって、未反応の遊離ビオチン／標識を除去した。
【０１２２】
モノビオチン化抗体コンジュゲートを得るため、０．５〜１Ｍ硫酸アンモニウムをコンジュゲート溶液に添加した。５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５〜１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したストレプトアビジン・ムテイン吸着剤（ＤＥ１９６３７７１８を参照されたい）に溶液を通過させた。いかなるビオチンもカップリング／結合していない抗体は、吸着剤に結合不能であり、そして洗い流された。モノビオチン化抗体コンジュゲートを５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌおよび２％ＤＭＳＯで溶出させた。抗体あたり１より多いビオチンを含む抗体コンジュゲートを、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌおよび２ｍＭビオチン（「＋ｍＳＡ」）で溶出させた。
【０１２３】
実施例３
ＨＣＶコア抗原の免疫学的検出に対するビオチン化試薬中のリンカーの影響
多様なリンカーを含むビオチン化試薬の使用によって、１つの、そして同じ抗ＨＣＶ（捕捉）抗体をビオチンにコンジュゲート化した。異なるビオチン−リンカー−抗体コンジュゲートの性能を、自動化ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）上で評価した。
【０１２４】
サンドイッチアッセイ形式で測定を行った。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置におけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。このサンドイッチアッセイにおいて、ビオチン−コンジュゲート（すなわち捕捉抗体）を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（平均ビーズサイズ２．８μｍ）の表面上に固定した。検出抗体は、シグナル伝達部分として、錯体ルテニウム陽イオンを所持する。分析物の存在下で、色素原ルテニウム錯体は、固相に架橋され、そしてｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置の測定セルに含まれる白金電極での励起後、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、恣意的光単位である。いくつかの供給源より購入した、ＨＣＶコア抗原陽性および陰性のヒト血清および血漿試料で、測定を行った。
【０１２５】
以下のように、実験ＨＣＶコア抗原アッセイを行った。５０μｌの正常またはＨＣＶ抗原陽性試料、および抗原を放出させるための２５μｌの界面活性剤含有前処理試薬を、ともに、９分間インキュベーションした後、３５μｌの２μｇ／ｍｌ捕捉抗体−ビオチンコンジュゲートおよび４０μｌの１μｇ／ｍｌ検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートを、ｐＨ７．０であり、そして１００ｍＭリン酸カリウムおよび２２５ｍＭ  ＫＣｌを含む、同じ生理的緩衝剤中に添加した。さらに９分間インキュベーションした後、５０μｌストレプトアビジン−コーティング常磁性微粒子を添加し、そしてさらに９分間インキュベーションした。その後、（これらの実験において生じた電気化学発光シグナルを通じて）ＨＣＶコア抗原を検出した。
【０１２６】
表１
異なるＨＣＶ捕捉抗体コンジュゲートの比較
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
一般的に、特にバックグラウンドシグナルに関する、高いシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）および低い変動係数（ＣＶ）は、特に、アッセイのより低い検出限界（アッセイ感度）に関して、重要なアッセイ性能パラメータである。ストレプトアビジンコーティング微粒子に基づくアッセイにおいて、ＥＰ  ６３２  ８１０に開示されるように、ビオチン−ＤＤＳビオチン化試薬は、それぞれ、より短いまたはより長いリンカーを含むビオチン−ＮＨＳまたはビオチン−Ｘ−ＮＨＳのような他のビオチン化試薬よりも好ましい。
【０１２９】
作業電極上のビーズ分布パターンを評価するため、光電子倍増管をカメラで置き換えた。一般的に、常磁性ストレプトアビジンコーティング微粒子のビーズ凝集および／または作業電極上の磁気捕捉中の不均質なビーズ分布パターンは、部分的シグナル喪失および特にＣＶ増加を導くことが知られる。いくつかの試料に存在する、いわゆるマトリックス効果が、ビーズ凝集によって引き起こされる問題をさらに増加させうることもまた知られる。
【０１３０】
表１中のデータは、抗体あたり多数のビオチン−ＤＤＳ部分にコンジュゲート化された抗体が、単一のビオチン−ＤＤＳ部分しか持たない抗体のコンジュゲートに比較された際、より高いＳ／Ｎ値を有することを示す。しかし、これは、単一ビオチン化対応物と比較した際、分析物不含血清に関するより高いＣＶ値と引き替えに起こる。さらに、ビオチン−ＤＤＳでの抗体の多重ビオチン化は、作業電極上での磁気捕捉中、非常に不均質なビーズ分布パターンによって明らかとなる、常磁性ストレプトアビジンコーティング微粒子のビーズ凝集を誘導する（図３）（ここで用いられる陰性血清は、マトリックス効果を持たないため、ＣＶに対する負の影響は中程度しかない）。厳密にモノビオチン化されたビオチンＤＤＳコンジュゲートは、作業電極上ではるかにより均質なビーズパターンを示し、そしてしたがって、マトリックス効果を起こす傾向が低い（図３）。
