(57)【要約】成人ヒト間葉系幹細胞由来の機械的に機能する培養軟骨を有する医療機器および同機器を作製する方法。【選択図】図１
2018510673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約８００ｋＰａを超えるヤング率と、約０．３未満の平衡摩擦係数とを有する培養ヒト軟骨を含む医療機器。
【請求項２】
前記培養ヒト軟骨が骨基質に付着される、請求項１に記載の医療機器。
【請求項３】
前記培養ヒト軟骨が解剖学的形状である、請求項１に記載の医療機器。
【請求項４】
前記培養ヒト軟骨がセンチメートルの大きさである、請求項１に記載の医療機器。
【請求項５】
前記培養ヒト軟骨が生理学的層状化特性を含む、請求項１に記載の医療機器。
【請求項６】
前記培養ヒト軟骨が剛性およびトライボロジー的性質を有する、請求項１に記載の医療機器。
【請求項７】
前記培養ヒト軟骨が送達デバイスに配置される、請求項１に記載の医療機器。
【請求項８】
前記送達デバイスがペン型注入器である、請求項７に記載の医療機器。
【請求項９】
前記骨基質が顆の関節面である、請求項２に記載の医療機器。
【請求項１０】
前記顆が患者の解剖学的ヒト顆に相当し、および前記医療機器が前記患者用に個別化された骨軟骨組織構築物である、請求項９に記載の医療機器。
【請求項１１】
骨様マトリックスと、
凝集間葉体と
を含む、解剖学的足場。
【請求項１２】
前記凝集間葉体が前記骨様マトリックス上に配置される高密度細胞層を形成する、請求項１１に記載の足場。
【請求項１３】
前記凝集間葉体の高密度細胞層および前記骨様マトリックスが層状構造体を形成する、請求項１２に記載の足場。
【請求項１４】
前記骨様マトリックスが脱細胞化骨である、請求項１１に記載の足場。
【請求項１５】
前記脱細胞化骨が多孔質であり、および前記凝集間葉体が細孔内に分散している、請求項１４に記載の足場。
【請求項１６】
前記骨様マトリックスがリン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイトを含む多孔質材料である、請求項１１に記載の足場。
【請求項１７】
凝集間葉体を形成するためにヒト間葉系幹細胞を培養することと、
前記凝集間葉体を骨基質上に付着させることと
を含む骨軟骨構築物を生成する方法。
【請求項１８】
前記凝集間葉体が前記骨基質に浸透する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記凝集間葉体が前記骨基質上に高密度層を形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨軟骨構築物が約８００ｋＰａを超えるヤング率を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記骨軟骨構築物が約０．３未満の平衡摩擦係数を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
凝集間葉体を形成するためにヒト間葉系幹細胞を培養することと、
前記凝集間葉体を骨基質上に付着させることと
を含む移植片を生成するための方法であって、
前記移植片が約８００ｋＰａを超えるヤング率と、約０．３未満の平衡摩擦係数とを有する方法。
【請求項２３】
軟骨欠損または半月板欠損または腱欠損を治療する方法であって、凝集間葉体を前記欠損に適用することを含む、方法。
【請求項２４】
前記適用するステップが前記凝集間葉体を前記欠損に注入することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記凝集間葉体がペン型注入器を用いて注入される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成番号第ＤＥ０１６５２５号および第ＥＢ００２５２０号の下で連邦政府支援によりなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、組織工学分野に関し、より具体的には、機械的に機能するヒト軟骨の組織工学に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界人口が熟成するにつれて、膝関節置換および股関節置換は長年にわたって何倍も増加すると推定される。加えて、筋骨格の損傷（例えば、スポーツ傷害）は増加の傾向にあり、過去十年間で小児集団については２倍以上増えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
患者の細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能組織を生成することで、損傷、疾患または老化により失われたあるいは損なわれた組織に生物学的代用品を提供することによって再生医療に改革をもたらす。胚発生および幹細胞生物学の理解が高まり、足場設計、細胞操作、および幹細胞分化と組織形成を調節する（生化学的および物理的）要因の取込みへの組織工学アプローチに多大な影響を与えている。
【０００５】
軟骨はその無血管の性質のためごくわずかな自然修復力を示すので、組織工学は軟骨再生に特に着目する。軟骨疾患の特徴的な性質としては、機械的性質の減少、コラーゲン分解、プロテオグリカン合成の減少、および細胞充実性の低下が挙げられる。局在性軟骨病変の修復へのアプローチとしては、レーザーはんだ溶接、骨膜移植を介する自家移植細胞／組織移植、自家骨軟骨移植術、および軟骨再生のための自家軟骨細胞移植方法が挙げられる。これらの選択肢は症状の一時的緩和をもたらすが、一方で長期の問題も持ち込まれる。
【０００６】
軟骨組織工学では、初代ウシ軟骨細胞とともに足場材料を用いて、天然の組織の性質と近似するものを有する軟骨を作ってきた。しかし、これらの方法は、臨床応用のための好ましい細胞源であるヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）とともに用いた場合、亜正常の軟骨組織になる。
【０００７】
組織または臓器でさえその生物学的代用品の工学技術は、ますます真実味を帯びてきているが、依然として大きな障害に直面している。軟骨は、わずか１種類の細胞型を含む無血管組織であるので、組織工学者にとって主要な焦点であり、最初は、容易な標的であると思われた。例えば、患者の膝から採取され、培養で増殖させた自家軟骨細胞による軟骨修復は、細胞治療製品を提供する。しかし、患者の膝から自家軟骨細胞を採取することは、関節炎の罹患およびリスクと関連する。骨髄または脂肪ｈＭＳＣなどの異なる細胞源は、膝から組織採取を回避できるので、臨床的関心が高まることになる。
【０００８】
さらに、臨床試験において軟骨再生を誘導するために、自家ｈＭＳＣおよび同種ｈＭＳＣは栄養因子源として使用されてきた。これらの方法のいずれも、機械的に機能するヒト軟骨を生成することができない。今まで、ｈＭＳＣから生成された軟骨の組成物および機械的性質は、軟骨細胞によって成し遂げられたそれらより依然として劣っている。したがって、機械的に機能する軟骨組織の効果的な組織工学への必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様において、機械的に機能する培養ヒト軟骨を含む医療機器が提供される。培養軟骨は、天然のヒト軟骨の特性を示す。例えば、培養軟骨は、これに限定されるものではないが、８００ｋＰａを超えるヤング率と、０．３未満の平衡摩擦係数を有する。別の実施形態において、培養ヒト軟骨は生理学的層状化特性、剛性またはトライボロジー的性質を有する。
