(57)【要約】  本発明は、タンパク質、とりわけモノクローナル抗体（ｍＡＢ）のその関連する電荷変化体（例えば酸性および塩基性モノマー）、グリコシル化変化体、および／または可溶性サイズ変化体（例えば集合体、モノマー、２／３フラグメント、３／４フラグメント、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）および結晶性フラグメント（Ｆｃ）からの改善された分取分離のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも２つの異なるタンパク質を含む試料を提供するステップ、
ｂ）この混合物を、≧５ｍｇ／ｍｌ、特に≧３０ｍｇ／ｍｌ、とりわけ≧６０ｍｇ／ｍｌの全タンパク質の量でイオン交換材料に適用するステップ、
ｃ）ｐＨおよび導電率の同時変化によって特徴付けられる溶出によってタンパク質を分離するステップ
によって、タンパク質の混合物からタンパク質を分離し、および精製するための方法。
【請求項２】
ａ）少なくとも２つの異なるタンパク質を含む試料を提供するステップ、
ｂ）この混合物をイオン交換材料に適用するステップ、
ｃ）ｐＨを上昇させ、および、塩濃度を下降させること、または逆にｐＨを下降させ、および、塩濃度を上昇させることによって、ｐＨ−塩の逆グラジエントを行い、タンパク質を分離するステップ、および任意に、
ｄ）ｃ）からの分離データを利用して、タンパク質分離のステップ溶出プロファイルを定義し、ステップ溶出プロファイルを行うステップ、
によって、タンパク質の混合物からタンパク質を分離し、および精製するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）少なくとも２つの異なるタンパク質を含む試料を提供するステップ、
ｂ）この混合物をイオン交換材料に適用するステップ、
ｃ）ｐＨを上昇させ、および、塩濃度を下降させること、または逆にｐＨを下降させ、および、塩濃度を上昇させることによって、ｐＨ−塩の逆グラジエントを行い、タンパク質を分離するステップ、および
ｄ）グラジエント溶出でタンパク質を分離するステップ、
によって、タンパク質の混合物からタンパク質を分離し、および精製するための、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
全タンパク質の量が、≧５ｍｇ／ｍｌ、特に≧３０ｍｇ／ｍｌ、とりわけ≧６０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質の混合物が、イオン交換材料に吸収または固定され、および、イオン交換材料から溶出される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質の混合物が、アニオンまたはカチオン交換材料に吸収され、およびアニオンまたはカチオン交換材料から溶出される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質の混合物が、混合モードクロマトグラフィー材料に吸収または固定され、および混合モードクロマトグラフィー材料から溶出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｃ）においてｐＨが４．５〜１０．５の範囲で変化され、および、塩濃度が０〜１Ｍの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｐＨグラジエントが、ｐＨ５および９．５に調整された緩衝系を適用することによって誘導される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
塩グラジエントが、０〜０．２５Ｍの濃度範囲で誘導される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨグラジエントが、少なくとも２つの緩衝液の緩衝系を適用することによって誘導され、これによって、１つの緩衝液の存在下でタンパク質の吸収または固定が起こり、ｐＨ値が上昇し、および、塩濃度が同時に下降する間に、他の緩衝液の増加する濃度の存在下で溶出が起こる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｐＨグラジエントが、少なくとも２つの緩衝液の緩衝系を適用することによって誘導され、これによって、１つの緩衝液の存在下でタンパク質の吸収または固定が起こり、ｐＨが下降し、および、塩濃度が同時に上昇する間に、他の緩衝液の増加する濃度の存在下で溶出が起こる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨグラジエントが、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＡＰＳなどを使用した緩衝系および塩化ナトリウムを使用した導電率変化系によって誘導される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質の混合物が、カチオン交換材料に吸収または固定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質の混合物が、アニオンまたは混合モードクロマトグラフィー材料に吸収または固定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質、とりわけモノクローナル抗体（ｍＡＢ）が、その関連する電荷変異体、グリコシル化変異体、および／または可溶性サイズ変異体、二量体および凝集体、単量体、２／３フラグメント、３／４フラグメント、一般的なフラグメント、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）および結晶性フラグメント（Ｆｃ）から分離および精製される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、とりわけモノクローナル抗体（ｍＡＢ）のその関連する電荷変化体（例えば酸性およびアルカリ性モノマー）、グリコシル化変化体、および／または可溶性サイズ変化体（例えば集合体、モノマー、２／３フラグメント、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）および結晶性フラグメント（Ｆｃ）からの改善された分取分離のためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質の多様性は、in vivoでの翻訳後修飾の結果として生じるか、またはそれは、化学的および酵素的反応を介して人工的に誘発されるか、または機械的応力、高温もしくは極度のｐＨに起因する発酵および精製プロセスにおける副産物として生じる［１〜４］。ｍＡｂと関連するタンパク質の多様性は、酸性および塩基性変化体のような電荷変化体、グリコシル化変化体、ならびに凝集体、モノマー、フラグメント、Ｆａｂ、およびＦｃ残基のようなサイズ変化体を含むが、それらに限定されない［５〜７］。治療的ｍＡｂにおいて、かかる生成物変化体によって、多様な薬物動態および薬力学がもたらされ、それは、薬物の安定性、有効性および効力に影響を及ぼす［１］。したがって、それらを、完全にプロファイリングし、最終製品プールから除去しなければならない。
【０００３】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、ｍＡｂ産生のための標準的な精製ツールとして使用されている［８］。ｍＡｂについての一般的な下流プロセス（ＤＳＰ）には、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が含まれるが、それらに限定されない［９］。ＩＥＣ（イオン交換クロマトグラフィー）、例えば強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）、弱陽イオン交換クロマトグラフィー（ＷＣＸ）、および弱陰イオン交換クロマトグラフィー（ＷＡＸ）は、極めて類似した等電点（ｐＩ）を有するｍＡｂ電荷変化体ならびにサイズ変化体、グリコシル化変化体、シリル化変化体、およびＣ末端／Ｎ末端加工変化体を含むがそれらに限定されない他のタンパク質変化体を分離するための分析スケールで広く使用されている［７、１０〜１４］。
【０００４】
固定されたｐＨ値を有する塩化ナトリウムを用いた浅い塩勾配傾斜を用いてｍＡｂ変化体を特徴付けることができる一方、電荷変化体分離におけるその適用は、タンパク質特異的であり、個々のｍＡｂについて最適化されなければならない［１５］。クロマトグラフィー（ＣＦ）は、塩勾配に対する代替であり、ここでｐＨ勾配が、両性高分子電解質緩衝液を使用してカラムの内部で［１６〜２１］、またはカラム入口で異なるｐＨ値を有する２種の適切な緩衝液を混合することによって外部で発生し、それはその後、カラムを通って移動する［２２］〜［２６］。それぞれのｐＩ値に依存して、ｍＡｂ電荷変化体は、ｐＨ勾配における異なる点に集束し、その結果高度に分割されたピークを生じる［２７］。
【０００５】
ｍＡｂ電荷変化体分離のためのＩＥＣにおける高速ＣＦの最初の適用は、７．３〜９．０のｐＩ範囲を有する中性および塩基性ｍＡｂに限定された［２８〜２９］。最近、この適用範囲を、ｐＨ勾配においてイオン強度を調節することによって酸性ｍＡｂ（ｐＩ＝６．２）に拡大することができることが、発見された［２９］。上昇した、および制御されたイオン強度でのｐＨ勾配により、酸性、中性、および塩基性ｍＡｂ変化体についてのより良好な分解ピークが得られたことが、報告されている［２９］。上記の例が分析的規模でのｍＡｂ電荷変化体分離のための塩媒介ｐＨ勾配の成功を示す一方、Kaltenbrunner et al.［３０］は、はるかに以前から、マンニトール、ホウ酸塩、および塩化ナトリウムを用いたそれらのｐＨ−塩複合勾配がｍＡｂイソ型を分取的規模において分離することができることを主張している。それらは、下降する塩勾配と組み合わせたｐＨ７．０〜９．１の上昇するｐＨ勾配を使用して、８．１５〜８．７０のｐＩを有するイソタンパク質を分離した。
【０００６】
しかし、いくつかの制限、欠点、および相違が、彼らのアプローチにおいて見られる。例えば、彼らによって示唆された方法は、いくつかの炭水化物側鎖において異なる糖タンパク質イソ型の分離に適しているに過ぎない［２９〜３０］。これによって、かかる勾配系の使用が糖化タンパク質のみに限定され、したがってそれが、他のタイプのｍＡｂ変化体、例えば電荷またはサイズイソ型について非現実的になる。ピーク間の増加した分解能がｐＨ−塩複合勾配に起因することが主張されているが、シス−ジオール含有オリゴ糖と緩衝成分ホウ酸塩との間の非特異的反応がまた改善された分離に対して顕著な効果を有するか否かは、依然として不明確である［２９］。さらに、イソタンパク質のそれらのいわゆる「予備的」分離は、充填した樹脂１ｍＬあたりわずか０．５ｍｇのｍＡｂであり［３０］、それは、プロセス規模分離において使用するには尚極めて低い。
【０００７】
現在まで、ｐＨ−塩複合勾配系を用いたプロセススケール（≧３０ｍｇ／ｍＬ）のｍＡｂ電荷変化体分離は、WCX-Fractogel（登録商標）ＣＯＯ−（Ｍ）について報告されている［３１］。しかし、上昇する塩勾配系を伴う上昇するｐＨ勾配は、酢酸塩を用いて生成され、それは、５〜６の極めて狭いｐＨ範囲のみを包含し、それによりこの方法を約５．６の溶出ｐＨを有するｍＡｂに限定する。それらのｐＨ−塩複合勾配において使用するｐＨ範囲は、カルボキシル官能基のｐＫａ（ｐＫａ＝４．５）に極めて近いことに、留意すべきである。ＷＣＸについて、移動相において使用する緩衝種のほかに、樹脂骨格上の官能基によってまた、特にカルボキシル基のｐＫａ付近のｐＨで一時的なｐＨ変化がもたらされることが、知られている［３２〜３３］。
【０００８】
彼らの研究において使用されたｐＨ範囲がカルボキシル基のｐＫａに極めて近いので、移動相において使用する酢酸塩の他に、樹脂骨格上の部分的にプロトン化されたカルボキシル基がまた勾配系に対して一定の緩衝作用を及ぼすことを予測するのは、合理的である。さらに、複合ｐＨ−塩系におけるｐＨ勾配が酢酸塩緩衝液単独によって発生するか、それがカルボキシル基および酢酸塩の組み合わせた効果であるかは、不明である。同様に、この効果が電荷変化体分離において主要な役割を果たすか否かもまた、不確実である。
