(57)【要約】ヒトMYF5、MYOD、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を作製する方法であって、以下の工程を含む方法が、本明細書に記載されている：(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、非ヒトMYF5、MYOD、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方のコピーが、非ヒト動物内での機能的なMYF5、MYOD、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト動物細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト胚盤胞を作製する工程；(c)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の胚盤胞を移植して、ヒトMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する工程。2018522553.tif 000022
2018522553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物細胞または胚盤胞が、機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムが、MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子に変異を有する、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞。
【請求項２】
変異が、MYF5遺伝子、MYOD遺伝子および／またはMRF4遺伝子の欠失である、請求項1記載の非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞。
【請求項３】
ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項1または2記載の非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞。
【請求項４】
ヒトMYF5、MYODおよび／またはMRF4を発現し、非ヒト動物MYF、MYODおよび／またはMRF4の発現を欠く、キメラ非ヒト動物、桑実胚または胚盤胞。
【請求項５】
前記非ヒト動物が、ヒト化骨格筋細胞および／または組織を生成する、請求項4記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項６】
外因性ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現し、内因性ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせの発現を欠く、キメラブタ（ブタ・ブタキメラ）。
【請求項７】
非ヒト動物が、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項4または5記載のキメラ非ヒト動物。
【請求項８】
ヒトMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方のコピーが、非ヒト動物内での機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；
(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト動物細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を作製する工程；
(c)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および
(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒトMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する工程。
【請求項９】
外因性MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、内因性ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的な内因性ブタMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；
(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ胚盤胞を作製する工程；
(c)ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の胚盤胞にブタ幹細胞を導入する工程；および
(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の胚盤胞を移植して、外因性ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する工程。
【請求項１０】
非ヒト動物においてヒトおよび／またはヒト化骨格筋細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、非ヒト動物MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子が、機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；
(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト動物細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物胚盤胞または桑実胚を作製する工程；
(c)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト胚盤胞または桑実胚にヒトドナー幹細胞を導入する工程；および
(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の胚盤胞または桑実胚を移植して、ヒトまたはヒト化骨格筋細胞を発現する非ヒト動物を作製する工程。
【請求項１１】
非ヒト動物が、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項8または10記載の方法。
【請求項１２】
ヒトドナー幹細胞が、組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、分化多能性成体幹細胞、人工多能性幹細胞または臍帯血幹細胞（UCBSC）である、請求項8または10記載の方法。
【請求項１３】
前記人工多能性細胞が、線維芽細胞から形成される、請求項8または10記載の方法。
【請求項１４】
請求項8〜13のいずれか一項記載の方法によって作製される非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、その優先権の恩典が本願で主張され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2015年6月30日出願の米国仮特許出願第62/187,027号の優先権の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
筋疾患、例えば筋ジストロフィーは、よく知られており、命にかかわるものである。さらに、多くの筋肉の状態、例えば萎縮およびサルコペニアが、加齢に伴って生じる。骨格筋は高い再生能を有しているが、この能力は、最終的には、疾患および加齢により消失する。末期筋疾患に対する処置は現時点で存在せず、老齢者における転倒の50パーセントは死を招いている。
【発明の概要】
【０００３】
臨床用の個人向けヒト／ヒト化筋肉／筋肉細胞の作製のための宿主としての、MYF5/MYOD/MRF4ノックアウトブタまたは他の動物、例えばウシもしくはヤギの開発が、本明細書に開示されている。
【０００４】
遺伝子編集技術を用いて、MYF5/MYOD/MRF4ヌルのブタ胚を作製した。MYF5/MYOD/MRF4の多遺伝子編集を行い、（例えば、非ヒト動物において）多能性を有するヒト細胞を用いて筋肉と共に再増殖され、ヒト化骨格筋を生成する、寛容なニッチを形成した。
【０００５】
1つの態様は、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞が、機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムが、MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子に変異を有する、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞を提供する。1つの態様において、変異は、MYF5遺伝子、MYOD遺伝子および／またはMRF4遺伝子の欠失である。1つの態様において、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞は、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。
【０００６】
1つの態様は、ヒトMYF5、MYODおよび／またはMRF4を発現し、非ヒト動物MYF、MYODおよび／またはMRF4の発現を欠く、キメラ非ヒト動物、桑実胚または胚盤胞を提供する。1つの態様において、非ヒト動物は、ヒト化骨格筋細胞および／または組織を生成する。1つの態様において、非ヒト動物は、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。
【０００７】
1つの態様は、外因性ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現し、内因性ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせの発現を欠く、キメラブタ（ブタ・ブタキメラ）を提供する。
【０００８】
1つの態様は、ヒトMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方のコピーが、非ヒト動物内での機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト動物細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒトMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する工程。
【０００９】
