(57)【要約】  本発明は、ピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ならびにピオケリンに対する結合特異性を有し、診断および／または治療用途を含む様々な用途において、例えば、緑膿菌の増殖を阻害もしくは減少させるためにならびに／または緑膿菌バイオフィルム感染および緑膿菌バイオフィルム感染に関連する疾患もしくは障害を予防もしくは処置するために使用することができる融合分子に関する。また本発明は、本明細書に記載の融合分子を製造する方法ならびにそのような融合分子を含む組成物およびキットに関係する。さらに本発明は、本明細書に記載の融合分子をコードする核酸分子に関する。
2018524003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ならびにピオケリンに対する結合特異性を有する融合分子であって、
（ａ）ピオベルジンＩ型に結合するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）ムテインを含む第１のポリペプチド；
（ｂ）ピオベルジンＩＩ型に結合するｈＮＧＡＬムテインを含む第２のポリペプチド；
（ｃ）ピオベルジンＩＩＩ型に結合するｈＮＧＡＬムテインを含む第３のポリペプチド；および
（ｄ）ピオケリンに結合するｈＮＧＡＬムテインを含む第４のポリペプチド；
を含み、ここで、第１、第２、第３および第４のポリペプチドは共有結合によって連結されている、前記融合分子。
【請求項２】
ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３４、３６、３９〜４２、４４〜４７、４９、５２、５４〜５５、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４、１４１および１４５位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む、請求項１に記載の融合分子。
【請求項３】
ｈＮＧＡＬムテインは、ピオベルジンＩ型、ピオベルジンＩＩ型、ピオベルジンＩＩＩ型およびピオケリンにそれぞれ２００ｎＭ以下の解離定数ＫＤで結合する、請求項１または２に記載の融合分子。
【請求項４】
第１、第２、第３および第４のポリペプチドは、リンカー分子、特にペプチドリンカーを介して共有結合によって連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項５】
融合分子の多量体化を可能にする多量体化ドメイン、特に、融合分子の二量体化を可能にする二量体化ドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項６】
二量体化ドメインは、Ｆｃドメイン、ＩｇＥ重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）、ＩｇＭ重鎖ドメイン２（ＭＨＤ２）、ＩｇＧ重鎖ドメイン３（ＧＨＤ３）、ＩｇＡ重鎖ドメイン３（ＡＨＤ２）、ＩｇＤ重鎖ドメイン３（ＤＨＤ３）、ＩｇＥ重鎖ドメイン４（ＥＨＤ４）、ＩｇＭ重鎖ドメイン４（ＭＨＤ４）、ウテログロビン二量体化ドメイン、および上記のいずれか１つのバリアントまたは断片からなる群から選択され、ここで、特に、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメインである、請求項５に記載の融合分子。
【請求項７】
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−Ｘ４−Ｃ’                （Ｉ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−Ｘ４−Ｌ４−ＭＤ−Ｃ’    （ＩＩ）、
Ｎ’−ＭＤ−Ｌ１−Ｘ１−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’    （ＩＩＩ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＭＤ−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’    （ＩＶ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−ＭＤ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’    （Ｖ）、および
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−ＭＤ−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’    （ＶＩ）
からなる群から選択される一般式を有し、
ここで、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、出現する毎に、第１、第２、第３および第４のポリペプチドからなる群から選択され、但し、融合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチドのそれぞれを含み；
ＭＤは、多量体化ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、出現する毎に、共有結合およびリンカー分子から独立して選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項８】
多量体（例えば、二量体）複合体として存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項９】
以下の特性：
（ｉ）融合分子の検出および／または単離を可能にする少なくとも１つの標識またはタグをさらに含む；
（ｉｉ）融合分子の安定性を増加させるおよび／または融合分子の血清半減期を延長させる１つまたはそれ以上の修飾をさらに含む；
（ｉｉｉ）緑膿菌によるピオケリンおよび／またはピオベルジンを介した鉄取り込みを阻害または減少させる；
（ｉｖ）緑膿菌による毒性因子発現を阻害または減少させる；
（ｖ）ピオケリンおよび／またはピオベルジン媒介シグナル伝達を阻害または減少させる；
（ｖｉ）緑膿菌細菌増殖を阻害または減少させる；ならびに
（ｖｉｉ）薬学的活性剤に会合しているまたはコンジュゲート／融合しており、ここで、特に、該薬学的活性剤は、抗生物質、細胞分裂抑制剤、毒素、金属もしくは金属化合物／錯体、キレート剤、ハプテンおよび抗体からなる群から選択される
のうちの１つまたはそれ以上を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１０に記載の核酸分子、または請求項１１に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の細胞、または請求項１２に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の細胞、または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
対象における緑膿菌バイオフィルム感染の予防または処置における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の細胞、または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
対象における緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の予防または処置における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合分子、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の細胞、または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
緑膿菌バイオフィルム感染は急性または慢性感染である、請求項１５または１６に記載の使用のための融合分子、核酸分子、細胞、または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ならびにピオケリンに対する結合特異性を有し、診断および／または治療用途を含む様々な用途において、例えば、緑膿菌の増殖を阻害もしくは減少させるためにならびに／または緑膿菌バイオフィルム感染および緑膿菌バイオフィルム感染に関連する疾患もしくは障害を予防もしくは処置するために使用することができる融合分子に関する。また本発明は、本明細書に記載の融合分子を製造する方法ならびにそのような融合分子を含む組成物およびキットに関係する。さらに本発明は、本明細書に記載の融合分子をコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））は、主として組織損傷に関連して、急性感染を引き起こす日和見病原体である。緑膿菌は、留置デバイスおよび遺伝的障害である嚢胞性線維症を有する患者の肺組織にバイオフィルムを形成する。バイオフィルム感染は、従来の抗生物質療法で処置することが困難である。しかしながら、研究によって緑膿菌による適切なバイオフィルム形成には鉄が必須であることが実証されており、したがって、鉄取り込み機構が抗シュードモナス療法のための潜在的標的である。
【０００３】
緑膿菌は、分泌される鉄結合性シデロフォアのピオケリンおよびピオベルジンを使用して、宿主環境から鉄を捕捉することができる。ピオベルジン（Ｐｖｄ）は、ペプチドが連結された、ヒドロキサム酸およびカテコール型配位子であり、ピオケリン（Ｐｃｈ）は、サリチレートと２分子のシステインとの誘導体化コンジュゲートであって、フェノール、カルボキシレートおよびアミン配位子官能基を有する。ＰｖｄとＰｃｈは両方とも、緑膿菌の毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）に関与し、いくらかの相乗作用の兆候を示すことが実証されている。いずれのシデロフォアも生成できない二重欠損変異体は、２つのシデロフォアのうちの１つしか生成できないいずれかの単一欠損変異体よりも、毒性がはるかに減弱化している（非特許文献１）。さらに、ピオベルジンは、いくつかの毒性因子ならびにピオベルジン自体の産生を制御するシグナル伝達分子として作用し；一方で、ピオケリンは、第二鉄に加えて緑膿菌の病原性に関わる二価金属、例えば第一鉄および亜鉛の取得のための機構の一部となりうることが提唱されている（Ｖｉｓｃａら、１９９２）。
【０００４】
構造的に異なる３つのピオベルジンの型または群が、いくつかの緑膿菌株：緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９２（非特許文献２）、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３（非特許文献３）および天然の単離体、緑膿菌Ｒ（非特許文献４）から同定されている。さらに、参照株：緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９２（Ｉ型ＰｖｄまたはＰｖｄ  Ｉ）、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３（ＩＩ型ＰｖｄまたはＰｖｄ  ＩＩ）および臨床分離株緑膿菌Ｒおよびｐａ６（ＩＩＩ型ＰｖｄまたはＰｖｄ  ＩＩＩ）による、８８の臨床分離株および上述の２つの収集株に対する比較生物学的調査から、３つの異なる株に特異的なピオベルジン媒介鉄取り込み機構が明らかにされた（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
各ピオベルジン型には、側鎖が異なるスクシニル、スクシナミドまたはα−ケトグルタリルの３つのメンバー（サブタイプ）、つまり、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシニル、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシナミド、Ｐｖｄ  Ｉ型α−ケトグルタリル、Ｐｖｄ  ＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩ型スクシナミド、Ｐｖｄ  ＩＩ型α−ケトグルタリル、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシナミドおよびＰｖｄ  ＩＩＩ型α−ケトグルタリルがある。
【０００６】
緑膿菌株はそれぞれ１つのＰｖｄ型を発現する、つまり、緑膿菌ＡＴＣＣ１５６９２はＩ型Ｐｖｄを発現し、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３はＩＩ型Ｐｖｄを発現し、緑膿菌Ｒおよびｐａ６はＩＩＩ型Ｐｖｄを発現し、ここで各Ｐｖｄ型にはそれぞれの型の３つ全てのメンバーが含まれ、また前記株はそれぞれピオケリンも発現する。
【０００７】
本発明者らは、ピオベルジンおよびピオケリンを緑膿菌の病原性にとって重大な標的として特定し、そのような標的、つまり、側鎖が異なる３つのメンバー（サブタイプ）（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、Ｐｖｄ  Ｉ  ｓａ、Ｐｖｄ  Ｉ  αＫＧ、Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓａ、Ｐｖｄ  ＩＩ  αＫＧ、Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓａ、Ｐｖｄ  ＩＩＩ  αＫＧ）の全ての型を含む各Ｐｖｄ型ならびにＰｃｈに対して、遊離のシデロフォアならびに鉄が結合したシデロフォアのいずれの場合にも特異的で、従来の抗生物質により課される強い選択圧を生じさせない、阻害剤を開発した（特許文献１も参照）。
【０００８】
バイオフィルム様式の増殖が、持続的な緑膿菌感染のために重要であると考えられている（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎら、１９９９；Ｓｉｎｇｈら、２０００）。またＰｖｄおよびＰｃｈ遺伝子の二重発現が、正常なバイオフィルム発達のために必要である（Ｂａｎｉｎら、２００５）。緑膿菌が産生する一連の印象的な毒性因子が全てその病原性において役割を果たしていることを考慮すると、緑膿菌の毒性を効率的に阻害するための好適な戦略は、いくつかの毒性因子を標的とすることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ１５３０５２４２．８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔａｋａｓｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０００年４月、１８３４〜１８３９頁
【非特許文献２】Ｂｒｉｓｋｏｔら、１９８９、Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ  Ｃｈｅｍ、３７５〜３８４頁
【非特許文献３】Ｔａｐｐｅら、１９９３、Ｊ．Ｐｒａｋｔ−Ｃｈｅｍ．、３３５、８３〜８７頁
【非特許文献４】Ｇｉｐｐら、１９９１、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、４６ｃ、５３４〜５４１頁
【非特許文献５】Ｃｏｒｎｅｌｌｓら、１９８９、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、５７、３４９１〜３４９７頁
【非特許文献６】Ｍｅｙｅｒら、１９９７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４３、３５〜４３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、ピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ならびにピオケリンに対する結合特異性を有する融合分子であって、
（ａ）ピオベルジンＩ型に結合するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ、ｈＮＧＡＬ）ムテインを含むまたはそれからなる第１のポリペプチド；
（ｂ）ピオベルジンＩＩ型に結合するｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなる第２のポリペプチド；
（ｃ）ピオベルジンＩＩＩ型に結合するｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなる第３のポリペプチド；および
（ｄ）ピオケリンに結合するｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなる第４のポリペプチド；
を含み、ここで、第１、第２、第３および第４のポリペプチドは共有結合によって連結されている、前記融合分子に関する。
【００１２】
一実施形態では、ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３４、３６、３９〜４２、４４〜４７、４９、５２、５４〜５５、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４、１４１および１４５位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む。
【００１３】
一実施形態では、ｈＮＧＡＬムテインは、ピオベルジンＩ型、ピオベルジンＩＩ型、ピオベルジンＩＩＩ型およびピオケリンにそれぞれ２００ｎＭ以下の解離定数ＫＤで結合する。
【００１４】
一実施形態では、第１、第２、第３および第４のポリペプチドは、リンカー分子を介して共有結合によって連結されている。
【００１５】
一実施形態では、リンカー分子は、ペプチドリンカーである。
【００１６】
一実施形態では、融合分子は、融合分子の多量体化を可能にする多量体化ドメインをさらに含む。
【００１７】
一実施形態では、多量体化ドメインは、融合分子の二量体化を可能にする二量体化ドメインである。
【００１８】
一実施形態では、二量体化ドメインは、Ｆｃドメイン、ＩｇＥ重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）、ＩｇＭ重鎖ドメイン２（ＭＨＤ２）、ＩｇＧ重鎖ドメイン３（ＧＨＤ３）、ＩｇＡ重鎖ドメイン３（ＡＨＤ２）、ＩｇＤ重鎖ドメイン３（ＤＨＤ３）、ＩｇＥ重鎖ドメイン４（ＥＨＤ４）、ＩｇＭ重鎖ドメイン４（ＭＨＤ４）、ウテログロビン二量体化ドメインおよび上記のいずれか１つのバリアントまたは断片からなる群から選択される。
【００１９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメインである。
【００２０】
一実施形態では、融合分子は、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−Ｘ４−Ｃ’                  （Ｉ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−Ｘ４−Ｌ４−ＭＤ−Ｃ’      （ＩＩ）、Ｎ’−ＭＤ−Ｌ１−Ｘ１−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （ＩＩＩ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＭＤ−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （ＩＶ）、Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−ＭＤ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （Ｖ）、および
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−ＭＤ−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （ＶＩ）
からなる群から選択される一般式を有し、
ここで、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、存在する毎に、第１、第２、第３および第４のポリペプチドからなる群から選択され、但し、融合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチドのそれぞれを含み；
ＭＤは、多量体化ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、存在する毎に、共有結合およびリンカー分子から独立して選択される。
【００２１】
一実施形態では、融合分子は、多量体（例えば、二量体）複合体として存在する。
【００２２】
一実施形態では、融合分子は、融合分子の検出および／または単離を可能にする少なくとも１つの標識またはタグをさらに含む。
【００２３】
一実施形態では、融合分子は、融合分子の安定性を増加させるおよび／または融合分子の血清半減期を延長させる１つまたはそれ以上の修飾をさらに含む。
【００２４】
一実施形態では、融合分子は、緑膿菌によるピオケリンおよび／またはピオベルジンを介した鉄取り込みを阻害または減少させる。
【００２５】
一実施形態では、融合分子は、緑膿菌による毒性因子発現を阻害または減少させる。
【００２６】
一実施形態では、融合分子は、ピオケリンおよび／またはピオベルジン媒介シグナル伝達を阻害または減少させる。
【００２７】
一実施形態では、融合分子は、緑膿菌細菌増殖を阻害または減少させる。
【００２８】
一実施形態では、融合分子は、薬学的活性剤に会合しているまたはコンジュゲート／融合している。
【００２９】
一実施形態では、薬学的活性剤は、抗生物質、細胞分裂抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、毒素、金属または金属化合物／錯体、キレート剤、ハプテンおよび抗体からなる群から選択される。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、上記に定義される融合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００３１】
一実施形態では、核酸分子は、核酸分子の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結されている。
【００３２】
一実施形態では、核酸分子は、ベクターに含まれている。
【００３３】
別の態様では、本発明は、上記に定義される核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、上記に定義される融合分子を製造する方法であって、ここで、融合分子は、（ｉ）上記に定義される宿主細胞を、該融合分子の発現を可能にする条件下で培養し、該宿主細胞またはその培養培地から該融合分子を単離することによって、または（ｉｉ）上記に定義される核酸分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳することによって製造される、前記方法に関する。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、または上記に定義される細胞を含む医薬組成物に関する。
【００３６】
一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。
【００３７】
一実施形態では、医薬組成物は、追加の薬学的活性剤をさらに含む。
【００３８】
一実施形態では、追加の薬学的活性剤は、抗生物質、細胞分裂抑制剤、毒素、金属または金属化合物／錯体、キレート剤、ハプテンおよび抗体からなる群から選択される。
【００３９】
さらに別の態様では、本発明は、上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、上記に定義される細胞、または上記に定義される医薬組成物を含むキットに関する。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、上記に定義される細胞、または上記に定義される医薬組成物に関する。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、対象における緑膿菌バイオフィルム感染の予防または処置における使用のための、上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、上記に定義される細胞、または上記に定義される医薬組成物に関する。
【００４２】
さらに別の態様では、本発明は、対象における緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の予防または処置における使用のための、上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、上記に定義される細胞、または上記に定義される医薬組成物に関する。
【００４３】
さらに別の態様では、本発明は、対象における緑膿菌バイオフィルム感染を予防または処置する方法であって、有効量の上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、上記に定義される細胞、または上記に定義される医薬組成物を該対象に投与することを含む、前記方法に関する。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、対象における緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害を予防または処置する方法であって、有効量の上記に定義される融合分子、上記に定義される核酸分子、上記に定義される細胞、または上記に定義される医薬組成物を該対象に投与することを含む、前記方法に関する。
【００４５】
一実施形態では、緑膿菌バイオフィルム感染は、急性または慢性感染である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１−１】緑膿菌シデロフォアの構造を示す図である。図１Ａ〜Ｃは、３つの緑膿菌ピオベルジンの構造を示す。図１Ａ：Ｐｖｄ  Ｉ型の構造（Ｂｉｒｓｋｏｔら、１９８９参照）；図１Ｂ：Ｐｖｄ  ＩＩ型の構造（Ｂｉｒｓｋｏｔら、１９８９参照）；図１Ｃ：Ｐｖｄ  ＩＩＩ型の構造（Ｇｉｐｐら、１９９１）；図１Ｄ：クロモフォア部分に付着したＲは、スクシニル、スクシンアミド、またはα−ケトグルタリル（ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｙｌ）側鎖であってもよい；および図１Ｅ：ピオケリンの構造（Ｂｒａｎｄｅｌら、２０１１）。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】配列番号１６のリポカリンムテインに結合しているＰｖｄ  Ｉ  ｓ（＋Ｆｅ）（Ａ）、配列番号３６のリポカリンムテインに結合しているＰｖｄ  ＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）（Ｂ）、配列番号５３のリポカリンムテインに結合しているＰｖｄ  ＩＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）（Ｃ）、および配列番号６２に結合しているピオケリン（＋Ｆｅ）（Ｄ）の表面プラズモン共鳴による会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の典型的な測定値を示す図である。さらに、１２００ｎＭの各シデロフォア（ピオケリンについては２００ｎＭ））が配列番号６４の陰性対照に結合しないことが図２Ｅ〜Ｈに示されている。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】表面プラズモン共鳴により決定した配列番号３５のリポカリンムテインの例示的特異性および交差反応性プロフィールを示す図である。ピオベルジンＩＩスクシニル、スクシンアミド、およびα−ケトグルタリルへの特異的結合が示され、一方、Ｉ型およびＩＩＩ型のピオベルジン、ピオケリン、エンテロバクチン、ならびにデフェロキサミンへの結合がないことが示されている。全ての分析物に対して２μＭの高濃度が使用されている。
【図４Ａ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ａ：配列番号１６のＰｖｄ  Ｉ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べてＰｖｄ  Ｉ特異的緑膿菌株（ＡＴＣＣ２７８５３）の増殖阻害を示す。
【図４Ｂ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ｂ：配列番号１９および３６のＰｖｄ  ＩＩ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べてＰｖｄ  ＩＩ特異的緑膿菌株（ＡＴＣＣ１５６９２）の増殖阻害を示す。配列番号３６は、配列番号１９と比べてより高い結合親和性を有し、より大きな増殖阻害を示す。
【図４Ｃ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ｃ：配列番号５３のＰｖｄ  ＩＩＩ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べてＰｖｄ  ＩＩＩ特異的緑膿菌株（ＡＴＣＣ３３３６０）の増殖阻害を示す。
【図４Ｄ】増殖阻害アッセイからの例示的データを示す図である。図４Ｄ：配列番号６２のＰｃｈ特異的ムテインは、ムテインなし増殖対照培養物と比べて鉄取り込みをＰｃｈに依存するＰｖｄ  Ｉノックアウト緑膿菌株（ＡＴＣＣ１５６９２  ΔｐｖｄＡ）の増殖阻害を示す。１０μＭリポカリンムテインを該アッセイに適用した。
【図５】細菌チャレンジの１時間前および細菌チャレンジ時点の配列番号１９の投与が、マウスにおける感染の発生を用量依存的に防ぐことをマウスにおける緑膿菌誘発肺感染モデルで示す図である。２００μｇ／マウスの配列番号１９から開始し、有意な予防効果が観察された。最大効果は２０００μｇ／マウスであった。
【図６】１位の開始メチオニン、２位のリジン、３〜８位のヘキサヒスチジンタグ、９〜１５位のアミノ酸ＤＹＤＩＰＴＴのリンカー領域（配列番号１３２）、１６〜２２位のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３３）と、これに続く２３位以降の目的とするムテインのアミノ酸配列を含む、結晶化発現アミノ酸配列（配列番号１２９）を示す図である。
【図７】配列番号３１−Ｐｖｄ−Ｆｅ複合体構造を示す図である。２つの配列番号３１の分子、すなわち非対称ユニットからのＡ鎖およびＢ鎖のオーバーレイが示されている。
【図８】配列番号３１とＰｖｄ−Ｆｅの相互作用を示す図である。非対称ユニットからの２つの分子がオーバーレイされている。Ｐｖｄ−Ｆｅと相互作用する側鎖が描かれている。
【図９】Ｐｖｄ組成を示す図である。鉄結合に関与する酸素原子が四角で囲まれている。
【図１０Ａ】本発明による融合分子の構造を示す図である。リポカリンムテイン１、２、３、および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介して遺伝子的に融合させた。ＬＭ１（配列番号３４または３６）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１６または１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０または５３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６２または６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。融合分子構築物（配列番号１３４または１３５）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群に対する１つの結合部分およびピオケリンに対する１つの結合部分を有した。
【図１０Ｂ】本発明によるＦｃ融合分子構築物の構造を示す図である。リポカリンムテイン１、２、３、および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介してヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＮ末端に遺伝子的に融合した。ＬＭ１（配列番号３４または３６）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１６または１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０または５３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６２または６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。Ｆｃ融合分子構築物（配列番号１３６または１３７）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群およびピオケリンに対する２つの結合部分を有した。
【図１０Ｃ】本発明によるＦｃ融合分子構築物の構造を示す図である。リポカリンムテイン１、２、３、および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介してヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＣ末端に遺伝子的に融合させた。ＬＭ１（配列番号３４）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。Ｆｃ融合分子構築物（配列番号１３８）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群およびピオケリンに対する２つの結合部分を有した。
【図１０Ｄ】本発明によるＦｃ融合分子構築物の構造を示す図である。リポカリンムテイン１および２および３および４（ＬＭ１、２、３、４）を、リンカー分子（ここでは配列（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカー；配列番号１４１参照）を介して遺伝子的に融合させた。ＬＭ１およびＬＭ２は、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＮ末端に遺伝子的に融合させ、ＬＭ３およびＬＭ４は、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメイン（ｈｕ  ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１４０）のＣ末端に遺伝子的に融合させた。ＬＭ１（配列番号３４）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ２（配列番号１７）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ３（配列番号５０）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオベルジンＩＩＩ群シデロフォアに結合し、ＬＭ４（配列番号６３）は、鉄イオンが結合しているおよび鉄イオンと錯体形成していないピオケリンシデロフォアに結合した。Ｆｃ融合分子構築物（配列番号１３９）は、１個の分子に全ての緑膿菌シデロフォアに対する結合能を含み、各Ｐｖｄ群およびピオケリンに対する２つの結合部分を有した。
【図１１】精製融合分子（ここでは配列番号１３４）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図１２】ＥＬＩＳＡベースのアッセイで決定した、溶液中の異なるピオベルジン群の鉄負荷スクシニルバリアントおよび鉄負荷ピオケリンへの、配列番号１３７、１３８、および１３９の異なるＦｃ融合分子構築物ならびに配列番号１７、３４、５０、および６３の各単一リポカリンムテインの結合を示す図である。全てのＦｃ融合分子フォーマットが単一標的への結合において活性であり、単一リポカリンムテインのＩＣ５０値に匹敵するＩＣ５０値を有した。
【図１３】融合分子（ここでは配列番号１３４）が、ピオベルジンおよびピオケリンの同時会合の能力があることを示す図である。スクシニル残基を有する各群（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）のそれぞれからのビオチン化ピオベルジンは、ニュートラアビジン被覆ＭＳＤプレートで捕捉し、融合分子を結合させた。結合融合分子は、スルホ−タグ標識ピオケリンにより検出した。
【図１４−１】融合分子（ここでは配列番号１３４）が、鉄制限培地におけるＰｖｄ  Ｉ（Ａ）、Ｐｖｄ  ＩＩ（Ｂ）、もしくはＰｖｄ  ＩＩＩ（Ｃ）を産生する株、またはΔｐｖｄＡ  Ｐｖｄ  ＩＩノックアウト株（Ｄ）のどちらかの増殖を阻害できることを示す図である。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５】融合分子（ここでは配列番号１３４、ＲＡ１０６８０５５０と呼ばれる）が、３日目の単回投与後の感染慢性モデルにおける緑膿菌肺負荷量（肺組織のＣＦＵ／グラム）を有意に低減すること、および１５日目まで再発が起こらないことを示す図である。図１５はさらに、融合分子がトブラマイシン活性に拮抗しないこと、および併用療法では２つの活性がシナジーを生むことを示している。各処置の幾何平均負荷が水平バーにより示されている。各列の上にビヒクルと比べたその処置群のＬｏｇ１０減少（ＬｏｇＲ）が記録されている（ＬＯＤ＝検出限界）。
【図１６】融合分子（ここでは配列番号１３４、ＲＡ１０６８０５５０とも呼ばれる）が、感染ラットの肺における総白血球数の増加をブロックし、それにより感染のクリアランスを増加させることを示す図である。トブラマイシン／融合分子併用は、それぞれの単一処置と対比して明らかな利点を示す。感染３、５、７、９、および１５日後の絶対ＢＡＬ白血球（単球および好中球）数平均＋ＳＤ（ＢＡＬ  １ｍｌあたりの細胞）（Ｌｏｇスケール）。
【図１７】融合分子が、定着の初期段階（Ａ）または定着の確立（Ｂ）中に毒性因子発現を減少させることを示す図である。配列番号１３４のテスト融合分子は、緑膿菌のｒｈＩＩの毒性遺伝子発現に対する有意な効果を示す。ｒｈｌＩは、Ｎ−ブタノイルホモセリンラクトン（ＢＨＬ）を産生してクオラムセンシングに関与する。ＢＨＬはその受容体ＲｈＩＲに結合し、それにより遺伝子の相補体（自身の遺伝子座を含む）の発現を誘導する（自己誘導性回路（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｉｔ）を補完する）。
【図１８】融合分子の結合能が、４つのリポカリンムテインを分けるリンカー分子の長さに影響されないことを示す図である。テストしたリンカー分子は、グリシン、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号１４２）、および（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１４１）であった。
【図１９−１】Ｆｃ融合分子が、鉄欠乏培地において細菌を指数関数的に増殖させてピオベルジンの産生を防ぐことを示す図である。Ｆｃ融合分子（配列番号１３６）または対照Ｆｃ融合分子による処置時のｃｆｕ／ｍｌの平均およびｓ．ｅ．ｍ．ならびに蛍光任意単位値が、緑膿菌株ＡＴＣＣ２７８５３（ＡおよびＢ）、株ＡＴＣＣ１５６９２（ＣおよびＤ）および株ＡＴＣＣ３３３６０（ＥおよびＦ）について示されている。
【図１９−２】図１９−１の続き。
【図１９−３】図１９−２の続き。
【図２０−１】Ｆｃ融合分子が、鉄欠乏培地において細菌を指数関数的に増殖させてピオベルジンの産生を防ぐことを示す図である（図２０も参照のこと）。Ｆｃ融合分子（配列番号１３６）または対照Ｆｃ融合分子による処置時のピオベルジン蛍光の正規化相対量が、株ＡＴＣＣ２７８５３（Ａ）、ＡＴＣＣ１５６９２（Ｂ）、およびＡＴＣＣ３３３６０（Ｃ）について示されている。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２１】図１９および２０に示された効果がピオベルジン特異的であることを示す図である。株ＡＴＣＣ２７８５３およびＡＴＣＣ２７８５３のｐｖｄＡ／ｐｃｈＤ二重変異体株の培養物における蛍光の平均値は、これらのシデロフォアを合成することができない変異体株が蛍光シグナルを全く示さないことを示している。
【図２２】図１９および２０に示された効果がピオベルジン特異的であることを示す図である（図２１も参照のこと）。蛍光シグナルを正規化するために、野生型ＡＴＣＣ２７８５３の上清から得られた精製ピオベルジンＩＩを使用して蛍光シグナルの収集前に培養物をスパイクし、検量線を得た。
【図２３】Ｆｃ融合分子存在下の蛍光シグナルの低下は、該化合物によるピオベルジン結合時の蛍光クエンチングによるものではなかったことを示す図である。Ｆｃ融合分子（配列番号１３６）はピオベルジンを含有する培養上清（ＡＴＣＣ２７８５３の濾過した２４時間培養物で得られた）にその場で添加し、蛍光を即座におよび２４時間後に読み取った。この実験で観察された蛍光の平均値に示されているように、蛍光クエンチングは検出されなかった。
【図２４】Ｆｃ融合分子が細菌増殖の動態に影響することを示す図である。株ＡＴＣＣ１５６９２およびＡＴＣＣ３３３６０に対するＦｃ融合分子（配列番号１３６）による１ｍｇ／ｍＬ処置の影響は、それぞれ（Ａ）および（Ｂ）にｃｆｕ／ｍＬの平均およびｓ．ｅ．ｍ．として示されている。
【図２５】Ｐｐｃｈｄ転写活性に対する鉄濃度の影響を示す図である。観察された発光の平均およびｓ．ｅ．ｍ．は、ｐｃｈＤプロモーター発現が鉄を添加しないとＣ−ＭＳ培地で誘導され、鉄添加により抑制され、それによりレポーター融合の機能性を実証したことを示している。
【図２６】様々な量の補充鉄の存在下、Ｐｐｃｈｄ転写活性に対するＦｃ融合分子（配列番号１３６）による処置の影響を示す図である。観察された発光の平均およびｓ．ｅ．ｍ．は、補充した鉄の量に関わらずＦｃ融合分子の存在下でプロモーター活性が消失したのに対し、対照Ｆｃ融合分子は影響がなかったことを示している。
【図２７】鉄補充せずにテストしたＰｐｃｈＤ転写活性に対する、一連の用量のＦｃ融合分子（配列番号１３６）の影響を示す図である。観察された発光の平均およびｓ．ｅ．ｍ．の点を標準用量反応曲線にフィットさせ、Ｆｃ融合分子についてＩＣ５０値０．０３ｍｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ：０．０２〜０．０５）を得たのに対し、アイソタイプ対照Ｆｃ融合分子については不明確であった。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明を以下で詳細に説明するが、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬は変動しうることから、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。また本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述するために使用されるものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されるべきである。他に定義していない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４８】
以下に、本発明の要素を説明する。これらの要素は特定の実施形態で列挙されているが、任意の様式でおよび任意の数で組み合わされて追加の実施形態を生じうると理解されるべきである。様々に記載された実施例および好ましい実施形態は、本発明を、明示的に記載された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。本明細書の記載は、明示的に記載された実施形態と任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持および網羅するものと理解されるべきである。さらに、この出願に記載される全ての要素の任意の順序および組合せが、文脈が他に言及していない限り、本出願の記載によって開示されていると解釈されるべきである。
【００４９】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｂ．ＮａｇｅｌおよびＨ．Ｋｏｌｂｌ編、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、（１９９５）に記載のように定義される。
【００５０】
本発明の実施は、他に言及されていない限り、化学、生化学、細胞生物学、免疫学の従来の方法、および当技術分野の文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）で説明されている組換えＤＮＡ技術を利用する。
【００５１】
本明細書および続く特許請求の範囲を通じて、文脈が他を要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびにその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、示されたメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群を含むが、任意の他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群を排除しないことを示し、但し、一部の実施形態では、そのような他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群は排除され、つまり、対象事項は示されたメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の包括からなると理解される。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに本発明を記載する文脈（特に特許請求の範囲の文脈）で使用される同様の参照は、本明細書で他に言及されていない限りまたは内容に明確に矛盾が生じない限り、単数形および複数形のいずれも包含すると解釈される。本明細書の数値範囲の引用は、範囲内に入るそれぞれ別個の値の個々の引用を簡略化した方法として示すことを意図するにすぎない。本明細書で他に言及されていない限り、個々の値はそれぞれ、あたかもそれらの値が個別に本明細書で再び引用されているかのように、本明細書に組み入れる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で他に言及されていない限りまたは内容に明確に矛盾が生じない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で示される任意のおよび全ての例または例示的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く例示することを意図するものにすぎず、特許請求の範囲に記載のない限定を本発明の範囲に課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、主張されていないいかなる要素をも示すものとして解釈されるべきではない。
【００５２】
いくつかの文献が、本明細書の文中で引用されている。本明細書で引用されている各文献（全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、前掲であれ後掲であれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような開示より日時が前であるという権利が与えられないという承認として解釈されるべきではない。
【００５３】
Ａ．融合分子
本発明は、ピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ならびにピオケリンに対する結合特異性を有する融合分子であって、
（ａ）ピオベルジンＩ型に結合するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）ムテインを含むまたはそれからなる第１のポリペプチド；
（ｂ）ピオベルジンＩＩ型に結合するｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなる第２のポリペプチド；
（ｃ）ピオベルジンＩＩＩ型に結合するｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなる第３のポリペプチド；および
（ｄ）ピオケリンに結合するｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなる第４のポリペプチド；
を含み、ここで、第１、第２、第３および第４のポリペプチドは共有結合によって連結されている、前記融合分子を提供する。
【００５４】