【０００９】
また、このタイプの樹脂に推奨される通常の作用ｐＨ範囲は、６〜８であり、ここでカルボキシル基は、完全に脱プロトン化（すなわちイオン化）される。６より低いｐＨ値で作業する場合、ＷＣＸが容量の喪失に苦しむ可能性がある。充填された樹脂１リットル当り３８〜５４ｇの高い結合能がそれらの研究において報告されている［３１］が、この結果は、タンパク質特異的である可能性が高く、それは、それらの研究において示された分離効率が当該特定の抗体にのみ特異的であるという論文中での彼らの最後のメッセージと一致する。６より高いｐＨについてさらなる分離例が示されておらず、他の抗体が研究において使用されていないという事実によって、他のｍＡｂの分離に対するこの方法の適用可能性が疑わしくなる。
【００１０】
いくつかの特許［３４〜３６］は、ｍＡｂ変化体分離のためのＣＥＸおよび混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）の使用をクレームしており、それは、酸性、塩基性、脱アミド化またはグリコール変化体のｍＡｂからのクリアランスを含むが、それに限定されない。それにもかかわらず、これらの特許請求の範囲［３４〜３６］において、塩濃度またはｐＨ値の変化を伴う一勾配溶出および段階溶出が、一度に１回適用された。さらに、供給物は、比較的「純粋」である産物であるｍＡｂ［３４〜３６］以外の電荷変化体−酸性変化体の１つのタイプのみを含んでいた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
解決すべき問題
したがって本発明の目的は、したがって、利用可能な手段で容易に行うことができ、追加の分離工程を必要としない、イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質分離のための新規であり、改善された方法を提供することにある。タンパク質の分離には、ペプチドの分離が含まれる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、タンパク質をタンパク質の混合物から分離し、精製する方法であって、
ａ）少なくとも２種の異なるタンパク質を含む試料を提供し、
ｂ）この混合物を、イオン交換物質に適用し、
ｃ）反対のｐＨ−塩勾配を上昇するｐＨおよび下降する塩濃度によって流して、タンパク質を分離するか、または逆に下降するｐＨおよび上昇する塩濃度を流して、タンパク質分離し、
ｄ）ｃ）からの分離データを用いて、タンパク質分離のためのステップ溶出プロフィールを定義する
ステップによる、前記方法に関する。
したがって、タンパク質を、勾配溶出において分離してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ｍＡｂ  Ａ電荷変化体の分離のための種々の勾配溶出タイプのスクリーニングを示す。
【図２−１】図２において、左の列は、上から下に、図１（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｄ）に示し、記載したそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図２−２】図２において、左の列は、上から下に、図１（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｄ）に示し、記載したそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図２−３】図２において、左の列は、上から下に、図１（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｄ）に示し、記載したそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−１】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−２】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−３】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−４】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−５】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−６】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図３−７】図３ａ〜３ｄにおいて、左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図４】図４において、左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上でのステップ溶出を用いた多重生成物分離を示す。中央および右側の列は、左側における分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図５−１】図５において、左の列は、Eshmuno（登録商標）ＣＰＸ上の３つの線形勾配溶出タイプのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図５−２】図５において、左の列は、Eshmuno（登録商標）ＣＰＸ上の３つの線形勾配溶出タイプのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図５−３】図５において、左の列は、Eshmuno（登録商標）ＣＰＸ上の３つの線形勾配溶出タイプのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図６−１】図６において、左の列は、５％ブレークスルー（ＤＢＣ５％）を使用した、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形塩勾配溶出０〜０．２５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌ、および反対のｐＨ塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図６−２】図６において、左の列は、５％ブレークスルー（ＤＢＣ５％）を使用した、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形塩勾配溶出０〜０．２５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌ、および反対のｐＨ塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図６−３】図６において、左の列は、５％ブレークスルー（ＤＢＣ５％）を使用した、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形塩勾配溶出０〜０．２５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌ、および反対のｐＨ塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図７−１】図７は、図６に示すそれぞれの勾配タイプの溶出したピークにおける個々の電荷変化体の合計百分率を示す。Ａ〜Ｈは、勾配に沿って図６のＣＥＸ−ＨＰＬＣにおいて示す個々の電荷変化体の最大値を示す。数字（１〜７）で標識した直線は、図６における画分プールが採取される位置を示す。
【図７−２】図７は、図６に示すそれぞれの勾配タイプの溶出したピークにおける個々の電荷変化体の合計百分率を示す。Ａ〜Ｈは、勾配に沿って図６のＣＥＸ−ＨＰＬＣにおいて示す個々の電荷変化体の最大値を示す。数字（１〜７）で標識した直線は、図６における画分プールが採取される位置を示す。
【図７−３】図７は、図６に示すそれぞれの勾配タイプの溶出したピークにおける個々の電荷変化体の合計百分率を示す。Ａ〜Ｈは、勾配に沿って図６のＣＥＸ−ＨＰＬＣにおいて示す個々の電荷変化体の最大値を示す。数字（１〜７）で標識した直線は、図６における画分プールが採取される位置を示す。
【図８−１】図８は、図６における反対のｐＨ−塩複合勾配の肩ピーク５〜７からプールした電荷変化体Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを含有する供給物の再クロマトグラフィーを示す。左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌ／０．１０〜０ＭのＮａＣｌ（上から下へ）のそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＥ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図８−２】図８は、図６における反対のｐＨ−塩複合勾配の肩ピーク５〜７からプールした電荷変化体Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを含有する供給物の再クロマトグラフィーを示す。左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌ／０．１０〜０ＭのＮａＣｌ（上から下へ）のそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＥ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図８−３】図８は、図６における反対のｐＨ−塩複合勾配の肩ピーク５〜７からプールした電荷変化体Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを含有する供給物の再クロマトグラフィーを示す。左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌ／０．１０〜０ＭのＮａＣｌ（上から下へ）のそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＥ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【図９】図９において、左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１０】図１０において、左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、３０ｍｇ／ｍＬの充填された樹脂の負荷を用いた、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１１】図１１において、左の列は、Eshmuno（登録商標）ＣＰＸ上でのステップ溶出を用いた多生成物分離を示す。中央および右の列は、左側におけるそれぞれのクロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。
【図１２】図１２において、左の列は、Capto（登録商標）MMC上での線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。右の列は、左側におけるそれぞれのクロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【００１４】
有利には、本発明による方法を、≧５ｍｇ／ｍｌ、特に≧３０ｍｇ／ｍｌ、特に≧６０ｍｇ／ｍｌの高い全タンパク質負荷で行うことができる。このために、タンパク質の混合物を、イオン交換物質に吸着または結合させ、溶出させる。これは、タンパク質混合物をカチオンまたはアニオンまたは混合モードのイオン交換物質上に適切な条件で負荷させ、溶出させることができることを意味する。
