(57)【要約】パーキンソン病を診断するか、またはパーキンソン病を発生させるリスクを同定するための方法が開示され、上記方法は、血液サンプル、肝臓サンプル、もしくは肝細胞中の生体分子の量を測定する工程を包含する。パーキンソン病を防止もしくは処置するための方法もまた開示され、上記方法は、治療上有効な複数の肝細胞を、その必要性のある被験体に投与する工程を包含する。いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を処置するための治療剤を同定するための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病を診断するための方法であって、該方法は、
被験体から採取した血液サンプル、該被験体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞を提供する工程であって、ここで該肝細胞は、該被験体から採取した非肝細胞の細胞から生成され、次いで、該肝細胞へと分化される、工程；
該血液サンプル、該肝臓サンプル、もしくは該肝細胞中の生体分子の量を測定する工程；ならびに
該生体分子の測定された量が、パーキンソン病と診断された個体から採取した血液サンプル、該個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量に匹敵する場合に、該被験体を、パーキンソン病を有すると診断する工程であって、ここで該肝細胞は、該個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、該肝細胞へと分化される、工程；
を包含し、ここで該生体分子は、タンパク質もしくはＲＮＡである、方法。
【請求項２】
パーキンソン病を発生させるリスクを同定するための方法であって、該方法は、
被験体から採取した血液サンプル、該被験体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞を提供する工程であって、ここで該肝細胞は、該被験体から採取した非肝細胞の細胞から生成され、次いで、該肝細胞へと分化される、工程；
該血液サンプル、該肝臓サンプル、もしくは該肝細胞中の生体分子の量を測定する工程；および
該生体分子の測定された量が、パーキンソン病と診断された個体から採取した血液サンプル、該個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量に匹敵する場合、パーキンソン病を発生させるリスクにあると該被験体を同定する工程であって、ここで該肝細胞は、該個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、該肝細胞へと分化される、工程；
を包含し、ここで該生体分子は、タンパク質もしくはＲＮＡである、方法。
【請求項３】
肝細胞が、提供され；該肝細胞を前記細胞から生成する工程は、多能性幹細胞を該細胞から生成する工程；および該多能性幹細胞を肝細胞へと分化させ、それによって、該肝細胞を生成する工程を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、末梢血単核細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、線維芽細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、前記被験体から直接得られていない、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
血液サンプルが提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
肝臓サンプルが提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体分子は、アルブミンもしくはアルブミンをコードするＲＮＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体分子は、アンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４、またはアンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４をコードするＲＮＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体分子は、シトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、システインジオキシゲナーゼ、またはシトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、もしくはシステインジオキシゲナーゼをコードするＲＮＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体分子は、ＲＮＡであり、該生体分子の量は、ＰＣＲを使用して測定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子は、ＲＮＡであり、該生体分子の量は、マイクロアレイ分析もしくは配列決定を使用して測定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体分子は、タンパク質であり、該生体分子の量は、フローサイトメトリー、磁性活性化セルソーティング、もしくはイムノアッセイを使用して測定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
パーキンソン病を処置するための治療剤を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）第１の肝細胞と化合物もしくは組成物とを接触させる工程；
（ｂ）該第１の肝細胞によって生成される生体分子の量を測定する工程；
（ｃ）該第１の肝細胞によって生成される該生体分子の量と、コントロール肝細胞によって生成される該生体分子の量とを比較する工程であって、ここで該コントロール肝細胞は、該第１の肝細胞と同じ供給源に由来するが、該化合物もしくは組成物と接触されていない工程；および
（ｄ）該第１の肝細胞によって生成される該生体分子の量が、該コントロール肝細胞によって生成される該生体分子の量とは異なる場合、該化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程；
を包含し、
ここで該第１の肝細胞は、パーキンソン病と一致する遺伝子型もしくは表現型を有し；該生体分子は、タンパク質もしくはＲＮＡであり；該第１の肝細胞によって生成される該生体分子の量は、パーキンソン病の非存在と一致する遺伝子型もしくは表現型を有するコントロール肝細胞によって生成される該生体分子の量へのシフトを反映する、方法。
【請求項１７】
前記第１の肝細胞は、多能性幹細胞に由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記肝細胞は、化合物と接触され、該化合物は、低分子である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記肝細胞は、組成物と接触され、該組成物は、生物製剤を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物製剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体分子は、アルブミンもしくはアルブミンをコードするＲＮＡである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体分子は、アンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４、またはアンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４をコードするＲＮＡである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体分子は、シトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、もしくはシステインジオキシゲナーゼ、またはシトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、もしくはシステインジオキシゲナーゼをコードするＲＮＡである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の肝細胞は、ヒト肝細胞である、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
