(57)【要約】  本明細書に記載する発明は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を用いた非ＨＬＡマッチヒト化マウスモデル（例えばＮＳＧマウスモデル）、ならびに該マウスを作製および使用する方法を提供する。【選択図】図１
2018524981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化免疫不全非肥満糖尿病マウスであって：
（１）ｓｃｉｄ突然変異に関してホモ接合性であり；
（２）ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全を有し；
（３）ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を生着させており；
（４）ヒト患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を接種されており；
前記ＨＳＣおよび前記ＰＤＸは非ＨＬＡマッチである、前記マウス。
【請求項２】
ヒト胸腺および肝臓断片をさらに外科的に移植されている、雌ＮＳＧマウスである、請求項１のマウス。
【請求項３】
ヒトインターロイキン−３（ＩＬ−３）、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および／またはヒトＳｔｅｅｌ因子（ＳＦ）を構成的に発現する導入遺伝子をさらに含む、請求項１のマウス。
【請求項４】
前記ｓｃｉｄ突然変異がＣｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄである、請求項１のマウス。
【請求項５】
前記ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全がＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌである、請求項１のマウス。
【請求項６】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（すなわち、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ））である、請求項１のマウス。
【請求項７】
前記ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣが尾静脈注射を通じて生着される（好ましくはマウスは雌である）、請求項１のマウス。
【請求項８】
前記ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣが約３週齢のマウスに生着される、請求項１のマウス。
【請求項９】
前記ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣがマウスの全身放射線照射（例えば約７００〜１３００ｃＧｙの線量）後に生着される、請求項１のマウス。
【請求項１０】
マウスに前記ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣを生着させた約２週間後に、前記ヒトＰＤＸが前記マウスに接種される、請求項１のマウス。
【請求項１１】
マウスに前記ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣを生着させた約１２週間後に、前記ヒトＰＤＸが前記マウスに接種される、請求項１のマウス。
【請求項１２】
前記ヒトＰＤＸが初代患者試料由来である、請求項１のマウス。
【請求項１３】
前記ヒトＰＤＸが、少なくとも１世代、異種移植片として継代されている、アーカイブされた腫瘍試料由来である、請求項１のマウス。
【請求項１４】
前記ヒトＰＤＸが、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような肺癌、膀胱癌、リンパ腫（例えばＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫））、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）のような乳癌、脳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胃／ＧＩＳＴ癌、肝細胞癌、腎臓癌／腎癌、皮膚癌（例えば黒色腫）、柔組織癌、肉腫、または癌細胞株由来の異種移植片である、請求項１のマウス。
【請求項１５】
約５ｘ１０６細胞の前記ヒトＰＤＸを接種される、請求項１のマウス。
【請求項１６】
マウス末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の割合が、ＰＤＸ接種後５０日（またはＨＳＣ生着後約９週）で約２０〜３０％に到達する、請求項１のマウス。
【請求項１７】
抗癌化合物が投与される、請求項１のマウス。
【請求項１８】
抗癌化合物が、５−ＦＵ、アバスチン、シスプラチン、カルボプラチン、キートルーダ、ドセタキセル、またはその組み合わせである、請求項１７のマウス。
【請求項１９】
マウスがＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全に関してホモ接合性または半接合性である、請求項１のマウス。
【請求項２０】
患者由来異種移植片を用いてヒト化免疫不全非肥満糖尿病マウスを作製する方法であって：
（１）免疫不全非肥満糖尿病マウスに、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を導入すること、ここでマウスは：
（ａ）ｓｃｉｄ突然変異に関してホモ接合性であり；そして
（ｂ）ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全を有する；
（２）前記マウスに、ヒト患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を接種すること、ここで前記ＨＳＣおよび前記ＰＤＸは非ＨＬＡマッチである、
を含む、前記方法。
【請求項２１】
腫瘍を治療するための複数の抗腫瘍剤に関して、有効性順位序列を予測する方法であって：
（１）前記の複数の抗腫瘍剤の各１つを、単剤として、請求項１のマウスに投与し、そして有効性を決定すること、ここで前記ＰＤＸは前記腫瘍に相当する；
（２）前記の複数の抗腫瘍剤の各１つに関して、有効性を比較しそして／または順位付けし、それによって前記腫瘍を治療するための前記の複数の抗腫瘍剤に関して、有効性順位序列を予測すること、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
２またはそれより多い候補剤を用いた、腫瘍を治療するための組み合わせ療法を試験する方法であって：
（１）前記の２またはそれより多い候補剤を、単剤としてまたは組み合わせとしてのいずれかで、請求項１のマウスに投与し、そして有効性を決定すること、ここで前記ＰＤＸは前記腫瘍に相当する；
（２）組み合わせの有効性および単剤の有効性を比較すること、ここで単剤の相加的有効性に比較して組み合わせの有効性がより高ければ、組み合わせが優れていることの指標となる、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
剤を用いて腫瘍を治療するための投与計画の有効性および／または安全性を決定する方法であって：
（１）請求項１のマウスに前記剤を投与すること、ここで前記ＰＤＸは前記腫瘍に相当し、そして前記剤は前記投与計画にしたがって投与される；
（２）有効性および／または安全性を決定すること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する言及
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に、本明細書にその全内容が援用される、２０１５年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１８３，３８６号に、出願日の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の免疫系は非常に複雑であり、そして免疫系の障害も同様に複雑である。脊椎動物免疫系は、自然免疫系および獲得免疫系を含む。自然免疫系は、非特異的免疫系とも呼ばれ、非特異的方式で、生物を防御する細胞を含む。自然免疫系は、抗原を特異的に認識し、そして長期保護を提供する獲得免疫系とは異なる。自然免疫系は、抗原非依存性反応によって特徴付けられ、そして自然免疫系の曝露は、免疫学的記憶を生じない。自然免疫系の細胞には、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球および好酸球が含まれる。
【０００３】
脊椎動物免疫系が複雑であるため、疾患および欠陥は、しばしば、特徴付けること、および治療することが困難である。免疫反応の側面の分離を可能にし、例えば免疫系の疾患および欠陥の有効な医学的および薬学的治療の同定に有用な方法および組成物を提供する、動物モデルについての継続的な必要性が存在する。
【０００４】
免疫不全マウスは、しばしば、正常なおよび異常な異種細胞の増殖および分化のモデルとして用いられる。免疫不全マウスは：機能する免疫細胞、例えばＴ細胞およびＢ細胞の欠如；ＤＮＡ修復欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再編成における欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠損の１またはそれより多くによって特徴付けられる。免疫不全マウスは、免疫機能に関与する遺伝子、例えばＲａｇ１およびＲａｇ２における１またはそれより多い不全によって特徴付けられうる（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４８：１５１７−１５２３，  １９９０；およびＳｃｈａｔｚ，  Ｄ．Ｇ．ら，  Ｃｅｌｌ，  ５９：１０３５−１０４８，  １９８９）。免疫不全マウスは、マウスにおいて異常な免疫機能を生じるこれらのまたは他の欠陥のいずれを有することもありうる。
【０００５】
特に有用な免疫不全マウス系統は、Ｓｈｕｌｔｚら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７４：６４７７−６４８９，  ２００５に詳細に記載される、一般的にＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスとして知られる、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；およびＳｈｕｌｔｚら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５４（２）：２７０−２８４，  ２００８に記載される、一般にＮＲＧマウスと称される、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪである。
【０００６】
いくつかの実験において、こうした免疫不全マウス系統は、免疫不全マウス内に、ヒト免疫系の一部を生着させることによって、ヒト化される。こうしたヒト化マウスモデルは特に強力な研究ツールである。大部分の実験研究は、齧歯類、例えばマウスにおいて行われるが、ネズミ研究によって予測される結果は、常に、ヒトにおける実際の結果の代表であるわけではない。ヒト化マウスモデルを作製すると、マウスにおいてヒト特異的感染および療法の研究が可能になり、したがって、患者を危険にさらす欠点を伴わずに、ヒト細胞、組織、および免疫系の臨床的に適切なｉｎ  ｖｉｖｏ研究が可能になる。
【０００７】
多様な免疫不全マウス系統が利用可能であるが、各々、使用において欠点および限界を有する。特に、異種幹細胞、例えば異種造血幹細胞（ＨＳＣ）の免疫不全マウスにおける効率的な生着には、レシピエントマウスの放射線照射またはブスルファンなどの放射線類似作用薬剤によるコンディショニングが必要である。新生マウスの放射線照射は、小さく、虚弱なマウスを生じ、そして放射線照射マウスの中には未成熟なうちに死ぬものもいる。さらに、処置動物の造血発生に対する放射線照射の影響に関しては懸念がある。例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｂｌｏｏｄ，  １１０（３）：１０７６−１０７７，  ２００７を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４８：１５１７−１５２３，  １９９０
【非特許文献２】Ｓｃｈａｔｚ，  Ｄ．Ｇ．ら，  Ｃｅｌｌ，  ５９：１０３５−１０４８，  １９８９
【非特許文献３】Ｓｈｕｌｔｚら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７４：６４７７−６４８９，  ２００５
【非特許文献４】Ｓｈｕｌｔｚら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５４（２）：２７０−２８４，  ２００８
【非特許文献５】Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｂｌｏｏｄ，  １１０（３）：１０７６−１０７７，  ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、免疫不全マウス系統における異種造血幹細胞の生着のための方法および組成物、ならびにこれらの使用についての継続的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明の１つの側面は、ヒト化免疫不全非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスであって：（１）ｓｃｉｄ突然変異に関してホモ接合性であり；（２）ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全を有し；（３）ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を生着（engrafted）させており；（４）ヒト患者由来異種移植片を接種されており；ＨＳＣおよびＰＤＸが非ＨＬＡマッチである（例えば部分的にしかマッチしないか、またはマッチしない）、前記マウスを提供する。
【００１１】
特定の態様において、ｓｃｉｄ突然変異は、Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄである。
特定の態様において、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全は、遺伝子ヌル突然変異、例えばＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌである。他の態様において、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全は、ＩＬ−２Ｒガンマ鎖における一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）突然変異（例えば細胞外または細胞内ドメインのラッチング）である。
【００１２】
特定の態様において、マウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（すなわち、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ））である。
特定の態様において、マウスは、ヒト胸腺および肝臓断片をさらに外科的に移植されている、雌ＮＳＧマウス、例えばｈｕ−ＢＬＴ  ＮＳＧＴＭマウス（ＢＬＴマウスまたはＢＬＴヒト化マウス）である。
【００１３】
特定の態様において、マウスは、ヒト末梢血単核細胞を生着させており、例えばｈｕ−ＰＢＭＣ  ＮＳＧＴＭマウス（またはＰＢＭＣヒト化マウス）である。
特定の態様において、マウスは、ヒトインターロイキン−３（ＩＬ−３）、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および／またはヒトＳｔｅｅｌ因子（ＳＦ）を構成的に発現する導入遺伝子をさらに含む。
【００１４】
特定の態様において、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣは尾静脈注射（好ましくはマウスは雌である）、顔面静脈注射、心内注射、または肝内注射を通じて生着される。
