(57)【要約】  本発明は、生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備えるデバイスを対象とする。各上記生体分子プロセッサは：固体基板によって画定されたバイオリアクタチャンバ；上記バイオリアクタチャンバ内の、上記固体基板に取り付けられた、複数の離間した支持構造体；及び上記複数の離間した支持構造体の一部又は全てに対して不動化された、１つ又は複数の捕集分子を備え、上記１つ又は複数の捕集分子は、試料中の標的核酸分子の一部分に結合するのに好適である。上記デバイスはまた、１つ又は複数のナノチューブを備え、これは上記固体基板によって画定され、また上記バイオリアクタチャンバに流体接続される。上記１つ又は複数のナノチューブはそれぞれ、上記バイオリアクタチャンバの近位の入力端部と、上記バイオリアクタチャンバの遠位の出力端部との間に延在する通路を有し、また上記通路内に１つ又は複数のナノ細孔を備え、各上記ナノ細孔は、上記通路より小さい直径を有する。上流での試料の調製のための１つ又は複数のユニットを含むシステムも開示される。これらのデバイス又はシステムを使用する方法も開示される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子プロセッサであって、各前記生体分子プロセッサは：
固体基板によって画定されたバイオリアクタチャンバ；
前記バイオリアクタチャンバ内の、前記固体基板に取り付けられた、複数の離間した支持構造体；
前記複数の離間した支持構造体の一部又は全てに対して不動化された、１つ又は複数の捕集分子であって、前記１つ又は複数の捕集分子は、試料中の標的核酸分子の一部分に結合するのに好適である、１つ又は複数の捕集分子
を備える、生体分子プロセッサ；並びに
前記固体基板によって画定され、また前記バイオリアクタチャンバに流体接続された、１つ又は複数のナノチューブであって、前記１つ又は複数のナノチューブはそれぞれ、前記バイオリアクタチャンバの近位の入力端部と、前記バイオリアクタチャンバの遠位の出力端部との間に延在する通路を有し、また前記通路内に１つ又は複数のナノ細孔を備え、各前記ナノ細孔は、前記通路より小さい直径を有する、１つ又は複数のナノチューブ
を備える、デバイス。
【請求項２】
前記バイオリアクタチャンバの上流及び前記１つ又は複数のナノチューブの下流の位置に位置決めされた、電極；並びに
前記バイオリアクタチャンバの上流の位置と、前記１つ又は複数のナノチューブの下流との間に、電圧勾配を確立することによって、前記バイオリアクタチャンバから前記１つ又は複数のナノチューブを通して前記出力端部へと分子を通過させるために、前記電極に電気的に接続された、電圧源
を更に備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
分子が前記１つ又は複数のナノチューブを通過する際の、前記１つ又は複数のナノ細孔に亘る電流レベルの変化を測定するよう位置決めされた、検出器
を更に備える、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記検出器は、電流測定装置を備える、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記デバイスは、全て前記固体基板によって画定された、複数の前記生体分子プロセッサ及び複数の前記ナノチューブを備え、
前記デバイスは：
入力ポート；並びに
前記固体基板によって画定され、また、試料を前記入力ポートから前記複数の生体分子プロセッサへと送達するために、前記入力ポートと前記複数の生体分子プロセッサとを流体接続する、供給側チャネル
を更に備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記供給側チャネルに入る試料を、前記入力ポートから前記複数の生体分子プロセッサ間で分散させるための、前記供給側チャネル内の複数のバッフル
を更に備える、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記基板によって画定された複数のセパレータであって、各前記セパレータは、ある特定の前記バイオリアクタチャンバからある特定の前記ナノチューブへと材料を配向するために、隣接する前記バイオリアクタチャンバ間に位置決めされる、複数のセパレータ
を更に備える、請求項５に記載のデバイス。
【請求項８】
前記支持構造体は、離間した支柱の形態である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記１つ又は複数のナノチューブはそれぞれ、前記通路内に２つ以上の離間した前記ナノ細孔を有し、前記離間したナノ細孔は飛行時間チャネルを形成し、
前記検出器は、前記離間したナノ細孔に亘る電流レベルの変化、及びある特定の分子に関する前記電流変化の間の時間を測定する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記飛行時間チャネルは、幅１０〜２００ｎｍ及び深さ１０〜２００ｎｍである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記飛行時間チャネルは、長さ５〜２５０μｍである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記離間したナノ細孔は、直径１〜１５０ｎｍである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記２つ以上の離間したナノ細孔はそれぞれ、長さ５〜５００ｎｍである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記２つ以上の離間したナノ細孔はそれぞれ寸法が異なり、これにより、ある特定の分子に関して、前記検出器が前記離間した２つ以上のナノ細孔に亘る前記電流レベルの変化を測定した場合、前記２つ以上の離間したナノ細孔の間の電流変化の差によって、前記分子が前記２つ以上の離間したナノ細孔を順次通過していること、及び前記電流変化の間の時間前記が確立される、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記１つ又は複数のナノチューブは、先細の入口を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記生体分子プロセッサと、前記１つ又は複数のナノチューブと、前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブが直接的又は間接的に流体接続される、いずれの更なるユニットとを内包する、ベースプレート；並びに
前記ベースプレート上に嵌合することによって、前記生体分子プロセッサ、前記１つ又は複数のナノチューブ及び前記更なるユニットを封止するコンパートメントを形成する、カバープレート
を更に備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記カバープレート及び前記ベースプレートは、溝内に嵌合する複数のピンによって一体に取り付けられ、
前記ピンは前記カバープレート内にあり、かつ前記溝は前記ベースプレート内にあるか、又は前記ピンは前記ベースプレート内にあり、かつ前記溝は前記カバープレート内にある、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記ベースプレート及び前記カバープレートは併せて、前記生体分子プロセッサ、前記１つ又は複数のナノチューブ及び前記更なるユニットに接続された、リザーバ、通路及びバルブの組み合わせを備える、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記バルブは：
固体台座に対して移動可能な１つ又は複数の可撓性膜；及び
前記１つ又は複数の膜を前記固体台座と接触させたり接触を解除したりするように移動させるための、前記１つ又は複数の可撓性膜と係合可能なユニット
を備える、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
リンカーは、前記捕集分子を前記複数の支持構造体に連結する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記１つ又は複数のナノチューブは、幅１０〜２００ｎｍ及び深さ１０〜２００ｎｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記１つ又は複数のナノチューブは、長さ５〜２５０μｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記１つ又は複数のナノ細孔は、直径１〜１５０ｎｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記１つ又は複数のナノ細孔はそれぞれ、長さ５〜５００ｎｍである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、１つ又は複数のユニットであって、前記１つ又は複数のユニットは、試料調製を実行するよう構成される、１つ又は複数のユニット
を更に備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
試料調製のための前記１つ又は複数のユニットは：
前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、流れ精製ユニットであって：
チャンバを画定するハウジング；
前記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；
前記チャンバに接続された産物出口；
前記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに
前記チャンバ内で産物を前記産物出口へと好ましく配向するため、及び前記チャンバ内で廃棄物を前記廃棄物出口へと配向するために、前記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物
を備える、流れ精製ユニット
を備える、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、１つ又は複数のリアクタユニットであって、前記１つ又は複数のリアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える、１つ又は複数のリアクタユニット
を更に備える、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記チャネルは、蛇行パターンを有する、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、セパレータユニット
を更に備え、
前記セパレータユニットは：
複数の固体表面を含む分離チャンバであって、前記固体表面は、前記固体表面の間にチャネルを画定し、また前記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着している、分離チャンバ；
前記チャンバへの入口；及び
前記チャンバからの出口
を備える、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、センサユニット
を更に備え、
前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記細胞カウンタは：
前記入口と前記出口との間に長手方向に延在する、流体チャネル；及び
前記流体チャネル内で互いに向かい合って位置決めされた、電極のペア
を備える、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、抽出器ユニット
を更に備え、
前記抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、
前記固体支持体は、核酸又はエキソソーム又は小胞を不動化するのに好適な材料を設けられる、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記抽出器ユニットは、前記固体支持体の複数のベッドを備え、前記ベッドは、前記ベッドへの共通の入口、及び前記ベッドからの共通の出口を備える、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記抽出器ユニット内の前記固体支持体は、光活性化ポリマー材料から作製される、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニット
を更に備え、
前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記固体基板によって画定されるセパレータユニットであって、前記セパレータユニットは：
固体表面を含む分離チャンバであって、前記固体表面は、前記固体表面の間にチャネルを画定し、また前記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着している、分離チャンバ；
前記チャンバへの入口；及び
前記チャンバからの出口
を備える、セパレータユニット；
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニットであって、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは、前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニットを備え、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、長手方向に延在する血漿単離ユニット；
前記固体基板によって画定され、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットに流体接続される、第１の抽出器ユニットであって、前記第１の抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸又はエキソソーム又は小胞を不動化するのに好適な材料を設けられる、第１の抽出器ユニット；
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、センサユニットであって、前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、センサユニット；
前記固体支持体によって画定され、前記センサユニットに流体接続される、第２の抽出器ユニットであって、前記第２の抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸を不動化するのに好適な材料を設けられる、第２の抽出器ユニット；
前記固体基板によって画定され、前記第２の抽出器ユニットに流体接続される、１つ又は複数のリアクタユニットであって、前記１つ又は複数のリアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える、１つ又は複数のリアクタユニット；並びに
前記固体基板によって画定され、前記１つ又は複数のリアクタユニット及び前記生体分子プロセッサに流体接続される、流れ精製ユニットであって、前記流れ精製ユニットは：
チャンバを画定するハウジング；
前記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；
前記チャンバに接続された産物出口；
前記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに
前記チャンバ内で産物を前記産物出口へと好ましく配向するため、及び前記チャンバ内で廃棄物を前記廃棄物出口へと配向するために、前記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物
を備える、流れ精製ユニット
を更に備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３７】
試料中の標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、
前記方法は：
請求項３に記載のデバイスを提供するステップ；
前記標的核酸分子を含む前記試料を、前記標的核酸分子が捕集分子に結合して、離間した支持構造体に対して不動化されるのに効果的な条件下において、生体分子プロセッサに供給するステップ；
前記不動化された標的核酸分子又は前記標的核酸分子の不動化された伸長産物を、リガーゼ検出反応に供して、前記不動化された標的核酸分子又は前記標的核酸分子の不動化された伸長産物に対してハイブリダイズされたライゲーション産物を生成するステップ；
前記ライゲーション産物を、前記不動化された標的核酸分子又は前記標的核酸分子の不動化された伸長産物から変性させることによって、前記ライゲーション産物を前記離間した支持構造体から放出させるステップ；
前記ライゲーション産物を、前記１つ又は複数のナノチューブに通過させるステップ；
前記検出器を用いて、前記１つ又は複数のナノチューブを通過した前記ライゲーション産物の同定シグニチャを検出するステップ；及び
前記検出に基づいて、前記試料中の他の核酸分子とは異なる、前記試料中の前記標的核酸分子の存在を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項３８】
前記デバイスは：
前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流の、試料調製のための１つ又は複数のユニット
を更に備える、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試料調製のための前記１つ又は複数のユニットは：
チャンバを画定するハウジング；
前記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；
前記チャンバに接続された産物出口；
前記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに
前記チャンバ内で産物を前記産物出口へと好ましく配向するため、及び前記チャンバ内で廃棄物を前記廃棄物出口へと配向するために、前記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物
を備える、流れ精製ユニットを備え、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記流れ精製ユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、１つ又は複数のリアクタユニットであって、前記１つ又は複数のリアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える、１つ又は複数のリアクタユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記１つ又は複数のリアクタユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、セパレータユニットであって、前記セパレータユニットは：
複数の固体表面を含む分離チャンバであって、前記固体表面は、前記固体表面の間にチャネルを画定し、また前記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着している、分離チャンバ；前記チャンバへの入口；及び前記チャンバからの出口
を備える、セパレータユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記セパレータユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、センサユニットであって、前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、センサユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記センサユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、抽出器ユニットであって、前記抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸又はエキソソームを不動化するのに好適な材料を設けられる、抽出器ユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記抽出器ユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニットであって、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、血漿単離ユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記血漿単離ユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定されるセパレータユニットであって、前記セパレータユニットは：
固体表面を含む分離チャンバであって、前記固体表面は、前記固体表面の間にチャネルを画定し、また前記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着している、分離チャンバ；
前記チャンバへの入口；及び
前記チャンバからの出口
を備える、セパレータユニット；
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニットであって、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、長手方向に延在する血漿単離ユニット；
前記固体基板によって画定され、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットに流体接続される、第１の抽出器ユニットであって、前記第１の抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸を不動化するのに好適な材料を設けられる、第１の抽出器ユニット；
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、センサユニットであって、前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、センサユニット；
前記固体支持体によって画定され、前記センサユニットに流体接続される、第２の抽出器ユニットであって、前記第２の抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸を不動化するのに好適な材料を設けられる、第２の抽出器ユニット；
前記固体基板によって画定され、前記第２の抽出器ユニットに流体接続される、１つ又は複数のリアクタユニットであって、前記１つ又は複数のリアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える、１つ又は複数のリアクタユニット；並びに
前記固体基板によって画定され、前記１つ又は複数のリアクタユニット及び前記生体分子プロセッサに流体接続される、流れ精製ユニットであって、前記流れ精製ユニットは：
チャンバを画定するハウジング；
前記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；
前記チャンバに接続された産物出口；
前記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに
前記チャンバ内で産物を前記産物出口へと好ましく配向するため、及び前記チャンバ内で廃棄物を前記廃棄物出口へと配向するために、前記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物
を備える、流れ精製ユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を、前記セパレータユニット、前記長手方向に延在する血漿単離ユニット、前記第１の抽出器ユニット、前記センサユニット、前記第２の抽出器ユニット、前記１つ又は複数のリアクタユニット、及び前記流れ精製ユニットに、連続して順次通過させるステップ
を更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記同定シグニチャは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）マルチマー、ペプトイド及びポリエーテルからなる群から選択される、電気泳動移動性修飾因子を含有してよい、前記ライゲーション産物の同定シグニチャによって生成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料は、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、喀痰、尿、体液、身体分泌物及び身体排泄物からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
試料からの標的核酸分子内のヌクレオチドを同定するための方法であって、
前記方法は：
請求項３に記載のデバイスを提供するステップ；
前記標的核酸分子を含む試料を、捕集分子に前記標的核酸分子を結合させることによって、前記標的核酸分子を離間した支持構造体に対して不動化するために効果的な条件下で、前記生体分子プロセッサに供給するステップ；
不動化された前記標的核酸分子、又は前記標的核酸分子に対して相補的な不動化された伸長産物を、溶液と接触させて、ヌクレオチド伸長反応混合物を形成するステップであって、前記溶液は、前記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物の一部分に対して相補的な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマ、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド三リン酸の集合を含み、各タイプのヌクレオチド三リン酸は：（１）異なる切断可能な同定シグニチャ生成部分；及び（２）更なるヌクレオチド伸長反応をブロックする切断可能なブロッキング部分を有する、ステップ；
前記ヌクレオチド伸長反応混合物をハイブリダイゼーション処理に供するステップであって、前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマは、塩基特異的な様式で、前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマの相補的な不動化された標的核酸分子、又は前記標的核酸分子の不動化された伸長産物に対してハイブリダイズするステップ；
ハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプライマを、前記ヌクレオチド三リン酸の集合からのあるヌクレオチド三リン酸の、前記ハイブリダイズしたプライマの３’末端に対する、単一塩基特異的な追加によって、伸長させるステップ；
前記同定シグニチャ生成部分を、前記伸長後に、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマに追加された各ヌクレオチドから切断するステップ；
切断された前記同定シグニチャ生成部分を、前記１つ又は複数のナノチューブに通過させるステップ；
前記検出器を用いて、前記切断された同定シグニチャ生成部分が前記１つ又は複数のナノチューブを通過する際に、前記切断された同定シグニチャ生成部分によって生成された、前記同定シグニチャを検出するステップ；並びに
前記伸長中に追加された前記ヌクレオチドの集合からのヌクレオチドを同定することによって、前記試料中の前記標的核酸分子中の１つ又は複数のヌクレオチドを同定するステップ
を含む、方法。
【請求項４９】
反復させるステップ、前記伸長させるステップ、前記切断するステップ、前記通過させるステップ、前記検出するステップ、及び前記同定するステップによって、前記標的ヌクレオチド配列を配列決定するステップ
を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヌクレオチド伸長反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドプライマは、３’切断可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体及びブロッキング基を有し、
前記ブロッキング基は、前記プライマの３’ポリメラーゼ伸長をブロックすることによって、前記オリゴヌクレオチドプライマの前記切断可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を切断し、
前記ブロッキング基は除去され、
前記オリゴヌクレオチドプライマの３’ＯＨ末端は、前記ハイブリダイゼーション処理に供するステップ中に自由にされ、これにより、ハイブリダイズされた前記オリゴヌクレオチドプライマが、前記伸長させるステップに好適なものとなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記デバイスは：
前記固体基板によって画定され、前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、試料調製のための１つ又は複数のユニット
を更に備える、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ又は複数のユニットは：
チャンバを画定するハウジング；
前記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；
前記チャンバに接続された産物出口；
前記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに
前記チャンバ内で産物を前記産物出口へと好ましく配向するため、及び前記チャンバ内で廃棄物を前記廃棄物出口へと配向するために、前記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物
を備える、流れ精製ユニットを備え、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記流れ精製ユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、１つ又は複数のリアクタユニットであって、前記１つ又は複数のリアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える、１つ又は複数のリアクタユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記１つ又は複数のリアクタユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、セパレータユニットであって、前記セパレータユニットは：
複数の固体表面を含む分離チャンバであって、前記固体表面は、前記固体表面の間にチャネルを画定し、また前記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着している、分離チャンバ；前記チャンバへの入口；及び前記チャンバからの出口
を備える、セパレータユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記セパレータユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、センサユニットであって、前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、センサユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記センサユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、抽出器ユニットであって、前記抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸又はエキソソームを不動化するのに好適な材料を設けられる、抽出器ユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記抽出器ユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニットであって、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、血漿単離ユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を前記長手方向に延在する血漿単離ユニットに通過させるステップ
を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つ又は複数のユニットは：
前記固体基板によって画定されるセパレータユニットであって、前記セパレータユニットは：
固体表面を含む分離チャンバであって、前記固体表面は、前記固体表面の間にチャネルを画定し、また前記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着している、分離チャンバ；
前記チャンバへの入口；及び
前記チャンバからの出口
を備える、セパレータユニット；
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、長手方向に延在する血漿単離ユニットであって、前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、長手方向に延在する血漿単離ユニット；
前記固体基板によって画定され、前記基板によって画定される前記長手方向に延在する血漿単離ユニットに流体接続される、第１の抽出器ユニットであって、前記第１の抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸を不動化するのに好適な材料を設けられる、第１の抽出器ユニット；
前記固体基板によって画定され、また前記生体分子プロセッサ及び前記１つ又は複数のナノチューブの上流にある、センサユニットであって、前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、センサユニット；
前記固体支持体によって画定され、前記センサユニットに流体接続される、第２の抽出器ユニットであって、前記第２の抽出器ユニットは、固体支持体、及び前記固体支持体間の通路を備え、前記固体支持体は、核酸を不動化するのに好適な材料を設けられる、第２の抽出器ユニット；
前記固体基板によって画定され、前記第２の抽出器ユニットに流体接続される、１つ又は複数のリアクタユニットであって、前記１つ又は複数のリアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える、１つ又は複数のリアクタユニット；並びに
前記固体基板によって画定され、前記固体支持体及び前記生体分子プロセッサに流体接続される、流れ精製ユニットであって、前記流れ精製ユニットは：
チャンバを画定するハウジング；
前記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；
前記チャンバに接続された産物出口；
前記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに
前記チャンバ内で産物を前記産物出口へと好ましく配向するため、及び前記チャンバ内で廃棄物を前記廃棄物出口へと配向するために、前記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物
を備える、流れ精製ユニット
を含み、
前記方法は：
前記試料を前記生体分子プロセッサに供給する前記ステップの前に、前記試料を、前記セパレータユニット、前記長手方向に延在する血漿単離ユニット、前記第１の抽出器ユニット、前記センサユニット、前記第２の抽出器ユニット、前記１つ又は複数のリアクタユニットに、連続して順次通過させるステップ
を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記同定シグニチャ生成部分は、酸性ポリペプチド、塩基性ポリペプチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）、荷電ポリマー、ナノスフィア、ナノ結晶、荷電オリゴ糖、デンドリマー、蛍光染料、赤外線染料、発色団、キノロン、クマリン、ポルフィリン、ポルフィリン‐金属錯体、水溶性芳香族多環式化合物、遷移金属錯体、金属キレート、金属キレートポリマー、２‐ニトロベンジル誘導体、又はこれらのいずれの組み合わせである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記試料は、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、喀痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、無細胞循環腫瘍核酸、妊娠中の女性の無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検及びエキソソームからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
