(57)【要約】本開示は、修飾アンチセンスオリゴマーおよび関連の組成物、ならびに機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させるための方法ならびに脊髄性筋萎縮症を処置するための方法に関するものであり、またＳＭＮ２  ｍＲＮＡ中のエクソン７の包含を誘導することに関するものである。ある特定の態様では、本開示は、機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させるための組成物および方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、被験体におけるエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルを増強するための多様に記載される修飾アンチセンスオリゴマーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８〜４０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマー化合物であって、
ａ．（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出のものの組合せを有するヌクレオチド類似体である、少なくとも１つのサブユニットと；
ｂ．ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域中の８またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列であって、前記標的領域がＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の領域を含む、ターゲティング配列と
を含む、修飾アンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項２】
前記修飾ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結、またはホスホロジアミデートから選択され、ここで、リン原子は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合している、請求項１に記載の修飾アンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項３】
前記修飾糖部分が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、またはモルホリノサブユニットのうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の修飾アンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項４】
前記修飾アンチセンスオリゴマー化合物の３’末端または５’末端にコンジュゲートしたアルギニンに富む細胞透過性ペプチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項５】
前記ターゲティング配列が、配列番号４〜１６または３３〜４５から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾アンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項６】
前記サブユニットの各々のヌクレオ塩基が独立に、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、または１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾アンチセンスオリゴマー。
【請求項７】
式（Ｖ）：
【化３０２】
2018525015.tif 000374
の化合物または薬学的に許容されるその塩であって、
式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化３０３】
2018525015.tif 000375
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８およびＲ１から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化３０４】
2018525015.tif 000376
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化３０５】
2018525015.tif 000377
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化３０６】
2018525015.tif 000378
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化３０７】
2018525015.tif 000379
を有し、式中、該ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、該ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
該ターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるか、（ｃ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるターゲティング配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または、（ｄ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択され、
ここで、以下の条件のうちの少なくとも１つが存在する：
ａ）Ｒ１の少なくとも１つが式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）であるか、あるいは
ｂ）Ｒ２がＧであるか、またはＴが
【化３０８】
2018525015.tif 000380
である、化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項８】
Ｔが式：
【化３０９】
2018525015.tif 000381
であり、Ｒ２がＨである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
各Ｒ１が
【化３１０】
2018525015.tif 000382
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔが
【化３１１】
2018525015.tif 000383
であり、Ｒ２がＨであり、ここで、少なくとも１つのＲ１が
【化３１２】
2018525015.tif 000384
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
各Ｒ１が
【化３１３】
2018525015.tif 000385
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔが
【化３１４】
2018525015.tif 000386
であり、Ｒ２がＨであり、ここで、少なくとも１つのＲ１が
【化３１５】
2018525015.tif 000387
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
各Ｒ１が−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２がＨおよびアシルから選択され、Ｔが式：
【化３１６】
2018525015.tif 000388
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２がＧであり、Ｔが式：
【化３１７】
2018525015.tif 000389
であり、各Ｒ１が−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２がＨまたはアシルから選択され、Ｔが式：
【化３１８】
2018525015.tif 000390
であり、各Ｒ１が−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｇが式：
【化３１９】
2018525015.tif 000391
であり、式中、ＲａがＨ、アセチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される、請求項１１、１２または１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ターゲティング配列が、配列番号３５、３６または３７から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ターゲティング配列が配列番号３７である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記ターゲティング配列が配列番号３５である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ターゲティング配列が配列番号３６である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｚが１６〜２３の整数であり、前記ターゲティング配列が配列番号３５、３６または３７から選択される、請求項７から１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｚが１６であり、前記ターゲティング配列が配列番号３５である、請求項７から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｚが１８であり、前記ターゲティング配列が配列番号３６である、請求項７から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｚが２３であり、前記ターゲティング配列が配列番号３７である、請求項７から１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
式（Ｖ）：
【化３２０】
2018525015.tif 000392
の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物であって、
式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化３２１】
2018525015.tif 000393
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８およびＲ１から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化３２２】
2018525015.tif 000394
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化３２３】
2018525015.tif 000395
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化３２４】
2018525015.tif 000396
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化３２５】
2018525015.tif 000397
を有し、式中、該ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、該ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
該ターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるか、（ｃ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるターゲティング配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または、（ｄ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択され、
ここで、以下の条件のうちの少なくとも１つが存在する：
ｃ）Ｒ１の少なくとも１つが式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）であるか、あるいは
ｄ）Ｒ２がＧであるか、またはＴが
【化３２６】
2018525015.tif 000398
である、医薬組成物。
【請求項２４】
有効量の式（Ｖ）：
【化３２７】
2018525015.tif 000399
の化合物または薬学的に許容されるその塩を対象に投与するステップを含む、脊髄性筋萎縮症の処置を必要とする該対象において脊髄性筋萎縮症を処置する方法であって、
式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化３２８】
2018525015.tif 000400
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８およびＲ１から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化３２９】
2018525015.tif 000401
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化３３０】
2018525015.tif 000402
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化３３１】
2018525015.tif 000403
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化３３２】
2018525015.tif 000404
を有し、式中、該ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、該ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
該ターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるか、（ｃ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるターゲティング配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または、（ｄ）配列番号４〜１６または３３〜４５から選択されるターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択され、
ここで、以下の条件のうちの少なくとも１つが存在する：
ａ）Ｒ１の少なくとも１つが式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）であるか、あるいは
ｂ）Ｒ２がＧであるか、またはＴが
【化３３３】
2018525015.tif 000405
である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本国際出願は、２０１５年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／２１１，６７８号および２０１６年８月２５日に出願された米国仮出願第６２／３７９，６９６号に対する優先権を主張し、これらのそれぞれは、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
機能的な生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質の発現レベルを増大させるための方法、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置するための方法、およびＳＭＡのための処置としてエクソン包含を誘導するための方法を含む、修飾アンチセンスオリゴマーならびに関連の組成物および方法が開示される。さらに、ＳＭＮ遺伝子によってコードされるＳＭＮタンパク質のレベルを回復させるためのエクソン７の包含を誘導するための方法が開示される。
【背景技術】
【０００３】
アンチセンス技術は近年、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）のスプライシング過程を変更するように適応している。プレｍＲＮＡとは、転写として公知の過程を介して、ＤＮＡ転写物から合成されるメッセンジャーＲＮＡの未成熟一本鎖である。プレｍＲＮＡ転写物は、２つの異なるセグメント型である、イントロンおよびエクソンを含む。イントロンは、スプライソソーム複合体により一般になされる、スプライシングと呼ばれる過程において除去される。残りのエクソンは、一体に接続され、最終的な成熟ｍＲＮＡ分子の一部となる。
【０００４】
イントロン／エクソンスプライシングの正確な過程は、イントロン領域内の、多様な構造エレメントを伴う。これらは、イントロンの５’末端に位置するイントロンスプライスドナー部位、イントロンの３’末端近傍に位置する分岐部位、およびイントロンの３’末端に位置するスプライスアクセプター部位を含む。スプライスドナー部位は一般に、エクソン／イントロン接合部の５’末端において、保存的ＧＵ配列を含む。スプライスアクセプター部位は一般に、イントロン／エクソン接合部の３’末端において、ＡＧ配列を含む。
【０００５】
スプライシング過程の変異は、ｍＲＮＡ内のエクソン組成を変異させることにより、結果として生じるｍＲＮＡの変異を創出する場合があり、選択的スプライシングと称することが多い過程である。選択的スプライシングは、多くの形で生じうる。エクソンは、延長される場合もあり、スキップされる場合もある。イントロンの一部が保持される場合もある。選択的スプライシングは、単一の遺伝子から複数のタンパク質を産生することにより、ヒトゲノムのコード潜在力を増加させる。不適切な選択的スプライシングはまた、ヒト疾患数の増加とも関連する。
【０００６】
ＳＭＡは、生存運動ニューロンＳＭＮ遺伝子によってコードされるＳＭＮタンパク質の喪失から生じる、多くの場合致死性の遺伝性障害である。ＳＭＮ遺伝子、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２は、第５染色体に位置付けられており、ＳＭＡは両染色体由来のＳＭＮ１の喪失によって生じる。ＳＭＮ２は、ＳＭＮ１とほとんど同一であるが、ＳＭＮタンパク質を作製する効果がより低い。ＳＭＡの重症度は、いくつかのコピーがあるＳＭＮ２がＳＭＮタンパク質を産生する効率によって影響を受ける。
【０００７】
ＳＭＮ１は、細胞生存のために必須の工程である、ｓｎＲＮＰの組み立てのために必要である、遍在的に発現される３８ｋＤａ  ＳＭＮタンパク質をコードしている。ほとんど同一のコピーの遺伝子であるＳＭＮ２は、エクソン７スキッピングのためにＳＭＮ１の喪失を代償できず、不安定な切断型タンパク質であるＳＭＮΔ７を産生する。ＳＭＮ１およびＳＭＮ２は、エクソン７の６位におけるＣからＴへの決定的な置換だけ異なっている（ＳＭＮ２の転写物中のＣ６Ｕ）。Ｃ６Ｕは、コード配列を変化させないが、ＳＭＮ２においてエクソン７スキッピングを生じるのに十分である。
【０００８】
ＳＭＡに対する現在の処置は、慢性運動単位喪失の二次的影響の予防および管理からなる。現在、ＳＭＡの処置または予防のために利用可能な薬物療法はない。
【０００９】
ＲＮＡ下方制御のために主に使用されるアンチセンス技術は、スプライシングプロセスを変えるように近年適応されている。ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングを変えることができる有効な薬剤は、治療的に有用である可能性が高い。
【００１０】
したがって、新規のアンチセンスオリゴマーおよび本明細書に記載する通りの機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増加させる方法は、有利であると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ある特定の態様では、本開示は、機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させるための組成物および方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、被験体におけるエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルを増強するための多様に記載される修飾アンチセンスオリゴマーを提供する。さらなる態様では、本開示は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性を有する修飾アンチセンスオリゴマーを投与するステップを含む、被験体においてエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルを増強する方法を提供する。ある特定の態様では、被験体は、ＳＭＡを有する。
【００１２】
多様な態様は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である、少なくとも１つのサブユニットと；ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６、エクソン７、イントロン７またはエクソン８内の領域（またはスプライス接合部をまたぐ領域）などのＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の８またはこれを超える連続ヌクレオチドの標的領域と相補的なターゲティング配列とを任意選択で含む８〜４０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマーを含む。さらなる態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、細胞取り込みを増強するペプチド部分をさらに含む。
【００１３】
さらなる態様は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、および（ｉｉｉ）ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７に相補的なターゲティング配列を有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む８〜４０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマーを含む。さらなる態様では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−７／−１４、−７／−１６、−１０／−２７、−１０／−２９、−１０／−３４、−１３７／−１５９、−１４９／−１７４、−１６７／−１８６、−２４９／−２７３もしくは−２８１／−２９９領域またはイントロン６の−５８／−３９、−１１２／−６７もしくは−２６４／−２４５領域に相補的な配列を含む。一部の態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−１０／−２７、−１０／−２９または−１０／−３４領域に相補的な配列を含む。
【００１４】
さらなる態様は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、および（ｉｉｉ）配列番号４〜１６から選択される配列を含むターゲティング配列を有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットを含む８〜４０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマーを含む。一部の態様では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号６、７および８から選択される配列を含む。
【００１５】
さらなる態様は、修飾糖部分を含むヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、少なくとも１つの修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットを含む。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの修飾糖部分を有し、ここで、少なくとも１つの修飾糖部分は、モルホリノサブユニットである。
【００１６】
さらなる態様は、修飾ヌクレオシド間連結を含むヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、およびホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。
【００１７】
さらなる態様は、修飾糖部分と修飾ヌクレオシド間連結との少なくとも１つの組合せを含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含み、ここで、１または複数のサブユニットは、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、モルホリノサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’Ｏ−メチルサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’−フルオロサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸サブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、トリシクロＤＮＡサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、ロックト核酸サブユニット、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、もしくは置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分に共有結合させたモルホリノサブユニット、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、４−アミノピペリジン−１−イル（４−ａｍｉｎｏｐｉｐｅｒｄｉｎ−１−ｙｌ）部分、もしくは置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合させたモルホリノサブユニット、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、ジメチルアミノ部分に共有結合させたモルホリノサブユニット、
ホスホロチオエートヌクレオシド間もしくはホスホルアミデートヌクレオシド間連結で置換された、リボース糖サブユニット、
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結もしくはホスホルアミデートヌクレオシド間連結で置換された、デオキシリボース糖サブユニット、
任意選択で置換された、ペプチド核酸サブユニット、
または前出の任意の組合せから選択される。
【００１８】
多様な態様および実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーに共有結合したペプチドをさらに含む。多様な実施形態では、アルギニンに富む細胞透過性ペプチドは、アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートしている。
【００１９】
多様な実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、以下：表１に明示されたターゲティング配列、表１のターゲティング配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片、または表１のターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体のうちのいずれかを含む。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、表１に明示されたターゲティング配列からなるかまたはこれらから本質的になる。
【００２０】
多様な態様および実施形態では、ヌクレオチドサブユニットのヌクレオ塩基は、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、および１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）から独立に選択される。
【００２１】
多様な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（Ｉ）：
【化１】
2018525015.tif 000002
の化合物または薬学的に許容されるその塩［式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化２】
2018525015.tif 000003
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨおよび−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化３】
2018525015.tif 000004
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化４】
2018525015.tif 000005
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化５】
2018525015.tif 000006
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および式：
【化６】
2018525015.tif 000007
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３〜１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１〜５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され；
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化７】
2018525015.tif 000008
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、ターゲティング配列は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域内の、８またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的である］
である。一部の実施形態では、連続ヌクレオチドは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の８またはこれを超える連続ヌクレオチドの標的領域を含む。
多様な実施形態では、Ｎｕは独立に、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、または１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）である。
【００２２】
多様な実施形態では、ターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号４〜１６から選択されるか、（ｃ）配列番号４〜１６から選択されるターゲティング配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または、（ｄ）配列番号４〜１６から選択されるターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号４〜１６の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【００２３】
一部の実施形態では、式（Ｉ）のターゲティング配列は、
ａ）配列番号７（ＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１６である）、
ｂ）配列番号８（ＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１８である）、および
ｃ）配列番号６（ＧＸＡＡＧＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは２３である）、
から選択され、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号６〜８の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号６〜８の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【００２４】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【００２５】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【００２６】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは５ｍＣである。
【００２７】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【００２８】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＴである。
【００２９】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＵである。
【００３０】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｙは５ｍＣである。
【００３１】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＹはＣである。
【００３２】
多様な実施形態では、式（Ｉ）のＲ１は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、Ｒ１基のうちの約５０〜約９０％は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、
【化８】
2018525015.tif 000009
から選択される。
【００３３】
多様な実施形態では、Ｔは、式：
【化９】
2018525015.tif 000010
［式中、Ａは、−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６は、式：
【化１０】
2018525015.tif 000011
を有し、式中、Ｒ１０は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである。
【００３４】
多様な実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）：
【化１１】
2018525015.tif 000012
の化合物または薬学的に許容されるその塩［式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１２】
2018525015.tif 000013
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８およびＲ１から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化１３】
2018525015.tif 000014
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化１４】
2018525015.tif 000015
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化１５】
2018525015.tif 000016
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは式
【化１６】
2018525015.tif 000017
であり、式中、該ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、該ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
以下の条件のうち少なくとも１つが存在する：
ａ）少なくとも１つのＲ１は式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）である、または
ｂ）Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化１７】
2018525015.tif 000018
である。
【００３５】
種々の実施形態では、化合物（Ｖ）のターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、（ｂ）配列番号４〜１６から選択されるか、（ｃ）配列番号４〜１６から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または（ｄ）配列番号４〜１６から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号４〜１６の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【００３６】
一部の実施形態では、式（Ｖ）のターゲティング配列は、
ａ）配列番号７（ＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１６である）、
ｂ）配列番号８（ＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１８である）、および
ｃ）配列番号６（ＧＸＡＡＧＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは２３である）
から選択され、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号６〜８の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号６〜８の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【００３７】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【００３８】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【００３９】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは５ｍＣである。
【００４０】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【００４１】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＴである。
【００４２】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＵである。
【００４３】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｙは５ｍＣである。
【００４４】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＹはＣである。
【００４５】
一部の実施形態では、ターゲティング配列は配列番号４〜１６から選択される。
【００４６】
多様な実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、細胞取込みを増強するペプチド部分をさらに含む。
【００４７】