別の態様は、外因性MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、内因性ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的な内因性ブタMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の桑実胚または胚盤胞にブタ幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、外因性ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する工程。
【００１０】
1つの態様は、非ヒト動物においてヒトおよび／またはヒト化骨格筋細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、非ヒト動物MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子が、機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト動物細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物胚盤胞または桑実胚を作製する工程；(c)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト胚盤胞または桑実胚にヒトドナー幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の胚盤胞または桑実胚を移植して、ヒトまたはヒト化骨格筋細胞を発現する非ヒト動物を作製する工程。
【００１１】
1つの態様において、非ヒト動物は、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。別の態様において、ヒトドナー細胞は、組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、分化多能性成体幹細胞、人工多能性幹細胞または臍帯血幹細胞（UCBSC）である。1つの態様において、人工多能性細胞は、線維芽細胞から形成される。
【００１２】
1つの態様は、本明細書に記載される方法によって作製される非ヒト動物を含む。
【００１３】
1つの態様は、機能的なMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムがMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子に変異（例えば、上流の停止コドンまたは欠失）を有するブタ細胞、桑実胚または胚盤胞を提供する。1つの態様において、変異は、MYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの欠失である。
【００１４】
1つの態様は、ヒトMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせを発現し、ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせの発現を欠くキメラブタを提供する。1つの態様において、キメラブタは、ヒト化骨格筋細胞および／または組織を生成する。
【００１５】
別の態様は、ブタ幹細胞由来のブタMYF5、MYOD、MRF4を発現するキメラブタ（ブタ・ブタキメラ）を提供する。
【００１６】
1つの態様は、ヒトMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的なブタMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒトMYF5、MYOD、MRF4（およびヒト骨格筋）またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する工程。
【００１７】
別の態様は、ブタにおいてヒト化骨格筋細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子が、機能的なブタMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)ブタMYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(b)のブタ桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒト化骨格筋細胞を発現するブタを作製する工程。
【００１８】
1つの態様において、この方法は、ヒト人工多能性幹細胞またはヒト臍帯血幹細胞を使用する。1つの態様において、この方法は、線維芽細胞から形成されたヒト人工多能性細胞を使用する。
【００１９】
1つの態様は、機能的なMYF5、MYOD、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムが、MYF5、MYOD、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の欠失を包含しており、その欠失がホモ接合性である、遺伝子ノックアウトブタ細胞または胚盤胞を提供する。1つの態様において、野生型ブタ（サス・スクロファ（Sus scrofa）)MYF5の配列は、MYF5 ENSSSCG00000000937（MYF5 ENSG00000111049）で提供され、MYODは、MYOD NC_010444（ヒト遺伝子：MYOD ENSG00000129152）で提供され、MRF4（MYF6としても公知）は、MYF6 ENSSSCG00000026533（ヒト遺伝子：MYF6 ENSG00000111046）で提供される。
【００２０】
各々のレシピエントの免疫複合体に特化したヒトまたはヒト化組織および器官を作製することが有用であろう。本明細書に開示されているように、宿主として大型動物を使用し、標的器官の成長および／または分化を担う遺伝子をノックアウトまたは失活させるようそのゲノムを編集し、胚盤胞または受精卵段階のその動物にドナー幹細胞を接種してその器官の成長および発生に関する失われた遺伝子情報を補完することによって、それが実現する。その結果は、補完された組織（ヒト／ヒト化器官）がドナーの遺伝子型および表現型に適合しているドナーキメラ動物である。そのような器官は一世代で作製され得、幹細胞は、患者自身の身体から採取または生成され得る。本明細書に開示されているように、細胞内で複数の遺伝子を同時に編集することによって、それが実現する（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2015/168125を参照のこと）。複数の遺伝子は、脊椎動物細胞または胚において標的化されたヌクレアーゼおよび相同組み換え修復（homology directed repair（HDR））テンプレートを用いて編集のために標的化され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ブタモデルにおいてヒト化骨格筋を生成するストラテジーの全体像を示している。多遺伝子編集を用いてMYF5/MYOD/MRF4変異ブタ線維芽細胞を作製し、SCNTおよびヒト幹細胞送達によってヒト化骨格筋を有するブタを作製する。
【図２】図2A〜Bは、Myf5、MyodおよびMrf4が骨格筋のマスターレギュレーターであり、発生期および成体において骨格筋に制限されることを示している。E11.5のマウスにおいて体節、横隔膜および形成された骨格筋に制限されるMyod-GFPトランスジェニック発現が同図に示されている（パネルA）。パネルBには、35S標識MyoDリボプローブを用いたE13.5（妊娠中期）マウス胚の傍矢状部のインサイチューハイブリダイゼーションが示されている。黒色で表されているのは、肋間筋および四肢筋グループである（9）。
【図３Ａ】（A)TALEN対を、ブタMYOD、MYF5およびMYF6（MRF4としても公知）遺伝子に対して設計した。TALEN結合部位（赤色の矢じりで示されている）は、各遺伝子の塩基性（＋）ヘリックス-ループ-ヘリックス（HLH）ドメインの上流であった。TALEN結合対が上に示されており（赤色の矢印で示されている）、未成熟停止コドンのために相同組み換え修復（HDR）により標的化されたアミノ酸は黄色の矢印で示されている。
【図３Ｂ】（B)1500 ngの各TALEN対を、HDRイベントの容易な分析のために未成熟停止コドンおよび新しい制限酵素認識部位（HindIII）を導入するよう設計された0.1 nmolの各90merHDRオリゴと共に、初代ブタ線維芽細胞に同時にトランスフェクトした。各遺伝子の関心対象の領域をPCRによって増幅し、トランスフェクト細胞の集団において制限フラグメント長多型（RFLP）を評価した。塗りつぶされた矢じりは、未切断または野生型対立遺伝子を示し、白抜きの矢じりは、HDR対立遺伝子を示している。MYOD、MYF5およびMYF6においてHDRについて陽性であった対立遺伝子の比率は、それぞれ、14％、31％および36％であった。
【図３Ｃ】（C）これらの集団を、個々のコロニーの単離のためにプレーティングした。768個のうちの38個（4.9％）のコロニーが、4またはそれ以上のRFLPイベントを示し、これらを配列決定によってさらに分析した。5個のコロニーが、未成熟停止コドンかフレームシフトを引き起こすインデルおよびそれに続く未成熟停止コドンのいずれかを組み込んだHDRにより3つすべての遺伝子についてホモ接合性ノックアウトであることが確認された。MYOD/MYF5/MYF6の三重ノックアウトであるクローンのRFLP分析および配列決定の例が示されている。
【図４】図4A〜Bは、E18.0の野生型（Wt）胚が非常に明確な体節（s）、デスミン陽性（赤色）筋節（m）および発生段階の筋肉組織を有していたことを示している（図3A）。加えて、発生段階の心管が、強いデスミンシグナルを示した（h）。これに対して、MYF5/MYOD/MRF4 KO胚は、筋節形成の欠落を示したが、心臓はデスミン陽性を維持していた（図3B）。
【図５】図5A〜Bは、（A)ICM内にDiI標識hiPSCを有する胚盤胞を示している。矢印は、DiIおよびHNA陽性の細胞を示している。（B)ICM内にEdU標識hiPSCを有する胚盤胞。hiPSCを40μM EdUで24時間標識し、注射した。胚盤胞を、10μM BrdUで1時間パルスして分裂細胞を標識した。二重陽性細胞が矢印で示されている。BrdU+/EdU-細胞は、分裂性の宿主細胞である。胚盤胞が孵化を始めており（括弧）、これは発生の進行を示すものであることに注目されたい。
