(57)【要約】  部位特異的ヌクレオチド置換によりグリホサート耐性イネを取得するための方法であって、標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換するステップと、１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換するステップとのみによって、植物、すなわちグリホサート耐性植物を取得することを含む方法を提供する。ＣＲＩＳＰＲ介在型ＮＨＥＪ経路を用いて部位特異的ヌクレオチド置換体および断片置換体を生成しうる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリホサート耐性植物を取得するための方法であって、前記方法は、
標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換するステップと、
１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換するステップと
のみによって、植物、すなわちグリホサート耐性植物を取得することを含み、前記標的植物の前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の前記保存領域の前記アミノ酸配列は、配列番号２に示される方法。
【請求項２】
前記「標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換するステップと、１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換するステップとのみ」は、前記標的植物の細胞または組織に、以下のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）：
ａ）遺伝物質１、遺伝物質２およびドナーベクター：前記遺伝物質１は、配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡであり、前記遺伝物質２は、配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｂ）遺伝物質１２およびドナーベクター：前記遺伝物質１２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｃ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能なｍＲＮＡであり、前記非遺伝物質２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能なｍＲＮＡである；
ｄ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ１のタンパク質であり、前記非遺伝物質２は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ２のタンパク質である；
ｅ）ドナーベクター；または
ｆ）前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、ドナーベクター；
を導入し、次いで得られた細胞または組織を培養して完全な植物とすることによって実現され、ここで、
前記ドナーベクターは、変異標的配列を保有するベクターであり、該変異標的配列は、ＤＮＡ断片配列を含み、該ＤＮＡ断片配列は、前記標的植物のゲノム中の標的断片１の５’末端から標的断片２の３’末端までの配列に相当するとともに、所望のヌクレオチド変異を含み；前記標的断片１は、前記標的植物のゲノム中の、前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン領域内またはプロモーター領域内に位置し；前記標的断片２は、前記標的植物のゲノム中の、前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の下流のイントロン領域内または３’−ＵＴＲ領域内に位置し；前記ヌクレオチド変異は、前記標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）に置換し、かつ１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）に置換する変異であり、
前記配列特異的ヌクレアーゼ１は、前記標的植物のゲノム中および前記ドナーベクター中の前記標的断片１を特異的に切断することができ、前記配列特異的ヌクレアーゼ２は、前記標的植物のゲノム中および前記ドナーベクター中の標的断片２を特異的に切断することができることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記配列特異的ヌクレアーゼ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集を実現しうるいずれかのヌクレアーゼであり、前記配列特異的ヌクレアーゼ２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集を実現しうるいずれかのヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記植物は、単子葉植物または双子葉植物であり、具体的には前記単子葉植物は、イネ科植物であり、より具体的には前記イネ科植物は、イネであることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記標的断片１は、前記標的植物のゲノム中の、前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン領域内に位置し、該イントロン領域をイントロン領域１と示し、該イントロン領域１のヌクレオチド配列は、配列番号３の１〜７０４位に相当し、前記配列特異的ヌクレアーゼ１および前記配列特異的ヌクレアーゼ２はどちらも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、前記標的断片１は、配列番号３の１〜７０４位に相当するヌクレオチド配列内の式５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−ＮＸ−３’にしたがう断片であり、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であり、Ｘは、整数であり、かつＮＸは、Ｘ個の連続するヌクレオチドを表し、かつ／または
前記標的断片２は、前記標的植物のゲノム中の、前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の下流のイントロン領域内に位置し、該イントロン領域をイントロン領域２と示し、該イントロン領域２のヌクレオチド配列は、配列番号３の９５０〜１０３０位に相当し、前記配列特異的ヌクレアーゼ１および前記配列特異的ヌクレアーゼ２はどちらも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、かつ前記標的断片２は、配列番号３の９５０〜１０３０位に相当するヌクレオチド配列内の式５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−ＮＸ−３’にしたがう断片であり、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であり、Ｘは、整数であり、かつＮＸは、Ｘ個の連続するヌクレオチドを表すことを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記標的断片１のヌクレオチド配列は、配列番号４に示され、前記標的断片２のヌクレオチド配列は、配列番号５に示されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝物質１は、ｐＨＵＮ４１１ベクターの２つの制限酵素ＢｓａＩの間の断片を、配列番号４の１〜２０位に相当するＤＮＡ断片で置換することにより得られる組換えプラスミドであり、前記遺伝物質２は、ｐＨＵＮ４１１ベクターの２つの制限酵素ＢｓａＩの間の断片を、配列番号５の１〜２０位に相当するＤＮＡ断片で置換することにより得られる組換えプラスミドであるか、または
前記ドナーベクターが保有する前記変異標的配列の前記ヌクレオチド配列は、配列番号６に示される
