(57)【要約】  ハリスコ州産のアガベ・テキラーナ・ウェーバーおよびオアハカ州産のアガベ・アングスティフォリア・ハウと、飲料の濃縮によって影響されないプレバイオティクス特性を持つアガベシロップとの混合によって生じる単一のフルクタンの濃縮方法である。本発明の濃縮方法は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ方法を用いて飲料に加えられた同量が分析によって示される程度には、重合度に影響を与えないことを示す。濃縮方法はまた、生体外およびマウスの生体内において、４つのビフィズス菌株および４つの乳酸菌株に含まれるプレバイオティクスの利点を繰り返し検証したものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユニークな特徴を有するプレバイオティクス飲料を濃縮するユニークな方法及び工程。
【請求項２】
低重合度フルクタン（ＤＰ３〜ＤＰ１０のフルクタン）および高重合度フルクタン（ＤＰ＞１０のフルクタン）の複雑なプロファイルを有する、（酵素的方法によって）可溶性炭水化物を３２８〜３４７ｍｇ／ｇの高い割合で含有し、またＴＬＣ方法を用いたネオケストース（三糖類ベースのネオシリーズタイプフルクタン）が存在する、ユニークなフルクタン（アガベ・アングスティフォリア・ハウおよびアガベ・テキラーナ・ウェーバーとアガベシロップとの混合物）。
【請求項３】
プレバイオティクス飲料に含まれる固有のプレバイオティクス性能が損なわれず、プレバイオティクス効果が消費者にまで及ぶように、混合物（フルクタン）の重合度を保持する方法。
【請求項４】
生体外すなわちビフィズス菌４株、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ１５７０３）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ（２７５３６）、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ（ＡＴＣＣ２９５２１）、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ２５９６２）、および乳酸菌４株、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ（ＡＴＣＣ４３５６）、Ｌ．ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ３９３）、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ２５３０２）、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ５３１０３）において、飲料がプレバイオティクス効果を有することが証明された濃縮方法。
【請求項５】
生体内評価によって、マウスはトリグリセリドおよびコレステロール含有量が少なく、マウスの糞には、残留炭水化物の量が多くＳＣＦＡの発生量が多いことが示された濃縮方法。
【請求項６】
濃縮方法／工程の開発とは別に、飲料の賞味期限の期間、プレバイオティクス性能を維持するために、飲料が有するユニークなｐＨおよび酸性の性質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクス系統および動物系統にプレバイオティクス効果を与える特徴を持つ、プレバイオティクス飲料に含まれるアガベ・テキラーナ・ウェーバーおよびオアハカ州産アガベ・アングスティフォリア・ハウのフルクタンの、生体内外の方法を用いた濃縮方法および過程に関する。本発明の濃縮方法は、特有のフルクタンを重合度合いの変化から守り、フルクタン生来のプレバイオティクス特性の維持を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
メキシコは、胃腸病によって最も影響を受けているラテンアメリカの国々の一つである。国立統計地理情報院（ＩＮＥＧＩ）は、毎年５００万人もの人々が胃腸の伝染病を患い、メキシコでの年間死亡者数の５％がこの伝染病で亡くなっていると推定する。（１）
【０００３】
さらに、人口の６４％以上が、胃炎、大腸炎、食道逆流炎、過敏性大腸炎などの消化器官の問題に悩まされている。（１）この事実に加え、小腸内の乳糖酵素（ラクターゼ酵素）の不足により、乳糖（ラクトース）を消化するための腸が機能しなくなることで起こる乳糖不耐症は世界中の重要な健康問題である。こうした状況は、どの年齢層においても生活の質に影響を与える。（２）メキシコでは、年齢層または性別に関わり無く、地域ごとに中央部では３０％、南東部では２２％、そして北部では９％の罹患率である。（３）
