(57)【要約】  本明細書において、ポリペプチドおよび１つ以上の薬物分子を含むコンジュゲートが提供される。ポリペプチドは、１つ以上の荷電モチーフを含み、かつ１つ以上の非荷電モチーフをさらに含み得る。コンジュゲートは、薬物分子を対象に効率的に送達するために使用され得る。
2018525989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つ以上の荷電モチーフを含むポリペプチドであって、それぞれの荷電モチーフが、独立して、配列番号１（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方である）からなるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；および
（ｂ）前記ポリペプチドに付着している１つ以上の薬物分子
を含むコンジュゲート。
【請求項２】
前記ポリペプチドが複数の荷電モチーフを含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記複数の荷電モチーフがタンデムリピート型である、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記ポリペプチドが１つ以上の非荷電モチーフをさらに含み、それぞれの非荷電モチーフが、独立して、配列番号３（ＶＰＧＸＧ）（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である）からなるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ポリペプチドが複数の非荷電モチーフを含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記複数の非荷電モチーフがタンデムリピート型である、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
１つ以上の非荷電モチーフが前記ポリペプチドの少なくとも２つの隣接荷電モチーフ間に位置する、請求項４〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号２（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリペプチドが配列番号４（ＶＰＧＸＧ）n（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが配列番号５（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ＶＰＧＸＧ）m（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列番号６（ＶＰＧＸＧ）m（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが配列番号７｛（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ＶＰＧＸＧ）｝b（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｂが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
Ｘ1が負荷電アミノ酸であり、Ｘ2が正荷電アミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
Ｘ1が正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負荷電アミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
負荷電アミノ酸が独立してグルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
正荷電アミノ酸が独立してリジンおよびアルギニンから選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、請求項４〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
Ｘがアルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンから選択される、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
Ｘがグリシンおよびバリンから選択される、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがリンカーをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記リンカーが１つ以上のシステインを含む、請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記リンカーが、配列番号（ＧＧＣ）、配列番号（（ＧＧＣ）8）、配列番号（（Ｇ4Ｓ）3）、および配列番号（（ＶＰＧＸＧ）16（ここで、Ｘが、１：１の比で存在するバリンまたはシステインである））から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
前記リンカーが前記ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端の両方に位置する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記１つ以上の薬物分子が前記リンカーを介して前記ポリペプチドに付着している、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記薬物分子が前記リンカー中のチオール反応性基を介して前記ポリペプチドに付着している、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記１つ以上の薬物分子が小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、およびそれらの組合せから選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記薬物分子が小分子を含む、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記薬物分子がタンパク質を含む、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記薬物分子が癌治療薬を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記薬物分子が抗体を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
前記薬物分子がパクリタキセルを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記薬物分子がＴｎ３（ＴＲＡＩＬ超アゴニスト）を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
対象への投与のために調製される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記コンジュゲートの前記ポリペプチドが組換え発現される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
組換え発現される、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項２８に記載のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４０】
薬物分子を対象に送達する方法であって、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４１】
疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４２】
試料中の標的の存在を判定する方法であって、
前記試料を請求項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、前記薬物分子と前記試料中の前記標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること；および
前記複合体の存在を検出することであって、前記複合体の存在が前記試料中の前記標的を示す、検出すること
を含む方法。
【請求項４３】
前記試料が対象から得られ、および前記方法が、疾患を診断し、前記対象の治療の効力を予後予測するかまたは評価することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象の治療の効力を評価することをさらに含む場合、必要に応じて前記対象の前記治療を改変して効力を改善することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
対象における疾患を診断する方法であって、
前記対象からの試料を請求項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、前記薬物分子と前記試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること；
前記試料中の前記標的のレベルを判定することであって、前記複合体のレベルが前記試料中の前記標的の前記レベルを示す、判定すること；および
前記試料中の前記標的の前記レベルと前記標的の対照レベルとを比較することであって、前記対照レベルと異なる前記標的のレベルが前記対象における疾患を示す、比較すること
を含む方法。
【請求項４６】
前記対照レベルが、前記対象が治療を開始した期間の前またはその期間中の時点での前記対象におけるレベルに対応し、前記試料が後の時点で前記対象から採取される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が、前記対象が治療を受けている期間中の時点で前記対象から採取され、前記対照レベルが、無疾患レベルまたは前記対象が治療を開始した期間の前の時点でのレベルに対応する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
治療が前記疾患の治療において無効であると判定される場合、前記治療を改変するか、または異なる治療を前記対象に施与することをさらに含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記コンジュゲートがレポーターで標識されている、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記コンジュゲートが前記対象に静脈内、動脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記コンジュゲートが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている前記薬物分子に対して低減された抗原性を有する、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記コンジュゲートが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている前記薬物分子に対して低減された免疫原性を有する、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
疾患が癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、および整形外科的障害から選択される、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記疾患が癌を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌が乳癌、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳癌、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、非上皮性悪性腫瘍、気管癌、頭頸部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ癌、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、および軟部組織癌から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が乳癌を含む、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１５年８月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２００，７２６号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金５Ｒ０１ＥＢ０００１８８  Ｒ０１のもとで政府支援を受けて作製された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、薬物送達の方法、より詳細には、治療薬にコンジュゲートされている双性イオン性ポリペプチドに関する。コンジュゲートは、改善された生体適合性および生体分解性を有する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、組換え発現させることができ、およびそれにより正確に設計されかつ遺伝子レベルで操作され得る。
【背景技術】
【０００４】
薬物または治療薬、例えば、小分子、ペプチド、およびタンパク質のそれらの天然形態での送達は、それらの不十分な安定性、低い溶解度、および短いインビボ循環により制限される。薬物送達におけるこれらの課題は、治療効力の減少およびオフターゲット毒性のリスク増加をもたらす。薬物への巨大分子担体の付着は、それらの溶解度、血漿半減期、腫瘍特異的取り込み、およびそれらの全体的な治療上の潜在性を改善し得る。種々の材料、多くは合成ポリマーが薬物を送達するために既に設計されている。１つのこのような合成ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、薬物の周囲に「水のケージ」を形成し、次いで、それが血液成分からの立体反発を提供し、そのオプソニン化および酵素的分解の両方を防止する、親水性および吸湿性ポリマーである。ＰＥＧのこの「ステルス」特性は、薬物の溶解度および安定性を改善し、対象からのそれらの早期クリアランスを低減させ、それにより、ＰＥＧ化（薬物をＰＥＧに付着させるプロセス）は医薬産業における重要な方法となる。近年、新たなクラスの双性イオン性合成ポリマー、交互のカチオン性およびアニオン性基をそれらのモノマー中で有するポリマーが同様のステルス特性を実証した。しかしながら、薬物送達ビヒクルとしての合成ポリマーの信頼性を弱体化させる３つの大きい欠点が存在する。第１に、ＰＥＧへの反復曝露は、有害な免疫応答を誘発するＰＥＧ特異的抗体を産生し得ることが十分に報告されている。第２に、合成ポリマーは、非生体分解性であり、薬物送達後のそれらのインビボ効果が十分に理解されていない。第３に、合成ポリマーは、それぞれのバッチが異なる分子量を有する鎖から構成されるという点で多分散性である。この多分散性は、合成ポリマーに固有であり、特に半減期および免疫原性に関して異なる生物学的特性を有する薬物コンジュゲートの集団をもたらし得る。当技術分野において、改善された生体適合性、溶解度、安定性および半減期、ならびに低減された毒性を有する薬物の効率的な送達が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本明細書において、（ａ）１つ以上の荷電モチーフを含むポリペプチドであって、それぞれの荷電モチーフが、独立して、配列番号１（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方である）からなるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；および（ｂ）ポリペプチドに付着している１つ以上の薬物分子を含むコンジュゲートが提供される。
【０００６】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、複数の荷電モチーフを含む。一部の実施形態において、複数の荷電モチーフは、タンデムリピート型である。一部の実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上の非荷電モチーフをさらに含み、それぞれの非荷電モチーフは、独立して、配列番号３（ＶＰＧＸＧ）（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である）からなるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、複数の非荷電モチーフを含む。一部の実施形態において、複数の非荷電モチーフは、タンデムリピート型である。一部の実施形態において、１つ以上の非荷電モチーフは、ポリペプチドの少なくとも２つの隣接荷電モチーフ間に位置する。