良好な分離結果は、ｃ）においてｐＨを４，５〜１０，５の範囲内で、および塩濃度を０〜１Ｍ塩の範囲内で変化させる場合に見出される。分離結果は、ｐＨ勾配をｐＨを５〜９．５に調整した緩衝系を適用することによって誘発させる場合、および塩勾配を０〜０．２５Ｍの濃度範囲内で誘発させる場合に、特に良好である。
【００１５】
本発明の分離方法を、少なくとも２種の緩衝液の緩衝系を適用することによってｐＨ勾配を誘発することによって処理することができ、これによりタンパク質の必要な吸着または結合が、１種の緩衝液の存在下で起こり、溶出が、他の緩衝溶液の増加する濃度の存在下で起こり、一方でｐＨは上昇し、塩濃度は同時に下降するか、またはもう一方の方法は、ｐＨは下降し、塩濃度は同時に上昇する。ｐＨ勾配を誘発するのに適した緩衝系は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＡＰＳなどおよび塩化ナトリウムを用いた導電率変化系を使用する。
【００１６】
好ましくは、タンパク質の分離および精製を、最初にタンパク質の混合物を陽イオン交換物質または混合モードクロマトグラフィー物質に吸着または結合させることによって行う。次に、タンパク質、特にモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を、その関連する電荷変化体、グリコシル化変化体ならびに／または可溶性サイズ変化体、例えばそれらの凝集体、モノマー、２／３フラグメント、３／４フラグメント、一般的フラグメント、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）および結晶性フラグメント（Ｆｃ）から分離し、精製する。
【００１７】
要約すると、これは、本発明がタンパク質、例えばモノクローナル抗体を、反対のｐＨ塩勾配をイオン交換クロマトグラフィーにおいて使用し、精製スキーム、例えばイオン交換クロマトグラフィーにおけるステップ溶出精製を利用することによって分離するプロセスに関することを意味する。精製スキームは、反対のｐＨ塩勾配を最良の操作条件を同定するために利用して開発される。結果として、改善されたタンパク質分離効率が、可能となる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書中に開示する発明は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）における反対のｐＨ−塩複合勾配溶出に関する。より詳細には、本発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の、その関連する電荷変化体（例えば酸性および塩基性モノマー）、グリコシル化変化体、ならびに／または可溶性サイズ変化体（例えば凝集体、モノマー、２／３−フラグメント、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、および結晶化可能フラグメント（Ｆｃ））からの予備的分離のための下降する塩勾配と組み合わせた上昇するｐＨ勾配の適用に関する。
【００１９】
先に記載した特許文献［３４〜３６］においてクレームされている塩またはｐＨ変化を用いたモノ勾配溶出およびステップ溶出とは異なり、本発明において、下降する塩勾配と組み合わせた上昇するｐＨ勾配から構成される反対のｐＨ−塩複合勾配を、ｍＡｂ変化体、例えば電荷変化体、グリコシル化変化体および／または可溶性サイズ変化体、例えばそれらの凝集体、モノマー、２／３フラグメント、３／４フラグメント、一般的フラグメント、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）および結晶性フラグメント（Ｆｃ）、ならびに生成物からの凝集物の分離のためＩＥＣ、好ましくはＣＥＸ、および最も好ましくＳＣＸにおいて使用する。
【００２０】
これらの特許文献［３４〜３６］に開示されている比較的「純粋な」供給物（１種の電荷変異型のみ）の使用とは対照的に、本発明の供給物は、１種より多い電荷変異タイプを含んでもよい。
【００２１】
したがって、分離すべきタンパク質物質を含む生物学的溶液を、最初に適切な緩衝液と混合する。次に、受けた混合物を、イオン交換クロマトグラフィーカラムに供給し、荷電基およびタンパク質、ペプチドまたは断片、凝集体、イソ型およびそれらの変化体を、強力なカチオン交換（ＳＣＸ）固定相に強く結合させる。検体を回収するために、樹脂を、次にこのイオン相互作用を中和する溶媒で洗浄する。中和洗浄および溶出を、好適な緩衝溶液の混合物で行う。
【００２２】
最も好ましい好適な生物学的緩衝液を、４，５〜１０，５の範囲内のｐＨを提供するものから選択する。適切な緩衝液は、既に上で述べた。多数の好適な緩衝液はまた、http://www.hsbt.com.tw/pdf/Biological%20Buffers.pdfの下でインターネット上で見出すことができる。好適な緩衝液は、好ましくは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＨＥＰＥＳとして知られている緩衝液を含む。しかし、それらが所望の分離生成物と、または分離物質との干渉反応または相互作用を示さない限り、使用することができるさらなる緩衝液または緩衝溶液もまたある。
【００２３】
高い負荷でのｐＨ勾配分離が、低い出発ｐＨ値によって特に強い陽イオン交換樹脂での高いタンパク質結合能力が可能になるので、可能である。ＭＡｂは、修飾、例えばシアリル化、脱アミド化およびＣ末端リジン切断などのために高度に不均一であり得る。塩勾配陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｍＡｂ電荷変化体を特徴づけるのにある程度成功して使用されている。しかしながら、追加的な努力が、個々のｍＡｂについての塩勾配法を調整するためにしばしば必要とされる。急速な薬物開発環境において、より汎用的なプラットフォーム方法は、大半のｍＡｂ分析に対応するために所望される。
【００２４】
２００９年、FarnanおよびMorenoは、ｐＨ勾配イオン交換クロマトグラフィーを用いてｍＡｂ電荷変化体を分離する方法を報告した。ｐＨ勾配を発生させるために用いた緩衝液は、ピペラジン、イミダゾールおよびトリスからなり、５〜９．５のｐＨ範囲を網羅していた。良好な分離が観察された一方、ｐＨ上昇の勾配は、最初は浅く、最後にかけて急峻であった［１５］。
【００２５】
現在、独自の実験を通して、プロテインＡ、ｍＡｂおよび対応するイソ型の改善された精製が、陽イオン交換クロマトグラフィーのための塩勾配法と組み合わせた新規なｐＨ勾配法において可能であることが、見出された。いくつかの緩衝種を、緩衝液配合のために選択し、緩衝液のｐＨを、水酸化ナトリウムで調整した。この方法は、線形勾配を低ｐＨ緩衝液（約５のｐＨ）の１００％溶出液から高ｐＨ緩衝液（約９．５〜１０．５のｐＨ）の１００％溶出液まで掛けた多成分緩衝系を特徴とする。各緩衝液種の濃度を、直線的な上昇する、または低下するｐＨ溶出プロファイルを達成するように調整する。好適な緩衝液組成物を、以下の例に開示する。
【００２６】
これに加えて、提供した例はまた、強い陽イオン交換樹脂を用いるより良好な分離のために、線形の上昇するｐＨ勾配法を下降する線形塩勾配法といかにして組み合わせるかを示す。線形ｐＨ勾配が達成されたことを確認するために、簡単なオンラインｐＨ計を、使用することができる。異なる緩衝液を、異なる容器中に提供し、それをカラム中に供給し、したがって所望のｐＨをカラムにおいて設定することができる。しかし、容器からの適切な量の異なる緩衝溶液を一緒に混合し、混合した緩衝液を上昇するｐＨでカラム中への分離の過程で導入することがまた、可能である。緩衝溶液のこの予備混合は、ｐＨ値を分離カラムにおいて調整してはならず、イオン交換体に結合したタンパク質混合物を均一に変化するｐＨに供するという利点を有する。
【００２７】
標的ｍＡｂのおおよそのｐＨ溶出範囲が最初の操作において確立されると、分離のさらなる最適化を、他の分離材料を使用して、例えばより浅いｐＨ勾配をより狭いｐＨ範囲において実行することによって単純に達成することができる。
【００２８】
強い陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）を使用するので、固定相からの緩衝効果の干渉はない。強い陽イオン交換（ＳＣＸ）固定相は、通常粒子状またはモノリシックな物質から構成され、それは、水溶液中に負に荷電した基を含む。これらの荷電した基とタンパク質、ペプチドまたは断片、凝集体またはイソ型およびそれらの変化体との間の相互作用の結果、これらの塩基性分析物の強固な結合がもたらされる。一般的に、前記ＳＣＸ材料は、スルホプロピル、スルホイソブチル、スルホエチルまたはスルホメチル基を保有する。
【００２９】
かかる固定相についての例は、交換材料、例えばEshmuno（登録商標）CPS、Eshmuno（登録商標）CPXまたはSP Fast Flow Sepharose（登録商標）、Eshmuno（登録商標）S Resin、Fractogel（登録商標）SO3(M)、Fractogel（登録商標）SO3(S)、Fractogel SE Hicap (M)、SP Cellthru BigBead Plus（登録商標）、Streamline（登録商標）SP XL、SP Sepharose（登録商標）Big Beads、Toyopearl（登録商標）M-Cap II SP-550EC、SP Sephadex（登録商標）A-25、Express-Ion（登録商標）S、Toyopearl（登録商標）SP-550C、Toyopearl（登録商標）SP-650C、Source（登録商標）30S、POROS（登録商標）50 HS、POROS（登録商標）50 XS、
【００３０】
SP Sepharose（登録商標）Fast Flow、SP Sepharose（登録商標）XL、Capto（登録商標）S、Capto（登録商標）SP ImRes、Capto（登録商標）S ImpAct、Cellufine（登録商標）MAX S-r、Cellufine（登録商標）MAX S-h、Nuvia（登録商標）S、Nuvia（登録商標）HR-S、UNOsphere（登録商標）S、UNOsphere（登録商標）Rapid S、Toyopearl（登録商標）Giga-Cap S-650 (M)、S HyperCel Sorbent（登録商標）、Toyopearl（登録商標）SP-650M、Macro-Prep（登録商標）High S、Macro-Prep（登録商標）CM、S Ceramic HyperD（登録商標）F、MacroCap（登録商標）SP、Capto（登録商標）SP ImpRes、Toyopearl（登録商標）SP-650S、SP Sepharose（登録商標）High Perform、Capto（登録商標）MMC、Capto（登録商標）MMC ImpRes、Eshmuno（登録商標）HCX、Nuvia（登録商標）High c-Primeまたは他のものである。
【００３１】
本発明による分離プロセスに適したＳＣＸ材料は、＞２５μｍ、好ましくは≧４０μｍ、特に好ましくは５０〜１００μｍの範囲内の平均粒子直径を有する粒状材料である。好適な陽イオン交換（ＳＣＸ）固定相および緩衝系を、タンパク質のｐＩに依存して選択すべきである。これは、非共有イオン相互作用を介してイオン交換樹脂に結合したタンパク質を溶出させるために、イオン相互作用を競合塩との相互作用によって、または中和によって弱めなければならないことを意味する。
【００３２】
あるいはまた、ならびにタンパク質の操作条件およびＰＩから依存して、また弱い陽イオン交換樹脂、例えばFractogel（登録商標）EMD COO (M)、CM Sepharose（登録商標）HP、CM Sepharose（登録商標）FF、Toyopearl（登録商標）AF Carboxy 650-M、Macro-Prep（登録商標）CM、Toyopearl（登録商標）GigaCap CM、CM Ceramic Hyper（登録商標）D、またはBio-Rex（登録商標）70を、用いてもよい。
【００３３】