種々の態様では、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域における８またはそれより多くの連続ヌクレオチドに相補的なターゲティング配列を含む修飾アンチセンスオリゴマーが提供される。一部の実施形態では、連続ヌクレオチドは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の８またはそれより多くの連続ヌクレオチドの標的領域を含む。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６のうちの１つを含むか、（ｂ）配列番号４〜１６から選択されるか、（ｃ）配列番号４〜１６から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または（ｄ）配列番号４〜１６から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。種々の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号４〜１６を含む。
【００４８】
また、生理学的に許容される担体と、本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーとを含む医薬組成物も含まれる。
【００４９】
多様な態様は、それを必要とする被験体において、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の、本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーを投与するステップを含む方法に関する。そのような方法は、エクソン欠失ＳＭＮ２  ｍＲＮＡに対するエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルが増強され、それにより患者を処置するように、ＳＭＮ２遺伝子内の領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性を有するヌクレオチド配列を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与するステップを含む。多様な実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを含む。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ部分を含む。
【００５０】
機能的な生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質の発現を増大させるための方法は、それを必要とする被験体に修飾アンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、ここで、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡの標的領域に結合し、機能的なＳＭＮタンパク質の発現が増大される。エクソン７を含有するＳＭＮ２  ｍＲＮＡの発現が、増大される。多様な実施形態では、標的はＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の領域である。さらなる実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７内の領域である。さらなる実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ部分を含む。
【００５１】
種々の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを投与することは、エクソン７を有するＳＭＮ２のｍＲＮＡの量における少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大をもたらす。
【００５２】
種々の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを投与することは、発現される機能的ＳＭＮタンパク質の量における少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大をもたらす。
【００５３】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置するための医薬であって、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域中の８またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列であって、連続ヌクレオチドが、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の８またはこれを超える連続ヌクレオチドの標的領域を含む、ターゲティング配列とを含む８〜４０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマー化合物を含む医薬が提供される。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ部分を含む。
【００５４】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の進行を阻害する方法は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡの標的領域に結合し、機能的なＳＭＮタンパク質の翻訳を増大させる本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを投与するステップを含む。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ部分を含む。
【００５５】
それを必要とする被験体において脊髄性筋萎縮症を処置する方法は、多様な実施形態では、有効量の本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを被験体に投与するステップを含み、ここで、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡの標的領域に結合し、機能的なＳＭＮタンパク質の発現が増大される。さらなる態様は、脊髄性筋萎縮症を処置するための医薬の調製において使用するための修飾アンチセンスオリゴマーを含む。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ部分を含む。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法は、有効量の本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを被験体に投与することによって、被験体における機能的なＳＭＮタンパク質の発現レベルを対照と比べて少なくとも約１０％だけ増大させるステップを含む。一部の実施形態では、被験体における機能的なＳＭＮタンパク質のレベルは、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００％だけ増大される。
【００５７】
以下の詳細な記載および添付の図面を参照すれば、本開示のこれらの態様および他の態様が明らかとなるであろう。本明細書で開示される全ての参考文献は、あたかも各々が個別に組み込まれたように、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】図１Ａは、修飾オリゴマーの実施形態を例示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしたアンチセンスオリゴマーを例示する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしたアンチセンスオリゴマーを例示する。
【図１ＤＥＦＧ】図１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、および１Ｇは、Ｄ〜Ｇと称する、例示的なホスホロジアミデートモルホリノベースのオリゴマーの、反復サブユニットセグメントを例示する。
【００５９】
【図２Ａ】図２Ａは、トリチルピペラジンフェニルカルバメートの調製を例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、樹脂／試薬混合物の調製を例示する。
【００６０】
【図３】図３は、イントロン７中の重複領域をターゲティングするホスホロジアミデートモルホリノベースのオリゴマー（ＰＭＯベースのオリゴマー）のインビトロのエクソン７包含率を示す。ｘ軸に表される０．００３μＭ〜１０μＭの複数の用量を、ＧＭ０３８１３、ＳＭＡ患者由来線維芽細胞で試験した。ｙ軸に表されるエクソン７包含率は、エクソン７が包含された増幅産物およびエクソン７が排除された増幅産物の強度から算出した。
【００６１】
【図４】図４は、イントロン７をターゲティングするＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率を示す。ｘ軸に表される０．０１μＭ〜１μＭの複数の用量を、ＧＭ０３８１３線維芽細胞で試験した。ｙ軸に表されるエクソン７包含率は、エクソン７が包含された増幅産物およびエクソン７が排除された増幅産物の強度から算出した。
【００６２】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、異なる長さを有するＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率を示す。１８量体および２０量体のデータは図５Ａに示されており、１８量体および２５量体のデータは図５Ｂに示されている。０．００１μＭ〜１μＭの複数の用量をＧＭ０３８１３線維芽細胞で試験したが、ｘ軸に表されている。ｙ軸に表されるエクソン７包含率は、エクソン７が包含された増幅産物およびエクソン７が排除された増幅産物の強度から算出した。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、異なる長さを有するＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率を示す。１８量体および２０量体のデータは図５Ａに示されており、１８量体および２５量体のデータは図５Ｂに示されている。０．００１μＭ〜１μＭの複数の用量をＧＭ０３８１３線維芽細胞で試験したが、ｘ軸に表されている。ｙ軸に表されるエクソン７包含率は、エクソン７が包含された増幅産物およびエクソン７が排除された増幅産物の強度から算出した。
【００６３】
【図６】図６は、異なる化学修飾を有するＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率を示す。同じ領域をターゲティングする２’−ＯＭｅ修飾アンチセンスオリゴマーを同様に試験した。ｘ軸に表される０．００３μＭ〜１μＭの複数の用量を、ＧＭ０３８１３線維芽細胞で試験した。ｙ軸に表されるエクソン７包含率は、エクソン７が包含された増幅産物およびエクソン７が排除された増幅産物の強度から算出した。
【００６４】
【図７Ａ】図７Ａは、異なる化学修飾を有するＰＭＯベースのオリゴマーによって誘導した場合のエクソン７含有ＳＭＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。ＰＭＯベースのオリゴマーと同じ領域をターゲティングする２’−ＯＭｅ修飾アンチセンスオリゴマーを並行して試験した。ＳＭＮ２タンパク質を、抗ＳＭＮ抗体でブロットした。アクチンを、ローディング対照として抗アクチン抗体で検出した。
【００６５】
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＭＮタンパク質に対応するバンドの平均定量強度を図７Ａに示す各実験群について表す。
【００６６】
【図８】図８Ａは、２０μｇのＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓもしくはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ化合物または生理食塩水のいずれかで処置したＳＭＮΔ７マウスの生存曲線を示す。各マウスは、Ｐ１（出生翌日）に生理食塩水またはＰＭＯベースのオリゴマーの脳室内（ＩＣＶ）注射で処置した。各実験群の最初のマウス数と比較した任意の残りのマウスの百分率がｙ軸に表されている。図８Ｂは、実験を通しての各実験群の体重増加を示す。生理食塩水で処置した野生型マウスの群を参照として使用した。
【００６７】
【図９】図９Ａは、２０μｇのＰＭＯ−、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓもしくはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ化合物または生理食塩水で処置したＳＭＮΔ７マウスの立直り反射を示す。生理食塩水で処置した野生型マウスの群を参照として使用した。各マウスは、Ｐ１（出生翌日）に脳室内（ＩＣＶ）注射で処置し、立直り反射試験は４日目から定期的に実施した。マウスが立ち上がるのに要した時間を測定したが、各実験群の平均時間がｙ軸に秒（ｓ）で表されている。図９Ｂは、実験を通して定期的に測定した各実験群の握力試験を示す。メッシュを握るためにマウスがかけた力のピーク量を測定し、各群の平均力がｙ軸にグラム（ｇ）で表されている。得られたデータは、ＰＭＯベースのオリゴマーのサブセットが平均力を野生型マウスのものに正常化したことを示している。具体的には、驚くべきことにＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙは、１４日目からの研究期間を通しておよび延長された生存期間の間、握力を野生型マウスに正常化した。
【００６８】
【図１０Ａ】図１０Ａは、図７Ａで試験されたマウスから得られた試料中のエクソン７含有ＳＭＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。ＳＭＮ２タンパク質を、抗ＳＭＮ抗体でブロットした。アクチンを、ローディング対照として抗アクチン抗体で検出した。Ｗ１〜Ｗ４は、４匹の異なる生理食塩水処置野生型マウス由来の頸髄試料を表している。Ｓ１〜Ｓ３は、３匹の異なる生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウス由来の頸髄試料を表している。Ａ１は、ＰＭＯ−３で処置したＳＭＮΔ７マウスから得られた頸髄試料を表している。Ｂ１〜Ｂ６は、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６で処置した６匹の異なるＳＭＮΔ７マウス由来の頸髄試料を表している。Ｃ１〜Ｃ２およびＤ１は、それぞれ、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−８およびＰＭＯ−Ｒ６−Ｇｌｙ−３で処置したＳＭＮΔ７マウス由来の頸髄試料を表している。
【００６９】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＳＭＮタンパク質に対応するバンドの平均定量強度を図１０Ａに示す各実験群について表す。
【００７０】
【図１１】図１１は、２０μｇの２つの異なる長さを有するＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓもしくはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ化合物または生理食塩水のいずれかで処置したＳＭＮΔ７マウスの生存曲線を示す。生理食塩水で処置した野生型マウスの群を参照として使用した。各マウスは、Ｐ１（出生翌日）に生理食塩水またはＰＭＯベースのオリゴマーの脳室内（ＩＣＶ）注射で処置した。各実験群の最初のマウス数と比較した任意の残りのマウスの百分率がｙ軸に表されている。
【図１２】図１２は、図１１に示す実験を通しての各実験群の体重増加を示す。生理食塩水で処置した野生型マウスの群を参照として使用した。統計解析は、線形回帰で行った。
【００７１】
【図１３】図１３は、図１１に示す実験を通して定期的に測定した各実験群の握力試験を示す。メッシュを握るためにマウスがかけた力のピーク量を測定し、各群の平均力がｙ軸にグラム（ｇ）で表されている。
【００７２】
【図１４Ａ】図１４Ａは、図１１で試験されたマウスから得られた試料中のエクソン７含有ＳＭＮタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。ＳＭＮ２タンパク質を、抗ＳＭＮ抗体でブロットした。アクチンを、ローディング対照として抗アクチン抗体で検出した。ＷＴ１〜ＷＴ３は、３匹の異なる生理食塩水処置野生型マウス由来の頸髄試料を表している。Ｓ１〜Ｓ３は、３匹の異なる生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウス由来の頸髄試料を表している。Ｂ１〜Ｂ５は、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６で処置した５匹の異なるＳＭＮΔ７マウスから得られた頸髄試料を表している。Ｃ１〜Ｃ４は、ＰＭＯ−２で処置した４匹の異なるＳＭＮΔ７マウスから得られた頸髄試料を表している。Ｄ１〜Ｄ３は、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１１で処置した３匹の異なるＳＭＮΔ７マウスから得られた頸髄試料を表している。Ｅ１〜Ｅ４は、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−３で処置した４匹の異なるＳＭＮΔ７マウスから得られた頸髄試料を表している。最後にＦ１は、ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−２で処置したＳＭＮΔ７マウスから得られた頸髄試料を表している。
【００７３】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＳＭＮタンパク質に対応するバンドの平均定量強度を図１４Ａに示す各実験群について表す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
詳細な説明
Ｉ．定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な、任意の方法および材料を、本開示の主題の実施または試験において使用しうるが、好ましい方法および材料について記載する。本開示の目的で、下記では、以下の用語について規定する。
【００７５】
本明細書では、冠詞の「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」を、冠詞の文法的対象物の１つまたは１つを超える対象物（すなわち、少なくとも１つの対象物）を指すのに使用する。例を目的として述べると、「ある要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００７６】
用語「約」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほど変動する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。「約」という用語は、数的範囲と共に使用される場合、記載の数値の上下に境界を広げることによってその範囲を改変する。一般に、「約」という用語は、記述された値の上下に１０％以下の変動だけ数値を改変するように意図される。
【００７７】
用語「配列」および「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与する、任意の核酸配列を意味する。これに対して、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに直接寄与しない、任意の核酸配列を指す。
【００７８】
本開示を通して、文脈によりそうでないことが要請されない限り、「〜を含む」、「〜を含む」、および「〜を含むこと」という語は、言明されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は含意しないことが理解されるであろう。
【００７９】
用語「〜からなること」は、「〜からなること」という語句に後続するあらゆる語句を含み、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなること」という語句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを指し示す。用語「〜から本質的になること」は、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、列挙される要素について、本開示で指定される活性または作用に干渉または寄与しない、他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になること」という語句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙される要素の活性または作用に、実質的に影響を及ぼすのかどうかに応じて、存在してもよく、存在しなくてもよいことを示す。
【００８０】
「〜を投与すること」または「〜を投与する」という用語は、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの、被験体への、局所投与または全身投与による送達を含む。投与は、局所投与（眼投与、ならびに膣送達および直腸送達を含む、粘膜への投与を含む）、例えば、噴霧器による投与を含む、粉末またはエアゾールによる吸入または送気による、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、経口投与、または非経口投与でありうる。非経口投与は、静脈内注射もしくは静脈内注入、動脈内注射もしくは動脈内注入、皮下注射もしくは皮下注入、腹腔内注射もしくは腹腔内注入、または筋内注射もしくは筋内注入；あるいは頭蓋内投与、例えば、髄腔内投与または脳室内投与を含む。
【００８１】
「細胞を接触させること」、「導入すること」、または「送達すること」という用語は、本開示のオリゴマーの、細胞への、当技術分野で慣例的な方法、例えば、トランスフェクション（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン）、エレクトロポレーション（例えば、ヌクレオフェクション）、マイクロインジェクション）による送達を含む。
【００８２】
「アルキル」という用語は、直鎖状（すなわち、非分枝状または非環式）、分枝状、環式、または多環式非芳香族の炭化水素基であって、任意選択で、１または複数の官能基により置換された炭化水素基を指す。そうでないことが指定されない限りにおいて、「アルキル」基は、１〜８個の炭素原子を含有し、好ましくは、１〜６個の炭素原子を含有する。Ｃ１〜Ｃ６アルキルとは、Ｃ１アルキル基、Ｃ２アルキル基、Ｃ３アルキル基、Ｃ４アルキル基、Ｃ５アルキル基、およびＣ６アルキル基を含むことを意図する。低級アルキルとは、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を指す。アルキルの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルなどを含むがこれらに限定されない。アルキルは、置換アルキルの場合もあり、非置換アルキルの場合もある。例示的な置換アルキル基は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、３−フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、ベンジル、置換ベンジル、フェネチル、置換フェネチルなどを含むがこれらに限定されない。
【００８３】
「アルコキシ」という用語は、アルキルのサブセットであって、上記で規定した、表示の数の炭素を伴うアルキル基が、酸素架橋を介して結合しているサブセットを指す。例えば、「アルコキシ」とは、直鎖状立体配置、分枝状立体配置、環式立体配置である、１〜８個の炭素原子を含有する−Ｏ−アルキル基を指す。「アルコキシ」の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ペントキシなどを含むがこれらに限定されない。
【００８４】
単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、または「アリールオキシアルキル」における通り、より大型の部分の一部として使用される「アリール」という用語は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、および２−アントラシルなど、６〜１４個の環原子を有する芳香環基を指す。「アリール」環は、１または複数の置換基を含有しうる。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用することができる。「アリール」はまた、芳香環を１または複数の環へと縮合させた、縮合多環式芳香環系も含む。有用なアリール環基の非限定的な例は、フェニル、ヒドロキシフェニル、ハロフェニル、アルコキシフェニル、ジアルコキシフェニル、トリアルコキシフェニル、アルキレンジオキシフェニル、ナフチル、フェナントリル、アントリル、フェナントロなどのほか、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、および２−アントラシルを含む。本明細書で使用される「アリール」という用語の範囲内にはまた、芳香環を１または複数の非芳香環へと縮合させた基であって、ラジカルまたは結合点が芳香環上にある、インダニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルなどにおける基も含まれる。
【００８５】
「アシル」という用語は、Ｃ（Ｏ）Ｒ基（式中、Ｒは、上記で規定したＨ、アルキル、またはアリールを意味する）を指す。アシル基の例は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、フェニルアセチル、および類似の基を含む。
【００８６】
「同族化合物」という用語は、同じ化学基の逐次的付加により規則的に異なる化合物を指す。例えば、化合物の同族化合物は、１または複数の−ＣＨ２−基、アミノ酸残基、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体の付加により異なりうる。
【００８７】
「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）または「細胞取込みを増強するペプチド部分」という用語は、互換的に使用され、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、または「ペプチド導入ドメイン」ともまた呼ばれる、カチオン性細胞透過性ペプチドを指す。例えば、ペプチドコンジュゲートホスホルアミデートまたはホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＰＭＯ）は、本明細書で記載される、細胞取込みを増強する細胞透過性ペプチドまたは細胞透過性ペプチド部分を含みうる。多様な実施形態では、ペプチドは、修飾アンチセンスオリゴマーに共有結合させることができる。さらなる実施形態では、ペプチドは、修飾アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートさせることができる。さらなる実施形態では、ペプチドは、３’末端のモルホリノ環のピペラジニル部分または窒素原子へと連結することができる。一部の実施形態では、細胞取込みを増強する、細胞透過性ペプチドまたは細胞透過性ペプチド部分は、本明細書で記載される、アルギニンに富むペプチドを含みうる。非限定的例では、本明細書で開示される通りの修飾アンチセンスオリゴマーは、（Ａｒｇ）６Ｇｌｙ（アルギニン６個およびグリシン１個がオリゴヌクレオチドに連結される）などのアルギニンに富むペプチドに結合されてよい。
【００８８】
本明細書で示されるペプチドは、全身投与されると、所与の細胞培養物集団の細胞のうちの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、または少なくともほぼこれらの比率の細胞内の細胞透過を誘導し、インビボにおいて、複数の組織内の高分子のトランスロケーションを可能とする能力を有する。一部の実施形態では、ＣＰＰは、式−［（Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ）ｍ］Ｒ’’［式中、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸、またはその１炭素同族化合物もしくは２炭素同族化合物の側鎖であり、Ｒ’’は、水素またはアシルから選択され、ｍは、最大で５０の整数である］を有する。当技術分野では、さらなるＣＰＰも周知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１０００１６２１５号において開示されている。他の実施形態では、ｍは、１〜５０から選択される整数であり、ここで、ｍが１である場合、部分は、単一のアミノ酸またはその誘導体である。
【００８９】
「アミノ酸」という用語は、一級アミノ基、カルボン酸基、側鎖、および水素原子が結合している炭素原子を含む化合物を指す。例えば、「アミノ酸」という用語は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸、ヒスチジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、システイン、グルタミン酸、セリン、チロシン、ピロリシン、セレノシステイン、およびアルギニンを含むがこれらに限定されない。加えて、本明細書で使用される「アミノ酸」はまた、エステル、およびアミド、および塩など、アミノ酸の誘導体のほか、活性形態へと代謝されると薬理学的特性を有する誘導体を含む、他の誘導体も含む。したがって、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含むことが理解される。
【００９０】
「電子対」という用語は、他の原子と結合しないかまたは共有されていない、電子の原子価対を指す。
【００９１】
「相同性」という用語は、同一なアミノ酸、または保存的置換を構成するアミノ酸の百分率数を指す。相同性は、ＧＡＰなどの配列比較プログラムを使用して決定することができる（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３８７〜３９５頁）。このようにして、本明細書で引例される配列と、類似の長さまたは実質的に異なる長さの配列を、アラインメントへのギャップの挿入により比較することができ、このようなギャップを、例えば、ＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定する。
【００９２】
「単離された」という用語は、その生来の状態では通常それに随伴する成分を、実質的または本質的に含まない材料を指す。例えば、本明細書で使用される「単離オリゴヌクレオチド」または「単離オリゴマー」とは、天然に存在する状態ではそれを挟む配列から精製されるかまたは取り出されたオリゴマー、例えば、ゲノム内の断片に隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す場合がある。細胞に関する場合の、「〜を単離すること」という用語は、細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の、供給源となる被験体（例えば、オリゴヌクレオチドリピート病を伴う被験体）からの精製を指す。ｍＲＮＡまたはタンパク質の文脈では、「〜を単離すること」とは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の、供給源、例えば、細胞からの回収を指す。
【００９３】
「〜をモジュレートする」という用語は、１または複数の定量化可能なパラメータを、任意選択で、規定された量および／または統計学的に有意な量で「増加」または「減少」させることを含む。「〜を増加させる」もしくは「〜を増加させること」、「〜を増強する」もしくは「〜を増強すること」、または「〜を刺激する」もしくは「〜を刺激すること」とは一般に、１または複数の修飾アンチセンスオリゴマー化合物または組成物が、細胞または被験体において、アンチセンスオリゴマー化合物を伴わずに引き起こされる応答、または対照化合物により引き起こされる応答と比べて、より大きな生理学的応答（すなわち、下流における効果）をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。関係のある生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者には明らかであり、ＳＭＮ２  ｍＲＮＡにおけるエクソン７の包含の増加、および／または細胞、もしくは例えばそれを必要とする被験体の組織における機能的なＳＭＮタンパク質の発現の増加を含みうる。「減少された」または「低減された」量とは、典型的には、「統計学的に有意な」量であり、修飾アンチセンスオリゴマー化合物の投与の非存在下で、それを必要とする被験体によりもたらされる量（例えば、特定の被験体またはコホートの、「生来」または「天然」の発現率）、または対照化合物によりもたらされる量の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０分の１またはこれ未満（例えば、１００、５００、１０００分の１）であって、全ての整数およびそれらの間にあり１より大きい小数（ｄｅｃｉｍａｌ  ｐｏｉｎｔ）（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９）を含む分数の減少を含みうる。「〜を低減する」または「〜を阻害する」という用語は一般に、１または複数のアンチセンスオリゴマー化合物または組成物が、本明細書で記載される疾患または状態の症状など、関与性の生理学的応答または細胞応答であって、診断技術分野で慣例的な技法に従い、測定される応答「を減少させる」能力に関する場合がある。「増加した」または「増強された」量とは通常、「統計学的に有意な」量であり、修飾アンチセンスオリゴマー化合物の投与の非存在下で、それを必要とする被験体によりもたらされる量（例えば、特定の被験体またはコホートの「生来の」または「天然の」発現率）または対照化合物によりもたらされる量に対して、全ての整数およびその間にあって１より大きい小数（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９）を含めて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれを超える（例えば、１００、５００、１０００倍）増加を含みうる。「〜を増強する」という用語は一般に、１または複数の修飾アンチセンスオリゴマー化合物または組成物が、本明細書で記載される疾患または状態の症状などの関係のある生理学的応答または細胞応答を、診断技術分野における慣例的な技法に従って測定したとき「増加させる」能力に関しうる。
【００９４】
関係のある生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者には明らかであり、ＳＭＡ  Ｉ型、ＳＭＡ  ＩＩ型、ＳＭＡ  ＩＩＩ型およびＳＭＡ  ＩＶ型などの脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の症状または病変の軽減を包含し得る。他の実施形態では、例えば、症状または病変の軽減が、機能的なＳＭＮタンパク質の発現の増加に随伴するか、またはこれに関連しうる、脊髄性筋萎縮症を処置する方法が提供される。応答の「増加」は、修飾アンチセンスオリゴマー化合物の投与の非存在下で、それを必要とする被験体によりもたらされる応答（例えば、特定の被験体またはコホートの「生来の」または「天然の」発現率）または対照化合物によりもたらされる応答に比べて「統計学的に有意」であり得、間にある全ての整数を含めて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の増加を含みうる。
【００９５】
ＳＭＮタンパク質に関しての「機能的」という用語は、エクソン７が含まれているｍＲＮＡ転写由来のおよび／または野生型もしくは正常ＳＭＮタンパク質の機能性を保有しているＳＭＮタンパク質を包含する。
【００９６】
非機能的、機能不全または不活性タンパク質は、エクソン７が除かれたｍＲＮＡ転写物由来のおよび／または野生型ＳＭＮタンパク質の機能性をほとんど乃至全く有しないタンパク質を包含する。
【００９７】
したがって、多様な実施形態では、機能的なＳＭＮタンパク質の存在、発現または発現の増大は、例えば、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーで処置したＳＭＡ患者由来線維芽細胞のウエスタンブロット分析およびＳＭＮ２遺伝子発現によって判定することができる。多様な実施形態では、ＳＭＡ線維芽細胞またはＳＭＡの処置を必要とする被験体を本開示の修飾アンチセンスオリゴマーで処置すると、例えば、正常細胞または正常被験体における正常なＳＭＮタンパク質発現量の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％、または上で開示した百分位数範囲のいずれかである量でのエクソン７含有ＳＭＮタンパク質の発現をもたらしうる。
【００９８】
多様な実施形態では、組織またはＳＭＡの処置を必要とする被験体によって発現されたエクソン７包含ＳＭＮタンパク質の機能性は、例えば、筋肉中の神経筋接合部の構造、脊髄中の運動ニューロンの量および質、非処置同等物と比較した場合のエクソン７含有ＳＭＮタンパク質の量の免疫組織化学分析によって判定することができる。ＳＭＡの処置を必要とする被験体のエクソン７包含ＳＭＮタンパク質の機能性は、筋肉サイズの測定、筋緊張、圧痛、強さ、反射、筋肉の不随意運動、筋電図検査、神経伝達速度試験、および心電図（ＥＫＧまたはＥＧＧ）を含む心血管系機能試験を含む運動機能試験などの身体および生理学的試験によってさらに分析することができる。
【００９９】
この場合では、修飾アンチセンスオリゴマーを使用してエクソン７包含を誘起した結果として、非処置に比べて約３０％〜約１００％の範囲または機能性に関して上で開示した百分率で、脊髄性筋萎縮症症状が改善される（すなわち、ＳＭＮタンパク質の機能性または安定性が回復する）。症状のそのような改善は、ミクロレベル（すなわち、例えば、免疫組織化学、免疫蛍光、ウエスタンブロット分析によって測定される、ＳＭＮ１／２タンパク質発現の回復；運動ニューロンの増大；筋肉中の神経筋接合部の回復）および生理学的レベル（すなわち、身体検査によって評価される運動機能の改善）で観察することができる。
【０１００】
「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオ塩基と、糖と、少なくとも１つのリン酸基（例えば、ホスホジエステル連結基）とを含む、天然に存在するヌクレオチドを指す。
【０１０１】
「ヌクレオチド類似体」という用語は、天然に存在するヌクレオチドの誘導体、または天然に存在するヌクレオチドに対する修飾、例えば、少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチドを指す。このような修飾は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せのうちの少なくとも１つを含みうる。当業者は、修飾を、ヌクレオチドサブユニットのうちの任意の１つの構成要素（例えば、修飾糖）に関して指定する場合、ヌクレオチドサブユニットのうちの、指定されていない部分は、依然として非修飾（例えば、非修飾ヌクレオシド間連結、非修飾ヌクレオ塩基）でありうることを察知すると予想される。
【０１０２】
「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンスオリゴマー」、「修飾アンチセンスオリゴマー」および「アンチセンスオリゴ」という用語、ならびにこれらの他の適切な組合せおよび派生語は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の直鎖状配列であって、１または複数のヌクレオ塩基が、ワトソン−クリック塩基対合により、標的配列と称される、オリゴマーが指向される標的ＲＮＡの部分とハイブリダイズして、標的配列内で、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成しうる直鎖状配列を指す。具体的に、「アンチセンス」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」、および「化合物」という用語は、このようなオリゴマーを指すように、多様な組合せで、かつ、互換的に使用することができる。ヌクレオチドの部分を含む環式サブユニットは、リボースまたは別の五炭糖、糖類似体に基づく場合もあり、ある特定の実施形態では、修飾糖、例えば、モルホリノ基である場合もある（下記のモルホリノベースのオリゴマーについての記載を参照されたい）。
