(57)【要約】  本開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９および古典的ＰＡＭ配列を含有しない標的配列に対して増加した活性を有するＣａｓ９変異体の操作に有用であるストラテジー、システム、試薬、方法およびキットを提供する。いくつかの態様において、かかるＣａｓ９変異体と核酸編集ドメイン、例えばデアミナーゼドメインを含む融合蛋白質が提供される。
2018537963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択されるアミノ酸残基において、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項２】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４Ｋ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ６９４Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＭ６９４Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３】
配列番号９〜２６２のいずれか１つに示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項２２または２３に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４Ｋ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ、Ｘ５４３ＤおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４ＫおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４５】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２４〜４４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４６】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２４〜４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４７】
ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２４〜４６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４８】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２４〜４７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４９】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤＩＯＡおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜４８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５０】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１ＯＸ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項２２〜４８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５１】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜５０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５２】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０においてＨを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む、請求項５１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５３】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２２〜５１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５４】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０においてＤを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む、請求項５３に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５５】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較して、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項２２〜５４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５６】
配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、
組み換えＣａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較して、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項５７】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項５６に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５８】
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのCas９の活性と比較し、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍の、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している、請求項５６または５７に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５９】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している、請求項５８に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６０】
標的配列の３’末端が、ＣＡＣ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡおよびＣＧＴからなる群から選択される配列と直接隣接している、請求項５８または５９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６１】
Ｃａｓ９蛋白質の活性が、ヌクレアーゼアッセイ、脱アミノアッセイまたは転写活性化アッセイで測定される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６２】
転写活性化アッセイがＧＦＰ活性化アッセイである、請求項６１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４Ｋ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜６６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜６７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜６８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜６９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ、Ｘ５４３ＤおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４ＫおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８３】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項５７〜８２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８４】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項５７〜８３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８５】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項５７〜８４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８６】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項５７〜８５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８７】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜８６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８８】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項５６〜８６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８９】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜８８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９０】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０でＨを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む、請求項８９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９１】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項５６〜８９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９２】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０でＤを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む、請求項９１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９３】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９からなる群から選択されるアミノ酸残基、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項９４】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項９３に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項９３または９４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩまたはＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、請求項９３〜９５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項９３〜９６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項９３〜９７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９９】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項９４〜９８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１００】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項９４〜９９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０１】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項９４〜１００のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０２】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項９４〜１０１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０３】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項９３〜１０２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０４】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項９３〜１０２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０５】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０においてＨを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む、請求項１０４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０６】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項９３〜１０５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０７】
配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、
組み換えＣａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０８】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項１０７に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０９】
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、
同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９の活性と比較し、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍の、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している、請求項１０７または１０８に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１０】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している、請求項１０９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１１】
Ｃａｓ９蛋白質の活性が、ヌクレアーゼアッセイ、脱アミノアッセイまたは転写活性化アッセイで測定される、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１２】
転写活性化アッセイがＧＦＰ活性化アッセイである、請求項１１１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１０７〜１１２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩまたはＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、請求項１０７〜１１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１０７〜１１４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１０７〜１１５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１７】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項１０８〜１１６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１８】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１０８〜１１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１９】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２０】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１０８〜１１９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２１】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１０７〜１２０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２２】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１０７〜１２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２３】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０においてＨを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む、請求項１２２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２４】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３、１０８、１１５、１４１、１８０、２３０、２５７、２６２、２６７、２８４、２９４、３２４、４０９、４５５、４６６、４７４、４８０、５４３、５５４、６５４、６９４、７１１、７２７、７６３、１０６３、１１００、１２１９、１２４４、１２５６、１２８９および１３２３、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０のアミノ酸残基の変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２５】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項１２４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３Ｎ、Ｘ１０８Ｇ、Ｘ１１５Ｈ、Ｘ１４１Ｑ、Ｘ１８０Ｎ、Ｘ２３０Ｓ、Ｘ２５７Ｎ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２８４Ｎ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４５５Ｆ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４７４Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ５５４Ｒ、Ｘ６５４Ｌ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ７２７Ｐ、Ｘ７６３Ｉ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１１００Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２４４Ｎ、Ｘ１２５６Ｋ、Ｘ１２８９ＱおよびＸ１３２３Ｓ、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは、少なくとも１０の変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４または１２５に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２３Ｎ、Ｅ１０８Ｇ、Ｒ１１５Ｈ、Ｋ１４１Ｑ、Ｄ１８０Ｎ、Ｐ２３０Ｓ、Ｄ２５７Ｎ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｄ２８４Ｎ、Ｋ２９４Ｒ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｌ４５５Ｆ、Ｔ４６６Ａ、Ｔ４７４Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ５５４Ｒ、Ｒ６５４Ｌ、Ｍ６９４Ｉ、Ａ７１１Ｅ、Ｌ７２７Ｐ、Ｍ７６３Ｉ、Ｉ１０６３Ｖ、Ｖ１１００Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｋ１２４４Ｎ、Ｑ１２５６Ｋ、Ｋ１２８９ＱおよびＡ１３２３Ｓ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の変異を含む、請求項１２４〜１２６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１１５Ｈ、Ｘ１４１Ｑ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｘ２３Ｎ、Ｘ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ７２７Ｐ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２８９Ｑ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２５７Ｎ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４０９Ｉ、Ｘ４５５Ｆ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６５４Ｌ、Ｘ１１００Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３２３Ｓ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３０Ｓ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１８０Ｎ、Ｘ２８４Ｎ、Ｘ４７４Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ５５４Ｒ、Ｘ７６３Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２４４Ｎ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３０Ｓ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４ＲおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２ＴおよびＸ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＲ１１５Ｈ、Ｋ１４１Ｑ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２３Ｎ、Ｅ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｌ７２７Ｐ、Ｅ１２１９ＶおよびＫ１２８９Ｑ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２５７Ｎ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｉ１０６３Ｖ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ４０９Ｉ、Ｌ４５５Ｆ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｒ６５４Ｌ、Ｖ１１００Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＡ１３２３Ｓ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ａ７１１Ｅ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＰ２３０Ｓ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１８０Ｎ、Ｄ２８４Ｎ、Ｔ４７４Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ５５４Ｒ、Ｍ７６３Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＫ１２４４Ｎ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＰ２３０Ｓ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４ＲおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２ＴおよびＳ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５８】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項１２４〜１５７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１５９】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１２５〜１５８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６０】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項１２５〜１５９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６１】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１２５〜１６０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６２】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１６１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６３】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項１２４〜１６２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６４】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１６３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６５】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＨを含む、請求項１６４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６６】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１２４〜１６４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６７】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＤを含む、請求項１６６に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６８】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項１２４〜１６７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１６９】
配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３、１０８、１１５、１４１、１８０、２３０、２５７、２６２、２６７、２８４、２９４、３２４、４０９、４５５、４６６、４７４、４８０、５４３、５５４、６５４、６９４、７１１、７２７、７６３、１０６３、１１００、１２１９、１２４４、１２５６、１２８９および１３２３、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０のアミノ酸残基の変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、
組み換えＣａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７０】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項１６９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７１】
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９の活性と比較し、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍の、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している、請求項１６９または１７０に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７２】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している、請求項１７１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７３】
標的配列の３’末端が、ＣＡＣ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡおよびＣＧＴからなる群から選択される配列と直接隣接している、請求項１７１または１７２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７４】
Ｃａｓ９蛋白質の活性が、ヌクレアーゼアッセイ、脱アミノアッセイまたは転写活性化アッセイで測定される、請求項１６９〜１７３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７５】
転写活性化アッセイがＧＦＰ活性化アッセイである、請求項１７４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３Ｎ、Ｘ１０８Ｇ、Ｘ１１５Ｈ、Ｘ１４１Ｑ、Ｘ１８０Ｎ、Ｘ２３０Ｓ、Ｘ２５７Ｎ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２８４Ｎ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４５５Ｆ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４７４Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ５５４Ｒ、Ｘ６５４Ｌ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ７２７Ｐ、Ｘ７６３Ｉ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１１００Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２４４Ｎ、Ｘ１２５６Ｋ、Ｘ１２８９ＱおよびＸ１３２３Ｓ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２３Ｎ、Ｅ１０８Ｇ、Ｒ１１５Ｈ、Ｋ１４１Ｑ、Ｄ１８０Ｎ、Ｐ２３０Ｓ、Ｄ２５７Ｎ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｄ２８４Ｎ、Ｋ２９４Ｒ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｌ４５５Ｆ、Ｔ４６６Ａ、Ｔ４７４Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ５５４Ｒ、Ｒ６５４Ｌ、Ｍ６９４Ｉ、Ａ７１１Ｅ、Ｌ７２７Ｐ、Ｍ７６３Ｉ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１１００Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｋ１２４４Ｎ、Ｑ１２５６Ｋ、Ｋ１２８９ＱおよびＡ１３２３Ｓ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、請求項１６９〜１７６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１１５Ｈ、Ｘ１４１Ｑ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１７９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｘ２３Ｎ、Ｘ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ７２７Ｐ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２８９Ｑ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２５７Ｎ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４０９Ｉ、Ｘ４５５Ｆ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６５４Ｌ、Ｘ１１００Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３２３Ｓ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３０Ｓ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１８０Ｎ、Ｘ２８４Ｎ、Ｘ４７４Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ５５４Ｒ、Ｘ７６３Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２４４Ｎ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１８９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３０Ｓ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４ＲおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２ＴおよびＸ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＲ１１５Ｈ、Ｋ１４１Ｑ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ，Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｄ２３Ｎ、Ｅ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｌ７２７Ｐ、Ｅ１２１９ＶおよびＫ１２８９Ｑ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２５７Ｎ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｉ１０６３Ｖ，Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ４０９Ｉ、Ｌ４５５Ｆ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｒ６５４Ｌ、Ｖ１１００Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＡ１３２３Ｓ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１９９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２００】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ５４３Ｄ、Ａ７１１Ｅ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＰ２３０Ｓ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１８０Ｎ、Ｄ２８４Ｎ、Ｔ４７４Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ５５４Ｒ、Ｍ７６３Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＫ１２４４Ｎ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＰ２３０Ｓ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４ＲおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２ＴおよびＳ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０８】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項１７０〜２０７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２０９】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１７０〜２０８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１０】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項１７０〜２０９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１１】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１７０〜２１０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１２】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜２１１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１３】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項１６９〜２１１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１４】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜２１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１５】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＨを含む、請求項２１４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１６】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１６９〜２１４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１７】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＤを含む、請求項２１６に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１８】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１７０、２３０、２５７、２６７、２９４、４６６、４８０、５４３、７１１、１０６３、１２０７、１２１９および１２５６、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９のアミノ酸残基の変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項２１９】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項２１８に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１７５Ｔ、Ｘ２３０Ｆ、Ｘ２５７Ｎ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ１２０７Ｇ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８または２１９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＮ１７５Ｔ、Ｐ２３０Ｆ、Ｄ２５７Ｎ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ａ７１１Ｅ、Ｅ１２０７Ｇ、Ｉ１０６３Ｖ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含む、請求項２１８〜２２０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３０Ｆ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ１２０７Ｇ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１７５Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２５７Ｎ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４ＲおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＰ２３０Ｆ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２２９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ａ７１１Ｅ、Ｅ１２０７Ｇ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＮ１７５Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２５７Ｎ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｉ１０６３Ｖ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４ＲおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３４】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２１８〜２３３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３５】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２１９〜２３４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３６】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２１９〜２３５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３７】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２１９〜２３６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３８】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２３７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２３９】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項２１８〜２３８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４０】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２３９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４１】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＨを含む、請求項２４０に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４２】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２１８〜２４０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４３】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＤを含む、請求項２４２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４４】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項２１８〜２４３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４５】
配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１７５、２３０、２５７、２６７、２９４、４６６、４８０、５４３、７１１、１０６３、１２０７、１２１９および１２５６からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、
組み換えＣａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４６】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項２４５に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４７】
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９の活性と比較し、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍の、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している、請求項２４５または２４６に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４８】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している、請求項２４７に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２４９】
標的配列の３’末端が、ＣＡＣ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡおよびＣＧＴからなる群から選択される配列と直接隣接している、請求項２４７または２４８に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５０】
Ｃａｓ９蛋白質の活性が、ヌクレアーゼアッセイ、脱アミノアッセイまたは転写活性化アッセイで測定される、請求項２４６〜２４９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５１】