【０００７】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４（ＶＰＧＸＧ）n（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ＶＰＧＸＧ）m（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸配列の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６（ＶＰＧＸＧ）m（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号７｛（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ＶＰＧＸＧ）｝b（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｂが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｘ1は、負荷電アミノ酸であり、Ｘ2は、正荷電アミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ1は、正荷電アミノ酸であり、Ｘ2は、負荷電アミノ酸である。一部の実施形態において、負荷電アミノ酸は、独立して、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される。一部の実施形態において、正荷電アミノ酸は、独立して、リジンおよびアルギニンから選択される。一部の実施形態において、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンから選択される。一部の実施形態において、Ｘは、グリシンおよびバリンから選択される。
【０００８】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、リンカーをさらに含む。一部の実施形態において、リンカーは、１つ以上のシステインを含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号（ＧＧＣ）、配列番号（（ＧＧＣ）8）、配列番号（（Ｇ4Ｓ）3）、および配列番号（（ＶＰＧＸＧ）16（ここで、Ｘは、１：１の比で存在するバリンまたはシステインである））から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端の両方に位置する。一部の実施形態において、１つ以上の薬物分子は、リンカーを介してポリペプチドに付着している。一部の実施形態において、薬物分子は、リンカー中のチオール反応性基を介してポリペプチドに付着している。一部の実施形態において、１つ以上の薬物分子は、小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、およびそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、薬物分子は、小分子を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、タンパク質を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、癌治療薬を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、抗体を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、パクリタキセルを含む。一部の実施形態において、薬物分子は、Ｔｎ３（ＴＲＡＩＬ超アゴニスト）を含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、対象への投与のために調製される。一部の実施形態において、コンジュゲートのポリペプチドは、組換え発現される。一部の実施形態において、コンジュゲートは、組換え発現される。
【０００９】
別の態様では、本明細書において、本明細書に詳述されるコンジュゲートを含む組成物が提供される。
【００１０】
別の態様では、本明細書において、本明細書に詳述されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。別の態様では、本明細書において、本明細書に詳述されるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドが提供される。別の態様では、本明細書において、ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００１１】
別の態様では、本明細書において、薬物分子を対象に送達する方法であって、本明細書に詳述されるコンジュゲートを対象に投与することを含む方法が提供される。
【００１２】
別の態様では、本明細書において、疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、本明細書に詳述されるコンジュゲートを対象に投与することを含む方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、本明細書において、試料中の標的の存在を判定する方法であって、試料を本明細書に詳述されるコンジュゲートと、薬物分子と試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること；および複合体の存在を検出することであって、複合体の存在が試料中の標的を示す、検出することを含む方法が提供される。
【００１４】
一部の実施形態において、試料は対象から得られ、および方法は、疾患を診断し、対象の治療の効力を予後予測するかまたは評価することをさらに含む。一部の実施形態において、方法が対象の治療の効力を評価することをさらに含む場合、方法は、必要に応じて対象の治療を改変して効力を改善することをさらに含む。別の態様では、本明細書において、対象における疾患を診断する方法であって、対象からの試料を本明細書に詳述されるコンジュゲートと、薬物分子と試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること；試料中の標的のレベルを判定することであって、複合体のレベルが試料中の標的のレベルを示す、判定すること；および試料中の標的のレベルと標的の対照レベルとを比較することであって、対照レベルと異なる標的のレベルが対象における疾患を示す、比較することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、対照レベルは、対象が治療を開始した期間の前またはその期間中の時点での対象におけるレベルに対応し、試料は、後の時点で対象から採取される。一部の実施形態において、試料は、対象が治療を受けている期間中の時点で対象から採取され、対照レベルは、無疾患レベルまたは対象が治療を開始した期間の前の時点でのレベルに対応する。一部の実施形態において、方法は、治療が疾患の治療において無効であると判定される場合、治療を改変するか、または異なる治療を対象に施与することをさらに含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、レポーターで標識されている。一部の実施形態において、コンジュゲートは、対象に静脈内、動脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される。一部の実施形態において、コンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている薬物分子に対して低減された抗原性を有する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている薬物分子に対して低減された免疫原性を有する。一部の実施形態において、疾患は、癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、および整形外科的障害から選択される。一部の実施形態において、疾患は、癌を含む。一部の実施形態において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳癌、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、非上皮性悪性腫瘍、気管癌、頭頸部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ癌、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、および軟部組織癌から選択される。一部の実施形態において、癌は、乳癌を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−Ｃ】ＺｉＰＰの考えられるアーキテクチャーを示す。（Ａ）ホモポリマー。（Ｂ）ジブロックポリマー。（Ｃ）マルチブロックポリマー。
【図１Ｄ】ＺｉＰＰの考えられる配列を示す。（Ｄ）荷電モチーフの考えられる配列。
【図２Ａ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの１２０個のリピートであった。（Ａ）精製ＺｉＰＰ構築物のＳＤＳ  ｐａｇｅ分析。
【図２Ｂ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの１２０個のリピートであった。（Ｂ）（ＶＰＫＤＧ）120および（ＶＰＲＤＧ）120についての代表的なＭＡＬＤＩスペクトルにより、精製ＺｉＰＰ構築物のＭＷが確認された（それぞれＭＷ＝６０．５ｋＤａ、ＭＷ＝６３．８ｋＤａ）。
【図２Ｃ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの１２０個のリピートであった。（Ｃ）動的光散乱を使用して計測された流体力学的半径は、ＥＬＰ対照と比較して十分に水和したＺｉＰＰを示した。
【図２Ｄ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの１２０個のリピートであった。（Ｄ）ＺｉＰＰのＣＤ−スペクトルは、低波長で負の楕円率およびより高波長でわずかに正の楕円率を示し、それはＥＬＰのような無秩序構造の典型である。
【図２Ｅ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの１２０個のリピートであった。（Ｅ）ネイティブＰＡＧＥゲルは、ＺｉＰＰがアルブミンと相互作用しないことを示した。
【図３Ａ】静脈内注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ａ）実験設計。
【図３Ｂ】静脈内注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ｂ）注射後の時間に応じた血漿濃度。
【図３Ｃ】静脈内注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ｃ）それぞれのコンジュゲートについての曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図３Ｄ】静脈内注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ｄ）それぞれのコンジュゲートについての排出半減期。
【図４Ａ】皮下注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ａ）実験設計。
【図４Ｂ】皮下注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ｂ）注射後の時間に応じた血漿濃度。
【図４Ｃ】皮下注射した場合のＥＬＰ（ＶＰＧＡＧ）およびＺｉＰＰの血漿薬物動態を示す。（Ｃ）それぞれのコンジュゲートについてのＡＵＣ。
【図５Ａ】ＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートの特徴付けを示す。（Ａ）ＺｉＰＰパクリタキセル（ＰＴＸ）ナノ粒子の設計概略図。パクリタキセルを、ｐＨ感受性リンカーを介して８つのＣ末端残基に化学的にコンジュゲートさせた。
【図５Ｂ】ＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートの特徴付けを示す。（Ｂ）ＰＴＸコンジュゲーション後の動的および静的光データは、ＺｉＰＰが５８ｎｍ半径のミセルに自己集合し、１ミセル当たり２６の凝集数であったことを示す。Ｒｇ／Ｒｈとして計算された形状因子（ρ）は０．８２であり、それは球状ミセルの形成を示す。ＺｉＰＰおよびＺｉＰＰ＋ＰＴＸコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＭＳは、１ポリマー鎖当たり３．２〜４つの薬物が存在することを示した。
【図５Ｃ】ＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートの特徴付けを示す。（Ｃ）７２時間の処理後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳癌細胞系におけるＺｉＰＰ−ＰＴＸ、ＥＬＰ−ＰＴＸ、および遊離ＰＴＸについての細胞生存率。
【図６Ａ】Ｚｉｐｐ化タンパク質を示す。（Ａ）（Ｔｎ３）6を有するＺｉＰＰ融合タンパク質についての設計概要。
【図６Ｂ】Ｚｉｐｐ化タンパク質を示す。（Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換え発現させた種々の長さのＺｉＰＰを有する（Ｔｎ３）6の親和性精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図６Ｃ】Ｚｉｐｐ化タンパク質を示す。（Ｃ）Ｃｏｌｏ２０５（結腸癌細胞）に対する細胞毒性アッセイおよび計算したＩＣ50値。
【図７Ａ−Ｂ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの８０個のリピートであった。（Ａ）精製ＺｉＰＰ構築物のＳＤＳ  ｐａｇｅ分析。５０ｋＤおよび７５ｋＤラダーを参照分子量として標識するが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用したラダーは球状タンパク質からのものであり、したがって非構造化ＺＩＰＰと直接比較可能でない。（Ｂ）（ＶＰＲＥＧ）80および（ＶＰＫＥＧ）80についての代表的なＭＡＬＤＩスペクトルにより、精製ＺＩＰＰ構築物の分子量（それぞれＭＷ＝４４．１ｋＤａ、ＭＷ＝４１．８ｋＤａ）が確認された。
【図７Ｃ】ＺｉＰＰの特徴付けを示す。使用したＺｉＰＰ構築物は、ペンタペプチド双性イオン性モチーフの８０個のリピートであった。（Ｃ）ＺＩＰＰのＣＤスペクトルは、低波長で負の楕円率およびより高波長でわずかに正の楕円率を示し、それはＥＬＰのような無秩序構造の典型である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、薬物分子を対象に送達するための組成物および方法が提供される。組成物および方法は、ポリペプチドおよびそれに付着している薬物分子を含むコンジュゲートを含む。ポリペプチドは、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸の両方を含む。本明細書に詳述される組成物および方法は、薬物送達における従来の課題、例として、生体適合性、溶解度、安定性および半減期、免疫原性、ならびに抗原性による制限を克服し得る。本明細書に詳述される構築物は、親水性原理を使用して「水のケージ」をコンジュゲートの周囲に提供して、コンジュゲートを分解から立体的に保護し得る。これにより、コンジュゲートは、コンジュゲート化治療薬の安定性および溶解度を増加させ、そのインビボ効力を改善する。コンジュゲートは、薬物を効率的に送達して疾患を治療することにより疾患の治療を可能にし得る。薬物が標的に結合する一部の実施形態において、コンジュゲートを使用して標的を検出し、疾患を検出もしくは診断し、および／または治療の効力を判定することもできる。本明細書に詳述されるコンジュゲートは、遺伝子操作により産生することもでき、それによりその設計および操作が容易になり、正確さ、より低い毒性、より良好な生体適合性、および改善された生体分解性を伴う。
【００１７】
１．定義
本明細書で使用される用語「含む」、「包含する」、「有している」、「有する」、「することができる」、「含有する」、およびそれらの変形語は、追加の作用または構造の可能性を除外しない制約のない移行句、用語、語であるものとする。単数形「１つの（ａ）」、「および」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り複数の参照対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「それらからなる」、および「本質的にそれらからなる」他の実施形態を企図する。
【００１８】
本明細書における数値範囲の引用について、同程度の精度でそれらの間のそれぞれの介在する数字が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲について、７および８の数字が６および９に加えて企図され、６．０〜７．０の範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数字が明示的に企図される。
【００１９】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。矛盾する場合、定義を含め本明細書が優先する。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと類似のまたは均等な方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本明細書に開示の材料、方法、および実施例は、説明目的にすぎず、限定的なものではない。
【００２０】