固体基板によって画定された、長手方向に延在する血漿単離ユニットを備えるデバイスであって、
前記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：
投入通路；
前記投入通路より幅広く浅い排出通路；
前記投入通路と前記排出通路とを接続する移行部通路であって、前記移行部通路は、前記移行部通路が前記投入通路から前記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；
前記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、前記投入通路と各前記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び
前記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、前記排出通路と各前記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、前記投入通路から前記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネル
を備える、デバイス。
【請求項６２】
固体基板によって画定される抽出器ユニットを備えるデバイスであって、
前記抽出器ユニットは：
入口；
出口；
前記入口と前記出口との間に延在して前記入口及び前記出口を共有する、複数の別個のチャンバ；及び
各前記チャンバ内の複数の固体支柱であって、前記固体支柱は、前記支柱間に通路を有し、また前記支柱は、試料からの細胞、核酸又はエキソソームを不動化するために好適な材料を設けられる、複数の固体支柱
を備える、デバイス。
【請求項６３】
固体基板によって画定されるセンサユニットを備えるデバイスであって、
前記センサユニットは：
入口；
出口；及び
前記センサユニットの前記入口から前記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタ
を備える、デバイス。
【請求項６４】
底面及び上面を有する第１の層であって、前記第１の層は：
前記上面上の入口ポート及び出口ポート；並びに
前記底面上の１つ又は複数の電極
を備える、第１の層；
上面及び底面を有する第２の層であって、前記第２の層は：
前記上面上の１つ又は複数の電極
を備える、第２の層；並びに
中間層であって、前記中間層は：
前記第１の層に接続され、前記第１の層の前記入口ポートと前記出口ポートとの間に長手方向に延在する、流体チャネルであって、前記流体チャネルは、前記第１の層及び前記第２の層の前記電極と垂直に交差し、前記第１の層の前記底面上の前記電極は、前記第２の層の前記上面上の前記電極と対向し、前記チャネルと、前記第１の層及び前記第２の層の前記電極とは、前記細胞カウンタを構成する、流体チャネル
を備える、中間層
を更に備える、請求項６３に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の検出及び計数に好適なデバイス及び方法に関する。
【０００２】
本出願は、２０１５年３月２３日出願の米国仮特許出願題６２／１３７，０２８号の優先権を主張するものであり、上記仮特許出願は参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、ＮＩＨ  Ｒ２１ＨＧ００６２７８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
健康管理は、「症状ベースの（ｓｙｍｐｔｏｍ‐ｂａｓｅｄ）」診断から「分子ベースの（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ‐ｂａｓｅｄ）」インビトロ診断（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ＩＶＤ）へと進化している。ＩＶＤは、米国の健康管理市場の＜１％を占めるが、全ての臨床的決定の７０％は、これらの試験の結果に基づくものである。その重要性及び複雑さは、ますます洗練され個別化された医療への努力と共に、増大し続けている。
【０００５】
分子診断は、グローバルＩＶＤ市場への大きな寄与因子であり、現在市場の１１％を占める。残念なことに、これらの試験の大半は高価であり、集中型ラボからのターンアラウンド時間が長く、またアッセイを実施するために、高度に専門化された設備及び熟練の技術者が必要となる。従って、個別化又は精密医療の実現を支援するために、患者の健康のより適時的かつ頻繁な監視を促進する、分子プラットフォーム及び能率化されたアッセイに対する需要が存在する。新規の試験パラダイムにより、ポイント・オブ・ケア試験へと移行するに従って集中型ラボサービスを徐々に置換するだけでなく、新規のシステムは、分子診断に対する全市場の需要を大きく拡大することになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、当該技術の上述の及び他の欠点を克服することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備えるデバイスを対象とする。各上記生体分子プロセッサは：固体基板によって画定されたバイオリアクタチャンバ；上記バイオリアクタチャンバ内の、上記固体基板に取り付けられた、複数の離間した支持構造体；及び上記複数の離間した支持構造体の一部又は全てに対して不動化された、１つ又は複数の捕集分子を備え、上記１つ又は複数の捕集分子は、試料中の標的核酸分子の一部分に結合するのに好適である。上記デバイスの上記１つ又は複数のナノチューブは、上記固体基板によって画定され、また上記バイオリアクタチャンバに流体接続される。上記１つ又は複数のナノチューブはそれぞれ、上記バイオリアクタチャンバの近位の入力端部と、上記バイオリアクタチャンバの遠位の出力端部との間に延在する通路を有し、また上記通路内に１つ又は複数のナノ細孔を備え、各上記ナノ細孔は、上記通路より小さい直径を有する。
【０００８】
本発明の別の態様は、長手方向に延在する血漿単離ユニットを備えるデバイスを対象とし、上記血漿単離ユニットは、上記固体基板によって画定され、また：投入通路；上記投入通路より幅広く浅い排出通路；上記投入通路と上記排出通路とを接続する移行部通路であって、上記移行部通路は、上記移行部通路が上記投入通路から上記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路；上記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルであって、上記投入通路と各上記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、上記投入通路から上記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される、一次側部チャネル；及び上記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルであって、上記排出通路と各上記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、上記投入通路から上記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される、二次側部チャネルを備える。
【０００９】
本発明の別の態様は、抽出器ユニットを備えるデバイスを対象とし、上記抽出器ユニットは、固体基板によって画定され、また：入口；出口；並びに上記入口と上記出口との間に延在して上記入口及び上記出口を共有する、複数の別個のチャンバを備える。上記デバイスはまた、各上記チャンバ内に複数の固体支柱も備え、上記支柱は、それらの間に通路を有し、また上記支柱は、試料からの細胞、核酸又はエキソソームを不動化するために好適な材料を設けられる。
【００１０】
本発明の別の態様は、センサユニットを備えるデバイスを対象とし、上記センサユニットは、固体基板によって画定され、また：入口；出口；及び上記センサユニットの上記入口から上記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタを備える。
【００１１】
本発明の別の態様は、ある試料中において、上記試料中の他のヌクレオチド配列とは１つ若しくは複数のヌクレオチド、１つ若しくは複数のコピー数、１つ若しくは複数の転写配列及び／又は１つ若しくは複数のメチル化残基だけ異なる、１つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を同定するための方法を対象とする。この方法は：上記標的ヌクレオチド配列又はその補体を含有する上記１つ又は複数の標的核酸分子を含有する試料を提供するステップ；及び１つ又は複数の不動化された捕集分子を含む固体支持体を提供するステップであって、上記捕集分子は、上記１つ又は複数の標的核酸分子に結合するのに好適である、ステップを伴う。上記方法は更に：上記１つ又は複数の標的核酸分子を、上記固体支持体上の上記１つ又は複数の不動化された捕集分子に結合させることによって、上記１つ又は複数の標的核酸分子を上記固体支持体上で不動化するステップ；及び上記不動化された標的核酸分子又は上記標的核酸分子に相補的な不動化された伸長産物を、リガーゼ検出反応に供し、上記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物とハイブリダイズしたライゲーション産物を産生するステップを伴う。上記ライゲーション産物は、上記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物から変性され、これによって上記固体支持体から上記ライゲーション産物が放出され、変性された上記ライゲーション産物は、上記ライゲーション産物を検出できる１つ又は複数のナノ細孔を通して供給される。上記方法は更に：上記供給の結果として、各上記産物が上記１つ又は複数のナノ細孔を通過する際に生成される、各上記ライゲーション産物の同定シグニチャを検出するステップ；及び上記検出に基づいて、上記試料中の他のヌクレオチド配列とは１つ若しくは複数のヌクレオチド、１つ若しくは複数のコピー数、１つ若しくは複数の転写配列及び／又は１つ若しくは複数のメチル化残基だけ異なる、１つ又は複数の標的ヌクレオチドの存在を同定するステップを伴う。
【００１２】
本発明の別の態様は、ある試料中において、標的ヌクレオチド配列中の１つ又は複数のヌクレオチドを同定するための方法を対象とする。この方法は：上記標的ヌクレオチド配列又はその補体を含有する上記１つ又は複数の標的核酸分子を含有する試料を提供するステップ；及び１つ又は複数の不動化された捕集分子を含む固体支持体を提供するステップであって、上記捕集分子は、上記１つ又は複数の標的核酸分子に結合するのに好適である、ステップを伴う。上記方法は更に：上記１つ又は複数の標的核酸分子を、上記固体支持体上の上記１つ又は複数の不動化された捕集分子に結合させることによって、上記１つ又は複数の標的核酸分子を上記固体支持体上で不動化するステップ；及び上記不動化された標的核酸分子又は上記標的核酸分子に相補的な不動化された伸長産物を、溶液に接触させて、ヌクレオチド伸長反応混合物を形成するステップを伴う。上記溶液は、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマ（上記オリゴヌクレオチドプライマは、上記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物の一部分に相補的である）、ポリメラーゼ、及び複数のヌクレオチド三リン酸の集合を含み、上記集合中の各タイプのヌクレオチド三リン酸は：（ｉ）異なる切断可能な同定シグニチャ生成部分；及び（ｉｉ）後続のヌクレオチド三リン酸の付与を阻害する切断可能なブロッキング部分を有する。上記ヌクレオチド伸長反応混合物は、ハイブリダイゼーション処理に供され、上記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマは、塩基特異的な様式で、その相補的な不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物とハイブリダイズし、ハイブリダイズされた上記オリゴヌクレオチドプライマは、上記ヌクレオチド三リン酸の集合からのヌクレオチド三リンの、上記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマの３’末端への、単一の塩基特異的な付加によって伸長される。上記同定シグニチャ生成部分及び上記ブロッキング部分は、上記伸長後に、上記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマに付加された各ヌクレオチドから切断され、切断された上記同定シグニチャ生成部分は、上記同定シグニチャ生成部分を検出できる１つ又は複数のナノ細孔を通して供給される。上記方法は更に：上記供給の結果として、上記切断された部分が上記１つ又は複数のナノ細孔を通過する際に、上記切断された同定シグニチャ生成部分によって生成される同定シグニチャを検出するステップ；及び上記検出に基づいて、上記伸長中に付加された、上記ヌクレオチド三リン酸の集合からの上記ヌクレオチド三リン酸を同定することによって、上記試料中の標的ヌクレオチド配列中の１つ又は複数のヌクレオチドを同定するステップを伴う。
【００１３】
血液からの循環マーカーは、これらのマーカー、並びに生体細胞、無細胞分子（タンパク質及び無細胞ＤＮＡ）並びに小胞（エキソソーム等のナノメートルアセンブリ）といった、血中に見られる大量のマーカータイプを保護する最小の侵襲性の性質により、興味深いインビトロ診断シナリオを提示する。残念なことに、これらの血液由来のマーカーの多くは、癌、感染症及び脳卒中を一例とする厄介な疾患の管理のための臨床的実践には効果的に利用されていない。この欠点は主に、疾患関連血液マーカーが、混合集団中で非常に少数であることにより、これらを単離するための効率的なプラットフォーム、及びこれらが有し得る分子構造的バリエーションを決定できるシステムが存在しないため、発見及び分析が困難であるという事実に起因する。この緊急の需要に対処するために、全血から循環マーカーを選択して、疾患特異的分子シグニチャを処理できる、革新的な診断プラットフォームデバイスが本明細書に記載される。想定されるシステムは、上記システムが提供する独自の処理能力を実行するために、複数の長さスケール（ｍｍ→ｎｍ）を利用する。上記システムは、全血（≧１ｍＬ）を処理し、臨床的に関連するマーカーをｎＬ体積まで濃縮し（＞１０６の富化係数）、複製ベースの技術を用いて単段ステップで製作された多数のポリマー支柱上で実施される固相リガーゼ検出反応（ｓｐＬＤＲ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方から多様な配列変異を探索する。ｓｐＬＤＲ産物を、分子依存性電気泳動移動性に基づく同定と共に、ナノメートル飛行管に動電学的に掃引し、単一分子処理を、ナノメートル飛行管を使用して実施し、検出は非光学的に実施する。このシステムは、単一の採血から臨床的に関連する全てのマーカー（細胞、無細胞ＤＮＡ及びエキソソーム）を選択し、これらマーカーから適切な情報を完全に自動化された方法で確保して、上記プラットフォームを臨床的実践に移行させる能力を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】本明細書に記載のデバイスの生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの斜視図である。図１Ａは、ナノセンサモジュール内のナノセンサチャンバ３０の斜視図である。この実施形態では、各ナノセンサチャンバ３０は８個の生体分子プロセッサ１を内包し、これらはそれぞれ単一のナノチューブ６に接続される。
【図１Ｂ】本明細書に記載のデバイスの生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの斜視図である。図１Ｂは生体分子プロセッサ１及びナノチューブ６の斜視図である。
【図１Ｃ】本明細書に記載のデバイスの生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの斜視図である。図１Ｃは、図１Ｂに示すナノチューブ６内のナノ細孔８の上面図である。
【図２Ａ】本明細書に記載のデバイスの、生体分子プロセッサ及び１つ又は複数の垂直に配向されたナノチューブの図である。図２Ａは、８個の生体分子プロセッサ１及び８個のナノチューブを内包する、ナノセンサチャンバの斜視図であり、上記ナノチューブの入力端部１２のみが示されている。
【図２Ｂ】本明細書に記載のデバイスの、生体分子プロセッサ及び１つ又は複数の垂直に配向されたナノチューブの図である。図２Ｂは、単離された生体分子プロセッサと、垂直に位置決めされたナノチューブとを示す斜視図である。
【図２Ｃ】本明細書に記載のデバイスの、生体分子プロセッサ及び１つ又は複数の垂直に配向されたナノチューブの図である。図２Ｃは、上記垂直に位置決めされたナノチューブの断面図である。
【図３】ナノチューブを通る単一分子の移動を示す、一連のパネルである。各パネルは、上記ナノチューブ内の上記単一分子の異なる位置を示し、図の底部のグラフは、上記分子が上記ナノチューブ及び上記ナノチューブ内のナノ細孔を横断する際の電流の変化を追跡したものである。
【図４】単一のナノチューブ内の（上記ナノチューブ内の切れ目で表される）３個以上の合成ナノ細孔の位置決めを示す、ナノチューブの斜視図である。この図はまた、ナノチューブカバー、及び上記カバー上の電極の配置も示す。
【図５】本明細書に記載のナノチューブの一実施形態の、簡略化された電気回路図を示す。
【図６】本明細書に記載のナノチューブの一実施形態の、簡略化された電気回路図を示す。
【図７Ａ】ナノチューブの上面図（図７Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図７Ｂ）を示す。
【図７Ｂ】ナノチューブの上面図（図７Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図７Ｂ）を示す。図７Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための一実施形態を示す。
【図８Ａ】ナノチューブの上面図（図８Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図８Ｂ）を示す。
【図８Ｂ】ナノチューブの上面図（図８Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図８Ｂ）を示す。図８Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図９Ａ】ナノチューブの上面図（図９Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図９Ｂ）を示す。
【図９Ｂ】ナノチューブの上面図（図９Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図９Ｂ）を示す。図９Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図１０Ａ】ナノチューブの上面図（図１０Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１０Ｂ）を示す。
【図１０Ｂ】ナノチューブの上面図（図１０Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１０Ｂ）を示す。図１０Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図１１Ａ】ナノチューブの上面図（図１１Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１１Ｂ）を示す。
【図１１Ｂ】ナノチューブの上面図（図１１Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１１Ｂ）を示す。図１１Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図１２Ａ】ナノチューブの上面図（図１２Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１２Ｂ）を示す。
【図１２Ｂ】ナノチューブの上面図（図１２Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１２Ｂ）を示す。図１２Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図１３Ａ】ナノチューブの上面図（図１３Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１３Ｂ）を示す。
【図１３Ｂ】ナノチューブの上面図（図１３Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１３Ｂ）を示す。図１３Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図１４Ａ】ナノチューブの上面図（図１４Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１４Ｂ）を示す。
【図１４Ｂ】ナノチューブの上面図（図１４Ａ）、並びに電極及び測定用回路構成を備えたナノチューブの回路図（図１４Ｂ）を示す。図１４Ｂの回路図は、生体分子が上記ナノチューブのナノ細孔を通過する際に上記生体分子の同定シグニチャを測定するための代替実施形態を示す。
【図１５Ａ】単一のナノチューブから生体分子同定シグニチャを検出して処理するための２つの方法を示す、電子システムのブロック図である。
【図１５Ｂ】単一のナノチューブから生体分子同定シグニチャを検出して処理するための２つの方法を示す、電子システムのブロック図である。
【図１６Ａ】ナノセンサモジュールとプリント回路基板（ＰＣＢ）との間の高密度電気接続の側面図（図１６Ａ）及び上面図（図１６Ｂ）である。
【図１６Ｂ】ナノセンサモジュールとプリント回路基板（ＰＣＢ）との間の高密度電気接続の側面図（図１６Ａ）及び上面図（図１６Ｂ）である。
【図１７Ａ】それぞれ、本発明が包含するデバイスの斜視図及び上面図である。本明細書では汎用分子処理システム（ｕＭＰＳ）と呼ばれるこのデバイスは、流体マザーボード（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｏｔｈｅｒｂｏａｒｄ）を介して相互接続された複数の特定タスク向けモジュールを備える。
【図１７Ｂ】それぞれ、本発明が包含するデバイスの斜視図及び上面図である。本明細書では汎用分子処理システム（ｕＭＰＳ）と呼ばれるこのデバイスは、流体マザーボード（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｏｔｈｅｒｂｏａｒｄ）を介して相互接続された複数の特定タスク向けモジュールを備える。
【図１８Ａ】ｕＭＰＳの細胞単離モジュールを示す。図１８Ａは、捕集ベッドを備える上記単離モジュールの斜視図である。
【図１８Ｂ】ｕＭＰＳの細胞単離モジュールを示す。図１８Ｂ（図１８Ａの挿入図）は、上記細胞単離モジュールの上記捕集ベッドを構成する正弦波状チャネルの斜視図である。
【図１９】細胞単離モジュールのチャネル壁に対して不動化された捕集抗体の概略図である。上記抗体は、切断可能なオリゴヌクレオチドリンカーを用いて不動化される。
【図２０Ａ】ｕＭＰＳの血漿単離モジュールを示す。図２０Ａは、上記血漿単離モジュールの斜視図である。
【図２０Ｂ】ｕＭＰＳの血漿単離モジュールを示す。図２０Ｂは、上記血漿単離モジュールの第１のメインチャンバ、第１の側部チャンバ、及び上記第１のメインチャンバと上記第１の側部チャンバとの間の通路を示す、（図２０Ａの線２０Ｂ‐２０Ｂを通る）断面斜視図である。
【図２０Ｃ】ｕＭＰＳの血漿単離モジュールを示す。図２０Ｃは、上記血漿単離モジュールの第２のメインチャンバ、第２の側部チャンバ、及び上記第２のメインチャンバと上記第２の側部チャンバとの間の通路を示す、（図２０Ａの線２０Ｃ‐２０Ｃを通る）断面斜視図である。
【図２０Ｄ】ｕＭＰＳの血漿単離モジュールを示す。図２０Ｄは、図２０Ａの線２０Ｄ‐２０Ｄを通る上記血漿単離ユニットの断面図である。
【図２１Ａ】ｕＭＰＳの代替の血漿単離モジュールを示す。図２１Ａは、この血漿単離ユニットの斜視図である。
【図２１Ｂ】ｕＭＰＳの代替の血漿単離モジュールを示す。図２１Ｂは、図２１Ａの線２１Ｂ‐２１Ｂを通るこの血漿単離ユニットの断面図である。
【図２２】エキソソーム又はｃｆＤＮＡ単離に使用される、ｕＭＰＳの固相抽出器（ＳＰＥ）モジュールの斜視図である。
【図２３Ａ】ｕＭＰＳのインピーダンスモジュールを示す。図２３Ａは、上記インピーダンスモジュールの斜視図である。
【図２３Ｂ】ｕＭＰＳのインピーダンスモジュールを示す。図２３Ｂは、上記インピーダンスモジュールの３つの層を示す、分解立体斜視図である。
【図２４】図２３Ａ〜２３Ｂに示すインピーダンスモジュールを作製するプロセスを示す。
【図２５】ｕＭＰＳのＳＰＥＲＮＡ／ＤＮＡ単離モジュールの斜視図である。
【図２６Ａ】ｕＭＰＳの拡散精製モジュールを示す。図２６Ａは、上記拡散精製モジュールの斜視図である。
【図２６Ｂ】ｕＭＰＳの拡散精製モジュールを示す。図２６Ｂは、拡散精製ベッド内の障害物間の間隔を示す、図２６Ａからの挿入図の上面図である。
【図２７】本発明のデバイス上のバルブを示す。エンボス加工を用いた、バルブ及びバルブ台座の同時の前面及び背面成形が示されている。
【図２８Ａ】ガスケットレスシールの、動力学的整列ピン及び溝を示す。上記整列ピン及び溝（図２８Ａ）は、両側エンボス加工を用いて流体基板背面に製作でき、上記ピン及び溝は２つの噛合片上に配置される。
【図２８Ｂ】ガスケットレスシールの、動力学的整列ピン及び溝を示す。図２８Ｂは、組み立て済みのガスケットレスシールを示す。整列精度は〜１０μｍである。
【図２８Ｃ】ガスケットレスシールの、動力学的整列ピン及び溝を示す。図２８Ｃは、整列した噛合片間の超疎水性シールを示す。
【図２９Ａ】インプリントを用いて、本明細書に記載のデバイスのナノ流体チャンバ及びチャネルを作製するための加工ステップを示す。図２９Ａは、図２９Ｂに示すナノ流体チャンバ及びチャネルを作製するプロセスに使用される樹脂型を作製するプロセスを示す。
【図２９Ｂ】インプリントを用いて、本明細書に記載のデバイスのナノ流体チャンバ及びチャネルを作製するための加工ステップを示す。
【図３０Ａ】本発明のデバイスの組み立てに関わるプロセスを示す。図３０Ａは、ハイブリッドベース流体デバイスと熱プレス機器とのアセンブリの概略図である。
【図３０Ｂ】本発明のデバイスの組み立てに関わるプロセスを示す。図３０Ｂは、熱融着結合サイクルのための６つのステージを示す、温度‐圧力プロセスプロファイルを示す。
【図３１】液圧ポンプ送達によって流れが作動された場合の、８個の生体分子プロセッサ及び８個のナノチューブを内包するナノセンサチャンバを通る流体経路のシミュレーションを示す。このシミュレーションは、デバイスのナノセンサチャンバ内の全ての生体分子プロセッサの均一な対処を示す。
【図３２Ａ】動電学的ポンプ送達によって流れが作動された場合の、生体分子プロセッサのバイオリアクタチャンバ内の複数の離間した固体支持構造体を通る流体経路のシミュレーションを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａに示す生体分子プロセッサのバイオリアクタチャンバを通る、対応する電界線を示す。
【図３３】生体分子プロセッサの単一のバイオリアクタチャンバ内の複数の支持構造体を通って核酸分子が移動する際の、核酸分子の捕集効率を決定するためのシミュレーションを示す。
【図３４】本発明のデバイスのナノセンサモジュールのナノチューブ内の、シミュレートされた電界分布を示すグラフである。
【図３５Ａ】ナノ細孔中の球状分析物を示す概略図であり、Ｖｐ＝粒子（分析物）の体積、Ｖｄ＝検出体積である。
【図３５Ｂ】バッファ電解質濃度の関数として、合成ナノ細孔を通って移動する荷電粒子に関するシミュレーション結果を示すグラフである。遮断電流の大きさは、キャリア電解質濃度（０．５×、１．０×、１．５×、２×及び２．５×のためのＴＲＩＳ／ホウ酸塩／ＥＤＴＡバッファ）に左右される。
【図３６Ａ】様々な長さのナノ細孔を通って移動する単一ＤＮＡ分子によって生成される電流遮断のシミュレーションである。
【図３６Ｂ】球状対象物／検出体積の関数として、電流遮断イベントの大きさ（ｎＡ）を示すグラフである。上記検出体積は、細孔容積を表す。
【図３７Ａ】２つの異なるサイズのポリマーベースナノ細孔を通って動電学的に移動する、５００塩基対単一ＤＮＡ分子に関する電流遮断イベントを示す。図３７Ａは、上記ナノ細孔内の電流振幅の変化を経時的に示すグラフである。
【図３７Ｂ】２つの異なるサイズのポリマーベースナノ細孔を通って動電学的に移動する、５００塩基対単一ＤＮＡ分子に関する電流遮断イベントを示す。図３７Ｂは、異なるサイズのナノ細孔を通る１５６の転座イベントから得られた電流ピークの振幅に関する統計を示す。
【図３８Ａ】異なる直径を有する貫通円錐ナノ細孔を有するＳＵ‐８膜に関するＳＥＭ画像である。
【図３８Ｂ】異なる直径を有する貫通円錐ナノ細孔を有するＳＵ‐８膜に関するＳＥＭ画像である。
【図３８Ｃ】リフロー時間の関数として、細孔サイズの低下をプロットしたグラフである。
【図３９Ａ】異なる細孔長さを有するナノ細孔のＳＥＭ画像である。
【図３９Ｂ】異なる細孔長さを有するナノ細孔のＳＥＭ画像である。
【図４０Ａ】ナノチューブを通した銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の電気泳動輸送の様々な態様を示す。図４０Ａは、ナノチューブ内に停留している単一ＡｇＮＰの強度画像であり、上記単一ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の強度を示す。
【図４０Ｂ】ナノチューブを通した銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の電気泳動輸送の様々な態様を示す。図４０Ｂは、ナノチューブ内の単一ナノ粒子（６０ｎｍ  ＡｇＮＰ）に関する電気泳動輸送イベントを表す。
【図４０Ｃ】ナノチューブを通した銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の電気泳動輸送の様々な態様を示す。図４０Ｃは、電気泳動移動性と、上記移動性の分散を測定する理論上のプレート数との、電界強度の関数としてのプロットを示す。
【図４０Ｄ】ナノチューブを通した銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の電気泳動輸送の様々な態様を示す。図４０Ｄは、ナノチューブ内の銀ナノ粒子に関する飛行時間のヒストグラムである。
【図４０Ｅ】ナノチューブを通した銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の電気泳動輸送の様々な態様を示す。図４０Ｅは、ナノチューブ内の銀ナノ粒子に関する飛行時間のヒストグラムである。
【図４０Ｆ】ナノチューブを通した銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の電気泳動輸送の様々な態様を示す。図４０Ｆは、ナノチューブ内の銀ナノ粒子に関する飛行時間のヒストグラムである。
【図４１】選択性の項の関数としてピーク容量を示すグラフであり、これは、２つの成分の電気泳動移動性の差を平均電気泳動移動性で除算することによって決定される。移動性の差が０．０１の場合、Ｒ＝６．０及び１５，６５０プレートに関して、ピーク容量は３１であり、これはナノチューブが区別できる生体分子の数を表す。
【図４２】本明細書に記載のデバイスのセンサモジュールを使用した、乳癌細胞（ＭＣＦ‐７）の単一細胞インピーダンス測定を示す。
【図４３】異なるサイズ（即ち２０、２５及び７５μｍ）の電極に関する、異なる直径の細胞のインピーダンス応答を示すシミュレーションのグラフである。７５μｍ幅の電極対に関する３つの異なる平均サイズの細胞に関する、インピーダンスピーク振幅についての実験データも示されている。
【図４４Ａ】無傷の細胞に関して登録された、バッファのみの抵抗より高い抵抗の起源（図４４Ａ）と損傷した膜を含有する細胞に関する抵抗の降下（図４４Ｂ）とを示す図である。Ｒ細胞は細胞の抵抗であり、Ｒ溶液は、細胞の体積と同一の体積の溶液の抵抗である。図４４Ｃ及び４４Ｄは、１×ＴＧバッファ中のＨｓ５７８Ｔ生存細胞（図４４Ｃ）、並びに１×ＴＧバッファ中のパラホルムアルデヒド及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ‐１００処置細胞（図４４Ｄ）に関するインピーダンスのトレースである。
【図４４Ｂ】無傷の細胞に関して登録された、バッファのみの抵抗より高い抵抗の起源（図４４Ａ）と損傷した膜を含有する細胞に関する抵抗の降下（図４４Ｂ）とを示す図である。Ｒ細胞は細胞の抵抗であり、Ｒ溶液は、細胞の体積と同一の体積の溶液の抵抗である。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、１×ＴＧバッファ中のＨｓ５７８Ｔ生存細胞（図４４Ｃ）、並びに１×ＴＧバッファ中のパラホルムアルデヒド及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ‐１００処置細胞（図４４Ｄ）に関するインピーダンスのトレースである。
【図４４Ｄ】図４４Ｄは、１×ＴＧバッファ中のＨｓ５７８Ｔ生存細胞（図４４Ｃ）、並びに１×ＴＧバッファ中のパラホルムアルデヒド及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ‐１００処置細胞（図４４Ｄ）に関するインピーダンスのトレースである。
【図４５Ａ】１５μｍの側部長さ及び５μｍの間隔を有するダイヤモンドマイクロ支柱からなる固相抽出ベッドを通る血漿流の、計算による流体力学的シミュレーションを示す。図４５Ｂは、モンテカルロ拡散シミュレーションを示す。図４５Ｃは、壁がエキソソームに対して特異的な親和剤でコーティングされた１０μｍ幅のチャネルを通る輸送（圧力駆動流）に関する、モンテカルロ拡散シミュレーションの結果を表す。「Ｘ」は、表面に付着した上記親和剤と、上記エキソソームの表面に存在する標的抗原との間の会合によって、上記エキソソームが上記表面に結合した位置を示す。
【図４６】図４５Ａに示すシミュレーションを用いて、エキソーム回収に対する速度及びＳＰＥベッド長さの影響を示すグラフである。
【図４７】図４５Ｂのモンテカルロ／チャン・ハマー（Ｃｈａｎｇ‐Ｈａｍｍｅｒ）シミュレーションによってエキソソーム回収が９５％であると予測される条件に関する、３Ｄ等値面及びその下にある等高線プロットである。
【図４８】支柱の直径の関数として、ｕＭＰＳデバイスのＳＰＥ  ＤＮＡ／ＲＮＡ単離モジュール中の血漿からのＤＮＡ分子の回収を示すグラフである。上記回収は、上記支柱の直径が＜７０μｍである場合に増大する。
【図４９】ｕＭＰＳのＳＰＥモジュールを用いて回収したＤＮＡ断片の毛細管ゲル電気泳動を示す。回収は、ＰＥＧ／ＮａＣｌ／ＥｔＯＨ含有量の関数であり、最大の回収は７％のＰＥＧ、０．９ｍＭのＮａＣｌ及び４３％のＥｔＯＨにおいて観察された。
【図５０】拡散精製モジュール中の、異なる塩基数を有するＤＮＡの拡散変位を示すグラフである。ｃｆＤＮＡからｄＮＴＰへの変位も、障害物の数の関数として示されている。
【図５１】ｕＭＰＳのバルブにおける、体積流量：バルブヘッド圧力を示すグラフである。
【図５２】シールを生成するための各ガスケットレスシールのためのマイクロ流体貫通孔の周りにスピンコートされた、超疎水性表面のＳＥＭ画像である。
【図５３】ガスケットレスシールが耐えられる測定された最大圧力が、ヤング‐ラプラス方程式を用いて推定したものと一致したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一態様は、生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備えるデバイスを対象とする。各上記生体分子プロセッサは：固体基板によって画定されたバイオリアクタチャンバ；上記バイオリアクタチャンバ内の、上記固体基板に取り付けられた、複数の離間した支持構造体；及び上記複数の離間した支持構造体の一部又は全てに対して不動化された、１つ又は複数の捕集分子を備え、上記１つ又は複数の捕集分子は、試料中の標的核酸分子の一部分に結合するのに好適である。上記デバイスの上記１つ又は複数のナノチューブは、上記固体基板によって画定され、また上記生体分子プロセッサの上記バイオリアクタチャンバに流体接続される。上記１つ又は複数のナノチューブはそれぞれ、上記バイオリアクタチャンバの近位の入力端部と、上記バイオリアクタチャンバの遠位の出力端部との間に延在する通路を有し、また上記通路内に１つ又は複数のナノ細孔を備え、各上記ナノ細孔は、上記通路より小さい直径を有する。