パーキンソン病を防止もしくは処置するための方法であって、該方法は、治療上有効な複数の肝細胞をその必要性のある被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記肝細胞は、パーキンソン表現型を含まない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝細胞は、パーキンソン病と一致する表現型を有する肝細胞より多いアルブミンを生成する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記肝細胞は、パーキンソン病と一致する表現型を有する肝細胞より多くのアンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４を生成する、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記肝細胞は、パーキンソン病と一致する表現型を有する肝細胞より多いシトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、もしくはシステインジオキシゲナーゼを生成する、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記肝細胞は、前記被験体から採取した細胞に由来する、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記肝細胞のゲノムは、編集されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記肝細胞のゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼによって編集されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記肝細胞は、前記被験体から採取した細胞に由来しない、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記肝細胞は、多能性幹細胞に由来する、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記多能性幹細胞は、末梢血単核細胞もしくは線維芽細胞に由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝細胞は、前記被験体の肝臓へと挿入することによって投与される、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記肝細胞は、肝門脈に挿入される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体は、哺乳動物である、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体は、ヒトである、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１５年１０月５日に出願した米国仮出願第６２／２３７，２４８号（これは、その全体がこれにより参考として援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
パーキンソン病は、高齢集団において発生が増加する運動障害である。それは、高齢者の一般的な身体障害性疾患であり、米国において６０歳を超える人口のうちの約１％に影響を及ぼす。パーキンソン病の発生率は、年齢とともに増加し、この疾患を発生させる個体の累積生涯リスクは、４０人に約１人である。症状としては、四肢の顕著な振戦、動作緩慢、強直および姿勢変化が挙げられる。パーキンソン病の仮定される病態生理的原因は、黒質緻密部（脳幹に位置した基底核）を含む大脳基底核におけるドパミン生成細胞の進行性の破壊である。
【０００３】
パーキンソン病は、軽度の四肢硬直、および希に起こる振戦で始まり得、１０年もしくはこれより長い年数にわたって頻繁な振戦および記憶障害へと進行し、制御不能な振戦および認知症へと至る進行性の障害である。
である。
【０００４】
この疾患の原因に関する研究は、大部分は、変化遺伝学（altered  genetics）および神経機能の変化の領域にあった。現在は、パーキンソン病に利用可能な臨床検査は存在しないので、この疾患は、臨床症状に基づいて診断される。
【０００５】
パーキンソン病に関する公知の治癒は存在しない。パーキンソン病と診断された患者に処方される利用可能な薬物療法は、それらの症状のうちのいくつかを軽減し得る。いくつかの薬物療法は、ドパミンへの前駆体からなる。その前駆体は、ニューロンによって取り込まれ、ドパミンへと変換されて、脳の中で低下したドパミン量を補う。上記疾患のより後のステージでは、この対症療法は、代表的には、もはや有効ではない。従って、新たな治療薬が強く必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を診断するための方法に関する。いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を発生させるリスクを同定するための方法に関する。ある特定の実施形態において、上記方法は、被験体から採取した血液サンプル、被験体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞を提供する工程を包含し、ここで上記肝細胞は、上記被験体から採取した非肝細胞の細胞から生成され、次いで、上記肝細胞へと分化される。ある特定の実施形態において、上記方法は、上記血液サンプル、上記肝臓サンプル、もしくは上記肝細胞中の生体分子の量を測定する工程を包含する。上記方法は、例えば、上記生体分子の測定された量が、パーキンソン病と診断された個体から採取した血液サンプル、パーキンソン病と診断された個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量と匹敵する場合、パーキンソン病を有すると上記被験体を診断する工程を包含し得、ここで上記肝細胞は、パーキンソン病と診断された個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、上記肝細胞へと分化される。上記方法は、例えば、上記生体分子の測定された量が、パーキンソン病と診断された個体から採取した血液サンプル、パーキンソン病と診断された個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量と匹敵する場合、パーキンソン病を発生させるリスクにあるとして上記被験体を同定する工程を包含し得、ここで上記肝細胞は、パーキンソン病と診断された個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、上記肝細胞へと分化される。上記生体分子は、例えば、タンパク質もしくはＲＮＡ分子であり得る。
【０００７】
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を処置するための治療剤を同定するための方法に関する。上記方法は、第１の肝細胞と化合物もしくは組成物とを接触させる工程、および上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量を測定する工程を包含し得る。上記方法は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量と、コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量とを比較する工程を包含し得る。上記方法は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量が、上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量とは異なる場合、上記化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程を包含し得る。例えば、上記第１の肝細胞およびコントロール肝細胞は、パーキンソン病と一致する遺伝子型および／もしくは表現型を有し得、そして化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量と上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量との間の差異を同定する工程を包含し得、ここで上記第１の肝細胞は、健康な肝細胞によって生成される量に類似でありかつ上記コントロール肝細胞によって生成される量とは異なる生体分子の量を生成する。上記化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量において、上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量から離れるシフトを同定する工程を包含し得る。すなわちここで上記シフトは、健康な肝細胞が生成する上記生体分子の量の近くへのシフトである。上記生体分子は、例えば、タンパク質もしくはＲＮＡであり得る。
【０００８】
同様に、上記第１の肝細胞は、パーキンソン病と一致する遺伝子型および／もしくは表現型を有し得、上記コントロール肝細胞は、非パーキンソン病の遺伝子型および／もしくは表現型を有し得、化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量の減少を同定する工程を包含し得る。従って、上記化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量において上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量へのシフトを同定する工程を包含し得る。すなわちここで上記シフトは、上記第１の肝細胞と上記化合物もしくは組成物とを接触させる前の上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量から離れる。上記生体分子は、例えば、タンパク質もしくはＲＮＡであり得る。
【０００９】