転写活性化アッセイがＧＦＰ活性化アッセイである、請求項２５０に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１７５Ｔ、Ｘ２３０Ｆ、Ｘ２５７Ｎ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ１２０７Ｇ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＮ１７５Ｔ、Ｐ２３０Ｆ、Ｄ２５７Ｎ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ａ７１１Ｅ、Ｅ１２０７Ｇ、Ｉ１０６３Ｖ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含む、請求項２４５〜２５２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２３０Ｆ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ７１１Ｅ、Ｘ１２０７Ｇ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１７５Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２５７Ｎ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４６６Ａ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１０６３Ｖ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２５９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４ＲおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＰ２３０Ｆ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ａ７１１Ｅ、Ｅ１２０７Ｇ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＮ１７５Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ２５７Ｎ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｔ４６６Ａ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｉ１０６３Ｖ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４ＲおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２５３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６６】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２４６〜２６５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６７】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２４６〜２６６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６８】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２４６〜２６７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２６９】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２４７〜２６８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７０】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２６９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７１】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項２４５〜２６９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７２】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２７１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７３】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＨを含む、請求項２７２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７４】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２４５〜２７２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７５】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＤを含む、請求項２７４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７６】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０８、２１７、２６２、３２４、４０９、４８０、５４３、６７３、６９４、１２１９、１２６４および１３６５、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７７】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項２７６に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２１７Ａ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６７３Ｅ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２６４ＹおよびＸ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６または２７７に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２７９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１０８Ｇ、Ｓ２１７Ａ、Ａ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ６７３Ｅ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｈ１２６４ＹおよびＬ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含む、請求項２７６〜２７８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６７３Ｅ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２１７Ａ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２６４Ｙ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６７３Ｅ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２ＴおよびＸ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２８９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｅ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ６７３Ｅ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｅ１０８Ｇ、Ｓ２１７Ａ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＨ１２６４Ｙ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ６７３Ｅ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２ＴおよびＳ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜２７９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９８】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２７６〜２９７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項２９９】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２７７〜２９８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３００】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項２７７〜２９９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０１】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項２７７〜３００のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０２】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜３０１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０３】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項２７６〜３０２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０４】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜３０３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０５】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＨを含む、請求項３０４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０６】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項２７６〜３０４のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０７】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＤを含む、請求項３０６に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０８】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項２７６〜３０７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３０９】
配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０８、２１７、２６２、３２４、４０９、４８０、５４３、６７３、６９４、１２１９、１２６４および１３６５からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、
組み換えＣａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１０】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項３０９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１１】
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９の活性と比較し、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍の、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している、請求項３０９または３１０に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１２】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している、請求項３１１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１３】
標的配列の３’末端が、ＣＡＣ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡおよびＣＧＴからなる群から選択される配列と直接隣接している、請求項３１１または３１２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１４】
Ｃａｓ９蛋白質の活性が、ヌクレアーゼアッセイ、脱アミノアッセイまたは転写活性化アッセイで測定される、請求項３１０〜３１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１５】
転写活性化アッセイがＧＦＰ活性化アッセイである、請求項３１４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２１７Ａ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６７３Ｅ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２６４ＹおよびＸ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１０８Ｇ、Ｓ２１７Ａ、Ａ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ６７３Ｅ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｈ１２６４ＹおよびＬ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９の変異を含む、請求項３０９〜３１６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６７３Ｅ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３１９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２１７Ａ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ３２４Ｌ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２６４Ｙ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６７３Ｅ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１０８Ｇ、Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２ＴおよびＸ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｅ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ６７３Ｅ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２８】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｅ１０８Ｇ、Ｓ２１７Ａ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３２９】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３０】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＨ１２６４Ｙ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３１】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｋ６７３Ｅ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１０８Ｇ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９ＶおよびＬ１３６５Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３５】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２ＴおよびＳ４０９Ｉ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３１７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３６】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項３１０〜３３５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３７】
ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項３１０〜３３０のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３８】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項３１０〜３３７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３９】
Ｒｕｖｃドメインのアミノ酸配列が、配列番号９のＲｕｖｃドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項３１０〜３３８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４０】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３３９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４１】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１がＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２がＨ以外のいずれかのアミノ酸である、請求項３０９〜３３９のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４２】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３４１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４３】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＨを含む、請求項３４２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４４】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項３０９〜３４２のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４５】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、においてＤを含む、請求項３４４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３４６】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片がエフェクタードメインと融合し、それにより融合蛋白質を形成する、請求項１〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質。
【請求項３４７】
エフェクタードメインが、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する、請求項３４６に記載の融合蛋白質。
【請求項３４８】
エフェクタードメインが、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する、請求項３４６に記載の融合蛋白質。
【請求項３４９】
Ｃａｓ９蛋白質およびエフェクタードメインが、リンカーを介して融合する、請求項３４６〜３４８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３５０】
エフェクタードメインが、核酸編集ドメインである、請求項３４６〜３４９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３５１】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎが独立に１〜３０の整数である、請求項３４９または３５０に記載の融合蛋白質。
【請求項３５２】
リンカーが、（ＧＧＳ）３モチーフを含む、請求項３４９〜３５１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３５３】
エフェクタードメインが、酵素ドメインを含む、請求項３４６〜３５２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３５４】
エフェクタードメインが、ヌクレアーゼドメイン、ニッカーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、デアミナーゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、メチラーゼドメイン、アセチラーゼドメイン、アセチルトランスフェラーゼドメイン、転写アクチベータードメインまたは転写リプレッサードメインを含む、請求項３４６〜３５３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３５５】
エフェクタードメインが、ヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、リコンビナーゼ活性、デアミナーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、メチラーゼ活性、アセチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性または転写抑制活性を含むドメインである、請求項３５４に記載の融合蛋白質。
【請求項３５６】
エフェクタードメインが、デアミナーゼドメインである、請求項３５０に記載の融合蛋白質。
【請求項３５７】
デアミナーゼが、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項３５６に記載の融合蛋白質。
【請求項３５８】
デアミナーゼが、アポリポ蛋白質ＢメッセンジャーＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３５９】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６０】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６１】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６２】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６３】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６４】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６５】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６６】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６７】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６８】
デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３６９】
デアミナーゼが、活性化により誘導されたデアミナーゼ（ＡＩＤ）である、請求項３５７に記載の融合蛋白質。
【請求項３７０】
エフェクタードメインが、配列番号２６３−２８１のいずれか１つのデアミナーゼドメインと、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する、請求項３５０〜３６９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３７１】
酵素ドメインが、ヌクレアーゼドメインである、請求項３５３に記載の融合蛋白質。
【請求項３７２】
ヌクレアーゼドメインが、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインである、請求項３７１に記載の融合蛋白質。
【請求項３７３】
請求項３７１または３７２に記載の融合蛋白質の二量体。
【請求項３７４】
融合蛋白質が、第２のＣａｓ９蛋白質に融合する、請求項３４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３７５】
第２のＣａｓ９蛋白質が、Ｃａｓ９である、請求項３７４に記載の融合蛋白質。
【請求項３７６】
第２のＣａｓ９蛋白質が、請求項１〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質である、請求項３７４または３７５に記載の融合蛋白質。
【請求項３７７】
第２のＣａｓ９蛋白質が、融合蛋白質のＮ末端に融合する、請求項３７４または３７６に記載の融合蛋白質。
【請求項３７８】
第２のＣａｓ９蛋白質が、融合蛋白質のＣ末端に融合する、請求項３７４または３７６に記載の融合蛋白質。
【請求項３７９】
Ｃａｓ９蛋白質および第２のＣａｓ９蛋白質が、第２のリンカーを介して融合する、請求項３７５〜３７８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３８０】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎが独立に１〜３０の整数である、請求項３７９に記載の融合蛋白質。
【請求項３８１】
第２のリンカーが、（ＧＧＳ）３モチーフを含む、請求項３７９に記載の融合蛋白質。
【請求項３８２】
第２のＣａｓ９蛋白質に融合した請求項２２〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質を含む、融合蛋白質。
【請求項３８３】
第２のＣａｓ９蛋白質が、請求項２２〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質である、請求項３８２に記載の融合蛋白質。
【請求項３８４】
第２のＣａｓ９蛋白質が、請求項３４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質である、請求項３８２に記載の融合蛋白質。
【請求項３８５】
第２のＣａｓ９蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する、請求項３８３または３８４に記載の融合蛋白質。
【請求項３８６】
第２のＣａｓ９蛋白質が、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する、請求項３８３または３８４に記載の融合蛋白質。
【請求項３８７】
第２のＣａｓ９蛋白質およびＣａｓ９蛋白質が、リンカーを介して融合する、請求項３８２〜３８６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３８８】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎが独立に１〜３０の整数である、請求項３８７に記載の融合蛋白質。
【請求項３８９】
リンカーが、（ＧＧＳ）３モチーフを含む、請求項３８７に記載の融合蛋白質。
【請求項３９０】
リンカーが、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）の配列である、請求項３８７に記載の融合蛋白質。
【請求項３９１】
請求項２２〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項３４６〜３９０のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、当該Ｃａｓ９蛋白質または当該Ｃａｓ９融合蛋白質と結合するガイドＲＮＡと、を含む複合体。
【請求項３９２】
ガイドＲＮＡが、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む、請求項３９１に記載の複合体。
【請求項３９３】
ガイドＲＮＡが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である、請求項３９２に記載の複合体。
【請求項３９４】
ガイドＲＮＡが、標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含む、請求項３９１〜３９３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３９５】
標的配列が、ＤＮＡの塩基配列である、請求項３９１〜３９４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３９６】
標的配列が、哺乳動物のゲノム中の配列である、請求項３９５に記載の複合体。
【請求項３９７】
標的配列が、ヒトのゲノム中の配列である、請求項３９６に記載の複合体。
【請求項３９８】
標的配列の３’末端が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない、請求項３９２〜３９７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項３９９】
請求項３７４〜３９０のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質に結合する第１のガイドＲＮＡと、融合蛋白質の第２のＣａｓ９蛋白質と結合する第２のガイドＲＮＡと、を含む、複合体。
【請求項４００】
第１のガイドＲＮＡが、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、第１の標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含み、第２のガイドＲＮＡが、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、第２の標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む、請求項３９９に記載の複合体。
【請求項４０１】
第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である、請求項４００に記載の複合体。
【請求項４０２】
第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡが、異なる、請求項３９９〜４０１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４０３】
第１のガイドＲＮＡが、第１の標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含み、第２のガイドＲＮＡが、第２の標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含む、請求項３９９〜４０２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４０４】
第１の標的配列および第２の標的配列が、異なる、請求項４００〜４０３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４０５】
第１の標的配列および第２の標的配列が、ＤＮＡの塩基配列である、請求項４００〜４０４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４０６】
第１の標的配列および第２の標的配列が、哺乳動物のゲノム中に存在する、請求項４０５に記載の複合体。
【請求項４０７】
第１の標的配列および第２の標的配列が、ヒトのゲノム中に存在する、請求項４０６に記載の複合体。
【請求項４０８】
第１の標的配列が、第２の標的配列の３０ヌクレオチド中に存在する、請求項４０５〜４０７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４０９】
第１の標的配列の３’末端が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない、請求項４０５〜４０８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４１０】
第２の標的配列の３’末端が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない、請求項４０５〜４０９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４１１】
ＤＮＡ分子に：
（ａ）請求項２２〜１２３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項３４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡと、を接触させること、または、
（ｂ）請求項３９１〜４１０のいずれか一項に記載の複合体を接触することを含む方法。
【請求項４１２】
標的配列が、ＤＮＡの塩基配列である、請求項４１１に記載の方法。
【請求項４１３】
標的配列の３’末端が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない、請求項４１１または４１２に記載の方法。
【請求項４１４】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している、請求項４１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項４１５】
標的配列が、疾患または異常に関連する配列を含む、請求項４１１〜４１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１６】
標的配列が、疾患または異常に関連する点変異を含む、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１７】
Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９融合蛋白質、または複合体の活性が、点変異の修正をもたらす、請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１８】
標的ＤＮＡ配列が、疾患または異常に関連するＴ→Ｃ点変異を含み、変異体Ｃ塩基の脱アミノ化が、疾患または異常に関連しない配列をもたらす、請求項４１１〜４１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１９】
標的ＤＮＡ配列が蛋白質をコードし、および点変異が、コドン中にあり、および野生型コドンと比較して、変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす、請求項４１８に記載の方法。
【請求項４２０】
変異体Ｃの脱アミノ化が、変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす、請求項４１９に記載の方法。
【請求項４２１】
変異体Ｃの脱アミノ化が、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす、請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２２】
接触が、対象に対してインビボで行われる、請求項４１１〜４２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２３】
対象が、疾患または異常があると診断されている、請求項４２２に記載の方法。
【請求項４２４】
疾患または異常が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽腫（ＮＢ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、ＨＩＶ、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）、変異体ＰＩ３ＫＣＡ蛋白質、変異体ＣＴＮＮＢ１蛋白質、変異体ＨＲＡＳ蛋白質、または変異体ｐ５３蛋白質に関連する新生物疾患である、請求項４１８〜４２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２５】
疾患または異常が、表６および７のそれぞれに開示されている遺伝子から選択される遺伝子のＴ＞ＣまたはＡ＞Ｇ変異に関連する、請求項４１５〜４２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２６】
疾患または異常が、表６および７のそれぞれに開示されている遺伝子から選択される遺伝子のＴ＞ＣまたはＡ＞Ｇ変異に関連する、請求項４１５〜４２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２７】
（ａ）請求項２２〜１２３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項２４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸配列；および
（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーター
を含む、核酸コンストラクトを含むキット。
【請求項４２８】
ガイドＲＮＡバックボーンをコードする発現コンストラクトをさらに含み、コンストラクトが、ガイドＲＮＡバックボーン中への標的配列と同一または相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む、請求項４２７に記載のキット。
【請求項４２９】
請求項２２〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項３４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４３０】
請求項４２９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４３１】
ベクターが、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項４３０に記載のベクター。
【請求項４３２】
請求項２２〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項３４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質、または請求項２２〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項３４６〜３７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸分子を含む、細胞。
【請求項４３３】
ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＴ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＴ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧおよびＴＴＴからなる群から選択される非古典的ＰＡＭ配列を認識する、変異Ｃａｓ９蛋白質。
【請求項４３４】
変異Ｃａｓ９蛋白質が、請求項１〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質を含む、請求項４３３に記載の変異ｃａｓ９蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2015年10月23日出願のU.S.S.N. 62/245,828、2016年1月15日出願のU.S.S.N. 62/279,346、2016年3月22日出願のU.S.S.N. 62/311,763、2016年4月13日出願のU.S.S.N. 62/322,178、2016年6月30日出願のU.S.S.N. 62/357,352、2016年8月3日出願のU.S.S.N. 62/370,700、2016年9月22日出願のU.S.S.N. 62/398,490、2016年10月14日出願のU.S.S.N. 62/408,686、および2016年6月30日出願のU.S.S.N. 62/357,332の米国仮特許出願に対して米国特許法§119(e)の下で優先権を主張する；これらのそれぞれは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列の標的特異的編集、例えばゲノムＤＮＡへの標的特異的切断または特定の改変の標的特異的導入は、遺伝子機能の研究のためには高度に有望なアプローチであり、ヒト遺伝子疾患の新たな治療法を提供するポテンシャルをもまた有する（１）。理想的な核酸編集テクノロジーは３つの特性を所有する：（１）所望の改変を実装する高い効率；（２）最小限のオフターゲット活性；および（３）所与の核酸中のいずれかの部位、例えばヒトゲノム中のいずれかの部位を正確に編集するようにプログラムされる能力（２）。現行のゲノム操作ツールは、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（３）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（４）、および最も最近ではＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９（５）を包含し、ゲノム中における配列特異的なＤＮＡ切断を生ぜしめる。このプログラム可能な切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって切断部位におけるＤＮＡの変異、または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって切断部位の周辺のＤＮＡの置き換えをもたらし得る（６、７）。
【０００３】
現行のテクノロジーの１つの欠点は、ＮＨＥＪおよびＨＤＲ両方が確率的なプロセスであり、これらが典型的には控えめな遺伝子編集効率と、所望の変改と競合し得る不要の遺伝子変改とをもたらすということである（８）。原理的には、多くの遺伝子疾患はゲノム中の特定の場所における特定のヌクレオチド変化を生ぜしめることによって処置され得るので（例えば、疾患に関連する遺伝子の特定のコドンにおけるＣからＴへの変化）（９）、かかる高精度遺伝子編集を達成するためのプログラム可能なやり方の開発は、強力な新たな研究ツール、かつ遺伝子編集に基づくヒト治療の潜在的な新たなアプローチということになるであろう。
【０００４】
現在のゲノムエンジニアリングツールの他の欠点は、それらが標的にできるＤＮＡの塩基配列が限定されるということである。ＺＮＦｓまたはＴＡＬＥＮＳを使用するとき、個々の標的配列毎に新規な蛋白質を生成させなければならない。Ｃａｓ９は、好適なガイドＲＮＡを提供することによって、実質的にいかなる標的配列も標的とすることができる一方、標的となるＤＮＡの塩基配列の３’末端に隣接して存在し、Ｃａｓ９蛋白質が結合し、標的配列に作用するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、典型的にはヌクレオチド配列５’−ＮＧＧ−３’の厳しい要件によって、標的にできる配列に関し、Ｃａｓ９の技術は未だ限定されたものである。このように、ＰＡＭの要件により、Ｃａｓ９蛋白質によって効率的に標的とされうる配列が限定されたものとなる。
【発明の概要】
【０００５】
重要なことに、ヒトの疾患に関与する蛋白質変異の８０〜９０パーセントは、単一ヌクレオチドのみの置換、削除または挿入から生じる（６）。現在の一塩基の遺伝子修正に対する大部分のストラテジーとしては、設計されたヌクレアーゼ（二本鎖切断（ＤＳＢ）の作成、それに続く確率的な、非効率的なホモロジー誘導型の修復（ＨＤＲ）に依存する）およびＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドが挙げられる（２２）。後者のストラテジーは、ゲノムＤＮＡ中の、編集しようとするヌクレオチド以外の特定の配列を有する塩基対に対するＲＮＡ／ＤＮＡの塩基配列の設計を含む。結果として生じる不適当な組合せは、細胞に内在する修復系により認識され、修復され、キメラまたはゲノムの配列の変化をもたらす。これらのストラテジーのいずれも、低い遺伝子編集効率および不必要な遺伝子変化が欠点であるが、それらは、ＨＤＲの確率論依存性ならびにＨＤＲと非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の両方によるものである（２３〜２５）。ＨＤＲ効率は、ゲノム内の標的遺伝子の位置（２６）、細胞周期の状態（２７）、ならびに細胞／組織のタイプに応じて変化する（２８）。酵素の様な効率で、ゲノムＤＮＡ内の正確な部位に特定のタイプの塩基修飾を導入するための、直接的な、プログラム可能な、また確率論に依存しない方法の開発は、遺伝子編集ベースの調査ツールおよびヒトの治療への強力かつ新規なアプローチとなる。
【０００６】
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）システムは最近発見された原核生物の適応免疫システムであり（１０）、これは改変されて、種々の生物および細胞株におけるロバストで一般的なゲノム操作を可能にしている（１１）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムは蛋白質−ＲＮＡ複合体であり、これは、塩基対形成によって標的ＤＮＡ配列に複合体を局在させるためのガイドとしてＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を用いる（１２）。それから、天然のシステムにおいては、Ｃａｓ蛋白質はエンドヌクレアーゼとして働いて、標的のＤＮＡ配列を切断する（１３）。システムが機能するためには、標的ＤＮＡ配列はｓｇＲＮＡに対して相補的であり、かつ相補領域の３’末端に「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）をもまた含有しなければならない（１４）。
【０００７】
本発明では、３’−末端に古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’、Ｎはいずれかのヌクレオチド）を含まない標的配列に対する活性を示す新規Ｃａｓ９変異体が提供される。かかるＣａｓ９変異体は、３’−末端に古典的ＰＡＭ配列を含む標的配列に限定されない。
【０００８】
公知のＣａｓ蛋白質のなかで、Streptococcus pyogenes Ｃａｓ９はゲノム操作のためのツールとして主として広く用いられてきた（１５）。このＣａｓ９蛋白質は２つの別々のヌクレアーゼドメインを含有する大きいマルチドメイン蛋白質である。点変異がヌクレアーゼ活性を喪失させるようにＣａｓ９に導入されて、ｓｇＲＮＡによってプログラムされた様式でＤＮＡに結合するその能力をなお保持する不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらし得る（１６）。原理的には、かかるＣａｓ９変異体は、別の蛋白質またはドメインに融合したときに、単純に適切なｓｇＲＮＡとの共発現によってその蛋白質を実質的にいずれかのＤＮＡ配列にターゲティングし得る。ゆえに、本発明の開示はまた、かかるＣａｓ９変異体およびＤＮＡ修復ドメイン（例えばデアミナーゼ、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写アクチベーターまたは転写リプレッサードメイン）を含む融合蛋白質、ならびに、かかる融合蛋白質の、ゲノム（例えばヒト被験者のゲノム）内の疾患に関係する変異の修正、またはゲノム（例えばヒトゲノム）内に変異を生成させ、遺伝子の発現を低減または防止することへの使用を包含する。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれも、酵素活性を有する蛋白質と融合できる。いくつかの態様において、酵素活性は、標的ＤＮＡを修飾する。いくつかの態様において、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性である。いくつかの態様では、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性である。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡの二本鎖を切断する。いくつかの態様では、酵素活性は、標的ＤＮＡと関連する標的ポリペプチドを修飾する。いくつかの態様では、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、フォスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン活性、アデニル化活性、脱アデニル活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または非ミリストイル化活性である。いくつかの態様では、標的ポリペプチドはヒストンであり、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、フォスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン活性である。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれも、酵素活性を有する蛋白質と融合できる。いくつかの態様において、酵素活性は、ＤＮＡ（例えばヒストン）に関連するポリペプチドを修飾する。いくつかの態様において、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、フォスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性（すなわちユビキチン化活性）、脱ユビキチン活性、アデニル化活性、脱アデニル活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、非ミリストイル化活性グリコシル化活性（例えばＯ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼから）または脱グリコシル活性である。本明細書において列挙される酵素活性は、蛋白質に対する共有結合的な修飾を触媒する。標的蛋白質の安定性または活性を変化させるためのかかる修飾は公知技術である（例えばキナーゼ活性によるリン酸化により、標的蛋白質に応じて蛋白質活性を刺激または鎮静化することができる）。標的蛋白質として特に挙げられるのは、ヒストンである。ヒストン蛋白質は、ＤＮＡと結合し、ヌクレオソームとして公知の複合体を形成するものとして、従来技術において周知である。ヒストンを（例えばメチル化、アセチル化、ユビキチン化、リン酸化によって）修飾することにより、周囲のＤＮＡの構造変化が生じそれにより、相互作用因子（例えば転写因子、ポリメラーゼなど）へのＤＮＡの潜在的に大きな部分のアクセス可能性が制御される。単一のヒストンは、様々な方法で、また様々な組合せで修飾できる（例えばヒストン３のリジン２７（Ｈ３Ｋ２７）のトリメチル化が、ＤＮＡ領域の転写抑制に関与し、ヒストン３のリジン４（Ｈ３Ｋ４）のトリメチル化が、ＤＮＡ領域の能動的な転写に関与する）。このように、ヒストン修飾活性を有する部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡ構造の部位特異的制御への使用を提供し、また標的ＤＮＡの選択された領域のヒストン修飾パターンの変更に用いることができる。かかる方法は、研究および臨床用途に使用できる。
