(57)【要約】  本発明は、ｅ１ループ内に式ＸｐＺｑＸｒの配列を有するＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含むタンパク質であって、Ｘは負電荷のアミノ酸残基であり、Ｚは正電荷のアミノ酸残基であり、並びにｐ、ｑ及びｒは各々独立して１〜１２の整数であり、並びに糖がＺ残基に結合しているタンパク質を提供する。前記タンパク質は、ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含み得、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーは、ｅ１ループに結合した糖を有する。第一のコピーはｅ１ループに結合した糖を有し得、第二のコピーはｅ１ループにおけるペプチド・エピトープを含み得る。前記タンパク質は、前記糖に対する免疫応答を誘導するために使用することができ、それゆえ、ワクチンとして作用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅ１ループ内に式ＸｐＺｑＸｒの配列を有するＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含むタンパク質であって、Ｘは負電荷のアミノ酸残基であり、Ｚは正電荷のアミノ酸残基であり、並びにｐ、ｑ及びｒは各々独立して１〜１２の整数であり、並びに糖がＺ残基に結合しているタンパク質。
【請求項２】
ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーは、ｅ１ループ内に請求項１において定義された式ＸｐＺｑＸｒの配列を有し、及び糖がＺ残基に結合しているタンパク質。
【請求項３】
ＨＢｃＡｇの第一のコピーが、ｅ１ループ内に請求項１において定義された式ＸｐＺｑＸｒの配列を有し、及び糖がＺ残基に結合し、並びに第二のコピーが、ｅ１ループ内にタンパク質エピトープを含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
Ｚがリジン又はアルギニンである、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｘがアスパラギン酸又はグルタミン酸である、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
Ｚがリジンであり、Ｘがアスパラギン酸である、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
ｐ、ｑ及びｒが各々独立して１〜６の整数である、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
ｐとｒの合計がｑと等しい、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
ｐが３であり、ｑが６であり及びｒが３である、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
Ｘがアスパラギン酸であり、Ｚがリジンであり、ｐが３であり、ｑが６であり及びｒが３である、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記式ＸｐＺｑＸｒの配列に複数のアラニンが隣接する、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記糖又は（複数の）糖が細菌由来である、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａである、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉである、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記糖又は（複数の）糖が、一般的な莢膜多糖（ＣＰＳ）を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記糖又は（複数の）糖が、１−３結合２−Ｏアセチル−６−デオキシ−β−Ｄ−マンノ−ヘプトピラノースの、分枝していないホモポリマーを含む、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質エピトープが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ由来である、請求項３〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質エピトープが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ由来である、請求項３〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質エピトープが、ＬｏｌＣ、ＰｏｔＦ、ＯｐｐＡ、Ｒｐ１、Ｒｐ２、Ｏｍｐ８５又はＨｃｐ２由来である、請求項３〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＨＢｃＡｇの前記タンデムコピーが、リンカーで連結されている、請求項２〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記リンカーが、少なくとも１．５ｎｍの長さである、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記リンカーが、複数コピーのＧｌｙｎＳｅｒ（ＧｎＳ）（ｎは２〜８である）配列を含む、請求項２０又は２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記ＨＢｃＡｇが、ＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＡｌａＡｌａＡｌａ（ＡＡＡＬＡＡＡ；配列番号３）配列を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
上記の請求項のいずれか一項に記載されているタンパク質を複数コピー含む粒子。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載されているタンパク質を産生する方法であって、前記方法がｅ１ループに糖を結合することを含む方法。
【請求項２６】
前記糖を還元的アミノ化によって、ｅ１ループに結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記糖を酸化し、ｅ１ループにおいて、第一級アミンに還元的にアミノ化される、末端のアルデヒド残基を生成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項２４に記載の粒子、及び医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
ヒト又は動物の身体のワクチン接種の方法において使用するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項２４に記載の粒子。
【請求項３０】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａに対する、ヒト又は動物の身体のワクチン接種の方法において使用するための、請求項２９に記載のタンパク質又は粒子。
【請求項３１】
ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬の製造のための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項２４に記載の粒子の使用。
【請求項３２】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａに対するワクチン接種のための、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
被検体における免疫応答を誘導する方法であって、前記方法が、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項２４に記載の粒子を、被検体に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａに対する免疫応答を誘導するための、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅ１ループに糖が結合した、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含むタンパク質、糖が結合した該タンパク質を産生する方法、該タンパク質を含む医薬組成物及び被検体における免疫応答を誘導するための該タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）タンパク質は、特徴的な「スパイク」構造を形成する、２つの逆平行α-ヘリックスからなる、ややユニークな構造を有する。次いで、２つのＨＢｃ分子は、１対のスパイク・バンドル（spike bundle）を形成するように、自発的に二量体化する。このバンドルは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構成要素（building block）である。その高度に反復する配列が複数コピーの抗原を送達するので、ＶＬＰは魅力的なワクチンシステムである。更に、ウイルス核酸が欠落することによって、それらは特に安全なベクターとなる。抗原性配列が挿入され得る幾つかの部位を有するために、ＨＢｃはワクチン担体として特に興味深い。次いで、ＨＢｃの過度な免疫原性が挿入された配列にも与えられ、それゆえ、それを免疫原性が非常に高いものとする。最適な挿入部位は、メジャー挿入領域（ＭＩＲ）である。しかし、ＭＩＲに大きいか又は疎水性配列が挿入されると、単量体ＨＢｃが二量体化できず、ＶＬＰが形成されないことが、既に示された。これによって、免疫原性が大幅に失われた。
【０００３】
細菌性の生物学的脅威をもたらす病原体（それぞれ、類鼻疽症及び鼻疽の原因となる病原体である、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）について利用可能である、認可を受けたワクチンは現在のところない。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明は、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）コア・タンパク質に基づくワクチン送達システムに関する。免疫応答が糖に対して起こり得るように、送達前にＨＢＶコア・タンパク質に糖が結合される。
従って、本発明は、ｅ１ループ内に式ＸｐＺｑＸｒの配列を有するＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含むタンパク質を提供し、ここで、Ｘは負電荷のアミノ酸残基であり、Ｚは正電荷のアミノ酸残基であり、並びにｐ、ｑ及びｒは各々独立して１〜１２の整数であり、並びに糖がＺ残基に結合している。該タンパク質は、ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含み得、ＨＢｃＡｇの一方又は両方のコピーは、ｅ１ループに結合した糖を有する。
【０００５】
本発明はまた、
-  複数コピーの本発明のタンパク質を含む粒子；
-  ｅ１ループに１以上の糖を結合することを含む、本発明のタンパク質を産生する方法；
-  本発明のタンパク質又は本発明の粒子及び医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物；
-  ヒト又は動物の身体にワクチン接種する方法において使用するための、本発明のタンパク質又は本発明の粒子；
-  ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬の製造のための、本発明のタンパク質又は本発明の粒子の使用；及び
-  被検体における免疫応答を誘導する方法であって、本発明のタンパク質又は本発明の粒子を被検体に投与することを含む方法、
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図面の簡易な説明