ことを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれかの細胞であり、前記組織は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれかの細胞であり、
具体的には前記細胞は、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であり、前記組織は、カルス、未熟胚または成熟胚であり、
前記標的植物の前記細胞または組織に前記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）を導入するための手法は、遺伝子銃による手法、アグロバクテリウム感染による手法、ＰＥＧ介在型プロトプラスト形質転換による手法またはそれ以外のいずれかの導入手法であることを特徴とする、請求項２から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
以下の生物学的物質のいずれか１つ：
（１）イネ内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換し、かつ１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換することのみによって形成されるタンパク質であって、ここで、前記イネ内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるものである；
（２）前記タンパク質のコード遺伝子；
（３）前記コード遺伝子を含む、発現カセット、組換えベクター、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株。
【請求項１０】
標的生物の標的遺伝子中の標的ヌクレオチドを置換するための方法において、前記方法は、前記標的生物の細胞または組織に、以下のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）：
ａ）遺伝物質１、遺伝物質２およびドナーベクター：前記遺伝物質１は、配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡであり、前記遺伝物質２は、配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｂ）遺伝物質１２およびドナーベクター：前記遺伝物質１２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｃ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能なｍＲＮＡであり、前記非遺伝物質２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能なｍＲＮＡである；
ｄ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ１のタンパク質であり、前記非遺伝物質２は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ２のタンパク質である；
ｅ）前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、ドナーベクター；
を導入するステップを含み、ここで、
前記ドナーベクターは、変異標的配列を保有するベクターであり；該変異標的配列は、ＤＮＡ断片配列を含み、該ＤＮＡ断片配列は、前記標的生物のゲノム中の標的断片１の５’末端から標的断片２の３’末端までの配列に相当するとともに、所望のヌクレオチド置換を含み；前記標的断片１は、前記標的生物のゲノム中の前記標的遺伝子の前記標的ヌクレオチドの上流のイントロン領域内またはプロモーター領域内に位置し；前記標的断片２は、前記標的生物のゲノム中の前記標的遺伝子の前記標的ヌクレオチドの下流のイントロン領域内または３’−ＵＴＲ領域内に位置し；
前記配列特異的ヌクレアーゼ１は、前記標的生物のゲノム中および前記ドナーベクター中の前記標的断片１を特異的に切断することができ、前記配列特異的ヌクレアーゼ２は、前記標的生物のゲノム中および前記ドナーベクター中の標的断片２を特異的に切断することができる方法。
【請求項１１】
前記配列特異的ヌクレアーゼ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集を実現しうるいずれかのヌクレアーゼであり、前記配列特異的ヌクレアーゼ２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集を実現しうるいずれかのヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記標的生物は、植物であり、前記植物には、例えばイネまたはシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）である単子葉植物または双子葉植物が含まれることを特徴とする、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれかの細胞であり、前記組織は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれかの細胞であり、
具体的には前記細胞は、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であり、前記組織は、カルス、未熟胚または成熟胚であり、
前記標的植物の前記細胞または組織に前記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）を導入するための手法は、遺伝子銃による手法、アグロバクテリウム感染による手法、ＰＥＧ介在型プロトプラスト形質転換による手法またはそれ以外のいずれかの導入手法であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記植物は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）であり、前記標的遺伝子は、配列番号９のＡｔｓｎｃ１（Ａｔ４ｇ１６８９０）であり、前記配列特異的ヌクレアーゼ１は、配列番号１２に相当するｓｇＤＮＡを含み、前記配列特異的ヌクレアーゼ２は、配列番号１３に相当するｓｇＤＮＡを含み、前記変異標的配列は、配列番号１４に示され、前記標的ヌクレオチドの置換により、配列番号１０のＡｔｓｎｃ１のエクソン３が配列番号１１に置換され、それによってシュードモナス・シリンガエ・パソバー・マクリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ）ＥＳ４３２６およびペロノスポラ・パラシチカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）Ｎｏｃｏ２に対する耐性が前記植物に付与される、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーによる育種の分野に属し、部位特異的ヌクレオチド置換によりグリホサート耐性イネを取得するための方法、ならびに部位特異的ヌクレオチド置換体および部位特異的断片置換体を生成するための方法に関する。
【０００２】
背景
イネは、中国における、そしてさらには世界中の主要な食糧作物である。本発明者らの国では、イネの総面積、総収穫量および単位面積当たりの収穫量は１位を占め、作付面積は約５億畝である。中国では、水田における雑草の発生面積は、イネ作付面積の約４５％を占める。雑草の防除を行わない場合、イネの収穫量は、一般に５％〜１５％減少し、毎年約１，０００万トンの損失を招く。厳しい状況では、収穫量が１５％〜３０％減少する場合もある。水田の雑草を防除するために多くの人的資源および物的資源および財源が投入され、また大量の除草剤が施用された。したがって、除草剤耐性イネの開発が極めて重要である。伝統的な育種には時間がかかり、利用可能な生殖質資源は不足している。トランスジェニック技術およびゲノム編集技術の開発に伴い、グリホサート耐性イネの育種に有効な方法が提供される。
【０００３】