１つ以上の目的の値に適用される本明細書で使用される用語「約」は、記述される参照値と類似する値を指す。ある態様において、用語「約」は、別途記述されない限りまたは別途内容から明らかでない限り、記述参照値のいずれかの方向（それよりも大きいまたは小さい）で２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれより小さい値内に収まる値の範囲を指す（このような数字が考えられる値の１００％を超過する場合を除く）。
【００２１】
本明細書で使用される「アミノ酸」は、天然存在および非天然合成アミノ酸、ならびに天然存在アミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然存在アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるものである。本明細書において、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨されるそれらの一般に公知の三文字記号または一文字記号のいずれかにより称することができる。アミノ酸は、側鎖およびポリペプチド骨格部分を含む。
【００２２】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」は、疾患または病態の同定および／または分類において有用な変動濃度で対象中に存在する天然存在生物学的分子を指す。バイオマーカーとしては、疾患についての指標もしくはマーカーとして使用される遺伝子、タンパク質、ポリヌクレオチド、核酸、リボ核酸、ポリペプチド、または他の生物学的分子を挙げることができる。一部の実施形態において、バイオマーカーは、疾患マーカーを含む。例えば、バイオマーカーは、疾患を有する対象において上方調節または下方調節される遺伝子であり得る。別の例として、バイオマーカーは、疾患を有し、または疾患を発症するリスクを有する対象においてレベルが増加または減少するポリペプチドであり得る。一部の実施形態において、バイオマーカーは、小分子を含む。一部の実施形態において、バイオマーカーは、ポリペプチドを含む。
【００２３】
用語「対照」、「参照レベル」および「参照」は、本明細書で互換的に使用される。参照レベルは、計測結果の比較評価対象となるベンチマークとして用いられる所定の値または範囲であり得る。本明細書で使用される「対照群」は、対照対象の群を指す。所定レベルは、対照群からのカットオフ値であり得る。所定レベルは、対照群からの平均であり得る。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、適応インデックスモデル（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｍｏｄｅｌ）（ＡＩＭ）法により決定することができる。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、患者群の生物学的試料から受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により決定することができる。生物学分野で一般に公知であるＲＯＣ分析は、ある条件を別の条件から区別するための、例えば、ＣＲＣを有する患者の同定におけるそれぞれのマーカーの性能を決定するための試験の能力の決定法である。ＲＯＣ分析の記載は、Ｐ．Ｊ．Ｈｅａｇｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２０００，５６，３３７−４４）（その開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に提供されている。あるいは、カットオフ値は、患者群の生物学的試料の四分位分析により決定することができる。例えば、カットオフ値は、２５〜７５パーセンタイル範囲の任意の値、好ましくは、２５パーセンタイル、５０パーセンタイルまたは７５パーセンタイル、より好ましくは、７５パーセンタイルに対応する値を選択することにより決定することができる。このような統計分析は、当技術分野における任意の方法を使用して実施することができ、多数の市販のソフトウェアパッケージ（例えば、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ  ＬＰ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ．からのもの）を介して実行することができる。標的またはタンパク質活性についての健常または正常レベルまたは範囲は、標準的技法に従って定義することができる。対照は、疾患状態が既知である対象またはその対象からの試料であり得る。対象またはその対象からの試料は、健常であるか、罹患しているか、治療前に罹患しているか、治療中に罹患しているか、または治療後に罹患しているか、またはそれらの組合せであり得る。
【００２４】
用語「発現ベクター」は、所望のタンパク質をコードするための核酸配列を挿入または導入することができる、当技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは別の媒体を示す。
【００２５】
用語「宿主細胞」は、核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入、コンジュゲーションなどを受けやすい細胞である。宿主細胞は、植物、細菌、酵母、真菌、昆虫、動物などに由来し得る。一部の実施形態において、宿主細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。
【００２６】
「単分散する」または「単分散」は、それぞれがほぼ同一の分子量を有する複数のコンジュゲートまたはそれらのポリペプチドの特性を指す。コンジュゲートの遺伝子コード合成は、分子量の正確な制御を容易にし得る。分子量は、分子のインビボ循環時間またはその半減期に影響する因子である。
【００２７】
「オプソニン化」は、分子、微生物、またはアポトーシス細胞が化学修飾されて、食細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上の細胞表面受容体とのより強力な相互作用を有する分子機序を指す。分子、微生物、またはアポトーシス細胞上の抗原は、オプソニン中でコートされる。オプソニンは、免疫細胞、例えば、マクロファージおよび好中球への結合を向上させる。オプソニン化は、細胞表面受容体からのシグナルカスケードを介する食作用も媒介する。
【００２８】
「合成ポリマー」は、化学プロセスにより少なくとも１つのモノマーから産生されるポリマーを指す。合成ポリマーは、生体によっては直接産生されない。合成ポリマーとしては、ホモポリマー、ヘテロポリマー、ブロックポリマー、コポリマー、ターポリマーなど、ならびにそれらのブレンド、組合せおよび混合物が挙げられる。合成ポリマーの例としては、限定されるものではないが、官能化ポリマー、例えば、５−ビニルテトラゾールモノマー単位を含み、２．０未満の分子量分布を有するポリマーが挙げられる。合成ポリマーは、星形ブロックコポリマー、直鎖ポリマー、分枝鎖ポリマー、超分枝鎖ポリマー、樹枝状ポリマー、櫛形ポリマー、グラフトポリマー、ブラシポリマー、ボトルブラシコポリマーおよび架橋構造、例えば、５−ビニルテトラゾールモノマー単位のブロックを含むブロックコポリマーの１つ以上であり得、またはそれを含有し得る。合成ポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリノルボルネンおよび不飽和結合を有するモノマーが挙げられる。例えば、両親媒性櫛形ポリマーが、Ｍａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００７／００８７１１４号明細書および米国特許第６，２０７，７４９号明細書（これらのそれぞれの開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。両親媒性櫛型ポリマーは、疎水性非水溶性ポリマーから形成される骨格と、短鎖親水性非細胞結合ポリマーから形成される側鎖とを含有するコポリマーの形態で存在し得る。他の合成ポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリクロロプレン；ポリビニルエーテル；例えば、ポリ（酢酸ビニル）；ハロゲン化ポリビニル、例えば、ポリ（塩化ビニル）；ポリシロキサン；ポリスチレン；ポリウレタン；ポリアクリレート；例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ｎ−ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）；ポリアクリルアミド、例えば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（エチルアクリルアミド）、ポリ（エチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ、イソ、およびｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド）；ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。これらの合成ポリマーとしては、有用な誘導体、例として、置換、化学基、例えば、アルキル基、アルキレン基の付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により定型的に作製される他の修飾を有する合成ポリマーを挙げることができる。合成ポリマーとしては、��性イオン性ポリマー、例えば、ポリホスホリルコリン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｃｈｏｌｉｎｅ）、ポリカルボキシベタイン、およびポリスルホベタインなどを挙げることができる。合成ポリマーは、ベタイン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）、サルコシンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の側鎖を有し得る。
【００２９】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。ポリヌクレオチドは、天然または合成核酸、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ポリヌクレオチドは、デオキシリボおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびに塩基、例として、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンの組合せを含有し得る。ポリヌクレオチドは、化学合成法によりまたは組換え法により得ることができる。
【００３０】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合している２つ以上のアミノ酸の結合配列である。ポリペプチドは、天然、合成、または改変または天然および合成の組合せであり得る。ペプチドおよびポリペプチドとしては、タンパク質、例えば、結合タンパク質、受容体および抗体が挙げられる。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、本明細書で互換的に使用される。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に秩序化された三次元構造を指す。これらの構造は、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔ドメイン、および細胞質尾部ドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの部分であり、典型的には、１５〜３５０アミノ酸長である。例示的なドメインとしては、酵素活性またはリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、より小さい組織化のセクション、例えば、ベータ−シートおよびアルファ−ヘリックスのストレッチから構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有会合により形成される三次元構造を指す。「モチーフ」は、ポリペプチド配列の一部分であり、少なくとも２つのアミノ酸を含む。モチーフは、２〜２０、２〜１５、または２〜１０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態において、モチーフは、３、４、５、６、または７つの連続アミノ酸を含む。
【００３１】
本明細書で使用される「薬物動態」は、体内の薬物の循環ならびにそのバイオアベイラビリティー、分布、および排泄を指す。
【００３２】
「組換え体」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変更により改変されたこと、またはその細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え体）形態内で見出されない遺伝子を発現し、またはそうでなければ異常に発現され、過小発現され、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００３３】
「レポーター」、「レポーター基」、「標識」、および「検出可能標識」は、本明細書で互換的に使用される。レポーターは、検出可能シグナルを生成し得る。標識は、肉眼または機器による手段により検出可能なシグナルを産生し得る。レポーター基のシグナル伝達の物理的性質（例えば、蛍光、電気化学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および電子常磁性共鳴（ＥＰＲ））および化学的性質が異なる種々のレポーター基を使用することができる。種々のレポーターとしては、シグナル産生物質、例えば、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などが挙げられる。一部の実施形態において、レポーターは、放射性標識を含む。レポーターとしては、光を産生する部分、例えば、アクリジニウム化合物、および蛍光を産生する部分、例えば、フルオレセインを挙げることができる。一部の実施形態において、レポーターからのシグナルは、蛍光シグナルである。レポーターは、フルオロフォアを含み得る。フルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、アクリロダン（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）、バダン（６−ブロモ−アセチル−２−ジメチルアミノ−ナフタレン）、ローダミン、ナフタレン、ダンシルアジリジン（ｄａｎｚｙｌ  ａｚｉｒｉｄｉｎｅ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、フルオレセイン、ジピロメテンホウ素ジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）、４−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（ＮＢＤ）、Ａｌｅｘａ蛍光色素、およびそれらの誘導体が挙げられる。フルオレセイン誘導体としては、例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセイン、およびイソチオシアネートを挙げることができる。
【００３４】
本明細書で使用される「試料」または「試験試料」は、標的の存在および／またはレベルを検出または判定すべき任意の試料を意味し得る。試料としては、液体、溶液、エマルション、または懸濁液を挙げることができる。試料としては、医学的試料を挙げることができる。試料としては、任意の生物学的体液または組織、例えば、血液、全血、血液の分画、例えば、血漿および血清、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙液、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻汁、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、嘔吐物、糞便物質、肺組織、末梢血単核細胞、全白血球、リンパ節細胞、脾細胞、扁桃腺細胞、癌細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、またはそれらの組合せを挙げることができる。一部の実施形態において、試料は、アリコートを含む。他の実施形態において、試料は、生体液を含む。試料は、当技術分野で公知の任意の手段により得ることができる。試料は、患者から得られたままで直接使用することができ、または例えば濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活性化、試薬の添加などにより前処理して、本明細書で考察されるとおりまたはそうでなければ当技術分野で公知のとおり、何らかの様式で試料の特徴を改変することができる。
【００３５】
本明細書で使用される用語「感度」は、真陽性の数を真陽性の数と偽陰性の数との合計により割ったものを指し、感度（「ｓｅｎｓ」）は、０＜ｓｅｎｓ＜１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書における方法の実施形態は、対象が実際に疾患を有する場合に対象がその疾患を有さないと誤って識別されないように、０に等しいかまたはほぼ０に等しい偽陰性の数を有する。逆に、評価は、感度に対する補完的な計測である予測アルゴリズムが陰性を正確に分類する能力からなることが多い。
【００３６】
