(57)【要約】  本開示は、ＭｒｋＡに結合し、かつクレブシエラ（例えば、肺炎桿菌）のオプソニン作用による死滅を誘導するＭｒｋＡ結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片を提供する。本開示はまた、クレブシエラ（例えば、肺炎桿菌）を低減するか、または対象においてクレブシエラ（例えば、肺炎桿菌）感染症を治療もしくは予防する方法であって、ＭｒｋＡ結合タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合断片、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含む方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質であって、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に結合するか、ｂ）肺炎桿菌のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導するか、またはｃ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合し、かつ肺炎桿菌のＯＰＫを誘導する、単離抗原結合タンパク質。
【請求項２】
Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される、少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される、少なくとも１つまたは２つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する、請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
生物発光ＯＰＫアッセイを使用して測定されるように、肺炎桿菌株９１４８（Ｏ２ａ：Ｋ２８）、９１７８（Ｏ３：Ｋ５８）、および９１３５（Ｏ４：Ｋ１５）において１００％のＯＰＫを誘導し、かつ／または肺炎桿菌株２９０１１（Ｏ１：Ｋ２）において８０％のＯＰＫを誘導する、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
Ｋｐ２９０１１、Ｋｐ９１７８、およびＫｐ４３８１６からなる群から選択される肺炎桿菌株に暴露された動物において延命効果を与える、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
クレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項７】
クレブシエラ細胞吸着を阻害するかまたは低下させる、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のセットを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質であって、
ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２が配列番号８のアミノ酸配列を有し、および
ＬＣＤＲ３が配列番号９のアミノ酸配列を有する、単離抗原結合タンパク質。
【請求項９】
配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１３を含むＶＨおよび配列番号１５を含むＶＬを含む、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号１３を含むＶＨを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１５を含むＶＬを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のセットを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質であって、
ＨＣＤＲ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３が配列番号６のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ１が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、および
ＬＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、単離抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号１４を含むＶＨおよび配列番号１６を含むＶＬを含む、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号１４を含むＶＨを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１６を含むＶＬを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２中のエピトープに結合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
ＭｒｋＡ（配列番号１７）に特異的に結合するが、配列番号２６または配列番号２７のいずれにも結合しない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２中のエピトープに結合する、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
ＭｒｋＡ（配列番号１７）に特異的に結合するが、配列番号２６または配列番号２７のいずれにも結合しない単離抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
（ｉ）それぞれ配列番号２９〜３１および４１〜４３、
（ｉｉ）それぞれ配列番号３２〜３４および４４〜４６、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号３５〜３７および４７〜４９、ならびに
（ｉｖ）それぞれ配列番号３８〜４０および５０〜５２
からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のセットを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
配列番号５３、５４、５５、もしくは５６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
配列番号５３、５４、５５、または５６を含むＶＨおよび配列番号５７、５８、５９、または６０を含むＶＬを含む、請求項２３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
配列番号５３、５４、５５、または５６を含むＶＨを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
配列番号５７、５８、５９、または６０を含むＶＬを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｃ）配列番号５３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｄ）配列番号５４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｅ）配列番号５５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｆ）配列番号５６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号６０を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される抗体と同じＭｒｋＡエピトープに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
ＭｒｋＡへの参照抗体の結合を競合的に阻害する単離抗原結合タンパク質であって、前記参照抗体が、
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｃ）配列番号５３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｄ）配列番号５４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
（ｅ）配列番号５５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｆ）配列番号５６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号６０を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される、単離抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
前記抗原結合タンパク質またはその抗原結合断片がオリゴマーＭｒｋＡに結合する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
オリゴマーＭｒｋＡに特異的に結合するが、単量体ＭｒｋＡに結合しない単離抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、リサーフェシング、またはヒトである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
抗体である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
抗体の抗原結合断片である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３４】
モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３５】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３６】
約１．０〜約１０ｎＭのＫｄでＭｒｋＡに結合する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
１．０ｎＭ以下のＫｄでＭｒｋＡに結合する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３８】
結合親和性がフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＫｉｎＥｘａ、ラジオイムノアッセイ、またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定される、請求項３６または３７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３９】
ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に結合するか、ｂ）肺炎桿菌のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導するか、またはｃ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合し、かつ肺炎桿菌のＯＰＫを誘導する、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４０】
前記抗原結合タンパク質がクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる、請求項１〜５または７〜３９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４１】
前記抗原結合タンパク質がクレブシエラ細胞吸着を阻害するかまたは低下させる、請求項１〜６または８〜４０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４２】
（ａ）ＩｇＡ定常ドメイン、
（ｂ）ＩｇＤ定常ドメイン、
（ｃ）ＩｇＥ定常ドメイン、
（ｄ）ＩｇＧ１定常ドメイン、
（ｅ）ＩｇＧ２定常ドメイン、
（ｆ）ＩｇＧ３定常ドメイン、
（ｇ）ＩｇＧ４定常ドメイン、および
（ｈ）ＩｇＭ定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４３】
前記抗原結合タンパク質が、
（ａ）Ｉｇカッパ定常ドメイン、および
（ｂ）Ｉｇラムダ定常ドメイン
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４４】
前記抗原結合タンパク質がヒトＩｇＧ１定常ドメインおよびヒトラムダ定常ドメインを含む、請求項４２または４３に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４５】
前記抗原結合タンパク質がＩｇＧ１定常ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４６】
前記抗原結合タンパク質がＩｇＧ１／ＩｇＧ３キメラ定常ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４８】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体を産生する単離宿主細胞。
【請求項４９】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体を作製する方法であって、（ａ）前記抗原結合タンパク質または抗体を発現する宿主細胞を培養するステップ、および（ｂ）前記抗原結合タンパク質または抗体を前記培養宿主細胞から単離するステップを含む方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法を使用して産生される抗原結合タンパク質または抗体。
【請求項５１】
請求項１〜４６または５０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５２】
前記薬学的に許容可能な賦形剤が保存剤、安定剤、または酸化防止剤である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
医薬として使用される、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
標識基またはエフェクター基をさらに含む、請求項１〜４６もしくは４９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質もしくは抗体または請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記標識基が、同位体標識、磁気標識、レドックス活性成分、光学色素、ビオチン化基、ビオチンシグナル伝達ペプチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの蛍光成分、ならびにヒスチジンペプチド（ｈｉｓ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、金結合ペプチド、およびＦｌａｇなどの二次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープからなる群から選択される、請求項５４に記載の抗原結合タンパク質、抗体、または医薬組成物。
【請求項５６】
前記エフェクター基が、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療薬、および化学療法剤からなる群から選択される、請求項５４に記載の抗原結合タンパク質、抗体、または医薬組成物。
【請求項５７】
クレブシエラ感染症に関連する状態を治療または予防するための、請求項１〜４６または５０〜５６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、または医薬組成物の使用。
【請求項５８】
クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、または回復を、それを必要としている対象において行う方法であって、有効量の請求項１〜４６または５０〜５６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、または医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項５９】
対象におけるクレブシエラの増殖を阻害する方法であって、請求項１〜４６または５０〜５６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、または医薬組成物を、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法。
【請求項６０】
クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、または回復を、それを必要としている対象において行う方法であって、有効量の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項６１】
対象におけるクレブシエラの増殖を阻害する方法であって、有効量の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法。
【請求項６２】
前記抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスＭｒｋＡに特異的に結合する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が肺炎桿菌ＭｒｋＡに特異的に結合する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記状態が、肺炎、尿路感染症、敗血症、新生児敗血症、下痢、軟部組織感染症、臓器移植後の感染症、外科手術による感染症、創傷感染症、肺感染症、化膿性肝膿瘍（ＰＬＡ）、眼内炎、髄膜炎、壊死性髄膜炎、強直性脊椎炎、および脊椎関節症からなる群から選択される、請求項５７、５８または６０のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項６５】
前記状態が院内感染症である、請求項５７、５８、６０または６４のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項６６】
前記クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである、請求項５７〜６５のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項６７】
前記クレブシエラがセファロスポリン、アミノグリコシド、キノロン、および／またはカルバペネムに対して抵抗性である、請求項５７〜６６のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項６８】
抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項５８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗生物質がカルバペネムまたはコリスチンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１〜４６または５０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質または抗体をコードする単離核酸分子。
【請求項７１】
配列番号１３、１４、５３、５４、５５、および５６からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列をコードする単離核酸分子。
【請求項７２】
配列番号１５、１６、５７、５８、５９、および６０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列をコードする単離核酸分子。
【請求項７３】
制御配列に作動可能に連結される、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７４】
請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７５】
請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項７４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７６】
請求項７１に記載の核酸ならびに配列番号１５、１６、５７、５８、５９、および６０からなる群から選択されるＶＬ配列をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項７７】
哺乳類宿主細胞である、請求項７５または７６に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項７７に記載の哺乳類宿主細胞。
【請求項７９】
ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８０】
ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン。
【請求項８１】
免疫学的有効量の前記ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７９または８０に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８２】
アジュバントを含む、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８３】
前記ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が単量体である、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８４】
前記ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片がオリゴマーである、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８５】
前記ＭｒｋＡが肺炎桿菌ＭｒｋＡである、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８６】
前記ＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一な配列を含むか、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される前記配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一な配列をコードする、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８７】
前記ＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列を含むか、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される前記配列をコードする、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項８８】
対象においてクレブシエラに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項７９〜８７のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチンを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項８９】
前記免疫応答が抗体応答を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記免疫応答が細胞媒介性免疫応答を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記免疫応答が細胞媒介性免疫応答および抗体応答を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記免疫応答が粘膜免疫応答である、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記免疫応答が防御免疫応答である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
クレブシエラに対して対象にワクチン接種する方法であって、請求項７９〜８７のいずれか一項に記載の医薬組成物またはワクチンを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項９５】
クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、またはその発生率の低下を、それを必要としている対象において行う方法であって、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項９６】
対象におけるクレブシエラの増殖を阻害する方法であって、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法。
【請求項９７】
前記クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである、請求項８８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記クレブシエラが肺炎桿菌である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が単量体である、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片がオリゴマーである、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＭｒｋＡが肺炎桿菌ＭｒｋＡである、請求項９５〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表に対する参照
本出願と共に提出され、ＡＳＣＩＩテキストファイルＭＲＫＡ−１００−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ（サイズ：４２，１５７バイト；および作成日：２０１６年８月１６日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明の分野は、概して、クレブシエラ感染症の予防または治療のためのＭｒｋＡポリペプチド、ＭｒｋＡコードポリヌクレオチド、および抗ＭｒｋＡ抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
クレブシエラは、肺炎、尿路感染症、新生児敗血症、および外科手術による創傷感染症を含む、見通しが甘いことによる感染および院内感染の原因病原体として臨床上の重要性が急速に増しているグラム陰性菌である。そのうえ、化膿性肝膿瘍（ＰＬＡ）、眼内炎、髄膜炎、および壊死性髄膜炎などのクレブシエラ感染症に関連する、出現しつつある症候群がある。
【０００４】
過去２０年間にわたり、抗生物質抵抗性が、細菌感染への対処における重大な課題の１つとして出現してきた。薬剤抵抗性の黄色ブドウ球菌に対していくらかの進歩が得られたが、多薬剤抵抗性（ＭＤＲ）グラム陰性日和見感染症は、非常に問題であり、新規な抗菌薬剤を必要とする（例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇｓ  ２０１４；２３：１６３−８２を参照されたい）。これらの中で、日和見感染症および院内感染症についての原因病原体である肺炎桿菌（Ｂｒｏｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐ  ２０１４；６：６４）は、多薬剤抵抗性株が広範にわたって広まっており、特に厄介なものとなってきた。広域スペクトルベータラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）、肺炎桿菌カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）、およびニューデリーメタロベータラクタマーゼ１（ＮＤＭ−１）などのクレブシエラ感染症は、世界中に拡散し、現在の抗生物質の分類は主として不適切なものになった。このような現実は、抗生物質流通ルートの縮小と合わさって、臨床医にわずかな治療の選択肢のみを残す（Ｍｕｎｏｚ−Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０１３；１３：７８５−９６）。最近、いくつかの注目を集める感染が発生しており、これは肺炎桿菌抗生物質抵抗性に関する緊急性を強調する。ＭｃＫｅｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３；４９９：３９４−６またはＳｎｉｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１２；４：１４８ｒａ１６を参照されたい。そのうえ、抵抗性の異種間での拡散は、抗生物質を補完するかまたは浪費しないための、抗体およびワクチンなどの代替の病原体特異的な戦略の必要性を指摘する。細菌感染症に対する種特異的な防御抗体は、急速に進化する抗生物質抵抗性メカニズムの影響を受けないであろう。また、前臨床データは、種特異的な防御抗体が補助的な使用において患者に対して有益性をさらに提供し得ることを実証した。例えば、ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１２；２０９：１２７３−８７；ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１４；６：２６２ｒａ１５５を参照されたい。
【０００５】
複数の毒性因子が肺炎桿菌の病原に関係してきた（Ｐｏｄｓｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９８；１１：５８９−６０３）。莢膜多糖（ＣＰＳ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）が最もよく特徴付けられている。ＬＰＳおよびＣＰＳに向けられるポリクローナル抗体は、致命的な肺炎桿菌感染症の前臨床モデルにおいて防御的である（Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２；３０：２４１１−２０；Ｒｕｋａｖｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９７；６５：１７５４−６０；Ｄｏｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９６；１７４：５３７−４３）。しかしながら、抗体によりまたはワクチン候補における免疫原としてそれらを使用してこれらの２つの抗原を標的にすることにより、株の対象範囲に関して重大な課題が生じる。７７を超える既知の莢膜血清型および８つのＯ抗原血清型があり、いずれが最も一般的であるかおよび／または病原に最も関連しているかは明らかでない。血清型特異的モノクローナル抗体は、ＬＰＳおよび莢膜血清型が明確な肺炎桿菌に対して防御を与えることができるが（Ｍａｎｄｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９０；５８：２８２８−３３）、多価の抗原および／または抗体の組み合わせが広範な株を対象としかつ防御するのに必要とされる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９６；２３：１７９−８１）。血清型非依存性交差防御抗原の同定は、今もなお非常に厄介である。例えば、血清型を越えて存在する保存コアＬＰＳエピトープを標的にするモノクローナル抗体は、動物モデルにおいてほとんどまたは全く防御をもたらさなかった（Ｂｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ，７（２）：１１９−２４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肺炎桿菌についての交差防御標的を同定するために、ゲノミクスおよびプロテオミクスのアプローチを含む複数の戦略が使用されてきた（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１２；９：４９７−５０５；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００５；２３：２０３５−４１；Ｍａｒｏｎｃｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００２；７０：４７２９−３４）。多くの標的がこれらの研究から提案されたが、その後の調査を通して検証されたものはほとんどない。注意すべきことに、そのようなアプローチを通して同定された有望な標的の大部分は、代謝経路に関与するタンパク質であり、これらは、入手しづらいために抗体標的として適していないことがあり得る。アンチゲノム戦略は、抗体応答を誘起することができる抗原を直接同定するための新規なアプローチに相当する（Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｖａｃｃｉｎｅ，２３（１７−１８）：２０３５−４１）。肺炎桿菌調査に対するその影響は現在のところ不明である。したがって、肺炎桿菌感染症に対して防御効果を有する抗体および／または免疫原性ポリペプチド／ワクチンを同定および開発する必要が大いにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
抗生物質抵抗性の肺炎桿菌感染症の出現および増えつつある症例は、予防および治療のための抗体療法および／またはワクチンなどの代替のアプローチを開発する十分な理由となる。しかしながら、様々な異なる臨床株によって共有される検証済み標的が不足していることにより、重大な課題が生じる。機能的標的非依存性（ｔａｒｇｅｔ−ａｇｎｏｓｔｉｃ）スクリーニングアプローチが新規な標的に対する防御抗体を同定するために採用された。いくつかのモノクローナル抗体は、オプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）に関する全細菌の結合およびスクリーニングを介してファージディスプレイおよびハイブリドーマのプラットフォームから同定された。これらの活性を有する抗体による肺炎桿菌細胞溶解物の免疫沈降、その後に続く質量分析法により、それらの標的抗原が、ＩＩＩ型フィンブリア複合体中の主なタンパク質であるＭｒｋＡであることを同定した。ＩＩＩ型フィンブリアは、生物および非生物の表面上でのバイオフィルム形成を媒介し、成熟したバイオフィルムの成長に必要とされる。３型フィンブリアの様々な構成成分は、ｍｒｋＡＢＣＤＦオペロンによってコードされ、これは、主なピリンサブユニットＭｒｋＡ、シャペロンＭｒｋＢ、外膜アッシャー（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｕｓｈｅｒ）ＭｒｋＣ、アドヘシンＭｒｋＤ、およびＭｒｋＦを産生する。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｎｏｖ  １４；８（１１）：ｅ７９０３８を参照されたい。クレブシエラの宿主細胞粘着およびバイオフィルム形成は、そのようなＭｒｋＡピリンによって媒介される。Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２８：７４２８−７４３５（２０１２）を参照されたい。これらの血清型非依存性ＭｒｋＡ抗体はまた、マウス肺炎モデルでもバイオフィルム形成を低下させ、防御を与えた。重要なことに、精製ＭｒｋＡタンパク質により免疫化されたマウスは、肺炎桿菌感染症に際して臓器負担の低下を示した。したがって、本開示は、クレブシエラに結合し、クレブシエラのオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導するＭｒｋＡ結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片を提供する。本開示はまた、ＭｒｋＡ結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、およびＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを使用してクレブシエラ感染症を治療する方法も提供する。
【０００８】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、抗原結合タンパク質が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に結合するか、ｂ）肺炎桿菌のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導するか、またはｃ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合し、かつ肺炎桿菌のＯＰＫを誘導する。１つの実例では、抗原結合タンパク質は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される、少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する。１つの実例では、抗原結合タンパク質は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される、少なくとも１つまたは２つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する。１つの実例では、抗原結合タンパク質は、生物発光ＯＰＫアッセイを使用して測定されるように、肺炎桿菌株９１４８（Ｏ２ａ：Ｋ２８）、９１７８（Ｏ３：Ｋ５８）および９１３５（Ｏ４：Ｋ１５）において１００％のＯＰＫを誘導し、かつ／または肺炎桿菌株２９０１１（Ｏ１：Ｋ２）において８０％のＯＰＫを誘導する。１つの実例では、抗原結合タンパク質は、Ｋｐ２９０１１、Ｋｐ９１７８、およびＫｐ４３８１６からなる群から選択される肺炎桿菌株に暴露された動物において延命効果を与える。
【０００９】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、抗原結合タンパク質がバイオフィルム形成を阻害する。
【００１０】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、抗原結合タンパク質が細胞吸着を阻害する。
【００１１】
１つの実例では、相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のセットを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号８のアミノ酸配列を有し、およびＬＣＤＲ３が配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。１つの実例では、その抗原結合タンパク質が、配列番号１３を含むＶＨおよび配列番号１５を含むＶＬを含む。
【００１３】
１つの実例では、配列番号１３を含むＶＨを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００１４】
