(57)【要約】  関節リウマチの治療に対する応答性を判定する方法。
2018518203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５種以上の染色体相互作用の有無を検出することを含む、対象における関節リウマチに対する特異的療法への応答性を判定する方法。
【請求項２】
前記染色体相互作用が、５個以上の異なる遺伝子座にある請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検出することが、相互作用の一部である染色体の領域が一つにまとまっているか否かを各相互作用について判定することを含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記検出することが、相互作用の一部である染色体の領域が、対象由来のサンプルにおいて架橋染色体相互作用によって一つにまとまっているか否かを各相互作用について判定すること、および一つにまとまっている両染色体領域由来の配列が架橋産物に存在するかどうかを検出することを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記染色体相互作用が、サブグループ由来の第一の核酸のセットと、染色体相互作用の指標集団に相当する第二の核酸のセットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含む、サブグループに関連する染色体相互作用を同定するアッセイ法において同定されまたは同定されており、該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物に相当し（特に、その形態にあり）、かつ該第一および第二の核酸のセットの間でのハイブリダイゼーションのパターンは、エピジェネティックな染色体相互作用が集団内のサブグループに特異的であるという判定を可能にし、該サブグループは、関節リウマチに対する特異的療法への応答性の点で異なる請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
対象がヒトである請求項１、２、３、４または５記載の方法；および／またはサブグループがヒト集団におけるサブグループである請求項５記載の方法。
【請求項７】
第一の核酸のセットが、少なくとも８個の個体由来であり；および／または第一の核酸のセットは、第一のサブグループ由来の少なくとも４個の個体、および該第一のサブグループと好ましくは重複しない第二のサブグループ由来の少なくとも４個の個体由来である請求項５または少なくとも請求項５に従属する請求項６記載の方法。
【請求項８】
第二の核酸のセットが、染色体相互作用の非選択群に相当する請求項５、少なくとも請求項５に従属する請求項６または請求項７記載の方法。
【請求項９】
第二の核酸のセットが、既定の位置でアレイに結合している請求項５、少なくとも請求項５に従属する請求項６、または請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
第二の核酸のセットは、少なくとも１００個の異なる遺伝子もしくは遺伝子座における染色体相互作用に相当する請求項５、少なくとも請求項５に従属する請求項６、または請求項７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
第二の核酸のセットは、少なくとも１０００種の異なるエピジェネティックな染色体相互作用に相当する少なくとも１０００種の異なる核酸を含む請求項５、少なくとも請求項５に従属する請求項６、または請求項７、８、９または１０記載の方法。
【請求項１２】
第一の核酸のセットおよび第二の核酸のセットは、１０〜１００ヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含む請求項５、少なくとも請求項５に従属する請求項６、または請求項７、８、９または１１記載の方法。
【請求項１３】
第一の核酸のセットは、
（i）染色体相互作用において一体となっている染色体領域をインビトロ架橋する工程；
（ii）架橋したＤＮＡを酵素による制限消化切断に供する工程；および
（iii）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、（特に、ライゲーションしたＤＮＡを含む）第一の核酸のセットを形成する工程
を含む方法において生成されるもしくは生成されている請求項５、少なくとも請求項５に従属する請求項６、または請求項７、８、９、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
−遺伝子座は遺伝子であり、および／または
−マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は遺伝子座から発現され、および／または
−ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は遺伝子座から発現され、および／または
−遺伝子座は、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基をコードする核酸配列を発現し、および／または
−遺伝子座は調節エレメントを発現する
請求項２、１０、少なくとも請求項２に従属する請求項３〜９のいずれか、または請求項２および／または請求項１０に従属する請求項１１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
５〜２０、５〜１００、５〜３００、または５〜５００、好ましくは２０〜３００、より好ましくは５０〜１００のエピジェネティックな染色体相互作用が型付けされる請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
関節リウマチに対する特異的療法は、関節リウマチの治療および／または予防においてヒトへの使用に好適な薬学的に許容され得る活性薬剤を含み、該薬学的に許容され得る活性薬剤は、
−葉酸の代謝および／または作用を阻害する、合成疾患修飾性抗リウマチ薬（ｓＤＭＡＲＤ）（好ましくは、メトトレキサートまたはペメトレキセドである）；
−スルファサラジンまたは５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ、メサラジン）、
−ピリミジン合成阻害剤（好ましくはレフルノミド、もしくはその活性代謝産物テリフルノミド）であるｓＤＭＡＲＤ、
−キノロン類の抗マラリア薬およびｓＤＭＡＲＤ（好ましくはヒドロキシクロロキン）、
−ヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤ｓＤＭＡＲＤ（好ましくはトファシチニブ）、
−または、上記に列記された２、３またはそれ以上のＤＭＡＲＤの組み合わせ；
ここで、各上記ｓＤＭＡＲＤ化合物は、独立して、遊離化合物および／またはその薬学的に許容され得る塩の形態であり；
および／または
−ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）阻害剤（好ましくは、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ・ペゴル、ゴリムマブ、またはこれらのいずれかのバイオシミラーまたはエタネルセプトもしくはそのバイオシミラー）、および／または
−Ｔ細胞共刺激阻害剤（好ましくはアバタセプト）、および／または
−インターロイキン１（ＩＬ−１）阻害剤（好ましくはアナキンラ）、および／または
−Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体（好ましくはリツキシマブまたはそのバイオシミラー）、および／または
−インターロイキン（ＩＬ−６）受容体阻害剤モノクローナル抗体（好ましくはトシリズマブまたはそのバイオ子ミラー）および／または
−関節リウマチの治療および／または予防における使用に適したグルココルチコイド薬（好ましくは、プレドニゾロンまたはデキサメタゾン）、
を含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
関節リウマチに対する特異的療法が、特に関節リウマチの治療および／または予防における使用のためのメトトレキサートまたはその薬学的に許容され得る塩を含む請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
個体（好ましくはヒト個体）における関節リウマチの治療および／または予防における使用のための関節リウマチの治療剤であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法により該薬剤を必要としていると同定されている治療剤。
【請求項１９】
関節リウマチに対する治療剤に対する個体の応答性について、個体（好ましくはヒト個体）における非応答状態を応答状態に変化させることのできる物質を同定する方法であって、候補薬剤が、染色体相互作用を、非応答状態に相当するものから応答状態に相当するものに変化させることができるか否かを決定することを含む方法。
【請求項２０】
候補物質（特に、薬学的に活性な薬剤）が、関節リウマチの治療および／または予防に適切であるかどうかを決定する方法であって、該薬物（すなわち、候補物質、特に薬学的に活性な薬剤）により生じるエピジェネティック染色体相互作用の変化を検出することを含み、該相互作用が薬物の作用機序または薬物の薬物動態特性に関係する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体相互作用および関節リウマチを検出することに関する。より特定的には、本発明は、対象における関節リウマチに対する特異的療法への応答性を判定する方法；コンパニオン診断法；個体における（特に、ヒト個体における）関節リウマチの治療および／または予防における使用のための治療用作用物質；関節リウマチに対する療法への（特に個体、例えばヒト個体の）応答性を変化させ得る作用物質、特に治療用作用物質をスクリーニングする（同定する）方法；薬物によって引き起こされるエピジェネティックな染色体相互作用の変化を検出する工程を含む、薬物（例えば、治療用作用物質）の効果を判定する方法；および／または核酸のライブラリーおよび／または核酸、に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療費は高騰しており、そのため既存の薬物をより効果的に用いて人々を治療する必要がある。一部の患者は、特定の薬学的治療に非応答である。一例は、メトトレキサート（ＭＴＸ）による関節リウマチの治療である。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の最大１％に影響を及ぼす慢性自己免疫疾患である。病因は多因性であり、そして環境因子、特に喫煙および他の肺刺激と相互作用する主たる免疫宿主遺伝子座によって特徴付けされる1,2,3。遺伝的に感受性がある個体のそのような環境因子への曝露は、疾患の発生および進行に関するエピジェネティックな背景を示唆する。クロマチンマーカー（例えば、ゲノムのメチル化状態）についての最近の調査は、ＲＡと関連があるエピジェネティックな差の最初の証拠を提供する4,5,6,7。しかしながら、今日まで、遺伝的関連性もエピジェネティックな変化も、所与の療法への応答に対する有効な予測的マーカーを提供していない。さらには、臨床提示は、メトトレキサート（ＭＴＸ）などの公知の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の効力および毒性をわずかに予測するのみである。
【０００４】
ＥＵＬＡＲおよびＡＣＲ管理指針によって推奨される最も一般的な第一選択医薬であるＭＴＸ8は、治療の６ヶ月後に５０％〜６５％に及ぶ臨床的に意義のある応答率をもたらす11。そのような応答、およびとりわけ、高いハードルの応答を呈する幾分より小さな割合は、個々の患者において現在予測され得ない。このことが、治療用レジメン選定（単一または組み合わせの治療法）への「試行錯誤」に基づく手法を生む。
【０００５】
第一線治療への応答が長期転帰の最も重要な予測因子であることを考慮すると、個々の患者におけるＭＴＸおよび／または他のＲＡ薬物への応答性を予測し得る能力は、貴重な臨床ツールであろう9,10。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、関節リウマチ（ＲＡ）に対するコンパニオン診断の基礎としてまたはそれと合わせた使用のための、特に、ＲＡ療法、特にメトトレキサートなどのＲＡの薬学的療法への応答性を判定するためのエピジェネティック状態の検出における、エピジェネティックな染色体相互作用の使用を検討した。本発明者らの仕事は、エピジェネティックな相互作用によって果たされる役割を示し、かつ関連する染色体相互作用を同定するための方法を提供する。本発明は、コンパニオン診断検査のための基礎として染色体相互作用を用いることに関する。
【０００７】
したがって、本発明の第一の局面は、５種以上（特に、７種以上、または１０種以上、または１５種以上、または２０種以上）の染色体相互作用の有無を検出する工程を含む、対象（好ましくは、ヒト対象などの哺乳類）における関節リウマチに対する特異的療法（特に、特異的薬学的療法）への応答性を判定する方法を提供し、該染色体相互作用は、好ましくは５個以上（例えば、５個）の異なる遺伝子座にある。
【０００８】
好ましくは、本発明のすべての局面において、検出する工程は、相互作用の一部である染色体の領域が一つにまとまっているか否かを各相互作用について判定する工程を含む。
【０００９】
より好ましくは、本発明のすべての局面において、検出する工程は、相互作用の一部である染色体の領域が、対象由来のサンプルにおいて架橋染色体相互作用によって一つにまとまっているか否かを各相互作用について判定する工程、および一つにまとまっている両染色体領域由来の配列が架橋産物に存在するかどうかを検出する工程を含む。
【００１０】
好ましくは、本発明のすべての局面において、染色体相互作用は、サブグループ由来の第一の核酸のセットと、染色体相互作用の指標集団に相当する第二の核酸のセットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含む、サブグループに関連する染色体相互作用を同定するアッセイ法において同定されまたは同定されており、該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物に相当し（特に、その形態にあり）、かつ該第一および第二の核酸のセットの間でのハイブリダイゼーションのパターンは、エピジェネティックな染色体相互作用が集団内のサブグループに特異的であるという判定を可能にし、該サブグループは、関節リウマチに対する特異的療法への応答性の点で異なる。
【００１１】
好ましくは、本発明のすべての局面において、「該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物に相当する」という特質は、「該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物（好ましくはライゲーションした核酸、より好ましくはライゲーションしたＤＮＡ）の形態にある」を含むまたはそれである。
【００１２】
より好ましくは、本発明のすべての局面において、
−第一の核酸のセットは、少なくとも８個の個体由来であり、および／または
−第一の核酸のセットは、第一のサブグループ由来の少なくとも４個の個体、および該第一のサブグループと好ましくは重複しない第二のサブグループ由来の少なくとも４個の個体由来であり、および／または
−第二の核酸のセットは、染色体相互作用の非選択群に相当し、および／または
−第二の核酸のセットは、既定の位置でアレイに結合しており、および／または
−第二の核酸のセットは、少なくとも１００個の異なる遺伝子もしくは遺伝子座における染色体相互作用に相当し、および／または
−第二の核酸のセットは、少なくとも１０００種の異なるエピジェネティックな染色体相互作用に相当する少なくとも１０００種の異なる核酸を含み、および／または
−第一の核酸のセットおよび第二の核酸のセットは、１０〜１００ヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含み、および／または
−第一の核酸のセットは、
（i）染色体相互作用において一体となっている染色体領域をインビトロ架橋する工程；
（ii）架橋したＤＮＡを酵素による制限消化切断に供する工程；および
（iii）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、（特に、ライゲーションしたＤＮＡを含む）第一の核酸のセットを形成する工程