【図６】図6A〜Dは、GFP標識割球で補完されたE20ブタMYF5/MYOD/MRF4ヌル胚を示している。ネイティブGFPが、ホールマウント胚において、胚の肝臓および卵黄嚢で観察される。B. GFP標識割球で補完されたMYF5/MYOD/MRF4ヌル胚（E20）のブタ肝臓部分。ネイティブGFPを肝臓で確認することができる。C. GFP標識割球で補完されたE20ブタMYF5/MYOD/MRF4ヌル胚由来の卵黄嚢のPCR（胚1（パネルA、B、Dで示されている）、3、5）。GFP標識ブタ線維芽細胞は陽性対照であり、WTブタ肝臓は陰性対照である。GFP標識線維芽細胞を用いて滴定を行った。これらのデータは、GFPが卵黄嚢において約1：10の細胞で発現されることを示している。D. GFP標識割球で補完されたE20ブタMYF5/MYOD/MRF4ヌル胚由来の体節部は、GFP補完が体節で見られることおよびデスミン（赤色）がGFP標識細胞内に存在すること（矢じり）を示している。これらのデータは、ブタ：ブタ補完を成功させる能力を示しており、さらに、デスミンが補完細胞で産生されることを示している。これらのデータは、補完組織の形成のためのニッチを生み出すであろう骨格筋を欠くブタモデルにおける三重ノックアウトの実現能力を示している。このアプローチは、ブタにおいてヒト化骨格筋を生成するために使用される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
遺伝子編集技術を用いて、MYF5/MYOD/MRF4ヌルのブタ胚を作製した。MYF5/MYOD/MRF4に対する多遺伝子編集の実施により、多能性を有するブタ細胞を用いて筋肉と共に、および非ヒト動物においてヒト幹細胞と共に再増殖され、ヒト化骨格筋を生成する、寛容なニッチが形成される。
【００２３】
定義
以下の定義は、本明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫性のある理解を提供するために含まれている。本明細書で使用される場合、列挙されている用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される他の用語およびフレーズはすべて、当業者が理解しているであろうそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、技術辞書、例えばHawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001を参照することによって知ることができる。
【００２４】
本明細書における「1つの態様」、「態様」等の参照は、記載される態様がある特定の局面、特性、構造、部分または特徴を含み得るが、必ずしもすべての態様がその局面、特性、構造、部分または特徴を含むとは限らないことを示している。さらに、そのようなフレーズは、本明細書の他の部分で参照されている同じ態様を参照し得るが、必ずそうであるということではない。さらに、特定の局面、特性、構造、部分または特徴がある態様に関連して記載されているのであれば、明示的に記載されているかどうかによらず、そのような局面、特性、構造、部分または特徴を他の態様に影響させるまたは他の態様と結びつけることも当業者の知識の範囲内である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、1つまたは2つ以上、すなわち少なくとも1つの、その冠詞の文法上の目的語を表す。例として、「要素（an element）」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２６】
「および（ならびに）／または（もしくは）」という用語は、この用語に関連する項目の任意の1つ、その項目の任意の組み合わせ、またはその項目のすべてを意味する。「1つまたは（もしくは）複数」というフレーズは、特にその用法に照らして読めば、当業者に直ちに理解される。例えば、フェニル環上の1つまたは複数の置換基は、1〜5つ、または例えばそのフェニル環が二置換である場合、1〜4つを表す。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「または（もしくは）」は、上で定義された「および（ならびに）／または（もしくは）」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、ある項目のリストに介在する場合、「および（ならびに）／または（もしくは）」または「または（もしくは）」は、内包的であること、例えば、多数の項目の少なくとも1つを含むが、2つ以上、かつ任意でさらなる列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。そうでないことを明確に示す用語、例えば、「〜のうちの1つのみ」または「〜のうちのただ1つ」、または特許請求の範囲で使用される場合は「〜からなる」、のみが、多数の要素または要素のリストのうちのただ1つの要素を含むことを表す。一般に、本明細書で使用される「または（もしくは）」という用語は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「〜のうちの1つ」、「〜のうちの1つのみ」または「〜のうちのただ1つ」、が先行する場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち、一方または他方であるが両方でないこと）を示すと解釈されるべきである。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「〜と共に（with）」という用語またはそれらの派生語は、「含む（comprising）」という用語と同様に内包的であることが意図されている。
【００２９】
「約」という用語は、指定されている値の±5％、±10％、±20％または±25％のばらつきを表し得る。例えば、「約50」パーセントは、いくつかの態様において、45〜55パーセントのばらつきを有し得る。整数の範囲について、「約」という用語は、その範囲の各々の外縁で指定されている整数よりも1または2大きいおよび／または小さい整数値を含み得る。本明細書にそれ以外のことが示されていない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物または態様の機能に関して等価である指定されている範囲に近似する値、例えば重量パーセント、を含むことが意図されている。約という用語はまた、指定されている範囲の終端を修飾し得る。
【００３０】
当業者に理解されるであろうが、成分の量、特性、例えば分子量、反応条件等を表すものを含むすべての数値は近似値であり、すべての例において任意で「約」という用語によって修飾されることが理解される。これらの値は、本明細書の教示を用いて当業者が取得しようとする所望の特性に依存して変化し得る。そのような値は、本来的に、それらの各々の試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じるばらつきを含むことも理解される。
【００３１】
当業者に理解されるであろうが、任意かつすべての目的において、特に書面による説明を提供する観点から、本明細書で言及されているすべての範囲は、任意かつすべての可能性のある部分範囲およびそれらの部分範囲の組み合わせ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に整数値も包含する。言及されている範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、その範囲内の各々の具体的な値、整数、分数または固有値（identity）を含む。あらゆる列挙されている範囲は、その同じ範囲が少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分または十等分に分割されることを十分に表し、それを可能にするものと容易に理解することができる。非限定的な例として、本明細書に記載されている各範囲は、下側の三分の一、中間の三分の一および上側の三分の一等に容易に分割され得る。当業者に理解されるであろうが、「最大〜」、「少なくとも〜」、「〜より高い」、「〜未満」、「〜より多い」、「またはそれ以上（複数）」等のすべての言語は、言及されている数を含み、かつそのような用語は、上記のようにその後に部分範囲に分割できる範囲を表す。同様に、本明細書で言及されているすべての比は、その広い比に含まれるすべての部分比も含む。したがって、基、置換基および範囲に関して言及されている特定の値は説明のためのものにすぎず、それらは他の明確な値または基および置換基に関する明確な範囲内の他の値を排除しない。
【００３２】
当業者はまた、メンバーが一般的な様式、例えばマーカッシュグループでひとまとめにされている場合、本発明は、列挙されているグループ全体をまとめて包含するだけでなく、そのグループの各メンバーを個々にもおよび主グループのすべての可能性のある部分グループも包含することを直ちに理解するであろう。
【００３３】
さらに、すべての目的のために、本発明は、その主グループだけでなく、そのグループメンバーの1つまたは複数を欠く主グループも包含する。したがって本発明は、言及されているグループのメンバーの任意の1つまたは複数の明示的な除外を想定している。したがって、例えば明示の負の制限で使用される、言及されている要素、種または態様の任意の1つまたは複数をそのようなカテゴリーまたは態様から除外し得るただし書きが、任意の開示されているカテゴリーまたは態様に適用され得る。
【００３４】
「単離された」という用語は、インビボでその因子、細胞または細胞群に付随する1つもしくは複数の因子、細胞または1つもしくは複数の細胞成分を付随しない因子、細胞または細胞群を表す。
【００３５】
「接触する」という用語は、例えば、細胞または分子レベルで、例えば溶液中、反応混合物中、インビトロまたはインビボで、生理学的反応、化学反応または物理的変化をもたらすことを含む、触れる、接点を作るまたは直にもしくは近くに接近させる動作を表す。
【００３６】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は、言い換え可能に使用され得る。これらの用語はすべて、任意かつすべての後続世代であるそれらの子孫も含む。すべての子孫は、意図的なまたは意図的でない変異により同一でない場合があることが理解される。
【００３７】
「細胞」は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物由来の細胞を含み、「対象」は脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、家畜動物、競技用動物およびコンパニオンアニマルを含むがこれらに限定されない。「動物」という用語には、イヌ、ネコ、魚類、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル（例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジーまたはオランウータン）、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよび鳥類が含まれる。
【００３８】
