(57)【要約】  植物または植物の一部分において目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法を提供する。本方法は、植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理し、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結され、かつ目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、植物または植物の一部分に導入することを含む。あるいは、植物または植物の一部分が、目的の異種タンパク質をコードする核酸を含み、該植物または植物の一部分がジャスモン酸経路アクチベーターで処理されてもよい。処理された植物は、目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。
2018524345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物の一部分において目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法であって、
ｉ）該植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、該植物または植物の一部分に導入する工程；および
ｉｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該植物または植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、植物または植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２の植物または第２の植物の一部分で産生された目的の異種タンパク質と比較したとき、発現の増加が観察される、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ型植物ウイルスが、昆虫媒介性ＤＮＡ型植物ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが、ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、コロナチン、または生物学的に活性なそれらの誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記処理工程において、ジャスモン酸経路アクチベーターが、植物または植物の一部分に噴霧されるか、あるいは植物または植物の一部分を支持する生長培地に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記処理工程および導入工程が組み合わされ、ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列とともに植物または植物の一部分に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが気体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが液体である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが気体である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが液体である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理工程（工程ｉ）において、前記ジャスモン酸経路アクチベーターを植物または植物の一部分に気体として適用するか、また液体として、植物または植物の一部分に噴霧する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
植物または植物の一部分が、ヌクレオチド配列およびジャスモン酸経路アクチベーターを含む液体培地に浸漬される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
目的の異種タンパク質が、ヒト病原体、ウイルスタンパク質、インターロイキン、サイトカイン、エリスロポエチン、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン、血液凝固因子、受容体、受容体アゴニスト、抗体、ニューロポリペプチド、増殖因子、成長調節物質、抗原、自己抗原、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
植物または植物の一部分において総宿主可溶性タンパク質を減少させる方法であって、
ｉ）植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、該植物または植物の一部分に導入する工程；および
ｉｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該植物または植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、植物または植物の一部分から抽出された総宿主タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２の植物または第２の植物の一部分で産生された総宿主タンパク質と比較したとき、該総宿主タンパク質の減少が観察される、方法。
【請求項１４】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが、ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、コロナチン、または生物学的に活性なそれらの誘導体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記処理工程において、該ジャスモン酸経路アクチベーターが、植物または植物の一部分に噴霧されるか、あるいは植物または植物の一部分を支持する生長培地に添加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記処理工程および導入工程が組み合わされ、ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列とともに植物または植物の一部分に導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが気体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが液体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分において目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法であって、
ｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分を、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；および
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２のトランスジェニック植物または第２のトランスジェニック植物の一部分で産生された目的の異種タンパク質と比較したとき、発現の増加が観察される、方法。
【請求項２０】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが、ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、コロナチン、または生物学的に活性なそれらの誘導体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記処理工程において、該ジャスモン酸経路アクチベーターが、植物または植物の一部分に噴霧されるか、あるいは植物または植物の一部分を支持する生長培地に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが気体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ジャスモン酸経路アクチベーターが液体である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物におけるタンパク質生産に関する。本発明はまた、植物または植物の一部分において異種タンパク質産生を増加させるための、ジャスモン酸経路アクチベーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
植物は、臨床的に有用な組換えタンパク質の生産のためのバイオファクトリーとして益々用いられている。植物により生産された組換えタンパク質発現に関連する利点には、タンパク質骨格の哺乳動物様翻訳後成熟（maturation）、インフラコストの低さ（工業規模の発酵槽に基づく古典的システムと比較して）、および微生物毒素またはヒト病原体による製品汚染に関する低下したバイオセーフティ事象が含まれる。
【０００３】
植物抽出物中で組換えタンパク質を濃縮する方法は、宿主タンパク質を優先的に除去し、さらなる精製を容易にするために、適当な抽出緩衝液のｐＨまたはイオン強度の選択に依存することが多い。硫酸アンモニウム沈殿および低ｐＨでの抽出は、緑色の組織抽出物において、細胞破片および光合成色素のような汚染物質を沈殿させるのに有用である。これらの方法はまた、葉の総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の５０％までを占め、高度に精製されたタンパク質産物の調製を困難にする（例えば、Gaeda et al., 2007）、非常に豊富な酵素リブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（RuBisCO）を沈殿させるのに有用である(Peckham et al., 2006)。
【０００４】
ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）は、ストレスホルモンジャスモン酸の揮発性誘導体である(Okada et al., 2015)。光合成関連遺伝子の転写に対する、ＭｅＪＡおよびジャスモン酸誘発シグナル、例えば創傷、草食動物または昆虫の口腔分泌物の下方制御効果が、報告されている（Hermsmeier et al., 2001； Jung et al., 2007； Bilgin et al., 2010； Zubo et al., 2011； Duceppe et al., 2012）。ＭｅＪＡはまた、おそらくジャスモン酸シグナル伝達経路に応答する細胞におけるタンパク質生合成機構を活性に保つのに有用な、葉におけるリボソーム遺伝子の増加した発現を促進することが示されている（Noir et al., 2013）。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、植物におけるタンパク質産生に関する。本発明はまた、植物または植物の一部分においてタンパク質産生を増加させるための、ジャスモン酸経路アクチベーターの使用に関する。
【０００６】
本発明の目的は、植物または植物の一部分において目的の異種タンパク質を産生する改良された方法を提供することである。
【０００７】
植物または植物の一部分において目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法（Ａ）を記載する。本方法は、
ｉ）該植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、該植物または植物の一部分に導入する工程；および
ｉｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該植物または植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、植物または植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２の植物または第２の植物の一部分で産生された目的の異種タンパク質と比較したとき、発現の増加が観察される。
【０００８】
上記に概説した方法（Ａ）に記載のＤＮＡ型植物ウイルスは、昆虫媒介性ＤＮＡ型植物ウイルスであり得る。さらに、上記の方法（Ａ）に記載のジャスモン酸経路アクチベーターは、ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、コロナチン、またはジャスモン酸メチル、ジャスモン酸もしくはコロナチンの生物学的に活性な誘導体であってもよい。
【０００９】
本明細書にはまた、処理工程（工程ｉ）において、ジャスモン酸経路アクチベーターが、植物または植物の一部分に気体として適用されるか、あるいは植物または植物の一部分に液体として噴霧されるか、または植物もしくは植物の一部分を支持する生長培地に添加される、上記方法（Ａ）も記載される。あるいは、処理工程（工程ｉ）および導入工程（工程ｉｉ）は、ジャスモン酸経路アクチベーターがヌクレオチド配列と共に植物または植物の一部分に導入されるように、組み合わされ得る。
【００１０】
上記の方法（Ａ）で用いるジャスモン酸経路アクチベーターは、気体であっても、液体であってもよい。
【００１１】
さらに、ヌクレオチド配列が、植物または植物の一部分がその中に浸漬された液体培地を用いて一時的に該植物または植物の一部分に導入され、ジャスモン酸経路アクチベーターを、処理工程（工程ｉ）において該液体培地に導入する、上記方法（Ａ）を提供する。あるいは、ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列と共に液体培地に導入され、そしてジャスモン酸経路アクチベーターおよびヌクレオチド配列が共に植物または植物の一部分に導入されるように、処理工程（工程ｉ)および導入工程（工程ｉｉ)を組み合わせてもよい。
【００１２】
また、植物または植物の一部分において総宿主可溶性タンパク質を減少させる方法（Ｂ）であって、
ｉ）植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、該植物または植物の一部分に導入する工程；および
ｉｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該植物または植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、植物または植物の一部分から抽出された総宿主タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２の植物または第２の植物の一部分で産生された総宿主タンパク質と比較したとき、該総宿主タンパク質の減少が観察される、方法も提供する。
【００１３】
上記に概説した方法（Ｂ）に記載のＤＮＡ型植物ウイルスは、昆虫媒介性ＤＮＡ型植物ウイルスであってよい。さらに、上記の方法に記載のジャスモン酸経路アクチベーターは、ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、コロナチン、あるいはジャスモン酸メチル、ジャスモン酸またはコロナチンの生物学的に活性な誘導体であり得る。
【００１４】
本明細書にはまた、処理工程（工程ｉ）において、ジャスモン酸経路アクチベーターが、植物または植物の一部分に気体として適用されるか、あるいは植物または植物の一部分に液体として噴霧されるか、または植物または植物の一部分を支持する生長培地に添加される、上記方法（Ｂ）も記載される。あるいは、処理工程（工程ｉ）および導入工程（工程ｉｉ）は、ジャスモン酸経路アクチベーターがヌクレオチド配列と共に植物または植物の一部分に導入されるように、組み合わされ得る。
【００１５】
上記の方法（Ｂ）で用いるジャスモン酸経路アクチベーターは、気体であっても、液体であってもよい。
【００１６】
さらに、ヌクレオチド配列が、植物または植物の一部分がその中に浸漬された液体培地を用いて一時的に該植物または植物の一部分に導入され、ジャスモン酸経路アクチベーターを、処理工程（工程ｉ）において該液体培地に導入する、上記方法（Ｂ）を提供する。あるいは、ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列と共に液体培地に導入され、そしてジャスモン酸経路アクチベーターおよびヌクレオチド配列が共に植物または植物の一部分に導入されるように、処理工程（工程ｉ)および導入工程（工程ｉｉ)を組み合わせてもよい。
【００１７】
さらに、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分において目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法（Ｃ）であって、
ｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分を、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；および
