(57)【要約】本発明は、少なくとも１のＸＴＥＮなどの異種部分を含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質を提供する。本発明は、上記ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法及び使用方法を更に開示する。  本発明は、ＦＩＸポリペプチドと、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、長さが４２のアミノ酸より長く且つ１４４のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含むＸＴＥＮとを含むＦＩＸ融合タンパク質も提供する。本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、それを必要とする患者における凝固疾患もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法を提供することを含むいくつかの用途を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で前記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮとを含み、凝血促進活性を示すＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項２】
前記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する、請求項１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＸＴＥＮが、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項４】
第２のＸＴＥＮを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で前記ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮが前記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された、請求項４に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項６】
Ｆｃドメインを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項７】
第２のＦｃドメインを含む、請求項６に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項８】
２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖が前記Ｆｃドメインに融合された前記ＦＩＸポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチド鎖が第２のＦｃドメインを含み、前記第１のＦｃドメインと前記第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合している、請求項７に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＦＩＸポリペプチドがＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載の発現ベクター、または請求項１２に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜９のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載の発現ベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、または請求項１３に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする患者における凝固疾患もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法。
【請求項１５】
第１の連鎖及び第２の連鎖を含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質であって、
ａ．前記第１の連鎖が、
ｉ．ＦＩＸポリペプチドと、
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で前記ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１のＸＴＥＮと、
ｉｉｉ．前記少なくとも１のＸＴＥＮの前記ＦＩＸポリペプチドに融合された第１のＦｃドメインと
を含み、
ｂ．前記第２の連鎖が第２のＦｃドメインを含み、
前記第１のＦｃドメインと前記第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合しており、凝血促進活性を示す前記ＦＩＸ融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出した配列表の参照
本出願と共に提出したＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２１５９＿４６６ＰＣ０３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ:６８８，１５４バイト；及び作成日：２０１６年８月２日）中で電子的に提出した配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ｂ（クリスマス病としても知られる）は、世界で最も多く見られる遺伝性出血障害の１つである。血友病は、インビボ及びインビトロでの血液凝固活性の低下を引き起こし、罹患した個体の生涯にわたって広範な医学的監視を要する。介入を行わない場合、罹患した個体は関節内における突発性出血を起こすこととなり、該出血によって重度の痛み及び衰弱性の不可動状態を生じ；筋肉中への出血は筋組織における血液貯留を引き起こし；咽喉及び頸部の突発性出血は、直ちに治療しなければ窒息を引き起こす場合があり；腎出血を引き起こし；及び手術、軽度の偶発的な受傷、または抜歯の後の重篤な出血もよく見られる。
【０００３】
正常なインビボでの血液凝固は、少なくとも、セリンプロテアーゼ第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子及び第ＸＩ因子（可溶性血漿タンパク質）；膜貫通タンパク質組織因子及び血漿タンパク質第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子を含む補助因子；フィブリノゲン、トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子、リン脂質（活性化血小板を含む）、及びカルシウムを必要とする。一部のインビトロ凝固試験に関しては、カリクレイン、高分子量キニノゲン、及び第ＸＩＩ因子を含む更なるタンパク質が必要であり、これらは病理学的条件下においてインビボで役割を果たし得る。
【０００４】
血友病においては、血液凝固が特定の血漿凝固因子の欠損によって妨げられる。血友病Ｂは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質の合成の低下もしくは該ＦＩＸタンパク質の欠損のいずれかに起因し得るＦＩＸの不足または活性が低い欠陥のあるＦＩＸ分子よって起こる。血友病の治療は、ＦＩＸを高度に富化させた外因性因子濃縮物によって、欠損した凝固因子を置換することによって行われる。しかしながら、かかる濃縮物を血液からつくり出すことは、以下に記載するように技術的困難を伴う。
【０００５】
血漿からのＦＩＸの精製（血漿由来ＦＩＸ；ｐｄＦＩＸ）では、ほぼ、完全にγ−カルボキシル化されたＦＩＸのみが得られる。しかしながら、ＦＩＸは血漿中に低濃度（５μｇ／ｍＬ）でしか存在しないために、かかる血漿からのＦＩＸの精製は非常に困難である。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：４５１  ４５９（１９７５）。更に、血液からの精製はＨＩＶ及びＨＣＶなどの感染性因子の除去または不活性化を要する。加えて、ｐｄＦＩＸは半減期が短く、そのために頻繁に投与する必要がある。組換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）も利用可能であるが、ｐｄＦＩＸと同様の短い半減期及び頻繁な投与の必要性（例えば、予防のために週に２〜３回）という悩みがある。
死亡率の低下、関節損傷の予防及び生活の質の改善は、血漿由来及び組換えＦＩＸの開発による重要な成果であった。長期的に出血から保護することは、血友病Ｂ患者の治療におけるもう１つの重要な進歩となる。したがって、有効な活性を維持しながら半減期がより長い、改良された組換えＦＩＸに対する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：４５１  ４５９（１９７５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
少なくとも１のＸＴＥＮを含む第ＩＸ因子融合タンパク質が開示される。一態様において、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮとを含み、凝血促進活性を示すＦＩＸ融合タンパク質を提供する。
【０００８】
本発明は、ＦＩＸポリペプチドと、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、長さが４２のアミノ酸より長く且つ１４４のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含むＸＴＥＮとを含むＦＩＸ融合タンパク質も提供する。
【０００９】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、それを必要とする患者における凝固疾患もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法を提供することを含むいくつかの用途を有する。一実施形態において、上記方法は、有効量の本明細書に記載のＦＩＸ融合タンパク質を（例えば、皮下投与によって）投与するステップを含む。
【００１０】
本発明はまた、ＦＩＸポリペプチドの半減期の延長方法であって、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内にＸＴＥＮを挿入し、それによってＦＩＸ融合タンパク質を構築することを含み、上記ＦＩＸタンパク質が凝血促進活性を示す、上記方法も提供する。
【００１１】
更なる発明の実施形態は以下の説明及び図面から明らかになろう。
【００１２】
参照による援用
本明細書に開示される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的且つ個別に参照により援用されることが示されているのと同様の程度に、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】種々の挿入部位で（例えば、配列番号２のアミノ酸に対応する、アミノ酸５２、アミノ酸５９、アミノ酸６６、アミノ酸８０、アミノ酸８５、アミノ酸８９、アミノ酸１０３、アミノ酸１０５、アミノ酸１１３、アミノ酸１２９、アミノ酸１４２、アミノ酸１４９、アミノ酸１６２、アミノ酸１６６、アミノ酸１７４、アミノ酸１８８、アミノ酸２０２、アミノ酸２２４、アミノ酸２２６、アミノ酸２２８、アミノ酸２３０、アミノ酸２４０、アミノ酸２５７、アミノ酸２６５、アミノ酸２７７、アミノ酸２８３、アミノ酸２９２、アミノ酸３１６、アミノ酸３４１、アミノ酸３５４、アミノ酸３９２、アミノ酸４０３、及びアミノ酸４１３で）挿入された、または上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された、４２のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ４２）を含むＦＩＸ融合タンパク質の活性を示すグラフである。Ｃ末端融合ＸＴＥＮ配列は、ＦＩＸと上記Ｃ末端融合物との間にトロンビン開裂性部位を含む。Ｙ軸は、発色アッセイによる、馴化培地中の、ベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性のパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は特定の挿入部位を、（配列番号２に対応する）アミノ酸番号及び１文字のアミノ酸の略称として示す。ＦＩＸの対応するドメイン（例えば、ＧＬＡ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、リンカー、ＡＰ、及び触媒ドメイン）、リンカー領域、ならびにＣ末端がＸ軸の下に示される。
【図２】種々の挿入部位で（例えば、配列番号２のアミノ酸に対応するアミノ酸１０３、アミノ酸１０５、アミノ酸１４２、アミノ酸１４９、アミノ酸１６２、アミノ酸１６６、アミノ酸１７４、アミノ酸２２４、アミノ酸４１３で）挿入された、または上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端（アミノ酸４１５）に融合された、４２のアミノ酸の（ＡＥ４２）、７２のアミノ酸の（ＡＥ７２）、１４４のアミノ酸の（ＡＥ１４４）、２８８のアミノ酸の（ＡＥ２８８）、及び８６４のアミノ酸の（ＡＥ８６４）ＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質の活性を示すグラフである。Ｙ軸は、発色アッセイによる、馴化培地中の、ベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性のパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は、各挿入部位及び特定の挿入部位のドメイン（例えば、ＥＧＦ２、ＡＰ、及び触媒ドメイン）または領域（例えば、リンカー及びＣ末端）を、（配列番号２に対応する）アミノ酸番号として示す。矢印は、更なる実験のために選択された挿入部位を示す（図３の３Ａ〜３Ｂを参照のこと）。
【図３】３ＡはＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体の上記領域及びドメインの概略図である。特定のアミノ酸残基（例えば、Ｎ１０５、Ｄ１６６、及びＥ２２４）及びＣ末端が、潜在的な異種部分、例えばＸＴＥＮの挿入部位として強調されている。３Ｂは３種の異なる角度からのブタＦＩＸ（ＰＤＢ：１ＰＦＸ）の３次元構造の図解を示す図である。挿入部位Ｎ１０５、Ｄ１６６、及びＥ２２４、Ｃ末端、及びＲ３３８Ｌ突然変異体の位置（例えば、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体における）を表示する。
【図４】１もしくは２のＸＴＥＮ（例えば、４２、７２、１４４、及び２８８のアミノ酸のＸＴＥＮ）、または１のＸＴＥＮ及び１のＦｃドメイン、またはＦＩＸＦｃを含むＦＩＸ融合タンパク質の相対的な活性をまとめた図である。Ｙ軸は、発色アッセイによる、馴化培地中の、ベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性のパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は構築物番号を示し、Ｘ軸の下の表は試験した各構築物のＸＴＥＮ及びＦｃの組成を示す。ＥＧＦ２（１０５）、ＡＰ（１６６）、６０ループ（２２４）、及びＣ末端ＸＴＥＮまたはＦｃは、ＸＴＥＮまたはＦｃが挿入または融合された位置を示す。Ｘ軸の下の表の各ボックス中の数字（ＸＴＥＮの大きさを示す、例えば４２、７２、１４４、及び２８８）ならびに「Ｆｃ」は、いずれの部分が当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されているかまたは該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されているかを示す。
【図５】５Ａは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス静脈内投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、種々の長さのトロンビン開裂性Ｃ末端ＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ＦＩＸ−ＣＴ．２８８（２８８のアミノ酸のＸＴＥＮ、例えばＡＥ２８８）及びＦＩＸ−ＣＴ．８６４（８６４のアミノ酸のＸＴＥＮ、例えばＡＥ８６４））の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。５Ｂは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス静脈内投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインに挿入された種々の長さのＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４、ＦＩＸ−ＡＰ．７２、及びＦＩＸ−ＡＰ．４２）の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。５Ｃは、５Ａ及び５Ｂに示した単回静脈内ボーラス投与したＦＩＸ融合タンパク質の、計算した薬物動態学的パラメータの編集したグラフである。Ｙ軸には、表示した分子のそれぞれの血漿活性回収率の百分位数を示す。Ｘ軸は計算した平均滞留時間（ＭＲＴ、単位：時間）を示し、円の面積は用量当たりの計算した相対的な曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表わす。
【図６】６Ａは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス静脈内投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインに挿入された種々の長さのＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びＦＩＸＦｃ−ＡＰ．４２）またはＥＧＦ２ドメインに挿入された上記ＸＴＥＮ融合物を有する上記融合タンパク質（例えばＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ．４２）の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。６Ｂは、６Ａに示した単回静脈内ボーラス投与したＦＩＸ融合タンパク質の計算した薬物動態学的パラメータの編集したグラフである。Ｙ軸には、表示した分子のそれぞれの血漿活性回収率の百分位数を示す。Ｘ軸は計算した平均滞留時間（ＭＲＴ、単位：時間）を示す。円の面積は用量当たりの計算した相対的な曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表わす。
【図７】７Ａは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス皮下投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された２８８のアミノ酸のトロンビン開裂性ＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク（ｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８）、ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内に挿入された７２のアミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）、及びＦＩＸポリペプチドのＥＧＦ２ドメイン内に挿入された４２のアミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（ｒＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ２．４２）の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。７Ｂは、７Ａに示した単回皮下ボーラス投与したＦＩＸ融合タンパク質の計算した薬物動態学的パラメータの編集したグラフである。Ｙ軸には、表示した分子のそれぞれの生物学的利用能の百分位数を示す。Ｘ軸は計算した平均滞留時間（ＭＲＴ、単位：時間）を示す。円の面積は用量当たりの計算した相対的な曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表わす。
【図８】８Ａは、回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）によって測定した、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃ及びＦＩＸのＡＰドメイン内に挿入された７２のアミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）の凝固時間（単位：秒）のグラフである。８Ｂは、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）のアルファ角（単位：度）のグラフである。８Ｃは、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）の最大血餅硬度（ＭＣＦ）（単位：ｍｍ）のグラフである。
【図９】尾切断出血モデルにおいてｒＦＩＸＦｃと比較したｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の急性の有効性を示すグラフである。示した結果は、表示した治療薬及び投与に対する、投与５分後における、３０分間にわたる各個体の及び中央値での失血量（μｌ）である。アスタリスクは、ビヒクル対他の全ての治療薬に関して有意なｐ値であることを示している。データは、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を投与したマウスにおいて、ｒＦＩＸＦｃと比較して類似のまたは向上した有効性を示している。
【図１０】尾静脈の切断後の時間（単位：時間）（Ｘ軸）に対してプロットした、生存するＨｅｍＢマウスのパーセンテージ（Ｙ軸）を示すグラフである。全てのマウスに、尾静脈の切断の７２時間前に、ＦＩＸＦｃ（点線）を静脈内でまたはＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を皮下で、表示したＩＵ／ｋｇ（ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２：１００ＩＵ／ｋｇ（黒丸）、５０ＩＵ／ｋｇ（灰色の三角）、及び１５ＩＵ／ｋｇ（灰色の逆三角）；ｒＦＩＸＦｃ：１００ＩＵ／ｋｇ（白丸）、５０ＩＵ／ｋｇ（白三角）、及び１５ＩＵ／ｋｇ（白の逆三角）；ビヒクル（閉じた灰色の丸）で事前投与した。ｒＦＩＸＦｃまたはＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のいずれかを投与したマウスの生存率のプロットは、ビヒクル処置したマウスと比較した場合、全て有意に異なる（ｐ＜０．０００１、ログランク（マンテル・コックス）検定。
【図１１】１１Ａは、時間に対してプロットした、静脈内注射（破線）または皮下注射（実線）のいずれかによって単回ボーラス（２００ＩＵ／ｋｇ）のｒＦＩＸ（灰色）またはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２融合タンパク質（黒）を投与した血友病Ｂマウスの、１段階血漿アッセイによって測定したＦＸ活性の血漿レベルを示すグラフである。１１Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．２．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｅｒｔａｒａ）を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いて決定された薬物動態学的パラメータを示す図である。
【図１２】１２ＡはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２一本鎖Ｆｃのドメイン構造を図解する模式図である。１２ＢはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２二本鎖Ｆｃのドメイン構造を示す模式図である。「ＦＩＸ  ＨＣ」とはＦＩＸの重鎖を指し、「ＦＩＸ  ＬＣ」とはＦＩＸの軽鎖を指し、これはＦＩＸのＥＧＦ及びＧＬＡドメインを含み、ＡＰとはＦＩＸの活性化ペプチドを指す。
【図１３】実施例で用いられるＦＩＸ−ＸＴＥＮ構築物を、一致する配列番号、説明及びプラスミドコードでまとめた表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、ＦＩＸポリペプチド及び少なくとも１の異種部分を含むＦＩＸ融合タンパク質、ならびにその製造及び使用方法を提供する。ある特定の態様において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１の異種部分を含み、本ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。特定の態様において、上記異種部分はＸＴＥＮである。
【００１５】
Ｉ．定義
本開示を通じて、用語“ａ”  ｅｎｔｉｔｙ（実体）または“ａｎ”  ｅｎｔｉｔｙとは１または複数の当該実体を指し、例えば、「ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ポリヌクレオチド）」は１または複数のポリヌクレオチドを表すと理解されるべきものである。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１または複数の」、及び「少なくとも１の」という用語は、本明細書では同義で用いることができる。
【００１６】
更に、本明細書では、「及び／または」とは、２の指定された特徴または構成要素のそれぞれの、それらの他方を伴うまたは伴わない明示と解釈されるべきものである。したがって、本明細書における「Ａ及び／またはＢ」などの句において用いられる「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」と、「ＡまたはＢ」と、「Ａ」（単独）と、「Ｂ」（単独）とを含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」などの句において用いられる「及び／または」という用語は、以下の態様、すなわち、Ａ、Ｂ及びＣと；Ａ、ＢまたはＣと；ＡまたはＣと；ＡまたはＢと；ＢまたはＣと；Ａ及びＣと；Ａ及びＢと；Ｂ及びＣと；Ａ（単独）と；Ｂ（単独）と；Ｃ（単独）とのそれぞれを包含することを意図する。
【００１７】
本明細書において、態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語によって何処に記載されていても、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／または「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」という言葉で記述される他の類似の態様も提供されるということが理解されるべきものである。
【００１８】
別段の定義がなされない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示において用いられる多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【００１９】
単位、接頭辞及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）に承認された形態によって表示される。数値範囲は当該範囲を画定する数字を含む。別段の表示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に書かれる。本明細書に記載される見出しは本開示の種々の態様を限定するものではなく、該態様は本明細書全体を参照することによって理解することができる。したがって、このすぐ後に定義される用語は、明細書全体を参照することにより完全に定義される。
【００２０】
本明細書では、「約」という用語は、概略、おおまかに、おおよそ、またはほぼを意味するために用いられる。「約」という用語が数値範囲と共に用いられる場合には、記載された数値の上下に境界を拡張することによって当該範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、数値を記載された値の上下に、例えば１０パーセントの上下（高低）の変動により変更することができる。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、在来型のホスホジエステル結合または非在来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に存在するようなアミド結合）を含む。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１または複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その本来の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれるＦＩＸポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞中に維持されるかまたは溶液中の他のポリヌクレオチドから（部分的にまたは実質的に）精製された組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成したかかる分子を更に包含する。更に、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルなどの調節エレメントを含んでいてもよい。
【００２２】
本明細書では、「コード領域」または「コード配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終結コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は一般的にはアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると見なしてもよいが、但し、いずれの隣接する配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロンなどはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、一般的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンと、得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終結コドンとによって決定される。本発明の２以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、または別個の複数のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別個の（異なる）複数のベクター上に存在してもよい。その結果、単一のベクターが単一のコード領域のみを含有していてもよく、または２以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば以下に説明するように、単一のベクターが結合ドメイン−Ａ及び結合ドメイン−Ｂを別々にコードしてもよいこととなる。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合しているかまたは融合していないかのいずれかの異種コード領域をコードしていてもよい。異種コード領域としては、限定はされないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊化したエレメントまたはモチーフが挙げられる。
【００２３】
哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は分泌シグナルペプチドと会合しており、該分泌シグナルペプチドは、粗面小胞体を通る成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、シグナルペプチドは一般に当該ポリペプチドのＮ末端に融合しており、完全なすなわち「全長」ポリペプチドから切断される、分泌された、すなわち「成熟した」形態のポリペプチドを生成することを認識している。ある特定の実施形態においては、天然のシグナルペプチド、または作動可能に会合している当該ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持している、その配列の機能性誘導体。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）もしくはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはそれらの機能を有する誘導体を用いることもできる。
【００２４】
「下流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、下流のヌクレオチド配列は転写の開始点に続く配列に関係する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。「下流」は、基準となるヌクレオチド配列のＣ末端側に位置するペプチド配列を指す場合もある。
【００２５】
