(57)【要約】  生物学的膜を通した薬物、特にタンパク質又はオリゴヌクレオチド等の巨大分子の新規な送達系、詳細にはｓｉＲＮＡの送達を提供する。この送達系は、膜を通した効果的な通過を可能にする部分に対する巨大分子薬物のコンジュゲーションを含む。それぞれ、前記送達系を利用する新規な化合物及び医薬組成物が提供される。本発明の一態様において、化合物は、医学的障害の処置のための医療行為、例えば生物学的膜を横切ったｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達において使用され得る。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的膜を横切って薬物を送達するための方法であって：
（ｉ）内部膜電界（ＩＭＥＦ）−基質にコンジュゲートされた薬物を提供することと；
（ｉｉ）生物学的膜を、ＩＭＥＦ−基質にコンジュゲートされた薬物と接触させることと、を含む、方法。
【請求項２】
薬物をＩＭＥＦ−基質にコンジュゲートすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的膜を横切って薬物を送達する方法であって、薬物に１つ以上の部分（Ｅ、Ｅ’又はＥ”）をコンジュゲートすることであって、各部分が：（ｉ）オクタノール／水分配係数＞１；（ｉｉ）以下のモチーフの少なくとも１つから選択される陰極：カルボニル、エーテル又はフッ素原子；及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの２炭素長の線状、分枝状又は脂肪族炭化水素鎖を含む陽極；を有する、コンジュゲートすることと、
生物学的膜を、コンジュゲートされた薬物と接触させることと、を含む、方法。
【請求項４】
生物学的膜を横切って薬物を送達する方法であって、式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート：
【化１】
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又は式（Ｉ）に示す構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物の利用を含む、方法。
（式中、Ｄは、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び自然の又は修飾された、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯからなる群から選択される、生物学的膜を横切って送達されるべき薬物であり；ｙ、ｚ及びｗは、それぞれ、０、１、２、３、４、５又は６から独立して選択される整数であり、整数が０の場合は常に、それぞれのＥ部分が無であることを意味し；ｙ、ｚ又はｗの少なくとも１つは、０とは異なり；
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、同一又は異なってもよく、それぞれは一般式（ＩＩ）に示す構造を有し：
（Ａ）ａ−Ｂ−Ｌ１−Ｑ１−Ｌ２−Ｑ２−Ｌ３
式（ＩＩ）
（式中、各Ａ部分は、独立して、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）に示す構造から選択され：
【化２】
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Ｍは、無、−Ｏ−又は−ＣＨ２−から選択され；ｇ、ｈ及びｋは、それぞれ個々に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６からなる群から選択される整数であり；＊は、−Ｈ又はＢ若しくは他のＡ基に対する結合点であり；ａは、１、２、３又は４から選択される整数であり；Ｑは、酸素又はアミンであり、
式中、Ｂは、以下からなる１つ以上の基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミンチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
コレステロール、胆汁酸、エストロゲン、エストラジオール、エストリオール、リトコール酸又はそれらの任意の類似体からなる群から選択される１つ以上のステロイド部分；又はこれらの任意の組み合わせ、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はそれぞれは、場合によりエーテル、エステル、アミン又はアミド基に結合される；
及びこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１及びＱ２は、それぞれ、無、エステル、チオ−エステル、アミド［例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−］、カルバメート［例えば−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−］、尿素［−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−］、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル［−Ｏ−］、アミン、イミダゾール、トリアゾール、ジラクトンから独立して選択される切断可能な基；そのキレート化金属イオンを含む、ＢＡＰＴＡ及びＥＧＴＡから選択される金属キレート剤；及びこれらの任意の組み合わせであり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して、無及び以下からなる基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｕ−、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換される；
ヌクレオシド、ヌクレオチド；イミダゾール、アジド、アセチレン；及びこれらの任意の組み合わせ、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；ｕは、１、２、３、４又は５の整数である；及びこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは無ではなく、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のそれぞれは、場合によりＴ部分を含み；Ｔは、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６−１，２−ジチオシクロアルキル（１，２−ジチオシクロ−ブタン；１，２−ジチオシクロ−ペンタン；１，２−ジチオシクロヘキサン；１，２−ジチオシクロヘプタン）；γ−ラクタム（５原子アミド環）、δ−ラクタム（６原子アミド環）又はε−ラクタム（７原子アミド環）；γ−ブチロラクトン（５原子エステル環）、δ−バレロラクトン（６原子エステル環）又はε−カプロラクトン（７原子エステル環）から選択されるイニシエータ基であり；それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；
Ｂ、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは、式（Ｉ）に定義した薬物にコンジュゲートされている））。
【請求項５】
ｙ＝１、ｚ＝ｏ及びｗ＝０；又はｙ＝１、ｚ＝１及びｗ＝０である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一般式（Ｉ）によるコンジュゲート（式中、Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、一般式（ＶＩＩ）に示す構造、及び関連構造を有するコンジュゲート。
【化３】
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Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｑ１、Ｑ２は、式（Ｉ）に関して記載したものと同じ意味を有し、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又はアミン（第２級又は第３級アミン）基から選択され；ｋ及びｄは、それぞれ独立して、無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；（式（ＶＩＩ）に示す構造により表される化合物又は関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項７】
Ｒ又はＲ’は、それぞれ独立して水素及びフッ素原子から選択される、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
エストラジオール部分は、エストラジオール、リトコール酸、及び関連類似体からなる群から選択される他のステロイド残基で置換される、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ個々に、無及び線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８炭化水素鎖から選択され、これらは場合によりエーテル又はアミン基に結合され；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、同一又は異なってもよい、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｑ１又はＱ２は、アミド、エステル、エーテル、カルバメート又はジスルフィドから選択される部分である、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
Ｌ１、Ｌ２又はＬ３は、Ｔ部分を含み、Ｔは、場合によりハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換された１，２−ジチオシクロ−ブタンである、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＶＩＩａ）に示す構造を有する、請求項６に記載のコンジュゲート。
【化４】
2018523680.tif 000093
（式中、ａ及びｋそれぞれ独立して０、１、２、３、４、５又は６の整数を表す）；（式（ＶＩＩａ）に示す構造により表される化合物又は関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項１３】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、（ｉ）ＭＮＭの陰極と陽極との間に位置するアミン基；及び（ｉｉ）アミンｐＫａ値を７．０〜８．５ｐＨ単位範囲に設定する、アミン部分に隣接する電子吸引基からなる「動的プロトン化部分」を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
隣接する電子吸引基のそれぞれは、カルボニル、エーテル、エステル及びフッ化炭素部分から選択される基から選択される、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）又は（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）に示す構造を有し、（関連する薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物であり；Ｌ３は、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；ａ、ｂ、ｋ及びｄは、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択される：請求項６に記載のコンジュゲート。
【化５】
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【化６】
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【化７】
2018523680.tif 000096
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【請求項１６】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＩＸ）に示す構造を有する、請求項６に記載のコンジュゲート：
【化１３】
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（式中、Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、は、式（Ｉ）に定義した通りであり；Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又は第２級若しくは第３級アミン基から選択され；ｄ及びｅは、それぞれ独立して無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；（式（ＩＸ）に示す構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項１７】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、独立して、式（ＩＸａ）、式（ＩＸｂ）、式（ＩＸｃ）、式（ＩＸｄ）、式（Ｘｅ）、式（ＩＸｆ）、式（ＩＸｇ）、及び式（ＩＸｈ）に示す構造を有する（薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物、及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）、請求項１６に記載のコンジュゲート：
【化１４】
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【化１５】
2018523680.tif 000104
式（ＩＸｂ）：ａ＝３、ｂ＝０及びｋ＝１の場合、この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される。
【化１６】
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式（ＩＸｃ）；ａ＝１、ｋ＝１の場合；この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇと指定される。
【化１７】
2018523680.tif 000106
【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
2018523680.tif 000109
【化２１】
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（式中、Ｌ３は、式（Ｉ）に定義した通りであり；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又は第２級若しくは第３級アミン基から選択され；ａ、ｂ、ｋ及びｄは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択され；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；（薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物、及び金属キレート、並びにそれぞれの塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項１８】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”の１つ以上が、カルバメート基を有し、切断可能なジスルフィド部分は、式（Ｘ）、式（Ｘａ）、式（Ｘｂ）又は式（Ｘｃ）による環状構造内にあり；ジスルフィドは、その酸化又は還元された（開環）形態のいずれかにあり得る、請求項６に記載のコンジュゲート：
【化２２】
2018523680.tif 000111
【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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（式中、ａ、ｂ、ｋは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６からなる群から選択される整数を表し；ｈは、１、２、３又は４の整数であり；Ｚは、水素、フッ素、ヒドロキシル及びアミン基からなる群から選択され；Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｌ３は、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；Ｇは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗは、酸素、アミド、エステル及びアミン（第２級又は第３級アミン）から選択され；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）。
【請求項１９】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”の少なくとも１つが、切断可能なカルバメート部分、及び動的プロトン化部分の両方を含み、式（ＸＩ）、式（ＸＩａ）、式（ＸＩｂ）、式（ＸＩｃ）又は式（ＸＩｄ）に示す構造を有する（これらの化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）、請求項６に記載のコンジュゲート；
【化２６】
2018523680.tif 000115
（式中、Ｌ３又はＬ２はそれぞれ、式（Ｉ）による意味を有し、Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及び第２級又は第３級アミンからなる群から選択され、ｂ及びｄはそれぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ’、Ｒ”及びＲ’’’は、それぞれ独立して、水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；
【化２７】
2018523680.tif 000116
（式中、Ｌ３は、式（Ｉ）による意味を有し、ａ、ｂ及びｄはそれぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ”、Ｒ’’’は、それぞれ独立して、水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；
【化２８】
2018523680.tif 000117
（式中、Ｌ３は、式（Ｉ）による意味を有し；ａ、ｂ及びｄはそれぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ”、Ｒ’’’、ＲＩＶは、それぞれ独立して水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；
【化２９】
2018523680.tif 000118
（式中、Ｌ３及びＤはそれぞれ、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有する）。
【化３０】
2018523680.tif 000119
（式中、Ｌ３及びＤはそれぞれ、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有する）。
【請求項２０】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”はそれぞれ独立して、薬物に付着された；式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに示す構造を有する、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
薬物は、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ及び治療的タンパク質からなる群から選択される巨大分子である、請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
請求項２１に記載のコンジュゲートを含み、薬学的に許容され得る塩又は担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
生物学的細胞内への薬物の送達方法であって、前記細胞が培養物又は生きた動物若しくはヒト対象中にあり；前記方法が細胞を請求項２０に記載のコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
医学的障害の処置方法であって、必要とする患者に治療的有効量の請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
生物学的膜は、細胞膜及び生物学的バリアからなる群から選択され、前記生物学的バリアは、血液脳関門、血液眼関門、又は血液胎盤関門から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
コンジュゲートの形成中に除去又は修飾されることになる化学的部分を含む又は該部分に結合した、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに示す構造を有する前駆体。
【請求項２７】
除去又は修飾されることになる化学的部分は、ホスホロアミデート、活性化エステル、アジド又はアセチレンからなる群から選択される、請求項２６に記載の前駆体。
【請求項２８】
式（ＸＩＩ）に示す構造を含む、請求項２６に記載の前駆体：
【化３１】
2018523680.tif 000120
（式中、Ｗは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるＥ、Ｅ’又はＥ”から選択される化学的部分である）。
【請求項２９】
式（ＸＩＩＩ）に示す構造を有する、請求項２６に記載の前駆体：
【化３２】
2018523680.tif 000121
（式中、Ｇは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるＥ、Ｅ’又はＥ”から選択される部分であり；ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）は、ヒドロキシルのための保護基であり；ＣＰＧは、調節多孔ガラスである）。
【請求項３０】
式（ＸＩＶ）に示す構造を有する、請求項２６に記載の前駆体：
【化３３】
2018523680.tif 000122
（式中、ＰＲＧは、ヒドロキシル基の保護に好適な任意の保護基であり；Ｗは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるＥ、Ｅ’又はＥ”から選択され；Ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８炭化水素リンカーから選択され、これらは場合により酸素又は窒素原子で置換され、場合により任意の天然又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ塩基に結合される）。
【請求項３１】
ＰＲＧはジメトキシトリチルビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）であり；塩基はチミン又はウラシルである、請求項３０に記載の前駆体。
【請求項３２】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”のＤへの付着のために、Ｄはタンパク質薬物であり；前記前駆体は、式Ａ又はＢに示す構造を含む、請求項２６に記載の前駆体：
【化３４】
2018523680.tif 000123
（式中、Ｗは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるＥ、Ｅ’又はＥ”から選択され；前記前駆体は、Ｄのアミン部分に結合することを意図する）。
【請求項３３】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、一般式（ＶＩＩ）に示す構造、及び関連構造を有する、請求項４に記載の方法：
【化３５】
2018523680.tif 000124
（Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｑ１、Ｑ２は、式（Ｉ）に関して記載したものと同じ意味を有し、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又はアミン（第２級又は第３級アミン）基から選択され；ｋ及びｄは、それぞれ独立して、無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；（式（ＶＩＩ）に示す構造により表される化合物又は関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項３４】
Ｒ又はＲ’は、それぞれ独立して、水素及びフッ素原子から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステロイド残基は、エストラジオール、リトコール酸、及び関連類似体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ個々に、無及び線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８炭化水素鎖から選択され、これらは場合によりエーテル又はアミン基に結合され；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３同一又は異なってもよい、請求項４に記載の方法。
【請求項３７】
Ｑ１又はＱ２は、アミド、エステル、エーテル、カルバメート又はジスルフィドから選択される部分である、請求項４に記載の方法。
【請求項３８】
Ｌ１、Ｌ２又はＬ３はＴ部分を含み、Ｔは、場合によりハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換された１，２−ジチオシクロ−ブタンである、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＶＩＩａ）に示す構造を有する、請求項４に記載の方法：
【化３６】
2018523680.tif 000125
（式中、ａ及びｋは、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５又は６の整数を表す）；（式（ＶＩＩａ）に示す構造により表される化合物又は関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項４０】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、（ｉ）ＭＮＭの陰極と陽極との間に位置するアミン基；及び（ｉｉ）アミンｐＫａ値を７．０〜８．５ｐＨ単位範囲に設定する、アミン部分に隣接する電子吸引基からなる「動的プロトン化部分」を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項４１】
隣接する電子吸引基のそれぞれは、カルボニル、エーテル、エステル及びフッ化炭素部分から選択される基から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）又は（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）に示す構造（関連する薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）を有し；式中、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物であり；Ｌ３は、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；ａ、ｂ、ｋ及びｄは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【化３７】
2018523680.tif 000126
【化３８】
2018523680.tif 000127
【化３９】
2018523680.tif 000128
【化４０】
2018523680.tif 000129
【化４１】
2018523680.tif 000130
【化４２】
2018523680.tif 000131
【化４３】
2018523680.tif 000132
【化４４】
2018523680.tif 000133
【請求項４３】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＩＸ）に示す構造を有する、請求項４に記載の方法：
【化４５】
2018523680.tif 000134
（式中、Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、は、式（Ｉ）に定義した通りであり；Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又は第２級若しくは第３級アミン基から選択され；ｄ及びｅは、それぞれ独立して無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択され；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義された薬物である）（式（ＩＸ）に示す構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項４４】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、独立して、式（ＩＸａ）、式（ＩＸｂ）、式（ＩＸｃ）、式（ＩＸｄ）、式（Ｘｅ）、式（ＩＸｆ）、式（ＩＸｇ）、及び式（ＩＸｈ）に示す構造（薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物、及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）を有する、請求項４３に記載の方法。
【化４６】
2018523680.tif 000135
【化４７】
2018523680.tif 000136
式（ＩＸｂ）：ａ＝３、ｂ＝０及びｋ＝１の場合、この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される。
【化４８】
2018523680.tif 000137
式（ＩＸｃ）；ａ＝１、ｋ＝１の場合；この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇと指定される。
【化４９】
2018523680.tif 000138
【化５０】
2018523680.tif 000139
【化５１】
2018523680.tif 000140
【化５２】
2018523680.tif 000141
【化５３】
2018523680.tif 000142
（式中、Ｌ３は、式（Ｉ）に定義した通りであり；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又は第２級若しくは第３級アミン基から選択され；ａ、ｂ、ｋ及びｄは、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択され；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）（薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物、及び金属キレート、並びにそれぞれの塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【請求項４５】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”の１つ以上がカルバメート基を有し、切断可能なジスルフィド部分は、式（Ｘ）、式（Ｘａ）、式（Ｘｂ）又は式（Ｘｃ）による環状構造内にあり；ジスルフィドは、その酸化又は還元された（開環）形態のいずれかであり得る、請求項４に記載の方法：