【００１６】
図１Ａは、本明細書に記載の、一連の生体分子プロセッサ１及びナノチューブ６を内包するナノセンサチャンバ３０の斜視図である。各生体分子プロセッサ１は、上記固体基板に取り付けられた複数の離間した固体支持構造体４を内包する、バイオリアクタチャンバ２を有する。各バイオリアクタチャンバ２の２つの壁は、バイオリアクタチャンバ２内の材料を、バイオリアクタチャンバ２に接続されたナノチューブ６内へと配向するのを支援する、セパレータ２２によって画定される。上記バイオリアクタチャンバは更に、図１Ａには示されていないトップカバープレートによって画定される。上記ナノセンサチャンバはまた、流体入力ポート１６及び供給側チャネル１８を備える。供給側チャネル１８は、試料を入力ポート１６から複数の生体分子プロセッサ１へと送達するために、入力ポート１６と複数の生体分子プロセッサ１とを流体接続する。上記供給側チャネルは任意に、１つ若しくは複数の、又は複数のバッフル２０を内包し、これは、入力ポート１６に入る上記試料を複数の生体分子プロセッサ１へと分散させる機能を果たす。
【００１７】
図１Ａに示すように、各生体分子プロセッサはナノチューブに接続される。図１Ｂの斜視図は、ナノチューブ６と、バイオリアクタチャンバ２を内包する生体分子プロセッサ１との拡大図を示す。ナノチューブ６は、生体分子プロセッサ１のバイオリアクタチャンバ２の近位の入力端部１２、バイオリアクタチャンバ２の遠位の出力端部１４、及び入力端部１２と出力端部１４との間に延在する通路１０を内包する。図１Ｂに示すナノチューブ６の入力端部１２は、分子をナノチューブ６に電気的に装填するのを支援するために、先細の入口を有する。ナノチューブ６の出力端部１４は、流体及び生体試薬の流入及び流出のために、マイクロ流体ネットワーク２４及びマイクロスケールリザーバ２６に接続できる。ナノチューブ６の通路１０の中には、１つ又は複数のナノ細孔８が存在する。図１Ｂに示す実施形態は、２つのナノ細孔８を有するナノチューブ６を示すが、本明細書に記載され図４に示されるように、上記ナノチューブは３つ以上のナノ細孔を内包できる。各ナノ細孔８は、図１Ｃに示すように、ナノチューブ６の残りの通路１０に対して直径が小さい。
【００１８】
一実施形態では、上記生体分子プロセッサ、１つ又は複数のナノチューブ、並びに上記生体分子プロセッサ及びナノチューブが直接的又は間接的に流体接続されるいずれの更なるユニットは、ベースプレート上に位置決めされる。カバープレートを上記ベースプレート上に嵌合させて、上記生体分子プロセッサ、上記ナノチューブ及びいずれの更なるユニットを封止するコンパートメントを形成する。
【００１９】
図２Ａ〜２Ｃは、本発明のデバイスの生体分子プロセッサ及びナノチューブの代替構成を示す。図２Ａは、８個の生体分子プロセッサ１及び８個のナノチューブを内包するナノセンサチャンバ３０の斜視図であり、この斜視図では上記ナノチューブの入力端部１２しか視認できない。この実施形態では、ナノチューブ６は固体基板３２内に垂直に位置決めされ、その一方で生体分子プロセッサ１のバイオリアクタチャンバ２は、上記ナノチューブの入力端部１２に隣接して、固体基板表面３４上に配置される。試料は流体入力１６を介してバイオリアクタチャンバ２に入り、ナノセンサチャンバ３０の供給側チャネル１８を通って流れ、ここで供給側チャネル１８内に存在するバッフル２０によって、バイオリアクタチャンバ２間で分散される。上記試料は、バイオリアクタチャンバ２内の複数の離間した支持構造体４を通って流れここで標的分子は、固体支持構造体４上に不動化された捕集分子によって捕集される。上記標的分子、又は上記標的分子を表す他の生体分子産物が、上記捕集分子から放出されると、上記標的分子又はその生体分子産物は、検出のために、上記ナノチューブの入力端部１２へと配向される。図２Ｂは、基板３２の表面３４上のナノセンサチャンバ内の、基板３２内に垂直に位置決めされたナノチューブ６に隣接する、１つの生体分子プロセッサ１の拡大斜視図を示す。図２Ｃは、基板３２内に垂直に位置決めされたナノチューブ６の断面図であり、ナノチューブ６の通路１０（ナノチャネルとも呼ぶ）及びナノ細孔８が示されている。
【００２０】
上記生体分子プロセッサの上記バイオリアクタチャンバの上記固体基板は、多様な材料から作製できる。上記固体基板は、生体材料、非生体材料、有機材料、無機材料又はこれらのいずれの組み合わせであってよい。一実施形態では、上記固体基板は、ポリマー材料又は他の成形可能な材料である。好適なポリマー材料としては、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、エポキシ系樹脂、コポリマー、ポリスルホン、エラストマ、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、及び高分子有機シリコンが挙げられるが、これらに限定されない。上記バイオリアクタチャンバは、例えば本明細書に記載のナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）によって熱可塑性材料から製作でき、加熱素子上に静置される。
【００２１】
バイオリアクタチャンバ２の離間した支持構造体４は、図１Ｂに示す支柱等の、いずれの隆起構造体を包含する。離間した支持構造体４は、固体基板表面３４の上部に載置され、露出した上部表面、底部表面及び側部表面を有する。これらの離間した支持構造体４は、球状、円錐形、円筒形、三角柱又は四面体、立方体、直方体、十二面体、六角柱、八角柱等を含むがこれらに限定されない、いずれの幾何学的３次元形状とすることができる。捕集分子は、上記支持構造体の表面（即ち上記構造体の上部表面及び側部表面）に対して不動化される。一実施形態では、上記捕集分子は、試料中の標的分子の一部であるか又は上記標的分子に付加されているヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドである。例えば一実施形態では、上記捕集分子は、標的核酸分子に付加されたポリ‐ｄＴテールに対して相補的である、ポリ‐ｄＡ３０オリゴヌクレオチドである。上記捕集分子は、いずれの好適なリンカー分子を介して、上記支持構造体の表面に対して不動化される。
【００２２】
上記バイオリアクタチャンバの寸法は、例えば上記バイオリアクタチャンバが格納されているデバイス、及び分析される試料のタイプを含む、多数の因子に応じて変化する。上記バイオリアクタチャンバは、高さ１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μｍで、幅５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μｍ×深さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μｍとすることができる。一実施形態では、上記生体分子プロセッサの上記バイオリアクタチャンバは、２０μｍ×２０μｍである。上記バイオリアクタチャンバのサイズは、その内部に格納される固体支持構造体の数を規定する。各バイオリアクタチャンバは、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個、又はそれ以上の離間した支持構造体を内包してよく、各支持構造体は、直径０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０μｍ、高さ０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０μｍである。上記支持構造体は、流体試料を流すことができるよう、上記バイオリアクタチャンバ内で互いから離間していなければならない。一実施形態では、生体分子プロセッサのバイオリアクタチャンバは、直径１μｍ、高さ５μｍの、２５０〜３００個の離間した支持構造体を内包する。
【００２３】
上記生体分子プロセッサの設計は、例えば１ｍＬの試験試料（例えば血漿）中に存在する標的核酸分子を収容できる最大積載能力に基づく。直径１．０μｍ及び高さ５．０μｍ（アスペクト比＝５．０）の支柱は、１．５７×１０‐７ｃｍ２の利用可能な表面積を有する。ＵＶ活性化環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）（１９．０×１０‐９モルｃｍ‐２）上の官能基の既知の表面密度（ジャクソン（Jackson）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻、ｐｐ．１０６‐１１７、２０１４年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））を用いると、このような寸法の支柱上には１．８×１０９の利用可能な部位が存在する。ＴｄＴテールを有する標的を捕集するためにｄＡ３０オリゴヌクレオチド（回転半径＝３ｎｍ）を不動化する場合、六角形に詰められる表面に関して達成できる最大表面密度は８×１０‐１２モル・ｃｍ‐２であり、これは、ＵＶ／Ｏ３活性化時の表面カルボキシレートの密度より低い。上記ポリマー支柱のＵＶ曝露（２５４ｎｍ）は、上記活性化放射に曝露された部位にのみ、表面に閉じ込められたカルボン酸を生成し、これは、ＥＤＣ／ＮＨＳの存在下でＮＨ２‐ｄＡ３０プライマを付着させることによって、上記表面に対する上記プライマの安定したアミド結合を生成するのに好適である（ジャクソン（Jackson）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻、ｐｐ．１０６‐１１７、２０１４年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。しかしながら、全ての捕集分子が標的を捕集するわけではない。１μｍ２あたり〜５，０００分子という文献による報告に基づくと、所与の支柱は〜７８，５００個の分子を収容すると推定される（マ（Ma）ら著、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、１１０巻、ｐｐ．１４３２０‐１４３２３、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。従って、〜４０００億個のｓｓＤＮＡ分子の捕集分を収容するために、完全な積載を行い、かつ反復しないためには、アレイは、５１０万個の支柱を有することになる。０．２５μｍだけ離間して六角形に詰められた支柱（各支柱は直径１μｍである）を有する、２０×２０μｍのバイオリアクタチャンバに関して、バイオリアクタチャンバあたりの支柱の数は２８８であり、必要なバイオリアクタチャンバの最小の個数は１７，６７４である。従って一実施形態では、ナノセンサモジュールは〜１７，７００個の生体分子プロセッサを有する。
【００２４】
本明細書により詳細に記載されるように、上記ナノチューブは、上記生体分子プロセッサの上記バイオリアクタチャンバ内で生成及び／又は処理される単一分子を検出する機能を果たす。上記バイオリアクタチャンバからの単一分子は、上記入力端部において上記ナノチューブに入り、上記ナノ細孔を内包する上記ナノチューブの通路を通って動電学的に移動して、上記出力端部を出る。上記分子がナノ細孔を通過する際、検出される分子のイオン性塩濃度及びサイズに応じて、電流シグニチャが生成される。図３は、このプロセスの概略図である。図３の一連のパネルは、ナノチューブ６内の生体分子２８の位置を経時的に示し、また、生体分子２８がナノチューブ通路１０を通って移動する際に生成される、結果的な過渡電流を示す。この図の底部のグラフは、飛行管を通る単一生体分子の移動時間の関数として、電流の変化を追跡する。単一生体分子２８が入力端部１２においてナノチューブ６に入る際、過渡電流の変化がある。単一生体分子２８がナノ細孔８に入る際、過渡電流の更なる変化があり、これは生体分子２８がナノ細孔８を出る際に以前の値に戻るため、従って図３の底部に示されている電流：時間プロットにおいて下落部を生成する。第２の面内合成細孔に到達すると、別の過渡電流が生成され、第１の過渡電流と第２の過渡電流との間の時間差から、上記単一分子の飛行時間を推定でき、これを用いて、上記飛行管を通って移動する上記単一分子を同定できる。上記飛行時間は、上記単一分子の分子構造及び電荷に左右される。
【００２５】
上記ナノチューブは、幅１０〜２００ｎｍ、深さ１０〜２００ｎｍ、長さ５〜２５０μｍであってよい。一実施形態では、上記ナノチューブは、幅１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｎｍである。別の実施形態では、上記ナノチューブは、深さ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｎｍである。別の実施形態では、上記ナノチューブは、長さ５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０又は２５０μｍである。一実施形態では、上記ナノチューブ通路の寸法は、幅５０ｎｍ以下、深さ５０ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、上記ナノチューブ通路の寸法は、幅２５ｎｍ以下、深さ２５ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、上記ナノチューブ通路の寸法は、幅１５ｎｍ以下、深さ１５ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、上記ナノチューブ通路の寸法は、幅１０ｎｍ以下、深さ１０ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、上記ナノチューブ通路の寸法は、幅５ｎｍ以下、深さ５ｎｍ以下である。上記ナノチューブ通路は、長さ１μｍ〜＞２５０μｍ、又は長さ５μｍ〜２５０μｍとすることができ、またいずれの所望の幾何学的断面、即ち半球、三角形、正方形、長方形、五角形、六角形、七角形又は八角形を有してよい。
【００２６】
本発明の一実施形態では、上記ナノチューブチャネルは、ポリマー材料、例えばＰＭＭＡ、ＰＣ、エポキシ系樹脂、コポリマー、ポリスルホン、エラストマ及び高分子有機シリコン、又はこれらの材料のいずれの組み合わせを含む。上記ポリマー材料は、その自然な状態であってよく、或いは生体分子弁別及び検出を増強するために表面修飾されていてよい。例えばポリマー通路壁は、鎖の次数が異なる中性の疎水性炭化水素表面を含んでよい。別の例では、上記ナノチューブ通路壁表面は、電荷が中性の、親水性の表面を含んでよい。更に別の例では、ナノチューブ通路壁表面は、帯電した親水性の表面を含んでよい。上述のように、上記ナノチューブ通路壁の組成は、上記生体分子の飛行時間に影響を与え、従って生体分子の同定シグニチャを定義するのを支援する。
【００２７】
鎖の次数が異なる中性の疎水性炭化水素表面を含む、上記ナノチューブ通路の壁表面は、ポリマーナノチャネル表面上に構築された様々な長さのメチル末端アルカン鎖の単層から形成できる（ヘンリー（Henry）ら著「マイクロ分析デバイスの製作に使用されるポリ（メチルメタクリレート）の表面修飾（Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical devices）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７２巻、ｐｐ．５３３１‐５３３７、２０００年（（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。上記単層は、カルボン酸末端表面にアミノアルカンを付着させることによって形成できる（マカーリー（McCarley）ら著「ポリマーベースマイクロ分析デバイスの表面アーキテクチャの、レジストのないパターン形成（Resist‐Free Patterning of Surface Architectures in Polymer‐Based Microanalytical devices）」、米国化学会誌（米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.））、１２７巻、ｐｐ．８４２‐８４３、２００５年；ウェイ（Wei）ら著「マイクロ分析デバイスの製作に使用される、光化学的にパターン形成されたポリ（メチルメタクリレート）表面（Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical devices）」、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリーＢ（J. Phys. Chem. B）、１０９巻、ｐｐ．１６９８８‐１６９９６、２００５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。或いは上記単層は、アミド結合を介してポリマーに付着させたアミン官能基上の尿素結合アルカン層から形成できる（ヘンリー，Ａ．Ｃ．（Henry, A.C.）著「マイクロ電気機械システムの構成に使用されるＰＭＭＡの表面修飾及び特性決定（Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems）」、ケミストリー（Chemistry）、ｐｐ．１４７、ルイジアナ州立大学（バトンルージュ）、２００１年；ヘンリー（Henry）ら著「マイクロ分析デバイスの製作に使用されるポリ（メチルメタクリレート）の表面修飾（Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical devices）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７２巻、ｐｐ．５３３１‐５３３７、２０００年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。例えば、良好に整えられたオクタデシル単層を、ｎ‐オクタデシルイソシアネートとアミン末端ＰＭＭＡ表面との反応によって、ＰＭＭＡ表面に形成でき（ヘンリー及びマカーリー（Henry & McCarley）著「マイクロ分析デバイスの構成に使用される、プラスチック上の金属の選択的堆積：ＰＭＭＡ上での金属特徴部分の光指向型形成（Selective Deposition of Metals on Plastics Used in the Construction of Microanalytical devices: Photo‐Directed Formation of Metal Features on PMMA）」、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリーＢ（J. Phys. Chem. B）、１０５巻、ｐｐ．８７５５‐８７６１、２００１年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））、またこれらのＣ１８‐ＰＭＭＡ表面は、エンボス加工された複数のチャネルにおけるクロマトグラフィー分離に関して優れている（ガロウェイ（Galloway）ら著「モノ‐及びポリアニオン分子の分析のためのポリ（メチルメタクリレート）ベースのマイクロ流体デバイスにおける接触導電度検出（Contact Conductivity Detection in Poly(methyl methacylate)‐Based Microfluidic devices for Analysis of Mono‐ and Polyanionic molecules）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７４巻、ｐｐ．２４０７‐２４１５、２００２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。よって、様々な鎖長のｎ‐アルキルイソシアネートを用いて、異なる程度の次数を有する疎水性ポリマー表面を作製でき、これは通過する分子の飛行時間に影響を及ぼす。ゼロでない電気浸透流（ＥＯＦ）に関連する問題には、未反応の基礎基をキャッピングすることによって対処できる（ヘンリー，Ａ．Ｃ．（Henry, A.C.）著「マイクロ電気機械システムの構成に使用されるＰＭＭＡの表面修飾及び特性決定（Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems)」、ケミストリー(Chemistry）、ｐｐ．１４７、ルイジアナ州立大学（バトンルージュ）、２００１年；ウェイ（Wei）ら著「マイクロ分析デバイスの製作に使用される、光化学的にパターン形成されたポリ（メチルメタクリレート）表面（Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical devices）」、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリーＢ（J. Phys. Chem. B）、１０９巻、ｐｐ．１６９８８‐１６９９６、２００５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
【００２８】
親水性の、電荷中性表面を生成するための１つのアプローチは、適切に活性化されたカルボン酸末端ポリマー表面を、エタノールアミン又はアミノ‐トリ（エチレングリコール）と反応させることを伴う（ウェイ，Ｓ．（Wei, S.）著（ポリマーベースのマイクロ分析デバイス上のハイブリッドマイクロアレイの製作による、乳癌の多検体検出（Multianalyte Detection of Breast Cancer by Fabrication of Hybridmicroarrays on Polymer‐based Microanalytical Devices）」、ケミストリー（Chemistry）ルイジアナ州立大学（バトンルージュ）、２００５年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。代替例として、アミン末端ＰＭＭＡ及びＰＣ表面を、グリコール酸又はカルボキシル‐トリ（エチレングリコール）等の表面生成カルボキシル基を有するグリコールで修飾できる。カチオン表面は、アミン末端ポリマーの生成のための十分に確立された方法を用いて形成できる（ヘンリー及びマカーリー（Henry & McCarley）著「マイクロ分析デバイスの構成に使用される、プラスチック上の金属の選択的堆積：ＰＭＭＡ上での金属特徴部分の光指向型形成（Selective Deposition of Metals on Plastics Used in the Construction of Microanalytical devices: Photo‐Directed Formation of Metal Features on PMMA）」、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリーＢ（J. Phys. Chem. B）、１０５巻、ｐｐ．８７５５‐８７６１、２００１年；ヘンリー（Henry）ら著「マイクロ分析デバイスの製作に使用されるポリ（メチルメタクリレート）の表面修飾（Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical devices）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７２巻、ｐｐ．５３３１‐５３３７、２０００年；マカーリー（McCarley）ら著「ポリマーベースマイクロ分析デバイスの表面アーキテクチャの、レジストのないパターン形成（Resist‐Free Patterning of Surface Architectures in Polymer‐Based Microanalytical devices）」、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１２７巻、ｐｐ．８４２‐８４３、２００５年；ウェイ（Wei）ら著「マイクロ分析デバイスの製作に使用される、光化学的にパターン形成されたポリ（メチルメタクリレート）表面（Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical devices）」、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリーＢ（J. Phys. Chem. B)、１０９巻、ｐｐ．１６９８８‐１６９９６、２００５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。アニオン表面は、カルボン酸末端表面（マカーリー（McCarley）ら著「ポリマーベースマイクロ分析デバイスの表面アーキテクチャの、レジストのないパターン形成（Resist‐Free Patterning of Surface Architectures in Polymer‐Based Microanalytical devices）」、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１２７巻、ｐｐ．８４２‐８４３、２００５年；ヴァイジャ（Vaidya）ら「微細加工されたポリ（カーボネート）デバイスの表面修飾及び特性決定：電気浸透流の操作（Surface Modification and Characterization of Microfabricated Poly(carbonate) Devices: Manipulation of Electroosmotic Flow）」、アナリスト（Analyst）、１２７巻、ｐｐ．１２８９‐１２９２、２００２年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））、又はスルホン酸を有する表面（ヘンリー，Ａ．Ｃ．（Henry, A.C.）著「マイクロ電気機械システムの構成に使用されるＰ��ＭＡの表面修飾及び特性決定（Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems）」、ケミストリー（Chemistry）、ｐｐ．１４７、ルイジアナ州立大学（バトンルージュ）、２００１年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））につながるルートから得られ、後者は略ｐＨ非依存性の表面電荷を有する。
【００２９】
本明細書に記載のナノチューブは、ナノチューブ内の２つのナノ細孔の間に位置する１つの飛行時間セグメントを備えてよい。或いは図４に示すように、上記ナノチューブは、複数の、即ち３つ以上の、一体に連結した飛行時間セグメントを備えてよく、各飛行時間セグメントは、２つのナノ細孔の間に位置する。一実施形態では、各飛行時間セグメントは、複数の通過する分子及びその同定シグニチャ修飾因子又は生成因子と様々に相互作用する独自の化学構造を有する、通路壁を特徴とする。上記飛行時間セグメントは、長さが同一であっても異なっていてもよく、表面化学構造が同一であっても異なっていてもよい。飛行時間チャネルは、幅及び深さに関して、上記ナノチューブと同一の寸法制限を有する。換言すれば、上記飛行時間チャネルは、幅１０〜２００ｎｍ、深さ１０〜２００ｎｍであってよい。長さに関しては、上記飛行時間チャネルは、２つのナノ細孔間の上記ナノチューブの長さである。従って上記飛行時間チャネルの長さは、＜５μｍ、及び＞２００μｍ、又は５〜２００μｍのいずれの長さであってよい。これらの設計フォーマットにより、上記ナノチューブを通って移動する個々の分子の同定及び特性決定を増強するための、多元的な分離が可能となる。
【００３０】
上記ナノチューブの上記ナノ細孔の寸法は、上記ナノチューブの上記通路より大幅に小さい。例えば上記ナノ細孔は、幅又は深さ又はその両方を１〜１５０ｎｍとすることができ、また長さ５〜５００ｎｍであってよい。上記ナノ細孔は、幅又は深さ又はその両方を１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は１５０ｎｍとしてよく、また長さ５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００ｎｍであってよい。１つのナノチューブ内に２つ以上のナノ細孔が存在する場合、上記２つ以上のナノ細孔のうちのそれぞれ又はいくつかは、同一の寸法を有しても、異なる寸法を有してもよい。一実施形態では、２つ以上の離間したナノ細孔は、異なる寸法であり、これにより、ある特定の生体分子に関して、検出器が、上記離間した２つ以上のナノ細孔に亘る電流レベルの変化を測定した場合、上記２つ以上の離間したナノ細孔の間の電流変化の差によって、上記生体分子が上記２つ以上の離間したナノ細孔を順次通過していること、及びこれらの電流変化の間の時間が確立される。
【００３１】
本明細書に記載されているように、上記ナノ細孔は、上記ナノチューブ内の小孔であり、上記ナノ細孔のいずれかの側に上記ナノチューブを通って延在する通路の直径よりも小さい直径を有する。上述のように、１つのナノチューブは２つ以上のナノ細孔を内包してよく、各ナノ細孔は同一であるか又は異なる。上記ナノ細孔の直径は、関心対象の分子が上記ナノ細孔を通過する際に、上記分子の通路が、上記ナノ細孔を通る電気信号、例えば電流の変化によって検出されるようなサイズである。一実施形態では、上記ナノ細孔は、α‐溶血素又はＭｓｐＡ等のタンパク質を含み、これは修飾されていてもされていなくてもよい。別の実施形態では、上記ナノ細孔は合成ナノ細孔、例えば固体状ナノ細孔又はグラフェンナノ細孔である。固体状ナノ細孔は、本明細書に記載されるように、又は米国特許第７，２５８，８３８号（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されているように、製造できる。例示的な固体状ナノ細孔は、ストーム（Storm）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Nature Mater.）、２巻、ｐｐ．５３７‐５４０、２００３年；ヴェンカテサン（Venkatesan）ら著、アドヴァンスド・マテリアルズ（Adv. Mater.）、２１巻、ｐｐ．２７７１‐２７７６、２００９年；キム（Kim）ら著、アドヴァンスド・マテリアルズ（Adv. Mater.）、１８巻、ｐｐ．３１４９‐３１５３、２００６年；ナム（Nam）ら著、ナノ・レターズ（Nano Lett.）、９巻、ｐｐ．２０４４‐２０４８、２００９年；及びハーリー（Healy））ら著、ナノメディシン（Nanomedicine）、２巻、ｐｐ．８７５‐８９７、２００７年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に開示されている。別の実施形態では、上記ナノ細孔は、ナノ細孔タンパク質が固体状ナノ細孔に組み込まれた、ハイブリッドタンパク質／固体状ナノ細孔を含む。好適なナノ細孔は例えば、メイガー，Ｍ．Ｄ．及びメロッシュ，Ｎ．Ａ．（Mager, M. D. & Melosh, N. A）著、アドヴァンスド・マテリアルズ（Adv. Mater.）、２０巻、ｐｐ．４４２３‐４４２７、２００８年；ホワイト，Ｒ．Ｊ．（White, R. J.）ら著、ラングミュア（Langmuir）、２２巻、ｐｐ．１０７７７‐１０７８３、２００６年；ベンカテセン，Ｂ．Ｍ．（Venkatesan, B. M.）ら著、バイオメディカル・マイクロデバイセズ（Biomed. Microdevices）、１３巻、ｐｐ．６７１‐６８２、２０１１年、；イクバル（Iqbal）ら著、ネイチャー・ナノテクノロジー（Nature Nanotech.）、２巻、ｐｐ．２４３‐２４８、２００７年；ワヌヌ（Wanunu）ら著、ナノ・レターズ（Nano Lett.）、７巻、ｐｐ．１５８０‐１５８５、２００７年；シウィ（Siwy）ら著、ケミカル・ソサイエティ・レビューズ（Chem. Soc. Rev.）、３９巻、ｐｐ．１１１５‐１１３２、２００９年；コワルチク（Kowalczyk）ら著、ネイチャー・ナノテクノロジー（Nature Nanotech.）、６巻、ｐｐ．４３３‐４３８、２０１１年；及び米国公開特許出願第２０１００３３１１９４号（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている。
【００３２】
別の実施形態では、上記ナノ細孔はグラフェンナノ細孔である。好適なグラフェンナノ細孔は、ゲイム，Ａ．Ｋ．（Geim, A. K.）著、サイエンス（Science）、３２４巻、ｐｐ．１５３０‐１５３４、２００９年；フィッシュバイン（Fischbein）ら著、アプライド・フィジックス・レターズ（Appl. Phys. Lett.）、９３巻、ｐｐ．１１３１０７‐１１３１０３、２００８年；ギリト（Girit）ら著、サイエンス（Science）、３２３巻、ｐｐ．１７０５‐１７０８、２００９年；ガライ（Garaj）ら著、ネイチャー（Nature）、４６７巻、ｐｐ．１９０‐１９３、２０１０年；マーチャント（Merchant）ら著、ナノ・レターズ（Nano Lett.）、１０巻、ｐｐ．２９１５‐２９２１、２０１０年；シュナイダー（Schneider）ら著、ナノ・レターズ（Nano Lett.）、１０巻、ｐｐ．３１６３‐３１６７、２０１０年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている。
【００３３】
一実施形態では、本発明のデバイスは、１〜１００個の生体分子プロセッサ及びナノチューブ、１００〜１，０００個の生体分子プロセッサ及びナノチューブ、１，０００〜１０，０００個の生体分子プロセッサ及びナノチューブ、１０，０００〜１００，０００個の生体分子プロセッサ及びナノチューブ、又は１００，０００〜１，０００，０００個の生体分子プロセッサ及びナノチューブを備える。別の実施形態では、本発明のデバイスは、１，０００，０００個超の生体分子プロセッサ及びナノチューブを備える。一連の生体分子プロセッサ及びナノチューブは、ナノセンサチャンバ内に共に格納でき、本明細書中で詳述するように、一連のナノセンサチャンバが、デバイス上のナノセンサユニット又はモジュールに共に格納される。例えば一実施形態では、８個の生体分子プロセッサ及び８個のナノチューブを共に格納して１つのナノセンサチャンバを形成し、上記ナノセンサユニットは、〜２，５００個のナノセンサチャンバを含む。
【００３４】
本発明のこの態様によると、上記デバイスは更に、上記バイオリアクタチャンバの上流かつ上記１つ又は複数のナノチューブの下流の位置に位置決めされた電極を備え、電圧源を上記電極に電気的に接続して、上記バイオリアクタチャンバの上流の位置と上記１つ又は複数のナノチューブの下流との間に電圧勾配を確立する。この電圧勾配により、分子は、上記バイオリアクタチャンバから、上記１つ又は複数のナノチューブを通って、上記出力端部へと通過する。生体分子が上記１つ又は複数のナノチューブを通過する際の、上記１つ又は複数のナノ細孔に亘る電流レベルの変化を測定するために、検出器を上記デバイス内に位置決めする。
【００３５】
図３に示す一連の概略図は、２つのナノ細孔に嵌合した飛行管を通る単一分子の移動と、上記飛行管を通る上記単一分子の移動時間の関数としての、電流の変化（ΔＩＢ）とを表す。図３の底部のプロットで確認できるように、電流は、上記分子が上記ナノチャネルに入る前は、開放チャネル状態である。上記分子が上記チャネルに入ったものの、この例において上記細孔には入っていない場合、ΔＩＢはネガティブな応答を示し始め、上記粒子がこのチャネルに入るとイオン流束が低下することを示す。面内細孔において、ΔＩＢの値は更に低い値まで降下するが、過渡特性は、上記粒子が細孔間隙容積内にあることを示し、上記分子が上記第１の細孔を出る際にはそのナノチャネルの値まで降下する。第２の面内細孔に到達すると、別の過渡電流が生成される。第１の過渡電流と第２の過渡電流との間の時間差から、上記単一分子の飛行時間を推定できる。ΔＩＢの振幅は、上記第１のナノ細孔よりも上記第２の面内細孔に関して大きくなるが、これは、細孔直径が小さいためである。第１及び第２の細孔に関するΔＩＢの差は、上記細孔をより長くすること、又は細孔直径を調整することによって推定できる。
【００３６】
また、上記飛行管内で一連の３つ以上のナノ細孔を使用することもできる。図４では、上記ナノチューブ内の切れ目は、直列に配置された「ｎ」個の細孔の存在を表し、ここで「ｎ」はいずれの所望の数である。これは、飛行時間の測定の間の一致を生成することによって、決定における誤差を削減する能力等、多数の利点を提供できる。更に、異なるタイプの表面コーティングを、上述のような細孔のセットの間の上記ナノチューブの壁上に付与することにより、多元的クロマトグラフィーと呼ばれる技法を利用して単一分子の同定を改善できる。この多元的アプローチはまた、上記システムのピーク容量を増大させることによって、より高い多重化能力をもたらすことができる。