【００１０】
一実施形態において、培養ヒト軟骨は骨基質に付着される。この点について、医療機器はインプラントである。一部の実施形態において、培養ヒト軟骨は解剖学的形状であり、およびこれを用いて骨を交換または修復することができる。この点において、医療機器および／または培養軟骨は、臨床的な大きさ、例えばセンチメートルの大きさであり得る。
骨基質は、顆の関節面であり得る。顆は、患者の解剖学的ヒト顆に対応するように、例えば患者の顆を画像化し、例えば３Ｄプリンティング技術を用いることによって構成されてもよい。このように、医療機器は特定の患者のために個別化された骨軟骨組織構築物であり得る。別の実施形態において、培養軟骨は、骨欠損への局所送達のための送達デバイス、例えばペン型注入器で使用されることができる。
【００１１】
別の態様において、本主題は、解剖学的な足場に関する。この足場は、脱細胞化骨マトリックスと、凝集間葉体とを含む。一実施形態において、凝集間葉体は、骨基質上に配置される高密度細胞層を形成する。凝集間葉体の高密度細胞層および骨基質は、層状構造体を形成する。
【００１２】
一部の実施形態において、脱細胞化骨マトリックスは多孔質であり、および凝集間葉体は細孔内に分散している。言い換えれば、凝集間葉体は、多孔質骨を浸透して構築物を形成する。
【００１３】
別の態様において、骨軟骨構築物を生成するための方法が提供される。この方法は、凝集間葉体を形成するためにヒト間葉系幹細胞を培養することと、次いで骨基質上に凝集間葉体を融合または付着させることとを含む。
【００１４】
本明細書に記載の主題の種々の態様、特徴および実施形態の詳細な説明は、以下に簡単に説明する添付の図面を参照して提示する。図面は例示であり、必ずしも縮尺で描かれてなく、一部の成分および特徴は明瞭性のために誇張されている。図面は本主題の種々の態様および特徴を示しており、本主題の１または複数の実施形態または実施例を全部もしくは一部を示し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本開示の主題の一実施形態を示す。１×１０５から２×１０６のｈＭＳＣで作製した３日目のＣＭＢを示す（スケールバー：１ｍｍ）。この実施形態において、（１〜５）×１０５の範囲内の細胞数では、凝集球状ＣＭＢが形成されたが、高い細胞数では、ＣＭＢは平坦であった。
【図２】凝集細胞体中のＤＮＡ含量が定量化され、および最初の播種のＤＮＡ含量に正規化された一実施形態を示す。細胞数が増加すると、凝集の効率が減少することを示している。
【図３】本開示の例示的な実施形態によるＣＭＢの凝集および融合の模式図である。
【図４】本開示の一部の例示的実施形態によるＣＭＢの接線方向細胞ライニングを１日目、３日目、５日目、７日目および９日目、トリクロームで、テネイシンの染色で示す。境界域凝固の表示（スケールバー：１００μｍ）。
【図５】本開示の実施形態によるＣＭＢの境界域の特徴を示す。ＴＮＣおよびＳＤＣ３の遺伝子は高発現を示し、ＨＯＸＡ２およびＣＤＨ２の遺伝子は発現の増加を示す。軟骨形成因子のＳＯＸ９は、ＣＭＢが成熟するにつれて、徐々に増加を示す。フィブロネクチン発現（ＦＮ）は、一定のままである。
【図６】本開示の実施形態によるＣＭＢの融合を異なる発達段階で示す（スケールバー：２００μｍ）。融合後、初期のＣＭＢ（１日目〜５日目）とは対照的に、７日目〜９日目で、すべてのＣＭＢは、周辺でテネイシンの沈着（上段）を示す。融合初期のＣＭＢにおける軟骨形成は、均質のグリコサミノグリカン構造（下段）をもたらしたが、隣接したＣＭＢ間の境界域は融合後期のＣＭＢ（矢印）ではっきり見られた。
【図７】本開示の実施形態による骨基質上に関節軟骨を形成する方法を示す。この方法においてＣＭＢはＰＤＭＳ環中に置かれ、骨足場は挿入され、ＣＭＢ上に押しつけられて、ＣＭＢは融合して、骨足場の細孔内に浸透し、複合骨軟骨構築物を作る。分化後、細胞層は軟骨に形成され、次いで多孔質足場と統合される。
【図８】本開示の実施形態による、融合後１日目と５週目のＣＭＢおよび骨軟骨構築物を示す。生物工学によって作られた軟骨および軟骨下骨の組織切片および免疫組織化学切片は適切なマトリックス組成物と軟骨形成を示す。
【図９】本開示の実施形態による関節軟骨プラグの上面図と側面図を示す。融合ＣＭＢは構築物の表面全体を覆う厚い軟骨層に発達した。
【図１０】骨軟骨誘導から５週間後、本開示の実施形態による、３日目、５日目および７日目のＣＭＢから作られた軟骨層のＤＮＡ、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）の含量を示す。軟骨下領域はＧＡＧとＨＹＰの含量が同程度であったが、７日目のＣＭＢのＤＮＡ含量がかなり低く、遊走能と統合能の低下を示唆している。
【図１１】本開示の実施形態によるＣＭＢを融合する方法を示す。この方法においてＣＭＢは顆の正確な形状内のモールドの軟骨側に置かれ、解剖学的形状の多孔質足場はモールドの他方側に置かれ、ツ−ピースモールドは圧入される。ＣＭＢは互いに融合し、厚い細胞層として関節面に沿って足場に接着する。
【図１２】本開示の実施形態による５週間の培養後、下層の骨上の関節軟骨の解剖学的な層を示す。
【図１３】本開示の実施形態による、Ｈ＆Ｅ染色した軟骨マトリックスの組織分析および免疫組織化学分析を示す（スケールバー：低倍率の画像−５００μｍ、高倍率の画像−５０μｍ）。
【図１４】本開示の実施形態による、ＧＡＧをアルシアンブルー染色した軟骨マトリックスの組織分析および免疫組織化学分析を示す（スケールバー：低倍率の画像−５００μｍ、高倍率の画像−５０μｍ）。
【図１５】本開示の実施形態による、抗ＩＩ型コラーゲンを染色した軟骨マトリックスの組織分析および免疫組織化学分析を示す（スケールバー：低倍率の画像−５００μｍ、高倍率の画像−５０μｍ）。
【図１６】本開示の実施形態による、抗ラブリシンを染色した軟骨マトリックスの組織分析および免疫組織化学分析を示す（スケールバー：低倍率の画像−５００μｍ、高倍率の画像−５０μｍ）。
【図１７】本開示の実施形態による、抗Ｉ型コラーゲンを染色した軟骨マトリックスの組織分析および免疫組織化学分析を示す（スケールバー：低倍率の画像−５００μｍ、高倍率の画像−５０μｍ）。
【図１８】本開示の実施形態による、抗Ｘ型コラーゲンを染色した軟骨マトリックスの組織分析および免疫組織化学分析を示す（スケールバー：低倍率の画像−５００μｍ、高倍率の画像−５０μｍ）。
【図１９】本開示の実施形態による軟骨を修復する方法を示す。直径１．５ｍｍの軟骨欠損を生検パンチで生成し、ＣＭＢを押しつけて充填して該欠損を融合し、埋める。
【図２０】本開示の実施形態による、天然の軟骨と、ＣＭＢで形成された軟骨組織の間の統合を示す。軟骨形成誘導から５週間後、ピーク力と統合面を壊すために必要なせん断応力とを測定した。
【図２１】本開示の実施形態によって達成された、グリコサミノグリカンとＩＩ型コラーゲンの構造的統合によるアルシアンブルーで示された高統合強度を示す。（スケールバー：５０μｍ）。