【０１０３】
オリゴマーに言及する場合の、「修飾された」、「天然に存在しない」、または「類似体」という用語、ならびにこれらの他の適切な組合せおよび派生形は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される、標準的なホスホジエステル連結以外のヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド内に見出される、リボース部分もしくはデオキシリボース部分以外の部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せから選択される、少なくとも１つの修飾を有する、１または複数のヌクレオチドサブユニットを有するオリゴマーを指す。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。多様な実施形態では、修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットから選択される。
【０１０４】
ヌクレオシド間連結への修飾は、オリゴマーの、少なくとも２つの糖部分および／または修飾糖部分の間の修飾でありうる。ヌクレオチド類似体は、ワトソン−クリック塩基対合により、天然に存在するオリゴヌクレオチド塩基への水素結合が可能な塩基を担い、ここで、類似体は、オリゴマー類似体分子と、天然に存在するオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）内の塩基との間で、配列特異的に、このような水素結合を可能とするように、塩基を提示する。例示的な類似体は、実質的に非荷電の、リンを含有するヌクレオシド間連結を有する類似体である。
【０１０５】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマーとは、そのヌクレオシド間連結が、非ハイブリダイズ形態でも、ハイブリダイズ形態でも、ヌクレアーゼによる切断であって、体内の、一般的な、細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼによる（例えば、３’−エクソヌクレアーゼなどのエクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＨによる）切断に対
して実質的に耐性であるオリゴマーを指す；すなわち、オリゴマーは、オリゴマーが曝露される、体内の正常なヌクレアーゼ条件下で、ヌクレアーゼによる切断を、ほとんどまたは全く示さない。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、ヘテロ二重鎖が、細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼによる、インビボにおける分解であって、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体または二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断することが可能な分解に対して、実質的に耐性となるように、修飾アンチセンスオリゴマーの、その相補的な標的への結合により形成されるヘテロ二重鎖を指す。「ヘテロ二重鎖」とは、修飾アンチセンスオリゴマーと、標的ＲＮＡの相補的部分との二重鎖を指す。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴマーは、本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーでありうる。
【０１０６】
「ヌクレオ塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」という用語は、自然発生または「生来」のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）のほか、天然に存在するプリンおよびピリミジンの類似体であって、結合アフィニティーなど、改善された特性を、オリゴマーへと付与する類似体において見出される、プリン塩基またはピリミジン塩基を指すように、互換的に使用される。例示的な類似体は、ヒポキサンチン（ヌクレオシドであるイノシンの塩基成分）；２，６−ジアミノプリン；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン；１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル（Ｇクランプ）などを含む。
【０１０７】
塩基対合部分のさらなる例は、それらのそれぞれのアミノ基を、アシル保護基で保護した、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、およびヒポキサンチン（イノシン）、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、シュードイソシトシンおよびシュードウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８−置換プリン、８−置換キサンチン、または８−置換ヒポキサンチン（後者の２つは、天然の分解産物である）など、他の修飾ヌクレオ塩基を含むがこれらに限定されない。それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＣｈｉｕおよびＲａｎａ、ＲＮＡ、２００３年、９巻、１０３４〜１０４８頁、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、２２巻、２１８３〜２１９６頁；ならびにＲｅｖａｎｋａｒおよびＲａｏ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７巻、３１３頁において開示されている修飾ヌクレオ塩基もまた想定される。
【０１０８】
塩基対合部分のさらなる例は、１または複数のベンゼン環を付加したサイズ拡大型ヌクレオ塩基を含むがこれらに限定されない。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴら、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、２００７年、４０巻、１４１〜１５０頁；Ｋｏｏｌ，  ＥＴ、Ａｃｃ．
Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、２００２年、３５巻、９３６〜９４３頁；Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．ら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、２００５年、６巻、５５３〜５４３頁；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００３年、７巻、７２３〜７３３頁；Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００６年、１０巻、６２２〜６２７頁（これらの内容は、本明細書において参考として援用される）において記載されている核塩基置換（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｂａｓｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）も、本明細書で記載されるオリゴマーの合成に有用であると想定される。サイズ拡大型ヌクレオ塩基の例を、下記：
【化１８】
2018525015.tif 000019
に示す。
【０１０９】
リボース、糖類似体、修飾糖、またはモルホリノに共有結合的に連結されたヌクレオ塩基は、ヌクレオシドを含む。「ヌクレオチド」は、少なくとも１つの連結リン酸基と併せたヌクレオシドを含む。リン酸基は、オリゴマーを形成するように、隣接するヌクレオチドへの共有結合的連結を含む。こうして、ヌクレオチドのリン酸基は一般に、「ヌクレオシド間連結」を形成すると称する。したがって、ヌクレオチドは、本明細書でさらに記載されるヌクレオシドと、ヌクレオシド間連結とを含む。一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、サブユニットを含み、ここで、「サブユニット」は、天然に存在するヌクレオチド、本明細書で記載されるヌクレオチド類似体、およびこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、サブユニットを含み、ここで、少なくとも１つのサブユニットは、ヌクレオチド類似体である。
【０１１０】
「ＰＭＯ−ＡＰＮ」という用語は、ジメチルアミノホスホロジアミデート連結および２−（４−アミノピペラジニル）ホスホロジアミデート連結（「ＡＰＮ」連結とも称される）からそれぞれ独立に選択されるサブユニット間連結を含むホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｔａｔｅ）モルホリノオリゴマーを指し、ここで少なくとも１つのサブユニット間連結は、ＡＰＮ連結である。例えば、本開示の一部の実施形態では、「ＰＭＯ−ＡＰＮ」は、例えば式（Ｉ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩａ）の化合物の各Ｒ１が
【化１９】
2018525015.tif 000020
（ＡＰＮ連結について）および−Ｎ（ＣＨ３）２（ジメチルアミノホスホロジアミデート連結について）から独立に選択され、少なくとも１つのＲ１が
【化２０】
2018525015.tif 000021
である（ＡＰＮ連結について）ものを含む。
【０１１１】
「ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ」という用語は、ジメチルアミノホスホロジアミデート連結および１−ピペラジニルホスホロジアミデート連結（「Ｐｌｕｓ」連結とも称される）からそれぞれ独立に選択されるサブユニット間連結を含むホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｔａｔｅ）モルホリノオリゴマーを指し、ここで少なくとも１つのサブユニット間連結は、Ｐｌｕｓ連結である。例えば、本開示の一部の実施形態では、「ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ」は、例えば式（Ｉ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩＩ）および（ＶＩＩＩａ）の化合物の各Ｒ１が
【化２１】
2018525015.tif 000022
（Ｐｌｕｓ連結について）および−Ｎ（ＣＨ３）２（ジメチルアミノホスホロジアミデート連結について）から独立に選択され、少なくとも１つのＲ１が
【化２２】
2018525015.tif 000023
である（Ｐｌｕｓ連結について）ものを含む。
【０１１２】
「ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ」という用語は、ジメチルアミノホスホロジアミデート連結および、グリシンリンカーによってオリゴマーの３’または５’末端のいずれかに連結された６個のアルギニン残基からなる細胞透過性ペプチド（下にさらに詳細に考察される「ＣＰＰ」）を含むホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。３’連結ＣＰＰについて、例えば、グリシンは、アミド結合によって最も３’側のモルホリノサブユニット環窒素に結合されてよい。５’連結ＣＰＰについて、グリシンはアミド結合によってＰＩＰ基の環窒素に連結されてよい。「ＰＩＰ」は、式：
【化２３】
2018525015.tif 000024
の化学部分を指す。
【０１１３】
「２’−ＯＭｅ」という用語は、下にさらに記載する２’−Ｏメチルホスホロチオエートオリゴマーを指す。
【０１１４】
「ＰＭＯ−ＥＴｐｉｐＴ」という用語は、ジメチルアミノホスホロジアミデート連結および１−（２−エチルピペラジニル）ホスホロジアミデート連結（ＥＴｐｉｐＴ連結とも称される）からそれぞれ独立に選択されるサブユニット間連結を含むホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｔａｔｅ）モルホリノオリゴマーを指し、ここで少なくとも１つのサブユニット間連結は、ＥＴｐｉｐＴ連結である。例えば、本開示の一部の実施形態では、「ＰＭＯ−ＥＴｐｉｐＴ」は、例えば式（Ｉ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩＩ）および（ＶＩＩＩａ）の化合物の各Ｒ１が
【化２４】
2018525015.tif 000025
（ＥＴｐｉｐＴ連結について）および−Ｎ（ＣＨ３）２（ジメチルアミノホスホロジアミデート連結について）から独立に選択され、少なくとも１つのＲ１が
【化２５】
2018525015.tif 000026
である（ＥＴｐｉｐＴ連結について）ものを含む。
【０１１５】
「配列同一性」および「配列相同性」という用語（例えば、「〜と５０％同一な配列」）は、配列が、ヌクレオチド対ヌクレオチドベースで、比較ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）にわたり同一である程度を指す。「同一性百分率」は、２つの最適にアラインメントされた配列を、比較ウィンドウにわたり比較し、両方の配列内で、同一な核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数をもたらし、マッチさせた位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率をもたらすことにより計算することができる。比較ウィンドウをアラインメントするための、配列の最適のアラインメントは、コンピュータへのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）の実行により行うこともでき、精査と、選択される多様な方法のうちのいずれかにより生成される、最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最高の相同性百分率をもたらすアラインメント）とにより行うこともできる。また、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁、１９９７年により開示されている通り、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照することができる。多様な実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、表１におけるターゲティング配列（配列番号４〜１６）に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１１６】
本明細書で使用される通り、融点（Ｔｍ）が、４０℃、４５℃、５０℃を実質的に超え、多様な実施形態では、６０℃〜８０℃またはこれを超える生理学的条件下で、オリゴマーが、標的とハイブリダイズする場合に、オリゴマーは、標的オリゴヌクレオチドと、「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応することが好ましい。所与のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔｍは、標的配列のうちの５０％が、相補的な配列とハイブリダイズする温度である。このようなハイブリダイゼーションは、修飾アンチセンスオリゴマーの、標的配列への「ほぼ（ｎｅａｒ）」または「実質的な」相補性により生じうるほか、正確な相補性によっても生じうる。一部の実施形態では、オリゴマーは、標的配列と、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％でハイブリダイズしうる。
【０１１７】
本明細書で使用される、「サブユニット」という用語は、天然に存在するヌクレオチド、または少なくとも１つの修飾を含む、天然に存在するヌクレオチドを指す。修飾は、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せのうちの少なくとも１つを含みうる。さらなる実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオ塩基を含みうる。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、「十分な長さ」という用語は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７などのＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の領域内の少なくとも８、より典型的には８〜４０の連続ヌクレオ塩基と相補的な修飾アンチセンスオリゴマーを指す。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ配列の標的領域と特異的にハイブリダイズすることが可能な、少なくともいくつかのヌクレオチドを含む。好ましくは、十分な長さのオリゴマーは、８〜３０ヌクレオチド、８〜２５ヌクレオチド、８〜２０ヌクレオチド、８〜１８ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２５ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１０〜１８ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜１８ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２５ヌクレオチド、または１８〜２０ヌクレオチド、これらの範囲の間の全ての整数を含めた長さである。好ましくは、修飾アンチセンスオリゴマーは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドの長さである。好ましくは、十分な長さのオリゴマーは、１８〜２５ヌクレオチドの長さである。
【０１１９】
本明細書で使用するとき「被験体」または「それを必要とする被験体」という用語は、ヒト被験体などの哺乳動物被験体を含む。例示的な哺乳動物被験体は、脊髄性筋萎縮症を有する。
【０１２０】
本明細書で使用するとき、「標的」または「標的領域」という用語は、本明細書で企図する修飾アンチセンスオリゴマーと関係している、プレｍＲＮＡ転写物内の領域を指す。多様な態様では、標的は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡの領域である。多様な態様では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７を含む領域である。多様な実施形態では、標的領域は、イントロン７の−７／−１４、−７／−１６、−１０／−２７、−１０／−２９、−１０／−３４、−１３７／−１５９、−１４９／−１７４、−１６７／−１８６、−２４９／−２７３もしくは−２８１／−２９９領域またはイントロン６の−５８／−３９、−１１２／−６７もしくは−２６４／−２４５領域を含む。好ましくは一部の態様では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−１０／−２７、−１０／−２９もしくは−１０／−３４領域を含む。
【０１２１】
多様な実施形態では、「ターゲティング配列」という用語は、アンチセンスオリゴマー内またはアンチセンスオリゴマー類似体内の配列であって、プレｍＲＮＡ転写物内の標的配列と相補的な配列を指す。修飾アンチセンスオリゴマーの全配列が、標的配列と相補的な場合もあり、アンチセンスオリゴマーの一部分だけが、標的配列と相補的な場合もある。例えば、１５〜３０塩基を有するオリゴマー内の、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個は、プレｍＲＮＡ転写物内の標的領域と相補的な配列（例えば、「ターゲティング配列」）を含有しうる。ターゲティング配列は、オリゴマー内の連続塩基から形成されることが典型的であるが、代替的に、例えば、オリゴマーの反対側の末端から一体とされると、標的配列にわたる配列を構成する非連続配列から形成される場合もある。
【０１２２】
「ターゲティング配列」は、標的配列に対して「ほぼ」または「実質的な」相補性を有し得、それでもなお、その意図した目的のため、例えば、エクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルを向上させる、または機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増加させるために機能しうる。本開示で用いる修飾アンチセンスオリゴマー化合物は、標的配列に対して、多くても１２ヌクレオチドに１つのミスマッチ、好ましくは、多くても２０ヌクレオチドに１つのミスマッチを有することが好ましい。代替的に、用いる修飾アンチセンスオリゴマーは、本明細書で示す例示的なターゲティング配列に対して、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有する。ターゲティング配列は、配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、配列番号４〜１６から選択されるか、配列番号４〜１６から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号４〜１６から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり得、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号４〜１６の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０１２３】
一部の実施形態では、ターゲティング配列は、
ａ）配列番号７（ＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１６である）、
ｂ）配列番号８（ＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１８である）、および
ｃ）配列番号６（ＧＸＡＡＧＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは２３である）
から選択され、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号６〜８の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号６〜８の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０１２４】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【０１２５】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【０１２６】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは５ｍＣである。
【０１２７】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【０１２８】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＴである。
【０１２９】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＵである。
【０１３０】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｙは５ｍＣである。
【０１３１】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＹはＣである。
【０１３２】
本明細書で使用される「ＴＥＧ」、「トリエチレングリコールテール」または「ＥＧ３」という用語は、例えば、その３’末端または５’末端でオリゴマーにコンジュゲートしたトリエチレングリコール部分を指す。例えば、一部の実施形態では、「ＴＥＧ」は、例えば、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）および（Ｘ）の化合物のＴが、式：
【化２６】
2018525015.tif 000027
を有するものを含む。
【０１３３】
本明細書で使用される、組成物の「治療有効量」または「有効量」という用語は、組成物が有効な処置のために、障害の防止または処置において有効な量を指す。「障害」とは、任意のＳＭＡ  Ｉ型、ＳＭＡ  ＩＩ型、ＳＭＡ  ＩＩＩ型およびＳＭＡ  ＩＶ型などの脊髄性筋萎縮症を指す。
【０１３４】
本明細書で使用される「〜を定量化すること」、「定量化」という用語、または他の類縁の語は、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の、数量、質量、または単位容量中の濃度を決定することを指す。
【０１３５】
多様な実施形態では、本明細書で使用される「処置」という用語は、被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の処置（処理）であって、被験体または細胞の現在の経過を変更する処置を含む。処置は、医薬組成物の投与を含むがこれに限定されず、予防的に実施することもでき、病理学的事象の開始または病因作用物質との接触に後続して実施することもできる。また、処置される疾患もしくは状態の進行速度の低減、この疾患もしくは状態の発症の遅延、またはその発症の重症度の軽減を指向しうる「予防的」処置も含まれる。「処置」または「予防」とは、必ずしも、疾患もしくは状態、またはこれらの関連する症状の、完全な根絶、治癒、または防止を指し示すものではない。
ＩＩ．ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーション
【０１３６】
多様な態様は、所与の試料（例えば、血清試料、血漿試料、組織試料、細胞試料など）においてエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルがエクソン７欠失ＳＭＮ２  ｍＲＮＡのレベルと比べて増強されるように、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロンおよびエクソンのスプライシングをモジュレートするための方法に関する。多様な方法は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域と相補的な、本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーを投与するステップを含み、エクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡの発現は、エクソン７欠失ＳＭＮ２  ｍＲＮＡの発現と比べて増加する。  
【０１３７】
例示を目的とし、理論に束縛されずに述べると、本明細書で記載される通りのアンチセンスオリゴマーは、スプライソソームの作用および成熟ｍＲＮＡ転写物の産生を阻害するなどにより、プレｍＲＮＡのプロセシングの遮断、阻害、またはモジュレーションを促進すると考えられ、また、標的としたｍＲＮＡの分解も誘導しうる。一部の例では、スプライソソームがエクソン／イントロンスプライス接合部に結合するのを阻害して、エクソン／イントロンスプライス接合部がスキップされ、ｍＲＮＡ転写物から１つまたは複数のエクソンが除去されるようにすることができる。野生型ｍＲＮＡ転写物より１つまたは複数少ないエクソンを有する成熟ｍＲＮＡ転写物は、オープンリーディングフレームを保持するｍＲＮＡ転写物をもたらし得、それにより、ｍＲＮＡ転写物は、分解されるのでなく、機能的なタンパク質へと翻訳されうる。野生型ｍＲＮＡより少ないエクソンを有するｍＲＮＡ転写物から翻訳されたタンパク質は、結果として、野生型ｍＲＮＡ転写物から転写されたタンパク質より少ないアミノ酸残基を含む転写タンパク質となりうる。野生型タンパク質より少ないアミノ酸残基で構成された機能的なタンパク質は、野生型タンパク質と同じまたは同様の活性／機能性を有しうる。修飾アンチセンスオリゴマーは、それがハイブリダイズする標的配列または標的領域「を指向する」またはこれら「に対してターゲティングされた」ということができる。ある特定の実施形態では、標的配列は、プレｍＲＮＡの３’スプライス接合部位もしくは５’スプライス接合部位を含む領域、分岐点、エクソンのスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）もしくはイントロンのスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、またはスプライシングの調節に関与する他の配列を含む。イントロン内では、ドナー部位（イントロンの５’末端）およびアクセプター部位（イントロンの３’末端）がスプライシングに必要である。スプライスドナー部位は、イントロンの５’末端にあるほとんど不変の配列ＧＵを、より大きい、それほど高度に保存されていない領域内に含む。イントロンの３’末端にあるスプライスアクセプター部位は、ほとんど不変のＡＧ配列によってイントロンを終結させる。標的配列は、エクソン／イントロンスプライス接合部部位内にある、またはエクソン／イントロンスプライス接合部にわたる配列を含み得る。標的配列は、エクソン／イントロンドナースプライス部位を含み得る。
【０１３８】
標的プレｍＲＮＡ配列に対する配列相補性であって、標的ＲＮＡのスプライシングをモジュレートするのに十分な配列相補性を有する修飾アンチセンスオリゴマーは、スプライソソーム複合体に対する結合部位の遮蔽または妨害を誘発するのに十分な配列であって、他の点で、このようなスプライシングに影響を及ぼし、かつ／または、他の点で、ターゲティングされたプレｍＲＮＡの三次元構造の変更を含む配列を有する修飾アンチセンスオリゴマーを含む。
【０１３９】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の配列に対する、十分な長さと相補性とを有する。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマー内のターゲティング配列は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的配列の領域、例えば、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−７／−１４，  −７／−１６、−１０／−２７、−１０／−２９、−１０／−３４、−１３７／−１５９、−１４９／−１７４、−１６７／−１８６、−２４９／−２７３もしくは−２８１／−２９９領域またはイントロン６の−５８／−３９、−１１２／−６７もしくは−２６４／−２４５領域とハイブリダイズする。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８塩基〜約４０塩基であり得、配列が、標的配列へのハイブリダイゼーション時に、スプライスモジュレーションを行うのに十分に相補的であり、任意選択で、ＲＮＡと共に、Ｔｍが、４５℃またはこれを超える、ヘテロ二重鎖を形成する限り、少数のミスマッチを含む。
【０１４０】
多様な実施形態では、アンチセンスターゲティング配列と、標的配列との相補性の程度は、安定的な二重鎖を形成するのに十分である。修飾アンチセンスオリゴマーの、標的配列との相補性の領域は、８〜１５塩基という短い領域でありうるが、８〜１８塩基またはこれを超える領域であることが可能であり、例えば、これらの範囲の間の全ての整数を含む、８〜４０塩基、８〜３０塩基、８〜２５塩基、８〜２２塩基、８〜２０塩基、１５〜２５塩基、１５〜２２塩基、または１５〜２０塩基でありうる。ある特定の実施形態では、本明細書で論じられる、必須の結合Ｔｍを達成するのに、最小の長さの相補塩基が要請されうる。
【０１４１】
多様な態様では、オリゴマーを、バイオアベイラビリティー、安定性、細胞更新（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｄａｔｅ）、およびヌクレアーゼ分解に対する耐性を含むがこれらに限定されない、さらなる機能性のために構成する。一般に、４０塩基を含むオリゴマーは、適切である可能性があり、ここで、少なくとも最小数の塩基、例えば、８塩基は、標的配列と相補的である。多様な態様では、オリゴマーを、促進された細胞取込みまたは能動的な細胞取込みを増強するように構成する。多様な態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、１または複数のホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８〜４０ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８〜２６ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１５〜２５ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１８〜２５ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１８〜２６ホスホルアミデートモルホリノ単量体サブユニットまたはホスホロジアミデートモルホリノ単量体サブユニットを含む。
【０１４２】
多様な態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、任意選択で、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の８またはこれを超える連続ヌクレオチドの標的領域と相補的なターゲティング配列とを含む８〜４０サブユニットを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。多様な実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６、エクソン７、イントロン７またはエクソン８の領域（またはスプライス接合部をまたぐ領域）内の８またはこれを超える連続ヌクレオチドを含む。多様な実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の領域を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−７／−１４、−７／−１６、−１０／−２７、−１０／−２９、−１０／−３４、−１３７／−１５９、−１４９／−１７４、−１６７／−１８６、−２４９／−２７３もしくは−２８１／−２９９領域またはイントロン６の−５８／−３９、−１１２／−６７もしくは−２６４／−２４５領域を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−１０／−２７、−１０／−２９または−１０／−３４領域を含む。
【０１４３】
多様な態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるターゲティング配列とを任意選択で含む８〜４０サブユニットを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。好ましくは、一部の態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号６、７および８から選択される配列を含む。
【０１４４】
追加の態様は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域に特異的にハイブリダイズする８〜４０サブユニットの修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６、エクソン７、イントロン７またはエクソン８内の領域（またはスプライス接合部をまたぐ領域）を含む。多様な実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の領域を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−７／−１４、−７／−１６、−１０／−２７、−１０／−２９、−１０／−３４、−１３７／−１５９、−１４９／−１７４、−１６７／−１８６、−２４９／−２７３もしくは−２８１／−２９９領域またはイントロン６の−５８／−３９、−１１２／−６７もしくは−２６４／−２４５領域を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン７の−１０／−２７、−１０／−２９または−１０／−３４領域を含む。
【０１４５】
さらなる態様は、修飾糖部分を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットから選択される。
【０１４６】
さらなる態様は、修飾ヌクレオシド間連結を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結およびホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。
【０１４７】
さらなる態様は、修飾糖部分と修飾ヌクレオシド間連結との少なくとも１つの組合せを含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーであって、多様な実施形態では、１または複数のサブユニットが、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロトリアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、モルホリノサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’Ｏ−メチルサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’−フルオロサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸サブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、トリシクロＤＮＡサブユニット、
任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結、もしくはホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換された、ロックト核酸サブユニット、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、もしくは置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分に共有結合させたモルホリノサブユニット、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、４−アミノピペリジン−１−イル部分、もしくは置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合させたモルホリノサブユニット、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、ジメチルアミノ部分に共有結合させたモルホリノサブユニット、
ホスホロチオエートヌクレオシド間もしくはホスホルアミデートヌクレオシド間連結で置換された、リボース糖サブユニット、
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結もしくはホスホルアミデートヌクレオシド間連結で置換された、デオキシリボース糖サブユニット、
任意選択で置換された、ペプチド核酸サブユニット、
