(57)【要約】  自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または損傷の処置において使用するための、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって個体における全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な作用物質を含む薬学的組成物が提供され、前記１つ以上の免疫チェックポイントは、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ等からなる群より選択される。この薬学的組成物は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによる投与のための薬学的組成物であり、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置のインターバルセッションを順に含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まない中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または損傷の処置において使用するための、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な作用物質であって、ここで、前記活性な作用物質は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによって投与され、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置のインターバルセッションを順に含み、
前記１つ以上の免疫チェックポイントは、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容抑制性チロシンモチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）およびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される、活性な作用物質。
【請求項２】
前記全身免疫抑制のレベルの低下が、ＩＦＮγ産生白血球の全身における存在または活性の増加を伴う、請求項１に記載の活性な作用物質。
【請求項３】
前記活性な作用物質が、前記全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こし、それによって、エフェクターＴ細胞の全身における存在または活性の増加を引き起こす、請求項１に記載の活性な作用物質。
【請求項４】
前記活性な作用物質が、前記１つ以上の免疫チェックポイントの遮断によって免疫抑制の解除を引き起こす、請求項１に記載の活性な作用物質。
【請求項５】
前記活性な作用物質が、
（ｉ）抗体、例えば、ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ；組換え抗体；および一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）；
（ｉｉ）抗体模倣物、例えば、アフィボディ分子；アフィリン；アフィマー；アフィチン；アルファボディ；アンチカリン；アビマー；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー；Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド；およびモノボディ；
（ｉｉｉ）アプタマー；および
（ｉｖ）小分子阻害剤
からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項６】
前記活性な作用物質が、
（ｉ）
（ａ）抗ＩＣＯＳ；
（ｂ）抗Ｂ７ＲＰ１；
（ｃ）抗ＶＩＳＴＡ；
（ｄ）抗ＣＤ４０；
（ｅ）抗ＣＤ４０Ｌ；
（ｆ）抗ＣＤ８０；
（ｇ）抗ＣＤ８６；
（ｈ）抗Ｂ７−Ｈ３；
（ｉ）抗Ｂ７−Ｈ４；
（ｊ）抗Ｂ７−Ｈ７；
（ｋ）抗ＢＴＬＡ；
（ｌ）抗ＨＶＥＭ；
（ｍ）抗ＣＤ１３７；
（ｎ）抗ＣＤ１３７Ｌ；
（ｏ）抗ＯＸ４０Ｌ
（ｐ）抗ＣＤ−２７；
（ｑ）抗ＣＤ７０；
（ｒ）抗ＳＴＩＮＧ；
（ｓ）抗ＴＩＧＩＴ；および
（ｔ）（ａ）〜（ｓ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択される抗体；
（ｉｉ）アジュバントと併用される（ａ）〜（ｓ）の任意の組み合わせ；
（ｉｉｉ）
（ａ）アデノシンＡ１レセプターアンタゴニスト；
（ｂ）アデノシンＡ２ａレセプターアンタゴニスト；
（ｃ）Ａ３レセプターアンタゴニスト
からなる群より選択される小分子；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）（ａ〜ｃ）と（ｉ）（ａ〜ｓ）との任意の組み合わせ；
および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項７】
前記処置セッションが、前記個体への前記活性な作用物質の投与を含み、前記処置セッションは、少なくともＩＦＮγ産生白血球の全身における存在またはレベルが基準より高くなるまで維持され、前記投与は、前記インターバルセッション中は休止され、前記インターバルセッションは、前記レベルが前記基準より高い限り維持され、
前記基準は、
（ａ）前記投与前の前記個体から得られた最新の血液サンプルにおいて測定されたＩＦＮγ産生白血球の全身における存在または活性のレベル；または
（ｂ）ＣＮＳの疾患、障害、状態または損傷に苦しんでいる個体の集団に特徴的なＩＦＮγ産生白血球の全身における存在または活性のレベル
から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項８】
前記処置セッションが、前記個体への前記活性な作用物質の投与を含み、前記処置セッションは、少なくとも前記活性な作用物質の全身における存在が治療レベルに達するまで維持され、前記投与は、前記インターバルセッション中は休止され、前記インターバルセッションは、前記レベルが、前記治療レベルの約９５％、９０％、８０％、７０％、６０％または５０％より高い限り維持される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項９】
前記処置セッション中の前記組成物の投与が、単回投与である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項１０】
前記処置セッション中の前記組成物の投与が、反復投与である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項１１】
前記反復投与が、２、３、４、５または６日ごとに１回行われる、請求項１０に記載の活性な作用物質。
【請求項１２】
前記反復投与が、１週間に１回行われる、請求項１０に記載の活性な作用物質。
【請求項１３】
前記反復投与が、４週間ごとに１回行われる、請求項１０に記載の活性な作用物質。
【請求項１４】
前記処置セッションが、３日〜４週間である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項１５】
前記非処置期間が、１週間〜６ヶ月である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項１６】
アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される神経変性疾患；一次性進行型多発性硬化症；二次性進行型多発性硬化症；大脳皮質基底核変性症；レット症候群；加齢性黄斑変性症および網膜色素変性症からなる群より選択される網膜変性障害；前部虚血性視神経症；緑内障；ブドウ膜炎；うつ病；外傷関連ストレスまたは外傷後ストレス障害；前頭側頭型認知症；レヴィー小体型認知症；軽度認識障害；後部皮質萎縮；原発性進行性失語；進行性核上性麻痺ならびに加齢性認知症からなる群より選択される疾患、障害または状態の処置において使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項１７】
前記神経変性疾患、障害または状態が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項１６に記載の活性な作用物質。
【請求項１８】
アルツハイマー病の処置において使用するための、請求項１７に記載の活性な作用物質。
【請求項１９】
脊髄損傷、閉鎖性頭部損傷、鈍的外傷、鋭的外傷、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、脳虚血、視神経損傷、心筋梗塞、有機リン中毒、および腫瘍切除術が原因の損傷からなる群より選択されるＣＮＳの損傷の処置において使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項２０】
前記処置が、ＣＮＳの運動機能および／または認知機能を改善する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の活性な作用物質。
【請求項２１】
加齢関連の認知機能喪失の軽減において使用するための、請求項２０に記載の活性な作用物質。
【請求項２２】
前記加齢関連の認知機能喪失が、診断された疾患を有しない個体において生じる、請求項２１に記載の活性な作用物質。
【請求項２３】
急性ストレスまたは外傷エピソードに起因する認知機能喪失の軽減において使用するための、請求項２１に記載の活性な作用物質。
【請求項２４】
前記認知機能が、学習、記憶またはその両方である、請求項１９に記載の活性な作用物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、循環中の全身免疫抑制のレベルを一過性に低下させることによって、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または損傷を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ほとんどの中枢神経系（ＣＮＳ）の病態は、疾患の進行の一部である、共通の神経炎症性の構成要素を共有する。これらの病態には、進行性の記憶喪失および認知機能喪失を特徴とする加齢性の神経変性疾患であるアルツハイマー病（ＡＤ）があり、アルツハイマー病では、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチド凝集物の蓄積が、ＣＮＳにおける炎症カスケードにおいて重要な役割を果たし、最終的には神経損傷および組織破壊に至ると示唆された（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，２０００；Ｈａｒｄｙ  ＆  Ｓｅｌｋｏｅ，２００２；Ｖｏｍ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。神経変性疾患における慢性神経炎症反応にもかかわらず、神経変性疾患における免疫抑制ベースの治療を研究した過去１０年間にわたる臨床研究および前臨床研究は、なぜ抗炎症薬が不十分であるかについての問題を提起した（Ｂｒｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｇｒｏｕｐ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，２０１２）。本発明者らは、ＡＤおよび類似の疾患ならびにＣＮＳ損傷の既存の治療の欠点を克服する新規の解決策を提供する；この方法は、ＣＮＳの維持および修復における全身および中枢の免疫系の種々の構成要素の役割の本発明者らのユニークな理解に基づく。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，２０００
【非特許文献２】Ｈａｒｄｙ  ＆  Ｓｅｌｋｏｅ，２００２
【非特許文献３】Ｖｏｍ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２
【非特許文献４】Ｂｒｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献５】Ｇｒｏｕｐ  ｅｔ  ａｌ，２００７
【非特許文献６】Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，２０１２
【発明の概要】
【０００４】
（発明の要旨）
１つの態様において、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または損傷の処置において使用するための、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって個体における全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な作用物質を含む薬学的組成物を提供し、ここで、前記薬学的組成物は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによる投与のための薬学的組成物であり、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置のインターバルセッションを順に含み；前記１つ以上の免疫チェックポイントは、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ  Ｉｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＩＮｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅｓ）（ＳＴＩＮＧ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）ドメイン（ＴＩＧＩＴ）およびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される。
【０００５】
別の態様において、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まない中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または損傷を処置するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする個体に、本発明にかかる１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な作用物質を含む薬学的組成物を投与する工程を含み、ここで、前記薬学的組成物は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによって投与され、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置期間のインターバルセッションを順に含み、前記１つ以上の免疫チェックポイントは、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容抑制性チロシンモチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）およびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、ＡＤの５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスモデル（ＡＤ−Ｔｇ）における疾患進行に沿った脈絡叢（ＣＰ）活性を示している。（Ａ）同齢のＷＴコントロールに対する変化倍率（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）として示されている、１、２、４および８月齢のＡＤ−Ｔｇマウスから単離されたＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定された遺伝子ｉｃａｍ１、ｖｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２のｍＲＮＡ発現レベル（１群あたりｎ＝６〜８；各時点についてスチューデントｔ検定）。（Ｂ）上皮タイトジャンクション分子クローディン−１、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色およびインテグリンリガンドＩＣＡＭ−１を免疫染色した、８月齢のＡＤ−Ｔｇマウスおよび同齢のＷＴコントロールのＣＰの代表的な顕微鏡像（スケールバー、５０μｍ）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、（Ａ）若年および高齢の非ＣＮＳ罹患患者およびＡＤ患者のヒト死後ＣＰにおけるＩＣＡＭ−１免疫反応性の定量（１群あたりｎ＝５；１元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ解析）；（Ｂ）８月齢のＡＤ−Ｔｇマウスおよび同齢のＷＴコントロールのＣＰにおけるＩＦＮ−γを発現している免疫細胞（細胞内染色され、ＣＤ４５で予めゲーティングされた）のフローサイトメトリー解析を示している。影付きヒストグラムは、アイソタイプコントロールを表している（１群あたりｎ＝４〜６；スチューデントｔ検定）；および（Ｃ）同齢のＷＴコントロールと比較された、４および８月齢のＡＤ−Ｔｇマウスから単離されたＣＰ組織における、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されたｉｆｎ−γのｍＲＮＡ発現レベル（１群あたりｎ＝５〜８；各時点についてスチューデントｔ検定）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜Ｂは、（Ａ）８月齢のＡＤ−ＴｇおよびＷＴコントロールマウスにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋脾細胞の出現率（ＴＣＲβで予めゲーティングされた）の代表的なフローサイトメトリープロット；および（Ｂ）１、２、４および８月齢のＡＤ−ＴｇおよびＷＴコントロールマウス由来の脾細胞の定量的解析（１群あたりｎ＝６〜８；各時点についてスチューデントｔ検定）を示している。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図４】図４は、最後のＤＴｘ注射の１日後のＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋／−マウス由来の脾細胞のゲーティングストラテジーおよび代表的なフローサイトメトリープロットを示している。ＤＴｘを４日連続ｉ．ｐ．注射したところ、Ｆｏｘｐ３＋細胞の約９９％枯渇が達成された。
