(57)【要約】本発明は、ヒストンＨ４尾部が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間に障害を与える低分子に関する。これらの低分子は、Ｈ４残基Ｋ１２〜Ｒ２３を包含するＴＯＮＳＬの結合ポケットを標的とし、Ｈ４尾部Ｋ１２〜Ｒ２３とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を、直接的な競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して阻止または破壊する。本願発明者らは、ＡＲＤ（アンキリンリピートドメイン）と呼ばれる、ＴＯＮＳＬのヒストン読み取りドメインの構造を同定し、明らかにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４への結合を阻害する、ＴＯＮＳＬ阻害剤。
【請求項２】
前記阻害剤は、残基Ｋ１２〜Ｒ２３を含むヒストンＨ４尾部が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間と結合し、また、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとのヒストンＨ４の結合を、直接的な競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して予防および／または破壊する、請求項１に記載のＴＯＮＳＬ阻害剤。
【請求項３】
前記阻害剤は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面と結合する、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記残基Ｋ１２〜Ｒ２３を含むヒストンＨ４尾部が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、前記ヒストンＨ４尾部Ｋ１２〜Ｒ２３と前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を、直接的な競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して阻止または破壊するよう作用する、低分子。
【請求項５】
ヒストンＨ４尾部伸長残基Ｌｙｓ１２〜Ａｒｇ２３とのＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの相互作用を、分子間の水素結合、静電的相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を介して標的とする、請求項４に記載の低分子または請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記分子は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとヒストンＨ４のＬｙｓ１２−Ｇｌｙ１３−Ｇｌｙ１４−Ａｌａ１５セグメントとの間の分子間接触を標的とする、請求項４〜５のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記分子は、ヒストンＨ４の残基Ｇｌｙ１３、Ｇｌｙ１４およびＡｌａ１５と、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの残基Ａｓｎ５０７、Ｃｙｓ５０８、Ｔｒｐ６４１、Ｔｙｒ６４５およびＬｅｕ６４９との間の疎水性相互作用を標的とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記分子は、ヒストンＨ４  Ｇｌｙ１４の主鎖のＯとＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ  Ｔｒｐ６４１のＮε１との水素結合、およびＨ４  Ａｌａ１５の主鎖のＮとＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ  Ｔｙｒ６４５のＯηとの水素結合を標的とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記分子は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ  Ａｓｎ５７１のＮδ２と水素結合するヒストンＨ４  Ｌｙｓ１６の主鎖のＯを標的とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
ＴＯＮＳＬ、ＢＡＲＤ１およびＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択されるタンパク質のヒストン読み取りドメインを遮断することができる、請求項４〜９のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
前記阻害剤は、ペプチドまたは任意選択でコンジュゲート部分に結合しているポリペプチドである、請求項１〜３および５〜１０のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記阻害剤は、配列Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓを含むペプチドであり、ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸であってよい、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１３】
前記阻害剤は、配列Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕを含むペプチドである、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１４】
前記阻害剤は、配列Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含むペプチドである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１５】
前記阻害剤は、配列Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含むペプチドである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１６】
前記ペプチドまたはポリペプチドは、
Ｉ．配列番号２３のアミノ酸１２〜２３または配列番号３４のアミノ酸１２〜２３からなる配列、または
ＩＩ．その機能性ホモログであって、配列番号２３のアミノ酸１２〜２３または配列番号３４のアミノ酸１２〜２３の配列からなり、最高５個のアミノ酸が置換されてよく、前記ペプチドは、配列番号３４の少なくともＡｒｇ１７、Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０を含む、前記機能性ホモログ、
ＩＩＩ．その機能性ホモログであって、配列番号２３のアミノ酸１２〜２３または配列番号３４のアミノ酸１２〜２３の配列からなり、最高６個のアミノ酸が置換されてよい、前記機能性ホモログ
を含むかまたは構成要素とするが、前記阻害剤は配列番号２３のヒストンＨ４とは異なる、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１７】
前記ペプチドまたはポリペプチドは、
配列番号２３のアミノ酸９〜２５または配列番号３４のアミノ酸９〜２５からなる配列、または
その機能性ホモログであって、配列番号２３のアミノ酸９〜２５または配列番号３４のアミノ酸９〜２５の配列からなり、最高５個のアミノ酸が置換されてよく、前記ペプチドは、配列番号３４の少なくともＡｒｇ１７、Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０を含む、前記機能性ホモログ、
その機能性ホモログであって、配列番号２３のアミノ酸９〜２５または配列番号３４のアミノ酸９〜２５の配列からなり、最高６個のアミノ酸が置換されてよい、前記機能性ホモログ
を含むかまたは構成要素とするが、前記阻害剤は配列番号２３のヒストンＨ４とは異なる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１８】
前記ペプチドまたはポリペプチドは、
配列番号２３のアミノ酸１４〜３３または配列番号３４のアミノ酸１４〜３３からなる配列、または
その機能性ホモログであって、配列番号２３のアミノ酸１４〜３３または配列番号３４のアミノ酸１４〜３３の配列からなり、最高５個のアミノ酸が置換されてよく、前記ペプチドは、配列番号３４の少なくともＡｒｇ１７、Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０を含む、前記機能性ホモログ、
その機能性ホモログであって、配列番号２３のアミノ酸１４〜３３または配列番号３４のアミノ酸１４〜３３の配列からなり、最高６個のアミノ酸が置換されてよい、前記機能性ホモログ
を含むかまたは構成要素とするが、前記阻害剤は配列番号２３のヒストンＨ４とは異なる、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１９】
前記機能性ホモログにおいて最大で４個、好ましくは最大で３個、例えば最大で２個、例えば最大で１個のアミノ酸が置換されてよい、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２０】
前記阻害剤は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるペプチドを含むかまたは構成要素とする、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項２１】
前記ペプチドは、最大で４０個のアミノ酸、例えば最大で２５個のアミノ酸、例えば最大で２０個のアミノ酸からなる、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２２】
前記ペプチドは、最大で１５個のアミノ酸、例えば最大で１２個のアミノ酸からなる、請求項１１〜１６および２１のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２３】
前記ペプチドは、配列番号２３の４個〜４０個の範囲の連続するアミノ酸を含むかまたは構成要素とする、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２４】
前記配列番号２３のＬｙｓ２０に対応するアミノ酸はメチル化されていない、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２５】
前記ペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２２を含むかまたは構成要素とする、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項２６】
前記ペプチドは、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２を含むかまたは構成要素とする、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項２７】
前記ペプチドのＣ末端はアミド化またはアルキル化されている、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２８】
前記ペプチドのＮ末端はアセチル化またはホルミル化されている、請求項１１〜２７のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項２９】
前記コンジュゲート部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの高分子である、請求項１１〜２８のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項３０】
前記阻害剤または前記低分子は、３−［（３−アミノシクロペンチル）カルボニル］−１Ｈ−キノリン−４−オンのコアを有する化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤または請求項４〜１０のいずれか１項に記載の低分子。
【請求項３１】
前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、配列番号１６のＴＯＮＳＬのアミノ酸５１２〜６９２として同定される、請求項１〜３および５〜３０のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項３２】
ヒストンＨ４は、配列番号２３のヒストンＨ４または配列番号３４のヒストンＨ４である、請求項１〜３および５〜３１のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項３３】
ヒストンＨ４尾部のＫ１２〜Ｒ２３は配列番号３４のアミノ酸１２〜２３に対応する、請求項２〜３２のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項３４】
医薬品として使用するための、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３および５〜３３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項３５】
癌治療に使用するための、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３および５〜３４のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項３６】
癌治療用医薬品の調製に使用するための、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の低分子または請求項１〜３および５〜３３のいずれか１項に記載の阻害剤の使用。
【請求項３７】
配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの機能性ホモログと、
任意選択で、配列番号２４のアミノ酸６１〜１３０からなるＭＣＭ２  ＨＢＤ、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する前記ＭＣＭ２  ＨＢＤの機能性ホモログと
を含むポリペプチド、
配列番号２３のヒストンＨ４、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する前記ヒストンＨ４の機能性ホモログ、および
任意選択で、配列番号２５のアミノ酸５７〜１３５からなるヒストンＨ３．３  Δ５６、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する前記ヒストンＨ３．３  Δ５６の機能性ホモログ
の複合体の三次元結晶。
【請求項３８】
前記ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸６１〜１３０からなるＭＣＭ２  ＨＢＤに、４個〜１２個の範囲のＧｌｙ残基のような、４個〜２０個の範囲のＧｌｙ残基のリンカーを介して連結されている、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤを含むかまたは構成要素とする、請求項３７に記載の結晶。
【請求項３９】
前記結晶は空間群Ｐ３  ２  １である、請求項３７〜３８のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項４０】
単位格子パラメータは、ａ＝ｂ＝１３９．５±３Å、ｃ＝７２．９±３Å、α＝β＝９０°±２°、およびγ＝１２０°±２°である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項４１】
単位格子パラメータは、ａ＝ｂ＝１３９．５、ｃ＝７２．９、α＝β＝９０°、およびγ＝１２０°である、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項４２】
ＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある、ヒストンＨ４Ｒ１７、Ｈ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の結合ポケットに障害を与えることのできる低分子を選択または設計する方法であって、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４に含有される原子座標データの少なくとも一部、またはそこから誘導可能なデータを使用することを含み、また、Ｈ３（５７〜１３５）およびＨ４と複合体をなすＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの構造の全部または一部のモデリングを行い、モデリングした構造のＨ４尾部とＴＯＮＳＬのアンキリンリピートとを阻止または破壊する能力の可能性に基づいてそのような低分子の同定を行うコンピュータモデリングパッケージまたは、コンピュータプログラムの使用を含む、前記方法。
【請求項４３】
ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４への結合を阻害するＴＯＮＳＬ阻害剤を同定する方法であって、
ａ）請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の結晶を得、
ｂ）工程ａ）で得た結晶を使用してＸ線回折パターンを得、
ｃ）工程ｂ）で得た回折パターンから結晶の三次元構造を明らかにし、これにより複合体の三次元構造を得、
ｄ）得られた三次元構造に基づいてＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部結合表面に結合する１つ以上の化合物を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項４４】
ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４への結合を阻害するＴＯＮＳＬ阻害剤を同定するためのコンピュータ利用による方法であって、
ａ）ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面の空間構造を、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４で提供される原子座標、またはＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４で提示される三次元構造からの偏差が、タンパク質骨格原子に対する平均二乗偏差平方根で３Å以下、好ましくは１Å以下である三次元構造の原子座標に基づいてコンピュータで作製し、
ｂ）可能性のある阻害剤の空間構造をコンピュータで作製し、
ｃ）前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面の少なくとも１つのアミノ酸残基と結合できる構造を有する、可能性のある阻害剤を選択する
工程を含む、前記方法。
【請求項４５】
前記可能性のある阻害剤は、前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面のアミノ酸の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも１０個と結合できる構造を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面は、少なくともアミノ酸Ａｓｐ５２７、Ｍｅｔ５２８、Ｇｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９、Ｔｙｒ５６０、Ｃｙｓ５６１、Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ａｓｎ５７１、Ｔｙｒ５７２、Ｇｌｙ５９５、Ｇｌｕ５９７、Ａｓｐ６０４、Ａｓｎ６０７、Ｃｙｓ６０８、Ｔｒｐ６４１、Ｔｙｒ６４５およびＬｅｕ６４９を含む、請求項４４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
配列番号１〜２２のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する、単離されたポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列。
【請求項４８】
前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面のアミノ酸に少なくとも１つの変異を含むＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドであって、前記変異を除いては配列番号１６と同一であるかまたは配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を共有し、ＭＭＳ２２Ｌと結合することができ、ヒストンＨ４と結合しない、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチド。
【請求項４９】
前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、Ｇｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９、Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ｇｌｎ５７１およびＤ６０４からなる群から選択されるアミノ酸の１つ以上に変異がある、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択される配列を含むかまたは構成要素とする、請求項４８〜４９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ＴＯＮＳＬの阻害による効果を予測する方法であって、
請求項１１〜３３および４８〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチドを、生物および／または生物の細胞に発現させ、ここで、前記ポリペプチドを任意選択により条件付きで発現させ、
前記生物および／または細胞における前記ポリペプチドの効果を決定する
工程を含み、
前記生物および／または細胞における前記ポリペプチドの発現による前記効果が、前記生物および／または細胞におけるＴＯＮＳＬ阻害の効果を指す
、前記方法。
【請求項５２】
前記効果は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４への結合を阻害するＴＯＮＳＬ阻害剤、例えば、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の阻害剤を用いてＴＯＮＳＬを阻害する効果を指す、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記生物または前記細胞は疾患モデルを表す、請求項５１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記生物は、マウス、例えば、癌にかかるよう遺伝子操作されたマウスである、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞は、三次元培養で培養される、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
ＴＯＮＳＬ阻害剤を同定し、かつ／または推定ＴＯＮＳＬ阻害剤の阻害効果を決定する方法であって、
ａ）被験化合物、すなわち推定ＴＯＮＳＬ阻害剤を提供し、
ｂ）配列番号１６のＴＯＮＳＬ、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、または配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する前記ＴＯＮＳＬまたは前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの任意の機能性ホモログを発現している宿主生物を提供し、
ｃ）前記宿主生物を前記推定阻害剤と接触させ、
ｄ）前記宿主生物においてクロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログを検出する
工程を含み、
クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはその機能性ホモログの低下は前記被験化合物がＴＯＮＳＬ阻害剤であることを指す
、前記方法。
【請求項５７】
前記被験化合物は、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験化合物は、請求項１１〜３３のいずれか１項に記載のペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記宿主生物は、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログをコードする異種核酸を含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログは、検出可能リンカー、例えば、蛍光ポリペプチドに連結されている、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
工程ｄ）は、
ｄ．１）前記宿主生物の細胞から可溶性タンパク質を抽出し、
ｄ．２）前記宿主生物の細胞中のＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログを検出し、これによりＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログと会合したクロマチンを検出する
工程を含み得る、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
推定ＴＯＮＳＬ阻害剤の阻害効果を決定する方法であって、
ｅ）少なくとも配列番号２３のアミノ酸１７〜２０を含むヒストンＨ４またはその断片を提供し、
ｆ）配列番号１６のＴＯＮＳＬ、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、または配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する前記ＴＯＮＳＬまたは前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの任意の機能性ホモログを提供し、
ｇ）前記ヒストンＨ４またはその断片を、推定ＴＯＮＳＬ阻害剤の存在下で前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログと共にインキュベートし、
ｈ）前記ヒストンＨ４またはその断片と、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログとの結合の有無を測定する
工程を含み、前記ヒストンＨ４またはその断片と、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログとの結合の低下は、前記推定ＴＯＮＳＬ阻害剤がＴＯＮＳＬを阻害することができることを指す、
前記方法。
【請求項６３】
前記阻害剤は、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の阻害剤または低分子である、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムの安定に必要なＴＯＮＳＬタンパク質の新規阻害剤に関する。ＴＯＮＳＬは、エラーフリーの相同組換え（ＨＲ）を介して、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復およびＤＮＡ複製中間体の安定化においてＭＭＳ２２Ｌと共に絶対ヘテロ二量体として機能する。
【０００２】
本願発明者らは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤがそのヒストン基質であるヒストンＨ４尾部と複合体をなしている構造を明らかにしており、これにより、直接的な競合を介するかまたはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して、Ｈ４尾部とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を阻止または破壊できる、低分子、ペプチドもしくはポリペプチドの薬剤設計を構造に基づいて合理的に行う根拠を提供する。
【背景技術】
【０００３】