【化５４】
2018523680.tif 000143
【化５５】
2018523680.tif 000144
【化５６】
2018523680.tif 000145
【化５７】
2018523680.tif 000146
（式中、ａ、ｂ、ｋはそれぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６からなる群から選択される整数を表し；ｈは、１、２、３又は４の整数であり；Ｚは、水素、フッ素、ヒドロキシル及びアミン基からなる群から選択され；Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｌ３は、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；Ｇは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗは、酸素、アミド、エステル及びアミン（第２級又は第３級アミン）から選択され；Ｄは、式（Ｉ）に定義された薬物である）。
【請求項４６】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”の少なくとも１つが、切断可能なカルバメート部分、及び動的プロトン化部分の両方を含み、式（ＸＩ）、式（ＸＩａ）、式（ＸＩｂ）、式（ＸＩｃ）又は式（ＸＩｄ）に示す構造（これらの化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）を有する請求項４に記載の方法；
【化５８】
2018523680.tif 000147
（式中、Ｌ３又はＬ２はそれぞれ、式（Ｉ）による意味を有し、Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及び第２級又は第３級アミンからなる群から選択され、ｂ及びｄはそれぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ’、Ｒ”及びＲ’’’は、それぞれ独立して水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；
【化５９】
2018523680.tif 000148
（式中、Ｌ３は、式（Ｉ）による意味を有し、ａ、ｂ及びｄはそれぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ”、Ｒ’’’はそれぞれ独立して、水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である）；
【化６０】
2018523680.tif 000149
（式中、Ｌ３は、式（Ｉ）による意味を有し；ａ、ｂ及びｄはそれぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ”、Ｒ’’’、ＲＩＶは、それぞれ独立して水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義された薬物である）；
【化６１】
2018523680.tif 000150
（式中、Ｌ３及びＤは、それぞれ式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有する）。
【化６２】
2018523680.tif 000151
（式中、Ｌ３及びＤはそれぞれ、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有する）。
【請求項４７】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”はそれぞれ独立して、薬物に付着された；式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに示す構造を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項４８】
薬物が、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ及び治療的タンパク質からなる群から選択される巨大分子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
化合物のライブラリー中からＩＭＥＦ−基質を選択する方法であって；前記方法が：
（ｉ）フロレチン（１００〜１０００μＭ）、及び／又は６−ＫＣ（１０〜１００μＭ）の存在下、細胞又はリポソームを、化合物のライブラリーからのＩＭＥＦ−基質であることが疑われる候補化合物とインキュベートすることと、
（ｉｉ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの存在下、候補化合物の膜を横切った細胞又はリポソーム中への取り込みレベルを測定することと；
（ｉｉｉ）フロレチン及び／又は６−ＫＣ（１０〜１００μＭ）の非存在下、細胞又はリポソームを候補化合物とインキュベートすることと；
（ｉｖ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの非存在下、候補化合物の膜を横切った細胞又はリポソーム中への取り込みレベルを測定することと；
（ｖ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの存在と非存在との間で、候補化合物の取り込みレベルを比較することであって；フロレチンの存在下の５０％を超える取り込みにおける増大；又は６−ＫＣの存在下の２倍を超える取り込みにおける増大は、候補化合物がＩＭＥＦ−基質であることを示す、比較することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な送達系、及び生物学的膜を横切って分子及び巨大分子を細胞内に送達し、場合により続いて細胞内捕捉する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質病理は、変異タンパク質の機能不全から機能の病理学的な獲得に及ぶ多くの医学的障害の病因又は病態形成における一般的な共通因子であり、ここで特定のタンパク質は、該タンパク質を有毒にする新たな性質を獲得する。概念的に、遺伝子療法によるこれらのタンパク質の合成の阻害は、それらのタンパク質異常を有する患者にとって有望であり得る。
【０００３】
近年の主な科学進歩の１つは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉による特定の遺伝子の発現のサイレンシングの概念である。ＲＮＡ干渉は、短い（約１９〜２７塩基対）二本鎖ＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡと指定）に基づき、該二本鎖ＲＮＡ配列は、細胞生物学的系［中でも、ダイサータンパク質複合体、これはより長い二本鎖ＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡ、及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を生成］と協調して、翻訳を抑制し、特定のｍＲＮＡ配列の分解に関してマークすることにより翻訳段階で遺伝子発現を抑制するよう作用することが可能である。特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的な非修飾又は化学的に修飾されたＤＮＡ分子である、短い配列（通常、１３〜２５ヌクレオチド）であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用は、特定の標的タンパク質の生成の発現を阻害し遮断するのに使用されている。しかしながら、医療のためのそれらの手法の多大な潜在的利益にも関わらず、そのような巨大分子を細胞内に送達することには、オリゴヌクレオチドの比較的大きく、高く荷電した構造（例えば、ｓｉＲＮＡは１３ｋＤａの平均分子量を有し、約４０の負に荷電したホスフェート基を保有する）に起因してかなりの困難が尚存在する。実際、オリゴヌクレオチドの膜貫通送達は、非常に大きいエネルギーバリアを克服する必要がある。
【０００４】
二極性膜電位は、水／膜界面と膜中心（正の内側）との間の任意のリン脂質膜内に存在する電位である。これは、リン脂質グリセロールエステル結合の高度に規則的なカルボニル基によって生成されると考えられ、その振幅は約２２０〜２８０ｍＶである。二極性膜電位は、非常に疎水性の高い誘電率２〜４の環境にあるため、内部膜電界（ＩＭＥＦ）と呼ばれる１０８〜１０９Ｖ／ｍという非常に強い電場を生成する。おそらく、二極性膜電位、及び関連する膜内電場は、重要な生理学的機能を有する。即ち、それらは、膜タンパク質の構成及び活動を決定することにより、該膜タンパク質の機能に影響を与え得る。しかしながら、本発明者らの知る限りでは、この双極子ポテンシャルは、いずれの産業的、生物学的又は医学的用途においても未だ利用されていない。
【０００５】
生物学的膜を横切ったオリゴヌクレオチド又はタンパク質等の巨大分子の送達のために、様々な方法が開発されてきた。これらの方法には、ウィルスベクター、及び、カチオン性脂質又はリポソーム等の非ウィルス性送達系が挙げられる。しかしながら今日まで、これらの方法の使用は、インビトロでの用途、又は、例えば眼内への直接注射若しくは肺内への直接投与によるインビボでの局所投与に高く限られている。効率的な送達は、肝臓に対して達成されている。毒性はこれらの送達方法のいくつか、例えばカチオン性脂質に関連したものにおける主な限定要因である。非ウィルス性送達系の中でも、エレクトロポレーションは効果的であることが知られており、インビトロでの巨大分子の送達方法に広く使用されている。この方法によれば、外部電場が細胞懸濁液に印加され、これは荷電標的分子の細胞膜との衝突と、続く一時的かつ局所的な膜不安定化をもたらし、その結果巨大分子を細胞内に通過させる。しかしながら、上述したように、エレクトロポレーションは主にインビトロで使用され、その使用をインビボでの用途に拡張する試みは、限られた成功のみを示し、外部電極が挿入可能な特定の器官（例えば、筋肉、肺）のみに対して実用的であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
結論として、細胞膜を通した、又は例えば血液脳関門、血液眼関門若しくは血液胎盤関門等の他の生物学的バリアを通したオリゴヌクレオチド又はタンパク質等の巨大分子の送達は、実質的な、満たされていない必要性を提示し、治療的巨大分子の全身送達は、尚、対処されていない大きな困難のままである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、医学、生物学又は農学等の様々な分野における用途のための、二極性膜電位に関連した、最近発見された内部膜電界（ＩＭＥＦ）の新規かつ革新的な利用に焦点を当てる。
【０００８】
本発明の一態様において、ＩＭＥＦ／二極性膜電位に依存する方法で、薬物に潜在的にコンジュゲートされることにより薬物の生物学的リン脂質膜を横切る細胞内への向上及び改善された送達を伴う、化学的部分であるＩＭＥＦ−基質を提示する。
【０００９】
したがって、本発明の一態様は、生物学的膜を横切って薬物を送達する方法であって、ＩＭＥＦ−基質にコンジュゲートされた薬物を提供することと、生物学的膜をＩＭＥＦにコンジュゲートされた薬物と接触させることと、を含む方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、本方法は更に、薬物をＩＭＥＦ−基質にコンジュゲートすることを含み得る。
【００１１】
本発明の別の態様は、生物学的膜を横切って薬物を送達する方法を提供し、該方法は、１つ以上の部分を薬物にコンジュゲートすることであって、各部分は、オクタノール／水分配係数＞１；以下のモチーフ：カルボニル、エーテル又はフッ素原子の少なくとも１つから選択される陰極；及び少なくとも１つの２炭素長の、線状又は分枝状の脂肪族炭化水素鎖を含む陽極を有する、コンジュゲートすることと；生物学的膜をコンジュゲートされた薬物と接触させることと、を含む。一実施形態において、該部分は、本明細書に定義する構造Ｅ、Ｅ’又はＥ”を有し得る。
【００１２】
本発明の別の態様は、生物学的膜を横切った薬物の送達に使用されるコンジュゲートを提供し、コンジュゲートは、１つ以上の部分にコンジュゲートされた薬物を含み、各部分は、オクタノール／水分配係数＞１；以下のモチーフ：カルボニル、エーテル又はフッ素原子の少なくとも１つから選択される陰極；及び少なくとも１つの２炭素長の、線状又は分枝状の脂肪族炭化水素鎖を含む陽極を有する。一実施形態において、該部分は、本明細書に定義する構造Ｅ、Ｅ’又はＥ”を有し得る。
【００１３】
フロレチンは、ＩＭＥＦを低減するように作用する化学的化合物であり、それ故、二極性膜電位／ＩＭＥＦに依存する特定の化合物の移動を評価することができる。したがって、本発明の実際的な目的のために、ＩＭＥＦ−基質は、場合により薬物に付着された化学的化合物であり、これはフロレチンの存在下、細胞膜を横切った送達における５０％を超える低下を示す。
【００１４】
本発明の一実施形態において、ＩＭＥＦ−基質は、新規な、合理的に設計された「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」であり、これは生物学的膜を横切った薬物の送達にＩＭＥＦを利用し得る。この目的のために、ＭＮＭは、ＩＭＥＦの静電気エネルギーを動的エネルギーに変換することができ、この動的エネルギーを、非常に高いことが多いエネルギーバリアの克服に利用し、該エネルギーバリアは、リン脂質膜を含む生物学的バリアを横切った、巨大分子薬物等の化学的化合物の送達において存在する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、生物学的膜を介した式（Ｉ）〜（ＸＩｄ）による部分を含むコンジュゲートの取り込みが、内部膜電界の薬理学的シャットダウン（例えばフロレチン、１００〜１，０００μＭによる）又はターンオン（ｔｕｒｎｉｎｇ−ｏｎ）（例えば６−ケト−コレスタノール１０〜１００μＭによる）によって劇的に阻害され又は増大し得るという本発明者らの発見に基づくものである。このことは、式（Ｉ）〜（ＸＩｄ）による本発明のコンジュゲートの取り込みの、二極性膜電位に関連した内部膜電界に対する直接的な依存を示し、したがって、これらの式（Ｉ）〜（ＸＩｄ）による化合物の全てをＩＭＥＦ−基質と定義する。
【００１６】
本発明の実施形態によるＭＮＭは、下記の式（ＩＩ）に示す部分Ｅ、Ｅ’又はＥ”の構造を含む。ＭＮＭにより送達されるべき薬物は、ペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチド（例えば天然又は修飾された、一本鎖又は二本鎖、ＲＮＡ又はＤＮＡ）等の小分子薬物又は巨大分子のいずれかであり得る。本発明の一実施形態において、送達されるべき巨大分子は、遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡ鎖、即ちｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）としての役割を果たすよう設計されたＤＮＡ配列を含むことができる。
【００１７】
本発明の実施形態によるＭＮＭを伴う薬物（例えば小分子薬物又は巨大分子）のコンジュゲートは、基礎研究、農学、化学又は非臨床又は臨床医療行為において利用することができる。中でも、それらは、異常なタンパク質又はタンパク質機能障害が関与し、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現のサイレンシングが有益であり得る医学的障害の処置に使用することができる。そのような医学的用途は、例えば、変性疾患、癌、毒性又は虚血発作、感染症又は免疫介在性疾患の処置のための手段であり得る。
【００１８】
本発明の一実施形態において、生物学的膜を横切って薬物を送達する方法を提供し、該方法は、式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート：
【化１】
2018523680.tif 000003
又は式（Ｉ）に示す構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物の使用を含む：
（式中、Ｄは、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び自然の又は修飾された、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯからなる群から選択される、生物学的膜を横切って送達されるべき薬物であり；ｙ、ｚ及びｗは、それぞれ、０、１、２、３、４、５又は６から独立して選択される整数であり、整数が０の場合は常に、それぞれのＥ部分が無（ｎｕｌｌ）であることを意味し；ｙ、ｚ又はｗの少なくとも１つは、０とは異なり；
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、同一又は異なってもよく、それぞれは一般式（ＩＩ）に示す構造を有し：
（Ａ）ａ−Ｂ−Ｌ１−Ｑ１−Ｌ２−Ｑ２−Ｌ３
式（ＩＩ）
（式中、各Ａ部分は、独立して式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）に示す構造から選択され：
【化２】
2018523680.tif 000004
Ｍは、無、−Ｏ−又は−ＣＨ２−から選択され；ｇ、ｈ及びｋは、それぞれ個々に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６からなる群から選択される整数であり；＊は、−Ｈ又はＢ若しくは他のＡ基に対する結合点であり；ａは、１、２、３又は４から選択される整数であり；Ｑは、酸素又はアミンであり、
式中、Ｂは、以下からなる１つ以上の基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミンチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
コレステロール、胆汁酸、エストロゲン、エストラジオール、エストリオール、リトコール酸又はそれらの任意の類似体からなる群から選択される１つ以上のステロイド部分；それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はそれぞれは、場合によりエーテル、エステル、アミン又はアミド基に結合される；
及びこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１及びＱ２は、それぞれ、無、エステル、チオ−エステル、アミド［例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−］、カルバメート［例えば−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−］、尿素［−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−］、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル［−Ｏ−］、アミン、イミダゾール、トリアゾール、ジラクトンから独立して選択される切断可能な基；そのキレート化金属イオンを含む、ＢＡＰＴＡ及びＥＧＴＡから選択される金属キレート剤；及びこれらの任意の組み合わせであり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して、無及び以下からなる基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｕ−、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換される；ヌクレオシド、ヌクレオチド；イミダゾール、アジド、アセチレン；及びこれらの任意の組み合わせ、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；ｕは、１、２、３、４又は５の整数である；及びこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは無ではなく、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のそれぞれは、場合によりＴ部分を含み；Ｔは、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６−１，２−ジチオシクロアルキル（１，２−ジチオシクロ−ブタン；１，２−ジチオシクロ−ペンタン；１，２−ジチオシクロヘキサン；１，２−ジチオシクロヘプタン）；γ−ラクタム（５原子アミド環）、δ−ラクタム（６原子アミド環）又はε−ラクタム（７原子アミド環）；γ−ブチロラクトン（５原子エステル環）、δ−バレロラクトン（６原子エステル環）又はε−カプロラクトン（７原子エステル環）から選択されるイニシエータ基であり；それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；
Ｂ、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは、式（Ｉ）に定義した薬物にコンジュゲートされている））。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、ｙ＝１、ｚ＝ｏ及びｗ＝０；又はｙ＝１、ｚ＝１及びｗ＝０である。
【００２０】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、一般式（Ｉ）を有し、生物学的膜を横切って細胞内に送達され得る：
【化３】
2018523680.tif 000005
（式（Ｉ）に示す構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む。）式中：
Ｄは、生物学的膜を横切って送達されるべき薬物である。Ｄは、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、又は自然の又は修飾された、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又はｓｉＲＮＡであってもよく；
ｙ、ｚ及びｗは、それぞれ、０、１、２、３、４、５又は６から独立して選択される整数であり、整数が０の場合は常に、それぞれのＥ部分が無であることを意味し；ｙ、ｚ又はｗの少なくとも１つは、０とは異なる。一実施形態において、ｙ＝１、ｚ＝ｏ及びｗ＝０であり；別の実施形態では、ｙ＝１、ｚ＝１及びｗ＝０である。
【００２１】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、同一又は異なってもよく、それぞれは一般式（ＩＩ）に示す構造を有し：
（Ａ）ａ−Ｂ−Ｌ１−Ｑ１−Ｌ２−Ｑ２−Ｌ３
式（ＩＩ）
（式中、各Ａ部分は、独立して、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）に示す構造から選択され：
【化４】
2018523680.tif 000006
Ｍは、−Ｏ−又は−ＣＨ２−から選択され；ｇ、ｈ及びｋは、それぞれ個々に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６からなる群から選択される整数であり；＊は、−Ｈ又はＢ若しくは他のＡ基に対する結合点であり；ａは、１、２、３又は４から選択される整数であり；Ｑは、酸素又はアミンである。
【００２２】
Ｂは、以下からなる１つ以上の基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
１つ以上のステロイド部分（コレステロール、胆汁酸、エストラジオール、エストリオール等）、エストロゲン、ヌクレオシド、ヌクレオチド；及びこれらの任意の組み合わせ、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はそれぞれは、場合によりエーテル、エステル、アミン又はアミド基に結合される；
又はこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１及びＱ２は、それぞれ、無、エステル、チオ−エステル、アミド［例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−］、カルバメート［例えば−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−］、尿素［−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−］、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル［−Ｏ−］、アミン、イミダゾール、トリアゾール、ジラクトン、ｐＨ−感受性部分、酸化還元感受性部分から独立して選択される切断可能な基；そのキレート化金属イオンを含む金属キレート剤；及びこれらの任意の組み合わせであり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して、無及び以下からなる基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｕ−、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換される；
ヌクレオシド、ヌクレオチド；イミダゾール、アジド、アセチレン；及びこれらの任意の組み合わせ、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合される；ｕは、１、２、３、４又は５の整数である；及びこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは無ではなく；Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のそれぞれは、場合によりＴで置換され；Ｔは、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７−１，２−ジチオシクロアルキル（１，２−ジチオシクロ−ペンタン、１，２−ジチオシクロ−ヘキサン、１，２−ジチオシクロ−ヘプタン）；γ−ラクタム（５原子アミド環）、δ−ラクタム（６原子アミド環）又はε−ラクタム（７原子アミド環）；γ−ブチロラクトン（５原子エステル環）、δ−バレロラクトン（６原子エステル環）又はε−カプロラクトン（７原子エステル環）から選択されるイニシエータ基であり；イニシエータ基のそれぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；Ｂ、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは、式（Ｉ）に定義した薬物にコンジュゲートされている。）
【００２３】
本発明の一実施形態において、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも２つが無ではないことを提供する；
本発明の一実施形態において、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも３つが無ではないことを提供する；
【００２４】
本発明の一実施形態において、一般式（Ｉ）によるコンジュゲートを提供し、ここでＥ、Ｅ’又はＥ”の少なくとも１つは、式（ＶＩＩＩｇ）又は式（ＩＸｃ）に示す構造を有する：
【化５】
2018523680.tif 000007
【００２５】
【化６】
2018523680.tif 000008
式中、Ｌ３及びＤはそれぞれ、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；
【００２６】
【化７】
2018523680.tif 000009
式（ＩＸｃ）；ａ＝１、ｋ＝１の場合；この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇと指定される。
（式（ＶＩＩＩｇ）又は式（ＸＩｃ）、及び式（ＩＸｃ）に示す構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）；式中、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物であり；Ｌ３は、無及びＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５又はＣ６アルキレンから選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態は、インビトロ又はインビボのいずれかで、薬物生物学的膜を横切って薬物を細胞内に送達する方法に関し、該方法は、細胞を本明細書に記載のコンジュゲートと接触させることを含む。
【００２８】
別の実施形態は、必要とする患者における医学的障害の処置方法に関し；該方法は、治療的に効率的な量の、本明細書に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、医学、例えば、ヒト又は獣医学における使用のための、本明細書に記載のコンジュゲートに関する。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする患者における医学的障害の処置のための、本明細書に記載のコンジュゲートの調製における、例えば式（ＩＩ）及び本明細書に示す部分Ｅ、Ｅ’又はＥ”の構造を含むＭＮＭ及び薬物の使用に関する。本発明の別の実施形態は、それを必要とする患者における医学的障害の処置のための医薬の調製における、本明細書に記載のコンジュゲートの使用に関する。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、医学的障害は癌である。
【００３２】
化合物のライブラリーの中からＩＭＥＦ−基質を選択する方法であって；前記方法は：
（ｉ）フロレチン（１００〜１０００μＭ）、及び／又は６−ＫＣ（１０〜１００μＭ）の存在下、細胞又はリポソームを、化合物のライブラリーからのＩＭＥＦ−基質であることが疑われる候補化合物とインキュベートすることと、
（ｉｉ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの存在下、候補化合物の膜を横切った細胞又はリポソーム中への取り込みレベルを測定することと；
（ｉｉｉ）フロレチン及び／又は６−ＫＣ（１０〜１００μＭ）の非存在下、細胞又はリポソームを候補化合物とインキュベートすることと；
（ｉｖ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの非存在下、候補化合物の膜を横切った細胞又はリポソーム中への取り込みレベルを測定することと；
（ｖ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの存在と非存在との間で、候補化合物の取り込みレベルを比較することであって；フロレチンの存在下の５０％を超える取り込みにおける増大；又は６−ＫＣの存在下の２倍を超える取り込みにおける増大は、候補化合物がＩＭＥＦ−基質であることを示す、比較することを含む。
【００３３】
特許又は特許出願ファイルは、着色された少なくとも１つ図面を含む。カラー図面を有するこの特許又は特許出願公開の複製は、要求により及び必要な料金の支払いにより会社から提供される。
【００３４】