タンパク質のｐＩから依存して、陰イオン交換樹脂（ＳＡＸ）を、使用してもよい。強いアニオン交換樹脂の例は、Fractogel（登録商標）EMD TMAE (M)、Fractogel（登録商標）EMD TMAE Medcap (M)、Fractogel（登録商標）EMD TMAE Hicap (M)、Eshmuno（登録商標）Q、Eshmuno（登録商標）QPX、Eshmuno（登録商標）QPX Hicap、Capto Q、Capto Q ImpRes、Q Sepharose（登録商標）FF、Q Sepharose（登録商標）HP、Q Sepharose（登録商標）XL、Source（登録商標）30Q、Capto（登録商標）Adhere、Capto（登録商標）Adhere ImpRes、POROS（登録商標）50 HQ、POROS（登録商標）50 XQ、POROS（登録商標）50 PI、Q HyperCel、Toyopearl（登録商標）GigaCap Q 650-M、Toyopearl（登録商標）GigaCap Q 650-S、Toyopearl（登録商標）Super Q、YMC（登録商標）BioPro Q、Macro-Prep（登録商標）High Q、Nuvia（登録商標）QまたはUNOsphere（登録商標）Qである。
【００３４】
あるいはまた、およびタンパク質の操作条件およびｐＩから依存して、またジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）官能性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）を担持する弱い陰イオン交換樹脂を、使用してもよい。例は、Fractogel（登録商標）EMD DEAE、Fractogel（登録商標）EMD DMAE、Capto（登録商標）DEAEまたはDEAE Ceramic HyperD（登録商標）Fである。
【００３５】
ここで、既に上述したように、予期せぬことに、タンパク質、ペプチドまたは断片、凝集体、イソ型および変化体の含む混合物の生体液からの分離を、反対のｐＨ−塩複合勾配を実行することによって優れた結果で行うことができることが見出され、これは、上昇するｐＨおよび同時に下降する塩濃度を意味し、逆もまた同様であり、タンパク質を分離するためである。勾配溶出は、ここでは主に高い塩濃度から低い塩濃度への変化するｐＨでの溶出緩衝液中の塩濃度の円滑な移行を指す。この分離プロセスのための適切な条件を発生させるために、両方の緩衝溶液を、好適な塩濃度と混合する。
【００３６】
反対のｐＨ−塩複合勾配のこれらの条件によって、複数の連続的な画分を改善された解像度において分離し、溶出条件、ｐＨおよび塩濃度は、線形的様式において調整しながら、それらを採集することが可能になる。反対のｐＨ−塩線形勾配は、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーのための最も高い解像度を提供し、多数の連続的画分が採集され得る。
【００３７】
本発明による分離を行うために、高い塩濃度を、好ましくは低いｐＨを有する緩衝溶液に加える。高いｐＨの緩衝溶液を、好ましくは塩を加えずに使用する。得られた２種の緩衝溶液を徐々に一緒に混合し、混合後に分離カラム中に直接徐々に導入する場合、溶出溶液のｐＨは時間と共に上昇し、一方塩濃度は同時に減少する。
【００３８】
一般に、ＮａＣｌは、ＮａＣｌ濃度を変化させることを変化する導電率と組み合わせ、それがイオン交換体に結合したタンパク質の荷電基の結合強度に影響するため、異なるタンパク質画分の結合および溶出プロセスを行うのに有用な塩である。
【００３９】
分離のための反対のｐＨ−塩複合勾配の適切な条件の後、タンパク質性混合物が確立され、異なるタンパク質画分の個々のピークを、混合物から分離が起こる最適条件に割り当てることができる。これらの条件を、各所望のタンパク質画分の段階的溶出のために使用することができる。例において、この原理の適用を示す。
【００４０】
以下に、少なくとも３種の生成物電荷変化体および少なくとも３種の生成物サイズ変化体の分離を行う実験を、例示する。前に列挙したこれらの変化体が本発明において単一クロマトグラフィー操作においてうまく解決されることが、見出されている。
【００４１】
この驚くべき分離結果を、単純な緩衝系を両性高分子電解質緩衝液の代わりに用いて４，５〜１０．５の広いｐＨ範囲、特に５〜９．５のｐＨ範囲を網羅する場合に、および塩化ナトリウムを使用して塩勾配を誘発する場合に達成することができる。反対のｐＨ−塩複合勾配を、異なるｐＨ値および塩化ナトリウム濃度（すなわち低いｐＨおよび高い塩濃度を有するＡ；高いｐＨおよび低い塩濃度を有するＢ）を有する２種の緩衝液（すなわちＡおよびＢ）をカラム入口で外部的に混合し、それが次にカラムを移動することによって発生させる。
【００４２】
実験によって、低い負荷および極めて高い負荷の両方で、良好な分離を、プロセスを相応に制御する場合に様々なタンパク質で達成することができることが、示された。
【００４３】
例示的な多重生成物分離の例を、低い負荷（≒１ｍｇ／ｍＬの充填した樹脂）、高い負荷（≧３０ｍｇ／ｍＬ）、および極めて高い負荷（≧６０ｍｇ／ｍＬ）で様々なｍＡｂイソタンパク質を含有する３種の異なる供給物について示す。分離のために、異なる勾配タイプ、例えば塩勾配、ｐＨ勾配、平行ｐＨ−塩複合勾配、および反対のｐＨ−塩複合勾配を、試験した。低い負荷での結果は、塩勾配がサイズ変化体分離（すなわち凝集体およびモノマー）の分離に適しており、一方ｐＨ勾配は、電荷変化体分離（すなわち酸性、中性および塩基性モノマー）に適していることを示した。驚くべきことに、サイズおよび電荷変化体の両方のための最良の分離は、反対のｐＨ−塩複合勾配系において達成される。
【００４４】
多数の実験の結果は、上昇するｐＨ勾配を下降する塩勾配と共に使用し、したがってタンパク質変化体が線形ｐＨ勾配におけるフォーカシング効果のみならず、同時にまた減少する塩濃度によるタンパク質移動速度の遅延を経験し、それによって向上した解像度がもたらされることを示唆する。また、Zhou et al.［３１］は、酢酸ナトリウムを唯一の緩衝成分として利用し、同時に彼らは、同一の塩を上昇した濃度で使用して、上昇する導電率勾配を発生させた。したがって、彼らは、１種のみの塩タイプを使用して、並行して上昇するｐＨおよび導電率勾配を付随して発生させた。酢酸塩のｐＫａのために、それらがこのタイプの緩衝系を使用して発生させたｐＨ勾配は、４．８〜６．２のｐＨに限定されるに過ぎない［２９、３１］。
【００４５】
これとは対照的に、本実験は、有利な結果が、移動相がＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＡＰＳなどを用いた緩衝系および塩化ナトリウムを用いた導電率変化系から構成されている場合に達成されることを示す。したがって、本発明の核心は、Zhou et al. ［３１］によって示唆されているものと同一でない。またZhou et al. ［３１］の複合勾配系と比較して、本発明は、４．５〜１０．５の広いｐＨ範囲を網羅する共通緩衝系を利用する。これによって、酸性、中性または塩基性ｐＩ値を有する広範囲のｍＡｂの分離のための利点が提供される。ＳＣＸを使用するので、５〜９．５のｐＨ範囲におけるカルボキシルリガンドを有するＷＣＸと比較して、固定相からの緩衝効果の干渉はない。Kaltenbrunner et al.［３０］によって記載されているｐＨ−塩複合系と比較して、それらの緩衝系は、移動相において酸性ｐＨ値を達成するためのマンニトールからのシス−ジオール基とホウ酸塩との反応から遊離されるヒドロキシルイオンを利用し、それは、本明細書中に開示した単純な緩衝系をとは基本的に異なる。
【００４６】
本発明の利点は、ホウ酸塩緩衝液の場合におけるように、移動相中の緩衝液成分とタンパク質との間に非特異的結合がないことである。ＤＳＰにおいて、高い動的結合能力が、常に好ましい。一方、低い導電率を有する生成物プールもまた、溶出液を所要に応じて次のＩＥＣ上に直接負荷させることができ、これにより中間体希釈または脱塩工程についての必要性を軽減することができるように望ましい。本明細書中に開示する複合ｐＨ−塩勾配系は、いくらかの塩を開始緩衝液に加えると動的結合容量（ＤＢＣ）が増加し、より低い導電率を有する溶出液が下降する塩勾配に伴って可能になることが観察されるので、これらの目的を極めて良好に果たす；下降塩勾配；タンパク質変化体間の尚良好な分離は、上昇するｐＨ勾配のクロマトフォーカシング効果によって促進される。
【００４７】
大事なことを言い忘れていたが、本明細書中に開示した方法は、分離効率の喪失を受けずにタンパク質負荷≧３０ｍｇ／ｍＬを有する分取スケールのｍＡｂ変化体分離に適している。これに加えて、勾配溶出を用いた分離プロセスを、同様の緩衝系を用いる段階溶出に直接移行させることができる。さらに、高いタンパク質負荷によって、本発明の有用性がさらに強化される。
【００４８】
種々の実験が行われており、それから例の選択を、以下に開示する。これらの例は、クレームした方法がいかにして変化して行われ得るかを示す。プロセスパラメータを簡単に調整することにより、分離が一般的に困難である異なるタンパク質画分を分離し、精製することが、可能である。したがって、ｐＨ勾配をより小さく変化させるか、または塩濃度を数ミリモルのみ変化させることが、可能である。
【００４９】
別の変形は、クロマトグラフィー材料を選択することにある。一般に、陽イオン交換物質、例えばEshmuno CPXが適しているが、所望の分離に依存して、混合モードクロマトグラフィー物質（ＭＭＣ）を使用することがまた、可能である。混合モードクロマトグラフィー材料は、イオン相互作用、水素結合および／または疎水性相互作用の組み合わせによるタンパク質吸着を可能にする多様な官能性のリガンドを含む。したがって、また異なるイオン交換材料の使用の結果、異なるタンパク質画分の特徴的な分離がもたらされる。
【００５０】
本説明によって、当業者が本発明を包括的に適用することが可能になる。さらなるコメントがなくても、当業者が上記の説明を最も広い範囲において利用することができることが、考えられる。
【００５１】
実行者は、常習的な実験的作業で、本明細書の教示を使用して、上記で定義したタンパク質を、精製スキーム、例えば最良の操作条件を同定するために反対のｐＨ−塩勾配を利用して開発されたイオン交換クロマトグラフィーにおける段階溶出精製を利用する新たなプロセスにおいて効率的に分離することができる。
尚不明なことがあれば、引用した刊行物および特許文献に相談すべきであることが、理解される。したがって、これらの文書を、本記載の開示内容の一部とみなす。
【００５２】
本発明をより良好に理解し、例示するために、例を以下に示し、それは本発明の保護の範囲内にある。これらの例はまた、可能な変形を例示するのに役立つ。記載した本発明の原理の一般的な妥当性のために、しかしながら、当該例は、本出願の保護の範囲をこれらのみに減少させるのに適していない。
【００５３】
さらに、示した例およびまた記載の残りの両方において、組成物中に存在する構成成分の量は、常に加えられて全体としての組成に基づいて１００重量％またはｍｏｌ％であるに過ぎず、より高い値が示した百分率範囲から生じ得る場合であってもこれを超過し得ないことは、当業者には言うまでもない。他に示さない限り、％データは重量％またはｍｏｌ％であり、比は例外であり、それを体積データにおいて示し、例えば溶出液、その調製のために一定の体積比における溶媒を、混合物において用いる。
例および説明ならびに特許請求の範囲において示す温度は、常に℃においてである。
【００５４】
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30. Kaltenbrunner, C. Tauer, J. Brunner, A. Jungbauer, Isoprotein analysis by ion-exchange chromatography using a linear pH gradient combined with a salt gradient, J. Chromatogr. 639 (1993) 41-49.