【００３７】
図４はまた、ナノチューブ６のトップカバー３８、及びトップカバー３８上の２つの電極３６の配置を示し、上記電極は、上記ナノチューブの入力端部及び出力端部付近に位置決めされる。別の実施形態では、上記カバープレートは、ナノ細孔の間に位置決めされる第３の電極を内包してよい。この実施形態によると、「ｎ」個のナノ細孔を内包するナノチューブは、上記カバープレート上に位置決めされた「ｎ」個の電極を内包できる。
【００３８】
図５及び６は、上記ナノチューブ内の電流変化を検出するための、代替的な単一電極構成を示す。
【００３９】
図５に示す実施形態では、追加のナノチャネルが、上記ナノ細孔を内包する上記ナノチューブに対して直交するように配置され、また２つのナノ細孔の間に配置される。上記ナノチャネルにイオン性溶液が充填され、上記ナノチャネルが外部電極に接続されると、イオン性溶液で充填された上記ナノチャネルは、２つの別個のナノ細孔における個別の過渡電流測定のための、共通の浮動設置として機能し、またこれによって、２つのナノ細孔間の分子の飛行時間を決定できる。同様の構造は、メナード（Menard）ら著、ＡＣＳナノ（ACS Nano）、６巻（１０）、ｐｐ．９０８７‐９０９４、２０１２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に開示されている。
【００４０】
図６に示す実施形態はまた、２つの上記ナノ細孔間に、上記ナノチューブに対して直交するように構築された、電極も示す。上記ナノチューブの通路を通過する上記分子の移動を阻害しないよう、上記直交電極は、上記飛行管の上面又は底面を通過するよう配置される。薄型絶縁層を、上記電極の表面にコーティングしてよい。上記直交電極は、２つの別個のナノ細孔における個別の過渡電流測定のための、共通の浮動設置として機能し、またこれによって、２つのナノ細孔間の分子の飛行時間を決定できる。
【００４１】
電子増幅回路構成は、分子が上記ナノチューブの上記ナノ細孔を通過して塞ぐ際の電流の変化を検出するために必要である。図７〜１４の回路図は、本明細書に記載のデバイスのナノチューブ内の電流変化を検出するのに好適な電気回路構成の、様々な代替実施形態を示す。
【００４２】
図７Ａは、流入細孔（Ｐｏｒｅ１）及び流出細孔（Ｐｏｒｅ２）を備えるナノチューブの上面図を示す。上記流入細孔の上には流体チャンバ又はウェルがあり、導電性電極Ａが、上記ウェルの流体内容物と接触している。同様に、上記流出細孔の下には別の流体チャンバがあり、その中には電極が存在する。イオン性溶液中に懸濁された生体分子又はナノ粒子は、上側ウェルから下側ウェルは、イオン泳動によって駆動される。上記生体分子が上記細孔を通って移動して上記細孔を塞ぐと、電流の変化が発生する（遮断電流）。
【００４３】
図７Ｂは、電極及び測定用回路構成を備えるナノチューブの回路図を示す。上記回路図は電圧（Ｖ１）を示し、これは、上記ナノチューブを通して分子又はナノ粒子を駆動するための電位源である。Ｖ１を調整することによって、上記ナノチューブ及びその細孔を通る上記分子の通行の所望の速度を提供する。各ナノ細孔の直径が極めて小さいことにより、電流の流れに対する抵抗が発生し、これは「Ｒｐｏｒｅ１」及び「Ｒｐｏｒｅ２」で表される。これらの抵抗はそれぞれ、可変抵抗器として示される。というのは、上記細孔が分子又は粒子によってブロックされた場合、上記抵抗は、ブロックされた上記細孔の直径のパーセンテージに比例して（或いは上記分子又は粒子のサイズに比例して）増大するためである。次にこの電流の変化を、図示されているような電流‐電圧コンバータ増幅器で測定し、その出力は：
Ｖｏｕｔ＝Ｉ＊Ｒｆ
となり、ここでＶｏｕｔは、上記増幅器の出力電圧であり、Ｉは、上記細孔に亘って印加された駆動電圧から得られる電流であり、Ｒｆは帰還抵抗の値である。
【００４４】
上記出力電圧は、上記分子又は粒子の速度及び上記細孔の長さに比例するパルス幅を有するパルスである。上記電圧パルスの振幅は、各細孔における遮断イベントによる電流の変化に比例する。なお、アナログ形態であるかデジタル形態であるかにかかわらず、フィルタ又はパルス整形回路構成を、ここで示した全ての回路と共に使用して、Ｓ／Ｎ比を改善でき、又は上記遮断イベントの検出能力を改善できる。
【００４５】
図８Ａ〜Ｂは、図７Ａ〜Ｂに示したものと同一の多くの特徴を繰り返すが、図８Ｂは、ＡＣ源の導入を示す。この場合、ＤＣ電圧源Ｖ１は依然として、上記ナノチャネル及びその細孔を通して上記分子又は粒子を輸送するために必要な電圧勾配を供給するが、ここでは遮断電流は、Ｖ１からのＤＣ電流に依存しない。この場合、ＡＣ信号源を、上記ナノチャネルに亘って容量的に連結して、ＤＣ駆動電圧の上部にＡＣ信号を重ねる。そして、ＤＣ電流の代わりにＡＣ電流の変化を用いて、遮断イベントを検出する。これにより、遮断電流の測定が、駆動電圧及び駆動電圧に発生し得るいずれの変化から切り離される。通常動作時、駆動電圧Ｖ１は、いずれの電気化学的現象が上記電極において発生するのを回避するために、極めて低い電位に維持しなければならない。これにより、測定できる電流変化の振幅が制限される。しかしながら、ＡＣ源を用いると、電気化学的現象の発生を防止するのに十分に高い周波数が選択される。更に、ＡＣ信号はゼロに関して対称であるため、イオン分極が発生しない。これにより、上記分子又は粒子の通行に影響を及ぼすことなく、上記ナノチューブに亘って比較的高い電圧を印加でき、これによって、得られる電流が上昇し、遮断イベントの測定能力が改善される。更に、フィルタリング（即ちローパス、バンドパス、ハイパス又は他のいずれのフィルタトポロジ）を効果的に適用することによって、ノイズ及びドリフトを低減できる。また、信号処理を実装することによって、遮断電流変化の振幅及び位相を測定でき、これにより、電流遮断イベントの測定に関する信号対ノイズ比を改善するために使用できる、更なる相関する測定を提示できる（例えば上記ナノ細孔内に存在する分子）。なお、この実施形態及び以下に記載の全ての後続の実施形態では、ＡＣ源は変圧器に接続することもでき、また二次センタータップを用いて、中点電圧、即ち共通の電圧を確立できる。
【００４６】
図９Ａ〜Ｂは、図７Ａ〜Ｂ及び８Ａ〜Ｂに示されているような、遮断電流を測定するための代替実施形態を示す。この方法は、電流変化を直接測定する代わりに電圧を測定することを伴う。同様の方法は、フライキン（Fraikin）ら著「高スループット無標識ナノ粒子アナライザ（A High‐throughput Label‐free Nanoparticle Analyser)」、ネイチャー・ナノテクノロジー（Nature Nanotechnology）６巻、ｐｐ．３０８‐３１３、２０１１年（本文献は、参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている。この実施形態では、第３の電極を、上記ナノチューブの中央の、上記細孔の間に配置する。図９Ａ〜Ｂは、第２の細孔に亘る電圧変化の測定を示すが、上記電圧変化は、いずれの細孔（Ｐｏｒｅ１又はＰｏｒｅ２）に亘って測定できる。標準的な電圧増幅器を用いて、図示されているようにこの測定を実施できる。この実施形態では、Ｐｏｒｅ１における遮断イベントにより、Ｐｏｒｅ２に亘って測定される電圧が上昇する。Ｐｏｒｅ２における遮断イベントにより、上記測定される電圧は低下する。この構成は、上記ナノ細孔の抵抗が同一であることによって、各細孔における遮断イベントに関する最大の電圧変化が得られる場合に、最も良好に動作する。しかしながら、上記ナノ細孔の抵抗が大幅に異なる場合、物理抵抗器を、抵抗が最低の細孔に直列に追加することによって、電圧を平衡化してよい。この測定方法は、図７Ａ〜Ｂ及び８Ａ〜Ｂの電流測定方法を上回る一定の利点を提供する。というのは、純電圧増幅器のＲｐｏｒｅの特定の値に関して、信号対ノイズ比及び帯域幅は、電流‐電圧増幅器よりも良好となり得るためである。
【００４７】
図１０Ａ〜Ｂに示す実施形態は、電圧増幅器が容量的に接続されていることを除いて、図９Ａ〜Ｂの全ての特徴を示す。この容量性接続は、物理キャパシタを上記電極と直列に使用することによって生成でき、又は中央電極自体に適用される誘電絶縁体から（若しくは上記電極自体の他の物理的特性によって）得ることができる。容量性接続の上記第１の方法は、測定から低周波数ノイズ及びドリフトを除去するように設計できるハイパスフィルタを生成する。絶縁体を上記電極に印加することによる、容量性接続の上記第２の方法は、上記電極を化学的に不活性化することによって、上記分子又は粒子が上記ナノチューブを横断する際の、ＤＣ電場電位に対する、及び上記分子又は粒子に対する上記電極の影響を低減又は排除するのを支援できる。この容量性接続は、遮断イベントの電圧シグニチャが、その高周波数成分のみを捕集することによって合理的に良好に再現できる、理論的には単一の方形波であることを理由として、使用できる。Ｃ１の値を調整することによって、形成されるハイパスフィルタのカットオフ周波数を最適化できる。
【００４８】
図１１Ａ〜Ｂは、ＤＣ駆動電圧（Ｖ１）に重ねられるＡＣ電圧信号の使用を示し、これは、上記図８Ａ〜Ｂと同様に、測定源から駆動電圧源を分離し、図８Ａ〜Ｂに関して記載されたものと同一の利点を全て有する。Ａ１は、Ｃ２を通して接続されたＡＣ又はＤＣとすることができる。Ｃ２は、直列キャパシタとすることができ、又は上述のように、上記電極自体に関連付けられた誘電体とすることができる。
【００４９】
図１２Ａ〜Ｂでは、バイポーラ様式で配設された２つのＤＣ電圧源を用いて、上記ナノチューブを通して分子又は粒子を駆動する。これらの電圧源は、単一の源で置換できるが、バイポーラ源を設けることにより、中点接続を、これによって利点を提供できる場合に、回路構成内で共通物又は基準として任意に使用できるようになる。また、このバイポーラ駆動方法により、２つの細孔に亘って異なる駆動電圧を印加できるようになり、これにより、個々の細孔を通る速度の完全な差動制御が可能となる。増幅器Ａ１、Ａ２及びＡ３は、典型的な差動増幅器、又は計測増幅器（ＩｎＡｍｐ）トポロジで配設される。この回路トポロジは、ディスクリート部品（トランジスタ若しくはオペアンプ）から構成でき、又は計装増幅器の多数の市販の実装形態のうちの１つを使用できる。
【００５０】
図１３Ａ〜Ｂに示す実施形態は、中央電極のＡＣ接続を示していることを除いて、図１２Ａ〜Ｂに示されているものと同一である。上述のように、Ｃ１は直列接続キャパシタとすることができ、又はＣ１は、上記電極自体に関連付けられた誘電体とすることができる。
【００５１】
図１４Ａ〜Ｂに示す実施形態は、ＤＣ駆動電圧に重ねられる容量性接続ＡＣ源の使用を示す。上記ＡＣ源の使用は、既に記載した上述の複数の実施形態において列挙したものと同一の利点を有する。１つ又は複数の差動増幅器は、Ｃ２の使用により、上述のようにＡＣ又はＤＣ接続できる。フィルタリング又は信号処理を、出力に対して使用できる。
【００５２】
図１５は、単一のナノチューブ内で生体分子によって生成される遮断イベント信号を検出及び処理するための２つの方法を示す。いずれの場合においても、増幅器Ａは、フィルタリング／信号処理と併せて、図７〜１４に示す測定方法のうちのいずれかを表すことができる。図１５Ａに示す方法では、各細孔における遮断イベントからのパルス信号を、アナログ‐デジタル変換器（ＡＤＣ）において連続的に変換して、バスを介してデータ処理／計算設備に提示する。これは、ＡＤＣに関する高い変換帯域幅を必要とし、またこれは、処理設備に対して相当な量のデータを長期間に亘って提示する。更にこの方法は、遮断信号が存在しない場合であっても、高変換率でデータを収集する。データ処理設備は、このデータを採取し、アルゴリズムを利用してパルス高及び飛行時間を決定しなければならない。この方法は、調査のための実験又は低スループット分析に関しては良好に作用するものの、プロセスの規模を数千又は数百万個のナノチューブにまで拡大すると、データスループットは持続不可能となる。図１５Ｂは、必要なデータの量を削減できる、代替的な方法を示す。飛行時間データのみを集める実施形態では、遮断信号は、流入遮断イベントに関するタイミングパルス及び流出イベントに関する別のタイミングパルスを提供する、定画分弁別器へと送ることができる。流入パルスは時間間隔カウンタを開始させ、流出パルスは上記カウンタを停止させる。上記時間間隔カウンタは次に、飛行時間を表す単一の数をデータ処理設備へと渡す。これにより、１秒あたり場合によっては数百万の試料を、遮断イベントのペア毎に１つの値にまで低減する。遮断イベントの大きさを測定する実施形態では、定画分弁別器を用いて、サンプル／ホールド及びＡＤＣをトリガでき、これにより、各遮断イベントに関していくつかの値のみが変換される。これにより、ＡＤＣを連続的に動作させる代わりに、各遮断イベント中にデータの量が僅か数点のみに削減される。
【００５３】
分子が面内合成ナノ最高を通って移動する際に生成される過渡電流を測定するために、上記ナノセンサユニットと外部電気回路構成との間の電気的接続が必要である。更に、上記バイオリアクタチャンバの上記離間した固体支持体からの放出後に、固相の生成産物の電気泳動を生成するための駆動電圧も、同様に発生しなければならない。図１６は、ナノセンサユニット５０と典型的なプリント回路基板（ＰＣＢ）５２との間の高密度電気的接続を可能とする構成を示す図である。以下で説明するように、金接点５４、５６がナノセンサ５０上及びＰＣＢ５２上に鍍金される。エラストマ性（「ゼブラ（Ｚｅｂｒａ）」）コネクタ５８を用いて、金パッド５４、５６間の接続を行う。エラストマ性コネクタ５８は、交互になった導電層及び絶縁層を圧縮性エラストマ内に備える、市販のコネクタである。エラストマ性コネクタ５８内に少なくとも２つの導電層を受承できる幅を有する金パッド５４、５６を用いると、パネルとコネクタとの間の整列が容易になる。次にナノセンサ５０及びＰＣＢ５２を圧縮して、接続を作製する。上記ナノセンサは、取り外し及び交換が可能であり、これにより上記ナノセンサを使い捨て部品とすることができる。
【００５４】
上記電気的接続は、コング（Kong）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２７巻、ｐｐ．２９４０‐２９５０、２００６年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載された戦略を採用して製作できる。この場合、上記トップカバープレートを適切なプラスチックから射出成形することにより、必要な貫通孔を作製する。プラスチックプレート上の電気リード線の位置は、フォトマスクを通して上記プラスチックカバープレートをＵＶ／Ｏ３放射に曝露することによって画定され、上記曝露により、上記プラスチックが上記放射に曝露された場所のみにカルボン酸官能基が生成される。光パターン形成された上記プレートを、光溶解領域の選択的アミノ化のために、ＥＤＣを含有するエチレンジアミンの溶液に浸漬する。選択的にアミノ化されたこの基板を、ＨＡｕＣｌ４、ＮａＢＨ４及びＫＳＣＮの水溶液に順次浸漬することにより、無電解鍍金のための準備を行う。金の微小接点は、Ｎａ３Ａｕ（ＳＯ３）２、ＮａＳＯ３及びホルムアルデヒドを含有する金鍍金浴中に上記プレートを置くことによって、上記プラスチックプレートの、選択的に活性化された領域上に、無電解鍍金される。
【００５５】
本発明のデバイスを市場において有用なものとするために、上記ナノセンサチャンバが大型アレイで動作することが必要である。従って電子装置を、ナノセンサチャンバのアレイを取り扱えるように十分な入力及び出力チャネルを備えた集積回路として、チップ形態に集積する。これらのＩＣは、ハイパーＢＧＡ（ＨｙｐｅｒＢＧＡ）パッキング等の高密度技術を用いてカプセル化でき、またプリント回路基板（ＰＣＢ）上に積載できる。
【００５６】
汎用分子プロセッサシステム（ｕＭＰＳ）
本発明のデバイスは更に、上記固体基板によって画定された、上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの上流の、１つ又は複数のユニット又はモジュールを備えてよい。これらの１つ又は複数の追加のモジュールは、上記生体分子プロセッサ及び上記ナノチューブに入るための、試料調製及び処理、即ち試料内の標的核酸分子の単離及び調製を実施するよう構成される。本明細書に記載されるような、上記生体分子プロセッサ及びナノチューブ内での処理及び検出のために生体試料を調製するために設計された複数の特定タスク向けユニットと共にナノセンサユニット内に格納される複数の生体分子プロセッサ及びナノチューブを内包する、例示的なデバイスが、図１７Ａ及び１７Ｂに示されており、これを本明細書では汎用分子プロセッサシステム（ｕＭＰＳ）と呼ぶ。
【００５７】
図１７Ａ（斜視図）及び１７Ｂ（上面図）に示すようなｕＭＰＳ１００は、１０個の特定タスク向けモジュール１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、及び５０で構成され、これらは、流体マザーボード１０２に接続され、以下で説明されるような３つのサブシステムに編成される。上記モジュールは、限定するものではないがホットエンボス加工、射出成形又はインプリント等の技術を用いて、プラスチックから製作される。各モジュールのために選択される特定のプラスチックは、当該モジュール上で実行されるタスクを最適化することを前提とする。これらのモジュールは、漏れの無い相互接続を用いて、上記流体マザーボードに接続され、上記相互接続はまた、掃引されない体積を最小限に押さえ、かつ溶液が上記相互接続を通って移動する際に溶液を脱気する（気泡を除去する）ように、加工される。上記モジュールは、ピン、及び上記基板にエンボス加工されたＶ字型溝を用いて、上記マザーボードに対して整列される。また、非特異的吸着アーティファクトを防止するための処置を用いて、プラスチック表面を修飾する。
【００５８】
図１７ＡのｕＭＰＳデバイス１００上の最後のモジュールとして図示されているナノセンサモジュール５０は、上述のように、上記生体分子プロセッサ及びナノチューブを格納する。上記ｕＭＰＳのナノセンサユニット５０は、１００〜１，０００，０００個のナノセンサチャンバ３０を格納し、各ナノセンサチャンバは、８個の生体分子プロセッサ及び８個のナノチューブを格納する（図１Ａ、３０参照）。一実施形態では、上記ナノセンサユニットは２，５００個のナノセンサチャンバを格納し、各ナノセンサチャンバは、〜２００μｍ×〜４１０μｍの寸法を有する。
【００５９】
４０００億個のｓｓＤＮＡを受承するための２，５００個のナノセンサチャンバのフットプリントに関する計算を以下に示す。
２，５００個のチャンバ＝２０，０００個の生体分子プロセッサを内包する正方形：
２，５００＝ＸＹ＝２．０５Ｙ２；よってＹ＝３４．９＝３５
よってＸ＝７１．６
２，５００個のチャンバは、１４．３×１４．３ｍｍのアレイ＝１．４×１．４ｃｍサイズ＝０．６×０．６インチ四方にフィットする。
２５，０００個のチャンバ＝２００，０００個の生体分子プロセッサを内包する正方形：
２５，０００＝ＸＹ＝２．０５Ｙ２；よってＹ＝１１０．４３
よってＸ＝２２６．３８
２５，０００個のチャンバは、４５×４５ｍｍのアレイ＝４．５×４．５ｃｍサイズ＝１．８×１．８インチ四方にフィットする。
【００６０】
ナノセンサモジュール５０上に配置されるナノセンサチャンバの上記個数の計算されたサイズにより、このモジュールは、ｕＭＰＳ１００を備える６”ウェハ上に容易にフィットさせることができ、またこのモジュールは、図１７Ａ〜１７Ｂに示すような他の処理モジュール１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０を収容するための十分な空間を提供できる。
【００６１】
上記ｕＭＰＳの用途に応じて、ｕＭＰＳデバイスあたりの生体分子プロセッサの数を最大化することが望ましい場合がある。従って一実施形態では、上記ナノセンサチャンバを、１７５×１７５μｍの寸法を示すように合理化でき、この寸法は８個の生体分子プロセッサを内包し、これらはそれぞれ、２５×１６μｍのフットプリント内にある（各生体分子プロセッサは２８８個の支柱を備える）。１６μｍの生体分子プロセッサ８個の間に５μｍの間隔があり、壁が５μｍであると、合計は１７５μｍ幅である。入力領域２５μｍ＋シェブロンバッフル５０μｍ＋２５μｍの生体分子プロセッサ＋５０μｍの飛行管＋２０μｍの間隔＋５μｍの壁＝１７５μｍである。
【００６２】
４×４インチウェハ＝１０１．６ｍｍ×１０１．６ｍｍである。これは、５８０×５８０＝３３６，４００個のチャンバそれぞれが８個の生体分子プロセッサを内包して、合計２，６９１，２００個の生体分子プロセッサとなることを意味している。従ってこの実施形態では、４×４インチウェハは、約３３６，０００個のチャンバ及び２，６００，０００個の生体分子プロセッサを内包する。
【００６３】
６×６インチウェハ＝１５２．４ｍｍ×１５２．４ｍｍであるが、１辺あたり１３５ｍｍ（５．３インチ）しか使用しないため、１３５ｍｍ×１３５ｍｍとなる。これは、７７１×７７１＝５９４，４４１個のチャンバそれぞれが８個の生体分子プロセッサを内包して、合計４，７５５，５２８個の生体分子プロセッサとなることを意味している。従ってこの実施形態では、６×６インチウェハは、約６００，０００個のチャンバ及び４，７００，０００個の生体分子プロセッサを内包する。
【００６４】
本発明のデバイスは、図１７Ａ及び１７ＢのｕＭＰＳデバイス上に示されている上記特定タスク向けユニット（モジュールとも呼ばれる）のうちのいずれの１つ又は複数を、上記生体分子プロセッサ及びナノチューブを格納する上記ナノセンサユニットと組み合わせて内包してよい。ユニットの特定の組み合わせは、上記ｕＭＰＳの所望の機能（即ち分析される試料（例えばエキソソーム：ｃｆＤＮＡ：ＲＮＡ）及び分析される端点（例えば変異検出、コピー数計数、メチル化検出、シーケンシング等））に左右される。本発明の一実施形態では、上記デバイスは、図１７Ａ及び１７Ｂに示すｕＭＰＳデバイスの上記モジュールの全てを内包する。上記デバイスの特定の用途に応じて、特定の試料を処理する際に、選択されたモジュールのみを利用する（即ち、上記デバイス上の全てのモジュールを、試料分析に採用する必要はない）。例えば一実施形態では、上記ｕＭＰＳデバイスの上記モジュールのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個全てを、いずれの所与の用途のために、ナノセンサモジュール５０と組み合わせて、利用できる。上記デバイスの様々なモジュールへの、様々なモジュールを通る、及び／又は様々なモジュールから離れる、上記試料の流れは、マザーボード１０２のマイクロ流体ネットワーク１３４を通して実施され、また、上記マイクロ流体ネットワーク全体に配置された一連のバルブ１３２によって制御される。試薬リザーバ１０８〜１１４、１１８、１２０、１２４〜１３０、洗浄剤リザーバ１０６、空気リザーバ１１６及び廃棄物リザーバ１２２は、上記マザーボードの対向する外側縁部を走り、上記様々な特定タスク向けモジュールに対する反応成分の送達及び除去を促進する。
【００６５】
図１７Ａを参照すると、上記ｕＭＰＳデバイスの第１のサブシステムは、６個のモジュールからなり、試料入力ポート１０４において上記デバイスに入る血液の試料を操作することによって、細胞選択モジュール１５０を介して標的生体細胞（例えば循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、免疫細胞等）又は微生物病原体を単離し、血漿単離ユニット２００を介して赤血球及び白血球から結晶を分離し、固相抽出モジュール２５０及び３００それぞれを介して、上記結晶からの、ｃｆＤＮＡの抽出及び／又はエキソソームの選択を行うことができる。このサブシステムのための他の２つのモジュールは、上記細胞選択モジュールから放出された個々の細胞をカウントするために使用されるインピーダンスセンサ３５０、及び全血から選択された溶解生体細胞から放出されるＤＮＡ／ＲＮＡを捕集するための固相抽出モジュール４００で構成される。
【００６６】
図１８Ａに、細胞選択モジュール１５０の斜視図を示す。上記モジュールは、入力ポート１５２、捕集ベッド１５４及び出力ポート１５６で構成される。図１８Ｂに、捕集ベッド１５４の拡大斜視図が示されている。この図に示されているように、上記捕集ベッドは、多数の平行チャネル１６０を備え、上記チャネルは、流体試料中の細胞とチャネル壁１６２との間の接触を増強するために使用される、正弦波状、準正弦波状又は他の蛇行するチャネル形状を有する。上記チャネルは、高いアスペクト比（３：１以上）を有し、標的細胞の直径の１〜２倍程度の幅を有する。上記チャネル壁は、モノクローナル抗体、アプタマー、又は標的細胞タイプに特異的な他の結合分子で装飾される（カマンデ（Kamande）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８５巻、ｐｐ．９０９２‐９１００、２０１３年；及びプラグルラ（Pullagurla）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）８６巻、ｐｐ．４０５８‐４０６５、２０１４年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。試料が流れた後、選択モジュール１５０の上記チャネル壁に結合した上記標的細胞は、洗浄剤リザーバ１０６からの洗浄流体によって洗浄される（図１７Ｂ参照）。
【００６７】
捕集及び洗浄後に標的細胞を選択的に放出するために、上記標的細胞を捕集するために利用される上記モノクローナル抗体、アプタマー又は他の親和剤を、図１９に示すように、ヘテロ二官能性リンカー（ＳＭＣＣ）を有するオリゴヌクレオチドによって、上記チャネル壁の表面に付着させる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカーは、修飾ヌクレオチド、例えばウリジン又は光切断性残基を含有し、これは、上記抗体又はアプタマーによって結合された標的細胞を放出するために、酵素によって切断される。切断酵素を含有する放出バッファを、図１７Ａ及び１７Ｂに示すように、細胞選択モジュール１５０に隣接する試薬リザーバ１０８内に格納する。オリゴヌクレオチドリンカーの使用は、オリゴヌクレオチドが安価であり、放出効率が＞９３％であり、また放出された細胞の＞９０％が生存したままであるため、魅力的である。更にＵＳＥＲ（ウラシル特異的励起試薬）の選択的な作用により、上記チャネル壁の表面に非特異的に付着した細胞は、放出されない。例えば抗体又はアプタマーといった親和性捕集分子を、上記細胞選択モジュールの上記チャネル壁に対して不動化することは、５’アミノ基を介したオリゴヌクレオチドの共有結合のために、表面に閉じ込められたカルボン酸を生成するための、熱可塑性物質へのＵＶ／Ｏ３（２５４ｎｍ）照射を伴い、その３’末端のスルフヒドリルは、ＳＭＭＣ／親和性コンジュゲートと反応する。
【００６８】
或いは、親和性を選択された標的細胞の放出のための他の方法を採用でき、例えば親和剤装飾済みの固体表面からのＣＴＣの放出を：トリプシン化（ダルマシリ（Dharmasiri）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）８３巻、ｐｐ．２３０１‐２３０９、２０１１年；カマンデ（Kamande）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８５巻、ｐｐ．９０９２‐９１００、２０１３年；アダム（Adams）ら著、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１３０巻、ｐｐ．８６３３‐８６４１、２００８年；及びシェン（Sheng）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻、ｐｐ．８９‐９８、２０１４年）；ヒドロゲル（ハッチ（Hatch）ら著、ラングミュア（Langmuir）、２７巻、ｐｐ．４２５７‐４２６４、２０１１年；ユ（Yu）ら著、スモール（Small）、９巻、ｐｐ．３８９５‐３９０１、２０１３年；及びシャー（Shah）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８４巻、ｐｐ．３６８２‐３６８８、２０１２年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））；媒介磁気放出（ユ（Yu）ら著、スモール（Small）、９巻、ｐｐ．３８９５‐３９０１、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））；アプタマーのヌクレアーゼ外消化（チェン（Chen）ら著、アドヴァンスド・マテリアルズ（Adv. Mater.）、２３巻、ｐｐ．４３７６‐４３８０、２０１１年；及びシェン（Shen）ら著、アドヴァンスド・マテリアルズ（Adv. Mater.）、２５巻、ｐｐ．２３６８‐２３７３、２０１３年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））；又はレーザ微小切開によって複数のセクションが除去されたＰＧＬＡナノファイバ（ホウ（Hou）ら著、アンゲヴァンテ・ヒェミー（Angew Chem. Int. Ed. Engl.）、５２巻、ｐｐ．３３７９‐３３８３、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））を用いて達成できる。
【００６９】
上記細胞選択モジュールは、プラスチックを用いて製作され、マイクロ複製によって製造される。図１８に示す細胞選択モジュールを作製及び使用する方法は、ソパー（Soper）らに対する米国公開特許第２０１２０１００５２１号；アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）８３巻、ｐｐ．２３０１‐２３０９、２０１１年；及びジャクソン（Jackson）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻（１）、ｐｐ．１０６‐１０７、２０１４年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に更に記載されている。図１７のｕＭＰＳデバイスでの使用に好適な、代替的なナノ構造形成された細胞選択モジュールは、当該技術において公知であり、例えばリム（Lim）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１２巻、ｐｐ．４３８８‐４３９６、２０１２年；ワン（Wang）ら著、アンゲヴァンテ・ヒェミー（Angew Chem. Int. Ed. Engl.）、５０巻、ｐｐ．３０８４‐３０８８、２０１１年；ワン（Wang）ら著、アンゲヴァンテ・ヒェミー（Angew Chem. Int. Ed. Engl.）、５０巻、ｐｐ．３０８４‐３０８８、２０１０年；ストット（Stott）ら著、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、１０７巻、ｐｐ．１８３９２‐１８３９７、２０１０年；リン（Lin）ら著、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clin. Cancer Res.）、１６巻、ｐｐ．５０１１‐５０１８、２０１０年；ホソカワ（Hosokawa）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８２巻、ｐｐ．６６２９‐６６３５、２０１０年；スー（Xu）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８１巻、ｐｐ．７４３６‐７４４２、２００９年；及びタン（Tan）ら著、バイオメディカル・マイクロデバイセズ（Biomed. Microdev.）、１１巻、ｐｐ．８８３‐８９２、２００９年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））を参照されたい。
【００７０】
本発明のデバイスは更に、長手方向に延在する血漿単離ユニットを備えてよく、上記血漿単離ユニットは、上記固体基板によって画定され、また生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの上流である。上記長手方向に延在する血漿単離ユニットは：投入通路；上記投入通路より幅広い排出通路；及び上記投入通路と上記排出通路とを接続する移行部通路を備える。上記移行部通路は、上記移行部通路が上記投入通路から上記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる、移行部通路を備える。上記血漿単離ユニットはまた、上記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルを備え、ここで上記投入通路と各上記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、上記投入通路から上記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される。上記血漿単離ユニットはまた、上記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルを備え、ここで上記排出通路と各上記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、上記投入通路から上記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される。
【００７１】
血漿単離ユニット２００は、図１７ＡのｕＭＰＳデバイス上の細胞単離ユニット１５０に隣接して配置される。例示的な血漿単離ユニットを図２０Ａ〜２０Ｄに示す。図２０Ａに示すように、上記血漿単離ユニットは一次先細単離チャネル（即ち投入通路）２０４を備え、これは、より幅広の二次単離チャネル（即ち排出通路）２０８に向かって開いている。図２０Ａの線２０Ｄ‐２０Ｄを通る図２０Ｄの断面図は、高流量の血漿除去を可能にする、深さ約１３０μｍの一次単離チャネル２０４を示す。サイズ選択フィルタとして機能する移行部チャネル２０６は、より深い一次単離チャネル２０４を、約３０μｍの深さしかない二次チャネル２０８に接続する。（図２０Ｄ参照）。一次側部チャネル２１０は、入力ポート２０２を介して上記血漿単離モジュールに入る血液試料から分離された血漿を収集及び輸送するために使用される。図２０Ｂは、図２０Ａの線２０Ｂ‐２０Ｂを通る断面であり、これは、一次チャネル側部ポート２２８（高さ〜２μｍ）を示し、この一次チャネル側部ポート２２８は、一次チャネル２０４及び移行部チャネル２０６の長さに亘って延在し、一次側部チャネル２１０へと開いている。図２０Ｂを参照すると、一次チャネル側部ポート２２８は、一次単離チャネル２０４と一次側部チャネル２１０との間に位置決めされた一次セパレータ２１２から形成される。一次セパレータ２１２は、血漿が一次チャネル側部ポート２２８を介して一次チャネル２０４を出て、一次側部チャネル２１０に入るのを可能にするが、細胞はこれを行うことができないようにサイズ設定される。一次側部チャネル２１０は一次レシーバポート２１６に繋がり、この一次レシーバポート２１６は、血漿並びにその構成成分（例えばエキソソーム、ｃｆＤＮＡ及びイオン）を収集するが、その一方で赤血球及び白血球等の細胞物質は、濾過壁に沿って、廃棄物ポート２２４に向かって輸送される。二次単離チャネル（即ち排出通路）２０８に入った血漿は同様に、二次チャネル側部ポート２３０を介して二次単離チャネル２０８を出て、二次レシーバポート２２６で収集されるために、二次側部チャネル２１８へと流入する。二次チャネル側部ポート２３０は、二次単離チャネル２０８と二次側部チャネル２１８との間に位置決めされた二次セパレータ２２０から形成される。二次セパレータ２２０は、血漿が二次チャネル側部ポート２３０を介して二次チャネル２０８を出て、二次側部チャネル２１８に入るのを可能にするが、細胞はこれを行うことができないようにサイズ設定される。二次チャネル側部ポート２３０を通過しない細胞物質は、二次チャネル壁に沿って廃棄物ポート２２４へと移動する。図２０Ｃは、図２０Ａの線２０Ｃ‐２０Ｃを通る断面図であり、二次チャネル２０８、二次側部チャネルポート２３０、二次セパレータ２２０及び二次側部チャネル２１８を示す。上記一次及び二次レシーバポートで収集された血漿は、他の処理モジュール、例えばエキソソーム及びｃｆＤＮＡの単離のための抽出器ユニットへと送り出される。レシーバポート２１６、２２６における流量を調整することによって、除去効率及び血漿回収速度に影響を及ぼす。
【００７２】
上記一次、二次及び側部チャネルは、熱融着結合を用いてカバープレート２３２によって封止される。一次側部レシーバポート２１６及び二次側部レシーバポート２２６並びに廃棄物出口２２４において吸入モードで動作する、２つのシリンジポンプは、本システムを流体に関して制御する。上記血漿単離ユニットからの廃棄物は、上記ユニットを出て、ｕＭＰＳ上の廃棄物リザーバ１２２に収集される（図１７Ａ）。