１つの実例では、配列番号１５を含むＶＬを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００１５】
１つの実例では、相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のセットを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、ＨＣＤＲ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、およびＬＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号１６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。１つの実例では、抗原結合タンパク質が、配列番号１４を含むＶＨおよび配列番号１６を含むＶＬを含む。
【００１７】
１つの実例では、配列番号１４を含むＶＨを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００１８】
１つの実例では、配列番号１６を含むＶＬを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００１９】
１つの実例では、抗原結合タンパク質が配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２中のエピトープに結合する。１つの実例では、抗原結合タンパク質がＭｒｋＡ（配列番号１７）に特異的に結合するが、配列番号２６（配列番号１７のアミノ酸１〜４０を欠くＭｒｋＡ）または配列番号２７（配列番号１７のアミノ酸１７１〜２０２を欠くＭｒｋＡ）のいずれにも結合しない。
【００２０】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、抗原結合タンパク質が配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２中のエピトープに結合する。
【００２１】
１つの実例では、ＭｒｋＡ（配列番号１７）に特異的に結合するが、配列番号２６および／または配列番号２７に結合しない単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００２２】
１つの実例では、（ｉ）それぞれ配列番号２９〜３１および４１〜４３、（ｉｉ）それぞれ配列番号３２〜３４および４４〜４６、（ｉｉｉ）それぞれ配列番号３５〜３７および４７〜４９、ならびに（ｉｖ）それぞれ配列番号３８〜４０および５０〜５２からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のセットを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００２３】
１つの実例では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、前記抗原結合タンパク質が、配列番号５３、５４、５５、もしくは５６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号５７、５８、５９、もしくは６０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。１つの実例では、抗原結合タンパク質が、配列番号５３、５４、５５、または５６を含むＶＨおよび配列番号５７、５８、５９、または６０を含むＶＬを含む。
【００２４】
１つの実例では、配列番号５３、５４、５５、または５６を含むＶＨを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００２５】
１つの実例では、配列番号５７、５８、５９、または６０を含むＶＬを含む、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。１つの実例では、
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｂ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｃ）配列番号５３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｄ）配列番号５４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｅ）配列番号５５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、ならびに（ｆ）配列番号５６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号６０を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片と同じＭｒｋＡエピトープに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。１つの実例では、ＭｒｋＡへの参照抗体の結合を競合的に阻害する単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供され、前記参照抗体が、（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｂ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｃ）配列番号５３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｄ）配列番号５４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、（ｅ）配列番号５５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５９を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、ならびに（ｆ）配列番号５６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号６０を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される。
【００２６】
１つの実例では、抗原結合タンパク質またはその抗原結合断片がオリゴマーＭｒｋＡに結合する。
【００２７】
１つの実例では、オリゴマーＭｒｋＡに特異的に結合するが、単量体ＭｒｋＡに結合しない単離抗原結合タンパク質が本明細書において提供される。
【００２８】
１つの実例では、抗原結合タンパク質がマウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、リサーフェシング、またはヒトである。
【００２９】
１つの実例では、抗原結合タンパク質が抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、またはその抗原結合断片である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が抗体の抗原結合断片である。１つの実例では、抗原結合タンパク質がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。１つの実例では、抗原結合タンパク質がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
【００３１】
１つの実例では、抗原結合タンパク質が約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでＭｒｋＡに結合する。１つの実例では、抗原結合タンパク質が１．０ｎＭ以下のＫｄでＭｒｋＡに結合する。１つの実例では、結合親和性がフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＫｉｎＥｘａ、ラジオイムノアッセイ、またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定される。
【００３２】
１つの実例では、抗原結合タンパク質が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に結合するか、ｂ）肺炎桿菌のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導するか、またはｃ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合し、かつ肺炎桿菌のＯＰＫを誘導する。
【００３３】
１つの実例では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。一部の態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がＫｐ４３８１６バイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。
【００３４】
１つの実例では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がクレブシエラ細胞吸着を阻害するかまたは低下させる。一部の態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がヒト細胞へのクレブシエラ（例えば、Ｋｐ４３８１６を含む）細胞吸着を阻害するかまたは低下させる。一部の態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がヒト上皮細胞へのクレブシエラ（例えば、Ｋｐ４３８１６を含む）細胞吸着を阻害するかまたは低下させる。一部の態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）が肺上皮細胞へのクレブシエラ（例えば、Ｋｐ４３８１６を含む）細胞吸着を阻害するかまたは低下させる。一部の態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がＡ５４９細胞へのクレブシエラ（例えば、Ｋｐ４３８１６を含む）細胞吸着を阻害するかまたは低下させる。
【００３５】
１つの実例では、抗原結合タンパク質が、（ａ）ＩｇＡ定常ドメイン、（ｂ）ＩｇＤ定常ドメイン、（ｃ）ＩｇＥ定常ドメイン、（ｄ）ＩｇＧ１定常ドメイン、（ｅ）ＩｇＧ２定常ドメイン、（ｆ）ＩｇＧ３定常ドメイン、（ｇ）ＩｇＧ４定常ドメイン、および（ｈ）ＩｇＭ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。１つの実例では、抗原結合タンパク質が、（ａ）Ｉｇカッパ定常ドメイン、および（ｂ）Ｉｇラムダ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。１つの実例では、抗原結合タンパク質がヒトＩｇＧ１定常ドメインおよびヒトラムダ定常ドメインを含む。
【００３６】
１つの実例では、抗原結合タンパク質がＩｇＧ１定常ドメインを含む。
【００３７】
１つの実例では、抗原結合タンパク質がＩｇＧ１／ＩｇＧ３キメラ定常ドメインを含む。
【００３８】
１つの実例では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を産生するハイブリドーマが本明細書において提供される。
【００３９】
１つの実例では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を産生する単離宿主細胞が本明細書において提供される。
【００４０】
１つの実例では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を作製する方法であって、（ａ）前記抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞を培養するステップ、および（ｂ）前記抗原結合タンパク質を前記培養宿主細胞から単離するステップを含む方法が本明細書において提供される。１つの実例では、その方法を使用して産生される抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）が本明細書において提供される。
【００４１】
本開示はまた、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。１つの実例では、薬学的に許容可能な賦形剤が保存剤、安定剤、または酸化防止剤である。１つの実例では、医薬組成物が医薬として使用するためのものである。
【００４２】
１つの実例では、抗原結合タンパク質または医薬組成物が標識基またはエフェクター基をさらに含む。１つの実例では、標識基が、同位体標識、磁気標識、レドックス活性成分、光学色素、ビオチン化基、ビオチンシグナル伝達ペプチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの蛍光成分、ならびにヒスチジンペプチド（ｈｉｓ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、金結合ペプチド、およびＦｌａｇなどの二次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープからなる群から選択される。１つの実例では、エフェクター基が、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療薬、および化学療法剤からなる群から選択される。
【００４３】
１つの実例では、クレブシエラ感染症に関連する状態を治療または予防するための、本明細書において提供される抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む）または医薬組成物の使用が本明細書において提供される。
【００４４】
本開示はまた、クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、または回復を、それを必要としている対象において行う方法であって、本明細書において提供される有効量の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む）または医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供する。
【００４５】
１つの実例では、対象におけるクレブシエラの増殖を阻害する方法であって、本明細書において提供される抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片を含む）または医薬組成物を、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。
【００４６】
１つの実例では、クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、または回復を、それを必要としている対象において行う方法であって、有効量の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、状態が、肺炎、尿路感染症、敗血症、新生児敗血症、下痢、軟部組織感染症、臓器移植後の感染症、外科手術による感染症、創傷感染症、肺感染症、化膿性肝膿瘍（ＰＬＡ）、眼内炎、髄膜炎、壊死性髄膜炎、強直性脊椎炎、および脊椎関節症からなる群から選択される。１つの実例では、状態が院内感染症である。１つの実例では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。１つの実例では、クレブシエラがセファロスポリン、アミノグリコシド、キノロン、および／またはカルバペネムに対して抵抗性である。１つの実例では、方法が抗生物質を投与するステップをさらに含む。１つの実例では、抗生物質がカルバペネムまたはコリスチンである。
【００４７】
１つの実例では、対象におけるクレブシエラの増殖を阻害する方法であって、有効量の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスＭｒｋＡに特異的に結合する。１つの実例では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が肺炎桿菌ＭｒｋＡに特異的に結合する。
【００４８】
本開示はまた、本明細書において提供される抗原結合タンパク質をコードする単離核酸分子も提供する。
【００４９】
１つの実例では、配列番号１３、１４、５３、５４、５５、および５６からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列をコードする単離核酸分子が本明細書において提供される。１つの実例では、配列番号１５、１６、５７、５８、５９、および６０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列をコードする単離核酸分子が本明細書において提供される。
【００５０】
１つの実例では、核酸分子が制御配列に作動可能に連結される。１つの実例では、本明細書において提供される核酸分子を含むベクターが本明細書において提供される。１つの実例では、本明細書において提供される核酸分子または本明細書において提供されるベクターで形質転換された宿主細胞が本明細書において提供される。
【００５１】
１つの実例では、配列番号１３、１４、５３、５４、５５、および５６からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列をコードする核酸ならびに配列番号１５、１６、５７、５８、５９、および６０からなる群から選択されるＶＬ配列をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞が本明細書において提供される。
【００５２】
１つの実例では、宿主細胞が哺乳類宿主細胞である。１つの実例では、宿主細胞がＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００５３】
本開示はまた、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供する。１つの実例では、本開示は、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物またはワクチンが、免疫学的有効量のＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実例では、医薬組成物またはワクチンがアジュバントを含む。１つの実例では、医薬組成物またはワクチンのＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が単量体である。１つの実例では、医薬組成物またはワクチンのＭｒｋＡまたはその免疫原性断片がオリゴマーである。１つの実例では、ＭｒｋＡが肺炎桿菌ＭｒｋＡである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一な配列を含むか、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一な配列をコードする。１つの実例では、ＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列を含むか、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列をコードする。
【００５５】
本開示はまた、対象においてクレブシエラに対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書において提供される医薬組成物、ＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片、またはワクチンを対象に投与するステップを含む方法も提供する。１つの実例では、免疫応答が抗体応答を含む。１つの実例では、免疫応答が細胞媒介性免疫応答を含む。１つの実例では、免疫応答が細胞媒介性免疫応答および抗体応答を含む。１つの実例では、免疫応答が粘膜免疫応答である。１つの実例では、免疫応答が防御免疫応答である。
【００５６】
加えて、クレブシエラに対して対象をワクチン接種する方法であって、本明細書において提供される医薬組成物、ＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片、またはワクチンを対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。１つの実例では、クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、またはその発生率の低下を、それを必要としている対象において行う方法であって、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを前記対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。１つの実例では、対象におけるクレブシエラの増殖を阻害する方法であって、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。本明細書において提供される方法の１つの実例では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。１つの実例では、クレブシエラが肺炎桿菌である。本明細書において提供される方法の１つの実例では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が単量体である。本明細書において提供される方法の１つの実例では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片がオリゴマーである。本明細書において提供される方法の１つの実例では、ＭｒｋＡが肺炎桿菌ＭｒｋＡである。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１−１】図１Ａ−１Ｆ：ファージおよびハイブリドーマのプラットフォームを通して単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の肺炎桿菌への結合および強力なＯＰＫ活性を示す。Ａ：全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＫｐ２９０１１への抗体の結合：２つのハイブリドーマクローン（８８Ｄ１０および８９Ｅ１０）ならびに２つのファージ抗体（Ｋｐ３およびＫｐ１６）が、実施例２において記載されるようにＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌株２９０１１に結合する。予想通り、コントロール抗体ｈＩｇＧコントロールは、肺炎桿菌株２９０１１に結合しなかった。Ｂ：抗体は、肺炎桿菌のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導する。ファージ（Ｋｐ３およびＫｐ１６）ならびにハイブリドーマ（８８Ｄ１０および８９Ｅ１０）由来の抗体を、仔ウサギ血清、ＨＬ６０、および肺炎桿菌株２９０１１．ｌｕｘと共にインキュベートした。細菌の死滅について、抗体を欠くコントロールと比較して計算した。Ｃ：ファージ抗体（Ｋｐ３およびＫｐ１６）は、肺炎桿菌への結合について競合する。１μｇ／ｍｌのビオチン標識Ｋｐ３を、示されるように、増加性の量の非標識ファージ抗体およびコントロール抗体と混合し、肺炎桿菌株２９０１１へのその結合について試験した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを検出剤として使用した。Ｋｐ３およびＫｐ１６は共に、肺炎桿菌株２９０１１へのビオチン標識Ｋｐ３の結合を妨げた。Ｄ：ファージ抗体（Ｋｐ３およびＫｐ１６）ならびにハイブリドーマ抗体（８８Ｄ１０）は肺炎桿菌への結合において競合する。１μｇ／ｍｌのハイブリドーマクローン８８Ｄ１０を、増加性の量のファージ抗体およびコントロール抗体（ｈＩｇＧ）と混合し、肺炎桿菌株２９０１１へのその結合について試験した。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを検出剤として使用した。ＥＬＩＳＡシグナルの低下を阻害のパーセンテージとして表現した。Ｋｐ３およびＫｐ１６は共に、肺炎桿菌株２９０１への８８Ｄ１０の結合を妨げた。Ｅ．ファージ（Ｋｐ３およびＫｐ１６）抗体ならびにハイブリドーマ（２１Ｇ１０、２２Ｂ１２、８８Ｄ１０、および８９Ｅ１０）抗体は、様々な血清型の肺炎桿菌株に結合する。「＋」は、結合を示す。Ｆ．抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂ  Ｋｐ３は、様々な血清型の肺炎桿菌に対して強力なＯＰＫ活性を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図２Ａ−２Ｄ】本明細書において生成される肺炎桿菌特異的抗体が結合する抗原としてＭｒｋＡを同定する実験の結果を示す。Ａ：肺炎桿菌の表面へのＫｐ３抗体結合を示す共焦点顕微鏡画像。Ｂ：非反応性（１８９９）および反応性（４３８１６ＤＭ）肺炎桿菌株由来の細胞溶解物からのＫｐ３、８８Ｄ１０、およびアイソタイプコントロール抗体による免疫沈降。免疫沈殿したポリペプチドに対応する付番したバンド（１〜４）をＬＣ−ＭＳ分析にかけた。Ｃ：免疫沈降産物のウエスタンブロット分析。図２ＢおよびＣのレーンは以下の通りであった：レーン１−あらかじめ染色した分子量マーカー、レーン２−Ｋｐ３非反応性株１８９９由来の細胞溶解物、レーン３−Ｋｐ３反応性株４３８１６ＤＭ由来の細胞溶解物、レーン４−アイソタイプコントロールによる免疫沈降にかけた１８９９溶解物、レーン５−Ｋｐ３による免疫沈降にかけた１８９９溶解物、レーン６−８８Ｄ１０による免疫沈降にかけた１８９９溶解物、レーン７−アイソタイプコントロールによる免疫沈降にかけた４３８１６ＤＭ溶解物、レーン８−Ｋｐ３による免疫沈降にかけた４３８１６ＤＭ溶解物、およびレーン９−８８Ｄ１０による免疫沈降にかけた４３８１６ＤＭ溶解物。Ｄ：図２Ｂのゲルバンド番号３のＬＣ−ＭＳ結果。質量分析法を通して同定されたペプチドを肺炎桿菌株ＭＧＨ７８５７８  ＭｒｋＡ配列（配列番号１７）に関して太字にし、下線を引く。
【図３Ａ−３Ｂ】ＭｒｋＡが、本明細書において生成される肺炎桿菌特異的抗体が結合する共通の抗原であることを示す。Ａ：抗ｈｉｓタグ（左のパネル）抗体およびＫｐ３（右のパネル）抗体を使用するウエスタンブロット分析によるＭｒｋＡの組換え発現。レーン１：宿主細胞のみ；レーン２：空のベクターで形質転換した宿主細胞；レーン３：ｈｉｓタグ付加ＭｒｋＡ  ＯＲＦを有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞；およびレーン４：株４３８１６ＤＭから調製した溶解物。これらの結果は、Ｋｐ３が組換えＭｒｋＡに結合することを示す。Ｂ：ＭｒｋＡのインビトロにおける転写および翻訳ならびにＫｐ３（左のパネル）抗体、抗Ｍｙｃタグ（右のパネル）抗体を使用するウエスタンブロット分析。試料１：ポジティブ細菌細胞溶解物；２：ネガティブ細胞溶解物；３：シグナルペプチドなし／ジスルフィド結合エンハンサーありの、インビトロにおいて発現されたＭｒｋＡ；４：シグナルペプチドあり／ジスルフィド結合エンハンサーあり；５：シグナルペプチドもジスルフィド結合エンハンサーもなし；６：シグナルペプチドあり、ジスルフィド結合エンハンサーなし；および７：ＭｒｋＡ  ＯＲＦなしのインビトロ発現系ネガティブコントロール。これらの結果は、Ｋｐ３がインビトロにおいて翻訳されたＭｒｋＡに結合することを示す。図３Ａおよび３Ｂの両方の左側の数値は、ｋＤａでのタンパク質の分子量である。
【図４Ａ−４Ｄ】様々なインビボモデルにおけるＫｐ３  ｍＡｂの防御活性を示す。ＡおよびＢ：Ｋｐ３は、それぞれＫｐ２９０１１（Ｏ１：Ｋ２）およびＫｐ９１７８（Ｏ３：Ｋ３８）に対する鼻内肺感染症モデルにおける臓器負担を低下させる。無関係のヒトＩｇＧ１抗体（ｈＩｇＧ１）およびＫｐ４３８１６に対するウサギポリクローナル抗体（Ｒａｂ  ＩｇＧ）は、コントロールとして使用した。抗体は、すべて１５ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。これらの結果は、細菌による攻撃前に投与された場合に抗ＭｒｋＡ抗体Ｋｐ３が臓器負担を低下させたことを示す。Ｃ：Ｋｐ３は、Ｋｐ４３８１６（Ｏ１：Ｋ２）を使用する致命的な細菌性肺炎モデルにおいて生存を強化した。無関係のヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）抗体は、コントロールとして使用した。両方の抗体を１５ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。Ｄ：Ｋｐ３は、多薬剤抵抗性（ＭＤＲ）株であるＫｐ９８５０４８を使用する致命的な細菌性肺炎モデルにおいて生存を有意に増強した。無関係のヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）抗体は、コントロールとして使用した。両方の抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。これらの結果は、細菌による攻撃の２４時間前に投与された場合に抗ＭｒｋＡ抗体Ｋｐ３が生存を増強することを示す。
【図５】腸内細菌科メンバー間のＭｒｋＡの保存を示す。保存残基は上に示し、異なる残基はボックスでマークする。ＭｒｋＡは、大部分の腸内細菌科メンバー間で保存されている。
【図６】ＭｒｋＡ結合アッセイの結果を示す。完全長ＭｒｋＡ（「ＭｒｋＡ−ＷＴ」；配列番号１７）、４０アミノ酸Ｎ末端欠失を有するＭｒｋＡ（「ＭｒｋＡ−Ｎ−ｄｌｔ」；すなわち配列番号１７のアミノ酸４１〜２０２（すなわち配列番号２６））、３２アミノ酸Ｃ末端欠失を有するＭｒｋＡ（「ＭｒｋＡ−Ｃ−ｄｌｔ」；すなわち配列番号１７のアミノ酸１〜１７０（すなわち配列番号２７））、ＮおよびＣ末端欠失の両方を有するＭｒｋＡ（「ＭｒｋＡ−Ｎ／Ｃ−ｄｌｔ」；すなわち配列番号１７のアミノ酸４１〜１７０（すなわち配列番号２８））、ならびに空のベクター（「Ｔｏｐ１０  ｃｏｎｔ」）を細胞において発現させた。細胞溶解物をＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングし、Ｋｐ３およびコントロールＭｒｋＡ抗体との結合についてアッセイした。ヒトＩｇＧ１はまた、コントロールとしての役割も果たした。Ｋｐ３が完全長ＭｒｋＡのみを検出したのに対して、コントロール抗体は、完全長ＭｒｋＡおよびＮ末端欠失を有するＭｒｋＡを検出した。これらの結果は、Ｋｐ３が立体エピトープを認識することを示す。
【図７】単量体ＭｒｋＡおよびオリゴマーＭｒｋＡの精製を示す。単量体ＭｒｋＡおよびオリゴマーＭｒｋＡの画分を発現させ、精製し、還元条件および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析し、青色の染色剤により視覚化した。Ｍ：分子量マーカー。レーン１および４は、プール１由来の単量体ＭｒｋＡを含有する。レーン２および５は、プール２由来の単量体ＭｒｋＡを含有する。レーン３および６は、オリゴマーＭｒｋＡを含有する。
【図８Ａ−８Ｂ】ＭｒｋＡワクチン接種が肺の負担を低下させることを示す。単量体ＭｒｋＡまたはオリゴマーＭｒｋＡにより免疫化したＣ５７／ｂｌ６マウスに、Ｋｐ２９０１１（Ｏ１：Ｋ２）を鼻腔内に抗原投与した。肺および肝臓における細菌の存在を感染の２４時間後に分析した。単量体ＭｒｋＡは、肺において細菌を有意に低下させ（図８Ａ）、オリゴマーＭｒｋＡは、肺および肝臓の両方において細菌を有意に低下させた（図８Ｂ）。（＊）は、スチューデントのｔ検定ｐ値＜．０５を示す。
【図９】Ｋｐ３がクレブシエラバイオフィルム形成を阻害することを示す。Ｋｐ４３８１６を、抗ＭｒｋＡ抗体Ｋｐ３（黒三角）またはｈＩｇＧ１（アイソタイプコントロール抗体、白三角、「Ｒ３４７」）の存在下においてＦａｌｃｏｎプラスチックプレートに追加した。バイオフィルム形成の阻害をグラフで示した。（＊＊）は、アイソタイプコントロールと比べたＫｐ３の値についての、スチューデントのｔ検定ｐ値＜０．０１を示す。
【図１０】Ｋｐ３が上皮細胞へのクレブシエラの結合を阻害することを示す。Ｋｐ４３８１６を、抗ＭｒｋＡ抗体Ｋｐ３（黒三角）またはｈＩｇＧ１（白三角、「Ｒ３４７」）の存在下においてＡ５４９細胞（２×１０５／ウェル）に追加した。試料は、二通りで実行し、グラフは、３つの別々の実験の代表である。（＊）は、アイソタイプコントロールと比べたＫｐ３の値についての、スチューデントのｔ検定ｐ値＜．０５を示す。エラーバーが見えない場合、エラーバーは記号の幅よりも小さい。
【図１１】実施例１０において記載されるファージパニングのアウトプットスクリーニングカスケードを示す。ファージパニング、ｓｃＦｖ．Ｆｃ変換、および形質転換後、４０００を超えるコロニーをハイスループットスクリーニングのために選んだ。クローン１、４、５、および６を含む４つのクローンをさらなる特徴付けのために選択した。
【図１２】ＭｒｋＡバインダーのスクリーニングに使用される、構成要素が４つの均一性時間分解蛍光法（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ＦＲＥＴ）（ＨＴＲＦ）の概略図を示す。構成要素Ａは、ストレプトアビジン−Ｅｕ（Ｋ）クリプタートであり、かつエネルギードナーとしての役割を果たすが、構成要素ＢおよびＣ間の相互作用により、構成要素Ｄと隣接した状態になり、構成要素Ｄは、抗ｈｕＦｃ−ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７であり、かつエネルギーアクセプターとしての役割を果たす。Ｂは、ビオチン標識ＭｒｋＡであり、Ｃは、ＭｒｋＡに特異的なｓｃＦｖ−Ｆｃである。
【図１３】抗ＭｒｋＡ抗体を使用する結合アッセイを示す。ＭｒｋＡタンパク質は、ＥＬＩＳＡプレート（右のパネル）上に直接コーティングしたまたはビオチン化後にストレプトアビジンによって捕捉した（左のパネル）。ＭｒｋＡタンパク質は、これらの異なる抗原提示フォーマットにおいて抗ＭｒｋＡ抗体によって異なって認識された。
【図１４】抗ＭｒｋＡ抗体が、大腸菌（Ｅ）において発現させた組換えＭｒｋＡと比較して、むしろＫＰ株（Ｋ）から直接調製したオリゴマーＭｒｋＡに結合することをウエスタンブロット分析において示す。クローン１は、ＫＰ由来の単量体ＭｒｋＡを検出することができる唯一の抗体である（矢印によって示す）。
【図１５】エピトープ結合アッセイの結果を示す。エピトープビニングは、３つの被験物質：ＫＰ３、クローン４、およびクローン５に対して実行した。
【図１６】ＯＰＫ活性がインビボ防御活性にとって重要であることを示す。ＫＰ３−ＴＭ突然変異を生成し、インビトロＯＰＫアッセイ（上のパネル）およびインビボ攻撃アッセイ（下のパネル）の両方において試験した。著しい低下がＯＰＫアッセイにおいて見られ、有意な傾向がインビボ攻撃アッセイにおいて見られた。
【図１７】抗ＭｒｋＡ抗体によるＫＰ株への血清型非依存性の結合を示す。フローサイトメトリー実験は、異なる血清型の３つのＷＴ  ＫＰ株に対する４つの抗ＭｒｋＡ抗体の結合を測るために使用した。Ｒ３４７は、ヒトＩｇＧアイソタイプコントロールとする。
【図１８】抗ＭｒｋＡ抗体による血清型非依存性のＯＰＫ活性を示す。ＬＰＳ血清型Ｏ１およびＯ２の２つの株をＯＰＫアッセイにおいて使用した。抗ＭｒｋＡ抗体クローン１、クローン４、クローン５、およびクローン６は、ＫＰ３と同等のＯＰＫ活性を示した。Ｒ３４７は、ヒトＩｇＧアイソタイプコントロールとする。
【図１９】予防インビボ攻撃モデルの結果を示す。抗体は、ＫＰ攻撃の２４時間前に与えた。
【図２０】治療インビボ攻撃モデルの結果を示す。抗体は、ＫＰ攻撃の１時間後に与えた。
【図２１】個々の抗体が、治療モデルにおいて抗体の組み合わせと同程度に有効であることを示す。ＫＰ３は、示されるように等量でクローン１またはクローン５と組み合わせ、治療モデルにおいて試験した。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本開示は、ＭｒｋＡに結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、単離結合タンパク質を提供する。関連するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および抗体またはその抗原結合断片を含むＭｒｋＡ結合タンパク質を含む医薬組成物も提供される。本明細書において開示される、抗体または抗原結合断片を含むＭｒｋＡ結合タンパク質を作製および使用する方法も提供される。本開示はまた、本明細書において開示される、抗体または抗原結合断片を含むＭｒｋＡ結合タンパク質を投与することにより、クレブシエラ感染症に関連する状態を予防および／または治療する方法も提供する。
【００５９】
本開示がより容易に理解されるために、ある用語について最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明の全体にわたって示される。
【００６０】
Ｉ．定義
用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に示さない限り、複数の指示物を含む。例えば、「抗原結合タンパク質」は、１つ以上の抗原結合タンパク質を示すことが理解される。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）ならびに用語「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合、２つの指定される特徴または構成要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示と解釈されるべきである。したがって、用語「および／または」は、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句で用いられるとき、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で用いられるとき、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
【００６１】
用語「含む」は、全般的に、包含するという意味で使用される、すなわち、１つ以上の特徴または構成要素の存在を許可する。本明細書において態様が用語「含む」を用いて記載される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」の用語で記載される他の点で類似の態様も提供される。
【００６２】
本明細書および請求項の全体にわたって数値に関連して使用される用語「約」は、当業者によく知られており、許容され得る精度の幅を意味する。一般に、そのような精度の幅は±１０％である。
【００６３】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００６４】
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有され得る種々の態様または本開示の態様の限定ではない。従って、この直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによってさらに十全に定義される。
【００６５】
用語「抗原結合タンパク質」は、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片など、標的、例えばＭｒｋＡを認識し、特異的に結合する１つ以上のポリペプチドから構成される分子を指す。
