(57)【要約】  対象に、治療上有効量の、パルボシクリブとＲＡＤ１９０１との組み合わせを投与することによって、対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法が、本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物耐性エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法であって、前記対象に、治療上有効量の、パルボシクリブと構造：
【化１】
2018518529.tif 000018
を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物との組み合わせを投与することを含む、方法。
【請求項２】
変異体エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法であって、前記対象に、治療上有効量の、パルボシクリブと構造：
【化２】
2018518529.tif 000019
を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物との組み合わせを投与することを含む、方法。
【請求項３】
前記癌が、乳癌、子宮癌、卵巣癌、及び下垂体癌からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、転移性癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が、Ｙ５３７Ｘ1、Ｌ５３６Ｘ2、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の変異を含む変異体エストロゲン受容体アルファに対して陽性であり、式中、
Ｘ1が、Ｓ、Ｎ、またはＣ、Ｄ５３８Ｇであり、Ｘ2がＲまたはＱである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記変異が、Ｙ５３７Ｓである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
投与後の前記腫瘍中のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物の濃度の、血漿中のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物の濃度に対する比（Ｔ／Ｐ）が、少なくとも約１５である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、骨粗鬆症または骨粗鬆症のより高いリスクを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、閉経前の女性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、ＳＥＲＭ及び／またはＡＩによるこれまでの治療後に、再発または進行している閉経後の女性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療上有効量が、１日１回約１５０〜約１，５００ｍｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記その塩が、ＲＡＤ１９０１二塩酸塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される薬物に耐性を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗エストロゲンが、タモキシフェンまたはフルベストラントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アロマターゼ阻害剤が、アロマシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療上有効量が、１５０ｍｇ〜２，０００ｍｇである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療上有効量が、２００ｍｇ、４００ｍｇ、または５００ｍｇである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
パルボシクリブ及びＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
薬物耐性エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において乳癌を治療する方法であって、前記対象に、治療上有効量の、ｃｄｋ４／６阻害剤と構造：
【化３】
2018518529.tif 000020
を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物との組み合わせを投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記薬物耐性乳癌が、１つ以上の抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤療法に対して耐性を示す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の抗エストロゲンが、タモキシフェン、トレミフェン、及びフルベストラントからなる群から選択され、前記１つ以上のアロマターゼ阻害剤が、アロマシン、レトロゾール、及びアナストロゾールからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記女性が、Ｄ５３８Ｇ、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、Ｙ５３７Ｃ、Ｅ３８０Ｑ、Ｓ４６３Ｐ、Ｌ５３６Ｒ、Ｌ５３６Ｑ、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ３９２Ｉ、及びＶ５３４Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの変異体エストロゲン受容体アルファを発現する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異体エストロゲン受容体アルファが、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、Ｙ５３７Ｃ、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｒ、Ｓ４６３Ｐ、及びＥ３８０Ｑからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体受容体アルファが、Ｙ５３７Ｓである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＡＤ１９０１が、１００ｍｇ〜１，５００ｍｇの合計１日投与量で投与される、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＡＤ１９０１が、１００ｍｇ〜１，０００ｍｇの合計１日投与量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＡＤ１９０１が、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、または１，０００ｍｇの合計１日投与量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１日投与量が、２回分の別々の用量で送達される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記別々の用量が、等しい用量である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記等しい用量がそれぞれ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、または５００ｍｇである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与量が、経口経路によって送達される、請求項２５〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記女性が、閉経後の女性である、請求項１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記女性が、まず、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＳＸＬ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＡ、ＢＡＰ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＲ２、ＤＮＭＴ３Ａ、Ｅ２Ｆ３、ＥＧＦＲ、ＥＭＬ４、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＷＳＲ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＦＲＳ２、ＨＩＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＯＳ１、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＸ２、ＳＴＫ１１、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、及びＶＨＬから選択される１つ以上の遺伝子の発現の増加における測定を介して治療のために特定される、請求項１９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の遺伝子が、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、及びＭＴＯＲから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｃｄｋ４／ｃｄｋ６阻害剤が、アベマシクリブ、リボシクリブ、及びパルボシクリブからなる群から選択される、請求項１９〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ｃｄｋ４／６阻害剤が、パルボシクリブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記パルボシクリブが、２５ｍｇ〜２５０ｍｇの１日用量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記パルボシクリブが、５０〜１２５ｍｇの１日用量で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記パルボシクリブが、７５ｍｇ〜１２５ｍｇの１日用量で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記パルボシクリブが、７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇで毎日投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記パルボシクリブが、３１．２５ｍｇ〜９３．７５ｍｇの１日用量で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記パルボシクリブが、２８日周期で２１日間投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記パルボシクリブが、２８日周期で２１日未満投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記パルボシクリブが、２８日周期で７日〜２０日投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記パルボシクリブが、２８日周期のうち７日または１４日投与される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記パルボシクリブが、２８日周期で２，６２５ｍｇの総量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記パルボシクリブが、２８日周期で６５６．２５ｍｇ〜１，９６８．７５ｍｇの総量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｃｄｋ４／６阻害剤が、リボシクリブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記リボシクリブが、２００ｍｇ〜１，０００ｍｇの１日用量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記リボシクリブが、２５０〜７５０ｍｇの１日用量で投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記リボシクリブが、６００ｍｇの１日用量で投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記リボシクリブが、１５０ｍｇ〜４５０ｍｇの１日用量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記リボシクリブが、２８日周期で２１日間投与される、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記リボシクリブが、２８日周期で２１日未満投与される、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記リボシクリブが、２８日周期で７日〜２０日投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記リボシクリブが、２８日周期のうち７日または１４日投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記リボシクリブが、２８日周期で１２，６００ｍｇの総量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記リボシクリブが、２８日周期で３，１５０ｍｇ〜９，４５０ｍｇの総量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記リボシクリブまたは前記パルボシクリブが、経口投与される、請求項３５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記リボシクリブ及び前記パルボシクリブが、１日１回経口投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｃｄｋ４／６阻害剤が、アベマシクリブである、請求項３４に記載の方法。
【請求項６２】
前記アベマシクリブが、３００ｍｇの１日用量で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アベマシクリブが、１５０ｍｇの１日用量で１日２回投与される、請求項６１に記載の方法
【請求項６４】
前記アベマシクリブが、２８日周期で２８日間投与される、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記アベマシクリブが、２８日周期で２８日未満投与される、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アベマシクリブが、２８日周期で２１日〜２７日投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記アベマシクリブが、２８日周期のうち７日または１４または２１日投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記アベマシクリブが、２８日周期で８，４００ｍｇの総量で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
前記アベマシクリブが、２８日周期で２，１００ｍｇ〜６，３００ｍｇの総量で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】
前記アベマシクリブが、経口投与される、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１５４，６９９号、２０１５年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／１５５，４５１号、２０１５年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５２，０８５号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，６９６号、２０１５年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１５８，４６９号、２０１５年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２５２，９１６号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，７７４号、２０１５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１９２，９４０号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，６５８号、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，５７２号、２０１５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１９２，９４４号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，６６３号、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，５７６号の利益を主張するものであり、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、３つの受容体：エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びヒト上皮成長因子受容体−２（Ｈｅｒ２）の発現に基づいて３つのサブタイプに分類される。ＥＲの過剰発現は、多くの乳癌患者において見出される。ＥＲ陽性（ＥＲ＋）の乳癌は、すべての乳癌の３分の２を含む。エストロゲン及びＥＲは、例えば、乳癌以外の卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、及び子宮内膜癌と関連している。
【０００３】
ＥＲは、エストロゲンによって活性化し、ＤＮＡに結合する細胞核へ移行し、それにより、様々な遺伝子の活性を調節することができる。例えば、Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，”  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７（８）：４９７−５０８（２００６）、及びＨｅｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｈｏｗ  Ｄｏ  Ｔｈｅｙ  Ｓｉｇｎａｌ  ａｎｄ  Ｗｈａｔ  Ａｒｅ  Ｔｈｅｉｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８７（３）：９０５−９３１（２００７）を参照されたい。
【０００４】
エストロゲン産生を阻害する薬剤、例えば、アロマターゼ阻害剤（ＡＩ、例えば、レトロゾール、アナストロゾール、及びアロマシン）、またはＥＲ活性を直接遮断するもの、例えば、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、及びＥＭ−６５２（ＳＣＨ  ５７０６８））ならびに選択的エストロゲン受容体ディグレーダー（ＳＥＲＤ、例えば、フルベストラント、ＴＡＳ−１０８（ＳＲ１６２３４）、ＺＫ１９１７０３、ＲＵ５８６６８、ＧＤＣ−０８１０（ＡＲＮ−８１０）、ＧＷ５６３８／ＤＰＣ９７４、ＳＲＮ−９２７、ＩＣＩ１８２７８２、及びＡＺＤ９４９６）は、すでに使用されているか、またはＥＲ陽性乳癌の治療において開発されている。
【０００５】
ＳＥＲＭ（例えばタモキシフェン）及びＡＩは、ＥＲ陽性乳癌のための第１選択のアジュバント全身療法としてよく使用されている。タモキシフェンは、ＥＲ陽性乳癌に一般に使用されている。ＡＩは、体内でアンドロゲンをエストロゲンに変える、アロマターゼの活性を遮断することによって末梢組織中のエストロゲン産生を抑える。しかしながら、ＡＩは、卵巣がエストロゲンを生成するのを止めることができず、そのため、ＡＩは、主に、閉経後の女性を治療するために使用される。さらに、ＡＩは、重篤な副作用が少なく、タモキシフェンよりもさらに有効であるため、ＡＩは、閉経前の女性を治療するために使用され、卵巣機能を抑えることもできる。例えば、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３７２：４３６−４４６（２０１５）を参照されたい。
【０００６】
これらの薬剤による初期治療が成功し得るが、多くの患者は、最終的には、薬物耐性乳癌を再発する。ＥＲに影響を及ぼす変異は、この抵抗性の発症のためにある潜在的機序として現れる。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＥＳＲ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，”  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５：１４４６−５１（２０１３）を参照されたい。ＥＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）における変異は、内分泌療法のうちの少なくとも１つの方針を受けている患者からの２１％の転移性ＥＲ陽性乳癌試料に見出される。Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，“ＥＳＲ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ−ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，”  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：５７３−８３（２０１５）。
【０００７】
フルベストラントは、現在、抗エストロゲン療法後の疾患の進行があるＥＲ陽性転移性乳癌の治療に承認されている唯一のＳＥＲＤである。その臨床的有効性にもかかわらず、フルベストラントの効用は、単回投与において投与され得る薬物の量によって、バイオアベイラビリティの低下によって制限されている。１８Ｆ−フルオロエストラジオール陽電子放出断層撮影法（ＦＥＳ−ＰＥＴ）を用いた画像研究は、５００ｍｇの用量レベルでさえ、患者の中には、完全なＥＲの阻害を有さない場合があり、不十分な投与は、治療不全の理由であり得ることを示唆している。
【０００８】
エストロゲン標的療法に関連する別の課題は、子宮、骨、及びその他の組織への望ましくない効果を有し得ることである。ＥＲは、多種多様な組織及び細胞型にエストロゲン応答性遺伝子の転写を指示する。これらの効果は、特に、エストロゲン及びその他の卵巣ホルモンの内因性レベルが、更年期中に減退する場合に、顕著であり得る。例えば、タモキシフェンは、子宮内膜における部分アゴニストとして作用するため、閉経前の女性における骨粗しょうを引き起こし、子宮内膜癌のリスクを増大させ得る。閉経後の女性では、ＡＩは、タモキシフェンよりもさらに骨喪失及び骨折を引き起こし得る。フルベストラントで治療された患者はまた、作用機序により、骨粗鬆症のリスクにさらされ得る。
【０００９】
サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）等の細胞周期調節因子は、ＥＲの発現への効果を有することが報告されている。Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｎｄ  ＣＤＫ４／６  ｈａｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １２（１５）：２３８４−２３９４（２０１３）。選択的ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、使用可能な腫瘍型を有し、ＣＤＫ４／６は、標的となるＧ１期からＳ期への細胞周期移行において、正常細胞に対して改善された有効性があり、副作用のより少ない、極めて重要な役割を有する。Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＣＤＫ４／６  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１６）、これは、２０１６年３月３１日にオンラインで発行されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖａｏｐ／ｎｃｕｒｒｅｎｔ／ｆｕｌｌ／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１６．２６．ｈｔｍｌ）。選択的なＣＤＫ４／６阻害剤は、ＥＲ陽性乳癌に罹患している患者において内分泌療法と併用して試験した場合に、最良の応答性を示した。
【００１０】
アロマターゼ阻害剤レトロゾール（ＰＡＬｏＭＡ−１／ＴＲＩＯ  １８研究）と組み合わせたパルボシクリブは、閉経後の女性における初期内分泌系療法として、２０１５年２月に、ホルモン受容体（ＨＲ）−陽性（ＨＲ＋）、ＨＥＲ２−陰性（ＨＥＲ２−）進行性乳癌の治療に承認された。２０１６年２月には、ＳＥＲＤフルベストラント（ＰＡＬＯＭＡ−３研究）と組み合わせたパルボシクリブが、これまでの内分泌療法では進行していたＥＲ＋、ＨＥＲ２進行性または転移性乳癌患者の治療に承認された。ＦＤＡは、第１相試験（ＪＰＢＡ試験）からのデータに基づいて、難治性ＨＲ陽性進行性乳癌に罹患している高度に前治療された患者に対する単剤療法として、ＣＤＫ４／６阻害剤アベマシクリブ（ＬＹ２８３５２１９）に、画期的な療法の称号を付与した。内分泌療法（例えばＡＩ、ＳＥＲＭ、及びＳＥＲＤ）との選択的ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）のさらなる組み合わせは、現在、開発中である。