または前出の任意の組合せ
から選択されるアンチセンスオリゴマーを含む。
【０１４８】
多様な態様および実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、修飾アンチセンスオリゴマーに共有結合したペプチドをさらに含む。多様な実施形態では、アルギニンに富む細胞透過性ペプチドを、アンチセンスオリゴマーの３’末端または５’末端にコンジュゲートさせる。
【０１４９】
種々の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０塩基からなる場合もあり、８〜４０、８〜３０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１８、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１８、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、１５〜１８、１８〜３０、１８〜２５または１８〜２０塩基の、これらの範囲の間の全ての整数を含む範囲の場合もある。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約８〜約４０または約８〜約３０塩基の長さである。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１８〜約２５塩基の長さである。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマー配列は、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の連続塩基または非連続塩基であって、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７などのＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的配列、あるいはＳＭＮ２プレｍＲＮＡの少なくとも一部にわたる配列と相補的な連続塩基または非連続塩基を含む。
【０１５０】
修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮタンパク質のＳＭＮ２プレｍＲＮＡ配列のイントロン６、エクソン７もしくはイントロン７内の配列もしくは領域と十分に相補的な塩基配列を含むことが典型的である。以下の表１は、イントロン６、エクソン７およびイントロン７内の配列もしくは領域を列挙する。
【表１−１】
2018525015.tif 000028
【表１−２】
2018525015.tif 000029
【０１５１】
修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡの異常なスプライシングを、有効にモジュレートし、これにより、機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増加させることが可能なことが理想的である。この要件は、任意選択で、オリゴマー化合物が、哺乳動物細胞により能動的に取り込まれ、取り込まれると、標的ｍＲＮＡと共に、任意選択で、Ｔｍが、約４０℃または４５℃を超える、安定的な二重鎖（またはヘテロ二重鎖）を形成する能力を有する場合に満たされる。
【０１５２】
本明細書で使用される「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」または「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、標的配列と相補的なヌクレオチド配列のうちの、約９０％〜約１００％を有する修飾アンチセンスオリゴマーを指す。複数の実施形態では、相補的なヌクレオチド配列は、標的配列と特異的にハイブリダイズして、所望の効果、例えば、本明細書で記載される治療効果を誘導する。ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、オリゴマーと標的配列との間に形成されるヘテロ二重鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用、およびインビボにおいて生じうる、他の様態の分解に抗するのに十分に安定である限りにおいて、標的配列と１００％相補的な場合もあり、例えば、改変体を擁するように、ミスマッチを含む場合もある。よって、ある特定のオリゴマーは、オリゴマーと、標的配列との間の、約９０％または少なくとも約９０％の配列相補性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相補性を意味する、実質的な相補性を有しうる。本明細書では、ヌクレアーゼによる切断を受けにくいオリゴマーのヌクレオシド間連結が提供される。ミスマッチは、存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央部より、末端領域に向かって、より不安定化しにくくなることが典型的である。許容されるミスマッチの数は、よく理解されている、二重鎖安定性の原理に従い、オリゴマーの長さ、二重鎖内のＧ：Ｃ塩基対の百分率、および二重鎖内のミスマッチの位置に依存すると予想される。このような修飾アンチセンスオリゴマーは必ずしも、標的配列に対する、１００％の相補性を含むわけではないが、標的プレｍＲＮＡのスプライシングを十分にモジュレートする、例えば、本明細書で記載される治療効果を達成するように、標的配列に、有効に、安定的に、かつ特異的に結合するのに十分な相補性を有するべきである。
【０１５３】
理論に束縛されずに述べると、オリゴマーと、標的配列との間で形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍと、二重鎖の、細胞酵素による切断の受けやすさとの関数であると考えられる。相補配列であるＲＮＡ二重鎖との関連における、オリゴマーのＴｍは、Ｈａｍｅｓら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年、１０７〜１０８頁により記載されている方法、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．  Ｇ．およびＷａｌｌａｃｅ  Ｒ．  Ｂ．、１９８７年、「Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４巻、９４〜１０７頁（この内容は、本明細書中に参考として援用される）において記載されている方法など、従来の方法により測定することができる。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、相補配列であるＲＮＡ二重鎖との関連における結合Ｔｍであって、例えば、約４５℃または５０℃を超えるなど、体温を超えるＴｍを有する。６０〜８０℃またはこれを超える範囲のＴｍもまた含まれる。周知の原理に従い、相補性ベースのＲＮＡハイブリッド二重鎖との関連における、オリゴマーのＴｍは、二重鎖内のＣ：Ｇ対合塩基の比を増加させ、かつ／またはヘテロ二重鎖の長さ（塩基対での）を増加させることにより、上昇させることができる。
【０１５４】
下記の表２は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７内の標的領域と相補的な例示的なターゲティング配列を示す（５’−３’の配向性で）。
【表２−１】
2018525015.tif 000030
【表２−２】
2018525015.tif 000031
【０１５５】
ある特定の修飾アンチセンスオリゴマーは、表１における配列（例えば、配列番号４〜１６）を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるか、配列番号４〜１６から選択されるか、配列番号４〜１６から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、あるいは、配列番号４〜１６から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、独立に、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から選択され、各Ｙは、独立に、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から選択される。例えば、ある特定のアンチセンスオリゴマーは、配列番号４〜１６のいずれかのうちの約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０の連続ヌクレオチドもしくは非連続ヌクレオチド、または少なくともほぼこれらの数の連続ヌクレオチドもしくは非連続ヌクレオチドを含む。非連続部分については、介在ヌクレオチドを、欠失させるか、または異なるヌクレオチドで置換することもでき、介在ヌクレオチドを付加することもできる。改変体のさらなる例は、約９０％または少なくとも約９０％の配列同一性または配列相同性、例えば、配列番号４〜１６のいずれかの全長にわたる、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列相同性を有するオリゴマーを含む。ある特定の実施形態では、ターゲティング配列は、配列番号４〜１６から選択される。
【０１５６】
修飾アンチセンスオリゴマーおよびその改変体の活性／機能性は、当技術分野における慣例的な技法に従いアッセイすることができる。例えば、サーベイされるＲＮＡのスプライス形態および発現レベルを、転写される核酸またはタンパク質のスプライス形態および／または発現を検出するための、多種多様な周知の方法のうちのいずれかにより評価することができる。このような方法の非限定的な例は、ＲＮＡのスプライシング形態についてのＲＴ−ＰＣＲに続く、ＰＣＲ産物のサイズによる分離、核酸ハイブリダイゼーション法、例えば、ノーザンブロット、ならびに／または核酸アレイ；核酸増幅法；タンパク質を検出するための免疫学的方法；タンパク質精製法；およびタンパク質機能アッセイまたはタンパク質活性アッセイの使用を含む。
【０１５７】
ＲＮＡ発現レベルは、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されるオリゴヌクレオチド）を、細胞、組織、または生物体から調製し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、アッセイされる核酸またはその断片の相補体である基準オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより評価することができる。ｃＤＮＡは、任意選択で、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、様々なポリメラーゼ連鎖反応またはインビトロにおける転写法のうちのいずれかを使用して増幅することもできるが；増幅しないことが好ましい。１または複数の転写物の発現はまた、転写物の発現レベルについて評価する、定量的ＰＣＲを使用して検出することもできる。
【０１５８】
ＩＩＩ．修飾アンチセンスオリゴマー化学
Ａ．一般的特徴
多様な態様および実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域と特異的にハイブリダイズする。例示的な修飾アンチセンスオリゴマーは、表１に明示されたターゲティング配列、表１のターゲティング配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片、または表１のターゲティング配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体を含む。他の例示的な修飾アンチセンスオリゴマーは、表１に明示されたターゲティング配列からなるか、またはこれらから本質的になる。
【０１５９】
さらなる態様では、ヌクレアーゼ耐性修飾アンチセンスオリゴマーが提供される。多様な実施形態では、１または複数のヌクレオシド間連結の修飾を含む修飾アンチセンスオリゴマーが提供される。他の実施形態では、１または複数の修飾糖部分を含む修飾アンチセンスオリゴマーが提供される。他の実施形態では、１または複数の修飾ヌクレオシド間連結と、１または複数の修飾糖部分との組合せを含む、修飾アンチセンスオリゴマーが提供される。他の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基単独、または修飾ヌクレオシド間連結もしくは修飾糖部分のうちのいずれかと組み合わせた修飾ヌクレオ塩基を含む、修飾アンチセンスオリゴマーが提供される。
【０１６０】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、完全に修飾されたヌクレオシド間連結を有するオリゴマーを含むことが可能であり、例えば、ヌクレオシド間連結の１００％が修飾されている（例えば、２５量体の修飾アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾のうちの１つまたはこれらの任意の組合せで修飾された、２４のヌクレオシド間連結を含む）。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、そのヌクレオシド間連結の約１００％〜２．５％が修飾されたものを含みうる。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、そのヌクレオシド間連結のうちの約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または２．５％、およびその間の整数（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）の％が修飾されたものを含みうる。他の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾の任意の組合せを含みうる。
【０１６１】
修飾ヌクレオシド間連結のパーセントについての実施形態と組み合わせた実施形態を含む、多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、完全修飾糖部分を有するオリゴマーを含むことが可能であり、例えば、糖部分の１００％が修飾されている（例えば、２５量体の修飾アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾のうちの１つまたはこれらの任意の組合せで修飾された、２５の糖部分を含む）。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、その糖部分の約１００％〜２．５％が修飾されたものを含みうる。多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、その糖部分のうちの約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または２．５％、およびその間の整数の％が修飾されたものを含みうる。他の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、本明細書で記載される修飾の任意の組合せを含みうる。
【０１６２】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、実質的に非荷電であり、任意選択で、細胞膜を横切る、能動的な輸送または促進された輸送のための基質として適する。一部の実施形態では、全てのヌクレオシド間連結は、非荷電である。オリゴマーが、標的プレｍＲＮＡと共に、安定的な二重鎖を形成する能力はまた、標的との関連における、修飾アンチセンスオリゴマーの相補性の長さおよび程度、Ｇ：Ｃ塩基マッチの、Ａ：Ｔ塩基マッチに対する比、ならびに任意のミスマッチ塩基の位置を含む、オリゴマーの他の特色にも関しうる。修飾アンチセンスオリゴマーが、細胞ヌクレアーゼに抵抗する能力は、薬剤の存続および細胞質への最終的な送達を促進しうる。
【０１６３】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、生理学的ｐＨで正に荷電しているか、またはカチオン性である、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を有する。さらなる実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約５．５〜約１２の間のｐＫａを呈示する、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を有する。さらなる実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０のヌクレオシド間連結、少なくともほぼこれらの数のヌクレオシド間連結、またはほぼこれらの数を超えないヌクレオシド間連結であって、約４．５〜約１２の間のｐＫａを呈示するヌクレオシド間連結を含有する。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％のヌクレオシド間連結、または少なくともほぼこれらの比率のヌクレオシド間連結であって、約４．５〜約１２の間のｐＫａを呈示するヌクレオシド間連結を含有する。任意選択で、修飾アンチセンスオリゴマーは、塩基性の窒素と、アルキル基、アリール基、またはアラルキル基との両方を伴う、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を有する。特定の実施形態では、１または複数のカチオン性ヌクレオシド間連結は、４−アミノピペリジン−１−イル（ＡＰＮ）基またはその誘導体を含む。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、モルホリノ環を含む。理論に束縛されるわけではないが、オリゴマー内の、１または複数のカチオン性連結（例えば、ＡＰＮ基またはＡＰＮ誘導体）の存在は、標的ヌクレオチド内の、負に荷電したホスフェートへの結合を促進することが考えられる。こうして、変異体ＲＮＡと、カチオン性連結を含有するオリゴマーとの間のヘテロ二重鎖の形成は、イオン性引力およびワトソン−クリック塩基対合の両方により一体に保持されうる。
【０１６４】
多様な実施形態では、カチオン性連結の数は、少なくとも２つであり、全ヌクレオシド間連結の約半分を超えず、例えば、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のカチオン性連結、またはほぼこれらを超えないカチオン性連結である。一部の実施形態では、しかし、ヌクレオシド間連結のうちの、最大で全ては、カチオン性連結であり、例えば、全ヌクレオシド間連結のうちの約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０、または少なくともほぼこれらの数は、カチオン性連結である。さらなる実施形態では、約１９〜２０単量体サブユニットのオリゴマーは、２つ〜１０、例えば、４〜８つのカチオン性連結と、残りの非荷電連結とを有しうる。他の具体的な実施形態では、１４〜１５サブユニットのオリゴマーは、２〜７つ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのカチオン性連結と、残りの非荷電連結とを有しうる。こうして、オリゴマー内のカチオン性連結の総数は、約１〜１０〜１８〜２０〜３０またはこれを超えて（間の全ての整数を含む）変動することが可能であり、オリゴマー全体にわたり散在しうる。
【０１６５】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、１０の非荷電連結ごとに約４つ〜５つまたは４つもしくは５つなど、２つ〜５つまたは２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非荷電連結ごとに約１つのカチオン性連結または最大で約１つのカチオン性連結を有しうる。
【０１６６】
ある特定の実施形態は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のカチオン性連結を含有する修飾アンチセンスオリゴマーを含む。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性の最適な改善は、ヌクレオシド間連結のうちの約２５％がカチオン性である場合に見ることができる。ある特定の実施形態では、増強は、少数（例えば、１０〜２０％）のカチオン性連結に関して見ることもでき、カチオン性連結の数が、約６０％など、５０〜８０％の範囲内にある場合に見ることもできる。
【０１６７】
さらなる実施形態では、カチオン性連結を、ヌクレオシド間連結に沿って散在させる。このようなオリゴマーは任意選択で、少なくとも２つの連続非荷電連結を含有する；すなわち、オリゴマーは任意選択で、その全長に沿って、厳密に交互のパターンを有さない。具体的な場合では、各１つまたは２つのカチオン性連結は、ヌクレオシド間連結に沿って、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの非荷電連結により隔てられる。
【０１６８】
また、カチオン性連結のブロックと、非荷電連結のブロックとを有するオリゴマーも含まれる。例えば、中央の非荷電連結のブロックが、カチオン性連結のブロックに挟まれる場合もあり、この逆の場合もある。一部の実施形態では、オリゴマーは、ほぼ等長の５’領域、３’領域、および中央領域を有し、中央領域内のカチオン性連結の百分率は、カチオン性連結の総数のうちの、約５０％、６０％、７０％、または８０％を超える。
【０１６９】
ある特定の修飾アンチセンスオリゴマーでは、カチオン性連結のバルク（例えば、カチオン性連結のうちの７０、７５％、８０％、９０％）は、ヌクレオシド間連結の「中央領域」、例えば、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の真ん中の連結（ｃｅｎｔｅｒｍｏｓｔ  ｌｉｎｋａｇｅ）に近接して分布する。例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４量体のオリゴマーは、全カチオン性連結のうちの、少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％を、８つ、９つ、１０、１１、または１２の真ん中の連結へと局在化させうる。
【０１７０】
Ｂ．化学の特色
修飾アンチセンスオリゴマーは、様々なヌクレオチド類似体サブユニットを含有しうる。さ
らなる例は、
ホスホルアミデートを含有するオリゴマー、
ホスホロジアミデートを含有するオリゴマー、
ホスホロトリアミデートを含有するオリゴマー、
ホスホロチオエートを含有するオリゴマー、
モルホリノを含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロジアミデートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’Ｏ−メチルを含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
ロックト核酸（ＬＮＡ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’−フルオロを含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］を含有するオリゴマーであって、任意選択で、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で置換されたオリゴマー、
モルホリノを含有するオリゴマーであって、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、または置換（１，４−ピペラジン）−１−イル（ＰＭＯプラス）部分に共有結合させたオリゴマー、
モルホリノを含有するオリゴマーであって、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含み、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、４−アミノピペリジン−１−イル部分（すなわち、ＡＰＮ）または置換４−アミノピペリジン−１−イル（ＰＭＯ−Ｘ）部分に共有結合させたオリゴマー、
ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むモルホリノサブユニットであって、ホスホロジアミデートのリン原子を、モルホリノ環の窒素原子に共有結合させ、かつ、ジメチルアミノ部分に共有結合させたサブユニット、
リボース糖を含有するオリゴマーであって、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結またはホスホルアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むオリゴマー、
デオキシリボース糖を含有するオリゴマーであってホスホロチオエートヌクレオシド間連結オリゴマーまたはホスホルアミデートヌクレオシド間連結をさらに含むオリゴマー、
任意選択でさらに置換された、ペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノ含有オリゴマー（ＰＰＭＯ）、
さらなる置換を含む、任意選択でさらに置換された、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、
および前出のうちのいずれかの組合せを含む。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、ホスホロジアミデート連結のリン原子を、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分で、さらに置換する。
【０１７２】
一般に、ＰＮＡ化学およびＬＮＡ化学は、ＰＭＯおよび２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーと比べた、それらの比較的高度な標的結合強度のために、より短いターゲティング配列を活用しうる。ホスホロチオエート化学と、２’Ｏ−Ｍｅ化学とを組み合わせて、２’Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオエート類似体を作出することができる。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１３／１１２０５３号および同第ＷＯ／２００９／００８７２５号を参照されたい。
【０１７３】
場合によって、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）などの修飾アンチセンスオリゴマーを、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートさせて、細胞内送達を促進することができる。ペプチドコンジュゲートＰＭＯは、ＰＰＭＯと呼ばれ、ある特定の実施形態は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１２／１５０９６０号において記載されているＰＰＭＯを含む。一部の実施形態では、例えば、本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートまたは連結させた、アルギニンに富むペプチド配列を使用することができる。
【０１７４】
１．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、骨格が、デオキシリボース骨格と構造的に同形である、ＤＮＡの類似体であって、ピリミジン塩基またはプリン塩基を結合させた、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる類似体である。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合則に従う相補的オリゴマーとハイブリダイズし、塩基対認識の点で、ＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９３年）。ＰＮＡのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合により形成されることから、アンチセンス適用（下記の構造を参照されたい）に良好に適する。骨格が非荷電である結果として、通常を超える熱安定性を呈示する、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖がもたらされる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼによっても、プロテアーゼによっても認識されない。ＰＮＡサブユニットを含むＰＮＡオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化２７】
2018525015.tif 000032
に描示する。
【０１７５】
天然構造に対する大幅な構造変化にもかかわらず、ＰＮＡは、ヘリックス形態による、ＤＮＡまたはＲＮＡへの配列特異的結合が可能である。ＰＮＡの特徴は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高結合アフィニティー、単一塩基ミスマッチにより引き起こされる不安定化効果、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度に依存しない、ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、およびホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成を含む。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）は、Ｂｔｓ  ＰＮＡ単量体（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）と、オリゴマー化工程とを開発している。Ｂｔｓ  ＰＮＡ単量体を使用する、ＰＮＡのオリゴマー化は、脱保護、カップリング、およびキャッピングの反復的サイクルから構成される。ＰＮＡは、当技術分野で公知の任意の技法を使用して、合成により作製することができる。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号、および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。ＰＮＡの調製についてはまた、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号も参照されたい。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１４９７〜１５００頁、１９９１年においても見出すことができる。前出の各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
２．ロックト核酸（ＬＮＡ）
修飾アンチセンスオリゴマー化合物はまた、「ロックト核酸」サブユニット（ＬＮＡ）も含有しうる。「ＬＮＡ」とは、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾のクラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環のコンフォメーションを、Ｃ３０−エンド（ノーザン）糖パッカー（ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒ）にロックする共有結合的連結を特徴とする。ＬＮＡでは、架橋は、２’−Ｏ位と４’−Ｃ位との間のメチレンから構成される。ＬＮＡは、骨格の事前組織化（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増加させる。
【０１７７】
ＬＮＡの構造は、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｇｅｌら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８年）、４５５巻；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８年）、５４巻：３６０７頁、およびＡｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９年）、３２巻：３０１頁）；Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７年）、３８巻：８７３５頁；（１９９８年）、３９巻：５４０１頁、ならびにＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８年）、１６巻：９２３０頁において見出すことができる。ＬＮＡサブユニットと、ホスホジエステルヌクレオシド間連結とを含む、ＬＮＡオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化２８】
2018525015.tif 000033
に描示する。
【０１７８】
本開示の化合物には、１または複数のＬＮＡを組み込むことができ、場合によって、化合物を、ＬＮＡから完全に構成することもできる。個別のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびオリゴマーへのそれらの組込みのための方法については、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号、および同第６，６７０，４６１号において記載されている。典型的なヌクレオシド間リンカーは、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分を含み、代替的に、リン非含有リンカーを使用することもできる。さらなる実施形態は、ＬＮＡ含有化合物を含み、各ＬＮＡサブユニットは、ＤＮＡサブユニットで隔てられている。ある特定の化合物は、交互のＬＮＡサブユニットおよびＤＮＡサブユニットから構成され、ヌクレオシド間リンカーは、ホスホロチオエートである。
【０１７９】
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＢＮＡのクラスの別のメンバーである。ＥＮＡサブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結の非限定的な例を、下記：
【化２９】
2018525015.tif 000034
に描示する。
ＥＮＡオリゴマーおよびそれらの調製については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｔｔ、３８巻（５０号）：８７３５頁において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のＥＮＡサブユニットを組み込むことができる。
【０１８０】
３．ホスホロチオエート
「ホスホロチオエート」（またはＳ−オリゴ）とは、生来ＤＮＡまたは生来ＲＮＡの改変体であって、ホスホジエステルヌクレオシド間連結の非架橋酸素のうちの１つを、硫黄で置きかえた改変体である。デオキシリボースサブユニットと、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結とを含む、ホスホロチオエートＤＮＡ（左）、および、リボースサブユニットと、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）ヌクレオシド間連結とを含む、ホスホロチオエートＲＮＡ（右）の非限定的な例を、下記：
【化３０】
2018525015.tif 000035
に描示する。
ヌクレオシド間結合の硫黄化（ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）は、５’−３’および３’−５’ＤＮＡ  ＰＯＬ  １エクソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮアーゼ、血清ヌクレアーゼ、ならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは、２つの主要な経路：ホスホン酸水素上の炭素ジスルフィド内の硫黄元素の溶解作用、または亜リン酸トリエステルを、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（３Ｈ−１，２−ｂｅｎｓｏｄｉｔｈｉｏｌ−３−ｏｎｅ  １，１−ｄｉｏｘｉｄｅ；ＢＤＴＤ）で硫黄化する方法（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｉｙｅｒら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．５５巻、４６９３〜４６９９頁、１９９０年を参照されたい）により作製し得る。後者の方法は、大半の有機溶媒中の硫黄元素の不溶性および炭素ジスルフィドの毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤ法およびＢＤＴＤ法はまた、高純度のホスホロチオエートももたらす。
【０１８１】
４．トリシクロＤＮＡおよびトリシクロホスホロチオエートヌクレオチド
トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）とは、各ヌクレオチドを、シクロプロパン環の導入
により修飾して、骨格のコンフォメーション可撓性を制約し、ねじれ角γの骨格形状を最適化した、拘束ＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基性のアデニン含有ｔｃ−ＤＮＡおよびチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的なＲＮＡと共に、極めて安定的なＡ−Ｔ塩基対を形成する。トリシクロＤＮＡおよびそれらの合成については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／１１５９９３号において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のトリシクロＤＮＡサブユニットを組み込むことができ、場合によって、化合物は、トリシクロＤＮＡサブユニットから完全に構成されうる。
【０１８２】
トリシクロホスホロチオエートヌクレオチドとは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を伴うトリシクロＤＮＡサブユニットである。トリシクロホスホロチオエートヌクレオチドおよびそれらの合成については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５３９２８号において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のトリシクロＤＮＡサブユニットを組み込むことができ、場合によって、化合物は、トリシクロＤＮＡヌクレオチドから完全に構成されうる。トリシクロＤＮＡ／三環系（ｔｒｉｃｙｃｌｅ）サブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結の非限定的な例を、下記：
【化３１】
2018525015.tif 000036
に描示する。
５．  ２’Ｏ−メチルオリゴマー、２’Ｏ−ＭＯＥオリゴマー、および２’−Ｆオリゴマー
「２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー」分子は、リボース分子の２’−ＯＨ残基において、メチル基を保有するサブユニットを含む。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡは、ＤＮＡと同じ（または類似の）挙動を示すが、ヌクレアーゼによる分解に対して保護されている。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡはまた、さらなる安定化のために、ホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わせることもできる。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー（２’ＯＭｅサブユニットが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結またはホスホロチオエートヌクレオシド間連結により接続されている）は、当技術分野における慣例的な技法（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２巻：２００８〜１６頁、２００４年を参照されたい）に従い、合成することができる。２’ＯＭｅサブユニットおよびホスホジエステルサブユニット間連結を含む２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化３２】