【図１】酵母菌溶解物の可溶画分においてタンデム・コアが見出されることを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。粗溶解物をとり（レーン３）、２０，０００×ｇでスピンし、その上清をとった（レーン４）。ペレット内のいずれのものも（レーン５）使用に適さなかった。上清を希釈し（レーン６）、次いで、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２μｍの３つのフィルターを通した（レーン７〜９）。材料は、クロスフロー・フィルターを通過させ、残余物を取り置いた（レーン１０）。これを濾過し、次いで、ＣＬ４Ｂカラムにセットした（レーン１１）。次いで、空隙容量を、Ｓ１０００カラムに通した（レーン１２）。
【図２】ＶＬＰを、ＣＬ４Ｂカラムの空隙容量から単離した（（Ｂ）の左パネルの大きいピーク）。レーン上の番号は、ＣＬ４Ｂカラムから回収した画分番号である。
【図３】次いで、ＣＬ４Ｂ空隙をＳ１０００カラムに通し、画分１２〜１５からＶＬＰを単離した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロットによって確認した。番号は、２番目のＳ１０００カラムから回収した、タンデム・コア陽性画分である。
【図４】（Ａ）銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで、タンデム・コア（＊で印を付けた）が存在するが、純度は同等の酵母菌調製物ほども高くなかったことを確認した。（Ｂ）電子顕微鏡によって、主な混入物質は、バキュロウイルス粒子そのものであると同定した。
【図５】レーンＡ：分子量マーカー、レーンＢ：未修飾ＶＬＰ、レーンＣ：修飾ＶＬＰ。
【図６】（Ａ）スクロース・クッションの模式図（一定の縮尺でない）、（Ｂ）未結合ＦＩＴＣ及び（Ｃ）ＦＩＴＣ−ＶＬＰ複合体。
【図７】レーンＡ：分子量マーカー、レーンＢ：ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、レーンＣ：ＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、レーンＤ：糖複合体（２ｍｇ／ｍｌ）及びレーンＥ：糖複合体（０．５ｍｇ／ｍｌ）。
【図８】野生型Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ細菌を感染させたマウスで生じた抗体を用いて、ＬｏｌＣインサートを有するＶＬＰを、ＥＬＩＳＡで検査した。３０ｕｇ／ｍｌの値を有するＶＬＰ  ＬｏｌＣに相当する線は、平均ＯＤ１．６〜１．８の間に位置する。３０ｕｇ／ｍｌの値を有するアンローデッド（unloaded）ＶＬＰに相当する線は、平均ＯＤ０．４付近に位置する。
【図９】電子顕微鏡の下で、可視化した複合体化したＣＰＳ。イムノゴールド染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）。（Ａ）トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）対照。（Ｂ）抗ＣＰＳモノクローナル抗体。
【図１０】ＶＬＰ−ＣＰＳ複合体化の有効性。ＢＡＬＢ／cマウスを、２週間の間隔で、３回ワクチン接種し、腹腔内経路を用いてＢ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ  Ｋ９６２４３を抗原投与した。（Ａ）複合体化していないＣＰＳよりも、（Ｂ）ＶＬＰ−ＣＰＳ複合体化ワクチンで、有意に高い防御が達成された。抗原投与量について調整したログランク（Mantel-Cox）で、p=0.0001。ＭＬＤ：最小致死投与量。
【図１１】ＣＰＳ特異的血清（Ａ）ＩｇＧ及び（Ｂ）ＩｇＭ力価は、複合体化していないＣＰＳでワクチン接種したマウスよりも、ＶＬＰ−ＣＰＳ複合体でワクチン接種したマウスにおいて高かった。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ａｙｗサブタイプのタンパク質（１８３アミノ酸）とＨＢｃＡｇのプレ配列（２９アミノ酸）及び対応するヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ａｙｗサブタイプのタンパク質（１８３アミノ酸）とＨＢｃＡｇのプレ配列（２９アミノ酸）である。
配列番号３は、α−ヘリックスをバランスする（balance）ために、ＨＢｃＡｇが含み得る配列である。
配列番号４は、コンストラクトＣｏＨｏ７ｅの配列である。
配列番号５は、コンストラクトＨ３Ｈｏの配列である。
配列番号６は、ＬｏｌＣ−なしコンストラクトの配列である。
配列番号７は、ＬｏｌＣ−Ｋ６コンストラクトの配列である。
配列番号８は、ＬｏｌＣ−Ｋ１コンストラクトの配列である。
配列番号９は、ＬｏｌＣの配列である。
配列番号１０は、Ｄ３−Ｋ６−Ｄ３配列を含むコンストラクトの配列である。
【０００８】
発明の詳細な説明
また、本明細書及び添付された請求項において用いる場合、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。それゆえ、例えば、「糖（a sugar）」には２以上のそのような糖が含まれ、又は「タンパク質エピトープ（a protein epitope）」には２以上の、そのようなタンパク質エピトープが含まれる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記であるか又は下記であるかに関係なく、その全てが参照によって本明細書に援用される。
【０００９】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）
ＨＢｃＡｇは、ＨＢＶのサブタイプに依存して、１８３又は１８５アミノ酸（ａａ）を有する。ａｙｗサブタイプのタンパク質（１８３アミノ酸）の配列とプレ配列（２９アミノ酸）は配列番号２に示される。成熟ＨＢｃＡｇは、プレ配列である配列（１〜２９位）を含む、メチオニン残基（３０位）からシステイン残基（最もＣ末端）までである。
【００１０】
タンパク質は、二量体を形成する２コピーのＨＢｃＡｇを含み得る。ＨＢｃＡｇの二量体は、ＶＬＰの構造的な構成要素を形成する。ＨＢｃＡｇユニットは、一般的に、最初から最後までの（head-to-toe）様式で、１つに接合する。即ち、１つのユニットのＣ末端は、隣接したユニットのＮ末端に接合する。ユニットは、共有結合（例えば、ペプチド結合）によって直接連結し得るが、好ましくは、隣接するユニットを離すように隔てるリンカーによって連結され、それによって隣接するユニットのパッキング（packing）の崩壊についての如何なる問題をも回避する。リンカーの性質については、以下で検討する。
【００１１】
タンパク質におけるＨＢｃＡｇは、ネイティブの完全長ＨＢｃＡｇである場合がある。ＨＢｃＡｇは、ｅ１ループに結合した糖を有する。１以上の糖は１以上の正電荷の残基に続いて結合され得るように、式ＸｐＺｑＸｒを有する配列がｅ１ループに挿入される。Ｘは負電荷のアミノ酸残基であり、Ｚは正電荷のアミノ酸残基であり、並びにｐ、ｑ及びｒは各々独立した１〜１２の整数である。該タンパク質は、ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含む場合、ＨＢｃＡｇの一方のコピーは式ＸｐＺｑＸｒを有する配列において、正電荷の残基を介してｅ１ループに結合した糖を有する。ＨＢｃＡｇの他方のコピーは、ネイティブＨＢｃＡｇであり得、明細書に記載されたように改変された型のＨＢｃＡｇであり得、ｅ１ループに結合した糖を有し得、又はｅ１ループにおいて、タンパク質エピトープを含み得る。糖及びタンパク質エピトープの候補の例は、以下で検討する。
【００１２】
一般則として、ＨＢｃＡｇの構造、及び粒子に会合する能力と干渉しないように、任意の改変が選択される。その構造の維持のために重要でないタンパク質の部位、例えば、ｅ１ループ、Ｃ末端及び／又はＮ末端において、そのような改変がなされる。ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、例えば、タンパク質の粒子形成能力を破壊することなく、１〜５００アミノ酸の挿入に耐え得る。
【００１３】
ＨＢｃＡｇ配列は、置換、挿入、欠失又は延長（extension）によって改変され得る。挿入、欠失又は延長のサイズは、例えば、１〜５００アミノ酸、１〜４００アミノ酸、１〜３００アミノ酸、１〜２００アミノ酸、３〜１００アミノ酸又は６〜５０アミノ酸であり得る。置換は、例えば、ＨＢｃＡｇ配列の長さを超える１、２、５、１０、２０又は５０アミノ酸までの数のアミノ酸を含み得る。延長はＨＢｃＡｇのＮ又はＣ末端であり得る。欠失は、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端又は内部の部位であり得る。置換は、タンパク質配列の任意の位置でなされ得る。挿入もまた、タンパク質配列の任意の点でなされ得るが、典型的には、ｅ１ループのようなタンパク質の表面に露出した領域においてなされる。挿入された配列は、タンパク質エピトープを有している場合がある。式ＸｐＺｑＸｒを有する配列は、１以上の糖が続いて結合され得るように、ｅ１ループに挿入される。該タンパク質が、ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含む場合、一方のコピーのみが、式ＸｐＺｑＸｒを有する配列において、正電荷の残基を介して、ｅ１ループに結合した糖を有する場合があり、又は両方のコピーが、式ＸｐＺｑＸｒを有する配列において、正電荷の残基を介して、ｅ１ループに結合した糖を有している場合がある。両方のコピーが、式ＸｐＺｑＸｒを有する配列において、正電荷の残基を介して、ｅ１ループに結合した糖を有する場合、式ＸｐＺｑＸｒの配列は、両方のコピーで同じであるか又は異なっている場合がある。Ｘは負電荷のアミノ酸残基であり、Ｚは正電荷のアミノ酸残基であり、並びにｐ、ｑ及びｒは各々独立した１〜１２の整数である。糖の結合のために挿入された任意のアミノ酸は、それに結合した糖を有することができなければならない。Ｚはリジン若しくはアルギニン、又はこれらの２つのアミノ酸の組合せであり得る。Ｚは、好ましくは、リジンである。ｑの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２であり得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のリジンが挿入され得る。Ｘは負電荷のアミノ酸であり、それゆえ、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸、又はこれら２つのアミノ酸の組合せであり得る。Ｘは、好ましくは、アスパラギン酸である。ｐの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２であり得る。rの値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２であり得る。ｐの値は、ｒと同じであり得る。好ましくは、ｐ及びｒの合計値が、ｑの値と同じである。例えば、配列の候補は、ｐが３であり、ｑが６であり及びｒが３であり得る。好ましい配列は、Ｚがリジンであり、Ｘがアスパラギン酸であり、ｐが３であり、ｑが６であり及びｒが３である。１以上のアラニンが、糖の結合のために挿入されているアミノ酸のどちらの側にも、挿入され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアラニンが挿入され得る。アラニンは、連続して挿入され得る。１を超える改変が、各ＨＢｃＡｇユニットに対してなされ得る。そのため、末端での延長又は欠失、及び内部への挿入がなされ得る。例えば、��ランケーション（truncation）がＣ末端でなされ得、挿入がｅ１ループにおいてされ得る。
【００１４】
本発明のタンパク質におけるＨＢｃＡｇ配列の各部分は、好ましくは、配列番号２に示される配列を有するタンパク質のような、天然のＨＢｃＡｇタンパク質の対応する配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、同一性が、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。タンパク質の相同性（homology）を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、本発明の文脈においては、相同性がアミノ酸の同一性に基づいて計算される（時々、「ハードな相同性」として参照する）ことは、当業者によって理解される。
【００１５】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージ（Devereuxら(1984) Nucleic Acids Research 12: 387-395）は、相同性を計算するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定で使用される）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300、Altschul, S, Fら(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、（典型的には、その初期設定で）相同性を計算し、又は配列を整列する（line up）ために使用され得る。
