(57)【要約】  本発明は、血清アルブミンに結合するフィブロネクチンタイプＩＩＩの１０番目のドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドを提供する。本発明はまた、診断および治療用途に用いるための異種タンパク質に連結された血清アルブミン結合１０Ｆｎ３を含む融合分子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンタイプＩＩＩの１０番目のドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、１μＭ以下のＫＤでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合し、かつＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含み、ここで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、該ＣＤループが１、２または３個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが１、２または３個のアミノ酸置換を有していてよく、そして１０Ｆｎ３ドメインに連結されている部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期が、１０Ｆｎ３ドメインに連結されていない部分の血清半減期に比べて延長されている、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）より大きいｋｄでＨＳＡに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの結合速度定数（ｋａ）の１桁倍（すなわち、１０倍以内）のｋａでＨＳＡに結合する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＣＤループが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループに対して２個のアミノ酸置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＣＤループが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループに対して１個のアミノ酸置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＦＧループが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループに対して１個のアミノ酸置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループおよびＦＧループに対して、ＣＤループが１個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが１個のアミノ酸置換を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
２個のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択される、請求項４に記載のポリペプチド：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【請求項９】
１個のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択される、請求項５に記載のポリペプチド：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【請求項１０】
ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、セリン（Ｓ）で置換される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、スレオニン（Ｔ）で置換される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、グルタミン（Ｑ）で置換される、請求項９に記載のポチペプチド。
【請求項１３】
ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）が、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換される、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ａ）ＣＤループにおける１個のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択される：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；ならびに、
ｂ）ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）が、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つの非ＣＤループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
１０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度に対する該ポリペプチドの解離速度の比率が、少なくとも約３倍である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
比率が、少なくとも約２５倍である、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
比率が、少なくとも約５０倍である、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
異種タンパク質を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
異種タンパク質が治療的部分である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
異種タンパク質が、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドである、請求項２１または２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド、および担体を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２６】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸分子または請求項２６に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項２８】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項２７に記載の細胞をポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し、該ポリペプチドを精製することを含む、方法。
【請求項２９】
ある部分の半減期を延長させる方法であって、請求項１から２３のいずれか一項に記載のヒト血清アルブミン結合ポリペプチドに該部分を連結させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２２２，５０８号（その内容は、引用により本明細書中に包含させる）に基づく優先権の利益を主張する。本明細書全体を通して引用された特許、特許出願、および引用文献は、それらの内容を引用により本明細書中に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療剤の半減期が不適当であると、治療効果のために必要な血清レベルを維持するために、高頻度および／または高用量での投与、あるいは徐放性製剤の使用が必要となることが多い。しかしながら、このことはしばしば、負の副作用と関連している。不適当な半減期を克服するための１つの戦略は、半減期を延長させるポリペプチドに治療剤を融合させることである。しかし、半減期の延長が有益であり得る一方で、過度に安定化された治療薬はまた、負の副作用をもたらし得る。従って、治療薬の半減期を微調整するための能力は有益となり得る。本出願は、種々の治療剤の血清半減期を微調整する化合物およびその産生方法を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は、融合パートナー（例えば、治療用ポリペプチド）の半減期を制御する多用途性を提供する、新規のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合フィブロネクチンタイプＩＩＩの１０番目のドメイン（１０Ｆｎ３）の開発に、少なくとも一部分、基づいている。
【０００４】
一側面において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合し、かつＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含み、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、そのＣＤループが１、２または３個のアミノ酸置換を有し、そしてそのＦＧループが１、２または３個のアミノ酸置換を有していてよく、かつ１０Ｆｎ３ドメインに連結されている部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期が、１０Ｆｎ３ドメインに連結されていない部分の血清半減期に比べて延長されている、ポリペプチドを提供する。
【０００５】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度 (off-rate）定数（ｋｄ）より速いｋｄでＨＳＡに結合する。
【０００６】
ある態様において、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度に対する該プリペプチドの解離速度の比率は、少なくとも約３倍である。ある態様において、比率は、少なくとも約２５倍である。ある態様において、比率は、少なくとも約５０倍である。
【０００７】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの結合速度(on-rate）定数（ｋａ）の１桁倍以内（すなわち、１０倍以内）のｋａでＨＳＡに結合する。
【０００８】
ある態様において、ＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して１または２個のアミノ酸置換を有する。ある態様において、ＦＧループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループと比較して１個のアミノ酸置換を有する。ある態様において、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループおよびＦＧループと比較して、ＣＤループは１個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループは、１個のアミノ酸置換を有する。
【０００９】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して、１または２個のアミノ酸置換を有し、ここで該１または２個の置換は、以下からなる群より選択される：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【００１０】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、上記の通り、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して１または２個のアミノ酸置換を有し、および／または１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＦＧループと比較して１個のアミノ酸置換を有する。ある態様において、ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）は、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換される。
【００１１】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号２３−２７、３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つの非ＣＤループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（ただし、場合により、該配列はＡＤＸ_２６２９_Ｅ０６の配列ではない）。ある態様において、ポリペプチドは、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（ただし、場合により、該配列は、ＡＤＸ_２６２９_Ｅ０６の配列ではない）。
【００１２】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合する。
【００１３】
ある態様において、本明細書に記載のポリペプチドは、治療部分（例えば、１０Ｆｎ３ドメイン）などの異種タンパク質をさらに含む。
【００１４】
ある側面において、本発明は、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのいずれかを含むポリペプチドまたはそれを含む融合ポリペプチド、ならびに担体（例えば、薬学的に許容される担体）を含む、組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【００１５】
ある側面において、本発明は、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのいずれか１つをコードする単離された核酸（例えば、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つをコードする単離された核酸）または該ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのいずれかを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸、それらを含む発現ベクター、ならびに核酸分子を含む細胞を提供する。
【００１６】
ある側面において、本発明は、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインまたはそれを含む融合ポリペプチドの産生方法であって、それらをコードする核酸分子を含む細胞を、１０Ｆｎ３ドメインまたは融合ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で培養し、それを精製することを含む方法を提供する。
【００１７】
ある側面において、本発明は、ある部分の半減期を延長する方法であって、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインを該部分に連結させることを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、結合の解離速度における差異を示す、解離相（dissociation phase）の開始時に正規化された、ＨＳＡに結合するアドネクチンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。
【図２】図２は、結合の解離速度における差異を示す、解離相の開始時に正規化された、ＨＳＡに結合するアドネクチンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムである。
【図３】図３は、結合の解離速度における差異を示す、解離相の開始時に正規化された、ＨＳＡおよびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合するさらなるアドネクチンのＳＰＲセンサーグラムである。
【図４】図４Ａ−４Ｄは、ＨＳＡ、ＭＳＡ、ラット血清アルブミン（ｒａｔ ＳＡ）、およびカニクイザル血清アルブミン（ｃｙｎｏ ＳＡ）に対する親和性を決定するための、親アドネクチン（ADX_7016_A01；PKE2）、ならびに7016_C03、7016_E02および7016_G01アドネクチンのＳＰＲ速度論的データである。
【図５】図５は、親アドネクチン（ADX_7016_A01；PKE2）、ならびに7016_C03、7016_E02および7016_G01アドネクチンのラットにおける血漿半減期を示すグラフである。
【図６】図６は、親アドネクチン（ADX_7016_A01；PKE2）、ならびに7016_C03、7016_E02および7016_G01アドネクチンのマウスにおける血漿半減期を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
定義
他にこれと異なる記載がない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な全ての方法および組成物を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および組成物を本明細書に記載する。
【００２０】
本明細書で用いる“ポリペプチド”は、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、２以上のアミノ酸の配列を意味する。“ポリペプチド”および“ペプチド”は本明細書中互換的に用いられる。ポリペプチドは、引用により本明細書中に包含させる米国特許第６，５５９，１２６号に記載のアミノ酸のような天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準化学的方法のいずれかで修飾されていてよい（例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてよい；カルボキシ末端アミノ酸を末端アミド基にしてよい；アミノ末端残基は、例えば親油性を増強するために、複数基で修飾されていてよい；または、ポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてよいか、あるいは、安定性またはインビボ半減期を増加させるために修飾されていてよい）。ポリペプチド修飾は、環状化合物または他の分子などの別の構造のポリペプチドへの結合を含んでいてよく、また、立体配置の異なる１以上のアミノ酸（すなわち、ＲまたはＳ；または、ＬまたはＤ）を含むポリペプチドも含み得る。
【００２１】
本明細書で用いる“ポリペプチド鎖”は、非共有相互作用またはジスルフィド結合とは異なって、そのドメインのそれぞれがペプチド結合（複数可）によって他のドメイン（複数可）に結合しているポリペプチドを意味する。
【００２２】
“単離された”ポリペプチドは、その天然環境の構成要素から同定され、分離され、および／または取得されたポリペプチドである。その天然環境の汚染要素とは、そのポリペプチドの診断または治療への使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様もしくは非タンパク質様溶質が含まれ得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定されるように、ポリペプチドの９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えて精製されるか、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも数残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど精製されるか、あるいは（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製され得る。単離されたポリペプチドには、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュウのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製され得る。
【００２３】
本明細書で用いる“１０Ｆｎ３ドメイン”または“１０Ｆｎ３部分”または“１０Ｆｎ３分子”は、野生型１０Ｆｎ３およびその生物学的に活性な変異体、例えば、標的タンパク質などの標的に特異的に結合する生物学的に活性な変異体を意味する。野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み得る。野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの生物学的に活性な変異体は、配列番号１を含む１０Ｆｎ３ドメインと比べて、少なくとも、多くとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０または４５個のアミノ酸変化、すなわち、置換、付加または欠失を有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【００２４】
本明細書で用いる、１０Ｆｎ３ドメインの“領域”は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインのループ（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ）、β鎖（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）、Ｎ末端（配列番号１のアミノ酸残基１〜８に対応する）、またはＣ末端（配列番号１のアミノ酸残基９３〜９４に対応する）の何れかを意味する。
【００２５】
“ノースポールループ”は、ヒトフィブロネクチン３型の第１０（１０Ｆｎ３）ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのいずれか１つを意味する。
【００２６】
“サウスポールループ”は、ヒトフィブロネクチン３型の第１０（１０Ｆｎ３）ドメインのＡＢ、ＣＤおよびＥＦループのいずれか１つを意味する。
【００２７】
本明細書で用いる“アドネクチン”は、目的の標的に特異的に結合するように修飾された１０Ｆｎ３ドメインを意味する。
【００２８】
“足場領域（scaffold region）”は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの非ループ領域を意味する。足場領域は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧのβ鎖ならびにＮ末端領域（配列番号１のアミノ酸残基１〜８に対応する）およびＣ末端領域（配列番号１のアミノ酸残基９３〜９４に対応し、要すれば、ヒトフィブロネクチン中のＦｎ３ドメインの第１０リピートと第１１リピートの間の天然リンカーを構成する７アミノ酸を含む）。
【００２９】
本明細書中、“アミノ酸配列の同一性（％）”は、配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後の、配列同一性％が最も高くなるようにしたときの、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部分として考慮せずに、選択配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一性％を決定する目的でのアラインメントは、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当技術の範囲内である種々の方法で行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための好適なパラメーターを決定することができる。しかしまがら、本明細書における目的に関して、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を用いて以下に記載のように得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムは、Genentech, Inc.によって作成され、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559においてユーザーの典拠資料と共にファイルされており、それはU.S. Copyright Registration No. TXU510087として登録されており、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0D上で用いられるように編集されるべきである。配列比較パラメーターは全て、ALIGN-2プログラムによって設定され、変更しない。
【００３０】
本発明の目的のために、所定のアミノ酸配列Ｂと比較した、Ｂとの、またはＢに対する所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂと比較した、Ｂとの、またはＢに対する任意のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所定のアミノ酸配列Ａと言うことができる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ（式中Ｘは、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一のマッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくないとき、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないと認識され得る。
【００３１】
本明細書中互換的に用いられる用語“特異的に結合する”、“特異的結合”、“選択的結合”および“選択的に結合する”は、ＨＳＡに対して親和性を示し、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ（例えば、競合的ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）などの、これらに限定されない、当技術分野で利用可能な技術によって測定されるように、異なるポリペプチドに有意に結合しない（例えば、約１０％未満の結合）、アドネクチンを意味する。該用語はまた、例えば、本発明のアドネクチンの結合ドメインがＨＳＡに特異的であるときにも適用可能である。
【００３２】
ポリペプチドの“半減期”は、一般的に、ポリペプチドの血清濃度がインビボで、例えば天然機序によるポリペプチドの分解および／またはポリペプチドのクリアランスもしくは隔離に起因して５０％低下するのに要する時間と定義され得る。半減期は、薬物動態解析などのそれ自体よく知られている方法で決定され得る。好適な技術は、当業者には明らかであり、例えば、一般的に、好適な用量のポリペプチドを霊長動物に投与する工程；該霊長動物から定期的な間隔で血液サンプルまたは他のサンプルを採取する工程；該血液サンプル中のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定する工程；このようにして得られたデータ（プロット）からポリペプチドのレベルまたは濃度が、投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する工程を含む。半減期を決定するための方法は、例えば、Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals： A Handbook for Pharmacists（1986）；Peters et al、Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach（1996）；および、“Pharmacokinetics”, M Gibaldi ＆ D Perron, Marcel Dekker出版、第２版（1982）に見いだされ得る。
【００３３】
半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメーターを用いて表すことができる。本明細書中、“半減期の増加”は、これらのパラメーターのいずれか１つ、これらのパラメーターのいずれか２つ、またはこれらの３つのパラメーター全てにおける増加を意味する。ある態様において、半減期の増加は、ｔ１／２−αおよび／またはＡＵＣまたは両方の増加を伴うかまたは伴わない、ｔ１／２−βの増加を意味する。
【００３４】
本明細書中、タンパク質へのアドネクチン結合に関して用いる用語“ＫＤ”は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを用いて測定される、特定のアドネクチン−タンパク質相互作用の解離平衡定数またはタンパク質（例えば、ＨＳＡ）に対するアドネクチンの親和性を意味する。本明細書で用いる“所望のＫＤ”は、意図される目的に十分なアドネクチンのＫＤを意味する。例えば、所望のＫＤは、インビトロアッセイ、例えば細胞ベースのルシフェラーゼアッセイにおいて機能的効果を誘導するために必要とされるアドネクチンのＫＤを意味し得る。
【００３５】
用語“ｋａｓｓ”、“ｋｏｎ”および“ｋａ”は、本明細書において互換的に用いられ、アドネクチン／タンパク質複合体へのアドネクチンの会合に関する会合速度定数を意味する。
【００３６】
用語“ｋｄｉｓｓ”、“ｋｏｆｆ”および“ｋｄ”は、本明細書において互換的に用いられ、アドネクチン from the アドネクチン／タンパク質複合体からのアドネクチンの解離速度定数を意味する。
【００３７】
本明細書で用いる用語“ＩＣ５０”は、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大阻害応答の５０％のレベルまで、すなわち最大阻害応答と未処理応答の中間レベルまで応答を阻害するアドネクチンの濃度を意味する。
【００３８】
用語“治療的有効量”とは、哺乳動物において疾患または障害を処置し、および／または該障害に関連する１または複数の症状をある程度緩和するのに有効な薬物の量を意味する。
【００３９】
本明細書で用いる、疾患または障害を“予防する”とは、未処置対照サンプルと比較して統計的サンプル中の疾患状態の発生の可能性を低減すること、または該未処理サンプルと比較して疾患または障害の１以上の症状の発症を遅延させるか、もしくはその重篤度を低下させることを意味する。患者は、一般的な集団と比較して臨床的疾患状態に罹患するリスクを増加させることが知られている因子に基づいて、予防的治療のために選択することができる。
【００４０】
本明細書で用いる用語“処置する”は、（ａ）疾患状態を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；および／または（b）疾患状態を緩和すること、すなわち、一旦確立された疾患状態の緩解をもたらすことを含む。
【００４１】
本明細書で用いる用語“約”は、記載された値の±１０％を意味する。
【００４２】
概要
本明細書に記載の新規のフィブロネクチンに基づく足場ポリペプチドは、ＨＳＡに結合し、異なる標的に結合する他の１０Ｆｎ３ドメインなどのさらなる分子（複数可）、または増加した半減期が有益なポリペプチドに連結され得る。
【００４３】
Ａ．ヒト血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメイン
Ｆｎ３は、フィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインを意味する。Ｆｎ３ドメインは、小さく、単量体で、可溶性、かつ安定である。それはジスルフィド結合を欠くので、還元条件下で安定である。Ｆｎ３の全体構造は、免疫グロブリンの折り畳みに似ている。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、β鎖またはβ様鎖（beta-like strand）であるＡ；ループＡＢ；β鎖またはβ様鎖であるＢ；ループＢＣ；β鎖またはβ様鎖であるＣ；ループＣＤ；β鎖またはβ様鎖であるＤ；ループＤＥ；β鎖またはβ様鎖であるＥ；ループＥＦ；β鎖またはβ様鎖であるＦ；ループＦＧ；および、β鎖またはβ様鎖であるＧを含む。７つの逆平行β鎖を安定したコアを形成する２つのβシートとして配置させて、該β鎖またはβ様鎖に結合するループからなる２つの“面”を作成する。ループＡＢ、ＣＤおよびＥＦは、一方の面に位置し（“サウスポール”）、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧは、反対の面に位置する（“ノースポール”）。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧの何れかまたは全てが、リガンド結合に関与し得る。ヒトフィブロネクチンには少なくとも１５種の異なるＦｎ３モジュールがあり、モジュール間の配列相同性は低いものの、それらはすべて三次構造において高い類似性を共有する。
【００４４】
ある態様において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に由来するＦｎ３ドメインである：
【化１】
2018532725.tif 000002
【００４５】
ある態様において、１０Ｆｎ３の非リガンド結合配列は、１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造的安定性を保持するならば、改変されてよい。種々の変異体１０Ｆｎ３足場ポリペプチドが報告されている。一側面において、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３の１つまたは複数が、例えば負に荷電していないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）のような別のアミノ酸で置換される。これらの変異は、野生型と比較して、中性ｐＨで変異体１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有することが報告されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４５２３を参照のこと）。有益なまたは中立的な（neutral）いずれかの１０Ｆｎ３足場ポリペプチドにおける様々な付加的改変が開示されている。例えば、Batori et al., Protein Eng 2002；15:1015-20；Koide et al., Biochemistry, 2001;40:10326-33を参照のこと。
【００４６】
変異型および野生型１０Ｆｎ３タンパク質は両方とも、同じ構造により特徴付けられ、すなわちＡ〜Ｇで示される７つのベータ鎖ドメイン配列および該７つのβ鎖ドメイン配列を連結する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、およびＦＧループ）を有する。Ｎ末端およびＣ末端に最も近い位置にあるβ鎖は、溶液中でβ様コンフォメーションをとることができる。配列番号１において、ＡＢループは、残基１４〜１７に対応し、ＢＣループは残基２３〜３１に対応し、ＣＤループは残基３７〜４７に対応し、ＤＥループは残基５１〜５６に対応し、ＥＦループは残基６３〜６７に対応し、そしてＦＧループは残基７５〜８７に対応する。可変性の多くは、一般的に、ループの１つまたは複数に発生し得る。しかしながら、ループ領域内の全ての残基が、所望の標的に対する強い親和性を有する１０Ｆｎ３結合ドメインを達成するために改変される必要はないことが理解されるべきである。いくつかの態様において、高親和性標的結合１０Ｆｎ３ドメインを産生するために、ループ内の残基、例えばＣＤループの残基のみが修飾される。
【００４７】
１０Ｆｎ３ポリペプチドのβ鎖またはβ様鎖の各々は、配列番号１、３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つの対応するβ鎖またはβ様鎖の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的に構成され得る。ただし、かかる変異は、生理的条件下でポリペプチドの安定性を阻害しない。
【００４８】
さらに、ループ領域における挿入および欠失はまた、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３結合ドメインを依然として産生しながら実行することもできる。従って、いくつかの態様において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される１以上のループは、野生型ヒト１０Ｆｎ３における対応するループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いずれかの所与のポリペプチドにおいて、１以上のループは伸長されてもよいか、１以上のループは短縮されてもよいか、またはその組合せであり得る。ある態様において、所与のループの長さは、２−２５、２−２０、２−１５、２−１０、２−５、５−２５、５−２０、５−１５、５−１０、１０−２５、１０−２０または１０−１５個のアミノ酸により延長され得る。ある態様において、所与のループの長さは、１−１５、１−１１、１−１０、１−５、１−３、１−２、２−１０または２−５個のアミノ酸だけ短縮され得る。