1つの態様において、幹細胞、前駆（progenitor）細胞または前駆（precursor）細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞および／または分化多能性幹細胞（例えば、分化多能性中胚葉前駆体）である。1つの態様において、幹細胞、前駆（progenitor）細胞または前駆（precursor）細胞は、哺乳動物細胞である。1つの態様において、幹細胞は、人工多能性幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉性幹細胞、多能性幹細胞を含むがこれらに限定されない。1つの態様において、幹細胞は、ヒト起源である。別の態様において、幹細胞は、ブタ起源である。
【００３９】
全能性（totipoent）（全能性（omnipotent）としても公知）幹細胞は、胚性および胚外性細胞型に分化し得る。そのような細胞は、完全な、生きた有機体を構築し得る。これらの細胞は、卵細胞と精子細胞の融合から生じる。受精卵の最初の数回の分裂によって生ずる細胞も全能性である。多能性幹細胞は、全能性細胞の子孫であり、ほぼすべての細胞、すなわち、3つの胚葉のいずれか由来の細胞に分化し得る。分化多能性幹細胞は、多くの細胞型であるが、関係の近い細胞ファミリーのそれらのみに分化し得る。複分化能性（oligopotent）幹細胞、例えばリンパまたは骨髄幹細胞は、少数の細胞型にのみ分化し得る。単分化能性（unipotent）細胞は、それら自身である1つのみの細胞型しか生成することができないが［4］、自己再生の特性を有し、これによって非幹細胞（例えば、前駆細胞、筋幹細胞）と区別される。
【００４０】
「増殖(expansion)」は、分化を伴わない細胞の増殖を表す。
【００４１】
「前駆細胞」は、最終分化した子孫のすべてではないがいくつかの特徴を有する、幹細胞の分化の過程で生じる細胞である。定義された前駆細胞は、特定のまたは最終分化した細胞型ではなく、ある系統に拘束されている。「内皮細胞」というフレーズは、最終分化した細胞型だけでなく、最終分化していないが内皮細胞系統に拘束されている細胞も含む。
【００４２】
「分化因子」は、系統への拘束を誘導する細胞因子、好ましくは成長因子または血管新生因子を表す。
【００４３】
「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」および「ブタ（porcine）」という用語は、言い換え可能に使用され、これらは性別、サイズまたは品種に関係なく同タイプの動物を表す一般用語である。「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」および「ブタ（porcine）」という用語、例えばヒトまたはブタ遺伝子で補完されるヌルである「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」および「ブタ（porcine）」は、胚、新生児または成体であり得る（生まれたてのブタまたは幼いブタを含む）ことにも留意されたい。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ヒト化骨格筋」というフレーズは、1つまたは複数のヒト遺伝子および／またはタンパク質を発現するブタまたは非ヒト動物内の細胞または組織を表す。1つの態様において、1つまたは複数のヒト遺伝子／タンパク質を発現するブタ細胞または組織は、対応する機能的なブタ遺伝子および／またはタンパク質を発現しない。
【００４５】
遺伝子の「コード領域」は、その遺伝子の転写によって生成されるmRNA分子のコード領域と相同であるまたは相補的である、それぞれ、その遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基およびその遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
【００４６】
「対照」細胞は、試験細胞と同じ細胞型を有する細胞である。対照細胞は、例えば、試験細胞が試験されるのと正確にまたはほぼ同じときに試験され得る。対照細胞はまた、例えば、試験細胞が試験されたのと異なるときに試験され得、対照細胞の試験の結果は、試験細胞の試験によって得られた結果と比較できるように記録され得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」は、選択された効果、例えば疾患または障害の症状の軽減、を生ずるのに十分な量を意味する。組み合わせの形態の化合物、例えば複数の化合物の投与の場合、各化合物の量は、別の化合物と組み合わせて投与される場合、その化合物を単独で投与するときとは異なり得る。したがって、各化合物の実際の量は様々であり得るが、化合物の組み合わせの有効量は、その組み合わせを全体としてまとめて表すものである。「より有効」という用語は、選択された影響が、比較対象の第2の処置よりもある処置によって大きく軽減されることを意味する。
【００４８】
「コードする」は、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）または定義されたアミノ酸配列のいずれかならびにそれらに由来する生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のテンプレートとして機能する、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子、cDNAまたはmRNA内の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を表す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてあるタンパク質を生成する場合、そのタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方が、そのタンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称され得る。
【００４９】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも1つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部分、または少なくとも1つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部分である。「フラグメント」および「セグメント」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「機能的」な生物学的分子は、それを特徴づける特性を示す形態にある生物学的分子である。機能的な酵素は、例えば、その酵素を特徴づける特徴的な触媒活性を示すものである。
【００５１】
本明細書で使用される「相同」は、2つのポリマー分子間、例えば2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を表す。2つの分子の両方のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子の各々の位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置において相同である。2つの配列間の相同性は、一致するまたは相同な位置の数の一次関数である、例えば、2つの化合物配列内の位置の半分（例えば、10サブユニット長のポリマーにおける5つの位置）が相同な場合、その2つの配列は50％相同であり、90％の位置、例えば10のうちの9が一致するまたは相同な場合、その2つの配列は90％の相同性を共有している。例として、DNA配列3'ATTGCC5'および3'TATGGCは、50％の相同性を共有している。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「相同性」は、「同一性」と同義的に使用される。
【００５３】
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、Karlin and Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268）のアルゴリズムであり、これはKarlin and Altschul （1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）で改変されている。このアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれており、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のワールドワイドウェブサイトでアクセス可能であり、NCBIウェブサイトにBLASTツールを使用するユニバーサルリソールロケーターがある。本明細書に記載される核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメータを用いるNBLASTプログラム（NCBIウェブサイトにおいて「blastn」で指定されている）によってBLASTヌクレオチド検索が実施され得る：ギャップペナルティ＝5；ギャップエクステンションペナルティ＝2；ミスマッチペナルティ＝3；マッチリワード＝1；期待値10.0；およびワードサイズ＝11。本明細書に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメータを用いるXBLASTプログラム（NCBIウェブサイトにおいて「blastn」で指定されている）またはNCBI「blastp」プログラムによってBLASTタンパク質検索が実施され得る：期待値10.0、BLOSUM62採点行列。比較目的でギャップ有りのアラインメントを得るために、Altschul et al.（1997, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402）に記載されるGapped BLASTが使用され得る。あるいは、ヌクレオチド間の距離的関係（同書）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実施するために、PSI-BlastまたはPHI-Blastが使用され得る。BLAST、Gapped BLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータが使用され得る。
【００５４】