以下、本発明は、本発明がより完全に理解できるように、特定の実施例及び実施形態に関連して、以下の例示的な図面を参照して非限定的に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の実施形態による化合物の推定上の作用メカニズム（ＭＯＡ）の基礎となる非対称極性の原理を概略的に示す；分子は、電気陰性の原子（１つ又は複数）、例えばフッ素原子（１つ又は複数）による陰極と、疎水性相互作用により隣接するリン脂質分子鎖と相互作用する炭化水素を含む陽極とを有する。結果として、分子は、全体として疎水性及び非荷電であるが、集中した個別の部分的負電荷を有する一方、対照的に、部分的正電荷が分散及び遮蔽されている。このことは、膜表面から膜中心への分子の移動をもたらす。
【図１Ｂ】図１Ｂは、式（ＩＸｂ）による化合物により例示される本発明の分子の構造的モチーフを概略的に示し；式中、Ｑ１は−Ｓ−Ｓ−であり；Ｑ２は無であり；ａ＝６；ｂ＝８；ステロイド部分はリトコール酸の残基である。
【図２Ａ】図２は、本発明の実施形態によるコンジュゲートの推定上のＭＯＡを概略的に示す：図２は、二極性膜電位に関連した内部膜電界によりエネルギーを与えられる「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＭＮＭにより誘導される膜表面への巨大分子の付加の強制を示し、それによりリン脂質水和殻を乱し、リン脂質頭部基の側方移動を強制する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、その結果としてのコンジュゲート及びエンドサイトーシスのフリップフロップの誘発と、エンドソーム内へのコンジュゲートの移動を示す；最終的にエンドソーム膜の小葉状部分の間のコンジュゲートのフリップフロップがあり、小葉状部分間の濃度平衡を生成する；続いて、濃度勾配により、及び本明細書に記載のパフォーマンス向上部分（ＰＥＭ）により駆動されるエンドソーム膜から細胞質内へのコンジュゲートの移動がある。
【図３Ａ】図３は、ダイサー酵素を使用してＭＮＭを切断及び除去する、細胞質内のｓｉＲＮＡの捕捉に関するメカニズムを概略的に示す；図３Ａは、２つのＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭに結合したｓｉＲＮＡのダイサータンパク質上への結合を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、酵素媒介ＲＮＡ切断による１つのモーターの除去を示す。続いて、ヘリカーゼ／アルゴノートはＲＮＡ鎖を分離するように作用し、ガイド／センス鎖を解放してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と相互作用させて、遺伝子サイレンシングを発揮する一方、第２のＭＮＭが尚付着しているパッセンジャー鎖は、分解されることになる。
【図４】図４は、タンパク質（例えば限定することなくＣａｓ９）及び式（Ｉ）に示すようなＥ、Ｅ’、Ｅ”部分を含む、本発明のコンジュゲートの例示的構造を示す。
【図５Ａ】図５は、式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩａ）；それぞれＡｐｏ−Ｓｉ−１１又はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４のいずれかの構造を有する本発明のＭＮＭを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートのインビトロでの生物学的パフォーマンスを例示する。３Ｔ３−細胞：図５Ａは、インビトロでのＥＧＦＰタンパク質を発現している３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞）の生物学的膜を横切った２９−ｍｅｒ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むコンジュゲートの送達の蛍光顕微鏡法を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ドットプロットとして示す、図５Ａに記載した送達のフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）による定量化を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、インキュベーションの２４時間後の、図５Ａに記載した送達のＥＬＩＳＡリーダーを使用した定量化を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、インビトロでのＥＧＦＰタンパク質を発現している３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞）の生物学的膜を横切った５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含むコンジュゲートの送達の蛍光顕微鏡法を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）による図５Ｄに記載した送達の定量化を示す：（ｉ）ドットプロットは事象の百分率を表し；（ｉｉ）ヒストグラムは用量反応を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、本発明の作用のメカニズムに関する、エンドソームコンパートメント内への、図５Ｄに記載した送達を示す共焦点顕微鏡法を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、Ａｐｏ−Ｓｉコンジュゲートは、細胞膜を通した効率的な取り込みと、細胞内での蓄積を示す。
【図６Ａ】図６は、式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩａ）；それぞれＡｐｏ−Ｓｉ−１１又はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４のいずれかの構造を有する本発明のＭＮＭを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートのインビトロでの生物学的パフォーマンスを例示する。マウスメラノーマＢ１６細胞：図６Ａは、インビトロでのＢ１６メラノーマ細胞の生物学的膜を横切ったＣｙ３フルオロフォア（赤色）で標識された５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを含む本発明のコンジュゲートの送達の蛍光顕微鏡法を示す：（Ｉ）（ＩＩ）明視野、細胞輪郭を描く；（ＩＩＩ）ＭＮＭを有さないＤＮＡからの蛍光シグナル；（ＩＶ）ＭＮＭを含むコンジュゲートからの蛍光シグナルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、フローサイトメトリー分析による図６Ａに記載した送達の定量化を示す（用量反応）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを含むコンジュゲートの、Ｂ１６細胞のエンドソームコンパートメント内への送達を示す、共焦点顕微鏡法により検出した図６Ａに記載した送達を示す。
【図７】図７は、式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩａ）；それぞれＡｐｏ−Ｓｉ−１１又はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４のいずれかの構造を有する本発明のＭＮＭを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートのインビトロでの生物学的パフォーマンスを例示する。マウスＣ２６結腸癌細胞：インビトロでのＣ２６細胞の生物学的膜を横切った、５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを含む本発明のコンジュゲートの送達のフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】図８は、式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩａ）；それぞれＡｐｏ−Ｓｉ−１１又はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４のいずれかの構造を有する本発明のＭＮＭを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートのインビトロでの生物学的パフォーマンスを例示する。ＨｅＬａ細胞：インビトロでのＨｅＬａ細胞の生物学的膜を横切った、５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを含む本発明のコンジュゲートの送達のフローサイトメトリー分析；用量反応を示す。
【図９Ａ】図９は、式（ＶＩＩ）又は式（ＶＩＩａ）；それぞれＡｐｏ−Ｓｉ−１１又はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４のいずれかの構造を有する本発明のＭＮＭを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートのインビトロでの生物学的パフォーマンスを例示する。図９は、ＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させるよう特別に設計されたそれぞれのｓｉＲＮＡであり、２つのＭＮＭ（それぞれは式（ＶＩＩＩｂ）に示す構造；即ち、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗを有する）に結合した、本発明のコンジュゲートによる、ヒトＨｅＬａ細胞インビトロにおいて発揮された遺伝子サイレンシング（ＥＧＦＰ遺伝子）を記載する（平均＋ＳＥＭ）。
【図９Ｂ】図９は、ＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させるよう特別に設計されたそれぞれのｓｉＲＮＡであり、２つのＭＮＭ（それぞれは式（ＶＩＩＩｂ）に示す構造；即ち、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗを有する）に結合した、本発明のコンジュゲートによる、ヒトＨｅＬａ細胞インビトロにおいて発揮された遺伝子サイレンシング（ＥＧＦＰ遺伝子）を記載する（平均＋ＳＥＭ）。
【図９Ｃ】図９は、ＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させるよう特別に設計されたそれぞれのｓｉＲＮＡであり、２つのＭＮＭ（それぞれは式（ＶＩＩＩｂ）に示す構造；即ち、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗを有する）に結合した、本発明のコンジュゲートによる、ヒトＨｅＬａ細胞インビトロにおいて発揮された遺伝子サイレンシング（ＥＧＦＰ遺伝子）を記載する（平均＋ＳＥＭ）。
【図９Ｄ】図９は、ＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させるよう特別に設計されたそれぞれのｓｉＲＮＡであり、２つのＭＮＭ（それぞれは式（ＶＩＩＩｂ）に示す構造；即ち、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗを有する）に結合した、本発明のコンジュゲートによる、ヒトＨｅＬａ細胞インビトロにおいて発揮された遺伝子サイレンシング（ＥＧＦＰ遺伝子）を記載する（平均＋ＳＥＭ）。
【図１０Ａ】図１０は、式（ＸＶＩ）による化合物の作用（ＭＯＡ）のメカニズムを例示し：図１０Ａは、細胞外空間内の無傷コンジュゲートを表す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、還元的細胞質環境におけるジスルフィド結合の切断を表す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ｐｋａ−依存性プロセスにおけるチオールのチオレートへの脱プロトン化を表す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、アミド基のカルボニル部分へのチオレート求核攻撃を表す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、四面体の中間体の生成を表す。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、その結果としてのコンジュゲートの切断と、チオ−エステルの生成を表す。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、続く加水分解を表す。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、身体から（ｆｏｒｍ）の分泌中の、細胞外空間の酸化環境内での閉環及びジスルフィド形成を表す。
【図１１Ａ】図１１は、式（ＸＶＩ）による化合物の作用（ＭＯＡ）のメカニズムを例示し：図１１Ａは、細胞外空間内の無傷コンジュゲートを表す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、還元的細胞質環境におけるジスルフィド結合の切断を表す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｐｋａ−依存性プロセスにおけるチオールのチオレートへの脱プロトン化を表す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、アミド基のカルボニル部分へのチオレート求核攻撃を表す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、四面体の中間体の生成を表す。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、その結果としてのコンジュゲートの切断と、チオ−エステルの生成を表す。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、続く加水分解を表す。
【図１１Ｈ】図１１Ｈは、身体から（ｆｏｒｍ）の分泌中の、細胞外空間の酸化環境内での閉環及びジスルフィド形成を表す。
【図１２】図１２は、ＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させるよう特別に設計されたそれぞれのｓｉＲＮＡであり、ヒストンＨ２Ａとの非共有結合複合体において２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４  ＭＮＭに結合した、本発明のコンジュゲートによる、ＥＧＦＰ遺伝子を発現している遺伝子導入マウスの肝細胞の一次培養物において発揮された遺伝子サイレンシングを記載する（平均＋ＳＥＭ）。
【図１３Ａ】図１３は、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−１と指定される式（ＶＩＩ）による化合物の作用（ＭＯＡ）のメカニズムを例示し；ここで：図１３Ａは、細胞外空間内の無傷コンジュゲートを表す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、還元的細胞質環境内でのジスルフィド結合の切断を表す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ｐｋａ−依存性プロセスにおけるチオレートへのチオールの脱プロトン化を表す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、アミド基のカルボニル部分上のチオレートの求核攻撃を表す。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、四面体の中間体の生成を表す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、その結果としてのコンジュゲートの切断と、チオエステルの生成を表す。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、ＣＯ２の解放も伴う続く加水分解を表す。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、身体からのＭＮＭの分泌中、細胞外空間の酸化環境に遭遇したジスルフィド基の形成による閉環を表す。
【図１４Ａ】図１４は、分子動的（ＭＤ）試験における本発明のＥ部分のリン脂質膜との相互作用を示す；図１４Ａは、式（ＶＩＩ）による化合物、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−１と指定を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、式（ＶＩＩ）による化合物、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２と指定を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、式（ＩＸｂ）による、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される化合物を示す）。
【図１５Ａ】図１５は、コンピュータ化分子シミュレーション試験により、動的プロトン化の原理を示す。ＭＮＭの第３級アミンのプロトン化状態に依存して（ｐｅｎｄｉｎｇ  ｏｎ）、分子の水溶性形態（第３級窒素がプロトン化し（正に荷電）、結果として血液血漿又は細胞質内で移動することが可能である）；及び水不溶性形態（窒素が非荷電状態にあり、したがって細胞膜環境内で移動することが可能である）の両方が提供される。インビボでのこれらの２つの形態の協奏的分布は、身体内でコンジュゲートの不可欠の（ｉｎｔｅｇｒａｌ）大量の分布をもたらし得る。図１５Ａは、膜から排除された、本発明の分子のプロトン化された、正に荷電した形態を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、区分化し、リン脂質膜のコア内に移動する分子の疎水性の非プロトン化形態を示す。
【図１６】図１６は、インビトロでの、ＭＮＭの１つが除去された、ダイサー酵素により行った式（ＶＩＩＩｂ、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗ）による本発明のコンジュゲートの切断の証拠を提供するゲル電気泳動を示す。
【図１７】図１７は、各鎖の５’末端において本発明のＥ、Ｅ’又はＥ”にコンジュゲートされたそれぞれのｓｉＲＮＡ二重鎖を含む、本発明のコンジュゲートによるＳ１６細胞内のＰＭＰ２２遺伝子のサイレンシングを示す。本発明のＥ、Ｅ’又はＥ”のそれぞれは式（ＩＸｂ）（式中、ａ＝３、ｂ＝０、ｋ＝１）に示す構造を有する。この部分は、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される。未処理細胞、及びＥＧＦＰに対抗する（ＰＭＰ２２に対抗しない）ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、対照とし手の役割を果たした。図示するように、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭコンジュゲートは、用量依存的に、ＰＭＰ２２遺伝子の発現レベルを効果的にノックダウン（発現停止）し、未処理細胞と比較して、用量４００ｎＭで５７％サイレンシングが観察され、６００ｎＭ用量で６６％に上昇した。
【図１８Ａ】図１８は、式（ＶＩＩａ）（式中、ａ＝２、及びｋ＝１、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定）による本発明のコンジュゲートの膜貫通送達と；二極性膜電位／内部膜電界（ＩＭＥＦ）との直接的な関連性を示す。図１８Ａは、フロレチン；フローサイトメトリー分析：フロレチンとの細胞のプレインキュベーションを示す。Ｃｙ３蛍光により評価して、二極性膜電位を低下させ、細胞によるＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４コンジュゲートの取り込みの顕著な低下をもたらす。視野当たりの細胞数の計数は、観察効果がそれぞれの細胞数の違いによることを除外した。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、６−ケト−コレスタノール（６−ＫＣ）；蛍光顕微鏡法：６−ＫＣとの細胞のプレインキュベーションを示す。二極性膜電位を増大させ、細胞によるＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４コンジュゲートの取り込みの著しい増加をもたらす。視野当たりの細胞数の計数は、観察効果がそれぞれの細胞数の違いによることを除外した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、とりわけ、医学、生物学又は農学等の様々な分野に適用される、二極性膜電位に関連した最近発見された内部膜電界（ＩＭＥＦ）の新規かつ革新的な利用に焦点を当てる。
【００３７】
重大な態様において、本発明は、ＩＭＥＦ−基質を提示し、これは、薬物へのそのコンジュゲート後、ＩＭＥＦ／二極性膜電位に依存する方法での、生物学的リン脂質膜を横切る細胞内への薬物の向上及び改善された送達を伴う化学的部分である。
【００３８】
フロレチンは、ＩＭＥＦを低下させるよう作用し、したがって二極性膜電位／ＩＭＥＦ上の特定の化合物の移動の依存を評価することができる化学的化合物である。したがって、本発明の実際的な目的のため、ＩＭＥＦ−基質は、フロレチンの存在下、細胞膜を横切った送達において、フロレチンの非存在下での送達と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を超える低下を示す化学的化合物である。
【００３９】
本発明の一実施形態において、ＩＭＥＦ−基質は、新規な、合理的に設計された「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」であり、これは生物学的膜を横切った薬物の送達のためにＩＭＥＦを利用し得る。この目的のために、ＭＮＭはＩＭＥＦの静電気エネルギーを運動エネルギーに変換してもよく、該エネルギーを、リン脂質膜を含む生物学的バリアを横切った巨大分子薬物等の化学的化合物の送達において存在する、度々巨大なエネルギーバリアを克服するために使用する。
【００４０】
別の態様において、式（Ｉ）〜（ＸＩｄ）による部分を含むコンジュゲートの生物学的膜を介した取り込みは、それぞれ内部膜電界の薬理学的シャットダウン（例えばフロレチン１００〜１０００μＭによる）又はターンオン（例えば６−ケト−コレスタノール１０〜１００μＭによる）により劇的に阻害又は増大され得るという本発明者らの発見に基づく。このことは、式（Ｉ）〜（ＸＩｄ）による本発明のコンジュゲートの取り込みの、二極性膜電位に関連した内部膜電界に対する直接的な依存を示し、したがって全てのこれらの式（Ｉ）〜（ＸＩｄ）による化合物を、ＩＭＥＦ−基質として定義する。
【００４１】
ＭＮＭにより送達されるべき薬物は、小分子薬物又はペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチド（例えば一本鎖又は二本鎖、ＲＮＡ又はＤＮＡ）等の巨大分子のいずれかであり得る。本発明の一実施形態において、送達されるべき巨大分子は、遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡ鎖、即ち、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）としての役割を果たすよう設計されているＤＮＡ配列を含む。
【００４２】
本発明の実施形態は、生物学的膜を横切った細胞質内への、又は血液脳関門（ＢＢＢ）、血液眼関門（ＢＯＢ）又は血液胎盤関門（胎盤血液関門）等の生物学的バリアを通した、薬物のための送達系を含む新規なコンジュゲートに関する。
【００４３】
本発明の実施形態による化合物は、二極性膜電位に関連した静電気エネルギーを動的エネルギーに変換するよう合理的に設計された新規な「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」を含み、これは非常に大きいエネルギーバリアを克服するよう使用され、リン脂質膜等の生物学的バリアを横切って巨大分子薬物等の化学的化合物を送達するために存在する。中でも、そのような使用は、カーゴ薬物に結合されたＭＮＭが、二極性膜電位により生成された内部膜電場（ＩＭＥＦ）を利用して、リン脂質膜中において、膜／水界面から膜中心へ移動することを含み得る。薬物に付着された際、送達系は薬物を膜中心に向かって移動し、それによりその膜貫通移動を補助する。中でも、この送達系は治療的巨大分子：タンパク質又はオリゴヌクレオチドの送達のために設計され、後者は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。中でも、送達系は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、又は、例えば限定することなくＣａｓ９タンパク質又は抗体等の治療的タンパク質の送達のために設計されている。
【００４４】
非限定に提案して、本発明の実施形態によるＭＮＭの構造の根底にある主要な原理の１つは、「非対称極性」の原理である。この原理は、本発明の発明者らによって、潜在的に大きい及び荷電した分子を、リン脂質膜のコア内で、膜表面から膜中心へ移動することを可能にするツールとして開発された；この移動は、膜内電場によってエネルギーを与えられて、関連エネルギーバリアを克服する。本発明は、この「非対称極性」の原理を、特定の分子構造に結び付けることに関する。したがって、これらの分子構造は、二極性膜電位に関連した静電ポテンシャルエネルギーを、膜コア内で移動する分子の動的エネルギーに変換することを意図している。構造的に、これらの分子は本発明者らによって、それらのｌｏｇＰが生物学的膜内へ分配可能であることに従って、疎水性及び非荷電であるよう合理的に設計された［例えば限定することなく、ｌｏｇＰ値＞１を有する（図１Ａ参照）］。更に、「非対称極性」の原理の重要な要素は、これらの分子が極性であり、それらの部分電荷が不均一に分布し：部分負電荷は高く集中し局在化する一方、部分正電荷は分子中の炭化水素鎖に沿って分散していることである。リン脂質膜との相互作用後、これらの部分的な正電荷も、分子の炭化水素鎖と隣接するリン脂質環境の炭化水素鎖との間で起こるロンドンタイプ疎水性相互作用を介して遮蔽される（ロンドン分散力）。これらの「非対称極性」の特徴（それによれば、分子は疎水性であるが極性であり、集中した部分的負電荷を有すると共に、それぞれの部分的正電荷が分散され及び遮蔽されている）は、分子が正式な負電荷を保有するが如く、図１Ａに示すように、疎水性膜環境内での分子の移動を生成する。内部膜電場は、膜／水界面において陰極、及び膜中心において陽極を有するため、本発明の分子は、したがって、膜中心に向かって移動し、カーゴ薬物（例えばｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、治療的タンパク質、抗体又は他の医薬等の薬物）に付着した場合、カーゴ薬物も膜コアへとこの方向に牽引される。結果として、この移動はカーゴ分子の膜貫通移動をいくつかの方法で促進し得る。中でも、この移動は荷電した巨大分子のリン脂質頭部基（ＰＬＨＧ）への付加を強要し、ＰＬＨＧの周りの水和殻を乱し、かくしてＰＬＨＧの側方移動を強制し得る。この局所的な膜不安定性は、エンドサイトーシス、及び膜リン脂質のフリップフロップを誘発し得、これらは両方ともカーゴ薬物を細胞内に導く（図２）。
【００４５】
本発明のコンジュゲートは、パフォーマンス向上部分（ＰＥＭ）も含み得る。そのような部分は、細胞内のその標的部位において、薬物又はその関連活性部分の濃度を向上させるように作用し得る化学的基又はメカニズムである。
【００４６】
そのようなパフォーマンス向上の手法（ＰＥＭ）の１つは、本発明のコンジュゲートの構造内に組み込まれた切断可能な基［Ｑ１及びＱ２部分、式（Ｉ）に定義した］に関する。本発明の文脈における用語「切断可能な基」は、例えば細胞内のｐＨの変化、酸化還元状態の変化又は他の変化等の特定の生理学的条件下で自発的又は酵素媒介切断を経ることが可能な化学的部分に関連する。切断可能な基の例は、ジスルフィド、ジラクトン、エステル、チオ−エステル、アミド、カルバメート、ｐＨ−感受性部分又は酸化還元感受性部分である。これらの部位での本発明のコンジュゲートの切断は、標的細胞の細胞質中のカーゴ薬物（例えば高く負に荷電したｓｉＲＮＡ又はＡＳＯ又は他の医薬）を捕捉するよう作用し得る。加えて、その切断に起因するコンジュゲート連続消費も、血漿又はエンドソーム膜を横切るコンジュゲートの濃度勾配を維持するのを補助し得る。本発明の範囲内に含まれる切断可能な基に基づくＰＥＭｓは特に、限定することなく、ジスルフィド、カルバメート及びジラクトンである。
【００４７】
本発明の範囲内の別のパフォーマンス向上部分（ＰＥＭ）は、コンジュゲートの投与に関し、ここでＤは二本鎖ＲＮＡであり、これはダイサー酵素に対する基質である。そのようなコンジュゲートは、一般に、遺伝暗号に従って及び特定の標的遺伝子のサイレンシングに好適なように選択される２３〜３０−ｍｅｒ  ｄｓＲＮＡを含む。ダイサーは、二本鎖ＲＮＡを特定の部位にて切断し、２１〜２３−ｍｅｒ二本鎖ＲＮＡセグメントを生成することが可能な唯一の独特なヌクレアーゼであり、遺伝子サイレンシングのためにＲＩＳＣ複合体と容易に相互作用する。この手法によれば、１つ又は数個のＭＮＭがそのようなオリゴヌクレオチド薬物に、好ましくはセンス（「パッセンジャー」）鎖の３’末端及び／又は５’末端、及び／又はアンチセンス（「ガイド」）鎖の５’末端にて結合し得る。コンジュゲートの投与後、ＭＮＭは巨大分子薬物の膜貫通送達を可能にするであろう。続く細胞質中のダイサー酵素によるｄｓＲＮＡの切断により、次いでガイド鎖（ｓｔａｎｄ）の５’末端にてＭＮＭ（１つ又は複数）が除去され、かくしてｓｉＲＮＡを送達系から解放するであろう。ｓｉＲＮＡは、その多数の負電荷に起因して、したがって最終的に細胞質中に捕捉され、ここでｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体と相互作用し、標的遺伝子のサイレンシングをもたらす。細胞内捕捉のダイサー仲介メカニズムは、図３に概略的に示される。
【００４８】
重要なことには、本発明は、「動的プロトン化」の概念に基づいた他の革新的なパフォーマンス向上手法にも関する。この概念は、７．０〜８．５の範囲のｐＫａ値を有する塩基性基（例えばアミン）を分子構造内に導入することに基づく。この手法は、塩基性分子では、界面ｐＨはバルク内のｐＨよりも約１ｐＨ単位低いことが既知であり、ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式を考慮すると、この特徴は、分子の２つの集団を生じる：１つは、プロトン化され、その結果として、親水性であり、及び血漿又は細胞質等の水性環境に可溶性である；及び第２の分子集団は、疎水性の非プロトン化分子であり、細胞及びエンドソーム膜との分子の相互作用をもたらすという事実を利用する。したがって、本発明のコンジュゲートに利用される動的プロトン化原理は、本発明のコンジュゲートが「二面性」の特徴を有することを可能にし、親水性及び疎水性環境の両方で移動可能であり、したがって、細胞質細胞膜を通した進入と、エンドソームコンパートメントからの細胞質中への逃避により、最終的に身体の全体においてコンジュゲートの大量の分布をもたらし、このことは全身遺伝子送達に効果的な系に所望される（実施例１７、図１５）。本発明はそれぞれＥ、Ｅ’又はＥ”を含み、これらは、「動的プロトン化部分を含む部分であり、動的プロトン化部分は、（ｉ）ＭＮＭの陰極と陽極との間に位置するアミン基；及び（ｉｉ）そのｐＫａ値を７．０〜８．５ｐＨ単位範囲に設定するよう作用する、アミン部分に隣接する電子吸引基を含む。そのような隣接する電子吸引基の例は、カルボニル、エーテル、エステル又はフッ化炭素基である。
【００４９】