ゲノム編集技術は、近年現れた新規な技術であり、これには主に３種類の配列特異的ヌクレアーゼ：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＬＥＮ）および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ）が関与する（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムが含まれる。これらの人工ヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的部位にＤＮＡ２本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を生成することができ、ＤＮＡ損傷後に生成されたこれらのＤＳＢによって、２つの異なる修復機構としての細胞内の固有の非相同末端連結（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）が活性化されることによって、損傷されたＤＮＡが修復される。ＨＲによる修復の確率は非常に低く、生物は主にＮＨＥＪによって修復される。その場合、破壊された染色体は再結合されるが、この結合は通常は正確ではなく、破壊箇所でいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失が起こり、それによってフレームシフト変異またはタンパク質翻訳の早期終結が生じ、このようにして標的遺伝子の部位特異的ノックアウトが実現される。
【０００４】
グリホサートは、高効率、低毒性および低残留性、大半の植物に対する非選択性といった広範な利点を有する非選択的除草剤であり、現在世界中で主に使用されている除草剤である。その作用機構は主に、シキミ酸経路における５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の活性の競合的な阻害によって芳香族アミノ酸の合成をブロックし、最終的に植物を枯らせることにある。
【０００５】
発明の概要
本発明は、グリホサート耐性植物を取得するための方法を開示する。
【０００６】
本発明により提供されるグリホサート耐性植物を取得するための方法は、
標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換するステップと、１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換するステップとのみによって、植物、すなわちグリホサート耐性植物を取得することを含み、ここで、前記標的植物の前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の前記保存領域の前記アミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【０００７】
前記置換後に得られた保存領域のアミノ酸配列を、配列番号７に示す。
【０００８】
本方法によれば、「標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換するステップと、１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換するステップとのみ」とは、標的植物の細胞または組織に、以下のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）：
ａ）遺伝物質１、遺伝物質２およびドナーベクター：前記遺伝物質１は、配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡであり；前記遺伝物質２は、配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｂ）遺伝物質１２およびドナーベクター：前記遺伝物質１２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｃ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能なｍＲＮＡであり、前記非遺伝物質２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能なｍＲＮＡである；
ｄ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ１のタンパク質であり、前記非遺伝物質２は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ２のタンパク質である；
ｅ）ドナーベクター；
ｆ）前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、ドナーベクター；
を導入し、次いで得られた細胞または組織を培養して完全な植物とすることによって実現され、ここで、
前記ドナーベクターは、変異標的配列を保有するベクターであり；該変異標的配列は、ＤＮＡ断片配列を含み、該ＤＮＡ断片配列は、前記標的植物のゲノム中の標的断片１の５’末端から標的断片２の３’末端までの配列に相当するとともに、所望のヌクレオチド変異を含み；前記標的断片１は、前記標的植物のゲノム中の、前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン領域（イントロン領域１と示す）内またはプロモーター領域内に位置し；前記標的断片２は、前記標的植物のゲノム中の、前記内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の下流のイントロン領域（イントロン領域２と示す）内または３’−ＵＴＲ領域内に位置し；前記ヌクレオチド変異は、前記標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）に置換し、かつ１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）に置換する変異である。
【０００９】
この変異標的配列は、標的植物のゲノム中の標的断片１の５’末端から標的断片２の３’末端までの配列に相当するとともに所望のヌクレオチド変異を含むＤＮＡ断片配列であってよく；またこの変異標的配列は、上流および／または下流の相同配列をさらに含んでよく、ここで、この上流の相同配列とは、標的植物のゲノム中の標的断片１の上流に位置する配列のセグメントであり、下流の相同配列とは、標的植物のゲノム中の標的断片２の下流に位置する配列のセグメントである。
【００１０】
配列特異的ヌクレアーゼ１は、標的植物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片１を特異的に切断することができ、配列特異的ヌクレアーゼ２は、標的植物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片２を特異的に切断することができる。この配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２が標的植物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片１と標的断片２とを同時に切断する場合、ドナーベクターの２つの標的部位の間の置換ヌクレオチドを含む断片が、標的植物のゲノムのこれら２つの標的部位の間に挿入されることができ、それによって部位特異的ヌクレオチド置換を有するゲノム配列が得られる。
【００１１】
配列特異的ヌクレアーゼ（例えば配列特異的ヌクレアーゼ１または配列特異的ヌクレアーゼ２）は、標的植物のゲノム中およびドナーベクター中の複数の標的断片を同時に特異的に切断し、それによって複数のヌクレオチドの挿入変異および／または欠失変異が生じる可能性があるが、そうした変異は、プロモーター領域および／またはイントロン領域および／またはＵＴＲ領域（非翻訳領域）内に位置し、それにより、総じてタンパク質の機能は影響を受けないことになる。２つの配列特異的ヌクレアーゼ（例えば配列特異的ヌクレアーゼ１または配列特異的ヌクレアーゼ２）が、標的植物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片１と標的断片２とを同時に切断する場合、２つの標的部位の間の配列のヌクレオチド置換変異が生じうる。
【００１２】