【００１１】
いくつかの態様において、デアミナーゼドメインは、分子内のアミン基の除去を触媒する。さらなる態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、シトシンを脱アミノ化し、ウラシルを産生する。他の態様において、ヌクレアーゼドメインは、酵素活性を有し、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断できる。いくつかの態様において、ＤＮＡの特定の配列を再結合するリコンビナーゼドメインは、ゲノム構造を操作し、遺伝子形質発現を制御するために用いることができる。さらなる態様において、メチラーゼドメインは、それらのそれぞれの基質のメチル化に利用でき、一方、アセチラーゼドメインは、それらのそれぞれの基質のアセチル化に用いることができる。他の態様において、アセチルトランスフェラーゼドメインは、アセチル基の転移のために用いることができる。アセチルトランスフェラーゼ分子の例としては、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えばＣＢＰヒストンアセチルトランスフェラーゼ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、セロトニンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ＮａｔＡアセチルトランスフェラーゼおよびＮａｔＢアセチルトランスフェラーゼがあげられるが、これらに限定されない。本発明の開示はまた、転写アクチベーターおよび転写リプレッサードメインも包含する。転写アクチベータードメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、一般的な転写因子およびＲＮＡポリメラーゼとの一または複数の相互作用を通じてプロモーターからの転写を活性化することができる転写因子の領域である。転写リプレッサードメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、一般的な転写因子およびＲＮＡポリメラーゼとの一または複数の相互作用を通じてプロモーターからの転写を抑制することができる転写因子の領域である。
【００１２】
ゲノム操作目的にとってのＣａｓ９システムのポテンシャルは甚大である。ｓｇＲＮＡによってプログラムされたゲノム中の特定の部位に蛋白質を持っていくそのユニークな能力は、転写活性化因子、転写リプレッサー、ヒストン修飾蛋白質、インテグラーゼ、デアミナーゼ、およびリコンビナーゼを包含する、ヌクレアーゼを超えた種々の部位特異的ゲノム操作ツールへと発展させられ得る（１１）。それらの潜在的な用途のいくつかは、転写活性化因子とのｄＣａｓ９融合体によって最近実装されて、ＲＮＡ誘導型の転写活性化因子（１７、１８）、転写リプレッサー（１６、１９、２０）、およびクロマチン修飾酵素を提供した（２１）。それらの融合体の種々のｓｇＲＮＡとの単純な共発現は、標的遺伝子の特異的発現をもたらす。これらの先駆的研究は、ゲノムの正確な操作のためのたやすくプログラム可能な配列特異的エフェクターの設計および構築への道を敷いた。
【００１３】
本発明の開示のいくつかの態様は、被験者のゲノム（例えばヒト被験者のゲノム）内の単一部位の編集などの、標的特異的な結合、編集および／または核酸の切断に有用なストラテジー、システム、蛋白質、核酸、組成物、細胞、試薬、方法およびキットを提供する。いくつかの態様において、組み換えＣａｓ９蛋白質は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質と比較し、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の変異を含み、３’−末端の古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’、Ｎはいずれかのヌクレオチド）を含まない標的配列に対して活性を示す。かかるＣａｓ９蛋白質変異の例を表３、５、８および９に示す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９と、核酸編集酵素または酵素的ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン）との融合蛋白質が提供される。いくつかの態様において、標的特異的な核酸との結合、編集および／または切断のための方法が提供される。いくつかの態様において、標的特異的な核酸との結合、編集および／または切断蛋白質（例えばＣａｓ９変異体と核酸編集酵素またはドメインとの融合蛋白質）の生成のための試薬およびキットが提供される。
【００１４】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号(SEQ ID NOs:)９〜２６２のいずれかにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む組み換えＣａｓ９蛋白質を提供し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。いくつかの態様において、組み換えＣａｓ９蛋白質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む。いくつかの態様において、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。
【００１５】
本発明の開示の他の側面は、配列番号１０〜２６２のいずれかにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む組み換えＣａｓ９蛋白質を提供し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２、または配列番号１０から２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、およびＱ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。
【００１６】
本明細書に記載のアミノ酸変異、例えば第１のアミノ酸残基（例えばＡ）から第２のアミノ酸残基（例えばＴ）へのアミノ酸変異（例えばＡ２６２Ｔ）は、第１のアミノ酸残基から、当該第２のアミノ酸残基と類似するアミノ酸残基への（保存的）変異を含むと理解されるべきである。例えばスレオニン（例えばＡ２６２Ｔ変異）へのアラニンの変異は、アラニンから、サイズおよび化学的性質の点でスレオニンと同様であるアミノ酸（例えばセリン）への変異でもよい。さらなる類似のアミノ酸対としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：フェニルアラニンおよびチロシン、アスパラギンおよびグルタミン、メチオニンおよびシステイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびにアルギニンおよびリジン。当業者であれば、かかる保存的アミノ酸置換がおそらく蛋白質構造に与える影響が軽微であり、機能の喪失をもたらさないことを認識するであろう。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からスレオニンへのいかなるアミノ酸変異も、セリンへのアミノ酸変異であってもよい。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からアルギニンへのいかなるアミノ酸変異も、リシンへのアミノ酸変異であってもよい。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からイソロイシンへのいかなるアミノ酸変異も、アラニン、バリン、メチオニンまたはロイシンへのアミノ酸変異であってもよい。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からリシンへのいかなるアミノ酸変異も、アルギニンへのアミノ酸変異であってもよい。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からアスパラギン酸へのいかなるアミノ酸変異も、グルタミン酸またはアスパラギンへのアミノ酸変異であってもよい。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からバリンへのいかなるアミノ酸変異も、アラニン、イソロイシン、メチオニンまたはロイシンへのアミノ酸変異であってもよい。いくつかの態様において、本発明で提供される、あるアミノ酸からグリシンへのいかなるアミノ酸変異も、アラニンへのアミノ酸変異であってもよい。しかしながら、さらなる保存的アミノ酸残基が当業者により認識され、他の保存的アミノ酸残基へのアミノ酸変異のいずれも本発明の開示の範囲内であることを認識すべきである。
【００１７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、融合蛋白質のＣａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。いくつかの態様において、変異は、Ｘ１２１９Ａ、Ｘ１２１９Ｉ、Ｘ１２１９ＭまたはＸ１２１９Ｌである。
【００１８】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、変異は、Ｅ１２１９Ａ、Ｅ１２１９Ｉ、Ｅ１２１９ＭまたはＥ１２１９Ｌである。
【００１９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。いくつかの態様において、変異は、Ｘ４８０Ｒである。
【００２０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、変異は、Ｅ４８０Ｒである。
【００２１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。いくつかの態様において、変異は、Ｘ５４３Ｎである。
【００２２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、変異は、Ｅ５４３Ｎである。
【００２３】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３ＤおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００２４】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００２５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００２６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、およびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００２７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００２８】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００２９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【００３２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＫ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＳ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４ＫおよびＱ１２５６Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【００３５】
Ｃａｓ９のＨＮＨヌクレアーゼドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相補的なＤＮＡ鎖を切断するように機能する。その活性部位は、ββαメタルフォールドからなり、そのヒスチジン８４０は水分子を活性化して切断されやすいリン酸エステルを攻撃させるが、それはマグネシウムイオンの配位のため求電子性であり、その結果３’−５’のリン酸結合が切断される。いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号９−２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と同一である。
【００３６】
Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断する。それは、配列的に隔離された部位でコードされるが、三次構造的に相互作用してＲｕｖＣ切断ドメインを形成し、またそれはＲＮａｓｅＨ折り畳み構造からなる。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号９〜２６２のＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と同一である。
【００３７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、ＤＮＡ二重らせんの一方または両方の鎖を切断するＣａｓ９の能力に影響を及ぼす（例えば阻害する）１以上の変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１はＤ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２はＨ以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０においてＨを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０においてＤを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基、を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明の開示に係るＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性（例えば結合活性）を示す。
【００３９】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であり、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは少なくとも７つの変異を含み、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質が提供される。いくつかの態様において、Streptococcus pyogenesのＣａｓ９は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む。他の態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。
【００４０】
一例として、Ｃａｓ９蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質が酵素活性を有する酵素などのさらなるドメインと融合するか否かに依存して、標的配列に対する強化された結合を示すことができ、標的配列に対する強化されたヌクレアーゼ活性を示すことができ、または他の強化された活性を示すことができる。いくつかの態様において、酵素活性は、標的ＤＮＡを修飾する。いくつかの態様において、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性である。いくつかの態様では、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性である。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡの二本鎖を切断する。いくつかの態様では、酵素活性は、標的ＤＮＡと関連する標的ポリペプチドを修飾する。いくつかの態様では、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、フォスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン活性、アデニル化活性、脱アデニル活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または非ミリストイル化活性である。いくつかの態様では、標的ポリペプチドはヒストンであり、酵素活性はメチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、フォスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性または脱ユビキチン活性である。
【００４１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のいずれも、酵素活性を有する蛋白質と融合する。いくつかの態様において、酵素活性は、ＤＮＡ（例えばヒストン）に関連するポリペプチドを修飾する。いくつかの態様において、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、フォスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性（すなわちユビキチン化活性）、脱ユビキチン活性、アデニル化活性、脱アデニル活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、非ミリストイル化活性グリコシル化活性（例えばＯ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼから）または脱グリコシル活性である。本明細書において列挙される酵素活性は、蛋白質に対する共有結合的な修飾を触媒する。標的蛋白質の安定性または活性を変化させるためのかかる修飾は公知技術である（例えばキナーゼ活性によるリン酸化により、標的蛋白質に応じて蛋白質活性を刺激または鎮静化することができる）。標的蛋白質として特に挙げられるのは、ヒストンである。ヒストン蛋白質は、ＤＮＡと結合し、ヌクレオソームとして公知の複合体を形成するものとして、従来技術において周知である。ヒストンを（例えばメチル化、アセチル化、ユビキチン化、リン酸化によって）修飾することにより、周囲のＤＮＡの構造変化が生じそれにより、相互作用因子（例えば転写因子、ポリメラーゼなど）へのＤＮＡの潜在的に大きな部分のアクセス可能性が制御される。単一のヒストンは、様々な方法で、また様々な組合せで修飾できる（例えばヒストン３のリジン２７（Ｈ３Ｋ２７）のトリメチル化が、ＤＮＡ領域の転写抑制に関与し、ヒストン３のリジン４（Ｈ３Ｋ４）のトリメチル化が、ＤＮＡ領域の能動的な転写に関与する）。このように、ヒストン修飾活性を有する部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡ構造の部位特異的制御への使用を提供し、また標的ＤＮＡの選択された領域のヒストン修飾パターンの変更に用いることができる。かかる方法は、研究および臨床用途に使用できる。
【００４２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していないか有していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenes Ｃａｓ９の活性と比較し、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している。
【００４３】
いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、直接ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡまたはＣＧＴに隣接する。
【００４４】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質活性は、ヌクレアーゼアッセイまたは核酸結合アッセイで測定され、それは従来技術において周知で、当業者にとり明らかである。本明細書に示されるように、Ｃａｓ９蛋白質は、蛋白質に核酸編集活性（例えばデアミナーゼ活性または転写活性化活性）などの活性を与える１以上のドメインと融合させることができ、当該活性は例えばデアミナーゼアッセイまたは転写活性化アッセイによって測定できる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質をデアミナーゼドメインと融合させ、その活性を、デアミナーゼアッセイを使用して測定できる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質を転写活性化ドメインと融合させ、その活性を、転写活性化アッセイ（例えばレポーター活性化アッセイ）を使用して測定でき、その際、当該レポーター（例えば特にＧＦＰまたはルシフェラーゼ）は、Ｃａｓ９の標的配列への結合に応答して発現される。
【００４５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、本明細書で提供される変異のいずれかを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。他の態様において、変異は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異であってもよい。
【００４６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、本明細書で提供される変異のいずれかを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。他の態様において、変異は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩまたはＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異であってもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異またはＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００４８】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ変異またはＥ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００４９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ５４３Ｄ変異またはＥ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９のアミノ酸配列は、変異Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３ＤおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９のアミノ酸配列は、変異Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、変異Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５３】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ、または変異Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５４】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、変異Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ、または配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤＥ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４ＫおよびＱ１２５６Ｋ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、変異Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ａ２６２Ｔ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。
【００５６】
いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号９〜２６２のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号９〜２６２のＨＮＨドメインのいずれかのアミノ酸配列と同一である。
【００５７】
いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号９〜２６２のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号９〜２６２のＲｕｖＣドメインのいずれかのアミノ酸配列と同一である。
【００５８】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列の変異Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ１および／またはＨ８４０Ｘ２変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘ１は、Ｄ以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｘ２はＨ以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０においてＨを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基を、含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０においてＤを、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する残基を、含む。
【００５９】
本発明の開示のいくつかの側面は、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質を提供し、それは第２の蛋白質と融合することにより、融合蛋白質を形成する。いくつかの態様において、第２の蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、第２の蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインおよびエフェクタードメインは、リンカーを介して融合する。リンカーは一個の共有結合でもよく、または多くの原子が重合した長いリンカーでもよい。特定の態様において、リンカーは、ポリペプチドまたはアミノ酸をベースとするものである。他の態様において、リンカーは、ペプチド様のものでない。特定の態様において、リンカーは、共有結合（例えば炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など）である。特定の態様において、リンカーは、アミド結合による炭素−窒素結合である。特定の態様において、リンカーは、環式または非環式の、置換または非置換の、分岐状または直鎖状の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。特定の態様において、リンカーは、重合体（例えばポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。特定の態様において、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマーまたはポリマーを含む。特定の態様において、リンカーは、アミノアルカン酸の（例えばグリシン、エタン酸、アラニン、βアラニン、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−ペンタン酸など）を含む。特定の態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、ダイマーまたはポリマーを含む。特定の態様において、リンカーは、炭素環式部分（例えばシクロペンタン、シクロヘキサン）をベースとするものである。他の態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーは、アミノ酸を含む。特定の態様において、リンカーは、ペプチドを含む。特定の態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。特定の態様において、リンカーは、フェニル環をベースとする。リンカーは、官能化部分を含むことで、ペプチド由来の求核種（例えばチオール、アミノ基）のリンカーへの結合を促進するものでもよい。いずれかの求電子種を用いてリンカーの一部としてもよい。例示的な求電子種としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシルおよびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
いくつかの態様において、リンカーは、２つの分子または部分、例えば融合蛋白質（例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインとエフェクタードメイン（例えばデアミナーゼドメイン）の２つのドメイン）を連結する化学基または分子を含む。いくつかの態様において、リンカーは、１以上のアミノ酸残基を含む。例えばリンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。いくつかの態様において、リンカーは、３、９、１６または２１アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）（またＸＴＥＮと称される）または（ＸＰ）ｎのモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎは独立に１〜３０の整数である。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＳ）３モチーフまたはSGSETPGTSESATPES（配列番号７）（ＸＴＥＮ）モチーフを含む。
【００６１】
本発明の開示のいくつかの側面は、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質を提供し、それは第２の蛋白質と融合することにより、融合蛋白質を形成する。いくつかの態様において、第２の蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、第２の蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインおよびエフェクタードメインは、核局在化配列（ＮＬＳ）（例えばアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９９）、ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号３００）またはＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号２８４）を含むＮＬＳ）を介して融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、上記のリンカーのいずれかと結合することができる。
【００６２】
いくつかの態様において、エフェクタードメインは酵素ドメインを含む。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、または転写リプレッサードメインを含み、これらはそれぞれ、ヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、リコンビナーゼ活性、デアミナーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、メチラーゼ活性、アセチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化因子活性、または転写リプレッサー活性を有していてもよい。いくつかの態様において、エフェクタードメインはエフェクタードメインである。いくつかの態様において、エフェクタードメインはデアミナーゼドメインである。いくつかの態様において、デアミナーゼはシトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはアポリポ蛋白質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、配列番号２６３〜２８１のいずれか１つのデアミナーゼドメインと、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント）、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、アポリポ蛋白質ＢメッセンジャーＲＮＡ−編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＤＡＴ系統デアミナーゼである。
【００６３】
本発明の開示のいくつかの側面は、エフェクタードメイン、例えばデアミナーゼおよびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）に融合するＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質を提供する。本開示のいくつかの側面は、ＵＧＩドメインを含まない融合蛋白質と比較し、かかる融合蛋白質では核酸編集効率が増加するという知見に基づくものである。デアミナーゼドメインおよびＵＧＩドメインなどのドメインがこれまで報告されており、本開示の範囲内である。例えば、デアミナーゼドメインおよびＵＧＩドメインなどのドメインは、米国仮特許出願第62/245,828号（2015年10月23日に出願）、米国仮特許出願第62/279,346号（2016年1月15日に出願）、米国仮特許出願第62/311,763号（2016年3月22日に出願）、米国仮特許出願第62/322,178号（2016年4月13日に出願）、米国仮特許出願第62/357,352号（2016年6月30日に出願）、米国仮特許出願第62/370,700号（2016年8月3日に出願）、米国仮特許出願第62/398,490号（2016年9月22日に出願）および米国仮特許出願第62/408,686号（2016年10月14日に出願）に記載され、各々の全開示内容を本明細書において参照により援用する。上記の参照文献に記載されているデアミナーゼドメインおよびＵＧＩドメインを、本発明の開示の範囲内で、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかと融合させうることは当然理解されることである。
【００６４】
いくつかの態様において、融合蛋白質のエフェクタードメインは、ヌクレアーゼドメインである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインである。いくつかの態様において、融合蛋白質は、二量体化する。特定の態様において、融合蛋白質のダイマーは、活性を有する。例えば２つのＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを二量体化させ、核酸を切断させることができる。
【００６５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、第２のＣａｓ９蛋白質に融合する。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９蛋白質は、請求項１〜３４５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質である。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９蛋白質は、融合蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９蛋白質は、融合蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質および第２のＣａｓ９蛋白質は、第２のリンカーを介して融合する。いくつかの態様において、第２のリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）、または（ＸＰ）ｎのモチーフまたはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎは独立に１〜３０の整数である。いくつかの態様において、第２のリンカーは、（ＧＧＳ）３のモチーフを含む。
【００６６】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質またはＣａｓ９融合蛋白質とＣａｓ９蛋白質またはＣａｓ９融合蛋白質に結合したガイドＲＮＡとを含む複合体を提供する。
【００６７】
いくつかの態様において、標的配列は、ＤＮＡの塩基配列である。いくつかの態様において、標的配列は、哺乳動物のゲノム中の配列である。いくつかの態様において、標的配列は、ヒトのゲノム中の配列である。
いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない。
【００６８】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質、融合蛋白質、または複合体を用いる方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの側面は、ＤＮＡ分子を（ａ）本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質または融合蛋白質およびガイドＲＮＡと；あるいは（ｂ）本明細書において提供されるｇＲＮＡとのＣａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９融合蛋白質、またはＣａｓ９蛋白質もしくは融合蛋白質複合体と接触させることを含む方法を提供し、ガイドＲＮＡは約１５〜１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連する配列を含む。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連する点変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９融合蛋白質または複合体の活性は、点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、被験者においてインビボで接触させるステップが行われる。
【００６９】
本開示のいくつかの側面は、（ａ）本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質またはＣａｓ９融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列と；（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターとを含む、核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、さらに、ガイドＲＮＡバックボーンをコードする発現コンストラクトを含み、コンストラクトは、ガイドＲＮＡバックボーン中への標的配列と同一または相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む。
【００７０】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される、Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９融合蛋白質、またはＣａｓ９蛋白質またはＣａｓ９融合蛋白質に結合したガイドＲＮＡのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
【００７１】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質、融合蛋白質、核酸分子、および／またはベクターを含む細胞を提供する。
【００７２】
上の概要は、限定しない様式で、本明細書において開示されるテクノロジーの態様、利点、特徴、および使用のいくつかを例解することを意味されている。本明細書において開示されるテクノロジーの他の態様、利点、特徴、および使用は、発明を実施するための形態、図面、例、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、古典的ＰＡＭライブラリーおよび非古典的ＰＡＭライブラリーに対する野生型(wild-type) Streptococcus pyogenesのＣａｓ９の活性を示す。
【００７４】
【図２】図２は、定方向進化後の、例の進化後Ｃａｓ９クローンのＰＡＭライブラリーに対する活性を示す。
【００７５】
【図３】図３は、哺乳動物のＧＦＰ活性化アッセイにおける、野生型および進化型Ｃａｓ９の比較を示す。
【００７６】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、Ｃａｓ９（ｐＪＨ３０６）および５’−ＮＧＧ−３’のＰＡＭ配列を有する進化型Ｃａｓ９蛋白質による、リードアウトとしてのＧＦＰを用いた結合活性を示す。５’−ＮＧＧ−３’のＰＡＭにおいて、進化型Ｃａｓ９蛋白質の多くが、野生型Ｃａｓ９と比較し、ＧＦＰ蛍光シグナルの増加に基づくＣａｓ９結合活性の増加を示した。図４Ａは、バックグラウンドより高い蛍光を示す細胞（パーセント）の関数としての、Ｃａｓ９結合活性を表すグラフである。図４Ｂは、蛍光の平均値の関数としての、Ｃａｓ９結合活性を示すグラフである。これらの実験において使用したＣａｓ９蛋白質は、ＶＰＲ転写アクチベーターに融合するｄＣａｓ９蛋白質である。
【００７７】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、野生型ｄＣａｓ９−ＶＰＲ（ｐＪＨ３０６）およびＮＮＮ ＰＡＭ配列を有する進化型ｄＣａｓ９−ＶＰＲ蛋白質の、リードアウトとしてのＧＦＰを用いた結合活性を示す。ＮＮＮ ＰＡＭのライブラリーにおいて、進化型Ｃａｓ９蛋白質の多くが、野生型Ｃａｓ９と比較し、ＧＦＰ蛍光シグナルの増加に基づくＣａｓ９結合活性の増加を示した。図５Ａは、バックグラウンドより高い蛍光を示す細胞（パーセント）の関数としての、Ｃａｓ９結合活性を表すグラフである。図５Ｂは、蛍光の平均値の関数としての、Ｃａｓ９結合活性を示すグラフである。これらの実験において使用したＣａｓ９蛋白質は、ＶＰＲに融合するｄＣａｓ９蛋白質である。
【００７８】
【図６】図６は、ｉＲＦＰ蛍光によりゲート制御されるトランスフェクション細胞における平均蛍光により示される、全６４のＰＡＭ配列に対するｄＣａｓ９−ＶＰＲを示す。野生型(WT)ｄＣａｓ９−ＶＰＲはｐＪＨ３０６である。
【００７９】
【図７】図７は、インビトロ切断アッセイを示す。ゲル上、ＷＴは野生型Ｃａｓ９（配列番号９）であり、１はＥ１２１９Ｖ変異を有するＣａｓ９（配列番号９）である。
【００８０】
【図８】図８は、ＰＡＭ特異性の調節に使用できるＣａｓ９融合蛋白質を示す。非古典的ＰＡＭへのＣａｓ９のターゲティングを増加させるために使用可能であるＣａｓ９−ｄＣａｓ９連結システムのための１つの可能な形状を示す。ｄＣａｓ９による５’−ＮＧＧ−３’または他のＰＡＭへの結合は、標的２付近の領域へＣａｓ９を局在化させることができる。この局在化は、これまでＣａｓ９が近づけなかったＰＡＭの切断を助長しうるものである。
【００８１】
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＮＮＮＮＮ ＰＡＭライブラリーに対するｄＣａｓ９−ＶＰＲ結合活性を示す。図９Ａは、バックグラウンドより高い蛍光を示す細胞（パーセント）の関数としての、ＮＮＮＮＮ ＰＡＭライブラリーに対するｄＣａｓ９−ＶＰＲ結合活性を表すグラフである。図９Ｂは、蛍光の平均値の関数としての、ＮＮＮＮＮ ＰＡＭライブラリーに対するｄＣａｓ９−ＶＰＲ結合活性を表すグラフである。
【００８２】
【図１０】図１０は、リードアウトとしてのＧＦＰ損失を示す細胞（パーセント）を用いた、Ｃａｓ９の切断活性を示す。Ｃａｓ９蛋白質は２つのｓｇＲＮＡで試験し、そこでは古典的５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭまたはＧＦＰ遺伝子中のＧＡＴ ＰＡＭのいずれかを標的とした。
【００８３】
【図１１】図１１は、Ｃａｓ９：ＤＮＡ編集酵素：ｓｇＲＮＡ複合体と結合した二本鎖ＤＮＡ基質を例示する。ＤＮＡ編集酵素は、限定されないが、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼまたはアセチルトランスフェラーゼであってもよい。
【００８４】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。ｐＪＨ７６０は４つの新規な標的：ｒｅ２（図１２Ａ）、ＶＥＧＦ（図１２Ｂ）、ＣＬＴＡ（図１２Ｃ）およびＣＣＲ５Ｄ（図１２Ｄ）に対するＰＡＭ減少アッセイにおいて試験した。
【００８５】
【図１３】図１３は、哺乳動物細胞におけるＧＦＰ切断を示す。
【００８６】
【図１４】図１４は、ｒｅ２標的に対するｐＪＨ７６０（ｘＣａｓ９ｖ１．０）の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【００８７】
【図１５】図１５は、ＶＥＧＦ標的に対するｐＪＨ７６０（ｘＣａｓ９ｖ１．０）の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【００８８】
【図１６】図１６は、ＣＬＴＡ標的に対するｐＪＨ７６０（ｘＣａｓ９ｖ１．０）の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【００８９】
【図１７】図１７は、ＣＣＲ５Ｄ標的に対するｐＪＨ７６０（ｘＣａｓ９ｖ１．０）の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【００９０】
【図１８】図１８は、ｒｅ２標的に対する４つのｘＣａｓ９ｖ３変異体の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【００９１】
【図１９】図１９は、ＶＥＧＦ標的に対する４つのｘＣａｓ９ｖ３変異体の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【００９２】
【図２０】図２０は、ＣＬＴＡ標的に対する４つのｘＣａｓ９ｖ３変異体の作用を試験したＰＡＭ減少アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
定義
本明細書および請求項において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明瞭に別様に示さない限り、単数および複数の参照を包含する。それゆえに、例えば、「物質」の参照は単一の物質および複数のかかる物質を包含する。
【００９４】
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９蛋白質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性型、もしくは不活性型のＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質）を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを言う。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、場合によってはｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）関連ヌクレアーゼともまた言われる。ＣＲＩＳＰＲは適応免疫システムであり、これは可動性遺伝子エレメント（ウイルス、転移エレメント、および接合型プラスミド）に対する防御を提供する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、祖先由来の可動性エレメントおよび標的侵入核酸に対して相補的な配列、スペーサーを含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写およびプロセシングされ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいては、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの正しいプロセシングは、trans-encoded small RNA（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内在性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９蛋白質を要求する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３によって支援されるプロセシングのガイドとしての用をなす。爾後に、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡはスペーサーに対して相補的な直鎖状または環状ｄｓＤＮＡ標的をエンド的に切断する。ｃｒＲＮＡに対して相補的でない標的鎖は、第１にエンド的に切られ、それから３’−５’エキソ的にトリミングされる。天然において、ＤＮＡ結合および切断は典型的には蛋白質および両方のＲＮＡを要求する。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単純に「ｇＮＲＡ」）が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ両方の側面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照。その内容全体は参照によってここで組み込まれる。Ｃａｓ９はＣＲＩＳＰＲリピート配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己を非自己から見分けることを助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９オーソログは種々の種について記載されており、S. pyogenesおよびS. thermophilusを包含するが、これに限定されない。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物およびローカスからのＣａｓ９配列を包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは不活性型（例えば不活性化型）ＤＮＡ切断ドメインを有する。