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２のトランスジェニック植物または第２のトランスジェニック植物の一部分で産生された目的の異種タンパク質と比較したとき、発現の増加が観察される、方法も提供する。
【００１８】
上記の方法（Ｃ）に記載のジャスモン酸経路アクチベーターは、ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、コロナチン、あるいはジャスモン酸メチル、ジャスモン酸またはコロナチンの生物学的に活性な誘導体であり得る。
【００１９】
本明細書にはまた、処理工程（工程ｉ）において、ジャスモン酸経路アクチベーターが、植物または植物の一部分に気体として適用されるか、あるいは植物または植物の一部分に液体として噴霧されるか、または植物または植物の一部分を支持する生長培地に添加される、上記方法（Ｃ）も記載される。
【００２０】
目的の組換え異種タンパク質の濃縮を促進するための、ジャスモン酸経路アクチベーター、例えばジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）の使用が本明細書に記載される。精製の収率および最終生成物の宿主タンパク質またはそれらのタンパク質分解フラグメントによる汚染、粗抽出物または培養培地中のタンパク質分解の減少、ならびにタンパク質濃縮のための回収スキームの最適化を含む、植物において発現された異種タンパク質の下流プロセスの全体効率は、宿主（天然）タンパク質に対する組換えタンパク質の比率を調節することによって改善され得る。本明細書に記載の通り、ジャスモン酸経路アクチベーターの適用は、植物の葉におけるプロテオームを変化させることが見出された。理論はともかく、この改変は、植物組織における目的の異種タンパク質の産生の特定のおよび相対的な収量に影響を及ぼし得る。ＭｅＪＡ処理は、ＲｕＢｉｓＣＯの大小のサブユニットプールの枯渇、およびジャスモン酸誘導性防御タンパク質（例えば、チオニン、Ｓｅｒプロテアーゼ阻害剤および抗微生物加水分解酵素）のレベルの増加を誘導した。ジャスモン酸誘導性防御タンパク質の増加は、アグロインフィルトレーションによって減少した。しかしながら、ＲｕＢｉｓＣＯ枯渇細胞環境は、アグロインフィルトレーションされた葉で維持され、目的の異種タンパク質の効率の良い濃縮を可能にした。
【００２１】
ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されなかった植物と比較して、ジャスモン酸経路アクチベーターを用いた処理は、目的の異種タンパク質の発現を増加させる。さらに、ジャスモン酸経路アクチベーターを用いる処理は、ＲｕＢｉｓＣＯと比較して、一時的に発現された目的の異種タンパク質の約５倍の濃縮をもたらす。目的の異種タンパク質の５倍の濃縮は、ＲｕＢｉｓＣＯの２倍以上の枯渇および目的の異種タンパク質のｍＲＮＡ転写物の約２倍の増加、ならびに新鮮重ベースでの目的の異種タンパク質レベルの約２倍の増加をもたらす。
【００２２】
従って、植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理すると、結果として、目的の異種タンパク質の収量が全体的に増加し、ＲｕＢｉｓＣＯのレベルと比較して、目的の異種タンパク質の収量が相対的に増加する。ＲｕＢｉｓＣＯレベルを低下させることにより、目的の異種タンパク質の抽出および精製もまた、抽出プロセス中のバックグラウンドタンパク質汚染の減少により簡素化され得る。
【００２３】
本発明のこの概要は、本発明の全ての特徴を必ずしも説明するものではない。
【００２４】
図面の簡単な説明
本発明のこれらのおよび他の特徴は、添付の図面を参照して、以下の説明により明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１ａ〜１ｄは、感染の２４時間前にストレスに対するエリシターであるＭｅＪＡで処理した、アグロインフィルトレーションされたタバコ（N. benthamiana）葉および対照タバコ葉における総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）、１−Ｄ プロテオームプロファイルおよびＲｕＢｉｓＣＯサブユニットレベルを示す。図１ａは、０、０．５、１または２ｍＭ ＭｅＪＡで処理した葉における新鮮重ベースのＴＳＰを示す。図１ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の対照葉およびＭｅＪＡ処理葉におけるクマシーブルー染色されたタンパク質プロファイルを示す。マーカー（Ｍｒ）：市販の分子量マーカー；ＰＲ：アグロインフィルトレーションされた葉において上方制御される病原性関連タンパク質；ＲｂｃＬおよびＲｂｃＳ：それぞれ、ＲｕＢｉｓＣＯラージおよびスモールサブユニット；Ａ、ＢおよびＣボックス：インフィルトレーションされていない植物におけるＭｅＪＡ誘導性タンパク質を含むゲル領域（タンパク質の同一性については表２を参照のこと)。図１ｃおよび１ｄは、適当な抗体を用いて免疫検出後のデンシトメトリーにより測定されたＭｅＪＡ処理葉における、ＲｕＢｉｓＣＯラージ（ＲｂｃＬ；図１ｃ）およびスモール（ＲｂｓＳ；図１ｄ）サブユニットの相対量を示す。Microtek ScanMaker II デジタライザー (Microtek Laboratory、Torrance CA、U.S.A.)でニトロセルロース膜をスキャンした後、Phoretix 2-D Expression software v．2005 (NonLinear USA、Durham NC、U.S.A.)を用いて、イムノブロット上のタンパク質シグナルを定量した。データは、１．０の任意のレベルが割り当てられた未処理の対照と比較した、相対レベルとして表される。パネル（ａ）および（ｃ）の各バーは、３つの独立した(葉の複製物)値の平均±ＳＥである。インフィルトレーションした葉を、ＭｅＪＡ処理の２４時間後にアグロバクテリウム属（A．tumefaciens）細胞を用いてトランスフェクトした。全ての植物試料を、ＭｅＪＡ処理の７日後(すなわち、トランスフェクトされた植物のアグロインフィルトレーションの６日後)に回収した。
【図２】図２ａ〜２ｃは、タバコ（N. benthamiana）葉における２つのアグロバクテリウム属（A．tumefaciens）の病原性タンパク質ＶｉｒＢ１およびＶｉｒＥ１のＰＲ−２タンパク質蓄積、アグロバクテリア数および転写数に対する、ＭｅＪＡ処理の効果を示す。図２ａは、免疫検出後のデンシトメトリーによってアッセイした対照葉およびアグロインフィルトレーションされた葉における、３３ｋＤａの病原体誘導性ＰＲ−２タンパク質の蓄積に対するＭｅＪＡ処理の効果を示す。Microtek ScanMaker II デジタライザー (Microtek Laboratory)でニトロセルロース膜をスキャンした後、Phoretix 2-D Expression software v．2005 (NonLinear USA)を用いて、イムノブロットシグナルを定量した。データは、３つの葉の複製物の値の平均±ＳＥである。対照の健常な葉におけるＰＲ−２レベルに対して１．０の任意の値を割り当てた。図２ｂは、アグロインフィルトレーションの０、２、４または６日後のタバコ（N．benthamiana）葉から回収された細菌を示す。データは、寒天プレート上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の対数として表され、各点は、５つの独立した(葉の複製物)値の平均±ＳＥである。図２ｃは、適当なＤＮＡプライマーを用いたリアルタイムＲＴ ＰＣＲによってアッセイした、０または１ｍＭ ＭｅＪＡで処理したアグロインフィルトレーションされた葉におけるＶｉｒＢ１およびＶｉｒＥ１のｍＲＮＡ転写物数を示す。各値は、５つ生物学的（葉の複製物）値の平均±ＳＥである。アスタリスクは、対照葉と比較して、ＭｅＪＡ処理した葉におけるＶｉｒＢ１転写物の有意に低い値を示す（スチューデントのｔ検定；Ｐ＜０．０５）。
【図３】図３ａ〜３ｃは、インフィルトレーションの２４時間前に、０、０．５、１または２ｍＭ ＭｅＪＡで処理した対照タバコ（N. benthamiana）葉およびアグロインフィルトレーションされたタバコ葉の粗タンパク質抽出物中のプロテアーゼ活性を示す。プロテアーゼアッセイを、カテプシンＬ様（Ｃ１Ａ） Ｃｙｓプロテアーゼ（図３ａ）、トリプシン様（Ｓ１） Ｓｅｒプロテアーゼ（図３ｂ）、およびカテプシンＤ／Ｅ様（Ａ１） Ａｓｐプロテアーゼ（図３ｃ）に特異的なフルオロジェニックペプチド基質を用いて、インビトロで行い、葉試料を、ＭｅＪＡ処理の７日後に回収した。各バーは、３つの独立した(葉の複製物)値の平均±ＳＥである。
【図４】図４ａ〜４ｄは、０、０．５、１または２ｍＭ ＭｅＪＡで処理したアグロインフィルトレーションされたタバコ（N．benthamiana）葉におけるＣ５−１抗体収量および発現を示す。図４ａは、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に免疫検出されたＣ５−１重鎖および軽鎖完全（矢印）および部分複合体を示す。Ｍｒ：市販の分子量マーカー。図４ｂは、ＭｅＪＡ処理した葉におけるＥＬＩＳＡアッセイしたＣ５−１を示す。データは、総可溶性タンパク質と比較した重量基準（二次曲線；ｒ２＝０．８８５）または相対基準で表される（ヒストグラム）。図４ｃは、リアルタイムＲＴ ＰＣＲによりアッセイした、０または１ｍＭのＭｅＪＡで処理した葉におけるＣ５−１軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）鎖のｍＲＮＡ転写物を示す。図４ｄは、インフィルトレーションの２４時間後に０、０．５または１ｍＭ ＭｅＪＡで、あるいはインフィルトレーションの２４時間前または後に１ｍＭ アラキドン酸で処理した葉における、ＥＬＩＳＡアッセイしたＣ５−１を示す。パネル（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）における各バーまたは点は、５つの独立した(葉の複製物)の値の平均±ＳＥである。
【図５】図５は、アグロインフィルトレーションの２４時間前（上パネル）または２４時間後（下パネル）に０、０．５または１ｍＭ ＭｅＪＡで、あるいは１ｍＭ アラキドン酸（ＡＡ）で処理した対照葉およびアグロインフィルトレーションされた葉の粗タンパク質抽出物中のタバコ葉の３３ｋＤａ ＰＲ−２タンパク質の免疫検出を示す。Ｍｒ：分子量マーカー。アグロインフィルトレーションには、pcambia2300 ‘空ベクター’またはＣ５−１をコードするベクターを含有する、アグロバクテリウム属（A．tumefaciens）での処理が含まれた。
【図６】図６は、０または１ｍＭ ＭｅＪＡで処理したアグロインフィルトレーションされたタバコ（N．benthamiana）葉におけるＣ５−１抗体収量を示す。Ｃ５−１抗体軽鎖および重鎖のコード配列は、アルファルファプラストシアニンプロモーターの制御下で発現された（ＵＳ ７，１２５，９７８、引用により本明細書中に包含させる）。データは、葉重量ベースで示される。各バーは、５つの独立した(葉の複製物)値の平均±ｓｅである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
以下に、好ましい態様を記載する。
【００２７】
本発明は、植物におけるタンパク質産生に関する。本発明はまた、植物または植物の一部分でのタンパク質産生を増加させるための、ジャスモン酸経路アクチベーターの使用に関する。
【００２８】
本明細書で用いる用語“含む（comprising）”、“有する（having）”、“含む（including）”および“含む（containing）”ならびにそれらの文法的変形は、包括的であるか、または制限なく、かつ追加の、記載されていない要素および／または方法ステップを除外しない。用語“本質的に〜からなる”は、使用または方法に関連して本明細書で使用されるとき、追加の要素および／または方法ステップが存在し得ることが示されるが、これらの追加は、記載される方法または使用が機能する方法で重大な影響を及ぼさないことを意味する。使用または方法に関連して本明細書で用いられるとき、用語“〜からなる”は、追加の要素および／または方法ステップの存在を除外する。特定の要素および／またはステップを含むものとして本明細書に記載の使用または方法は、これらの態様が具体的に言及されているか否かにかかわらず、特定の態様において、本質的にこれらの要素および／またはステップからなり、他の態様において、それらの要素および／またはステップからなる。加えて、単数形の使用は複数形を含み、“または”は、他にこれと異なる記載がない限り、“および／または”を意味する。本明細書で用いる用語“複数の”は、２以上、例えば、２またはそれ以上、３またはそれ以上、４またはそれ以上などを意味する。本明細書中で他にこれと異なる記載がない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で用いる用語“約”は、所与の値から約±１０％の変動を意味する。そのような変動は、それが具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される所与の値に常に含まれることが理解されるべきである。本明細書において用語“含む（comprising）”と合わせて使用されるとき、用語“ａ”または“ａｎ”は、“１つ”を意味し得るが、“１つ以上”、“少なくとも１つ”および“１つまたは２以上”もまた意味する。
【００２９】
以下により詳細に記載されるように、植物または植物の一部分での目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法が提供される。この方法は：
ｉ)植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、植物または植物の一部分に導入する工程；および
ｉｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該植物または植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、植物または植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２の植物または第２の植物の一部分で産生された目的の異種タンパク質と比較したとき、発現の増加が観察される。
【００３０】
ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列と共に、植物または植物の一部分に同時に導入されるように、処理工程（工程ｉ）および導入工程（工程ｉｉ）を組合せてもよい。
【００３１】
さらに、バックグラウンド宿主タンパク質を減少させ、目的の異種タンパク質の精製を単純化するために、植物または植物の一部分での総宿主可溶性タンパク質を減少させる方法が提供される。この方法は、
ｉ)植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードする核酸を含むヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を、植物または植物の一部分に導入する工程；および
ｉｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該植物または植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、植物または植物の一部分から抽出された総宿主タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２の植物または第２の植物の一部分で産生された総宿主タンパク質と比較したとき、総宿主タンパク質の減少が観察される。
【００３２】
ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列と共に、植物または植物の一部分に同時に導入されるように、処理工程（工程ｉ）および導入工程（工程ｉｉ）を組合せてもよい。
【００３３】
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分での目的の異種タンパク質の発現を増加させる方法がさらに提供される。この方法は、
ｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分を、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理する工程；および
ｉｉ）目的の異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分をインキュベートする工程
を含み、ここで、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の量を、同じヌクレオチド配列を含み、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない第２のトランスジェニック植物または第２のトランスジェニック植物の一部分で産生された目的の異種タンパク質と比較したとき、発現の増加が観察される。