用語「融合分子」は、一般に、２つまたはそれ以上の別個の分子（例えば、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質）を、特に頭尾結合（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）で（例えば、Ｎ端からＣ端に、またはその逆で）繋ぐことにより生成され、その結果、元の分子（例えば、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質）のそれぞれから誘導される機能特性を有する単一分子となった分子を指す。一実施形態では、融合分子は、融合タンパク質である。
【００５５】
用語「結合特異性」は、本明細書で使用するとき、標的（例えば、ピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、ならびにピオケリン）と１つまたはそれ以上の参照標的とを区別することができるリガンド（例えば、本発明の融合分子）の能力を指し、したがって、結合特異性は、絶対的ではなく、相対的特性である。特異的結合は、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ試験、ＦＡＣＳ、ＩＨＣおよびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００５６】
本明細書で使用するとき、「ピオベルジン」は、鉄欠乏増殖条件下でグラム陰性細菌である緑膿菌により産生され、鉄に対して高い親和性を有する蛍光シデロフォアを意味する。ピオベルジンは、３つの構造部分：ジヒドロキシキノリン発色団、側鎖および可変ペプチド鎖で構成される。ペプチド鎖部分は、受容体認識および結合に関与する。それらのペプチド鎖が異なる３つの異なるＰｖｄ鎖が同定されている（Ｉ〜ＩＩＩ型；図１Ａ〜Ｄ）。ピオベルジン型のサイズおよびアミノ酸組成は、それぞれの種ならびにピオベルジン認識特異性に特有である。３つの緑膿菌株が区別でき、そのそれぞれが異なるピオベルジン型および同種のＦｐｖＡ受容体を製造する。それぞれの型には、側鎖が異なる、スクシニル、スクシナミドまたはα−ケトグルタリルの３つのメンバー（サブタイプ）があり、つまり、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシニル、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシナミド、Ｐｖｄ  Ｉ型α−ケトグルタリル、Ｐｖｄ  ＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩ型スクシナミド、Ｐｖｄ  ＩＩ型α−ケトグルタリル、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシナミドおよびＰｖｄ  ＩＩＩ型α−ケトグルタリルがある。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「ピオケリン」は、フェノール、カルボキシレートおよびアミン配位子官能基を有し、緑膿菌により生成され、第二鉄を可溶化する、サリチレートと２分子のシステインとのチアゾリン誘導体化コンジュゲートを意味する。ピオケリンは、フェノレートを有するがヒドロキサム酸部分もカテコール部分も有しない、構造的に特有なシデロフォアである（図１Ｅ）。
【００５８】
用語「好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）」（「ヒトリポカリン２」もしくは「ヒトＬｃｎ２」もしくは「ヒトＮＧＡＬ」または単に「リポカリン」とも称される）は、本明細書で使用するとき、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンク受託番号Ｐ８０１８８を有する成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を指す。ヒトＮＧＡＬ（ｈＮＧＡＬ）ムテインは、本明細書において、「リポカリンムテイン」または単に「ムテイン」とも称される。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンク受託番号Ｐ８０１８８に示されるアミノ酸配列が、特定の「参照配列」として使用される。一実施形態では、配列番号１に示されるアミノ酸配列が、参照配列として使用される。野生型ｈＮＧＡＬは、ピオベルジンまたはピオケリンに結合しない。野生型ｈＮＧＡＬの天然のリガンドは、ｈＮＧＡＬのカリックス（ｃａｌｙｘ）に高親和性でドッキングするエンテロバクチンである。
【００５９】
本明細書で使用するとき、「ムテイン」、「変異」実体（タンパク質もしくは核酸のいずれであろうと）または「変異体」は、天然に存在する（野生型）核酸またはタンパク質参照配列／骨格と比較して１つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換体、欠失体もしくは挿入体を指す。前記用語は、本明細書に記載されるムテインおよびバリアントの断片も含む。本発明の融合分子、その断片またはバリアントで使用するムテインは、好ましくは、本明細書に記載されるピオベルジンまたはピオケリンに対する結合の機能を保持している。
【００６０】
一実施形態では、第１、第２、第３および第４のポリペプチドにより構成されるｈＮＧＡＬムテインは、それぞれピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型ならびにピオケリンに特異的であるまたはそれらに特異的に結合する。
【００６１】
本明細書において、ピオベルジンまたはピオケリンに結合するｈＮＧＡＬムテインの文脈で使用するとき、用語「特異的」は、ムテインが、それぞれピオベルジンまたはピオケリンに指向する、それに結合する、または反応することを含む。したがって、指向すること、結合すること、または反応することは、ムテインがピオベルジンまたはピオケリンにそれぞれ特異的に結合することを含む。この文脈における用語「特異的に」は、ムテインが、本明細書に記載されるように、ピオベルジンタンパク質またはピオケリンタンパク質と反応するが、別のタンパク質とは本質的に反応しないことを意味する。用語「別のタンパク質」は、それぞれ任意の非ピオベルジンまたは非ピオケリンタンパク質、例えば、ピオベルジンまたはピオケリンに密接に関連するまたは同種であるが本明細書に開示のムテインの指向に反するタンパク質を含む。しかし、「対象」の定義の文脈で記載される種などのヒト以外の種由来のピオベルジンまたはピオケリンタンパク質、断片および／またはバリアントは、用語「別のタンパク質」によって排除されない。用語「本質的に結合しない」は、本開示のムテインが別のタンパク質に結合しないこと、つまり、３０％未満、特に２０％未満、より特には１０％未満、さらに特には９、８、７、６または５％未満の交差反応性を示すことを意味する。ムテインが本明細書に定義されるように特異的に反応するかどうかは、特に、本開示のリポカリンムテインとピオベルジンまたはピオケリンとの反応を、前記ムテインと他のタンパク質（複数可）との反応と比較することによって、容易に試験される。また特異的結合は、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ試験、ＦＡＣＳ、ＩＨＣおよびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００６２】
一実施形態では、第１、第２、第３および第４のポリペプチドにより構成されるｈＮＧＡＬムテインは、検出可能な親和性で、それぞれピオベルジンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型ならびにピオケリンに結合する。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「検出可能な親和性」は、選択された標的に、一般的に約１０−５Ｍ以下、例えば約１０−６Ｍ以下、または約１０−７Ｍ以下の解離定数ＫＤで結合する能力を意味する。より低い親和性（つまり、より高いＫＤ値）は、一般的に、ＥＬＩＳＡなどの一般的方法によってもはや測定できず、したがってあまり重要ではない。
【００６４】
本明細書で使用するとき、本開示のタンパク質（例えば、ヒトリポカリン２のムテイン）の選択された標的（本件では、ピオベルジンまたはピオケリン）に対する「結合親和性」は、当業者に既知の多数の方法によって測定することができる（したがってムテイン−リガンド複合体のＫＤ値が決定される）。そのような方法には、限定されないが、蛍光滴定、直接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、等温滴定型カロリメトリー（ＩＴＣ）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）が含まれる。そのような方法は当技術分野で十分確立されており、その実施例を下記にも説明している。
【００６５】
さらに、個々の結合物質とそのリガンドとの複合体形成は、多くの様々な因子、例えば、個々の結合パートナー、競合因子の存在、使用する緩衝系のｐＨおよびイオン強度、ならびに解離定数ＫＤの決定に使用される実験的方法（例えば、いくつか例を挙げれば、蛍光滴定、直接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、もしくは表面プラズモン共鳴）、またさらには、実験データの評価に使用される数学的アルゴリズムにより影響を受けることも留意される。
【００６６】
したがって、当業者には、ＫＤ値（個々の結合物質とその標的／リガンドとの間で形成される複合体の解離定数）が、所与のリガンドに対する特定のムテインの親和性を決定するために使用される方法および実験的設定に依存して、ある特定の実験的範囲で変動しうることも明白である。このことは、測定されたＫＤ値または許容範囲に、例えば、ＫＤ値が表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）、競合ＥＬＩＳＡ、または「直接ＥＬＩＳＡ」のいずれによって決定されたかに依存して、わずかな偏差がありうることを意味する。
【００６７】
一部の実施形態では、本発明の融合分子で使用されるピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）に特異的なムテインは、２００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１５ｎＭ以下の解離定数ＫＤでピオベルジン（それぞれＩ、ＩＩまたはＩＩＩ型）に結合することができる。一部の実施形態では、本発明の融合分子で使用されるピオケリンに特異的なムテインは、２００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１５ｎＭ以下の解離定数ＫＤでピオケリンに結合することができる。一部のさらなる特定の実施形態では、本発明による融合分子のムテインは、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）またはピオケリンに、それぞれ、ピオベルジン（それぞれＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）またはピオケリンに対して約１０ｎＭ以下、または約５ｎＭ以下、または約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下、または約１０ｐＭ以下の解離定数で結合する。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明の融合分子は、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）ならびにピオケリンに、それぞれ、２００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１５ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下、または約５ｎＭ以下、または約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下、または約１０ｐＭ以下の解離定数ＫＤで結合する。
【００６９】
一実施形態では、ＫＤ値は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、競合ＥＬＩＳＡによって、または「直接ＥＬＩＳＡ」によって決定される。
【００７０】
本発明の融合分子に使用するためのｈＮＧＡＬムテインならびにそれらの生成および同定のための方法は、ＥＰ１５３０５２４２．８およびＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５３２２６ならびに下記「ｈＮＧＡＬムテイン」の項目に詳細に開示／記載されている。
【００７１】
特定の実施形態では、ピオベルジンＩ型に特異的なｈＮＧＡＬムテインは、配列番号２〜１８のいずれか１つ（例えば、配列番号１６）に示される。特定の実施形態では、ピオベルジンＩＩ型に特異的なｈＮＧＡＬムテインは、配列番号１９〜３７のいずれか１つ（例えば、配列番号３６）に示される。特定の実施形態では、ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なｈＮＧＡＬムテインは、配列番号３８〜５３のいずれか１つ（例えば、配列番号５３）に示される。特定の実施形態では、ピオケリンに特異的なｈＮＧＡＬムテインは、配列番号５４〜６３のいずれか１つ（例えば、配列番号６２）に示される。
【００７２】
用語「共有結合によって連結」は、本明細書で使用するとき、共有結合を介したまたは共有結合リンカー分子を介した連結を指す。一実施形態では、第１、第２、第３および第４のポリペプチドは、リンカー分子を介して共有結合によって連結されている。
【００７３】
用語「リンカー分子」は、本明細書で使用するとき、タンパク質部分、例えば、本明細書に定義される第１、第２、第３および第４のポリペプチドに接続／連結するように適合された分子を指す。本発明によるリンカー分子は、任意のサイズ／長さを有しうる。しかしながら、接続された／連結された部分が例えば立体障害により互いの活性に干渉することを防止する適度な柔軟性をもたらすために、また適切なタンパク質折り畳みが可能であるために、十分な長さであることが好ましい：さらに、細胞内の安定性（例えば、タンパク質分解安定性）をもたらすために十分短いことが好ましい。適切なリンカー分子は当業者にとって既知であり、例えば、ペプチド、ならびに非ペプチド性分子、例えば適切な長さの非ペプチド性オリゴマーおよびポリマーが挙げられる。本発明によれば、本明細書に記載される単一の融合分子内の様々なリンカー分子は同じでも異なってもよい。
【００７４】
一実施形態では、リンカー分子は、ペプチドリンカーである。本発明によるペプチドリンカーは任意の長さを有してよく、つまり任意の数のアミノ酸残基を含みうる。しかしながら、接続された／連結された部分が例えば立体障害により互いの活性に干渉することを防止する適度な柔軟性をもたらすために、また適切なタンパク質折り畳みが可能であるために、十分な長さであることが好ましい：さらに、細胞内の安定性（例えば、タンパク質分解安定性）をもたらすために十分短いことが好ましい。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、１〜３０アミノ酸長、または１〜２５アミノ酸長、または１〜２０アミノ酸長、または１〜１５アミノ酸長、または１〜１２アミノ酸長、または１〜１０アミノ酸長を有する。そのように、本発明によれば、ペプチドリンカーを単一のアミノ酸残基、例えばグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）によって構成してもよい。
【００７５】
本発明によるペプチドリンカーのアミノ酸は、全ての天然のまたは天然に存在しないアミノ酸から、特にアミノ酸のグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、およびトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）から選択することができる。一実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン−セリン−トレオニン−リッチリンカーまたはグリシン−セリン−リッチリンカーであり、ここで少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸が、それぞれグリシンもしくはセリンもしくはトレオニン残基またはグリシンもしくはセリン残基である。別の実施形態では、アミノ酸は、グリシン、セリンおよびトレオニンから選択され、つまり、ペプチドリンカーは、排他的にグリシン、セリンおよびトレオニン残基から構成される（グリシン−セリン−トレオニンリンカーと称される）。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリン残基から排他的に構成される（グリシン−セリンリンカーと称される）。
【００７６】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン−セリンリンカーであり、１〜３０アミノ酸長、または１〜２５アミノ酸長、または１〜２０アミノ酸長、または１〜１５アミノ酸長、または１〜１２アミノ酸長、または１〜１０アミノ酸長を有する。本発明による特定のペプチドリンカーは、一般式（ＧＧＧＧＸ）ｎを有し、ここでＸは、存在する毎に、ＳおよびＴから独立して選択され、ｎは、１〜５、または１〜４、または１〜３、または１および２から選択される整数である。一実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１４１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１４２のアミノ酸配列を有する。
【００７７】
一実施形態では、融合分子は、融合分子の多量体化を可能にする多量体化ドメインをさらに含む。多量体化は、多量体（例えば、２、３または４つ、特に２または３つ、より特には２つの）多量体化ドメイン間の、非共有結合性相互作用および／または、特に１つもしくはそれ以上のジスルフィド結合を介した共有結合性相互作用によって起こりうる。
【００７８】
適切な多量体化ドメインは、当業者に既知であり、例えば、テネイシン三量体化モチーフ、コレクチン三量体化ドメインおよびストレプトアビジンなどの三量体化ドメイン、ならびに、Ｆｃドメイン、ＩｇＥ重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）、ＩｇＭ重鎖ドメイン２（ＭＨＤ２）、ＩｇＧ重鎖ドメイン３（ＧＨＤ３）、ＩｇＡ重鎖ドメイン３（ＡＨＤ２）、ＩｇＤ重鎖ドメイン３（ＤＨＤ３）、ＩｇＥ重鎖ドメイン４（ＥＨＤ４）、ＩｇＭ重鎖ドメイン４（ＭＨＤ４）、ウテログロビン二量体化ドメインなどの二量体化ドメインが挙げられる。一実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメインであり、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃドメインは、特定の実施形態では、配列番号１４０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。さらに、上記ドメインのいずれか１つのバリアントまたは断片、例えば、半減期を延長させるようにおよび／または効率を向上させるように修飾されたドメインも、依然として融合分子の多量体化（例えば、二量体化）が可能である、つまり機能的である限り、含まれる。適切な修飾は、当業者にとって既知であり、限定されないが、例えばＺａｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．ら（２０１０）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８（２）：１５７〜９頁に記載されているような、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させるＦｃドメインの修飾（例えば、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、およびＶ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ）が挙げられる。
【００７９】
一実施形態では、融合分子は、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−Ｘ４−Ｃ’                  （Ｉ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−Ｘ４−Ｌ４−ＭＤ−Ｃ’      （ＩＩ）、Ｎ’−ＭＤ−Ｌ１−Ｘ１−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （ＩＩＩ）、
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＭＤ−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （ＩＶ）、Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−ＭＤ−Ｌ２−Ｘ２−Ｌ３−Ｘ３−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （Ｖ）、および
Ｎ’−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−Ｘ３−Ｌ３−ＭＤ−Ｌ４−Ｘ４−Ｃ’      （ＶＩ）
からなる群から選択される一般式を有し、
ここで、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、存在する毎に、第１、第２、第３および第４のポリペプチドからなる群から選択され、但し、融合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチドのそれぞれを含み；
ＭＤは、多量体化ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、存在する毎に、共有結合およびリンカー分子から独立して選択される。
【００８０】
本発明によれば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、同じでも異なってもよい。
【００８１】
一実施形態では、融合分子は、多量体（例えば、二量体）複合体として存在する。
【００８２】
それゆえ、一態様では、本発明は、２つまたはそれ以上の本明細書に記載の融合分子を含む多量体（または多量複合体）（例えば、二量体または二量複合体）も提供する。そのような複合体は、融合分子複合体とも称される。一実施形態では、２つまたはそれ以上の融合分子が、非共有結合または共有結合によって（例えば、ジスルフィド結合を介して）会合して、融合分子複合体を形成する。
【００８３】
一実施形態では、融合分子は、融合分子の検出および／または単離を可能にする少なくとも１つの標識またはタグをさらに含む。
【００８４】
「融合分子の検出および／または単離を可能にする標識またはタグ」には、これらの目的のために当該分野で既知の任意の標識／タグを含むことが意図される。これらには、親和性タグ、例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５、７５３〜７６６頁）、ｍｙｃ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ６−ｔａｇもしくはＨＡ−ｔａｇ、またはタンパク質、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ならびにそれらの組合せ（例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩとＨｉｓ−６−ｔａｇ）が含まれる。発色または蛍光特性を有するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）も同様に適切な標識である。
【００８５】
（ポリ）ペプチド標識またはタグのアミノ酸配列は、融合分子のアミノ酸配列内の任意の位置で導入することができ、例えば、コードされたタンパク質の構造内（例えば、標識／タグがその機能に干渉しない限り、本明細書に記載の任意のペプチドリンカー内またさらにはムテイン内）でループを形成してもよく、またはＮ端もしくはＣ端に融合することもできる。標識またはタグはさらに、融合分子からの標識またはタグの除去を可能にする切断部位を含んでもよい。同様に、非ペプチド性標識またはタグ、例えば、蛍光色素も、任意の適切な部位で融合分子にコンジュゲートすることができる。
【００８６】
一般に、本発明の融合分子を、化学、物理、光学または酵素反応で検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する任意の適切な化学物質または酵素で標識することができる。物理反応と同時の光学反応／マーカーの例は、照射時の蛍光放出、または放射活性標識を使用するときのＸ線放出である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼは、発色反応生成物の形成を触媒する酵素標識（と同時に光学的標識）の例である。
【００８７】
融合分子は、分子の分泌を容易にするためのアミノ酸配列、例えばＮ端分泌シグナル、またはシグナル配列を含んでもよい。さらに本発明の融合分子は、例えば特定の細胞型への選択性を増強するために役立つ結合ドメインを含んでもよい。これは、例えば、前記細胞型の表面に発現される特定の抗原に結合する結合ドメインを提供することにより達成される。
【００８８】
一実施形態では、融合分子は、融合分子の安定性を増加させるおよび／または融合分子の血清半減期を延長させる１つまたはそれ以上の修飾をさらに含む。
【００８９】
一実施形態では、融合分子の「安定性」は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの融合分子の「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量または数を半減するために必要とされる期間を指す。
【００９０】
融合分子は、一部の実施形態では、融合分子の血清半減期を延長させる部分にコンジュゲートされる（この点に関して、そのようなコンジュゲーション戦略がヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのムテインのＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を参照して記載されているＰＣＴ公開ＷＯ２００６／５６４６４Ａ２も参照のこと）。血清半減期を延長させる部分は、いくつか例を挙げると、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、ポリシアル酸、パルミチン酸などの脂肪酸分子（Ｖａｊｏ＆Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２、１〜９頁）、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、またはトランスフェリンでありうる。アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、抗体断片、例えばドメイン抗体（例えば、米国特許第６６９６２４５号を参照）、またはアルブミンに対する結合活性を有するムテインでありうる。したがって、本発明の融合分子の半減期を延長させる適切なコンジュゲーションパートナーとしては、アルブミン結合タンパク質、例えば、細菌アルブミン結合ドメイン、例えば連鎖球菌タンパク質Ｇの１種（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．、＆Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１８、７３〜８３頁）が挙げられる。コンジュゲーションパートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｍｅｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ，Ｄ．、Ｃｏｍｂｓ，Ｄ．＆Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７、３５０３５〜３５０４３頁）に記載されているような、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコンセンサス配列を有するものであり、ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり；Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；またＸａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【００９１】
他の実施形態では、アルブミン自体（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら、２００２、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３、５４０〜５４８頁）、またはアルブミンの生物学的に活性な断片が、本発明の融合分子のコンジュゲーションパートナーとして使用される。用語「アルブミン」には、全ての哺乳動物アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン、またはラットアルブミンが含まれる。アルブミンまたはその断片は、米国特許第５７２８５５３号または欧州特許出願ＥＰ０３３０４５１およびＥＰ０３６１９９１に記載されるように組換え的に製造することができる。組換えヒトアルブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を、融合分子の半減期を延長させるために、本発明の融合分子にコンジュゲートまたは融合することができる。
【００９２】
アルブミン結合性タンパク質は、ドメイン抗体でありうる抗体断片である。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、生成物プロファイルの最適な安全性および有効性を生じさせるために、生物物理特性およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を精密に制御できるように改変される。ドメイン抗体は、例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫおよびＭＡ、ＵＳＡ）から市販されている。
【００９３】
トランスフェリンを本発明の融合分子の血清半減期を延長させるための部分として使用するとき、融合分子は、非グリコシル化トランスフェリンのＮ端、Ｃ端、または両方に遺伝子的に融合することができる。非グリコシル化トランスフェリンは１４〜１７日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質は、延長された半減期を同様に有する。またトランスフェリン担体は、高いバイオアベイラビリティ、体内分布、および循環安定性を有する。この技術は、ＢｉｏＲｅｘｉｓ（ＢｉｏＲｅｘｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）から市販されている。タンパク質安定剤／半減期延長パートナーとして使用するための組換えヒトトランスフェリン（ＤｅｌｔａＦｅｒｒｉｎ（商標））も、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から市販されている。
【００９４】
免疫グロブリンのＦｃ部分を本発明のムテインの血清半減期を延長させる目的で使用する場合、Ｓｙｎｔｏｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ（ＭＡ、ＵＳＡ）から市販されているＳｙｎＦｕｓｉｏｎ（商標）技術を使用することができる。このＦｃ融合技術の使用により、長時間作用型バイオ医薬品の作製が可能であり、例えば、薬物動態、溶解性および生産効率を高めるために、抗体のＦｃ領域に連結された少なくとも４つのムテインのそれぞれ２つのコピーで構成しうる。
【００９５】
本発明の融合分子の半減期を延長させるためのさらに別の代替的方法は、融合分子のＮ端またはＣ端に、長い構造化されていない柔軟なグリシンリッチ配列（例えば、約２０〜８０の連続グリシン残基を有するポリグリシン）を融合することである。例えばＷＯ２００７／０３８６１９に開示されているこのアプローチは、「ｒＰＥＧ」（組換えＰＥＧ）とも呼ばれる。
【００９６】
ポリアルキレングリコールがコンジュゲーションパートナーとして使用される場合、ポリアルキレングリコールは、置換されていても、置換されていなくても、直鎖状であっても、または分岐状であってもよい。また活性化されたポリアルキレン誘導体であってもよい。適切な化合物の例は、インターフェロンに関してＷＯ９９／６４０１６、米国特許第６１７７０７４号もしくは米国特許第６４０３５６４号に記載されているような、またはＰＥＧ−修飾アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）もしくはＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼなどの他のタンパク質について記載されているような（例えば、Ｆｕｅｒｔｇｅｓら（１９９０）Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １１、１３９〜１４８頁）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。そのようなポリマー、例えばポリエチレングリコールの分子量は、約３００〜約７０，０００ダルトンの範囲でありえ、例えば、約１０，０００、約２０，０００、約３０，０００、または約４０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。さらに、例えば、米国特許第６５００９３０号または第６６２０４１３号に記載されているように、デンプンまたはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などの炭水化物オリゴマーおよびポリマーを、血清半減期を延長させる目的で、本発明の融合分子にコンジュゲートすることができる。
【００９７】
一実施形態では、本発明の融合分子は、融合分子の血清半減期を延長させるタンパク質ドメインである融合パートナーに、そのＮ端および／またはそのＣ端で融合される。さらなる特定の実施形態では、タンパク質ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質である。
【００９８】
別の実施形態では、本発明の融合分子は、融合分子の血清半減期を延長させる化合物にコンジュゲートされる。より特には、ムテインは、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群から選択される化合物にコンジュゲートされる。
【００９９】
一実施形態では、融合分子は、緑膿菌によるピオケリンおよび／またはピオベルジンを介した鉄取り込みを阻害または減少させる。
【０１００】
一実施形態では、融合分子は、緑膿菌による毒性因子発現を減少させる。
【０１０１】
一実施形態では、融合分子は、緑膿菌細菌増殖を阻害または減少させる。
【０１０２】
一実施形態では、融合分子は、薬学的活性剤に会合しているまたはコンジュゲート／融合している。そのようなコンジュゲートは、当技術分野で周知の方法によって製造することができる。
【０１０３】
一実施形態では、薬学的活性剤は、抗生物質、細胞分裂抑制剤、毒素、酵素、金属または金属化合物／錯体、キレート剤、放射性核種、有機小分子、治療的活性ペプチド、治療的活性核酸分子、ハプテンおよび抗体からなる群から選択される。
【０１０４】
適切な抗生物質としては、トブラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、コリスチン、およびカルバペネムが挙げられる。
【０１０５】
適切な金属または金属化合物／錯体は、ガリウム、ガリウム化合物、およびガリウム系錯体である。
【０１０６】
用語「有機小分子」は、本明細書で使用するとき、少なくとも２つの炭素原子を含み、好ましくは７または１２以下の回転的な炭素結合を含み、分子量が１００〜２０００ダルトン、特に１００〜１０００ダルトンまたは＜９００ダルトンの範囲であり、場合により１つまたは２つの金属原子を含む、有機分子を指す。
【０１０７】
用語「治療的活性ペプチド」は、例えば、細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチドまたは所与の細胞標的に対してタンパク質結合部位で競合するペプチドを指す。
【０１０８】
用語「治療的活性核酸分子」は、例えば、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムを指す。
【０１０９】
特定の薬学的活性剤としては、ドルナーゼアルファ、コルチコステロイド、ロイコトリエン調節薬、Ｎ−アセチルシステイン、吸入グルタチオン、抗コリン薬、イブプロフェン、およびβ２−アドレナリン受容体アゴニストが挙げられる。
【０１１０】
一実施形態では、融合分子は、配列番号１３４〜１３９および配列番号１４３〜１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、ここで、特定の実施形態では、配列番号１４４〜１８６のアミノ酸配列は、（Ｃ端）Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩおよびＨｉｓ６タグを欠いている。一実施形態では、融合分子は、配列番号１３４または配列番号１３６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１１１】
Ｂ．本発明の融合分子において使用するためのｈＮＧＡＬムテイン
一部の実施形態では、ｈＮＧＡＬムテイン結合ピオベルジン（Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）またはピオケリンは、別のアミノ酸、例えばセリン残基による天然システイン残基（例えば、ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列、配列番号１の８７位のシステイン残基）の少なくとも１つのアミノ酸置換を含みうる。一部の他の実施形態では、ムテイン結合ピオベルジンまたはピオケリンは、野生型ｈＮＧＡＬの１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換する１つまたはそれ以上の非天然システイン残基を含みうる。さらなる特定の実施形態では、本開示によるｈＮＧＡＬムテインは、システイン残基による、天然アミノ酸の少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、それにより、１つまたはそれ以上のシステイン架橋を形成している。一部の実施形態では、前記システイン架橋は、少なくとも２つのループ領域を接続しうる。これらの領域の定義は、本明細書において、Ｆｌｏｗｅｒ（Ｆｌｏｗｅｒ、１９９６、前掲、Ｆｌｏｗｅｒら、２０００、前掲）およびＢｒｅｕｓｔｅｄｔら（２００５、前掲）に従って使用される。
【０１１２】
一部の実施形態では、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、エンテロバクチンに結合しない。
【０１１３】
一態様では、本開示は、例えば、少なくとも検出可能な親和性で、ピオベルジンまたはピオケリンに結合する様々なｈＮＧＡＬムテインを含む。この意味で、ピオベルジンまたはピオケリンは、参照野生型ｈＮＧＡＬの非天然リガンドとみなされ、ここで「非天然リガンド」は、生理学的条件下で野生型ヒトリポカリン２に結合しない化合物を指す。本発明者は、野生型ｈＮＧＡＬを、ある特定の配列位置で１つまたはそれ以上の変異で改変することによって、非天然リガンドのピオベルジンまたはピオケリンに対して高い親和性および高い特異性が可能となることを実証した。一部の実施形態では、野生型ヒトリポカリン２のある特定の配列位置をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のヌクレオチドトリプレット（複数可）で、ランダム変異誘発が、これらの位置でのヌクレオチドトリプレットのサブセットによる置換を通じて実施される。
【０１１４】
本開示のムテインは、ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列のある特定の配列位置、例えば、ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３４、３６、３９〜４２、４４〜４７、４９、５２、５４〜５５、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４、１４１および１４５の配列位置に対応する配列位置の任意のうちの１つまたはそれ以上、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかで変異アミノ酸残基を有しうる。一部の実施形態では、変異アミノ酸残基は、保存的または非保存的置換を表す。一部の実施形態では、ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬ（配列番号１）の線状ポリペプチド配列の２８、５４、６５および８７位に対応する１つまたはそれ以上の位置で変異アミノ酸残基を含む。
【０１１５】
本開示のムテインは、変異アミノ酸配列位置以外で、「親」タンパク質骨格（例えばｈＮＧＡＬ）の野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。一部の実施形態では、本開示によるｈＮＧＡＬムテインは、そのような変異により少なくとも本質的にムテインの結合活性および折り畳みが妨げられないまたは干渉されない限り、１つまたは複数の配列位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸変異を保有しうる。そのような変異は、確立された標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を使用して、ＤＮＡレベルで非常に容易に達成される。アミノ酸配列の改変の実例は、挿入または欠失ならびにアミノ酸置換である。そのような置換は、保存的、つまり、特に極性ならびにサイズに関して、化学的に類似の特性を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換える置換であってもよい。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間での置き換えである：１）アラニン、セリンおよびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。一方で、アミノ酸配列に非保存的改変を導入してもよい。さらに、個々のアミノ酸残基を置き換える代わりに、ヒトリポカリン２の一次構造の１つまたはそれ以上の連続アミノ酸を、その欠失または挿入により安定に折り畳まれた／機能的ムテインがもたらされる限り、挿入または欠失のいずれかをさせてもよい（例えば、短縮ＮおよびＣ端を有するｈＮＧＡＬムテイン）。そのようなムテインでは、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮまたはＣ端で付加または欠失される。一般的に、そのようなムテインは、成熟ｈＮＧＡＬのアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。実例として、本開示は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列の４つのアミノ酸残基（Ｇ−Ｎ−Ｉ−Ｋ；９５〜９８位；配列番号１３０）が欠失している（例えば、配列番号４６）、上記に定義されるｈＮＧＡＬムテインも包含する。
【０１１６】
本明細書に開示のｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比較するとき、成熟ｈＮＧＡＬ（配列番号１）と高い配列同一性を有する。この一般的な文脈で、本開示のムテインのアミノ酸配列は、天然の野生型ｈＮＧＡＬのアミノ酸配列と、例えばアミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメントに（下記に定義されるような）ギャップが存在する可能性がある場合、少なくとも実質的に類似している。本開示のムテインの各配列は、成熟ｈＮＧＡＬの配列と実質的に類似しており、一部の実施形態では、例えば、改変された位置または配列が保持されており、１つまたはそれ以上のギャップが可能である場合、成熟ｈＮＧＡＬの配列に対して、少なくとも７０％の同一性または配列相同性、少なくとも７５％の同一性または配列相同性、少なくとも８０％の同一性または配列相同性、少なくとも８２％の同一性または配列相同性、少なくとも８５％の同一性または配列相同性、少なくとも８７％の同一性または配列相同性、または少なくとも９０％の同一性または配列相同性、例えば少なくとも９５％の同一性または配列相同性を有する。
【０１１７】
ａ）ピオベルジンに特異的なｈＮＧＡＬムテイン
一態様では、本開示は、ピオベルジンの１つの型、例えば、Ｐｖｄ  Ｉ型、Ｐｖｄ  ＩＩ型またはＰｖｄ  ＩＩＩ型に特異的な、特異的結合性ヒトリポカリン２（ヒトＬｃｎ２またはｈＮＧＡＬ）ムテインに関する。
【０１１８】
本開示の一実施形態は、ピオベルジンの１つの型と、例えば検出可能な親和性で、例えば、約２００ｎＭ以下、例えば約１５０ｎＭ以下のＫＤにより測定される親和性で、結合することができるムテインに関する。
【０１１９】
一態様では、本開示は、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下、例えば１５ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているＰｖｄ  Ｉ型と結合することができる、ｈＮＧＡＬムテインを提供する。
【０１２０】
一部のさらなる実施形態では、本開示の１つまたはそれ以上のｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないＰｖｄ  Ｉ型スクシニル、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシナミドおよびＰｖｄ  Ｉ型α−ケトグルタリルと結合することができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオベルジンＩ型スクシニルによって媒介される鉄取り込みを阻害することができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  Ｉ株の細菌増殖を阻害することができる。
【０１２３】
この点に関して、本開示は、ポリペプチド（例えば、本明細書で参照される第１のポリペプチド）であって、前記ポリペプチドは、ｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなり、前記ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、配列位置２８、３６、３９〜４１、４６、４９、５２、５４〜５５、５９、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１３６に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含み、前記ポリペプチドは、Ｐｖｄ  Ｉ型、例えばＰｖｄ  Ｉ型スクシニル、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシナミドおよびＰｖｄ  Ｉ型α−ケトグルタリルに結合する、前記ポリペプチドに関する。
