(57)【要約】  肺炎球菌(SP)関連疾患を予防又は治療するための組成物又は方法を提供する。より詳細には、Ｎ末端からＣ末端にかけて、肺炎球菌表面抗原Ａ（PsaA）のＮ末端天然脂質シグナルペプチドと、PsaAに対するC末端構造遺伝子とを含む、PsaAを含む組換え脂質化融合タンパク質を提供する。組換え脂質化融合タンパク質を含むワクチンを投与する工程を含む、SPに対する広範囲の粘膜免疫を誘導する方法もまた記載される。
2018537107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端にかけて、肺炎球菌表面抗原Ａ（PsaA）のＮ末端天然脂質シグナルペプチドと、PsaAに対するC末端構造遺伝子とを含む、PsaAを含む組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項２】
C末端にタグもしくは検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項３】
前記タグが６個のヒスチジン残基を含むアミノ酸タグである、請求項２に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項４】
単離される、もしくは精製される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項５】
天然脂質化シグナルペプチドが、アミノ酸配列MKKLGTLLVLFLSAIILVAC（配列番号５）を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号１又は７に規定されるアミノ酸配列、又はそのホモログ、フラグメント、アナログもしくはバリアントを含む、請求項１から５に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１に規定されるアミノ酸配列に少なくとも約80%から95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項８】
大腸菌において生成される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号６に規定されるヌクレオチド配列を有するDNAを含むベクターの発現により生成される、請求項８に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１０】
同種の脂質構造を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１１】
前記同種の脂質構造が、質量分析器により分析される単一主要ピークを含む、又は図６Ｄに示す質量分析スペクトルを有する、請求項１０に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１２】
前記単一主要ピークが、約1266のm/zを有する、請求項１１に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１３】
対象における肺炎球菌関連疾患に対する粘膜免疫応答を誘導することができる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１４】
Th1応答及び/又は分泌性IgAの生成が対象で誘導される、請求項１３に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１５】
アジュバントの不在下で投与される場合に粘膜免疫応答を誘導することができる、請求項１４に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１６】
併用して投与される1種以上の非脂質化肺炎球菌（SP)抗原に対して誘導される粘膜免疫応答をさらに誘導することができる、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１７】
前記1種以上の非脂質化SP抗原が、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（PsaA）、肺炎球菌表面タンパク質C（PspC）、肺炎球菌ベータガラクトシダーゼ(BgaA)、肺炎球菌ホスホリルコリン(ChoP)、肺炎球菌エノラーゼ(Eno)、肺炎球菌ヒアルトナートリアーゼ(Hyl)、肺炎球菌オートリジンＡ(LytA)、肺炎球菌ノイラミニダーゼ(Nan)、肺炎球菌接着及びビルレンスＡ(PavA)、肺炎球菌鉄捕捉(PiaA)ならびに肺炎球菌表面結合Phtタンパク質(PhtA、PhtB、PhtD及びPhtE)から選択される、請求項１６に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１８】
前記粘膜免疫応答がセロタイプ特異的ではない、請求項１３から１７の一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項１９】
肺炎球菌関連疾患が、肺炎、髄膜炎、耳感染、副鼻腔感染症又は菌血症である、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質。
【請求項２０】
以下の工程を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質を生成するための方法：
（１）PsaAのN末端天然脂質シグナルペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列と、PsaAに対するC末端構造遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を提供する工程、ならびに
（２）大腸菌形質転換体を培養して、PsaAのN末端天然脂質シグナルペプチドとPsaAに対するC末端構造遺伝子を含む融合タンパク質を発現させる工程。
【請求項２１】
前記宿主大腸菌細胞が、高レベルタンパク質発現を提供する株に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記株が、C43(DE3)、(ECCC B96070445)、C41(DE3) (ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S (NCIMB 40885)及びC2014(DE3) (NCIMB 40884)から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記大腸菌形質転換体をM9培地中で培養する、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
組換え脂質化融合タンパク質の発現後に大腸菌から組換え脂質化融合タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現ベクターが、配列番号６に規定されるヌクレオチド配列を含む、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換え脂質化融合タンパク質、又は請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法で生成した組換え脂質化融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤を含む組成物。
【請求項２７】
1種以上の非脂質化SP抗原をさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記1種以上の非脂質化SP抗原が、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（PsaA）、肺炎球菌表面タンパク質C（PspC）、肺炎球菌ベータガラクトシダーゼ(BgaA)、肺炎球菌ホスホリルコリン(ChoP)、肺炎球菌エノラーゼ(Eno)、肺炎球菌ヒアルトナートリアーゼ(Hyl)、肺炎球菌オートリジンＡ(LytA)、肺炎球菌ノイラミニダーゼ(Nan)、肺炎球菌接着及びビルレンスＡ(PavA)、肺炎球菌鉄捕捉(PiaA)ならびに肺炎球菌表面結合Phtタンパク質(PhtA、PhtB、PhtD及びPhtE)から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１から１９に記載の組換え脂質化融合タンパク質、又は請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法で生成した組換え脂質化融合タンパク質、ならびにアジュバントを含む、SP関連疾患を予防又は治療するためのワクチン。
【請求項３０】
1種以上の非脂質化SP抗原をさらに含む、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
前記1種以上の非脂質化SP抗原が、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（PsaA）、肺炎球菌表面タンパク質C（PspC）、肺炎球菌ベータガラクトシダーゼ(BgaA)、肺炎球菌ホスホリルコリン(ChoP)、肺炎球菌エノラーゼ(Eno)、肺炎球菌ヒアルトナートリアーゼ(Hyl)、肺炎球菌オートリジンＡ(LytA)、肺炎球菌ノイラミニダーゼ(Nan)、肺炎球菌接着及びビルレンスＡ(PavA)、肺炎球菌鉄捕捉(PiaA)ならびに肺炎球菌表面結合Phtタンパク質(PhtA、PhtB、PhtD及びPhtE)から選択される、請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
請求項１から１９に記載の組換え脂質化融合タンパク質、又は請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法で生成した組換え脂質化融合タンパク質に特異的な、単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項３３】
ポリクローナルである、請求項３２に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項３４】
モノクローナル抗体である、請求項３２に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項３５】
ヒト化されている抗体又はフラグメント、ヒト抗体又はフラグメント、あるいはキメラ抗体又はフラグメントである、請求項３２に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項３６】
完全免疫グロブリン分子；単一鎖抗体：単一鎖バリアブルフラグメント(scFv)；単一ドメイン抗体；Fabフラグメント；F(ab’)2フラグメント；又はジスルフィド結合Fv (di-scFv)を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項３７】
ヒトIgM、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4及びヒトIgA1/2から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項３８】
ヒトIgカッパ及びヒトIgラムダから選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項３９】
少なくとも約107Mから1010Mの親和定数で抗原に結合する、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメント。
【請求項４０】
請求項３２から３９のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメント、ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤を含む組成物。
【請求項４１】
SP関連疾患を予防もしくは治療するための第二の薬剤をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第二の薬剤が、PspAに結合する抗体；PspCに結合する抗体；ならびに抗生物質のうち１種以上を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
対象においてSP関連疾患が予防又は治療されるように、請求項２６から２８及び４０から４２のいずれか一項に記載の組成物；請求項２９から３１のいずれか一項に記載のワクチン；あるいは請求項３２から３９に記載の抗体又はフラグメントを対象に投与する工程を含む、SP関連疾患を予防又は治療するための方法。
【請求項４４】
対象においてSP関連疾患が予防又は治療されるように、請求項１から１９に記載の組換え脂質化融合タンパク質、又は請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法で生成した組換え脂質化融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、SP関連疾患を予防又は治療するための方法。
【請求項４５】