【図２２】本開示の実施形態によって達成された、グリコサミノグリカンとＩＩ型コラーゲンの構造的統合による抗ＩＩ型コラーゲン免疫組織化学染色で示された高統合強度を示す（スケールバー：５０μｍ）。
【図２３】軟骨下骨と適合する十分に発達した軟骨層が形成されたことを示す組織切片および免疫組織化学切片を示す。
【図２４】軟骨形成誘導から５週間後、３日目、５日目および７日目のＣＭＢを用いて形成された構築物中の軟骨層と軟骨下骨領域の生化学組成物を示す。軟骨層において、ＤＮＡ、ＧＡＧおよびヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）の含量は異なる群間で同等であった。骨領域において、ＤＮＡ含量は、７日目のＣＭＢから作製された構築物中でかなり低く、より成熟したＣＭＢの遊走能と統合能が低いことを示唆している。
【図２５】生物工学によって作られた軟骨のトライボロジー的性質を例示する。３日目、５日目および７日目のＣＭＢを用いて作製された関節軟骨で測定した摩擦係数（μ）は、成人ヒト関節軟骨の値の範囲内であり、および負荷時間とともに、軟骨の粘弾性特性の挙動指数が増加した。μｍｉｎ：試験開始時の最初のμ；μｅｑ：１８００秒間の検査後の平衡μ値。
【図２６】トリクローム染色で骨軟骨構築物中の軟骨マトリックスの組織を示す。軟骨層の全体の断面を左側に示し、高倍率の表面層、中間層および深層を右側に示す。Ｉ型コラーゲンとＸ型コラーゲンは、軟骨下領域（ｄ）では高度に発現し、および表層領域（ｂ）と深い軟骨領域（ｃ）では最小限でのみ発現した。スケールバー：（ａ）５００μｍ；（ｂ〜ｄ）５０μｍ。
【図２７】ヒト間葉系幹細胞に由来し、解剖的形状の足場と適合し、およびマッチングバイオリアクターチャンバーで培養された凝集間葉体（ＣＭＢ）から始まる、ヒト骨軟骨構築物の画像誘導技術のステップのフローチャートである。
【図２８】本開示の実施形態による骨軟骨移植片の製作を示す。Ａ：シリコーンモールドをツーピースで作製し、ＣＭＢを関節側に置いた。Ｂ：次いで、天然の骨マトリックスを画像誘導処理により機械加工された解剖的形状の足場を該モールドの他方側に置く。Ｃ：ツーピースモールドを互いに融合させ、該モールドが足場上の関節面の所望の形にＣＭＢを押しつけるようにする。Ｄ：骨面で形成されたヒト軟骨の二つの天然様組織形態。次いで、骨軟骨構築相は、適合している解剖学的形状のバイオリアクターチャンバー内で培養される。
【図２９】骨面でＭＳＣから形成されたヒト軟骨の天然様組織形態を示す。軟骨形成培地中で５週間培養した後、高密度細胞層は、層状軟骨に発達した。Ａ：Ｈ＆Ｅ、Ｂ：アルシアンブルー、Ｃ：ＩＩ型コラーゲン、Ｄ：ラブリシン、Ｅ：Ｉ型コラーゲン、およびＦ：Ｘ型コラーゲン［バー：５００μｍ］。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ここで本開示の主題の例示的な実施形態を詳細に参照する。本開示の主題の方法および対応するステップは、本システムの詳細な説明と共に説明される。
【００１７】
本開示の一態様によれば、生理学的層状化と生体力学を有する培養ヒト軟骨が提供される。例示的な一実施形態によれば、培養ヒト軟骨を含む医療機器が提供される。医療機器は、プラグまたはインプラントとして構成されることが可能である。培養ヒト軟骨を含むプラグは、対象における欠損を塞ぐことができる。プラグは、対象の組織と統合することができる。別の実施形態において、医療機器はインプラントである。インプラントは、骨基質に固定される培養ヒト軟骨を含む。
【００１８】
別の態様において、機械的に機能するヒト軟骨を作る方法が説明される。この方法に関して、トランスフォーミング増殖因子−βに曝されると、間葉系幹細胞は誘導されて細胞体に凝集し、軟骨形成分化を起こし、および天然のヒト軟骨と類似する特性を示す軟骨組織を形成することが分かったのは驚くべきことであった。培養ヒト軟骨を作るための従来の方法は、天然のヒト軟骨と類似する特性を示す機械的に機能するヒト軟骨を形成することができなかった。
【００１９】
例示的な一実施形態において、凝集間葉細胞体（ＣＭＢ）は、間葉凝集遺伝子の発現およびテネイシンの沈着によって示されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのセットで５日間の培養の後、外部境界を形成した。境界域の凝固前に、ＣＭＢは均質の細胞凝集体に融合され、高分化し、機械的に機能する軟骨を生じる。ＣＭＢの間葉凝集および融合を用いて、５週間にわたる培養で、センチメートルの大きさの解剖学的形状のヒト関節軟骨片を生成する。この方法から形成された軟骨の生体力学的性質は天然のヒト軟骨と同等である。一実施形態において、培養軟骨は８００ｋＰａを超えるヤング率と、０．３未満の平衡摩擦係数を有する。培養軟骨の従来の方法は、これらの特性を成し遂げられなかった。ＣＭＢがｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨欠損モデルにおいて機械的に強力な軟骨−軟骨界面を形成する能力があることがわかった。「レゴ様」ブロックの新生軟骨としての働きをするＣＭＢは、生理学的様構造および機械的性質を有するヒト軟骨に組み込むことができる。
【００２０】
本開示の種々の実施形態によれば、機械的に機能するヒト軟骨を作るために、細胞分化および初期の軟骨発達へのシグナルが細胞環境に供給される。一部の実施形態において、
骨格組織および他の間葉組織の発達において極めて重要な段階であり、細胞接着分子および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）によって媒介される間葉凝集を模倣する細胞自己組織化方法が提供される。生理学的な凝集の間、細胞は、一連の間葉凝集段階を経て高密度細胞体を形成することができる。間葉凝集は、細胞体のその後の増殖と分化を明確にすることができる境界域を凝固する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、間葉系幹細胞はＴＧＦ−βなどの調節因子の存在下で細胞凝集および軟骨形成が行われることが示される。
【００２１】
種々の実施形態によれば、間葉系幹細胞凝集は、機能するヒト軟骨を作る方法として提供される。凝集間葉細胞体（ＣＭＢ）は、それらの凝集境界域の凝固前に融合することによって大きな均質の細胞凝集体を形成するよう誘導されることが可能である。この方法は、生理学的層状化特性、剛性またはトライボロジー的性質を有するセンチメートルの大きさの解剖学的形状の関節軟骨構築物を生成することができる。軟骨を修復するＣＭＢの能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨欠損モデルで明らかにされている。このアプローチは、軟骨に関連するばかりでなく、間葉凝集由来の他の組織に関する再生医療で使用されることができる。
【００２２】
本明細書に記載のように、間葉凝集の一部の態様の反復発生は、機能する軟骨をｈＭＳＣから形成することをもたらした。図１〜６を参照して、ｈＭＳＣ凝集および境界域凝固をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。例示されるように、一実施形態において、ｈＭＳＣは凝集後、１日以内にＣＭＢへの凝集が起こり、早くも７日目に境界域凝固が起きた。
【００２３】