特定の態様において、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣは、約２〜４週齢、例えば約２週齢、３週齢、または４週齢のマウスに生着される。
【００１５】
特定の態様において、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣは、約２４〜７２時間齢、例えば約２４時間齢、３６時間齢、４８時間齢、６０時間齢、７２時間齢、または９０時間齢のマウスに生着される。
【００１６】
特定の態様において、ＣＤ３４ｉｇ．＋ヒトＨＳＣは、マウスの全身放射線照射（例えば約１、２、３、４、５、１０、２０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００ｃＧｙの用量で、あるいは２つの本明細書に列挙する用量のいずれかの間、例えば１００〜３００ｃＧｙまたは７００〜１３００ｃＧｙの線量）後に生着される。
【００１７】
特定の態様において、マウスにＣＤ３４＋ヒトＨＳＣを生着させた約２週間後に、ヒトＰＤＸをマウスに接種する。特定の態様において、マウスにＣＤ３４＋ヒトＨＳＣを生着させたのち約１２週間で、ヒトＰＤＸをマウスに接種する。特定の態様において、マウスにＣＤ３４＋ヒトＨＳＣを生着させたのち約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週間（または任意の２つの数値によって定義される範囲）で、ヒトＰＤＸをマウスに接種する。
【００１８】
特定の態様において、ヒトＰＤＸは初代患者試料由来である。特定の態様において、ヒトＰＤＸは、少なくとも１世代、異種移植片として継代されている、アーカイブされた腫瘍試料由来である。特定の態様において、ヒトＰＤＸは少ない継代数を有し、例えば５、４、３、２、または１世代より多く、異種移植片としてまたは培養中で継代されていないものである。特定の態様において、ヒトＰＤＸは、由来するヒト癌の遺伝的および／または表現型的異種性を保持する。特定の態様において、ヒトＰＤＸは治療を受けたことがない患者由来である。特定の態様において、ヒトＰＤＸは治療耐性患者由来である。
【００１９】
特定の態様において、ヒトＰＤＸは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで維持され、そして入手可能なＰＤＸ  ＬＩＶＥＴＭ腫瘍由来の１またはそれより多くの任意のＰＤＸである。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙは、ＰＤＸ  ＬＩＶＥＴＭ腫瘍生着ＮＳＧマウスのコレクションとして、より広い範囲の、より早い継代数の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）癌モデルへのアクセスを提供する。容易に入手可能で在庫があるＰＤＸ腫瘍のこのコレクションは、ＮＳＧマウスバックグラウンド中で維持可能であり、そして任意のＰＤＸはまた、対象の非ＨＬＡマッチヒト化免疫不全マウス（例えばＮＳＧ、ＮＳＧＳ、ＢＬＴなど）中にあることも可能である。
【００２０】
例えば、特定の態様において、ＰＤＸ腫瘍は、浸潤性腺管癌を含む乳房腫瘍である。代表的な乳房腫瘍には、ＴＭ０００８９、ＴＭ０００９５〜ＴＭ０００９９、ＴＭ００１０３およびＴＭ  ００１２９が含まれる（ＴＭ番号は、ｔｕｍｏｒ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｍｔｂｗｉ／ｉｎｄｅｘ．ｄｏのマウス腫瘍生物学データベースにおけるＰＤＸモデルＩＤに相当する）。特定の態様において、ＰＤＸ腫瘍は、ＡＬＫ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、またはその組み合わせにおける突然変異を持つものなどの肺癌である。ＴＭ０００４６、ＴＭ００１８６、ＴＭ００１９２〜ＴＭ００１９４、ＴＭ００２００、ＴＭ００２０２〜ＴＭ００２０４、ＴＭ００２０６、ＴＭ００２０８、ＴＭ００２１３、ＴＭ００２１４、ＴＭ００２１９、ＴＭ００２２２、ＴＭ００２２６、ＴＭ００２３３、ＴＭ００２５３、ＴＭ００３０２、ＴＭ００３５５、ＴＭ００７８４、ＴＭ００８３２を参照されたい。特定の態様において、ＰＤＸ腫瘍は膀胱癌である（例えば、ＴＭ０００１５）。特定の態様において、ＰＤＸ腫瘍は脳癌である（例えば、ＴＭ０００５８およびＴＭ０１０８７）。特定の態様において、ＰＤＸ腫瘍は結腸癌である（例えば、ＴＭ００１６４およびＴＭ００１６５）。特定の態様において、ＰＤＸ腫瘍は卵巣癌である（例えば、ＴＭ００３３４、ＴＭ００３３５、ＴＭ００３９１）。
【００２１】
特定の態様において、ヒトＰＤＸは、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような肺癌、膀胱癌、リンパ腫（例えばＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫））、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）のような乳癌、脳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胃／ＧＩＳＴ癌、肝細胞癌、腎臓癌／腎癌、皮膚癌（例えば黒色腫）、柔組織癌、肉腫、または癌細胞株由来の異種移植片である。
【００２２】
特定の態様において、ヒトＰＤＸは、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現する腫瘍／癌由来の異種移植片である。
特定の態様において、約０．５〜１０ｘ１０６細胞（例えば約１〜９ｘ１０６細胞、約２〜８ｘ１０６細胞、約３〜７ｘ１０６細胞、約４〜６ｘ１０６細胞、または約５ｘ１０６細胞）のヒトＰＤＸを接種する。
【００２３】
特定の態様において、マウス末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の割合は、ＰＤＸ接種後５０日（またはＨＳＣ生着後約９週）で約２０〜３０％に到達する。
特定の態様において、マウスには、抗癌化合物が投与される。例えば、抗癌化合物は、５−ＦＵ、アバスチン、シスプラチン、カルボプラチン、キートルーダ、ドセタキセル、またはその組み合わせである。特定の態様において、抗癌化合物は化学療法試薬である。特定の態様において、抗癌化合物は前臨床薬剤である。特定の態様において、抗癌化合物は、免疫調節剤、例えば、ＰＤ−１またはそのリガンド／受容体の調節剤、あるいはＣＴＬＡ−４またはそのリガンド／受容体の調節剤である。特定の態様において、抗癌化合物は、抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１剤、例えば抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００２４】
抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１ならびにそのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の間の相互作用をブロックし、一方、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１ならびにＰＤ−１およびＴ細胞反応の下方調節に関与するＢ７−１（ＣＤ８０）の両方の間の相互作用をブロックする。
【００２５】
いくつかのＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１阻害剤は、非常に多様な癌に渡って、初期および後期臨床試験において、臨床開発中である。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１阻害剤の任意の１またはそれより多くを、本発明の抗癌剤として用いてもよい。
【００２６】
代表的な抗ＰＤ−Ｌ１剤には、表１の以下の剤が含まれ、そして代表的な抗ＰＤ−１剤には、表２の以下が含まれ、これらの表はどちらもＤｏｌａｎおよびＧｕｐｔａ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  ２１（３）：２３１−７，  ２０１４（本明細書に援用される）から改変されている。
【００２７】
例えば、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５は、ＰＤ−Ｌ１に対する、完全ヒト高アフィニティ免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ４モノクローナル抗体である。ＭＰＤＬ３２８０Ａは、ＰＤ−Ｌ１をターゲティングする操作ヒトモノクローナル抗体である。ＣＴ−０１１／ピジリズマブは、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６／ニボルマブは、ＰＤ−１に対する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブは、ＰＤ−１に対する活性を持つ、非常に選択的なヒト化ＩｇＧ４−カッパ・モノクローナル抗体である。
【００２８】
【表１】
2018524981.tif 000003
【００２９】
【表２】
2018524981.tif 000004
【００３０】
特定の態様において、抗癌剤は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば黒色腫を治療するためのＦＤＡ認可ＣＴＬＡ−４阻害剤であるイピリムマブ；および以前、チシリムマブまたはＣＰ−６７５，２０６と呼ばれ、Ｐｆｉｚｅｒによって製造される完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、そして癌治療に関してヒト臨床試験を受けているトレメリムマブ）である。
【００３１】
特定の態様において、抗癌剤は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストおよびＰＤ−１アンタゴニスト／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストの組み合わせである。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１は、別個の免疫阻害経路を制御するため、両方の免疫阻害経路の同時の阻害は、どちらか一方のみを阻害するよりもより有効でありうる。
【００３２】
ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞上の重要な阻害性細胞表面タンパク質であり、そして癌増殖は、免疫反応を調節する天然のフィードバック機構における不均衡と関連する可能性がある。例えば、腫瘍は、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、およびＣＤ１３７を含む、Ｔ細胞活性化に関する同時刺激経路を下方制御しうる。一方またはあるいは、腫瘍は、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、およびＢ７−Ｈ３を含む、阻害性免疫チェックポイント機構を上方制御しうる。前臨床および／または臨床証拠は、進行した癌が、ＯＸ４０のＴ細胞発現減少；ＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント経路の利用による正常な免疫攻撃の腫瘍回避；Ｔ細胞活性化および増殖を制限することによる、ＣＴＬＡ−４のＴ細胞発現の抗腫瘍反応阻害；免疫チェックポイントＬＡＧ−３のＴ細胞発現増加（したがって、Ｔ細胞活性化および機能に対する阻害性効果の増加）；およびＴ細胞仲介性免疫反応を損ないうるＢ７−Ｈ３の腫瘍細胞発現と関連してきていることを示唆する。したがって、対象マウスを用いて、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、および／またはＣＤ１３７同時刺激経路の上方制御、あるいはＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、および／またはＢ７−Ｈ３阻害性免疫チェックポイント経路の下方制御が、ＰＤＸ腫瘍のいずれかを治療可能であるかどうかを決定することも可能である。
【００３３】
腫瘍はまた、免疫反応を回避するため、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１によって仲介されるものに加えて、別の機構も用いる。例えば、多数の骨髄増殖因子が、多くの腫瘍の微小環境内で放出され、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）と呼ばれる骨髄細胞下位集団を含む、ユニークな免疫抑制能を持つ未成熟骨髄細胞に増殖するようにシグナルを伝達する。ＴＡＭは、固形腫瘍中にある豊富な白血球集団であり、多くのセッティングで、例えばＴＩＬ活性を抑制し、そして腫瘍血管形成を増加させることによって、腫瘍進行を制限するよりもむしろ促進する。
【００３４】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＴヘルパー２細胞（ＴＨ２）は、ＴＡＭによって促進されて、腫瘍において強い免疫抑制作用を生じる。これらの細胞は、通常、免疫寛容の維持に関連付けられる。
【００３５】
腫瘍中に見られる他の骨髄細胞には、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が含まれ、これらは、未成熟細胞の雑多な群に相当し、マクロファージ、顆粒球、および樹状細胞の前駆体を含み、Ｔ細胞増殖を抑制し、そして血管形成を促進する能力によって定義される。ＭＤＳＣは、腫瘍が免疫を回避するのを補助する、広範囲の免疫抑制機構を用い、その効果の大部分は、Ｔ細胞抑制に向けられる。
【００３６】
腫瘍免疫において重要な他の免疫細胞集団には、樹状細胞（ＤＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。ＤＣは「プロフェッショナル抗原提示細胞」であり、そしてユニークな腫瘍特異的抗原をプロセシングして、ＴおよびＢ細胞を活性化することが可能である。したがって、ＤＣは、腫瘍ワクチンを開発し、そして続く養子免疫療法のため、腫瘍特異的ＣＴＬＳをｅｘ  ｖｉｖｏで増やすことに向けられる研究の中心にある。
【００３７】
ＮＫ細胞は、自己組織の免疫監視に重要であり、そしてその活性が、大部分の正常細胞および腫瘍上に見られるＨＬＡクラスＩ抗原提示分子の結合によって仲介される、ユニークな細胞表面受容体を有する。ＨＬＡクラスＩ発現を保持する腫瘍は、ＮＫ細胞仲介性細胞傷害性を回避するが、発現を失ったものは、もはやＮＫ細胞によって「自己」とは認識されず、そして殺される。ＮＫ細胞活性化を促進する化合物および同種ＮＫ細胞を用いる養子免疫療法は、前臨床および臨床研究の盛んな分野である。
【００３８】
特定の態様において、抗癌剤は抗体（例えばモノクローナル抗体またはｍＡｂ）またはその抗原結合性断片である。特定の態様において、抗体は、細胞間（例えば腫瘍細胞および免疫細胞、例えばＴ細胞、ＴＡＭ、ＭＤＳＣ、ＤＣ、ＮＫ細胞等の間）のリガンド−受容体相互作用をブロックするかまたは増進させる。特定の態様において、抗体は、細胞間（例えば腫瘍細胞および免疫細胞、例えばＴ細胞、ＴＡＭ、ＭＤＳＣ、ＤＣ、ＮＫ細胞等の間）のリガンド−受容体相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。特定の態様において、抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）による細胞破壊をターゲティングする。特定の態様において、抗体は、特定のターゲット細胞にコンジュゲート化された薬剤ペイロードを送達する。
【００３９】
特定の態様において、抗癌剤は、養子細胞移入免疫療法において使用可能な、慣用的なＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたリンパ球である。特定の態様において、遺伝子操作されたリンパ球は、癌関連抗原に対する抗体を発現するＴ細胞であり、ここで抗体は、ＣＡＲの膜貫通および／またはシグナル伝達ドメインに連結されるかまたは融合される。こうしたＴ細胞は、養子Ｔ細胞療法に使用可能である。
【００４０】
特定の態様において、抗癌剤は、腫瘍細胞上の抗原にＣＴＬを直接結合させて、腫瘍殺傷を増進させるため、２つの抗体由来の結合特異性領域を単一の分子に融合させて含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
【００４１】