【０００４】
免疫システムは、人体のシステムに影響を及ぼすような異生物から身体を守っている。消化管は、免疫システム細胞の約７０％が腸内に存在するため、直接的にリンクしている。腸は善玉菌（プロバイオティクス）と悪玉菌を識別する能力を有する。善玉菌は酵母や寄生虫の過度な成長を防ぎ、微生物相は免疫システムの細胞の機能改善を促進するために、強力でなくてはならない。（４）
【０００５】
中でも、個人の生活スタイルは重要な要因であり、特定の病気の増加につながる。炭水化物は全ての生物に必要不可欠であり、最も豊富な種類の生体分子である。自然界にあるほとんどの炭水化物は多糖類で、酸あるいは酵素により加水分解されるとき、単糖類または誘導体を生じさせる。多糖類はその生体機能により、２つの主要なグループである構造グループと貯蔵グループに区別される。植物由来の貯蔵多糖類にはでんぷんとフルクタンがある。（５）炭水化物は構造上の結合のタイプによって、消化性または非消化性に分類される。フルクタンは「非消化性」に分類されるため、フルクトースモノマーでのアノマーＣ２の構造により、ヒトの消化酵素（ｂ−グルコシダーゼ、マルターゼ−イソマルターゼ、スクロース等）による加水分解に対して抵抗力がある。（６）
【０００６】
プレバイオティクスのようなタイプｂ（２−１）フルクタンの役割に関する、強力な科学的証拠がある。プレバイオティクスは、結腸内の限られた数のバクテリアの選択的成長および／または代謝活動を刺激することによってホスト（宿主）に有益効果を生み出す非消化性食品成分のことである。プレバイオティクス特性があるとされるフルクタンの重要な性質により、フルクタンは、腐敗菌を犠牲にして、ビフィズス菌または乳酸菌の成長を選択的に刺激することが可能である。さらに、上記フルクタンの発酵は、大腸の通常機能に寄与する短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）や乳酸に分類される酢酸塩、プロピオン酸および酪酸を生じさせる。（７）
【０００７】
イヌリンは５つのフルクタングループの１つであり、アーティチョークやアスパラガスのような食品に多く含まれており、結腸内の微生物相によって発酵し、可溶性繊維として働く。（７）また、イヌリンが、低水準にあるバクテロイデス、クロストリジウムあるいは大腸菌群を犠牲にして、ビフィズス菌の成長を選択的に促進することは非常に興味深い。（７）
【０００８】
これらプレバイオティクスの細菌発酵により、結腸内に少量の酪酸を含むＳＣＦＡが生じ、結腸内でアポトーシスが増加する。（７）
【０００９】
最近のアガベのフルクタンに関する研究では、リュウゼツラン科に含まれる高水準のプレバイオティクスについて言及している。（８）
【００１０】
民族または風土資源の使用について、メキシコ中で非常に大きな関心があるが、近年テキーラ，メスカル，バカノラおよびソトルなどの酒類を生産するために使用されない、異なるアガペ種の大部分を一体的に使用することについて、その関心が増している。
【００１１】
しかし、現在は多くの農場労働者が、上記酒類の生産に使用される原産地名称によって保護された種を含む、アガベの栽培を増やしている。このことは近年、メキシコに見られる全種、主にオアハカ州産のアガペ・アングスティフォリア・ハウおよびハリスコ州産アガペ・テキラーナ・ウェーバーの上記栽培に関して、他の用途を見出だす必要性について懸念を生じさせている。
【００１２】
オアハカ州産のアガペ・アングスティフォリア・ハウのフルクタンと同州産のアガペシロップの飲料の濃縮は、技術的側面だけでなく経済的および社会的にも、その作物の農場労働者や商人にとって非常に大きな可能性がある。それによりさらに、当該地域のアガベフルクタンが正確に、広く認識され、また、当該企業だけでなくアガベ栽培者やメキシコ全体にとって技術的影響力を持つだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＢ１からＢ５の分析のためのサンプルである。
【図２】図２はサンプルＢ１からＢ５に含まれる炭水化物とフルクタンのクロマトグラフプロファイルである。（矢印は異なる重合度合いを示す。）
【図３】図３は混合物と濃縮されたプレバイオティクス飲料に含まれるフルクタン識別のための薄層クロマトグラフィである。
【図４】図４はプレバイオティクス飲料に含まれるフルクトース、グルコース、スクロース、ケストース、重合度（ＤＰ）＝５および全ての炭水化物の水準を示す。
【図５】図５はプレバイオティクス飲料のプロバイオティクスの成長プレートを示す。
【図６】図６は飼育器でプレバイオティクス飲料を投与されたマウスが入ったケージである。