【００７３】
図２１Ａ〜２１Ｂには、代替的な血漿単離モジュールが示されている。このデバイスは、ディモフ（Dimov）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）、１１巻、ｐｐ．８４５‐８５０、２０１１年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に既に記載されているように、沈降の差に基づいて、白血球及び赤血球を、エキソソーム及び無細胞ＤＮＡを含有する血漿から分離する。図２１Ａの斜視図は、入力ポート６０２及び供給側チャネル６０４から構成される例示的な代替の血漿単離モジュール６００を示す。供給側チャネル６０４は、一連の平行な単離チャネル６０６と交差し、各単離チャネルは、血液細胞トラップ６０８を内包する。図２１Ａの線２１Ｂ‐２１Ｂを通る断面図である図２１Ｂは、入力ポート６０２を示し、ここで全血試料が上記モジュールに入り、上記平行な単離チャネル６０６のうちの１つは、トラップ６０８を内包する。各トラップは、深さ〜１ｃｍ、直径〜０．２４ｃｍ、合計容積〜０．０４５ｍＬである。上記試料が上記単離チャネルを通って移動すると、上記血液細胞は、細胞トラップ６０８内に保持されるが、血漿並びにその構成成分（例えばエキソソーム、ｃｆＤＮＡ及びイオン）は上記単離チャネルを出て、共通の流出チャネル６１０へと流れ込み、出力ポート６１２を介して上記モジュールを出る。
【００７４】
スループット、及び収集できる血液細胞の量を増大させるために、それぞれ１つの細胞トラップ６０８を内包する１０個の単離チャネル６０６を、図２１Ａに示す平行な配置であるＺ字型構成に配置する。供給側チャネル６０４は大きな断面積を有し、これは、トラップ６０８を内包する各単離チャネル６０６に血液が入る前に血液で充填される。これは、これらの比較的大きなチャネルにおいて流体抵抗がより小さいためである。１０個のトラップを内包するデバイスに関して、堆積スループットは０．２５ｍｌ／秒であり、トラップ内に内包できる血液細胞の合計堆積は０．４５ｍＬである。
【００７５】
一実施形態では、本発明のデバイスは更に、１つ又は複数の抽出器ユニットを備える。各抽出器ユニットは、上記固体基板によって画定され、また上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの上流に配置される。上記抽出器ユニットは、間に通路を有する複数の固体支持体を備え、上記固体支持体は、核酸又はエキソソーム又は小胞の不動化に好適な材料を設けられる。
【００７６】
上記抽出器ユニットは、図１７Ａ及び１７Ｂに示されているｕＭＰＳのモジュール２５０及び３００として示されており、モジュール２５０はエキソソーム抽出に好適であり、モジュール３００は核酸抽出に好適である。構造的にはこれらのモジュールは同一であり、例示的な抽出器ユニット２５０が図２２に示されている。これらのモジュールは、所望の標的（即ちエキソソーム又は核酸）を不動化するために使用される上記固体支持体上の材料が異なる。図２２に示す実施形態に関して、抽出器ユニット２５０は、入力チャネル２５２を備え、これは一連の平行なチャネル２５４と交差し、各チャネルは少なくとも１つの抽出ベッド２５６を内包する。図２２の抽出器ユニット２５０は、平行に配設された一連の５つの抽出ベッド２５６と共に図示されているが、抽出器ユニット２５０は、１０個を超える抽出ベッドを同一の平行な構成で保持するよう、容易に設計できる。上記抽出ベッドを平行に配設することにより、抽出ベッド供給側チャネル２５４及び抽出ベッド流出チャネル２６０を先細にした場合に、一定の流速での、全てのベッドに対する均一な対処が提供される。更に、単一の抽出ベッド２５６内において、固体支持体２５８の全周が、標的によって均一にアクセス可能となる（バトル（Battle）ら著、アナリスト（Analyst）、１３９巻、ｐｐ．１３５５‐１３６３、２０１４年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。抽出ベッド２５６の固体支持体２５８は例えば、限定するものではないが、支柱（例えばポリカーボネート支柱）、ビーズ（例えばシリカビーズ）（ブレッドモア（Breadmore）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７５巻、ｐｐ．１８８０‐１８８６、２００３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））、反応性イオンエッチングシリカ支柱（クリステル（Christel）ら著、ジャーナル・オブ・バイオメカニカル・エンジニアリング（J. Biomech. Engin.）、１２１巻、ｐｐ．２２‐２７、１９９９年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））又は樹脂（ティアン（Tian）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）、２８３巻、ｐｐ．１７５‐１９１、２０００年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））とすることができる。上記固体支持体の間の上記通路は、例えば正弦波状構成といったいずれの所望の構成を有することができる。試料が抽出ベッド２５６を通って流れると、標的分子、例えばエキソソーム又はｃｆＤＮＡが、適切な不動化された親和剤によって、上記固体支持体に捕集される。上記試料の残りは、出力チャネル２６０を介して上記抽出ベッドを出て、共通のＳＰＥモジュール出力チャネル２６２を介してＳＰＥモジュール２５０を出る。図１７Ａ及び１７Ｂを参照すると、抽出器ユニット２５０、３００は、不動化バッファ、洗浄剤、及び放出試薬を、それぞれ、デバイス１００のマザーボード上の隣接するリザーバ１１２、１０６及び１０８から供給される。
【００７７】
一実施形態では、上記抽出器ユニットは、ポリカーボネートから作製され、抽出ベッドには、ソパー（Soper）らに対する米国公開特許出願第２００４０１９１７０３号（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に開示されているような複数の微小支柱が設けられる。これらのような、ポリカーボネート固相抽出（ＳＰＥ）ベッドは、単一の複製ステップを用いて製作でき、ベッドの調製にはＵＶ／Ｏ３照射しか必要ない（ウィテク（Witek）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl. Acids Res.）、３４巻（１０）、ｅ７４、２００６年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。上記支柱／ビーズの直径及び間隔は、標的分子の回収を最適化するために、変更される。
【００７８】
標的分子（例えばエキソソーム又は核酸）を選択的に放出するために、細胞単離ユニットに関して上述し、また図１９に示したように、オリゴヌクレオチド、及び切断可能なヌクレオチドを含有するヘテロ二官能性リンカー（ＳＭＣＣ）で修飾された親和剤によって、親和剤を支持体表面に付着させることができる。上述のように、上記親和性捕集剤の不動化は、５’アミノ基を介したオリゴヌクレオチドの共有結合のために、表面に閉じ込められたカルボン酸を生成するための、熱可塑性物質へのＵＶ／Ｏ３（２５４ｎｍ）照射を伴い、その３’末端のスルフヒドリルは、ＳＭＭＣ／親和性コンジュゲートと反応する。
【００７９】
エキソソームの抽出に好適な抽出器ユニットは、循環エキソソームに特異的な親和性選択試薬を使用する。このモジュールでは、上記支柱を、エキソソームに特異的な抗体又はアプタマーで装飾する。例えば上記支柱を、循環エキソソーム集団において発現するＣＤ６３又はＲＡＰ５タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーで装飾してよい（クレイトン（Clayton）ら著、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Methods）、２４７巻、ｐｐ．１６３‐１７４、２００１年；ゾウ（Zhou）ら著、メソッズ（Methods）、Ｓ１０４６‐２０２３（１５）、ｐｐ．３０１３０‐４、２０１５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。或いは上記支柱を、ＥｐＣＡＭ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、又は試料から腫瘍関連エキソソームを選択するためのセパラーゼに特異的な、抗体又はアプタマーで装飾してよい。一実施形態では、上記エキソソーム抽出器モジュールは、ＣＯＣから作製される。というのは、この材料は効率的にＵＶ活性化でき、これにより、高アスペクト比の構造体に関してでさえ、表面に閉じ込められたカルボン酸の形態の官能基の高い積載分を提供するためである（ジャクソン（Jackson）ら著、「ポリマー高アスペクト比微小構造体のＵＶ活性化：循環腫瘍細胞の選択のための抗体表面積載における結果（UV Activation of Polymeric High Aspect Ratio Microstructures: Ramifications in Antibody Surface Loading for Circulating Tumor Cell Selection）」、ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）、１４巻、ｐｐ．１０６‐１１７、２０１４年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
【００８０】
ｃｆＤＮＡの抽出に好適な例示的な抽出器ユニットは、ｃｄＤＮＡと同様のサイズの短いＤＮＡを単離するためにＵＶ活性化されたポリカーボネートＳＰＥベッドを備えてよい。ｃｆＤＮＡの単離の効率は、不動化バッファの組成に左右される。一実施形態では、好適な不動化バッファは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びエタノール（ＥｔＯＨ）を含む。
【００８１】
一実施形態では、本発明のデバイスは更にセンサユニットを備え、上記センサユニットは上記固体基板によって画定され、また上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの上流に配置される。上記センサユニットは、入口及び出口を備え、また上記センサユニットを通過する細胞をカウントするよう構成される。上記センサユニットはまた、電極のペア及び流体チャネルを備える。上記流体チャネルは、上記電極のペアの間にあり、上記セパレータユニットに流体接続される。
【００８２】
上記デバイスの上記センサユニットは、図１７Ａ及び１７Ｂに示されているｕＭＰＳのモジュール３５０として示されている。図２３Ａ及び２３Ｂには、インピーダンスユニットとも呼ばれる例示的なセンサユニットが示されている。上記インピーダンスモジュールは、上記デバイスの上流のユニットから放出された細胞を計数して、上記細胞の生存性を決定するために使用される。
【００８３】
本明細書に記載のデバイスへの組み込みに好適な、又はスタンドアロンモジュールとしての、例示的なインピーダンスモジュールは、流体チャネルの上面及び底面上の電極で構成される３層モジュールである。図２３Ａにはこのモジュールの斜視図が示されており、図２３Ｂの分解立体図には、上記デバイスの個々の層が示されている。これらの図に示されているように、第１の層又は上部層３６４は、上面及び底面を有し、入口ポート３５２及び出口ポート３５８は、上記第１の層の上記上面に配置される。第１の層３６４はまた、組み立て済みの上記モジュールの中間層３６６のマイクロ流体チャネル３５４と交差する、マイクロ電極３５６を、その底面上に有する。インピーダンスユニット３５０の第２の又は底部層３６８もまた、上面及び底面を有する。第２の層３６８は、組み立て済みの上記ユニットの第１の層３６４の底面上に配置されたマイクロ電極３５６と対向する、上記中間層のマイクロチャネル３５４と交差するマイクロ電極３６０を、その上面上に有する。上記第２の（底部）層の上面はまた、組み立て済みの上記ユニットの第１の（上部）層３６４の底面にマイクロ電極３５６を接触させる、接触パッド３６２を有する。上記第２の層はまた、上記インピーダンスモジュールを上記流体マザーボードに相互接続させるために使用される、メス型円錐形ポートを内包する。上記モジュールの中間層３６６は、マイクロ流体チャネル３５４を内包する薄型プラスチック層を備える。上記中間層は、上記第１及び第２の層それぞれのマイクロ電極３５６、３６０間に、間隔を設定する。上記マイクロ流体チャネルの、検出用容積として機能するセクションは、溶液を、上部電極３５６及び底部電極３６０の両方と電気的に接触させるための、貫通孔を有する。
【００８４】
使用時、上記インピーダンスモジュールは、細胞分離モジュールの上流捕集表面から放出された細胞を計数し、また上記細胞の生存性を決定する。細胞含有試料は、入力ポート３５２を介してインピーダンスモジュール３５０に入り、マイクロチャネル３５４を通って、マイクロ電極３５６とマイクロ電極３６０との間を通過する。上記モジュールが測定する信号は、上記電極間の中央の抵抗に比例する。上記電極間に細胞が存在しない場合、上記信号はバッファ溶液の抵抗に比例し、これは測定のためのベースラインを画定する。上記電極間を通過する全ての細胞は、少量のバッファ溶液を置換する。無傷の細胞は、高い細胞膜のキャパシタンスにより、電極間に印加される電気信号（４０ｋＨｚ）の周波数において非導電性であると考えられる。従って、細胞によって置換された少量の溶液は、対応する体積のバッファ単独よりも高い抵抗を有する。これにより、インピーダンスセンサによって測定される全体の抵抗が上昇し、これは、通過する細胞に関して記録される正のピークとして現れる（図４４Ａ参照）。細胞膜が損傷すると、細胞の抵抗は、主に細胞質成分で構成される細胞内部の抵抗に近似され得る。細胞の細胞質の抵抗が、対応する体積のバッファ溶液の抵抗より小さい場合、センサによって測定される全体の抵抗は降下し、これは負のピークをもたらす（図４４Ｂ参照）。
【００８５】
図２４は、図２３Ａ及び２３Ｂに示されているインピーダンスモジュールを製造するために採用される例示的な製作方法の概略全体図を提供する。この製作の様相は、事前に製作されたチャネルへの白金ワイヤの手動挿入を必要としない（アダムズ（Adams）ら著、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１３０巻、ｐｐ．８６３３‐８６４１、２００８年；及びガロウェイ（Galloway）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７４巻、ｐｐ．２４０７‐２４１５、２００２年（これらの文書は参照によりその全体が本出願に援用される））。ステップ１及び２では、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）を含む上記モジュールの上部及び底部カバーを、ホットエンボス加工又は射出成形を用いて調製する。ステップ３及び４では、フォトリソグラフィ又は無電解鍍金を用いて、電子ビーム蒸発（ステップ５）及びリフトオフ（ステップ６）を用いて実行される薄膜（２００ｎｍ）Ａｕ電極堆積（シャドポー（Shadpour）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７９巻、８７０‐８７８、２００７年；及びコング（Kong）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２７巻、ｐｐ．２９４０‐２９５０、２００６年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））のための準備において、フォトレジストをパターン形成する。ステップ７では、リソグラフィを用いて、Ｓｕ‐８フォトレジストをマイクロチャネル上に画定する。上記上部カバーの流体ポートを開放し（ステップ８）、パターン形成済みの上部及び底部カバーを、ＵＶ接着剤注入及び硬化のために整列させる（ステップ９）。
【００８６】
或いは、当該技術分野において公知の他のマイクロ流体インピーダンスユニットを、本明細書に記載の本発明のｕＭＰＳデバイス上に含めることができる。好適なインピーダンスモジュールとしては、限定するものではないが、マイクロ流体クールターシステム（例えばツァン（Zhang）ら著、マイクロフルイディクス・アンド・ナノフルイディクス（Microfluid. Nanofluid.）、７巻、ｐｐ．７３９‐７４９、２００９年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）、マイクロ流体ＦＡＣシステム（例えばフー（Fu）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotech.）、１７巻、ｐｐ．１１０９‐１１１１、１９９９年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）、及びマイクロ流体インピーダンスシステム（例えばダルマシリ（Dharmasiri）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８３巻、ｐｐ．２３０１‐２３０９、２０１１年；アダムズ（Adams）ら著、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１３０巻、ｐｐ．８６３３‐８６４１、２００８年；アウフフォート（Aufforth）ら著、アナルズ・オブ・サージカル・オンコロジー（Annals of Surg. Oncol.）、２０巻、ｐｐ．１２９‐１２９、２０１３年；スペゲル（Spegel）ら著、エレクトロアナリシス（Electroanalysis）、２０巻、ｐｐ．６８０‐７０２、２００８年；及びパターソン（Patterson）に対する米国特許第８，３９０，３０４号（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）が挙げられる。本発明のデバイスにおける使用に好適な他のインピーダンスモジュールは、チュン（Cheung）ら著、サイトメトリー・パートＡ（Cytometry Part A）、７７Ａ、ｐｐ．６４８‐６６６、２０１０年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）において吟味されている。
【００８７】
一実施形態では、代替的なインピーダンスモジュールは、クールターカウンタモジュールの構成を備え、これは、無標識細胞計数及びサイズ設定を提供する。このモジュールは、小さなオリフィスで接続された２つの流体充填チャンバと、上記オリフィスの各側に位置決めされた２つの電極とで構成される。細胞がこのオリフィスを通過すると、上記細胞は導電性流体を変位させ、上記オリフィスの抵抗を変化させる。各信号パルスは、上記オリフィスを通る単一細胞の運動に対応し、その大きさは、変位された流体の量に比例する。上記オリフィスのサイズが測定される細胞のサイズと同一である場合に、最高の測定感度が達成される。例えば５０×５０μｍ２のオリフィスサイズは、６〜３０μｍのサイズ範囲の細胞の検出に十分な感度を達成する。上記オリフィスの両側に配置された測定電極の寸法は大きく（数ｍｍ２）、これにより、電気二重層キャパシタンスの影響を低減でき、また上記測定電極は、ポリマー表面上に導電性銀インクをスクリーン印刷することによって製造でき、リソグラフィを必要としない（サン及びモーガン（Sun and Morgan）著、マイクロフルイディクス・アンド・ナノフルイディクス（Microfluid. Nanofluid.）、８巻、ｐｐ．４２３‐４４３、２０１０年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）。
【００８８】
一実施形態では、本発明のデバイスは更にセパレータユニットを備え、上記セパレータユニットは上記固体基板によって画定され、また上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの上流にある。上記セパレータユニットは、複数の固体表面を含む分離チャンバを備え、上記固体表面は、これらの間にチャネルを画定し、また上記固体表面には細胞特異的捕集剤が付着しており、また上記セパレータユニットは、上記チャンバへの入口、及び上記チャンバからの出口を含む。
【００８９】
上記セパレータユニットは、図１７Ａ及び１７ＢのｕＭＰＳデバイスにおいて、モジュール４００として示されている。これらの図に示すように、セパレータユニット４００は、センサモジュール３５０から試料を受け取る。計数された細胞が上記センサモジュールを出ると、上記細胞は、リザーバ１１０からの溶解バッファへと導入され、セパレータユニット４００の上流の小型蛇行マイクロ流体ネットワーク１３６内で細胞溶解が発生する。溶解した細胞の内容物はセパレータユニット４００に入り、ここで核酸成分の単離が行われる。セパレータユニット４００には、不動化バッファ、空気、エタノール、及び放出試薬が、図１７Ａ及び１７Ｂに示すようにｕＭＰＳ１００のマザーボードの周縁部に配置されたそれぞれのリザーバ１１２、１１４、１１６及び１０８から供給される。
【００９０】
図２５には、上記セパレータモジュールの斜視図が示されている。この図に示されているように、セパレータユニット４００は、上述の抽出器ユニット２５０及び３００と構造及び機能が同一であるが、複数の固体支持体又は表面４０８を内包する単一の固相抽出ベッド４０６を備える点で異なる。単一の抽出ベッドは、処理が必要な試料の堆積が小さく（〜１０μＬ）、また上流で単離された少数の細胞から抽出される標的材料、例えばＤＮＡ／ＲＮＡの量が同様に小さいため、好適である。上記試料は、入力ポート４０２を介してセパレータモジュール４００に入り、ベッド供給側チャネル４０４を通って流れ、抽出ベッド４０６に入る。抽出ベッド４０６の固体支持体４０８上で捕集されない試料成分は、固体支持体４０８によって画定されたチャネルを通って抽出ベッド出力チャネル４１０へと移動し、出力ポート４１２を介して上記モジュールを出る。抽出された試料物質（例えばＤＮＡ／ＲＮＡ）が抽出ベッド４０６の固体支持体４０８から放出されると、上記物質もまた、出力チャネル４１０及び出力ポート４１２を介して上記分離ユニットから流出する。
【００９１】
一実施形態では、本発明のデバイスは、１つ又は複数のリアクタユニットを備え、上記リアクタユニットは上記固体基板によって画定され、また上記生体分子プロセッサの上流にある。上記リアクタユニットは、ヒータを備えた反応チャネルを備える。１つ又は複数のリアクタユニット４５０及び５００は、図１７Ａ及び１７ＢのｕＭＰＳデバイスの第２のサブシステムを構成し、これらは、ｃＤＮＡを生成するためのＲＮＡの多重逆転写、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いた、ＤＮＡへのポリｄＴの付加といった、分子事前処理反応のために使用される、連続流リアクタである。これらのユニットで実施できる代替的な分子事前処理反応としては、限定するものではないが、後続のメチル化状態の決定のための、１つ若しくは複数の制限エンドヌクレアーゼを用いた入力ＤＮＡの消化；初期逆転写ステップ；プライマ伸長反応；並びに／又はｍｉＲＮＡの正確なテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）、捕集及び検出を促進するｍｉＲＮＡへのループプライマの付加が挙げられる。
【００９２】
上述の生化学的熱反応に使用されるデバイスの、上記連続流リアクタユニットは、図１７Ａ及び１７Ｂに示されているｕＭＰＳデバイスのモジュール４５０及び５００として示されている。これらのリアクタは連続流フォーマットに基づくものであり、単一の蛇行チャネルに、隣接するリザーバ１２４からの反応試薬（例えばＲＴ反応試薬）と、標的物質とが供給される。反応領域の下側に配置された熱ヒータは、必要な温度を生成する。この連続流熱リアクタは蛇行チャネルで構成され、反応チャネルの線速度及び長さが反応時間を決定する。これらの連続流熱リアクタは、ＰＣＲ、リガーゼ検出反応、及び熱可塑性基板を用いた逆転写を含む多様な反応のために使用されている（例えばハシモト（Hashimoto）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）、４巻、ｐｐ．６３８‐６４５、２００４年；ハシモト（Hashimoto）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）、７７巻、ｐｐ．３２４３‐３２５５、２００５年；チェン（Chen）ら著、「ポリカーボネートマイクロ連続流ポリメラーゼ連鎖リアクタ（ＣＦＰＣＲ）の熱性能の評価及び改善（Assessment and Improvement of the Thermal Performance of a Polycarbonate Micro Continuous Flow Polymerase Chain Reactor (CFPCR)）」、２００７年；チェン（Chen）ら著、バイオメディカル・マイクロデバイセズ（Biomedical Microdevices）、１０巻、ｐｐ．１４１‐１５２、２００８年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）。上記リアクタは、流体ベースプレートの製造に使用されるインプリントステップ中に構築される。薄膜カプトンヒータを上記リアクタの下側に配置して、反応に必要な温度を生成する。
【００９３】
一実施形態では、本発明のデバイスは、流れ精製ユニットを有し、上記流れ精製ユニットは、上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブの上流にある。上記流れ精製ユニットは：チャンバを画定するハウジング；上記チャンバに接続された１つ又は複数の入口；上記チャンバに接続された産物出口；上記チャンバに接続された廃棄物出口；並びに上記チャンバ内で産物を上記産物出口へと好ましく配向するため、及び上記チャンバ内で廃棄物を上記廃棄物出口へと配向するために、上記チャンバ内に位置決め及び配向された、複数の障害物を備える。流れ精製ユニット５５０及びナノセンサユニット５０は、図１７Ａ及び１７Ｂに示されているｕＭＰＳデバイスの第３のサブシステムを構成する。
【００９４】
上記流れ精製ユニットは、過剰なｄＮＴＰ及び／又は他の非標的核酸ヌクレオチド成分から、上記デバイスの他の上流ユニットにおいて生成された標的核酸分子（例えばｃＤＮＡ）を精製するよう設計される。精製は、上記生体分子プロセッサユニットの上記バイオリアクタチャンバの上記固体支持構造体上で利用可能な結合部位の数が限定されているため、必要となる。クロマトグラフィー又は電気泳動技法といった、１つ又は複数の過剰な試薬の必要な除去を達成するための多様な方法が存在するが、これらは「バッチ（ｂａｔｃｈ）」動作モードを用い、この動作モードでは、試料をカラム上に注入し、ハートカットによって誘発される分離を用いて所望の物質を単離する。本明細書に記載のデバイスの上記流れ精製ユニットは、連続分離モードを使用し、このモードは、注入及びハートカットを必要とせず、これによって動作が簡略化される。注入／動作サイクルが必要なく、反応産物が分離マトリクスに連続的に挿入され、１つ又は複数の過剰な試薬を廃棄物リザーバ中に再配向しながら、処理済みの標的を別の経路に同時に配向できるため、連続流フォーマットの使用は特に魅力的である。
【００９５】
図２６Ａには、拡散型流れ精製ユニット５５０のアーキテクチャが示されている。上記モジュールは、流体ネットワークの製造に使用されるものと同一のステップのマイクロ複製を用いて、適切な基板に製作されるため、多段リソグラフィ技法を必要としない。基本的なコンセプトは、対称な障害物５５８の規則的な格子の使用を採用するものであり、これにより、分子の横方向のブラウン運動を変化させることによって、異なるサイズの分子が上記デバイスを通る異なる軌跡を辿るようにする。一実施形態では、流れ精製ベッド５５６内の障害物５５８は、長さ〜５‐７μｍ、幅〜０．５‐２μｍ、間隙距離（Ｇ）〜４‐５μｍであり、流路に対して〜４５°の角度で配置される（チョウ（Chou）ら著、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、９６巻、ｐｐ．１３７６２‐１３７６５、１９９９年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。試料中の分子の混合物は、試料入力チャネル５５２を介してモジュール５５０に入り、バッファは、バッファ入力チャネル５５４を介して上記モジュールに入り、上記混合物は、上記デバイスを通って移動する際に連続的にソートされる。出力は２つのチャネル５６０、５６２に分割され、一方のチャネル５６２は、試薬（例えばｄＮＴＰ）を廃棄物に向けて配向するためのものであり、他方のチャネル５６０は、最終処理及び検出のために、標的分子（例えばｃＤＮＡ）を上記ｕＭＰＳの最終モジュール、即ちナノセンサモジュールに向けて配向するためのものである。このモジュールの性能の尺度としては、短い発現時間（＜６０秒）の生成、１つ又は複数の過剰な試薬の＞９５％の除去、及び標的の最小の損失（＜１％）が挙げられる。
【００９６】
図１７Ａ及び１７ＢのｕＭＰＳデバイスの様々なユニットを通る流体の流れは、デバイス１００の流体ネットワーク１３４全体に配置された複数のバルブ１３２によって制御される。上記バルブは、図２７に示すような３層構造を有する。これらの３つの層は、カバープレート、流体層及び背面カバープレートで構成される。バルブ台座及びバルブ膜は、上記バルブを作動させるための機械的ソレノイドと共に、ｕＭＰＳ１００のための流体マザーボードの背面上にあるように構成される。これにより、上記ｕＭＰＳのトップカバープレート上に配置された完全な電気的接続が可能となる。図２７はまた、エンボス加工を用いた、上記バルブ及びバルブ台座の前面及び背面の同時成形を示す。上記マザーボードの上部に配置された上記流体ネットワークは、同一のエンボス加工ステップにおいて作製される。
【００９７】
図１７ＡのｕＭＰＳデバイスの、大半のマイクロ流体相互接続は、接続される流体ポートとユニットとの間の直接的な物理的接触によるものである。各接触は、組立体に対する受動的な動力学的制約として作用する。注意しなければ、他の組立体の特徴と併せた２つ以上の相互接続により、過剰に制約を受けたシステム、及び予測できない死容積が発生することになる。
【００９８】
対面する表面間のマイクロスケールの空隙を有するマイクロ流体ポートに関して、ヤング‐ラプラス方程式によって定義されるような毛細管力は、上記対面する表面間のいずれの直接的な物理的接触なしに、漏れに耐え、図２８Ｂに示すようなガスケットレスシールを形成しなければならない（ブラウン（Brown）ら著、ＩＭＥＣＥ  ２０１２、２０１２年１１月９日〜１５日、米国機械学会（ＡＳＭＥ）（テキサス州ヒューストン）、ｐｐ．ＩＭＥＣＥ２０１２‐８９６３４、２０１２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。これらのガスケットレスシールの動力学的ピン及び溝が、図２８Ａに示されている。上記整列ピン及び溝は、両側エンボス加工を用いて上記流体基板の背面に製作でき、上記ピン及び溝は、２つの噛合部品上に配置される。整列精度は〜１０μｍである。噛合部品間の超疎水性シールは、完璧に整列させることができ、又は僅かにオフセットさせることができる。各噛合部品上の貫通孔は、水接触角度〜１５０°の表面によって取り囲まれ、表面張力及び毛細管力により、溶液は対向する孔へと移動され、死容積は存在しない（図２８Ｃ参照）。
【００９９】
上記ガスケットレスシールは、各入口／出口ポートの周辺の対向する表面上に、超疎水性表面を必要とする。超疎水性表面を得るために：（１）射出成形；（２）ＮＩＬ；又は（３）層毎の堆積を含む異なるアプローチを使用できる。別のアプローチは、陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）膜を、従来の鋳型インサート内に設置するステップ、及びポリマー溶融物でパターンを充填するステップを伴う。これらの技法は、必要な超疎水性を提供する。このアプローチの利点は、超疎水性表面を、上記デバイスと同一の材料で同時に成形でき、従って表面の接着又は吸収の問題が存在しない点である。
【０１００】
ポリマースタンプを用いたＮＩＬを用いて、超疎水性パターンを上記入口／出口表面に転写できる。これは、射出成形又はホットエンボス加工した基板に対して、二次プロセスとして実施できる。別のアプローチは、層毎の堆積（ｌａｙｅｒ‐ｂｙ‐ｌａｙｅｒ（ＬＢＬ）ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）であり、これは、大きな静的接触角（１８８）を有するナノスケール薄膜を構築するために使用できる。これは、所望の領域のみ確実に被覆されるように、２つのマスクを用いて実施される。上記ＬＢＬプロセスは、厚さを遥かに良好に制御しながら、層を製造できる。連続浸漬ステップは、所望の層特性を得るために追加の時間を必要とするが、ＮＩＬの場合のように別の機械に移動させるために必要な期間と同等のものであり得る。
【０１０１】
パッシブアラインメント構造（ｐａｓｓｉｖｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）：パッシブアラインメント構造を用いて、２つのモジュールを隔てる空隙の高さ（＜２０μｍ）を確立し、横方向のオフセットを最小化することにより、死容積がモジュールの入口／出口に導入されなくなり、また２つの表面の間の相対角度が最小化される（図２８Ａ〜２８Ｂ参照）。これは、使用するアラインメント構造のタイプ、サイズ及び配置の選択を必要とする。これらのアラインメント構造は、Ｖ字型の溝内に半球状ピンが入った、特性決定されている動力学的ペアである（ユー（You）ら著、ジャーナル・オブ・マイクロメカニクス・アンド・マイクロエンジニアリング（J. Micromech. Microeng.）、１９巻、ｐｐ．１２５０２５、２００９年；及びユー（You）ら著、ジャーナル・オブ・マイクロエレクトロメカニカル・システムズ（ＪＭＥＭＳ）、２４巻、ｐｐ．６３４‐６５０、２０１５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。ポストの周囲の環状リングにより、より良好なピンが得られ、これにより、ピン間のより良好な充填及びより小さな変動が可能となった（チェン（Chen）ら著、「ポリマーモジュラーマイクロ流体システムのための高信頼性組立体特徴部分の複製（Replication of Reliable Assembly Features for Polymer Modular Microfluidic Systems）」、２００８年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
【０１０２】
本発明の別の態様は、上述のような、図２０Ａ〜２０Ｄに示す、長手方向に延在する血漿単離ユニットを備えるデバイスを対象とする。上記長手方向に延在する血漿単離ユニットは、上記固体基板によって画定され、また投入通路、上記投入通路より幅広く浅い排出通路、及び上記投入通路と上記排出通路を接続する移行部通路を備える。上記移行部通路は、上記移行部通路が上記投入通路から上記排出通路へと進行するにつれて幅広く浅くなる。上記血漿単離ユニットは更に、上記投入通路から側方に延在する一次側部チャネルを備え、上記投入通路と各上記一次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、上記投入通路から上記一次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないよう、サイズ設定される。上記血漿単離ユニットは更に、上記排出通路から側方に延在する二次側部チャネルを備え、上記排出通路と各上記二次側部チャネルとの間に位置決めされたセパレータは、上記投入通路から上記二次側部チャネルへと血漿を通過させるが細胞は通過させないようサイズ設定される。
【０１０３】
本発明の別の態様は、上述のような、図２５に示す、抽出器ユニットを備えるデバイスを対象とする。上記抽出器ユニットは固体基板によって画定され、また：入口；出口；並びに上記入口と上記出口との間に延在して上記入口及び上記出口を共有する、複数の別個のチャンバを備える。上記デバイスはまた、各上記チャンバ内に複数の固体支柱も備え、上記支柱は、それらの間に通路を有し、また上記支柱は、試料からの細胞、核酸又はエキソソームを不動化するために好適な材料を設けられる。
【０１０４】
本発明の別の態様は、上述のような、図２３Ａ〜２３Ｂに示す、センサユニットを備えるデバイスを対象とする。上記センサユニットは、上記固体基板によって画定され、また：入口；出口；及び上記センサユニットの上記入口から上記出口へと通過する細胞をカウントするために位置決めされた、細胞カウンタを備える。