【図５Ａ−Ｇ】図５Ａ〜Ｇは、ＡＤ−ＴｇマウスにおけるＴｒｅｇの一過性の枯渇の効果を示している。（Ａ）ＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋（ＤＴＲ導入遺伝子を発現する）およびＤＴＲを発現しないＡＤ−Ｔｇ同腹仔（ＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−）コントロール群を４日連続ＤＴｘで処置した。最後のＤＴｘ注射の１日後のＤＴｘで処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇマウスにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定された遺伝子ｉｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２のＣＰにおけるｍＲＮＡ発現レベル（１群あたりｎ＝６〜８；スチューデントｔ検定）。（Ｂ〜Ｄ）最後のＤＴｘ注射の３週間後の、ＤＴｘで処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇマウスおよびコントロールの脳実質（別個に切除された脈絡叢を除く）のフローサイトメトリー解析。ＤＴｘで処置されたＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋マウスおよびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−コントロールのＣＤ１１ｂｈｉｇｈ／ＣＤ４５ｈｉｇｈｍｏ−ＭΦおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加を示す定量的フローサイトメトリー解析（Ｂ）、および代表的なフローサイトメトリープロット（Ｃ）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ出現率の定量的解析（Ｄ）（１群あたりｎ＝３〜７；スチューデントｔ検定）。（Ｅ）最後のＤＴｘ注射の３週間後の、ＤＴｘで処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇ  ＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋およびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−コントロール）の脳実質におけるｆｏｘｐ３およびｉｌ１０のｍＲＮＡ発現レベル（１群あたりｎ＝６〜８；スチューデントｔ検定）。（Ｆ）最後のＤＴｘ注射の３週間後の、ＤＴｘで処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋およびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−コントロールマウス由来の海馬切片において低減したアストログリオーシス（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）を示しているＧＦＡＰ免疫染色の定量的解析（スケールバー、５０μｍ；１群あたりｎ＝３〜５；スチューデントｔ検定）。（Ｇ）最後のＤＴｘ注射の３週間後の、脳実質におけるｉｌ−１２ｐ４０およびｔｎｆ−ａのｍＲＮＡ発現レベル（１群あたりｎ＝６〜８；スチューデントｔ検定）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図６Ａ−Ｅ】図６Ａ〜Ｅは、Ａβプラークの学習／記憶能力に対するＴｒｅｇの一過性の枯渇の効果を示している。最後のＤＴｘ注射の３週間後の、ＤＴｘで処置された５月齢のＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋およびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−コントロールマウスの脳の、ＡβプラークおよびＨｏｅｃｈｓｔ核染色を免疫染色した（Ａ）代表的な顕微鏡像および（Ｂ）定量的解析（スケールバー、２５０μｍ）。海馬歯状回（ＤＧ）および大脳皮質５層におけるＡβプラークの平均面積および数を定量した（６μｍ脳切片において；１群あたりｎ＝５〜６；スチューデントｔ検定）。図６Ｃ〜Ｅ）は、最後のＤＴｘ注射の３週間後の、ＤＴｘで処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ＋およびコントロールマウスのモーリス水迷路（ＭＷＭ）試験の成績を示している。一過性のＴｒｅｇ枯渇の後、ＡＤ−Ｔｇマウスは、ＡＤ−Ｔｇコントロールと比べて、ＭＷＭの（Ｃ）習得期、（Ｄ）探索期および（Ｅ）逆転期において、より良好な空間学習／空間記憶の能力を示した（１群あたりｎ＝７〜９；個別の対比較のための２元配置反復測定分散分析に続くボンフェローニの事後解析；＊，習得、探索および逆転の全体についてＰ＜０．０５）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、同齢のＷＴコントロールと比べたときの、６および１２月齢のＡＰＰ／ＰＳ１  ＡＤ−Ｔｇマウス（アルツハイマー病のマウスモデル（材料および方法を参照のこと））から単離されたＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されたｉｆｎ−γのｍＲＮＡ発現レベルを示している（１群あたりｎ＝５〜８；スチューデントｔ検定）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５。
【図８Ａ−Ｉ】図８Ａ〜Ｉは、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける毎週の酢酸グラチラマー（ＧＡ）の投与の治療効果を示している。（Ａ）毎週のＧＡ処置レジメンの模式図。マウス（５月齢）に、ＧＡ（１００μｇ）を第１週において２回（１および４日目に）およびその後４週間の全期間にわたって１週間ごとに１回、ｓ．ｃ．注射した。それらのマウスを、最後の注射の１週間後（ＭＷＭ）、１ヶ月後（ＲＡＷＭ）および２ヶ月後（ＲＡＷＭ、異なる実験空間設定を用いて）に認知能力について、ならびに海馬の炎症について調べた。図８Ｂ〜Ｄは、処置されていないＡＤ−Ｔｇマウスおよび毎週ＧＡで処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇマウスの海馬における遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示しており、毎週ＧＡで処置されたマウスにおける、（Ｂ）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ４０）の低発現、（Ｃ）抗炎症性サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの増加、および（Ｄ）神経向性因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）ＩＧＦ−１およびＢＤＮＦの増加を示している（１群あたりｎ＝６〜８；スチューデントｔ検定）。図８Ｅ〜Ｇでは、ＡＤ−Ｔｇマウス（５月齢）を毎週ＧＡまたはビヒクル（ＰＢＳ）で処置し、ＭＷＭタスクにおいて６月齢の同齢のＷＴ同腹仔と比較した。処置されたマウスは、コントロールと比べて、ＭＷＭの習得期（Ｅ）、探索期（Ｆ）および逆転期（Ｇ）において、より良好な空間学習／空間記憶の成績を示した（１群あたりｎ＝６〜９；個別の対比較のための２元配置反復測定分散分析に続くボンフェローニのｐｏｓｔ−ｈｏｃ解析；ＷＴマウス、黒丸；ＡＤ−Ｔｇコントロール、白丸；処置されたＡＤ−Ｔｇ、灰色丸）。図８Ｈ〜Ｉは、最後のＧＡ注射の１ヶ月後（Ｈ）または２ヶ月後（Ｉ）のＲＡＷＭタスクにおける同じマウスの認知能力を示している（１群あたりｎ＝６〜９；個別の対比較のための２元配置反復測定分散分析に続くボンフェローニのｐｏｓｔ−ｈｏｃ解析）。データは、少なくとも３回の独立した実験の代表である。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図９Ａ−Ｈ】図９Ａ〜Ｈは、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける毎週ＧＡの投与のさらなる治療効果を示している。Ａ〜Ｂは、毎週ＧＡまたはビヒクル（ＰＢＳ）で処置され、投与レジメンの第１週の終わり（合計２回のＧＡ注射の後）に調べられた、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスを示している。同齢のＷＴコントロールと比べたときの、処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇマウスにおける、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋脾細胞の出現率（Ａ）およびＣＰにおけるＩＦＮ−γを発現している免疫細胞（Ｂ；細胞内染色され、ＣＤ４５で予めゲーティングされた）のフローサイトメトリー解析（１群あたりｎ＝４〜６；１元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析）。（Ｃ）毎週ＧＡまたはビヒクルで処置され、毎週ＧＡレジメンの第１週または第４週の終わりに調べられた、４月齢のＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定された遺伝子ｉｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２のｍＲＮＡ発現レベル（１群あたりｎ＝６〜８；１元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析）。図９Ｄ〜Ｅは、毎週ＧＡ後の、６月齢のＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋ＢＭキメラ由来の脳切片の代表的な像を示している。ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ細胞は、毎週ＧＡで処置されたＡＤ−Ｔｇマウスの第３脳室のＣＰ（３Ｖ；ｉ）、隣接する脳室腔（ｉｉ）、および側脳室のＣＰ（ＬＶ；ｉｉｉ）に局在した（Ｄ；スケールバー、２５μｍ）。共焦点のｚ軸スタックの代表的な正射影は、毎週ＧＡで処置された７月齢のＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスのＣＰにおいて、ＧＦＰ＋細胞と骨髄マーカーＣＤ６８との共局在化を示しているが、コントロールのＰＢＳで処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスでは共局在を示さない（Ｅ；スケールバー、２５μｍ）。（Ｆ）ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ細胞は、ＧＡで処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋マウスの脳においてＡβプラークの近くに骨髄マーカーＩＢＡ−１と共局在し、骨髄マーカーＩＢＡ−１を共発現する（スケールバー、２５μｍ）。図９Ｇ〜Ｈは、毎週ＧＡレジメンの第２週における、４月齢のＷＴマウス、処置されていないＡＤ−ＴｇマウスおよびＡＤ−Ｔｇマウスの海馬から単離された細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示している。ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ／ＣＤ４５ｈｉｇｈ  ｍｏ−ＭΦをゲーティングし（Ｇ）、定量した（Ｈ；１群あたりｎ＝４〜５；一元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図１０Ａ−Ｈ】図１０Ａ〜Ｈは、ＡＤ−Ｔｇマウスにおけるｐ３００阻害剤（Ｃ６４６）の投与の治療効果を示している。図１０Ａ〜Ｂでは、高齢のマウス（１８ヶ月）を１週間にわたってｐ３００ｉまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）で処置し、処置休止の１日後に調べた。ｐ３００ｉ処置後の、脾臓におけるＩＦＮ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率の上昇（Ａ）およびＣＰにおけるＩＦＮ−γを発現する免疫細胞数の増加（Ｂ）を示す代表的なフローサイトメトリープロット。図１０Ｃ〜Ｅは、１週間にわたってｐ３００ｉまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）を投与され、その後、さらに３週間後に調べられた、１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスの脳の代表的な顕微鏡像（Ｃ）およびその脳におけるＡβプラーク量の定量的解析を示している。脳のＡβプラークを免疫染色し、脳をＨｏｅｃｈｓｔ核染色によって免疫染色した（１群あたりｎ＝５；スケールバー、２５０μｍ）。海馬ＤＧ（Ｄ）および大脳皮質５層（Ｅ）における、Ａβプラークの平均面積および平均プラーク数を定量した（６μｍ脳切片において；１群あたりｎ＝５〜６；スチューデントｔ検定）。（Ｆ）１または２セッションにおける、７月齢の種々の群のＡＤ−Ｔｇマウスへのｐ３００ｉ処置（またはビヒクルとしてのＤＭＳＯ）投与レジメンの模式図。図１０Ｇ〜Ｈは、処置されていないＡＤ−Ｔｇ群と比べたときの、大脳皮質（５層）のＡβプラークのカバー率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）の平均変化（Ｇ）、ならびに大脳の可溶性Ａβ１−４０およびＡβ１−４２タンパク質の平均レベルの変化（Ｈ）を示している（非処置群のＡβ１−４０およびＡβ１−４２の平均レベル、それぞれ９０．５±１１．２および６３．８±６．８ｐｇ／ｍｇ全部分（ｔｏｔａｌ  ｐｏｒｔｉｏｎ）；１群あたりｎ＝５〜６；一元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図１１Ａ−Ｄ】図１１Ａ〜Ｄは、ＰＤ−１遮断が、ＡＤ−ＴｇマウスにおいてＩＦＮ−γ依存性の脈絡叢活性を高めることを示している。１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスに、１日目および４日目に２５０ｕｇの抗ＰＤ−１またはコントロールＩｇＧをｉ．ｐ．注射し、全身免疫応答およびＣＰ活性に対する効果について７〜１０日目に調べた。（Ａ〜Ｂ）αＰＤ−１またはＩｇＧで処置されたＡＤ−Ｔｇマウスおよび処置されていないＡＤ−ＴｇおよびＷＴコントロールにおける、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋脾細胞の出現率（細胞内染色され、ＣＤ４５およびＴＣＲ−βで予めゲーティングされた）の代表的なフローサイトメトリープロット（Ａ）および定量的解析（Ｂ）（１群あたりｎ＝４〜６；一元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析；＊＊，示されている処置群間においてＰ＜０．０１；エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している）。（Ｃ）ＩｇＧで処置されたおよび処置されていないＡＤ−Ｔｇコントロールと比べたときの、抗ＰＤ−１で処置されたＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されたｉｆｎ−ｇのｍＲＮＡ発現レベル、（Ｄ）同じマウスのＣＰにおけるＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて濃縮されたＧＯアノテーションターム（１群あたりｎ＝３〜５；１元配置分散分析の後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析；＊，Ｐ＜０．０５）（灰色のスケールは、Ｐ値の底１０の対数に負号をつけたものに相当する）。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜Ｂは、ＰＤ−１遮断が、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける認知機能低下を緩和することを示している。１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスに、１日目および４日目に、２５０ｕｇの抗ＰＤ−１またはコントロールＩｇＧをｉ．ｐ．注射し、１または２ヶ月後に、病態に対する効果についてそれらのマウスを調べた。（Ａ〜Ｂ）実験計画のスキーム。単一矢印は、処置の時点を示し、二重矢印は、認知試験の時点を示す。同齢のＷＴマウスおよび処置されていないＡＤ−Ｔｇマウスと比べたときの、ＲＡＷＭ学習および記憶タスクにおける１日あたりの平均エラー数によって評価される、抗ＰＤ−１およびＩｇＧで処置されたマウスの認知能力（１群あたりｎ＝６〜８；個別の対比較のための二元配置反復測定分散分析に続くボンフェローニのｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析）。（Ａ）抗ＰＤ−１またはＩｇＧコントロールによる１処置セッション後の、ＲＡＷＭにおけるＡＤ−Ｔｇマウスの能力。（Ｂ）単一の抗ＰＤ−１処置セッションまたは１ヶ月のインターバルを含む２セッションの、成績に対する効果。
【図１３Ａ−Ｄ】図１３Ａ〜Ｄは、ＰＤ−１遮断がＡＤの病態を緩和すること示している代表的な顕微鏡像（Ａ）、ならびに１０月齢において抗ＰＤ−１（図１２ａ〜ｂに示されているような１または２セッション）またはＩｇＧコントロールで処置され、その後、１２月齢において調べられたＡＤ−Ｔｇマウスの脳におけるＡβプラーク量およびアストログリオーシスの定量的解析（Ｂ、Ｃ、Ｄ）を示している。脳におけるＡβプラーク（赤色）、ＧＦＡＰ（アストログリオーシス、緑色）を免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色によって染色した（１群あたりｎ＝４〜５；スケールバー、５０μｍ）。Ａβプラークの平均面積および平均プラーク数を、海馬歯状回（ＤＧ）および大脳皮質５層において定量し、ＧＦＡＰ免疫反応性を海馬において測定した（６μｍ脳切片において；１群あたりｎ＝５〜６；スチューデントｔ検定）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４は、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける認知機能低下に対する抗ＰＤ−１抗体の異なる投与および投与頻度の効果を示している。雌５ＸＦＡＤ  ＡＤトランスジェニックマウス（６ヶ月の平均コホート齢）を、抗ＰＤ−１特異的抗体（ＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１）またはＩｇＧコントロール（ラットＩｇＧ２ａ）で処置した。抗ＰＤ−１で処置されたマウスには、実験の１日目に５００ｕｇの抗体の注射を１回行うか、または２５０ｕｇの注射を２回、注射の間に３日間のインターバルを空けて行った。同齢の野生型（ＷＴ）マウスをさらなるコントロール群として用いた。本発明者らは、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）タスクを用いて空間学習および空間記憶の能力に対する効果を評価した。実験計画が示されている。黒矢印は、処置の時点を示し、イラストは、認知試験の時点を示している。抗ＰＤ−１で処置された５ＸＦＡＤマウス−１回の注射（ｎ＝７）または２回の注射（ｎ＝１１）、ＩｇＧ２ａで処置された５ＸＦＡＤマウス（ｎ＝１０）およびＷＴ（ｎ＝１４）コントロールのＲＡＷＭの成績；２元配置反復測定分散分析およびＤｕｎｎｅｔのｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、抗ＰＤ−１で処置されたマウス（１回の注射）対ＩｇＧで処置されたコントロール。