「上流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、上流のヌクレオチド配列はコード領域または転写の開始点の５’側に位置する配列に関係する。例えば、殆どのプロモーターは転写の開始部位の上流に位置する。「上流」は、基準となるヌクレオチド配列のＮ末端側に位置するペプチド配列を指す場合もある。
【００２６】
本明細書では、「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’側非コード配列）、内部、または下流（３’側非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節領域としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を挙げることができる。コード領域が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常、当該コード配列に対して３’側に位置することとなる。
【００２７】
例えばポリペプチドである遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及び／または１もしくは複数のコード領域に作動可能に会合している他の転写または翻訳調節エレメントを含んでいてもよい。作動可能な会合において、例えばポリペプチドである遺伝子産物のためのコード領域は、上記遺伝子産物の発現を１または複数の調節領域の影響下または制御下に置くような形態で、上記調節領域（複数可）に会合している。例えば、プロモーターの機能を誘導することによって、コード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写され、且つ上記プロモーターと上記コード領域との間の連結の特質が、上記プロモーターの上記遺伝子産物の発現を指示する能力に干渉しない、または転写されるＤＮＡテンプレートの能力に干渉しないならば、当該コード領域とプロモーターとは「作動可能に会合している」。プロモーター以外の他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、作動因子、抑制因子、及び転写終結シグナルも、コード領域に作動可能に会合して、遺伝子産物発現を指示することができる。
【００２８】
種々の転写調節領域が当業者に公知である。これらの転写調節領域としては、限定はされないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロン−Ａと共に）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントなどの、但しこれらに限定されない、脊椎動物細胞で作用する転写調節領域が挙げられる。他の転写調節領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する転写調節領域、ならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。更なる好適な転写調節領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００２９】
同様に種々の翻訳調節エレメントが当業者に公知である。これらの翻訳調節エレメントとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３０】
本明細書では、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現には、限定はされないが、当該ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子産物」を産生する。本明細書では、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであってよい。本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化またはスプライシングを伴う核酸、または、翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解切断を伴うポリペプチドを更に包含する。
【００３１】
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニング及び／または導入のための任意のビヒクルを指す。ベクターはレプリコンであってもよく、レプリコンには、別の核酸セグメントが複製されるように、該別のセグメントが結合する。「レプリコン」とは、インビボでの自律複製の単位として作用する、すなわちそれ自体の制御下で複製する能力を有する任意の遺伝エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス及び非ウイルスビヒクルの両方を包含する。例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む多数のベクターが公知であり、本技術分野で使用されている。適宜のベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、適宜のポリヌクレオチド断片を、相補的な付着端を有する選択されたベクターに結合することによって実現することができる。
【００３２】
ベクターを、当該ベクターを取り込んだ細胞を選別または識別する選別可能なマーカーまたはレポーターをコードするように操作してもよい。選別可能なマーカーまたはレポーターの発現によって、当該ベクター上に含まれる他のコード領域を取り込んで発現する宿主細胞を識別及び／または選別することが可能になる。本技術分野において公知であり且つ使用されている選別可能なマーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミド等に対する耐性を付与する遺伝子、及び表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。本技術分野において公知であり且つ使用されているレポーターの例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。選別可能なマーカーはレポーターと見なすこともできる。
【００３３】
「プラスミド」とという用語は、多くの場合、当該細胞の中心代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を有する染色体外エレメントを指す。かかるエレメントは、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適宜の３’非翻訳配列と共に細胞中に導入することができる特有の構築物中に結合されまたは組換えられている、任意の起源に由来する、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状、または高次コイルである、自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってよい。
【００３４】
用いることができる真核生物ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びポックスウイルススベクター、例えばワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定はされない。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、及び生体高分子が挙げられる。
【００３５】
「クローニングベクター」とは、逐次複製する単位長さの核酸であり、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの複製開始点を含む「レプリコン」を指し、上記複製開始点には、別の核酸セグメントが複製されるように、該別のセグメントが結合する。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞型、例えばバクテリアにおいて複製することが可能であり、且つもう一方の細胞型、例えば真核細胞において発現することが可能である。クローニングベクターは一般的には、目的の核酸配列を挿入するためのベクター及び／または１もしくは複数の多重クローニング部位を含む細胞の選択に使用できる１つまたは複数の配列を含む。
【００３６】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたビヒクルを指す。上記挿入された核酸配列は、上述の調節領域に作動可能に会合している。
【００３７】
ベクターは、本技術分野で周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによって宿主細胞に導入される。
【００３８】
本明細書では、「培養する」、「培養すること」及び「培養」とは、細胞増殖または分裂を可能にする、または細胞を生存状態に維持するインビトロ条件下で細胞をインキュベートすることを意味する。本明細書では、「培養細胞」とはインビトロで増殖させる細胞を意味する。
【００３９】
本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を指し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２以上のアミノ酸の任意の連鎖または複数の連鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の連鎖または複数の連鎖を指すために用いられる任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語はこれらの用語のいずれかに代えて、またはこれらの用語のいずれかと同義で用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然起源のアミノ酸による修飾を含む上記ポリペプチドの発現後修飾の産物をいうことも意図する。ポリペプチドは天然の生物学的供給源または生み出された組換え技術に由来してもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは化学合成によることを含む、任意の形態で生成させることができる。
【００４０】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その天然の環境にないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製を必要とはしない。例えば、単離されたポリペプチドは、単にその天然または自然の環境から取り出されていてもよい。組み換えによって産生されたポリペプチド及び宿主細胞中で発現されたタンパク質は、任意且つ適宜の技法によって分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的のために単離されたと見なされる。
【００４１】
本明細書では、「宿主細胞」という用語は、組換え核酸を内部に保有するもしくは内部に保有することができる細胞または細胞の集団を指す。宿主細胞は原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）であってもよく、あるいは、該宿主細胞は真核細胞、例えば真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどの酵母細胞）、及び昆虫細胞（例えばＳｆ−９）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３）などの種々の動物細胞であってもよい。
【００４２】
ポリペプチドの断片または変異体、及びそれらの任意の組み合わせも本発明に包含される。「断片」または「変異体」という用語は、本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子に言及する場合、言及しているポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインもしくはＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合親和性、またはＦＩＸ変異体の凝固活性）の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを包含する。ポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で論じる特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片ならびに欠失断片を包含するが、天然起源の全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の変異体は、上述の断片、及びアミノ酸の置換、欠失、または挿入に起因する改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。変異体は天然起源または非天然起源であってよい。非天然起源の変異体は本技術分野で公知の変異誘発技法を用いて産生させることができる。変異体ポリペプチドは、保存的なもしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。本明細書に開示される１つの特定のＦＩＸ変異体はＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）である。例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｐａｄｕａ），’’  ＮＥＪＭ  ３６１：１６７１−７５（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００９）を参照されたく、該文献はその全体が参照により本明細書に援用される。
【００４３】
「保存的アミノ酸置換」とは、当該アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられた置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の群は本技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同一の側鎖群に属する別のアミノ酸によって置換されている場合、当該の置換は保存的であると見なされる。別の実施形態において、アミノ酸のストリング（ａ  ｓｔｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）は、側鎖群を構成するアミノ酸の順序及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングによって保存的に置換することができる。
【００４４】
２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「パーセント表記配列同一性」という用語は、当該の２の配列の最適なアラインメントに対して導入する必要がある付加または削除（すなわちギャップ）を考慮に入れた、比較ウィンドウ全体にわたる、該配列が共有する、同一の一致する位置の数を指す。一致する位置は、任意の位置であって、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列及び参照配列の両方の当該位置に示されている上記位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないことから、標的配列に示されるギャップはカウントされない。同様に、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされ、参照配列に属するヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされないことから、参照配列に示されるギャップはカウントされない。
【００４５】
配列同一性のパーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基または核酸塩基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得ること、上記一致する位置の数を比較するウィンドウ内の位置の総数で除すこと、及び上記結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。２の配列間の配列の比較及びパーセント表記配列同一性の決定は、オンライン使用及びダウンロード用の両方の、容易に利用可能なソフトウェアを用いて実施することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から且つタンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアラインメント用に入手可能である。パーセント表記配列同一性を決定するための１つの好適なプログラムとしては、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能であるＢＬＡＳＴプログラム一式の一部であるｂｌ２ｓｅｑがある。ｂｌ２ｓｅｑはＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２の配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられる一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。他の好適なプログラムとしては、例えば、ＥＭＢＯＳＳ生命情報科学プログラム一式の一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅrがあり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにおいてｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも利用可能である。
【００４６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自のパーセント表記配列同一性を有していてもよい。上記パーセント表記配列同一性の値は小数第２位で四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数になることにも留意されたい。
【００４７】
当業者であれば、パーセント表記配列同一性の計算のための配列アラインメントの作成は、専ら一次配列データによって進められるバイナリー配列−配列比較に限定されるものではないことを理解しよう。配列アラインメントは多重整列に由来してもよい。多重配列アラインメントを作成するための１つの好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２がある。別の好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から利用可能なＭＵＳＣＬＥがある。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、上記に代えて、例えばＥＢＩからも利用可能である。
【００４８】
配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば変異の位置）、または系統発生学的データなどの異種の出所からのデータと統合することによって作成することができることも理解されよう。多重配列アラインメントを作成するために異種データを統合する好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにおいて利用可能な、また上記に代えてＥＢＩからも利用可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅがある。また、パーセント表記配列同一性を計算するために用いられる最終的なアラインメントは、自動的にまたは手動でのいずれでキュレートされてもよいことも理解されよう。
【００４９】
本明細書では、第ＩＸ因子タンパク質配列における「〜に対応するアミノ酸」、「〜に対応する部位」、または「等価なアミノ酸」は、第１のＦＩＸ配列と第２のＦＩＸ配列との間の同一性または類似性を最大化するようなアラインメントによって識別される。第２のＦＩＸ配列において等価なアミノ酸を識別するために用いられる番号は、第１のＦＩＸ配列において対応するアミノ酸を識別するために用いられる番号に基づく。
【００５０】
本明細書では、「挿入部位」という用語は、ＦＩＸポリペプチド（一般的には成熟ＦＩＸポリペプチド）、またはその断片、変異体、もしくは誘導体における、異種部分を挿入することができる位置の隣接する上流のアミノ酸残基の番号を指す。「挿入部位」は番号として特定され、該番号は、上記挿入部位が対応し、上記挿入の位置に隣接するＮ末端側である、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）中のアミノ酸の番号である。例えば、「上記ＥＧＦ２ドメインは配列番号２のアミノ酸１０５に対応する挿入部位にＸＴＥＮを含む」という表現は、異種部分が、配列番号２のアミノ酸１０５とアミノ酸１０６とに対応する２のアミノ酸の間に位置することを示す。但し、当業者であれば、いずれのＦＩＸ変異体においても対応する位置を容易に識別することができるであろうし、本開示はＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体において単独で行われる挿入に限定されるものではない。逆に、本明細書に開示される挿入は、凝血促進活性を有する任意のＦＩＸ変異体またはその断片において、上記Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体の位置に対応する位置で行うことができる。
【００５１】
本明細書では、「アミノ酸の隣接する下流」という表現は、当該アミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸の隣接する上流」という表現は、当該アミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。したがって、本明細書では、「挿入部位の２のアミノ酸の間」という表現は、ＸＴＥＮまたは任意の他のポリペプチドが挿入される２の隣接するアミノ酸の間の位置を指す。
【００５２】
本明細書では、「挿入されている」（ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、「挿入される」（ｉｓ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、「〜に挿入された」（ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ）という用語または文法的に関連する用語は、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）における類似の位置に対応する、融合ポリペプチド中のＸＴＥＮの位置を指す。当業者であれば、配列番号１として示されるものなどの他のＦＩＸポリペプチド配列に関する、対応する挿入位置を識別する方法を理解しよう。本明細書では、上記用語は、当該組換えＦＩＸポリペプチドのＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体と対比した特徴を指し、当該融合ポリペプチドを製造したいずれの方法またはプロセスも示さず、示唆せずまたは暗示しない。例えば、本明細書において提供される融合ポリペプチドに関して、「ＸＴＥＮが、ＦＩＸポリペプチドの残基１０５の隣接する下流で、ＥＧＦ２ドメイン中に挿入されている」という表現は、当該融合ポリペプチドがＸＴＥＮを、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体（配列番号２）中のアミノ酸１０５に対応するアミノ酸の隣接する下流に、例えば、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体のアミノ酸１０５及び１０６アミノ酸に対応するアミノ酸によって囲まれた状態で含んでいる。
【００５３】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、第２のアミノ酸配列に連結した第１のアミノ酸配列を含み、第１のアミノ酸配列は天然においては第２のアミノ酸配列に自然に連結することはない。通常、別個のタンパク質中に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド中で結合することができ、または通常同一のタンパク質中に存在するアミノ酸配列を本融合ポリペプチド、例えば、本発明のＦＩＸドメインのＩｇ  Ｆｃドメインとの融合物中に新たな編成で配置することができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされたポリヌクレオチドを創生し、翻訳することによって創生される。融合タンパク質は、非ペプチド結合である共有結合または非共有結合によって第１のアミノ酸配列と会合している第２のアミノ酸配列を更に含んでいてもよい。
【００５４】
「異種の」及び「異種部分」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分が、当該ポリヌクレオチド等が比較されている相手の実体のポリヌクレオチド等とは異なる実体に由来することを意味する。例えば、異種ポリペプチドは、合成品であっても、あるいは異なる種、１つの個体の異なる細胞型、または別個の個体の同一もしくは異なる型の細胞に由来していてもよい。一態様において、異種部分は、別のポリペプチドに融合し、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質を生成するポリペプチドである。別の態様において、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質に接合したＰＥＧなどの非ポリペプチドである。
【００５５】
本明細書では、「半減期」という用語は、インビボでの特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半量が当該の動物における循環及び／または他の組織から除去されるのに要する時間によって表すことができる。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として描かれている場合、該曲線は通常、急速なα相及びより長いβ相を有する二相性である。上記α相は一般的には、投与されたポリペプチドの血管内空間と血管外空間との間での平衡化を表しており、部分的にはポリペプチドの大きさによって決定される。上記β相は一般的には、血管内空間における当該ポリペプチドの異化を表わす。いくつかの実施形態において、ＦＩＸ及びＦＩＸを含む融合タンパク質は単相性であり、したがってα相がなく、単一のβ相のみを有する。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書では、半減期という用語は、上記β相中の当該ポリペプチドの半減期を指す。一般的なヒトにおけるヒト抗体のβ相での半減期は２１日である。
【００５６】
本明細書では、「連結された」及び「融合された」という用語は、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列であって、それぞれ第２のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に共有結合もしくは非共有結合した上記アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列は、直接第２のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列と結合しているかまたは並べられていてもよく、あるいは、介在する配列が第１の配列を第２の配列に結合させてもよい。「連結された」という用語は、第１のアミノ酸配列の第２のアミノ酸配列に対する、そのＣ末端またはＮ末端での融合を意味するのみならず、第１のアミノ酸配列（または第２のアミノ酸配列）全体の、第２のアミノ酸配列（または第１のアミノ酸配列）中の任意の２のアミノ酸への挿入も包含する。一実施形態において、第１のアミノ酸配列はペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結されている。第１のヌクレオチド配列はホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のヌクレオチド配列に連結することができる。上記リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖に対して）またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖に対して）または任意の化学的部分（ポリペプチド及びポリヌクレオチド鎖の両方に対して）であってよい。「連結された」という用語はまた、ハイフン（−）によっても示される。
【００５７】
本明細書では、「〜と会合している」という用語は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖との間に形成された共有結合または非共有結合を指す。一実施形態において、「〜と会合している」という用語は、非ペプチド結合である共有結合または非共有結合を意味する。この会合はコロン、すなわち（：）で表示してもよい。別の実施形態において、会合はペプチド結合以外の共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とジスルフィド結合すなわちブリッジを形成することができるチオール基を含む。殆どの天然起源のＩｇＧ分子においては、ＣＨ１及びＣＬ領域はジスルフィド結合によって会合し、２の重鎖は、Ｋａｂａｔ付番方式を用いた２３９及び２４２に対応する位置（ＥＵ付番方式では２２６位または２２９位）で２のジスルフィド結合によって会合している。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アゴスチック結合、曲がった結合、双極子結合、パイの逆結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられるが、これらに限定はされない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン−パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合、または対称水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学的極性が挙げられる。
【００５８】
本明細書では、「切断部位」または「酵素切断部位」という用語は、酵素によって認識される部位を指す。ある特定の酵素切断部位は細胞内プロセシング部位を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化される酵素によって切断される酵素切断部位を有しているので、かかる部位の切断は血餅形成の部位で起こる。例示的なかかる部位としては、例えば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子によって認識される部位が挙げられる。例示的なＦＸＩａ切断部位としては、例えば、ＴＱＳＦＤＦＴＲ（配列番号１６６）及びＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１６７）が挙げられる。例示的なトロンビン切断部位としては、例えば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１６８）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号１６９）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１７０）及びＡＬＲＰＲ（配列番号１７１）が挙げられる。他の酵素切断部位は本技術分野において公知である。
【００５９】
本明細書では、「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に作用する酵素の標的である、当該ポリペプチド中の一種の酵素切断部位を指す。一実施形態において、かかる酵素はゴルジ内腔からトランス−ゴルジ区画への輸送中に作用する。細胞内プロセシング酵素は、当該細胞からのタンパク質の分泌の前にポリペプチドを切断する。かかるプロセッシング部位の例としては、ＰＡＣＥ／フューリン（ＰＡＣＥはＰａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅの頭字語である。）群のエンドペプチダーゼによって標的とされる部位が挙げられる。これらの酵素はゴルジ膜に局在化しており、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇで）−Ａｒｇのカルボキシ末端側でタンパク質を切断する。本明細書では、「フューリン」群の酵素としては、例えば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／Ｐｃ３としても知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られる）、ＰＣＳＫ３（フューリンもしくはＰＡＣＥとしても知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られる）、ＰＣＳＫ５（ＰＣ５もしくはＰＣ６としても知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４としても知られる）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、もしくはＳＰＣ７としても知られる）が挙げられる。その他のプロセシング部位は本技術分野で公知である。本明細書において言及される「プロセシング可能なリンカー」という用語は、細胞内プロセシング部位を含むリンカーを指す。
【００６０】
複数のプロセシング部位または切断部位を含む構築物においては、かかる部位は同一であってもまたは異なっていてもよいことが理解されよう。
【００６１】