【００４９】
ある態様において、本発明は、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに特異的に結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、１０Ｆｎ３ドメインが、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥおよびＦＧループを含み、配列番号１のヒト１０Ｆｎ３ドメインまたは配列番号２３のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して変更されたアミノ酸配列を有するＣＤおよびＦＧループから選択される少なくとも１つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ＣＤおよびＦＧループは、改変される。ある態様において、ＣＤループのみが改変される。ある態様において、ＦＧループのみが改変される。ある態様において、１つまたは複数の特定の足場の改変が、１つまたは複数のループの改変と組み合わされる。“改変された”とは、テンプレート配列（すなわち、対応する野生型ヒトフィブロネクチンドメインまたは配列番号２３に記載の１０Ｆｎ３ドメイン）と比較した１以上のアミノ酸配列の改変を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換が含まれる。
【００５０】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、ノースポールおよびサウスポールループの改変の組み合わせを有する。例えば、ループＣＤおよびＦＧの１つ以上を、ループＡＢ、ＢＣ、ＤＥおよびＥＦの１つ以上と組み合わせることにより、配列番号１のヒト１０Ｆｎ３ドメインまたは配列番号２３のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの対応するループと比較して改変することができる。
【００５１】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つの非ループ領域および／または非修飾ループ領域に少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここで、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが改変されている、１０Ｆｎ３ドメインを含む。例えば、ある態様において、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８の対応するＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよび／またはＦＧループと比較して、ＡＢループは、４個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、３個までのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてよく、ＢＣループは、９個までのアミノ酸置換、４個までのアミノ酸挿入、３個までのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてよく、ＣＤループは、６個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、４個までのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてよく、ＤＥループは、６個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、４個までのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてよく、ＥＦループは、５個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、３個までのアミノ酸欠失、またはそれらの組合せを有していてよく、および／またはＦＧループは、１２個までのアミノ酸置換、１１個までのアミノ酸欠失、２５個までのアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有していてよい。
【００５２】
いくつかの態様において、インテグリン結合モチーフ“アルギニン−グリシン−アスパラギン酸”（ＲＧＤ）（配列番号１のアミノ酸７８〜８０）の１以上の残基を、インテグリン結合を破壊するように置換することができる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドのＦＧループは、ＲＧＤインテグリン結合部位を含まない。ある態様において、ＲＧＤ配列は、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列で（Ｎ末端からＣ末端方向に）置換される。ある態様において、ＲＧＤ配列は、ＳＧＥで置換される。さらに特定の態様において、ＲＧＤ配列は、ＲＧＥで置換される。
【００５３】
ある態様において、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質は、以下の配列に従って定義される１０Ｆｎ３ドメインを含む：
【化２】
2018532725.tif 000003
【００５４】
配列番号２において、ＡＢループは（Ｘ）Ｕで表され、ＢＣループは（Ｘ）ｖで表され、ＣＤループは（Ｘ）ｗで表され、ＤＥループは（Ｘ）ｘで表され、ＥＦループは（Ｘ）ｙで表され、そしてＦＧループはＸｚで表される。Ｘは、任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く添字は、アミノ酸数を整数で表す。特に、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、何れの位置であっても、２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７、または６−７個のアミノ酸であり得る。β鎖の配列（下線）は、何れの位置であっても、配列番号２に示す対応するアミノ酸と比較して７つ全ての足場領域に亘って、０から１０個、０から８個、０から６個、０から５個、０から４個、０から３個、０から２個、または０から１個の置換、欠失または付加を有し得る。ある態様において、β鎖の配列は、何れの位置であっても、配列番号２に示す対応するアミノ酸と比較して７つ全ての足場領域に亘って、０から１０個、０から８個、０から６個、０から５個、０から４個、０から３個、０から２個、または０から１個の保存的置換を有し得る。ある態様において、疎水性コアアミノ酸残基（上記の配列番号２の太字の残基）は固定されており、置換、保存的置換、欠失または付加は、該疎水性コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドの疎水性コア残基は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）に対して修飾されていない。
【００５５】
ある側面において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメイン連結された部分のｔ１／２を延長するために、ＨＳＡに特異的に結合するサウスポールおよび／またはノースポールの修飾を有する１０Ｆｎ３ドメインを提供する。
【００５６】
ＨＳＡは、ヒトでは６００μＭの血清濃度を有し、ｔ１／２は１９日である。ＨＳＡの延長されたｔ１／２は、部分的に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介するその再循環に帰されている。ＨＳＡは、内皮細胞へのエンドソーム取り込み後、ｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合する。この相互作用は、ＨＳＡを血流中に再循環させ、それによりＨＳＡをリソソーム分解から遠ざける。ＦｃＲｎは広範に発現されており、再循環経路は構成的であると考えられている。大部分の細胞型では、ほとんどのＦｃＲｎは、細胞内ソーティングエンドソーム内に存在する。ＨＳＡは、液相ピノサイトーシス（fluid phase pinocytosis）の非特異的機構によって容易に内在化され、ＦｃＲｎによるリソソームにおける分解から保護される。エンドソーム中で見いだされる酸性ｐＨでは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡの親和性が増加する（ｐＨ６．０にて５μＭ）。一旦ＦｃＲｎに結合すると、ＨＳＡは、リソソーム分解経路から除かれ、細胞表面にトランスサイトーシスされて、細胞表面で放出される。
【００５７】
ノースポールに基づくＨＳＡ結合アドネクチンは、“第１世代”の血清アルブミン結合アドネクチンと呼ばれ、例えば、ＷＯ２０１１１４００８６に記載されている。一部のものがマウスまたはラットの血清アルブミンに結合せず、種間の血清アルブミンに対する親和性が高くなく、そして多価１０Ｆｎ３ベースのプラットフォームでは必ずしも適合性ではなかった、第１世代のノースポールベースの血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）を改良するために、改変されたサウスポールループを有する第２世代のサウスポールベースのＨＳＡ結合アドネクチン（ＰＫＥ２アドネクチン）が開発された（ＰＣＴ／ＵＳ１５／２１５３５を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。そのようなアドネクチンの１つは、ADX_7016_A01であり（第２世代のＰＫＥ２アドネクチン）、それはＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合し、以下のコア配列を有する：
【化３】
2018532725.tif 000004
【００５８】
ADX_7016_A01は、低い免疫原性を有し、約３−６ｎＭのＫＤでＨＳＡに結合する。ADX_7016_A01に融合された異種１０Ｆｎ３ドメインを含む融合ポリペプチドは、マウスにおいて約８２時間の半減期を有する。ADX_7016_A01は、融合パートナーの半減期を実質的に延長するが、任意の状況では、融合パートナーの半減期はADX_7016_A01によって付与されるよりも短い半減期を有することが求められ得る。
【００５９】
従って、本発明は、ＨＳＡに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよび／またはＦＧループが、１、２または３個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが要すれば１、２または３個のアミノ酸置換を有し、１０Ｆｎ３ドメインに連結された部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期が、１０Ｆｎ３ドメインに連結されていない部分の半減期と比較して延長されている、ポリペプチドを提供する。
【００６０】
ある態様において、ＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して、２個のアミノ酸置換を有する。
【００６１】
ある態様において、ＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループと比較して１個のアミノ酸置換を有する。
【００６２】
ある態様において、ＦＧループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループと比較して１個のアミノ酸置換を有する。
【００６３】
ある態様において、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループおよびＦＧループと比較して、ＣＤループは１個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループは１個のアミノ酸置換を有する。
【００６４】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）よりも大きいｋｄでＨＳＡに結合する。
【００６５】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）よりも大きいｋｄを有する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドは、本明細書中、“ＰＫＥ３”アドネクチンと呼ばれる。
【００６６】
従って、本発明は、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよび／またはＦＧループが、１、２または３個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが要すれば、１、２または３個のアミノ酸置換を有し、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）よりも大きいｋｄでＨＳＡに結合し、該ポリペプチドの血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインを欠くポリペプチドと比較して延長されている、ポリペプチドを提供する。
【００６７】
ある態様において、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度に対する１０Ｆｎ３ドメインの解離速度の比率は、少なくとも約２倍、例えば少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍またはそれ以上である。ある態様において、該比率は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、または約６０倍である。ある態様において、該比率は、１．０、１．１、１．２、３．３、３．９、４．０、４．１、４．８、５．０、５．６、６．５、６．６、８、１１、１４、１７、２０、２３、２８、２８．９、３０．３、３２．０、３４．０、３４．３、３７．３、５０．０、５２、５２．７、５３．０、５６．０または７９．４倍である。ある態様において、該比率は、２−１００、２−７５、２−５０、２−４５、２−４０、２−３５、２−３０、２−２５、２−２０、２−１５、２−１０、２−５、５−１００、５−７５、５−５０、５−４５、５−４０、５−３５、５−３０、５−２５、５−２０、５−１５、５−１０、１０−１００、１０−７５、１０−５０、１０−４５、１０−４０、１０−３５、１０−３０、１０−２５、１０−２０、１０−１５、２０−１００、２０−７５、２０−５０、２０−４５、２０−４０、２０−３５、２０−３０、２０−２５、３０−１００、３０−７５、３０−５０、３０−４５、３０−４０、３０−３５、４０−１００、４０−７５、４０−５０、４０−４５、５０−１００、５０−７５、６０−１００、６０−７５、７０−１００、７０−７５、８０−１００、８０−９０、９０−１００、３−４、３−５、３−６、３−７、２５−４０、３０−４０、５０−５５、７５−８５、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４０、１−３０、１−２０、１−１０、または１−５倍の範囲内である。
【００６８】
ある態様において、ＨＳＡに結合する１０Ｆｎ３ドメインの解離速度は、少なくとも２．５×１０−４ ｓ−１；２．５×１０−４ ｓ−１；３×１０−４ ｓ−１；５×１０−４ ｓ−１；１０−３ ｓ−１；３×１０−３ ｓ−１；５×１０−３ ｓ−１；７×１０−３ ｓ−１；１０−２ ｓ−１；３×１０−２ ｓ−１；または、５×１０−２ ｓ−１である。ある態様において、ＨＳＡに結合する１０Ｆｎ３ドメインの解離速度は、２．５×１０−４ ｓ−１〜５×１０−４ ｓ−１；３×１０−４ ｓ−１〜１０×１０−４ ｓ−１；５×１０−４ ｓ−１〜１０×１０−４ ｓ−１；７×１０−４ ｓ−１〜１０×１０−４ ｓ−１；３×１０−４〜３×１０−３ ｓ−１；１０−３ ｓ−１〜１０−２ ｓ−１；または、３×１０−４ ｓ−１〜１０−３ ｓ−１の範囲である。
【００６９】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの結合速度定数（ｋａ）の約１桁倍以内（すなわち、約１０倍以内）のｋａでＨＳＡに結合する。
【００７０】
従って、本発明は、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよび／またはＦＧループが、１、２または３個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが要すれば１、２または３個のアミノ酸置換を有し、該ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）よりも大きいｋｄでＨＳＡに結合し、該ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの結合速度定数（ｋａ）の約１桁倍以内（すなわち、約１０倍以内）のｋａでＨＳＡに結合するし、そして該部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインに結合していない部分の血清半減期と比較して延長されている、ポリペプチドを提供する。
【００７１】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して２個のアミノ酸置換を有する。
【００７２】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して２個のアミノ酸置換を有し、ここで、該２個のアミノ酸置換は、以下からなる群より選択される：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【００７３】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して１個のアミノ酸置換を有する。
【００７４】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループと比較して１個のアミノ酸置換を有し、ここで、該１個のアミノ酸置換は、以下からなる群より選択される：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【００７５】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループと比較して１個のアミノ酸置換を有する。
【００７６】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループと比較して１個のアミノ酸置換を有し、ここで、ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）は、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換されている。
【００７７】
ある態様において、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループおよびＦＧループと比較して、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、１個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループは、１個のアミノ酸置換を有する。
【００７８】
ある態様において、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループおよびＦＧループと比較して、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、１個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループは、１個のアミノ酸置換を有し、ここで、
ａ）ＣＤループにおける１個のアミノ酸置換は、以下からなる群より選択される：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；そして、
ｂ）ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）が、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換される。
【００７９】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインに対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含むか、あるいは本明細書に記載のアミノ酸置換の１つまたは複数などの、最大１個、２個、３個、１−２個または１−３個のアミノ酸変化（すなわち、置換、例えば欠失、付加または保存的置換）を含む。ある態様において、ＨＳＡ結合分子は、配列番号２３−２７、３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８の非ＣＤループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００８０】
特定の態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
【化４】
2018532725.tif 000005
【００８１】
特定の態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
【化５】
2018532725.tif 000006
【００８２】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメイン内のさらなる領域、例えばβ鎖、Ｎ末端および／またはＣ末端領域もまた、配列番号２３、３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８と比較して配列の改変がされていてよく、かかるさらなる改変もまた、標的への結合に寄与し得る。
【００８３】
本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの非結合領域は、配列番号１、２３、３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８の足場アミノ酸残基と比較して、０から２０個、０から１５個、０から１０個、０から８個、０から６個、０から５個、０から４個、０から３個、０から２個、または０から１個の置換、保存的置換、欠失または付加を何れかの場所に有し得る。かかる足場修飾は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインが所望のＫＤでＨＳＡに結合することができる限り、行うことができる。
【００８４】
ある態様において、本発明のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端領域のアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応する領域のアミノ酸配列と比較して、欠失、置換または挿入により修飾され得る。１０Ｆｎ３ドメインは、一般的に、配列番号１のアミノ酸番号１で始まる。しかしながら、アミノ酸欠失を有するドメインも包含される。
【００８５】
さらなる配列はまた、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端またはＣ末端に付加されてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｎ末端伸長は、例えば、配列番号１において、“ＶＳＤ”で始まる１０Ｆｎ３ドメインに付加され得る、Ｍ、ＭＧおよびＧからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。例示的態様において、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１個のアミノ酸長を有する別のＮ末端領域は、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つのＮ末端領域に付加され得る。例示的な別のＮ末端領域には、（一文字アミノ酸コードによって表される）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号３）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４）が含まれる。他の好適な別のＮ末端領域には、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号５）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号６）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号７）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号８）、ＸｎＲＤＬ（配列番号９）、ＸｎＤＬ（配列番号１０）、またはＸｎＬ（式中、ｎ＝０、１または２個のアミノ酸であり、ここで、ｎ＝１のとき、Ｘは、ＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２のとき、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである）が含まれる。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に付加されるとき、Ｍは、通常切断され、Ｎ末端にＧが残る。ある態様において、別のＮ末端領域は、アミノ酸配列ＭＡＳＴＳＧ（配列番号１１）を含む。
【００８６】
例示的態様において、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１個のアミノ酸長を有する別のＣ末端領域は、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つのＣ末端領域に付加され得る。別のＣ末端配列の特定の例には、例えば、ＥＩＥＫ（配列番号１２）、ＥＧＳＧＣ（配列番号１３）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号１４）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号１５）、ＥＩＥＫＰ（配列番号１６）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号１７）、またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号１８）を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドが含まれる。ある態様において、別のＣ末端領域は、ＥＩＤＫ（配列番号１９）を含み、特定の態様では、別のＣ末端領域は、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号２０）か、またはＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号２１）のいずれかである。さらなる好適な別のＣ末端領域には、配列番号１４８−１７２に記載のものが含まれる。
【００８７】
ある態様において、Ｃ末端伸長配列は、ＥおよびＤ残基を含み、８から５０、１０から３０、１０から２０、５から１０、および２から４個のアミノ酸長であり得る。ある態様において、末端配列は、その配列がＥＤのタンデムリピートを含むＥＤベースのリンカーを含む。ある態様において、末端配列は、２−１０、２−７、２−５、３−１０、３−７、３−５、３、４または５個のＥＤリピートを含む。ある態様において、ＥＤベースの末端配列は、例えば、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳおよびＥＧＣのような、追加のアミノ酸残基を含んでもよい。そのような配列は、残基ＤおよびＫが除去されたＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号２１）などの既知のアドネクチン末端配列に、部分的に基づく。ある態様において、ＥＤベースの末端は、ＥＤリピートの前にＥ、ＩまたはＥＩ残基を含む。
【００８８】
ある態様において、本発明の１０Ｆｎ３ドメインの任意のＣ末端アミノ酸ＲＴ（すなわち、配列番号１のアミノ酸９３−９４に対応する）に連結され得る別のＣ末端部分は、アミノ酸ＰｍＸｎ（式中、Ｐはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数であり、ｎは０または少なくとも１である整数である）を含む。ある態様において、別のＣ末端部分は、アミノ酸ＰＣを含む。ある態様において、別のＣ末端部分は、アミノ酸ＰＩ、ＰＣ、ＰＩＤ、ＰＩＥ、ＰＩＤＫ（配列番号１５９）、ＰＩＥＫ（配列番号１６０）、ＰＩＤＫＰ（配列番号１６１）、ＰＩＥＫＰ（配列番号１６２）、ＰＩＤＫＰＳ（配列番号１６３）、ＰＩＥＫＰＳ（配列番号１６４）、ＰＩＤＫＰＣ（配列番号１６５）、ＰＩＥＫＰＣ（配列番号１６６）、ＰＩＤＫＰＳＱ（配列番号１６７）、ＰＩＥＫＰＳＱ（配列番号１６８）、ＰＩＤＫＰＣＱ（配列番号１６９）、ＰＩＥＫＰＣＱ（配列番号１７０）、ＰＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７１）およびＰＣＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７２）を含む。
【００８９】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、６×ｈｉｓ末端を含むか、あるいはそれを欠く。
【００９０】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号３０、３６、４２、４８、５１、５４、５７、６０、６２、６５、６７、７０、７３、７５、７８、８１、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５および１１７に記載の、Ｎ末端リーダーおよびＣ末端テールを欠くコア１０Ｆｎ３ドメインに対応する。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明は、例えば、異種部分（例えば、１０Ｆｎ３ドメインのような異種ポリペプチド）に化学的に結合可能になるように、特定の位置にシステイン残基が導入された変異ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインを提供する。好ましい態様において、システイン突然変異は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのＨＳＡへの結合を実質的に変化させない。
【００９２】
ある態様において、プロリン残基は、例えば、配列番号３３、３４、３９、４０、４５および４６に示される通り、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に導入される。本明細書に記載の他のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン、例えば、配列番号４８、５１、５４、５７、６０、６２、６５、６７、７０、７３、７５、７８、８１、８３、８６、８９、９１、９３、９５、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５および１１７のコア配列を有するものは、同様に修飾され得る。ある態様において、プロリン残基が、タンデムＨＳＡ結合アドネクチンのＣ末端に導入される。プロリン残基の付加は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインまたはタンデムＨＳＡ結合アドネクチンのＣ末端へのさらなるアミノ酸配列の付加を排除するものではない。
【００９３】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤでＨＳＡに結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【００９４】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインはまた、カニクイザル、アカゲザル、ラットまたはマウスの１種以上由来の血清アルブミンに結合し得る。
【００９５】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【００９６】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３は、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【００９７】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【００９８】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡに５．５から７．４のｐＨの範囲で結合する。
【００９９】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合する。
【０１００】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの血清半減期または異種部分（例えば、第２の１０Ｆｎ３ドメイン）に結合したＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの血清半減期は、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの血清半減期または異種部分（例えば、第２の１０Ｆｎ３ドメイン）に結合したＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの血清半減期は、２〜２００時間、５〜２００時間、１０〜２００時間、２５〜２００時間、５０〜２００時間、１００〜２００時間、１５０〜２００時間、２〜１５０時間、２〜１００時間、２〜５０時間、２〜２５時間、２〜１０時間、２〜５時間、５〜１５０時間、１０〜１００時間、または２５〜５０時間である。
【０１０１】
Ｂ．交差競合するアドネクチンおよび／または同じアドネクチン結合部位に結合するアドネクチン
本発明は、本明細書に記載の特定のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン、例えば、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９、および１１１−１１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン（アドネクチン）とＨＳＡとの結合に対して競合する（例えば、交差競合する）、アドネクチン、抗体またはその抗原結合フラグメント、小分子、ペプチドなどのタンパク質を提供する。そのような競合タンパク質は、標準的血清アルブミン結合アッセイにおいて本明細書に記載の血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインのＨＳＡへの結合を競合的に阻害する能力に基づいて同定され得る。例えば、組換えＨＳＡがプレート上に固定化され、タンパク質の１つが蛍光標識され、標識されたタンパク質の結合と競合する非標識タンパク質の能力が評価される標準的ＥＬＩＳＡアッセイを、用いることができる。
【０１０２】
以下の例示的な競合アッセイは、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの１つとＨＳＡとの結合に対して競合するＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインとの関連で提供される。非アドネクチンタンパク質が競合について試験される場合、同じアッセイを行うことができる。一態様において、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを行い、２つのＨＳＡ結合アドネクチンがＨＳＡ上の重複するアドネクチン結合部位（エピトープ）に結合するか否かを決定することができる。１つのフォーマットにおいて、アドネクチン ♯１をプレート上にコーティングし、その後ブロッキングし、洗浄する。このプレートに、ＨＳＡのみ、または飽和濃度のアドネクチン ♯２と共に予めインキュベートしたＨＳＡのいずれかを添加する。好適なインキュベート時間後、プレートを洗浄し、ポリクローナル抗ＨＳＡ抗体でプローブし、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ結合法および標準的テトラメチルベンジジン発色法で検出する。ＯＤシグナルが、アドネクチン ♯２とのプレインキュベート有無で同じであるとき、２つのアドネクチンは、互いに独立して結合し、そのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、血清アルブミン／アドネクチン♯２ 混合物を受容した複数ウェルのＯＤシグナルが、ＨＳＡのみを受容したものよりも低いとき、アドネクチン ♯２の結合は、アドネクチン ♯１のＨＳＡへの結合を阻止することが確認される。