細胞は、ＤＮＡ損傷をもたらすさまざまな源に絶えず曝露されており、この攻撃に立ち向かうため、細胞は一連のＤＮＡ修復戦略を構築させた。ＤＮＡ二本鎖切断、損傷した複製フォークを修復する重要経路の一つであり増殖細胞の生存の鍵となるのが相同組換え（ＨＲ）である。
【０００４】
多くの癌細胞は高負荷の複製ストレスを受けることで、ＨＲ阻害に対し脆弱になる。
【０００５】
また、癌細胞は、従来の化学療法によって生じたＤＮＡ損傷を修復するこの経路に依存することが多いため、ＨＲを標的とする薬物は罹患細胞を合成致死させるため臨床的に魅力のあるものである。
【０００６】
また、ＨＲ阻害剤の開発は、ＰＡＲＰ阻害薬がＨＲ欠損細胞を死滅させることから臨床的関心も高い。したがって、２つの代替経路の遮断は、いずれか一方の経路のみを標的にするよりもはるかに大きな影響をもたらすであろう。さらに、一部の腫瘍細胞は他のＤＮＡ修復経路が欠損しているためＨＲ依存的であり、このためＨＲ修復抑制に対し感受性が高くなっている。
【０００７】
ＴＯＮＳＬ（Ｔｏｎｓｏｋｕ様、ＮＦＫＢＩＬ２）は、ＭＭＳ２２Ｌとのヘテロ二量体複合体となって機能し、ＨＲによるＤＳＢおよび損傷複製フォークの修復を促進する極めて重要なＨＲ調節因子である。ＨＲでは、ｓｓＤＮＡに装填されるＲａｄ５１を調節するＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌが提案される。ＭＭＳ２２ＬまたはＴＯＮＳＬの枯渇は、細胞増殖の顕著な低下およびＩ型トポイソメラーゼの毒であるカンプトテシン（ＣＰＴ）に対する著しい高感受性をもたらし、これは、壊れた複製フォークのＲＡＤ５１介在による修復を促進できないことが原因であると考えられる。しかし、ＤＮＡ修復においてＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ機能を調節する分子機構は不明である。
【０００８】
ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌは、ヒストンＨ３−Ｈ４、ヒストンシャペロンＡＳＦ１、およびＴＯＮＳＬのアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）に応じたＭＣＭ２、４、６、７と複合体を形成し、このことからＡＲＤはＴＯＮＳＬ機能にとって重要であり得ることが示唆される。
【０００９】
ＡＲＤは、転写イニシエーター、細胞周期制御因子、細胞骨格タンパク質、イオン輸送体およびシグナル伝達物質など機能的に異なる多数のタンパク質に出現し、約３３アミノ酸のタンデムリピートモジュールからなる、共通して見られるタンパク質間相互作用モチーフである。
【００１０】
リシン９でメチル化されたヒストンＨ３に特異的に結合するＧ９ａ／ＧＬＰ  ＡＲＤなどいくつかのＡＲＤタンパク質の結晶構造が明らかになっている（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：２４５，２００８）。しかし、大部分のＡＲＤの特異性は依然として不明である。
【００１１】
配列類似性で見ると、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤはＢＡＲＤ１  ＡＲＤと高度に類似している。ＢＡＲＤ１は、ＢＲＣＡ１の絶対的パートナーとして特徴が明らかになっているＨＲ因子であり、ＢＲＣＡ１のほとんどの細胞機能および腫瘍抑制因子機能に必要とされる（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：７９２６，  ２００３）。
【００１２】
ＢＡＲＤ１  ＡＲＤの結晶構造は入手可能（Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：２１１７９，２００８）であるが、ＢＡＲＤ１  ＡＲＤの結合特異性は不明であり、そのため阻害剤設計に対する根拠は提供されない。
【００１３】
したがって、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤが結合する標的分子を同定すること、およびこれらのタンパク質複合体の結晶を得ることが、それらの構造を原子分解能で明らかにするために望ましい。これにより、かかる結合がＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ機能にとって重要であるのか、ひいては魅力的な薬物標的となるのか否かを決定するための基準が提供される。さらに、対応基質と結合する結合ポケットの高分解能構造により、当業者は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとその標的分子との結合に障害を与える低分子を設計し、その後、その効果を短時間かつ再現可能にバイオアッセイで検証することができる。
【発明の概要】
【００１４】
本願発明者らは、癌治療においてＨＲ修復経路を標的とするための道を開く、ＴＯＮＳＬとそのパートナーＭＭＳ２２Ｌが複製後クロマチンに動員される分子機構を発見した。この機構は、新たなヒストンを読み取るドメインとして機能するドメイン、ＴＯＮＳＬアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）が、Ｋ２０で修飾されていないヒストンＨ４（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０）を認識することに依存する。
【００１５】
今回の発見研究の主要項目には、以下が含まれる。
１．Ｋ２０がメチル化されていないＨ４尾部（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０）に特異的な第１のヒストン読み取り因子としてＴＯＮＳＬ  ＡＲＤを同定する構造データと生化学的データ。Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０はＤＮＡ複製中に取り込まれた新たに合成されたヒストンに特異的であり、Ｋ２０ｍｅ１が確立されるＧ２／Ｍ後期まで複製後クロマチンを標識する。
２．ＴＯＮＳＬがＡＲＤによるＨ４Ｋ２０ｍｅ０の認識を介して、ＭＣＭ２およびＡＳＦ１と複合体をなす新しい可溶性ヒストンと結合することを明らかにし、ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌを複製中クロマチンに送達する手段を証明する機能データと構造データ。
３．ＴＯＮＳＬは、ＡＲＤによるＨ４Ｋ２０ｍｅ０の認識を介して複製後クロマチンのヌクレオソームのヒストンと結合するという機能データ、ならびにかかる認識が、障害のある複製フォークおよびＤＮＡ損傷部位でＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌが蓄積するために必要であることの実証。
４．ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体タンパク質は、クロマチンから離れた部位でＭＭＳ２２Ｌを増量させ、細胞に対し毒性であるという機能データ。
５．ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体タンパク質は、Ｇ２／Ｍ期停止、複製に伴うＤＮＡ損傷（５３ＢＰ１フォーカス）を誘導し、カンプトテシン（ＣＰＴ）存在時および不在時に細胞生存力を低下させる。
６．クロマチンからＴＯＮＳＬを除去することにより、ＤＮＡ修復におけるＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ複合体の機能は不能になる。
７．ＴＯＮＳＬ阻害剤、例えば、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤと会合することができるＴＯＮＳＬ阻害剤。
７．ヒストンＨ４ペプチドまたはその機能性ホモログは、ＴＯＮＳＬ阻害剤として作用する可能性がある。
【００１６】
以上をまとめると、上記データから、ＤＮＡの複製では、Ｈ４Ｋ２０で修飾を受けていない新しいヒストンの積み込み（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）という形で目印が残され、それらをＨＲ修復複合体のＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌが認識して複製前と複製後のクロマチンを区別していることが示される。
【００１７】
さらに、今回の研究は、主要ＨＲ因子ＴＯＮＳＬが複製後のクロマチン状態を読み取り、それによって、障害のある複製フォークおよびＤＳＢでのＲａｄ５１の装填が仲介されるという機構を理解する上での突破口を提供する。したがって、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤを標的とする低分子阻害剤は、ＤＳＢおよび障害のある複製フォークの効率的ＨＲ修復を不能にすることができる。
【００１８】
したがって、本発明は、ヒストンＨ４尾部によって占有されるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間に障害を与える低分子に関する。これらの低分子は、Ｈ４残基であるＫ１２〜Ｒ２３を包含するＴＯＮＳＬの結合ポケットを標的とし、Ｈ４尾部であるＫ１２〜Ｒ２３とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を、直接的競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して阻止または破壊する。
【００１９】
したがって、一態様では、本発明は、ＢＡＲＤ１  ＡＲＤの結合ポケット（ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部Ｋ１２〜Ｒ２３結合ポケットとのその高度な構造類似性により定義される）にある基質の結合を、直接的競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケット破壊を介して阻止または破壊する低分子に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本願発明者らは、ＡＲＤ（アンキリンリピートドメイン）と呼ばれる、ＴＯＮＳＬのヒストン読み取りドメインの構造を同定し、明らかにした。重要なことには、本願発明者らは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤがそのヒストン基質であるヒストンＨ４尾部と複合体をなしている構造を明らかにしており、これにより、構造に基づくＴＯＮＳＬ阻害剤の合理的な薬剤設計の根拠が提供される。ＤＳＢおよび障害のある複製フォーク修復のＨＲにとってＴＯＮＳＬが必要であることから、ＴＯＮＳＬ阻害剤は、ＨＲに障害を与える上で効果的であり得るとともに、癌細胞の殺傷に単独または従来の化学療法との併用のいずれでも使用され得る。したがって、本明細書に記載するＴＯＮＳＬ阻害剤のいずれも癌治療において有用であり得る。
【００２１】
本発明の複合体、組換え型ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ発現細胞株（野生型およびヒストンＨ４結合変異体）の結晶構造はすべて、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４Ｋ２０ｍｅ０認識を妨げる特定の低分子阻害剤を設計および同定するのに役立つ。
【００２２】
また、本願発明者らは、ＴＯＮＳＬ阻害剤の開発に有用な生化学的および細胞ベースのアッセイのパイプライン開発を以下に開示する。
【００２３】
これらのデータおよび情報は、抗癌療法薬として好適な新規阻害剤の設計に必要不可欠である。したがって、本発明は、ＴＯＮＳＬとそのヒストン基質との結合を阻害して、ＨＲを妨げ、結果として、直接的な抗腫瘍効果および／または利用可能な細胞増殖抑制化合物の有効性増大をもたらすことができる低分子阻害剤を、インシリコで設計した後、それらを合成し、また本発明で提供されるアッセイにおいて試験を行うための手段を提供する。
【００２４】
本願発明者らは、界面変異体を使用して、Ｈ４尾部をＴＯＮＳＬに結合させる主要決定因子を同定した。さらに、本願発明者らは、Ｈ４尾部結合部位を破壊するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体は、複製後クロマチン、障害のある複製フォーク、またはＤＮＡ損傷部位（例えば、ＤＮＡ二本鎖切断）に動員されなくなることを実証した。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体タンパク質は、Ｇ２／Ｍ期停止、複製に伴うＤＮＡ損傷（５３ＢＰ１フォーカス）を誘導し、カンプトテシン（ＣＰＴ）存在時および不在時に細胞生存力を低下させる。
【００２５】
下記に詳述するように、前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体は、ＴＯＮＳＬ阻害剤の作用、特に、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４への結合を阻害する阻害剤の作用を表現型模写し得る。したがって、本発明は、そのような阻害剤は、Ｇ２／Ｍ期停止、複製に伴うＤＮＡ損傷（５３ＢＰ１フォーカス）を誘導し、かつ／またはカンプトテシン（ＣＰＴ）存在時および／もしくは不在時に細胞生存力を低下させるのに有用であるということを提供する。これにより、阻害剤が癌治療において有用となる。かかる阻害剤は本明細書に記載する阻害剤のいずれであってもよい。また、本願発明者らは、ＴＯＮＳＬのＡＲＤドメイン変異体（残基５１２〜６９２）のいくつかが、肺、皮膚、胃、大腸、胆道、前立腺、子宮内膜、卵巣、膵臓、食道、尿路および中枢神経系など複数の臓器の癌組織で同定されていることも強調する（ＣＯＳＭＩＣ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｇｒｃｈ３７−ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｓｅａｒｃｈ？ｑ＝ＴＯＮＳＬ）。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤという用語は、配列番号１６の５１２から６９２のアミノ酸を指す。
【００２６】
本願発明者らは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、構造が公開されているＢＡＲＤ１のＡＲＤに高度に類似しているが、ＢＡＲＤ１  ＡＲＤの結合特異性は不明であるため、ここでもやはり阻害剤設計の根拠とはならないと判断した。
【００２７】
しかしながら、Ｈ４尾部に対するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結合の詳細から、ヒストンに対するＴＯＮＳＬの結合を破壊する阻害剤は、ＢＡＲＤ１  ＡＲＤにも結合してその基質（例えば、ヒストン）との相互作用を破壊し得ることが予測される。ＢＡＲＤ１とＴＯＮＳＬが同一のＤＮＡ修復経路（ＨＲ）内の別々の段階で作用するので、上記のことは望ましいことであり、恐らく薬効を高めると考えられる。また、本願発明者らは、乳癌に見られるＢＡＲＤ１で明らかにされている腫瘍抑制因子変異は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−Ｈ４構造に基づくヒストン結合に必要であると予測されている重要残基を標的とすることも強調する。
【００２８】
一態様では、本発明は、ＨＲタンパク質であるＴＯＮＳＬをＤＮＡ損傷部位に動員させないようにすると考えられる薬物、低分子阻害剤の設計および開発に関する。ＴＯＮＳＬはそのパートナータンパク質ＭＭＳ２２Ｌと共にＨＲにとって必要であることから、ＤＮＡ損傷部位へのＴＯＮＳＬ動員を妨げることによってＨＲ修復を低下させ、単独で、または従来の化学療法との併用治療で癌細胞またはＨＲ修復経路に依存する細胞を死滅させることになる。
【００２９】
結晶構造
本発明は、ＤＮＡ損傷部位およびＤＮＡ複製フォークにＴＯＮＳＬおよびＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ複合体が動員されるのを妨げる化合物を同定する、構造に基づく薬剤設計方法の使用に関する。
【００３０】
本発明は、そのヒストン基質であるヒストンＨ４尾部と複合体をなすＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結晶構造を開示する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、Ｈ４尾部の伸長残基Ｌｙｓ１２からＡｒｇ２３を標的とし、主に分子間の水素結合、静電気的およびファンデルワールス力による相互作用を介する（図１〜９）。
【００３１】
本発明は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結合ポケット構造の原子の詳細、およびＨ４尾部（Ｋ４〜Ｒ２３）とＴＯＮＳＬ結合ポケットに並ぶ残基との間の認識特異性を構成する、Ｈ４尾部ペプチドとの分子間相互作用に関する。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明は、２０１６年４月１１日に寄託されたＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで利用可能な原子座標を有するか、またはＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに記載されている原子座標から任意の方向への原子座標変動が３Å未満である構造を有する、結晶構造に関する。
【００３３】
本発明の原子座標の変動は、好ましくは３Å未満、例えば２．７５Å未満、例えば２．５Å未満、例えば２．２５Å未満、例えば２．０Å未満、例えば１．７５Å未満、例えば１．５Å未満、例えば１．２５Å未満、例えば１．０Å未満、例えば０．７５Å未満、例えば０．５Å未満または例えば０．２５Å未満でなければならない。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで利用可能な原子座標データの少なくとも一部またはそこから誘導可能なデータに関する。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、そのヒストン基質であるヒストンＨ４尾部と複合体をなすＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結晶構造の少なくとも一部を含む結晶に関する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで利用可能な結晶構造、またはそれを変形させた結晶構造のうち、ヒストンＨ４尾部残基Ｌｙｓ１２〜Ａｒｇ２３と相互作用するＴＯＮＳＬの結合表面を定義する任意の結晶構造における、原子座標間の距離に関する（図１〜９）。
【００３７】
ヒストンＨ４（Ｋ１２〜Ｒ２３）ペプチドは、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートドメイン表面のチャネル内に位置する。この表面は酸性パッチを構成し、Ｈ４の側鎖Ｈｉｓ１８とＬｙｓ２０に対する狭い結合ポケットを含有する。さらに、Ｈ４の側鎖のＲ１７は、側鎖のＴｙｒ５７２とＣｙｓ６０８の間に挟まれるように整列している。したがって、いかなる阻害剤も、２つの狭いポケットを標的にし、かつ、結合表面の静電的性質と適合性がある必要がある。
【００３８】
結晶構造の形成方法
一実施形態では、本発明は、
配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する、その機能性ホモログ、および
任意選択で、配列番号２４のアミノ酸６１〜１３０からなるＭＣＭ２  ＨＢＤ、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する、その機能性ホモログを含む、ポリペプチド、
配列番号２３のヒストンＨ４、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する、その機能性ホモログ、および
任意選択で、ヒストンＨ３もしくはその断片、例えば、配列番号２５のアミノ酸５７〜１３５からなるヒストンＨ３．３  Δ５６、またはそれとの配列同一性を少なくとも９０％共有する、その機能性ホモログ
の複合体の三次元結晶に関する。
【００３９】
特に、ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって前記ＭＣＭ２  ＨＢＤもしくはその機能性ホモログに連結されている前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤもしくはその機能性ホモログを含んでよい。そのようなペプチドリンカーは、典型的に、４〜２０個の範囲のアミノ酸、例えば、４〜１２個のアミノ酸からなる。前記アミノ酸はＧｌｙであってよく、そのため、リンカーは４〜２０個の範囲のＧｌｙ残基、例えば４〜１２個の範囲のＧｌｙ残基からなる。
【００４０】
一般に、複合体は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤを含むポリペプチドを１つ含み、ヒストンＨ４および任意選択のヒストンＨ３は典型的に別々のペプチドとして存在する。好ましくは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤを含むポリペプチドはＭＣＭ２  ＨＢＤも含み、ここで、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤはリンカー、例えば、ペプチドリンカーによってＭＣＭ２  ＨＢＤに連結されてよい。前記ヒストンＨ３断片は、ヒストンＨ３．３の断片、例えば、配列番号２５のアミノ酸５７〜１３５であってよい。この断片は、同一断片を含有する、ヒストンＨ３．１またはヒストンＨ３．２の断片であってもよい。
【００４１】
本発明は、特に、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体の複合体の結晶化を可能にする特異な融合タンパク質であるＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（配列番号１５）の使用に基づいてよい。融合タンパク質は、ヒトＴＯＮＳＬアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ：配列番号１６の残基５１２〜６９２）およびＭＣＭ２ヒストン結合ドメイン（ＨＢＤ：配列番号２４の６１から１３０までの断片）からなり、グリシン４つのリンカー（Ｇ４リンカー）を介して共有結合して１つの発現カセットになる。
【００４２】
本発明の有用な単離されたポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、９９％の配列同一性または１００％の配列同一性というように少なくとも９０％の配列同一性を有する下掲配列データ表に開示する。掲載配列のいずれも本発明の実施形態である。遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列の配列同一性を定義するには多数の方法がある。一つの方法は、整列させた２配列を直接比較して行うものである。そのような比較は技術的には単純である。
【００４３】
特に、本明細書で使用する用語「配列同一性」は、アラインメントを行った後の候補配列と参照配列間で同一なアミノ酸またはヌクレオチドの割合（％）を指し得る。したがって、参照配列と８０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメントを行った後、候補配列中のアミノ酸の８０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一である必要がある。本発明による同一性は、好ましくはコンピュータ支援解析、例えば、限定することなく、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータアラインメントプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．、１９９４．  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０）、およびその中で提案されているデフォルトのパラメータによって決定する。ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｌｕｓｔａｌＷ  ＷＷＷ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ．から利用可能である。このプログラムをそのデフォルトの設定値と共に使用し、候補アミノ酸配列および参照アミノ酸配列のアラインメントを行う。完全に保存された残基数を数え、参照配列長で割る。したがって、配列同一性は、好ましくは、参照配列長全体にわたって決定される。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを同様に使用してヌクレオチド配列のアラインメントを行ってよい。アミノ酸配列の場合に示された方法と同様の方法で、配列同一性を計算してよい。本明細書で提供する配列同一性は、参照配列長全体にわたって計算される。
【００４４】
本発明による参照ペプチドまたは参照ポリペプチドの機能性ホモログは、前記参照ペプチドまたは参照ポリペプチドと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するペプチドまたはポリペプチドであってよい。別の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドのいずれかに低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を下掲配列データに開示しており、それらは本発明の実施形態である。
【００４５】
本明細書では、低ストリンジェンシー下でハイブリダイズする配列は、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を含有するハイブリダイゼーション溶液中で６５℃にて１６時間、上記の例えばＤＮＡまたは上記相補配列に特異的にハイブリダイズさせ、０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液中６５℃で２０分の洗浄を２回行った配列として定義される。
【００４６】
広範囲にわたるスクリーニングにもかかわらず、Ｈ４尾部またはＨ３−Ｈ４四量体と複合体をなすＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結晶化は失敗に終わった。さらなる結合タンパク質によって複合体全体の安定化を助け、結晶化を助ける場合があることから、ＭＣＭ２  ＨＢＤおよびＨ３−Ｈ４四量体との複合体をなすＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結晶化を試験した。
【００４７】
この複合体では非常に小さな結晶は得られたが、大きな、十分な回折の結晶は得られなかった。ＭＣＭ２  ＨＢＤおよびＨ３−Ｈ４四量体とのＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ複合体全体が厳しい結晶化条件によって不安定となってサブ複合体を形成したために、結晶の最適化が妨げられた可能性が考えられる。
【００４８】
そのため、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとＭＣＭ２  ＨＢＤを共有結合で連結して１つのカセットにしたものを、長さの異なるグリシンリンカー（Ｇｘリンカー）によって試験した。Ｇ１２、Ｇ１１、Ｇ１０、Ｇ９、Ｇ８、Ｇ７、Ｇ６、Ｇ５およびＧ４の各リンカーを試したところ、これらのすべてのカセットを結晶化することができた。
【００４９】
Ｇ４リンカーを有する構成体（ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤカセット）のうちの１つは、Ｈ３．３（Δ５６）−Ｈ４との複合体で十分な回折の結晶を与え（実施例１を参照のこと）、本明細書ではこれをＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体の複合体として表す（図１）。
【００５０】
したがって、本発明は、タンパク質構築体であるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４をその結晶形態で含む組成物および／またはこの結晶の構造解析から推測された、かかる複合体の構造の詳細に関する。
【００５１】