【００１１】
しかしながら、ＣＤＫ４／６阻害剤は、間欠治療（Ｏ’Ｌｅａｒｙ）を必要とし得る毒性を示している。さらに、進行段階の及び／または前治療への耐性がある癌と闘うために、ＣＤＫ４／６阻害剤と混合することによってさらなる利点を提供しながら、現行の内分泌療法と関連した課題を克服し得る、より永続的かつ有効なＥＲ標的療法が依然として必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＥＳＲ１状態及び前内分泌療法にもかかわらず、様々な患者由来の異種移植片（ＰＤｘ）モデルにおけるＲＡＤ１９０１の単剤治療と比較して、改善した腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示した。ＲＡＤ１９０１単独でまたはパルボシクリブと組み合わせて治療したＰＤｘモデルにおけるＴＧＩの割合を示す。
【図２】ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせは、野生型（ＷＴ）のＥＲα  ＭＣＦ−７異種移植片モデル（ＰＲ＋、ＨＥＲ２−）における腫瘍成長阻害及び退行を示した。（Ａ）：ビヒクル対照、パルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせ、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルの腫瘍成長；一元配置分散分析、「ｎｓ」は、有意差なし、＊ｐ値＜０．０５、及び＊＊＊ｐ値＜０．００１；（Ｂ）：ビヒクル対照、パルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせ、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルのベースラインから研究終了までの個々の腫瘍サイズの変化；（Ｃ）：ビヒクル対照、パルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）及びパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ＲＡＤ１９０１（３０もしくは６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の組み合わせ、ならびにＲＡＤ１９０１（３０もしくは６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルの腫瘍成長。
【図３】ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせは、ＷＴ  ＥＲα  ＰＤｘ−１１モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤、フルベストラント、及び化学療法で以前に治療した）における腫瘍成長阻害及び退行を示した。（Ａ）：ビヒクル対照、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、パルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−１１モデルの腫瘍成長；（Ｂ）：ビヒクル対照、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−１１モデルにおけるベースラインから研究終了までの個々の腫瘍サイズの変化。ｎ＝８〜１０／群。
【図４】ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせは、ＷＴ  ＥＲ＋ＰＤｘ−２モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、治療ナイーブ）における腫瘍成長の阻害を示した。（Ａ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）との組み合わせで治療したＰＤｘ−２モデルの腫瘍成長；（Ｂ）：ビヒクル対照、パルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−２モデルの腫瘍成長。ｎ＝８〜１０／群。
【図５】ＲＡＤ１９０１の有効性は、エストラジオール治療は、ＷＴ  ＥＲα  ＰＤｘ−４モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、治療ナイーブ）において継続したが、ＲＡＤ１９０１での治療を終了してから少なくとも２カ月持続した。
【図６】ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせは、変異体（Ｙ５３７Ｓ）ＥＲα  ＰＤｘ−５モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤で以前に治療した）における腫瘍成長の阻害を示した。（Ａ）：ビヒクル対照、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−５モデルの腫瘍成長；（Ｂ）：フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、パルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０、１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせにおけるベースラインから１７日目までの個々の腫瘍サイズの変化、ならびに（Ｃ）パルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ＲＡＤ１９０１（６０，１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせにおけるベースラインから５６日目までの個々の腫瘍サイズの変化。ｎ＝８〜１０／群。
【図７】ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせは、変異体（Ｙ５３７Ｓ）ＥＲαＰＤｘ−５モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤で以前に治療した）における腫瘍成長の阻害を示した。（Ａ）：ビヒクル対照、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−５モデルの腫瘍成長；（Ｂ）：ビヒクル対照、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ＲＡＤ１９０１（１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（１日１回経口投与）、ならびにＲＡＤ１９０１（１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−５モデルの腫瘍成長。
【図８】ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせは、変異体（Ｙ５３７Ｓ）ＥＲα  ＰＤｘ−５モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤で以前に治療した）における腫瘍成長の阻害を示した。ビヒクル対照、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（７５ｍｇ、１日１回経口投与）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）とパルボシクリブ（７５ｍｇ、１日１回経口投与）との組み合わせ、ならびにＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（７５ｍｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療したＰＤｘ−５モデルの腫瘍成長。ｎ＝８〜１０／群。
【図９】ヌードマウスにおけるフルベストラントの薬物動態分析。１ｍｇ／用量（黒ひし形）、３ｍｇ／用量（黒丸）、及び５ｍｇ／用量（黒三角）のフルベストラントの血漿濃度を示す。ヌードマウスに、１日目にフルベストラントを皮下投与し、２回目を８日目に投与した。フルベストラントの血漿濃度を、２回目の投与から１６８時間まで指示された時点でモニタリングした。
【図１０】頭蓋内ＭＣＦ−７腫瘍モデルにおけるマウス生存へのＲＡＤ１９０１及びフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）の効果。
【図１１】２００及び５００ｍｇのＲＡＤ１９０１を１日１回の経口投与で治療を受けた対象の子宮のＦＥＳ−ＰＥＴスキャンの代表的な画像、及びＲＡＤ１９０１治療後のＥＲ関与の変化。（Ａ）：２００ｍｇのＲＡＤ１９０１での治療前（ａ）及び治療後（ｃ）の子宮ＣＴスキャンの横断図ならびにＲＡＤ１９０１での治療前（ｂ）及び治療後（ｄ）の子宮ＦＥＳ−ＰＥＴスキャンの横断図；（Ｂ）：５００ｍｇのＲＡＤ１９０１での治療前（（ａ）上パネル）及び治療後（（ａ）下パネル）の子宮ＣＴスキャンの矢状図、ＲＡＤ１９０１での治療前（（ｂ）上パネル）及び治療後（（ｂ）下パネル）の子宮ＦＥＳ−ＰＥＴスキャンの矢状図、ＲＡＤ１９０１での治療前（（ｃ）上パネル）及び治療後（（ｃ）下パネル）の子宮ＣＴスキャンの横断図、ＲＡＤ１９０１での治療前（（ｄ）上パネル）及び治療後（（ｄ）下パネル）の子宮ＦＥＳ−ＰＥＴスキャンの横断図；（Ｃ）：ベースライン（ＲＡＤ１９０１治療前）と比較した、対象１〜３（２００ｍｇ）及び対象４〜７（５００ｍｇ）のＲＡＤ１９０１での治療後のＥＲ関与の変化率（％）。
【図１２】ＲＡＤ１９０１（５００ｍｇ）での治療前（ベースライン）及びその後（治療後）の子宮（Ａ）及び下垂体（Ｂ）のＦＥＳ−ＰＥＴスキャンの代表的な画像。（ａ）側面断面図、（ｂ）経度断面図、及び（ｃ）経度断面図。
【図１３】ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１、パルボシクリブ、ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせ、フルベストラント、ならびにフルベストラントとパルボシクリブとの組み合わせで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲ及びＥＲ発現。
【図１４】ＲＡＤ１９０１治療は、完全なＥＲの低下をもたらし、インビトロでのＭＣＦ−７細胞株（Ａ）及びＴ４７Ｄ細胞株（Ｂ）におけるＥＲシグナル伝達を阻害した。０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、及び１μＭの様々な濃度で、それぞれ、ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントで治療した両方の細胞株において、ＥＲ発現を示した。試験した３つのＥＲ標的遺伝子：ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、及びＴＦＦ１によって、ＥＲシグナル伝達を示した。
【図１５】ＲＡＤ１９０１での治療は、ＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＥＲ分解及びＥＲシグナル伝達の廃止をもたらした。（Ａ）：最後の投与から２時間または８時間後に、ビヒクル対照、３０及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１、ならびに３ｍｇ／用量のフルベストラントで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲ及びＥＲ発現を示すウェスタンブロット；（Ｂ）：最後の投与から２時間または８時間後に、ビヒクル対照、３０及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１、ならびに３ｍｇ／用量のフルベストラントで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＥＲタンパク質発現；（Ｃ）：最後の投与から８時間後に、ビヒクル対照、３０及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１、ならびに３ｍｇ／用量のフルベストラントで治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲタンパク質発現。
【図１６】ＲＡＤ１９０１での治療は、ＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲの急激な減少をもたらした。（Ａ）：単回投与から８時間または１２時間後に、ビヒクル対照、３０、６０、及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲ発現を示すウェスタンブロット；（Ｂ）：７回目の投与から４時間または２４時間後に、ビヒクル対照、３０、６０、及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で処置したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲ発現を示すウェスタンブロット；（Ｃ）：３０、６０、及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおけるＰＲ発現の用量依存的な減少。
【図１７】ＲＡＤ１９０１での治療は、ＭＣＦ−７異種移植片モデルにおける増殖の急激な減少をもたらした。（Ａ）：単回投与から８時間後及び４回目の投与から２４時間後に、ビヒクル対照及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療し、増殖マーカーＫｉ−６７に対して染色した、ＭＣＦ−７異種移植片モデルから採取した切片腫瘍の代表的な写真；（Ｂ）：単回投与から８時間後及び４回目の投与から２４時間後に、ビヒクル対照及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療したＭＣＦ−７異種移植片モデルにおける増殖マーカーＫｉ−６７の減少を示すヒストグラム。
【図１８】３０、６０、及び１２０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１での治療は、５６日の有効性研究の最終日において４時間のＰＤｘ−４モデルの研究腫瘍の終わりに、フルベストラント（１ｍｇ／動物）よりもさらに著しいＫｉ６７の減少をもたらした。
【図１９】６０及び１２０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１での治療は、ＰＲ発現の減少に伴って、ＰＤｘ−５モデルにおけるインビボでのＥＲのシグナル伝達の低下をもたらした。
【図２０】乳離れしたばかりの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける子宮組織へのＲＡＤ１９０１の効果。（Ａ）：最終投与から２４時間後に殺処分したラットの子宮湿重量；（Ｂ）：子宮の組織切片における上皮重量；（Ｃ）：４００倍率のトルイジンブルーＯ染色した子宮組織の代表的な切片；（Ｄ）：子宮組織から抽出し、１８ＳリボソームＲＮＡハウスキーピング遺伝子と比較して、補体Ｃ３発現のレベルに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した全ＲＮＡ。
【図２１】７日目に２００、５００、７５０、及び１０００ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１を投与した後の血漿薬物動態の結果。
【図２２】３ＥＲＴ（Ｉ）。
【図２３】３ＥＲＴ（ＩＩ）。
【図２４】表１０に要約されたＥＲα  ＬＢＤ−アンタゴニスト複合体の重ね合わせ。
【図２５】（Ａ）ＲＡＤ１９０１−１Ｒ５Ｋ及び（Ｂ）ＧＷ５−１Ｒ５Ｋのモデリング。
【図２６】（Ａ）ＲＡＤ１９０１−１ＳＪ０及び（Ｂ）Ｅ４Ｄ−１ＳＪ０のモデリング。
【図２７】（Ａ）ＲＡＤ１９０１−２ＪＦＡ及び（Ｂ）ＲＡＬ−２ＪＦＡのモデリング。
【図２８】（Ａ）ＲＡＤ１９０１−２ＢＪ４及び（Ｂ）ＯＨＴ−２ＢＪ４のモデリング。
【図２９】（Ａ）ＲＡＤ１９０１−２ＩＯＫ及び（Ｂ）ＩＯＫ−２ＩＯＫのモデリング。
【図３０】１Ｒ５Ｋ及び２ＯＵＺによるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造の重ね合わせ。
【図３１】２ＢＪ４及び２ＪＦＡによるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造の重ね合わせ。
【図３２】２ＢＪ４、２ＪＦＡ、及び１ＳＪ０によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造の重ね合わせ。
【図３３】２ＢＪ４によるＲＡＤ１９０１のＩＦＤ。
【図３４】ＩＦＤによって２ＢＪ４にドックされたＲＡＤ１９０１のタンパク質表面相互作用。
【図３５】２ＢＪ４によるフルベストラントのＩＦＤ。
【図３６】２ＢＪ４によるフルベストラント及びＲＡＤ１９０１のＩＦＤ。
【図３７】２ＢＪ４によるフルベストラント及びＲＡＤ１９０１のＩＦＤの重ね合わせ。
【図３８】ＷＴ及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物によるＲＡＤ１９０１のインビトロ結合アッセイ。
【図３９】ＥＲαの例示的な変異の位置及びそれらの頻度。
【図４０】４０日間治療した後の、ＭＣＦ７細胞を移植したマウスの血漿、腫瘍、及び脳におけるＲＡＤ１９０１レベル。
【図４１】２００ｍｇの用量の経口投与で、１日１回、６日間治療したヒト対象の子宮、筋肉、及び骨のＳＵＶ。
【図４２】５００ｍｇの用量の経口投与で１日１回、６日間治療したヒト対象（ｎ＝４）の子宮、筋肉、及び骨のＳＵＶ。
【図４３】卵巣摘出ラットにおけるＢＭＤへのＲＡＤ１９０１の効果。成体雌ラットは、ビヒクル、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＡＤ１９０１（３ｍｇ／ｋｇ）で１日１回の治療開始の前に、偽手術または卵巣摘出手術のいずれかを施行した。（治療群当たりｎ＝２０）。ＢＭＤは、ベースライン及び治療から４週間後に、二重放射Ｘ線吸光光度法によって測定された。データは、平均±標準偏差で表される。＊Ｐ＜０．０５対対応するＯＶＸ＋Ｖｅｈ対照。ＢＭＤ、骨ミネラル濃度；Ｅ２、ベータエストラジオール；ＯＶＸ、卵巣摘出した；Ｖｅｈ、ビヒクル。
【図４４】卵巣摘出ラットにおける大腿マイクロアーキテクチャへのＲＡＤ１９０１の効果。成体雌ラットは、ビヒクル、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＡＤ１９０１（３ｍｇ／ｋｇ）で１日１回の治療開始の前に、偽手術または卵巣摘出手術のいずれかを施行した。（治療群当たりｎ＝２０）。４週間後、骨マイクロアーキテクチャは、マイクロコンピュータ断層撮影法を用いて評価した。データは、平均±標準偏差で表される。＊Ｐ＜０．０５対対応するＯＶＸ＋Ｖｅｈ対照。ＡＢＤ、見掛け骨密度；ＢＶ／ＴＶ、骨体積密度；ＣｏｎｎＤ、連結密度；Ｅ２、ベータエストラジオール；ＯＶＸ、卵巣摘出した；ＴｂＮ、骨梁数；ＴｂＴｈ、骨梁幅；ＴｂＳｐ、骨梁中心距離；Ｖｅｈ、ビヒクル。
【図４５】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験の重要なベースライン人口統計。
【図４６】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験における最も頻繁に起こる（１０％超）治療関連ＡＥ。ＣＴＣＡＥ  ｖ４．０により等級分けされたＡＥ。同じ優先使用語の複数のシナリオを有する任意の患者は、最も重度のグレードまで１回のみ計数した。＊任意の関連ＴＥＡＥを有した全活性群における１０％超の患者。Ｎ＝所与のカテゴリーにおける少なくとも１つの治療関連ＡＥを有する対象の数。
【図４７】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験における薬物動態学的パラメータ（７日目）。
【図４７】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験における薬物動態学的パラメータ（７日目）。
【図４８】ＬＢＤ変異の頻度。
【図４９】残留姿勢対３ＥＲＴにおけるＥＲ−α  ＬＢＤ−アンタゴニスト複合体の違い。
【図５０】ＲＭＳＤ計算によるＥＲ−α  ＬＢＤ−アンタゴニスト複合体の構造オーバーラップの評価。
【図５１】ＥＲ−α  ＬＢＤ−アンタゴニスト複合体におけるリガンド結合の分析。
【図５２】ＲＡＤ１９０１ドッキングのモデル評価。
【図５３】１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＩＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺによるＲＡＤ１９０１の誘導適合ドッキングスコア。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の実施例の項に示されるように、ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせ（ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせ）（以下の構造）は、ＥＳＲ１状態、ＰＲ状態、及びこれまでの内分泌療法にもかかわらず、乳癌異種移植片モデルにおいてＲＡＤ１９０１単独よりも大きな腫瘍成長の阻害を示した（実施例Ｉ（Ａ））。治療された異種移植片モデルは、ＰＲの発現を有するまたは有さない、高いまたは低いＨｅｒ２の発現を有し、これまでの内分泌療法（例えばタモキシフェン（ｔａｍ）、ＡＩ、フルベストラント）、化学療法（ｃｈｅｍｏ）、Ｈｅｒ２阻害剤（Ｈｅｒ２ｉ、例えばトラスツズマブ、ラパチニブ）、ベバシズマブ、及び／またはリツキシマブを有するまたは有さない、野生型（ＷＴ）または変異（例えばＹ５３７Ｓ）ＥＲαを発現する腫瘍を有した（図１）。ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、異種移植片モデルにおいてより大きな腫瘍成長の阻害（６５％以上のＴＧＩ）を示し、ＲＡＤ１９０１は単独で、２６〜６４％のＴＧＩを達成し、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、異種移植片モデルにおいてより大きな腫瘍成長の阻害（２６〜６４％のＴＧＩ）を示し、ＲＡＤ１９０１は単独で、２５％未満のＴＧＩを達成した。ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＲＡＤ１９０１治療に対して高応答性（６５％以上のＴＧＩ）である異種移植片モデル、例えばＰＤｘ−１１においてＲＡＤ１９０１単独よりも大きな腫瘍退縮を示した（図３Ａ〜Ｂ）。
【００１４】
ＥＲ  ＷＴ  ＰＤｘモデル及びＥＲ変異体ＰＤｘモデルは、フルベストラント単独で、パルボシクリブ単独で、及び／またはフルベストラントとパルボシクリブとの組み合わせ（フルベストラント−パルボシクリブの組み合わせ）による治療に対する異なるレベルの反応性を有し得る。しかしながら、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＰＤｘモデルがフルベストラント治療及び／またはフルベストラント−パルボシクリブの組み合わせに対する反応性があったかどうかにかかわらず、ＲＡＤ１９０１単独またはパルボシクリブ単独による治療と比較して、改善された腫瘍成長の阻害及び／または腫瘍退縮を示した。換言すれば、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、フルベストラント耐性癌において腫瘍成長を阻害し、及び／または腫瘍退縮を生じ得る。
【００１５】
ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせ治療は、フルベストラント単独またはフルベストラント−パルボシクリブの組み合わせによる治療と比較して、改善された腫瘍成長の阻害及び／または腫瘍退縮を示した。例えば、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、これらの異種移植片モデルが、フルベストラント治療に対する多様な反応性（例えば、フルベストラント治療に対するＭＣＦ７細胞株異種移植片モデル（図２Ａ〜Ｃ）、フルベストラント治療に対するＰＤｘ−１１モデル（図３Ａ〜Ｂ）、及びフルベストラント治療に対して最も反応性が少ないＰＤｘ−２モデル（図３Ａ〜Ｂ））を有するとしても、フルベストラント単独、ＲＡＤ１９０１単独、またはパルボシクリブ単独による治療よりも、さらにＷＴ  ＥＲ＋異種移植片モデルにおいて、さらに有意な腫瘍退縮を生じた。ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせはまた、フルベストラント−パルボシクリブの組み合わせによる治療よりも、さらにＷＴ  ＥＲ＋ＭＣＦ７細胞株異種移植片モデル及びＰＤｘ−１１モデルにおいて、さらに有意な腫瘍退縮を生じた（図２Ａ〜Ｃ及び３Ａ〜Ｂ）。ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇの用量でＲＡＤ１９０１による同様の効果を与えたが、３０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１単独は、腫瘍成長を阻害する際に、６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１単独ほど有効ではなかった（図２Ｃ）。当該の結果は、より低用量（例えば３０ｍｇ／ｋｇ）のＲＡＤ１９０１を用いたＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、当該異種移植片モデルにおいて腫瘍成長の阻害／腫瘍退縮の効果を最大限にするのに十分であったことを示唆している。