本明細書で使用される用語「特異度」は、真陰性の数を真陰性の数と偽陽性の数との合計により割ったものを指し、特異度（「ｓｐｅｃ」）は、０＜ｓｐｅｃ＜１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書に記載の方法は、対象が実際に疾患を有さない場合に対象がその疾患を有すると誤って識別されないように、０に等しいかまたはほぼ０に等しい偽陽性の数を有する。したがって、１または１００％に等しい感度および特異度の両方を有する方法が好ましい。
【００３７】
「特異的に結合する」は、一般に、ポリペプチドがランダムな非関連標的に結合するよりも容易に標的に結合する場合、ポリペプチドがその標的に結合することを意味する。
【００３８】
「ステルス」または「ステルスポリマー」は、長期間にわたり血流中で免疫細胞により検出されないままであり得るコンジュゲートまたはそのポリペプチドを指す。ステルスポリマーは、少なくとも部分的に、例えば、プロテアーゼによるコンジュゲートの酵素的分解またはそのポリペプチドへの分解、および外来粒子を認識するために免疫系により使用される一般的方法であるオプソニン化に耐性である。したがって、ステルスポリマーは、他のポリマー、コンジュゲート、非ステルスポリマー、および／または非ステルスコンジュゲートに対して低減された抗原性、低減された免疫原性、増加した安定性、増加した半減期、および増加したバイオアベイラビリティーの１つ以上を有し得る。オプソニン化、免疫系による認識、または体内からのコンジュゲート（またはそのポリペプチドもしくは薬物分子）のクリアランスを遅延、低減、または防止する能力は、本明細書でステルス特性と称され得る。
【００３９】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のコンジュゲートまたは融合タンパク質を所望するかまたはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、霊長類または非霊長類であり得る。哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒト；非霊長類、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、およびモルモットなど；または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、およびテナガザルなどであり得る。対象は、任意の年齢または発生段階のもの、例えば、成人、青年、または幼児などであり得る。
【００４０】
本明細書で使用される「標的」は、薬物分子が結合する実体を指し得る。標的としては、例えば、小分子、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、またはそれらの組合せを挙げることができる。
【００４１】
「転移」または「相転移」は、熱応答性ポリペプチドの凝集を指す。相転移は、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）または逆転移温度Ｔtと呼ばれる規定の温度で急激に可逆的に生じる。転移温度未満では、熱応答性ポリペプチド（または熱応答性ポリペプチドを含むポリペプチド）は、高度に可溶性である。転移温度を超えた加熱時、熱応答性ポリペプチドは疎水的に崩壊し、凝集し、別個のゲル様相を形成する。「逆転移サイクリング（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｉｎｇ）」は、熱応答性ポリペプチド（または熱応答性ポリペプチドを含むポリペプチド）のためのタンパク質精製法を指す。このタンパク質精製法は、可溶相および不溶相を介して溶液をサイクルさせ、それにより汚染物質を除去するための熱応答性ポリペプチドの可逆的相転移挙動の使用を含み得る。
【００４２】
「治療」または「治療すること」は、疾患からの対象の保護を指す場合、その疾患を予防、抑制、抑止、改善、または完全に排除することを意味する。疾患の予防は、本発明の組成物を対象に疾患発症前に投与することを含む。疾患の抑制は、本発明の組成物を対象に疾患誘導後であるがその臨床的所見前に投与することを含む。疾患の抑止または改善は、本発明の組成物を対象に疾患の臨床的所見後に投与することを含む。
【００４３】
「実質的に同一」は、第１および第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００アミノ酸の領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味し得る。
【００４４】
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部または断片；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列またはその一部の相補鎖；（ｉｉｉ）参照ポリヌクレオチドまたはその相補鎖と実質的に同一であるポリヌクレオチド；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチド、その相補鎖、またはそれと実質的に同一の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドとしてさらに定義することができる。「生物学的活性」の代表例としては、特異的抗体もしくはポリペプチドにより結合される能力、または免疫応答を促進する能力が挙げられる。バリアントは、実質的に同一の配列を意味し得る。バリアントは、その機能的断片を意味し得る。バリアントは、ポリペプチドの多重コピーも意味し得る。多重コピーは、タンデムであっても、リンカーにより離隔されていてもよい。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドも意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸の、類似特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸による置き換えは、典型的には、微小変化を伴うとして当技術分野で認識されている。これらの微小変化は、部分的には、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することにより同定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２，１５７，１０５−１３２を参照されたい。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシー指数のアミノ酸が置換され得、タンパク質機能を依然として保持することは当技術分野で公知である。一態様において、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換されている。アミノ酸の疎水性を使用して生物学的機能を保持するポリペプチドをもたらす置換を明らかにすることもできる。ポリペプチドに関するアミノ酸の親水性の考慮により、そのポリペプチドの最大局所平均親水性（参照により本明細書に完全に取り込まれる米国特許第４，５５４，１０１号明細書に考察される、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告された有用な尺度）の計算が可能となる。類似する親水性値を有するアミノ酸の置換は、当技術分野で理解されている生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するポリペプチドをもたらし得る。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸により実施することができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方が、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の特性により明らかにされるとおり、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対類似性に依存することが理解される。
【００４６】
バリアントは、全遺伝子配列またはその断片の全長に対して実質的に同一であるポリヌクレオチド配列であり得る。ポリヌクレオチド配列は、遺伝子配列またはその断片の全長に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列またはその断片の全長に対して実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００４７】
「水のケージ」は、分子を包囲し、その分子とイオン的に相互作用する水分子を指す。分子は、例えば、ポリペプチド、ＺｉＰＰ、薬物分子、またはコンジュゲートであり得る。分子が溶液中に存在する場合、例えば、その分子は、包囲水分子とイオン性相互作用を形成し、その結果、その周囲に水のケージが形成される。例えば、ポリペプチドの正および負荷電アミノ酸は、溶液中でその周囲の水分子とのイオン性相互作用を形成し得る。溶液としては、例えば、対象の血漿または血液または他の体液を挙げることができる。イオン性相互作用は、水素結合または他の分子間引力よりも強力であり、摂動状態になるためにより多くのエネルギーを必要とする。一部の実施形態において、水のケージは、分子（例えば、ポリペプチド、ＺｉＰＰ、薬物分子、またはコンジュゲート）を分解またはオプソニン化から保護し得る。水のケージは、ステルス特性を分子に付与し得る。
【００４８】
「双性イオン性」または「双性イオン」は、０の正味電荷を有するが、分子内の独立した個々の原子上の負および正電荷を含む分子を指す。荷電原子は、１つ以上の共有結合により結合している。ポリペプチドは、双性イオン性であり得る。
【００４９】
２．コンジュゲート
コンジュゲートは、ポリペプチドおよびそのポリペプチドに付着している１つ以上の薬物分子を含む。コンジュゲートは、少なくとも１つのリンカーをさらに含み得る。コンジュゲートは、薬物送達のためのステルスポリマーとみなされる。
【００５０】
ａ．ポリペプチド
ポリペプチドは、１つ以上の荷電モチーフを含む。荷電モチーフは、１つ以上の正荷電アミノ酸および１つ以上の負荷電アミノ酸を含み、正荷電アミノ酸および負荷電アミノ酸は１：１の比で存在する。一部の実施形態において、モチーフの正味電荷は、中性である。一部の実施形態において、荷電モチーフは、双性イオン性モチーフである。１つのモチーフ内の正荷電アミノ酸は、同一でも異なっていてもよい。１つのモチーフ内の負荷電アミノ酸は、同一でも異なっていてもよい。本明細書で使用されるアミノ酸の電荷（正および／または負）は、アミノ酸側鎖の電荷を指す。荷電アミノ酸は、中性ｐＨ、生理学的ｐＨ、またはタンパク質フォールド内の局所ｐＨ、またはそれらの組合せにおいて正および／または負荷電である。荷電モチーフは、１つ以上の非荷電アミノ酸をさらに含み得る。一部の実施形態において、荷電モチーフは、ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ（配列番号１）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方である）のアミノ酸配列を有する。１つ以上の荷電モチーフを含むポリペプチドは、双性イオン性ポリペプチド（ＺｉＰＰ）であり得る。ＺｉＰＰは、負電荷を有するアミノ酸および正電荷を有するアミノ酸の両方を含む全体として中性のポリペプチドである。
【００５１】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、複数の荷電モチーフを含む。複数の荷電モチーフは、リピート型であり得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（配列番号２）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。Ｘ1は、隣接モチーフ間で同一でも異なっていてもよい。Ｘ2は、隣接モチーフ間で同一でも異なっていてもよい。一部の実施形態において、ｎは、約１００、２００、３００、４００、または５００以下の整数である。一部の実施形態において、ｎは、１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１０〜約５００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約５００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００に等しい整数である。一部の実施形態において、（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（配列番号２）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをホモポリマーと称することができる。
【００５２】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上の荷電モチーフに加えて１つ以上の非荷電モチーフを含む。非荷電モチーフは、非荷電アミノ酸を含む。一部の実施形態において、非荷電モチーフは、いかなる荷電アミノ酸も含まない。一部の実施形態において、非荷電モチーフは、ＶＰＧＸＧ（配列番号３）（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である）からなるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
複数の非荷電モチーフは、タンデムリピート型であり得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上の荷電モチーフに加えて（ＶＰＧＸＧ）n（配列番号４）（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｎは、約１００、２００、３００、４００、または５００未満の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１０〜約５００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約５００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００に等しい整数である。一部の実施形態において、１つ以上の荷電モチーフに加えて（ＶＰＧＸＧ）n（配列番号４）（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎが１以上の整数である）からなるアミノ酸配列を有する非荷電モチーフを含むポリペプチドをエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）と称する。
【００５４】
ポリペプチドのモチーフは、多数の考えられる手法で配置することができる。考えられる配置およびアーキテクチャーの例を図１に示す。図１では、灰色枠は正荷電アミノ酸を示す一方、黒色枠は負荷電アミノ酸を示す。図１Ａは、ホモポリマーの一例を示し、それぞれの単位は、ペンタペプチド配列ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ（配列番号１）または荷電モチーフのリピートである。図１Ｄは、ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ（配列番号１）の考えられる配列を示す。図１Ｂは、ジブロックポリマーの一例を示す。ジブロックアーキテクチャーでは、ポリマーの１つのブロックはリピート型の荷電モチーフから作製される一方、他の部分はリピート型の非荷電モチーフを含む。図１Ｃは、マルチブロックポリマーの一例を示し、荷電モチーフおよび非荷電モチーフは、そのポリマーの多様性を増加させるように異なる部位に置かれる。モチーフの特定の数、アイデンティティー、および配置は、溶媒和の最適レベルを達成し得るコンジュゲートを作出し、水のケージを作出し、および／またはその周囲の層を作出して治療薬または薬物分子の薬物動態の改善に役立つように設計することができる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ステルス特性をそのポリペプチドまたはコンジュゲートに付与するように配置される。一部の実施形態において、１つ以上の非荷電モチーフは、ポリペプチドの少なくとも２つの隣接荷電モチーフ間に位置する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、タンデムリピート型の複数の荷電モチーフおよびタンデムリピート型の複数の非荷電モチーフを含む。一部の実施形態において、タンデムリピート型の複数の荷電モチーフは、タンデムリピート型の複数の非荷電モチーフに対してＣ末端に位置する。一部の実施形態において、タンデムリピート型の複数の荷電モチーフは、タンデムリピート型の複数の非荷電モチーフに対してＮ末端に位置する。