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示のＰｖｄ  Ｉ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置３６、４０〜４１、４９、５２、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４のうちの任意の１つまたはそれ以上で、以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＰｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ、ＴｒｐまたはＰｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＴｈｒ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＡｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＧｌｕ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＡｓｐ；Ａｓｎ９６→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＡｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＴｙｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、ＴｒｐまたはＡｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ、ＧｌｎまたはＰｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＧｌｙまたはＬｙｓ；およびＬｙｓ１３４→Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐのうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬのこれらの配列位置で、２つまたはそれ以上の、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個もしくはさらにそれ以上または全ての変異アミノ酸残基を含む。
【０１２５】
さらに、本開示によるＰｖｄ  Ｉ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｔｈｒ５４→ＶａｌまたはＡｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→ＡｓｐまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→ＳｅｒまたはＡｓｎ；およびＴｈｒ１３６→Ａｌａのうちの１つもしくはそれ以上または全てを含んでもよい。
【０１２６】
一部の追加の実施形態では、Ｐｖｄ  Ｉ型に結合する本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置き換え：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ；Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｎ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｎ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｐ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｈｒ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｐｈｅ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｌｅｕ７０→Ｔｒｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ｔｙｒ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１３２→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｎ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ａｌａ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ａｓｎ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｖａｌ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｐｈｅ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｐｈｅ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ｔｒｐ；Ａｒｇ７２→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｕ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｖａｌ；Ｓｅｒ１２７→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｌｙｓ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｉ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｔｈｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｊ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ；Ａｓｐ７７→Ｖａｌ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｋ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；
（ｌ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｍ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ８７→Ａｓｎ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；
（ｎ）  Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｓｎ３９→Ａｓｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；Ｔｈｒ１３６→Ａｌａ；
（ｏ）  Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；Ｔｈｒ１３６→Ａｌａ；
（ｐ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ８７→Ａｓｎ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；または
（ｑ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ８７→Ａｓｎ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ
を含む。
【０１２７】
残余の領域、つまり、配列位置２８、３６、３９〜４１、４６、４９、５２、５４〜５５、５９、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１３６と異なる領域で、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、変異アミノ酸配列位置以外の野生型（天然）アミノ酸配列を含んでもよい。
【０１２８】
さらなる特定の実施形態では、本開示によるムテインは、配列番号２〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１２９】
本開示のＰｖｄ  Ｉ型結合性ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、配列番号２〜１８からなる群から選択される配列に対して、高い配列同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【０１３０】
また本開示は、配列番号２〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するｈＮＧＡＬムテインの構造的相同体を含み、該構造的相同体は、前記ｈＮＧＡＬムテインに対して、約６０％を超える、特に６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９２％を超える、および最も特には９５％を超えるアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する。
【０１３１】
本開示によるＰｖｄ  Ｉ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、ヒトリポカリン２の天然に存在する形態の変異誘発という手段によって取得することができる。変異誘発の一部の実施形態では、置換（または置き換え）は保存的置換である。それにもかかわらず、非保存的置換または下記の例示的置換のうちの１つもしくはそれ以上を含む任意の置換が、ムテインがＰｖｄ  Ｉ型へのその結合能力を保持する、および／または成熟ヒトリポカリン２のアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号Ｐ８０１８８）と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれを超える同一性で置換された配列への同一性を有する限り、想定されている。
【０１３２】
別の態様では、本開示は、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているＰｖｄ  ＩＩ型と結合する、ｈＮＧＡＬムテインを提供する。
【０１３３】
一部のなおさらなる実施形態では、本開示の１つまたはそれ以上のｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないＰｖｄ  ＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩ型スクシナミドおよびＰｖｄ  ＩＩ型α−ケトグルタリルと結合することができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオベルジンＩＩ型スクシニルによって媒介される鉄取り込みを阻害することができる。
【０１３５】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  ＩＩ株の細菌増殖を阻害することができる。
【０１３６】
一部の他の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例１０に本質的に記載されるアッセイにおいて、ピオベルジンＩＩ型を発現する緑膿菌株の増殖を阻害または低減させることができる。
【０１３７】
この点に関して、本開示は、ポリペプチド（例えば、本明細書で参照される第２のポリペプチド）であって、前記ポリペプチドは、ｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなり、前記ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、配列位置２８、３６、４０〜４１、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含み、前記ポリペプチドはＰｖｄ  ＩＩ型に結合する、前記ポリペプチドに関する。
【０１３８】
一部の実施形態では、本開示のＰｖｄ  ＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置３６、４０〜４１、４９、５２、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４のうちの任意の１つまたはそれ以上で、以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＶａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＨｉｓ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ、ＶａｌまたはＴｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＴｒｐまたはＰｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＧｌｕ；Ｌｅｕ７０→ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＧｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＡｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＰｈｅまたはＴｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＡｓｐ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＡｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＴｙｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＶａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ａｌａ、ＩｌｅまたはＡｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；Ｔｙｒ１３２→Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＶａｌ；およびＬｙｓ１３４→ＴｒｐまたはＴｙｒのうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬのこれらの配列位置で、２つまたはそれ以上の、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個もしくはさらにそれ以上または全ての変異アミノ酸残基を含む。
【０１３９】
さらに、本開示によるＰｖｄ  ＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→ＡｓｐまたはＧｌｎおよびＣｙｓ８７→Ｓｅｒのうちの１つもしくはそれ以上または全てを含んでもよい。
【０１４０】
一部の追加の実施形態では、Ｐｖｄ  ＩＩ型に結合する本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置き換え：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｐｒｏ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ａｌａ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ａｓｎ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｎ；Ａｓｐ７７→Ｍｅｔ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ；Ａｒｇ８１→Ｔｙｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１００→Ｐｒｏ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｙｓ；Ｓｅｒ１２７→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ａｌａ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ；Ｌｅｕ７０→Ｔｒｐ；Ａｒｇ７２→Ａｓｎ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｎ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｔｈｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｙｒ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｙ；Ｔｒｐ７９→Ｔｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｔｒｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｙｓ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｉ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｊ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｐｈｅ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｋ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｔｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｌ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ｐｈｅ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｍ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｎ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｐｈｅ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｏ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｐｈｅ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｐ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｑ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｒ）  Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；または
（ｓ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ
を含む。
【０１４１】
残余の領域、つまり、配列位置２８、３６、４０〜４１、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４と異なる領域で、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、変異アミノ酸配列位置以外の野生型（天然）アミノ酸配列を含んでもよい。
【０１４２】
さらなる特定の実施形態では、本開示によるムテインは、配列番号１９〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１４３】
本開示のＰｖｄ  ＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、配列番号１９〜３７からなる群から選択される配列に対して、高い配列同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【０１４４】
また本開示は、配列番号１９〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するｈＮＧＡＬムテインの構造的相同体を含み、該構造的相同体は、前記ｈＮＧＡＬムテインに対して、約６０％を超える、特に６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９２％を超える、および最も特には９５％を超えるアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する。
【０１４５】
本開示によるＰｖｄ  ＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、ヒトリポカリン２の天然に存在する形態の変異誘発という手段によって、取得することができる。変異誘発の一部の実施形態では、置換（または置き換え）は、保存的置換である。それにもかかわらず、非保存的置換または下記の例示的置換のうちの１つもしくはそれ以上を含む任意の置換が、ムテインがＰｖｄ  Ｉ型へのその結合能力を保持する、および／または成熟ヒトリポカリン２のアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号Ｐ８０１８８）と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれを超える同一性で置換された配列への同一性を有する限り、想定されている。
【０１４６】
なお別の態様では、本開示は、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下、例えば、１０ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているＰｖｄ  ＩＩＩ型と結合するｈＮＧＡＬムテインを提供する。
【０１４７】
一部のなおさらなる実施形態では、本開示の１つまたはそれ以上のｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していない、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシナミドおよびＰｖｄ  ＩＩ型α−ケトグルタリルと結合することができる。
【０１４８】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオベルジンＩＩＩ型によって媒介される鉄取り込みを阻害することができる。
【０１４９】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  ＩＩＩ株の細菌増殖を阻害することができる。
【０１５０】
この点に関して、本開示は、ポリペプチド（例えば、本明細書で参照される第３のポリペプチド）であって、前記ポリペプチドが、ｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなり、前記ｈＮＧＡＬムテインが、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、配列位置２８、３６、４０〜４２、４５〜４７、４９、５２、６５、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０５〜１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１４５に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含み、前記ポリペプチドはＰｖｄ  ＩＩＩ型に結合する、前記ポリペプチドに関する。
【０１５１】
一部の実施形態では、本開示のＰｖｄ  ＩＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置３６、４０〜４１、４９、５２、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４のうちの任意の１つまたはそれ以上で、以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→ＰｈｅまたはＧｌｕ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＡｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＴｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＭｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎ；Ｌｅｕ７０→Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＴｙｒ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＴｙｒ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ｔｒｐ７９→ＳｅｒまたはＡｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＶａｌ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｔｙｒ１００→Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ＰｒｏまたはＡｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→ＴｒｐまたはＴｈｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＡｌａ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；およびＬｙｓ１３４→Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕのうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬのこれらの配列位置で、２つまたはそれ以上の、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個もしくはさらにそれ以上または全ての変異アミノ酸残基を含む。
【０１５２】
さらに、本開示によるＰｖｄ  ＩＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ａｓｐ４７→Ａｓｎ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１０５→ＰｒｏおよびＴｈｒ１４５→Ｐｒｏのうちの１つもしくはそれ以上または全てを含んでもよい。
【０１５３】
一部の追加の実施形態では、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型に結合する本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置き換え：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ｌｙｓ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｎ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ５２→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｎ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１００→Ｉｌｅ；Ｌｅｕ１０３→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７３→Ｔｙｒ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｌａ；Ｌｅｕ１０３→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ｐｒｏ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１００→Ｐｒｏ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｎ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｉ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｔｙｒ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→−；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｊ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｋ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４７→Ａｓｎ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；Ｔｈｒ１４５→Ｐｒｏ；
（ｌ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｍ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｎ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４７→Ａｓｎ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；Ｔｈｒ１４５→Ｐｒｏ；
（ｏ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；または
（ｐ）  Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ
を含む。
【０１５４】
残余の領域、つまり、配列位置２８、３６、４０〜４２、４５〜４７、４９、５２、６５、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０５〜１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１４５と異なる領域で、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、変異アミノ酸配列位置以外の野生型（天然）アミノ酸配列を含んでもよい。
【０１５５】
さらなる特定の実施形態では、本開示によるムテインは、配列番号３８〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１５６】
本開示のＰｖｄ  ＩＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、配列番号３８〜５３からなる群から選択される配列に対して、高い配列同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【０１５７】
また本開示は、配列番号３８〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するｈＮＧＡＬムテインの構造的相同体を含み、該構造的相同体は、前記ｈＮＧＡＬムテインに対して、約６０％を超える、特に６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９２％を超える、および最も特には９５％を超えるアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する。
【０１５８】
本開示によるＰｖｄ  ＩＩＩ型結合性ｈＮＧＡＬムテインは、ヒトリポカリン２の天然に存在する形態の変異誘発という手段によって、取得することができる。変異誘発の一部の実施形態では、置換（または置き換え）は、保存的置換である。それにもかかわらず、非保存的置換または下記の例示的置換のうちの１つもしくはそれ以上を含む任意の置換が、ムテインがＰｖｄ  Ｉ型へのその結合能力を保持する、および／または成熟ヒトリポカリン２のアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号Ｐ８０１８８）と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれを超える同一性で置換された配列への同一性を有する限り、想定されている。
【０１５９】
ｂ）ピオベルジンに特異的なムテインの用途
したがって、本開示のピオベルジン結合性ムテインについての多数の可能性のある用途が、医学において存在する。一つのさらなる態様では、本開示は、試料中のピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）を検出するためのならびにそれぞれの診断方法のための、本明細書に開示のピオベルジン結合性ムテインの使用に関する。
【０１６０】
また本開示は、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）との複合体形成について記載されるような、１つまたはそれ以上のピオベルジン結合性ムテインの使用を含む。
【０１６１】
したがって、本開示の別の態様では、開示されたムテインは、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）の検出のために使用される。そのような使用は、１つまたはそれ以上の前記ムテインを、適切な条件下、ピオベルジンを含有すると疑われる試料と接触させ、それによりムテインとピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）との複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって複合体を検出する工程を含みうる。
【０１６２】
検出可能なシグナルは、上述のように、標識によって、または結合、つまり複合体の形成それ自体による物理的特性の変化によって、生じる。１つの例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、一方が金箔などの表面に固定化されている結合パートナーの結合の間に変化する。
【０１６３】
また本明細書に開示のピオベルジン結合性ムテインは、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）の分離のために使用される。そのような使用は、１つまたはそれ以上の前記ムテインを、適切な条件下、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩおよび／またはＩＩＩ型）を含有すると推定される試料と接触させ、それにより、それぞれムテインとピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）との複合体の形成を可能にする工程、ならびに試料から複合体を分離する工程を含みうる。
【０１６４】
ピオベルジンの検出およびピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）の分離のための開示されたムテインの使用では、ムテインおよび／またはピオベルジンもしくはそのドメインもしくは断片を、適切な固相に固定してもよい。
【０１６５】
なお別の態様では、本開示は、本開示によるピオベルジン結合性ムテインを含む診断または分析キットを特徴とする。
【０１６６】
診断におけるそれらの使用に加えて、さらに別の態様では、本開示は、対象におけるピオベルジン（Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）の結合および／または対象における緑膿菌の増殖の阻害もしくは低減のための、本開示のピオベルジン結合性ムテインまたは該ムテインを含む組成物の使用を包含する。
【０１６７】
なお別の態様では、本開示は、対象におけるピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）を結合する方法であって、有効量の、本開示の１つもしくはそれ以上のピオベルジン結合性ムテインまたは該ムテインを含む１つもしくはそれ以上の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法を特徴とする。
【０１６８】
なお別の態様では、本開示は、対象において緑膿菌の増殖を阻害または低減させる方法であって、有効量の、本開示の１つもしくはそれ以上のピオベルジン結合性ムテインまたは該ムテインを含む１つもしくはそれ以上の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法を含む。
【０１６９】
ｃ）ピオケリンに特異的なｈＮＧＡＬムテイン
一態様では、本開示は、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下、例えば、１ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているピオケリンと結合する、ｈＮＧＡＬムテインに関する。
【０１７０】
一部のなおさらなる実施形態では、本開示の１つまたはそれ以上のｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約５００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているピオケリンと結合することができる。
【０１７１】
一部のなおさらなる実施形態では、本開示の１つまたはそれ以上のｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成していないピオケリンと結合することができる。
【０１７２】
一部のなおさらなる実施形態では、本開示の１つまたはそれ以上のｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないピオケリンと結合することができる。
【０１７３】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオケリンによって媒介される鉄取り込みを阻害することができる。
【０１７４】
一部の実施形態では、ムテインは、例えば、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  Ｉノックアウト（ΔｐｖｄＡ）の細菌増殖を阻害することができる。
【０１７５】
この点に関して、本開示は、ポリペプチド（例えば、本明細書で参照される第４のポリペプチド）であって、前記ポリペプチドは、ｈＮＧＡＬムテインを含むまたはそれからなり、前記ｈＮＧＡＬは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、配列位置２８、３４、３６、４０〜４１、４４〜４６、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７４、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４および１４１に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含み、前記ポリペプチドはピオケリンに結合する、前記ポリペプチドに関する。
【０１７６】
一部の実施形態では、本開示のピオケリン結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置３６、４０〜４１、４９、５２、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４のうちの任意の１つまたはそれ以上で、以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ、ＭｅｔまたはＶａｌ；Ａｌａ４０→Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、ＴｙｒまたはＰｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＴｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＡｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｌｅｕ、ＴｒｐまたはＰｒｏ；Ｓｅｒ６８→ＡｓｐまたはＨｉｓ；Ｌｅｕ７０→ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＧｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＡｓｐ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＴｒｐ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＰｒｏまたはＡｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＧｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＨｉｓまたはＧｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＩｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；およびＬｙｓ１３４→Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｓｎまたはＰｈｅのうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬのこれらの配列位置で、２つまたはそれ以上の、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個もしくはさらにそれ以上または全ての変異アミノ酸残基を含む。
【０１７７】
さらに、本開示によるピオケリン結合性ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｖａｌ３４→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ４４→Ｇｌｙ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ→ＡｒｇまたはＴｙｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ９４→Ｐｈｅ；Ｖａｌ１０８→Ａｌａ；Ｐｈｅ１２３→ＳｅｒおよびＴｈｒ１４１→Ａｌａのうちの１つもしくはそれ以上または全てを含んでもよい。
【０１７８】
一部の追加の実施形態では、ピオケリンに結合する本開示のｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置き換え：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｉｌｅ；Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ５２→Ｌｅｕ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ７２→Ｌｙｓ；Ｌｙｓ７３→Ｔｒｐ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｌｅｕ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｐｒｏ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｈｒｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｖａｌ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｙｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｔｒｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ａｒｇ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｅｕ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｖａｌ３４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｐｒｏ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｔｒｐ；Ｐｈｅ１２３→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｈｒｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｖａｌ；Ｔｈｒ１４１→Ａｌａ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｐｒｏ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｔｒｐ；Ｐｈｅ１２３→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｈｒｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｖａｌ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｕ４４→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ｔｙｒ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ９４→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｖａｌ１０８→Ａｌａ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；または
（ｉ）  Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅを含む。
【０１７９】
残余の領域、つまり、配列位置２８、３４、３６、４０〜４１、４４〜４６、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７４、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４および１４１と異なる領域で、本開示のｈＮＧＡＬムテインは、変異アミノ酸配列位置以外の野生型（天然）アミノ酸配列を含んでもよい。
【０１８０】
さらなる特定の実施形態では、本開示によるムテインは、配列番号５４〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１８１】
本開示のピオケリン結合性ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、配列番号５４〜６３からなる群から選択される配列に対して、高い配列同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％の同一性、例えば、少なくとも９５％の同一性を有しうる。
【０１８２】
また本開示は、配列番号５４〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するｈＮＧＡＬムテインの構造的相同体を含み、該構造的相同体は、前記ｈＮＧＡＬムテインに対して、約６０％を超える、特に６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９２％を超える、および最も特には９５％を超えるアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する。
【０１８３】
本開示によるピオケリン結合性ｈＮＧＡＬムテインは、ヒトリポカリン２の天然に存在する形態の変異誘発という手段によって、取得することができる。変異誘発の一部の実施形態では、置換（または置き換え）は、保存的置換である。それにもかかわらず、非保存的置換または下記の例示的置換のうちの１つもしくはそれ以上を含む任意の置換が、ムテインがＰｖｄ  Ｉ型へのその結合能力を保持する、および／または成熟ヒトリポカリン２のアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受託番号Ｐ８０１８８）と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれを超える同一性で置換された配列への同一性を有する限り、想定されている。
【０１８４】
ｄ）ピオケリンに特異的なムテインの用途
したがって、本開示のピオケリンに対する結合親和性を有するムテインについての多数の可能性のある用途が、医学において存在する。一つのさらなる態様では、本開示は、試料中のピオケリンを検出するためのならびにそれぞれの診断方法のための、本明細書に開示のそのようなムテインの使用に関する。
【０１８５】
また本開示は、ピオケリンとの複合体形成について記載したように、ピオケリンに対する結合親和性を有する１つまたはそれ以上のムテインの使用も含む。
【０１８６】