を含む方法において生成されるもしくは生成されている。
【００１３】
好ましくは、本発明のすべての局面において、対象はヒトであり；および／またはサブグループはヒト集団内のサブグループである。
【００１４】
好ましくは、本発明のすべての局面において、
ａ．遺伝子座は遺伝子であり、および／または
ｂ．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は遺伝子座から発現され、および／または
ｃ．ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は遺伝子座から発現され、および／または
ｄ．遺伝子座は、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基をコードする核酸配列を発現し、および／または
ｅ．遺伝子座は調節エレメントを発現する。
【００１５】
好ましくは、本発明のすべての局面において、５種以上（特に、５〜２０、５〜１００、５〜３００、または５〜５００種）、７種以上（例えば、７〜５００または７〜１００種）、より好ましくは１０種以上または１５種以上（例えば、１０〜５００もしくは１０〜１００または１５〜５００もしくは１５〜１００種）、またはさらにより好ましくは２０種以上（例えば、２０〜５００、２０〜３００、または２０〜１００種）、なおより好ましくは５０種以上、例えば５０〜１００種のエピジェネティックな染色体相互作用が型付けされる。
【００１６】
好ましくは、本発明の第一の局面（および／またはすべての他の局面）において、関節リウマチに対する特異的療法（特に、特異的薬学的療法）、および／または治療用作用物質（特に、薬学的治療用作用物質）は、特に哺乳類における、より特定的にはヒトにおける、関節リウマチ（ＲＡ）の治療および／または予防における使用（特に、ヒト使用）に適した薬学的活性作用物質（例えば、化合物、またはタンパク質もしくは抗体などの生物的／生物学的な作用物質）、好ましくは疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を含む。
【００１７】
より好ましくは、本発明のすべての局面において、薬学的活性作用物質は、
−好ましくは、
−葉酸の代謝および／または作用を阻害するｓＤＭＡＲＤ（好ましくは、ｓＤＭＡＲＤは、哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の阻害剤、最も好ましくはメトトレキサート、またはそれほど好ましくなくはペメトレキセドである）；
−スルファサラジン、もしくはスルファサラジンの活性代謝産物である５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ、メサラジン）、
−ピリミジン合成阻害剤（特に、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤）、最も好ましくはレフルノミド、もしくはその活性代謝産物テリフルノミドであるｓＤＭＡＲＤ、
−キノリン類の抗マラリア薬およびｓＤＭＡＲＤ、最も好ましくはヒドロキシクロロキン、
−ヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤ｓＤＭＡＲＤ、好ましくはＪＡＫ−１および／またはＪＡＫ−３阻害剤ｓＤＭＡＲＤ、最も好ましくはトファシチニブ、
−または、本明細書において挙げられるｓＤＭＡＲＤのうちの２、３種、もしくはそれを上回る種類の組み合わせ（そのような組み合わせは、特に、メトトレキサート＋スルファサラジン、メトトレキサート＋レフルノミド、メトトレキサート＋ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン＋レフルノミド、メトトレキサート＋スルファサラジン＋ヒドロキシクロロキン、［スルファサラジンおよび／またはレフルノミド］＋ヒドロキシクロロキン、またはトファシチニブ＋［メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、および／またはヒドロキシクロロキン］を含み得るもしくはそれらであり得る）
を含む合成疾患修飾性抗リウマチ薬（ｓＤＭＡＲＤ）であって、上記で言及される各ｓＤＭＡＲＤ化合物は、独立して、遊離化合物および／または薬学的に許容されるその塩の形態にあり得る、合成疾患修飾性抗リウマチ薬；ならびに／あるいは
−ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）阻害剤、特に、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ・ペゴル、ゴリムマブ、もしくはこれらのいずれかのバイオシミラー（特に、ＵＳＡ（例えば、ＦＤＡ）および／またはヨーロッパ（例えば、ＥＭＥＡ）に認可されたバイオシミラー）（特に、ＣＴ−Ｐ１３など、インフリキシマブのバイオシミラー）；および／またはエタネルセプトもしくはそのバイオシミラーなどの循環受容体融合タンパク質ＴＮＦ−α阻害剤（特に、ＵＳＡ（例えば、ＦＤＡ）および／またはヨーロッパ（例えば、ＥＭＥＡ）に認可されたそのバイオシミラー）；ならびに／あるいは
−アバタセプトなどのＴ細胞共刺激阻害剤；ならびに／あるいは
−アナキンラなどのインターロイキン１（ＩＬ−１）阻害剤；ならびに／あるいは
−リツキシマブまたはそのバイオシミラー（特に、ＵＳＡ（例えば、ＦＤＡ）および／またはヨーロッパ（例えば、ＥＭＥＡ）に認可されたそのバイオシミラー）など、Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体、ならびに／あるいは
−トシリズマブまたはそのバイオシミラー（特に、ＵＳＡ（例えば、ＦＤＡ）および／またはヨーロッパ（例えば、ＥＭＥＡ）に認可されたそのバイオシミラー）など、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体阻害剤モノクローナル抗体；ならびに／あるいは
−プレドニゾン、プレドニゾロン、またはデキサメタゾンなど、関節リウマチの治療および／または予防における使用に適したグルココルチコイド薬（特に、例えば上記で挙げられた、ｓＤＭＡＲＤと組み合わせたグルココルチコイド薬）
を含む。
【００１８】
さらにより好ましくは、本発明のすべての局面において、薬学的活性作用物質は、
−好ましくは、
−葉酸の代謝および／または作用を阻害するｓＤＭＡＲＤ（好ましくは、ｓＤＭＡＲＤは、哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の阻害剤、最も好ましくはメトトレキサート、またはそれほど好ましくなくはペメトレキセドである）；
−スルファサラジン、もしくはスルファサラジンの活性代謝産物である５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ、メサラジン）、
−ピリミジン合成阻害剤（特に、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤）、最も好ましくはレフルノミド、もしくはその活性代謝産物テリフルノミドであるｓＤＭＡＲＤ、
−キノリン類の抗マラリア薬およびｓＤＭＡＲＤ、最も好ましくはヒドロキシクロロキン、
−ヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤ｓＤＭＡＲＤ、好ましくはＪＡＫ−１および／またはＪＡＫ−３阻害剤ｓＤＭＡＲＤ、最も好ましくはトファシチニブ、
−または、本明細書において挙げられるｓＤＭＡＲＤのうちの２、３種、もしくはそれを上回る種類の組み合わせ（そのような組み合わせは、特に、メトトレキサート＋スルファサラジン、メトトレキサート＋レフルノミド、メトトレキサート＋ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン＋レフルノミド、メトトレキサート＋スルファサラジン＋ヒドロキシクロロキン、［スルファサラジンおよび／またはレフルノミド］＋ヒドロキシクロロキン、またはトファシチニブ＋［メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、および／またはヒドロキシクロロキン］を含み得るもしくはそれらであり得る）
を含む合成疾患修飾性抗リウマチ薬（ｓＤＭＡＲＤ）であって、上記で言及される各ｓＤＭＡＲＤ化合物は、独立して、遊離化合物および／または薬学的に許容されるその塩の形態にあり得る、合成疾患修飾性抗リウマチ薬
を含む。
【００１９】
最も好ましくは、本発明のすべての局面において、薬学的活性作用物質は、
−葉酸の代謝および／または作用を阻害する合成疾患修飾性抗リウマチ薬（ｓＤＭＡＲＤ）（好ましくは、ｓＤＭＡＲＤは、哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の阻害剤、最も好ましくはメトトレキサート、またはそれほど好ましくなくはペメトレキセドである）；
−または、以下のｓＤＭＡＲＤ：スルファサラジン、レフルノミド、ヒドロキシクロロキン、および／またはトファシチニブのうちの１つもしくは複数との、メトトレキサートもしくはペメトレキセド（好ましくは、メトトレキサート）の組み合わせ
を含み、上記で言及される各ｓＤＭＡＲＤ化合物は、独立して、遊離化合物および／または薬学的に許容されるその塩の形態にあり得る。
【００２０】
最も好ましくは、本発明のすべての局面において、関節リウマチに対する特異的療法は、特に関節リウマチの治療および／または予防における使用のための、メトトレキサートまたは薬学的に許容されるその塩を含む。
【００２１】
本発明の第二の局面は、本発明の第一の局面に従った方法によって作用物質を必要としていると同定されている個体における（好ましくは、ヒト個体における）関節リウマチの治療および／または予防における使用のための、関節リウマチに対して治療的である作用物質（特に薬学的活性作用物質、好ましくはメトトレキサートまたは薬学的に許容されるその塩）を提供する。本発明の第二の局面は、本発明の第一の局面に従った方法によって作用物質を必要としていると同定されている個体における（好ましくは、ヒト個体における）関節リウマチの治療および／または予防における使用のための医薬（例えば、薬学的活性作用物質を含む薬学的組成物）の製造における、関節リウマチに対して治療的である作用物質（特に薬学的活性作用物質、好ましくはメトトレキサートまたは薬学的に許容されるその塩）の使用も提供する。本発明の第二の局面は、関節リウマチに対して治療的である作用物質（特に薬学的活性作用物質、好ましくはメトトレキサートまたは薬学的に許容されるその塩）を個体に投与する工程を含む、個体における（好ましくは、ヒト個体における）関節リウマチの治療および／または予防の方法も提供し、該個体は、本発明の第一の局面に従った方法によって該作用物質を必要としていると同定されている。
【００２２】
本発明の第三の局面は、候補作用物質が、染色体相互作用を非応答状態に当たるものから応答状態に当たるものに変化させ得るか否かを判定する工程を含む、関節リウマチに対する治療用作用物質への個体の応答性に関して、個体における（好ましくは、ヒト個体における）非応答状態を応答状態に変化させ得る物質を同定する方法を提供する。
【００２３】
本発明の第四の局面は、薬物（すなわち候補物質、特に薬学的活性作用物質）によって引き起こされるエピジェネティックな染色体相互作用の変化を検出する工程を含む、候補物質（特に、薬学的活性作用物質）が関節リウマチの治療および／または予防に適しているかどうかを判定する方法を提供し、該相互作用は薬物の作用のメカニズムまたは薬物の薬力学的特性に関する。
【００２４】
本発明の第五の局面は、アレイに任意で結合している、本明細書において規定される、少なくとも２００種の異なる第二の核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）を含む、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）のライブラリーを提供する。
【００２５】
好ましくは、本発明の第五の局面において、ライブラリーは、そのそれぞれが、
（i）表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる核酸（例えば、ＤＮＡ）配列；ならびに
（ii）表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる１つまたは複数の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）配列
からなる群より選択される核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を含む（例えば、そのそれぞれが本質的にそれらからなる、例えばそれらからなる）、５種以上、７種以上、１０種以上、１５種以上、２０種以上、２５種以上、３０種以上、または４０種以上、または５０種以上の核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）を含む。
【００２６】
本発明の第六の局面は、そのそれぞれが、
（i）表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる核酸（例えば、ＤＮＡ）配列；ならびに
（ii）表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる１つまたは複数の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）配列
からなる群より選択される核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を含む（例えば、そのそれぞれが本質的にそれらからなる、例えばそれらからなる）、５種以上、７種以上、１０種以上、１５種以上、２０種以上、２５種以上、３０種以上、または４０種以上、または５０種以上、または７０種以上の核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）を含む、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）のライブラリーを提供する。
【００２７】
本発明の第七の局面は、
（i）表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる核酸（例えば、ＤＮＡ）配列；ならびに
（ii）表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる１つまたは複数の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）配列
からなる群より選択される核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を含む（例えば、本質的にそれらからなる、例えばそれらからなる）核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）を提供する。
【００２８】
本発明は、表７ａおよび／または表８ａおよび／または表９（好ましくは表７ａおよび／または表８ａ、最も好ましくは表７ａ）で挙げられる核酸（例えば、ＤＮＡ）配列より選択される核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を含む（例えば、本質的にそれらからなる、例えばそれらからなる）核酸（例えば、ＤＮＡおよび／または単離した核酸）も提供する。
【００２９】
明確性のために、配列同一性は、２つの配列間で正確に合致するヌクレオチド文字の量であり、そしてこれらの値は、典型的に、ＢＬＡＳＴおよび／またはＢＬＡＴなどの一般的アルゴリズムによって概算される。より多くの情報に関しては、下記で「ホモログ」にて参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関するパイ図表である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。パイ図表は、ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者の両方に関するＣＤＡＩスコアの臨床的解釈を示している。
【図１Ｂ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関するグラフである。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者のＣＤＡＩスコア。