【００９５】
ヌクレアーゼ不活性化型Ｃａｓ９蛋白質は、交換可能に「ｄＣａｓ９」蛋白質（ヌクレアーゼ「不活性」なＣａｓ９）と言われ得る。不活性型ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９を生成するための方法は公知である（例えば、Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)；Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83を参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインを包含することが公知である。ＨＮＨサブドメインはｇＲＮＡに対して相補的な鎖を切断するのに対して、ＲｕｖＣ１サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０ＡはS. pyogenes Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)；Qi et al., Cell. 28; 152(5): 1173-83 (2013)）。
【００９６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９の断片を含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様において、蛋白質は、２つのＣａｓ９ドメイン：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン、または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン、のうちの１つを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９を含む蛋白質またはその断片は、「Ｃａｓ９変異体」と呼ばれる。Ｃａｓ９変異体は、Ｃａｓ９とのホモロジーを共有する。例えば、Ｃａｓ９変異体は、野生型Ｃａｓ９に対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、または少なくとも約９９．９パーセント同一である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、断片は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９に対応する（NCBI参照配列：NC_017053.1、配列番号１（ヌクレオチド）；配列番号２（アミノ酸））。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA（配列番号１）
【数１】
2018537963.tif 000003
（配列番号２）（一重下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【００９７】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、配列番号３（ヌクレオチド）および／または配列番号４（アミノ酸）に対応するか、またはそれ（ら）を含む：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA（配列番号３）
【数２】
2018537963.tif 000004
（配列番号４）（一重下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【００９８】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９に対応する（NCBI参照配列：NC_002737.2、配列番号２８２（ヌクレオチド）；およびUniport参照配列：Q99ZW2、配列番号９（アミノ酸）。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA（配列番号２８２）
【数３−１】
2018537963.tif 000005
【数３−２】
2018537963.tif 000006
（配列番号９）（一重下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【００９９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs：NC_015683.1、NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs：NC_016782.1、NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref：NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref：NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref：NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref：NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref：NC_018010.1）；Psychroflexus torquisI（NCBI Ref：NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref：YP_820832.1）；Listeria innocua（NCBI Ref：NP_472073.1）；Campylobacter jejuni（NCBI Ref：YP_002344900.1）；またはNeisseria. meningitidis（NCBI Ref：YP_002342100.1）に由来するＣａｓ９を指すか、または例３に列挙されている生物のいずれかからのＣａｓ９を指す。
【０１００】
いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１以上の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列の、一部または全部に対応するか、またはこれを含む。例えば、いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異を含む。
ｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）：
【数４−１】
2018537963.tif 000007
【数４−２】
2018537963.tif 000008
（配列番号８）（一重下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【０１０１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を変化させる１以上の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に対応するか、または一部もしくは全体において含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９はＣａｓ９ニッカーゼでもよく、それは特定の部位で共発現されたｇＲＮＡ特異的標的配列に基づいて（二本鎖ＤＮＡ切断よりも）一重鎖ＤＮＡ切断を行うＣａｓ９のバージョンである。例えば、いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ変異（例えば配列番号３０１）および／またはＨ８４０Ａ変異（例えば配列番号３０２）を含む。典型的なＣａｓ９ニッカーゼを以下に示す。しかしながら、ＤＮＡ二重らせんの一本鎖ＤＮＡを切断するさらなるＣａｓ９ニッカーゼが当業者にとり自明であり、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。
Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼ：
【数５】
2018537963.tif 000009
（配列番号３０１）（一重下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
Ｃａｓ９ Ｈ８４０Ａニッカーゼ：
【数６−１】
2018537963.tif 000010
【数６−２】
2018537963.tif 000011
（配列番号３０２）（一重下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
【０１０２】
他の態様においては、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するｄＣａｓ９バリアントが提供され、これは例えばヌクレアーゼ不活性化型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。かかる変異は、例として、Ｄ１０およびＨ８２０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換を包含する（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメインにおける置換）。いくつかの態様においては、ｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログ（例えば、配列番号９のバリアント）が提供され、これらが、配列番号９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様においては、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号９のバリアント）が提供され、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはより多くだけ配列番号９よりも短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
いくつかの態様において、本明細書に示すＣａｓ９融合蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質の全長アミノ酸配列（例えば上記で示した配列の１つ）を含む。しかしながら、他の態様において、本明細書に示す融合蛋白質は、全長Ｃａｓ９配列でなく、その断片のみを含む。例えば、いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９融合蛋白質は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと結合するが、機能的なヌクレアーゼドメインを含まない（例えばヌクレアーゼドメインの欠失バージョンのみを含むかまたはヌクレアーゼドメインを全く含まない）Ｃａｓ９断片を含む。好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片のアミノ酸配列の例は、本明細書において示すとおりであり、Ｃａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片のさらなる好適な配列は、当業者にとり自明である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９断片は、対応する野生型Ｃａｓ９蛋白質に対して、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも４５パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも５５パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも６５パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセントの同一性、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントのアミノ酸長である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９断片は、少なくとも１００アミノ酸長を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９断片は、対応する野生型Ｃａｓ９蛋白質のうちの、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，２００、１，２５０、１，３００、１，３５０、１，４００、１，４５０、１，５００、１，５５０または少なくとも１６００のアミノ酸である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９断片は、対応する野生型Ｃａｓ９蛋白質のうちの、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００または少なくとも１２００の同一の隣接するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
Ｃａｓ９
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs：NC_015683.1、NC_017317.1）、Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs：NC_016782.1、NC_016786.1）、Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref：NC_021284.1）、Prevotella intermedia（NCBI Ref：NC 017861.1）、Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref：NC_021846.1）、Streptococcus iniae（NCBI Ref：NC_021314.1）、Belliella baltica（NCBI Ref：NC_018010.1）、Psychroflexus torquisl（NCBI Ref：NC_018721.1）、Streptococcus thermophilus（NCBI Ref：YP_820832.1）、Listeria innocua（NCBI Ref：NP_472073.1）、Campylobacter jejuni（NCBI Ref：YP_002344900.1）、またはNeisseria, meningitidis（NCBI Ref：YP_002342100.1）に由来するＣａｓ９を指す。
【０１０５】
本明細書中で使用する「デアミナーゼまたはデアミナーゼドメイン」なる用語は、脱アミノ化反応を触媒する蛋白質または酵素を意味する。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼであり、シチジンまたはデオキシシチジンを、それぞれウリジンまたはデオキシウリジンに加水分解する脱アミノ化反応を触媒する。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼであり、シトシンのウラシルに加水分解する脱アミノ化反応を触媒する。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラットまたはマウスなどの生物に由来する天然型のデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然には存在しない、生物由来の天然型デアミナーゼの変異体である。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物由来の天然型デアミナーゼに対して、少なくとも５０パーセント、少なくとも５５パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも６５パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。
【０１０６】
本明細書中で使用する「有効量」なる用語は、目的の生物学的反応を生じさせるのに十分な、生物学的活性物質の量を意味する。例えば、いくつかの態様において、ヌクレアーゼの有効量は、ヌクレアーゼによる切断される標的部位への特異的結合および切断を誘導するのに十分なヌクレアーゼの量を指す。いくつかの態様において、本明細書に示される融合蛋白質（例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインおよびエフェクタードメイン（例えばデアミナーゼドメイン）からなる融合蛋白質）の有効量は、融合蛋白質による編集される標的部位への特異的結合および編集を誘導するのに十分な融合蛋白質の量を指す。当業者により理解されるように、例えば融合蛋白質、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッド蛋白質、蛋白質ダイマー、蛋白質（または蛋白質ダイマー）とポリヌクレオチドとの複合体、またはポリヌクレオチドなどの剤の有効量は、目的の生物学的反応（例えば編集される特定のアレル、ゲノムまたは標的部位に対する）、標的とする細胞または組織、ならびに用いる剤などの、各種の要因に応じて変化しうる。
【０１０７】
「２つの核酸配列に関する文脈で用いられる「直接隣接する」という用語は、２つの配列が同じ核酸分子の一部として各々直接に連結し、１以上のヌクレオチドによって分離されていないことを意味する。したがって、それらの配列は、１つの配列３’末端のヌクレオチドが、他の配列の５’末端のヌクレオチドにホスホジエステル結合を介して直接連結するとき、直接隣接しているという。
【０１０８】
本明細書中で使用する「リンカー」なる用語は、２つの分子または部分、例えば融合蛋白質（例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインとエフェクタードメイン（例えばデアミナーゼドメイン））の２つのドメインを連結する化学基または分子を指す。いくつかの態様において、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインなどの、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと、核酸編集蛋白質の触媒ドメインと、を連結する。いくつかの態様において、リンカーは、ｄＣａｓ９と核酸編集蛋白質とを連結する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子または他の部分の間に位置するか、またはそれらに挟まれ、共有結合を経て、これらの２つのものを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機性の分子、基、ポリマーまたは化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００のアミノ酸長であり、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０または１５０〜２００のアミノ酸長である。より長いまたは短いリンカーも包含される。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「変異」は、配列（例えば核酸またはアミノ酸配列）内の１以上の残基の、他の残基による置換、欠失または挿入を指す。本明細書において変異は、典型的には、まず元の残基を特定し、続いて配列内の残基の位置を特定し、そして新しく置換された残基を特定することにより記載される。本明細書で提供されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法が公知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)に記載されている。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「核酸」および「核酸分子」は、核酸塩基および酸部分（例えばヌクレオシド、ヌクレオチドまたはヌクレオチドのポリマー）を含む化合物を指す。典型的には、重合した核酸（例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子）は直鎖状分子であり、隣接するヌクレオチドはホスホジエステル結合を介して各々連結される。いくつかの態様において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えばヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドである）を指す。いくつかの態様において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で用いられるように、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指すもの（例えば少なくとも３つのヌクレオチドの鎖）として交換可能に使用できる。いくつかの態様において、「核酸」には、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡが包含される。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体または他の天然由来の核酸分子など、天然に存在するものであってもよい。一方、核酸分子は、例えば非天然に存在する組換え分子ＤＮＡまたはＲＮＡ、人工染色体、設計されたゲノムまたはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよく、または非天然のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含有するものであってもよい。さらにまた、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および／または同様の用語には、核酸類似体（例えばホスホジエステル骨格以外の骨格を有する類似体）が含まれる。核酸は、天然の給源から精製されてもよく、組換え発現系を使用して、任意に精製を行い製造してもよく、化学合成してもよい。必要に応じて、例えば化学合成された分子の場合、核酸は、ヌクレオシド類縁体（例えば化学修飾塩基または糖、および修飾された骨格を有する類似体）を含むことができる。特に明記しない限り、核酸配列は５’から３’の方向に示す。いくつかの態様において、核酸は、以下のものであっても、またはそれを含んでもよい：天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類縁体（例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチル・アデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニンおよび２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えばメチル化塩基）、インターカレーションされた塩基、修飾糖（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）、および／または修飾リン酸基（例えばホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）。いくつかの態様において、ＲＮＡは、Ｃａｓ９システムと関連するＲＮＡである。例えばＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランスコードされたスモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であってもよい。
【０１１１】
本明細書中で使用する「増殖疾患」なる用語は、細胞または細胞集団が異常に高い増殖速度を示すという点で、細胞または組織のホメオスタシスが妨害されるあらゆる疾患を意味する。増殖疾患には、高増殖性疾患（例えば前新生物過形成性症状および新生物疾患）が含まれる。新生物疾患は、異常な細胞増殖によって特徴づけられ、良性および悪性新形成が含まれる。悪性新形成は癌とも呼ばれる。
【０１１２】
用語「蛋白質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、いかなるサイズ、構造または機能の蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドをも指す。典型的には、蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドは、個々の蛋白質または一まとまりの蛋白質を指す場合もある。１以上の蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸を、例えば化学的部分（例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲートのためのリンカー、官能化または他の修飾など）の付加によって修飾してもよい。蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドは、単一の分子でもよく、または多分子の複合体であってもよい。蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの断片のみでもよい。蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドは、天然由来、組み換え体、合成物またはそれらのいかなる組み合わせであってもよい。本明細書中で使用する「融合蛋白質」なる用語は、少なくとも２つの異なる蛋白質に由来する蛋白質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを意味する。１つの蛋白質は、融合蛋白質のアミノ末端（Ｎ末端）部分または蛋白質のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置してもよく、それにより、「アミノ末端融合蛋白質」または「カルボキシ末端融合蛋白質」がそれぞれ形成される。蛋白質はいくつかのドメインを含んでもよく、例えば核酸結合ドメイン（例えば標的部位への蛋白質の結合を促進するＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）および核酸編集蛋白質の核酸切断ドメインまたは触媒ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、蛋白質はタンパク様部分を含み、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列および有機化合物（例えば核酸分解剤として作用できる化合物）を含む。いくつかの態様において、蛋白質は、核酸（例えばＲＮＡ）と共に、またはそれとの会合において複合体として存在する。本発明で提供されるいずれの蛋白質も、公知技術のいずれかの方法によって製造することができる。例えば、本発明で提供される蛋白質は、組換え蛋白質発現および精製を経て製造されてもよく、特にペプチドリンカーを含む融合蛋白質に適する。組換え蛋白質の発現および精製のための方法は公知であり、参照により全開示内容が援用されるGreen and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual（4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)）に記載の方法が挙げられる。
【０１１３】
用語「ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ」および「ＲＮＡガイドされるヌクレアーゼ」は、本明細書において交換可能に用いられ、切断の標的ではない１以上のＲＮＡと複合錯体を形成する（例えば結合または会合する）ヌクレアーゼを指す。いくつかの態様において、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体であるとき、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と称されうる。典型的には、結合する一以上のＲＮＡはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される。ｇＲＮＡは、二つ以上のＲＮＡの複合体として、または一本鎖のＲＮＡ分子として存在してもよい。一本鎖のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称されるが、「ｇＲＮＡ」は交換可能に、単一分子として、または二つ以上の分子の複合体として存在するガイドＲＮＡを指すこともある。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２つのドメイン：（１）標的核酸酸とのホモロジーを共有するドメイン（例えば、Ｃａｓ９複合体の標的への結合を促進する）、および（２）Ｃａｓ９蛋白質と結合するドメイン、を含む。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の配列に対応し、ステム−ループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、全開示内容を参照により本明細書に援用するJinek et al, Science 337:816-821(2012)に記載のｔｒａｃｒＲＮＡと同一であるか、または相同性を有する。ｇＲＮＡｓの他の例（例えばドメイン２を含むもの）は、米国仮特許出願第６１／８７４，６８２号（２０１３年９月６日に出願）「切り替え可能なＣａｓ９ヌクレアーゼおよびその使用」、および米国仮特許出願第６１／８７４，７４６号（２０１３年９月６日に出願）「機能性ヌクレアーゼの送達システム」に記載され、各々の全開示内容を本明細書において参照により援用する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、二つ以上のドメイン（１）および（２）を含み、それは「伸長型(extended)ｇＲＮＡ」と称されることもある。例えば伸長型ｇＲＮＡは、例えば本明細書に記載のように、二つ以上のＣａｓ９蛋白質と結合し、二つ以上の異なった領域において標的核酸と結合する。ｇＲＮＡは、標的部位と相補的なヌクレオチド配列を含み、前記標的部位に対するヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ−会合系）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えばStreptococcus pyogenes由来のＣａｓ９（Ｃｓｎｌ）である（例えば、全開示内容を参照により本明細書に援用する"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663 (2001)、"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471 : 602-607 (2011)、および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821 (2012)を参照。
【０１１４】
ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）は、標的ＤＮＡ切断部位に対するＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いるため、これらの蛋白質は、原則として、ガイドＲＮＡにより特定されるいかなる配列も標的とすることが可能である。部位特異的な切断（例えばゲノムの修飾）のためのＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）を使用する方法は公知技術である（例えば、全開示内容を参照により本明細書に援用するCong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)、Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)、Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)、Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)、Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照）。
【０１１５】
本明細書で使用される用語「被験者」は、個々の生物（例えば個々の哺乳動物）を指す。いくつかの態様において、被験者は、ヒトである。いくつかの態様において、被験者は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、被験者は、非ヒト霊長動物である。いくつかの態様において、被験者は、齧歯動物である。いくつかの態様において、被験者は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコまたはイヌである。いくつかの態様において、被験者は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚、昆虫、ハエまたは線虫である。いくつかの態様において、被験者は、実験動物である。いくつかの態様において、被験者は、遺伝子操作された、例えば遺伝子操作された非ヒト被験者である。被験者は、いずれの性でも、いかなる年齢でも、またいかなる発生段階のものでもあってもよい。
【０１１６】
「標的部位」という用語は、核酸分子内の、デアミナーゼまたはデアミナーゼを含む融合蛋白質によって脱アミノ化される配列を指す（例えば、本発明で提供されるｄＣａｓ９−デアミナーゼ融合蛋白質）。
【０１１７】
用語「処置」、「処置する」および「処置すること」は、本明細書に記載の疾患もしくは障害またはその１以上の徴候の進展を逆転させるか、軽減するか、発症を遅延させるか、または阻害するために行われる臨床的介入を指す。本明細書で用いられる用語「処置」、「処置する」および「処置すること」は、本明細書に記載の疾患もしくは障害またはその１以上の徴候の進展を逆転させるか、軽減するか、発症を遅延させるか、または阻害するために行われる臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、１以上の症状が発症した後で、および／または、疾患が診断された後で、施すことができる。他の態様において、処置は、徴候がない場合にも、例えば症状の発症を予防または遅延させるか、または疾患の発症または進行を阻害するために施してもよい。例えば、処理は、（例えば症状の病歴を考慮し、および／または、遺伝的もしくは他の感受性要因を考慮し）徴候が現れる前に、感受性を有する個人に施してもよい。処理は、徴候が解消した後も、例えばそれらの再発を防止または遅延させるために、継続させてもよい。
【０１１８】
蛋白質または核酸の前後関係において本明細書で用いられる「組み換え」という用語は、天然には発生せず、人為的な工学的製品である蛋白質または核酸を指す。例えば、いくつかの態様において、組み換え蛋白質または核酸分子には、いずれかの天然に生じる配列と比較し、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む、アミノ酸またはヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１９】
本明細書中で使用する「核酸編集酵素」なる用語は、核酸または核酸中の１以上のヌクレオチド塩基を修飾できる蛋白質を意味する。例えば、いくつかの態様において、核酸編集酵素は、ＣからＴへの、またはＧからＡへの変化を触媒することができるデアミナーゼである。本明細書の開示に従い使用できる他の好適な核酸編集酵素としては、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼまたはアセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明の特定態様の詳細な説明：
本発明の開示のいくつかの側面は、３’末端に古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’、Ｎはいずれかのヌクレオチド（例えばＡ、Ｔ、ＧまたはＣ））を含まないＤＮＡの塩基配列を効率的に標的とする組み換えＣａｓ９蛋白質の提供に関する。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質は、ランダム化されたＰＡＭ配列を含む標的配列ライブラリーを使用した定方向進化実験において同定された１以上の変異を含む。本発明で提供される組み換えＰＡＭ非拘束型Ｃａｓ９蛋白質は、３’末端に古典的ＰＡＭ配列を含まないＤＮＡの塩基配列のターゲティングに有用であり、それにより、遺伝子編集に対するＣａｓ９技術の有用性を非常に高めるものである。
【０１２１】
本発明の開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９蛋白質と、例えばデアミナーゼドメインなどのエフェクタードメイン（例えばＤＮＡ編集ドメイン）と、を含む融合蛋白質の提供に関する。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化により、特定の残基における点変異をもたらすことができ、それは本発明においては核酸編集と称される。Ｃａｓ９蛋白質またはその変異体と、ＤＮＡ編集ドメインと、を含む融合蛋白質は、ゆえに、核酸配列の標的特異的な編集のために使用できる。かかる融合蛋白質は、例えば変異細胞または動物の作製のための、例えばエクスビボでの細胞内の（例えば同一または異なる被験者にその後再導入される、被験者由来の細胞内の）遺伝子欠損の修復を目的とする、標的特異的な変異導入のための、ならびに、例えばインビボでの被験者の疾患関連遺伝子における遺伝子欠損の修復または当該遺伝子の不活性化のための変異導入を目的とする、標的特異的な変異導入のための、インビトロでのＤＮＡの標的特異的な編集に有用である。典型的には、本明細書に記載の融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質は、いかなるヌクレアーゼ活性も有さず、代わりにＣａｓ９断片またはｄＣａｓ９蛋白質である。本明細書に記載のＣａｓ９融合蛋白質の使用方法も提供される。
【０１２２】
非限定的に例示されるヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９蛋白質が本明細書に提供される。例示される１つの好適なヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９蛋白質は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９蛋白質変異：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号２６２；例えば、Qi et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013; 152(5):1173-83を参照。これの全内容は参照により組み込まれる）。
【０１２３】
追加の好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインは、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかる追加の例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９蛋白質は、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ、Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ／Ｎ８６３Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体蛋白質を包含するが、これに限定されない（例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838参照。その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１２４】
組み換えＣａｓ９蛋白質
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号１０〜２６２のいずれかにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む組み換えＣａｓ９蛋白質の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない。
【０１２５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘは、対応する位置のいずれかのアミノ酸を表す。
【０１２６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩまたはＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１２７】
いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号９のＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０〜２６２のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号９のＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１２８】
非古典的ＰＡＭに対する活性を有する組み換えＣａｓ９蛋白質
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む組み換えＣａｓ９の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する活性（増加した活性）を示す。
【０１２９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenes Ｃａｓ９の活性と比較し、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧまたはＣＡＡ配列と直接隣接している。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質活性は、ヌクレアーゼアッセイ、脱アミノアッセイまたは転写活性化アッセイで測定される。いくつかの態様において、転写活性化アッセイは、レポーター活性化アッセイ（例えばＧＦＰ活性化アッセイ）である。転写活性化アッセイを用いた（例えばＣａｓ９の）結合活性測定のための典型的な方法は、公知技術であり、当業者に自明である。例えば三要素(tripartite)活性化因子ＶＰＲを用いたＣａｓ９活性の測定方法は、全開示内容を参照により本明細書に援用するChavez A., et al., "Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming." Nature Methods 12, 326-328 (2015)に記載されている。
【０１３０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘは、対応する位置のいずれかのアミノ酸を表す。
【０１３１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩまたはＥ１２１９Ｖ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１３２】
いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０〜２６２のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１３３】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む組み換えＣａｓ９の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１３４】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む組み換えＣａｓ９の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９はさらに、配列番号９に示される位置８４０においてヒスチジン残基を含むか、または、配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて対応するヒスチジン残基を含む。いかなる特定の理論にも拘束されないが、触媒的残基Ｈ８４０の存在により、Ｃａｓ９による、非標的鎖（すなわちｓｇＲＮＡにより結合される鎖）の切断が可能となる。いくつかの態様において、配列番号９に示されるアミノ酸配列の位置８４０、または配列番号１０〜２６２に示される対応するアミノ酸配列中の位置に、ヒスチジン以外のアミノ酸残基を有するＣａｓ９は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０−２６２に示される対応するアミノ酸配列中の位置が、ヒスチジンに変更または変異されてもよい。
【０１３５】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む組み換えＣａｓ９の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４および１２５６からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する活性（増加した活性）を示す。
【０１３６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenes Ｃａｓ９の活性と比較し、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加している。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＴ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＴ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧまたはＴＴＴ ＰＡＭ配列と直接隣接している。
【０１３７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４Ｋ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、Ｘは、対応する位置のいずれかのアミノ酸を表す。
【０１３８】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１３９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ４８０Ｋ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１４０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＥ５４３Ｄ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１４１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される変異の組合せを含む：配列番号９に示されるアミノ酸配列の、（Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３ＤおよびＸ１２１９Ｖ）、（Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ）、（Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ）、（Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ）、（Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ）、ならびに（Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ）、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される変異の組合せを含む：配列番号９に示されるアミノ酸配列の、（Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ）、（Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ）、（Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ）、（Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ）、（Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４ＫおよびＱ１２５６Ｋ）ならびに（Ａ２６２Ｔ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ）、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異。
【０１４２】
いくつかの態様において、ＨＮＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＨＮＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１４３】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む組み換えＣａｓ９蛋白質の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１４４】