【図１５Ａ−Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける認知機能低下に対する抗ＰＤ−１抗体の反復投与の効果を示している。雄５ＸＦＡＤ  ＡＤトランスジェニックマウスを、反復処置セッションにおいて１ヶ月に１回、抗ＰＤ−１特異的抗体（ＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１）またはＩｇＧコントロール（ラットＩｇＧ２ａ）で処置した。１回目の注射は、３月齢において、２回目の注射は、４月齢において、および３回目の注射は、５月齢において行った。投与量は、実験計画のスキーム（Ａ）に示されている。同齢の野生型（ＷＴ）マウスをさらなるコントロール群として用いた。本発明者らは、２つの異なる時点、すなわち５月齢（Ｂ）および６月齢（Ｃ）において、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）タスクを用いて空間学習および空間記憶の能力に対する効果を評価した。実験計画が示されている。黒矢印は、処置の時点を示し、イラストは、認知試験の時点を示している。抗ＰＤ−１で処置された５ＸＦＡＤマウス（ｎ＝７；白丸）、ＩｇＧ２ａで処置された５ＸＦＡＤマウス（ｎ＝９；白四角）およびＷＴ（ｎ＝８）コントロール（黒丸）のＲＡＷＭの成績；２元配置反復測定分散分析およびＤｕｎｎｅｔのｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、抗ＰＤ−１で処置されたマウス対ＩｇＧで処置されたコントロール。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
免疫チェックポイント機構は、活性化Ｔ細胞の応答性の細胞固有のダウンレギュレーションおよび抑制性レセプターによるエフェクター機能を含み、全身の免疫ホメオスタシスおよび自己免疫寛容を維持している（Ｊｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２）。近年、プログラム死−１（ＰＤ−１）経路（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）などのこれらの免疫チェックポイントの遮断が、注目すべき抗腫瘍の有効性を示したことから、様々な悪性疾患と闘う際、免疫系の力の抑制を解くことの可能性に脚光が当てられた。最近、アルツハイマー病の動物モデルに抗ＰＤ−１抗体を投与することにより、Ａβのクリアランス、認知機能低下の回復がもたらされ、その投与は、神経炎症反応の消散に関連することが示された（ＷＯ２０１５／１３６５４１；Ｂａｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０００８】
したがって、全身免疫抑制は、ＡＤの病態を退ける能力を干渉するので、全身免疫系に対する制限（ｒｅｓｔｒａｉｎｓ）を解除することによって、ＡＤの病態は、緩和され得る。
【０００９】
本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まない中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または損傷を処置するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする個体に、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な作用物質を投与する工程を含み、ここで、前記活性な作用物質は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによって投与され、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置のインターバルセッションを順に含み、前記１つ以上の免疫チェックポイントは、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容抑制性チロシンモチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）およびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される。
【００１０】
別の態様において、本発明は、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって個体において全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な作用物質、または自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または損傷の処置において使用するためのその活性な作用物質を含む薬学的組成物に関し、ここで、前記薬学的組成物は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによる投与のための薬学的組成物であり、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置のインターバルセッションを順に含み；前記１つ以上の免疫チェックポイントは、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、ＳＴＩＮＧ、ＴＩＧＩＴおよびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される。
【００１１】
ある特定の実施形態において、投与レジメンは、全身免疫抑制のレベルが一過性に低下するように調整される。
【００１２】
用語「処置する」は、本明細書中で使用されるとき、所望の生理学的効果を得る手段のことを指す。その効果は、ある疾患および／またはその疾患に帰する症状を部分的または完全に治癒することに関して治療的な効果であり得る。この用語は、疾患の阻害、すなわち、その発症の停止もしくは遅延；または疾患の回復、すなわち、疾患の後退のことを指す。
【００１３】
用語「非処置セッション」は、用語「非処置の期間」と本明細書中で交換可能に使用され、処置されている個体に活性な作用物質を投与しないセッションのことを指す。
【００１４】
制御性Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞の「全身における存在」という用語は、本明細書中で使用されるとき、制御性Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞が循環免疫系、すなわち、血液、脾臓およびリンパ節に存在すること（それらのレベルまたは活性によって測定される）を指す。脾臓内の細胞集団のプロファイルが、血液中の細胞集団のプロファイルに反映されることは、免疫学の分野において周知の事実である（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【００１５】
本処置は、全身免疫抑制の上昇を示す患者とそのような上昇を示さない患者の両方に適用できる。時折、本発明にかかる処置を必要とする個体は、ある特定の末梢免疫抑制レベルを有し、その末梢免疫抑制は、循環中のＴｒｅｇの出現率または数の増加ならびに／あるいはそれらの機能活性の増大ならびに／またはＩＦＮγ産生白血球の減少および／もしくは刺激に応答した白血球の増殖の減少によって反映される。Ｔｒｅｇの出現率または数の増加は、全ＣＤ４細胞の総数または全ＣＤ４細胞のパーセンテージの増加であり得る。例えば、アルツハイマー病の動物モデルでは、ＣＤ４細胞のうちＦｏｘｐ３の出現率が野生型マウスと比べて高いことが本発明に基づいて見出された。しかしながら、前記個体において、全身のＴｒｅｇ細胞のレベルが上昇していなかったか、それらの機能活性が高まっていなかったか、ＩＦＮγ産生白血球のレベルが低下していなかったか、または刺激に応答した白血球の増殖が減少していなかったとしても、全身免疫抑制のレベルまたは活性を低下させる本発明の方法は、自己免疫性神経炎症性疾患ＲＲＭＳを含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または損傷の処置において有効である。重要なことには、前記全身免疫抑制は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などのＴｒｅｇ以外のさらなる免疫細胞型も関係し得る（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＆  Ｎａｇａｒａｊ，２００９）。
【００１６】
全身免疫抑制のレベルは、当業者に周知の様々な方法によって検出され得る。例えば、Ｔｒｅｇのレベルは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーまたは細胞内の核マーカー（Ｃｈｅｎ  ＆  Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，２０１１）、リンパ球のＣＤ４５、ＴＣＲ−βまたはＣＤ４マーカーで免疫染色された、末梢血単核球またはＴリンパ球のフローサイトメトリー解析、およびそれらの細胞に特異的に結合した抗体の量を測定することによって測定され得る。Ｔｒｅｇの機能活性は、様々なアッセイによって測定され得る；例えば、チミジン取り込みアッセイが通常使用され、このアッセイでは、抗ＣＤ３ｍＡｂによって刺激されるＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（従来のＴ細胞）の増殖の抑制を、［３Ｈ］チミジンの取り込みまたはＣＦＳＥ（５−（および６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（これは細胞に入り込むことができ；ＣＦＳＥの蛍光強度の経時的な半減として細胞分裂を測定する））の使用によって測定する。ＩＦＮγ産生白血球の数またはそれらの活性もしくは増殖能は、当該分野で公知の方法を用いて当業者によって容易に評価され得る；例えば、ＩＦＮγ産生白血球のレベルは、短時間のエキソビボ刺激およびゴルジ停止後の末梢血単核球のフローサイトメトリー解析、ならびにＩＦＮγ細胞内染色（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍＴＭ固定／透過処理キットを使用して）による免疫染色、これらの細胞の馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）を回収し、分泌されたサイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて定量すること、またはその馴化培地中の種々のサイトカインの比、例えば、ＩＬ２／ＩＬ１０、ＩＬ２／ＩＬ４、ＩＮＦγ／ＴＧＦβなどを比較することによって、測定され得る。ヒト末梢血中のＭＤＳＣのレベルは、当業者によって、例えば、報告されているように（Ｋｏｔｓａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）、ＤＲ−／ＬＩＮ−／ＣＤ１１ｂ＋、ＤＲ−／ＬＩＮ−／ＣＤ１５＋、ＤＲ−／ＬＩＮ−／ＣＤ３３＋およびＤＲ（−／ｌｏｗ）／ＣＤ１４＋細胞の出現率のフローサイトメトリー解析を用いることによって、容易に評価され得る。
【００１７】
ヒトにおいて、循環中のＴｒｅｇの総数が、健康なコントロール集団よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％またはそれ以上高いか、全ＣＤ４＋細胞のうちのＴｒｅｇ細胞のパーセンテージが、健康なコントロール集団よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％またはそれ以上上昇しているか、またはＴｒｅｇの機能活性が、健康なコントロール集団よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％またはそれ以上上昇しているとき、末梢／全身免疫抑制は、増加していると見なされ得る。あるいは、ＩＦＮγ産生白血球またはそれらの活性のレベルが、健康なコントロール集団より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％低下しているか；または刺激に応答した白血球の増殖が、健康なコントロール集団より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％低下しているとき、末梢／全身免疫抑制は、増加していると見なされ得る。
【００１８】
ある作用物質をある個体に投与した際、この個体の循環中のＴｒｅｇの総数が、その作用物質の投与前のレベルと比べて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％減少したとき、または全ＣＤ４＋細胞のうちのＴｒｅｇ細胞のパーセンテージが、健康なコントロール集団と比べて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％低下したとき、またはＴｒｅｇの機能活性が、その作用物質の投与前のレベルと比べて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％減少したとき、その作用物質は、全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす作用物質であると見なされ得る。あるいは、ある作用物質をある個体に投与した際、ＩＦＮγ産生白血球の総数またはそれらの活性が、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％またはそれ以上増加したとき；または刺激に応答した白血球の増殖が、健康なコントロール集団よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％またはそれ以上増加したとき、その作用物質は、全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす作用物質であると見なされ得る。
【００１９】
ある特定の実施形態において、上記活性な作用物質は、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって、例えば、１つ以上の免疫チェックポイントの遮断によって、全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす。
【００２０】
ある特定の実施形態において、全身免疫抑制のレベルの低下は、ＩＦＮγ産生白血球の全身における存在または活性の増加を伴う。
【００２１】
ある特定の実施形態において、活性な作用物質は、全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こし、それによって、エフェクターＴ細胞の全身における存在または活性の増加を引き起こす。
【００２２】
全身免疫抑制を解除するように操作され得るチェックポイントは、本明細書中で、免疫チェックポイントレセプターとその天然のリガンドとの対またはそれらの２つのパートナーのうちのいずれか１つとして言及される。例えば、ＰＤ１は、２つの公知のリガンドを有し、本明細書中で「ＰＤ１−ＰＤＬ１」または「ＰＤ１−ＰＤＬ２」と称され、Ｂ７Ｈ３は、そのリガンドが特定されておらず、単に「Ｂ７Ｈ３」と称される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、本発明に従って使用され得る活性な作用物質は、（ｉ）抗体、例えば、ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）；組換え抗体；および一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）（ｉｉ）抗体模倣物、例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子；アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）；アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）；アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）；アルファボディ；アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）；アビマー（ａｖｉｍｅｒ）；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）；Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド；およびモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）；（ｉｉｉ）アプタマー；および（ｉｖ）小分子阻害剤からなる群より選択され得る。
【００２４】
抗体模倣物の非限定的な例を表１に示す：
【表１】
2018524362.tif 000002
［１］Ｎｙｇｒｅｎ  ＰＡ（Ｊｕｎｅ  ２００８）；［２］Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）；［３］Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）；［４］Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）；［５］Ｄｅｓｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）；［６］Ｓｋｅｒｒａ  Ａ（２００８）；［７］Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）；［８］Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）’［９］Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）；［１０］Ｎｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）；［１１］Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．
【００２５】
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド分子またはペプチド分子である。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本発明に従って使用され得る活性な作用物質は、