【０１０５】
ｕＭＰＳ上での熱可塑性表面の表面修飾
表面特性は、特に分子が電荷を有し、輸送が電気運動現象によって実現されている場合に、ｕＭＰＳ上のモジュールの様々なマイクロチャネル、ナノチャネル及び他のナノ構造体を通した分子の輸送を制御するために重要である。ポリマーナノ構造体及びマイクロ構造体の表面は、官能性骨格を生成するための活性化プロセスと、これに続く、ポリマー基板の表面上に新たな化学種を生成するための表面修飾との組み合わせを用いて、修飾される（ジャクソン（Jackson）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻、ｐｐ．１０６‐１１７、２０１４年；及びマカーリー（McCarley）ら著、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１２７巻、ｐｐ．８４２‐８４３、２００５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。更に、様々な生物作用剤（例えば抗体又はオリゴヌクレオチド）の共有結合のために、マイクロ及びナノドメインのポリマー表面上に官能基が必要となる場合、官能基を領域特異的に生成するための技法が利用される。例えば、ナノセンサモジュール内の様々な分子標的の共有結合のために、支柱が形成された領域のみを活性化する必要がある場合、領域特異的活性化を、フォトマスクを通したＵＶ／Ｏ３活性化を用いて達成できる。
【０１０６】
多くの熱可塑物質は表面官能基を含有しないため、適切な官能性骨格を生成するために、活性化プロトコルを採用できる。マイクロスケールのレジメンにおける、熱可塑性物質のための、好適な、ロバストであるが簡単な表面修飾化学現象（ここではＵＶ／Ｏ３又はＯ２プラズマを用いて表面を活性化する）が、当該技術分野において公知である（ジャクソン（Jackson）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻、ｐｐ．１０６‐１１７、２０１４年；及びシツマ（Situma）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）、３４０巻、ｐｐ．１２３‐１３５、２００５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。プラズマ又はＵＶ／Ｏ３への曝露により、表面上の高エネルギラジカルの相互作用によって、表面は親水性となる。十分に高いエネルギにおいて、ＵＶ及び酸化ストレスの両方により、ポリマー内にラジカルを生成でき、これは、カルボン酸又は他のＯ含有種を形成できる。これらの官能基の存在は、イオン化可能な基を提供し、上記基は、溶液と接触すると、電気浸透流を変化させることができ、又は生物製剤の付着のための骨格として機能できる。
【０１０７】
ナノチューブの製作
本明細書に記載の面内合成ナノ細孔及び飛行時間チャネルを備えるナノチューブを作製するために、３つの異なる戦略を使用できる。第１のアプローチは、単段ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）を伴う。この手順の概要が、図２９Ａ〜２９Ｂ及び図３０に示されている。要するに、＜１０ｎｍのスタンプ構造体が必要となるため、マスターの製作に、集束イオンビーム（ＦＩＢ）ミリングのための、クロム層（〜３００オングストローム）でコーティングされたＳｉ基板を使用でき、曝露線量を変化させることによって、ナノチャネル及び面内合成ナノ細孔の幅及び深さ両方を制御する（メナード及びラムゼー（Menard & Ramsey）著、ナノ・レターズ（Nano Letters）、１１巻、ｐｐ．５１２‐５１７、２０１０年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。図２９Ａに示すように、樹脂スタンプは、ＵＶ‐ＮＩＬプロセスによって製作できる。この樹脂スタンプを用いて、図２９Ｂに示すように、様々なポリマー基板に上記センサ構造体をインプリントする。上記面内合成ナノ細孔によって生成される過渡電流のＳ／Ｎ比は、細孔に対するナノチャネルのサイズ比に左右される。
【０１０８】
第２の製作アプローチは、ＮＩＬとサイズ削減プロセスとの組み合わせを伴う。単段ＮＩＬを用いて、必要な面内合成ナノ細孔を備える長いナノチャネルを製造するのは、困難であり得る。というのはこの製作は、中間クロム層の均一でない堆積、ＦＩＢにおける大面積走査のための均一でないビーム電流、及び表面欠陥といった、様々な因子によって影響されるためである。従っていくつかの実施形態では、ＮＩＬをサイズ削減プロセスと組み合わせることが望ましい場合がある。２〜５のスケール比のポリマー基板に、大型化されたセンサ構造体を製造でき、これは、ナノチャネルの幅及び深さが１００〜２００ｎｍの範囲となり、オリフィスのサイズが２０〜５０ｎｍとなることを意味している。ナノメートルスケールでのポリマーの変形に対する正確な制御が、１０ｎｍ未満の構造体を達成するためのサイズ削減プロセスの鍵であり、これはＮＩＬ中の成形温度においては達成が困難である。
【０１０９】
２つの好適なサイズ削減プロセスとして：（ｉ）プレスト・セルフ・パーフェクション（ｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｌｆ‐ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ：ＰＳＰ）プロセス及び（ｉｉ）ポリマーリフロープロセスが挙げられる。ＰＳＰプロセスでは、ポリマーナノ構造体を、ガラス転移温度付近の温度において、ブランクシリカウェハで押圧する（ワン（Wang）ら著、ナノ・レターズ（Nano Letters）、８巻、ｐｐ．１９８６‐１９９０、２００８年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。このプロセスは、ナノスケールのトレンチの幅及び孔の直径を低減するだけでなく、これらの構造体の側壁の粗度も低減する。ＰＳＰをＮＩＬと併用することによって、自立ポリマー膜にナノ細孔を生成できる（チョイ（Choi）ら著、ジャーナル・オブ・ナノサイエンス・アンド・ナノテクノロジー（J. Nanosci. Nanotechnol.）、１３巻、ｐｐ．４１２９‐４１３３、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。直径３μｍの微小細孔を用いて開始した場合、細孔サイズを〜３００ｎｍまで効果的に削減できる。第２のサイズ削減プロセス、即ちポリマーリフロープロセスは、１０ｎｍ未満の細孔を有する自立ＳＵ‐８膜を生成できる。４５℃のポリマーリフロープロセスによる未硬化ＳＵ‐８に関する収縮速度は、〜３ｎｍ／分であり（図３８Ｃ参照）、これは、高エネルギ電子ビームを用いた照射によるシリコン及びガラス系ナノ細孔の製作のために使用される収縮速度である６〜１６ｎｍ／分及び１．２〜１５ｎｍ／分と同等である（スタインボック（Steinbock）ら著、ナノ・レターズ（Nano Letters）、１３巻、ｐｐ．１７１７‐１７２３、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。収縮速度が低いことにより、ポリマーリフロープロセスは、ポリマーナノ製造のためのナノスケール制御可能性を達成するにあたって極めて魅力的となる。
【０１１０】
第３の製作アプローチは、ナノ細孔膜とトラックエッチドメンブレン（ｔｒａｃｋ‐ｅｔｃｈｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）との一体化を伴う。このアプローチでは、ナノチューブは、事前に製作したナノ細孔膜を、トラックエッチドメンブレンと垂直に積み重ねることによって製作される。このプロセスでは、１０ｎｍの範囲の良好に画定された直径を有する自立ナノ細孔膜を、単一のＮＩＬステップによって、二重レジスト層へと形成する。上記膜の細孔サイズは、ＮＩＬ後のポリマーリフロープロセスを採用することによって更に削減でき、１０ｎｍ未満の細孔が達成される。ナノチャネルに関しては、トラックエッチングポリカーボネート膜を用いて、低密度ナノ細孔を生成する。細孔直径及び膜厚さは、それぞれ１００〜２００ｎｍ及び６０〜１００μｍの範囲である。自立ＳＵ‐８膜のナノ細孔とトラックエッチング膜の細孔との整列は、光学顕微鏡を用いて行われる。これは、ＳＵ‐８膜のナノ細孔が、膜厚さに沿った先細構造を有し、トラックエッチング膜のマイクロスケールの底部細孔が、良好に画定された八角形形状を有することによって、実行可能となる。積み重ねられた膜（ＳＵ‐８膜／トラックエッチング膜／ＳＵ‐８膜）は、２つのナノ細孔、並びに上記ナノ細孔のための先細入口及び出口を、ＳＵ‐８内に有する、ナノチャネルの計画された構造を内包し、これにより、飛行時間の決定におけるエントロピー的な障壁によって引き起こされる誤差が低減される。最後に、上記積み重ねられた膜を、２つの熱可塑性（ＰＭＭＡ又はその他）チップの間に挟み、マイクロチャネルは交差構成となり、長手方向の過渡電流測定のための封入型流体デバイスが完成する。上記積み重ねられた膜の単一の細孔は、マイクロチャネルの幅を制御することによって、上側マイクロチャネルと下側マイクロチャネルとの間に配置できる。図２Ａ〜２Ｂは、このアプローチを用いて製作された、垂直に位置決めされたナノ細孔の例を示す。
【０１１１】
標的核酸分子を検出するための方法
本発明の別の態様は、試料中の標的核酸分子の存在を検出するための方法に関し、上記方法は：本明細書に記載の生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備えるデバイスを提供するステップ；並びに標的核酸分子又はその相補的伸長産物を含む試料を、
上記標的核酸分子を離間した支持構造体上の捕集分子に結合させて、上記標的核酸分子を上記離間した支持構造体に対して不動化するために効果的な条件下で、上記生体分子プロセッサに供給するステップを伴う。上記方法は更に、不動化された上記標的核酸分子、又は不動化された上記標的核酸分子の補体を、反応プロセスに供して、オリゴヌクレオチド反応産物を形成し、上記オリゴヌクレオチド反応産物が放出されて上記ナノチューブに供給され、上記ナノチューブの上記１つ又は複数のナノ細孔を通過する際に検出されるステップを伴う。以下でより詳細に記載するように、検出器は、上記オリゴヌクレオチド反応産物の同定シグニチャを検出し、上記同定シグニチャは、そのオリゴヌクレオチドに固有のものであり、上記オリゴヌクレオチドを、上記反応プロセス中に形成され得る他のオリゴヌクレオチド産物から区別する。
【０１１２】
一実施形態では、上記反応プロセスは、上記不動化された標的核酸分子又は不動化されたその伸長産物に対してハイブリダイズされたライゲーション産物を生成する、リガーゼ検出反応である。上記ライゲーション産物は、上記不動化された標的核酸分子又は不動化されたその伸長産物から変性され、これによって上記離間した支持構造体から上記ライゲーション産物が放出される。上記ライゲーション産物は、上記１つ又は複数のナノチューブを通過し、上記検出器は、上記１つ又は複数のナノチューブを通過するライゲーション産物の同定シグニチャを検出する。試料中に、上記試料中の他の核酸分子とは異なる標的核酸分子が存在することは、上記ライゲーション産物の上記同定シグニチャの検出に基づいて同定される。
【０１１３】
本発明のこの態様によると、上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備える上記デバイスは、上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブ内での分析のために上記試料を調製するよう構成された、上記生体分子プロセッサの上流の１つ又は複数のユニットを内包してよい。これらのユニットについては上述されており、これらのユニットとしては：標的生体細胞（例えば循環腫瘍細胞）を分離又は富化するための細胞セパレータユニット（例えばモジュール１５０、図１７Ａ及び１７Ｂ）；赤血球及び白血球から血漿を分離するための、長手方向に延在する血漿単離ユニット（例えばモジュール２００、図１７Ａ及び１７Ｂ）；エキソソームをアフィニティ精製するための第１の抽出器ユニット（例えばモジュール２５０、図１７Ａ及び１７Ｂ）；ｃｆＤＮＡの精製のための第２の抽出器ユニット（例えばモジュール３００、図１７Ａ及び１７Ｂ）；細胞をカウントして生存性を決定するためのセンサユニット（例えばモジュール３５０、図１７Ａ及び１７Ｂ）；ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの単離のための第２の抽出器ユニット（例えばモジュール４００、図１７Ａ及び１７Ｂ）；逆転写酵素反応及びＴｄＴ反応のための１つ又は複数のリアクタモジュール（例えばモジュール４５０及び５００、図１７Ａ及び１７Ｂ）；並びに過剰なｄＮＴＰ及び他の非標的核酸分子成分を、ナノセンサチャンバ及び生体分子プロセッサに入る前に上記試料から除去するための、流れ精製モジュール（例えばモジュール５５０、図１７Ａ）が挙げられる。
【０１１４】
上記生体分子プロセッサの上記バイオリアクタチャンバ内で上記ライゲーション反応を実施し、上記ライゲーション産物を生成する方法は、以下に記載される。上記ライゲーション産物は、一旦形成されると、その相補的な不動化された標的核酸分子又はその伸長産物から変性され、１つ又は複数のナノ細孔を内包するナノチューブを通して供給され、上記ナノチューブは、上記ライゲーション産物が上記ナノチューブを通過する際に各ライゲーション産物の同定シグニチャを検出及び区別できる。一実施形態では、ライゲーション産物の同定シグニチャは、上記ライゲーション産物が通過する際に発生する１つ又は複数のナノ細孔を通る電流の変化である。電流の変化は、１つ又は複数のナノ細孔を通る電流の上昇（即ち電流増加）又は電流の低下（即ち電流遮断）となり得る。あるナノ細孔を通る電流変化の大きさ及び持続時間を検出及び測定することによって、ライゲーション産物を同定して互いに区別する。この実施形態によると、ライゲーション産物の同定シグニチャは、上記ライゲーション産物のサイズ（即ち長さ）、形状又は構造（例えば折り畳まれているか直線状であるか）、電荷、及び導電性に影響される。
【０１１５】
別の実施形態では、ライゲーション産物の同定シグニチャは、上記ナノチューブの１つ又は複数のセクションを通る上記ライゲーション産物の飛行時間である。この実施形態では、上記ライゲーション産物は、あるナノチューブの少なくとも第１及び第２のナノ細孔を通して供給され、ここで上記第１及び第２のナノ細孔は、上記ナノチューブの飛行時間チャネルの対向する両端部に位置決めされる。上記ライゲーション産物が上記第１のナノ細孔、上記飛行時間チャネル及び上記第２のナノ細孔を通過するためにかかる時間を測定し、これを、上記ライゲーション産物の上記同定シグニチャとして用いる。この実施形態によると、ライゲーション産物の同定シグニチャは、上記ライゲーション産物のサイズ（即ち長さ）、形状又は構造（例えば折り畳まれているか直線状であるか）、電荷、及び導電性に影響される。
【０１１６】
別の実施形態では、ライゲーション産物の同定シグニチャは、上記ライゲーション産物が少なくとも２つのナノ細孔を通過する際に発生する、上記２つのナノ細孔を通る電流の変化と、上記２つのナノ細孔の間の飛行時間の測定とを組み合わせたものである。この実施形態によると、ライゲーション産物の同定シグニチャは、上記ライゲーション産物のサイズ（即ち長さ）、形状又は構造（例えば折り畳まれているか直線状であるか）、電荷、及び導電性に影響される。
【０１１７】
ライゲーション産物の同定シグニチャは、１つ又は複数の同定シグニチャ修飾因子の組み込み又は付加によって更に修飾できる、上記ライゲーション産物自体の固有の特性である。一実施形態では、同定シグニチャ修飾因子は、上記ライゲーション産物の移動性を修飾する、水溶性、中性又は荷電分子、例えばドラッグタグである。例示的な移動性修飾因子としては、限定するものではないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）マルチマー、ペプトイド、ポリエーテル（ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシド）、ナノスフィア、ナノ結晶、オリゴ糖、デンドリマー、ポリエステル（ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリリン酸、ポリホスホネート、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。このアプローチは、自由溶液コンジュゲート電気泳動（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＦＳＣＥ）に基づくものであり、これは末端標識自由溶液電気泳動（ｅｎｄ‐ｌａｂｅｌｅｄ  ｆｒｅｅ‐ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＥＬＦＳＥ）とも呼ばれる（レン（Ren）ら著、「篩マトリクスを用いない、ＤＮＡ配列決定フラグメントの分離（Separating DNA Sequencing Fragment without a Sieving Matrix）」、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２０巻（１２）、ｐｐ．２５０１‐９、１９９９年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。この実施形態では、ライゲーション産物の単一塩基の差異を、上記ライゲーション産物を生成するためのライゲーション反応に使用されるライゲーションプローブのうちの１つの、異なる長さのテール及び／又はドラッグタグを用いて区別する（アルブレヒト（Albrecht）ら著、「ガラスマイクロチップ上のリガーゼ検出反応産物の自由溶液コンジュゲート電気泳動による、１９のＫ‐ｒａｓの突然変異の同時検出（Simultaneous Detection of 19 K‐ras Mutations by Free Solution Conjugate Electrophoresis of Ligase Detection Reaction Products on Glass Microchips）」、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、３４巻（４）、ｐｐ．５９０‐７、２０１３年；シンヴィル（Sinville）ら著、「ポリマーマイクロ流体デバイスにおける自由溶液コンジュゲート電気泳動を用いた点突然変異の分析のための、リガーゼ検出反応（Ligase Detection Reaction for the Analysis of Point Mutations using Free‐solution Conjugate Electrophoresis in a Polymer Microfluidic Device）」、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２９巻（２３）、ｐｐ．４７５１‐６０、２００８年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。得られるライゲーション産物は、長さ及び／又は質量／電荷比が異なり、従ってこれらは、互いから及び初期プローブから様々に移動し、また、ナノ細孔を通る電流に対するこれらの影響によって区別できる。ＤＮＡドラッグタグの自由溶液コンジュゲート電気泳動は、長さが最大２６５塩基のＤＮＡに関して実証されている（アルブレヒト（Albrecht）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８３巻（２）、ｐｐ．５０９‐１５、２０１１年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
【０１１８】
別の実施形態では、上記同定シグニチャ修飾因子は、分子配列バーコード、即ち、１つ又は複数のナノ細孔を通る配列特異的電流修飾に基づいて、ナノ細孔によって区別できる、ヌクレオチド配列である（マンラオ（Manrao）ら著、「突然変異ＭｓｐＡナノ細孔及びｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた単一ヌクレオチド解像度におけるＤＮＡの読み取り（Reading DNA at Single‐nucleotide Resolution with a Mutant MspA Nanopore and phi29 DNA Polymerase）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat Biotechnol.）、３０巻（４）、ｐｐ．３４９‐５３、２０１２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。この例では、ライゲーション接合部における単一塩基の差異を、上流のオリゴヌクレオチドライゲーションプローブ上の異なる複数の配列バーコードを用いて区別し、上記配列バーコードは、問い合わせ対象の個々の塩基に関するマーカーとして機能する。生成される短いライゲーション産物は、ナノ細孔を通過することにより、その固有の配列によって、又は既存のナノ細孔配列決定システムの高い誤差率を補償するよう設計された配列バーコードの使用によって、区別できる。
【０１１９】
或いは上記バーコードは、非ヌクレオチドポリマーで構成でき、上記非ヌクレオチドポリマーは、これらがナノ細孔を通過する際のこれらの検出及び弁別を増強する（クマー（Kumar）ら著、「合成による単一分子ＤＮＡ配列決定のためのＰＥＧ標識ヌクレオチド及びナノ細孔検出（PEG‐Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis)」、サイエンティフィック・レポーツ（Sci. Reports）、２巻、ｐｐ．６８４、２０１２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。ナノ細孔を通るｓｓＤＮＡ分子の移動性は、正確な配列の決定には高すぎるため、上記ナノ細孔に、或いは上記ライゲーション産物に共有結合した配列モチーフに、分子モータを直接付加して、上記ナノ細孔を通る上記ライゲーション産物の、制御された段階的なラチェッティング（ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ）を可能とすることが必要となる場合がある（リーバーマン（Lieberman）ら著「個々のＤＮＡポリメラーゼ複合体において測定される転座ステップの動態（Dynamics of the translocation step measured in individual DNA polymerase complexes）」、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１３４巻（４５）、ｐｐ．１８８１６‐２３、２０１２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
【０１２０】
本発明の別の態様は、試料からの標的核酸分子内のヌクレオチドを同定するための方法を対象とする。この方法は、本明細書に記載の生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備えるデバイスを提供するステップを伴う。標的核酸分子を含む上記試料を、上記離間した支持構造体上で不動化された上記標的核酸分子の相補的な捕集分子に上記標的核酸分子を結合させることによって、上記標的核酸分子を上記離間した支持構造体に対して不動化するために効果的な条件下で、上記生体分子プロセッサに供給する。不動化された上記標的核酸分子、又は上記標的核酸分子に対して相補的な不動化された伸長産物を、溶液と接触させて、ヌクレオチド伸長反応混合物を形成する。上記溶液は、上記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物の一部分に対して相補的な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマ、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド三リン酸の集合を含む。上記集合中の各タイプのヌクレオチド三リン酸は：（１）異なる切断可能な同定シグニチャ生成部分；及び（２）更なるヌクレオチド伸長反応をブロックする切断可能なブロッキング部分を有する。上記方法は更に、上記ヌクレオチド伸長反応混合物をハイブリダイゼーション処理に供するステップを伴い、ここで上記溶液の上記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマは、塩基特異的な様式で、その相補的な不動化された標的核酸分子、又はその不動化された伸長産物に対してハイブリダイズする。ハイブリダイズした上記オリゴヌクレオチドプライマを、上記ヌクレオチド三リン酸の集合からのあるヌクレオチド三リン酸の、上記ハイブリダイズしたプライマの３'末端に対する、単一塩基特異的な追加によって、伸長させる。上記同定シグニチャ生成部分は、伸長後に、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマに追加された各ヌクレオチドから切断され、切断された同定シグニチャ生成部分は、上記１つ又は複数のナノチューブを通過する。上記検出器は、上記切断された同定シグニチャ生成部分が上記１つ又は複数のナノチューブを通過する際に、上記切断された同定シグニチャ生成部分によって生成された、同定シグニチャを検出し、上記伸長中に追加された上記ヌクレオチドの集合からのヌクレオチドを、上記同定シグニチャの検出に基づいて同定することによって、試料中の標的核酸分子中の１つ又は複数のヌクレオチドを同定する。
【０１２１】
本発明のこの態様によると、標的核酸分子の標的ヌクレオチド配列は、反復、伸長、切断、通過、検出及び同定ステップによって配列決定できる。
【０１２２】
本発明のこの態様によると、ナノセンサユニット内に格納された上記生体分子プロセッサ及び１つ又は複数のナノチューブを備える上記デバイスは、上記生体分子プロセッサ内での分析のために上記試料を調製するよう構成された、上記ナノセンサユニットの上流の１つ又は複数のユニットを内包してよい。これらのユニットについては上述されており、これらのユニットとしては：標的生体細胞（例えば循環腫瘍細胞）を分離又は富化するためのセパレータユニット（例えばモジュール１５０、図１７Ａ）；赤血球及び白血球から血漿を分離するための、長手方向に延在する血漿単離ユニット（例えばモジュール２００、図１７Ａ）；エキソソームをアフィニティ精製するための第１の抽出器ユニット（モジュール２５０、図１７Ａ）；ｃｆＤＮＡの精製のための第２の抽出器ユニット（モジュール３００、図１７Ａ）；細胞をカウントして生存性を決定するためのセンサユニット（モジュール３５０、図１７Ａ）；ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの単離のための第２の抽出器ユニット（モジュール４００、図１７Ａ）；逆転写酵素反応及びＴｄＴ反応のための１つ又は複数のリアクタモジュール（モジュール４５０及び５００、図１７Ａ）；並びに過剰なｄＮＴＰ及び他の非標的核酸分子成分を、ナノセンサチャンバ及び生体分子プロセッサに入る前に上記試料から除去するための、流れ精製モジュール（モジュール５５０、図１７Ａ）が挙げられる。
【０１２３】
上記ヌクレオチド三リン酸のブロッキング部分は、ヌクレオチド三リン酸３’ＯＨ基における後続のヌクレオチド三リン酸の追加を直接的にブロックできる。この実施形態では、上記ブロッキング部分は、リボースの２’‐Ｏ、又はデオキシリボースの３’‐Ｏに付加される。これらのヌクレオチド三リン酸は、合成による蛍光配列決定に類似している（ジュ（Ｊｕ）ら著「切断可能な蛍光ヌクレオチド可逆転写ターミネータを用いた合成による４色ＤＮＡ配列決定（Four‐color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators）」、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、１０３巻（５２）、ｐｐ．１９６３５‐４０、２００６年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。３’‐Ｏブロッキング基の場合、文献において十分に実証された例が複数存在し、限定するものではないが、アミノ、アジドメチル及びシアノエチル基が挙げられる。上記基の特定の性質を、酵素的取り込みの効率と、ブロッキング解除ステップ中の除去の容易さとの組み合わせに関して選択しなければならない。ブロッキング基の除去は、ブロッキング基の化学的性質に特異的である。しかしながら、例としては、プライマ‐鋳型二重鎖を保存して、プライマ‐鋳型二重鎖の溶融による信号の損失を引き起こさない温度での、穏やかな水性試薬（例えば還元剤）の使用が挙げられる。
【０１２４】
或いは、ヌクレオチド三リン酸のブロッキング部分は、その３’ＯＨ基における後続のヌクレオチド三リン酸の追加を可逆的に阻害する。これらのブロッキング部分は、ヌクレオチドのＣ５又はＣ７位、即ちそれぞれピリミジン又はプリンにおいて、ヌクレオチド三リン酸に付加できる。これらのヌクレオチド三リン酸は、ライトニング・ターミネータ（商標）（Lightning TerminatorsTM（レーザジェン社（LaserGen, Inc.））（ガードナー（Gardner）ら著「新規のクラスの３’OH非ブロック可逆ターミネータの、迅速な取り込み動態及び改善された忠実度（Rapid Incorporation Kinetics and Improved Fidelity of a Novel Class of 3’OH Unblocked Reversible Terminators）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ３３０、２０１２年５月；及びリトッシュ（Litosh）ら著「２ニトロベンジルアルキル化ＨＯＭｅｄＵ三リン酸の分子調整による、３’‐ＯＨ非ブロック可逆ターミネータの改善されたヌクレオチド選択性及び終結（Improved Nucleotide Selectivity and Termination of 3’‐OH Unblocked Reversible Terminators by Molecular Tuning of 2 nitrobenzyl Alkylated HOMedU Triphosphate）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、３９巻（６）：ｅ３９、２０１１年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）、及びバーチャル・ターミネータ（商標）（Virtual TerminatorTM）（ヘリコス・バイオサイエンス社（Helicos BioSciences））（バウアーズ（Bowers）ら著「次世代ＤＮＡ配列決定のためのバーチャルターミネータヌクレオチド（Virtual Terminator Nucleotides for Next‐Generation DNA Sequencing）」、ネイチャー・メソッズ（Nat. Methods）、６巻、ｐｐ．５９３‐５９５、２００３年；エフカビッチ（Efcavitch）らに対する米国特許第８，０７１，７５５号；シディッキ（Siddiqi）らに対する米国特許第８，１１４，９７３号；シディッキ（Siddiqi）らに対する国際公開第２００８／０１６９０７７号（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））と同様である。立体的なバルク若しくは荷電型阻害又はこれら両方の組み合わせを利用する、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるｄＮＴＰの組み込みを阻害する化学部分を使用できる。阻害性部分の例は、Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ又はＡｓｐ‐Ａｓｐといったジペプチドである。
【０１２５】
本発明のこの態様によると、好適な同定シグニチャ生成部分は、ヌクレオチド三リン酸に連結できるものであり、また、１つ又は複数のナノ細孔を通る電流を測定可能に修正又は変調（即ち増加又はブロック）できるものである。
【０１２６】
好適な同定シグニチャ生成部分としては、水溶性荷電分子、例えば限定するものではないが、酸性ポリペプチド、塩基性ポリペプチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、荷電ポリマー（例えばポリエチレングリコールポリマー）、ナノスフィア、ナノ結晶、荷電オリゴ糖、デンドリマー、蛍光染料、赤外線染料、発色団、キノロン、クマリン、ポルフィリン、ポルフィリン‐金属錯体、水溶性芳香族多環式分子、水溶性芳香族複素環式分子、遷移金属錯体、金属キレート、金属キレートポリマー、２‐ニトロベンジル誘導体、又はこれらの部分のいずれの組み合わせが挙げられる。上記切断可能な同定シグニチャ生成部分は、各ヌクレオチド三リン酸に対して、そのヌクレオシドＣ５位又はそのヌクレオシドＣ７位に付加される。
【０１２７】
上記同定シグニチャ生成部分を切断した後、上記同定シグニチャは、検出のために１つ又は複数のナノチューブを通して供給される。上記同定シグニチャ生成部分は、上記同定シグニチャが１つ又は複数のナノ細孔を通過する際に、上記部分が各ナノ細孔を通過する際に生成される各ナノ細孔を通る電流の測定可能な変化に基づいて検出される。上述のように、電流の変化は、１つ又は複数のナノ細孔を通る電流の上昇（即ち電流増加）又は電流の低下（即ち電流遮断）となり得る。あるナノ細孔を通る電流変化の大きさ、持続時間及び方向を検出及び測定することによって、各ヌクレオチド三リン酸を同定して互いに区別する。上記同定シグニチャ生成部分の上記同定シグニチャは、上位部分のサイズ、形状、電荷及び導電性、並びに上述のように、上記ナノ細孔の長さ、直径及び分子特性（例えば上記ナノ細孔の組成及び／又は表面コーティング）に影響される。
【０１２８】
別の実施形態では、上記同定シグニチャ生成部分は、上記ナノチューブ内の飛行時間チャネルにおけるその飛行時間に基づいて検出及び区別される。この実施形態では、上記切断された電気生成部分は、少なくとも第１及び第２のナノ細孔を通して供給され、ここで上記第１及び第２のナノ細孔は、上記ナノチューブの飛行時間チャネルの対向する両端部に位置決めされる。ある部分が上記第１のナノ細孔、上記飛行時間チャネル及び上記第２のナノ細孔を通過するためにかかる時間を測定し、これを、上記同定シグニチャ生成部分の上記同定シグニチャとして用いる。上記同定シグニチャ生成部分の上記同定シグニチャは、上位部分のサイズ、形状、電荷及び導電性、並びに上述のように、上記ナノ細孔及び上記飛行時間ナノチャネルの長さ、直径及び分子特性（例えば上記ナノ細孔及びナノチャネルの組成及び／又は表面コーティング）に影響される。
【０１２９】
別の実施形態では、上記同定シグニチャ生成部分は、上記同定シグニチャ生成部分が少なくとも２つのナノ細孔を通過する際に発生する、上記２つのナノ細孔を通る電流の変化と、上記２つのナノ細孔の間の飛行時間の測定とを組み合わせたものである。
【０１３０】
本発明のこの態様及び全ての態様によると、本明細書に記載の方法を用いた分析のための関心対象の核酸分子を含有する試料としては、限定するものではないが、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、喀痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、無細胞循環腫瘍核酸、妊娠中の女性の無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検及びエキソソームが挙げられる。
【０１３１】
検出される試料中の標的核酸分子は、二本鎖デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ分子、１つ又は複数のメチル化ヌクレオチド基を含むＤＮＡ分子、１つ又は複数の修飾又は損傷ヌクレオチド基を含むＤＮＡ分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子（即ち長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び短鎖阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、１つ又は複数の修飾又は損傷ヌクレオチド基を含むＲＮＡ分子、並びにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子が挙げられる。
【０１３２】