この結晶を定義する具体的データは実施例１の表１に詳述されている。具体的には、本発明の本態様は、ヒストンＨ４尾部残基Ｌｙｓ１２−Ａｒｇ２３と結合するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの結合表面を定義する原子座標（例えば、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで利用可能な結晶構造またはその変異型構造）から推測された、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ結合ポケット構造およびＨ４尾部ペプチドとの分子間相互作用に関する。
【００５２】
結合ポケットデータ
Ｈ４のＬｙｓ１２−Ｇｌｙ１３−Ｇｌｙ１４−Ａｌａ１５セグメントは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ足場表面の狭いチャネル内に位置する（図２〜４）。ヒストンＨ４に関して提供されるアミノ酸番号は一般に配列番号３４のヒストンＨ４に関して提供される番号である。
【００５３】
Ｈ４のＬｙｓ１２−Ｇｌｙ１３−Ｇｌｙ１４−Ａｌａ１５セグメントに及ぶ分子間接触には、Ｈ４の残基Ｇｌｙ１３、Ｇｌｙ１４およびＡｌａ１５と、ＡＲＤの残基Ａｓｎ５０７、Ｃｙｓ５０８、Ｔｒｐ６４１、Ｔｙｒ６４５およびＬｅｕ６４９との間の疎水性相互作用、ならびにＨ４  Ｇｌｙ１４の主鎖のＯとＡＲＤ  Ｔｒｐ６４１のＮε１との水素結合、およびＨ４  Ａｌａ１５の主鎖のＮとＡＲＤ  Ｔｙｒ６４５のＯηとの水素結合（図３、８）が含まれる。
【００５４】
Ｈ４  Ｌｙｓ１６の主鎖のＯはＡＲＤ  Ａｓｎ５７１のＮδ２と水素結合し、Ｈ４  Ｌｙｓ１６の側鎖は、ＡＲＤ  Ａｓｎ６０７との接触およびＡＲＤ  Ｇｌｕ５９７の側鎖との静電的相互作用を形成する（図３）。
【００５５】
Ｈ４  Ａｒｇ１７の側鎖は、ＡＲＤのＴｙｒ５７２とＣｙｓ６０８の両側鎖にわたって積み重なる一方で、そのＮη１原子は、ＡＲＤ  Ａｓｎ５７１の主鎖のＯおよびＯδ１との２つの水素結合を形成する（図３、５）。
【００５６】
Ｈ４  Ｈ１８の側鎖は、厳密に保存された４つの残基（Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ａｓｎ５７１およびＡｓｐ６０４）を結んでできるポケット内へ深く入り込んでおり、ＡＲＤのＨｉｓ５６７上に位置している。Ｈ４  Ｈｉｓ１８の側鎖は、Ｔｒｐ５６３とＡｓｎ５７１の間で積み重なり、ＡＲＤのＧｌｕ５６８およびＡｓｐ６０４と水素結合を形成する（図３、６）。
【００５７】
Ｈ４  Ａｒｇ１９の主鎖のＯはＴｒｐ５６３のＮε１と水素結合を形成し、その側鎖はＡＲＤのＣｙｓ５６１およびＧｌｙ５９５との接触を形成する（図３）。
【００５８】
Ｈ４  Ｌｙｓ２０残基は、Ｈ４  Ｈｉｓ１８結合ポケットに隣接するＡＲＤ表面の酸性ポケット内で結合している。Ｈ４  Ｌｙｓ２０の側鎖はＭｅｔ５２８の側鎖と相互作用し、ＡＲＤのＴｒｐ５６３の縁部と接触する一方、Ｈ４  Ｌｙｓ２０の主鎖の原子はＡＲＤのＣｙｓ５６１に対して集まる。Ｈ４  Ｌｙｓ２０のＮζ原子は、ＡＲＤの厳密に保存された残基Ｇｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９およびＧｌｕ５６８の各側鎖と３つの強い水素結合（距離＜３Å）を形成し、それが正三角形様に整列してＨ４  Ｌｙｓ２０を囲んでいる（図３、７）。
【００５９】
Ｈ４のＶａｌ２１−Ｌｅｕ２２−Ａｒｇ２３セグメントに及ぶ分子間接触には、Ｈ４  Ｖａｌ２１の側鎖と、ＡＲＤのＴｙｒ５６０およびＣｙｓ５６１との間の接触が含まれ、Ｈ４  Ｌｅｕ２２はＡＲＤのＡｓｐ５２７およびＭｅｔ５２８と相互作用する。Ｈ４  Ａｒｇ２３の主鎖のＮは、ＡＲＤのＡｓｐ５２７の主鎖のＯと水素結合を形成する一方、側鎖はＡＲＤのＴｙｒ５６０の側鎖に対して集まる（図３、９）。
【００６０】
上述の構造説明から、長いβ鎖様の立体構造コンフォメーションをしたＨ４尾部（残基１２〜２３）は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの窪んだ表面上の長く伸びたチャネルにあることは明らかである。このチャネルは主に酸性であり、正電荷を持つＨ４尾部と静電的に相補的な適合を提供する。最も重要なことには、Ｈ４のＨｉｓ１８およびＬｙｓ２０の側鎖が隣接する２つのポケット内に収められていることである（図４）。
【００６１】
Ｈ４  Ｈｉｓ１８をより大きなＴｒｐ残基で置換するとＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合が完全に破壊され（図１３）、ポケット内にＨｉｓ１８が適合することの重要性を明確に示している。Ｈ４  Ｌｙｓ２０のＮζ原子はその結合ポケット内で３つの強い水素結合を形成することから、Ｈ４Ｋ２０でのメチル化がこれらの重要な相互作用を切断するはずであると予測できる。
【００６２】
組換え型のＡＲＤおよび細胞抽出物から得た完全長ＴＯＮＳＬの等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）およびＨ４尾部ペプチドプルダウン法いずれでも、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１／２はＴＯＮＳＬ結合と適合しないことが確認された（図１３、１４、１５、１７、１８、１９）。
【００６３】
さらに、修飾再構成モノヌクレオソームを用いた組換え型完全長ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌのインビトロ・プルダウン法では、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２によりＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ結合が有意に低下することが示された（図１６）。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部結合表面」は、Ｈ４尾部と結合するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ部分を指す。Ｈ４尾部の結合に関与するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのアミノ酸はこの項ですでに詳述されているが、「ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部結合表面」はこれらのアミノ酸のいずれを含んでもよい。特に、「ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部結合表面」は、配列番号１６のアミノ酸Ａｓｐ５２７、Ｍｅｔ５２８、Ｇｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９、Ｔｙｒ５６０、Ｃｙｓ５６１、Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ａｓｎ５７１、Ｔｙｒ５７２、Ｇｌｙ５９５、Ｇｌｕ５９７、Ａｓｐ６０４、Ａｓｎ６０７、Ｃｙｓ６０８、Ｔｒｐ６４１、Ｔｙｒ６４５およびＬｅｕ６４９を含んでよい。
【００６５】
我々のデータは、Ｈ４Ｋ２０のメチル化がＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を妨げることを立証している。
【００６６】
これまでの研究でＧ９ａ／ＧＬＰメチルトランスフェラーゼのＡＲＤはＨ３Ｋ９ｍｅ１／２を特異的に認識することが見出されたが、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤはＨ３Ｋ９ｍｅ１ペプチドに対する結合を全くを示さなかった。
【００６７】
構造データと一致して、ヒストンＨ４の変異のＨ１８ＡおよびＫ２０Ａは細胞抽出物のＴＯＮＳＬへの結合を破壊した（図１１）。逆に、Ｈ４  Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０の結合ポケットに並ぶ６つの保存されたＴＯＮＳＬ残基の変異では、インビボおよびインビトロいずれでもＨ３−Ｈ４およびＭＣＭ２への結合が破壊されたが、これまでにＴＯＮＳＬのＣ末端部分への結合が示されているＭＭＳ２２Ｌへの結合には影響を与えなかった（図１０、１２）。インビボでは、これらの変異体は可溶性Ｈ３−Ｈ４への結合を抑制し、その結果、ＡＳＦ１およびＭＣＭ２との会合は失われたが、ＴＯＮＳＬのＣ末端部分へのＭＭＳ２２Ｌの結合には影響を与えなかった（図１２）。
【００６８】
以上をまとめると、これらの結果から、ＴＯＮＳＬはＡＲＤがＨ４尾部を認識することによって遊離のヒストンおよびヌクレオソームに結合し、重要残基Ｈｉｓ１８とＬｙｓ２０を隣接する２つのポケット内に適合させていることが示される。また、配列番号２３のアミノ酸９〜２５はＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２）に結合できること、しかし、変異体は、Ｈ４尾部ペプチドの結合が大きく低下していることが示されている。
【００６９】
Ｈｉｓ１８結合ポケットまたはＬｙｓ２０結合ポケットに結合できる低分子、ならびにＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの両ポケットを標的とする単一または共有結合した低分子であれば、Ｈ４とＴＯＮＳＬ間の相互作用を破壊するであろうことは明らかである。
【００７０】
薬物設計
最も基本的意味において、本発明の薬物設計では、本発明の標的分子と形状および電荷が相補的な単一または結合した低分子の設計を行う。本発明はまた、標的に結合するよう設計されたペプチドまたはポリペプチドに関する。
【００７１】
本発明の薬物設計は、本明細書で提供される三次元構造についての知見に依存する。低分子に加え、バイオ医薬品は重要性がますます高まっているクラスの薬物であり、これらのタンパク質を用いた治療薬の親和性、選択性、および安定性を改善するコンピュータによる方法もまた本発明の実施形態である。
【００７２】
本発明の低分子は、好ましくは、「標的外」（しばしば抗標的と呼ばれる）のいかなる重要分子にも影響を与えないよう設計されるが、その理由は、標的外分子と薬物が相互作用すると望ましくない副作用を引き起こし得るからである。
【００７３】
本明細書で使用する用語「低分子」は、分子量が１０００Ｄａより小さい、例えば５００Ｄａより小さい任意の分子を指す。好ましくは、「低分子」は、分子量が５００Ｄａより小さい有機分子であってよい。
【００７４】
本発明の実施形態を構成する別のクラスの低分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチドのユニットで構成され得るアプタマーである。アプタマーは特定の標的分子に結合するもので、それを本明細書の本項に記載するように設計してよい。あるいは、大規模なランダム配列プールから選別を行ってアプタマーを作製してよい。したがって、アプタマーは、本明細書に記載する結合特性を有するいずれのアプタマーであってもよい。
【００７５】
従来の創薬法（フォワード薬理学として知られる）が、化学物質の試行錯誤による実験を培養細胞または動物で行い、明らかな作用と治療をマッチングさせることに依存するのとは異なり、合理的薬物設計（リバース薬理学とも呼ばれる）は、ある具体的な生物学的標的の調節に治療価値があり得るという仮説をもとに開始される。
【００７６】
本発明による薬物標的としての低分子を選択するには、どうしても欠かせない一つの情報、すなわち、本発明の低分子による標的調節が疾患を改変することになるという証拠が必要である。これに関する知見は、ある関連、例えば、生物学的標的における変異と疾患の特定状態との関連を示す疾患関連研究から得られる。
【００７７】
低分子の検索は、可能性のある薬物化合物ライブラリーのスクリーニングにより開始してよい。これは、既存の利用可能な低分子ライブラリーの仮想スクリーニングを使用することにより実施してよい。本発明の原子座標データまたはそこから誘導可能なデータは、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある隣接するヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の両結合ポケットに障害を与えることができる低分子を選択および／または設計する際に有用である。
【００７８】
したがって、一態様では、本発明は、そのような低分子を選択および／または設計する方法に関し、ここで、例えば、かかる方法では、コンピュータモデリングまたは、コンピュータプログラムを使用して、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに開示の構造またはそこから誘導可能なデータのすべてまたは一部のモデリングを行い、モデリングした構造と相互作用する能力の可能性に基づいて上記のような低分子として可能性のあるものを同定し、その低分子を合成するかまたは商業的供給源から入手し、その機能性のインビトロ試験を実施する。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある隣接するヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の両結合ポケットに障害を与えることができる低分子を同定するコンピュータ利用による方法に関し、かかる方法は、
ａ）ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートの表面にあるヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の結合ポケットの３Ｄ構造による表現をコンピュータの記憶媒体に提供し、ここで、かかる３Ｄ構造による表示は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで利用可能であるかまたはその変異型である原子座標に由来し、その場合すべての重原子の座標ｘ、ｙおよびｚのｒ．ｍ．ｓ．偏差は１．０Å未満であり、かつ
ｂ）コンピュータを使用して構造に基づく薬剤設計技術を構造表現に適用する
工程を含む。
【００８０】
一実施形態では、構造に基づく薬剤設計には、ドッキング、例えば、限定されることなく、構造ライブラリーのメンバーのスクリーニングを行うドッキング工程の１つ以上の工程が含まれる。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある隣接するヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の両結合ポケットに障害を与えることができる低分子を同定するコンピュータによる方法に関し、かかる方法は、
ａ）ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートの表面にあるヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の結合ポケットの３Ｄ構造による表現をコンピュータの記憶媒体に提供し、ここで、かかる３Ｄ構造による表現は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで利用可能であるかまたはその変異型である原子座標に由来し、その場合すべての重原子の座標ｘ、ｙおよびｚのｒ．ｍ．ｓ．偏差は１．０Å未満であり、
ｂ）コンピュータを使用して構造に基づく薬剤設計技術を構造表現に適用し、
ｃ）前記構造に基づく薬剤設計技術によって同定された化合物を提供し、かつ
ｄ）前記化合物をＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある結合ポケットと接触させ、それらの相互作用を評価する
工程を含む。
【００８２】
別の実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートの表面にあるヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ１８の結合ポケットに障害を与えることのできる低分子、またはその断片もしくは変異型を同定する方法に関し、前記方法は、
ａ．ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに提示される原子座標、そこから誘導可能なデータで提示される原子座標、またはタンパク質骨格原子に対する平均二乗偏差平方根が１．０Å以下の原子座標を使用して、ポケットの空間構造をコンピュータ画面上で作製し、
ｂ．それらの空間構造を用いて可能性のある低分子をコンピュータ画面上で作製し、かつ
ｃ．一連の結合相互作用部位の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合できる低分子を選択する
工程を含む。
【００８３】
別の実施形態では、本発明は、プロセッサ、データ記憶システム、データ入力装置およびデータ出力装置を備えるプログラムしたコンピュータを使用して、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートの表面にあるヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の結合ポケットに障害を与えることのできる低分子、またはその断片もしくは変異型を同定する、コンピュータ利用による方法に関し、かかる方法は以下の工程を含む：
ａ．本発明による原子サブセットの原子座標を含むデータを、プログラムしたコンピュータに前記入力装置により入力し、これにより基準データセットを作製し、ここで、前記原子座標は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに提示される原子座標、そこから誘導可能なデータに提示される原子座標、またはタンパク質骨格原子に対する平均二乗偏差平方根が１．０Å以下の原子座標から選択され、
ｂ．前記プロセッサを使用して、基準データセットと、データ保存システムに保存されている低分子量有機化学構造およびペプチド断片のコンピュータデータベースとを比較し、かつ
ｃ．コンピュータの方法を使用して、基準データセットと構造的に相補性のある部分を有する化学構造を前記データベースから選択する。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、リガンドを同定する方法に関し、かかる方法は、
ａ．原子座標をコンピュータモデリングと併用して、可能性のあるリガンドを選択し、ここで、前記原子座標は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに提示される原子座標、そこから誘導可能なデータに提示される原子座標であり、またはタンパク質骨格原子に対する平均二乗偏差平方根が１．０Å以下の原子座標によってコンピュータモデリングで作製した一連の結合相互作用部位に可能性のあるリガンドをドッキングさせ、ＴＯＮＳＬの前記一連の結合相互作用部位の少なくとも１個のアミノ酸に結合することのできる、可能性のあるリガンドを選択することによって行い、
ｂ．前記可能性のあるリガンドおよび前記ＴＯＮＳＬを提供し、
ｃ．可能性のあるリガンドを前記ＴＯＮＳＬと接触させ、かつ
ｄ．前記可能性のあるリガンドとＴＯＮＳＬとの結合を検出する
工程を含む。
【００８５】
本発明の低分子または阻害剤を同定する方法の非限定的な実施例を下記の本明細書実施例１６に提供する。
【００８６】
ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲによる解析
ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲ製ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｓｕｉｔｅには、創薬および最適化の工程ごとに最新のサポートを提供するための総合的なプログラム一式が含まれている。これは、低分子阻害剤設計用の構造に基づくドッキングプログラムを代表する一種であるが、他のプログラムも使用可能と思われる。創薬の基本は、（１）ある標的タンパク質の機能に影響を与えるかまたは制御する、その標的タンパク質上の主要隣接ポケット（複数可）を見出すこと、および（２）かかる隣接ポケット（複数可）に対する結合親和性の高い共有結合した低分子を既知のデータベースで見出し、その後、置換基の付加／欠失を介して反復最適化を行う一方、形状、水素結合および静電気力の相補性を最大化するということにある。
【００８７】
結合ポケットを最も効果的に定義することができるのは、タンパク質−リガンド複合体の結晶構造が既知の場合である。この場合、ＧＬＩＤＥの高精度なアルゴリズムを適用してグリッドを計算した後、それを市販の低分子のハイスループットドッキングに使用する。このグリッドは、全親油性原子、全水素結合原子および水素結合の配向に占めるスコア、金属原子（タンパク質中に存在する場合）、電荷分布、ならびにファンデルワールス原子間相互作用など、結合表面の基本構成成分についての三次元空間情報を表す。確率の最も低い構成をフィルタリングし、見込みのあるリガンドのｐＨ依存的なさまざまなイオン化状態を考慮してくれるＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲのＬｉｇＰｒｅｐアプリケーションでリガンドの立体構造も予め計算する。
【００８８】
こうして表示された相互作用する２つの構成成分についてのドッキング計算は高精度であり、タンパク質構成成分内部で制御された柔軟性をさまざまに変えて、高度なスケールで実施可能である。次に、ドッキング後のＥｍｂｒａｃｅによる最小化およびＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲ  ｓｕｉｔｅのｐｒｉｍｅ  ＭＭ  ＧＢＳＡの利点を使用して、データベースからスクリーニングされたリガンドを有するタンパク質−リガンド複合体の順位付けを行うことができる。これらの手順から結合自由エネルギーの推定値が与えられるため、これらは計算された結合親和性に基づくリガンドの順位付けを行うための好適なツールである。
【００８９】
ＴＯＮＳＬ−Ｈ４尾部複合体の場合のように薬物−タンパク質複合体の結晶構造が不明の場合、タンパク質結合ポケット（複数可）および対応するグリッド（複数可）は、見込みのあるリガンド（複数可）が結合すれば、相互作用、例えば、ヒストンＨ４尾部上のアミノ酸残基Ｈ１８およびＫ２０などの相互作用、または上掲の任意の相互作用にとって最も重要側面を破壊するはずであると仮定することにより計算することができる。
【００９０】
この場合、ドッキンググリッド（複数可）は、個々に独立しているかまたは共有結合でつながっているこれらの２残基を取り込む空洞によって画定されるＴＯＮＳＬポケット（複数可）に対して計算される。この場合の競合低分子のスコアリング機能を、本来の結合の標的の場合と比較する。Ｒ基の導入／欠失を行い、それらの分子の親和性に対して得られる効果を等温滴定型熱量測定で計算することによって、同定された低分子リードの最適化を実現し、その後で、最も有望な候補の化学合成を行う。
【００９１】
Ｘ線による構造決定およびリガンド最適化という反復プロセスで見込みのある薬物候補を作製し、ＴＯＮＳＬ足場上のＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０のポケットを同時に標的とする、共有結合している最適化されたリガンドの同定を目標とする。
【００９２】
本発明による有効な化合物を得るための手段は、
１．インシリコでの構造の足場／座標およびインシリコでの標準の結合／スコアリングアルゴリズムの使用によって、本明細書に開示するＴＯＮＳＬ／Ｈ４結晶構造に対する結合親和性の高い分子を決定すること、
２．薬物様化合物を表示するために、かかる低分子構造（Ｒ置換を有する）をインシリコで修飾すること、
３．そのような構造を標準化学により合成すること、
４．得られた合成構造を本発明のアッセイで試験すること、
５．最も有望な化合物を選択し、修飾して最適化を行うこと
である。
【００９３】
この方法の代替となるのは、それぞれのアッセイで既存のライブラリーのスクリーニングを行い、任意選択で、記載の空間で結合するようこれらを最適化することである。
【００９４】
したがって、一実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートの表面にあるヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の結合ポケットに障害を与えることのできる低分子を選択または設計する方法に関し、前記方法は、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに含有される原子座標データまたはそこから誘導可能なデータの少なくとも一部を使用することを含み、ここで、前記方法では、コンピュータモデリングパッケージまたはコンピュータプログラムを使用して、Ｈ３（５７〜１３５）およびＨ４と複合体をなすＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの構造の全部または一部のモデリングを行い、モデリングした構造のＨ４尾部とＴＯＮＳＬのアンキリンリピートとを阻止または破壊する能力の可能性に基づいてそのような低分子の同定を行う。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、融合タンパク質であるＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（配列番号１５）またはその変異型（例えば、Ｇｘリンカー＝Ｇ１２、Ｇ１１、Ｇ１０、Ｇ９、Ｇ８、Ｇ７、Ｇ６、またはＧ５）に関し、これらは、ＴＯＮＳＬ結合低分子阻害剤の構造詳細を決定するために有益である。
【００９６】
別の実施形態では、本発明は、ＴＯＮＬＳおよびＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとヒストンＨ４との相互作用を破壊する、ＴＯＮＳＬおよびＨ４の変異体に関する（図１０〜１３、実施例２〜４）。変異体データから、複合体形成の特異性および安定性に寄与する主要な分子間相互作用が同定される。検証されたＴＯＮＳＬのヒストン結合変異体は、ＴＯＮＳＬ−ヒストン相互作用およびＴＯＮＳＬ機能の遮断におけるスクリーニングされた低分子阻害剤の有効性を評価する生化学アッセイおよびバイオアッセイの設計にとって有益である。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、３−［（３−アミノシクロペンチル）カルボニル］−１Ｈ−キノリン−４−オンのコアを有する化合物に関する。そのような化合物は任意の化合物であってよく、好ましくは、１つ以上の位置が置換基で置換され得る、３−［（３−アミノシクロペンチル）カルボニル］−１Ｈ−キノリン−４−オンを含む任意の低分子有機化合物であってよい。したがって、化合物は、１つ以上の−Ｈが別の基で置換されている３−［（３−アミノシクロペンチル）カルボニル］−１Ｈ−キノリン−４−オンであってよい。
【００９８】
ＴＯＮＳＬのペプチド阻害剤
本発明はまた、ＴＯＮＳＬ阻害剤、特に、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４への結合を阻害できるような阻害剤も提供する。好ましい実施形態では、阻害剤は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面と結合する化合物であってよい。
【００９９】
そのような阻害剤を同定する方法は、本明細書の他の箇所に記載がある。
【０１００】
阻害剤は、例えば、ペプチド阻害剤または低分子など、有用な任意の化合物であってよい。本発明の一実施形態では、阻害剤はペプチド阻害剤である。ペプチド阻害剤は、例えば、癌治療において有用であり得る。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「ペプチド阻害剤」は、ペプチドまたは任意選択でコンジュゲートコンジュゲート部分に結合しているポリペプチドを含む化合物を指す。以下、ペプチド阻害剤のペプチドまたはポリペプチド部分を「ペプチド」と呼ぶ。
【０１０２】