【００１６】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さの文字とアライメントさせた（aligned）とき、幾つかの正の閾値スコアＴと一致するか又は満たす、クエリ配列において、長さＷの短い文字を同定することによって、最初の高いスコアリング配列ペア（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。隣の文字のスコア閾値（Altschulら（上記））としてＴは参照される。これらの最初の隣の文字のヒット（initial neighbourhood word hits）は、それらを含有するＨＳＰを見出すための探索を開始するためのシーズ（seeds）として働く。文字のヒットは、累積したアライメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方の方向に伸長される。累積したアライメント・スコアが、得られた最大値から量Ｘ落ちたとき、１以上のネガティブ・スコア残基のアライメントが蓄積したために、累積したスコアが０以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に到達したとき、ヒットした文字の各方向への伸長は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期値として、１１の文字長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919参照）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両方の鎖の比較を用いる。
【００１７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の目安を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第一の配列を第二の配列と比べたときの、最小合計確率が約1より小さい、好ましくは約０．１より小さい、より好ましくは約０．０１より小さい及び最も好ましくは約０．００１より小さい場合、配列は他の配列に類似すると考えられる。
【００１８】
ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、成熟配列の６８〜９０位にあり、及びタンパク質エピトープは、これらの位置の間のどこに挿入されても良い。上記において検討したように、糖の結合のためのアミノ酸は、これらの位置の間のどこに挿入されても良い。好ましくは、前記エピトープ又は糖の結合のためのアミノ酸は、６９〜９０、７１〜９０又は７５〜８５位の領域に挿入される。最も好ましいのは、アミノ酸残基７９と８０の間又は残基８０と８１の間に、エピトープ又は糖の結合のためのアミノ酸を挿入することである。タンパク質エピトープ又は糖の結合のためのアミノ酸が挿入されるとき、ＨＢｃＡｇの全体配列が維持され得、又は代替的にｅ１ループ配列の全体又は一部が、欠失し及びタンパク質配列によって置換され得る。そのため、アミノ酸残基６９〜９０、７１〜９０又は７５〜８５は、タンパク質エピトープ又は糖の結合のためのアミノ酸によって置換され得る。タンパク質エピトープ又は糖の結合のためのアミノ酸が、ｅ１ループ配列を置換する場合、置換配列は一般に、それが置換する配列よりも短くない。
【００１９】
ＨＢｃＡｇのＣ末端トランケーションは、一般的に、アミノ酸１４４を超えないであろう。更なる任意のトランケーションがなされた場合、粒子を形成し得ないからである。そのため、欠失されたアミノ酸は、例えば、アミノ酸１４４からＣ末端のアミノ酸（アミノ酸１８３又は１８５）、アミノ酸１５０からＣ末端のアミノ酸、アミノ酸１６４からＣ末端のアミノ酸又はアミノ酸１７２からＣ末端のアミノ酸を含み得る。ＨＢｃＡｇのＣ末端は、ＤＮＡを結合し、Ｃ末端のトランケーションは、それゆえ、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｃＡｇハイブリッド・タンパク質の調製物から、ＤＮＡを減少させるか、又は完全に除去する。
【００２０】
本発明のタンパク質は粒子を形成し、それは好ましくは、ネイティブＨＢｃＡｇによって形成される粒子に似ている。本発明の粒子は、本発明のタンパク質を複数コピー含む。粒子はＶＬＰの形態であり得る。本発明の粒子は、典型的には、直径が少なくとも１０ｎｍ、例えば、直径が１０〜５０ｎｍ又は２０〜４０ｎｍであるが、好ましくは、直径がネイティブＨＢｃＡｇ 粒子のサイズである、約２７ｎｍである。それらは、複数のＨＢｃＡｇユニット、例えば、１５０〜３００ユニットを含んでおり、一般的に、それらはネイティブＨＢｃＡｇ粒子のユニット数である約１８０又は約２４０ユニットに調整される。本発明のタンパク質は二量体であり得るので、このことは粒子における単量体タンパク質数が７５〜１５０であり得るが、一般的に約９０又は約１２０であることを意味する。
【００２１】
リンカーを、ＨＢｃＡｇコピーの近傍に連結（join）する場合がある。リンカーは、ｅ１ループ中の式ＸｐＺｑＸｒの配列の片側又は両側に存在する場合がある。隣接するＨＢｃＡｇコピー間のリンカーは、一般的に、アミノ酸鎖の長さが、少なくとも１．５ｎｍ（１５Å）、例えば、１．５〜１０ｎｍ、１．５〜５ｎｍ又は１．５〜３ｎｍである。このリンカーは、例えば、４〜４０アミノ酸又は１０〜３０アミノ酸、好ましくは、１５〜２５アミノ酸を含み得る。式ＸｐＺｑＸｒの配列の片側又は両側に存在するリンカーは、典型的には、より短く、例えば、４〜１２アミノ酸等の３〜２０アミノ酸である。リンカーは、一般的にはフレキシブル（flexible）である。リンカーにおけるアミノ酸は、例えば、グリシン、セリン及び／又はプロリンを含むか、又はこれらから完全になる。例えば、リンカーは１又は２以上のＧｌｙｎＳｅｒ（ＧｎＳ）（ｎは１、２、３、４、５、６、７又は８である）配列の反復を含み得る。代替的に、リンカーは、１以上のＧｌｙＰｒｏ（ＧＰ）ジペプチドの反復を含み得る。反復の数は、例えば、１〜１８であり得、好ましくは、１〜１２である。リンカーは、ｎについて異なる値を有するＧｎＳ配列の反復を含み得る。Ｇ２Ｓ反復の場合、隣接するＨＢｃＡｇコピーを連結するリンカーにおける、５、６又は７反復の使用では、粒子の形成が可能であることが見出された。リンカーは、抗体のヒンジ領域に相当する場合がある。このヒンジ領域は、抗体の抗原結合ドメイン及びテイル・ドメインの間のフレキシブルな連結を提供すると考えられる。
【００２２】
ＨＢｃスパイク領域を含む２つのα−ヘリックスは、対称形でなく、その結果生じるＭＩＲはＶＬＰから完全に垂直を向いていないが、僅かに相殺されている（offset）。そのため、分子モデリングは、挿入された任意の抗原が、直角よりもむしろＶＬＰに平行であり得ることを示唆する。このことは、恐らく立体障害や免疫原性における低下に繋がり得る。ＨＢｃＡｇは、最初のヘリックス（成熟配列の５０〜７３位にある）に、追加の１つのターン又は複数のターンを付与することによって、α−ヘリックスを「バランスする（balance）」ように働く挿入された配列を含み得る。このことは、ＶＬＰに対して垂直配向の、挿入されたタンパク質エピトープの提示をもたらす。このことは、ＨＢｃＡｇに３〜１２アミノ酸（例えば、３、５又は７アミノ酸）が挿入されることによって達成され得る。これらのアミノ酸は、好ましくは、 アラニン、ロイシン、セリン及びトレオニン等の非荷電アミノ酸である。挿入された配列は、好ましくは、ＡＡＡＬＡＡＡ（配列番号３）である。挿入は、成熟配列のアミノ酸５０と７５の間の部位、例えば、残基６０及び７５又は残基７０及び７３の間の部位であり得る。
【００２３】
糖
用語「糖」は、ポリサッカライド、オリゴサッカライド及びモノサッカライドを指す。タンパク質は、糖がｅ１ループに結合したＨＢｃＡｇを含む。１以上の糖が、続いて、１以上の正電荷の残基に結合されるように、ｅ１ループに式ＸｐＺｑＸｒを有する配列が挿入される。タンパク質は、ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含み得る。ＨＢｃＡｇの２つのコピーがタンデムにある場合、ＨＢｃＡｇの片方又は両方のコピーがｅ１ループに結合した糖を有する。
【００２４】
ｅ１ループに結合した、１より多くの糖が存在する場合がある。ｅ１ループは、結合した糖の型を１より多く有する場合がある。ｅ１ループは、結合した様々な糖を有する場合がある。２コピーのＨＢｃＡｇがタンデムに存在する場合、各ＨＢｃＡｇのｅ１ループに結合した様々な糖又は様々な糖（複数）が存在する場合がある。糖が１より多くの病原体又はアレルゲンに由来する場合、１より多くの病原体又はアレルゲンに対する免疫応答を同時に誘導するために有用であり得る。糖タンパク質がｅ１ループに結合されるよう、糖は糖タンパク質の部分であり得る。
【００２５】
糖は、任意の病原体又はアレルゲンに由来し得る。糖は、Ｔ細胞又はＢ細胞エピトープを含み得る。それがＴ細胞エピトープである場合、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ又はＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ（例えば、Ｔｈ１又はＴｈ２エピトープ）であり得る。１より多くのエピトープが存在する場合がある。１より多くのエピトープが存在する場合、エピトープの１つは、Ｔヘルパー細胞エピトープであり得、もう一方はＢ細胞又はＣＴＬエピトープであり得る。Ｔヘルパー細胞エピトープの存在が、Ｂ細胞又はＣＴＬエピトープに対する免疫応答を促進する。
【００２６】
糖の選択は、免疫応答を惹起することか又はそれに対するワクチン接種を望む疾患に依存する。糖は、例えば、病原生物、がん関連抗原又はアレルゲンに由来し得る。病原生物は、例えば、ウイルス、細菌又は原生動物であり得る。該糖は、タンパク質エピトープが由来することができる、本明細書に記載された、糖を含む病原生物及びがん等の、いずれかの供給源に由来し得る。
【００２７】
好ましくは、病原生物は細菌由来である。細菌はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉであり得る。病原生物は、一般的な莢膜多糖（ＣＰＳ）を含み得る。糖は、ＣＰＳに由来する抗原を含み得る。糖は、ＣＰＳに由来する１以上のエピトープを含み得る。ＣＰＳは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉに由来し得る。ＣＰＳは、１−３結合２−Ｏアセチル−６−デオキシ−β−Ｄ−マンノ−ヘプトピラノースの、分枝していないホモポリマーを含む。それゆえ、糖は、１−３結合２−Ｏアセチル−６−デオキシ−β−Ｄ−マンノ−ヘプトピラノースの、分枝していないホモポリマーを含み得る。ＣＰＳは、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ及びＢ．ｍａｌｌｅｉの両方において、主な病原性決定因子として同定されており、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉにおけるＣＰＳ発現の喪失によって、マウスにおけるＭＬＤは７０ｃｆｕから１０６ｃｆｕを超えるまでに増加する。ＣＰＳに対して惹起された抗体の受動輸送もまた防御を提供し得る一方で、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉのＣＰＳは、マウスモデルにおける後続の抗原投与に対して部分的な防御を提供することが実証されている。
【００２８】
タンパク質エピトープ
本発明のタンパク質は、ＨＢｃＡｇの第一及び第二のコピーを、タンデムに含み得、ここで第一のコピーはｅ１ループに結合した糖を有し、第二のコピーはｅ１ループにおけるタンパク質エピトープを含む。「第一のコピー」は、Ｎ末端又はＣ末端のコピーのいずれかであり得る。
【００２９】
タンパク質エピトープは免疫応答を惹起するアミノ酸の配列を含む。エピトープは、立体的又は直線的であり得る。それは、例えば、６〜５００アミノ酸、２０〜５００アミノ酸、５０〜５００アミノ酸、１００〜５００アミノ酸、２００〜５００アミノ酸、３００〜５００アミノ酸又は３００〜４００アミノ酸の配列であり得る。
【００３０】