本発明の開示のいくつかの側面は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む組み換えＣａｓ９蛋白質の提供に関し、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す。いくつかの態様において、ＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列は、配列番号２、４または９のいずれかのＲｕｖＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９はさらに、配列番号９に示される位置８４０においてヒスチジン残基を含むか、または、配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて対応するヒスチジン残基を含む。いかなる特定の理論にも拘束されないが、触媒的残基Ｈ８４０の存在により、Ｃａｓ９による、非標的鎖（すなわちｓｇＲＮＡにより結合される鎖）の切断が可能となる。いくつかの態様において、配列番号９に示されるアミノ酸配列の位置８４０、または配列番号１０−２６２に示される対応するアミノ酸配列中の位置に、ヒスチジン以外のアミノ酸残基を有するＣａｓ９は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８４０、または配列番号１０−２６２に示される対応するアミノ酸配列中の位置が、ヒスチジンに変更または変異されてもよい。
【０１４５】
Ｃａｓ９融合蛋白質
本発明の開示のいくつかの側面は、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質の提供に関し、当該Ｃａｓ９蛋白質は、第２の蛋白質または「融合パートナー」（例えばエフェクタードメイン）と融合することにより、融合蛋白質を形成する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質およびエフェクタードメインは、リンカーを介して相互に融合する。リンカーを使用して、またはリンカーを使用せずに、本発明の開示に係る融合蛋白質を作製するための好適なストラテジーは、本明細書の記載および当分野の技術的知識に鑑み、当業者にとり自明である。例えばGilbert et al, CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154(2): 442-51では、リンカーとして２つのＮＬＳ（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ、配列番号２８４）を用いた、Ｃａｓ９のＶＰ６４とのＣ末端融合体が転写活性化に使用できることを示している。Mali et al, CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013; 31(9): 833-8は、リンカーを用いない、ＶＰ６４とのＣ末端融合体が転写活性化に使用できることを報告している。また、Maeder et al, CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.Nat Methods. 2013; 10: 977-979は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号５）リンカーを用いたＶＰ６４とのＣ末端融合体が、転写アクチベーターとして使用できることを報告している。近年では、ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体の作製に成功し、それは親のＣａｓ９酵素と比較し改良された酵素特異性を示すことが報告されている（Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82、およびTsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 2014; 32(6): 569-76を参照。ＰＭＩＤ：２４７７０３２５  ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、またはＧＧＧＧＳｎ（配列番号５）リンカーが、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合蛋白質において、それぞれで用いられている）。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎは独立に１〜３０の整数である。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、酵素ドメインを含む。好適なエフェクタードメインとしては、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写アクチベーターおよび転写リプレッサーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
リンカーは１個の共有結合でもよく、または多くの原子からなる重合リンカーでもよい。特定の態様において、リンカーは、ポリペプチドまたはアミノ酸をベースとするものである。他の態様において、リンカーは、ペプチド様のものでない。特定の態様において、リンカーは、共有結合（例えば炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など）である。特定の態様において、リンカーは、アミド結合による炭素−窒素結合である。特定の態様において、リンカーは、環式または非環式の、置換または非置換の、分岐状または非分岐状の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。特定の態様において、リンカーは、重合体（例えばポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。特定の態様において、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマーまたはポリマーを含む。特定の態様において、リンカーは、アミノアルカン酸の（例えばグリシン、エタン酸、アラニン、βアラニン、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−ペンタン酸など）を含む。特定の態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、ダイマーまたはポリマーを含む。特定の態様において、リンカーは、炭素環式部分（例えばシクロペンタン、シクロヘキサン）をベースとするものである。他の態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーは、アミノ酸を含む。特定の態様において、リンカーは、ペプチドを含む。特定の態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。特定の態様において、リンカーは、フェニル環をベースとする。リンカーは、官能化部分を含むことで、ペプチド由来の求核種（例えばチオール、アミノ基）のリンカーへの結合を促進するものでもよい。いずれかの求電子種を用いてリンカーの一部としてもよい。例示的な親電子種としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシルおよびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
いくつかの態様において、エフェクタードメインは、エフェクター酵素を含む。本発明の開示に従い使用できる好適なエフェクター酵素としては、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼおよびデアミナーゼが挙げられる。しかしながら、さらなるエフェクター酵素も当業者にとり自明であり、本発明の範囲内である。他の態様において、エフェクタードメインは、転写活性を調節するドメインを含む。かかる転写調節ドメインは、限定されないが、転写アクチベーターまたは転写リプレッサードメインであってもよい。
【０１４８】
いくつかの態様において、エフェクタードメインは、エフェクタードメインである。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、デアミナーゼドメインである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、アポリポ蛋白質ＢメッセンジャーＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。
【０１４９】
いくつかの態様において、エフェクタードメインは、配列番号２６３〜２８１のいずれか１つのデアミナーゼドメインと、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセントの同一性を有する。
【０１５０】
いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ヌクレアーゼドメインである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインである。いくつかの態様において、本発明の開示は、本発明に係る融合蛋白質の二量体の提供に関し、例えば、融合蛋白質のダイマーは、二量体化したヌクレアーゼドメインを含んでもよい。
【０１５１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号１０〜２６２のいずれかにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、Ｃａｓ９蛋白質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質アミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する活性を示す。
【０１５２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号１０〜２６２のいずれかにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセントまたは少なくとも９９．５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、Ｃａｓ９蛋白質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基、からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９により示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４および１２５６からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異を含み、組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列は、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でなく、組み換えＣａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較し、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す。
【０１５３】
本発明の開示のいくつかの側面は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９蛋白質と、（ｉｉ）エフェクタードメインと、を含む融合蛋白質の提供に関する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、ＤＮＡ編集ドメインである。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、デアミナーゼ活性を有する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、デアミナーゼドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、アポリポ蛋白質ＢメッセンジャーＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの核酸編集ドメインならびにかかるドメインを含むＣａｓ９融合蛋白質を、本明細書において詳述する。さらなる好適なエフェクタードメインは、本明細書の開示に基づき当業者にとり自明である。いくつかの態様において、核酸編集ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである。
【０１５４】
本発明の開示は、各種の立体構造のＣａｓ９：エフェクタードメイン融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、エフェクタードメインは、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質およびエフェクタードメインは、リンカーを介して融合する。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）のモチーフ（全開示内容を参照により本明細書に援用する、Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82を参照）、または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎは独立に１〜３０の整数である。いくつかの態様において、ｎは独立に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であるか、または、１つ以上のリンカーまたは１つ以上のリンカーモチーフが、それらのいずれかの組み合わせにおいて存在する。さらなる好適なリンカーモチーフおよびリンカー構造は、当業者にとり自明である。いくつかの態様において、好適なリンカーのモチーフおよび構造としては、全開示内容を参照により本明細書に援用するChen et al, Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10): 1357-69に記載のものが挙げられる。さらなる好適なリンカー配列は、本発明の開示および当分野の技術常識に基づき、当業者にとり自明である。
【０１５５】
いくつかの態様において、本発明で提供される例示的なＣａｓ９融合蛋白質の一般構成としては、以下の構造：
［ＮＨ２］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］、または、
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＣＯＯＨ］であり、
ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。図１１は、ｓｇＲＮＡとの複合体における、エフェクタードメイン（例えばｒＡＰＯＢＥＣｌ）と融合したＣａｓ９蛋白質、および標的核酸配列に対する結合の概略を示す。
【０１５６】
いくつかの態様において、本発明で提供されている融合蛋白質のいずれも、１以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。本明細書において、核局在化配列は、（例えば核内輸送を介して）細胞核への蛋白質（例えばＮＬＳを有する本発明で提供される融合蛋白質のいずれか）の輸入を促進するアミノ酸配列を指す。典型的には、ＮＬＳは、蛋白質表面に露出する正荷電のリジンまたはアルギニンの１以上の短いアミノ酸配列を含む。核局在化配列は、従来技術において周知であり、当業者にとり自明である。例えば核局在化配列は、Kalderon D., et al, "A short amino acid sequence able to specify nuclear location". Cell (1984) 39 (3 Pt 2): 499-509、Dingwall C, et al, "The nucleoplasmin nuclear location sequence is larger and more complex than that of SV-40 large T antigen". J Cell Biol. (1988) 107 (3): 841-9、Makkerh LP., et al, "Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids". Curr Biol. (1996) 6 (8): 1025-7、およびRay M., et al., "Quantitative tracking of protein trafficking to the nucleus using cytosolic protein delivery by nanoparticle-stabilized nanocapsules". Bioconjug. Chem. (2015) 26 (6): 1004-7に記載されており、各々の全開示内容を本明細書において参照により援用する。さらなる核局在化配列は、例えばＰｌａｎｋらの国際特許出願第PCT/EP2000/011690号に記載されており、全開示内容を参照により本明細書に援用する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９９）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号３００）を含む。
【０１５７】
存在しうる特徴の例は、局在化配列（例えば核局在化配列）、細胞質局在化配列、輸出配列（例えば核外輸送配列）、または他の局在化配列、ならびに、融合蛋白質の可溶化、精製または検出に有用な配列タグである。好適な局在化シグナル配列および蛋白質タグ配列が本明細書において示され、限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアー蛋白質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジンタグ、ヒスチジンもしくはＨｉｓタグ、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えばＳｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグおよびＳＢＰタグが挙げられる。さらなる好適な配列は当業者に自明であり、本発明の開示の範囲内である。
【０１５８】
本発明で提供される核局在化配列のいずれも、いずれかの好適な位置において融合蛋白質と融合できる。例えば融合蛋白質の機能を損なうことなく、細胞核への融合蛋白質のトランスロケーションを促進するために行われる。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のエフェクタードメインのＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のエフェクタードメインのＣ末端に融合する。
【０１５９】
いくつかの態様において、エフェクタードメインは、デアミナーゼである。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼドメインを有する典型的なＣａｓ９融合蛋白質の一般構成としては、以下の構造が挙げられる：
［ＮＨ２］−［ＮＬＳ］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［ＮＬＳ］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［ＮＬＳ］−［デアミナーゼ］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［デアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＮＬＳ］−［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ＣＯＯＨ］
ここでＮＬＳは核局在化シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、リンカーは、Ｃａｓ９蛋白質とデアミナーゼドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、「］−［」は、１以上のリンカーであってもよい。いくつかの態様において、ＮＬＳは、デアミナーゼおよび／またはＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、デアミナーゼとＣａｓ９ドメインとの間に位置する。さらなる特徴（例えば配列タグ）が存在してもよい。
【０１６０】
好適なタイプのエフェクタードメインの一例には、例えばＡＰＯＢＥＣファミリーのシトシンデアミナーゼが含まれる。シトシンデアミナーゼ酵素の、アポリポ蛋白質ＢメッセンジャーＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーには、制御され、有利な態様における変異導入に有用な１１の蛋白質が含まれる（２９）。ファミリーの一員である活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）は、ｓｓＤＮＡ中のシトシンを、転写依存的に、鎖バイアス的にウラシルに変換することにより、抗体の成熟に関与する（３０）。アポリポ蛋白質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）酵素は、特定のＨＩＶ−１株に対して、逆転写されたウイルスｓｓＤＮＡのシトシンの脱アミノを経てヒト細胞を保護する（３１）。これらの蛋白質は、触媒活性のために、Ｚｎ２＋配位モチーフ（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｘ２３〜２６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ２〜４−Ｃｙｓ、配列番号２８３）および結合水分子を全て必要とする。Ｇｌｕ残基は、脱アミノ化反応における求核攻撃のために、水分子を活性化して水酸化亜鉛とする作用を示す。各ファミリーは、ｈＡＩＤではＷＲＣ（ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧ）から、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＦではＴＴＣのように、それら自身の特定の「ホットスポット」を選択的に脱アミノ化する（３２）。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの触媒ドメインに関する近年の結晶構造解析では、６つのαヘリックスに挟まれた５本鎖のαシートコアから構成される二次構造が確認され、それは全てのファミリーにわたり保存されていると考えられている（３３）。活性中心ループは、ｓｓＤＮＡとの結合および「ホットスポット」のアイデンティティの決定の両方に関与することが示されている（３４）。これらの酵素の過剰発現は、ゲノムの不安定性および癌と関連しており、ゆえに配列特異的ターゲティングの重要性を強調するものである（３５）。
【０１６１】
本発明の開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９とデアミナーゼドメイン（例えばＡＰＯＢＥＣ酵素などのシトシンデアミナーゼ酵素またはＡＤＡＴ酵素などのアデノシンデアミナーゼ酵素）との間に融合の系統的シリーズの提供に関し、その作製により、ゲノムＤＮＡ内の特定の部位にこれらのデアミナーゼの酵素活性を作用させることが可能となる。認識剤としてＣａｓ９を使用する利点は、２倍となる：（１）Ｃａｓ９の配列特異性を、単にｓｇＲＮＡ配列を変更することにより容易に変化させることができること、および（２）ｄｓＤＮＡを変性させることによってＣａｓ９がその標的配列と結合し、その結果ＤＮＡが伸展し、それは一本鎖であるため、デアミナーゼのための基質となる。他の触媒ドメインまたは他のデアミナーゼに由来する触媒ドメインを用いてＣａｓ９との融合蛋白質を作製できることは当然のことであり、この点に関して本明細書の開示に限定されないことが理解されよう。
【０１６２】
本発明の開示のいくつかの側面は、ｃａｓ９：デアミナーゼ融合蛋白質が、図１１の付番位置３〜１１において、ヌクレオチドを効率的に脱アミノ化することができるという知見に基づくものである。当業者であれば、脱アミノ化ヌクレオチドを含む標的配列に対して融合蛋白質をターゲッティングするために好適なガイドＲＮＡを設計できるのは当然のことである。本明細書に示す、ＰＡＭ依存的なＣａｓ９蛋白質またはＰＡＭのない標的配列を標的とすることができるＣａｓ９蛋白質は、いずれも標的ヌクレオチドの脱アミノ化に使用できる。
【０１６３】
本発明の開示の側面に係るＣａｓ９ドメインと融合できる、いくつかの好適な核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼおよびデアミナーゼドメイン）を以下に示す。典型的には、デアミナーゼは、Ｚｎ２＋配位モチーフ（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｘ２３〜２６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ２〜４−Ｃｙｓ、配列番号２８３）および触媒活性のための結合水分子を必要とする。Ｇｌｕ残基は、脱アミノ化反応における求核攻撃のために、水分子を活性化して水酸化亜鉛とする作用を示す。いくつかの態様において、それぞれの配列の活性ドメインとして、例えば局在化シグナル（核局在化シグナル、核外輸送シグナルなし、細胞質局在化シグナル）のないドメインを使用できることが理解されよう。
【０１６４】
ヒトＡＩＤ：
【数７】
2018537963.tif 000012
（配列番号２６３）（下線：核局在化シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
【０１６５】
マウスＡＩＤ：
【数８】
2018537963.tif 000013
（配列番号２６４）（下線：核局在化シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
【０１６６】
イヌＡＩＤ：
【数９】
2018537963.tif 000014
（配列番号２６５）（下線：核局在化シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
【０１６７】
ウシＡＩＤ：
【数１０】
2018537963.tif 000015
（配列番号２６６）（下線：核局在化シグナル；二重下線：核外輸送シグナル）
【０１６８】
マウスＡＰＯＢＥＣ−３：
【数１１】
2018537963.tif 000016
（配列番号２６７）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１６９】
ラットＡＰＯＢＥＣ−３：
【数１２】
2018537963.tif 000017
（配列番号２６８）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１７０】
Rhesus macaque ＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【数１３】
2018537963.tif 000018
（配列番号２６９）（斜字体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０１７１】
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【数１４】
2018537963.tif 000019
（配列番号２７０）（斜字体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０１７２】
ミドリザルＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【数１５】
2018537963.tif 000020
（配列番号２７１）（斜字体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０１７３】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【数１６−１】
2018537963.tif 000021
【数１６−２】
2018537963.tif 000022
（配列番号２７２）（斜字体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【０１７４】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｆ：
【数１７】
2018537963.tif 000023
（配列番号２７３）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１７５】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｂ：
【数１８】
2018537963.tif 000024
（配列番号２７４）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１７６】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｃ：
【数１９】
2018537963.tif 000025
（配列番号２７５）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１７７】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａ：
【数２０】
2018537963.tif 000026
（配列番号２７６）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１７８】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｈ：
【数２１】
2018537963.tif 000027
（配列番号２７７）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１７９】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｄ：
【数２２】
2018537963.tif 000028
（配列番号２７８）（斜字体：核酸編集ドメイン）
【０１８０】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−１：
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR（配列番号２７９）
【０１８１】
マウスＡＰＯＢＥＣ−１：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK（配列番号２８０）
【０１８２】
ラットＡＰＯＢＥＣ−１：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK（配列番号２８１）
【０１８３】
いくつかの態様において、本明細書に示す融合蛋白質は、エフェクタードメイン（例えば上記で示される配列のいずれか）の全長アミノ酸を含む。しかしながら、他の態様において、本明細書に示す融合蛋白質は、エフェクタードメインの全長配列でなく、その断片のみを含む。例えば、いくつかの態様において、本発明で提供される融合蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質と、エフェクタードメインの断片と、を含み、当該断片は、エフェクタードメインを含む。エフェクタードメインのアミノ酸配列の例を、上記の配列中イタリック体文字として示すが、かかるドメインのさらなる好適な配列は、当業者にとり自明である。
【０１８４】
本発明の開示の側面に従い使用できる、例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９蛋白質と融合できるさらなる好適な核酸編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン配列）は、本発明の開示に基づき当業者にとり自明である。いくつかの態様において、かかるさらなるドメイン配列には、本明細書に示す配列と、少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセントまたは少なくとも９９パーセントの類似性を有するデアミナーゼドメイン配列が含まれる。さらなる好適なＣａｓ９蛋白質、変異体および配列は、当業者にとり自明である。かかるさらなる好適なＣａｓ９蛋白質の例としては、限定されないが、以下の変異を有するＣａｓ９蛋白質が挙げられる：Ｄ１０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０ＡおよびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ（例えば、全開示内容を参照により本明細書に援用する、Prashant et al, CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照。
【０１８５】
Ｃａｓ９蛋白質およびエフェクタードメイン（例えばＤＮＡ編集ドメイン）を含む融合蛋白質を作製するためのさらなる好適なストラテジーは、本発明の開示に基づき、技術常識と組み合わせることにより、当業者にとり自明である。リンカーを使用して、またはリンカーを使用せずに、本発明の開示に係る融合蛋白質を作製するための好適なストラテジーは、本明細書の記載および当分野の技術的知識に鑑み、当業者にとり自明である。例えばGilbert et al, CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. 2013; 154(2): 442-51では、リンカーとして２つのＮＬＳ（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ、配列番号２８４）を用いた、Ｃａｓ９のＶＰ６４とのＣ末端融合体が転写活性化に使用できることを示している。Mali et al, Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013; 31(9): 833-8は、リンカーを用いない、ＶＰ６４とのＣ末端融合体が転写活性化に使用できることを報告している。また、Maeder et al, CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.Nat Methods. 2013; 10: 977-979は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号５）リンカーを用いたＶＰ６４とのＣ末端融合体が、転写アクチベーターとして使用できることを報告している。近年では、ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合体の作製に成功し、それは親のＣａｓ９酵素と比較し改良された酵素特異性を示すことが報告されている（Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR.Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification.Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82、およびTsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK.Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing.Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 569-76、およびＰＭＩＤ：２４７７０３２５  ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号５）リンカーが、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合蛋白質において、それぞれで用いられている）。
【０１８６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９融合蛋白質は、以下を含む：（ｉ）Ｃａｓ９蛋白質、および（ｉｉ）転写アクチベータードメイン。いくつかの態様において、転写アクチベータードメインは、ＶＰＲを含む。ＶＰＲは、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ三要素アクチベーターである。
いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９２の核酸配列：GAGGCCAGCGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCTAGATAG（配列番号２９２）によってコードされるＶＰ６４アミノ酸配列を含む。
【０１８７】
いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９３：EASGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLINSR（配列番号２９３）に示すＶＰ６４アミノ酸配列を含む。
【０１８８】
いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９４：
TCGCCAGGGATCCGTCGACTTGACGCGTTGATATCAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAAAGAGGCCAGCGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCTAGAAGTTCCGGATCTCCGAAAAAGAAACGCAAAGTTGGTAGCCAGTACCTGCCCGACACCGACGACCGGCACCGGATCGAGGAAAAGCGGAAGCGGACCTACGAGACATTCAAGAGCATCATGAAGAAGTCCCCCTTCAGCGGCCCCACCGACCCTAGACCTCCACCTAGAAGAATCGCCGTGCCCAGCAGATCCAGCGCCAGCGTGCCAAAACCTGCCCCCCAGCCTTACCCCTTCACCAGCAGCCTGAGCACCATCAACTACGACGAGTTCCCTACCATGGTGTTCCCCAGCGGCCAGATCTCTCAGGCCTCTGCTCTGGCTCCAGCCCCTCCTCAGGTGCTGCCTCAGGCTCCTGCTCCTGCACCAGCTCCAGCCATGGTGTCTGCACTGGCTCAGGCACCAGCACCCGTGCCTGTGCTGGCTCCTGGACCTCCACAGGCTGTGGCTCCACCAGCCCCTAAACCTACACAGGCCGGCGAGGGCACACTGTCTGAAGCTCTGCTGCAGCTGCAGTTCGACGACGAGGATCTGGGAGCCCTGCTGGGAAACAGCACCGATCCTGCCGTGTTCACCGACCTGGCCAGCGTGGACAACAGCGAGTTCCAGCAGCTGCTGAACCAGGGCATCCCTGTGGCCCCTCACACCACCGAGCCCATGCTGATGGAATACCCCGAGGCCATCACCCGGCTCGTGACAGGCGCTCAGAGGCCTCCTGATCCAGCTCCTGCCCCTCTGGGAGCACCAGGCCTGCCTAATGGACTGCTGTCTGGCGACGAGGACTTCAGCTCTATCGCCGATATGGATTTCTCAGCCTTGCTGGGCTCTGGCAGCGGCAGCCGGGATTCCAGGGAAGGGATGTTTTTGCCGAAGCCTGAGGCCGGCTCCGCTATTAGTGACGTGTTTGAGGGCCGCGAGGTGTGCCAGCCAAAACGAATCCGGCCATTTCATCCTCCAGGAAGTCCATGGGCCAACCGCCCACTCCCCGCCAGCCTCGCACCAACACCAACCGGTCCAGTACATGAGCCAGTCGGGTCACTGACCCCGGCACCAGTCCCTCAGCCACTGGATCCAGCGCCCGCAGTGACTCCCGAGGCCAGTCACCTGTTGGAGGATCCCGATGAAGAGACGAGCCAGGCTGTCAAAGCCCTTCGGGAGATGGCCGATACTGTGATTCCCCAGAAGGAAGAGGCTGCAATCTGTGGCCAAATGGACCTTTCCCATCCGCCCCCAAGGGGCCATCTGGATGAGCTGACAACCACACTTGAGTCCATGACCGAGGATCTGAACCTGGACTCACCCCTGACCCCGGAATTGAACGAGATTCTGGATACCTTCCTGAACGACGAGTGCCTCTTGCATGCCATGCATATCAGCACAGGACTGTCCATCTTCGACACATCTCTGTTTTGA（配列番号２９４）の核酸配列によってコードされるＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９５：
SPGIRRLDALISTSLYKKAGYKEASGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLINSRSSGSPKKKRKVGSQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLGSGSGSRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF（配列番号２９５）に示すＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
本発明の開示のいくつかの側面は、転写アクチベーターを含む融合蛋白質の提供に関する。いくつかの態様において、転写アクチベーターは、ＶＰＲである。いくつかの態様において、ＶＰＲは野生型ＶＰＲまたは配列番号２９３に記載のＶＰＲを含む。いくつかの態様において、本発明で提供されるＶＰＲ蛋白質には、ＶＰＲの断片、ならびにＶＰＲまたはＶＰＲ断片と相同な蛋白質が含まれる。例えば、いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９３に記載されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９３に記載されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列、または、配列番号２９３に記載されるアミノ酸配列の断片に相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＶＰＲまたはＶＰＲの断片を含む、または、ＶＰＲまたはＶＰＲ断片と相同な蛋白質は、「ＶＰＲ変異体」と称される。ＶＰＲ変異体は、ＶＰＲまたはその断片とホモロジーを共有する。例えばＶＰＲ変異体は、野生型ＶＰＲまたは配列番号２９３に記載のＶＰＲに対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、少なくとも約９９．９パーセント同一である。いくつかの態様において、ＶＰＲ変異体はＶＰＲの断片を含み、当該断片は、野生型ＶＰＲまたは配列番号２９３に記載のＶＰＲの対応する断片に対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、または少なくとも約９９．９パーセント同一である。いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９３に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＶＰＲは、配列番号２９２に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１９１】
いくつかの態様において、ＶＰＲは、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡの３要素アクチベーターである。いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡは、配列番号２９５に示すＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡを含む。いくつかの態様において、本発明で提供されるＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ蛋白質には、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡの断片、ならびにＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡおよびＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ断片に相同な蛋白質が含まれる。例えば、いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡは、配列番号２９５に記載されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡは、配列番号２９５に記載されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列、または、配列番号２９５に記載されるアミノ酸配列の断片に相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡまたはＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡの断片を含む、または、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡまたはＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ断片と相同な蛋白質は、「ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ変異体」と称される。ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ変異体は、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡまたはその断片とホモロジーを共有する。例えばＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ異型は、配列番号２９５に記載のＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡに対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、または少なくとも約９９．９パーセント同一である。いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡ変異体は、配列番号２９５に記載のＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡの対応する断片に対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、または少なくとも約９９．９パーセント同一である、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡの断片を含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡは、配列番号２９５に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４−ＳＶ４０−Ｐ６５−ＲＴＡは、配列番号２９４に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１９２】
本発明の開示のいくつかの側面は、（ｉ）Ｃａｓ９蛋白質と、（ｉｉ）エフェクタードメインと、を含む融合蛋白質の提供に関する。いくつかの側面において、本発明で提供される融合蛋白質はさらに、（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合性蛋白質（例えばＺｎフィンガードメイン、ＴＡＬＥまたは第２のＣａｓ９蛋白質）を含む。いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＤＮＡ結合性蛋白質（例えば第２のＣａｓ９蛋白質）を、（ｉ）蛋白質と、（ｉｉ）エフェクタードメインと、を含む融合蛋白質に融合させることは、標的核酸配列に対する融合蛋白質の特異性を改良するために、または、古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）配列を含まない標的核酸との結合における融合蛋白質の特異性または結合能を改良するために有用でありうる。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９蛋白質は、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかである。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９蛋白質は、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９蛋白質は、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質と第２のＣａｓ９蛋白質は、リンカーを介して融合する。
【０１９３】
本発明ではさらに、本発明で提供されるいずれかの融合蛋白質と、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質に結合する第１のガイドＲＮＡと、融合蛋白質の第２のＣａｓ９蛋白質に結合する第２のガイドＲＮＡと、を含む複合体が提供される。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡは、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、第１の標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含み、第２のガイドＲＮＡは、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、第２の標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡは異なる。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡは、第１の標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含み、第２のガイドＲＮＡは、第２の標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は異なる。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は、ＤＮＡの塩基配列である。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は、哺乳動物のゲノム中に存在する。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は、ヒトのゲノム中に存在する。いくつかの態様において、第１の標的配列は、第２の標的配列の３０ヌクレオチド中に存在する。いくつかの態様において、第１の標的配列の３’末端は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない。いくつかの態様において、第２の標的配列の３’末端は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない。