本発明の文脈における用語「イニシエータ基」は、自発的又は酵素媒介化学的反応を経た際、隣接する化学的結合の切断を開始する化学的基に関する。本発明のより特定の実施形態において、イニシエータ基は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６−１，２−ジチオシクロアルキル（１，２−ジチオシクロブタン；１，２−ジチオシクロペンタン；１，２−ジチオシクロヘキサン；１，２−ジチオシクロヘプタン）；γ−ラクタム（５原子アミド環）、δ−ラクタム（６原子アミド環）又はε−ラクタム（７原子アミド環）；γ−ブチロラクトン（５原子エステル環）、δ−バレロラクトン（６原子エステル環）又はε−カプロラクトン（７原子エステル環）から選択される。
【００５０】
本発明の文脈における用語「活性化エステル」は、良好な脱離基を含むため、アミンと相互作用してアミドを形成することが可能なカルボン酸の誘導体に関する。カルボン酸に関するそのような活性化剤の例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。
【００５１】
本発明の文脈における用語「金属キレート剤」は、配位を介して金属イオンを捕捉する化学的部分に関し、配位原子は、窒素、硫黄又は酸素原子から選択される。好ましい実施形態では、キレート化イオン（１つ又は複数）は、キレート化部分の窒素及び酸素原子により配位されているカルシウム（Ｃａ２＋）である。他の好ましい実施形態では、金属キレート剤は、Ｍｇ２＋等の他のイオンよりもＣａ２＋に対する有利な選択性を示すＢＡＰＴＡ［１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸］、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）又はそれらの類似体である。このようなキレート剤は、カーゴ薬物からのＭＮＭの潜在的な解放並びに細胞質内の標的薬物の捕捉及び蓄積のために、細胞外空間との間のＣａ２＋の相当の濃度勾配を利用することが可能であり得る。
【００５２】
本発明の文脈における用語ヘテロアルキル、ヘテロアルキレン又はヘテロアリール」は、原子の少なくとも１つが窒素、酸素又は硫黄原子又はこれらの任意の組み合わせで置き換えられている、それぞれの炭化水素構造に関する。
【００５３】
本発明の実施形態の１つによれば、「カーゴ」又は「カーゴ薬物」は、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、治療的タンパク質又は細胞膜を横切る及び細胞内に送達されるべき任意の他の医薬である。前記細胞は、生きた動物又はヒト対象の身体内の細胞培養物のいずれかであり得、前記送達は、有益な治療的効果を与えることを目的とし得る。
【００５４】
本発明の文脈における用語「前駆体」は、本発明の実施形態によるコンジュゲートの合成に使用される化学的部分に関する。前駆体は、合成の様々な段階で、例えば限定することなく、巨大分子の付着中、例えば本発明のＭＮＭへのオリゴヌクレオチドの付着中等、コンジュゲートの合成中に除去されることになる化学的基を含む。
【００５５】
細胞内標的（ＰＤＩＴ）用のタンパク質薬物の分野は、比較的新規な分野であり、ヒトゲノム解読計画の完成に部分的に由来し、このゲノム解読計画は、タンパク質薬物の投与、遺伝子サイレンシング、ＲＮＡ又はＤＮＡ編集又はタンパク質補充療法による潜在的な医療介入のための膨大な数の新規な細胞内標的の特定を可能にする。概念的に、そのような治療的戦略は、殆ど全ての医学的障害の処置に有用であり得る。ＰＤＩＴ分野の特定の、非常に魅力的な候補タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）−関連タンパク質、及び詳細には、Ｃａｓ９タンパク質である。実際には、Ｃａｓ９は任意のＲＮＡ配列を負荷することができ、タンパク質をゲノム内の任意の位置に特に指向させる特異性を伴い、変異した欠陥遺伝子に対するその潜在的な関連性に従って合理的に選択される。次いで、Ｃａｓ９は、ＤＮＡの正確な二本鎖切断を誘導する。次いで、天然に存在するＤＮＡ修復メカニズムが続いて動員されて、機能不全遺伝子内の前記ＤＮＡ位置修復し得る。したがって、Ｃａｓ９及び関連タンパク質は、非常に効果的な遺伝子編集（特定の遺伝子の配列の追加、中断又は変更）並びに遺伝子調節及び修復が可能である、生命体の系図全体にわたって種に適用可能である。したがって、Ｃａｓ９タンパク質及び適切なガイドＲＮＡを細胞内に送達することにより、器官のゲノムは任意の所望の位置で切断され、編集及び修復に供されることができる。
【００５６】
下記に例示するように（実施例４）、本発明の実施形態は、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集の役割を潜在的に有するＣａｓ９タンパク質に結合された１つ以上の「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」を含む。本発明の別の実施形態は、補充療法として投与される治療的タンパク質に関する。そのような補充療法は、その欠損又は変異に起因した、低下されたレベルの生理学的に重要なタンパク質に関連した疾病の処置に必要であり得る。このような場合、それぞれのタンパク質は、薬物として体外から送達され得る。タンパク質は荷電した巨大分子であるため、多くの場合、本発明のＭＮＭ等の送達系にコンジュゲートされない限り膜貫通送達が不可能である。
【００５７】
本発明の実施形態によるＭＮＭは、一般に疎水性［例えば、限定することなく、オクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ）＞１を有する］の、双極性の非荷電化学的部分であり、非対称極性の原理（上記に説明した）に従って設計される。論じたように、ＭＮＭ（即ち、疎水性であり、全体として全中性電荷であるが、極性であり、集中された部分的負電荷及び分散された部分的正電荷を有する、この特徴の唯一の独特な組は、内部膜電場内に置かれた際、膜／水界面から膜中心へのリン脂質環境内の分子の移動を伴う、唯一の独特なベクトル系を構成する。薬物に付着された際、この分子はそれぞれ薬物を膜コアへ牽引する。
【００５８】
図１Ｂに概略的に示すように、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、一般に、Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分［例えば、式（ＶＩＩ〜ＸＩａ）のいずれかによる部分により示される］である上述した「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」を含む。「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」は、以下の構造的モチーフを含む疎水性部分（オクタノール／水分配係数＞１）である：
【００５９】
（ｉ）陰極（部分Ｅ、Ｅ’又はＥ”の基Ａ）、一般に、空間内に集中的に球状（又はほぼ球状）配置にて配置され得るハロゲン［例えば、フッ素原子（１つ又は複数）］又は酸素から選択される少なくとも１つ電気陰性の原子を含む。それらの原子の電子吸引性、及び空間内のそれらの構造的配置に起因して、コンジュゲートの陰極は、電子に富んだ焦点である。好ましい実施形態では、Ａは、ノナ−フルオロ−ｔｅｒｔブタノールの残基である。
【００６０】
（ｉｉ）陽極（部分Ｅ、Ｅ’又はＥ”の基Ｂ）、リン脂質膜中に置かれた際、好ましくは、線状、分枝状若しくは環状鎖又はこれらの組み合わせの脂肪族又は芳香族構造としての配置を介して、隣接する炭化水素鎖との最大の相互作用を可能にするように配置され得る、炭素、ケイ素、ホウ素、リン及び硫黄から選択される比較的陽性の原子を含む。本発明の一実施形態において、陽極は、線状の飽和炭化水素鎖、又はコレステロール、胆汁酸、エストラジオール、エストリオール若しくは誘導体等のステロイド部分、又はこれらの組み合わせを含む。場合により、本発明のコンジュゲートは、式（Ｉ〜ＸＩｄ）のいずれかにより例示される、いくつかの陰極及び／又はいくつかの陽極構造的モチーフ、例えば、炭化水素鎖により分離された、連続して配置されたペルフルオロ−及び酸素−モチーフを含んでもよい。
【００６１】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、「分子ナノモーター（ＭＮＭ）」及び薬物Ｄに加えて、更に本発明の特定の式に記載するように、１つ以上のリンカー（Ｌ）及び切断可能な基（Ｑ）も含み得る。分子ナノモーターＥ、Ｅ’又はＥ”に対する薬物Ｄの結合は、直接又は部分Ｌ若しくはＱを介してであり得る；前記結合は、共有結合又は静電気若しくは配位結合等の非共有結合を介してであり得る。
【００６２】
上記に加えて、本発明のＭＮＭは、活性薬物に加えて医薬組成物の一部として使用してもよい。ＭＮＭにより提供される膜相互作用の向上により、活性薬物のパフォーマンスは、効力又は安全性等の点で、ＭＮＭの包含により改善され得る。
【００６３】
本発明の実施形態は更に、本発明によるコンジュゲートの使用に関し、該使用は、それを必要とする対象における医学的障害の処置のための、治療的に有用な薬物、例えばタンパク質又はオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ又はＡＳＯ）を含む。医学的障害は、特定のタンパク質（１つ又は複数）が疾病の病因又は病態形成のいずれかに役割を果たし、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスメカニズムを介したそれぞれの遺伝子（１つ又は複数）の発現の調節、又は、治療的タンパク質若しくは抗体による又はタンパク質補充療法によるそれぞれのタンパク質の活性の調節が、疾病関連プロセスの阻害又は疾病の処置に有益な効果を有し得る、非限定的に変性疾患、癌、外傷、毒性又は虚血発作、感染症又は免疫介在性疾患であってもよい。
【００６４】
例えば、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、アンチセンス療法として使用されてもよく、該療法は、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、又は、タンパク質への翻訳が起こるそれぞれのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合する一本鎖又は二本鎖核酸鎖（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は化学的類似体）を投与することを含む治療の形態である。この処置は、それぞれの遺伝子の発現を阻害するように作用し、それによりそれぞれのタンパク質の生成を防止することができる。代替的に、本発明のコンジュゲートは、Ｃａｓ９タンパク質等の治療的タンパク質を含んでもよい。
【００６５】
本発明の文脈における用語「薬物」又は「医薬」は、疾病に苦しむ患者に投与された際、患者に有益な効果を付与することができる化学的物質に関する。有益な効果は、症状の寛解、又は疾病プロセスにおいて役割を果たす薬剤又は物質の効果を弱めることであってもよい。薬物は、投与されて遺伝子発現を抑制する小分子、又はタンパク質又は一本又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ等の巨大分子であってもよい。中でも、薬物は、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯを含んでもよい。いくつかの実施形態では、薬物は、変性疾患、癌、虚血、感染、毒性発作又は免疫介在性疾患の処置を目的とする。
【００６６】
本発明による用語「生物学的膜」は、生物学的系に関連した任意のリン脂質膜を指す。そのようなリン脂質膜の例は、細胞の原形質膜、細胞間膜又は血液脳関門（ＢＢＢ）、血液網膜関門（ＢＯＢ）若しくは血液胎盤関門等の生物学的バリアである。
【００６７】
本発明の実施形態は、本発明の実施形態によるＭＮＭ、及び薬物を含むコンジュゲートを提供する。本発明の実施形態は更に、本明細書に記載するコンジュゲート、及び薬学的に許容され得る担体又は塩を含む医薬組成物を提供する。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする患者における医学的障害の処置における使用のための、本発明のコンジュゲート又は本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物を含む。更に、本発明の実施形態は、それを必要とする患者における医学的障害の処置のための医薬組成物の調製における本発明のコンジュゲートの使用を含む。いくつかの実施形態では、医学的障害は癌である。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、本発明のコンジュゲート及び医薬組成物は、臨床状況において、インビボで、補充タンパク質療法又は遺伝子療法、［例えば、限定することなくｓｉＲＮＡ又はアンチセンス療法（ＡＳＯ）］の効率的な送達及び効果的なパフォーマンスを達成するのに使用することができる。
【００７０】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、細胞膜を通した、又は、血液脳関門（ＢＢＢ）等の生物学的バリアを通したｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、治療的タンパク質又は抗体の送達を改善し、それにより例えば、効力、毒性又は薬物動態等の１つ以上の局面において、巨大分子薬物のパフォーマンスを改善するのに有利であり得る。
【００７１】
本発明の一実施形態において、薬物が、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ及び治療的タンパク質からなる群から選択される巨大分子であることを提供する。
【００７２】
本発明の一実施形態において、本発明のコンジュゲート、及び薬学的に許容され得る塩又は担体を提供する。
【００７３】
本発明の一実施形態において、生物学的細胞内への薬物の送達方法を提供し、前記細胞は、生きた動物又はヒト対象中にあり；本方法は、細胞を本発明のコンジュゲートと接触させることを含む。
【００７４】
本発明の一実施形態において、生物学的膜が細胞膜及び生物学的バリアからなる群から選択され、前記生物学的バリアが血液脳関門、血液眼関門又は血液胎盤関門から選択される、方法を提供する。
【００７５】
上記にて非限定的な潜在的な作用メカニズム（ＭＯＡ）に記載したように、ＭＮＭ（１つ又は複数）にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ又は治療的タンパク質等の薬物を含む本発明の実施形態によるコンジュゲートは、リン脂質膜と相互作用した際、膜貫通送達を経る。この作用メカニズムは、図２に概略的にまとめられている。非対称極性の原理により、当初、ＭＮＭは内部膜電場によりエネルギーを与えられて膜表面から膜コアに移動する（図２Ａ）。第２の段階として（図２Ｂ）、ＭＮＭに結合した巨大分子が、膜表面に接近するよう強制され、そのためカーゴ巨大分子薬物及びリン脂質頭部基の両方の水和殻が乱される。結果として、リン脂質頭部基が側方に移動し、一過性の膜細孔が形成され、その細孔を通して巨大分子薬物が細胞内へ送達される。次いで、エネルギー的に好ましい、続く膜治癒を伴う一過性の細孔の閉鎖が起こる（図２Ｃ）。
【００７６】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
【化８】
2018523680.tif 000010
に示すような構造を有し、これは式（Ｉ）に示すような構造により表される化合物の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、及び該塩の溶媒和物及び水和物を含み、式中、Ｄは、生物学的膜を横切って送達されるべき薬物である。Ｄは、小分子薬物、ペプチド、タンパク質又は自然の又は修飾された、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯ等の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく；ｙ、ｚ及びｗは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６から選択される整数であり、整数が０の場合は常に、対応するＥ部分は無であることを意味し；ｙ、ｚ又はｗの少なくとも１つは、０とは異なる。一実施形態において、ｙ＝１、ｚ＝ｏ及びｗ＝０；別の実施形態では、ｙ＝１、ｚ＝１及びｗ＝０である。
【００７７】
Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、同一又は異なってもよく、それぞれは、一般式（ＩＩ）：
（Ａ）ａ−Ｂ−Ｌ１−Ｑ１−Ｌ２−Ｑ２−Ｌ３
式（ＩＩ）
に示すような構造を有し、式中、各Ａ部分は、独立して、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）：
【化９】
2018523680.tif 000011
に示すような構造から選択され、
Ｍは、無、−Ｏ−又は−ＣＨ２−から選択され；ｇ、ｈ及びｋは、それぞれ個々に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６から選択される整数であり；＊は、−Ｈ又はＢ若しくは他のＡ基への結合地点であり；ａは、１、２、３又は４から選択される整数であり；Ｑは、酸素又はアミンである。
【００７８】
Ｂ（上述した陽極）は、以下からなる１つ以上の基から選択され：線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又は場合によりエーテル、エステル又はアミド基に結合される；
１つ以上のステロイド部分（コレステロール、胆汁酸、エストロゲン、エストラジオール、エストリオール、リトコール酸又はそれらの任意の類似体等）；それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はそれぞれは、場合によりエーテル、エステル、アミン又はアミド基に結合される；及びこれらの任意の組み合わせ；
Ｑ１及びＱ２は、ぞれぞれ、独立して、無、エステル、チオ−エステル、アミド［例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−］、カルバメート［例えば−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−］、尿素［−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−］、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル［−Ｏ−］、アミン、イミダゾール、トリアゾール、ジラクトン、ｐＨ−感受性部分、酸化還元感受性部分；そのキレート化金属イオンを含む金属キレート剤；及びこれらの任意の組み合わせ；から選択される、場合により切断可能な基であり、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して、無及び以下からなる基から選択され：
線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４、アルキル又はヘテロ−アルキル、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
線状、環状又は分枝状Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アルキレン又はヘテロアルキレン、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３又はＣ１４アリール又はヘテロアリール、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合される；
−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｕ−、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換される；
ヌクレオシド、ヌクレオチド；イミダゾール、アジド、アセチレン；及びこれらの任意の組み合わせ、それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン、チオールで置換され；又はエーテル基に結合され；ｕは、１、２、３、４又は５の整数である。
【００７９】
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは、無ではなく、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のそれぞれは、場合によりＴ部分を含み；Ｔは、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６−１，２−ジチオシクロアルキル（１，２−ジチオシクロ−ブタン；１，２−ジチオシクロ−ペンタン；１，２−ジチオシクロヘキサン；１，２−ジチオシクロヘプタン）；γ−ラクタム（５原子アミド環）、δ−ラクタム（６原子アミド環）又はε−ラクタム（７原子アミド環）；γ−ブチロラクトン（５原子エステル環）、δ−バレロラクトン（６原子エステル環）又はε−カプロラクトン（７原子エステル環）から選択されるイニシエータ基であり；それぞれは、場合により１つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換され；又はエーテル基に結合され；
Ｂ、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも１つは、式（Ｉ）に規定されるように、薬物（Ｄ）にコンジュゲートされている。
【００８０】
本発明の一実施形態において、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも２つが無ではないことを提供する；
本発明の一実施形態において、Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の少なくとも３つが無ではないことを提供する；
【００８１】
分子の他の部分に対するＤの結合は、共有結合、静電気又は配位結合によるものであり得る。結合が共有結合の場合、結合はそれぞれエーテル、エステル、アミド、チオエステル、チオエーテル及びカルバメート基からなる群から選択されるＱ１又はＱ２部分を介したものであり得る。結合が配位結合の場合、結合は金属キレート剤であるＱ１又はＱ２基が関与し、結合はカルシウムイオン（１つ又は複数）の配位を含むことが好ましい。静電気結合の例は、Ｅ、Ｅ’又はＥ”の部分Ｌ１、Ｌ２又はＬ３のアミン基と、Ｄの負に荷電したホスフェート基との間の塩橋であり得る。Ｄがオリゴヌクレオチドの場合、結合は核酸塩基に対する、リボース部分（例えばリボースの２’、３’又は５’位置を介して）又はヌクレオチドのホスフェート部分に対するものであり得；結合は、オリゴヌクレオチド鎖の末端又は非末端ヌクレオチドのいずれかに対するものであり得；結合は、天然又は修飾されたヌクレオチドを介したものであり得る。Ｄがタンパク質の場合、分子の他の部分に対するその結合は、リシン、システイン、グルタメート又はアスパルテート等の、タンパク質のアミノ酸の側鎖（１つ又は複数）に対する結合を介したものであり得る。
【００８２】
本発明の文脈における用語「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含んでもよく、それぞれ１つ以上のヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖配列である。各ヌクレオチドは、窒素塩基（核酸塩基）、５炭素糖（リボース又はデオキシリボース）、及びホスフェート基を含む。核酸塩基は、プリン（アデニン、グアニン）及びピリミジン（チミン、シトシン、ウラシル）から選択される。加えて、この用語は、ヌクレオチドの修飾された形態も指し得、ここで修飾は分子の骨格（例えばホスホロチオエート、ペプチド核酸）におけるもの、又は核酸塩基（例えばＲＮＡのリボース基の２’位のメチル化、又はその部位のフッ素原子の付着）におけるものであってもよい。これらの修飾は、体液中でのオリゴヌクレオチドの改善された安定性又は改善された薬物動態等の特性を可能にし得る。したがって、そのような修飾されたオリゴ−ヌクレオチドの使用も本発明の範囲内に含まれる。
【００８３】
一実施形態において、インビトロ又はインビボのいずれかで適用可能な、遺伝子発現の特定の阻害方法を開示する。本方法は、本発明のコンジュゲート又は該コンジュゲートを含む医薬組成物の使用を含み、Ｄは、疾病の病因又は病態形成に役割を有する病原性タンパク質をコードする特定の遺伝子の発現を発現停止させるように設計されたｓｉＲＮＡ又はＡＳＯである。
【００８４】
したがって、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的障害の処置に使用され得る。したがって、本発明の実施形態は、必要とする患者に、治療的有効量の本発明の実施形態による医薬組成物を投与することを含む、治療方法を開示する。一実施形態において、投与される医薬組成物は、疾病関連タンパク質をコードする特定の遺伝子の発現の阻害に活性な、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００８５】
本発明の一実施形態において、Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分が一般式（ＶＩＩ）に示す構造、及び関連構造を有する一般式（Ｉ）によるコンジュゲートを提供し：
【化１０】
2018523680.tif 000012
Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｑ１、Ｑ２は、式（Ｉ）に関して記載したものと同じ意味を有し、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して、無、酸素、エステル、アミド又はアミン（第２級又は第３級アミン）基から選択され；ｋ及びｄは、それぞれ独立して無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である；（式（ＶＩＩ）に示す構造により表される化合物又は関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）。
【００８６】
本発明の一実施形態において、Ｒ又はＲ’は、それぞれ独立して、水素及びフッ素原子から選択される。
【００８７】
本発明の一実施形態において、エストラジオール部分は、他のステロイド残基で置換される。前記ステロイド残基は、コレステロール、リトコール酸、又は関連類似体であってもよい。
【００８８】
本発明の一実施形態において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ個々に、無及び線状、環状又は分枝状Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８炭化水素鎖から選択され、これらは場合によりエーテル又はアミン基に結合され；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、同一又は異なってもよい。
【００８９】
本発明の一実施形態において、Ｑ１又はＱ２は、アミド、エステル、エーテル、カルバメート又はジスルフィドから選択される部分である。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３は、Ｔ部分を含み、Ｔは、場合によりハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、フッ化炭素、アミン又はチオールで置換された１，２−ジチオシクロ−ブタンである。
【００９１】
より特定の実施形態において、本発明は一般式（Ｉ）又は式（ＶＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、式（ＶＩＩａ）に示す構造を有する：
【化１１】
2018523680.tif 000013
式中、ａ及びｋは、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５又は６の整数を表す；（式（ＶＩＩａ）に示す構造により表される化合物又は関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む。）
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、以下のコンジュゲートを提供する：
クラスＡ：Ｅ、Ｅ’又はＥ”が「動的プロトン化部分」を含む、式（Ｉ）、（ＶＩＩ）によるコンジュゲート：
本発明は、ＭＮＭを含む一般式（Ｉ）又は式（ＶＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、（ｉ）ＭＮＭの陰極と陽極の間に位置したアミン基；及び（ｉｉ）アミンｐＫａ値を７．０〜８．５ｐＨ単位範囲に設定する、アミン部分に隣接する電子吸引基からなる、上述した「動的プロトン化部分」を含み得る。そのような隣接する電子吸引基の例は、カルボニル、エーテル、エステル又はフッ化炭素部分／基である。これらのＥ、Ｅ’又はＥ”部分のそれぞれは、独立して式（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）又は（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）に示す構造を有し得る。（関連する薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）；式中、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物であり；Ｌ３は、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；ａ、ｋ、ｄは、適用可能な場合、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択される：
【化１２】
2018523680.tif 000014
【化１３】
2018523680.tif 000015
式（ＶＩＩＩｂ）；ａ＝２及びＬ３＝無の場合；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗと指定される。
【化１４】
2018523680.tif 000016
【化１５】
2018523680.tif 000017
【化１６】
2018523680.tif 000018
【化１７】
2018523680.tif 000019
【化１８】
2018523680.tif 000020
【化１９】
2018523680.tif 000021
【００９３】
クラスＢ：Ｅ、Ｅ’又はＥ”が切断可能なジスルフィド部分を含む、式（Ｉ）、（ＶＩＩ）によるコンジュゲート：
本発明は、一般式（Ｉ）又は式（ＶＩＩ）によるコンジュゲートも提供し、式中、Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、ジスルフィド部分である切断可能な基を含み得る。これらのＥ、Ｅ’又はＥ”部分は、それぞれ、式（ＩＸ）に示す構造、及び式（ＩＸａ）、式（ＩＸｂ）、式（ＩＸｃ）、式（ＩＸｄ）、式（Ｘｅ）、式（ＩＸｆ）、式（ＩＸｇ）、及び式（ＩＸｈ）による関連構造を有し得る：
【化２０】
2018523680.tif 000022