本明細書では、「プロセシング可能なリンカー」とは、少なくとも１の細胞内プロセシング部位を含むリンカーを指し、該リンカーは本明細書の他の箇所に記載される。
【００６２】
本明細書では、「ベースライン」とは、投薬を行う前の対象における最低の血漿ＦＩＸレベルの測定値である。上記ＦＩＸ血漿レベルは投与前の２の時点で測定することができる。すなわち、スクリーニングのための往訪時及び投与の直前である。あるいは、（ａ）治療前のＦＩＸ活性が１％未満であり、検出可能なＦＩＸ抗原を有しておらず、且つナンセンス遺伝子型を有する対象におけるベースラインは０％と定義することができ、（ｂ）治療前のＦＩＸ活性が１％未満であり、且つ検出可能なＦＩＸ抗原を有する対象のベースラインは０．５％に設定することができ、（ｃ）治療前のＦＩＸ活性が１〜２％である対象のベースラインはＣｍｉｎ（ＰＫの検討全体を通じて最低の活性）であり、及び（ｄ）治療前のＦＩＸ活性が２％以上である対象のベースラインは、２％に設定することができる。
【００６３】
本明細書では、「対象」とはヒトを意味する。本明細書における対象としては、少なくとも１回の制御されない出血症状の発現があったことが判っている個人、制御されない出血症状の発現を伴う疾患または障害、例えば出血性疾患または障害、例えば血友病Ｂであると診断されている個人、制御されない出血症状の発現を起こしやすい個人、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。対象としてはまた、特定の活動、例えば、外科手術、スポーツ活動、または任意の激しい活動の前に、１または複数の制御されない出血症状の発現の危険性がある個人も挙げることができる。上記対象のベースラインＦＩＸ活性は、１％未満、０．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、または４％未満であってよい。対象としては小児のヒトも挙げられる。小児のヒトの対象は、出生時〜２０才、好ましくは出生時〜１８才、出生時〜１６才、出生時〜１５才、出生時〜１２才、出生時〜１１才、出生時〜６才、出生時〜５才、出生時〜２才、及び２〜１１才である。
【００６４】
本明細書では、治療する、治療、治療することとは、例えば、疾患もしくは疾病の重篤度の低減；疾患経過の継続期間の短縮；疾患もしくは疾病に伴う１もしくは複数の症状の改善；疾患もしくは疾病を有する対象に対する有益な効果の提供であって、必ずしも当該疾患もしくは疾病の治癒を伴わない上記提供；または疾患もしくは疾病に伴う１もしくは複数の症状の予防を指す。一実施形態において、「治療すること」または「治療」とは、本発明の融合タンパク質を投与することによって、対象において、ＦＩＸのトラフレベルを、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。別の実施形態において、治療することまたは治療とは、ＦＩＸのトラフレベルを、約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。疾患もしくは疾病の治療またはそれらを治療することとは、対象におけるＦＩＸ活性を、非血友病の対象におけるＦＩＸ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％に相当するレベルに維持することも包含する。治療に必要な最低限のトラフレベルは1種または複数種の公知の方法によって測定することができ、それぞれの人に対して調節（増加または減少）することができる。
【００６５】
本明細書では、止血障害とは、フィブリン血餅を形成する能力の低下または該能力の欠如に起因する、自発的にまたは外傷の結果としてのいずれかで出血する傾向を特徴とする、遺伝性または後天性の疾病を意味する。かかる障害の例としては血友病が挙げられる。３種の主たる形態は血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症または「クリスマス病」）及び血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠乏症、軽度の出血傾向）である。他の止血障害としては、例えば、フォンビルブラント病、第ＸＩ因子欠乏症（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠乏症、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠乏または構造上の異常、ＧＰＩｂの欠損症または欠乏症であるバーナード・スーリエ症候群が挙げられる。ＶＷＦの受容体であるＧＰＩｂは欠損する場合があり、一次血餅形成（一次止血）の不足及び出血傾向の増加）、ならびにグランツマン及びネーゲリの血小板無力症（グランツマン血小板無力症）に繋がる場合がある。（急性及び慢性の形態の）肝不全において、肝臓による凝固因子の産生が不十分になり、これが出血の危険性を高める場合がある。
【００６６】
本明細書では、「急性出血」という用語は、根本的な原因にかかわらず、出血症状の発現を指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠乏症）、血小板障害、または凝固因子に対する抗体の発生に起因する抵抗性を有する場合がある。
【００６７】
ＩＩ．ＦＩＸ融合タンパク質
本発明は、ＦＩＸポリペプチド、及び該ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも１の異種部分、該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された少なくとも１の異種部分、またはそれらの両方を含むＦＩＸ融合タンパク質を対象とする。本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記異種部分の挿入または該異種部分への融合後に、１または複数のＦＩＸ活性を保持することができる。一実施形態において、上記ＦＩＸ活性は凝血促進活性である。「凝血促進活性」という用語は、天然ＦＩＸに代わって血液における凝固カスケードに関与する、本発明のＦＩＸタンパク質の能力を意味する。例えば、本発明の組換えＦＩＸタンパク質は、該タンパク質が、例えば発色アッセイにおいて試験される、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の存在下で第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）へと変換することができる場合に、凝血促進活性を有する。別の実施形態において、上記ＦＩＸ活性はテナーゼ複合体を生成する能力である。他の実施形態において、上記ＦＩＸ活性はトロンビン（または血餅）を生成する能力である。
【００６８】
本発明の組換えＦＩＸタンパク質は、天然の成熟ヒトＦＩＸの凝血促進活性の１００％を示す必要はない。実際、特定の態様において、本発明のＦＩＸポリペプチドに挿入された異種部分は当該タンパク質の半減期または安定性を有意に増加させることができ、その結果より低い活性は十分に許容される。したがって、ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、天然ＦＩＸの凝血促進活性の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％を有する。但し、いくつかの発明の実施形態において、本発明の組換えＦＩＸタンパク質は、ＦＩＸパドゥバＲ３３８Ｌ高活性変異体を含有するタンパク質に関して、天然ＦＩＸの活性の１００％よりも大きな活性、例えば、天然ＦＩＸの活性の少なくとも約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％もしくは２００％またはそれ以上を有する場合がある。
【００６９】
凝血促進活性は、任意且つ適宜のインビトロまたはインビボアッセイによって測定することができる。ＦＩＸの上記活性は、血餅の生成を監視すること（凝固アッセイ）によって凝固カスケードの下流で、またはＦＶＩＩＩ−ＦＩＸ複合体による活性化に続くＦＸの酵素活性を直接測定すること（発色アッセイ）によって上流でのいずれかで測定することができる（例えば、Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２８：２４７−５６（２００２）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１６４４−４７（１９９９）；Ｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４５：２−１２（２００７）を参照されたい。）。したがって、凝血促進活性は、発色基質アッセイ、凝固アッセイ（例えば、１段階もしくは２段階凝固アッセイ）、またはそれらの両方を用いて測定することができる。発色アッセイの機構は、活性化されたＦＩＸがＦＶＩＩＩ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下でＦＸをＦＸａへと変換する血液凝固カスケードの原理に基づいている。ＦＸａ活性はＦＸａに特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価される。４０５ｎＭで測定されるｐ−ニトロアニリンの初期放出速度は、ＦＸａ活性に、延いては当該試料中のＦＩＸ活性に正比例する。上記発色アッセイは、国際血栓症及び止血学会（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（ＩＳＴＨ）の科学及び標準化委員会（ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＳＳＣ）の第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子小委員会（ｔｈｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって推奨されている。
【００７０】
凝血促進活性を測定するために有用な他の好適なアッセイとしては、例えば、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ及びＤｏｃｋａｌに対する米国出願公開第２０１０／００２２４４５号に開示されるアッセイが挙げられ、該公開公報はその全体が参照により本明細書に援用される。
【００７１】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＩＸタンパク質の凝血促進活性が天然の成熟ＦＩＸと比較され、ある特定の態様において、該活性が国際標準と比較される。
【００７２】
上記少なくとも１の異種部分は、以下により詳細に説明するように、任意の異種部分を含んでいてもよく、または当該ＦＩＸタンパク質の特性を改善することができる部分であってもよい。例えば、一態様において、本発明に有用な異種部分は、当該ＦＩＸタンパク質の半減期を延長することができる部分、または当該ＦＩＸタンパク質の安定性を向上させることができる部分であってもよい。本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸポリペプチド中に挿入または該ポリペプチドに融合された複数の異種部分を有していてもよい。一実施形態において、上記複数の異種部分は同一である。別の実施形態において、上記複数の異種部分は異なる。他の実施形態において、上記異種部分は、ＸＴＥＮ、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合性低分子、Ｆｃドメイン、ＦｃＲｎ結合パートナー、ＰＡＳ、ＣＴＰ、ＰＥＧ、ＨＥＳ、ＰＳＡ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１の異種部分が当該ＦＩＸポリペプチドのドメイン内に挿入され、ドメイン間には挿入されない。ＦＩＸポリペプチドは、複数のドメイン、例えば、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、上皮成長因子様１（ＥＧＦ１）ドメイン、上皮成長因子様２（ＥＧＦ２）ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー、及び触媒ドメイン（例えば、セリンプロテアーゼドメイン）を含む。ＦＩＸ酵素前駆体は４６１のアミノ酸を含む。すなわち、アミノ酸１〜２８（配列番号３に対応する）がシグナルペプチドであり、アミノ酸２９〜４６（配列番号３に対応する）がプロペプチドであり、その後に４１５のアミノ酸のＦＩＸタンパク質配列が続く。この４１５のプロセッシングを受けたＦＩＸにおいて、アミノ酸１〜１４５（配列番号１または配列番号２に対応する）はＦＩＸ軽鎖であり、アミノ酸１４６〜１８０は活性化ペプチドであり、アミノ酸１８１〜４１５（配列番号１または配列番号２に対応する）は触媒ＦＩＸ重鎖である。上記軽鎖及び重鎖内で、ＧＬＡドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜４６に対応し、ＥＧＦ１ドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸４７〜８４に対応し、ＥＧＦ２ドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸８５〜１２７に対応し、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカーは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１２８〜１４５に対応し、ＡＰドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４６〜１８０に対応し、触媒ドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１８１〜４１５に対応する。
【００７４】
ある特定の実施形態において、少なくとも１の異種部分がＦＩＸポリペプチドの１または複数のドメイン内に挿入される。例えば、少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、ＡＰドメイン、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー、触媒ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるドメイン内に挿入されていてもよい。１つの特定の実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＧＬＡドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜４６内に挿入される。１つの特定の実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＥＧＦ１ドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸４７〜８３内に挿入される。１つの特定の実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＥＧＦ２ドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸８４〜１２５内に挿入される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１３２〜１４５内に挿入される。１つの特定の実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＡＰドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４６〜１８０内に挿入される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、触媒ドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１８１〜４１５内に挿入される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、１または複数の異種部分は種々の挿入部位内に挿入されてもよい。ある特定の実施形態において、少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮが１または複数のこれらの挿入部位に挿入されることによって、ＦＩＸ活性を喪失することはなく、及び／または当該ＦＩＸタンパク質の特性の向上を誘導する。例えば、少なくとも１の異種部分が、配列番号２のアミノ酸１０３（すなわち、配列番号２のアミノ酸１０３に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１０５（すなわち、配列番号２のアミノ酸１０５に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１４２（すなわち、配列番号２のアミノ酸１４２に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１４９（すなわち、配列番号２のアミノ酸１４９に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１６２（すなわち、配列番号２のアミノ酸１６２に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１６６（すなわち、配列番号２のアミノ酸１６６に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１７４（すなわち、配列番号２のアミノ酸１７４に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸２２４（すなわち、配列番号２のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸２２６（すなわち、配列番号２のアミノ酸２２６に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸２２８（すなわち、アミノ酸２２８に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸４１３（すなわち、配列番号２のアミノ酸４１３に対応するアミノ酸の隣接する下流）及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されていてもよく、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
【００７６】
一実施形態において、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１７４、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。別の実施形態において、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。他の実施形態において、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０５、及びそれらの両方からなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。別の実施形態において、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４２で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。
【００７７】
以下により詳細に考察するように、上記異種部分は、様々な長さであってよいＸＴＥＮであってよい。例えば、上記ＸＴＥＮは、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、少なくとも約２８８のアミノ酸、または少なくとも約８６４のアミノ酸を含んでいてよい。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ８６４、及びＡＧ８６４からなる群より選択される。ＦＩＸポリペプチド中に挿入されてもよい、または該ポリペプチドに融合されていてもよいＸＴＥＮの非限定的な例は本明細書の他の箇所に挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、４２のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えばＡＥ４２またはＡＧ４２が、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
【００７９】
いくつかの実施形態において、７２のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ７２またはＡＧ７２が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されるか、または上記ＸＴＥＮがＣ末端に融合され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
【００８０】
いくつかの実施形態において、１４４のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ１４４またはＡＧ１４４が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
【００８１】
いくつかの実施形態において、２８８のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ２８８またはＡＧ２８８が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
【００８２】
更に他の実施形態において、８６４のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ８６４またはＡＧ８６４８が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
【００８３】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ内に挿入された、当該ＦＩＸのＣ末端に融合された、またはそれらの両方である第２の異種部分、例えば第２のＸＴＥＮを更に含んでいてもよい。第２の異種部分は、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されていてもよく、または第２のＸＴＥＮは当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されている。いくつかの実施形態において、第１のＸＴＥＮ及び第２のＸＴＥＮは、それぞれ、配列番号１または２のアミノ酸１０５及び配列番号１または２のアミノ酸１６６；配列番号１または２のアミノ酸１０５及び配列番号１または２のアミノ酸２２４；配列番号１または２のアミノ酸１０５及びＣ末端に融合された；配列番号１または２のアミノ酸１６６及び配列番号１または２のアミノ酸２２４；配列番号１または２のアミノ酸１６６及びＣ末端に融合された；ならびに配列番号１または２のアミノ酸２２４及びＣ末端に融合されたからなる群より選択される、配列番号１または２のアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され及び／または当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合される。一実施形態において、第１のＸＴＥＮは配列番号１または２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されており、第２のＸＴＥＮは当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されている。
【００８４】
第２のＸＴＥＮは、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第２のＸＴＥＮは、６のアミノ酸、１２のアミノ酸、３６のアミノ酸、４２のアミノ酸、７２のアミノ酸、１４４のアミノ酸、または２８８のアミノ酸を含む。第２のＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されてもよい。１つの特定の実施形態において、第２のＸＴＥＮはＡＥ７２またはＡＥ１４４である。
【００８５】
１つの特定の実施形態において、第２のＸＴＥＮは、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、第３、第４、第５、及び／または第６のＸＴＥＮを更に含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号５４〜配列番号１５３からなる群より選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号５４〜配列番号１５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号１１９、１２０、１２１、及び１２３からなる群より選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号１１９、１２０、１２３、１２１及び２２６または１２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、ＦＩＸ−ＡＰ．７２、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４、ＦＩＸ−ＣＴ．７２、ＦＩＸ−ＣＴ．１４４、ＦＩＸ−ＡＰ．２８８及びＦＩＸ−ＣＴ．２８８からなる群より選択される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は２種の異なる型の異種部分を含む。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、ＸＴＥＮ、及びＦｃドメイン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは当該ＦＩＸ内に挿入され、上記Ｆｃドメイン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は当該ＦＩＸのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは、表３に列挙される挿入部位から選択される１または複数の挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。一実施形態において、上記ＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、及び配列番号１または２のアミノ酸４１３からなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、上記Ｆｃドメイン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は当該ＦＩＸのＣ末端に融合される。ある特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１６６、及び配列番号１または２のアミノ酸２２４からなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、上記Ｆｃドメイン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は当該ＦＩＸのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、及びＡＥ１４４から選択される。
【００８９】
本発明のある特定の態様において、本ＦＩＸ融合タンパク質は１または２のポリペプチド鎖を含む。一実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖はＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）に融合された当該ＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖は第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とは共有結合によって会合している。
【００９０】
別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド及びＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む単一のポリペプチド鎖を含む。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチドと上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とを連結するリンカーを更に含む。別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン、及び第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とを連結するリンカーを更に含む。別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）、及び第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、上記ＦＩＸポリペプチドはリンカーによって上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結している。別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）、及び第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、上記ＦＩＸポリペプチドは第１のリンカーによって上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結し、上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）はリンカーによって第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結している。ある特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、
（ｉ）        ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１、
（ｉｉ）      ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１、
（ｉｉｉ）    ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１−Ｆ２、
（ｉｖ）      ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１−Ｆ２、
（ｖ）        ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ２−Ｆ２、
（ｖｉ）      ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１−Ｌ１−Ｆ２、
（ｖｉｉ）    ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１：Ｆ２、
（ｖｉｉｉ）  ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２、及び
（ｉｘ）      それらの任意の組み合わせ
からなる群より選択される式を含み、式中、ＦＩＸ（Ｘ）は１または複数の本明細書に記載の挿入部位に挿入されたＸＴＥＮを有するＦＩＸポリペプチドであり、Ｌ１及びＬ２のそれぞれはリンカーであり、Ｆ１はＦｃドメインまたはＦｃＲｎ結合パートナーであり、Ｆ２は第２のＦｃドメインまたは第２のＦｃＲｎ結合パートナーであり、（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸であり、（：）は共有結合、例えばジスルフィド結合である。
【００９１】
上記リンカー（ＬＩ及びＬ２）は同一であってもまたは異なっていてもよい。上記リンカーは開裂性であってもまたは非開裂性であってもよく、該リンカーは１または複数の細胞内プロセシング部位を含んでいてもよい。上記リンカーの非限定的な例は本明細書の他の箇所に記載される。任意の上記リンカーを用いて、ＦＩＸを異種部分（例えばＸＴＥＮもしくはＦｃ）と結合させてもよく、または第１の異種部分（例えば第１のＦｃ）を第２の異種部分（例えば第２のＦｃ）と結合させてもよい。
【００９２】
ある特定の実施形態において、上記リンカーはトロンビン切断部位を含む。１つの特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、但し、Ｘは任意の脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン）である。１つの特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＬＶＰＲを含む。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含むＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）、ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列を更に含む。他の実施形態において、上記リンカーはＦＸＩａ切断部位ＬＤＰＲを含む。
【００９３】