2018525015.tif 000037
に描示する。
２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーはまた、ホスホロチオエート連結（２’Ｏ−Ｍｅホスホロチオエートオリゴマー）も含みうる。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーなどの２’Ｏ−メトキシエチルオリゴマー（２’−Ｏ  ＭＯＥ）は、リボース分子の２’−ＯＨ残基において、メトキシエチル基を保有するサブユニットを含み、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ、７８巻、４８６〜５０４頁、１９９５年において論じられている。２’Ｏ−ＭＯＥサブユニットの非限定的な例を、下記：
【化３３】
2018525015.tif 000038
に描示する。
【０１８３】
前出のアルキル化２’ＯＨリボース誘導体と対照的に、２’−フルオロオリゴマーは、２’位において、２’ＯＨの代わりにフルオロラジカルを有するサブユニットを含む。２’−Ｆサブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結を含む２’−Ｆオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化３４】
2018525015.tif 000039
に描示する。
２’−フルオロオリゴマーについては、参照によりその全体において本明細書に組み込
まれる、ＷＯ２００４／０４３９７７においてさらに記載されている。本開示の化合物には、１または複数の２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−ＭＯＥサブユニット、および２’−Ｆサブユニットを組み込むことができ、本明細書で記載されるヌクレオシド間連結のうちのいずれかを活用することができる。場合によって、本開示の化合物は、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥ、または２’−Ｆサブユニットから完全に構成しうると予想される。本開示の化合物についての一実施形態は、２’Ｏ−メチルサブユニットから完全に構成される。
【０１８４】
６．  ２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示の化合物中で有用な、２’Ｏ修飾リボヌクレオチドの別の例である。この例では、２’ＯＨを、２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル部分へと誘導体化して、ヌクレアーゼ耐性を増加させる。ＭＣＥサブユニットおよびホスホジエステルヌクレオシド間連結を含むＭＣＥオリゴマーの非限定的な例を、下記：
【化３５】
2018525015.tif 000040
に描示する。
ＭＣＥおよびそれらの合成については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｄａら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、７６巻（９号）：３０４２〜５３頁において記載されている。本開示の化合物には、１または複数のＭＣＥサブユニットを組み込むことができる。
【０１８５】
７．モルホリノベースのオリゴマー
モルホリノベースのオリゴマーとは、ヌクレオ塩基を支持するモルホリノサブユニットを含むオリゴマーを指し、リボースの代わりに、モルホリニル環を含有する。例示的なヌクレオシド間連結は、例えば、１つのモルホリノサブユニットのモルホリニル環窒素を、隣接するモルホリノサブユニットの４’環外炭素に接合する、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結またはホスホロジアミデートヌクレオシド間連結を含む。各モルホリノサブユニットは、塩基特異的水素結合により、オリゴヌクレオチド内の塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジンのヌクレオ塩基を含む。
【０１８６】
モルホリノベースのオリゴマー（修飾アンチセンスオリゴマーを含む）については、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号；ならびに係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号；同第１２／２７１，０４０号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号および同第ＷＯ／２０１２／０４３７３０号；ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７年、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、７巻、１８７〜１９５頁において詳述されている。本明細書では、用語「モルホリノサブユニット」を、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎらに記載されるとおりに使用する。
【０１８７】
オリゴマー構造内で、リン酸基は一般に、オリゴマーの「ヌクレオシド間連結」を形成する基として言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結は、３’−５’ホスホジエステル連結である。「ホスホルアミデート」基が、３つの結合酸素原子と、１つの結合窒素原子とを有するリンを含むのに対し、「ホスホロジアミデート」基は、２つの結合酸素原子と、２つの結合窒素原子とを有するリンを含む。「ホスホロトリアミデート」基（またはリン酸トリアミド基）は、接合した酸素原子１個および接合した窒素原子３個を有するリンを含む。本明細書で記載されるモルホリノベースのオリゴマーの非荷電ヌクレオシド間連結またはカチオン性ヌクレオシド間連結では、１つの窒素は常に、連結鎖に対してペンダントであるものである。ホスホロジアミデート連結における第２の窒素は、モルホリン環構造内の環窒素であることが典型的である。
【０１８８】
「ＰＭＯ」とは、（ｉ）モルホリン環の窒素原子への共有結合、および（ｉｉ）ジメチルアミノの窒素への第２の共有結合を伴うリン原子を有するホスホロジアミデートモルホリノベースのオリゴマーを指す。「ＰＭＯ−Ｘ」とは、（ｉ）モルホリン環の窒素原子への共有結合、および（ｉｉ）例えば、４−アミノピペリジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）または４−アミノピペリジン−１−イルの誘導体の環窒素への第２の共有結合を伴うリン原子を有するホスホロジアミデートモルホリノベースのオリゴマーを指す。例示的なＰＭＯ−Ｘオリゴマーについては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３８４５９号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０７４８３４号において開示されている。ＰＭＯ−Ｘは、リン原子を、モルホリノ基、および４−アミノピペリジン−１−イル（すなわち、ＡＰＮ）の環窒素へと連結する、少なくとも１つのヌクレオシド間連結を含む、ＰＭＯ−Ｘオリゴマーを指す、「ＰＭＯ−ａｐｎ」、「ＰＭＯ−ＡＰＮ」または「ＡＰＮ」を含む。具体的な実施形態では、表２に明示されたターゲティング配列を含む修飾アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つのＡＰＮを含有する連結またはＡＰＮ誘導体を含有する連結を含む。多様な実施形態は、モルホリノベースのオリゴマーであって、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の、ＡＰＮ／ＡＰＮ誘導体を含有する連結を有し、残りの連結（１００％未満である場合）が、非荷電連結であり、例えば、全ヌクレオシド間連結のうちの約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０、または少なくともほぼこれらの数が、ＡＰＮ／ＡＰＮ誘導体を含有する連結であるオリゴマーを含む。
【０１８９】
多様な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｉ）：
【化３６】
2018525015.tif 000041
の化合物または薬学的に許容されるその塩［式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化３７】
2018525015.tif 000042
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８およびＲ１から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化３８】
2018525015.tif 000043
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化３９】
2018525015.tif 000044
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化４０】
2018525015.tif 000045
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２３、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２４Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および式：
【化４１】
2018525015.tif 000046
の部分から選択され、式中、
Ｒ２３は、式−（Ｏ−アルキル）ｖ−ＯＨを有し、式中、ｖは、３〜１０の整数であり、ｖ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ２４は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｓは、１〜５の整数であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され；
各Ｒ２５は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、式中、各Ｒ２６は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有し、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化４２】
2018525015.tif 000047
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している］
である。
【０１９０】
一部の実施形態では、Ｒ２は、式：
【化４３】
2018525015.tif 000048
の部分であり、
式中、Ｌは−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、
各Ｒ２５は式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２６）２を有し、各Ｒ２６は式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２を有する。そのような部分は、米国特許第７，９３５，８１６号に記載されており、これは、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、
【化４４】
2018525015.tif 000049
に描示するいずれかの部分を含みうる。
【０１９２】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２は、ＨまたはＧから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、式中、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、Ｒ１基の約５０〜９５％はジメチルアミノ（すなわち−Ｎ（ＣＨ３）２）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１基の約７０％〜約８０％はジメチルアミノである。ある特定の実施形態では、Ｒ１基の約７５％はジメチルアミノである。ある特定の実施形態では、Ｒ１基の約６６％はジメチルアミノである。
【０１９４】
本開示の一部の実施形態では、Ｒ１は、
【化４５】
2018525015.tif 000050
から選択されうる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、
【化４６】
2018525015.tif 000051
から選択される。
【０１９６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化４７】
2018525015.tif 000052
である。
【０１９７】
種々の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化４８】
2018525015.tif 000053
である。
【０１９８】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化４９】
2018525015.tif 000054
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化５０】
2018525015.tif 000055
である。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化５１】
2018525015.tif 000056
を有し、
式中、Ａは−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６は式：
【化５２】
2018525015.tif 000057
を有し、
式中、Ｒ１０は−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１ＯＨである。
【０２００】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２はＨ、Ｇまたはアシルであり、Ｔは、
【化５３】
2018525015.tif 000058
から選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、Ｔは、
【化５４】
2018525015.tif 000059
から選択される。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化５５】
2018525015.tif 000060
を有する。
【０２０３】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化５６】
2018525015.tif 000061
を有し、
各ＹはＯであり、Ｒ２はＧである。
【０２０４】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化５７】
2018525015.tif 000062
を有し、
各ＹはＯであり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２０５】
種々の実施形態では、Ｒ２は、Ｈまたはアシルから選択され、Ｔは式：
【化５８】
2018525015.tif 000063
を有し、各ＹはＯであり、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化５９】
2018525015.tif 000064
を有し、各ＹはＯであり、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＧである。
【０２０７】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化６０】
2018525015.tif 000065
を有し、各ＹはＯであり、Ｒ２はＨである。
【０２０８】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、各Ｒ１は
【化６１】
2018525015.tif 000066
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化６２】
2018525015.tif 000067
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化６３】
2018525015.tif 000068
である。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、各ＹはＯであり、各Ｒ１は
【化６４】
2018525015.tif 000069
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化６５】
2018525015.tif 000070
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化６６】
2018525015.tif 000071
である。
【０２１０】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化６７】
2018525015.tif 000072
であり、Ｔは
【化６８】
2018525015.tif 000073
であり、Ｒ２はＧである。
【０２１１】
一部の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０２１２】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化６９】
2018525015.tif 000074
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化７０】
2018525015.tif 000075
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２１４】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２は、ＨまたはＧから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、式中、ＣＰＰは以下で記載される配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０２１５】
他の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）：
【化７１】
2018525015.tif 000076
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、式：
【化７２】
2018525015.tif 000077
の部分から選択され、
式中、Ｒ３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１の各例は独立に−Ｎ（Ｒ４）２であり、式中、各Ｒ４はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択される。
種々の実施形態では、Ｒ２は、Ｈまたはアシルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化７３】
2018525015.tif 000078
を有し、Ｒ２は水素である。
【０２１７】
別の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶａ）：
【化７４】
2018525015.tif 000079
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは６〜３８の整数である。
【０２１８】
別の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）：
【化７５】
2018525015.tif 000080
の化合物または薬学的に許容されるその塩［式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり；
Ｚは、６〜３８の整数であり；
各Ｙは、Ｏおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、式中、Ｒ５は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり；
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化７６】
2018525015.tif 000081
の部分から選択され、式中、
Ａは、−ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）２Ｒ８およびＲ１から選択され、式中、
各Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ８は、電子対およびＨから選択され、そして
Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ９）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化７７】
2018525015.tif 000082
の部分から選択され、式中、
Ｒ９は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１０は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１ＯＨ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
ｍは、１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−を有し、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基の各々は、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され；
Ｒ１２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１の各例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）は、
−Ｎ（Ｒ１３）２Ｒ１４［式中、各Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、そしてＲ１４は電子対およびＨから選択される］；
式（ＩＩ）：
【化７８】
2018525015.tif 000083
の部分［式中、
Ｒ１５は、Ｈ、Ｇ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ１８Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、式中、
Ｒ１８は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｒ１６は、電子対およびＨから選択され；そして
各Ｒ１７は、Ｈおよびメチルから独立に選択される］；および
式（ＩＩＩ）：
【化７９】
2018525015.tif 000084
の部分［式中、
Ｒ１９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝
ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ２２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２、およびＧから選択され、式中、
Ｒ２２は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
ｒは、１〜５の整数であり、
Ｒ２０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ２１は、電子対およびＨから選択される］
から独立に選択され；
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
ここで、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化８０】
2018525015.tif 000085
を有し、式中、ＣＰＰは、Ｇの最大で１つの例が存在するという条件で、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、以下の条件のうちの少なくとも１つが存在する：
ｃ）Ｒ１の少なくとも１つが式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）であるか、または
ｄ）Ｒ２がＧであるか、またはＴが
【化８１】
2018525015.tif 000086
である］
である。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、
【化８２】
2018525015.tif 000087
から選択される。
【０２２０】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化８３】
2018525015.tif 000088
である。
【０２２１】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、各Ｒ１は
【化８４】
2018525015.tif 000089
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化８５】
2018525015.tif 000090
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化８６】
2018525015.tif 000091
である。
【０２２２】
種々の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化８７】
2018525015.tif 000092
である。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、各ＹはＯであり、各Ｒ１は
【化８８】
2018525015.tif 000093
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化８９】
2018525015.tif 000094
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化９０】
2018525015.tif 000095
である。
【０２２４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化９１】
2018525015.tif 000096
であり、
少なくとも１つの他のＲ１は
【化９２】
2018525015.tif 000097
である。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化９３】
2018525015.tif 000098
であり、Ｔは
【化９４】
2018525015.tif 000099
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２２６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化９５】
2018525015.tif 000100
であり、Ｔは
【化９６】
2018525015.tif 000101
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化９７】
2018525015.tif 000102
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化９８】
2018525015.tif 000103
であり、Ｔは
【化９９】
2018525015.tif 000104
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２２８】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化１００】
2018525015.tif 000105
を有し、各ＹはＯであり、Ｒ２はＨである。
【０２２９】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化１０１】
2018525015.tif 000106
を有し、Ｒ２はＧである。
【０２３０】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化１０２】
2018525015.tif 000107
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２３１】
種々の実施形態では、Ｒ２はＨまたはアシルから選択され、Ｔは式：
【化１０３】
2018525015.tif 000108
を有し、各ＹはＯであり、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化１０４】
2018525015.tif 000109
を有し、各ＹはＯであり、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＧである。
【０２３３】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１０５】
2018525015.tif 000110
であり、Ｔは
【化１０６】
2018525015.tif 000111
であり、Ｒ２はＧである。
【０２３４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１０７】
2018525015.tif 000112
であり、Ｔは式：
【化１０８】
2018525015.tif 000113
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２３５】
種々の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０２３６】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化１０９】
2018525015.tif 000114
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化１１０】
2018525015.tif 000115
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２３８】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２は、ＨまたはＧから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、式中、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０２３９】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｖａ）：
【化１１１】
2018525015.tif 000116
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、
【化１１２】
2018525015.tif 000117
から選択される部分であり、
各Ｒ１は、
【化１１３】
2018525015.tif 000118
から独立に選択され、
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは式：
【化１１４】
2018525015.tif 000119
を有し、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、以下の条件のうち少なくとも１つが存在する：
ｅ）少なくとも１つのＲ１は
【化１１５】
2018525015.tif 000120
である、または
ｆ）Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化１１６】
2018525015.tif 000121
である。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、
【化１１７】
2018525015.tif 000122
から選択される。
【０２４１】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１１８】
2018525015.tif 000123
である。
【０２４２】
一部の実施形態では、各Ｒ１は
【化１１９】
2018525015.tif 000124
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化１２０】
2018525015.tif 000125
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化１２１】
2018525015.tif 000126
である。
【０２４３】
種々の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１２２】
2018525015.tif 000127
である。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、各Ｒ１は
【化１２３】
2018525015.tif 000128
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化１２４】
2018525015.tif 000129
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化１２５】
2018525015.tif 000130
である。
【０２４５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１２６】
2018525015.tif 000131
であり、
少なくとも１つの他のＲ１は
【化１２７】
2018525015.tif 000132
である。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１２８】
2018525015.tif 000133
であり、Ｔは
【化１２９】
2018525015.tif 000134
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、各Ｒ１は、
【化１３０】
2018525015.tif 000135
から独立に選択される。
【０２４８】
種々の実施形態では、以下の条件のうち少なくとも１つが存在する：
ａ）少なくとも１つのＲ１は
【化１３１】
2018525015.tif 000136
である、または
ｂ）Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化１３２】
2018525015.tif 000137
である。
【０２４９】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１３３】
2018525015.tif 000138
であり、Ｔは
【化１３４】
2018525015.tif 000139
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２５０】
種々の実施形態では、Ｒ２はＨまたはアシルから選択され、Ｔは式：
【化１３５】
2018525015.tif 000140
を有し、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１３６】
2018525015.tif 000141
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化１３７】
2018525015.tif 000142
であり、Ｔは
【化１３８】
2018525015.tif 000143
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２５２】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化１３９】
2018525015.tif 000144
を有し、Ｒ２はＧである。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化１４０】
2018525015.tif 000145
を有し、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＧである。
【０２５４】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化１４１】
2018525015.tif 000146
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２５５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１４２】
2018525015.tif 000147
であり、Ｔは
【化１４３】
2018525015.tif 000148
であり、Ｒ２はＧである。
【０２５６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１４４】
2018525015.tif 000149
であり、Ｔは式：
【化１４５】
2018525015.tif 000150
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２５７】
種々の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０２５８】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化１４６】
2018525015.tif 000151
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化１４７】
2018525015.tif 000152
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２６０】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｖｂ）：
【化１４８】
2018525015.tif 000153
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、
【化１４９】
2018525015.tif 000154
から選択される部分であり、
各Ｒ１は、
【化１５０】
2018525015.tif 000155
から独立に選択され、
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、およびアシルから選択され、
式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、Ｇは式：
【化１５１】
2018525015.tif 000156
を有し、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
ここで、以下の条件のうち少なくとも１つが存在する：
ｃ）少なくとも１つのＲ１は
【化１５２】
2018525015.tif 000157
である、または
ｄ）Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化１５３】
2018525015.tif 000158