【００６６】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介してタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせなどの標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、その抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、および任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称されるその重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づき、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかのものであり得る。異なる免疫グロブリンクラスは異なる周知のサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであってもよく、または毒素、放射性同位体等の他の分子にコンジュゲートしてもよい。
【００６７】
用語「抗体断片」または「その抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分を指す。「抗原結合断片」または「その抗原結合断片」は、抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を指す。抗原結合断片は、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含有することができる。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ、ならびに一本鎖抗体が挙げられる。
【００６８】
元の抗体または断片の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子またはその断片を産生するために、モノクローナル抗体および他の抗体またはその断片を得て、組換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。そのような技術は、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域およびフレームワーク領域に抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを導入することを含むことができる。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号明細書、英国特許第２１８８６３８Ａ号明細書、または欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号明細書および多くのそれに続く文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝子突然変異または他の変化を受けることがあり、これにより、産生される抗体またはその断片の結合特異性が改変されてもまたは改変されなくてもよい。
【００６９】
抗体工学の技術において利用可能なさらなる技術は、ヒト抗体およびヒト化抗体またはその断片を単離することを可能にした。例えば、ヒトハイブリドーマは、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｅｆａｎ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｓ（２００１）によって記載されるように作製することができる。抗原結合タンパク質を生成するための別の確立された技術、ファージディスプレイは、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｅｆａｎ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｓ（２００１）および国際公開第９２／０１０４７号パンフレットなどの多くの刊行物に詳細に記載された。マウス抗体遺伝子が不活性化され、かつヒト抗体遺伝子と機能的に置き換えられているが、マウス免疫系のインタクトな他の構成要素が残っているトランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対するヒト抗体を単離するために使用することができる。
【００７０】
合成抗体分子またはその断片は、例えばＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６，５７−８６またはＫｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４  ２００１  ６７−８４によって記載されるように、適した発現ベクター内で合成され、アセンブルされるオリゴヌクレオチドによって生成される遺伝子からの発現によって作り出すことができる。
【００７１】
全抗体の断片が抗原に結合する機能を実行し得ることが示された。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４）；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが結び付いて、抗原結合部位を形成するのを可能にするペプチドリンカーによって連結されている（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築される多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化されてもよい（Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインにつながれたｓｃＦｖを含むミニボディも作製されてもよい（Ｓ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。
【００７２】
二重特異性抗体が使用されることになる場合、これらは、従来の二重特異性抗体であってもよく、これらは、様々な方法で製造することができ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができるかまたは上記に言及される二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。二重特異性抗体の例は、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインを使用し、短い可動性のペプチドを介して直接連結することができるＢｉＴＥ（商標）技術のものを含む。これは、短い単一ポリペプチド鎖上で２つの抗体を組み合わせる。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域なしで構築し、抗イディオタイプ反応の影響を可能性として低下させることができる。二重特異性ダイアボディはまた、二重特異性全抗体とは対照的に、それらを容易に構築することができ、大腸菌において発現させることができるため、特に有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（および抗体断片などの他の多くのポリペプチド）は、ライブラリからファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を使用して容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが、例えばＭｒｋＡに対して特異的な特異性を有するように一定に保たれることになる場合、他方のアームが多種多様であるライブラリを作製することができ、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性全抗体は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）遺伝子操作によって作製されてもよい（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）。多重特異性および／または多価分子を作り出した免疫グロブリン様ドメインベースの技術は、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ＢｉＴＥ、ＳＭＩＰ、ＤＮＬ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、Ａｌｂｕ−ｄａｂ、ＤＡＲＴ、ＤＶＤ−ＩＧ、Ｃｏｖｘボディ、ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、ＳＶＤ−Ｉｇ、ｄＡｂ−Ｉｇ、ノブインホール（Ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−Ｈｏｌｅｓ）、ＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（商標）、およびｔｒｉｏｍＡｂを含む。二重特異性二価抗体およびそれらを作製する方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号明細書；米国特許第５，８０７，７０６号明細書；米国特許第５，８２１，３３３号明細書；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号明細書および米国特許出願公開第２００２／０１５５５３７号明細書において記載され、これらのすべての開示は、本明細書において参照により援用される。二重特異性四価抗体およびそれらを作製する方法は、例えば国際公開第０２／０９６９４８号パンフレットおよび国際公開第００／４４７８８号パンフレットにおいて記載され、これらの両方の開示は、本明細書において参照により援用される。一般に、国際公開第９３／１７７１５号パンフレット；国際公開第９２／０８８０２号パンフレット；国際公開第９１／０���３６０号パンフレット；国際公開第９２／０５７９３号パンフレット；Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号明細書；米国特許第４，７１４，６８１号明細書；米国特許第４，９２５，６４８号明細書；米国特許第５，５７３，９２０号明細書；米国特許第５，６０１，８１９号明細書；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００７３】
語句「エフェクター機能」は、Ｆｃ受容体または補体成分との抗体のＦｃ構成要素の相互作用から結果として生じる抗体の活性を指す。これらの活性は、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を含む。したがって、エフェクター機能が改変された抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ）の活性を変えるＦｃ領域における改変（例えば、アミノ酸置換、欠失、追加、またはオリゴ糖の変化）を含有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指す。エフェクター機能が改善された抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ）の活性を増加させるＦｃ領域における改変（例えば、アミノ酸置換、欠失、追加、またはオリゴ糖の変化）を含有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指す。
【００７４】
用語「特異的な」は、特異的な結合ペアのあるメンバーがその特異的結合パートナー以外の分子にいかなる有意な結合も示さないであろう状態を指すために使用されてもよい。用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多くの抗原が有する特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを有する抗原結合タンパク質は、そのエピトープを有する様々な抗原に結合することができるであろう。
【００７５】
「特異的に結合する」により、抗体またはその抗原結合断片を含む抗原結合タンパク質がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することならびに結合が抗原結合ドメインおよびエピトープ間のいくらかの相補性を必要とすることを一般に意味する。この定義に従って、抗体が偶然の関係がないエピトープに結合するよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、抗体は、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。
【００７６】
「親和性」は、リガンド結合反応の本質的な結合強度の尺度である。例えば、抗体（Ａｂ）−抗原（Ａｇ）相互作用の強度の尺度は、結合親和性を通して測定され、これは、解離定数ｋｄによって定量化されてもよい。解離定数は、結合親和性定数であり、
【数１】
2018527924.tif 000002
によって与えられる。親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ親和性アッセイ、フローサイトメトリー、および／またはラジオイムノアッセイを使用して測定されてもよい。
【００７７】
「効力」は、定められた強度の効果をもたらすために必要とされる化合物の量で表現される化合物の薬理活性についての尺度である。それは、明確な生物学的効果を実現するために必要とされる化合物の量を指し、必要とされる用量が少ないほど、その薬剤は強力である。ＭｒｋＡに結合する抗原結合タンパク質の効力は、例えば、本明細書において記載されるようにＯＰＫアッセイを使用して決定されてもよい。
【００７８】
「オプソニン作用による死滅」または「ＯＰＫ」は、免疫細胞による食作用の結果として生じる、細胞、例えばクレブシエラの死を指す。ＯＰＫ活性を実証するために使用することができるアッセイは、実施例において使用される生物発光ＯＰＫ活性または寒天プレート上の細菌コロニーを数えることによるものを含む。さらなるアッセイは、例えばＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９：１２７３−８７（２０１２）において提供され、これは、参照により本明細書に援用される。
【００７９】
抗体またはその抗原結合断片を含む抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質がエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合をある程度ブロックする場合、定められたエピトープへの参照抗体もしくはその抗原結合断片の結合を競合的に阻害するか、または参照抗体もしくは抗原結合断片と「競合する」と言われる。競合的阻害は、当技術分野において知られている任意の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。結合分子は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、定められたエピトープへの参照抗体もしくは抗原結合断片の結合を競合的に阻害するか、または参照抗体もしくはその抗原結合断片と競合すると言うことができる。
【００８０】
用語「競合する」は、抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）に関して使用される場合、試験下の抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能的断片）が、共通抗原（例えば、ＭｒｋＡタンパク質またはその断片）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的な結合を妨げるかまたは阻害するアッセイによって決定されるように、抗原結合タンパク質の競合を意味する。多数のタイプの競合的結合アッセイ、例えば、固相直接的または間接的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接的または間接的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９２：２４２−２５３を参照されたい）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固相直接的標識アッセイ、固相直接的標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；１−１２５標識を使用する固相直接的標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照されたい）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照されたい）；および直接的標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）を使用することができる。典型的に、そのようなアッセイは、これら非標識試験抗原結合タンパク質および標識参照抗原結合タンパク質のいずれかを有する固体表面またはセルに結合した精製抗原の使用を伴う。
【００８１】
競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下において固体表面またはセルに結合した標識の量を決定することによって測定することができる。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質および立体障害が生じるほど、参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに限りなく近い隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、競合抗原結合タンパク質は、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％、共通抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的な結合を阻害するであろう。一部の実例では、結合が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて阻害される。
【００８２】
本明細書において開示される抗原結合タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片は、抗原、例えばそれらが認識するかまたは特異的に結合する標的ポリペプチドのエピトープまたは一部分に関して説明するかまたは特徴付けることができる。例えば、本明細書において開示される抗原結合ポリペプチドまたはその断片の抗原結合ドメインと特異的に相互作用するＭｒｋＡの一部分は、「エピトープ」である。エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並ぶようになる連続していないアミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への接触に際して典型的に保持されるのに対して、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、変性溶媒による処置に際して典型的に失われる。立体エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションで構成され得る。線状エピトープは抗原の連続したアミノ酸配列によって形成される。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含んでいてもよく、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、ユニークな空間的コンホメーションに少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５のアミノ酸を典型的に含む。エピトープは、当技術分野において知られている方法を使用して決定することができる。
【００８３】
アミノ酸は、本明細書において、その一般に知られている三文字記号によるか、あるいはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する一文字記号により参照される。ヌクレオチドも同様に、その一般に認められている一文字コードによって参照される。
【００８４】
本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に連結される単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。本明細書において使用されるように、用語「タンパク質」は、いくつかの実例ではアミド結合以外の結合によって結び付けることができる１つ以上のポリペプチドから構成される分子を包含することが意図される。他方では、タンパク質はまた、単一ポリペプチド鎖とすることができる。この後者の実例では、単一ポリペプチド鎖は、いくつかの実例では、タンパク質を形成するために互いに融合された２つ以上のポリペプチドサブユニットを含むことができる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」はまた、限定を伴うことなくグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、知られている保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む発現後修飾の産物も指す。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然の生物学的な供給源に由来するかまたは組換え技術によって産生することができるが、示される核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成によるものを含む任意の方法で生成することができる。
【００８５】
用語「単離」は、本開示の抗原結合タンパク質またはそのような結合タンパク質をコードする核酸が全般的に本開示に従うであろう状態を指す。単離タンパク質および単離核酸は、それらが自然環境またはそのような調製物がインビトロにおいてもしくはインビボにおいて実施される組換えＤＮＡ技術によるものである場合にそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）において見つけられる、他のポリペプチドまたは核酸など、それらが自然に関連している物質がないかまたは本質的にないであろう。タンパク質および核酸は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤されてもよく、なお実際的な目的のために単離されてもよく、例えば、タンパク質は、イムノアッセイで使用されるマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合、ゼラチンまたは他の担体と通常混合されるか、または診断もしくは療法において使用される場合、薬学的に許容可能な担体もしくは希釈剤と混合されるであろう。抗原結合タンパク質は、天然にまたは異種真核細胞（例えば、ＣＨＯもしくはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞）の系によってグリコシル化されてもよく、またはそれらは非グリコシル化であってもよい（例えば、原核細胞における発現によって産生される場合）。
【００８６】
「単離される」ポリペプチド、抗原結合タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界で見つけられない形態のポリペプチド、抗原結合タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離ポリペプチド、抗原結合タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、それらがもはや自然界で見つけられる形態でない程度まで精製されたものを含む。いくつかの実施形態では、単離される抗原結合タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物が本質的に純粋である。
【００８７】
「組換え」ポリペプチド、タンパク質、または抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質または抗体を指す。宿主細胞で発現する組換え産生ポリペプチド、タンパク質、および抗体は、任意の好適な技術によって分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製されている天然または組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されていると見なされる。
【００８８】
ポリペプチドの断片、変異体、または誘導体およびその任意の組み合わせも本開示に含まれる。用語「断片」は、本開示のポリペプチドおよびタンパク質を指す場合、参照ポリペプチドまたはタンパク質の特性の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。ポリペプチドの断片は、タンパク分解断片および欠失断片を含む。
【００８９】
用語「変異体」は、本明細書において使用されるように、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親の抗体またはポリペプチド配列と異なる抗体またはポリペプチド配列を指す。本開示の抗体またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸置換、欠失、または挿入によりアミノ酸配列が改変された断片およびさらに抗体またはポリペプチドを含む。変異体は、天然に存在し得るかまたは天然に存在し得ない。天然に存在しない変異体は、当技術分野において知られている突然変異誘発技術を使用して産生することができる。変異ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または追加を含むことができる。
【００９０】
抗体またはポリペプチドに適用される用語「誘導体」は、天然のポリペプチドまたはタンパク質上に見つけられないさらなる特徴を示すように改変された抗体またはポリペプチドを指す。「誘導体」抗体の１つの例は、第２のポリペプチドもしくは他の分子（例えば、ＰＥＧなどのポリマー、発色団、もしくはフルオロフォア）または原子（例えば、放射性同位体）との融合物またはコンジュゲートである。
【００９１】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、本明細書において使用されるように、単数の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある種の態様では、ポリヌクレオチドが、従来のホスホジエステル結合または従来のものではない結合（ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見つけられるものなどのアミド結合）を含む。
【００９２】
用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ断片を指す。核酸またはポリヌクレオチドに適用される場合、用語「単離」は、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指し、例えば、ベクターに含有される抗原結合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドは、本開示のために単離されていると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に維持されるかまたは溶液中の他のポリヌクレオチドから精製された（部分的にもしくは実質的に）組換えポリヌクレオチドを含む。単離ＲＮＡ分子は、本開示のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本開示による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成して産生されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナルなどの調節エレメントを含むことができる。
【００９３】
本明細書において使用されるように、用語「宿主細胞」は、組換え核酸を有するかまたは有することができる細胞または細胞の集団を指す。宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌）またはその代わりに、宿主細胞は、真核生物、例えば真菌細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、もしくは分裂酵母などの酵母細胞）および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ−９）または哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくはハイブリドーマ）などの様々な動物細胞とすることができる。
【００９４】
用語「アミノ酸置換」は、親配列に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置き換えることを指す。アミノ酸は、親配列において、例えば化学的ペプチド合成を用いるか、または当技術分野において公知の組換え方法で置換することができる。従って、「Ｘ位での置換」と言う場合、Ｘ位に存在するアミノ酸を代替的なアミノ酸残基で置換することを指す。一部の実施形態において、置換パターンは、スキーマＡＸＹに従い記述することができ、ここでＡは、天然でＸ位に存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは置換するアミノ酸残基である。他の態様において、置換パターンはスキーマＸＹに従い記述することができ、ここでＹは、天然でＸ位に存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字コードである。
【００９５】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸に置き換えられる場合、この置換は保存的であると見なされる。別の態様では、一続きのアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順番および／または組成が異なる構造的には同様の一続きによって保存的に置き換えることができる。
【００９６】
非保存的置換は、（ｉ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が電気陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）に代えて、またはそれによって置換されているか、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）に代えて、またはそれによって置換されているか、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが任意の他の残基に代えて、またはそれによって置換されているか、または（ｉｖ）かさ高い疎水性または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｒｐ）がより小さい側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）または側鎖を有しないもの（例えば、Ｇｌｙ）に代えて、またはそれによって置換されているものを含む。
【００９７】
当業者は他の置換を容易に特定することができる。例えば、アミノ酸アラニンについて、置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システインおよびＤ−システインのいずれか１つから選択することができる。リジンについて、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、またはＤ−オルニチンのいずれか１つであってもよい。概して、単離ポリペプチドの特性の変化を引き起こすと予想し得る機能的に重要な領域の置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンまたはスレオニンが疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはアラニンに代えて（またはそれによって）置換されるか、（ｉｉ）システイン残基が任意の他の残基に代えて（またはそれによって）置換されるか、（ｉｉｉ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンが電気陰性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸に代えて（またはそれによって）置換されるか、または（ｉｖ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、かかる側鎖を有しないもの、例えばグリシンに代えて（またはそれによって）置換されるものである。前述の非保存的置換の１つがタンパク質の機能特性を変化させ得る可能性はまた、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置にも相関する。従って一部の非保存的置換は、生物学的特性に対する効果をほとんどまたは全く有しない。
【００９８】
用語「アミノ酸挿入」は、親配列に存在する２つのアミノ酸残基間に新規アミノ酸残基を導入することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を用いるか、または当技術分野において公知の組換え方法で親配列に挿入することができる。従って本明細書で使用されるとき、語句「Ｘ位とＹ位との間への挿入」または「Ｋａｂａｔ  Ｘ位とＹ位との間への挿入」（ここでＸおよびＹはアミノ酸位置に対応する）は（例えば、２３９位と２４０位との間へのシステインアミノ酸挿入）、Ｘ位とＹ位との間へのアミノ酸の挿入を指し、また、核酸配列における、Ｘ位およびＹ位のアミノ酸をコードするコドン間への、あるアミノ酸をコードするコドンの挿入も指す。挿入パターンは、スキーマＡＸｉｎｓに従い記述することができ、ここでＡは、挿入されるアミノ酸に対応する一文字コードであり、およびＸは挿入前の位置である。
【００９９】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」という用語は、２つの配列の最適アラインメントのため導入しなければならない付加または欠失（即ちギャップ）を考慮した、比較ウィンドウにわたって配列が共有される同一のマッチ位置の数を指す。マッチ位置は、標的配列と参照配列との両方で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が提供される任意の位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、標的配列に提供されるギャップはカウントしない。同様に、カウントするのは標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸であり、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、参照配列に提供されるギャップもカウントしない。配列同一性のパーセンテージは、両方の配列に同一のアミノ酸残基または核酸塩基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を求め、そのマッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることにより計算される。２つの配列間の配列の比較およびパーセント配列同一性の決定は、容易に利用可能なソフトウェアプログラムを用いて達成することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給元から、タンパク質配列およびヌクレオチド配列の両方のアラインメントについて利用可能である。パーセント配列同一性を決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰのいずれかのアルゴリズムを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に用いられ、一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に用いられる。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラムスイートの一部であって、かつ欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａからも入手可能なニードル（Ｎｅｅｄｌｅ）、ストレッチャー（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）、ウォーター（Ｗａｔｅｒ）、またはマッチャー（Ｍａｔｃｈｅｒ）である。
【０１００】
「特異的な結合メンバー」は、互いに結合特異性を有する分子のペアのメンバーを示す。特異的な結合ペアのメンバーは、天然に由来してもよく、または全体的もしくは部分的に合成して産生されてもよい。分子のペアの一方のメンバーは、その表面上に、あるエリアまたはくぼみを有し、これは、分子のペアの他方のメンバーに特異的に結合し、そのため、その特定の空間的な正反対の構造に対して相補的である。したがって、ペアのメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的な結合ペアのタイプについての例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本開示は、抗原−抗体タイプの反応に関する。
【０１０１】
本明細書において使用される用語「ＩｇＧ」は、認められている免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを指す。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３を含む。
【０１０２】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部またはすべてに特異的に結合し、相補的であるエリアを含む、抗体分子の一部を示す。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の一部にのみ結合してもよく、この一部は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインによってもたらされてもよい（例えば、ＶＨドメインからなる、いわゆるＦｄ抗体断片）。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよい。
【０１０３】
用語「抗原結合タンパク質断片」または「抗体断片」は、インタクトな抗原結合タンパク質または抗体の一部分を指し、インタクトな抗原結合タンパク質または抗体の抗原決定可変領域を指す。当技術分野において、抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって果たされ得ることは公知である。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体、および抗体断片で形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【０１０４】