１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質はＦＩＸポリペプチド及びＸＴＥＮを含む異種部分を含み、該ＸＴＥＮは、開裂性であっても開裂性でなくてもよいリンカーによってまたはリンカーなしで当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合しており、且つ長さが４２のアミノ酸よりも長く８６４のアミノ酸よりも短い、好ましくは長さが１４４のアミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。上記ＸＴＥＮは、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、もしくは７１のアミノ酸よりも長く、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１、１２０、１１９、１１８、１１７、１１６、１１５、１１４、１１３、１１２、１１１、１１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７６、７５、７４、または７３などのアミノ酸よりも短い、またはそれらの任意の組み合わせであるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは長さが７２のアミノ酸である。１つの特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮはＡＥ７２である。別の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、配列番号３５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、少なくとも１の挿入されたＸＴＥＮ配列及び、開裂性であっても開裂性でなくてもよいリンカーによってまたはリンカーなしで当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合しているＸＴＥＮを含む異種部分を含む。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは長さが８６４のアミノ酸よりも短く、好ましくは長さが１４４のアミノ酸より短い。他の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、長さが２４４、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、または７５のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含む。
【００９５】
他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、
（ｉ）      ＦＩＸ−Ｘ
（ｉｉ）    ＦＩＸ−Ｌ１−Ｘ
（ｉｉｉ）  ＦＩＸ（Ｘ）−Ｘ
（ｉｖ）    ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｘ
（ｖ）      ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１：Ｘ
（ｖｉ）    それらの任意の組み合わせ
からなる群より選択される式を含み、式中、ＦＩＸはＦＩＸポリペプチドであり、ＦＩＸ（Ｘ）は１または複数の本明細書に記載の挿入部位中に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮを有するＦＩＸポリペプチドであり、（Ｘ）は４２のアミノ酸よりも長く、１４４のアミノ酸よりも短いＸＴＥＮあり、Ｘは４２のアミノ酸よりも長く、８６４のアミノ酸よりも短い２８８のアミノ酸など、好ましくは１４４のアミノ酸よりも短いＸＴＥＮ（例えば、７２のアミノ酸を有するＸＴＥＮ）であり、Ｌ１はリンカーであり；（−）はペプチド結合または１もしくは複数のアミノ酸であり、（：）は共有結合、例えばジスルフィド結合である。
【００９６】
上記リンカー（Ｌ１）は同一であってもまたは異なっていてもよい。上記リンカーは、必要に応じて開裂性であってもまたは非開裂性であってもよく、該リンカーは１または複数の細胞内プロセシング部位を含んでいてもよい。上記リンカーの非限定的な例は本明細書の他の箇所に記載される。任意の上記リンカーを用いて、ＦＩＸを異種部分（例えばＸＴＥＮもしくはＦｃ）と結合させてもよい。以下は多くの発明の実施形態に好適なリンカーの非限定的な例である。
【化１】
2018522563.tif 000002
【００９７】
ある特定の他の実施形態において、上記リンカーはトロンビン切断部位を含む。１つの特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、但し、Ｘは、任意の脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン）である。１つの特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＬＶＰＲを含む。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含むＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）：ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列を更に含む。ある特定の他の実施形態において、上記リンカーは、上記ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフに結合することができるＬＤＰＲを含むＦＸＩａ切断部位を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態において、Ｃ末端でＸＴＥＮに融合されたＦＩＸポリペプチドは、第２のＸＴＥＮを更に含んでいてもよい。第２のＸＴＥＮは、本明細書に開示の挿入部位を始めとする、但しこれらに限定されない、本ＦＩＸ融合タンパク質の任意の部分に融合または挿入されていてもよい。本ＦＩＸ融合タンパク質は、第３のＸＴＥＮ、第４のＸＴＥＮ、第５のＸＴＥＮ、または第６のＸＴＥＮを更に含んでいてもよい。
【００９９】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は天然ＦＩＸと比較して活性のレベルを維持している。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、天然ＦＩＸの凝血促進活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％を有する。凝血促進活性は、発色基質アッセイ、１段階凝固アッセイ、またはそれらの両方を含む、但しこれらに限定されない、本技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。
【０１００】
ＩＩ．Ａ．第ＩＸ因子
ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、血液凝固カスケードの内因系経路の重要な構成要素であるセリンプロテアーゼである。本明細書では、「第ＩＸ因子」すなわち「ＦＩＸ」は、凝固因子タンパク質ならびにその種変異体及び配列変異体を指し、ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプチド（「プレプロ」）の４６１の単鎖アミノ酸配列、成熟ヒトＦＩＸの４１５の単鎖アミノ酸配列（配列番号１）、及びＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）を包含するが、これらに限定はされない。ＦＩＸは、血液凝固ＦＩＸの一般的な特性を有する任意の形態のＦＩＸ分子を包含する。本明細書では、「第ＩＸ因子」及び「ＦＩＸ」は、ドメインＧｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有する領域）、ＥＧＦ１及びＥＧＦ２（ヒト上皮増殖因子に相同な配列を含有する領域）、活性化ペプチド（「ＡＰ」、成熟ＦＩＸのＲ１３６−Ｒ１８０残基によって形成される）、及びＣ末端プロテアーゼドメイン（「プロ」）、または本技術分野で公知のこれらのドメインの同義語を含むポリペプチドを包含することを意図し、または当該の天然タンパク質の生物学的活性の少なくとも一部を保持するトランケートされた断片または配列変異体であってもよい。ＦＩＸまたは配列変異体は、米国特許第４，７７０，９９９号及び第７，７００，７３４号に記載されるようにクローニングされており、また、ヒト第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡは、単離、特徴づけられ、発現ベクター中にクローニングされている（例えば、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：１７８−１８０（１９８２）；Ｆａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ６４：１９４−２０４（１９８４）；及びＫｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４６１−６４６４（１９８２）を参照のこと）。Ｓｉｍｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９によって特徴づけられたＦＩＸの１つの特定の変異体であるＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）は機能獲得型突然変異を含み、該突然変異はパドゥバ変異体が天然ＦＩＸと比較して活性が８倍近く増加することと関係がある（表１）。ＦＩＸ変異体はまた、当該ＦＩＸポリペプチドのＦＩＸ活性に影響を及ぼさない１または複数の保存的アミノ酸置換を有する任意のＦＩＸポリペプチドを包含してもよい。
【表１】
2018522563.tif 000003
【０１０１】
上記ＦＩＸポリペプチドは、３の領域、すなわち、２８のアミノ酸（配列番号３のアミノ酸１〜２８）のシグナルペプチド、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化に必要な１８のアミノ酸（アミノ酸２９〜４６）のプロペプチド、及び４１５のアミノ酸の成熟第ＩＸ因子（配列番号１または２）からなるプレプロポリペプチド鎖（配列番号１）として合成された５５ｋＤａのポリペプチドである。上記プロペプチドは、上記ガンマ−カルボキシグルタミン酸ドメインに対してＮ末端側の１８のアミノ酸残基の配列である。上記プロペプチドはビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼと結合し、次いで内因性プロテアーゼ、最も可能性が高いのはフューリンまたはＰＣＳＫ３としても知られるＰＡＣＥ（Ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）によってＦＩＸの前駆体ポリペプチドから切断される。ガンマカルボキシル化が起こらなければ、Ｇｌａドメインがカルシウムに結合して、当該タンパク質を負に荷電したリン脂質表面に固定するのに必要な正しい立体構造をとることができず、それによって第ＩＸ因子の機能が損なわれる。カルボキシル化が行われたとしても、保持されたプロペプチドはカルシウム及びリン脂質への最適な結合に必要なＧｌａドメインの立体構造の変化を妨害することから、Ｇｌａドメインは、適正な機能を果たすためには上記プロペプチドの切断にも依存している。ヒトにおいては、肝細胞によって、生成した成熟第ＩＸ因子が概略１７重量％の炭水化物を含有する４１５のアミノ酸残基の単鎖タンパク質である不活性な酵素前駆体として血流中に分泌される（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ，１３：３９）。
【０１０２】
上記成熟ＦＩＸは、Ｎ末端からＣ末端への構成で、ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン、及びプロテアーゼ（または触媒）ドメインである数種のドメインからなる。短いリンカーがＥＧＦ２ドメインをＡＰドメインに結合している。ＦＩＸは、それぞれＲ１４５〜Ａ１４６及びＲ１８０〜Ｖ１８１によって形成される２の活性化ペプチドを含有する。活性化に続いて、上記単鎖ＦＩＸは２の連鎖がジスルフィド結合によって連結された二本鎖分子となる。凝固因子を、該因子の活性化ペプチドを置換することによって操作してもよく、その結果活性化特異性が変化する。哺乳類動物において、第ＩＸａ因子を産生するためには、成熟したＦＩＸが活性化された第ＸＩ因子によって活性化される必要がある。ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化に際して、上記プロテアーゼドメインがＦＩＸの触媒活性を提供する。活性化された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）が第ＦＩＸａ因子の活性を完全に発現させるための特異的な補因子である。
【０１０３】
他の実施形態において、ＦＩＸポリペプチドは、Ｔｈｒ１４８対立遺伝子形態の血漿由来の第ＩＸ因子を含み、内因性第ＩＸ因子と同様の構造的及び機能的特徴を有する。
【０１０４】
機能を有する非常に多くのＦＩＸ変異体が公知である。国際公開第ＷＯ０２／０４０５４４Ａ３号は、４ページ、９〜３０行及び１５ページ、６〜３１行に、ヘパリンによる阻害に対する向上した抵抗性を示す変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０３／０２０７６４Ａ２号は、表２及び表３（１４〜２４ページ）及び１２ページ、１〜２７行に、低下したＴ細胞免疫原性のＦＩＸ変異体を開示する。国際公開第ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２号は、４ページ、１行〜１９ページ、１１行に、増加したタンパク質安定性、増加したインビボ及びインビトロ半減期、及びプロテアーゼに対する増加した耐性を示す、機能を有する変異ＦＩＸ分子を開示する。ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２も、１９ページ、１２行〜２０ページ、９行に、キメラ及び他の変異体ＦＩＸ分子を開示する。国際公開第ＷＯ０８／１１８５０７Ａ２号は、５ページ、１４行〜６ページ、５行に、増加した凝固活性を示すＦＩＸ変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０９／０５１７１７Ａ２号は、９ページ、１１行〜２０ページ、２行に、Ｎ結合及び／またはＯ結合グリコシル化部位の数が増加し、その結果増加した半減期及び／または回収率を有するＦＩＸ変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号も、２ページ、段落［００６］〜５ページ、段落［０１１］及び１６ページ、段落［０４４］〜２４ページ、段落［０５７］に、グリコシル化部位の数が増加した第ＩＸ因子変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０９／１３０１９８Ａ２号は、４ページ、２６行〜１２ページ、６行に、グリコシル化部位の数が増加し、その結果半減期が増加した機能性変異体ＦＩＸ分子を開示する。国際公開第ＷＯ０９／１４００１５Ａ２号は、１１ページ、段落［００４３］〜１３ページ、段落［００５３］に、ポリマー（例えばＰＥＧ）の複合化に用いることができるＣｙｓ残基の数が増加した、機能性ＦＩＸ変異体を開示する。２０１１年７月１１日に出願され、２０１２年１月１２日にＷＯ２０１２／００６６２４として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９号に記載のＦＩＸポリペプチドも、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０５】
また、血友病患者において、機能しない数百種のＦＩＸにおける突然変異体が特定されており、それらの多くが国際公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号の１１〜１４ページ、表５に開示される。かかる機能しない突然変異体は本発明には含まれないが、如何なる突然変異体によって、機能性ＦＩＸポリペプチドが生じる可能性がより高いかまたはより低いかに関する更なる指針を提供する。
【０１０６】
一実施形態において、上記ＦＩＸポリペプチド（または融合ポリペプチドの第ＩＸ因子部分）は、配列番号１または２に示される配列（配列番号１または２のアミノ酸１〜４１５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、あるいはプロペプチド配列と共に、またはプロペプチド配列及びシグナル配列と共に（全長ＦＩＸ）含む。別の実施形態において、上記ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
第ＩＸ因子の凝固活性は国際単位（複数可）（ＩＵ）として表される。１ＩＵのＦＩＸ活性は、１ミリリットルの正常なヒト血漿中のＦＩＸの量にほぼ相当する。第ＩＸ因子活性の測定には、１段階凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間、ａＰＴＴ）、トロンビン生成時間（ＴＧＡ）及び回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））を含むいくつかのアッセイが利用可能である。本発明は、ヒト、非ヒト霊長動物、（家畜を含む）哺乳動物由来などの天然の、及びＦＩＸの生物学的活性または生物学的機能の少なくとも一部を保持している非天然配列変異体である、及び／または凝固因子関連の疾患、欠乏、障害または疾病（例えば、外傷、外科手術に関連した凝固因子の欠乏の出血症状の発現）の予防、治療、調節、または改善に有用な、ＦＩＸ配列、配列断片に対する相同性を有する配列を企図する。ヒトＦＩＸに対する相同性を有する配列は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴなどの標準的な相同性検索技法によって見出すことができる。
【０１０８】
ＩＩ．Ｂ．異種部分
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内の１または複数の部位に挿入された、Ｃ末端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１の異種部分を有していてもよく、凝血促進活性を有し、且つ宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。「異種部分」は異種ポリペプチド部分、もしくは非ポリペプチド部分、またはそれらの両方を含んでいてもよい。ある特定の態様において、上記異種部分はＸＴＥＮである。いくつかの態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内の１または複数の部位に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮを含む。他の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内の１または複数の部位に挿入された少なくとも１の異種部分を含み、該異種部分は半減期を延長する部分（例えば、インビボで半減期を延長する部分）である。
【０１０９】
当該ＦＩＸがその凝血促進活性の少なくとも一部を保持する挿入部位を見出すことによって、１または複数のこれらの同一の部位においてＦＩＸタンパク質に融合される場合に、半減期の延長を伴う体系化されていないまたは体系化された特性のいずれかを有する他のペプチド及びポリペプチドを挿入することが可能になると考えられる。異種部分（例えば半減期を延長する部分）の非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ＦｃＲｎ結合パートナー、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、ペプチドが挙げられ、５０％未満〜５０％超の異なる程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される２種のアミノ酸の、６〜４０のアミノ酸の短いポリペプチドがとりわけ、ＦＩＸの上記特定された活性な挿入部位に挿入するのに適していると思われる。
【０１１０】
ある特定の態様において、異種部分は本ＦＩＸ融合タンパク質のインビボまたはインビトロ半減期を増加させる。他の態様において、異種部分は本ＦＩＸ融合タンパク質の可視化及び位置の特定を容易にする。ＦＩＸ融合タンパク質の可視化及び／または位置の特定は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはそれらの組み合わせとすることができる。他の態様において、異種部分は本ＦＩＸ融合タンパク質の安定性を増加させる。本明細書では、「安定性」という用語は、本技術分野で認知された、環境条件（例えば、高いまたは低い温度）に対して、本ＦＩＸ融合タンパク質の１または複数の物理的特性が維持されることの尺度を指す。ある特定の態様において、上記物理的特性は本ＦＩＸ融合タンパク質の共有結合構造の維持（例えば、タンパク質分解切断、不要な酸化または脱アミド化がないこと）である。他の態様において、上記物理的特性は、本ＦＩＸ融合タンパク質が適切に折り畳まれた状態で存在していること（例えば、可溶性または不溶性の凝集体または沈殿物がないこと）である場合もある。一態様において、上記本ＦＩＸ融合タンパク質の安定性は、当該ＦＩＸ融合タンパク質の生物物理学的特性、例えば、熱安定性、ｐＨ−アンフォールディングプロファイル、グリカンの安定な除去、溶解性、生化学的機能（例えば、他のタンパク質に結合する能力）など、及び／またはそれらの組み合わせをアッセイすることによって測定される。別の態様において、生化学的機能は相互作用の結合親和性によって実証される。一態様において、タンパク質の安定性の1つの尺度は熱安定性、すなわち熱負荷に対する耐性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）等の当該分野で公知の方法を用いて測定することができる。熱安定性の測定方法としては、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）、及び熱負荷アッセイが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１１１】
特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質中の１または複数の挿入部位に挿入された異種部分は当該ＦＩＸ融合タンパク質の生化学的活性を保持する。特定の実施形態において、上記異種部分はＸＴＥＮである。一実施形態において、上記生化学的活性はＦＩＸ活性であり、該活性は発色アッセイによって測定することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１の異種部分は、該異種部分のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置するリンカーを介して挿入部位に間接的に挿入されている。上記異種部分のＮ末端及びＣ末端のリンカーは同一であるかまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、いくつかのリンカーが、上記異種部分の一方または両方の末端にタンデムで隣接していてもよい。いくつかの実施形態において、上記リンカーは「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」である。「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」とという用語はグリシン及びセリン残基を含むペプチドを指す。
【０１１３】
例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーとしては、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１６１）（但し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００に等しいかそれ以上の整数）が挙げられるが、これに限定はされない。一実施形態において、ｎ＝１、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１６１）である。一実施形態において、ｎ＝２、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。別の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１７２）である。別の実施形態において、ｎ＝４、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１７３）である。別の実施形態において、ｎ＝５、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１７４）である。更に別の実施形態において、ｎ＝６、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号１７５）である。別の実施形態において、ｎ＝７、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１７６）である。更に別の実施形態において、ｎ＝８、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号１７７）である。別の実施形態において、ｎ＝９、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１７８）である。更に別の実施形態において、ｎ＝１０、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号１７９）である。
【０１１４】
別の例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１８０）（但し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００に等しいかそれ以上の整数）を含む。一実施形態において、ｎ＝１、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１８０）である。一実施形態において、ｎ＝２、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１８１）である。別の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１８２）である。別の実施形態において、ｎ＝４、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１８３）である。別の実施形態において、ｎ＝５、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）である。更に別の実施形態において、ｎ＝６、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号１８５）である。更に別の実施形態において、ｎ＝７、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１８６）である。更に別の実施形態において、ｎ＝８、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号１８７）である。更に別の実施形態において、ｎ＝９、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１８８）である。更に別の実施形態において、ｎ＝１０、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号１８９）である。
【０１１５】
ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された挿入部位に挿入された１の異種部分を含む。他の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された２の挿入部位に挿入された２の異種部分を含む。ある特定の実施形態において、上記２の異種部分は、表８に列挙された２の挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された３の挿入部位に挿入された３の異種部分を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された４の挿入部位に挿入された４の異種部分を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された５の挿入部位に挿入された５の異種部分を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された６の挿入部位に挿入された６の異種部分を含む。いくつかの態様において、上記全ての挿入された異種部分は同一である。他の態様において、上記挿入された異種部分の少なくとも１は、残余の挿入された異種部分と異なる。
【０１１６】
上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮへの上記ＦＩＸポリペプチドの融合は、本発明の融合タンパク質の物理的または化学的特性、例えば薬物動態に影響を与えることができる。特定の実施形態において、ＦＩＸタンパク質に連結した上記異種部分は、少なくとも1種の薬物動態学的特性増加させ、例えば、増加した終末相半減期または増加した曲線下面積（ＡＵＣ）とし、その結果、本明細書に記載の融合タンパク質は、野生型ＦＩＸまたは当該異種部分をもたない対応するＦＩＸと比較して、長い期間インビボに留まる。更なる実施形態において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、少なくとも1種の薬物動態学的特性、例えば、終末相半減期の増加、皮下投与に対する回収率の増加及び／または生物学的利用能の増加、曲線下面積（ＡＵＣ）の増加を増加させ、その結果、本明細書に記載の融合タンパク質は、野生型ＦＩＸまたは当該異種部分をもたない対応するＦＩＸと比較して、長い期間インビボに留まる。
【０１１７】
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質の半減期を増加させる異種部分は、限定はされないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、変異体、もしくは組み合わせを含む。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は半減期を増加させる異種ポリペプチドを含み、該異種ポリペプチドはＸＴＥＮ配列である。他の関連する態様において、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらの部分の任意の誘導体、変異体、もしくは組み合わせなどの非ポリペプチド部分のための結合部位を含んでいてもよい。
【０１１８】
他の実施形態において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は１または複数のポリマーに複合化している。上記ポリマーは水溶性または非水溶性であってよい。該ポリマーは、共有結合もしくは非共有結合でＦＩＸまたはＦＩＸに複合化した他の部分に結合していてもよい。上記ポリマーの非限定的な例としては、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイルモルホリン）であってよい。
【０１１９】
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、１、２、３またはそれ以上の異種部分を含み、該異種部分は、それぞれ同一または異なる分子であってよい。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は１または複数のＸＴＥＮを含む。他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は１または複数のＸＴＥＮ及び１または複数のＦｃドメインを含む。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸ内に挿入されたＸＴＥＮ及び該ＦＩＸのＣ末端に融合されたＦｃを含んでいてもよい。
【０１２０】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、天然ＦＩＸ、ｒＦＩＸＦｃ、またはＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌと比較して増加したインビボ半減期を有し得る。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記異種部分をもたない天然ＦＩＸと比較して、または上記異種部分をもたないＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍長いインビボ半減期を有することができる。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記異種部分をもたない上記ＦＩＸポリペプチドよりも２倍を超える長さのインビボ半減期を有する。
【０１２１】
他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質のインビボ半減期は、異種部分をもたないＦＩＸポリペプチドのインビボ半減期よりも、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、または少なくとも約３４時間長くてもよい。
【０１２２】