したがって、本開示の別の態様では、開示されたムテインは、ピオケリンの検出のために使用される。そのような使用は、１つまたはそれ以上の前記ムテインを、適切な条件下、ピオケリンを含有すると疑われる試料と接触させ、それによりムテインとピオケリンとの複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって複合体を検出する工程を含みうる。
【０１８７】
検出可能なシグナルは、上述のように、標識によって、または結合、つまり複合体の形成それ自体による物理的特性の変化によって、生じる。１つの例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、一方が金箔などの表面に固定化されている結合パートナーの結合の間に変化する。
【０１８８】
また本明細書に開示のムテインは、ピオケリンの分離のために使用される。そのような使用は、１つまたはそれ以上の前記ムテインを、適切な条件下、ピオケリンを含有すると推定される試料と接触させ、それによりムテインとピオケリンとの複合体の形成を可能にする工程、および試料から複合体を分離する工程を含みうる。
【０１８９】
ピオケリンの検出およびピオケリンの分離のための開示されたムテインの使用では、ムテインおよび／またはピオケリンもしくはそのドメインもしくは断片を、適切な固相に固定してもよい。
【０１９０】
したがって、例えば、試料中の、ピオケリンなどの分子の存在または非存在ならびにその濃度またはレベルが決定される。
【０１９１】
なお別の態様では、本開示は、本開示によるピオケリンに対して結合親和性を有するムテインを含む診断または分析キットを特徴とする。
【０１９２】
診断におけるそれらの使用に加えて、さらに別の態様では、本開示は、対象におけるピオケリンの結合および／または対象における緑膿菌の増殖の阻害もしくは低減のための、本開示のそのようなムテインまたは該ムテインを含む組成物の使用を包含する。
【０１９３】
なお別の態様では、本開示は、対象におけるピオケリンを結合する方法であって、有効量の、本開示のピオケリンに対して結合親和性を有する１つもしくはそれ以上のムテインまたは該ムテインを含む１つもしくはそれ以上の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法を特徴とする。
【０１９４】
なお別の態様では、本開示は、対象において緑膿菌の増殖を阻害または低減させる方法であって、有効量の、本開示のピオケリンに対して結合親和性を有する１つもしくはそれ以上のムテインまたは該ムテインを含む１つもしくはそれ以上の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法を含む。
【０１９５】
ｅ）ピオベルジン結合性ムテインおよび／またはピオケリン結合性ムテインを含む組成物ならびにムテインの組合せ
本開示は、対象におけるピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンの結合のための、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはそのポリペプチドおよび／または（ｉｖ）ピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはそのポリペプチドの使用を包含する。そのような使用は、有効量の（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはそのポリペプチドおよび／または（ｉｖ）ピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはそのポリペプチドを、対象に投与する工程を含む。また本開示は、対象において緑膿菌によるピオケリンおよび／またはピオベルジンを介した鉄取り込みを予防または減少させるための、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはそのポリペプチドおよび／または（ｉｖ）ピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはそのポリペプチドの使用を企図する。同様に、本開示は、対象における緑膿菌感染および／またはバイオフィルム形成の処置または緩和のための、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはそのポリペプチドおよび／または（ｉｖ）ピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはそのポリペプチドの使用を開示する。一部のさらなる実施形態では、緑膿菌感染は、急性または慢性感染でありうる。
【０１９６】
第１、第２、第３および／もしくは第４のムテインまたはそのポリペプチドは、同時、付随的または連続投与を含め、組合せで投与される。一部の実施形態では、第１、第２、第３および／もしくは第４のムテインまたはそのポリペプチドは、投与される組成物に含まれる。組成物は、活性剤としての有効量の第１、第２、第３および／もしくは第４のムテインまたはそのポリペプチドを、少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と共に含んでもよい。また第１、第２、第３および／もしくは第４のムテインまたはそのポリペプチドは、個々の間隔、個々の時間点を含め、互いに独立して投与してもよい。
【０１９７】
一部の実施形態では、本開示で使用されるピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）に特異的なムテインは、例えば、検出可能な親和性で、つまり約２００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１５ｎＭ以下の解離定数で、ピオベルジン（それぞれＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ型）に結合することができる。一部の実施形態では、本開示で使用されるピオケリンに特異的なムテインは、例えば、検出可能な親和性で、つまり約２００ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約２５ｎＭ以下、または約１５ｎＭ以下の解離定数で、ピオケリンに結合することができる。一部のさらなる好ましい実施形態では、本開示による組合せのムテインは、ピオベルジン（それぞれＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）またはピオケリンに対して約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下、または約１０ｐＭ以下の解離定数で、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）またはピオケリンにそれぞれ結合する。したがって、本開示は、（ｉ）ピオベルジンＩ型（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、ｓａ、αＫＧ±Ｆｅ）に結合するｈＮＧＡＬのムテイン、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型（Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、ｓａ、αＫＧ±Ｆｅ）に結合するｈＮＧＡＬのムテイン、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型（Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、ｓａ、αＫＧ±Ｆｅ）に結合するｈＮＧＡＬのムテインおよび／または（ｉｖ）ピオケリン（Ｐｃｈ±Ｆｅ）に結合するｈＮＧＡＬのムテインの組合せを提供する。
【０１９８】
ピオベルジンに結合するｈＮＧＡＬムテインに関するさらなる詳細は、本開示の上記項目ａ）に見出せる。
【０１９９】
特定の実施形態では、ピオベルジンＩ型に特異的なムテインは、配列番号２〜１８のいずれか１つに示される。特定の実施形態では、ピオベルジンＩＩ型に特異的なムテインは、配列番号１９〜３７のいずれか１つに示される。特定の実施形態では、ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なムテインは、配列番号３８〜５３のいずれか１つに示される。
【０２００】
ピオケリンに結合するｈＮＧＡＬムテインのさらなる詳細は、本開示の上記項目ｃ）に開示される。
【０２０１】
特定の実施形態では、ピオケリンに特異的なムテインは、配列番号５４〜６３のいずれか１つに示される。
【０２０２】
また本開示は、ピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンの結合方法において使用することができる、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはそのポリペプチド、および（ｉｖ）ピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはそのポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む組成物に関する。
【０２０３】
本開示は、第１のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物、第２のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物、第３のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物、および／または第４のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物の組合せに関する。これらのムテインのうちの１つは、所与の非天然標的としてのピオベルジン（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型）に、例えば、検出可能な親和性で結合することができる。これらのムテインのうちの１つは、所与の非天然標的としてのピオケリンに、例えば、検出可能な親和性で、結合することができる。そのように、それぞれのムテインは、所与の非天然標的としてのピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型またはピオケリンにそれぞれ結合する。用語「非天然標的」は、生理学的条件下で、対応するリポカリン（野生型ｈＮＧＡＬ）に結合しない化合物を指す。例えば、第１のムテインもしくはポリペプチドまたはその組成物はピオベルジンの１つの型（Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩ型）またはピオケリンに結合することができ、第２、第３または第４のムテインもしくはポリペプチドまたはその組成物はピオケリンまたは別の型のピオベルジンにそれぞれ結合することができ、逆も同様である。第１、第２、第３および／または第４のムテインもしくはポリペプチドまたはその組成物の組合せは、様々な形態および方向性で提供される。
【０２０４】
なお別の態様では、本開示は、対象においてピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンを結合する方法であって、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的なムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的なムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なムテインもしくはそのポリペプチド、および（ｉｖ）ピオケリンに特異的なムテインもしくはそのポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法を特徴とする。一部の実施形態では、そのような組成物は、（ｉ）〜（ｉｖ）の２つまたはそれ以上、例えば３つまたは全てを含む。
【０２０５】
なお別の態様では、本開示は、対象において緑膿菌の増殖を阻害または低減させる方法であって、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的なムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的なムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なムテインもしくはそのポリペプチド、および（ｉｖ）ピオケリンに特異的なムテインもしくはそのポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法を含む。一部の実施形態では、そのような組成物は、（ｉ）〜（ｉｖ）の２つまたはそれ以上、例えば３つまたは全てを含む。
【０２０６】
また本開示は、ピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンと複合体を形成するための、（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはそのポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはそのポリペプチドおよび／または（ｉｖ）ピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはそのポリペプチドの使用を含む。
【０２０７】
したがって、本開示の別の態様では、開示されたムテインまたはポリペプチドは、ピオベルジンおよびピオケリンの検出のために使用することができる。そのような使用は、１つまたはそれ以上の前記ムテインまたはポリペプチドを、適切な条件下、ピオベルジンおよび／またはピオケリンを含有すると疑われる試料と接触させ、それにより、それぞれムテインもしくはポリペプチドとピオベルジンとの複合体および／またはムテインとピオケリンとの複合体の形成を可能にする工程、ならびに適切なシグナルによって複合体を検出する工程を含みうる。
【０２０８】
検出可能なシグナルは、上述のように、標識によって、または結合、つまり複合体の形成それ自体による物理的特性の変化によって生じうる。１つの例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、一方が金箔などの表面に固定化されている結合パートナーの結合の間に変化する。
【０２０９】
また本明細書に開示のムテインまたはポリペプチドは、ピオベルジンおよび／またはピオケリンの分離のために使用することができる。そのような使用は、１つまたはそれ以上の前記ムテインを、適切な条件下、ピオベルジンおよび／またはピオケリンを含有すると推定される試料と接触させ、それにより、それぞれムテインとピオベルジンとの複合体および／またはムテインとピオケリンとの複合体の形成を可能にする工程、ならびに試料から複合体を分離する工程を含みうる。
【０２１０】
ピオベルジンおよび／またはピオケリンの検出ならびにピオベルジンおよび／またはピオケリンの分離のための開示されたムテインまたはポリペプチドの使用では、ムテインおよび／またはピオベルジンおよびピオケリンまたはそのドメインもしくは断片を、適切な固相に固定してもよい。
【０２１１】
そのように、例えば、試料中の、ピオベルジンおよび／またはピオケリンの存在または非存在ならびにその濃度またはレベルが決定される。
【０２１２】
別の態様では、本開示は、キットオブパーツを提供する。キットは、１つまたはそれ以上の容器と、別個にまたは混合して、ピオベルジンＩ型に特異的なムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物、ピオベルジンＩＩ型に特異的なムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物、ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物、および／またはピオケリンに特異的なムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物とを含む。一部のさらなる好ましい実施形態では、キットは、ピオベルジンＩ型に特異的な第１のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物を含む第１の容器、ピオベルジンＩＩ型に特異的な第２のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物を含む第２の容器、ピオベルジンＩＩＩ型に特異的な第３のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物を含む第３の容器、および／またはピオケリンに特異的な第４のムテインもしくはポリペプチドもしくはその組成物を含む第４の容器を含む。一部の実施形態では、キットはさらに、内容物またはキットおよびムテインまたはそのポリペプチドの使用に係る情報を、一体的に、または１つもしくはそれ以上の別個の文書として含む。キットは、一部の実施形態では、希釈剤で再構成するために製剤化された１つまたはそれ以上の組成物を含むことができる。そのような希釈剤、例えば、滅菌希釈剤も、キット内、例えば、容器内に含むことができる。
【０２１３】
ｆ）ｈＮＧＡＬムテインならびにそのバリアントおよび断片
本開示によるムテインのアミノ酸配列は、別のリポカリンとの配列同一性を比較するとき、ヒトリポカリン２に対して高い配列同一性を有する（上記も参照）。この一般的文脈において、本開示による組合せのムテインのアミノ酸配列は、対応するリポカリン（野生型ｈＮＧＡＬ）のアミノ酸配列と少なくとも実質的に類似している。本開示による組合せのムテインのそれぞれの配列は、成熟ｈＮＧＡＬの配列と実質的に類似しており、成熟ｈＮＧＡＬの配列に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一である。この点に関して、当然のことながら本開示のムテインは、比較に際して、ムテインをピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型またはピオケリンにそれぞれ結合させることができる本明細書に記載される置換を含有してもよい。典型的に、ｈＮＧＡＬのムテインは、ｈＮＧＡＬのリガンド結合部位の開放端で４つのループにおけるアミノ酸に、ｈＮＧＡＬの天然配列と比較して１つまたはそれ以上の変異を含む。上記で説明したように、これらの領域は、ピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型またはピオケリンに対するムテインの結合特異性を決定するために、不可欠である。ムテイン誘導ｈＮＧＡＬまたはその相同体は、Ｎ端領域および／または天然の結合ポケットの反対側に位置するβ−バレル構造の端に配置された３つのペプチドループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧにおける任意の配列位置に、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の変異アミノ酸残基を有しうる。
【０２１４】
本開示によるムテインは、該ムテインがそれぞれピオベルジンまたはピオケリンに結合可能であることを条件として、対応する天然のｈＮＧＡＬと比較して、１つまたはそれ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、またさらには２０個の置換を含む。例えば、ムテインは、ｈＮＧＡＬの別々の位置に対応する位置に（つまり、対応位置に）置換を有しうる。一部の実施形態では、本開示による組合せのムテインは、アルギニン残基による天然アミノ酸の少なくとも２つのアミノ酸置換、例えば、２、３、４、５、またはさらにそれ以上のアミノ酸置換を含む。したがって、本明細書に記載されるタンパク質「参照」骨格の核酸は、ピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型またはピオケリンにそれぞれ結合可能なムテインを生成する目的の変異誘発の対象とされる。
【０２１５】
さらに、本明細書に開示のムテインは、そのＮまたはＣ端、特にそのＣ端に、ムテインの生物学的活性（その標的、例えば、それぞれピオベルジンまたはピオケリンへの結合性）に影響を与えない、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）、例えばＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩなどの異種アミノ酸配列を含むことができる。
【０２１６】
具体的には、野生型ｈＮＧＡＬと異なるムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が野生型ｈＮＧＡＬのアミノ酸配列におけるある特定の位置に対応するかを決定するために、当業者は、当技術分野で周知の手段または方法、例えばアラインメントを、手動で、または配列アラインメントを生成するために適切なコンピュータプログラム、例えばＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴ２．０またはＣｌｕｓｔａｌＷもしくは任意の他の適切なプログラムを使用して、利用することができる。したがって、野生型ｈＮＧＡＬは、「対象配列」または「参照配列」の役割を果たすことができ、一方、本明細書に記載の野生型ｈＮＧＡＬと異なるムテインのアミノ酸配列は「クエリー配列」の役割をする。用語「参照配列」および「野生型配列」は、本明細書で相互に交換可能に使用される。
【０２１７】
一部の実施形態では、置換（または置き換え）は、保存的置換である。それにもかかわらず、非保存的置換または以下に列挙する例示的置換のうちの１つもしくはそれ以上を含む任意の置換が、ムテインがそれぞれピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型またはピオケリンへのその結合能力を保持する、および／または「元の」配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれを超える同一性で置換された配列への同一性を有する限り、想定されている。
【０２１８】
保存的置換は、一般的に、変異されるアミノ酸、続いて保存的であると認められる１つまたはそれ以上の置き換えにより列挙される以下の置換である：Ａｌａ→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ；Ａｒｇ→Ｌｙｓ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ→Ａｓｎ；Ｇｌｕ→Ａｓｐ；Ｇｌｙ→Ａｌａ；Ｈｉｓ→Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ→Ｌｅｕ、Ｖａｌ；Ｌｅｕ→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｍｅｔ→Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ；Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ；Ｖａｌ→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ。他の置換も許容され、実験的にまたは他の既知の保存的もしくは非保存的置換に従って決定される。さらなる方向性として、以下の８つの群はそれぞれ、互いの保存的置換を定義すると典型的に認められるアミノ酸を含む：
ａ．アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
ｂ．アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
ｃ．アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
ｄ．アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）；
ｅ．イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
ｆ．フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
ｇ．セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；および
ｈ．システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）
【０２１９】
そのような置換が生物学的活性に変化を生じる場合、より実質的な、例えば以下のようなまたはアミノ酸分類を参照して下記にさらに記載されるような変化を導入し、その生成物を所望の特徴についてスクリーニングする。そのような、より実質的な変化の例は以下のとおりである：Ａｌａ→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；Ａｒｇ→Ｇｌｎ；Ａｓｎ→Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ａｓｎ；Ｃｙｓ→Ａｌａ；Ｇｌｎ→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ→Ｇｌｎ；Ｈｉｓ→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；Ｌｅｕ→Ａｌａ、Ｍｅｔ、ノルロイシン；Ｌｙｓ→Ａｓｎ；Ｍｅｔ→Ｐｈｅ；Ｐｈｅ→Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ；Ｔｒｐ→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ→Ｔｈｒ、Ｓｅｒ；Ｖａｌ→Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ。
【０２２０】
ｈＮＧＡＬの生物学的特性における実質的修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の例えばシートもしくは、らせん構造としての構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの作用が顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、側鎖の共通する特性に基づいて、群：（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；（２）中性、親水性：システイン、セリン、トレオニン；（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン；（５）鎖の方向性に影響を与える残基：グリシン、プロリン；ならびに（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンに分けられる。
【０２２１】
非保存的置換は、これらのクラスの１つを別のクラスに交換することを必然的に伴う。分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、ｈＮＧＡＬの適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般的にセリンを用いて置換してもよい。逆に、システイン結合（複数可）を追加して、安定性を改善してもよい。
【０２２２】
挿入を含め、上述の任意の変異が、核酸、例えばＤＮＡレベルで、確立された標準的方法を使用して非常に容易に達成される。アミノ酸配列の改変の実例は、挿入または欠失ならびにアミノ酸置換である。そのような置換は、保存的、つまり、特に極性ならびにサイズに関して化学的に類似の特性を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換える置換でありうる。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間での置き換えである：１）アラニン、セリン、およびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。一方で、アミノ酸配列に非保存的改変を導入してもよい。加えて、個々のアミノ酸残基を置き換える代わりに、ｈＮＧＡＬの一次構造の１つまたはそれ以上の連続アミノ酸を、その欠失または挿入により安定に折り畳まれた／機能的ムテインがもたらされる限り、挿入または欠失のいずれかをさせてもよい。
【０２２３】
アミノ酸配列の修飾には、ある特定の制限酵素についての切断部位を組み込むことにより変異ｈＮＧＡＬ遺伝子またはその部分のサブクローニングを簡素化するための単一のアミノ酸位置を指向した変異誘発が含まれる。加えて、これらの変異は、ピオベルジンまたはピオケリンなどの所与の標的に対するムテインの親和性をさらに高めるためにも組み込まれる。さらに、必要に応じて、変異は、ムテインのある特定の特徴を調節するために、例えば、折り畳みの安定性、血清安定性、タンパク質の耐性もしくは水溶性を改善するために、または凝集傾向を低下させるために、導入される。例えば、天然に存在するシステイン残基は、ジスルフィド架橋形成を防止するために、他のアミノ酸に変異される。さらに、例えば、他の化合物、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチドもしくはタンパク質に対するコンジュゲーションのために、または天然に存在しないジスルフィド連結の形成のために、新たな反応性基を導入するため、他のアミノ酸配列位置をシステインへ故意に変異させることも可能である。生じるチオール部分は、例えば、それぞれのムテインの血清半減期を増加させるために、ムテインをＰＥＧ化またはＨＥＳ化するために使用される。
【０２２４】
さらに、例えば、他の化合物、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチドもしくはタンパク質に対するコンジュゲーションのために、または天然に存在しないジスルフィド連結の形成のために、新たな反応性基を導入するため、他のアミノ酸配列位置をシステインへ変異させることも可能である。
【０２２５】
一部の実施形態では、上述の部分の１つを本開示のムテインにコンジュゲートする場合、アミノ酸側鎖へのコンジュゲーションが有利でありうる。適切なアミノ酸側鎖は、ｈＮＧＡＬのアミノ酸配列に天然に存在するものでもよく、または変異誘発により導入してもよい。適切な結合部位が変異誘発を介して導入される場合、１つの可能性はシステイン残基による適切な位置でのアミノ酸の置き換えである。
【０２２６】
ヒトリポカリン２のムテインに関して、ヒトリポカリン２ムテインを含むリポカリンのアミノ酸配列にシステイン残基を導入するそのような変異の典型的な可能性としては、ヒトＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６または１５８に対応する少なくとも１つの配列位置にシステイン（Ｃｙｓ）残基を導入することが挙げられる。一部の実施形態では、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンク受託番号Ｐ８０１８８の配列と比較して、システインが別のアミノ酸残基により置き換えられている配列を有する本開示のヒトリポカリン２ムテインでは、対応するシステインが、配列に再導入される。実例として、そのような場合において、アミノ酸８７位のシステイン残基が、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ８０１８８の配列に当初存在するシステインに戻すことにより、導入される。アミノ酸１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６および／または１５８位のいずれかの側鎖に生じるチオール部分は、例えば、それぞれのヒトリポカリン２ムテインの血清半減期を増加させるために、ムテインをＰＥＧ化またはＨＥＳ化するために使用することができる。
【０２２７】
別の実施形態では、上記化合物の１つを本開示によるムテインにコンジュゲートするための適切なアミノ酸側鎖を提供するために、人工アミノ酸が変異誘発により導入される。一般的に、そのような人工アミノ酸は、より反応性であって、したがって所望の化合物へのコンジュゲーションを容易にするように設計される。人工ｔＲＮＡを介して導入されるそのような人工アミノ酸の一例が、パラ−アセチル−フェニルアラニンである。
【０２２８】
本明細書に開示のムテインのいくつかの用途では、融合タンパク質の形態でそれらを使用することが有利である。一部の実施形態では、本開示のムテインは、本発明の融合分子に関連して本明細書に記載されるように、そのＮ端またはそのＣ端でタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチド、例えばシグナル配列および／または親和性タグに融合される。また本開示のムテインは、本発明の融合分子に関連して本明細書に記載されるように、ムテインの血清半減期を延長する部分にコンジュゲートしてもよい。また本開示のムテインは、本発明の融合分子に関連して本明細書に記載されるように、薬学的活性剤にコンジュゲート／融合してもよい。
【０２２９】
一般に、抗体のために通常使用される全ての標識（免疫グロブリンのＦｃ部分の糖部分と共に専ら使用されるものを除く）を、本開示のムテインに対するコンジュゲーションにも使用することができる。また本開示のムテインは、例えば、任意の適切な治療的活性剤を所与の細胞、組織もしくは器官に標的送達するために、または細胞、例えば腫瘍細胞を、周囲の正常細胞に影響させずに選択的に標的化するために、そのような治療的活性剤にコンジュゲートしてもよい。そのような治療的活性剤の例としては、放射性核種、毒素、有機小分子、および治療ペプチド（例えば、細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチドまたは所与の細胞標的に対してタンパク質結合で競合するペプチド）が挙げられる。一方で、本開示のムテインは、治療的活性核酸、例えば、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムにコンジュゲートしてもよい。そのようなコンジュゲートは、当技術分野で周知の方法によって製造することができる。
【０２３０】
さらに、本明細書に開示のムテインは、本開示のムテインに新たな特徴、例えば酵素活性または他の分子への結合親和性を付与しうる部分に融合してもよい。適切な融合パートナーの例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＧのアルブミン結合性ドメイン、プロテインＡ、抗体断片、オリゴマー化ドメイン、または毒素である。
【０２３１】
特に、本明細書に開示のムテインを、別の酵素活性部位に融合して、得られた融合タンパク質の両方の「成分」を一緒に所与の治療標的に作用させることも可能である。ムテインの結合ドメインを疾患原因標的に結合して、酵素ドメインに標的の生物学的機能を失わせる。
【０２３２】
本開示の一実施形態では、方法は、ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置２８、３４、３６、３９〜４２、４４〜４７、４９、５２、５４〜５５、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４、１４１および１４５に対応する配列位置のうちの少なくとも１つまたはさらにそれ以上をコードするヌクレオチドトリプレットで核酸分子を変異誘発に供することを含む。
【０２３３】
また本開示は、実験的変異誘発の示された配列位置以外に追加の変異を含む、本開示のムテインをコードする核酸分子を含む。そのような変異は、例えば、ムテインの折り畳み効率、血清安定性、熱安定性、またはリガンド結合親和性の改善に寄与する場合には容認されることが多く、さらには利点を示すことができる。
【０２３４】
用語「断片」は、本開示のムテインに関連して本明細書で使用するとき、Ｎ端および／またはＣ端が短縮されている、つまりＮ端および／またはＣ端アミノ酸のうちの少なくとも１つを欠く、全長成熟ヒトリポカリン２に由来するタンパク質またはペプチドに関する。そのような断片は、成熟ヒトリポカリン２の一次配列の、少なくとも１０、さらには例えば２０もしくは３０またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができ、通常、成熟ヒトリポカリン２のイムノアッセイで検出可能である。一般に、用語「断片」は、本開示のムテインまたは本開示による組合せまたは本明細書に記載の融合タンパク質の対応するタンパク質リガンドに関して本明細書で使用するとき、全長リガンドが本開示によるムテインにより認識および／または結合される能力を保持しているＮ端および／またはＣ端短縮タンパク質またはペプチドリガンドに関する。
【０２３５】
用語「変異誘発」は、本明細書で使用するとき、成熟ヒトリポカリン２の所与の配列位置に天然に存在するアミノ酸が、それぞれの天然ポリペプチド配列でその特定位置に存在しない少なくとも１つのアミノ酸によって置換されるように、実験的条件が選択されることを意味する。用語「変異誘発」には、１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（付加的）修飾も含まれる。したがって、例えば、選択された配列位置の１つのアミノ酸が、３つのランダム変異のストレッチにより置き換えられ、野生型タンパク質の個々のセグメントの長さと比較して２つのアミノ酸残基の挿入が導かれることも、本開示の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本開示における変異誘発の対象となりうるペプチドセグメントのいずれかに互いに独立して導入される。
【０２３６】
用語「ランダム変異誘発」は、変異誘発の間に、ある特定の配列位置に存在する所定の単一のアミノ酸（変異）は存在しないが、所定の配列位置に少なくとも２個のアミノ酸が、ある特定の確率で組み込まれうることを意味する。
【０２３７】
「同一性」は、配列の類似性または関係の尺度となる配列の特性である。用語「配列同一性」または「同一性」は、本開示で使用されるとき、本開示のポリペプチドの配列と検討配列との（相同）アラインメント後の、これらの２つの配列の長い方の残基の数に対する、ペアワイズ同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一のアミノ酸残基の数を残基の総数で割り、得られた値に１００を掛けることによって測定される。
【０２３８】
用語「相同性」は、本明細書で使用されるとき、その通常の意味において使用され、同一のアミノ酸ならびに本開示のポリペプチド（例えば、本開示の任意のムテイン）の線状アミノ酸配列の同等の位置で保存的置換（例えば、グルタミン酸残基がアスパラギン酸残基により交換）されたとみなされるアミノ酸を含む。
【０２３９】
配列相同性または配列同一性の割合は、例えば、プログラムＢＬＡＳＴＰ、バージョンｂｌａｓｔｐ  ２．２．５（２００２年１１月１６日；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２頁参照）を使用して本明細書で測定される。この実施形態で、相同性のパーセンテージは、好ましくはペアワイズ比較の参照として野生型タンパク質骨格を使用する、プロペプチド配列を含む全体のポリペプチド配列に対するアラインメント（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：１１．１；カットオフ値１０−３に設定）に基づく。それは、ＢＬＡＳＴＰプログラムの出力の結果として示される「ポジティブ」（相同アミノ酸）の数を、アラインメントのためにプログラムにより選択されたアミノ酸の総数で割ったパーセンテージとして計算される。
【０２４０】
具体的には、野生型ヒトリポカリン２と異なるムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が野生型ヒトリポカリン２のアミノ酸配列におけるある特定の位置に対応するかを決定するために、当業者は、当技術分野で周知の手段または方法、例えばアラインメントを、手動で、または配列アラインメントを生成するために適切なコンピュータプログラム、例えばＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴ２．０またはＣｌｕｓｔａｌＷもしくは任意の他の適切なプログラムを使用して、利用することができる。したがって、野生型ヒトリポカリン２は、「対象配列」または「参照配列」の役割を果たすことができ、本明細書に記載の野生型ヒトリポカリン２と異なるムテインのアミノ酸配列は「クエリー配列」の役割をする。用語「参照配列」および「野生型配列」は、本明細書で相互に交換可能に使用される。
【０２４１】
「ギャップ」は、アミノ酸の付加または欠失の結果である、アラインメントの空白である。したがって、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが、あまり高度に保存されておらず、欠失、付加または置き換えを有する配列同士は、低い配列同一性を有しうる。当業者は、いくつかのコンピュータプログラムが、標準的パラメータを使用して配列同一性を決定するために利用可能であることを認識しており、例えば、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２頁）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０頁）、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７、１９５〜１９７頁）のコンピュータプログラムである。
【０２４２】
本開示で使用される用語「バリアント」は、アミノ酸配列の修飾、例えば、置換、欠失、挿入または化学修飾による修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。そのような修飾は、一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドの機能を減少させない。そのようなバリアントとしては、１つまたはそれ以上のアミノ酸が、そのそれぞれのＤ−立体異性体によって、または天然に存在する２０アミノ酸以外のアミノ酸、例えば、オルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどによって置き換えられているタンパク質が挙げられる。しかし、そのような置換は、保存的であってもよく、つまりアミノ酸残基を、化学的に類似のアミノ酸残基によって置き換えてもよい。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間での置き換えである：１）アラニン、セリン、およびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【０２４３】
「天然配列」によって、ヒトリポカリン２は、自然由来の対応ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するヒトリポカリン２を意味する。したがって、天然配列ヒトリポカリン２は、それぞれの天然に存在するヒトリポカリン２のアミノ酸配列を有することができる。そのような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することができ、または組換えもしくは合成手段により製造することができる。用語「天然配列」ポリペプチドは、具体的には、ヒトリポカリン２の天然に存在する短縮もしくは分泌形態、選択的にスプライシングされた形態などの天然に存在するバリアント形態、およびヒトリポカリン２の天然に存在する対立バリアントを包含する。ポリペプチド「バリアント」は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのようなバリアントには、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が該ポリペプチドのＮまたはＣ端で付加または欠失されている、ポリペプチドが含まれる。一般に、バリアントは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２４４】
用語「位置（位）」は、本開示に従って使用されるとき、本明細書に示されるアミノ酸配列内のアミノ酸または本明細書に示される核酸配列内のヌクレオチドのいずれかの位置を意味する。本明細書で使用される用語「対応」または「対応する」を、１つまたはそれ以上のムテインのアミノ酸配列位置の文脈で理解するために、対応する位置は、先行のヌクレオチド／アミノ酸の数のみによっては決定されない。したがって、置換される本開示による所与のアミノ酸の位置は、（変異型または野生型）ヒトリポカリン２における他の場所のアミノ酸の欠失または付加によって変化しうる。同様に、置換される本開示による所与のヌクレオチドの位置は、プロモーターおよび／または任意の他の制御配列または遺伝子（エキソンおよびイントロンを含む）を含むムテインまたは野生型ヒトリポカリン２の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）における他の場所の欠失または付加的ヌクレオチドによって変化しうる。
【０２４５】
そのように、本開示による対応する位置について、ヌクレオチド／アミノ酸の位置は、類似の隣接するヌクレオチド／アミノ酸と指定された数で異なりうるが、交換、欠失、または付加された前記隣接するヌクレオチド／アミノ酸も、１つまたはそれ以上の対応する位置によって含まれると理解されることが好ましい。
【０２４６】
さらに、本開示による参照骨格に基づくムテインの対応する位置について、ヌクレオチド／アミノ酸の位置は、それらが指定された数で異なる場合でも、ムテインまたは野生型ヒトリポカリン２における他の位置に構造的に対応すると理解されることが好ましい。
【０２４７】
ｇ）例えば、本発明の融合分子で使用するための、ｈＮＧＡＬムテインおよびそれを含むポリペプチドに関する特定の実施形態
１．ピオベルジンＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ型またはピオケリンに対する結合特異性を有するポリペプチドであって、ピオベルジンＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ型またはピオケリンに例えば検出可能な親和性で結合するｈＮＧＡＬムテインを含む、前記ポリペプチド。
２．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３４、３６、３９〜４２、４４〜４７、４９、５２、５４〜５５、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４、１４１および１４５位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。
３．前記ムテインは、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下のＫＤで、鉄錯体形成しているピオベルジンＩ型と結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
４．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないＰｖｄ  Ｉ型スクシニル、Ｐｖｄ  Ｉ型スクシナミド、およびＰｖｄ  Ｉ型α−ケトグルタリルと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
５．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオベルジンＩ型によって媒介される鉄取り込みを阻害することができる、実施形態３に記載のポリペプチド。
６．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  Ｉ株の細菌増殖を阻害することができる、実施形態３に記載のポリペプチド。
７．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３６、３９〜４１、４６、４９、５２、５４〜５５、５９、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１３６位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態３〜６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