したがって、ペプチド阻害剤は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤと結合することができるペプチドであってよい。したがって、ペプチド阻害剤は、本明細書で以下に記載するいずれのペプチドであってもよく、ここで、前記ペプチドは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（例えば、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるペプチド）に結合することができ、Ｋｄは高くても１０μＭ、好ましくは、Ｋｄは高くても５μＭ、例えば、高くても３μＭのＫｄである。前記Ｋｄは、例えば、下記実施例１０および１５に記載のように決定してよい。一実施形態では、ペプチドは、配列モチーフＩ：Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ（配列番号２６）を含んでよく、ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸であってよい。一実施形態では、ペプチドは、配列モチーフＩＩ：Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号２７）を含んでよく、ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸であってよい。一実施形態では、ペプチドは、配列モチーフＩＩＩ：Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含んでよい。一実施形態では、ペプチドは、配列モチーフＩＶ：Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号２８）を含んでよく、ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸であってよい。
【０１０３】
特に、ペプチドは、配列Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ、および／または配列モチーフＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの１つ以上を含む４〜４０個の範囲のアミノ酸からなるペプチドであってよい。ペプチドは、配列Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｌｙｓ、および／または配列モチーフＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの１つ以上を含む、４〜２５個の範囲のアミノ酸、例えば４〜１５個の範囲のアミノ酸、好ましくは、７〜１５個の範囲のアミノ酸、例えば７〜１２個の範囲のアミノ酸、例えば４〜１０個の範囲のアミノ酸、例えば６〜９個の範囲のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。ペプチドは、最大で２５個のアミノ酸、好ましくは、最大で１５個のアミノ酸、例えば最大で１２個のアミノ酸、例えば最大で個のアミノ酸からなるペプチドであってもよく、ここで、かかるペプチドは、配列モチーフＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの１つ以上を含む。前記Ｌｙｓは、好ましくは、メチル化されていない。前記Ｘａａは、任意のアミノ酸であってよく、例えば、ＡｌａおよびＡｒｇからなる群から選択されてよい。本発明の一実施形態では、ＸａａはＡｒｇではない。一実施形態では、ペプチドは、
Ｉ．配列番号２３のアミノ酸１２〜２３または配列番号３４のアミノ酸１２〜２３からなる配列、または
ＩＩ．その機能性ホモログであり、配列番号２３のアミノ酸１２〜２３または配列番号３４のアミノ酸１２〜２３の配列からなるもの（ただし、最高５個のアミノ酸、例えば最高４個のアミノ酸、例えば最高３個のアミノ酸、例えば最高２個のアミノ酸、例えば１個のアミノ酸が置換されてよく、前記ペプチドは、配列番号２３または配列番号３４の、少なくともＡｒｇ１７、Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０を含む）、
ＩＩＩ．その機能性ホモログであり、配列番号２３のアミノ酸１２〜２３の配列からなるもの（ただし、最高６個のアミノ酸、例えば最高５個のアミノ酸、例えば最高４個のアミノ酸、例えば最高３個のアミノ酸、例えば最高２個のアミノ酸が置換されてよい）
を含むかまたは構成要素とするが、阻害剤は配列番号２３のヒストンＨ４とは異なる。
【０１０４】
一実施形態では、ペプチドは、
ＩＶ．配列番号２３のアミノ酸９〜２５または配列番号３４のアミノ酸９〜２５からなる配列、または
Ｖ．その機能性ホモログであり、配列番号２３のアミノ酸９〜２５または配列番号３４のアミノ酸９〜２５の配列からなるもの（ただし、最高５個のアミノ酸、例えば最高４個のアミノ酸、例えば最高３個のアミノ酸、例えば最高２個のアミノ酸、例えば１個のアミノ酸が置換されてよく、前記ペプチドは、配列番号２３または配列番号３４の、少なくともＡｒｇ１７、Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０を含む）、
ＶＩ．その機能性ホモログであり、配列番号２３のアミノ酸９〜２５または配列番号３４のアミノ酸９〜２５の配列からなるもの（ただし、最高６個のアミノ酸、例えば最高５個のアミノ酸、例えば最高４個のアミノ酸、例えば最高３個のアミノ酸、例えば最高２個のアミノ酸が置換されてよい）
を含むかまたは構成要素とするが、阻害剤は配列番号２３のヒストンＨ４とは異なる。
【０１０５】
一実施形態では、ペプチドは、
ＶＩＩ．配列番号２３のアミノ酸１４〜３３または配列番号３４のアミノ酸１４〜３３からなる配列、または
ＶＩＩＩ．その機能性ホモログであり、配列番号２３のアミノ酸１４〜３３または配列番号３４のアミノ酸１４〜３３の配列からなるもの（ただし、最高５個のアミノ酸、例えば最高４個のアミノ酸、例えば最高３個のアミノ酸、例えば最高２個のアミノ酸、例えば１個のアミノ酸が置換されてよく、前記ペプチドは、配列番号２３の少なくともＡｒｇ１７、Ｈｉｓ１８およびＬｙｓ２０を含む）、
ＩＸ．その機能性ホモログであり、配列番号２３のアミノ酸１４〜３３または配列番号３４のアミノ酸１４〜３３の配列からなるもの（ただし、最高６個のアミノ酸、例えば最高５個のアミノ酸、例えば最高４個のアミノ酸、例えば最高３個のアミノ酸、例えば最高２個のアミノ酸が置換されてよい）
を含むかまたは構成要素とするが、阻害剤は配列番号２３のヒストンＨ４とは異なる。
【０１０６】
ペプチドが、本明細書の上記ＩＩＩ．、ＶＩ．またはＩＸに記載のような機能性ホモログを含む本発明の実施形態では、
Ｉ．配列番号２３のアミノ酸１７または配列番号３４のアミノ酸１７に相当するアミノ酸は、正電荷を持つアミノ酸のような電荷を持つアミノ酸であり、例えば、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群から選択されるアミノ酸であること、
ＩＩ．配列番号２３のアミノ酸１８または配列番号３４のアミノ酸１８に相当するアミノ酸は、正電荷を持つアミノ酸のような電荷を持つアミノ酸、例えばＨｉｓであること、
ＩＩＩ．配列番号２３のアミノ酸２０または配列番号３４のアミノ酸２０に相当するアミノ酸は、正電荷を持つアミノ酸のような電荷を持つアミノ酸であり、例えば、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群から選択されるアミノ酸であること
が好ましい場合がある。
【０１０７】
一実施形態では、ペプチド阻害剤の同定は、配列番号２３のヒストンＨ４の配列またはその断片に基づいて、すなわち、Ｈ４ペプチドの１つ以上のアミノ酸、またはＨ４天然ペプチドの特定部分を、他のアミノ酸で体系的または無作為に置換することにより行ってよい。
【０１０８】
一般にペプチド阻害剤は大きすぎてはならない。したがって、ペプチドは、最大で４０個のアミノ酸、例えば最大で２５個のアミノ酸、例えば最大で２０個のアミノ酸、例えば最大で１５個のアミノ酸、例えば最大で１２個のアミノ酸からなることが好ましい場合がある。例えば、ペプチドは、配列番号２３の４個〜４０個の範囲、例えば４個〜２５個の範囲、例えば４個〜２０個の範囲、例えば４個〜１５個の範囲、例えば４個〜１２個の範囲、例えば７〜１５個の範囲のアミノ酸、例えば７〜１２個の範囲のアミノ酸、例えば５個〜１０個の範囲または例えば６個〜９個の範囲の連続するアミノ酸を含むかまたは構成要素としてよい。
【０１０９】
一実施形態では、ペプチドは、配列番号２３の４個〜４０個の範囲、例えば４個〜２５個の範囲、例えば４個〜２０個の範囲、例えば４個〜１５個の範囲、例えば４個〜１２個の範囲、例えば７〜１５個の範囲のアミノ酸、例えば７〜１２個の範囲のアミノ酸、例えば５個〜１０個の範囲または例えば６個〜９個の範囲の連続するアミノ酸を含むかまたは構成要素としてよく、ここで、最高３個、例えば最高２個、例えば最大で１個のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されていてよく、ペプチドは、配列モチーフＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの１つ以上を含む。
【０１１０】
配列番号２３の断片の前記機能性ホモログは、好ましくはペプチドであり、上記で定義した配列を含み、ＴＯＮＳＬと結合することができる。
【０１１１】
上記のように、ペプチドは、１つ以上のＬｙｓ残基を含んでよい。少なくとも１つのＬｙｓ残基、例えばすべてのＬｙｓ残基がメチル化されていないことが好ましい場合がある。特に、ペプチドが配列番号２３の断片を含む場合、配列番号２３のＬｙｓ２０に対応するアミノ酸はメチル化されていないことが好ましい場合がある。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドのＣ末端はアミド化されている、すなわち、化学構造−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を有する。
【０１１３】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドのＣ末端はアルキル化、例えばメチル化されている、すなわち、化学構造−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３を有する。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドのＮ末端はアセチル化されている、すなわち、化学構造ＣＨ３Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−を有する。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドのＮ末端はホルミル化されている、すなわち、化学構造ＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−を有する。
【０１１６】
所与の配列からなるペプチドは、アミド化またはアルキル化されたＣ末端および／またはアセチル化またはホルミル化されたＮ末端を有し得ると理解される。
【０１１７】
ペプチド阻害剤は、具体的に、
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２、
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２、
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２、および
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２からなる群から選択されるペプチドを含むかまたは構成要素とするペプチドであってよい。
【０１１８】
上記配列で示されている「−ＮＨ２」という部分は、ペプチドのＣ末端がアミド化されていることを指す。しかし、本発明には、アミド化されていないペプチドも包含される。したがって、一実施形態では、本発明は、最大で４０個、例えば最大で２５個、例えば最大で２０個、例えば最大で１５個、例えば最大で１２個のアミノ酸を含むかまたは構成要素とするペプチド阻害剤に関し、ここで、かかるペプチドは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択される配列を含む。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチド、例えば、本明細書で以下の「ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチド」の項に記載のＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドのいずれかである。例えば、ペプチドは、配列番号１７の、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の各ポリペプチドからなる群から選択されてよい。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＯＮＳＬの断片であり、詳しくは、ヒストンＨ４と結合することができるが、ＴＯＮＳＬの他の結合パートナーの少なくとも１つと結合することができない、例えば、ＭＭＳ２２Ｌと結合することができないＴＯＮＳＬの断片である。前記ＴＯＮＳＬの断片は、例えば、ＴＯＮＳＬのＨ４尾部結合表面を含む断片であってよい。一実施形態では、断片は、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２またはその機能性ホモログを含むかまたは構成要素とし、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を共有する。
【０１２１】
本明細書に記載するペプチドは、実施形態によっては、コンジュゲート部分に連結されてよく、例えば、ペプチドは、コンジュゲート部分に共有結合で連結されてよい。前記コンジュゲート部分は、例えば、本明細書で以下に記載する部分のいずれかであってよい。
【０１２２】
一実施形態では、コンジュゲート部分は、ペプチド、糖、脂質、高分子、またはペプチドに共有結合で連結可能な他の任意の化学基であってよい。例えば、コンジュゲート部分は、ペプチドの物性、例えば、その溶解度、安定性または半減期を改善し得る。
【０１２３】
一実施形態では、コンジュゲート部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような高分子である。高分子は、修飾ＰＥＧ、例えばＮＰＥＧであってもよい。
【０１２４】
本発明の低分子を確認するアッセイ
本発明にしたがって同定された分子を、下掲の生化学的アッセイおよび細胞生物学アッセイで試験する。これらのアッセイにおいてＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体と同様のＴＯＮＳＬ機能阻害に対する活性を示す分子を、癌細胞殺傷の有効性についてハイスループットバイオアッセイでさらに試験し、最終的に、前臨床試験および臨床試験を行う。
【０１２５】
生化学的スクリーニングおよび生物物理学的試験（アッセイ）
アッセイの主な構成要素は、以下の通りである。
ａ）組換え型ヒトＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（残基５１２〜６９２、ポイント１）、
ｂ）組換え型ヒトＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体Ｅ５３０Ａ、Ｄ５５９Ａ、Ｗ５６３Ａ、Ｅ５６８Ａ、Ｎ５７１Ａ、Ｄ６０４Ａ（ポイント２）、
ｃ）蛍光分子またはビオチンに結合させた、Ｋ１６にアセチル化を含むまたは含まない、Ｋ２０ｍｅ０含有ヒストンＨ４ペプチド（ＴＯＮＳＬ結合に重要な残基、例えば９〜２５または１４〜３３を含むＨ４尾部）、
ｄ）蛍光分子またはビオチンに結合させた、Ｋ１６にアセチル化を含むまたは含まない、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤに結合しない対照としてのＫ２０ｍｅ２含有ヒストンＨ４ペプチド（ＴＯＮＳＬ結合に重要な残基、例えば９〜２５または１４〜３３を含むＨ４尾部）、
ｅ）タグ標識したＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの野生型（ＷＴ）またはヒストン結合変異体（例えば、本明細書の「ＴＯＮＳＬ変異体ポリペプチド」の項に記載される任意の変異体、例えば、Ｅ５３０Ａ、Ｄ５５９Ａ、Ｗ５６３Ａ、Ｅ５６８Ａ、Ｎ５７１Ａ、またはＤ６０４Ａのいずれか）を発現しているヒト細胞。
我々は、変異体のＧＦＰ融合タンパク質発現構成体ならびにＷＴ、Ｅ５６８ＡおよびＮ５７１Ａの誘導可能な細胞株を作製し、検証を行った。
【０１２６】
アッセイ１：ポイント２に詳述される低分子依存性のＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−Ｈ４尾部相互作用破壊のハイスループット（ＨＴ）測定。
最初に行うスクリーニングは、蛍光プローブをコンジュゲートさせたヒストンＨ４ペプチドを使用する蛍光異方性測定に基づいてよい。アッセイ条件は、以下で我々が示したＩＴＣアッセイ（実施例２）に詳述されるとおりであり、ＡＲＤ結合はＨ４（残基９〜２５）に対しては観察されるが、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２（残基９〜２５、Ｋ２０でジメチル化されている）には観察されないという重要な基準を設けた（図１３）。
【０１２７】
アッセイ２：低分子阻害剤のＡＲＤに対する結合特性の測定
第２に行うスクリーニングでは、結合親和性／会合定数（Ｋａ）を決定する等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）および速度定数を決定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用してよい。得られる分子のうち、非修飾ヒストンＨ４ペプチドよりもＴＯＮＳＬに対する結合親和性が高い分子（実施例２）をさらに簡単な一覧にし、有効範囲がμＭ〜ｎＭにあるものを同定する。
【０１２８】
アッセイ３．結晶化および最適化
候補低分子はＴＯＮＳＬ  ＡＲＤと共に結晶化され（実施例１のポイント１に概説した、我々の示す結晶化条件を使用）、薬物を最適化するためのさらなる可能性が提供され得る。
【０１２９】
アッセイ４．ペプチドプルダウンに基づく競合アッセイ
ａ．Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０ペプチドに対する組換え型ＡＲＤの結合を抑制する能力が選択された低分子にあるか確認する（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２およびＡＲＤ変異体を陰性対照として使用し、アッセイ条件は実施例３に記載の通り）。
ｂ．細胞抽出物において、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０ペプチドに対するＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌの結合を抑制する能力が選択された低分子にあるか確認する。
【０１３０】
タグ標識したＴＯＮＳＬ  ＷＴまたはＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体を発現している細胞を増殖させる（ヒストンＨ４を結合していない対照用）。標準プロトコルにしたがって全細胞抽出物を調製する（実施例４における本アッセイの記載条件）。細胞抽出物を表面結合ビオチン化ヒストンＨ４ペプチドと共にインキュベートする（例えば、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０とＷＴ  ＴＯＮＳＬに結合しない対照としてＨ４Ｋ２０ｍｅ２とを対比）。低分子阻害剤を用いた用量反応分析を行い、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０ペプチドに対するＷＴ  ＴＯＮＳＬ結合の消失をＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法または類似の手法によって評価する。
【０１３１】
低分子阻害剤についてスクリーニングするＨＴバイオアッセイ
本願発明者らは、ＴＯＮＳＬが、ヌクレオソームのＫ２０がメチル化されていないヒストンＨ４尾部をＡＲＤが認識することによってクロマチンに結合することを実証した（図２１）。したがって、低分子阻害剤の生物学的機能は、ＴＯＮＳＬとヒストンＨ４との結合を防ぎ、ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ複合体をクロマチンから離すことである。
【０１３２】
本願発明者らは、ハイコンテント顕微鏡を用いるアッセイを複数開発しており、それらは薬物スクリーニングに使用される（実施例５）。
１）内在性ＴＯＮＳＬの免疫蛍光染色は、複製後クロマチンへの結合を示し、これはＲＮＡｉでＴＯＮＳＬを枯渇させると消失する（図２０）。
２）ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのクロマチンへの結合は、Ｈ４結合を破壊するＡＲＤ変異体により破壊される（図２１）。
【０１３３】
本発明は、ＴＯＮＳＬおよびＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ複合体を複製後クロマチンから離し、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体を模倣する低分子阻害剤を包含する。
主要構成成分：
ａ）抗ＴＯＮＳＬ抗体（Ｓｉｇｍａ製、参照番号ＨＰＡ０２４４６７９）、我々のハイコンテントアッセイで試験（実施例５）
ｂ）可溶性ＴＯＮＳＬを除去するための予備抽出条件（実施例５）
ｃ）ＴＯＮＳＬ枯渇（陰性対照）の条件（実施例５）
ｄ）ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴおよびＡＲＤ変異体の細胞株
ＨＴアッセイの根拠：
１．内在性ＴＯＮＳＬおよびＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ複合体をクロマチンから除去する低分子を同定するハイコンテントイメージング（図２１）
２．ハイコンテントイメージングによる、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴおよびＡＲＤ変異体（Ｎ５７１Ａ、ポイント２）を発現している細胞を使用してＴＯＮＳＬ阻害剤とインキュベーションを行った際の、クロマチンに結合するＴＯＮＳＬのハイコンテントイメージング
【０１３４】
アッセイ１：クロマチンに結合した内在性ＴＯＮＳＬのＨＴイメージング
細胞をＨＴフォーマット（９６または３８４ウェル−プレート）で増殖させる。用量反応および経時的構成で低分子ＴＯＮＳＬ阻害剤と共にインキュベートする。細胞予備抽出によって可溶性タンパク質を除去した後、標準プロトコルにしたがって細胞を固定する。我々によって特異性が立証されている市販抗体（Ｓｉｇｍａ製、参照番号ＨＰＡ０２４４６７９）を用いてクロマチンに結合したＴＯＮＳＬを検出する（実施例５）。ＴＯＮＳＬ  ｓｉＲＮＡを対照として使用する。クロマチンに結合したＴＯＮＳＬは、従来の方法によって、例えば標準のハイコンテントイメージングを使用して（実施例５）定量するか、または別法としてＦＡＣＳ解析によって定量してよい。
【０１３５】
アッセイ２：ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのＨＴイメージング
ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのＷＴおよびＡＲＤ変異体（Ｎ５７１Ａ、ポイント２：結合についての陰性対照）を発現する細胞をＨＴフォーマット（９６または３８４ウェル−プレート）で増殖させる。低分子ＴＯＮＳＬ阻害剤と共に用量反応および経時的構成でインキュベートする。予備抽出細胞によって可溶性タンパク質を除去し、標準プロトコルにしたがって細胞を固定する。標準的なハイコンテントイメージングによってクロマチン上のＧＦＰ−ＴＯＮＳＬレベルを定量化する（実施例５）。
【０１３６】
ＨＲ阻害を測定するバイオアッセイ
ＴＯＮＳＬは障害のある複製フォークおよびＤＮＡ二本鎖切断のＨＲに必要である（Ｄｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０：６１９；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  ４０：６１９；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０：６４５；Ｐｉｗｋｏ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０１０  ２９：４２１０）。したがって、クロマチンへのＴＯＮＳＬまたはＭＭＳ２２Ｌの動員を妨げる低分子阻害剤はＴＯＮＳＬまたはＭＭＳ２２Ｌの消失を表現型模写する。
【０１３７】
低分子阻害剤がＨＲを低下させる能力を試験するため、修復タンパク質の動員を監視するための公開済みアッセイ（例えば、Ｄｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０：６１９；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  ４０：６１９；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０：６４５；Ｐｉｗｋｏ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０１０  ２９：４２１０）およびＨＲレポーター細胞株を使用する（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：２６３３，１９９９）。それらのアッセイでは、低分子ＴＯＮＳＬ阻害剤を用いて経時的かつ用量依存的方法で細胞を処理し、ハイコンテント顕微鏡によってＨＲ修復の有効性を評価する。
【０１３８】
ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチド
一実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドに関する。前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは好ましくはＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドであり、ヒストンＨ４と結合することができないが、他のＴＯＮＳＬ機能は保持している。好ましくは、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、ＭＭＳ２２Ｌと結合することができ、ここで、前記ＴＯＮＳＬ変異体はヒストンＨ４と結合しない。そのようなＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドはドミナントネガティブ変異体として機能するであろう。その理由は、それらは、ＭＭＳ２２Ｌおよび複合体の他のメンバーと、好ましくは野生型ＴＯＮＳＬポリペプチドと同一または同様の親和性で結合することになるが、複製後クロマチンに対しては何ら大きな程度で結合することはないからである。
【０１３９】
一実施形態では、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、１つ以上の変異、好ましくは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部結合表面に寄与するアミノ酸（複数可）の１つ以上の変異がある配列番号１６のポリペプチドである。したがって、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４尾部結合表面のアミノ酸に少なくとも１つの変異を含んでよく、ここで、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、前記変異を除いては配列番号１６と同一であるかまたは配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を共有し、ＭＭＳ２２Ｌと結合することができ、ヒストンＨ４と結合しない。特に前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸番号５２７、５２８、５３０、５５９、５６０、５６１、５６３、５６８、５７１、５７２、５９５、５９７、６０４、６０７、６０８、６４１、６４５および６４９からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸に変異がある、配列番号１６のポリペプチドであってよい。
【０１４０】
一実施形態では、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、配列番号１６のＧｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９、Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ｇｌｎ５７１およびＤ６０４からなる群から選択されるアミノ酸の１つ以上に変異がある。
【０１４１】
一実施形態ではＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択される配列を含むかまたは構成要素とする。