【図１Ｃ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。ＲおよびＮＲ、ならびに健常対照（ＨＣ）から診断時に採取された末梢血単核細胞のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ解析は、９２２種の統計的に有意な層別化マーカー候補を同定した。さらなる解析により、４２０種はＮＲに、２１０種はＲに、そして１５９種はＨＣに特異的であることが明らかになった。パイ図表は、スクリーニングされた１３，３２２種の条件付き染色体コンフォメーションに関する割合を示している。すべてのマーカーは、調整されたｐ＜０．２を示した。
【図１Ｄ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。完全連結凝集によるマンハッタン距離測定を用いた階層的クラスタリングが、ヒートマップによって示されている。３つの群（Ｒ、ＮＲ、およびＨＣ）にわたる二元パターン形成（pattering）を用いたマーカー選択により、初めに９２２種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーは６５種に、次いで上位３０種のマーカーに縮小された。
【図２Ａ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関するパイ図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。パイ図表は、ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者の両方に関するＣＤＡＩスコアの臨床的解釈を示している。
【図２Ｂ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関するグラフである。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者のＣＤＡＩスコア。****Ｐ＜０．０００１、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較事後検定とのクラスカル・ウォリス検定による。
【図２Ｃ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。５種の分類化ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの相関プロット。赤色のボックスは、ＮＲを規定するマーカーを示し、一方でオレンジ色のボックスは、Ｒを規定するマーカーを示した。
【図２Ｄ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。５種の分類化ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関するそれらの二元スコアに基づく、６０人の患者コホートに対する主成分分析（ＰＣＡ）。
【図３Ａ】メトトレキサート（ＭＴＸ）治療への応答に関する予後層別化およびモデル検証に関するグラフである。５種のＣＣＳマーカーロジスティック回帰分類子を用いたデータの１５０回の無作為化からの、５種の選択された受信者動作特徴（ＲＯＣ）曲線の代表的な例。
【図３Ｂ】メトトレキサート（ＭＴＸ）治療への応答に関する予後層別化およびモデル検証に関するグラフである。ＭＴＸ応答者とＭＴＸ非応答者とを判別するために選択されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーを用いた、応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者対健常対照（ＨＣ）に関する因子分析。
【図４】３Ｃ抽出過程の概略図である。３Ｃとは、クロマチン立体構造キャプチャーまたは染色体コンフォメーションキャプチャーを意味する。
【図５】ＭＴＸ治療の６ヶ月以内に応答者（Ｎ）または非応答者（ＮＲ）として確認された、ＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者に関するエピジェネティックな層別化バイオマーカーシグネチャーの発見および検証のための設計を図解したスキームである。エピジェネティックな層別化は、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイおよびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プラットフォームによってスクリーニングされかつモニターされた条件付き染色体コンフォメーションに基づいた。同定されたバイオマーカーの疾患特異的なエピジェネティックな性質は、健常対照（ＨＣ）に対する層別化によって確認された。検証は、６０人のＲＡ患者（３０人の応答者および３０人の非応答者）および３０人のＨＣに対して実施された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、いくつかの異なる局面：
−対象における関節リウマチに対する特異的療法への応答性を判定する方法；
−コンパニオン診断法；
−個体の治療および／または予防における（具体的には、個体における、特にヒト個体における、関節リウマチの治療および／または予防における）使用のための治療用作用物質であって、該個体は、特に本発明の応答性を判定する方法および／またはコンパニオン診断法によって治療用作用物質を必要としていると同定されている、治療用作用物質；
−関節リウマチに対する療法への（特に個体、例えばヒト個体の）応答性を変化させ得る作用物質、特に治療用作用物質をスクリーニングする（同定する）方法；
−薬物によって引き起こされるエピジェネティックな染色体相互作用の変化を検出する工程を含む、薬物（例えば、治療用作用物質）の効果を判定する方法
を有する。
【００３２】
エピジェネティックな相互作用
本明細書において使用するとき、「エピジェネティックな」相互作用という用語は、典型的に、染色体上の遺伝子座の遠位領域間での相互作用を指し、該相互作用は、染色体の領域の状態に応じて動的であり、かつ変容し、形成され、または壊れる。
【００３３】
本発明の特定の方法において、染色体相互作用は、染色体相互作用の一部である染色体の両領域由来の配列を含むライゲーションした核酸をまず生成することによって検出される。そのような方法において、領域は、任意の適切な手段によって架橋され得る。好ましい態様において、相互作用は、ホルムアルデヒドを用いて架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルもしくはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによっても架橋され得る。パラホルムアルデヒドは、４オングストローム離れているＤＮＡ鎖を架橋し得る。
【００３４】
染色体相互作用は、染色体の領域の状態、例えばそれが生理学的条件の変化に応答して転写されているまたは抑制されているかどうかを反映し得る。本明細書において規定されるサブグループに特異的である染色体相互作用は、安定であることが見出されており、ゆえに２つのサブグループ間での差を測定する確実な手段を提供する。
【００３５】
加えて、疾患状況に特異的な染色体相互作用は、通常、例えばメチル化またはヒストンタンパク質の結合への変化などの他のエピジェネティックマーカーと比較して、疾患過程における早期に生じると考えられる。ゆえに、本発明のコンパニオン診断法は、疾患状態の早期ステージを検出することができる。このことは、結果としてより効果的であり得る早期治療を可能にする。本発明の別の利点は、関連する染色体相互作用の同定にどの遺伝子座が関連するかについての事前知識を必要としないことである。さらに、同じサブグループ内の個体間で、関連する染色体相互作用にほとんど変動がない。染色体相互作用を検出することは、１遺伝子あたり最大５０種の考え得る異なる相互作用を有して非常に有益であり、そのため本発明の方法は、５００，０００種の異なる相互作用を詮索し得る。
【００３６】
エピジェネティックな相互作用の位置および原因
エピジェネティックな染色体相互作用は、関連するまたは記載されていない遺伝子をコードすることが示された染色体の領域と重複し得かつ含み得るが、同様に遺伝子間領域にあり得る。さらに留意すべきは、本発明者らは、すべての領域におけるエピジェネティックな相互作用が、染色体座の状態を判定することにおいて同様に重要であることを発見したことである。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域にあるわけではなく、遺伝子間領域にあり得る。
【００３７】
本発明において検出される染色体相互作用は、基礎となるＤＮＡ配列への変化によって、環境因子、ＤＮＡメチル化、ノンコーディングアンチセンスＲＮＡ転写産物、非変異原性発癌物質、ヒストン修飾、クロマチン再構成、および特異的な局所ＤＮＡ相互作用によって引き起こされ得る。染色体相互作用につながる変化は、それ自体は遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響を及ぼさない、基礎となる核酸配列への変化によって引き起こされ得る。そのような変化は、例えば遺伝子の内部および／または外側のＳＮＰ、遺伝子融合、および／または遺伝子間ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびノンコーディングＲＮＡの欠失であり得る。例えば、大体２０％のＳＮＰがノンコーディング領域にあることが知られており、それゆえ記載される方法は、ノンコーディング場面においても有益である。一態様において、一体となって相互作用を形成する染色体の領域は、５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対、または２００塩基対未満離れている。
【００３８】
コンパニオン診断法において検出される染色体相互作用は、好ましくは本明細書において表中で言及される遺伝子のいずれかの内部にあるものである。しかしながら、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子からまたはコード配列から最大５０，０００、３０，０００、２０，０００、１０，０００、または５０００塩基上流または下流にもあり得る。
【００３９】
検出される染色体相互作用は、遺伝子（コード配列を含む）と、プロモーターなどのその調節領域との間で生じるものであってもなくてもよい。検出される染色体相互作用は、遺伝性であるもの、例えば遺伝子領域の遺伝性の刷り込まれた特徴であってもなくてもよい。個体は、雄または雌であり得る。個体は、３０歳またはそれよりも高齢であり得る。個体は、２９歳またはそれよりも若齢であり得る。
【００４０】
臨床場面のタイプ
ＲＡ（関節リウマチ）を治療するメトトレキサート（ＭＴＸ）の使用についての具体的症例は、一般原理を解説する。現在、患者が最初に薬物を与えられた際に患者がＭＴＸに応答するかどうかを臨床医が判定するために先験的に用い得る検査はない。相当数（約３０％）の患者はＭＴＸに応答しないため、患者が応答者または非応答者であるかどうかを予測し得ることは、ＲＡの治療に成功する、ならびに時間および金銭を節約する機会を増加させるであろう。
【００４１】
本発明は、関節リウマチに関係する特異的表現型に対するバイオマーカーに基づく、すなわち特定の染色体コンフォメーション（confirmation）シグネチャーおよび／またはその特定のシグネチャーの変化を認識することによって、層別化を可能にする。
【００４２】
方法は、関節リウマチの存在の診断に用いられても用いられなくてもよい。本発明の方法を用いて、疾患のメカニズムが不明である、不明確である、または複雑である遺伝子座を型付けし得る。染色体相互作用の検出は、その一部が複雑である、種々のレベルの調節における変化に従う効率的なやり方を提供する。例えば、ある場合には、３７，０００個前後のノンコーディングＲＮＡは、単一の誘発因子によって活性化され得る。
【００４３】
サブグループおよび個別化治療
本明細書において使用するとき、「サブグループ」とは、好ましくは、集団サブグループ（集団内のサブグループ）、より好ましくは特定の哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスもしくはラット）または特定の線虫（例えば、シー・エレガンス（C. elegans））などの特定の動物の集団内のサブグループを指す。最も好ましくは、「サブグループ」とは、ヒト集団内のサブグループを指す。
【００４４】
関心対象の特定の集団、例えばヒト集団には、ヒト集団全体、ヒトＲＡ集団（すなわち、ＲＡに罹患しているヒト）、ヒト健常集団（健常対照）、ＲＡに罹患していないという意味で健常であるヒト集団、特定の薬物／療法に応答者であるヒト（健常および／またはＲＡ）集団、または特定の薬物／療法に非応答者であるヒト（健常および／またはＲＡ）集団が含まれる。
【００４５】
本発明は、集団における、好ましくはヒト集団における特定のサブグループを検出することおよび治療することに関する。そのようなサブグループの中には、本明細書において論じられる特徴（治療および／または予防への応答性；特に、特異的な、例えば薬学的な治療および／または予防への、例えば治療的活性物質／治療用作用物質、例えば薬学的治療用作用物質）への応答性など）が存在するまたは存在しないと考えられる。染色体上のエピジェネティックな相互作用の差は、一般的に言えば、ゲノムレベルで存在する構造差である。本発明者らは、これらが、所与の集団における部分集合（例えば２つの、または２つ以上の部分集合）の間で異なることを発見した。これらの差を同定することにより、医師は、方法において記載される集団の１つの部分集合の一部としてそれらの患者を類別することが可能となる。それゆえ、本発明は、患者に対する医療を彼らのエピジェネティックな染色体相互作用に基づいて個別化する方法を医師に提供し、かつ代替的なより効果的な治療および／または予防レジームを提供する。
【００４６】
別の態様において、どの程度対象が集団（例えばヒト集団、例えばヒトＲＡ集団）の一方のサブグループに属しかつ他方のサブグループに属しないものとして規定されるかを判定するための閾値レベルが適用される。サブグループが特定の疾患（例えばまたはすなわち、ＲＡ）の治療のための療法の応答者対非応答者を含む１つの好ましい態様において、閾値は、ＤＡＳ２８スコア（２８関節の疾患活動性スコア）の変化によって測定され得る。一態様において、１．２単位を上回るスコアは、対象が応答者サブグループに入ることを示し、一方で１．２単位を下回るスコアは、対象が非応答者として規定されることを示す。
【００４７】
典型的に、サブグループは、一般集団の少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である。
【００４８】
ライゲーションした核酸を生成する
本発明のある特定の態様は、ライゲーションした核酸、特にライゲーションしたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用において一体となる領域の両方由来の配列を含み、それゆえ、相互作用についての情報を提供する。本明細書において記載されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、そのようなライゲーションした核酸の生成を用いて、染色体相互作用を検出する。
【００４９】
１つのそのような方法、特に、染色体相互作用を検出する１つの特定の方法、および／またはエピジェネティックな染色体相互作用を判定する１つの特定の方法、および／またはライゲーションした核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成する１つの特定の方法は、
（i）染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用をインビトロ架橋する工程；
（ii）任意で、架橋したＤＮＡを染色体座から単離する工程；
（iii）架橋したＤＮＡを、少なくとも１回それを切る酵素（特に、該染色体座内で少なくとも１回切る酵素）による制限消化に供する工程；
（iv）（特に、ＤＮＡループを形成するために、）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションする工程；ならびに
（v）特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの技法を用いて、ライゲーションしたＤＮＡおよび／またはＤＮＡループの存在を同定して、特異的な染色体相互作用の存在を同定する工程
を含む。
【００５０】