配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２はどちらも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであってもよいし、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼであってもよいし、ジンクフィンガーヌクレアーゼであってもよいし、ゲノム編集を実現しうるいずれの配列特異的ヌクレアーゼであってもよい。配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２は、同一の種類のものであってもよいし、異なる種類のものであってもよい。
【００１３】
本方法によれば、植物は、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。単子葉植物は、イネ科植物であってもよい。具体的には、イネ科植物は、イネであってもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態において、具体的には、植物は、イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）である。
【００１５】
したがって、ゲノムＤＮＡレベルでは、標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列中の変異させるべき残基（８位および１２位）は、該標的植物の内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の第２エクソン内に位置する。イントロン領域１は、第１イントロンであり、そのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３の１〜７０４位に相当する。イントロン領域２は、第２イントロンであり、そのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３の９５０〜１０３０位に相当する。配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２はどちらも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。標的断片１は、配列表の配列番号３の１〜７０４位に相当するヌクレオチド配列内の式５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−ＮＸ−３’にしたがう断片であり、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であり、Ｘは、整数であり（例えばＸは、２０であり）、かつＮＸは、Ｘ個の連続するヌクレオチドを表す。標的断片２は、配列表の配列番号３の９５０〜１０３０位に相当するヌクレオチド配列内の式５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−ＮＸ−３’にしたがう断片であり、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であり、Ｘは、整数であり（例えばＸは、２０であり）、かつＮＸは、Ｘ個の連続するヌクレオチドを表す。
【００１６】
さらに、標的断片１のヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４に示す。標的断片２のヌクレオチド配列を、配列表の配列番号５に示す。
【００１７】
したがって本発明によれば、具体的には、遺伝物質１とは、ｐＨＵＮ４１１ベクターの２つの制限酵素ＢｓａＩの間の小断片を、配列表の配列番号４の１〜２０位に相当するＤＮＡ断片で置換することにより得られる組換えプラスミド（ｐＨＵＮ４１１−Ｃ３）である。具体的には、遺伝物質２とは、ｐＨＵＮ４１１ベクターの２つの制限酵素ＢｓａＩの間の小断片を、配列表の配列番号５の１〜２０位に相当するＤＮＡ断片で置換することにより得られる組換えプラスミド（ｐＨＵＮ４１１−Ｃ４）である。
【００１８】
具体的には、ドナーベクターが保有する変異標的配列のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６である。具体的には、ドナーベクターは、配列表の配列番号６に示されるＤＮＡ断片を、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号：ＣＢ１０１）に挿入することにより得られる組換えプラスミド（ｐＥＰＳＰＳドナー）である。
【００１９】
本発明によれば、ｐＨＵＮ４１１−Ｃ３、ｐＨＵＮ４１１−Ｃ４およびｐＥＰＳＰＳドナーを１：１：２のモル比で、イネのカルス（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）に導入する。
【００２０】
本方法によれば、細胞は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれの細胞であってもよく、組織は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれの細胞であってもよい。具体的には、例えば細胞は、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であってよく、例えば組織は、カルス、未熟胚または成熟胚であってよい。
【００２１】
本方法によれば、標的植物の細胞または組織にａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）を導入するための手法は、遺伝子銃による手法であってもよいし、アグロバクテリウム感染による手法であってもよいし、ＰＥＧ介在型プロトプラスト形質転換による手法であってもよいし、それ以外のいずれかの導入手法であってもよい。
【００２２】
以下の生物学的物質のいずれか１つも、本発明の保護範囲に包含される：
（１）イネ内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換し、かつ１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換することのみによって形成されるタンパク質であって、ここで、前記イネ内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の保存領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるものである；
（２）前記タンパク質のコード遺伝子；
（３）前記コード遺伝子を含む、発現カセット、組換えベクター、組換え細菌またはトランスジェニック細胞株。
【００２３】
前記トランスジェニック細胞株は、非増殖性物質である。
【００２４】
本発明はさらに、標的遺伝子中の標的ヌクレオチドを置換するための方法であって、前記標的ヌクレオチドは、１つまたは複数の連続しないヌクレオチドであってもよいし、複数の連続したヌクレオチドにより形成される断片であってもよい方法を提供する。
【００２５】
標的遺伝子中の標的ヌクレオチドを置換するための方法において、標的生物の前記標的遺伝子中の前記標的ヌクレオチドを置換するステップは、前記標的生物の細胞または組織に、以下のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）：
ａ）遺伝物質１、遺伝物質２およびドナーベクター：前記遺伝物質１は、配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡであり、前記遺伝物質２は、配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｂ）遺伝物質１２およびドナーベクター：前記遺伝物質１２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ断片またはインビトロで転写されたＲＮＡである；
ｃ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、前記配列特異的ヌクレアーゼ１を発現可能なｍＲＮＡであり、前記非遺伝物質２は、前記配列特異的ヌクレアーゼ２を発現可能なｍＲＮＡである；
ｄ）非遺伝物質１、非遺伝物質２およびドナーベクター：前記非遺伝物質１は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ１のタンパク質であり、前記非遺伝物質２は、インビトロで発現される前記配列特異的ヌクレアーゼ２のタンパク質である；
ｅ）前記配列特異的ヌクレアーゼ１のみならず前記配列特異的ヌクレアーゼ２をも発現可能な、ドナーベクター；