【００５５】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ＶＰＧＸＧ）m（配列番号５）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｎは、約１００、２００、３００、４００、または５００以下の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１０〜約５００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約５００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００に等しい整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１００、２００、３００、４００、または５００以下の整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１０〜約５００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約５００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００に等しい整数である。一部の実施形態において、（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ＶＰＧＸＧ）m（配列番号５）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをジブロックポリマーと称することができる。
【００５６】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、（ＶＰＧＸＧ）m（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（配列番号６）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｎは、約１００、２００、３００、４００、または５００以下の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１０〜約５００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約５００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｎは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００に等しい整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１００、２００、３００、４００、または５００以下の整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１０〜約５００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約５００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｍは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００に等しい整数である。一部の実施形態において、（ＶＰＧＸＧ）m（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（配列番号６）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをジブロックポリマーと称することができる。
【００５７】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、｛（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ＶＰＧＸＧ）｝b（配列番号７）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｂが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｂは、約１００、２００、または３００以下の整数である。一部の実施形態において、ｂは、約１、１０、５０、１００、１５０、または２００以上の整数である。一部の実施形態において、ｂは、約１０〜約３００、約１０〜約２００、約１０〜約１００、約１０〜約５０、約１〜約３００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０の整数である。一部の実施形態において、ｂは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、または３００に等しい整数である。一部の実施形態において、｛（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ＶＰＧＸＧ）｝b（配列番号７）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｂが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをマルチブロックポリマーと称することができる。
【００５８】
一部の実施形態において、Ｘ1は、負荷電アミノ酸であり、Ｘ2は、正荷電アミノ酸である。一部の実施形態において、Ｘ1は、正荷電アミノ酸であり、Ｘ2は、負荷電アミノ酸である。一部の実施形態において、負荷電アミノ酸は、独立して、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される。一部の実施形態において、正荷電アミノ酸は、独立して、リジンおよびアルギニンから選択される。一部の実施形態において、Ｘは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンから選択される。一部の実施形態において、Ｘは、グリシンおよびバリンから選択される。
【００５９】
一部の実施形態において、ポリペプチドは温度感受性であり、熱応答性と称することもできる。熱応答性ポリペプチドは、相転移を有し得る。熱応答性ポリペプチドは、相転移特徴をポリペプチドおよび／またはコンジュゲートに付与し得る。相転移は、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）または逆転移温度（Ｔt）と呼ばれる規定の温度で急激に可逆的に生じる。「相転移」または「転移」は、熱応答性ポリペプチドの凝集と称することもできる。転移温度（ＬＣＳＴまたはＴｔ）未満では、熱応答性ポリペプチド（または熱応答性ポリペプチドを含むポリペプチド）は、高度に可溶性であり得る。転移温度を超えた加熱時、熱応答性ポリペプチドは疎水的に崩壊および凝集し得、別個のゲル様相または不溶性疎水性凝集物を形成する。ポリペプチドの熱応答性特性は、「逆転移サイクリング」と称される方法に従ってポリペプチドおよび／またはコンジュゲートの精製において利用することができる。相転移は、コスモトロピック塩、例えば、硫酸アンモニウムなどを使用して誘発することもできる。例えば、塩化ナトリウムをコスモトロピック塩とともに使用することができる。コスモトロピック塩は、ポリペプチドおよび／またはコンジュゲートを含む溶液に添加することができ、コスモトロピック塩は、ポリペプチドおよび／またはコンジュゲートが凝集物を形成するまで、または溶液から沈殿するまで添加する。凝集物は、遠心分離によりペレット化し、第２の溶液または緩衝液中で再懸濁させることができる。ポリペプチドおよび／またはコンジュゲートの凝集物は、それらのＴｔ未満に冷却されたら、またはコスモトロピック塩が溶液から除去された場合に溶液中に再可溶化し得る。一部の実施形態において、コンジュゲートを、いかなるクロマトグラフィー精製も用いずに精製する。一部の実施形態において、コンジュゲートを細菌培養物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などから組換え生成し、精製する。
【００６０】
ｂ．薬物分子
コンジュゲートは、１つ以上の薬物分子を含み得る。薬物分子は、治療薬であり得る。一部の実施形態において、薬物分子は、小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、およびそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、薬物分子は、小分子を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、タンパク質を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、癌治療薬を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、抗体を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、Ｔｎ３（ＴＲＡＩＬ超アゴニスト）を含む。一部の実施形態において、薬物分子は、コンジュゲートのポリペプチドのシステインに付着している。
【００６１】
コンジュゲートは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の薬物分子を含み得る。コンジュゲートは、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、または少なくとも約３つの薬物分子を含み得る。コンジュゲートは、約１０個未満、約８つ未満、または約５つ未満の薬物分子を含み得る。一部の実施形態において、コンジュゲートは、１つの薬物分子を含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、コンジュゲートの１ポリペプチド当たり１つの薬物分子を含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、１〜１０個の薬物分子を含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、２〜５つの薬物分子を含む。
【００６２】
ｃ．リンカー
一部の実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも１つのリンカーをさらに含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、２つ以上のリンカーを含む。このような実施形態において、リンカーは、互いに同一でも異なっていてもよい。コンジュゲートは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のリンカーを含み得る。コンジュゲートは、２０個未満、１５個未満、１０個未満、または５つ未満のリンカーを含み得る。コンジュゲートは、１〜２０個、５〜１５個、または１〜５つのリンカーを含み得る。リンカーは、ポリペプチドのＣ末端、ポリペプチドのＮ末端、またはポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方に位置してよい。一部の実施形態において、リンカーは、ポリペプチド配列内のいずれの場所に位置してもよい。複数のリンカーは、互いに隣接して位置してよい。
【００６３】
リンカーは、任意のアミノ酸配列および長さのポリペプチドであり得る。リンカーは、スペーサーペプチドとして作用し得る。一部の実施形態において、リンカーは、荷電アミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーは、非荷電アミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーは、フレキシブルである。一部の実施形態において、リンカーは、１つ以上のシステインを含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号８（ＧＧＣ）、配列番号９（（ＧＧＣ）8）、配列番号１０（（Ｇ4Ｓ）3）、および配列番号１１（（ＶＰＧＸＧ）16（ここで、Ｘが、１：１の比で存在するバリンまたはシステインである））から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
リンカーは、ポリペプチドへの薬物分子のための付着部位として機能し得る。薬物分子は、当技術分野で公知の任意の好適な手段によりリンカーに付着し得る。薬物分子は、チオール反応性結合基を介してリンカーに付着し得る。一部の実施形態において、１つ以上の薬物分子は、リンカーを介してポリペプチドに付着している。一部の実施形態において、薬物分子は、リンカー中のチオール反応性基を介してポリペプチドに付着している。
【００６５】
３．ポリヌクレオチド
本明細書に詳述されるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドがさらに提供される。ベクターは、本明細書に詳述されるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含み得る。ポリペプチドの発現を得るため、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指向するためのプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中にサブクローニングすることができる。ベクターの一例は、ｐｅｔ２４である。好適な細菌プロモーターは、当技術分野で周知である。本明細書に詳述されるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換または形質移入された宿主細胞がさらに提供される。タンパク質発現のための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（Ｐａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９８３，２２，２２９−２３５；Ｍｏｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８３，３０２，５４３−５４５）で利用可能である。このような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は当技術分野で周知であり、同様に市販されている。本発明ではレトロウイルス発現系を使用することができる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、配列番号１３のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む。
【００６６】
コンジュゲートは、当業者により宿主細胞中で組換え発現させることができる。コンジュゲートは、当業者に公知の任意の手段により精製することができる。例えば、コンジュゲートは、クロマトグラフィー、例えば、液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組合せを使用して精製することができる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、クロマトグラフィーを用いずに精製する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、逆転移サイクリングを使用して精製する。
【００６７】
４．投与
組成物は、コンジュゲートを含み得る。上記に詳述されるコンジュゲートは、医薬分野における当業者に周知の標準的技術に従って組成物中に配合することができる。組成物は、対象への投与のために調製することができる。コンジュゲートを含むこのような組成物は、年齢、性別、体重、および特定の対象の病態、ならびに投与経路などの因子を考慮して医学分野の当業者に周知の投与量でおよびその技術により投与され得る。
【００６８】
コンジュゲートは、予防または治療的に投与され得る。予防的投与では、コンジュゲートは、応答を誘導するために十分な量で投与され得る。治療用途では、コンジュゲートは、治療効果を誘導するために十分な量でそれを必要とする対象に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与されるコンジュゲートレジメンの特定の組成物、投与方式、疾患の段階および重症度、患者の一般健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。
【００６９】
コンジュゲートは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，１５，６１７−６４８）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，５８０，８５９号明細書、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  （米国特許第５，７０３，０５５号明細書、１９９７年１２月３０日発行）；およびＣａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，６７９，６４７号明細書、１９９７年１０月２１日発行）（それらの全ての内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載のとおり、当技術分野で周知の方法により投与され得る。コンジュゲートは、例えば、ワクチン銃（ｖａｃｃｉｎｅ  ｇｕｎ）を使用して個体に投与することができる粒子またはビーズに複合体化することができる。当業者は、薬学的に許容可能な担体、例として、生理学的に許容可能な化合物の選択が例えば投与経路に依存することを理解している。
【００７０】
コンジュゲートは、種々の経路を介して送達することができる。典型的な送達経路としては、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内または皮下送達が挙げられる。他の経路としては、経口投与、鼻腔内、膣内、経皮、静脈内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、および表皮経路が挙げられる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、対象に静脈内、動脈内、または腹腔内投与される。
【００７１】