式中、Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、上記と同じ意味を有し；Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗ及びＧは、それぞれ独立して無、酸素、エステル、アミド又はアミン（第２級又は第３級アミン）基から選択され；ａ、ｂ、ｋ及びｄは、それぞれ独立して、無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である；（式（ＩＸ）に示す構造により表される化合物又は式（ＩＸａ）、式（ＩＸｂ）、式（ＩＸｃ）、式（ＩＸｄ）、式（Ｘｅ）、式（ＩＸｆ）、式（ＩＸｇ）及び式（ＩＸｈ）に示す構造を有する関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）：
【化２１】
2018523680.tif 000023
【化２２】
2018523680.tif 000024
式（ＩＸｂ）：ａ＝３、ｂ＝０及びｋ＝１の場合、この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される。
【化２３】
2018523680.tif 000025
式（ＩＸｃ）；ａ＝１、ｋ＝１の場合；この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇと指定される。
【００９４】
クラスＣ：切断可能なジスルフィド部分及び動的プロトン化部分の両方を含む、式（Ｉ）、（ＶＩＩ）、（ＩＸ）による構造：
式中、Ｌ３は、上記と同じ意味を有し；ｂ、ｄは、それぞれ独立して無、０、１、２、３、４、５又は６から選択される整数を表し；Ｒ’’’は、水素、メチル及びエチルからなる群から選択され；Ｅ、Ｅ’又はＥ”部分は、Ｄにコンジュゲートされ、Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である；
【化２４】
2018523680.tif 000026
【化２５】
2018523680.tif 000027
【化２６】
2018523680.tif 000028
【化２７】
2018523680.tif 000029
【化２８】
2018523680.tif 000030
【００９５】
クラスＤ：Ｅ、Ｅ’又はＥ”が環状ジスルフィド部分及びカルバメート部分を含む、式（Ｉ）、（ＶＩＩ）、（Ｘ）によるコンジュゲート：
本発明は、式（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）又は（Ｘｃ）による、Ｅ、Ｅ’又はＥ”が、カルバメート基を含んでもよく、切断可能なジスルフィド部分が環状構造内にある、一般式（Ｘ）によるコンジュゲート；及びジスルフィドがその酸化又は還元された（開環）形態のいずれかであり得る関連構造も提供する：
【化２９】
2018523680.tif 000031
式中、ａ、ｄ、ｋ、ｄは、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５、６からなる群から選択される整数を表し；ｈは、１、２、３又は４の整数であり；Ｚは、水素、フッ素、ヒドロキシル及びアミン基から選択され；Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｌ３は、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有し；Ｇは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、メトキシ基、及びフッ化炭素基からなる群から選択され；Ｗは、酸素、アミド、エステル及びアミン（第２級又は第３級アミン）から選択され；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である；（式（Ｘ）に示す構造により表される化合物又は式（ＩＸａ）、式（ＩＸｂ）、式（Ｘａ）、式（Ｘｂ）、式（Ｘｃ）に示す構造を有する関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）：
【００９６】
本発明の一実施形態において、ｋ＝１、及びｈ＝１である。本発明の一実施形態において、少なくともＲ’のＲ上はフッ素原子であり、他は水素原子である。
【００９７】
環状ジスルフィド部分を含み、したがって式（Ｘ）に関連する本発明の構造は、以下である：
【化３０】
2018523680.tif 000032
【化３１】
2018523680.tif 000033
【化３２】
2018523680.tif 000034
（式（Ｘ）に示す構造により表される化合物又は式（Ｘａ）、式（Ｘｂ）、式（Ｘｃ）に示す構造を有する関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む。）
【００９８】
クラスＥ：Ｅ、Ｅ’又はＥ”が切断可能なカルバメート部分、及び動的プロトン化部分の両方を含む、式（Ｉ）、（ＶＩＩ）、（ＸＩ）によるコンジュゲート：
【化３３】
2018523680.tif 000035
式中、Ｌ３又はＬ２はそれぞれ、式（Ｉ）による意味を有し、Ｕは、無、−Ｏ−、エステル、アミド、及びアミン（第２級又は第３級アミン）からなる群から選択され、ｂ及びｄは、それぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ’、Ｒ”及びＲ’’’は、それぞれ独立して水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である。（式（ＸＩ）に示す構造により表される化合物又は式（ＩＸａ）、式（ＩＸｂ）、式（ＩＸｃ）又は式（ＩＸｄ）に示す構造を有する関連類似体の薬学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物及び金属キレート、並びに塩の溶媒和物及び水和物を含む）：
【化３４】
2018523680.tif 000036
式中、Ｌ３は、式（Ｉ）による意味を有し、ａ、ｂ及びｄは、それぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ”、Ｒ’’’、ＲＩＶは、それぞれ独立して水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である。
【化３５】
2018523680.tif 000037
式中、Ｌ３は、式（Ｉ）による意味を有し；ａ、ｂ及びｄは、それぞれ、０、１、２、３、４、５又は６の整数を表し；Ｒ”、Ｒ’’’、ＲＩＶは、それぞれ独立して水素、メチル又はエチルを表し；Ｄは、式（Ｉ）に定義した薬物である。
【化３６】
2018523680.tif 000038
式中、Ｌ３及びＤは、それぞれ、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有する。
【化３７】
2018523680.tif 000039
式中、Ｌ３及びＤは、それぞれ、式（Ｉ）におけるものと同じ意味を有する。
【００９９】
本発明の一実施形態において、Ｅ、Ｅ’又はＥ”がそれぞれ独立して、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲートを提供し；これらは薬物に付着される。
【０１００】
本発明の範囲内には、「前駆体」と称される分子も含まれる。本発明の文脈における「前駆体」は、本発明の実施形態によるコンジュゲートの合成に使用される化学的部分である。多くの場合、前駆体は、本発明のＭＮＭに対する治療的タンパク質、オリゴヌクレオチド又は他の巨大分子付着等の段階において、コンジュゲートの合成中に除去又は修飾されることになる化学的基を含む。そのような化学的基の例は、ホスホロアミダイト、アジド、アセチレン又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基である。したがって、本発明はそのような前駆体もそれぞれ開示し、該前駆体は、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに示す構造の化合物であり；これらは、コンジュゲートの合成中に除去又は修飾されることになる化学的部分を含み又は該部分に結合されている。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、除去又は修飾されることになる化学的部分がホスホロアミデート、活性化エステル、アジド又はアセチレンからなる群から選択される前駆体を提供する。
【０１０２】
一実施形態において、前駆体は、式（ＸＩＩ）に示す構造を有する：
【化３８】
2018523680.tif 000040
式中、Ｗは、式（Ｉ）、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに記載されたＥ、Ｅ’又はＥ”から選択される部分である。この前駆体は、限定することなく、オリゴヌクレオチドの５’末端への付着に有用である。
【０１０３】
本発明の他の前駆体は、式（ＸＩＩＩ）による構造を有する：
【化３９】
2018523680.tif 000041
式中、Ｇは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに記載されたＥ、Ｅ’又はＥ”から選択される部分である。この前駆体は、中でも、オリゴヌクレオチドの３’末端への付着に有用であり得る。ＤＭＴは、ジメトキシトリチルビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチルであり；ＣＰＧ＝調節多孔ガラスである。
【０１０４】
更に他の前駆体は、オリゴヌクレオチド配列の内部位置においてオリゴヌクレオチドであるＤに付着する役割を果たす。その目的のために、前駆体は、式（ＸＩＶ）による構造を有する：
【化４０】
2018523680.tif 000042
式中、Ｗは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに記載されるＥ、Ｅ’又はＥ”から選択される部分であり；ＰＲＧは、ヒドロキシル基の保護に好適な任意の保護基である。そのような基の例は：ジメトキシトリチルビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ）；アセチル；メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）であり；
Ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８炭化水素リンカーから選択され、これらは場合により酸素又は窒素原子（１つ又は複数）で置換され、及び場合により任意の天然又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ塩基に結合される。好ましい実施形態では、前記塩基はチミン又はウラシルである。
【０１０５】
更に別の前駆体は、Ｅ、Ｅ’又はＥ”を、タンパク質薬物であるＤに付着させる役割を果たす。前記前駆体は、Ａ及びＢの構造から選択される以下の構造を有する：
【化４１】
2018523680.tif 000043
【０１０６】
前記前駆体は、Ｄのアミン部分への結合が意図され、式中、Ｗは、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるＥ、Ｅ’又はＥ”から選択される。本発明の別の実施形態では、前駆体は、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかに示す構造を有し；式中、Ｄに対する結合点において、ホスホロアミダイト、活性化エステル、アジド又はアセチレンから選択される基に対する結合が存在する。後者の２つの基は、「クリックケミストリー」による、例えば限定することなくアジド−アルキンヒュスゲン環化付加反応を介したＤに対する付着に有用であり得る。
【０１０７】
本発明の実施形態は、更に、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるコンジュゲート；及び薬学的に許容され得る塩又は担体を含む医薬組成物を含むことができる。
【０１０８】
本発明はまた、インビトロ又はインビボでの遺伝子発現の特定の阻害のための方法を含む。一実施形態において、本方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるコンジュゲート；又はそれぞれの医薬組成物の使用を含むことができ、式中、Ｄは、特定の遺伝子の発現を発現停止させるように設計されたｓｉＲＮＡ又はＡＳＯである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、疾病の病因又は病態形成に役割を有する病原性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｄは治療的タンパク質である。
【０１０９】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的障害の処置に使用することができる。本発明の実施形態は、治療のための方法を含み、該方法は、必要とする患者に治療的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによるコンジュゲートを含み；式中、Ｄは、それぞれの医学的障害の処置に有用な薬物である。
【０１１０】
一実施形態において、本方法は、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯを用いた遺伝子治療のためであり、前記方法は、必要とする患者に、治療的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）；（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）；（ＶＩＩＩａ）、（ＶＩＩＩｂ）、（ＶＩＩＩｃ）、（ＶＩＩＩｄ）、（ＶＩＩＩｅ）、（ＶＩＩＩｆ）、（ＶＩＩＩｇ）、（ＶＩＩＩｈ）；（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（ＩＸｂ）、（ＩＸｃ）、（ＩＸｄ）、（ＩＸｅ）、（ＩＸｆ）、（ＩＸｇ）、（ＩＸｈ）；（Ｘ）、（Ｘａ）、（Ｘｂ）、（Ｘｃ）；（ＸＩ）、（ＸＩａ）、（ＸＩｂ）、（ＸＩｃ）、（ＸＩｄ）のいずれかによる本発明のコンジュゲートを含み；式中、Ｄは、特定の患者の疾病に関与する遺伝子の発現を阻害するのに有用な、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ又は治療的タンパク質である。
【０１１１】
本発明の別の実施形態では、本発明は、治療的タンパク質による疾病の治療の方法を含み、Ｄは、生物学的リン脂質膜を横切って細胞内に、又は血液脳関門等の生物学的バリアを通して送達されるべきタンパク質である。前記細胞は、インビトロでの細胞培養物又はインビボでの生きた動物若しくはヒト対象のいずれかにおけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は新生物細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、転移にある細胞である。細胞は、真核生物細胞、発癌性因子でトランスフェクトされた真核生物細胞、ヒト細胞、前癌細胞である細胞、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。細胞は、細胞培養物中又は生きた動物若しくはヒト対象中の細胞であってもよい。
【０１１２】
本発明の更に別の実施形態において、Ｄは、例えば変異した、機能不全タンパク質を置き換えることにより、生理学的ニーズに対処する補充療法として投与されるタンパク質である。別の実施形態では、Ｄは、遺伝子調節の役割を有するタンパク質であり、該タンパク質は、中でも、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集（特定の遺伝子の配列の追加、中断又は変更）の役割を有するタンパク質を含む。一実施形態において、前記タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）関連タンパク質のメンバーであってもよい。詳細には、前記タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）、ＲＮＡ−ガイドｄＤＮＡヌクレアーゼ酵素又はその類似体であってもよく、又はこれらを含んでもよい。
【０１１３】
本発明の実施形態の１つにおいて、医学的障害の遺伝子治療の方法を記載し、前記方法は、必要とする患者に、治療的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物は、式（Ｉ）によるコンジュゲートを含み、ここでＤはＣａｓ９等のＣＲＩＳＰＲタンパク質であり、該タンパク質は、適切なガイドオリゴヌクレオチドと共に投与されることによって、それぞれのガイドオリゴヌクレオチドが搭載されたタンパク質の細胞内への送達を達成し、該細胞内でＣＲＩＳＰＲタンパク質はそのゲノム編集活性を発揮することができる。この文脈におけるガイドオリゴヌクレオチドは、Ｃａｓ９タンパク質をＤＮＡ上の特定の位置（場所）に案内して、その部位にて二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、それにより遺伝子物質における局所欠陥を修復することを可能にするＲＮＡ又はＤＮＡの配列である。Ｃａｓ９の場合、ガイドオリゴヌクレオチドは、その配列が標的ＤＮＡ位置の配列と相補的なＲＮＡの短いセグメントである。
【０１１４】
したがって、本発明の実施形態によるコンジュゲート、及びそれぞれの医薬組成物及び方法は中でも、中でも癌、毒性発作、虚血性疾患、感染性疾患、タンパク質貯蔵疾患、外傷、免疫介在性疾患又は変性疾患から選択される医学的障害の処置において有益であり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、医学的障害は、癌である。本明細書で使用するとき、用語「癌」は、例えば制御されない増殖、特化機能の喪失、不死、有意な転移能、有意な抗アポトーシス活性の増大、急速な成長及び増殖率、又は特定の特徴的な形態及び細胞マーカー等の、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を所有する細胞の存在を指す。一般に、癌細胞は、動物内にて局所的に存在し、又は例えば、白血病細胞のように、独立した細胞として血液流中を循環する腫瘍の形態である。
【０１１６】
神経障害の領域では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、中でも、アルツハイマー病、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症及びクロイツフェルト・ヤコブ病等の神経変性障害の処置に有用であり得る。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、リン脂質膜を横切った細胞内への化学的化合物の送達を向上させるための本発明の化合物の使用に関する。付着された化学的化合物及び所望の効能に応じて、そのような送達は、様々な有用な利用法を有することができる。例えば、植物において、そのような送達は；中でも、植物の遺伝子の改善、又は様々な昆虫、細菌若しくは真菌の根絶によって、作物の品質及び量の改善を補助することができる。
【０１１８】
尚別の実施形態では、本発明は、方法Ａ、化合物のライブラリーの中からＩＭＥＦ−基質を選択する方法に関し；前記方法は：
（ｉ）フロレチン（１００〜１０００μＭ）、及び／又は６−ＫＣ（１０〜１００μＭ）の存在下、細胞又はリポソームを、化合物のライブラリーからのＩＭＥＦ−基質であることが疑われる候補化合物とインキュベートすることと；
（ｉｉ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの存在下、候補化合物の膜を横切った細胞又はリポソーム中への取り込みレベルを測定することと；
（ｉｉｉ）フロレチン（１００〜１０００μＭ）、及び／又は６−ＫＣ（１０〜１００μＭ）の非存在下、細胞又はリポソームを候補化合物とインキュベートすることと；
（ｉｖ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの非存在下、候補化合物の膜を横切った細胞又はリポソーム中への取り込みレベルを測定することと；
（ｖ）フロレチン及び／又は６−ＫＣの存在と非存在との間で、候補化合物の取り込みレベルを比較することであって；フロレチンの存在下の５０％を超える取り込みにおける増大；又は６−ＫＣ存在下の２倍を超える取り込みにおける増大は、候補化合物がＩＭＥＦ−基質であることを示す、比較することを含む。
【実施例】
【０１１９】
ここで本発明を更に説明し、本発明の実施形態を実際に実行できる方法を示すためにいくつかの実施例を記載する。
【０１２０】
以下の実施例では、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドに付着された本発明のＭＮＭを含むコンジュゲートが記載される。これらの実施例は、様々な本発明のコンジュゲートに関して、本発明の全体を示し、即ち本発明のＭＮＭは：（ｉ）首尾よく合成され；（ｉｉ）首尾よく巨大分子薬物（例えば一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ）にコンジュゲートされ；（ｉｉｉ）強く荷電した巨大分子の効率的な送達が可能であり（疎水性リン脂質膜を横切って細胞内に；及び（ｉｖ）これらの巨大分子を、該分子が一旦細胞内部に入ったらそれらの作用部位に到達し、有用な生物学的活性（例えば、細胞質中で起こる遺伝子サイレンシング）を発揮することを可能にする。
【０１２１】
実施例１：オリゴヌクレオチドを含む、本発明の実施形態によるコンジュゲートの合成のための一般的方法：
最初に、発現停止されるべき遺伝子を、その疾病の病因又は病態形成における役割に基づいて選択する。次いで、当技術分野にて既知の生物情報学的方法論に基づいて、ヌクレオチド配列を決定する（一般に、ＲＩＳＣ基質の場合、１９〜２１塩基対二本鎖ＲＮＡ、又はダイサー基質の場合、２５〜２９塩基対二本鎖ＲＮＡ）。
【０１２２】
合成は、３’から５’方向へ行う。保護２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ）又は化学的に修飾されたヌクレオシド、例えばＬＮＡ（ロックド核酸）又はＢＮＡ（架橋核酸）から誘導されたホスホロアミダイト構成要素を使用した固相合成が適用される。構成要素は、連続的に結合されて、所望のｓｉＲＮＡの配列により決定された順序にオリゴヌクレオチド鎖を延長する。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドの構成後、本発明のＥ部分を、オリゴヌクレオチドの構成要素の１つとして加える。Ｅ部分は、上述したその前駆体形態で加えられる。化合物をオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するために、ホスホロアミダイト部分を含む式（ＸＩＩ）による前駆体が使用される。化合物をオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するために、式（ＸＩＩＩ）よる前駆体が使用される。化合物をオリゴヌクレオチドに沿って内部位置に結合するために、式（ＸＩＶ）による前駆体が使用される。中でも、この前駆体はアセチレン又はアジド部分を含んで、Ｅ部分のオリゴヌクレオチド鎖への結合を仲介してもよい。このプロセスは完全自動化される。鎖の組み立ての完了後、生成物を固相支持体から溶液中に解放し、脱保護し、収集する。次いで、所望のコンジュゲートを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により単離して、所望のコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを高純度で得る。ｓｉＲＮＡの場合、相補的ＲＮＡ鎖のそれぞれを別個に合成した後、当技術分野で既知の標準的な条件下で２つの鎖のアニーリングを行って、所望の二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。
【０１２４】
実施例２：本発明のＥ部分の化学的合成（Ｅ、Ｅ’又はＥ”）。
出発物質ペルフルオロ−ｔｅｒｔブタノールは市販されている。この実施例では、Ｅ部分はオリゴヌクレオチドの５’末端に結合されるよう設計されており、したがって、ホスホロアミダイト部分は、オリゴヌクレオチド鎖のコンジュゲーションに向かう合成の最終ステップで加えられる。
【０１２５】
実施例２ａ：式（ＶＩＩ）によるＥ部分の合成方法：
Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定された、式（ＶＩＩａ）による本発明のＥ部分の前駆体の合成方法を例示する。前駆体は、オリゴヌクレオチドの５’末端への付着用に設計され、以下の構造を有する：
【化４２】
2018523680.tif 000044
【０１２６】
合成は、エストラジオールから開始する。
【化４３】
2018523680.tif 000045
【０１２７】
スキーム１に従って合成を行った。例えば、エストラジオールをベンジル基で保護して、化合物１１を提供した。最適反応条件下でのアルコール１１（２５．６ｇ）のアリル化（臭化アリル、ＮａＨ、ｃａｔ．テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＩ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、還流、１６時間）により、アリルエーテル２４（２１．８５ｇ、７７％）を白色固体（ヘプタン及びＭｅＯＨ中の連続粉砕により精製）として得た。９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ）を用いた末端アルケン２４（２１．８ｇ）の位置選択的ハイドロボレーションにより、標準的な酸化処理（ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ２）後、アルコール２２が提供された。最適反応条件下での［ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）、ＰＰｈ３、４Ａ分子篩（ＭＳ）、ＴＨＦ、ＲＴ、１６時間］過剰のペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブタノールを用いたアルコール２２（１３．６ｇ）のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応により、所望のエーテル２１を得た。化合物２１をＴＨＦ及び２，２，２−トリフルオロエタノールの混合物（１：１）を溶媒として使用した接触水素化（１０％Ｐｄ／Ｃ、ＲＴ）に供して（５ｂａｒｓ、Ｐａｒｒ反応器）、フェノール２６を白色固体として得た（〜１８時間後）。次いで、脱ベンジル化を行った後、テトラヒドロパルマチン（ＴＨＰ）−保護ブロモブタノールを使用してアルキル化を行った。次いで、保護基を除去し、所望の化合物の最終ステップとして、ホスホロアミダイト基を付着させた。次いで、この生成物を、オリゴヌクレオチド鎖の合成の最終的な構成要素として、ホスホロアミダイト基を介したオリゴヌクレオチド鎖への５’末端におけるコンジュゲーションに供した。
【０１２８】
実施例２ｂ：式（ＶＩＩ）によるＥ部分の合成方法：
式（ＶＩＩ）による本発明のＥ部分の前駆体の合成方法を例示し、ここでエストロゲン骨格はリトコール酸の残基と交換され；Ｒ及びＲ’は、それぞれ水素原子であり；Ｌ１、Ｌ２、Ｑ１、Ｑ２は、全て無であり、Ｌ３は、１４−炭素炭化水素リンカーであり；この化合物は、下記に前駆体として示すＡｐｏ−Ｓｉ−１１と指定され、ホスホロアミダイト基に結合されることにより、オリゴヌクレオチドの５’末端への付着のために設計されている：
【化４４】
2018523680.tif 000046
【０１２９】
合成は、リトコール酸、市販されている胆汁酸から出発した。合成は、合成スキーム２に従う：
【化４５】
2018523680.tif 000047
【０１３０】
例えば、２５ｇの材料１を、対応するメチル−エステルに定量的収率で変換した。２５ｇの材料２をｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ）２９ｇ（８７％、ＮＭＲ）と反応させた。純粋な化合物３を得た。ＮａＢＨ４ＴＨＦ／ＭｅＯＨによる化合物３（２９ｇ）の４への還元により、後処理及び精製後に、ＮＭＲにより化合物４（８５％）を得、尚幾分かの化合物３が存在した。ペルフルオロｔ−ブタノールによる材料４のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応により、後処理、カラムクロマトグラフィー及びＭｅＯＨからの粉砕後、３３．５ｇ（９２％）の化合物５を得、これをその後脱保護してステロイド６を得た。次いで、ステロイド６（２．５ｇ）をＴＨＰ−保護ブロモテトラデカノールにカップリングした。カップリングは３日を要し、完全変換に到達するのに４当量のＴＨＰ−保護ブロモテトラデカノールを必要とした。生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した。ＭｅＯＨ／１，４−ジオキサン（ＨＣｌ、４Ｎ）／ＴＨＦで保護基（ＴＨＰ）を除去した後、生成物７をカラムクロマトグラフィーで精製して不純物を除去した。生成物７（１．５ｇ、ｃ．ｙ．４８％）を白色固体として得た。次いで、生成物７をホスホロアミダイト基の付着により所望の化合物８に変換した。次いで、この生成物を、オリゴヌクレオチド鎖の合成の最終的な構成要素として、５’末端においてオリゴヌクレオチド鎖への付着に供した。
【０１３１】
実施例２ｃ：式（Ｘｃ）によるＥ部分の合成方法：
式（Ｘｃ）による本発明のＥ部分の前駆体の合成方法を例示し、該Ｅ部分は以下の構造を有する。前駆体は、オリゴヌクレオチドの５’末端への付着のために設計され、以下の構造を有する：
【化４６】
2018523680.tif 000048
【０１３２】
中間体４は、以下のスキーム３に従って合成した。
【化４７】
2018523680.tif 000049
【０１３３】
ジチオール−ブチルアミン（０．５ｇ）及び塩基性条件下でのヨウ素は、１，２−ジチアン１０（３．１３ｇ、９０％）を結晶性白色固体として提供した。中間体１１に対応するアルコールは市販されており、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護した。ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３の存在下、アミン１０（２５８ｍｇ）を用いた還元的アミノ化は、所望の第２級アミン４（３３０ｍｇ、９１％）を主な生成物として提供した。次いで、実施例２ａによる中間体２６を、当技術分野にて既知のように、カルバモイル化により中間体４に付着させた。次いで、ＤＭＴを除去し、ホスホロアミダイト基を付着させて前駆体化合物を得た。次いで、この前駆体を、その最終的な構成要素として、鎖の５’末端におけるオリゴヌクレオチド鎖に対するコンジュゲーションに供した。結合は、酸素原子を介して行った。前記コンジュゲーションは、式（Ｘｃ）によるＥ部分を含む所望のコンジュゲートを提供した。
【０１３４】
実施例２ｄ：本発明の化合物の主要構成要素の合成方法（ステロイド１）：
ステロイド１は、本発明の多数の構造の主な構成要素である。ステロイド１の合成のための出発物質は、エストラジオールである。本発明の化合物用に開発された化学反応は、芳香族ヒドロキシル基の保護後の、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を利用したペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブタノールの付着を含む。合成は、以下の合成スキームに従って行い、Ｂｎはベンジル保護基を意味し；ＢｎＢｒ＝臭化ベンジル；ＴＢＡＩ＝テトラブチルアンモニウムヨージド；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；９−ＢＢＮ＝９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン；ＤＩＡＤ＝ジイソプロピルアゾジ−カルボキシレートである。