間葉凝集の間の主要な境界域凝固タンパク質であるテネイシン−Ｃおよびシンデカン−３が上腕骨、橈骨および尺骨の外形を描いている発育中のニワトリ四肢の周辺で高度に発現することを発達研究は明らかにしている。境界域の凝固前、わずかに初期（７日目以前）のＣＭＢが均質に融合され、軟骨形成分化と大きな機能する軟骨組織の形成とを誘導することが可能である。これらの知見は、フィブロネクチンへの細胞付着性を調節する際のテネイシン−Ｃの既報告の役割と整合している。
【００２４】
本開示の種々の実施形態によれば、生理学的圧縮弾性率と潤滑特性を有する大きな軟骨組織は、ＣＭＢを融合し、それらの軟骨形成分化を誘導しながら、図７〜１０に示すように軟骨下骨との界面も確定することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作製に成功している。
【００２５】
一実施形態において、ｈＭＳＣはＴＧＦ−β３を補充した培養液に懸濁され、ウェルの底で凝集され、１２時間のインキュベーションの後に単一細胞体に凝集された。３日目までに、図１に示すように不適当な凝集を表す両凹面ディスク構造体を形成した大きな凝集体（５×１０５〜２×１０６の細胞を含有する）とは対照的に、小さな凝集体（＜５×１０５の細胞を含有する）は高密度の球状細胞体を形成した。図２は、細胞充実性の相対的増加も、大きな凝集体よりも小さな凝集体の方が高かったことを示している。ＣＭＢの形成のために２．５×１０５細胞が選択された。
【００２６】
凝集後、ＣＭＢは発達し、長期間にわたってその球状構造体を維持した。組織境界域の形成を調査するために、間葉凝集中の境界域凝固タンパク質であるテネイシンの生成と局在化が検討された。テネイシンの生成は経時的に増加し、その結果、凝集の７日目までにはＣＭＢの外面全体にテネイシンの豊富なＥＣＭが存在し、凝集の進展段階の境界域が凝固した（図４）。フィブロネクチン（ＦＮ１）の発現は安定した状態を保っていたが、一方、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス９の軟骨形成分化因子（ＳＯＸ９）、細胞接着ホメオボックスＡ２の転写因子（ＨＯＸＡ２）、細胞接着カドヘリン２（ＣＤＨ２）遺伝子および境界域凝固タンパク質  テネイシンＣ（ＴＮＣ）とシンデカン３（ＳＤＣ３）の発現のすべては経時的に増加し（図５）、凝集過程の成熟および間葉凝集境界域の凝固についての証拠を示した。
【００２７】
７〜９日間の培養の間、ＣＭＢは境界域を発達させ、種々の発達段階で互いに均質に融合するＣＭＢの能力が調査された（図３）。融合から７日目、テネイシンがＣＭＢの外面および隣接するＣＭＢ間に存在し、統合が不十分であることを示唆した（図６）。成熟するＣＭＢ（７〜９日間）の周りの凝固境界域は、組織体の周辺で定着した境界になり、５週間の軟骨形成分化にわたり維持された（図６）。対照的に、初期のＣＭＢ（１〜５日間の凝集）が互いに融合されるとき、均質の統合が達成された（図６）。
【００２８】
図７および図８を参照して、融合ＣＭＢから生成された機能する軟骨を含む医療機器が調製された。この例示的な実施形態において、ＣＭＢの層は、多孔質の脱細胞化骨マトリックスに付着された。高密度細胞領域が生成され（関節軟骨の前駆体）、およびＣＭＢの骨マトリックスへの浸透が促進された（軟骨下領域の前駆体）。高密度細胞層は軟骨に発達し、５週間にわたる培養で骨マトリックスと統合された（図８および９）。軟骨下領域の細胞内含量によって測定されるように、初期ＣＭＢ（１〜５日間）内の細胞は後期ＣＭＢ（７日間）内の細胞よりも浸透力があり、遊走性が高いことが観察された（図４）。グリコサミノグリカンおよびヒドロキシプロリンの量によって示されるように、成熟の異なる段階の融合ＣＭＢの軟骨形成分化能は類似していた（図４）。表１を参照して、関節軟骨組織の得られた機械的性質は、かなり異なっていた。軟骨のヤング率は、後期ＣＭＢよりも初期ＣＭＢに対してかなり高かった。対応する摩擦係数と有意差がなかった。特にｉｎ  ｖｉｔｒｏで初期ＣＭＢから５週間にわたり培養した軟骨のヤング率（平均８００ｋＰａ超、表１）および平衡摩擦係数（約０．２８、表１および図１〜２）は、成人ヒト関節軟骨の生理学的範囲内であった。
【００２９】
【表１】
2018510673.tif 000003
【００３０】
別の実施形態において、解剖学的形状軟骨は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された。この実施形態において、顆軟骨は、ＣＭＢを解剖学的形状の多孔質骨足場上にプレス成形によって作られた（図１）。ＣＭＢは足場に浸透する高密度細胞層を形成し、５週間の培養後、足場の顆表面を覆う厚い軟骨層（＞１ｍｍ）に発達した（図１２）。組織学的分析により、生理学的様関節軟骨の組織構造が明らかになった（図１３〜１８）。軟骨性のＥＣＭは、大量のグリコサミノグリカンとＩＩ型コラーゲンを含有した（図１４〜１５）。深いゾーン（１３０３、１４０３、１５０３、１６０３、１７０３、１８０３）において、細胞は、グリコサミノグリカン（１４０３）とＩＩ型コラーゲン（１５０３）が豊富なＥＣＭによって囲まれているラクナで見いだされた。表面的ゾーン（１３０２、１４０２、１５０２、１６０２、１７０２、１８０２）は、関節面（１６０２）に対して接線方向に配置されている扁平細胞とラブリシンの豊富なＥＣＭから構成されていた。軟骨下領域において、ＥＣＭはグリコサミノグリカン、Ｉ型コラーゲンとＸ型コラーゲン（１３０４、１４０４、１５０４、１６０４、１７０４、１８０４）から構成されていた。
【００３１】
一態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル内でＣＭＢによる軟骨修復が提供される。前に使用されたモデルに類似する軟骨欠損のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて、軟骨再生に関するＣＭＢの能力を評価した。軟骨形成条件下での５週間の培養後、融合ＣＭＢは完全に軟骨欠損を満たし、周囲の軟骨と統合していた。統合強度は、融合ＣＭＢと周囲の軟骨の間の統合界面を壊すのに必要な力と応力で決定した。力と応力は双方とも、未処理の対照欠損においてよりもＣＭＢ群において２桁高かった（それぞれ、２．５±０．４８Ｎ  ｖｓ．０．０３±０．０２Ｎ；３９９±５６ｋＰａ  ｖｓ．４．４±１．９ｋＰａ）（図２０）。高い統合強度は、融合ＣＭＢによる軟骨性のＥＣＭ形成と相関した（図２１〜２２）。
【００３２】
これまでに提案された軟骨組織工学の足場に基づく技術または自己凝集技術とは異なり、本開示の方法は、下層の骨と適合した十分な層状軟骨に最終的に発達する、密集細胞凝集体内で間葉凝集を模倣する。５週間の培養後、培養軟骨について測定した圧縮弾性率と摩擦係数は、天然の関節軟骨の測定値の範囲内である。コラーゲン総含量は天然の軟骨よりも低いが、得られた圧縮弾性率は高密度のＧＡＧに関連し（図７〜１０）、軟骨細胞由来の培養軟骨との結果値に似ていた。凝集境界域の凝固前のＣＭＢ融合は、機能する軟骨構築物の形成および下層の骨とのシームレス統合に不可欠であった。これまで、そのような生物学的忠実度は、ｈＭＳＣからの軟骨形成のいかなる方法によっても達成されなかった。
【００３３】