（ｉ）（ａ）抗ＩＣＯＳ；（ｂ）抗Ｂ７ＲＰ１；（ｃ）抗ＶＩＳＴＡ；（ｄ）抗ＣＤ４０；（ｅ）抗ＣＤ４０Ｌ；（ｆ）抗ＣＤ８０；（ｇ）抗ＣＤ８６；（ｈ）抗Ｂ７−Ｈ３；（ｉ）抗Ｂ７−Ｈ４；（ｊ）Ｂ７−Ｈ７；（ｋ）抗ＢＴＬＡ；（ｌ）抗ＨＶＥＭ；（ｍ）抗ＣＤ１３７；（ｎ）抗ＣＤ１３７Ｌ；（ｏ）抗ＯＸ４０Ｌ；（ｐ）抗ＣＤ−２７；（ｑ）抗ＣＤ７０；（ｒ）抗ＳＴＩＮＧ；（ｓ）抗ＴＩＧＩＴ；および（ｔ）（ａ）〜（ｓ）の任意の組み合わせからなる群より選択される抗体；
（ｉｉ）アジュバントと併用される（ａ）〜（ｓ）の任意の組み合わせ；
（ｉｉｉ）（ａ）アデノシンＡ１レセプターアンタゴニスト；（ｂ）アデノシンＡ２ａレセプター；および（ｃ）Ａ３レセプターアンタゴニストからなる群より選択される小分子；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）（ａ〜ｃ）と（ｉ）（ａ〜ｓ）との任意の組み合わせ；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ
からなる群より選択され得る。
【００２７】
ある特定の実施形態において、上に記載された抗体は、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇまたは１．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの投与量でヒトに投与され得る。
【００２８】
ある特定の実施形態において、アデノシンＡ１レセプターアンタゴニストは、ＰＳＢ３６（１−ブチル−８−（ヘキサヒドロ−２，５−メタノペンタレン−３ａ（１Ｈ）−イル）−３，７−ジヒドロ−３−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）であり得る；アデノシンＡ２ａレセプターアンタゴニストは、ＳＣＨ５８２６１（５−アミノ−７−（２−フェニルエチル）−２−（２−フリル）−ピラゾロ（４，３−ｅ）−１，２，４−トリアゾロ（１，５−ｃ）ピリミジン）、ＳＹＮ１１５（４−ヒドロキシ−Ｎ−［４−メトキシ−７−（４−モルホリニル）−２−ベンゾチアゾリル］−４−メチル−１−ピペリジンカルボキサミド）、ＦＳＰＴＰ（ＳＣＨ５８２６１（５−アミノ−７−［２−（４−フルオロスルホニル）フェニルエチル］−２−（２−フリル）−ピラゾロ［４，３−ε］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジンとも呼ばれる）、ＳＣＨ４４２４１６（２−（２−フラニル）−７−［３−（４−メトキシフェニル）プロピル］−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン−５−アミン）またはＺＭ２４１３８５（トザデナント（ｔｏｚａｄｅｎａｎｔ）（４−ヒドロキシ−Ｎ−（４−メトキシ−７−モルホリノベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−４−メチルピペリジン−１−カルボキサミドとも呼ばれる）であり得る；Ａ３レセプターアンタゴニストは、ＭＲＳ３７７７（２−フェノキシ−６−（シクロヘキシルアミノ）プリンヘミオキサレート）であり得る。
【００２９】
上で述べたように、上記活性な作用物質は、少なくとも２コースの治療を含む投与レジメンによって投与され、治療の各コースは、処置セッションに続く非処置のインターバルセッションを順に含む。その投与レジメンは、いくつかの方法で決定され得る。例えば、免疫抑制のレベルは、ＩＦＮγ産生白血球のレベルもしくは活性または刺激に応答した白血球の増殖速度を個別にモニターし、モニタリングの結果から決定される、処置セッション、投与頻度およびインターバルセッションを経験的かつ個人的に調節することによって、処置されている各患者に対して所望のレベルに調整され得る（個別化医療）。
【００３０】
したがって、処置セッションは、個体への活性な作用物質または薬学的組成物の投与を含み得、処置セッションは、少なくともＩＦＮγ産生白血球の全身における存在もしくはレベルまたは刺激に応答した白血球の増殖速度が基準より高くなるまで維持され、その投与は、インターバルセッション中は休止され、インターバルセッションは、そのレベルが基準より高い限り維持され、その基準は、（ａ）前記投与前の前記個体から得られた最新の血液サンプルにおいて測定された、ＩＦＮγ産生白血球の全身における存在もしくは活性のレベルまたは刺激に応答した白血球の増殖速度；あるいは（ｂ）ＣＮＳの疾患、障害、状態または損傷に苦しんでいる個体の集団に特徴的な、ＩＦＮγ産生白血球の全身における存在もしくは活性のレベルまたは刺激に応答した白血球の増殖速度から選択される。
【００３１】
処置セッションおよびインターバルセッションの長さは、ある特定の患者集団を対象にした臨床試験において医師によって決定され得、個人ベースで免疫抑制レベルをモニタリングする必要なく、この患者集団に一貫して適用され得る。
【００３２】
ある特定の実施形態において、処置セッションは、個体への活性な作用物質の投与を含み、処置セッションは、少なくとも、活性な作用物質の全身における存在が治療レベルに達するまで維持され、投与は、インターバルセッション中は休止され、インターバルセッションは、そのレベルが前記治療レベルの約９５％、９０％、８０％、７０％、６０％または５０％より高い限り維持される。用語「治療レベル」は、本明細書中で使用されるとき、癌治療などの公知の治療において免疫チェックポイントを遮断するために使用される薬物の一般に認められている全身レベルのことを指す（上記を参照のこと）。
【００３３】
ある特定の実施形態において、処置セッションは、単回投与であり得るか、または１日〜４週間、例えば、１日、２日もしくは３日、または１〜４週間のコースにおいて行われる複数回投与を含み得る。例えば、処置セッションは、２回の投与を含み得、その両方が、１週間以内に行われ、例えば、２回目の投与は、１回目の投与の１、２、３、４、５または６日後に行われる。別の例として、処置セッションは、３回の投与を含み得、そのすべてが、１週間以内に行われ、例えば、直前の投与の１、２または３日後に行われる。別の例として、処置セッションは、３回の投与を含み得、そのすべてが、２週間以内に行われ、例えば、直前の投与の１、２、３、４または５日後に行われる。別の例として、処置セッションは、４回の投与を含み得、そのすべてが、２週間以内に行われ、例えば、直前の投与の１、２、３または４日後に行われる。別の例として、処置セッションは、４回の投与を含み得、そのすべてが、３週間以内に行われ、例えば、直前の投与の１、２、３、４、５または６日後に行われる。別の例として、処置セッションは、５回の投与を含み得、そのすべてが、３週間以内に行われ、例えば、直前の投与の１、２、３、４または５日後に行われる。
【００３４】
ある特定の実施形態において、非処置のインターバルセッションは、１週間〜６ヶ月、例えば、２〜４週間、３〜４週間、２週間〜６ヶ月の長さ、３週間〜６ヶ月の長さ、特に、２、３または４週間の長さであり得る。ある特定の実施形態において、非処置のインターバルセッションは、１〜２ヶ月の長さ、１〜３ヶ月の長さまたは２〜３ヶ月の長さであり得る。
【００３５】
処置セッションにおいて、活性な作用物質または薬学的組成物の投与は、単回投与または反復投与であり得、例えば、活性な作用物質または薬学的組成物は、１回だけ投与され、次いで、そのすぐ後にインターバルが続き得るか、または活性な作用物質もしくは薬学的組成物は、毎日、または２、３、４、５もしくは６日ごとに１回、または１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、または４週間ごとに１回投与され得る。これらの頻度は、いずれの活性な作用物質にも当てはめることができ、当該分野において通常使用される慣習に基づき得、最終的には、臨床試験における医師によって決定され得る。あるいは、処置セッションにおける反復投与の頻度は、活性な作用物質の性質に応じて適合され得、ここで、例えば、ある小分子は、毎日投与され得、ある抗体は、３日ごとに１回投与され得る。ある作用物質が、処置セッション中に比較的低頻度で、例えば、１ヶ月の処置セッション中に１週間に１回または６ヶ月の処置セッション中に１ヶ月に１回、投与されるとき、この処置セッションの後に、処置セッション中の反復投与間の期間より長い（すなわち、この例ではそれぞれ１週間または１ヶ月より長い）長さの非処置インターバルセッションが続くことが理解されるべきである。この例における処置セッション中の投与間の１週間または１ヶ月という休止は、インターバルセッションと見なされない。
【００３６】
処置セッションおよびインターバルセッションの長さは、例えば、活性な作用物質を３日ごとに１回投与するという頻度が、６または９日間の処置セッションおよびそれに応じて開始されるインターバルセッションをもたらし得るような投与の頻度に調整され得る。
【００３７】
処置セッションが、単回投与からなる場合、投与レジメンは、インターバルの長さによって決定され、その単回投与の後、次の単回投与の処置セッション前に、７、８、９、１０、１４、１８、２１、２４または２８日またはそれより長いインターバルが続く。特に、投与レジメンは、２、３または４週間の非処置のインターバルが間に挿入された単回投与からなる。さらに、投与レジメンは、２〜４週間、２〜３週間または３〜４週間の非処置のインターバルが間に挿入された単回投与からなり得る。
【００３８】
処置セッションが、複数回投与からなる場合、投与レジメンは、インターバルの長さによって決定され、１週間以内に行われる複数回投与の後、次の複数回投与の処置セッションの前に、７、１０、１４、１８、２１、２４または２８日またはそれより長いインターバルが続く。特に、投与レジメンは、２または３または４週間の非処置のインターバルが間に挿入された、１週間以内に行われる複数回投与からなり得る。さらに、投与レジメンは、２〜４週間、２〜３週間または３〜４週間の非処置のインターバルが間に挿入された、１週間以内に行われる複数回投与からなり得る。
【００３９】
別の例として、投与レジメンは、２週間以内に行われる複数回投与に続いて、次の複数回投与の処置セッションの前に、２週間、３週間または１、２、３もしくは４ヶ月あるいはそれより長いインターバルを含み得る。特に、投与レジメンは、１、２、３または４ヶ月の非処置のインターバルが間に挿入された、２週間以内に行われる複数回投与からなり得る。さらに、投与レジメンは、１〜２ヶ月、１〜３ヶ月、１〜４ヶ月、２〜３ヶ月、２〜４ヶ月または３〜４ヶ月の非処置のインターバルが間に挿入された、２週間以内に行われる複数回投与からなり得る。
【００４０】
別の例として、投与レジメンは、３週間以内に行われる複数回投与に続いて、次の複数回投与の処置セッションの前に１、２、３、４、５もしくは６ヶ月またはそれより長い時間を含み得る。特に、投与レジメンは、１、２、３、４、５または６ヶ月の非処置のインターバルが間に挿入された、３週間以内に行われる複数回投与からなり得る。さらに、投与レジメンは、１〜２ヶ月、１〜３ヶ月、１〜４ヶ月、１〜５ヶ月、１〜６ヶ月、２〜３ヶ月、２〜４ヶ月、２〜５ヶ月、２〜６ヶ月、３〜４ヶ月、３〜５ヶ月、３〜６ヶ月、４〜５ヶ月、４〜６ヶ月または５〜６ヶ月の非処置のインターバルが間に挿入された、３週間以内に行われる複数回投与からなり得る。
【００４１】
当然のことながら、ある特定のレジメンから開始され、別のもので置き換えられる、自在な投与レジメンが想定される。例えば、各１つの処置セッションが３日空けた２回の単回投与を含み、処置セッション間に例えば１週間のインターバルを含む処置セッションは、適切であると考えられるとき、例えば、２、３または４週間のインターバルによって分断された単回投与の処置セッションを含む投与レジメンによって置き換えられ得る。別の例として、各１つの処置セッションが７日空けた２回の単回投与を含み、処置セッション間に例えば２週間のインターバルを含む処置セッションは、適切であると考えられるとき、例えば、２、３、４、５または６週間のインターバルによって分断された単回投与の処置セッションを含む投与レジメンによって置き換えられ得る。別の例として、各１つの処置セッションが３日空けた３回の単回投与を含み、処置セッション間に例えば２週間のインターバルを含む処置セッションは、適切であると考えられるとき、例えば、２、３、４、５または６週間のインターバルによって分断された単回投与の処置セッションを含む投与レジメンによって置き換えられ得る。
【００４２】
いずれの場合も、投与レジメン、すなわち、処置セッションおよびインターバルセッションの長さは、免疫抑制レベルの低下が、例えば、その個体における制御性Ｔ細胞の全身における存在もしくは活性のレベルの低下またはＩＦＮγ産生白血球の全身における存在もしくは活性のレベルの上昇によって測定されるとき、一過性であるように調整される。
【００４３】
本発明にかかる方法、活性な作用物質または薬学的組成物は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病  ハンチントン病、一次性進行型多発性硬化症；二次性進行型多発性硬化症、大脳皮質基底核変性症、レット症候群、加齢性黄斑変性症および網膜色素変性症からなる群より選択される網膜変性障害；前部虚血性視神経症；緑内障；ブドウ膜炎；うつ病；外傷関連ストレスまたは外傷後ストレス障害、前頭側頭型認知症；レヴィー小体型認知症、軽度認識障害、後部皮質萎縮、原発性進行性失語または進行性核上性麻痺から選択される神経変性疾患、障害または状態であるＣＮＳの疾患、障害または状態を処置するためのものであり得る。ある特定の実施形態において、ＣＮＳの状態は、加齢性認知症である。
【００４４】
ある特定の実施形態において、ＣＮＳの状態は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病  ハンチントン病である。
【００４５】
ある特定の実施形態において、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、ＳＴＩＮＧ、ＴＩＧＩＴおよびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンから選択される免疫チェックポイントの１つを遮断する上に記載された活性な作用物質（例えば、免疫チェックポイントの２つのパートナーのうちの１つに対する抗体）の各１つは、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病  ハンチントン病、一次性進行型多発性硬化症；二次性進行型多発性硬化症、大脳皮質基底核変性症、レット症候群、加齢性黄斑変性症および網膜色素変性症からなる群より選択される網膜変性障害；前部虚血性視神経症；緑内障；ブドウ膜炎；うつ病；外傷関連ストレスまたは外傷後ストレス障害、前頭側頭型認知症；レヴィー小体型認知症、軽度認識障害、後部皮質萎縮、原発性進行性失語または進行性核上性麻痺から選択される神経変性疾患、障害または状態のいずれか１つの処置において使用するためのものである。これらの活性な作用物質のいずれか１つの使用を含むこれらの疾患のいずれか１つの処置は、上に記載されたレジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）に従って行われ得る。
【００４６】
本発明にかかる方法、活性な作用物質および薬学的組成物はさらに、脊髄損傷、閉鎖性頭部損傷、鈍的外傷、鋭的外傷、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、脳虚血、視神経損傷、心筋梗塞、有機リン中毒、および腫瘍切除術が原因の損傷から選択されるＣＮＳの損傷を処置するためのものであり得る。
【００４７】
ある特定の実施形態において、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、ＳＴＩＮＧ、ＴＩＧＩＴおよびＡ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）−Ｌ−トリプトファンから選択される免疫チェックポイントの１つを遮断する上に記載された活性な作用物質（例えば、免疫チェックポイントの２つのパートナーのうちの１つに対する抗体）の各１つは、脊髄損傷、閉鎖性頭部損傷、鈍的外傷、鋭的外傷、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、脳虚血、視神経損傷、心筋梗塞、有機リン中毒、および腫瘍切除術が原因の損傷から選択されるＣＮＳの損傷の処置において使用するためのものである。これらの活性な作用物質のいずれか１つの使用を含むこれらの損傷のいずれか１つの処置は、上に記載されたレジメンに従って行われ得る。
【００４８】
上で述べたように、本発明者らは、本発明が、アルツハイマー病を模倣するマウスにおいて認知機能を改善することを見出した。したがって、上記方法、活性な作用物質および薬学的組成物は、ＣＮＳの運動機能および／または認知機能の改善において使用するため、例えば、診断された疾患を有しない個体ならびに神経変性疾患に罹患している人々において生じ得る、加齢関連の認知機能喪失の軽減において使用するためのものであり得る。さらに、上記方法、活性な作用物質および薬学的組成物は、急性ストレスまたは外傷エピソードに起因する認知機能喪失の軽減において使用するためのものであり得る。本明細書中の上記で述べられた認知機能は、学習、記憶またはその両方を含み得る。
【００４９】
アルツハイマー病を模倣するマウス（５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウス）における認知機能の改善が観察され、その改善が、疾患発現の様々な段階において本発明者らによって特徴付けられたこと；疾患の病態の初期と後期の両方の進行段階が、処置によって緩和され得ることは、強調されるべきである。５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスは、２．５月齢において大脳プラークの病態を示し始め、５月齢において失認を示し始める（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。注目すべきは、下記の実施例２において、本発明者らは、６月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて治療効果を報告し、実施例５では、このモデルにおいてアミロイドベータプラークの沈着および失認が極めて進行した段階である１１および１２月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて治療効果を特徴付ける。ゆえに、提案される発明は、様々な疾患進行の段階（例えば、ステージ１−軽度／初期（２〜４年続く）；ステージ２−中等度／中期（２〜１０年続く）；およびステージ３−重度／後期（１〜３＋年続く））の患者にとって妥当であり得ると予想される。
【００５０】
用語「ＣＮＳ機能」は、本明細書中で使用されるとき、とりわけ、知覚情報の受け取りおよび処理、思考、学習、記銘、言語の認知、生成および理解、運動機能および聴覚的および視覚的応答の制御、バランスおよび平衡の維持、運動協調、知覚情報の伝導、ならびに呼吸、心拍および消化のような自律神経機能の制御のことを指す。
【００５１】