特定の態様において、抗癌剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏで増やされた再注入ＴＩＬであり、ここで、ＴＩＬは、ユニークな腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作されている。特定の態様において、腫瘍は子宮頸癌、リンパ腫、または白血病である。特定の態様において、抗癌剤は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体をさらに含む。
【００４２】
特定の態様において、抗癌剤は、同種ドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）、または同種ＮＫ細胞注入である。
特定の態様において、抗癌剤は、養子移入（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）前に腫瘍特異的抗原によってプライミングされている養子移入された樹状細胞である。
【００４３】
特定の態様において、抗癌剤は、腫瘍特異的抗原を含むワクチンであり、ここでワクチンは内因性腫瘍特異的Ｔ細胞反応を増幅する。
特定の態様において、マウスは、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全に関してホモ接合性または半接合性である。
【００４４】
本発明の別の側面は、患者由来異種移植片を用いてヒト化免疫不全非肥満糖尿病マウスを作製する方法であって：（１）免疫不全非肥満糖尿病マウスに、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を導入すること、ここでマウスは：（ａ）ｓｃｉｄ突然変異に関してホモ接合性であり；そして（ｂ）ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全を有する；（２）前記マウスに、ヒト患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を接種すること、ここで前記ＨＳＣおよび前記ＰＤＸは非ＨＬＡマッチである、を含む、前記方法を提供する。
【００４５】
本発明の別の側面は、重症複合免疫不全症を有する免疫不全非肥満糖尿病マウスにおける異種幹細胞移植法であって：異種幹細胞をマウスに投与することを含む、前記方法を提供する。
【００４６】
本発明の別の側面は、腫瘍を治療するための複数の抗腫瘍剤に関して、有効性順位序列を予測する方法であって：（１）複数の抗腫瘍剤の各１つを、単剤として、対象の（非ＨＬＡマッチＰＤＸ）マウス（例えばＮＳＧマウス）に投与し、そして有効性を決定すること、ここで前記ＰＤＸは腫瘍に相当する；（２）複数の抗腫瘍剤の各１つに関して、有効性を比較しそして／または順位付けし、それによって腫瘍を治療するための前記の複数の抗腫瘍剤に関して、有効性順位序列を予測すること、を含む、前記方法を提供する。
【００４７】
本発明の別の側面は、２またはそれより多い候補剤を用いた、腫瘍を治療するための組み合わせ療法を試験する方法であって：（１）前記の２またはそれより多い候補剤を、単剤としてまたは組み合わせとしてのいずれかで、請求項１のマウスに投与し、そして有効性を決定すること、ここで前記ＰＤＸは前記腫瘍に相当する；（２）組み合わせの有効性および単剤の有効性を比較すること、ここで単剤の相加的有効性に比較して組み合わせの有効性がより高ければ、組み合わせが優れていることの指標となる、を含む、前記方法を提供する。
【００４８】
本発明の別の側面は、剤を用いて腫瘍を治療するための投与計画の有効性および／または安全性を決定する方法であって：（１）請求項１のマウスに前記剤を投与すること、ここで前記ＰＤＸは前記腫瘍に相当し、そして前記剤は前記投与計画にしたがって投与される；（２）有効性および／または安全性を決定すること、を含む、前記方法を提供する。
【００４９】
実施例にのみ記載されるもの、および本発明の１つの側面の下にのみ記載されるものを含めて、本明細書記載の態様の任意の１つは、明確に言及されるか、または当業者が理解するように適用不能であるのではない限り、任意の１またはそれより多い他の態様と組み合わせることも可能であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ヒト化ＮＳＧマウスにおける非ＨＬＡマッチ腫瘍に関する増殖曲線を示す。
【図２】図２は、ヒト化ＮＳＧマウスにおける非ＨＬＡマッチＳＫＯＶ３卵巣癌異種移植片の増殖曲線を示す（ｎ＝７）。
【図３】図３は、ＳＫＯＶ３癌細胞接種後５０日での末梢血におけるｈＣＤ４５＋細胞（％）を示す。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｃは、ＮＳＧ対ヒト化ＮＳＧマウスにおける、非ＨＬＡマッチ腫瘍（それぞれＢＲ０７４４、ＬＧ０９７７、およびＳＡ０２０９）に関する増殖曲線を示す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｃは、ＮＳＧ対ヒト化ＮＳＧマウスにおける、非ＨＬＡマッチ腫瘍（それぞれＢＲ０７４４、ＬＧ０９７７、およびＳＡ０２０９）に関する増殖曲線を示す。
【図４−３】図４Ａ〜４Ｃは、ＮＳＧ対ヒト化ＮＳＧマウスにおける、非ＨＬＡマッチ腫瘍（それぞれＢＲ０７４４、ＬＧ０９７７、およびＳＡ０２０９）に関する増殖曲線を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＮＳＧ対ヒト化ＮＳＧモデルにおける、総腫瘍（それぞれＢＲ０７４４、ＬＧ０９７７、およびＳＡ０２０９）集団に対するｈＣＤ４５＋細胞の割合を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、３つの非ＨＬＡマッチ腫瘍ＰＤＸ（それぞれＢＲ０７４４、ＬＧ０９７７、およびＳＡ０２０９）における総浸潤ＣＤ４５＋細胞のヒトリンパ球の割合を示す。
【図７−１】図７Ａは、示す投与計画で、５−ＦＵ、アバスチン、およびビヒクル対照で処置した、非ＨＬＡマッチヒト化ＮＳＧモデルにおける結腸癌ＣＮ１５７２Ｐ５  ＰＤＸの腫瘍体積曲線を示す。
【図７−２】図７Ｂは、３群における研究第２１日の平均腫瘍体積を示す。
【図８−１】図８Ａは、示す投与計画で、シスプラチン、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、およびビヒクル対照で処置した、非ＨＬＡマッチヒト化ＮＳＧモデルにおける乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＰＤＸの腫瘍体積曲線を示す。
【図８−２】図８Ｂは、ペムブロリズマブ（キートルーダ）およびビヒクル群における、研究第２０日の平均腫瘍体積を示す。
【図８−３】図８Ａにおけるものと類似の実験を行い、そして結果を図８Ｃに示した。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の両方）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋）が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＰＤＸマウスの末梢血に存在することを示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＰＤＸマウスの腫瘍組織に、ヒトＴ細胞が存在することを示す。
【図１１−１】図１１Ａは、示す投与計画で、シスプラチン、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、およびビヒクル対照で処置した、非ＨＬＡマッチヒト化ＮＳＧモデルにおける乳癌ＢＲ１１２６  ＰＤＸの腫瘍体積曲線を示す。
【図１１−２】図１１Ｂは、３群における、研究第１７日の平均腫瘍体積を示す。
【図１１−３】図１１Ａにおけるものと類似の実験を行い、そして結果を図１１Ｃに示した。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の両方）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋）が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＢＲ１１２６  ＰＤＸマウスの末梢血に存在することを示す。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、ヒトＴおよびＢ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＢＲ１１２６  ＰＤＸマウスの腫瘍組織に存在することを示す。
【図１３−２】図１３Ｅ〜１３Ｈは、ヒトＴおよびＢ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＢＲ１１２６  ＰＤＸマウスの脾臓に存在することを示す。
【図１４−１】図１４Ａは、示す投与計画で、ドセタキセルを伴うまたは伴わない、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、およびビヒクルで処置した、非ＨＬＡマッチヒト化ＮＳＧモデルにおける肺癌ＬＧ１３０６  ＰＤＸの腫瘍体積曲線を示す。
【図１４−２】図１４Ｂは、３群における、研究第２４日の平均腫瘍体積を示す。
【図１４−３】図１４Ａにおけるものと類似の実験を行い、そして結果を図１４Ｃに示した。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｄは、ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の両方）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋）が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＬＧ１３０６  ＰＤＸマウスの末梢血に存在することを示す。
【図１５−２】図１５Ｅ〜１５Ｈは、ヒトＴおよびＢ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＬＧ１３０６  ＰＤＸマウスの脾臓に存在することを示す。
【図１５−３】図１５Ｉ〜１５Ｋは、ヒトＴおよびＢ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチ１３０６  ＰＤＸマウスの腫瘍組織に存在することを示す。
【図１６】図１６は、ビヒクル（対照）、化学療法のみ、抗ＰＤ１（キートルーダ）、および抗ＣＴＬＡ４剤（イピリムマブ）によって処置したＰＤＸ試料における、ＣＤ４５＋ＣＤ８＋浸潤Ｔ細胞の存在に関する免疫染色を示す。データは、抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４療法が、ＰＤＸ腫瘍における浸潤Ｔ細胞の強い存在を導くことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
１．概説
癌治療に対する伝統的なアプローチは、迅速に分裂する細胞、例えば腫瘍／癌細胞に対して毒性である、広域作用化学剤を利用する。この化学療法アプローチは成功することもありうるが、広い範囲のオフ・ターゲット毒性によって複雑なものになる可能性もあり、そして薬剤耐性を誘導するリスクを有する。哺乳動物免疫系は、病原体に感染した細胞および癌性になった細胞を含む、ターゲット細胞を排除するための多くの効率的で非常に特異的な機構を発展させてきている。これに反応して、腫瘍細胞は、免疫検出を回避するためのそれ自体の機構セットを発展させてきている。したがって、免疫エフェクター細胞および腫瘍の間の相互作用のよりよい理解を得ることで、臨床使用のための、永続性がある免疫仲介性の腫瘍退行を刺激する治療戦略の新規でそして有望な手段への道が開く。このクラスの新規免疫腫瘍学治療戦略は、非常に有望であるが、この分野におけるさらなる研究は、ヒト免疫および腫瘍細胞相互作用のより優れた生物学的理解に関する洞察を可能にし、そして臨床適用に移行する際に、成功するより高い確率を有する新規療法の前臨床試験を可能にする、対象のヒト化小動物モデルに基づく（例えばマウスに基づく）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験プラットホームから利益を受けうる。
【００５２】
本明細書に記載する発明は、ヒトＣＤ３４＋生着ＮＳＧマウスにおける患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の増殖速度は、ＰＤＸおよび生着ヒト免疫細胞の間の完全なＨＬＡ型マッチを必要としないという驚くべき発見に、部分的に基づく。
【００５３】
本明細書に記載する発明はまた、癌細胞株生着のタイミングは、ヒト化に比較して、異種移植片増殖に有意な影響を持たないという驚くべき発見にも、部分的に基づく。一方、癌細胞株生着のタイミングはまた、ＣＤ４５＋細胞集団に対する有意な影響も持たない。
【００５４】
したがって、本発明の１つの側面は、ヒト化免疫不全非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスであって：（１）ｓｃｉｄ突然変異に関してホモ接合性であり；（２）ＩＬ−２受容体ガンマ鎖不全を有し；（３）ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を生着させており；（４）ヒト患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を接種されており；ＨＳＣおよびＰＤＸは非ＨＬＡマッチである、前記マウスを提供する。
【００５５】
本明細書において、「非ＨＬＡマッチ」は、完全なＨＬＡマッチではないことを指し、部分的ＨＬＡマッチしかないか、またはＨＬＡマッチがまったくないものを含む。特定の態様において、ＨＳＣおよびＰＤＸの間には、部分的ＨＬＡマッチしかない。特定の態様において、ＨＳＣおよびＰＤＸの間には、ＨＬＡマッチはまったくない。
【００５６】
特定の態様において、マウスは、ＮＳＧマウス、または近縁派生物、例えばＮＳＧＳマウス、ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウス、またはヒトＣＤ４５＋生着ＢＬＴマウスである。
本発明のヒト化マウスは、いくつかのみを挙げると、癌生物学、免疫腫瘍学、再生医学、ヒト造血、感染性疾患、移植、前臨床薬剤有効性試験研究、ならびに免疫および自己免疫を含む、広い範囲の生物学的、医学的、および臨床研究において使用可能である。
【００５７】
例えば、対象のヒト化マウスモデルを用いて、癌療法における免疫反応、感染性疾患の治療、遺伝子療法、および巨大分子薬剤の免疫原性等を研究することも可能である。
対象のヒト化マウスモデルはまた、前臨床予測研究においても使用可能であり、したがって、生着させたヒト造血系の存在下で、対象のマウスモデルにおいて、患者特異的異種移植片（例えば癌由来のＰＤＸ）を研究することも可能である。対象のマウスモデルに対する１またはそれより多い投与計画の下に、こうした試験化合物または薬剤を投与することによって、任意の試験化合物または薬剤の効果、安全性（例えば免疫系に対する何らかの関連副作用）、および有効性を研究することも可能である。これは特に、免疫腫瘍学または免疫調節剤の研究、あるいは疾患組織（例えば癌、自己免疫疾患）および免疫系の間の相互作用を伴う任意の研究において強力である。
【００５８】
さらに、対象のヒト化マウスモデルを用いて、生着ヒト造血系の存在下で、任意のＰＤＸを研究することも可能である。これには、腫瘍組織学研究、オミクス研究またはプロファイリング（プロテオミクス、ゲノミクス、メタボロミクス等）の実行が含まれる。特定の態様において、実験モデルを選択し、特定の癌における突然変異のパターンを再検討し、そして広範囲の癌に渡って共通に突然変異している遺伝子を同定するなどの分野の研究者を補助するために設計された、マウス腫瘍生物学データベース（ＭＴＢ）から、研究下のＰＤＸに関する情報を得ることも可能である。
【００５９】
また、対象のヒト化マウスモデルを用いて、ヒト化マウスモデルの開発、自然免疫細胞機能の分析、Ｔ細胞ホメオスタシスの研究、および／またはＢＬＴ（胎児胸腺／胎児肝臓）マウスモデルの特徴付けを含めて、ヒト免疫系発展および機能を研究することも可能である。
【００６０】
上述の本発明の一般的な側面とともに、本発明の特定の側面または態様を、以下のセクションにさらに記載する。
２．定義