【０１０３】
あるいは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ）によって同様の実験を行う。アドネクチン ♯１をＳＰＲチップ表面上に固定化し、次いで、ＨＳＡのみ、または飽和濃度のアドネクチン ♯２でプレインキュベートしたＨＳＡのいずれかを注入する。ＨＳＡ／アドネクチン♯２ 混合物の結合シグナルが、ＨＳＡのみのものと同じかまたはそれより高いとき、２つのアドネクチンは、互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、ＨＳＡ／アドネクチン♯２ 混合物の結合シグナルが、ＨＳＡのみの結合シグナルよりも低いとき、アドネクチン ♯２の結合は、アドネクチン ♯１のＨＳＡへの結合を阻止することが確認される。これらの実験の特徴は、飽和濃度のアドネクチン ♯２の使用である。ＨＳＡがアドネクチン ♯２で飽和していないとき、上記の結論は成り立たない。いずれか２つのＨＳＡ結合タンパク質が重複するアドネクチン結合部位に結合するかどうかを決定するために、同様の実験を用いることができる。
【０１０４】
例示した上記の両方のアッセイは、アドネクチン♯２を固定化し、ＨＳＡ−アドネクチン♯１をプレートに添加する、逆の順序でも行うことができる。あるいは、アドネクチン ♯１および／または♯２は、モノクローナル抗体および／または可溶性受容体−Ｆｃ融合タンパク質で置き換えることができる。
【０１０５】
ある態様において、競合は、ＨＴＲＦサンドイッチアッセイを用いて決定することができる。
【０１０６】
候補競合ＨＳＡ結合タンパク質、例えばアドネクチンは、本明細書に記載のアドネクチンのＨＳＡへの結合を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％阻害し得る。競合％は、上記の方法を用いて決定することができる。
【０１０７】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインと同じアドネクチン結合部位に結合するアドネクチンを提供する。特定のアドネクチンによって結合されたエピトープは、抗原：アドネクチン複合体の結晶のＸ線分析（エピトープの原子分解能を提供する）、プロテアーゼマッピング、水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）、二次元核磁気共鳴、アラニンスキャニング、および次世代タンパク質変異導入スキャニング（deep mutational scanning）などの当該分野で認識されるエピトープマッピング法を用いて決定され得る（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.（1996）を参照のこと）。
【０１０８】
Ｃ．多価／タンデムアドネクチン
本発明は、２以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み、そのうちの少なくとも１つがＨＳＡに特異的に結合する多価タンパク質を提供する。例えば、多価タンパク質は、共有結合的に会合された２、３またはそれ以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み得る。ある態様において、多価タンパク質は、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む二重特異的または二量体タンパク質である。ある態様において、多価タンパク質は、ＨＳＡに結合する第１の１０Ｆｎ３ドメイン（例えば、セクションＡにおいて上記の１０Ｆｎ３ドメイン）および第２の標的分子に結合する第２の１０Ｆｎ３ドメインを含む。第１および第２の標的分子が両方ともＨＳＡであるとき、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、同一または異なるエピトープに結合し得る。さらに、第１および第２標的分子が同じであるとき、標的結合に関連する１０Ｆｎ３ドメインの修飾領域は、同じであっても異なっていてもよい。
【０１０９】
ある態様において、多価フィブロネクチンに基づくタンパク質足場の各１０Ｆｎ３ドメインは、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１０ｐＭ未満のＫＤでＨＳＡに結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。例示的態様において、多価フィブロネクチンに基づくタンパク質足場の各１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡに、すなわち、野生型１０Ｆｎ３ドメイン、特に野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインに結合しない標的に特異的に結合する。
【０１１０】
多価フィブロネクチンに基づく足場タンパク質における１０Ｆｎ３ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結されていてよい。ポリペプチドリンカーの例には、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３または１−２個のアミノ酸を有するポリペプチドが含まれる。１０Ｆｎ３ドメインを連結するのに好適なリンカーは、別個のドメインが互いに独立して折り畳まれて標的分子との高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するのを可能にするリンカーである。好適なリンカーの具体的な例には、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、プロリン−アラニンベースのリンカー、ならびにアミノ酸配列ＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ（配列番号１２０）を有するリンカーが含まれる。ある態様において、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含み、８から５０、１０から３０、および１０から２０アミノ酸長であり得る。例としては、アミノ酸配列（ＧＳ）７（配列番号１２１）、Ｇ（ＧＳ）６（配列番号１２２）、およびＧ（ＧＳ）７Ｇ（配列番号１２３）を有するリンカーが挙げられる。他のリンカーは、グルタミン酸を含み、例えば、（ＧＳＥ）５（配列番号１２４）およびＧＧＳＥＧＧＳＥ（配列番号１２５）を含む。他のグリシン−セリンリンカーの例には、（ＧＳ）４（配列番号１２６）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号１２７）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１２８）、および（ＧＧＧＧＳ）３Ｇ（配列番号１２９）が含まれる。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、３から３０、１０から３０、および３から２０アミノ酸長であり得る。例としては、アミノ酸配列（ＧＰ）３Ｇ（配列番号１３０）、（ＧＰ）５Ｇ（配列番号１３１）、およびＧＰＧを有するリンカーが挙げられる。ある態様において、リンカーは、３から３０、１０から３０、および３から２０アミノ酸長を有するプロリン−アラニンベースのリンカーであり得る。プロリン−アラニンベースのリンカーの例としては、例えば、（ＰＡ）３（配列番号１３２）、（ＰＡ）６（配列番号１３３）および（ＰＡ）９（配列番号１３４）が挙げられる。最適なリンカーの長さおよびアミノ酸組成は、当技術分野で周知の方法によって常套的に行われる実験によって決定され得ることが企図される。例示的態様において、リンカーは、Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＫ）対を含まない。
【０１１１】
ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１３５）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１３６）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１３７）、またはＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１３８）を有する。一般的に、リンカーは、アミノ酸配列（ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ）ｎ（配列番号１４４）を含んでいてよく、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１−５または１−１０である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＥＥＥＥＤＥ（配列番号１３９）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥ（配列番号１４０）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥ（配列番号１４１）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥ（配列番号１４２）を有する。一般的に、リンカーは、配列（ＥＥＥＥＤＥ）ｎＥ（配列番号１４５）を含んでいてよく、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１−５または１−１０である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ（配列番号１４３）を有する。そのようなリンカーを用いて、ＨＳＡ結合アドネクチンを別のポリペプチド（例えば、別のアドネクチン）に連結することができる。ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１３５）のリンカーの例示的な使用を、以下に示す（配列番号７４のＹＲＴＰの後の“Ｇ”および配列番号７５のＴＰＥＰは任意である）。
Ｃ末端ポリペプチドに連結されたＮ末端アドネクチン：
【化６】
2018532725.tif 000007
Ｃ末端アドネクチンに連結されたＮ末端ポリペプチド：
【化７】
2018532725.tif 000008
【０１１２】
ある態様において、多価アドネクチンは、ＨＳＡに結合する第１の１０Ｆｎ３ドメイン（例えば、ＰＫＥ３アドネクチン）、および特定の標的に結合する第２の１０Ｆｎ３ドメインを含むタンデムアドネクチンである。タンデムアドネクチンは、ＨＳＡ結合アドネクチン−ＸおよびＸ−ＨＳＡ結合アドネクチン（ここで、Ｘは標的特異的１０Ｆｎ３ドメインである）の形状を有していてよい。当業者は、機能的活性を試験する方法およびかかるタンデムアドネクチン分子の生物物理学的特性を評価するための方法に精通しているであろう。
【０１１３】
一側面において、本発明は、第１のフィブロネクチンタイプＩＩＩの１０番目のドメイン（１０Ｆｎ３）および第２の１０Ｆｎ３ドメインを含む融合ポリペプチドであって、ここで、該第１の１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡに結合し、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含み、ここで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、該ＣＤループが、１、２または３個のアミノ酸置換を有し、そしてＦＧループが要すれば１、２または３個のアミノ酸置換（例えば、セクションＡにおいて、上記のＣＤおよび／またはＦＧループに対するアミノ酸置換）を有し、ここで、１０Ｆｎ３ドメインに連結された部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期が、１０Ｆｎ３ドメインに連結されていない部分のそれと比較して延長されている、融合ポリペプチドを提供する。“第１の”ドメインおよび第２の“ドメイン”は、Ｎ末端からＣ末端またはＣ末端からＮ末端の方向であってよい。
【０１１４】
ある態様において、第１の１０Ｆｎ３ドメインの解離速度の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度に対する比率は、少なくとも約２倍、例えば少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍またはそれ以上である。ある態様において、該比率は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９または約６０倍である。ある態様において、該比率は、１．０、１．１、１．２、３．３、３．９、４．０、４．１、４．８、５．０、５．６、６．５、６．６、８、１１、１４、１７、２０、２３、２８、２８．９、３０．３、３２．０、３４．０、３４．３、３７．３、５０．０、５２、５２．７、５３．０、５６．０または７９．４倍である。ある態様において、該比率は、２−１００、２−７５、２−５０、２−４５、２−４０、２−３５、２−３０、２−２５、２−２０、２−１５、２−１０、２−５、５−１００、５−７５、５−５０、５−４５、５−４０、５−３５、５−３０、５−２５、５−２０、５−１５、５−１０、１０−１００、１０−７５、１０−５０、１０−４５、１０−４０、１０−３５、１０−３０、１０−２５、１０−２０、１０−１５、２０−１００、２０−７５、２０−５０、２０−４５、２０−４０、２０−３５、２０−３０、２０−２５、３０−１００、３０−７５、３０−５０、３０−４５、３０−４０、３０−３５、４０−１００、４０−７５、４０−５０、４０−４５、５０−１００、５０−７５、６０−１００、６０−７５、７０−１００、７０−７５、８０−１００、８０−９０、９０−１００、３−４、３−５、３−６、３−７、２５−４０、３０−４０、５０−５５、７５−８５、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４０、１−３０、１−２０、１−１０、または１−５倍の範囲である。
【０１１５】
ある態様において、第１の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの結合速度定数（ｋａ）の１桁倍以内（すなわち、１０倍以内）であるｋａでＨＳＡに結合する。
【０１１６】
例えば多価アドネクチンの、特定の態様において、第１の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、またはそれと最大で１個、１−２個、１−５個、１−１０個または１−２０個のアミノ酸が異なる（例えば、アミノ酸の欠失、付加または置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、例えば、本明細書中に記載される１以上のアミノ酸置換を有する）。
【０１１７】
ある態様において、第１の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
いくつかの態様において、多価アドネクチンは、ＨＳＡ以外の標的タンパク質、例えば、セクションＤで上記の標的タンパク質（例えば、治療部分）に特異的に結合する１０Ｆｎ３ドメインである第２の１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【０１１９】
一側面において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤでＨＳＡに結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【０１２０】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンはまた、カニクイザル、アカゲザル、ラットまたはマウスの１以上に由来する血清アルブミンにも結合し得る。
【０１２１】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【０１２２】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【０１２３】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから３μＭ、５０ｎＭから２μＭ、５０ｎＭから１μＭ、５０ｎＭから５００ｎＭ、５０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから３μＭ、１００ｎＭから２μＭ、１００ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから３μＭ、２５０ｎＭから２μＭ、２５０ｎＭから１μＭ、２５０ｎＭから５００ｎＭ、５００ｎＭから３μＭ、５００ｎＭから２μＭ、５００ｎＭから１μＭ、１μＭから３μＭ、または１μＭから２μＭの範囲であり得る。
【０１２４】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、５．５から７．４の範囲のｐＨで血清アルブミンに結合する。
【０１２５】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、ＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合する。
【０１２６】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、ＨＳＡ、カニクイザル血清アルブミン、アカゲザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、および／またはラット血清アルブミンの存在下で、少なくとも１時間、２時間、５時間、１０時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１５０時間、２００時間、または少なくとも約３００時間の血清半減期を有する。
【０１２７】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合タンデムアドネクチンは、ＨＳＡ、カニクイザル血清アルブミン、アカゲザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、および／またラット血清アルブミンの存在下で、１−３００時間、例えば１−２５０時間、１−２００時間、１−１５０時間、１−１００時間、１−９０時間、１−８０時間、１−７０時間、１−６０時間、１−５０時間、１−４０時間、１−３０時間、１−２０時間、１−１０時間、１−５時間、５−３００時間、１０−３００時間、２０−３００時間、３０−３００時間、４０−３００時間、５０−３００時間、６０−３００時間、７０−３００時間、８０−３００時間、９０−３００時間、１００−３００時間、１５０−３００時間、２００−３００時間、２５０−３００時間、５−２５０時間、１０−２００時間、５０−１５０時間または８０−１２０時間の血清半減期を有する。
【０１２８】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチン中のパートナーアドネクチンの血清半減期は、ＨＳＡ結合アドネクチンに連結されていないときの該パートナーアドネクチンの血清半減期に比べて長い。
【０１２９】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチンの血清半減期は、ＨＳＡ結合アドネクチンに融合されていないときの該パートナーアドネクチンの血清半減期と比べて、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００または３０００％ 長い。
【０１３０】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチンの血清半減期は、ＨＳＡ結合アドネクチンに融合されていないときの該パートナーアドネクチンの血清半減期と比べて、２０−３０００％、例えば４０−３０００％、６０−３０００％、８０−３０００％、１００−３０００％、１２０−３０００％、１５０−３０００％、１８０−３０００％、２００−３０００％、４００−３０００％、６００−３０００％、８００−３０００％、１０００−３０００％、１２００−３０００％、１５００−３０００％、１８００−３０００％、１９００−３０００％、２０００−３０００％、２５００−３０００％、２０−２５００％、２０−２０００％、２０−１９００％、２０−１８００％、２０−１５００％、２０−１２００％、２０−１０００％、２０−８００％、２０−６００％、２０−４００％、２０−２００％、２０−１８０％、２０−１５０％、２０−１２０％、２０−１００％、２０−８０％、２０−６０％、２０−４０％、５０−２５００％、１００−２０００％、１５０−１５００％、２００−１０００％、４００−８００％、または５００−７００％長い。
【０１３１】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチンの血清半減期は、ＨＳＡ結合アドネクチンに融合されていないときのパートナーアドネクチンの血清半減期よりも、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍または５０倍大きい。
【０１３２】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチンの血清半減期は、ＨＳＡ結合アドネクチンに融合されていないときのパートナーアドネクチンの血清半減期よりも、１．５−５０倍、例えば１．５−４０倍、１．５−３５倍、１．５−３０倍、１．５−２７倍、１．５−２５倍、１．５−２２倍、１．５−２０倍、１．５−１７倍、１．５−１５倍、１．５−１３倍、１．５−１２倍、１．５−１０倍、１．５−９倍、１．５−８倍、１．５−７倍、１．５−６倍、１．５−５倍、１．５−４．５倍、１．５−４倍、１．５−３．５倍、１．５−３倍、１．５−２．５倍、１．５−２倍、２−５０倍、２．５−５０倍、３−５０倍、３．５−５０倍、４−５０倍、４．５−５０倍、５−５０倍、６−５０倍、７−５０倍、８−５０倍、１０−５０倍、１２−５０倍、１３−５０倍、１５−５０倍、１７−５０倍、２０−５０倍、２２−５０倍、２５−５０倍、２７−５０倍、３０−５０倍、４０−５０倍、２−４０倍、５−３５倍、１０−２０倍、または１０−１５倍大きい。
【０１３３】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチンの血清半減期は、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間または２００時間である。
【０１３４】
ある態様において、ＨＳＡ結合タンデムアドネクチンの血清半減期は、２−２００時間、２．５−２００時間、３−２００時間、４−２００時間、５−２００時間、６−２００時間、７−２００時間、８−２００時間、９−２００時間、１０−２００時間、１５−２００時間、２０−２００時間、２５−２００時間、３０−２００時間、３５−２００時間、４０−２００時間、５０−２００時間、６０−２００時間、７０−２００時間、８０−２００時間、９０−２００時間、１００−２００時間、１２５−２００時間、１５０−２００時間、１７５−２００時間、１９０−２００時間、２−１９０時間、２−１７５時間、２−１５０時間、２−１２５時間、２−１００時間、２−９０時間、２−８０時間、２−７０時間、２−６０時間、２−５０時間、２−４０時間、２−３５時間、２−３０時間、２−２５時間、２−２０時間、２−１５時間、２−１０時間、２−９時間、２−８時間、２−７時間、２−６時間、２−５時間、２−４時間、２−３時間、５−１７５時間、１０−１５０時間、１５−１２５時間、２０−１００時間、２５−７５時間または３０−６０時間である。
【０１３５】
Ｄ．ＨＳＡ結合アドネクチンのコンジュゲート
本発明の特定の側面は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン（例えば、セクションＡおよびＢに記載されている）および少なくとも１つのさらなる部分（例えば、治療部分）を含む複合体（コンジュゲート）を提供する。該さらなる部分は、診断、画像化または治療目的に有用であり得る。
【０１３６】
いくつかの態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、小さな有機分子、核酸、ペプチドまたはタンパク質である第２の部分に融合される。
【０１３７】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインは、受容体、受容体リガンド、ウイルスコートタンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原または細胞シグナル伝達タンパク質を標的とする治療部分に融合される。融合は、第２の部分をＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインのいずれかの末端に結合させることによって形成され、すなわちＨＳＡ結合ドメイン、すなわち、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン−治療分子または治療分子−ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの配列である。
【０１３８】
ある態様において、１０Ｆｎ３ドメインに連結された部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインに連結されていない部分の血清半減期に対して延長されている。ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合体の血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインに融合されていないとき、該部分の血清半減期に比べて、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００または３０００％長い。ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合体の血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインに融合されていないときの該部分の血清半減期に比べて、５−３０００％、例えば１０−３０００％、１５−３０００％、２０−３０００％、３０−３０００％、４０−３０００％、５０−３０００％、６０−３０００％、７０−３０００％、８０−３０００％、９０−３０００％、１００−３０００％、１２０−３０００％、１５０−３０００％、１８０−３０００％、２００−３０００％、４００−３０００％、６００−３０００％、８００−３０００％、１０００−３０００％、１２００−３０００％、１５００−３０００％、１８００−３０００％、１９００−３０００％、２０００−３０００％、２５００−３０００％、２０−２５００％、２０−２０００％、２０−１９００％、２０−１８００％、２０−１５００％、２０−１２００％、２０−１０００％、２０−８００％、２０−６００％、２０−４００％、２０−２００％、２０−１８０％、２０−１５０％、２０−１２０％、２０−１００％、２０−８０％、２０−６０％、２０−４０％、１０−２０００％、１０−１９００％、１０−１８００％、１０−１５００％、１０−１２００％、１０−１０００％、１０−８００％、１０−６００％、１０−４００％、１０−２００％、１０−１８０％、１０−１５０％、１０−１２０％、１０−１００％、１０−８０％、１０−６０％、１０−４０％、１０−２０％、５−２０００％、５−１９００％、５−１８００％、５−１５００％、５−１２００％、５−１０００％、５−８００％、５−６００％、５−４００％、５−２００％、５−１８０％、５−１５０％、５−１２０％、５−１００％、５−８０％、５−６０％、５−４０％、５−２０％、５−１５％、５−１０％、５０−２５００％、１００−２０００％、１５０−１５００％、２００−１０００％、４００−８００％または５００−７００％長い。
【０１３９】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合体の血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインに融合されていないときの該部分の血清半減期に比べて、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍または５０倍大きい。
【０１４０】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合物の血清半減期は、１０Ｆｎ３ドメインに融合されていないときの該部分の血清半減期に比べて、１．５−５０倍、例えば１．５−４０倍、１．５−３５倍、１．５−３０倍、１．５−２７倍、１．５−２５倍、１．５−２２倍、１．５−２０倍、１．５−１７倍、１．５−１５倍、１．５−１３倍、１．５−１２倍、１．５−１０倍、１．５−９倍、１．５−８倍、１．５−７倍、１．５−６倍、１．５−５倍、１．５−４．５倍、１．５−４倍、１．５−３．５倍、１．５−３倍、１．５−２．５倍、１．５−２倍、２−５０倍、２．５−５０倍、３−５０倍、３．５−５０倍、４−５０倍、４．５−５０倍、５−５０倍、６−５０倍、７−５０倍、８−５０倍、１０−５０倍、１２−５０倍、１３−５０倍、１５−５０倍、１７−５０倍、２０−５０倍、２２−５０倍、２５−５０倍、２７−５０倍、３０−５０倍、４０−５０倍、２−４０倍、５−３５倍、１０−２０倍または１０−１５倍大きい。
【０１４１】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合体の血清半減期は、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間または２００時間である。ある態様において、ＨＳＡ結合アドネクチン融合体の血清半減期は、２−２００時間、２．５−２００時間、３−２００時間、４−２００時間、５−２００時間、６−２００時間、７−２００時間、８−２００時間、９−２００時間、１０−２００時間、１５−２００時間、２０−２００時間、２５−２００時間、３０−２００時間、３５−２００時間、４０−２００時間、５０−２００時間、６０−２００時間、７０−２００時間、８０−２００時間、９０−２００時間、１００−２００時間、１２５−２００時間、１５０−２００時間、１７５−２００時間、１９０−２００時間、２−１９０時間、２−１７５時間、２−１５０時間、２−１２５時間、２−１００時間、２−９０時間、２−８０時間、２−７０時間、２−６０時間、２−５０時間、２−４０時間、２−３５時間、２−３０時間、２−２５時間、２−２０時間、２−１５時間、２−１０時間、２−９時間、２−８時間、２−７時間、２−６時間、２−５時間、２−４時間、２−３時間、５−１７５時間、１０−１５０時間、１５−１２５時間、２０−１００時間、２５−７５時間または３０−６０時間である。
【０１４２】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤでＨＳＡに結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭから５０ｎＭ、０．１ｎＭから１００ｎＭ、０．１ｎＭから１μＭ、０．５ｎＭから５０ｎＭ、０．５ｎＭから１００ｎＭ、０．５ｎＭから１μＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭまたは１ｎＭから１μＭの範囲であり得る。
【０１４３】
ある態様において、治療部分は、例えば、本明細書に記載のポリマーリンカー（例えば、セクションＣに記載のリンカーなど）を介して、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに直接的または間接的に連結され得る。ポリマーリンカーを用いて、融合体の各成分間の距離を最適に変化させて、以下の特徴の１以上を有するタンパク質融合体を作製することができる：１）目的のタンパク質に結合するときの１以上のタンパク質ドメインの結合の立体障害の減少または増加、２）タンパク質の安定性または溶解性の増加、３）タンパク質凝集の減少、および４）タンパク質の全体的なアビディティー（Avidity）または親和性の増加。
【０１４４】
例えば、本明細書のセクションＣに記載の、２つのアドネクチンを連結するためのリンカーは、アドネクチンを異種部分、例えばポリペプチドに連結するために用いることができる。
【０１４５】
ある態様において、部分、例えばポリペプチドは、血液または標的組織中のプロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介してＨＳＡ結合アドネクチンに連結される。そのような態様は、より良好な送達または治療特性またはより効率的な産生のために治療用タンパク質を放出するために用いられ得る。
【０１４６】
さらなるリンカーまたはスペーサーは、１０Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーとの間の１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に導入され得る。
【０１４７】
ある態様において、治療部分は、ポリマー糖などの生体適合性ポリマーを介してＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに連結される。ポリマー糖は、血液または標的組織中の酵素によって切断可能な酵素的切断部位を含み得る。かかる態様は、より良好な送達または治療特性またはより効率的な産生のために治療用タンパク質を放出するために用いられ得る。
【０１４８】
本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合分子は、治療部分とＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインとの融合体を産生することにより、治療部分の半減期を延長させるために有用である。かかる融合分子は、融合物に含まれる治療部分の生物学的活性に応答する病状を処置するために用いられ得る。従って、本発明は、以下のタンパク質または分子のいずれかの調節不全によって引き起こされる疾患における、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合分子の使用を提供する。
【０１４９】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン（Ｃ末端またはＮ末端のいずれか）に連結された治療部分は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、Ａｌｐｈａ３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−Ｉ、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−Ｉ、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｗ１．２、ＯＸ４０、ＩＬ−１ｂ、ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦまたはＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−Ｉ−Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１−Ａ５、エフリンＢ１−Ｂ３、アルファ−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１Ｏ、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１，２、ＩＦＮａ，ｂ，ｇ、カスパーゼ−２，３，７，８，１０、ＡＤＡＭ Ｓ１，Ｓ５，８，９，１５，ＴＳ１，ＴＳ５；アディポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−Ｉ、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンジオジェニン、アンフィレグリン、アンジオポエチン−１，２，４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｃｌ−２、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２，３，４，５，６，７，８；ＣＲＰ、カドヘリン６、８、１１；カテプシンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｖ，Ｘ；ＣＤ１ １ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ Ｆ タンパク質、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、α４−β１、α４−β７、ＴＮＦ／リンフォトキシン、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘、肝炎、ＣＭＶ、破傷風、ワクシニア、抗毒素、ボツリヌス、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えばＬＡ ＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンフォトキシンａ／ｂ受容体、ＷｓＩ−Ｉ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６ ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／［γ］ＮＦＲＳＦ １８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１ ＩＢ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１ ＩＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦＩＯ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ Ｌ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦＳ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦＩＯＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ／ＴＮＦＳＦ１ Ａ、Ｐｒｏ−ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンフォトキシンβＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンフォトキシンβＲ（ＬＴｂＲ）／Ｆｃ キメラ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＢ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦＩＡ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡである。