本発明のこの態様及び全ての態様によると、不動化された捕集分子は、上記標的核酸分子の一部分、又は上記標的核酸分子に付加された部分に対する結合パートナーである。核酸分子上に存在する、好適な捕集分子及びそのそれぞれの結合パートナーとしては、限定するものではないが、ビオチン及びストレプトアビジン、マルトース及びマルトース結合タンパク質、キチン及びキチン結合タンパク質、アミラーゼ及びＭＢＰ、グルタチオントランスフェラーゼ及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ、Ｈｉｓタグ及びＮＴＡマトリクス、インテグリン及びインテグリン結合ペプチドが挙げられる。別の実施形態では、上記捕集分子は、上記標的核酸分子の核酸配列の一部分に対して相補的なポリヌクレオチド配列である。例えば一実施形態では、上記捕集分子は、モノヌクレオチド三リン酸のホモポリマー配列、例えばポリ‐ｄＡ又はポリ‐Ｔプライマであり、また上記試料の上記標的核酸分子は、モノヌクレオチド三リン酸の相補的なホモポリマー配列、即ちポリ‐Ｔ又はポリｄＡテールを含有する。
【０１３３】
本発明の一実施形態では、上記不動化された捕集分子の結合パートナーを、上記標的核酸分子に付加することによって、不動化を促進する。試料中の核酸分子をランダムに断片化し、好適な結合パートナーを含有するアダプタタンパク質、及び任意に１つ又は複数の更なるタンパク質、例えばプライマ結合部分を、断片化された上記核酸分子の各末端に付加するよう処理できる。例えば、平滑末端であるか、又はＴ４ポリメラーゼ若しくは大腸菌ポリメラーゼ等の様々な酵素を用いて平滑としたものである、ＤＮＡ分子の末端を、Ｔ４キナーゼを用いてリン酸化できる。３’〜５’プルーフリーディング活性を有しないポリメラーゼ（クレノウ（ｅｘｏ）等）を用いて、更なる「Ａ」を３’末端に追加し、単一塩基３’Ｔオーバハングを含有するリンカーを用いたアダプタライゲーションに好適な、単一塩基３’Ａオーバハングを生成する。核酸分子及びその補体へのアダプタ部分の付加はまた、当該技術分野において公知の多様な酵素反応のうちのいずれを用いて達成することもできる。好適な酵素としては、限定するものではないが、リガーゼ（例えば大腸菌リガーゼ又はＴ４ＤＮＡリガーゼ）、ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ又は大腸菌ポリメラーゼ）、リコンビナーゼ、末端トランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修復酵素、及び逆転写酵素が挙げられる。様々な標的核酸分子（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）にアダプタ部分を付加するための例示的なアプローチは、当該技術分野において公知である。
【０１３４】
一実施形態では、上記アダプタ部分は、モノヌクレオチド三リン酸のホモポリマー配列、即ちポリ‐Ｔ又はポリ‐ｄＡテールを、標的核酸分子の３’末端に付加するための、末端トランスフェラーゼを用いて追加される。別の実施形態では、上記アダプタ部分は、遺伝子座特異的なオリゴヌクレオチドプライマ及びポリメラーゼのセットを用いて、標的核酸分子に付加される。この実施形態では、上記プライマセットの第１のオリゴヌクレオチドプライマは、上記捕集分子に対する結合パートナー、例えばポリ‐ｄＡ、ポリ‐Ｔ配列テールとして機能する、５’ヌクレオチドアダプタ配列と、上記標的核酸分子の一部分に対して相補的な３’標的ヌクレオチド配列とを含む。上記プライマセットの第２のオリゴヌクレオチドプライマは、任意の５’プライマ特異的部分と、上記第１のプライマから形成される伸長産物の一部分に対して相補的な３’ヌクレオチド配列とを含む。アダプタ付加ポリメラーゼ反応の特異性を増強するために、上記オリゴヌクレオチドプライマセットの一方又は両方のオリゴヌクレオチドプライマは、３’切断可能なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体と、一方又は両方のプライマのポリメラーゼ媒介型伸長をブロックするブロッキング基とを有する。好適なブロッキング基としては例えば、限定するものではないが、プロパノール基（３’ＳｐＣ３）、ジデオキシリボース塩基（３’ｄｄＣ）、リン酸（３’リン酸）、又はホスホロチオエート基が挙げられる（ニキホロフ（Nikiforow）ら著「一本鎖ＰＣＲ産物の調製、及び固相ハイブリダイゼーションによるその検出のための、ホスホロチオエートプライマ及びエキソヌクレアーゼ加水分解の使用（The Use of Phosphorothioate Primer and Exonuclease Hydrolysis for the Preparation of Single‐stranded PCR Products and their Detection by Solid-phase Hybridization）」、ＰＣＲメソッズ・アンド・アプリケーションズ（PCR Methods and Applications）、３巻、ｐｐ．２８５‐２９１、１９９４年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
ポリメラーゼに好適な３’ＯＨを自由にするための、上記オリゴヌクレオチドプライマの３’ブロッキング基の切断は：上記プライマが内部リボヌクレオチド基を含有するように設計されている場合には、ＲＮａｓｅＨを用いて（ドボシー（Dobosy）ら著、「ＲＮａｓｅ  Ｈ依存性ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：改善された特異性、及びブロックされた切断可能なプライマを用いた一本鎖ヌクレオチド多型の検出（RNase H‐Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primer）」、ＢＭＣバイオテクノロジー（BMC Biotechnology）、１１巻（８０）、ｐｐ．１０１１、２０１１年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）；上記プライマが内部無塩基部位（例えばテトラヒドロフラン）を含有するように設計されている場合には、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ若しくは大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶを用いて；又は上記プライマが、鋳型上のＧと対になった内部Ｕを含有するように設計されている場合には、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＶ若しくは大腸菌エンドヌクレアーゼＶを用いて（切断により、Ｕ‐Ｇのミスマッチに対する２番目若しくは３番目のホスホジエステル結合３’が自由になる）、達成できる。
【０１３５】
標的核酸分子は任意に、上記標的核酸分子それぞれの捕集分子への結合による固体支持体に対する不動化の前に、富化してよい。標的核酸分子の富化は、当該技術分野において公知の、及び本明細書に記載の方法を用いて実行できる。
【０１３６】
標的核酸分子それぞれの捕集分子への結合によって標的核酸分子を固体支持体に対して不動化した後、不動化された上記標的核酸分子、又は上記標的核酸分子に対して相補的な不動化された伸長産物を、ライゲーション反応プロセス、伸長反応プロセス又は他の酵素反応に供する。
【０１３７】
一実施形態では、上記不動化された標的核酸分子は、上記ライゲーション反応プロセスのための鋳型として使用される。この実施形態では、末端トランスフェラーゼは、ビオチン化ヌクレオチド三リン酸を上記核酸分子の末端に付加し、ビオチン化した標的核酸分子を、上記固体支持体の表面にコーティングされたストレプトアビジンへの結合によって、上記固体支持体上で不動化する。ビオチン‐ストレプトアビジンは共有結合相互作用ではないが、ビオチンを用いたテーリングにより一般に、ストレプトアビジンテトラマー上の同一の分子から２‐３個のビオチンを捕集でき、この様式での不動化は、ライゲーション反応プロセスの変性条件（高ホルムアルデヒド及び／又は９０℃への加熱）に耐えることができる。このような変性は、後続の区別及び検出ステップのために、ライゲーション反応プロセスによって生成されたライゲーション産物を、固体支持体表面上の不動化された標的から放出させるために、必要となる。
【０１３８】
別の実施形態では、末端トランスフェラーゼは、ｄＣＴＰを標的核酸末端に付加し、標識された上記標的核酸分子は、上記固体支持体上のｄＧ５０オリゴヌクレオチド捕集分子への結合によって、上記固体支持体上で不動化される。上記ビオチン‐ストレプトアビジン結合相互作用と同様、ホモポリマーｄＣ：ｄＧ結合は、上述の変性条件に耐えるために十分な強さを有する。このような変性は、後続の区別及び検出ステップのために、ライゲーション反応によって生成されたライゲーション産物を、固体支持体表面上の不動化された標的から放出させるために、必要となる。これにより、上記標的核酸分子を、ライゲーション反応プロセスのための鋳型として機能させることができる。
【０１３９】
別の実施形態では、上記不動化された標的核酸分子に対して相補的な、不動化された伸長産物が、バイオリアクタチャンバの離間した支持構造体上に生成され、これは、ライゲーション反応プロセスのための鋳型として使用される。不動化された伸長産物は、当業者に公知の、及び／又は本明細書に記載の、固相増幅反応を用いて生成される。
【０１４０】
一実施形態では、上記捕集分子は捕集オリゴヌクレオチドであり、これもまた、結合した標的核酸分子の線形固相増幅を促進するためのプライマとして機能する。この実施形態によると、上記標的核酸分子の相補的部分、例えばポリ‐Ｔテールを含有する上記標的核酸分子のアダプタ部分に対してハイブリダイズされた、捕集オリゴヌクレオチド、例えばポリ‐ｄＡ捕集プライマを、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰのプールを用いて伸長させて、上記不動化された標的核酸分子の全長コピーを作製する。Ｂｓｔポリメラーゼ等の鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いることにより、上記標的核酸分子の線形増幅が可能となる。上記標的核酸分子に対して相補的な不動化された伸長産物の形成のためのプライマ伸長に続いて、温度を上昇させることにより、標的核酸分子及びその伸長産物のポリ‐Ｔ部分が変性し、これにより、隣接する非ハイブリダイズ捕集オリゴヌクレオチドを、上記標的核酸分子に結合させて伸長させることができる。この線形増幅は、上記核酸分子の元の鋳型鎖が次のプライマへと「引き渡される（ｈａｎｄｅｄ‐ｏｆｆ）」際に、そのコピーを確実に生成する。このプロセスは、上記固体支持体上の非ハイブリダイズ捕集オリゴヌクレオチドが枯渇するまで継続される。
【０１４１】
別の実施形態では、付加されたアダプタ部分を有する標的核酸分子を環状化し、固相増幅を、ローリングサークル増幅反応によって達成する（リザルディ（Lizardi）ら著、「等温ローリングサークル増幅を用いた突然変異の検出及び単一分子のカウント（Mutation Detection and Single‐Molecule Counting Using Isothermal Rolling‐circle Amplification）、ネイチャー・ジェネティクス（Nat Genet）、１９巻、ｐｐ．２２５‐２３２、１９９８年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。この実施形態によると、上記不動化された捕集オリゴヌクレオチドは、固相ローリングサークル増幅を開始させるためのプライマとして機能する。環状化された核酸分子を、その相補的アダプタ部分を介して、上記不動化された捕集オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする（上記環状化された核酸分子のポリＴ‐配列を、不動化されたポリ‐ｄＡ捕集オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする）。鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びｄＮＴＰのプールの存在下において、上記不動化されたプライマを、上記環状化された核酸分子の周囲で連続的に伸長させることによって、環状化されたアダプタ付加標的核酸分子の配列に対して相補的な、多量体タンデム直鎖反復配列を含む、不動化された伸長産物を生成する。
【０１４２】
上記標的核酸分子に対して相補的な伸長産物の固相増幅及び不動化を更に増強するために、上記標的核酸分子のアダプタ部分を、１つ又は複数の汎用プライマ特異的部分を含有するように設計する。この実施形態によると、上記標的核酸分子の上記アダプタ部分の汎用プライマ特異的部分の配列と同一の配列を有する３’部分を有する、１つ又は複数のプライマを提供して、上記不動化された伸長産物の、相補的な汎用プライマ特異的部分に対してハイブリダイズする。上記不動化された伸長産物上のハイブリダイズされたプライマの伸長により、二次伸長産物が形成される。上記二次伸長産物を、上記固体支持体上の、隣接する又は近隣の捕集オリゴヌクレオチドプライマにおいて、変性及び捕集し、次に上記プライマが伸長して、上記標的核酸分子に対して相補的な、追加の不動化された伸長産物を形成する。このプロセスは、上記固体支持体上の非ハイブリダイズ捕集オリゴヌクレオチドプライマが枯渇するまで継続される。
【０１４３】
本発明の方法による固相増幅を実行するための別の好適なアプローチは、バラニー（Barany）らに対する国際公開第２０１３／０１２４４０号（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている。本発明の方法による固相増幅を実行するための等温アプローチは、マー（Ma）ら著、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、１１０巻（３５）、ｐｐ．１４３２０‐３、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている。
【０１４４】
本発明のこの態様によると、上記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物をライゲーション反応に供し、ライゲーション産物を生成する。本発明の一実施形態では、上記ライゲーション反応は、ライゲーション検出反応である。ライゲーション検出反応混合物は、リガーゼと、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットとを含み、各プローブセットは、ある標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブと、ある標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブとを有する。プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な様式で、上記不動化された標的核酸分子又はその不動化された伸長産物の相補的領域に対してハイブリダイズするよう構成される。一実施形態では、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、互いに直接隣接してハイブリダイズし、これらの接合部が、上記不動化された標的核酸又はその伸長産物の相補的領域上に存在し、一体にライゲーションして、ライゲーション産物を形成する。別の実施形態では、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、上記標的核酸分子又はその伸長産物上で、これらの相補的領域に対してハイブリダイズし、これらの間には空間又は間隙が存在する。この実施形態では、ポリメラーゼを利用して、上記第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を伸長させることにより、上記第２のオリゴヌクレオチドプローブとの接合部を生成し、続いてリガーゼがこれら２つのプローブを一体にライゲーションして、ライゲーション産物を形成する。
【０１４５】
上述のライゲーション反応のいくつかの変形例を採用して、ライゲーション産物生成の特異性、従って標的核酸検出を増強できる。一実施形態では、上記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーションコンピテント３’ＯＨ基を有し、その一方で上記第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーションインコンピテント５’末端を有する（即ち５’リン酸を有しないオリゴヌクレオチドプローブ）。本発明の方法によると、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの最も３’側の塩基は、上記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、上記標的核酸分子に対して相補的な、隣接する上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの最も５’側の塩基と重複している。この重複したヌクレオチドは、「フラップ（ｆｌａｐ）」と呼ばれる。上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの重複するフラップヌクレオチドが、上記標的核酸分子配列に対して相補的であり、かつ上記第１のオリゴヌクレオチドプローブの終端の３’ヌクレオチドと同一の配列である場合、上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの上記フラップヌクレオチドのすぐ上流のホスホジエステル結合は、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）又は５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、区別して切断される。この特異的なＦＥＮ活性は、上記第２のオリゴヌクレオチドプローブ上に、新規のライゲーションコンピテント５’リン酸末端を生成し、これは、上記第１のオリゴヌクレオチドプローブの隣接する３’ＯＨと並んで正確に位置決めされる。この方法、及び本発明のこの態様による使用に好適なこの方法の変形例は、バラニー（Barany）らに対する米国公開特許出願第２０１５／００３８３３６号（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている。
【０１４６】
リガーゼの区別は、様々なプローブの設計の特徴を採用することによって更に増強できる。例えば、故意のミスマッチ又はヌクレオチド類似体（例えばイノシン、ニトロインドール若しくはニトロピロール）を、３’接合末端から２番目又は３番目の塩基において上記第１のオリゴヌクレオチドプローブに組み込むと、これが上記３’末端において完璧にマッチしていれば、上記３’末端のハイブリダイゼーションを僅かにしか不安定化できないが、上記３’末端においてミスマッチしていれば、ハイブリダイゼーションを大幅に不安定化できる。この設計は、突然変異型プローブが野生型標的に対してハイブリダイズする場合の、不適切なミスライゲーションを削減する。あるいは、ＲＮＡｓｅによって切断できるＲＮＡ塩基を上記オリゴヌクレオチドプローブに組み込むことによって、鋳型依存性の産物形成を保証できる。例えばドボシー（Dobosy）ら著「ＲＮａｓｅ  Ｈ依存性ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：改善された特異性、及びブロックされた切断可能なプライマを用いた一本鎖ヌクレオチド多型の検出（RNase H‐Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primer）」、ＢＭＣバイオテクノロジー（BMC Biotechnology）、１１巻（８０）、ｐｐ．１０１１、２０１１年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）は、ブロックされた３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブの３’末端に近接したＲＮＡ塩基を用い、ＲＮＡｓｅ  Ｈ２を用いてこれを切断して、ＰＣＲ伸長可能かつライゲーション可能な３’‐ＯＨを生成することについて記載している。このアプローチを用いて、５’‐ＲＮＡ塩基をライゲーションできるリガーゼを利用すれば、ライゲーションコンピテント３’ＯＨ又は５’‐Ｐ又はこれら両方を生成できる。
【０１４７】
挿入又は欠失に関して、接合部から２番目又は３番目の位置における、上記第１のオリゴヌクレオチドプローブ中の、マッチした塩基又はヌクレオチド類似体（例えば‐アミノ‐ｄＡ又は５‐プロピニル‐ｄＣ）の組み込みは安定性を改善し、また野生型配列からのこのようなフレームシフト突然変異の区別を改善し得る。挿入に関しては、上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの所望の分裂性リン酸結合から下流における、１つ又は複数のチオホスフェート修飾ヌクレオチドの使用により、上記プローブを野生型ＤＮＡに対してハイブリダイズした場合の、５’ヌクレアーゼ酵素による不適当な切断が防止され、従って野生型標的上での偽陽性ライゲーションが削減される。同様に、欠失に関しては、上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの所望の分裂性リン酸結合から上流における、１つ又は複数のチオホスフェート修飾ヌクレオチドの使用により、上記プローブを野生型ＤＮＡに対してハイブリダイズした場合の、５’ヌクレアーゼ酵素による不適当な切断が防止され、従って野生型標的上での偽陽性ライゲーションが削減される。
【０１４８】
他の可能な修飾としては、無塩基部位、例えばｄＳｐａｃｅｒ（ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）として公知）又はオキソ‐Ｇが挙げられる。これらの異常な「塩基（ｂａｓｅ）」は、異常な塩基を除去してライゲーションコンピテント３’‐ＯＨ又は５’Ｐ部位を生成する、特異的酵素を有する。エンドヌクレアーゼＩＶであるＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ（ＮＥＢ）は、ライゲーションオリゴヌクレオチドが上記標的核酸に対してアニールした後に無塩基残基を除去するが、一本鎖ＤＮＡからは除去しない。同様に、オキソ‐ＧをＦｐｇと共に、又はイノシン／ウラシルをエンドヌクレアーゼＶと共に、又はチミングリコールをエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと共に使用できる。
【０１４９】
別の実施形態では、ライゲーション反応のためのプローブセットは更に、これもまた上記不動化された標的核酸分子又はその伸長産物のある領域に対して相補的な標的特異的部分を有する、第３のオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。この実施形態では、プローブセットの第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブは、上記標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズし、これらの間に接合部が存在する。上記第３のオリゴヌクレオチドプローブの上記標的特異的部分は、プローブセット内の上記第２のオリゴヌクレオチドプローブとの上記接合部に、重複する同一のヌクレオチドフラップを有し、このフラップは、このフラップが上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、かつ上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの終端３’ヌクレオチドと同一の配列である場合、ＦＥＮ活性を有する酵素によって除去される。上記フラップの切断により、上記第３のオリゴヌクレオチドプローブ上のライゲーションコンピテント５’リン酸が自由になり、これにより、上記接合部における上記第２のオリゴヌクレオチドプローブと上記第３のオリゴヌクレオチドプローブとの間のライゲーションが、ライゲーションした産物配列を形成できる。１つのプライマセット内で３つのプローブを利用することにより、より長い標的領域をより高い特異性で検出できる。
【０１５０】
ライゲーション前に上記第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’フラップを切断するのに好適な、フラップエンドヌクレアーゼ又は５’ヌクレアーゼとしては、限定するものではないが、５’ヌクレアーゼ活性を備えるポリメラーゼ、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＴａｑ及びテルムス・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のポリメラーゼ、並びにＴ４  ＲＮａｓｅ  Ｈ及びＴａｑＥｘｏが挙げられる。
【０１５１】
本発明の方法において利用されるライゲーション反応は、当該技術分野において公知である。上記第２のオリゴヌクレオチドプローブ上での５’フラップの切断後に、プローブセットのオリゴヌクレオチドを共にライゲーションするのに好適なリガーゼとしては、限定するものではないが、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．）ＡＫ１６Ｄリガーゼ、大腸菌リガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、９Ｎ°リガーゼ、及びピロコックス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）リガーゼ、又は当該技術分野において公知の他のいずれの熱安定性リガーゼが挙げられる。本発明によると、本発明のヌクレアーゼライゲーションプロセスは：オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応（ランデグレン（Landegren）ら著、「リガーゼ媒介型遺伝子検出技法（A Ligase‐Mediated Gene Detection Technique）」、サイエンス（Science）、２４１巻、ｐｐ．１０７７‐８０、１９８８年；ランデグレン（Landegren）ら著、「ＤＮＡ診断‐分子技法及び自動化（DNA Diagnostics - Molecular Techniques and Automation）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４２巻、ｐｐ．２２９‐３７、１９８８年；及びランデグレン（Landegren）らに対する米国特許第４，９８８，６１７号（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）；１セットの相補的オリゴヌクレオチドプローブを利用したライゲーション検出反応（ＬＤＲ）（例えばバラニー（Barany）らに対する国際公開第９０／１７２３９号（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）；又は２セットの相補的オリゴヌクレオチドプローブを利用したライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（バラニー（Barany）らに対する国際公開第９０／１７２３９号（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される）参照）を用いて実行できる。
【０１５２】
プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、修飾ペプチドヌクレオチド類似体、修飾リン酸‐糖‐バックボーンオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及びこれらの混合物の形態とすることができる。
【０１５３】
本明細書に記載されているように、本発明のデバイス及び方法は、１つ若しくは複数のヌクレオチド塩基突然変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異型、ｍｉＲＮＡ変異型、転写の変化、開始部位の変化、コーディング配列の変化、非コーディング配列の変化、スプライシングの変化、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、突然変異、又はゲノムレベルでの他の再編成、及び／又はメチル化ヌクレオチド塩基を含む、低存在量核酸分子を、検出、同定、定量（即ちコピー数）及び区別するよう設計される。１つ若しくは複数のヌクレオチド塩基突然変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異型、ｍｉＲＮＡ変異型、転写の変化、開始部位の変化、コーディング配列の変化、非コーディング配列の変化、スプライシングの変化、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、突然変異、又はゲノムレベルでの他の再編成、及び／又はメチル化ヌクレオチド塩基を有する、低存在量核酸分子は、本発明の方法を用いて、上記低存在量核酸分子と同様のヌクレオチド配列を有するものの、１つ若しくは複数のヌクレオチド塩基突然変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異型、ｍｉＲＮＡ変異型、転写の変化、開始部位の変化、コーディング配列の変化、非コーディング配列の変化、スプライシングの変化、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、突然変異、又はゲノムレベルでの他の再編成、及び／又はメチル化ヌクレオチド塩基を有しない、試料中の高存在量核酸分子から、同定及び区別される。
【０１５４】
試料中の低存在量核酸分子を、検出、同定、定量（即ちコピー数）及び区別することができることにより、疾患の状態の早期診断及び予後が可能となる。別の実施形態では、試料中の低存在量核酸分子を、検出、同定、定量及び区別することができることにより、遺伝子型又は疾患の傾向の決定が可能となる。
【０１５５】
検出、同定及び区別される標的核酸分子は、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、喀痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、無細胞循環腫瘍核酸、妊娠中の女性の無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検及びエキソソームを含むがこれらに限定されない、いずれの好適な試料から単離できる。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するために提供されているが、本発明の範囲を限定することは一切意図されていない。
【０１５７】
実施例１‐ｕＭＰＳのナノセンサチャンバ中の単一分子の検出及び区別
シミュレーションデータ：
ＣＯＭＳＯＬ（登録商標）シミュレーションソフトウェアを用いて生成される予備シミュレーションを、８個の生体分子プロセッサからなるナノセンサチャンバに対して実施した。各プロセッサは、２０×２０μｍを測定し、２８８個の支柱（１μｍ×５μｍ、間隔２５０ｎｍ）を内包していた。これらのシミュレーションに関して、３つの動作に関する疑問に対処した：（１）ナノチューブ内へと流体を移動させずに、単一のチャンバの全ての生体分子プロセッサに、１つの共通の入力から流体力学的に均一に対処できる（チャンバのフットプリントを削減できる）かどうか；（２）表面に不動化されたｄＡ３０プライマに対するＴｄＴテールＤＮＡ産物の捕集効率はどの程度か；及び（３）熱変性に続いて、上記産物をナノチューブセンサ内へと直接、動電学的に効率的に配向できるかどうか。
【０１５８】
圧力駆動流に関して（図３１参照）、チャンバの生体分子プロセッサ前領域にシェブロンバッフルを含めることによって、入力流体を、生体分子プロセッサアレイ全体に亘って、長手方向の拡散のみよりも有意に短い時間で分散する。更に、断面が小さい（５０×５０ｎｍ未満、長さ１００μｍ超）ことに起因する、流体力学的動作中のナノチューブ内の高い流体抵抗により、流体は、極めて高い流体抵抗により、ナノチューブに仮に入る場合であっても殆ど入らない。これは、圧力駆動流を用いて試料／試薬をポンプ送達する、アッセイの積載及び反応段階中において、図３１に示すように全ての材料が飛行管周辺を移動することになるため、便利である。
【０１５９】
しかしながら、上記チャンバを動電学的に作動させる（これは固相産物を、バイオリアクタチャンバの支柱に付着した不動化された標的から熱溶融させた後に生じる）と、この熱溶融した産物は、飛行管内へと優先的に配向される（図３２Ａ）。図３２Ａから分かるように、負荷電産物（ドラッグタグ標識を備えてよいがポリアニオン性であるオリゴヌクレオチド）は飛行管内へと優先的に引き込まれる。というのは、電気的ポテンシャルの降下の大半（＞９５％）がナノメートル飛行管内で発生するためである。これにより、電場の印加によって生成された仮想境界と、所望の産物を飛行管に注入する強力な力線が可能となる（図３２Ｂ）。よって、適切な方向に流体の流れを配向するためのバルブ操作を必要とする固体壁を、インプリントによって製造する必要はない。
【０１６０】
最後に、支柱が形成された抽出ベッドの回収並びに採用される支柱サイズ及び間隔を予測するために開発された、支柱ベースの拡散モードを用いると、テールＤＮＡの捕集効率は＞８０％であり、全ての支柱に同一の積載が得られる（図３３）。この回収は、流れを流体力学的に駆動する際に、単一のチャンバ構成部品の入力支柱に関して計算される。シェブロンバッフルの使用、及び単一のチャンバの全ての生体分子プロセッサ、即ちナノセンサチャンバあたり８個の生体分子プロセッサ（図３１）への均一な対処により、上記チャンバ内の各支柱による捕集の蓋然性は均等である。ここで上記支柱は、測定に必要な標的材料の積載分を収容するための所与の用途に適応するいずれのサイズ及び形状とすることができる。上記支柱は、図３１に示すように円形とすることができ、又は上述のように正方形、菱形、長方形等とすることができる。
【０１６１】
この用途に独特なのは、１つの長いナノチャネルと２つ以上の面内合成ナノ細孔とで構成されるナノチューブを通って移動する単一分子の検出を可能とする戦略である。上記ナノ細孔は、５〜５０ｎｍの範囲の開口を有し、飛行管として機能する上記ナノチャネルの投入端部及び出口端部付近に配置される（図１Ｂ参照）。分子がナノ細孔を通過する際、上記分子のイオン性塩濃度及びサイズに応じて電流シグニチャが生成され、これは、窒化ケイ素膜上に静止した細孔内の小型開口で構成される垂直なナノ細孔において観察されるものと同様である。上記ナノ細孔は、α溶血素、又は集束イオンビームミリング若しくは電子ビームミリングによって上記窒化ケイ素膜に作製されたナノ細孔といった、自然発生的な細孔とすることができる。この用途に独特なのは、上記細孔が、ナノメートル飛行管に対して面内であり、ナノ流体ネットワークの生成に使用されるものと同一のインプリントステップで製作されることである。更に、多数の細孔を同一の経路に沿って直列に配置でき、第１の細孔に出入りして後続の細孔へと移動する分子は、１００％の効率でサンプリングされる。
【０１６２】
１つのナノチャネル内に形成される２つのナノ細孔は、２つの電流シグニチャを生成し、２つのピークの間の分離は、バイオリアクタチャンバの支柱から放出された、熱溶融した固相産物の飛行時間に対応する。
【０１６３】
単一分子の検出のための面内合成ナノ細孔戦略の可能性を実証するために、広範なシミュレーションを実行した。図３４は、ナノ細孔を内包するナノチューブ内の位置の関数として、シミュレートされた電場分布を示すグラフである。この例では、飛行管は１００×１００ｎｍ（幅×深さ）及び長さ１００μｍであり、細孔は５０×５０×５０ｎｍであり、上記管に亘って印加される電圧は１０Ｖである。しかしながら、上記飛行管の長さは、所与の用途に適応するよう、数十ミクロンとすることができる。より長い飛行管は、より良好な電気泳動の解像度を提供し、単一分子の同定効率を改善する。図３４のグラフに示すように、長手方向の電場がナノメートル飛行管の長さの上から下へと印加されると、面内細孔に亘る電場が、上記細孔のサイズが上記飛行管に対して低減されることにより、大きく増強される。これは、単一分子が飛行管のこの領域を移動する際に、単一分子の速度が上昇することを示している。
【０１６４】
図３５Ａは、面内合成ナノ細孔内に存在する球形の粒子のモデルを示す。この例では、上記球形粒子は直径〜４０ｎｍであり、細孔は５０×５０ｎｍであり、厚さ５０ｎｍである。上記球形粒子が上記細孔内にある時に生成される電流応答（ΔＩＢ）は、ΔＩＢ≒Ｉ（ＶＰ／ＶＤ）によって予測される。この場合、ΔＩＢは、ブロックされていない電流（Ｉ）に、上記細孔間の間隙容量（ＶＤ）に対する上記粒子の体積（ＶＰ）の比を乗算したものに等しい。図３５Ｂにおいて観察できるように、上記粒子が上記細孔容積ＶＤで存在する場合、キャリア電解質のイオン強度に関係なく、明瞭な電流遮断イベントが生成される。