【０１９４】
いくつかの態様において、本発明で提供される例示的なＣａｓ９融合蛋白質の一般構成は、
［ＮＨ２］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［エフェクターまたはドメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］；または
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］の構造であり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、上記の一般構成において使用される「］−［」は、任意のリンカー配列の存在を示す。他の例において、本発明で提供される例示的なＣａｓ９融合蛋白質の一般構成は、
［ＮＨ２］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］；
［ＮＨ２］−［Ｃａｓ９］−［エフェクタードメイン］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］；または
［ＮＨ２］−［第２のＣａｓ９蛋白質］−［エフェクタードメイン］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［ＣＯＯＨ］の構造であり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、上記の一般構成において使用される「−」は、任意のリンカー配列の存在を示す。いくつかの態様において、第２のＣａｓ９は、ｄＣａｓ９蛋白質である。いくつかの態様において、本発明で提供される例示的なＣａｓ９融合蛋白質の一般構成は、図８に示す構造を含む。例示的なＣａｓ９融合蛋白質の一般構成に示される蛋白質はいずれも、本発明で提供される１以上のリンカーにより連結されうることは当然のことである。いくつかの態様において、リンカーは、同一である。いくつかの態様において、リンカーは異なる。いくつかの態様において、例示的なＣａｓ９融合蛋白質のいずれかの一般構成に示される蛋白質の１以上は、リンカーを介して融合しない。いくつかの態様において、融合蛋白質はさらに、核ターゲティング配列（例えば核局在化配列）を含む。いくつかの態様において、本発明で提供される融合蛋白質はさらに、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、第２のＣａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、第２のＣａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、エフェクタードメインのＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、エフェクタードメインのＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、ＵＧＩ蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、ＵＧＩ蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、１以上のリンカーを介して融合蛋白質に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、リンカーを介さずに融合蛋白質に融合する。
【０１９５】
ウラシルグリコシラーゼ阻害剤融合蛋白質
本発明の開示のいくつかの側面は、エフェクタードメイン、例えばデアミナーゼおよびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）に融合するＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、以下の構造を含む：
［デアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［Ｃａｓ９］−［任意のリンカー配列］−［ＵＧＩ］；
［デアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［ＵＧＩ］−［任意のリンカー配列］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［任意のリンカー配列］−［デアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［任意のリンカー配列］−［Ｃａｓ９］−［任意のリンカー配列］−［デアミナーゼ］；
［Ｃａｓ９］−［任意のリンカー配列］−［デアミナーゼ］−［任意のリンカー配列］−［ＵＧＩ］；または
［Ｃａｓ９］−［任意のリンカー配列］−［ＵＧＩ］−［任意のリンカー配列］−［デアミナーゼ］。
いくつかの態様において、融合蛋白質は、リンカー配列を含まない。いくつかの態様において、任意のリンカー配列の一方または両方が存在する。
【０１９６】
いくつかの態様において、融合蛋白質はさらに、第２のＣａｓ９蛋白質を含む。例えば、第２のＣａｓ９蛋白質は、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかでもよい。いくつかの態様において、融合蛋白質は、以下の構造を含む：
［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］；
［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］；
［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］；
［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］；
［第２のＣａｓ９］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］；
［第２のＣａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］；
［第２のＣａｓ９］−［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］；
［第２のＣａｓ９］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］；
［第２のＣａｓ９］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］；
［第２のＣａｓ９］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］；
［デアミナーゼ］−［第２のＣａｓ９］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］；
［デアミナーゼ］−［第２のＣａｓ９］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］；
［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］；
［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９］−［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］；
［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９］−［ＵＧＩ］；
［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］−［第２のＣａｓ９］−［Ｃａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９］−［デアミナーゼ］；
［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［第２のＣａｓ９］−［ＵＧＩ］；
［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９］−［デアミナーゼ］；
［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９］；
［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］−［Ｃａｓ９］−［第２のＣａｓ９］；
［ＵＧＩ］−［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［第２のＣａｓ９］；
［Ｃａｓ９］−［デアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−［第２のＣａｓ９］；または
［Ｃａｓ９］−［ＵＧＩ］−［デアミナーゼ］−［第２のＣａｓ９］。
いくつかの態様において、上記の一般構成において使用される「−」は、任意のリンカー配列の存在を示す。いくつかの態様において、ＵＧＩを含む融合蛋白質はさらに、核ターゲティング配列（例えば核局在化配列）を含む。いくつかの態様において、本発明で提供される融合蛋白質はさらに、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、融合蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、ＵＧＩ蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、ＵＧＩ蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、Ｃａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、Ｃａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、デアミナーゼのＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、デアミナーゼのＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、第２のＣａｓ９蛋白質のＮ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、第２のＣａｓ９蛋白質のＣ末端に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、１以上のリンカーを介して融合蛋白質に融合する。いくつかの態様において、ＮＬＳは、リンカーを介さずに融合蛋白質に融合する。
【０１９７】
いくつかの態様において、ＵＧＩは、野生型ＵＧＩまたは配列番号５５３に示すＵＧＩを含む。いくつかの態様において、本発明で提供されるＵＧＩ蛋白質には、ＵＧＩの断片、ならびにＵＧＩまたはＵＧＩ断片と相同な蛋白質が含まれる。例えば、いくつかの態様において、ＵＧＩは、配列番号５５３に記載されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、配列番号５５３に記載されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列、または、配列番号５５３に記載されるアミノ酸配列の断片に相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩまたはＵＧＩ断片を含む蛋白質またはＵＧＩまたはＵＧＩ断片のホモログは、「ＵＧＩ変異体」と称される。ＵＧＩ変異体は、ＵＧＩまたはその断片とのホモロジーを共有する。例えばＵＧＩ変異体は、野生型ＵＧＩまたは配列番号５５３に記載のＵＧＩに対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、少なくとも約９９．９パーセント同一である。いくつかの態様において、ＵＧＩ変異体はＵＧＩの断片を含み、当該断片は、野生型ＵＧＩまたは配列番号５５３に記載のＵＧＩの対応する断片に対して、少なくとも約７０パーセント同一であるか、少なくとも約８０パーセント同一であるか、少なくとも約９０パーセント同一であるか、少なくとも約９５パーセント同一であるか、少なくとも約９６パーセント同一であるか、少なくとも約９７パーセント同一であるか、少なくとも約９８パーセント同一であるか、少なくとも約９９パーセント同一であるか、少なくとも約９９．５パーセント同一であるか、または少なくとも約９９．９パーセント同一である。いくつかの態様において、ＵＧＩは、以下のアミノ酸配列を含む：
＞sp|P14739|UNGI_BPPB2  ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤
MTLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGEKIKML（配列番号５５３）。
【０１９８】
好適なＵＧＩ蛋白質およびヌクレオチド配列は、本明細書で提供されるとおりであり、またさらなる好適なＵＧＩ配列も当業者に周知であり、例えば、Wang et al.,Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase.J. Biol. Chem. 264: 1163-1171(1989)、Lundquist et al.,Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase.J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997)、Ravishankar et al.,X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG.Nucleic Acids Res. 26: 4880-4887(1998)、およびPutnam et al.,Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase.J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)にて公表されたものが挙げられ、各々の全開示内容を本明細書において参照により援用する。
【０１９９】
当然ながら、さらなる蛋白質はウラシルグリコシラーゼ阻害剤でもよい。例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ塩基−切除修復酵素を阻害できる（例えば立体的ブロックする）他の蛋白質も、本発明の開示の範囲内である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ＤＮＡと結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、一本鎖ＤＮＡと結合する蛋白質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、Erwinia tasmaniensisの一本鎖結合蛋白質であってもよい。いくつかの態様において、一本鎖結合蛋白質は、アミノ酸配列（配列番号３０３）を含む。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ウラシルと結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ中のウラシルと結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒的に不活性なウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼ蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ウラシルをＤＮＡから切除しない、触媒的に不活性なウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼ蛋白質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ＵｄｇＸである。いくつかの態様において、ＵｄｇＸは、アミノ酸配列（配列番号３０４）を含む。別の例として、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒的に不活性なＵＤＧである。いくつかの態様において、触媒的に不活性なＵＤＧは、アミノ酸配列（配列番号３０５）を含む。当然ながら、他のウラシルグリコシラーゼ阻害剤は当業者にとり自明であり、本発明の開示の範囲内である。
Erwinia tasmaniensisのＳＳＢ（熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質）
MASRGVNKVILVGNLGQDPEVRYMPNGGAVANITLATSESWRDKQTGETKEKTEWHRVVLFGKLAEVAGEYLRKGSQVYIEGALQTRKWTDQAGVEKYTTEVVVNVGGTMQMLGGRSQGGGASAGGQNGGSNNGWGQPQQPQGGNQFSGGAQQQARPQQQPQQNNAPANNEPPIDFDDDIP（配列番号３０３）
ＵｄｇＸ（ＤＮＡ中のウラシルに結合するが、切除しない）
MAGAQDFVPHTADLAELAAAAGECRGCGLYRDATQAVFGAGGRSARFMIGEQPGDKEDLAGLPFVGPAGRLLDRALEAADIDRDALYVTNAVKHFKFTRAAGGKRRIHKTPSRTEVVACRPWLIAEMTSVEPDVVVLLGATAAKALLGNDFRVTQFIRGEVLHVDDVPGDPALVATVHPSSLLRGPKEERESAFAGLVDDLRVAADVRP（配列番号３０４）ＵＤＧ（触媒的に不活性なヒトＵＤＧ、ＤＮＡ中のウラシルと結合するが、切除しない）
MIGQKTLYSFFSPSPARKRHAPSPEPAVQGTGVAGVPEESGDAAAIPAKKAPAGQEEPGTPPSSPLSAEQLDRIQRNKAAALLRLAARNVPVGFGESWKKHLSGEFGKPYFIKLMGFVAEERKHYTVYPPPHQVFTWTQMCDIKDVKVVILGQEPYHGPNQAHGLCFSVQRPVPPPPSLENIYKELSTDIEDFVHPGHGDLSGWAKQGVLLLNAVLTVRAHQANSHKERGWEQFTDAVVSWLNQNSNGLVFLLWGSYAQKKGSAIDRKRHHVLQTAHPSPLSVYRGFFGCRHFSKTNELLQKSGKKPIDWKEL（配列番号３０５）
【０２００】
高正確性(High Fidelity)のＣａｓ９
本発明の開示のいくつかの側面は、正確性が高いＣａｓ９蛋白質の提供に関する。いくつかの態様において、高正確性のＣａｓ９蛋白質は、野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９蛋白質とＤＮＡの糖‐リン酸主鎖との間の静電的相互作用が低い。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかは、Ｃａｓ９蛋白質とＤＮＡの糖‐リン酸主鎖との間の会合を低下させる１以上の変異を含む。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかは、Ｃａｓ９蛋白質とＤＮＡの糖‐リン酸主鎖との間の会合を、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも４５パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセントまたは少なくとも９５パーセント低下させる、１以上の変異を含む。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかは、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＮ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘおよび／またはＱ９２６Ｘ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９蛋白質のいずれかは、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａおよび／またはＱ９２６Ａ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、配列番号３０６に示すアミノ酸配列を含む。正確性が高いＣａｓ９蛋白質は、先行技術文献に記載されており、当業者にとり自明である。例えば、正確性が高いＣａｓ９蛋白質は、Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016)、およびSlaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015)に記載されており、各々の全開示内容を本明細書において参照により援用する。当然ながら、本発明の開示および技術常識に基づき、いずれかのＣａｓ９蛋白質を変異させ、野生型Ｃａｓ９ドメインと比較し、Ｃａｓ９蛋白質とＤＮＡの糖‐リン酸主鎖との間の静電的相互作用が低減した、正確性が高いＣａｓ９蛋白質を創出できる。
配列番号９のＣａｓ９に対するＣａｓ９ドメインの変異箇所を太字および下線で示す。
【数２３】
2018537963.tif 000029
【数２４】
2018537963.tif 000030
（配列番号３０６）
【０２０１】
縮減されたＰＡＭ排他性を有するＣａｓ９ドメイン
本開示のいくつかの側面は、異なるＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９蛋白質を提供する。典型的には、Ｃａｓ９蛋白質、例えばS. pyogenesからのＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）は、具体的な核酸領域に結合するためには古典的ＮＧＧ ＰＡＭ配列を要求する。古典的（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含有しないヌクレオチド配列に結合する能力を限定し得る。。例えば、非古典的ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９蛋白質はKleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されており；それぞれの内容全体はここで参照によって組み込まれる。
【０２０２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はStaphylococcus aureusからのＣａｓ９蛋白質である（ＳａＣａｓ９）。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９蛋白質は、ヌクレアーゼ活性なＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性型ＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９はアミノ酸配列配列番号３０７を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、配列番号３０７のＮ５７９Ｘ変異、または配列番号９〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、ＸはＮ以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、配列番号３０７のＮ５７９Ａ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９蛋白質、ＳａＣａｓ９ｄ蛋白質、またはＳａＣａｓ９ｎ蛋白質は、非古典的ＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９蛋白質、ＳａＣａｓ９ｄ蛋白質、またはＳａＣａｓ９ｎ蛋白質は、ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９蛋白質は、配列番号３０７のＥ７８１Ｘ、Ｎ９６７Ｘ、またはＲ１０１４Ｘ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９蛋白質は、配列番号３０７のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、またはＲ１０１４Ｈ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９蛋白質は、配列番号３０７のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。これらの変異が、本明細書に提供される他の変異のいずれかと組み合わされてもよいことは理解されるべきである。
【０２０３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９蛋白質は、配列番号３０７〜３０９のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９蛋白質は、配列番号３０７〜３０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９蛋白質は配列番号３０７〜３０９のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
例示のＳａＣａｓ９配列
【数２５−１】
2018537963.tif 000031
【数２５−２】
2018537963.tif 000032
（配列番号３０７）
下線が引かれかつ太字の、配列番号３０７の残基Ｎ５７９は、変異が（例えばＡ５７９へ）導入されることで、ＳａＣａｓ９ニッカーゼが産生されてもよい。
例示のＳａＣａｓ９ｎ配列
【数２６】
2018537963.tif 000033
（配列番号３０８）
配列番号３０８の残基Ｎ５７９は、配列番号３０７のＮ５７９から変異が導入されることでＳａＣａｓ９ニッカーゼが産生され得るが、下線が引かれかつ太字である。
例示のＳａＫＫＨＣａｓ９
【数２７】
2018537963.tif 000034
（配列番号３０９）
配列番号３０９の残基Ａ５７９は、配列番号３０７のＮ５７９から変異が導入されることでＳａＣａｓ９ニッカーゼが産生され得るが、下線が引かれかつ太字である。配列番号３０９の残基Ｋ７８１、Ｋ９６７、およびＨ１０１４は、配列番号３０７のＥ７８１、Ｎ９６７、およびＲ１０１４から変異が導入されることでＳａＫＫＨＣａｓ９が産生され得るが、下線が引かれかつ斜字体である。
【０２０４】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はStreptococcus pyogenesからのＣａｓ９蛋白質である（ＳｐＣａｓ９）。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質はヌクレアーゼ活性なＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性型ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９はアミノ酸配列配列番号９を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号９のＤ１０Ｘ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、ＸはＤ以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号９のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質、ＳｐＣａｓ９ｄ蛋白質、またはＳｐＣａｓ９ｎ蛋白質は、非古典的ＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質、ＳｐＣａｓ９ｄ蛋白質、またはＳｐＣａｓ９ｎ蛋白質は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３５Ｒ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３８Ｘ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｘ、Ｇ１２１８Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異の１以上、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異の１以上、または配列番���１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９蛋白質は、配列番号９のＤ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または配列番号１０〜２６２によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。これらの変異が、本明細書に提供される他の変異のいずれかと組み合わされてもよいことは理解されるべきである。
【０２０５】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９蛋白質は、配列番号９、３１０〜３１３のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは、配列番号９、３１０〜３１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは配列番号９、３１０〜３１３のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
例示のＳｐＣａｓ９
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号９）
例示のＳｐＣａｓ９ｎ
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号３１０）
例示のＳｐＥＱＲ Ｃａｓ９
【数２８】
2018537963.tif 000035
【数２９】
2018537963.tif 000036
（配列番号３１１）
配列番号３１１の残基Ｅ１１３４、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６は、配列番号９のＤ１１３４、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異が導入されることで、ＳｐＥＱＲ Ｃａｓ９が産生され得るが、下線が引かれかつ太字である。
例示のＳｐＶＱＲ Ｃａｓ９
【数３０】
2018537963.tif 000037
【数３１】
2018537963.tif 000038
（配列番号３１２）
配列番号３１２の残基Ｖ１１３４、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６は、配列番号９のＤ１１３４、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異が導入されることでＳｐＶＱＲ Ｃａｓ９が産生され得るが、下線が引かれかつ太字である。
例示のＳｐＶＲＥＲ Ｃａｓ９
【数３２】
2018537963.tif 000039
【数３３】
2018537963.tif 000040
（配列番号３１３）
【０２０６】
配列番号３１３の残基Ｖ１１３４、Ｒ１２１７、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６は、配列番号９のＤ１１３４、Ｇ１２１７、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異が導入されることでＳｐＶＲＥＲ Ｃａｓ９が産生され得るが、下線が引かれかつ太字である。
【０２０７】
ガイドＲＮＡとのＣａｓ９複合体
本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供されるとおりのＣａｓ９蛋白質またはＣａｓ９融合蛋白質を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは約１５〜１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、標的配列に対して相補的である１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列はＤＮＡ配列である。いくつかの態様において、標的配列は哺乳動物のゲノム中の配列である。いくつかの態様において、標的配列はヒトのゲノム中の配列である。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）に直ちには隣接しない。
【０２０８】
本発明の開示のいくつかの側面では、融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質に結合した第１のガイドＲＮＡと、融合蛋白質の第２のＣａｓ９蛋白質と結合した第２のガイドＲＮＡと、を含む複合体が提供される。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡは、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、第１の標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含み、第２のガイドＲＮＡは、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、第２の標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡは異なる。いくつかの態様において、第１のガイドＲＮＡは、第１の標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含み、第２のガイドＲＮＡは、第２の標的配列と相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の連続するヌクレオチドを含む。
【０２０９】
いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は異なる。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は、ＤＮＡの塩基配列である。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は、哺乳動物のゲノム中に存在する。いくつかの態様において、第１の標的配列および第２の標的配列は、ヒトのゲノム中に存在する。いくつかの態様において、第１の標的配列は、第２の標的配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ヌクレオチド中に存在する。いくつかの態様において、第１の標的配列の３’末端は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない。いくつかの態様において、第２の標的配列の３’末端は、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない。
Ｃａｓ９融合蛋白質の使用方法：
【０２１０】
Ｃａｓ９融合蛋白質を用いる方法
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質、融合蛋白質、または複合体を用いる方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの側面は、ＤＮＡ分子を（ａ）本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質または融合蛋白質のいずれか、および少なくとも１つのガイドＲＮＡ；あるいは（ｂ）本明細書において提供される少なくとも１つのｇＲＮＡとのＣａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９融合蛋白質、またはＣａｓ９蛋白質もしくは融合蛋白質複合体と接触させることを含む方法を提供し、ガイドＲＮＡは約１５〜１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）に直ちには隣接しない。いくつかの態様において、標的配列の３’末端はＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に直ちに隣接する。
【０２１１】
いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または異常に関連する配列を含む。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は疾患または異常に関連する点変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９融合蛋白質、または複合体の活性は点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は疾患または異常に関連するＴ→Ｃ点変異を含み、変異体Ｃ塩基の脱アミノ化は、疾患または異常に関連しない配列をもたらす。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は蛋白質をコードし、点変異はコドン中にあり、野生型コドンと比較して変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの態様において、変異体Ｃの脱アミノ化は、変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの態様において、変異体Ｃの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの態様において、接触は、対象に対してインビボである。いくつかの態様において、対象は疾患または異常を有するか、またはそれと診断されている。いくつかの態様において、疾患または異常は、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽腫（ＮＢ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、ＨＩＶ、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）、変異体ＰＩ３ＫＣＡ蛋白質、変異体ＣＴＮＮＢ１蛋白質、変異体ＨＲＡＳ蛋白質、または変異体ｐ５３蛋白質に関連する新生物疾患である。
【０２１２】
いくつかの態様は、本明細書において提供されるＣａｓ９ ＤＮＡ編集融合蛋白質を用いるための方法を提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、標的核酸塩基、例えばＣ残基を脱アミノ化することによって核酸に点変異を導入するために用いられる。いくつかの態様において、標的核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝子欠損の修正、例えば遺伝子産物の機能喪失に至る点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、遺伝子欠損は、疾患または異常、例えばリソソーム蓄積異常または例えばＩ型糖尿病などの代謝疾患に関連する。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、疾患または異常に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子またはアレルに不活性化点変異を導入するために用いられる。例えば、いくつかの態様においては、不活性化点変異を癌遺伝子に導入するために（例えば、増殖性疾患の処置に）Ｃａｓ９ ＤＮＡ編集融合蛋白質を使用する方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様においては、不活性化変異はコード配列中に未成熟ストップコドンを創り得、これが、短縮された遺伝子産物、例えば全長蛋白質の機能を欠く短縮された蛋白質の発現をもたらす。
【０２１３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の目的は、ゲノム編集によって、機能不全の遺伝子の機能を回復させることである。本明細書において提供されるＣａｓ９デアミナーゼ融合蛋白質は、例えばヒト細胞培養物の疾患関連変異を修正することによって、遺伝子編集に基づくヒト治療についてインビトロでバリデーションされ得る。本明細書において提供される融合蛋白質、例えばＣａｓ９ドメインと核酸デアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質が、いずれかの単一のＴ→ＣまたはＡ→Ｇ点変異を修正するために用いられ得るということは当業者によって理解されるであろう。第１のケースにおいては、変異体ＣからＵに戻る脱アミノ化は変異を修正し、後者のケースにおいては、変異体Ｇと塩基対形成しているＣの脱アミノ化、次に複製の１ラウンドが変異を修正する。
【０２１４】
提供される融合蛋白質によってインビトロまたはインビボで修正され得る例示的な疾患に関係する変異は、ＰＩ３ＫＣＡ蛋白質のＨ１０４７Ｒ（Ａ３１４０Ｇ）多型である。ホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファサブユニット（ＰＩ３ＫＣＡ）蛋白質は、ホスファチジルイノシトールのイノシトール環の３−ＯＨ基をリン酸化するために働く。ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子は多くの異なる癌腫において変異していることが見出されており、それゆえに、これは強力な癌遺伝子であると見なされる（５０）。事実、Ａ３１４０Ｇ変異は例えばＨＣＴ１１６、ＳＫＯＶ３、およびＴ４７Ｄ細胞株などの数個のＮＣＩ−６０癌細胞株に存在しており、これらはAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からたやすく利用可能である（５１）。
【０２１５】
いくつかの態様において、修正されるべき変異をはらむ細胞、例えば点変異、例えばＰＩ３ＫＣＡ蛋白質にＨ１０４７Ｒ置換をもたらすＰＩ３ＫＣＡ遺伝子のエキソン２０のＡ３１４０Ｇ点変異をはらむ細胞は、Ｃａｓ９デアミナーゼ融合蛋白質、およびコードするＰＩ３ＫＣＡ遺伝子中のそれぞれの変異部位に融合蛋白質をターゲティングする適切に設計されたｓｇＲＮＡをコードする発現コンストラクトと接触させられる。コントロール実験が行われ得、ｓｇＲＮＡは、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子内にある非Ｃ残基に融合酵素をターゲティングするように設計される。処置された細胞のゲノムＤＮＡが抽出され、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子の関係する配列がＰＣＲ増幅およびシーケンシングされて、融合蛋白質の活性をヒト細胞培養物によって評価し得る。
【０２１６】
ＰＩ３ＫＣＡの点変異を修正する例は例解の目的で提供されており、本開示を限定することを意味されていないということは理解されるであろう。当業者は、本開示のＤＮＡ編集融合蛋白質が、他の癌、および他の増殖性疾患を包含する癌以外の疾患に関連する他の点変異および変異を修正するために用いられ得るということを理解するであろう。
【０２１７】
疾患関連遺伝子およびアレルの点変異の上首尾な修正は、治療および基礎研究に用途を有する遺伝子修正のための新たな戦略を開く。Ｃａｓ９とデアミナーゼ酵素またはドメインとの開示される融合体のような、部位特異的な一塩基改変システムは、「逆」遺伝子治療にもまた用途を有し、ある種の遺伝子機能が故意に抑圧または喪失される。それらのケースにおいて、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｇｌｎ（ＣＡＡおよびＣＡＧ）、またはＡｒｇ（ＣＧＡ）残基を未成熟ストップコドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）に部位特異的変異させることは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで蛋白質機能を喪失させるために用いられ得る。
【０２１８】
本開示は、本明細書において提供されるＣａｓ９ ＤＮＡ編集融合蛋白質によって修正され得る点変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患と診断された、対象の処置のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様においては、かかる疾患、例えば上に記載されているＰＩ３ＫＣＡ点変異に関連する癌を有する対象に、点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入するＣａｓ９デアミナーゼ融合蛋白質の有効量を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、疾患は増殖性疾患である。いくつかの態様において、疾患は遺伝子疾患である。いくつかの態様において、疾患は新生物疾患である。いくつかの態様において、疾患は代謝疾患である。いくつかの態様において、疾患はリソソーム蓄積症である。点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入することによって処置され得る他の疾患は、当業者には公知であろう。本開示はこの点で限定されない。
【０２１９】
本開示は、追加の疾患または異常、例えば、デアミナーゼによって媒介される遺伝子編集によって修正され得る点変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または異常の処置のための方法を提供する。いくつかのかかる疾患は本明細書に記載されており、本明細書において提供される戦略および融合蛋白質によって処置され得る追加の好適な疾患は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。例示的な好適な疾患および異常が下に挙げられている。それぞれの配列中の特定の位置または残基の付番は、具体的な蛋白質および用いられる付番スキームに依存するということは理解されるであろう。付番は、例えば成熟蛋白質の前駆体および成熟蛋白質それ自体では異なり得、種間の配列の違いは付番に影響し得る。当業者は、当分野において周知の方法によって、例えば配列アラインメントおよび相同な残基の決定によって、いずれかの相同な蛋白質およびそれぞれのコードする核酸中のそれぞれの残基を同定する能力があるであろう。例示的な好適な疾患および異常は、限定なしに、嚢胞性線維症（例えば、Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658；およびWu et. al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662参照。これらのいずれも、遺伝子欠損を修正するためにデアミナーゼ融合蛋白質を用いてはいない）；フェニルケトン尿症−例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の位置８３５（マウス）もしくは２４０（ヒト）または相同な残基におけるフェニルアラニンからセリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばMcDonald et al., Genomics. 1997; 39:402-405を参照；ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）−例えば、血小板糖糖蛋白質ＩＸの位置５５もしくは相同な残基におけるフェニルアラニンからセリンへの変異、または残基２４もしくは相同な残基におけるシステインからアルギニン（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばNoris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320およびAli et al., Hematol. 2014; 93: 381-384を参照；表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）−例えば、ケラチン１の位置１６０または１６１（開始メチオニンをカウントする場合）または相同な残基におけるロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばChipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828を参照、www.uniprot.orgのUNIPROTデータベースのアクセッション番号P04264もまた参照；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）−例えば、α１−アンチトリプシンのプロセシングされた形態の位置５４もしくは５５（開始メチオニンをカウントする場合）または相同な残基、あるいは非プロセシング形態の残基７８もしくは相同な残基におけるロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばPoller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743を参照、UNIPROTデータベースのアクセッション番号P01011もまた参照；シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型−例えば、ＦＩＧ４の位置４１または相同な残基におけるイソロイシンからトレオニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばLenk et al, PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104を参照；神経芽腫（ＮＢ）−例えば、カスパーゼ９の位置１９７または相同な残基におけるロイシンからプロリンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばKundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234を参照；フォン・ヴィレブ���ンド病（ｖＷＤ）−例えば、フォン・ヴィレブランド因子のプロセシングされた形態の位置５０９もしくは相同な残基、またはフォン・ヴィレブラン因子の非プロセシング形態の位置１２７２もしくは相同な残基におけるシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばLavergne et al., Br. J. Haematol. 1992；82: 66-72を参照、UNIPROTデータベースのアクセッション番号P04275もまた参照；先天性ミオトニー−例えば、筋肉型塩化物イオンチャネル遺伝子ＣＬＣＮ１の位置２７７または相同な残基におけるシステインからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばWeinberger et al., The J. of Physiology. 2012; 590: 3449-3464を参照；遺伝性腎アミロイドーシス−例えば、アポリポ蛋白質ＡＩＩのプロセシングされた形態の位置７８もしくは相同な残基、または非プロセシング形態の位置１０１もしくは相同な残基におけるストップコドンからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）−例えばYazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16を参照；拡張型心筋症（ＤＣＭ）−例えば、ＦＯＸＤ４遺伝子の位置１４８または相同な残基におけるトリプトファンからアルギニンへの変異（Ｔ＞Ｃ変異）、例えばMinoretti et. al., Int. J. of Mol. Med. 2007; 19: 369-372を参照；遺伝性リンパ浮腫−例えば、ＶＥＧＦＲ３チロシンキナーゼの位置１０３５または相同な残基におけるヒスチジンからアルギニンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）、例えばIrrthum et al, Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301を参照；家族性アルツハイマー病−例えば、プレセニリン１の位置１４３または相同な残基におけるイソロイシンからバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）、例えばGallo et. al., J. Alzheimer’s disease. 2011; 25: 425-431を参照；プリオン病−例えば、プリオン蛋白質の位置１２９または相同な残基におけるメチオニンからバリンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−例えばLewis et. al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449を参照；慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）−例えば、クリオピリンの位置５７０または相同な残基におけるチロシンからシステインへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−例えばFujisawa et. al. Blood. 2007; 109: 2903-2911を参照；ならびにデスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）−例えば、αβクリスタリンの位置１２０または相同な残基におけるアルギニンからグリシンへの変異（Ａ＞Ｇ変異）−例えばKumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141を参照、を包含する。全ての参照およびデータベースエントリーの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