対象においてSPに対する粘膜免疫が誘導される、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象においてTh1応答及び/又は分泌性IgAの生成が誘導される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記粘膜免疫がセロタイプ特異的ではない、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
1種以上の非脂質化SP抗原に対する粘膜免疫を誘導する、請求項４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
対象においてSP感染が予防又は治療されるように、請求項２６から２８及び４０から４２のいずれか一項に記載の組成物；請求項２９から３１のいずれか一項に記載のワクチン；あるいは請求項３２から３９に記載の抗体又はフラグメントを対象に投与する工程を含む、対象においてSP感染に対する免疫を誘導する方法。
【請求項５０】
対象においてSP感染が予防又は治療されるように、請求項１から１９に記載の組換え脂質化融合タンパク質、又は請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法で生成した組換え脂質化融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、対象においてSP感染に対する免疫を誘導する方法。
【請求項５１】
前記組成物、前記ワクチン、前記抗体もしくはフラグメント、又は前記組換え脂質化融合タンパク質を、静脈内、皮下、筋肉内、経粘膜、又は経口で投与する、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物、前記ワクチン、前記抗体もしくはフラグメント、又は前記組換え脂質化融合タンパク質を、SP感染もしくはSP関連疾患を予防もしくは治療するための第二の薬剤と組み合わせて投与する、請求項４３から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物、前記ワクチン、前記抗体もしくはフラグメント、又は前記組換え脂質化融合タンパク質と前記第二の薬剤を、同時に又は順次投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
SP感染の予防もしくは治療用ワクチンの製造における、請求項１から１９に記載の組換え脂質化融合タンパク質、又は請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法で生成した組換え脂質化融合タンパク質の使用。
【請求項５５】
請求項２６から２８のいずれか一項に記載の組成物を含む、SP感染の予防もしくは治療用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2015年12月10日に提出された米国仮特許出願番号62/265,525号の優先権を享受し、その全体の内容が本明細書に参照して組み込まれる。
【０００２】
本明細書は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）感染の防止又は治療用の組成物及び方法を提供する。より詳細には、本明細書は、肺炎連鎖球菌抗原、その調製方法、及び肺炎連鎖球菌関連疾患に対するワクチンとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae, SP）は、子供において、肺炎、髄膜炎及び敗血症の原因となる主要な細菌性病原体である。世界中で毎年約100万人の子供が、SP感染を原因として死亡している(O'Brien, K.L., et al., Lancet 374: 893-902, 2009)。
【０００４】
現在承認されている肺炎ワクチンは、SPのカプセル多糖（capsular polysaccharide, CPS）のみを標的としており、これらのワクチンは、厳密にセロタイプ特異的な保護を提供する。CPS抗原の貧弱な免疫原性が肺炎球菌CPSタンパク質コンジュゲートワクチン（PCV)により克服されているにも関わらず、保護はいまだセロタイプ特異的であり、PCVの高コストはワクチン化のカバー率を減少させている。さらに、SPによる鼻咽頭コロニー形成は、空いたニッチが、潜在的に疾患を引き起こす可能性がある非ワクチン肺炎球菌セロタイプにより急速に占有されたことを示している。従って、長い間、CPSとPCVの広範なイントロダクションは、全体のSP疾患負荷を低減することなく侵襲的な肺炎球菌疾患のセロタイプ分布を単に変更するものであるかもしれない（総説として、Kadioglu, A. et. al., Nature Reviews Microbiology 6: 288-301, 2008参照）。
【０００５】
現在までに最も有望なアプローチは、病原性に貢献し、かつすべてのセロタイプに共通である肺炎球菌抗原に基づくワクチンの開発であり続けている。PsaAのような天然タンパク質抗原、又はその免疫原性断片は、宿主に投与された場合に免疫応答を刺激することができるが、そのような抗原は、免疫原性が乏しく、かつ貧弱な粘膜抗原である。SPは、感染を確立するために最初に粘膜表面を通して宿主に侵入しなければならないため、抗原特異的IgG応答に加えて、粘膜免疫（例えば粘膜分泌性IgA抗体）を誘導することが望ましい。実際に、Th1応答の誘導なしに、CD4+T細胞欠陥マウスは鼻咽頭コロニー形成をクリアできないことが示されている。
【０００６】
粘膜免疫を誘導する、広範囲の肺炎球菌ワクチンに対する必要性が存在する。
【０００７】
一般的に、脂質化(lipidated)タンパク質のような修飾(modified)タンパク質が、非修飾(unmodified)タンパク質よりもより免疫原性である。あるワクチン製品におけるタンパク質は、組換え技術を使用した大腸菌（E.coli）における発現により調製されているが、大腸菌細胞は天然に脂質化タンパク質をほとんど脂質化せず、脂質化形態の非天然脂質化タンパク質を生成しないため、大腸菌は修飾タンパク質、特に脂質化タンパク質の精製には適さないと一般的にみられている。
【０００８】
米国特許第7,833,776号は、Ag473由来の脂質化配列と標的ポリペプチドとを含有する脂質化融合タンパク質の大腸菌における生成を開示する。そこには、Ag473の少なくともN末端の40残基(D1)を含有することにより融合タンパク質の大腸菌における脂質化を容易にする脂質化配列が開示されている。脂質化形態で融合タンパク質を生成する方法もまた記載されている。
【０００９】
米国特許第7,960,535号には、組換え脂質化PsaAタンパク質、及びそのような脂質化PsaAタンパク質が発現する組換え構築物が記載されている。そこには、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)のospA遺伝子に由来する異種リーダー配列の使用により、脂質化が影響を受ける脂質化PsaAタンパク質であって、該リーダー配列がpsaA構造遺伝子と翻訳リーディングフレームで連結している脂質化PsaAタンパク質が記載されている。本発明はまた、脂質化PsaAタンパク質の調製方法と、免疫組成物におけるそのようなタンパク質の使用も提供する。また、免疫原性脂質化PsaAタンパク質を含むワクチンと、肺炎球菌感染の予防及び治療におけるそのようなワクチンの使用方法も提供する。
【００１０】
米国特許第6,538,118号には、大腸菌のような発現システムにおいて組換え形成された異所脂質化タンパク質が記載されている。異所脂質化タンパク質は、脂質化タンパク質のタンパク質部位に天然では存在しないリーダー配列を有する。脂質化タンパク質は、ボレリアOspAリーダー配列を有することもできる。該タンパク質部位は、OspC、PspA、UreA、Ure B又はそれらのフラグメントであり得る。該タンパク質を形成し、使用する方法及び組成物もまた、本願発明に記載される。
【００１１】
米国特許第8,771,990号には、大腸菌における組換え脂質化ポリペプチドの製造方法が記載されている。該方法には、組換え脂質化ポリペプチドを発現するために適応させた大腸菌宿主細胞を提供する工程、及び脂質化形態で該ポリペプチドの発現を可能とする条件下で、最小培地中の大腸菌宿主細胞を培養する工程が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国仮特許出願番号62/265,525号
【特許文献２】米国特許第7,833,776号
【特許文献３】米国特許第7,960,535号
【特許文献４】米国特許第6,538,118号
【特許文献５】米国特許第8,771,990号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】O'Brien, K.L., et al., Lancet 374: 893-902, 2009
【非特許文献２】Kadioglu, A. et. al., Nature Reviews Microbiology 6: 288-301, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
先行技術に存在する少なくとも複数の欠点を改善することが、本発明の目的である。本発明技術の態様は、肺炎球菌(SP)感染及びSP関連疾患の予防及び/又は治療のための改善された組成物及び方法が必要とされているという発明者の認識に基づいて開発されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、少なくとも部分的に、組換え脂質化SP抗原を、その天然脂質シグナルペプチドを使用して大腸菌中で生産することができるという発明者の発見に基づく。特に、異種脂質シグナルペプチドに依存して大腸菌で脂質化SP抗原を生成する従来のワクチンと対照的に、発明者は、天然PsaA脂質シグナルペプチドを使用して大腸菌で組換え脂質化PsaA融合タンパク質（本明細書で「rlipo-PsaA」と呼ぶ）を生成した。さらに、rlipo-PsaAは、粘膜免疫応答を誘導し、マウスモデルでSP関連疾患に対して保護効果を示した。驚くべきことに、rlipo-PsaAは、異所脂質構造を示した。すなわち脂質修飾の単一の形態のみを発現した。マウスモデルで引き起こした免疫応答ははセロタイプ特異的ではなく、例えば1つより多いタイプのSPに対して保護的であった。さらに、rlipo-PsaAは、それ自体非免疫原性の他の共投与非脂質化SP抗原に対する粘膜免疫を引き起こし、rlipo-PsaAについて強力な粘膜アジュバント効果を示す。
【００１６】
従って、第一の態様において、肺炎球菌表面抗原A(PsaA)を含む組換え脂質化タンパク質が提供され、該組換え脂質化タンパク質は、N末端からC末端までに、PsaAのN末端天然脂質シグナルペプチドとPsaAに対するC末端構造遺伝子とを含む。
【００１７】
組換え脂質化融合タンパク質は、NもしくはC末端においてタグもしくは検出可能な標識をさらに含んでよい。一態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、C末端において6個のヒスチジン残基を含むアミノ酸タグを含む。
【００１８】
複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、配列番号５（MKKLGTLLVLFLSAIILVAC）に示されるアミノ酸配列を有する天然PsaA脂質シグナルペプチドを含む。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列に少なくとも約80から99%、例えば配列番号５に示されるアミノ酸配列に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%同一である脂質シグナルペプチドを含む。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、PsaAのN末端部分を含む脂質シグナルペプチドを含む。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、最大で長さ約15から40のアミノ酸を含む脂質シグナルペプチドを含む。
【００１９】
複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、配列番号１もしくは７（rlipo-PsaA）、又はそのホモログ、フラグメント、アナログもしくはバリアントを含む。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、配列番号１もしくは７に示されるアミノ酸配列に少なくとも約80から99%同一であるアミノ酸配列を含む。組換え脂質化融合タンパク質は、配列番号１もしくは７に示されるアミノ酸配列に少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含んでよい。組換え脂質化融合タンパク質は、全長PsaAタンパク質もしくはその免疫原性部分を含んでよいことが理解されるべきである。その機能的同等物、又は生物学的活性ホモログ、フラグメント、アナログ及び／もしくはバリアントもまた包含される。
【００２０】