初期ＣＭＢの自由形成特性を用いて、天然の関節軟骨に似ている組成物、構造および機械的性質と表面性質を有し、解剖学的な脱細胞化骨足場の顆表面を覆う連続する厚さ１ｍｍの軟骨層が作られる（図１１〜１８）。そのラブリシンの豊富な層を有する表在面の層状形成（図１６）は、軟骨面の生理学的に低い摩擦係数（表１）と関連していた。さらに、軟骨層と軟骨下領域の間の界面で存在するＸ型コラーゲン（図１８）は、石灰化軟骨の発達を示唆した。大きな構築物内の骨界面近くのＧＡＧ密度は、Ｘ型コラーゲンとＧＡＧの両方が豊富な天然の軟骨−骨の界面においてよりも低く、さらなる肥大軟骨細胞系列または長期間の培養に向かって分化の必要性を示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで肥大する治療方法およびそれに続く関節への移植によって検証される場合、ＣＭＢ系軟骨の特許を存続させることを確認するために、さらなる研究も必要であろう。
【００３４】
融合するＣＭＢの有用性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨欠損モデルを用いてさらに検討された（図１９〜２２）。軟骨形成の誘導の後、融合ＣＭＢは欠損を満たし、周囲の天然の軟骨と機械的、構造的に統合していた。この統合能により、ＣＭＢを臨床的に応用して、軟骨球システムと同様に簡単な注入送達によって欠損を修復し得ることが期待できる。
【００３５】
本開示の種々の実施形態によれば、軟骨下骨基質と適合した機械的に機能するヒト軟骨は、間葉凝集の重要な発達過程の一部の態様を模倣することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。この技術は、生理学的層状化、ヤング率（＞８００ｋＰａ）および摩擦係数（＜０．３）を有する臨床的な大きさで、解剖学的形状のヒト軟骨をつくる。４００ｋＰａの統合強度を有する軟骨−軟骨界面の形成によって証明されるように、この技術は天然関節軟骨の欠損を修復するために用いることができる。この技術は、腱または半月板などの他の組織の生物工学での作製、および胚性幹細胞や人工多能性幹細胞などの他の細胞源の使用まで拡張することができる。
【００３６】
実施例
骨髄由来のヒト間葉系幹細胞。
新鮮なヒト骨髄穿刺液をＣａｍｂｒｅｘから入手した。骨髄由来のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をプラスチック表面に付着させることによって分離した。細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよび０．１ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子を補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。ｈＭＳＣを第３継代まで培養し、多系列分化能を示すことを明らかにした。
【００３７】
凝集間葉体（ＣＭＢ）の生成。
ｈＭＳＣを培養液（１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコビル酸−２−リン酸、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム、４０μｇ／ｍｌのプロリン、１％インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム［ＩＴＳ＋］混合物、１％抗生物質、および１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子−β３［ＴＧＦ−β３］を補充した高グルコースＤＭＥＭ）に懸濁させた。ＣＭＢの最適規模を決定するために、ｈＭＳＣを１０５、２．５×１０５、５×１０５、１０６、１．５×１０６および２×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁させた。１ｍｌの細胞懸濁液を深い丸底の９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）に加え、２５０ｇで５分間遠心させた。細胞を制御された加湿チャンバー（３７℃、５％ＣＯ２）内でインキュベートした。培地は３日間、一日１回交換した。ＤＮＡ含量を分析するために、試料（ｎ＝４）を画像化して収集した。２．５×１０５細胞を用いて作製したＣＭＢは凝集能が最も高い（図１〜２）ためすべての実験で使用した。
【００３８】
ＣＭＢの成熟度を調べるために、ＣＭＢを培地中でインキュベートし、遠心分離後１日目に開始して９日間まで、一日おきに収集した。ＣＭＢを１０％ホルマリンで固定した、またはトリゾール中に保管した（ｎ＝４）。ＣＭＢの融合能を検査するために、遠心分離後１日目、３日目、５日目、７日目および９日目に、３個のＣＭＢをポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ウェル（直径３ｍｍ、深さ２ｍｍ）の内側に押しつけた。融合ＣＭＢをさらに７日間培養した。ＣＭＢの融合をパラフィン切片で組織学的に調べた。
【００３９】
関節軟骨の製作。
円柱状の関節軟骨を製作するために、（３日目、５日目または７日目）のＣＭＢを８個、内径４ｍｍ×厚さ４．５ｍｍのＰＤＭＳ環内に置いた。脱細胞化骨梁マトリックス足場（内径４ｍｍ×厚さ４ｍｍ）を２個、ＣＭＢの上部の環の内部に押しつけた。ＣＭＢは互いに融合し、多孔質足場の内側に浸透して、足場上に（軟骨領域）厚さ５００μｍの細胞層を有する構築物を作り、軟骨下領域に浸透した（図２２〜２３）。この構築物を５週間培養し、機械的分析（ｎ＝４）、生化学的分析（ｎ＝４）および組織学的分析を行った。
【００４０】
解剖学的な関節軟骨を製作するために、ヒト顆の３Ｄ画像を患者（現行のＩＲＢに従って、画像を完全に匿名化した）から撮ったＣＴスキャンから取得した。厚さ１ｍｍの軟骨領域を顆の関節面の上に作製した。ＰＤＭＳモールドを、３Ｄプリンティングした、軟骨層を有する顆から製作し、足場を保持するための１片と、ＣＭＢのプレス成形のために関節軟骨側を保持するための別の１片との２片に切断した。３日目のＣＭＢ（ｎ＝１２０）を関節軟骨側でモールドの内側に置いた。ＣＭＢを融合させ、細胞浸透を足場に誘導するために、前述の通り、脱細胞化骨梁から作製した解剖学的なヒト顆足場をＰＤＭＳモールドの内側にフィットさせ、ＰＤＭＳモールドの関節軟骨側の上まで下げた。構築物を１０ｍｌの培地で５週間培養し、培養中１週間に２回培地を変えた。
【００４１】
トリゾール法を用いて、メーカーの説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲ  ＲＮＡを精製した。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、ＣＡ）とともにリアルタイムＰＣＲ機械を使用して、間葉凝集転写因子（ＳＯＸ９とＨＯＸＡ２）、細胞接着遺伝子（ＣＤＨ２）および凝集細胞外マトリックス遺伝子（ＦＮ１、ＴＮＣとＳＤＣ３）を定量化した。
【００４２】
【表２】
2018510673.tif 000004
【００４３】