コンジュゲートは、液体製剤、例えば、懸濁液、シロップ剤、またはエリキシル剤であり得る。コンジュゲートは、リポソーム、マイクロスフェア、または他のポリマーマトリックス中に取り込むことができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，７０３，０５５号明細書；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ｔｏ  ＩＩＩ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９３）（それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載の方法による）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり得、作製および投与が比較的簡易な非毒性の生理学的に許容可能で代謝可能な担体であり得る。
【００７２】
コンジュゲートは、ワクチンとして使用することができる。ワクチンは、エレクトロポレーションを介して、例えば、米国特許第７，６６４，５４５号明細書（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により投与され得る。エレクトロポレーションは、米国特許第６，３０２，８７４号明細書；同第５，６７６，６４６号明細書；同第６，２４１，７０１号明細書；同第６，２３３，４８２号明細書；同第６，２１６，０３４号明細書；同第６，２０８，８９３号明細書；同第６，１９２，２７０号明細書；同第６，１８１，９６４号明細書；同第６，１５０，１４８号明細書；同第６，１２０，４９３号明細書；同第６，０９６，０２０号明細書；同第６，０６８，６５０号明細書；および同第５，７０２，３５９号明細書（それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載の方法および／または機器によるものであり得る。エレクトロポレーションは、最小侵襲装置を介して実施することができる。
【００７３】
一部の実施形態において、コンジュゲートは、放出制御配合物中で投与される。コンジュゲートは、例えば、循環または腫瘍中に放出させることができる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも約１日、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１週間、少なくとも約１．５週間、少なくとも約２週間、少なくとも約２．５週間、少なくとも約３．５週間、少なくとも約４週間、または少なくとも約１ヵ月の期間にわたり放出させることができる。
【００７４】
５．検出
本明細書で使用される用語「検出する」または「〜の存在を判定する」は、標的に結合している検出不可能、低濃度、通常濃度、または高濃度の１つ以上のコンジュゲートの定性的計測を指す。一部の実施形態において、標的は、バイオマーカーであり得る。検出としては、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ検出を挙げることができる。検出としては、１つ以上のコンジュゲートまたは標的の存在と、１つ以上のコンジュゲートまたは標的の不存在との検出を挙げることができる。検出としては、１つ以上のコンジュゲートまたは標的のレベルの定量を挙げることもできる。用語「定量する」または「定量」は、互換的に使用することができ、相対または絶対にかかわらず、物質（例えば、コンジュゲートまたは標的）の量または存在量を判定するプロセスを指し得る。任意の好適な検出方法は、本開示の一般的範囲内に収まる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、検出のためのそれに付着しているレポーターを含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、レポーターで標識されている。一部の実施形態において、標的に結合しているコンジュゲートの検出は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット上のバンド強度、フローサイトメトリー、放射性標識イメージング、細胞結合アッセイ、活性アッセイ、ＳＰＲ、免疫アッセイが挙げられる方法により、または当技術分野で公知の種々の他の方法により判定することができる。
【００７５】
一部の実施形態において、例として、コンジュゲートが標的への結合および／またはその検出のための抗体を含む実施形態では、任意の免疫アッセイを利用することができる。免疫アッセイは、例えば、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合阻害アッセイ、例えば、順方向または逆方向競合阻害アッセイ、蛍光偏光アッセイ、または競合結合アッセイであり得る。ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。標的へのコンジュゲートの特異的免疫学的結合は、コンジュゲートに付着している直接的標識を介して、または間接的標識、例えば、アルカリホスファターゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼを介して検出することができる。固定化コンジュゲートの使用を免疫アッセイに取り込むことができる。コンジュゲートは、種々の支持体、例えば、磁気またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、固体支持体材料片などの上に固定化することができる。コンジュゲートまたは複数のコンジュゲートを固体支持体上においてアレイでコートすることによりアッセイストリップを調製することができる。次いで、このストリップを試験生物学的試料中に浸漬させることができ、次いで、洗浄および検出ステップを介して迅速に処理して計測可能なシグナル、例えば、有色スポットを生成することができる。
【００７６】
６．方法
ａ．薬物分子を送達する方法
本発明は、薬物分子を対象に送達する方法を対象とする。方法は、本明細書に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含み得る。一部の実施形態において、コンジュゲートは、薬物分子単独または合成ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている薬物分子に対して改善された特性、例えば、ステルス、生体適合性、溶解度、安定性、半減期、血漿中滞留性、抗原性、免疫原性、単分散、またはそれらの組合せから選択される改善された特性を有する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、容易に合成される。一部の実施形態において、コンジュゲートは、容易に精製される。一部の実施形態において、容易な合成および／または精製は、コンジュゲートの改善された費用有効性をもたらし得る。一部の実施形態において、コンジュゲートまたはそのポリペプチドは、遺伝子コードされ、それにより正確な分子量を有するコンジュゲートの設計が容易になる。一部の実施形態において、コンジュゲートの分子量は、そのインビボ半減期を決定し、および／またはそれに影響する。コンジュゲートの分子量を容易に正確に制御できることにより、インビボでのコンジュゲートの半減期の制御が容易になり得る。これと比較して、合成ポリマー、例えば、ＰＥＧの分子量を制御することは容易であり得ない。一部の実施形態において、コンジュゲートは、合成ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている薬物分子に対して低減された抗原性を有する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、合成ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている薬物分子に対して低減された免疫原性を有する。
【００７７】
ｂ．疾患を治療する方法
本発明は、疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法を対象とする。方法は、有効量の本明細書に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含み得る。疾患は、例えば、癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、または整形外科的障害であり得る。
【００７８】
代謝疾患は、体内の異常な化学反応が正常な代謝プロセスを変動させる場合に生じ得る。代謝疾患としては、例えば、インスリン耐性、非アルコール性脂肪肝疾患、２型糖尿病、インスリン耐性疾患、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝障害、高血糖症、高インスリン血症、高脂血症、およびグルコース代謝障害を挙げることができる。
【００７９】
自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答から生じる。自己免疫疾患としては、限定されるものではないが、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、心筋炎、乾癬、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および線維筋痛を挙げることができる。
【００８０】
心血管疾患は、心臓または血管に関わる疾患のクラスである。心血管疾患としては、例えば、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、例えば、狭心症および心筋梗塞（心臓発作）、脳卒中、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋ミオパチー、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈障害、および静脈血栓症を挙げることができる。
【００８１】
整形外科的障害または筋骨格障害は、四肢、頸部、および背部を支持する体内の関節、靭帯、筋肉、神経、腱、および構造の傷害または疼痛である。整形外科的障害としては、疼痛を引き起こし、正常な活動を害する変性疾患および炎症病態を挙げることができる。整形外科的障害としては、例えば、毛根管症候群、上顆炎、および腱炎を挙げることができる。
【００８２】
癌としては、限定されるものではないが、乳癌、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳癌、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、非上皮性悪性腫瘍、気管癌、頭頸部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ癌、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、および軟部組織癌を挙げることができる。一部の実施形態において、癌は、乳癌である。
【００８３】
ｃ．疾患を診断する方法
本明細書において、疾患を診断する方法が提供される。方法は、本明細書に記載のコンジュゲートを対象に投与すること、および標的へのコンジュゲートの結合を検出して対象における標的の存在を判定することを含み得る。標的の存在または不存在は、対象における疾患を示し得る。他の実施形態において、方法は、対象からの試料を本明細書に記載のコンジュゲートと接触させること、試料中の標的のレベルを判定すること、および試料中の標的のレベルと標的の対照レベルとを比較することであって、対照レベルと異なる標的のレベルが対象における疾患を示す、比較することを含み得る。一部の実施形態において、対照未満の標的の検出レベルは、疾患を示し得る。一部の実施形態において、対照を上回る標的の検出レベルは、疾患を示し得る。一部の実施形態において、疾患は、上記で詳述される癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、および整形外科的障害から選択される。一部の実施形態において、標的は、疾患マーカーまたはバイオマーカーを含む。
【００８４】
ｄ．標的の存在を判定する方法
本明細書において、試料中の標的の存在を判定する方法が提供される。方法は、試料を本明細書に記載のコンジュゲートと、そのコンジュゲートと試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること、および複合体の存在を検出することを含み得る。複合体の存在は、試料中の標的を示し得る。標的は、例えば、タンパク質または核酸であり得る。タンパク質は、例えば、受容体または抗原であり得る。抗原は、例えば、疾患に関連し得る。一部の実施形態において、標的は、バイオマーカーを含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、検出のためのレポーターで標識されている。
【００８５】
一部の実施形態において、試料は対象から得られ、および方法は、対象の治療の効力を診断、予後予測または評価することをさらに含む。方法が対象の治療の効力を評価することを含む場合、方法は、必要に応じて対象の治療を改変して効力を改善することをさらに含み得る。
【００８６】
ｅ．治療の有効性を判定する方法
本明細書において、疾患についての治療の有効性の判定を、それを必要とする対象において行う方法が提供される。方法は、対象からの試料を本明細書に詳述されるコンジュゲートと、そのコンジュゲートと試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること、試料中の複合体のレベルを判定することであって、複合体のレベルが試料中の標的のレベルを示す、判定すること、および試料中の標的のレベルと標的の対照レベルとを比較することをさらに含み得、標的のレベルが対照レベルと異なる場合、治療は、その疾患の治療において有効または無効であると判定される。
【００８７】
時点としては、疾患の発症前、治療法の施与前、治療法の施与中の種々の時点および治療法が完了した後、またはそれらの組合せを挙げることができる。対象へのコンジュゲートの投与時、コンジュゲートは標的に結合し得、標的の存在または不存在は、種々の時点における対象における疾患の存在を示す。一部の実施形態において、標的は、疾患マーカーまたはバイオマーカーを含む。種々の時点における標的へのコンジュゲートの結合の比較は、疾患が悪化したか否か、疾患が進行したか否か、治療法が疾患を治療または予防するように機能しているか否か、またはそれらの組合せを示し得る。
【００８８】
一部の実施形態において、対照レベルは、対象が治療を開始した期間の前またはその期間中の種々の時点での対象におけるレベルに対応し、および試料は、後の時点で対象から採取される。一部の実施形態において、試料は、対象が治療を受けている期間中の時点で対象から採取し、および対照レベルは、無疾患レベルまたは対象が治療を開始した期間の前の時点でのレベルに対応する。一部の実施形態において、方法は、治療が疾患の治療において無効であると判定される場合、治療を改変するか、または異なる治療を対象に施与することをさらに含む。
【実施例】
【００８９】
実施例１
材料および方法
クローニング。ＺｉＰＰのための合成遺伝子を化学合成オリゴマー（ＩＤＴ  Ｉｎｃ．；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）からアセンブルした。オリゴマーを、プラスミド再構築回帰的方向性ライゲーション（ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）（Ｐｒｅ−ＲＤＬ）技術（ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１０，１１，９４４−９５２）を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｐＥＴ発現ベクター中にクローニングした。
【００９０】
逆転移サイクリング（ＩＴＣ）によるＺｉＰＰの発現および精製。ＺｉＰＰを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｐＥＴ発現ベクターから発現させた。水溶液中の全てのＺｉＰＰは、可逆的な逆相転移を示す。これらは、それらの転移温度（Ｔｔ）を超えて加熱された場合、可溶性タンパク質から不溶性疎水性凝集物に移行する。同一の現象（相分離）は、コスモトロピック塩を使用して誘発することもできる。ＺｉＰＰの凝集物は、そのＴｔ未満に冷却されると、または塩が溶液から除去された場合、溶液中に再可溶化し得る。ＺｉＰＰのこの熱応答特性により、タンパク質精製のための簡易な非クロマトグラフィー法が可能となる。この精製方法は、「逆転移サイクリング」（ＩＴＣ）（Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ａ．Ｃｈｉｌｋｏｔｉ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７，１１１２−１１１５；ＭａｃＥｗａｎ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１４，８８，ｅ５１５８３）と呼ばれる。
【００９１】