別に示さない限り、本明細書で用いる科学的および技術的用語は、一般の当業者に一般的に理解される意味を有すると意図される。こうした用語は、例えば、Ｊ．  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版，  ２００１；  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ監修，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；第５版，  ２００２；  Ｂ．  Ａｌｂｅｒｔｓら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  第４版，  Ｇａｒｌａｎｄ，  ２００２；  Ｄ．  Ｌ．  ＮｅｌｓｏｎおよびＭ．  Ｍ．  Ｃｏｘ，  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  第４版，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ２００４；  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，  Ｐ．（監修），  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００４；  Ａ．  Ｎａｇｙ，  Ｍ．  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｋ．  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，  Ｒ．  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ（監修）  ２００２，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；およびＫ．  Ｔｕｒｋｓｅｎ（監修），  “Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １８５：４９９，  ２００２，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０８を含む、多様な標準的参考文献の背景で定義され、そして用いられていることが見出される。
【００６１】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別に明確に記載されるか、または文脈が別に明らかに示さない限り、限定しないと意図され、そして複数の対象物を含む。
用語「発現する」、「発現」、「発現している」、および「発現する」は、遺伝子に関するか、または対応するｍＲＮＡを産生するための遺伝子の転写、そして／または機能的な対応するコードタンパク質を産生するためのｍＲＮＡの翻訳を指す。
【００６２】
用語「免疫不全非ヒト動物」は：機能する免疫細胞、例えばＴ細胞およびＢ細胞の欠如；ＤＮＡ修復欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再編成における欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠如の１またはそれより多くによって特徴付けられる非ヒト動物（例えばマウス）を指す。
【００６３】
用語「免疫不全マウス」は：機能する免疫細胞、例えばＴ細胞およびＢ細胞の欠如；ＤＮＡ修復欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再編成における欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠如の１またはそれより多くによって特徴付けられるマウスを指す。免疫不全マウスは、免疫機能に関与する遺伝子、例えばＲａｇ１およびＲａｇ２における１またはそれより多くの欠損によって特徴付け可能である（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４８：１５１７−１５２３，  １９９０；およびＳｃｈａｔｚら，  Ｃｅｌｌ，  ５９：１０３５−１０４８，  １９８９）。免疫不全マウスは、マウスにおいて異常な免疫機能を生じる、これらのまたは他の欠陥のいずれを有することも可能である。
【００６４】
特に有用な免疫不全マウス系統は、Ｓｈｕｌｔｚら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７４：６４７７−６４８９，  ２００５に詳細に記載され、一般的にＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスと称される、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍｌ  Ｗｊｌ／ＳｚＪ；およびＳｈｕｌｔｚら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５４（２）：２７０−２８４，  ２００８に記載される、一般的にＮＲＧマウスと称される、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍｌＭｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍｌ  Ｗｊｌ／ＳｚＪである。
【００６５】
用語「重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）」は、Ｔ細胞が存在せず、そしてＢ細胞機能を欠くことによって特徴付けられる状態を指す。
ＳＣＩＤの一般的な型には：ＩＬ２ＲＧ遺伝子におけるガンマ鎖遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）によって特徴付けられるＸ連鎖ＳＣＩＤ；ならびにＪａｋ３遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）、ＡＤＡ遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（−）、ＩＬ−７Ｒアルファ鎖突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＣＤ３デルタまたはイプシロン突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、アルテミス遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、ＣＤ４５遺伝子突然変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）によって特徴付けられる常染色体劣性ＳＣＩＤが含まれる。
【００６６】
本発明の側面にしたがって、遺伝子修飾されたマウスは、一般的にｓｃｉｄ突然変異と称される、重症複合免疫不全突然変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）を有する。ｓｃｉｄ突然変異は周知であり、そしてＢｏｓｍａら，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２９：５４−５６，  １９８９に記載されるように、マウス第１６染色体上に位置する。ｓｃｉｄ突然変異に関してホモ接合性であるマウスは、機能するＴ細胞およびＢ細胞が存在せず、リンパ球減少症、低グロブリン血症および正常造血微小環境を有することによって特徴付けられる。ｓｃｉｄ突然変異は、例えば、周知の方法、例えばＰＣＲまたはフローサイトメトリーを用い、ｓｃｉｄ突然変異に関してマーカーを検出することによって、検出可能である。
【００６７】
本発明の側面にしたがって、遺伝子修飾されたマウスは、ＩＬ２受容体ガンマ鎖不全を有する。用語「ＩＬ２受容体ガンマ鎖不全」は、ＩＬ２受容体ガンマ鎖減少を指す。ＩＬ２受容体ガンマ鎖減少は、遺伝子欠失または突然変異のためでありうる。ＩＬ２受容体ガンマ鎖減少は、例えば周知の方法を用いたＩＬ２受容体ガンマ鎖遺伝子欠失または突然変異の検出、ならびに／あるいはＩＬ２受容体ガンマ鎖発現減少の検出によって検出可能である。特定の態様において、ＩＬ２受容体ガンマ鎖不全は、ＩＬ２受容体ガンマ鎖遺伝子のヌル突然変異である。特定の態様において、ＩＬ２受容体ガンマ鎖不全を有する動物は、ＩＬ２受容体ガンマ鎖に関してホモ接合性突然変異である。
【００６８】
ｓｃｉｄ突然変異を有するか、またはｓｃｉｄ突然変異と組み合わせてＩＬ２受容体ガンマ鎖不全を有する、遺伝子修飾免疫不全マウスを、本発明の側面にしたがって提供する。遺伝子修飾ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンママウスを、本発明の側面にしたがって提供する。
【００６９】
用語「ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ」および「ＮＳＧ」は、本明細書において交換可能に用いられ、周知の免疫不全マウス系統ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄを指す。ＮＳＧマウスは、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪバックグラウンドからの多数の免疫欠陥、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）突然変異、およびインターロイキン−２受容体ガンマ鎖の完全ノックアウトを組み合わせる。その結果、ＮＳＧマウスは、成熟Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞を欠き、そしてサイトカインシグナル伝達が欠損している。ＮＳＧマウスは、ＩＬ２Ｒ−γ（ガンマｃ）発現が欠如し、血清免疫グロブリンが検出不能であり、溶血性補体がなく、成熟Ｔリンパ球がなく、そして成熟ナチュラルキラー細胞がないことによって特徴付けられる。
【００７０】
重症複合免疫不全を有するか、または重症複合免疫不全と組み合わせてＩＬ２受容体ガンマ鎖不全を有する、遺伝子修飾された免疫不全非ヒト動物（例えばマウス）を、本発明の側面にしたがって提供する。
【００７１】
遺伝子修飾された免疫不全非ヒト動物の作製は、遺伝子ターゲティングベクターを移植前の胚または幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞内に導入することによって達成可能である。
【００７２】
用語「遺伝子ターゲティングベクター」は、ターゲティングされる遺伝子内への挿入または該遺伝子との置換などにより、特定の染色体遺伝子座を組み換え、そして突然変異させるために有効な、二本鎖組換えＤＮＡ分子を指す。
【００７３】
用語「野生型」は、天然存在または非突然変異生物、タンパク質または核酸を指す。
場合によって、本発明の遺伝子修飾免疫不全非ヒト動物（例えばマウス）は、選択的育種によって産生される。第一の望ましい遺伝子型を有する非ヒト動物の第一の親系統を、第二の望ましい遺伝子型を有する非ヒト動物の第二の親系統と交配して、第一および第二の望ましい遺伝子型を有する、遺伝子修飾非ヒト動物である子孫を生じることも可能である。
【００７４】
本発明の遺伝子修飾された免疫不全非ヒト動物は、好ましくは非ヒト哺乳動物、特に齧歯類、例えばマウス、ラットまたはモルモットである。
本発明の側面にしたがって提供される、ｓｃｉｄ突然変異と組み合わせて、ＩＬ２受容体ガンマ鎖不全を有する、遺伝子修飾された免疫不全マウスは、ＮＳＧマウス、ＮＳＧＳマウス、ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＣ生着ＮＳＧ／ＮＳＧＳマウス、またはヒトＣＤ３４＋生着ＢＬＴマウスであることも可能である。
【００７５】
用語「異種」は、本明細書において、宿主細胞または生物に関連して、「異種」と称される材料が、宿主細胞または生物のものとは別の種に由来することを示す。
用語「造血幹細胞」は、本明細書において、免疫系を生じさせる機能を有する、多能性幹細胞を指す。マウス由来の造血幹細胞は、ｃ−Ｋｉｔ受容体を発現する。ｃ−Ｋｉｔ受容体は、当該技術分野に周知であり、例えば、Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら，  “Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ｋｉｔ  ｇｅｎｅ，”  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ７（７）：  １２５９−１２６６，  １９９２；およびＥｄｌｉｎｇ  ＆  Ｈａｌｌｂｅｒｇ，  “ｃ−Ｋｉｔ−−ａ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，”  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ３９（１１）：１９９５−１９９８，  ２００７に記載される通りである。ヒト造血幹細胞はＣＤ３４を発現する。ＣＤ３４は、例えばＳｉｍｍｏｎｓら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＣＤ３４，  ａ  ｓｉａｌｏｍｕｃｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８（１）：２６７−２７１，  １９９２に記載されるような、周知のタンパク質である。
【００７６】
本発明の側面にしたがって、異種（例えばヒト）造血幹細胞を、本発明の遺伝子修飾された免疫不全非ヒト動物（例えばマウス）に投与して、ここで異種造血幹細胞は、遺伝子修飾された免疫不全非ヒト動物において、異種免疫細胞に分化する。
【００７７】
本発明の側面にしたがって、ヒト造血幹細胞を、本発明の遺伝子修飾された免疫不全マウスに投与して、ここでヒト造血幹細胞は、遺伝子修飾された免疫不全マウスにおいて、ヒト免疫細胞に分化する。
【００７８】
遺伝子修飾された免疫不全動物への投与のための造血幹細胞は、ＨＳＣを含有する任意の組織、例えば限定されるわけではないが、臍帯血、骨髄、ＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血および胎児肝臓から得られうる。
【００７９】
場合によって、遺伝子修飾された免疫不全動物への投与のための造血幹細胞は、投与前に、ＨＳＣを含有する１またはそれより多い組織、例えば限定されるわけではないが、臍帯血、骨髄、ＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血および胎児肝臓から得た細胞集団を増やすためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した細胞として得られうる。
【００８０】
多様な経路を通じた、例えば限定されるわけではないが、心臓（心内注射）、肝臓（肝内注射）および／または顔面静脈内などへの投与によって、ＨＳＣを新生動物に投与することも可能である。多様な経路、例えば限定されるわけではないが、尾静脈内への投与、大腿骨髄腔内または脾臓内への投与によって、ＨＳＣを成体動物に投与することも可能である。さらなる例において、胎児肝臓および／または胎児胸腺としてのＨＳＣを、腎被膜下に生着させてもよい（例えばＢＬＴマウスにおいて、１ｍｍ３立方体オルガノイドとして）。
【００８１】
場合によって、コンディショニングされた動物にＨＳＣを投与する。ＨＳＣの受け入れのための準備において、レシピエント動物のコンディショニングを行って、異種ＨＳＣを受け入れる前に、レシピエント動物に内因性であるＨＳＣおよび前駆体細胞を枯渇させるかまたは抑制する。レシピエント動物のコンディショニングには、異種ＨＳＣの受け入れ前に、レシピエント動物に内因性であるＨＳＣおよび前駆体細胞を枯渇させるかまたは抑制するために有効な放射線照射および／または１またはそれより多い化学剤の投与が含まれる。ブスルファンは、異種ＨＳＣの受け入れ前に、レシピエント動物に内因性であるＨＳＣおよび前駆体細胞を枯渇させるかまたは抑制するために有効な化学剤の周知の例である。異種ＨＳＣの受け入れ前に、レシピエント動物に内因性であるＨＳＣおよび前駆体細胞を枯渇させるかまたは抑制するために有効な放射線照射および／または１またはそれより多い化学剤によるコンディショニングを、コンディショニングされた動物を産生するための周知のプロトコルにしたがって行う。
【００８２】
異種ＨＳＣの生着を、ＨＳＣ投与後の１またはそれより多い時点で、任意の多様な方法、例えば限定されるわけではないが、異種ＨＳＣが投与されている動物における細胞のフローサイトメトリー分析によって、評価することも可能である。