固定化後の免疫蛍光および免疫組織化学染色、試料は、Ｉｍｍｕｎｏｃａｌ溶液（脱細胞化骨足場を含んでいる場合）で脱灰し、パラフィン包埋して、厚さ５μｍの切片に切断した。この切片をＧＡＧおよびトリクロームについてヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）、アルシアンブルーで染色した。試料をＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲンおよびラブリシン（Ａｂｃａｍ，ＭＡ）についても免疫組織化学的に染色した。Ｎ−カドヘリンとテネイシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）を免疫蛍光染色のために使用した。
【００４４】
前述の通り、生化学的分析ＤＮＡ、ＧＡＧおよびヒドロキシプロリンの含量を測定した。手短に述べると、軟骨領域と軟骨下領域を多孔質の脱細胞化骨足場の平面に沿って分離し、湿重量を決定した。試料（群当たりｎ＝４）を５０℃で、０．５ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液中で消化した。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）を用いてＤＮＡ含量を決定した。抽出物の硫酸化ＧＡＧ（ｓ−ＧＡＧ）含量は、基準としてコンドロイチン−６−硫酸とともに１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）染料比色アッセイを用いて決定した。ヒドロキシプロリン含量を酸加水分解で測定した。関節軟骨の機械的試験、軟骨の圧縮ヤング率を前述の通り、ＰＢＳ中で一軸圧縮を用いて測定した。円柱状構築物を最高３，０００秒間まで、０．０１％ひずみ／秒で圧縮し、次いで圧縮荷重を測定した。ヤング率を応力−ひずみ曲線の線形勾配から算出した。
【００４５】
軟骨とガラスの間の摩擦係数を前述の通り、一軸圧縮で、ＰＢＳ浴中で測定した。連続する往復摺動を１ｍｍ／秒の速度および平行移動範囲±１０ｍｍで使用した。軟骨の法線力、摩擦力および軸変形を試験の間、モニターした。すべての検査は、１，８００秒後に終えた。時間依存摩擦係数（μｅｆｆ）を摩擦力対法線力の比率で算出した。最小摩擦係数（μｍｉｎ）および平衡摩擦係数（μｅｑ）は、それぞれμｅｆｆの最小値と、実験終了時に達した値を表した。
【００４６】
統計的分析の結果のペアワイズ比較を、多元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行い、続いてＰｒｉｓｍソフトウェアを使用し、０．０５のａで、テューキーの多重比較検定を行った。
【００４７】
ＣＭＢの生成と融合。
ＣＭＢを生成するために、ｈＭＳＣを軟骨形成培養液（１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３、１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコビル酸−２−リン酸、１００μｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウム、４０μｇ／ｍＬのプロリン、１％インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）＋混合物、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭ）に懸濁させた。ＣＭＢの最適規模を決定するために、ｈＭＳＣを１０５、２．５×１０５、５×１０５、１０６、１．５×１０６および２×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。１ミリリットルの細胞懸濁液を深い丸底の９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に等分し、次いで２５０×ｇで５分間遠心させた（図３）。細胞を制御された加湿チャンバー［３７℃、５体積％  ＣＯ２］内でインキュベートした。培地は３日間まで、一日１回交換した。ＤＮＡ含量を分析するために、試料を画像化して収集した（ｎ＝４）。２．５×１０５細胞を用いて作製したＣＭＢは、その凝集能およびコンパクトな球状ＣＭＢの形成のためにすべての実験で使用した。ＣＭＢの発達と成熟度を調べるために、ＣＭＢを培地中でインキュベートし、遠心分離後１日目に開始して９日間まで、一日おきに収集した。ＣＭＢを組織学的および免疫組織化学分析のために１０体積％ホルマリンで固定した、または遺伝子発現分析のためにトリゾール中に保管した（ｎ＝４）。ＣＭＢの融合能を検査するために、遠心分離後、１日目、３日目、５日目、７日目および９日目に、３個のＣＭＢをポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ウェル（直径３ｍｍ、深さ２ｍｍ）の内側にステンレス鋼ブロックで押しつけ（図３）、５週間まで培養して、組織学的評価を行った。
【００４８】
円柱状軟骨プラグの生成。
（３日目、５日目または７日目）のＣＭＢを８個、ＰＤＭＳ環（内径４ｍｍ×高さ４．５ｍｍ）の内側に置いた。脱細胞化円柱状の骨梁マトリックス足場（直径４ｍｍ×高さ４ｍｍ）を前述の通り処理し、ＣＭＢの上部の環の内部に押しつけた。骨軟骨構築物を、その骨部分をＣＭＢ層内に押しつけることによって形成した。モールドの内部形態は軟骨層の形成のための０．５ｍｍの空き空間があり、一つの試料から別の試料への加圧が一貫して維持された。ＣＭＢ層をステンレス鋼ブロック上に押しつけることによって軟骨層を再現性よく形成することができたが、ＣＭＢの自然融合によって加圧せずに軟骨層を再現性よく形成することはできなかった。構築物を５週間培養し、機械的分析（ｎ＝４）、生化学的分析（ｎ＝４）および組織学的分析（ｎ＝４）を行った。
【００４９】
解剖学的形状軟骨の生成。
解剖学的ヒト顆の３Ｄ画像を、前述の調査のように患者のＣＴスキャンから取得した。顆の関節面を覆うために、厚さ１ｍｍの軟骨領域を、再構築した３Ｄ画像から設計した。上述の骨軟骨プラグに関しては、軟骨層の形成のための１ｍｍの空き空間を備えたモールドを用いることによって、解剖学的形状の構築物を、その骨部分をＣＭＢ層内に押しつけることによって形成した。ＰＤＭＳモールドを作製し、足場を保持するための１片と、ＣＭＢのプレス成形のために関節軟骨側を含有するための別の１片との２片に切断した（図１１）。計１２０個のＣＭＢ（３日目）を関節軟骨側でモールドの内側に置いた。ＣＭＢを融合させ、足場内への細胞浸透により解剖学的形状にＣＭＢを成形するために、前述の通り、脱細胞化骨梁から解剖学的ヒト顆足場を作製し、ＰＤＭＳモールドの内側にフィットさせ、ＰＤＭＳモールドの関節軟骨側の上まで下げた。構築物を５週間培養し、１週間に２回培地を変えた。
【００５０】
軟骨欠損モデル。
骨軟骨外植片を２月齢〜４月齢のウシの手根中手関節の中心から切り離し、円柱（直径４ｍｍ×厚さ４〜６ｍｍ）に切断した。外植片の中心で軟骨片を取り除くことによって軟骨欠損モデルを形成し、１．５ｍｍの生検パンチによって軟骨環を生成しながら、軟骨下骨をそのまま残した。４個のＣＭＢを軟骨の空隙内に置き、平らなステンレス鋼ブロックで押しつけることによって詰めた（図１９）。構築物を軟骨形成培養液中または増殖培地（陰性対照）中で５週間培養し、機械的分析（ｎ＝４）および組織学的分析（ｎ＝４）を行った。
【００５１】
解剖学的足場およびバイオリアクターチャンバーの製作。