複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、例えば、それが生成される発現システムから単離される、単離もしくは精製形態である。
【００２１】
組換え脂質化融合タンパク質は、組換え技術を使用して生成され、適切な発現システムのいずれかを使用して生成してよい。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、大腸菌において、例えば、（制限されることなく）C43(DE3)、(ECCC B96070445)、C41(DE3) (ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S (NCIMB 40885)又はC2014(DE3) (NCIMB 40884)のような高レベルタンパク質発現を提供する株において発現され、場合によりその単離もしくは精製形態である。一態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するDNAを含むベクターの発現により生成される。
【００２２】
複数の態様において、本明細書で提供される組換え脂質化融合タンパク質は、均一な脂質構造を含み、例えば質量分析により単一の主要ピークが観察される。ある態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、図６Ｄに示される質量分析スペクトルを有する。
【００２３】
複数の態様において、本明細書で提供される組換え脂質化融合タンパク質は、対象におけるSP感染及びSP関連疾患に対する、粘膜免疫応答を含む免疫応答を誘導することができる。粘膜免疫応答は、対象におけるTh1応答及び／又は分泌性IgAの生成を含んでよい。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、アジュバントの不存在下で投与された場合に粘膜免疫応答を誘導することができる。
【００２４】
複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、同時に投与される一種以上の非脂質肺炎連鎖球菌(SP)抗原（例えば、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（PsaA）、肺炎球菌表面タンパク質C（PspC）等）に対する粘膜免疫応答をさらに誘導することができる。
【００２５】
誘導された免疫応答は、制限されることなく、肺炎、髄膜炎、敗血症、耳感染、副鼻腔感染症及び菌血症のような、急性及び慢性疾患の両方を含む広範囲のSP関連疾患に対して保護的であってよい。複数の態様において、誘導された免疫応答はセロタイプ特異的ではない。
【００２６】
別の態様において、本明細書に記載される組換え脂質化融合タンパク質の生成方法が提供される。該方法は、（１）PsaAのN末端天然脂質シグナルペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列と、PsaAに対するC末端構造遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を提供する工程、ならびに（２）大腸菌形質転換体を培養して、PsaAのN末端天然脂質シグナルペプチドとPsaAに対するC末端構造遺伝子を含む融合タンパク質を発現させる工程を含む。宿主大腸菌細胞は、制限されることなく、C43(DE3)、(ECCC B96070445)、C41(DE3) (ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S (NCIMB 40885)及びC2014(DE3) (NCIMB 40884)のような高レベルでタンパク質発現を提供する株からのものであってよい。複数の態様において、大腸菌形質転換体は、M9培地中で培養される。複数の態様において、発現ベクターは、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。複数の態様において、該方法は、その発現後、大腸菌から組換え脂質化融合タンパク質を単離もしくは精製する工程をさらに含む。
【００２７】
複数の態様において、本明細書で提供される方法により作成された組換え脂質化融合タンパク質が提供される。
【００２８】
別の態様において、本明細書に記載の１種以上の組換え脂質化融合タンパク質、及び薬学的に許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤を含む組成物が提供される。複数の態様において、該組成物は、PspA及び／又はPspCのような１種以上の非脂質化SP抗原をさらに含む。
【００２９】
別の態様において、本明細書に記載の１種以上の組換え脂質化融合タンパク質、及びアジュバントを含む、SP関連疾患を予防もしくは治療するためのワクチンが提供される。複数の態様において、該ワクチンは、PspA及び／又はPspCのような１種以上の非脂質化SP抗原をさらに含む。
【００３０】
さらに別の態様において、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質に特異的な単離抗体もしくはそのフラグメントが提供される。複数の態様において、該抗体もしくはそのフラグメントは、ポリクローナル抗体である。別の態様において、該抗体もしくはそのフラグメントは、モノクローナル抗体である。該抗体もしくはそのフラグメントは、ヒト化されていてよく、ヒト抗体もしくはキメラ抗体であってよい。複数の態様において、該抗体もしくはそのフラグメントは、完全免疫グロブリン分子；単一鎖抗体：単一鎖バリアブルフラグメント(scFv)；単一ドメイン抗体；Fabフラグメント；F(ab’)2フラグメント；又はジスルフィド結合Fv (di-scFv)を含む。該抗体もしくはそのフラグメントは、ヒトIgM、ヒトIgG1、ヒトIgG2, 、ヒトIgG3、ヒトIgG4及びヒトIgA1/2から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでよい。さらに該抗体もしくはそのフラグメントは、ヒトIgカッパ及びヒトIgラムダから選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでよい。複数の態様において、該抗体もしくはそのフラグメントは、107Mから1010Mの高親和定数で抗原に結合する。
【００３１】
単離された抗体もしくはそのフラグメント、及び薬学的に許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤を含む組成物も提供される。
【００３２】
複数の態様において、本明細書で提供される組成物は、SP感染もしくはSP関連疾患を予防もしくは治療するための第二の薬剤をさらに含む。複数の態様において、第二の薬剤は、制限されることなく、PspAに結合する抗体及びPspCに結合する抗体のうち１種以上を含む。別の態様において、第二の薬剤は、制限されることなく、メトロニダゾールもしくはバンコマイシンのような抗生物質を含む。
【００３３】
別の態様において、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は抗体もしくはそのフラグメントを対象に投与する工程を含む、SP感染及び/又はSP関連疾患を予防もしくは治療するための方法が提供され、例えばSP感染及び/又はSP関連疾患が対象で予防もしくは治療される。SP感染を対象で予防もしくは治療するような、対象におけるSP感染に対する免疫を誘導する方法も提供される。複数の態様において、SP感染を対象で予防もしくは治療するような、対象におけるSP感染に対する粘膜免疫を誘導する方法が提供される。複数の態様において、粘膜免疫は、Th1応答及び分泌性IgAの生成の一つ以上を含んでよい。複数の態様において、1種より多いセロタイプによるSP感染を対象で予防もしくは治療するような、対象におけるSP感染に対する非セロタイプ特異的免疫を誘導する方法が提供される。
【００３４】
組換え脂質化融合タンパク質、組成物、ワクチン、抗体もしくはそのフラグメントは、静脈内、皮下、筋肉内、経粘膜、又は経口で投与されてよい。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質、組成物、ワクチン、抗体もしくはそのフラグメントは、SP感染を予防もしくは治療するための第二の薬剤と組み合わせて投与される。第二の薬剤は、組換え脂質化融合タンパク質、組成物、ワクチン、抗体もしくはそのフラグメントに付随して投与されてよく、あるいはそれらは順次、すなわち一方の後にもう一方が投与されてよい。
【００３５】
SP感染を予防もしくは治療するためのワクチンの製造における組換え脂質化PsaA融合タンパク質の使用もまた提供される。
【００３６】
さらに別の態様において、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質、抗体、組成物、及び／又はワクチンの一つ以上を含む、SP感染又はSP関連疾患を予防もしくは治療するためのキットが提供される。本明細書に記載の方法を使用もしくは実行するための説明書もまた、キットにおいて提供されてよい。キットは、本明細書に記載の方法を実行するために必要な追加の試薬、溶媒、バッファー、アジュバント等をさらに含んでよい。
【００３７】
本件特許又は本出願は、カラーで記載された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を有する本件特許又は本出願刊行物は、必要に応じ、必要な経費の支払いのもとに官庁により提供されるであろう。
【００３８】
本発明をよりよく理解し、どのように有効に実施されるかをより明確に示すために、添付の図面に付随する実施例により、参照がなされ、該図面は、本発明のより好ましい態様及び特徴を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】(A) 全長PsaAタンパク質のアミノ酸配列；(B) シグナルペプチドを有さないPsaAのアミノ酸配列；(C) コリン結合ドメイン(CBD)欠失肺炎球菌表面タンパク質A (PspA△CBD)；及び(D) CBD欠失PspC (PspC△CBD)を示す。
【図２】Ａ：rlipo-PsaAの精製プロセスを、還元条件下、クーマシーブルー染色で15% SDS-PAGEによりモニターした。レーン１：IPTG誘導後の細胞溶解物；レーン２：IPTG誘導前の細胞溶解物；レーン３：誘導した細胞の可溶性画分；レーン４：精製したrlipo-PsaA。レーン５から８は、抗(His)6抗体を使用した、rlipo-PsaA精製プロセスのイムノブロットモニタリングの結果である。Ｂ：rPsaA-Ctの精製プロセスを、還元条件下、クーマシーブルー染色で15% SDS-PAGEによりモニターした。レーン１：IPTG誘導後の細胞溶解物；レーン２：IPTG誘導前の細胞溶解物；レーン３：誘導した細胞の可溶性画分；レーン４：精製したrPsaA-Ct。レーン５から８は、抗(His)6抗体を使用した、rPsaA-Ct精製プロセスのイムノブロットモニタリングの結果である。Ｃ：rPspA△CBDの精製プロセスを、還元条件下、クーマシーブルー染色で15% SDS-PAGEによりモニターした。レーン１：IPTG誘導後の細胞溶解物；レーン２：IPTG誘導前の細胞溶解物；レーン３：誘導した細胞の可溶性画分；レーン４：精製したrPspA△CBD。レーン５から８は、抗(His)6抗体を使用した、rPspA△CBD精製プロセスのイムノブロットモニタリングの結果である。Ｄ：rPspC△CBDの精製プロセスを、還元条件下、クーマシーブルー染色で15% SDS-PAGEによりモニターした。レーン１：IPTG誘導後の細胞溶解物；レーン２：IPTG誘導前の細胞溶解物；レーン３：誘導した細胞の可溶性画分；レーン４：精製したrPspC△CBD。レーン５から８は、抗(His)6抗体を使用した、rPspC△CBD精製プロセスのイムノブロットモニタリングの結果である。
【図３Ａ】rlipo-PsaAのN末端フラグメントの同定と、rlipo-PsaAによる骨髄由来樹状細胞(BMDC)の活性化を示す。Ａ：10分消化サンプルを、Bruker AutoFlex（登録商標）III質量分析器により分析した。MALDI-TOF MSスペクトルもまた、m/z 1266における主要ピークがrlipo-PsaAのN末端からのリポペプチドフラグメントであったことを示した。
【図３Ｂ】Ｂ：CD40分子を、rlipo-PsaAで刺激した後上昇させることができ、一方rPsaA-Ctでの刺激効果ははっきりしなかった。
【図３Ｃ】Ｃ：TNF-αの分泌が、rlipo-PsaAにより用量依存的に誘導されたが、rPsaA-Ctでは誘導されなかった。
【図３Ｄ】Ｄ：IL-12p40が、rlipo-PsaAにより用量依存的に誘導されたが、rPsaA-Ctでは誘導されなかった。