【０１６５】
図３６Ａ及び３６Ｂは、長さは様々であるが断面が一定（５０×５０ｎｍ）の面内合成ナノ細孔を通って移動する、直径４０ｎＭの単一球形ＤＮＡ分子によって生成される電流遮断のシミュレーションの結果を示す。この場合、細孔の長さは、２０ｎｍ、５０ｎｍ及び８０ｎｍというステップで変化させた。図３６Ａのグラフから分かるように、過渡電流の幅（ΔＩＢ）のピークは、細孔の長さの関数として変化し、孔が長いほど幅広の信号であった。図３６Ｂは、ΔＩＢの振幅の関数としての、比ＶＰ／ＶＤのプロットを示す。このプロットは、添付のグラフに示される関数関係により、非線形であった。
【０１６６】
これらのシミュレーションは、分子の同定シグニチャ（この場合は遮断電流イベント）を、細孔の長さによって成形できること、即ち、より長い細孔はより幅広の過渡電流を生成することを実証している。従って、ナノチューブ内の異なる細孔からの同定シグニチャは、これらのシミュレーションが示すように細孔の長さを調整することによって弁別できる。同定シグニチャ、即ち電流遮断イベントの形状を変更するための別の方法は、細孔の直径を変化させることである。より長い細孔は、振幅がより小さい電流遮断イベントを生成する。
【０１６７】
実験データ：
穿孔されたナノ細孔を有するＳＵ‐８中の自立ポリマー膜を製造するための、簡単かつ高収率のプロセスを開発した。このプロセスの重要な特徴は、ＮＩＬのためのに、順次スピンコートされた二重レジスト層を使用することである。まず、リフトオフレジスト（ＬＯＲ）
を犠牲層として使用し、続いてネガ型フォトレジストＳＵ‐８を活性層として使用する。マイクロ／ナノ構造体は、リソグラフィ及び湿式化学エッチング又は深堀り反応性イオンエッチングによって生成されたＳｉスタンプをを用いたＮＩＬを使用して、画定される。単段ＮＩＬプロセスによって達成される最小の細孔は、直径〜１０ｎｍであった。細孔サイズは、ポリマーリフロープロセスを採用することによって、〜６ｎｍまで更に削減され、上記ポリマーリフロープロセスでは、ナノ細孔を２つのプレートの間に配置し、ポリマーをそれぞれのガラス転移温度超から４５℃まで１分間加熱した。図３８Ａ及び３８Ｂは、直径１０ｎｍ（図３８Ａ）又は６ｎｍ（図３８Ｂ）のこれらのＳＵ‐８膜円錐ナノ細孔のＳＥＭ画像である。図３８Ｃは、リフロー時間の関数としての、細孔サイズの削減をプロットしたグラフである。サイズ削減速度は、３ｎｍ／分であると推定された。
【０１６８】
図３９Ａ及び３９Ｂは、異なる長さの複数のナノ細孔を有する、製作済みナノチューブを示す。
【０１６９】
この製作済みナノチューブを用いた予備実験的研究は、シミュレーションデータを確認するものであった。図３７Ａは、２つの異なるサイズのナノ細孔（第１の細孔が５０ｎｍ×５０ｎｍ、第２の細孔が８０ｎｍ×８０ｎｍ）を内包する製作済みナノチューブにおける、過渡電流：時間の例示的なグラフを示す。この実験ではまず、上記ナノチューブにバッファ電解質を充填した。次に、上記バッファ電解質と同一のイオン強度のλ‐ＤＮＡ溶液をリザーバに追加した。駆動電圧を印加して、上記ＤＮＡ分子を、上記ナノチューブを通して電気泳動的に駆動した。ＤＮＡ転座中の過渡電流を測定した。得られた図３７Ａのグラフは、異なる振幅の複数の電流ピークを示す。図３７Ｂは、１５６個の転座イベントから得られた電流ピークの振幅に関する統計を示す。この図は、２つの異なるナノ細孔から得られた、１１０ｐＡ及び２００ｐＡを中心とする２つの振幅ピークを有する、二峰性分布を示す。この結果は、電流ピークの振幅及び幅を、相補的な分子シグニチャとして使用できることを確認するものである。
【０１７０】
実施例２‐多重化のための電気泳動
バイオリアクタチャンバの支柱において実行される固相反応の結果として生成される、固相ＬＤＲ（ｓｐＬＤＲ）産物及び他のオリゴヌクレオチド産物の同定は、これらの長さ（ｂｐ）に基づくものであり、これは、電気泳動移動性のマッチングを用いて達成される。これにより、システムのピーク容量（Ｐ）によって決定される多重化冪数による移動性の多重化が可能となる（ここでの多重化は、異なるＬＤＲプライマ対を用いて単一の分析サイクルで同定できる突然変異の個数として定義される）。
【０１７１】
ナノチャネルの単一銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）を可視化するための暗視野顕微鏡の感度を試験するために、静止したＡｇＮＰ（６０ｎｍ）を撮像し、その局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）を監視した。図４０Ａは、高感度を実証する得られた信号の３次元画像を示す。強度プロファイルは経時的に一定であり、これは漂白がないことを示している。外部電場強度２００Ｖ／ｃｍでＰＭＭＡナノチャネル飛行管を通って移動する単一ＡｇＮＰ（６０ｎｍ）のタイムラプス画像が得られた。図４０Ｂもまた、ＰＭＭＡナノチャネルを通って電気泳動的に移動する単一ＡｇＮＰのＬＳＰＲ画像を示す。粒子の移動は、アノードからカソードへの方向（ＥＯＦと同一の方向）であり、このイベントの輸送時間は１．３秒であった。ナノスリットの寸法は、長さ１００μｍ、深さ／幅１５０ｎｍであった。この場合、上記粒子は、くっ付き／スリップ挙動によるいずれの間欠的な運動もなく、一定の速度で移動した。
【０１７２】
図４０Ｃは、電場強度の関数として、プレート数Ｎで示される、単一ＡｇＮＰの電気泳動移動性及び移動性の変動を示す。電気泳動移動性は、くっ付き／スリップ運動による比較的低い電場強度（＜２００Ｖ／ｃｍ）を除いて、電場強度に無関係に比較的一定であることが分かった。しかしながら、高い電場強度（＞２００Ｖ／ｃｍ）では、プレート数は劇的に増加した。
【０１７３】
図４０Ｄ〜Ｆは、１００Ｖ／ｃｍ（図４０Ｄ）、５００Ｖ／ｃｍ（図４０Ｅ）、１５００Ｖ／ｃｍ（図４０Ｆ）の印加された電場強度を用いて、０．０５ｍＭクエン酸バッファ中で１５０ｎｍ飛行管を通って動電学的に輸送される、６０ｎｍ（左下から右上への斜線）及び１００ｎｍ（左上から右下への斜線）ＡｇＮＰに関する、電気泳動飛行時間のヒストグラム（１００イベント）を示す。ＡｇＮＰの「くっ付き／スリップ（ｓｔｉｃｋ／ｓｌｉｐ）」運動は、１００Ｖ／ｃｍの電場強度において観察され、これにより、単一粒子の飛行時間の幅広い性質がもたらされた。より高い電場強度（５００及び１５００Ｖ／ｃｍ）ではこれは観察されず、これにより、より幅狭のピーク幅がもたらされ、これによりガウス分布の分離が改善された。
【０１７４】
多重化冪数は、より高い電場強度の使用及び／又はカラムの延長によって改善される。例えば電場強度を４０００Ｖ／ｃｍまで上昇させ、ナノカラムの長さを２００μｍまで増大させると、Ｐ≒３１が得られる（図４１）。これは、電気泳動の分解能を６と想定して計算されたものであり、上記分解能は、９９．７５％の分類精度（即ち飛行時間に基づく分子同定精度）を説明するものである。図４１において生成されているデータは、１５，６５０の電気泳動プレート数（Ｎ）での２つの電解質間の電気泳動移動性の差（Δμａｐｐ）が０．０１であることを想定して収集された。この結果は、３１個の異なる分子種を、９９．７５％の精度で同定できることを示している。ピーク容量及び同定精度は、ｓｐＬＤＲ産物の電気泳動移動性の差を増大させることで選択性を改善することによって、増強される。これは例えば、分子ドラッグタグを用いてオリゴヌクレオチドの自由溶液移動性を増強することによって達成される（アルブレヒト（Albrecht）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８３巻、ｐｐ．５０９‐５１５、２０１１年；チュビンスキー及びスレーター（Chubynsky & Slater)著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、３５巻、ｐｐ．５９６‐６０４、２０１４年；フォースター（Forster）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、３０巻、ｐｐ．２０１４‐２０２４、２００９年；マコーミック及びスレーター（McCormick & Slater）著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２７巻、ｐｐ．１６９３‐１７０１、２００６年；ミーガー（Meagher）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、８０巻、ｐｐ．２８４２‐２８４８、２００８年；シンヴィル（Sinville）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２９巻、ｐｐ．４７５１‐４７６０、２００８年；及びアルブレヒト（Albrecht）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、３４巻、ｐｐ．５９０‐５９７、２０１３年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。図４１に示されているように、異なる飛行時間の２つの分子の間で電気泳動解像度が６．０である場合、判定精度は９９．７５％である。解像度の変化は分離のための特定の選択性及び異なるプレート数に関して、Ｎｃに対する影響を有することになる。
【０１７５】
ポリマーマイクロチャネル／ナノチャネル界面において発生し得る濃度分極の影響を理解することは重要であり、これは、ｓｓＤＮＡ産物がナノスケール電気泳動飛行管に入るのを防止できる。濃度分極は、ｄ／λＤのみによって決定されるのではなく、より重要なことには、Ｇｂｕｌｋ／Ｇσ＝（Ｆｄｚｃｏ／σ）によって与えられる逆デューヒン（Ｄｕｋｈｉｎ）数によって決定され、ここでＧｂｕｌｋはバルクコンダクタンスであり、Ｇσは表面コンダクタンスであり、Ｆはファラデー定数であり、ｄはチャネルの臨界寸法（本発明者らの場合は幅及び深さ、アスペクト比＝１）であり、ｚは電荷であり、ｃｏはＥＤＬの外側のイオン濃度であり、σは表面電荷である。
【０１７６】
従来の毛細管電気泳動に関して、動作特性を最適化することによって、高いピーク容量で短時間において最大の成分を提供する。解像度を最大化するために、ゾーン分散を最小化して選択性を最大化する（即ち電気泳動移動性の差）。ゾーン分散に関しては、拡散、注入及び検出長さ、ジュール加熱、試料／バッファ導電性差、並びに溶質‐壁相互作用を含む、分散に影響を及ぼす複数のパラメータが存在する。２つの成分（ｉ，ｊ）に関する解像度（Ｒｅｓ）は、以下の式から決定できる：
【数１】
2018514225.tif 000003
ここでＮはプレート数であり、Δμａｐｐは、それらに関してＲｅｓｉｊを決定しようとしている２つの成分に関する、見かけの移動性（ｃｍ２Ｖ‐１ｓ‐１）の差であり、μａｐｐ，ａνｇは、上記２つの成分の平均移動性である。良好に設計されたシステムにおいて、長手方向の拡散は支配的な分散効果であり、Ｎは以下の式から計算できる：
【数２】
2018514225.tif 000004
ここでＤは分子拡散係数であり、Ｖは印加される電圧であり；従ってＲｅｓｉｊはＶ１／２に比例する。式（２）に示されている関係は、ナノチャネル内のイオン分離を評価した、スアン（Xuan）が提供した形式と同様である。（スアン，Ｘ．（Xuan, X.）著、、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２９巻、ｐｐ．３７３７‐３７４３、２００８年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
削減されたプレート高さ（ｈｉ＝Ｈｉ／ｄ；ここでＨｉ＝Ｌ／Ｎ）は、以下によって与えられる：
【数３】
2018514225.tif 000005
ここでｖｉは、イオンｉに関する平均イオン速度であり、ｄはチャネル臨界寸法であり、Ｄ’ｉは有効拡散係数であり、これは流体力学的分散及び分子拡散を含む。
【０１７７】
式（２）及び（３）から明らかなように、印加される電圧を上昇させると、平均分子速度の上昇により、プレート数を増大させるか又はｈｉの値を低下させることができる。図４０Ｄ〜４０Ｆから分かるように、ナノカラムを用いる場合、Ｎに対して有害な影響を及ぼすことなく、極めて高い電場強度を使用できる。
【０１７８】
ナノチャネル内での動電学的分離に関する理論及び実験的研究は、最近のレビューに見られる（バルデサリ及びサンティアゴ（Baldessari & Santiago）著、ジャーナル・オブ・ナノバイオテクノロジー（J. Nanobiotechnol.）、４巻、ｐｐ．１２、２００６年；及びユアン（Yuan）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２８巻、ｐｐ．５９５‐６１０、２００７年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。１〜１０の範囲のｄ／λｄ比のイオン輸送に関して、壁／溶質静電効果に起因する横方向エレクトロマイグレーション（ＴＥＭ）による電荷依存性イオン速度等の、異常な輸送挙動が観察され（ペンナトゥール及びサンティアゴ（Pennathur & Santiago）著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７７巻、ｐｐ．６７８２‐６７８９、２００５年；ペンナトゥール及びサンティアゴ（Pennathur & Santiago）著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７７巻、ｐｐ．６７７２‐６７８１、２００５年；及びスアン及びリー（Xuan & Li）著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２７巻、ｐｐ．５０２０‐５０３１、２００６年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））；イオン最大解像度は、カラム直径がλＤの１〜１０倍である場合に発生する（スアン，Ｘ．（Xuan, X.）、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２９巻、ｐｐ．３７３７‐３７４３、２００８年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。ペンナトゥール（Pennathur）及びサンティアゴ（Santiago）は、ナノチャネル内での動電学的分離が、イオン価ζ（ゼータポテンシャル）、イオン移動性、及びλＤに依存すると判断した（ペンナトゥール及びサンティアゴ（Pennathur & Santiago）著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７７巻、ｐｐ．６７８２‐６７８９、２００５年；及びペンナトゥール及びサンティアゴ（Pennathur & Santiago）著、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、７７巻、ｐｐ．６７７２‐６７８１、２００５年（これらの文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。例えばガルシア（Garcia）らは、３５〜２００ｎｍの範囲の様々な幅のナノチャネル内での、蛍光染料アレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８（負電荷）及びロダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）Ｂ（中性）の動電学的分離を例示している（ガルシア（Garcia）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、５巻、ｐｐ．１２７１‐１２７６、２００５年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。上記蛍光染料の移動性は、それらの電荷、及びチャネル壁との１つ又は複数の相互作用に基づいていた。従って、ナノスケール電気泳動から生成される独特な効果を用いて、従来のマイクロスケール分離を用いた場合に不可能である電気泳動分離を実施できる。
【０１７９】
ドラッグタグを用いれば、ナノスケール電気泳動を用いて、オリゴヌクレオチド産物間の移動性の差を増強することもできる（１７５、１７６）。この場合、自由溶液中での移動性は、ＤＮＡ分子の長さにかかわらず一定の値を有する。しかしながら、ドラッグタグをＤＮＡ分子に付着させると、ドラッグタグはその自由な排出挙動を緩和し、上記ＤＮＡに、そのサイズに応じた速度で自由溶液中を移動させる（長いＤＮＡは短いＤＮＡより速く移動する）。独自の配列の反復アミノ酸単位で構成されたペプチド及び／若しくはタンパク質（アルブレヒト（Albrecht）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、３４巻、ｐｐ．５９０‐５９７、２０１３年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））、又は更にストレプトアビジン（ヘラー（Heller）ら著、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＡ（J. Chromatog. A）、８０６巻、ｐｐ．１１３‐１２１、１９９８年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））といった、多様な異なるドラッグタグを使用できる。上記ドラッグタグは、ＬＤＲプライマのうちの１つに共有結合で係留できる。移動性の差を増大させることによって解像度を増強するために、ドラッグタグを、各プライマの末端にも付着させることができる（ミーガー（Meagher）ら著、エレクトロフォレシス（Electrophoresis）、２７巻、ｐｐ．１７０２‐１７１２、２００６年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。
【０１８０】
実施例３‐インピーダンスモジュールを用いた単一細胞係数及び生存性評価
上述のように、インピーダンスモジュール（センサモジュールとも呼ばれる）を用いて、単一細胞をカウントし、また細胞の生存性及び細胞サイズを決定する。図４２は、本明細書に記載の３層インピーダンスモジュール（図２３Ａ〜２３Ｂに示す）を用いた、乳癌細胞（ＭＣＦ‐７）の単一細胞インピーダンス測定を示す。ＭＣＦ‐７細胞を、入力ポートを介してインピーダンスモジュールのマイクロチャネルに導入し、上記マイクロチャネルの対向する側部と交差する１対の電極を上記ＭＣＦ‐７細胞が別個に通過する際に測定した。図４２のグラフ中の各ピークは、１つの単一細胞からのシグニチャを表し、振幅は上記細胞のサイズに関連する。上記インピーダンス測定は、４０ｋＨｚで実施した。
【０１８１】
コムソル（ＣＯＭＳＯＬ）（登録商標）ソフトウェアを用いて生成したシミュレーションを用いて、上記インピーダンスモジュール内の電極サイズの効果を、粒子直径の関数として決定することにより、粒子サイズによる信号振幅の相対差は電極サイズによって大きく影響されないものの、信号対ノイズ比は影響されることを示した。より小さい電極は、より大きい電極に比べて、良好な信号対ノイズ比を提供した。図４３は、異なるサイズ（即ち２０、２５及び７５μｍ）の電極に関する、異なる直径の細胞のインピーダンス応答を示すシミュレーションデータのグラフである。７５μｍ幅の電極ペアに関する、３つの異なる平均サイズ（即ち８、１２及び１６μｍ）の細胞に関するインピーダンスピーク振幅の実験データも示されている。
【０１８２】
本明細書に記載の３層インピーダンスモジュールにとって独特なのは、細胞の生存性を決定する能力である。インピーダンスセンサによって測定される信号は、上記電極間の媒体の抵抗に比例し、またこれを用いて、細胞の生存性を決定できる。上記電極間に細胞が存在しない場合、上記信号はバッファ溶液の抵抗に比例し、これは測定のためのベースラインを画定する。上記電極間を通過する全ての細胞は、少量のバッファ溶液を置換する。無傷の細胞は、高い細胞膜のキャパシタンスにより、電極間に印加される電気信号（４０ｋＨｚ）の周波数において非導電性であると考えられる。従って、細胞によって置換された少量の溶液は、対応する体積のバッファ単独よりも高い抵抗を有する。これにより、インピーダンスセンサによって測定される全体の抵抗が上昇し、これは、図４４Ａに実証されているように、通過する細胞に関して記録される正のピークとして現れる。細胞膜が損傷すると、細胞の抵抗は、主に細胞質成分で構成される細胞内部の抵抗に近似され得る。細胞の細胞質の抵抗が、対応する体積のバッファ溶液の抵抗より小さい場合、センサによって測定される全体の抵抗は降下し、これは負のピークをもたらす（図４４Ｂ）。
【０１８３】
上記インピーダンスモジュールの、生存細胞と非生存細胞とを区別する機能性を実証するために、生存Ｈｓ５７８Ｔ細胞及び穏やかに透過処理した固定Ｈｓ５７８Ｔ細胞を、インピーダンスセンサ中に導入された１×ＴＧバッファ中に再懸濁した。図４４Ｃ及び４４Ｄは、生存細胞及び固定細胞それぞれに関するトレースを示す。生存細胞懸濁液に関しては、無傷の膜に対応する正のピークのみが観察された。固定され、僅かに透過処理された細胞に関しては、正及び負のピークが観察された。明らかに、損傷した膜を有する（即ち透過処理された）細胞は、細胞内部の電気的感知を提供しており、従って、電極ペア間の溶液体積に関して、細胞不在時よりも低い抵抗又はインピーダンスを生成し、キャリア電解質に関するトレースにおいて負極性ピークを生成している。これらの結論は、ホルムアルデヒドのみで処置した細胞が主として正のピーク（細胞膜の架橋）を生成する一方で、固定後にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ‐１００による長時間のインキュベーションに供した細胞は負のピーク（損傷細胞膜）しか示さなかったことを示す、他の実験によっても支持される。
【０１８４】
実施例４‐ｕＭＰＳでのエキソソーム抽出
計算流体力学シミュレーション実験を実行して、固相抽出ベッドを通る血漿流を、エキソソームの単離に関して調査した。これらのシミュレーションのＳＰＥベッドは、側部長１５μｍで間隔が５μｍのダイヤモンドマイクロ支柱からなる（図４５Ａ参照）。上記マイクロ支柱の隅部付近の領域を除いて、ＳＰＥベッドにおける流体動態は、ポアズイユ流に典型的な簡略化された放物線速度プロファイルを用いて近似でき、これにより、移動する流体中のエキソソームの動態をシミュレートするための計算コストが大幅に削減される。ここで、有効マイクロチャネル幅は、マイクロ支柱の間隔及びチャネルの長さによって、ＳＰＥベッドの端から端までの長さとして与えられ、続いてこれを、支柱の周囲に亘る距離を調整する経路補正係数によって増幅する。モンテカルロシミュレーションに使用されるエキソソームの物理的特性を、以下の表１にまとめる。
【０１８５】
続いてモンテカルロ法によって、エキソソームの対流移動及び拡散移動の両方をシミュレートする。エキソソームの位置は、増分時間ステップ（Δｔ）に亘って伝播される。エキソソームの位置はまず、ポアズイユ流プロファイルを用いて対流移動し、エキソソームの軸方向及び長手方向位置は拡散性動態によって乱され、上記動態は、エキソソームの位置に関して正規分布する擬似乱数生成器によって近似され、σは以下の式：
【数４】
2018514225.tif 000006
によって与えられ、ここでＤはエキソソームの拡散係数である（図４５Ｂ参照）。
【０１８６】
マイクロ支柱表面との遭遇はそれぞれ、上記エキソソームの膜に見られる抗原に関連する抗体で装飾された上記表面に対する上記エキソソームの良好なＳＰＥをもたらす場合ももたらさない場合もあり、これらの反応動態を、均一な分布を有する擬似乱数生成器を用いて、チャン・ハマー動態に従って抗体／抗原の関連の蓋然性を比較することによって評価する。なお、上記シミュレーションは、シミュレートされたエキソソーム軌道の数及び時間の離散化に関して、結果の回収が収束するまで繰り返される。更に全てのシミュレーションに関して、４１個の異なる軸方向開始位置からの回収を平均して、初めは均質であるエキソソーム溶液を表す。
【０１８７】
【表１】
2018514225.tif 000007
【０１８８】
図４６は、シミュレーション実験における、速度及び抽出ベッドの長さの、エキソソーム回収に対する影響を示すグラフである。各支柱間隔及びベッド長さに関して、速度を変化させて回収を評価した。ここで使用したベッド長さは、２．５ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、２５ｍｍ及び５０ｍｍであった。上記支柱は、１５μｍのサイズであり、間隔は５μｍであった。図４６に示すように、エキソソーム回収は、より長い抽出ベッドによって、より低い速度において、最大化された。
【０１８９】
図４７は、上記モンテカルロ／チャン・ハマーシミュレーションによってエキソソーム回収が９５％であると予測される条件に関する、３Ｄ等値面及びその下にある等高線プロットである。なお、ＳＰＥベッド長さは、このグラフに関しては５０ｍｍで一定に維持されている。スループットは、このシミュレーションによって出力された速度から導出される。ＳＰＥデバイス中の気泡の蓋然性を低減する長手方向圧力を提供するために、ベッド幅は２ｍｍまでに制限され、これは、支柱の数、及びスループットに影響を及ぼす支柱間の開放導管の数に影響した。高い回収、及びＳＰＥベッドあたり１．４μＬ／分の最大スループットを提供する、以下の２つの条件が挙げられる：支柱寸法１０μｍ×５μｍ×２０μｍ及び２５μｍ×１０μｍ×１００μｍ（側部長×間隔×高さ）。また、大きな支柱寸法は、血漿注入のために必要な圧力が１桁以上低くなり、これにより、（直交マーカーを用いてエキソソームを抽出するために）複数のＳＰＥベッドを直列接続でより簡単に組み込むことができるようになり、またＳＰＥシステムを、同一の血液試料に対して更なるアッセイを実施できる、より複雑な統合型マイクロ流体に組み込むことができるようになる。
【０１９０】
実施例５‐ｕＭＰＳの固相抽出器モジュールによる核酸抽出
プラスチックの射出成形を用いて、固相抽出器（ＳＰＥ）ユニットを製作した。このユニットは、入力から出力へのサイズの傾斜を有する複数のマイクロ支柱のベッドで構成され、これにより、粒子がＳＰＥベッドに入るのをある程度フィルタリングできる。図４８のグラフは、ＤＮＡ／ＲＮＡの回収が、同様の間隔では支柱の直径に大きく依存することを示している。例えば１０μｍ間隔の１０μｍの支柱を使用すると、＞８０％のＤＮＡ回収を提供できる。以下の表２は、支柱サイズ及び間隔の、ベッド容積及びゲノムＤＮＡ積載分に対する影響を示す。１０μｍの支柱サイズ及び１０μｍの間隔に関して、単一のＳＰＥベッドは、１２０ｎＬの容積で１９０ｎｇのゲノムＤＮＡを収容できる。
【０１９１】
【表２】
2018514225.tif 000008
【０１９２】
ＵＶ活性化したポリカーボネートＳＰＥベッドを用いて、ｃｆＤＮＡと同様のサイズの短鎖ＤＮＡを単離でき、単離の効率は、不動化バッファの組成に左右され、上記不動化バッファは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びエタノール（ＥｔＯＨ）からなる。図４９に示されているように、ＤＮＡの最大の回収は、７％のＰＥＧ、０．９ｍＭのＮａＣｌ及び４３％のＥｔＯＨという不動化バッファ組成に対して発生する。ＳＰＥモジュールはまた、ｃｆＤＮＡを予備濃縮するためにも同様に使用できる。ＤＮＡを、初期の開始体積である１ｍＬの血漿から、最終体積である１０μＬまで富化できる（１０２の富化係数）。
【０１９３】
実施例６‐拡散精製モジュールによる標的核酸分子の精製
ｕＭＰＳデバイスの拡散流れ精製モジュールは、上記デバイスの他の上流のユニットで生成された上記標的核酸分子を、過剰なｄＮＴＰ及び／又は他の非標的核酸ヌクレオチド成分から精製するよう設計される。図５０は、ｃｆＤＮＡと関連する塩基の数が異なるＤＮＡの、シミュレーションした変位を示す。このグラフに関するデータは、二本鎖ＤＮＡ及びｄＮＴＰ拡散係数を用いた計算に基づくものである。ｃｆＤＮＡからｄＮＴＰの大半を除去するために必要なアレイの長さ（解像度はＮ１／２（Ｎは障害物の数である）に比例し；側方変位はＮに比例する）を、ｄＮＴＰと、二本鎖無細胞ＤＮＡ分子の長さとの間の拡散係数の差を考慮することによって決定する。図５０から分かるように、障害物の数が増加すると、無細胞ＤＮＡ分子とｄＮＴＰとの間の分離距離は線形増加する。例えば４０００個の障害物を含むアレイは、〜３，７５０μｍの、上記アレイを通って移動した後のｄＮＴＰとｃｆＤＮＡとの間の分離距離を生成する。また図５０には、流量が高くなると、障害物による無細胞ＤＮＡの移動のシフトが小さくなることも示している。最後に図５０は、主に、より大きなＤＮＡ分子に関して拡散係数はより小さくなるという事実によって、上記ＤＮＡ分子の長さが長くなると、無細胞ＤＮＡ分子に関するシフト距離が有意に小さくなることを示している。＞１００個の塩基を含有するＤＮＡ分子に関しては、流量にかかわらず、運動のシフトは観察されない。
【０１９４】
実施例７‐ｕＭＰＳを構築するための、流体マザーボードへのモジュールの組み付け
ｕＭＰＳ上のバルブは、カバープレート、流体層及び背面カバープレートの３層構造を必要とする。バルブ台座及びバルブ膜は、上記バルブを作動させるための機械的ソレノイドと共に、ｕＭＰＳのための流体マザーボードの背面上にあるように構成される。従って、これらの熱可塑性バルブを製造するための独自の戦略が採用され、これは、比較的高速での良好なバルブの製造を提供するだけでなく、組み立てのための熱処理を必要としないものであった（ジャクソン（Jackson）ら著、ラボ・オン・ア・チップ（Lab Chip.）、１４巻、ｐｐ．１０６‐１１７、２０１４年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。圧力感受性接着材でコーティングされた積層体を上記膜として使用することにより、熱接着が不要となる。好ましい引張強度（２５〜４０ｍＰａ）、高い破壊伸び率（１５０〜３００％）、〜１００μｍの厚さを有し、かつシリコーンアクリレート圧力感受性接着材（５０μｍ厚）でコーティングされた、ポリオレフィン積層体を利用した。試験デバイスは、上述の積層体を熱可塑性マイクロチャネルに加圧封着することによって構築した。ＵＶ／Ｏ３処理によって上記接着材を「不活性化（ｄｅａｃｔｉｖａｔｅ）」できることが分かった：上記バルブ台座上に直接配置された上記積層体を不活性化することによって、上記膜が上記バルブ台座にくっ付くのを防止できる。この積層体は、＞６００ｋＰａの圧力に、破断することなく耐えることができ（図５１）、これはｕＭＰＳによって実行される処理ステップには十分である。
【０１９５】
ガスケットレスシール：大半のマイクロ流体相互接続は、接続される流体ポートとデバイスとの間の直接的な物理的接触によるものである。各接触は、組立体に対する受動的な動力学的制約として作用する。注意しなければ、他の組立体の特徴と併せた２つ以上の相互接続により、過剰に制約を受けたシステム、及び予測できない死容積が発生することになる。
【０１９６】
対面する表面間のマイクロスケールの空隙を有するマイクロ流体ポートに関して、ヤング‐ラプラス方程式によって定義されるような毛細管力は、上記対面する表面間のいずれの直接的な物理的接触なしに、漏れに耐え、ガスケットレスシールを形成しなければならない（図３３Ｂ参照）（ブラウン（Brown）ら著、ＩＭＥＣＥ  ２０１２、２０１２年１１月９日〜１５日、米国機械学会（ＡＳＭＥ）（テキサス州ヒューストン）、ｐｐ．ＩＭＥＣＥ２０１２‐８９６３４、２０１２年（本文献は参照によりその全体が本出願に援用される））。このコンセプトを試験し、そして、上記対面する表面が超疎水性であり（水接触角＞１３０°）、上記毛細管力が、典型的なマイクロ流体チャネルにおける圧力降下に耐えるのに十分なものであることが分かった。試験パーツを、顕微鏡による観察を可能とする縁部付近のマイクロ流体貫通孔と、噛合パーツの相対的なオフセットを測定するための整列基準と、ボール軸受台座として機能するＶ字型溝とを有する、環状オレフィンコポリマー部品を、両側射出成形することによって、製造した（図２８Ｂ参照）。異なる直径の精密セラミックボール軸受を動力学的制約として用いて、異なる間隙を生成した。上記貫通孔の周りの上記ポリマー表面を、市販のコーティングを用いてスピンコートすることにより、超疎水性表面を生成した（図５２参照）。図５３は、上記シールが耐えられる測定された最大圧力が、ヤング‐ラプラス方程式を用いて推定したものと一致したことを示すグラフである。
【０１９７】
本発明について、例示を目的として詳細に説明したが、このような詳細は上記目的のためだけのものであり、当業者は、以下の請求項によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明において変形を行うことができることが理解される。
【符号の説明】
【０１９８】
１      生体分子プロセッサ
２      バイオリアクタチャンバ
４      固体支持構造体
６      ナノチューブ
８      ナノ細孔
１０    通路、ナノチューブ通路
１２    入力端部
１４    出力端部
１６    流体入力ポート、流体入力
１８    供給側チャネル
２０    バッフル
２２    セパレータ
２４    マイクロ流体ネットワーク
２６    マイクロスケールリザーバ
２８    生体分子
３０    ナノセンサチャンバ
３２    固体基板
３４    固体基板表面
３６    電極
３８    トップカバー
５０  ナノセンサモジュール、ナノセンサユニット、ナノセンサ
５２  プリント回路基板、ＰＣＢ
５４、５６  金接点、金パッド
５８  エラストマ性コネクタ
１００  ｕＭＰＳ、ｕＭＰＳデバイス
１０２  流体マザーボード
１０４  試料  入力ポート
１０６  洗浄剤リザーバ
１０８〜１１４、１１８、１２０、１２４〜１３０  試薬リザーバ
１１６  空気リザーバ
１２２  廃棄物リザーバ
１３２  バルブ
１３４  マイクロ流体ネットワーク
１３６  小型蛇行マイクロ流体ネットワーク
１５０  細胞選択モジュール、細胞単離モジュール、細胞単離ユニット
１５２  入力ポート
１５４  捕集ベッド
１５６  出力ポート
１６０  平行チャネル
１６２  チャネル壁
２００  血漿単離ユニット
２０２  入力ポート
２０４  一次先細単離チャネル（即ち投入通路）
２０６  移行部チャネル
２０８  二次単離チャネル（即ち排出通路）
２１０  一次側部チャネル
２１２  一次セパレータ
２１６  一次レシーバポート
２１８  二次側部チャネル
２２０  二次セパレータ
２２４  廃棄物ポート、廃棄物出口
２２６  二次レシーバポート
２２８  一次チャネル側部ポート
２３０  二次チャネル側部ポート
２３２  カバープレート
２５０、３００  固相抽出モジュール、抽出器ユニット、ＳＰＥモジュール
２５２  入力チャネル
２５４  一連の平行チャネル、抽出ベッド供給側チャネル
２５６  抽出ベッド
２５８  固体支持体
２６０  抽出ベッド流出チャネル、出力チャネル
２６２  ＳＰＥモジュール出力チャネル
３５０  インピーダンスユニット、インピーダンスモジュール、センサモジュール
３５２  入口ポート、入力ポート
３５４  マイクロ流体チャネル
３５６  マイクロ電極、上部電極
３５８  出口ポート
３６０  マイクロ電極、底部電極
３６２  接触パッド
３６４  第１の層、上部層
３６６  中間層
３６８  第２の層
４００  固相抽出モジュール、セパレータユニット
４０２  入力ポート
４０４  ベッド供給側チャネル
４０６  固相抽出ベッド
４０８  固体支持体
４１０  抽出ベッド出力チャネル
４１２  出力ポート
４５０、５００  リアクタユニット
５５０  流れ精製ユニット、拡散型流れ精製ユニット
５５２  試料入力チャネル
５５４  バッファ入力チャネル
５５６  流れ精製ベッド
５５８  障害物
５６０、５６２  チャネル
６００  血漿単離モジュール
６０２  入力ポート
６０４  供給側チャネル
６０６  単離チャネル
６０８  血液細胞トラップ
６１０  流出チャネル
６１２  出力ポート
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2018514225.tif 000073
【図５１】
2018514225.tif 000074
【図５２】
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【図５３】
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【国際調査報告】
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