用語「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体の両方、ならびに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物によることを含めた、任意の方法で作製されたかかる抗体を指す。
【０１０５】
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、または当技術分野において公知の任意の技法を用いて作製されるヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義には、インタクトなまたは完全長の抗体、その断片、および／または少なくとも１つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含むように改変された非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。
【０１０６】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳動物の１つの種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、別の種（通常はヒト）に由来する抗体の配列と同種であり、その種における免疫応答の誘発が回避される。
【０１０７】
用語「抗体結合部位」は、相補的な抗体が特異的に結合する連続または不連続な部位（すなわちエピトープ）を含む抗原（例えば、ＭｒｋＡ）内の領域を指す。したがって、抗体結合部位は、抗原内に、エピトープを越えた、結合親和性および／または安定性などの特性を決定し得るかまたは抗原酵素活性または二量化などの特性に影響を与え得る追加的な範囲を含み得る。したがって、２つの抗体が抗原内の同じエピトープに結合する場合であっても、抗体分子がエピトープ外のアミノ酸との個別的な分子間接触を確立する場合、かかる抗体は個別的な抗体結合部位に結合すると見なされる。
【０１０８】
Ｋａｂａｔ付番方式は、概して、可変ドメインの残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）を参照するときに用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
【０１０９】
語句「Ｋａｂａｔにある通りのアミノ酸位置付番」、「Ｋａｂａｔ位置」、およびその文法上の変化形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編成の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに用いられる付番方式を指す。この付番方式を用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷまたはＣＤＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないかまたは追加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含み、および重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ等）を含み得る。
【０１１０】
残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることにより決定し得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番したときのＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４で異なる（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり、３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ  構造ループとの妥協案に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられている。ＣＤＲのＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３））分類も使用することができる。
【０１１１】
用語「Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックス」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）において記載されるヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の付番方式を指す。本出願で参照されるアミノ酸の位置はすべてＥＵインデックスの位置を指す。例えば、「Ｌ２３４」および「ＥＵ  Ｌ２３４」は共に、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従って２３４位のアミノ酸ロイシンを指す。
【０１１２】
本明細書において使用される用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ領域」、および「ＩｇＧ  Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶化可能断片に対応する、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ分子の一部分を指す。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結される、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のＣ末端半分を含む。それは、抗原結合活性を有していないが、炭水化物成分ならびに補体およびＦｃＲｎ受容体を含むＦｃ受容体に対する結合部位を含有する。例えば、Ｆｃドメインは、第２の定常ドメインＣＨ２（ヒトＩｇＧ１のＥＵ２３１〜３４０位の残基）および第３の定常ドメインＣＨ３（ヒトＩｇＧ１のＥＵ３４１〜４４７位の残基）全体を含有する。
【０１１３】
Ｆｃとは、独立してこの領域を指し得るか、または抗体、抗体断片、もしくはＦｃ融合タンパク質に関連してこの領域を指し得る。多型は、ＥＵ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８位を含むが、これらに限定されない、Ｆｃドメイン中の多くの位置に観察される。したがって、「野生型ＩｇＧ  Ｆｃドメイン」または「ＷＴ  ＩｇＧ  Ｆｃドメイン」は、任意の天然に存在するＩｇＧ  Ｆｃ領域（すなわち任意の対立遺伝子）を指す。数限りないＦｃ突然変異体、Ｆｃ断片、Ｆｃ変異体、およびＦｃ誘導体が、例えば米国特許第５，６２４，８２１号明細書；米国特許第５，８８５，５７３号明細書；米国特許第５，６７７，４２５号明細書；米国特許第６，１６５，７４５号明細書；米国特許第６，２７７，３７５号明細書；米国特許第５，８６９，０４６号明細書；米国特許第６，１２１，０２２号明細書；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；米国特許第５，６４８，２６０号明細書；米国特許第６，５２８，６２４号明細書；米国特許第６，１９４，５５１号明細書；米国特許第６，７３７，０５６号明細書；米国特許第７，１２２，６３７号明細書；米国特許第７，１８３，３８７号明細書；米国特許第７，３３２，５８１号明細書；米国特許第７，３３５，７４２号明細書；米国特許第７，３７１，８２６号明細書；米国特許第６，８２１，５０５号明細書；米国特許第６，１８０，３７７号明細書；米国特許第７，３１７，０９１号明細書；米国特許第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００４／０００２５８７号明細書；ならびに国際公開第９９／０５８５７２号パンフレット、国際公開第２０１１／０６９１６４号パンフレット、および国際公開第２０１２／００６６３５号パンフレットにおいて記載される。
【０１１４】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖の配列は、多くの配列データベースにおいて、例えばＵｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）でそれぞれ受託番号Ｐ０１８５７（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８５９（ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）、およびＰ０１８６１（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）の下で見つけることができる。
【０１１５】
用語「ＹＴＥ」または「ＹＴＥ突然変異体」は、ヒトＦｃＲｎへの結合の増加をもたらし、かつ突然変異を有する抗体の血清半減期を改善するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン中の突然変異のセットを指す。ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧの重鎖中に導入される３つの「ＹＴＥ突然変異」の組み合わせ：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅを含み、付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。参照により本明細書に援用される米国特許第７，６５８，９２１号明細書を参照されたい。ＹＴＥ突然変異体は、同じ抗体の野生型バージョンと比較して、抗体の血清半減期を増加させることが示された。例えば、それらの全体が参照により本明細書に援用されるＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４（２００６）および米国特許第７，０８３，７８４号明細書を参照されたい。「Ｙ」突然変異体は、Ｍ２５６Ｙ突然変異のみを含み、同様に、「ＹＴ」突然変異は、Ｍ２５２ＹおよびＳ２５４Ｔのみを含み、「ＹＥ」突然変異は、Ｍ２５２ＹおよびＴ２５６Ｅのみを含む。他の突然変異がＥＵ２５２位および／または２５６位に存在してもよいことが明確に企図される。特定の態様では、ＥＵ２５２位の突然変異が、Ｍ２５２Ｆ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｗ、もしくはＭ２５２Ｔであってもよく、および／またはＥＵ２５６位の突然変異が、Ｔ２５６Ｓ、Ｔ２５６Ｒ、Ｔ２５６Ｑ、もしくはＴ２５６Ｄであってもよい。
【０１１６】
用語「天然に存在するＭｒｋＡ」は、一般に、ＭｒｋＡタンパク質またはその断片が存在し得る状態を指す。天然に存在するＭｒｋＡは、組換え技術を使用するコード核酸の導入なしで、細胞によって天然に産生されるＭｒｋＡタンパク質を意味する。したがって、天然に存在するＭｒｋＡは、天然に、例えば肺炎桿菌によって産生されるものであってもよく、および／またはクレブシエラ属の様々なメンバーから単離されるものであってもよい。
【０１１７】
用語「組換えＭｒｋＡ」は、ＭｒｋＡタンパク質またはその断片が存在してもよい状態を指す。組換えＭｒｋＡは、組換えＤＮＡにより、例えば異種宿主において産生されるＭｒｋＡタンパク質またはその断片を意味する。組換えＭｒｋＡは、グリコシル化によって天然に存在するＭｒｋＡと異なっていてもよい。
【０１１８】
原核生物の細菌発現系において発現される組換えタンパク質は、グリコシル化されないが、哺乳類細胞または昆虫細胞などの真核生物の系において発現されるものは、グリコシル化される。昆虫細胞において発現されるタンパク質は、しかしながら、哺乳類細胞において発現されるタンパク質とグリコシル化において異なる。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「半減期」または「インビボにおける半減期」は、所与の動物の血液循環中の本開示の特定のタイプの抗体、抗原結合タンパク質、またはポリペプチドの生物学的半減期を指し、動物に投与された量の半分が動物の血液循環および／または他の組織から取り除かれるのに必要とされる時間によって示される。
【０１２０】
本明細書において使用される用語「対象」は、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、クマ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含めた、特定の治療のレシピエントとなる任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。本明細書において使用される用語「対象」および「患者」は、クレブシエラ感染症に関連する状態の診断、予後診断、または療法のための任意の対象、特に哺乳類対象を指す。本明細書において使用されるように、「クレブシエラ感染症に関連する状態を有する患者」などの語句は、クレブシエラ感染症に関連するその状態のための療法の投与、画像処理手順もしくは他の診断手順、および／または予防的治療から利益を得るであろう哺乳類対象などの対象を含む。
【０１２１】
「クレブシエラ」は、腸内細菌科のグラム陰性条件的嫌気性桿菌の属を指す。クレブシエラは、例えば肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、およびＫ．グラニュロマティスを含む。
【０１２２】
クレブシエラ属のメンバーは、典型的に、それらの細胞表面上に２つのタイプの抗原：Ｏ抗原およびＫ抗原を発現する。Ｏ抗原はリポ多糖であり、Ｋ抗原は莢膜多糖である。これらの抗原の構造のばらつきは、抗原をクレブシエラ「血清型」に分類するための基準となる。したがって、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）が、複数の血清型に結合する能力は、様々なＯ抗原および／またはＫ抗原を有するクレブシエラに結合するその能力を指す。
【０１２３】
本明細書において使用される用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効となるのを可能にするような形態の調製物であって、その組成物を投与しようとする対象にとって許容できない毒性がある追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は無菌とすることができる。
【０１２４】
ポリペプチド、例えば、本明細書において開示される抗原結合タンパク質（抗体もしくはその抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドの「有効量」は、特に記載される目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、記載される目的に関して実験的に常法で決定することができる。本明細書において使用される用語「治療有効量」は、対象または哺乳類における疾患または状態を「治療する」のに有効である、ポリペプチド、例えば抗体を含む抗原結合タンパク質または他の薬剤の量を指し、クレブシエラ媒介性の疾患または状態を有する対象に対していくらかの改善または有益性をもたらす。したがって、「治療有効」量は、クレブシエラ媒介性の疾患または状態の、少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの軽減、緩和、および／または減少をもたらす量である。本開示の方法および系によって治療することができる、クレブシエラ媒介性の疾患または状態に関連する臨床症状は、当業者によく知られている。さらに、当業者は、いくらかの有益性が対象に対してもたらされる限り、治療効果が完全であるかまたは根治的である必要がないことを十分に理解するであろう。いくつかの実施形態では、用語「治療有効」は、それを必要としている患者においてＭｒｋＡ活性を低下させることができる治療剤の量を指す。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間的経過は、治療されているものの性質および重症度に依存するであろう。治療についての処方せん、例えば投薬量に関する決定などは、開業医および他の医師の責任の範囲内にある。抗体およびその抗原結合断片の適切な用量は、当技術分野においてよく知られている。Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２を参照されたい。
【０１２５】
本明細書において使用されるように、「十分な量」またはクレブシエラ媒介性の疾患または状態を有する患者において特定の結果を実現する「のに十分な量」は、任意選択で治療効果である、所望の効果をもたらすのに有効である、治療剤（例えば、本明細書において開示される抗体を含む抗原結合タンパク質）の量を指す（すなわち治療有効量の投与によるもの）。いくつかの実施形態では、そのような特定の結果が、それを必要としている患者におけるＭｒｋＡ活性の低下である。
【０１２６】
本明細書において使用される用語「標識」は、「標識」ポリペプチドまたは抗体を生成するために、ポリペプチド、例えば抗体を含む抗原結合タンパク質に直接または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変を触媒することができる。
【０１２７】
「治療する」または「治療」または「治療すること」または「軽減する」または「軽減すること」または「回復させること」または「回復させる」などの用語は、診断された病的状態または障害を治癒し、減速させ、その症状を和らげ、および／またはその進行を止める治療手段を指す。「予防する」などの用語は、標的にされる病的状態または障害の発症を予防しかつ／または遅らせる予防または防止手段を指す。したがって、治療を必要としている人は、疾患または状態をすでに有している人を含む。予防を必要としている人は、疾患または状態を起こしやすい人および疾患または状態を予防すべき人を含む。例えば、語句「クレブシエラ媒介性の疾患または状態を有する患者を治療する」は、好ましくは、対象がもはやそれによって不快感および／または機能異常を被らない程度まで、クレブシエラ媒介性の疾患または状態の重症度を低下させることを指す（例えば、未治療患者と比較した場合の喘息増悪における相対的な低下）。語句「クレブシエラ媒介性の疾患または状態を予防する」は、クレブシエラ媒介性の疾患もしくは状態の可能性を低下させることおよび／またはクレブシエラ媒介性の疾患もしくは状態の発生を低下させることを指す。
【０１２８】
ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドの「免疫学的有効量」は、クレブシエラに対する対象自身の免疫応答を増強するのに十分な量である。誘導される免疫のレベルは、例えば、中和分泌抗体および／または血清抗体の量を測定することにより、例えば補体結合、酵素結合免疫吸着、血清殺菌アッセイ、オプソニン作用による死滅アッセイ、またはバイオフィルム形成阻害アッセイによりモニターすることができる。
【０１２９】
用語「免疫原性断片」は、単独でまたは任意選択で適したアジュバントと共に対象に投与された場合に免疫応答を生成する（すなわち、免疫原性活性を有する）断片を意味する。
【０１３０】
本発明による「ワクチン」組成物は、その免疫活性切断型、一部分、断片、およびセグメントを含むＭｒｋＡまたはその免疫活性切断型、一部分、断片、およびセグメントを含むＭｒｋＡをコードするポリヌクレオチドの免疫有効量をその任意のおよびすべての活性な組み合わせで含む組成物であり、前記ポリペプチドまたは活性断片または断片またはポリヌクレオチドは、適した希釈剤または賦形剤をすべて含む薬理学的に許容可能な担体中に懸濁される。
【０１３１】
本明細書において使用されるように、「免疫応答」は、これらに限定されないが抗体および／またはＴ細胞の産生に通常特徴付けられる、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドの導入に対する対象における応答を指す。通常、免疫応答は、クレブシエラに対して特異的である、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはその両方の誘導もしくは活性化などの細胞応答、抗クレブシエラ抗体の産生の増加といった体液性応答、または細胞応答および体液性応答の両方であってもよい。免疫応答はまた、粘膜応答、例えば粘膜抗体応答、例えばＳ−ＩｇＡ産生または粘膜細胞媒介性応答、例えばＴ細胞応答を含むこともできる。
【０１３２】
「防御免疫応答」は、対象がクレブシエラに暴露された場合に防御する、対象によって示される免疫応答を指す。いくつかの実例では、クレブシエラがなお感染症を引き起こす場合があるが、クレブシエラは、重篤な感染症を引き起こすことができない。典型的に、防御免疫応答は、インビトロおよびインビボにおいてクレブシエラを中和することができる、検出可能なレベルの、宿主から生じる血清および抗体をもたらす。
【０１３３】
用語「アジュバント」は、（１）特定の抗原に対する免疫応答を改変するかもしくは増加させるか、または（２）薬理学的作用物質の効果を増加させるかもしくは支援する能力を有する任意の物質を指す。本明細書において使用されるように、本明細書において提供されるＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片の発現、抗原性、または免疫原性を増加させ得る任意の化合物は、有望なアジュバントである。
【０１３４】
本明細書において使用されるように、用語「クレブシエラ感染症に関連する状態」は、疾患または状態を有する対象における、クレブシエラ感染症（例えば、肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスによる感染症）によって引き起こされる（単独でもしくは他の媒介物質と共同して）、それによって悪化するか、それに関連するか、またはそれによって長引く任意の病態を指す。クレブシエラ感染症に関連する状態の非限定的な例は、肺炎、尿路感染症、敗血症、新生児敗血症、下痢、軟部組織感染症、臓器移植後の感染症、外科手術による感染症、創傷感染症、肺感染症、化膿性肝膿瘍、眼内炎、髄膜炎、壊死性髄膜炎、強直性脊椎炎、および脊椎関節症を含む。いくつかの実施形態では、クレブシエラ感染症が、院内感染症である。いくつかの実施形態では、クレブシエラ感染症が、日和見感染症である。いくつかの実施形態では、クレブシエラ感染症が、臓器移植の結果として生じる。いくつかの実施形態では、対象が、例えば人工呼吸器、カテーテル、または静脈内カテーテルを含む、クレブシエラに汚染された医療デバイスに暴露される。
【０１３５】
ＣＤＲまたはＣＤＲのセットを有する構造は、一般に、ＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置に位置する抗体の重鎖配列もしくは軽鎖配列またはその実質的な一部分でできているであろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、（参照により本明細書において援用されるＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７およびその最新版、現在はインターネットで入手可能（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕまたは任意の検索エンジンを使用して「Ｋａｂａｔ」を検索）を参照することによって決定されてもよい。ＣＤＲはまた、フィブロネクチンまたはシトクロムＢなどの他の足場によって運ぶこともできる。
【０１３６】
ＣＤＲアミノ酸配列は、実質的に本明細書において説明されるように、ヒト可変ドメインまたは実質的なその一部分中にＣＤＲとして有することができる。ＨＣＤＲ３配列は、実質的に本明細書において説明されるように、本開示の実施形態を示し、これらのそれぞれは、ヒト重鎖可変ドメインまたは実質的なその一部分中にＨＣＤＲ３として担持され得る。
【０１３７】
本開示において用いられる可変ドメインは、任意の生殖系もしくは再編成されたヒト可変ドメインから得ることができるか、または知られているヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づいた合成可変ドメインとすることができる。ＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く可変ドメインのレパートリーに導入することができる。
【０１３８】
例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３；参照により本明細書に援用される）は、可変ドメインエリアの５’末端に向けられるかまたはそれに近接するコンセンサスプライマーが、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーをもたらすために、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に使用される、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法を提供する。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．は、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせることができる方法をさらに記載する。類似した技術を使用して、本開示のＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルすることができ、シャッフルして完成したＶＨまたはＶＬドメインを、抗原結合タンパク質をもたらすために、同種のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせることができる。次いで、レパートリーは、適した抗原結合タンパク質が選択されるために、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットのファージディスプレイ系またはＫａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを含む、それに続く多くの文献のいずれかなどの適した宿主系においてディスプレイすることができる。レパートリーは、１０４以上のいずれの個々のメンバーからも、例えば１０６〜１０８または１１０のいずれのメンバーからもなることができる。他の適した宿主系は、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、リボソームディスプレイなどを含む。リボソームディスプレイの概説については、本明細書において参照により援用されるＬｏｗｅ  Ｄ  ａｎｄ  Ｊｅｒｍｕｔｕｓ  Ｌ，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，５１７−２７、さらに国際公開第９２／０１０４７号パンフレットを参照されたい。
【０１３９】
類似したシャッフリング技術またはコンビナトリアル技術はまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ（本明細書において参照により援用されるＮａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）よっても開示され、Ｓｔｅｍｍｅｒは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関しての技術を記載しているが、このアプローチが抗体の生成に使用されてもよいことを述べている。
【０１４０】
さらなる代案は、可変ドメイン全体において突然変異を生成するために、１つ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して、本開示のＣＤＲ由来の配列を有する新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成することである。そのような技術は、エラープローンＰＣＲを使用したＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０）によって記載される。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのアミノ酸置換が、ＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲのセット内でなされる。
【０１４１】
使用されてもよい他の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対して突然変異誘発を誘導することである。そのような技術は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）によって開示される。
【０１４２】
本開示の方法および技術は、別段の指示がない限り、当技術分野においてよく知られており、本明細書の全体にわたって引用され、考察される様々な全般的なおよびより詳細な参考文献において記載される従来の方法に従って全般的に実行される。例えば、すべて本明細書において参照により援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２），ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。
【０１４３】
当業者は、当技術分野におけるルーチン的な手法を用いて、本開示の抗原結合タンパク質、ＭｒｋＡポリペプチド、およびその免疫原性断片を提供するために上記に記載されるそのような技術を使用することができるであろう。
【０１４４】
ＩＩ．ＭｒｋＡ結合分子
本開示は、ＭｒｋＡ、例えばクレブシエラＭｒｋＡに特異的に結合するＭｒｋＡ結合分子、例えば抗体、抗原結合タンパク質、およびその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合分子、例えば抗体、抗原結合タンパク質、およびその抗原結合断片が、肺炎桿菌ＭｒｋＡに特異的に結合する。ＭｒｋＡ結合分子は、「ＭｒｋＡ結合分子」、「ＭｒｋＡ結合タンパク質」、または「ＭｒｋＡ結合剤」と本明細書において同義的に指される。
【０１４５】
ＭｒｋＡについての完全長アミノ酸配列および完全長ヌクレオチド配列は、当技術分野において知られている（例えば、肺炎桿菌ＭｒｋＡについてのＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｂ６Ｓ７６７または大腸菌ＭｒｋＡについてのＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｂ０ＺＤＷ４を参照されたい。共にそれらの全体が参照により本明細書に援用される）。本明細書において使用されるように、用語「肺炎桿菌ＭｒｋＡ」は、図２Ｄにおいて示されるアミノ酸配列を指す（配列番号１７）。肺炎桿菌分離株は、共通して、２つの線毛アドヘシン、１型および３型フィンブリアを発現する。１型フィンブリアは、肺炎桿菌コロニー形成およびバイオフィルム形成の促進に関係するが、３型フィンブリアは、生物および非生物表面上のバイオフィルム形成を媒介し、成熟したバイオフィルムの成長に必要とされる。３型フィンブリアの様々な構成成分は、ｍｒｋＡＢＣＤＦオペロンによってコードされ、これは、主なピリンサブユニットＭｒｋＡ、シャペロンＭｒｋＢ、外膜アッシャーＭｒｋＣ、アドヘシンＭｒｋＤおよびＭｒｋＦを産生する。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｎｏｖ  １４；８（１１）：ｅ７９０３８を参照されたい。肺炎桿菌３型フィンブリアは、集まってヘリックス状のフィラメントになるＭｒｋＡピリンから主として構成される。３型フィンブリアは、ＭｒｋＡタンパク質から構成される線毛の軸と結合するＭｒｋＤアドヘシンを使用して、標的組織への結合を媒介する。Ｌａｎｇｓｔｒａａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｓｅｐ；６９（９）：５８０５−５８１２を参照されたい。クレブシエラの宿主細胞粘着およびバイオフィルム形成は、そのようなＭｒｋＡピリンによって媒介される。その全体が参照により本明細書に援用されるＣｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２８：７４２８−７４３５（２０１２）を参照されたい。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する抗体またはポリペプチドである単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ＭｒｋＡに特異的に結合する抗体の抗原結合断片である。
【０１４７】
ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合分子が抗体またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合するマウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、リサーフェシング、またはヒト抗原結合タンパク質であるその単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合分子がヒト化抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合分子がヒト抗体またはその抗原結合断片である。
【０１４８】
本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に結合するか、ｂ）肺炎桿菌のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導するか、またはｃ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合し、かつ肺炎桿菌のＯＰＫを誘導する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも３つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも４つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも５つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも６つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも７つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも８つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも９つの肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも１０の肺炎桿菌血清型に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、表５に列挙される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の肺炎桿菌の血清型に結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）を提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示は、肺炎桿菌血清型Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２：Ｋ２８、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０に結合する単離抗原結合タンパク質を提供する。
【０１５１】
本開示は、例えば肺炎桿菌を含むクレブシエラのＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも１つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも２つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも３つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも４つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも５つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも６つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも７つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも８つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも９つの肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０からなる群から選択される少なくとも１０の肺炎桿菌血清型においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質を提供する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、肺炎桿菌血清型Ｏ１：Ｋ２、Ｏ１：Ｋ７９、Ｏ２ａ：Ｋ２８、Ｏ５：Ｋ５７、Ｏ３：Ｋ５８、Ｏ３：Ｋ１１、Ｏ３：Ｋ２５、Ｏ４：Ｋ１５、Ｏ５：Ｋ６１、Ｏ７：Ｋ６７、およびＯ１２：Ｋ８０においてＯＰＫを誘導する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合すること、ｂ）インビトロにおいて少なくとも１つまたは２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫを誘導すること、ｃ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて細菌の負担を低下させること、およびｄ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて延命効果を与えることからなる群から選択される、少なくとも１つの特性を有する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合すること、ｂ）インビトロにおいて少なくとも１つまたは２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫを誘導すること、ｃ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて細菌の負担を低下させること、およびｄ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて延命効果を与えることからなる群から選択される、少なくとも２つの特性を有する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合すること、ｂ）インビトロにおいて少なくとも１つまたは２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫを誘導すること、ｃ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて細菌の負担を低下させること、およびｄ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて延命効果を与えることからなる群から選択される、少なくとも３つの特性を有する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、ａ）少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合し、ｂ）インビトロにおいて少なくとも１つまたは２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫを誘導し、ｃ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて細菌の負担を低下させ、およびｄ）マウスクレブシエラ感染症モデルにおいて延命効果を与える。