【００１６】
ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、フルベストラント治療に対してほとんど反応性がない変異体ＥＲ＋（例えばＹ５３７Ｓ）ＰＤｘモデルにおいて、腫瘍退縮または改善された腫瘍成長の阻害を示した。例えば、ＰＤｘ−５は、フルベストラント治療に対してほとんど反応性がないＥＲ  Ｙ５３７Ｓ変異体ＰＤｘモデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、ＡＩによるこれまでの治療）である。ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＰＤｘ−５モデルにおいて腫瘍退縮を示し、一方、パルボシクリブ単独またはＲＡＤ１９０１単独が、腫瘍退縮を生じることなく、腫瘍成長のみを阻害した（図６Ａ〜Ｃ及び７Ａ〜Ｂ）。さらに、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、６０ｍｇ／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇの用量でＲＡＤ１９０１による同様の効果を与え（図７Ａ〜Ｂ）、より低用量のＲＡＤ１９０１（例えば６０ｍｇ／ｋｇ）を用いたＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、当該ＰＤｘモデルにおいて腫瘍成長の阻害／腫瘍退縮の効果を最大限にするのに十分であったことを示唆している。ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、変異体ＰＤｘ−５モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１単独、パルボシクリブ単独、フルベストラント単独、またはフルベストラント−パルボシクリブの組み合わせよりもさらに有意な腫瘍成長の阻害を生じた（図８）。意外なことには、フルベストラント−パルボシクリブの組み合わせは、ＰＤｘ−５モデルにおいて、パルボシクリブ単独による治療と比較して、有意に腫瘍成長の阻害を増強しなかった（図８）。それ故に、フルベストラントの添加は、パルボシクリブと組み合わせて適用するときに、ＰＤｘ−５モデルに利益をもたらさなかったが、一方、ＲＡＤ１９０１の添加は、利益をもたらした。さらに、治療が長いほど、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、ＲＡＤ１９０１治療単独またはパルボシクリブ治療単独と比較したときに、さらに有意な腫瘍成長の阻害を達成した（図８）。それ故に、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＰＲの発現を有するまたは有さない、高いまたは低いＨｅｒ２の発現を有し、フルベストラントに対する耐性を有するまたは有さない、ＥＲ＋乳癌を発現するＷＴまたは変異体ＥＲに対する強力な抗腫瘍療法を提供する。
【化１】
2018518529.tif 000002
【００１７】
本明細書に提供される結果はまた、ＲＡＤ１９０１が脳に送達され得ることを示し（実施例ＩＩ）、当該送達は、野生型ＥＲαを発現する頭蓋内腫瘍モデル（ＭＣＦ−７異種移植片モデル、実施例Ｉ（Ｂ））においてマウス生存を改善した。パルボシクリブが脳−血液関門を横断することが報告されたため（Ｏ’Ｌｅａｒｙ）、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、脳血液関門を横断し、脳内のＥＲ＋腫瘍を治療することができる可能性が高い。これは、フルベストラントが脳血液関門を横断することができないため、脳内のＥＲ＋腫瘍を治療するためにフルベストラント−パルボシクリブの組み合わせを上回るさらなる利点を表す（Ｖｅｒｇｏｔｅ１  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ，ａ  ｎｅｗ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｖｅｒｓｕｓ  ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ，”Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７（２）：２００−２０４（２００６））。脳血液関門を横断することができる他のＣＤＫ４／６阻害剤（複数可）（例えばアベマシクリブ（Ｏ’Ｌｅａｒｙ））とのＲＡＤ１９０１の組み合わせはまた、脳内のＥＲ＋腫瘍への同様の治療効果を有し得る。
【００１８】
ＲＡＤ１９０１は、エストラジオール治療は継続したが、治療を終了した後に、腫瘍成長を阻害する際に持続的な有効性を示した（例えばＰＤｘ−４モデル）。それ故に、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、特に、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）が、それらの副作用（Ｏ’Ｌｅａｒｙ）により間欠的にのみ投与され得るときに、治療を終了した後に、腫瘍成長を阻害することによって患者に利益をもたらす可能性が高い。
【００１９】
ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、パルボシクリブ単独またはパルボシクリブと他のホルモン療法（例えば、レトロゾール等のＡＩ及びフルベストラント等のＳＥＲＤ）との組み合わせによる治療よりも低い副作用を有する可能性が高い。例えば、ＡＩ及びフルベストラントは両方とも、治療した患者において骨喪失を生じ得る。ＲＡＤ１９０１は、同様の副作用を有する可能性は低い。ＲＡＤ１９０１は、腫瘍中に優先的に蓄積することが見出され、最大約３５の腫瘍中のＲＡＤ１９０１レベル対血漿中のＲＡＤ１９０１レベル（Ｔ／Ｐ比）があった（実施例ＩＩ）。子宮、筋肉、及び骨に対する標準取り込み値（ＳＵＶ）は、約２００ｍｇ〜最大約５００ｍｇの用量で、１日１回ＲＡＤ１９０１で治療したヒト対象について計算された（実施例ＩＩＩ（Ａ））。投与後の子宮シグナルは、「非標的組織」（エストロゲン受容体を発現しない組織）からのレベルに近く、ＲＡＤ１９０１治療後のＦＥＳ−ＰＥＴの取り込みの完全な減衰を示唆している。エストロゲン受容体を有意に発現しなかった組織（例えば筋肉、骨）中の治療前対治療後ＰＥＴスキャンについては、ほとんど変化が観察されなかった（実施例ＩＩＩＡ）。最終的に、ＲＡＤ１９０１治療は、卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットにおける子宮組織のエストラジオール刺激に拮抗し（実施例ＩＶ（Ａ））、治療を受けた対象の骨質を大いに保存した。例えば、ＲＡＤ１９０１で治療したＯＶＸラットは、維持されたＢＭＤ及び大腿マイクロアーキテクチャを示した（実施例ＩＶ（Ａ））。それ故に、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、特に、骨粗鬆症または骨粗鬆症のより高いリスクを有する患者において有用であり得る。
【００２０】
さらに、ＲＡＤ１９０１は、ＭＣＦ７細胞株異種移植片モデルにおいてインビボで野生型ＥＲαを分解し、ＥＲシグナル伝達を廃止することが見出され、これらのＭＣＦ７細胞株異種移植片モデルにおいて、ＰＲの用量依存的な減少を示した（実施例ＩＩＩ（Ｂ））。ＲＡＤ１９０１は、治療を受けた対象から採取した腫瘍中の増殖マーカーＫｉ６７の減少からも明らかなように、ＭＣＦ７細胞株異種移植片モデル及びＰＤｘ−４モデルにおける増殖を減少した。ＲＡＤ１９０１はまた、フルベストラント治療に対してほとんど反応性がなかったＥＲ変異体ＰＤｘモデルにおいてインビボでＥＲシグナル伝達を減少した（実施例ＩＩＩ（Ｂ））。
【００２１】
フルベストラント治療に対してほとんど反応性がない腫瘍及び変異体ＥＲαを発現する腫瘍におけるＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせの予期せぬ有効性は、ＲＡＤ１９０１とＥＲαとの間の固有の相互作用によるものであり得る。ＲＡＤ１９０１に結合するＥＲα及び他のＥＲαと結合する化合物の構造モデルは、特定の結合相互作用についての情報を得るために分析した（実施例Ｖ）。コンピュータモデリングは、ＲＡＤ１９０１−ＥＲαの相互作用が、ＥＲαのＬＢＤの変異、例えばＹ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘが、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、及びＳ４６３Ｐによって影響を受ける可能性が低いことを示し、これは、内分泌療法のうちの少なくとも１つを施した患者からの転移性ＥＲ陽性乳房の腫瘍試料の最近の研究に見出されたＬＢＤ変異の約８１．７％を占める（表９、実施例Ｖ）。それ故に、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせは、本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせと同様に比較的低い副作用を有する治療効果を有する可能性が高い。コンピュータモデリングは、結合にとって欠かせないＥＲαのＣ末端リガンド結合ドメインにおける特定の残基の特定をもたらし、野生型ＥＲαだけでなく、ある特定の変異体及びそれらのバリアントもまた結合し、拮抗する化合物を発生するために使用することができる情報は、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）と組み合わせたときに、本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせと同様に比較的低い副作用を有する強力な抗腫瘍療法を提供し得る。
【００２２】
これらの結果に基づいて、対象に、治療上有効量の、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩と本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）との組み合わせを投与することによって、それらを必要とする対象においてＥＲα陽性腫瘍の成長を阻害する、またはその退行を生じるための方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の投与は、腫瘍成長に加えてさらなる治療的有効性を有し、例えば、（例えば、エストラジオール結合を阻害することによってまたはＥＲαを分解することによって）癌細胞増殖を阻害するまたはＥＲα活性を阻害することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、筋肉、骨、乳部、及び／または子宮に対する負の効果を生じない。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、ＥＲα及び変異体ＥＲαを調節する及び／または分解する。
【００２４】
本明細書に提供される、腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、対象に、治療上有効量の、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせを投与することによって、それらを必要とする対象においてＥＲα陽性腫瘍の成長を阻害する、またはその退行を生じるための方法が、本明細書に提供される。ある特定のこれらの実施形態では、その塩は、構造：
【化２】
2018518529.tif 000003
を有するＲＡＤ１９０１二塩酸塩である。
【００２５】
ＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤
ある特定の実施形態では、ＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤としては、以下に開示される、パルボシクリブ、アベマシクリブ、リボシクリブ、ＡＭＧ９２５、式ＩＩの化合物、式ＩＩＩの化合物、及び式ＩＶの化合物、それらの溶媒和物、それらの塩、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【化３】
2018518529.tif 000004
【化４】
2018518529.tif 000005
【化５】
2018518529.tif 000006
【化６】
2018518529.tif 000007
【００２６】
式ＩＩの化合物は、式ＩＩの構造を有し、その薬学的に許容される溶媒和物（例えば水和物）、及びその薬学的に許容される塩を含み、
【化７】
2018518529.tif 000008
式中、
各Ｘは独立して、ヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、及びＮ）であり、
各Ｒ1は独立して、水素、低級アルキル、カルボキシ低級アルキル、酸素、及びシクロアルキルからなる群から選択される。
【００２７】
別段指定されない限り、本明細書に使用される低級アルキルは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の炭素を有するアルキルである。
【００２８】
式ＩＩＩの化合物は、式ＩＩＩの構造を有し、その薬学的に許容される溶媒和物（例えば水和物）、及びその薬学的に許容される塩を含み、
【化８】
2018518529.tif 000009
式中、
Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、ＮＨ2、ＮＨＲ2、ＮＨＣＯＲ2、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＨ2ＮＨ2  ＣＨ2ＮＨＲ2、フェニル及び複素芳香族基からなる群から選択され、式中、フェニルまたは複素芳香族基は、任意に、低級アルキル、カルボキシ低級アルキル、酸素、及びシクロアルキル基からなる群から選択されさらなる置換で置換され、
Ａｒは、フェニルまたは複素芳香族基であり、式中、フェニルまたは複素芳香族基は、任意に、低級アルキル、カルボキシ低級アルキル（−（Ｃ＝Ｏ）−低級アルキル）、酸素（＝Ｏ）、またはシクロアルキル基からなる群から選択されるさらなる置換で置換され、
ｎは、０、１、２、または３である。
【００２９】
式ＩＶの化合物は、ＥＰ１２９５８７８Ｂ１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、式ＩＶの構造を有し、その薬学的に許容される溶媒和物（例えば水和物）、及びその薬学的に許容される塩をさらに含み、
【化９】
2018518529.tif 000010
式中、
Ａｒ2は
【化１０】
2018518529.tif 000011
であり、Ａｒは
【化１１】
2018518529.tif 000012
であるか、または
Ａｒ2は同上であり、Ａｒは
【化１２】
2018518529.tif 000013
である。
【００３０】
併用療法
（１）ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩と、１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）との組み合わせ
ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）は両方とも、対象に単独で投与された場合、１つ以上の癌または腫瘍への治療効果を有する（実施例Ｉ（Ａ）及びＩ（Ｂ））。対象に併用投与されるとき、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）は、癌／腫瘍への有意に改善された効果を有する（実施例Ｉ（Ａ）及びＩ（Ｂ））。
【００３１】
本明細書に使用されるＥＲα陽性腫瘍の「成長を阻害すること」は、腫瘍成長の速度を減速すること、または腫瘍成長を完全に停止することを指し得る。
【００３２】
本明細書に使用されるＥＲα陽性腫瘍の「腫瘍退縮」または「退縮」は、最大サイズの腫瘍を軽減することを指し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせの投与は、腫瘍のサイズ対ベースライン（すなわち、治療開始前のサイズ）の減少、または腫瘍の根絶もしくは部分的根絶でさえももたらし得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍退縮の方法は、代替的に、腫瘍のサイズ対ベースラインを減少する方法と特徴付けられ得る。
【００３３】
本明細書に使用される「腫瘍」は、悪性腫瘍であり、「癌」と同義に使用される。
【００３４】
腫瘍成長の阻害または退縮は、特定の組織または臓器内の単発性腫瘍または一連の腫瘍に限局され得るか、または全身性であり得る（すなわち、すべての組織または臓器における腫瘍に影響を及ぼす）。
【００３５】
ＲＡＤ１９０１は、ＥＲα対エストロゲン受容体ベータ（ＥＲβ）と優先的に結合することが周知であるため、別段記述がない限り、エストロゲン受容体、エストロゲン受容体アルファ、ＥＲα、ＥＲ、野生型ＥＲα、及びＥＳＲ１は、本明細書において同義に使用される。本明細書に使用される「エストロゲン受容体アルファ」または「ＥＲα」は、遺伝子ＥＳＲ１によってコードされる、野生型ＥＲαアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、ポリペプチドを指す。本明細書に使用される「エストロゲン受容体アルファに対して陽性である」、「ＥＲα陽性」、「ＥＲ＋」、または「ＥＲα＋」である腫瘍は、１つ以上の細胞がＥＲαのうちの少なくとも１つのイソ型を発現する腫瘍を指す。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、ＥＲαを過剰発現する。ある特定の実施形態では、患者は、ＥＲβのうちの１つ以上の型を発現する腫瘍内に１つ以上の細胞を有する。ある特定の実施形態では、ＥＲα陽性腫瘍及び／または癌は、乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌と関連している。ある特定のこれらの実施形態では、患者は、乳部、子宮、卵巣、または下垂体組織に位置する腫瘍を有する。患者が乳部に位置する腫瘍を有するような実施形態では、腫瘍は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ２＋腫瘍に対して陽性であり得るかまたはあり得ない、内腔乳癌と関連し得、腫瘍は、高いまたは低いＨＥＲ２を発現し得る（例えば図１）。他の実施形態では、患者は、別の組織または臓器（例えば、骨、筋肉、脳）に位置する腫瘍を有するが、それにもかかわらず、乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌（例えば、乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌の移動または転移に由来する腫瘍）とは関連しない。したがって、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、標的とされる腫瘍は、転移性腫瘍である、及び／または腫瘍が、他の臓器（例えば、骨及び／または筋肉）におけるＥＲの過剰発現を有する。ある特定の実施形態では、標的とされる腫瘍は、脳腫瘍及び／または癌である。ある特定の実施形態では、標的とされる腫瘍は、別のＳＥＲＤ（例えば、フルベストラント、ＴＡＳ−１０８（ＳＲ１６２３４）、ＺＫ１９１７０３、ＲＵ５８６６８、ＧＤＣ−０８１０（ＡＲＮ−８１０）、ＧＷ５６３８／ＤＰＣ９７４、ＳＲＮ−９２７、ＩＣＩ１８２７８２、及びＡＺＤ９４９６）、Ｈｅｒ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ、ラパチニブ、アド−トラスツズマブエムタンシン、及び／もしくはペルツズマブ）、化学療法（例えば、アブラキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、サイトキサン、ダウノルビシン、ドキシル、エレンス、フルオロウラシル、ジェムザール、ヘラベン、ｌｘｅｍｐｒａ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミコキサントロン（ｍｉｃｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ナベルビン、タクソール、タキソテール、チオテパ、ビンクリスチン、及びキセロダ）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、及びレトロゾール）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、及び／もしくはトレミフェン）、血管新生阻害剤（例えばベバシズマブ）、ならびに／またはリツキシマブによる治療よりも、ＲＡＤ１９０１ならびに本明細書に開示されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤の治療に対してより感受性がある。
【００３６】
本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせを投与する前に、患者がＥＲαを発現する腫瘍を有するかどうかを決定するステップをさらに含む。本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせを投与する前に、患者が変異体ＥＲαを発現する腫瘍を有するかどうかを決定するステップをさらに含む。本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせを投与する前に、患者がフルベストラント治療に応答するまたは応答しないＥＲαを発現する腫瘍を有するかどうかを決定するステップをさらに含む。これらの決定は、当該技術分野で周知である発現の検出のうちのいずれかの方法を用いて行われ得、対象から摘出された腫瘍または組織試料を用いてインビトロで行われ得る。
【００３７】
野生型ＥＲαを発現する腫瘍において腫瘍成長を阻害するＲＡＤ１９０１の能力を示すことに加えて、本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１がＥＲαの変異型、すなわちＹ５３７Ｓ  ＥＲαを発現する腫瘍の成長を阻害する予期しない能力を示したことを示す（実施例Ｉ（Ａ））。ＥＲα変異の例のコンピュータモデリング評価は、例えば、Ｙ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘが、Ｓ、Ｎ、またはＣである）を有するＥＲα、Ｄ５３８Ｇ変異体を有するＥＲα、及びＳ４６３Ｐ変異体を有するＥＲαからなる群から選択される１種以上の変異体を有するＥＲαのような、これらの変異のいずれも、ＬＢＤに影響を与えるか、またはＲＡＤ１９０１結合を特異的に妨げることが期待されなかったことを示したことを示した（実施例Ｖ（Ａ））。これらの結果に基づいて、対象に、治療上有効量の、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせを投与することによって、癌に罹患している対象において、Ｙ５３７Ｘ1（式中、Ｘ1が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ2（式中、Ｘ2が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、特にＹ５３７Ｓ  ＥＲαからなる群から選択される、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内に１種以上の変異体を有するＥＲαに対して陽性である腫瘍の成長を阻害するか、またはその退縮を生じるための方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩である。本明細書に使用される「変異体ＥＲα」は、ＥＲαのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、１つ以上の置換または欠失を含むＥＲα、及びそれらのバリアントを指す。
【００３８】
動物異種移植片モデルにおける乳癌腫瘍成長を阻害することに加えて、本明細書に開示される結果は、ＲＡＤ１９０１が、腫瘍細胞内に有意な蓄積を示し、血液脳関門を通過することができることを示す（実施例ＩＩ）。血液脳関門を通過する能力は、ＲＡＤ１９０１の投与が、脳転移異種移植片モデルにおいて有意に生存期間の延長を示すことによって確認された（実施例Ｉ（Ｂ））。したがって、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、標的とされるＥＲα陽性腫瘍は、脳または中枢神経系の他の場所に位置する。ある特定のこれらの実施形態では、ＥＲα陽性腫瘍は、主として脳癌と関連している。他の実施形態では、ＥＲα陽性腫瘍は、主として、別の組織または臓器から遊走してきた乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌等の別のタイプの癌と関連している転移性腫瘍である。ある特定のこれらの実施形態では、腫瘍は、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）等の脳転移である。本明細書に開示される方法のある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、標的腫瘍内の１つ以上の細胞に蓄積する。
【００３９】
本明細書に開示される方法のある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、好ましくは、約１５以上、約１８以上、約１９以上、約２０以上、約２５以上、約２８以上、約３０以上、約３３以上、約３５以上、約４０以上のＴ／Ｐ（腫瘍中のＲＡＤ１９０１濃度／血漿中のＲＡＤ１９０１濃度）比で腫瘍に蓄積する。
【００４０】