用語「認知」、「認知機能」および「認知能力」は、本明細書中で交換可能に使用され、学習、記憶、心象の創造、思考、自覚、推理、空間能力、発話および言語技能、言語習得、ならびに判断注意の能力を含むがこれらに限定されない任意の心理過程または心理状態に関する。認知は、脳の複数の領域（例えば、海馬、皮質および他の脳構造）において形成される。しかしながら、長期記憶は皮質の少なくとも一部に保存されると仮定され、知覚情報は、島皮質の中に存在する特定の皮質構造である味覚野によって獲得され、整理統合され、読みだされることが知られている。
【００５２】
ヒトでは、認知機能は、任意の公知の方法によって測定され得、その方法は、例えば、臨床全般印象変化尺度（ＣＩＢＩＣ−ｐｌｕｓスケール）；ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）；神経精神症状評価（ＮＰＩ）；臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）；ケンブリッジ神経心理学的検査バッテリー（ＣＡＮＴＡＢ）またはサンド老年者臨床評価（ＳＣＡＧ）であるが、これらに限定されない。認知機能は、イメージング技術（例えば、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）または脳機能を測定することが可能な他の任意のイメージング技術）を用いても間接的に測定され得る。
【００５３】
患者における認知に影響する１つ以上のプロセスの改善は、前記患者における認知機能の改善を意味するので、ある特定の実施形態において、認知の改善は、学習、可塑性および／または長期記憶の改善を含む。用語「改善する」および「高める」は、交換可能に使用され得る。
【００５４】
用語「学習」は、新しい知識、行動、技能、価値もしくは好みの獲得もしくは増加、または既存の知識、行動、技能、価値もしくは好みの改変および強化に関する。
【００５５】
用語「可塑性」は、脳が学習によって変化する能力およびすでに獲得している記憶を変更する能力に関連する、シナプス可塑性、脳可塑性または神経可塑性に関する。可塑性を反映する１つの測定可能なパラメータは、記憶の消去である。
【００５６】
用語「記憶」は、情報がコード化され、保存され、検索されるプロセスに関する。記憶は、３つの識別可能なカテゴリー：感覚記憶、短期記憶および長期記憶を有する。
【００５７】
用語「長期記憶」は、長時間または無期限にわたって情報を維持する能力である。長期記憶は、２つの主要な部分：明確な記憶（陳述記憶）および暗黙の記憶（非陳述記憶）を含む。長期記憶は、記憶を最初に獲得した後に記憶痕跡を安定させるプロセスの１カテゴリーである記憶固定によって達成される。固定は、２つの特定のプロセス、すなわち、学習後の最初の数時間以内に行われるシナプス固定（ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）、および海馬依存性の記憶が数週間から数年間にわたって海馬から独立するようになるシステム固定（ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）に分類される。
【００５８】
本発明の薬学的組成物の種々の特徴を説明する上記の実施形態は、本発明の方法にも関連する。なぜなら、本方法は、同じ薬学的組成物を使用するからである。
【００５９】
さらに別の態様において、本発明は、アルツハイマー病と診断された患者においてＡβプラーク量を減少させるための方法を提供し、その方法は、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす上記の本明細書中で定義されたような活性な作用物質または薬学的組成物を前記患者に投与する工程を含む。
【００６０】
なおも別の態様において、本発明は、アルツハイマー病と診断された患者において海馬グリオーシスを低減するための方法を提供し、その方法は、１つ以上の免疫チェックポイントによって免疫系に課された制限の解除によって全身免疫抑制のレベルの低下を引き起こす上記の本明細書中で定義されたような活性な作用物質または薬学的組成物を前記患者に投与する工程を含む。
【００６１】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、１つ以上の生理的に許容され得る担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化され得る。それらの担体は、その組成物の他の成分と適合しかつそのレシピエントにとって有害でないという意味において、「許容され得る」ものでなければならない。
【００６２】
以下の担体、投与様式、剤形などの例証は、使用される可能性のある公知のものとして列挙され、それらから本発明とともに使用するための担体、投与様式、剤形などが選択され得る。しかしながら、当業者は、まず、任意の所与の製剤および選択された投与様式が、所望の結果を達成するかを判定するために試験されるべきであることを理解するだろう。
【００６３】
投与方法としては、非経口的、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻腔内、頬側、膣、直腸、眼内）、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、局所的および皮内経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、全身投与または局所投与であり得る。
【００６４】
用語「担体」とは、活性な作用物質とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのことを指す。薬学的組成物中の担体は、結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、トウモロコシデンプンなど）；潤滑剤または界面活性物質（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）；および流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）を含み得る。
【００６５】
経口投与の場合、薬学的調製物は、液体の形態、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤として存在し得るか、または使用前に水もしくは他の好適なビヒクルで再構成するための薬物製品として提供され得る。そのような液体調製物は、薬学的に許容され得る添加物（例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または可食の硬化脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステルまたは分画された植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸））を用いて、従来の手段によって調製され得る。薬学的組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤（例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム））とともに従来の手段によって調製される、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされてもよい。
【００６６】
経口投与用の調製物は、活性な化合物の制御放出をもたらすように適切に製剤化され得る。
【００６７】
頬側投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化される錠剤または舐剤の形態をとり得る。
【００６８】
組成物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプル内に、または保存剤が加えられた複数回用量の容器内に、提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとることがあり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含むことがある。あるいは、活性成分は、使用する前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌されたパイロジェンフリー水で構成するための粉末の形態であり得る。
【００６９】
組成物は、例えば、従来の坐剤用基剤（例えば、カカオバターまたは他のグリセリド）を含む、直腸組成物（例えば、坐剤または停留浣腸）にも製剤化され得る。
【００７０】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための組成物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用して、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーを提供する形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量の単位は、一定量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。化合物と好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含む、吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンでできた、カプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。
【００７１】
ヒトにおいて使用するために使用される活性成分の用量の決定は、当該分野で通常用いられる慣習に基づき、臨床試験では最終的に医師が決定する。ヒトに投与する場合の近似の等価用量の予測値は、公知の式を用いて（例えば、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｏｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２：６５９−６６１）、下記の本明細書中に開示されるインビボの実験的証拠に基づいて計算され得る。このパラダイムによると、成人の等価用量（ｍｇ／ｋｇ体重）は、マウスに投与される用量（ｍｇ／ｋｇ体重）に０．０８１を掛けた値に等しい。
【００７２】
本発明は、以下の非限定的な例によって例証される。
【実施例】
【００７３】
（材料および方法）
(動物)
家族性ＡＤ変異型のヒトＡＰＰ（Ｓｗｅｄｉｓｈ変異、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ；Ｆｌｏｒｉｄａ変異、Ｉ７１６Ｖ；およびＬｏｎｄｏｎ変異、Ｖ７１７Ｉ）およびＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ／Ｌ２８６Ｖ）導入遺伝子をニューロン特異的マウスＴｈｙ−１プロモーター（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）の転写制御下で共過剰発現する５ＸＦＡＤトランスジェニックマウス（Ｔｇ６７９９）、ならびにＡＤダブルトランスジェニックＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｊマウス（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。先に記載されたように（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、テイルＤＮＡのＰＣＲ解析によって、ジェノタイピングを行った。ヘテロ接合性変異ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウス（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０００）（ＣＸ３ＣＲ１ケモカインレセプターの対立遺伝子の１つがＧＦＰをコードする遺伝子で置換されたＢ６．１２９Ｐ−ｃｘ３ｃｒ１ｔｍ１Ｌｉｔｔ／Ｊ）をＢＭキメラのドナーとして使用した。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの条件的枯渇を可能にするために、Ｆｏｘｐ３．ＬｕｃｉＤＴＲマウス（Ｓｕｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）を５ＸＦＡＤマウスと交配させた。Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅが動物を飼育し、維持した。本明細書中で詳述されるすべての実験が、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって策定された規則に従った。
【００７４】
（ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成および定量的リアルタイムＰＣＲ解析）
海馬の歯状回（ＤＧ）の全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解産物から精製した。脈絡叢の全ＲＮＡを、ＲＮＡ  ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて抽出した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｍＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに変換した。特定のｍＲＮＡの発現を、蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を用いてアッセイした。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応は、Ｆａｓｔ−ＳＹＢＲ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。定量反応は、検量線法を用いて各サンプルに対して３つ組で行った。ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ｐｐｉａ）を参照（ハウスキーピング）遺伝子として選択した。増幅サイクルは、９５℃５秒、６０℃２０秒および７２℃１５秒であった。アッセイの終わりに、融解曲線を構築することにより、その反応の特異性を評価した。ｉｆｎ−γおよびｐｐｉａ遺伝子の解析のために、ｃＤＮＡを、製造者のプロトコル（ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、非ランダムＰＣＲプライマーを用いて１４ＰＣＲサイクルで事前に増幅することによって、その後のリアルタイムＰＣＲ解析の感度を高めた。ｍＲＮＡ発現を、製造者の指示書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定した。すべてのＲＴ−ｑＰＣＲ反応を、ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアＶ２．２．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、解析した。以下のＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ＤｅｍａｎｄＴＭプローブを使用した：Ｍｍ０２３４２４３０＿ｇ１（ｐｐｉａ）およびＭｍ０１１６８１３４＿ｍ１（ｉｆｎ−γ）。
他のすべての遺伝子について調べるため、以下のプライマーを使用した：
ｐｐｉａ
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＧＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴ−３’（配列番号３３）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号３４）；
ｉｃａｍ１
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＧＡＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡ−３’（配列番号３５）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡ−３’（配列番号３６）；
ｖｃａｍ１
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号３７）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＡＴＧＴＴＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３８）；
ｃｘｃｌ１０
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号３９）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４０）；
ｃｃｌ２
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号４１）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＧＴ−３’（配列番号４２）；
ｔｎｆ−γ
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号４３）
ｒｅｖｅｒｓｅ  ＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧ−３’（配列番号４４）；
ｉｌ−１β
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号４５）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＧ−３’（配列番号４６）；
ｉｌ−１２ｐ４０
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡ−３’（配列番号４７）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＴＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号４８）；
ｉｌ−１０
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号４９）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＡＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＴＴ−３’（配列番号５０）；
ｔｇｆβ２
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号５１）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴ−３’（配列番号５２）；
ｉｇｆ−１