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を防止もしくは処置するための方法に関し、上記方法は、治療上有効な複数の肝細胞をその必要性のある被験体に投与する工程を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、コントロールのヒトサンプル（１０９８）およびパーキンソン患者のサンプル（６１１）から分化した肝細胞における特徴的な肝マーカーの遺伝子発現分析を示す。特異的肝マーカー（アンチトリプシン、ＨＮＦ４およびＡＳＧＲ）ｍＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。各マーカーをＧＡＰＤＨに対して正規化し、相対的変化を、親ヒトＩＰＳ細胞株と比較して表した。多能性遺伝子であるＯｃｔ４およびＳｏｘ２は、有意にダウンレギュレートされた。
【図２】図２は、コントロールヒトサンプル（１０９８）およびパーキンソン患者のサンプル（６１１）に由来するヒトＩＰＳＣ由来肝細胞によるアルブミン分泌を示す。アルブミン分泌は、肝細胞の十分に確立された機能的尺度である。馴化培地を２４時間後に集め、アルブミンレベルを、アルブミンＥＬＩＳＡによって培養培地において測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
本発明の局面は、ある特定のパーキンソン病患者に由来する肝細胞が、健康な個体とは異なり、従って、肝細胞機能不全が、パーキンソン病の発症および進行においてある役割を果たし得るという所見に関する。具体的には、パーキンソン病患者は、適切な機能を欠いておりかつ同定するマーカーの異常なレベルを発現する肝細胞を有する。例えば、パーキンソン病の肝細胞は、健康な個体に由来する肝細胞より低いレベルのアルブミンを発現し、成熟肝細胞と関連する他の遺伝子（例えば、トリプシン、肝細胞核因子４（ＨＮＦ４）、およびアシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＲ））は、健康なコントロールに由来する肝細胞よりパーキンソン病患者に由来する肝細胞において低下したレベルで発現される。
【００１２】
Ｉ．パーキンソン病の診断に関する方法
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を診断するための方法に関する。いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を発生させるリスクを同定するための方法に関する。ある特定の実施形態において、上記方法は、被験体から採取した血液サンプル、被験体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞を提供する工程を包含し、ここで上記肝細胞は、上記被験体から採取した非肝細胞の細胞から生成され、次いで、上記肝細胞へと分化される。ある特定の実施形態において、上記方法は、上記血液サンプル、上記肝臓サンプル、もしくは上記肝細胞中の生体分子の量を測定する工程を包含する。上記方法は、例えば、上記生体分子の測定された量が、パーキンソン病と診断された個体から採取した血液サンプル、上記個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量に匹敵する場合、上記被験体を、パーキンソン病を有すると診断する工程を包含し、ここで上記肝細胞は、上記個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、上記肝細胞へと分化される。上記方法は、上記生体分子の測定された量が、パーキンソン病と診断された個体から採取した血液サンプル、上記個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量に匹敵する場合、上記被験体を、パーキンソン病を発生させるリスクがあると同定する工程を包含し得、ここで上記肝細胞は、上記個体から採取した非肝細の胞細胞に由来し、次いで、上記肝細胞へと分化される。
【００１３】
上記方法は、例えば、上記生体分子の測定された量が、健康な個体から採取した血液サンプル、上記個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量に匹敵する場合、上記被験体を、パーキンソン病を有しないと診断する工程を包含し得、ここで上記肝細胞は、上記個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、上記肝細胞へと分化される。上記方法は、上記生体分子の測定された量が、健康な個体から採取した血液サンプル、上記個体から採取した肝臓サンプル、もしくは肝細胞中に存在する量に匹敵する場合に、上記被験体を、パーキンソン病の発生に関して低リスクと同定する工程を包含し得、ここで上記肝細胞は、上記個体から採取した非肝細胞の細胞に由来し、次いで、上記肝細胞へと分化される。
【００１４】
上記生体分子は、例えば、タンパク質もしくはＲＮＡであり得る。
【００１５】
ある特定の実施形態において、上記被験体は、ヒトである。上記被験体は、パーキンソン病の少なくとも１つの症状（例えば、振戦、寡動、固縮、姿勢反射障害、もしくは神経精神障害（例えば、認知症））を示し得る。上記被験体は、パーキンソン病と診断され得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、パーキンソン病の症状を示さず、上記被験体は、パーキンソン病と診断されたことがない。いくつかの実施形態において、上記被験体は、パーキンソン病を有する少なくとも１名の親類を有する。すなわち、上記親類および上記被験体は、遺伝性の遺伝子型を共有する。例えば、上記被験体は、パーキンソン病を有するかまたは有した個体の子孫であり得る。上記被験体は、パーキンソン病と相関することが公知である変異（例えば、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導性推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、ＤＪ−１、グルコセレブロシダーゼ、もしくはＡＴＰ１３Ａ２に対する変異）を有し得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、パーキンソン病を有することが既知である親類を有しない。いくつかの実施形態において、上記被験体は、検出可能なレビー小体を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、検出可能なレビー小体を実質的に含まない。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、肝細胞を提供する工程を包含し、ここで上記肝細胞は、幹細胞、例えば、多能性幹細胞（人工多能性幹細胞など）から生成される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、肝細胞を提供する工程を包含し、ここで上記肝細胞は、上記被験体から採取した非肝細胞の細胞から生成され、次いで、上記肝細胞へと分化される。上記肝細胞を非肝細胞の細胞から生成する工程は、多能性幹細胞を上記細胞から生成する工程および上記多能性幹細胞を肝細胞へと分化させ、それによって、上記肝細胞を生成する工程を包含し得る。上記細胞は、例えば、末梢血単核細胞もしくは線維芽細胞であり得る。
【００１８】
上記多能性幹細胞を上記細胞から生成する工程は、上記細胞を、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４（Ｋｌｆ４）、オクタマー結合転写因子３／４（Ｏｃｔ−３／４）、オクタマー結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ２）、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの遺伝子で形質導入する工程を包含し得る。多能性幹細胞を生成する工程は、上記細胞を、Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｇｌｉｓ１、Ｅｓｒｒｂ、および／もしくはＥｓｒｒｇの遺伝子で形質導入する工程を包含し得る。上記細胞を形質導入する工程は、上記細胞を、少なくとも１種のベクターで形質導入する工程を包含し得、例えば、ここで上記少なくとも１種のベクターは、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの遺伝子を含む。上記ベクターは、例えば、プラスミドベクターもしくはウイルスベクター（例えば、センダイウイルスベクター）であり得る。上記細胞を形質導入する工程は、上記細胞を、少なくとも１種のセンダイウイルスベクターで形質導入する工程を包含し得、例えば、ここで上記少なくとも１種のセンダイウイルスベクターは、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの遺伝子を含む。多能性幹細胞を細胞から生成するための方法は、当該分野で周知であり、米国特許出願公開第２０１１／０２２３６６９号および同第２０１３／００６５３１１号（これらの各々は、参考として援用される）に記載されるものを含む。核酸ではなく低分子を使用して、多能性幹細胞を体細胞から生成するための方法はまた、当該分野で公知である（例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  ２０１５／００３６４３（参考として本明細書によって援用される）を参照のこと）。
【００１９】