【０１５０】
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン（Ｃ末端またはＮ末端のいずれか）に連結された治療部分は、以下のタンパク質またはそれに結合するタンパク質のいずれかである：４ＥＢＰ１、１４−３−３ζ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、８Ｄ６Ａ、４−１ＢＢ リガンド／ＴＮＦＳＦ９、８−オキソ−ｄＧ、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼＮ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ、アミノペプチダーゼＰ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼＰ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、無羊膜タンパク質（Amnionless）、アクチン、アンフィレグリン(Amphiregulin）、β−アクチン、ＡＭＰＫα１／２、アクチビンＡ、ＡＭＰＫα１、アクチビンＡＢ、ＡＭＰＫα２、アクチビンＢ、ＡＭＰＫβ１、アクチビンＣ、ＡＭＰＫβ２、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アンジオジェニン、アクチビンＲＩＩＡ、アンジオポエチン−１、アクチビンＲＩＩＢ、アンジオポエチン−２、ＡＤＡＭＳ、アンジオポエチン−３、ＡＤＡＭ９、アンジオポエチン−４、ＡＤＡＭ１Ｏ、アンジオポエチン様１、ＡＤＡＭ１２、アンジオポエチン様２、ＡＤＡＭ１５、アンジオポエチン様３、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、アンジオポエチン様４、ＡＤＡＭ１９、アンジオポエチン様７／ＣＤＴ６、ＡＤＡＭ３３、アンジオスタチン、ＡＤＡＭＴＳ４、アネキシンＡ１／アネキシンＩ、ＡＤＡＭＴＳ５、アネキシンＡ７、ＡＤＡＭＴＳ１、アネキシンＡ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／プンクチン（Punctin）、アネキシンＶ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、ＡＰサイト、アグリカン、ＡＰＡＦ−Ｉ、Ａｇｒｉｎ、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＪ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−Ｉ、Ａｋｔ、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔ１、アポリポタンパク質ＡＩ、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ、血清アルブミン、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−Ｉ、アルテミン、ＡＬＫ−７、アリールスルファターゼＡＪＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎ−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素−２、α２ｕ−グロブリン、ＡＳＣ、アルファ−１−酸糖タンパク質、ＡＳＧＲ１、アルファ−フェトプロテイン、ＡＳＫ１、ＡＬＳ、ＡＴＭ、エナメル上皮細胞ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、オーロラ（Aurora）Ａ、ＡＭＩＧＯ、オーロラ（Aurora）Ｂ、ＡＭＩＧ０２、Ａｘｉｎ−１、ＡＭＩＧ０３、ＡｘＩ、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼＡ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、Ｂ７−１／ＣＤ８０、６−Ｂｉｏｔｉｎ−１７−ＮＡＤ、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＢＬＩＭＰ１、Ｂ７−Ｈ３、ＢＩｋ、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＩ−Ｉ、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＢＡＣＥ−２、ＢＭＰ−２、Ｂａｄ、ＢＭＰ−３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＭ���−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ １３Ｃ、ＢＭＰ−４、Ｂａｇ−１、ＢＭＰ−５、ＢＡＫ、ＢＭＰ−６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＭＰ−７、ＢＡＲＤ １、ＢＭＰ−８、Ｂａｘ、ＢＭＰ−９、ＢＣＡＭ、ＢＭＰ−１０、Ｂｃｌ−１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、Ｂｃｌ−２関連タンパク質Ａ１、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＯＫ、ＢＤＮＦ、ＢＰＤＥ、ベンズアミド、ブラキウリ、共通β鎖、Ｂ−Ｒａｆ、βＩＧ−Ｈ３、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ベータセルリン、ＢＲＣＡ１、β−ディフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、ビグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ＣＤ９０／Ｔｈｙｌ、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＤ９４、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＤ９７、ＣＩｑ Ｒ１／ＣＤ９３、ＣＤ１５１、ＣＩｑＴＮＦ１、ＣＤ１６０、ＣｌｑＴＮＦ４、ＣＤ１６３、ＣｌｑＴＮＦ５、ＣＤ１６４、補体成分ＣＩｒ、ＣＤ２００、補体成分ＣＩｓ、ＣＤ２００ Ｒ１、補体成分Ｃ２、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、補体成分Ｃ３ａ、ＣＤ２３／ＦｃεＲ１１、補体成分Ｃ３ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、補体成分Ｃ５ａ、ＣＤ５Ｌ、カドへリン−４／Ｒ−カドへリン、ＣＤ６９、カドへリン−６、ＣＤＣ２、カドへリン−８、ＣＤＣ２５Ａ、カドへリン−１１、ＣＤＣ２５Ｂ、カドへリン−１２、ＣＤＣＰ１、カドへリン−１３、ＣＤＯ、カドへリン−１７、ＣＤＸ４、Ｅ−カドへリン、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、Ｎ−カドへリン、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｐ−カドへリン、ケルベロス（Cerberus）１、ＶＥ−カドへリン、ＣＦＴＲ、カルビンジンＤ、ｃＧＭＰ、カルシニューリンＡ、Ｃｈｅｍ  Ｒ２３、カルシニューリンＢ、ケマリン（Chemerin）、カルレティキュリン−２、ケモカインサンプラーパック、ＣａＭキナーゼＩＩ、キチナーゼ３様１、ｃＡＭＰ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋ１、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１Ｉ３、ＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２、炭酸脱水酵素Ｉ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｂＡＴ、炭酸脱水酵素ＩＩ、コンドロレクチン、炭酸脱水酵素ＩＩＩ、コーディン、炭酸脱水酵素ＩＶ、コーディン−様１、炭酸脱水酵素ＶＡ、コーディン−様２、炭酸脱水酵素ＶＢ、ＣＩＮＣ−Ｉ、炭酸脱水酵素ＶＩ、ＣＩＮＣ−２、炭酸脱水酵素ＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、炭酸脱水酵素ＶＩＩＩ、クラスピン、炭酸脱水酵素ＩＸ、クローディン−６、炭酸脱水酵素Ｘ、ＣＬＣ、炭酸脱水酵素ＸＩＩ、ＣＬＥＣ−Ｉ、炭酸脱水酵素ＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、炭酸脱水酵素ＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ １３／ＣＬＥＣ４Ｆ、カルボキシメチルリシン、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−Ｉ、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラステリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラステリン−様１、カルボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸ１、ＣＭＶ ＵＬ１４６、カルジオトロフィン−１、ＣＭＶ ＵＬ１４７、カルノシンジペプチダーゼ１、ＣＮＰ、カロン（Caronte）、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦ Ｒα、カスパーゼ、血液凝固因子ＩＩ／トロンビン、カスパーゼ−１、血液凝固因子Ｉ１１／組織因子、カスパーゼ−２、血液凝固因子ＶＩＩ、カスパーゼ−３、血液凝固因子Ｘ、カスパーゼ−４、血液凝固因子ＸＩ、カスパーゼ−６、血液凝固因子ＸＩＶ／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヒーシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ−１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通γ鎖／ＩＬ−２ Ｒγ、カスパーゼペプチド阻害剤、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分ＣＩｒＬＰ、βカテニン、補体成分ＣＩｑＡ、カテプシン１、補体成分ＣＩｑＣ、カテプシン３、補体因子Ｄ、カテプシン６、補体因子Ｉ、カテプシンＡ、補体ＭＡＳＰ３、カテプシンＢ、コネクシン４３、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、コンタクチン−１、カテプシンＤ、コンタクチン−２／ＴＡＧ１、カテプシンＥ、コンタクチン−４、カテプシンＦ、コンタクチン−５、カテプシンＨ、コリン（Ｃｏｒｉｎ）、カテプシンＬ、コルヌリン（Cornulin）、カテプシンＯ、ＣＯＲＳ２６／ＣｌｑＴＮＦ，３、カテプシンＳ、ラット初代皮質幹細胞、カテプシンＶ、コルチゾール、カテプシンＸＩＴＪ−、ＣＯＵＰ−ＴＦ Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、ＣＢＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ ＩＩ／ＮＲ２Ｆ２、ＣＣＩ、ＣＯＸ−Ｉ、ＣＣＫ−Ａ Ｒ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２８、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＣＲ１、Ｃ−反応性タンパク質、ＣＣＲ２、クレアチンキナーゼ、筋肉／ＣＫＭＭ、ＣＣＲ３、クレアチニン、ＣＣＲ４、ＣＲＥＢ、ＣＣＲ５、ＣＲＥＧ、ＣＣＲ６、ＣＲＥＬＤ１、ＣＣＲ７、ＣＲＥＬＤ２、ＣＣＲ８、ＣＲＨＢＰ、ＣＣＲ９、ＣＲＨＲ−Ｉ、ＣＣＲ１Ｏ、ＣＲＩＭ１、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ２、ＣＲＩＳＰ−２、ＣＤ３、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＤ４、クロスベインレス（Crossveinless）−２、ＣＤ４＋／４５ＲＡ−、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ４＋／４５ＲＯ、ＣＲＴＨ−２、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４４、ＣＲＹ１、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４、Ｃｒｙｐｔｉｃ、ＣＤ５、ＣＳＢ／ＥＲＣＣ６、ＣＤ６、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＤ８、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＣＤ８＋／４５ＲＡ−、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８＋／４５ＲＯ−、キュビリン、ＣＤ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＸＣＬ１６、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ２８、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＸＣＲ５、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＸＣＲ６、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、シクロフィリンＡ、ＣＤ３４、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＣＤ３６／ＳＲ−Ｂ３、シスタチンＡ、ＣＤ３８、シスタチンＢ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、シスタチンＣ、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、シスタチンＤ、ＣＤ４３、シスタチンＥ／Ｍ、ＣＤ４４、シスタチンＦ、ＣＤ４５、シスタチンＨ、ＣＤ４６、シスタチンＨ２、ＣＤ４７、シスタチンＳ、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、シスタチンＳＡ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、シスタチンＳＮ、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、シトクロムｃ、ＣＤ５９、アポチトクロームｃ、ＣＤ６８、ホロチトクロ���ムｃ、ＣＤ７２、サイトケラチン８、ＣＤ７４、サイトケラチン１４、ＣＤ８３、サイトケラチン１９、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、サイトニン、Ｄ６、ＤＩＳＰ１、ＤＡＮ、Ｄｋｋ−１、ＤＡＮＣＥ、Ｄｋｋ−２、ＤＡＲＰＰ−３２、Ｄｋｋ−３、ＤＡＸ１／ＮＲ０Ｂ１、Ｄｋｋ−４、ＤＣＣ、ＤＬＥＣ、ＤＣＩＲ／ＣＬＥＣ４Ａ、ＤＬＬ１、ＤＣＡＲ、ＤＬＬ４、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ｄ−ルシフェリン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＤＮＡＭ−Ｉ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＤＲ１、ＤＮＥＲ、ＤＤＲ２、Ｄｏｐａ 脱カルボキシラーゼ／ＤＤＣ、ＤＥＣ−２０５、ＤＰＣＲ−Ｉ、デカペンタプレジック、ＤＰＰ６、デコリン、ＤＰＰ Ａ４、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、デクチン−２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＤＰＰＩＩ／ＱＰＰ／ＤＰＰ７、ＤＥＰ−１／ＣＤ１４８、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、デザートヘッジホッグ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、デスミン、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、デスモグレイン−１、ＤＳＣＡＭ、デスモグレイン−２、ＤＳＣＡＭ−Ｌ１、デスモグレイン−３、ＤＳＰＧ３、ディシブルド（Dishevelled）−１、Ｄｔｋ、ディシブルド−３、ダイナミン、ＥＡＲ２／ＮＲ２Ｆ６、ＥｐｈＡ５、ＥＣＥ−Ｉ、ＥｐｈＡ６、ＥＣＥ−２、ＥｐｈＡ７、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＥｐｈＡ８、ＥＣＭ−Ｉ、ＥｐｈＢ１、エコチン、ＥｐｈＢ２、ＥＤＡ、ＥｐｈＢ３、ＥＤＡ−Ａ２、ＥｐｈＢ４、ＥＤＡＲ、ＥｐｈＢ６、ＥＤＧ−Ｉ、エフリン、ＥＤＧ−５、エフリン−Ａ１、ＥＤＧ−８、エフリン−Ａ２、ｅＥＦ−２、エフリン−Ａ３、ＥＧＦ、エフリン−Ａ４、ＥＧＦＲ、エフリン−Ａ５、ＥＧＲ１、エフリン−Ｂ、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、エフリン−Ｂ１、ｅＩＦ２α、エフリン−Ｂ２、ｅＩＦ４Ｅ、エフリン−Ｂ３、ＥＩｋ−Ｉ、エピジェン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、エピモルフィン／シンタキシン２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、エピレグリン、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ、ＥＰＲ−１／Ｘａ受容体、エンドカン、ＥｒｂＢ２、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＥｒｂＢ３、エンドグリカン、ＥｒｂＢ４、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＥＲＣＣ１、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＥＲＣＣ３、エンドヌクレアーゼＶ、ＥＲ
Ｋ１／ＥＲＫ２、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＥＲＫ１、エンドレペリン（Endorepellin）／ペルレカン、ＥＲＫ２、エンドスタチン、ＥＲＫ３、エンドセリン−１、ＥＲＫ５／ＢＭＫ１、Engrailed−２、ＥＲＲα／ＮＲ３Ｂ１、ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＥＲＲβ／ＮＲ３Ｂ２、エンテロペプチダーゼ／エンテロキナーゼ、ＥＲＲγ／ＮＲ３Ｂ３、ＣＣＬ１  １／エオタキシン、エリスロポエチン、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、エリスロポエチンＲ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＥＳＡＭ、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１、ＥＲα／ＮＲ３Ａ１、ＥＰＣＲ、ＥＲβ／ＮＲ３Ａ２、Ｅｐｈ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、ＥｐｈＡ１、エキソストシン(Exostosin)−様２／ＥＸＴＬ２、ＥｐｈＡ２、エキソストシン(Exostosin)−様３／ＥＸＴＬ３、ＥｐｈＡ３、ＦＡＢＰ１、ＦＧＦ−ＢＰ、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦ Ｒ１−４、ＦＡＢＰ３、ＦＧＦ Ｒ１、ＦＡＢＰ４、ＦＧＦ Ｒ２、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦ Ｒ３、ＦＡＢＰ７、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＡＢＰ９、ＦＧＦ Ｒ５、補体因子Ｂ、Ｆｇｒ、ＦＡＤＤ、ＦＨＲ５、ＦＡＭ３Ａ、フィブロネクチン、ＦＡＭ３Ｂ、フィコリン−２、ＦＡＭ３Ｃ、フィコリン−３、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＩＴＣ、線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰ、ＦＫＢＰ３８、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、Ｆｌａｐ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＦＬＩＰ、ＦＡＴＰ１、ＦＬＲＧ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＴ１、ＦＡＴＰ５、ＦＬＲＴ２、ＦｃγＲ１／ＣＤ６４、ＦＬＲＴ３、ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、Ｆｌｔ−３、ＦｃγＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、ホリスタチン、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ホリスタチン−様１、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＦｏｘＤ３、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＦｏｘＪ１、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＦｏｘＰ３、Ｆｃ受容体−様３／ＣＤ１６−２、Ｆｐｇ、ＦＥＮ−Ｉ、ＦＰＲ１、フェチュインＡ、ＦＰＲＬ１、フェチュインＢ、ＦＰＲＬ２、ＦＧＦ 酸性、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＦＧＦ 塩基性、Frizzled−１、ＦＧＦ−３、Frizzled−２、ＦＧＦ−４、Frizzled−３、ＦＧＦ−５、Frizzled−４、ＦＧＦ−６、Frizzled−５、ＦＧＦ−８、Frizzled−６、ＦＧＦ−９、Frizzled−７、ＦＧＦ−ＩＯ、Frizzled−８、ＦＧＦ−１１、Frizzled−９、ＦＧＦ−１２、Ｆｒｋ、ＦＧＦ−１３、ｓＦＲＰ−１、ＦＧＦ−１６、ｓＦＲＰ−２、ＦＧＦ−１７、ｓＦＲＰ−３、ＦＧＦ−１９、ｓＦＲＰ−４、ＦＧＦ−２０、フリン、ＦＧＦ−２１、ＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４、ＦＧＦ−２２、Ｆｙｎ、ＦＧＦ−２３、Ｇ９ａ／ＥＨＭＴ２、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ Ｒα−３、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα１、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ Ｒα−４、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα２、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα４、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα５、ＧＬＩ−Ｉ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα６、ＧＬＩ−２、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ１、ＧＬＰ／ＥＨＭＴ１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ２、ＧＬＰ−Ｉ Ｒ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ３、グルカゴン、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒγ２、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２、ＧＩｕＲ１、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、ＧｌｕＲ２／３、ＧＡＤ２／ＧＡＤ６５、ＧｌｕＲ２、ＧＡＤＤ４５��、ＧｌｕＲ３、ＧＡＤＤ４５β、Ｇｌｕｔ１、ＧＡＤＤ４５γ、Ｇｌｕｔ２、ガレクチン−１、Ｇｌｕｔ３、ガレクチン−２、Ｇｌｕｔ４、ガレクチン−３、Ｇｌｕｔ５、ガレクチン−３ ＢＰ、グルタレドキシン１、ガレクチン−４、グリシンＲ、ガレクチン−７、グリコホリンＡ、ガレクチン−８、グリピカン２、ガレクチン−９、グリピカン３、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、グリピカン５、ＧＡＰ−４３、グリピカン６、ＧＡＰＤＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇａｓ１、ＧＭ−ＣＳＦ Ｒα、Ｇａｓ６、ＧＭＦ−β、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ｇｐｌ３０、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／ＧＰＢＢ、ＧＡＴＡ−Ｉ、ＧＰＲ１５、ＧＡＴＡ−２、ＧＰＲ３９、ＧＡＴＡ−３、ＧＰＶＩ、ＧＡＴＡ−４、ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１、ＧＡＴＡ−５、Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ、ＧＡＴＡ−６、グラニュリシン、ＧＢＬ、グランザイムＡ、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、グランザイムＢ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、グランザイムＤ、Ｇ−ＣＳＦ、グランザイムＧ、Ｇ−ＣＳＦＲ、グランザイムＨ、ＧＤＦ−Ｉ、ＧＲＡＳＰ、ＧＤＦ−３ ＧＲＢ２、ＧＤＦ−５、グレムリン、ＧＤＦ−６、ＧＲＯ、ＧＤＦ−７、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＧＤＦ−８、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ、ＧＤＦ−９、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ、ＧＤＦ−１１、成長ホルモン、ＧＤＦ−１５、成長ホルモンＲ、ＧＤＮＦ、ＧＲＰ７５／ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＦＡＰ、ＧＳＫ−３α／β、ＧＦＩ−Ｉ、ＧＳＫ−３α、ＧＦＲアルファ−１／ＧＤＮＦ Ｒアルファ−１、ＧＳＫ−３β、ＧＦＲアルファ−２／ＧＤＮＦ Ｒアルファ−２、ＥＺＦＩＴ、Ｈ２ＡＸ、ヒスチジン、Ｈ６０、ＨＭ７４Ａ、ＨＡＩ−Ｉ、ＨＭＧＡ２、ＨＡＩ−２、ＨＭＧＢ１、ＨＡＩ−２Ａ、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１β、ＨＡＩ−２Ｂ、ＨＮＦ−３β／ＦｏｘＡ２、ＨＡＮＤ１、ＨＮＦ−４α／ＮＲ２Ａ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＮＦ−４γ／ＮＲ２Ａ２、気道特異的トリプシン様プロテアーゼ／ＨＡＴ、ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＯ−２／ＨＭＯＸ２、ＣＣＬ  １４ａ／ＨＣＣ−１、ＨＰＲＧ、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、Ｈｒｋ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＨＲＰ−Ｉ、αＨＣＧ、ＨＳ６ＳＴ２、Ｈｃｋ、ＨＳＤ−Ｉ、ＨＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／Ｂ、ＨＳＤ−２、ＨＤＧＦ、ＨＳＰ１０／ＥＰＦ、ヘモグロビン、ＨＳＰ２７、ヘパソシン（Hepassocin）、ＨＳＰ６０、ＨＥＳ−１、ＨＳＰ７０、ＨＥＳ−４、ＨＳＰ９０、ＨＧＦ、ＨＴＲＡ／プロテアーゼＤｏ、ＨＧＦアクティベーター、ＨＴＲＡ１／ＰＲＳＳ１１、ＨＧＦ Ｒ、ＨＴＲＡ２／０ ｍｌ、ＨＩＦ−Ｉα、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＩＦ−２α、ヒアルロナン、ＨＩＮ−１／セクレトグロビン３Ａ１、４−ヒドロキシノネナール、Ｈｉｐ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＩＬ−ＩＯ、ｃＩＡＰ（ｐａｎ）、ＩＬ−ＩＯ Ｒα、ｃＩＡＰ−１／ＨＩＡＰ−２、ＩＬ−１０ Ｒβ、ｃＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１、ＩＬ−１１、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、ＥＬ−１１ Ｒα、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＩＬ−１２、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ ｐ４０、ＩＣＡＭ−３／ＣＤ５０、ＩＬ−１２ Ｒβ１、ＩＣＡＭ−５、ＩＬ−１２ Ｒβ２、ＩＣＡＴ、ＩＬ−１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１３ Ｒα１、イズロン酸−２−スルファターゼ／ＥＯＳ、ＩＬ−１３ Ｒα２、ＥＦＮ、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５ Ｒα、ＩＦＮ−α１、ＩＬ−１６、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α４ｂ、ＩＬ−１７ Ｒ、ＩＦＮ−αＡ、ＩＬ−１７ ＲＣ、ＩＦＮ−αＢ２、ＩＬ−１７ ＲＤ、ＩＦＮ−αＣ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＦＮ−αＤ、ＩＬ−１７Ｂ Ｒ、ＩＦＮ−αＦ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＦＮ−αＨ２、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＦＮ−αＩ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＦＮ−αＪ１、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＦＮ−αＫ、ＩＬ−１８ ＢＰａ、ＩＦＮ−αＷＡ、ＩＬ−１８ ＢＰｃ、ＩＦＮ−α／βＲ１、ＩＬ−１８ ＢＰｄ、ＩＦＮ−α／βＲ２、ＩＬ−１８ Ｒα／ＩＬ−１ Ｒ５、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１８ Ｒ β／ＩＬ−１ Ｒ７、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１９、ＩＦＮ−γＲ１、ＩＬ−２０、ＩＦＮ−γ Ｒ２、ＩＬ−２０ Ｒα、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−２０ Ｒβ、ＩｇＥ、ＩＬ−２１、ＩＧＦＢＰ−Ｉ、ＩＬ−２１ Ｒ、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＬ−２２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ−２２ Ｒ、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−２２ＢＰ、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＬ−２３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２３ Ｒ、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、ＩＬ−２４、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＬ−２６／ＡＫ１５５、ＩＧＦＢＰ−ｒＰＩＯ、ＩＬ−２７、ＩＧＦ−Ｉ、ＥＬ−２８Ａ、ＩＧＦ−Ｉ Ｒ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−２９／ＥＦＮ−λ１、ＩＧＦ−ＩＩ Ｒ、ＩＬ−３１、ＩｇＧ、ＥＬ−３１ ＲＡ、ＩｇＭ、ＩＬ−３２α、ＩＧＳＦ２、ＩＬ−３３、ＩＧＳＦ４Ａ／ＳｙｎＣＡＭ、ＩＬＴ２／ＣＤ８５Ｊ、ＩＧＳＦ４Ｂ、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、ＩＧＳＦ８、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、ＩｇＹ、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、ＩｋＢ−β、ＩＬＴ６／ＣＤ８５ｅ、ＩＫＫα、インディアン・ヘッジホッグ、ＩＫＫε、ＩＮＳＲＲ、ＥＫＫγ、インスリン、ＩＬ−１α／ＩＬ−ＩＦ１、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｆ２、プロインスリン、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、インスリシン／ＥＤＥ、ＩＬ−１Ｆ５／ＦＩＬ１ δ、インテグリンα２／ＣＤ４９ｂ、ＩＬ−１Ｆ６／ＦＩＬ１ε、インテグリンα３／ＣＤ４９ｃ、ＩＬ−１Ｆ７／ＦＩＬ１ ζ、インテグリンα３β１／ＶＬＡ−３、ＩＬ−１Ｆ８／ＦＩＬ１η、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＩＬ−１Ｆ９／ＩＬ−１ Ｈ１、インテグリンα５／ＣＤ４９ｅ、ＩＬ−１Ｆ１０／ＩＬ−１ＨＹ２、インテグリンα５β１、ＩＬ−Ｉ ＲＩ、インテグリンα６／ＣＤ４９ｆ、ＩＬ−Ｉ ＲＩＩ、インテグリンα７、ＩＬ−Ｉ Ｒ３／ＩＬ−１ Ｒ ＡｃＰ、インテグリンα９、ＩＬ−Ｉ Ｒ４／ＳＴ２、インテグリンαＥ／ＣＤ１０３、ＩＬ−Ｉ Ｒ６／ＩＬ−１ Ｒ ｒｐ２、インテグリンαＬ／ＣＤ１ Ｉａ、ＩＬ−Ｉ Ｒ８、インテグリンαＬβ２、ＩＬ−Ｉ Ｒ９、インテグリンαＭ／ＣＤ１ Ｉｂ、ＩＬ−２、インテグリンαＭβ２、ＩＬ−２ Ｒα、インテグリンαＶ／ＣＤ５１、ＩＬ−２ Ｒβ、インテグリンαＶβ５、ＩＬ−３、インテグリンαＶβ３、ＩＬ−３ Ｒα、インテグリンαＶβ６、ＩＬ−３ Ｒβ、インテグリンαＸＪＣＤ１ Ｉｃ、ＩＬ−４、インテグリンβ１／ＣＤ２９、ＩＬ−４ Ｒ、インテグリンβ２／ＣＤ１８、ＩＬ−５、インテグリンβ３／ＣＤ６１、ＩＬ−５ Ｒα、インテグリンβ５、ＩＬ−６、インテグリンβ��、ＩＬ−６ Ｒ、インテグリンβ７、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ１０／ＥＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＩＬ−７ Ｒα／ＣＤ１２７、ＩＲＡＫＩ、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８ ＲＡ、ＩＲＡＫ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ ＲＢ、ＥＲＳ−Ｉ、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、Ｉｓｌｅｔ−１、ＩＬ−９、ＣＸＣＬ１ １／Ｉ−ＴＡＣ、ＩＬ−９ Ｒ、ジャグ配列（Jagged）１、ＪＡＭ−４／ＩＧＳＦ５、ジャグ配列２、ＪＮＫ、ＪＡＭ−Ａ、ＪＮＫ１／ＪＮＫ２、ＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭ、ＪＮＫ１、ＪＡＭ−Ｃ、ＪＮＫ２、キニノゲン、カリクレイン３／ＰＳＡ、キニノスタチン（kininostatin）、カリクレイン４、ＫＥＲ／ＣＤ１５８、カリクレイン５、ＫＥＲ２Ｄ１、カリクレイン６／ニューロシン、ＫＩＲ２ＤＬ３、カリクレイン７、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、カリクレイン８／ニューロプシン、ＫＩＲ２ＤＳ４、カリクレイン９、ＫＩＲ３ＤＬ１、血漿カリクレイン／ＫＬＫＢ１、ＫＥＲ３ＤＬ２、カリクレイン１０、Ｋｉｒｒｅｌ２、カリクレイン１１、ＫＬＦ４、カリクレイン１２、ＫＬＦ５、カリクレイン１３、ＫＬＦ６、カリクレイン１４、クロソ（Klotho)、カリクレイン１５、クロソβ、ＫＣ、ＫＯＲ、Ｋｅａｐ１、クレメン（Kremen）−１、ＫｅＩ１、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＡＩＲ１、リピン２、ＬＡＩＲ２、リポカリン−１、ラミニンα４、リポカリン−２／ＮＧＡＬ、ラミニンγ１，５−リポキシゲナーゼ、ラミニンＩ、ＬＸＲα／ＮＲ１Ｈ３、ラミニンＳ、ＬＸＲβ／ＮＲ１Ｈ２、ラミニン−１、リビン（Livin）、ラミニン−５、ＬＥＸ、ＬＡＭＰ、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ランゲリン、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、Ｌａｔｅｘｉｎ、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、ライリン（Layilin）、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ、ＬＭＯ２、ＬＤＬ Ｒ、ＬＯＸ−１／ＳＲ−Ｅ１、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ、ＬＲＩＧ１、Ｌｅｆｔｙ、ＬＲＩＧ３、Ｌｅｆｔｙ−１、ＬＲＰ−Ｉ、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、ＬＲＰ−６、レグマイン、ＬＳＥＣｔｉｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ１５／ラングカイン（Lungkine）、ロイコトリエンＢ４、ＸＣＬ１／リンホタクチ