【００３４】
ジャスモン酸経路アクチベーターが、ヌクレオチド配列と共に、植物または植物の一部分に同時に導入されるように、処理工程（工程ｉ）および導入工程（工程ｉｉ）を組合せてもよい。
【００３５】
“作動可能に連結された”とは、特定の配列が直接的または間接的に相互作用して、核酸配列の発現の媒介または調節のような意図された機能を実行することを意味する。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
【００３６】
ジャスモン酸シグナル伝達分子は、様々な環境ストレス、例えば、創傷、乾燥ストレス、病原体の攻撃、または害虫の攻撃に対する植物の応答を調節することが知られている。ジャスモン酸経路は、いくつかのシグナル伝達事象を伴う。一次創傷またはストレス刺激に続いて、ジャスモン酸生合成を誘導する局所および全身シグナルが生成される。ジャスモン酸塩は、サリチル酸（サリチル酸経路を減少させる）、エチレン、および他のシグナル伝達経路からのアウトプットと相互作用する。ジャスモン酸経路におけるシグナル伝達には、ＳＣＦ（ＣＯＩ１）複合体（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）およびＣＳＮ（ＣＯＰ９シグナルソーム）複合体を形成するタンパク質相互作用が関与する。ＳＣＦ（ＣＯＩ１）は、ＣＳＮと相互作用して、よく特徴付けられたジャスモン酸反応を制御する。例えば、ＣＳＮ／ＳＣＦ（ＣＯＩ１）複合体は、ＪＡＺタンパク質を含む転写リプレッサーを、ポリユビキチン化およびそれらの２６Ｓプロテアソームによる修飾または分解の標的とする。
【００３７】
例えば、ＭｅＪＡおよび関連するジャスモン酸誘導シグナル、例えば傷害、草食動物または昆虫の経口分泌物などは、光合成関連遺伝子の転写を下方制御することが知られている（Hermsmeier et al., 2001； Jung et al., 2007； Bilgin et al., 2010； Zubo et al., 2011； Duceppe et al., 2012）。これらの抑制効果は、葉におけるストレス関連タンパク質および炭素代謝酵素の蓄積と関連しており、ＲｕＢｉｓＣＯレベルの低下を招く可能性がある（Giri et al., 2006； Wei et al., 2009； Duceppe et al., 2012； Ullmann-Zeunert et al., 2013； Mahajan et al., 2014； Leuzinger et al., 2013）。
【００３８】
“ジャスモン酸経路アクチベーター”とは、植物内のジャスモン酸経路を活性化することができる化合物を意味する。理論はともかく、ジャスモン酸経路アクチベーターは、結合して、ジャスモン酸応答遺伝子の転写を調節する転写因子の活性を抑制する、ジャスモン酸ＺＩＭドメイン（ＪＡＺ）タンパク質の分解をもたらし得る。ＳＣＦ（ＣＯＩ１）とＪＡＺリプレッサーとの相互作用は、ＪＡＺタンパク質の分解およびその後の転写因子、例えばＭＹＣ２の抑制解除をもたらし得る。
【００３９】
アクチベーターは、液体であっても、気体であってもよい。例えば、これに限定されないが、ジャスモン酸経路アクチベーターは、ジャスモン酸メチル：
【化１】
2018524345.tif 000003
ジャスモン酸：
【化２】
2018524345.tif 000004
または、コロナチン：
【化３】
2018524345.tif 000005
であり得る。
【００４０】
コロナチンは、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）に構造的に関連し、植物に適用したとき、同様の効果を生じる植物病原菌（Pseudomonas syringae）によって産生される植物毒素である(Feys et al., 1994)。
【００４１】
ジャスモン酸経路アクチベーターの他の例には、ＭｅＪＡの機能的等価体が含まれ、例えば、これらに限定されないが、ジャスモン酸の生物学的に活性な誘導体、類縁体または前駆体、例えばジャスモン酸（遊離体）、コロナチン（微生物）、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）前駆体（例えば、α−リノレン酸）またはこれらの酸化生成物、ジャスモン酸の誘導体（ＭｅＪＡを除く)、例えば、シス−ジャスモン、ジャスモノイルイソロイシン(JA-Ile)、ジャスモノイルＡＣＣなどである。さらに、合成ジャスモン酸類縁体、例えば、BLUSh（商標）(プロヒドロジャスモン(プロピル−３−オキソ−２−ペンチルシクロ−ペンチルアセテート；Fine Agrochemicals Ltd.から入手可能)、および化合物Ｉ(ジャスモン酸メチルの５，７，９，１０−テトラブロモ誘導体、活性誘導体)を使用することができる。
【００４２】
ジャスモン酸経路アクチベーターは、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を導入する前に、一定期間、例えば約０時間から１４日間、または任意の期間（約０時間から１４日間）、植物または植物の一部分をアクチベーターに暴露することにより（または、予め処理することにより）該植物または植物の一部分に適用され得る。例えば、植物または植物の一部分は、約０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４時間、またはその間の任意の時間、アクチベーター化合物で予め処理され得るか、またはアクチベーターを、植物または植物の一部分に目的のタンパク質をコードする核酸を導入する前に、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、またはその間の任意の期間、適用することができる。
【００４３】
ジャスモン酸経路アクチベーターはまた、目的のタンパク質を抽出する前に、一定期間、例えば約０時間から１４日間、またはその間の任意の期間、該トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分にアクチベーターを暴露することにより、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分に適用され得る。例えば、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分は、約０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４時間、またはその間の任意の時間、アクチベーター化合物で処理され得るか、またはアクチベーターを、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分から目的のタンパク質を抽出する前に、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、またはその間の任意の期間、適用することができる。
【００４４】
アクチベーターが液体形態である場合、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を植物または植物の一部分に導入する工程、または目的の異種タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分から該目的のタンパク質を抽出する工程の前に、該アクチベーターが該植物または植物の一部分と相互作用し得るように、所望のように該植物の葉および他の器官に噴霧され得る。アクチベーターが気体である場合、植物または植物の一部分を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を植物または植物の一部分に導入する工程、または目的の異種タンパク質を発現するトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部から目的のタンパク質を抽出する工程の前に、該気体が該植物または植物の一部分と相互作用し得るように、密封環境に入れることができる。
【００４５】
あるいは、ヌクレオチド配列を、目的のタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部分に導入する前に一定の期間、該植物または植物の一部分が浸漬された液体培地を用いて該植物または植物の一部分に一時的に導入し、その後、ジャスモン酸経路アクチベーターを液体培地中に導入し得る。例えば、植物または植物の一部分を、目的のタンパク質をコードする核酸を該植物または植物の一部分に導入する前に、約０時間から約２４時間、またはその間の任意の時間、予め処理してよい。あるいは、植物または植物の一部分を暴露する（処理する）工程、ならびに目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を該植物または植物の一部分に導入する工程を組合せて、ジャスモン酸経路アクチベーターおよびヌクレオチド配列が植物または植物の一部分に共に導入されるように、ジャスモン酸経路アクチベーターを該ヌクレオチド配列と共に液体培地に導入することが可能である。
【００４６】
本明細書に記載の通り、ジャスモン酸経路アクチベーターもまた、ＤＮＡ型植物ウイルスに由来する調節領域に作動可能に連結された、目的の異種タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分に適用されて、該トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分での目的の異種タンパク質の発現を増加させることができる。この方法において、異種ヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理し、目的の異種タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下である時間の間インキュベートする。目的の異種タンパク質の発現の増加は、該トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分から抽出された目的の異種タンパク質の収量を、同じヌクレオチド配列を含み、同様の様式で処理されているが、ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない、第２のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分において産生された目的の異種タンパク質と比較することにより、観察され得る。
【００４７】
理論はともかく、ジャスモン酸経路を誘導するために選択される化合物（すなわち、ジャスモン酸経路アクチベーター）を用いることにより、内在性のプロテアーゼの阻害剤が活性化され得て、それにより、目的の異種タンパク質のインビボでの分解が減少される。例えば、ジャスモン酸シグナル伝達に関与する転写因子ＭＹＣ２は、創傷反応に関与する遺伝子を正に調節するが、病原体防御に関与する遺伝子を負に調節する(Lorenzo et al., 2004)。さらに、ジャスモン酸経路を活性化することによって、サリチル酸経路が下方制御され得る。サリチル酸経路の活性化は、内在性プロテアーゼの活性の増加をもたらし得る。従って、サリチル酸経路を下方制御することにより、内因性植物プロテアーゼ活性が低下する。
【００４８】
本明細書に記載の方法を用いて、目的の異種タンパク質の精製収率および宿主タンパク質、そのタンパク質分解フラグメント、またはそれらの両方による該目的の異種タンパク質の汚染、ならびに粗抽出物中のタンパク質分解の低減は、宿主（天然）タンパク質に対する目的の異種タンパク質の比を調整することにより改善することができる。ジャスモン酸経路アクチベーターの適用は、植物の葉のプロテオームを改変し、組換え型の目的の異種タンパク質の濃縮を誘発することが見いだされた。理論はともかく、この改変は、植物組織における目的の異種タンパク質の産生の特異的および相対的収量に影響を及ぼし得る。植物または植物の一部分のジャスモン酸経路アクチベーターでの処理は、ＲｕＢｉｓＣＯのラージおよびスモールサブユニットプールの枯渇を誘導し、ジャスモン酸誘導性防御タンパク質（例えば、チオニン、Ｓｅｒ−プロテアーゼ阻害剤および抗菌性加水分解酵素（antimicrobial hydrolases））のレベルを増加させた。ジャスモン酸誘導性防御タンパク質の増加は、アグロインフィルトレーションによって減少した。しかしながら、ＲｕＢｉｓＣＯ枯渇細胞環境は、アグロインフィルトレーションされた葉で維持され、目的の異種タンパク質の効率のよい濃縮を可能にした。
【００４９】
ジャスモン酸経路アクチベーターで処理されていない（が、同様の方法で処理されている）植物と比較して、ジャスモン酸経路アクチベーターを用いた処理は、結果として、目的の異種タンパク質の発現増加をもたらした。さらに、ジャスモン酸経路アクチベーターでの処理は、結果として、ＲｕＢｉｓＣＯと比較して、一時的に発現された目的の異種タンパク質の約５倍の濃縮をもたらした。目的の異種タンパク質の５倍の濃縮は、ＲｕＢｉｓＣＯの２倍以上の枯渇および目的の異種タンパク質のｍＲＮＡ転写物の２倍の増加、ならびに目的の異種タンパク質レベルの新鮮重量ベースでの２倍の増加に起因する。
【００５０】
従って、植物または植物の一部分をジャスモン酸経路アクチベーターで処理することにより、目的の異種タンパク質の収量が全体的に増加し、ＲｕＢｉｓＣＯのレベルと比較して、目的の異種タンパク質の収量が相対的に増加する。ＲｕＢｉｓＣＯレベルを低下させることにより、目的の異種タンパク質の抽出および精製もまた、抽出プロセス中のバックグラウンドタンパク質汚染の減少により簡素化され得る。
【００５１】
本明細書に記載の通り、目的のタンパク質をコードする核酸が、植物ＤＮＡウイルスから得られたプロモーター、例えば３５Ｓプロモーターを含む調節領域に作動可能に連結されたとき、該目的のタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の発現の増加が観察された。光合成遺伝子の調節領域（例えば、プラストシアニンプロモーター)を用いたときには、このようなヌクレオチド配列の発現の増加は観察されなかった。理論はともかく、ジャスモン酸経路の活性化を誘導する条件、ジャスモン酸経路アクチベーターの活性化を誘導する条件、またはジャスモン酸経路およびジャスモン酸経路アクチベーターの活性化を誘導する条件の両方もまた、植物ＤＮＡウイルスから得られたプロモーターを含む調節領域の活性化に有益であり得る。 ジャスモン酸経路の活性化を誘導する条件、ジャスモン酸経路アクチベーターの活性化を誘導する条件、またはジャスモン酸経路およびジャスモン酸経路アクチベーターの活性化を誘導する条件の両方は、昆虫による植物の摂食を含むストレス条件または病原体攻撃、ならびに昆虫から植物への関連する植物ＤＮＡウイルスの伝染を含み得る。
【００５２】
本明細書に記載の方法において使用されるプロモーターを含む調節領域は、カリモウイルス科、ジェミニビリダエ科およびナノウイルス科のウイルスを含む任意のＤＮＡ型植物ウイルスから得られ得る。プロモーターの例には、これらに限定されないが、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを含む、カリモウイルス科のウイルスの遺伝子から得られるプロモーターが含まれる（Odell et al., 1985、Nature、313: 810-812）。同様に、ジェミニビリダエ科およびナノウイルス科のウイルス由来のプロモーターの例としては、cotton leaf curl Burewala ウイルスのＲｅｐおよびＣＰ遺伝子のもの(Khan et al., 2015、PLoS ONE 10(3): e0121656) およびMilk vetch dwarf ウイルスのＣ１からＣ１１のもの(Shirasawa-Seo et al., 2005、J Gen Virol 86: 1851-1860)がそれぞれ挙げられる。
【００５３】
本明細書に記載の通り、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、植物ＤＮＡウイルスから得られるプロモーターまたは植物調節領域、および３’ＵＴＲ配列およびターミネーター配列を直列に含む発現カセットを提供する。当業者は、終結（ターミネーター）配列が植物宿主で活性な任意の配列であり得て、例えば終結配列がＮＯＳターミネーターであり得ることを、理解し得る。“発現カセット”とは、宿主細胞中の目的の核酸の転写のために、適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、それに作動可能に連結されている目的の核酸を含むヌクレオチド配列を意味する。
【００５４】