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＣＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＴＴＧ（配列番号５３）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡ−３’（配列番号５４）；
ｂｄｎｆ
ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴ−３’（配列番号５５）および
ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＡ−３’（配列番号５６）；
【００７５】
（免疫組織化学）
パラフィン包埋切片にしたマウス（６μｍ厚）およびヒト（１０μｍ厚）脳において、組織の処理および免疫組織化学を行った。ヒトＩＣＡＭ−１染色の場合、１次マウス抗ＩＣＡＭ（１：２０  Ａｂｃａｍ；ａｂ２２１３）抗体を使用した。スライドを、３％Ｈ２Ｏ２とともに１０分間インキュベートし、２次ビオチンコンジュゲート抗マウス抗体を使用した後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてビオチン／アビジン増幅を行った。続いて、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ基質）（Ｚｙｔｏｍｅｄキット）を適用し；スライドを脱水し、キシレンベースのマウント液を用いてマウントした。組織染色の場合、マウスをＰＢＳで経心的に灌流した後、組織切除および固定を行った。解剖顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４；Ｚｅｉｓｓ）下で、脳の側脳室、第３脳室および第４脳室からＣＰ組織を単離した。ホールマウントＣＰ染色の場合、組織を２．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃にて１時間固定し、続いて、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに移した。染色の前に、解剖した組織をＰＢＳで洗浄し、室温で１時間ブロッキングした（２０％ウマ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＰＢＳ）。１次抗体（２％ウマ血清および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中）または二次抗体によるホールマウント染色を室温で１時間行った。各工程の後、ＰＢＳで３回洗浄した。組織をスライドに載せ、Ｉｍｍｕ−ｍｏｕｎｔ（９９９０４０２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いてマウントし、カバーガラスで覆った。切片にした脳の染色の場合、先に記載されたような（Ｂａｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｋｕｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）２つの異なる組織調製プロトコル（パラフィン包埋切片またはミクロトームで切片にした浮遊切片）を適用した。以下の１次抗体を使用した：マウス抗Ａβ（１：３００，Ｃｏｖａｎｃｅ，＃ＳＩＧ−３９３２０）；ウサギ抗ＧＦＰ（１：１００，ＭＢＬ，＃５９８）；ラット抗ＣＤ６８（１：３００，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃１４−０６８１）；ラット抗ＩＣＡＭ−１（１：２００，Ａｂｃａｍ，＃ＡＢ２２１３）；ヤギ抗ＧＦＰ（１：１００，Ａｂｃａｍ，＃ａｂ６６５８）；ウサギ抗ＩＢＡ−１（１：３００，Ｗａｋｏ，＃０１９−１９７４１）；ヤギ抗ＩＬ−１０（１：２０，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＡＦ５１９）；ラット抗Ｆｏｘｐ３（１：２０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃１３−５７７３−８０）；ウサギ抗ＣＤ３（１：５００，Ｄａｋｏ，＃ＩＳ５０３）；；マウス抗ＺＯ−１、マウス抗Ｅ−カヘドリン（Ｃａｈｅｄｒｉｎ）およびウサギ抗クローディン−１（すべて１：１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃３３−９１００，＃３３−４０００，＃５１−９０００）；ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：２００，Ｄａｋｏ，＃Ｚ０３３４）。二次抗体には、Ｃｙ２／Ｃｙ３／Ｃｙ５コンジュゲートロバ抗マウス／ヤギ／ウサギ／ラット抗体（１：２００；すべてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ製）が含まれた。スライドをＨｏｅｃｈｓｔ核染色（１：４０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｒｏｂｅｓ）に１分間曝露した。免疫染色手順では、２つ��ネガティブコントロールを日常的に使用し、アイソタイプコントロール抗体で染色した後、二次抗体で染色するか、または二次抗体のみで染色した。Ｆｏｘｐ３細胞内染色の場合、パラフィン包埋スライドからの抗原回復を、Ｒｅｔｒｅｉｖａｇｅｎ  Ｋｉｔ（＃５５０５２４，＃５５０５２７；ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ）を用いて行った。顕微鏡解析は、蛍光顕微鏡（Ｅ８００；Ｎｉｋｏｎ）またはレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。蛍光顕微鏡には、デジタルカメラ（ＤＸＭ  １２００Ｆ；Ｎｉｋｏｎ）、および２０×ＮＡ０．５０または４０×ＮＡ０．７５対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ；Ｎｉｋｏｎ）が備え付けられていた。共焦点顕微鏡には、ＬＳＭ５１０レーザー走査能（３つのレーザー：Ａｒ４８８、ＨｅＮｅ５４３およびＨｅＮｅ６３３）が備わっていた。後固定した組織に対して、取得ソフトウェア（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｆ３［Ｎｉｋｏｎ］またはＬＳＭ［Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．］）を用いて、記録を行った。染色強度の定量の場合、細胞およびバックグラウンドの全染色を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて測定し、特定の染色の強度を、先に記載されたように（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）計算した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６  １３．０（Ａｄｏｂｅ）を用いて像を切り取り、マージし、最適化し、Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ５  １５．１（Ａｄｏｂｅ）を用いて並べた。
【００７６】
（ヒトＣＰのパラフィン包埋切片）
若年および高齢の死後の非ＣＮＳ疾患個体ならびにＡＤ患者のヒト脳切片を、適切な同意および倫理委員会の承認（ＴＷ２２０）を得て、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋ（かつてはＴｈｏｍａｓ  Ｗｉｌｌｉｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＴＷＯＢＣ）として知られた）から入手した。これらの切片が関わる実験は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００７７】
（フローサイトメトリー、サンプル調製および解析）
マウスをＰＢＳで経心的に灌流し、組織を先に記載されたように（Ｂａｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）処理した。脳を解剖し、解剖顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ  ＤＶ４；Ｚｅｉｓｓ）下にてＰＢＳ中で種々の脳領域を取り出し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭ分離機（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて組織を分離させた。脈絡叢組織を、脳の側脳室、第３脳室および第４脳室から単離し、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む）中、３７℃で４５分間インキュベートし、次いで、手作業でピペッティングすることによってホモゲナイズした。脾臓をシリンジのプランジャーですりつぶし、ＡＣＫ（塩化アンモニウムカリウム）溶解緩衝液で処理して、赤血球を除去した。すべての場合において、製造者のプロトコルに従ってサンプルを染色した。すべてのサンプルを７０μｍナイロンメッシュで濾過し、抗Ｆｃ  ＣＤ１６／３２（１：１００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロッキングした。ＩＦＮ−γの細胞内染色の場合、細胞をパラ−メトキシアンフェタミン（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに６時間インキュベートし、最後の４時間にわたって、ブレフェルジン−Ａ（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。サイトカインの細胞内標識を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭＰｌｕｓ固定／透過処理キット（ｃａｔ．ｎｏ．５５５０２８）を用いて行った。Ｔｒｅｇ染色の場合、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦｏｘＰ３染色緩衝液セット（ｃａｔ．ｎｏ．００−５５２３−００）を使用した。以下の蛍光色素で標識されたモノクローナル抗体を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、製造者のプロトコルに従って使用した：ＰＥまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４５０コンジュゲート抗ＣＤ４；ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ＣＤ４５；ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＴＣＲβ；ＡＰＣコンジュゲート抗ＩＦＮ−γ；ＡＰＣコンジュゲート抗ＦｏｘＰ３；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ−ｖｉｏｌｅｔコンジュゲート抗ＣＤ４５。細胞を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＬＳＲＩＩ血球計算器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において解析した。各実験において、各組織に対する妥当なネガティブコントロール群、ポジティブコントロールおよび単一染色サンプルを用いて、目的の集団を特定し、他の集団を排除した。
【００７８】
（ＢＭキメラの調製）
ＢＭキメラを、先に記載されたように（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）調製した。手短に言えば、同性のレシピエントマウスを、頭部を遮蔽しながら致死性の全身照射（９５０ｒａｄ）にさらした（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。次いで、それらのマウスの静脈内に、ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋ドナー由来の５×１０６個のＢＭ細胞を注射した。ＢＭ移植後、マウスを８〜１０週間放置することにより、造血系の再構成を可能にした後、実験で使用した。血液サンプルのＦＡＣＳ解析によって、キメラ化のパーセンテージを、循環単球（ＣＤ１１ｂ＋）のうちのＧＦＰ発現細胞のパーセンテージに従って測定した。この頭部遮蔽モデルでは、６０％のキメラ化の平均値が達成され、ＣＮＳに浸潤するＧＦＰ＋骨髄性細胞が、単球由来のマクロファージであってミクログリアではないＣＤ４５ｈｉｇｈ／ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）であると立証された。
【００７９】
（モーリス水迷路）
プール（直径１．１ｍ）内の水面の１．５ｃｍ下に配置された隠れたプラットフォームを探す方法を習得させるために、マウスに、４日連続して、１日あたり３回の試行を行わせた。水の温度は、２１〜２２℃で維持した。水を粉乳で不透明にした。試験室内において、水没したプラットフォームの位置の特定を助けるためにマウスにとって利用可能な手がかりは遠位の視覚的形状および物体だけであった。逃避潜時、すなわち、プラットフォームを探してその上に上がるのに要した時間を最大６０秒間、記録した。各マウスをプラットフォーム上に１５秒間とどまらせ、次いで、迷路から取り出してホームケージに戻した。マウスが、６０秒以内にプラットフォームを探せなかった場合、そのマウスを手作業でプラットフォーム上に置き、１５秒後にホームケージに戻した。各マウスに対する試行の間のインターバルは、１０分間であった。５日目に、プラットフォームを除去し、マウスに、利用可能な逃避場所なしで６０秒間続く１回の試行を行わせた。６および７日目に、プラットフォームを、元の訓練の四半分と反対の四半分に置き、１日あたり３セッションでマウスを再訓練した。Ｅｔｈｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｖ７．１自動追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、データを記録した。統計解析を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニのｐｏｓｔ−ｈｏｃテストを用いて行った。すべてのＭＷＭ試験を、消灯期の間の午前１０時〜午後５時に行った。
【００８０】
（放射状アーム水迷路）
先に詳細に記載された（Ａｌａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ，２００６）放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）を用いることにより、空間学習および空間記憶を試験した。簡潔には、６本のステンレス鋼挿入物をタンク内に置き、中央の開けた領域から放射状に伸びる６本の水泳アームを形成させた。逃避プラットフォームを、１本のアーム（ゴールアーム）の末端の、直径１．１ｍのプール内の水面の１．５ｃｍ下に配置した。水の温度を２１〜２２℃で維持した。水を粉乳で不透明にした。試験室内において、水没したプラットフォームの位置の特定を助けるためにマウスにとって利用可能な手がかりは遠位の視覚的形状および物体だけであった。ゴールアームの位置は、所与のマウスにおいて一定のままであった。１日目に、マウスを１５回の試行（３時間超、間隔をあける）で訓練し、試行は、見えるプラットフォームと隠れたプラットフォームとを交互に用い、最後の４回の試行は、隠れたプラットフォームだけを用いた。２日目に、隠れたプラットフォームを用いる１５回の試行でマウスを訓練した。間違ったアームに進入したとき、または１５秒以内にアームの選択をしなかったときは、エラーとしてスコア付けした。各試行におけるマウスのアーム進入エラーの回数または逃避潜時をカウントすることによって、空間学習および空間記憶を測定した。３回連続した試行の訓練ブロックについて、訓練データをエラーまたは逃避潜時の平均値として解析した。
【００８１】
（ＧＡの投与）
各マウスの皮下に（ｓ．ｃ．）、２００μｌのＰＢＳに溶解された１００μｇの総用量のＧＡ（バッチｎｏ．Ｐ５３６４０；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｐｅｔａｈ  Ｔｉｑｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）を注射した。毎週のＧＡレジメン（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）または毎日のＧＡ投与（図８および図１６）に従って、マウスに注射した。各実験に対して示されているように、最後のＧＡ注射の１週間後または処置の１ヶ月後に、マウスを安楽死させた。
【００８２】
（Ｔｒｅｇの条件的除去）
ジフテリア毒素（ＤＴｘ；８ｎｇ／ｇ体重；Ｓｉｇｍａ）を、４日連続して、Ｆｏｘｐ３．ＬｕｃｉＤＴＲマウスの腹腔内に（ｉ．ｐ．）毎日注射した（Ｓｕｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。ＤＴｘの効率を血液および脾臓における免疫細胞のフローサイトメトリー解析によって確認したところ、ＧＦＰを発現しているＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のほぼ完全な（＞９９％）枯渇が達成された（図４）。
【００８３】
（Ｐ３００の阻害）
マウスにおけるｐ３００の阻害を、先の記載（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）と同様に行った。ｐ３００ｉ（Ｃ６４６；Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＤＭＳＯに溶解し、１週間にわたって毎日ｉ．ｐ．注射した（８．９ｍｇｋｇ−１ｄ−１、ｉ．ｐ．）。ビヒクルで処置されるマウスにはＤＭＳＯを同様に注射した。
【００８４】
（ＡＴＲＡ処置）
マウスへのオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）投与を、先の記載（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）と同様に行った。ＡＴＲＡ（Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯに溶解し、１週間にわたって１日おきにｉ．ｐ．注射した（８ｍｇｋｇ−１ｄ−１）。ビヒクルで処置されるマウスにはＤＭＳＯを同様に注射した。
【００８５】
（可溶性Ａβ（ｓＡβ）タンパク質の単離および定量）