ＩＴＣによるＺｉＰＰの典型的な精製において、１Ｌの培養物からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を遠心分離により回収し、低温ＰＢＳ中で再懸濁させる。次いで、細胞を超音波破壊により４℃で溶解させる。次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を１５，０００×ｇで遠心分離して細胞壁および他の細胞残屑を除去する。ＺｉＰＰは、細胞溶解物の可溶性分画（上清）中に存在する可溶性タンパク質である。ポリエチレンイミンを細胞溶解物の上清に添加し、１４，０００×ｇで遠心分離してＤＮＡおよび任意の残留細菌細胞壁をペレット化する。次いで、硫酸アンモニウムおよび塩化ナトリウムを使用して相分離を誘発し、次いで１５，０００×ｇにおいて４℃で１５分間遠心分離することによりＺｉＰＰを上清から精製する。次いで、ペレットを低温ＰＢＳ中で再懸濁させ、いかなる不溶性物質も４℃における１０分間の遠心分離ステップにより除去する。これらのステップを均一になるまで繰り返し、均一性はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の単一バンドの出現により確認する。分子量（ＭＷ）もＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）機器により確認した。ＺｉＰＰの非構造化性質は、Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｖｉｖ  ２０２）により確認した。動物実験のため、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してエンドトキシンを除去する。
【００９２】
インビボ薬物動態（ＰＫ）試験。この試験では、ＺｉＰＰを非荷電ポリマー（ＶＰＧＡＧ）120および（ＶＰＧＡＧ）160と比較した。ポリマーをＮ末端中でＡｌｅｘａ  ４８８により蛍光標識し、尾静脈注射を使用してＢａｌｂ／ｃマウス中に注射した。類似性質であるがいかなる電荷も有さない生体ポリマーのＶＰＧＡＧを対照として使用して、確認される薬物動態パラメータのいかなる変化も、ＶＰＸ1Ｘ2Ｇモチーフ中で取り込まれる電荷の結果であることを示した。それぞれのマウスは、単一用量のＺｉＰＰまたは対照（１５０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）を静脈内注射または皮下注射で受容した。血液試料を注射の４０秒、１５分、０．５、２、４、８、２４、４８、および７２時間後に尾静脈から回収した（１００μＬのヘパリンを有するチューブ中に１０μＬを回収した）。Ａｌｅｘａ  ４８８の標準曲線を使用して血中の蛍光標識ポリマーの濃度を計算した。血液濃度時間経過データを、静脈内ｐｋデータについての標準的な２つのコンパートメントＰＫモデルにより分析して薬物動態パラメータを確認した。
【００９３】
パクリタキセル（ＰＴＸ）コンジュゲーション。（ＶＰＧＸＧ）16（ｘは、１：１のＶまたはＣである）モチーフ中に配置された８つの周期的に間隔の空いたシステイン残基をＺｉＰＰのＣ末端にクローニングした。薬物コンジュゲーションセグメントは、ＰＴＸの多重コピーがコンジュゲートしている８つのシステインを含有した。ＰＴＸの最初の２’ＯＨをレブリン酸により修飾した（Ｅｔｒｙｃｈ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１０，７，１０１５−１０２６）。この修飾は、ＰＴＸの細胞毒性を保持する。次いで、ＺｉＰＰ上のチオール基と反応して安定な炭素−硫黄結合を形成する末端マレイミドを有する酸不安定ヒドラジドリンカー（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）リンカー）を使用して活性化ＰＴＸを遊離チオールにコンジュゲートさせた（Ａｎｄｒｅｗ  ＭａｃＫａｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２００９，８，９９３−９９９）。
【００９４】
ＺｉＰＰ−ＰＴＸ薬物コンジュゲーションの特徴付け。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して薬物コンジュゲーションの純度を評価した。ＰＴＸの吸光度に対応する２２８ｎｍの吸光度におけるピーク下面積の積分を使用してＨＰＬＣデータを定量した。薬物とＺｉＰＰとのコンジュゲーション比を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、窒素レーザー（３３７ｎｍ）を備えるＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）機器により測定した。動的光散乱（ＤＬＳ）技術を実施してＤｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用して２５℃および２５μＭ濃度におけるＺｉＰＰ−ＰＴＸナノ粒子の流体力学的半径（Ｒｈ）を測定した。データを自己相関関数の正則化フィットにより分析し、ラレー球体（Ｒａｌｅｉｇｈ  ｓｐｈｅｒｅｓ）モデルを使用して割合強度を質量強度に変換した。次いで、正則化フィットを使用してランダムコイルについての質量パーセントにより秤量された流体力学的半径を測定した。ＰＴＸコンジュゲーション後に静的光散乱（ＳＬＳ）を使用して回転半径を計算した。形状因子（ρ）をＲｇ／Ｒｈとして計算した。
【００９５】
ＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートのインビトロ細胞毒性。インビトロ細胞毒性をＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト三重陰性乳癌細胞に対して行った。Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養プレート（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中の１００μＬの１培地当たり３×１０3個の細胞を播種した。細胞を１６〜１８時間接着させてから、サブナノモル濃度から高マイクロモル濃度までの範囲に及ぶ濃度における遊離ＰＴＸおよびＺｉＰＰ−ＰＴＸにより処理した。薬物処理の７２時間後、２０μＬの３−（４，５，−ジメチル２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ（商標）Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をそれぞれのウェルに添加し、さらに２時間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって４９０ｎｍにおけるそれぞれのウェルの吸光度を計測することにより、遊離薬物およびＺｉＰＰ−薬物コンジュゲートについての用量応答曲線を構築した。データを以下の式（Ａｎｄｒｅｗ  ＭａｃＫａｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２００９，８，９９３−９９９）にフィットさせることにより、５０％阻害濃度ＩＣ50を決定した：
【数１】
2018525989.tif 000003
（ここで、Ｖは、細胞の生存率であり、Ｃ処理は、薬物濃度であり、ｐは、用量応答曲線の傾きである）。このＩＣ50値を使用してコンジュゲートの効力を評価した。
【００９６】
実施例２
ＺｉＰＰの発現および精製
ＺｉＰＰの熱応答特性により、ＩＴＣを使用する簡易な非クロマトグラフィー精製が可能となった。銅染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の単一バンドの出現により、産物の純度が確認された（図２Ａ）。２つの異なるＺｉＰＰ、（ＶＰＫＥＧ）80（ＭＷ＝４４ｋＤａ）および（ＶＰＲＥＧ）80（ＭＷ＝４２ｋＤａ）を精製産物の代表例として図７Ａに示す。５０ｋＤａラダーをゲル中の参照ＭＷとして標識するが、ＳＤＳゲル中で使用されたラダーは、球状タンパク質からのものであり、したがって非構造化ＺｉＰＰと直接比較可能でない。純度およびＭＷを確認するため、精製産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。ＭＡＬＤＩスペクトルは、（ＶＰＫＥＧ）80について２１ｋＤａおよび４２ｋＤａ（ピーク１および２）のｍ／ｚ値ならびに（ＶＰＲＥＧ）80について２２ｋＤａおよび４４ｋＤａ（ピーク３および４）のｍ／ｚ値におけるイオンの存在を示した（図７Ｂ）。ＭＡＬＤＩスペクトルは、（ＶＰＫＤＧ）120について２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、および６０．５ｋＤａのｍ／ｚ値および（ＶＰＲＤＧ）120について２１ｋＤａおよび３２ｋＤａおよび６３．８ｋＤａのｍ／ｚ値におけるイオンの存在を示し（図２Ｂ）、それにより精製ＺｉＰＰ構築物の分子量（それぞれＭＷ＝６０．５ｋＤａ、ＭＷ＝６３．８ｋＤａ）が確認された。本発明者らは、ＣＤスペクトルを使用することによりＺｉＰＰの固有の無秩序性質も確認した。図２Ｄおよび図７ＣのＣＤスペクトルは、低波長で負の楕円率およびより高い波長でわずかに正の楕円率を示し、それはＥＬＰのような無秩序構造の典型であるランダムコイルの特徴であり、それによりポリマーの非構造化性質が確認された。動的光散乱を使用して流体力学的半径を計測し、それはＥＬＰ対照と比較して十分に水和したＺｉＰＰを示した（図２Ｃ）。ネイティブＰＡＧＥゲルは、ＺｉＰＰがアルブミンと相互作用しないことを示した（図２Ｅ）。
【００９７】
実施例３
インビボ薬物動態試験
ＺｉＰＰの薬物動態パラメータを判定するため、尾静脈注射または皮下注射を介するマウスにおける全身投与後の７２時間の期間にわたり血漿濃度を追跡した。合致するアミノ酸長を有する非荷電ポリマーを対照として使用した。実験設計を図３Ａおよび図４Ａに示す。ポリマーをＡｌｅｘａ４８８により蛍光標識し、マウスに注射した。血液試料を７２時間までの種々の時点で回収した。ＥＬＰ１２０（ＶＰＧＡＧ）120を長さ対照として使用した一方、ＥＬＰ１６０（ＶＰＧＡＧ）160を分子量対照として使用した。図３Ｂおよび図４Ｂは、注射後の時間に応じた血漿ポリマー濃度を示し、それは、双性イオン性モチーフ（具体的には、例として、それぞれＸ1およびＸ2についてＫ、Ｄ、およびＥ）の取り込みがステルス特性を付与し、それが次いで非荷電ＥＬＰと比較してポリマーの循環時間を増加させることを示した。注射後の時間に応じた血漿濃度は、ＺｉＰＰがＥＬＰよりも良好に機能することを示した。これらのポリマーは、２つのコンパートメンタルモデルに従い、したがってこのモデルを使用して半減期および曲線下面積を計算した。２つのコンパートメントモデルを血漿ポリマー濃度にフィットさせ、薬物動態パラメータの曲線下面積（ＡＵＣ）（図３Ｃおよび図４Ｃ）および排出半減期（図３Ｄ）を生じさせた。ＡＵＣを実験の時間経過にわたる全ポリマー曝露の尺度として計算した。ＡＵＣは、ＶＰＫＥＧおよびＶＰＫＤＧが非荷電ＥＬＰ長さ対照および分子量対照よりも有意に良好に機能することを示した。データは、図３Ｃについて平均±ＳＥ、ｎ＝５を表し、図４Ｃについて平均±ＳＥ、ｎ＝３〜４を表す。ＺｉＰＰの最終半減期は、ＶＰＧＡＧ構築物のものと比較して６時間だけ増加した（図３Ｄ）。さらに、最も記述的な薬物動態パラメータの、ＺｉＰＰについての血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ）により計測されるポリマーの全累積血液曝露は、同一鎖長の非荷電ポリペプチドＶＰＧＡＧのものよりも約３倍高かった（図３Ｃ）。結果は、ペプチドポリマー中への双性イオン性モチーフ、より具体的には荷電残基の取り込みが、ポリマーの薬物動態の改善において重要な役割を担うことを示した。
【００９８】
実施例４
パクリタキセル−ＺｉＰＰコンジュゲートの特徴付け
パクリタキセル（ＰＴＸ）を、（ＶＰＧＸＧ）16（ここで、Ｘが１：１の比のＶまたはＣである）にＶＰＫＥＧペンタペプチド単位の１２０個のリピートのＣ末端におけるトレーラーに化学的にコンジュゲートさせた。パクリタキセルを、ｐＨ感受性リンカーを介して８つのＣ末端残基に化学的にコンジュゲートさせた。この設計を図５Ａに示す。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用してポリマー薬物コンジュゲートを精製し、精製産物をＨＰＬＣ上でランして未反応遊離薬物の不存在を確認した。ＨＰＬＣクロマトグラムにより、無視可能な量の遊離薬物でのポリマー−薬物コンジュゲートの純度が確認された。精製ＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを使用して親ＺｉＰＰポリマー鎖とＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートとの間で計算されたＭＷの差異により確認されるとおり、１ポリマー鎖当たり３．２〜４つの薬物を有した（図５Ｂ）。さらに、動的光散乱計測は、ＰＴＸコンジュゲーション後、ＺｉＰＰが実際に５８ｎｍの流体力学的半径（Ｒｈ）のナノ粒子に自然に自己集合することを示した。これらは、５８ｎｍ半径のミセルに自己集合し、１ミセル当たりの凝集数は２６であった。Ｒｇ／Ｒｈとして計算された形状因子（ρ）は０．８２であり、それは球状ミセルの形成を示す。
【００９９】
実施例５
ＺｉＰＰ−ＰＴＸコンジュゲートのインビトロ抗腫瘍効力
時間に応じた一連の濃度にわたる細胞生存率を検査することにより、ＺｉＰＰ−ＰＴＸのインビトロ細胞毒性を計測した。ヒト三重陰性乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をモデルとして使用した。薬物処理の７２時間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖は、対照（薬物なし）と比較して阻害された（図５Ｃ）。さらに、阻害は、遊離薬物のものと同等であった。遊離薬物についてのＩＣ50値は約２ｎＭであった一方、ＺｉＰＰ−ＰＴＸのものは１２．４ｎＭ（薬物に関する濃度）であった。ＺｉＰＰ−ＰＴＸについてのＩＣ50値は、遊離薬物のものよりも６倍高かったが、そのような結果は、遊離薬物が薬物トランスポーターを介して細胞内外に容易に拡散し得る一方、薬物−ポリマーコンジュゲートからのＰＴＸがエンドソーム内側に存在する場合にのみ放出されるインビトロ環境で予測される。このプロセスは緩慢である。なぜなら、ナノ粒子がエンドサイトーシスを介して取り込まれ、ｐＨが低い後期エンドソームにナノ粒子が移動した後に薬物が放出されるためである。この低いｐＨは、ＺｉＰＰからのＰＴＸの放出を誘発する。これらの結果は有望である。なぜなら、これらは、ＰＴＸ−ポリマーコンジュゲートがインビボプラットフォームに順応するほど十分に安定であり、強力であることを示すためである。ＩＣ50値は、細胞生存率を５０％だけ低減させる薬物の濃度を表した。
【０１００】
実施例６
ＺｉＰＰ−Ｔｎ３コンジュゲート
多価足場タンパク質（Ｔｎ３）は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体２（ＴＲＡＩＬ２）の超アゴニストであり、ＺｉＰＰに付着させるためのタンパク質として選別した。融合タンパク質の設計の概要を図６Ａに示す。ＴＲＡＩＬ２の超アゴニストを選択した。なぜなら、ＴＲＡＩＬＲ２の活性化は種々のヒト癌でアポトーシスを誘導し得、したがって癌治療薬についての潜在性を有するためである。（Ｔｎ３）6は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅにより高親和性でＴＲＡＩＬ２に結合するように遺伝子操作されたモノマーＴｎ３単位の６つのタンデムリピートを表す。種々の長さのＺｉＰＰを有する（Ｔｎ３）6を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換え発現させた。親和性精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図６Ｂに示す。Ｃｏｌｏ２０５（結腸癌細胞）に対する細胞毒性アッセイは、図６Ｃに示されるとおり、融合タンパク質が高度に細胞毒性であり、それらの効力は遊離タンパク質（付着ＺＩＰＰを有さない（Ｔｎ３）6）と同等であることを示した。ＩＣ50値は、細胞生存率を５０％だけ低減させる薬物の濃度を表した。
【０１０１】
具体的態様の上記の説明は、当技術分野の技能の範囲内の知識を適用することにより、そのような具体的態様を過度の実験なしで本開示の一般的概念から逸脱することなく他者が容易に改変および／または種々の用途に適合させ得る本発明の一般的性質を完全に明らかにする。したがって、このような適合形態および改変形態は、本明細書に提示される教示および指針に基づき、開示される態様の均等物の意味および範囲内にあるものとする。本明細書における語句または用語は、説明目的のためのものであり、限定を目的とするものではないことを理解すべきであり、その結果、本明細書の用語または語句は、その教示および指針に照らして当業者により解釈されるべきである。
【０１０２】
本開示の広さおよび範囲は、上記の例示的態様のいずれによっても限定されるべきでないが、以下の特許請求の範囲およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。
【０１０３】
本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別的に示されるのと同程度に全ての目的のために全体として参照により組み込まれる。
【０１０４】
網羅性の理由で、本発明の種々の態様を以下の番号付与された条項に記載する。
【０１０５】
条項１。（ａ）１つ以上の荷電モチーフを含むポリペプチドであって、それぞれの荷電モチーフが、独立して、配列番号１（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方である）からなるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、および（ｂ）前記ポリペプチドに付着している１つ以上の薬物分子を含むコンジュゲート。
【０１０６】