本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１投与が卵巣摘出ラットにおける骨量の減少を防ぐことを示す（実施例ＩＶ（Ａ））。したがって、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせは、例えば、治療された対象の骨体積密度、骨表面密度、骨ミネラル濃度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、連結密度、及び／または見掛け骨密度への望ましくない効果を含む、骨への望ましくない効果を有さない。タモキシフェンが、閉経前の女性において骨喪失と関連し得るため、フルベストラントは、作用機序により骨構造を害し得、本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせは、閉経前の女性、タモキシフェンまたは抗エストロゲン療法に耐性を示す腫瘍、ならびに骨粗鬆症及び／または骨粗鬆症の高いリスクを有する患者に特に有用であり得る。
【００４１】
本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１が卵巣摘出ラットにおける子宮組織のエストラジオール刺激を拮抗することを示す（実施例ＩＶ（Ａ））。さらに、２００ｍｇまたは最大５００ｍｇの用量のＲＡＤ１９０１で１日１回治療したヒト対象において、ＥＲを有意に発現しなかった子宮、筋肉、及び骨組織に対する標準取り込み値（ＳＵＶ）は、治療前及び治療後のシグナルにおいてほとんど変化を示さなかった（実施例ＩＩＩ（Ａ））。したがって、ある特定の実施形態では、かかる投与はまた、例えば、子宮、筋肉、または乳部組織を含む、他の組織への望ましくない効果をもたらさない。
【００４２】
本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、それを必要とする対象に併用投与される。「併用」という語句は、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩が、ＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤の投与前、その中、またはその後に投与され得ることを意味する。例えば、本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、約１週間毎に、約６日間毎に、約５日間毎に、約４日間毎に、約３日間毎に、約２日間毎に、約２４時間毎に、約２３時間毎に、約２２時間毎に、約２１時間毎に、約２０時間毎に、約１９時間毎に、約１８時間毎に、約１７時間毎に、約１６時間毎に、約１５時間毎に、約１４時間毎に、約１３時間毎に、約１２時間毎に、約１１時間毎に、約１０時間毎に、約９時間毎に、約８時間毎に、約７時間毎に、約６時間毎に、約５時間毎に、約４時間毎に、約３時間毎に、約２時間毎に、約１時間毎に、約５５分間毎に、約５０分間毎に、約４５分間毎に、約４０分間毎に、約３５分間毎に、約３０分間毎に、約２５分間毎に、約２０分間毎に、約１５分間毎に、約１０分間毎に、または約５分間毎に投与され得る。他の実施形態では、本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、対象に、同時にまたは実質的に同時に投与される。ある特定のこれらの実施形態では、本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、単一製剤の一部として投与され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩と単一のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤との組み合わせが、対象に投与される。他の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩と１種を超えるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤との組み合わせが、対象に投与される。例えば、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、癌／腫瘍を治療するために、２種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤と混合され得る。
【００４４】
（２）投与量
本明細書に開示される方法で用いるための、治療上有効量の本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）及びＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、特定の時間間隔にわたって投与される場合、１つ以上の治療的基準の達成をもたらす（例えば、腫瘍成長を遅らせるまたは停止すること、腫瘍退縮を生じさせること、症状の停止等の）量である。現在開示されている方法で用いるための組み合わせは、対象に１回または複数回投与され得る。化合物が複数回投与されるこれらの実施形態では、それらは、一連の間隔、例えば、毎日、隔日、毎週、または毎月投与され得る。あるいは、それらは、例えば、症状、患者の健康状態等に基づいて、必要に応じて、不規則な間隔で投与され得る。治療上有効量の組み合わせは、１日１回、１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、または少なくとも１５日間投与され得る。任意に、癌の状態または腫瘍の退縮は、例えば、対象のＦＥＳ−ＰＥＴスキャンによって、治療中またはその後にモニタリングされる。対象に投与される組み合わせの投与量は、検出された癌の状態または腫瘍の退縮に応じて増加または減少させることができる。
【００４５】
理想的には、治療上有効量は、治療を受けた対象の５０％以上が吐き気またはさらなる薬物投与を阻む他の毒性反応を経験する最大耐性用量を超えない。治療上有効量は、様々な症状、性別、年齢、体重の範囲、または対象の一般的健康、投与モード及び塩または溶媒和物タイプ、薬物に対する感受性の変動、特定のタイプの疾患等を含む、様々な要因に応じて対象において変動し得る。
【００４６】
本明細書に開示される方法で用いるための治療上有効量のＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の例としては、耐性ＥＲ駆動腫瘍または癌に罹患している対象において、１日１回、約１５０〜約１，５００ｍｇ、約２００〜約１，５００ｍｇ、約２５０〜約１，５００ｍｇ、または約３００〜約１，５００ｍｇの投与量、野生型ＥＲ駆動腫瘍及び／または癌ならびに耐性腫瘍及び／または癌の両方を有する対象において、１日１回、約１５０〜約１，５００ｍｇ、約２００〜約１，０００ｍｇ、約２５０〜約１，０００ｍｇ、または約３００〜約１，０００ｍｇの投与量、主に野生型ＥＲ駆動腫瘍及び／または癌を有する対象において、１日１回、約３００〜約５００ｍｇ、約３００〜約５５０ｍｇ、約３００〜約６００ｍｇ、約２５０〜約５００ｍｇ、約２５０〜約５５０ｍｇ、約２５０〜約６００ｍｇ、約２００〜約５００ｍｇ、約２００〜約５５０ｍｇ、約２００〜約６００ｍｇ、約１５０〜約５００ｍｇ、約１５０〜約５５０ｍｇ、または約１５０〜約６００ｍｇの投与量が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、成人対象において、現在開示されている方法で用いるための式Ｉの化合物（例えばＲＡＤ１９０１）またはそれらの塩もしくは溶媒和物の投与量は、１日１回、約２００ｍｇ、４００ｍｇ、３０ｍｇ〜２，０００ｍｇ、１００ｍｇ〜１，５００ｍｇ、または１５０ｍｇ〜１，５００ｍｇ経口投与であり得る。この１日投与量は、単回投与または複数回投与を介して達成され得る。
【００４７】
治療上有効量または投与量の、本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、その特定のタイプに応じて異なる。全般に、本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）の１日投与量は、約１ｍｇ〜約１，５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１ｍｇ〜約６００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１，５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１，２００ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約３５０ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲に及ぶ。
【００４８】
アベマシクリブ
アベマシクリブによるＲＡＤ１９０１の投与は、１日当たり１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇのＲＡＤ１９０１で達成され得る。特に、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇが、知られている。ある特定の状況下で、１日２回の投与スケジュールが好ましい。経口投与後のヒトにおいて、驚くほど半減期が長いＲＡＤ１９０１が、特に実行可能なこの選択肢を作成する。したがって、薬物は、１日２回、２００ｍｇ（１日当たり合計４００ｍｇ）、１日２回、２５０ｍｇ（１日当たり合計５００ｍｇ）、１日２回、３００ｍｇ（１日当たり合計６００ｍｇ）、１日２回、４００ｍｇ（１日当たり８００ｍｇ）、または１日２回、５００ｍｇ（１日当たり合計１，０００ｍｇ）投与され得る。好ましくは、投与は経口である。アベマシクリブの用量は、毎日５０ｍｇ〜５００ｍｇまたは毎日１５０ｍｇ〜４５０ｍｇであり得、この投与は、２８日周期において毎日または２８日周期当たり２１日または２８日周期当たり１４日または２８日周期当たり７日等の２８日周期当たり２８日未満であり得る。いくつかの実施形態では、アベマシクリブは、１日１回投与される、または好ましくは、投与が経口である１日２回のスケジュールで投与される。１日２回の投与の場合、この投与は、４時間、８時間、または１２時間毎に別々であり得る。ある特定の実施形態では、アベマシクリブは、投与が間隔を１２時間あけることを推奨される場合に、経口を介して、１５０ｍｇで１日２回投与される。
【００４９】
本明細書において発見され、説明されるように、ＲＡＤ１９０１とｃｄｋ４／６阻害剤との間で顕著な相乗効果であると思われ、したがって、通常推奨されたまたは承認された投与からのＲＡＤ１９０１及び／またはアベマシクリブの減量は、企図され、本明細書に記載される。例えば、ＲＡＤ１９０１は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇの用量で、またはより具体的には、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇで単剤療法での治療において推奨され得る。合わせて、所与の割合によって特定の用量の減少は、通常の用量よりも２５％〜７５％の用量が可能であることを意味する。非限定的な例によって、１日当たり４００ｍｇのＲＡＤ１９０１の推奨された用量は、１日当たり１００ｍｇ〜３００ｍｇの最終用量、または１日当たり１００ｍｇ、１日当たり２００ｍｇ、または１日当たり３００ｍｇ減少され得る。ＲＡＤ１９０１の用量が記載されるように減少される場合、同じ割合の減少は、概して、投与が１日２回または１日１回であるかどうか適用される。例えば、４００ｍｇが５０％減少された１日２回の投与が、２００ｍｇの１日２回のスケジュールにおいて投与され得る。いくつかの例外では、毎日推奨された１日２回の投与の減少が、１日当たりの総量が１日１回の投与として投与することが可能であるのに十分であり得る。例えば、アベマシクリブと組み合わせて与えられる３００ｍｇの通常の１日２回の用量は、５０％減少され得る。したがって、用量は、１５０ｍｇを１日２回または３００ｍｇを１日１回投与され得る。
【００５０】
同様に、アベマシクリブの通常推奨された用量は、ＲＡＤ１９０１と組み合わせて使用される場合に減少され得る。減少された用量が、真上に例示されるように通常の推奨された用量よりも２５％〜７５％少ない場合、アベマシクリブの用量は、減少され、ＲＡＤ１９０１の通常の推奨された単剤療法の用量または減少されたＲＡＤ１９０１の用量と組み合わせられ得る。例えば、１日２回の１５０ｍｇのアベマシクリブの推奨された用量は、１日２回の１５０ｍｇの用量よりも１日２回の用量が２５％〜７５％少なく投与され得る。例えば、１日２回の１５０ｍｇのアベマシクリブが、１日２回の用量の３７．５ｍｇ〜１１２．５ｍｇ（１日当たり合計７５ｍｇ〜２２５ｍｇ）まで減少され得る。あるいは、推奨された２８日周期からある程度少ない量までアベマシクリブの頻度を減少させることが望ましいものであり得る。例えば、投与頻度は、２８日周期のうち２２日〜２７日または２８日周期のうち２１日まで減少され得るか、または投与頻度は、２８日周期のうち１５日〜２０日または２８日周期のうち１４日まで減少され得るか、または投与頻度は、２８日周期のうち８日〜１３日または２８日周期のうちわずか７日まで減少され得る。投与された日数は、状況下で必要とされるように、連続的または組み合わせられ得る。一実施形態では、投与間隔にわたって総量は、推奨された用量の２５％〜７５％減少され、その減少が、頻度が少ない投与、投与量の減少、またはこれらの組み合わせの結果として生じ得る。例えば、１日２回の１５０ｍｇ（１日当たり合計３００ｍｇ）の用量でアベマシクリブの２８日の推奨された投与サイクルは、２８日にわたって総量８，４００ｍｇ（２８日×１日当たり合計３００ｍｇ）をもたらす。この量は、２８日当たり２，１００ｍｇから２８日当たり６，３００ｍｇまで減少され得る。
【００５１】
リボシクリブ
リボシクリブによるＲＡＤ１９０１の投与は、１日当たり１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇのＲＡＤ１９０１で達成され得る。特に、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇが、知られている。ある特定の状況下で、１日２回の投与スケジュールが好ましい。経口投与後のヒトにおいて、驚くほど半減期が長いＲＡＤ１９０１が、特に実行可能なこの選択肢を作成する。したがって、薬物は、１日２回、２００ｍｇ（１日当たり合計４００ｍｇ）、１日２回、２５０ｍｇ（１日当たり合計５００ｍｇ）、１日２回、３００ｍｇ（１日当たり合計６００ｍｇ）、１日２回、４００ｍｇ（１日当たり８００ｍｇ）、または１日２回、５００ｍｇ（１日当たり合計１，０００ｍｇ）投与され得る。好ましくは、投与は経口である。リボシクリブの用量は、毎日２００ｍｇ〜１，０００ｍｇまたは毎日２５０ｍｇ〜７５０ｍｇであり得、この投与は、２８日周期において毎日または２８日周期当たり２１日または２８日周期当たり１４日または２８日周期当たり７日等の２８日周期当たり２８日未満であり得る。いくつかの実施形態では、リボシクリブは、投与が経口である１日１回投与される。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１と組み合わせて使用されるリボシクリブの用量は、１日１回、６００ｍｇであり、投与間隔は、２８日周期のうち２１日である。
【００５２】
本明細書において発見され、説明されるように、ＲＡＤ１９０１とｃｄｋ４／６阻害剤との間で顕著な相乗効果であると思われ、したがって、通常推奨されたまたは承認された投与からのＲＡＤ１９０１及び／またはリボシクリブの減量は、企図され、本明細書に記載される。例えば、ＲＡＤ１９０１は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇの用量で、またはより具体的には、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇで単剤療法での治療において推奨され得る。合わせて、所与の割合によって特定の用量の減少は、通常の用量よりも２５％〜７５％の用量が可能であることを意味する。非限定的な例によって、１日当たり４００ｍｇのＲＡＤ１９０１の推奨された用量は、１日当たり１００ｍｇ〜３００ｍｇの最終用量、または１日当たり１００ｍｇ、１日当たり２００ｍｇ、または１日当たり３００ｍｇ減少され得る。ＲＡＤ１９０１の用量が記載されるように減少される場合、同じ割合の減少は、概して、投与が１日２回または１日１回であるかどうか適用される。例えば、４００ｍｇが５０％減少された１日２回の投与が、２００ｍｇの１日２回のスケジュールにおいて投与され得る。いくつかの例外では、毎日推奨された１日２回の投与の減少が、１日当たりの総量が１日１回の投与として投与することが可能であるのに十分であり得る。例えば、リボシクリブと組み合わせて与えられる３００ｍｇの通常の１日２回の用量は、５０％減少され得る。したがって、用量は、１５０ｍｇを１日２回または３００ｍｇを１日１回投与され得る。
【００５３】
同様に、リボシクリブの通常推奨された用量は、ＲＡＤ１９０１と組み合わせて使用される場合に減少され得る。減少された用量が、真上に例示されるように通常の推奨された用量よりも２５％〜７５％少ない場合、リボシクリブの用量は、減少され、ＲＡＤ１９０１の通常の推奨された単剤療法の用量または減少されたＲＡＤ１９０１の用量と組み合わせられ得る。例えば、１日１回の６００ｍｇのリボシクリブの推奨された用量は、１日１回の６００ｍｇの用量よりも１日１回の用量が２５％〜７５％少なく投与され得る。例えば、６００ｍｇのリボシクリブの推奨された用量は、１５０ｍｇ〜４５０ｍｇの用量まで減少され得る。あるいは、２８日周期のうち推奨された２１日からある程度少ない量までリボシクリブの頻度を減少させることが望ましいものであり得る。例えば、投与頻度は、２８日周期のうち１５日〜２０日または２８日周期のうち１４日まで減少され得るか、または投与頻度は、２８日周期のうち８日〜１３日または２８日周期のうち７日まで減少され得る。投与された日数は、状況下で必要とされるように、連続的または組み合わせられ得る。一実施形態では、投与間隔にわたって総量は、推奨された用量の２５％〜７５％減少され、その減少が、頻度が少ない投与、投与量の減少、またはこれらの組み合わせの結果として生じ得る。例えば、リボシクリブの２８日の推奨された投与サイクル（１日１回の６００ｍｇの用量で２１日）は、２８日にわたって総量１２，６００ｍｇ（２１投与日数×１日当たり合計６００ｍｇ）をもたらす。この量は、２８日周期当たり３，１５０ｍｇから２８日周期当たり９，４５０ｍｇまで減少され得る。
【００５４】
パルボシクリブ
パルボシクリブによるＲＡＤ１９０１の投与は、１日当たり１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇのＲＡＤ１９０１で達成され得る。特に、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇが、知られている。ある特定の状況下で、１日２回の投与スケジュールが好ましい。経口投与後のヒトにおいて、驚くほど半減期が長いＲＡＤ１９０１が、特に実行可能なこの選択肢を作成する。したがって、薬物は、１日２回、２００ｍｇ（１日当たり合計４００ｍｇ）、１日２回、２５０ｍｇ（１日当たり合計５００ｍｇ）、１日２回、３００ｍｇ（１日当たり合計６００ｍｇ）、１日２回、４００ｍｇ（１日当たり８００ｍｇ）、または１日２回、５００ｍｇ（１日当たり合計１，０００ｍｇ）投与され得る。好ましくは、投与は経口である。パルボシクリブの用量は、毎日２５ｍｇ〜２５０ｍｇまたは１日当たり５０ｍｇ〜１２５ｍｇまたは１日当たり７５ｍｇ〜１２５ｍｇまたは毎日７５ｍｇまたは毎日１００ｍｇまたは毎日１２５ｍｇであり得る。投与は、２８日周期において毎日、または２８日周期当たり２１日または２８日周期当たり１４日または２８日周期当たり７日等の２８日周期当たり２８日未満であり得る。いくつかの実施形態では、パルボシクリブは、投与が経口である１日１回投与される。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１と組み合わせて使用されるパルボシクリブの用量は、１日１回、１２５ｍｇであり、投与間隔は、２８日周期のうち２１日または１日１回、１００ｍｇであり、投与間隔は、２８日周期のうち２１日または７５ｍｇであり、投与間隔は、２８日周期のうち２１日である。
【００５５】
本明細書において発見され、説明されるように、ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの間で顕著な相乗効果であると思われ、したがって、通常推奨されたまたは承認された投与からのＲＡＤ１９０１及び／またはパルボシクリブの減量は、企図され、本明細書に記載される。例えば、ＲＡＤ１９０１は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇの用量で、またはより具体的には、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇで単剤療法での治療において推奨され得る。合わせて、所与の割合によって特定の用量の減少は、通常の用量よりも２５％〜７５％の用量が可能であることを意味する。非限定的な例によって、１日当たり４００ｍｇのＲＡＤ１９０１の推奨された用量は、１日当たり１００ｍｇ〜３００ｍｇの最終用量、または１日当たり１００ｍｇ、１日当たり２００ｍｇ、または１日当たり３００ｍｇ減少され得る。ＲＡＤ１９０１の用量が記載されるように減少される場合、同じ割合の減少は、概して、投与が１日２回または１日１回であるかどうか適用される。例えば、４００ｍｇが５０％減少された１日２回の投与が、２００ｍｇの１日２回のスケジュールにおいて投与され得る。いくつかの例外では、毎日推奨された１日２回の投与の減少が、１日当たりの総量が１日１回の投与として投与することが可能であるのに十分であり得る。例えば、パルボシクリブと併用投与される３００ｍｇの通常の１日２回の用量は、５０％減少され得る。したがって、用量は、１５０ｍｇを１日２回または３００ｍｇを１日１回投与され得る。
【００５６】
同様に、パルボシクリブの通常推奨された用量は、ＲＡＤ１９０１と組み合わせて使用される場合に減少され得る。減少された用量が、真上に例示されるように通常の推奨された用量よりも２５％〜７５％少ない場合、パルボシクリブの用量は、減少され、ＲＡＤ１９０１の通常の推奨された単剤療法の用量または減少されたＲＡＤ１９０１の用量と組み合わせられ得る。例えば、１日１回の１２５ｍｇのパルボシクリブの推奨された用量は、１日１回の１２５ｍｇの用量よりも１日１回の用量が２５％〜７５％少なく投与され得る。例えば、１２５ｍｇのパルボシクリブの推奨された用量は、３１．２５ｍｇ〜９３．７５ｍｇの用量まで減少され得る。いくつかの実施形態では、毎日１２５ｍｇ〜１００ｍｇまたは毎日１２５ｍｇ〜７５ｍｇの特定の事前に特定された用量減少が使用され得る。あるいは、２８日周期のうち推奨された２１日からある程度少ない量までパルボシクリブの頻度を減少させることが望ましいものであり得る。例えば、投与頻度は、２８日周期のうち１５日〜２０日または２８日周期のうち１４日まで減少され得るか、または投与頻度は、２８日周期のうち８日〜１３日または２８日周期のうち７日まで減少され得る。投与された日数は、状況下で必要とされるように、連続的または組み合わせられ得る。一実施形態では、投与間隔にわたって総量は、推奨された用量の２５％〜７５％減少され、その減少が、頻度が少ない投与、投与量の減少、またはこれらの組み合わせの結果として生じ得る。例えば、パルボシクリブの２８日の推奨された投与サイクル（１日１回の１２５ｍｇの用量で２１日）は、２８日にわたって総量２，６２５ｍｇ（２１投与日数×１日当たり合計１２５ｍｇ）をもたらす。この量は、２８日周期当たり６５６．２５ｍｇから２８日周期当たり１，９６８．７５ｍｇまで減少され得る。別の実施形態では、２８日周期当たり２，１００ｍｇまで減少された推奨された２８日のサイクル用量の合計２，６２５ｍｇ。
【００５７】
ある特定の実施形態では、治療上有効量の組み合わせは、治療上有効量の単独で投与されたいずれかの化合物を利用し得る。他の実施形態では、組み合わせによって達成される有意に改善された相乗作用の治療効果のため、併用投与されたときに、治療上有効量のＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、単独で投与されたときに必要とされる治療上有効量のＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）よりも少なくてもよく、一方または両方の化合物が、別々に投与された場合に通常投与され得る投与量よりも低い投与量で投与され得る。任意の特定の理論によって拘束するものではないが、併用療法は、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）のうちの少なくとも１つまたはすべての投与量を減少させ、それによって望ましくない毒性副作用を排除または軽減することによって、有意に改善された効果を達成する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、組み合わせの一部として投与されたときに、治療上有効量のＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、単独で投与されたときに、治療上有効量のＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の約３０％〜約２００％、約４０％〜約２００％、約５０％〜約２００％、約６０％〜約２００％、約７０％〜約２００％、約８０％〜約２００％、約９０％〜約２００％、約１００％〜約２００％、３０％〜約１５０％、約４０％〜約１５０％、約５０％〜約１５０％、約６０％〜約１５０％、約７０％〜約１５０％、約８０％〜約１５０％、約９０％〜約１５０％、約１００％〜約１５０％、約３０％〜約１２０％、約４０％〜約１２０％、約５０％〜約１２０％、約６０％〜約１２０％、約７０％〜約１２０％、約８０％〜約１２０％、約９０％〜約１２０％、約１００％〜約１２０％、３０％〜約１１０％、約４０％〜約１１０％、約５０％〜約１１０％、約６０％〜約１１０％、約７０％〜約１１０％、約８０％〜約１１０％、約９０％〜約１１０％、または約１００％〜約１１０％である。いくつかの実施形態では、組み合わせの一部として投与されたときに、治療上有効量の本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、単独で投与されたときに、本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）の約３０％〜約２００％、約４０％〜約２００％、約５０％〜約２００％、約６０％〜約２００％、約７０％〜約２００％、約８０％〜約２００％、約９０％〜約２００％、約１００％〜約２００％、３０％〜約１５０％、約４０％〜約１５０％、約５０％〜約１５０％、約６０％〜約１５０％、約７０％〜約１５０％、約８０％〜約１５０％、約９０％〜約１５０％、約１００％〜約１５０％、約３０％〜約１２０％、約４０％〜約１２０％、約５０％〜約１２０％、約６０％〜約１２０％、約７０％〜約１２０％、約８０％〜約１２０％、約９０％〜約１２０％、約１００％〜約１２０％、３０％〜約１１０％、約４０％〜約１１０％、約５０％〜約１１０％、約６０％〜約１１０％、約７０％〜約１１０％、約８０％〜約１１０％、約９０％〜約１１０％、または約１００％〜約１１０％である。