組織の均質化およびｓＡβタンパク質の抽出を、先に記載されたように（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ，２００５）行った。簡潔には、大脳実質を解剖し、急凍し、ホモゲナイズするまで−８０℃で維持した。タンパク質をサンプルから連続的に抽出することにより、異なる溶解度のタンパク質を含む別個の画分を得た。サンプルを、２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ｐＨ７．４）を含む１０体積の氷冷組織均質化緩衝液中で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいてすりガラス乳棒を用いてホモゲナイズした。６ストロークの後、ホモジネートを１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液中の０．４％ジエチルアミン（ＤＥＡ）と１：１混合した後、さらに６ストローク行い、次いで、４℃にて１３５，０００ｇで４５分間遠心した。上清（細胞外およびサイトゾルのタンパク質を含むＤＥＡ可溶性画分）を回収し、１０％の０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）で中和した。Ａβ１−４０およびＡβ１−４２を、商業的に入手可能なキット（それぞれＢｉｏｌｅｇｅｎｄ；＃ＳＩＧ−３８９５４および＃ＳＩＧ−３８９５６）を製造者の指示書に従って使用して、可溶性画分から酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって個別に測定した。
【００８６】
（Ａβプラークの定量）
各脳から、目的の領域（歯状回または大脳皮質）全体にわたる４つの異なる所定の深さから、６μｍの冠状切片を回収し、マウス１匹あたり８枚の切片を免疫染色した。陽染されたピクセルのヒストグラムベースの区分けを、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて行った。歯状回の領域または皮質Ｖ層において、区分けのアルゴリズムを各像に手作業で適用し、全Ａβ免疫染色によって占有された領域のパーセンテージを測定した。プラークの数を同じ６μｍ脳冠状切片から定量し、脳領域１つあたりのプラークの平均数として提示する。定量の前に、切片をコード化して実験群の同一性を隠し、群の同一性について盲検の観察者がプラーク量を定量した。
【００８７】
（統計解析）
各実験セットを解析するために用いられた具体的な試験を図の説明文に示す。２群間を比較するために両側スチューデントｔ検定を用いてデータを解析し、いくつかの群を比較するために１元配置分散分析を使用し、続いて帰無仮説が棄却された後（Ｐ＜０．０５）、群の対ごとの比較のためにＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓのｐｏｓｔ−ｈｏｃテストを用いた。行動試験のデータは、２元配置反復測定分散分析を用いて解析し、追跡の対ごとの比較のために、ボンフェローニのｐｏｓｔ−ｈｏｃテストを用いた。サンプルサイズは、文献および過去の経験に基づいて適切な統計的検出力によって選択し、マウスを齢、性別および遺伝子型に従って実験群に割り当てた。研究者は、実験中および結果の評価中、群の同一性について盲検であった。すべての選択規準および除外規準は、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って予め決められていた。結果は、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。グラフにおいて、ｙ軸のエラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。統計的計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。
実施例１．ＡＤのマウスモデルにおける疾患進行に沿った脈絡叢（ＣＰ）ゲートウェイ活性（ｇａｔｅｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）
【００８８】
本発明者らは、最初に、ＡＤの５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスモデル（ＡＤ−Ｔｇ）において疾患進行に沿ったＣＰ活性を調べた；これらのマウスは、家族性ＡＤに関連する５つの変異を共発現し、２月齢という早さで大脳のＡβ病態およびグリオーシスを発症する（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。本発明者らは、疾患の病態の進行段階に沿って、ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰが、同齢の野生型（ＷＴ）コントロールと比べて、有意に低いレベルの白血球ホーミングならびにｉｃａｍ１、ｖｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２を含む輸送決定因子（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）を示すこと（図１Ａ）を見出した（これらの輸送決定因子は、急性ＣＮＳ損傷に応答してＣＰによってアップレギュレートされると示され、白血球の経上皮遊走に必要である（Ｋｕｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３））。インテグリンリガンドであるＩＣＡＭ−１の免疫組織化学的染色によって、ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰ上皮によるその発現の低下が確認された（図１ｂ）。さらに、ヒト死後脳におけるＩＣＡＭ−１の染色は、ＣＰ上皮においてその加齢関連の減少を示し、これは、本発明者らの以前の知見（Ｂａｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）と一致し、この作用の定量的評価によって、ＣＮＳ疾患を有しない高齢個体と比べてＡＤ患者においてさらに減少することが明らかになった（図２Ａ）。ＣＰによる白血球の輸送決定因子の誘導は、上皮のインターフェロン（ＩＦＮ）γシグナル伝達に依存するので（Ｋｕｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）、本発明者らは、次に、観察された作用が、ＣＰにおけるＩＦＮ−γの利用可能性の喪失を反映し得るかを試験した。細胞内染色のフローサイトメトリーを用いて５ＸＦＡＤ  ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰを調べることにより、このコンパートメントにおける有意に少ない数のＩＦＮγ産生細胞が明らかになり（図２Ｂ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）解析から、ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおいて、同齢のＷＴコントロールと比べてより低いｉｆｎ−γのｍＲＮＡ発現レベルが確かめられた（図２Ｃ）。
実施例２．Ｔｒｅｇ媒介性全身免疫抑制とＣＰゲートウェイ活性とＡＤの病態との間の機能的関係性
【００８９】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、全身のエフェクター免疫応答の抑制において中心的役割を果たす（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。本発明者らは、Ｔｒｅｇ媒介性の全身免疫抑制が、ＣＰにおけるＩＦＮ−γの利用可能性に影響すると想定したので、ＡＤの病態へのＴｒｅｇの関与に注目した。ＡＤ患者ではＴｒｅｇレベルおよび抑制活性が高いという以前の報告と一致して（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｓａｒｅｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスの脾細胞におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの出現率を同齢のＷＴ同腹仔と比べて評価することにより、疾患進行に沿ってそれらの高いレベルが明らかになった（図３Ａ、Ｂ）。Ｔｒｅｇ媒介性の全身免疫抑制とＣＰゲートウェイ活性とＡＤの病態との間の機能的関係性を研究するために、本発明者らは、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−ＴｇマウスをＦｏｘｐ３−ジフテリア毒素レセプター（ＤＴＲ＋）マウスと交雑して、ＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ＋マウスにおいてジフテリア毒素（ＤＴｘ）の投与によってＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの一過性の条件的インビボ枯渇を可能にした（図４Ａ）。Ｔｒｅｇの一過性の枯渇は、ＤＴｘで処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ−同腹仔と比べて、ＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ＋マウスのＣＰによる白血球輸送分子のｍＲＮＡ発現を増加させた（図５Ａ）。脳実質に対する一過性のＴｒｅｇ枯渇の長期効果の解析（３週間後）から、浸潤性ｍｏ−ＭΦに相当する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）ＣＤ４５ｈｉｇｈ／ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ骨髄性細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加を含む免疫細胞の脳内蓄積が明らかになった（図５Ｂ）。さらに、Ｔｒｅｇの短期および一過性の枯渇は、フローサイトメトリーによって評価されたとき、脳内に蓄積したＣＤ４＋Ｔ細胞の中でもＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの顕著な富化をもたらした（図５Ｃ、Ｄ）。海馬のＲＴ−ｑＰＣＲ解析は、ｆｏｘｐ３およびｉｌ１０  ｍＲＮＡの高発現を示した（図５Ｅ）。
【００９０】
本発明者らは、次に、脳の病態の部位に免疫調節性細胞が蓄積する前のＴｒｅｇの短期枯渇が、脳機能に対する長期効果をもたらすかを調べた。本発明者らは、海馬グリオーシスの低減（図５Ｆ）、および炎症促進性サイトカイン（例えば、ｉｌ−１２ｐ４０およびｔｎｆ−α）の低いｍＲＮＡ発現レベル（図５Ｇ）を観察した。さらに、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスにおいて頑強なＡβプラーク病態を示す２つの脳領域である海馬歯状回および大脳皮質（５層）（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）における大脳のＡβプラーク量は減少した（図６Ａ、Ｂ）。モーリス水迷路（ＭＷＭ）試験を用いて認知機能に対する効果を評価することにより、ＤＴｘで処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ−同齢マウスと比べて、Ｔｒｅｇ枯渇後のＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ＋マウスにおいて空間学習および空間記憶の有意な改善が明らかになり、ＷＴマウスと同様の成績に達した（図６Ｃ〜Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＡＤ−ＴｇマウスにおいてＴｒｅｇ媒介性の全身免疫抑制を一過性に中断することにより、炎症を消散させる細胞（ｍｏ−ＭΦおよびＴｒｅｇを含む）の脳内蓄積がもたらされ、その中断の後、神経炎症反応の消散、Ａβのクリアランスおよび認知機能低下の回復が続くことを実証した。
実施例３．コポリマ−１の毎週投与は、Ｔｒｅｇ媒介性の全身免疫抑制を減少させ、ＣＰゲートウェイ活性を改善し、ＡＤの病態を緩和する。
【００９１】
全身免疫抑制とＣＰ機能とＡＤの病態との間の逆相関の原因となる性質をさらに裏付けるために、本発明者らは次に、免疫調節性化合物であるグラチラマー酢酸塩（ＧＡ；コポリマ−１またはＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）としても知られる）を利用した。酢酸グラチラマーは、毎週投与レジメンでＡＤのＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおいて治療効果を有すると見出された（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）；この効果は、疾患病態の大脳部位へのｍｏ−ＭΦの動員と機能的に関連した（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ここでは、まず本発明者らは、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスにおける本発明者らの知見と同様に、ＡＰＰ／ＰＳ１  ＡＤ−ＴｇマウスにおけるＣＰもＩＦＮ−γ発現レベルに関して不足しているかを調べた。本発明者らは、ＡＰＰ／ＰＳ１  ＡＤ−Ｔｇマウスにおいて、ＣＰにおけるＩＦＮ−γレベルが、同齢のＷＴコントロールと比べて低下していることを見出した（図７Ａ）。これらの結果は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける毎週ＧＡの治療効果（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）が、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスにおいて再現され得るかを試験するように促し、ならびにもしそうであれば、それが全身のＴｒｅｇおよびｍｏ−ＭΦ輸送に対するＣＰの活性化に影響し得るかを試験するように促した。ゆえに、本発明者らは、４週間にわたって、５ＸＦＡＤ  ＡＤ−ＴｇマウスをＧＡの毎週投与レジメンで処置した（以後、「毎週ＧＡ」；図８Ａに模式的に示される）。本発明者らは、毎週ＧＡで処置された５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇマウスが、神経炎症の低減（図８Ｂ〜Ｄ）および認知能力の改善を示し、それは処置後最大２ヶ月続く（図８Ｅ〜Ｉ）ことを見出した。全身免疫およびＣＰに対する毎週ＧＡの効果をフローサイトメトリーによって調べたとき、本発明者らは、脾細胞のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇレベルの低下（図９Ａ）、および処置された５ＸＦＡＤ  ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおいて、ＷＴコントロールで観察されたレベルと同様のレベルに達するＩＦＮ−γ産生細胞の増加（図９Ｂ）を見出した。毎週ＧＡで処置されたマウスのＣＰにおける高レベルのＩＦＮ−γ発現細胞は、白血球輸送分子の上皮発現のアップレギュレートを伴った（図９Ｃ）。
【００９２】
ＣＮＳへの浸潤性ｍｏ−ＭΦの進入を検出するために、本発明者らは、循環中の（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）＋で標識された）骨髄性細胞の可視化を可能にする５ＸＦＡＤ  ＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋骨髄（ＢＭ）キメラマウス（頭部保護を用いて作製された）を使用した（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。本発明者らは、毎週ＧＡ処置の後に、ビヒクルで処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ／＋コントロールと比べて、ＣＰおよび隣接する脳室腔へのＧＦＰ＋ｍｏ−ＭΦのホーミングが増加することを見出した（図９Ｄ〜Ｅ）。脳実質の免疫組織化学から、大脳のプラーク形成部位におけるＧＦＰ＋ｍｏ−ＭΦ蓄積の存在が明らかになり（図９Ｆ）、ＡＤ−Ｔｇ非キメラマウスにおける海馬のフローサイトメトリー解析による浸潤性の骨髄性細胞の定量から、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＣＤ４５ｈｉｇｈ発現細胞の数の増加が示された（図９Ｇ、Ｈ）。まとめると、これらの結果は、ＡＤの病態の部位へのｍｏ−ＭΦの動員と全身のＴｒｅｇレベルの低下とＣＰのＩＦＮ−γ依存的活性化との間の機能的関連を裏付けた。
実施例４．小分子ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤を用いたＴｒｅｇ活性の干渉
【００９３】
Ｔｒｅｇ媒介性の全身免疫抑制が、ＡＤの病態と闘う能力を干渉することを示唆した上記の知見は、癌免疫療法（免疫系が効果的な抗腫瘍応答を開始する能力をＴｒｅｇが妨害する）におけるこれらの細胞に起因する機能を連想させる（Ｂｏｓ  ＆  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，２０１２；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＆  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，２０１０）。ゆえに、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の活性を直接干渉する処置が、ＡＤにおいて有益であるだろうと考えた。本発明者らは、Ｔｒｅｇの機能を制御するヒストンアセチルトランスフェラーゼであるｐ３００の非ペプチド阻害剤である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）ｐ３００ｉ（Ｃ６４６（Ｂｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１０））を試験した；この阻害剤は、保護的なＴエフェクター細胞応答をインタクトなまま放置しつつ、Ｔｒｅｇ抑制活性に影響すると示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。本発明者らは、ｐ３００ｉで処置されたマウスが、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処置されたコントロールと比べて、高レベルの全身性ＩＦＮ−γ発現細胞を脾臓（図１０Ａ）ならびにＣＰ（図１０Ｂ）において示すことを見出した。本発明者らは、次に、ＡＤ−Ｔｇマウスを１週間にわたってｐ３００ｉまたはビヒクルで処置し、３週間後に大脳のＡβプラーク量についてそれらのマウスを調べた。免疫組織化学的解析から、ｐ３００ｉで処置されたＡＤ−Ｔｇマウスにおいて、大脳のＡβプラーク量の有意な減少が明らかになった（図１０Ｃ〜Ｅ）。本発明者らは、１コースの処置後のプラークの病態に対する効果が、３週間を超えて継続し得るかを試験し、およびもしそうであれば、さらなるコースの処置が長期間の効果に寄与し得るかも試験した。ゆえに、本発明者らは、単一コースのｐ３００ｉ処置を受けたＡＤ−Ｔｇマウスを、間に１ヶ月のインターバルを含む２コースの処置をこの期間中に受けた同齢群と比較し、２ヶ月後に調べた（図１０Ｆに模式的に示される）。本発明者らは、大脳のプラーク量の減少が、単一コースの処置の２ヶ月後でさえ明らかであったが、間に１ヶ月のインターバルを含む２コースの処置を受けたマウスにおいてより強力であったことを見出した（図１０Ｇ）。ＡＤにおけるシナプス可塑性および記憶の障害は、可溶性Ａβ１−４０／Ａβ１−４２（ｓＡβ）レベルの大脳レベルの上昇に関連するので（Ｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８）、本発明者らは、単一または反復サイクルのｐ３００ｉ処置後のｓＡβレベルも測定した。また、本発明者らは、１コースと２コース（間に１ヶ月のインターバルを含む）の両方が、大脳のｓＡβの減少において効果的であるが、ｓＡＰ１−４２に対する効果に関して、この効果が反復コースの後により強いことを見出した（図１０Ｈ）。これらの結果は、短期の単一コースの処置が効果的であるが、本発明者らの毎週ＧＡ処置後の知見と同様に、反復コースの処置が長期間の治療効果を維持するために有益であり得ることを示唆した。