【００８３】
異種ＨＳＣの単離、宿主生物への異種ＨＳＣの投与、およびその生着評価法に関する例示的な方法は，本明細書に、そしてすべて本明細書に援用されるＴ．  Ｐｅａｒｓｏｎら，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ８１：１５．２１．１−１５．２１．２１，  ２００８；  Ｉｔｏら，  Ｂｌｏｏｄ，  １００：３１７５−３１８２，  ２００２；  Ｔｒａｇｇｉａｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３０４：１０４−１０７，  ２００４；  Ｉｓｈｉｋａｗａら，  Ｂｌｏｏｄ，  １０６：１５６５−１５７３，  ２００５；  Ｓｈｕｌｔｚら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：６４７７−６４８９，  ２００５；  Ｈｏｌｙｏａｋｅら，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ２７（９）：１４１８−１４２７，  １９９９に記載される。
【００８４】
投与するＨＳＣを、元来の供給原材料から単離して、ＨＳＣが濃縮された細胞集団を得る。単離ＨＳＣは純粋であってもまたはなくてもよい。
特定の態様において、ＨＳＣは、細胞マーカー、例えばＣＤ３４に関する選択によって精製される。
【００８５】
特定の態様において、投与されるヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞が総細胞の約１〜１００％を構成するヒト細胞集団であるが、ＣＤ３４＋細胞が総細胞の１％未満を構成するヒト細胞集団も使用可能である。特定の態様において、投与されるヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞が総細胞の約１〜３％を構成するＴ細胞枯渇臍帯血細胞、ＣＤ３４＋細胞が総細胞の約５０％を構成する細胞系譜枯渇臍帯血細胞、またはＣＤ３４＋細胞が総細胞の約９０％を構成するＣＤ３４＋陽性選択細胞である。
【００８６】
投与されるＨＳＣの数は、免疫不全マウスにおける異種免疫系の生成に関して、限定するとは見なされない。単一のＨＳＣが免疫系の細胞を生成することも可能である。したがって、投与されるＨＳＣの数は、一般的に、レシピエントがマウスである場合、１〜１０ｘ１０６ＨＳＣの範囲であるが、これより多くも使用可能である。他の種に関しては、細胞数は、必要に応じてルーチンの実験のみを用いて、調整可能である。
【００８７】
一般的に、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋のより大きな集団におけるＣＤ３４＋細胞の下位集団として存在する。したがって、ＨＳＣを含有する任意の組織、例えば限定されるわけではないが、臍帯血、骨髄、ＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血および胎児肝臓から得たＣＤ３４＋細胞集団を投与して、生着させようとするレシピエント動物にＨＳＣ下位集団を送達する。生着させようとするレシピエント動物にＨＳＣ下位集団を送達するために投与される、ＨＳＣを含有する任意の組織、例えば限定されるわけではないが、臍帯血、骨髄、ＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血および胎児肝臓から得られるＣＤ３４＋細胞の数は、限定されず、そして１細胞〜１０億細胞、例えば１細胞〜５億細胞、１細胞〜１億細胞、１細胞〜１０００万細胞、１細胞〜５００万細胞、１細胞〜１００万細胞、１細胞〜５０万細胞、１細胞〜１０万細胞、１細胞〜５万細胞、１細胞〜１万細胞、１細胞から１，０００細胞の範囲のこうしたＣＤ３４＋細胞であることも可能である。さらに、投与されるＣＤ３４＋細胞の数は、１００細胞〜１０００万細胞、１００細胞〜５００万細胞、１００細胞〜１００万細胞、１００細胞〜５０万細胞、１００細胞〜１０万細胞、１００細胞〜５万細胞、１００細胞〜１万細胞または１００細胞〜１，０００細胞の範囲である。さらに、投与されるＣＤ３４＋細胞の数は、１０００細胞〜１０００万細胞、１０００細胞〜５００万細胞、１０００細胞〜１００万細胞、１０００細胞〜５０万細胞、１０００細胞〜１０万細胞、１０００細胞〜５万細胞または１０００細胞〜１万細胞の範囲である。
【００８８】
投与した任意の非ＨＳＣの大部分が変性した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）時点で、異種ＨＳＣおよびＨＳＣから分化した細胞が、レシピエント動物において検出されたならば、生着は成功である。ヒトＨＳＣ生着成功の特徴は、多系譜ヒト免疫細胞分化、ならびに骨髄、胸腺、脾臓、およびＰＢＬ等へのホーミングである。ＮＳＧマウスは、多系譜生着、ならびにほぼすべての適切な臓器および組織への免疫細胞ホーミングを補助する。ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスにおいて検出されるヒト免疫細胞集団の全範囲は、Ｉｓｈｉｋａｗａら（Ｂｌｏｏｄ，  １０６（５）：  １５６５−１５７３，  ２００５）；およびＴａｎａｋａら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １８８（１２）：  ６１４５−６１５５，  ２０１２）に要約される。
【００８９】
分化したＨＳＣ細胞の検出は、例えば、レシピエント動物における異種ＤＮＡの検出、または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）異種ＨＳＣおよびＨＳＣから分化した細胞の検出によって達成可能である。二次レシピエントへのＣＤ３４＋細胞の連続移入および異種造血系の生着は、一次レシピエントにおけるＨＳＣ生着のさらなる試験である。生着は、ＨＳＣ投与１０〜１２週間後、血中の０．０５％またはそれより多い異種ＣＤ４５＋細胞としてフローサイトメトリーによって検出可能である。
【００９０】
免疫不全動物における異種造血幹細胞への異種幹細胞因子（ＳＣＦ）の送達を含む、本発明の側面にしたがった方法を提供する。ＳＣＦは、急性または慢性に動物に送達可能である。本発明の側面にしたがって、免疫不全非ヒト動物には、プロモーターに機能可能であるように連結された異種ＳＣＦをコードする導入遺伝子がさらに含まれてもよい。さらなるオプションにおいて、動物が異種ＳＣＦを発現する場合、異種幹細胞を投与する前に、動物は放射線類似作用剤投与によってコンディショニングされない。
【００９１】
本発明の側面にしたがって、免疫系反応の調節剤を同定するための方法には、非ヒト遺伝子修飾免疫不全動物を提供すること；異種造血幹細胞を非ヒト遺伝子修飾免疫不全動物に投与すること、ここで異種造血幹細胞は、非ヒト遺伝子修飾免疫不全動物において、異種免疫細胞を生じるように分化する；免疫系刺激因子を動物に投与すること；試験化合物を動物に投与すること；免疫系刺激因子に対する異種免疫細胞の反応をアッセイすること；そして標準に反応を比較して、刺激因子に対する異種免疫細胞の反応に対する試験化合物の影響を決定すること、ここで試験物質の影響は、動物における異種免疫系の調節剤を同定する、が含まれる。
【００９２】
本発明の方法で用いる試験化合物は、任意の化学実体であってもよく、例えば合成もしくは天然存在化合物または合成もしくは天然存在化合物の組み合わせ、小有機もしくは無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質またはこれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００９３】
本明細書において、試料は、非ヒト動物から得られる試料であってもよく、例えば、脾臓、骨髄、血液、血漿および血清が含まれる。
場合によって、免疫系の特定の細胞集団、例えば樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、骨髄樹状細胞、マスト細胞、単球／マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球および好酸球、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞）、Ｂリンパ球（例えばＣＤ１９＋  Ｂ細胞）をアッセイする。
【００９４】
生着されたヒト免疫系を有する遺伝子修飾免疫不全非ヒト動物の単離骨髄細胞を本発明によって提供する。生着されたヒト免疫系を有する遺伝子修飾免疫不全非ヒト動物の単離骨髄細胞を本発明によって提供する。
【００９５】
遺伝子修飾免疫不全非ヒト動物の単離細胞を本発明によって提供する。こうした単離細胞を多様なアッセイで用いるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養してもよい。例えば、こうした単離細胞は、試験物質の活性を決定するための、試験物質の評価のためのアッセイにおける対照として有用である。さらなる例において、こうした単離骨髄細胞は、免疫系の活性に対する試験物質の活性を決定するために有用である。
【００９６】
イムノアッセイ法を用いて、試料中のターゲット分析物または免疫細胞反応の指標をアッセイすることも可能であり、こうした方法には、限定されるわけではないが、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫ろ過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、フローサイトメトリー、イムノブロット、免疫沈降、免疫組織化学、免疫細胞化学、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびラジオイムノアッセイが含まれる。アッセイ法を用いて、定性的および／または定量的結果を得ることも可能である。試料の定性的および定量的アッセイ両方のための適切なアッセイ法の特定の詳細は、標準的な参考文献に記載され、例えば、Ｅ．  ＨａｒｌｏｗおよびＤ．  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８；  Ｆ．  ＢｒｅｉｔｌｉｎｇおよびＳ．  Ｄｕｂｅｌ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９；  Ｈ．  Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，  Ｂａｓｉｃｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ２０００；  Ｂ．  Ｋ．  Ｃ．  Ｌｏ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３；  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｗｉｌｅｙ，  ２００２；  Ｓ．  Ｋｌｕｓｓｍａｎ監修，  Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｗｉｌｅｙ，  ２００６；  Ｏｒｍｅｒｏｄ，  Ｍ．  Ｇ．，  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００；  Ｇｉｖａｎ，  Ａ．  Ｌ．，  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  Ｆｉｒｓｔ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１；  Ｇｏｒｃｚｙｃａ，  Ｗ．，  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  ２００６；  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００；  Ｗｉｌｄ，  Ｄ．，  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  第３版，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００５；ならびにＪ．  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓ���ｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第３版，  ２００１が含まれる。
【００９７】
抗体および抗体を調製するための方法は、当該技術分野に周知である。本明細書において、用語「（単数または複数の）抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｃ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体および上述のいずれかの抗原結合性断片を含む。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスである。
【００９８】
本明細書において、用語「抗体断片」および「抗原結合性断片」は、ターゲット分析物に免疫特異的に結合する抗体の断片を定義する。当業者に知られる任意の技術によって、抗体断片を作製することも可能である。例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を産生することも可能である。また、組換えＤＮＡ技術によって、抗体断片を産生することも可能である。
【００９９】
抗体、抗原結合性断片、その作製法、および抗原への実質的に特異的な結合に関して、作製された抗体をスクリーニングするための方法が当該技術分野に知られ、そしてこうした抗体、抗原結合性断片および方法は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．およびＤｕｂｅｌ，  Ｓ．（監修），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ２００１；  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．およびＬａｎｅ，  Ｄ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８；  Ｆ．  ＢｒｅｉｔｌｉｎｇおよびＳ．  Ｄｕｂｅｌ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９；  Ｈ．  Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，  Ｂａｓｉｃｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ２０００；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．ら（監修），  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ，  ２００２；  Ｊ．  Ｄ．  Ｐｏｕｎｄ（監修）  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版，  １９９８；  Ｂ．  Ｋ．  Ｃ．  Ｌｏ（監修），  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３；ならびにＫｏｈｌｅｒ，  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−４９７  （１９７５）にさらに詳細に記載される。ターゲット分析物、例えばｔｏｌｌ様受容体４の抗体または自然免疫細胞反応の指標、を、動物において産生し、合成し、組換え法によって産生し、そして／または商業的に得ることも可能である。
【０１００】
試料中に存在するターゲット分析物および結合パートナーの間の結合の検出は、当該技術分野に知られる任意の多様な方法によって達成され、これには例えば、ターゲット分析物または結合パートナーに直接または間接的に付着した検出可能標識の検出が含まれる。用語「検出可能標識」は、任意の適切な方法によって、検出可能標識の存在の指標となるシグナルを産生可能な物質を指し、これには例えば、分光光度的、光学的、光化学的、生化学的、酵素的、電気的および／または免疫化学的なものが含まれる。検出可能標識の例には、例えば、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分、高電子密度粒子、磁気粒子、酵素、基質、放射性同位体および発色団が含まれる。