【００５９】
ある特定の実施形態では、癌または腫瘍は、耐性ＥＲ駆動型癌または腫瘍（例えば、変異体ＥＲ結合ドメイン（例えば、Ｙ５３７Ｘ1（式中、Ｘ1が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ2（式中、Ｘ2が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、１種以上の変異を含むＥＲα）を有する）であり、ＥＲまたは腫瘍及び／もしくは癌の増殖の過剰発現体がリガンド非依存性になるか、または別のＳＥＲＤ（例えば、フルベストラント、ＴＡＳ−１０８（ＳＲ１６２３４）、ＺＫ１９１７０３、ＲＵ５８６６８、ＧＤＣ−０８１０（ＡＲＮ−８１０）、ＧＷ５６３８／ＤＰＣ９７４、ＳＲＮ−９２７、ＩＣＩ１８２７８２、及びＡＺＤ９４９６）、Ｈｅｒ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ、ラパチニブ、アド−トラスツズマブエムタンシン、及び／もしくはペルツズマブ）、化学療法（例えば、アブラキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、サイトキサン、ダウノルビシン、ドキシル、エレンス、フルオロウラシル、ジェムザール、ヘラベン、ｌｘｅｍｐｒａ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミコキサントロン（ｍｉｃｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ナベルビン、タクソール、タキソテール、チオテパ、ビンクリスチン、及びキセロダ）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、及びレトロゾール）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、及び／もしくはトレミフェン）、血管新生阻害剤（例えばベバシズマブ）、ならびに／またはリツキシマブの治療で進行する腫瘍及び／または癌である。
【００６０】
ある特定の実施形態では、成人対象において、現在開示されている方法で一般に用いるための、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩と本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）との組み合わせの投与量は、１日１回、経口投与の約３０ｍｇ〜２，０００ｍｇ、１００ｍｇ〜１，５００ｍｇ、または１５０ｍｇ〜１，５００ｍｇであり得る。この１日投与量は、単回投与または複数回投与を介して達成され得る。
【００６１】
本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせは、対象に１回または複数回投与され得る。化合物が複数回投与されるこれらの実施形態では、それらは、一連の間隔、例えば、毎日、隔日、毎週、または毎月投与され得る。あるいは、それらは、例えば、症状、患者の健康状態等に基づいて、必要に応じて、不規則な間隔で投与され得る。
【００６２】
（３）製剤
いくつかの実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、別々の製剤で投与される。ある特定のこれらの実施形態では、製剤は、同じタイプのものであり得る。例えば、両方の製剤は、経口投与用（例えば２種の別々の丸剤を介して）または注射用（例えば２種の注射製剤を介して）に設計され得る。他の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、異なるタイプの製剤で製剤化され得る。例えば、ある化合物は、経口投与用に設計される製剤であり得るが、その他は、注射用に設計される製剤であり得る。
【００６３】
他の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、単一製剤の一部として投与される。例えば、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、経口投与用の単一の丸剤または注射用の単一用量で製剤化される。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）を含む組み合わせ製剤が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、単一製剤における化合物の投与は、患者のコンプライアンスを改善する。
【００６４】
併用投与されたときに、治療上有効量の各化合物は、単独で投与されたときに、治療上有効量の各化合物よりも低くなり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩、ＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）での１種以上、あるいはＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）の両方を含む製剤は、１種以上の薬学的賦形剤、担体、アジュバント、及び／または保存剤をさらに含み得る。
【００６６】
現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、単一剤形に製剤化され得、治療を受けている対象のための単一投与量として好適な物理的に別々の単位を意味し、各単位は、任意に、好適な薬学的担体と関連して、所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の予め決定された量を含有する。単位剤形は、単一の１日用量または複数の１日用量（例えば、１日１回、約１〜４回またはそれ以上）のうちの１つであり得る。複数の１日用量が使用される場合、単位剤形は、各用量について同じであってもよく、または異なっていてもよい。ある特定の実施形態では、本化合物は、制御放出のために製剤化され得る。
【００６７】
現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩及び塩または溶媒和物ならびにＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、任意の利用可能な従来の方法に従って製剤化され得る。好ましい剤形の例としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等が挙げられる。製剤化には、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、及び必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤のような通常用いられる添加剤を使用することができる。加えて、製剤化はまた、従来の方法に従って、一般に薬学的製剤の原料として用いられる成分を混合することによって行われる。これらの組成物の例には、例えば、（１）大豆油、牛脂、及び合成グリセリド等の油、（２）流動パラフィン、スクアラン、及び固形パラフィン等の炭化水素、（３）ミリスチン酸オクチルドデシル及びミリスチン酸イソプロピル等のエステル油、（４）セトステアリルアルコール及びベヘニルアルコール等の高級アルコール、（５）シリコーン樹脂、（６）シリコーン油、（７）ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、固形ポリオキシエチレンヒマシ油、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤、（８）ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子、（９）エタノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、（１０）グリセロール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びソルビトール等の多価アルコール、（１１）グルコース及びスクロース等の糖類、（１２）無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びケイ酸アルミニウム等の無機粉末、（１３）精製水等が含まれる。上の製剤で用いるための添加剤には、例えば、１）希釈剤として、ラクトース、コーンスターチ、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、結晶セルロース、及び二酸化ケイ素、２）結合剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガカント、ゼラチン、セラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール−ポリオキシエチレン−ブロックコポリマー、メグルミン、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等、３）崩壊剤として、デンプン、寒天、ゼラチン粉末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース／カルシウム等、４）滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等、５）添加が薬学的に許容される着色剤として十分である任意の着色剤、６）香味剤として、ココアパウダー、メントール、アロマタイザー、ハッカ油、及びシナモンパウダー、７）アスコルビン酸またはアルファ−トフェノール等の添加が薬学的に許容される抗酸化剤が含まれ得る。
【００６８】
現在開示されている方法で用いるための本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）ならびにＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、本明細書に記載される活性化合物のうちのいずれか１つ以上及び生理学的に許容される担体（薬学的に許容される担体または溶液または希釈剤とも称される）として、薬学的組成物に製剤化され得る。かかる担体及び溶液には、本発明の方法で使用された化合物の薬学的に許容される塩及び溶媒和物、ならびにかかる化合物のうちの２つ以上、該化合物の薬学的に許容される塩、及び該化合物の薬学的に許容される溶媒和物を含む混合物が含まれる。かかる組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような許容される薬学的手順に従って調製される。
【００６９】
「薬学的に許容される担体」という用語は、患者においてアレルギー反応または他の不都合な反応を生じず、該患者に投与され、製剤中の他の材料と混合可能である、担体を指す。薬学的に許容される担体は、例えば、目的の投与形態に対して適当に選択され、かつ従来の薬務と一致する、薬学的希釈剤、賦形剤、または担体を含む。例えば、固体担体／希釈剤としては、ガム、デンプン（例えば、コーンスターチ、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば微結晶性セルロース）、アクリレート（例えばポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体は、湿潤剤または乳化剤、治療剤の貯蔵期間または有効性を増強する保存剤または緩衝剤等の少量の補助物質をさらに含み得る。
【００７０】
本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）ならびにＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、遊離形態で、従来の方法によって塩に変換され得る。本明細書に使用される「塩」という用語は、塩がＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩で形成され、薬理学的に許容される限り、限定されず、塩の好ましい例には、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸性塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、第４級アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩等）等が含まれる。加えて、塩酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩等は、本発明に従って化合物の「薬理学的に許容される塩」として好ましい。
【００７１】
ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに／または本明細書に開示されるＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）の異性体（例えば、幾何異性体、光学異性体、回転異性体、互変異性体等）は、例えば、再結晶化、ジアステレオマー塩法等の光学的分解能、酵素分画法、様々なクロマトグラフ法（例えば、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガラスクロマトグラフィー等）を含む通常の分離方法を用いて、単一異性体に精製することができる。本明細書において「単一異性体」という用語は、１００％の純度を有する異性体だけでなく、従来の精製操作を通してでさえ存在する、標的物以外の異性体を含有する異性体も含む。結晶多形は、時には、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに／またはＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）に対して存在し、そのすべての結晶多形は、本発明に含まれる。結晶多形は、時には、単一であり、時には、混合物であり、その両方が、本明細書に含まれる。
【００７２】
ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩  ならびに／またはＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、プロドラッグ形態であり得、その活性型を達成するために、いくつかの変化（例えば、酸化または加水分解）を行わなければならないことを意味する。あるいは、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに／またはＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）は、その活性型への親プロドラッグの変化によって生成される化合物であり得る。
【００７３】
（４）投与経路
ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに／または本明細書に開示されるＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）の投与経路としては、局所投与、経口投与、皮内投与、筋肉投与、腹腔内投与、静脈内投与、膀胱腔内注入、皮下投与、経皮投与、及び経粘膜投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
（５）遺伝子プロファイリング
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法は、対象を遺伝子プロファイリングすることをさらに含み、プロファイリングされた遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＳＸＬ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＡ、ＢＡＰ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＲ２、ＤＮＭＴ３Ａ、Ｅ２Ｆ３、ＥＧＦＲ、ＥＭＬ４、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＷＳＲ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＦＲＳ２、ＨＩＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＯＳ１、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＸ２、ＳＴＫ１１、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、及びＶＨＬから選択される１つ以上の遺伝子である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、サブ集団の乳癌患者を治療する方法であって、当該サブ集団が、上記に開示された遺伝子のうちの１つ以上の発現を増加する、治療する方法と、本開示に記載される投与の実施形態に従って、有効用量の本明細書に記載される１種以上のＣＤＫ４及び／またはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）とＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩との組み合わせで当該サブ集団を治療する方法と、を提供する。
【００７６】
（６）用量の調節
ＲＡＤ１９０１の腫瘍成長を阻害する能力を構築することに加えて、本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１が、子宮及び下垂体においてＥＲへのエストラジオール結合を阻害することを示す（実施例ＩＩＩ（Ａ））。これらの実験において、子宮及び下垂体組織においてＥＲへのエストラジオール結合は、ＦＥＳ−ＰＥＴ画像化によって評価された。ＲＡＤ１９０１による治療後、ＥＲ結合の観察されたレベルは、バックグラウンドレベルでまたはそのレベルを下回った。これらの結果は、ＥＲ活性へのＲＡＤ１９０１の拮抗効果は、リアルタイムの走査を用いて評価され得る。これらの結果に基づいて、結合の減少または消失が有効性を示す、１つ以上の標的組織においてエストラジオール−ＥＲ結合を測定することによって、本明細書に開示される併用療法においてＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩で治療の有効性をモニタリングするための方法が、本明細書に提供される。
【００７７】
エストラジオール−ＥＲ結合に基づいて、本明細書に開示される併用療法において、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の投与量を調節する方法が、さらに提供される。これらの方法のある特定の実施形態では、結合は、第１の投与量の化合物のうちの１つ以上の投与後のいくつかの時点で測定される。エストラジオール−ＥＲ結合が影響を及ぼさないか、または予め決定された閾値を下回る減少（例えば、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、または５０％未満のベースラインに対する結合の減少）を示す場合、第１の投与量は、低すぎると見なされる。ある特定の実施形態では、これらの方法は、増加した第２の投与量の化合物を投与するさらなるステップを含む。これらのステップを繰り返して、エストラジオール−ＥＲ結合の所望の低下が達成されるまで、投与量を繰り返し増加させることができる。ある特定の実施形態では、これらのステップは、本明細書に提供される腫瘍成長を阻害する方法に組み込まれ得る。これらの方法において、エストラジオール−ＥＲ結合は、腫瘍成長の阻害の代用、または成長の阻害を評価する補助手段としての役割を果たし得る。他の実施形態では、これらの方法は、例えば、癌細胞増殖の阻害を含む、腫瘍成長の阻害以外の目的のために、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の投与と併用して使用することができる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、併用療法において、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）の投与量を調節するための本明細書に提供される方法は、
（１）第１の投与量のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）（例えば、約３５０〜約５００または約２００〜約６００ｍｇ／日）を、３、４、５、６、または７日間投与することと、
（２）エストラジオール−ＥＲ結合活性を、例えば、本明細書に開示されるＦＥＳ−ＰＥＴ画像化を用いて検出することであって、
（ｉ）ＥＲ結合活性が、検出不可能である、または予め決定された閾値レベルを下回る場合、第１の投与量を継続して投与する（すなわち、投与量レベルを維持する）こと、または
（ｉｉ）ＥＲ結合活性が、検出可能である、または予め決定された閾値レベルを上回る場合、第１の投与量よりも多い第２の投与量（例えば、第１の投与量＋約５０〜約２００ｍｇ）を３、４、５、６、または７日間投与し、次いで、ステップ（３）に進むこと、
（３）エストラジオール−ＥＲ結合活性を、例えば、本明細書に開示されるＦＥＳ−ＰＥＴ画像化を用いて検出することであって、
（ｉ）ＥＲ結合活性が、検出不可能である、または予め決定された閾値レベルを下回る場合、第２の投与量を継続して投与する（すなわち、投与量レベルを維持する）こと、または
（ｉｉ）ＥＲ結合活性が、検出可能である、または予め決定された閾値レベルを上回る場合、第２の投与量よりも多い第３の投与量（例えば、第２の投与量＋約５０〜約２００ｍｇ）を３、４、５、６、または７日間投与し、次いで、ステップ（４）に進むこと、
（４）ＥＲ結合活性が検出されなくなるまで、第４の投与量、第５の投与量等を通して、上のステップを繰り返すこと、を含む。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＥＲ感受性またはＥＲ耐性癌を検出及び／または投与するために、ＰＥＴ画像化の使用を含む。
【００８０】
（７）本明細書に開示される方法のための組み合わせ
本発明の別の態様は、本明細書に記載の組み合わせ方法のために、本明細書に開示される治療上有効量で、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩ならびに／または本明細書に開示されるＣＤＫ４及び／もしくはＣＤＫ６阻害剤（複数可）（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）を含む薬学的組成物に関する。
【００８１】
ＲＡＤ１９０１−ＥＲαの相互作用
（１）内分泌療法のうちの少なくとも１つの方針を受けている患者からのＥＲ陽性乳癌腫瘍試料中の変異体ＥＲα
過去２年間に報告された５つの研究において、内分泌療法のうちの少なくとも１つの方針を受けている患者からの合計１８７の転移性ＥＲ陽性乳癌腫瘍試料が、配列決定され、ＥＲ  ＬＢＤ変異が、３９人の患者（２１％）において特定された（Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎ）。３９人の患者の中で、６つの最も頻繁なＬＢＤ変異を、Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎから適合された図３９に示す。
【００８２】
すべてのＬＢＤ変異の頻度を、表９に要約する。
【００８３】
コンピュータモデリングは、ＲＡＤ１９０１−ＥＲαの相互作用が、ＥＲαのＬＢＤの変異体、例えばＹ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘが、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、及びＳ４６３Ｐによって影響を受ける可能性が低いことを示し、これは、内分泌療法のうちの少なくとも１つを施した患者からの転移性ＥＲ陽性乳房の腫瘍試料の最近の研究に見出されたＬＢＤ変異の約８１．７％を占める（表１０、実施例Ｖ）。
【００８４】
ＥＲα及び／または変異体ＥＲαと結合するＲＡＤ１９０１の複合体及び結晶が、本明細書に提供され、変異体ＥＲαは、Ｙ５３７Ｘ1（式中、Ｘ1が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ2（式中、Ｘ2が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の変異を含む。
【００８５】
本明細書に提供される方法のある特定の実施形態では、ＥＲα及び変異体ＥＲαのＬＢＤは、ＡＦ−２を含む。他の実施形態では、ＬＢＤは、ＥＲαのアミノ酸２９９〜５５４を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。ある特定の実施形態では、変異体ＥＲαのＬＢＤは、Ｙ５３７Ｘ1（式中、Ｘ1が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ2（式中、Ｘ2が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の変異を含む。本明細書に使用される「及び／または」という用語は、「及び」の場合と「または」の場合の両方を含む。