調節領域は、追加の調節エレメントを含んでいてよく、例えば、これに限定されないが、発現エンハンサーも含み得る。好適なエンハンサーとしては、Sainsbury et. al, 2008(Plant Physiol. 148:1212-1218)；ＷＯ２００９／０８７３９１、ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０００９、ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０２４０（それぞれ、引用により本明細書中に包含させる）に記載のＣＰＭＶ ５’ＵＴＲから得られたエンハンサーが挙げられる。発現エンハンサーは、目的のヌクレオチド配列の植物宿主内での発現を駆動するために、植物において活性である調節領域を有するエンハンサー配列の５’末端で作動可能に連結されていてよく、発現エンハンサーの３’末端で目的のヌクレオチド配列に作用可能に連結されていてよい。
【００５５】
“目的のヌクレオチド（または核酸）配列”、“目的のコーディング領域”、または目的のタンパク質とは、宿主生物、例えば植物内で発現されて、目的のタンパク質を産生するべきヌクレオチド配列またはコーディング領域（これらの用語は、互換的に用いられ得る）を意味する。そのような目的のヌクレオチド配列は、飼料、食品またはそれらの両方のための、異種タンパク質、改変された異種タンパク質、工業用酵素または改変された工業用酵素、農業用タンパク質または改変された農業用タンパク質、ヘルパータンパク質、タンパク質サプリメント、薬学的に活性なタンパク質、栄養補助食品、付加価値製品、またはそのフラグメント、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、スブチリシンなどの工業用酵素をコードするが、これらに限定されない。
【００５６】
目的のヌクレオチド配列、または目的のコーディング領域はまた、薬学的に活性なタンパク質、例えば増殖因子、成長調節因子、抗体、抗原、およびそれらのフラグメント、または免疫もしくはワクチン接種に有用なそれらの誘導体などをコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのようなタンパク質には、ヒト病原体、ウイルスタンパク質、例えば限定されないが、以下由来の１以上のタンパク質、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、またはインターロイキン、例えば１または２以上のＩＬ−１からＩＬ−２４、ＩＬ−２６およびＩＬ−２７、サイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはそれらの組合せ、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはｔＰＡ ｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、抗体、例えば限定されないが、リツキサン、ニューロポリペプチド、インスリン、ワクチン、増殖因子、例えば限定されないが、上皮細胞増殖因子、ケラチン生成細胞増殖因子、形質転換増殖因子、成長調節因子、抗原、自己抗原、それらのフラグメント、またはそれらの組合せ、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
目的のタンパク質にはまた、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ；ＷＯ２００９／００９８７６参照、引用により本明細書中に包含させる）が含まれ得る。ＨＡは、一般的にシグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、ならびにＣ末端の膜貫通アンカー部位および小さな細胞質テールを含むＨＡ２ドメインを含む、ホモ三量体のＩ型膜糖タンパク質である。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は、よく知られており、利用可能である（例えば、the BioDefense and Public Health Database (Influenza Research Database； Squires et al., 2008 Nucleic Acids Research 36:D497-D503) at URL: biohealthbase.org/GSearch/home.do−decorator＝Influenzaを参照；または、the National Center for Biotechnology Informationにより維持されるデータベース(URL: ncbi.nlm.nih.govを参照)、両者とも、引用により本明細書中に包含させる）。
【００５８】
ＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザのものであり得るか、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６の群から選択されるＡ型インフルエンザ ＨＡのサブタイプである。本発明のいくつかの側面において、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９の群より選択されるＡ型インフルエンザ由来であり得る。上に列記したＨＡのフラグメントもまた、目的のタンパク質であると見なされ得る。さらに、上に列記したＨＡタイプまたはサブタイプ由来のドメインは、キメラＨＡを産生するために組み合わされ得る（例えば、引用により本明細書中に包含されるＷＯ２００９／０７６７７８を参照のこと）。
【００５９】
ＨＡタンパク質を含むサブタイプの例としては、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、A/Indonesia/5/2006 (H5N1)、A/chicken/New York/1995、A/herring gull/DE/677/88 (H2N8)、A/Texas/32/2003、A/mallard/MN/33/00、A/duck/Shanghai/1/2000、A/northern pintail/TX/828189/02、A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4)、A/shoveler/Iran/G54/03、A/chicken/Germany/N/1949(H10N7)、A/duck/England/56(H11N6)、A/duck/Alberta/60/76(H12N5)、A/Gull/Maryland/704/77(H13N6)、A/Mallard/Gurjev/263/82、A/duck/Australia/341/83 (H15N8)、A/black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/Johannesburg/66、A/PuertoRico/8/34 (H1N1)、A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1)、A/Brisbane 10/2007 (H3N2)、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/4/2006、A/Singapore/1/57 (H2N2)、A/Anhui/1/2005 (H5N1)、A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)、A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1)、A/Equine/Prague/56 (H7N7)、A/HongKong/1073/99 (H9N2)が挙げられる。
【００６０】
ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプであり得る。例えば、Ｈ１タンパク質は、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、A/PuertoRico/8/34 (H1N1)、A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1)、A/California/04/2009 (H1N1)またはA/California/07/2009 (H1N1)株由来のものであり得る。Ｈ３タンパク質はまた、A/Brisbane 10/2007 (H3N2)、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)、A/Victoria/361/2011 (H3N2)、A/Texas/50/2012 (H3N2)、A/Hawaii/22/2012 (H3N2)、A/New York/39/2012 (H3N2)、または A/Perth/16/2009 (H3N2)株由来のものであり得る。本発明のさらなる側面において、Ｈ２タンパク質は、A/Singapore/1/57 (H2N2) 株由来のものであり得る。Ｈ５タンパク質は、A/Anhui/1/2005 (H5N1)、A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)、またはA/Indonesia/5/2005 株由来のものであり得る。本発明の一側面において、Ｈ６タンパク質は、A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1)株由来のものであり得る。Ｈ７タンパク質は、A/Equine/Prague/56 (H7N7)株またはH7 A/Hangzhou/1/2013、A/Anhui/1/2013(H7N9)、もしくはA/Shanghai/2/2013 (H7N9)株由来のものであり得る。本発明の一側面において、Ｈ９タンパク質は、A/HongKong/1073/99 (H9N2)株由来である。本発明のさらなる側面において、ＨＡタンパク質は、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/4/2006、B/Brisbane/60/08、B/Massachusetts/2/2012 −様ウイルス(山形系統)、またはB/Wisconsin/1/2010(山形系統)を含む、Ｂ型インフルエンザウイルス由来のものであり得る。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の限定されない例としては、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５(引用により本明細書中に包含させる)に記載の配列が挙げられる。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、H5 Indonesiaであり得る。
【００６１】
ＨＡはまた、ＨＡの天然の膜貫通ドメインが異種膜貫通ドメインで置換されているキメラＨＡであってもよい。ＨＡタンパク質の膜貫通ドメインは、高度に保存されている（例えば、ＷＯ２０１０／１４８５１１の図１Ｃを参照のこと；それは、引用により本明細書中に包含される）。異種膜貫通ドメインは、任意のＨＡ膜貫通ドメインから得られ得て、例えば、こられに限定されないが、H1 California、B/Florida/4/2006 (GenBank 受託番号ACA33493.1)、B/Malaysia/2506/2004 (GenBank 受託番号ABU99194.1)、H1/Bri (GenBank 受託番号ADE28750.1)、H1 A/Solomon Islands/3/2006 (GenBank 受託番号ABU99109.1)、H1/NC (GenBank 受託番号AAP34324.1)、H2 A/Singapore/1/1957 (GenBank 受託番号AAA64366.1)、H3 A/Brisbane/10/2007 (GenBank 受託番号ACI26318.1)、H3 A/Wisconsin/67/2005 (GenBank 受託番号ABO37599.1)、H5 A/Anhui/1/2005 (GenBank 受託番号ABD28180.1)、H5 A/Vietnam/1194/2004 (GenBank 受託番号ACR48874.1)、H5-Indo (GenBank 受託番号ABW06108.1)由来の膜貫通ドメインである。膜貫通ドメインはまた、以下のコンセンサスアミノ酸配列により定義され得る：
iLXiYystvAiSslXlXXmlagXsXwmcs (配列番号１)。
【００６２】
目的のタンパク質がＶＬＰである場合、ＶＬＰは、ＨＡ０前駆体形態、またはジスルフィド架橋によって共に保持されたＨＡ１もしくはＨＡ２ドメインを含み得る。ＶＬＰは、約２０ｎｍから１μｍの平均サイズ、またはその間の任意のサイズ、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ １６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００ｎｍ、またはその間の任意のサイズ、例えば１００ｎｍを有していてよく、脂質膜を含み得る。ＶＬＰは、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、またはウイルスコートタンパク質などのエンベロープまたは非エンベロープであり得る。ＶＬＰは、１以上の脂質、リン脂質、核酸、膜などをさらに含み得る。
【００６３】
用語“ウイルス様粒子”（ＶＬＰ）、または“（複数の）ウイルス様粒子”もしくは“（複数の）ＶＬＰ”は、自己集合し、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造を意味する。ＶＬＰは、一般的に、感染において産生されるビリオンと形態学的におよび抗原的に類似しているが、複製に十分な遺伝情報がなく、そのため非感染性である。いくつかの例において、ＶＬＰは、単一のタンパク質種、または２以上のタンパク質種を含み得る。２以上のタンパク質種を含むＶＬＰについては、タンパク質種は、同じウイルス種に由来してもよいか、または異なる種、属、サブファミリーまたはウイルスファミリー（ＩＣＴＶ命名法によって指定される）由来のタンパク質を含んでもよい。他の例において、ＶＬＰを含む１以上のタンパク質種は、天然に存在する配列から修飾されてもよい。ＶＬＰは、植物および昆虫宿主細胞を含む適切な宿主細胞中で産生され得る。宿主細胞から抽出し、適切な条件下で単離およびさらなる精製を行った後、ＶＬＰを無傷の構造として精製することができる。
【００６４】
本発明により、インフルエンザ由来タンパク質から産生されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質は、ＶＬＰ調製物の混入物であるＲＮＡに結合することが知られている(Wakefield and Brownlee、1989)。ＲＮＡの存在は、ＶＬＰ産物に対する規制上の承認を得るのに望ましくないため、ＲＮＡを含まないＶＬＰ調製物が有利であり得る。
【００６５】
ＨＡは、天然の、または非天然のシグナルペプチドを含み得る；非天然のシグナルペプチドは、植物由来であり得る。例えば、シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＰＤＩ）であり得る。天然のシグナルペプチドは、発現される赤血球凝集素のそれに対応してもよく、または第２の赤血球凝集素に対応してもよい。
【００６６】
本発明はまた、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子はさらに、ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１以上の調節領域を含み得る。核酸分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型インフルエンザ由来のＨＡをコードする配列を含み得る。例えば、核酸分子によりコードされるＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９サブタイプまたはＢ型由来のＨＡであり得る。核酸によりコードされるＨ１タンパク質は、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、A/PuertoRico/8/34 (H1N1)、A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1)、A/California/04/2009 (H1N1) または A/California/07/2009 (H1N1) 株由来であり得る。核酸分子によりコードされるＨ３タンパク質は、A/Brisbane 10/2007 (H3N2)、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)、A/Victoria/361/2011 (H3N2)、A/Texas/50/2012 (H3N2)、A/Hawaii/22/2012 (H3N2)、A/New York/39/2012 (H3N2)、または A/Perth/16/2009 (H3N2) 株由来であり得る。核酸分子によりコードされるＨ２タンパク質は、A/Singapore/1/57 (H2N2) 株由来であり得る。核酸分子によりコードされるＨ５タンパク質は、A/Anhui/1/2005 (H5N1)、A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)、または A/Indonesia/5/2005 株由来であり得る。核酸分子によりコードされるＨ６タンパク質は、A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1) 株由来であり得る。核酸分子によりコードされるＨ７タンパク質は、A/Equine/Prague/56 (H7N7) 株、または H7 A/Hangzhou/1/2013、A/Anhui/1/2013 (H7N9)、もしくはA/Shanghai/2/2013 (H7N9) 株由来であり得る。さらに、核酸分子によりコードされるＨ９タンパク質は、A/HongKong/1073/99 (H9N2) 株由来であり得る。核酸分子によりコードされるＨＡタンパク質は、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/4/2006、B/Brisbane/60/08、B/Massachusetts/2/2012−様ウイルス (山形系統)、または B/Wisconsin/1/2010 (山形系統)を含む、Ｂ型インフルエンザウイルス由来であり得る。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡ蛋白質のアミノ酸配列の限定しない例としては、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５ (引用により本明細書中に包含される)に記載の配列が挙げられる。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、H5 Indonesiaであり得る。