【０１３５】
【化４８】
2018523680.tif 000050
【０１３６】
実施例２ｅ：式（ＩＸｂ）によるＥ部分の合成方法
この実施例は、以下の構造を有する式（ＩＸｂ）（式中、ａ＝３；ｂ＝０、ｋ＝１）によるＥ部分の前駆体の合成を記載する。この化合物は、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓの前駆体と指定される：
【化４９】
2018523680.tif 000051
【０１３７】
合成は、実施例２ｄに記載した主要中間体１から出発して、以下のスキームに従って行った：
【化５０】
2018523680.tif 000052
【０１３８】
化合物１（５ｇ）をアルキル化して５３とし、４．９５ｇの単離された材料をもたらした。これをＬｉＡｌＨ４を使用して還元し、続いて塩化メシル（ＭｓＣｌ）（４．５６ｇのメシル酸塩）で保護した。カリウムチオアセテート（ＫＳＡｃ）を使用したアセテート３２への変換は成功し、精製後、４．３５ｇの３２を単離した。ピロリジンを使用して脱保護して化合物３３を提供し、続いて３５に変換して９．８８ｇの粗材料をもたらし、これを続いて精製に供した。殆ど過剰のイミデート試薬を含んでいたＡＰＯ−Ｓｉ−ＳＳの粗材料をペンタン及びＭｅＯＨで精製して、２相系を提供した。次いで、上澄みをデカントし、その溶媒から白色油を取り除いて（ｓｔｒｉｐ）ＡＰＯ−Ｓｉ−ＳＳの純粋な前駆体（１．３３グラム）を提供した。
【０１３９】
実施例２ｈ：式（ＶＩＩＩｂ）によるＥ部分の合成方法：
式（ＶＩＩＩｂ）によるＥ部分は以下の構造を有し、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗと指定される。この実施例は、その５’末端におけるオリゴヌクレオチド薬物への付着のためのホスホロアミダイト基を含む前駆体の合成を記載する：
【化５１】
2018523680.tif 000053
【０１４０】
エストラジオールから出発して、以下のスキームに従って合成を行った：
【化５２】
2018523680.tif 000054
式中、Ｂｎ＝ベンジルである。
【０１４１】
Ｗ−２の全材料をアリル化した。大々的な後処理後、化合物Ｗ−３（６６．４グラム）を高純度で単離した。並行して、化合物Ｗ−６を以下の合成スキームに従って合成した：
【化５３】
2018523680.tif 000055
Ａｌｌｏｃ＝アリルオキシ）カルボニル；固相合成用に使用した試薬；Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応は、アルコールを様々な官能基に変換する。
【０１４２】
次いで、還元的アミノ化を行ってＷ−７を提供した。次いで、Ｗ−７を以下の反応に供し、Ｄに対する結合点であるホスホロアミダイト基を有する所望の化合物をもたらした：
【化５４】
2018523680.tif 000056
【０１４３】
実施例２ｉ：式（ＶＩＩＩｈ）によるＥ部分の合成方法：
この実施例は、以下の構造を有する、式（ＶＩＩＩｈ）によるＥ部分の前駆体の合成を記載する：
【化５５】
2018523680.tif 000057
【０１４４】
合成は以下のスキームに従って行った。最初に、下記のスキームに記載するＢ３−１を合成した。容易に入手可能な出発物質のアルキル化により、Ｂ３−２が良好な純度及び量で提供された。次いで、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を行って８．５グラムの単離されたＢ３−３を提供した。
【化５６】
2018523680.tif 000058
【０１４５】
次いで、以下のスキームに従って合成をエストロンから進行させて、所望の化合物を提供した。
【化５７】
2018523680.tif 000059
式中、Ｂｚ−Ｃｌ＝塩化ベンジル；Ｂｎ＝ベンジル；ＴｓＯＨ＝トシル酸；ＴＢＳ＝ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル；ＴＢＡＦ＝テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフロリド
【０１４６】
実施例２ｊ：式（ＩＸｈ）によるＥ部分の合成方法：
この実施例は、以下の構造を有する、式（ＩＸｈ）によるＥ部分の前駆体の合成を記載する：
【化５８】
2018523680.tif 000060
【０１４７】
合成は、下記に示すヒドロキシル−プロリン由来の構成要素から出発した。
【化５９】
2018523680.tif 000061
【０１４８】
ＮａＢＨ４によるプロリンメチルエステル（［ＣＡＳ＃４０２１６−８３−９］の還元により、対応するジオールを得た。続くエチルトリフルオロアセテートによる処理により、アセトアミド３を得た。塩化メシルによる第１級アルコールの選択的反応により化合物４を得た。チオアセテートによる反応により化合物５を得、次いでこれをアセテート基の除去に供した。続く合成ステップを下記に記載し、式（ＩＸｈ）による化合物の目標前駆体分子を提供した。
【化６０】
2018523680.tif 000062
【０１４９】
実施例３：オリゴヌクレオチド鎖に対するＭＮＭのコンジュゲーションの実施例：
オリゴヌクレオチド鎖にコンジュゲートされた際の、前駆体及びそれぞれの化合物の構造の実施例
ａ．オリゴヌクレオチドの５’末端における結合：
前駆体：
【化６１】
2018523680.tif 000063
オリゴヌクレオチドに付着したとき：
【化６２】
2018523680.tif 000064
【０１５０】
ｂ．オリゴヌクレオチドの３’末端における結合：
前駆体：
【化６３】
2018523680.tif 000065
式中、ＤＭＴ＝ジメトキシトリチル；及びＣＰＧ＝オリゴヌクレオチドの合成用の固相支持体としての調節多孔ガラスである。
オリゴヌクレオチドに付着したとき：
【化６４】
2018523680.tif 000066
【０１５１】
ｃ．オリゴヌクレオチド鎖上の内部部位における結合：
この場合、ヌクレオチド（例えばチミン）がＥに付着され、Ｅをオリゴヌクレオチド鎖に固定する役割を果たす。この修飾はＥ部分が末端位置ではなくオリゴヌクレオチド鎖内に付着するよう機能し得る。これは下記にて式（ＶＩＩａ）による構造を有するＥにより例示される：
【０１５２】
前駆体：
【化６５】
2018523680.tif 000067
オリゴヌクレオチドに付着
【化６６】
2018523680.tif 000068
【０１５３】
実施例４：本発明のＥ部分にコンジュゲートされたタンパク質（例えば、限定することなく、Ｃａｓ９）を含む本発明のコンジュゲートの例示的構造：
下記に概略的に示すように、本発明の実施形態によるＭＮＭ、Ｅ、Ｅ’又はＥ”は、リンカー基を介してタンパク質に付着された。結合はカルバメート又はアミド結合を介してタンパク質表面上のリシン側鎖に対して行った。付着のために、活性エステルを使用した。この目的のために、アルコール基を活性エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＨＳ）に変換した。このような部分は、酸素（水）よりもタンパク質リシン側鎖の窒素と優先的に反応する。反応は、以下のスキームに従って行われた：
【化６７】
2018523680.tif 000069
【０１５４】
可能な誘導化剤は：
ａ）ホスゲン：結合は、クロロギ酸エステルを介する。
ｂ）ジスクシンイミジルカーボネート（Ｘ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）：結合は、スクシンイミジルカーボネートを介する。
ｃ）カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、Ｘ＝イミダゾール）：結合は、イミダゾリルカルバメートを介する。
【０１５５】
これらの基のいずれかによるタンパク質標識は、アミンを含まない僅かに塩基性の緩衝液（ｐＨ＝８〜９）中で行われる。結合点は疎水性であり、したがってタンパク質との反応が起こるように共溶媒［通常、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）］を必要とする。上記の３つの選択肢のうち、その酸素選択性を超える最も多数の窒素、及びそれぞれの合成の単純さのために、カルボニル−ジ−イミダゾールが好ましい。タンパク質分子当たりのＥ、Ｅ’又はＥ”部分の数は、所望のモル比を予め設定することにより換算及び決定される。
【０１５６】
実施例５：本発明の１つ又は２つの分子ナノモーターにコンジュゲートされたＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの細胞取り込み：
図５〜９は、インビトロでの様々な細胞型内への本発明のＭＮＭを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートの送達における生物学的パフォーマンスを例示する。前記コンジュゲートは、式（ＶＩＩａ）（式中、ａ＝２、及びｋ＝１（Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定））；又は上記の実施例２ｂに特定したＡｐｏ−Ｓｉ−１１によるＭＮＭを含む。これらのＭＮＭはＣｙ３−標識一本鎖２９−ｍｅｒ  ＤＮＡ配列（２９負電荷を保有）又は二本鎖５８−ｍｅｒ  ＤＮＡ配列（５８負電荷を保有）のいずれかに付着され、各配列は赤色フルオロフォアＣｙ３により標識された。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＭＮＭ−ＴＴ−ｉＣｙ３−ＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡ  ＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１）；及び５’−ＭＮＭ−ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣ  ＧＡＡ．ｉＣｙ３（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．２）であった；これはフルオロフォアＣｙ３が配列に沿って内部位置にあることを意味する。これらの配列（例えば限定することなくＩＤＴ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡにより合成）は無作為に選択され、細胞内への膜貫通送達の一例として役立つことを目的とした。フルオロフォアの組み込みは、調べたコンジュゲートの局在化を検出するツールとしての役割を果たした。Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭによる巨大分子の膜貫通送達が普遍的であり、特定の細胞型に限定されないことを示すように様々な細胞株におけるパフォーマンスを提示する。一般的に、以下の本発明のコンジュゲート：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１  Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｇ及びＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗの全部が同様のパフォーマンスプロファイルを示すことも注目に値する。
【０１５７】
実施例５ａ：３Ｔ３細胞：
２９−ｍｅｒ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを細胞内に送達する本発明のＭＮＭの能力を評価するために、インビトロでのアッセイを行った。実験の１日前、指数増殖期にある、ＥＧＦＰタンパク質を安定的にトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞）を、抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋補充成長培地（５００μｌ／ウェル）中、４．５×１０４細胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレート内に蒔いた。当初、５’−Ａｐｏ−ｓｉ−１１−ＴＴ−ｉＣｙ３−ＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．３）の配列を有するＣｙ３−標識２９−ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを試験した。このコンジュゲートの細胞内への取り込みを、Ｃｙ３を有する同じＤＮＡ鎖であるが、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭを有さない対照化合物の取り込みと比較した。各コンジュゲートを１００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｃａｔ．３１９８５０６２、ＵＳＡ）で希釈し、室温で１０分間インキュベートし、最終濃度１００ｎＭで細胞に加えた。対照に対する細胞によるコンジュゲートの取り込みを、８時間のインキュベーションにおいて、細胞がハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）で洗浄され、分析に供された際、評価した。水銀ランプからのＵＶ照明を備えたＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡（ＢＸ５１ＴＦ；Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ、Ｕ．Ｋ．）を使用して細胞を可視化した（×２０の大きさ）。Ｃｙ３−フルオロフォアを励起波長４７０〜４９５ｎｍ及び５９０ｎｍでの発光により可視化した一方、ＥＧＦＰフルオロフォアを励起波長５３０〜５５０ｎｍ及び５１０〜５５０ｎｍでの発光により可視化した。図５Ａの蛍光顕微鏡法に示すように、２９−ｍｅｒ  ＤＮＡ鎖に結合されたＡｐｏ−ｓｉ−１１を含むＡｐｏ−Ｓｉ−１１は、ＭＮＭを有さない対照オリゴヌクレオチドとは対照的に、細胞膜を横切った３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞内への効率的な送達を示し、対照オリゴヌクレオチドでは有意な取り込みは観察されなかった。
【０１５８】
Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭが２９−ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞に送達する能力はまた、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して定量化した（図５Ｃ）。この目的のために、指数増殖期にある細胞を、実験の１日前、抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋補充成長培地（５００μｌ／ウェル）を用いて、４．５×１０４細胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレート内に蒔いた。各Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチドを１００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ）で希釈し、４０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の最終濃度で細胞に加えた。ＭＮＭを有さない対照化合物に対する、細胞内でのＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭ−コンジュゲートの蓄積を、２４時間のインキュベーションにて評価した。この目的のために、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄し、分析に供した。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  ＰＲＯマルチモードリーダー（励起波長５４８±４．５ｎｍ及び発光波長５８０±１０ｎｍ）を使用してＣｙ３−ポジティブ集団の検出及び定量化を行った。Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭコンジュゲートの取り込みを対照ＤＮＡオリゴヌクレオチドの取り込みと同じ濃度で比較し、結果を百分率で表し、対照と比較した。図５Ｃに示すように、対照と比較して、細胞内への有意なコンジュゲートの取り込みが観察された。
【０１５９】
２９−ｍｅｒ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合したＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭの細胞取り込みをフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によっても評価した。上述したように、実験の１日前、指数増殖期にある３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞を、抗生物質を有さないＤＭＥＭ完全培地を用いて、６−ウェルプレート内に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で蒔いた。Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチドのそれぞれを５００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈し、１ｎＭ〜４０ｎＭの様々な最終濃度で細胞に加えた。コンジュゲートの送達をトランスフェクションから２４〜７２時間後に評価した。インキュベーション期間の後、細胞をトリプシン処理し、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）で補充し、１１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、細胞をハンクス緩衝塩溶液で再懸濁し、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖａソフトウェアを利用して、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析に供した。各サンプルについて、全部で１０４の事象が収集された。Ｃｙ３−ポジティブ細胞集団の検出及び定量化は、同じ配列を有するがＭＮＭを欠いた対照オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした細胞に対する、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１コンジュゲートと共にインキュベートした細胞における蛍光強度の測定を用いて行った。
【０１６０】
ＦＡＣＳ分析では、Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭが３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞内への２９−ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの効率的な送達が可能であることが確認された。図５Ｂは、コンジュゲートの取り込みが起こらなかった対照に照らして、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１コンジュゲートとインキュベートした細胞集団において、実際に全細胞がコンジュゲートの取り込みを示したことを示すドットプロット分析を提供する。
【０１６１】
次いで、二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を細胞膜を横切って送達するＡｐｏ−Ｓｉ−１１の能力を評価した。その目的のために、２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭを、ｃｙ３フルオロフォアで標識された２９ｂｐ  ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの各５’末端において１つずつ付着させ、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するようアニールした。ｄｓＤＮＡの配列は、上述した通りであった：５’−Ａｐｏ−ｓｉ−１１−ＴＴ−ｉＣｙ３−ＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．３）；及び５’−Ａｐｏ−ｓｉ−１１−ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．４）。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドへのＭＮＭの付着は、上記の実施例３に例示されたように行った。３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞を４０ｎＭのコンジュゲートと共にインキュベートし、２４時間のインキュベーションにおける細胞取り込みを蛍光顕微鏡法により評価し、同一配列であるがＭＮＭを欠いた対照オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした細胞による取り込みと比較した。図５Ｄに記載するように、２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭもまた、５８−ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞内に効率的に送達することができた。
【０１６３】
この送達を、更にＦＡＣＳにより実証した。この目的のために、３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞を６−ウェルプレート内に播き、図５Ｃに記載されるように処理した。Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチド（ＭＮＭを有する又は有さない）のそれぞれを、５００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈し、最終濃度４０ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭで細胞に加えた。２４時間のインキュベーション期間後、オリゴヌクレオチドの送達をＦＡＣＳ−Ａｒｉａ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により評価し、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖａソフトウェアにより分析した。各サンプルについて全部で１０４事象を収集した。ＭＮＭを欠いた対照オリゴヌクレオチドに暴露した細胞の蛍光強度に対する、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭコンジュゲートとインキュベートした細胞における蛍光強度の測定を用いて、Ｃｙ３−ポジティブ集団の検出及び定量化を行った。図５Ｅ及び図５Ｆに示すように、ＦＡＣＳ分析は、２つのＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭが３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞中への５８−ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの効率的な送達が可能であることを確認した：図５Ｅ（左及び右）は、ドットプロット分析を示し、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１コンジュゲートとインキュベートした細胞のみが細胞内へのＤＮＡ取り込みを示し、コンジュゲートの蓄積は実際的に全細胞におけることを示した；図５Ｆは、ヒストグラムゲノム分析、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１を欠いた対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞における低いバックグラウンドレベルとは対照的な、Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭ−コンジュゲート−処理細胞における顕著なシグナルを示す。調べた濃度（４０ｎＭ、１０ｎＭ、及び１ｎＭ）において、明らかな用量反応が観察された。
【０１６４】
共焦点顕微鏡法を使用して、２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭに付着されたコンジュゲートの取り込みを更に確認した。細胞は、上述したように調製した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染料（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、ＨＢＳＳ中１：１０００、１時間）による核染色も行った。図５Ｇに示すように、Ａｐｏ−Ｓｉコンジュゲートは、細胞膜を通した効率的な取り込みと、細胞内での蓄積を示した。
【０１６５】
実施例５ｂ：マウスＢ１６メラノーマ細胞：
この実験の組の目的は、２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭ（それぞれ鎖の５’末端に付着）を含むコンジュゲートが、培養したＢ１６ネズミ−皮膚メラノーマ細胞内への取り込みを行う能力を決定することであった。この目的のために、Ｂ１６細胞を実施例５Ａに記載したように成長させ及び維持した。手短には、細胞を５％ＣＯ２含む加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐで補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）中で３７℃で成長させた。トランスフェクションの１日前、２×１０４のＢ１６細胞を標準的な２４−ウェルプレートチャンバ内に蒔いた。２つのＡｐｏ−ｓｉ−１１  ＭＮＭにコンジュゲートされた４０ｎＭのＣｙ３−標識５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを、完全成長培地の存在下、細胞と共に２４時間インキュベートした。Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭを欠いた同一のＣｙ−３−標識オリゴヌクレオチドを対照として使用し、細胞と共に同じ期間インキュベートした。蛍光の定量化の前に各ウェルをＨＢＳＳで２回洗浄した。顕微鏡法の図は、上述したように、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡で撮影した。
【０１６６】
Ｂ１６細胞をＦＡＣＳ分析にも供した。この目的のために、トランスフェクションの１日前、１６×１０４のＢ１６細胞を標準的な６−ウェルプレート内に播種した。２つのＡｐｏ−ｓｉ−１１  ＭＮＭにコンジュゲートされた１０ｎＭ及び４０ｎＭのＣｙ３−標識５８−ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡを、完全成長培地と共に２４時間インキュベートした。ＭＮＭを欠いたＣｙ３−標識５８−ｍｅｒ  ＤＮＡを対照として使用した。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、上述したようにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩを用いて蛍光強度に関して分析した。
【０１６７】
加えて、２つのＭＮＭを含むＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭコンジュゲートの取り込み及び細胞内局在化を更に確認するために、共焦点顕微鏡法を使用した。細胞を上述したように調製した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染料を用いた核染色（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、ＨＢＳＳ中１：１０００、約１時間）も行った。
【０１６８】
５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを含むＡｐｏ−Ｓｉ−１１コンジュゲートで処理した細胞において著しい取り込みが検出されたが、同一であるがＭＮＭを有さないＣｙ３−標識オリゴヌクレオチドに暴露された細胞では検出されなかった。これは蛍光顕微鏡法（図６Ａ）、及びＦＡＣＳ分析（図６Ｂ）からも明らかであった。４０ｎＭでは、Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭコンジュゲートは、９８％の細胞による取り込みを示した。１０ｎＭに対する４０ｎＭでのシグナル強度の比較により明白な用量反応が観察された。共焦点顕微鏡法（図６Ｃ）は、更にＡｐｏ−Ｓｉコンジュゲートの細胞膜を通した細胞内への効率的な取り込みを示した。
【０１６９】
したがって、Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭは、Ｂ１６メラノーマ細胞内への５８−ｍｅｒ  ｄｓ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの効率的な送達を用量依存的に可能にする。
【０１７０】
実施例５ｃ：Ｃ２６ネズミ結腸腺癌細胞
Ｃ２６結腸腺癌細胞への強く荷電した５８−ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡの送達を可能にするＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭの能力を実証するために、細胞を上述したように成長させ及び維持した。手短には、細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐで補充したＤＭＥＭ中で３７℃で成長させた。
【０１７１】
細胞をＦＡＣＳ分析に供した。この目的のために、トランスフェクションの１日前、１６×１０４のＣ２６細胞を標準的な６−ウェルプレート内に播種した。それぞれオリゴヌクレオチドの５’末端において２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭにコンジュゲートされ、Ｃｙ３フルオロフォアに結合した、４０ｎＭの５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを完全成長培地の存在下で２４時間インキュベートした。Ａｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭを欠いた同じ構築物は、対照としての役割を果たした。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、上述したようにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩを用いて蛍光強度に関して分析した。
【０１７２】
図７に示すように、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１コンジュゲートで処理した細胞の９８％において、顕著なＣｙ３蛍光が検出された。このような取り込みは、対照オリゴヌクレオチドに暴露された細胞では検出されなかった。したがって、Ａｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭは、オリゴヌクレオチドの効率的な膜貫通送達を可能にする。
【０１７３】
実施例５ｄ：ヒトＨｅＬａ細胞株