大きい及び／又は疎水的な挿入物は、ＶＬＰを破壊することなく、収容され得る。インサートとして使用されるタンパク質エピトープは、ＶＬＰ形成を妨害しない、任意の好適なサイズであり得る。好ましくは、それは、１００ｋＤａより小さく、例えば、８０ｋＤａより小さく、６０ｋＤａより小さく、４０ｋＤａより小さく、２０ｋＤａより小さく、１０ｋＤａより小さく又は５ｋＤａより小さい。それは、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は３０ｋＤａより大きくてもよい。
【００３１】
本発明のタンパク質は、１より多くのタンパク質エピトープ、例えば、２、３、５又は８までのタンパク質エピトープを含有し得る。１より多くのエピトープのコピーは、ＨＢｃＡｇのコピーに挿入され得る（例えば、２〜８コピーが挿入され得る）。本発明のタンパク質におけるタンパク質エピトープが２以上ある場合、それらは、同じか又は異なる生物に由来する場合があり、同じか又は異なるタンパク質に由来する場合がある。
【００３２】
エピトープは、Ｔ細胞又はＢ細胞エピトープであり得る。それがＴ細胞エピトープである場合、それは細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ又はＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ（例えば、Ｔｈ１又はＴｈ２エピトープ）であり得る。本発明の好ましい実施形態においては、エピトープの一つは、Ｔヘルパー細胞エピトープであり、もう一つは、Ｂ細胞又はＣＴＬエピトープである。Ｔヘルパー細胞エピトープの存在が、Ｂ細胞又はＣＴＬエピトープに対する免疫応答を促進する。
【００３３】
エピトープの選択は、それに対するワクチン接種が望まれる疾患に依存する。エピトープは、例えば、病原生物、がん関連抗原又はアレルゲンに由来し得る。病原生物は、例えば、ウイルス、細菌又は原生動物であり得る。
【００３４】
エピトープは、オルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）（例えば、インフルエンザＡ、Ｂ及びＣウイルスを含む）、アデノウイルス科（adenoviridae）（例えば、ヒト・アデノウイルスを含む）、カリシウイルス科（Caliciviridae）（ノーウォークウイルスグループ等）、ヘルペスウイルス科（herpesviridae）（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＥＢＶ、ＣＭＶ及びＶＺＶを含む）、パポバウイルス科（papovaviridae）（例えば、ヒト・パピローマウイルス−ＨＰＶを含む）、ポックスウイルス科（poxviridae）（例えば、天然痘及びワクシニアを含む）、パルボウイルス科（parvoviridae）（例えば、パルボウイルスＢ１９を含む）、レオウイルス科（reoviridae）（例えば、ロタウイルスを含む）、コロナウイルス科（coronaviridae）（例えば、ＳＡＲＳを含む）、フラビウイルス科（flaviviridae）（例えば、黄熱病、西ナイルウイルス、デング熱、Ｃ型肝炎及びダニ媒介性脳炎を含む）、ピコルナウイルス科（picornaviridae）（エンテロウイルス、ポリオ、ライノウイルス及びＡ型肝炎を含む）、トガウイルス科（togaviridae）（例えば、風疹ウイルスを含む）、フィロウイルス科（filoviridae）（例えば、マールブルク及びエボラを含む）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）（パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、流行性耳下腺炎及びはしかを含む）、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）（例えば、狂犬病ウイルスを含む）、ブニヤウイルス科（bunyaviridae）（例えば、ハンタウイルスを含む）、レトロウイルス科（retroviridae）（例えば、ＨＩＶ及びＨＴＬＶ−ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスを含む）及びヘパドナウイルス科（hepadnaviridae）（例えば、Ｂ型肝炎を含む）のメンバーを含むウイルス等であるが、これらに限定されない、任意の病原体に由来し得る。
【００３５】
エピトープは、バークホルデリア（Burkholderia）、Ｍ．ツベキュローシス（M. tuberculosis）、クラミジア（Chlamydia）、Ｎ．ゴノレー（N. gonorrhoeae）、赤痢菌（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）、ビブリオ・コレラ（Vibrio Cholera）、梅毒トレポネマ（Treponema pallidua）、シュードモナス（Pseudomonas）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ（Brucella）、野兎病菌（Franciscella tulorensis）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、レプトスピラ・インタロガンス（Leptospria interrogaus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pnumophila）、ペスト菌（Yersinia pestis）、連鎖球菌（Ａ及びＢ型）、肺炎球菌（Pneumococcus）、髄膜炎菌（Meningococcus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）（Ｂ型）、カンピロバクター症菌（Complybacteriosis）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ドノヴァン症菌（Donovanosis）及び放線菌（Actinomycosis）を含む細菌、カンジダ症菌及びアスペルギルス症菌を含む真菌病原体、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、タエニア（Taenia）、フルーク（Flukes）、回虫、フラットワーム、アメーバ症、ジアルジア症（Giardiasis）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、シトソーマ（Schitosoma）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、トリコモナス症（Trichomoniasis）及びトリキノシス（Trichinosis）を含む寄生虫病原体に由来し得る。
【００３６】
エピトープは、ａ）気道、ｂ）泌尿生殖器系又はｃ）胃腸管を通って感染する病原体に由来し得る。そのような病原体の例としては、ａ）アデノウイルス科、パラミクソウイルス科及びポックスウイルス科、ライノウイルス、インフルエンザ及びハンタウイルスのメンバー、ｂ）ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）、単純ヘルペスウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）及びカルマトバクテリウム・グラニュロマチス（Calmatobacterium granulomatis）、及びｃ）赤痢菌、サルモネラ、ビブリオ・コレラ、大腸菌、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、カンピロバクター、クロストリジウム、エルシニア、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、回虫、フラットワーム、ジアルジア症及びクリプトスポリジウムが挙げられる。
【００３７】
本発明において使用されるエピトープは、肺、膵臓、腸、結腸、乳房、子宮、子宮頸部、卵巣、精巣、前立腺のがん、メラノーマ、カポジ肉腫、リンパ腫（例えば、ＥＢＶ誘発Ｂ細胞リンパ腫）及び白血病等であり得るが、これらに限定されないがんに由来し得るが。腫瘍関連抗原の特異的な例としては、ＭＡＧＥファミリー（ＭＡＧＥ１、２、３等）、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２のメンバー等のがん−精巣抗原、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２及びＣＥＡ等の分化抗原、発がん性ＨＰＶ型に由来するＥ６及び／又はＥ７等の変異自己抗原及びウイルス腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない。注目すべき腫瘍抗原の更なる例としては、ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａＩＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、Ｐ１Ａ、ＥｐＣａｍ、メラノーマ抗原ｇｐ７５、Ｈｋｅｒ８、高分子量メラノーマ抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒｌ、Ｔｙｒ２、ｐＭｅｌ１７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−ＭＥＴ、ＰＳＭ（前立腺ムチン抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、前立腺分泌（prostate secretary）タンパク質、αフェト（alpha-feto）タンパク質、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＴＡＧ−７２、ＢＲＣＡ−１及びＢＲＣＡ−２抗原が挙げられる。
【００３８】
本発明における使用のための他のエピトープ候補の例としては、以下の抗原：インフルエンザ抗原ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）、ＮＰ（核タンパク質／核キャプシド・タンパク質）、Ｍ１、M２、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１及びＮＳ２；ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ及びＲｅｆ；マラリア抗原ＣＳタンパク質及びスポロゾイト表面タンパク質２；ヘルペスウイルス抗原ＥＢＶ  ｇｐ３４０、ＥＢＶ  ｇｐ８５、ＨＳＶ  ｇＢ、ＨＳＶ  ｇＤ、ＨＳＶ  ｇＨ、ＨＳＶ初期タンパク質産物、サイトメガロウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＨ、及びＩＥタンパク質ｇＰ７２；ヒト・パピローマウイルス抗原Ｅ４、Ｅ６及びＥ７；呼吸器合胞体ウイルス抗原Ｆタンパク質、Ｇタンパク質及びＮタンパク質；百日咳菌のパータクチン（pertactin）抗原、腫瘍抗原がんＣＥＡ、がん関連ムチン、がんＰ５３、メラノーマＭＰＧ、メラノーマＰ９７、ＭＡＧＥ抗原、がんＮｅｕがん遺伝子産物、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺関連抗原、ｒａｓタンパク質及びｍｙｃ；及びイエダニアレルゲンに由来するエピトープが挙げられる。
【００３９】
好ましくは、タンパク質エピトープは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、例えば、 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉに由来する。タンパク質エピトープは、表１に列記した、いずれかのタンパク質に由来し得る。タンパク質エピトープは、表１に列記した、いずれかのタンパク質を含み得、又はそれからなり得る。タンパク質エピトープは、表１に列記した、いずれかのタンパク質の断片であり得る
【００４０】
【表１】
2018514512.tif 000002
【００４１】
好ましくは、タンパク質エピトープは、ＬｏｌＣタンパク質に由来する。以下の段落では、ＬｏｌＣタンパク質について検討するが、検討は表１に列記した、いずれかのタンパク質にも同じように適用される。ＬｏｌＣタンパク質は、天然に存在するＬｏｌＣタンパク質であるか、又は天然に存在するＬｏｌＣタンパク質の変異体である場合がある。タンパク質エピトープは、ＬｏｌＣタンパク質を含み得、又はそれからなり得る。それゆえ、完全長ＬｏｌＣ又はその断片は、ｅ１ループに挿入され得る。
本明細書に記載されたＬｏｌＣタンパク質配列は：ALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGS（配列番号 9）である。
【００４２】