【００６７】
目的のタンパク質（または、目的のコーディング領域）は、天然の、または非天然のシグナルペプチドを含み得る；非天然のシグナルペプチドは、植物起源のものであってもよいし、動物もしくは細菌ポリペプチドから得られたものであってもよい。天然のシグナルペプチドは、発現される目的のタンパク質のそれに対応してもよく、さらに、シグナルペプチドは、インフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質または赤血球凝集素由来であってもよい。使用され得るシグナルペプチドの限定しない例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのもの（PDI SP；受託番号Z11499のヌクレオチド３２−１０３)、またはパタチンシグナルペプチド（PatA SP；GenBank 受託番号A08215のヌクレオチド１７３８−１８０６に位置する）である。この受託番号のPatA SPのヌクレオチド配列は：
ATGGCAACTACTAAAACTTTTTTAATTTTATTTTTTATGATATTAGCAACTACTAGTTCAACATGTGCT（配列番号２)であり；
パタチンＡシグナルペプチドのアミノ酸配列は：
MATTKTFLILFFMILATTSSTCA （配列番号３）である。
【００６８】
目的のコーディング領域または目的のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、核酸分子、遺伝子コンストラクト、またはベクターを形質転換したか、またはそれを含む、任意の好適な植物宿主中で発現させることができる。好適な植物宿主の例としては、アラビドプシス、例えばキャノーラなど、ブラシカ種、トウモロコシ、例えばベンサミアナタバコなどのニコチアナ属種(タバコ)、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ(Ipomoea batatus)、ジンセン（ginseng）、えんどう豆、オート麦、米、大豆、小麦、大麦、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、ライムギ (Secale cereale)、ソルガム(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)を含む農作物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で用いる用語“バイオマス”、“植物性物質”または“植物の一部分”は、植物由来のあらゆる物質を意味する。バイオマスまたは植物性物質は、植物全体、または葉、根、茎、花、種子を含む植物の一部分を含み得て、それは、植物のあらゆる組織、植物のあらゆる細胞、または植物、植物の一部分、組織もしくは細胞のあらゆる画分もまた含み得る。さらに、バイオマスまたは植物性物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、バイオマスまたは植物性物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組み合わせからの、植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはそれらの組合せを含み得る。植物の一部分は、植物性物質またはバイオマスを含み得る。
【００７０】
目的のタンパク質は、塩またはＰＥＧの存在下での沈殿、サイズ排除、イオン交換、親和性またはそれらの組み合わせを含むクロマトグラフィー、濾過などを含む、既知の精製技術を用いて、植物または植物の一部分から抽出および精製することができる（Wilken, L.R. and Nikolov, Z.L. 2012, Biotechnol. Adv. 30, 419−433を参照のこと)。４℃で、ｐＨ７．０またはそれ以上での抽出バッファーの使用は、抽出中の内因性タンパク質分解活性が低下する可能性もある。
【００７１】
特定の配列に言及するとき、用語“％類似性”または“％同一性”は、例えばウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプログラムに記載されているように、または手動アラインメントおよび目視検査により使用される(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al., eds. 1995 補遺参照)。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith ＆ Watermanのアルゴリズム(1981, Adv. Appl. Math. 2:482)を用いて、Needleman ＆ Wunschのアライメントアルゴリズム(1970, J. Mol. Biol. 48:443)により、Pearson ＆ Lipmanの同様の方法の探索(1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（例えば、Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group (GCG)、575 Science Dr., Madison、Wis.）により、実行され得る。
【００７２】
％配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それらは、Altschulらの(1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) およびAltschulらの(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０を、本明細書に記載のパラメーターと共に使用して、本発明の核酸およびタンパク質の％配列同一性を決定する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、初期設定（デフォルト）としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用し得る。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、初期設定としてワード長３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff ＆ Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用し得る。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (URL: ncbi.nlm.nih.gov/参照)を通して公開されている。
【００７３】
“調節領域”、“調節エレメント”または“プロモーター”とは、常にではないが一般的には、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る遺伝子のタンパク質コーディング領域の上流にある、核酸の部分を意味する。調節領域が活性であり、目的の遺伝子に関連するか、または機能的に連結されているとき、これは、該目的の遺伝子の発現をもたらし得る。調節エレメントは、臓器特異性を媒介するか、または発生もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することができる。“調節領域”は、プロモーターエレメント、定常的プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導可能なエレメント、負の調節エレメントもしくは転写エンハンサーのようなプロモーター活性を媒介するエレメントを含む。本明細書で用いる“調節領域”はまた、転写後に活性であるエレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子などの、遺伝子発現を調節する調節エレメントも含む。これらの後者のエレメントのいくつかは、コーディング領域の近位に位置し得る。
【００７４】
本明細書中、用語“調節エレメント”または“調節領域”は、一般的に、通常は、必ずしもそうではないが、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写に必要な他の因子の認識を特定の部位で開始させることによって、コーディング領域の発現を制御する、構造遺伝子のコーディング配列の上流（５’）のＤＮＡの配列を意味する。しかしながら、イントロン内に位置する他のヌクレオチド配列、または該配列の３’もまた、目的のコーディング領域の発現調節に寄与し得ることが理解されるべきである。特定の部位での開始を確実にするＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子の認識を提供する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。全てではないが、殆どの真核生物プロモーターエレメントは、通常は転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対からなる保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基本プロモーターエレメント、ならびに遺伝子発現を改変する他の調節エレメントを含み得る。
【００７５】
発生学的に調節される、誘導可能な、または構成的な調節領域を含む、いくつかのタイプの調節領域が存在する。発生学的に調節される、またはその制御下の遺伝子の差次的発現を制御する調節領域は、器官または組織の発達中の特定の時間に、特定のその器官または器官の組織内で活性化される。しかしながら、発生学的に調節されるいくつかの量節領域は、特定の発生段階で特定の臓器または組織内で優先的に活性化されてもよく、それらは、発生学的に調節された方法で活性であってもよいか、または植物内の器官もしくは組織の基底レベルで活性であってもよい。組織特異的調節領域の例としては、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターが挙げられる、例えば詳しくは調節領域を参照のこと（Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599； Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130）。葉特異的プロモーターの例には、プラストシアニンプロモーターが含まれる（ＵＳ ７，１２５，９７８を参照、引用により本明細書中に包含させる）。
【００７６】
目的の核酸配列が、植物に直接的または間接的に毒性である生成物をコードする場合、そのような毒性は、目的のヌクレオチド配列を所望の組織内で、または植物発生の所望の段階で選択的に発現させることによって低減され得る。あるいは、ジャスモン酸メチル、または他のジャスモン酸経路アクチベーターの存在によって誘導されるプロモーターを用いて、本明細書に記載の目的のヌクレオチド配列の発現を駆動することもできる。
【００７７】
誘導性調節領域は、誘導物質（インデューサー）に応答して１以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することができる領域である。インデューサーの不存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写され得ない。一般的に、転写を活性化するために誘導性調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性型で存在していてよく、インデューサーにより直接または間接的に活性形態に変換される。しかしながら、タンパク質因子もまた存在しなくてもよい。インデューサーは、タンパク質、代謝産物、成長調節剤、除草剤またはフェノール化合物などの化学物質であってよいか、または加熱、冷却、塩もしくは毒素エレメントにより直接的にまたはウイルスなどの病原体または疾患原因の作用により間接的に与えられる生理的ストレスであり得る。誘導可能な調節領域を含む植物細胞は、噴霧、散水、加熱または同様の方法によるような、誘導物質を細胞または植物に外部から適用することにより該誘導物質に暴露され得る。誘導性調節エレメントは、植物または非植物遺伝子のいずれか由来であり得る（例えば Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358；引用により本明細書中に包含される)。可能性のある誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48、89-108；引用により本明細書中に包含される)、ステロイド誘導性プロモーター（Aoyama, T. and Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404；引用により本明細書中に包含される）およびエタノール誘導性プロモーター（Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132； Caddick、M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180、引用により本明細書中に包含される）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019； Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985；引用により本明細書中に包含される）およびオーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971；引用により本明細書中に包含される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
構成的制御領域は、植物の様々な部分全体にわたって、そして植物発生の間、連続的に、遺伝子の発現を主導する。既知の構成的調節要素の例には、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写産物に関連するプロモーター(p35S； Odell et al., 1985、Nature、313: 810-812)またはCassava Vein Mosaic ウイルスプロモーターｐＣＡＳ(Verdaguer et al., 1996) が含まれる。
【００７９】
本明細書で用いる用語“構成的”は、必ずしも、構成的調節領域の制御下にあるヌクレオチド配列が全ての細胞タイプにおいて同じレベルで発現されることを示すわけではなく、たとえ存在量の変動がしばしば観察されるとしても、その配列が幅広い範囲の細胞タイプにおいて発現されることを意味する。
【００８０】
本明細書に記載の発現コンストラクトは、ベクター中に存在し得る。ベクターは、生物または宿主のゲノムへの発現カセットの移入および組み込みを可能にする境界配列を含み得る。コンストラクトは、植物バイナリーベクター、例えばｐＰＺＰに基づくバイナリー形質転換ベクター(Hajdukiewicz, et al. 1994)であり得る。他のコンストラクトの例には、ｐＢｉｎ１９（Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, et al. 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409)が含まれる。
【００８１】