架橋、制限消化、ライゲーション、および同定についてのとりわけ上記の工程を伴う、染色体相互作用および／またはエピジェネティックな変化を検出する、判定する、および／またはモニターする１つの特に好ましい方法が、国際公開第２００９／１４７３８６号（オックスフォード  バイオダイナミックス社）に開示されており、その全開示（特に、その請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１）は、あたかも完全に明記されているかのように参照により本明細書に組み入れられる。ライゲーションした産物および／またはライゲーションした核酸を伴う本発明のそうした方法において用いられ得るＷＯ  ２００９／１４７３８６  Ａ１の請求項１は、少なくとも１つの染色体座における条件付きの長距離染色体相互作用の変化をモニターする工程を含む、エピジェネティックな変化をモニターする方法であって、長距離相互作用のスペクトルは特異的な生理学的条件と関連がある方法を開示し、該方法は、
（i）少なくとも１つの染色体座に存在する長距離染色体相互作用をインビトロ架橋する工程；
（ii）架橋したＤＮＡを染色体座から単離する工程；
（iii）架橋したＤＮＡを、少なくとも１つの染色体座内で少なくとも１回切る酵素による制限消化に供する工程；
（iv）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ＤＮＡループを形成する工程；および
（v）ＤＮＡループの存在を同定する工程
を含み、ＤＮＡループの存在は特異的な長距離染色体相互作用の存在を示す。
【００５１】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ライゲーションした核酸を検出するまたは同定するために用いられ得、例えば産生されたＰＣＲ産物のサイズは、存在する特異的染色体相互作用を示し得、それゆえ遺伝子座の状態を同定するために用いられ得る。当業者であれば、関心対象の染色体座内でＤＮＡを切るために用いられ得る無数の制限酵素を承知しているであろう。用いられる特定の酵素が、調査される遺伝子座およびそこに位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明において記載されるＤＮＡを切るために用いられ得る制限酵素の非限定的な例は、ＴａｋａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼである。
【００５２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術などの態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャーの検出における、マイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関係する。本発明者らは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームが、健常対照に対して特定の不利な表現型サブグループに特異的な潜在的バイオマーカーの染色体シグネチャープールの発見にどのように用いられているかを本明細書において記載する。本発明者らは、アレイで検査されたコホート由来のサブグループの間での特異的ないくつかのマーカーの例を用いて、マイクロアレイからの染色体コンフォメーションシグネチャーの有効な使用およびＰＣＲプラットフォームへの転換の例も提供する。
【００５３】
（関連する染色体相互作用を同定するための、およびコンパニオン診断法における）本明細書において記載される様式で、ライゲーションした核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの態様は、いくつかの利点を有する。例えば本発明の第一の核酸のセット由来の核酸配列は、第二の核酸のセットとハイブリダイズするまたはハイブリダイズしないため、それらは低レベルの確率的ノイズを有する。これは、エピジェネティックなレベルにおける複雑なメカニズムを測定する比較的簡潔なやり方を可能にする二元結果を提供する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、迅速な処理時間および低コストも有する。一態様において、処理時間は３時間〜６時間である。
【００５４】
サンプルおよびサンプル処置
サンプルは、個体由来のＤＮＡを含有すると考えられる。それは、通常細胞を含有すると考えられる。一態様において、サンプルは、最小限に侵襲的な手段によって獲得され、例えば血液であり得る。ＤＮＡは抽出され得、かつ標準的な制限酵素で細かく切られ得る。これは、どの染色体コンフォメーションが保持されかつＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかをあらかじめ判定し得る。サンプルが患者から以前に獲得された血液サンプルである一態様において、記載される方法は、手順が最小限に侵襲的であるため有利である。水平移動を含めた、組織と血液との間での染色体相互作用の同時性により、血液サンプルを用いて、疾患に関連した組織などの組織における染色体相互作用を検出し得る。癌などのある特定の病状に関しては、変異による遺伝子ノイズが、関連組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼし得、それゆえ血液を用いることが有利である。
【００５５】
本発明の核酸の特性
本明細書における開示は、第一および第二の核酸に言及する。加えて、該核酸をコンパニオン診断法においておよび他の態様において用いて、染色体相互作用の有無を検出する（例えば、サンプルから生成されたライゲーションした核酸に結合させることによって）。本発明の核酸は、典型的に、染色体相互作用において一体となる染色体の２つの領域の一方由来の配列をそれぞれが含む２つの部分を含む。典型的に、それぞれの部分は、長さが少なくとも８、１０、１５、２０、３０、または４０ヌクレオチドである。好ましい核酸は、特に核酸がその表に関連した病状に関連した態様において用いられる場合、表中で言及される遺伝子のいずれか由来の配列を含む。好ましい核酸は、特異的な病状、またはそのような配列のフラグメントもしくはホモログに対して、表中で言及される特異的プローブ配列を含む。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の態様において必要に応じて相補体を用い得ると理解される。
【００５６】
第二の核酸のセット−「指標」配列
第二の核酸配列のセットは、指標であるという機能を有し、かつ本質的に、サブグループ特異的配列を同定するのに適している核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用に相当し得、かつ何らかのやり方で選択され得るまたは選択され得ない。それらは、すべての考え得る染色体相互作用の部分集合である。
【００５７】
第二の核酸のセットは、任意の適切な方法によって導き出され得る。それらは、コンピューターにより導き出され得る、またはそれらは、個体における染色体相互作用に基づき得る。それらは、典型的に、第一の核酸のセットよりも大きな集団群に相当する。一態様において、第二の核酸のセットは、遺伝子の特異的セットにおけるすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用に相当する。別の態様において、第二の核酸のセットは、本明細書において記載される集団に存在するすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用の大部分に相当する。一態様において、第二の核酸のセットは、少なくとも２０、５０、１００、または５００種の遺伝子におけるエピジェネティックな染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％に相当する。
【００５８】
第二の核酸のセットは、典型的に、集団における疾患状態／表現型を改変する、調節する、または何らかのやり方で仲介する少なくとも１００種の考え得るエピジェネティックな染色体相互作用に相当する。第二の核酸のセットは、例えば任意の疾患状態、疾患または疾患表現型になりやすい傾向と関連があるサイトカイン、キナーゼ、または調節因子をコードする核酸配列を含む、種における疾患状態に影響を及ぼす染色体相互作用に相当し得る。第二の核酸のセットは、コンパニオン診断法に関連したおよび関連しないエピジェネティックな相互作用に相当する配列を含む。
【００５９】
一態様において、第二の核酸のセットは、集団における天然に生じる配列に少なくとも部分的に由来し、かつ典型的にインシリコ法によって獲得される。該核酸は、天然に生じる核酸に存在する核酸の対応する部分と比較して、単一または複数の変異をさらに含み得る。変異には、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の欠失、置換、および／または付加が含まれる。一態様において、第二の核酸のセットは、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルソログに相当する配列を含み得る。別の態様において、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００６０】
第二の核酸のセットの特性
一態様において、第二の核酸のセットには、少なくとも１００種の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００、または５０００種の異なる核酸配列、最大で１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００種の異なる核酸配列が存在する。典型的な数は、１，０００〜１００，０００種の異なる核酸配列など、１００〜１，０００，０００種であると考えられる。これらのすべてまたは少なくとも９０％もしくは少なくとも５０％は、異なる染色体相互作用に当たると考えられる。
【００６１】
一態様において、第二の核酸のセットは、１００〜１０，０００種の異なる遺伝子座または遺伝子など、少なくとも２０種の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、好ましくは少なくとも４０種の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、およびより好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００種の異なる遺伝子座もしくは遺伝子における染色体相互作用に相当する。
【００６２】
第二の核酸のセットの長さは、それらが、ワトソン・クリック塩基対合に従って第一の核酸のセットに特異的にハイブリダイズして、サブグループに特異的な染色体相互作用の同定を可能にするのに適している。典型的に、第二の核酸のセットは、染色体相互作用において一体となる２つの染色体領域に配列が対応する２つの部分を含むと考えられる。第二の核酸のセットは、典型的に、長さが少なくとも１０、好ましくは２０、およびさらに好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）である核酸配列を含む。別の態様において、核酸配列は、長さが多くても５００、好ましくは多くても１００、およびさらに好ましくは多くても５０塩基対であり得る。好ましい態様において、第二の核酸のセットは、１７〜２５塩基対の核酸配列を含む。一態様において、第二の核酸配列のセットの少なくとも１００、８０％、または５０％は、上記で記載される長さを有する。好ましくは、異なる核酸は、いかなる重複する配列も有せず、例えば該核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％、または５０％は、少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって同じ配列を有しない。
【００６３】
第二の核酸のセットが「指標」として作用することを考慮すると、第二の核酸の同じセットは、種々の特徴に対するサブグループに相当する第一の核酸の種々のセットとともに用いられ得る、すなわち第二の核酸のセットは、種々の疾患特徴に関連する染色体相互作用を同定するために用いられ得る核酸の「普遍的な」コレクションに相当し得る。
【００６４】
第一の核酸のセット
第一の核酸のセットは、通常、本明細書において言及される任意のそのような特徴など、コンパニオン診断に関連した特徴の有無によって規定される２つ以上の個別のサブグループにあることが知られる個体由来である。第一の核酸は、本明細書において言及される第二の核酸のセットの特徴および特性のいずれかを有し得る。第一の核酸のセットは、通常、本明細書において記載される処置および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けている個体由来のサンプルに由来する。典型的に、第一の核酸のセットは、個体から採取されたサンプルに存在する染色体相互作用のすべてまたは少なくとも８０％もしくは５０％に相当する。
【００６５】
典型的に、第一の核酸のセットは、第二の核酸のセットによって表される染色体相互作用と比較して、第二の核酸のセットによって表される遺伝子座または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さな集団に相当する、すなわち第二の核酸のセットは、遺伝子座または遺伝子の規定のセットにおける相互作用のバックグラウンドまたは指標セットに相当している。
【００６６】
核酸のライブラリー
本発明は、第二の核酸のセット由来の少なくとも２００、５００、１０００、５０００、または少なくとも１０，０００種の異なる核酸を含む、核酸のライブラリーを提供する。本発明は、典型的に少なくとも２００種の異なる核酸を含む、核酸の特定のライブラリーを提供する。核酸のライブラリーは、本明細書において言及される第二の核酸のセットの特徴または特性のいずれかを有し得る。ライブラリーは、アレイに結合している核酸の形態にあり得る。
【００６７】
ハイブリダイゼーション
本発明は、第一の核酸のセットおよび第二の核酸のセット由来の全体的にまたは部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズするのを可能にするための手段を要する。一態様において、第一の核酸のセットのすべてと第二の核酸のセットのすべてとを単一アッセイで、すなわち単一ハイブリダイゼーション工程で接触させる。しかしながら、任意の適切なアッセイが用いられ得る。
【００６８】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書において言及される核酸は、好ましくは成功するハイブリダイゼーションの検出を支援するフルオロフォア（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を用いて標識され得る。ある特定の標識は、ＵＶ光の下で検出され得る。
【００６９】
例えば本明細書において記載されるアレイ上での、ハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループ間でのエピジェネティックな染色体相互作用の差に相当し、ゆえにエピジェネティックな染色体相互作用を比較する方法、およびエピジェネティックな染色体相互作用が本発明の集団内のサブグループに特異的であるという判定を提供する。
【００７０】
「ハイブリダイゼーションのパターン」という用語は、第一および第二の核酸のセットの間でのハイブリダイゼーションの有無、すなわち第一のセット由来のどの特異的核酸が、第二のセット由来のどの特異的核酸にハイブリダイズするかを広く網羅し、そのためそれは、いかなる特定のアッセイもしくは技法にも、またはそこで「パターン」が検出され得る表面もしくはアレイを有する必要性に限定されない。
【００７１】
コンパニオン診断法
本発明は、染色体相互作用によって提供される情報に基づくコンパニオン診断法を提供する。個体が、コンパニオン診断に関連した特定の特徴を有するかどうかを同定する、２つの個別のコンパニオン診断法が提供される。一方の方法は、任意の適切なやり方で遺伝子座を型付けすることに基づき、そして他方は、染色体相互作用の有無を検出することに基づく。特徴は、病状に関係する本明細書において言及される特徴のいずれか１つであり得る。コンパニオン診断法は、１つを上回る数の時点において行われ得、例えば個体のモニタリングが要される。
【００７２】
遺伝子座を型付けすることに基づくコンパニオン診断法