ＬｏｌＣタンパク質の配列は、配列番号９又は任意の天然に存在するＬｏｌＣタンパク質と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一性等の、相同性を、例えば、全長配列に亘ってか、又は少なくとも２０、例えば、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００又は少なくとも３５０以上連続したアミノ酸の領域に亘って、有する場合がある。タンパク質の相同性を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、ＨＢＶコア・タンパク質に関連して上記において検討されている。
【００４３】
相同なタンパク質は、典型的には、天然に存在するＬｏｌＣ配列から、置換、挿入又は欠失、例えば、１、２、３、４、５〜８以上の置換、欠失又は挿入によって異なっている。置換は、好ましくは、「保存的」であり、例えば、表２に従ってなされ得る。２列目の同じブロックのアミノ酸、及び、好ましくは、３列目の同じ行のアミノ酸が、互いに置換され得る。
【００４４】
【表２】
2018514512.tif 000003
【００４５】
インサートとして使用されるＬｏｌＣタンパク質の断片は、免疫応答を誘導する能力を維持している完全長ＬｏｌＣタンパク質の短縮バージョンである。幾つかの例においては、断片は、天然に存在するＬｏｌＣ配列又は配列番号９の配列の長さの、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％等、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、 少なくとも７０％、更により好ましくは、少なくとも８０％、なおより好ましくは、少なくとも９０％及び更により好ましくは、少なくとも９５％であり得る。例えば、断片は、６〜３５４アミノ酸、６〜３００アミノ酸、６〜２００アミノ酸、６〜１００アミノ酸、６〜５０アミノ酸又は６〜２５アミノ酸の長さであり得る。
【００４６】
糖をタンパク質に結合させるための方法
本発明は、本発明のタンパク質を産生するための方法を提供する。該方法は、ｅ１ループに１以上の糖を結合することを含む。明細書に記載されているように、糖は、ｅ１ループの１以上のアミノ酸に結合される。糖は、酸化した糖の還元的アミノ化によって、ｅ１ループのアミノ酸に結合され得る。該アミノ酸は、リジンである場合がある。糖を酸化するために、過ヨウ素酸ナトリウムが使用され得る。糖の酸化は、末端のアルデヒド残基を生成する。糖の末端のアルデヒド残基は、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて、第一級アミンに還元的にアミノ化され得る。糖を結合する前に、タンパク質は精製され得る。
【００４７】
前記方法は、糖の結合に先立ってタンパク質を作製することを、更に含み得る。糖の結合に先立ったタンパク質の生成は、以下においてより詳細に記載する。
【００４８】
糖の結合に先立ったタンパク質の作製
糖の結合に先立って、タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって、作製され得る。該核酸分子は、核酸を操作するための公知の技術を用いて作製され得る。タンパク質が２コピーのＨＢｃＡｇを含む場合、典型的には、２コピーのＨＢｃＡｇをコードする、２つの別のＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで、オーバーラッピングＰＣＲによって１つに連結する（joined）。
【００４９】
糖の結合に先立って、タンパク質が発現される条件下で、該タンパク質をコードする核分子（nucleic molecule）を含有する宿主細胞を培養し、及びタンパク質を回収することによって、該タンパク質が産生され得る。好適な宿主細胞としては、大腸菌等の細菌、酵母菌、哺乳動物細胞及び他の真核細胞、例えば、昆虫Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【００５０】
本発明の核酸分子を構成するベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターであり得る。それらは、複製起点、タンパク質をコードする配列を発現するためのプロモーター、エンハンサー等のプロモーターの調節因子、転写停止シグナル、翻訳開始シグナル及び／又は翻訳停止シグナルを含有しても良い。該ベクターはまた、１以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合には、アンピシリン耐性遺伝子、又は哺乳動物ベクターの場合には、ネオマイシン耐性遺伝子を含有しても良い。ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ＲＮＡの産生のために使用され得る、又は宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトするために使用され得る。該ベクターはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、遺伝子治療又はＤＮＡワクチン接種の方法において使用するよう適合され得る。
【００５１】
プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞と適合するよう、選択され得る。例えば、原核プロモーター、特に大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１等）において使用するために好適なものが使用され得る。周囲の環境の変化、嫌気条件等に応答して、活性が誘導されるプロモーターが使用され得る。好ましくは、ｈｔｒＡ又はｎｉｒＢプロモーターが使用され得る。これらのプロモーターは、例えば、ワクチンとして使用するための、弱毒化した細菌において、特にタンパク質を発現させるために使用され得る。タンパク質の発現が哺乳動物細胞において行われるとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、哺乳動物プロモーターが使用され得る。組織特異的プロモーター、例えば、肝細胞特異的プロモーターもまた使用され得る。ウイルス・プロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末端反復配列（long terminal repeat）（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルス・プロモーター及びアデノウイルス・プロモーターもまた使用され得る。これらのプロモーターは全て、当該技術分野において容易に利用できる。
【００５２】
該タンパク質は、タンパク質を精製するための従来技術を用いて精製され得る。タンパク質は、例えば、精製されたか、純粋であるか又は単離された形態で提供され得る。ワクチンにおける使用のために、一般的には、該タンパク質は高レベルの純度で、例えば、該タンパク質が、調製物におけるタンパク質の８０％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて又は９８％を超えて構成するレベルで、提供されなければならない。但し、最終的なワクチン製剤においては、該タンパク質を他のタンパク質と混合することが望ましい場合がある。
【００５３】
免疫応答の誘導
本発明のタンパク質又は粒子は、免疫応答を誘導するために使用し得る。該タンパク質又は粒子は、ワクチンとして使用され得る。該タンパク質又は粒子は、全ての要素（ＨＢｃＡｇ及び糖）に対する、複数の同時の免疫応答を惹起するために、使用され得る。該タンパク質が２コピーのＨＢｃＡｇを含む場合、複数の免疫応答はまた、追加的な糖に対する免疫応答及び／又はタンパク質エピトープに対する免疫応答を更に含み得る。全ての糖及び任意のタンパク質エピトープが、同じ供給源に由来する場合、これは供給源、例えば、病原体に対する増強された免疫応答を誘導し得る。全ての糖及び任意のタンパク質エピトープが、１を超える供給源に由来する場合、これは様々な供給源、例えば、１を超える病原体に対する同時の免疫応答を誘導し得る。
【００５４】
該タンパク質又は粒子は、単独で用いられ得、又は医薬組成物、ワクチン組成物又は免疫治療用組成物を含むが、これらに限定されない、組成物の一部として用いられ得る。本発明は、それゆえ、複数コピーの本発明のタンパク質及び医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む、本発明のタンパク質又は粒子を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）を提供する。該組成物は、アジュバントを更に含み得る。該組成物は、ヒト又は動物の身体のワクチン接種のために使用され得る。該組成物は、本明細書に記載された、いずれかの病原体に対するワクチン接種のために使用され得る。特に、該組成物は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉに対するワクチン接種のために使用され得る。
【００５５】
本発明のタンパク質又は本発明の粒子は、ヒト又は動物の身体のワクチン接種の方法において使用され得る。本発明は、ヒト又は動物の身体のワクチン接種用の医薬の製造のための、本発明のタンパク質又は本発明の粒子の使用を提供する。該タンパク質又は粒子は、本明細書に記載された、いずれかの病原体に対するワクチン接種のために使用され得る。特に、該組成物は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉに対するワクチン接種のために使用され得る。
【００５６】
ワクチン接種の背景にある原理は、宿主における免疫記憶を生成するために、宿主における免疫応答を誘導することである。このことは、宿主が毒性のある病原体に曝されるとき、病原体は効果的な（防御的な）免疫応答、即ち、病原体を不活性化する及び／又は殺す免疫応答を開始する（mounts）ことを意味する。本発明は、本明細書に記載された、いずれかの病原体、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａに対するワクチンの基礎を形成する。該タンパク質は、該タンパク質が含む糖及び任意のタンパク質エピトープに依存する、広い範囲のいずれかの疾患及び状態に対して、個体を、同時にワクチン接種し得る。そのような疾患及び状態としては、本明細書に記載された、いずれかのもの、並びにＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＣＶ、口蹄疫、ポリオ、ヘルペス、狂犬病、ＡＩＤＳ、デング熱、黄熱病、マラリア、結核、百日咳、腸チフス、食中毒、下痢、髄膜炎及び淋病が挙げられる。該糖及びタンパク質エピトープは、ワクチンがそれに対する防御を提供することを意図している疾患にとって適切であるように選択される。
【００５７】
本発明は、本発明のタンパク質又は粒子を被検体に投与することを含む、被検体における免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましくは、該免疫応答は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉに対するものである。
【００５８】
本明細書において、用語「個別に」及び「被検体」は、交換できるように使用され、限定されない、ヒト及び他の霊長類（チンパンジー及び他の類人猿及びサル種等の非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ等の家畜；犬や猫等の家畜哺乳動物；マウス、ラット及びモルモット等のげっ歯類並びにブタを含む実験動物；例えば、鶏、七面鳥や他の家禽、アヒル、ガチョウ等等の家禽、野生の鳥類、狩猟鳥を含む鳥類を含む、脊索動物亜門（subphylum cordata）の任意のメンバーを指す。該用語は、特定の年齢を意味するものでない。それゆえ、成体個体及び生まれたばかりの個体の両方が、対象とされることを意図している。明細書に記載の方法は、上記のいずれかの脊椎動物種における使用を意図している。これらの脊椎動物の全てにおける免疫システムは、同じように作動するためである。
【００５９】
幾つかの例においては、本発明は、任意の好適な被検体、特に所与の種類の任意の好適な被検体、好ましくは好適なヒトの被検体に投与され得る。それゆえ、できる限り多くの被検体が、例えば、任意の特定の被検体群に重点を置くことなく、投与に供され得る。例えば、被検体の集団全体が、又はなるべく多くが、投与に供され得る。
【００６０】