本発明のコンストラクトは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子発現に影響を与え得る任意の他の調節シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸トラックをｍＲＮＡ前駆体の３’末端に付加することにより特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、通常、一般的な形態 ５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’（配列番号４）との相同性の存在によって認識されるが、変異は珍しくはない。好適な３’領域の限定されない例は、例えばノパリンシンターゼ（Nos遺伝子）および大豆貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子などのアグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む３’転写非翻訳領域、リブロース−１,５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ssRUBISCO；ＵＳ４，９６２，０２８；引用により本明細書中に包含される）、プラストシアニン発現の調節に使用されるプロモーター（Pwee and Gray 1993；引用により本明細書中に包含される）である。終結（ターミネーター）配列は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲから得ることができる。
【００８２】
要すれば、本発明のコンストラクトをさらに操作して、選択マーカーを含めることができる。しかしながら、これは必須ではない。有用な選択マーカーとしては、抗生物質、例えばゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンなどの化学物質、またはホスフィノトリシン、グリホサート、クロロスルフロンなどのような除草剤に対する耐性をもたらす酵素が挙げられる。同様に、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）、またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰなどのルミネッセンスなどの色の変化によって識別可能な化合物の産生をもたらす酵素も使用することができる。
【００８３】
ベクターはまた、本明細書に記載の発現エンハンサーを含み得る。発現エンハンサーは、遺伝子サイレンシングおよびＮＰＴＩＩのサプレッサーも含むＴ−ＤＮＡ上に位置してもよい。ポリリンカーもまた、タンパク質精製を容易にするために、目的のタンパク質へのＮ末端もしくはＣ末端Ｈｉｓタグの包含を可能にするために、１セットまたは２セットの６×ヒスチジン残基をコードし得る。
【００８４】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、植物における導入遺伝子の発現を制限することに関与し、ジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）からのサイレンシングのサプレッサーの同時発現は、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を相殺するために使用され得る（Brigneti et al., 1998, EMBO J. 17, 6739-6746、引用により本明細書中に包含される）。サイレンシングの代替サプレッサーは当技術分野においてよく知られており、本明細書に記載の通りに使用可能であり（Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；引用により本明細書中に包含される)、例えば、これに限定されないが、TEV-p1/HC-Pro (Tobacco etch virus-p1/HC-Pro)、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９(TBSV p19； ｐ１９の構築は、ＷＯ２０１０／０００３２２５に記載されている、引用により本明細書中に包含される)、トマトクリンクルウイルスのキャプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）、ポテトウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ポテトウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ポテトウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、シトラストリステバウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス（Grapevine leafroll-associated virus）−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウ葉巻ウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウ葉巻ウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド潜在ウイルス（Heracleum latent virus）のｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜伏ウイルスのｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）である。
【００８５】
従って、植物内における高レベルのタンパク質産生をさらに確実にするために、サイレンシングのサプレッサー、例えばこれに限定されないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ｒｇｓｃａｍ、ＦＨＶ由来Ｂ２タンパク質、ＣＰＭＶの小コートタンパク質、およびＴＣＶ由来のコートタンパク質、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６、またはＧＶＡ−ｐ１０などを、コモウイルスベースの発現カセット、ジェミニウイルス由来の増幅エレメント、および目的のタンパク質をコードする核酸配列と共に同時発現させることができる。
【００８６】
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて、植物細胞に導入され得る。これらの技術の概要については、例えば、Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988)； Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988)；および、Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)に見いだされ得る。他の方法には、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、エレクトロポレーション、例えばプロトプラストを使用するもの、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー（whisker）、および減圧浸潤が含まれる。例えば、Bilang, et al. (1991, Gene 100: 247-250)、Scheid et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112)、Guerche et al. (1987, Plant Science 52: 111-116)、Neuhause et al. (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36)、Klein et al., (2987, Nature 327: 70-73)； Freeman et al. (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353)、Howell et al. (1980, Science 208: 1265)、Horsch et al. (1985, Science 227: 1229-1231)、DeBlock et al., (1989, Plant Physiology 91: 694-701)、Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988)、Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski、eds., Academic Press Inc., 1989)、ＷＯ９２／０９６９６、ＷＯ９４／００５８３、ＥＰ ３３１０８３、ＥＰ １７５９６６、Liu and Lomonossoff (2002、J Virol Meth, 105:343-348)、ＥＰ２９０３９５；ＷＯ８７０６６１４；米国特許番号第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；および同第５，１００，７９２、１９９５年５月１０日出願の米国特許出団番号第０８／４３８，６６６、および１９９２年９月２５日出願の同第０７／９５１，７１５号(それらは全て、引用により本明細書中に包含される)を参照のこと。
【００８７】
本発明のコンストラクトを発現するために一過性発現方法を使用することができる（D’Aoust et al., 2009, Methods in molecular biology, Vol 483, pages41-50；Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348を参照のこと；引用により本明細書中に包含される）。あるいは、Kapila et al., (1997, Plant Sci. 122, 101-108; 引用により本明細書中に包含される)またはＷＯ００／０６３４００, ＷＯ００／０３７６６３（これらの文献は引用により本明細書中に包含される）に記載されているような、減圧ベースの一過性発現法を使用することもできる。これらの方法には、例えば、アグロイノキュレーション（Agro-inoculation）またはアグロインフィルトレーション、シリンジインフィルトレーション（syringe infiltration）の方法が含まれ得るが、これらに限定されず、他の一過性の方法を上述のように使用することもできる。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーション、またはシリンジインフィルトレーションにより、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、植物の組織、例えば葉、植物の地上部分（茎、葉、および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、あるいは植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を通過後、アグロバクテリアは、感染して、細胞内にｔ−ＤＮＡコピーを導入する。ｔ−ＤＮＡは染色体外で（episomally）転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて、感染細胞における目的のタンパク質の生産をもたらすが、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
【００８８】
本明細書に記載される一過性タンパク質発現に好適なプラットフォーム植物として用いられ得る、本発明の遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニック植物、植物細胞または種子もまた、本発明の一部と見なされる。植物細胞から植物全体を再生する方法もまた、当技術分野では知られている（例えば、Guerineau and Mullineaux（1993, Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRDed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148）を参照のこと）。一般的には、形質転換植物細胞が、抗生物質などの選択剤を含有し得る適当な培地で培養され、ここでは、形質転換植物細胞の同定が容易になるように、選択可能マーカーが使用される。カルスが形成されると、既知の方法に従って適当な植物ホルモンを使用することにより、シュート形成を促し、そのシュートを発根培地に移して植物を再生させることができる。次に、それらの植物を使って、種子から、または栄養繁殖技法を使って、反復的発生（repetitive generation）を樹立することができる。トランスジェニック植物は、組織培養物を使用せずに作製することもできる。これらの生物の安定的な形質転換および再生の方法は、当分野で確立されており、当業者には知られている。利用できる技術は、Vasil et al., (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984)、および Weissbachand Weissbach, (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989)に概説されている。形質転換植物および再生植物を得る方法は、本発明にとって重要ではない。
【００８９】
植物、植物の一部分、または植物細胞を、２以上の核酸コンストラクトにより形質転換あるいは同時形質転換しようとする場合、核酸コンストラクトは、核酸をプールし、そして記載のように細菌細胞にトランスフェクトする１回のトランスフェクションでアグロバクテリウムに、導入され得る。あるいは、当該コンストラクトは連続的に導入され得る。この場合、第１のコンストラクトは記載されたようにアグロバクテリウムに導入され、単一の形質転換された細菌のみが生育できる選択的条件下（例えば、抗生物質存在下）で、細胞を増殖させる。この第１の選択ステップに続いて、第２の核酸コンストラクトが、記載されたようにアグロバクテリウムに導入され、二重に形質転換された細菌のみが生育できる二重選択的条件下で、細胞を増殖させる。二重に形質転換された細菌は、本明細書に記載される植物、植物の一部分、または植物細胞を形質転換するために用いられ得るか、または、さらなる形質転換ステップの対象となり第３の核酸コンストラクトを受け入れ得る。
【００９０】
あるいは、植物、植物の一部分、または植物細胞を２以上の核酸コンストラクトで形質転換あるいは同時形質転換しようとする場合、核酸コンストラクトは、アグロバクテリウムの混合物を該植物、植物の一部分、または植物細胞に共インフィルトレーションすることにより、植物に導入され得て、各アグロバクテリウム細胞は、植物内に導入される１以上のコンストラクトを含み得る。植物、植物の一部分、または植物細胞内の、コンストラクト内の目的のヌクレオチド配列の相対的発現レベルを変化させるために、浸潤ステップの間、所望のコンストラクトを含む異なるアグロバクテリウム集団の濃度を変えることができる。
【００９１】
本明細書に記載の発現系を発現する植物または植物の一部分を提供する工程、組織、器官、または植物を収穫する工程を含む、目的のタンパク質を生成する方法を提供し、ここで、目的のタンパク質が発現され、必要に応じて、目的のタンパク質を組織、器官または植物から単離することを含む。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例において本発明をさらに説明する。
【００９３】
材料および方法
植物組織試料採取およびエリシター処理
温室内で４２日間生育させたタバコ科植物（N. benthamiana）を実験に用いた。各植物に、０．１％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００（Sigma-Aldrich, Mississauga ON, Canada）を含む水中、０．５ｍＭ、１ｍＭまたは２ｍＭのＭｅＪＡ ５０ｍｌを噴霧するか、または同じ溶媒中、１ｍＭアラキドン酸（Girardら、2007）の溶液５０ｍｌを噴霧し、Convironグロースチャンバー（Conviron, Winnipeg MB, Canada）に移し、７日間維持した。０．１％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００を含む水溶液５０ｍｌを噴霧した植物を、実験条件による交絡効果を避けるために陰性対照として並行して用いた。タンパク質抽出およびＲＮＡ抽出のための原料として、７日後に第３の主稈葉から２または３個の１ｃｍ２の葉片（リーフディスク）を採取した（Robert et al., 2013参照）。葉試料を液体窒素中で直ちに凍結させ、タンパク質抽出またはＲＮＡ抽出まで−８０℃保管した。データの統計的処理を可能にするために、３から５個の生物学的（植物）複製物を各処理に用いた。
【００９４】
遺伝子コンストラクトおよび葉アグロインフィルトレーション