移植片は、修復される欠損の磁気共鳴画像またはコンピュータ断層撮影画像に基づいて設計する。個々のスライスをＭｉｍｉｃｓ（登録商標）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）などのコンピュータ支援ソフトウェアを用いて、３次元（３Ｄ）ファイルに変換する。再構築される移植片のために正確な解剖学的適合を定義した後に、移植片の３Ｄコンピュータモデルを．ＳＴＬファイルとしてエクスポートし、足場およびバイオリアクターのマッチングインナーチャンバーの製作で使用する。
【００５２】
解剖学的足場を製作するためには、３ＤモデルＳＴＬファイルをＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）にインポートし、材料のブロックから解剖学的足場をミリングするためのＧコードをＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓのアドインのＭａｓｔｅｒＣＡＭ（ＣＮＣ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＣＴ，ＵＳＡ）を使用して作成する。本検討で使用した足場材料は、子牛の膝から筋肉、膝蓋骨、線維性結合組織、靭帯および半月板を取り除いた後採取し、露出した大腿骨頭だけを残したウシ骨梁であった。卓上バンドソーを使用して、関節軟骨と皮質骨を取り除いて、海綿状骨梁を分離した。旋盤（ＬｉｔｔｌｅＭａｃｈｉｎｅＳｈｏｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、機械加工の間、ブロックを保持するのに十分な構造であるように、直径が３Ｄ移植片モデルの幅よりも少し大きく、長さが３Ｄ移植片モデルよりもおよそ３ｃｍ長い円柱状ブロックに海綿骨を成形した。４枚刃１／４”ボールエンドミル（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、４軸ＣＮＣフライス盤（ＬｉｔｔｌｅＭａｃｈｉｎｅＳｈｏｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）で円柱状骨ブロックから解剖学的骨足場を成形した。解剖学的形状の骨ブロックは、以前に確立した方法を用いて低張液、界面活性剤（複数回洗浄）およびＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅ溶液を使用して完全に脱細胞化した。
【００５３】
次いで、各解剖学的移植片と同じ３Ｄ画像を使用して、骨軟骨構築物を培養するための内側バイオリアクターチャンバーを製作するためのモールドを設計した。ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓで関節面の形状を設定するための表面選択ツールを使用することで、望ましい軟骨の厚さを関節面にわたって確立した。望ましい厚さはほとんどの場合、１ｍｍ以上であった。次いで、Ｇコードを作成して、構築物を保持するＴｅｆｌｏｎロッド（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ，ＮＪ，ＵＳＡ）をミリングした。次いで、ミリングした部分を使用して、ＳｙｌＧａｒｄ（登録商標）１８４  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＭＩ，ＵＳＡ）をミリングした構造に注いでネガ型モールドを作製した。硬化してすぐ、シリコーン樹脂を、脱細胞化骨足場を保持するための１片と、モールド内部で関節面に押しつけられることになる凝集間葉体（ＣＭＢ）を保持するための別の１片との２片に切断した。ツーピースモールドを高圧蒸気滅菌法で滅菌した。この処理の主要なステップを図２７に模式的に示す。
【００５４】
骨髄由来の間葉系幹細胞の調製。
新鮮なヒト骨髄穿刺液を整形外科（完全に非特定化された外科材料については非ヒトＩＲＢを通して）から、または市販供給元、例えばＣａｍｂｒｅｘ（ＮＪ，ＵＳＡ）からのいずれかで入手した。間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）は、細胞培養プラスチック製品に付着させることによって分離し、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよび０．１ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞を第３継代まで培養し、多系列分化能を検査した。
【００５５】
凝集間葉体の生成。
トリプシン処理後、１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのアスコビル酸−２−リン酸、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム、４０μｇ／ｍｌのプロリン、１％インスリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ＋）との混合物、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子−β３（ＴＧＦ−β３）を補充した高グルコースＤＭＥＭからなる軟骨形成培養液に５×１０５細胞／ｍｌの濃度でＢＭＳＣを懸濁させた。１ｍｌの細胞懸濁液を深い丸底の９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）のウェルに加え、２５ｇで５分間遠心させた。細胞を３７℃／５％  ＣＯ２で一晩インキュベートして、球状ＣＭＢを形成し、これを骨軟骨組織構築物の軟骨層を生成するために用いた。
【００５６】
組織構築物の製作。
３日の培養の後、球状ＣＭＢは直径がちょうど１ｍｍを超えるまで成長する。各構築物で使用したＣＭＢの数は、式Ｉを用いて設計することが必要な軟骨層の体積から算出することができる。
【００５７】
【数１】
2018510673.tif 000005
【００５８】
例えば、表面積が１ｃｍ２で、厚みが１ｍｍの関節軟骨の層の場合、モールドの関節側に移される１９０個のＣＭＢが必要になるだろう。次いで、解剖学的足場をモールドの他方側に挿入して、関節側にゆっくり押しつける（図２８）。圧縮力をかけることによってＣＭＢを互いに融合させて、関節面上に均一の深さで成形させる。十分な量の融合ＣＭＢが骨相に浸透して、形成軟骨と骨の間を統合させることが重要である。骨軟骨組織構築物を軟骨形成培地で５週間培養した。培地は、ＣＭＢ当たり１００μｌの量を使用し、１週間に２回交換した。
【００５９】
プレス形成の後、融合ＣＭＢは、モールド内部の骨基質の表面に高密度細胞層を形成した。最初の構築物は、（ｉ）培養に続いて軟骨面を形成する高密度細胞層と、（ｉｉ）骨基質との明らかに区別される２つの層からなっていた。骨基質に融合ＣＭＢが浸透すると界面が生成され、層状構造が形成されることによってこれらの２つの層が徐々に組み合う。
【００６０】
軟骨形成培地での５週間の培養後、軟骨組織の高密度層、その下の骨組織、その間の界面を有する骨軟骨組織構築物が形成される（図２９）。これらの構築物は、軟骨から骨領域まで構造特性と組成特性の天然様勾配を有する非常に発達した層状構造を示した。軟骨領域は、グリコサミノグリカンと、天然の関節軟骨の主成分であるＩＩ型コラーゲンとが豊富にあったが、Ｉ型コラーゲンは主に骨領域に存在していた（図２９）。特に、関節軟骨面の潤滑に不可欠なタンパク質であるラブリシンは、軟骨層の表在面に存在していた。