【０１５７】
本明細書において開示されるＭｒｋＡ結合タンパク質は、ＭｒｋＡ抗体Ｋｐ３およびＫｐ１６ならびにその抗原結合断片を含む。本明細書において開示されるＭｒｋＡ結合タンパク質はまた、ＭｒｋＡ抗体クローン１、クローン４、クローン５、およびクローン６ならびにその抗原結合断片も含む。本開示のＭｒｋＡ結合タンパク質はまた、Ｋｐ３またはＫｐ１６と同じＭｒｋＡエピトープに特異的に結合するＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）も含む。本開示のＭｒｋＡ結合タンパク質はまた、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６と同じＭｒｋＡエピトープに特異的に結合するＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）も含む。いくつかの実施形態では、本開示は、オリゴマーＭｒｋＡに結合する単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）を提供する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が単量体ＭｒｋＡに結合しない。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が単量体ＭｒｋＡに結合する（例えば、クローン１、クローン１の６つのＣＤＲもしくはＶＨおよびＶＬを含有する抗体もしくはその抗原結合断片、またはクローン１と同じエピトープに結合するか、もしくはＭｒｋＡへのクローン１の結合を競合的に阻害する抗体もしくはその抗原結合断片）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）が配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２内のエピトープに結合する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）が、配列番号１７において示されるＭｒｋＡ配列に結合するが、配列番号１７のアミノ酸１〜４０を欠くＭｒｋＡ（すなわち配列番号２６）に結合しない。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が、配列番号１７において示されるＭｒｋＡ配列に結合するが、配列番号１７のアミノ酸１７１〜２０２を欠くＭｒｋＡ（すなわち配列番号２７）に結合しない。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が、配列番号１７において示されるＭｒｋＡ配列に結合するが、配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２を欠くＭｒｋＡ（すなわち配列番号２８）に結合しない。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）がＭｒｋＡ（配列番号１７）に特異的に結合するが、配列番号２６または配列番号２７のいずれにも結合しない。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）がＭｒｋＡ（配列番号１７）に特異的に結合するが、配列番号２６〜２８のいずれにも結合しない。
【０１６１】
ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）はまた、ＭｒｋＡへのＫｐ３またはＫｐ１６の結合を競合的に阻害するＭｒｋＡ結合タンパク質も含む。ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）はまた、ＭｒｋＡへのクローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の結合を競合的に阻害するＭｒｋＡ結合タンパク質も含む。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＭｒｋＡへのＫｐ３またはＫｐ１６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＭｒｋＡへのクローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌へのＫｐ３またはＫｐ１６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌へのクローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌株２９０１１へのＫｐ３またはＫｐ１６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌株２９０１１へのクローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌株９６１８４２へのＫｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて肺炎桿菌株９８５０４８へのＫｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の結合を競合的に阻害する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも２０％、ＭｒｋＡへの１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも２５％、ＭｒｋＡへの１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも３０％、ＭｒｋＡへの１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも２０％、肺炎桿菌への１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも２５％、肺炎桿菌への１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも３０％、肺炎桿菌への１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも２０％、肺炎桿菌株２９０１１への１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも２５％、肺炎桿菌株２９０１１への１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。いくつかの実施形態では、１０２倍過剰の抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片が競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて少なくとも３０％、肺炎桿菌株２９０１１への１μｇ  Ｋｐ３の結合を減少させる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）がクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）が少なくとも２５％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも３０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも４０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも５０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも５５％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも６０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約２５％〜約６５％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約５０％〜約６０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約３μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも２５％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約４μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも２５％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約５μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも２５％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも５０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも６０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で約２５％〜約６５％ｖクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で約５０％〜約６０％だけクレブシエラバイオフィルム形成を阻害するかまたは低下させる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）がクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも２０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも３０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が少なくとも４０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約２０％〜約５０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約４０％〜約５０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも２０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも３０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも４０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で約２０％〜約５０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、クレブシエラ上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）が約１０μｇ／ｍｌの濃度で約４０％〜約５０％だけクレブシエラ細胞粘着（例えば、上皮細胞粘着）を阻害するかまたは低下させる。
【０１７３】
ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）はまた、Ｋｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含むＭｒｋＡ結合タンパク質も含む。Ｋｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、およびクローン６のＣＤＲ配列は、下記の表１および２に示される。
【０１７４】
【表１】
2018527924.tif 000003
【０１７５】
【表２】
2018527924.tif 000004
【０１７６】
本明細書において記載される抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）は、本明細書において記載される個々の可変軽鎖または可変重鎖の１つを含むことができる。本明細書において記載される抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）はまた、可変軽鎖および可変重鎖の両方を含むこともできる。抗ＭｒｋＡ  Ｋｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、およびクローン６抗体の可変軽鎖配列および可変重鎖配列は、下記の表３および４に提供される。
【０１７７】
【表３】
2018527924.tif 000005
【０１７８】
【表４】
2018527924.tif 000006
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３〜１４または５３〜５６と少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％同一な重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１５〜１６または５７〜６０と少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％同一な軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質が、配列番号１３〜１４または５３〜５６の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１５〜１６または５７〜６０の配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１３〜１６または５３〜６０に対して一定のパーセンテージの配列同一性を有するポリペプチドが、保存的アミノ酸置換によってのみ配列番号１３〜１６または５３〜６０と異なる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９５％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９５％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９５％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９５％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫをインビトロにおいて誘導する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９５％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９５％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象における細菌の負担を低下させる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９５％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９５％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９５％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９５％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象において延命効果を与える。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９６％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９６％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９６％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９６％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫをインビトロにおいて誘導する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９６％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９６％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象における細菌の負担を低下させる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９６％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９６％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９６％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９６％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象において延命効果を与える。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９７％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９７％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９７％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９７％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫをインビトロにおいて誘導する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９７％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９７％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象における細菌の負担を低下させる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９７％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９７％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９７％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９７％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象において延命効果を与える。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９８％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９８％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９８％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９８％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫをインビトロにおいて誘導する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９８％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９８％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象における細菌の負担を低下させる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９８％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９８％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９８％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９８％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象において延命効果を与える。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９９％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９９％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型に結合する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９９％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９９％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が少なくとも２つの肺炎桿菌血清型のＯＰＫをインビトロにおいて誘導する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９９％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９９％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象における細菌の負担を低下させる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｒｋＡに特異的に結合する単離抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）を提供し、前記抗原結合タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１５と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号１４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号１６と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５３と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５７と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５４と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５８と少なくとも９９％同一なＶＬ、配列番号５５と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号５９と少なくとも９９％同一なＶＬ、または配列番号５６と少なくとも９９％同一なＶＨおよび配列番号６０と少なくとも９９％同一なＶＬを含み、抗原結合タンパク質が対象において延命効果を与える。
【０２００】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって記載されるものなどのハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法の使用では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を上記に記載した通り免疫し、免疫抗原に特異的に結合し得る抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球はまた、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を形成し、次にそこから未融合のリンパ球および骨髄腫細胞を選択によって除くことができる。次に、免疫沈降、免疫ブロット法によるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定するとき選択の抗原を特異的に対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準方法を用いたインビトロ培養か（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、あるいは動物においてインビボで増殖させることができる。次に、モノクローナル抗体を培養培地または腹水から精製することができる。
【０２０１】
あるいは、モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載される通り組換えＤＮＡ方法を用いて作製することもできる。成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から、その抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるなどして、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、従来の手順を用いてその配列を決定する。次に、重鎖および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを好適な発現ベクターにクローニングし、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクトすると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。また、記載される通り、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片を単離することもできる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）。
【０２０２】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を用いた何らかの種々の方法でさらに修飾することができ、それにより代替的な抗体を作成し得る。一部の実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインが、１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作成されるか、または２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作成され得る。一部の実施形態では、定常領域がトランケートされるか、または除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作成される。可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡに対するモノクローナル抗体がヒト化抗体である。ある実施形態では、そのような抗体が、ヒト対象に投与された場合に抗原性およびＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答を低下させるために治療上使用される。ヒト化抗体は、当技術分野において知られている様々な技術を使用して産生することができる。ある代替の実施形態では、ＭｒｋＡに対する抗体がヒト抗体である。
【０２０４】
ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を用いて直接調製することができる。インビトロで免疫されるか、または標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された固定化ヒトＢリンパ球を作成することができる（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい）。また、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９−３１４、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：６１５７−６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１に記載される通り、ヒト抗体はファージライブラリから選択することもでき、ここで、そのファージライブラリはヒト抗体を発現する）。抗体ファージライブラリを作成および使用する技術は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；および同第７，２６４，９６３号明細書；およびＲｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８（これらの各々は、全体として参照により援用される）にも記載されている。親和性成熟戦略およびチェインシャッフリング戦略（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３、全体として参照により援用される）が当技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体の作成に用いることができる。
【０２０５】
ヒト化抗体はまた、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスでも作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；および同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。
【０２０６】
本開示によれば、ＭｒｋＡに特異的な一本鎖抗体の作製技法を適合させることができる（米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）。加えて、ＭｒｋＡに対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片またはその断片の迅速かつ有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリの構築方法を適合させることができる（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。抗体断片は、限定はされないが：（ａ）抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片、（ｃ）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片、および（ｄ）Ｆｖ断片を含め、当技術分野における技法によって作製することができる。
【０２０７】
その血清半減期を増加させるために抗体を修飾することは、とりわけ抗体断片の場合にさらに望ましいものとなり得る。これは、例えば、抗体断片の適切な領域の突然変異によって抗体断片にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによるか、または後に抗体断片にいずれかの末端もしくは中央で（例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって）融合するペプチドタグにそのエピトープを組み込むことによって達成し得る。
【０２０８】
本開示の抗原結合タンパク質は、抗体定常領域またはその一部をさらに含むことができる。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ−末端部で、ヒトＣκまたはＣγ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに付けることができる。同様に、ＶＨドメインをベースとする抗原結合タンパク質は、そのＣ−末端部で、任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭならびにアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部（例えばＣＨ１ドメイン）に結合することができる。例えば、免疫グロブリン重鎖は、抗体アイソタイプサブクラス、ＩｇＧ１に由来することができる。これらの特性を有し、可変領域を安定化する任意の合成または他の定常領域変異体も本開示の実施形態で使用することが企図される。抗体定常領域は、ＹＴＥ突然変異を有するＦｃ領域とすることができ、Ｆｃ領域は、下記のアミノ酸置換を含む：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ。この残基の付番は、Ｋａｂａｔの付番に基づく。Ｆｃ領域中のＹＴＥ突然変異は、抗原結合タンパク質の血清中での持続性を増加させる（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８１，２３５１４−２３５２４を参照されたい）。
【０２０９】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片が、エフェクター機能を改善するために、例えば、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を増強するために修飾される。これは、１つ以上のアミノ酸置換をなすことによってまたはＦｃ領域中にシステインを導入することによって実現することができる。抗体のエフェクター機能を増強するかもしくは衰えさせ、かつ／または抗体の薬物動態学的特性（例えば、半減期）を改変することができるＦｃ領域の変異体（例えば、アミノ酸置換および／または追加および／または欠失）は、例えば米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号明細書、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、ならびに米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書において開示される。置換のある特定のセット、３重突然変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」）は、ヒトＣ１ｑ、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、およびＣＤ１６に対するヒトＩｇＧ１分子の結合活性における大幅な減少を引き起こす。例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４：７００−７０４（２００８）を参照されたい。他の場合、定常領域修飾が血清半減期を増加させることができる。Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることによって増加させることができる。
【０２１０】
抗原結合タンパク質が抗体またはその抗原結合断片である場合、それは、（ａ）ＩｇＡ定常ドメイン、（ｂ）ＩｇＤ定常ドメイン、（ｃ）ＩｇＥ定常ドメイン、（ｄ）ＩｇＧ１定常ドメイン、（ｅ）ＩｇＧ２定常ドメイン、（ｆ）ＩｇＧ３定常ドメイン、（ｇ）ＩｇＧ４定常ドメイン、および（ｈ）ＩｇＭ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ＩｇＧ１重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３キメラ重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む抗体またはその抗原結合断片である。
【０２１１】
本開示の抗原結合タンパク質は、（ａ）Ｉｇカッパ定常ドメイン、および（ｂ）Ｉｇラムダ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含むことができる。
【０２１２】
本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１定常ドメインおよびヒトラムダ定常ドメインをさらに含むことができる。
【０２１３】
本開示の抗原結合タンパク質は、２５２、２５４、および２５６位に突然変異を含有するＩｇＧ  Ｆｃドメインを含むことができ、位置付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅの突然変異を含有することができ、位置付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。
【０２１４】
本開示はまた、本開示の抗原結合タンパク質の単離ＶＨドメインおよび／または本開示の抗原結合タンパク質の単離ＶＬドメインにも関する。
【０２１５】
本開示の抗原結合タンパク質（抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片を含む）は、検出可能なまたは機能的な標識により標識することができる。検出可能な標識は、１３１Ｉまたは９９Ｔｃなどの放射能標識を含み、これらは、抗体画像処理について当技術分野において知られている従来の化学を使用して本開示の抗体に付けられてもよい。標識はまた、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。標識は、特定の関連する検出可能な成分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出されてもよいビオチンなどの化学成分をさらに含む。本開示の抗原結合タンパク質（抗体またはその抗原結合断片を含む）に付けられてもよい他の検出可能なまたは機能的な標識の非限定的な例は、同位体標識、磁気標識、レドックス活性成分、光学色素、ビオチン化基、ビオチンシグナル伝達ペプチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの蛍光成分、ならびにヒスチジンペプチド（ｈｉｓ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、金結合ペプチド、Ｆｌａｇなどの二次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープ、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療剤および化学療法剤を含む。
【０２１６】
ＩＩＩ．医薬組成物およびワクチン
本開示はまた、本明細書において記載される１つ以上のＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくは抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、医薬組成物が薬学的に許容可能なビヒクルまたは薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。ある実施形態では、これらの医薬組成物がヒト患者においてクレブシエラ感染症に関連する状態を治療するか、予防するか、または回復させる際に使用を見出す。ある実施形態では、これらの医薬組成物がクレブシエラの増殖を阻害する際に使用を見出す。