上記多能性幹細胞を上記肝細胞へと分化させる工程は、上記多能性幹細胞を内胚葉細胞へと、例えば、上記多能性幹細胞を内胚葉培地中でインキュベートすることによって、分化させる工程を包含し得る。上記多能性幹細胞を上記肝細胞へと分化させる工程は、上記多能性幹細胞もしくは内胚葉細胞を、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）および／もしくは線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）を含む培地（例えば、無血清培地）中でインキュベートする工程を包含し得る。上記多能性幹細胞を上記肝細胞へと分化させる工程は、上記多能性幹細胞もしくは内胚葉細胞を、ヒト増殖因子（ＨＧＦ）を含む培地（例えば、無血清培地）中でインキュベートする工程を包含し得る。上記多能性幹細胞を上記肝細胞へと分化させる工程は、上記多能性幹細胞もしくは内胚葉細胞を、オンコスタチンを含む培地（例えば、無血清培地）中でインキュベートする工程を包含し得る。多能性幹細胞を肝細胞へと分化させるための他の方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１９００５９号（参考として本明細書によって援用される）を参照のこと）。
【００２０】
上記血液サンプル、肝臓サンプル、もしくは非肝細胞の細胞は、上記被験体から、例えば、上記被験体の血液を抜くことによって、肝臓生検を行うことによって、もしくは別の手段（例えば、皮膚生検）によって、直接得られ得る。上記血液サンプル、肝臓サンプル、もしくは非肝細胞の細胞は、上記被験体から間接的に得られ得る。例えば、上記サンプルもしくは細胞は、上記被験体のヘルスケア提供者から、例えば、メールを介して得られ得る。上記サンプルもしくは細胞は、血液バンクもしくは組織バンクまたは他のアーカイブから得られ得る。
【００２１】
上記生体分子は、アルブミンもしくはアルブミンをコードするＲＮＡであり得る。上記生体分子は、アンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４、またはアンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４をコードするＲＮＡであり得る。上記生体分子は、シトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、システインジオキシゲナーゼ、またはシトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、もしくはシステインジオキシゲナーゼをコードするＲＮＡであり得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記生体分子は、ＲＮＡであり、上記生体分子の量は、ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、もしくは配列決定によって測定される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記生体分子は、ペプチドもしくはタンパク質であり、上記生体分子の量は、フローサイトメトリー、磁性活性化セルソーティング、もしくはイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して測定される。
【００２４】
上記方法は、上記被験体（すなわち、パーキンソン病と診断されているかまたはパーキンソン病を発生させるリスクを示す被験体）に薬剤を投与して、パーキンソン病を防止するか、パーキンソン病の発症を遅らせるか、またはパーキンソン病を処置する工程をさらに包含し得る。上記方法は、上記被験体（すなわち、パーキンソン病と診断されているかまたはパーキンソン病を発生させるリスクを示す被験体）に薬剤を投与して、パーキンソン病を防止するか、その発症を遅らせるか、またはその１もしくはこれより多くの症状を処置する工程をさらに包含し得る。上記薬剤は、例えば、レボドパであり得る。
【００２５】
ＩＩ．パーキンソン病を処置するための治療剤を同定することに関する方法
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を処置するための治療剤を同定するための方法に関する。上記方法は、第１の肝細胞と化合物もしくは組成物とを接触させる工程および上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量を測定する工程を包含し得る。上記方法は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量と、コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量とを比較する工程を包含し得る。上記方法は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量が、上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量とは異なる場合に、上記化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程を包含し得る。例えば、上記第１の肝細胞およびコントロール肝細胞は、パーキンソン病と一致する遺伝子型および／もしくは表現型を有し得、そして化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量と上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量との間の差異を同定する工程を包含し得、ここで上記第１の肝細胞は、上記コントロール肝細胞より健康な肝細胞に類似である生体分子の量を生成する。従って、上記化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量における上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量から離れるシフトを同定する工程を包含し得、すなわち、ここで上記シフトは、健康な肝細胞が生成する上記生体分子の量の近くへのシフトである。
【００２６】
同様に、上記第１の肝細胞は、パーキンソン病と一致する遺伝子型および／もしくは表現型を有し得、そして上記コントロール肝細胞は、非パーキンソン遺伝子型および／もしくは表現型を有し得、そして化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量が、上記第１の肝細胞と上記化合物もしくは組成物とを接触させる工程の前に、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量より上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量に類似であることを同定する工程を包含し得る。従って、上記化合物もしくは組成物を、パーキンソン病を処置するための治療剤として同定する工程は、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量における上記コントロール肝細胞によって生成される生体分子の量へのシフトを同定する工程を包含し得、すなわち、ここで上記シフトは、上記第１の肝細胞と上記化合物もしくは組成物とを接触させる工程の前に、上記第１の肝細胞によって生成される生体分子の量から離れる。
【００２７】
上記生体分子は、例えば、タンパク質もしくはＲＮＡであり得る。
【００２８】
上記第１の肝細胞は、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する細胞株、例えば、不死化細胞株に由来し得る。上記第１の肝細胞は、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体から得られる細胞株に由来し得る。上記第１の肝細胞は、パーキンソン病を有する被験体から得られる細胞株に由来し得る。
【００２９】
上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する細胞株、例えば、不死化細胞株に由来し得る。上記第１の肝細胞および上記コントロール肝細胞は、同じ細胞株に由来し得る。上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体から得られる細胞株に由来し得る。上記第１の肝細胞および上記コントロール肝細胞は、同じ被験体に由来し得る。上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病を有する被験体から得られる細胞株に由来し得る。上記第１の肝細胞および上記コントロール肝細胞は、同じ細胞株に由来し得る。
【００３０】
上記コントロール肝細胞は、健康な遺伝子型および／もしくは表現型を有する、例えば、パーキンソン病と関連しない細胞株、例えば、不死化細胞株に由来し得る。上記コントロール肝細胞は、健康な被験体、例えば、パーキンソン病と関連しない遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体から得られる細胞株に由来し得る。上記コントロール肝細胞は、健康な被験体、例えば、パーキンソン病を有しない被験体から得られる細胞株に由来し得る。
【００３１】
上記第１の肝細胞は、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体に由来する肝細胞であり得る。上記第１の肝細胞は、パーキンソン病を有する被験体に由来する肝細胞であり得る。
【００３２】
上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体に由来する肝細胞であり得る。上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病を有する被験体に由来する肝細胞であり得る。上記第１の肝細胞および上記コントロール肝細胞は、同じ被験体に由来し得る。