【００８６】
以下の実施例は、請求された発明をよりよく例証するために提供され、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。特定の材料が言及される程度では、それは、単に例証の目的のためであり、及び本発明を限定することを意図しない。当業者は、発明能力の行使なしで、及び本発明の範囲を逸脱しない範囲で、均等な手段または反応を開発するであろう。多くの変更が、本明細書に記載される手順でなされ得るが、一方、依然として本発明の範囲内で維持されることを理解されよう。かかる変更が、本発明の範囲内に含まれることが本発明者らの意図である。
【実施例】
【００８７】
材料及び方法
試験化合物
以下の実施例に使用されるＲＡＤ１９０１は、ＩＲＩＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって製造された（６Ｒ）−６−（２−（Ｎ−（４−（２−（エチルアミノ）エチル）ベンジル）−Ｎ−エチルアミノ）−４−メトキシフェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−オール二塩酸塩であった（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＳＣ）。ＲＡＤ１９０１は、乾燥粉末として保存され、脱イオン水中の０．５％（ｗ／ｖ）メチルセルロース中の均一の懸濁液として使用するために製剤化され、動物モデルにおいては、経口投与によって投与された。タモキシフェン、ラロキシフェン、及びエストラジオール（Ｅ２）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られ、皮下注射によって投与された。フルベストラントは、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得られ、皮下注射によって投与された。その他の実験試薬は、別途記述がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００８８】
細胞株
ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳房転移性腺癌）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した、２ｍＭのＬ−グルタミン及びＥａｒｌｅのＢＳＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッドフリーの最小必須培地（ＭＥＭ）中で、通常、５％ＣＯ2で維持した。
【００８９】
Ｔ４７Ｄ細胞を、１０％ＦＢＳ及び５μｇ／ｍＬのヒトインスリンを補充したＲＰＭＩ増殖培地中で約７５％コンフルエントになるまで１０ｃｍの皿中で５％ＣＯ2インキュベーターで培養した。
【００９０】
インビボでの異種移植片モデル
すべてのマウスを、明暗周期（人工光の１２〜１４時間の概日周期）ならびに制御された室温及び湿度下で、不断で滅菌食及び水へのアクセスする、滅菌した埃のない寝わらの塊（ｂｅｄｄｉｎｇ  ｃｏｂ）を有する個々に換気したケージの中に無菌ハウジングに収容した。腫瘍は、ノギスで週２回測定し、体積は、式：（Ｌ＊Ｗ2）＊０．５２を用いて計算した。
【００９１】
ＰＤｘモデル
患者由来の異種移植片モデル（ＰＤｘモデル）のいくつかの例を、図１に示す。患者由来の乳癌腫瘍を有するＰＤｘモデルは、腫瘍の不均一性を維持するために、動物（無胸腺ヌードマウス（Ｎｕ（ＮＣＦ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ））において、限定された回数、連続継代している生存ヒト腫瘍組織または液体から構築された。前試験腫瘍体積は、その推定された開始日より約１週間前に開始する各実験で記録した。腫瘍がおよそ腫瘍体積開始（ＴＶＩ）の範囲（１５０〜２５０ｍｍ3）に達したとき、動物を治療及び対照群にランダム化し、投与を開始し（０日目、各群において８〜１０匹）、すべての試験における動物は各実験において個々に従った。投与開始は、０日目に開始、すべての群の動物は、体重別に投与した（１グラム当たり０．０１ｍＬ、１０ｍｌ／ｋｇ）。各群は、０日目から特定されるように、ビヒクル（対照、エンドポイントまで１日１回経口投与）、タモキシフェン（１ｍｇ／対象、皮下注射、エンドポイントまで１日毎）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）；必要に応じて、１ｍｇ／対象または３ｍｇ／対象、週１回皮下注射×５、必要に応じて延長）、またはＲＡＤ１９０１（３０または６０または１２０ｍｇ／対象のｋｇ、エンドポイントまで１日１回経口投与）で治療した。治療期間は、モデルに応じて、５６〜６０日間続いた。これらのＰＤｘモデルのための飲料水に、１７β−エストラジオールを補充した。
【００９２】
薬剤の有効性
すべての試験において、０日目に開始し、腫瘍寸法を、各群に対して記録された個々の及び平均の推定された腫瘍体積（平均ＴＶ±標準誤差）を含むデジタルキャリパーによって測定し、腫瘍体積を、式（Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １７：２５９−２６９（１９９７）、これは参照により本明細書に組み込まれる）：ＴＶ＝幅2×長さ×０．５２を用いて計算した。腫瘍体積（ＴＶ）エンドポイントに達したらすぐに、各群または試験を終了し（時間エンドポイントは、６０日であり、体積エンドポイントは、群平均２ｃｍ3であった）、２ｃｍ3以上の腫瘍体積に達する個々のマウスは、試験から除外し、最終測定は、平均が体積エンドポイントに達するかまたは試験が時間エンドポイントに達するまで群平均に含まれた。
【００９３】
有効性の計算及び統計学的分析
腫瘍成長阻害（％）（ＴＧＩ（％））値は、単一時点で計算し（対照群が腫瘍体積または時間エンドポイントに達したとき）、式によって初期（ｉ）及び最終（ｆ）腫瘍測定を用いて各治療群（Ｔ）対対照（Ｃ）について報告した（Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＴＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｉｎ：  Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ．２００４：９９−１２３．）：ＴＧＩ（％）＝１−Ｔｆ−Ｔｉ／Ｃｆ−Ｃｉ。
【００９４】
統計学
ＴＧＩ試験−一元配置分散分析＋Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定（Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＴＨら）。
【００９５】
試料採集
エンドポイントで、腫瘍を除去した。ある断片を急速冷凍し、一方、別の断片を、１０％ＮＢＦ中に少なくとも２４時間入れ、ホルマリン固定パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）。急速冷凍した試料を、−８０℃で保存し、ＦＦＰＥブロックを、室温で保存した。
【００９６】
ウェスタンブロット
細胞を採取し、タンパク質発現を、標準的技法を用いて分析した。腫瘍を、投与の最終日後に指示された時点で採取し、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。等量のタンパク質を、ＭＷによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、標準的技法を用いて以下の抗体でブロットした：
●エストロゲン受容体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  （ＨＣ−２０）；ｓｃ−５４３）
●プロゲステロン受容体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；３１５３）
●ビンキュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｖ９１３１）
【００９７】
ｑＰＣＲ分析を、次のように行った：細胞を採取し、ｍＲＮＡを抽出し、等量が、プロゲステロン受容体、ＧＲＥＢ１、及びＴＦＦ１（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）に特異的なプライマーを有するｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲのために使用した。帯は、１Ｄ  Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を用いて定量化した。
【００９８】
免疫組織化学
腫瘍を採取し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。包埋した腫瘍を切断し（６μＭ）、ＥＲ、ＰＲ、及びＨｅｒ２に特異的な抗体で染色した。定量化を以下の通りに行った：５つの分野を、陽性細胞（０〜１００％）及び染色強度（０〜３＋）について計数した。Ｈスコア（０〜３００）を、以下の式：陽性（％）＊強度、を用いて計算した。
【００９９】
実施例Ｉ．ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、異なる事前内分泌療法を用いて、ＷＴ  ＥＲまたは変異体ＥＲ（例えばＹ５３７Ｓ）を発現する腫瘍及び／または癌において増強した腫瘍成長の阻害を提供した。
【０１００】
Ｉ（Ａ）．動物異種移植片モデルにおけるＲＡＤ１９０１の有効性
Ｉ（Ａ）（ｉ）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＥＲ状態及び事前内分泌療法にもかかわらず、ＰＤｘモデル（ＰＤｘ−１〜ＰＤｘ−１２）において改善された腫瘍成長の阻害を示した。
【０１０１】
図１は、ＲＡＤ１９０１単独及び／またはＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせで治療したマウスにおける様々なＰＤｘモデルにおいて腫瘍成長の阻害を実証する。１２の患者由来の異種移植片モデルをスクリーニングして、様々なレベルのＥＲ、ＰＲ、及びＨｅｒ２を有する様々な遺伝的バッググラウンドにおけるＲＡＤ１９０１反応を試験した。ｎ＝８〜１０を有する、「＊」の印が付いたＰＤｘモデル（ＰＤｘ−１〜ＰＤｘ−４、及びＰＤｘ−１２）に対して、完全有効性試験を行った。これらのＰＤｘモデルを、６０ｍｇ／ｋｇの投与量のビヒクル（陰性対照）、ＲＡＤ１９０１で、１日１回経口投与、またはＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせ（６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１とパルボシクリブ）で、１日１回経口投与で６０日間治療した。スクリーニング試験は、９０ｍｇ／ｋｇの投与量のビヒクル（陰性対照）またはＲＡＤ１９０１を１日１回経口投与で６０日間治療した、ｎ＝３を有する他のＰＤｘモデル（ＰＤｘ−５〜ＰＤｘ−１１）に対して行われた。図１で示されるように、ＥＲ及びさらなるドライバー（例えばＰＲ＋及び／またはＨｅｒ２＋）で成長を引き起こしたＰＤｘモデルに対して、ＲＡＤ１９０１治療が有効であった。ＲＡＤ１９０１は、前治療、ナイーブ（Ｒｘ−陰性）、またはアロマターゼ阻害剤、タモキシフェン（ｔａｍ）、化学療法（ｃｈｅｍｏ）、Ｈｅｒ２阻害剤（Ｈｅｒ２ｉ、例えばトラスツズマブ、ラパチニブ）、ベバシズマブ、フルベストラント、及び／もしくはリツキシマブのいずれかの治療にもかかわらず、ＥＲ変異及び／または高いレベルの発現のＨｅｒ２（ＰＤｘ）を有するモデルにおいて腫瘍成長を阻害する際に有効であった。
【０１０２】
ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＲＡＤ１９０１の単一薬剤治療が、６４％以下のＴＧＩに達したＰＤｘモデル（ＰＤｘ−２、ＰＤｘ−５、ＰＤｘ−７、ＰＤｘ−８、ＰＤｘ−９、及びＰＤｘ−１０）において腫瘍成長の阻害の増強を示した。当該ＰＤｘモデルは、ナイーブモデル（ＰＤｘ−２、ＥＲ＋＋、ＰＲ＋＋、及びＨｅｒ２＋）、ならびにアロマターゼ阻害剤（ＡＩ、タモキシフェン（ｔａｍ）、化学療法（ｃｈｅｍｏ）、Ｈｅｒ２阻害剤（Ｈｅｒ２ｉ、例えばトラスツズマブ、ラパチニブ）、ベバシズマブ、フルベストラント、及び／またはリツキシマブ（ＰＤｘ−５、ＰＤｘ−７、ＰＤｘ−８、ＰＤｘ−９、及びＰＤｘ−１０）の前治療を受けているモデルを含む。ＰＤｘ−５モデルは、変異体ＥＳＲ１を発現したが、一方、他のＰＤｘモデルは、ＷＴ  ＥＳＲ１を発現した。ＰＤｘ−２及びＰＤｘ−５モデルは、ＰＲ＋及びＨｅｒ２＋であったが、一方、他のＰＤｘモデルは、ＰＲ−及びＨＥＲ２＋であった。ＲＡＤ１９０１単一薬剤治療が、ＰＤｘ−６及びＰＤｘ−１１モデルにおいて６５％以上のＴＧＩを提供したため、パルボシクリブを用いた及び用いなかったＲＡＤ１９０１治療間の差は、図１に示すことができなかった。例えば、ＰＤｘ１１モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１単独よりもさらに有意な腫瘍退縮を生じさせた、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせを示す実施例（Ｉ）（Ａ）（ｉｉ）及び図３Ｂを参照されたい。
【０１０３】
Ｉ（Ａ）（ｉｉ）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＷＴ  ＥＲを発現する異種移植片モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１単独よりもさらに退縮を引き起こした。
【０１０４】
Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（１）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブは、フルベストラント治療に反応したＭＣＦ−７異種移植片において、ＲＡＤ１９０１単独よりもさらに退縮を引き起こした。
【０１０５】
ＭＣＦ７異種移植片モデル
細胞移植の２日前に、Ｂａｌｂ／Ｃ−ヌードマウスを、１７β−エストラジオールペレットで０．１８／９０日の放出でインキュベートした。ＭＣＦ７細胞（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−）を採取し、１×１０7細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃ−ヌードマウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍は、２００ｍｍ3の平均を達した場合、マウスを、腫瘍体積別に治療群にランダム化し、試験化合物で治療した。各群は、０日目から特定されるように、ビヒクル（対照、エンドポイントまで１日１回経口投与）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）；３ｍｇ／対象、週１回皮下注射×５、必要に応じて延長）、ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／対象のｋｇ、エンドポイントまで１日１回経口投与）、パルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇまたは７５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ、エンドポイントまで１日１回経口投与）、またはＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせで治療した。治療期間は、２８日間続いた。
【０１０６】
図２Ａ〜Ｃは、ＭＣＦ７異種移植片モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１を６０ｍｇ／ｋｇで１日１回経口投与、及びパルボシクリブを４５ｍｇ／ｋｇで１日１回経口投与したＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇの１日１回経口投与）を１４日目に腫瘍サイズを約５０％まで著しく減少させたことを示す。ＲＡＤ１９０１及びパルボシクリブは、単独で投与された場合に、腫瘍成長を阻害する際に、有効性を示した。
【０１０７】
これらの結果を確認するために、ＭＣＦ７異種移植片マウスを、ビヒクル（陰性対照）、ＲＡＤ１９０１（３０または６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、ＲＡＤ１９０１（３０または６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせ、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、またはフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせで治療した。腫瘍サイズを、様々な時点で２７日間測定した。
【０１０８】
結果を図２Ａ〜Ｂに示す。ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ）とパルボシクリブ（４５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせによる治療は、有意な腫瘍退縮を再度もたらし、ＲＡＤ１９０１、パルボシクリブ、またはフルベストラント単独、またはフルベストラントとパルボシクリブとの組み合わせでの治療に対して優れた結果を有した（図２Ａ〜Ｂ）。
【０１０９】
図２Ｃは、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇの用量でＲＡＤ１９０１による同様の効果を与えたが、３０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１単独は、腫瘍成長を阻害する際に、６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１単独ほど有効ではなかったことを示す。当該の結果は、より低用量（例えば３０ｍｇ／ｋｇ）のＲＡＤ１９０１を用いたＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、当該異種移植片モデルにおいて腫瘍成長の阻害／腫瘍退縮の効果を最大限にするのに十分であったことを示唆している。
【０１１０】
ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせでの治療はまた、ＲＡＤ１９０１、パルボシクリブ、もしくはフルベストラント単独で治療、またはフルベストラントとエベロリムスとの組み合わせ（図１３）；最終投与から２時間後に採取した腫瘍）よりもＭＣＦ−７異種移植片モデルにおいて、インビボでＥＲ及びＰＲの発現を減少させる場合にさらに有効であった。
【０１１１】
Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（２）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブは、フルベストラント治療に反応したＰＤｘ−１１及びＰＤｘ−２モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１単独よりもさらに腫瘍退縮を引き起こした。
【０１１２】
ＥＲ  ＷＴ  ＰＤｘモデルＰＤｘ−２（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−、治療ナイーブ）ならびにＰＤｘ−１１（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、ＡＩ、フルベストラント、及び化学療法で治療した）は、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）に対して異なる感受性を示した。ＰＤｘ−２及びＰＤｘ−１１モデルは、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とパルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）との組み合わせ、ＲＡＤ１９０１単独（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ単独（７５ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、またはフルベストラント単独（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療した。ＰＤｘ−１１モデルはまた、パルボシクリブ（７５ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回）とフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）との組み合わせでも治療した。
【０１１３】
ＰＤｘ−１１モデルでは、フルベストラントまたはパルボシクリブ単独は、腫瘍成長を有意に阻害し、フルベストラントで治療したマウスは、腫瘍成長の阻害においてより良好な効果を示した。フルベストラント−パルボシクリブの組み合わせは、わずかに腫瘍退縮を示した。意外にも、ＲＡＤ１９０１単独またはパルボシクリブとの組み合わせの投与は、有意な腫瘍退縮をもたらし、この組み合わせは、野生型ＥＳＲ１  ＰＤｘモデルにおいてより有意な腫瘍退縮の効果を達成した（図３Ｂ））。
【０１１４】
ＰＤｘ−２モデルでは、ＲＡＤ１９０１単独の経口投与は、フルベストラント単独の注射と比較して腫瘍成長を阻害する良好な効果を達成した（図４Ａ）。さらに、ＲＡＤ１９０１またはパルボシクリブ単独の投与は、腫瘍成長を有意に阻害した。意外にも、パルボシクリブと組み合わせたＲＡＤ１９０１の投与は、腫瘍成長を阻害する際にさらに増強した効果をもたらした（図４Ｂ））。
【０１１５】
さらに、フルベストラント治療（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）に対して反応したＰＤｘ−４モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１の媒介による腫瘍成長の阻害は、ＲＡＤ１９０１治療（３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）期間が終了してから少なくとも２カ月間治療の不在下で維持された（図５）。
【０１１６】
それ故に、ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、特に、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、リボシクリブ、アベマシクリブ、及びパルボシクリブ）が、それらの副作用（Ｏ’Ｌｅａｒｙ）により間欠的にのみ投与され得るときに、治療を終了した後に、腫瘍成長を阻害することによって患者に利益をもたらす可能性が高い。
【０１１７】
Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブは、変異体ＥＲ（ＥＲα  Ｙ５３７Ｓ）を発現する異種移植片モデルにおいてＲＡＤ１９０１単独よりもさらに退縮を引き起こした。
【０１１８】
Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（１）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブは、フルベストラントに対してほとんど反応しなかったＰＤｘ−５モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１単独よりも退縮を引き起こした。
【０１１９】
ＰＤｘ−５モデルは、ＰＤｘモデルについて上述されるように、以下の同様のプロトコルを調製した。各投与群の腫瘍サイズは、ノギスで週２回測定し、体積は、式（Ｌ＊Ｗ２）＊０．５２を用いて計算した。
【０１２０】
変異体ＥＲ  ＰＤｘ−５モデル（Ｙ５３７Ｓエストロゲン受容体変異を有する患者由来の乳癌腫瘍を有するＰＤｘモデル、ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤による前治療）において、パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、耐性問題のため、７５ｍｇ／ｋｇの中間試験まで低下させた）と組み合わせた、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、耐性問題のため、７５ｍｇ／ｋｇの中間試験まで低下させた、１日１回経口投与）、及びＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）による腫瘍成長の阻害は、上述の方法を用いて評価された。ある特定のＥＲα変異（例えばＹ５３７Ｓ）を発現する腫瘍については、ＲＡＤ１９０１及びパルボシクリブの組み合わせ治療が、いずれかの薬剤単独での治療よりも腫瘍成長を阻害する際により有効であった（図６Ａ））。これらのＰＤｘモデルは、フルベストラント（３ｍｇ／用量）による治療ほど感受性ではなかった（図６Ａ）。ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせ治療は、ＲＤｘ−５モデル（図６Ｂ〜Ｃ）において腫瘍退縮を引き起こす際に、いずれかの薬剤単独での治療よりも有効であり、これは、１７日目と５６日目にそれぞれ、ベースラインからの個々の腫瘍サイズの変化を示した）。
【０１２１】