である。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、各Ｒ１は、
【化１５４】
2018525015.tif 000159
から独立に選択される。
【０２６２】
種々の実施形態では、以下の条件のうち少なくとも１つが存在する：
ａ）少なくとも１つのＲ１は
【化１５５】
2018525015.tif 000160
である、または
ｂ）Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化１５６】
2018525015.tif 000161
である。
【０２６３】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１５７】
2018525015.tif 000162
である。
【０２６４】
一部の実施形態では、各Ｒ１は
【化１５８】
2018525015.tif 000163
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化１５９】
2018525015.tif 000164
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化１６０】
2018525015.tif 000165
である。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、各Ｒ１は
【化１６１】
2018525015.tif 000166
および−Ｎ（ＣＨ３）２から独立に選択され、Ｔは
【化１６２】
2018525015.tif 000167
であり、Ｒ２はＨであり、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化１６３】
2018525015.tif 000168
である。
【０２６６】
種々の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１６４】
2018525015.tif 000169
である。
【０２６７】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１６５】
2018525015.tif 000170
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化１６６】
2018525015.tif 000171
である。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１６７】
2018525015.tif 000172
であり、Ｔは
【化１６８】
2018525015.tif 000173
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２６９】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１６９】
2018525015.tif 000174
であり、Ｔは
【化１７０】
2018525015.tif 000175
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１７１】
2018525015.tif 000176
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化１７２】
2018525015.tif 000177
であり、Ｔは
【化１７３】
2018525015.tif 000178
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２７１】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化１７４】
2018525015.tif 000179
を有し、Ｒ２はＧである。
【０２７２】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化１７５】
2018525015.tif 000180
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２７３】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１７６】
2018525015.tif 000181
であり、Ｔは
【化１７７】
2018525015.tif 000182
であり、Ｒ２はＧである。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、Ｔは式：
【化１７８】
2018525015.tif 000183
を有し、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＧである。
【０２７５】
種々の実施形態では、Ｒ２はＨまたはアシルから選択され、Ｔは式：
【化１７９】
2018525015.tif 000184
を有し、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０２７６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化１８０】
2018525015.tif 000185
であり、Ｔは式：
【化１８１】
2018525015.tif 000186
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２７７】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化１８２】
2018525015.tif 000187
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化１８３】
2018525015.tif 000188
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０２７９】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化１８４】
2018525015.tif 000189
を有する。
【０２８０】
ある特定の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩ）：
【化１８５】
2018525015.tif 000190
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
各ＹはＯおよび−ＮＲ４から独立に選択され、式中、各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アラルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＲ５Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、およびＧから独立に選択され、ここで、Ｒ５はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｔは、式：
【化１８６】
2018525015.tif 000191
の部分から選択され、
式中、Ｒ３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
各Ｒ１は、
【化１８７】
2018525015.tif 000192
から独立に選択され、
Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
式中、少なくとも１つのＲ１は
【化１８８】
2018525015.tif 000193
である。
【０２８１】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、少なくとも１つのＲ１は
【化１８９】
2018525015.tif 000194
である。
【０２８２】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、少なくとも１つのＲ１は
【化１９０】
2018525015.tif 000195
である。
【０２８３】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、少なくとも１つのＲ１は
【化１９１】
2018525015.tif 000196
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化１９２】
2018525015.tif 000197
である。
【０２８４】
ある特定の実施形態では、各ＹはＯであり、少なくとも１つのＲ１は
【化１９３】
2018525015.tif 000198
であり、Ｔは
【化１９４】
2018525015.tif 000199
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２８５】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、各Ｒ１は
【化１９５】
2018525015.tif 000200
から独立に選択され、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化１９６】
2018525015.tif 000201
であり、Ｔは
【化１９７】
2018525015.tif 000202
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２８６】
一部の実施形態では、各ＹはＯであり、少なくとも１つのＲ１は
【化１９８】
2018525015.tif 000203
であり、Ｔは
【化１９９】
2018525015.tif 000204
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２８７】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、各Ｒ１は
【化２００】
2018525015.tif 000205
から独立に選択され、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２０１】
2018525015.tif 000206
であり、Ｔは
【化２０２】
2018525015.tif 000207
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２８８】
ある特定の実施形態では、各ＹはＯであり、少なくとも１つのＲ１は
【化２０３】
2018525015.tif 000208
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化２０４】
2018525015.tif 000209
であり、Ｔは
【化２０５】
2018525015.tif 000210
であり、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩａ）：
【化２０６】
2018525015.tif 000211
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
各Ｒ１は、
【化２０７】
2018525015.tif 000212
から独立に選択され、
Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２０８】
2018525015.tif 000213
である。
【０２９０】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化２０９】
2018525015.tif 000214
である。
【０２９１】
種々の実施形態では、各Ｒ１は、
【化２１０】
2018525015.tif 000215
から独立に選択され、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２１１】
2018525015.tif 000216
であり、Ｔは
【化２１２】
2018525015.tif 000217
である。
【０２９２】
種々の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化２１３】
2018525015.tif 000218
である。
【０２９３】
種々の実施形態では、各Ｒ１は、
【化２１４】
2018525015.tif 000219
から独立に選択され、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２１５】
2018525015.tif 000220
であり、Ｔは
【化２１６】
2018525015.tif 000221
である。
【０２９４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化２１７】
2018525015.tif 000222
であり、少なくとも１つの他のＲ１は
【化２１８】
2018525015.tif 000223
である。
【０２９５】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩＩ）：
【化２１９】
2018525015.tif 000224
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、
【化２２０】
2018525015.tif 000225
の部分から選択され、
各Ｒ１は、
【化２２１】
2018525015.tif 000226
から独立に選択され、
Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２２２】
2018525015.tif 000227
である。
【０２９６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化２２３】
2018525015.tif 000228
である。
【０２９７】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は
【化２２４】
2018525015.tif 000229
であり、Ｔは
【化２２５】
2018525015.tif 000230
である。
【０２９８】
種々の実施形態では、各Ｒ１は、
【化２２６】
2018525015.tif 000231
から独立に選択され、式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２２７】
2018525015.tif 000232
であり、Ｔは
【化２２８】
2018525015.tif 000233
である。
【０２９９】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩＩａ）：
【化２２９】
2018525015.tif 000234
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
各Ｒ１は、
【化２３０】
2018525015.tif 000235
から独立に選択され、
式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２３１】
2018525015.tif 000236
である。
【０３００】
種々の実施形態では、各ＹはＯであり、Ｒ２は、ＨまたはＧから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２はＧであり、式中、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０３０１】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩＩＩ）：
【化２３２】
2018525015.tif 000237
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、式：
【化２３３】
2018525015.tif 000238
の部分から選択され、
各Ｒ１は、
【化２３４】
2018525015.tif 000239
から独立に選択され、
Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２３５】
2018525015.tif 000240
である。
【０３０２】
ある特定の実施形態では、Ｔは
【化２３６】
2018525015.tif 000241
である。
【０３０３】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩＩＩａ）：
【化２３７】
2018525015.tif 000242
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
各Ｒ１は、
【化２３８】
2018525015.tif 000243
から独立に選択され、
式中、少なくとも１つのＲ１は
【化２３９】
2018525015.tif 000244
である。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＩＸ）：
【化２４０】
2018525015.tif 000245
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、
【化２４１】
2018525015.tif 000246
から選択される部分であり、式中、Ｒ３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１の各例は独立に−Ｎ（Ｒ４）２であり、ここで、各Ｒ４はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは式：
【化２４２】
2018525015.tif 000247
を有し、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
式中、Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化２４３】
2018525015.tif 000248
である。
【０３０５】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化２４４】
2018525015.tif 000249
を有し、Ｒ２はＧである。
【０３０６】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化２４５】
2018525015.tif 000250
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０３０７】
一部の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０３０８】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化２４６】
2018525015.tif 000251
を有し、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３０９】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化２４７】
2018525015.tif 000252
を有し、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３１０】
一部の実施形態では、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０３１１】
ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＩＸａ）：
【化２４８】
2018525015.tif 000253
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、
【化２４９】
2018525015.tif 000254
から選択される部分であり、
Ｒ２は、Ｇ、Ｈ、およびアシルから選択され、
式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは式：
【化２５０】
2018525015.tif 000255
を有し、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合しており、
式中、Ｒ２はＧであるか、またはＴは
【化２５１】
2018525015.tif 000256
である。
【０３１２】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化２５２】
2018525015.tif 000257
を有し、Ｒ２はＧである。
【０３１３】
一部の実施形態では、Ｔは式：
【化２５３】
2018525015.tif 000258
を有し、Ｒ２はＨまたはアシルである。
【０３１４】
一部の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０３１５】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化２５４】
2018525015.tif 000259
を有し、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３１６】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化２５５】
2018525015.tif 000260
を有し、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｘ）：
【化２５６】
2018525015.tif 000261
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｔは、
【化２５７】
2018525015.tif 000262
から選択される部分であり、
式中、Ｒ３は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ１の各例は独立に−Ｎ（Ｒ４）２であり、ここで、各Ｒ４はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは式：
【化２５８】
2018525015.tif 000263
を有し、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している。
【０３１８】
種々の実施形態では、Ｔは式：
【化２５９】
2018525015.tif 000264
を有する。
【０３１９】
一部の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０３２０】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化２６０】
2018525015.tif 000265
を有し、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化２６１】
2018525015.tif 000266
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３２１】
一部の実施形態では、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（Ｘａ）：
【化２６２】
2018525015.tif 000267
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３２３】
一部の実施形態では、Ｒａはアシルである。
【０３２４】
ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＸＩ）：
【化２６３】
2018525015.tif 000268
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｒ１の各例は独立に−Ｎ（Ｒ２）２であり、ここで、各Ｒ２はＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
ＲはＨまたはアシルから選択され、
式中、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは式：
【化２６４】
2018525015.tif 000269
を有し、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している。
【０３２５】
一部の実施形態では、ＣＰＰは配列番号１７〜３２から選択される配列を有する。
【０３２６】
一部の実施形態では、Ｇは式：
【化２６５】
2018525015.tif 000270
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。ある特定の実施形態では、ＣＰＰは式：
【化２６６】
2018525015.tif 000271
を有し、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０３２７】
一部の実施形態では、各Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、式（ＸＩａ）：
【化２６７】
2018525015.tif 000272
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
各Ｎｕは、一緒になってターゲティング配列を形成するヌクレオ塩基であり、
Ｚは、６〜３８の整数であり、
Ｒは、Ｈまたはアシルから選択され、
Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
一部の実施形態では、Ｒａはアシルである。ある特定の実施形態では、ＲはＨである。
【０３２９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）のターゲティング配列は、
ａ）配列番号７（ＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１６である）、
ｂ）配列番号８（ＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは１８である）、および
ｃ）配列番号６（ＧＸＡＡＧＡＸＸＹＡＹＸＸＸＹＡＸＡＡＸＧＹＸＧＧ）（Ｚは２３である）
から選択され、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号６〜８の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、配列番号６〜８の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０３３０】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＴである。
【０３３１】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＸはＵである。
【０３３２】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各Ｙは５ｍＣである。
【０３３３】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、ターゲティング配列の各ＹはＣである。
【０３３４】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＸはＴである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＴである。
【０３３５】
種々の実施形態では、ターゲティング配列の少なくとも１つのＸはＵである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＸはＵである。
【０３３６】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹは５ｍＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｙは５ｍＣである。
【０３３７】
種々の実施形態では、配列番号４〜１６の少なくとも１つのＹはＣである。種々の実施形態では、配列番号４〜１６の各ＹはＣである。
【０３３８】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、６〜２８の整数である。
【０３３９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、８〜２８の整数である。
【０３４０】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１４〜２８の整数である。
【０３４１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１６〜２８の整数である。
【０３４２】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、６〜２６の整数である。
【０３４３】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、８〜２６の整数である。
【０３４４】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１４〜２６の整数である。
【０３４５】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１６〜２６の整数である。
【０３４６】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、６〜２３の整数である。
【０３４７】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、８〜２３の整数である。
【０３４８】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１４〜２３の整数である。
【０３４９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１６〜２３の整数である。
【０３５０】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、６〜１６の整数である。
【０３５１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、は６である。
【０３５２】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、８〜１６の整数である。
【０３５３】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、は８である。
【０３５４】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、６〜１０の整数である。
【０３５５】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、は１０である。
【０３５６】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１６〜１８の整数である。
【０３５７】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、は１６である。
【０３５８】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、１８〜２０の整数である。
【０３５９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、は１８である。
【０３６０】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、２３〜２５の整数である。
【０３６１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｚは、は２３である。
【０３６２】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの各Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン（イノシン）、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、および１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）から独立に選択される。
【０３６３】
例えば、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖｂ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む多様な実施形態では、ターゲティング配列は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域に相補的である。一部の実施形態では、ターゲティング配列は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６またはイントロン７（例えば、配列番号４〜１６または３３〜４５）内の標的領域における８またはそれより多くの連続ヌクレオチドに相補的である。
【０３６４】
種々の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）のターゲティング配列は、配列番号４〜１６または３３〜４５のうちの１つを含むか、配列番号４〜１６または３３〜４５のうちの１つから選択されるか、配列番号４〜１６または３３〜４５のうちの少なくとも１つから選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号４〜１６または３３〜４５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、配列番号４〜１６について、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。一部の実施形態では、配列番号４〜１６の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、および配列番号４〜１６の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。
【０３６５】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖｂ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、配列番号４〜１６から選択される配列を含むか、配列番号４〜１６から選択されるか、配列番号４〜１６から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号４〜１６から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。
【０３６６】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、配列番号６、７、および８から選択される配列を含むか、配列番号６、７、および８から選択されるか、配列番号６、７、および８から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号６、７、および８から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここで、各Ｘは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から独立に選択され、各Ｙは、シトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から独立に選択される。
【０３６７】
種々の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）のターゲティング配列は、配列番号３３〜４５のうちの１つを含むか、配列番号３３〜４５のうちの１つから選択されるか、配列番号３３〜４５のうちの少なくとも１つから選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号３３〜４５のうちの少なくとも１つから選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体である。
【０３６８】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、配列番号３５、３６、および３７から選択される配列を含むか、配列番号３５、３６、および３７から選択されるか、配列番号３５、３６、および３７から選択される配列のうちの、少なくとも８連続ヌクレオチドの断片であるか、または配列番号３５、３６、および３７から選択される配列に対する、少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体である。
【０３６９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）のターゲティング配列は、
ａ）配列番号３５（ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ）（Ｚは１６である）、
ｂ）配列番号３６（ＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ）（Ｚは１８である）、および
ｃ）配列番号３７（ＧＴＡＡＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ）（Ｚは２３である）
から選択される。
【０３７０】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号７、１０、１４、および１５から選択されるターゲティング配列を含む。
【０３７１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号８および１２から選択されるターゲティング配列を含む。
【０３７２】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号１３および１６から選択されるターゲティング配列を含む。
【０３７３】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号６、７、および８から選択されるターゲティング配列を含む。
【０３７４】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号６であるターゲティング配列を含む。
【０３７５】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号７であるターゲティング配列を含む。
【０３７６】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号８であるターゲティング配列を含む。
【０３７７】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号３５、３６、および３７から選択されるターゲティング配列を含む。
【０３７８】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号３５であるターゲティング配列を含む。
【０３７９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号３６であるターゲティング配列を含む。
【０３８０】
一部の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）、（ＩＸ）、（ＩＸａ）、（Ｘ）、（Ｘａ）、（ＸＩ）、および（ＸＩａ）の化合物を含む本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、配列番号３７であるターゲティング配列を含む。
【０３８１】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１−１】
2018525015.tif 000273
【表Ａ１−２】
2018525015.tif 000274
【表Ａ１−３】