【００３３】
上記コントロール肝細胞は、健康な被験体、例えば、パーキンソン病と関連しない遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体に由来する肝細胞であり得る。上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病を有しない被験体に由来する肝細胞であり得る。
【００３４】
上記第１の肝細胞および／もしくはコントロール肝細胞は、多能性幹細胞、例えば、パーキンソン病と関連する遺伝子型および／もしくは表現型を有する被験体に由来する多能性幹細胞に由来し得る。例えば、上記第１の肝細胞は、パーキンソン病を有する被験体に由来する多能性幹細胞に由来し得る。上記多能性幹細胞は、被験体（例えば、パーキンソン病を有する被験体）から得られる多能性幹細胞であり得るか、または上記多能性幹細胞は、被験体（例えば、パーキンソン病を有する被験体）からえられる分化した細胞（例えば、末梢血単核細胞もしくは線維芽細胞）から生成され得る。上記コントロール肝細胞は、パーキンソン病を有する被験体に由来するか、もしくは健康な被験体に由来するかのいずれかの多能性幹細胞に由来し得る。多能性幹細胞は、任意の方法（本明細書で開示される任意の方法を含む）によって生成され得る。肝細胞は、任意の方法（本明細書で開示される任意の方法を含む）によって生成され得る。
【００３５】
ある特定の実施形態において、上記第１の肝細胞は、ヒト肝細胞であり、すなわち、上記第１の肝細胞は、ヒトゲノムを含む。ある特定の実施形態において、上記コントロール肝細胞は、ヒト肝細胞である。すなわち、上記コントロール肝細胞は、ヒトゲノムを含む。ある特定の実施形態において、上記第１の肝細胞および上記コントロール肝細胞は、同じ種のゲノムを含む（例えば、各ゲノムは、ヒトゲノムである）。
【００３６】
上記化合物は、低分子もしくは生物製剤であり得る。例えば、上記化合物は、低分子であり得、上記低分子は、約２００ａｍｕ〜約５０００ａｍｕ（例えば、約３００ａｍｕ〜約２０００ａｍｕ、もしくは約４００ａｍｕ〜約１０００ａｍｕ）の分子量を有し得る。上記化合物は、生物製剤であり得、上記生物製剤は、約１０００ａｍｕ〜約５００，０００ａｍｕ（例えば、約５０００ａｍｕ〜約２００，０００ａｍｕ、例えば、約５，０００ａｍｕ〜約１０，０００ａｍｕ、約１０，０００ａｍｕ〜約２５，０００ａｍｕ、約２５，０００ａｍｕ〜約７５，０００ａｍｕ、約７５，０００ａｍｕ〜約１２５，０００ａｍｕ、もしくは約１２５，０００ａｍｕ〜約１７５，０００ａｍｕ）の分子量を有し得る。いくつかの実施形態において、上記化合物は、生物製剤であり、上記生物製剤は、核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、またはタンパク質（例えば、ペプチドもしくはポリペプチド）である。いくつかの実施形態において、上記化合物は、抗体もしくは抗体のフラグメント（すなわち、タンパク質）である。いくつかの実施形態において、上記化合物は、抗体もしくは抗体のフラグメント（すなわち、タンパク質）を含む。上記化合物は、例えば、単一ドメイン抗体もしくは抗体のＦａｂフラグメントであり得る。上記化合物は、低分子干渉ＲＮＡであり得る。上記化合物は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびガイドＲＮＡをコードするプラスミドであり得る。上記化合物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸であり得る。上記化合物は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはＴＡＬＥＮをコードする核酸であり得る。上記化合物は、アルブミンをコードする核酸であり得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記肝細胞は、組成物と接触させられる。上記組成物は、本明細書で記載されるとおりの化合物（例えば、生物製剤）を含み得る。上記組成物は、遺伝子のＣＲＩＳＰＲ媒介性編集のための混合物を含み得る。同様に、上記組成物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性もしくはＴＡＬＥＮ媒介性の遺伝子編集のための混合物を含み得る。上記組成物は、遺伝子治療ベクター（例えば、ウイルスベクター）を含み得る。
【００３８】
ＩＩＩ．パーキンソン病を処置することに関する方法
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を防止もしくは処置するための方法に関し、上記方法は、治療上有効な複数の肝細胞を、その必要性のある被験体に投与する工程を包含する。
【００３９】
上記複数の肝細胞は、パーキンソン病と関連するゲノムを有する肝細胞（すなわち、上記被験体のゲノムを含む肝細胞）を含み得る。例えば、ここで肝細胞は、同じゲノムを有する改変されていない肝細胞より、健康な表現型に類似である表現型を示すように改変されている。
【００４０】
上記複数の肝細胞は、パーキンソン表現型を含まない肝細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの各々の肝細胞は、健康な表現型を含む。いくつかの実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞のいずれも、パーキンソン表現型を含まない。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞は、パーキンソン病表現型を有する肝細胞より多くアルブミンを生成する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞は、パーキンソン病表現型を有する肝細胞より多くのアンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、もしくは肝細胞核因子４を生成する。いくつかの実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞は、パーキンソン病表現型を有する肝細胞より多くのシトクロムＰ４５０ＩＩＤ６、シトクロムＰ４５０ＭＰ、シトクロムＰ４５０ＰＡ、もしくはシステインジオキシゲナーゼを生成する。
【００４３】
ある特定の実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞は、上記被験体から採取した細胞、好ましくは体細胞（例えば、二倍体細胞）に由来する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、上記肝細胞のゲノムは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼによって編集されている。例えば、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞は、上記被験体（すなわち、パーキンソン病と関連する遺伝子型を有する被験体）から採取した細胞に由来し得、上記肝細胞のゲノムは、上記肝細胞が、パーキンソン病の肝細胞より、健康な肝細胞により類似の表現型を示すように、編集され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態において、上記肝細胞は、上記被験体から採取した細胞に由来する。上記肝細胞は、多能性幹細胞、例えば、上記被験体から採取した多能性幹細胞に由来し得る。上記肝細胞は、多能性幹細胞に由来し得、上記多能性幹細胞は、上記被験体から採取した１もしくはこれより多くの分化した細胞（例えば、血液単核細胞もしくは線維芽細胞）に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記肝細胞は、上記被験体から採取した細胞に由来しない。
【００４６】
ある特定の実施形態において、上記複数の肝細胞のうちの肝細胞は、上記被験体から採取した細胞に由来しない。上記肝細胞は、例えば、同種異系ドナーから採取した細胞に由来し得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記肝細胞は、上記被験体の肝臓への挿入によって投与される。例えば、上記肝細胞は、上記被験体の肝門脈へと挿入され得る。上記細胞を挿入する工程は、上記細胞を移植する（例えば、上記細胞を外科的に移植することによる）工程を包含し得る。上記細胞を挿入する工程は、上記細胞を注射する（例えば、肝臓もしくは肝門脈へと上記細胞を注射することによる）工程を包含し得る。
【００４８】
いくつかの局面において、本発明は、パーキンソン病を防止もしくは処置するための方法に関し、上記方法は、治療上有効な複数の細胞をその必要性のある被験体に投与する工程を包含し、ここで上記細胞は、肝細胞であるか、または上記細胞は、肝細胞へと分化し得る。上記方法は、肝細胞を被験体へと投与するために、本明細書で記載される方法のうちのいずれか１つを包含し得、例えば、上記細胞が完全に分化した肝細胞ではないという点でのみ異なる。にもかかわらず、上記細胞は、例えば、上記細胞を被験体へと投与した後に、肝細胞へと分化することが可能であり得る。従って、上記方法は、治療上有効な複数の幹細胞を被験体へと投与する工程を包含し得る。上記幹細胞は、例えば、少なくとも１種の肝細胞前駆細胞マーカーもしくは少なくとも１種の成熟肝細胞マーカーを発現し得る。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、例えば、多能性幹細胞であり、そして上記幹細胞は、肝細胞前駆細胞マーカーもしくは成熟肝細胞マーカーを発現しない。