２つの遺伝子ベクターをアグロインフィルトレーションアッセイに用いた：細胞分泌のためにＮ末端シグナルペプチド配列に融合されたＣ５−１の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子操作されたｐｃａｍｂｉａ２３００ベクター（Goulet et al., 2012 詳しくは、遺伝子コンストラクトに記載)；および、アグロインフェクションのための対照として、オリジナル（“空”）のｐｃａｍｂｉａ２３００バイナリーベクター（CAMBIA、Canberra、Australia)。２つのバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A．tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４にエレクトロポレーションし、培養物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを添加したLuria-Bertani (LB)培地中で維持した。インフィルトレーションのために、細菌を、２８℃にてＯＤ６００が１．０になるまで安定的に増殖させ、２，０００ｇで遠心して回収した。細菌ペレットを、１００μＭのアセトシリンゴンおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭの２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸]（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．８）中に再懸濁した。Ｃ５−１抗体（または空ベクター）アグロバクテリア懸濁液と等容量のタンパク質サイレンシングサプレッサーｐ１９（Voinnet et al., 2003）のためのバイナリーベクターを担持する細菌懸濁液とを混合した後、上記のように無針シリンジを用いて、葉のインフィルトレーションを行った（D’Aoust et al., 2009）。他にこれと異なる記載がない限り、感染の６日後（すなわち、post-ＭｅＪＡまたはアラキドン酸処理の７日後)に、分子特性決定のためのインフィルトレーションした組織を採取した。統計的分析を可能にするために、３から５個の生物学的（植物）複製物を各処理に用いた。
【００９５】
タンパク質抽出、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング
Mini-Beadbeater 装置(BioSpec, Bartlesville OK, USA)中でタングステンカーバイドビーズ（Qiagen, Mississauga ON, Canada)を用いて葉試料を破壊することにより、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む氷冷した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ４００μｌ中３つの１ｃｍ２のリーフディスクから、全葉タンパク質を抽出した。プロテアーゼ活性モニタリング専用の抽出物を除き、供給元により特記された組織破壊の前に、ＣＯＭＰＬＥＴＥ‘プロテアーゼ阻害剤カクテル’(Roche, Laval QC, Canada)を該抽出緩衝液に添加した。粗葉抽出物を４℃にて２０，０００ｇで３０分間遠心することにより清澄化し、総可溶性タンパク質を、タンパク質標準（Sigma−Aldrich)としてウシ血清アルブミンを用いてBradford (1976)に従ってアッセイした。他にこれと異なる記載がない限り、還元条件での１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Laemmli, 1970)により、タンパク質の電気泳動分離を行った。溶解したタンパク質をクマシーブルーで染色して、タンパク質バンドパターンを可視化するか、または適当な一次および二次抗体を用いる免疫検出のためにニトロセルロース膜上に電気転写した。ＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニットを、合成小サブユニットペプチドに対するウサギのポリクローナルＩｇＧ（Agrisera, Vaennaes, Sweden）および二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma−Aldrich）を用いて検出した。ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットを、合成大サブユニットペプチドに対する鶏のポリクローナルＩｇＧ(Agrisera)および二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗トリＩｇＧ(Sigma−Aldrich)を用いて検出した。３３ｋＤａの病原体誘導性ＰＲ−２タンパク質を、ウサギポリクローナルＩｇＹ一次抗体(Agrisera)およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体(Sigma-Aldrich)を用いて検出した。Ｃ５−１軽鎖および重鎖を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Sigma−Aldrich)を用いて検出した。
【００９６】
質量分析
ＭＳ同定のための葉タンパク質（図１ｂのボックスＡ、ＢおよびＣのタンパク質ゲル領域に対応する）を、ゲルから手動で切り出し、１００μｌのMilli-Q水中に入れ、イオントラップＭＳ／ＭＳ分析のためにEastern Quebec Proteomics Center (Centre de Recherche du CHUL, Quebec QC, Canada)に送った。供給元の指示に従って、MassPrep液体ハンドリングロボット（Waters, Milford MA, U.S.A.）中でシーケンシング等級トリプシン（Promega, Madison WI, U.S.A.）を用いたゲル内タンパク質消化を行った。ペプチド試料をオンライン逆相ナノスケールキャピラリー液体クロマトグラフィーにより分析し、ナノエレクトロスプレーイオン源（ThermoFisher, San Jose CA, U.S.A.)を備えたＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計に接続されたThermo Surveyor MSポンプを用いてエレクトロスプレー質量分析によって分析した。１０μｌのペプチドアリコートを、内径７５μｍのBioBasic C18ピコフレットカラム（New Objective, Woburn MA, U.S.A.）に充填した。ペプチドを、水−アセトニトリル／０．１（ｖ／ｖ）ギ酸勾配に沿って、分流（flow splitting）によって得られた２００ｎｌ／分の流速で溶出した。質量分析を、Xcalibur ソフトウェア、ｖ. ２．０を用いて、データ依存取得モードで得た。各全ＭＳスキャン（４００から２０００ ｍ／ｚ）の後に、衝突誘起解離（Collision-induced dissociation）を用いて７種の最も強い前駆体イオンのＭＳ／ＭＳスキャンを行った。相対衝突分裂エネルギーは３５％に設定され、動的排除機能は３０秒の除外時間で有効になった。
【００９７】
タンパク質同定
ＭＳ／ＭＳスペクトルデータは、Thermo's BioworksアプリケーションパッケージのExtractMSnユーティリティを用いて、電荷状態デコンボリューションまたはデアイソトープなしで抽出された。タンパク質の同一性（identity）を、Mascot プログラム、v. 2.3.02 (Matrix Science, London, U.K.)およびOpen Source ソフトウェア X! タンデム (Craig et al., 2004)を用いて評価した。両ソフトウェアは、全ての既知のSolanaceae種のタンパク質配列（Taxonomy ID: 4070、３９，８９６個のタンパク質について)、A. tumefaciens タンパク質配列(１２，５５４個のタンパク質)およびトリプシン消化物中に一般的に見られるタンパク質汚染物質のデータ配列を含むカスタムデータベースを検索するように設定された。０．５０Ｄａのフラグメントイオン質量許容範囲および２．０Ｄａの親イオン許容範囲(tolerance)を用いてデータベースを検索した。Ｃｙｓ残基のヨードアセトアミド誘導体は、MascotおよびX! タンデムの両方において固定修正（fixed modification）として特定された；Ａｒｇ残基のシトルリン化およびＭｅｔ残基の酸化は、可変修正（variable modification）として特定された。ＭＳ／ＭＳベースのペプチドおよびタンパク質の同定を、Scaffold、v．３．４．９（Proteome Software, Portland OR, U.S.A.）を用いて検証した。同定物は、それらが少なくとも４つのペプチドを含んでいれば認められ、Peptide Prophet アルゴリズム（Keller et al., 2002）により指定されるように９５％以上の確率で確立され得た。Nesvizhskiiら(2003)によって記載されるように、Protein Prophet アルゴリズムによってタンパク質確率を割り当てた。類似のペプチドを含み、ＭＳ／ＭＳデータに基づいて区別できなかったタンパク質は、単純さの原理（principles of parsimony）を満たすためにグループ分けされた。
【００９８】
リアルタイムＲＴ ＰＣＲ
Ｃ５−１のｍＲＮＡ転写物およびA．tumefaciensの病原性タンパク質ＶｉｒＢ１およびＶｉｒＥ１を、ABI PRISM 7500 Fast リアルタイムＰＣＲ装置、システムバージョン２．０．１（Applied Biosy stems, Carlsbad CA, U.S.A.）を用いてリアルタイムＲＴ ＰＣＲによりアッセイした。供給元の指示に従ってQiagen RNeasy植物ミニキット（Qiagen）を用いて、第３の主稈葉 (Robert et al., 2013)上に集めた２枚の１ｃｍ２の葉ディスクから全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅ Ｉ（Roche Diagnostics）で処理して汚染ＤＮＡを除去し、Nanodrop（登録商標） ND-1000 分光光度計 (NanoDrop Technologies, Wilmington DE, USA)を用いて質および量を評価した。４ユニットのOmniscript逆転写酵素(Qiagen)および１μＭのオリゴ−dT(15)ヌクレオチド(Roche)を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、１０μｌのFast SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)、２μｌのｃＤＮＡ鋳型ならびに各２．５μｌの適当なフォワードおよびリバースプライマー（６２５ｎＭ終濃度）（表１）を含んでいた。鋳型なしの混合物対照を各９６ウェルプレートに含めた。増幅ラウンドは、９５℃にて２０秒の変性工程、続いて９５℃にて３秒および６０℃にて３０秒の４０回の２ステップサイクルで構成された。SYBR Green Master Mixを用いて増幅後に解離曲線解析を行い、次いで、各サンプルのサイクル閾値を各プライマー対について設計したＤＮＡ標準曲線と比較した。NEB Taq ポリメラーゼルーチンプロトコール（New England Biolabs, Pickering ON, Canada）に従って２μｌのｃＤＮＡ鋳型を用いて標準曲線を作成した。増幅産物を、Illustra GFXキット（GE Healthcare）を用いて精製し、ヌクレアーゼ不含有水（１μlあたり１０７から１０２コピー）中の精製ＰＣＲ産物の連続希釈液を用いてＤＮＡ標準曲線を考案した。Ｃｔデータを転写物コピーの対応する数に対してプロットした。全ての増幅をデュプリケートで実施した。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
細菌数
葉の細菌負荷は、第３の主稈葉から異なる時点で回収された細菌で被覆されたＬＢ寒天プレート上のＣＦＵ計数により決定された。各複製は、アグロインフィルトレーションの０、２、４または６日後に集めた２枚の１ｃｍ２葉ディスクからなっていた。この葉ディスクを、BioSpec Mini-Beadbeater（上記のタンパク質抽出、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングを参照のこと）中、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８）中でホモジナイズした。得られた懸濁液を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に希釈プレートし、２日後にＣＦＵ計数するまで２８℃でインキュベートした。
【０１０１】
プロテアーゼアッセイ
プロテアーゼ活性を、以下の合成フルオロジェニック基質（Peptides International, Louisville KY, USA)を用いて、基質加水分解反応進行曲線(Goulet et al., 2012)のモニタリングによりアッセイした：カテプシンＬ様Ｃ１Ａ ＣｙｓプロテアーゼのためのＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−メチルクマリン（ＭＣＡ）、トリプシン様Ｓ１ ＳｅｒプロテアーゼのためのＺ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、およびカテプシンＤ／Ｅ様Ａ１ ＡｓｐプロテアーゼのためのＭＯＣＡｃ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２。カテプシンＬ基質について、１０ｍＭのＬ−Ｃｙｓを含む５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．８）中、２５℃にて、葉抽出プロテアーゼによる基質加水分解（反応混合物１μlあたり３６ｎｇの葉タンパク質）を進行させた。ＭＯＣＡｃ基質について、プロテアーゼ活性レベルを、Fluostar Galaxy マイクロプレート蛍光光度計（BMG、Offenburg、Germany）を用いて、ＭＣＡ基質に対してそれぞれ３６０ｎｍおよび４５０ｎｍの励起および発光フィルター；またはそれぞれ３４０ｎｍおよび４００ｎｍの励起および発光フィルターを用いて観測した。３つの独立した(生物学的)複製物を各アッセイに用いた。
【０１０２】
Ｃ５−１定量
Ｃ５−１抗体定量のためのＥＬＩＳＡプレート（Becton Dickinson、Mississauga ON、Canada）を、５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中３．７５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウス重鎖特異的ＩｇＧ１ (Sigma-Aldrich)で、４℃にて１６から１８時間、コーティングした。プレートを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Pierce、Rockford IL、USA)中１％（ｗ／ｖ）カゼイン中で、３７℃にて１時間インキュベートしてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。０、４、８、１６、２４、３２、４０および６０ｎｇ／ｍｌの精製マウスＩｇＧ１(Sigma-Aldrich)を含む各プレートについて標準曲線を作成した。全ての希釈液（対照および試料）を、マトリックス効果を排除するために、モック（mock）接種物でインフィルトレーションした葉組織から得られた対照抽出物で行った。プレートを３７℃にて１時間、タンパク質試料と共にインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、その後、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体(ブロッキング溶液中０．０２μｇ／ｍｌ)(Jackson ImmunoResearch)と共に３７℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでさらに洗浄後、プレートを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・シュア・ブルー・ペルオキシダーゼ基質（KPL、Gaithersburg MD、USA）と共にインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌの添加により反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍにて読み取った。３つの独立した(生物学的)複製物を各アッセイに用いた。
【０１０３】
統計解析