サブグループに特異的である染色体相互作用を同定した本発明の方法を用いて、コンパニオン診断検査の基礎として型付けされ得る遺伝子であり得る遺伝子座を同定し得る。多くの異なる遺伝子関連効果は、生じている同じ染色体相互作用につながり得る。この態様において、遺伝子座におけるまたは発現した核酸もしくはタンパク質における多型の存在、遺伝子座からの発現のレベル、遺伝子座の物理的構造、あるいは遺伝子座に存在する染色体相互作用など、遺伝子座の任意の特徴が型付けされ得る。１つの特定の態様において、遺伝子座は、本明細書において表中で、特に表１、３、５、７、８、および／または９（特に、表１、３、および／または５）で言及される遺伝子のいずれか、または関連する病状に結び付くことが見出された染色体相互作用の近くにある遺伝子座の任意の特性であり得る。
【００７３】
染色体相互作用を検出することに基づくコンパニオン診断法
本発明は、染色体相互作用、典型的には５〜２０または５〜５００種のそのような相互作用、好ましくは２０〜３００または５０〜１００種の相互作用の有無を検出して、個体における特徴の有無を判定する工程を含むコンパニオン診断法を提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。１つの特定の態様において、例えば方法が、それらの表において規定される特徴の有無を判定する目的のためのものである場合、型付けされる染色体相互作用は、本明細書において表中で、特に表７ａ、８ａ、および／または９で開示される核酸によって表されるものである。
【００７４】
特異的な病状
コンパニオン診断法を用いて、本明細書において言及される特異的な病状または特徴のいずれかの存在を検出し得る。コンパニオン診断法を用いて、関節リウマチ患者におけるメトトレキサートへの応答性を検出し得る。
【００７５】
好ましくは、表中で言及される関連遺伝子のいずれかの内部にある染色体相互作用のいずれかの有無が検出される。例えば、表のいずれか１つで言及される遺伝子の少なくとも１、３、１０、２０、５０種において。好ましくは、表中のプローブ配列によって表される染色体相互作用の有無が、方法において判定される。例えば、表のいずれか１つからの関連する染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、１０、２０、５０、または１００種。遺伝子または染色体相互作用についてのこれらの数は、本明細書において言及される種々の態様のいずれにおいても用いられ得る。
【００７６】
コンパニオン診断法を用いて検査された個体
検査される対象となる個体は、本明細書において言及される任意の疾患状況の任意の症状、または特徴を有しても有しなくてもよい。個体は、任意のそのような病状または特徴の危険性があり得る。個体は、病状または特徴から回復している可能性があるまたは回復する過程にあり得る。個体は、好ましくは霊長類、ヒト、または齧歯類などの哺乳類である。
【００７７】
スクリーニング法
候補作用物質が、染色体相互作用を非応答状態に当たるものから応答状態に当たるものに変化させ得るかどうかを判定する工程を含む、関節リウマチに対する治療用作用物質に対して個体における非応答状態を応答状態に変化させ得る物質を同定する方法。
【００７８】
１つの特定の態様において、方法は、候補作用物質が、本明細書において言及される任意の染色体相互作用を変化させ得るかどうかを判定する。
【００７９】
方法は、インビトロで（細胞の内側または外側で）またはインビボで（非ヒト生命体で）行われ得る。１つの特定の態様において、方法は、関連する染色体相互作用を含むものなど、細胞、細胞培養物、細胞抽出物、組織、器官、または生命体で行われる。方法は、典型的に、候補作用物質と遺伝子、細胞、細胞培養物、細胞抽出物、組織、器官、または生命体とを接触させる（または投与する）ことによって行われる。
【００８０】
上記のスクリーニング法で検査される適切な候補物質には、抗体作用物質（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲ移植された抗体）が含まれる。さらに、ディスプレイライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）など、組み合わせライブラリー、規定の化学的同一性、ペプチドおよびペプチド模倣体、オリゴヌクレオチド、ならびに天然作用物質ライブラリーも検査され得る。候補物質は、本明細書において言及される作用物質の特性のいずれかを有し得る小分子を中心とした合成に由来する化学的化合物であり得る。
【００８１】
好ましい遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用
本発明のすべての局面に関して、好ましい遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が表中で言及される。本発明のすべての局面に関して、好ましい遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が表中で提供される。典型的に、方法の染色体相互作用は、表中で挙げられる関連遺伝子のうちの少なくとも１、３、１０、２０、３０、または５０種から検出される。好ましくは、任意の１つの表におけるプローブ配列によって表される関連する特異的染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、１０、２０、３０、または５０種の有無が検出される。
【００８２】
遺伝子座は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００８３】
サンプル調製および染色体相互作用検出のための好ましい態様
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法が、本明細書において記載される。例えばこの節で記載されるように、これらの方法の最適化された（非従来的な）バージョンが用いられ得る。
【００８４】
典型的に、サンプルは、少なくとも２×１０5個の細胞を含有すると考えられる。サンプルは、最大５×１０5個の細胞を含有し得る。一態様において、サンプルは、２×１０5〜５．５×１０5個の細胞を含有すると考えられる。
【００８５】
染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用の架橋が、本明細書において記載される。これは、細胞溶解が起きる前に実施され得る。細胞溶解は、４〜６または約５分間など、３〜７分間実施され得る。一部の態様において、細胞溶解は、少なくとも５分間かつ１０分間未満実施される。
【００８６】
制限酵素でＤＮＡを消化することが、本明細書において記載される。典型的に、ＤＮＡ制限は、約６５℃などの約５５℃〜約７０℃で、約２０分間などの約１０〜３０分間の期間実施される。
【００８７】
好ましくは、最大４０００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす高頻度カッター制限酵素が用いられる。任意で、制限酵素は、約２５６塩基対などの約２００〜３００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす。一態様において、典型的なフラグメントサイズは、４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対など、２００塩基対〜４，０００塩基対である。
【００８８】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ法の一態様において、ＤＮＡ沈殿工程は、ＤＮＡ制限消化工程とＤＮＡライゲーション工程との間では実施されない。
【００８９】
ＤＮＡライゲーションが本明細書において記載される。典型的に、ＤＮＡライゲーションは、約１０分間など、５〜３０分間実施される。
【００９０】
サンプル中のタンパク質は、例えばプロテイナーゼ、任意でプロテイナーゼＫを用いて酵素的に消化され得る。タンパク質は、約３０分間〜１時間の期間、例えば約４５分間酵素的に消化され得る。一態様において、タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化の後に、架橋反転またはフェノールＤＮＡ抽出の工程はない。
【００９１】
一態様において、ＰＣＲ検出は、好ましくはライゲーションした核酸の存在／非存在に対する二元読み出しを有して、ライゲーションした核酸の単一コピーを検出し得る。
【００９２】
ホモログ
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログが、本明細書において触れられる。そのようなホモログは、典型的に、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性に基づいて算出され得る（時には、「厳密な相同性（hard homology）」と称される）。
【００９３】
それゆえ、特定の態様において、ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログは、本明細書において配列同一性％を参照して触れられる。典型的に、そのようなホモログは、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００９４】
例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性および／または配列同一性％を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、そのデフォルト設定で用いられる）を提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性および／または配列同一性％を算出し得、および／または配列を整列させ得る（（典型的にそれらのデフォルト設定で）同等のまたは対応する配列を同定するなど）。
【００９５】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードでアライメントした場合に合致する、またはある正の値を有する閾値スコアＴを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定する工程を伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al、上記）。これらの初回の近隣ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出す検索を始めるための種として作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。それぞれの方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大限に達した値から分量Ｘだけ下落する；負のスコアを取る１つもしくは複数の残基アライメントの累積により、累積スコアがゼロもしくはそれより下に行く；または、いずれかの配列の末端に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターのＷ５  ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【００９６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間での類似性についての統計解析を実施する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性についての１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのポリヌクレオチド配列間の合致が偶然に生じるであろう確率の表示を提供する。例えば、第一の配列を第二の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列はもう一方の配列と類似していると見なされる。
【００９７】
相同な配列は、典型的に、１０、１５、または２０塩基未満など、１、２、３、４個、またはそれを上回る数の塩基だけ異なる（それはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る）。これらの変化は、相同性および／または配列同一性％を算出する工程に関して上記で言及された領域のいずれかにわたり測定され得る。
【００９８】
アレイ
第二の核酸のセットがアレイに結合され得、そして一態様において、好ましくは少なくとも３００、９００、２０００、または５０００個の遺伝子座に相当する、アレイに結合している少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００、または２５０，０００種の異なる第二の核酸が存在する。一態様において、第二の核酸の種々の集団のうちの１つ、または複数、またはすべては、アレイの１つを上回る数の個別の領域に結合され、事実上アレイで反復され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づき得る。アレイへの第一の核酸の結合の検出は、二色システムによって実施され得る。
【００９９】
治療用作用物質
治療用作用物質が本明細書において言及される。本発明は、関連する病状を阻止するまたは治療することにおける使用のためのそのような作用物質を提供する。これは、必要としている個体に治療上効果的な量の作用物質を投与する工程を含み得る。本発明は、疾患を阻止するまたは治療するための医薬の製造における作用物質の使用を提供する。本発明の方法を用いて、治療に対する個体を選択し得る。本発明の方法、特にコンパニオン診断検査を行うための方法は、該方法によって同定された人に、次いで、関連する病状を阻止するまたは治療する作用物質を投与し得る治療工程を含み得る。
【０１００】
作用物質の製剤化は、該作用物質の性質に依存すると考えられる。作用物質は、該作用物質および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含有する薬学的組成物の形態で提供される。適切なキャリアおよび希釈剤には、等張生理食塩溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。典型的な経口投薬組成物には、錠剤、カプセル、液体溶液、および液体懸濁液が含まれる。作用物質は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または経口の投与のために製剤化され得る。
【０１０１】
作用物質の用量は、様々なパラメーターに従って、とりわけ用いられる物質；治療される対象となる個体の年齢、重量、および病状；投与の経路；ならびに要求されるレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の作用物質に対する投与の要求経路、および投薬量を決定することができる。しかしながら、適切な用量は、例えば１日に１〜３回摂取されるべき、１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重などの０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０１０２】
本明細書において言及される物質の形態
本明細書において言及される核酸または治療用作用物質などの物質のいずれも、精製したまたは単離した形態であり得る。それらは、天然に見出されるものとは異なる形態であり得、例えばそれらは、それらが天然ではともに生じない他の物質と組み合わせて存在し得る。核酸（本明細書において規定される配列の一部分を含む）は、天然に見出されるものと異なる配列を有し得、例えば、相同性に関する節で記載される配列において、少なくとも１、２、３、４個、またはそれを上回る数のヌクレオチド変化を有する。核酸は、５’または３’末端に異種配列を有し得る。核酸は、天然に見出されるものとは化学的に異なり得、例えばそれらは何らかのやり方で修飾され得るが、好ましくはなおもワトソン・クリック塩基対合が可能である。適当な場合には、核酸は、二重鎖または一本鎖の形態で提供される。本発明は、本明細書において言及される特異的核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖の形態で提供し、ゆえに開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
【０１０３】
本発明は、特定のサブグループと関連がある染色体相互作用の検出を含む、本発明の任意の方法を行うためのキットも提供する。そのようなキットは、本発明の方法によって生成されるライゲーションした核酸を検出し得る作用物質など、関連する染色体相互作用を検出し得る特異的な結合作用物質を含み得る。キットに存在する好ましい作用物質には、ライゲーションした核酸、または例えば本明細書において記載されるように、ライゲーションした核酸をＰＣＲ反応において増幅し得るプライマーペアにハイブリダイズし得るプローブが含まれる。