を導入することにより実現され、ここで、
前記ドナーベクターは、変異標的配列を保有するベクターであり；該変異標的配列は、ＤＮＡ断片配列を含み、該ＤＮＡ断片配列は、前記標的生物のゲノム中の標的断片１の５’末端から標的断片２の３’末端までの配列に相当するとともに、所望のヌクレオチド置換を含み；前記標的断片１は、前記標的生物のゲノム中の前記標的遺伝子の前記標的ヌクレオチドの上流のイントロン領域内またはプロモーター領域内に位置し；前記標的断片２は、前記標的生物のゲノム中の前記標的遺伝子の前記標的ヌクレオチドの下流のイントロン領域内または３’−ＵＴＲ領域内に位置する。前記２つの配列特異的ヌクレアーゼの前記標的部位は、プロモーター領域および／またはイントロン領域および／またはＵＴＲ領域（非翻訳領域）内に位置しており、前記標的遺伝子の発現は総じて、そうした領域における少数のヌクレオチドの挿入および欠失には影響を受けないことになる。
【００２６】
この変異標的配列は、標的生物のゲノム中の標的断片１の５’末端から標的断片２の３’末端までの配列に相当するとともに所望のヌクレオチド置換を含むＤＮＡ断片配列であってよく、またこの変異標的配列は、上流および／または下流の相同配列をさらに含んでよく、ここで、この上流の相同配列とは、標的生物のゲノム中の標的断片１の上流に位置する配列のセグメントであり、下流の相同配列とは、標的生物のゲノム中の標的断片２の下流に位置する配列のセグメントである。
【００２７】
配列特異的ヌクレアーゼ１は、標的生物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片１を特異的に切断することができ、配列特異的ヌクレアーゼ２は、標的生物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片２を特異的に切断することができる。このドナーベクターは、該ドナーベクター中の上流および下流の相同配列によって、標的生物の遺伝子中の標的遺伝子へと向けられる。この配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２が標的生物のゲノム中およびドナーベクター中の標的断片１と標的断片２とを同時に切断する場合、ドナーベクターの２つの標的部位の間の置換すべきヌクレオチドを含む断片が、標的生物のゲノムのこれら２つの標的部位の間に挿入されることができ、それによって部位特異的ヌクレオチド置換を有するゲノム配列が得られる。
【００２８】
標的生物は、標的植物であってもよいし、標的動物であってもよいし、標的微生物であってもよい。配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２はどちらも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであってもよいし、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼであってもよいし、ジンクフィンガーヌクレアーゼであってもよいし、ゲノム編集を実現しうるいずれの配列特異的ヌクレアーゼであってもよい。配列特異的ヌクレアーゼ１および配列特異的ヌクレアーゼ２は、同一の種類のものであってもよいし、異なる種類のものであってもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、前記標的生物は、単子葉植物または双子葉植物含む植物であり、例えばイネまたはシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）である。細胞は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれの細胞であってもよく、組織は、導入レシピエントとして使用できかつ組織培養により完全な植物へと再生できるいずれの細胞であってもよい。具体的には、例えば細胞は、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であってよく、例えば組織は、カルス、未熟胚または成熟胚であってよい。標的植物の細胞または組織にａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）を導入するための手法は、遺伝子銃による手法であってもよいし、アグロバクテリウム感染による手法であってもよいし、ＰＥＧ介在型プロトプラスト形質転換による手法であってもよいし、それ以外のいずれかの導入手法であってもよい。
【００３０】
特定の一実施形態において、前記植物は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）であり、前記標的遺伝子は、配列番号９のＡｔｓｎｃ１（Ａｔ４ｇ１６８９０）であり、前記配列特異的ヌクレアーゼ１は、配列番号１２に相当するｓｇＤＮＡを含み、前記配列特異的ヌクレアーゼ２は、配列番号１３に相当するｓｇＤＮＡを含み、前記変異標的配列は、配列番号１４に示され、前記標的ヌクレオチドの置換により、配列番号１０のＡｔｓｎｃ１のエクソン３が配列番号１１に置換され、それによってシュードモナス・シリンガエ・パソバー・マクリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ）ＥＳ４３２６およびペロノスポラ・パラシチカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）Ｎｏｃｏ２に対する耐性が前記植物に付与される。
【００３１】
本発明では、ＣＲＩＳＰＲ介在型のＮＨＥＪ経路にしたがって、ＥＰＳＰＳ遺伝子の第１イントロン内および第２イントロン内にそれぞれ位置する２つのｇＲＮＡ部位を設計し、これら２つのｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてゲノム中およびドナーベクター中の標的断片１と標的断片２とを同時に切断し、これらの標的部位の間の配列に相当するとともにヌクレオチドが１つまたは複数置換されている断片が、ゲノム中のこれらの標的部位の間に挿入してイネの第２エクソンを置換する機会を得ることによって、保存領域内の２つのアミノ酸の部位特異的変異を実現し、このようにしてグリホサート耐性を有するイネを生成する。このことは、新規な除草剤耐性植物変種の育種において非常に重要である。
【００３２】
本発明はさらに、標的遺伝子中の標的ヌクレオチドを部位特異的に置換するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術に関するＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子の構造および２つの標的部位（Ｃ３およびＣ４）の配列を示す概略図である。
【図２】図２は、イネのプロトプラストにおけるＣ３およびＣ４の標的ＯｓＥＰＳＰＳの活性の検出、ならびにこれに対応する配列決定の結果を示す。ａ）は、プロトプラストにおける標的部位Ｃ３のＰＣＲ／ＲＥ検出結果を示し、ｂ）は、これに対応する標的部位Ｃ３の配列決定の結果を示し、ｃ）は、プロトプラストにおける標的部位Ｃ４のＰＣＲ／ＲＥ検出結果を示し、ｄ）は、これに対応する標的部位Ｃ４の配列決定の結果を示す。ＷＴは、野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）のゲノム配列を表し、「−」は、欠失変異を表し、「＋」は、挿入変異を表し、「−／＋」後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表し（小文字は、挿入されたヌクレオチドを表し）、かつＭ１〜Ｍ４は、４つの変異型を表す。
【図３】図３は、置換を含むドナーベクター（ｐＥＰＳＰＳドナー）の構造を示す概略図である。ａ）は、イネのゲノム中のＥＰＳＰＳの保存領域内のＤＮＡ配列と、該保存領域のコードされたアミノ酸配列とを示し、ｂ）は、ドナーベクター中のＥＰＳＰＳの保存領域のＤＮＡ配列と、該保存領域のコードされたアミノ酸配列とを示し、ここで、太字のアミノ酸は、置換アミノ酸である。後の検出を容易にするために、同義変異によって酵素部位ＰｖｕＩを得る。