実施例５．アルツハイマー病におけるＰＤ−１免疫チェックポイント遮断の治療的可能性
【００９４】
本発明者らは、まず、ＰＤ−１阻害経路を標的化することによって、家族性ＡＤに関連する５つの変異を共発現する５ＸＦＡＤ  ＡＤトランスジェニック（ＡＤ−Ｔｇ）マウス（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６）におけるＩＦＮ−γ関連の全身免疫が影響され得るかを試験した。大脳の病態が進行した時点である１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスに、ＰＤ−１に対する遮断抗体（抗ＰＤ−１）またはＩｇＧコントロール抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を２回、１および４日目に投与し、次いで、７日目に調べた。フローサイトメトリー解析から、ＰＤ−１経路の遮断によって、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔ脾細胞の高い出現率がもたらされることが明らかになった（図１１Ａ、Ｂ）。
【表２】
2018524362.tif 000003
【００９５】
本発明者らは、次に、この全身免疫応答がＣＰ活性に影響するかを調べた。ＣＰのゲノムワイドＲＮＡ配列決定（示さず；完全解析は、実施例５の表題を有する本発明者らによる報告に開示され、要請があれば本発明者らから入手することができる）は、ＩＦＮ−γに対する応答に関連する発現プロファイルを示し（図１１Ｄおよび表２）、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）は、ＩｇＧで処置されたまたは処置されていないＡＤ−Ｔｇコントロールと比べたとき、ＣＰにおけるＩＦＮ−γのｍＲＮＡレベルの上昇を立証した（図１１Ｃ）。これらの知見から、ＰＤ−１遮断後の全身性のおよびＣＰ組織特異的なＩＦＮ−γ免疫応答が確かめられ、次に疾患病態に対する効果を試験するように促された。
【００９６】
ＡＤの病態に対するＰＤ−１遮断の機能的影響を調べるために、本発明者らは、１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスを抗ＰＤ−１抗体またはＩｇＧコントロール抗体で処置し、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）タスクを用いて空間学習および空間記憶の能力に対する効果を評価した。
【００９７】
抗ＰＤ１で処置されたＡＤ−Ｔｇマウスは、処置（３日間のインターバルを含む２回のｉ．ｐ．注射）の１ヶ月後に、ＩｇＧで処置されたまたは処置されていない同齢のコントロールと比べて認知機能の有意な改善を示し、同齢のＷＴマウスと同様の認知レベルに達した（図１２Ａ）。本発明者らは、次に、ＡＤ−Ｔｇマウスの認知能力に対するＰＤ−１遮断の恩恵が１ヶ月を超えて継続するか、およびさらなる治療セッションが有益であるかを試験した。本発明者らは、ＡＤ−Ｔｇマウスを１０月齢において（「１セッション」）または１０月齢と１１月齢の両方において（「２セッション」）抗ＰＤ−１で処置し、１２月齢において認知能力に対する結果を調べた（図１２Ｂに模式的に示す）。コントロール群には、ＷＴマウス、処置されていないＡＤ−Ｔｇマウス、および２セッションのＩｇＧ処置を受けたＡＤ−Ｔｇマウスが含まれた。本発明者らは、単一セッションの抗ＰＤ−１投与が、処置の１ヶ月後に空間学習および空間記憶に対して有益な効果を及ぼすが（図１２Ａ）、単一セッションの処置を受け、２ヶ月後に試験されたマウスでは有意な効果を検出できなかった（図１２Ｂ）ことを見出した。対照的に、２セッションの抗ＰＤ−１を１ヶ月のインターバルで受けたＡＤ−Ｔｇマウスは、２ヶ月の時間枠の終わりに、ＷＴマウスと同様の認知能力を示した（図１２Ｂ）。
【００９８】
本発明者らは、ＰＤ−１遮断が、大脳のＡβプラーク量およびグリオーシスによって現れるＡＤの病態に影響するかを調べた。抗ＰＤ−１またはＩｇＧを１または２セッションで受けたＡＤ−Ｔｇマウスの脳を、Ａβおよびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する免疫組織化学によって調べた。本発明者らは、大脳のＡβプラーク量が、海馬歯状回（図１３Ａ、Ｂ）、および大脳皮質（５層）（図１３Ａ、Ｃ）において減少することを見出した（これらの２つの脳領域は、５ＸＦＡＤマウスにおいて確固としたＡβプラークの病態を示す（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００６））。Ａβクリアランスに対する効果は、単一セッションの抗ＰＤ−１投与後に明らかであり、２セッション後にさらに強かった。ＧＦＡＰ免疫染色の定量的解析は、ＩｇＧで処置されたコントロールと比べて、１セッションのＰＤ−１遮断で処置されたＡＤ−Ｔｇマウスと２セッションのＰＤ−１遮断で処置されたＡＤ−Ｔｇマウスの両方において、海馬アストログリオーシスの低減を示した（図１３Ａ、Ｄ）。
【００９９】
投与量および投与頻度の影響を調べるために、雌５ＸＦＡＤ  ＡＤトランスジェニックマウス（６ヶ月の平均コホート齢）を、抗ＰＤ−１特異的抗体（ＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１）またはＩｇＧコントロール（ラットＩｇＧ２ａ）で処置した。抗ＰＤ−１で処置されたマウスには、実験の１日目に５００ｕｇの抗体の注射を１回行うか、または２５０ｕｇの注射を２回、注射の間に３日間のインターバルを空けて行った。同齢の野生型（ＷＴ）マウスをさらなるコントロール群として用いた。本発明者らは、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）タスクを用いて、空間学習および空間記憶の能力に対する効果を評価した。
【０１００】
処置（３日間のインターバルを含む２回のｉ．ｐ．注射）の１ヶ月後に、抗ＰＤ１で処置されたＡＤ−Ｔｇマウスは、ＩｇＧで処置されたまたは処置されていない同齢のコントロールと比べて、認知機能の有意な改善を示し、同齢のＷＴマウスと同様の認知レベルに達した（図１４）。
【０１０１】
最後に、雄５ＸＦＡＤ  ＡＤトランスジェニックマウスを、反復処置セッションにおいて１ヶ月に１回、抗ＰＤ−１特異的抗体（ＩｇＧ２ａ抗マウスＰＤ−１）またはＩｇＧコントロール（ラットＩｇＧ２ａ）で処置した。１回目の注射は、３月齢において、２回目の注射は、４月齢において、および３回目の注射は、５月齢において行った。投与量は、実験計画のスキーム（図１５Ａ）に示されている。同齢の野生型（ＷＴ）マウスをさらなるコントロール群として用いた。本発明者らは、２つの異なる時点、すなわち５月齢（図１５Ｂ）および６月齢（図１５Ｃ）において、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）タスクを用いて空間学習および空間記憶の能力に対する効果を評価した。実験計画が示されている。黒矢印は、処置の時点を示し、イラストは、認知試験の時点を示す。抗ＰＤ−１で処置された５ＸＦＡＤマウス（ｎ＝７）、ＩｇＧ２ａで処置された５ＸＦＡＤマウス（ｎ＝９）およびＷＴ（ｎ＝８）コントロールのＲＡＷＭの成績；２元配置反復測定分散分析およびＤｕｎｎｅｔのｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、抗ＰＤ−１で処置されたマウス対ＩｇＧで処置されたコントロール。これらの知見は、ＰＤ−１遮断による反復セッションの処置が、疾患の進行段階の５ＸＦＡＤマウスに対して行われたときに疾患進行を逆転させることだけでなく、認知機能低下前の若齢において処置を開始したときに疾患の発症を遅延させることもできたことを実証する（図１５Ｂ〜Ｃ）。
実施例６．アルツハイマー病における免疫チェックポイント遮断の治療的可能性
【０１０２】
免疫チェックポイントの遮断が、ＡＤの病態を弱め得るかを試験するために、ＡＤ−Ｔｇマウスを６〜１０月齢において以下の抗チェックポイント抗体のうちの１つで処置する：抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ７、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ−２７、抗ＣＤ７０、抗ＳＴＩＮＧまたは抗ＴＩＧＩＴ抗体。いくつかのマウスを、ポジティブコントロールとして抗ＰＤ−１抗体で、ネガティブコントロールとしてＩｇＧコントロールで、または抗ＰＤ１と上で述べた他の抗チェックポイント抗体のうちの１つとの併用で処置する。放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）タスクを用いて空間学習および空間記憶の能力に対する処置の効果、Ａβの免疫組織化学によるＡβプラーク量およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の免疫組織化学による海馬アストログリオーシスを、処置の１ヶ月後に測定する。
【０１０３】
抗体で処置されたマウスは、ＩｇＧで処置されたおよび処置されていないＡＤ−Ｔｇマウスと比較して有意な認知機能改善、ならびに大脳のプラーク量の有意な減少を示すと予想される。
実施例７．ＰＴＳＤ病態における免疫チェックポイント遮断アプローチの治療的可能性
【０１０４】
ひどくストレスの多い状態または慢性ストレスは、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）およびうつ病をもたらし得る。本発明者らは、マウスが、過剰に用心深い（ｈｙｐｅｒｖｉｇｉｌａｎｔ）行動、注意障害、リスク評価の増加および睡眠不足を示す生理学的ＰＴＳＤ様動物モデル（Ｌｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）を採用した。ＰＴＳＤ誘導のこの実験モデルでは、マウスを、逆転した昼／夜サイクルに１０日間慣らし、「ＰＴＳＤ誘導」と称される２エピソードの電気ショック（外傷およびトリガー）を与え、外傷後の種々の時点において評価する。外傷性事象の後、マウスに、免疫チェックポイントを遮断する前記化合物を注射する。以下のレジメンのうちの１つに従って、マウスを処置する：
【０１０５】
マウスを、以下の抗チェックポイント抗体のうちの１つで処置する：抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ７、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ−２７、抗ＣＤ７０、抗ＳＴＩＮＧもしくは抗ＴＩＧＩＴ抗体のみまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用。いくつかのマウスを、ポジティブコントロールとして抗ＰＤ−１抗体で、ネガティブコントロールとしてＩｇＧコントロールで、または抗ＰＤ１と上で述べた他の抗チェックポイント抗体のうちの１つとの併用で処置する。
【０１０６】
いくつかのマウスに、適切なインターバルセッションを含むさらなる処置セッションを行う。
【０１０７】
（Ｌｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）に記載されている暗い／明るい迷路または他の行動タスクにおいて探索およびリスク評価に費やした時間によって評価されるとき、処置を受けたマウスは、この実験モデルにおいてＰＴＳＤに関連する不安行動を示さないと予想される。
実施例８．パーキンソン病の病態における免疫チェックポイント遮断アプローチの治療的可能性
【０１０８】
パーキンソン病（ＰＤ）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスまたはＰＤのＭＰＴＰ誘発マウスモデルをこれらの実験において使用する。それらのマウスを、以下のレジメンのうちの１つに従って、疾患の進行段階において処置する：
【０１０９】
ＰＤ−Ｔｇマウスを以下の抗チェックポイント抗体のうちの１つで処置する：抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ７、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ−２７、抗ＣＤ７０、抗ＳＴＩＮＧもしくは抗ＴＩＧＩＴ抗体のみまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用。いくつかのマウスを、ポジティブコントロールとして抗ＰＤ−１抗体で、ネガティブコントロールとしてＩｇＧコントロールで、または抗ＰＤ１と上で述べた他の抗チェックポイント抗体のうちの１つとの併用で処置する。
【０１１０】
運動神経機能を、例えば、回転するロッド上にマウスが留まる能力を評価するロータロッド能力試験を用いて、評価する。
【０１１１】
１処置セッションで処置されたＰＤ−Ｔｇマウスは、ＩｇＧで処置されたもしくはビヒクルで処置されたコントロール群または処置されていない群と比べて、有意に改善された運動能力を示すと予想される。２コースの治療を受け、適切なインターバルセッション後に調べられたＰＤ−Ｔｇマウスは、長期間の治療効果を示すと予想される。この治療効果を維持するために、マウスを、各処置セッション間に適切な非処置のインターバルセッションを含む有効な処置セッションに供する。
実施例９．ハンチントン病の病態における免疫チェックポイント遮断の治療的可能性
【０１１２】
これらの実験において用いられるモデルは、ハンチントン病（ＨＤ）Ｒ６／２トランスジェニックマウス（Ｔｇ）試験システムであり得る。Ｒ６／２トランスジェニックマウスは、疾患の進行段階において、複数のＣＡＧリピートマウスの挿入を含む変異したヒトハンチンチン遺伝子を過剰発現する。これらのマウスは、５〜６週齢という早さで進行性の行動運動障害を示し始め、１０〜１３週において成熟前に死亡する。これらの症状には、低体重、抱き締め行動（ｃｌａｓｐｉｎｇ）、振戦および痙攣が含まれる。
【０１１３】
４５日齢になったとき、以下のレジメンのうちの１つに従って、マウスを処置する：
【０１１４】
マウスを以下の抗チェックポイント抗体のうちの１つで処置する：抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ７、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ−２７、抗ＣＤ７０、抗ＳＴＩＮＧもしくは抗ＴＩＧＩＴ抗体のみまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用。いくつかのマウスを、ポジティブコントロールとして抗ＰＤ−１抗体で、ネガティブコントロールとしてＩｇＧコントロールで、または抗ＰＤ１と上で述べた他の抗チェックポイント抗体のうちの１つとの併用で処置する。
【０１１５】
運動神経機能を、例えば、回転するロッド上にマウスが留まる能力を評価するロータロッド能力試験を用いて、評価する。
【０１１６】
１処置セッションで処置されたＨＤ−Ｔｇマウスは、ＩｇＧで処置されたもしくはビヒクルで処置されたコントロール群または処置されていない群と比べて、有意に改善された運動能力を示すと予想される。２コースの治療を受け受け、適切なインターバルセッション後に調べられたＨＤ−Ｔｇマウスは、長期間の治療効果を示すと予想される。この治療効果を維持するために、マウスを、各処置セッション間に適切な非処置のインターバルセッションを含む有効な処置セッションに供する。
実施例１０．萎縮性側索硬化症の病態における免疫チェックポイント遮断アプローチの治療的可能性
【０１１７】
この実験において用いられるモデルは、Ｇｌｙ９３→Ａｌａ（Ｇ９３Ａ）遺伝子を含む欠損ヒト変異体ＳＯＤ１対立遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ（本明細書中の「ＡＬＳマウス」）であり得る。このモデルは、運動ニューロン疾患を発症するので、ＡＬＳを試験するために認められた動物モデルである。
【０１１８】
７５日齢になったとき、以下のレジメンのうちの１つに従って、それらのマウスを処置する：
【０１１９】
マウスを以下の抗チェックポイント抗体のうちの１つで処置する：抗ＩＣＯＳ、抗Ｂ７ＲＰ１、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ７、抗ＢＴＬＡ、抗ＨＶＥＭ、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、抗ＣＤ−２７、抗ＣＤ７０、抗ＳＴＩＮＧもしくは抗ＴＩＧＩＴ抗体のみまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用。いくつかのマウスを、ポジティブコントロールとして抗ＰＤ−１抗体で、ネガティブコントロールとしてＩｇＧコントロールで、または抗ＰＤ１と上で述べた他の抗チェックポイント抗体のうちの１つとの併用で処置する。
【０１２０】
運動神経機能を、例えば、回転するロッド上にマウスが留まる能力を評価するロータロッド能力試験を用いて、評価するか、またはマウスに、下端に小さいループを有する鉛直方向のワイヤ（直径２ｍｍ）を掴ませて、しがみつかせる。鉛直方向のワイヤは、マウスがワイヤに掴まるために前肢と後肢の両方を使用させる。そのワイヤを２４ｒｐｍの鉛直方向の円運動（円の半径は１０ｃｍ）で維持する。マウスがワイヤを放さずにいることができる時間をタイマーで記録する。
【０１２１】
１処置セッションで処置されたＡＬＳマウスは、ＩｇＧで処置されたもしくはビヒクルで処置されたコントロール群または処置されていない群と比べて、運動能力の有意な改善を示すと予想される。２コースの治療を受け受け、適切なインターバルセッション後に調べられたＡＬＳマウスは、長期間の治療効果を示すと予想される。この治療効果を維持するために、マウスを、各処置セッション間に適切な非処置のインターバルセッションを含む有効な処置セッションに供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ−Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018524362.tif 000062
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