【０１０１】
用いる特定の単数または複数の検出可能標識の同一性は、用いる検出プロセスに依存する。こうした検出プロセスは、特定のアッセイ形式に取り込まれ、これには例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫蛍光アッセイ、液体クロマトグラフィ、フローサイトメトリー、当該技術分野に知られる他の検出プロセス、またはその組み合わせが含まれる。
【０１０２】
結合アッセイは、支持体に付着した結合パートナーを組み込むことも可能である。結合アッセイに用いる付着した結合パートナーを含む支持体は、固形または半固形であってもよく、そしてガラス、シリコン、紙、合成または天然存在ポリマー、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ナイロン、セルロース、アガロース、デキストラン、およびポリアクリルアミド、または結合アッセイで使用するために、結合パートナーが安定に付着可能な任意の他の材料などの多様な材料のいずれであることも可能である。
【０１０３】
用いる支持体には、結合パートナーへの結合に関する官能基、例えば限定されるわけではないが、カルボキシル、アミン、アミノ、カルボキシレート、ハロゲン化物、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、クロロメチル、硫黄酸化物、窒素酸化物、エポキシおよび／またはトシル官能基が含まれうる。支持体への結合パートナーの付着は、任意の多様な方法によって達成され、例えば、吸着および化学結合が含まれる。１つの例において、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、ＥＤＣまたはＥＤＡＣ化学を用いて、結合パートナーを粒子に付着させることも可能である。結合パートナーを、直接または間接的に、例えば支持体上に配置されたコーティングまたはリンカーへの結合を通じて、支持体の材料に結合させることも可能である。官能基、その修飾および支持体への結合パートナーの付着は、例えばＦｉｔｃｈ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７に記載されるように、当該技術分野に知られる。
【０１０４】
こうした支持体は、限定されるわけではないが、マイクロタイタープレート、マイクロタイターウェル、ピン、ファイバー、ビーズ、スライド、シリコンチップおよび膜、例えばニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜を含む、任意の多様な型および形状であってもよい。
【０１０５】
任意の多様な分光光度法を用いて、本発明の側面にしたがって、ターゲット分析物、例えばｔｏｌｌ様受容体４または自然免疫細胞反応の指標をアッセイすることも可能であり、こうした分光光度法には、限定されるわけではないが、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、イオン移動度分光測定、質量分析、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣ−ＭＳ）、イオン移動度分光測定−質量分析、タンデム質量分析、ガスクロマトグラフィ−質量分析、マトリックス支援脱離イオン化時間飛行（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、表面増進レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）および核磁気共鳴分光測定が含まれ、これらはすべて当業者に周知である。
【０１０６】
場合によって、分光光度分析を用いて、ｔｏｌｌ様受容体４または自然免疫細胞反応の指標などのターゲット分析物に関して、試料をアッセイする。本発明の側面にしたがったアッセイにおいて、質量分析を用いてもよい。例えば、時間飛行（ＴＯＦ）質量分析またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析を用いて、質量分析を行う。質量分析技術は当該技術分野に周知であり、そしてタンパク質および／またはペプチドアッセイに関する方法の例示的な詳細な説明は、Ｌｉ  Ｊ．ら，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．，  ４８（８）：１２９６−１３０４，  ２００２；  Ｈｏｒｔｉｎ，  Ｇ．  Ｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５２：  １２２３−１２３７，  ２００６；  Ａ．  Ｌ．  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら（監修），  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００；およびＤ．  Ｍ．  Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０に見られる。
【０１０７】
３．ヒト化腫瘍担持ＮＳＧマウス
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ストック番号００５５５７）はまた、一般的に、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ；ＮＳＧ；ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマヌル；およびＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇヌルとしても知られる。これらは、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪバックグラウンド（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙストック番号００１９７６）、重症複合免疫不全突然変異（ｓｃｉｄ）およびＩＬ２受容体ガンマ鎖不全の特徴を合わせ持つ。その結果、ＮＳＧマウスは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞（そしてしたがってマウス抗体を産生しない）、および機能するＮＫ細胞を欠き、補体系を持たず、そしてサイトカインシグナル伝達が欠損しており、他の公表されているマウス系統いずれよりも、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のより優れた生着を導く。ＮＳＧマウスはまた、欠陥マクロファージおよび樹状細胞も有する。最近の刊行物によって、膵島移植、造血幹細胞および癌幹細胞の研究における、この系統の驚くべき有用性が立証されてきている。
【０１０８】
具体的には、ＮＳＧマウスは、Ｐｒｋｄｃ遺伝子またはＸ連鎖Ｉｌ２ｒｇ遺伝子を発現しない。ＮＳＧマウスは、生存可能であり、繁殖性であり、サイズは正常で、そしていかなる巨視的物理的または行動上の異常も示さない。リンパ組織の組織学的検査は、胸腺におけるリンパ細胞およびいくつかの嚢胞性構造の欠如、脾臓における濾胞の欠如、ならびにリンパ節の細胞充実性の顕著な減少を明らかにする。ＮＳＧマウスは、成熟ＴおよびＢリンパ球を欠き、血清Ｉｇは検出不能であり、そしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞細胞傷害性活性は極端に低い。これらのマウスは、致死量以下の照射処置後であっても、リンパ腫発展に耐性である。これらの突然変異マウスは、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞の生着を容易に支持することが示されてきており、そして異種移植戦略を使用する研究に適した、優れた長期生存（生存中央値は８９週を超える）モデルに相当する。
【０１０９】
ＮＳＧマウスは、一部切除インターロイキン２受容体ガンマ鎖を発現する他の系統とは対照的に、真のヌルインターロイキン−２受容体ガンマ鎖突然変異を担持する（Ｏｈｂｏら，  Ｂｌｏｏｄ，  ８７：９５６−９６７，  １９９６を参照されたい）。ＮＳＧマウスは、研究試料提供契約（ＭＴＡ）のもとに、非営利研究施設に提供可能であり、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙは、ＮＩＨとの合意のもとに、ＮＳＧマウスを分配している。
【０１１０】
対象のヒト化ＮＳＧマウス（ＨＵ−ＮＳＧＴＭ）を作り出すため、造血幹細胞、例えばヒトＣＤ３４＋  ＨＳＣを、例えば尾静脈注射、心内注射、または肝内注射によって、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＮＳＧマウスに導入する。ＨＳＣを、約２、３、または４週齢のＮＳＧマウスに導入することも可能である。典型的には、２５ゲージ針を尾静脈注射に用いてもよい。より小さいゲージの針もまた使用可能であるが、接種中の細胞の剪断の可能性は増加する。
【０１１１】
ＨＳＣ送達の別の部位には、後眼窩静脈洞、骨髄腔自体、および脾臓が含まれる。後眼窩静脈洞への注入は、尾静脈を用いるよりも、実行するのはより簡単であるが、より侵襲性であり、そしてレシピエントマウスを麻酔する必要がある。骨髄への幹細胞ホーミングは、末梢血から骨髄腔に幹細胞を導く、間質由来因子１および幹細胞因子などの分子に依存する。したがって、循環に（または同所性に骨髄に）幹細胞を送達すると、細胞が新規宿主の骨髄中に常在を確立する可能性が増加する。
【０１１２】
場合によって、ＨＳＣ導入の直前、ＮＳＧマウスを、骨髄破壊のため、全体または全身照射（ＴＢＩ）に曝露し、これはＮＳＧマウスを特に設計された照射装置に入れ、動物が一過性にまたは長期にのいずれかで免疫抑制されるようになるように設計された全体ガンマ照射線量を加えることによって達成可能である。
【０１１３】
ＮＳＧマウスにおけるヒト免疫系の生存成功は、何らかの方式で、ＨＶＧ（宿主対移植片）拒絶を防止する、宿主免疫系の抑制を必要としうる。宿主の免疫系を抑制することに加え、照射はまた、宿主前駆体細胞の骨髄ニッチを枯渇させ、それによってドナー幹細胞の生着のスペースを可能にするのを補助する。ＮＳＧマウスに関しては、この用意は、一般的に、全身ガンマ照射によって達成される。照射装置は、意図される使用に応じて、サイズが多様でありうる。小型照射装置（例えば、ＪＬ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、カリフォルニア州サンフェルナンドのＭａｒｋ−Ｉ照射装置）は、冷蔵庫の大きさであり、そして一般に、細胞および少数のマウスの両方を照射するために用いられる。対照的に、１つの一般的に用いられるより大きい（６６００ポンド）ガンマ照射装置（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ−４０、ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ、カナダ・オタワ）を用いて、数ダースのマウスを一度に照射することも可能である。動物は、一般的に、短期間（１５分間未満）照射される。照射装置内側で掛かる時間の長さは、放射性同位体崩壊チャート、必要な照射の量、およびイオン化エネルギー供給源（すなわち、Ｘ線対ガンマ線、セシウムまたはコバルト供給源が必要）に応じて多様である。より大きな照射装置、例えばＣｌｉｎａｃ  ４／８０線形加速装置（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州パロアルト）もまた、必要であれば使用可能である。一般的に、マウスは、照射のために麻酔をする必要はない。
【０１１４】
骨髄破壊照射線量は、通常７００〜１３００ｃＧｙであるが、いくつかの態様において、より低い線量、例えば１〜１００ｃＧｙ（例えば２、５、または１０ｃＧｙ）、または３００〜７００ｃＧｙを用いてもよい。セシウムまたはＸ線照射のいずれであってもよい。
【０１１５】
特定の態様において、雌ＮＳＧマウスに、ヒト胸腺および肝臓断片を外科的に移植し、そしてドナーマッチヒトＣＤ３４＋造血幹細胞とともに移植する（ヒト化ＢＬＴ  ＮＳＧマウス）。こうしたヒト化ＢＬＴマウス（ｈｕ−ＢＬＴ）は、任意の現在のヒト化マウスモデルのうち、最も機能的な免疫系を有し、そして特定の研究、例えば粘膜に基づく免疫反応において別個の利点および改善された性能を示す。
【０１１６】
特定の態様において、ＮＳＧマウスをヒト化に用いる代わりに、ＮＳＧＳまたはＮＳＧ−ＳＧＭ３マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ  Ｔｇ（ＣＭＶ−ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙストック番号０１３０６２、一般的に、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇヌル−３／ＧＭ／ＳＦとしても知られる）を用いてもよい。これは、ヒト骨髄細胞増殖を補助するいくつかの導入遺伝子ヒトサイトカインの存在と、免疫不全環境を組み合わせた多数対立遺伝子マウス系統であり、そして異種移植片の宿主となるために特に有用なモデルに相当する。特に、これらのマウスは、３つの導入遺伝子、各々、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列によって駆動される、ヒトインターロイキン−３（ＩＬ−３）、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびヒトＳｔｅｅｌ因子（ＳＦ）遺伝子を有する。これらのマウスは、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスバックグラウンド上で維持され、そして構成的に、２〜４ｎｇ／ｍＬ血清レベルのヒトＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＳＦを産生する。Ｉｌ２ｒｇ−／−特異的ＮＯＤ．ＳＣＩＤバックグラウンドは、ヒトおよびネズミ造血細胞生着を補助し、そしてヒト骨髄または胎児肝臓細胞の移植後、マウスにおいて、ヒト赤血球生成を抑制し、ヒト骨髄造血を増進させ、そしてヒトＢリンパ球生成を減少させる。
【０１１７】
特定の態様において、マウスは、ヒト末梢血単核細胞を生着させており、例えばｈｕ−ＰＢＭＣ  ＮＳＧＴＭマウス（またはＰＢＭＣヒト化マウス）である。
単純化のため、特定の態様において、多様なＮＳＧまたはＮＳＧ由来マウス系統を集合的に、ＮＳＧマウスと称することも可能である。
【０１１８】
特定の態様において、マウスがおよそ３週齢になったら、ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＣをＮＳＧマウス（またはＮＳＧＳマウス、またはＢＬＴ−ＮＳＧマウス）に導入し、そして成熟ヒトＢ細胞は、ほぼ第１２週に現れ、そして成熟ヒトＴ細胞は、ほぼ第１５週に現れる。
【０１１９】
特定の態様において、ヒトＣＤ３４＋生着ＮＳＧマウス（またはＮＳＧＳマウス、またはＢＬＴ−ＮＳＧマウス）は、ＨＳＣ生着約１２週後、マウス末梢血中に、少なくとも約２０％、２５％、３０％またはそれより多いヒトＣＤ４５＋細胞を有する。
【０１２０】
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を有する、対象のヒト化ＮＳＧマウス（またはＮＳＧＳマウス、またはＢＬＴ−ＮＳＧマウス）を作り出すため、ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＣを再配置したＮＳＧマウス（またはＮＳＧＳマウス、またはＢＬＴ−ＮＳＧマウス）に、適切な量の患者由来細胞、例えば１〜１０ｘ１０６ヒト癌細胞を注射する。癌細胞がヒト起源であることは、Ｋｉ６７染色によって検証可能である。特定の態様において、ＨＳＣ生着の約２週間後に、ＰＤＸをマウスに導入する。特定の態様において、ＨＳＣ生着後約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５週で、ＰＤＸをマウスに導入する。特定の態様において、生着したヒト免疫細胞（例えばヒトＢまたはＴ細胞またはＮＫ細胞）が現れる前に、ＰＤＸをマウスに導入する。
【０１２１】
特定の態様において、ＰＤＸのＨＬＡ型は、ドナーヒトＨＳＣのＨＬＡ型とはマッチしない。
【実施例】
【０１２２】
本明細書に言及する任意の特許または刊行物は、各個々の刊行物が具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いで、本明細書に援用される。