【０１０４】
本発明は、関連する染色体相互作用を検出し得るデバイスも提供する。デバイスは、好ましくは、本明細書において記載される任意のそのような作用物質、プローブ、またはプライマーペアなど、染色体相互作用を検出し得る任意の特異的な結合作用物質、プローブ、またはプライマーペアを含む。
【０１０５】
刊行物
本明細書において言及されるすべての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み入れられ、そして本発明に関連する特質をさらに規定するために用いられ得る。
【０１０６】
具体的な態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常および異常な病状の間での調節的変化についてのエピジェネティックな調節的シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られるヒト染色体の調節的高次構造と関連がある遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定しかつモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子脱調節のカスケードにおける個別の一次工程である。それらは、ＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングなど、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現のバイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、固有の一連の利点を有する高次バイオマーカーである。
【０１０７】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションという４つの密度があり、それぞれのキメラフラグメントはアレイで４回反復され、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万という効果的な密度を作製する。
【０１０８】
カスタム設計されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見技術で詮索された３００個前後の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングし得る。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに構築され；この技術は、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万個という４つの密度のプローブを付与する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブは四つ組として提示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋに減り、ゆえに再現性についての統計的評価を可能にする。遺伝子座あたりの詮索される潜在的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり；そのため、検討され得る遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【０１０９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、１組のサンプルを有する二色システムであり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリー生成の後、Ｃｙ５で標識され、かつ比較／解析される対象となるサンプル（対照）の他方はＣｙ３で標識される。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎスキャナーを用いてスキャンされ、かつ結果として生じた特質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて抽出される。次いで、データは、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを用いて処理される。アレイは、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準的な二色パッケージ：Ｌｉｍｍａ*を用いて処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ*におけるアレイ内正規化機能を用いてなされ、かつこれは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対してなされる。データはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルターにかけられ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは除去され、かつ技術的複製プローブは平均化されて、それらはＬｉｍｍａ*を用いて解析される。プローブは、比較されておりかつ次いで偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｒａｔｅ）を用いることによって補正されている２つのシナリオ間でのそれらの差に基づいてモデル化される。＜１または＞１でありかつｐ＝０．０１のＦＤＲ  ｐ値を通過する、＜３０％の変動係数（ＣＶ）を有するプローブが、さらなるスクリーニングに用いられる。プローブセットを縮小するために、さらなる多因子分析が、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを用いて実施される。
【０１１０】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を査定するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１１１】
プローブのプールは、最終選抜のために、調整されたｐ値、ＦＣ、および＜３０％のＣＶ（任意のカットオフポイント）のパラメーターに基づいて初めに選択される。さらなる解析および最終リストは、最初の２つのパラメーター（調整された（ａｄｊ）ｐ値；ＦＣ）のみに基づいて引き出される。
【０１１２】
刊行物
本明細書において言及されるすべての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み入れられ、そして本発明に関連する特質をさらに規定するために用いられ得る。
【０１１３】
具体的な態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常および異常な病状の間での調節的変化についてのエピジェネティックな調節的シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られるヒト染色体の調節的高次構造と関連がある遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定しかつモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子脱調節のカスケードにおける個別の一次工程である。それらは、ＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングなど、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現のバイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、固有の一連の利点を有する高次バイオマーカーである。
【０１１４】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションという４つの密度があり、それぞれのキメラフラグメントはアレイで４回反復され、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万という効果的な密度を作製する。
【０１１５】
カスタム設計されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見技術で詮索された３００個前後の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングし得る。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに構築され；この技術は、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万個という４つの密度のプローブを付与する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブは四つ組として提示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋに減り、ゆえに再現性についての統計的評価を可能にする。遺伝子座あたりの詮索される潜在的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり；そのため、検討され得る遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【０１１６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、１組のサンプルを有する二色システムであり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリー生成の後、Ｃｙ５で標識され、かつ比較／解析される対象となるサンプル（対照）の他方はＣｙ３で標識される。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎスキャナーを用いてスキャンされ、かつ結果として生じた特質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて抽出される。次いで、データは、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを用いて処理される。アレイは、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準的な二色パッケージ：Ｌｉｍｍａ*を用いて処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ*におけるアレイ内正規化機能を用いてなされ、かつこれは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対してなされる。データはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルターにかけられ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは除去され、かつ技術的複製プローブは平均化されて、それらはＬｉｍｍａ*を用いて解析される。プローブは、比較されておりかつ次いで偽発見率を用いることによって補正されている２つのシナリオ間でのそれらの差に基づいてモデル化される。≦−１．１または≧１．１でありかつｐ≦０．１のＦＤＲ  ｐ値を通過する、≦３０％の変動係数（ＣＶ）を有するプローブが、さらなるスクリーニングに用いられる。プローブセットを縮小するために、さらなる多因子分析が、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを用いて実施される。
【０１１７】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を査定するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１１８】
プローブのプールは、最終選抜のために、調整されたｐ値、ＦＣ、および＜３０％のＣＶ（任意のカットオフポイント）のパラメーターに基づいて初めに選択される。さらなる解析および最終リストは、最初の２つのパラメーター（調整されたｐ値；ＦＣ）のみに基づいて引き出される。
【実施例】
【０１１９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例証される。
【０１２０】
統計的パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイを、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージを用いて処理して、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームへの転換のための高い値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択する。
【０１２１】
工程１
プローブを、改変した線形回帰モデルの産物であるそれらの補正ｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値≦０．１より下のプローブが選択され、次いでそれらのエピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに縮小され、さらなる解析に選択されるためにプローブＥＲは≦−１．１または≧１．１でなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは≦０．３より下でなければならない。
【０１２２】
工程２
統計リストからの上位４０種のマーカーが、ＰＣＲ転換に対するマーカーとしての選択のためにそれらのＥＲに基づいて選択される。最も高いの負のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカー、および最も高い正のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカーがリストを形成する。
【０１２３】
工程３
工程１からの結果として生じたマーカーである統計的に有意なプローブが、超幾何学的濃縮（ＨＥ）を用いたエンリッチメント解析の基盤を形成する。この解析は、有意なプローブリストからのマーカー縮小を可能にし、かつ工程２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに転換されるプローブのリストを形成する。
【０１２４】
統計的プローブをＨＥによって処理して、どの遺伝的位置が統計的に有意なプローブの濃縮を有するかを判定し、どの遺伝的位置がエピジェネティックな差の中心地であるかが示される。
【０１２５】
補正されたｐ値に基づく最も有意な濃縮された遺伝子座が、プローブリスト作成に選択される。０．３または０．２のｐ値より下の遺伝的位置が選択される。工程２からのマーカーとともに、これらの遺伝的位置にマッピングする統計的プローブが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ転換のための高い値のマーカーを形成する。
【０１２６】
実施例１：関節リウマチの治療のためのメトトレキサートの非応答者と応答者とを識別するコンパニオン診断に関連する染色体相互作用を判定する方法
【０１２７】
供給源：グラスゴーのスコットランド教育研究協会（ＳＥＲＡ）コホート
【０１２８】
実施例１の序論および簡単な概要
個々の患者の安定したエピジェネティックプロファイルは、シグナル伝達経路の感度を変調し、遺伝子発現を調節し、疾患発症の道筋に影響し、かつ薬物の効果的な作用および治療への応答に関わる調節制御を無効の状態にし得る。ここで、本発明者らは、関節リウマチ（ＲＡ）患者のエピジェネティックプロファイルを解析して、メトトレキサート（ＭＴＸ）治療への非応答者を規定することにおけるその役割を評価した。
【０１２９】
第一線の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、通常メトトレキサート（ＭＴＸ））への応答についての確実な臨床的予測は、現在可能でない。現在、第一線のＤＭＡＲＤ（特に、メトトレキサート（ＭＴＸ））への応答を判定し得る能力は、療法後の経験的臨床測定に依存している。
【０１３０】