【００６１】
界面は、最小限の量のグリコサミノグリカンとＩＩ型コラーゲンだけを沈着させ、代わりにＩ型コラーゲンとＸ型コラーゲに囲まれていた足場孔に存在する細胞からなっており、石灰化軟骨の形成を示していた。
【００６２】
本方法は、初めて、ヒトＭＳＣから作られた軟骨をもたらし、生理学的範囲で機械的性質を達成した。圧縮で測定されたヤング率および培養軟骨のトライボロジー検討で測定された摩擦係数の双方とも若い天然軟骨で測定されたそれらと同等であった（表３）。
【００６３】
【表３】
2018510673.tif 000006
【００６４】
本明細書に記載の方法は、四肢発生の間、軟骨形成に先立つ、間葉凝集の自然過程の基礎をなす機序に特に関してＢＭＳＣの自己組織化の機序を利用している。本技術は、ＢＭＳＣ凝集による外部境界域の凝固の理解を必要とする。球状細胞体を形成した後に、ＢＭＳＣは、細胞外マトリックスを分化させて、沈着し始める。このマトリックスの主要な成分の一つはテネイシンであり、これは組織境界域を凝固する間葉凝集の間、沈着される境界域凝固タンパク質である。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＳＣ凝集の間、テネイシンは、凝集後５日目までに、球状体の外面で周辺を蓄積し始める。これは境界域凝固の表示であった。間葉体が互いに押しつけられるときでも、間葉体上の外部境界域の凝固によって間葉体の融合が阻止された。次に、これが示唆するのは、球状形成から５日以内に融合が誘導される場合のみ、大量の軟骨が単独で、または骨軟骨構築物の内部で生成されることがあり得ることである。
【００６６】
実際、ＢＭＳＣの凝集によって形成される間葉体のプレス成形（図２８）により、高密度で空間的に均一な細胞層になる。この高密度細胞層は、自然の間葉凝集の間、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成され、および軟骨形成のプラットフォームとして役立つ層に似ている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、極めて高い細胞密度のこれらの緻密層は、細胞外マトリックスの急速な沈着を誘導する。その結果、培養組織は機械的強度が強くなり、ヤング率と摩擦係数の両方が生理学的レベルに達した（表３）。同時に、緻密細胞層は、表面にラブリシン、バルク相にプロテオグリカンとＩＩ型コラーゲン、骨基質との界面でＸ型コラーゲン、および骨相内にＩ型コラーゲンを含有している生理的層状軟骨に発達した（図２９）。
【００６７】
このように、骨基質との界面でＢＭＳＣから形成された間葉体の融合は、生理学的組成物、組織形態および機械的性質とともにヒト骨軟骨組織構築物を生成する効果的な方法であり得る。このアプローチにより、ＢＭＳＣから生成されたヒト軟骨が生理学的な剛性および摩擦係数に達することを可能にする。また、本方法は、画像誘導製造によって作製された足場を使用して、生成される解剖学的形状骨軟骨構築物の工学技術を可能にする。
【００６８】
厚さが２ｍｍの軟骨層の軟骨面１ｃｍ２の再構築には、ほぼ１億のＢＭＳＣが必要である。顆全体を再構築するには、何億もの細胞が必要である。この数を減らすために、間葉凝集を、足場の使用および脂肪組織などの容易に利用でき豊富な間葉系細胞源の利用と組み合わせてもよい。
【００６９】
本開示の主題は、いくつかの例示的な実施形態の観点から本明細書に記載されているが、当業者は、その範囲から逸脱することなく、本開示の主題に対して種々の修正および改善がなされ得ることを認識するであろう。さらに、本開示の主題の一実施形態の個々の特徴は、本明細書に述べられているか、または該一実施形態の図面に示されていて、別の実施形態には述べられていない場合があるが、一実施形態の個々の特徴が別の実施形態の１または複数の特徴、または複数の実施形態からの特徴と組み合わせ得ることが明らかであろう。
【００７０】
以下に主張する具体的な実施形態に加えて、本開示の主題は、以下に主張する従属特徴と上に開示の特徴との任意の他の可能な組み合わせを有する他の実施形態にも関する。ということで、従属クレームに提示し、および上に開示の特定の特徴は、本開示の主題の範囲内で、他の方法で互いに組み合わせることが可能であり、したがって本開示の主題は他の可能な組み合わせを有する別の実施形態にも本質的に関すると認識されるべきである。したがって、本開示の主題の具体的な実施形態についての上述の記載は、例示と説明を目的として提示されている。本開示の主題は開示した実施形態を網羅している、またはそれに限定されることを意図するものではない。
【００７１】
種々の修正および変更が本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の方法およびシステムになされ得ることは当業者には明らかであろう。したがって、本開示の主題は添付の特許請求の範囲および均等物の範囲内にある修正および変更を含むことを意図している。
【図１】
2018510673.tif 000007
【図２】
2018510673.tif 000008
【図３】
2018510673.tif 000009
【図４】
2018510673.tif 000010
【図５】
2018510673.tif 000011
【図６】
2018510673.tif 000012
【図７】
2018510673.tif 000013
【図８】
2018510673.tif 000014
【図９】
2018510673.tif 000015
【図１０】
2018510673.tif 000016
【図１１】
2018510673.tif 000017
【図１２】
2018510673.tif 000018
【図１３】
2018510673.tif 000019
【図１４】
2018510673.tif 000020
【図１５】
2018510673.tif 000021
【図１６】
2018510673.tif 000022
【図１７】
2018510673.tif 000023
【図１８】
2018510673.tif 000024
【図１９】
2018510673.tif 000025
【図２０】
2018510673.tif 000026
【図２１】
2018510673.tif 000027
【図２２】
2018510673.tif 000028
【図２３】
2018510673.tif 000029
【図２４】
2018510673.tif 000030
【図２５】
2018510673.tif 000031
【図２５−２】
2018510673.tif 000032
【図２６】
2018510673.tif 000033
【図２７】
2018510673.tif 000034
【図２８Ａ】
2018510673.tif 000035
【図２８Ｂ】
2018510673.tif 000036
【図２８Ｃ】
2018510673.tif 000037
【図２８Ｄ】
2018510673.tif 000038
【図２９】
2018510673.tif 000039
【国際調査報告】
2018510673.tif 000040