本発明の開示では、病原性のＴ＞ＣまたはＡ＞Ｇ変異を含む遺伝子のリストが提供され、それらは本発明で提供されるＣａｓ９融合蛋白質のいずれかを用いて修正することができる。本明細書においては、それらの遺伝子の名称、それらの各々の配列番号、それらの遺伝子のＩＤ、および変異部位に隣接する配列番号を示す。表４および５を参照。いかなる特定の理論にも拘束されないが、表４および５に示す変異は、古典的ＰＡＭ配列を欠く標的配列と結合することができる、本発明で提供されるＣａｓ９融合を使用して、修正できる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９−デアミナーゼ融合蛋白質は、非古典的ＰＡＭに対する活性を示し、そのため、表４および５に列挙される全ての病原性Ｔ＞ＣまたはＡ＞Ｇ変異（配列番号６７４〜２５３９および３１４４〜５０８３）をそれぞれ修正できる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９−デアミナーゼ融合蛋白質は、古典的ＰＡＭを認識し、そのため、古典的ＰＡＭ（例えば５’−ＮＧＧ−３’）を有する病原性Ｔ＞ＣまたはＡ＞Ｇ変異を修正できる。当然ながら、当業者であれば、ＲＮＡ（例えばｇＲＮＡ）を設計して、本明細書で提供されるＣａｓ９蛋白質または融合蛋白質のいずれかを用いて、いずれかの標的配列をターゲッティングし、本明細書に示されるいずれかの変異、例えば表４および５に示す変異を修正する方法を理解するであろう。本明細書において開示されるＣａｓ９／エフェクタードメイン融合蛋白質を、標的部位、例えば編集されるべき点変異を含む部位にターゲティングするためには、典型的には、Ｃａｓ９／エフェクタードメイン融合蛋白質をガイドＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡと一緒に共発現することが必要であるということは当業者には明らかであろう。本明細書の他所により詳細に説明されているように、典型的には、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９結合を許すｔｒａｃｒＲＮＡフレームワークと、配列特異性をＣａｓ９／エフェクタードメイン融合蛋白質に付与するガイド配列とを含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは構造５’−［ガイド配列］−guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu−３’（配列番号２８５）を含み、ガイド配列は、標的配列に対して相補的である配列を含む。典型的には、ガイド配列は２０ヌクレオチドの長さである。Ｃａｓ９／エフェクタードメイン融合蛋白質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための好適なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。典型的には、かかる好適なガイドＲＮＡ配列は、編集されるべき標的ヌクレオチドの５０ヌクレオチド以内上流または下流の核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を特定の標的配列にターゲティングするために好適ないくつかの例示的なガイドＲＮＡ配列が、下で提供されている。
【０２２１】
キット、ベクター、細胞
本開示のいくつかの側面は、（ａ）本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質またはＣａｓ９融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列と；（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターとを含む、核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、さらに、ガイドＲＮＡバックボーンをコードする発現コンストラクトを含み、コンストラクトは、ガイドＲＮＡバックボーン中への標的配列と同一または相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む。
【０２２２】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のＣａｓ９蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
【０２２３】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるＣａｓ９蛋白質、融合蛋白質、核酸分子、ならびに／またはベクターを含む細胞を提供する。
【０２２４】
本明細書のレポーターシステムの例示的な態様の記載は、例解の目的でのみ提供されており、限定することを意味されていない。追加のレポーターシステム、例えば上で詳細に記載されている例示的なシステムのバリエーションもまた、本開示によって包摂される。
【０２２５】
例１：ＰＡＭ配列抑制のないＣａｓ９のＰＡＣＥ進化
ＰＡＭライブラリーの構築
４つの異なるプロトスペーサー標的配列を合成した：
Doench 1  ５’−AAGAGAGACAGTACATGCCC−３’（配列番号２８６）、Doench 2  ５’−GGAGCCCACCGAGTACCTGG−３’（配列番号２８７）、G7’  ５’−AGTCTCCTCAGCAAAACGAA−３’（配列番号２８８）、およびVEGF Target 2  ５’−GACCCCCTCCACCCCGCCTC−３’（配列番号２８９）。プロトスペーサー標的配列ごとに、３’−ＮＮＮ ＰＡＭライブラリーを構築した。古典的ＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧ−３’であり（例えば、［Doench 1］−［古典的ＰＡＭ］標的配列は、５’―［AAGAGAGACAGTACATGCCC］−［ＮＧＧ］−３’（配列番号２９１）であり、一方、各プロトスペーサー標的配列のための３’−ＮＮＮ ＰＡＭライブラリーは、完全にランダムなＰＡＭ配列を含むものであった（例えば、Doench 1  ５’−AAGAGAGACAGTACATGCCCNNN−３’（配列番号２９０）、Ｎはいずれかのヌクレオチドを表す）。ゆえにＮＮＮ ＰＡＭライブラリーは、それぞれのプロトスペーサー標的配列の３’末端において、ＰＡＭ配列のあらゆる可能な組み合わせが含まれるものであった。
【０２２６】
ω−ｄＣａｓ９ルシフェラーゼアッセイにおける、ＰＡＭライブラリーに対するＣａｓ９の活性試験
細菌ルシフェラーゼ活性化アッセイを用いてＣａｓ９活性を試験した。当該アッセイでは、ｄＣａｓ９と大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（ｒｐｏＺ）のωサブユニットとの融合蛋白質（例えばBikard et al., Nucleic Acids Res. 2013 Aug; 41(15): 7429-7437を参照）が、ｓｇＲＮＡにより標的とされうる配列を含む弱いプロモーターの制御下の核酸によりコードされるルシフェラーゼの産生を促進する。各ＰＡＭライブラリーを、かかる弱いプロモーターを含むプラスミドにクローニングし、そこでは、［標的配列］―［ＰＡＭライブラリー］核酸配列は、ｓｇＲＮＡにより標的とされうる配列として機能する。プロモーターにＰＡＭライブラリーをクローニングし、古典的ＰＡＭおよびランダムＰＡＭライブラリーの両方について、４つすべてのプロトスペーサー標的に対するω−ｄＣａｓ９アッセイを実施した。図１は、ＰＡＭライブラリーに対する野生型のS. pyogenesのＣａｓ９の活性を示す。
【０２２７】
ＰＡＭライブラリーにおけるＣａｓ９の進化
S. pyogenesのｄＣａｓ９を、ＲＮＡポリメラーゼのωユニットに融合させた。得られるω−ｄＣａｓ９融合蛋白質を、ｐＩＩＩ（伝染性ファージ粒子の生成に必要な遺伝子）をコードする遺伝子の機能性バージョンを除き全てのＭ１３ファージゲノムを含む、Ｍ１３ファージベースの選抜ファージミド（ＳＰ）にクローニングした。ｐＩＩＩをコードするファージ遺伝子を、ω−ｄＣａｓ９によって転写が活性化されるプロモーターの制御下、別々のプラスミド（アクセサリープラスミド、ＡＰ）に挿入した。ＰＡＭライブラリーを、アクセサリープラスミドのプロモーター領域にクローニングした。ＰＡＭ抑制のないＣａｓ９蛋白質の定方向進化のために使用する宿主細胞に、アクセサリープラスミドを導入した。それにより、選抜ファージによる感染の際、所与の宿主細胞によって産生される伝染性ファージ粒子の量は、選抜ファージによってコードされ、アクセサリープラスミドのプロモーターで制御される、ｐＩＩＩ蛋白質の産生のために必要とされるω−ｄＣａｓ９融合蛋白質の活性に依存する。ゆえに、アクセサリープラスミドは、異なる非古典的ＰＡＭ配列に対する活性が増加したω−ｄＣａｓ９融合蛋白質変異体をコードするそれらの選抜ファージに選択有利性を与える。
【０２２８】
ラグーンを付与し、アクセサリープラスミドを有する宿主細胞のフローをラグーンに沿って発生させた。宿主細胞を選抜ファージミドと接触させ、その結果、ラグーンに沿った宿主細胞のフロー内に拡散した選抜ファージの集団が得られた。ファージ感染した宿主細胞をラグーンから取り除き、新しい、感染していない宿主細胞をラグーン内に所定の速度で入れ、その結果、ラグーン内に残存する宿主細胞は、平均時間において、宿主細胞の細胞分割間の平均時間より短いが、Ｍ１３ファージの平均寿命時間よりも長かった。
【０２２９】
定方向進化実験の間にＣａｓ９変異体を作製するため、ラグーン内の宿主細胞を、変異率が上昇する条件下でインキュベートした。宿主細胞は変異導入プラスミド（ＭＰ）を有しており、それは変異導入率を上昇させ、それにより、ファージの寿命の間に、選抜ファージミドによりコードされるω−ｄＣａｓ９融合蛋白質に変異が導入された。ラグーンに沿った宿主細胞のフロー速度によって、平均時間において、ラグーンに残留する宿主細胞が宿主細胞の分割間の平均的時間より短くなるため、ラグーン内の宿主細胞は、それらのゲノムにおける、またはアクセサリープラスミドにおける、変異導入プラスミドによって付与される変異導入率の上昇に由来する変異を蓄積することができない。しかしながら、選抜ファージは、宿主細胞のフロー中でラグーンにおいて複製し、ゆえに、時間とともに変異を蓄積し、その結果、新規な、進化したω−ｄＣａｓ９融合蛋白質変異体の作製をもたらす。
【０２３０】
これらの進化したω−ｄＣａｓ９融合蛋白質変異体のいずれかが、ＰＡＭライブラリーを含むアクセサリープラスミドに対する活性を増加させる変異を含む場合、これが直接、それぞれのω−ｄＣａｓ９融合蛋白質変異体をコードする選抜ファージに感染した宿主細胞によるｐＩＩＩのさらなる産生へと移行する。ｐＩＩＩの産生増加は次に、より感染性の高い選抜ファージ粒子の作製をもたらし、それは時間とともに、かかる変異を有さない選抜ファージに対して、かかる有利な変異を有する変異体選抜ファージに対して競争的優位性をもたらす。所定の時間後、アクセサリープラスミドによって加えられる選抜圧の付与は、有利な変異を取得した選抜ファージを、宿主細胞のフロー中における複製が可能という意味で優勢種に位置づけ、一方、変異のない、または、不利な変異を有する選抜ファージは、ラグーンから洗浄除去される。
【０２３１】
ＰＡＭライブラリーに対するω−ｄＣａｓ９融合蛋白質の活性が、実験の始めでは非常に低かったため、ＰＡＭライブラリーを含むアクセサリープラスミドを有する宿主細胞における選抜ファージミドの終夜にわたる複数回の増殖を行い、非古典的ＰＡＭ配列に対する活性が増加したＣａｓ９変異体を進化させた。定方向進化実験終了後、選抜ファージの進化した集団をラグーンから分離し、代表的なクローンをいくつかアッセイに供し、有利な変異を有するＣａｓ９変異体を検出した。観察される全ての変異が有利な表現型を与えるものであるが、複数のクローンによって、または全てのクローンによって共有される変異は、特に興味深い。
【０２３２】
Ｃａｓ９ ＰＡＣＥからの変異
上記のＰＡＭライブラリーのアクセサリープラスミドを使用した定方向進化実験から、多くの選抜ファージのクローンを単離した。いくつかの例示的なクローンのＣａｓ９のアミノ酸配列において同定された変異を、下記の表１に示す（残基の付番は配列番号９に従う）：
【表１】
2018537963.tif 000041
【０２３３】
クローン１〜４を、上記のω−ｄＣａｓ９ルシフェラーゼ活性化アッセイにおいて試験した。ＰＡＭライブラリー全体を試験したとき、様々なクローンがルシフェラーゼの発現上昇を示した（図２−  定方向進化の後のＰＡＭライブラリーに対する例示的な進化型クローンのＣａｓ９活性）。
【０２３４】
非古典的ＰＡＭ配列に対するＣａｓ９活性の改良
非古典的ＰＡＭを有する標的配列に対する進化型Ｃａｓ９蛋白質の活性をさらに詳細に評価した。クローン４（Ｉ１２２、Ｄ１８２およびＥ１２１９Ｖ変異を有する）の相対活性を、様々な［Doench 2  ５’−GGAGCCCACCGAGTACCTGG−３’、配列番号２８７］−［ＰＡＭ］標的配列に対して、ω−ｄＣａｓ９ルシフェラーゼ活性化アッセイで試験し、野生型ｄＣａｓ９の活性と比較した。
【０２３５】
非古典的ＰＡＭ配列に対するＣａｓ９活性の改良
非古典的ＰＡＭを有する標的配列に対する進化型Ｃａｓ９蛋白質の活性をさらに詳細に評価した。クローン４（Ｉ１２２、Ｄ１８２およびＥ１２１９Ｖ変異を有する）の相対活性を、様々な［Doench 2  ５’−GGAGCCCACCGAGTACCTGG−３’、配列番号２８７］−［ＰＡＭ］標的配列に対して、ω−ｄＣａｓ９ルシフェラーゼ活性化アッセイで試験し、野生型ｄＣａｓ９の活性と比較した。データを表２に示す。
【表２】
2018537963.tif 000042
【０２３６】
例２：いかなるＰＡＭ配列抑制のないＣａｓ９のＰＡＣＥ進化
ＮＮＮ−ＰＡＭライブラリーに対するω−ｄＣａｓ９融合蛋白質の活性が非常に低かったため、ＰＡＣＥ実験の第２ラウンドを実施した。本ラウンドでは、ω−ｄＣａｓ９融合蛋白質集団の多様化の第一フェーズを選択圧の非存在下、ω−ｄＣａｓ９融合蛋白質活性に依存しないｐＩＩＩの給源を供給することにより実施した。最初の多様化ステージにより、選択圧が実験全般にわたって適用されるＰＡＣＥ実験においては得られない変異が生じた。
【０２３７】
Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を有する、配列番号８として示されるｄＣａｓ９配列を有するω−ｄＣａｓ９融合蛋白質を有する選抜ファージを、１０３０宿主細胞において、ＭＰ６変異生成プラスミドと共に、アラビノースの存在下で増殖させ、ω−ｄＣａｓ９融合蛋白質変異体のライブラリーをコードする変異選抜ファージのライブラリーを構築した。宿主細胞の個々のプラスミドから、この最初の多様化ステージの間、ＰＩＩＩを発現させた。終夜（１２時間）の多様化後、弱いプロモーター制御下でクローニングされたＮＮＮ ＰＡＭライブラリーを含む、ガイドＲＮＡの標的配列としてのアクセサリープラスミドと、変異導入プラスミドとを有する１０３０宿主細胞を対数増殖させ、ラグーンに沿った宿主細胞のフローを行うための宿主細胞の給源として用いた。ラグーン内の細胞を、終夜培養から得た多様化された選抜ファージにより感染させた。ラグーン内の宿主細胞をアラビノースと接触させ、変異導入プラスミドからの変異誘導性遺伝子の発現レベルを高い状態に維持した。
【０２３８】
最初のファージ力価は、約１０８ｐｆｕ／ｍＬであった。上記のように弱いプロモーター制御下でｐＩＩＩを発現させるアクセサリープラスミドにクローニングした４つのＮＮＮ−ＰＡＭライブラリー（［Doench 1］−［ＮＮＮ−ＰＡＭ］、［Doench 2］−［ＮＮＮ−ＰＡＭ］、［G7］−［ＮＮＮ−ＰＡＭ］および［ＶＥＧＦ標的］−［ＮＮＮ−ＰＡＭ］）の各々においてＰＡＣＥ実験を実施した。ＰＡＣＥ実験の間、ファージ力価をモニターした。徐々に１０４ｐｆｕ／ｍＬへのファージ力価の低下が観察された。その時点でファージ集団をラグーンから単離し、別のｐＩＩＩの給源（ｐｓｐ誘導型ｐＩＩＩ）を含む２２０８宿主細胞内で増殖させた。この低いストリンジェンシーによる増殖期間の後、新しいラグーンにおけるｐＩＩＩの唯一の給源としてのアクセサリープラスミドを有する新しい宿主細胞に、上清の１：１００の希釈液を添加し、ＰＡＣＥ実験を継続させた。ファージ力価の低下は、２２０８細胞におけるこの低ストリンジェンシー培養後は観察されなかった。
【０２３９】
一実験例として、ＰＡＣＥ実験を７２時間実施した。その時間の後、２４個の生存クローンをラグーンから単離し、シークエンシングし、解析した。同定された変異には、Ａ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ（配列番号９のアミノ酸の付番に従う）が含まれていた。他の実験例において、１５日間の培養の後、生存クローンを単離した。同定されたｄＶａｓ９変異体の活性を、ω−ｄＣａｓ９ルシフェラーゼアッセイにおいて解析した。非古典的ＰＡＭ標的配列に対する最高のω−ｄＣａｓ９融合蛋白質活性を有するクローンは、以下の変異を有していた：Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＴ１３２９。
【０２４０】
Ｃａｓ９による、哺乳動物におけるＧＦＰの活性化
野生型ｄＣａｓ９（配列番号９）および進化型Ｃａｓ９の両クローンを、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞におけるｄＣａｓ９−ＧＦＰアッセイにおいて試験した。細胞を、［ｇＲＮＡ標的配列］−［ＰＡＭ］配列を含む、弱いプロモーターの制御によりＧＦＰコード配列を発現させるレポーター構築物と接触させた。転写アクチベーターＶＰ６４−ｐ６５−Ｒｔａ（ＶＰＲ）に結合させたｄＣａｓ９（野生型およびＰＡＣＥ変異体）の融合蛋白質を作製し、ＨＥＫ２９３細胞のＧＦＰレポーターを活性化させるそれらの能力について、各種のｄＣａｓ９−ＶＰＲ変異体を試験した。
【０２４１】
以下の４つのプラスミドそれぞれによってＨｅｋ２９３Ｔをトランスフェクションした：ｄＣａｓ９−ＶＰＲ発現プラスミド、ＧＦＰレポータープラスミドのｇＲＮＡ標的配列を標的とするｓｇＲＮＡを発現するプラスミド、ＧＦＰレポータープラスミド、およびｉＲＦＰトランスフェクションコントロール。ある実験では、ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＡＡ ＰＡＭを含むＧＦＰレポーターと接触させ、他の実験では、ＨＥＫ２９３細胞を、ＮＮＮ ＰＡＭライブラリーを含むレポータープラスミドの集団と接触させた。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ＧＦＰ発現細胞をBD LSR-FORTESSAセルアナライザーを用いて定量化した。
【０２４２】
図３−  Ｃａｓ９による哺乳動物におけるＧＦＰ活性化
野生型Ｃａｓ９と比較し、進化型Ｃａｓ９ｓは、ＴＡＡ ＰＡＭ（上記のネガティブコントロール細胞０．６０パーセントに対し、２１．０８パーセント）およびＮＮＮ ＰＡＭライブラリー（上記のネガティブコントロール細胞の３．３８パーセントに対し、２２．７６パーセント）に対して非常に高い活性を示した。
【０２４３】
非古典的ＰＡＭを有する標的配列に対する進化型Ｃａｓ９の切断活性
ＰＡＣＥ変異がＰＡＭ抑制のないＣａｓ９活性を普遍的に付与することを立証するため、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異はないが、様々なＰＡＣＥ変異を有する配列に基づいてヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９蛋白質を作製した。進化型Ｃａｓ９変異体をＣａｓ９ ＧＦＰアッセイにおいて試験し、進化型Ｃａｓ９蛋白質変異体の、非古典的ＰＡＭを有する配列を標的とするガイドＲＮＡを使用し、ＨＥＫ２９３細胞のゲノムに組み込まれたｅｍＧＦＰ遺伝子を標的として不活性化する能力を評価した。観察の結果、野生型ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９（配列番号９）と接触したときは、細胞の６．４５パーセントがＧＦＰ発現の低下を示したが、進化型Ｃａｓ９（Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＴ１３２９）と接触した細胞では、５４．５５パーセントがＧＦＰ発現の低下を示した。
【０２４４】
例３：ＰＡＭ抑制のないＣａｓ９変異体
非古典的ＰＡＭ配列にＣａｓ９活性を与える有利な変異を、S. pyogenesの野生型配列にマップ化した。その例示的なＣａｓ９配列（配列番号９の各アミノ酸残基に従い、アスタリスク表示のＤ１０およびＨ８４０残基を有するS. pyogenesのＣａｓ９）を下記に示す。配列番号９のＤ１０およびＨ８４０残基を変異させることにより、ヌクレアーゼ不活性なＣａｓ９（例えばＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）の作製、またはニッカーゼＣａｓ９（例えばＤ１０ＡとＨ８４０を有するか、またはＤ１０とＨ８４０Ａを有する）の作製が可能となる。ＨＮＨドメイン（太字および下線部）およびＲｕｖＣドメイン（囲い文字）を示す。様々なＰＡＣＥ実験から単離されたクローンに存在する変異残基として、アミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９を、各アミノ酸残基に基づき、アスタリスクで識別する。
【数３４】
2018537963.tif 000043
（配列番号９）
【０２４５】
非古典的ＰＡＭ配列にＣａｓ９活性を付与する有利な変異を、さらなる例示的な野生型Ｃａｓ９配列にマップ化した。ＨＮＨドメイン（太字および下線部）およびＲｕｖＣドメイン（囲い）を示す。配列番号９内の変異残基と相同な残基として、アミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９を、各アミノ酸残基に基づき、アスタリスクで識別する。さらに、ｄＣａｓ９蛋白質変異体において変異するアミノ酸残基１０および８４０も、アスタリスクにより識別する。
【数３５】
2018537963.tif 000044
（配列番号２９７）
【数３６】
2018537963.tif 000045
（配列番号２９８）
＞gi 504540549｜ref｜014727651.1｜ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド付きエンドヌクレアーゼ(type II CRISPR RNA-guided endonuclease)Ｃａｓ９［Streptococcus thermophilus］
【数３７】
2018537963.tif 000046
（配列番号２６０）
＞gi 924443546｜Staphylococcus Aureus Ｃａｓ９
【数３８】
2018537963.tif 000047
（配列番号２６１）
【０２４６】
本発明の開示は、本明細書に記載の、アスタリスクにより識別されるアミノ酸残基の１以上が変異したＣａｓ９変異体の提供に関する。いくつかの態様において、Ｄ１０およびＨ８４０残基を例えばアラニン残基に変異させ、さらにＣａｓ９変異体は本願明細書に示されるアスタリスク表示のアミノ酸残基の１以上を変異させる。いくつかの態様において、Ｄ１０残基を例えばアラニン残基に変異させ、さらにＣａｓ９変異体は本明細書に示されるアスタリスク表示のアミノ酸残基の１以上を変異させる。
【０２４７】
種々の種からのいくつものＣａｓ９配列をアラインメントして、対応する相同なアミノ酸残基が他のＣａｓ９蛋白質中に同定され、相同なアミノ酸残基の対応する変異を有するＣａｓ９バリアントの生成を許し得るかどうかを決定した。アラインメントはNCBI Constraint-based Multiple Alignment Tool（COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにおいてアクセス可能）を用いて、次のパラメータによって実施した。アラインメントパラメータ：Gap Penalties -11,
-1；End-Gap Penalties -5、-1。CDD Parameters：Use RPS BLAST  オン；Blast E-value 0.003；Find Conserved columns and Recompute  オン。Query Clustering Parameters：Use query clusters  オン；Word Size 4；Max cluster distance 0.8；Alphabet Regular。
【０２４８】
４つのＣａｓ９配列の例示的なアラインメントを下に提供する。アラインメント中のＣａｓ９配列は、配列１（Ｓ１）：配列番号１０｜WP_010922251｜gi 499224711｜ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド付きエンドヌクレアーゼＣａｓ９［Streptococcus pyogenes］；配列２（Ｓ２）：配列番号１１｜WP_039695303｜gi 746743737｜ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド付きエンドヌクレアーゼＣａｓ９［Streptococcus gallolyticus］；配列３（Ｓ３）：配列番号１２｜WP_045635197｜gi 782887988｜ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイド付きエンドヌクレアーゼＣａｓ９［Streptococcus mitis］；配列４（Ｓ４）：配列番号１３｜5AXW_A｜gi 924443546｜Staphylococcus aureus Ｃａｓ９である。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびＲｕｖＣドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。Ｓ１中のアミノ酸残基１０、１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、８４０、１２１９、および１３２９とアラインメントされた配列中の相同なアミノ酸とは、それぞれのアミノ酸残基の次のアスタリスクによって同定されている。
【数３９】
2018537963.tif 000048
【数４０】
2018537963.tif 000049
【数４１】
2018537963.tif 000050
【０２４９】
アラインメントは、当分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを用いて、参照配列または参照残基とアラインメントするアミノ酸配列または残基を同定することによって、参照Ｃａｓ９アミノ酸配列またはアミノ酸残基に対して相同であるアミノ酸配列およびアミノ酸残基が、異なる種からのＣａｓ９配列を包含するがこれに限定されないＣａｓ９配列バリアントから同定され得るということを実証している。本開示は、配列番号９中のアスタリスクによって同定されているアミノ酸残基の１以上（例えば、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４）が本明細書に記載されるように変異した、Ｃａｓ９バリアントを提供する。配列番号９においてアスタリスクによって同定されている残基に対応する配列番号９以外のＣａｓ９配列の残基は、本明細書において「相同な」または「対応する」残基と言われる。かかる相同な残基は、例えば上に記載されているように配列アラインメントによって、参照配列または残基とアラインメントする配列または残基を同定することによって同定され得る。類似して、本明細書における配列番号９中の同定された変異、例えば配列番号９中の残基１０、１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、８４０、１２１９、および１３２９の変異に対応する配列番号９以外のＣａｓ９配列の変異は、本明細書において「相同な」または「対応する」変異と言われる。例えば、上の４つのアラインメントされた配列について、Ｓ１に対応する変異は、Ｓ２ではＤ１０Ａ、Ｓ３ではＤ９Ａ、Ｓ４ではＤ１３Ａであり；Ｓ１のＨ８４０Ａに対応する変異は、Ｓ２ではＨ８５０Ａ、Ｓ３ではＨ８４２Ａ、Ｓ４ではＨ５６０であり；Ｓ１のＸ１２１９に対応する変異は、Ｓ２ではＸ１２２８Ｖ、Ｓ３ではＸ１２２６、Ｓ４ではＸ９０３Ｖ等である。
【０２５０】
異なる種からの合計で２５０個のＣａｓ９配列（配列番号１０〜２６２）を、上で概述されている同じアルゴリズムおよびアラインメントパラメータを用いてアラインメントした。残基１０、１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、８４０、１２１９、および１３２９に対して相同なアミノ酸残基を、上で概述されている同じ様式で同定した。アラインメントは下に提供されている。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびＲｕｖＣドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。配列番号９のアミノ酸残基１０、１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、８４０、１２１９、および１３２９に対応する残基はアラインメント中の配列番号１０において枠囲みされており、アラインメントされた配列中の対応するアミノ酸残基の同定を許す。
【０２５１】
本発明においては、配列番号９のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１，２１９および１，３２９と相同なアミノ酸残基の１以上の変異を有するＣａｓ９変異体が提供される。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９変異体は、ヌクレアーゼ不活性なｄＣａｓ９となる配列番号９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異に対応する変異と、配列番号９のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９と相同なアミノ酸残基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは、少なくとも７つの変異と、を含む。
【０２５２】
本発明においては、配列番号９のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９と相同なアミノ酸残基の１以上の変異を有するＣａｓ９変異体が提供される。いくつかの態様において、本発明で提供されるＣａｓ９変異体は、非標的鎖にはニック入れをするが標的鎖にはニック入れをしない、部分的にヌクレアーゼ不活性なｄＣａｓ９となる配列番号９のＤ１０Ａ変異に対応する変異と、配列番号９のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、１２１９および１３２９と相同なアミノ酸残基の少なくとも１つか、少なくとも２つか、少なくとも３つか、少なくとも４つか、少なくとも５つか、少なくとも６つか、少なくとも７つの変異を含む。
【数４２】
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【数４３】
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【数４４】
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【数４５】
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【数４６】
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【数４７】
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【数４８】
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【数４９】
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【数５０】
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【数５１】
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【数５２】
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【数５３】
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【数５４】
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【数５５】
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【数５６】
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【数５７】
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【数５８】
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【数５９】
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【数６０】
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【数６１】
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【数６２】
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【数６３】
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【数６４】
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【数６５】
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【数６６】
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【数７０】
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【数７１】
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【数７２】
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【数７３】
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【数７４】
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【数７５】
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【数７６】
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【数７７】
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【数８０】
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【数８１】
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【数８２】
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【数８３】
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【数８７】
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【数８８】
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【数８９】
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【数９０】
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【数９１】
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【数９２】
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【数９３】
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【数９４】
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【数９５】
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【数９６】
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【数９７】
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【数９８】
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【数９９】
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【数１００】
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【数１０１】
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【数１０４】
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【数１０５】
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【数１０６】
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【数１０７】
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【数１０８】
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【数１０９】
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【数１１０】
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【数１１１】
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【数１１２】
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【数１１３】
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【数１１４】
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【数１１５】
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【数１２６】
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【数１２７】
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【数１２８】
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【数１２９】
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【数１３０】
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【数１３１】
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【数１３２】
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【数１３３】
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【数１３４】
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【数１３５】
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【数１３６】
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【数１３７】
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【数１３８】
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【数１３９】
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【数１４０】
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【数１４１】
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【数１４２】
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【数１４３】
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【数１４４】
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【数１４５】
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【数１４６】
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【数１４７】
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【数１４８】
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【数１４９】
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【数１５０】
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【数１５１】
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【数１５２】
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【数１５３】
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【数１５４】
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【数１５５】
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【数１５６】
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【数１５７】
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【数１５８】
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【数１５９】
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【数１６０】
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【数１６２】
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【数１６３】
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【数１６４】
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【数１６６】
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【数１６７】
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【数１６９】
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【数１７０】
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【数１７６】
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【数１７７】
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【数１７８】
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【数１８０】
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【数１８１】
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【数１８２】
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【数１８６】
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【数１８７】
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【数１８８】
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【数１８９】
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【数１９０】
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【数１９１】
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【数１９２】
2018537963.tif 000201
【数１９３】
2018537963.tif 000202
【数１９４】
2018537963.tif 000203
【０２５３】
配列番号９の残基１０、１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、８４０、１２１９および／または１３２９に相同なアミノ酸残基が同定できるさらなる好適なＣａｓ９配列は、当業者に公知である。例えば、Supplementary Table S2 and Supplementary Figure S2 of Fonfara et al.,Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems,Nucl. Acids Res. 2013, doi: 10.1093/nar/gktl074を参照（全開示内容を参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に示すか、または従来技術において公知の配列を有するＣａｓ９変異体であって、例えば配列番号９のアミノ酸残基１０、１２２、１３７、１８２、２６２、２９４、４０９、４８０、５４３、６６０、６９４、８４０、１２１９および／または１３２９に相同な１以上のアミノ酸残基の１以上の変異（例えば本明細書において示される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６または少なくとも７つの変異）を含むＣａｓ９変異体は、例えばＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉおよび／またはＥ１２１９Ｖ変異を含むＣａｓ９変異体として、本発明の開示により提供される。