本発明のタンパク質又は粒子は、被検体に投与するためのものである。それは、アジュバントを伴って、同時に又は順に投与され得る。それゆえ、該タンパク質又は粒子を含む本発明の組成物はまた、アジュバントを含み得る。本発明の組成物は、注射（皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内及び腹腔内等）、経皮的粒子送達、吸入により、局所的に、経口的に又は経粘膜的に（経鼻、舌下、経膣又は直腸等）送達されるものであり得る。
【００６１】
該組成物は、従来的な医薬調製物として製剤され得る。これは、当業者に利用可能である標準的な医薬製剤化学及び方法論を用いて、実行し得る。例えば、アジュバント存在下又は非存在下で、該タンパク質又は粒子を含有する組成物を、液体調製物を提供するために、１以上の医薬的に許容される賦形剤又はビヒクルと組み合わせ得る。それゆえ、該タンパク質又は粒子を含む医薬組成物はまた、医薬的に許容される担体又は希釈剤と供に提供される。該組成物は、任意で、アジュバントを含む。
【００６２】
例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が、存在する場合がある。これらの担体、希釈剤及び補助物質は、一般的に、過度の毒性を伴わずに投与することができ、抗原組成物の場合においては、該組成物の投与を受ける個体において、それ自体は免疫応答を誘導しないであろう。医薬的に許容される担体としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール及びエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩も、これらに含まれ得る。必要とされるものではないが、それはまた好ましくは、それらが組成物に含まれる場合、該調製物は、特にペプチド、タンパク質又は他の同様の分子の安定剤として役割を果たす、医薬的に許容される担体を含有する。ペプチドにとっての安定剤としても作用する好適な担体の例としては、デキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等の医薬グレードのものが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な担体としては、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウム又はリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらについてもまた限定されない。医薬的に許容される賦形剤、ビヒクル及び補助物質の徹底的な検討は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において利用可能であり、それは参照することによって、本明細書において組み込まれる。
【００６３】
代替的に、該タンパク質若しくは粒子及び／又はアジュバントは、粒子状の担体に封入され、吸収され、又は結合され得る。好適な粒子状の担体としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもの、並びにポリ（ラクチド）及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来するＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Jefferyら、(1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照。他の粒子状システム及びポリマー、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン及びこれらの分子の複合体等のポリマーも使用し得る。
【００６４】
一度製剤化した組成物は、様々な公知の経路及び技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、被検体に送達され得る。例えば、液体調製物は、注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンとして提供され得、及び従来の針及びシリンジを用いてか、又は液体ジェット注入システムを用いて、非経口的、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、骨内及び腹腔内注射によって投与され得る。液体調製物はまた、皮膚又は粘膜組織（例えば、経鼻、舌下、経膣又は直腸）に対して局所的に投与され得、又は呼吸器又は経肺投与にとって好適な微粉スプレーとして提供され得る。投与の他の様式としては、経口投与、坐剤、及び能動的又は受動的な経皮送達技術が挙げられる。
【００６５】
典型的には、本発明のタンパク質又は粒子は、免疫応答を調節するための有効量で、被検体に投与される。適した有効量は、比較的広い範囲に収まるが、当業者であれば、通常行う取組により、容易に決定し得る。「Physicians Desk Reference」及び「Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics」は、必要量を決定する目的のために有用である。予防有効量とは、疾患又は病気の１以上の症状が発症するのを防ぐ量である。
【００６６】
典型的には、該タンパク質又は粒子は、０．１〜２００ｍｇ、好ましくは、１〜１００ｍｇ、より好ましくは、１０〜５０ｍｇ体重の投与量で投与される。該ワクチンは、一回投与計画又は複数回投与計画、例えば、２〜３２又は４〜１６回の投与量で、与えられる場合がある。投与経路及び上記投与量は、単なる指針であることを意図しており、該投与経路及び投与量は、最終的には医師の裁量に委ねられ得る。
【００６７】
幾つかの事例においては、一回目の投与後、本発明の組成物の事後的な投与が行われる場合がある。特に、一回目の投与の後、被検体は「追加免疫」を受ける場合がある。追加免疫は、例えば、本明細書のいずれかの記載から選択された投与量である場合がある。追加免疫投与は、例えば、一回目の投与の後、少なくとも１週間、２週間、４週間、６週間、１ヶ月、２ヶ月又は６ヶ月である場合がある。
【００６８】
本発明のタンパク質又は粒子及びアジュバントは、順番に又は同時に、好ましくは、同時に投与され得る。その２つの物は、同じか又は異なる組成物、好ましくは、同じ組成物にして投与され得る。アジュバント効果が見られるように、即ち、見られる免疫応答が、アジュバントが抗原と共に投与されなかった場合の免疫応答とは異なるように、アジュバントが送達される。その２つの物は、同じか又は異なる部位に、好ましくは、同じ部位に投与され得る。好ましくは、その２つの物は、同じとき、同じ部位に、同じ組成物にして、好ましくは注射で投与される。
【００６９】
任意の好適なアジュバントが使用され得る。現在使用されるワクチン・アジュバントとしては：
-  アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム）又はリン酸カルシウム等の、無機化合物。アルミニウム塩は、別名ミョウバンとして知られている。
-  油エマルジョン及び界面活性剤ベースの製剤、例えば、ＭＦ５９（マイクロ流動化し、界面活性剤で安定化した油中水型エマルジョン）、ＱＳ２１（精製したサポニン）、ＡＳ０２［ＳＢＡＳ２］（油中水型エマルジョン＋ＭＰＬ＋ＱＳ−２１）、モンタナイドＩＳＡ−５１及びＩＳＡ−７２０（安定化した油中水型エマルジョン）。
-  粒子状アジュバント、例えば、ウィロソーム（例えば、インフルエンザ赤血球凝集素を取り込んでいる単層リポソーム・ビヒクル）、ＡＳ０４（［ＳＢＡＳ４］ＭＰＬを伴ったアルミニウム塩）、ＩＳＣＯＭＳ（サポニン及び脂質の構造化複合体）、及びポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）。
-  微生物派生物（天然及び合成）、例えば、モノホスホリル・リピドＡ（ＭＰＬ）、Ｄｅｔｏｘ（ＭＰＬ＋Ｍ．Ｐｈｌｅｉ細胞壁骨格）、ＡＧＰ［ＲＣ−５２９］（合成アシル化モノサッカライド）、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ（リポソームに自己組織化することができるリポイド免疫賦活剤）、ＯＭ−１７４（リピドＡ派生物）、ＣｐＧモチーフ（免疫賦活ＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、及び修飾ＬＴ及びＣＴ（非毒性アジュバント効果を提供するよう、遺伝的に改変された細菌毒素）。
-  内在性ヒト免疫調節剤、例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦ又はｈＩＬ−１２（タンパク質又はそれをコードするプラスミドのいずれかとして、投与され得るサイトカイン）、及びＩｍｍｕｄａｐｔｉｎ（Ｃ３ｄタンデム・アレイ）。
-  金粒子等の不活性ビヒクル。
好ましくは、使用されるアジュバントは、ミョウバンである。最も好ましくは、該アジュバントは、水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウムの混合物、例えば、Ｉｎｊｅｃｔ  ａｌｕｍ（Pierce Laboratories）である。
【００７０】
本発明を以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１
材料と方法
コンストラクトの設計
全てのタンデム・コア・クローンは、親コンストラクトＣｏＨｏ７ｅに由来する。タンデム・コアのこの型においては、α−ヘリックスが上記のように「バランスされて（balanced）」おり、及びＨＢｃの両方のコピーは、核酸結合領域が除去されている。それゆえ、該コンストラクトは、コアの両方の型が本質的に同一であり、唯一の違いは、制限酵素部位の改変を可能にするサイレント変異であるので、ホモ・タンデムと名付けられる。使用されるタンデム・コアＣｏＨｏ７ｅの配列は：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEGSAGGGRDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEFAGASDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVL（配列番号４）であった。
【００７２】
Ｈ３Ｈｏコンストラクトは、国際出願公開第2001/077158号で概説されているように、オリジナルのタンデム・コア型ＣｏＨｏをベースにした。標準的なアミン化学を用いて、ＣＰＳが結合され得る反応性の「ホットスポット」を作り出す６×リジン・インサートが設計された。これらは、合成的に設計され、上記のようにα−ヘリックスを「バランスする（balance）」ように、配列ＡＡＡＬＡＡＡ（配列番号３）を含む再設計したＭＩＲを含んでいた。合成したインサートは、Ｈ３Ｈｏを作り出すように結合した。最終的な配列が確認され、以下：
MSDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVALAAAESGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE （配列番号５）の通りであった。
【００７３】
代替的なアプローチは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａから単離されたタンパク質抗原を挿入することであった。ＬｏｌＣタンパク質は、以前に免疫原性であることが示されており、そのため、インサートの候補として選択した。しかし、ＶＬＰの会合が妨げられないことを確実にするため、α−ヘリックスフォールディング領域をＮ及びＣ末端の両方で見出した。それゆえ、抗原の挿入は、α−ヘリックス二次構造の中から、ＨＢｃスパイクのα−ヘリックスにされるであろう。現在、ＬｏｌＣの結晶学的データが存在しないので、その構造をＰＳＩＰＲＥＤアルゴリズム（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）を用いて予測した。予測された挿入領域及び隣接領域を化学的に合成し、標準的なライゲーション技術を用いてＨ３Ｈｏのコア１に挿入した。最終的なシーケンス解析で、これが成功していたことを確認した。ＬｏｌＣ−なし配列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE（配列番号６）
【００７４】
次いで、ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩを用いて、Ｈ３Ｈｏコンストラクト（ＬｏｌＣ−なし）のコア２を切断することによって、ＬｏｌＣインサートの２つのバリエーションを作製した。次いで、反復アラニン残基が隣接した、６×リジン又は１つリジンのいずれかを含有する合成インサートを結合して入れ込んだ。再度、シーケンス解析によって、これらの同一性を確認した。ＬｏｌＣ−Ｋ６配列:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGGSGSKKKKKKGSGSSGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE（配列番号７）