【図４】抗PsaA IgG及びIgA抗体力価の上昇、ならびにrlipo-PsaAの投与後のTh1偏向免疫応答の誘導を示す。Ａ．マウスを、2週間間隔でPBS中30μgのrlipo-PsaA、及びPBS中30μgのrPsaA-Ctで2回皮下注射により免疫化した。２、４及び５週目においてrlipo-PsaAにより引き起こされたIgG力価は、rPsaA-Ctにより引き起こされたものよりも1000倍高かった。Ｂ．２、４及び５週目においてrlipo-PsaAでの免疫化により引き起こされたIgA力価は、rPsaA-Ctにより引き起こされたものよりも10000倍高かった。Ｃ．引き続き、５週目においてrlipo-PsaA及びrPsaA-Ctでの免疫化により引き起こされた抗体アイソタイプを分析するために、IgG1及びIgG2bの誘導レベルを測定した。IgG1レベルは、rlipo-PsaA及びrPsaA-Ct免疫化マウスの両方において同等であった。rlipo-PsaA免疫化マウスにおけるIgG2bレベルは、rPsaA-Ct免疫化マウスにおけるものよりも高かった。Ｄ．Th1偏向現象を、これらのマウスのおけるIgG2b/IgG1比を比較することにより明確に観察することができる。
【図５ＡＢ】rlipo-PsaA及び他のワクチン候補による免疫化が、動物モデルにおいてSPに対してマウスを保護したことを示す。（Ａ）第一の試験において、rlipo-PsaA及びrPsaA-Ctでマウスがワクチン化され、その後10 x LD用量のSPを使用してチャレンジしたことをを示す。2 X 105 D39株（高病原性株）でチャレンジしたマウスは、rlipo-PsaAで免疫化した後100%保護され、rPsaA-Ctで免疫化した後75%保護された。（Ｂ）第二の試験において、rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rlipo-PsaA、rPsaA-Ct及びPBSでマウスがワクチン化され、その後10 x LD用量のSPを使用してチャレンジしたことをを示す。3.9 X 106 D39株でチャレンジしたマウスは、免疫化により、それぞれ83.3%、50%、33.3%、16.7%及び0%保護された。
【図５Ｃ１】（Ｃ）追加の試験において、示されるように、アジュバント(CT)とともにもしくはアジュバント(CT)なしでrlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD (T1+T2+T3)、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD (T1+T2+T4)、rlipo-PsaA (T3)、rPsaA-Ct (T4)及びPBSでマウスがワクチン化され、その後異なるセロタイプの肺炎連鎖球菌でチャレンジしたことをを示す。
【図５Ｃ２】ワクチン化マウスは、肺炎連鎖球菌セロタイプ35B、14及び19Fにより鼻咽頭コロニー形成が顕著に減少し、又はセロタイプ3の致死チャレンジで生存したことを示した。
【図６Ａ】組換え脂質化融合タンパク質上に見いだされる脂肪構造の質量分析を使用した分析を示す。（Ａ）質量分析による分析により、髄膜炎菌タンパク質Ag473からの脂肪シグナルペプチドが少なくとも3つのピークをもたらしたことを示す。
【図６Ｂ】（Ｂ）及び（Ｃ）それぞれAg473の脂肪シグナルペプチドに融合した抗原D1E3及びE7mもまた、少なくとも3つのピークを含んでいた。
【図６Ｃ】（Ｂ）及び（Ｃ）それぞれAg473の脂肪シグナルペプチドに融合した抗原D1E3及びE7mもまた、少なくとも3つのピークを含んでいた。
【図６Ｄ】（Ｄ）対照的に、それ自身の天然脂質シグナルペプチドを使用して発現したrlipo-PsaAは1つの主要ピーク（分子量）として示された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、PsaAタンパク質及びその部分を含む組換え脂質化融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、従来不可能であったPsaAの天然脂質シグナルペプチドを含む。
【００４１】
特に、本明細書において出願人は、天然リポタンパク質である肺炎球菌表面抗原A(PsaA)が、それ自身の脂肪シグナルペプチドを使用して、PsaAをコードする合成DNAフラグメントを含む大腸菌構築物から組換え脂質化融合タンパク質を生成することができることを報告する。マウスモデルにおいて、組換え脂質化PsaA融合タンパク質で免疫化することにより、PsaA特異的IgG及びIgA抗体力価を上昇させ、Th1偏向免疫応答(Th1-biased immune response)を誘導し、ならびに異なる肺炎球菌株のチャレンジに対してマウスを保護する。さらに、他の切断抗原、コリン結合ドメイン(CBD)欠失肺炎球菌表面タンパク質A(PspA△CBD)及びCBD欠失PspC (PspC△CBD)と組換え脂質化PsaA融合タンパク質が、共投与した抗原に対する免疫応答を誘導することができ、高用量のチャレンジからマウスを保護する一方、PspA及びPspCとの非脂質化PsaAは保護を提供しなかった。それゆえ、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質及びその組成物は、広範囲のSP感染及びSP関連疾患に対するワクチンとして有用である。
【００４２】
複数の態様において、本明細書で提供される組換え脂質化融合タンパク質は、全身免疫応答に加えて、肺炎球菌(SP)に対する広範囲の粘膜免疫応答を誘導する。さらに、組換え脂質化融合タンパク質は、他の共投与SP抗原に対してアジュバント効果を有することができ、それらに対する免疫応答を引き起こす。複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質は、質量分析を使用して測定される均一な脂肪修飾を有してよい。SP関連疾患に対するワクチンとしての、組換え脂質化融合タンパク質の調製方法及びその使用もまた、本明細書で提供される。
【００４３】
複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質、それを使用する組成物及び方法は、以下のうち1つ以上の利点を提供してよい：SPに対して、粘膜免疫応答を含む保護免疫応答を誘導する能力；セロタイプ特異的ではないSPに対する保護免疫応答を誘導する能力；及び/又は、組換え脂質化PsaA融合タンパク質と配合した、及び/又は共投与した1つ以上の非脂質化SP抗原に対して粘膜免疫応答を誘導する（すなわち、粘膜アジュバント効果を有する）能力。複数の態様において、PsaAの天然脂質シグナルペプチドをを含む組換え脂質化PsaA融合タンパク質により、均一な脂肪構造を有する、例えば単一のピークが観察される質量分析を使用して測定される、単一形態の脂肪修飾のみを有する、脂質化タンパク質が提供される。均一な脂質構造は、複数の場合において、より簡単な融合タンパク質生成物を提供し、バッチ間の調和を改善することにより、製造をより簡単にし、及び/又は製造コストを減少させることにより、利点となり得る。複数の態様において、本明細書で提供される組換え脂質化融合タンパク質は、有利には、特に均質な脂肪修飾（例えば髄膜炎菌タンパク質、rAg473、融合タンパク質、rlipo-D1E3及びrlipo-E7m）を使用する公知の抗原と比較して、誘導される免疫応答の特異性を増加させ、及び/又は交差反応を減少させてよい。本明細書に記載の、組換え脂質化融合タンパク質、それを使用した組成物及び方法を使用して、他の技術効果を得てもよい。本明細書に記載のの技術効果及び利点の全てが、本発明技術の各態様及びそれぞれの態様において享受される必要がるわけではないことが理解されるべきである。
【００４４】
組換え脂質化融合タンパク質
本明細書において、肺炎球菌表面タンパク質A(PsaA)をを含む組換え脂質化融合タンパク質が提供され、該組換え脂質化タンパク質は、N末端からC末端までに、PsaAのN末端天然脂質シグナルペプチドとPsaAに対するC末端構造遺伝子とを含み、場合によりNもしくはC末端においてタグもしくは検出可能な標識を有する。
【００４５】
組換え脂質化融合タンパク質のいずれの免疫原性ホモログ、アナログ、バリアントもしくはフラグメント、又は部分もまた、本発明に含まれてよく、本明細書で提供される組成物及び方法で使用されてよいことが理解されるべきである。SPの多くの異なる株及びセロタイプが知られており、異なる株及びセロタイプにより発現される抗原は、そのアミノ酸配列において微細に相違していてよいことに注意すべきである。しかし、本明細書で提供される組換え脂質化融合タンパク質は、いずれかの特定の株又はセロタイプにより発現されるPsaAタンパク質に限定することを意味しない。ホモログ、バリアント、フラグメント、及びアナログが、本発明技術により包含されることが、明確に意図される。
【００４６】
「組換え脂質化融合タンパク質」及び「組換え脂質化PsaA融合タンパク質」の語は、本明細書で交換可能で使用され、本明細書で提供される天然PsaA脂質シグナルペプチドを含む、及び／又は本明細書で提供される組換え方法により生成されるPsaA融合タンパク質を指す。
【００４７】
「脂質化」の語は、本明細書において、脂質基の結合により共有結合で修飾されたタンパク質を指す。タンパク質は、脂肪酸、イソプレノイド及びコレステロールを含む、種々の脂質と共有結合で修飾されてよい。脂質化は、タンパク質の活性及び／又はその細胞内局在に影響し、かつペプチド抗原の免疫原性を増大させ得る。脂質化タンパク質は、多くの微細物感染プロセスに重要である。
【００４８】
「組換え」の語は、本明細書において、インビトロで生成される、又は組換え発現システムを使用して生成される、すなわち（微生物もしくは動物細胞のような）宿主細胞においてタンパク質をコードする、（発現ベクターのような）組換え構築物から発現されるタンパク質を指し、場合により該タンパク質は宿主細胞から単離及び/又は精製され、あるいは発現システムからの抽出物において使用される。組み換えタンパク質は、典型的には高収率及び高純度で生成され、かつ所望の活性を最大化し、望ましくない活性を最小化するよう操作されうる。
【００４９】
一般的に、組み換えタンパク質は以下の工程により生成される：所望のPsaA融合タンパク質をコードする合成もしくは半合成DNAを構築する工程；脂質化PsaA融合タンパク質の発現に適したやり方で、該DNAを発現ベクターに挿入する工程；適切な原核生物もしくは真核生物宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程；脂質化PsaA融合タンパク質が発現するように、該形質転換もしくは形質感染宿主細胞を培養する工程；ならびに、場合により生成された該組換え脂質化PsaA融合タンパク質を単離もしくは精製する工程。
【００５０】
組換え発現のために、脂質化PsaA融合タンパク質をコードするDNAは、完全に合成であるか、半合成であるか、あるいは天然PsaA遺伝子の修飾の結果であってよい。発現ベクターは、アミノ酸タグ等の融合タンパク質の検出もしくは精製のための、あるいは制限エンドヌクレアーゼ切断部位、リンカー等のようなDNA配列の捜査のための付加配列を含んでよい。当業者であれば、融合タンパク質の異なる部位が、一般的に互いに隣接して設置され、翻訳オープンリーディングフレーム関係で連結されることを理解するであろう。
【００５１】
複数の態様において、本明細書に記載の組換え脂質化PsaA融合タンパク質をコードするDNAフラグメントを、強力なプロモーター（例えばT7、T5、T3もしくはSP6プロモーター）を含むベクターのような発現ベクターに挿入し、発現プラスミドを構築する。強力なプロモーターは、例えばイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)により誘導可能であってよい。そして発現プラスミドを大腸菌宿主株に導入し、タンパク質発現に適した条件下で陽性形質転換体を培養してよい。複数の態様において、大腸菌宿主株は、外来性タンパク質の過剰発現により誘導することができる毒性効果に耐性であってよい。そのような大腸菌株を、例えば米国特許第6,361,966号に記載の方法により同定し、製造することができる。そのような大腸菌株の例は、C43(DE3) (ECCC B96070445)、C41(DE3) (ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S (NCIMB 40885)及びC2014(DE3) (NCIMB 40884)を含むがそれに限定されない。そして組換え脂質化融合タンパク質を、大腸菌宿主細胞から単離もしくは精製してよい。タンパク質の脂質化状態を、抗リポタンパク質抗体でのイムノブロット又は質量分析のような公知の方法を使用して確認してよい。
【００５２】
例示的な組換え脂質化融合タンパク質及び他のSP抗原のタンパク質／ペプチド部分の配列、ならびにそのコードDNAの配列を表１に示す。
【００５３】
【表１−１】
2018537107.tif 000003
【表１−２】
2018537107.tif 000004
【００５４】
組換え脂質化PsaA融合タンパク質のバリアント、アナログ及びフラグメントもまた包含される。本明細書において、「バリアント」は少数のアミノ酸が置換され、挿入されもしくは欠失し、出発タンパク質の関連する生物学的活性もしくは機能を保持する、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を指す。例えば、ワクチンに使用するための抗原の場合、バリアントは、免疫を誘導する際のその意図する用途に十分である出発タンパク質の免疫原性を保持してよい。抗体の場合、バリアントは、抗原に特異的に結合する際のその意図する用途に充分である出発タンパク質の抗原結合特性を保持してよい。