統計解析は、ＳＡＳプログラムｖ．９．１（SAS Institute、Cary NC、USA）を用いて行った。ＡＮＯＶＡおよびＰＲＯＣ ＧＬＭ手法を用いて、処理、デンシトメトリーデータおよびプロテアーゼ活性の間のＣ５−１収量を比較した。対比計算は、ＡＮＯＶＡが有意であったときに、５％のα値閾値を用いて行った。スチューデントのｔ検定を実施して、対照およびＭｅＪＡ処理植物におけるA．tumefaciensの病原性タンパク質およびＣ５−１鎖についてｍＲＮＡ転写数を比較した。
【０１０４】
実施例１：ｉ）ＭｅＪＡは、N．benthamiana における葉のプロテオームの再平衡を誘導する
４２日生育させたN．benthamiana植物を、０．５、１または２ｍＭのＭｅＪＡで処理して、ジャスモン酸シグナル伝達の葉組織中の全タンパク質プロファイルに及ぼす影響を決定した（図１）。新鮮重ベースでは、ＭｅＪＡ処理植物の成熟葉は、エリシター投与量に依存して、非処理対照葉と比較して、７日後に、ＴＳＰ含量が２０〜３０％減少した（ANOVA；P＜0.001）（図１ａ）。他のナス科（Solanaceae）で観察されたように(Lawrence et al., 2008； Duceppe et al., 2012； Ullman-Zeunert et al., 2013)、ＭｅＪＡ処理は、葉抽出物中のＲｕＢｉｓＣＯ大小サブユニットプールを強枯渇させ（図１ｂ）、０．５ｍＭのＭｅＪＡ用量の対照よりも４０％以上低く、２ｍＭ 用量で９０％を超えて減少すると推定された（ANOVA； RbcLについてP＜0.05；RbcSについてP＜0.001)（図１ｃ）。ＲｕＢｉｓＣＯ枯渇は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にクマシーブルー染色されたゲル上で視覚化される通り、約３０ｋＤａ、約２５ｋＤａおよび約６ｋＤａの分子量範囲で、いくつかのタンパク質の上方制御によって相殺された（図１ｂ、ボックスＡ、ＢおよびＣ）。図１ｂのボックスＡ、ＢおよびＣのタンパク質バンドのトリプシン消化物から得られたタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）ペプチドのスペクトルカウント分析に基づいて、ショットガンプロテオーム解析を行って、これらの質量範囲の最も豊富なタンパク質を同定した（表２）。同定されたタンパク質のほとんどは、チオニン、キチナーゼ、Kunitz のSer プロテアーゼ阻害剤およびプロテイナーゼ阻害剤ＩＩタンパク質ファミリー、ならびにスーパーオキシドジスムターゼ、炭酸脱水酵素およびチオレドキシンペルオキシダーゼなどのストレス関連酵素を含む、ＭｅＪＡ誘導性ストレス関連（または防御）タンパク質である（ＭＳ／ＭＳペプチド配列の詳細は、表３を参照のこと)。
【０１０５】
通常、組換えタンパク質発現のために細菌感染後６日から７日間、ＭｅＪＡ介在性の葉プロテオームの変化が維持され得るかどうかを評価するために、‘空’のｐＣＡＭＢＩＡ２３００ベクター（Goulet et al., 2012）を有するA．tumefaciens細胞でＭｅＪＡ処理の２４時間後に多数の植物をインフィルトレーションさせた。アグロインフィルトレーションは、おそらく病原体誘導性サリチル酸シグナル伝達経路を伴うN. benthamiana葉アポプラストにおいて、ＰＲ−２（β−グルカナーゼ）およびＰＲ−３（キチナーゼ）タンパク質を含むＰＲタンパク質の能動分泌を誘発することが知られている (Goulet et al., 2010)。適用されたＭｅＪＡ用量に関わらず、２５〜３３ｋＤａの質量範囲の３つのタンパク質バンド（ＰＲ−２およびＰＲ−３タンパク質に対応する）が、アグロインフィルトレーションされた葉において強く上方制御された。ジャスモン酸シグナル伝達経路とサリチル酸シグナル伝達経路との間の拮抗的相互作用(Derksen et al., 2013)の結果、インフィルトレーションした葉におけるＰＲタンパク質誘導は、非感染植物において検出されたＭｅＪＡ介在性ストレスタンパク質誘導の強い逆転と関連し、感染の６日後にボックスＡ、ＢおよびＣの非常に弱いタンパク質シグナルを示した(図１ｂ)。ＲｕＢｉｓＣＯの大小サブユニットの両方は、未処理の植物と比較して、１または２ｍＭのＭｅＪＡで処理した葉において、元の含有量の５０％未満で検出された（図１ｂ,ｃ）。
【０１０６】
これらのデータは、demonstrate  N．benthamiana葉におけるＲｕＢｉｓＣＯ枯渇の強力な、感染前トリガーとしてのＭｅＪＡの有効性、ならびに回収後の富化および精製の前に粗タンパク質抽出物中の組換えタンパク質相対含量を増加させながらＲｕＢｉｓＣＯ負荷を低減させるその使用を実証する。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１０９】
ｉｉ）ＭｅＪＡは、N．benthamiana−A．tumefaciens 相互作用にはほとんど影響を与えない
アグロインフィルトレーション後、防御タンパク質に対するＭｅＪＡ上方制御効果のほぼ完全な逆転が観察され、細菌感染に対するＰＲタンパク質ベースの防御応答を付与する植物の能力および植物細胞をトランスフェクトし、葉組織に正常に保持される細菌の能力の両方に対するジャスモン酸処理の限定された影響が示された。植物−細菌相互作用をさらに試験するために、ＰＲ−２タンパク質のイムノブロットを葉でのＰＲタンパク質誘導の基準 (Goulet et al., 2010) として用いて、サリチル酸によって調節される２つのアグロバクテリウム毒性遺伝子のｍＲＮＡ転写数をトランスフェクションプロセスのマーカーとして用いた(Yuan et al., 2007) (図２)。ジャスモン酸シグナル伝達に対するサリチル酸または機能的相同体の強い拮抗作用、ならびにサリチル酸またはＭｅＪＡ処理によるサリチル酸誘導性ＰＲタンパク質およびジャスモン酸誘導性防御タンパク質に対する分散制御パターンについて、いくつかの試験結果が報告されている(Thaler et al., 2012)。
【０１１０】
クマシーブルー染色したタンパク質プロファイル(図１ｂ)と一致して、０．５または１ｍＭで噴霧したＭｅＪＡは、インフィルトレーションしていない葉における構成的に発現される３３ｋＤａの病原体誘導性ＰＲ−２タンパク質の発現に有意な影響を及ぼさなかった(ANOVA； P＞0.05；図２ａ)。
【０１１１】
サリチル酸は、病原性遺伝子の発現と宿主細胞へのＴ−ＤＮＡの組み込み(Yuan et al., 2007)に影響を及ぼす細菌の毒性遺伝子群(Vir)レギュロン（regulon）の下方制御により、葉におけるアグロインフェクションを弱めることが知られている(Veena et al., 2003； Yuan et al., 2007； Anand et al., 2008)。サリチル酸を欠く植物は、病原体に対してより感受性が高いことが示されているが、この代謝産物を過剰に産生する植物は、感染に対する増加した抵抗性（recalcitrance）を示した(Yuan et al., 2007)。そこで、インフィルトレーションした葉におけるアグロバクテリウム細胞数および病原性タンパク質のｍＲＮＡ転写物プールを、ＭｅＪＡ処理の有無に関わらず比較するために、細菌数およびリアルタイムＲＴ ＰＣＲアッセイを行い、アグロバクテリウム増殖を促進するジャスモン酸誘導体のサリチル酸塩抑制作用および病原性遺伝子の発現を調べた（図２ｂ、ｃ）。
【０１１２】
インフィルトレーションの後２日までのアポプラスト抽出物１ｍｌ当たりの細菌数が１０〜１億コロニー形成単位（ＣＦＵ）であり、４日後または６日後には１００万ＣＦＵ未満であることから決定されるように、同様の数の細菌が対照およびＭｅＪＡ処理葉のアポプラストから回収された（図２ｂ）。レシピエント宿主細胞へのＴ−ＤＮＡ転座およびその後の核への組み込みに関与する２つの毒性タンパク質であるＶｉｒＢ１およびＶｉｒＥ１のＤＮＡコーディング配列(Lacroix et al., 2006)を、ＲＴ ＰＣＲアッセイ用のサリチル酸応答性細菌マーカーとして使用した。サルチル酸シグナル伝達に対するジャスモン酸の天然の拮抗作用にもかかわらず、ＭｅＪＡ処理葉ではＶｉｒＢ１発現が減少し（negatively altered）、ＭｅＪＡ処理後７日にはどちらの遺伝子も転写に対する正の効果は観察されなかった（図２ｃ）。
【０１１３】
これらのデータは、アグロインフィルトレーション時のＭｅＪＡ処理葉および対照葉における細菌感染に対する強力な防御応答の開始（onset）を全体的に確認し、この応答および遺伝子トランスフェクションに対する細菌の効力の両方に対するＭｅＪＡ前処理の正の影響はなかった。
【０１１４】
ｉｉｉ）ＭｅＪＡは、トランスフェクトされた葉におけるプロテアーゼ活性にほとんど影響を与えない
葉粗抽出物中のプロテアーゼ活性に対するＭｅＪＡ処理の効果を調べるために、合成ペプチド基質を用いて酵素アッセイを行った（図３）。内在性プロテアーゼは、タンパク質の回収のための組織破壊の際に、発現中の植物体内または植物体外のいずれかにおけるタンパク質ターンオーバーにおけるそれらの直接的な役割を果たす植物系における組換えタンパク質収量に強い影響を及ぼす(Benchabane et al., 2008)。プロテアーゼプロファイルは、葉齢、アグロバクテリア感染および組換えタンパク質発現を含む、N. benthamianaの異なる発生または環境因子によって影響を受ける（Robert et al., 2013）。防御関連のシグナル伝達経路間の複雑なクロストーク(Robert-Seilaniantz et al., 2011)、病原体感染時の分泌プロテアーゼの重要性（Hoerger and van der Hoorn, 2013； Ramirez et al., 2013； Hoewing et al., 2014； Figueiredo et al., 2014）および粗抽出物における内在性プロテアーゼの活性に影響を与える可能性のあるＭｅＪＡ介在性のプロテアーゼ阻害剤の過剰発現を念頭におき（図１ｂおよび表２参照）、対照およびアグロインフィルトレーションされた葉における主要なエンドプロテアーゼ活性に対するＭｅＪＡ処理の影響を評価した。
【０１１５】
粗抽出物中で測定されたプロテアーゼ活性は、組織破壊時の抽出媒体中のプロテアーゼ分子およびプロテアーゼ阻害剤分子の相対的存在量、ならびに内在性プロテアーゼに対する放出阻害剤の阻害特異性の両方を反映する正味の値を表す（Benchabane et al., 2009）。カテプシンＬ様 Ｃｙｓ プロテアーゼ活性、トリプシン様 Ｓｅｒ プロテアーゼ活性およびカテプシンＤ／Ｅ様 Ａｓｐ プロテアーゼ活性を、ＭｅＪＡ処理の７日後に収穫した対照葉およびＭｅＪＡ処理葉の粗抽出物中でアッセイして、葉のプロテアーゼプロファイルに対するジャスモン酸シグナル伝達の基本的な長期効果を記録した。ＭｅＪＡは、３つの試験用量についてカテプシンＬ様活性に影響を及ぼさなかった（ANOVA； Ｐ＞０．０５）（図３ａ）。トリプシン様酵素は、葉におけるＳｅｒプロテアーゼ阻害剤の同時に起こる（concomitant）上方制御にもかかわらず（表２参照）、０．５および１ｍＭ用量について活性の増加が最小限または全くないことを示した（Ｐ＜０．００１）（図３ｂ）。カテプシンＤ／Ｅ様活性は、インフィルトレーションされていない植物ではＭｅＪＡ処理の７日後に用量依存的現象を示した（Ｐ＜０．００１）が、それは、アグロインフィルトレーションされた葉でも観察された（図３ｃ）。カテプシンＬ様（Ｐ＜０．０５）およびトリプシン様（Ｐ＜０．００１）活性は、ＭｅＪＡ前処理とは無関係に、感染後６日目のインフィルトレーションされた葉で上方制御された（図３ａ,ｂ）。
【０１１６】
これらのデータは、ＭｅＪＡ介在性プロテアーゼ阻害剤誘導とは無関係に、細菌感染時のＣｙｓおよびＳｅｒプロテアーゼの役割ならびにアグロインフィルトレーションされた葉におけるこれらの酵素の特異的発現パターンの開始の可能性を示唆している。。このデータはまた、ＲｕＢｉｓＣＯサブユニットの顕著に枯渇したプールを示す、インフィルトレーションの６日後のＭｅＪＡ処理された葉における再平衡化されたプロテオームの確立を示し、病原体誘発性ＰＲタンパク質の量が著しく増加した。
【０１１７】
ｉｖ）ＭｅＪＡ処理は、一時的に発現された組換えタンパク質の蓄積を増価させる
アグロインフィルトレーションアッセイを行って、葉組織中に一過性に発現される臨床的に有用な組換えタンパク質の発現および定常状態レベルに対するＭｅＪＡ処理の影響を決定した（図４）。ヒト血液型モノクローナル抗体Ｃ５−１(Khoudi et al., 1999)は、植物系におけるこのタンパク質の発現、成熟およびタンパク質分解プロセシングに関して利用可能な豊富な情報を与えられたモデルとして選択された(Khoudi et al., 1999； Bardor et al., 2003； Sainsbury et al., 2008； Vezina et al., 2009； D’Aoust et al., 2009； Goulet et al., 2012； Robert et al., 2013)。N．benthamiana葉で同時に発現されたＣ５−１の軽鎖および重鎖は、約１５０ｋＤａの完全に組み立てられたバージョンの抗体およびいくつかのより小さいが未だ活性なフラグメントを含む、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて高分子量多バンドタンパク質パターンとしてイムノブロット上で検出される(Goulet et al., 2012； Robert et al., 2013)。約１５０ｋＤａの主タンパク質バンドを、抗ＩｇＧ一次抗体を用いて免疫検出した（図４ａ）。対照植物と比較して、ＭｅＪＡ処理植物の葉抽出物において、視覚的に類似のタンパク質バンドパターンが観察された。
【０１１８】
抗体蓄積に対するＭｅＪＡの見掛けの正の効果を確認し、ジャスモン酸介在性応答の可能性のある用量曲線関係を定義するために、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った（図４ｂ）。ＭｅＪＡ処理葉では、対照植物で測定したレベルの約１．５〜２．５倍の定常状態レベルに達するように、有意に多量の抗体が測定された（ANOVA；Ｐ＜０．０５）。ＭｅＪＡの上方制御効果は、２ｍＭ ＭｅＪＡにて〜３２５μｇ／ｇ 葉組織または対照葉にて２００μｇ／ｇ未満 と比較して、１ｍＭ ＭｅＪＡで測定された〜４２５μｇ／ｇ葉組織の最大収量値を有する二次曲線を示した（図４ｂ）。ＭｅＪＡの効果はまた、１ｍＭ ＭｅＪＡで処理された葉において７０ｎｇの抗体/μｇ 可溶性タンパク質（または〜７％のＴＳＰ）の正味収量を与えるタンパク質相対ベースで確認され、対照葉で得られた収率の約２倍であった（Ｐ＜０．０５）（図４ｂ）。１ｍＭ ＭｅＪＡを噴霧した植物のリアルタイムＰＣＲデータから推測されるように、ＭｅＪＡ処理葉におけるより高いＣ５−１収量は、軽鎖および重鎖の両方についてより多数のｍＲＮＡ転写物と関連し、対照葉抽出物で測定された数の約２倍であった（図４ｃ）。
【０１１９】
インフィルトレーションの２４時間後にＭｅＪＡを噴霧したとき（図４ｄ）、またはサリチル酸の機能的類縁体であるアラキドン酸（Girard et al., 2007）によるインフィルトレーションの２４時間前に葉を処理するとき（図４ｄ）、収量の増加は観察されなかった。
【０１２０】
さらに、インフィルトレーションの２４時間前に１ｍＭのＭｅＪＡを噴霧したN．benthamiana葉におけるＣ５−１収量の２倍以上の減少が、換え抗体がアルファルファプラストシアニンプロモーターの制御下で発現されるとき、観察された(引用により本明細書中に包含させる、米国特許第７，１２５，９７８号）。
【０１２１】
空のｐＣＡＭＢＩＡ２３００ベクターでトランスフェクトされた葉における３３ｋＤａのＰＲ−２タンパク質の誘導（図２ａ参照）は、抗体をコードするベクターでトランスフェクトされた葉において同様であり（図５）、このことは、アグロインフィルトレーションに対する宿主植物の応答に対するＣ５−１抗体発現の、ゼロでなければ、限定された影響を提案した。本発明者らの観察は、ジャスモンサン経路の転写促進効果は未だ理解されていないが、N. benthamiana葉における組換えタンパク質発現を高めるためのインフィルトレーション前のＭｅＪＡ処理の実用的有用性を全体的に示唆している。
【０１２２】
全ての引用文献は、引用により本明細書中に包含させる。
【０１２３】
本発明は、１以上の態様を記載している。しかしながら、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形および修正を行うことができることは、当業者には明らかである。特許請求の範囲は、実施例に記載された好ましい態様によって限定されるべきではなく、本明細書の記載全体と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【０１２４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2018524345000001.app
【国際調査報告】
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2018524345.tif 000022
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