ＩＩ．Ｂ．１．ＸＴＥＮ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分はＸＴＥＮである。本明細書では、「ＸＴＥＮ配列」とは、生理学的条件下で二次または三次構造をとることがないまたはその程度が小さい配列を有する、主として小さな親水性アミノ酸からなる、非天然起源の、実質的に非反復配列を有する、長尺のポリペプチドを指す。ＸＴＥＮは、融合タンパク質のパートナーとして、本発明のＦＩＸ配列に連結されて融合タンパク質を創生した場合に、ある特定の所望の薬物動態学的、物理化学的及び薬学的特性を与える運搬体として作用することができる。かかる望ましい特性としては向上した薬物動態学的パラメータ及び溶解特性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書では、「ＸＴＥＮ」には、詳細には、単鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片などの抗体あるいは抗体断片は含まれない。
【０１２３】
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、本ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、且つ宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。ある特定の態様において、２の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、３の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、４の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、５の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、６の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明にとって有用なＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００よりも多いアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態において、ＸＴＥＮは、約２０を超えて約３０００までのアミノ酸残基、３０を超えて約２５００までの残基、４０を超えて約２０００までの残基、５０を超えて約１５００までの残基、６０を超えて約１０００までの残基、７０を超えて約９００までの残基、８０を超えて約８００までの残基、９０を超えて約７００までの残基、１００を超えて約６００までの残基、１１０を超えて約５００までの残基、または１２０を超えて約４００までの残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。１つの特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、長さが４２のアミノ酸よりも長く且つ１４４のアミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
本発明のＸＴＥＮ配列は、５〜１４（例えば９〜１４）のアミノ酸残基の配列モチーフまたは該配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよく、上記モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）からなる群より選択される４〜６種のアミノ酸（例えば５種のアミノ酸）を含む、上記アミノ酸から本質的に構成される、または上記アミノ酸から構成される。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは、非オーバーラッピング配列モチーフであって、該配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％が、表２Ａから選択される単一モチーフファミリーから選択される非オーバーラッピング配列の複数のユニットからなり、その結果ファミリーモチーフとなる上記非オーバーラッピング配列モチーフを含む。本明細書では、「ファミリー」とは、上記ＸＴＥＮが、表２Ａの単一モチーフカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ  ＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有すること、及びファミリーモチーフに属さない当該ＸＴＥＮ中の他のアミノ酸が、コード化ヌクレオチドによる制限部位の組み込み、切断部位の組み込みを可能にするなどの必要な特性を実現するように、またはＦＩＸへのより良好な連結を実現するように選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリーのいくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリーの、またはＡＥモチーフファミリーの、またはＡＦモチーフファミリーの、またはＡＧモチーフファミリーの、またはＡＭモチーフファミリーの、またはＡＱモチーフファミリーの、またはＢＣファミリーの、またはＢＤファミリーのモチーフファミリーの非オーバーラッピング配列モチーフの複数のユニットを含み、得られるＸＴＥＮは上記の範囲の相同性を示す。他の実施形態において、上記ＸＴＥＮは表２Ａのモチーフファミリーの２つ以上のモチーフ配列の複数のユニットを含む。これらの配列を選択して、以下により詳細に説明する、当該モチーフのアミノ酸組成によって付与される、正味電荷、親水性、二次構造をとらないこと、または反復性がないことなどの特性を含む、所望の物理的／化学的特性を実現することができる。本段落に上述の実施形態において、上記ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフを、本明細書に記載の方法を用いて選択し且つ組み立てて、約３６〜約３０００のアミノ酸残基のＸＴＥＮを得ることができる。
【表２Ａ−１】
2018522563.tif 000004
【表２Ａ−２】
2018522563.tif 000005
【０１２７】
ＦＩＸ中への挿入またはＦＩＸへの連結のためのＸＴＥＮは様々な長さを有していてよい。一実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列（複数可）の長さは本融合タンパク質において達成されるべき特性または機能に基づいて選択される。ＸＴＥＮは、意図する特性または機能に応じて、短いもしくは中間の長さの配列または、運搬体としての役割を果たすことができるより長い配列であってもよい。ある特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、約６〜約９９アミノ酸残基の短いセグメント、約１００〜約３９９のアミノ酸残基の中間の長さ、ならびに約４００〜約１０００の及び最大で約３０００のアミノ酸残基のより長い長さを含む。したがって、ＦＩＸ中に挿入されたまたはＦＩＸに連結された上記ＸＴＥＮは、長さが、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または最大で３０００のアミノ酸残基の長さであってよい。他の実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、長さが、約６〜約５０、約５０から約１００、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００、または約２０００〜約３０００のアミノ酸残基である。ＦＩＸ中に挿入されたまたはＦＩＸに連結されたＸＴＥＮの正確な長さは、上記ＦＩＸの活性に悪影響を与えることなく変化し得る。一実施形態において、本明細書で用いられる１または複数のＸＴＥＮは、４２のアミノ酸、７２のアミノ酸、１４４のアミノ酸、２８８のアミノ酸、５７６のアミノ酸、または８６４のアミノ酸の長さを有し、且つ上記ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤの１または複数から選択することができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明で用いられるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。１つの特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１２９】
一実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号２１７）、ＡＥ４２（配列番号３４）、ＡＥ７２（配列番号３５）、ＡＥ７８（配列番号２１８）、ＡＥ１４４（配列番号３６）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号３７）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号３８）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号３９）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号４０）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号４１）、ＡＧ１４４（配列番号４２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号４３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号４４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号４５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号４６）、ＡＥ２８８（配列番号４７）、ＡＥ２８８＿２（配列番号４８）、ＡＧ２８８（配列番号４９）、ＡＥ５７６（配列番号５０）、ＡＧ５７６（配列番号５１）、ＡＥ８６４（配列番号５２）、ＡＧ８６４（配列番号５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿１（配列番号２０２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号２０３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号２０４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２（配列番号２０５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号２０６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿５Ａ＿２（配列番号２０７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号２０８）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号２０９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配列番号２１０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号２１１）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４＿１Ａ（配列番号２１２）、ＡＥ１５０（配列番号２１３）、ＡＧ１５０（配列番号２１４）、ＡＥ２９４（配列番号２１５）、ＡＧ２９４（配列番号２１６）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮの１００％未満のアミノ酸が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択され、または該配列の１００％未満が、表２Ａの配列モチーフまたは表２ＢのＸＴＥＮ配列からなる。かかる実施形態において、上記ＸＴＥＮの残余のアミノ酸残基は、その他の１４種の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかから選択されるが、上記ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の親水性アミノ酸を含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択されてもよい。上記複合化構築物において利用される上記ＸＴＥＮ中の疎水性アミノ酸の含有量は、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量であってよい。ＸＴＥＮの構築においてあまり好ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンが挙げられる。また、ＸＴＥＮ配列中の以下のアミノ酸、すなわち、メチオニン（例えば、酸化を回避するため）、またはアスパラギン及びグルタミン（脱アミド化を回避するため）の含有量は、５％未満もしくは４％未満もしくは３％未満もしくは２％未満もしくは１％未満であってもよく、またはＸＴＥＮは上記アミノ酸を含まなくてもよい。
【０１３１】
別の実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号２１７）、ＡＥ４２（配列番号３４）、ＡＥ７２（配列番号３５）、ＡＥ７８（配列番号２１８）、ＡＥ１４４（配列番号３６）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号３７）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号３８）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号３９）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号４０）、Ａ１４４＿６Ｂ（配列番号４１）、ＡＧ１４４（配列番号４２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号４３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号４４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号４５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号４６）、ＡＥ２８８（配列番号４７）、ＡＥ２８８＿２（配列番号４８）、ＡＧ２８８（配列番号４９）、ＡＥ５７６（配列番号５０）、ＡＧ５７６（配列番号５１）、ＡＥ８６４（配列番号５２）、ＡＧ８６４（配列番号５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿１（配列番号２０２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号２０３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号２０４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２(配列番号２０５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号２０６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿５Ａ＿２（配列番号２０７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号２０８）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号２０９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配列番号２１０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号２１１）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４＿１Ａ（配列番号２１２）、ＡＥ１５０（配列番号２１３）、ＡＧ１５０（配列番号２１４）、ＡＥ２９４（配列番号２１５）、ＡＧ２９４（配列番号２１６）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、及びＡＥ２８８からなる群より選択される。本発明の特定のＸＴＥＮ配列のアミノ酸配列を表２Ｂに示す。
【表２Ｂ−１】
2018522563.tif 000006
【表２Ｂ−２】
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【表２Ｂ−３】
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【表２Ｂ−４】
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【表２Ｂ−５】
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【０１３２】
更なる実施形態において、本発明で用いられるＸＴＥＮ配列は、本発明の融合タンパク質の物理的または化学的特性、例えば薬物動態に影響を及ぼす。本発明で用いられるＸＴＥＮ配列は、以下の有利な特性、すなわち、立体構造の柔軟性、水に対する高い溶解性、高いプロテアーゼ耐性、低免疫原性、哺乳動物の受容体への低結合性、または流体力学的（またはストークス）半径の増加の1種または複数種を示すことができる。特定の実施形態において、本発明におけるＦＩＸタンパク質に連結されたＸＴＥＮ配列は、より長い終末相半減期、増加した生物学的利用能または曲線下面積（ＡＵＣ）など、薬物動態学的特性を増加させ、その結果、本明細書に記載のタンパク質は、野生型ＦＩＸと比較して、長い期間インビボに留まる。更なる実施形態において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、より長い終末相半減期または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加などの薬物動態学的特性を増加させ、その結果、ＦＩＸタンパク質は、野生型ＦＩＸと比較して、長い期間インビボに留まる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、上記ＦＩＸタンパク質は、天然のＦＩＸ、ｒＦＩＸＦｃ、ＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌ、もしくは上記ＸＴＥＮをもたない対応するＦＩＸタンパク質よりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍長いインビボ半減期を示す。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質のインビボ半減期は、異種部分をもたないＦＩＸポリペプチドよりも２倍を超えて長い場合がある。
【０１３４】
他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分をもたないＦＩＸポリペプチドのインビボ半減期よりも、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、または少なくとも約３４時間長いインビボ半減期を示す。
【０１３５】
上記ＸＴＥＮ配列を含むタンパク質の物理的／化学的特性を決定するために、様々な方法及びアッセイを用いることができる。かかる方法としては、分析用遠心法、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光分析、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、及びＵＶ／可視分光法が挙げられるが、これらに限定はされない。更なる方法がＡｍａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  ４８，１−１３（２００６）に開示される。
【０１３６】
本発明に従って用いることができるＸＴＥＮの更なる例が米国特許公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、第２０１１／００４６０６０Ａ１号、第２０１１／００４６０６１Ａ１号、第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もしくは第２０１１／１７２１４６Ａ１号、または国際特許公開第ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１号、第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２号、第ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２号、または第２０１５／０２３８９１号に記載される。
【０１３７】
いくつかの態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入されているか、ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である１または複数のＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列はＧＬＡドメイン内に挿入されている。別の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列はＥＧＦ１ドメイン内に挿入されている。他の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列はＥＧＦ２内に挿入されている。更に他の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列はＡＰ内に挿入されている。更に他の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列は触媒ドメイン内に挿入されている。いくつかの実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列は上記ＦＩＸのＣ末端に融合されている。
【０１３８】
特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される挿入部位に挿入された１または複数のＸＴＥＮ配列を含む。他の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される２の挿入部位に挿入された２のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様において、上記２のＸＴＥＮ配列は表８に列挙される２の挿入部位に挿入されている。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される３の挿入部位に挿入された３のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される４の挿入部位に挿入された４のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される５の挿入部位に挿入された５のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される６の挿入部位に挿入された６のＸＴＥＮ配列を含む。いくつかの態様において、全ての上記挿入されたＸＴＥＮ配列は同一である。他の態様において、少なくとも１の上記挿入されたＸＴＥＮ配列は残余の挿入されたＸＴＥＮ配列と異なる。
【０１３９】
いくつかの態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入された１のＸＴＥＮを含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。いくつかの態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に第２のＸＴＥＮを含むか、または第２のＸＴＥＮは上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。１つの特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸのＣ末端に融合された１のＸＴＥＮ配列を含み、該ＸＴＥＮは、長さが４２のアミノ酸よりも長く且つ１４４のアミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
ＩＩ．Ｂ．２．Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、Ｆｃ領域（例えば、ＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片である。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ内に挿入された、該ＦＩＸのＣ末端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１のＦｃ領域（例えば、ＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、且つ宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。本明細書では、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは、別段の明示がない限り、Ｆｃドメイン、その変異体、または断片を含む機能性胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーであってもよい。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合することができ、その結果として生じる、アルブミンを始めとする、但しそれには限定されない、当該ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による能動輸送を伴う任意の分子である。したがって、Ｆｃという用語は、機能性である、ＩｇＧ  Ｆｃの任意の変異体を包含する。上記ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９（１９９４））。上記Ｆｃの上記ＦｃＲｎとの主要な接触領域はＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの接合部の近傍である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触部は全て単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、及びＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他の断片が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を伴なってまたは伴わずに免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。融合タンパク質中でＦｃ領域の所望の特性、例えば、半減期、例えばインビボ半減期の増加を維持するＦｃ断片、変異体、または誘導体も含まれる。無数の突然変異体、断片、変異体及び誘導体が、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０６９１６４Ａ２号、第ＷＯ２０１２／００６６２３Ａ２号、第ＷＯ２０１２／００６６３５Ａ２号、または第ＷＯ２０１２／００６６３３Ａ２号等に記載されており、これらは全て、それらの全体が本明細書に参照により援用される。
【０１４１】
上記１または複数のＦｃドメインは、上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入されているか、該ポリペプチドのＣ末端に融合されているか、またはその両方であってよい。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃドメインは上記ＦＩＸポリペプチドに融合されている。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃドメインは、ＸＴＥＮなどの、上記ＦＩＸ内に挿入されているかまたは上記ＸＴＥＮのＣ末端に融合されている別の異種部分に融合されている。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は第２のＦｃドメインを含む。第２のＦｃドメインは、例えば、１または複数の共有結合を介して第１のＦｃドメインと会合していてもよい。
【０１４２】
ＩＩ．Ｂ．３．アルブミン
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、もしくはアルブミン結合低分子、またはそれらの変異体、誘導体もしくは断片である。特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸ内に挿入された、上記ＦＩＸのＣ末端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１のアルブミンポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、その完全長の形態で６０９のアミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧の相当部分を担い、且つ内因性及び外因性リガンドの運搬体としても作用する。本明細書では、「アルブミン」という用語は、完全長アルブミンまたはその機能を有する断片、変異体、誘導体、または類似体を包含する。アルブミンまたはその断片もしくは変異体の例は、米国特許公開第２００８／０１９４４８１Ａ１号、第２００８／０００４２０６Ａ１号、第２００８／０１６１２４３Ａ１号、第２００８／０２６１８７７Ａ１号、もしくは第２００８／０１５３７５１Ａ１号、またはＰＣＴ出願公開第２００８／０３３４１３Ａ２号、第２００９／０５８３２２Ａ１号、または第２００７／０２１４９４Ａ２号に開示され、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【０１４３】
アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）は、限定されるものではないが、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンに結合することができるアルブミン結合抗体断片を損なう場合がある。Ｋｒａｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８：１９０−１９４（１９９６）及びＬｉｎｈｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１１：２０６−２１３（２００２）によって開示されたレンサ球菌タンパク質Ｇ由来のドメイン３が細菌アルブミン結合ドメインの例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、核となる配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１６３）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）を参照されたい。アルブミン結合抗体断片の例は、Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９−３２６（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３−３１７（２００７），及びＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．，２１：２８３−２８８（２００８）に開示され、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【０１４４】
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入された、該ＦＩＸのＣ末端に融合された、またはそれらの両方であるアルブミンに結合することができる非ポリペプチド低分子、その変異体、または誘導体（例えばアルブミン結合低分子）のための少なくとも１の結合部位を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。例えば、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、１または複数の挿入部位で上記ＦＩＸ内に結合された、または該ＦＩＸのＣ末端に融合された１または複数の有機アルブミン結合部分を含んでいてもよく、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。かかるアルブミン結合部分の一例には、Ｔｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０：２２８６−２２９２（２００９）によって開示される２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）がある。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、上記アルブミン結合ポリペプチド配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接している。いくつかの実施形態において、上記Ｇｌｙ−ＳｅｒペプチドリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態において、上記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
【０１４６】