【図７】図７は３つのグループのマウスの異なる食物摂取による違いを示す。（標準管理、ＲＮＥチコリー  イヌリン、ＢＥＢ飲料）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
天然成分に基づく機能製品の消費を通して健康的な生活スタイルを促進するために、２０１２年から２０１４年にかけて、ハリスコ州産アガベ・テキラーナ・ウェーバーおよび／またはオアハカ州産アガベ・アングスティフォリア・ハウ由来のフルクタンと、アガベシロップとの混合物から成るプレバイオティクス飲料の濃縮方法は進化してきた。この濃縮は生体内外で評価されたプレバイオティクス効果を達成する。
【００１５】
第一に、フルクタンとアガベシロップの理想的な混合が行われ、５つの異なる混合物が分析された。これらは室温で貯蔵され、貯蔵期間を通してその外観と濃度が分析された。サンプルは７０日間の貯蔵の間、その外観と濃度に変化は見られなかった。分析された混合物（図１）は、サンプル（糖度７３．４８から７３．８０）に類似した可溶性固形物を含んでいた。サンプル混合物はｐＨ値５．２という均質性を有しており、すなわち弱酸性ｐＨレベルであった。サンプルの色は、グリセリンを基準として、アガペシロップのバイオラドベンチマーク／プラスマイクロプレート分光光度計（９）で５６０ｎｍでの吸光度により測定された。
【００１６】
理想的な混合を決めるために、以下のものが分析された。
１）酵素的方法による、イヌリン（５サンプル）、蜂蜜（５サンプル）および混合物のうち一つのサンプル内の可溶性炭水化物の含有量。これはその混合が、飲料を濃縮するための成分として最良の選択であることを保証するためである。混合サンプルはフルクタンの含有量が３２８〜３４７ｍｇ／ｇの範囲であった。
２）ＴＬＣによる炭水化物プロファイル。溶液は５０ｍｇ／ｍＬの濃度で調整され、それぞれの溶液１マイクロリットル（μＬ）は薄層クロマトグラフィによって、オリゴ糖標準（ＭＯＳおよびＦＯＳ）に基づいて分析された。使用された染色によって、グルコースおよびフルクトース誘導体を色の斑点（それぞれ青および赤）に基づいて区別することができる。サンプルは低重合度フルクタン（重合度３〜１０のフルクタン）および高重合度フルクタン（重合度１０を超えるフルクタン）を示し、さらに小さい青斑点が、ネオケストースに相当するマルトースの下方に確認された（三糖類ベースのネオシリーズタイプフルクタン）。ＴＬＣプレートの基準線にある多くの斑点は、フルクタンに相当する（重合度１０を超えるポリマー）ため、分析されたサンプルが広範囲な重合度のフルクタンを含んでいることが推定される（図２）。
【００１７】
理想的な混合が決定すると、プレバイオティクス効果を測定するために生体内外で評価されたプレバイオティクス飲料向け濃縮方法が開発された。
【００１８】
濃縮は、正確な量および制御温度で混合物を追加する方法によって行われた。この方法は混合物とそのフルクタンの重合度合いの管理に基づいている。これは、その構造を損なうことがなく、プレバイオティクスの利点を維持することができる。
【００１９】
樹脂、活性炭素および軟化フィルタの濾過過程を通過した水は、最大３０ｐｐｍの炭酸カルシウムを含み、それぞれ１１：１の割合で４５℃にて混合物と混合された。このことにより、混合フルクタンが非常に大きい水性基剤において可溶性および分散型になることが可能となり、さらに６０℃での３０分間の低温殺菌に対して抵抗力を持つことが可能となったため、その構造は損なわれず、プレバイオティクスの利点が保持された。低温殺菌はガスおよび抵抗で熱せられた釜で行われた。混合物は６０ｒｐｍ以下でプロペラ攪拌機を用いて絶えずかき混ぜられた。フルクタンは急激な温度変化を受けるとその構造が変化してしまうため、その後混合物はいかなる熱交換器を用いることなく攪拌された。濃縮された混合物が汚染されないよう、処理条件に細心の注意を払うことが必要であった（釜は２８℃以下の涼しい場所に隔離された）。
【００２０】
開発された濃縮方法が理想的なものであるか測定するために、濃縮されたプレバイオティクス飲料に含まれるフルクタンの存在とそのプロファイルを測定するＴＬＣ分析が行われた。フルクタンの含有率は非常に高く、当該飲料は希釈することができた。１０を超える重合度を持つフルクタンの存在が確認された（図３）。フルクタンの量は酵素技術によって測定され、当該飲料は３．７〜４％のフルクタンを含んでいた。これは、４％のフルクタンが当該飲料に追加されたため、濃縮方法が成功したことを証明している。この値を修正するために、炭水化物の測定が液体クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により個別に行われ、３．９％のフルクタン値が示された（図４）。
【００２１】