【図４】図４は、ＰＣＲ／ＲＥによるＣＲＩＳＰＲ介在型の部位特異的変異イネＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子のＴ０世代変異体の検出、および配列決定の結果を示す。ａ）は、Ｔ０世代変異体のＰＣＲ／ＲＥ検出結果を示し、ここで、１〜１６は、異なる再生系統であり、ＰＣＲ産物は、ＰｖｕＩ制限酵素を用いて切断され、ｃｋは、対照である野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）である。ｂ）は、変異体１、５および７の配列決定の結果を示す。ここで、Ｇは、野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）のＥＰＳＰＳ遺伝子の部分配列を表し、左側の配列は、Ｃ３部位の配列であり、中央の配列は、ＥＰＳＰＳの保存領域内のＤＮＡ配列であり、右側の配列は、Ｃ４部位の配列である。Ｄは、ドナーベクターのＥＰＳＰＳ遺伝子の部分配列を表し、左側の配列は、Ｃ３部位の配列であり、中央の配列は、部位特異的変異を有するＥＰＳＰＳの保存領域内のＤＮＡ配列であり、右側の配列は、Ｃ４部位の配列である。「−」は、欠失変異を表し、「＋」は、挿入変異を表し、「−／＋」後の数字は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を表す（小文字は、挿入されたヌクレオチドを表す）。
【図５】図５は、１ｍｇ／Ｌのグリホサートを含有するＮ６培地におけるイネ植物の成長を示す。１０日間の培養後、ａ）は、ＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子においてＴＩＰＳ部位特異的変異を生じさせることにより得られた変異体Ｔ０−１を表し、ｂ）は、対照である野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）である。
【００３４】
好ましい実施形態の詳細な説明
特に明記しない限り、以下の例で使用した実験方法はすべて、従来の方法である。
【００３５】
特に明記しない限り、以下の例で使用した材料、試薬等は、市販されている。
【００３６】
ｐＨＵＮ４１１ベクターは、文献“Ｈｕｉ−Ｌｉ  Ｘｉｎｇ，Ｌｉ  Ｄｏｎｇ，Ｚｈｉ−Ｐｉｎｇ，Ｗａｎｇ  Ｈａｉ−Ｙａｎ  Ｚｈａｎｇ，Ｃｈｕｎ−Ｙａｎ  Ｈａｎ，Ｂｉｎｇ，Ｌｉｕ  Ｘｕｅ−Ｃｈｅｎ  Ｗａｎｇ，Ｑｉ−Ｊｕｎ  Ｃｈｅｎ．Ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ  ＢＭＣ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ．１４：３２７−３３８（２０１４）”に開示されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より一般に入手可能である。このプラスミドを使用することで、ガイドＲＮＡの転写とＣａｓ９タンパク質の発現とを同時に行うことができる。
【００３７】
例１  イネのＯｓＥＰＳＰＳ標的部位の選択およびＣＲＩＳＰＲベクターの構築
Ｉ．  ＯｓＥＰＳＰＳ標的部位の選択
ＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子の座位番号は、０６ｇ０４２８０である。このＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子は、イネの６番染色体上に位置し、８個のエクソンおよび７個のイントロンを含み、かつ５１５のアミノ酸をコードする。このＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子の保存領域は、第２エクソン内に位置し、ノックアウトベクター構築のために選択された標的部位は、第１イントロン内および第２イントロン内にそれぞれ位置する（図１）。イネのゲノム中のこのＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子の、第１イントロンと、保存領域を含む第２エクソンと、第２イントロンとの配列を配列番号３に示し、ここで、配列番号３の１〜７０４位が第１イントロンであり、７０５〜９４９位が第２エクソンであり、かつ９５０〜１０３０位が第２イントロンである。
【００３８】
ＣＲＩＳＰＲノックアウト技術の標的となる２本鎖のうちの１本鎖は、以下の構造：５−ＮＸ−ＮＧＧ−３を有し、ここで、ＰＡＭ（ＮＧＧ）におけるＮは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのいずれか１つを表し、ＮＸにおけるＮは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのいずれか１つを表し、かつｘは、２０である。ＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子の標的配列は、以下の通りであり、下線部は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）である。標的Ｃ３は、第１イントロン内に位置し、標的Ｃ４は、第２イントロン内に位置する。
【００３９】
Ｃ３：５’−ＴＡＣＴＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号４）；
Ｃ４：５’−ＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号５）。
【００４０】
イネをノックアウトベクターで形質転換させた後、Ｃａｓ９タンパク質によってｇＲＮＡの介在下にこの標的配列領域を切断してＤＮＡ２本鎖切断を生じさせてこの生物における自己損傷修復機構を誘発すると、細胞が自発的に間隙を修復する過程で変異（この「変異」とは、挿入変異、欠失変異、置換変異および他の形態を含むすべての変異を指し、これらの変異の大多数は、遺伝子機能不活性化変異であった）が導入されることになる。
【００４１】
上述の標的配列Ｃ３は、ＢｓａＪＩ酵素消化認識配列（太字斜体の配列）を含み、これは、ＢｓａＪＩ制限酵素により切断可能である。上述の標的配列Ｃ４は、ＥｃｏＲＩ酵素消化認識配列（太字斜体の配列）を含み、これは、ＥｃｏＲＩ制限酵素により切断可能である。Ｃ３標的配列領域が切断された後に変異が生じた場合には、ＢｓａＪＩ酵素消化認識配列が破壊されることとなり、制限酵素ＢｓａＪＩによりこのＢｓａＪＩ酵素消化認識配列を切断することはできなくなるが、変異が生じなかった場合には、制限酵素ＢｓａＪＩによりＢｓａＪＩ酵素消化認識配列を切断することができる。同様に、Ｃ４標的配列領域が切断された後に変異が生じた場合には、ＥｃｏＲＩ酵素消化認識配列が破壊されることとなり、制限酵素ＥｃｏＲＩによりこのＥｃｏＲＩ酵素消化認識配列を切断することはできなくなるが、変異が生じなかった場合には、制限酵素ＥｃｏＲＩによりＥｃｏＲＩ酵素消化認識配列を切断することができる。
【００４２】
ＩＩ．  組換えベクターの構築
１．  ｐＨＵＮ４１１プラスミド（このプラスミドは、ＢｓａＩ制限酵素認識部位を２つ含む）を制限酵素ＢｓａＩにより消化し、約１２．５ｋｂのベクター骨格を回収して、これをＨＵＮ４１１と命名した。
【００４３】
２．  ステップＩにより設計したＣ３およびＣ４標的部位配列により、粘着末端（下線部）を有するプライマーを以下のように合成した。
【００４４】
Ｃ３−Ｆ：５’−ＧＧＣＧＴＡＣＴＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＴ−３’；
Ｃ３−Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＴＡＴＡＴＴＴＡＧＴＡ−３’；
Ｃ４−Ｆ：５’−ＧＧＣＧＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴ−３’；
Ｃ４−Ｒ：５’−ＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴ−３’。
【００４５】
３．  Ｃ３−ＦおよびＣ３−ＲならびにＣ４−ＦおよびＣ４−Ｒをそれぞれアニールして、粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これらをＣ３およびＣ４と命名し、そしてこれらを、ステップ１におけるゲル回収生成物ＨＵＮ４１１に連結することにより、組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ３およびｐＨＵＮ４１１−Ｃ４を得た。
【００４６】
この組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ３の構造は、以下の通りであった：ｐＨＵＮ４１１ベクターの２つの制限酵素ＢｓａＩの間の小断片（約１．２ｋｂ）を、配列番号４の１〜２０位に相当するＤＮＡ断片で置換することによりこの組換えプラスミドを取得し、このプラスミドを使用して、配列番号４を含むガイドＲＮＡの転写とＣａｓ９タンパク質の発現とを行うことができる。
【００４７】
組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ４の構造は、以下の通りであった：ｐＨＵＮ４１１ベクターの２つの制限酵素ＢｓａＩの間の小断片（約１．２ｋｂ）を、配列番号５の１〜２０位に相当するＤＮＡ断片で置換することによりこの組換えプラスミドを取得し、このプラスミドを使用して、配列番号５を含むガイドＲＮＡの転写とＣａｓ９タンパク質の発現とを行うことができる。
【００４８】
例２  イネプロトプラストの形質転換およびプロトプラストにおける組換えベクターの活性の検出
例１で構築した組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ３およびｐＨＵＮ４１１−Ｃ４をそれぞれ、ＰＥＧ介在型の手法によってイネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）のプロトプラストに送達した。これらのプロトプラストのゲノムＤＮＡを抽出し、特定のプライマーを用いたＰＣＲにより、標的部位Ｃ３およびＣ４を含むＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子を増幅させた。次いで、標的部位Ｃ３およびＣ４を含むＰＣＲ増幅産物をそれぞれ、制限酵素ＢｓａＩおよびＥｃｏＲＩで消化した（ＰＣＲ増幅産物のいくつかのバンドが切断できない場合、それは、例１で設計した標的部位が有効であることを示す）。これらの制限酵素で消化できなかったＰＣＲ増幅産物をゲル回収に供し、これをｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号：ＣＢ１０１）に挿入し、配列決定のために個々のコロニーを選択した。
【００４９】
標的部位Ｃ３およびＣ４を含む遺伝子をそれぞれ増幅させるためのプライマーは、以下の配列を有していた。
【００５０】
上流プライマーＯｓＥＣ３−Ｆ：５’−ＣＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＡＴＣ−３’；
下流プライマーＯｓＥＣ３−Ｒ：５’−ＣＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣ−３’；
上流プライマーＯｓＥＣ４−Ｆ：５’−ＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＧＣＧ−３’；
下流プライマーＯｓＥＣ４−Ｒ：５’−ＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣ−３’。
【００５１】
実験中、野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）の未消化のＰＣＲ産物対照と、ＢｓａＪＩまたはＥｃｏＲＩで消化した野生型ＰＣＲ産物対照とを設定した。実験を３回繰り返した。
【００５２】
プロトプラストにおけるＣ３組換えベクターの活性の検出に関する酵素消化結果を、図２ａに示す。レーン１および２は、ＢｓａＪＩによって切断されなかったＰＣＲバンドを有する形質転換プロトプラストであり（サイズは、予想通り約６４０ｂｐであった）、このことは、標的部位Ｃ３が有効であることを示す。レーン３は、未消化の野生型ＰＣＲ産物対照であった。レーン４は、ＢｓａＪＩによって完全に消化された消化野生型ＰＣＲ産物対照であった。配列決定の結果（図２ｂ）から、少数のヌクレオチドの挿入または欠失が標的部位に生じたことが判明し、また組換えベクターｐＨＵＮ４１１−Ｃ３によって標的部位Ｃ３で部位特異的遺伝子編集が行われたことが確認された。
【００５３】
プロトプラストにおけるＣ４組換えベクターの活性の検出に関する酵素消化結果を、図２ｃに示す。レーン１および２は、ＥｃｏＲＩによって切断されなかったＰＣＲバンドを有する形質転換プロトプラストであり（サイズは、予想通り約７３０ｂｐであった）、このことは、標的部位Ｃ４が有効であることを示す。レーン３は、未消化の野生型ＰＣＲ産物対照であった。レーン４は、ＥｃｏＲＩによって完全に切断された消化野生型ＰＣＲ産物対照であった。配列決定の結果（図２ｄ）から、少数のヌクレオチドの挿入または欠失が標的部位に生じたことが判明し、また組換えベクターｐＨＵＮ４１１−Ｃ４によって標的部位Ｃ４で部位特異的遺伝子編集が行われたことが確認された。
【００５４】
例３  ドナーベクターの構築
本例の目的は、変異標的配列を含むドナーベクターを構築し、該ドナーベクターをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼと併用することにより、イネ内在性ＥＰＳＰＳタンパク質の配列番号２に示す保存領域ポリペプチド（この保存領域ポリペプチドのコード遺伝子を、配列表の配列番号１に示す）の８位のスレオニン（Ｔ）をイソロイシン（Ｉ）で置換し、さらに１２位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）で置換することにあった。すなわち、変異された保存領域ポリペプチドの配列を、配列表の配列番号７に示し、以後この変異を、略してＴＩＰＳ変異と呼んだ。ドナーベクターの具体的な構築方法は、以下の通りであった。
【００５５】
野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、プライマー対ＯｓＥＰＳＰＳ−ＤＦ／ＯｓＥＰＳＰＳ−ＤＲをＰＣＲ増幅に用いた。増幅産物を、電気泳動検出に供した。１．２Ｋｂの標的バンドを取得し、ＰＣＲ産物を精製し、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号：ＣＢ１０１）に連結した。ＰＣＲによる検証の後に、ＥＰＳＰＳ断片を含むクローンを取得し、プラスミドを抽出した。配列決定の結果から、得られたプラスミドはＴ−Ｂｌｕｎｔベクターに挿入された配列番号８に示すＤＮＡ断片を含むことが判明し、このＤＮＡ断片を、ＴＢ−ＥＰＳＰＳ−Ｄと命名した。配列番号８の１２〜１０４１位は、配列番号３と完全に同一であった。
【００５６】
ＯｓＥＰＳＰＳ−ＤＦ：３’５’−ＣＣＣＴＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＧ−（配列番号８の１〜１９位）；
ＯｓＥＰＳＰＳ−ＤＲ：５’−ＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号８の１１７９〜１１９９位の逆相補的配列）。
【００５７】
プラスミドＴＢ−ＥＰＳＰＳ−Ｄを鋳型として使用し、これを、プライマーＯｓＥＰＳＰＳ−ＴＩＰＳＦ／ＯｓＥＰＳＰＳ−ＴＩＰＳＲを用いて増幅した（後の検出を容易にするために、ＰｖｕＩ制限酵素消化部位を、双方のプライマーの同義変異によって消化した）。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで処理し、これをＥ．ｃｏｌｕに導入して形質転換を行った。クローンを選択し、これを配列決定へと送った。配列決定を行った後、配列番号６に示すＤＮＡ断片をＴ−Ｂｌｕｎｔベクターに挿入することにより得られた組換えプラスミドを、ｐＥＰＳＰＳドナーと命名した。配列番号６と配列番号８との相違点は、ＯｓＥＰＳＰＳ−ＴＩＰＳＦ／ＯｓＥＰＳＰＳ−ＴＩＰＳＲプライマーに導入された変異部位のみであり、保存領域内の変異されたアミノ酸配列を、配列表の配列番号７に示す。
【００５８】
ＰＥＰＳＰＳドナーの構造を示す概略図を、図３に示す。
【００５９】
【化１】
2018527920.tif 000002
【００６０】
変異ヌクレオチドを、枠内に示し、変異により生じた酵素消化部位ＰｖｕＩを、太字で示す。
【００６１】
例４  イネの形質転換およびＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ変異体の検出