31. J.X. Zhou, S. Dermawan, F. Solamo, G. Flynn, R. Stenson, T. Tressel, S. Guhan, pH-conductivity hybrid gradient cation-exchange chromatography for process-scale monoclonal antibody purification, J. Chromatogr. A 1175 (2007) 69-80.
32. T.M. Pabst, G. Carta, pH transitions in cation exchange chromatographic columns containing weak acid groups, J. Chromatogr. A 1142 (2007) 19-31.
【００６３】
33. T.M. Pabst, G. Carta, N. Ramasubramanyan, A.K. Hunter, Protein separations with induced pH gradients using cation-exchange chromatographic columns containing weak acid groups, J. Chromatogr. A 1181 (2008) 83-94.
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35. J. Burg, B. Hilger, T. Kaiser, W. Kuhne, L. Stiens, C. Wallerius, F. Zetti, Optimizing the production of antibodies, 国際特許出願WO 2011/009623 A1 (2011).
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【００６４】
例
例１
ＩＥＣを用いたｍＡｂ  Ａ電荷変化体の予備的分離
予備的クロマトグラフィー試行を、以下のように行う：
機器：AEKTApurifier 100 
カラム：Eshmuno （登録商標）CPX、Merck Millipore、平均粒径５０μｍ、イオン容量６０μｍｏｌ／ｍＬ、カラム寸法８  ｉ．ｄ．  ×５０ｍｍ（２．５ｍＬ）
供給物：ＭＡｂポストプロテインＡプール
【００６５】
移動相：
（Ａ）線形塩勾配のための緩衝液は、１０ｍＭのＭＥＳからなった。緩衝液Ａは、ＮａＣｌを含まない。緩衝液Ｂは、１ＭのＮａＣｌを含む。両方の緩衝液のｐＨを、ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整した。
（Ｂ）線形ｐＨ勾配のための緩衝液は、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、６ｍＭのＭＯＰＳ、４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８ｍＭのＴＡＰＳ、８ｍＭのＣＨＥＳ、１１μＭのＣＡＰＳ、５３ｍＭのＮａＯＨからなった。図面の説明において述べない限り、ＮａＣｌを、緩衝液ＡおよびＢ中に加えない。緩衝液Ａを、ＨＣｌでｐＨ５に調整する。ｐＨ調整は、緩衝液Ｂについて必要でなかった（ｐＨ＝１０．５）。
【００６６】
（Ｃ）下降するｐＨおよび上昇する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配のための緩衝液は、１２ｍＭの酢酸、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、６ｍＭのＭＯＰＳ、４ｍＭのＨＥＰＥＳからなった。緩衝液Ａは、ＮａＣｌがなく、ｐＨを、ＮａＯＨで８に調整した。緩衝液Ｂは、２００ｍＭのＮａＣｌを有し、ｐＨを、ＮａＯＨで５に調整した。
【００６７】
（Ｄ）上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配のための緩衝液は、１２ｍＭの酢酸、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、６ｍＭのＭＯＰＳ、４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８ｍＭのＴＡＰＳ、８ｍＭのＣＨＥＳ、１１ｍＭのＣＡＰＳからなった。緩衝液Ａは、１５０ｍＭのＮａＣｌを有し、ｐＨを、ＮａＯＨで５に調整した。緩衝液Ｂは、ＮａＣｌがなく、ｐＨを、ＮａＯＨで１０．５に調整した。
（Ｅ）上昇するｐＨおよび上昇する塩勾配を有する平行ｐＨ−塩複合勾配のための緩衝液は、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、６ｍＭのＭＯＰＳ、４ｍＭのＨＥＰＥＳからなった。緩衝液Ａは、ＮａＣｌがなく、ｐＨを、ＮａＯＨで５に調整した。緩衝液Ｂは、２００ｍＭのＮａＣｌを有し、ｐＨを、ＮａＯＨで８に調整した。
【００６８】
線形勾配溶出：
勾配傾斜：６０ＣＶ（２．５ｍＬ／ＣＶ）、他の点を、図面の説明において述べる
流量：１ｍＬ／分（＝１１９ｃｍ／ｈ）
タンパク質負荷：１ｍｇ／ｍＬ、他の点を、図面の説明において述べる
クリーニング・イン・プレース（ＣＩＰ）：０．５ＭのＮａＯＨ（３〜５ＣＶ）
【００６９】
段階溶出：
流量：１ｍＬ／分（＝１１９ｃｍ／ｈ）を用いて、タンパク質を結合した；３ｍＬ／分（＝３５８ｃｍ／ｈ）を用いて、タンパク質を溶出させた
タンパク質負荷：３０ｍｇ／ｍＬ
クリーニング・イン・プレース（ＣＩＰ）：０．５ＭのＮａＯＨ（３〜５ＣＶ）
【００７０】
（Ｄ）において述べた緩衝液ＡおよびＢ（移動相を参照）を、用いる。ゼロ％の緩衝液Ｂを、タンパク質結合のために使用する。タンパク質溶出のために、種々のステップを、緩衝液ＡおよびＢを種々の濃度で以下のように混合することによって発生させる：
【００７１】
【表１】
2018537458.tif 000002
【００７２】
分析を、以下のように行う。
機器：AEKTAmicro
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を、BioSep（商標）-SEC-s3000, Phenomenex、カラム寸法７．８ｉ．ｄ．×３００ｍｍ、粒径５μｍを使用して行った。使用する緩衝液は、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７からなった。１ｍＬ／分の流量でのアイソクラチック溶出を、用いた。注入量を、４０μＬから１００μＬまで変化させた。
【００７３】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）を、YMC BioPro Sp-F, YMC Co. Ltd.、カラム寸法４．６ｉｄ×５０ｍｍ、粒径５μｍを用いて行った。前に（Ｂ）において記載した緩衝液を、使用した。０．７ｍＬ／分の流量で８．７５ＣＶの勾配長さにおいて５０％〜８５％の緩衝液Ｂからの勾配溶出を、使用した。注入量を、４０μＬから１００μＬまで変化させた。
【００７４】
結果：
以下のデータを収集して、ｍＡｂ  Ａ電荷変化体を分離する際の種々の勾配タイプの効率を、ＣＥＸを用いて比較する。
【００７５】
図１に、ｍＡｂ  Ａ電荷変化体の分離のための種々の勾配溶出タイプのスクリーニングを示す。（Ａ）線形塩勾配溶出：０〜１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５、（Ｂ）線形ｐＨ勾配溶出：ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ＭのＮａ＋、（Ｃ）下降するｐＨおよび上昇する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配溶出：ｐＨ８〜５、０〜１ＭのＮａＣｌ、（Ｄ）上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配溶出：ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ、（Ｅ）上昇するｐＨおよび上昇する塩勾配を有する並行するｐＨ−塩複合勾配溶出：Eshmuno（登録商標）CPX上のｐＨ５〜８、０〜０．２ＭのＮａＣｌ。水酸化ナトリウム（緩衝液のｐＨ調整のために使用する）から由来する対イオンを、Ｎａ＋として示し、一方塩化ナトリウムからのものを、ＮａＣｌとして示す。
【００７６】
図１に示すすべての勾配溶出試行の中で、（Ｄ）における反対のｐＨ−塩複合勾配は、６の分解ピークの最高の数を示し、一方他の２種の複合勾配（Ｃ）および（Ｅ）は、中程度に分解されたピーク（ピークの数−３）を示した。古典的な溶出法、例えば線形ｐＨ勾配（Ｂ）は、末端に肩を有する３つの高度に分解されたピークを示し、一方線形塩勾配は、２つのピークを示したに過ぎない。
【００７７】
以下のデータは、図１の勾配タイプ（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）においてプールされた画分の詳細なＨＰＬＣ分析を示す。
【００７８】
図２において、左の列は、上から下に、図１（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｄ）に示し、記載したそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す（破線：導電率(cond.)、点線：ｐＨ）。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。Mono.−モノマー、Ａｇ１、２および３−凝集体変化体１、２および３、ＡＶ−酸性電荷変化体、ＭＰ−主ピーク、ＢＶ−塩基性電荷変化体。水酸化ナトリウム（緩衝液のｐＨ調整のために使用する）から由来する対イオンを、Ｎａ＋として示し、一方塩化ナトリウムからのものを、ＮａＣｌとして示す。
【００７９】