ＩＩ．Ｂ．４．ＣＴＰ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその断片、変異体もしくは誘導体である。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少なくとも１のＣＴＰまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。組換えタンパク質中に挿入された１または複数のＣＴＰペプチドは、当該のタンパク質の半減期を増加させることが知られている。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたい。例示的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号１６４）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１６５）が挙げられる。例えば、参照により援用される、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１Ａ１号を参照されたい。いくつかの実施形態において、上記ＣＴＰ配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接する。いくつかの実施形態において、上記Ｇｌｙ−ＳｅｒペプチドリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態において、上記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
【０１４７】
ＩＩ．Ｂ．５．ＰＡＳ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分はＰＡＳペプチドである。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少なくとも１つのＰＡＳペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。本明細書では、「ＰＡＳペプチド」または「ＰＡＳ配列」とは、主としてアラニン及びセリン残基を含む、または主としてアラニン、セリン及びプロリン残基を含み、生理学的条件下でランダムコイルの立体構造を形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、上記ＰＡＳ配列は、本融合タンパク質中において上記異種部分の一部として用いることができる、アラニン、セリン、及びプロリンを含む、それらから本質的になる、もしくはそれらからなる、ビルディングブロック、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。アミノ酸ポリマーは、アラニン、セリン、及びプロリン以外の残基がＰＡＳ配列中の微量成分として添加される場合、ランダムコイル立体構造を形成することもできる。「微量成分」とは、アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸が、ある程度まで、例えば、アミノ酸の約１２％、すなわち上記ＰＡＳ配列の１００のアミノ酸の約１２まで、約１０％まで、約９％まで、約８％まで、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち約２％、または約１％、上記ＰＡＳ配列中に添加されていてもよいことを意味する。上記アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸は、Ａｌｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択することができる。生理学的条件下では、ＰＡＳペプチドはランダムコイル立体構造を形成し、それにより本発明の組換えタンパク質に対してインビボ及び／またはインビトロ安定性の増加を媒介することができ、凝血促進活性を有する。
【０１４８】
上記ＰＡＳペプチドの非限定的な例としては、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号１５４）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１５５）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１５６）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１５７）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１５８）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１５９）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１６０）またはそれらの任意の変異体、誘導体、断片、もしくは組み合わせが挙げられる。ＰＡＳ配列の更なる例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２９２１３０Ａ１号及びＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１号から公知である。欧州交付特許第２１７３８９０号。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、上記ＰＡＳ配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接する。いくつかの実施形態において、上記Ｇｌｙ−ＳｅｒペプチドリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態において、上記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
【０１５０】
ＩＩ．Ｂ．６．ＨＡＰ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、ホモ−アミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体である。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸ内に挿入されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少なくとも１のホモ−アミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０のアミノ酸、少なくとも１００のアミノ酸、１２０のアミノ酸、１４０のアミノ酸、１６０のアミノ酸、１８０のアミノ酸、２００のアミノ酸、２５０のアミノ酸、３００のアミノ酸、３５０のアミノ酸、４００のアミノ酸、４５０のアミノ酸、または５００のアミノ酸の長さであるグリシンの反復配列を含んでいてよい。ＨＡＰ配列は、当該ＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半減期を延長することができる。上記ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、それらに限定はされないが、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられ、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。一実施形態において、ｎは、２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態において、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０：２７３−２８４（２００７）を参照されたい。
【０１５１】
ＩＩ．Ｂ．７．有機ポリマー
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリシアル酸、またはヒドロキシエチルデンプンである。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である非ポリペプチド異種部分またはその断片、変異体、もしくは誘導体のための少なくとも１の結合部位を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。例えば、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸ配列内に結合されているか、該ＦＩＸのＣ末端に結合されているか、またはそれらの両方である１または複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでいてもよく、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。
【０１５２】
ペグ化ＦＩＸは、ＦＩＸと少なくとも１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間で形成される複合体を指すことができる。多種多様な分子量及び平均分子量範囲のＰＥＧが市販されている。ＰＥＧの平均分子量範囲の一般的な例としては、約２００、約３００、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、約６００００、及び約８００００ダルトンが挙げられるが、これらに限定はされない。これらの平均分子量は単なる例として記載されており、何ら限定することを意味するものではない。
【０１５３】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、ペグ化してモノまたはポリ（例えば、２〜４）ＰＥＧ部分を含んでいてもよい。ペグ化は本技術分野で公知のペグ化反応のいずれかによって行うことができる。ペグ化タンパク質生成物の調製方法は、概括的には、（ｉ）ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と、本発明のペプチドが１または複数のＰＥＧ基に結合した状態となる条件下で反応させること、及び（ｉｉ）反応生成物を得ることを含むこととなる。一般に、当該反応の最適反応条件は、既知のパラメータ及び所望の結果に基づいて個々の場合に応じて決定される。
【０１５４】
当業者に利用可能ないくつかのＰＥＧ結合方法、例えば、Ｍａｌｉｋ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−３５（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４−１０（１９９２）；欧州特許公開第ＥＰ０４０１３８４号、第ＥＰ０１５４３１６号、及び第ＥＰ０４０１３８４号；及び国際特許出願公開第Ｗ０９２／１６２２１号及び第ＷＯ９５／３４３２６号がある。非限定的な例として、ＦＩＸ変異体は、本明細書に記載の１または複数の挿入部位またはその付近でのシステイン置換を含んでいてもよく、該システインはＰＥＧポリマーに更に複合化されていてもよい。参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０−２７９（２０１０）及び米国特許第７，６３２，９２１号を参照されたい。
【０１５５】
他の実施形態において、上記有機ポリマーはポリシアル酸（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、特定の細菌株によって及びある特定の細胞中の哺乳動物中で産生される、天然起源のシアル酸の非分枝ポリマーである。例えば、Ｒｏｔｈ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ｉｎ  Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍａｎ，ｅｄｓ．Ｒｏｔｈ  Ｊ．，Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ  Ｕ．，Ｔｒｏｙ  Ｆ．Ａ．（ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），ｐｐ．３３５−４８を参照されたい。ＰＳＡは、限定された酸加水分解またはノイラミニダーゼによる消化、または天然の、細菌由来の形態のポリマーの分画によって、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基からｎ＝２までの様々な重合度で産生することができる。当業者に利用可能な多数のＰＳＡ結合方法、例えば上記の同一のＰＥＧ結合方法がある。ある特定の態様において、活性化したＰＳＡをＦＩＸ上のシステインアミノ酸残基に結合することもできる。例えば、米国特許第５８４６９５１号を参照されたい。
【０１５６】
他の実施形態において、上記有機ポリマーはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ポリマーである。特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、１または複数の部位で上記ＦＩＸ内に複合化されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少なくとも１のＨＥＳポリマーを含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。
【０１５７】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び製造方法
本発明は、更に、本明細書に記載のＦＩＸ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、上記ポリヌクレオチドもしくは上記ベクターを含む宿主細胞、または上記ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法を提供する。
【０１５８】
ＦＩＸ融合タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド配列、２のヌクレオチド配列、３のヌクレオチド配列、またはそれ以上であってよい。一実施形態において、単一のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチド及び異種部分（例えばＸＴＥＮ）を含むＦＩＸ融合タンパク質、例えば、ＦＩＸポリペプチド及び、該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されたＸＴＥＮ、該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されたＦｃドメイン、及び任意選択のリンカーによって上記ＦＩＸポリペプチドに融合された第２のＦｃドメインを含むＦＩＸ融合タンパク質をコードする。別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列はＦＩＸポリペプチド及び該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されたＸＴＥＮをコードし、第２のヌクレオチド配列は異種部分、例えばＦｃをコードする。他の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチド、該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されたＸＴＥＮ、及び該ＦＩＸポリペプチドに融合されたＦｃドメインをコードし、第２のヌクレオチド配列は第２のＦｃドメインをコードする。上記コードされたＦｃドメインは発現後に共有結合を形成してもよい。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドはコドン最適化されている。
【０１６０】
本明細書では、発現ベクターとは、適宜の宿主細胞に導入されたときに、挿入されたコード配列を転写及び翻訳するために必要な要素を含む任意の核酸構築物、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製及び翻訳するために必要な要素を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を包含することができる。
【０１６１】
本明細書では、遺伝子発現制御配列とは、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせなどの、当該遺伝子発現制御配列が作動可能に連結されたコード核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオチド配列である。上記遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの、哺乳動物またはウイルスのプロモーターであってよい。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子、すなわち、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーター、及び他の構成的プロモーターの遺伝子のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。真核細胞において構成的に作用するウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、及び他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとしては、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で誘導され、転写及び翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【０１６２】
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を用いることができる。これらの発現ベクターは、一般的には、宿主生物中でエピソームとしてまたは宿主の染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能である。発現ベクターは、プロモーター（例えば、天然に会合しているプロモーターまたは異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列を含む、但しこれらに限定されない発現制御配列を含んでいてもよい。上記発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核生物プロモーター系であることが好ましい。発現ベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルス由来のＤＮＡエレメントを利用することもできる。他の発現ベクターは内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を含む。
【０１６３】
一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする選別マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含む（例えば、Ｉｔａｋｕｒａｅｔａｌ、米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。当該ＤＮＡをその染色体中に組み込んだ細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選別を可能にする１種または複数種のマーカーを導入することによって選別することができる。上記マーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性、殺生剤耐性（例えば抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を付与することができる。上記選別可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接連結するか、または同時形質転換によって同一細胞中に導入するかのいずれかとすることができる。
【０１６４】
最適化されたＦＩＸ配列を発現するのに有用なベクターの例としてはＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）がある。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβ−グロビンの主要なプロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１及びエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びリーダー配列を含む。このベクターは、可変領域及び定常領域遺伝子を組み込み、細胞中にトランスフェクトし、続いてＧ４１８含有培地中において選別し、且つメトトレキセート増幅を行うと、抗体を非常に高レベルで発現することが見出されている。ベクター系は米国特許第５，７３６，１３７号及び第５，６５８，５７０号においても教示され、それらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に援用される。この系は高発現レベル、例えば３０ｐｇ超／細胞／日を与える。他の例示的なベクター系が、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０１６５】
他の実施形態において、本発明のポリペプチドは多シストロン性構築物を用いて発現される。これらの発現系においては、多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドなどの複数の目的とする遺伝子産物を、単一の多シストロン性構築物から産生させることができる。これらのシステムは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に用いて、真核生物宿主細胞において比較的高レベルのポリペプチドを与える。適合性のあるＩＲＥＳ配列が、これも本明細書に援用される、米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。
【０１６６】
より概括的には、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されれば、当該発現ベクターを適宜の宿主細胞に導入することができる。すなわち、上記宿主細胞を形質転換することができる。上記宿主細胞への上記プラスミドの導入は、上記に議論した、当業者に周知の様々な技法によって実現することができる。上記形質転換された細胞を、当該ＦＩＸポリペプチドの産生に適した条件下で増殖させて、ＦＩＸポリペプチドの合成に関してアッセイを行う。例示的なアッセイ技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞ソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【０１６７】
組換え宿主からポリペプチドを単離する方法の説明において、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、別段の明確な明示がない限り、ポリペプチドの供給源を表わすために同義で用いられる。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、遠沈した細胞全体から、または培地と懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物からのいずれかを意味する場合がある。
【０１６８】
タンパク質発現のために用いられる宿主細胞株は、好ましくは哺乳動物起源、最も好ましくはヒトまたはマウス起源の細胞株である。例示的な宿主細胞株は上述されている。ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの製造方法の一実施形態において、上記宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの製造方法の別の実施形態において、上記宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１６９】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌または酵母または植物細胞などの非哺乳動物細胞においても発現させることができる。この点に関して、細菌などの種々の単細胞非哺乳動物微生物、すなわち、培養または発酵で増殖させることができる微生物も形質転換させることができることが理解されよう。形質転換しやすい細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株などの腸内細菌科に属する細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。上記ポリペプチドは、細菌中で発現される場合、一般的には封入体の一部となることが更に理解されよう。上記ポリペプチドを単離し、精製し、次いで機能をもつ分子へと組み立てるする必要がある。
【０１７０】
あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子導入動物のゲノムへの導入及びその後の該遺伝子導入動物の乳における発現のための導入遺伝子中に組み込まれてもよい（例えば、Ｄｅｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，７４１，９５７，Ｒｏｓｅｎ，ＵＳ５，３０４，４８９，及びＭｅａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，８４９，９９２を参照のこと）。好適な導入遺伝子としては、カゼインまたはβ−ラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーター及びエンハンサーと作動可能に連結したポリペプチドのためのコード配列が挙げられる。
【０１７１】
インビトロでの産生により、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養技法は本技術分野で公知であり、例えば、エアリフト型反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一浮遊培養、または例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）または封入（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）細胞培養が挙げられる。必要及び／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後に、または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィーステップの前もしくはその後に、慣用的なクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたは（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。任意選択で、下流での精製を容易にするために、親和性タグ配列（例えば、Ｈｉｓ（６）タグ）を当該ポリペプチド配列内に結合させてもまたは含ませてもよい。
【０１７２】
発現後、本ＦＩＸタンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む、本技術分野の標準的な手順に従って精製してもよい（概括的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。医薬用途には、少なくとも約９０％〜９５％の均一性の実質的に純粋なタンパク質が好ましく、９８％〜９９％またはそれ以上の均一性の上記タンパク質が最も好ましい。
【０１７３】
一実施形態において、上記宿主細胞は真核細胞である。本明細書では、真核細胞とは明確な核を有する任意の動物または植物細胞を指す。動物の真核細胞としては、脊椎動物、例えば哺乳動物の細胞、及び無脊椎動物、例えば昆虫の細胞が挙げられる。植物の真核細胞としては、詳細には酵母細胞を挙げることができるが限定はされない。真核細胞は原核細胞、例えば細菌とは異なる。
【０１７４】
特定の実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は哺乳動物に由来する任意の細胞である。哺乳動物細胞としては、詳細には哺乳動物細胞株が挙げられるがこれらに限定はされない。一実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト胚性腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３細胞である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＲＬ−１５３３として、バージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより、及び２９３−Ｈ細胞、カタログ番号１１６３１−０１７または２９３−Ｆ細胞、カタログ番号１１６２５−０１９として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）より入手可能である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞は、網膜由来のヒト細胞株であるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞はＣｒｕｃｅｌｌ（オランダ国ライデン）より入手可能である。他の実施形態において、上記哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞はバージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能である。（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＣＬ−６）。更に他の実施形態において、上記哺乳動物細胞はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞はバージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能である。（例えば、ＣＲＬ−１６３２）。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞株であるＨＫＢ１１細胞である。Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２）：１６５−７８（２００６）。
【０１７５】
更に他の実施形態において、トランスフェクトされた細胞は安定にトランスフェクトされている。これらの細胞は、当業者に公知の従来の技法を用いて、安定な細胞株として選別し且つ維持することができる。
【０１７６】
本タンパク質のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞を適宜の増殖培地中で増殖させる。本明細書では、「適宜の増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要な栄養素を含む培地を意味する。細胞増殖に必要な栄養素としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及び成長因子を挙げることができる。任意選択で、上記培地は１種または複数種の選別因子を含有していてもよい。任意選択で、上記培地は仔ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有していてもよい。一実施形態において、上記培地は実質的にＩｇＧを含有しない。上記増殖培地は、一般に、例えば、薬物選別、または上記ＤＮＡ構築物上のもしくは該ＤＮＡ構築物と共に同時トランスフェクトされた選別可能なマーカーによって補完される必須栄養素の欠乏によって、上記ＤＮＡ構築物を含有する細胞を選別する。培養された哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で増殖させる。一実施形態において、上記培地はＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）である。別の実施形態において、上記培地はＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）である。用いられる特定の細胞株に適した培地の選択は当業者のレベル内である。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、上記核酸、ベクター、または宿主細胞は、タンパク質転換酵素をコードする更なるヌクレオチドを更に含む。上記タンパク質転換酵素は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、及びそれらの２種以上の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記タンパク質転換酵素はＰＡＣＥ、ＰＣ５またはＰＣ７である。特定の実施形態において、上記タンパク質転換酵素はＰＣ５またはＰＣ７である。参照により本明細書に援用される、国際出願公開第ＷＯ２０１２／００６６２３号を参照されたい。別の実施形態において、上記タンパク質転換酵素はＰＡＣＥ／フューリンである。
【０１７８】
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって製造されるＦＩＸ融合タンパク質に関する。
【０１７９】