【０２５４】
例４：広いＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９の進化
ＰＡＣＥを用い、ＮＮＮ ＰＡＭライブラリーに対するS. pyogenesのＣａｓ９の進化によって、多くの非古典的ＰＡＭに対して高い活性を有する、ＰＡＭ特異性が拡張された進化型Ｃａｓ９ｓが得られた。かかるＣａｓ９は未だ、その天然のＤＮＡ結合および切断活性を保持し、現在用いられているあらゆるツールによる利用が可能である。Ｃａｓ９のＤＮＡとの相互作用を調節することによって、Ｃａｓ９のＰＡＭ特異性を改良および拡張することができると仮定される。Staphylococcus aureusなどの他のＣａｓ９ｓの設計を行い、かかる方法に従い、それらのＰＡＭ特異性を改変および拡張することができる。例えば、Ｃａｓ９蛋白質の標的特異的変異導入、ＤＮＡ結合性蛋白質との融合、各々連結された複数のＣａｓ９蛋白質の使用などの、ＤＮＡ結合性の調節方法を用いることにより、標的とすることができるＰＡＭを拡張することも可能となる。
【０２５５】
Ｃａｓ９の進化
変異導入プラスミド（ＭＰ）によるファージの終夜増殖を用いた進化の後、ＰＡＣＥ変異による上記の変異を有するファージを用いた。２４個のファージを、ＰＡＣＥのランから配列決定した。Ｃａｓ９遺伝子に存在した変異を、下記の表３に示す。これらの変異を含むＣａｓ９遺伝子をファージからクローニングアウトし、プラスミドにクローニングし、ＤＮＡ結合および切断活性を試験した。
表３：Ｃａｓ９変異
【表３】
2018537963.tif 000204
【０２５６】
ヒト培養細胞におけるＧＦＰ活性化
ｄＣａｓ９−ＶＰＲにより活性化するＧＦＰレポーターを有するレポーターに対する試験を実施した。試験は、最初に５’−ＮＧＧ−３’ ＰＡＭ（図４Ａおよび４Ｂ）に対して実施し、次に、全て同じＣａｓ９標的部位を含むが、ＰＡＭ位置にＮＮＮを有するＧＦＰレポーターのライブラリー（図５Ａおよび５Ｂ）を用いて実施した。この試験において、ｄＣａｓ９−ＶＰＲは、ＧＦＰシグナルを活性化させることが解った。変異のない野生型Ｃａｓ９（ｐＪＨ３０６）、終夜増殖により進化したＣａｓ９（ｐＪＨ５６２）およびＰＡＣＥにより進化したＣａｓ９（ｐＪＨ５９９−ｐＪＨ６０５）の全てを試験した。各Ｃａｓ９変異について、上記の表３に示す。
【０２５７】
全６４のＰＡＭ配列に対するｄＣａｓ９−ＶＰＲ
ｐＪＨ３０６（野生型ｄＣａｓ９−ＶＰＲ）およびｐＪＨ５９９（変異Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖを有する野生型ｄＣａｓ９−ＶＰＲ）を用い、全６４のＰＡＭ配列に対する試験を行った（図６）。ｄＣａｓ９−ＶＰＲを用い、上記の通りにＧＦＰを活性化し、異なるレポータープラスミドを各ウェルに用い、全６４の異なるＰＡＭ配列に対する活性化効率を確認した。平均ＧＦＰ蛍光を全てのトランスフェクション細胞について測定した（ｉＲＦＰシグナルによってゲート）。ｐＪＨ５９９は、ｐＪＨ３０６と比較し、全てのＰＡＭ配列について、同程度〜高い活性化レベルを示した。
【０２５８】
インビトロ切断アッセイ
発現および精製された野生型Ｃａｓ９（ＷＴ）およびＥ１２１９Ｖ変異（１）を有するＣａｓ９の、異なるＰＡＭを有するＤＮＡを切断する能力を試験した（図７）。標的部位を含有するｄｓＤＮＡと共にＣａｓ９をインキュベートした。ＤＮＡをゲル電気泳動させ、未切断物の量を切断生成物の量と比較することにより、切断能力を測定した（サイズが小さいため、急速に泳動させた）。Ｅ１２１９Ｖ変異は、非古典的ＰＡＭに対するＣａｓ９の切断活性を増加させる一方で、５’−ＮＧＧ−３’ ＰＡＭに対する活性を維持することが解った。
【０２５９】
様々な系の進化
S. pyogenesのＣａｓ９の進化に加え、他のＣａｓ９系（例えばS. aureus、S. thermophilus、N. meningitidisおよびT. denticolaなど）を進化させ、それらのＰＡＭ特異性を改良および拡張させることができる。データより、S. pyogenesのＣａｓ９進化で用いたのと同様の系を用いて、ファージを含むS. aureusのＣａｓ９を進化させ、そのＰＡＭ特異性を拡張できることが示される。
【０２６０】
ＰＡＭ特異性の調節
中性および負荷電アミノ酸を正荷電アミノ酸に変異させることによって、標的とすることができるＰＡＭが拡張されるようにＣａｓ９を改変できる。一般的に、正電荷を増加させる変異をＣａｓ９蛋白質に導入することにより、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合親和性が向上する。本発明で提供されるＣａｓ９変異との組合せにおいて、S. pyogenesのＣａｓ９におけるＰＡＭターゲティング能力を向上させるために変異を導入できるさらなる残基としては、ＰＡＭ特異性を改変するものとして同定されたもの（Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｒ１３３３、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７）（３８）およびＣａｓ９活性を向上させることができる残基（Ｓ８４５およびＬ８４７）が挙げられる（３７）。Ｃａｓ９の特異性を向上させる残基（例えばこれまで確認されたアルギニン、ヒスチジンおよびリジンのアラニンへの変異（３７）、およびこれまで確認されたアスパラギン、アルギニンおよびグルタミンのアラニンへの変異（３９））は、これらの変異がおそらくＣａｓ９とＤＮＡとの間の相互作用を低下させるため、非古典的ＰＡＭに対する許容度を低下させるものである。
【０２６１】
ＰＡＭ特異性の調節のための融合
プログラム可能ＤＮＡ結合性蛋白質（例えばＺｎフィンガードメイン、ＴＡＬＥｓおよび他のＣａｓ９蛋白質）をＣａｓ９に融合させることにより、古典的または非古典的ＰＡＭを有するヌクレオチド配列へのターゲッティング能力を向上（例えば活性、特異性または効率を向上）させることが可能となる。ヌクレアーゼ欠失（ｎｕｌｌ）ｄＣａｓ９を、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９と融合させ、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９の様々なＰＡＭ配列を標的とする能力を向上させることが可能となる。ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９に融合させるヌクレアーゼ欠失ｄＣａｓ９の一例を図８に示す。かかる融合は、古典的または非古典的ＰＡＭを有するヌクレオチド配列へのターゲッティング能力を向上させるのに有用でありうる。Ｃａｓ９ｓは、同じ種、または異なる種に由来してもよい。さらに、両方のＣａｓ９がヌクレアーゼ欠失ｄＣａｓ９であってもよく、ＶＰ６４、ＶＰ６４−ｐ６５−Ｒｔａ、ＦｏｋＩ、ＧＦＰおよび他の蛍光蛋白質、デアミナーゼまたは本発明で提供されるいずれかのエフェクター蛋白質などの、エフェクター蛋白質とさらに融合させてもよい。
【０２６２】
Ｃａｓ９を用いた、他のヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ結合蛋白質の局在化
Ｃａｓ９を用いることで、それらのＤＮＡ標的に対する局在化を通じて、他の蛋白質の天然の結合特異性を超克することが可能となる。ＤＮＡヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼおよび他のエフェクターは通常、固有のＤＮＡ特異性を有する。Ｃａｓ９をこれらの蛋白質に融合させることにより、それらの天然のＤＮＡ特異性を超克および拡張することが可能となる。ｇＲＮＡｓは、ＤＮＡエフェクターの標的部位に隣接する部位にＣａｓ９をターゲッティングし、それらの標的部位へのそれらの局在化を補助する。
【０２６３】
ＮＮＮＮＮ ＰＡＭライブラリーに対するｄＣａｓ９−ＶＰＲ
進化型Ｃａｓ９ｓが第４および第５のＰＡＭ部位への特異性を有するか否かを試験するため、ＮＮＮＮＮ ＰＡＭライブラリーに対しｄＣａｓ９−ＶＰＲを試験した。ＮＮＮライブラリーに見られたように、大部分の構築物（例えばｐＪＨ５６２、ｐＪ５５９、ｐＪＨ６００、ｐＪＨ６０１、ｐＪＨ６０２、ｐＪＨ６０３およびｐＪＨ６０５）は活性が向上していた。ｐＪＨ５９９は、ＧＦＰ活性化（図９Ａ）を示した細胞のパーセンテージの増加、およびＧＦＰ活性化（図９Ｂ）を示した細胞の平均蛍光の増加、を一貫して示した。
【０２６４】
Ｃａｓ９によるＧＦＰの切断
野生型Ｃａｓ９（ｐＪＨ４０７）を、ヌクレアーゼ陽性進化型Ｃａｓ９（ｐＪＨ７６０、図１０）と比較した。ｐＪＨ７６０は、ｐＪＨ５９９と同じ変異を含むが、ヌクレアーゼ不活性化変異Ｄ１０ＡおよびＨ４８０Ａを含まず、またＶＰＲと融合していない。ゲノム中にインテグレートされたＧＦＰ遺伝子をＣａｓ９で切断し、細胞のＧＦＰシグナルの損失を指標に活性を測定した。５’−ＮＧＧ−３’ ＰＡＭを有する部位に対し、ｐＪＨ４０７およびｐＪＨ７６０は良好な活性を示した。ＧＡＴ  ＰＡＭを有する部位に対し、ｐＪＨ７６０は、ｐＪＨ４０７と比較し活性の顕著な向上を示した。
【０２６５】
例５：Ｃａｓ９：ＤＮＡ編集酵素融合蛋白質
本発明の開示はさらに、ＤＮＡの塩基配列の標的特異的編集のためのＤＮＡ編集酵素と融合させたＣａｓ９の提供に関する。図１１は、ＤＮＡ編集酵素−ｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体に結合した二本鎖ＤＮＡ基質を例示する。図示するＤＮＡ編集酵素は、デアミナーゼである。図１１の構造を、それらの配列において同定する（３６ｂｐ：下線、ｓｇＲＮＡ標的配列：太字、ＰＡＭ：囲い文字、２１ｂｐ：斜字体）。
【０２６６】
例６：ＰＡＭ減少アッセイ
ＰＡＭ配列をコードし、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌ライブラリーを得た。Ｃａｓ９がプラスミド上のＰＡＭ配列を切断できる場合、プラスミドは複製されずに失われ、切断されないプラスミドのみが集団として残存できる。初期のプラスミド集団および最終的なプラスミド集団のシークエンシングを行うハイスループットシークエンシングにより、Ｃａｓ９によって切断されたプラスミドを測定できる。全リード数でＰＡＭ配列を含むリード数を除算することにより、各ＰＡＭ配列からなるライブラリーの比率を得た。次に、選抜後ＰＡＭ配列を含むライブラリーの比率で、選抜前のＰＡＭセクションを含むライブラリーの比率を除算することにより、減少スコアを算出した。高い減少スコアは、Ｃａｓ９による特定のＰＡＭ配列の切断活性が高いことを示す。ＰＡＭ減少アッセイの結果を図１２に示す。
【０２６７】
野生型Ｃａｓ９で切断されなかった多くのＰＡＭ配列は、進化型Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９ ｖ１．０、ｐＪＨ７６０）で切断された。特に、ＮＧＮおよびＮＮＧ、ならびにＧＡＡおよびＧＡＴの全てのＰＡＭ配列は、ｘＣａｓ９に対して１０倍超の減少を示した。第２または第３のＰＡＭ位置の唯一のＧは、新規に進化したＣａｓ９による切断に充分でありえ、Ｃａｓ９を使用して標的とできる標的部位の配列スペースを顕著に開けるものである。ＰＡＭ減少スコアを表４に示す。
表４．ＰＡＭ減少スコア
【表４−１】
2018537963.tif 000205
【表４−２】
2018537963.tif 000206
【表４−３】
2018537963.tif 000207
【０２６８】
例７：ＧＦＰ切断哺乳動物細胞
ゲノムにインテグレートされたＧＦＰ遺伝子を含む哺乳動物細胞に、野生型または進化型Ｃａｓ９およびｇＲＮＡｓをトランスフェクションした。異なるｇＲＮＡは異なるＰＡＭ配列を有する異なる部位を標的とし、Ｃａｓ９によるＧＦＰのカットは、ＧＦＰシグナルの喪失をもたらす。ＧＦＰシグナルは、５日後にフローサイトメトリにより定量化した。図１３に示すように、進化型Ｃａｓ９は、哺乳動物細胞においてＧＦＰを切断し、これはＧＦＰ活性化アッセイ、およびＰＡＭ減少アッセイの結果と整合する。切断された部位の周辺のハイスループットシークエンシングは、フローサイトメトリによって観察された結果を確認するものであり、フローサイトメトリによって観察された切断のパーセンテージと整合していた。
【０２６９】
例８：ＨＨＨライブラリーのさらなる進化
ＳｐＣａｓ９が第２および第３の塩基におけるＧ残基への選択性を有するため、ＨＨＨ（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）ＰＡＭライブラリーに対する最終の進化からのエンドポイントを用いて、進化を継続させた。進化の後、１３のコロニーをシークエンシングし、多くの新規な変異が同定された。３つの変異、Ｅ１２１９Ｖ、Ｅ４８０ＫおよびＥ５４３Ｄ変異が全てのクローンに存在した。Ｓ２６７Ｇ／Ｋ２９４Ｒ／Ｑ１２５６Ｋ変異を有するか、またはＡ２６２Ｔ／Ｓ４０９Ｉ変異を有する多くのクローンは存在したが、それらの変異が共存することは決してなく、これは、進化的ランドスケープに沿って、クローンが、２つの分化経路を採ったことを示唆するものである。新規な変異を表５に示す。
表５．新規な変異
【表５−１】
2018537963.tif 000208
【表５−２】
2018537963.tif 000209
【０２７０】
例９：遺伝子編集のためのさらに進化したＣａｓ９蛋白質
ｐＪＨ７６０（例６に記載）を用い、多くの新しい標的に対するＰＡＭ減少アッセイにおいて試験した。４つの新しい標的を選択した：ｒｅ２：GGGGCCACTAGGGACAGGAT（配列番号３１４）、哺乳動物細胞のＧＦＰ活性化に従来用いられた合成標的。ＶＥＧＦ：GGGTGGGGGGAGTTTGCTCC（配列番号３１５）、ＶＥＧＦ遺伝子中の標的。ＣＬＴＡ：GCAGATGTAGTGTTTCCACA（配列番号３１６）、ＣＬＴＡ遺伝子中の標的。およびＣＣＲ５Ｄ：TCACTATGCTGCCGCCCAGT（配列番号３１７）、ＣＣＲ５Ｄ遺伝子中の標的。ＰＡＭ減少アッセイの結果を、図１４〜１７に示す。ＰＡＭ減少は、古典的ＮＧＧ配列に加え、大部分のＮＧＮおよびいくつかのＮＮＧ配列に対する切断も示すことがわかった。
【０２７１】
ＨＨＨ（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）ＰＡＭライブラリーに対する最後の進化からのエンドポイントを使用して、ＨＨＨ ＰＡＭライブラリーをさらに進化させた。進化の後、１３のコロニーをシークエンシングし、多くの新規な変異が同定された。３つの変異、Ｅ１２１９Ｖ、Ｅ４８０ＫおよびＥ５４３Ｄ変異が全てのクローンに存在した。Ｋ２９４Ｒ／Ｑ１２５６Ｋ変異を有するか、またはＡ２６２Ｔ／Ｓ４０９Ｉ変異を有する多くのクローンは存在したが、それらの変異が共存することは決してなく、これは、進化的ランドスケープに沿って、クローンが、２つの分化経路を採ったことを示唆するものである。新規な変異を下記の表８および９に示す。
【０２７２】
予想されたように、標的の相違による活性の変動が観察された。ＰＡＭ減少アッセイスコアを表１０に示す。ＮＧＮは、いくつかの標的と共に切断活性を一貫して示した。特に最大の活性を有した変異体であるｘＣａｓ９ ３．ｘ変異体において変動が観察された。特に、ｘＣａｓ９ ３．３はＫ２９４Ｒ／Ｑ１２５６Ｋの変異シリーズを含み、一方、その他の３つの変異体（３．６、３．７および３．８）はＡ２６２Ｔ／Ｓ４０９Ｉの変異シリーズを含んだ。ｘＣａｓ９ ３．６および３．７は、３．８を上回った。大部分のケースでは３．３が最も高い活性を有するようであったが、３．６および３．７は特定のＰＡＭ配列に対しては良好に機能した。上記の３つの新しい標的に対するＰＡＭ減少アッセイの結果を図１８〜２０に示す。
【０２７３】
ＮＮＮＮＮ ＰＡＭ減少ライブラリーを構築した。アッセイを行い、第４または第５の塩基への特異性を試験した。ＰＡＭ減少アッセイの最初の結果は、予想通り、第４および第５の塩基に対する選択性はないことを示すものであった。
【０２７４】
要約すると、Ｅ１２１９Ｖが、進化において確立された最も初期の変異の１つであることが解った。それは結晶構造中ではＰＡＭ配列の付近にある。Ｅ４８０ＫおよびＥ５４３Ｄもまた、進化の初期から得た全クローンで観察され、重要であると考えられる。Ｋ２９４Ｒ／Ｑ１２５６ＫおよびＡ２６２Ｔ／Ｓ４０９Ｉは、２つの分化経路であると考えられ、重要であると考えられる。それらのＰＡＭ配列プロファイルはわずかに異なるようであり、それはＰＡＭ活性の決定に関連してそれらの重要性を意味するものである。
表６．ＴからＣへの変化を含有する疾患／障害。表は、シトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）へ変化させることによって修正されてもよいヒト遺伝子変異を含む。遺伝子名、遺伝子記号、およびGene IDが表示される。
【表６−１】
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【表６−２】
2018537963.tif 000211
【表６−３】
2018537963.tif 000212
【表６−４】
2018537963.tif 000213
【表６−５】
2018537963.tif 000214
【表６−６】
2018537963.tif 000215
【表６−７】
2018537963.tif 000216
【表６−８】
2018537963.tif 000217
【表６−９】
2018537963.tif 000218
【表６−１０】
2018537963.tif 000219
【表６−１１】
2018537963.tif 000220
【表６−１２】
2018537963.tif 000221
【表６−１３】
2018537963.tif 000222
【表６−１４】
2018537963.tif 000223
【表６−１５】
2018537963.tif 000224
【表６−１６】
2018537963.tif 000225
【表６−１７】
2018537963.tif 000226
【表６−１８】
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【表６−１９】
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【表６−２０】
2018537963.tif 000229
【表６−２１】
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【表６−２２】
2018537963.tif 000231
【表６−２３】
2018537963.tif 000232
【表６−２４】
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【表６−２５】
2018537963.tif 000234
【表６−２６】
2018537963.tif 000235
【表６−２７】
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【表６−２８】
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【表６−２９】
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【表６−３０】
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【表６−３１】
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【表６−３２】
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【表６−３３】
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【表６−３４】
2018537963.tif 000243
【表６−３５】
2018537963.tif 000244
【表６−３６】
2018537963.tif 000245
【表６−３７】
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【表６−３８】
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【表６−３９】
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【表６−４０】
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【表６−４１】
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【表６−４２】
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【表６−４３】
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【表６−４４】
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【表６−４５】
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【表６−４６】
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【表６−４７】
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【表６−４８】
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【表６−４９】
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【表６−５０】
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【表６−５１】
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【表６−５２】
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【表６−５３】
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【表６−５４】
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【表６−５５】
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【表６−５６】
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【表６−５７】
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【表６−５８】
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【表６−５９】
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【表６−６０】
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【表６−６１】
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【表６−６２】
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【表６−６３】
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【表６−６４】
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【表６−６５】
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【表６−６６】
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【表６−６７】
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【表６−６８】
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【表６−６９】
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【表６−７０】
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【表６−７１】
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【表６−７２】
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【表６−７３】
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【表６−７４】
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【表６−７５】
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【表６−７６】
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【表６−７７】
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【表６−７８】
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【表６−７９】
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【表６−８０】
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【表６−８１】
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【表６−８２】
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【表６−８３】
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【表６−８４】
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【表６−８５】
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【表６−８６】
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【表６−８７】
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【表６−８８】
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【表６−８９】
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【表６−９０】
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表７．ＡからＣへの変化を含有する疾患／障害。表は、グアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）へ変化させることによって修正されてもよいヒト遺伝子変異を含む。遺伝子名、遺伝子記号、およびGene IDが表示される。
【表７−１】
2018537963.tif 000300
【表７−２】
2018537963.tif 000301
【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表７−２３】
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【表７−２４】
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【表７−２５】
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【表７−２６】
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【表７−２７】
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【表７−２８】
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【表７−２９】
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【表７−３０】
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【表７−３１】
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【表７−３２】
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【表７−４０】
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【表７−８２】
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【表７−８８】
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【表７−８９】
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【表７−９０】
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【表７−９１】
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【表７−９２】
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【表７−９３】
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表８．ｘＣａｓ９ｖ３変異（Ｋ２９４Ｒ／Ｑ１２５６Ｋのシリーズ）
【表８】
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表９．ｘＣａｓ９ｖ３変異（Ａ２６２Ｔ／Ｓ４０９Ｉのシリーズ）
【表９】
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表１０．ＰＡＭ減少スコア（ｘＣａｓ９ｖ３．０〜３．６変異）
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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表１０のつづき．ＰＡＭ減少スコア（ｘＣａｓ９ｖ３．７〜３．１２変異）
【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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参考文献
1.  Humbert O, Davis L, Maizels N. Targeted gene therapies: tools, applications, optimization. Crit Rev Biochem Mol.2012; 47(3):264-81. PMID: 22530743.
2.  Perez-Pinera P, Ousterout DG, Gersbach CA. Advances in targeted genome editing. Curr Opin Chem Biol. 2012; 16(3-4):268-77. PMID: 22819644.
3.  Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 2010; 11(9):636-46. PMID: 20717154.
4.  Joung JK, Sander JD. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14(1):49-55. PMID: 23169466.
5.  Charpentier E, Doudna JA. Biotechnology: Rewriting a genome. Nature. 2013; 495, (7439):50-1. PMID: 23467164.
6.  Pan Y, Xia L, Li AS, Zhang X, Sirois P, Zhang J, Li K. Biological and biomedical applications of engineered nucleases. Mol Biotechnol. 2013; 55(1):54-62. PMID: 23089945.
7.  De Souza, N. Primer: genome editing with engineered nucleases. Nat Methods. 2012; 9(1):27. PMID: 22312638.
8.  Santiago Y, Chan E, Liu PQ, Orlando S, Zhang L, Urnov FD, Holmes MC, Guschin D, Waite A, Miller JC, Rebar EJ, Gregory PD, Klug A, Collingwood TN. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(15):5809-14. PMID: 18359850.
9.  Cargill M, Altshuler D, Ireland J, Sklar P, Ardlie K, Patil N, Lane CR, Lim EP, Kalyanaraman N, Nemesh J, Ziaugra L, Friedland L, Rolfe A, Warrington J, Lipshutz R, Daley GQ, Lander ES. Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes. Nat Genet. 1999; 22(3):231-8. PMID: 10391209.
10.  Jansen R, van Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 2002; 43(6):1565-75. PMID: 11952905.
11.  Mali P, Esvelt KM, Church GM. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 2013; 10(10):957-63. PMID: 24076990.
12.  Jore MM, Lundgren M, van Duijin E, Bultema JB, Westra ER, Waghmare SP, Wiedenheft B, Pul U, Wurm R, Wagner R, Beijer MR, Barendregt A, Shou K, Snijders AP, Dickman MJ, Doudna JA, Boekema EJ, Heck AJ, van der Oost J, Brouns SJ. Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade. Nat Struct Mol Biol. 2011; 18(5):529-36. PMID: 21460843.
13.  Horvath P, Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 2010; 327(5962):167-70. PMID: 20056882.
14.  Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 2012; 482(7385):331-8. PMID: 22337052.
15.  Gasiunas G, Siksnys V. RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing? Trends Microbiol. 2013; 21(11):562-7. PMID: 24095303.
16.  Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013; 152(5):1173-83. PMID: 23452860.
17.  Perez-Pinera P, Kocak DD, Vockley CM, Adler AF, Kabadi AM, Polstein LR, Thakore PI, Glass KA, Ousterout DG, Leong KW, Guilak F, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 2013; 10(10):973-6. PMID: 23892895.
18.  Mali P, Aach J, Stranges PB, Esvelt KM, Moosburner M, Kosuri S, Yang L, Church GM. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013; 31(9):833-8. PMID: 23907171.
19.  Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154(2):442-51. PMID: 23849981.
20.  Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 2013; 8(11):2180-96. PMID: 24136345.
21.  Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013; 339(6121):823-6. PMID: 23287722.
22.  Cole-Strauss A, Yoon K, Xiang Y, Byrne BC, Rice MC, Gryn J, Holloman WK, Kmiec EB. Correction of the mutation responsible for sickle cell anemia by an RNA-DNA oligonucleotide. Science. 1996; 273(5280):1386-9. PMID: 8703073.
23.  Tagalakis AD, Owen JS, Simons JP. Lack of RNA-DNA oligonucleotide (chimeraplast) mutagenic activity in mouse embryos. Mol Reprod Dev. 2005; 71(2):140-4. PMID: 15791601.
24.  Ray A, Langer M. Homologous recombination: ends as the means. Trends Plant Sci. 2002; 7(10):435-40. PMID 12399177.
25.  Britt AB, May GD. Re-engineering plant gene targeting. Trends Plant Sci. 2003; 8(2):90-5. PMID: 12597876.
26.  Vagner V, Ehrlich SD. Efficiency of homologous DNA recombination varies along the Bacillus subtilis chromosome. J Bacteriol. 1988; 170(9):3978-82. PMID: 3137211.
27.  Saleh-Gohari N, Helleday T. Conservative homologous recombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phase of the cell cycle in human cells. Nucleic Acids Res. 2004; 32(12):3683-8. PMID: 15252152.
28.  Lombardo A, Genovese P, Beausejour CM, Colleoni S, Lee YL, Kim KA, Ando D, Urnov FD, Galli C, Gregory PD, Holmes MC, Naldini L. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat Biotechnol. 2007; 25(11):1298-306. PMID: 17965707.
29.  Conticello SG. The AID/APOBEC family of nucleic acid mutators. Genome Biol. 2008; 9(6):229. PMID: 18598372.
30.  Reynaud CA, Aoufouchi S, Faili A, Weill JC. What role for AID: mutator, or assembler of the immunoglobulin mutasome? Nat Immunol. 2003; 4(7):631-8.
31.  Bhagwat AS. DNA-cytosine deaminases: from antibody maturation to antiviral defense. DNA Repair (Amst). 2004; 3(1):85-9. PMID: 14697763.
32.  Navaratnam N, Sarwar R. An overview of cytidine deaminases. Int J Hematol. 2006; 83(3):195-200. PMID: 16720547.
33.  Holden LG, Prochnow C, Chang YP, Bransteitter R, Chelico L, Sen U, Stevens RC, Goodman MF, Chen XS. Crystal structure of the anti-viral APOBEC3G catalytic domain and functional implications. Nature. 2008; 456(7218):121-4. PMID: 18849968.
34.  Chelico L, Pham P, Petruska J, Goodman MF. Biochemical basis of immunological and retroviral responses to DNA-targeted cytosine deamination by activation-induced cytidine deaminase and APOBEC3G. J Biol Chem. 2009; 284(41). 27761-5. PMID: 19684020.
35.  Pham P, Bransteitter R, Goodman MF. Reward versus risk: DNA cytidine deaminases triggering immunity and disease. Biochemistry. 2005; 44(8):2703-15. PMID 15723516.
36.  Chen X, Zaro JL, Shen WC. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-69. PMID: 23026637.
37.  Slaymaker, I. M. et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, doi:10.1126/science.aad5227  (2015).
38.  Kleinstiver, B. P. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 523, 481-485, doi:10.1038/nature14592 (2015).
39.  Pattanayak, V. et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA- programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology 31, 839-843, doi:10.1038/nbt.2673 (2013).
40.  Shcherbakova, D. M. & Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nature Methods 10, 751-754, doi:10.1038/nmeth.2521 (2013).
41.  Kleinstiver, et al., High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 529, 490-495 doi:10.1038/nature16526 (2016).
【０２７５】
本明細書において、例えば背景技術、要約、発明の詳細な説明、例および／または参考文献のセクションにおいて、言及される全ての刊行物、特許、特許出願、刊行およびデータベースエントリー（例えば配列データベースエントリー）は、個々の刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリーが、具体的かつ個別的に本明細書に引用されたのと同様に、参照によりその全開示内容が本明細書に援用されるものとする。不一致が生じる場合には、本出願（本明細書中の定義も含む）が優先する。
【０２７６】
均等物と範囲
当業者は、本明細書に記載される態様の多くの均等物を認識するか、または慣例的な実験作業だけを用いて確かめる能力があるであろう。本開示の範囲は、上の記載に限定されることを意図されておらず、むしろ添付のクレームに示されている通りである。
【０２７７】
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、それと逆に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。ある群の２つ以上のメンバーの間に「または」を包含するクレームまたは記載は、それと逆に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが存在する場合には、満足されると見なされる。２つ以上の群のメンバー間に「または」を包含する群の開示は、群の厳密に１つのメンバーが存在する態様、群の１つよりも多くのメンバーが存在する態様、および群のメンバーの全てが存在する態様を提供する。簡潔性の目的のために、それらの態様は本明細書において個々に書き出していないが、それらの態様のそれぞれが本明細書において提供されており、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。
【０２７８】
本発明は、１以上の限定、要素、節、または記述用語がクレームの１以上からまたは明細書の１以上の関係する部分から別の請求項に導入される全てのバリエーション、組み合わせ、および順列を包摂するということは理解されるはずである。例えば、別のクレームに従属するあるクレームは、同じ基礎クレームに従属するいずれかの他のクレームに見出される限定の１以上を包含するように改変され得る。さらにその上に、別様に示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生起するであることが当業者に明白でない限り、クレームが組成物を記載しているところでは、適宜、本明細書において開示される作るもしくは用いる方法のいずれかに従って、または当分野において公知の方法に従って、組成物を作るまたは用いる方法が包含されるということは理解されるはずである。
【０２７９】
要素がリストとして、例えばマーカッシュ群フォーマットで提示されているところでは、要素のあらゆる可能な下位群もまた開示されるということと、いずれかの要素または要素の下位群が群から除去され得るということとは理解されるはずである。用語「含む」は開放的であることを意図されており、追加の要素またはステップの包含を許容するということもまた注意される。一般的に、ある態様、産物、または方法が具体的な要素、特徴、またはステップを含むと言われるところでは、かかる要素、特徴、またはステップからなるかまたは本質的になる態様、産物、または方法も同じく提供されるということは理解されるはずである。簡潔性の目的のために、それらの態様は本明細書において個々に書き出されていないが、それらの態様のそれぞれが本明細書において提供されており、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。
【０２８０】
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上に、いくつかの態様において、別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は、記された範囲内のいずれかの特定の値を、文脈が明瞭に別様に述べていない限り範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるはずである。簡潔性の目的のために、各範囲内の値は本明細書において個々に書き出さなかったが、それらの値のそれぞれが本明細書において提供されており、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるはずである。別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ程度の正確度で表されるということもまた理解されるはずである。
【０２８１】
加えて、本発明のいずれかの具体的な態様がクレームのいずれか１以上から明示的に除外され得るということは理解されるであろう。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値がクレームのいずれか１以上から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、用途、または側面は、いずれか１以上のクレームから除外され得る。簡潔性の目的のために、１以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された態様の全てが本明細書に明示的に示されているわけではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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