2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容してまたは許容せずに、上記と同様の技術を用いて決定され得る。パーセント同一性を計算する際、典型的に正確な一致が計上される。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「指示書」は、出版物、記録、図または本明細書で言及されている様々な疾患または障害を軽減するためのキットにおける本発明の有用性を伝達するために使用できる任意の他の表現媒体を含む。任意で、または代替的に、指示書は、哺乳動物の細胞または組織において疾患または障害を軽減する1つまたは複数の方法を説明し得る。本発明のキットの指示書は、例えば、本発明もしくはその一部を含む容器に貼り付けられ得る、または本発明もしくはその一部を含む容器と共に出荷され得る。あるいは、指示書は、指示書および化合物が受取者によって一緒に使用され得るよう、本発明を含む容器とは別に出荷され得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、RNAならびに一本鎖および二本鎖DNAおよびcDNAを含む。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語およびその類語はまた、核酸アナログ、すなわち、ホスホジエステルではない骨格を有するアナログを含む。例えば、当技術分野で公知であり、その骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であるとみなされる。「核酸」は、デオキシリボヌクレオシドから構成されるかリボヌクレオシドから構成されるかによらず、かつホスホジエステル連結から構成されるか修飾された連結、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン連結ならびにそのような連結の組み合わせから構成されるかによらず、任意の核酸を意味する。核酸という用語はまた、特に5つの生物学的に生成される塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も含む。本明細書では、ポリヌクレオチド配列を記載する上で従来的な表記法が使用されており、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5’方向と称される。新生RNA転写物への5’から3’へのヌクレオチド付加の方向は、転写方向と称される。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と称され、DNA上の参照点の5’側に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と称され、DNA上の参照点の3’側にあるDNA鎖上の配列は「下流配列」と称される。
【００５７】
「核酸コンストラクト」という用語は、本明細書で使用される場合、ゲノム法によって得られたものであるか合成法によって得られたものであるかによらず、望まれる特定の遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするDNAおよびRNA配列を含む。
【００５８】
それ以外のことが示されていない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重版であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【００５９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、通常約50ヌクレオチド以下である、短いポリヌクレオチドを表す。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわち、A、T、G、C）によって表される場合、これは「U」が「T」と置き換わったRNA配列（すなわち、A、U、G、C）も含むことが理解されるであろう。
【００６０】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって作製された人工的な制限酵素である。これらの試薬は、インサイチューでのゲノム編集のための、効率的、プログラム可能かつ特異的なDNA切断を実現する。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、配列特異的な様式でDNAに結合するタンパク質である。そのようなTALEをヌクレアーゼ（例えば、FokIエンドヌクレアーゼ）に融合することによって、極めて特異的なDNA用の「ハサミ」になる（これらの分子は、任意のDNA配列に結合するよう改変することができる）。TALENという用語は、本明細書で使用される場合、広義的であり、別のTALENからの援助がなくとも二本鎖DNAを切断することができる単量体のTALENを含む。TALENという用語はまた、同じ部位のDNAを切断するよう共同作用するよう改変されたTALENの対の一方または両方のメンバーを表すために使用される。共同作用するTALENは、DNAの利き手を参照して左側TALENおよび右側TALENと称され得る。
【００６１】
TALEN遺伝子は、構築された後、プラスミドに挿入され、次いでそのプラスミドが、標的細胞をトランスフェクトするために使用され、そこで遺伝子産物を発現させ、核に侵入してゲノムにアクセスする。TALENは、二本鎖分裂（DSB）を誘導し、任意で積載されている／予め選択された遺伝子を挿入し、これらに対して細胞に修復機構を用いて応答させることによってゲノムを編集するために使用され得る。このようにして、それらは、例えば疾患を引き起こすゲノム内の変異を修正するために使用され得る。
【００６２】
遺伝子編集を含む遺伝子操作は、当業者が利用可能な任意の方法によって、例えば標的化エンドヌクレアーゼの使用、ならびに遺伝子編集のため（例えば、所望の標的遺伝子をノックアウトするため）の相同組み換え修復（HDR）、TALEN、CRISPR（例えば、CAS9/CRISPR）、リコンビナーゼ融合分子、合成ブタ人工染色体、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはrAAVベースのシステムによって実施され得る。さらに、ノックアウトの目的で、遺伝子の不活性化のために（例えば、干渉性RNA（shRNA、siRNA、dsRNA、RISC、miRNA））または遺伝子の発現のために、様々な核酸が、細胞に導入され得る。
【００６３】
体細胞核移植（SCNT）は、体細胞および卵細胞から生きた胚を作製する研究技術である。体細胞核移植のプロセスでは、2つの異なる細胞が使用される。第1は、卵子（卵／卵母細胞）としても公知の、メスの配偶子である。第2は、ヒトの身体の細胞を表す、体細胞である。皮膚細胞、脂肪細胞および肝細胞は、その一例である。ドナー卵細胞の核は取り出され、廃棄され、それが「プログラム解除」された状態とされる。体細胞の核も取り出されるがそれは維持され、除核された体細胞が廃棄される。残されるのは、一つの体細胞核と除核された卵細胞である。次いでこれらを、体細胞核を「空の」卵子に吹き付けることによって融合させる。卵に導入された後、体細胞核は、その宿主である卵細胞によって再プログラムされる。ここで、体細胞の核を含んでいる卵子は、電撃により刺激され、分裂を開始するであろう。この卵は、この時点で生きており、1体のみの親由来のすべての必要とされる遺伝子情報を含む成体器官を生成することができる。発生は通常通り進み、多数回の有糸分裂の後に、この単一細胞は、元の生物と同一のゲノムを有する胚盤胞（約100個の細胞を含む初期段階の胚）（すなわち、クローン）を形成する。その後、治療目的クローニングにおいて使用するために、このクローン胚の破壊によって幹細胞が取得され得、または複製目的クローニングの場合は、さらなる発生のためにクローン胚が宿主母（偽妊娠／代理）に移植され、出産が行われる。
【００６４】
「キメラ」は、遺伝的に異なる細胞から構成される単一の生物を表す。
【００６５】
「ヒト化」は、そのタンパク質配列および遺伝子の相補鎖が非ヒト宿主よりもヒトのそれに類似する非ヒト動物から収集された器官または組織を表す。
【００６６】
「器官」は、共通の機能を発揮するようある構造単位に参加した組織の集合体を表す。本明細書で使用される「組織」は、一体となって特定の機能を発揮する同じ起源の類似細胞の集合体を表す。
【００６７】
ヌル欠損性生物は、同じ遺伝子に関して2つの変異または欠失対立遺伝子を有する。変異／欠失対立遺伝子は、完全な機能喪失対立遺伝子または「ヌル」対立遺伝子の両方であり、したがってホモ接合性ヌルまたはヌル欠損性は同義語である。
【００６８】
遺伝子ノックアウト（略称：KO）は、生物の対立遺伝子の両方を非機能的にする（その生物からノックアウトする）遺伝子技術である。ノックアウト、不活性化および破壊という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、その遺伝子発現産物が除去されるまたは大きく減少するよう標的化された部位が変更されることを意味する。ノックアウト生物または単にノックアウトとしても公知である。この用語はまた、遺伝子を「ノックアウトする」というように、そのような生物を作製するプロセスも表す。この技術は本質的に、遺伝子のノックインの逆である。
【００６９】
遺伝子という用語は、広義的であり、機能的な産物を生成するよう発現される染色体DNAを表す。遺伝子は、対立遺伝子を有する。遺伝子編集は、単対立遺伝子的または両対立遺伝子的な編集である。
【００７０】
2つのポリヌクレオチドを「機能的に連結されている」と表現することによって、その2つのポリヌクレオチドの少なくとも一方が、それを他者に対して特徴づける生理学的効果を発揮することができるように、一本鎖または二本鎖核酸部分がその核酸部分内に配置された2つのポリヌクレオチドを含んでいることが意味される。例として、遺伝子のコード領域に機能的に連結されたプロモーターは、そのコード領域の転写を促進することができる。
【００７１】
「組み換えポリヌクレオチド」は、自然界では接続されてひとつになっていない配列を有するポリヌクレオチドを表す。増幅または構築された組み換えポリヌクレオチドは、適当なベクターに含まれ得、そのベクターが、適当な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【００７２】
組み換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）としての役割も果たし得る。
【００７３】
組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」と称される。組み換え宿主細胞において発現される、組み換えポリヌクレオチドを含む遺伝子は、「組み換えポリペプチド」を生成する。
【００７４】
「組み換え細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。そのような細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。また、トランスジェニック細胞は、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、トランスジェニック胚性幹細胞由来のキメラ哺乳動物から得られる、導入遺伝子を含む細胞、トランスジェニック哺乳動物またはそれらの胎生もしくは胎盤組織から得られる細胞、および導入遺伝子を含む原核細胞を含むがこれらに限定されない。
【００７５】