【０１３１】
モノビオチン化コンジュゲートを生産するためのビオチン化にはるかにより長いリンカーを含むビオチン−ＰＥＧ２４−ＮＨＳを用いると、シグナル対ノイズ比およびＣＶ値は、それぞれ、増加し、そして減少しうる。ビーズパターンは、ビオチン−ＤＤＳに基づくモノコンジュゲートに関しては、非常に均質である（図４）。驚くべきことに、ビオチン−ＰＥＧ２４モノコンジュゲートを用いると、シグナル対ノイズ比に関しても、また変動係数に関しても、どちらも非常に優れた結果を得ることが可能である。抗体あたり多数のビオチン−ＰＥＧ２４−ＮＨＳビオチン化試薬でコンジュゲート化した抗体を用いることによって、モノビオチン化コンジュゲートに関して得られる結果と匹敵する均質なビーズ分布パターンおよび低いＣＶ値を得ることが可能であった（図４）。シグナル対ノイズ比は、少なくともこれらの実験に用いた抗体あたりのビオチン残基の範囲において、抗体あたりのビオチン残基の数が増加するにつれて上昇する。
【０１３２】
実施例４
トロポニンＴ（ＴｎＴ）の免疫学的検出に対するビオチン化試薬におけるリンカーの影響
多様なリンカーを含むビオチン化試薬の使用によって、１つの、そして同じ抗トロポニンＴ（抗ＴｎＴ）（捕捉）抗体をビオチンにコンジュゲート化した。ＥｌｅｃｓｙｓトロポニンＴ  ｈｓアッセイキットに関する指示にしたがった実験プロトコルに基づいて、異なるビオチン−リンカー−抗体コンジュゲートの性能を、自動化ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）上で評価した。
【０１３３】
サンドイッチアッセイ形式で測定を行った。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置におけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。このサンドイッチアッセイにおいて、ビオチン−コンジュゲート（すなわち捕捉抗体）を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（平均ビーズサイズ２．８μｍ）の表面上に固定する。検出抗体は、シグナル部分として、錯体ルテニウム陽イオンを所持する。分析物の存在下で、色素原ルテニウム錯体は、固相に架橋され、そしてｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置の測定セルに含まれる白金電極での励起後、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、恣意的光単位である。
【０１３４】
標準物質として、定義する量の組換えヒト心臓ＴｎＴを補充したヒト血清で、測定を行い、そして結果を表２に示す。
表２
実験トロポニンＴアッセイで得た結果
【０１３５】
【表３】
2018525637.tif 000006
【０１３６】
表２に示すデータから、長いビオチン−ＰＥＧ２４−ＮＨＳビオチン化試薬で産生される捕捉抗体コンジュゲートは、ビオチンおよび抗体間の平均比に関わらず、より短いビオチン−ＤＤＳビオチン化試薬よりも優れていると結論づけ可能である（実施例１において説明するように、概念「＋ｍＳＡ」を伴うコンジュゲートは、抗体あたり２またはそれより多いビオチン部分を含む分画を示す）。
【０１３７】
実施例５
ＨＣＶコア抗原プロトタイプアッセイに対するビオチン化試薬におけるリンカーの長さの変動
リンカーの最適な長さを決定するため、異なるビオチン−ＰＥＧ（ｎ）−ＮＨＳ誘導体を、ＨＣＶ捕捉抗体でコンジュゲート化し、そして実施例３に記載するようなＨＣＶコア抗原実験アッセイにおいて測定した。各ビオチン化試薬に関して、モノビオチン化および多重ビオチン化コンジュゲート両方を生成し、そして結果を表３に示す。
【０１３８】
表３
ＨＣＶコア抗原実験アッセイの性能に関するＰＥＧ−リンカーの長さの影響
【０１３９】
【表４】
2018525637.tif 000007
【０１４０】
表３からわかるように、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を通じて示されるような非常に優れた結果が、１２〜３０の間のエチレングリコール単位を含むリンカーで達成されている。ビオチン−ＰＥＧ２４−ＮＨＳビオチン化試薬の使用によって生じる変異体は、ある程度の最適シグナル対ノイズ比を示す傾向があった。しかし、表３から明らかであるように、１２〜３０の間のエチレングリコール単位を含むリンカーは、やはり試験した、より短いリンカーならびにより長いリンカーよりも非常に優れており、そして優れた結果を生じる。
【図１】
2018525637.tif 000008
【図２】
2018525637.tif 000009
【図３】
2018525637.tif 000010
【図４】
2018525637.tif 000011
【国際調査報告】
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