条項２。前記ポリペプチドが複数の荷電モチーフを含む、条項１に記載のコンジュゲート。
【０１０７】
条項３。前記複数の荷電モチーフがタンデムリピート型である、条項２に記載のコンジュゲート。
【０１０８】
条項４。前記ポリペプチドが１つ以上の非荷電モチーフをさらに含み、それぞれの非荷電モチーフが、独立して、配列番号３（ＶＰＧＸＧ）（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である）からなるアミノ酸配列を有する、条項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１０９】
条項５。前記ポリペプチドが複数の非荷電モチーフを含む、項４に記載のコンジュゲート。
【０１１０】
条項６。前記複数の非荷電モチーフがタンデムリピート型である、項５に記載のコンジュゲート。
【０１１１】
条項７。１つ以上の非荷電モチーフが前記ポリペプチドの少なくとも２つの隣接荷電モチーフ間に位置する、条項４〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１１２】
条項８。前記ポリペプチドが配列番号２（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、条項１に記載のコンジュゲート。
【０１１３】
条項９。前記ポリペプチドが配列番号４（ＶＰＧＸＧ）n（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、条項４に記載のコンジュゲート。
【０１１４】
条項１０。前記ポリペプチドが配列番号５（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ＶＰＧＸＧ）m（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、条項４に記載のコンジュゲート。
【０１１５】
条項１１。前記ポリペプチドが配列番号６（ＶＰＧＸＧ）m（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、条項４に記載のコンジュゲート。
【０１１６】
条項１２。前記ポリペプチドが配列番号７｛（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ＶＰＧＸＧ）｝b（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｂが１以上の整数である）のアミノ酸配列を含む、条項４に記載のコンジュゲート。
【０１１７】
条項１３。Ｘ1が負荷電アミノ酸であり、Ｘ2が正荷電アミノ酸である、条項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１１８】
条項１４。Ｘ1が正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負荷電アミノ酸である、条項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１１９】
条項１５。前記負荷電アミノ酸が独立してグルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される、条項１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２０】
条項１６。前記正荷電アミノ酸が独立してリジンおよびアルギニンから選択される、条項１〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２１】
条項１７。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、条項４〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２２】
条項１８。Ｘがアルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンから選択される、条項１７に記載のコンジュゲート。
【０１２３】
条項１９。Ｘがグリシンおよびバリンから選択される、条項１８に記載のコンジュゲート。
【０１２４】
条項２０。前記ポリペプチドがリンカーをさらに含む、条項１〜１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２５】
条項２１。前記リンカーが１つ以上のシステインを含む、条項２０に記載のコンジュゲート。
【０１２６】
条項２２。前記リンカーが、配列番号（ＧＧＣ）、配列番号（（ＧＧＣ）8）、配列番号（（Ｇ4Ｓ）3）、および配列番号（（ＶＰＧＸＧ）16（ここで、Ｘが、１：１の比で存在するバリンまたはシステインである））から選択されるアミノ酸配列を含む、条項２０〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２７】
条項２３。前記リンカーが前記ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端の両方に位置する、条項２０〜２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２８】
条項２４。前記１つ以上の薬物分子が前記リンカーを介して前記ポリペプチドに付着している、条項２０〜２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１２９】
条項２５。前記薬物分子が前記リンカー中のチオール反応性基を介して前記ポリペプチドに付着している、条項２０〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３０】
条項２６。前記１つ以上の薬物分子が小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、およびそれらの組合せから選択される、条項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３１】
条項２７。前記薬物分子が小分子を含む、条項２６に記載のコンジュゲート。
【０１３２】
条項２８。前記薬物分子がタンパク質を含む、条項２６に記載のコンジュゲート。
【０１３３】
条項２９。前記薬物分子が癌治療薬を含む、条項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３４】
条項３０。前記薬物分子が抗体を含む、条項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３５】
条項３１。前記薬物分子がパクリタキセルを含む、条項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３６】
条項３２。前記薬物分子がＴｎ３（ＴＲＡＩＬ超アゴニスト）を含む、条項１〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３７】
条項３３。対象への投与のために調製される、条項１〜３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３８】
条項３４。前記コンジュゲートの前記ポリペプチドが組換え発現される、条項１〜３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０１３９】
条項３５。組換え発現される、条項２８に記載のコンジュゲート。
【０１４０】
条項３６。条項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【０１４１】
条項３７。条項１〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１４２】
条項３８。条項２８に記載のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。
【０１４３】
条項３９。条項３７または３８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１４４】
条項４０。薬物分子を対象に送達する方法であって、条項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
【０１４５】
条項４１。疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、条項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
【０１４６】
条項４２。試料中の標的の存在を判定する方法であって、前記試料を条項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、前記薬物分子と前記試料中の前記標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること；および前記複合体の存在を検出することであって、前記複合体の存在が前記試料中の前記標的を示す、検出することを含む方法。
【０１４７】
条項４３。前記試料が対象から得られ、および方法が、疾患を診断し、前記対象の治療の効力を予後予測するかまたは評価することをさらに含む、条項４２に記載の方法。
【０１４８】
条項４４。前記対象の治療の効力を評価することをさらに含む場合、必要に応じて前記対象の前記治療を改変して効力を改善することをさらに含む、条項４３に記載の方法。
【０１４９】
条項４５。対象における疾患を診断する方法であって、前記対象からの試料を条項１〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、前記薬物分子と前記試料中の標的との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で接触させること；前記試料中の前記標的のレベルを判定することであって、前記複合体のレベルが前記試料中の前記標的のレベルを示す、判定すること；および前記試料中の前記標的のレベルと前記標的の対照レベルとを比較することであって、前記対照レベルと異なる前記標的のレベルが前記対象における疾患を示す、比較することを含む方法。
【０１５０】
条項４６。前記対照レベルが、前記対象が治療を開始した期間の前またはその期間中の時点での前記対象におけるレベルに対応し、前記試料が後の時点で前記対象から採取される、条項４５に記載の方法。
【０１５１】
条項４７。前記試料が、前記対象が治療を受けている期間中の時点で前記対象から採取され、前記対照レベルが、無疾患レベルまたは前記対象が治療を開始した期間の前の時点でのレベルに対応する、条項４５に記載の方法。
【０１５２】
条項４８。前記治療が前記疾患の治療において無効であると判定される場合、前記治療を改変するか、または異なる治療を前記対象に施与することをさらに含む、条項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【０１５３】
条項４９。前記コンジュゲートがレポーターで標識されている、条項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【０１５４】
条項５０。前記コンジュゲートが前記対象に静脈内、動脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される、条項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【０１５５】
条項５１。前記コンジュゲートが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている前記薬物分子に対して低減された抗原性を有する、条項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【０１５６】
条項５２。前記コンジュゲートが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされている前記薬物分子に対して低減された免疫原性を有する、条項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【０１５７】
条項５３。前記疾患が癌、代謝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、および整形外科的障害から選択される、条項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【０１５８】
条項５４。前記疾患が癌を含む、条項５３に記載の方法。
【０１５９】
条項５５。前記癌が乳癌、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳癌、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、非上皮性悪性腫瘍、気管癌、頭頸部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ癌、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、および軟部組織癌から選択される、条項５４に記載の方法。
【０１６０】
条項５６。前記癌が乳癌を含む、条項５５に記載の方法。
【０１６１】
配列
配列番号１
ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方である）。
【０１６２】
配列番号２
（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、かつｎが１以上の整数である）。
【０１６３】
配列番号３
ＶＰＧＸＧ（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である）。
【０１６４】
配列番号４
（ＶＰＧＸＧ）n（ここで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎが１以上の整数である）。
【０１６５】
配列番号５
（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ＶＰＧＸＧ）m（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）。
【０１６６】
配列番号６
（ＶＰＧＸＧ）m（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）n（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｎおよびｍが独立して１以上の整数である）。
【０１６７】
配列番号７
｛（ＶＰＸ1Ｘ2Ｇ）（ＶＰＧＸＧ）｝b（ここで、Ｘ1が負または正荷電アミノ酸であり、Ｘ2が負または正荷電アミノ酸の他方であり、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり、かつｂが１以上の整数である）。
【０１６８】
配列番号８
ＧＧＣ。
【０１６９】
配列番号９
（ＧＧＣ）8。
【０１７０】
配列番号１０
（Ｇ4Ｓ）3。
【０１７１】
配列番号１１
（ＶＰＧＸＧ）16（ここで、Ｘが、１：１の比で存在するバリンまたはシステインである）。
【０１７２】
配列番号１２
ポリペプチドの例
Ｖ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｋ  Ｄ  Ｇ。
【０１７３】
配列番号１３
ポリペプチドの例をコードするポリヌクレオチド
ＧＴＣ  ＣＣＧ  ａａａ  ｇａｃ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ａａｇ  ｇａｃ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ａａａ  ｇａｔ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ａａｇ  ｇａｃ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ａａａ  ｇａｔ  ＧＧＧ。
【図１Ａ−Ｃ】
2018525989.tif 000004
【図１Ｄ】
2018525989.tif 000005
【図２Ａ】
2018525989.tif 000006
【図２Ｂ】
2018525989.tif 000007
【図２Ｃ】
2018525989.tif 000008
【図２Ｄ】
2018525989.tif 000009
【図２Ｅ】
2018525989.tif 000010
【図３Ａ】
2018525989.tif 000011
【図３Ｂ】
2018525989.tif 000012
【図３Ｃ】
2018525989.tif 000013
【図３Ｄ】
2018525989.tif 000014
【図４Ａ】
2018525989.tif 000015
【図４Ｂ】
2018525989.tif 000016
【図４Ｃ】
2018525989.tif 000017
【図５Ａ】
2018525989.tif 000018
【図５Ｂ】
2018525989.tif 000019
【図５Ｃ】
2018525989.tif 000020
【図６Ａ】
2018525989.tif 000021
【図６Ｂ】
2018525989.tif 000022
【図６Ｃ】
2018525989.tif 000023
【図７Ａ−Ｂ】
2018525989.tif 000024
【図７Ｃ】
2018525989.tif 000025
【配列表】
2018525989000001.app
【国際調査報告】
2018525989.tif 000026
2018525989.tif 000027