本明細書に記載する発明の非ヒト動物（例えばマウス）、組成物、および方法は、特定の例示的態様、代表的態様の現在の代表であり、そしてそうでなければ本発明の範囲に対する限定とは意図されない。その改変および他の使用が、当業者に思い浮かぶであろう。こうした改変および他の使用は、請求項に示すような本発明の範囲から逸脱することなく、実行可能である。
【０１２３】
実施例１  マウス
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍｌ  Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγヌル、ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）で開発され、そして維持されているコロニーから得た。すべての動物を、特定病原体除去施設で、マイクロアイソレーターケージ中で飼育し、そしてオートクレーブされたフードを与え、そして１週おきにスルファメトキサゾール−トリメトプリム添加水（Ｇｏｌｄｌｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フロリダ州フォート・ローダーデール）および酸性化オートクレーブ水で維持した。
【０１２４】
実施例２  マウスへのヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の生着
Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８１：１５．２１．１−１５．２１．２１，  ２００８）に記載されるように、２４〜７２時間齢（新生）ＮＳＧマウスの群に、１００ｃＧｙで照射する。Ｂｒｅｈｍら（Ｃｌｉｎｉｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５（１）：８４−９８，  ２０１０）に記載されるように、照射したマウスに、２５〜５０μＬ体積中、３×１０４  ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有するＣＤ３  Ｔ細胞枯渇ヒト臍帯血（ＵＣＢ）を、心内注射を通じて注射する。１２週後、ＨＳＣレシピエントの血液のフローサイトメトリー分析によって、ヒト免疫系の生着を定量化する。実験研究には、＞２０％の末梢ヒトＣＤ４５＋細胞および＞５％のヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を有するマウスのみを用いる。
【０１２５】
同様に、Ｂｒｅｈｍら（Ｃｌｉｎｉｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３５（１）：８４−９８，  ２０１０）に記載されるように、致死量以下で照射した新生ＮＳＧマウスにまた、３×１０４  ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有するＣＤ３  Ｔ細胞枯渇ヒト臍帯血（ＵＣＢ）を、肝内注射を通じてまたは顔面静脈注射を通じて注射してもよい。
【０１２６】
さらに、標準技術を用い、側方尾静脈を通じて０．２〜１×１０６  ＣＤ３４＋ＨＳＣを注射する前に、約２００〜１３００ｃＧｙの線量で、約３週齢のＮＳＧマウスの群を、全身致死量以下照射に供してもよい。例えば、注射前に各動物の体重を測定し、そして体積で動物体重の最大約１％を、注射によって投与可能である。注射前に、５〜１０分間動物を温め（例えば商業的に入手可能な加温ボックス中、またはオーバーヘッド加熱ランプ下で、またはケージの下に置いた温水循環パッドを用いて）、静脈を拡張させる。次いで、軽く麻酔した動物を、再充電可能加熱パックまたは循環温水パッド上に横向きに置き、麻酔中に動物を温め続ける。次いで、切り口を上にして、小ゲージ（２８〜３０）針を、針およびシリンジが尾に平行であり続けるように努めながら、動物の頭部方向に向けて静脈内に挿入する。針は、静脈内にスムーズに進行するはずである。注射後、動物をケージに戻し、５〜１０分間観察して、出血が再開していないことを確認する。
【０１２７】
ＢＬＴ（骨髄／肝臓／胸腺）マウスモデルに関しては、胎児肝臓および胎児胸腺の約１ｍｍ３の立方体を、オーガノイドとして宿主ＮＳＧマウスに移植し、該マウスはあらかじめ、約２００ｃＧｙの全身照射に供されているマウスである。次いで、標準的技術を用いて、約０．２〜１×１０６  ＣＤ３４＋ＨＳＣを側方尾静脈を通じて注射する。ＢＬＴマウスモデルは、多数の造血系譜を含む、ロバストでそして一貫した異種移植片（例えばヒト）免疫系発展を可能にし；持続した高レベルのＴ細胞発展を示し；そしてＴ細胞は、自己胸腺組織上で教育される。こうしたマウスモデルは、典型的には、ウイルス感染（例えばＥＢＶおよびＨＩＶ）に対して検出可能なＴおよびＢ細胞反応を有する。
【０１２８】
任意の適切なヒト化マウスモデルにおいて、例えばヒト化ＮＳＧマウスにおいて、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）または癌細胞株を、特定の時点で、例えばヒトＣＤ３４＋細胞注入後２または１２週で、接種する。体重および腫瘍体積を頻繁に（例えば週２回）監視しながら、異種移植片を例えば約７週間増殖させる。
【０１２９】
ヒトＣＤ４５＋ドナー細胞生着の度合いを分析するため、研究終了時に、マウス由来の末梢血を収集してもよい。好ましくは、ヒトＣＤ４５＋ドナー細胞は、末梢血中、少なくとも２０〜３０％に到達していなければならない。
【０１３０】
実施例３  予期されるＰＤＸ増殖率の再現は、ＨＬＡ型マッチを必要としない
実質的に実施例２に上述するように、ＮＳＧマウスのヒト化を行った。簡潔には、標準的技術を用い、側方尾静脈注射を通じて、約０．２〜１ｘ１０６  ＣＤ３４＋ＨＳＣを注射する前に、約３週齢ＮＳＧマウスの群を全身照射（約２００ｃＧｙ）に供した。３つの異なる癌試料（乳癌細胞ＢＲ０６２０、肺癌細胞ＬＧ１２０８、および膀胱癌細胞ＢＬ０４４０）を用いたＰＤＸ異種移植片を、対象のヒト化ＮＳＧマウスモデル、すなわち、ＨＬＡミスマッチＨＳＣドナーから得た、樹立され、そして機能的に成熟したヒト免疫細胞を含む、ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウス内に皮下移植し、そしてＰＤＸ生着の増殖を、ＰＤＸ生着後最長約５５日まで監視した。３つの腫瘍はすべて、ロバストな増殖を示し、そして拒絶の明らかな徴候はなかった（図１）。
【０１３１】
結果は、ＨＬＡ型マッチが、対象のヒト化ＮＳＧマウスモデルにおいて、予期されるＰＤＸ増殖率を再現するために必要ではないことを示す。
実施例４  Ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭマウスにおける腫瘍増殖に対するＰＤＸ生着の時間的評価
非ＨＬＡマッチヒト化ｈＣＤ３４＋  ＮＳＧマウスにおけるＰＤＸ異種移植片腫瘍増殖に対するいかなる時間的影響も評価するため、約５ｘ１０６ヒトＳＫＯＶ３卵巣癌細胞を、実質的に上記の実施例２および３に記載するような方法にしたがって、非ＨＬＡマッチヒトＣＤ３４＋細胞注射の２または１２週後のいずれかに、ＮＳＧマウスに接種した。体重および腫瘍体積を週２回監視しながら、異種移植片を約７週間さらに増殖させた。ヒトＣＤ４５＋ドナー細胞生着の度合いを分析するため、マウスから末梢血を研究終了時に収集した。各７匹のマウス２群（２週対１２週）からの平均結果を図２に示した。
【０１３２】
生着後２週では、ヒト免疫はまだ発展していなかった。実際、成熟ヒトＴおよびＢ細胞は、ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスのＰＢＬ中で検出可能になるまでに少なくとも１２週を要する。しかし、腫瘍生着研究において、腫瘍生着は、どちらの群でも１００％（どちらもＮ＝７）であり、そして時間に対する腫瘍体積の増加は、２週群において、１２週群をわずかに上回った（図２）。
【０１３３】
結果は、マウスの２群間で有意な相違はないことを示し、ヒト化に比較した癌細胞株生着のタイミングは、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞の増殖に（あるとしても）有意な影響は持たないことが示唆された。
【０１３４】
癌細胞接種の５０日後、ヒト造血キメラ性に関してマウスを試験し、そしてすべて、ＰＢＬ中、２５〜５０％のｈｕＣＤ４５＋細胞を示し、生着が成功したことが示された（図３）。結果は、非ＨＬＡマッチヒト化ＮＳＧ  ＰＤＸモデルにおいて、ＣＤ４５＋細胞集団に対して、癌細胞株生着のタイミングが（あるとしても）有意な影響は持たないことを示した。
【０１３５】
実施例５  ヒト化は、ＰＤＸ増殖動態に有意な影響を持たない
これらの上記実験で取り組まれていない重要な問題は、ヒト免疫細胞の存在が、正常非ヒト化ＮＳＧマウスにおける増殖率に比較して、腫瘍増殖率に影響を及ぼすかどうかであった。
【０１３６】
ＮＳＧマウスモデルにおけるヒト化が、非ＨＬＡマッチＰＤＸの増殖動態になんらかの有意な影響を有するかどうかを決定するため、実質的に上記と同じ方法を用いて、３つの新鮮なＰＤＸ腫瘍試料、乳癌ＢＲ０７４４（図４Ａ）、肺癌ＬＧ０９７７（図４Ｂ）、および柔組織肉腫ＳＡ０２０９（図４Ｃ）を平行して独立に、ＮＳＧマウスモデル、またはｈｕＣＤ３４ヒト化ＮＳＧマウスモデルに生着させ、そして適宜、ＰＤＸ増殖曲線を測定し、そしてプロットした。
【０１３７】
ＮＳＧおよびヒト化ＮＳＧモデルのどちらにおいても、３つの腫瘍すべての生着率は１００％であり、そして腫瘍は、生着された宿主各々において発展した。ＮＳＧ対ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧレシピエントにおいて、乳房腫瘍のみがわずかにより速い率で増殖し（図４Ａ）；他の２つの腫瘍は、両方の宿主において、同じ速度で増殖した（図４Ｂおよび４Ｃ）。しかし全体的に、生着後４０〜７０日の全実験期間に渡って、ＰＤＸ腫瘍の、ＮＳＧ対ｈＮＳＧモデルにおける腫瘍増殖曲線には有意な相違はない。
【０１３８】
すべてのｈＮＳＧ実験群において、末梢血中のｈＣＤ４５＋細胞は２０％を超えており、ヒト化が成功したことを示唆した。また、図５Ａ〜５Ｃを参照すると、非ヒト化ＮＳＧマウスには、ｈＣＤ４５＋細胞が観察されないことが示されている。
【０１３９】
腫瘍増殖研究終了時、腫瘍もまた収集し、そしてＴＩＬの存在に関して、フローサイトメトリーによって分析した。３つの腫瘍はすべて、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を含有したが、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞はほとんど検出されなかった（図６Ａ〜６Ｃを参照されたい）。いかなる特定の理論によって束縛されることも望ましくないが、ＴＩＬがｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧレシピエントにおいて、腫瘍増殖を緩慢にすることに失敗したことは、腫瘍を認識するＴ細胞がアネルギーになったことを示唆する。
【０１４０】
総合すると、これらの結果は、ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスが、非ＨＬＡマッチ腫瘍増殖を支持し、そしてヒト免疫細胞の存在は、腫瘍生着または増殖率に有意な影響を及ぼさないことを立証する。
【０１４１】
実施例６  Ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ  ＰＤＸマウスは、薬剤有効性を評価するための機能性プラットホームである
上に示すように、ヒト化ＮＳＧマウスが非ＨＬＡマッチヒト腫瘍の増殖を支持可能であることは、この前臨床試験プラットホームの開発において、重要な知見であった。
【０１４２】
臨床的に適切な標準ケア（ＳＯＣ）治療を用い、非ＨＬＡマッチＰＤＸを含む対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭマウスを用いて、ＰＤＸに対する薬剤有効性を評価できるかどうかを試験するため、結腸癌ＣＮ１５７２Ｐ５  ＰＤＸに対して、それぞれ５−ＦＵおよびアバスチンを用い、陰性対照／ビヒクル群、および２つの治療群に関して、２１日に渡る腫瘍増殖曲線を得た。具体的には、５−ＦＵを、約２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ７ｄｘ２（７日間毎日、２回の総投薬）でｉ.ｖ．投与した。アバスチンを、約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、週２回、５回の総投薬でｉ．ｐ．投与した。ビヒクル（Ｄ５Ｗ）をＱ７ｄｘ３でｉ．ｖ．投与した。
【０１４３】
図７Ａおよび７Ｂの結果は、対象のヒト化ＮＳＧモデルにおいて、５−ＦＵおよびアバスチンの両方が、非ＨＬＡマッチ結腸癌ＰＤＸに対してどちらも有効であることを示す。これは、対象の非ＨＬＡマッチＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ  ＰＤＸモデルが、臨床的に適切な標準ケア（ＳＯＣ）薬剤の有効性を評価するための機能性プラットホームであることを立証する。
【０１４４】
実施例７  キートルーダおよびシスプラチンは、Ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭにおけるＰＤ−Ｌ１＋  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌腫瘍モデルの増殖を阻害する
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１およびＣＤ２７９としても知られる）は、ヒトにおいて、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのＣＤ２８ファミリーに属し、そしてＴ細胞、プロＢ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、および多くの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上に発現される、免疫阻害細胞表面受容体である。該タンパク質は、重要な免疫「チェックポイント」受容体であり、Ｔ細胞反応を阻害し、そしてＴ細胞機能の調節において重要な役割を果たす。
【０１４５】
ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合し、これらはどちらも腫瘍細胞上に見られており、そしてこれらはどちらも、腫瘍細胞によって、活性化Ｔ細胞上のＰＤ−１受容体に結合して、活性化Ｔ細胞の機能を抑制し、こうして腫瘍細胞に対する免疫反応を回避するために用いられてきている。したがって、ＰＤ−１およびそのリガンドは、Ｔ細胞の活性化を防止し、続いて癌に対する免疫反応を下方制御するが、また、自己免疫を減少させ、そして自己寛容を促進することによって、免疫系を下方制御する際に重要な役割を果たす。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進する一方、同時に、制御Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを減少させる二重機構を通じて、達成されると考えられる。
【０１４６】
ＰＤ−１をブロッキングする薬剤の新規クラス、ＰＤ−１阻害剤は、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃し、そしてしたがって癌を治療するために有用である。例えば、ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体は、免疫系をブーストし、こうして癌の治療に有用である。さらに、多くの腫瘍細胞が、免疫抑制性のＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１を発現する。したがって、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を阻害すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞反応が増進され、そして前臨床抗腫瘍活性が仲介されうる。
【０１４７】