【００５５】
複数の態様において、バリアントは、1つ以上の保存的アミノ酸置換、1つ以上の非保存アミノ酸置換、1つ以上の欠失及び／又は1つ以上の挿入を含む。保存的置換は、アミノ酸が残基が、類似の特性（例えば電荷もしくは疎水性）を有する別のアミノ酸残基により置換されるものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、以下を含む：１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン。例示的な保存的アミノ酸置換の群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸及びアスパラギン−グルタミン。他の保存的アミノ酸置換が当業者に公知であり、本明細書において含有される。塩基性アミノ酸を疎水性のもので置換するような、非保存的置換もまた、当業者に公知である。
【００５６】
本明細書において、「アナログ」の語は、1つ以上のアミノ酸がアミノ酸アナログにより置換されている、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列を指す。アミノ酸アナログの非限定的な例は、天然に存在しないアミノ酸、合成アミノ酸、無関係の生物システムにおいてのみ天然に存在するアミノ酸、ほ乳類システムからの修飾アミノ酸、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに天然に存在する、及び天然に存在しない、他の当業者に公知の修飾を含む。複数の態様において、アナログは、糖タンパク質もしくは糖ペプチドの安定性を増大させる修飾を含む。ある態様において、アナログは、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、又はD-アミノ酸を含む。
【００５７】
「フラグメント」は、出発分子の関連する生物学的活性もしくは機能（例えば、抗原性、抗原結合、免疫原性）を保持する出発分子の部分を指す。
【００５８】
「生物学的に活性な」もしくは「機能的に同等な」フラグメント、バリアントもしくはアナログは、本発明の組成物及び方法において使用するために十分な、出発物質の生物学的活性もしくは機能を一般的に保持している。「生物学的に活性な」もしくは「機能的に同等な」フラグメント、バリアントもしくはアナログは、出発分子の結合特異性、抗原性もしくは免疫原性を保持していてよい。複数の態様において、フラグメント、バリアントもしくはアナログは、出発分子（例えばタンパク質）に対して、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する。抗体に対する場合、「機能的に同等」は、本発明の組成物及び方法において使用するために十分な、抗原結合親和性、特異性及び/又は選択性を維持する抗体のフラグメント、誘導体、バリアント、アナログ又は融合タンパク質を一般的に指す。機能的に同等な抗体もしくはフラグメントの抗原結合特性は、それらが、肺炎球菌関連疾患を予防又は治療するための本発明の組成物及び方法で使用するために十分である限り、参照抗体のものと同一である必要はない。
【００５９】
フラグメント、バリアントもしくはアナログはまた、N及び/又はC末端で改変され、ポリペプチドもしくはフラグメントを構造的に緊張させてもよく、及び/又は免疫原性担体と連結させてもよい。
【００６０】
担体分子にコンジュゲートされた組換え脂質化PsaA融合タンパク質を含む、コンジュゲート化脂質化PsaA抗原がさらに提供される。担体分子は、制限されないが、以前に記載されたタイプの担体分子のいずれかでロードされた、又は脂質化PsaA抗原それ自体でロードされた、ペプチド、膜タンパク質、炭水化物部分、又は1つ以上のリポソームのような適切な分子のいずれかであってよい。多くのそのような担体分子が当業者に公知であり、本明細書に提供されるコンジュゲート化脂質化PsaA抗原において使用されてよい。さらに、担体分子は、当業者に公知ないずれかの適切な方法を使用して、例えば、直接又はリンカーを使用する、共有結合又はイオン交換により脂質化PsaA抗原に結合されてよい。
【００６１】
別の態様において、脂質化PsaA抗原は、アミノ酸リンカーもしくは免疫原性担体のような、天然SP PsaA配列の一部ではない、他の異なるアミノ酸配列、ならびにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ及びブドウ球菌タンパク質Aのようなタンパク生成に有用なリガンドを含有する融合タンパク質又はコンジュゲートとして生成される。異種ポリペプチドを、例えば組換え脂質化PsaA融合タンパク質のN末端もしくはC末端に融合することができる。
【００６２】
本明細書において、「単離される」の語は、由来の起源又はソースにより、（１）その天然状態において伴う天然の関連成分と結合しておらず、（２）同一の主由来の他の巨大分子（例えばタンパク質、グリカン）が存在せず、（３）異なる種由来の細胞により発現され、又は（４）天然に存在しない分子を指す。そして、化学合成される、あるいはその天然に由来する細胞と異なる細胞システムにおいて合成される脂質化タンパク質は、その天然の結合成分から「単離される」であろう。脂質化タンパク質は、さらに、公知の精製もしくは分離技術を使用して、単離により天然の結合成分が実質的に存在しないものとなってもよい。本明細書に記載の組成物及び方法において使用される組換え脂質化PsaA融合タンパク質は、精製もしくは実質的精製形態、すなわち他のタンパク質もしくはポリペプチド、特に他のSPもしくは宿主細胞タンパク質もしくはポリペプチドが実質的に存在しない形態で一般的に提供される。複数の態様において、組換え脂質化PsaA融合タンパク質は、（重量換算で）少なくとも約50%の純度、少なくとも約60%の純度、少なくとも約70%の純度、少なくとも約80%の純度、少なくとも約90%の純度又は少なくとも約95%の純度である。
【００６３】
組換え脂質化PsaA融合タンパク質を、種々の手法（例えば組換え発現、細胞培養からの精製、化学合成等）により調製することができる。複数の態様において、組換え脂質化PsaA融合タンパク質を、異種細胞における発現後に精製する。例えば、上記記載のように、組換え脂質化PsaA融合タンパク質をコードするポリペプチドを、公知の技術を使用して適切な発現システムにおいて発現することができる発現ベクター中に導入し、その後発現した融合タンパク質を単離又は精製することができる。典型的には、組換え脂質化PsaA融合タンパク質を、大腸菌のような異種微生物において発現する。種々の微生物発現システムが、当業者に利用可能であり、そのような適切な発現システムのいずれも使用することができる。
【００６４】
本明細書に記載の種々の技術は公知であり、組換え脂質化PsaA融合タンパク質を調製するために使用されてよい。
【００６５】
医薬組成物及び方法
本明細書において、組換え脂質化PsaA融合タンパク質を含む、対象におけるSP感染及び／又はSP関連疾患の予防もしくは治療のための組成物もしくは方法が提供される。SPに対する免疫応答を誘導するための組成物及び方法もまた提供される。本明細書に提供される方法は、SPに対する免疫応答を誘導し、それによりSP関連疾患を軽減、除去、予防又は治療するために有効な量で対象に組換え脂質化PsaA融合タンパク質を投与することを含む。組成物及び方法は、SP関連疾患の受動免疫に使用するための抗体の製造のためにも提供される。
【００６６】
肺炎連鎖球菌(SP)は、多くのタイプの肺炎球菌感染の原因となる病原性微生物である。SPのカプセル形態セロタイプは90種類以上知られており、そのうち23種類が肺炎球菌疾患の約85-90%を占める。最も一般的な感染である肺炎と髄膜炎に加えて、SPはまた、制限されるわけではないが、敗血症、気管支炎、鼻炎、急性副鼻腔炎、中耳炎、結膜炎、菌血症、敗血症、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、蜂巣炎及び脳膿瘍の原因ともなる。SP関連疾患は、急性感染又は慢性感染の結果でもあり得る。複数の態様において、SP関連疾患は、肺炎、髄膜炎、耳感染、副鼻腔感染症及び菌血症から選択される。
【００６７】
「対象」及び「患者」の語は、本明細書で交換可能で使用され、SP関連疾患のため、又はSPに関連した感染のための予防又は治療を必要とする対象を指す。対象は、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヤギ又は他の動物のような、脊椎動物であってよい。動物は、全ての脊椎動物、例えば、マウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、鳥類、アヒル、ガチョウ、ブタ、ニワトリ、両生類及び爬虫類のような哺乳動物及び非哺乳動物を含む。ある態様において、対象はヒトである。
【００６８】
「治療する」又は「治療」は、（ｉ）感染又は再感染の防止、例えば予防、あるいは（ｉｉ）所望の疾患の兆候の軽減又は除去、例えば治療のいずれかを指す。「治療する」又は「治療」は、本明細書に記載の組換え脂質化PsaA融合タンパク質を含む組成物の投与、又はこれらの融合タンパク質に対する抗体の投与を指しうる。組成物で対象を治療することにより、感染の危険を防止もしくは軽減し、かつ／又はSPに対する免疫応答を誘導することができる。
【００６９】
治療は、予防的（例えば疾患の開始を防止するもしくは遅延させる、その臨床上もしくは無症状の兆候の顕在化を防止する、又は疾患の再発を防止する）、あるいは治療的（例えば疾患の顕在化後の兆候の抑制もしくは回避）であり得る。「防止する」又は「防止」は、感染したことがない、又は症状がない、及び／もしくは感染の危険にある対象において、組換え脂質化PsaA融合タンパク質で予防的投与又はワクチン化することを指す。
【００７０】
本明細書において、「免疫応答」の語は、免疫細胞移動、標的細胞の殺傷、ファゴサイトーシス、抗体の生成、免疫応答の可溶性エフェクターの生成等をもたらす、芽根基細胞における生化学的変化を生み出す外部もしくは内部刺激（例えば、抗原、細胞表面レセプター、サイトカイン、ケモカイン、及び他の細胞）に対する免疫系細胞の応答を指す。「免疫原性」分子は、投与後に対象において免疫応答を引き起こすことができるものである。「粘膜免疫」及び「粘膜免疫応答」の語は、典型的には共通の粘膜免疫システムの揺動に関わる、粘膜表面における免疫応答を指すために、交換可能に使用される。粘膜免疫応答は、典型的には分泌性IgAの生成及び／又はTh1応答の活性化を含む。
【００７１】
「活性免疫化」は、免疫応答を誘導するために、対象に抗原（例えば免疫原性分子、例えば本明細書に記載の組換え脂質化PsaA融合タンパク質）を投与するプロセスを指す。対照的に、「受動免疫」は、対象に、通常事前に製造された抗体の形態の、活性液性免疫の投与を指す。受動免疫は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの投与により達成することができる短期免疫化の形態である。複数の可能な形態で、例えばヒトもしくは動物血漿もしくは血清として、プールした動物もしくはヒト免疫グロブリンとして、免疫化した対象もしくは疾患から回復したドナーからの高力価動物もしくはヒト抗体として、ポリクローナル抗体として、又はモノクローナル抗体として、抗体を投与することができる。典型的には、受動免疫に由来する免疫は、即時の保護もしくは治療を提供するが、短時間にのみ継続するかもしれない。
【００７２】
複数の態様において、SP感染及び/又はSP関連疾患に対する活性免疫化のための組成物及び方法が提供される。組成物及び方法は、対象におけるSP微生物に対する免疫応答を誘導するために提供され、場合によりアジュバントの存在下、対象における免疫応答を誘導するために有効な量の組換え脂質化PsaA融合タンパク質を対象に投与することを含む。ある態様において、免疫化に有効な量の本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質とアジュバントを含む組成物が提供され、該組成物は、それを必要とする対象におけるSP関連疾患を防止もしくは治療するために有効である。ある態様において、アジュバントは必要ではない、すなわち組成物及び方法は、対象におけるSP微生物に対する免疫応答を誘導するために提供され、対象における免疫応答を誘導するために有効な量で、組換え脂質化PsaA融合タンパク質及び医薬的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤を対象に投与することを含む。
【００７３】
複数の態様において、組成物及び方法は、対象におけるSPに対する粘膜免疫を誘導するために提供され、例えばTh1応答及び／又は分泌IgAの生成を含む免疫応答が誘導される。複数の態様において、全身性免疫応答が誘導され、例えばIgGのような抗体アイソタイプが生成される。複数の態様において、粘膜性及び全身性免疫応答の両方が誘導される。
【００７４】