【００４９】
ある特定の実施形態において、上記被験体は、哺乳動物（例えば、マウスもしくは霊長類）である。上記被験体は、マウスであり得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ヒトである。
【００５０】
上記被験体は、パーキンソン病の少なくとも１つの症状（例えば、振戦、寡動、固縮、姿勢反射障害、もしくは認知症のような神経精神障害）を示し得る。上記被験体は、パーキンソン病と診断され得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、パーキンソン病の症状を示さず、上記被験体は、パーキンソン病と診断されたことがない。いくつかの実施形態において、上記被験体は、パーキンソン病を有する少なくとも１名の親類を有する。すなわち、ここで上記親類および上記被験体は、遺伝性の遺伝子型を共有する。例えば、上記被験体は、パーキンソン病を有するもしくは有した人間の子孫であり得る。上記被験体は、パーキンソン病と相関することが公知の変異（例えば、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導性推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、ＤＪ−１、グルコセレブロシダーゼ、もしくはＡＴＰ１３Ａ２に対する変異）を有し得る。いくつかの実施形態において、上記被験体は、パーキンソン病を有することが既知の親類を有しない。いくつかの実施形態において、上記被験体は、検出可能なレビー小体を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、検出可能なレビー小体を実質的に含まない。
【００５１】
ＩＶ．多能性幹細胞を生成するための方法
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞に由来する人工幹細胞であり、これは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のものとほぼ同じ特性（例えば、分化多能性および自己再生による増殖の能力）を有する。ｉＰＳ細胞は、ある特定の核再プログラミング物質を、核酸もしくはタンパク質の形態で体細胞へと移入することによって調製され得る（例えば、Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｙａｍａｎａｋａ  （２００６）  Ｃｅｌｌ，  １２６：  ６６３−６７６；  Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉら  （２００７）  Ｃｅｌｌ，  １３１：  ８６１−８７２；  Ｊ．  Ｙｕら  （２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８：  １９１７−１９２０；  Ｍ．  Ｎａｋａｇａｗａら  （２００８）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６：  １０１−１０６；  ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００７／０６９６６６；  ＷＯ２０１１／０７４６９０、および米国特許出願公開第２０１１／０２２３６６９号および同第２０１３／００６５３１１号（これらの各々は、参考として本明細書によって援用される）を参照のこと）。上記核再プログラミング物質は、ＥＳ細胞において特異的に発現される任意の遺伝子、またはＥＳ細胞の未分化状態の維持において鍵となる役割を果たす遺伝子、またはこれらの遺伝子生成物であり得る。例としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、ＥｓｒｒｂおよびＥｓｒｒｇが挙げられる。これらの再プログラミング物質は、ｉＰＳ細胞を樹立する場合に組み合わせて使用され得る。例えば、これらの再プログラミング物質のうちの少なくとも１種、２種もしくは３種を含む組み合わせが使用され得る。好ましいのは、４種を含む組み合わせが与えられることである。
【００５２】
これらの核再プログラミング物質は、例えば、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドへの結合、およびマイクロインジェクションによってタンパク質の形態で体細胞へと移入され得るか、または例えば、ベクター（例えば、ウイルス、プラスミドおよび人工染色体）、ならびにリポフェクション、リポソーム、およびマイクロインジェクションによって、ＤＮＡの形態で体細胞へと移入され得る。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６  （２００６）；  Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２  （２００７）；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０  （２００７）（これらの各々は、参考として本明細書によって援用される））、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４５−９４９  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Ｐｒｏｃ．  Ｊｐｎ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｒ．  Ｂ．  Ｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ８５：３４８−６２  （２００９）（参考として本明細書によって援用される））などが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが挙げられる。哺乳動物細胞のためのプラスミドが使用され得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４９−９５３  （２００８（参考として本明細書によって援用される））。上記ベクターは、核再プログラミング物質が発現されるようにするために、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、ターミネーター、もしくはポリアデニル化部位）を含み得、必要な場合には、薬物耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、選択マーカー配列（例えば、チミジンキナーゼ遺伝子もしくはジフテリア毒素遺伝子）、レポーター遺伝子配列（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）もしくはＦＬＡＧの遺伝子）などをさらに含み得る。上記ベクターは、体細胞へと移入された後に、その切除を可能にするために、核再プログラミング物質をコードする遺伝子の、またはプロモーターおよびこれに接続された遺伝子の両末端に配置されたｌｏｘＰ配列を有し得る。上記ベクターはまた、ベクターが複製され、染色体の中に組み込まれなくても、エピソームとして起こることを可能にするために、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ配列またはラージＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含み得る。
【００５３】
他の因子は、上記の因子に加えて、核再プログラミングにおいてｉＰＳ細胞誘導効率を増大させるために使用され得る。例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター｛例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６（７）：７９５−７９７  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））｝、低分子インヒビター（例えば、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ  １２９３、およびＭ３４４、核酸ベースの発現インヒビター（例えば、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ｛例えば、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨＤＡＣ１に対するＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ構築物（ＯｒｉＧｅｎｅ）など｝、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、５’−アザシチジン）（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６（７）：７９５−７９７  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼインヒビター｛例えば、低分子インヒビター（例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ２：５２５−５２８  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））、核酸ベースの発現インヒビター（例えば、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例えば、Ｇ９ａ  