「調節する」という用語は、関心対象の機能または活性を刺激することまたは阻害することのいずれかを表す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、本発明からの利益を享受するであろう患者、動物、哺乳動物またはヒトである。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「実質的に相同なアミノ酸配列」は、参照抗体鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％の相同性、好ましくは少なくとも約96％の相同性、より好ましくは少なくとも約97％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約98％の相同性、そして最も好ましくは少なくとも約99％またはそれ以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列の類似性または同一性は、BLAST（basic local alignment search tool）2.0.14アルゴリズムを採用するBLASTPおよびTBLASTNプログラムを使用することによって算出され得る。これらのプログラムで使用されるデフォルト設定は、本発明の目的で実質的に類似のアミノ酸配列を同定するのに適している。
【００７８】
「実質的に相同な核酸配列」は、参照核酸配列によってコードされるペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するペプチド、例えば、そのペプチドの機能に実質的に影響しないアミノ酸にのみ変化が生じているペプチド、をコードする、参照核酸配列に対応する核酸配列を意味する。好ましくは、実質的に同一の核酸配列は、参照核酸配列によってコードされるペプチドをコードする。実質的に類似の核酸配列と参照核酸配列の間の同一性の比率は、少なくとも約50％、65％、75％、85％、95％、99％またはそれ以上である。核酸配列の実質的同一性は、2つの配列の配列同一性を比較することによって、例えば、物理的／化学的方法（すなわち、ハイブリダイゼーション）によってまたはコンピュータアルゴリズムを通じた配列アラインメントによって、決定され得る。ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列と実質的に類似するかどうかを決定するための適当な核酸ハイブリダイゼーション条件は：7％ドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、および2X標準生理食塩水クエン酸（SSC）、0.1% SDS、50℃での洗浄；好ましくは7％（SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃、および1X SSC、0.1％SDS、50℃での洗浄；好ましくは7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、および0.5X SSC、0.1％SDS、50℃での洗浄；より好ましくは、7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃、および0.1X SSC、0.1％SDS、65℃での洗浄、である。2つの核酸配列間の実質的類似性を決定するための適当なコンピュータアルゴリズムは、GCSプログラムパッケージ（Devereux et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12:387）およびBLASTNまたはFASTAプログラム（Altschul et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 87:14:5509-13; Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215:3:403-10; Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を含む。これらのプログラムで提供されるデフォルト設定は、本発明の目的で核酸配列の実質的類似性を決定するのに適している。
【００７９】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない多くのベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移送または送達を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組み換えウイルスベクター等を含むがこれらに限定されない。非ウイルスベクターの例は、リポソーム、DNAのポリアミン誘導体等を含むがこれらに限定されない。
【００８０】
従来的な分子生物学技術を利用する方法が本明細書に記載されている。そのような技術は一般に当技術分野で公知であり、方法論の論文、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な更新あり）に詳細に記載されている。核酸の化学合成法は、例えば、Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts 22: 1859-1862, 1981およびMatteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981で議論されている。
【００８１】
「含む（comprises）」、「含む（comprising）」等の用語は、米国特許法においてそれらが有する意味を有し得、かつ「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得る。本明細書で使用される場合、「含む（including）」または「含む（includes）」等は、非限定的に含むことを意味する。
【００８２】
外来器官／組織の生成
ヒト化された大型動物モデルは、再生医療のリソースであり、個人向けヒト化ブタモデルのプラットフォームとして機能するであろう。このストラテジーは、現在の臨床実務のパラダイムを慢性筋骨格疾患および移植用に変換するであろう。ブタ骨格筋の除去は、大型動物モデルにおいてヒト化骨格筋を作製することを目指しているという理由だけでなく、免疫拒絶を回避する新規のアプローチであり、外来器官作製ストラテジーに広く適用可能であるという理由から、唯一の存在である。
【００８３】
現在、進行性の筋衰弱、筋骨格疾患（例えば、筋ジストロフィー等の遺伝病）またはサルコペニア（加齢プロセスに伴う筋肉の衰弱および萎縮）に対しては限定的な治療しか利用可能でない。いくつかの例において、進行した最終段階の臓器不全または状態／疾患を処置する必要のある組織に対する唯一の明確な治療は、移植である。移植の制限要因は、ドナー器官／組織の入手性である。数百または数千の患者がそのような治療からの利益を享受できるが、彼らの合併症が理由で適切な移植候補とならない。したがって、死体または生体に関連するドナー器官／組織には大きな短所がある。さらに、器官または組織の移植は、生涯にわたる免疫抑制を必要とし、これもまた有害な副作用を有する。本明細書には、ブタにおけるヒト化組織、特に筋肉組織の作製が記載されており、これは移植のための全筋の無制限の供給源として機能し、多くの疾患および／または疾患状態の処置にパラダイムシフトをもたらすプラットフォームを提供するであろう。
【００８４】
異種移植が注目を集めている。例えば、ラット膵臓が、胚盤胞補完プロセスによってマウスにおいて作製された（27）。これらの研究において、膵臓発生のマスター調節遺伝子であるPdx1に関する胚盤胞変異体が、野生型（Wt）ラット由来の多能性幹細胞（rPSC）に注射された（27）。代理マウス母獣へのrPSC注射胚盤胞の導入により、ラット細胞から構成される機能的な膵臓を有するマウスキメラが誕生した。これらの研究は、その胚が標的器官／組織を完全に欠くよう鍵となる発生調節因子に欠陥を有する胚盤胞の作製を実証した。これらの変異宿主は、その後、健常なドナー幹細胞が増殖し、ドナー由来器官および／または組織を生成するための発生上の「ニッチ」を提供する。この胚盤胞補完ストラテジーはまた、げっ歯類において腎臓、胸腺および肝臓、ならびに最近、ブタにおいて膵臓等の器官も生成した（28〜31）。
【００８５】
遺伝子編集プラットフォームを用いて、器官および／または組織欠損ブタが生成するよう様々な発生遺伝子を変異させることができ、その中で外来器官および／または組織を生成するために胚盤胞補完が実施され得る。このシステムの能力により、多くの遺伝子を実験的に試験することができる。複数の調節遺伝子の同時修飾は、複雑な組織オントロジーの調節を可能にする。
【００８６】
筋疾患／障害
筋肉は、運動を助け、身体の動作を助ける。異なるタイプの筋肉は、異なる役割を有する。筋肉に影響を及ぼし得る問題は多く存在する。筋肉障害は、衰弱、疼痛または麻痺さえも引き起こし得る。
【００８７】
筋疾患／障害の原因は、損傷または酷使、例えば捻挫または緊張、けいれんまたは腱炎；遺伝的障害、例えば、筋ジストロフィー、癌、炎症、例えば筋炎、筋肉に影響する神経の疾患、感染および特定の医薬を含む。
【００８８】
ミオパシーは、筋繊維が多くの理由のいずれか1つのために機能せず、筋肉の衰弱を引き起こす筋疾患である。「ミオパシー」は、単に筋肉の疾患を意味する（myo-ギリシャ語μυο「筋肉」＋pathos -pathyギリシャ語「罹患する」）。この意味は、その主要な欠陥が、神経（「ニューロパシー」もしくは「神経性」障害）またはその他の箇所（例えば、脳等）ではなく、筋肉内にあることを暗示している。筋肉のけいれん、凝りおよび発作もまた、ミオパシーに付随し得る。
【００８９】
筋疾患は、本質的に神経筋系または筋骨格系に分類され得る。いくつかの状態、例えば筋炎は、神経筋系および筋骨格系の両方とみなされ得る。
【００９０】
全身疾患におけるミオパシー（筋ジストロフィーとしても公知）は、遺伝性（生まれつき症状を示すもの）、内分泌性、炎症性（例えば、皮膚筋炎、多発筋炎、封入体筋炎によって引き起こされる炎症性ミオパシー）、ウイルス性（HIV）、腫瘍随伴性、感染性、薬物および毒物誘導性（例えば、アルコール、コルチコステロイド、麻酔薬、コルヒチン、クロロキン）、重度ミオパシー、代謝性、腫瘍随伴性ミオパシー、コラーゲン関連ならびに他の全身障害を伴うミオパシーを含む、いくつかの異なる疾患プロセスから生じる。全身性ミオパシー患者はしばしば、急性的または亜急性的に症状を示す。他方、家族性ミオパシーまたはジストロフィーは一般に、症状がときに急性的に蓄積され得る代謝性ミオパシーを除いて、慢性的様式で発症する。炎症性ミオパシーのほとんどは、悪性病巣を伴う可能性を有し得、その発生率は、皮膚筋炎患者において特に高いようである。
【００９１】
ミオパシーには多くのタイプがある。
【００９２】