複数の態様において、誘導される免疫応答は、セロタイプ特異的ではない。本明細書において、「セロタイプ特異的ではない」とは、1つ以上のSPセロタイプに対して保護的である免疫応答を指す。言い換えれば、特定の組換え脂質化PsaA融合タンパク質で免疫化した対象において、誘導した免疫応答は、融合タンパク質が由来するセロタイプに対してのみではなく、1つ以上のさらなるSPセロタイプに対しても保護的である。複数の態様において、本明細書に記載の組成物及び方法は、SPに対して、粘膜免疫を含めて、広範囲の免疫をそのように提供することができる。
【００７５】
複数の態様において、組成物及び方法は、1つ以上のさらなるSP抗原と組み合わせて、組換え脂質化PsaA融合タンパク質を投与することをさらに含む。さらなるSP抗原は、例えば、SP抗原に対して保護的でありうるカプセル状多糖抗原、膜結合病原性因子、又は表面抗原を含んでよい。複数の態様において、さらなるSP抗原は、PspA又はPspCである。さらなるSP抗原の非限定的な例は、肺炎球菌ベータガラクトシダーゼ(BgaA)、肺炎球菌ホスホリルコリン(ChoP)、肺炎球菌エノラーゼ(Eno)、肺炎球菌ヒアルトナートリアーゼ(Hyl)、肺炎球菌オートリジンA (LytA)、肺炎球菌ノイラミニダーゼ(Nan)、肺炎球菌接着及びビルレンスA (PavA)、肺炎球菌鉄捕捉(PiaA)及び肺炎球菌表面結合Phtタンパク質(PhtA、PhtB、PhtD及びPhtE)を含む。
【００７６】
複数の態様において、1つ以上のさらなるSP抗原と組み合わせた組換え脂質化PsaA融合タンパク質の投与は、該1つ以上のさらなる抗原がそれ自体脂質化されていない、及び/又は免疫原ではない（すなわち、組換え脂質化PsaA融合タンパク質の不存在下で投与された場合）としても、（PsaAに対する粘膜免疫応答に加えて）1つ以上のさらなる抗原に対する粘膜免疫応答を誘導する。このようにして、組換え脂質化PsaA融合タンパク質は、共配合及び/又は共投与される非脂質化抗原に対する特定の粘膜免疫を誘導する、粘膜アジュバント効果を有してよい。
【００７７】
そのような非脂質化抗原の非限定的な例は、PspA、PspC、肺炎球菌ベータガラクトシダーゼ(BgaA)、肺炎球菌ホスホリルコリン(ChoP)、肺炎球菌エノラーゼ(Eno)、肺炎球菌ヒアルトナートリアーゼ(Hyl)、肺炎球菌オートリジンA (LytA)、肺炎球菌ノイラミニダーゼ(Nan)、肺炎球菌接着及びビルレンスA (PavA)、肺炎球菌鉄捕捉(PiaA)及び肺炎球菌表面結合Phtタンパク質(PhtA、PhtB、PhtD及びPhtE)を含む。
【００７８】
一般的にアジュバントは、免疫応答の特異性及び/又はレベルを増大させる。そしてアジュバントは、免疫応答を誘導するために必要な抗原の量、及び/又は対象に利益を享受させるため十分な免疫応答を生成するために必要な注射の回数を減少させてもよい。抗原に対する免疫応答を増大するために作用し、対象における使用に適する（例えば、薬学的に許容される）化合物（複数可）を、本発明の組成物、ワクチン及び方法におけるアジュバントとして使用してよい。複数の態様において、アジュバントは、コンジュゲートされた、又は組換え抗原における、担体分子（例えば、コレラ毒素Bサブユニット、リポソーム等であるがそれに限定されない）であってよい。別の態様において、アジュバントは、免疫システムの応答を増大させることが知られている無関係の分子（例えば、弱毒化微生物もしくはウイルスベクター、AMVAD等であるがそれに限定されない）であってよい。ある態様において、アジュバントは、弱毒化ウイルスもしくは微生物、又はアルミニウム塩のような、強力な免疫応答を生成するものであってよい。
【００７９】
アジュバントの例は、コレラ毒素、大腸菌易熱性エンテロトキシン、リポソーム、免疫刺激複合体(ISCOM)、免疫刺激配列オリゴデオキシヌクレオチド及び水酸化アルミニウムを含むがそれに限定されない。組成物は、インビボ送達を容易にするポリマーも含むことができる(例えば、Audran R. et al. Vaccine 21:1250-5, 2003; 及びDenis-Mize et al., Cell Immunol., 225:12-20, 2003参照)。他の適切なアジュバントは、当業者に公知である。あるいは、複数の態様において、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質を、追加のアジュバントなしでSP関連疾患に対するワクチンにおいて使用することができる。
【００８０】
本明細書に記載の1つ以上のPsaA抗原を含む組成物、配合物及びワクチンを、混合、超音波破砕及びマイクロ流体化を含むがそれに限定されない、当業者に公知の技術を使用して、抗原とアジュバントを一様にかつ密接に結合させることにより調製することができる。アジュバントは、典型的には、組成物の約5から約10% (v/v)又は約10から約50% (v/v)を含むであろう。
【００８１】
別の態様において、PSに特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、受動免疫用の組成物及び方法が提供される。本明細書において、「抗体」の語は、いずれかの免疫グロブリン又は完全分子、ならびに特異的な抗原もしくはエピトープに結合するそれらのフラグメントを指す。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単一鎖、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)'フラグメント及び/又は完全抗体のF(v)部分及びそれらのバリアントを含むがそれに限定されない。IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMを含む全てのアイソタイプは、この語に包含される。
【００８２】
本明細書において「抗体フラグメント」の語は、抗体の機能的同等フラグメントもしくは部分、すなわち親抗体の抗原結合能（例えば、特異性、親和性及び/又は選択性）を保持する、抗体の全長配列の不完全もしくは単離部分を指す。抗原結合部分の非限定的な例は、以下を含む：（ｉ）Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）F(ab')2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された2個のFabフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一腕のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；（ｖ）VHドメインからなるdAbフラグメント；（ｖｉ）単離した相補性決定領域(CDR)；ならびに、（ｖｉｉ）Fvフラグメントの2つのドメインVL及びVHからなる、単一鎖Fv (scFv)。抗体フラグメントの他の非限定的な例は、Fab'フラグメント；ディアボディ(diabodies)；直鎖抗体；単一鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成される多特異性抗体である。
【００８３】
完全「抗体」は、ジスルフィド結合で相互に連結された、少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(VH)及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称するより保存された領域が分散して組み込まれた、相補性決定領域(CDR)と称する超可変性領域にさらに下位分割することができる。VH及びVLのそれぞれは、3つのCDR及び4つのFRからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で配置されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、種々の免疫系の細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一因子(C1q)を含む宿主組織もしくは因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
【００８４】
本明細書において、「モノクローナル抗体」もしくは「mAb」の語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一結合特性及び親和性を示す。「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び（存在するならば）定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。一態様において、不死化細胞に融合したヒト重鎖形質転換遺伝子及び軽鎖形質転換遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマによりヒトモノクローナル抗体を生成する。「ヒト化抗体」は、非抗原結合領域及び/又は抗原結合領域におけるアミノ酸配列が、抗体がよりヒト抗体に類似するが、いまだそのオリジナルの結合特性を保持するよう改変されている少なくとも1つの抗体分子を指す。ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト種からの1つ以上のCDRとヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域とを有する非ヒト種からの抗体分子である。「キメラ抗体」の語は、異なる部分が、異なる動物種に由来する抗体、例えば、マウスmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を指す。
【００８５】
本明細書において、「抗原」の語は、抗体の生成を促進し、免疫応答を引き起こすことができる物質を指す。本明細書において、「抗原」及び「免疫原」の語は交換可能に使用されるが、厳密な意味で、免疫原は免疫システムからの応答を引き起こす物質である一方、抗原は特定の抗体に結合する物質として定義される。抗原もしくはそのフラグメントは、特定の抗体と接触する分子（すなわちエピトープ）であり得る。組換え脂質化融合タンパク質もしくはそのフラグメントを使用して宿主動物を免疫化した場合、脂質化融合タンパク質の無数の領域が、抗原（例えば、脂質化融合タンパク質の所与の領域もしくは三次元構造）に特異的に結合する抗体の生成を誘導する（すなわち免疫応答を引き起こす）ことができる。
【００８６】
「特異的な」もしくは「特異的に結合する」の語は、交換可能に使用され、抗体とそれに対応する抗原との間の相互作用を指す。該相互作用は、結合分子により認識されるタンパク質の特定の構造（すなわち抗原もしくはエピトープ)の存在に依存する。特異的に結合するためには、所望のエピトープでありバックグラウンド抗原ではない抗体結合（すなわち、非常に少ない量の（他のタンパク質もしくは脂質構造、宿主細胞タンパク質等の）他の抗原との交差反応）に関わるべきである。本開示の抗体、又はその抗原結合フラグメント、バリアントもしくは誘導体を、抗原に対するその結合親和性の観点から記載もしくは特定することもできる。抗原に対する抗体の親和性を、公知の方法を使用して実験的に決定することができる。抗体に関する「高い親和性」の語は典型的には、少なくとも約1×107リットル／モル、もしくは少なくとも約1×108リットル／モル、もしくは少なくとも約1×109リットル／モル、もしくは少なくとも約1×1010リットル／モル、もしくは少なくとも約1×1011リットル／モル、もしくは少なくとも約1×1012リットル／モル、もしくは少なくとも約1×1013リットル／モル、もしくは少なくとも約1×1014リットル／モル、もしくはより大きい会合平衡定数(Kaff)を指す。会合平衡定数KDを、抗体親和性を記載するためにも使用することができ、それはKaffの逆数である。
【００８７】
本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質は、典型的には、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を組み合わせて、医薬組成物を形成する。薬学的に許容される担体は、例えば医薬組成物の吸着もしくはクリアランス率を安定化もしくは増大もしくは減少させるようにに作用する、薬学的に許容される化合物を含むことができる。一般的に、薬学的に許容される担体は、組成物の活性成分と共存可能でなきればならず、場合により活性成分を安定化することが可能であり、かつ治療される対象に有害ではない。生理学的に許容可能な化合物は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、重炭酸塩溶液、グルコース、スクロースもしくはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンのような抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、糖ペプチドもしくは賦形剤もしくは他の安定化剤及び/又はバッファーのクリアランス又は加水分解を低減させる組成物を含むことができる。他の生理学的に許容可能な化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤又は微生物の生育もしくは作用を防止するために特に有用な保存剤を含む。種々の保存剤が公知であり、例えばフェノール及びアスコルビン酸を含む。界面活性剤もまた、リポソーム担体を含む医薬組成物の吸着を安定化もしくは増大もしくは減少させるために使用することができる。薬学的に許容される担体及び配合物は当業者に公知であり、科学的文献及び特許文献に詳細に記載される（例えば最新版のRemington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. ("Remington's")を参照）。当業者であれば、生理学的に許容可能な化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば本発明の脂質化融合タンパク質、組成物、抗原もしくは抗体の投与モード及び経路、ならびにその特定の生理化学的特徴に依存することを理解するであろう。