選択したすべての３つの勾配溶出タイプについて、凝集体をモノマーから分割することができることが、観察される（図２におけるＳＥ−ＨＰＬＣを参照）。図２における分取クロマトグラムによれば、線形塩勾配溶出により、モノマーピーク（ピーク番号１）からわずかにより良好な分割された凝集ピーク（ピーク番号２）が提供される。しかし、塩基性電荷変化体を除いて、電荷変化体の分離は、全くない（図２におけるＣＥＸ−ＨＰＬＣを参照）。上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する線形ｐＨ勾配および反対の（Ｏｐｐ．）ｐＨ−塩複合勾配は、主なピーク（ＭＶ）からの高度に分割された酸性（ＡＶ）および塩基性電荷変化体（ＢＶ）ピークを示す。電荷変化体分離に加えて、反対のｐＨ−塩複合勾配はまた、３つの別個の凝集ピークを示し、それによって、このタイプの複合勾配の利点が例証される。
【００８０】
以下のデータは、反対のｐＨ−塩複合勾配溶出および線形ｐＨ勾配の容量ならびに対応するイソタンパク質分離効率を比較する。
【００８１】
図３ａ〜３ｄ：左の列は、種々の標的負荷を使用した、反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜１０．５、０．１５〜０ＭのＮａＣｌ（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、線形ｐＨ勾配、ｐＨ５〜１０．５、０．０５３ｍｍｏｌのＮａ＋（Ｂ、Ｄ）、およびEshmuno （登録商標）CPXにおける塩ｐＨ５〜１０．５、０．１５ＭのＮａＣｌ（Ｅ）を有する線形ｐＨ勾配のそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。（Ａ）〜（Ｆ）勾配傾きについて、６０ＣＶであり、一方（Ｇ）について、それは、２７６ＣＶであった。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。中央および右側の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。Mono.−モノマー、Ａｇ１、２および３−凝集体変化体１、２および３、ＡＶ−酸性電荷変化体、ＭＰ−主ピーク、ＢＶ−塩基性電荷変化体。水酸化ナトリウム（緩衝液のｐＨ調整のために使用する）から由来する対イオンを、Ｎａ＋として示し、一方塩化ナトリウムからのものを、ＮａＣｌとして示す。各試行についてのタンパク質回収率は、＞９０％であった。
【００８２】
３０ｍｇ／ｍＬの充填した樹脂の標的負荷を使用する際に、タンパク質のブレークスルーが、線形ｐＨ勾配系について観察される（図３における（Ｂ）を参照）一方これは、反対のｐＨ−塩複合勾配系については観察されない（図３における（Ａ）を参照）。標的負荷が６０ｍｇ／ｍＬの充填樹脂に増加した際、タンパク質のブレークスルーは、線形ｐＨ勾配系について約８０％（供給物についての１００％ＵＶシグナル≒１５６０ｍＡＵ）に増加する（図３における（Ｄ）を参照）。６０ｍｇ／ｍＬの充填樹脂の同一の標的負荷で、反対のｐＨ−塩複合勾配系において観察されるタンパク質のブレークスルーはなかったことに、留意すべきである。ＶＲ〜４０および５０ｍＬ（図３における（Ｃ）を参照）の間のピークが、試料注入が終了した後に（すなわちカラムを結合緩衝液で洗浄した際に）生じた。
【００８３】
動的結合能力（ＤＢＣ）が上昇した塩濃度に伴い増加し得ることを確認するために、ｐＨ勾配溶出実験を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを緩衝液ＡおよびＢの両方中に加えることによって繰り返し、（Ｅ）における結果は、６０ｍｇ／ｍＬの充填樹脂の標的負荷をいかなるタンパク質もカラムを通過して流動せずに達成することを示す。それにもかかわらず、分離効率に関して、６０ｍｇ／ｍＬ負荷で、反対のｐＨ−塩複合勾配（図３における（Ｃ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣを参照）においてプールした画分は、０．１５ＭのＮａＣｌを有するｐＨ勾配のものと比較して、個々の変化体種のより高い純度を示す（図３における（Ｅ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣを参照）。また、主ピーク２および塩基性電荷変化体ピーク３は、反対のｐＨ−塩複合勾配において、上昇した塩濃度でのｐＨ勾配におけるよりも良好に分割される（図３における分取クロマトグラム（Ｃ）および（Ｅ）を比較されたい）。
【００８４】
反対のｐＨ−塩複合勾配系について、５％ブレークスルーでの動的結合能力（ＤＢＣ５％）は、約９８ｍｇ／ｍＬの充填樹脂であることが見出される（図３における（Ｆ）を参照）。異なる勾配傾斜間の分離効率を調査するために、同一のＤＢＣ５％実験を、極めて浅い勾配−２７６ＣＶを用いて繰り返した（図３における（Ｇ）を参照）。浅い勾配における個々のピーク間のより高い分解能以外には、それぞれのプールの純度における顕著な改善は、より急峻な勾配と比較して観察されなかった（図３における（Ｆ）および（Ｇ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣを比較されたい。結合能力の有意な増加に加えて、反対のｐＨ−塩複合勾配系はまた、酸性および塩基性電荷変化体の主ピークからの高い分割分離を支持する。古典的なｐＨ勾配溶出と比較して、反対のｐＨ−塩複合勾配系は、以下の利点を提供する：より高い結合能力（少なくとも２〜３倍）、生成物関連電荷変化体間のより良好な分離がない場合に匹敵、および生成物関連凝集種間の顕著な改善された分離。
【００８５】
１５０ｍＭの反対のｐＨ−塩における初期の塩濃度は、分取ＣＥＸ樹脂について比較的高いことに、留意すべきである。より低い塩濃度（例えば５０ｍＭまたは１００ｍＭ）を使用する場合、ピーク間の改善された分解能でより高い結合能力を達成することができることを予想することは、合理的である。
【００８６】
以下は、複合ｐＨ−塩勾配溶出から一連の段階溶出中への、同一の緩衝系を用いた分離プロセスの移送を示す。
【００８７】
図４：左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上でのステップ溶出を用いた多重生成物分離を示す。ピーク１および２は、第１ステップにおいて溶出し（４６％緩衝液Ｂ）、ピーク３は、第２ステップにおいて溶出し（５５％緩衝液Ｂ）、ピーク４は、第３ステップにおいて溶出し（７０％緩衝液Ｂ）、ピーク５は、第４ステップにおいて溶出し（緩衝液Ｂ８１％）、ピーク６は、第５ステップにおいて溶出し（緩衝液Ｂ８９％）、ピーク７は、第６ステップにおいて溶出する（緩衝液Ｂ９３％）。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。中央および右側の列は、左側における分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。Mono.−モノマー、Ａｇ１、２および３−凝集体変化体１、２および３、ＡＶ−酸性電荷変化体、ＭＰ−主ピーク、ＢＶ−塩基性電荷変化体。
【００８８】
図３の（Ａ）における溶出プロフィールに基づいて、各変化体種が溶出する緩衝液Ｂのそれぞれの濃度を、同一の緩衝系を用いて一連の段階溶出中に移す。図４において見られるように、個々の生成物変化体は、ステップ溶出を介して互いから極めて良好に分離される。良好な分離に加えて、それぞれのモノマー種（すなわちＡＶ、ＭＰおよびＢＶ）の８０％より大きい収率（図４のＣＥＸ−ＨＰＬＣにおけるピーク下の面積による）が、ピーク１、２および３において達成される。
【００８９】
分離プロセスを勾配溶出からステップ溶出に移行させることの容易さにより、最小の経験的努力を用いて最短の時間において複数生成物分離のプロセス開発のための反対のｐＨ−塩複合勾配の利点が補強される。
【００９０】
例２
ＩＥＣを用いたｍＡｂＢ電荷変化体の予備的分離
予備的クロマトグラフィー試行を、以下のように行った：
機器：AEKTApurifier 100 
カラム：Eshmuno （登録商標）CPX、Merck Millipore、平均粒径５０μｍ、イオン容量６０μｍｏｌ／ｍＬ、カラム寸法８  ｉ．ｄ．  ×２０ｍｍ（１ｍＬ）
供給物：ＭＡｂＢモノマーポストプロテインＡプール
【００９１】
移動相：
（Ａ）線形塩勾配について、緩衝液ＡおよびＢは、２０ｍＭの酢酸からなった。緩衝液Ｂに、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを加え、一方緩衝液Ａには加えなかった。両方の緩衝液を、ＮａＯＨでｐＨ５に調整した。
（Ｂ）線形ｐＨ勾配について、緩衝液Ａは、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、および１０ｍＭのＭＯＰＳからなり、一方緩衝液Ｂは、６ｍＭのＭＯＰＳ、６ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＴＡＰＳ、および９ｍＭのＣＨＥＳからなった。緩衝液ＡおよびＢを、それぞれＮａＯＨでｐＨ５および９．５に調整した。
【００９２】
（Ｃ）上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配について、（Ａ）と同一の緩衝液組成物を使用したが、ある量の塩化ナトリウム（５０ｍＭまたは１００ｍＭ）を、緩衝液Ａ中に加え、一方緩衝液Ｂには何も加えなかった。両方の緩衝液を、それぞれＮａＯＨでｐＨ５および９．５に調整した。
【００９３】
勾配傾斜：６０ＣＶ（１ｍＬ／ＣＶ）、他の点を、図面の説明において述べる。
流量：１ｍＬ／分（＝１１９ｃｍ／ｈ）
タンパク質負荷：１ｍｇ／ｍＬ、他の点を、図面の説明において述べる
ＣＩＰ：０．５ＭのＮａＯＨ（３〜５ＣＶ）
【００９４】
分析を、以下のように行った。
機器：AEKTAmicro
ＣＥＸ−ＨＰＬＣを、YMC BioPro Sp -F、YMC Co. Ltd.、カラム寸法４．６  ｉｄ×５０ｍｍ、粒径５μｍを用いて行った。緩衝液は、１０ｍＭのＭＥＳ、６ｍＭのＭＯＰＳ、４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８ｍＭのＴＡＰＳ、８ｍＭのＣＨＥＳおよび３１．８ｍＭのＮａＯＨからなっていた。緩衝液Ａを、ＨＣｌでｐＨ６に調整した。緩衝液Ｂ（ｐＨ＝９．５）については、ｐＨ調整は必要でなかった。１５．７６ＣＶの勾配長において０．７ｍＬ／分の流量で、２５％〜６０％の緩衝液Ｂからの勾配溶出を、使用した。注入容積を、４０μＬから１００μＬまで変化させた。