ｓｉＲＮＡ（ヒト）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）））など｝、Ｌ型カルシウムチャネルアゴニスト（例えば、Ｂａｙｋ８６４４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３：５６８−５７４  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））、ｐ５３インヒビター｛例えば、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３，  ４７５−４７９  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））｝、Ｗｎｔシグナル伝達（例えば、可溶性Ｗｎｔ３ａ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３，  １３２−１３５  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））、サイトカイン（例えば、ＬＩＦ、ｂＦＧＦなど）、ＡＬＫ５インヒビター（例えば、ＳＢ４３１５４２）（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６：８０５−８  （２００９）（参考として本明細書によって援用される））、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達インヒビター、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３インヒビター（ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ６（１０），  ２２３７−２２４７  （２００８）（参考として本明細書によって援用される））、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、およびｍｉＲ−２９５（Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｄｓｏｎら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２７：４５９−４６１  （２００９）（参考として本明細書によって援用される）））などが、使用され得る。
【００５４】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地の例としては、以下が挙げられる：（１）１０〜１５％  ＦＢＳを含む、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２もしくはＤＭＥ培地（これらの培地は、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノールなどをさらに含み得る）、（２）ｂＦＧＦもしくはＳＣＦを含むＥＳ細胞培養培地、例えば、マウスＥＳ細胞培養培地（例えば、ＴＸ−ＷＥＳ培地、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ  ＮＶ）または霊長類ＥＳ細胞培養培地（例えば、霊長類（ヒトおよびサル）ＥＳ細胞培養培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ，Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）など。
【００５５】
培養法において、例えば、体細胞および核再プログラミング物質（ＤＮＡ、もしくはタンパク質）は、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地上で互いと接触させられ得、３７℃において、５％  ＣＯ２の存在下で約４〜約７日間培養され得、その後、上記細胞は、上記体細胞および上記核再プログラミング物質の接触の約１０日後に開始して、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣで予め処理された、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞および他の細胞）上に再播種され得、ｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養培地を使用して再び培養され得、それによって、ｉＰＳ様コロニーが、接触の約３０〜約４５日後もしくはこれより後に生成され得る。ｉＰＳ細胞誘導の効率を増大させるために、体細胞は、５〜１０％の低酸素濃度を含む条件下で培養され得る。
【００５６】
あるいは、上記細胞は、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣで予め処理された、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞および他の細胞）上で、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（これは、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノールなどをさらに含み得る）を使用して培養され得、それによって、ＥＳ様コロニーは、約２５〜約３０日後もしくはこれより後に生成され得る。
【００５７】
培養期間の間に、上記培地は、培養の２日目に開始して、毎日１回、新鮮な同じ培地を供給することによって、交換され得る。核再プログラミングに使用される体細胞の数は、制限を受けないが、その数は、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲に入り得る。
【００５８】
薬物耐性遺伝子がマーカー遺伝子として使用される場合、このマーカー遺伝子を発現する細胞は、その相当する薬物を含む培地（選択培地）を使用する培養によって選択され得る。上記マーカー遺伝子を発現する細胞は、マーカー遺伝子としての蛍光タンパク質遺伝子を、蛍光顕微鏡を使用して観察することによって、マーカー遺伝子としての発光酵素遺伝子に関する発光基質を添加することによって、およびマーカー遺伝子としての発色酵素遺伝子に関する発色基質を添加することによって、検出され得る。
【００５９】
哺乳動物起源（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラットなど）の生殖細胞以外の任意の細胞が、本発明の「細胞」として使用され得る。例としては、以下が挙げられる：角化上皮細胞（keratinizing  epithelial  cell）（例えば、角化表皮細胞（keratinized  epidermal  cell））、粘膜上皮細胞（例えば、舌の表面層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例えば、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例えば、副腎髄質細胞）、代謝もしくは貯蔵のための細胞（例えば、肝臓細胞）、界面を構成する内膜上皮細胞（ｉｎｔｉｍａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）（例えば、タイプＩ肺胞細胞）、閉鎖管の内膜上皮細胞（例えば、血管内皮細胞）、輸送能を有する線毛を有する細胞（例えば、気道上皮細胞）、細胞外マトリクス分泌のための細胞（例えば、線維芽細胞）、収縮細胞（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）（例えば、平滑筋細胞）、血液および免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球）、感覚関連細胞（例えば、桿体細胞）、自律ニューロン（例えば、コリン作動性ニューロン）、感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞（例えば、サテライト細胞）、中枢神経系のニューロンおよびグリア細胞（例えば、星状グリア細胞）、色素細胞（例えば、網膜色素上皮細胞）、これらの前駆細胞（組織前駆細胞）など。細胞分化の程度、細胞が収集される動物の年齢など；さらには分化していない前駆細胞（体性幹細胞を含む）に関する制限はなく、最終的に分化した成熟細胞は、本発明における細胞の供給源として同様に使用され得る。
【００６０】
本発明において、体細胞が収集される哺乳動物個体の選択は、特に限定されないが、それは好ましくは、ヒトである。本発明の種々の実施形態において、体細胞は、パーキンソン病を有する患者またはこの疾患と相関する遺伝的多型を有する健康な個体から集められることが、望ましい。
【００６１】
Ｖ．幹細胞を肝細胞へと分化させるための方法