【００８８】
本発明の組成物及びワクチンを、適切な手段、例えば錠剤、タブレット、カプセル、顆粒もしくは粉末のような経口；舌下；皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは胸骨下注射による、又は注入技術（例えば無菌注射水又は非水性溶液もしくは懸濁物）を使用するような非経口；吸入噴霧、エアロゾル、ミストもしくはネブライザーによるもののような経鼻；クリーム、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、粉末もしくはゲルの形態にあるもののような局所；パッチの形態のような経皮；経粘膜；あるいは坐剤の形態のような直腸により投与してよい。本発明の組成物をまた、適切な即効型放出もしくは延長型放出に適した形態で投与してもよい。即効型放出もしくは延長型放出を、適切な医薬組成物の使用により、あるいは特に延長型放出の場合において、皮下インプラントもしくは浸透圧ポンプのような装置の使用により達成してよい。
【００８９】
複数の態様において、本明細書に記載の医薬組成物を、非経口、例えば皮下注射もしくは筋肉内注射により、又は坐剤及び経口配合物のような他の投与モードを使用して投与してよい。坐剤用に、結合剤及び担体は、例えばポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドを含んでよい。経口組成物は、医薬グレードのサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常使用される初期成分を含んでよい。これらの組成物は、溶液、懸濁物、タブレット、ピル、カプセル、徐放性配合物、もしくは粉末の形態をとってよい。組成物を、液体溶液もしくはエマルジョンのような、注射用の最終製品として調製してよい（例えば米国特許番号第4,601,903号；米国特許番号第4,599,231号；米国特許番号第4,599,230号及び米国特許番号第4,596,792号参照）。
【００９０】
投与を容易にし、用量を均一にするための用量単位形態(dosage unit form)で経口もしくは非経口組成物を配合することが有利であることがしばしばある。用量単位形態は、治療する対象のための単位用量として適した物理的個別単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療もしくは免疫原効果を生成するよう計算された、所定の量の活性化合物を含む。脂質化融合タンパク質、抗原もしくは抗体の組成物を、経口投与される場合、公知の方法を用いて（例えば、Fix, Pharm Res. 13: 1760-1764, 1996; Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48: 119-135, 1996参照）、消化から保護することができる。
【００９１】
一態様において、組成物もしくはワクチンを、注射物として液体溶液もしくは懸濁物のいずれかとして、あるいは注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁物に適する固体形態として調製する。別の態様において、組成物もしくはワクチンを、乳化された、又は徐放性送達のために使用されるリポソームビヒクルもしくは他の微粒子担体中にカプセル化された固体形態で調製する。例えば、ワクチンを、エマルジョン、油中水エマルジョン、水中油中水エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期抵抗性エマルジョン、粘性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、微粒子、マイクロスフェア、又はナノ粒子の形態で調製することができる。ワクチンは、ワクチンの徐放性放出を可能とする、ヒドロゲルのような膨張性ポリマー、コラーゲンのような吸収性ポリマー、又は吸収性縫合を製造するために使用されるもののようなポリ酸もしくはポリエステルを含んでよい。
【００９２】
複数の態様において、本明細書で提供される組成物は、SP関連疾患に対する1つ以上の追加の治療もしくは予防薬剤を含む。例えば、組成物は、SP感染を防止もしくは治療するための第二の薬剤を含んでよい。そのような第二の薬剤のれいは、それに限定されないが、（メトロニダゾール及びバンコマイシンのような）抗体ならびに（それに限定されないが、PspA及びPspCのような追加のSP抗原に結合する抗体のような）抗体を含む。
【００９３】
別の態様において、本発明の組成物を、単独で、あるいはSP関連疾患の防止もしくは治療に有用な他の適切な薬剤と組み合わせて使用してよい。複数の態様において、本発明の組成物を、SP関連疾患ようの第二の治療もしくは予防薬剤を含む第二の組成物と同時に投与する。
【００９４】
本明細書において、「治療上有効量」もしくは「有効量」は、SP関連疾患を防止もしくは治療するため、SP関連疾患に関連する兆候の少なくとも1つを回避（例えば、緩和、減少、軽減）するため、及び/又は対象に対する便益が提供されるようにSPに対する免疫応答を誘導するために十分な、組換え脂質化融合タンパク質、組成物、ワクチン、抗原又は抗体の量を指す。組成物、ワクチン、抗原又は抗体の有効量を、当業者により決定してもよい。大人のヒトに対する例示的な抗原用量は、それに限定されないが、単一形態、あるいは1日、又は1週、又は2週当たり1回から5回のような、個別に分割された容量の形態で投与されてよい、1日当たり約0.1から500mg/kg体重の抗原又は抗体を含む。
【００９５】
複数の態様において、組換え脂質化融合タンパク質を含む組成物の有効量は、約0.05から約1500μgのタンパク質、約10から約1000μgのタンパク質、約30から約500μgのタンパク質、約40から約300pgのタンパク質、又はこれらの値の間のいずれかの数を含む。例えば、タンパク質を、被験者に約0.1μgから約200 mgの、例えば約0.1μgから約5μgの、約5μgから約10μgの、約10μgから約25μgの、約25μgから約50μgの、約50μgから約100μgの、約100μgから約500μgの、約500μgから約1mgの、又は約1mgから約2mgの用量で、例えば1週間、2種間、3週間、4週間、2ヶ月、3ヶ月、6か月及び/又は1年に与えられる任意のブースター(booster)ととともに投与してよい。
【００９６】
複数の態様において、受動免疫用の抗体組成物の量は、約0.001から約30mg/kg体重、例えば約0.01から約25mg/kg体重、約0.1から約20mg/kg体重、約1から約10mg/kg体重、約10から約20mg/kg体重の範囲である。
【００９７】
脂質化融合タンパク質、組成物、ワクチン、抗原又は抗体をまた、1ヶ月に1回、1ヶ月に2回、1ヶ月に3階、2週ごと(qow）、週1回(qw)、週2回(biw)、週3回(tiw)、週4回、週5回、週6回、1日ごと(qod)、毎日(qd)、1日2回(qid)又は1日3回(tid)投与してもよい。予防目的のために、そのような用量の脂質化融合タンパク質の量を、典型的なワクチンにおける顕著な副作用を伴わなず免疫保護応答を誘導する量として選択する。最初のワクチン化に続き、対象は、十分な間隔で1回もしくは複数回のブースター免疫化を受けてよい。
【００９８】
いずれかの特定の対象に対する特定の用量レベルもしくは用量の頻度は、変動しうること、ならびに使用される特定の化合物の活性、該化合物の作用の代謝安定性及び長さ、対象の種、体重、全体的な健康、性別及び食事、投与のモード及び時間、排出及びクリアランスの速度、薬物の組み合わせ、並びに特定の条件の重篤度を含む種々の因子に依存するであろうことが理解されるであろう。
【００９９】
キット
本明細書に記載の組換え脂質化PsaA融合タンパク質、抗原、抗体、組成物及び/又はワクチンを含むキットが、SP感染及び/又はSP関連疾患の防止もしくは治療のために提供される。本明細書に記載の方法を使用するもしくは実行するための説明書もまた、キットにおいて提供されてよい。キットは、本明細書に記載の方法を実行するために必要な、追加の試薬、溶媒、バッファー、アジュバント等をさらに含んでよい。
【０１００】
本明細書において、単数形の「一つの("a", "an")」及び「該("the")」は、内容が明確にそうではないと記述しない限り、複数の記載を含む。
【０１０１】
本明細書において、「約」の語は、実験の測定もしくは数値決定の誤差の限界内にある値を指す。例えば、標準誤差を訂正した後にお互いに約5%、約10%、約15%又は約20%離れた2つの値を、「ほぼ同じ(about the same)」又は「類似(similar)」とみなしてよい。複数の態様において、「約」は、当業者に理解されるであろうように、開示された方法を実行するため、又は開示された組成物及び方法を記載するために適切な、特定の値から±20%、±10%又は±5%の変動を指す。
【０１０２】
本明細書に記載の既述は、特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的システムに限定することを意味することなく、当然変動しうる。本明細書で使用される専門用語は、特定の側面を記載することのみを目的としており、限定する意図がないこともまた理解されるべきである。
【実施例】
【０１０３】
本発明は、本発明を説明するために提供され、いかなるやり方でもその範囲を限定するものと意図されない、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【０１０４】
別途規定されない、又は文脈上別途明確に記述されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様もしくは同等のいかなる方法及び物質も、本発明の技術の実行もしくは試験において使用することができることが理解されるべきである。
【０１０５】
実施例１．脂質化融合タンパク質rlipo-PsaAの発現
図１Ａに記載の配列（配列番号１、７；rlipo-PsaA）を有する、天然PsaA脂質シグナル配列を含む組換え脂質化融合タンパク質（rlipo-PsaA）を発現し、特徴付けした。出願人は以下で、この組換え脂質化融合タンパク質が、粘膜免疫を誘導し、Th1に向けて免疫応答を傾斜させることができ、肺炎連鎖球菌(SP)関連疾患に対してマウスを保護することができたことを報告する。非脂質化PsaA-Ct（脂質シグナルペプチドを有さないPsaA；rPsaA-Ct）（図１ｂ）もまた、rlipo-PsaAの効力と比較するために生成した。さらに、切断型肺炎球菌表面抗原Ａ（PspA△CBD；図１ｃ）及び肺炎球菌表面抗原Ｃ（PspC△CBD；図１ｄ）を生成し、ワクチン効力を増大させることが発見された。
【０１０６】
rlipo-PsaAの発現及び特徴付けのために、PsaAのアミノ酸配列を、公共のデータベースから得て、PsaAの受託番号はNP_359087である。生成収率を増大するために、大腸菌(E. coli)のコドン使用頻度を使用して、PsaA発現用のDNA配列を最適化した。PsaA遺伝子は、バイオテクノロジー会社により完全に合成され、Nde I及びXho I部位を使用して発現ベクターpET-22b(+) (Novagen, Madison, WI, USA)に挿入し、pPsaAプラスミドを生成した。その結果、組み換えタンパク質のC末端は、富化的なヘキサヒスチジン(His6)タグ含んだ（図１Ａ）。シグナルペプチドを有さないPsaAを得るために、同様の方法によりp pPsaA-Ctプラスミドを構築した。
【０１０７】
発現プラスミドpPsaA-Ctを、タンパク質発現のための大腸菌株BL21(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)に形質転換した。形質転換細胞を37℃で一晩培養し、その後1mMのIPTGで３時間(h)誘導した。脂質化免疫原を発現するためのプラスミドを得るために、pPsaAを、リポタンパク質発現のための大腸菌株C43(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)に形質転換した。形質転換細胞を37℃で一晩培養し、その後1mMのIPTGと12℃で３日間誘導した。