早期関節リウマチ（ＥＲＡ）において、第一線のＤＭＡＲＤ（特に、メトトレキサート（ＭＴＸ））への応答を予測することは可能になっておらず、そのため治療決定は、主に臨床的アルゴリズムに頼る。薬物ナイーブ患者を第一線のＤＭＡＲＤに応答しないであろうものに分類する能力は、患者層別化のための貴重なツールであろう。ここで、本発明者らは、早期ＲＡ患者の血中白血球における染色体コンフォメーションシグネチャー（ＲＡにおいて以前に記載されていない、非常に有益でかつ安定したエピジェネティックな修飾）は、ＭＴＸ治療への非応答性を予測し得ることを報告する。
【０１３１】
方法：
スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートに採用されたＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を獲得した。この調査への包含は、中程度から高い疾患活動性（ＤＡＳ２８≧３．２）を有するＲＡの診断（２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準を満たす）、およびメトトレキサート（ＭＴＸ）による後続の単一療法に基づいた。ＤＡＳ２８＝２８関節の疾患活動性スコア。ＥＵＬＡＲ＝欧州リウマチ学会。ＡＣＲ＝米国リウマチ学会（American College of Rheumatology）。ＭＴＸ応答性を、以下の基準：応答者−ＤＡＳ２８寛解（ＤＡＳ２８＜２．６）または良好な応答（＞１．２のＤＡＳ２８改善、およびＤＡＳ２８≦３．２）、非応答者−ＤＡＳ２８の改善なし（≦０．６）を用いて、６ヶ月の時点で規定した。４人のＭＴＸ応答者、４人のＭＴＸ非応答者、および４人の健常対照における染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）についての初回解析に、３０９個のＲＡ関連遺伝子座を網羅する１３，３２２種の一意的なプローブを含有するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイを用いて着手した。差別化ＣＣＳを、ＬＩＭＭＡ*線形モデリング、後続の二元フィルタリング、およびクラスター分析によって規定した。３０人のＭＴＸ応答者および３０人の非応答者の検証コホートを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームを用いて差別化ＣＣＳについてスクリーニングした。差別化シグネチャーを、二元スコアおよびロジスティック回帰モデリング、ならびにＲＯＣ**分析によって判定されるモデルの精度および堅牢性を用いてさらに洗練させた。
【０１３２】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を査定するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１３３】
**注記：ＲＯＣは、受信者動作特徴を意味しかつＲＯＣ曲線を指す。ＲＯＣ曲線は、その弁別閾値が変動するため、二元分類子システムの性能を図解する図式的プロットである。曲線は、様々な閾値設定で偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることによって創出される。
【０１３４】
ＣＣＳのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ解析は、応答者および非応答者のＥＲＡ患者を差別化する３０種マーカー層別化プロファイルを同定した。本発明者らの検証コホートにおけるこのシグネチャーについての後続の評価は、これを、応答者と非応答者とを弁別し得る５種マーカーＣＣＳシグネチャーに洗練させた。予測モデリングは、０．００９８〜０．９９に及ぶ、応答者および非応答者に対する確率スコアを提供した（０＝応答者、１＝非応答者）。応答者に関して９２％の真陽性率（９５％の信頼区間［９５％  ＣＩ］７５〜９９％）、および非応答者に関して９３％の真陰性率（９５％  ＣＩ  ７６〜９９％）があった。重要なことには、この層別化モデルを検証するＲＯＣ分析は、シグネチャーが、ＭＴＸへのＮＲに対して９２％の感度の予測力を有することを実証した。
【０１３５】
本発明者らは、診断の時点で患者を層別化する力を有する、ＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者の末梢血における非常に有益な全身的エピジェネティック状態を同定した。血液に基づく臨床検査を用いて患者を非応答者に先験的に差別化する能力は、貴重な臨床ツールであると考えられ；層別化された医療への道を開き、かつＥＲＡ臨床におけるより積極的な治療レジームを正当化する。
【０１３６】
実施例１の詳細なバージョン
患者を応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）に先験的に差別化する能力は、効果的な治療のより早期の導入につながる患者層別化のための貴重なツールであろう。本発明者らは、疾患状態およびＭＴＸ応答性を示す、血液由来の白血球における染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）を同定するために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームを用いた。それによって、本発明者らは、治療ナイーブの早期ＲＡ（ＥＲＡ）患者のＭＴＸ  ＲおよびＮＲへの層別化を可能にする第一の予後分子シグネチャーを提供する、ＣＸＣＬ１３、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２１Ｒ、およびＩＬ−２３遺伝子座に含有されるエピジェネティックなシグネチャーを同定した。重要なことには、この層別化モデルは、ＭＴＸへのＮＲに対して９２％の感度の予測力を有した。このエピジェネティックなＲＡバイオマーカーシグネチャーは、ＥＲＡと健常対照（ＨＣ）との間で識別され得る。この組み合わせの予測的末梢血シグネチャーは、臨床におけるより積極的な療法のより早期の導入を支持し得、ＲＡにおける個別化医療への道を開く。
【０１３７】
ＲＡは、世界人口の最大１％に影響を及ぼす慢性自己免疫疾患である。病因は多因性であり、そして環境因子、特に喫煙および他の肺刺激と相互作用する主たる免疫宿主遺伝子座によって特徴付けされる1,2,3。遺伝的に感受性がある個体のそのような環境因子への曝露は、疾患の発生および進行に関するエピジェネティックな背景を示唆する。クロマチンマーカー（例えば、ゲノムのメチル化状態）についての最近の調査は、ＲＡと関連があるエピジェネティックな差の最初の証拠を提供する4,5,6,7。しかしながら、今日まで、遺伝的関連性もエピジェネティックな変化も、所与の療法への応答に対する有効な予測的マーカーを提供していない。さらには、臨床提示は、従来的ＤＭＡＲＤの効力および毒性をわずかに予測するのみである。ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）およびＡＣＲ（米国リウマチ学会）管理指針によって推奨される最も一般的な第一選択医薬であるＭＴＸ8は、治療の６ヶ月後に５０〜６５％に及ぶ臨床的に意義のある応答率をもたらす11。そのような応答、およびとりわけ、高いハードルの応答を呈する幾分より小さな割合は、個々の患者において現在予測され得ない。このことが、治療用レジメン選定（単一または組み合わせの治療法）への「試行錯誤」に基づく手法を生む。第一線治療への応答が長期転帰の最も重要な予測因子であることを考慮すると、個々の患者における薬物応答性を予測し得る能力は、貴重な臨床ツールであろう9,10。
【０１３８】
本明細書において、本発明者らは、スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートからのＤＭＡＲＤナイーブのＥＲＡ患者のエピジェネティックプロファイリングに焦点を合わせて、ＭＴＸ治療へのＮＲを示しゆえに代替療法へのそのような患者の先験的な同定および層別化を可能にする、安定した血液に基づくエピジェネティックプロファイルが存在するかどうかを確かめた。供給源のエピジェネティックな変調は、細胞活性化および転写プロファイルに強く影響し得る。考えられる限りでは、薬物に対する作用の様式は、エピジェネティックに修飾された遺伝子座によって影響を受け得る。本発明者らは、長距離クロマチン相互作用としても知られるＣＣＳに焦点を合わせた、というのもそれらは、転写調節に対する重要な意味合いを有する非常に有益でかつ安定した高次のエピジェネティック状態を反映するためである12,13,14。それらは、重要な利点15および表現型の差への早期の機能的結び付き16も付与し、かつ腫瘍学および他の疾患エリアにおける有益なバイオマーカー候補として報告されている17,18,19。
【０１３９】
本発明者らは、スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートによって提供される早期ＲＡ（ＥＲＡ）患者を用いた。人口統計学的な、臨床的な、および免疫学的な因子を、診断時および６ヶ月の時点で獲得した。この調査への包含は、中程度から高い疾患活動性（ＤＡＳ２８≧３．２）を有するＲＡの診断（２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準を満たす）、およびＭＴＸによる後続の単一療法に基づいた。応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８寛解（ＤＡＳ２８＜２．６）または良好な応答（＞１．２のＤＡＳ２８改善、およびＤＡＳ２８≦３．２）に達する患者として規定された。非応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８の改善を有しない（≦０．６）患者として規定された。エピジェネティック解析のための血液サンプルを診断時に回収した。（ＤＡＳ２８＝２８関節の疾患活動性スコア）。
【０１４０】
本発明者らは、ＲＡに機能的に結び付いた３０９個の遺伝子座にわたり、１３，３２２種の染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）（１３，３２２種の一意的なプローブ）にわたって解析することによる、二元エピジェネティックバイオマーカープロファイリングを用いた。非常に有益なクラスのエピジェネティックバイオマーカー（１）としてのＣＣＳを、早期黒色腫（２）を有するメイヨークリニックコホートの血液に基づく層別化においてすでに利用に成功しており、かつＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１による免疫療法への応答の予測的層別化に現在用いられるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで読み取り、モニターし、かつ評価した。
【０１４１】
ナイーブＲＡ患者についての同定されたエピジェネティックプロファイルを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＷＥＫＡ、およびＲ統計的言語に供した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームおよび９０個の臨床サンプルの拡張コホートを用いることによって、本発明者らは、応答者、非応答者、ＲＡ患者、および健常対照に対して統計的に有意な、９２２種のエピジェネティックなリードバイオマーカーのプールを同定した。
【０１４２】
ＥＲＡ患者における治療前の循環ＣＣＳ状態を同定するために、ＲＡ病因と関連がある１２３個の遺伝子座（表１）を選択し、かつＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）インシリコ予測パッケージ20を用いて予測された染色体コンフォメーション相互作用で注釈を付した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）インシリコ予測により、１３，３２２種の高信頼度ＣＣＳマーカー候補（表１）が作成された。これらの候補を用いて、特注の発見ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ（図５）を作り出して、すべてが６ヶ月の療法の後に臨床的に規定された４人のＭＴＸ応答者（Ｒ）および４人のＭＴＸ  ＮＲ（図１Ａ、Ｂ、および表２）、ならびに４人の健常対照（ＨＣ）から診断の時点（ＤＭＡＲＤナイーブ）で単離された末梢血単核細胞をスクリーニングした。Ｒ、ＮＲ、およびＨＣを差別化したＣＣＳを同定するために、正規化されたエピジェネティック負荷のＬＩＭＭＡ線形モデルを採用した。合計９２２種の統計的に有意な層別化マーカー（調整されたｐ値およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）比に基づいて査定された有意性）を同定した。９２２種のリードマーカーのうち、４２０種はＮＲと、２１０種はＲと、そして１５９種はＨＣと関連付けされた（図１Ｃ）。二元フィルタリングおよびクラスター分析をＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに適用して、同定されたＣＣＳの有意性を査定した。段階的な階層的クラスター手法（完全連結凝集によるマンハッタン距離測定を用い、かつＲ対ＮＲ、ＨＣ対Ｒ、およびＨＣ対ＮＲを考慮に入れる）は、有意なマーカーの数を９２２種から６５種に縮小し、かつ最終的に３０種マーカー層別化プロファイルをもたらした（図１Ｄおよび表３）。
【０１４３】
ＣＣＳシグネチャーを洗練させかつ検証するために、３０種の同定されたマーカーを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームを用いて（図５）、段階的な手法でＲおよびＮＲの第二のＥＲＡ患者コホートにおいて（図２Ａ、Ｂ、および表４）スクリーニングした。第一の例において、３０種のＣＣＳマーカー全体を、１２人のＥＲＡ患者（６人のＲおよび６人のＮＲ）においてランした。二元スコアに対して、イェーツの連続補正による独立性に関するカイ二乗検定を適用することによって、最良の差別化ＣＣＳマーカーを同定し、１２種マーカーのＣＣＳプロファイルが明らかになった（表５）。これら１２種のＣＣＳマーカーを付加的な１２人のＥＲＡ患者（６人のＲおよび６人のＮＲ）に対してランし、かつデータを以前の１２人のＥＲＡと組み合わせた。２４人の患者サンプル（１２人のＲおよび１２人のＮＲ）を組み合わせて、ＷＥＫＡ分類プラットフォーム（各マーカーの判別力を採点する５分割交差検証を用いる）におけるロジスティック回帰モデルを構築し、かつ初回のデータセットの無作為データ再サンプリングによって１０回ランして、モデル作成のための１０個の異なる出発点を作成した。最も高い平均スコアを有するマーカーを選択し、ゆえにプロファイルを１０種の最良の判別ＣＣＳマーカーまで縮小した（表５）。１０種のＣＣＳマーカーを用いて、さらなる３６人のＥＲＡサンプル（１８人のＲおよび１８人のＮＲ）をプローブした。すべてのデータ（３０人のＲおよび３０人のＮＲ）を組み合わせ、かつ同じロジスティック回帰およびスコア算出解析を用いて、ＭＴＸ  ＲとＮＲとを識別する５種のＣＣＳマーカーシグネチャー（ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７Ａ、およびＣＸＣＬ１３）が明らかになった（図２Ｃおよび表５）。ＣＸＣＬ１３およびＩＬ−１７Ａ遺伝子座におけるＣＣＳは非応答者と関連付けされ、一方でＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−２３、およびＩＬ−２１Ｒ遺伝子座におけるＣＣＳは応答者と関連付けされた。ヒト自己免疫におけるＩＬ−１７軸に対して仮定される中心的役割を考慮すると、これは興味深いプロファイルであった。
【０１４４】
重要なことには、層別化シグネチャーの構成は、ＭＴＸ応答を判定するのに最も重要である遺伝的位置を潜在的に制御する染色体コンフォメーションの位置を同定する。５種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーを分類するための二元スコアについての主成分分析（ＰＣＡ）は、それらのＭＴＸ応答に基づくＥＲＡ患者の明確な分離を提供した（図２Ｄ）。モデルは、０．００９８〜０．９９に及ぶ、応答者および非応答者に対する予測確率スコアを提供した（０＝応答者、１＝非応答者）。カットオフ値は、応答者に対して≦０．３０および非応答者に対して≧０．７０に設定された。≦０．３０のスコアは９２％の真陽性率（９５％の信頼区間［９５％  ＣＩ］７５〜９９％）を有し、一方で≧０．７０のスコアは９３％の真陰性応答率（９５％  ＣＩ  ７６〜９９％）を有した。応答カテゴリー（ＭＴＸへのＲまたはＮＲ）あたりの観察されたおよび予測された患者の数が、表６に示されている。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーモデルを用いて、５３人の患者（８８％）は、応答者または非応答者のいずれかとして分類された。