この目的は、ＨｅＬａヒト頸部上皮癌細胞株内への強く荷電した５８−ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡの送達を可能にするＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭの能力を実証することであった。この目的のために、細胞を上述したように成長させ及び維持した。手短には、細胞を５％ＣＯ２を含む３７℃加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐで補充したＤＭＥＭ中で成長させた。
【０１７４】
ＦＡＣＳ分析のために、トランスフェクションの１日前、１６×１０４のＨｅＬａ細胞を標準的な６−ウェルプレート内に播種した。２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭにコンジュゲートされた４０ｎＭのＣｙ３−標識、５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡを、完全成長培地の存在下、２４時間インキュベートした。Ｃｙ３−標識５８−ｍｅｒ  ＤＮＡを対照として使用した。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、上述したようにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩシステムにより蛍光強度に関して分析した。２つのＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭにコンジュゲートされた５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡで処理した細胞は、培養物中のほぼ全細胞内への顕著な取り込みを示した（図８）。対照的に、そのような取り込みは、対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞では観察されなかった。したがって、結論として、５８負電荷を保有し、２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭにコンジュゲートされたＣｙ３−標識、５８−ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡは、インビトロでヒトＨｅＬａ細胞株内への効率的な送達を示す。
【０１７５】
まとめると、実施例５に提示され、４つの異なる細胞型：３Ｔ３ネズミ線維芽細胞、ネズミメラノーマＢ１６細胞、ネズミＣ２６結腸癌細胞、及びヒトＨｅＬａ子宮頸癌細胞から得られたこれらの結果は、１つ又は２つのＡｐｏ−Ｓｉ−１１  ＭＮＭのいずれかに結合した際の、効率的な膜貫通送達及び高く荷電した巨大分子の取り込みを実証する。そのような取り込みは、ＭＮＭを欠いた対照オリゴヌクレオチドでは観察されなかった。これらのデータにより、オリゴヌクレオチドの膜貫通送達を可能にする本発明のＭＮＭのパフォーマンスは、普遍的であり、特定の細胞型に限定されないという考えが支持される。
【０１７６】
実施例６：ダイサー基質を含むパフォーマンス向上部分（ＰＥＭ）の実証
本発明の一実施形態において、遺伝子サイレンシングのためのＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）との相互作用に好適な、二本鎖ＲＮＡを１９〜２１塩基対のサイズに切断することにより二本鎖ＲＮＡのプロセシングが可能なエンドヌクレアーゼである酵素ダイサーの活性に基づいた、効率的な遺伝子サイレンシングのためのＭＮＭの除去方法を開示する。前記方法は、以下を含む：（ｉ）本発明のコンジュゲートの投与、ここでオリゴヌクレオチドは、２５〜３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡからなるダイサー基質であり、配列は、サイレンシングのための所望の標的遺伝子に関して選出され；及びセンス（パッセンジャー）鎖の３’末端又は５’末端において付着され、及び／又はアンチセンス（ガイド）鎖の５’末端において付着された、１〜２の本発明のＭＮＭにコンジュゲートされている；（ｉｉ）ＭＮＭにより可能にされたｓｉＲＮＡの膜貫通送達；（ｉｉｉ）ダイサー酵素によるｄｓＲＮＡの切断、それにより二重鎖から１つのＭＮＭを除去する；（ｉｖ）続く二本ヘリックスの生理学的分離（例えばアルゴノート／ヘリカーゼ酵素により）、ＲＩＳＣと相互作用する無傷アンチセンス鎖の解放をもたらして、特定の標的遺伝子を発現停止させる（図３）。
【０１７７】
このメカニズムをインビトロで実証するために、各鎖が５’末端において式（ＶＩＩＩｂ）による１つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗ  ＭＮＭにコンジュゲートされた２５〜２７−ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）；及びＭＮＭを欠いた対照の同一ｄｓＲＮＡを、２０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で、１単位の組み換えヒトダイサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に２４時間インキュベートした。次いで、各反応の３ｍｌアリコート（１５ｐｍｏｌ  ＲＮＡ）を１５％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＧｅｌＳｔａｒ（Ａｍｂｒｅｘ）で染色し、ＵＶ励起を用いて可視化した。図１６に示すように、２つのＭＮＭを含むコンジュゲートは、ダイサーにより効果的に切断され、より短いｄｓ−ＲＮＡ断片が生成され、ＭＮＭの１つが除去された。重要なことには、付着したＭＮＭは、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗ修飾を有さない２５〜２７ｄｓＲＮＡの切断と比較して、ダイサー仲介切断の効力の任意の有意な干渉を生じかなかった。図１６において：レーン＃１：２１−ヌクレオチドｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣの正しいサイズ；レーン＃２：ダイサーによるＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗ  ＮＭＮを含むコンジュゲートの切断、その結果１つのＭＮＭが除去される。２番目のＭＮＭは依然として付着しているため、ゲル中のコンジュゲート運動は僅かに遅くなる；レーン＃３：ヌクレオチドのいくつかに対するメチル化を有する２５〜２７ｄｓｉＲＮＡ、ダイサー酵素の基質である；レーン＃４：２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗ  ＭＮＭを含むｄｓｉＲＮＡコンジュゲート。レーン＃５：ダイサーを含まない２５〜２７ｄｓｉＲＮＡ。
【０１７８】
単離された酵素系におけるこれらの試験は、インビトロでの生細胞系におけるＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗを含むｓｉＲＮＡのコンジュゲートによって発揮されるＥＦＧＰ遺伝子の観察された効果的なサイレンシングによって更に支持された（実施例７ａ、７ｂ）。
【０１７９】
実施例７ａ：インビトロでのＨｅＬａ細胞内のＡｐｏ−Ｓｉ−ＷコンジュゲートによるＥＧＦＰ遺伝子のサイレンシング
この実証に使用した生物学的系は、向上された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を安定発現しているヒトＨｅＬａ細胞（ＮＩＨ−ＨｅＬａ  ＥＧＦＰ細胞）であった。投与された本発明のコンジュゲートは、ＥＧＦＰ遺伝子の発現を発現停止させるよう設計されたｓｉＲＮＡを含んでいた。通常、トランスフェクション試薬を使用しない限り、そのようなＲＮＡ構築物は細胞膜を貫通して、その遺伝子サイレンシング活性を発揮し得る細胞質に入ることはできない。本発明のＭＮＭ［例えば限定することなく、式（ＶＩＩＩｂ）（式中、ａ＝２、及びＬ３は無、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗと指定）に示す構造を有するＥ部分へのこのｓｉＲＮＡのコンジュゲーションにより、トランスフェクション試薬を必要とすることなく遺伝子サイレンシング活性が観察された。
【化６８】
2018523680.tif 000070
式（ＶＩＩＩｂ）；ａ＝２及びＬ３＝無の場合；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗと指定される。
【０１８０】
この目的のために、細胞を、式（ＶＩＩＩｂ）による２つのＭＮＭに結合した、ＥＧＦＰタンパク質（ＩＤＴ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）のサイレンシング用に設計されたｓｉＲＮＡを含む本発明のコンジュゲートと共にインキュベートした。二本鎖ＲＮＡの配列は：センス配列５’から３’：ＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．５）；アンチセンス配列５’から３’：ＣＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．６）であった。ＭＮＭ部分に結合したそれぞれの二本鎖ＤＮＡ配列は、そのようなＤＮＡ構築物が遺伝子サイレンシング活性を発揮できないため、対照として機能した。詳細には、実験の１日前、指数増殖期にあるＮＩＨ−ＨｅＬａ  ＥＧＦＰ細胞を、抗生物質を有さないＤＭＥＭ及び補充成長培地（５００μｌ／ウェル）を用いて、２４−ウェルプレート内に４．５×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。ｓｉＲＮＡ−Ａｐｏ−Ｓｉ−ＭＮＭコンジュゲートを１００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、最終濃度４０ｎＭで細胞に加えた。
【化６９】
2018523680.tif 000071
式（ＶＩＩＩｂ）；ａ＝２及びＬ３は無の場合；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗと指定される。
【０１８１】
遺伝子サイレンシングを７２時間のインキュベーションのにて評価した。その時点で、細胞をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）で洗浄し、分析に供した。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  ＰＲＯマルチモードリーダー（励起波長４８８±４．５ｎｍ及び発光波長５３５±１０ｎｍ）を使用して、ＥＬＩＳＡリーダーによりＥＧＦＰ−関連蛍光シグナルの検出及び定量化を行った。図９Ａに示すように、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗ  ＭＮＭに結合したｓｉＲＮＡのコンジュゲートで効果的な及び顕著な遺伝子サイレンシングが観察された。遺伝子サイレンシングは用量依存的に生じ、４０ｎＭのコンジュゲートで２２％の平均サイレンシングであり、それぞれコンジュゲート濃度３００ｎＭ及び６００ｎＭで５１％及び６８％に増大した（ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
実施例７ｂ：インビトロでの３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞内のＡｐｏ−Ｓｉ−ＷによるＥＧＦＰ遺伝子のサイレンシング
方法：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗが効果的にＥＧＦＰ遺伝子の発現を送達し及び発現停止させる能力を評価するために、２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗ  ＭＮＭをそれぞれのｓｉＲＮＡにコンジュゲートし（各鎖の５’末端に）、このコンジュゲートを３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞と共にインキュベートした。細胞を、２４−ウェルプレート（２５，０００細胞／ウェル）内の抗生物質を含まない完全培地中に播種した。血清を含まない培地を使用した最初の２４時間を除いて、細胞をＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗ−ｄｓｉ−ＲＮＡと共にこれらの条件下で７２時間インキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に、培地を吸引し、細胞を溶解緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．７５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール及び完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）］）に溶解した。次いで、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏマルチモードリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いてＥＧＦＰ蛍光強度を定量化し；励起波長は４８８ｎｍ、発光波長は５３５ｎｍであった。Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗ  ＭＮＭにコンジュゲートしていない同じｓｉＲＮＡ配列に曝露された細胞は、対照として役立った。
【０１８３】
結果：図９Ｂに示すように、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、６００ｎＭＭのコンジュゲートで観察された６５％阻害を有し、遺伝子発現の著しい用量依存的低下を発揮した（ｐ＜０．００１）。
【０１８４】
結論：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗコンジュゲートは、インビトロで、細胞質へのＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの送達の仲介、及びＥＧＦＰ−３Ｔ３細胞内でのそれぞれの遺伝子サイレンシングに効果的である。
【０１８５】
実施例７ｃ：インビトロでのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭ（式ＩＸｂ）を含むコンジュゲートによる、ＨｅＬａ細胞内のＥＧＦＰ遺伝子の遺伝子サイレンシング
コンジュゲートは、式（ＩＸｂ）による２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭを含んでいた。
【化７０】
2018523680.tif 000072
式（ＩＸｂ）：ａ＝３、ｂ＝０及びｋ＝１の場合；これはＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される：
【０１８６】
したがって、コンジュゲートは以下の構造を有した：
【化７１】
2018523680.tif 000073
【０１８７】
方法：ＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させる本発明のコンジュゲートの能力を評価するために、ＨｅＬａ−ＧＦＰ細胞を、蛍光ベースのアッセイ用に設計された２４ウェルプレート内に播種し（４０，０００細胞／ウェル）、ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートと共にインキュベートして、配列のＥＧＦＰ遺伝子を発現停止させた：
アンチセンス配列：５’−Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ−ＣＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．７）；センス配列：５’−Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ−ＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．８）。
【０１８８】
翌日、細胞をハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、培地を血清フリー−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２４時間変更した後、完全培地中で４８時間のインキュベーションを行った。トランスフェクションから７２時間後、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。ＥＧＦＰ蛍光強度をｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏマルチモードリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて、励起波長４８８ｎｍ；発光波長５３５ｎｍで定量化した。
【０１８９】
結果：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭコンジュゲートによるＥＧＦＰ遺伝子のサイレンシングを図９ｃに提示する。図示するように、ＥＧＦＰ遺伝子の効率的な用量依存的サイレンシングが観察された。平均で、対照未処理細胞と比較して、２つのＡｐｏ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭを含む１０ｎＭのｓｉＲＮＡコンジュゲートにより６２％遺伝子サイレンシングが観察された。サイレンシングは、コンジュゲート濃度を４０ｎＭに増大させると８０％に増大した。ｐ＜０．００１（図９Ｃ）。
【０１９０】
結論：２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭに結合したｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートは、ＨｅＬａ細胞におけるレポーター遺伝子ＥＧＦＰの強力なサイレンシングを示す。
【０１９１】
実施例７ｄ：インビトロでの、式（ＩＸｂ）；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓによる本発明のコンジュゲートによる、ＥＧＦＰ遺伝子を発現している３Ｔ３細胞における遺伝子サイレンシング：
方法：実験は、以下の修正を加えて上記の実施例７ｃに記載したように行った：ＥＧＦＰタンパク質を発現しているＮＩＨ−３Ｔ３マウス線維芽細胞株を、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター内にて１０％ＦＢＳ  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐで補充したＤＭＥＭ中で３７℃で成長させ及び維持した。次いで、細胞を上記のコンジュゲートと共に、濃度４０ｎＭ、１５０ｎＭ及び３００ｎＭで７２時間インキュベートした。続いて、ＥＬＩＳＡリーダーを使用してＥＧＦＰタンパク質蛍光の強度を定量化した。並行して、いずれの処理にも暴露されなかった（未処理）細胞が対照として役立った。
【０１９２】
結果：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓコンジュゲートで処理した細胞において、遺伝子発現の劇的なサイレンシングが観察された。観察されたＥＧＦＰ遺伝子サイレンシングの程度は、それぞれ４０ｎＭ、１５０ｎＭ及び３００ｎＭのコンジュゲートで処理された細胞において９０．０％、９１．５％、及び９２．０％（＋０．１％）であった。
【０１９３】
結論：したがって、この実施例は、「分子ナノモーター（ＭＮＭ）が：（ｉ）さもなくば膜−不透過性のｓｉＲＮＡの膜貫通送達。（ｉｉ）細胞質内へのＥ−ＲＮＡ−Ｅ’コンジュゲートの進路決定、及び；（ｉｉｉ）本発明のコンジュゲートを含む遺伝子サイレンシングタンパク質複合体の所望のパフォーマンスの発揮、を可能にすることを実証する。注目すべきことに、このコンジュゲートは、切断可能な基（ジスルフィド部分）に結合したＭＮＭを含み、本発明のコンジュゲートに組み込まれた切断可能な基のパフォーマンスを示している。
【０１９４】
実施例７ｅ：インビトロでのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇ  ＭＮＭを含むコンジュゲートによるＥＧＦＰレポーター遺伝子のサイレンシング
【化７２】
2018523680.tif 000074
式（ＩＸｃ）；ａ＝１、ｋ＝１、Ｌ３＝無の場合；この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇと指定される。
【０１９５】
方法：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｇ  ＭＮＭコンジュゲートが３Ｔ３−ＧＦＰ細胞内でＥＧＦＰ遺伝子をノックダウンする能力を評価するために、細胞を、蛍光ベースのアッセイ用に設計された２４ウェルプレート内に播種し（４０，０００細胞／ウェル）、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓを含むコンジュゲートと共にインキュベートした。翌日、細胞をハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、培地を血清フリー−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２４時間変更した後、完全培地中で４８時間のインキュベーションを行った。トランスフェクションから７２時間後、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。ＥＧＦＰ蛍光強度をｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏマルチモードリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて；励起波長４８８ｎｍ；発光波長５３５ｎｍで定量化した。
【０１９６】
結果：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｇ  ＭＮＭコンジュゲートによるＥＧＦＰ遺伝子サイレンシングを図９ｄに提示する。図示するように、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｇを含むコンジュゲートは、１０ｎＭのコンジュゲート濃度で平均６６％サイレンシングを示し、４０ｎＭで８４％サイレンシングに上昇した（ｐ＜０．００１）。
【０１９７】
結論：２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｇ  ＭＮＭに結合したｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートは、ＨｅＬａ細胞内でレポーター遺伝子ＥＧＦＰの効果的なサイレンシングを示した。同様の結果が、３Ｔ３−ＥＧＦＰ及び２９３Ｔ−ＥＧＦＰ細胞株でも得られた。
【０１９８】
まとめると、実施例７は、異なる構造を有するが、全て式（Ｉ）及び式（ＶＩＩ）によるコア構造的モチーフを共有し、全て細胞内へのｓｉＲＮＡの非常に効果的な送達及びそれぞれの遺伝子サイレンシングを示す、いくつかの異なる本発明のコンジュゲートを提示する。
【０１９９】
実施例８：Ｅが式（ＶＩＩａ）による構造を有する本発明のコンジュゲートの細胞膜を横切った送達：
【化７３】
2018523680.tif 000075
図（ＶＩＩａ）：式中、ａ＝２及びｋ＝１の場合、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定される。
【０２００】
３Ｔ３細胞及びＣ２６細胞を、上記の実施例５に記載したように成長させ及び調製した。細胞を、Ｃｙ３フルオロフォアに結合した、及び２つのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４部分に結合した５８−ｍｅｒ二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを含むコンジュゲートと共に１、２、及び２４時間インキュベートした。２つの濃度のコンジュゲートを試験した：４０ｎＭ及び１００ｎＭ。分析は、上記の実施例５に記載したように、蛍光顕微鏡法及びＥＬＩＳＡリーダーによるシグナル定量化を含んだ。Ｅ部分に結合していない同一の５８−ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡは、対照として役立った。
【０２０１】
細胞内のコンジュゲートの蛍光検出は、１時間後に既に可能であった。所望により、細胞質においてシグナルを獲得した。シグナル強度は、２時間で著しく増大し、２４時間のインキュベーションで更に増大した。取り込みは、ＥＬＩＳＡリーダーにより非常に明白に測定された：Ｃ２６細胞に関する、コンジュゲートと、ＭＮＭを欠いたそれぞれの対照ｄｓＤＮＡとのシグナル強度の比は：８０及び７２倍であり；一方、３Ｔ３では、比は、それぞれ４０ｎＭ及び１００ｎＭの濃度で、１０４及び１０１倍であった。したがって、両方の細胞型において、本発明のコンジュゲートは、ＭＮＭ部分を欠いた対照と比較して、高く荷電した５８−ｍｅｒ  ｄｓ−ＤＮＡの非常に効率的な送達を可能にした。
【０２０２】
実施例９ａ：Ｅ、Ｅ’又はＥ”が環状ジスルフィド部分及びアミド部分を含む、本発明のコンジュゲートの酸化還元感受性切断のメカニズム：
【化７４】
2018523680.tif 000076
【０２０３】
このメカニズムを非限定に提示する。このコンジュゲートは、６員環内にジスルフィド部分を有する。細胞外空間で支配的な酸化条件により、この環は、血漿及び細胞外空間内で安定性を示す。対照的に、細胞内では、このコンジュゲートは、細胞質中の高いグルタチオンレベルにより提供される還元的周囲条件に供される。その結果、ジスルフィド結合が切断し、遊離チオール基がもたされる。他の環状ジスルフィド分子との類似性に基づいて、遊離チオール基のｐＫａ値は約８及び９である。約７の生理学的細胞内ｐＨを考慮すると、ジスルフィド結合の切断後に生じた大部分のチオール基は、何時でも遊離チオール基（−ＳＨ）であり、それぞれのチオレート（−Ｓ−）（より求核的であると見なされる）としてではない。戦略的に、アミドカルボニル基は、チオール基から５及び６原子離れた位置にある。システインプロテアーゼのタンパク質分解の触媒作用におけるその作用と同様、アミド基のカルボニル炭素原子上で求核攻撃が起こり、エストラジオール部分の切断がもたされる。したがって、この作用は細胞質中でカーゴ薬物（Ｄ）を選択的に解放する。Ｄが例えばｓｉＲＮＡである場合、これは高く負に荷電したオリゴヌクレオチドの細胞質中の捕捉をもたらし、その遺伝子サイレンシング活性を発揮するための、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）とのインサイチューの相互作用が容易となる。
【０２０４】
このメカニズムを図１０に記載する。図中、Ａ．は、細胞外空間内（ｎ）の無傷コンジュゲートを表し；Ｂ．は、還元的細胞質環境内でのジスルフィド結合の切断を表し；Ｃ．は、ｐｋａ−依存性プロセスにおいて、チオレートを提供するチオールの脱プロトン化を表し；Ｄ．は、アミド基のカルボニル部分上のチオレートの求核攻撃を表し；Ｅ．は、四面体の中間体の生成を表し；Ｆ．は、その結果としてのコンジュゲートの切断と、チオエステルの生成を表し；Ｇ．は、続く加水分解を表し；Ｈ．は、身体からのＭＮＭの分泌中、細胞外空間の酸化環境に遭遇したジスルフィド基の形成による閉環を表す。
【０２０５】
実施例９ｂ：Ｅが式（Ｘｃ）による構造を有する、本発明のコンジュゲートの酸化還元感受性切断のメカニズム、及び細胞質へのカーゴ薬物（Ｄ）の標的化のためのその使用：
【化７５】
2018523680.tif 000077
【０２０６】
アミド結合を含む式（ＩＸ）による化合物の切断に関して上述したものと同じメカニズムが、カルバメート基を含む式（Ｘｃ）による化合物の切断にも適用される。図１１に記載するように：Ａ．は、細胞外空間内（ｎ）の無傷コンジュゲートを表し；Ｂ．は、還元的細胞質環境内でのジスルフィド結合の切断を表し；Ｃ．は、ｐｋａ−依存性プロセスにおいて、チオレートを提供するチオールの脱プロトン化を表し；Ｄ．は、アミド基のカルボニル部分上のチオレートの求核攻撃を表し；Ｅ．は、四面体の中間体の生成を表し；Ｆ．は、その結果としてのコンジュゲートの切断と、チオエステルの生成を表し；Ｇ．は、ＣＯ２の放出も伴う、続く加水分解を表し；Ｈ．は、身体からのＭＮＭの分泌中、細胞外空間の酸化環境に遭遇したジスルフィド基の形成による閉環を表す。
【０２０７】
実施例１０：式（ＸＩａ）による構造の安定性：
本発明のコンジュゲートの合成は、習慣的に、化学的基による、合成したオリゴヌクレオチドの核酸塩基の保護を含む。例えば、アデニンは、多くの場合、ベンゾイル保護基により保護され、グアニンはイソブチリルにより、シトシンはアセチルにより保護される。これらの保護基は、機能性オリゴヌクレオチドを得るために、合成の終了時に除去される必要がある。この除去は、強塩基性条件下で習慣的に行われる。例えば、オリゴヌクレオチドの合成中の保護基の除去のための標準的なＩＤＴ（Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）プロトコルは、水酸化アンモニウムとの６５℃で２時間のインキュベーションを含む。本発明の化合物がこれらの厳しい条件下で脱保護を持続できるか否かを評価するために、以下の構造を有する以下のモデル化合物Ａに基づいたモデル系を構築した：
【化７６】
2018523680.tif 000078
【０２０８】
２ｍｇのこの化合物を、脱保護に使用する上記の標準的な条件下でインキュベートした。サンプルを１５分後に引き出し、１及び２時間インキュベーションし、ＨＰＬＣ／ＭＳで評価して、新たなピークの形成を探索及び分析した。重要なことには、上記のプロトコルの条件下で、化合物Ａの分解の兆候は存在しなかった。したがって、この本発明の化合物の類似体は、これらの比較的厳しい塩基性条件下での安定性を示した。加えて、本発明のコンジュゲートの合成中のオリゴヌクレオチドの脱保護に対するこの観察事項に関連して、この観察された高い安定性は、保管中のこれらのコンジュゲートの安定性も示唆する。
【０２０９】
実施例１１：式（ＶＩＩａ）（式中、ａ＝２、及びｋ＝１）（Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定）による本発明のコンジュゲートによる、ＥＧＦＰ遺伝子を発現している遺伝子導入マウスの肝細胞の一次培養物において発揮された遺伝子サイレンシング：
実施例７に特定した二本鎖ＲＮＡ配列を、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定された式（ＶＩＩａ）（式中、ａ＝２、及びｋ＝１）による２つのＭＮＭに付着させた。次いで、コンジュゲート（４０ｎＭ）をヒストン２Ａタンパク質（ヒストンＨ２Ａ、分子量１４ｋＤａ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）と共に３０分間（２：１ヒストン／ＲＮＡ比で）インキュベートして、ＲＮＡ＋ＭＮＭ＋タンパク質複合体を生成した。次いで、複合体を、ＥＧＦＰ遺伝子を発現している、遺伝子導入マウスの肝細胞の一次培養物の細胞と共にインキュベートした。７２時間後、実施例７に記載したように、ＥＬＩＳＡリーダーを使用してＥＧＦＰシグナルの蛍光を定量化した。図１２に示すように、同じＲＮＡ配列＋Ｈ２Ａを含むが本発明のＭＮＭを有さない対照複合体と共にインキュベートした細胞の蛍光シグナルと比較して、７６％のＥＧＦＰシグナルの顕著な低下が観察された。これらの結果は、巨大分子構造の膜貫通送達を可能にすることにおける、本発明のＭＮＭの強力なパフォーマンスを示す：ｄｓＲＮＡ＋Ｈ２Ａ＋２つのＡｐｏ−Ｓｉ  ＭＮＭの複合体は、約３０ｋＤａの分子量を有し、多数の電荷を保有している。結果から明らかなように、この複合体は細胞膜を効果的に横切ることができ、更に、遺伝子サイレンシングにおいて有益な生物学的パフォーマンスを発揮した。ＭＮＭを欠いていた対照複合体のパフォーマンスと比較することにより、観察された結果は本発明のＭＮＭだけに起因させることができる。