８．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＰｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ、ＴｒｐまたはＰｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＴｈｒ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＡｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＧｌｕ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＡｓｐ；Ａｓｎ９６→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＡｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＴｙｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、ＴｒｐまたはＡｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ、ＧｌｎまたはＰｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＧｌｙまたはＬｙｓ；およびＬｙｓ１３４→Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐのうちの少なくとも１つを含む、実施形態３〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
９．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｔｈｒ５４→ＶａｌまたはＡｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→ＡｓｐまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→ＳｅｒまたはＡｓｎ；およびＴｈｒ１３６→Ａｌａを含む、実施形態３〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置２８、３６、３９〜４１、４６、４９、５２、５４〜５５、５９、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１３６に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態３〜８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２４８】
１１．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ；Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｎ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｎ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｐ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｈｒ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｐｈｅ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｌｅｕ７０→Ｔｒｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ｔｙｒ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１３２→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｎ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ａｌａ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ａｓｎ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｖａｌ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｐｈｅ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｐｈｅ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ｔｒｐ；Ａｒｇ７２→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｕ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｖａｌ；Ｓｅｒ１２７→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｌｙｓ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｉ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｔｈｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｊ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ；Ａｓｐ７７→Ｖａｌ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｋ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；
（ｌ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｍ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ８７→Ａｓｎ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→ｓＥＲ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；
（ｎ）  Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｓｎ３９→Ａｓｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；Ｔｈｒ１３６→Ａｌａ；
（ｏ）  Ｌｅｕ３６→Ｔｒｐ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；Ｔｈｒ１３６→Ａｌａ；
（ｐ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ８７→Ａｓｎ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→ｓＥＲ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ；または
（ｑ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ４６→Ｇｌｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ｉｌｅ５５→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ｖａｌ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ７５→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ８７→Ａｓｎ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→ｓＥＲ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｈｉｓ
のうちの１つを含む、先行する実施形態３〜１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２４９】
１２．ｈＮＧＡＬムテインは、配列番号２〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む、実施形態３〜１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１３．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているピオベルジンＩＩ型と結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
１４．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないＰｖｄ  ＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩ型スクシナミド、およびＰｖｄ  ＩＩ型α−ケトグルタリルと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
１５．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオベルジンＩＩ型によって媒介される鉄取り込みを阻害することができる、実施形態１３に記載のポリペプチド。
１６．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  ＩＩ株の細菌増殖を阻害することができる、実施形態１３に記載のポリペプチド。
１７．前記ｈＮＧＡＬムテインは、実施例９に本質的に記載されるアッセイにおいて、ピオベルジンＩＩ型を発現する緑膿菌株の増殖を阻害することができる、実施形態１３に記載のポリペプチド。
１８．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３６、４０〜４１、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態１３〜１７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１９．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＶａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＨｉｓ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ、ＶａｌまたはＴｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＴｒｐまたはＰｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＧｌｕ；Ｌｅｕ７０→ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＧｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＡｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＰｈｅまたはＴｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＡｓｐ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＡｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＴｙｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＶａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ａｌａ、ＩｌｅまたはＡｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、ＡｓｐまたはＡｓｎ；Ｔｙｒ１３２→Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＶａｌ；およびＬｙｓ１３４→ＴｒｐまたはＴｙｒのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１３〜１８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２０．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→ＡｓｐまたはＧｌｎおよびＣｙｓ８７→Ｓｅｒを含む、実施形態１３〜１９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２１．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置２８、３６、４０〜４１、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７５、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態１３〜２０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２５０】
２２．ｈＮＧＡＬムテインは、天然の野生型ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｐｒｏ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１００→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ａｌａ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ａｓｎ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｎ；Ａｓｐ７７→Ｍｅｔ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ；Ａｒｇ８１→Ｔｙｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１００→Ｐｒｏ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｙｓ；Ｓｅｒ１２７→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１２５→Ａｌａ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ａｓｎ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ；Ｌｅｕ７０→Ｔｒｐ；Ａｒｇ７２→Ａｓｎ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｎ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｔｈｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｙｒ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｙ；Ｔｒｐ７９→Ｔｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｔｒｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｙｓ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｉ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｊ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｐｈｅ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｋ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｔｒｐ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｌ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ｐｈｅ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｍ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｎ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｐｈｅ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｏ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ４１→Ｖａｌ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ；Ａｓｐ７７→Ａｓｎ；Ｔｒｐ７９→Ｐｈｅ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｓｎ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｐ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｑ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｒ）  Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；または
（ｓ）  Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｈｒ；Ｉｌｅ４１→Ｉｌｅ；Ｇｌｎ４９→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ；Ａｓｎ６５→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｔｙｒ；Ａｒｇ８１→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｈｒ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｉｌｅ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ
のうちの１つを含む、先行する実施形態１３〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２５１】
２３．ｈＮＧＡＬムテインは、配列番号１９〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む、実施形態１３〜２２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２４．前記ムテインは、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているピオベルジンＩＩＩ型と結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
２５．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないＰｖｄ  ＩＩＩ型スクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩＩ型スクシナミド、およびＰｖｄ  ＩＩＩ型α−ケトグルタリルと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
２６．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオベルジンＩＩＩ型によって媒介される鉄取り込みを阻害することができる、実施形態２４に記載のポリペプチド。
２７．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  ＩＩＩ株の細菌増殖を阻害することができる、実施形態２４に記載のポリペプチド。
２８．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３６、４０〜４２、４５〜４７、４９、５２、６５、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０５〜１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１４５位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態２４〜２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２９．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→ＰｈｅまたはＧｌｕ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＡｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＴｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＭｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎ；Ｌｅｕ７０→Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＴｙｒ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＴｙｒ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ｔｒｐ７９→ＳｅｒまたはＡｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＶａｌ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｔｙｒ１００→Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ＰｒｏまたはＡｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＰｈｅまたはＰｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→ＴｒｐまたはＴｈｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＡｌａ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；およびＬｙｓ１３４→Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕのうちの少なくとも１つを含む、実施形態２４〜２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３０．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ａｓｐ４７→Ａｓｎ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１０５→ＰｒｏおよびＴｈｒ１４５→Ｐｒｏを含む、実施形態２４〜２９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３１．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置２８、３６、４０〜４２、４５〜４７、４９、５２、６５、６８、７０、７２〜７３、７７、７９、８１、８７、９６、１００、１０３、１０５〜１０６、１２５、１２７、１３２、１３４および１４５に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態２４〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２５２】
３２．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ｌｙｓ；Ａｒｇ７２→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｎ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ５２→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｎ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１００→Ｉｌｅ；Ｌｅｕ１０３→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ７３→Ｔｙｒ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｌａ；Ｌｅｕ１０３→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｐｈｅ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ｐｒｏ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１００→Ｐｒｏ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｎ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｉ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｔｙｒ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→−；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｊ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｋ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４７→Ａｓｎ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；Ｔｈｒ１４５→Ｐｒｏ；
（ｌ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｍ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；
（ｎ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４７→Ａｓｎ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；Ｔｈｒ１４５→Ｐｒｏ；
（ｏ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ；または
（ｐ）  Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ；Ａｌａ４０→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ５２→Ｍｅｔ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｖａｌ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ１０５→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｔｒｐ
のうちの１つを含む、先行する実施形態２４〜３１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２５３】
３３．配列番号３８〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む、実施形態２４〜３２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３４．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例６に本質的に記載されるアッセイにおいてＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器によって測定されると、約２０ｎＭ以下のＫＤで、鉄と錯体形成しているピオケリンと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
３５．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるアッセイにおいて測定されると、約５００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているピオケリンと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
３６．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成していないピオケリンと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
３７．前記ｈＮＧＡＬムテインは、例えば、実施例５に本質的に記載されるアッセイにおいて測定されると、約２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で測定される親和性で、鉄と錯体形成しているおよび錯体形成していないピオケリンと結合することができる、実施形態１に記載のポリペプチド。
３８．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例７に本質的に記載される競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、約１５０ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ピオケリンによって媒介される鉄取り込みを阻害することができる、実施形態３４に記載のポリペプチド。
３９．ｈＮＧＡＬムテインは、実施例８に本質的に記載されるアッセイにおいて、Ｐｖｄ  Ｉノックアウト（ΔｐｖｄＡ）の細菌増殖を阻害することができる、実施形態３４に記載のポリペプチド。
４０．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の２８、３４、３６、４０〜４１、４４〜４６、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７４、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４および１４１位に対応する１つまたはそれ以上の位置に変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態３４〜３９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
４１．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の変異アミノ酸残基：Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ、ＭｅｔまたはＶａｌ；Ａｌａ４０→Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、ＴｙｒまたはＰｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＴｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＡｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｌｅｕ、ＴｒｐまたはＰｒｏ；Ｓｅｒ６８→ＡｓｐまたはＨｉｓ；Ｌｅｕ７０→ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ａｒｇ７２→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＧｌｙ；Ｌｙｓ７３→Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＡｒｇ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＡｓｐ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＴｒｐ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＰｒｏまたはＡｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＧｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＨｉｓまたはＧｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＩｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；およびＬｙｓ１３４→Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｓｎまたはＰｈｅのうちの少なくとも１つを含む、実施形態３４〜４０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
４２．ｈＮＧＡＬムテインのアミノ酸配列は、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して以下の置換：Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｖａｌ３４→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ４４→Ｇｌｙ；
Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ→ＡｒｇまたはＴｙｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ９４→Ｐｈｅ；Ｖａｌ１０８→Ａｌａ；Ｐｈｅ１２３→ＳｅｒおよびＴｈｒ１４１→Ａｌａを含む、実施形態３４〜４１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
４３．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ヒトＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列（配列番号１）の配列位置２８、３４、３６、４０〜４１、４４〜４６、４９、５２、５４、６５、６８、７０、７２〜７４、７７、７９〜８１、８７、９６、１００、１０３、１０６、１０８、１２３、１２５、１２７、１３２、１３４および１４１に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の変異アミノ酸残基を含む、先行する実施形態３４〜４２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２５４】
４４．ｈＮＧＡＬムテインは、成熟ｈＮＧＡＬの線状ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット：
（ａ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｉｌｅ；Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ５２→Ｌｅｕ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ７２→Ｌｙｓ；Ｌｙｓ７３→Ｔｒｐ；Ａｓｐ７７→Ｉｌｅ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｌｅｕ；
（ｂ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；
（ｃ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｐｒｏ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｈｒｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｖａｌ；
（ｄ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ａｌａ４０→Ｔｙｒ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ａｌａ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｓｐ；Ａｒｇ８１→Ｔｒｐ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ａｒｇ；Ｌｙｓ１２５→Ｌｅｕ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｅ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｖａｌ３４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｐｒｏ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｔｒｐ；Ｐｈｅ１２３→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｈｒｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｖａｌ；Ｔｈｒ１４１→Ａｌａ；
（ｆ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ａｌａ４０→Ｐｈｅ；Ｉｌｅ４１→Ｈｉｓ；Ｇｌｎ４９→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ５２→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ６８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ７０→Ｐｒｏ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｌａ；Ａｓｐ７７→Ａｌａ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｉｌｅ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ａｓｎ９６→Ａｌａ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｔｒｐ；Ｐｈｅ１２３→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｈｒｕ；Ｌｙｓ１３４→Ｖａｌ；
（ｇ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；
（ｈ）  Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ｇｌｕ４４→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ｔｙｒ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ７４→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ９４→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｖａｌ１０８→Ａｌａ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；または
（ｉ）  Ｌｅｕ３６→Ｈｉｓ；Ａｌａ４０→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ４１→Ｔｒｐ；Ａｓｐ４５→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ４６→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｔｒｐ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｐ；Ｌｅｕ７０→Ａｓｐ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｉｌｅ；Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ；Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ；Ｔｙｒ１００→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１０６→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ａｌａ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅのうちの１つを含む、先行する実施形態３４〜４３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２５５】
４５．配列番号５４〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む、実施形態３４〜４４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
４６．配列番号２〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含む、実施形態１に記載のポリペプチド。
４７．前記ｈＮＧＡＬムテインは、野生型ｈＮＧＡＬの１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換する１つまたはそれ以上の非天然システイン残基を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
４８．前記ｈＮＧＡＬムテインは、別のアミノ酸による天然システイン残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
４９．前記別のアミノ酸は、セリン残基である、実施形態４８に記載のポリペプチド。
５０．ｈＮＧＡＬムテインは、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂抑制剤、毒素、金属錯体、金属、および金コロイドからなる群から選択される化合物にコンジュゲートしている、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５１．ｈＮＧＡＬムテインは、そのＮ端および／またはそのＣ端で、タンパク質、またはタンパク質ドメインまたはペプチドである融合パートナーに融合している、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５２．ｈＮＧＡＬムテインは、ポリペプチドの血清半減期を延長させる化合物にコンジュゲートしている、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５３．血清半減期を延長させる化合物は、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群から選択される、実施形態５２に記載のポリペプチド。
５４．ポリアルキレングリコールは、ポリエチレン（ＰＥＧ）またはその活性化誘導体である、実施形態５３に記載のポリペプチド。
５５．実施形態１〜５４のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
５６．前記核酸分子の発現を可能にするように制御配列に作動可能に連結されている、実施形態５５に記載の核酸分子。
５７．ベクターまたはファージミドベクターに含まれている、実施形態５５または５６に記載の核酸分子。
５８．実施形態５５〜５７のいずれか１つに記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
５９．ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的手法により製造される、実施形態１〜５４のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造する方法。
６０．ポリペプチドは、細菌または真核宿主生物で製造され、この宿主生物またはその培養物から単離される、実施形態５９に記載の方法。
６１．（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的なポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的なポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なポリペプチド、および（ｉｖ）ピオケリンに特異的なポリペプチドからなる群から選択される１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む、組成物。
６２．（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的なポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的なポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なポリペプチド、および（ｉｖ）ピオケリンに特異的なポリペプチドからなる群から選択される２つまたはそれ以上のポリペプチドを含む、実施形態６１に記載の組成物。
６３．（ｉ）ピオベルジンＩ型に特異的なポリペプチド、（ｉｉ）ピオベルジンＩＩ型に特異的なポリペプチド、（ｉｉｉ）ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なポリペプチド、および（ｉｖ）ピオケリンに特異的なポリペプチドからなる群から選択される３つまたは４つのポリペプチドを含む、実施形態６２に記載の組成物。
６４．ピオベルジンＩ型に特異的なポリペプチドは、実施形態３〜１１のいずれか１つに記載のポリペプチドである、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の組成物。
６５．ピオベルジンＩＩ型に特異的なポリペプチドは、実施形態１２〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチドである、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の組成物。
６６．ピオベルジンＩＩＩ型に特異的なポリペプチドは、実施形態２２〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドである、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の組成物。６７．ピオケリンに特異的なポリペプチドは、実施形態３１〜４１のいずれか１つに記載のポリペプチドである、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の組成物。
６８．少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体をさらに含む、実施形態６１〜６７のいずれか１つに記載の組成物。
６９．対象においてピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンを結合する方法であって、有効量の実施形態６１〜６７のいずれか１つに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
７０．対象において緑膿菌の増殖を阻害または低減させる方法であって、有効量の実施形態６１〜６７のいずれか１つに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
７１．１つまたはそれ以上の容器と、別個にまたは混合して、実施形態６１〜６７のいずれか１つに記載の組成物とを含む、キット。
７２．対象におけるピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンの結合のための、（ｉ）実施形態３〜１１のいずれか１つに記載の第１のポリペプチド、（ｉｉ）実施形態１２〜２１のいずれか１つに記載の第２のポリペプチド、（ｉｉｉ）実施形態２２〜３０のいずれか１つに記載の第３のポリペプチド、および／または（ｉｖ）実施形態３１〜４１のいずれか１つに記載の第４のポリペプチドの使用。