ン、ロイコトリエンＢ４ Ｒ１、リンフォトキシン、ＬＥＦ、リンフォトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＬＩＦ Ｒα、リンフォトキシンβＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｎ、リミチン、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リジルオキシダーゼホモログ２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−Ｉ、ＬＩＮＧＯ−Ｉ、α２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン（Mimecan）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ミンディン、ＭａｆＢ、ミネラルコルチコイドＲ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１αイソ型ＬＤ７８β、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／Ｓｉｇｌｅｃ−４−ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＥＰ−１δ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１γ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン／パンクレアシン（Marapsin／Pancreasin）、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−Ｉ、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン−２、ＭＩＰ−ＩＩＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳ ＲＩＩ、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、ＭｃＩ−Ｉ、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−Ｉ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４α、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦ Ｒ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶ−ＩＩ型、ＭＭＰ−ＩＯ、ＭＤ−Ｉ、ＭＭＰ−Ｉ １、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−Ｉ、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ−２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン（Melusin）、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンα、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンβ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、Ｍｅｒ、Ｍｒｅｌ １、メソテリン、ＭＲＰ１メテオリン、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫ１、メチオニンアミノペプチダーゼ、ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−Ｉ、ＭＧＬ２、ムサシ−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＩＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロペルオキシダーゼ、β２ミクログロブリン、ミオカルディン、ミッドカイン、ミオシリン（myocilin）、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰ ＮＧＦＩ−Ｂγ／ＮＲ４Ａ３、Ｎａｎｏｇ、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨ１、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓｌ、ニドゲン−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ニドゲン−２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、一酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１ １２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリライシン／ＣＤＩＯ、ＮＫｐ４４、ネプリライシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇｌａ、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、Ｎ−Ｍｅ−６，７−ｄｉＯＨ−ＴＩＱ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、Ｎｏｄａｌ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン、ニューリティン（Neuritin）、Ｎｏｇｏ受容体、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｏｇｏ−Ａ、ニューロファスチン、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、Ｎｏｐｅ、ニューロゲニン−２、Ｎｏｒｒｉｎ、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ノイロリシン(Neurolysin）、ｉＮＯＳ、ニューロフィジン(Neurophysin）ＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、Ｎｏｔｃｈ−１、ニューロピリン−２、Ｎｏｔｃｈ−２、ニューロポイエチン、Ｎｏｔｃｈ−３、ニューロトリミン、Ｎｏｔｃｈ−４、ニュールツリン、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭ１、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢ１、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−Ｌ、ＮＴ−４、ＮＦ−Ｍ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨ１、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン、β−ＮＧＦ、Ｎｕｒｒ−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂα／ＮＲ４Ａ１、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタンチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２１、ＯＳＭ Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、Ｏｌｉｇ １、２、３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ １、オステオクリン、Ｏｌｉｇ ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１ ＩＢ、オリゴデンドロサイトマーカー０１、Ｏｔｘ２、オリゴデンドロサイトマーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、Ｏｐｔｉｃｉｎ、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、０ＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドへリン（osteoadherin）、Ｏｌｉｇ １、２、３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ １、オステオクリン（osteocrin）、Ｏｌｉ ｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１ ＩＢ、オリゴデンドロサイトマーカー０１、Ｏｔｘ２、オリゴデンドロサイトマーカー０４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫ１、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢα／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢβ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、Ｒｅｘ−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１α、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−１β、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ��１δ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１ε、リボソームタンパク質Ｓ６、Ｒａｅ−１γ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、Ｒａ１Ａ／Ｒａ１Ｂ、Ｒ０Ｂ０３、ＲａＩＡ、ＲＯＢＯ４、ＲａＩＢ、Ｒ０Ｒ／ＮＲ１Ｆ１−３（ｐａｎ）、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１ １Ａ、ＲＯＲα／ＮＲ１Ｆ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲγ／ＮＲ１Ｆ３、Ｒａｐ１Ａ／Ｂ、ＲＴＫ−様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＲＡＲα／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ−様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲβ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲγ／ＮＲ１Ｂ３、ＲＰ Ａ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ（ｐａｎ）、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫ１、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、ＲｅｇＩ、ＲＳＫ３、ＲｅｇＩＩ、ＲＳＫ４、ＲｅｇＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、Ｒｅｇ Ｉ１ｉａ、Ｒ−スポンジン２、Ｒｅｇ ＩＶ、Ｒ−スポンジン３、レラキシン−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、レラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、レラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭα、ＲＸＲα／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭβ、ＲＸＲβ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲγ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン、Ｓ１ＯＯＡｌＯ、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰＩ、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／ディアブロ、Ｓ１ＯＯＢ、Ｓｍａｄ１、Ｓ１ＯＯＰ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、δ−サルコグリカン、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−Ｉ、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ８、ＳＣＦ Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、アルファ−平滑筋アクチン、ＳＣＬ／Ｔａｌｌ、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、Ｓｎａｉｌ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウムカルシウム交換輸送体１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、Ｓｏｇｇｙ−１、アルファ−セクレターゼ、ソニック・ヘッジホッグ、ガンマ−セクレターゼ、ＳまたはＣＳ１、β−セクレターゼ、ＳまたはＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソーティリン、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマフォリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマフォリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマフォリン３Ｅ、ＳＯＸ７、セマフォリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマフォリン６Ａ、ＳＯＸ１Ｏ、セマフォリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマフォリン６Ｃ、ＳＯＸ２１セマフォリン６Ｄ、ＳＰＡＲＣ、セマフォリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ−様１、セパラーゼ、ＳＰ−Ｄ、セリン／スレオニンホスファターゼ基質Ｉ、スピネシン、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣ阻害剤、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンギオテンシノーゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−Ｉ、セルピンＣ１／抗トロンビン−ＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリン補因子ＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２、スタビリン−１、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン（stanniocalcin）１、セルピンＧ１／Ｃ１阻害剤、スタニオカルシン２、セルピン１２、ＳＴＡＴ１、血清アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、��ＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲ０Ｂ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−Ｉ、ＳＴＡＴＥ、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、Ｓｔｅｌｌａ／Ｄｐｐａ３、Ｓｉｇｌｅｃ−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−Ｉ、Ｓｉｇｌｅｃ−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、Ｓｉｇｌｅｃ−５、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、Ｓｉｇｌｅｃ−６、スルファターゼ修飾因子１／ＳＵＭＦ１、Ｓｉｇｌｅｃ−７、スルファターゼ修飾因子２／ＳＵＭＦ２、Ｓｉｇｌｅｃ−９、ＳＵＭＯ１、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、Ｓｉｇｌｅｃ−１１、ＳＵＭＯ３、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ［００９９］−−Ｚｎ ＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ−２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰβ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サバイビン、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシンＩ、スリーピング・ビューティー（Sleeping Beauty）トランスポゼース、シンデカン−Ｉ／ＣＤ １３８、Ｓｌｉｔ３、シンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＥＦＦ １／トモレギュリン（Tomoregulin）−１、ＴＡＯ２、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ ＩＡ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、Ｔａｕ、ＴＮＦ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＣＡＭ−Ｉ、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−Ｉ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲα／ＮＲ１Ａ１、テナシンＣ、ＴＲβ１／ＮＲ１Ａ２、テナシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスチカン（Testican）１／ＳＰＯＣＫ１、ＴＲＡＤＤ、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２，ＴＲＡＦ−１、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−α、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦ−β１、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦＩＯＡ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−β１）、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、潜在型ＴＧＦ−β１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／Ｔ
ＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦ−β１．２、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦ−β２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１ １、ＴＧＦ−β３、ＴｆＲ（トランスフェリンＲ）、ＴＧＦ−β５、Ａｐｏ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−β ｂｙ  １、Ｈｏｌｏ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ２、トラッピン（Trappin）−２／エラフィン（Elafin）、潜在型ＴＧＦ−βｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦ−βＲ１／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦ−βＲ１１、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦ−β ＲＩＩｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＴＲＦ−Ｉ、サーモリシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ−分解エクト酵素／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭＳ、チオレドキシン−８０、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、チオレドキシン−様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰ１、ＴｒｋＢ、トロンボモデュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポエチンＲ、トロポニンＩペプチド３、トロンボスポンジン−１、トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン−４、トリプシン１、チモポイエチン（thymopoietin）、トリプシン２／ＰＲＳＳ２、胸腺ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、Ｔｉｅ−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、Ｔｉｅ−２、トリプターゼα／ＴＰＳ１、ＴＩＭ−Ｉ／ＫＩＭ−Ｉ／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼβ−１／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼβ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼε／ＢＳＳＰ−４、ＴＩＭ−４、トリプターゼγ−１／ＴＰＳＧ１、ＴＩＭ−５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−Ｉ、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰ  Ｒ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、β−ＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ １２、ＴＬＲ５、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ホスホ−チロシン、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、チロシンホスファターゼ基質Ｉ、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＵＧＲＰ１、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−Ｉ、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦＲ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、バゾヒビン、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン（Vasorin）、ＶＥＧＦＲ３／ＦＵ−４、バソスタチン、バーシカン、Ｖａｖ−１、ＶＧ５Ｑ、ＶＣＡＭ−１、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１Ｉ１、ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ−Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレイン−α、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７ｂ、ＷＩＦ−Ｉ、Ｗｎｔ−８ａ ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−５ｂ、ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲ１、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡ���、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ１、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４。
【０１５１】
多数のヒトイオンチャネルが特に興味深い標的である。限定されない例としては、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体Ｂサブユニット、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体前駆体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体３サブユニットＣ、ＡＡＤ１４タンパク質、アセチルコリン受容体タンパク質、αサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、βサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、δサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、εサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、γサブユニット前駆体、酸感知イオンチャネル３スプライス変異体ｂ、酸感知イオンチャネル３スプライス変異体ｃ、酸感知イオンチャネル４、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、ミトコンドリア前駆体、α１ Ａ−電位依存性カルシウムチャネル、アミロライド感受性カチオンチャネル１、神経性アミロライド感受性カチオンチャネル２、神経性アミロライド感受性カチオンチャネル４、イソ型２、アミロライド感受性ナトリウムチャネル、アミロライド感受性ナトリウムチャネル α−サブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネル β−サブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネル δ-サブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネル γ−サブユニット、アネキシン Ａ７、アピカル様タンパク質、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル １０、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル １１、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル １４、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル １５、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル ８、カルシウムチャネルα１２．２ サブユニット、カルシウムチャネルα１２．