2018525015.tif 000275
【０３８２】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２−１】
2018525015.tif 000276
【表Ａ２−２】
2018525015.tif 000277
【０３８３】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３】
2018525015.tif 000278
【０３８４】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ４】
2018525015.tif 000279
【０３８５】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ５】
2018525015.tif 000280
【０３８６】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ６】
2018525015.tif 000281
【０３８７】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ７】
2018525015.tif 000282
【０３８８】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ８】
2018525015.tif 000283
【０３８９】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ９】
2018525015.tif 000284
【０３９０】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１０】
2018525015.tif 000285
【０３９１】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１１】
2018525015.tif 000286
【０３９２】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１２】
2018525015.tif 000287
【０３９３】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１３】
2018525015.tif 000288
【０３９４】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１４】
2018525015.tif 000289
【０３９５】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１５】
2018525015.tif 000290
【０３９６】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１６】
2018525015.tif 000291
【０３９７】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１７】
2018525015.tif 000292
【０３９８】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１８】
2018525015.tif 000293
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ１９−１】
2018525015.tif 000294
【表Ａ１９−２】
2018525015.tif 000295
【表Ａ１９−３】
2018525015.tif 000296
【０３９９】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２０−１】
2018525015.tif 000297
【表Ａ２０−２】
2018525015.tif 000298
【表Ａ２０−３】
2018525015.tif 000299
【０４００】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２１】
2018525015.tif 000300
【０４０１】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２２】
2018525015.tif 000301
【０４０２】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２３】
2018525015.tif 000302
【０４０３】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２４】
2018525015.tif 000303
【０４０４】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２５】
2018525015.tif 000304
【０４０５】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２６】
2018525015.tif 000305
【０４０６】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２７】
2018525015.tif 000306
【０４０７】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２８】
2018525015.tif 000307
【０４０８】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ２９】
2018525015.tif 000308
【０４０９】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３０】
2018525015.tif 000309
【０４１０】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３１】
2018525015.tif 000310
【０４１１】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３２】
2018525015.tif 000311
【０４１２】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３３】
2018525015.tif 000312
【０４１３】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３４】
2018525015.tif 000313
【０４１４】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３５】
2018525015.tif 000314
【０４１５】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３６】
2018525015.tif 000315
【０４１６】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３７】
2018525015.tif 000316
【０４１７】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３８】
2018525015.tif 000317
【０４１８】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ３９】
2018525015.tif 000318
【０４１９】
一部の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、以下の化合物から選択される。
【表Ａ４０】
2018525015.tif 000319
【０４２０】
先行頁の表に記載の化合物それぞれについて、ターゲティング配列の配列番号の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、ターゲティング配列の配列番号の各Ｙはシトシン（ｃｙｓｔｏｓｉｎｅ）（Ｃ）であり、各太字および下線付き塩基はそのサブユニットと先行するサブユニットとの間に修飾の列に示す種類のサブユニット間連結を有するサブユニットを示している。太字および下線付きではない場合、サブユニット間連結はジメチルアミノホスホロジアミデート連結である。
【０４２１】
上記の表および本開示全体において記載の化合物それぞれの化学構造は、本開示全体を通じて提供される記載に基づいて当業者によって容易に理解される。例えばＰＭＯ−２が次の構造：
【化２６８】
2018525015.tif 000320
を有し、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１１が次の構造：
【化２６９】
2018525015.tif 000321
を有することは容易に理解される。
【０４２２】
同様に、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−３が次の構造：
【化２７０】
2018525015.tif 000322
を有し、ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−２が次の構造：
【化２７１】
2018525015.tif 000323
を有することは容易に理解される。
【０４２３】
既に考察の通り、表の全ての他の化合物の構造も同様に理解される。明確にするために、例えばＰＭＯ−２、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１１、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−３およびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−２の上の構造を含む本開示の構造は、５’から３’に連続的であり、コンパクトな形態で全体構造を示す利便性のために、「中断Ａ」および「中断Ｂ」および「中断Ｃ」と標識される多様な図示による中断が含まれている。当業者によって理解される通り、例えば「中断Ａ」という各表示は、これらの点における構造の図の連続を示している。当業者は、上の構造中の「中断Ｂ」および「中断Ｃ」の各場合についても同じであることを理解する。しかし、図の中断は、上の構造の実際の不連続性を示すことを意図しておらず、当業者はそれを意味すると理解しない。
【０４２４】
本開示に従い使用されうる、さらなる修飾アンチセンスオリゴマー／化学は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、以下の特許および特許公報：ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／００２３９０号；同第ＷＯ２０１０／１２０８２０号；および同第ＷＯ２０１０／１４８２４９号；米国特許第７，８３８，６５７号；ならびに米国特許出願第２０１１／０２６９８２０号において記載されているアンチセンスオリゴマー／化学を含む。
【０４２５】
Ｃ．モルホリノサブユニットおよびホスホルアミデートヌクレオシド間リンカーの調製
モルホリノ単量体サブユニット、修飾ヌクレオシド間連結、およびこれらを含むオリゴマーは、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８５，４４４号および同第７，９４３，７６２号において記載されている通りに調製することができる。モルホリノサブユニットは、以下の一般的な反応スキームＩに従い調製することができる。
【化２７２】
2018525015.tif 000324
【０４２６】
反応スキーム１［式中、Ｂは、塩基対合部分を表し、ＰＧは、保護基を表す］を参照すると、モルホリノサブユニットは、示される通り、対応するリボヌクレオシド（１）から調製することができる。モルホリノサブユニット（２）は、任意選択で、適切な保護基前駆体、例えば、トリチルクロリドを伴う反応により保護することができる。下記でより詳細に記載される通り、３’保護基は一般に、固体オリゴマー合成時に除去する。塩基対合部分は、固相オリゴマー合成に適するように保護することができる。適切な保護基は、アデニンおよびシトシンのためのベンゾイル、グアニンのためのフェニルアセチル、およびヒポキサンチン（Ｉ）のためのピバロイルオキシメチルを含む。ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位へと導入することができる。非保護のヒポキサンチンサブユニットも使用しうるが、塩基を保護する場合の活性化反応の収率は、はるかに優れている。他の適切な保護基は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０７６，４７６号において開示されている保護基を含む。
【０４２７】
活性化リン化合物４を伴う化合物３の反応は、所望の連結部分である化合物５を有するモルホリノサブユニットをもたらす。構造４の化合物は、任意の数の、当業者に公知の方法を使用して調製することができる。例えば、このような化合物は、対応するアミンと、オキシ塩化リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）との反応により調製することができる。この点で、アミン出発材料は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、実施例、ならびに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８５，４４４号、同第７，９４３，７６２号、および同第８，７７９，１２８号において記載されている方法を使用して調製することができる。
【０４２８】
構造５の化合物は、ヌクレオシド間連結を含むオリゴマーを調製するための固相自動式オリゴマー合成において使用することができる。このような方法は、当技術分野で周知である。略述すると、構造５の化合物は、固体支持体へのリンカーを含有するように、５’末端において修飾することができる。例えば、化合物５は、Ｌ１１およびＬ１５を含むリンカーにより、固体支持体へと連結することができる。支持がなされたら、保護基（例えば、トリチル）を除去し、遊離アミンを、第２の構造５の化合物の活性化リン部分と反応させる。このシークエンスを、所望の長さのオリゴが得られるまで繰り返す。５’末端における保護基は、除去することもでき、５’修飾が望ましい場合は、残すこともできる。オリゴは、任意の数の方法、例えば、ＤＴＴによる処理に続く、水酸化アンモニウムによる処理を使用して、固体支持体から除去することができる。
【０４２９】
修飾モルホリノサブユニットおよびモルホリノベースのオリゴマーの調製については、実施例においてより詳細に記載する。本明細書で記載される方法、当技術分野で公知であり、かつ／または参照により本明細書で記載される方法を使用して、任意の数の修飾連結を含有するモルホリノベースのオリゴマーを調製することができる。実施例ではまた、既に記載されている（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０３６１２７号を参照されたい）通りに調製された、モルホリノベースのオリゴマーの全般的な修飾についても記載する。
【０４３０】
「保護基」という用語は、化合物の一部または全部の反応性部分をブロックし、保護基を除去するまで、このような部分が、化学反応に参与することを防止する化学的部分、例えば、Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９年）（その全体が本明細書において参考として援用される）において列挙および記載されている部分を指す。異なる保護基を使用する場合、各（異なる）保護基が、異なる手段により除去可能であることは、有利でありうる。完全に非対応の反応条件下で切断される保護基は、このような保護基の示差的な除去を可能とする。例えば、保護基は、酸、塩基、および加水分解により除去することができる。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタール、およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの基は、酸不安定性であり、加水分解により除去可能なＣｂｚ基、および塩基不安定性のＦｍｏｃ基で保護されるアミノ基の存在下で、カルボキシ反応性部分およびヒドロキシ反応性部分を保護するのに使用することができる。カルボン酸部分は、限定なしに述べると、メチルまたはエチルなどの塩基不安定性基でブロックすることができ、ヒドロキシ反応性部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートなどの酸不安定性基、または酸安定性であり、かつ、塩基安定性であるが、加水分解により除去可能なカルバメートでブロックされるアミンの存在下では、アセチルなどの塩基不安定性基でブロックすることができる。
【０４３１】
カルボン酸反応性部分およびヒドロキシル反応性部分はまた、ベンジル基など、加水分解により除去可能な保護基でブロックしうるのに対し、アミン基は、Ｆｍｏｃなどの塩基不安定性基でブロックすることができる。式（Ｉ）の化合物を合成するのに、特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分が、２，４−ジメトキシベンジルなど、酸化により除去可能な保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）でブロックしうるのに対し、共存するアミノ基は、フルオリド不安定性シリルカルバメートでブロックすることができる。
【０４３２】
アリルブロッキング基は、酸保護基および塩基保護基の存在下において、前者が、安定であり、その後、金属またはパイ−酸触媒により除去されうるので、有用である。例えば、アリルでブロックされたカルボン酸は、酸不安定性ｔ−ブチルカルバメートまたは塩基不安定性アセテートアミン保護基の存在下で、パラジウム（０）触媒反応により脱保護することができる。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体が結合しうる樹脂である。残基が樹脂に結合する限りにおいて、その官能基は、ブロックされており、反応することができない。樹脂から放出されると、官能基は、反応に利用可能である。
【０４３３】
典型的なブロッキング／保護基は、当技術分野で公知であり、以下：
【化２７３】
2018525015.tif 000325
の部分を含むがこれらに限定されない。
【０４３４】
そうでないことが注記されない限りにおいて、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。ベンゾイルアデノシン、ベンゾイルシチジン、およびフェニルアセチルグアノシンは、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から得た。
【０４３５】
本明細書で記載される、さらなる連結修飾を含有する、ＰＭＯ、ＰＭＯプラス、ＰＰＭＯ、およびＰＭＯ−Ｘの合成は、当技術分野で公知であり、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／２７１，０３６号および同第１２／２７１，０４０号ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０６４４７１号において記載されている方法を使用して行った。
【０４３６】
３’トリチル修飾を伴うＰＭＯは、脱トリチル化（ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）ステップを省くことを除き、本質的に、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０６４４７１号において記載されている通りに合成する。
【０４３７】
Ｄ．細胞透過性ペプチド
本開示の修飾アンチセンスオリゴマー化合物は、本明細書ではまた、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とも称するペプチドにコンジュゲートしていてもよい。ある特定の好ましい実施形態では、ペプチドは、化合物の、細胞への輸送を増強するのに有効な、アルギニンに富むペプチド輸送部分である。輸送部分は、オリゴマーの末端に結合させることが好ましい。ペプチドは、全身投与されると、所与の細胞培養物集団の細胞のうちの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であって、間の全ての整数を含む％の細胞内の細胞透過を誘導し、インビボにおいて、複数の組織内の高分子のトランスロケーションを可能とする能力を有する。一実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アルギニンに富むペプチド輸送体でありうる。別の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ペネトラチンまたはＴａｔペプチドでありうる。当技術分野では、これらのペプチドが周知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１０−００１６２１５Ａ１号において開示されている。ペプチドの、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーへのコンジュゲーションのための１つの手法は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１５０９６０号において見出すことができる。本開示のペプチドコンジュゲートオリゴマーについての一部の実施形態は、ＣＰＰと、修飾アンチセンスオリゴマーとの間のリンカーとして、グリシンを活用する。例えば、本開示のペプチドコンジュゲートＰＭＯは、Ｒ６−Ｇ−ＰＭＯからなる。
【０４３８】
上記で記載した輸送部分は、結合オリゴマーの細胞移入を、結合輸送部分の非存在下におけるオリゴマーの取込みと比べて大幅に増強することが示されている。取込みは、非コンジュゲート化合物と比べて、少なくとも１０倍増強することが好ましく、２０倍増強することがより好ましい。
【０４３９】
アルギニンに富むペプチド輸送体（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本開示を実施するのに特に有用である。ある特定のペプチド輸送体は、アンチセンス化合物の、筋細胞を含む初代細胞への送達において、高度に有効であることが示されている（参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｏｄａら、２００７年；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年；Ｗｕ，  Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年）。さらに、ペネトラチンおよびＴａｔペプチドなど、他の公知のペプチド輸送体と比較して、本明細書で記載されるペプチド輸送体は、アンチセンスＰＭＯにコンジュゲートさせると、複数の遺伝子転写物のスプライシングを変更する能力の増強を裏付ける（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｏｄａら、２００７年）。
【０４４０】
リンカーを除く、例示的なペプチド輸送体を、下記の表３に示す。
【表３】
2018525015.tif 000326
【０４４１】
多様な実施形態では、Ｇ（式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、Ｖａ、Ｖｂ、ＩＸ、ＩＸａ、ＸおよびＸＩで列挙された）は、以下：
−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択される細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）およびリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化２７４】
2018525015.tif 000327
を有し、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端において、アミド結合により、リンカー部分に結合している。一部の実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１７〜３２から選択される。
【０４４２】
一部の実施形態では、Ｇ（式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、Ｖａ、Ｖｂ、ＩＸ、ＩＸａ、ＸおよびＸＩにおいて列挙する通り）は、式：
【化２７５】
2018525015.tif 000328
であり、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｊは、４〜９の整数である。ある特定の実施形態では、Ｊは、６である。
【０４４３】
一部の実施形態では、Ｇ（式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、Ｖａ、Ｖｂ、ＩＸ、ＩＸａ、ＸおよびＸＩにおいて列挙する通り）はＡｃ−Ｒ６Ｇｌｙ−であり、式中Ｇは式：
【化２７６】
2018525015.tif 000329
であり、Ｒａは、アセチルである。
【０４４４】
多様な実施形態では、ＣＰＰ（式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、Ｖａ、Ｖｂ、ＩＸ、ＩＸａ、ＸおよびＸＩにおいて列挙する通り）は、式：
【化２７７】
2018525015.tif 000330
であり、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｊは、４〜９の整数である。ある特定の実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１５である。多様な実施形態では、Ｊは、６である。一部の実施形態では、Ｒａは、Ｈおよびアセチルから選択される。例えば、一部の実施形態では、Ｒａは、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｒａは、アセチルである。
【０４４５】
ＩＶ．製剤
本開示の化合物はまた、取込み、分布、および／または吸収を支援するために、例えば、リポソーム、受容体にターゲティングされた分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤、または他の製剤として、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合するか、これらと共に封入するか、これらにコンジュゲートさせるか、またはこれらと他の形で会合させることもできる。このような取込み支援製剤、分布支援製剤、および／または吸収支援製剤の調製について教示する、代表的な米国特許は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号および同第５，５９５，７５６号を含むがこれらに限定されない。
【０４４６】
本開示のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物へと投与されると、生物学的に活性の代謝物もしくはその残余物をもたらす（直接的または間接的に）ことが可能な、他の任意の化合物を包含する。したがって、例えば、本開示はまた、本開示の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物へも導かれる。
【０４４７】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素または他の化学物質および／もしくは条件の作用により、体内またはその細胞内で活性形態（すなわち、薬物）へと転換される、不活性形態で調製された治療剤を指し示す。特に、本開示のオリゴマーのプロドラッグバージョンは、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、１９９３年１２月９日に公開された、ＧｏｓｓｅｌｉｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ１９９３／２４５１０号またはＩｍｂａｃｈらによる、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／２６７６４号および米国特許第５，７７０，７１３号において開示されている方法に従い、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【０４４８】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の、生理学的かつ薬学的に許容される塩：すなわち、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果をこれに付与しない塩を指す。オリゴマーについては、薬学的に許容される塩およびそれらの使用の例については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０４４９】
本開示はまた、本開示のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本開示の医薬組成物は、局所処置が望ましいのか、全身処置が望ましいのか、および処置される領域に応じて、多数の方式で投与することができる。投与は、局所投与（眼投与および膣送達および直腸送達を含む粘膜への投与を含む）、肺投与、例えば、噴霧器による投与を含む、散剤またはエアゾールによる吸入または送気による投与；気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、経口投与、または非経口投与でありうる。非経口投与は、静脈内注射もしくは静脈内注入、動脈内注射もしくは動脈内注入、皮下注射もしくは皮下注入、腹腔内注射もしくは腹腔内注入、または筋内注射もしくは筋内注入；あるいは頭蓋内投与、例えば、髄腔内投与または脳室内投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴うオリゴマーは、経口投与に特に有用であると考えられる。局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤（ｌｉｑｕｉｄ）、および散剤を含みうる。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが、必要であるかまたは望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた、有用でありうる。
【０４５０】
単位剤形で提示されると好都合でありうる本開示の医薬製剤は、製薬業界で周知の従来の技法に従い調製することができる。このような技法は、有効成分を、医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を、液体担体もしくは微細に分割された固体担体、またはこれらの両方と、均一かつ十分に会合させ、次いで、必要な場合、生成物を成形することにより調製する。
【０４５１】
本開示の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐剤、および浣腸剤（ｅｎｅｍａ）などであるがこれらに限定されない、多くの可能な剤形のうちのいずれかへと製剤化することができる。本開示の組成物はまた、水性媒体中、非水性媒体中、または混合媒体中の懸濁物としても製剤化することができる。水性懸濁物は、懸濁物の粘性を増加させる物質であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む物質をさらに含有しうる。懸濁物はまた、安定化剤も含有しうる。
【０４５２】
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルジョン、泡沫、およびリポソームを含有する製剤を含むがこれらに限定されない。本開示の医薬組成物および製剤は、１または複数の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の活性成分もしくは不活性成分を含みうる。
【０４５３】
エマルジョンは、通常０．１μｍの直径を超える液滴の形態で、別の液体中に分散させた１つの液体による不均質系であることが典型的である。エマルジョンは、分散相に加えたさらなる成分と、水相中、油相中の溶液、または分離相としてのそれ自体として存在しうる活性薬物とを含有しうる。マイクロエマルジョンは、本開示の実施形態として含まれる。当技術分野では、エマルジョンおよびそれらの使用が周知であり、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０４５４】
本開示の製剤は、リポソーム製剤を含む。本開示で使用される「リポソーム」という用語は、１または複数の球状の二重層内に配置された、両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームとは、親油性材料から形成された膜と、送達される組成物を含有する水性の内部とを有する、単層または多重層の小胞である。カチオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定的な複合体を形成すると考えられる。ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを捕獲すると考えられる。カチオン性リポソームおよび非カチオン性リポソームのいずれも、ＤＮＡを、細胞へと送達するのに使用されている。
【０４５５】
リポソームはまた、本明細書で使用される用語であって、１または複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指す、「立体安定化」リポソームも含み、この脂質は、リポソームへと組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比べて、循環寿命の増強を結果としてもたらす。立体安定化リポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１もしくは複数の糖脂質を含むか、またはリポソームの小胞形成脂質部分の一部を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分など、１もしくは複数の親水性ポリマーで誘導体化した立体安定化リポソームである。リポソームおよびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０４５６】
本開示の医薬製剤および医薬組成物はまた、界面活性剤も含みうる。当技術分野では、薬物製品中、製剤中、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が周知である。界面活性剤およびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０４５７】
一部の実施形態では、本開示は、多様な浸透増強剤を使用して、核酸、特に、オリゴマーの効率的な送達を行う。細胞膜を横切る非親油性薬物の拡散の支援に加えて、浸透増強剤はまた、親油性薬物の透過性も増強する。浸透増強剤は、５つの大きな類別、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類することができる。浸透増強剤およびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。
【０４５８】
当業者は、製剤が、それらの意図される使用、すなわち、投与経路に従い、慣例的にデザインされることを認識するであろう。
【０４５９】
局所投与のための製剤は、本開示のオリゴマーを、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤など、局所送達剤と混合した製剤を含む。脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。
【０４６０】
局所投与または他の投与のために、本開示のオリゴマーを、リポソーム内に封入することもでき、リポソーム、特に、カチオン性リポソームとの複合体を形成することもできる。代替的に、オリゴマーは、脂質、特に、カチオン性脂質と複合体化させることもできる。脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるそれらの塩、ならびにそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。局所製剤については、それらの全体において本明細書に参考として援用される、１９９９年５月２０日に出願された、米国特許出願第０９／３１５，２９８号およびＭｏｕｒｉｃｈら，２００９，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２９（８）：１９４５−５３において詳細に記載されている。
【０４６１】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水中または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）を含む。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合がある。経口製剤は、本開示のオリゴマーを、１または複数の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート剤と共に投与する経口製剤である。界面活性剤は、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩を含む。胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。一部の実施形態では、本開示は、浸透増強剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩を提示する。例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本開示のオリゴマーは、経口送達することもでき、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で送達することもでき、マイクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体化させることもできる。オリゴマー複合体化剤およびそれらの使用については、その全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，２８７，８６０号においてさらに記載されている。オリゴマーのための経口製剤およびそれらの調製については、それらの全体において本明細書に参考として援用される、米国出願第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日に出願された）、同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日に出願された）、および同第１０／０７１，８２２号（２００２年２月８日に出願された）において詳細に記載されている。
【０４６２】
非経口投与、髄腔内投与、または脳室内投与のための組成物および製剤は、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などであるがこれらに限定されない、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤もまた含有しうる、滅菌水溶液を含みうる。
【０４６３】
別の関連する実施形態では、本開示の組成物は、第１の核酸へとターゲティングされた、１または複数のアンチセンス化合物、特にオリゴマーと、第２の核酸標的へとターゲティングされた、１または複数のさらなるアンチセンス化合物とを含有しうる。代替的に、本開示の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域へとターゲティングされた、２つまたはこれを超えるアンチセンス化合物を含有しうる。当技術分野では、アンチセンス化合物の多数の例が公知である。２つまたはこれを超える組合せ化合物を、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。
【０４６４】
Ｖ．使用方法