遺伝型は以下のものを含む：ジストロフィー（（または筋ジストロフィー）は、筋肉の衰退および再生によって特徴付けられるミオパシーのサブグループである。臨床的に、筋ジストロフィーは典型的に、筋肉の再生能力が最終的に失われることから進行性であり、進行性の衰弱を引き起こし、しばしば車椅子の使用が必要になり、そして最終的に、通常呼吸衰弱に関連して死亡する）、ミオトニー、神経ミオトニー、先天性ミオパシー（進行性のジストロフィープロセス（すなわち、筋肉の死）または炎症のいずれの証拠も示さないが、その代わりに筋肉の収縮能の低下を伴う特徴的な微視的変化が見られる）。先天性ミオパシーは、ネマリン・ミオパシー（筋肉における「ネマリン桿状体」の存在によって特徴付けられる）、マルチ／ミニコアミオパシー（筋繊維内の複数の小さな断絶「コア」または領域によって特徴付けられる）、中心核ミオパシー（または筋細管ミオパシー）（筋繊維の中心に核が異常なほど見出される、稀な筋肉消耗性障害である）、ミトコンドリア・ミオパシー（筋肉のエネルギー源を提供するミトコンドリアの欠陥に起因する）、家族性周期性四肢麻痺、炎症性ミオパシー（免疫系が筋肉の成分を攻撃する問題によって引き起こされ、筋肉に炎症の兆候があらわれる）、代謝性ミオパシー（主として筋肉に影響する生化学的代謝の欠陥から生じる）、糖原病（筋肉に影響し得る）および／または脂質蓄積障害を含むがこれらに限定されない。
【００９３】
後天型は以下のものを含む：外部物質誘導ミオパシー、薬物誘導ミオパシー、グルココルチコイド・ミオパシー（は、筋肉タンパク質の分解を増加させ筋萎縮を引き起こすこのクラスのステロイドによって引き起こされる）、アルコール性ミオパシー、他の毒物に起因するミオパシー、皮膚筋炎は筋肉の衰弱および皮膚の変化をもたらす；多発筋炎は筋肉の衰弱をもたらす、封入体筋炎（は、握力および膝伸ばしの低下をもたらすゆるやかに進行する疾患である）、骨化性筋炎、横紋筋融解症および／またはミオグロブリン尿症。
【００９４】
MYF5/MYOD/MRF4
MYF5/MYOD/MRF4を変異させ、骨格筋系統欠損ブタ胚（MYF5/MYOD/MRF4ヌルブタ胚；詳細については実施例2を参照のこと）を作製した。具体的に、E18およびE24で収集した胚は、筋節にデスミンが存在しなかったが、心臓のデスミンは保存されていた。さらに、GFP標識ブタ割球をヌル胚盤胞に注射することによるブタ：ブタ補完が、PCR、組織学および免疫組織学的アプローチを用いて実証された。これらの補完された胚において、GFPは、デスミンと共に体節に共局在化された（E24）。MYF5/MYOD/MRF4の多遺伝子編集を行うことで、多能性を有するブタ幹細胞を用いて筋肉と共に増殖され、野生型ブタ骨格筋を生成する寛容なニッチが作製された。MYF5/MYOD/MRF4を欠くこの遺伝子編集ブタモデルは、その変異桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を送達した後にヒト化骨格筋を生成するために使用されるであろう。
【００９５】
ヒト化された大型動物モデルは、再生医療の重要なリソースであり、個人向けの器官を作製するためのプラットフォームとして機能するであろう。このストラテジーは、現在の臨床実務のパラダイムを筋疾患および移植用に変換するであろう。現時点で、器官の外部移植は、マウスとラット（27,29）およびブタとブタ（31）の間で行われており、大型動物モデルにおけるヒト化器官の発生の成功は報告されていない。米国仮出願第62/247,092号、同第62/247096号および同第62/247,122号が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９６】
以下の実施例は、本発明の特定の態様をさらに説明することを意図しており、いかなる様式によっても本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【００９７】
実施例1
材料および方法
雌性ブタ：家畜用母体雌性ブタ（8〜12月齢）を、胚移植用レシピエントとして使用し、承認されたIACUCプロトコルの下で予定されている妊娠および分娩において通常の家畜用ブタとして世話および維持する。
【００９８】
発情同期化および授精：発情を同期化するため、雌性ブタに、その発情周期の第11〜22日に、朝の飼料に混合された6.8mLのMatrix（アルトレノジスト 2.2mg/mL）を与える。Lutalyse（2cc）を、Matrixの最終日および4日後にIM投与する。Matrix投与の終了の6日後から1日2回、雌性ブタを発情についてチェックする。最初に発情が検出された後、最大3回、雌性ブタを、選択された雄性ブタの精液を用いて授精させる。リニア5mHzトランスデューサーを用いたドップラー超音波検査または経腹超音波検査のいずれかを用いて、妊娠の23〜90日の間、雌性ブタを妊娠についてチェックする。いずれの形態の超音波検査も侵襲的ではなく、雌性ブタまたは胎児に危害を与えない。獣医の要望で疾患が存在しないかどうかを決定するためにまたは遺伝的分析のために、妊娠雌性ブタから血液サンプルが採取され得る。
【００９９】
胚移植：再構築クローン化胚を、非同期レシピエント雌性ブタの子宮に外科的に移植する。外科的胚移植において、以下の組み合わせを用いて麻酔を誘導する：ケタミン（2 mg/kg）、チレタミン／ゾラゼパム（0.25 mg/kg）、キシラジン（1 mg/kg）およびアトロピン（0.03 mg/kg；すべてIowa Veterinary Supply製）。イソフルランまたはセボフルランを用いて、この手順の残りの期間、全身麻酔を維持する（5％誘導、手術台上で保持するために1〜4％で維持）。仰向け（dorsal recumbence）の状態で、レシピエントは、無菌的に手術の準備をされ、子宮、卵管および卵巣を含む生殖器官を露出および試験するために尾側腹部切開が行われる。典型的に、5.5インチTomCat（登録商標）カテーテル（Iowa Veterinary Supply）を用いて150〜200個の再構築クローン化胚を、卵管の峡部に設置する。子宮を腹腔に戻し、レシピエント動物を縫合し、術後回復に供する。妊娠中、3.5 MHz経腹プローブを装着したAloka 500 Ultrasound Scanner（Aloka Co. Ltd, Wallingford, CT）を用いるリアルタイム超音波試験を使用して、妊娠を確認およびモニタリングする。レシピエントの飼育は、妊娠雌性ブタとして維持されるであろう。子ブタの出産のために、レシピエントに自然分娩させるかまたは妊娠第118日より前に帝王切開により取り出す。必要な場合、Nurtinger飼育施設を含む初乳給与および集中新生児サポートが利用可能である。
【０１００】
Myf5、MyodおよびMrf4は筋形成のレギュレーターである
Myod、Myf5、Mrf4およびMyogを含むMyodファミリーの発見は、骨格筋形成の調節メカニズムを理解するための土台を提供する（6〜8）。
【０１０１】
筋形成時のMyodファミリーの調節ネットワークを調査するために、複数のストラテジー、例えば、トランスクリプトーム分析、プロモーター分析およびChIP-seqが使用された（6〜7；10）。Myodファミリーのメンバーは、筋原性細胞運命を推進するために筋肉特異的遺伝子、転写因子、細胞周期遺伝子等を含む広範囲の遺伝子ファミリーを転写活性化する、マスター筋原性レギュレーターである（6〜7；10〜11）。以前の遺伝子破壊研究は、Myf5/Myod/MRF4を欠くマウスが骨格筋を有さず、おそらく呼吸不能により（横隔膜の欠如により）誕生後すぐに死亡することを実証した（8）。
【０１０２】
MYOD、MYF5およびMRF4をノックアウトするためのTALENおよび相同組み換え修復（HDR）の利用
ブタにおけるMYF5/MYOD/MRF4（MYF6としても公知）の役割を試験するため、各コード配列を、ブタ線維芽細胞においてその遺伝子に隣接する2つのTALEN対を用いて除去した（図3）。
【０１０３】
MYF5/MYOD/MRF4ノックアウトブタ胚は骨格筋系統を欠く
MYF5/MYOD/MRF4ヌル胚をE18.0で収集し、分析した（図4Aおよび4B）。このヌル体では、Wt胚と比較して、筋節発生が損なわれ、デスミンは存在しない。これに対して、心臓デスミンはこのヌル体において保存されており、このことはこの遺伝子編集の特異性を示している。マウスおよびブタにおける結果は、同様の表現型を反映しており、変異胚が骨格筋を欠いていることから、MYF5/MYOD/MRF4の機能がマウスとブタの間で保存されているという考えを支持している。これらのデータは、2つ以上の細胞型でヒト化されるであろうキメラ器官の成長を支持するためにブタゲノムに複数の変異を導入できることを示している。
【０１０４】
GFP WTブタ割球を用いたMYF5/MYOD/MRF4ノックアウト表現型の補完
SCNTを用いてブタMYF5/MYOD/MRF4ヌル胚盤胞を作製し、これにGFP標識ブタ割球を注入した（検証済みのブタES細胞が入手可能でなかったため、この実験では割球を使用した）。得られたキメラを、偽妊娠雌性ブタに移植し、E20で試験した。肝臓および卵黄嚢がGFP陽性であったことにより、補完の実現性が実証された。加えて、PCR分析により、ブタMYF5/MYOD/MRF4ヌル胚盤胞の約10％が、GFP標識されていた。これらのデータは、このブタ変異宿主におけるブタ：ブタ補完の実現性を支持している。
【０１０５】
ブタ単為生殖性胚盤胞の内部細胞塊へのヒト人工ヒト多能性幹細胞（hiPSC）の導入、およびヒト幹細胞ドナーの選別
ヒト・ブタキメラの作製を実証するさらなるデータを提供する。ヒト臍帯血幹細胞（hUCBSC）およびhiPSCの能力を、ブタ胚盤胞に導入され胚発生に参加するそれらの能力について試験した。ブタ単為生殖性胚盤胞を、卵母細胞の電気刺激を用いて作製した（そしてこれらは妊娠中期を超えて生きられない）。活性化から６日後、9〜12の色素標識されたhUCBSCまたはhiPSCを卵割腔に注射した。胚盤胞を2日間培養下で回復させ、その後に画像化した（図5）。標識hUCBSCおよびhiPSCが、ブタ胚盤胞の90％の内部細胞塊において観察された（それぞれ、図5Aおよび5B）。ヒト核抗原特異的抗体（HNA）を用いた免疫組織化学によるDil分布の比較は、HNA抗体が、注射されたヒト幹細胞を検出することを明らかにした（図5A、矢印）。EdU標識hiPSCを注射された胚盤胞をBrdUで1時間さらにパルスし、その後に増殖性細胞の検出のために収集した。EdUによる二重染色は、注射されたヒト幹細胞が注射から48時間後も増殖し続けていることを明らかにした（図5B、矢印）。これらの結果は、ブタ胚盤胞のICMへのヒト幹細胞の導入、および子宮への移植の準備におけるキメラ胚盤胞の孵化段階への発生の進行を実証している。
【０１０６】
新しい遺伝子編集ストラテジーをブタにおいて使用し、データはhiPSCが発生期のブタ胚（桑実胚または胚盤胞）に関係し得ること示している。したがって、ヒト幹／前駆細胞集団は、MYF5/MYOD/MRF4変異ブタ胚を救済することができる。幹細胞、例えばhiPSCは、MYF5/MYOD/MRF4変異早期胚においてあらゆる骨格筋細胞の前駆体となり得る。