【０２１７】
ある実施形態では、製剤は、本明細書において記載される抗体もしくは抗ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを薬学的に許容可能なビヒクル（例えば、担体、賦形剤）と組み合わせることにより、保存および使用のために調製される（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、製剤が保存剤を含む。
【０２１８】
本開示の医薬組成物は、局所的なおよび全身性の治療のために任意の数の方法で投与することができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される１つ以上のＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくは抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、肺炎、尿路感染症、敗血症、新生児敗血症、下痢、軟部組織感染症、臓器移植後の感染症、外科手術による感染症、創傷感染症、肺感染症、化膿性肝膿瘍（ＰＬＡ）、眼内炎、髄膜炎、壊死性髄膜炎、強直性脊椎炎、または脊椎関節症を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される１つ以上のＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくは抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、院内感染症、日和見感染症、臓器移植後の感染症、ならびにクレブシエラ感染症に関連する他の状態（例えば、肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスによる感染症）において有用である。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される１つ以上のＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくは抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、例えば人工呼吸器、カテーテル、または静脈内カテーテルを含む、クレブシエラに汚染されたデバイスに暴露される対象において有用である。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象におけるクレブシエラの増殖を阻害するのに有効な量のＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を含む。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象においてクレブシエラに対する免疫応答、例えば抗体の産生を誘起するのに有効な量のＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、クレブシエラ感染症に関連する状態を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法は、クレブシエラに感染した対象を、インビボにおいて、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、感染症を予防するために、対象が細菌に暴露されたのと同時にまたはその直後に投与される。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質を含む医薬組成物が感染後に治療薬として投与される。
【０２２３】
ある実施形態では、クレブシエラ感染症を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法は、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、対象がヒトである。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、対象がクレブシエラに感染する前に投与される。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、対象がクレブシエラに感染した後に投与される。
【０２２４】
ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が人工呼吸器で対象に投与される。ある実施形態では、対象がカテーテル（例えば、尿道カテーテルまたは静脈内カテーテル）を有する。ある実施形態では、対象が抗生物質を受けている。
【０２２５】
ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、院内クレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、ＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が日和見クレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が臓器移植後のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。
【０２２６】
ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、セファロスポリン抵抗性のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物がアミノグリコシド抵抗性のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物がキノロン抵抗性のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物がカルバペネム抵抗性のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、セファロスポリン、アミノグリコシド、キノロン、およびカルバペネム抵抗性のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が広域スペクトルのベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生するクレブシエラによる感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物がセファロスポリン、アミノグリコシド、およびキノロン抵抗性のクレブシエラ感染症の治療または予防のためのものである。ある実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、カルバペネマーゼを産生するクレブシエラによる感染症の治療または予防のためのものである。
【０２２７】
クレブシエラ感染症に関連する状態の治療、予防、および／または回復のために、本明細書において記載される医薬組成物、抗体、抗ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドの適切な投薬量は、状態のタイプ、状態の重症度および経過、状態の応答性、医薬組成物、抗体、抗ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが治療目的に投与されるかまたは防止目的に投与されるか、以前の療法、患者の病歴など、治療している医者の判断によるあらゆることに依存する。本明細書において記載される医薬組成物、抗体、抗ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、１回または数日〜数か月まで続く一連の治療中またはある治療法が実行されるか、もしくは状態の縮小が実現されるまで投与することができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬剤蓄積についての測定値から計算することができ、個々の抗体または作用物質の相対的な効力に依存して変動するであろう。投与している医者は、最適な投薬量、投薬の手法、および反復率を容易に決定することができる。
【０２２８】
本明細書において提供されるように、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、防御ＭｒｋＡ抗原に対する抗体を誘起することにより、クレブシエラによる感染症から防御するために対象に投与することができる。さらなる態様では、ＭｒｋＡ、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物が、クレブシエラ感染症を診断するための抗体を産生するためにまたはそのようなクレブシエラ感染症の予防処置および／もしくは治療のためのワクチンならびに免疫原性組成物の免疫原に対する抗体の高い力価を維持するためのブースターワクチンを産生するために利用することができる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が肺炎桿菌ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が肺炎桿菌ＭｒｋＡである。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が単量体である。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片がオリゴマーである。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも７５％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも８０％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも８５％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも９０％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも９５％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも９６％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも９７％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも９８％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７において示される配列に少なくとも９９％同一な配列を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１〜４０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１〜５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１〜１００または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１〜１５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１〜１７５または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１７１〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１５０〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１００〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸５０〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも７５％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも８０％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも８５％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも９０％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも９５％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも９６％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも９７％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも９８％同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９において示される配列に少なくとも９９％同一な配列を含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１〜４２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１〜５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１〜１００または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１〜１５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１〜１７５または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１７３〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１５０〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸１００〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはその免疫原性断片が、配列番号１９のアミノ酸５０〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列を含む。
【０２３７】
ワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして注射液として調製することができる。吸入用など、油ベース中のワクチンもよく知られている。使用前に溶解または懸濁される固体の形態も製剤することができる。活性成分と適合性でありかつ医薬品の使用に許容可能である医薬品の担体、希釈剤、および賦形剤が一般に追加される。そのような担体の例は、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールを含むが、これらに限定されない。担体の組み合わせも使用されてよい。ワクチン組成物は、ワクチンの有効性を改善する役割を果たすことができる、ｐＨを安定化するかまたはアジュバント、湿潤剤、もしくは乳化剤として機能するための物質を含むことができる。いくつかの実施形態では、ワクチンが１つ以上のアジュバントを含む。
【０２３８】
ワクチン投与は、従来のルート、例えば静脈内、皮下、腹腔内、または粘膜のルートに一般によるものである。投与は、非経口注射、例えば皮下または筋肉内注射によるものとすることができる。
【０２３９】
ワクチンは、単一用量スケジュールまたは任意選択で複数回の用量スケジュールで与えられてもよい。クレブシエラに対する免疫を付与するのに十分なワクチンの量は、当業者によく知られている方法によって決定される。この量は、年齢、性別、および全般的な理学的状態ならびに必要とされる免疫のレベルの考慮を含めて、ワクチンレシピエントの特性に基づいて決定されるであろう。
【０２４０】
ＩＶ．使用の方法
本明細書において記載されるＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体およびその抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、ならびにＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、肺炎、尿路感染症、敗血症、新生児敗血症、下痢、軟部組織感染症、臓器移植後の感染症、外科手術による感染症、創傷感染症、肺感染症、化膿性肝膿瘍（ＰＬＡ）、眼内炎、髄膜炎、壊死性髄膜炎、強直性脊椎炎、および脊椎関節症を含むが、これらに限定されない様々な適用に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるＭｒｋＡ結合剤（抗体およびその抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、ならびにＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、院内感染症、日和見感染症、臓器移植後の感染症、ならびにクレブシエラ感染症に関連する他の状態（例えば、肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスによる感染症）において有用である。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、およびＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、例えば人工呼吸器、カテーテル、または静脈内カテーテルを含む、クレブシエラに汚染されたデバイスに暴露される対象において有用である。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本開示は、クレブシエラ感染症に関連する状態を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法であって、有効量のＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その量は、対象におけるクレブシエラの増殖を阻害するのに有効である。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌である。いくつかの実施形態では、対象がクレブシエラに暴露された。いくつかの実施形態では、クレブシエラが対象において検出された。いくつかの実施形態では、対象が、例えば症状に基づいてクレブシエラに感染していることが疑われる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本開示は、クレブシエラ感染症に関連する状態を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法であって、ある量のＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含み、その量が、対象においてクレブシエラに対する免疫応答をもたらす（例えば、抗体の産生）のに有効である。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌である。いくつかの実施形態では、対象がクレブシエラに暴露された。いくつかの実施形態では、クレブシエラが対象において検出された。いくつかの実施形態では、対象が、例えば症状に基づいてクレブシエラに感染していることが疑われる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本開示は、クレブシエラの増殖を阻害する方法であって、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランチコラ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌、Ｋ．オキシトカ、および／またはＫ．グラニュロマティスである。いくつかの実施形態では、クレブシエラが肺炎桿菌である。いくつかの実施形態では、対象がクレブシエラに暴露された。いくつかの実施形態では、クレブシエラが対象において検出された。いくつかの実施形態では、対象が、例えば症状に基づいてクレブシエラに感染していることが疑われる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、クレブシエラ感染症に関連する状態を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法は、クレブシエラに感染した対象を、インビボにおいて、ＭｒｋＡ結合剤（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドと接触させるステップを含む。ある実施形態では、細胞を、ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドと接触させるステップが対象において行われる。例えば、ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、およびＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを、細菌の負担を低下させるためにマウスクレブシエラ感染症モデルに投与することができる。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、感染症を予防するために対象への細菌の導入前に投与される。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、感染症を予防するために対象が細菌に暴露されたのと同時にまたはその直後に投与される。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡ結合剤、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが感染後に治療薬として対象に投与される。
【０２４５】
ある実施形態では、クレブシエラ感染症を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法は、有効量のＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、対象がヒトである。いくつかの実施形態では、有効量のＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが対象または患者がクレブシエラに感染する前に投与される。いくつかの実施形態では、有効量のＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドが、対象または患者がクレブシエラに感染した後に投与される。
【０２４６】
ある実施形態では、対象が人工呼吸器をしている。ある実施形態では、対象がカテーテル（例えば、尿道カテーテルまたは静脈内カテーテル）を有する。ある実施形態では、対象が抗生物質を受けている。
【０２４７】
ある実施形態では、クレブシエラ感染症が院内感染症である。ある実施形態では、クレブシエラ感染症が日和見感染症である。ある実施形態では、クレブシエラ感染症が臓器移植の結果として生じる。
【０２４８】
ある実施形態では、クレブシエラがセファロスポリン抵抗性である。ある実施形態では、クレブシエラがアミノグリコシド抵抗性である。ある実施形態では、クレブシエラがキノロン抵抗性である。ある実施形態では、クレブシエラがカルバペネム抵抗性である。ある実施形態では、クレブシエラがセファロスポリン、アミノグリコシド、キノロン、およびカルバペネム抵抗性である。ある実施形態では、クレブシエラが広域スペクトルのベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生する。ある実施形態では、クレブシエラがセファロスポリン、アミノグリコシド、およびキノロン抵抗性である。ある実施形態では、クレブシエラがカルバペネマーゼを産生する。
【０２４９】
ある実施形態では、クレブシエラ感染症を治療し、予防し、かつ／または回復させる方法は、有効量のＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドおよび抗生物質を対象に投与するステップを含む。ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドおよび抗生物質は、同時にまたは逐次的に投与することができる。ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドおよび抗生物質は、同じ医薬組成物において投与することができる。ＭｒｋＡ結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドおよび抗生物質は、別々の医薬組成物において同時にまたは逐次的に投与することができる。抗生物質は、例えばカルバペネムまたはコリスチンとすることができる。
【０２５０】
本開示はまた、ＭｒｋＡ、例えばＭｒｋＡオリゴマーを検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＭｒｋＡまたはＭｒｋＡオリゴマーを検出する方法は、試料を、本明細書において提供されるＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップおよび試料への抗体またはその抗原結合断片の結合についてアッセイするステップを含む。結合を評価する方法は、当技術分野においてよく知られている。
【０２５１】
Ｖ．キット
本開示の任意の態様または実施形態による単離抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体分子もしくはその抗原結合断片）、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドを含むキットも本開示の一態様として提供される。キットにおいて、抗原結合タンパク質もしくは抗ＭｒｋＡ抗体、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、またはＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、試料中でのその反応性を例えば下記にさらに記載されるように決定することができるように標識することができる。キットの構成要素は、一般に無菌であり、密封バイアルまたは他の容器中にある。キットは、抗体分子が有用な診断分析または他の方法において用いることができる。キットは、方法、例えば本開示に従う方法における構成要素の使用のための説明書を含有することができる。そのような方法の実行を支援するかまたは可能にする付随的な材料が本開示のキットに含まれてもよい。
【０２５２】
試料中の抗体またはその抗原結合断片の反応性は、任意の適切な手段によって決定することができる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、可能性として考えられる１つの手段である。放射性標識抗原を非標識抗原（試験サンプル）と混合し、抗体に結合させる。結合した抗原を結合していない抗原から物理的に分離し、抗体に結合した放射性抗原の量を決定する。試験サンプル中に抗原が多くあるほど、抗体に結合する放射性抗原は少ないであろう。競合的結合アッセイはまた、レポーター分子に連結された抗原または類似体を使用して、非放射性抗原と共に使用することもできる。レポーター分子は、スペクトルで特定される吸収特性または放射特性を有する蛍光色素、蛍光体、またはレーザー色素とすることができる。適した蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを含む。適した発色性色素は、ジアミノベンジジンを含む。
【０２５３】
他のレポーターは、有色、磁気、または常磁性のラテックスビーズなどの高分子コロイド粒子または微粒子物質および検出可能なシグナルを直接または間接的に、視覚的に観察するか、電子的に検出するか、または他に記録することができるようにする生物学的または化学的活性剤を含む。これらの分子は、例えば、色を生じるかもしくは変化させるか、または電気的な特性における変化を引き起こす反応を触媒する酵素とすることができる。それらは、分子が反応性であり、あるエネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトルの吸収または放射をもたらす。それらは、バイオセンサーと共に使用される化学物質を含むことができる。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を用いることができる。
【０２５４】
個々の抗体−レポーターコンジュゲートによって生成されるシグナルは、試料（標準および試験）中の適切な抗体結合の定量化可能な絶対的または相対的データを得るために使用することができる。
【０２５５】
本開示はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための、上記に記載される抗原結合タンパク質の使用も提供し、競合アッセイにおいて本開示によって提供される抗原結合タンパク質を用いることにより、試料中のＭｒｋＡのレベルを測定する方法を含む。いくつかの実施形態では、結合していない抗原からの結合している抗原の物理的な分離が必要とされない。いくつかの実施形態では、物理的なまたは光学的な変化が結合に際して起こるように、レポーター分子が抗原結合タンパク質に連結される。レポーター分子は、検出可能であり、好ましくは測定可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる。いくつかの実施形態では、レポーター分子の連結が直接的もしくは間接的であるかまたは共有結合性であり、例えば、ペプチド結合または非共有結合性の相互作用を介したものである。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポーター分子をコード遺伝子融合物の組換え発現の結果としてのものとすることができる。
【０２５６】
本開示はまた、本開示による抗原結合タンパク質を用いることにより、ＭｒｋＡのレベルを直接測定する方法も提供する。いくつかの実施形態では、これらの方法が、バイオセンサー系を利用する。
【０２５７】
ＶＩ．ポリヌクレオチドおよび宿主細胞
さらなる態様では、本開示は、本開示による抗原結合タンパク質、ＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメイン、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片をコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書において記載される抗原結合タンパク質、ＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメイン、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片を作製または調製する方法であって、前記抗原結合タンパク質、ＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメイン、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片の産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させるステップ、ならびに抗原結合タンパク質、ＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメイン、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片を任意選択で回収するステップを含む方法を提供する。
【０２５８】
本開示によって提供される核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。一態様では、核酸がｃＤＮＡである。一態様では、本開示は、上記に記載されるＣＤＲもしくはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインもしくはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖもしくはＩｇＧ１をコードする核酸を提供する。
【０２５９】
本開示の一態様は、本明細書において記載されるＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲ配列をコードする核酸、一般に単離核酸、任意選択でｃＤＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲが配列番号１〜６または２９〜４０から選択される。いくつかの実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲが配列番号７〜１２または４１〜５２から選択される。Ｋｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６のＣＤＲのセットをコードする核酸、Ｋｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６のＨＣＤＲのセットをコードする核酸、およびＫｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６のＬＣＤＲのセットをコードする核酸も、表１および２に記載される個々のＣＤＲ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ、およびＣＤＲ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲのセットをコードする核酸のように提供される。いくつかの実施形態では、本開示の核酸が、表３および４に記載されるＫｐ３、Ｋｐ１６、クローン１、クローン４、クローン５、またはクローン６のＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも７５％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも８０％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも８５％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも９０％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも９５％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも９６％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも９７％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも９８％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７において示される配列に少なくとも９９％同一な配列をコードする。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜４０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜１００または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜１５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜１７５または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１７１〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１５０〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１００〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸５０〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１７のアミノ酸１〜４０および１７１〜２０２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも７５％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも８０％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも８５％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも９０％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも９５％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも９６％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも９７％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも９８％同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９において示される配列に少なくとも９９％同一な配列をコードする。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１〜４２または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１〜５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１〜１００または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１〜１５０または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１〜１７５または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１７３〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１５０〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸１００〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１９のアミノ酸５０〜２０４または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％それに同一な配列をコードする。
【０２６７】
本開示は、本明細書において開示される核酸分子またはその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の断片である、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、またはシークエンシングプライマーとしての使用に十分な単離ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡ分子を提供する。核酸分子は、例えば、制御配列に作動可能に連結することができる。