プレバイオティクス飲料の混合物の濃縮方法の科学的評価および効力を達成するため、異なるプレバイオティクス株を用いた生体外での研究、および実験用マウスを用いた生体内での研究によって、検証が行われた。
【００２２】
生体外でのイヌリンの評価において、フルクタン検出のための電流滴定検出器に結合された薄層クロマトグラフィおよび高性能陰イオン交換クロマトグラフィによる研究が行われた。同様に、飲料に含まれる全ての可溶性固形物が糖度値で測定された。最終的にフルクタンの含有量は酵素方法によって数量化された。
【００２３】
ＭＲＳ培地として知られる、Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ培地を用いたプロバイオティクスバクテリア研究によって、プレバイオティクス飲料の可能性が生体外の評価によって測定された。（図５）研究に使用されたプロバイオティクスバクテリアは、ビフィズス菌（６株）および乳酸菌（４株）タイプである。ビフィズス菌６株はＢ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ１５７０３）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ（２７５３６）、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ（ＡＴＣＣ２９５２１）、Ｂ．ｂｒｅｖｅ（ＡＴＣＣ１５７００）、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ（１５７０７）、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ２５９６２）であり、乳酸菌４株は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ（ＡＴＣＣ４３５６）、Ｌ．ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ３９３）、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ２５３０２）、およびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ５３１０３）である。
【００２４】
飲料濃縮方法のプレバイオティクス効果が存在すると結論づけられた。以下において成長が確認された。
１）ビフィズス菌４株、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ１５７０３）、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ（２７５３６）、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ（ＡＴＣＣ２９５２１）、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＡＴＣＣ２５９６２）
２）乳酸菌４株、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ（ＡＴＣＣ４３５６）、Ｌ．ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ３９３）、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ２５３０２）、およびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ５３１０３）
【００２５】
ビフィズス菌ｌｏｎｇｕｍおよびビフィズス菌ｂｒｅｖｅはどのような方法でも、何度行われても成長が見られなかった。
【００２６】
生体内研究は、メキシコ、サカテカス州の飼育器のＣ５７ＢＬ／６Ｊ血統の１２週齢のマウス１８匹を用いて行われた。マウスは、制御された温度および湿度の下で、１２時間毎の明／暗のサイクルで、実験の最初に使用された。（図６）食物摂取量、水分消費量、マウスの体重、糞の量（残留炭水化物）は毎週測定され、またグルコースを測定するために、血液サンプルがマウスの尾から採取された。５週間後、マウスは安楽死させられ、ｐＨおよびＳＣＦＡを測定するために大腸および結腸の内容物が採取された。さらに、トリグリセリド（ＴＧＡ）およびコレステロールを測定するために門脈から血液が採取された。
【００２７】
結果が以下の通りであった。
１）プレバイオティクス飲料を摂取したマウスは（当該飲料に含まれる繊維およびその満腹感により）小食であった。（図７）
２）プレバイオティクス飲料を摂取したマウスは、他の２つのグループよりもトリグリセリドおよびコレステロールの量が少なかったが、その差は大きくはない。