【０１４５】
【表１】
2018518203.tif 000003
【０１４６】
５種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＳＳマーカーを決定したロジスティック分類モデルの「精度」および「性能の堅牢性」を検査するために、ＲおよびＮＲデータの無作為データ再サンプリングによって、１５０個のＲＯＣ**曲線（一意的な出発点を有する）を作成した（図３Ａ）。これは、訓練群（６６％、６０００個の既知のクラスのサンプルに等しい）および検査群（３４％、３０００個の不明なクラスのサンプルに等しい）に分裂されるデータをもたらし；重要なことには、同じ分裂は、交差検証に対するデータには決して見られない。モデルの平均弁別能（ＡＵＣ）は８９．９％（９５％  ＣＩ  ８７〜１００％）であり、９２％というＮＲに対する平均感度（応答普及率に対して調整される）および８４％というＲに対する平均特異性を有した。モデルの予測能力を判定するために、平均モデル精度統計を、ベイズ有病率定理を用いてＭＴＸに対する集団Ｒ／ＮＲに対して調整した21。５５％のＭＴＸ応答率を用いると、陽性の予測値（ＰＰＶ）は９０．３％であり、一方で陰性の予測値（ＮＰＶ）は８６．５％であった。応答率を６０％に調整した場合、これはＰＰＶを８７％に減少させ、一方でＮＰＶを８９％に増加させた。
【０１４７】
**注記：ＲＯＣは、受信者動作特徴を意味しかつＲＯＣ曲線を指す。ＲＯＣ曲線は、その弁別閾値が変動するため、二元分類子システムの性能を図解する図式的プロットである。曲線は、様々な閾値設定で偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることによって創出される。
【０１４８】
選択された５種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーの判別力についての独立した評価として、３０人のＨＣを組み入れた混合データの因子分析（ＦＡＭＤ）を実施した。これは、シグネチャーが、ＭＴＸ  ＲとＮＲとを差別化する力を有するだけではなく、健常個体とＲＡ患者とを差別化する十分な疾患特異的特質も保持することを例証した（図３Ｂ）。
【０１４９】
実施例１−表８ａ−ＲＡ−ＭＴＸ応答者と非応答者との間の層別化
下記で提示される表８ａおよび続きの表８ｂは、とりわけ約５４種のＤＮＡプローブ（６０マー）およびそれらのＤＮＡ配列のリストを示している。これらのプローブは、実施例１で用いられるプローブの一部に相当する。拘束されることなく、表８ａ＋８ｂにおいて例証されるプローブのほとんどは、ＲＡ−ＭＴＸ応答者とＲＡ−ＭＴＸ非応答者との間を層別化するのに重要である／有用である可能性が高いと思われる。示されたプローブを、ＰＣＲによってさらに検討した。Ｐ値＝確率値；ａｄｊ．＝調整された。
【０１５０】
実施例１−結論
結論として、Ｒ／ＮＲについての有望な臨床査定に基づく、ＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者のエピジェネティックプロファイル分類についての本発明者らの調査は、ＭＴＸ応答につながるおよびつながらないエピジェネティック状態を弁別する一貫したエピジェネティックなシグネチャーを同定した。これは、本発明者らの知る限りでは、（健常対照に対して）疾患関連であるように見えかつ第一線ＭＴＸ療法への非応答性を予測し得る、早期ＲＡ患者における安定したかつ選択的に差別化する血液に基づくエピジェネティックバイオマーカーの最初の例である。このモデルは、臨床業務内で近い将来日常的に利用可能である可能性を有する、５種の条件付きＣＣＳおよび産業用ＩＳＯ−１３４８５のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームによるそれらの検出に基づく有効な分類子を有して、直接的かつ実際的な利益を付与する。重要なことには、この予測的シグネチャーを取り入れることによって、ＭＴＸナイーブＥＲＡ患者をＲおよびＮＲコホートに層別化することが可能であるはずである。これは、効果的な療法のより早期の使用を探求するＥＲＡに対する現在認可されている治療ストラテジーを通じた患者の進行を加速する可能性を付与し、それゆえ「個別化された」治療レジームにつながる。さらに、臨床においてファストトラックの生物学的治療レジームを正当化するために用いられ得る代替的ＣＣＳシグネチャーが、ＲＡ患者（および他の自己免疫疾患を有する患者）に存在すると考えられる。これは、遠大な社会経済的な意味合いを有すると考えられ、よりコスト効果がよくかつ堅牢な治療的手法を提供する。
【０１５１】
実施例１−材料および方法
実施例１−ＲＡ患者集団
この調査におけるＥＲＡ患者は、スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートの一部である。人口統計学的な、臨床的な、および免疫学的な因子を、診断時および６ヶ月の時点で獲得した（表２）。開始コホートへの包含は、スコットランドにおける二次ケアリウマチ科での差別化されない多発性関節炎またはＲＡの臨床診断（≧１の関節腫脹）に基づいた。除外基準は、以前もしくは現在のＤＭＡＲＤ／生物学的療法、および／または確立された代替診断（すなわち、乾癬性関節炎、反応性関節炎）であった。この調査への包含は、中程度から高い疾患活動性（ＤＡＳ２８≧３．２）を有するＲＡの診断（ＲＡに対する２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準を満たす）、およびＭＴＸによる後続の単一療法に基づいた。［ＤＡＳ２８＝２８関節の疾患活動性スコア。ＥＵＬＡＲ＝欧州リウマチ学会。ＡＣＲ＝米国リウマチ学会］。応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８寛解（ＤＡＳ２８＜２．６）または良好な応答（＞１．２のＤＡＳ２８改善、およびＤＡＳ２８≦３．２）に達する患者として規定された。非応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８の改善を有しない（≦０．６）患者として規定された。血液サンプルを診断時（ベースライン）にＥＤＴＡチューブ内に回収し、かつ遠心分離してＰＢＭＣを含有するバフィー層を生成し、それを収集しかつ−８０℃で保存した。地域倫理委員会は調査プロトコールを認可し、かつすべての患者は、調査への登録前にインフォームドコンセントを与えた。
【０１５２】
実施例１−ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）処理、アレイ、およびＰＣＲ検出。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイのためのプローブの設計および位置
パターン認識方法論を用いて、ヒトゲノムにおける転写単位に関係するヒトゲノムデータを解析した。独自のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）パターン認識ソフトウェア18,20は、領域がクロマチン相互作用に関与する確率的スコアを提供する。１２３個の遺伝子座からの配列をダウンロードしかつ処理して、１３，３２２種の最も起こりそうな染色体相互作用のリストを作成した。６０マーのプローブを設計して、これらの潜在的相互作用を詮索し、かつＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎウェブサイトにカスタムアレイとしてアップロードした。ネステッドＰＣＲにより潜在的マーカーをスクリーニングするための選定された部位で、Ｐｒｉｍｅｒ３23を用いて配列特異的オリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチド特異的ＢＬＡＳＴを用いて、オリゴヌクレオチドを特異性について検査した。
【０１５３】
実施例１−患者ＰＢＭＣからのクロマチン立体構造シグネチャー解析
鋳型調製：５０μｌの各ＰＢＭＣサンプルからのクロマチンを、メーカーの指示（Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌｔｄ）に従って、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイを用いて抽出した。簡潔には、高次構造をホルムアルデヒドで固定し、クロマチンを抽出し、ＴａｑＩで消化し、分子内ライゲーションを最大限に高める条件での希釈およびライゲーション、ならびに後続のプロテイナーゼＫ処置。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイ：ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイハイブリダイゼーションを、メーカーの指示（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って、Ａｇｉｌｅｎｔシステムを用いたカスタムＡｇｉｌｅｎｔ  ８×６０ｋアレイを用いて実施した。各アレイは、四つ組になった、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）パターン認識ソフトウェアによって予測された１３，３２２種の潜在的な染色体相互作用、それに加えてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）およびＡｇｉｌｅｎｔの対照に相当する、５５０８８個のプローブスポットを含有する。簡潔には、１μｇのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）鋳型を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇ標識キットを用いて標識した。標識されたＤＮＡの処理を実施した。アレイ解析を、洗浄の直後に、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーおよびソフトウェアを用いて実施した。すべての実験を比較するために、データをバックグラウンド補正しかつ正規化した。アレイにおける各スポットは四つ組で存在するため、アレイにおける各プローブの４つのスポットの中央値を算出し、かつそのｌｏｇ２変換された値をさらなる解析に用いた。変動係数およびｐ値を、各プローブ複製物に対して算出した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ検出：オリゴヌクレオチドを鋳型に対して検査して、各プライマーセットが正しく働いていることを確認した。技術的なおよび複製の変動に適応するために、各サンプルを４回処理した。これら４つの複製物からのすべての抽出物をプールし、かつ最終的なネステッドＰＣＲを各サンプルに対して実施した。この手順は、限定されたコピー数の鋳型の検出をより高い精度で可能にした24。ＰＣＲ増幅されたすべてのサンプルを、ＬａｂＣｈｉｐ  ＤＮＡ  １Ｋ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製のＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸにおける電気泳動によって可視化し、かつ内部ＤＮＡマーカーを、蛍光色素を用い、メーカーのプロトコールに従って、ＤＮＡチップにのせた。蛍光をレーザーによって検出し、かつエレクトロフェログラムの読み出しを、機器ソフトウェアを用いて、ゲル写真上のシミュレートされたバンドに転換した。陽性であると見なされる対象となるバンドに対して本発明者らが設定した閾値は、３０蛍光単位およびそれより上であった。
【０１５４】
実施例１−統計の方法およびパッケージ
ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍおよびＳＰＳＳを、臨床データのすべての統計解析に用いた。カイ二乗検定およびフィッシャーの正確検定（カテゴリー変数に関して）、独立したサンプルに対するｔ検定（連続的な通常分布変数に関して）、ならびにマン・ホイットニーＵ検定（通常分布ではない連続変数に関して）を用いて、差を同定した。統計的有意性のレベルを０．０５に設定し、かつすべての検定は両側であった。Ｒ（および適当なパッケージ）を、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）データの評価に用いた。これには、カイ二乗検定およびＧＬＭ（ロジット）に対するＳｔａｔｓパッケージ、ＷＥＫＡ見込み率からのＲＯＣ曲線に対するＲＯＣＲパッケージ、ヒートマップに対するＲにおけるｇｐｌｏｔおよびｓｔａｔｓパッケージが含まれた。ＦａｃｔｏｒＭｉｎｅｒパッケージを、ＰＣＡおよび因子プロットに用いた。Ｗｅｋａを、属性縮小、データの無作為化および再サンプリング、ロジスティックモデル分類子、ＡＵＣ算出、ならびにモデル精度算出に用いた。
【０１５５】
実施例１および本特許出願明細書の全てのための参考資料
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【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
【表４】
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【表５】
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【０１５９】
【表６】
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【０１６０】
【表７】
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【０１６１】
【表８】
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【０１６２】
実施例１Ａ−ＲＡ解析：ＭＴＸ応答者対非応答者、およびＲＡ対健常対照：実施例１の後の作業
実施例１の後に続いて、実施例１Ａにおいて、本明細書における実施例の節の始まりにある「統計的パイプライン」の方法を用いて、生物統計学的超幾何学的解析を行って、ＭＴＸ単一療法でのＲＡ患者に対して、ＭＴＸ応答者対ＭＴＸ非応答者の間を層別化するさらに洗練されたＤＮＡプローブを生成した。
【０１６３】
実施例１Ａ結果：下記の表７（パートａおよび続きのパートｂ）は、ＲＡ−ＭＴＸに対するプローブおよび遺伝子座のデータ−応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）との間を層別化するＤＮＡプローブを開示する。Ｂ＝その遺伝子が差異的に発現するという対数オッズである、Ｂ統計（ロッドまたはＢ）。ＦＣは、非対数倍変化である。ＦＣ＿１は、ゼロを中心とする非対数倍変化である。表７ａは、超幾何学的解析からの、ＭＴＸ応答者（ＭＴＸ−Ｒ）を同定するための２５種の洗練された好ましいＤＮＡプローブ（６０マー）、およびＭＴＸ非応答者（ＭＴＸ−ＮＲ）を同定するための２４種（または２５種）の洗練された好ましいＤＮＡプローブ（６０マー）の配列を含むと見られる。下記の表９（パートａ、ｂ、およびｃ）は、ＲＡ患者対健常対照（ＨＣ）についての超幾何学的解析からの濃縮されたデータを開示しており、かつＲＡ患者におけるＭＴＸ応答には関係しない。
【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
【表１０】
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【０１６６】
【表１１】
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【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
【表１４】
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【０１７０】
【表１５】
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【０１７１】
【表１６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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