２ サブユニット、カルシウムチャネルα１Ｅ サブユニット、δ１９ δ４０ δ４６ スプライス変異体、カルシウム活性化カリウムチャネルαサブユニット １、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット １、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット ２、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット ３、カルシウム依存性クロライドチャネル−１、カチオンチャネル ＴＲＰＭ４Ｂ、ｃＤＮＡ ＦＬＪ９０４５３ ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００１５４２、カリウムチャネル 四量体化ドメイン含有６に高度に類似、ＣＤＮＡ ＦＬＪ９０６６３ ｆｉｓ、クローンＰＬＡＣＥ １００５０３１、クロライド細胞内チャネル タンパク質 ５に高度に類似、ＣＧＭＰ−開口型カチオンチャネルβサブユニット、クロライドチャネル タンパク質、クロライドチャネル タンパク質 ２、クロライドチャネル タンパク質 ３、クロライドチャネル タンパク質 ４、クロライドチャネル タンパク質 ５、クロライドチャネル タンパク質 ６、クロライドチャネル タンパク質 Ｃ１Ｃ−Ｋａ、クロライドチャネル タンパク質 Ｃ１Ｃ−Ｋｂ、クロライドチャネル タンパク質、足場筋、クロライド細胞内チャネル ６、クロライド 細胞内チャネル タンパク質 ３、クロライド 細胞内チャネル タンパク質 ４、クロライド 細胞内チャネル タンパク質 ５、ＣＨＲＮＡ３ タンパク質、Ｃｌｃｎ３ｅ タンパク質、ＣＬＣＮＫＢ タンパク質、ＣＮＧＡ４ タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎ−５、環状ＧＭＰ開口型カリウムチャ��ル、環状ヌクレオチド開口型カチオンチャネル ４、環状ヌクレオチド開口型カチオンチャネルα３、環状ヌクレオチド開口型カチオンチャネルβ３、環状ヌクレオチド開口型嗅覚（olfactory）チャネル、嚢胞性線維症膜通過伝導制御、チトクロム Ｂ−２４５ 重鎖、ジヒドロピリジン感受性Ｌ型、カルシウムチャネル アルファ−２／δサブユニット前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御３前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御５前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御６前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御７、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御８前駆体、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル１、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル２、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル３、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル４、ガンマ−アミノ酪酸受容体α−１ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α−２ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 α−３ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 α−４ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 α−５ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 α−６ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 β−１ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 β−２ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 β−３ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体δサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体εサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 γ−１ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 γ−３ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 ｐｉ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 ｒｈｏ−１ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 ｒｈｏ−２ サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体 θサブユニット前駆体、ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、グルタミン酸受容体 １前駆体、グルタミン酸受容体 ２前駆体、グルタミン酸受容体 ３前駆体、グルタミン酸受容体 ４前駆体、グルタミン酸受容体 ７、グルタミン酸受容体 Ｂ、グルタミン酸受容体δ−１ サブユニット前駆体、グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸１前駆体、グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸２前駆体、グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸３前駆体、グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸４前駆体、グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸５前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ａ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ｂ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε１前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε２前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε４前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット ζ １前駆体、グリシン受容体α−１鎖前駆体、グリシン受容体α−２鎖前駆体、グリシン受容体α−３鎖前駆体、グリシン受容体β鎖前駆体、Ｈ／ＡＣＡリボヌクレオタンパク質複合体サブユニット１、高親和性免疫グロブリンε受容体 β−サブユニット、仮想タンパク質 DKFZp31310334、仮想タンパク質 DKFZp761M1724、仮想タンパク質 FLJ12242、仮想タンパク質 FLJ14389、仮想タンパク質 FLJ14798、仮想タンパク質 FLJ14995、仮想タンパク質 FLJ16180、仮想タンパク質 FLJ16802、仮想タンパク質 FLJ32069、仮想タンパク質 FLJ37401、仮想タンパク質 FLJ38750、仮想タンパク質 FLJ40162、仮想タンパク質 FLJ41415、仮想タンパク質 FLJ90576、仮想タンパク質 FLJ90590、仮想タンパク質 FLJ90622、仮想タンパク質 KCTD15、仮想タンパク質 MGC15619、イノシトール １，４，５−三リン酸受容体タイプ１、イノシトール １，４，５−三リン酸 受容体タイプ２、イノシトール １，４，５−三リン酸受容体タイプ3、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質４、内向き整流カリウムチャネル１３、内向き整流カリウムチャネル１６、内向き整流カリウムチャネル４、内向き整流性Ｋ（＋）チャネルネガティブレギュレーターKir2.2v、カイニン酸受容体サブユニット KA2a、KCNH5 タンパク質、KCTD 17 タンパク質、KCTD2 タンパク質、ケラチン生成細胞関連膜貫通タンパク質１、Ｋｖチャネル内在化タンパク質 ４、メラスタチン１、膜タンパク質 MLC1、MGC 15619 タンパク質、ムコリピン−１、ムコリピン−２、ムコリピン−３、多剤耐性関連タンパク質 ４、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体 ２Ｃ サブユニット前駆体、NADPH オキシダーゼ ホモログ１、Nav1.5、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−２サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−３サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−４サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−５サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−６サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−７サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、α−９サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、β−２サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、β−３サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質、β−４サブユニット前駆体、神経性電位依存性カルシウムチャネルα２Ｄサブユニット、P2X プリン受容体１、P2X プリン受容体２、P2X プリン受容体３、P2X プリン受容体４、P2X プリン受容体５、P2X プリン受容体６、P2X プリン受容体７、膵臓カリウムチャネル TALK-Ib、膵臓カリウムチャネル TALK-Ic、膵臓カリウムチャネル TALK-Id、ホスホレマン前駆体、プラスモリピン(plasmolipin)、多嚢胞性腎疾患２関連タンパク質、多嚢胞性腎疾患２−様１タンパク質、多嚢胞性腎疾患 ２−様２タンパク質、多嚢胞性腎疾患およびエッグジェリー関連（egg jelly related）タンパク質前駆体の受容体、ポリシスチン（Polycystin）-2、カリウムチャネル制御因子、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１０、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー４、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー５、カリウムチャネルサブファミリーＫメ���バー６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー９、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有３、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１４、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質４、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質５、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有１０、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１３、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＡメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＡメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＡメンバー４、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＡメンバー５、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＡメンバー６、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＢメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＢメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＣメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＣメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＣメンバー４、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＤメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＤメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＤメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＥメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＥメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＥメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＥメンバー４、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＦメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＧメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＧメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＧメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＧメンバー４、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサ
ブファミリーＨメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー４、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー５、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー６、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー７、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＨメンバー８、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー４、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー５、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＳメンバー１、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＳメンバー２、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＳメンバー３、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーＶメンバー２、カリウム電位開口型チャネルチャネルサブファミリーＨメンバー７、イソ型２、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド開口型チャネル １、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド開口型チャネル ２、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド開口型チャネル ３、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド開口型チャネル４、推定ミトコンドリア移入 受容体サブユニット TOM40 ホモログ、プリン受容体 P2X5、イソ型Ａ、推定 ４リピート電位開口型イオンチャネル、推定 クロライドチャネル タンパク質７、推定 GluR6カイニン酸受容体、推定イオンチャネルタンパク質 CATSPER2 変異体１、推定イオンチャネルタンパク質 CATSPER2 変異体２、推定イオンチャネルタンパク質 CATSPER2 変異体３、カリウムチャネルタンパク質変異体１の推定の制御因子、推定チロシン-タンパク質ホスファターゼ TPTE、リアノジン受容体１、リアノジン受容体２、リアノジン受容体３、SH3 KBP1結合タンパク質１、ショートトランジェント受容体電位チャネル１、ショートトランジェント受容体電位チャネル４、ショートトランジェント受容体電位チャネル５、ショートトランジェント受容体電位チャネル６、ショートトランジェント受容体電位チャネル７、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル タンパク質１、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル タンパク質２、イソ型ｂ、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質３、イソ型ｂ、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ２、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル ＳＫ３、ナトリウムチャネル、ナトリウムチャネル β−1 サブユニット前駆体、ナトリウムチャネル タンパク質タイプIIαサブユニット、ナトリウムチャネル タンパク質タイプIIIαサブユニット、ナトリウムチャネル タンパク質タイプIVαサブユニット、ナトリウムチャネル タンパク質タイプIXαサブユニット、ナトリウムチャネル タンパク質タイプVαサブユニット、ナトリウムチャネル タンパク質タイプVIIαサブユニット、ナトリウムチャネル タンパク質タイプVIIIαサブユニット、ナトリウムチャネルタンパクタイプ×αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質タイプXIαサブユニット、ナトリウムおよびクロライド活性化ＡＴＰ感受性カリウムチャネル、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰaseγ鎖、精子特異的なカチオンチャネル１、精子特異的なカチオンチャネル２、イソ型４、シンタキシン−１Ｂ１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー６、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー７、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー４、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー５、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー６、一過性受容体電位チャネル４εスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル４ ζ スプライス変異体、一過性受容体電位チャネル ７γスプライス変異体、腫瘍壊死因子、α−誘導タンパク質１、内皮、二孔カルシウムチャネルタンパク質２、VDAC4 タンパク質、電位開口型カリウムチャネル Kv3.2b、電位開口型ナトリウムチャネルβ1B サブユニット、電位依存性陰イオンチャネル、電位依存性陰イオンチャネル２、電位依存性陰イオン選択的チャネル タンパク質１、電位依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質２、電位依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質３、電位依存性カルシウムチャネル γ−１ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−２ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−３ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−４ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−５ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−６ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−７ サブユニット、電位依存性カルシウムチャネル γ−８ サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル α−１Ｃ サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル α−１Ｄ サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル α−ＩＳサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル β−１ サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル β−２サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル β−３ サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル β−４ サブユニット、電位依存性Ｎ型カルシウムチャネル α−１Ｂ サブユニット、電位依存性Ｐ／Ｑ型 カルシウムチャネル α−１Ａ サブユニット、電位依存性Ｒ型カルシウムチャネル α−１Ｅ サブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル α−１Ｇ サブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル α−１Ｈ サブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル α−１Ｉ サブユニット、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネル α−１ サブユニット、電位開口型 カリウムチャネル β−１ サブユニット、電位開口型 カリウムチャネル β−２ サブユニット、電位開口型 カリウムチャネル β−３ サブユニット、電位開口型 カリウムチャネル KCNA7が挙げられる。ヒト電位開口型ナトリウムチャネルのＮａｖ１.ｘファミリーもまた��特に見込みがある標的である。このファミリーには、例えば、チャネルＮａｖ１．６およびＮａｖ１．８が含まれる。
【０１５２】
ある態様において、治療用タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり得る。例示的ＧＰＣＲには、以下のようなクラスＡロドプシン様受容体が含まれるが、これらに限定されない：ムスカリン（Muse）アセチルコリン脊椎動物１型、Muse、アセチルコリン脊椎動物タイプ２、Muse、アセチルコリン脊椎動物タイプ３、Muse、アセチルコリン脊椎動物タイプ４；アドレナリン受容体（αアドレナリン受容体タイプ１、αアドレナリン受容体タイプ２、βアドレナリン受容体タイプ１、βアドレナリン受容体タイプ２、βアドレナリン受容体タイプ３、ドーパミン脊椎動物タイプ１、ドーパミン脊椎動物タイプ２、ドーパミン脊椎動物タイプ３、ドーパミン脊椎動物タイプ４、ヒスタミンタイプ１、ヒスタミンタイプ２、ヒスタミンタイプ３、ヒスタミンタイプ４、セロトニンタイプ１、セロトニンタイプ２、セロトニンタイプ３、セロトニンタイプ４、セロトニンタイプ５、セロトニンタイプ６、セロトニンタイプ７、セロトニンタイプ８、他のセロトニンタイプ、トレースアミン、アンギオテンシンタイプ１、アンギオテンシンタイプ２、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Fmet-leu-phe、APJ様、インターロイキン−８タイプＡ、インターロイキン−８タイプＢ、インターロイキン−８他のタイプ、C--C ケモカインタイプ１からタイプ１１および他のタイプ、C--X--C ケモカイン（タイプ２から６および他のタイプ）、C--X3-C ケモカイン、コレシストキニンCCK、CCKタイプＡ、CCKタイプＢ、CCK 他のタイプ、エンドセリン、メラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、ダフィー（Duffy）抗原、プロラクチン分泌促進ペプチド（GPR10）、ニューロペプチド Ｙ（タイプ１から７）、ニューロペプチド Ｙ、ニューロペプチド Ｙ 他のタイプ、ニューロテンシン、オピオイド（タイプＤ、Ｋ、Ｍ、Ｘ）、ソマトスタチン（タイプ１から５）、タキキニン（サブスタンスＰ（NK1）、サブスタンスＫ（NK2）、ニューロメジンＫ（NK3）、タキキニン様１、タキキニン様２、バソプレッシン／バソトシン（タイプ１から２）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレッシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシン＆ ニューロペプチド FF.QRFP、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ 様（Neuromedin U、PRXアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン／胎盤性性腺刺激ホルモン、チロトロピン、ゴナドトロピンタイプＩ、ゴナドトロピンタイプＩＩ）、(ロド）プシン、ロドプシン脊椎動物（タイプ１−５）、ロドプシン脊椎動物タイプ５、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物タイプ１、ロドプシン節足動物タイプ２、ロドプシン節足動物タイプ３、ロドプシン軟体動物、ロドプシン、オルファクトリー（Olfactory）（Olfactory II fam １から１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジン Ｅ２ サブタイプ EP1、プロスタグランジン E2／D2 サブタイプ EP2、プロスタグランジン E2 サブタイプ EP3、プロスタグランジン E2 サブタイプ EP4、プロスタグランジン F2-α、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシンタイプ１から３、プリン受容体、プリン受容体P2RY1-4,6,1 1 GPR91、プリン受容体P2RY5,8,9,10 GPR35,92,174、プリン受容体P2RY12-14 GPR87（UDP-���ルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン様放出ホルモンタイプI、ゴナドトロピン放出ホルモンタイプII、脂質動員ホルモン様、コラゾニン、サイロトロピン放出ホルモン ＆ 分泌促進物質、サイロトロピン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、脱皮行動誘導ホルモン（ETHR）、メラトニン、リゾスフィンゴ脂質＆ LPA（EDG）、スフィンゴシン１−ホスフェート Edg-1、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−２、スフィンゴシン１−ホスフェート Edg-3、リゾホスファチジン酸Edg-4、スフィンゴシン １−ホスフェート Edg-5、スフィンゴシン １−ホスフェート Edg-6、リゾホスファチジン酸Edg-7、スフィンゴシン １−ホスフェート Edg-8、Edg以外のロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体 BLT1、ロイコトリエンＢ４受容体 BLT2、クラスＡ オーファン／他、推定神経伝達物質、SREB、Masプロトオンコジーン＆ Mas関連（MRG）、GPR45様、システイニルロイコトリエン、Ｇタンパク質共役胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（GP40、GP41、GP43）、クラスＢセクレチン様、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、PACAP、セクレチン、血管作動性腸管ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリンタイプ１、ラトロフィリンタイプ２、ラトロフィリンタイプ３、ETL 受容体、脳特異的血管形成阻害剤（BAI）、メトシェラ様タンパク質（MTH）、カドへリン EGF LAG（CELSR）、超大型Ｇ−タンパク質共役受容体、クラスＣ 代謝型グルタミン酸／フェロモン、代謝型グルタミン酸グループＩからＩＩＩ、カルシウムセンシング様、細胞外カルシウム-センシング、フェロモン、カルシウム-センシング様他、推定上 フェロモン受容体、GABA-B、GABA-B サブタイプ １、GABA-B サブタイプ ２、GABA-B 様、オーファンGPRC5、オーファンGPCR6、ブライド・オブ・セブンレスタンパク質（BOSS）、味覚受容体（T1R）、クラスＤ真菌フェロモン、真菌フェロモンＡ-因子様（STE2.STE3）、真菌フェロモンＢ様（BAR,BBR,RCB,PRA）、クラスＥ cAMP 受容体、眼球白子症タンパク質、Frizzled／スムーズンドファミリー、frizzled グループＡ（Fz １＆２＆４＆５＆７−９）、frizzledグループＢ（Fz ３ ＆ ６）、frizzled グループＣ（他のタイプ）、フェロモン（Vomeronasal）受容体、線形動物化学受容器、昆虫嗅覚受容体、およびクラスＺ古細菌／細菌／真菌オプシン。
【０１５３】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合物は、以下の活性ポリペプチドのいずれかを含み得る：BOTOX、Myobloc、Neurobloc、Dysport（または、他の血清型のボツリヌス神経毒）、アルグルコシダーゼα、ダプトマイシン、YH-16、絨毛ゴナドトロピンα、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンα−n3（注射）、インターフェロンα-n1、DL-8234、インターフェロン、サントリー（γ−Ia）、インターフェロンγ、チモシンα1、タソミン、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、クロファブ、ネシリチド、アバターセプト、アレフェット、レビフ、エクトターミナルファー、テリパラチド(骨粗鬆症）、注射可能なカルシトニン（骨疾患）、カルシトニン（鼻、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮細胞増殖因子（局所ゲル、創傷治癒）、DWP-401、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デスルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグα、モノニン、エタコグアファ(活性化）、組換え因子VIII+VWF、リコネイト（Recombinate）、組換え因子VIII、因子VIII（組換え）、アルファネート、オクトコグ アルファ、因子VIII、パリフェルミン、インディキナーゼ（Indikinase）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、rFSH、hpFSH、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、サルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルパース、ロイコトロピン、モルグラモスチム、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、ヒドロン）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、リュープロリド徐放性デポ製剤（ATRIGEL）、リュープロリドインプラント（DUROS）、ゴセレリン、ソマトロピン、ユートロピン（Eutropin）、KP-102プログラム、ソマトロピン、ソマトロピン、メカサミン（成長不全）、エンフュービルタイド、Org-33408、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミール、インスリン（頬粘膜、RapidMist）、メカゼルミンリファバート、アナキンラ、セルモロイキン、99 mTc-アプシチド（apcitide）インジェクション、ミエロピッド、Betaseron、酢酸グラチラマー、Gepon、サルグラモスチム、オレレベキン、ヒト白血球由来αインターフェロン、Bilive、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト（insulin aspart）、メカセルミン、ロフェロン−Ａ、インターフェロン−α２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンα、アボネックス組換えヒト黄体化ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベアプルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、CTC-111、Shanvac-B、HPV ワクチン（四価）、NOV-002、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼβ、アガルシダーゼα、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅(局所ゲル）、���スブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、PEG-イントロン、トリコミン(Tricomin)、組換えハウスダストダニアレルギー脱感作注射、組換えヒト副甲状腺ホルモン（PTH） 1-84（sc、骨粗鬆症）、エポエチンδ、トランスジェニックアンチトロンビンIII、グランディトロピン、ビトラゼ、組換えインスリン、インターフェロン−α（経口ロゼンジ）、GEM-2 IS、バプレオチド、イドルスルファゼ、オマパトリラート、組換え血清アルブミン、セソリズマブペゴール、グルカピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフュービルタイド（無針注射、Biojector 2000）、VGV-I、インターフェロン（α）、ルシナクタント（Lucinactant）、アビプタディール(Aviptadil)（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、アウログラブ（Aurograb）、酢酸ペキシガナン、ADI-PEG-20、LDI-200、デガレリクス、シントレデキン・ベスドトクス、FavId、MDX-1379、ISAtx-247、リラグルチド、テリパラチド(骨粗鬆症）、チファコジン、AA-4500、T4N5リポソームローション、カニューレキシマブ、DWP-413、ART-123、クリサリン（Chrysalin）、デスモテプラーゼ、アメディプラーゼ（amediplase）、コリフォリトロピンα、TH-9507、テデュグルチド、Diamyd、DWP-412、成長ホルモン（徐放性注射）、組換え G-CSF、インスリン（吸入、AIR）、インスリン（吸入、テクノスフィア）、インスリン（吸入、AERx）、RGN-303、DiaPep277、インターフェロンβ(Ｃ型肝炎ウイルス感染（HCV））、インターフェロンα−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、AMG-531、MBP-8298、キセレセプト（Xerecept）、オペバカン、AIDSVAX、GV-1001、リンホスキャン、ランピルナーゼ、リポキシサン、ルスプルチド、MP52（β−リン酸三カルシウム担体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプリューセル−Ｔ、CTP-37、Insegia、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科的出血）、トロンビン、TransMID、アルフィメプラーゼ、プリケアーゼ、テルリプレシン(静脈内、肝腎症候群）、EUR-1008M、組換え FGF-I（注射可能、血管疾患）、BDM-E、ロティガプチド、ETC-216、P-113、MBI-594AN、デュラマイシン(吸入、嚢胞性線維症）、SCV-07、OPI-45、エンドスタチン、アンジオスタチン、ABT-510、ボーマンバーク阻害剤濃縮物、XMP-629、99 mTc-Hynic−アネキシンＶ、カハラリドＦ、CTCE-9908、テベレリクス(延長された放出）、オザレリクス、ロミデプシン、BAY-50-4798、インターロイキン−４、PRX-321、ペプスキャン（Pepscan）、イボクタデキン（iboctadekin）、rhラクトフェリン、TRU-015、IL-21、ATN-161、シレンジチド、アルブフェロン、バイファシック（Biphasix）、IRX-2、ωインターフェロン、PCK-3145、CAP-232、パシレオチド、huN901-DM1、卵巣癌免疫療法ワクチン、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（MART-I、gp100、チロシナーゼ）、ネミフィチド（nemifitide）、rAAT（吸入）、rAAT（皮膚の）、CGRP（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、チモシン β−4、プリチデプシン（plitidepsin）、GTP-200、ラモプラニン、GRASPA、OBI-I、AC-100、サケカルシトニン（経口、eligen）、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エキソレリン、カンプロモレリン、カルデバ、ベラフェルミン、131I-TM-601、KK-220、TP-10、ウラリチド（ularitide）、デペレスタット（Depelestat）、ヘマタイド（hematide）、クリサリン（Chrysalin）（局所）、rNAPc2、組換え因子 VIII（PEG化リポソーム）、bFGF、PEG化組換えスタフィロキナーゼ変異体、V-10153、ソノリシスプロリーゼ（SonoLysis Prolyse）、ニューロバクス、CZEN-002、島細胞ネオゲネシス療法、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、エクセナチド(制御放出、Medisorb）、AVE-0010、GA-GCB、アボレリン、AOD-9604、リナクロチドアセテート、CETi-I、ヘモパン、VAL（注射可能）、速効型インスリン(注射可能、ビアデル）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン(経口、エリジェン）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入乾燥粉末、喘息）、マルチキン、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn1O（自己免疫性疾患／炎症）、タラクトフェリン(局所）、rEV-131（眼科）、rEV-131（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、RPI-78M、オレレベキン(経口）、CYT-99007 CTLA4-Ig、DTY-001、バラテグラスト、インターフェロン α−ｎ３（局所）、IRX-3、RDP-58、タウフェロン、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ、アルカリホスファターゼ、EP-2104R、メラノタン-II、ブレメラノチド、ATL-104、組換えヒトマイクロプラスミン、AX-200、SEMAX、ACV-I、Xen-2174、CJC-1008、ダイノルフィンA、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、マラリアワクチン（ヴィロソーム、PeviPRO）、ALTU-135、パルボウイルスＢ １９ ワクチン、インフルエンザワクチン(組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／HBVワクチン、炭疽ワクチン、Vacc-5q、Vacc-4x、HIV ワクチン（経口）、HPV ワクチン、Tatトキソイド、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34） リポソームクリーム(Novasome）、オスタボリン−Ｃ、PTH類縁体（局所、乾癬）、MBRI-93.02、MTB72F ワクチン（結核）、MVA-Ag85 A ワクチン（結核）、FAR-404、BA-210、組換えペストF1V ワクチン、AG-702、OxSODro1、rBetV1、Der-p1／Der-p2／Der-p7アレルゲン標的ワクチン（イエダニアレルギー）、PR1 ペプチド抗原（白血病）、突然変異体ras ワクチン、HPV-16 E7 リポペプチド ワクチン、ラビリンティンワクチン（腺癌腫）、CML ワクチン、WT1-ペプチド ワクチン（癌）、IDD-5、CDX-110、Pentrys、ノレリン（norelin）、CytoFab、P-9808、VT-111、イクロカプチド（icrocaptide）、テルベルミン（皮膚科学、糖尿病性足潰瘍）、ルピントリビル、レチクロース(reticulose)、rGRF、P1A、α−ガラクトシダーゼＡ、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、アンギオテンシン療法ワクチン、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07（経口、結核）、DRF-7295、ABT-828、ErbB2-特異的免疫毒素(抗腫瘍）、DT388IL-3、TST-10088、PRO-1762、Combotox、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン−受容体結合ペプチド、1 1 1ln-hEGF、AE-37、トラスツマブ-DM1、アンタゴニストＧ、IL-12（組み換え）、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647（topical）、L-19ベースの放射免疫療法(癌）、Re-188-P-2045、AMG-386、DC／I540／KLH ワクチン（癌）、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-I ワクチン（ペプチド）、NA17.A2 ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原療法）、前立腺癌ワクチン、CBP-501、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、FX-06、AP-214、WAP-8294A2（注射可能）、ACP-HIP、SUN-11031、ペプチド YY [3-36]（肥満、鼻腔内）、FGLL、アタシセプト（atacicept）、BR3-Fc、BN-003、BA-058、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（経鼻、骨粗鬆症）、F-18-CCR1、AT-1001（シリアック病／糖尿病）、JPD-003、PTH(7-34） リポソームクリーム(Novasome）、ズラマイシン(眼科、ドライアイ）、CAB-2、CTCE-0214、GlycoPEGylated エリスロポエチン、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、アミノカンジン、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、テベレリックス(teverelix)（即時放出）、EP-51216、hGH（制御放出、Biosphere）、OGP-I、シフビルタイド、TV-4710、ALG-889、Org-41259、rhCCIO、F-991、チモペンチン(肺疾患）、r(m）CRP、肝選択的インスリン、スバリン、L 19-IL-2 融合タンパク質、エラフィン、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、AL-108、AL-208、神経増殖因子アンタゴニスト（疼痛）、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、経口テリパラチド（eligen）、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合ワクチン（Therapore）、EP-1043、肺炎連鎖球菌小児ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎菌グループＢワクチン、新生児グループB連鎖球菌ワクチン、炭疽ワクチン、HCVワクチン（gpE1+gpE2+MF-59）、中耳炎療法、HCV ワクチン（コア抗原+ISCOMATRIX）、hPTH(1-34）（経皮、ViaDerm）、768974、SYN-101、PGN-0052、アビスクミン、BIM-23190、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム（enkastim）、APC-8024、G1-5005、ACC-OO1、TTS-CD3、血管標的TNF（固形腫瘍）、デスモプレシン(頬側制御放出）、オネルセプト、TP-9201。
【０１５４】
さらなる修飾
ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれらの融合物は、翻訳後修飾をさらに含み得る。翻訳後タンパク質修飾の例には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ADPリボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、SUMO化、ビオチン化あるいはポリペプチド側鎖の付加または疎水性基の付加が含まれる。その結果、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれらの融合物は、脂質、多糖もしくは単糖およびリン酸などの非アミノ酸要素を含み得る。グリコシル化の好ましい形態は、１以上のシアル酸部分をポリペプチドに結合させるシアリル化である。シアル酸部分は、可溶性および血清半減期を改善すると同時に、タンパク質の可能な免疫原性も低下させる。例えば、Raju et al. Biochemistry 2001;40:8868-76。そのような非アミノ酸要素がＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれらの融合物の機能性に及ぼす影響を、特定のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに結合する能力および／または特定の非１０Ｆｎ３部分によって付与される機能的役割について試験することができる。
【０１５５】
Ｅ．ベクターおよびポリヌクレオチド態様
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドおよびその融合物）のいずれかをコードする核酸も提供する。従って、ある態様において、本発明は、配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つにコードされる核酸を提供し、その核酸配列は、親７０１６＿Ａ０１核酸配列（配列番号１７３）から当業者により容易に決定され得る。
【０１５６】
当業者に認識されるように、第３塩基の縮重のために、ほとんど全てのアミノ酸は、コードヌクレオチド配列において２以上のトリプレットコドンによって表され得る。さらに、マイナーな塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列における保存的置換をもたらし得るが、遺伝子産物の生物学的活性を実質的に変化させるとは予期されない。従って、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列は、わずかに配列が改変されていてもよく、依然としてそれぞれの遺伝子産物をコードしている。いくつかの態様において、ヌクレオチド置換は、得られた翻訳されたアミノ酸配列を変更しないように導入される。ある態様において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびその融合物をコードする核酸は、本明細書に記載のアミノ酸置換（配列番号２３と比較して）をコードする核酸配列を有する。
【０１５７】
本明細書に記載の種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドンの使用は、細胞における発現を改善するように選択され得る。そのようなコドンの使用は、選択された細胞タイプに依存し得る。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために、特殊なコドンの使用パターンが開発されている。例えば、Mayfield et al., PNAS 2003;100:438-42；Sinclair et al. Protein Expr Purif 2002;26::96-105；Connell., Curr Opin Biotechnol 2001;12:446-9；Makrides et al. Microbiol Rev 1996;60:512-38；および、Sharp et al. Yeast 1991;7:657-78を参照のこと。
【０１５８】
核酸操作の一般的技術は、当業者の認識の範囲内であり、また例えば、参照により本明細書中に包含させる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989, またはF. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987）および定期改訂版に記載されている。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。通常、複製起点によって与えられる宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれる。好適な調節エレメントは、当技術分野においてよく知られている。
【０１５９】
本明細書に記載のポリペプチドおよびその融合物は、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として産生され得る。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然シグナル配列を認識せず処理しない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ ｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌については、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロマイセスおよびクルイベロミセスα因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、またはＰＣＴ公開公報WO 90／13646に記載のシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡは、該タンパク質をコードするＤＮＡにリーディングフレームで連結されていてもよい。
【０１６０】
真核生物宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。そのような配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの、通常５’のおよび時には３’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載の発現ベクターを参照のこと。
【０１６１】
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用であり得るタンパク質タグ配列の全てのタイプを含み得る。タンパク質タグの例としては、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。 細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主との使用に適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual（Elsevier, New York, 1985）に見いだされ得て、その関連する開示は参照により本明細書中に包含される。
【０１６２】
発現構築物は、当業者には明らかであるように、宿主細胞に適切な方法を用いて該宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法が当技術分野において知られており、それらには、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および、感染（ベクターが感染性因子であるとき）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
好適な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞が含まれる。好適な細菌には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌またはバチルス属菌が含まれる。好ましくはサッカロマイセス種の酵母、例えば出芽酵母も、ポリペプチドの産生に用いられ得る。種々の哺乳動物細胞または昆虫細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることができる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers（Bio／Technology, 6:47, 1988）によって概説されている。いくつかの例において、グリコシル化のためなど、脊椎動物細胞においてタンパク質を産生することが望ましく、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、常套法になっている。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。多くの用途のために、本明細書に記載された小サイズのタンパク質多量体が、大腸菌を好ましい発現方法とする。
【０１６４】
Ｆ．タンパク質産生
宿主細胞は、タンパク質産生のために本明細書に記載の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された常套栄養培地中で培養される。
【０１６５】
本明細書に記載のような、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれらを含む融合分子を産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。Ham's F10（Sigma）、最小必須培地((MEM）、(Sigma））、RPMI-1640（Sigma）、およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM）、(Sigma））のような市販の培地は、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ham et al., Meth Enz 58:44（1979）, Barnes et al., Anal Biochem 102:255（1980）, 米国特許第4,767,704号；同第4,657,866号；同第4,927,762号；同第4,560,655号；または同第5,122,469号；WO90／03430；WO87／00195；または、米国特許第Re. 30,985 に記載の培地を宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地には、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、緩衝液（HEPESなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（GENTAMYCIN（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源が添加されてよい。他の必要なサプリメントもまた、当業者に知られている適当な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかである。
【０１６６】
ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子は、本明細書に記載の通り、無細胞翻訳系を用いて産生することもできる。このような目的のために、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質をコードする核酸は、インビトロ転写がｍＲＮＡを生成し、利用されている特定の無細胞（哺乳動物または酵母のような真核生物の無細胞翻訳系または細菌などの原核生物の無細胞翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。
【０１６７】
ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子は、本明細書に記載の通り、化学合成により（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載の方法により）産生され得る。フィブロネクチンに基づく足場タンパク質への改変はまた、化学合成によっても産生され得る。
【０１６８】
ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子は、本明細書に記載の通り、タンパク質化学の分野で一般的に知られているタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。限定を意図しない例としては、抽出、再結晶、塩析(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。 精製後、本明細書に記載の血清アルブミン結合剤および融合分子は、異なる緩衝液に交換されてもよく、および／または濾過および透析を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々の方法により濃縮されてもよい。
【０１６９】
本明細書に記載のように精製ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子は、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値を問わず、本明細書に記載されたＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子は、医薬品として使用するのに十分に純粋である。
【０１７０】
本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子はまた、以下のプロトコールを用いて作製され得る。
【０１７１】
アドネクチンをＰＥＴ９ｄベクター中のＨＩＳ６タグの上流にクローニングし、大腸菌BL21 DE3 plysS細胞を形質転換し、該細胞を２４ウェルフォーマットの５０μg／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ培地５ｍＬ中に接種して、３７℃で一晩増殖させる。誘導発現のために、一晩培養した培養液から２００μｌ吸引して、新鮮な５ｍｌ ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン）培養物を調製し、適当なウェルに分注する。培養物をＡ６００ ０．６−０．９まで３７℃で培養する。１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した後、培養物を３０℃で６時間発現させて、４℃にて、２７５０ｇで１０分間遠心して回収する。
【０１７２】
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット）を、４５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｘ 完全（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含有（Roche）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ イミダゾール、１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、３０μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌアプロトニン、ｐＨ８．０）中に再懸濁して溶解し、室温で１−３時間振とうする。溶解物を清澄化し、９６ウェル、１．２ｍｌのキャッチプレート（catch plate）を備え、陽圧でろ過した、９６ウェルのWhatman GF／D Unifilterに移して、再度９６ウェルフォーマットにした。清澄化した溶解物を、平衡緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化した９６ウェルのニッケルまたはコバルトキレートプレートに移し、５分間インキュベートする。結合していない物質は陽圧によって除去される。樹脂を、洗浄緩衝液♯１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を１ウェルあたり０．３ｍｌ用いて２回洗浄する。各洗浄液を陽圧で除去する。溶出の前に、各ウェルを５０μｌの溶出バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、この洗浄液を陽圧で廃棄する。各ウェルに１００μｌの溶出バッファーを添加してタンパク質を溶出させる。室温で３０分間インキュベートした後、プレートを５分間２００ｇで遠心して、溶出されたタンパク質を、溶出前に溶出キャッチプレートの底に添加した５μｌの０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む９６ウェルキャッチプレートに集めた。溶出されたタンパク質を、タンパク質標準として野生型１０Ｆｎ３ドメインを用いた全タンパク質アッセイを用いて定量する。
【０１７３】
不溶性アドネクチンの発現のために、アドネクチン、続いてＨＩＳ６タグをコードする核酸を、ｐＥＴ９ｄ（EMD Bioscience、San Diego、CA）ベクター中にクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０ｍｌの接種培養物（単一播種コロニーから産生）を用いて、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１リットルに接種する。培養物を、３７℃にて、Ａ６００ ０．６−１．０になるまで増殖させる。１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃にて４時間増殖させて、４℃にて、１０，０００ｇ以上で３０分間遠心して回収する。細胞ペレットを−８０℃で凍結させる。細胞ペレットを、ULTRA-TURRAX（登録商標）ホモジナイザー（IKA社製）を用いて氷上で、２５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ａＨ２Ｐ０４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｌｘ 完全プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含有（Roche）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させる。細胞溶解物を、Model M-l 10S MICROFLUIDIZER（登録商標）（Microfluidics）を用いて高圧ホモジナイゼーション（＞１８，０００ｐｓｉ）により得る。不溶性画分を、４℃にて、２３，３００ｇで３０分間遠心して分離する。溶解物の遠心から回収された不溶性ペレットを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄する。ペレットを、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４中、６．０Ｍの塩化グアニジニウムに、超音波処理しながら再溶解させ、次いで３７℃で１−２時間インキュベートする。再溶解したペレットを０．４５μｍフィルターで濾過し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／６．０Ｍ グアニジン ｐＨ７．４緩衝液で平衡化したHistrap カラム上に添加する。添加後、カラムを同じ緩衝液を用いてさらに２５ＣＶで洗浄する。結合したタンパク質を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６．０Ｍ ｇｕａｎ−ＨＣｌ ｐＨ７．４中、５０ｍＭ イミダゾールを用いて溶出する。精製したタンパク質を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ４．５に対して透析して再折りたたみ(refolding）させる。
【０１７４】
可溶性アドネクチンの発現のために、アドネクチン、続いてＨＩＳ６タグをコードする核酸を、ｐＥＴ９ｄ（EMD Bioscience、San Diego、CA）ベクター中にクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０ｍｌの接種培養物（単一播種コロニーから産生）を用いて、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１リットルに接種する。培養物を、３７℃にて、Ａ６００ ０．６−１．０になるまで増殖させる。１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃にて４時間増殖させて、４℃にて、１０，０００ｇ以上で３０分間遠心して回収する。細胞ペレットを−８０℃で凍結させる。細胞ペレットを、ULTRA-TURRAX（登録商標）ホモジナイザー（IKA社製）を用いて氷上で、２５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ａＨ２Ｐ０４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｌｘ 完全プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含有（Roche）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させる。細胞溶解物を、Model M-l 10S MICROFLUIDIZER（登録商標）（Microfluidics）を用いて高圧ホモジナイゼーション（＞１８，０００ｐｓｉ）により得る。可溶性画分を、４℃にて、２３，３００ｇで３０分間遠心して分離する。上清を、０．４５μｍフィルターにより清澄化する。清澄化された溶解物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で予め平衡化したHistrap カラム（ＧＥ）上に添加する。その後、カラムを２５カラム容量の同じ緩衝液を用いて洗浄し、次いで２０カラム容量の２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／２５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄し、次いで、３５カラム容量の２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４を用いて溶出し、画分をＡ２ｓｏの吸光度に基づいて集め、ｌｘＰＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．５または５０ｍＭ ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析する。沈殿物を０．２２μｍフィルターで濾過することにより除去する。
【０１７５】
Ｇ．イメージング、診断および他の適用
本発明のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３融合物は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに融合された異種分子の同一性に基づいて、種々の疾患および障害を処置するために用いられ得る。ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３融合物の適用は、当該分野における知識および本明細書の記載の情報に基づいて当業者によって決定され得る。種々のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３融合タンパク質の使用が、本明細書に詳細に記載されている。ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３融合物は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含む、哺乳動物対象または患者に投与され得る。
【０１７６】
本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよび融合分子は、検出可能に標識されていてよく、例えば、イメージングまたは診断用途のために融合分子によって結合されたタンパク質を発現する細胞と接触するのに使用され得る。Hunter et al., Nature 1962;144:945；David et al., Biochemistry 1974;13:1014；Pain et al., J Immunol Meth 1981;40:219；および、Nygren、Histochem and Cytochem 1982;30:407に記載されている方法を含む、タンパク質を検出可能な部分に結合させるための当技術分野で公知の方法を用いることができる。
【０１７７】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子は、検出を可能にする標識にさらに結合される（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。標識は、放射性重金属、例えば鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉまたは９９Ｔｃなどの放射性物質であり得る。ある態様において、標識は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物；あるいは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインまたはかかる部分に結合した融合分子は、造影剤として使用され、ヒトなどの哺乳動物において診断用途に有効な量で投与され、造影剤の局在および蓄積が検出される。造影剤の局在および蓄積は、放射性シンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法または陽電子放出断層撮影法によって検出することができる。当業者に明らかであるように、投与される放射性同位元素の量は、放射性同位元素によって変わる。当業者は、活性部分として使用される所定の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与される造影剤の量を容易に決定することができる。
【０１７８】
本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子はまた、親和性精製剤として有用である。このプロセスでは、当技術分野で周知の方法を用いて、タンパク質を適切な支持体、例えばSephadex樹脂または濾紙上に固定する。タンパク質は、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で用いられ得る（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158（CRC Press、Inc., 1987））。
【０１７９】
Ｈ．生物物理学的および生化学的特徴付け
結合親和性のためのインビトロアッセイ
ＨＳＡに結合するアドネクチンは、種々のインビトロアッセイを用いて同定され得る。ある態様において、該アッセイは、複数の候補アドネクチンを同時にスクリーニングすることを可能にするハイスループットアッセイである。
【０１８０】
その標的に対するアドネクチンの結合親和性を決定するための例示的アッセイには、溶液 phase methods such as the結合平衡除外（kinetic exclusion）アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）（Blake et al., JBC 1996；271:27677-85；Drake et al., Anal Biochem 2004；328:35-43）、Biacore（登録商標）システムを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Uppsala, Sweden）（Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991；23:1；Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998；295:268）および均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ（Newton et al., J Biomol Screen 2008；13:674-82；Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008；6:55-68）などの液相法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
ある態様において、生体分子相互作用は、Biacore（登録商標）システムを用いてリアルタイムでモニタリングされ、それは、ＳＰＲを用いて、３００ｎｍまで離れた表面の屈折率における変化の結果としてのガラス支持体上の薄い金膜の表面での光の共鳴角度の変化を検出する。Biacore分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および親和定数を生じる。結合親和性は、Biacore表面プラズモン共鳴システム(Biacore、Inc.）を用いて、会合および解離速度定数を評価することにより得られる。バイオセンサーチップは、標的の共有結合のために活性化される。次いで、標的を希釈し、チップ上に注入して、固定された材料の応答単位でシグナルを得る。共鳴単位（ＲＵ）のシグナルは、固定された材料の質量に比例するため、これは、マトリックス上の固定された標的密度の範囲を表す。会合データおよび解離データは、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＲｍａｘ（飽和時の最大応答）に最適な値をもたらす、１：１の２分子相互作用の正味速度式を解くためのグローバル解析に同時に適合する。結合の平衡解離定数、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＳＰＲ測定値から計算される。
【０１８２】
ヒト、カニクイザル、ラット、マウスからの血清アルブミンへの結合についての本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）、結合速度定数（ｋａ）および解離平衡定数（ＫＤ）は、SPR Biacore分析を用いて決定され得る。ある態様において、それぞれの血清アルブミンは、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリングを用いて、Biacore CM5チップ上に、約１２００ＲＵの表面密度で固定化される。試験すべきＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインの濃度範囲（０．２５ｎＭ−５ｕＭ）を、固定されたアルブミンに対して、ＨＢＳ−Ｐ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５% ｖ／ｖ 界面活性剤 Ｐ−２０）または酢酸（０．０２ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５% ｖ／ｖ 界面活性剤 Ｐ−２０）泳動バッファー中に添加する。反応速度測定を、３分間の会合相および６〜１０分間の解離相を用いて行う。対照を差し引いたセンサーグラム（reference-subtracted sensogram）の反応速度曲線を、Biaevaluationソフトウェアを用いて１：１結合モデルに適合させる。