１つのこうした抗ＰＤ−１抗体薬剤、ニボルマブ（オプジーボ、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、総数２９６人の患者での臨床試験において、小細胞肺癌、黒色腫、および腎細胞癌において、完全または部分的反応を生じた。ニボルマブはまた、ＰＤ−１受容体もターゲティングし、そして転移性黒色腫を治療するため、２０１４年７月に日本で、そして２０１４年１２月にＵＳ  ＦＤＡにより、認可された。
【０１４８】
別のこうした抗ＰＤ−１抗体薬剤、ペムブロリズマブ（キートルーダ、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１受容体をターゲティングし、そして転移性黒色腫を治療するため、２０１４年９月、ＦＤＡによって認可された。ペムブロリズマブは、２０１５年３月、英国医薬品早期アクセス制度（ＥＡＭＳ）を通じて、英国の進行黒色腫患者にも利用可能になってきている。ペムブロリズマブはまた、肺癌および中皮腫に関しても、米国において臨床試験で用いられている。
【０１４９】
ＰＤ−１受容体をターゲティングする開発初期段階の他の薬剤には、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）、ＢＭＳ９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、およびＭＰＤＬ３２８ＯＡ（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。
【０１５０】
一方、シスプラチンは、現在の白金含有抗癌化学療法薬剤クラスの第一のメンバーであり、このクラスにはまた、カルボプラチンおよびオキサリプラチンも含まれる。これらの白金複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで反応し、ＤＮＡに結合して、そして架橋を引き起こし、これが最終的にアポトーシス（プログラム細胞死）を誘発する。
【０１５１】
生着したＰＤＸ腫瘍がまた、臨床的に適切な免疫腫瘍学チェックポイント阻害剤に反応するかどうか、またこうしたチェックポイント阻害剤が常在ヒト免疫細胞において抗腫瘍反応を再活性化可能であるかどうかを決定するため、これらの疑問に取り組む、一連の実験を設計し、そして実行した。
【０１５２】
第一に、チェックポイント阻害剤ペムブロリズマブ（キートルーダ）が、対象の非ＨＬＡマッチＰＤＸヒト化ＮＳＧモデルにおいて有効であるかどうかを決定するため、本発明の方法にしたがって、ＰＤＸ  ｈｕＮＳＧモデルを確立した。特に、ヒト化ＮＳＧマウス（ヒトＣＤ４５＋細胞は、ｈＮＳＧマウスの末梢血において、２５％を超えることが見出され、ｈｕＣＤ３４生着が成功したことが立証された）に、マトリゲルでのｓ．ｃ．接種を通じた、マウスあたり５ｘ１０６の非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を生着させた。この細胞株は、腫瘍細胞表面上に、ＰＤ−Ｌ１を非常に高レベルで発現し、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＰＤ−１に結合可能であり、ＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の約９４．３％でアネルギーを誘導可能である。次いで、腫瘍生着ヒト化ＮＳＧマウスをビヒクル、シスプラチン、またはペムブロリズマブ（キートルーダ）のいずれかで処置した。
【０１５３】
陰性対照／ビヒクル群、ならびにそれぞれシスプラチンおよびペムブロリズマブ（キートルーダ）を用いる２つの処置群に関して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＰＤＸに対する、２１日間に渡る腫瘍増殖曲線を得た。具体的には、シスプラチンを、約２ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ７ｄｘ２（７日間毎日、２回の総投薬）でｉ.ｖ．投与した。ペムブロリズマブ（キートルーダ）を、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ５ｄｘ４（５日間毎日、４回の総投薬）でｉ．ｐ．投与した。ビヒクル（生理食塩水）を、Ｑ５ｄｘ４でｉ．ｐ．投与した。
【０１５４】
シスプラチンは、迅速に分裂している細胞において、ＤＮＡ架橋およびアポトーシスを引き起こす、白金含有化学療法剤である。シスプラチン処置は、ヒト化マウスにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖率を最低限にしか減少させない。対照的に、キートルーダは、処置開始〜２週間以内に、腫瘍増殖を有意に遅延させた（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０１５５】
増殖研究終了時、実験マウスの末梢血を収集し、そしてヒトＣＤ１９＋  Ｂ細胞ならびにヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に関してアッセイした。図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方を含むヒトＴ細胞、ならびにＣＤ１９＋  Ｂ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＰＤＸマウスの末梢血に存在することを示す。
【０１５６】
腫瘍もまた収集し、そしてヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋浸潤Ｔ細胞に関してアッセイした。図１０Ａ〜１０Ｃは、ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方）が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＰＤＸマウスの腫瘍組織に存在することを示す。
【０１５７】
したがって、３つの処置群はすべて、治療に関わりなく、類似の割合のこれらの細胞を示した。キートルーダ処置腫瘍においてさらなるＴＩＬが存在しないことは、腫瘍のより緩慢な増殖が常在ＴＩＬの再活性化から生じ、そしてＰＢＬまたは脾臓からのＴＩＬ浸潤のさらなる刺激からではないことを示唆する。
【０１５８】
データは再び、対象の非ＨＬＡマッチＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ  ＰＤＸモデルが、生着ヒト免疫細胞の機能に頼る可能性もある免疫調節薬剤を含めて、薬剤有効性を評価するための機能的プラットホームであることを立証する。
【０１５９】
実施例８  キートルーダおよびシスプラチンは、Ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭにおけるＰＤ−Ｌ１＋  ＴＮＢＣ  ＢＲ１１２６乳癌腫瘍モデルの増殖を阻害する
非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性乳癌細胞株ＢＲ１１２６細胞、三重陰性乳癌細胞（ＴＮＢＣ）細胞株で置き換えた本実施例では、実施例７と実質的に同じ結果を得た。三重陰性乳癌は、治療オプションが限定されている、悪性度が高い乳癌のサブセットである。ＰＤ−Ｌ１発現はＴＮＢＣ患者で報告されている。ＰＤ−Ｌ１発現をＴＩＬにおいて評価する際、これはより高い悪性度およびより大きい腫瘍と相関する。腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現はまた、ＴＮＢＣにおけるＴ制御細胞の浸潤とも相関し、この知見は、ＴＮＢＣにおける免疫反応の制御における、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１発現ＴＩＬの役割を示唆する。
【０１６０】
具体的には、ヒト化ＮＳＧマウスに、ｓ．ｃ．接種を通じて、マウスあたり５ｘ１０６の非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性乳癌細胞株ＢＲ１１２６細胞を生着させた。これはマトリゲルの存在下で実行可能である。約５６．９％のＢＲ１１２６細胞がＰＤ−Ｌ１を発現した。ヒトＣＤ４５＋細胞は、ｈＮＳＧマウスの末梢血中、２５％より多く見られた。
【０１６１】
ＢＲ１１２６  ＰＤＸに対して、陰性対照／ビヒクル群、ならびにそれぞれシスプラチンおよびペムブロリズマブ（キートルーダ）を用いた２つの処置群に関して、２１日間に渡る、腫瘍増殖曲線を得た。具体的には、シスプラチンを、約２ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ７ｄｘ３（７日間毎日、３回の総投薬）でｉ.ｖ．投与した。ペムブロリズマブ（キートルーダ）を、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ５ｄｘ４（５日間毎日、４回の総投薬）でｉ．ｐ．投与した。ビヒクル（生理食塩水）を、Ｑ５ｄｘ４でｉ．ｐ．投与した。
【０１６２】
図１１Ａおよび１１Ｂの結果は、対象のヒト化ＮＳＧモデルにおいて、非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１＋乳癌ＰＤＸに対して、ビヒクル対照に比較して、シスプラチンおよびキートルーダの両方が、腫瘍増殖を有意に減少させたことを示す。
【０１６３】
図１２Ａ〜１２Ｄは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方を含むヒトＴ細胞、ならびにＣＤ１９＋  Ｂ細胞が、Ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＢＲ１１２６  ＰＤＸマウスの末梢血中に存在することをさらに示す。
【０１６４】
キートルーダ処置マウスから、研究終了時に腫瘍を収集し、そしてリンパ球浸潤に関して調べた。図１３Ａ〜１３Ｄは、ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方）およびＣＤ１９＋  Ｂ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＢＲ１１２６  ＰＤＸマウスの腫瘍組織中に存在することを示す。したがって、癌細胞株実験におけるように、腫瘍にはまた、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞、ならびにヒトＢ細胞も浸潤し、そしてキートルーダでの処置は、ビヒクル処置マウスに比較して、腫瘍浸潤を増加させず、やはり、常在免疫エフェクター細胞の再活性化から、より緩慢な腫瘍増殖が生じたことが示唆された。
【０１６５】
図１３Ｅ〜１３Ｈは、ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞両方）およびＣＤ１９＋  Ｂ細胞が、対象のＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ非ＨＬＡマッチＢＲ１１２６  ＰＤＸマウスの脾臓に存在することをさらに示す。
【０１６６】
類似の実験において、化学療法のみ、抗ＰＤ１剤キートルーダ、および抗ＣＴＬＡ４剤イピリムマブによって処置したＰＤＸ腫瘍試料に対して、ＣＤ４５＋ＣＤ８＋浸潤Ｔリンパ球の存在に関して免疫染色を行った。図１６は、抗ＰＤ１剤キートルーダ、および抗ＣＴＬＡ４剤イピリムマブを用いた処置が、化学療法単独に比較して、浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ８＋  Ｔリンパ球の強い存在を導いたことを示す。
【０１６７】
これは再び、対象の非ＨＬＡマッチＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ  ＰＤＸモデルが、生着ヒト免疫細胞の機能に頼る可能性がある免疫調節薬剤を含めて、薬剤有効性を評価するための機能的プラットホームであることを立証する。
【０１６８】
実施例９  キートルーダ＋／−ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｏｌ）は、Ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭにおいて、ＰＤ−Ｌ１＋  ＬＧ１３０６肺癌腫瘍モデルの増殖を阻害する
ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスにおける腫瘍の組み合わせ治療が、いずれかの単剤療法よりも、より高い有効性を示すかどうかを決定するため、実験を行った。
【０１６９】
非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＢＲ１１２６細胞を非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性肺癌細胞株ＬＧ１３０６で置換した本実施例において、実施例７および８におけるものと実質的に同じ結果を得た。
【０１７０】
具体的には、ヒト化ＮＳＧマウスに、マウスあたり５ｘ１０６の非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１陽性ＰＤＸ肺癌細胞株ＬＧ１３０６を生着させた。約８９．１％のＬＧ１３０６細胞がＰＤ−Ｌ１を発現した。ヒトＣＤ４５＋細胞は、ｈＮＳＧマウスの末梢血中、２０％より多く見られた。
【０１７１】
ＬＧ１３０６  ＰＤＸに対して、陰性対照／ビヒクル群、および抗有糸分裂化学療法剤ドセタキセル（Ｄｅｃｏｔａｘｏｌ）を伴うまたは伴わないペムブロリズマブ（キートルーダ）を用いた２つの処置群に関して、２４日間に渡る、腫瘍増殖曲線を得た。具体的には、存在する場合、ドセタキセル（Ｄｅｃｅｔａｘｏｌ）を、約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ７ｄｘ４（７日間毎日、４回の総投薬）でｉ.ｖ．投与した。ペムブロリズマブ（キートルーダ）を、約５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、Ｑ５ｄｘ６（５日間毎日、６回の総投薬）でｉ．ｐ．投与した。ビヒクル（生理食塩水）を、Ｑ５ｄｘ６でｉ．ｐ．投与した。
【０１７２】
キートルーダ単独のマウス由来の腫瘍は、ビヒクル処置対照由来のものに比較して、減少した増殖を示したが、その反応は、１０匹のマウスのうち１匹がキートルーダに反応しなかったため、非常に多様であった。キートルーダをドセタキセルと組み合わせると、腫瘍増殖は、治療後１０日以内に有意に抑制され、マウス間（腫瘍間）変動はほとんどなかった。しかし、キートルーダに反応しなかった１匹のマウスを計算から除外すると、キートルーダおよび組み合わせアームの間に相違はなかった。どちらのアームも腫瘍増殖の有意な減少を示し、そしてキートルーダおよびドセタキセルを組み合わせた際、相加的な効果は観察されなかった。
【０１７３】
したがって、図１４Ａおよび１４Ｂに示すような結果は、ドセタキセルを伴うまたは伴わないペムブロリズマブ（キートルーダ）が、対象のヒト化ＮＳＧモデルにおいて、非ＨＬＡマッチＰＤ−Ｌ１＋乳癌ＰＤＸに対して有効であることを示した。
【０１７４】
総合すると、本明細書に記載する実験、特に実施例６〜９の実験は、ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスに生着させたヒト腫瘍が、標準ケア化学療法に反応可能であることを立証した。しかし、さらにより重大な知見は、生着された腫瘍が、由来した患者においてそうするのと同様に、ヒト免疫を回避するようであることである。さらに、ＴＩＬチェックポイント阻害剤での処置は、おそらく、アネルギーからＴ細胞を解放し、そして腫瘍に対する細胞傷害性を刺激する。
【０１７５】
データは、ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧマウスがヒト免疫細胞および腫瘍の相互作用に関する新規洞察を集め、そして免疫腫瘍学および組み合わせ療法を試験する、強力なプラットホームであることを立証する。
【０１７６】
全体として、本明細書の実施例で立証される結果は、対象のヒト化マウス（例えばＮＳＧマウス）におけるＰＤＸ腫瘍の生着および増殖、生着マウスの標準ケア（ＳＯＣ）治療に対する反応、およびチェックポイント阻害剤での治療後の免疫仲介性腫瘍退行を立証する。これらの結果は、対象のヒト化マウス（例えばＮＳＧマウス）を、免疫腫瘍学療法の新規前臨床架橋として使用することを支持する。
【０１７７】
本明細書に引用するような、特許文献を含むすべての参考文献は、本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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