【０２１０】
実施例１２：Ｅ、Ｅ’又はＥ”が以下の式による構造を有する本発明のコンジュゲートの酸化還元感受性切断のメカニズム、及び細胞質へのカーゴ薬物（Ｄ）の標的化のためのその使用：
【化７７】
2018523680.tif 000079
【０２１１】
図１３に記載する、式（ＶＩＩ）；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−１による例示的な化合物において：Ａ．は、細胞外空間内（ｎ）の無傷コンジュゲートを表し；Ｂ．は、還元的細胞質環境内でのジスルフィド結合の切断を表し；Ｃ．は、ｐｋａ−依存性プロセスにおいて、チオレートを提供するチオールの脱プロトン化を表し；Ｄ．は、アミド基のカルボニル部分上のチオレートの求核攻撃を表し；Ｅ．は、四面体の中間体の生成を表し；Ｆ．は、その結果としてのコンジュゲートの切断と、チオエステルの生成を表し；Ｇ．は、ＣＯ２の放出も伴う、続く加水分解を表し；Ｈ．は、身体からのＭＮＭの分泌中、細胞外空間の酸化環境に遭遇したジスルフィド基の形成による閉環を表す。
【０２１２】
実施例１３：本発明のＥ部分のリン脂質膜との相互作用を示す分子動的シミュレーション（ＭＤ）試験
この実証のため、３つ化合物を選出した。それらの構造を下記に示す：ａ．式（ＶＩＩ）による化合物、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−１と指定；ｂ．式（ＶＩＩ）による化合物、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２と指定；ｃ．式（ＩＸｂ）による化合物、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される。
【化７８】
2018523680.tif 000080
【０２１３】
方法：１２８  ＰＯＰＣ脂質及び２０Å  ＴＩＰ３Ｐ水層からなる、予備平衡化した（３０３０Ｋで４００ｎｓｅｃ）ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）二層膜をＳｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｌｉｐｉｄｓウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｍｍｋｌｕｓｔｅｒ．ｆｏｓ．ｓｕ．ｓｅ／ｓｌｉｐｉｄｓ／Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌ）からダウンロードした。ＡｎｔｅＣｈａｍｂｅｒソフトウェアを使用してＡｐｏ−Ｓｉ化合物Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−１、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２及びＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓをパラメータ化した。Ｇｒｏｍａｃｓ（ｖ．４．５）にて実行されるように、ＡＭＢＥＲ１２ｓｂ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄを使用してシミュレーションを行った。全化合物は、当初、膜に平行な配向で水層中に位置づけた。溶液にイオンを添加して系を電気的に中性とし、濃度０．１５Ｍ  ＮａＣｌとした。この系を最初に、それらの初期位置に制約される化合物により最小化し、続いて５０，０００ステップの最急降下法を用いて制約をなくした。次に、系を平衡化した；最初にＮＶＴ条件下で（５００ｐｓｅｃ）、続いてＮＰＴ条件下で（２ｎｓｅｃ）。ＮＶＴ平衡化中、温度を徐々に３０３ｏＫ（脂質の相転移温度を超える）に上昇させた。垂直（ｚ）方向において脂質頭部基及び化合物に位置的制約を課した。ＮＰＴ平衡化は、化合物のみに対する位置的制約を保ちながら、準等方性圧力カップリングを有するＨｏｓｅ−Ｈｏｏｖｅｒサーモスタットを使用した。生成ＭＤシミュレーションをＮＰＴ条件下で１００ｎｓ行った。全シミュレーションは、ファンデルワールス及びクーロン相互作用に関する１２Åカットオフを使用した。Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｓｈ  Ｅｗａｌｄ  Ｓｕｍｍａｔｉｏｎを使用して長距離静電気相互作用を計算した。周期的境界条件を適用した。ＬＩＮＣＳアルゴリズムを使用して、結合長を制約した。
【０２１４】
結果：図１４に示すように、当初、各分子は、膜周囲水層内に配置した。重要なことに、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−１及びＡｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２では３０ｎｓｅｃで、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓでは１００ｎｓｅｃで（それぞれ図１４Ａ、Ｂ、Ｃ）、分子はシフトし、膜炭化水素コア内で水／脂質界面から、各分子が最終的に残留する膜中心に垂直方向に移動した。各化合物に関して、ペルフルオロ−部分、即ちそれぞれのＭＮＭの陰極（白の矢印）は、膜中心に向かって牽引されることが見出された。移動の同一パターンが、調べた３つの化合物の全部に観察された。
【０２１５】
結論：したがって、リン脂質膜の力場に対する分子のエネルギー論を分析するこの精巧で非バイアスの計算作業は、本発明のＭＮＭの作用メカニズム（ＭＯＡ）に対する追加の検証を提供する。３つの分子によって示される同様の観察は、それらのパフォーマンスの根底にある統一された作用メカニズムを支持する。二極性膜電位に応答する様式で、ＭＮＭの水／炭化水素連結部から膜中心への移動を担う、ＭＮＭの構造／機能特性が実証された。
【０２１６】
実施例１４：全身投与後の本発明のコンジュゲートの広範な全身分布を高めるための、部分Ｅ内への「動的プロトン化部分」の導入：
巨大分子カーゴ薬物を含む本発明のコンジュゲートの効果的な膜貫通送達を行うために、部分Ｅは疎水性構造を有する。そのような部分は、血漿タンパク質、主にアルブミンに貪欲に結合する特徴を有する。この血漿タンパク質に対する強い結合は、これらのコンジュゲートの分布量をかなり制限し、血管内コンパートメントへの分布を制限し得る。このことは、広範な全身分布を有し、身体全体における様々な組織に到達するように設計されるコンジュゲートの所望のプロファイルとは対照的である。このような潜在的な制限に対処するために、本発明は、Ｅ内へのアミン基の導入を含む。このような基は、式（ＶＩＩＩｂ、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗ）により示される構造に例示されている：
【０２１７】
【化７９】
2018523680.tif 000081
式（ＶＩＩＩｂ）；ａ＝２、及びＬ３は無の場合；
Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗと指定される。
形態Ａ（非荷電アミン）
【化８０】
2018523680.tif 000082
形態Ｂ（プロトン化された、正に荷電したアンモニウム）
アミン基の導入は、Ｅ部分の２つの形態を生じる：
【０２１８】
形態Ａ：疎水性
この形態は、アミンがその非荷電形態にある場合に生じる。この形態は、二極性膜電位に関連した内部膜電界を利用して、付着された巨大分子薬物を細胞膜に結合させ、膜を横切るよう駆動する分子ナノモーターの効果的な形態である。
【０２１９】
形態Ｂ：比較的親水性
この形態は、アミンのプロトン化後に生じる。このプロトン化により、生理学的ｐＨ７．４における分子の脂質／水分配係数（Ｌｏｇ  Ｄ）は、ほぼ３桁低下する。加えて、Ｅ部分の中心に正電荷を導入することにより、膜中心において正である二極性膜電位とのＥ部分の適合性を阻害し、かくしてＥの膜内挿入及びその膜内移動を拒絶する。この形態にあるため、次いでコンジュゲートは、身体内の流体コンパートメント、即ち血漿、細胞内又は細胞外流体全域で自由に移動する間、細胞膜又は血漿タンパク質に低い度合で結合する。この形態はまた、カーゴ薬物からの切断後に所望されるように、身体からのＥ部分の分泌（尿又は胆汁を介して）を高め及び促進する。
【０２２０】
Ｅ部分の形態Ａと形態Ｂとの間の比を決定する主な因子は、アミン基のｐＫａである。このアミンのような第２級アミンは、通常、約１１のｐＫａ値を有する一方、本発明の部分Ｅは、アミン基が８．５のｐＫａを有する例示的なＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗとして設計された。結果として、任意の所定の時点において、及び身体内の任意のコンパートメント内で、かなりの量の両方の形態Ａ及び形態Ｂが、これらの形態の間を転換させることが可能な分子と遭遇する。したがってこのことは、細胞膜を通したコンジュゲートの効果的な膜貫通通過を提供する分子ナノモーターの特性と組み合わせされて、身体内のコンジュゲートの広い全身分布を可能とする。更に、この系は、パフォーマンスを最大にするように炭化水素リンカー及び関連ペルフルオロ−モチーフの長さを変化させることによって、容易に較正することができる。
【０２２１】
実施例１５：式（ＩＸｂ）による本発明のコンジュゲートによる肝臓ネズミＨｅｐａ  １−６細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現のサイレンシング：
【化８１】
2018523680.tif 000083
式（ＩＸｂ）：ａ＝３、ｂ＝０及びｋ＝１の場合、この部分はＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される。
【０２２２】
ＰＣＳＫ９は、血液コレステロールレベルを低下させる役割を有する。即ち、ＰＣＳＫ９がＬＤＬ受容体に結合した際、受容体は破壊され、もはやＬＤＬコレステロールを血液から除去することができない。したがって、ＰＣＳＫ９が遮断された場合、より多くのＬＤＬ受容体が肝臓の表面上に存在し、より多くのＬＤＬコレステロールを血液から除去するよう作用し、それにより血液コレステロールレベルが低下する。この実施例の重要性は、疾病の病態形成（この場合、高コレステロール血症）における役割を有し得る遺伝子を発現停止させる本発明のコンジュゲートの能力の実証であり、ここでそれぞれの遺伝子サイレンシングは治療的戦略に役割を有し得る。加えて、この実施例は、関連細胞、即ちこの場合では肝臓細胞の細胞株におけるそれぞれの遺伝子サイレンシングを実証する。したがって、本発明のコンジュゲートの活性が疾病関連遺伝子のサイレンシングへと、ＥＧＦＰ等のレポーター遺伝子のサイレンシングを超えることを実証する。
【０２２３】
調べたコンジュゲートは２つのＥ部分を有し、それぞれはＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定された式（ＩＸｂ）による構造を有し、したがって、下記に記載する構造を有し、本明細書で「Ｅ−ＲＮＡ−Ｅ’コンジュゲート」と称される一般式（Ｉ）によるコンジュゲートを形成する。Ｅ部分はＳｙｎｃｏｍ，Ｌｔｄ．，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより構築された。ＲＮＡへのコンジュゲーションはＩＤＴ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡ．により行った。コンジュゲートの構造は、下記であった：
【化８２】
2018523680.tif 000084
【０２２４】
コンジュゲートのｄｓＲＮＡ部分は、ＰＣＳＫ９遺伝子を発現停止させるよう特別に設計された２５〜２７ダイサー基質、二本鎖ＲＮＡを含み、結合された。本発明のコンジュゲートは、同じ配列であるが、Ａｐｏ−Ｓｉ分子ナノモーターを欠いたＲＮＡ対照と比較して、４００ｎＭの用量で、ＰＣＳＫ９遺伝子のサイレンシングを７５．５％程度まで誘導することが見出された（ｐ＜０．００１）。
【０２２５】
したがって、この実施例は、「分子ナノモーター（ＭＮＭ）が：（ｉ）さもなくば膜−不透過性のｓｉＲＮＡの膜貫通送達。（ｉｉ）細胞質内へのＥ−ＲＮＡ−Ｅ’コンジュゲートの進路決定、及び；（ｉｉｉ）疾病関連遺伝子の発現のサイレンシングにおける所望のパフォーマンスの発揮、を可能にすることを実証する。
【０２２６】
実施例１６：式（Ｘｂ）（Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２）による本発明のコンジュゲートによる、ＥＧＦＰ遺伝子を発現している３Ｔ３細胞内で発揮される遺伝子サイレンシング：
この実施例で調べたコンジュゲートは、Ｅ及びＥ’がそれぞれ式（Ｘｂ）（式中、Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝Ｈ、ａ＝２、Ｗ＝Ｏ、ｋ＝１）に示す構造を有し；以下の構造を有し、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２と指定されるコンジュゲートであった：
【化８３】
2018523680.tif 000085
【０２２７】
細胞は、ＥＧＦＰ遺伝子を安定発現している３Ｔ３細胞であった。細胞株を１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌで補充したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させ、５％ＣＯ２、加湿空気を有するインキュベーター内で３７℃で維持した。トランスフェクションの１日前、２５，０００の３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞を２４−ウェルチャンバ内に蒔いた。翌日、ＥＧＦＰ遺伝子（実施例１２に記載した配列）をノックダウンするよう設計されたｓｉ−ＲＮＡ配列にコンジュゲートされたＡｐｏ−Ｓｉ−Ｘ−２（０．６μＭ）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、培地を吸引し、細胞を溶解し、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  ＰＲＯマルチモードリーダーにより蛍光定量化に供した。励起４８８±５ｎｍ及び発光５３５±１０ｎｍでＥＧＦＰタンパク質レベルを定量化した。Ａｐｏ−Ｓｉ分子ナノモーターを欠いたｓｉＲＮＡで処理した対照と比較して、本発明のコンジュゲートで処理した細胞は、遺伝子発現の７５％までのノックダウンを示し、コンジュゲートのパフォーマンスを実証した。
【０２２８】
実施例１７：ＭＮＭのプロトン化状態に依存（ｐｅｎｄｉｎｇ  ｏｎ）することを伴う、本発明でパフォーマンス向上部分として利用される動的プロトン化の原理を例示する分子シミュレーション試験は、一緒になってコンジュゲートの分布量を増大させる、血漿又は細胞質中で移動可能な分子の水溶性形態、及び細胞膜環境内で移動可能な水不溶性形態の両方を提供する。
【０２２９】
方法：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗの非プロトン化及びプロトン化形態の相互作用の分子シミュレーション試験を、実施例１３に記載したように行った。使用したＭＮＭは、ホスフェート基に結合した式（ＶＩＩＩｂ）によるＡｐｏ−Ｓｉ−Ｗの構造のものであり、ＲＮＡのホスフェート基をシミュレートした。Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｗの第３級アミンの２つのプロトン化状態を、実施例１４に従って使用した：非プロトン化；及びプロトン化（正に荷電した）。各プロトン化状態の構造を、１００ナノ秒のシミュレーションが達成されるまで、リン脂質膜のコンピュータ化分子シミュレーションモデルシステムにおいて数日間独立して実行した。各構造の初期の位置は、膜表面に平行であった。
【化８４】
2018523680.tif 000086
【０２３０】
結果：図１５は、１００ナノ秒実行の終わりの各分子の代表的な位置を示す。プロトン化された、正に荷電した形態の図１５Ａは、シミュレーション期間中、膜から排除されていることが判明した。対照的に、疎水性の非プロトン化形態の分子は、リン脂質膜内への卓越した分割を示した（図１５Ｂ）。興味深いことに、及び重要なことには、非荷電形態の膜内への膜分割は内部膜電界の極性に従い、ＭＮＭの陰極は膜の中心、即ち電界の陽極に到達した。
【０２３１】
結論：この分子シミュレーションモデルで評価されたように、単一の、動的にプロトン化した窒素原子のプロトン化状態は、Ｅモチーフ全体の膜相互作用を支配することが可能であった。
【０２３２】
実施例１８：本発明のコンジュゲートによるＳ１６細胞内のＰＭＰ２２遺伝子のサイレンシング：
シャルコー・マリー・トゥース病は、神経線維の電気的隔離にとって重要な末梢神経のミエリン鞘を構成するシュワン細胞に影響を及ぼす一般的な神経障害である。この疾患を有する患者では、シュワン細胞の重要な構造タンパク質であるタンパク質ＰＭＰ２２をコードする遺伝子セグメントの三重化が存在し、シュワン細胞の有害な代謝経路である過剰量のＰＭＰ２２をもたらし、それらの退化において最高点に達する。したがって、ＰＭＰ２２遺伝子をサイレンシングするように設計されたｓｉＲＮＡは、シュワン細胞のタンパク質過負荷を低減するのに有益であり、それぞれ疾病の進行を停止させ、適切な組織再生を可能にし得る。
【０２３３】
方法：ＰＭＰ２２遺伝子の発現を発現停止させる本発明のコンジュゲートの能力を実証するために、本発明者らは、各鎖（ｓｔａｎｄ）の５’末端において本発明のＥ、Ｅ’又はＥ”にコンジュゲートされた特定のそれぞれのｓｉＲＮＡ配列、それぞれのｓｉＲＮＡ二重鎖を使用し、Ｅ、Ｅ’又はＥ”のそれぞれは式（ＩＸｂ）（式中、ａ＝３、ｂ＝０、ｋ＝１）に示す構造を有した。この部分は、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓと指定される：
【化８５】
2018523680.tif 000087
【０２３４】
使用した細胞系はＳ１６細胞であった。これはラットのシュワン細胞起源のものである。この細胞を６ウェルプレート内に播種した（８００，０００細胞／ウェル）。翌日、細胞をハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、次いで培地を血清フリーＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に変更した。細胞を４００ｎＭ及び６００ｎＭのＡｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ−ｄｓｉ−ＲＮＡ（ダイサーの基質）で２４時間処理し、その後完全培地で更に２４時間処理した。トランスフェクションから４８時間後、培地を吸引し、細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し、ＲＮＡを製造業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってｐｕｒｅ  ｌｉｎｋ  ＲＮＡ抽出ミニキットで抽出した。次いで、ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡをＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲに供した。
【０２３５】
結果：Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ−ＭＮＭコンジュゲートがＰＭＰ２２の発現をノックダウンする能力を、図１７に提示する（平均±ＳＤ）。未処理細胞、及びＥＧＦＰ（及びＰＭＰ２２）に対抗するｓｉＲＮＡで処理した細胞は、対照としての役割を果たした。図示するように、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ  ＭＮＭコンジュゲートはＰＭＰ２２遺伝子の発現レベルを用量依存的に効果的にノックダウン（発現停止）し、未処理細胞と比較して、４００ｎＭの用量で５７％サイレンシングが観察され、６００ｎＭ用量で６６％に上昇した。
【０２３６】
結論：２つの本発明のＭＮＭに結合したＰＭＰ２２に対抗するｓｉＲＮＡを含む本発明のコンジュゲート［Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｓ−Ｓ−ｄｓｉ−ＲＮＡ（ダイサーの基質）］は、過剰発現したＰＭＰ２２タンパク質をコードする疾病関連遺伝子の発現を発現停止させる能力を示すことによって、シャルコー・マリー・トゥース病に対する有効な処置としての潜在的有用性を示す。
【０２３７】
実施例１９：式（ＶＩＩａ）（式中、ａ＝２、及びｋ＝１；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定）による本発明のコンジュゲートの膜貫通送達と、二極性膜電位／内部膜電界（ＩＭＥＦ）との間の直接的関連性の実証
フロレチンは、二極性膜電位及び関連ＩＭＥＦの阻害剤であり、一方、６−ケト−コレスタノール（６−ＫＣ）は、ＩＭＥＦの強力なエンハンサーである）。したがって、双極子ポテンシャルモジュレーター、フロレチン又は６−ＫＣの効果と、上記の本発明のコンジュゲート（配列：センス：／５’−ＭＮＭ／ＴＴ／ｉＣｙ３／ＣＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．９）；
アンチセンス：／５’−ＭＮＭ／ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．Ｎｏ．１０）のｄｓＤＮＡに結合したＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４  ＭＮＭを含む；式中、Ｃｙ３は、赤色フルオロフォアである）の取り込みレベル；との間の潜在的な関係性を調べた。
【０２３８】
方法：
実験の１日前、指数増殖期にある３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞を、抗生物質を有さないＤＭＥＭ完全培地を用いて、６−ウェルプレート内に５×１０５細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞をフロレチン７５０μＭと共に３７℃で、又は６−ＫＣ１００μＭと共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、６−ＫＣを洗い流した一方、フロレチンを培地中に保持した。上述したコンジュゲートを５００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈し、上記の細胞に最終濃度４０ｎＭで２時間添加した。コンジュゲートの送達を、トランスフェクションから２時間後に評価した。その時点で、細胞をトリプシン処理し、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）で補充し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、細胞をハンクス緩衝塩溶液で再懸濁し、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖａソフトウェアを利用して、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析に供した。各サンプルについて、全部で１０４の事象が収集された。
【０２３９】
結果：
ＦＡＣＳ分析は、上記の本発明のコンジュゲートが細胞内への効率的な送達が可能であり、６８％の細胞がすでに２時間のインキュベーションで標識されていることを確認した。対照的に、フロレチンで処理した細胞のわずか１．５％がＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４コンジュゲートの結合を示した（図１８Ａ）。６−ケト−コレスタノールは、細胞によるＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４コンジュゲートの取り込みの増加を誘導した（図１８Ｂ）：明視野画像によって評価された細胞の数は等しかったが、Ｃｙ３蛍光は６−ＫＣ細胞内で著しく高く、これらの細胞内への著しく高い取り込みを示した。
【０２４０】
結論：この実験に例示されているように、二極性膜電位および内部膜電界のそれぞれのシャットダウン又はターンオンは、Ａｐｏ−Ｓｉ−ＭＮＭ構築物の取り込みを決定し、また該取り込みに直接関連する。
【０２４１】
実施例２０：本発明の分子の極性の構造／機能
目的：式（ＶＩＩ）〜（ＸＩｄ）による全ＭＮＭが共有する非対称極性の重要性を実証すること：
方法：
この目的のために、２つの類似したコンジュゲートを構築し、評価した：
（ｉ）それぞれ式（ＶＩＩａ）に示す構造を有し；Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４と指定されるＥ及びＥ’に結合したｄｓＤＮＡのコンジュゲート：
【化８６】
2018523680.tif 000088
【０２４２】
（ｉｉ）ＥおよびＥ’がそれぞれＡｐｏ−Ｓｉ−Ｃ４の構造を有するが、フッ素原子を欠いており、分子の非対称極性の生成において重要な寄与を有する、対照Ａと指定される「類似した改変類似体：
【化８７】
2018523680.tif 000089
【０２４３】
これらのＭＮＭ部分の両方を、Ｃｙ３−フルオロフォアで標識した５８−ｍｅｒ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合し、ＦＡＣＳ分析に供した。
【０２４４】
実験の１日前、指数増殖期における３Ｔ３−ＥＧＦＰ細胞を、抗生物質を有さない、ＤＭＥＭ完全培地を有する６−ウェルプレート内に０．２〜０．５×１０５細胞／ウェルの密度で蒔いた。ＥＣｙ３−標識オリゴヌクレオチド（ＭＮＭを有する又は有さない）のそれぞれを５００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈し、最終濃度４０ｎＭで細胞に加えた。コンジュゲートの送達を２〜２４時間のインキュベーションにて評価した。インキュベーション期間の後、細胞をトリプシン処理し、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ緩衝液；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）で補充し、１１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、細胞をハンクス緩衝塩溶液で再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用しＣｅｌｌ  Ｄｉｖａソフトウェアを利用した分析に供した。各サンプルに関して、全部で１０４事象を収集した。対照コンジュゲートとインキュベートした細胞に対する、Ａｐｏ−Ｓｉ−４Ｃコンジュゲートとインキュベートした細胞における蛍光強度の測定を用いて、Ｃｙ３−ポジティブ細胞集団の検出及び定量化を行った。
【０２４５】
結果：
Ａｐｏ−Ｓｉ−４Ｃコンジュゲートと共にインキュベートした殆どの細胞が、インキュベーションから２時間後に既に強力な（ｓｔｒｏｎ）Ｃｙ−３蛍光シグナルを示した。シグナル強度は、２４時間のインキュベーションにより更に増大した。対照的に、対照Ａコンジュゲートと共にインキュベートした細胞は、２時間及び２４時間のインキュベーションのいずれでも、任意の有意なＣｙ３シグナルを示さなかった。
【０２４６】
結論：
実施例は、本発明のＭＮＭの機能を可能にする際の非対称極性の重要性を示す。この原理は、式（ＶＩＩ）〜（ＸＩｄ）による全化合物により共有され、したがって実施例は、膜貫通送達における機能を含む、本発明を統合する一般的規則を示す。
【図１Ａ】
2018523680.tif 000152
【図１Ｂ】
2018523680.tif 000153
【図２Ａ】
2018523680.tif 000154
【図２Ｂ】
2018523680.tif 000155
【図２Ｃ】
2018523680.tif 000156
【図３Ａ】
2018523680.tif 000157
【図３Ｂ】
2018523680.tif 000158
【図４】
2018523680.tif 000159
【図５Ａ】
2018523680.tif 000160
【図５Ｂ】
2018523680.tif 000161
【図５Ｃ】
2018523680.tif 000162
【図５Ｄ】
2018523680.tif 000163
【図５Ｅ】
2018523680.tif 000164
【図５Ｆ】
2018523680.tif 000165
【図５Ｇ】
2018523680.tif 000166
【図６Ａ】
2018523680.tif 000167
【図６Ｂ】
2018523680.tif 000168
【図６Ｃ】
2018523680.tif 000169
【図７】
2018523680.tif 000170
【図８】
2018523680.tif 000171
【図９Ａ】
2018523680.tif 000172
【図９Ｂ】
2018523680.tif 000173
【図９Ｃ】
2018523680.tif 000174
【図９Ｄ】
2018523680.tif 000175
【図１０Ａ】
2018523680.tif 000176
【図１０Ｂ】
2018523680.tif 000177
【図１０Ｃ】
2018523680.tif 000178
【図１０Ｄ】
2018523680.tif 000179
【図１０Ｅ】
2018523680.tif 000180
【図１０Ｆ】
2018523680.tif 000181
【図１０Ｇ】
2018523680.tif 000182
【図１０Ｈ】
2018523680.tif 000183
【図１１Ａ】
2018523680.tif 000184
【図１１Ｂ】
2018523680.tif 000185
【図１１Ｃ】
2018523680.tif 000186
【図１１Ｄ】
2018523680.tif 000187
【図１１Ｅ】
2018523680.tif 000188
【図１１Ｆ】
2018523680.tif 000189
【図１１Ｇ】
2018523680.tif 000190
【図１１Ｈ】
2018523680.tif 000191
【図１２】
2018523680.tif 000192
【図１３Ａ】
2018523680.tif 000193
【図１３Ｂ】
2018523680.tif 000194
【図１３Ｃ】
2018523680.tif 000195
【図１３Ｄ】
2018523680.tif 000196
【図１３Ｅ】
2018523680.tif 000197
【図１３Ｆ】
2018523680.tif 000198
【図１３Ｇ】
2018523680.tif 000199
【図１３Ｈ】
2018523680.tif 000200
【図１４Ａ】
2018523680.tif 000201
【図１４Ｂ】
2018523680.tif 000202
【図１４Ｃ】
2018523680.tif 000203
【図１５Ａ】
2018523680.tif 000204
【図１５Ｂ】
2018523680.tif 000205
【図１６】
2018523680.tif 000206
【図１７】
2018523680.tif 000207
【図１８Ａ】
2018523680.tif 000208
【図１８Ｂ】
2018523680.tif 000209
【配列表】
2018523680000001.app
【国際調査報告】
2018523680.tif 000210