【０１４２】
ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドはコンジュゲート部分に連結されてよく、例えば、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは検出可能マーカーに連結されてよい。前記検出可能マーカーは、ペプチドまたはポリペプチド、例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質であってよい。
【０１４３】
ＴＯＮＳＬの阻害による効果を予測する方法
本発明はまた、ＴＯＮＳＬの阻害による効果を予測する方法も提供する。本明細書でこれまでに記載したように、本明細書に記載のＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、ドミナントネガティブ変異体であってよい。そのような変異体の発現は、ＴＯＮＳＬ／ＭＭＳ２２Ｌの枯渇を表現型模写し得るため、ヒストンＨ４へのＴＯＮＳＬ結合の阻害剤の作用を模倣し得る。
【０１４４】
したがって、一実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬの阻害による効果を予測する方法に関し、前記方法は、
ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドを生物および／または生物の細胞に発現させ、ここで、前記ポリペプチドを任意選択で条件付き発現させ、
前記生物および／または細胞における前記ポリペプチドの効果を決定し、
ここで、前記生物および／または細胞における前記ポリペプチドの発現の前記効果が、前記生物および／または細胞におけるＴＯＮＳＬ阻害の効果を示す
工程を含む。特に、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、本明細書の上記「ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチド」の項に記載のＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドのいずれであってもよい。生物および／または細胞は、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドのいずれかをコードする異種核酸を含んでよい。したがって、ドミナントネガティブのＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドの発現後に得られる効果は、前記生物および／または細胞におけるＴＯＮＳＬ阻害による効果を模倣し得る。したがって、観察される効果は、生物／細胞をＴＯＮＳＬ阻害剤、特に、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとヒストンＨ４間の結合を阻害する阻害剤で処置した場合に得られることが期待される効果を示す。
【０１４５】
生物または細胞は疾患モデルを表してよく、したがって、かかる方法を使用して、前記疾患をＴＯＮＳＬ阻害剤、例えば、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとヒストンＨ４間の結合を阻害する阻害剤で処置する有効性を予測してよい。生物は、任意の生物、例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラットまたは、ウサギであってよい。生物は、特定の疾患、例えば癌にかかるよう遺伝子組換えを行ってよい。したがって、生物は、癌にかかるよう遺伝子操作されたマウスであってよい。
【０１４６】
細胞もまた疾患モデルを表してよい。細胞は、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞といった任意の細胞であってよい。細胞は、従来の任意の方法を使用して培養してよい。例えば、生体内により近い状態を模倣し得る三次元培養で細胞を培養してよい。
【０１４７】
ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドの発現は細胞に対して毒性があるため、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドを条件付きでのみ発現させることが好ましい場合がある。したがって、ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、前記生物の特定細胞でのみ発現させてよく、かつ／または前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドは、特定時期に発現するよう誘導され得る。したがって、生物および／または細胞は、誘導可能なプロモーターに機能的に連結された、本明細書で上記「ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチド」の項に記載するＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドのいずれかをコードする異種核酸を含んでよい。そのようにすることにより、どの特定時間においても前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドの発現が誘導され得る。誘導可能なプロモーターは当技術分野において周知であり、当業者は有用プロモーターの選択ができるであろう。生物は、一部の細胞型にのみ発現を導くプロモーターに機能的に連結された、前記ＴＯＮＳＬ変異ポリペプチドのいずれかをコードする異種核酸を含んでよい。そのようなプロモーターもまた当技術分野で公知である。
【０１４８】
ＴＯＮＳＬ阻害効果を決定する方法
本発明はまた、推定ＴＯＮＳＬ阻害剤のＴＯＮＳＬ阻害効果を同定する方法も提供する。特に、前記方法を使用して、化合物がＴＯＮＳＬとヒストンＨ４間の結合を阻害することができるか否かを決定できる。そのような方法は、ＴＯＮＳＬ阻害剤のスクリーニングにとって有用である。しかし、かかる方法は、推定阻害剤が実際にＴＯＮＳＬを阻害できるか否かの確認にとっても有用である。したがって、かかる方法を使用して、既知のＴＯＮＳＬ阻害剤と、類似化合物、すなわち推定ＴＯＮＳＬ阻害剤との生物学的類似性を判定することができる。また、かかる方法をＴＯＮＳＬ阻害剤の品質管理に使用してもよい。かかる方法はまた、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４、ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂとしてＰＤＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋで提供の原子座標を使用するコンピュータ支援技術によって同定された阻害剤の阻害効果を確認するためにも使用され得る。
【０１４９】
前記方法は、
ａ）被験化合物、すなわち推定ＴＯＮＳＬ阻害剤を提供し、
ｂ）配列番号１６のＴＯＮＳＬ、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、または配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する前述のＴＯＮＳＬまたはＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの任意の機能性ホモログを発現している宿主生物を提供し、
ｃ）前記宿主生物を前記推定阻害剤と接触させ、
ｄ）前記宿主生物においてクロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログを検出する工程を含んでよく、
ここで、クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはその機能性ホモログの低下は前記被験化合物がＴＯＮＳＬ阻害剤であることを示す。
【０１５０】
クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはその機能性ホモログの前記低下は、好ましくは、前記阻害剤の非存在下における前記宿主生物中の前記レベルと比較した場合の低下である。特に、前記低下は、前記阻害剤の非存在下における前記宿主生物中のクロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはその機能性ホモログが、５０％未満に低下すること、例えば３０％未満に低下すること、例えば２０％未満に低下すること、例えば、１０％未満に低下することであってよい。一実施形態では、低下は、検出可能な、クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、またはその機能性ホモログがないことである。
【０１５１】
宿主生物は、細胞、例えば、組織培養中に維持された哺乳類細胞など、有用な任意の宿主生物であってよい。したがって、用語「宿主生物の細胞」は、宿主生物が細胞である場合、多細胞宿主生物の一部を指し得るか、または宿主生物それ自体を指し得る。宿主生物はＴＯＮＳＬを内因的に発現してよく、その場合、方法では、クロマチンと会合した内在性ＴＯＮＳＬの検出が行われ得る。内在性ＴＯＮＳＬはさまざまな手段によって検出され得るが、多くの場合、抗体、抗体の結合断片、またはＴＯＮＳＬを特異的に認識し結合する別の結合分子を手段として内在性ＴＯＮＳＬを検出する。抗体、断片または結合分子は、検出可能な標識を用いて直接標識化され得る。方法は、第１の抗体、断片または結合分子と結合する、第２の抗体、断片または結合分子を使用して行うことも可能であり、ここで、第２の抗体、断片または結合分子は検出可能な標識を用いて標識化される。抗体、断片または結合分子の結合を検出する他の方法も利用可能であり、それらの方法をかかる方法と共に使用してよい。
【０１５２】
検出可能な標識は、フルオロフォア、生物発光体、化学発光体、色素、酵素、重金属、または放射性化合物が含まれるが、これらに限定されない検出可能な任意の標識であってよい。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、すなわち、蛍光部分である。
【０１５３】
前記宿主生物は、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログをコードする異種核酸を含み、これも本発明内に含まれる。そのような実施形態では、方法では、クロマチンと会合した、異種のＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログの検出を行ってよい。異種のＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログは、検出可能な標識、例えば、ＧＦＰなどの蛍光ポリペプチドに連結されてよい。したがって、検出工程は、検出可能な標識を検出する工程であってよい。異種のＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログは、内在性ＴＯＮＳＬの検出に有用な同一の方法を使用して検出してもよい。
【０１５４】
検出可能な標識は、特定の検出可能標識の検出に有用な任意の技術的手段を使用して検出してよい。本発明の実施形態では、検出可能標識が蛍光である場合は、その検出可能標識を、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法またはハイコンテント顕微鏡法という手段によって検出してよい。
【０１５５】
方法の工程ｄ）には、前記宿主生物の細胞から可溶性タンパク質を抽出する工程を含んでよい。この工程により、クロマチンと会合していないＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログを前記宿主生物の細胞から抽出することが確実に行われ得る。可溶性タンパク質の抽出後、残存するすべてのＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログは、クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログであると考えてよい。
【０１５６】
可溶性タンパク質の抽出は、従来の任意の方法で、例えば、細胞膜の透過処理により、例えば、界面活性剤を使用し、その後、任意選択で１回または複数回の洗浄工程を行うことによって実施してよい。透過処理には任意の界面活性剤を使用してよく、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ＮＰ−４０、サポニン、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、ジギトニンまたはＬｅｕｃｏｐｅｒｍを使用してよい。抽出後、検出に先立ち細胞を固定してよい。固定試薬は当技術分野において周知であり、それらには、例えばアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドが挙げられる。
【０１５７】
クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログを測定する有用な方法の一つは本明細書の実施例５に記載されている。クロマチンと会合したＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログを測定する他の有用な方法は、「癌細胞殺傷における低分子阻害剤の有効性を調べるためのハイスループット（ＨＴ）バイオアッセイ」の項、例えば、同項のアッセイ１および２に記載がある。ＴＯＮＳＬ阻害効果を決定する方法は、本明細書の「本発明の低分子を確認するアッセイ」の項に記載の任意の方法、例えばアッセイ１、２、３または４のいずれに記載の方法であってもよい。したがって、これらの方法は、低分子の確認用に使用され得るだけではなく、ある化合物のＴＯＮＳＬ阻害効果を決定するために一般に使用可能である。
【０１５８】
一実施形態では、方法は、
ａ）配列番号２３の少なくともアミノ酸１７〜２０、例えば少なくともアミノ酸１２〜２３など、例えば少なくともアミノ酸９〜２５、例えば少なくともアミノ酸１４〜３３を含むヒストンＨ４またはその断片を提供し、ここで、前記ヒストンＨ４またはその断片は任意選択で検出可能な標識に連結されてよく、
ｂ）配列番号１６のＴＯＮＳＬ、配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２からなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたは配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する前述のＴＯＮＳＬまたはＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの任意の機能性ホモログを提供し、
ｃ）前記ヒストンＨ４またはその断片を、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログと共に推定ＴＯＮＳＬ阻害剤の存在下でインキュベートし、
ｄ）前記ヒストンＨ４またはその断片と、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログとの結合の有無を測定する
工程を含み、
ここで、前記ヒストンＨ４またはその断片と、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログとの結合の低下は、前記推定ＴＯＮＳＬ阻害剤はＴＯＮＳＬを阻害できることを示す。
【０１５９】
前記結合低下は、特に、前記推定阻害剤の非存在下で観察される、前記ヒストンＨ４またはその断片と、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたはその機能性ホモログとの結合の最大でも５０％の低下、例えば３０％未満の低下など、例えば２０％未満の低下など、例えば、１０％未満の低下であってよい。一実施形態では、低下は、前記ヒストンＨ４またはその断片と、前記ＴＯＮＳＬ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤまたは、その機能性ホモログとの間に検出可能な結合がないことである。
【０１６０】
癌細胞殺傷における低分子阻害剤の有効性を調べるためのハイスループット（ＨＴ）バイオアッセイ
ＴＯＮＳＬの消失は、複製に伴うＤＮＡ損傷の蓄積をもたらし、細胞をカンプトテシン（ＣＰＴ）誘導性のＤＮＡ損傷に対して感受性にする（Ｄｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０：６１９；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  ４０：６１９；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０：６４５；Ｐｉｗｋｏ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０１０  ２９：４２１０）。さらに、ＨＲの消失により細胞がＰＡＲＰ阻害に対して感受性になることが十分に立証されている。したがって、予測されることは、ＴＯＮＳＬ阻害は、単独でもＣＰＴ様薬もしくはＰＡＲＰ阻害薬との併用でも、癌細胞にとって毒性であろうということである。
【０１６１】
主要構成成分：
ａ）癌細胞株および初代細胞のパネル
ｂ）カンプトテシン、ＰＡＲＰ阻害薬、ＤＮＡ複製を標的とする従来の化学療法薬
ＨＴアッセイの根拠：
ｉ．癌細胞株および初代細胞のパネルのスクリーニングによってＴＯＮＳＬ阻害剤の細胞傷害性を評価する。
ｉｉ．癌細胞殺傷におけるＴＯＮＳＬ阻害剤と他の抗がん剤（従来の化学療法、ＣＰＴと誘導体、ＰＡＲＰ阻害薬）の相乗効果。
【０１６２】
典型的細胞毒性アッセイ：
任意のＨＴフォーマット（例えば、９６または３８４プレート）で細胞を増殖させ、低分子阻害剤と共に用量依存的および時間依存的にインキュベートする。細胞増殖および細胞死に対する影響は、利用可能な任意の好適な方法、例えば、比色分析法またはＨＴ顕微鏡法を使用して分析してよい。
【０１６３】
薬物試験用インビボモデル
臨床試験開始を目的としたＴＯＮＳＬ阻害剤前臨床動物試験。
【０１６４】
本発明の低分子
本発明の低分子は、相同組換えの低下に有用である。これらの低分子には、短い直鎖および環式のペプチドとペプチド模倣物質のいずれも使用可能と思われ、それらは分子量が低いため細胞透過が可能である。
【０１６５】
本出願で提示の構造データおよび上記の概念実証アッセイの使用によって、本願発明者らは、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある隣接するヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の両結合ポケットに障害を与えるファーマコフォア指向型分子、例えば低分子、共有結合低分子、ペプチドまたは環式ペプチドなどを同定した。
【０１６６】
低分子阻害剤の構造特性
本発明は、低分子阻害剤に関し、これは、残基Ｋ１２〜Ｒ２３を包含するヒストンＨ４尾部が占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、Ｈ４尾部Ｋ１２〜Ｒ２３とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を、直接的な競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して破壊するよう作用する。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、これは、残基Ｋ１２〜Ｒ２３を包含するヒストンＨ４尾部が占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とするかまたは障害を与え、Ｈ４尾部Ｋ１２〜Ｒ２３とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を、直接的な競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して阻止または破壊するよう作用する。
【０１６８】
当業者であれば知っているように、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ上のＨｉｓ１８結合ポケットもしくはＬｙｓ２０結合ポケットまたはその両方のポケットに結合できる低分子であれば、Ｈ４とＴＯＮＳＬ間の相互作用を破壊すると考えられることは明らかである。
【０１６９】
一実施形態では、本発明は、Ｈ４尾部の伸長残基Ｌｙｓ１２からＡｒｇ２３を、分子間の水素結合、静電的相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を介して標的とする低分子に関する。
【０１７０】
より好ましい実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４のＬｙｓ１２−Ｇｌｙ１３−Ｇｌｙ１４−Ａｌａ１５セグメントに及ぶ分子間接触を標的とする。
【０１７１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４の残基Ｇｌｙ１３、Ｇｌｙ１４およびＡｌａ１５と、ＡＲＤの残基Ａｓｎ５０７、Ｃｙｓ５０８、Ｔｒｐ６４１、Ｔｙｒ６４５およびＬｅｕ６４９との間の疎水性相互作用を標的とする。
【０１７２】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ｇｌｙ１４の主鎖のＯとＡＲＤ  Ｔｒｐ６４１のＮε１との間の水素結合、およびＨ４  Ａｌａ１５の主鎖のＮとＡＲＤ  Ｔｙｒ６４５のＯηとの間の水素結合を標的とする。
【０１７３】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、ＡＲＤ  Ａｓｎ５７１のＮδ２と水素結合するＨ４  Ｌｙｓ１６の主鎖のＯを標的とする。
【０１７４】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ａｒｇ１７の側鎖が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ａｒｇ１７の側鎖は、ＡＲＤのＴｙｒ５７２およびＣｙｓ６０８の両側鎖にわたって積み重なる一方で、そのＮη１原子がＡＲＤ  Ａｓｎ５７１の主鎖のＯおよびＯδ１との２つの水素結合を形成している。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、ＡＲＤのＴｙｒ５７２およびＣｙｓ６０８の両側鎖と会合でき、ＡＲＤ  Ａｓｎ５７１の主鎖のＯおよびＯδ１との水素結合を形成できるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１７５】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ｈ１８の側鎖が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ｈ１８の側鎖は、厳密に保存された４つの残基（Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ａｓｎ５７１およびＡｓｐ６０４）を結んでできるポケット内へ深く入り込んだ、ＡＲＤのＨｉｓ５６７上に位置している。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＴｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ａｓｎ５７１、Ａｓｐ６０４およびＨｉｓ５６７と会合することができるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１７６】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ｈｉｓ１８の側鎖が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ｈｉｓ１８の側鎖は、Ｔｒｐ５６３とＡｓｎ５７１の間で積み重なり、ＡＲＤのＧｌｕ５６８およびＡｓｐ６０４と水素結合を形成する。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、Ｔｒｐ５６３およびＡｓｎ５７１と会合することができ、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＧｌｕ５６８およびＡｓｐ６０４と水素結合を形成することができるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１７７】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｔｒｐ５６３のＮε１と水素結合を形成するＨ４  Ａｒｇ１９の主鎖のＯならびにＡＲＤのＣｙｓ５６１およびＧｌｙ５９５と接触を形成するＨ４  Ａｒｇ１９の側鎖が占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合する。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、Ｔｒｐ５６３のＮε１ならびにＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＣｙｓ５６１およびＧｌｙ５９５と会合することができるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１７８】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ｌｙｓ２０残基が占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ｌｙｓ２０残基は、Ｈ４  Ｈｉｓ１８結合ポケットに隣接するＡＲＤ表面の酸性ポケット内で結合している。
【０１７９】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ｌｙｓ２０の側鎖が占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ｌｙｓ２０の側鎖は、Ｍｅｔ５２８の側鎖と相互作用し、ＡＲＤのＴｒｐ５６３の縁部と接触する一方、Ｈ４  Ｌｙｓ２０の主鎖の原子はＡＲＤのＣｙｓ５６１に対して集まる。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、Ｍｅｔ５２８の側鎖ならびにＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＴｒｐ５６３およびＣｙｓ５６１と会合することができるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１８０】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ｌｙｓ２０のＮζ原子が占めるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ｌｙｓ２０のＮζ原子は、ＡＲＤの厳密に保存された残基Ｇｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９およびＧｌｕ５６８の各側鎖と３つの強い水素結合（距離＜３Å）を形成し、それが正三角形様に整列してＨ４  Ｌｙｓ２０を囲んでいる。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＧｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９およびＧｌｕ５６８の各側鎖と水素結合を形成することができるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１８１】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４のＶａｌ２１−Ｌｅｕ２２−Ａｒｇ２３セグメントに及ぶ分子間接触を標的とし、これには、Ｈ４  Ｖａｌ２１の側鎖とＡＲＤのＴｙｒ５６０およびＣｙｓ５６１との間の接触が含まれ、またＨ４  Ｌｅｕ２２は、ＡＲＤのＡｓｐ５２７およびＭｅｔ５２８と相互作用する。
【０１８２】
一実施形態では、本発明は、低分子に関し、ここで、かかる分子は、Ｈ４  Ａｒｇ２３の主鎖のＮが占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、かつ／またはそれと会合し、ここで、Ｈ４  Ａｒｇ２３の主鎖のＮは、ＡＲＤのＡｓｐ５２７の主鎖のＯと水素結合を形成し、一方でその側鎖はＡＲＤのＴｙｒ５６０の側鎖に対して集まる。したがって、一実施形態では、本発明は、化合物、例えば、ＡＲＤのＡｓｐ５２７の主鎖のＯと水素結合（複数可）を形成し、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＴｙｒ５６０の側鎖と結合することができるＴＯＮＳＬ阻害剤に関する。