【０１０７】
最近の研究は、鍵となる調節遺伝子を欠く遺伝的に変異させた宿主を用いた胚盤胞補完ストラテジーにより、ブタにおいてドナー器官が作製されたことを示している（1〜4）。本明細書では、ブタ胚においてMYF5/MYOD/MRF4を首尾よくノックアウトするためにTALENを通じた技術（21,22）を使用し、データは、これらの変異胚が筋節およびデスミンを欠くという考えを支持している（図4）。本明細書は、WT-GFP標識ブタ割球がブタMYF5/MYOD/MRF4ヌル宿主に骨格筋系統を導入する（図6）証拠を提供し、このことはMYF5/MYOD/MRF4が骨格筋補完のための宿主を作製する上で理想的な標的であることを示している。データはさらに、ヒト幹細胞（ヒト臍帯血幹細胞およびヒトiPSC）がブタ単為生殖体のICMに導入され得るという考えを支持している（図5）。
【０１０８】
実施例2
材料および方法
TALENの設計および作製
候補TALEN標的DNA配列およびRVD配列は、オンラインツール「TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER 2.0」を用いて特定した。次いで、TALEN DNAトランスフェクションまたはインビトロTALEN mRNA転写のためのプラスミドを、最終目標ベクターとしてRCIscript-GOLDYTALEN（Addgene ID 38143）を用いるGolden Gate Assemblyプロトコル（Carlson 2012）にしたがい構築した。QIAPREP SPIN MINIPREPキット（Qiagen）を用いて調製した構築したRCIscriptベクターを、以前に示された（Carlson, 2009）ようにmMESSAGE mMACHINE（登録商標）T3キット（Ambion）を用いるインビトロTALEN mRNA転写におけるテンプレートとして使用するために、SacIにより直鎖状にした。得られたmRNAを、MEGACLEAR REACTION CLEANUPキット（Applied Biosciences）またはRNeasyキット（Qiagen）を用いる精製の前にDNAse処理した。
【０１０９】
組織培養およびトランスフェクション
ブタ線維芽細胞は、（示されているように）摂氏37または30度、5％CO2下、10％ウシ胎仔血清、100 I.U./mLペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L-グルタミンおよび10mM Hepesを補充したDMEM中で維持した。Neon Transfectionシステム（Life Technologies）を使用して、TALENおよびHDRオリゴを送達した。70〜100％コンフルエンスの低継代OssabawまたはLandraceブタ線維芽細胞を、1：2に分割し、次の日に70〜80％コンフルエンスで収集した。約600,000細胞を、mRNA TALENおよびHDRオリゴを含む"R"Buffer（Life Technologies）中に再懸濁し、100μLチップ内で以下のパラメータを用いて電気穿孔した：入力電圧：1800V；パルス幅：20ms；パルス数：1。関心対象の特定の遺伝子につき0.1〜4 ugのTALEN mRNAおよび0.1〜0.4 nmolのHDRオリゴを各トランスフェクションに含めた。トランスフェクトされた細胞を摂氏30度で2〜3日間培養し、その後に遺伝子編集効率について分析し、コロニー形成のためにプレーティングした。
【０１１０】
希釈クローニング
トランスフェクションの2または3日後に、50〜250個の細胞を10cmディッシュに播種し、個々のコロニーが約5mm径に達するまで培養した。8 mLのTrypLEおよびDMEM培地の1：4（vol/vol）混合物（Life Technologies）を添加し、コロニーを吸引し、48ウェルディッシュおよびレプリカの96ウェルディッシュのウェルに移し、同一条件下で培養した。凍結保存のためおよび遺伝子タイピング用のサンプル調製のために、コンフルエンスに達したコロニーを収集した。
【０１１１】
サンプル調製
第3および10日のトランスフェクト細胞集団を、6ウェルディッシュのウェルから回収し、10〜30％を、200μg/mlプロテイナーゼKを直前に補充した50μlの1X PCR適合溶解緩衝液：10mM Tris-Cl pH 8.0、2mM EDTA、0.45％ Tryton X-100（vol/vol）、0.45％ Tween-20（vol/vol）に再懸濁させた。その溶解産物を、サーマルサイクラーで以下のプログラムを用いて処理した：55℃で60分間、95℃で15分間。
【０１１２】
遺伝子編集の分析
意図する部位に隣接するPCRを、AccuStart（商標）Taq DNA Polymerase HiFi（Quanta Biosciences）および1μlの細胞溶解産物を製造元の推奨にしたがい用いて行った。集団内の変異頻度を、上記のように10μlのPCR産物を用いて製造元の推奨にしたがうSURVEYOR MUTATION DETECTION Kit（Transgenomic）により分析した。SURVEYOR反応物を、10％ TBEポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。バンドの濃度測定を、ImageJを用いて行い、SURVEYOR反応物の変異率を、（Guschin et al. 2010）に記載されるようにして計算した。個々のコロニーを、ssMYODにおけるHDR対立遺伝子についてはプライマーssMYOD NJ F2とssMYOD NJ R2を、ssMYF5におけるHDR対立遺伝子についてはssMYF5 NJ F1とssMYF5 NJ R1を、ssMYF6におけるHDR対立遺伝子についてはssMYF6 NJ F1とssMYF6 NJ R1を用いてHDR対立遺伝子の存在についてスクリーンした。得られたPCR増幅産物をHindIIIで消化することによって、PCR産物を制限酵素断片長多型分析（RFLP）に供し、対立遺伝子の一方、両方が切断されたかまたはいずれも切断されなかったか、したがってHDR対立遺伝子を含んでいたかどうかを決定した。生成物を、アガロースゲル上で分離した。
【０１１３】
ブタ遺伝子：MYOD NC_010444
ヒト遺伝子：MYOD ENSG00000129152
フレームシフトKO対立遺伝子：ssMYODのエクソン1にフレームシフトおよび未成熟停止コドンを導入する
TALEN：
ssMYOD 1.2（5’から3’に向かって）
左側：
2018522553.tif 000003
右側：
2018522553.tif 000004
ssMYOD 1.2 HDRオリゴ
2018522553.tif 000005
下線＝MYOD 1.2切断部位の右側から52bpの相同領域
太字＝MYOD 1.2切断部位の左側から33bpの相同領域
斜体＝挿入された塩基
下線＝HindIII部位
大文字＝未成熟終止コドン
ssMYOD NJ F2からssMYOD NJ R2までの全長
スクリーニングプライマー：
2018522553.tif 000006
これはHDRが生じたときに予想されるPCR産物である：
2018522553.tif 000007
これは野生型対立遺伝子の予想されるPCR産物である：
2018522553.tif 000008
【０１１４】
ブタ遺伝子：MYF5 ENSSSCG00000000937
ヒト遺伝子：MYF5 ENSG00000111049
フレームシフトKO対立遺伝子：ssMYF5のエクソン1にフレームシフトおよび未成熟停止コドンを導入する
TALEN：
ssMYF5 1.1（5’から3’に向かって）
左側：
2018522553.tif 000009
右側：
2018522553.tif 000010
ssMYF5 1.1 HDRオリゴ
2018522553.tif 000011
下線＝MYF5 1.1切断部位の右側から42bpの相同領域
太字＝MYF5 1.1切断部位の左側から43bpの相同領域
斜体＝挿入された塩基
下線＝HindIII部位
大文字＝未成熟終止コドン
ssMYF5 NJ F1からssMYF5 NJ R1までの全長：
スクリーニングプライマー：
2018522553.tif 000012
これはHDRが生じたときに予想されるPCR産物である：
2018522553.tif 000013
これは野生型対立遺伝子の予想されるPCR産物である：
2018522553.tif 000014
【０１１５】
ブタ遺伝子：MYF6 ENSSSCG00000026533（MRF4としても公知）
ヒト遺伝子：MYF6 ENSG00000111046
フレームシフトKO対立遺伝子：ssMYF6のエクソン1にフレームシフトおよび未成熟停止コドンを導入する
TALEN：
ssMYF6 1.2（5’から3’に向かって）
左側：
2018522553.tif 000015
右側：
2018522553.tif 000016
ssMYF6 1.2 HDRオリゴ
2018522553.tif 000017
下線＝MYF6 1.2切断部位の右側から32bpの相同領域
太字＝MYF6 1.2切断部位の左側から54bpの相同領域
斜体＝挿入された塩基
下線＝HindIII部位
大文字＝未成熟終止コドン
ssMYF6 NJ F1からssMYF6 NJ R1までの全長：
スクリーニングプライマー：
2018522553.tif 000018
これはHDRが生じたときに予想されるPCR産物である：
2018522553.tif 000019
これは野生型対立遺伝子の予想されるPCR産物である：
2018522553.tif 000020
【０１１６】
参考文献一覧
2018522553.tif 000021
【０１１７】
本明細書の開示を通じて参照されているすべての刊行物、特許および特許出願、Genbank配列、ウェブサイトならびに他の公開されている資料は、各々個々の刊行物、特許または特許出願、Genbank配列、ウェブサイトおよび他の公開されている資料が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているものとして、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる用語の定義が本明細書で定義されている用語と相反する場合、本明細書が優先される。
【図１】
2018522553.tif 000023
【図２】
2018522553.tif 000024
【図３Ａ】
2018522553.tif 000025
【図３Ｂ】
2018522553.tif 000026
【図３Ｃ】
2018522553.tif 000027
【図４】
2018522553.tif 000028
【図５】
2018522553.tif 000029
【図６】
2018522553.tif 000030
【国際調査報告】
2018522553.tif 000031
2018522553.tif 000032
2018522553.tif 000033