ある特定の態様において、本発明の宿主細胞は、インビボまたはインビトロで本ＦＩＸ融合タンパク質を発現することができる。インビトロでの産生により、大量の所望の本発明の改変ポリペプチドを得るためのスケールアップが可能となる。ＦＩＸ融合タンパク質は、本ＦＩＸ融合タンパク質が発現される条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することによって産生することができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養技法は本技術分野で公知であり、例えば、エアリフト型反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一浮遊培養、または例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化または封入細胞培養が挙げられる。必要及び／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を、慣用的なクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。他の態様において、上記宿主細胞はインビボで本ＦＩＸ融合タンパク質を発現する。
【０１８０】
一実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法であって、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸのＣ末端に異種部分を融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が凝血促進活性を示す上記方法を含む。
【０１８１】
別の実施形態において、本発明は、ＦＩＸタンパク質の半減期を、該ＦＩＸタンパク質の凝血促進活性を失うまたは低下させることなく増加させる方法であって、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸのＣ末端に異種部分を融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が、凝血促進活性、及び上記異種部分をもたない上記ＦＩＸタンパク質と比較して半減期の増加を示す上記方法を含む。
【０１８２】
他の実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の構築方法であって、本明細書に記載の、挿入部位中の、上記ＦＩＸのＣ末端に融合した、またはそれらの両方の少なくとも１の異種部分を含む上記ＦＩＸ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を設計することを含む上記方法を提供する。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の発現の増加方法であって、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸのＣ末端に融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が凝血促進活性を示す上記方法を含む。
【０１８４】
更に他の実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の凝血促進活性の保持方法であって、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸのＣ末端に異種部分を融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が凝血促進活性を示す上記方法を提供する。
【０１８５】
ＩＶ．医薬組成物及び治療方法
本発明は、本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物を用いて、本方法を必要とするヒトの対象における凝固疾患もしくは疾病または出血性疾病の予防、治療、改善、または管理方法を更に提供する。例示的な方法は、治療上有効な量の本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物／製剤を、本方法を必要とする対象に投与することを含む。他の態様において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物が、それを必要とする対象に投与されてもよい。本発明のある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質を発現する細胞が、それを必要とする対象に投与されてもよい。本発明のある特定の態様において、上記医薬組成物は、（ｉ）ＦＩＸ融合タンパク質、（ｉｉ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする単離された核酸、（ｉｉｉ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、（ｉｖ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする単離された核酸及び／またはＦＩＸ融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む細胞、または（ｖ）それらの組み合わせを含み、当該医薬組成物は許容される賦形剤または担体を更に含む。
【０１８６】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、患者に静脈内投与、皮下投与、または経口投与することができる。ある特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は静脈内注射によって対象に投与される。他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、皮下注射によって対象に投与される。上記注射は単回ボーラスから構成されてもよい。対象は複数回の注射を受けてもよい。
【０１８７】
本発明の融合タンパク質は予防的に用いることができる。本明細書では、「予防的処置」という用語は、出血症状の発現の前に分子を投与することを指す。一実施形態において、一般的な止血剤を必要とする上記対象は、外科手術を受けているか、または受けようとしている。本発明の融合タンパク質を予防薬として術前または術後に投与してもよい。本発明の融合タンパク質を、急性出血症状の発現を制御するために、術中または術後に投与してもよい。上記外科手術としては、肝移植、肝切除、歯科処置、または幹細胞移植が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１８８】
本発明の融合タンパク質はオンデマンド処置にも用いられる。「オンデマンド処置」という用語は、出血症状の発現の徴候に応じて、または出血を起こす場合がある活動の前に融合タンパク質を投与することを指す。一態様において、上記オンデマンド処置は、受傷後などの出血が始まったとき、または外科手術の前などの出血が予期される場合に対象に施される。別の態様において、上記オンデマンド処置は、接触を伴うスポーツなどの出血の危険性を高める活動の前に施される。
【０１８９】
他の実施形態において、本融合タンパク質は、急性の出血症状の発現を制御、改善、または治療するために用いられる。他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記異種部分をもたない対応するＦＩＸタンパク質と比較して、１種または複数種の薬物動態学的パラメータを示す。ＰＫパラメータは、ＦＩＸ抗原レベル（本明細書中では、多くの場合、「抗原」として挿入句的に表記される。）またはＦＩＸ活性レベル（本明細書中では、多くの場合、「活性」として挿入句的に表記される。）を基にする場合がある。文献においては、多くの場合、一部の対象の血漿中に、投与された（すなわち外因性の）ＦＩＸを、ＦＩＸに対する抗体を用いて測定することができることに支障をきたす内因性の不活性なＦＩＸが存在するために、ＰＫパラメータはＦＩＸ活性レベルを基にしている。しかしながら、本明細書において提供されるＦｃ融合タンパク質の一部としてＦＩＸが投与される場合には、上記異種ポリペプチドに対する抗体を用いて、投与された（すなわち外因性の）ＦＩＸ抗原を正確に測定することができる。また、ある特定のＰＫパラメータはモデル予測データ（本明細書中では、多くの場合、「モデル予測」として挿入句的に表記される）または観察データ（本明細書中では、多くの場合、「観察」として挿入句的に表記される）を基にすることができ、好ましくは観察データを基にする。
【０１９０】
本ＦＩＸ融合タンパク質は、本技術分野で公知の任意の手段によって対象に投与することができる。例えば、本ＦＩＸ融合タンパク質は、局所（例えば、経皮または眼）、経口、頬側、鼻腔、膣、直腸、または非経口（例えば、皮下、皮内、血管内／静脈内、筋内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液包内、及び腹腔内注入）投与によって投与することができる。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は皮下注射によって投与される。上記皮下注射としては、例えば、本ＦＩＸ融合タンパク質の単回ボーラスを始めとする１回または複数回のボーラスを挙げることができる。あるいは、本ＦＩＸ融合タンパク質は、静脈内注射によって投与することができる。
【０１９１】
本ＦＩＸ融合タンパク質の用量は、特定の融合タンパク質の性質及び対象の疾病の性質に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質の用量は、１〜１０００ＩＵ／ｋｇの間の本ＦＩＸ融合タンパク質を含んでいてもよい。
【０１９２】
出血性疾病は血液凝固障害により起こる場合がある。血液凝固障害は凝血異常と呼ばれる場合もある。一例において、本開示の医薬組成物によって治療することができる血液凝固障害は血友病である。別の例において、本開示の医薬組成物によって治療することができる血液凝固障害は血友病Ｂである。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、出血性疾病に関連する出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）の種類は、関節内出血、筋肉出血（ｂｌｅｅｄ）、口腔出血（ｂｌｅｅｄ）、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、筋肉中への出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、口腔出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、外傷、頭部外傷、消化管出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、頭蓋内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、腹腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、胸腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、骨折、中枢神経系での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、後腹膜臓器での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、咽頭後空間での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、及び腸腰筋鞘での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）から選択される。
【０１９４】
他の実施形態において、出血性疾病に罹患している上記対象は、例えば、外科手術上の予防または周術期管理を含む外科手術に対する処置を必要とする。一例において、上記外科手術は小手術及び大手術から選択される。例示的な外科手技としては、抜歯、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切除術、滑膜切除術、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、関節置換術（例えば、膝関節全置換、股関節置換等）、心臓手術、及び帝王切開術が挙げられる。
【０１９５】
別の例において、上記対象は同時に第ＶＩＩＩ因子による治療を受ける。本発明の化合物はＦＩＸａを活性化することができることから、上記対象へＦＩＸａを投与する前に、ＦＩＸａポリペプチドを予備活性化するために該化合物を用いてもよい。
【０１９６】
本発明の方法は、予防的処置またはオンデマンド処置を必要とする対象に実施してもよい。
【０１９７】
本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物は、例えば、局所（例えば、経皮または眼）、経口、頬側、鼻腔、膣、直腸または非経口投与を含む任意且つ適宜の投与形態用に製剤化されてもよい。
【０１９８】
本明細書では、非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば静脈内）、筋内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液包内及び腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または注入技法を包含する。特に、本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物は、皮下投与用に処方されてもよい。本組成物はまた、例えば、懸濁液剤、乳化液剤、持続放出製剤、クリーム剤、ジェル剤または散剤であってもよい。本組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体と共に、座薬として製剤化されてもよい。
【０１９９】
一例において、上記医薬製剤は液体製剤、例えば、緩衝、等張性水溶液である。別の例において、本医薬組成物は、生理学的ｐＨ、または略生理学的ｐＨを有する。他の例において、上記水性製剤は生理学的または略生理学的浸透圧及び塩分を有する。上記水性製剤は塩化ナトリウム及び／または酢酸ナトリウムを含んでいてもよい。いくつかの例において、本発明の組成物は凍結乾燥されている。
【０２００】
本発明の融合タンパク質は、出血性凝固障害、関節内出血、筋肉出血（ｂｌｅｅｄ）、口腔出血（ｂｌｅｅｄ）、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、筋肉中への出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、口腔出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、外傷、頭部外傷、消化管出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、頭蓋内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、腹腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、胸腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、骨折、中枢神経系での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、後腹膜臓器での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、咽頭後空間での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、及び腸腰筋鞘での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）からなる群より選択される出血性疾患または障害の治療に対する遺伝子治療手法を用いて、哺乳動物、例えば、ヒトの患者においてインビボで産生させることができ、このことは治療上有益となろう。一実施形態において、上記出血性疾患または障害は血友病である。別の実施形態において、上記出血性疾患または障害は血友病Ｂである。これは、適宜の発現制御配列に作動可能に連結した、融合タンパク質をコードする適宜の核酸の投与を含む。ある特定の実施形態において、これらの配列はウイルスベクター中に組み込まれる。かかる遺伝子治療に適したウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン・バールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。上記ウイルスベクターは複製欠損ウイルスベクターであってよい。他の実施形態において、アデノウイルスベクターはそのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠失を有する。アデノウイルスベクターが用いられる場合、上記哺乳動物は選別可能なマーカー遺伝子をコードする核酸に曝露させなくてもよい。他の実施形態において、上記配列は、当業者に公知の非ウイルスベクター中に組み込まれる。
【０２０１】
本発明の実施は、別段の表示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を用いることとなり、それらは本技術分野の範囲内である。かかる技法は文献において詳細に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【０２０２】
免疫学の全般的な原理を記載する標準的な参考資料としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が挙げられる。
【０２０３】
ここまで本発明を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することによって本発明がより明確に理解されよう。これらの実施例は例証のみを目的として本明細書に付随するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２０４】
実施例１：活性なＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の識別
ＦＩＸ融合タンパク質であって、ＦＩＸポリペプチドを、上記ＦＩＸタンパク質の特性を向上させるための１または複数のＸＴＥＮ挿入物と共に含む上記ＦＩＸ融合タンパク質を構築した。但し、ＸＴＥＮ修飾物の位置、長さ、組成及び数は容易に変えることができ、ＦＩＸの活性及びクリアランスに対するこれら修飾物の影響を評価することができる。
【０２０５】
本実施例は、ＦＩＸ活性を損なうことなくＸＴＥＮの導入を受け入れることができ、且つ他の面では修飾されていないＦＩＸの融合タンパク質及び組換えＦＩＸ−Ｆｃ融合タンパク質の両方に対してこの手法を適用することができる、ＦＩＸ中の部位を特定することを目的とする。
【０２０６】
方法
開始Ｍｅｔ残基をコードするＡＴＧコドンに隣接する５’側にコザック翻訳開始配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）を導入した後に、ＦＩＸポリペプチドコード配列を発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、カリフォルニア州カールスバッド）中、ＢｓｉＷＩ部位とＰｍｅＩ部位との間に結合させた。
【０２０７】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、カリフォルニア州カールスバッド）をプラスミドでトランスフェクトした。上記一過性にトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３培地またはＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３培地とＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、カリフォルニア州カールスバッド）との混合培地中で増殖させた。トランスフェクションの５日後に上記細胞培養培地を回収し、発色ＦＩＸ活性アッセイまたはａＰＴＴ  ＦＩＸ活性アッセイによってＦＩＸ活性を分析した。
【０２０８】
ＡｎｉａｒａのＢＩＯＰＨＥＮ第ＩＸ因子キットを用いて発色によるＦＩＸ活性を測定し、全てのインキュベーションを３７℃のプレートヒーター上で振とうしながら実施した。６ウェルプレートからのＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の一過性トランスフェクション培地からの細胞培養回収物を、トリスＢＳＡ希釈緩衝液（Ｒ４）を用いて所望のＦＩＸ活性範囲に希釈した。ＦＩＸ標準液もトリスＢＳＡ希釈緩衝液中で調製した。上記標準液、希釈した細胞培養物試料、及びプールした正常なヒト血漿アッセイ対照（５０μＬ／ウェル）を、２つの同一組成の試料による繰返しでＬＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに添加した。ヒト第Ｘ因子、ＦＶＩＩＩ：Ｃ及びフィブリン重合禁止剤（５０μＬ）、５０μＬの第ＸＩａ因子のトロンビン、リン脂質及びカルシウムとの混合液、及び５０μＬの第Ｘａ因子特異的発色基質（ＳＸａ−１１）を、それぞれの添加の間に２分間のインキュベーションを行いながら、各ウェル中に逐次添加した。基質と共にインキュベートした後、５０μＬの２０％酢酸を添加して呈色反応を停止させ、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）ｐｌｕｓ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ（登録商標））装置を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。データ解析はＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を用いて行った。
【０２０９】
１段階での活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイを用いてＦＩＸ活性を評価した。ＳＹＳＭＥＸ（登録商標）ＣＡ−１５００装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州タリータウン）を用いてＦＩＸ−ＸＴＥＮ  ａＰＴＴ活性を測定した。アッセイ用の標準曲線を作成するために、ＷＨＯ第ＩＸ因子標準液を、培養培地の濃度を試験試料に一致させて偽トランスフェクション培地で希釈した。６ウェルプレートからのＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の一過性トランスフェクション培地からの細胞培養回収物を、偽トランスフェクション培地を用いて所望のＦＩＸ活性範囲に希釈した。希釈後に、Ｓｙｓｍｅｘ装置を用い、以下のようにして、上記ａＰＴＴアッセイを実施した。すなわち、５０μＬの希釈した標準液及び試料を、５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓのＦＩＸを枯渇させたヒト血漿と、次いで５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓのＡｃｔｉｎ  ＦＳＬ（エラグ酸）活性化剤と混合した。この混合物を１分間インキュベートした。続いて５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓのＣａＣｌ２を上記混合物に添加し、この混合物を２４０秒間インキュベートした。このインキュベーション直後の凝固時間を測定した。試験試料のＦＩＸ活性を測定するために、ログスケールを用いて上記標準液の凝固時間をプロットし、凝固時間とＦＩＸ活性との間の式を外挿し、次いでＦＩＸ−ＸＴＥＮの活性を上記標準曲線に対して算出した。
【０２１０】
挿入部位の選択
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  ＢａｎｋのＦＩＸ構造、１ＰＦＸ、１ＩＸＡ、１ＣＦＩ、１ＣＦＨ、１ＥＤＭ、３ＬＣ３、３ＬＣ５、１ＲＦＮ、１Ｘ７Ａ及び３ＫＣＧを解析して、ＦＩＸ中のＸＴＥＮ挿入のための部位を選択した。ＧＬＡドメイン内へのＸＴＥＮ挿入は、リン脂質表面と内皮下ＩＶ型コラーゲンへのＦＩＸの固定化におけるＧＬＡドメインの重要な役割により回避した。ＸＴＥＮ挿入部位は、以下の選択基準、すなわち、１）アルゴリズムソフトウェアＡＳＡ  Ｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｅｎ．ｎｅｔ／ａｓａｖｉｅｗ／）及びＧｅｔ  Ａｒｅａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ）によって計算した到達可能な表面積、２）水素／重水素交換質量分析（Ｈ／ＤＸ−ＭＳ）によって評価した溶媒の到達可能性、３）限定された二次構造エレメント内の部位の除外、４）顕著な種間でのタンパク質配列の可変性による位置の優先性、及び５）既知の血友病Ｂの突然変異に近位の部位の除外と共に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋにおける利用可能なＦＩＸの構造の解析によって選択した。
【０２１１】
ＥＧＦ１ドメイン中の４の部位、ＥＧＦ２ドメイン中の５の部位、ＡＰドメインとＥＧＦ２ドメインとの間のリンカー領域中の２の部位、ＡＰ（活性化ペプチド）ドメイン中の４の部位及び触媒ドメイン中の１８の部位がＸＴＥＮの挿入に対して選択された（表６）。
【表６】
2018522563.tif 000011
【０２１２】
４２アミノ酸ＸＴＥＮの挿入及びＣ末端融合の活性スクリーニング
ＸＴＥＮの導入によって生じる活性低下に起因する潜在的なＦＩＸ活性の減損を打ち消すためのスキャフォールドとして、高活性ＦＩＸパドゥバ変異体（Ｒ３３８Ｌ）を用いた。４２残基のＸＴＥＮエレメント（ＡＥ４２）を、上記の選択基準を用いて選択した部位に挿入するかまたはＦＩＸのＣ末端に融合した。これらの変異体のＦＩＸ活性を、上述のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の馴化培地中で評価した。ＦＩＸ−ＡＥ４２のＦＩＸ活性を、ＸＴＥＮをもたないベース構築物、ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌの百分率として示す（図１）。
【０２１３】
ＦＩＸ発色アッセイによって判定されるように、ＸＴＥＮ挿入は限られた部位で許容された（図１及び表７）。ＦＩＸ中の合計３３の部位を選択し、ＡＥ−４２の挿入によって評価を行った。これらのうち、ＥＧＦ２ドメイン中の２、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー領域中の１、ＡＰドメイン中の４、及び触媒ドメイン中の４が、Ｃ末端を含めて、ＦＩＸ活性アッセイによって許容される部位として特定された（図１及び表７）。
【表７−１】
2018522563.tif 000012
【表７−２】
2018522563.tif 000013
【０２１４】
より長いＸＴＥＮ挿入物及びＣ末端融合物の活性
次に、より長いＸＴＥＮ（ＡＥ７２、１４４、及び２８８）を、ＡＥ４２の挿入に対して許容されることが示された部位で同様に試験した。ＦＩＸ活性を上述のようにして測定し、ＸＴＥＮをもたないベース構築物であるＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌのパーセンテージとして示す（図２）。
【０２１５】
ＡＰ中の部位及びＦＩＸのＣ末端のまたはＣ末端近傍の部位のみにおいて、より長いＸＴＥＮ（ＡＥ１４４、ＡＥ２８８またはＡＥ８６４）が許容された（図２）。馴化培地において検出されたＦＩＸ活性は導入されたＸＴＥＮの長さと逆の相関を示した（図２、表７）。ＦＩＸの異なるドメイン中の４の挿入が許容される部位を、コンビナトリアルライブラリをつくるために選択した。
【０２１６】
複数のＸＴＥＮ挿入物
単一のＸＴＥＮの変異体を用いて得られた結果に基づいて、種々の長さの且つ４の異なる位置の複数のＸＴＥＮ挿入物を有するＦＩＸ変異体（図４及び表８を参照のこと）のＦＩＸ活性を、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の馴化培地中で、ａＰＴＴアッセイにより評価した（表８〜１０）。ＦＩＸ活性を、ＸＴＥＮをもたないベース構築物であるＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌのパーセンテージとして示す（図４）。
【表８−１】
2018522563.tif 000014
【表８−２】
2018522563.tif 000015
【表９】
2018522563.tif 000016
【表１０−１】
2018522563.tif 000017
【表１０−２】
2018522563.tif 000018
【０２１７】
３の群、単一のＸＴＥＮを有するＦＩＸ、二元のＸＴＥＮ挿入物を有するＦＩＸ及び単一のＸＴＥＮ挿入物を有するＦＩＸ−Ｆｃが検出可能な活性を示した一方、３以上の部位での挿入／融合の組み合わせはＦＩＸ活性が消失した（図４）。
【０２１８】
結論として、ＦＩＸ中にはいくつかのＸＴＥＮ挿入が許容される部位が存在し、選ばれた組み合わせのＸＴＥＮ挿入物変異体はＦＩＸ活性を保持する。ここで特定された活性なＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体は、血友病Ｂマウスにおける薬物動態学的特性の特徴づけの候補である。
【０２１９】
実施例２：ＦＩＸ融合タンパク質ならびにその血漿回収率及びＡＵＣ／Ｄ
第ＩＸ因子欠損（ＨｅｍＢ，Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆ９ｔｍ１Ｄｗｓ／Ｊ，ＭＧＩ：１９３２２９７）マウス（Ｌｉｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は、当初Ｄａｒｒｅｌ  Ｓｔａｆｆｏｒｄ博士（ノースカロライナ大学、チャペルヒル）より入手した。オス／メスのＨｅｍＢマウスに、それぞれ５０または２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ＦＩＸ−ＣＴ．２８８（ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されたＡＥ２８８  ＸＴＥＮ）、ＦＩＸ−ＣＴ．８６４（ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合したＡＥ８６４  ＸＴＥＮ）、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後に挿入されたＡＥ１４４  ＸＴＥＮ）、ＦＩＸ−ＡＰ．７２（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後に挿入されたＡＥ７２  ＸＴＥＮ）、ＦＩＸ−ＡＰ．４２（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後に挿入されたＡＥ４２  ＸＴＥＮ）、ＦＩＸＦｃ、及びＦＩＸ）の単回静脈内ボーラス注射を、ｔ＝０時間において、１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で静脈内注射した。投与の５分後から投与の１６８時間（７日）後まで血液を採取した。表示した各時点について、約１００μＬのクエン酸塩添加血液を、時点当たり３〜４頭のマウスから、後眼窩または端末大静脈での採血によって採取した。マウス当たり最大３回の時点で採血を行った。５０００ｒｐｍで８分間の遠心分離によって血漿を単離し、血漿試料をドライアイス−エタノール浴中で瞬間凍結し、分析を行うまで−８０℃で保存し、分析は、活性化剤としてデイドベーリング試薬及びアクチンＦＳＬを、そして活性の標準として投与物質を用いた、Ｓｙｓｍｅｘ−ＣＡ１５００凝固分析装置上での１段階での活性化トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによって行った。図５の５Ａ〜５Ｂに、注射した用量の％として血漿活性をプロットする。平均滞留時間（ＭＲＴ）及び他の薬物動態学的（ＰＫ）パラメータをＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＮＣＡ解析によるＣｅｒｔｅｒａ）により、ノンコンパートメント解析を用いて計算した。図５ＣはＭＲＴ（Ｘ軸）に対する相対的血漿回収率（Ｙ軸）を示す。円の面積は用量当たりの曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表し、ＸＴＥＮの長さが増加すると共に、ＦＩＸ血漿活性回収率及びＡＵＣ／Ｄが増加することを示している（図５の５Ｃ）。これらの図は、大きなＸＴＥＮ長（Ｃ末端における２８８及び８６４またはＡＰドメイン中の１４４、７２、及び４２）を有するＦＩＸ融合タンパク質は、静脈内ボーラス投与後に、血漿回収率の６０％に及ぶ長さ依存性の増加及びＡＵＣ／Ｄの増加を示す。
【０２２０】
実施例３：ＦＩＸ融合タンパク質及びそれらの半減期
ＦＩＸ欠損マウスに、５０または２００ＩＵ／ｋｇの本ＦＩＸ融合タンパク質、すなわち、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ２８８）に融合されたＦＩＸ、７２のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ７２）がＡＰドメイン中、Ｄ１６６の後に挿入されたＦＩＸ−Ｆｃ、４２のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ４２）がＡＰドメイン中、Ｄ１６６の後に挿入されたＦＩＸ−Ｆｃ、及び対照（例えばＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ）を静脈内投与した。血漿を採取し、ＦＩＸ活性の分析及びＰＫ分析を実施例５に記載の方法と同様にして実施した。図６の６Ａは注射した用量の％として血漿活性をプロットする。薬物動態学的（ＰＫ）パラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＮＣＡ解析によるＣｅｒｔｅｒａを用いて計算し、図６の６ＢはＭＲＴ（Ｘ軸）に対する相対的血漿回収率（Ｙ軸）を示す。円の面積は用量当たりの曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表し、ＦＩＸＦｃの活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインへのＸＴＥＮ配列の挿入によって、ｒＦＩＸＦｃ単独の平均滞留時間よりも長い平均滞留時間が、ＦＩＸに比較して延長されることを示す（図６の６Ｂ）。また、血漿活性回収率及びＡＵＣ／ＤがＸＴＥＮ長の増加に伴って向上する（図６の６Ａ〜６Ｂ）。ｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８（配列番号２２６）及びｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（配列番号１５１）のＡＵＣ／Ｄは、ｒＦＩＸＦｃと比較してそれぞれ３．４倍及び４．５倍向上した（図６の６Ａ〜６Ｂ）。これは、静脈内投与したｒＦＩＸと比較した場合、それぞれ８．５倍及び１４．５倍に相当する（図６の６Ａ〜６Ｂ）。したがって、ＡＰドメイン中へのＸＴＥＮの挿入をｒＦＩＸＦｃ−Ｒ３３８ＬにおけるＦｃに媒介される半減期の延長と組み合わせることによって、半減期ならびに血漿回収率及びＡＵＣ／用量の増加の両方が、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃのそれに比較して拡大される。