ＬｏｌＣ−Ｋ１配列：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGGSGSGGGKGGGSGSSGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE（配列番号８）
【００７５】
プラスミドの設計
２つのシステム（酵母菌Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ及びバキュロウイルス・ベクター）を用いて、タンパク質の発現を行った。これは、２つの異なるプラスミド、具体的には、酵母菌用のｐＰＩＣｚ（インビトロジェン）及びバキュロウイルス用のｐＯＥＴ１（Oxford Expression Technologies）の使用が必要であった。Ｈ３Ｈｏ配列は、ＭｆｅＩ及びｐｓｐＯＭＩを用いて、ｐＰＩＣｚのマルチ・クローニング・サイトに挿入した一方、ｐｓｐＯＭＩ及びＢｃｌＩを用いて、ｐＯＥＴ１に挿入した。
【００７６】
酵母菌におけるタンデム・コアのタンパク質発現
酵母菌を、電気穿孔法により、３００ｎｇの直鎖化したプラスミドＤＮＡで形質転換した。次いで、酵母菌を、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートにストリークし、最も大きいクローンを選択した。次いで、これらのクローンを、濃度を濃くしたゼオシンで個別に試し、最も耐性を示したクローンを、電気穿孔法による２回目の形質転換用に選択した。クローン選択のために、より高いレベルのゼオシンを含む選択プレートを用いて、該方法を繰り返した。このようにして、ＶＬＰ発現レベルが大幅に改善された、高コピー数のクローンを開発した。２００ｍｌのＹＰＤで、ラージスケールでの酵母菌培養を開始した。約４日後、培地を誘導培地に交換し、メタノールを用いて酵母菌を誘導した（０．８％、７２時間）。この期間後、酵母菌細胞を遠心分離（１５００ｇ）で回収し、精製前に、ペレットを−８０℃で保管した。
【００７７】
バキュロウイルスにおける、タンデム・コアのタンパク質発現
Ｓｆ９昆虫細胞において、共トランスフェクションで、組換えウイルスを産生した。リポフェクタミン・リポソーム形成試薬（ｂａｃｕｌｏＦＥＣＴＩＮ）を含み、ｆｌａｓｈＢＡＣＰＲＩＭＥ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ（１００ｎｇ）及びトランスファー・ベクターＤＮＡ（５００ｎｇ；ｐＯＥＴ１−Ｋ６−ｌｏｌｃ）をそれぞれ含有するデュプリケートの反応混合物を、Ｓｆ９昆虫細胞を１×１０６細胞／ディッシュの密度で播種した、３５ｍｍ２ディッシュに添加した。次いで、ディッシュを２８℃で５日間インキュベートした後、それぞれのウイルスを含有する培地を滅菌チューブに回収した。２×１０６細胞／ｍｌの密度で、０．５ｍｌの共トランスフェクション・ミックスを用いて感染させた、５０ｍｌのＳｆ９細胞から、ウイルスのストックを作製した。感染させた振とう培養液を、２８℃で５日間インキュベートし、その後、遠心分離（５００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収した。タンパク質の発現のために、Ｓｆ９細胞を１×１０６細胞／ディッシュで、３５ｍｍ２ディッシュに播種した一方で、Ｔｎｉ細胞を０．５×１０６細胞／ディッシュで播種した。各ディッシュを多重感染度（ｍｏｉ）５で、ウイルスに感染させた。２８℃で７２時間インキュベートした後、細胞ペレット及び上清を各ディッシュから回収した。
【００７８】
タンパク質の精製
用いた発現ベクター又はインサートの性質に関わらず、精製は同様の様式で行った。誘導した細胞を回収し、スピンダウンし（３００×ｇ）、２．５ｇ湿重／１０ｍｌ溶解バッファーの比で、溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ）に再懸濁した。次いで、得られた溶液を、５００ｐｓｉに設定された、微粉化装置（ＡＶＰ  Ｇａｕｌｉｎ  ＬＡＢ  ４０）を３回通過させた。０．５％溶液となるよう界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を添加し、該溶解物をスピンし（２５，０００×ｇ、３０分間）、上清を回収した。澄んだ上清を、０．８ｕｍデッドエンド・フィルター（Nalgene）を通過させ、続いて、０．４５ｕｍ及び最終的には０．２ｕｍで濾過した。１ＭＤａ分子量カットオフの接線流装置（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）を通過させる前に、この材料を１０倍希釈した（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）。このステップで、低分子量の汚染物を除去すると共に、体積を２５ｍｌにまで減量した。
【００７９】
次いで、濃縮した溶解物は、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｅ  ＦＰＬＣシステムによって作動される、セファロースＣＬ４Ｂレジンを充填したＸＫ２６／９２カラムにアプライされた。バッファーは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡであった。その画分を、２６０、２８０及び３５０ｎｍでモニターした。ＶＬＰを含む大きなタンパク質を含有するため、空隙容量を回収した。カラムを通して単離したタンパク質の残余は、廃棄した。空隙容量の画分をプールし、接線流（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）を用いて濃縮し、１０ｍｌにまで戻した。次いで、この材料を、セファクリルＳ１０００レジンを充填したＸＫ２６／５５カラムに通した。このレジンは、かなりより大きい孔サイズを有しており、他の大きいタンパク質からＶＬＰを分けることができる。以前に、我々は、単量体の組換えＨＢｃ（Biospacific Inc）を用いて、カラムのキャリブレーションを行っており、それゆえ、会合したＶＬＰがいつ溶出するか分っていた。これらの画分を回収し、最後に接線流を通して濃縮した。
【００８０】
タンパク質の正体（identity）及び性質の認定
精製方法の各ステップにおいて、サンプルを定常通りに保管したので、工程内をモニタリングすることができる。各発現システムが、間違いなくＶＬＰを作製した一方で、タンデム・コア・タンパク質の全てが、この最終的な構造をとっていたわけでないことが分かっていた。それゆえ、除去する必要がある最も重要な混入物質は、実のところ、単量体であるか、又はミスフォールドした状態のいずれかであるタンデム・コアそのものであった。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロッティングは、本質的には、変性を伴う技術であるので、これらは、ＦＰＬＣカラムの保持時間を用いて見積もることができる、タンパク質サイズの知見と組合せなければならなかった。
【００８１】
タンデム・コアを含有する試料は、方法の全ての段階で、１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル（Laemmli, 1970）での電気泳動後、クーマシー・ブルー染色によって、性状を調べた。ＨＢｃタンパク質に対するモノクローナル一次抗体（１０Ｅ１１[Abcam]）、続いて西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに複合体化したマウス二次抗体及び化学発光基質ＥＣＬｐｌｕｓ（Amersham Pharmacia）を用いて、Konigら、1998に記載されているようにして、ウェスタン・ブロット分析を行った。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法（BioRad）によって測定した。
【００８２】
電子顕微鏡
全ての試料を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８中、０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、グリッドに吸着させる直前に、ウォーターバス・ソニケーターの中で４５秒間、超音波処理した。パラフィルム上の希釈した試料液滴の上に、カーボン側を下にして、フォルムバー／カーボンでコーティングした銅グリッド（４００メッシュ）を置いた。材料を１０分間吸収させた。次いで、１％酢酸ウラニルを４回交換して、グリッドを洗浄した。ブロッティングし、空気乾燥させる前に、最後に交換した酢酸ウラニルで、グリッドを２０秒間インキュベートした。グリッドをＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  ＴＥＭに表示し、デジタル画像を取得した。画像は、８７，０００倍、４３，０００倍及び２６，０００倍の倍率で取得した。
【００８３】
ＬｏｌＣの抗原性についてのＥＬＩＳＡ
９６ウェル・マイクロタイタープレートを、１ウェル当たり、１００μｌの精製したＬｏｌＣ（標準、２〜０．０３μｇ／ｍＬ）、ＶＬＰ（陰性対照、３０〜０．２μｇ／ｍＬ）及びＶＬＰ−ＬｏｌＣ（試験試料、３０〜０．２μｇ／ｍＬ）でコートした（４℃、２４時間）。全ての試料は、リン酸緩衝生理食塩水（１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ、インビトロジェン）中で、２倍に連続希釈した。各ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、３回洗浄し、３７℃で１時間、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末を含有するＰＢＳ（２００μＬ）でブロックした。次いで、各ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、３回洗浄し、エンドトキシン・フリーのＬｏｌＣタンパク質でワクチン接種したマウス由来の１：１０００希釈血清を添加し（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１時間、インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、１：２０００希釈のＩｇＧヤギ抗マウス・西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を各ウェルに添加し（１００μＬ）、３７℃で１時間、インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で、更に６回洗浄し、４１４ｎｍでの光学濃度測定の前に、結合した複合体をＡＢＴＳ／過酸化水素基質（１００μＬ／ウェル）で検出した（室温で２０分間インキュベーション）。
【００８４】
ＶＬＰに対するＣＰＳの化学複合体化
メタ過ヨウ素酸ナトリウム（６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及びＣＰＳ（５ｍｇ）をＰＢＳ（１ｍｌ）中に溶解し、反応混合液を、室温で１時間、放置した。ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて、過剰量のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ＰＢＳで平衡化した。酸化したＣＰＳを、ＰＢＳ（１ｍｌ）中５ｍｇ／ｍｌで、タンパク質溶液に添加した。２０μｌのＮａＢＨ３ＣＮ（１０ｍＭ  ＮａＯＨ中、１Ｍ）を溶液に添加し、暗黒中、室温で４日間、放置した。２０μｌのＮａＢＨ４（１０ｍＭ  ＮａＯＨ中、１Ｍ  ＮａＢＨ４）を添加し、撹拌後、反応を４０分間放置した。溶液をＭＱ水で希釈し、重炭酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）に対して大々的に透析し、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ（Thermo Scientific）を用いて、真空中で濃縮した。
【００８５】