【０２６８】
本開示はまた、上記に記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物も提供する。
【０２６９】
本開示はまた、１つ以上の核酸、プラスミド、ベクターを含むかまたは上記に記載される組換え宿主細胞も提供する。提供される任意のＣＤＲまたはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインもしくはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位、抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１（例えば、表１〜４を参照されたい）、ＭｒｋＡポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸は、それ自体、コード産物の産生の方法のように、本開示の一態様を形成し、この方法は、産物（例えば、本明細書において開示される抗原結合タンパク質）をコードする核酸からの発現を含む。発現は、適切な条件下で、本明細書において記載される核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することによって好都合に実現することができる。発現による産生後、ＣＤＲ、ＣＤＲのセット、ＶＨもしくはＶＬドメイン、抗原結合タンパク質、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片は、任意の適した技術を使用して単離および／または精製することができる。
【０２７０】
いくつかの実例では、宿主細胞が、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類宿主細胞である。
【０２７１】
抗原結合タンパク質、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＭｒｋＡポリペプチド、その免疫原性断片、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの自然環境から、実質的に純粋なもしくは均質の形態で単離および／もしくは精製することができるか、または核酸の場合、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外のもともとの核酸もしくは遺伝子がないかもしくは実質的にないものとすることができる。本開示による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、全体的にまたは部分的に合成することができる。本明細書において説明されるヌクレオチド配列への言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ＵがＴと置換される、特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０２７２】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が、よく知られている。適した宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系、ならびにトランスジェニック植物および動物を含む。異種ポリペプチドの発現のための当技術分野において利用可能な哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒト胎児由来網膜細胞、およびその他多くの細胞を含む。一般的な細菌宿主は、大腸菌である。
【０２７３】
大腸菌などの原核細胞における抗体および抗体断片の発現は、当技術分野において十分に確立されている。概説については、例えばＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたい。培養中の真核細胞における発現も抗原結合タンパク質の産生のための選択肢として当業者に利用可能である。例えば、Ｃｈａｄｄ  ＨＥ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｏｗ  ＳＭ（２００１）１１０  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１８８−１９４、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＤＣ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１１７、Ｌａｒｒｉｃｋ  ＪＷ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  ＤＷ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：４１１−４１８。
【０２７４】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含有する適したベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えば「ファージまたはファージミドであってもよい。より詳細については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの知られている技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８８，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９９において詳細に記載される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（両方）の開示は、参照により本明細書に援用される。
【０２７５】
したがって、本開示のさらなる態様は、本明細書において開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。例えば、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質または抗体ＣＤＲ、ＣＤＲのセット、抗原結合タンパク質のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、本開示のＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、本開示の発現抗原結合タンパク質または抗体ＣＤＲ、ＣＤＲのセット、抗原結合タンパク質のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、本開示のＭｒｋＡポリペプチドもしくはその免疫原性断片を含む。
【０２７６】
そのような宿主細胞は、インビトロにおけるものとすることができ、培養中のものとすることができる。そのような宿主細胞は、単離宿主細胞とすることができる。そのような宿主細胞は、インビボにおけるものとすることができる。
【０２７７】
本明細書において提供されるさらなる態様は、宿主細胞中にそのような核酸を導入するステップを含む方法である。導入は、任意の利用可能な技術を用いることができる。真核細胞について、適した技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性のトランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えばワクシニアウイルスまたは昆虫細胞についてバキュロウイルスを使用する形質導入を含んでいてもよい。宿主細胞、特に真核細胞中への核酸の導入は、ウイルスまたはプラスミドベースの系を使用することができる。プラスミド系は、エピソームで維持されてもよく、または宿主細胞中にもしくは人工染色体中に組み込まれてもよい。組み込みは、単一の遺伝子座または複数の遺伝子座での１つ以上のコピーのランダムまたは標的統合によるものとすることができる。細菌細胞について、適した技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含んでいてもよい。
【０２７８】
導入後、核酸からの発現を引き起こすまたは可能にする、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することができる。
【０２７９】
一実施形態では、本開示の核酸が、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）中に統合される。統合は、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の組み入れによって促進することができる。
【０２８０】
本開示はまた、上記に記載される抗原結合タンパク質またはポリペプチドを発現するために発現系において構築物（例えば、上記に記載されるプラスミド、ベクターなど）を使用するステップを含む方法を提供する。
【０２８１】
別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＭｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片）を産生するハイブリドーマを提供する。
【０２８２】
本開示のさらなる態様は、本開示の抗体結合タンパク質、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片の産生の方法であって、コード核酸からの発現を引き起こすステップを含む方法を提供する。そのような方法は、前記抗原結合タンパク質、ＭｒｋＡポリペプチド、またはその免疫原性断片の産生に適した条件下で宿主細胞を培養するステップを含むことができる。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、産生の方法が、宿主細胞またはハイブリドーマから産生される抗原結合タンパク質（抗体もしくはその抗原結合断片を含む）、ＭｒｋＡポリペプチド、または免疫原性断片を単離および／または精製するステップをさらに含む。
【実施例】
【０２８４】
クレブシエラ感染症に対して防御し、有効である作用物質を同定する必要性を考慮して、グラム陰性菌肺炎桿菌についての交差防御標的を同定するために新規な機能ベーススクリーニングアッセイを使用した。この新規なアッセイは、オプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）を誘導することができる抗体を同定し、最初は、いかなる特定の標的抗原にも注目しなかった。
【０２８５】
材料および方法
肺炎桿菌株についての情報
肺炎桿菌分離株は、すべてＡｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）またはＥｕｒｏｆｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。莢膜およびＯ抗原欠損肺炎桿菌４３８１６株（４３８１６ΔｃｐｓＢΔＷａａＬまたは４３８１６ＤＭ）は、ＣｐｓＢ  ＯＲＦおよびＷａａＬ  ＯＲＦを含有するプラスミドによる対立遺伝子置換を通して構築し、ゲンタマイシンの存在下において選択した。ゲンタマイシン抵抗性のコロニーを選択し、増やした。ＣｐｓＢおよびＷａａＬ遺伝子の欠失は、ＰＣＲ分析によって確認した。ルシフェラーゼを発現する肺炎桿菌株（Ｌｕｘ株）を構築するために、様々な肺炎桿菌臨床分離株を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドで形質転換し、ゲンタマイシン抵抗性のコロニーを選択した。特に指定のない限り、肺炎桿菌培養物は、すべて３７℃で２×ＹＴ培地中で維持し、適切な場合、抗生物質を補足した。
【０２８６】
ファージパニングおよびスクリーニング
健康なドナーから構築されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリを、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−１４（１９９６）において記載されるように選択のために使用した。選択のために、４３８１６ΔｃｐｓＢΔＷａａＬ由来の９×１０９肺炎桿菌細胞をラウンド１のパニング抗原として使用し、野生型株１９０１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１９０１）および１８９９（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８９９）の均等なミックスでさらに２ラウンドのパニングを続けた。それぞれのラウンドについて、細菌細胞は、対数期の中間部で回収し、ブロックし（２×ＹＴ＋３％粉ミルク）、その後、１×１０１２ブロックファージ粒子を追加した。次いで、細胞は、ＰＢＳ中での再懸濁を繰り返すことによって７回洗浄した。結合したファージ粒子を、０．１Ｎ  ＨＣｌにより溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０により中和し、ファージ粒子増幅およびパニングの続くラウンドのためにＴＧ１を感染させるために使用した。第３ラウンドファージパニングアウトプットに感染したＴＧ１細胞は、ファージミドを調製するために使用した。ｓｃＦｖ断片を、精製ファージミドプールから調製し、産物に近いフォーマットでの発現およびスクリーニングのためにｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクター中にサブクローニングした。１９００、３５５６、およびＭＧＨ７８５７８分離株に交差反応性のクローンを、ＯＰＫアッセイにおいてさらに特徴付けた。
【０２８７】
肺炎桿菌特異的ハイブリドーマの単離
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、４週間、毎週、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）ルートを介して４３８１６ΔｃｐｓＢΔＷａａＬにより免疫化し、その後、野生型肺炎桿菌臨床分離株（Ｋｐ１９０１および１８９９）の混合物により最終的な追加免疫を続けた。免疫の終了時に、リンパ節リンパ球および脾細胞を回収し、Ｐ３Ｘ骨髄腫と融合し、１×ＨＡＴ培養培地において選択にかけた。次いで、結果として生じるハイブリドーマ由来の上清を全細菌ＥＬＩＳＡによって４３８１６ΔｃｐｓＢΔＷａａＬへの結合についてスクリーニングした。ポジティブなバインダーを、肺炎桿菌に対する防御ハイブリドーマの可能性のあるハイブリドーマを選択するためにハイスループットＯＰＫアッセイにかけた。
【０２８８】
抗肺炎桿菌全細菌ＥＬＩＳＡ
複数の株に対する抗肺炎桿菌抗体の結合を、参照により本明細書に援用されるＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０９：１２７３−８７（２０１２）において記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価した。手短かに言えば、単一コロニーの肺炎桿菌を、培養物が対数期に達するまで、２×ＹＴ培地に接種した。細菌を４℃で一晩、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）上にコーティングした。１セットのプレートを、ネガティブコントロールとしてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ  ｐｉｔｔｉ  １９００４（ＡＴＣＣ１９００４）の同様に調製した培養物でコーティングした。４％ＢＳＡを補足したＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｂ）でブロックした後、コーティングプレートを抗肺炎桿菌抗体と共に１時間インキュベートした。次いで、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を追加する前にプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）により１時間洗浄し、その後、洗浄およびＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質の追加を続けた。発色現像を０．１Ｎ  ＨＣＬの追加によって停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定した。データをＰｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。
【０２８９】
ハイスループットなオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）アッセイ
ＯＰＫアッセイは、ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０９：１２７３−８７（２０１２）において記載されるものに変更を加えた手順に基づいて実行した。手短かに言えば、ルシフェラーゼを有する肺炎桿菌株（Ｌｕｘ）の対数期培養物を約２×１０６細胞／ｍｌまで希釈した。４つの構成要素を、ＯＰＫアッセイのために３８４ウェルプレート中で一緒に混合した：細菌、希釈仔ウサギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、１：１０）、分化ＨＬ−６０細胞、および抗体。混合物は、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）２時間３７℃でインキュベートした。次いで、相対発光単位（ＲＬＵ）をＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレート読み取り装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。死滅のパーセンテージは、抗肺炎桿菌ｍＡｂおよびネガティブコントロールｍＡｂによるアッセイから得られたＲＬＵを比較することによって決定した。
【０２９０】
共焦点顕微鏡
肺炎桿菌４３８１６を、３７℃で２×ＹＴ培養培地中で一晩成長させた。蛍光標識は、ＭｒｋＡ特異的モノクローナル抗体Ｋｐ３と、その後、Ａｌｅｘａ  ４８８標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と細菌をインキュベートすることによって実現した。次いで、細菌は、４％中性バッファーホルマリンにより固定し、カバーガラス上にマウントした。共焦点顕微鏡は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００  Ｂ倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなるＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点システムにより実行した。画像は、ＬＡＳ  ＡＦバージョン２．２．１  Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
【０２９１】
肺炎桿菌溶解物からの免疫沈降
肺炎桿菌一晩培養物を遠心分離によって収集し、細胞ペレットは、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびＤＮａｓｅＩ（２００Ｕ／μｌで２μｌ／ｍｌ）を補足した３ｍｌのＢ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）バッファー中で再懸濁した。４０分間室温でインキュベートした後、上清は、４℃で２０分間テーブルトップＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ／分）で最高速度での遠心分離によって収集した。透明の溶解物を、４０μｌのプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２０４２２）と混合し、２時間４℃でインキュベートした。溶解物を、４℃で１５分間最高速度で（１４，０００ｒｐｍ／分）再び遠心分離によって収集した。透明の溶解物を、１５μｌのプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｂ−ＰＥＲによりあらかじめ洗浄）、６μｇの免疫沈降抗体を含有する新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、４℃で３時間ローテーター上でインキュベートした。次いで、ビーズは、４℃で１分、１０，０００ｒｐｍで回転させ、その後、氷冷Ｂ−ＰＥＲバッファーにより３回洗浄することによって収集した。次いで、免疫沈殿した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％勾配ゲルＮｏｖｅｘ）上に直接ロードした。試料の半分は、青色染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および続く質量分析試料調製のために一方のゲル上にロードし、他方の半分は、ウエスタンブロット分析のために別のゲルにロードした。
【０２９２】
免疫沈降産物のＬＣ−ＭＳ同定
関心のあるバンドを切り取り、脱染色し、洗浄し、その後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によるゲル内還元および暗中でのヨードアセトアミドによるアルキル化を続けた。タンパク質は、３７℃でトリプシンによりゲル内消化し、その後、消化されたペプチドの抽出を続けた。トリプシン消化試料は、参照により本明細書に援用されるＡｂｏｕｌａｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３０：１１１４−１１２４（２０１４）において提供されるプロトコールに類似する方法を使用して、オンラインナノＬＣ−ＭＳによって分析した。ペプチドのＬＣ分離は、４００ｎＬ／分の流速で作動する内径１８０μｍ×長さ２０ｍｍのＣ１８  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｔｒａｐ  ｃｏｌｕｍｎおよび１００μｍ×１００ｍｍ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）逆相カラムを備えたｎａｎｏ−ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ）システムで実行した（バッファー−Ａ：０．１％ギ酸；バッファー−Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）（Ｈｅｉｄｂｒｉｎｋ  Ｔｈｏｍｓｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  ２８：８５５−６０（２０１４）を参照されたい）。それぞれの試料は、１％バッファーＢを使用してトラップカラムに注入した。ペプチドを６０分間溶出した。ＬＣ分離後、溶出したペプチドは、ＭＳ／ＭＳについて衝突誘起解離（ＣＩＤ）を使用し、データ依存モードでＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ｔｏｐ  ｓｉｘ  ＭＳ／ＭＳ法）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オンラインで分析した。それぞれのタンパク質の特徴は、ＳｅｑｕｅｓｔノードおよびＭａｓｃｏｔノード（Ａｂｏｕｌａｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３０：１１１４−１１２４（２０１４））を備えたＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  ｖ．１．３ソフトウェアにより、肺炎桿菌タンパク質配列データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔ）に対して質量スペクトルデータを検索することによって決定した。データベースはまた、ヒトＩｇＧ１タンパク質配列も含有した。１タンパク質当たり最低２つの中程度または高度な信頼度の（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアのＰｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｌｉｄａｔｏｒノードにおいて決定される）ペプチドがそれぞれのタンパク質を明確に同定するために必要とされた。
【０２９３】
組換えＭｒｋＡタンパク質発現
ＭｒｋＡ−ｈｉｓタグオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を合成し、発現ベクターｐＡＣＹＣ−ｄｕｅｔ−１（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。クロラムフェニコール抵抗性のコロニーを選択し、１５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地中で増やした。ＯＤ（６００ｎｍ）が０．４に達したら、４時間３７℃でＭｒｋＡ−ｈｉｓの発現を誘導するために、１ｍＭ  ＩＰＴＧを培養物に追加した。細菌をＢ−ＰＥＲにより溶解し、ＭｒｋＡ−ｈｉｓの存在は、本明細書において記載される抗ｈｉｓまたはＭｒｋＡ特異的ｍＡｂを使用してウエスタンブロットによって調べた。
【０２９４】
ＭｒｋＡタンパク質のインビトロにおける転写および翻訳
インビトロにおける発現のためのＭｒｋＡのＤＮＡ鋳型をＰＣＲによって増幅した。鋳型は、ＭｒｋＡ  ＯＲＦの５’にＴ７プロモーター、ｃ−Ｍｙｃタグ、および３’にＴ７ターミネーターを含む。２５０ｎｇのＤＮＡ鋳型を、２５μｌの反応混合物中でＤｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＮＥＢ  Ｅ６８２０Ｓ）ありまたはなしのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓインビトロタンパク質系（ＮＥＢ  Ｅ６８００）に追加し、反応ミックスを２時間３７℃でインキュベートした。合成されたタンパク質は、本明細書において記載されるように抗ｃ−ＭｙｃおよびＭｒｋＡ特異的ｍＡｂを使用してウエスタンブロットによって分析した。
【０２９５】
細菌感染モデル
Ｃ５６／ＢＬ６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、特別な病原体なしの設備で維持した。動物実験は、すべてＩＡＣＵＣプロトコールおよびガイダンスに従って行った。肺炎桿菌株は、一晩、寒天プレート上で成長させ、適切な濃度で食塩水中で希釈した。接種材料の力価は、攻撃前および後に、寒天プレート上に段階希釈した細菌を平板培養することによって決定した。抗体およびコントロールは、細菌感染の２４時間前に投与した。臓器負担モデルについて、Ｃ５７／ｂｌ６マウスに、肺炎を誘導するために５０μｌ食塩水中１ｅ７  ＣＦＵ細菌を鼻腔内に接種した。肺細菌負担は、感染の２４時間後にＣＦＵを決定するために寒天プレート上に肺ホモジネートを平板培養することによって測定した。急性肺炎型では、Ｃ５７／ｂｌ６マウスに、それぞれ５ｅ３  ＣＦＵもしくは１ｅ８  ＣＦＵの肺炎桿菌４３８１６株（Ｏ１：Ｋ２）または肺炎桿菌９８５０４８株を鼻腔内に接種した。Ｋｐ３およびヒトＩｇＧ１コントロール抗体は、細菌攻撃の１日前に与えた。マウスの生存は、８日目まで毎日モニターした。３つの実験について合わせた生存データをＰｒｉｓｍでプロットした。
【０２９６】
統計分析
統計分析は、すべてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６で実行した。細菌負担を比較するために、Ｋｐ３治療動物は、対応のないｔ検定によってヒトアイソタイプコントロール抗体治療動物と比較した。生存結果は、カプランマイヤー曲線としてプロットし、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍｅｎｔａｌ−Ｃｏｘ）検定で分析した。
【０２９７】
実施例１：生きている肺炎桿菌に対するファージパニング
健康なドナーから得たヒトｓｃＦｖライブラリ（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−１４（１９９６））は、肺炎桿菌特異的抗体を選択するために使用した。このプロセスは、特異的な抗原を使用するのではなく、機能的に関係のある標的を選択するために設計した。肺炎桿菌の莢膜多糖およびＯ抗原の非常に可変性の構造のために、莢膜およびＯ抗原欠失突然変異株４３８１６ＤＭ（４３８１６ΔｃｐｓＢΔＷａａＬ）は、選択プロセスを、より保存されている表面抗原の方に向けるために生成した。親和性選択パニングの第１ラウンドを４３８１６ＤＭに対して実行し、その後、さらに２ラウンドのパニングを野生型分離株（１９０１および１８９９）の混合物に対して実行した。１００倍超濃度が高くなったことが、３ラウンドのパニングにわたるアウトプット力価から観察された。
【０２９８】
この研究において使用したファージライブラリは、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）ライブラリであった。ｓｃＦｖフォーマットは、特異的な結合に基づく予備的なスクリーニングに適切であるが、ＯＰＫがＦｃ断片によって媒介されるエフェクター機能に依存するため、ＯＰＫなどの機能的スクリーニングフォーマットには適していない。したがって、第３ラウンドのパニングのアウトプットをｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットにバッチ変換した。このプラットフォームは、細菌および哺乳類宿主の両方におけるｓｃＦｖ−Ｆｃ発現を可能にし、ハイスループットおよび機能的スクリーニングの両方の必要に適している。ｓｃＦＶ−Ｆｃクローンを細菌中で発現させ、結果として生じる上清を、３つの生きている肺炎桿菌野生型株への結合について試験した。合計３５２０のｓｃＦｖ−Ｆｃクローンをスクリーニングし、４００を超えるクローンが３つの肺炎桿菌分離株すべてに対して特異的な結合を示した。非特異的バインダーは、ＥＬＩＳＡスクリーニング中にコントロールとして無関係の細菌を使用することによって除外した。シークエンシングにより２つの重要なファージ由来クローン、Ｋｐ３およびＫｐ１６が明らかになった。これらを哺乳類細胞においてｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットで発現させ、ＯＰＫ活性について試験した。ＩｇＧ１に再フォーマットした後、それらは、全細菌ＥＬＩＳＡにおいてＫｐ２９０１１に対する強い結合を保持し（図１Ａ）、強力なＯＰＫ活性を示し（図１Ｂ）、様々な莢膜およびＯ抗原血清型を有する大部分の分離株に対する結合を示した（図１Ｅ）。Ｋｐ３およびＫｐ１６はまた、様々な血清型の肺炎桿菌のパネルに対してＯＰＫ活性を示した（図１Ｆ）。スペクトルの広い７００の最近の肺炎桿菌臨床分離株によりさらに試験すると、Ｋｐ３は、６２％を超える株に結合し、それらの大部分は多薬剤抵抗性の分離株であった。Ｋｐ３によって認識される代表的な肺炎桿菌臨床分離株のリストを表５に示す。
【０２９９】
【表５】
2018527924.tif 000007
【０３００】
【表６】
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【０３０１】
【表７】
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【０３０２】
【表８】
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【０３０３】
実施例２：肺炎桿菌に対するハイブリドーマ生成
４３８１６ＤＭ（４３８１６ΔｃｐｓＢΔＷａａＬ）株は、莢膜またはＬＰＳ  Ｏ抗原と異なる抗原に対する抗体を誘起する目的で、マウスを免疫化するために使用した。突然変異株による初期の免疫後、最終的な追加免疫を、脾臓およびリンパ節をハイブリドーマ生成のために収集する前に野生型株（１９０１および１８９９）の組み合わせにより実行した。結合による全細胞細菌スクリーニングは、交差反応性の抗体を同定するために、上記のファージパニングアプローチと同様に、ハイブリドーマ生成において初めに適用した。試験したおよそ９０００のハイブリドーマのうち、４つのハイブリドーマ（２１Ｇ１０、２２Ｂ１２、８８Ｄ１０、および８９Ｅ１０）が、試験した肺炎桿菌株に対して血清型非依存性の結合を示した（図１ＡおよびＥ）。
【０３０４】
実施例３：血清型非依存性のオプソニン作用による死滅（ＯＰＫ）活性の実証
ＯＰＫ活性を有する抗体は、インビボにおける防御機能と相関することが報告された。例えば、参照により本明細書に援用されるＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０９：１２７３−８７（２０１２）を参照されたい。表現型のスクリーニングを容易にするハイスループットＯＰＫアッセイは適していた。およそ１０００のハイブリドーマを抗生物質なしの培地中に維持し、ＯＰＫ活性について試験した。次いで、ＯＰＫポジティブハイブリドーマをクローニングし、抗体精製のために増やした。これらの中で２つのハイブリドーマから得られた抗体（８８Ｄ１０、８９Ｅ１０）がＯＰＫ活性の増強を示し（図１Ｂ）、全細菌ＥＬＩＳＡアッセイによって肺炎桿菌株に対する強い結合を示した（図１Ａ）。
【０３０５】
ＯＰＫポジティブなファージおよびハイブリドーマ由来の抗体はまた、ＥＬＩＳＡによって様々な莢膜およびＯ抗原血清型を有する肺炎桿菌株の選択パネルへの結合についても試験した（図１Ｅ）。ファージおよびハイブリドーマ由来の抗体は、同様の結合パターンを示し、すべて複数の莢膜およびＯ抗原血清型に結合した。
【０３０６】
ファージ由来のＫｐ３抗体が、エクスビボにおいて成長させたクレブシエラに結合する能力も試験した。これらの実験では、クレブシエラ株は、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩、２×ＹＴブロス中で培養した。次いで、培養物は、１：２００に希釈し、対数期まで成長させた。５ｅ８  ＣＦＵ細菌は、腹腔内（エクスビボＩＰ）または鼻内（エクスビボＩＮ）ルートを介してマウスに注射した。２時間後、マウスを犠牲死させ、細菌を肺ホモジネート、腹膜の洗浄液、または血液から単離した。これらの条件下で単離した細菌は、Ｋｐ３を使用して、ＦＡＣＳ結合アッセイにかけた。下記の表６に示されるように、Ｋｐ３はまた、エクスビボにおいて成長させた複数のクレブシエラ血清型にも結合する（「＋または＋＋または＋＋＋」は、結合のレベルを示し、「−」は、結合しないことを示す）。
【０３０７】
【表９】
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【０３０８】
実施例４：ＭｒｋＡ抗原の同定
２つのファージ（Ｋｐ３およびＫｐ１６）ならびに４つのハイブリドーマクローン（８８Ｄ１０、８９Ｅ１０、２１Ｇ１０、および２２Ｂ１２）の同様の結合パターン（図１Ｅを参照されたい）が、それらが同じ抗原を認識する可能性についての調査を促した。これらの競合ＥＬＩＳＡ実験では、１μｇ／ｍｌのビオチン標識抗体（図１ＣのＫｐ３または図１Ｄの８８Ｄ１０）を増加性の量のＫｐ３またはＫｐ１６と混合し（図１に示されるように）、肺炎桿菌に対するその結合について試験した。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを検出剤として使用した。ＥＬＩＳＡシグナルの低下を阻害のパーセンテージとして表現した。競合ＥＬＩＳＡは、それらがすべて、試験した肺炎桿菌分離株への結合について互いに競合したことを示し、同じ抗原上の重複するエピトープにそれらが結合することを示した（図１Ｃおよび１Ｄ）。
【０３０９】
結合分析前の全細胞プロテアーゼ処理により、ｍＡｂ  ＫＰ３および８８Ｄ１０の反応性がなくなった。これは、これらの抗体の標的がタンパク質であろうことを示す。線毛に類似している突き出ている繊維状の細胞表面構造が視覚化されたように、Ｋｐ３染色を使用する共焦点顕微鏡によって抗原標的が肺炎桿菌の表面上に位置することも確認された（図２Ａ）。
【０３１０】
次いで、免疫沈降を、ｍＡｂ結合抗原標的を単離するために使用した。これらの実験において、細胞溶解物を非反応性（１８９９）および反応性（４３８１６ＤＭ）の株から調製し、Ｋｐ３、８８Ｄ１０、およびアイソタイプ抗体コントロールによる免疫沈降にかけた。免疫沈降産物を分けて二等分し、還元条件下で２つの４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。一方のゲルは、青色染色によって分析した。他方の同一のゲルは、ＰＶＤＦ膜に転写し、検出抗体としてビオチン化８８Ｄ１０．１およびＫｐ３の混合物を使用してウエスタン分析にかけた。
【０３１１】
コントロール抗体と比較して、Ｋｐ３および８８Ｄ１０は４つの主なタンパク質バンドを捕捉し、バンド１はネガティブコントロール分離株１８９９由来のものであった（図２Ｂ）。それらの中でバンド番号３は、ウエスタンブロット分析においてＫｐ３に対して反応性である（図２Ｃ）。４つのバンドすべてを切り取り、ＬＣ−ＭＳ分析にかけた。完全ＭｒｋＡ配列の５０％以上を包含するペプチドが回収されたため、最も目立つタンパク質バンド（図２Ｂバンド＃３）がＭｒｋＡとして同定された。質量分析法によって同定したＭｒｋＡペプチドに図２Ｄにおいて太字で下線を引く。他方の目立つバンド（図２Ｂバンド＃２）は、ＭｒｋＡ線毛サブユニットのフォールディングおよび細胞膜周辺腔を通る輸送を容易にするシャペロンタンパク質であるＭｒｋＢとして同定された（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２８：７４２８−３５（２０１２）；Ｂｕｒｍｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５４：１８７−９５（２００８））。最も目立たなかったバンド（図２Ｂバンド＃４）およびネガティブコントロール分離株から単離されたバンド（図２Ｂバンド＃１）は、いかなる特異的細胞表面局在化タンパク質も同定しなかった。
【０３１２】
実施例５：抗原としてのＭｒｋＡの確認
ＭｒｋＡは、ＬＣ−ＭＳによって図２ＢバンドＮｏ．３から同定された単一のタンパク質種であったが、ＭｒｋＡについて予測されるＭＷ（約２０ｋＤａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけ上のＭＷ（６０〜２００ｋＤａ）に明らかな差異があった（図２ＢおよびＣ）。Ｂ群連鎖球菌のアルファタンパク質ＣおよびＭｒｋＡを含む、梯子状に現れる細菌表面タンパク質が以前に報告された。Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２８：７４２８−３５（２０１２）ａｎｄ  Ｌａｎｇｓｔｒａａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５８０５−１２（２００１）を参照されたい。抗原の特徴をさらに確認するために、組換えＭｒｋＡを、肺炎桿菌ＭＧＨ７８５７８の公開ＭｒｋＡ配列に基づいて大腸菌において発現させた。詳細に述べると、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース由来の株ＭＧＨ７８５７８のＭｒｋＡ  ＯＲＦを発現ベクター中にクローニングし、ＢＬ２１細胞において発現させた。次いで、溶解物をＢ−ＰＥＲを使用して調製し、抗ｈｉｓタグまたはＫｐ３を使用してウエスタンブロット分析にかけた。内因性ＭｒｋＡと同様に、組換えＭｒｋＡは、６０ｋＤａ〜２００ｋＤａ超の見かけ上のサイズの範囲にわたるバンドを含む梯子状のパターンを示した（図３Ａ）。興味深いことに、抗ｈｉｓ抗体は、単量体およびオリゴマーＭｒｋＡの両方を認識したが、Ｋｐ３は、オリゴマー形態のみを認識した。ＭｒｋＡ  ｍＡｂ標的の特徴も、共焦点実験において示される線毛構造と一致する（図２Ａ）。組換えＭｒｋＡはまた、異なる実験条件下でインビトロ転写および翻訳系でｃ−Ｍｙｃタグと共に発現させ、産物をウエスタンブロット分析にかけた。抗Ｍｙｃ検出によって示されるように、インビトロ発現系は、ＭｒｋＡ単量体タンパク質を主に産生した（図３Ｂ）。Ｋｐ３は、細菌細胞溶解物中に存在する、より高分子量のバンドを認識したが（図３Ｂ、試料１）、それはＭｒｋＡ単量体を検出することができなかった。これは、Ｋｐ３が、ＩＩＩ型線毛における高次のＭｒｋＡ構造に結合することおよびＭｒｋＡの構築には、この研究において使用されるインビトロ発現系において欠けている他の細胞構成要素または条件の寄与が必要とされ得ることを示唆する。