【０１８３】
一実施形態では、本発明は、ＴＯＮＳＬ、ＢＡＲＤ１およびＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択されるタンパク質のヒストン読み取りドメインを遮断することができる本発明の低分子に関する。
【０１８４】
そのような分子は、典型的に、ＴＯＮＳＬのアンキリンリピート表面にある隣接するヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の両結合ポケットを標的とする共有結合低分子薬物を同定および確認するＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲパッケージによって同定および確認される。
【０１８５】
ＢＡＲＤ１との関連
ヒストン結合表面を含むＴＯＮＳＬ  ＡＲＤドメインのトポロジーは、ＢＡＲＤ１のＡＲＤに高度に類似している（図２３）。ＢＡＲＤ１はＢＲＣＡ１の絶対結合パートナーであり、ＢＲＣＡ１のほとんどの細胞機能および腫瘍抑制因子機能に必要である。ヒストンＨ４結合に関与する重要残基は、ＢＡＲＤ１のＡＲＤに保存されている。さらに、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＮ５７１残基はヒストンＨ４結合（図１０、１２）ならびにクロマチン（図２１）およびＤＮＡ損傷部位（図２２）へのＴＯＮＳＬの動員にとって必須であり、生存力（図）は、ＢＡＲＤ１  Ｎ４７０Ｓ癌変異に対応している（図２３）。したがって、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤに対する低分子阻害剤は、ＢＡＲＤ１  ＡＲＤドメインも標的とすることが予測される。ＴＯＮＳＬおよびＢＡＲＤ１はいずれも同一のＤＮＡ修復経路で機能するとすれば、ＴＯＮＳＬとＢＡＲＤ  ＡＲＤの両方を標的すると思われる、本発明を基に設計される低分子阻害剤は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤにのみ特異的な阻害剤と比較して、より効率的にＨＲを阻害し、より強力な抗癌活性を示すだろうと予測される。
【０１８６】
概要
本発明による化合物との関連で上記で論じたいかなる特徴および／または態様も、類推により、本明細書に記載する結晶構造および／または方法に適用されることを理解されるべきである。
【０１８７】
本発明の結晶構造の原子座標の、例えば、１Åから最高３Åまでといった変動は、互換的に使用される。
【０１８８】
以下の配列データ、構造、図および実施例を以下に記載し、本発明を例示する。それらは、例示を意図するものであり、何ら限定するものではないと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】２つのＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ、２つのＭＣＭ２  ＨＢＤおよびＨ３−Ｈ４四量体の相対的位置を示す、ＴＯＮＳＬ−ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体複合体の全体構造の図である。
【図２】４つのＡＮＫリピートからなるＴＯＮＳＬ  ＡＲＤが、その窪んで長く伸びた表面を使用してＨ４尾部の伸長残基１２〜２３を標的とする図である。
【図３】ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとＨ４尾部（１２〜２３）間の分子間相互作用である。
【図４】Ｈ４尾部に対する窪んだ酸性表面結合部位を示すＡＲＤの静電ポテンシャル表面である。
【図５】Ｈ４  Ａｒｇ１７とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの分子間相互作用の主要部分である。
【図６】Ｈ４  Ｈｉｓ１８とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの分子間相互作用の主要部分である。
【図７】Ｈ４  Ｌｙｓ２０とＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの分子間相互作用の主要部分である。
【図８】ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとＨ４尾部領域残基１２〜１５との相互作用の分子詳細である。
【図９】ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとＨ４尾部領域残基２１〜２３との相互作用の分子詳細である。
【図１０】組換え型ＧＳＴ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの野生型または記載変異体との組換え型ヒストンＨ３−Ｈ４のインビトロ・プルダウン法である。
【図１１】ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  Ｕ−２−ＯＳ細胞に一過性にトランスフェクションしたＨＡ−ＳＮＡＰ−Ｈ４の野生型（ＷＴ）および記載変異体の免疫沈降法である。
【図１２】一過性にトランスフェクションしたＨｅＬａ  Ｓ３細胞由来のＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴまたは記載変異体の免疫沈降法である。
【図１３】記載の修飾を有するＨ４尾部ペプチドに結合するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＩＴＣ分析である。
【図１４】ビオチン化Ｈ４尾部ペプチドとの組換え型ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのインビトロ・プルダウン法である。
【図１５】ビオチン化Ｈ４尾部ペプチドを用いた細胞抽出物由来ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのインビボ・プルダウン法である。
【図１６】ビオチン化組換え型モノヌクレオソーム、Ｋ２０が未修飾のもの、またはＫ２０がジメチル化されているものを用いた組換え型ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ二量体のインビトロ・プルダウン法である。＊は、非特異的バンドを指す。（下図）ヒストンに対して定量したＴＯＮＳＬ結合である。対応のないｔ検定：＊、Ｐ＜０．０５；６つの独立した実験の平均を示す；各ひげ、外れ値。
【図１７】ビオチン化Ｈ４尾部ペプチドとの細胞抽出物由来ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのプルダウン法である。
【図１８】ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  Ｕ−２−ＯＳ細胞の可溶化クロマチンに由来するＧＦＰ−ＴＯＮＳＬの免疫沈降法である。
【図１９】ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  Ｕ−２−ＯＳ細胞の可溶化クロマチンに由来するＧＦＰ−ＴＯＮＳＬの免疫沈降法である。
【図２０】予備抽出したＵ−２−ＯＳ線維芽細胞におけるＴＯＮＳＬの定量的ハイコンテントイメージングである。プロットは、対照またはＴＯＮＳＬ  ｓｉＲＮＡで処理した細胞における総ＴＯＮＳＬおよびＤＡＰＩの各強度を示し、ＴＯＮＳＬ抗体の特異性が確認される。各点は、個々の細胞核の測定強度を表す。
【図２１】ａ）クロマチンへのＴＯＮＳＬ動員にはＨ４Ｋ２０ｍｅ０を認識する必要がある。ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴまたはＮ５７１Ａに対する条件付きＵ−２−ＯＳ細胞を直接固定または予備抽出して可溶性タンパク質を除去した。スケールバー、２０μＭ。ｂ）クロマチンへのＴＯＮＳＬ動員にはＨ４Ｋ２０ｍｅ０を認識する必要がある。（左図）細胞分画法によるＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴおよび変異体の分析である。（右図）総ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬに対するクロマチンに結合した分画（Ｃ）をウエスタンブロット法により定量した（エラーバー、ＳＤ；ｎ≧３）。Ｓは可溶性分画、Ｃはクロマチンに結合した分画である。タンパク質量の調節にはＭｅｍＣｏｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）による染色を使用した。
【図２２】ＤＮＡ損傷部位へのＴＯＮＳＬ動員にはＨ４Ｋ２０ｍｅ０を認識する必要がある。（上図）ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴまたはＮ５７１Ａに対する条件付きＵ−２−ＯＳ細胞にレーザー照射し、ＤＮＡ損傷マーキングのための５３ＢＰ１およびＳ／Ｇ２細胞同定のためのサイクリンＢそれぞれについて共染色した。白抜きの矢じりはＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ動員、黒抜きの矢じりは動員なしを表す。スケールバー、１０μＭ。（下図）レーザー照射跡への動員を示すＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ細胞の定量を表す（エラーバー、ＳＤ；ｎ＝３）
【図２３】ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとＢＡＲＤ１  ＡＲＤの構造の重ね合わせである。Ｈ４尾部とのＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ相互作用に関与する主要残基を、ＢＡＲＤ１  ＡＲＤの対応残基と比較している。２つのＡＲＤは、ヒストン結合表面のトポロジーと保存の高度な類似を示している。
【図２４】誘導可能な細胞株におけるＭＣＭ２（Ａ）およびＥｄＵ（Ｂ）を用いたクロマチン結合ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬの共局在解析である。細胞は、ＥｄＵをパルス標識（左図）するか、またはＥｄＵの継続的存在下でＳ期に移行させた（右）。デコンボリューション顕微鏡法および単一細胞におけるピアソンの係数の測定によって共局在を解析した（ｎ＞１５、独立した２つの実験による）。代表的画像。
【図２５】細胞周期を通したＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴおよびＡＲＤ変異体のクロマチン結合の分析である（２つの実験の代表的結果）。
【図２６】予備抽出した誘導可能Ｕ−２−ＯＳ細胞を記載のようにＣＰＴ処理して（３時間、１μＭ  ＣＰＴ）ハイコンテントイメージングにより解析したＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴおよび変異体のクロマチン結合を示す（３つの実験の代表的結果）。
【図２７】Ａ）ＨＵ処理細胞（２時間、３ｍＭ）由来の可溶化クロマチンから単離されたＦｌａｇ−ＨＡ−ＭＣＭ２のＷＴまたはＭＭＳ２２Ｌのヒストン結合変異体（Ｙ８１Ａ、Ｙ９０Ａ）を用いたＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌの共免疫沈降法による解析（２つの実験の代表的結果）。Ｂ）記載のようにＮＣＣによって解析した、ＣＰＴ投与を受けた複製フォーク（ＣＰＴ、１μＭ）へのＧＦＰ  ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴおよび変異体の動員を示す。（−）はビオチン−ｄＵＴＰなし。
【図２８】ＴＯＮＳＬ枯渇におけるテトラサイクリン誘導によるＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ発現コロニー形成を示す。細胞をｓｉＲＮＡ処理して、ｓｉＲＮＡ抵抗性ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴおよび変異体を発現するようテトラサイクリン（ｔｅｔ）で誘導し、ＣＰＴ処理（２４時間、５０ｎＭ）を記載のように行った。ＴＯＮＳＬ枯渇細胞のコロニー形成能によって決定したレスキュー効率を示す（Ａ）。対照ｓｉＲＮＡ処理細胞のコロニー形成能によって決定したＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体のドミナントネガティブ効果を示す（Ｂ）。データポイントは、別個の生物学的複製試料２つまたは４つから得た３連測定における、異なる２種類の細胞濃度を表す（図２８、左パネル）。
【図２９】対照細胞におけるテトラサイクリン誘導によるＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ発現コロニー形成を示す。
【図３０】Ａ）図４ｆに示し、かつさらなるＡＲＤ変異体を含む、ＴＯＮＳＬ枯渇細胞および対照細胞におけるテトラサイクリン誘導によるＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ発現コロニー形成である。生物学的複製試料、２つ（Ｅ５６８Ａ、Ｄ５５９Ａ）または４つ（ＷＴ、Ｎ５７１Ａ）から得た３連測定における、２種類の細胞濃度を示す。Ｂ）図４ｆからの相補性解析をＣＰＴ処理細胞および未処理細胞の両方を含めて単一パネルに表したものである。この図は、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体の毒性はＷＴ  ＴＯＮＳＬ発現細胞のＣＰＴ処理に匹敵することを示す。
【図３１】細胞を図２９のように処理し、ＥｄＵおよびＤａｐｉ（左図）ならびに５３ＢＰ１フォーカス（右図）を使用して細胞周期分布について分析した。エラーバーは平均と標準偏差（４つ（左図）または５つ（右）の生物学的複製試料の３連分析）。
【図３２】ＭＭＳ２２Ｌのクロマチン結合を示す。クロマチンに結合した分画をウエスタンブロット法（Ｂ）によって分析し、総ＭＭＳ２２Ｌ量（Ａ）に対して定量した（未処理：エラーバー、ＳＤ、ｎ＝３；ＣＰＴ：エラーバー、平均と範囲、ｎ＝２）。
【図３３】ＧＳＴ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴまたは記載の変異体を用いた、組換え型ヒストンＨ３−Ｈ４およびＭＣＭヒストン結合ドメイン（ＨＢＤ）のプルダウンを示す。
【図３４】ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴおよび記載のＡＲＤ変異体の円偏光二色性（ＣＤ）分析である。記載の各ＡＲＤ点変異ではＡＲＤの全体構造の安定性は損なわれない。
【図３５】Ｈ３Ｋ９ｍｅ１（アミノ酸１〜２１）およびＨ４（アミノ酸９〜２５）を用いた、ＴＯＮＳＬの酸性伸展部およびＡＲＤ（アミノ酸４５０〜６９２）のＩＴＣ分析である。
【図３６】ＭＯＦ枯渇細胞におけるＴＯＮＳＬのクロマチン結合の分析である。内在性ＴＯＮＳＬに対して染色した予備抽出細胞のハイコンテントイメージングによってクロマチン結合ＴＯＮＳＬを定量した。ＴＯＮＳＬ強度平均を示す。Ａ．Ｕ．は任意の単位を表す。ウエスタンブロット法によってノックダウン効率および期待されるヒストン修飾への効果を確認した（２つの実験の代表的結果）。
【図３７】同調したＴＩＧ３細胞における質量分析法で測定したＨ４Ｋ２０のメチル化レベルである。移行から３〜６時間後、細胞をＨＵ（３ｍＭ）またはＣＰＴ（１μＭ）で処理または未処理放置（６時間）した（エラーバー、範囲；ｎ＝２）。
【実施例】
【０１９０】
実施例１−結晶構造
タンパク質の作製：本明細書実施例に記載のすべてのタンパク質は、特に明記しない限り、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）に発現させた。ＧＳＴタグ標識ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤならびにその変異体として含まれるＥ５３０Ａ、Ｄ５５９Ａ、Ｗ５６３Ａ、Ｅ５６８Ａ、Ｎ５７１ＡおよびＤ６０４ＡをｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にクローニングした。発現したタンパク質を、最初にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを使用して精製し、次いで、ゲルろ過工程でさらに精製した。場合によって、ゲルろ過工程の前に、３ＣプロテアーゼでＧＳＴタグ標識を除去した。ＧＳＴ−Ｈ３尾部およびＧＳＴ−Ｈ４尾部のタンパク質の精製では、それぞれ、ヒトヒストンのＨ３断片１〜５９およびＨ４断片１〜３１をｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターにクローニングした。タンパク質を発現させ、同一の方法で精製した。
【０１９１】
組換え型完全長ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ二量体の作製では、完全長ＭＭＳ２２Ｌをコードする配列を５’末端にてＭＢＰタグと、また３’末端にて１０×Ｈｉｓタグと融合させた。完全長ＴＯＮＳＬをコードする配列を５’末端にてＧＳＴタグと融合させた。ＭＭＳ２２ＬおよびＴＯＮＳＬの両構成体をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターにクローニングした。製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨にしたがって２つの組換え型バキュロウイルスを用いて重複感染させることによりＳｆ９細胞に複合体を発現させた。タンパク質をＳｆ９細胞から抽出し、これまでに記載のあるＳｇｓ１の場合と同様に精製した。簡単に言うと、アミロースレジンを用いて複合体を精製した後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを用いてＭＢＰおよびＧＳＴの両タグを切断した。その後、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーレジンを使用して二量体をさらに精製した。３００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で洗浄を実施した。
【０１９２】
結晶化：ヒトＴＯＮＳＬアンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ、残基５１２〜６９２）およびＭＣＭ２ヒストン結合ドメイン（ＨＢＤ、残基６１〜１３０）をグリシンが４つのリンカー（Ｇ４リンカー）を介して共有結合で連結し単一発現カセット（配列番号１５）にした。
【０１９３】
ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ発現カセットを、Ｎ末端にＨｉｓ６−ＳＵＭＯタグ標識した改変ＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にクローニングした。得られたプラスミドを、ヒトヒストン遺伝子Ｈ３．３（５７〜１３５）およびＨ４（１〜１０２）を有するｐＥＴＤｕｅｔプラスミドと共にＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）に共発現させた。
【０１９４】
カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、アンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地を使用してＥ．ｃｏｌｉを３７℃で培養した。
【０１９５】
Ｅ．ｃｏｌｉの細胞密度が約１．０のＯＤ６００に達したら、ＬＢ培地にＩＰＴＧを０．５ｍＭ加え、それをさらに２０℃で一晩インキュベートした。
【０１９６】
発現したタンパク質複合体は、最初にＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）で精製した。Ｕｌｐ１（ＳＵＭＯプロテアーゼ）を使用してＨｉｓ６−ＳＵＭＯタグ標識を除去した後、ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）と５００ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液を用いてタンパク質複合体をさらに精製した。
【０１９７】
精製Ｇ４リンカー複合体、すなわち、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）と１Ｍ  ＮａＣｌの緩衝液に溶解させた濃度２３ｍｇ  ｍｌ−１のＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤカセット−Ｈ３．３（５７〜１３５）−Ｈ４（１〜１０２）複合体（本明細書では、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体複合体とする）を、１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６〜６．６）、５〜１０％イソプロパノールという条件で２０℃にてセッティングドロップ（ｓｅｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）蒸気拡散法を使用して結晶化した。液体窒素で瞬間冷凍する前に、すべての結晶を２５％グリセロールを添加した母液で構成される凍結保護剤に浸漬した。
【０１９８】
２４−ＩＤ−Ｃ／Ｅ  ＮＥ−ＣＡＴ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて０．９７９ÅでＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体複合体のデータセットを収集した。ＨＫＬ２０００プログラムを使用してデータを処理した。ＰＨＡＳＥＲで我々の先の構造であるＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体複合体を検索モデルとして分子置換することにより複合体の初期構造を明らかにし、手動で精密化を行いＣｏｏｔを使用して構築した。この複合体の最終構造をＰＨＥＮＩＸを使用して分解能２．４３Åまで精密化した。表１は、収集データおよび構造精密化の統計の概要である。
【０１９９】
【表１】
2018537411.tif 000003
2018537411.tif 000004
【０２００】
得られた構造データは下記附属書１に記載されている。
【０２０１】
タンパク質ＭＣＭ２  ＨＢＤ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤカセット、Ｈ３およびＨ４それぞれの１分子が非対称単位に存在する。結晶構造の対称操作でＨ３−Ｈ４の四量体を再構成することにより、Ｈ３−Ｈ４四量体と複合体をなす２コピーのＭＣＭ２  ＨＢＤ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤカセットを有する完全複合体（すなわち、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体複合体）が生成され、これは、ＭＣＭ２  ＨＢＤは生理的条件下でＨ３−Ｈ４四量体と結合し、安定化させるという我々の先の知見と一致する。また、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ−ＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４四量体複合体は我々の先の構造体であるＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｈ３−Ｈ４複合体との高度な類似も見せており、１対のＭＣＭ２  ＨＢＤがＨ３−Ｈ４四量体の側面周囲を包み込む一方で、２つのＴＯＮＳＬ  ＡＲＤがＨ４尾部の各々と相互作用する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤはＭＣＭ２  ＨＢＤと分子間相互作用を形成せず、細胞内でＨ３−Ｈ４四量体がＴＯＮＳＬとＭＣＭ２間の相互作用を架橋することと一致する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、Ｈ４尾部（残基１２−２３）のセグメントと広範な接触を形成するが、Ｈ３−Ｈ４四量体のコアとは最小限の接触しか示さない。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、ヌクレオソームという状況下では立体衝突（ｓｔｅｒｉｃ  ｃｌａｓｈ）を起こさずにＨ４尾部と結合するようモデル化が可能であると思われ、保存された正電荷をもつパッチ領域（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｃｈ）がヌクレオソームのＤＮＡと相互作用し得ることから、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとＨ４尾部間の広範な相互作用によって、ＴＯＮＳＬが、ＭＣＭ２と共に可溶性の非ヌクレオソームのヒストンＨ３−Ｈ４に結合し、かつヌクレオソームのＨ３−Ｈ４にも結合することが説明できるだろうと示唆される。
【０２０２】
アンキリン（ＡＮＫ）リピートの折り畳みは、それぞれインナーヘリックスおよびアウターヘリックスと呼ばれる逆平行になった２本のヘリックス、およびそれに続くフィンガーと呼ばれるヘアピンループを含有する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは４つのＡＮＫリピートからなり、そのうちの３つは標準的な折り畳みのＡＮＫリピート（ＡＮＫ１〜３）、残る１つは非典型的なキャッピングリピート（ＡＮＫ４）になっている。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、内部フィンガー１〜３の近傍に、ＡＮＫ１に先行するフィンガー０と表された別のループを含有する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、インナーヘリックス（αＡ１、αＢ１、αＣ１およびαＤ１）およびフィンガー０〜４で構成される、その窪んだ伸長表面を使用して、Ｈ４尾部の長いβ鎖様の立体構造との広範な分子間接触を形成する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＨ４尾部結合表面を構成する１８残基中１５例残基が高度に保存されていることは注目に値する。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、Ｈ４尾部の伸長残基Ｌｙｓ１２からＡｒｇ２３を標的とし、主に分子間の水素結合、静電気的およびファンデルワールス力による相互作用を介する。
【０２０３】
実施例２−等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）によるヒストンＨ４ペプチドに結合するＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの決定
ＩＴＣ滴定はすべてＭｉｃｒｏｃａｌ  ＩＴＣ２００カロリメータで２５℃にて実施した。ヒストンＨ４のペプチド（残基９〜２５）とその修飾ペプチドＫ１６ａｃ（Ｌｙｓ１６でアセチル化）、Ｈ１８Ｗ（Ｈｉｓ１８をＴｒｐ１８に変異）、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１（Ｌｙｓ２０でモノメチル化）およびＨ４Ｋ２０ｍｅ２（Ｌｙｓ２０でジメチル化）、ならびにヒストンＨ３のペプチド（１〜１９）Ｋ９ｍｅ１（Ｌｙｓ９でモノメチル化）はすべてＴｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにて合成された。２．２  μｌのペプチド（１．４１ｍＭ、緩衝液２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および０．５Ｍ  ＮａＣｌに溶解）を、２００μｌのＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ溶液（１４５μＭ、同一緩衝液）に１５０秒間隔で１７回連続注入し、反応による発熱を測定した。データをＭｉｃｒｏｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアで処理し、曲線を単一サイズ結合モデルに当てはめた。
【０２０４】
実施例３−インビトロにおける組換え型ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのヒストンＨ４ペプチドへの結合評価