濃縮したタンパク質試料は、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣ精製システムで精製した。複合体溶液はＳ５００セファロースＳＥＣカラムＸＫ２６／６０（ＧＥヘルスケア）に注入し、重炭酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）を用いて、１ｍｌ／分で溶出した。全ての画分（２．５ｍｌ）を回収し、フェノール：硫酸アッセイを用いて、並びにＴＥＭ及びドットブロット分析によって、炭水化物について分析した。プールした画分を真空中で濃縮し（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ、Thermo Scientific）、ＰＢＳに透析した。
【００８６】
結果
酵母菌試料からのタンパク質の単離
方法全体を通して、試料を採取したので、方法が進むにつれて純度が改良されるのを追跡することができた。最も重要なことには、存在するインサートに関わらず、溶解後の、最初の遠心分離後に、可溶画分においてタンデム・コアの大部分が見られた。僅かなコア・タンパク質だけが、このスピン後のペレットにおいて見られ、このことは複雑な組成物であるにも関わらず、キメラＶＬＰが可溶性を維持していることを示唆する。
【００８７】
アフィニティー・クロマトグラフィーが、タンデム・コアと容易に適合しないことが見出されているので、酵母菌又はバキュロウイルス溶解物のいずれかからのＶＬＰの単離は、やや通常通りではない。それゆえ、発展させた方法は、試料内のサイズクラスの段階的な改良に基づいていた。まず、特に大きいデブリを濾過によって除去し、２００ｎｍより小さい粒子を存在したままにした。次いで、試料を、１ＭＤａ分子量カットオフの接線流フィルターに通した。これは、大きいＶＬＰを維持することに役立ったが、小さい分子量の混入物質をいくらか除去した。
【００８８】
次いで、試料を、ＣＬ４Ｂサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分離した。このマトリクスは、比較的小さい孔サイズを有しており、ＶＬＰを含む非常に大きい材料はレジンに入らない。それゆえ、大きい材料は、カラムをそのまま通過し、空隙容量において見られる。また一方、相当量の小さいタンパク質がレジンに入り、遅く進む。それゆえ、空隙容量だけを保持することにより、試料は効果的に濃縮される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロットを再度行うことで、タンデム・コアの大部分が、確かに、ＣＬ４Ｂ空隙容量にみられるかが示される。
【００８９】
次いで、ＣＬ４Ｂ空隙試料を、Ｓ１０００ＳＥＣカラムに通した。これは、核酸等の大きい分子を単離するために、従来用いられるが、また他の大きいデブリからＶＬＰを分離することもできる。カラムは、以前に、タンデム・コアＶＬＰ（３４．６ｎｍ）に類似するサイズのＶＬＰであることが知られていた組換えＨＢｃを用いて、キャリブレートしていた。それゆえ、タンデム・コアＶＬＰが、カラム溶出の最後の１／３において見られることを決定できた。これは、確かに事実であり、純粋なＶＬＰがこれらの画分から単離された。このことは、電子顕微鏡によって確認された。
【００９０】
図１〜３は、酵母菌試料からのタンパク質の単離についてのデータを含有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、酵母菌溶解物の可溶画分に、タンデム・コアがみられることを確認した（図１）。図２は、ＶＬＰがＣＬ４Ｂカラムの空隙容量から単離されたことを示す（図２Ｂの左パネルの大きいピーク）。次いで、ＣＬ４Ｂ空隙をＳ１０００カラムに通し、画分１２〜１５からＶＬＰを単離した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロットによって確認した（図３）。
【００９１】
バキュロウイルス試料からのタンパク質の単離
タンデム・コア・タンパク質はまた、最初のスピン（２５，０００×ｇ）に由来する上清においてみられた。このことは、ＶＬＰが可溶性であることを、再度、示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロットによって、ごく僅かなタンパク質だけが、不溶性ペレットへと失われたことを確認した。殆どの観点において、バキュロウイルスからのＶＬＰの単離は、酵母菌からの単離と非常に類似した。但し、バキュロ−ビリオンがタンデム・コアと共精製されるのが見られることが一般的であったので、１つの大きな違いが存在した。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５０ＫＤａのバンドとして）（図４Ａ）及び電子顕微鏡写真（長い管として、やはり明瞭に見えた）の両方で検出可能であった（図４Ｂ）。
【００９２】
数回の反復した精製にも関わらず、バキュロウイルス内で作られたＶＬＰを、均一性を有するまでに精製することはできなかった。そのため、ＶＬＰの好ましい発現システムは、酵母菌システムである。
【００９３】
ＣＰＳへの複合体化
複合体化アプローチの実現可能性を実証するために、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、以前に概説されている技術を用いて、ＶＬＰに複合体化した。
【００９４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、本質的に、変性を伴う技術であるので、分子量が増加していることから、これらのデータは、タンデム・コアの構成要素が効果的に修飾されていることを示すことに注目すべきである（図５）。但し、これらの複合体化粒子が、スクロース・クッションを移動したとき、蛍光バンドがＶＬＰ領域においてみられた。そのため、このことは、ＶＬＰを破壊することなく、複合体化が達成された事実を支持している（図６）。
【００９５】
同様に、我々は、ＣＰＳそのものの複合体化は、これをウシ血清アルブミンに複合体化することによっても可能であることを、更に実証する（図７）。そのため、我々は、ＣＰＳの複合体化は、我々が明らかにした化学的方法を用いて可能であり、ＶＬＰへの複合体化もまたあること（present）を示している。それゆえ、ＶＬＰへのＣＰＳの直接的な結合もまた、実行可能なはずである。
【００９６】
抗原性及び免疫原性
ＶＬＰへのＣＰＳの複合体化は、糖タンパク質の三次元構造を、根本的に変化させないはずである。ｉｎ  ｖｉｖｏでの複合体化のテストは、進行中である。
【００９７】
しかし、代替的なアプローチは、タンデム・コア分子に直接的に抗原を挿入することである。これは、挿入された抗原で高度に修飾されたＶＬＰとなる可能性が高い一方で、両方の末端で拘束されているために、インサートのフォールディングに潜在的に深刻な立体的な制限を課す。このことを調べるために、野生型Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ細菌で感染させたマウスにおいて惹起された抗体を用いたＥＬＩＳＡで、ＬｏｌＣインサートを有するＶＬＰをテストした。意外なことに、ＶＬＰを有するＬｏｌＣ（LolC carrying VLP）は、野生型Ｌｏｌｃタンパク質そのものと殆ど同じ程度の高い親和性で認識された。アンロードされた（unloaded）ＶＬＰに対しては、小さい反応があったが、反応は明らかに、インサートに対するものが主であった（図８）。図８において、３０ｕｇ／ｍｌの値を有するＶＬＰ  ＬｏｌＣに相当する線は、平均ＯＤ１．６〜１．８の間にある。３０ｕｇ／ｍｌの値を有するアンロードされたＶＬＰに相当する線は、平均ＯＤ０．４の近くにある。
【００９８】
ディスカッション
ＭＩＲへの抗原性インサートを許容する能力があるので、単量体コア・タンパク質の免疫原性は十分に証明されている。しかし、大きいか又は疎水性のインサートが加えられたときに、コア二量体は、もはや形成されず、ＶＬＰ形成の失敗に繋がることから、その技術には大きな弱点があることが、同じように立証されている。タンデム・コア ・コンストラクトの開発は、この大きな制限を克服するものである。
【００９９】
挿入されたタンパク質抗原の、送達システムとしてのタンデム・コアの有用性が、他の場所で実証されている一方で、化学複合体化の様式でシステムを使用することもできる。このケースにおいては、非特異的なリンカーのアミノ酸がＭＩＲに挿入され、これらの上述の標的アミノ酸に対する、抗原の化学複合体化から、疾患特異性が生じる。この技術では、従来のクローニング方法を用いて付加できなかった糖タンパク質を複合体化できるため、タンデム・コアが有し得る抗原を、更に拡張する。ＶＬＰの多量体的な性質は、１ＶＬＰあたり複数コピーの標的複合体が付加されることを意味する。ＶＬＰごとに９０〜１２０のＨＢｃ二量体が存在することを前提とすると、非常に高い抗原送達密度にまで到達し得る。もちろん、特異的な抗原の挿入と化学複合体化を組合せることができ、それゆえ、特異的なタンパク質及び特異的な糖タンパク質の両方を同時に有する、キメラ分子が作製される。
【０１００】
好ましいＶＬＰの発現システムは、酵母菌Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。但し、細菌、バキュロウイルス及び植物ベースの発現さえも含む、複数のシステムを使用し得る。これらのデータは、システムの特異性が、タンパク質一次配列に専ら由来しており、特定の発現システムに存在する場合がある翻訳後修飾とは関連がないことを証明した。更に、我々は、使用した精製戦略が任意の発現システムに適用でき、それゆえ、産業的な方法に拡張できる可能性が高いことを実証している。
【０１０１】
実施例２
ＣＰＳを、式ＸｐＺｑＸｒ（ここでＸはアスパラギン酸であり、Ｚはリジンであり、ｐは３であり、ｑは６であり及びｒは３である）を有する配列のリジンを介して、タンデム・コアのｅ１ループに結合した。タンデム・コア・コンストラクトは以下の配列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEGSGGSGGGSGSGRDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEFGSGSGGDDDKKKKKKDDDGGSGSASDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC（配列番号１０）を有していた。
３つのアスパラギン酸残基、６つのリジン残基及び３つのアスパラギン酸残基の配列は、コンストラクトの配列上で下線を引いた。このコンストラクトは、マウスにおける免疫応答を誘導する能力についてテストした。この結果は、以下で記載する。
【０１０２】
結果
ＶＬＰに対するＣＰＳの複合体化
ＣＰＳを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでＶＬＰに複合体化した。複合体化したＣＰＳは、電子顕微鏡下で可視化した（図９）。
【０１０３】
ＣＰＳ−ＶＬＰ複合体の効能
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２週間間隔で、３回、ワクチン接種し、腹腔内経路で、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ  Ｋ９６２４３を用いて抗原投与した。複合体化していないＣＰＳよりも、ＶＬＰ−ＣＰＳ複合体化ワクチンで、有意により強い防御が達成された（図１０）。
【０１０４】
複合体化していないＣＰＳでワクチン接種したマウスよりも、ＶＬＰ−ＣＰＳ複合体でワクチン接種したマウスにおいて、ＣＰＳ特異的血清のＩｇＧ及びＩｇＭ力価が大きかった（図１１）。
【０１０５】
ディスカッション
腹腔内投与したＢ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉに対して、ＶＬＰ−ＣＰＳ複合体は、複合体化していないＣＰＳよりも有意により強い防御を与える。
【図１】
2018514512.tif 000004
【図２】
2018514512.tif 000005
【図３】
2018514512.tif 000006
【図４】
2018514512.tif 000007
【図５】
2018514512.tif 000008
【図６】
2018514512.tif 000009
【図７】
2018514512.tif 000010
【図８】
2018514512.tif 000011
【図９】
2018514512.tif 000012
【図１０】
2018514512.tif 000013
【図１１】
2018514512.tif 000014
【配列表】
2018514512000001.app
【国際調査報告】
2018514512.tif 000015
2018514512.tif 000016
2018514512.tif 000017
2018514512.tif 000018
2018514512.tif 000019