【０３１３】
実施例６：抗ＭｒｋＡ抗体はインビボにおいて肺炎桿菌からマウスを防御する
本明細書において開示される抗ＭｒｋＡ抗体による優れた血清型非依存性のＯＰＫ活性およびバイオフィルム予防を考慮して、２つの主なＯ血清型株による肺炎桿菌感染症のマウスモデルにおいてＫｐ３を評価した。様々な臨床肺炎桿菌分離株の毒性は、免疫応答性マウスにおいて劇的に変動する。評価した大部分の分離株は、わずかな例外を除いて、急性肺炎モデルにおいて高接種用量（１ｅ９ＣＦＵ／マウス）でさえ有毒とならなかった。そのため、臓器負担モデルを、複数の分離株に対する抗ＭｒｋＡ抗体の効能を実証するために採用した。これらの実験では、マウスは、１ｅ７ＣＦＵの細菌による鼻内感染の２４時間前にＩＰ投与による抗体の単回投与を受けた。次いで、マウスを犠牲死させ、感染した肺における菌の数を評価した。１５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＫｐ３は、Ｋｐ２９０１１（Ｏ１：Ｋ２）およびＫｐ９１７８（Ｏ３：Ｋ５８）に感染したマウスにおける肺負担を有意に低下させた（図４Ａおよび４Ｂ）。Ｋｐ４３８１６に対するヒトＩｇＧ１ウサギポリクローナル抗体をコントロールとして使用した。抗体用量漸増法は、１５ｍｐｋが最善の防御をもたらしたことを示し、用量をより多くしてもさらなる有益性がもたらされることはなかった。
【０３１４】
Ｋｐ３はまた、Ｋｐ４３８１６、有毒なＯ１：Ｋ２株（図４Ｃ）、または最近単離された臨床多薬剤抵抗性株であるＫｐ９８５０４８（図４Ｄ）を使用して、致命的な肺炎モデルでも試験した。このモデルでは、５ｅ３  ＣＦＵ（Ｋｐ４３８１６）または１ｅ８  ＣＦＵ（Ｋｐ９８５０４８）の細菌を抗体投与の２４時間後に鼻腔内に与えた。マウスを感染の８日後までモニターした。ＭＡｂ  Ｋｐ３は、これらのモデルにおいて有意な防御効果を示した（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０３１５】
これらのデータは、抗ＭｒｋＡ抗体のＯＰＫ活性が細菌負担を低下させ、かつ肺炎桿菌の複数の血清型に感染したマウスの生存を強化するそれらの能力に寄与し得ることを示す。
【０３１６】
実施例７：ＭｒｋＡエピトープの同定
ＭｒｋＡ欠失を生成するために、４０アミノ酸Ｎ末端欠失（「ＭｒｋＡ−Ｎ−ｄｌｔ」）、３２アミノ酸Ｃ末端欠失（「ＭｒｋＡ−Ｃ−ｄｌｔ」）、ならびにＮおよびＣ末端欠失の組み合わせ（「ＭｒｋＡ−Ｎ／Ｃ−ｄｌｔ」）を有するＭｒｋＡ遺伝子配列をＣ末端にＨｉｓタグが追加されたｐＣＡＢＮＴＡＢ６（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）細菌発現ベクター中にクローニングした。単一のコロニーを選択し、１００ユニットのカルベニシリンを補足したＬＢ中に接種した。細菌を２５０ｒｐｍ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０４〜０．６に達したら、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで追加し、細菌をさらに３時間培養した。次いで、細菌細胞を収集し、Ｂ−ＰＥＲ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶解にかけた。透明な細胞溶解物を、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために直接使用し、Ｋｐ３の結合を、標準的なＥＬＩＳＡの手順を使用して測定した。ヒトＩｇＧ１および関係がない抗ＭｒｋＡ抗体をコントロールとして使用した。図６に示されるように、Ｋｐ３は、完全長ＭｒｋＡのみ検出し、ＭｒｋＡ−Ｎ−ｄｌｔ；すなわち、配列番号１７のアミノ酸４１〜２０２（すなわち配列番号２６）、ＭｒｋＡ−Ｃ−ｄｌｔ；すなわち、配列番号１７のアミノ酸１〜１７０（すなわち配列番号２７）、またはＭｒｋＡ−Ｎ／Ｃ−ｄｌｔ；すなわち、配列番号１７のアミノ酸４１〜１７０（すなわち配列番号２８）のいずれにも結合しなかった。対照的に、コントロール抗ＭｒｋＡ抗体は、完全長ＭｒｋＡおよびＮ末端欠失を有するＭｒｋＡを検出した（データ示さず）。これらの結果は、Ｋｐ３が立体エピトープを認識することを示す。
【０３１７】
実施例８：単量体およびポリマーＭｒｋＡは細菌攻撃モデルにおける臓器負担を低下させる
予防の治療における抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂの血清型非依存性防御活性を考慮して、精製ＭｒｋＡがワクチン抗原として防御を付与する能力について試験した。組換えＭｒｋＡタンパク質は、単量体およびポリマー形態の両方で存在する（図３Ａ）。防御免疫を誘導する際の単量体およびオリゴマーＭｒｋＡタンパク質の役割を評価するために、単量体およびポリマー種の両方をカラム分画によって精製した。手短かに言えば、ＭｒｋＡを大規模で発現させ、ＭｒｋＡの成熟形態（配列番号１７）を、Ｎ端６×ｈｉｓタグとインフレームでｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。タンパク質を宿主ＢＬ２１−ＤＥ３大腸菌株によって発現させた。形質転換細胞を０．６のＯＤ６００に達するまで２５０ＲＰＭで振盪させながら３７℃でＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）中で成長させた。ＩＰＴＧ（１Ｍ）（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を培養物に追加して最終濃度を１ｍＭにし、培養物をさらに４時間インキュベートした。細胞を遠心分離（１０分間１２，０００Ｘｇ）によって回収し、細胞ペレットを精製まで−８０℃で保存した。ＭｒｋＡ精製のために、細胞ペレットを氷上で解凍し、Ｂ−ＰＥＲを使用して溶解し、不溶性の封入体画分を遠心分離によって収集し、可溶化バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１００ｍＭリン酸ナトリウム、８Ｍ尿素、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁した。可溶化された封入体を１０℃で１５分間２７，０００ｘｇで遠心分離によって清澄化し、次いで、可溶化バッファーにより平衡化した５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。フロースルーおよび溶出した画分の両方を収集し、記載されるプロトコールに従ってリフォールディングにかけた。リフォールディングした混合物を、ＨｉｓＴｒａｐカラムにロードし、５００ｍＭ  ＮａＣｌを有する２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中５００ｍＭイミダゾールまでの直線勾配で溶出した。単量体ＭｒｋＡは、勾配（およそ１５０ｍＭイミダゾール）で初めに収集され、オリゴマー種は、勾配（およそ２５０ｍＭイミダゾール）で後に収集された。それぞれのプールをＶｉｖａｓｐｉｎ  ５  Ｋ  ＭＷＣＯデバイス（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）により濃縮し、１００ｍＭ  ＮａＣｌを有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に透析した。
【０３１８】
透析によってリフォールディングするために、試料を３容量のＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭシステアミン、０．５ｍＭシスタミン、ｐＨ８］により希釈した。それらを４℃で一晩混合した。それらを４℃でリフォールディングバッファー（ＥＤＴＡなしのＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）中に透析し（２回交換）、次いで１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に透析した。透析した試料を、ＨｉｓＴｒａｐを使用して精製した（５００ｍＭ  ＮａＣｌを有する２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中５００ｍＭイミダゾールまで直線勾配で溶出）。
【０３１９】
第１のローディングステップ中にカラム中に保持されたＭｒｋＡは、ほとんどオリゴマーＭｒｋＡを含有した。それを、上記に記載されるようにカラム上でリフォールディングし、溶出し、濃縮した。封入体からの精製により、高純度の単量体およびオリゴマーＭｒｋＡがもたらされ（図７）、これを続く免疫実験において使用した。
【０３２０】
精製し、濃縮した単量体およびオリゴマーＭｒｋＡをマウスにワクチン接種するために使用した。６〜８週齢Ｃ５７／ｂｌ６マウスに、フロインドアジュバントを有する１５マイクログラムの単量体またはポリマーＭｒｋＡの皮下注射を通して３回ワクチン接種した。３回目の感染後、ＭｒｋＡに対する強い血清力価が検出された。次いで、マウスは、第３の免疫後に１．４ｅ７  ＣＦＵ  Ｋｐ２９０１１（Ｏ１：Ｋ２）を鼻腔内に抗原投与した（４週目）。感染の２４時間後、肺および肝臓を１ｍＬのＰＢＳ中でホモジナイズし、ホモジネートのＣＦＵ／ｍＬを計算するためにＬＢ寒天プレート上で平板培養した。
【０３２１】
図８に示される結果は、アジュバントコントロール群（ＰＢＳ−ＣＦＡ／ＩＦＡ）と比較して、単量体およびオリゴマーＭｒｋＡのワクチン接種の両方が細菌攻撃後に臓器負担を低下させたことを実証し、ＭｒｋＡがワクチン抗原として防御を付与し得ることを示唆する。単量体ＭｒｋＡは、肺において細菌を有意に低下させ、オリゴマーＭｒｋＡは、肺および肝臓の両方において細菌を有意に低下させた（図８Ａ〜Ｂ）。したがって、これらの結果は、単量体および／またはオリゴマーＭｒｋＡによるワクチン接種がクレブシエラ臓器負担を低下させることを実証する。
【０３２２】
実施例９：抗ＭｒｋＡ抗体はバイオフィルム形成および細胞吸着を阻害する
抗ＭｒｋＡ抗体がバイオフィルム形成を阻害するかどうかを決定するために、バイオフィルムアッセイを、変更を加えたＷｉｌｋｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ＰＬｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ７（８）：ｅ１００２２０４（２０１１））に従って実行した。肺炎桿菌４３８１６を増殖させて対数期の培養物にし、０．１に等しいＯＤ６５０となるように最少培地（ＲＰＭＩ−１％ＢＳＡ）中に希釈した。三通り、細菌を、Ｋｐ３またはｈＩｇＧ１（アイソタイプコントロール）抗体の一連の希釈液を有する平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でインキュベートした。３７℃、１２０ｒｐｍでの２時間のインキュベーション後、浮遊性の細菌を洗い流し、ウェルを蒸留水により洗浄した。ウェル表面に結合したバイオフィルムは、１５０μＬの０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）クリスタルバイオレット溶液により室温で１５分間染色した。クリスタルバイオレット溶液をデカントし、非結合色素を徹底的に除去するためにウェルを続いて洗浄した。結合した色素は、２００μｌ  ９５％エタノールにより可溶化し、５９５ｎｍで吸光度を測定することによって定量化した。増殖培地のみを含有するウェルは、阻害のパーセンテージを計算するためにネガティブコントロールとして使用した。細菌が宿主組織または非生物表面にコロニーを形成し、微小コロニー、群集、またはバイオフィルムを形成する能力は、細菌感染症の病原および持続に重要な役割を果たす。Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，
“Ｂｉｏｆｉｌｍ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  −  ａ  ｊｏｕｒｎｅｙ  ｔｏ  ｂｒｅａｋ  ｔｈｅ  ｗａｌｌ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．”Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ  １６。肺炎桿菌におけるＩＩＩ型線毛は、真核細胞および非生物表面への粘着を媒介する、繊維状の付属器である。主な線毛サブユニットであるＭｒｋＡは、バイオフィルム形成を容易にすることが以前に示されたが、アドヘシン（ＭｒｋＤ）は示されなかった（Ｌａｎｇｓｔｒａａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００１；６９：５８０５−１２）。抗ＭｒｋＡ抗体が細菌表面上のＭｒｋＡに結合し、続いてバイオフィルム形成をブロックするかどうかを決定するために、抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂ  Ｋｐ３またはヒトＩｇＧ１コントロール抗体の存在下における非生物プレートへの細菌吸着を測定した。Ｋｐ３は、用量依存的な方法でクレブシエラ４３８１６株によるバイオフィルム形成を有意にブロックした（図９）。したがって、図９に示される結果は、抗ＭｒｋＡ  Ｋｐ３抗体がクレブシエラバイオフィルム形成を阻害することを実証する。
【０３２３】
ＩＩＩ型線毛の他の重要な特徴は、感染の定着に至る宿主組織のクレブシエラコロニー形成を容易にすることである。抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂ  Ｋｐ３が肺上皮細胞とのクレブシエラの結合を予防したかどうかを試験するために、細胞吸着アッセイも実行した。手短かに言えば、これらの実験では、Ｋｐ３またはｈＩｇＧ１（アイソタイプコントロール）抗体を、不透明な９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ）において増殖させたコンフルエントなＡ５４９細胞に追加した。対数期発光性肺炎桿菌４３８１６を５０の感染多重度（ＭＯＩ）で追加した。９０分間の３７℃でのインキュベーション後、細胞を洗浄し、その後、０．０５ｍｌの２×ＹＴ＋０．５％グルコースを追加した。細菌ＲＬＵは、３７℃での１５分のインキュベーション後にＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレート読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。図１０に示されるように、Ｋｐ３は、Ａ５４９ヒト肺の上皮細胞への肺炎桿菌の吸着を有意に低下させ、それにより、抗ＭｒｋＡ  Ｋｐ３抗体が上皮細胞へのクレブシエラの結合を阻害することを実証する。
【０３２４】
考察
標的不可知論的（ｔａｒｇｅｔ  ａｇｎｏｓｔｉｃ）戦略は、肺炎桿菌感染症の治療のための交差防御抗体を同定するために適用した。肺炎桿菌を標的にする交差反応性の抗体を同定する著しい努力がなされてきたが、そのような治療薬の開発には、大きな障壁がある。ＣＰＳおよびＬＰＳを含む、十分に検証された抗体標的は、血清型特異的であり、そのため、広範な株を対象とするために複数の抗体を必要とする。この課題は、より保存された表面抗原に注目するためにＣＰＳおよびＬＰＳ  Ｏ抗原欠失変異体を構築することによって改善された。全細菌結合アッセイおよびよりハイスループットなＯＰＫアッセイを利用することにより、クレブシエラに対する著しいインビトロおよびインビボ効能を示す、ハイブリドーマおよびファージディスプレイプラットフォームの両方からの抗ＭｒｋＡ抗体が同定された。
【０３２５】
ＭｒｋＡは、ＩＩＩ型線毛複合体の主なタンパク質であり、宿主細胞吸着およびバイオフィルム形成（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１２；７：９９１−１００２を参照されたい）、感染を確立するために病原菌が使用する戦略（Ｂｕｒｍｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００８；１５４：１８７−９５）に関係してきた。１つの概念実証実験では、精製ＩＩＩ型線毛により免疫化されたマウスは、続く肺炎桿菌攻撃に対して比較的低い抗原投与量にすぎないにもかかわらず抵抗性を示した（Ｌａｖｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５；２９５：１５３−９）。体液性免疫は、防御メカニズムとして関係したが、防御を誘起した抗原成分は、解明されなかった。本明細書において開示される抗ＭｒｋＡモノクローナル抗体は、複数のメカニズムを通して免疫防御に寄与する。第１に、抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂは、肺細胞株への細菌吸着およびバイオフィルム形成を低下させ、これは、続いて、宿主組織に対する細菌コロニー形成を低下させ、細菌除去を容易にし得る。第２に、抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂは、血清型に非依存性のＯＰＫ活性の強い向上を示した。ＯＰＫ活性は、細菌負担を低下させ、肺炎桿菌の複数の血清型に感染したマウスにおける生存を強化するのを支援し得る。興味深いことに、ＩＩＩ型線毛アドヘシンタンパク質ＭｒｋＤに対する抗体は、抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂと同様に、複数の肺炎桿菌株に対して交差反応性を示したが、ＯＰＫを誘導せず、インビボにおいて防御を付与しなかった（データ示さず）。これにより、ＯＰＫ活性が、これらの抗体についてのインビボにおける防御に必要となり得ることがさらに確認された。
【０３２６】
抗体治療標的としてのＭｒｋＡの有望な特徴は、様々な分離株間での高度な配列保存および細胞外標的としての全体的な接近容易性である。２つの最も重要な病原性分離株である肺炎桿菌およびＫ．オキシトカ由来のＭｒｋＡは、９５％の相同性を有し、腸内細菌科の代表的なメンバー間の相同性は、他のものと非常に異なるエンテロバクター・クロアカを除いて、９０％を超える（図５）。さらなる研究が、他のメンバー由来のＭｒｋＡ配列を広範囲に調査するために必要である。しかしながら、これは、ＭｒｋＡベースの抗肺炎桿菌および全グラム陰性（ｐａｎ  Ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）戦略を開発する有望な機会を提供する。
【０３２７】
２つの異なるプラットフォームから単離された抗ＭｒｋＡ抗体が、同様のエピトープを標的にすることにおいてよく類似していることは注目に値する。これは、ハイブリドーマおよびファージ作戦から結果として生じる抗体が様々なエピトープを標的にしたことを示す最近の報告と全く対照的である（Ｒｏｓｓａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ２０１４；６：１４２５−３８）。エピトープは、事実上、立体エピトープと思われる。それは、本明細書において開示される同定された機能的抗体がオリゴマーＭｒｋＡ上に主に存在するエピトープを認識するという発見と一致している。精製単量体および多量体ＭｒｋＡ抗原によるワクチン接種研究は、両方の形態の抗原が防御免疫を誘導し得ることを示唆した。これらの観察は、ＭｒｋＡベースの治療薬およびワクチンの開発にとって重要な意味合いを有し得る。
【０３２８】
要約すると、これらの研究は、抗体の機能的スクリーニングが肺炎桿菌に対する治療薬の開発および新たな標的発見における強力なツールとなることをさらに実証する。ＭｒｋＡおよび抗ＭｒｋＡ抗体を巡るこの研究から生成された多くの情報は、肺炎桿菌病原の分野にとって有用であるはずであり、肺炎桿菌および他の重度の細菌感染に対処する際に集積されるべきである。
【０３２９】
実施例１０：組換えＭｒｋＡタンパク質に対するファージライブラリのパニング
さらなる抗ＭｒｋＡ抗体は、精製組換えＭｒｋＡタンパク質に対してナイーブヒト単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体ファージライブラリをパニングすることによって同定した。
【０３３０】
組換えＭｒｋＡタンパク質を調製するために、材料および方法のセクションにおいて記載されるものに変更を加えて、ｈｉｓタグ付加組換えＭｒｋＡを発現させ、精製した。大腸菌宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現されたＭｒｋＡは、主として封入体中にとどまった。８モルの尿素を含有するバッファーを、ＭｒｋＡを可溶化するために使用し、ｈｉｓタグ付加ＭｒｋＡは、変性ＭｒｋＡをアフィニティーカラムに直接ロードし、最初にリフォールディングせずに変性条件下で精製した以外は、前に記載されるようにＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した（参照により本明細書に援用されるＷａｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ，２０１６．Ｔａｒｇｅｔ  Ａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ＭｒｋＡ  Ｆｉｍｂｒｉａｌ  Ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２１３（１１）：１８００−１８０８を参照されたい）。単量体およびオリゴマーＭｒｋＡは、さらなる分離を伴うことなく一緒に溶出した。溶出したＭｒｋＡ画分を収集し、ＰＢＳバッファーに対して透析して、ビオチン標識およびパニングの準備を整えた。ビオチン標識のために、Ｐｉｅｒｃｅの標識キットを使用し、メーカーのプロトコールに従った。
【０３３１】
パニング選択は、Ｌｉｌｌｏ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ，”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２７７５６（２０１１））において記載されるものに変更を加えて、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ自動化システムを使用して、溶液のフォーマットで実行した。この研究において使用されるナイーブｓｃＦｖファージディスプレイライブラリは、Ｖａｕｇｈａｎ  Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：３０９−３１４（１９９６））において前に記載された。パニング抗原ＭｒｋＡをビオチン化し、０．３μｇを最初の２ラウンドの各パニングに使用した。第３ラウンドを必要とした選択について、ビオチン化ＭｒｋＡは、０．１μｇまで低下させた。ファージアウトプットが第１ラウンドと比較して１００倍超まで改善したら、パニング選択を停止し、ハイスループットスクリーニングを開始した。
【０３３２】
スクリーニングの第１ラウンドは、ＭｒｋＡに対する特異的な結合に基づいた。大腸菌株Ｔｏｐ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてｐＳｐｌｉｃｅ．Ｖ５ベクターを通して発現させたｓｃＦｖ．Ｆｃは、特異的なバインダーをスクリーニングするために均一性時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）に基づいたアッセイにおいて使用した（Ｘｉａｏ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｕａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｋｅ  Ｆｏｒｍａｔ，”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１４０６９１（２０１５）；Ｎｅｗｔｏｎ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １８：２３７−２４６（２０１３））。結果として生じるＭｒｋＡ特異的バインダーを１つにまとめ、配列決定した。ユニークなクローンは、前に記載されるように、哺乳類細胞トランスフェクション、ｓｃＦｖ．Ｆｃ発現、およびＯＰＫ分析のためのプラスミドを調製するために使用した（Ｘｉａｏ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｕａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｋｅ  Ｆｏｒｍａｔ，”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１４０６９１（２０１５）を参照されたい）。
【０３３３】
パニングの目的のために、単量体ＭｒｋＡは、オリゴマーＭｒｋＡから分離しなかった。選択の第２または第３のラウンド後、パニングアウトプットは、第１ラウンドと比較して、１００倍超改善した。パニングアウトプットは、ｐＳｐｌｉｃｅ．Ｖ５においてｓｃＦｖ．Ｆｃに変換し、上記に記載され、かつ図１１に概説されるようにハイスループットスクリーニングにかけ、均一性時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）プロセスは、図１２においてさらに説明する。４０００を超えるコロニーから始めて、様々なエピトープに結合する様々なＭｒｋＡ特異的で、ＯＰＫポジティブな４つの抗体を同定した。これらの４つの抗体をヒトＩｇＧ１フォーマットに変換し、下記に記載されるようにさらなる特徴付けをした。それらを抗ＭｒｋＡクローン１、４、５、および６と名付ける。
【０３３４】
実施例１１：抗ＭｒｋＡクローン１、４、５、および６の特徴付け
ポジティブなＯＰＫ活性を示すそれらのｓｃＦｖ．Ｆｃクローンは、それらの見かけ上の親和性および関連する結合エピトープを評価するためにバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイに基づいてビニングした。
【０３３５】
親和性測定のために、２つの異なるフォーマットを使用した。第１に、単量体およびオリゴマーＭｒｋＡの混合物に対するＩｇＧを使用した。第２に、単量体ＭｒｋＡに対するＦａｂを使用した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４機器は、抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂの反応速度について研究するために使用した。アッセイは、すべて３０℃のＦｏｒｔｅＢｉｏ  １０×ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ中２００μｌ／ウェルで行った。０．３μｇ／ｍｌのビオチン化ＭｒｋＡを４００秒間、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＳＡ）の表面上にロードし、１．０〜１．５ｎｍのレベルに達した後、３００秒間のバイオセンサー洗浄ステップを続けた。溶液中の個々のｍＡｂ（０．２７４〜２００ｎＭ）に対するバイオセンサー上のＭｒｋＡの結合を６００秒間分析した。相互作用の解離を６００秒間調べた。リガンドをロードしたが分析物なしでインキュベートしたセンサーについて記録したシフトを差し引くことにより、いかなる規則的なベースラインドリフトも修正した。Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン８．０は、１：１相互作用モデルに利用可能な結合方程式を用いてカーブフィッティングに使用した。網羅的分析は、非線形最小二乗フィッティングを使用して行った。データについての適合度は、生成された残差プロット、Ｒ２、およびχ２値によって評価した。
【０３３６】
４つのクローン１、４、５、および６は、２９３  ｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてヒトＩｇＧ１として発現させ、精製した。それらは頑健な（ｒｏｂｕｓｔ）結合活性を維持したが、ＥＬＩＳＡフォーマットは結合に有意に影響を与えた。それらの見かけ上の親和性は、ＩｇＧフォーマットにおいてＢＬＩアプローチによって測定されるように、３〜１０ｎＭである（図１３および表７）。ウエスタンブロットデータは、クローン１のみが単量体ＭｒｋＡを検出することができたのに対して、他のいずれも検出することができなかったことを示した（図１４）。
【０３３７】
【表１０】
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【０３３８】
ＭｒｋＡは、とりわけ突然変異に対して不耐性であり、ＭｒｋＡ由来の断片のサブクローンおよび発現は、多くの場合、発現をもたらさなかった。したがって、突然変異分析は、エピトープ分析に適した方法ではない。その代わりに、ｍＡｂのエピトープの相対的な位置を研究するためのＢＬＩベースのアプローチを使用した。エピトープビニングは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４で行った。ビオチン化ＭｒｋＡをストレプトアビジンバイオセンサー上に捕捉し、６００秒間２００ｎＭの飽和濃度で試験ｍＡｂによりコーティングした。他のｍＡｂのエピトープは、等濃度の試験ｍＡｂと一緒に１００ｎＭのそれぞれの他のｍＡｂにおいて試験ｍＡｂコーティングバイオセンサーをアッセイすることにより、試験ｍＡｂに関連して調べた。グラフはすべて重ね合わせ、ベースラインでそろえた。
【０３３９】
ビニング実験では、ＩｇＧクローン１は、他のすべてとは異なるエピトープに結合するように思われるのに対して、ＩｇＧクローン４、５、６、およびＫＰ３は、様々なビニング構成によって明らかにされるように、程度は限られているが重複するエピトープに結合した（図１５）。ペプチドスキャニング実験では、抗体のいずれも、ＭｒｋＡの全長を包含する重複ペプチドアレイを認識しなかった。
【０３４０】
単量体ＭｒｋＡを４つのクローンのＦａｂフォーマットに対してＢＬＩアッセイにおいて使用した場合、クローン１および５のみが異なるレベルで結合活性を保持したのに対して、クローン４およびＫＰ３は結合を全体的に失ったことを発見したことは驚くべきことであった（表８）。
【０３４１】
【表１１】
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【０３４２】
これらのデータは、クローン４、５、および６ならびにＫＰ３がオリゴマーＭｒｋＡ上の重複エピトープに結合するのに対して、クローン１は、ＭｒｋＡの非重複エピトープおよび単量体ＭｒｋＡに結合することを実証する。
【０３４３】
実施例１２：ＯＰＫ活性はインビボにおける防御にとって重要である
インビボにおける防御におけるＯＰＫ活性の役割を理解するために、ＫＰ３  ＩｇＧを生成した。それは、そのエフェクター機能をなくすＴＭ突然変異を含有した（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６４：７００−７０４（２００８））。ＯＰＫ活性は、有意に低下し（図１６、上のパネル）、ＯＰＫ活性における低下は、インビボ予防処置防御攻撃モデルにおける低下と一致した。しかしながら、ＯＰＫ活性もインビボにおける防御も完全にはなくならなかった（図１６、下のパネル）。これらのデータは、ＯＰＫが抗ＭｒｋＡ抗体ＫＰ３の防御メカニズムにとって重要であることを示す。
【０３４４】
実施例１３：フローサイトメトリーによって例証される生きている細菌への抗体結合
クローンが肺炎桿菌「ＫＰ」に結合するかどうかを決定するために、フローサイトメトリー分析を、様々な血清型の生きている細菌に対して実行した。これらのアッセイでは、細菌を一晩、２×ＹＴブロス中で培養し、次いで、２ｅ７  ＣＦＵ／ｍＬのおよその濃度までＦＡＣＳバッファー（０．５％のウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ）中に希釈した。細菌（１ｅ６）は、穏やかに振盪させながら４℃で１時間、抗ＭｒｋＡ抗体またはネガティブコントロール抗体と共にインキュベートした。プレートをＦＡＣＳバッファーにより洗浄し、遠心分離し（３５００ｒｐｍ、５分）、その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベーションを続けた。プレートは、穏やかに振盪させながら４℃で１時間、暗中でインキュベートし、ＦＡＣＳバッファーにより２度洗浄した。試料は、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【０３４５】
４つのクローン１、４、５、および６は、すべて試験した３つの分離株を認識した。たとえ、それぞれの抗体による様々な分離株への結合パターンに明らかな差異があったとしても、抗体の中で有意差はなかった（図１７）。さらに、選択した分離株を鼻内ルートによって接種し、気管支肺胞洗浄液を感染の３時間後に収集した。これらのインビボ継代細菌に結合する抗ＭｒｋＡ抗体を次いで分析した。結果により、抗ＭｒｋＡ  ｍＡｂは、インビトロにおける培養により増殖させた細菌と同様に、インビボにおいて増殖させた細菌に結合することが確認された。要するに、抗ＭｒｋＡ抗体は、広範囲に収集されたＫＰ分離株に明確に結合した。
【０３４６】
実施例１４：ＯＰＫアッセイによる抗体特徴付け
ＯＰＫ活性を特徴付けるために、クローン１、４、５、および６を含むそれぞれのビニンググループ由来の代表的なクローンをＩｇＧ１に変換し、発現させ、精製し、前に記載されるようにＯＰＫアッセイにおいて分析した。手短かに言えば、発光性ＫＰ株（Ｌｕｘ）の対数期培養物を約２×１０６細胞／ｍｌまで希釈した。細菌、補体を提供する希釈仔ウサギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、１：１０）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、分化ＨＬ−６０細胞または新たに単離された多形核白血球（ＰＭＮ）細胞、および抗ＭｒｋＡ  ＩｇＧを９６ウェルプレート中で混合し、振盪させながら（２５０ｒｐｍ）２時間３７℃でインキュベートした。次いで、相対発光単位（ＲＬＵ）をＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレート読み取り装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。死滅のパーセンテージは、抗ＫＰ  ｍＡｂおよびネガティブコントロールｍＡｂから得られたＲＬＵと抗体なしのアッセイから得られたＲＬＵを比較することによって決定した。
【０３４７】
クローン１、４、５、および６は、スクリーニングプロセス中にｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットにおいてそれらの異なるエピトープおよびそれらのポジティブＯＰＫ活性のためにさらなる分析のために選択した。ＯＰＫ分析は、それらのＩｇＧ１対応物を用いて実行し、それらはすべて様々な血清型のＫＰに対するＫＰ３のＯＰＫ活性と同等の強力なＯＰＫ活性を示した（図１８）。したがって、抗ＭｒｋＡ抗体は、複数のＫＰ血清型に対して強力なＯＰＫ活性を有する。
【０３４８】
実施例１５：インビボ攻撃モデルにおける抗体防御効果
抗ＭｒｋＡ抗体のインビボ防御活性を評価するために、急性肺炎モデルを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１−２ｅ８  ＣＦＵの多薬剤抵抗性の分離株を鼻腔内に接種した。ＫＰ３、ヒトＩｇＧ１コントロール抗体Ｒ３４７、ならびにクローン１、４、５、および６抗体を、予防処置のために細菌攻撃の２４時間前にまたは療法のために細菌攻撃の１時間後に腹腔内（ＩＰ）ルートを介して与えた。マウスの生存は、最低５日間、８日目まで毎日モニターした。代表的な実験の生存データをＰｒｉｓｍでプロットした。
【０３４９】
それらの同等の細菌結合およびＯＰＫ活性を反映して、クローン１、４、５、および６抗体は、すべて予防処置モデルにおいて同様に強力なインビボ防御活性を示した（図１９）。１ｍｇ／ｋｇ用量で、クローン１、４、５、および６抗体のすべてが、完全に近い防御を付与した。治療モデルでは、適度の防御が、５ｍｇ／ｋｇの用量で見られた（図２０）。いずれのモデルでもそれらの活性において異なるエピトープを標的にする抗体間に有意な差異があるようには思われなかった。
【０３５０】
驚いたことに、用量応答は、必ずしもインビボ防御モデルにおいてすべての抗ＭｒｋＡ抗体について該当するとは限らず、細菌に対する抗ＭｒｋＡ抗体結合強度およびそれらのインビボ防御効果間に直接的な相関性はなかった。それにもかかわらず、抗ＭｒｋＡ抗体は、インビボにおいて防御活性を示した。
【０３５１】
実施例１６：単一抗体は抗体の組み合わせと同程度に防御する
抗菌分野における抗体の組み合わせは、いくつかの非常に有望な結果を実現した。したがって、抗ＭｒｋＡ抗体の組み合わせについて調査した。ＫＰ３をクローン１または５のいずれかと組み合わせた場合に有意な相加または相乗効果は観察されなかった（図２１）。３つまでのｍＡｂを有するより複雑な組み合わせも、いかなるさらなる有益性も示さなかった。そのため、単一抗ＭｒｋＡ抗体は、抗ＭｒｋＡ抗体の組み合わせと同程度に防御する。
【０３５２】
具体的な実施形態の前出の説明は、本開示の一般的性質を十分に完全に明らかにするものであり、従って第三者が、当技術分野の範囲内の知識を適用することにより、本開示の一般的概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなしにかかる具体的な実施形態を容易に改良しおよび／またはそれを様々な適用に適合させることができる。従って、かかる適合形態および改良形態は、本明細書に提供される教示および指針に基づけば、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書における用語法または表現法は、限定ではなく、説明を目的とするものであり、従って本明細書の用語法または表現法は当業者によって教示および指針を踏まえて解釈されるべきであることが理解されなければならない。
【０３５３】
本開示の広さおよび範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されないが、下記の請求項およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
【０３５４】
本出願において引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献が事実上、参照により組み込まれるように個々に示されるのと同じように、事実上、それらの全体が参照により組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２Ａ−２Ｄ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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