【００９５】
結果：
以下のデータは、３つの異なる勾配溶出系のイソタンパク質分離効率を比較する：線形塩勾配溶出、線形ｐＨ勾配溶出、およびＣＥＸ上での反対のｐＨ−塩複合勾配溶出。
【００９６】
図５：左の列は、Eshmuno（登録商標）ＣＰＸ上の３つの線形勾配溶出タイプのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【００９７】
図５における３つの異なる勾配タイプを比較することにより、線形塩勾配溶出は、１つの溶出ピークを示すに過ぎず、一方他の２つは、主ピークおよび肩を示す。これは、塩勾配がここで試験した３つの方法の中で最も効率の低い系であることを示す。ｐＨ勾配および複合勾配溶出について、特定の荷電変化体の除去を両方のセットアップにおいて達成することができるが、後者は、基本的な荷電変化体を含むより良好に分割された肩を示す。また、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析から、複合勾配中の肩ピーク３は、ｐＨ勾配（Ｆ、Ｇ、およびＨ）と比較して２種の基本的な荷電変化体（ＧおよびＨ）を含み、それは、従来のｐＨ勾配溶出系と比較して複合勾配を使用するイソタンパク質のより良好な分離を示すことが、明らかである。
【００９８】
以下のデータは、線形ｐＨ勾配および反対のｐＨ−塩複合勾配溶出の能力ならびに対応する電荷変化体分離効率を比較する。
【００９９】
図６：左の列は、５％ブレークスルー（ＤＢＣ５％）を使用した、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形塩勾配溶出０〜０．２５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌ、および反対のｐＨ塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー試行を示す。勾配傾斜−６９０ＣＶ。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。毎回についてのタンパク質回収率は、＞９０％であった。
【０１００】
図７ａ〜７ｃ：図６に示すそれぞれの勾配タイプの溶出したピークにおける個々の電荷変化体の合計百分率。Ａ〜Ｈは、勾配に沿って図６のＣＥＸ−ＨＰＬＣにおいて示す個々の電荷変化体の最大値を示す。数字（１〜７）で標識した直線は、図６における画分プールが採取される位置を示す。
【０１０１】
古典的な線形塩および線形ｐＨ勾配溶出（ＤＢＣ５％≒５３〜５５ｍｇ／ｍＬの充填樹脂）のＤＢＣと比較して、ｍＡｂＢのＤＢＣは、上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配を使用する際には有意に高い（ＤＢＣ５％≒７１ｍｇ／ｍＬ充填樹脂）（図６を参照）。溶出勾配（図７を参照）に沿った電荷変化の変化によれば、線形塩勾配において、酸性電荷変化体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）および塩基性電荷変化体（Ｇ、Ｈ）は、それぞれ勾配の開始時および勾配の終了時に上昇し、したがって電荷変化体の非効率的な分離がもたらされることが、観察される。反対に、これらの電荷変化体は、それぞれｐＨ勾配および複合勾配に沿って均一に分布する。
【０１０２】
複合勾配と比較してｐＨ勾配に沿った電荷変化体のわずかに良好な分布は、より少ないタンパク質を、ＤＢＣ５％に達する前にｐＨ勾配緩衝液を用いてカラム上に負荷させることができるためであったことに、留意すべきである。例１（図３ａ〜３ｄ（Ｃ）および（Ｅ）を参照）に示すように、複合勾配において使用したものと同様の量のタンパク質（すなわち充填樹脂あたり〜７１ｍｇ／ｍＬ）をカラム上にｐＨ勾配緩衝液を使用して高められた塩濃度で負荷させる場合、電荷変化体の分離は、複合勾配よりも劣悪になるであろう。したがって、複合勾配がタンパク質のＤＢＣを古典的なｐＨ勾配法と比較してイソタンパク質分離効率の損失なしに改善すると結論付けることは、合理的である。
【０１０３】
実験によって、電荷変化体分離を、より少ないかかる種を含む混合物を使用する場合に改善することができることが示された。したがって、図６における反対のｐＨ−塩複合勾配の肩ピーク５〜７をプールし、組み合わせて、より少ない電荷変化体（Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）を有する供給物を形成し、同様の実験的組立を用いて再クロマトグラフィー分離する。
【０１０４】
以下のデータは、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ電荷変化体を含む再クロマトグラフィー分離した供給物の結果を示す。
【０１０５】
図８：図６における反対のｐＨ−塩複合勾配の肩ピーク５〜７からプールした電荷変化体Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを含有する供給物の再クロマトグラフィー。左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌ／０．１０〜０ＭのＮａＣｌ（上から下へ）のそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＥ〜Ｈは、種々のモノマー電荷変化体を示す。
【０１０６】
肩ピーク１と主ピーク２との間の最良の分割は、０．０５ＭのＮａＣｌでの反対のｐＨ−塩複合勾配を使用する場合に達成される（図８中の中段）。それにもかかわらず、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ結果によって、０．１０ＭのＮａＣｌでの複合勾配における主ピーク２が１種のみの主要な電荷変化体Ｈを含むことが示され、この系が最も有効な電荷変化体分離を有することが示される。３つの系の中で、複合勾配系は、分割および電荷変化体除去効率の点で線形ｐＨ勾配系より性能が優れている。
【０１０７】
例３
ＩＥＣを用いたｍＡｂ  Ｂ  Ｆｃ、Ｆａｂ、２／３断片、およびモノマー種の予備的分離
予備的クロマトグラフィー試行を、以下のように行った：
機器：AEKTApurifier 100 
カラム：Eshmuno （登録商標）CPX、Merck Millipore、平均粒径５０μｍ、イオン容量６０μｍｏｌ／ｍＬ、カラム寸法８  ｉ．ｄ．  ×２０ｍｍ（１ｍＬ）
供給物：Ｆｃ／Ｆａｂを有するＭＡｂ  Ｂ天然モノマースパイク、および２／３断片
【０１０８】
移動相：
（Ａ）線形ｐＨ勾配について、緩衝液Ａは、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、および１０ｍＭのＭＯＰＳからなり、一方緩衝液Ｂは、６ｍＭのＭＯＰＳ、６ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＴＡＰＳ、および９ｍＭのＣＨＥＳからなった。緩衝液ＡおよびＢを、それぞれＮａＯＨでｐＨ５および９．５に調整した。
【０１０９】
（Ｂ）上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配について、（Ａ）と同一の緩衝液構成成分を使用したが、ある量の塩化ナトリウム（５０ｍＭまたは１００ｍＭ）を、緩衝液Ａ中に加え、一方緩衝液Ｂには何も加えなかった。両方の緩衝液を、それぞれＮａＯＨでｐＨ５および９．５に調整した。
【０１１０】
勾配傾斜：６０ＣＶ（１ｍＬ／ＣＶ）
流量：１ｍＬ／分（＝１１９ｃｍ／ｈ）
タンパク質負荷：１ｍｇ／ｍＬ、他の点を、図面の説明において述べる。
ＣＩＰ：０．５ＭのＮａＯＨ（３〜５ＣＶ）
ステップ溶出：
流量：１ｍＬ／分（＝１１９ｃｍ／ｈ）を使用して、タンパク質を結合させた；３ｍＬ／分（＝３５８ｃｍ／ｈ）を使用して、タンパク質を溶出させた。
タンパク質負荷：３０ｍｇ／ｍＬ
クリーニング・イン・プレース（ＣＩＰ）：０．５ＭのＮａＯＨ（３〜５ＣＶ）
【０１１１】
（Ｂ）（移動相を参照）において述べた緩衝液ＡおよびＢを、使用した。ゼロ％緩衝液Ｂを、タンパク質結合のために使用した。タンパク質溶出のために、種々のステップを、緩衝液ＡおよびＢを以下の通りの種々の濃度で混合することによって発生させた：
【０１１２】
【表２】
2018537458.tif 000003
【０１１３】
分析を、以下のように行った。
機器：AEKTAmicro
ＳＥ−ＨＰＬＣを、Superdex（商標） 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare、カラム寸法１０  ｉ．ｄ．×３００ｍｍ、平均粒径８．６μｍを使用して行った。使用する緩衝液は、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７からなった。０．５ｍＬ／分の流量でのアイソクラチック溶出を、用いた。注入容積を、４０μＬから１００μＬまで変化させた。
【０１１４】
結果：
以下のデータは、本発明のプロセスが、ＣＥＸを用いて２／３断片、ＦｃおよびＦａｂのような他の可溶性サイズ変化体からの天然のｍＡｂの分離のためのｐＨ勾配を用いるプロセスよりも特別な利点を有することを示す。
【０１１５】
図９：左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。ｍＡｂ−天然のモノマーｍＡｂ  Ｂ、２／３Ｆｇ．−２／３断片、Ｆｃ−結晶化可能な断片、Ｆａｂ−抗原結合断片。
【０１１６】
分離結果は説得力があるが、図９におけるＳＥ−ＨＰＬＣ結果におけるＦｃおよびＦａｂピークを解釈する場合に、熟練した専門家が必要である。Ｆｃ（ＶＲ≒１５ｍＬ）は、Ｆａｂ（ＶＲ≒１５．５ｍＬ）の前に肩として出現する。線形ｐＨ勾配溶出を用いたクロマトグラフィー的試行のＳＥ−ＨＰＬＣ分析のために、画分プール１および２は、Ｆｃのみを含み、一方Ｆａｂは、画分プール４および５中に見出される。同様に、反対のｐＨ−塩複合勾配溶出を用いるクロマトグラフィー的試行について、対応するＳＥ−ＨＰＬＣ結果によって、画分プール１が主にＦａｂを含み、一方画分プール２がＦｃおよびＦａｂの両方の混合物であることが示される。