幹細胞を肝細胞へと分化させるための方法は、当該分野で周知である（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２０１２／１０５５０５（参考として本明細書によって援用される）を参照のこと）。肝細胞もしくは肝幹細胞は、ｉＰＳ細胞から分化され得る。例えば、酪酸ナトリウムの存在下でｉＰＳ細胞を培養する工程は、肝細胞を生成し得る（例えば、Ｒａｍｂｈａｔｌａら  （２００３）  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １２：１−１１（参考として本明細書によって援用される）を参照のこと）。別の例では、肝細胞は、アクチビンＡの存在下で、無血清培地中でｉＰＳ細胞を培養し、続いて、上記細胞を線維芽細胞増殖因子−４および骨形成タンパク質−２中で培養することによって生成され得る（例えば、Ｃａｉら  （２００７）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４５（５）：１２２９−３９（参考として本明細書によって援用される））。別の例示的実施形態において、ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ細胞をアクチビンＡの存在下で約２〜約６日間、例えば、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、もしくは約６日間培養し、次いで、ｉＰＳＣを肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の存在下で約５日間〜約１０日間、例えば、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、もしくは約１０日間培養することによって、肝細胞もしくは肝幹細胞へと分化される。
【実施例】
【００６２】
例示
実施例１．末梢血単核細胞の採取
１２ｍＬ  ＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭチューブに、３ｍＬ  ＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭ分離培地（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）を満たした。そのチューブを、３０秒間、１０００ｒｃｆで、室温において遠心分離して、そのチューブの中の分離培地を多孔性バリアの下に配置した。
【００６３】
４ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；カルシウムおよびマグネシウムを含まない）を、１５ｍＬ  コニカルチューブに添加した。４ｍＬ  バキュテイナー中のヒト血液を、１０回転倒混和して、血液を混合した。次いで、その血液を、上記ＰＢＳを含むコニカルチューブに添加し、その血液およびＰＢＳを混合した。次いで、その血液およびＰＢＳ混合物を、ＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭチューブの中に注いだ。
【００６４】
そのＬｅｕｃｏＳｅｐＴＭチューブを、Ｌａｂｎｅｔ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで室温において３０分間、１２５０ｒｃｆで（またはＢｅｃｋｍａｎスイングバケット遠心分離機で２１００ｒｐｍにおいて）遠心分離した。その富化された細胞画分（リンパ球および末梢血単核細胞を含む）を、多孔性バリアの上の血漿上清および富化された細胞画分の両方を新しい１５ｍＬ  遠心分離チューブに注ぐことによって集めた。その細胞を、５００ｒｃｆで１０分間、Ｌａｂｎｅｔ遠心分離機で（または１１００ｒｐｍにおいて１０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機で）ペレットにし、その上清を廃棄した。
【００６５】
上記ペレットを、１ｍＬの凍結用培地（熱不活性化牛胎仔血清中１０％  ＤＭＳＯ）の中で再懸濁した。その１ｍＬサンプルを、２つの０．５ｍＬアリコートに分け、−８０℃冷凍庫中で凍結した。各０．５ｍＬのアリコートは、およそ１，０００，０００個の末梢血単核細胞を含んでいた。
【００６６】
実施例２．末梢血単核細胞の形質導入
末梢血単核細胞の０．５ｍＬのアリコートを、１５ｍＬ  コニカルバイアル中に入れた０．５ｍＬの拡大培地で洗浄した。上記細胞を、２５０ｒｃｆにおいて７分間ペレットにし、およそ１００μＬの培地をチューブの中に残して、その上清を廃棄した。
【００６７】
０．４ｍＬ  ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  Ｌａｎｃｅ  Ｍｅｄｉａ；５μＬ  ｈＫＯＳ；５μＬ  ｈｃ−Ｍｙｃ；３μＬ  ｈ−Ｋｌｆ４；２μＬ  水中ポリブレン（１ｍｇ／ｍＬ希釈物）；およびポリブレン試薬（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む形質導入培地を調製した。
【００６８】
凍結したＣｙｔｏＴｕｎｅウイルスバイアルを、３７℃のバスの中に８秒間入れ、試薬を融解させ、次いで、４℃の冷ブロックに置いた。そのウイルスを、ＰＢＭＣ拡大培地へと混合した。
【００６９】
次いで、その形質導入培地を、１５ｍＬ  コニカルバイアルの中に入れて、その細胞ペレットを再懸濁した。上記形質導入培地および細胞を、２４ウェルプレートのうちの１ウェルに入れ、３７℃において、５％  ＣＯ２加湿雰囲気中で一晩インキュベートした。
【００７０】
実施例３．形質導入した細胞の培養
１ｍＬのＧｅｌｔｒｅｘのすぐに使える（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）溶液を、６ウェルプレートの各ウェルに添加した。そのプレートを、３７℃および５％  ＣＯ２において１時間インキュベートした。
【００７１】
ＭＥＦ培地中の約８５００個の細胞の凍結したバイアルを、３７℃の浴で４分間解凍し、その細胞溶液を、１５ｍＬコニカルチューブへと移した。８ｍＬの予め加温したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）培地を、１５ｍＬ  チューブに添加し、０．５ｍＬのＭＥＦ培地を使用して、空のバイアルを１５ｍＬ  チューブの中にすすぎ入れた。その細胞懸濁物を、２５０ｒｃｆにおいて８分間遠心分離し、その上清を廃棄し、細胞を２ｍＬのＭＥＦ培地中で再懸濁した。
【００７２】
上記Ｇｅｌｔｒｅｘを、６ウェルプレートのウェルから除去し、ＭＥＦ培地中の上記細胞を、６ウェルプレートへと移した。上記細胞を、３７℃において５％  ＣＯ２の加湿雰囲気中で１日間培養した。
【００７３】
次いで、上記細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地中で３日間、３７℃において５％  ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養した。次いで、上記細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むｉＰＳＣ培地中で、１４日間、３７℃において５％  ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養した。
【００７４】
実施例４．多能性幹細胞の、肝細胞への分化
ＩＰＳ細胞株１０９８が、２０〜４０％  コンフルエントになったときに、上記細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅを使用して採取した。胚体内胚葉培地Ａを、上記細胞に添加し、上記細胞を、１日間インキュベートした。次いで、胚体内胚葉培地Ｂを、上記細胞に添加し、上記細胞をさらに１日間インキュベートした。次いで、上記細胞を、ＢＭＰ−４およびＦＧＦ−２を含むＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地中で５日間インキュベートした。次いで、上記細胞を、肝細胞増殖因子を含むＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地とともに５日間インキュベートした。次いで、上記細胞を、オンコスタチンを含む肝細胞培養培地とともに５日間インキュベートした。細胞および細胞培養上清を、分析のために集めた。次いで、上記細胞を、オンコスタチンを含む肝細胞培養培地とともに１０日間インキュベートし、細胞および細胞培養上清を、分析のために集めた。
【００７５】
実施例５．肝細胞生体マーカーの分析
パーキンソン病患者（６１１）および健康なコントロール（１０９８）に由来する肝細胞を、実施例１〜４に記載されるとおりに調製した。細胞サンプルを、ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析のために調製した（図１）。パーキンソン病患者（６１１）に由来する肝細胞は、健康なコントロール（１０９８）に由来する肝細胞より少ないアンチトリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、および肝細胞核因子４のｍＲＮＡを発現した。パーキンソン病患者（６１１）に由来する肝細胞は、健康なコントロール（１０９８）に由来する肝細胞より多くのＫｒｕｐｐｅｌ様因子４  ｍＲＮＡを発現した。細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡを使用してアルブミンに関してアッセイした（図２）。上記パーキンソン病患者（６１１）に由来する肝細胞の細胞培養上清は、健康なコントロール（１０９８）に由来する肝細胞の細胞培養上清より少ないアルブミンを含んだ。
【００７６】
参考による援用
本明細書で引用される特許、公開された特許出願、および非特許参考文献の各々は、それらの全体において参考として援用される。
【００７７】
均等物
当業者は、慣用的実験法のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
2018537118.tif 000003
【図２】
2018537118.tif 000004
【国際調査報告】
2018537118.tif 000005
2018537118.tif 000006