３）ＢＥＢ飲料を摂取したマウスの糞は、他の２つのグループよりも残留炭水化物の量が多く、ＳＣＦＡの発生量が多かった。
４）プレバイオティクス飲料は、マウスの消化システムにプレバイオティクス効果をもたらす。
【００２８】
最後に、プレバイオティクス飲料の試作品生産工場において、当該飲料の濃縮方法の実験的な設計試験、ならびに理想的な混合物の開発が行われた。単一フルクタンを有する飲料の技術的濃縮方法を有利にする技術プロジェクトの実施期間は２４ヶ月間であり、それはプレバイオティクス飲料を消費する者に、固有の利益をもたらした。
【００２９】
製品の賞味期限の間、含有されるフルクタンの賞味期限を維持するために、当該飲料がｐＨおよび酸性の特有の性質を有することに言及することが重要である。
【００３０】
（書誌参照）
１．ＩＮＥＧＩ．１９９６
２．Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｈｏｗ  ｉｓ  Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ？  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｉｎｇｈｏｕｓｅ  （ＮＤＤＩＣ）．  Ｄiｓｐｏｎｉｂｌｅ  ｅｎ：ｗｗｗ．ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
３．Ｌｏｐｅｚ  Ｐ．  ｙ  ｃｏｌｓ．  Ｌａｃｔｏｓｅ  ｍａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｘｉｃｏ  ａｎｄ  ｉｔ’ｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｌｋ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．  Ｒｅｖ．  ｉｎｖｅｓｔ．  Ｃｌｉｎ：４８（Ｓｕｐｌ）：１５−２２，  ｎｏ．１９９６  
４．Ｔｈｅ  Ｂｌｏｋｅｈｅａｄ，Ｓｕｐｅｒ  Ｉｎｍｕｎｉｄａｄ  ｙ  Ｓｕｐｅｒ  Ａｌｉｍｅｎｔｏｓ．  Ｃａｐｉｔｕｌｏ  ３：Ｃｅｎｔｒｏｓ  Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇｉｃｏｓ  ｄｅｌ  Ｃｕｅｒｐｏ．２０１５．Ｂａｂｅｌｃｕｂｅ  Ｉｎｃ．
５．Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｊ．１９９５．Ｃａｒｂｏｈｉｄｒａｔｏｓ：ｅｓｔｒｕｃｔｕｒａ，ｃｏｎｆｉｇｕｒａｃｉｏｎ  ｙ  ｐｒｏｐｉｅｄａｄｅｓ．Ｅｎ：  Ｂｉｏｑｕｉｍｉｃａ．  Ｍｃ  Ｇｒａｗ  Ｈｉｌｌ．１４２−１６１
６．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ,  Ｍ．Ｂ．２０００．Ｃｈｉｃｏｒｙ  ｆｒｕｃｔｏｏｌiｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｎｕｔｒ．１６：６７７−６７９．
７．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．  ｙ  Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，Ｍ．Ｒ．１９９５．Ｄｉｅｔａｒｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：１４０１−１４１２．
８．Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｍａｎｃｈｉｌｌａ−Ｍａｒｇａｌｌｌｉ，Ｎ．Ａ．  ｙ  Ｍｅｎｄｏｚａ−Ｄｉａｚ，Ｇ．２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｒｕｃｔａｎｓ  ｆｒｏｍ  Ａｇａｖｅ  ｔｅｑｕｉｌａｎａ  Ｗｅｂｅｒ  ｖａｒ．  Ａｚｕｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５１：７８３５−７８４０．
９．ＵＳＡ  ａ  ｌａ  Ｎｏｒｍａ  Ｍｅｘｉｃａｎａ  ＮＭＸ−ＦＦ−１１０−ＳＣＦＩ−２００８．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
2018523634.tif 000010
2018523634.tif 000011
2018523634.tif 000012
2018523634.tif 000013