【０２２１】
実施例４：皮下送達によるＦＩＸ融合タンパク質の薬物動態の向上
ＦＩＸ欠損マウスに、ｔ＝０において、５０または２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ融合タンパク質、すなわち、２８８のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ２８８）にＣ末端で融合されたＦＩＸ（ＦＩＸ−ＣＴ．２８８）、７２のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ７２）をＡＰドメイン中に有するＦＩＸＦｃ（ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）、４２のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ４２）をＥＧＦ２ドメイン中に有するＦＩＸＦｃ（例えばＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ．４２）、及び対照（ＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ）を皮下投与した。血漿を採取し、ＦＩＸ活性の分析及びＰＫ分析を実施例１に記載の方法と同様にして実施した。図７の７Ａは注射した用量の％として血漿活性をプロットする。薬物動態学的（ＰＫ）パラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＮＣＡ解析によるＣｅｒｔｅｒａを用いて計算し、図７の７ＢはＭＲＴ（Ｘ軸）に対する相対的血漿回収率（Ｙ軸）を示す。円の面積は用量当たりの曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表し、ｒＦＩＸのカルボキシ末端におけるＸＴＥＮポリペプチドの融合またはＦＩＸＦｃの活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインもしくはＥＧＦ２ドメインへのＸＴＥＮ配列の挿入によって、上記ＦＩＸ融合タンパク質の皮下投与プロファイルが大幅に向上することを示す（図７の７Ｂ）。ＨｅｍＢマウスにおいて皮下投与に関し、ｒＦＩＸＦｃと比較して、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８のＡＵＣ／Ｄは６〜９倍向上し、生物学的利用能は１．５〜２倍向上し、且つＣｍａｘ／Ｄは３〜１０倍向上している。ｒＦＩＸと比較した場合、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８の薬物動態学的パラメータの向上は、ｒＦＩＸと比較して、それぞれ、２８〜４０倍のＡＵＣ／Ｄの向上、３倍の生物学的利用能の増加及び１５〜３０倍のＣｍａｘ／Ｄの向上である（図７の７Ａ〜７Ｂ）。
【０２２２】
まとめると、皮下投与に関して、上記ＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８及びｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）は、ｒＦＩＸＦｃの静脈内投与と比較した場合、２．６倍及び１．９倍のＡＵＣ／Ｄの向上を示し、後者は、ヒトにおける予防のための週１回またはそれよりも低頻度での静脈内投与を支持する。
【０２２３】
実施例５：ＦＩＸ融合タンパク質のインビトロでの有効性
ヒト血友病Ｂの血液に、３、１０、及び３０ＩＵ／ｄＬの表示した用量のｒＦＩＸＦｃ（白丸、点線）またはＦＩＸ融合タンパク質（例えばｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）（黒丸、実線）またはビヒクル（白三角）を添加した（図８の８Ａ〜８Ｃ）。回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）を用いて全血凝固特性を測定し、当該血液の再石灰化（ＮＡＴＥＭ）によって凝固を開始させた。ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２は、血友病Ｂの血液中において、凝固時間（ＣＴ、単位：秒）、アルファ角（単位：度）及び最大血餅硬度（ＭＣＦ、単位：ｍｍ）に関して、ｒＦＩＸＦｃと比較して同様の活性を示した（図８の８Ａ〜８Ｃ）。各時点におけるデータは４〜５の同一組成の試料による繰返しの平均値＋／−標準偏差である（図８の８Ａ〜８Ｃ）。
【０２２４】
ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８は、ＨｅｍＢマウスにおいて、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃの両方と比較して、皮下投与での薬物動態の大幅な向上を示している。有効性及び相対成長率に対処するための更なる検討が、前臨床動物モデルにおいて進行中である。
【０２２５】
実施例６：急性マウス尾切断出血モデルにおけるｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のインビトロでの有効性
既報（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９（１３）：３０２４−３０３０，２０１２）のとおりに、尾の先端を切断した後に、投与したマウスにおける全失血量を測定する、盲検化マウス尾切断出血モデルにおいて急性の有効性を検討した。簡単に説明すると、８〜１５週齢のオスの血友病Ｂマウス（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）  ９０：３９６２−３９６６）を、５０ｍｇ／ｋｇのケタミンと０．５ｍｇ／ｋｇのデクスメデトミジンとの混合物で麻酔した。尾を３７℃の生理的食塩水に１０分間浸漬して側脈を拡張させ、続いてビヒクル（３．８８ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、２３．８ｇ／Ｌのマンニトール、１１．９ｇ／Ｌのスクロース、３．２５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０（ｐＨ  ７．１）、３％のヒト血清アルブミン）、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２、またはｒＦＩＸＦｃのいずれかを、５０、１００、及び２００ＩＵ／ｋｇで静脈内尾部静脈注射した。投与の５分後に尾の遠位先端部の５ｍｍを切断し、事前に重量を測定した、１３ｍＬの生理的食塩水が入った管の中に３０分間浸漬した。失血量を重量で定量した。統計的有意性をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６において、対応のない両側ｔ検定を用いて算出した。かかる両側ｔ検定は、上記５０、１００、及び２００ＩＵ／ｋｇの用量のｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２はビヒクルと有意に異なることを示した（Ｐ値＜０．０００１）。また、データは、低用量、例えば５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２によって、同一の低用量、すなわち５０ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃと比較して、失血量が有意に低くなることを示している。これらの結果から、この出血モデルにおいては、ｒＦＩＸＦｃに比較して、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の同等または向上した急性の有効性が実証される。
【０２２６】
実施例７：予防的なマウス尾静脈切断出血モデルにおけるＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のインビボでの有効性
既報（Ｔｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４８２５５，２０１６；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４：２８０２−２８２２（２００９））のとおりに、外側尾静脈の切断後の、投与した血友病Ｂマウスの生存時間を測定する盲検化マウス尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデルにおいて、長期の有効性を検討した。簡単に説明すると、８〜１５週齢のオスの血友病Ｂマウス（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：３９６２−３９６６（１９９７））に、１５、５０、１００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ活性のｒＦＩＸＦｃまたはこれに対応する皮下用量のＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を静脈内投与し、ビヒクルをボーラス投与したマウスと比較した。投与の７２時間後に、全てのマウスを麻酔し、尾の径が２．７ｍｍの部分で一方の外側尾静脈を切断した。ＴＶＴの直後から９〜１１時間の間、次いで２４時間の一昼夜の時点で、再出血及び（マウスが瀕死であった場合に決定された安楽死までの時間として定義される）死亡時刻を含む定性的な終点を監視し、毎時間記録した。２４時間の検討の終了時に全てのマウスを安楽死させ、死亡または瀕死ではないマウスを２４時間生存していたと判定した。
【０２２７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて、データをＴＶＴ後のパーセント表記の生存率としてプロットした。ビヒクルを皮下投与したマウス（点線）、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を皮下投与したマウス（実線、閉じた記号）またはＦＩＸＦｃを静脈内投与したマウス（破線、白抜きの記号）（１５ＩＵ／ｋｇ、５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ  ｎ＝３０であるビヒクル投与以外はｎ＝２０／用量）（図１０）。対応するＩＵ／ｋｇ表記の用量で皮下投与したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２対静脈内投与したｒＦＩＸＦｃで処置したマウスの生存率曲線は、試験した全ての用量において、等価の静脈内投与したｒＦＩＸＦｃと比較して、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を皮下投与したＨｅｍＢマウスの生存率が向上したことを示した（図１０）。
【０２２８】
実施例８：ＨｅｍＢマウスにおけるｒＦＩＸと比較したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ＦＩＸ−２１６、二重鎖Ｆｃ）の静脈内及び皮下投与での薬物動態学的パラメータの向上
血友病−Ｂマウスに、２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ＦＩＸ−２１６、二重鎖Ｆｃ）またはｒＦＩＸのいずれかを投与した。表示した時点で、血液を後眼窩での採血によって採取した。活性の標準として投与物質を用いた１段階凝固アッセイ活性によって、ＦＩＸの血漿レベルを測定した。図１１の１１Ａにおいて、血漿活性を注射した用量の％としてプロットする。図１１の１１Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｅｒｔａｒａ）を用い、ＮＣＡ（ノンコンパートメント）解析によって計算した薬物動態学的パラメータの表を示す。ｒＦＩＸに対するＦＩＸ−２１６について示された薬物動態学的パラメータの向上には、平均滞留時間（ＭＲＴ）、ＡＵＣ／用量及び他のパラメータが含まれる。
【０２２９】
ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の皮下投与において、マウスにおける投与後概略２０時間のｔｍａｘ、及び同様（ＩＵ／ｋｇ）の静脈内投与したｒＦＩＸまたはｒＦＩＸＦｃと比較した場合の血漿活性レベルの向上が示されている。本発明者らは、ＨｅｍＢマウスにおける上記ＴＶＴ出血モデルを用いて、投与後７２時間において、皮下投与したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２が、試験した全ての用量において静脈内投与したｒＦＩＸＦｃと比較して、インビボでの有効性が向上したことを示している。同様に、ＨｅｍＢマウス尾切断出血モデルにおける急性の有効性試験によって、静脈内投与したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２がｒＦＩＸＦｃと比較して有効性が向上することが示された。これらのデータは、ヒトにおけるＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の週１回またはそれよりも低頻度での予防的皮下投与の可能性を支持する。
【０２３０】
詳細な実施形態の上述の説明は本発明の概括的な特徴を十分に明らかにすることとなるので、他の者は当業者の範囲内の知識を適用することにより、過度の実験をすることなく、発明の概括的な概念から逸脱することなく、かかる詳細な実施形態を種々の用途に対して容易に改変及び／または適合させることができる。したがって、かかる適合及び改変は、本明細書に提示される教示及び指針に基づけば、上記開示された実施形態の均等物の意味及び範囲の内であることが意図される。本明細書における語法または用語は説明を目的とするものであって限定を目的とするものではなく、本明細書の用語または語法は、本明細書の教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきものであることを理解する必要がある。
【０２３１】
本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の詳述及び実施を考慮すれば当業者には明らかとなろう。上記詳述及び実施例は単に例示的と見なされるべきものであり、本発明の真の範囲及び趣旨は後述の特許請求の範囲によって示されることを意図する。
【０２３２】
本出願は、２０１５年８月３日出願の米国仮出願第６２／２００，５９０号及び２０１６年１月２２日出願の同第６２／２８１，９９３号の優先権を主張し、上記出願はそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３３】
実施形態
Ｅ１．  第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮとを含み、凝血促進活性を示すＦＩＸ融合タンパク質。
【０２３４】
Ｅ２．  上記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２３５】
Ｅ３．  上記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１またはＥ２に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２３６】
Ｅ４．  上記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、及び両方からなる群より選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２３７】
Ｅ５．  上記挿入部位が配列番号２のアミノ酸１４２に対応する、Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２３８】
Ｅ６．  上記ＸＴＥＮが、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２３９】
Ｅ７．  上記ＸＴＥＮが、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、またはそれらの任意の組み合わせを含む、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４０】
Ｅ８．  上記ＸＴＥＮが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４１】
Ｅ９．  上記ＸＴＥＮがＡＥ７２またはＡＥ１４４を含む、Ｅ７またはＥ８に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４２】
Ｅ１０．  第２のＸＴＥＮを更に含む、Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４３】
Ｅ１１．  第２のＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入されているか、または第２のＸＴＥＮが、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端もしくは該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されているリンカーのいずれかに融合されている、Ｅ１０に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４４】
Ｅ１２．  上記ＸＴＥＮ及び第２のＸＴＥＮが、それぞれ、
ｉ．配列番号２のアミノ酸１０５及び配列番号２のアミノ酸１６６、
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１０５及び配列番号２のアミノ酸２２４、
ｉｉｉ．配列番号２のアミノ酸１０５及びＣ末端に融合された、
ｉｖ．配列番号２のアミノ酸１６６及び配列番号２のアミノ酸２２４、
ｖ．配列番号２のアミノ酸１６６及びＣ末端に融合された、ならびに
ｖｉ．配列番号２のアミノ酸２２４及びＣ末端に融合された
からなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入され及び／または上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合される、Ｅ１０またはＥ１１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４５】
Ｅ１３．  上記ＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮが上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された、Ｅ１０またはＥ１１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４６】
Ｅ１４．  第２のＸＴＥＮが、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、Ｅ１０〜Ｅ１３のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４７】
Ｅ１５．  第２のＸＴＥＮが、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、Ｅ１０〜Ｅ１４のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４８】
Ｅ１６．  第２のＸＴＥＮがＡＥ７２またはＡＥ１４４である、Ｅ１５に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２４９】
Ｅ１７．  第２のＸＴＥＮが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１０〜Ｅ１６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５０】
Ｅ１８．  第３、第４、第５、または第６のＸＴＥＮを更に含む、Ｅ１０〜Ｅ１７のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５１】
Ｅ１９．  ＦＩＸポリペプチドと、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、長さが４２のアミノ酸より長く且つ１４４のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含むＸＴＥＮとを含むＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５２】
Ｅ２０．  上記ＸＴＥＮが、５０、５５、６０、６５、もしくは７０のアミノ酸より長く且つ１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０もしくは８０のアミノ酸より短い、またはそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含む、Ｅ１９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５３】
Ｅ２１．  上記ＸＴＥＮの長さが７２のアミノ酸である、Ｅ２０に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５４】
Ｅ２２．  上記ＸＴＥＮがＡＥ７２である、Ｅ２１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５５】
Ｅ２３．  上記ＸＴＥＮが、配列番号３５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５６】
Ｅ２４．  Ｆｃドメインを更に含む、Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５７】
Ｅ２５．  上記Ｆｃドメインが上記ＦＩＸポリペプチドまたは上記ＸＴＥＮに融合されている、Ｅ２４に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５８】
Ｅ２６．  第２のＦｃドメインを含む、Ｅ２４またはＥ２５に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２５９】
Ｅ２７．  第２のＦｃドメインが第１のＦｃドメインと会合している、Ｅ２６に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６０】
Ｅ２８．  ２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が上記Ｆｃドメインに融合された上記ＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖が第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合している、Ｅ２６またはＥ２７に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６１】
Ｅ２９．  上記ＦＩＸポリペプチドと、上記Ｆｃドメインと、第２のＦｃドメインと、上記Ｆｃドメインと第２のＦｃドメインとを連結するリンカーとを含む単一のポリペプチド鎖である、Ｅ２６またはＥ２７に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６２】
Ｅ３０．  上記リンカーが１または複数の細胞内プロセッシング部位を更に含む、Ｅ２９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６３】
Ｅ３１．  上記リンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、但しｎは１〜１００の整数である、Ｅ２９またはＥ３０に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６４】
Ｅ３２．  上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号５４〜配列番号１５３からなる群より選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１〜Ｅ３１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６５】
Ｅ３３．  天然ＦＩＸの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％の凝血促進活性を有する、Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６６】
Ｅ３４．  上記凝血促進活性が発色基質アッセイ、１段階凝固アッセイ、またはそれらの両方によって測定される、Ｅ３３に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６７】
Ｅ３５．  上記ＦＩＸポリペプチドがＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体である、Ｅ１〜Ｅ３４のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６８】
Ｅ３６．  上記Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体が、配列番号２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ３５に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２６９】
Ｅ３７．  Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【０２７０】
Ｅ３８．  Ｅ３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０２７１】
Ｅ３９．  Ｅ３７に記載のポリヌクレオチドまたはＥ３８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０２７２】
Ｅ４０．  上記ＦＩＸ融合タンパク質がインビボで発現される、Ｅ３９に記載の宿主細胞。
【０２７３】
Ｅ４１．  上記ＦＩＸ融合タンパク質がインビトロで発現される、Ｅ３９に記載の宿主細胞。
【０２７４】
Ｅ４２．  ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法であって、Ｅ３９に記載の宿主細胞を上記ＦＩＸ融合タンパク質が発現される条件下で培養することを含む、上記方法。
【０２７５】
Ｅ４３．  Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質、Ｅ３７に記載のポリヌクレオチド、Ｅ３８に記載の発現ベクター、またはＥ３９〜Ｅ４１のいずれか１に記載の宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【０２７６】
Ｅ４４．  有効量のＥ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質、Ｅ３７に記載のポリヌクレオチド、Ｅ３８に記載の発現ベクター、Ｅ３９〜Ｅ４１のいずれか１に記載の宿主細胞、Ｅ４３に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする患者における凝固疾患もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法。
【０２７７】
Ｅ４５．  上記投与することが上記患者への皮下投与を含む、Ｅ４４に記載の方法。
【０２７８】
Ｅ４６．  患者における凝固疾患もしくは疾病の診断または画像診断方法であって、Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質、Ｅ３７に記載のポリヌクレオチド、Ｅ３８に記載の発現ベクター、Ｅ３９〜Ｅ４１のいずれか１に記載の宿主細胞を上記対象の試料と接触させることを含む上記方法。
【０２７９】
Ｅ４７．  ＦＩＸポリペプチドの半減期の延長方法であって、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内にＸＴＥＮを挿入し、それによってＦＩＸ融合タンパク質を構築することを含み、上記ＦＩＸタンパク質が凝血促進活性を示す、上記ＦＩＸポリペプチドの半減期の延長方法。
【０２８０】
Ｅ４８．  第１の連鎖及び第２の連鎖を含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質であって、
ａ．第１の連鎖が、
ｉ．ＦＩＸポリペプチドと、
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１のＸＴＥＮと、
ｉｉｉ．上記少なくとも１のＸＴＥＮの上記ＦＩＸポリペプチドに融合された第１のＦｃドメインと
を含み、
ｂ．第２の連鎖が第２のＦｃドメインを含み、
第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合しており、凝血促進活性を示す、上記ＦＩＸ融合タンパク質。
【０２８１】
Ｅ４９．  上記少なくとも１のＸＴＥＮが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ４８に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２８２】
Ｅ５０．  上記ＦＩＸ融合タンパク質の第１の連鎖が、配列番号２２７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ上記ＦＩＸ融合タンパク質の第２の連鎖が、配列番号２２８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ４８またはＥ４９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２８３】
Ｅ５１．  上記ＦＩＸ融合タンパク質の第１の連鎖が配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、且つ上記ＦＩＸ融合タンパク質の第２の連鎖が配列番号２２８のアミノ酸配列を含む、Ｅ４８〜Ｅ５０のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
【０２８４】
以下のベクター配列は、上述の実施例及び本出願中の他所において参照される。以下の記号の説明は当該情報の理解の助けになろう。
【化２】
2018522563.tif 000019
【化３】
2018522563.tif 000020
【化４】
2018522563.tif 000021
【化５】
2018522563.tif 000022
【化６】
2018522563.tif 000023
【化７】
2018522563.tif 000024
【化８】
2018522563.tif 000025
【化９】
2018522563.tif 000026
【化１０】
2018522563.tif 000027
【化１１】
2018522563.tif 000028
【化１２】
2018522563.tif 000029
【化１３】
2018522563.tif 000030
【化１４】
2018522563.tif 000031
【化１５】
2018522563.tif 000032
【化１６】
2018522563.tif 000033
【化１７】
2018522563.tif 000034
【化１８】
2018522563.tif 000035
【化１９】
2018522563.tif 000036
【化２０】
2018522563.tif 000037
【化２１】
2018522563.tif 000038
【化２２】
2018522563.tif 000039
【化２３】
2018522563.tif 000040
【化２４】
2018522563.tif 000041
【化２５】
2018522563.tif 000042
【図１】
2018522563.tif 000043
【図２】
2018522563.tif 000044
【図３】
2018522563.tif 000045
【図４】
2018522563.tif 000046
【図５】
2018522563.tif 000047
【図６】
2018522563.tif 000048
【図７】
2018522563.tif 000049
【図８】
2018522563.tif 000050
【図９】
2018522563.tif 000051
【図１０】
2018522563.tif 000052
【図１１】
2018522563.tif 000053
【図１２】
2018522563.tif 000054
【図１３】
2018522563.tif 000055
【配列表】
2018522563000001.app
【国際調査報告】
2018522563.tif 000056
2018522563.tif 000057