【０１０８】
pPsaAを大腸菌株C43(DE3)に形質転換した後、形質転換細胞を5 mlのLuria-Bertani (LB)培地中、37℃で一晩増殖させた。その後一晩培養した培養物を、1000 mlのM9培地(9 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 47.8 mM Na2HPO4, 19 mM NH4Cl, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2及び0.4%グルコース)中に移し、37℃で培養した。微生物が後期対数増殖期(OD 600 nm ~0.7)に到達した後、1 mMのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)を添加することにより20℃で20時間タンパク質発現を誘導した。
【０１０９】
実施例２．rlipo-PsaAの生成及び特徴付け
pPsaA-Ctから発現した抗原(rPsaA-Ct)の非脂質化形態、及びpPsaAから発現したrlipo-PsaAを、それぞれBL21(DE3)及びC43(DE3)細胞から、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)により以下のように単離した。大腸菌細胞を、４リットル細胞培養物から遠心(8000 x g を20分間)により回収し、そして回収したペレットを、50 mM Tris (pH 8.0)を含む100 mlの均一化バッファー中に再懸濁した。その後大腸菌細胞を、界面活性剤の存在下27 Kpsiでフレンチプレス(Constant Systems, Daventry, UK)を使用して破砕し、得られた細胞破砕物を80,000 x gで60分間遠心分離した。ペレットを回収し、抽出バッファー(1% Triton X-100/50 mM Tris (PH8.9))を使用して可溶化した。80000xgで40分間遠心後、上清を、コールドルームで一晩5 mL Ni-NTA 樹脂(Qiagen, San Diego, CA, USA)とインキュベートした。インキュベートしたサンプルと樹脂のスラリーを、カラム(1.6 cm i.d. x 2.7 cm)にロードした。最初にカラムを50 mLの抽出バッファーで洗浄した。組み換えタンパク質を、溶出バッファー(1% Triton X-100; 50mM Tris (PH8.9))で溶出し、SDS-PAGEとイムノブロットの両方で特徴付けした。そうして得られた結果（図２Ａに示す）は、組換えリポE7mが高純度で単離されたことを示す。リポ多糖(LPS)の除去を、銅イオンと連結したIMACを使用して実行し、1000 mLの溶出バッファー及び300 mLの洗浄バッファー(100 mM イミダゾール; 1% Triton X-100; 50mM Tris (pH 8.9))で洗浄した。調製物中の残余LPSは、30 EU/mg未満であった。
【０１１０】
同様の方法を使用して、rPsaA-Ct（図２Ｂ）、rPspA△CBD（図２Ｂ）及びrPspC△CBD（図２Ｂ）を得た。
【０１１１】
以下に記載のように、rlipo-PsaAを、質量分析器(MS)にかけた。rlipo-PsaAのN末端フラグメントを同定するために、最初にpH 8.5で5 mM二炭酸アンモニウムに対してrlipo-PsaAを透析し、その後室温で５分間、25 mM二炭酸アンモニウム(pH 8.5)中、50:1 (wt/wt)のrlipo-PsaA:トリプシン比率でトリプシン(Promega Co., Madison, WI, USA)と処理した。ギ酸の添加（最終濃度1.2%）により、酵素反応を終結させた。反応混合物を、さらにZiptip（登録商標）(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)を使用して調製した。1μlのトリプシン処理タンパク質を、アクリロニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(1:3, vol/vol)中の1μlのα−シアノ４−ヒドロジ桂皮酸(Sigma, St. Louis, MI, USA)と混合した。1ミリリットルの混合物を、分析用のマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析器(Bruker, Madison, WI, USA)の標的プレート上に設置した。上記記載のMALDI-TOF分析により得られた結果は、部分トリプシン消化生成物がrlipo-PsaAのN末端フラグメントに対応し、これらのペプチドが脂質化していることを示した（図３Ａ）。
【０１１２】
実施例３．rlipo-PsaAの免疫原性試験
rlipo-PsaAの免疫刺激特性を試験するためのモデルとして、BM-DCを使用した。rlipo-PsaAは、表面マーカーCD80の発現を情報制御した一方、rPsaA-Ctは効果を有さなかった（図３Ｂ）。サイトカイン分泌試験で同様の結果が得られた。TNF-α（図３Ｃ）及びIL-12p40（図３Ｄ）の分泌は、rlipo-PsaAにより誘導されたが、rPsaA-Ctグループでは誘導されなかった（図３Ｃ及び３Ｄ）。これらの結果は、rlipo-PsaAの免疫刺激活性がその脂質部分とリンクしていることを示す。
【０１１３】
実施例４．rlipo-PsaAでの免疫化は、抗原特異的IgG及びIgAを増大させ、Th1偏向応答を生成する
rlipo-PsaAのインビボでの固有アジュバント特性を評価するために、rlipo-PsaA又はrPsaA-Ctのいずれかで免疫化したマウスにおける抗原特異的抗体反応の強度を分析した（図４Ａ）。2週間隔でＰＢＳ中30μgのrlipo-PsaA又はＰＢＳ中30μgのrPsaA-Ctを2回皮下注射することにより、マウスを免疫化した。rlipo-PsaAにより引き起こされたIgG力価は、２、４及び5週でrPsaA-Ctにより引き起こされたものより1000倍高かった（図４Ａ）。rlipo-PsaAにより引き起こされたIgA力価は、２、４及び5週でrPsaA-Ctにより引き起こされたものより10000倍高かった（図４Ｂ）。続けて、５週のrlipo-PsaA及びrPsaA-Ctで免疫化により引き起こされた抗体アイソタイプを分析するために、IgG1及びIgG2の誘導レベルを測定した。IgG1レベルは、rlipo-PsaA及びrPsaA-Ct免疫化マウスの両方で同等であった。rlipo-PsaA免疫化マウスのIgG2レベルは、rPsaA-Ct免疫化マウスのものよりも高かった（図４Ｃ）。これらのマウスにおけるIgG2b/IgG1比率を比較することにより、Ｔｈ１現象を明確に観察することができる。
【０１１４】
実施例５．インビボ保護試験
本実施例において、マウスモデルを用いた試験においてマウスを免疫原でワクチン化し、その後異なる株の肺炎連鎖球菌（SP）でチャレンジしたことを報告する。
【０１１５】
インビボ保護試験のために、ICRマウス（グループあたり6匹のマウス）を、30μgのrlipo-PsaA又はrPsaA-Ctで免疫化した。最初の試験で、マウスをrlipo-PsaA及びrPsaA-Ctでワクチン化し、その後10 x LD用量のSPを使用してチャレンジした。2 X 105のD39株（高病原性株）でチャレンジしたマウスは、rlipo-PsaAで免疫化した後100%保護を示し、rPsaAで免疫化したものに対して約75%の保護がみられた（図５Ａ）。第二の試験で、rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rlipo-PsaA、rPsaA-Ct及びPBSでマウスをワクチン化し、その後100 x LD用量のSPを使用してチャレンジした。3.9 X 106のD39株でチャレンジしたマウスは、それぞれ83.3%、50%、33.3%、16.7%及び0%の保護を示した。
【０１１６】
これらの結果は、30μgのrlipo-PsaAで免疫化したマウスは、2 x 105 cfu/mLのD39株（高病原性株）に対して100%保護されることを示す。rPsaA単独で免疫化したマウスに対して、保護率は約75%であることが発見された（図５Ａ）。これらのデータは、rlipo-PsaAが、rPsaAよりも顕著に強力な保護免疫を誘導しうること、そしてより重要なことに、異なる株のSPからのチャレンジに対してワクチン化動物を保護することを示す。
【０１１７】
rlipo-PsaAが、より高いチャレンジ率（100 x LD50, 3.9 X 106 cfu/mLのD39株）に対して保護を授与することができるか、rlipo-PsaA及び切断rPspA△CBD及びrPspC△CBDを含む他の抗原について試験した。動物チャレンジ試験における結果は印象的であり、rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBDでワクチン化したグループで>80 %保護がみられた一方、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD、又はrlipo-PsaA、rPsaA-CtもしくはPBSで免疫化したグループにおける保護率は、それぞれ50%、33%、16%及び0%であることが見いだされた（図５Ｂ）。これらの結果は、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質を、タンパク質ベースの肺炎球菌ワクチンの開発に使用することができることを示す。
【０１１８】
異なるセロタイプの肺炎球菌に対する組換え脂質化融合タンパク質の潜在的保護を測定するために、さらに４つの異なるセロタイプ（タイプ３、１４、１９Ｆ及び３５Ｂ）の微生物株でもワクチン化マウスをチャレンジした。図５に示すように、セロタイプ２に対する保護（図５Ａ及びＢ）に加えて、ワクチンは、肺炎球菌セロタイプ１４、１９Ｆ及び３５Ｂによる鼻咽頭コロニー化を顕著に減少させ、あるいはセロタイプ３による致死的侵入感染を防止した。これらのデータは、本明細書に記載の組換え脂質化融合タンパク質が、複数のセロタイプの肺炎球菌に起因する感染に対して広範な保護を提供することができることを示す。
【０１１９】
実施例６．rlipo-PsaAの脂質構造の特徴付け
質量分析器を使用して、rlipo-PsaAの脂質構造の特徴付けを行い、異種脂質シグナルペプチドを使用して、大腸菌で生成された他の脂質化SP抗原の脂質構造と比較した。大腸菌システムで発現した（シグナルペプチド配列：MKKLLIAAMMAAALAACを有する）髄膜炎菌タンパク質Ag473からの脂肪シグナルペプチドは、質量分析による分析により少なくとも3つのピークをもたらした（図６Ａ）。脂肪シグナルペプチドに融合した抗原D1E3及びE7mもまた、少なくとも3つのピークを含んでいた（図６Ｂ及びＣ）。対照的に、それ自身の天然脂質シグナルペプチド（配列番号６）を使用して発現したrlipo-PsaAは、大腸菌システムにおいて1つの主要ピーク（分子量）を示した（図６Ｄ）。脂質部分の分子構造のさらなる情報については、Proteomics, 2011 11(13):2620-7を参照されたい。驚くべきことに、これらの結果は、脂質修飾の単一形態のみが、rlipo-PsaAについて発現されたことを示す。
【０１２０】
本発明は、その好ましい態様について詳細に記載されているが、これらの態様は本願発明を説明するが限定しないことを示している。本願発明の原理を使用し、その精神及び特許請求の範囲に規定される範囲に含まれる他の態様を生ずることも可能である。
【０１２１】
本明細書に記載の全ての特徴は、他のいずれかの組み合わせと組み合わせてよい。本明細書に記載の各特徴は、同一、同等もしくは類似の目的を提供する異なる特徴により置換してよい。そして、他に明記して記述されない限り、開示された各特徴は、同等もしくは類似の包括的なシリーズの例にすぎない。
【０１２２】
本明細書に引用される全ての文書及び参照文献の内容は、その全体が参照されて本明細書に取り込まれる。
【図１】
2018537107.tif 000005
【図２】
2018537107.tif 000006
【図３Ａ】
2018537107.tif 000007
【図３Ｂ】
2018537107.tif 000008
【図３Ｃ】
2018537107.tif 000009
【図３Ｄ】
2018537107.tif 000010
【図４】
2018537107.tif 000011
【図５ＡＢ】
2018537107.tif 000012
【図５Ｃ１】
2018537107.tif 000013
【図５Ｃ２】
2018537107.tif 000014
【図６Ａ】
2018537107.tif 000015
【図６Ｂ】
2018537107.tif 000016
【図６Ｃ】
2018537107.tif 000017
【図６Ｄ】
2018537107.tif 000018
【配列表】
2018537107000001.app
【国際調査報告】
2018537107.tif 000019
2018537107.tif 000020
2018537107.tif 000021
2018537107.tif 000022
2018537107.tif 000023