例１で構築した組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ３およびｐＨＵＮ４１１−Ｃ４と、例３で構築した組換えプラスミドｐＥＰＳＰＳドナーとを、遺伝子銃形質転換法によりイネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）に同時に導入した。形質転換のレシピエントとして、イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）のカルスを用いた。同時形質転換の際の組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ３と組換えプラスミドｐＨＵＮ４１１−Ｃ４とｐＥＰＳＰＳドナーとのモル比は、１：１：２であった。形質転換後の組織培養によって、完全な植物（すなわちＴ０世代）を再生した。
【００６２】
Ｔ０世代のトランスジェニック植物のゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位Ｃ３およびＣ４とＴＩＰＳ変異部位とを含む特異的プライマーＯｓＥＦ１およびＯｓＥＲを、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いた。
【００６３】
ＯｓＥＦ１：５’−ＣＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣ−３’（イネゲノムにおける配列番号８／６の３０ｂｐ上流に位置する）；
ＯｓＥＲ：５’−ＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号６の１１７９〜１１９９位に対する逆相補的配列）。
【００６４】
ＰＣＲ産物を単一の酵素ＰｖｕＩで消化した。この酵素消化の結果を、図４ａに示す。ＰＣＲおよび酵素消化検出を行った後、ＴＩＰＳ部位に変異を有する３つの植物系統、例えばＴ０−１、Ｔ０−５、Ｔ０−７（それぞれ図４ａのレーン１、５および７に相当し、これらは、（約１．２ｋｂのサイズを有する）ＰＣＲ産物バンドの他に、ＰｖｕＩの消化による（約９５０ｂｐおよび２７０ｂｐのサイズを有する）標的バンドをも含む）を取得し、番号が付された残りの植物（それぞれ図４ａのレーン２、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６に相当する）は、野生型に属していた。
【００６５】
さらに、変異体の配列決定の結果を、図４ｂに示す。３つの系統（Ｔ０−１、Ｔ０−５およびＴ０−７）は、設計した標的部位に標的ヌクレオチド変異を含み、少数のヌクレオチドの挿入および欠失が、標的部位Ｃ３と標的部位Ｃ４とに同時に生じた。Ｃ３およびＣ４はイントロン内に位置していたため、ＯｓＥＰＳＰＳ遺伝子のオープンリーディングフレームは、こうした少数のヌクレオチドの欠失および挿入の影響を受けなかった。翻訳により生成されたタンパク質は、標的ヌクレオチド変異の影響を受けていた。このことは、ＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ部位に変異を含む変異体がうまく得られたことを示している。
【００６６】
例５  ＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ部位変異体のグリホサート耐性に関する検証
例４で得られた３つのＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ部位変異系統（Ｔ０−１、Ｔ０−５およびＴ０−７）と、野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）植物とを、１ｍｇ／Ｌのグリホサートを含有するＮ６培地内に置き、通常の培養条件下で培養した。１０日後に、耐性結果を記録した。各ＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ部位変異系統について、４体以上の植物で検証を行った。
【００６７】
その結果、野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）植物は、萎黄病になり、しおれて枯れたが、ＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ部位変異植物はすべて正常に生存した（その葉は、緑色であった）ことが判明した。図５ａは、ＴＩＰＳ  ＥＰＳＰＳ部位を変異させたＴ０−１を示し、図５ｂは、野生型イネ（オリザ・サティバＬ．ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ．）栽培品種「日本晴」）対照植物を示す。
【００６８】
例６  アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるイントロン介在型部位特異的遺伝子置換
双子葉植物のモデル植物であるアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における機能的ゲノム研究には、例えば点変異および遺伝子置換のような正確なゲノム改変の生成が非常に重要となっている。本発明者らは本明細書において、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた非相同末端連結（ＮＨＥＪ）経路によるイントロン介在型部位特異的遺伝子置換手法について報告する。
【００６９】
Ａｔｓｎｃ１（Ａｔ４ｇ１６８９０）における点変異（Ｇ１６５４−Ａ）により、Ｇｌｕ５５２がＬｙｓ５５２に置換された置換体が生じ、これによって病原性関連（ＰＲ）遺伝子が構成的に発現されて、シュードモナス・シリンガエ・パソバー・マクリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ）ＥＳ４３２６およびペロノスポラ・パラシチカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）Ｎｏｃｏ２のいずれに対する耐性をも植物に付与できる可能性があることがすでに分かっている。したがって本発明者らは、内在性Ａｔｓｎｃ１遺伝子のアミノ酸置換体の取得に着手した。Ａｔｓｎｃ１のゲノム配列を、配列番号９に示す。
【００７０】
この点変異は、Ａｔｓｎｃ１のエクソン３で行われる。エクソン３のコード配列を、配列番号１０に示す。この内在性エクソン３を、点変異（Ｇ１６５４−Ａ）を含む新たなエクソン（配列番号１１）で置換するため、本発明者らは、Ａｔｓｎｃ１のイントロン２および３をそれぞれ標的とするデュアルｓｇＲＮＡを設計した。Ａｔｓｎｃ１のイントロン２を標的とするｓｇＲＮＡを、配列番号１２（Ｓ１）に示し、Ａｔｓｎｃ１のイントロン３を標的とするｓｇＲＮＡを、配列番号１３（Ｓ２）に示す。
【００７１】
本発明者らは、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）とＣａｓ９発現カセットとを保有するｐＨＥＥ４０１ベクターに、（ＡｔＵ６２６プロモーターにより駆動される）Ｓ１ｓｇＲＮＡと、（ＡｔＵ６２９プロモーターにより駆動される）Ｓ２ｓｇＲＮＡと、ヌクレオチド置換を１つ含むドナー配列（Ｇ１６５４−Ａ）とを組み込んで、コンストラクトｐＨＥＥ４１１−Ｓ１Ｓ２ドナーを得た。このヌクレオチド置換を含むドナー配列を、配列番号１４に示す。
【００７２】
この最終ベクターｐＨＥＥ４１１−Ｓ１Ｓ２ドナーを、凍結融解法によりアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に導入して形質転換させる。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｃｏｌ−０野生型植物を、フローラルディップ法による形質転換に用いた。収集した種子を、２５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含有するＭＳプレート上でスクリーニングした。土壌で成長させたＴ１トランスジェニック植物から、ゲノムＤＮＡを抽出した。標的部位の周囲の断片を、遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、配列決定した。最後に、遺伝子置換植物を得た。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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