【０１８３】
上記のアッセイは例示のものであり、タンパク質環の結合親和性を決定するための当技術分野で公知の方法（例えば、蛍光ベースのエネルギー転移（ＦＲＥＴ）法、酵素結合免疫吸着アッセイ、および競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ））を用いて、本明細書に記載の血清（rum）アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインの結合親和性を評価することができることが理解されるべきである。
【０１８４】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合タンパク質の融解温度（Ｔｍ）は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または熱走査蛍光（ＴＳＦ）を用いて測定したとき、少なくとも５０℃、例えば少なくとも５１℃、少なくとも５２℃、少なくとも５３℃、少なくとも５４℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃、少なくとも５９℃、少なくとも６０℃、少なくとも６１℃、少なくとも６２℃、少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃、少なくとも６６℃、少なくとも６７℃、少なくとも６８℃、少なくとも６９℃、少なくとも７０℃、少なくとも７１℃、少なくとも７２℃、少なくとも７３℃、少なくとも７４℃、または少なくとも７５℃である。
【０１８５】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合タンパク質の融解温度（Ｔｍ）は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または熱走査蛍光（ＴＳＦ）を用いて測定したとき、５０−７５℃、例えば５１−７５℃、５２−７５℃、５３−７５℃、５４−７５℃、５５−７５℃、５６−７５℃、５７−７５℃、５８−７５℃、５９−７５℃、６０−７５℃、６１−７５℃、６２−７５℃、６３−７５℃、６４−７５℃、６５−７５℃、６６−７５℃、６７−７５℃、６８−７５℃、６９−７５℃、７０−７５℃、５０−７４℃、５０−７３℃、５０−７２℃、５０−７１℃、５０−７０℃、５０−６９℃、５０−６８℃、５０−６７℃、５０−６６℃、５０−６５℃、５０−６４℃、５０−６３℃、５０−６２℃、５０−６１℃、５０−６０℃、５０−５９℃、５０−５８℃、５０−５７℃、５０−５６℃、５０−５５℃、５１−７４℃、５２−７３℃、５３−７１℃、５４−７０℃、または５５−６５℃である。
【０１８６】
Ｉ．インビボでの治療使用
本発明は、障害の処置に有用であるＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子を提供する。ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインを含む融合タンパク質の場合、処置され得る疾患または障害は、その部分、例えばアドネクチンに結合された第２の１０Ｆｎ３ドメインの結合特異性によって決まる。本明細書に記載の通り、フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、目的の標的に結合するように設計され得る。一態様において、標的はＰＣＳＫ９である。ＰＳＣＫ９に結合するフィブロネクチンベースの足場タンパク質およびそれを含む融合タンパク質は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患を処置するために用いられ得る。
【０１８７】
本発明はまた、フィブロネクチンベースの足場タンパク質を対象に投与するための方法を提供する。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、哺乳動物、特にヒトに薬学的に許容される。“薬学的に許容される”組成物とは、重大な有害な医学的影響なしに動物に投与される組成物を意味する。薬学的に許容される組成物の例には、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠いている１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを含む組成物および本質的にエンドトキシンもしくは発熱物質を含まないか、またはエンドトキシンもしくは発熱物質レベルが非常に低い組成物が含まれる。
【０１８８】
Ｊ．製剤および投与
本発明は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに融合された部分（例えば、治療的部分）を投与するための方法であって、ここで、該部分の半減期はＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに融合されたとき延長される方法を提供する。融合構築物の投与のための技術および投与量は、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインに融合された治療部分のタイプおよび処置される特定の病状によって変わるが、当業者によって容易に決定され得る。一般的に、規制当局は、治療剤として使用されるタンパク質試薬が、発熱物質を許容可能な低レベルで含むように製剤されることを要求する。従って、治療用製剤は、一般に、適当な規制当局（例えば、ＦＤＡ）によって決定されるように、実質的に発熱物質を含まないか、または少なくとも許容レベルを超えないレベルで発熱物質を含む点で、他の製剤とは区別される。
【０１８９】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合部分の医薬製剤は、例えば、１−２０ｍＭ コハク酸、２−１０％ ソルビトールおよび１−１０％ グリシン（ｐＨ４．０−７．０）を含む。一態様例において、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合分子の医薬製剤は、例えば、１０ｍＭ コハク酸、８％ソルビトールおよび５％ グリシン（ｐＨ６．０）を含む。
【０１９０】
ある態様において、本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合物は、哺乳動物、特にヒトに薬学的に許容される。“薬学的に許容される”ポリペプチドとは、重大な有害な医学的影響なしに動物に投与されるポリペプチドを意味する。本明細書に記載のＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびそれを含む融合物の例には、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠いている１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを含む組成物および本質的にエンドトキシンを含まないか、またはエンドトキシンレベルが非常に低いＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインまたはＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合物の組成物が含まれる。
【０１９１】
組成物（例えば、治療用組成物）は、単一投与量形態で、担体（例えば、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤）と共に投与され得る。投与は、限定しない例として、非経腸（例えば、静脈内、皮下）、経口または局所であってよい。組成物は、経口投与のための丸薬、錠剤、カプセル剤、液剤、または徐放性錠剤の形態；静脈内、皮下または非経腸投与のための液剤；あるいは、局所投与のためのゲル剤、ローション、軟膏、クリームまたはポリマーまたは他の徐放性ビヒクルであり得る。
【０１９２】
製剤を製造するための当技術分野で周知の方法は、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”（20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams ＆ Wilkins, Philadelphia, Pa.）に見出される。非経腸投与用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含み得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、化合物の放出を制御することができる、ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を用いて、化合物の生体内分布を制御することができる。他の可能性のある有用な非経腸送達システムには、include エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。製剤中の化合物の濃度は、投与される薬物の投与量および投与経路を含む多くの要因によって変わる。
【０１９３】
ポリペプチドは、要すれば、薬学的に許容される塩、例えば製薬業界で一般的に使用される非毒性の酸付加塩または金属錯体として投与され得る。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどの高分子酸；および、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が挙げられる。金属錯体としては、亜鉛、鉄などが挙げられる。一例において、ポリペプチドは、ポリペプチドは、熱安定性を高めるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤される。
【０１９４】
経口使用のための製剤には、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して有効成分（複数可）を含む錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、および付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油またはタルク）であり得る。
【０１９５】
経口使用のための製剤はまた、咀嚼錠剤として、または有効成分が不活性固体希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分が水もしくは油媒体と混合されている軟ゼラチンカプセルとして、提供され得る。
【０１９６】
治療的有効用量とは、それが投与されて治療的効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置される障害によって変わり、既知の技術を用いて当業者によって確認され得る。一般に、ＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメインまたはＨＳＡ結合１０Ｆｎ３ドメイン融合物は、１日当たり約０．０１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、１日１回、２回、３回、または４回）またはそれ以下の頻度で（例えば、２日に１回、週に１または２回、２週間に１回、または毎月）提供されてよい。さらに、当技術分野で知られているように、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に対する調整が必要とされ、当業者による常套的な実験で確かめることができる。
【０１９７】
Ｋ．例示的態様
態様１．
フィブロネクチンタイプＩＩＩの１０番目のドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、１μＭ以下のＫＤでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合し、かつＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを含み、ここで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤおよびＦＧループと比較して、該ＣＤループが１、２または３個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが１、２または３個のアミノ酸置換を有していてよく、そして１０Ｆｎ３ドメインに連結されている部分（例えば、ポリペプチド）の血清半減期が、１０Ｆｎ３ドメインに連結されていない部分の血清半減期に比べて延長されている、ポリペプチド。
【０１９８】
態様２．
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度定数（ｋｄ）より大きいｋｄでＨＳＡに結合する、態様１に記載のポリペプチド。
【０１９９】
態様３．
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの結合速度定数（ｋａ）の１桁倍（すなわち、１０倍以内）のｋａでＨＳＡに結合する、態様１または２に記載のポリペプチド。
【０２００】
態様４．
ＣＤループが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループに対して２個のアミノ酸置換を有する、態様１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２０１】
態様５．
ＣＤループが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの対応するＣＤループに対して１個のアミノ酸置換を有する、態様１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２０２】
態様６．
ＦＧループが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＦＧループに対して１個のアミノ酸置換を有する、態様１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２０３】
態様７．
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループおよびＦＧループに対して、ＣＤループが、１個のアミノ酸置換を有し、ＦＧループが１個のアミノ酸置換を有する、態様１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２０４】
態様８．
２個のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択される、態様４に記載のポリペプチド：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【０２０５】
態様９．
１個のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択される、態様５に記載のポリペプチド：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される。
【０２０６】
態様１０．
ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、セリン（Ｓ）で置換される、態様９に記載のポリペプチド。
【０２０７】
態様１１．
ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、スレオニン（Ｔ）で置換される、態様９に記載のポリペプチド。
【０２０８】
態様１２．
ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、グルタミン（Ｑ）で置換される、態様９に記載のポチペプチド。
【０２０９】
態様１３．
ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）が、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換される、態様６に記載のポリペプチド。
【０２１０】
態様１４．
ａ）ＣＤループにおける１個のアミノ酸置換が、以下からなる群より選択される：
（ｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置２のアルギニン（Ｒ）が、Ｄ、Ｅ、Ａ、ＱまたはＮから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置５のグルタミン（Ｑ）が、Ｄで置換される；
（ｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置７のチロシン（Ｙ）が、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｉｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１０のロイシン（Ｌ）が、Ｓ、ＴまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１３のロイシン（Ｌ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１４のチロシン（Ｙ）が、ＡまたはＴから選択されるアミノ酸で置換される；
（ｖｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１５のイソロイシン（Ｉ）が、Ｄ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；および
（ｖｉｉｉ）ＣＤループ（配列番号２８）の位置１６のチロシン（Ｙ）が、Ｑ、Ｅ、ＳまたはＡから選択されるアミノ酸で置換される；ならびに、
ｂ）ＦＧループ（配列番号２９）の位置１２のリシン（Ｋ）が、Ａ、ＴまたはＳから選択されるアミノ酸で置換される、態様７に記載のポリペプチド。
【０２１１】
態様１５．
配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれか１つの非ＣＤループ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１から１４のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２１２】
態様１６．
配列番号３０−３４、３６−４０、４２−４６、４８、４９、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６５−６８、７０、７１、７３−７６、７８、７９、８１−８４、８６、８７、８９−９８、１００−１０９および１１１−１１８のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１から１５のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２１３】
態様１７．
１０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合する、態様１から１６のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２１４】
態様１８．
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインの解離速度に対する該ポリペプチドの解離速度の比率が、少なくとも約３倍である、態様１から１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２１５】
態様１９．
比率が、少なくとも約２５倍である、態様１７に記載のポリペプチド。
【０２１６】
態様２０．
比率が、少なくとも約５０倍である、態様１７に記載のポリペプチド。
【０２１７】
態様２１．
異種タンパク質を含む、態様１から２０のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２１８】
態様２２．
異種タンパク質が治療的部分である、態様２０に記載のポリペプチド。
【０２１９】
態様２３．
異種タンパク質が、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドである、態様２１または２２に記載のポリペプチド。
【０２２０】
態様２４．
態様１から２３のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド、および担体を含む、組成物。
【０２２１】
態様２５．
態様１から２３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【０２２２】
態様２６．
態様１から２３のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【０２２３】
態様２７．
態様２５に記載の核酸分子または態様２６に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【０２２４】
態様２８．
態様１から２３のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、態様２７に記載の細胞をポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し、該ポリペプチドを精製することを含む、方法。
【０２２５】
態様２９．
ある部分の半減期を延長させる方法であって、態様１から２３のいずれかに記載のヒト血清アルブミン結合ポリペプチドに該部分を連結させることを含む、方法。
【０２２６】
本出願を通じて引用される全ての図および全ての文献、Genbank配列、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書中に明示的に包含させる。特に、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２１５３５号およびＷＯ２０１１／１４００８６号の開示内容は、参照により本明細書中に明示的に包含させる。
【０２２７】
上記の開示は、以下の実施例によりさらに例示される本願の開示を一般的に記載するものである。これらの具体的な例は、説明のためのみに記載されており、本開示の範囲を限定することを意図しない。特定のターゲット、用語および値が本明細書で使用されているが、このようなターゲット、用語および値は、同様に、例示として、そして本開示の範囲を限定するものではないと理解される。
【実施例】
【０２２８】
実施例
実施例１：ヒト血清アルブミン結合ADX_2629_E06ベースの変異体１０Ｆｎ３ドメインの産生
アドネクチン ADX_7016_A01（本明細書中、ＰＫＥ２アドネクチンとも言う）を、以下のコア配列を有するＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合するポリペプチドとして単離した：
【化８】
2018532725.tif 000009
【０２２９】
ADX_7016_A01は、免疫原性が低く、約３−６ｎＭのＫＤでＨＳＤに結合する。ADX_7016_A01に融合されたＰＣＳＫ９結合アドネクチンを含むポリペプチドは、マウスにおいて約８２時間の半減期を有する。融合パートナーの半減期範囲の汎用性を増加させるために（例えば、特定の状況では、ADX_7016_A01によって与えられる半減期よりも短い半減期が好ましいこともある）、ADX_7016_A01のＣＤおよび／またはＦＧループは、突然変異を誘発され（一置換または二重置換）、そしてADX_7016_A01よりも低い解離速度定数（ｋｄ）を示すアドネクチンが同定された。これらのアドネクチンは、本明細書中、“ＰＫＥ３”アドネクチンと称される。
【０２３０】
ポリペプチドの低い免疫原性を保持する、ＣＤまたはＦＧループにおける単一のアミノ酸置換（ADX_7016_A01のＣＤまたはＦＧループと比較して）を、ＨＳＡに対する種々の異なる範囲の親和性（低いｎＭからμＭの範囲で予想されるＫＤ）を有する一連の分子を同定するために産生した。
【０２３１】
相同性モデルを、Molecular Operating Environment（MOE）（Chemical Computing Group Inc., Montreal, QC, Canada）内の標準的な相同性モデリングツールを用いてADX_7016_A01（その親アドネクチンに基づく）について作製した。ＨＳＡと複合体化したADX_7016_A01のモデル化された結合部位は、結合に関与するアドネクチンの２つの領域があることを示した。ＦＧループからの選択残基は、ＨＳＡとの弱い相互作用を形成するが、主な結合残基は、ＣＤループ（“サウスポール”に位置する）中に見出される。DISCOVERY STUDIOのCalculateInteractionEnergyプロトコール（Dassault Systemes BIOVIA、Discovery Studio Modeling Environment、San Diego）を用いて、ＨＳＡに結合したアドネクチンについて相互作用エネルギーを計算した。結合ＨＳＡに最も寄与すると予測される残基の全ては、ＣＤループ内に位置する。明示的な残基相互作用を示す表を、BIOLUMINATEのProtein Interaction Analysisプロトコールを用いて作成した。相互作用エネルギーを相互作用のタイプおよび量と組み合わせることにより、アドネクチンのＣＤおよびＦＧループ内の残基を、突然変異解析のためにランク付けした。
【０２３２】
結合部位分析の結果に基づいて、突然変異誘発のために位置を選択した。これらのアミノ酸は、小さくかつ極性であり、そして突然変異解析で使用されたとき、ＨＳＡ中のアミノ酸との表面接触を減少させると予測されるものが選択された。該位置のそれぞれが置換され、ＨＳＡに結合したアドネクチンについて相互作用エネルギーが計算される、計算化学的ミューテーション研究（Computational mutation study）を行った。計算された相互作用がアドネクチン−ＨＳＡ親和性の減少を予測する特定の位置を同定した。変異体はまた、Ｔ細胞エピトープの予測されるリスクを増加させないように設計された。変異体は、Ｔ細胞エピトープの予測されたリスクを増加させず、可能な限り低い免疫原性スコア（iDABスコア）を有することに基づいて選択された。
【０２３３】
iDAB免疫原性スコアは、IEDB（Vita et al., Nucleic Acids Res 2015;43(Database issue）:D405-12に記載されている）に基づき、そして世界の総人口において一般に見いだされる８つのアレルのうちの少なくとも４つに対して高い結合親和性を示すと予測されるタンパク質配列中の１５マー（mer）の割合に比例する。スコアは、強力に結合する１５マーの割合を実験的結合親和性に対して線形回帰フィットすることにより得られる。結合部位分析において同定された位置について、低い免疫原性スコアを有すると予測された単一変異体を同定し、二重変異体に組み合わせた。
【０２３４】
得られた単一および二重変異体を表１から３にまとめる（列挙した置換は、配列番号２３に記載のコア7016_A01配列中の位置に関連する）。
【０２３５】
【表１】
2018532725.tif 000010
【０２３６】
表２に示すように、ADX_7016_A01のＣＤループに対して、ＣＤループにおける二重アミノ酸置換（すなわち、ＣＤ／ＣＤ変異）を作製した。
【０２３７】
【表２】
2018532725.tif 000011
【０２３８】
表３に示すように、ADX_7016_A01のＣＤおよびＦＧループに対して、ＣＤおよびＦＧループにおける二重アミノ酸置換（すなわち、ＣＤ／ＦＧ変異）を作製した。
【０２３９】
【表３】
2018532725.tif 000012
【０２４０】
変異体は、好ましい生物物理学的特性を示し、２つの変異体のみがＳＥＣ２であった。残りの変異体はＳＥＣ１であった。また、すべての変異体が１ｍｇ／ｍＬ以上で高度に発現した。
【０２４１】
実施例２：速い解離速度のヒト血清アルブミン結合アドネクチンのスクリーニング
野生型親アドネクチン（すなわち、ADX_7016_A01）よりも早い解離速度を有するアドネクチンを同定するために、変異体ＨＳＡ結合アドネクチンを、ＨＳＡに対する結合親和性についてスクリーニングした。
【０２４２】
実施例１で作製した変異体アドネクチンのスクリーニングにより、４クラスのアドネクチンを同定した：親アドネクチンと同様の親和性で結合するもの、高い結合親和性を有するもの（１００％結合に達するもの）、中程度の結合親和性を有するもの（親アドネクチンと比較して＜１００％の結合のもの）、および低い結合親和性を有するもの（親アドネクチンと比較して＜５０％の結合のもの）。
【０２４３】
測定はＳＰＲおよびＥＬＩＳＡによって行った。ＳＰＲは、以下のように行った。完全長のＨＳＡまたはマウスアルブミンを、標準ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングを用いて、１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１５μｇ／ｍＬで、Biacore T シリーズ CM5 チップ上に、約１０００−１１００ ＲＵの表面密度で固定化した。２５℃での解離速度測定のために、ＰＫＥアドネクチンを、ＨＢＳ−Ｐ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｐ２０）泳動バッファー中５００ｎＭ濃度で、固定化されたアルブミンに対して２０μｌ／分の流速で１２０秒間適用し、次いで解離のために８００秒間適用した。３７℃で実施された速度論的親和性測定のために、ＰＫＥアドネクチンの濃度シリーズ（０．０５−３３３ｎＭ）を、ＨＢＳ−Ｐ＋泳動バッファー中、４０ｕｌ／分の流速で１８０秒間適用し、次いで２４０秒または６００秒で解離させた。サイクル間のチップ表面の再生は、１０ｍＭ グリシン、ｐＨ２．０の３０秒間の２回のパルス刺激で達成した。対照を差し引いたセンサーグラム（reference-subtracted sensogram）の反応速度曲線を、Biaevaluationソフトウェアを用いて親和性についての１：１結合モデルに適合させた。解離相のみが解離速度の決定に適合した。
【０２４４】
直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。完全長ヒトおよびマウス血清アルブミン（ＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍｌ）を、Nunc Maxisorpプレート上に一晩、４℃にてコーティングした。プレートをカゼイン／ＰＢＳ緩衝液でブロッキングした。ＰＫＥアドネクチンは、ＨＳＡについては０．０３２−４ｕＭ、ＭＳＡについては０．００８−１ｕＭの４点濃度範囲に亘って結合した。結合したアドネクチンを、カゼイン／ＰＢＳ中１：１５００希釈したＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）と複合体化した抗Ｈｉｓ抗体によって検出した。プレートをＴＭＢ基質で処理して、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。アドネクチンは、濃度応答曲線の観察されたＹｍａｘに基づき、high（高）、medium（中）およびlow（低）親和性結合体として分類された（binned）。
【０２４５】
ＨＳＡおよびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）への結合の両方についてのＳＰＲ分析およびＥＬＩＳＡデータを含む、変異体アドネクチンのサブセットの結果を、表４に提供する。
【０２４６】
【表４】
2018532725.tif 000013
【表５】
2018532725.tif 000014
【０２４７】
図１および２に示す通り、ＨＳＡの解離速度センサーグラム（ＳＰＲ分析により得られた）は、DB ELISAの分類（binning）と相関していた。
【０２４８】
さらなる解析のために、さらに１５個の変異体ＨＳＡ結合アドネクチンを選択した。ＨＳＡおよびＭＳＡ結合データを含む、これらの変異体のＳＰＲおよびＥＬＩＳＡデータのまとめを、表５に提供し、これらの変異体の解離速度センサーグラムを図３に示す。
【０２４９】
【表６】
2018532725.tif 000015
【０２５０】
まとめると、データは、4pt DB HSA／MSA ELISAデータが解離速度スクリーニングと良好に相関すること、すなわち、より遅い解離速度を有するＨＳＡ結合アドネクチンが、ＥＬＩＳＡにおいてより良好な結合剤であることを示している（例外あり）。
【０２５１】
実施例３：速い解離速度のＰＫＥ３変異体の血清アルブミンに対する結合親和性
ＳＰＲ解析を用いて、ＨＳＡ、ＭＳＡ、ラット血清アルブミン（rat SA）およびカニクイザル血清アルブミン（cynoSA）に対する結合親和性について、３つの変異体ＨＳＡ結合アドネクチンを試験した。
【０２５２】
ＳＰＲを以下のように行った。完全長ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザル血清アルブミンを、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリングを用いて、１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１５μｇ／ｍＬで、Biacore T シリーズ CM5 チップ上に、約１０００−１１００ ＲＵの表面密度で固定化した。２５℃での解離速度測定のために、ＰＫＥアドネクチンを、ＨＢＳ−Ｐ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｐ２０）泳動バッファー中５００ｎＭ濃度で、固定化されたアルブミンに対して２０μｌ／分の流速で１２０秒間適用し、次いで解離のために８００秒間適用した。３７℃で実施された速度論的親和性測定のために、ＰＫＥアドネクチンの濃度シリーズ（０．０５−３３３ｎＭ）を、ＨＢＳ−Ｐ＋泳動バッファー中、４０ｕｌ／分の流速で１８０秒間適用し、次いで２４０秒または６００秒で解離させた。サイクル間のチップ表面の再生は、１０ｍＭ グリシン、ｐＨ２．０の３０秒間の２回のパルス刺激で達成した。対照を差し引いたセンサーグラム（reference-subtracted sensogram）の反応速度曲線を、Biaevaluationソフトウェアを用いて親和性についての１：１結合モデルに適合させた。解離相のみが解離速度の決定に適合した。
【０２５３】
結果を表６にまとめ、センサーグラムを図４Ａ−４Ｄに示す。
【０２５４】
【表７】
2018532725.tif 000016
【０２５５】
実施例４：速い解離速度のＰＫＥ３アドネクチンは、野生型親ＰＫＥ２アドネクチンよりも迅速な排出を示す
実施例３からの３つのＰＫＥ３アドネクチンの排出速度を、Sprague Dawleyラット（ｎ＝２／群）においてインビボで試験した。ラットに、各ＰＫＥ３アドネクチン（２ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ用量を投与し、そして５分、１時間、２時間、４時間、８時間、１日、２日、３日、５日および７日の時点で血漿を採取した。
【０２５６】
図５に示す通り、親ＰＫＥ２アドネクチン（ADX_7016_A01）は、最も遅い半減期を示したが、一方で、３つのＰＫＥ３アドネクチンは、より短い半減期を示した。同様の結果がマウスで観察された（図６）。
【０２５７】
【表８】
2018532725.tif 000017
【表９】
2018532725.tif 000018
【表１０】
2018532725.tif 000019
【表１１】
2018532725.tif 000020
【表１２】
2018532725.tif 000021
【表１３】
2018532725.tif 000022
【表１４】
2018532725.tif 000023
【表１５】
2018532725.tif 000024
【表１６】
2018532725.tif 000025
【０２５８】
均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、または常套の実験を用いて確認することができる。そのような均等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2018532725.tif 000026
【図２】
2018532725.tif 000027
【図３Ａ】
2018532725.tif 000028
【図３Ｂ】
2018532725.tif 000029
【図３Ｃ】
2018532725.tif 000030
【図３Ｄ】
2018532725.tif 000031
【図４Ａ】
2018532725.tif 000032
【図４Ｂ】
2018532725.tif 000033
【図４Ｃ】
2018532725.tif 000034
【図４Ｄ】
2018532725.tif 000035
【図５】
2018532725.tif 000036
【図６】
2018532725.tif 000037
【配列表】
2018532725000001.app
【国際調査報告】
2018532725.tif 000038
2018532725.tif 000039
2018532725.tif 000040