７３．対象において緑膿菌によるピオケリンおよび／またはピオベルジンを介した鉄取り込みを予防または減少させるための、（ｉ）実施形態３〜１２のいずれか１つに記載の第１のポリペプチド、（ｉｉ）実施形態１３〜２３のいずれか１つに記載の第２のポリペプチド、（ｉｉｉ）実施形態２４〜３３のいずれか１つに記載の第３のポリペプチド、および／または（ｉｖ）実施形態３４〜４５のいずれか１つに記載の第４のポリペプチドの使用。
７４．対象における緑膿菌バイオフィルム感染の処置または緩和のための、（ｉ）実施形態３〜１２のいずれか１つに記載の第１のポリペプチド、（ｉｉ）実施形態１３〜２３のいずれか１つに記載の第２のポリペプチド、（ｉｉｉ）実施形態２４〜３３のいずれか１つに記載の第３のポリペプチド、および／または（ｉｖ）実施形態３４〜４５のいずれか１つに記載の第４のポリペプチドの使用。
７５．緑膿菌バイオフィルム感染は急性または慢性感染である、実施形態７４に記載の使用。
７６．前記第１、第２、第３および／または第４のポリペプチドは、同時、付随的、または連続投与を含め、組合せで投与される、実施形態７２〜７５のいずれか１つに記載の使用。
７７．前記第１、第２、第３および／または第４のポリペプチドは、個々の間隔、個々の時間点を含め、互いに独立して投与される、実施形態７２〜７５のいずれか１つに記載の使用。
７８．（ｉ）実施形態３〜１１のいずれか１つに記載のポリペプチド、（ｉｉ）実施形態１２〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチド、（ｉｉｉ）実施形態２２〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチド、および／または（ｉｖ）実施形態３１〜４１のいずれか１つに記載のポリペプチドの組合せ。
【０２５６】
Ｃ．核酸分子
また本発明は、本発明の融合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。遺伝コードの縮重により、ある特定のコドンを、同じアミノ酸を特定する他のコドンで置換することが可能であるので、本発明は、本明細書に記載の融合分子をコードする特定の核酸分子に限定されず、機能的融合分子をコードするヌクレオチド配列を含む全ての核酸分子を包含する。
【０２５７】
この出願で開示される核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にする制御配列（または複数の制御配列）に「作動可能に連結」することができる。
【０２５８】
核酸分子、例えばＤＮＡは、転写および／または翻訳制御に関する情報を含む配列エレメントを含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」される場合、「核酸分子の発現を可能にする」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」ことができると称される。作動可能な連結は、制御配列エレメントと発現される配列とが遺伝子発現を可能にする様式で接続されている連結である。遺伝子発現に必要な制御配列の精密な性質は、種間で異なりうるが、一般的には、これらの領域はプロモーターを含み、プロモーターには、原核生物では、プロモーターそれ自体、つまり転写の開始を指示するＤＮＡエレメントと、ＲＮＡに転写されたときに翻訳開始のシグナルを送るＤＮＡエレメントとの両方が含まれる。そのようなプロモーター領域は、通常、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列が含まれ、例えば、原核生物の場合には−３５／−１０ボックスおよびシャイン・ダルガーノエレメント、真核生物の場合にはＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列および５’キャップエレメントが含まれる。これらの領域には、エンハンサーおよびリプレッサーエレメント、ならびに翻訳シグナル、ならびに宿主細胞の特定の区画に天然ポリペプチドを標的化するためのリーダー配列を含めることもできる。
【０２５９】
一部の実施形態では、この出願に開示される核酸分子、例えばＤＮＡは、開示される融合タンパク質の発現を可能にする別の開示される核酸分子に「作動可能に連結」されている。この点に関して、作動可能な連結は、第１の核酸分子の配列エレメントおよび第２の核酸分子の配列エレメントが、融合タンパク質の単一ポリペプチドとしての発現を可能にするように接続されている連結である。
【０２６０】
さらに、３’非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する制御エレメントを含んでもよい。しかしながら、これらの終結配列が、特定の宿主細胞で十分に機能しない場合、その細胞において機能的なシグナルで置換してもよい。
【０２６１】
したがって、本発明の核酸分子は、プロモーター配列などの制御配列を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターは、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーターまたはＴ７プロモーターである。真核細胞における発現のために有用なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。
【０２６２】
一実施形態では、核酸分子は、ベクターに含まれている。用語「ベクター」としては、本明細書で使用するとき、当業者に既知の任意のベクター、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えばラムダファージ、ファージミドもしくはファスミド、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクター、または人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）が挙げられる。前記ベクターは、発現ベクターならびにクローニングベクターを含む。発現ベクターとしては、プラスミドならびにウイルスベクターが挙げられ、発現ベクターは、一般的に、所望のコード配列と、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系で作動可能に連結される該コード配列を発現するために必要な適切なＤＮＡ配列とを含む。クローニングベクターは、一般的に、所望のＤＮＡ断片を改変または増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列は欠いていてもよい。多数の適切な発現およびクローニングベクターが当技術分野で既知であり、市販されている。
【０２６３】
一実施形態では、核酸分子は、ファスミドに含まれる。ファスミドベクターは、溶原ファージ（ｔｅｍｐｅｒｅｎｔ  ｐｈａｇｅ）の遺伝子間領域、例えばＭ１３もしくはｆ１、または目的のｃＤＮＡに融合されたその機能部分をコードするベクターを意味する。そのようなファスミドベクターおよび適切なヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３またはＲ４０８）で細菌宿主細胞を重感染した後、無傷のファージ粒子が製造され、それによって、コードされた異種ｃＤＮＡを、ファージ表面に示されたその対応するポリペプチドに物理的に結合させることができる（例えば、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６、４０１〜４２４頁、またはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０、８７〜９３頁を参照）。
【０２６４】
本明細書に記載される融合分子をコードするＤＮＡ分子、特にそのような融合分子のコード配列を含むベクターは、遺伝子の発現を可能にする宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトすることができる。形質転換またはトランスフェクションは、標準的な技術を使用して実施される。したがって、本発明は、本明細書に開示される核酸分子を含む宿主細胞も対象とする。
【０２６５】
一実施形態では、用語「細胞」または「宿主細胞」は、無傷の細胞、つまり、酵素、細胞小器官または遺伝物質などの通常の細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞に関する。一実施形態では、無傷の細胞は、生細胞、つまり、通常の代謝機能を実行可能な、生きている細胞である。一実施形態では、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸でトランスフェクトまたは形質転換される任意の細胞に関する。一実施形態では、細胞は、外因性核酸でトランスフェクトまたは形質転換され、レシピエントに移行されるとき、レシピエントで核酸を発現することができる。用語「細胞」には、原核細胞、例えば細菌細胞、および真核細胞、例えば酵母細胞、真菌細胞もしくは哺乳動物細胞が含まれる。適切な細菌細胞としては、グラム陰性細菌株、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ならびにグラム陽性細菌株、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。適切な真菌細胞としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種由来の細胞が挙げられる。適切な酵母細胞としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））ならびにハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種由来の細胞が挙げられる。適切な哺乳動物細胞としては、初代哺乳動物細胞または不死化哺乳動物細胞株、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ＨＥＫなどが挙げられる。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９またはＨｉｇｈ５）、植物細胞、および異種タンパク質の発現のために当技術分野で使用されるいずれの他の細胞も同様に使用することができる。
【０２６６】
また本発明は、本明細書に記載される融合分子を製造するための方法であって、融合分子が、該融合分子をコードする核酸から出発して遺伝子工学的手法という手段により製造される、前記方法に関する。方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができ、融合分子は、例えば、細菌または真核宿主生物／細胞で製造され、次いでこの宿主生物／細胞またはその培養物から単離される。タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して、製造することも可能である。
【０２６７】
融合分子をｉｎ  ｖｉｖｏで製造するとき、そのような融合分子をコードする核酸を、適切な細菌または真核宿主生物／細胞に、組換えＤＮＡ技術という手段によって（上記で既に概略を述べたように）導入する。この目的のため、最初に宿主細胞は、確立された標準的な方法を使用して、本明細書に記載される融合分子をコードする核酸分子を含むクローニングベクターで形質転換される。次いで宿主細胞は、異種ＤＮＡの発現、したがって対応するポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養される。続いて、ポリペプチドが、細胞または培養培地のいずれかから回収される。
【０２６８】
一部の実施形態では、Ｃｙｓ７６とＣｙｓ１７５との間の天然に存在するジスルフィド結合は、融合分子で使用するｈＮＧＡＬムテインにおいて除去される。したがって、そのようなムテインは、還元レドックス環境を有する細胞コンパートメント、例えば、グラム陰性細菌の細胞質で製造することができる。
【０２６９】
本発明の融合分子が分子内ジスルフィド結合を含む場合、適切なシグナル配列を使用して、酸化レドックス環境を有する細胞コンパートメントに新生ポリペプチドを指向させることが好ましい場合がある。そのような酸化環境は、グラム陰性細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム、グラム陽性細菌の細胞外環境、または真核細胞の小胞体内腔で提供され、通常、構造的ジスルフィド結合の形成に好適である。
【０２７０】
しかしながら、宿主細胞、特に大腸菌の細胞質において、本発明の融合分子を製造することもできる。この場合に、融合分子は、可溶性および折り畳まれた状態で直接取得されるかまたは封入体の形態で回復され、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生される。さらなる選択肢は、細胞質内のジスルフィド結合の形成をしたがって可能にしうる酸化細胞内環境を有する特定の宿主株の使用である（Ｖｅｎｔｕｒｉら（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５、１〜８頁）。
【０２７１】
しかしながら、本明細書に記載される融合分子は、遺伝子工学のみの使用によって生成または製造される必要はない。むしろ、そのような融合分子は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ポリペプチド合成などの化学合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写および翻訳によって取得することもできる。タンパク質の固相および／または液相合成のための方法は当技術分野で周知であり（例えば、Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ，Ｔ．ら（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５、２９〜４３頁参照）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のための方法についても同様である。有望な変異を、分子モデリングを使用して識別し、次いで所望の（設計された）ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成して、ピオベルジンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型および／またはピオケリンに対する結合活性を調査することも可能である。タンパク質の固相および／または液相合成のための方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ，Ｔ．ら（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５、２９〜４３頁参照）。
【０２７２】
熟練した作業者は、本発明によって企図されているがそのタンパク質または核酸配列が本明細書に明白に開示されていない融合分子を調製するための方法を認識する。概要として、アミノ酸配列のそのような修飾には、例えば、ある特定の制限酵素についての切断部位を組み込むことにより、ｈＮＧＡＬムテイン遺伝子またはその部分のサブクローニングを簡素化するための単一のアミノ酸位置を指向した変異誘発が含まれる。加えてこれらの変異は、その標的（例えば、それぞれピオベルジンまたはピオケリン）に対するムテインの親和性をさらに高めるために組み込まれてもよい。さらに、必要に応じて、ムテインおよび融合分子のある特定の特徴を調節するために、例えば、折り畳みの安定性、血清安定性、タンパク質の耐性もしくは水溶性を改善するために、または凝集傾向を低下させるために、変異を導入してもよい。例えば、天然に存在するシステイン残基を、ジスルフィド架橋形成を防止するために、他のアミノ酸に変異させてもよい。
【０２７３】
また本開示は、本明細書に開示のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。この点に関して、本開示は、配列番号６５〜１２６に示されるような、本開示の一部のムテインをコードするヌクレオチド配列を提供する。遺伝コードの縮重により、ある特定のコドンを、同じアミノ酸を特定する他のコドンで置換することが可能であるので、本開示は、本明細書に記載のムテインをコードする特定の核酸分子に限定されず、機能的ムテインをコードするヌクレオチド配列を含む全ての核酸分子を包含する。本開示は、前記核酸分子を含有する宿主細胞をさらに包含する。本発明の融合分子に関連して開示される核酸分子および（宿主）細胞に関連する全ての態様および実施形態が、単一のムテインおよびその組合せにも適用可能である。同じことが、それらの製造方法にも適用される。
【０２７４】
Ｄ．組成物およびキット
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義されているような融合分子、本明細書に定義されているような核酸分子、または本明細書に定義されているような細胞を含む医薬組成物に関する。
【０２７５】
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、無菌であり、および／または、所望の反応または所望の効果を生じる、本明細書に記載された、有効量の融合分子、核酸分子、または細胞を含有する。
【０２７６】
本記載を通して使用される場合、用語「有効量」は、有益な、または所望の結果をもたらすのに十分である量を指し、有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。特定の疾患または特定の状態の処置の場合、有益な、または所望の結果は特に、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、および、特に、疾患の進行を妨害し、または逆転させることを含む。疾患または状態の処置における有益な、または所望の結果はまた、該疾患または該状態の発症の遅延、またはその発症の予防であり得る。本明細書に記載された作用物質または組成物の有効量は、処置されるべき状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む対象の個々のパラメータ、処置期間、（もしあれば）付随的な治療の型、特定の投与経路、ならびに類似した因子に依存する。したがって、本明細書に記載された作用物質の投与される用量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。対象における反応が初回量で不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される、効果的により高い用量）が使用される。
【０２７７】
医薬組成物は、通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製される。医薬組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形であり得る。
【０２７８】
医薬組成物は、１つまたはそれ以上の担体および／または賦形剤をさらに含んでもよく、それらの全部は、特定の実施形態において、薬学的に許容される。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、特定の実施形態において医薬組成物の活性物質の作用と相互作用しない、材料の無毒性を指す。
【０２７９】
用語「担体」は、適用を促進し、増強し、または可能にするために活性成分が組み合わせられる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、用語「担体」はまた、対象への投与に適している、１つまたはそれ以上の適合性固体または液体の増量剤、希釈剤、または封入用物質を含む。
【０２８０】
非経口投与に適した医薬組成物は通常、特定の実施形態においてレシピエントの血液と等張である、活性化合物の無菌水性または非水性調製物を含む。非経口投与用の適合性担体／溶媒／希釈剤の例は、例えば、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン／ポリオキシ−プロピレンコポリマーである。加えて、通常、滅菌固定油が、溶液または懸濁液媒質として使用される。
【０２８１】
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、医薬組成物中に存在し得、かつ塩、結合剤、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝物質、香味剤、または着色剤などの活性成分ではない全ての物質を含むことを意図される。
【０２８２】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用される場合があり、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸から調製された塩を含む：塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。薬学的に許容される塩はまた、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製される。
【０２８３】
医薬組成物に使用される適切な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールが挙げられる。
【０２８４】
医薬組成物に使用される適切な緩衝物質には、塩の形での酢酸、塩の形でのクエン酸、塩の形でのホウ酸、および塩の形でのリン酸が挙げられる。
【０２８５】
医薬組成物はまた、１つまたはそれ以上の薬学的に許容されるアジュバントを含み得る。
【０２８６】
一実施形態において、医薬組成物は、全身投与、特に非経口（例えば、皮下）投与用に製剤化される。別の実施形態において、医薬組成物は吸入用に製剤化される。
【０２８７】
一実施形態において、医薬組成物はさらに、追加の薬学的活性剤を含む。
【０２８８】
一実施形態において、追加の薬学的活性剤は、抗生物質、細胞分裂阻害剤、毒素、酵素、金属または金属化合物／錯体、キレート剤、放射性核種、有機低分子、治療効果のあるペプチド、治療効果のある核酸分子、ハプテン、および抗体からなる群から選択される。適切な抗生物質には、トブラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、コリスチン、およびカルバペネムが挙げられる。
【０２８９】
適切な金属または金属化合物／錯体は、ガリウム、ガリウム化合物、およびガリウム系錯体である。
【０２９０】
本明細書で使用される場合、用語「有機低分子」は、少なくとも２個の炭素原子を含むが、好ましくは、７個以下または１２個以下の回転可能な炭素結合を含み、１００ダルトンから２０００ダルトンの間、特に１００ダルトンから１０００ダルトンの間、または９００ダルトン未満の範囲での分子量を有し、かつ、場合により、１個または２個の金属原子を含む、有機分子を指す。
【０２９１】
用語「治療効果のあるペプチド」は、例えば、所定の細胞標的上のタンパク質結合部位において競合する、細胞表面受容体またはペプチドのアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチドを指す。
【０２９２】
用語「治療効果のある核酸分子」は、例えば、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、またはリボザイムを指す。
【０２９３】
本発明の融合分子が組み合わせられ得る、特定の追加の薬学的活性剤には、ドルナーゼアルファ、コルチコステロイド、ロイコトリエンモディファイア、Ｎ−アセチルシステイン、吸入グルタチオン、抗コリン剤、イブプロフェン、およびβ２−アドレナリン受容体アゴニストが挙げられる。
【０２９４】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物を含むキットに関する。キットは、診断用または分析用キットであり得る。
【０２９５】
本明細書で使用される場合、用語「キットオブパーツ（手短に言えば、キット）」は、１つまたはそれ以上の容器、および場合により、データキャリアを含む製造品を指す。該１つまたはそれ以上の容器は、本明細書で開示された手段または試薬のうちの１つまたはそれ以上で詰められる。例えば、希釈剤、緩衝剤、およびさらなる試薬を含有する追加の容器が、キットに含まれる。該データキャリアは、非電子データキャリア、例えば、グラフィックデータキャリア、例えば、情報リーフレット、情報シート、バーコードもしくはアクセスコード、または電子データキャリア、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップ、もしくは別の半導体に基づいた電子データキャリアであり得る。アクセスコードは、データベース、例えば、インターネットデータベース、集中または分散データベースへのアクセスを可能にし得る。該データキャリアは、本発明の融合分子、核酸分子、細胞、および／または医薬組成物の説明書を含み得る。
【０２９６】
本発明の融合分子に関連して開示された組成物およびキットに関する全ての態様および実施形態はまた、単一のムテインおよびそれらの組合せにも適用できる。
【０２９７】
Ｅ．診断的および治療的適用
ピオベルジンは、緑膿菌などのシュードモナス菌の主要なシデロフォアである。インビトロ実験により、フェリトランスフェリンからの鉄の遊離における緑膿菌ピオベルジンの潜在的な役割が示されたが、インビボで鉄において競合するピオベルジンの能力は、最近になってやっと実証されている（Ｍｅｙｅｒら、１９９６、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６４、５１８〜５２３頁）。毒性親株から生じた変異体におけるピオベルジン産生の欠如は、これらの変異体の毒性の喪失と相関すること、および野生株から生じた相同性ピオベルジンが補充された場合、毒性が回復することが、火傷マウスモデルを使用して観察された。さらに、異種性ピオベルジンでの補充は、後者の変異体の毒性を回復させなかった。したがって、感染中の所与の緑膿菌単離物によって使用されるピオベルジン媒介性鉄取り込み系の正確な知識は、細菌の鉄代謝による緑膿菌感染の処置の新しい方法（例えば、ピオベルジン生合成またはピオベルジン媒介性鉄輸送を遮断することによる）を開発するために必須であると思われる。
【０２９８】
ピオケリン（Ｐｃｈ）は、鉄を同化するために緑膿菌によって産生され、分泌される２つの主要なシデロフォアのうちの１つである。ピオケリンは、細胞外培地において鉄をキレート化し、それを特異的な外膜トランスポーター、ＦｐｔＡを介して細胞内へ輸送する。Ｐｃｈは、Ｚｎ（ＩＩ）（ｐ［Ｈ］７．４においてｐＺｎ＝１１．８）およびＣｕ（ＩＩ）（ｐ［Ｈ］７．４においてｐＣｕ＝１４．９）などの二価金属を強くキレート化し、主に１：２（Ｍ２＋／Ｐｃｈ）錯体を形成する。シデロフォアは、鉄（ＩＩＩ）シャットリングに充てられるだけでなく、最も可能性が高いことには、微生物における微妙な金属恒常性において他の特異的な生物学的役割を示す。
【０２９９】
それゆえに、本発明のピオベルジン／ピオケリン結合性融合分子について多数の可能な適用が医学において存在する。
【０３００】
一態様において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物に関する。
本明細書で使用される場合、用語「医薬」は、治療、すなわち、疾患の処置において使用される物質／組成物を指す。
【０３０１】
本明細書で使用される場合、用語「疾患の処置」は、治癒させること、持続期間を短縮させること、寛解させること、予防すること、進行もしくは悪化を遅らせ、もしくは阻害すること、または疾患もしくはその症状の発生を予防もしくは遅延させることを含む。
【０３０２】
本発明によれば、用語「疾患」は、任意の病理学的状態、特に、対象における緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害を指す。
【０３０３】
別の態様において、本発明は、対象における緑膿菌バイオフィルム感染の予防または処置における使用のための、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物に関する。
【０３０４】
本記載を通して使用される場合、用語「対象」は、本発明によれば、処置または診断についての対象、特に、罹患対象（「患者」とも呼ばれる）、または罹患していると予想され、想定され、もしくは罹患するリスクがある対象を意味する。「対象」は、脊椎動物、特に哺乳類である。用語「哺乳類」は、哺乳類として分類される任意の動物を指すように本明細書で使用され、その哺乳類には、非限定的に、ヒト、家畜および農場用動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット用の動物が挙げられ、例えば、ほんの数個の実例を挙げると、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、カニクイザルなどのサルである。特定の実施形態において、哺乳類はヒトである。
【０３０５】
さらに別の態様において、本発明は、対象における緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の予防または処置における使用のための、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物に関する。
【０３０６】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象において緑膿菌バイオフィルム感染を予防または処置する方法に関する。
【０３０７】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象において緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害を予防または処置する方法に関する。
【０３０８】
一実施形態において、緑膿菌バイオフィルム感染は、急性または慢性感染である。一実施形態において、緑膿菌バイオフィルム感染に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害は、嚢胞性線維症、院内肺炎、人工呼吸器肺炎、尿路感染症、眼感染症、耳感染症、および熱傷創感染症からなる群から選択される。
【０３０９】
さらに別の態様において、本発明は、対象におけるピオベルジン（Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩ型）および／もしくはピオケリンの結合、ならびに／または対象において緑膿菌の増殖を阻害し、もしくは減らすことにおける使用のための、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物に関する。
【０３１０】
なお別の態様において、本発明は、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む、対象においてピオベルジン（Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩ型）および／またはピオケリンに結合する方法を特徴とする。
【０３１１】
なお別の態様において、本発明は、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む、対象において緑膿菌の増殖を阻害し、または減らすための方法を特徴とする。
【０３１２】
まださらなる態様において、本発明は、（ｉ）対象における緑膿菌バイオフィルム感染の予防もしくは処置、（ｉｉ）対象における緑膿菌バイオフィルム感染に関連するもしくはそれによって引き起こされる疾患もしくは障害の予防もしくは処置、または（ｉｉｉ）対象において緑膿菌の増殖を阻害し、もしくは減らすことのための医薬の製造における、本明細書で定義されているような融合分子、本明細書で定義されているような核酸分子、本明細書で定義されているような細胞、または本明細書で定義されているような医薬組成物の使用に関する。
【０３１３】
本明細書に記載された作用物質および組成物は、局所的または全身的（すなわち、腸内または非経口）投与によるなどの任意の通常の経路を介して投与される。非経口投与には、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内、または筋肉内への、注射または注入が挙げられる。局所投与には、吸入、加えて点眼および点耳が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の融合分子は、吸入により（融合分子）、または全身的に、例えば、皮下に（Ｆｃ−融合分子構築物）、投与される。
【０３１４】
本発明はさらに、試料においてピオベルジン（Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩ型）および／またはピオケリンを検出するための、加えて、それぞれの診断方法のための、本明細書に開示された融合分子の使用に関する。
【０３１５】
本明細書で使用される場合、用語「検出する」、「検出」、「検出可能な」、または「検出すること」は、定量的レベルと定性的レベルの両方、加えて、それらの組合せにおいてであると理解される。したがって、それは、関心対象の分子の定量的、半定量的、および定性的測定を含む。
【０３１６】
そのような使用は、１つまたはそれ以上の融合分子を適切な条件下で、ピオベルジンおよび／またはピオケリンを含有するのではないかと疑われる試料と接触させ、それにより、該融合分子と、ピオベルジン（Ｉ、ＩＩ、および／またはＩＩＩ型）および／またはピオケリンとの間の複合体の形成を可能にする工程、ならびに該複合体を適切なシグナルにより検出する工程を含み得る。シグナルは、上記で説明されているような標識により、または結合、すなわち、複合体形成による、それ自体の物理的性質の変化により、生じ得る。一例は、表面プラズモン共鳴であり、その値は、結合パートナーの結合中に変化し、その結合パートナーの１つが金箔などの表面に固定化されている。
【０３１７】
本明細書に開示された融合分子はまた、ピオベルジンおよび／またはピオケリンの分離のために使用される。そのような使用は、そのような融合分子を適切な条件下で、ピオベルジンおよび／またはピオケリンを含有すると思われる試料と接触させ、それにより、該融合分子とピオベルジンとの間、および／または該融合分子とピオケリンとの間のそれぞれの複合体の形成を可能にする工程、ならびに該複合体を試料から分離する工程を含み得る。
【０３１８】
ピオベルジンおよび／またはピオケリンの検出、加えて、ピオベルジンおよび／またはピオケリンの分離のための、開示された融合分子の使用において、融合分子ならびに／またはピオベルジンおよび／もしくはピオケリンもしくはそれらのドメインもしくは断片は、適切な固相上に固定化される。
【０３１９】
したがって、例えば試料中の、ピオベルジンおよび／またはピオケリンの存在または非存在、加えてそれの濃度またはレベルが決定される。
【０３２０】
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料として定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３２１】
本明細書に開示された融合分子は、抗体またはその断片に類似した多くの分野で使用することができる。例えば、融合分子は、酵素、抗体、放射性物質、または生化学的活性もしくは定義された結合特性を有する任意の他の群で標識するために使用することができる。そのように行うことにより、それらのそれぞれの標的が、検出することができ、またはそれらと接触することができる。加えて、本発明の融合分子は、確立された分析方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）を用いて、または顕微鏡法もしくは免疫センサー法（ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｉｃｓ）により、化学構造を検出する役割を果たすことができる。この点において、検出シグナルは、適切な融合分子コンジュゲートの使用により直接的か、またはその結合した融合分子の抗体による免疫化学的検出により間接的かのいずれかで、生じることができる。
【０３２２】
本発明の融合分子と関連して開示された診断的および治療的適用に関する全ての態様および実施形態はまた、単一のムテインおよびそれらの組合せにも適用できる。
【０３２３】
この発明の追加の目的、利点、および特徴は、以下の実施例およびそれらの添付の図（それらは、限定することを意図されない）の吟味で当業者に明らかになるだろう。したがって、本発明は、例示的な実施形態および任意の特徴により特定的に開示されているが、本明細書に具体化された開示の改変およびバリエーションが当業者により用いられること、ならびにそのような改変およびバリエーションがこの発明の範囲内であるとみなされることは理解されるべきである。特に、本発明の融合分子と関連して開示された全ての態様および実施形態はまた、本明細書に開示された単一のムテイン、およびそれらの組合せにも適用でき、逆もまた同様である。
【実施例１】
【０３２４】
緑膿菌シデロフォアの精製およびビオチン化
緑膿菌は、ピオベルジンの３つ群、すなわちピオベルジンＩ型、ピオベルジンＩＩ型、およびピオベルジンＩＩＩ型を産生する。各群は、側鎖（スクシニル、スクシンアミド、またはα−ケトグルタリル）が異なる３つの形態を有する。さらに、緑膿菌はピオケリンを産生する。１０種類のシデロフォアは全て、鉄Ｆｅ３＋と錯体形成することができる。
【０３２５】
目的とするムテインを選択およびスクリーニングするには、シデロフォアをビオチン化してもよい。ビオチン化は、ピオベルジンＩスクシニルバリアントについてはスクシニル側鎖で、ピオベルジンＩＩスクシニルバリアントについてはＬ−オルニチン側鎖で、ピオベルジンＩＩＩスクシニルバリアントについては主にグリシン側鎖で行った。ピオケリンはフェノール環でビオチン化した。
【実施例２】
【０３２６】
緑膿菌シデロフォアに特異的に結合するムテインの選択
成熟ｈＮＧＡＬのランダム変異誘発により生成したｈＮＧＡＬベースのライブラリーを、緑膿菌の種々のシデロフォアに特異的に結合するムテインの選択に使用した。ビオチン化および鉄負荷Ｐｖｄ  Ｉスクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩスクシニル、およびＰｖｄ  ＩＩＩスクシニル、ならびにビオチン化非鉄負荷ピオケリンを、独立したファージディスプレイおよび選択プロセスにおいて使用した。
【０３２７】
これらのライブラリーからの２×１０１２ファージミドを、２００ｎＭまたは５００ｎＭまたは１μＭビオチン化標的とインキュベートした。ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズを使用して標的／ファージミド複合体を捕捉し、その後に磁石で単離した。非結合ファージミドは、ＰＢＳＴまたはＰＢＳでビーズを洗浄して除去した。結合ファージミドを、先ず３００μｌ  ７０ｍＭトリエチルアミンで１０分間溶出し、続いて１００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．０で上清を即座に中和した。１回の中間洗浄サイクル後、残っているファージミドを１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．２で１０分間溶出し、続いて５０μｌ  ０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で即座に中和した。両方の溶出画分をプールし、再増幅のために大腸菌ＸＬ１ブルー培養物（ＯＤ５５０  ０．４５〜０．６）４ｍｌを感染させるのに使用した。３０分間インキュベーションした後、撹拌下で細菌を５０００×ｇで２分間、遠心分離により回収し、１ｍｌ  ２×ＹＴ培地に再懸濁し、３つの大きなＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート（１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１５ｇ／ｌ寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）にプレーティングした。プレートを３２℃で一晩インキュベートした。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した５０ｍｌ  ２×ＹＴ培地（２×ＹＴ／Ａｍｐ）を用いて、感染細胞を寒天プレートから擦り取った。０．０８のＯＤ５５０に達するように適切な容量の細菌懸濁液を５０ｍｌ  ２×ＹＴ／Ａｍｐ培地に接種した。０．５のＯＤ５５０に達するまで培養物を振盪器（１６０ｒｐｍ）で３７℃でインキュベートし、次いで穏やかに撹拌しながら１５分間、および振盪器で３７℃、４５分間のインキュベーションにより、ヘルパーファージ（１．５×１０１１ｐｆｕ）に感染させた。その後、カナマイシンを最終濃度７０μｇ／ｍｌに添加して、ヘルパーファージに感染した細菌を選択した。最後に、２５ｎｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンの添加により、ｐＩＩＩ−ｈＮＧＡＬムテインの発現を誘導した。
【０３２８】
２４℃で１５時間インキュベーションした後、培養物の上清を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間）により清澄化した。その後、２０ｍｌ上清を孔径０．２２μｍのポリエーテルスルホン膜に通過させた。濾液に２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００および１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有する水溶液５ｍｌを添加し、穏やかに混合した。溶液を氷上で３０分間インキュベートした後、４℃、２０分間、５０００×ｇで遠心分離した。ファージミドを含有するペレットを、２００ｍＭホウ酸、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１ｍｌ緩衝液に溶解した。不溶性粒子を遠心分離（５０００×ｇ、５分間）により除去した。上清を新鮮なチューブに移し、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００および１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有する水溶液２００μｌと混合した。溶液を氷上で３０分間インキュベートし、沈殿したファージミドをその後、遠心分離（５０００×ｇ、５分間）により回収した。５０ｍＭベンゾアミジンを補充したＰＢＳにファージミドを再懸濁し、次のラウンドのファージミド選択に使用した。
【０３２９】
４連続ラウンドの選択を行なった。異なる洗浄条件を適用した：ｉ）全４回の選択ラウンドで洗浄ステップ毎に１ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔで８回、５分間インキュベーション、ｉｉ）洗浄サイクル数をラウンド１から４で増やし、ｉｉｉ）迅速洗浄ステップを５分間インキュベーション洗浄ステップと変え、洗浄ステップ数をラウンド毎に増やした。
【０３３０】
ファージミドＤＮＡを第４選択ラウンドの産出物に感染した大腸菌細胞から調製し、ＢｓｔＸ１でＤＮＡを消化し、その後、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）を用いてアガロースゲル電気泳動により精製してｈＮＧＡＬムテインカセットを単離した。ｈＮＧＡＬムテインカセットは、テトラサイクリンプロモーターの制御下でｈＮＧＡＬムテインの細菌産生を可能にする同じような切断ベクターに挿入した。ＣａＣｌ２コンピテントＴＧ１−Ｆ’細胞をライゲーション混合物で形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐプレートにプレーティングした。
【０３３１】
Ｐｖｄ  Ｉ、Ｐｖｄ  ＩＩ、Ｐｖｄ  ＩＩＩ、およびＰｃｈ特異的ムテインを最適化するために、追加のライブラリーを配列番号４、配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４２、配列番号５５、配列番号５６、ならびにその後、配列番号８、配列番号１２、および配列番号４５のムテインに基づき生成した。ライブラリーは、選択した位置の偏ったランダム化またはエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法のどちらかを用いて生成した。ムテインの選択は記載されているように行なったが、ストリンジェンシーを高めた。
【０３３２】
真核細胞での発現を促すために、可能性のあるＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を除去した。
【０３３３】
さらに、変異を導入して安定性に関してさらに最適化した。
【実施例３】
【０３３４】
ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いた各緑膿菌シデロフォアに特異的に結合するムテインの同定
個々のコロニーを使用して２×ＹＴ／Ａｍｐ培地に接種し、定常期まで一晩（１４〜１８時間）増殖させた。その後、５０μｌ  ２×ＹＴ／Ａｍｐに定常期培養物から接種し、３７℃で３時間インキュベートし、次いで０．６〜０．８のＯＤ５９５に達するまで２２℃に変更した。１．２μｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンを補充した１０μｌ  ２×ＹＴ／Ａｍｐを添加して、ムテインの産生を誘導した。培養物は翌日まで２２℃でインキュベートした。５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ４０μｌをＰＢＳ／Ｔに添加し、２５℃で１時間インキュベーションした後、培養物スクリーニングアッセイで使用するために準備した。
【０３３５】
各シデロフォア標的への単離したムテインの特異的結合は、ニュートラアビジンおよびストレプトアビジンの１：１混合物（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）を、マイクロタイタープレートで４℃で、一晩被覆してテストした。プレートをＰＢＳＴ中２％ＢＳＡで１時間ブロックした後、選択に使用した各ビオチン化シデロフォア標的を、被覆マイクロタイタープレートでＰＢＳ／Ｔ中１．５〜２．５μｇ／ｍｌの濃度で捕捉した。ビオチン化アルドステロンで同じように被覆したプレートを、スクリーニングにおける陰性対照標的として使用した。その後、ＢＳＡブロック培養物２０μｌを、捕捉した標的またはアルドステロンのどちらかを含有する被覆マイクロタイタープレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。結合したムテインを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗Ｔ７抗体（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、ダルムシュタット）または西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）抗体（ＩＢＡ、ベッティンゲン）と１時間インキュベーションした後で検出した。定量化のために、ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光発生ペルオキシダーゼ基質２０μｌを添加し、蛍光を３２０ｎｍの励起波長および４３０ｎｍの発光波長で決定した。各シデロフォア標的に特異的に結合するムテインを次いで配列決定した。
【０３３６】
親和性および安定性が増加したムテインを選択するために、スクリーニングを、ｉ）低下した抗原濃度、および／またはｉｉ）非ビオチン化標的との競合、および／またはｉｉｉ）標的プレートに添加する前の６５℃または７０℃でのスクリーニング上清のインキュベーションにより、および／またはｉｖ）逆スクリーニングフォーマットを用いて行い、ムテインを、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）抗体で被覆したマイクロタイタープレートでＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）により捕捉し、異なる濃度のビオチン化標的を添加し、エクストラビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）により検出した。
【実施例４】
【０３３７】
ムテインの発現
ＳＡリンカーおよびＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ、ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１２８）を含むＣ末端配列ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１２７）を有する固有のムテインを、２ＹＴ−Ａｍｐ培地中、大腸菌で発現させて、ストレプタクチンを用いてムテインを発現後に精製し、アフィニティークロマトグラフィーおよび分取サイズ排除クロマトグラフィーが適用された。
【実施例５】
【０３３８】
ＥＬＩＳＡベースの設定で決定した可溶性緑膿菌シデロフォアに対するムテインの親和性
ムテインの溶液結合を「溶液結合ＥＬＩＳＡ」によりアッセイした。その原理は次の通りである：一定濃度のテストムテインを、様々な濃度のリガンド（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｃｈ±Ｆｅ）と１時間インキュベートした。溶液中でのこのプレインキュベーション後、ムテイン／リガンド混合物のアリコートを、ニュートラアビジンを介して固定化したビオチン化Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）、またはＰｃｈを含むＥＬＩＳＡプレートに移して、遊離ムテインの残留濃度を測定した。遊離（非リガンド結合）ムテインの濃度を定量的ＥＬＩＳＡセットアップにより決定した。
【０３３９】
詳細には、蛍光測定に適した３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）６００、黒色平底、高結合性）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度のニュートラアビジン２０μｌで、４℃で一晩被覆した。洗浄後、ニュートラアビジン被覆ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ）を含有する１００μｌブロッキング緩衝液で１時間、室温でブロックした。再び洗浄後、ブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍＬの濃度の２０μｌビオチン化ピオベルジンまたはピオケリンを室温で１時間添加し、過剰な試薬を除去した。
【０３４０】
ピコモル範囲のＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡまで１：３比で連続希釈する適切な開始濃度を用いて、リガンド（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｃｈ±Ｆｅ）の濃度を変えながら、固定濃度のムテインを溶液中でインキュベートした。室温で１時間インキュベーションした後、ビオチン化ピオベルジンまたはピオケリンを固定化した３８４ウェルプレートに反応混合物２０μｌを移して、未結合（遊離）ムテインを室温で２０分間捕捉した。ＥＬＩＳＡ読み取り結果を絶対遊離ムテイン濃度に変換できるように、変動濃度のムテインを含有する標準曲線をＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで作成し、同じＥＬＩＳＡプレートで同様に２０分間インキュベートした。
【０３４１】
残留上清を捨て、２０μｌ  ＨＲＰ標識抗ｈＮＧＡＬ抗体を所定の最適濃度でＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウサギをムテインの混合物で免疫して抗ｈＮＧＡＬ抗体を得、その後、キット（ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  活性化Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造元の説明書に従ってＨＲＰに結合させて、抗体−ＨＲＰコンジュゲートを得た。洗浄後、２０μｌ蛍光発生ＨＲＰ基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ、Ｔｈｅｒｍｏ）を各ウェルに添加し、反応を１５〜６０分間進行させた。プレートのウェル毎の蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダー（ＴｅｃａｎまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取った。データを評価するために、遊離ムテイン濃度、ｃ（ムテイン）遊離を標準曲線結果に基づき計算し、リガンド濃度、ｃ（リガンド）に対してプロットした。リガンド／ムテイン複合体の形成が５０％ブロックされたリガンド濃度（ＩＣ５０）を得るために、合計トレーサー濃度ｃ（ムテイン）合計および遊離パラメータとしてＩＣ５０値を用いた、ｃ（ムテイン）遊離＝ｃ（ムテイン）合計／（１＋ｃ（リガンド）／ＩＣ５０）に従った単一部位結合モデルによる非線形回帰により、曲線をフィットさせた。曲線フィッティングはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを用いて行った。
【０３４２】
得られたＩＣ５０値を表１Ａ〜Ｄにまとめている。ビオチン化および鉄負荷Ｐｖｄ  Ｉスクシニル、Ｐｖｄ  ＩＩスクシニル、およびＰｖｄ  ＩＩＩスクシニルに対して選択したムテインは、各Ｐｖｄ群の全てのサブタイプにそれぞれ結合した。すなわち、ビオチン化および鉄負荷Ｐｖｄ  Ｉスクシニルに対して選択したムテインは、鉄イオンと錯体形成していても錯体形成していなくても、類似した親和性でＰｖｄ  Ｉスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリルに結合し、ビオチン化および鉄負荷Ｐｖｄ  ＩＩスクシニルに対して選択したムテインは、鉄イオンと錯体形成していても錯体形成していなくても、類似した親和性でＰｖｄ  ＩＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリルに結合し、ビオチン化および鉄負荷Ｐｖｄ  ＩＩＩスクシニルに対して選択したムテインは、鉄イオンと錯体形成していても錯体形成していなくても、類似した親和性でＰｖｄ  ＩＩＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリルに結合した。選択したムテインのほとんどは、鉄イオンと錯体形成していても錯体形成していなくても、同等の親和性で各群の全てのサブタイプに結合した。
【０３４３】
ビオチン化非鉄負荷ピオケリンに対する選択は、鉄負荷Ｐｃｈに２〜３桁のｎＭ親和性で結合する、および非鉄負荷Ｐｃｈに弱い親和性で結合する、または全く結合しない配列番号５６および５７のリポカリンムテインなどの、好ましくは非鉄負荷ピオケリンに結合するリポカリンムテイン、ならびに好ましくは鉄負荷ピオケリンに結合する配列番号５５などのリポカリンムテインをもたらした。
【０３４４】
配列番号５６の親和性最適化は、向上した親和性で非鉄負荷Ｐｃｈに結合する、および依然として親和性なしでまたは弱い親和性で鉄負荷Ｐｃｈに結合するリポカリンムテインをもたらしたのに対し、配列番号５５の親和性最適化は、７５倍を超える向上した親和性で非鉄負荷Ｐｃｈに結合するが、１桁ｎＭ親和性で鉄負荷Ｐｃｈにも結合するリポカリンムテインをもたらした。
【０３４５】
したがって、リポカリンムテインの選択および最適化により、わずか４つの異なるムテインが、鉄イオンと錯体形成していてもしていなくても、緑膿菌シデロフォアの１０種類のサブタイプ全てを結合するのに十分であることが達成された（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、ｓａ、αＫＧ±Ｆｅ；Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、ｓａ、αＫＧ±Ｆｅ；Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、ｓａ、αＫＧ±Ｆｅ；Ｐｃｈ±Ｆｅ）。
【０３４６】
【表１】
2018524003.tif 000003
【０３４７】
【表２】
2018524003.tif 000004
【０３４８】
【表３】
2018524003.tif 000005
【０３４９】
【表４】
2018524003.tif 000006
【０３５０】
ハイスループット親和性順位に関して同じアッセイを使用したが、リガンド濃度の違いは少なかった。
【実施例６】
【０３５１】
Ｂｉａｃｏｒｅにおいて決定された、緑膿菌シデロフォアに結合するムテインの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたアッセイにおいて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、鉄イオンと錯体形成しているピオベルジンＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリル、または鉄イオンと錯体形成しているピオベルジンＩＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリル、または鉄イオンと錯体形成しているピオベルジンＩＩＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリルに対するムテインの結合親和性を測定した。ピオベルジンとの結合について選択したムテインおよび陰性対照（配列番号６４）を、適切な過剰量のＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ＃２１３２９）をアプライして、室温で２時間ビオチン化し、続いてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ＃２１３２９）を用い製造元の説明書に従って未反応ビオチンを分離した。
【０３５２】
ＳＰＲ親和性アッセイにおいて、ビオチン化ムテインおよび陰性対照をＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、センサーチップＣＡＰで捕捉した：センサーチップＣＡＰはｓｓＤＮＡオリゴで予め固定化されている。無希釈のＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（相補的ｓｓ−ＤＮＡオリゴとコンジュゲートしたストレプトアビジン）を２μｌ／分の流速で３００秒間アプライした。その後、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍＬのビオチン化ムテインまたは陰性対照を５μｌ／分の流速で３００秒間アプライした。参照チャネルにＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔのみをローディングした。
【０３５３】
結合親和性を決定するために、５〜２０００ｎＭの範囲の濃度の各Ｐｖｄ代表物（スクシニル、スクシンアミド、−α−ケトグルタリル＋Ｆｅを含むＰｖｄ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）の４〜５つの希釈物をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に調製し、調製したチップ表面にアプライした。３０μｌ／分流速を適用して、単一サイクルまたは複数サイクル動態アプローチを、１２０〜１８０秒間の試料接触時間および９００〜２４００秒間の解離時間で使用した。配列番号６４の陰性対照に結合しないことは、高濃度（例えば１２００ｎＭ）のそれぞれのＰｖｄを使用して確認した。リガンド固定化後、単一サイクル動態を使用した分析には、４〜５つの濃度全てのＰｖｄを昇順で連続的にアプライした後、解離をモニターした。複数サイクル動態を使用した分析には、Ｐｖｄの４つの希釈物をアプライし、それぞれ解離段階がその後に続いた。全ての測定は２５℃で行なった。センサーチップＣＡＰ表面の再生は、６Ｍ  Ｇｕａ−ＨＣｌの０．２５Ｍ  ＮａＯＨの注入、続いて、ランニング緩衝液での追加の洗浄および１２０秒間の安定化時間により達成した。データはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ１．０）を使用して評価した。二重参照を使用した。１：１結合モデルを使用して生データをフィットさせた。
【０３５４】
リポカリンムテインの選択に関して得られた速度定数を表２Ａ〜Ｃにまとめている。各Ｐｖｄ群の全てのサブタイプにｎＭ以下から１桁の低ｎＭ範囲で結合するリポカリンムテインを、Ｐｖｄ群毎に生成することができた。しかし、野生型ｈＮＧＡＬ  Ｆｅ−エンテロバクチンの天然のリガンドは、Ｐｖｄ特異的リポカリンムテインにより結合されなかった。
【０３５５】
【表５】
2018524003.tif 000007
【０３５６】
【表６】
2018524003.tif 000008
【０３５７】
【表７】
2018524003.tif 000009
【０３５８】
さらに、各ピオベルジンサブグループ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）およびＭＭＰ−９に属さない様々なシデロフォアに対する結合がないことを、固定化したムテインに高濃度（≧１μＭ）の以下の分析物をアプライして、上記に記載したアッセイを用いて確認した：Ｆｅ−エンテロバクチン、デフェロキサミン、ピオケリン、それぞれの他のサブグループからのピオベルジン、ＭＭＰ−９プロ形態、および活性化ＭＭＰ−９。この分析の概要を表３に示す。
【０３５９】
配列番号６２のムテインとＰｃｈ＋Ｆｅとの相互作用に関する速度定数および得られたＫＤを決定するために、ムテインまたは配列番号６４の陰性対照をＣＭ５チップの表面に、標準的なアミン化学法を使用して固定化した：チップの表面をＥＤＣおよびＮＨＳを使用して活性化した。その後、ムテインまたは１０ｍＭ酢酸塩溶液５μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０中の陰性対照を、約２０００ＲＵの高固定化レベルが達成されるまで１０μｌ／分の流速でアプライした。残留する活性化群をエタノールアミンでクエンチした。参照チャネルを、エタノールアミン後ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した（ブランク固定化）。
【０３６０】
親和性を決定するために、ピオケリン（＋Ｆｅ）の５つの希釈物をＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液中に調製し、調製したチップ表面にアプライした。結合アッセイを１８０秒間の接触時間、１２００〜１８００秒間の解離時間で、３０μｌ／分の流速を適用して実施した。測定は２５℃で実施した。固定化したムテイン表面の再生は、１０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ１．５（１２０秒）の３回の連続注入、続いて、ランニング緩衝液での追加の洗浄および安定化時間により達成した。データはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ１．０）を用いて評価した。二重参照を使用した。１：１結合モデルを使用して生データをフィットさせた。
【０３６１】
配列番号６２に関して得られた速度定数を表２Ｄに示す。
【０３６２】
同じアッセイを使用して、ピオケリンとは異なるシデロフォアおよびＭＭＰ−９に結合しないことを、固定化した配列番号６２のムテインに高濃度（≧１μＭ）の以下の分析物をアプライすることにより確認した：Ｆｅ−エンテロバクチン、デフェロキサミン、ピオベルジン、ＭＭＰ−９プロ形態、および活性化ＭＭＰ−９。結果の概要を表３に示す。
【０３６３】
【表８】
2018524003.tif 000010
【０３６４】
【表９】
2018524003.tif 000011
【実施例７】
【０３６５】
緑膿菌シデロフォアに結合するムテインの機能テスト；鉄取り込みの阻害
生きた細菌における機能的鉄取り込み阻害を決定するために、緑膿菌シデロフォアに結合する用量範囲濃度のリポカリンムテインを、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０緩衝液で１００ｎＭ放射性鉄負荷シデロフォアと１時間インキュベートした後、９６ウェルプレートで最終濃度ＯＤ＝１、５９５ｎｍで細菌と３０分間インキュベートした。その後、ポリエチレンイミン溶液、５％とプレインキュベートした９６ウェルプレートＧＦ／Ｂフィルターを通じてセルハーベスターで細菌を濾過し、Ｔｒｉｓ緩衝液で３回洗浄した。濾過および乾燥後、シンチラントカクテル３０μｌを各フィルターウェル添加した後、カウントした。鉄負荷ピオベルジンに対して、２００μＭ最終溶液中４対１比のピオベルジンおよび鉄を含むＴｒｉｓ緩衝液で、シデロフォアを５５Ｆｅ−Ｃｌ３と１５分間インキュベートした。ピオケリンに放射性鉄を負荷するために、ＨＣｌ  ０．５Ｎ中５５ＦｅＣｌ３、０．２５ｍＭの４０μｌ溶液を、ピオケリン、１ｍＭのメタノール溶液に添加した。１５分のインキュベーション時間後、９４０μｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０を添加して、ピオケリンと鉄の２対１比の２０μＭ  ５５Ｆｅ−Ｐｃｈ溶液を得た。細菌は次の通りに調製した：単離クローンを接種したＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍでの一晩培養物１０ｍｌを遠心分離し、洗浄したペレットをコハク酸培地２５ｍｌに再懸濁し、振盪下で２時間インキュベートした。並行して、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ２０ｍｌに一晩培養物５ｍｌを接種し、振盪下で２時間インキュベートしてバックグラウンド鉄取り込みレベルとして使用した。２５ｍｌ細菌培養物を次いで遠心分離し、対応する培地で洗浄した後、ペレットをＴｒｉｓ．ＨＣＬ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０緩衝液に再懸濁し、該アッセイでの最終濃度ＯＤ＝１を有するように５９５ｎｍのＯＤを測定した。
【０３６６】
各濃度点の取り込みのパーセンテージを計算し、阻害をインハウスソフトウェアを用いて計算した。この計算に関して、鉄取り込みの最大レベルは、リポカリンムテインが全くない最小コハク酸培地で得た値に基づき、バックグラウンド値は、シデロフォア受容体が発現されない富栄養Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍで得た。
【０３６７】
【表１０】
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【実施例８】
【０３６８】
緑膿菌シデロフォアに結合するムテインの機能テスト；増殖阻害
細菌の増殖阻害は、Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを補充したＣｈｅｌｅｘ処理コハク酸培地で緑膿菌シデロフォアに結合するムテインを、底が透明な黒色９６ウェルプレート中、最終ＯＤ０．０５、５９５ｎｍで希釈したＭＳ細菌培養物とインキュベートして決定した。プレートを、２０分毎に振盪し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ製のＩＥＭＳ  Ｒｅａｄｅｒ  ＭＦ、５９５ｎｍでＯＤを読み取りながら、３７℃で一晩インキュベートした。増殖阻害を、Ｐｖｄ  Ｉ株および配列番号１６のＰｖｄ  Ｉ特異的ムテインについては図４Ａに、Ｐｖｄ  ＩＩ株および配列番号１９および配列番号３６のＰｖｄ  ＩＩ特異的ムテインについては図４Ｂに、Ｐｖｄ  ＩＩＩ株および配列番号５３のＰｖｄ  ＩＩＩ特異的ムテインについては図４Ｃに、増殖するための鉄取り込みをピオケリンに依存するＰｖｄ  Ｉノックアウト（ΔｐｖｄＡ）株および配列番号６２のピオケリン特異的ムテインについては図４Ｄに例示的に示す。対照はリポカリンムテインなしの細菌増殖であった。
【実施例９】
【０３６９】
ムテインの安定性評価
全体的な安定性の一般的指標として融解温度を決定するために、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度のシデロフォア特異的ムテイン（配列番号：１３〜１８；２６、３１〜３６；４７〜５３；５８〜６２）を、キャピラリーｎａｎｏＤＳＣ機器（ＣＳＣ６３００、ＴＡ機器）を用いて１℃／分でスキャンした（２５〜１００℃）。融解温度（Ｔｍ）を、統合Ｎａｎｏ  Ａｎａｌｙｚｅソフトウェアを用いて表示されたサーモグラムから計算した。
【０３７０】
リポカリンムテイン（配列番号：１３〜１８；２６、３１〜３６；４７〜５３；５８〜６２）について得られた融解温度および融解の開始を、以下の表５Ａ〜Ｄに列挙する。全てのＰｖｄ群およびｐｃｈには７０℃の範囲にＴｍを有するリポカリンムテイン、各Ｐｖｄタイプおよびｐｃｈには６８〜７４℃の範囲の最良のリポカリンムテインを選択することができ、該分子の優れた安定性を示した。
【０３７１】
【表１１】
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【０３７２】
【表１２】
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【０３７３】
【表１３】
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【０３７４】
【表１４】
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【０３７５】
保管および凍結／解凍安定性を評価するために、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度のムテインを３７℃で１週間インキュベートし、または３回の凍結／解凍サイクルを行なった。活性なムテインを定量的ＥＬＩＳＡ設定で測定した。単量体タンパク質は分析サイズ排除クロマトグラフィーで測定した。配列番号１６、３６、５３、６２の例示的なデータを表６に示す。
【０３７６】
タンパク質活性をアッセイするために、以下のＥＬＩＳＡを適用した：蛍光測定に適した３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）６００、黒色平底、高結合性）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度のニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２０μＬで、４℃で一晩被覆した。洗浄後、ニュートラアビジン被覆ウェルを、１００μｌブロッキング緩衝液（０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中２％ｗ／ｖ  ＢＳＡ）で１時間ブロックした。再び洗浄後、ブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化および鉄負荷ピオベルジンＩスクシニル、ピオベルジンＩＩスクシニル、ピオベルジンＩＩＩスクシニル、またはビオチン化ピオケリン２０μｌを添加した。プレートを洗浄し、適切に希釈したタンパク質標準物質、非ストレス参照試料、またはストレス試料２０μｌをＥＬＩＳＡプレートに移し、インキュベートした。プレート結合タンパク質を定量するために、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、残留上清を捨て、２０μｌ  ＨＲＰ標識抗ｈＮＧＡＬ抗体を所定の最適濃度でブロッキング緩衝液に添加し、インキュベートした。洗浄後、２０μｌ蛍光発生ＨＲＰ基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ、Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、反応を２０〜３０分間進行させた。プレートのウェル毎の蛍光強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて読み取った。
【０３７７】
特に明記しない限り、全てのインキュベーションステップは室温で１時間行い、各インキュベーションステップ後、プレートはＢｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５  ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷ洗浄機を用いて、１００μｌ  ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で５回洗浄した。
【０３７８】
上記に記載したＥＬＩＳＡに関して、典型的には０．００８〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲の１１希釈物を含む検量線を作成し、検量線の直線範囲内の３つの異なる独立した希釈物を試料毎に調製した。場合により１％ヒトまたはマウス血漿を補充したブロッキング緩衝液を希釈物に使用した。
【０３７９】
検量線は４  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｌｏｇｉｓｔｉｃ（４ＰＬ）非線形回帰モデルを用いてフィットさせ、テスト試料の活性なタンパク質濃度を計算するのに使用した。決定した活性なタンパク質濃度は非ストレス試料に対して参照し、同じ濃度および同じマトリックスで保管した。
【０３８０】
分析サイズ排除クロマトグラフィーは、１列に２つのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムで、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を溶離液として用いて流速０．３ｍＬ／分で行った。
【０３８１】
血漿中の保管安定性を評価するために、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のムテインをヒト、マウス、およびラット血漿中で、３７℃で１週間インキュベートした。活性なムテインを、記載したように定量的ＥＬＩＳＡ設定で測定した。
【０３８２】
全てのテストリポカリンムテインは、全てのテスト条件下で安定であることが判明した。
【０３８３】
【表１５】
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【実施例１０】
【０３８４】
マウスモデルにおけるリポカリンムテインのインビボ効力
マウスにおける緑膿菌誘発肺感染での静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の配列番号１９の予防効果を試験した。
【０３８５】
配列番号１９を感染１時間前および感染時に投与した。肺細菌量を感染２４時間後に評価した。
【０３８６】
この試験で使用した株は緑膿菌（ＡＴＣＣ２７８５３）であった。ＰＢＳ／１５％グリセリン中−８０℃で保管した緑膿菌から開始して、一晩培養物をＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中で振盪下、３７℃で伝導し、続いて増殖の対数期の終わりまで追加の二次培養（１００μｌ一晩培養物＋ＭＨＢ１００ｍｌ）を行なった。培養物を２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した後、１Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｍｌで凍結した。実験毎に新鮮なバイアルを解凍し、接種材料を生菌数により検証した。
【０３８７】
７〜８週齢の雄のスイスマウス（５匹／群）をＪａｎｖｉｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｏｕｔｅ  ｄｅｓ  ｃｈｅｎｅｓ  ｓｅｃｓ、５３９４０  Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｌｅ、フランス）から購入し、使用前に少なくとも５日間順化させた。動物を温度２２±２℃、相対湿度４０〜７０％、および１２〜１５回換気／時間で維持した。光サイクル１２／１２時間：照明午前７時〜午後７時（通常サイクル）。温度および相対湿度導出は連続的に記録した。動物を１ケージあたり５匹収容し、水および標準食（ＡＯ４  Ｃ標準食（ＳＡＦＥ））に自由にアクセスさせた。全ての実験は、Ｓａｎｏｆｉ研究開発倫理委員会（ＣＥＰＡＬ）の承認を得て行った。
【０３８８】
肺感染は、５０μｌ  ＮａＣｌ  ０．９％中、緑膿菌１．Ｅ＋０７ＣＦＵ／マウスによる雄のスイスマウスの鼻内チャレンジにより誘導した。
【０３８９】
２００、４００、１０００、または２０００μｇ／マウスの濃度の配列番号１９を、感染１時間前および感染時にｉ．ｖ．ボーラスで投与した。
【０３９０】
感染２４時間後、動物を安楽死させ、肺ホモジネートからの細菌数を決定し、平均±標準誤差としてｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｍｌで表した。
【０３９１】
統計分析はＳＡＳ  ｖ９．２を用いて行った。Ｅｘｃｅｌソフトウェア２００３を図表示に使用した。配列番号１９用量対ビヒクルの比較を、一元配置分散分析とそれに続くダネット検定で評価した（ＺＡＲ  Ｊ．Ｈ．、《Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ》、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ、４ｅｍｅ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９９．；Ｃ．Ｗ．  Ｄｕｎｎｅｔｔ、「Ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｔｒｏｌ」、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ａｓｓｏｃ．、５０（１９５５）、１０９６〜１１２１頁、１９５５）。
【０３９２】
マウスにおける緑膿菌誘発肺感染モデルでは、配列番号１９を細菌チャレンジの１時間前および細菌チャレンジ時に投与し、配列番号１９は、マウスにおける感染の発生を用量依存的に防いだ。有意な予防効果が、２００μｇ／マウスで開始する配列番号１９について観察された。最大効果は２０００μｇ／マウスであった。
【実施例１１】
【０３９３】
結晶化
Ｐｖｄ−Ｆｅと複合体形成した配列番号３１タンパク質の３次元構造を決定するために、以下の手順を適用した。
【０３９４】
図６に描かれたタンパク質配列を、ｐＥＴ−２４ａプラスミドにおいてクローニングし、Ｎ末端にタグ付けされた６Ｈｉｓ−ＴＥＶプロテアーゼ認識部位構築物として発現した。
【０３９５】
そのプラスミドを使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ大腸菌細胞を形質転換し、生じたクローンを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）に接種し、その細胞を、２００ＲＰＭで撹拌しながらの１８℃での４７時間のインキュベーション後、最終ＯＤ６００  ４．７時点で収集した。細胞ペレットを、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、５％グリセロール、および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４を含有する緩衝液中に再懸濁し、標準超音波処理手順により溶解した。生じた抽出物を、低速遠心分離により清澄にし、上清を２２ｎｍ膜に通して濾過し、その後、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８緩衝液と前もって平衡に達したＮｉ  ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）５ｍｌカラムに負荷した。そのタンパク質を、イミダゾール１０ｍＭ〜３００ｍＭの直線勾配によって溶出し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８緩衝液へ一晩、さらに透析した。そのタンパク質を、２０ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ＧＥ）に負荷した。生じたタンパク質を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８緩衝液へ、ＴＥＶプロテアーゼ（１／５０比率）の存在下で一晩、透析して、６ＨｉｓＮ末端タグを除去し、その後、上記のようなネガティブＮｉ  ＮＴＡ精製工程を行い、切断されたタンパク質を分離した。最終タンパク質を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中１２ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、分注し、液体窒素中で急速凍結し、さらなる使用のために−８０℃で保存した。
【０３９６】
結晶化について、そのタンパク質を、１０倍高いモル濃度のＰｖｄ−Ｆｅと一晩、インキュベートし、ＳＢＳ形式プレートで行われる結晶化スクリーニングのためにプレーティングし、蒸気拡散シッティングドロップ形式実験において２０℃および４℃で、タンパク質ドロップ１００ｎＬを結晶化スクリーニング溶液１００ｎＬと混合した。いくつかの結晶化ヒットを検出し、うまく回折したｘ線品質結晶を得るために結晶化条件をさらに最適化した。
【０３９７】
結晶回折品質を、シンクロトロンｘ線源を使用して評価し、最良の回折結晶が、２０％ＰＥＧ３３５０および０．２Ｍ  ＬｉＳＯ４条件下、２０℃で得られた。その最良の結晶を、ＰＥＧ３３５０濃度を３５％へ増加させることにより、凍結保護し、その後、液体窒素中で急速凍結し、１．８Åデータセットを１００Ｋ温度で収集した。
【０３９８】
ｘ線データをＭＯＳＦＬＭによって処理し、タンパク質構造を、検索モデルとしてｐｄｂ  １ＬＫＥを用いる分子置換法により決定し、その構造モデルをさらに、非対称単位あたり２個の３元タンパク質複合体を有するＰ４１２１２においてＲｆｒｅｅ＝０．２３３  −  Ｒ＝０．２００品質までさらに精密化した。
【０３９９】
そのタンパク質構造は、古典的リポカリン骨格を示し、Ｐｖｄ−Ｆｅが、非対称単位に存在する両方のムテインタンパク質に結合している、図７。Ｐｖｄ−Ｆｅ結合に関与するアミノ酸残基が分析され、図８に示されている。Ｆｅを直接的に結合するＰｖｄの酸素が同定され、図９に示されている。
【実施例１２】
【０４００】
融合分子構築物の作製
４つの単一リポカリンムテインを、遺伝子的に融合して、遺伝子合成による融合分子を形成した（図１０Ａ参照）。リポカリンムテインを、（Ｇ４Ｓ）２のようなリンカーによりお互いから分離させ、潜在的Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を除去し、続いて、生じた構築物をエピソーム発現ベクターｐＸＬ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（２００２）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２）により記載されたｐＴＴベクターの類似体）へサブクローニングした。配列番号１３４の融合分子を、配列番号３６、１６、５３、および６２のリポカリンムテインの遺伝子融合により作製した。配列番号１３５の融合分子を、配列番号３４、１７、５０、および６３のリポカリンムテインの遺伝子融合により作製した。
【０４０１】
いわゆるＦｃ−融合分子構築物を、（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離した４つの単一リポカリンムテインの、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン（配列番号１４０）への融合により作製した。配列番号１３６を、（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離した配列番号３６、１６、５３、および６２のリポカリンムテインの、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１４０）のＮ末端への遺伝子融合により作製した。配列番号１３７を、（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離した配列番号３４、１７、５０、および６３のリポカリンムテインの、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１４０）のＮ末端への遺伝子融合により作製した。配列番号１３８を、（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離した配列番号３４、１７、５０、および６３のリポカリンムテインの、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１４０）のＣ末端への遺伝子融合により作製した。配列番号１３９を、（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離した配列番号３４および１７のリポカリンムテインの、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１４０）のＮ末端への遺伝子融合、ならびに（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離した配列番号５０および６３のリポカリンムテインの、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１４０）のＣ末端への遺伝子融合により作製した。これらのＦｃ−融合分子構築物の全体的な構造は図１０Ｂ〜Ｄに示されている。
【０４０２】
さらなる例示的な融合分子構築物は、配列番号１４３〜１８６の融合分子構築物である。配列表においてムテインおよび融合分子構築物について使用される内部参照は、参照配列、すなわち、野生型ｈＮＧＡＬの配列（例えば、配列番号１）と比較しての、変異または全ての変異を必ずしも反映しているとは限らないことは留意されたい。実際の変異は、ムテイン／融合分子配列を参照配列と比較することにより容易に決定することができる。
【実施例１３】
【０４０３】
融合分子構築物の発現および品質管理
トランスフェクションのための発現プラスミドを、大腸菌において増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ社製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｍｅｇａキットを使用して調製した。融合分子は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７発現培地において増殖したＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。細胞を、１１０ｒｐｍでのＫｕｅｈｎｅｒ  ＩＳＦ１−Ｘインキュベーターシェーカーにおいて、８％ＣＯ２、３７℃で培養した。トランスフェクションから６〜７日後、４５００  ｇで２０分間の遠心分離により細胞を除去した。上清を、０．２μｍ膜を介して濾過し、残存する粒子を除去した。
【０４０４】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＨｉｓＴｒａｐカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。非特異的結合を避けるために、捕捉工程の前に２０ｍＭイミダゾールを加えた。そのタンパク質を、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）およびＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８）で洗浄し、Ｔｒｉｓ緩衝液における５００ｍＭまでのイミダゾールの勾配で溶出した。
【０４０５】
Ｆｃバリアントを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。そのタンパク質を、ＰＢＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、続いて、１００ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３で溶出し、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９で中和した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質およびＦｃバリアントのポリシング工程は、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からなった。限外濾過による濃縮後、その融合分子を、滅菌濾過（０．２μｍ）し、分注し、−８０℃で保存した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により決定した。
【０４０６】
さらなる品質管理を、分析ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１参照）、および質量分析法により行った。分析ＳＥＣを、ガードカラム（７．８×５０  ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）を有するＴＳＫｇｅｌ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）か、またはＭａｂＰａｃ  ＳＥＣ−１カラム（４×３００ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ）およびＭａｂＰａｃ  ＳＥＣ−１ガードカラム（４×５０ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）かのいずれかを備えたＢｉｏＳＥＣｃｕｒｉｔｙ  ＨＰＬＣ（ＰＳＳ）を使用して実施した。分析を、１ｍｌ／分（ＴＳＫｇｅｌカラムについて）または０．２５ｍｌ／分（ＭａｂＰａｃカラム）で、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｎａ−リン酸ｐＨ６．７を使用して実行し、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍで検出した。タンパク質５μｇ（Ｄ−ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）をカラムにアプライした。分子サイズの推定について、カラムを、ゲル濾過標準混合物（ゲル濾過キットＭＷＧＦ−１０００、ＳＩＧＭＡ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＰｒｏｔｅｉｎ−Ｋｉｔ、ＰＳＳ）を使用して較正した。データ評価を、ＷｉｎＧＰＣソフトウェアｖ５．１１（ＰＳＳ）を使用して実施した。１つの融合分子および１つのＦｃ−融合分子構築物についての結果は、下記の表７に示されている。
【０４０７】
【表１６】
2018524003.tif 000018
【０４０８】
正確な質量分析を、二重ＥＳＩイオン源を備えた６５４０  ＵＨＤ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ−ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。拡張質量範囲（２ＧＨｚ）での陽イオンモードにおいて測定を行った。試料を、Ｄ−ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。還元型試料の測定について、１０ｍＭのＴＣＥＰを加えた。Ｄ−ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌでの試料に関して、ＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）２５０ユニットのタンパク質１２．５μｇへの添加および３７℃で１８時間のインキュベーション後、自然条件下での脱グリコシル化を行った。タンパク質２μｇを、ガードカラム（Ｎａｒｒｏｗ  ｂｏｒｅ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ８、２．１×１２．５ｍｍ、５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を有するＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（０．５×７５ｍｍ、５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）へアプライし、４０℃で流した。溶出剤Ａは、０．１％ギ酸を含むＬＣ水であった；溶出剤Ｂは、０．１％ギ酸を含む９０％アセトニトリルであった。５％Ｂから１００％Ｂまでの直線勾配を用いて、７分間、１８０μｌ／分の流速で分離を達成した。データ処理および分析を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェアバージョンＢ．０６を使用して行った。１つの融合分子および１つのＦｃ−融合分子構築物についての結果は、下記の表８に示されている。
【０４０９】
【表１７】
2018524003.tif 000019
【実施例１４】
【０４１０】
単一リポカリンムテインの発現
トランスフェクションのための発現プラスミドを、大腸菌において増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ社製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｍｅｇａキットを使用して調製した。リポカリンムテインは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７発現培地において増殖したＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。細胞を、１１０ｒｐｍでのＫｕｅｈｎｅｒ  ＩＳＦ１−Ｘインキュベーターシェーカーにおいて、８％ＣＯ２、３７℃で培養した。トランスフェクションから６〜７日後、４５００ｇで２０分間の遠心分離により細胞を除去した。上清を、０．２μｍ膜を介して濾過し、残存する粒子を除去した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＨｉｓＴｒａｐカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。非特異的結合を避けるために、捕捉工程の前にイミダゾール２０ｍＭを加えた。そのタンパク質を、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）およびＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８）で洗浄し、Ｔｒｉｓ緩衝液における５００ｍＭまでのイミダゾールの勾配で溶出した。ポリシング工程は、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からなった。限外濾過による濃縮後、そのタンパク質を、滅菌濾過（０．２μｍ）し、分注し、−８０℃で保存した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により決定した。さらなる品質管理を、分析ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および質量分析法により行った。
【実施例１５】
【０４１１】
融合分子の安定性評価
全体的な安定性についての一般的な指標としての融解温度を決定するために、配列番号１３４のシデロフォア特異的融合分子および単一リポカリンムテイン（配列番号１６、３６、５３、および６２）を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で使用し、キャピラリーｎａｎｏＤＳＣ計器（ＣＳＣ  ６３００、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１℃／分の増分で２５〜１００℃の温度範囲において走査した。融解温度（Ｔｍ）を、組み込まれたＮａｎｏ  Ａｎａｌｙｚｅソフトウェアを使用して、ディスプレイされたサーモグラムから計算した。生じた融解温度および融解の開始は、下記の表９に列挙されている。
【０４１２】
【表１８】
2018524003.tif 000020
【０４１３】
融解の開始は、単一リポカリンムテイン（配列番号１６、３６、５３、および６２）について６１〜６７℃の間、融合分子（配列番号１３４）について５７℃である。融解温度は、単一リポカリンムテイン（配列番号１６、３６、５３、および６２）について６６〜７６℃の間、融合分子（配列番号１３４）について６４／６６℃である。融解の開始および融解温度は、単一リポカリンムテインと比較して融合分子についてわずかに低いとはいえ、融合分子と単一リポカリンムテインの間では同等であり、それらのタンパク質の良い安定性を示している。
【０４１４】