精製した組換え型ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（残基５１２〜６９２）を濃度４００μＭで１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に−８０℃で保存した。プルダウン各々について、４００ｐｍｏｌのＡＲＤストック（１μｌ、４００μＭ）を９９μｌの結合緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５％グリセロール、０．２５％  ＮＰ−４０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭロイペプチン、１ｍＭペプスタチン）で希釈した。ＡＲＤ投入物質を実施するプルダウン数に合わせて計量した。プルダウン各々について、Ｃ末端のビオチニル−リシン残基またはビオチン（２．５μｌ、４００μＭ）を有するヒストンＨ４ペプチド（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ製）の伸長残基１４〜３３（２．５μｌ、２５０μＭ）を、１００μｌのＡＲＤ投入物質に加えた１．１ｍｌの結合緩衝液に加え、混合物を４℃で回転させながら一晩インキュベートした。翌日、各プルダウンの結合緩衝液（３×５００μｌ）中で２５μｌのＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を洗浄し、最終洗浄液をビーズから除去した。ＡＲＤ／ペプチドまたはＡＲＤ／ビオチンの混合物を予備洗浄したＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１ビーズの分注量に加え、４℃で３時間回転させながらインキュベートした。最後に、ビーズの洗浄（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５％グリセロール、０．２５％  ＮＰ−４０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭロイペプチン、１ｍＭペプスタチンを用いて２×３００μｌ、１×２００μｌ）を行い、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ゲルでＳＤＳ  ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、クマシー染色によってプルダウン物質を可視化した。
【０２０５】
実施例４−細胞抽出物におけるヒストンＨ４Ｋ２０ｍｅ０ペプチドに対するＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ結合測定
界面活性剤可溶性抽出物（ＮＰ４０／ＮａＣｌ）では、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのＷＴまたはＡＲＤ変異体を発現している、Ｕ−２−ＯＳ細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、こすり取った後、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤（５ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭ  μ−グリセロールホスフェイト（ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．２ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、Ｓｉｇｍａ製）を添加したＨＳ緩衝液中で１５分氷上でインキュベートした。４℃で１６．０００ｇ、１５分の遠心分離にかけた後、上清を採取した。細胞抽出物からのプルダウンでは、ＭｙＯｎｅ  Ｔ１ビーズを、高塩濃度（ＨＳ；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、５％グリセロール）緩衝液中で１μｇのビオチン化ヒストンペプチドと共に一晩インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  Ｕ−２−ＯＳ細胞の抽出物ＮＰ４０／ＮａＣｌの１ｍｇをビーズに加え、４℃で回転させながら２時間インキュベートした。その後、ビーズをＨＳ緩衝液で５回洗浄し、４℃で２分回転させた。洗浄後、ビーズを１×ＬＳＢに再懸濁させ、１０分間沸騰させた。溶出したタンパク質を４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅゲル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に担持させた。その後、タンパク質を、２０Ｖのウェット式転写を一晩行って０．２μｍのニトロセルロース膜に転写し、ウエスタンブロット法で検出した。
【０２０６】
実施例５−ＨＴ顕微鏡を用いたヒト細胞のクロマチン結合ＴＯＮＳＬの定量
Ｕ−２−ＯＳ細胞およびＴＩＧ３細胞を６ウェルプレートで増殖させた（分析前日、ウェルあたり１ｘ１０５細胞を播種）。クロマチンに結合したＴＯＮＳＬのみを分析するため、ＣＳＫ緩衝液０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ（ＣＳＫ緩衝液：１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭスクロース、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、およびプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤として１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｕｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｕｇ／ｍｌペプスタチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．２ｍＭバナジウム酸ナトリウム、５ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭベータ−グリセロールホスフェイト（ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ））と共に氷上で５分インキュベーションすることにより、可溶性タンパク質を除去した（予備抽出）。その後、細胞をＣＳＫおよびＰＢＳですすいでから、４％ホルムアルデヒド中で１０分固定させ、ＴＯＮＳＬ抗体を用いて染色を行った。
【０２０７】
検出を行うため、５％  ＢＳＡおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで細胞を１時間ブロックし、ＴＯＮＳＬ抗体（Ｓｉｇｍａ製、参照番号ＨＰＡ０２４４６７９）と共に４℃で一晩インキュベートした（ブロッキングバッファー中１：４００）。５％  ＢＳＡおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄後、抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ブロッキング緩衝液中１：１０００）を添加し、３０分インキュベートさせた。細胞を３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ製）でＤＮＡに対比染色を行った。ＳｃａｎＲハイコンテントイメージングシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ製）で画像を取得し、ＳｃａｎＲソフトウェアを使用して分析を行った。ＴＯＮＳＬ枯渇細胞に対するＴＯＮＳＬ相対蛍光強度を、特定ｓｉＲＮＡ（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  ４０：６１９、Ｓｉｇｍａ社により合成）を濃度１００ｎＭで３０時間使用して定量した。
【０２０８】
実施例６
ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌが、積み込み前（ｐｒｅ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）にＡＳＦ１およびＭＣＭ２とすでに複合体となっているヒストンと結合するとすれば、新しいヒストンと合わせて複製中のＤＮＡ上にＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌを搭載できると思われる。初期（ｎａｓｃｅｎｔ）クロマチンでは、新しいヒストンに限りＨ４Ｋ２０がメチル化されておらず（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０は９８％）、古い、リサイクルされたヒストンはほぼ完全にＨ４Ｋ２０がメチル化されていた（ｍｅ１は７％、ｍｅ２は８８％、ｍｅ３は２％）ことが本明細書で示される。新しいヒストンはＧ２／Ｍ後期にメチル化され、Ｇ１期のクロマチンからＨ４Ｋ２０ｍｅ０がなくなる。これにより、新しいヒストン上のＨ４Ｋ２０ｍｅ０が複製後クロマチンのシグネチャーとして識別され、このことは、Ｇ２／Ｍ後期まで複製フォークおよび姉妹染色分体においてＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌが新しいヒストンのＨ４尾部と結合できることを示している。この予測を裏付けるように、ＴＯＮＳＬはＳ期のクロマチンに蓄積し、Ｇ２細胞集団ではクロマチンに結合したままとどまっており、Ｇ１期のクロマチンから排除されていた（図２０）。複製前と複製後のクロマチンを識別するため、我々は、複製中のＤＮＡにはＥｄＵ標識し（進行中の複製にはパルス標識、また複製後クロマチンの同定には連続標識した）、また複製前クロマチンはＭＣＭ２で標識し、ＴＯＮＳＬとの共局在を解析した。ＴＯＮＳＬ染色はＭＣＭ２と互いに排他的であった（図２４Ａ）が、Ｓ期前期のＥｄＵパルス標識とＳ期全体を通した複製後ＤＮＡ（連続ＥｄＵ標識）とは共局在した（図２４Ｂ）。ＴＯＮＳＬはＳ期全体を通してＤＮＡ複製中の部位に見られたが、共局在の程度は、Ｓ期の中後期に低下し（図２４Ｂ、左パネル）、フォーク通過後も複製後クロマチンにＴＯＮＳＬが結合することと一致している、（図２４Ｂ、右パネル）。ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの変異は、ＤＮＡ複製部位を含め、クロマチンへのＴＯＮＳＬ動員を抑制した（図２５、）。まとめると、このことは、新しいヒストン上のＨ４Ｋ２０ｍｅ０をＡＲＤが認識することによって複製フォークおよび複製後クロマチンにＴＯＮＳＬが動員されることを実証している。複製後クロマチンに結合し、また障害のあるフォークおよびＤＮＡ損傷部位に動員にはＴＯＮＳＬ  ＡＲＤによるＨ４尾部の認識が必要とされる。
【０２０９】
ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの変異もまたクロマチン結合を抑制し（図２６）、カンプトテシン（ＣＰＴ）およびヒドロキシウレア（ＨＵ）のような複製にとっての毒の存在下で複製フォークへの動員を抑制した（図２７ＡおよびＢ）。さらに、ＡＲＤ変異は部位特異的ＤＳＢ（図２８）およびマイクロレーザーにより生じたＤＮＡ損傷へのＴＯＮＳＬの蓄積を妨げた。細胞周期マーカーとの共染色により、ＴＯＮＳＬは、予想通りＳ期およびＧ２期の細胞にしかＤＮＡ修復部位に動員されないことが確認された。Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０結合は、複製後クロマチンの障害のあるフォークおよびＤＮＡ損傷部位にＴＯＮＳＬが蓄積されるために必要である。しかし、これはＨ４Ｋ２０ｍｅ０の増加のためではなかったことから、クロマチン脱凝縮時のＨ４尾部の露出（ｕｎｍａｓｋｉｎｇ）および／または修復因子との相互作用が修復部位におけるＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌの蓄積に寄与することが示唆される。修復因子と相互作用することと一致して、ＭＭＳ２２ＬとＲａｄ５１との相互作用は刺激を受けたフォークにおいて複合体を安定させることができる（Ｐ．ＣｅｊｋａおよびＭ．Ｐｅｔｅｒ、私信）。これがＨ４Ｋ２０結合に続いて生じることを我々のデータは示している（図２６〜２８）。相補性解析では、ＴＯＮＳＬ  ＷＴはＣＰＴ存在下、非存在下のＴＯＮＳＬ枯渇細胞の生存力を部分的に救済した（図２８、図３０ＡおよびＢ）が、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体では高い毒性が示された（図２８、図３０ＡおよびＢ）。対照細胞では、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体は、生存力も低下させ、複製に伴うＤＮＡ損傷に付随したＧ２／Ｍ期停止を引き起こした（図２９および図３１）。さらに、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体はクロマチンから離れた部位でＭＭＳ２２Ｌを増量させ、これはＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ枯渇を模倣するドミナントネガティブ表現型を説明している（図３２ＡおよびＢ）。まとめると、このことから、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０の認識はゲノム安定性の保護におけるＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌ機能の中核をなすことが示される。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡ抵抗性ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのＷＴまたはＡＲＤ変異体（Ｄ５５９Ａ、Ｅ５６８Ａ、Ｎ５７１Ａ）を発現する誘導可能なＵ２ＯＳ細胞を使用してＣＰＴ存在下または非存在下で、クローン原性アッセイ（アッセイ詳細については本明細書の下記実施例８を参照のこと）によって細胞生存力を評価した。前述の結果は、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴは、増殖障害およびＴＯＮＳＬ枯渇細胞のＣＰＴ感受性を部分的に補うことができるが、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体を発現させると、細胞生存力およびＣＰＴに対する生存がさらに低下することを示している。また、対照細胞にＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体を発現させると細胞増殖に対しドミナントネガティブ作用があることを示している。
【０２１１】
ゲノム不安定性マーカーである５３ＢＰ１の蓄積、およびＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体を発現している細胞のＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を測定した。誘導可能なＵ２ＯＳ細胞を、抵抗性ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬのＷＴまたはＡＲＤ変異体（Ｄ５５９Ａ、Ｅ５６８Ａ、Ｎ５７１Ａ）を発現するよう２４時間誘導し、次いで、固定した後、さらに２４時間後５３ＢＰ１およびＥｄＵについて染色した。ハイスループット顕微鏡により画像を取得した。これにより、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体の発現はＴＯＮＳＬ／ＭＭＳ２２Ｌ枯渇を表現型模写することが示される。したがって、これらの変異体は、さまざまな疾患モデルにおけるＴＯＮＳＬ阻害剤の効果を試験するために有用である。ＣＰＴ非存在下でも存在下でも、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ変異体を発現している細胞においてクロマチンから離れた部位でのＭＭＳ２２Ｌの増量が示されたことにより、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの発現がＴＯＮＳＬ／ＭＭＳ２２Ｌ枯渇を表現型模写する理由が説明され得る。
【０２１２】
複製後クロマチンは、ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌエフェクタータンパク質によって読み取られる明確なヒストン修飾シグネチャーを有することが明らかとなった。これは、ＤＮＡ修復および他の染色体トランスアクションがゲノム遺伝子座の複製状態と直接関連付けされ得る機序を理解するための新たな道を開くものである。興味深いことに、複製後クロマチンの区別を可能にしているのは新しいヒストンである。ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌは、ＡＳＦ１およびＭＣＭ２との積み込み前複合体を介して新しいヒストンを有する初期クロマチンに送達されることが提示される。したがって、ＴＯＮＳＬには、ヒストンシャペロンおよびヒストン読み取り因子として二重の機能があり得る。構造研究から、ＴＯＮＳＬは、Ｈ４尾部を隔離してＨ３−Ｈ４積み込み中のＤＮＡとの偽（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）接触を妨げることによってヒストンシャペロン様として作用することが提案される。さらに、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤは、Ｈ４尾部が近接ヌクレオソームのＨ２Ａ−Ｈ２Ｂ酸性パッチ領域と会合しないようにすることにより、クロマチン凝縮を相殺し得る。したがって、ＴＯＮＳＬは、可溶性ヒストンおよびヌクレオソームのヒストンのいずれにも結合することで、我々のヒストンシャペロンについての見識を変える。ＴＯＮＳＬのヒストン読み取り因子として機能では、ＴＯＮＳＬはＭＭＳ２２ＬをＨ４Ｋ２０ｍｅ０を介して複製後クロマチンに局在させ、障害のあるフォークおよびＤＮＡ損傷部位でのＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２Ｌの蓄積を可能にする。我々は、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０はアフィニティートラップとして働き、ＴＯＮＳＬ−ＭＭＳ２２ＬがＨＲ中のＲａｄ５１搭載の支持にすぐに利用されるようにしていると想定する。これにより、ＤＮＡ修復におけるＨ４Ｋ２０の役割を理解するための新たな観点が提供され、５３ＢＰ１を動員してＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１と競合してＮＨＥＪを促進することが十分に明らかになっているＨ４Ｋ２０ｍｅ１／２の役割を補完するものとなる。複製後クロマチンでは、古いヒストンのＨ４Ｋ２０ｍｅ１／２が５３ＢＰ１の動員を支持することになる。新しいヒストンのＨ４Ｋ２０ｍｅ０もＤＮＡ修復経路の選択に影響を与えるのかどうかは、今後の研究対象となるであろう。ヒストン結合表面を含め、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの構造は、ＢＲＣＡ１の腫瘍抑制因子機能およびＨＲにとって必要なＢＡＲＤ１のＡＲＤと高度に類似していることは注目に値する。癌ではＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの複数の変異（Ｃ６０８Ｇ、ＣＯＳＭ４８７９９０９；Ｐ５５７Ｓ、ＣＯＳＭ４５６５０３２；Ｅ５９７Ｋ、ＣＯＳＭ３３８２１６３）が報告されており、Ｈ４結合に重要なＮ５７１残基は、ＢＡＲＤ１  Ｎ４７０Ｓ癌変異と対応している。これは、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ０認識がもつ腫瘍抑制因子機能、およびそれによって標的型癌治療にもたらされる可能性を今後探索していかなければいけないこと明確に示している。
【０２１３】
ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴまたは変異体の安定性に関する円偏光二色性分析（図３４）では、記載のＡＲＤ点変異はＡＲＤの全体構造を不安定化させないことを示している。Ｈ４尾部（９〜２５）およびＨ３Ｋ９ｍｅ１（１〜２１）ペプチドを用いたＴＯＮＳＬの酸性伸展部およびＡＲＤ（４５０〜６９２）のＩＴＣ分析（図３５）では、ＴＯＮＳＬ（４５０〜６９２）はＨ３Ｋ９ｍｅ１には結合しないが、Ｈ４ペプチドを認識することを示している。
【０２１４】
免疫蛍光抗体法、顕微鏡およびレーザーマイクロ照射に使用した方法を以下の実施例７に記載する。
【０２１５】
実施例７
免疫蛍光抗体法、顕微鏡およびレーザーマイクロ照射
Ｕ−２−ＯＳ、ＨｅＬａ  Ｓ３、およびＴＩＧ−３の各細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ製）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび選択薬を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ製）で増殖させた。ｓｉＲＮＡ抵抗性ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬの構成体については記載があり（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４０，６１９−６３１（２０１０））、この構成体に部位特異的変異誘発によってＡＲＤ変異を導入した。ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＷＴおよびＡＲＤ変異体を誘導可能な細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００で製造者の操作手順にしたがってｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬプラスミドにトランスフェクションし、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）で選択してＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｕ−２−ＯＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に作製した。ウエスタンブロット法および免疫蛍光抗体法によって全細胞株の認証を行った。１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン添加を２４時間行い、ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬの発現を誘導した。Ｕ−２−ＯＳ細胞およびＴＩＧ３細胞をシングルチミジンブロック（２ｍＭ）により同調させ、２４□Ｍ  ｄＣＴＰの存在下でＳ期に移行させた。ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬの一過性発現では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で製造者の操作手順にしたがってトランスフェクションして発現プラスミドを導入し、トランスフェクション２４時間後に細胞を採取した。ＲＮＡｉＭａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて製造者の操作手順にしたがってｓｉＲＮＡトランスフェクションを実施した。ｓｉＲＮＡ配列：ｓｉＳＥＴ８＃１：５’−ＧＵＡＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＵＧＡＡＧＵ−３’；ｓｉＳＥＴ８＃２：５’−ＡＣＵＵＣＡＵＧＧＣＧＣＵＣＣＧＵＡＣＵＵ−３’；ｓｉＭＯＦ＃１：５’−ＧＵＧＡＵＣＣＡＧＵＣＵＣＧＡＧＵＧＡ−３’；ｓｉＭＯＦ＃２：５’−ＧＵＧＡＵＣＣＡＧＵＣＵＣＧＡＧＵＧＡ−３’；ｓｉＴＯＮＳＬ：５’−ＧＡＧＣＵＧＧＡＣＵＵＡＡＧＣＡＵＧＡ−３’。本試験に使用した全細胞株はマイコプラズマ汚染陰性について試験された。ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬに対する条件付きＵ−２−ＯＳ細胞をカバーガラス上で増殖させ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＡＦ）に１０分間、直接固定させるか、またはＣＳＫで洗浄し、ＣＳＫ／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分の予備抽出を行い、ＣＳＫおよびＰＢＳですすいでから４％  ＰＡＦ中で１０分固定させた。ＤＡＰＩを含有するＭｏｗｉｏｌ封入剤（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いてカバーガラスでスライドガラスを封入した。４０×または６０×の油浸対物レンズを備えたＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎシステムで蛍光画像を収集した。デコンボリューション顕微鏡法では、ｚ−スタック（０．２□ｍのステップ）を取得し、デコンボリューション処理をした後、ＳｏｆｔＷｏＲＸ  ５．０．０で解析した。ＳｏｆｔＷｏＲＸ  ５．０．０を使用して単一細胞でピアソンの係数による相関解析を実施した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６を使用して明るさとコントラストを調整した。ハイコンテント定量分析では、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳｃａｎＲハイコンテント顕微鏡を使用して蛍光画像を取得し、ＳｃａｎＲ解析ソフトウェアで処理した。試料あたり５０００以上の細胞を分析した。ＴＩＢＣＯ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアを用いてグラフを作製した。マイクロ照射実験では、カバーガラスで増殖させた細胞を４％ホルムアルデヒド中で１５分固定させ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳで５分間透過処理を行い、ＤＭＥＭに希釈した１次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。２次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、５６８および６４７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いて３０分染色した後、核染色ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）中でカバーガラスでスライドガラスを封入した。ＤＮＡ複製中のヌクレオチドの取り込み検出では、ＥｄＵ−Ｐｌｕｓ標識キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を製造者の指示書にしたがって使用した。Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ  ４０×／１．３油浸対物レンズ装備Ｚｅｉｓｓ−ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１に取り付けたＬＳＭ−７８０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ製）で共焦点画像を取得した。ＬＳＭ−ＺＥＮソフトウェアを用いて画像取得と解析を行った。細胞のレーザーマイクロ照射を基本的には記載のように実施した。
【０２１６】
実施例８
クローン原性アッセイ
ＧＦＰ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤのＷＴおよび変異体について誘導可能なＵ−２−ＯＳにｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、２４時間後にトリプシン処理を行い、テトラサイクリン存在下または非存在下で１０００または３０００細胞を技術的に３連で播種した。２４時間後、細胞を洗浄し、新鮮培地に１２〜１５日放置してから、固定し、ＭｅＯＨ／クリスタルバイオレット染色を行った。マニュアル式コロニー計数、またはＩｍａｇｅＪソフトウェアによるクリスタルバイオレット染色の定量によってコロニー形成能を測定し、非誘導対照に正規化した。
【０２１７】
実施例９
初期（Ｎａｓｃｅｎｔ）クロマチンキャプチャー（ＮＣＣ）
（Ａｌａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，２８１−２９３（２０１４））のＮＣＣ操作手順を接着Ｕ−２−ＯＳ細胞用に調整した。ｂ−ｄＵＴＰ標識の５分前にＣＰＴ（１μＭ）を加え、固定までの全工程で含んでいた。細胞を、ビオチン−ｄＵＴＰ含有低張緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）中で５分インキュベートし、新鮮細胞培地にさらに１５分再懸濁させた。細胞を１％ホルムアルデヒドで１５分固定し、ＰＢＳで２回すすいだ後、冷蔵室にてこすって採取した。スクロース緩衝液（０．３Ｍスクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および２ｍＭ  ＭｇＯＡｃ）中で核を機械的に単離した。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒを４℃にて使用して超音波破砕用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８）、０．２％ＳＤＳ、０．１％サルコシルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｒｋｏｓｙｌ）および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）中で３０秒ＯＮ、９０秒ＯＦＦを２８サイクル行ってクロマチンを可溶化した。ビオチンと共に予めインキュベートしたストレプトアビジンコート済み磁性ビーズ（ＭｙＣ１ストレプトアビジンビーズ）を使用して可溶化クロマチンをプレクリア処理した。次に、ｂ−ｄＵＴＰ標識されたクロマチンをストレプトアビジンコート済み磁性ビーズを使用して４℃で一晩かけて精製した。ビーズを洗浄用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．１％ＳＤＳ；１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で２分洗浄し、それを５回行った。総クロマチン（投入）および単離された初期クロマチンをＬＳＢ  １×（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、８％グリセロール、ブロモフェノールブルー）中、ビーズ上で４０分沸騰させ、ウエスタンブロット法のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＮＣＣの代わりに使用され得る代替的方法にはｉＰＯＮＤ（Ｓｉｒｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３，５９４−６０５（２０１２））がある。
【０２１８】
実施例１０
タンパク質−ペプチド複合体の未変性状態でのＭＳ分析
実施例１１、１２、１３、１４および１５に記載のペプチドを含め、さまざまなペプチドを得た。ペプチドがトリフルオロ酢酸塩（ＴＦＡ塩）形態の場合は、高分子弱陽イオン交換吸着剤（Ｓｔｒａｔａ  Ｘ−ＣＷ，  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（フランス、サルトルーヴィル）製）で脱塩し、Ｄｒｙペプチド（１〜３μｍｏｌ）を２００μＬの純水に可溶化させた（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（フランス、リヨン）製）。１ｍＭ水酸化アンモニウム水溶液（２０％濃縮水酸化アンモニウムから新たに調製した溶液）を添加して溶液のｐＨを７〜７．５に調整した。交換カラムの条件付けを１ｍＬのメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（フランス、リヨン）製）に次いで１ｍＬの水を用いて行った。溶液を注入し、５００μＬの純水でカラムを２回洗浄した。最後に、５００μＬのアセトニトリル／水／ギ酸混合物（２０：８０：５）を２回流して重力落下によりペプチドを溶出させた。期待ペプチドを含有する溶出画分を質量分析法により同定した。ＴＦＡ不含溶液をフリーズドライし白色固体を得た。固体を３００μＬの純水に溶解させ、その溶液を２回目のフリーズドライに供した。得られた固体に３００μＬの純水を加えてペプチドのストック溶液を調製し、その溶液の濃度を波長２０５ｎｍのＵＶで測定した。対応するペプチド配列の吸光係数を、Ｎｉｃｋ  Ａｎｔｈｉｓオンラインタンパク質パラメータ算出スクリプト（ｈｔｔｐ：／／ｎｉｃｋａｎｔｈｉｓ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ａ２０５．ｈｔｍｌ）を使用して計算した。未変性条件にて低加速電圧（Ｖｃ  ２５Ｖ）でタンパク質−ペプチド混合物を注入する質量分析法によってＴＦＡ付加物がないことを確認した。ＮＡＰ５カラム（ＮＡＰ（商標）−５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、精製したＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（すなわち、配列番号１６のＴＯＮＳＬのアミノ酸５１２〜６９２）に５００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ７．５）に対する緩衝液交換を行った。緩衝液を交換したタンパク質でブラッドフォード法によるタンパク質定量を実施した。タンパク質を水に希釈し最終濃度を１０μＭとし、Ｎａｔｉｖｅ  ＭＳ解析実施まで氷上維持した。
【０２１９】
チップベース全自動ｎａｎｏＥＳＩ装置（Ｔｒｉｖｅｒｓａ  Ｎａｎｏｍａｔｅ、Ａｄｖｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＹ、イサカ）製）を取り付けたエレクトロスプレー飛行時間型質量分析計（ＬＣＴ、Ｗａｔｅｒｓ（ＵＫ、マンチェスター））で質量分析（ＭＳ）を行った。０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸で酸性化した水／アセトニトリルの５０／５０混合液に希釈した０．４μＭのウマ心筋ミオグロビン溶液で生成させた多価イオンを使用し、質量範囲ｍ／ｚ２００〜６０００に対して陽イオンモードで外部校正を行った。タンパク質を、０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸で酸性化した水／アセトニトリルの５０／５０混合液に希釈して１μＭとし、変性条件下でＴＯＮＳＬ−ＡＲＤの均質性および純度を最初に確認した。質量測定により、分子量２０７４７．１８±０．３４Ｄａの種の存在が主に明らかにされた。ＥｔＯＨを５％の一定量（ｖ／ｖ）に維持しながら５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ７．５）中で未変性条件下のＴＯＮＳＬ−ＡＲＤに対するペプチド結合の特性解析を実施した。タンパク質濃度を１０μＭに設定し、モル当量１〜５の範囲の各種ペプチド濃度を加えた。インキュベーションを室温で１５分実施した。イオンが十分に脱溶媒され、気相の弱い非共有結合複合体の完全性が保たれる微調整機器設定値に相当する低コーン電圧（Ｖｃ＝５０Ｖ）と高インターフェース圧（Ｐｉ＝５ｍｂａｒ）を使用して質量スペクトルを記録した。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１を使用してデータの取得と処理を行った。数種のペプチド濃度（１０、２０、３０、４０、５０μＭ）を用いたＴＯＮＳＬ−ＡＲＤ１０μＭのインキュベーションにより、タンパク質−ペプチド複合体の未変性状態でのＭＳ分析を試みた。
【０２２０】
未変性条件下のデータ処理では、化合物の結合によるタンパク質応答因子の変性はないと仮定して、遊離および結合したＴＯＮＳＬ−ＡＲＤの電荷状態９＋および８＋のピーク高さからタンパク質−ペプチド複合体の存在量（％ＰＬ）を推定した。以下の方程式にしたがって化学量論比１：１の複合体を計算した。
【数１】
2018537411.tif 000005
【０２２１】
ＴＯＮＳＬ−ＡＲＤに対するペプチドの結合親和性（Ｋｄ）を推定するため、タンパク質／ペプチド混合物を、ペプチドとタンパク質の比を一定にし、最小検出限界に達するまでタンパク質濃度を低下させながら分析を行った。未変性条件下のデータ処理では、遊離および結合したＴＯＮＳＬ−ＡＲＤの電荷状態９＋および８＋のピーク高さからタンパク質−ペプチド複合体の存在量（％ＰＬ）を推定した。このタンパク質比を使って、結合したタンパク質、遊離タンパク質および遊離ペプチドの各濃度を計算する。各タンパク質／ペプチド濃度につき、以下の方程式を使用してＫｄを計算する。各ペプチドの最終Ｋｄは、異なるタンパク質／ペプチド比のＫｄの平均である。
【数２】
2018537411.tif 000006
【０２２２】
被験化合物
実施例１１
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−ＮＨ２
（ヒストンＨ４ペプチド）
ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ、ベルリン）より購入
【０２２３】
Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ  Ａｐｓ（デンマーク、コペンハーゲン）から以下のペプチドを入手し、当業者に公知の方法であるクロロトリチル樹脂のＦｍｏｃ化学を使用して調製した。
【０２２４】
実施例１２
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２２５】
実施例１３
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２２６】
実施例１４
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２２７】
実施例１５
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【０２２８】
実施例１０に記載のアッセイを使用し、以下の値を得た。
【表２】
2018537411.tif 000007
【０２２９】
実施例１６
構造に基づく低分子およびペプチド阻害剤の設計：
本発明の構造情報を使用し、我々は、リガンドの創薬アプリケーションに直接関連する、世界の販売業者による利用可能スクリーニング化合物（低分子およびペプチド）の化合物ライブラリーからの蓄積されたレパートリーの、大規模な仮想スクリーニングを実施しており、これにより、強力かつ有効なＴＯＮＳＬ阻害剤の開発が可能である。スクリーニング（インシリコ）した化合物ライブラリーおよび仮想スクリーニングのプロトコルを以下に記載する。
化学薬品販売業者のライブラリー：
対イオンと割り当てられている互変異性体、プロトン化状態、電荷および３Ｄ立体構造を記載した、生物学的に関連する１２，７８２，５９０のスクリーニング分子を有するＺＩＮＣデータベースの「Ｉｎ  Ｓｔｏｃｋ」サブセットを、ｈｔｔｐ：／／ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇから入手し、ＳＤＦファイルに保存した。
【０２３０】
ドッキング用ＴＯＮＳＬ構造の調製：
ａ．ヒストンＨ４尾部（Ｋ１２〜Ｄ２４）と結晶水分子をＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ複合体構造から除去した（実施例１を参照のこと）。
ｂ．すべての水素原子を構築し、ＩＣＭ（Ｍｏｌｓｏｆｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．（ＵＳＡ、ＣＡ、サンディエゴ）製）を使用して最適化した。
ｃ．Ｅ５３０、Ｄ５５９、Ｅ５６８およびＤ６０４周囲に中心のある相互作用グリッドボックス（２０×２０×２０Å）を、ＩＣＭ（Ｍｏｌｓｏｆｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．（ＵＳＡ、ＣＡ、サンディエゴ）製）ドッキングツールを使用して計算した。
ｄ．ＩＣＭ（Ｍｏｌｓｏｆｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．（ＵＳＡ、ＣＡ、サンディエゴ）製）を使用して、１２，７８２，５９０のスクリーニング分子（デフォルトのパラメータ）の完全なフレキシブル「リガンド」ドッキングを実施した。
ｅ．ＭＷ＜５００Ｄａ、０．２＜薬物様スコア＜１、ｃｌｏｇＰ値＜５、回転可能結合数＜１２、化合物のひずみ＜１０である、スコアが０．００１％の上位化合物の化学構造および予測される結合立体構造をマニュアルで評価した。
ｆ．最初に、合計４９の高スコア化合物を取得し、そのうち２７化合物を、標準的未変性状態でのＭＳ結合実験を使用してＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ結合について試験した。ＭＳ結合実験プロトコルは実施例１０に概説されている。
【０２３１】
ＴＯＮＳＬ−ＡＲＤの発見が初回結合スクリーニングで見つかる
非修飾ヒストンＨ４ペプチド尾部（配列番号）との競合結合実験における被験化合物のうち、「３−［（３−アミノシクロペンチル）カルボニル］−１Ｈ−キノリン−４−オン」足場に基づく少なくとも１つの化学種について、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ（配列番号１６のアミノ酸５１２〜６９２）に対する弱い結合が観察された。ＡＧ１０００２１（ＭＷ  ３１７）は、約２０％の複合体（２０μＭ）を生成し、この最初の結合実験で最も良く結合する化合物であった。
【０２３２】
構造データ
附属書１−ＴＯＮＳＬ−ＧＦＰの構造データ
「ヒストンＨ３−Ｈ４四量体に結合するヒトＴＯＮＳＬとＭＣＭ２  ＨＢＤＳの結晶構造」の座標を含む構造データは、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４としてＰＤＢデータベースで提供されている。本明細書で使用する用語「ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４」は、２０１６年４月１１日にＰＤＢに寄託されたＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４を指す。ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４にはＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ５ｊａ４／ｐｄｂがあり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ？ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＩｄ＝５ＪＡ４にてアクセス可能である。また、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４と同一の座標を含む構造データは、デンマーク特許出願ＰＡ２０１５  ００６０５の附属書１および米国特許出願第６２／３２４，２５７号の附属書１にも記載されている。
【０２３３】
配列データ
配列番号１−ＴＯＮＳＬ  ＷＴ／ＧＦＰ
【化１】
2018537411.tif 000008
2018537411.tif 000009
【０２３４】
配列番号２−ＴＯＮＳＬ  ＷＴ
【化２】
2018537411.tif 000010
2018537411.tif 000011
【０２３５】
配列番号３−ＴＯＮＳＬ  Ｅ５３０Ａ
【化３】
2018537411.tif 000012
2018537411.tif 000013
【０２３６】
配列番号４−ＴＯＮＳＬ  Ｅ５３０Ａ／ＧＦＰ
【化４】
2018537411.tif 000014
2018537411.tif 000015
【０２３７】
配列番号５−ＴＯＮＳＬ  Ｄ５５９Ａ
【化５】
2018537411.tif 000016
2018537411.tif 000017
【０２３８】
配列番号６−ＴＯＮＳＬ  Ｄ５５９Ａ／ＧＦＰ
【化６】
2018537411.tif 000018
2018537411.tif 000019
【０２３９】
配列番号７−ＴＯＮＳＬ  Ｗ５６３Ａ
【化７】
2018537411.tif 000020
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【０２４０】
配列番号８−ＴＯＮＳＬ  Ｗ５６３Ａ／ＧＦＰ
【化８】
2018537411.tif 000022
2018537411.tif 000023
【０２４１】
配列番号９−ＴＯＮＳＬ  Ｅ５６８Ａ
【化９】
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【０２４２】
配列番号１０−ＴＯＮＳＬ  Ｅ５６８Ａ／ＧＦＰ
【化１０】
2018537411.tif 000026
2018537411.tif 000027
【０２４３】
配列番号１１−ＴＯＮＳＬ  Ｎ５７１Ａ
【化１１】
2018537411.tif 000028
【０２４４】
配列番号１２−ＴＯＮＳＬ  Ｎ５７１Ａ／ＧＦＰ
【化１２】
2018537411.tif 000029
2018537411.tif 000030
【０２４５】
配列番号１３−ＴＯＮＳＬ  Ｄ６０４Ａ
【化１３】
2018537411.tif 000031
2018537411.tif 000032
【０２４６】
配列番号１４−ＴＯＮＳＬ  Ｄ６０４Ａ／ＧＦＰ
【化１４】
2018537411.tif 000033
2018537411.tif 000034
【０２４７】
配列番号１５−ＴＯＮＳＬ融合体（ＭＣＭ２  ＨＢＤ−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤ）
【化１５】
2018537411.tif 000035
【０２４８】
配列番号１６−ＴＯＮＳＬ野生型（単一変異体の変異アミノ酸を強調表示）
＞ｇｉ｜１８７６０８７７７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３８４６０．４｜ｔｏｎｓｏｋｕ様タンパク質［ホモ・サピエンス］
【化１６】
2018537411.tif 000036
【０２４９】
配列番号１７−ＴＯＮＳＬ  Ｅ５３０Ａ単一変異体のタンパク質配列（変異アラニンを強調表示）
【化１７】
2018537411.tif 000037
【０２５０】
配列番号１８−ＴＯＮＳＬ  Ｄ５５９Ａのタンパク質配列
【化１８】
2018537411.tif 000038
【０２５１】
配列番号１９−ＴＯＮＳＬ  Ｗ５６３Ａのタンパク質配列
【化１９】
2018537411.tif 000039
【０２５２】
配列番号２０−ＴＯＮＳＬ  Ｅ５６８Ａのタンパク質配列
【化２０】
2018537411.tif 000040
【０２５３】
配列番号２１−ＴＯＮＳＬ  Ｎ５７１Ａのタンパク質配列
【化２１】
2018537411.tif 000041
【０２５４】
配列番号２２−ＴＯＮＳＬ  Ｄ６０４Ａのタンパク質配列
【化２２】
2018537411.tif 000042
【０２５５】
配列番号２３−ヒストンＨ４のタンパク質配列
＞ｓｐ｜Ｐ６２８０５｜Ｈ４＿ヒト  ヒストンＨ４  ＯＳ＝ホモ・サピエンス
【化２３】
2018537411.tif 000043
【０２５６】
配列番号２４−ＭＣＭ２のタンパク質配列
＞ｓｐ｜Ｐ４９７３６｜ＭＣＭ２＿ヒト  ＤＮＡ複製ライセンス因子ＭＣＭ２  ＯＳ＝ホモ・サピエンス
【化２４】
2018537411.tif 000044
【０２５７】
配列番号２５−ヒストンＨ３．３のタンパク質配列
＞ｓｐ｜Ｐ８４２４３｜Ｈ３３＿ヒト  ヒストンＨ３．３  ＯＳ＝ホモ・サピエンス
【化２５】
2018537411.tif 000045
【０２５８】
配列番号２６
ＲＨＸＫ
【０２５９】
配列番号２７
ＲＨＸＫＶＬ
【０２６０】
配列番号２８
ＲＨＸＫＶＬＲ
【０２６１】
配列番号２９
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
【０２６２】
配列番号３０
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
【０２６３】
配列番号３１
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
【０２６４】
配列番号３２
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
【０２６５】
配列番号３３
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ
【０２６６】
配列番号３４−ヒストンＨ４のタンパク質配列
ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲＤＮＩＱＧＩＴＫＰＡＩＲＲＬＡＲＲＧＧＶＫＲＩＳＧＬＩＹＥＥＴＲＧＶＬＫＶＦＬＥＮＶＩＲＤＡＶＴＹＴＥＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ
【０２６７】
本発明事項
本発明のいくつかの態様はさらに以下の項によって特定され得る。
【０２６８】
１．残基Ｋ１２〜Ｒ２３を包含するヒストンＨ４尾部が占める、ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの立体構造空間を標的とし、前記Ｈ４尾部Ｋ１２〜Ｒ２３と前記ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤとの結合を、直接的な競合を介するか、またはアロステリックによる結合ポケットの破壊を介して阻止または破壊するよう作用する、低分子。
【０２６９】
２．前記Ｈ４尾部の伸長残基Ｌｙｓ１２からＡｒｇ２３を、分子間の水素結合、静電的相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を介して標的とする、項１に記載の低分子。
【０２７０】
３．前記分子は、Ｈ４のＬｙｓ１２−Ｇｌｙ１３−Ｇｌｙ１４−Ａｌａ１５セグメントに及ぶ分子間接触を標的とする、項１〜２のいずれかに記載の低分子。
【０２７１】
４．前記分子は、Ｈ４の残基Ｇｌｙ１３、Ｇｌｙ１４およびＡｌａ１５と、ＡＲＤの残基Ａｓｎ５０７、Ｃｙｓ５０８、Ｔｒｐ６４１、Ｔｙｒ６４５およびＬｅｕ６４９との間の疎水性相互作用を標的とする、項１〜３のいずれかに記載の低分子。
【０２７２】
５．前記分子は、Ｈ４  Ｇｌｙ１４の主鎖のＯとＡＲＤ  Ｔｒｐ６４１のＮε１との間の水素結合、およびＨ４  Ａｌａ１５の主鎖のＮとＡＲＤ  Ｔｙｒ６４５のＯηとの間の水素結合を標的とする、項１〜４のいずれかに記載の低分子。
【０２７３】
６．前記分子は、ＡＲＤ  Ａｓｎ５７１のＮδ２と水素結合するＨ４  Ｌｙｓ１６の主鎖のＯを標的とする、項１〜５のいずれかに記載の低分子。
【０２７４】
７．前記分子は、Ｈ４  Ａｒｇ１７の側鎖を標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ａｒｇ１７の側鎖は、ＡＲＤのＴｙｒ５７２およびＣｙｓ６０８の両側鎖にわたって積み重なる一方で、そのＮη１原子はＡＲＤ  Ａｓｎ５７１の主鎖のＯおよびＯδ１との２つの水素結合を形成する、項１〜６のいずれかに記載の低分子。
【０２７５】
８．前記分子は、Ｈ４  Ｈ１８の側鎖を標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ｈ１８の側鎖は、厳密に保存された４つの残基（Ｔｒｐ５６３、Ｇｌｕ５６８、Ａｓｎ５７１およびＡｓｐ６０４）を結んでできるポケット内へ深く入り込んでおり、ＡＲＤのＨｉｓ５６７上に位置している、項１〜７のいずれかに記載の低分子。
【０２７６】
９．前記分子は、Ｈ４  Ｈｉｓ１８の側鎖を標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ｈｉｓ１８の側鎖は、Ｔｒｐ５６３とＡｓｎ５７１の間で積み重なり、ＡＲＤのＧｌｕ５６８およびＡｓｐ６０４と水素結合を形成する、項１〜８のいずれかに記載の低分子。
【０２７７】
１０．前記分子は、Ｈ４  Ａｒｇ１９の主鎖のＯを標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ａｒｇ１９の主鎖のＯは、Ｔｒｐ５６３のＮε１と水素結合を形成し、その側鎖はＡＲＤのＣｙｓ５６１およびＧｌｙ５９５との接触を形成する、項１〜９のいずれかに記載の低分子。
【０２７８】
１１．前記分子は、Ｈ４  Ｈｉｓ１８結合ポケットに隣接するＡＲＤ表面の酸性ポケット内で結合しているＨ４  Ｌｙｓ２０残基を標的とする、項１〜１０のいずれかに記載の低分子。
【０２７９】
１２．前記分子は、Ｈ４  Ｌｙｓ２０の側鎖を標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ｌｙｓ２０の側鎖は、Ｍｅｔ５２８の側鎖と相互作用し、ＡＲＤのＴｒｐ５６３の縁部と接触する一方、Ｈ４  Ｌｙｓ２０の主鎖の原子はＡＲＤのＣｙｓ５６１に対して集まり、項１〜１１のいずれかに記載の低分子。
【０２８０】
１３．前記分子は、Ｈ４  Ｌｙｓ２０のＮζ原子を標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ｌｙｓ２０のＮζ原子は、ＡＲＤの厳密に保存された残基Ｇｌｕ５３０、Ａｓｐ５５９およびＧｌｕ５６８の各側鎖と３つの強い水素結合（距離＜３Å）を形成し、それが正三角形様に整列してＨ４  Ｌｙｓ２０を囲んでいる、項１〜１２のいずれかに記載の低分子。
【０２８１】
１４．前記分子は、Ｈ４のＶａｌ２１−Ｌｅｕ２２−Ａｒｇ２３セグメントに及ぶ分子間接触を標的とし、ここで、前記Ｈ４のＶａｌ２１−Ｌｅｕ２２−Ａｒｇ２３セグメントに及ぶ分子間接触には、Ｈ４  Ｖａｌ２１の側鎖と、ＡＲＤのＴｙｒ５６０およびＣｙｓ５６１との間の接触が含まれ、Ｈ４  Ｌｅｕ２２はＡＲＤのＡｓｐ５２７およびＭｅｔ５２８と相互作用する、項１〜１３のいずれかに記載の低分子。
【０２８２】
１５．前記分子は、Ｈ４  Ａｒｇ２３の主鎖のＮを標的とし、ここで、前記Ｈ４  Ａｒｇ２３の主鎖のＮは、ＡＲＤのＡｓｐ５２７の主鎖のＯと水素結合を形成する一方、側鎖はＡＲＤのＴｙｒ５６０の側鎖に対して集まる、項１〜１４のいずれかに記載の低分子。
【０２８３】
１６．ＴＯＮＳＬ、ＢＡＲＤ１およびＡＮＫＲＤ１１からなる群から選択されるタンパク質のヒストン読み取りドメインを遮断することができる、項１〜１５のいずれかに記載の低分子。
【０２８４】
１７．医薬品として使用するための、項１〜１６のいずれかに記載の低分子。
【０２８５】
１８．癌治療に使用するための、項１〜１７のいずれかに記載の低分子。
【０２８６】
１９．ＴＯＮＳＬのアンキリンリピートの表面にあるヒストンＨ４Ｈ１８およびＨ４Ｋ２０の結合ポケットに障害を与えることのできる低分子を選択または設計する方法であって、ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４に含有される原子座標データの少なくとも一部またはそこから誘導可能なデータを使用することを含み、また、Ｈ３（５７〜１３５）およびＨ４と複合体をなすＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤの構造の全部または一部のモデリングを行うコンピュータモデリングパッケージまたはコンピュータプログラムを使用して、モデリングした構造と相互作用する能力の可能性に基づいて分子を設計または選択することによって前記分子を同定する、前記方法。
【０２８７】
２０．配列番号１〜２２のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する、単離されたポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列。
【０２８８】
２１．Ｈ３（５７〜１３５）およびＨ４（２．４３Å分解能まで回折）と複合体をなす、共有結合で連結されたＭＣＭ２  ＨＢＤ−Ｇ４−ＴＯＮＳＬ  ＡＲＤを含む、結晶。
【０２８９】
２２．ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＡ４に記載の原子座標もしくはそのサブセットを有するか、またはそこに記載の原子座標から任意の方向への原子座標変動が３Å未満である構造を有する、結晶構造。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2018537411.tif 000062
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2018537411.tif 000080
【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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