【０１１７】
図９における左側の両方のクロマトグラフィー的試行を比較することにより、線形ｐＨ勾配溶出を用いて得られた分割したピークのより大きい数にもかかわらず、生成物ピーク（すなわち左上のクロマトグラムにおけるピーク６）は、Ｆａｂピーク（すなわち同一のクロマトグラムにおけるピーク５）と重複する。反対に、より低いピークが反対のｐＨ−塩複合勾配溶出において分割されるが、生成物ピーク（すなわち左下のクロマトグラムにおけるピーク４）は、他の不純物ピークから極めて良好に遮断され得、それによって、ステップ溶出を用いる生成物の溶出のためのより広いウィンドウが提供される。
【０１１８】
ここで、下降する塩勾配を上昇するｐＨ勾配において用いることにより、Ｆａｂと固定相との間の相互作用が強く抑制され、それによりこのピークの生成物ピークからの完全な排除がもたらされることがまた、明らかである。ｐＨ勾配溶出（図９における左上）において、Ｆａｂ種は、Ｆｃおよび２／３断片の後に溶出する。しかし、複合勾配溶出（図９における左下）において、Ｆａｂ種は、Ｆｃおよび２／３断片の前に溶出する。
【０１１９】
この研究において使用する天然のモノマーｍＡｂは、例２において使用したものと同一であるので、反対のｐＨ−塩複合勾配溶出のピーク４および５（図９における左下）は、図５（左下）における溶出ピークと類似し、以前に、電荷変化体が図５において分離したことが示されている。したがって、例２および３の両方の結果を組み合わせることによって、反対のｐＨ−塩複合勾配を用いて電荷およびサイズ変化体の両方を同時に分離することができることが明らかになり、それによって、再び例１に示す結果が確認される。
【０１２０】
以下のデータは、より高い負荷での線形ｐＨ勾配および反対のｐＨ−塩複合勾配溶出の対応する荷電変化体分離効率を比較する。
【０１２１】
図１０：左の列は、Eshmuno（登録商標）CPX上での、３０ｍｇ／ｍＬの充填された樹脂の負荷を用いた、線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。右の列は、左側におけるそれぞれの分取クロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。ｍＡｂ−天然のモノマーｍＡｂ  Ｂ、２／３Ｆｇ．−２／３断片、Ｆｃ−結晶化可能な断片、Ｆａｂ−抗原結合断片。
【０１２２】
図１０において、多生成物分離効率を、高い負荷（＝３０ｍｇ／ｍＬの充填した樹脂）で試験する。図９と同一の分離結果が、再現される。この実験において使用した供給物が図９において使用した供給物と比較してＦｃおよびＦａｂのわずかに高い百分率を含んでいたことに、留意するべきである。それにもかかわらず、溶出プロフィールおよび溶出剤順序は、両方の場合において同一である；ｐＨ勾配溶出はより大きい数の分離されたピークを示すが、より低効率で分離された生成物プールを示し（図１０における左上のクロマトグラムのピーク６）、一方それは、複合勾配溶出については逆である（図１０における左下のクロマトグラムのピーク４）。したがって、複合勾配溶出系を高負荷精製のために使用することができることが、再び示される。
【０１２３】
以下に、複合ｐＨ−塩勾配溶出から同一の緩衝系を用いた一連の段階溶出への分離プロセスの移行を、示す。
【０１２４】
図１１：左の列は、Eshmuno（登録商標）ＣＰＸ上でのステップ溶出を用いた多生成物分離を示す。ピーク１は、第１のステップにおいて溶出し（２８．５％緩衝液Ｂ）、ピーク２は、第２のステップにおいて溶出し（３４％緩衝液Ｂ）、ピーク３は、第３のステップにおいて溶出し（４６％緩衝液Ｂ）、ピーク４は、第４のステップにおいて溶出し（６３％緩衝液Ｂ）、ピーク５は、第５のステップにおいて溶出した（７６％）。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。中央および右の列は、左側におけるそれぞれのクロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＨＰＬＣ分析である。ｍＡｂ−天然のモノマーｍＡｂ  Ｂ、２／３Ｆｇ．−２／３断片、Ｆｃ−結晶化可能な断片、Ｆａｂ−抗原結合断片。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析におけるＡ〜Ｈは、異なるモノマー電荷変化体を示す。
【０１２５】
例１と同様に、分離プロセスは、複合溶出系から一連の段階溶出に移行する。図１１におけるＳＥ−ＨＰＬＣの結果によれば、ピーク１は、＞９９％の純度および〜９１％の収率を有するＦａｂを含み、一方ピーク４は、＞９９％の純度および〜７０％の収率を有するｍＡｂを含有する。ピーク２は、〜７５％の純度の２／３断片を〜２５％の純度のＦｃと一緒に含んでいた。２／３断片の約５０％収率が、ピーク２において溶出され、一方他方の半分は、数種のｍＡｂと一緒にピーク３において見出される。またピーク４および５において、電荷変化体分離が観察され、図１０におけるＣＥＸ−ＨＰＬＣ結果において示し、ここで酸性変化体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、画分プール４中に見出され、塩基性変化体ＧおよびＨは、最終的な画分プール５中に見出される。ステップ溶出を用いた電荷変化体の分離によって、対応する緩衝液系が酸性電荷変化体の塩基性電荷変化体からの分離に適しているという、例２に示す複合勾配溶出における観察が再確認される。
【０１２６】
要約すると、例３は、高い負荷で動作し、また一連の段階溶出に容易に移行可能である、サイズ変化体および電荷変化体分離のための本反対の複合ｐＨ−塩勾配系の普遍的な適合性を示す。
【０１２７】
例４
ＭＭＣを用いたｍＡｂ  Ｂ  Ｆｃ、Ｆａｂ、２／３断片、およびモノマー種の予備的分離
予備的クロマトグラフィー試行を、以下のように行った：
機器：AEKTApurifier 100 
カラム：Capto（登録商標）MMC、GE Healthcare、平均粒径７５μｍ、イオン容量７０〜９０μｍｏｌ／ｍＬ、カラム寸法８  ｉｄ×２０ｍｍ（１ｍＬ）
供給物：Ｆｃ／Ｆａｂを有するＭＡｂ  Ｂ天然モノマースパイク、および２／３断片
【０１２８】
移動相：
（Ａ）線形ｐＨ勾配について、緩衝液Ａは、１２ｍＭの酢酸、１０ｍＭのＭＥＳ、および１０ｍＭのＭＯＰＳからなり、一方緩衝液Ｂは、６ｍＭのＭＯＰＳ、６ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＴＡＰＳ、および９ｍＭのＣＨＥＳからなった。緩衝液ＡおよびＢを、それぞれＮａＯＨでｐＨ５および９．５に調整した。
【０１２９】
（Ｂ）上昇するｐＨおよび下降する塩勾配を有する反対のｐＨ−塩複合勾配について、（Ａ）と同一の緩衝液構成成分を使用したが、ある量の塩化ナトリウム（５０ｍＭまたは１００ｍＭ）を、緩衝液Ａ中に加え、一方緩衝液Ｂには何も加えなかった。両方の緩衝液を、それぞれＮａＯＨでｐＨ５および９．５に調整した。
【０１３０】
勾配傾斜：６０ＣＶ（１ｍＬ／ＣＶ）
流量：１ｍＬ／分（＝１１９ｃｍ／ｈ）
タンパク質負荷：１ｍｇ／ｍＬ
ＣＩＰ：０．５ＭのＮａＯＨ（３〜５ＣＶ）
【０１３１】
分析を、以下のように行った。
機器：AEKTAmicro
ＳＥ−ＨＰＬＣを、Superdex（商標） 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare、カラム寸法１０  ｉ．ｄ．×３００ｍｍ、平均粒径８．６μｍを使用して行う。使用する緩衝液は、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７からなった。０．５ｍＬ／分の流量でのアイソクラチック溶出を、用いる。注入容積を、４０μＬから１００μＬまで変化させた。
【０１３２】
結果：
以下のデータを収集して、本発明が、ＭＭＣを用いて２／３フラグメント、ＦｃおよびＦａｂのような他の可溶性サイズ変化体から未変性ｍＡｂを分離するためのｐＨ勾配にまさる利点を提供することを示す。
【０１３３】
図１２：左の列は、Capto（登録商標）MMC上での線形ｐＨ勾配溶出ｐＨ５〜９．５、０ＭのＮａＣｌおよび反対のｐＨ−塩複合勾配ｐＨ５〜９．５、０．０５〜０ＭのＮａＣｌのそれぞれの分取クロマトグラフィー的試行を示す。破線−導電率(cond.)、点線−ｐＨ。右の列は、左側におけるそれぞれのクロマトグラフィー試行からプールした個々のピークのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。ｍＡｂ−天然のモノマーｍＡｂ  Ｂ、２／３Ｆｇ．−２／３断片、Ｆｃ−結晶化可能な断片、Ｆａｂ−抗原結合断片。
【０１３４】
図１２によれば、線形ｐＨ勾配の結果、４つのピーク（ピーク１〜４）がもたらされ、ここでタンパク質は、ＳＥ−ＨＰＬＣにおいて検出され、一方反対のｐＨ−塩複合勾配の結果、タンパク質で３つのピーク（ピーク２〜４）がもたらされた。それにもかかわらず、生成物ピーク（ピーク４）は、線形ｐＨ勾配と比較して反対のｐＨ−塩複合勾配を使用して他のピーク（すなわち不純物）からより良好に分割される。これは、ＣＥＸ上でのイソタンパク質の分離からの結果と整合しており（図９を参照）、それはまた、不純物からの生成物分離のためのステップ溶出を行うための最適化のウインドウが、反対のｐＨ−塩複合勾配系を用いて、古典的な線形ｐＨ勾配アプローチと比較して広いことを意味する。これは、ＣＥＸに対するイソタンパク質分離結果（図９を参照）と整合しており、それはまた、不純物からの生成物分離のための段階溶出を開発するための最適化のウインドウが古典的な線形ｐＨ勾配アプローチと比較して反対のｐＨ−塩複合勾配系を用いてより広いことを意味する。
【０１３５】
したがって、本発明は、ＩＥＣにおいてのみならずＭＭＣにおいてもイソタンパク質の分離のために使用することができることが、示される。
【図１】
2018537458.tif 000004
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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