保存および凍結／解凍の安定性を評価するために、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度での配列番号１３４の融合分子または配列番号１３６のＦｃ−融合分子を、３７℃もしくは４２℃で１週間、インキュベートし、または３回の凍結／解凍サイクルを受けさせた。活性融合分子濃度を、定量的ＥＣＬアッセイ設定において測定した。実施例８に記載されているような３つの異なる同時的結合形式を用いて、各ピオベルジン（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）およびピオケリンと同時に結合する能力を調べた。単量体タンパク質のピーク面積を、分析サイズ排除クロマトグラフィーにおいて測定した。
【０４１５】
実施例９に記載されているような定量的ＥＣＬアッセイについて、典型的には０．１〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲での１１個の希釈を含む較正曲線を調製し、較正曲線の直線的範囲内の３個の異なる独立した希釈を、各試料について調製した。場合により１％ヒト血漿を追加した、ブロッキング緩衝液を希釈に使用した。較正曲線を、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）非線形回帰モデルを使用してフィットさせ、それを使用して、試験された試料についての活性タンパク質濃度を計算した。決定された活性タンパク質濃度を、同じ濃度かつ同じマトリックスで保存されたストレス無負荷の試料に対して参照した。
【０４１６】
分析サイズ排除クロマトグラフィーを、溶出剤としてＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を０．３ｍＬ／分の流速で使用して、一列に並んだ２つのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を有するＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムにおいて実施した。ストレス負荷試料およびストレス無負荷参照試料の単量体ピーク面積を、ＷｉｎＧＰＣ  Ｕｎｉｃｈｒｏｍ  ＧＰＣ／ＳＥＣソフトウェア（ＰＳＳ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ−ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）を使用して計算した。単量体ピーク面積の回復を、回復＝単量体ピーク面積試料／単量体ピーク面積参照試料として計算した。血漿中の保存安定性を評価するために、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度での融合分子およびＦｃ−融合分子を、ヒト血漿において３７℃で１週間、インキュベートした。活性融合分子の濃度を、上記のように定量的ＥＣＬアッセイ設定において測定した。
【０４１７】
配列番号１３４および配列番号１３６の構築物についてのデータは下記の表１０に示されている。融合分子およびＦｃ−融合分子構築物は、全ての試験された条件下で高い安定性を示した。
【０４１８】
【表１９】
2018524003.tif 000021
【実施例１６】
【０４１９】
ＥＬＩＳＡに基づいた設定において決定された緑膿菌シデロフォアへの融合分子の親和性
個々のムテイン、融合分子、またはＦｃ−融合分子の溶液結合を、「溶液結合ＥＬＩＳＡ」（その原理は以下の通りであった：一定濃度の試験される個々のムテインまたは融合分子構築物を、様々な濃度のリガンド（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｃｈ±Ｆｅ）と１時間、インキュベートした。この溶液中でのプレインキュベーション後、ムテイン／リガンド混合物のアリコートを、ビオチン化Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）、またはＰｃｈがニュートラアビジンを介して固定化されているＥＬＩＳＡプレートへ移して、遊離のムテインまたは融合分子構築物の残存濃度を測定した。遊離の（リガンドに結合していない）ムテインまたは融合分子構築物の濃度を、定量的ＥＬＩＳＡ設定により決定した）によってアッセイした。
【０４２０】
詳細には、蛍光測定に適した３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＦＬＵＯＴＲＡＣ（商標）６００、黒色平底、高結合性）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度のニュートラアビジン２０μｌで、４℃で一晩被覆した。洗浄後、ニュートラアビジン被覆ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ）１００μｌで、室温で１時間、ブロッキングした。再び洗浄した後、ブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍＬの濃度でのビオチン化ピオベルジンまたはピオケリン２０μｌを、室温で１時間、加え、過剰な試薬を除去した。固定濃度のムテインまたは融合分子構築物を、ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中１：３比からピコモル範囲に至るまで段階希釈される、適切な出発濃度を使用しての様々な濃度のリガンド（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｖｄ  ＩＩＩ  ｓ、ｓａ、ａＫＧ±Ｆｅ／Ｐｃｈ±Ｆｅ）を含む溶液中でインキュベートした。室温で１時間のインキュベーション後、その反応混合物２０μｌを、ビオチン化ピオベルジンまたはピオケリンが固定化された３８４ウェルプレートへ移して、結合していない（遊離）ムテインまたは融合分子構築物を、室温で２０分間、捕捉した。ＥＬＩＳＡ読み取り結果の絶対的遊離ムテイン／融合分子構築物濃度への変換を可能にするために、様々な濃度のムテイン／融合分子構築物を含有する標準曲線を、ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡにおいて調製し、同様に同じＥＬＩＳＡプレートにおいて２０分間、インキュベートした。
【０４２１】
残留上清を捨て、ＨＲＰ標識抗ｈＮＧＡＬ抗体２０μｌを、ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中のあらかじめ定められた最適な濃度で加え、室温で１時間、インキュベートした。抗ｈＮＧＡＬ抗体は、ムテインの混合物でのウサギの免疫化により得られており、その後、それを、キット（ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造元の説明書に従って、ＨＲＰに連結して、抗体−ＨＲＰコンジュゲートを得た。洗浄後、蛍光発生性ＨＲＰ基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ、Ｔｈｅｒｍｏ）２０μｌを各ウェルに加え、その反応を１５〜６０分間、進行させた。プレート上の全てのウェルの蛍光強度を、蛍光マイクロプレートリーダー（ＴｅｃａｎまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読んだ。データを評価するために、遊離ムテインまたは融合分子構築物濃度、ｃ（ムテイン／融合分子）遊離を、標準曲線結果に基づいて計算し、リガンド濃度、ｃ（リガンド）に対してプロットした。ＩＣ５０値を、単一部位結合モデルに関する非線形回帰によりフィットさせた。曲線フィッティングを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを使用して実施した。
【０４２２】
生じたＩＣ５０値は表１１に要約されている。融合分子およびＦｃ−融合分子は、事実上、個々のムテインと同じ親和性で、全てのそれぞれのシデロフォアに結合した。
【０４２３】
【表２０】
2018524003.tif 000022
【０４２４】
融合分子およびＦｃ−融合分子構築物は、Ｐｖｄ標的と１ｎＭ未満〜２ｎＭの範囲でのＩＣ５０値で結合し、鉄負荷ＰｃｈとＩＣ５０＜１０ｎＭで結合し、鉄を含まないＰｃｈとＩＣ５０＜５０ｎＭで結合し、それらのＩＣ５０値は、個々のリポカリンムテインの結合能が融合分子形式において完全に維持されているという条件でのＰｖｄｘ  ｓ（＋Ｆｅ）およびピオケリン（±Ｆｅ）について例示的に示されているようなそれぞれの単一リポカリンムテインのＩＣ５０値と同等である。
【実施例１７】
【０４２５】
ＥＬＩＳＡに基づいた設定において決定された、異なる融合分子形式の結合能の比較
配列番号１３７、１３８、および１３９のＦｃ−融合分子構築物（実施例１ならびに図１０Ｂ、Ｃ、およびＤ参照）の、含有された個々のリポカリンムテイン（配列番号３４、１７、５０、および６３）と比較しての、溶液中のそれぞれのシデロフォア群（Ｐｖｄ  Ｉｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩＩｓ（＋Ｆｅ）、およびＰｃｈ）との結合を、実施例５に記載されたものと同等の溶液結合アッセイにおいて試験した。
【０４２６】
表１２および図１２に示されているように、個々のリポカリンムテインおよび異なるＦｃ−融合分子形式についての生じたＩＣ５０値は同等である。
【０４２７】
【表２１】
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【実施例１８】
【０４２８】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて決定された、緑膿菌シデロフォアに結合する融合分子の親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいたアッセイにおいて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ピオベルジンシデロフォア（鉄イオンと錯体形成しているピオベルジンＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリル、または鉄イオンと錯体形成しているピオベルジンＩＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリル、または鉄イオンと錯体形成しているピオベルジンＩＩＩスクシニル、−スクシンアミド、−α−ケトグルタリル）に対する個々のムテインまたは融合分子の結合親和性を測定した。この目的を達成するために、ピオベルジンとの結合について選択したムテイン（配列番号１６、３６、５３）、融合分子（配列番号１３４）および陰性対照（配列番号６４）を、適切な過剰量のＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ＃２１３２９）をアプライして、室温で２時間ビオチン化し、続いてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ＃２１３２９）を用い製造元の説明書に従って未反応のビオチンを分離した。
【０４２９】
ＳＰＲ親和性アッセイにおいて、ビオチン化ムテインおよび陰性対照をＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、センサーチップＣＡＰで捕捉した。センサーチップＣＡＰはｓｓＤＮＡオリゴで予め固定化されている。無希釈のＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（相補性ｓｓ−ＤＮＡオリゴとコンジュゲートしたストレプトアビジン）を２μｌ／分の流速で３００秒間アプライした。その後、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍＬのビオチン化ムテインまたは融合分子陰性対照を５μｌ／分の流速で３００秒間アプライした。参照チャネルにＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔのみをローディングした。結合親和性を決定するために、それぞれのＰｖｄの４つの希釈物をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に調製し、チップ表面にアプライした。３０μｌ／分の流速を適用して、単一サイクル動態アプローチを、１８０秒間の試料接触時間および１８００〜２４００秒間の解離時間で使用した。配列番号６４の陰性対照に結合しないことは、１２００ｎＭの高濃度のそれぞれのＰｖｄを使用して確認した。リガンド固定化後、４つの濃度のＰｖｄを昇順で連続的にアプライした後、解離をモニターした。全ての測定を２５℃で実施した。センサーチップ表面の再生は、０．２５Ｍ  ＮａＯＨと共に６Ｍ  Ｇｕａ−ＨＣｌの注入、続いて、ランニング緩衝液での追加の洗浄および１２０秒間の安定化時間により達成した。データはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ１．０）を用いて評価した。二重参照を実施した。１：１結合モデルを使用して生データをフィットさせた。加えて、上記のアッセイを使用して、緑膿菌によって産生されない様々なシデロフォアおよびＭＭＰ−９に結合しないことを、固定化した融合分子に高濃度（≧１μＭ）の以下の分析物をアプライすることにより確認した：Ｆｅ−エンテロバクチン、デスフェロキサミン、ＭＭＰ−９プロ形態（ｐｒｏｆｏｒｍ）、および活性化ＭＭＰ−９。
【０４３０】
リポカリンムテインのピオケリンに対する親和性の決定のためのＢｉａｃｏｒｅ分析
配列番号６２のムテインとｐｃｈ＋Ｆｅとの相互作用に関する速度定数および得られたＫＤを決定するために、ムテインまたは陰性対照（配列番号６４）をＣＭ５チップの表面に、以下の標準的なアミン化学法を使用して固定化した：チップの表面をＥＤＣおよびＮＨＳを使用して活性化した。その後、５μｇ／ｍＬのムテインまたは１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．０中の陰性対照溶液を、約２０００ＲＵの高固定化レベルが達成されるまで１０μｌ／分の流速でアプライした。残留する活性化群をエタノールアミンでクエンチした。参照チャネルを、エタノールアミン後ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した（ブランク固定化）。親和性を決定するために、ピオケリン（±Ｆｅ）の４〜５つの希釈物をＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液中に調製し、調製したチップ表面にアプライした。結合アッセイを１８０秒間の接触時間および１５００〜１８００秒間の解離時間で、３０μｌ／分の流速を適用して実施した。測定は２５℃で実施した。固定化したムテイン表面の再生は、１０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ  ｐＨ１．５（１２０秒）の３回の連続注入、続いて、ランニング緩衝液での追加の洗浄および安定化時間により達成した。データはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ１．０）を用いて評価した。二重参照を使用した。１：１結合モデルを使用して生データをフィットさせた。同じアッセイを使用して、ピオケリンとは異なるシデロフォアおよびＭＭＰ−９に結合しないことを、配列番号６２の固定化したムテインに高濃度（≧１μＭ）の以下の分析物をアプライすることにより確認した：Ｆｅ−エンテロバクチン、デスフェロキサミン、ピオベルジン、ＭＭＰ−９プロ形態、および活性化ＭＭＰ−９。
【０４３１】
融合分子のピオケリンとの結合の検出のためのＢｉａｃｏｒｅ分析
配列番号１３４の捕捉された融合分子とのピオケリンの特異的結合は、ＳＰＲに基づいたアッセイにおいて、Ｓｅｒｉｅｓ  ＳセンサーチップＮＴＡおよびＮＴＡ試薬キット（どちらもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、明らかに実証された。Ｈｉｓタグ付き融合分子（配列番号１３４）およびＨｉｓタグ付きリポカリンムテイン（Ｐｖｄ  ＩＩに結合する配列番号１６、およびＰｖｄ  ＩＩに結合する配列番号５３、どちらも陰性対照として使用される）を、Ｎｉ２＋負荷ＮＴＡを介して捕捉した。ピオケリンを分析物として使用した。ピオケリン（±Ｆｅ）の結合は明らかに検出可能であり、センサグラムは、共有結合によって固定化された配列番号６２のムテインとのピオケリン結合とほとんど同等であったが、速度定数は、調製された表面の不安定性（捕捉された融合分子のニッケル−ＮＴＡチップからの解離）により決定することができなかった。
【０４３２】
融合分子および対応する単一リポカリンムテインについての異なるＢｉａｃｏｒｅ分析からの結果は、下記の表１３に要約されている。
【０４３３】
【表２２】
2018524003.tif 000024
【０４３４】
Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ＋Ｆｅ、Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ＋Ｆｅ、およびＰｖｄ  ＩＩＩ  ｓ＋Ｆｅに対する融合分子およびリポカリンムテインについてＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて測定された親和性は同等である。全てのＰｖｄ亜型に対する配列番号１３４の融合分子についてＢｉａｃｏｒｅにおいて測定された親和性は、１ナノモル未満〜１桁のナノモルの範囲であり、実施例５に記載された溶液結合ＥＬＩＳＡにおいて決定されたＩＣ５０値と同等でもある。さらに、結合した鉄を含むピオベルジン標的とそれを含まないピオベルジン標的に対する結合親和性は、類似している。配列番号１３４の融合分子のピオケリンとの結合は、配列番号１３４のＨｉｓタグ付き融合分子をＮｉ−ＮＴＡを介して捕捉するＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能であったが、高いドリフトのせいで、正確なＫＤを決定することができなかった。ピオケリンなどの低分子有機標的との結合を検出するようにＳＰＲアッセイを設定するための難題は、予想外であった。配列番号１３４の融合分子および配列番号１６、３６、５３、および６２の単一リポカリンムテインがそれらの標的と特異的に結合するが、他のシデロフォア、すなわち、Ｆｅ−エンテロバクチンおよびデスフェロキサミン、またはＭＭＰ−９タンパク質と結合しないことが、特異性評価により確認された。Ｆｅ−エンテロバクチンについての陽性対照として使用された配列番号１および６４のリポカリンムテインは、天然リガンドＦｅ−エンテロバクチンとの結合を示し、ＭＭＰ−９についての陽性対照として使用されたＭＭＰ−９特異的抗体は、ＭＭＰ−９との結合を示した。配列番号６４は、ピオベルジンとの結合もピオケリンとの結合も示さなかった（データ未呈示）。
【実施例１９】
【０４３５】
融合分子のピオベルジンおよびピオケリンとの同時的結合
融合分子（配列番号１３４）の、４つのそれぞれの標的群の２つの代表的な標的（ピオベルジンＩ  スクシニル（＋Ｆｅ）とピオケリン、ピオベルジンＩＩ  スクシニル（＋Ｆｅ）とピオケリン、またはピオベルジンＩＩＩ  スクシニル（＋Ｆｅ）とピオケリン）との一度での同時的結合が、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームにおいて実施された電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイにおいて示された。簡単に述べると、それぞれのビオチン化ピオベルジンを、ニュートラアビジンを介してＭＳＤプレート上に捕捉し、様々な濃度の融合分子を加えた。結合した融合分子を、スルホタグ標識ピオケリンで検出した。
【０４３６】
他に特定されない限り、全てのインキュベーション工程を、３００ｒｐｍで振盪させながら、室温で１時間、実施し、各インキュベーション工程後、プレートを、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５  ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷ洗浄器を使用して、ＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）８０μＬで５回、洗浄した。アッセイ緩衝液はＰＢＳＴ／ＢＳＡ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、２％ＢＳＡ）であった。３８４ウェルのＭＳＤプレート（Ｌ２５ＸＡ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの濃度のニュートラアビジン２０μＬで、４℃で一晩被覆した。洗浄後、被覆ウェルを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ／ＢＳＡ）６０μＬでブロッキングし、さらなる洗浄工程後、０．２μｇ／ｍＬの濃度でのビオチン化ピオベルジンを加え、インキュベートした。融合分子の濃度を５μｇ／ｍＬに調整し、その後、その溶液を、ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中１：３の比で段階希釈した。希釈溶液の２０μＬの体積を、３８４ウェルのプレートに移し、１時間、結合させた。インキュベーション後、残留する上清を捨て、ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中０．１μｇ／ｍＬでのスルホタグ標識ピオケリン２０μＬを加え、１時間、インキュベートした。洗浄後、表面活性剤を含む２倍に濃縮されたＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（Ｒ９２ＴＣ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）３５μＬを加え、プレートを、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００リーダー（ＭＳＤ）において１５分以内で測定した。ＥＣＬシグナルを融合分子濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５において単一部位結合モデルを使用してフィットさせた。生じたＥＣ５０値は、結合親和性を表していない。
【０４３７】
それぞれのピオベルジン型（Ｐｖｄ  Ｉ  ｓ（＋Ｆｅ）、Ｐｖｄ  ＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ）、およびＰｖｄ  ＩＩＩ  ｓ（＋Ｆｅ））およびピオケリンの代表物のそれぞれとの融合分子の同時的結合を検出することができた。生じた結合曲線は図１３に示されている。
【実施例２０】
【０４３８】
緑膿菌シデロフォアと結合する融合分子の機能試験  −  鉄取り込み阻害
生きている細菌における機能的な鉄取り込み阻害を決定するために、９６ウェルプレートにおいて、用量範囲濃度の配列番号１３４の融合分子を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ８．０緩衝液中１００ｎＭ放射性鉄負荷シデロフォアと１時間、インキュベートし、その後、５９５ｎｍでＯＤ＝１の最終濃度での細菌と３０分間、インキュベートした。その後、細菌を、５％でのポリエチレンイミン溶液とプレインキュベートされた９６ウェルプレートＧＦ／Ｂフィルターを通して細胞ハーベスターで濾過し、５％ＢＳＡ溶液で３回、洗浄した。濾過および乾燥後、シンチラントなカクテル３０μｌを各フィルターウェルに加え、その後、カウントした。シデロフォアを鉄負荷ピオベルジンについて、２００μＭ最終溶液においてピオベルジンと鉄が４：１の比である、Ｔｒｉｓ緩衝液中の５５Ｆｅ−Ｃｌ３と１５分間、インキュベートした。ピオケリンに放射性鉄を負荷するために、ＨＣｌ  ０．５Ｎ中０．２５ｍＭでの５５ＦｅＣｌ３の溶液４０μｌを、１ｍＭでのピオケリンのメタノール溶液に加えた。１５分間のインキュベーション時間後、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ８．０  ９４０μｌを加えて、ピオケリンと鉄が２：１の比である２０μＭ  ５５Ｆｅ−Ｐｃｈ溶液を得た。細菌を以下のように調製した：単離されたクローンを接種されたＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地における一晩の培養物１０ｍｌを遠心分離し、洗浄したペレットを、コハク酸塩培地２５ｍｌ中に再懸濁し、振盪させながら２時間、インキュベートした。並行して、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地２０ｍｌに一晩の培養物５ｍｌを接種し、振盪させながら２時間、インキュベートして、バックグランド鉄取り込みレベルとして使用した。その後、細菌培養物２５ｍｌを遠心分離し、対応する培地で洗浄し、その後、ペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ８．０緩衝液中に再懸濁し、５９５ｎｍにおけるＯＤを測定し、ＯＤ＝１のアッセイにおける最終濃度を得た。組込みのパーセンテージを各濃度点について計算し、阻害を、インハウスのソフトウェアで計算した。この計算について、鉄取り込みの最大レベルは、少しの融合分子も含まない最小コハク酸塩培地において得られた値に基づき、バックグラウンド値は、シデロフォア受容体が発現していない豊富なＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地において得られた。
【０４３９】
融合分子は、生細胞における鉄取り込みを効果的に遮断した（表１４および表１５参照）。それは、単一リポカリンムテインと匹敵する鉄取り込みの阻害を示し、ＩＣ５０値は、１００〜２００ｎＭ範囲であった（表１４）。単一リポカリンムテインは、それぞれのピオベルジン群を発現する緑膿菌株の鉄取り込みを遮断することができるだけであり、すなわち、配列番号１６は、群Ｉのピオベルジンを発現する緑膿菌株における鉄取り込みを遮断することができるだけであり、配列番号３６は、群ＩＩのピオベルジンを発現する緑膿菌株における鉄取り込みを遮断することができるだけであり、配列番号５３は、群ＩＩＩのピオベルジンを発現する緑膿菌株における鉄取り込みを遮断することができるだけである。配列番号６２は、ピオケリンによって媒介される緑膿菌株における鉄取り込みを遮断することができるだけである．しかしながら、融合分子タンパク質は、全ての緑膿菌株における鉄取り込みを遮断することができ、すなわち、配列番号１３４は、Ｐｖｄ  Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩを発現する株における鉄取り込み、加えてピオケリンによって媒介される鉄取り込みを遮断することができる。
【０４４０】
【表２３】
2018524003.tif 000025
【０４４１】
【表２４】
2018524003.tif 000026
【実施例２１】
【０４４２】
緑膿菌シデロフォアと結合する融合分子の機能試験  −  増殖阻害
透明底の黒色９６ウェルプレートにおいて、緑膿菌シデロフォアと結合する配列番号１３４の融合分子を、微量元素溶液および０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで補完したＣｈｅｌｅｘ処理されたコハク酸塩培地中で、５９５ｎｍで０．０５の最終ＯＤで希釈されたＭＳ細菌培養物とインキュベートすることにより、細菌増殖阻害を決定した。プレートを、３７℃で一晩、インキュベートし、２０分間毎に振盪させて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社製のＩＥＭＳ  Ｒｅａｄｅｒ  ＭＦにおいて５９５ｎｍでのＯＤ読み取りを行った。
【０４４３】
図１４Ａ〜Ｄにおいて、増殖阻害が、異なるピオベルジン型緑膿菌株（Ｐｖｄ  Ｉ株、Ｐｖｄ  ＩＩ株、およびＰｖｄ  ＩＩＩ株）について、およびピオケリン媒介性鉄取り込みの阻害を実証するためにｐｖｄＡ遺伝子を欠失した株について例示的に示されている。対照は、リポカリンムテインの非存在下での細菌増殖であった。
【０４４４】
融合分子は、試験されたあらゆる単一緑膿菌株の増殖を阻害することができた。
【実施例２２】
【０４４５】
融合分子のインビボ効力
緑膿菌ＰＡ０１を、新鮮な血液寒天プレート上へ継代培養し、３７℃で一晩、インキュベートすることにより、−８０℃での長期保存から回復させた。接種菌液を、培養プレートから５〜１０個の別個のコロニーを採取し、続いて、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス１０ｍＬ中に懸濁することにより調製した。その培養物を、オービタルシェーカーにおいて３００ｒｐｍ、３７℃で１８時間、インキュベートした。その培養物を、ＰＢＳ中で２回、洗浄し、その後、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、６００ｎｍで０．６６９の光学密度（およそ１．２×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した。これをさらに希釈して、６×１０７ＣＦＵ／ｍＬの接種菌液濃度を得た。この接種菌液１ｍＬを、アガロースビーズを調製するために使用される細菌学的寒天（ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇａｒ）３０ｍＬに加えた（Ｃａｓｈ  Ｈ．Ａ．ら、１９７９）。アガロースビーズにおけるＰＡ０１の最終濃度は、２×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（５０μＬ接種菌液あたり１×１０５ＣＦＵ）であった。主要な研究の前に、３匹のラットにおいて、接種菌液を感染力について試験し、以前のモデルと同様に、感染４８時間後において、肺組織の５×１０６ＣＦＵ／グラムの組織負荷が達成された。
【０４４６】
この研究に使用されたスプラーグドーリーラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＵＫによって供給された。ラットは、出産の時点で２００〜２２５ｇであり、特定の病原体はなかった。到着後、研究を開始する前に、少なくとも７日間、ラットを順化させた。ラットは、研究の開始時点で２５０〜３００ｇであった。ラットを、常に動物をＨＥＰＡフィルターにかけられた無菌空気に曝している滅菌した個々に換気されたケージ内でグループ飼育した。ラットは、食物および水（無菌）を自由に入手でき、滅菌したアスペンチップの寝床（３〜４日間毎に、または必要に応じて、交換）をあてがわれた。室温は２２℃±１℃であり、５０〜６０％の相対湿度、および５６ｄＢの最大背景雑音であった。ラットを、夜明け相／夕暮れ相を有する１２時間の明／暗サイクルに曝した。全ての動物研究は、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｌｉｃｅｎｓｕｒｅの下で、かつ地域倫理委員会認可を以て、実施された。全ての研究は、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｌｉｃｅｎｓｅコースのパート１、２、および３を完了しており、かつ最新の個人用ライセンスをもつ技術者によって実施された。
【０４４７】
深い麻酔下のラットを、１×１０５ＣＦＵ／ラットで、ＰＡ０１を包埋したビーズ５０μＬを用いて、気管内に感染させた。非感染性対照ラットに、無菌ビーズスラリーを接種した。処置を、感染から３日後、開始し、動物に、感染後３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、および８日目に投与した。融合分子（配列番号１３４；ＲＡ１０６８０５５０）を、１日２回（ｂｉｓ  ｄｉｅ，ＢＤ）、その２回の投与間に５時間の間隔をあけて、静脈内（ＩＶ）投与した。トブラマイシンを、１２時間の間隔でＢＤ、ＩＶ投与した。動物を、感染後３日目、５日目、７日目、９日目、および１５日目に安楽死させた。３日目、５日目、および７日目に、動物を、処置の１回目の投与から４時間後、安楽死させた。９日目から、動物を、処置の１回目の投与が与えられた時点で安楽死させた。安楽死後、細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）および白血球計数およびサイトカイン／炎症マーカー分析のために、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を収集し、肺を摘出した。
【０４４８】
融合分子単剤療法は、それぞれの媒体群と比較して有意な効力を示し、たいていの場合、感染後７日目までに組織負荷を排除した（図１５）。
【０４４９】
２０ｍｇ／ｋｇ／用量でのトブラマイシンは、感染後５日目から開始し、感染を排除した。融合分子とトブラマイシンでの併用療法は、肺負荷の排除の加速を誘導し、融合分子のトブラマイシン活性へのアンタゴニスト効果がないことを示した（図１５）。
【０４５０】
融合分子単剤療法は、抗炎症性を示し、全白血球数と、単球および好中球の絶対数の両方を減少させた（図１６）。融合分子単剤療法は、媒体またはトブラマイシン単剤療法より有意に効果的であり、融合分子が、トブラマイシンより抗炎症性が高いことを示唆した。同様の結果は、併用群において見られたが、融合分子単剤療法データは、併用療法によって引き起こされる抗炎症効果を推進するのは、融合分子であって、トブラマイシンではないことを示唆している。
【実施例２３】
【０４５１】
緑膿菌での肺定着のマウスモデルにおける融合分子のクオラムセンシング転写産物減少へのインビボ効力
緑膿菌ＰＡ０１を、トリプチックソイブロス（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）中、回転振盪水浴において３７℃で８時間、増殖させた。接種菌液を、１×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌで分光法により較正し、その後、病原体を、寒天ビーズ中に捕捉した。
【０４５２】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｏｍａｉｎｅ  ｄｅｓ  ｏｎｃｉｎｓ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入された雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（週齢８週間）を、保護されたユニット内で維持した。全ての実験は、Ｌｉｌｌｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を以て実施された。マウスを、セボフルラン吸入（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＫ）で麻酔し、背殿位に置いた。２４−Ｇ動物経口ゾンデの経気管挿入を使用して、アガロースビーズ調製物６０μｌ（２×１０５ｃｆｕ／マウス）を滴下注入した。
【０４５３】
処置を、感染から１時間後（定着の初期段階）または４８時間後（定着の後期段階）のいずれかに開始し、動物に、５時間の間隔で１日２回、２日間、腹腔内（ｉｐ）に投与した。
【０４５４】
感染から４８時間後（初期段階の場合）または９６時間後（後期段階の場合）に、マウスを安楽死させ、ＲＮＡ抽出のために肺を収集した。逆転写後、ＥｘｏＡ、アルギン酸塩、およびＲｈＬの遺伝子発現をｑＰＣＲ分析によって行った。
【０４５５】
融合分子（配列番号１３４；ＲＡ１０６８０５５０）は、細菌の宿主免疫応答に抵抗する能力を阻止し、毒性因子発現を遮断する。融合分子処置は、定着の初期段階中、クオラムセンシングの３つの主要な遺伝子の有意な減少を誘導した（図１７Ａ）。この効果は、確立された定着においてでさえも、ｒｈＩＩについて維持される（図１７Ｂ）。これらのデータは、細菌の宿主免疫応答に抵抗する能力を阻止し、毒性因子発現を遮断する融合分子の効力を実証した。
【実施例２４】
【０４５６】
リンカー分子長の、融合分子の結合能への効果
異なるリンカー分子長およびリンカー分子組成を、融合分子設計のために試験した。より具体的には、（Ｇ４Ｓ）２ペプチドリンカー（１０アミノ酸）から、リンカーとしての単一グリシンまで低下する範囲でのリンカー長を試験し、単一標的の結合への影響はないか、またはほんのわずかだけ生じることが見出された（図１８）。長さが１０アミノ酸より長いペプチドリンカーもまた、融合分子の結合能へマイナスの影響を生じないだろうと推測することができる。
【実施例２５】
【０４５７】
菌株、化合物、培地、および増殖条件
緑膿菌株ＡＴＣＣ１５６９２／ＰＡ０１（ピオベルジンＩシデロ型）、ＡＴＣＣ２７８５３（ピオベルジンＩＩシデロ型）、およびＡＴＣＣ３３３６０（ピオベルジンＩＩＩシデロ型）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、指示通り、維持した。試験された化合物は、配列番号１３６のＦｃ−融合分子（ＳＡＲ４３９３４９またはＲＡ１０６８０５７８とも呼ばれる）または非結合性対照Ｆｃ−融合分子（ＲＡ１１０４３７１５）であった。他に特定されない限り、細菌を、以下のように調製されたＣｈｅｌｅｘ（登録商標）処理されたコハク酸塩培地（Ｃ−ＭＳ）において増殖させた：コハク酸塩培地を、Ｋ２ＨＰＯ４：６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：３ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．２ｇ／Ｌ、およびコハク酸ナトリウム：４ｇ／Ｌで調製し；その後、０．２２μＭ膜を使用する濾過の前に、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）−１００（Ｂｉｏｒａｄ）を５０ｇ／Ｌで、室温で５時間、加えた。
【０４５８】
各実験について、トリプチックソイ寒天プレートから採取された緑膿菌の様々な菌株の単一コロニーを、細胞培養チューブにおいて、Ｃ−ＭＳ中、３７℃で振盪させながら一晩、増殖させた。一晩の培養物を遠心分離して、増殖培地に存在するピオベルジンを除去した。その後、細菌ペレットを、新鮮なＣ−ＭＳ培地中に再懸濁し、５×１０５ｃｆｕ／ｍＬの密度に希釈し、３７℃インキュベータにおいて、振盪させながら、９６ウェルプレート中で２連または３連で増殖させた。ｃｆｕ／ｍＬの値を、以下の式を使用して、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）から概算した：０．１２５  ＯＤ６００ｎｍ単位＝１．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬ。
【実施例２６】
【０４５９】
Ｆｃ−融合分子の存在下でのピオベルジン産生の速度論
実施例２５に記載されているように調製された細菌を、単独で（未処置の対照）、または様々な用量のＦｃ−融合分子（配列番号１３６）もしくは対照Ｆｃ−融合分子の存在下で、２００μＬの総体積で、９６ウェルプレートにおいて２連で、２４時間、増殖させた。様々な時点において、培養物中のピオベルジン蛍光を、以前に記載されているように（Ｗｉｌｄｅｒｍａｎら、２００１、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、６９（９）、５３８５〜９４頁）、４０５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長でマイクロプレートリーダー（Ｅｎｓｐｉｒｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、プレートにおいて直接、測定した。同時に、細菌バイオマスを、ＯＤ６００ｎｍを測定し、それをｃｆｕ／ｍＬへ変換することにより評価した。実験を、緑膿菌のＡＴＣＣ１５６９２株、ＡＴＣＣ２７８５３株、およびＡＴＣＣ３３３６０株のそれぞれに関して、少なくとも５回、再現した。
【０４６０】
生データを提示するために、代表的な実験についてのｃｆｕ／ｍｌおよび蛍光任意単位値の平均値およびｓ．ｅ．ｍ．が、未処置の対照および２つの化合物での処置（用量反応に関して）について、ＡＴＣＣ２７８５３に関して、それぞれ、図１９Ａおよび１９Ｂ；ＡＴＣＣ１５６９２に関して、それぞれ、図１９Ｃおよび１９Ｄ、ならびにＡＴＣＣ３３３６０に関して、それぞれ、図１９Ｅおよび１９Ｆにおいて、示されている。化合物のバイオマスへの影響（それは、ピオベルジンレベルの差を明らかにすることができる）を説明するために、各時点でのピオベルジンの蛍光の平均量を、対応する平均ＯＤ６００ｎｍで割った。その後、これらの相対量を、未処置の対照のピオベルジン蛍光の相対量に対して正規化した。正規化された相対量は、ＡＴＣＣ２７８５３、ＡＴＣＣ１５６９２、およびＡＴＣＣ３３３６０について、それぞれ、図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃに示されている。実験は３連で２回、実施され、平均値およびｓ．ｅ．ｍ．が表されている。未処置の対照に対する、一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定を実施して、Ｆｃ−融合分子での処置の影響を確認した（＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＾＞０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１）。加えて、点を、標準用量反応曲線にフィットさせ、ＡＴＣＣ２７８５３、ＡＴＣＣ１５６９２、およびＡＴＣＣ３３３６０について、それぞれ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．１１ｍｇ／ｍＬ、および０．８ｍｇ／ｍＬのＩＣ５０値が得られた。
【０４６１】
蛍光シグナルのピオベルジンに対する特異性を、実施例２５に記載されているように増殖した菌株ＡＴＣＣ２７８５３の培養物の蛍光、およびＡＴＣＣ２７８５３のｐｖｄＡ／ｐｃｈＤ二重変異株のそれを測定することにより確認した。この実験で得られた蛍光の平均値が図２１に示されているように、変異株は、これらのシデロフォアを合成する能力がない変異株は、少しの蛍光シグナルも示さない。蛍光シグナルを正規化するために、野生型ＡＴＣＣ２７８５３の上清から得られた精製されたピオベルジンＩＩを使用して、蛍光シグナル獲得の前に、培養物にスパイクし、この実験で得られた蛍光の平均値により、図２２に示されているように、較正曲線が得られた。加えて、Ｆｃ−融合分子の存在下での蛍光シグナルの降下が、その化合物によるピオベルジン結合による蛍光クエンチングによるものではないことを確認するために、ピオベルジンを含有する培養物上清（ＡＴＣＣ２７８５３の、濾過された２４時間培養物で得られる）にＦｃ−融合分子を即座に加え、蛍光を、すぐに、および２４時間後に読み取った。この実験で観察された蛍光の平均値に関して図２３に示されているように、蛍光クエンチングは観察されなかった。
【０４６２】
これらの実験をまとめて考えると、測定された蛍光は、明確に、ピオベルジン存在によること、およびＦｃ−融合分子での処置で観察された蛍光の降下は、鉄を欠乏させた培地中で指数関数的に増殖した細菌によるピオベルジンの産生を阻止する化合物によることが示されている。さらに、この現象は、ロバストであり、全ての３つのシデロタイプのそれぞれの菌株において見られる。
【実施例２７】
【０４６３】
Ｆｃ−融合分子の存在下での増殖の速度論
実施例２５に記載されているように調製された細菌を、単独で（未処置の対照）、または０．１ｍｇ／ｍＬもしくは１ｍｇ／ｍＬのＦｃ−融合分子（配列番号１３６）もしくは非結合性対照Ｆｃ−融合分子の存在下で、２００μＬの総体積で、９６ウェルプレートにおいて２連で、２４時間、増殖させた。３０分間毎に、ＯＤ６００ｎｍを、プレートにおいて直接、測定し、それをｃｆｕ／ｍＬへ変換した。実験は、様々な緑膿菌株に関して５回、再現され、１ｍｇ／ｍＬ処置のＡＴＣＣ１５６９２およびＡＴＣＣ３３３６０への影響を例示する代表的な実験は、それぞれ、図２４Ａおよび２４Ｂにおいて、ｃｆｕ／ｍＬの平均値およびｓ．ｅ．ｍ．として示されている。増殖曲線の対数期の増殖速度を計算し、表１６にΔｃｆｕ・ｍＬ−１・Δｈ−１として表されている。
【０４６４】
【表２５】
2018524003.tif 000027
【０４６５】
全体として、これらの結果は、Ｆｃ−融合分子が明確に、鉄を欠乏させた培地における細菌の指数関数的増殖を遅らせていること、およびこの現象が全ての３つのシデロタイプのそれぞれの菌株において見られることを示している。
【０４６６】
１０μＭでの別の融合分子（ＲＡ１０６８０５５０；配列番号１３４）の、Ｃ−ＭＳ培地における細菌増殖への影響もまた、緑膿菌の５つの最近のＶＡＰ臨床分離株に対して試験し、全ての５つの場合において、指数関数的増殖の傾きの低下が観察された。
【実施例２８】
【０４６７】
Ｆｃ−融合分子のｐｃｈＤプロモーター活性への影響
ピオケリン生合成遺伝子発現は、ＰｃｈＲ制御因子を介して転写レベルで作用する鉄結合ピオケリンによって、正に制御されることが示されている（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓら、１９９６、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８（９）、２５８６〜９２頁）。Ｆｃ−融合分子のピオケリン生合成遺伝子発現への影響を試験するために、合成ｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンを、ｐｃｈＤプロモーターの調節下でクローニングし、ＰｐｃｈＤ：：ｌｕｘ融合体を、ＡＴＣＣ３３３６０の染色体内に挿入した。
【０４６８】
ｐｃｈＤプロモーター活性を測定するために、ＰｐｃｈＤ：：ｌｕｘ融合体を有するＡＴＣＣ３３３６０を、単独で（未処置の対照）、または０．１ｍｇ／ｍＬもしくは１ｍｇ／ｍＬのＦｃ−融合分子（配列番号１３６）もしくは非結合性対照Ｆｃ−融合分子の存在下で、かつ様々な量のＦｅＣｌ３の存在下で、２００μＬの総体積で、９６ウェルプレートにおいて２連で、２４時間、３７℃インキュベータにおいて振盪させながら、増殖させた。２４時間の増殖後、発光を、マイクロプレートリーダー（Ｅｎｓｐｉｒｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、プレートにおいて直接、測定した。
【０４６９】
鉄濃度のＰｐｃｈｄ転写活性への影響を、３連で実施された３つの独立した実験において評価し、代表的な実験は、図２５において、観察された発光の平均値およびｓ．ｅ．ｍ．として示されている。予想された通り、ｐｃｈＤプロモーター発現は、鉄の添加無しのＣ−ＭＳ培地において誘導され、鉄の添加によって抑制された。これは、そのレポーター融合体の機能を確証している。
【０４７０】
様々な量の補給の鉄の存在下での、Ｆｃ−融合分子処置のＰｐｃｈｄ転写活性への影響を、３連で実施された単一実験において評価し、その結果は、図２６において、観察された発光の平均値およびｓ．ｅ．ｍ．として示されている。それは、このプロモーターの活性が、補給の鉄の量に関わらず、Ｆｃ−融合分子の存在下で消失し、一方、対照Ｆｃ−融合分子は効果を生じなかったことを示している。
【０４７１】
様々な用量のＦｃ−融合分子または対照Ｆｃ−融合分子のＰｐｃｈＤ転写活性への影響を、鉄を補給することなく、３連で実施される３つの実験において、試験した。各実験において、ルシフェラーゼ活性の量を、未処置の対照に対して正規化した。これらの３つの実験において得られた、観察された発光の平均値およびｓ．ｅ．ｍ．は、図２７に示されている。点を、標準用量反応曲線にフィットさせ、Ｆｃ−融合分子について０．０３ｍｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ：０．０２〜０．０５）ＩＣ５０値が得られ、アイソタイプの対照Ｆｃ−融合分子については不確定であった。
【０４７２】
全体として、これらの結果は、Ｆｃ−融合分子が、明確に、鉄を欠乏させた培地において、鉄結合ピオケリンにより通常、伝達されるシグナルを阻止していることを示している。これは、ピオベルジンに関して観察されたように、このシデロフォアの量の減少を生じるはずである。逆に、ピオベルジン自体によるピオベルジン合成の同様の正の制御が示されているため（Ｌａｍｏｎｔら、２０００、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９９（１０）、７０７２〜７頁）、上記で見られたＦｃ−融合分子のピオベルジン産生への影響が、ピオベルジン媒介性シグナル伝達の遮断によると推測することは興味深い。シデロフォア媒介性シグナル伝達はまた、毒性因子の合成に影響を及ぼすことが知られており（Ｌａｍｏｎｔら、２０００、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９９（１０）、７０７２〜７頁）、したがって、Ｆｃ−融合分子が毒性に影響するであろうと予想される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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