ＰＤｘ−５は、ビヒクル（陰性対照）、フルベストラント（ｆａｓｌｏｄｅｘ  ３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、耐性問題のため、７５ｍｇ／ｋｇの中間試験まで低下させた）、またはＲＡＤ１９０１（６０または１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）及びパルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、耐性問題のため、７５ｍｇ／ｋｇの中間試験まで低下させた）で治療した。測定された腫瘍サイズを、（図７Ａ〜Ｂ）に示した。ＰＤｘ−５モデルは、フルベストラント治療に耐性があったが、ＲＡＤ１９０１及びパルボシクリブは、いずれか単独でまたは併用は、腫瘍成長を阻害した。６０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＲＡＤ１９０１単独は、１００ｍｇ／ｋｇでパルボシクリブ単独と実質的に同一の有効性を有したが（図７Ａ）、一方、１２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＲＡＤ１９０１単独は、１００ｍｇ／ｋｇでパルボシクリブ単独と比較して、改善された有効性を有した（図７Ｂ）。６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１の経口投与は、腫瘍成長の有意な阻害を達成した（図８）。さらに、パルボシクリブ単独またはフルベストラントとの併用投与は、変異体ＰＤｘモデルにおいて有意に腫瘍成長を阻害したが、併用は、阻害をさらに増強しなかった（図８）。
【０１２２】
意外にも、ＲＡＤ１９０１単独またはパルボシクリブとの併用は、さらに有意な腫瘍阻害を達成し、この併用は、変異体ＰＤｘモデルにおいてほぼ完全に腫瘍成長を阻害し、より低用量（例えば６０ｍｇ／ｋｇ）のＲＡＤ１９０１を用いたＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせが、ＰＤｘ−５モデルにおいて腫瘍成長の阻害／腫瘍退縮の効果を最大限にするのに十分であった（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１２３】
それ故に、これらの結果は、ＲＡＤ１９０１が、標的薬剤の腫瘍成長の阻害を促進した有効な内分泌骨格であったことを示した。さらに、ＲＡＤ１９０１は、フルベストラントに対して反応がないものを含む、複数の前内分泌療法を受けた患者から由来するＰＤｘモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した。
【０１２４】
Ｉ（Ａ）（ｉｖ）非腫瘍担持マウスに対するフルベストラント治療の薬物動態評価。
【０１２５】
様々な用量のフルベストラントをマウスに投与し、これらは、対象への有意な用量曝露を示した（図９）。
【０１２６】
フルベストラントを、１、３、または５ｍｇ／用量で、ヌードマウスに、１日目（Ｄ１  Ｒｘ）及び８日目（Ｄ８  Ｒｘ、ｎ＝４／用量レベル）に皮下投与した。血液を、２回目の投与から１６８時間まで指示された時点で採血し、遠心分離し、血漿を液体クロマトグラフィー質量分析法で分析した。
【０１２７】
Ｉ（Ｂ）ＲＡＤ１９０１は、脳転移のマウス異種移植片モデル（ＭＣＦ−７頭蓋内モデル）において生存を助長した。
【０１２８】
血液脳関門を横断し、腫瘍成長を阻害するＲＡＤ１９０１の潜在能力は、ＭＣＦ−７頭蓋内腫瘍異種移植片モデルを用いてさらに評価された。
【０１２９】
雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を、腫瘍異種移植片試験のために使用した。腫瘍細胞移植の３日前に、エストロゲンペレット（０．３６ｍｇのＥ２、６０日の放出；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を、滅菌套管針を用いてすべての試験動物の肩甲骨間に皮下移植した。ＭＣＦ−７ヒト乳腺癌細胞は、１０％  ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭ  グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０７５％  重炭酸ナトリウム、及び２５ｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地内で中間ログ相まで培養した。腫瘍細胞移植日に、細胞をトリプシン化し、ペレット化し、５×１０7細胞／ｍＬの濃度で、リン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁した。各試験マウスに、１×１０6  ＭＣＦ−７細胞を頭蓋内に移植した。
【０１３０】
腫瘍細胞移植から５日後に（試験の１日目と表される）、マウスを、１２匹ずつの動物の３つの群にランダム化し、上述のように、ビヒクル、フルベストラント（０．５ｍｇ／動物  １日１回）、またはＲＡＤ１９０１（１２０ｍｇ／ｋｇ  １日１回）で治療した。
【０１３１】
エンドポイントは、死亡率または対照群の３倍の生存率のいずれか早い方として定義された。体重測定、及び処置に関連した副作用の臨床症候に関する頻繁な観察により、処置耐性を評価した。１回の測定において３０％を超える、または３回の測定において２５％を超える体重減少を有する動物は、人道的に殺処分し、処置関連死として分類された。許容され得る毒性は、試験期間中で２０％未満の群平均体重損失、及び１０匹の処置動物の中で多くても１匹の処置関連死、または１０％として定義された。試験の終了時に、動物は、イソフルラン麻酔下で末期的心穿刺によって殺処分した。血漿及び腫瘍中のＲＡＤ１９０１及びフルベストラント濃度は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて決定した。
【０１３２】
カプランマイヤー生存分析は、ＲＡＤ１９０１がフルベストラントと比較して有意に生存を延ばしたことを示した（Ｐ＜０．０００１；図１０）。対照またはフルベストラント群の動物は、それぞれ、２０日目及び３４日目を超えて生存したものはいなかったが、ＲＡＤ１９０１で処置した動物のうちの４１％（５／１２）が、５４日目の試験終了まで生存した。
【０１３３】
血漿中のＲＡＤ１９０１の濃度は、７３８±４７１ｎｇ／ｍＬであり、頭蓋内腫瘍では、４６２±１０５ｎｇ／ｇであり、このことは、ＲＡＤ１９０１が血液脳関門を有効に横断することができるという仮説を支持した。対照的に、フルベストラントの濃度は、血漿中（２１±１０ｎｇ／ｍＬ）及び頭蓋内腫瘍中（８．３±０．８ｎｇ／ｇ）で実質的には低かった。
【０１３４】
実施例ＩＩ．ＲＡＤ１９０１は、好ましくは腫瘍中で蓄積し、脳に送達され得る。
【０１３５】
実施例Ｉ（Ａ）（ｉ）に記載されるように、ＭＣＦ−７異種移植片を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、血漿及び腫瘍中のＲＡＤ１９０１濃度についてさらに評価した。試験の終了時に、血漿中のＲＡＤ１９０１の濃度は、３４４±１１７ｎｇ／ｍＬであり、腫瘍中では、６０ｍｇ／ｋｇの用量レベルに対して１１，１１８±３，８０１ｎｇ／ｍＬであった。腫瘍濃度が血漿中よりも約２０〜３０倍高かった場合に、同様の腫瘍対血漿の比率も、より低い用量レベルで観察された。４０日間処置されたマウスの血漿、腫瘍、及び脳中のＲＡＤ１９０１レベルを、表１に要約する。有意な量のＲＡＤ１９０１が、処置マウスの脳に送達され（例えば、Ｂ／Ｐ比（脳中のＲＡＤ１９０１濃度／血漿中のＲＡＤ１９０１濃度）を参照のこと）、このことは、ＲＡＤ１９０１が血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができたことを示した。意外にも、ＲＡＤ１９０１は、好ましくは腫瘍中で蓄積した。例えば、表１に示されるＴ／Ｐ（腫瘍中のＲＡＤ１９０１濃度／血漿中のＲＡＤ１９０１濃度）比を参照されたい。
【０１３６】
実施例ＩＩＩ．ＲＡＤ１９０１は、ＥＲ経路を阻害し、ＥＲを分解した。
【０１３７】
ＩＩＩ（Ａ）．ＲＡＤ１９０１は、健常な閉経後の女性ヒト対象の子宮及び下垂体においてＥＲ関与を軽減した。
【０１３８】
対象は、少なくとも１２か月間無月経であり、血清ＦＳＨが閉経と一致した。対象は、１８．０〜３０ｋｇ／ｍ2のＢＭＩを有する、４０〜７５歳であった。対象は、無傷子宮であった。臨床的に関連する病理の証拠を有し、卒中もしくは過去に静脈血栓塞栓事象のリスク増加がある、または臨床研究センターに登録する１４日以内に併用薬（パラセタモールは、３日前まで許容された）の使用を有する患者は、除外された。
【０１３９】
ＦＥＳ−ＰＥＴは、子宮内のＥＲ関与を評価するために、ベースライン及びＲＡＤ１９０１への曝露から６日後に行われた。ＲＡＤ１９０１は、それぞれ、２００ｍｇ（７人の対象）及び５００ｍｇ（６人の対象）の用量レベルで、子宮内でＥＲが８３％及び９２％を占めた。
【０１４０】
ＦＥＳ−ＰＥＴ画像は、２００ｍｇまたは５００ｍｇのＲＡＤ１９０１による治療（１日１回経口投与、６日）後に、子宮及び下垂体の両方への標識エストラジオールの結合の有意な減少を示した。
【０１４１】
高いＥＲ発現により、子宮は、ＲＡＤ１９０１治療前にベースラインで強力なＦＥＳ−ＰＥＴシグナル（図１１Ａ）、２００ｍｇの用量レベルで治療した対象３の子宮ＦＥＳ−ＰＥＴスキャンにおけるベースラインの横断図；図１１Ｂ、５００ｍｇの用量レベルで治療した対象７のベースラインの子宮ＦＥＳ−ＰＥＴスキャンにおける、それぞれ、矢状図及び横断図）を示した。しかしながら、試験中の６日目に投与してから４時間後にスキャンした場合、子宮は、ほとんど見えなかった（バックグラウンドＦＥＳ−ＰＥＴシグナルでまたはそれの近くに（図１１Ａ）、対象３の子宮スキャンにおける６日目の横断図；及び図１１Ｂ、対象７の子宮スキャンにおける、それぞれ、６日目の矢状図及び横断図）。かかるデータは、ＥＲの分解及び／または受容体への結合に対する競合と一致した。図１１Ａ〜Ｂはまた、ＲＡＤ１９０１治療前及び後の子宮の存在を示す、ＦＥＳ−ＰＥＴによってスキャンされた子宮のＣＴスキャンも含む。
【０１４２】
ＦＥＳ−ＰＥＴの子宮スキャンの結果は、２００ｍｇの用量群及び５００ｍｇの用量群の例として、それぞれ、対象１〜３及び対象４〜７を示す、７人の対象についてベースラインから投与後のＥＲ結合の変化を示すためにさらに定量化した（図１１（Ｃ））。ＲＡＤ１９０１は、低用量（２００ｍｇ）で強固なＥＲ関与を示した。
【０１４３】
図１２は、５００ｍｇのＲＡＤ１９０１の１日１回経口投与で６日間治療する前（ベースライン）及び治療した後（治療後）の子宮（Ａ）及び下垂体（Ｂ）のＦＥＳ−ＰＥＴスキャンの代表的な画像を示した。図１２Ａは、（ａ）側面横断図、（ｂ）縦横断図、及び（ｃ）縦横断図によって子宮のＦＥＳ−ＰＥＴスキャンを示した。
【０１４４】
子宮及び下垂体の対象の投与後のＦＥＳ−ＰＥＴスキャンは、それぞれ、子宮（図１２Ａ、治療後）及び下垂体（図１２Ｂ、治療後）でＥＲ結合の顕著なシグナルを示さなかった。
【０１４５】
それ故に、結果は、ＲＡＤ１９０１が、２００及び５００ｍｇの投与量で、１日１回６日間経口投与したヒトにおいてＥＲが有効に関与したことを示した。
【０１４６】
子宮、筋肉、及び骨に対する標準取り込み値（ＳＵＶ）を計算し、２００ｍｇ及び５００ｍｇで１日１回経口投与したＲＡＤ１９０１での治療について、それぞれ、表２及び３に要約した。投与後の子宮シグナルは、「非標的組織」からのレベルに非常に近く、ＲＡＤ１９０１治療後のＦＥＳ−ＰＥＴの取り込みの完全な減衰を示唆している。エストロゲン受容体を有意に発現しなかった組織中の治療前対治療後ＰＥＴスキャンについては、ほとんど変化が観察されなかった。
【０１４７】
それ故に、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）は、他の臓器（例えば、骨、筋肉）への悪影響を有さない、ＥＲの過剰発現を有する癌及び／または腫瘍細胞（例えば、乳癌、子宮癌、及び卵巣癌）を治療する際に使用することができる。ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）は、他の臓器（例えば、骨、筋肉）への乳癌、子宮癌、及び／または卵巣癌病巣を治療するために、当該臓器への悪影響を有さない、他の臓器においてＥＲ過剰発現を有する転移性癌及び／または腫瘍、例えば、他の臓器（例えば、骨、筋肉）に移動する元の乳癌、子宮癌、及び／または卵巣癌を治療する際に特に有用であり得る。
【０１４８】
ＩＩＩ（Ｂ）．ＲＡＤ１９０１は、ＥＲ発現を減少させ、ＥＲ経路を阻害した。
【０１４９】
ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（１）ＲＡＤ１９０１−パルボシクリブの組み合わせは、ＭＣＦ７異種移植片モデルにおいてＥＲ及びＰＲ発現を減少させ、ＲＡＤ１９０１、パルボシクリブ、またはフルベストラント単独、またはフルベストラント−パルボシクリブの組み合わせによる治療においてより有効であった。
【０１５０】
ＲＡＤ１９０１とパルボシクリブとの組み合わせによる治療はまた、ＲＡＤ１９０１、パルボシクリブ、またはフルベストラント単独、またはフルベストラントとパルボシクリブとの組み合わせによる治療よりもＭＣＦ７異種移植片モデル（実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉ）で記載されるように）においてインビボでＥＲ及びＰＲ発現を減少させる際により有効であった（図１３）、腫瘍は最終投与から２時間後に採取した）。
【０１５１】
ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（２）ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞株におけるＲＡＤ１９０１及びフルベストラントの比較
【０１５２】
ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントの効果を、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞株（両方とも、ヒト乳癌細胞株である）を用いて、０．０１μＭ、０．１μＭ、及び１μＭの様々な濃度で比較した（ＭＣＦ７細胞株アッセイについては図１４Ａ、及びＴ４７Ｄ細胞株については図１４Ｂ）。３つのＥＲ標的遺伝子、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、乳癌１におけるエストロゲンによる成長調節（ＧＲＥＢ１）、及びトレフォイル因子１（ＴＦＦ１）を、マーカーとして使用した。ＲＡＤ１９０１は、ＥＲの分解を引き起こし、ＥＲのシグナル伝達を阻害した（図１４）。意外にも、実施例Ｉ（Ａ）及び実施例Ｉ（Ｂ）において、上に開示されるように、ＲＡＤ１９０１は、腫瘍成長を阻害し、腫瘍退縮を引き起こす際に、フルベストラントと同等またはフルベストラントよりも有効であった。
【０１５３】
ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（３）ＲＡＤ１９０１治療は、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（１）において上述されるように、ＭＣＦ７異種移植片モデルにおいて、ＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の廃止をもたらした。
【０１５４】
ＲＡＤ１９０１治療は、インビボでＥＲの分解をもたらし（図１５Ａ〜Ｃ、スチューデントのｔ検定：＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１）、インビボでＥＲのシグナル伝達を阻害した（図１５Ａ及び１５Ｃ、スチューデントのｔ検定：＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１）。
【０１５５】
ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）またはフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）の最終投与から２時間後にＭＣＦ−７異種移植片から採取した腫瘍は、ＥＲ及びＰＲの発現を有意に減少したことを示した（図１５Ａ〜Ｂ）。フルベストラント治療の最終投与から８時間後にＭＣＦ−７異種移植片から採取した腫瘍は、ＰＲ及びＥＲの発現を変化させたことを示した。しかしながら、ＲＡＤ１９０１治療の最終投与から８時間後にＭＣＦ−７異種移植片から採取した腫瘍は、ＰＲ及びＥＲの発現を減少したことを示した（図１５Ａ及び１５Ｃ）。
【０１５６】
ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、または９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の単回投与から８時間または１２時間後にＭＣＦ−７異種移植片から採取した腫瘍は、ＰＲの発現を急速に減少したことを示した（図１６Ａ）。ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、または９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の７回目の投与から４時間または２４時間後にＭＣＦ−７異種移植片から採取した腫瘍は、ＥＲのシグナル伝達の一貫した安定した阻害を示した（図１６Ｂ）。ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、または９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の治療中の様々な時点でＭＣＦ−７異種移植片から採取した腫瘍のウェスタンブロット分析の定量化は、ＰＲの用量依存的な減少を示した（図１６ｃ）。
【０１５７】
ＲＡＤ１９０１治療は、ＭＣＦ−７異種移植片モデルにおいて増殖の急速な減少を起こした。例えば、ＲＡＤ１９０１（９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の単回投与から８時間後及びＲＡＤ１９０１（９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の４回目の投与から２４時間後に、ＭＣＦ−７異種移植片モデルから採取した腫瘍を切断し、染色して、増殖マーカーＫｉ６７の急速な減少を示した（図１７Ａ〜Ｂ）。
【０１５８】
これらの結果は、ＲＡＤ１９０１治療が、ＥＲ  ＷＴ異種移植片において、インビボでＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の阻害をもたらすことを示唆している。
【０１５９】
ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（４）ＲＡＤ１９０１治療は、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉ）において上述されるように、ＰＤｘ−４モデルにおいて、ＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の廃止をもたらした。
【０１６０】
ＲＡＤ１９０１治療は、ＰＤｘ−４モデルにおいて増殖の急速な減少を起こした。例えば、５６日の有効性試験の最終日に最終投与から４時間後に、ＲＡＤ１９０１（３０、６０、または１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）またはフルベストラント（１ｍｇ／動物、週１回）で治療したＰＤｘ−４モデルから採取した腫瘍を切断し、これは、フルベストラントで治療したＰＤｘ−４モデルと比較して、増殖マーカーＫｉ６７の急速な減少を示した（図１８）。
【０１６１】
これらの結果は、ＲＡＤ１９０１治療が、ＥＲ  ＷＴ異種移植片において、インビボでＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の阻害をもたらすことを示唆している。
【０１６２】
ＩＩＩ（Ｂ）（ｉｉ）ＲＡＤ１９０１治療は、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（１）において上述されるように、変異体ＥＲ異種移植片ＰＤｘ−５モデルにおいて、ＥＲのシグナル伝達の低下をもたらした。
【０１６３】
腫瘍を、投与の最終日後に指示された時点で採取し（別途特定されない限り）、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。等量のタンパク質を、ＭＷによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、材料及び方法の項：プロゲステロン受容体（ＰＲ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；３１５３）に記載されるように、以下の抗体でブロットした。
【０１６４】
バンドを、１Ｄ  Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を用いて定量化し、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（１）に記載されるように、ＰＤｘ−５モデルから得られたＰＲ  ＩＨＣ  Ａｌｌｒｅｄスコアを、図１９に示す。フルベストラントは、ＰＲの発現に対してほとんど影響を与えなかったが、ＲＡＤ１９０１は、６０ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇの両方の投与量で有効性を示した（１日１回経口投与、ＩＩＩ（Ｂ）（ｉｉ）−図１）。
【０１６５】
これらの結果は、ある特定のＥＲα変異（例えばＹ５３７Ｓ）を発現する腫瘍については、ＲＡＤ１９０１が、腫瘍成長を阻害するときに、フルベストラントよりもさらに有効であり、フルベストラント治療（例えば３ｍｇ／用量の投与量で、週１回皮下注射、ＰＤｘ−５については図６Ａ）に対してほとんど反応しなかった腫瘍の成長を阻害する際に特に有効であったことを示す。さらに、フルベストラント治療に対してあまり反応しなかった腫瘍（例えばＰＤｘ−５）については、ＲＡＤ１９０１は、インビボでＰＲの発現を減少する際に有効であったが、フルベストラントは有効でなかった（図１９）。
【０１６６】
実施例ＩＶ  子宮組織及び／またはＢＭＤに対するＲＡＤ１９０１治療の影響
ＩＶ（Ａ（１））：ＲＡＤ１９０１は、子宮組織のエストラジオール刺激を拮抗した。
【０１６７】
ＲＡＤ１９０１の子宮向性効果を、未成熟ラットにおいて、子宮重量、組織、及びＣ３遺伝子発現の変化を評価することによって調査した。代表的な試験からの結果を図２０Ａ〜Ｄに示す。
【０１６８】
子宮向性活性の評価
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ仔ラットを、１９日齢で乳離れさせ、群（ｎ＝４）にランダム化し、ビヒクル（水性メチルセルロース）、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、ラロキシフェン（３ｍｇ／ｋｇ）、タモキシフェン（１ｍｇ／ｋｇ）、ＲＡＤ１９０１単独（０．３〜１００ｍｇ／ｋｇ）、またはＥ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＲＡＤ１９０１（０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を、必要に応じて、皮下注射または経口投与のいずれかで、（上の試薬を参照されたい）１日１回３日間連続で投与した。最終投与から２４時間後、すべての動物を、二酸化炭素の吸入によって殺処分した。体重及び湿子宮重量を、各動物について記録した。同様のアッセイも、ラット及びマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ）において、ＲＡＤ１９０１（０．０３〜１００ｍｇ／ｋｇ）で行った。
【０１６９】
各ラットからの新鮮な子宮組織を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、エタノールで脱水し、ＪＢ４プラスチック製樹脂に包埋した。切片を８μｍで切断し、０．１％トルイジンブルーＯで染色した。子宮内膜上皮組織の厚さは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ４０顕微鏡及びＳｐｏｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄプログラムを用いて測定し、標本当たり９つの測定の平均を計算した。
【０１７０】
子宮成分の成分３（Ｃ３）遺伝子発現
処置した子宮組織中のＣ３の相対的発現レベルを決定するために、ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、Ｍｉｃｒｏ  ｔｏ  Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて残りの組織から抽出した。ＲＮＡを定量化し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、等量を逆転写した。
【０１７１】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７３００  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。Ｃ３に対して及び参照遺伝子として１８ＳリボソームＲＮＡに対してプローブセットを有するＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲを行った。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間の初期変性ステップ、続いて、９５℃で１５秒、及び６０℃で１分間の４０サイクルを含んだ。
【０１７２】
相対遺伝子発現を、内因性対照（１８Ｓ）に各試料を正規化し、較正器（ビヒクル）で比較することによって決定した。相対遺伝子発現を、等式：２−ΔΔＣｔ（式中、Ｃｔ＝サイクル閾値またはＰＣＲ生成物が最初に検出されたサイクル数、ΔＣｔ＝正規化した試料値、及びΔΔＣｔ＝投与された対象とビヒクルとの間の正規化差）を用いて決定した。５つの複製遺伝子発現の決定を、各試験内の各投与について行った。
【０１７３】
Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、ラロキシフェン（ＲＡＬ、３ｍｇ／ｋｇ）、またはタモキシフェン（ＴＡＭ、１ｍｇ／ｋｇ）による治療は、ビヒクル単独と比較して、子宮湿重量の有意な増加をもたらし、一方、０．３〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でのＲＡＤ１９０１治療は、子宮湿重量に有意な影響を及ぼさなかった（図２０Ａ）。示されたデータ（図２０Ａ）は、平均（±平均誤差）、群当たりｎ＝４のラット、Ｐ対ビヒクル：＊＜０．０５；対Ｅ２：‡＜０．０５である。さらに、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）と併用投与された場合に、ＲＡＤ１９０１は、用量依存的様式においてＥ２の媒介による子宮の刺激を拮抗し、０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で子宮向性活性の有意な阻害及び３ｍｇ／ｋｇで完全な阻害を示した。ＲＡＤ１９０１のＥＣ50は、約０．３ｍｇ／ｋｇであった。０．０３〜１００ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１投与もまた、子宮湿重量または上皮の厚さに影響を及ぼさなかったマウスにおいて、同様の結果を得た（データ示さず）。
【０１７４】
子宮組織における治療依存的変化を、定量的顕微鏡組織学によってさらに調査した。０．０１及び０．３ｍｇ／ｋｇの両方でＥ２による治療後の、子宮内膜上皮の厚さの統計的に有意な増加があった（図２０Ｂ）。上皮の厚さの有意な増加はまた、タモキシフェン（１ｍｇ／ｋｇ）またはラロキシフェン（３ｍｇ／ｋｇ）による治療後にも観察された。対照的に、ＲＡＤ１９０１治療は、最も高く評価された用量の１００ｍｇ／ｋｇまで子宮内膜上皮の厚さを増加しなかった。子宮内膜上皮の代表的な画像を、図２０Ｃに示す。
【０１７５】
子宮重量及び子宮内膜上皮の厚さの両方の変化と一致して、Ｅ２、タモキシフェン、及びラロキシフェンはすべて、エストロゲンを調節した成分遺伝子Ｃ３の発現を有意に増加した（図２０Ｄ））。対照的に、ＲＡＤ１９０１は、試験した用量のいずれか（０．３〜１００ｍｇ／ｋｇ）でＣ３遺伝子発現を増加しなかった。さらに、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１は、Ｅ２で刺激されたＣ３遺伝子発現を有意に抑制した。
【０１７６】
ＲＡＤ１９０１は、未成熟雌ラットの子宮を刺激しなかった
未成熟雌ラットに、ビヒクル（ＶＥＨ）、エストラジオール（Ｅ２）、ラロキシフェン（ＲＡＬ）、タモキシフェン（ＴＡＭ）、ＲＡＤ１９０１、またはＲＡＤ１９０１＋Ｅ２で３日間連続して１日１回経口投与を施した。子宮湿重量を測定した。示されたデータ（図２０Ａ）は、平均（±平均誤差）、群当たりｎ＝４のラット、Ｐ対ビヒクル：＊＜０．０５；対Ｅ２：‡＜０．０５である。
【０１７７】
実施例ＩＩ（Ａ）（２）．ＲＡＤ１９０１による治療は、卵巣摘出ラットにおいて骨量の減少を防いだ
ＲＡＤ１９０１の骨特異的効果を、卵巣摘出ラットにおいて試験した。
【０１７８】
閉経後骨量減少のモデルとして、麻酔をかけた雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、卵巣摘出術を行い、対照として偽手術を行った。手術後、群当たり２０の動物を有する、卵巣摘出ラットを、ビヒクル、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＡＤ１９０１（０．１、０．３、１、３ｍｇ／ｋｇ）で４週間１日１回処置し、上述のように投与した。偽手術群の動物は、ビヒクルで処置した。すべての動物を、最終投与から２４時間後に、二酸化炭素の吸入によって殺処分した。ＰＩＸＩｍｕｓ二重発光Ｘ線吸光光度法を用いて、骨ミネラル濃度を、ベースラインさらに処置から４週間後に評価した。
【０１７９】
剖検時に、各動物の左大腿骨を除去し、軟組織がないように切開し、分析前に７０％エタノール中に保存した。マイクロ−ＣＴ４０システム（Ｓｃａｎｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）を用いて、詳細な定性的及び定量的３Ｄ評価を行った。各標本については、大腿遠位骨幹端の２５０の画像枚数を必要とした。予め選択された分析領域において直接３Ｄアプローチを用いて、形態学的パラメータを決定した。骨梁において決定されたパラメータは、骨体積密度、骨表面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、連結密度、及び見掛け骨密度を含んだ。
【０１８０】
卵巣摘出術後、未処置（ビヒクル対照）ラットは、ベースラインと比較して、完全大腿骨全体及び腰椎の両方の骨ミネラル濃度を減少した（表５）。Ｅ２による治療は、大腿骨及び脊椎の両方の骨量減少の防止と関連した。ＲＡＤ１９０１による治療は、卵巣摘出術で誘発した骨量減少の用量依存的で統計的に有意な抑制をもたらした（３ｍｇ／ｋｇの処置群について示されたデータ）。０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの用量で、ＲＡＤ１９０１で処置したラットにおける骨ミネラル濃度は、完全であり、Ｅ２で処置した群と統計的に有意差はなかった。
【０１８１】
大腿遠位のマイクロＣＴ分析（表６）は、卵巣摘出術が、偽手術動物と比較した場合に、多数の主なマイクロアーキテクチャパラメータの有意な変化を誘発したことを示した。これらの変化は、骨量の減少と一致し、骨体積の減少、骨梁数、厚さ、及び密度の減少、ならびに骨梁間隔の増加を含む。ＲＡＤ１９０１による処置後に観察された骨ミネラル濃度の保存と一致して、骨梁アーキテクチャの有意な保存は、主なマイクロ構造パラメータにおいて観察された（表６）。
【０１８２】
実施例ＩＶ（Ｂ）：健常な閉経後の女性におけるＲＡＤ１０１の第１相用量漸増試験
第１相試験では、安全性、耐性、及び薬物動態が、４４人の健常な閉経後の女性において評価された。用量を制限する毒性（ＤＬＴ）は観察されず、最大耐容量（ＭＴＤ）は構築されなかった。血漿曝露は、試験した用量範囲にわたって用量比例的よりも増加した。
【０１８３】
対象
４４人の健常な閉経後の女性を、この第１相試験の対象として登録した。対象は、少なくとも１２か月間無月経であり、血清ＦＳＨが閉経と一致した。対象は、１８．０〜３０ｋｇ／ｍ2のＢＭＩを有する、４０〜７５歳であった。臨床的に関連する病理の証拠を有し、卒中もしくは過去に静脈血栓塞栓事象のリスク増加がある、または臨床研究センターに登録する１４日以内に併用薬（パラセタモールは、３日前まで許容された）の使用を有する患者は、除外された。
【０１８４】
投与
対象を、それぞれ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、及び１０００ｍｇの用量レベルで、軽い朝食後に、プラセボまたは少なくとも１つの経口量で１日１回７日間治療した。第１相試験に登録した４４人の閉経後の女性の主なベースライン人口統計を、表７に要約する。
【０１８５】
治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）
ＴＥＡＥを記録し、最も頻繁に起こる（任意の関連したＴＥＡＥを有した全活性群の患者の１０％超）有害事象（ＡＥ）を表８に要約し、「ｎ」は、所与のカテゴリー中の少なくとも１つの治療に関連したＡＥを有する対象の数であり、ＡＥは有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０のように等級分けされ、同じ優先使用語の複数のシナリオを有する任意の患者は、最も重度のグレードまで１回のみ計数した。用量を制限する毒性は観察されず、最大耐容量（ＭＴＤ）は構築されなかった。
【０１８６】
薬物動態評価
血漿中のＲＡＤ１９０１の分析のための試験期間中に、一連の血液試料を採血した。留置ＩＶカテーテルを介して、または抗凝血剤としてＫ3−ＥＤＴＡを含有するチューブへの直接静脈穿刺によって、５ｍＬの血液試料をそれぞれ、採血した。定常状態は、治療から５日目で達成した。ＲＡＤ１９０１の幾何平均（Ｇｅｏ−Ｍｅａｎ）血漿濃度−時間プロファイルを評価した。試験において、７日目のＲＡＤ１９０１（２００、５００、７５０、または１，０００ｍｇ）により治療した群（Ｎ＝３５）の血漿薬物動態の結果を、例として、表８及び図２１に提供する。中央値ｔ1/2は、３７．５〜４２．３時間であった（表８）。ＲＡＤ１９０１の複数回投与後、中央値ｔmaxは、投与後の３〜４時間であった。
【０１８７】
実施例Ｖ（Ａ）−１．選択公開されたＥＲ構造を用いたＲＡＤ１９０１−ＥＲα結合のモデリング。
別途記述がない限り、構造をそれらのスティックモデルで示す場合、結合の各末端を、それに結合する原子と同じ色で色付けし、灰色は炭素であり、赤色は酸素であり、青色は窒素であり、白色は水素である。
【０１８８】
様々なＥＲリガンド複合体形成されたＥＲαリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の１４の公開された構造（すなわち、モデル）を、慎重な評価によって９６の公開されたモデルから選択した。これらの１４のモデルのうちの１つは、３ＥＲＴ（４−ヒドロキシタモキシフェンに結合したヒトＥＲα  ＬＢＤ（ＯＨＴ））であった。ＯＨＴは、タモキシフェンの活性代謝産物で、乳房組織中のアンタゴニストとしての役割を果たす第一世代のＳＥＲＭである。
【０１８９】
３ＥＲＴ（図２１及び２２）では、ＥＲα結合部位は、らせん３（Ｈ３）、らせん５（Ｈ５）、及びらせん１１（Ｈ１１）を含む疎水性ポエットを形成する３つの層「らせんサンドイッチ」を導入する（図２１）。図２２中の点線の箱は、結合部位、及び重要であるまたはＯＨＴ結合によって達成される結合部位内の残基を表す。ＯＨＴは、ＬＸＸＬＬコアクチベータ（複数可）を結合する部位にＨ１２を置換することによって、アンタゴニストとして役割を果たす。ＯＨＴは、Ｌ５４０によって正常に充填したスペースを占有し、らせん１１のＣ末端上に４つの残基（Ｇ５２１、Ｈ５２４、Ｌ５２５、及びＭ５２８）の立体構造を修飾する。ＯＨＴはまた、Ｄ３５１との塩橋を形成し、電荷中和をもたらす。
【０１９０】
その他の１３のＥＲα  ＬＢＤ−ＥＲリガンドモデルを、３ＥＲＴと比較した。それらの残基構造の違いを、表１０に要約する。１４のモデルのＥＲα構造の重ね合わせ（図２３）は、これらの構造が、残基Ｅ３８０、Ｍ４２１、Ｇ５２１、Ｍ５２２、Ｈ５２４、Ｙ５２６、Ｓ５２７、Ｍ５２８、Ｐ５３５、Ｙ５３７、Ｌ５４０、及びこれらの様々な組み合わせで有意に異なったことを示す。
【０１９１】
１４のモデルの任意の対の標準偏差（ＲＭＳＤ）の計算を、表１１に要約する。構造は、ＲＭＳＤが２Å未満であった場合に、重なり合うと見なされた。表１１は、すべての１４のモデルが、１．５Å未満のＲＭＳＤを有したことを示す。フォーマット分析の使用は、１Ｒ５Ｋ及び３ＵＵＣが、他のモデルにあまり同様でなかったことを示唆した（分析は示さず）。したがって、１Ｒ５Ｋ及び３ＵＵＣは、試験された固有の別々の構造クラスターであると見なされた。
【０１９２】
１４のモデルにおけるリガンドによって結合されたＥＲα残基を、表１２に要約する。表１２はまた、ＥＲα  ＬＢＤ−アンタゴニスト複合体におけるＥＣ50を示す。１４のモデルのうち、１３のモデルは、リガンドとＥ３５３との間のＨ結合相互作用を示し、１２のモデルは、リガンドとＦ４０４との間のπ相互作用を示し、５つのモデルは、リガンドとＤ３５１との間のＨ結合相互作用を示し、６つのモデルは、リガンドとＨ５２４との間のＨ結合相互作用を示し、４つのモデルは、リガンドとＲ３９４との間のＨ結合相互作用を示し、１つのモデル（３ＵＵＣ）は、リガンドとＴ３４７との間の相互作用を示した。
【０１９３】
１４のモデルの各々は、リガンドに加えて１，０００の化合物のランダムライブラリーをドックするために使用し、このモデルは、周知のアンタゴニストを特定し、優先順位を付け得るかどうかを決定するために、（周知のアンタゴニスト）と共に公開された。このモデルが周知のアンタゴニストを特定し得る場合、このモデルは、それ自体が公開されたリガンドの構造を予測することができることが決定された。次いで、ＥＦ50を計算して、ランダム選択よりもいかに良好であるかを知るためにモデルの強度を定量化した。ＲＡＤ１９０１を、選択したモデルにドッキングした（例えば図２４〜２８）。モデルにおける公開されたリガンド及びＲＡＤ１９０１のドッキングスコアを決定した。また、ＥＣ50も決定した。ＲＡＤ１９０１の目視検査は、それが、１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、２ＯＵＺにおいて公開されたリガンドと共に示される相互作用に「従う」ことを示した。空間不調和は認められなかった。ある特定の実施形態では、例えば、１Ｒ５ｋ及び２ＢＪ４において、ＲＡＤ１９０１は、公開されたリガンドよりも高いドッキングスコアを有した。
【０１９４】
９つのモデル（１ＥＲＲ、３ＥＲＴ、３ＵＣＣ、２ＩＯＫ、１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺ）の評価結果を、表１３に要約する。
【０１９５】
１ＥＲＲ及び３ＥＲＴは、それらの結晶リガンドの正確な構造を予測することができなかった。ＲＡＤ１９０１は、３ＵＣＣにドッキングされなかった。２ＩＯＫ−ＲＡＤ１９０１においてテトラヒドロナフタアレンは非伝統的な様式で結合した。
【０１９６】
モデル１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺの間の大きな違いは、らせん１１のＣ末端の残基（Ｇ５２１−Ｍ５２８）であった。
【０１９７】
図２４は、ＲＡＤ１９０１−１Ｒ５Ｋ（ａ）及びＧＷ５−１Ｒ５Ｋ（ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３、Ｒ３９４、及びＬ５３６とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。
【０１９８】
図２５は、ＲＡＤ１９０１−１ＳＪ０（ａ）及びＥ４Ｄ−１ＳＪ０（ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３及びＤ３５１とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。
【０１９９】
図２６は、ＲＡＤ１９０１−２ＪＦＡ（ａ）及びＲＡＬ−２ＪＦＡ（ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｆ４０４とのｐ相互作用で結合した。
【０２００】
図２７は、ＲＡＤ１９０１−２ＢＪ４（ａ）及びＯＨＴ−２ＢＪ４（ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３及びＲ３９４とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。
【０２０１】
図２８は、ＲＡＤ１９０１−２ＩＯＫ（ａ）及びＩＯＫ−２ＩＯＫ（ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３、Ｒ３９４、及びＤ３５１とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。
【０２０２】
モデルにおいて公開したリガンドは、以下の構造を有する：
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【０２０３】
実施例Ｖ（Ａ）−２．ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントによるＥＲαの誘導適合ドッキング（ＩＦＤ）
ＥＲαにおいて、ＲＡＤ１９０１の結合立体構造は、５つのＥＲα結晶構造１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺのＩＦＤ分析によってさらに最適化された。ＩＦＤ分析は、その正確な結合立体構造に適合するために（リガンド結合時の）受容体柔軟性を明らかにした。
【０２０４】
各リガンド（例えばＲＡＤ１９０１及びフルベストラント）に対して異なる立体構造のライブラリーは、回転結合について回転の関数として局所最小値を探すことによって生成した。ＲＡＤ１９０１のライブラリーは、２５の異なる立体構造を有した。
【０２０５】
５つのＥＲα結晶構造を調製し、最小化した。公開されたＸ線構造において対応するリガンドは、ＥＲα結合ポケットを定義するために使用した。
【０２０６】
ＲＡＤ１９０１の立体構造は、調製されたＥＲα構造にドッキングして、結合ポケットに位置する残基への側鎖または骨格運動を誘導することを可能にした。これらの運動は、ＥＲαがその結合部位を変化させることを可能にし、そのため、ＲＡＤ１９０１の立体構造の形状及び結合様式にさらに密接に適合した。いくつかの例では、受容体構造における小さな骨格弛緩及び有意な側鎖の立体構造の変化が、ＩＦＤ分析において可能になった。
【０２０７】
経験的スコアリング関数は、ドッキングスコアまたはＧスコアを提供するために、リガンド結合自由エネルギーを概算するために使用した。Ｇスコアはまた、ＧｌｉｄｅＳｃｏｒｅとして知られており、この実施例では、ドッキングスコアと同義に使用してもよい。ドッキングスコアは、結合親和性の推定値であった。したがって、ドッキングスコアの値が低いほど、「より良好に」リガンドがその受容体に結合した。−１３〜−１４のドッキングスコアは、非常に良好な結合相互作用に相当した。
【０２０８】
１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺによるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、それぞれ、それらの違いを示すために重ね合わせた（図２９〜３１、スティックモデルにおいて示される）。各ＲＡＤ１９０１の立体構造におけるすべての結合を、図２９、３０、及び３１（ａ）において同じ色で示した。
【０２０９】
１Ｒ５Ｋ（青色）及び２ＯＵＺ（黄色）によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、前面にＲＡＤ１９０１のＮ−ベンジル−Ｎ−エチルアニリン基を有した（図２９）。２ＢＪ４（緑色）及び２ＪＦＡ（ピンク色）によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、背面にＲＡＤ１９０１のＮ−ベンジル−Ｎ−エチルアニリン基を有した（図３０）。２ＢＪ４（緑色）、２ＪＦＡ（ピンク色）、及び１ＳＪ０（茶色）によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、それらの重ね合わせによって示されるように、ほぼ同様であった（図３１（ａ）及び（ｂ））。ＲＡＤ１９０１のＩＦＤドッキングスコアをＶ（Ａ）−表５に要約する。
【０２１０】
２ＢＪ４によるＲＡＤ１９０１のＩＦＤは、Ｅ３５３及びＤ３５１との水素結合相互作用及びＦ４０４とのπ相互作用を示した（図３２（ａ）〜（ｃ））。図３２（ａ）は、Ｈ結合受容体基（赤色）、Ｈ結合ドナー基（青色）、及び疎水性基（黄色）に適している結合部位内の領域を示した。図３２（ａ）〜（ｂ）では、薄青色は、ＲＡＤ１９０１の炭素に対するものであった。図３３（ａ）〜（ｃ）は、ＲＡＤ１９０１と２ＢＪ４とのＩＦＤのタンパク質表面の相互作用を示す。Ｖ（Ａ）−図３３（ａ）及び（ｂ）は、正面図であり、図３３（ｃ）は、側面図である。ＲＡＤ１９０１の分子表面は、図３３（ａ）中では青色であり、図３３（ｃ）中では緑色であった。図３３（ｂ）〜（ｃ）は、ＥＲαの溶媒接触可能性のある表面の静電気を示し、赤色は陰性を示し、青色は陽性を示した。
【０２１１】
上述のように、２ＢＪ４とのフルベストラントに対して、同様のＩＦＤ分析を行った。フルベストラント−２ＢＪ４のＩＦＤは、−１４．９４５のＧスコアをもたらし、Ｅ３５３、Ｙ５２６、及びＨ５２４との水素結合相互作用、ならびにＦ４０４とのπ相互作用を示した（図３４（ａ）〜（ｃ））。図３４（ａ）は、Ｈ結合受容体基（赤色）、Ｈ結合ドナー基（青色）、及び疎水性基（黄色）に適している結合部位内の領域を示した。図３４（ａ）では、薄青色は、ＲＡＤ１９０１において炭素に対するものであった。
【０２１２】
図３５（ａ）〜（ｂ）は、ＩＦＤによって２ＢＪ４にドックされたＲＡＤ１９０１及びフルベストラントがＦ４０４とのπ相互作用及びＥ３５３との水素結合相互作用の両方を有したことを示した。さらに、ＲＡＤ１９０１は、Ｄ３５１との水素結合相互作用を有した（青色は、ＲＡＤ１９０１分子表面を表す、図３５（ｂ））が、一方、フルベストラントは、Ｙ５２６及びＨ５２４との水素結合相互作用を有した（緑色は、フルベストラント分子表面を表す、図３５（ｃ））。ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントでドッキングされた２ＢＪ４の重ね合わせを、図３６（ａ）〜（ｂ）に示す。図３６（ａ）では、緑色は、フルベストラント分子表面を表し、青色は、ＲＡＤ１９０１分子表面を表す。図３６（ｂ）では、茶色構造は、フルベストラントであり、青色構造は、ＲＡＤ１９０１である。
【０２１３】
実施例Ｖ（Ａ）−３．選択ＥＲα変異のモデリング評価。
Ｃ末端リガンド結合ドメイン上の様々なＥＲα変異の効果を評価した。評価した特定のＥＲα変異は、Ｙ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘは、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、及びＳ４６３Ｐであった。
【０２１４】
らせん１２中のＹ５３７残基。それは、一旦リン酸化されると、リガンド結合、ホモ二量体化、及びＤＮＡ結合を調節し得、ＥＲαがリン酸化によって媒介された対照を逃れ、潜在的に選択的な腫瘍形成の利点を有する細胞を提供することを可能にし得る。加えて、それは、受容体を構造的に活性にする立体構造を変化させ得る。
【０２１５】
Ｙ５３７Ｓ変異は、リガンドによって占有されているかどうかにかかわらず、転写活性のある閉鎖したポケット構造が好ましい。閉鎖しているが、占有されていないポケットは、ＥＲαの構成的活性を説明し得る（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１４８９７−１４９０５（１９９７））。Ｓｅｒ５３７は、Ａｓｐ３５１との水素結合相互作用を構築し、らせん１１〜１２のループの変化した構造及び溶媒が到達しにくい位置のＬｅｕ５３６の埋設をもたらす。これは、Ｙ５３７Ｓ変異体タンパク質の構成的活性の一因となり得る。Ｙ５３７Ｓ表面変異は、ＬＢＤポケットの表面上に影響を及ぼさない。
【０２１６】
Ｙ５３７Ｎは、ＥＲα陰性転移性乳癌でよく見られる。この部位の変異は、ＥＲαがリン酸化によって媒介された対照を逃れ、潜在的に選択的な腫瘍形成の利点を有する細胞を提供することを可能にし得る。具体的には、Ｙ５３７Ｎ置換は、ホルモン結合を模倣し得るＥＲαにおいて構造変化を誘導し、受容体の二量化する能力に影響を及ぼさないが、受容体への構成的トランス活性化機能を与える（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：１２４４−１２４９（１９９７））。
【０２１７】
Ｙ５３７Ｃは、Ｙ５３７Ｎと同様の効果を有する。
【０２１８】
Ｄ５３８Ｇは、より好ましくは活性構造であるが、活性及び不活性の両方の構造を安定化させることによって全エネルギー景観を変え得る。これは、ホルモン耐性乳癌において観察されるように、ホルモンの不在下でこの変異体の構成的活性をもたらし得る（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｅｗｆｏｕｎｄ  ｃａｎｃｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｈａｐｅｓ  ｔｈｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔ．１０：２８９７−２９００（２０１４））。
【０２１９】
これらの変異のいずれも、リガンド結合ドメインに影響を及ぼすまたは具体的には、ＲＡＤ１９０１結合を妨げることを期待されない。Ｙ５３７及びＤ５３８は、リガンド結合と無関係である構成的受容体の活性化をもたらす立体構造を変化させ得る。
【０２２０】
実施例Ｖ（Ｂ）．ＲＡＤ１９０１及び他の化合物による野生型及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物のインビトロ結合アッセイ
ＲＡＤ１９０１による野生型（ＷＴ）及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物のインビトロ結合アッセイは、ＲＡＤ１９０１がＷＴ  ＥＲαと同様の親和性を有する変異体ＥＲαと結合したことを示した。
【０２２１】
ＷＴ及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物は、発現し、Ｎ末端チオレドキシン及びＴＥＶプロテアーゼによって切断された６ｘＨｉｓタグで対応するＬＢＤ残基３０２〜５５２を精製することによって調製した。
【０２２２】
蛍光偏光（ＦＰ）は、製造業者の取扱説明書（Ｐｏｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のように、２ｎＭ  フルオロモン、１００ｎＭ  ＷＴまたはＬＢＤ変異体のＥＲα構築物を用いて、ＥＲαへの試験化合物（ＲＡＤ１９０１、フルベストラント、バゼドキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、及びＡＺＤ９４９６）の結合を決定するために使用した。各セットは、二重に行われ、異なるＥＲα構築物に対するＩＣ50を決定するためにある試験化合物を試験した（ＲＡＤ１９０１結合アッセイについては図３８）。
【０２２３】
上記のように、前述は、本発明の様々な実施形態を例示することを単に意図するものである。上に論じられる特定の改変は、本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。様々な同等物、変更、及び改変が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者にとって明らかであろうから、かかる同等の実施形態が、本明細書中に含まれるべきことも理解されるべきである。本明細書中に引用されたすべての参考文献は、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【国際調査報告】
2018518529.tif 000109
2018518529.tif 000110