ある特定の態様は、治療目的（例えば、脊髄性筋萎縮症を有する被験体を処置すること）のために本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを使用して機能的なＳＭＮタンパク質を増大させる方法に関する。一部の態様では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＮ２遺伝子のプレｍＲＮＡ内の領域に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性を有するヌクレオチド配列を含み、ここでこの領域への修飾アンチセンスオリゴマーの結合は、被験体の細胞および／または組織におけるエクソン７含有ＳＮＭ２  ｍＲＮＡのレベルを増大させる。被験体におけるエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡの増大は、機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させるようにさらに変換される場合がある。それにより、本開示は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを使用してエクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡを増大させることによる機能的なＳＭＮタンパク質の増大方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に罹患しているか、またはこれを発症する危険性がある個体を処置する方法であって、有効量の本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを、被験体に投与するステップを含む方法を提供する。本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーによってターゲティングされる例示的な配列は、表１および２に示されている。
【０４６５】
また、ＳＭＡを処置するためまたはＳＭＡを処置するための医薬の調製において使用するための修飾アンチセンスオリゴマーであって、処置または医薬が本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを含む、修飾アンチセンスオリゴマーも含まれ、例えば、ここで修飾アンチセンスオリゴマーは、（ｉ）修飾ヌクレオシド間連結、（ｉｉ）修飾糖部分、または（ｉｉｉ）前出の組合せを有するヌクレオチド類似体である少なくとも１つのサブユニットと；ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ内の標的領域中の８またはこれを超える連続ヌクレオチドと相補的なターゲティング配列とを任意選択で有する８〜４０のサブユニットを含む。一部の実施形態では、標的領域は、ＳＭＮ２遺伝子および／またはプレｍＲＮＡ  ＳＭＮ２のイントロン６、イントロン７、またはエクソン７内の領域（配列番号１〜３）を含む。さらなる実施形態では、標的領域は、イントロン７内の領域（配列番号１）を含む。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのターゲティング配列は、（ａ）配列番号４〜１６から選択される配列を含む、（ｂ）配列番号４〜１６から選択される、（ｃ）配列番号４〜１６から選択される配列の少なくとも８の連続ヌクレオチドの断片である、または（ｄ）配列番号４〜１６から選択される配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する改変体であり、ここでＸはウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）から選択され、Ｃはシトシン（Ｃ）または５−メチルシトシン（５ｍＣ）から選択される。
【０４６６】
一部の実施形態では、ＳＭＡを処置する方法またはＳＭＡの処置のための医薬は、修飾糖部分を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。修飾糖部分は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）サブユニット、ロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニット、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）サブユニット、トリシクロＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）サブユニット、２’Ｏ−メチルサブユニット、２’Ｏ−メトキシエチルサブユニット、２’−フルオロサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］サブユニット、およびモルホリノサブユニットから選択されうる。
【０４６７】
これらのさらなる態様および実施形態は、修飾ヌクレオシド間連結を含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。多様な実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、ホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結から選択される。さらなる実施形態では、ホスホロジアミデートヌクレオシド間連結は、（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、置換（１，４−ピペラジン）−１−イル部分、４−アミノピペリジン−１−イル部分、または置換４−アミノピペリジン−１−イル部分に共有結合したリン原子を含む。
【０４６８】
これらのさらなる態様および実施形態は、修飾糖部分と修飾ヌクレオシド間連結との少なくとも１つの組合せを含む、ヌクレオチド類似体サブユニットを有する、修飾アンチセンスオリゴマーを含む。
【０４６９】
一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、哺乳動物細胞によって活発に取り込まれる。さらなる実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、そのような取り込みを促進するために本明細書で記載される通りの輸送部分（例えば、輸送ペプチドまたはＣＰＰ）にコンジュゲートされてよい。
【０４７０】
多様な態様は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを使用してエクソン７含有ＳＭＮ  ｍＲＮＡ転写物および／または機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させる方法に関する。いくつかの場合では、エクソン７含有ＳＭＮ  ｍＲＮＡ転写物および／または機能的なＳＭＮタンパク質を、対照、例えば、対照細胞／被験体（例えば、ＳＭＡを有する被験体）、修飾アンチセンスオリゴマーを含まない対照組成物、処置の非存在、および／またはより前の時点と比べて約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％だけ増大されるまたは増強される。また、対照、例えばＳＭＡを有する被験体のレベルと比べて、機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させる方法も含まれる。本明細書で使用するとき「有効量」または「治療量」は、ＳＭＮプレｍＲＮＡ転写物の標的領域に結合でき、エクソン７含有ＳＭＮ２  ｍＲＮＡ転写物および機能的なＳＭＮタンパク質の発現を、被験体に投与された場合に対照細胞／被験体と比較したときの増大に関して開示された百分率の範囲内で増大できる修飾アンチセンスオリゴマーの用量を指す。
【０４７１】
多様な態様は、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーを使用して、細胞、組織、および／または被験体においてエクソン７含有ＳＭＮ  ｍＲＮＡ転写物および／または機能的なＳＭＮタンパク質の発現を増大させる方法に関する。いくつかの場合では、エクソン７欠失ＳＭＮ  ｍＲＮＡ転写物または機能不全ＳＭＮタンパク質を、対照、例えば、対照細胞／被験体（例えば、ＳＭＡを有する被験体）、修飾アンチセンスオリゴマーを含まない対照組成物、処置の非存在、および／またはより前の時点と比べて約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％、またはほぼこれらの比率で減少させるまたは低減する。また、対照、例えばＳＭＡを有する被験体のレベルと比べて、エクソン７含有ＳＭＮ  ｍＲＮＡ転写物の発現を増大させるまたは機能不全ＳＭＮタンパク質の発現を減少させる方法も含まれる。
【０４７２】
本明細書で使用するとき、被験体は、脊髄、脳および末梢神経系などの神経系組織、心臓、筋肉、腎臓ならびに肝臓を含む１つまたは複数の組織におけるＳＭＮタンパク質の発現および／または活性が低減している（例えば、健常被験体またはより前の時点と比べて）場合がある。一部の実施形態では、被験体は脊髄中の運動ニューロンの数が減少している。被験体は、クレアチンキナーゼを含む脊髄性筋萎縮症に関連する生物学的マーカーの循環レベルが上昇している場合がある。一部の実施形態では、被験体はこれだけに限らないが、筋力低下、脊柱湾曲症ならびに呼吸、吸気、嚥下および真っすぐに座ることに伴う困難などのＳＭＡに関する１つまたは複数の症状を呈する。一部の実施形態では、被験体はそのような症状をまだ呈しておらず、被験体は、ＳＭＮ１遺伝子の存在、変異および／または欠失を検出する現在利用可能な遺伝子試験によって同定されていてもよい。ある特定の実施形態では、被験体は、ＳＭＡ  Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型を有するとして診断された患者である。
【０４７３】
本明細書の修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＡを処置するために被験体に投与することができる。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーは、ＳＭＡの１つまたは複数の症状を呈している被験体に対して好適な医薬用担体において投与される。本明細書で使用するとき、「処置する」という用語は、ＳＭＡ、またはＳＭＡに関する少なくとも１つの識別可能な症状の改善を指す。一部の実施形態では「処置する」は、被験体によって必ずしも識別可能ではない少なくとも１つの測定可能な身体的および／または生物学的パラメーターの改善を指す。被験体は、例えば、筋肉の力および協調の身体的改善、および脊髄中の運動ニューロンの数の増大を経験する場合がある。これらのパラメーターは、例えば、自己評価、医師の検査、身体的および生理学的測定物のための検査室の試験、ならびに被験体由来の試料の生物学的試験によって評価することができる。別の実施形態では、「処置する」はＳＭＡの進行を遅くするまたは進行を元に戻すことを指す。本明細書で使用するとき、「予防する」または「阻害する」は、ＳＭＡの発病を遅らせるまたは発症の危険性を低減することを指す。
【０４７４】
このような処置と共に、ゲノム薬理学（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物または薬物へのその個体の応答との関係についての研究）について考慮することもできる。治療剤の代謝の差違は、薬理学的な活性薬物の用量と血中濃度との関係を変更することにより、重度の毒性または治療の失敗をもたらしうる。こうして、医師または臨床医は、治療剤を投与すべきなのかどうかの決定においてのほか、治療剤による処置の投与量および／または治療レジメンの調整においても関与性のゲノム薬理学研究において得られる知見の適用について考慮することができる。
【０４７５】
修飾アンチセンスオリゴマーの、標的核酸への有効な投与および送達は、処置の１つの側面である。修飾アンチセンスオリゴマーの送達経路は、経口経路および非経口経路を含む、多様な全身経路、例えば、静脈内送達、皮下送達、腹腔内送達、および筋内送達のほか、吸入送達、経皮送達、および局所送達を含むがこれらに限定されない。適切な経路は、当業者が、処置下にある被験体の状態に適切な経路として決定することができる。血管循環または血管外循環の、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、ＲＮＡを導入しうる、一部の非限定的な部位である。直接的なＣＮＳ送達を使用することができ、例えば、脳室内（ＩＣＶ）投与または髄腔内（ＩＴ）投与を、投与経路として使用することができる。
【０４７６】
一部の実施形態では、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーは、ＩＣＶ投与によって被験体に投与される。例示的目的のためだけに、脳内脳室を通じて修飾アンチセンスオリゴマーを投与するための例示的方法は、次の通り提供される：被験体は、脳半球中の側脳室に位置付けられた頭蓋内カテーテルを受ける。非優位脳半球は、カテーテルを埋め込むために好ましい。カテーテルは、修飾アンチセンスオリゴマーの溶液を含有する皮下に埋め込まれた注入ポンプまたは体外ポンプに繋がれていてもよい。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される通りの修飾アンチセンスオリゴマーは、ＩＴ投与によって被験体に投与される。例えば、被験体は側臥位にされる。修飾アンチセンスオリゴマーは、脊髄穿刺針を有するシリンジにロードされ、この針が下部腰椎間空に挿入され、修飾アンチセンスオリゴマーを脊髄に直接送達する。一部の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのＰＭＯ、ＰＭＯ−ＸまたはＰＰＭＯ形態はＩＣＶまたはＩＴ注射によって投与される。
【０４７７】
特定の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーを、被験体に、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与する、すなわち、アンチセンスオリゴマーを、静脈へと静脈内投与もしくは静脈内送達するか、または皮膚と筋肉との間の脂肪層へと皮下投与もしくは皮下送達する。静脈内注射部位の非限定的な例は、腕、手、脚、または足の静脈を含む。皮下注射部位の非限定的な例は、腹部、大腿部、下方背部（ｌｏｗｅｒ  ｂａｃｋ）、または上腕部を含む。例示的な実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーのＰＭＯ形態、ＰＭＯ−Ｘ形態、またはＰＰＭＯ形態を、ＩＶ投与またはＳＣ投与する。他の実施形態では、修飾アンチセンスオリゴマーを、被験体に、筋内内（ＩＭ）投与する、例えば、修飾アンチセンスオリゴマーを、腕部の三角筋、脚部の外側広筋、腰部の腹側臀筋（ｖｅｎｔｒｏｇｌｕｔｅａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）、臀部の背側臀筋（ｄｏｒｓｏｇｌｕｔｅａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）、横隔膜および胸郭の肋間筋へと投与または送達する。
【０４７８】
ある特定の実施形態では、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは、経皮的な方法により（例えば、このような修飾アンチセンスオリゴマーを、任意選択で、リポソームへとパッケージングする、修飾アンチセンスオリゴマーの、例えば、エマルジョンへの組込みを介して）送達することができる。送達のこのような経皮的な方法およびエマルジョン／リポソーム媒介型の方法は、修飾アンチセンスオリゴマーの送達について、当技術分野、例えば、それらの全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，９６５，０２５号において記載されている。
【０４７９】
本明細書で記載される修飾アンチセンスオリゴマーはまた、植込み可能なデバイスを介して送達することもできる。このようなデバイスのデザインは、当技術分野で認知された工程であって、例えば、それらの全体において本明細書に参考として援用される、米国特許第６，９６９，４００号において記載されている、例えば、合成インプラントデザインを伴う工程である。
【０４８０】
当技術分野で認知された技法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー性粒子、およびウイルスベクターおよび非ウイルスベクターのほか、当技術分野で公知の他の手段）を使用して、修飾アンチセンスオリゴマーを、細胞へと導入することができる。選択される送達法は、少なくとも、オリゴマー化学、処置（処理）される細胞、および細胞の場所に依存し、そして当業者には明らかであろう。例えば、局在化は、表面上にリポソームを方向づける特異的なマーカーを伴うリポソーム、標的細胞を含有する組織への直接的な注射、特異的な受容体媒介型の取込みなどにより達成することができる。
【０４８１】
当技術分野で公知の通り、修飾アンチセンスオリゴマーは、例えば、リポソーム媒介型の取込み、脂質コンジュゲート、ポリリシン媒介型の取込み、ナノ粒子媒介型の取込み、および受容体媒介型のエンドサイトーシスのほか、マイクロインジェクション、透過化（例えば、ストレプトリジンＯによる透過化、アニオン性ペプチドによる透過化）、エレクトロポレーション、およびエンドサイトーシス以外の多様な非侵襲性送達法であって、当技術分野で公知の送達法など、エンドサイトーシス以外のさらなる送達方式（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＤｏｋｋａおよびＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、４４巻、３５〜４９頁（２０００）を参照されたい）を伴う方法を使用して送達することができる。
【０４８２】
修飾アンチセンスオリゴマーは、生理学的および／または薬学的に許容される、任意の好都合なビヒクルまたは担体により投与することができる。このような組成物は、薬学的に許容される、様々な標準的担体であって、当業者により使用される担体のうちのいずれかを含みうる。例は、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョンなどのエマルジョン、錠剤、およびカプセルを含むがこれらに限定されない。生理学的に許容される適切な担体の選出は、選び出される投与方式に応じて変動するであろう。「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合性の担体など、任意で全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含むことを意図する。当技術分野では、薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物に不適合性である場合を除き、組成物中のその使用が想定される。補充の活性化合物もまた、組成物へと組み込むことができる。
【０４８３】
本開示の修飾アンチセンスオリゴマーは一般に、遊離酸または遊離塩基として活用することができる。代替的に、本開示の化合物は、酸付加塩または塩基付加塩の形態で使用することもできる。本開示の遊離アミノ化合物の酸付加塩は、当技術分野で周知の方法により調製することができ、有機酸および無機酸から形成することができる。適切な有機酸は、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、およびベンゼンスルホン酸を含む。
【０４８４】
適切な無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸を含む。塩基付加塩は、カルボン酸アニオンと共に形成される塩を含み、さらに、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム、およびカルシウム）から選択されるもののほか、アンモニウムイオンおよびその置換誘導体（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウムなど）などの、有機カチオンおよび無機カチオンと共に形成される塩を含む。こうして、「薬学的に許容される塩」という用語は、任意で全ての許容される塩形態を包含することを意図する。
【０４８５】
加えて、本開示の文脈にはまた、プロドラッグも含まれる。プロドラッグとは、このようなプロドラッグを、患者へと投与すると、インビボにおいて、化合物を放出する、共有結合した任意の担体である。プロドラッグは一般に、慣例的な操作により、またはインビボにおいて、修飾が切断されて、親化合物をもたらすように、官能基を修飾することにより調製する。プロドラッグは、例えば、本開示の化合物であって、ヒドロキシ基、アミン基、またはスルフヒドリル基を、患者へと投与されると、切断されて、ヒドロキシ基、アミン基、またはスルフヒドリル基を形成する任意の基に結合させた化合物を含む。こうして、プロドラッグの代表例は、本開示の修飾アンチセンスオリゴマーのアルコール官能基およびアミン官能基の、酢酸誘導体、ギ酸誘導体、および安息香酸誘導体を含む（がこれらに限定されない）。さらに、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）の場合は、メチルエステル、エチルエステルなどのエステルも使用することができる。
【０４８６】
場合によって、リポソームを使用して、修飾アンチセンスオリゴマーの、細胞への取込みを促進することもできる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１０巻（１２号）：１９８０〜１９８９頁、１９９６年；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、２３巻：１１９頁、１９９４年；Ｕｈｌｍａｎｎら、「ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻、４号、２５  ５４４〜５８４頁、１９９０年；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｇ．、１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９年を参照されたい）。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９３／０１２８６において記載されている通り、ヒドロゲルもまた、修飾アンチセンスオリゴマーを投与するためのビヒクルとして使用することができる。代替的に、オリゴマーは、マイクロスフェアまたはマイクロ粒子により投与することもできる（例えば、Ｗｕ，  Ｇ．Ｙ．およびＷｕ，  Ｃ．Ｈ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻：４４２９〜４４３２頁、３０  １９８７年を参照されたい）。代替的に、米国特許第６，２４５，７４７号において記載されている通り、修飾アンチセンスオリゴマーと複合体化させたガス充填マイクロバブルの使用によっても、標的組織への送達を増強することができる。持続放出組成物もまた、使用することができる。これらは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態にある半透性ポリマーマトリクスを含みうる。かかる文献の各々は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０４８７】
一部の実施形態では、アンチセンス化合物を、少なくとも２００〜４００ｎＭの修飾アンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度を結果としてもたらすのに有効な量および様式で投与する。一般に、約１〜２週間にわたり、定期的な間隔で、１または複数の用量の修飾アンチセンスオリゴマーが投与されることが典型的である。経口投与に好ましい用量は、７０ｋｇ当たりのオリゴマー約１〜１０００ｍｇである。場合によって、患者１人当たりのオリゴマー１０００ｍｇを超える用量が必要でありうる。ｉ．ｖ．投与では、好ましい用量は、７０ｋｇ当たりのオリゴマー約０．５〜１０００ｍｇである。修飾アンチセンスオリゴマーは、短期間にわたり、定期的な間隔で、例えば、２週間またはこれ未満にわたり、毎日投与することができる。しかし、場合によって、オリゴマーを、より長期間にわたり、間欠的に投与する。投与は、抗生剤または他の治療的処置の投与が後続する場合もあり、これらと共時的な場合もある。処置レジメンは、処置下の被験体についての、イムノアッセイ、他の生化学的試験および生理学的精査の結果に基づき指し示される通りに、調整することができる（用量、頻度、経路など）。
【０４８８】
本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを使用する、インビボにおける有効な処置レジメンは、持続期間、用量、頻度、および投与経路のほか、処置下の被験体の状態（すなわち、限局感染または全身感染に応答した投与と対比した予防的投与）に従い変化させることができる。したがって、このようなインビボにおける治療は、最適な治療転帰を達成するために、処置下にある特定の種類の障害に適切な試験によるモニタリング、および用量または処置レジメンにおける対応する調整を要請することが多いであろう。
【０４８９】
処置は、例えば、当技術分野で公知の、疾患についての一般的な指標によりモニタリングすることができる。インビボにおいて投与される、修飾アンチセンスオリゴマーの効力は、修飾アンチセンスオリゴマーの投与前、投与時、および投与後に、被験体から採取される生物学的試料（組織、血液、尿など）により決定することができる。このような試料についてのアッセイは、（１）当業者に公知の手順、例えば、電気泳動によるゲル移動度アッセイを使用して、標的配列および非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の存在または非存在についてモニタリングすること；（２）ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロット法などの標準的技法により決定される、基準のエクソン７欠失ＳＭＮタンパク質のｍＲＮＡとの関係で、ＳＭＮタンパク質エクソン７を含むｍＲＮＡの量をモニタリングすることを含む。一部の実施形態では、処置は症状の評価によってモニタリングされる。これらの評価として、これだけに限らないが、自己評価、医師の検査、運動機能試験（例えば、改訂ハマースミス運動機能スケール［ＭＨＦＭＳ］およびフィラデルフィア小児病院の乳児神経筋疾患試験［ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ］）、例えば、筋肉サイズの測定、筋緊張、圧痛、強さ、反射、筋肉の不随意運動、筋電図検査、神経伝達速度測定試験、および心電図（ＥＫＧまたはＥＧＧ）を含む心血管系機能試験が挙げられる。
【０４９０】
ＶＩ．投薬
治療用組成物の製剤化およびそれらのその後における投与（投薬）は、当業者の技術の範囲内にあると考えられる。投薬は、処置される疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置の過程は、数日間から数カ月間にわたり持続するか、または治癒がなされるか、もしくは疾患状態の減殺が達成されるまで持続する。最適の投薬スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適の投与量、投薬法、および反復速度を容易に決定することができる。最適の投与量は、個々のオリゴマーの相対的効力に応じて変動させることができ、一般に、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であることが見出されているＥＣ５０に基づき推定することができる。一般に、投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年１回もしくは複数回にわたり、なおまたは２〜２０年間ごとに１回施すことができる。当業者は、体液中または組織内の、薬物の測定された滞留時間および濃度に基づき、投薬の反復速度を、容易に推定することができる。処置が成功した後、患者に、疾患状態の再発を防止する維持療法であって、オリゴマーを、経口投与のためには、体重７０ｋｇ当たり１〜１０００ｍｇのオリゴマー、またはｉ．ｖ．投与のためには、体重７０ｋｇ当たり０．５ｍｇ〜１０００ｍｇのオリゴマーの範囲の維持用量で、毎日１回または複数回〜２０年ごとに１回投与する維持療法を受けさせることが望ましい場合がある。
【０４９１】
その実施形態のうちのいくつかに従い、本開示について具体的に記載してきたが、以下の実施例は、本開示を例示することだけに資するものであり、これを限定することを意図するものではない。本出願で列挙される、参考文献、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号などの各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０４９２】
ＶＩＩ．実施例
次の実施例は、例示的目的のために使用されてよく、本発明の範囲を狭めると考えるべきではない。
【０４９３】
本開示の修飾アンチセンスオリゴマーを、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ転写物内の標的領域に結合するように設計し、次のプロトコルを使用して調製した。
活性サブユニットの調製のための手順Ａ：
【化２７８】
2018525015.tif 000331
【０４９４】
ジクロロメタン中の６（１当量）の撹拌溶液にＰＯＣｌ３（１．１当量）、続いてジイソプロピルエチルアミン（３当量）を０℃で添加し、氷浴で冷却した。１５分後、氷浴を除き、溶液を１時間室温に温めた。反応完了時に、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥した後、有機層をシリカゲルのプラグに通し、減圧下で濃縮した。得られたホスホロアミドジクロリド（４）をさらなる精製を行わずに次のステップに直接使用した。
【０４９５】
ジクロロメタン中のホスホロアミドジクロリド（４）（１当量）、２，６−ルチジン（１当量）の溶液にＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（０．５当量）／ジクロロメタン溶液、続いてＮ−メチルイミダゾール（０．２当量）を添加した。反応は室温で一晩撹拌した。反応完了時に、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液で３回洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥した後、有機層を濾過し、次いで濃縮した。生成物（８）をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサンの勾配で溶出）によって精製し、次いで−２０℃で保存した。構造をＬＣＭＳ分析によって確認した。
活性化サブユニットの調製のための手順Ｂ：
【化２７９】
2018525015.tif 000332
【０４９６】
ジクロロメタン中のＰＯＣｌ３（１．１当量）の溶液に２，６−ルチジン（２当量）を添加した後、Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（７）（１当量）／ジクロロメタン溶液を０℃で滴下添加した。１時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液で素早く３回洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、所望のホスホジクロリデート（９）を得た。
【０４９７】
ジクロロメタン中のホスホジクロリデート（１当量）の溶液にアミン（１当量）／ジクロロメタンを溶液への滴下によって０℃で添加した。１５分後、反応混合物を約１時間室温に温めた。反応完了時に、ヘキサンの添加によって沈殿させた後、濾過によって白色固体の生成物（８）を回収した。生成物を真空での乾燥後に−２０℃で保存した。構造をＬＣＭＳ分析によって確認した。
（実施例１）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルホスホロジクロリデート
【化２８０】
2018525015.tif 000333
【０４９８】
オキシ塩化リン（２．１２ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（４．８２ｍＬ、４１．４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いでＤＣＭ溶液（２０ｍＬ）Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（１０．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下添加し（開始温度０〜１０℃）、次いで浴を除き、周囲温度で２０分間撹拌を続けた。反応物をクエン酸溶液（４０ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、白色のフォーム（９．７９ｇ）に濃縮し、次いで続く手順に直接使用した。
（実施例２）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８１】
2018525015.tif 000334
【０４９９】
実施例１からのジクロロホスフェート（５．００ｇ、５．００ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（５ｍＬ）にピペリジン（０．６１ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）を滴下添加し、次いで浴を除き、周囲温度で３０分間撹拌し続けた。反応物をカラムに直接ロードした。［ＳｉＯ２カラム（４０ｇ）、ＤＣＭ／ＥｔＯＨ溶離液（１：０から１：１への勾配）］でのクロマトグラフィーは、表題化合物（２．５ｇ）を白色のフォームとして与えた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ７ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は８６２．４、実測値ｍ／ｚ＝８６３．６（Ｍ＋１）だった。
（実施例３）
１−（１−（クロロ（（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ホスホリル）ピペリジン−４−イル）−１−メチルピロリジン−１−イウムクロリド
【化２８２】
2018525015.tif 000335
【０５００】
表題化合物を実施例２に記載の方法と類似した方法で合成し、表題化合物（０．６ｇ）が白色固体として生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４９Ｈ６０Ｎ８Ｏ７ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は９０３．４、実測値ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ＋）だった。
（実施例４）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−メチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８３】
2018525015.tif 000336
【０５０１】
オキシ塩化リン（１．０２ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）ＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に、２，６−ルチジン（３．４９ｍＬ、２９．９ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いでメチルピペラジン（１．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を滴下添加し、１時間撹拌を続けた。Ｍｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（４．８２、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）およびＮＭＩ（７９μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、４時間撹拌し、次いでカラムに直接ロードした。
【０５０２】
［ＳｉＯ２カラム（８０ｇ）、２％ＴＥＡを含むＤＣＭ／アセトン溶離液（１：０から０：１への勾配）］でのクロマトグラフィーは、表題化合物（０．８ｇ）を白色のフォームとして与えた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４３Ｈ４８Ｎ７Ｏ８ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は８３４．４、実測値ｍ／ｚ＝８３５．５（Ｍ＋ｌ）だった。
（実施例５）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８４】
2018525015.tif 000337
【０５０３】
表題化合物を実施例４に記載の方法と類似した方法で合成し、表題化合物（１１．５ｇ）が白色のフォームとして生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４５Ｈ５３Ｎ８Ｏ７ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は８４８．４、実測値ｍ／ｚ＝８４９．７（Ｍ＋ｌ）だった。
（実施例６）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−エチルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８５】
2018525015.tif 000338
【０５０４】
表題化合物を実施例４に記載の方法と類似した方法で合成し、表題化合物（４．５ｇ）が白色のフォームとして生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ５２Ｈ５６Ｎ１１Ｏ６ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は９６１．４、実測値ｍ／ｚ＝９６２．８（Ｍ＋ｌ）だった。
（実施例７）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８６】
2018525015.tif 000339
【０５０５】
表題化合物を実施例４に記載の方法と類似した方法で合成し、表題化合物（３．５ｇ）が白色のフォームとして生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ７ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は８６２．４、実測値ｍ／ｚ＝８６３．７（Ｍ＋１）だった。
（実施例８）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）ホスホラミドクロリデート
【化２８７】
2018525015.tif 000340
【０５０６】
表題化合物を実施例４に記載の方法と類似した方法で合成し、表題化合物（１．０ｇ）が白色のフォームとして生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４４Ｈ４８Ｆ３Ｎ８Ｏ８ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は９０４．３、実測値ｍ／ｚ＝９０３．７（Ｍ−１）だった。
（実施例９）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（２−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）エチル）ホスホルアミドクロリデート
【化２８８】
2018525015.tif 000341
【０５０７】
表題化合物を実施例４に記載の方法と類似した方法で合成し、表題化合物（１．８ｇ）が白色のフォームとして生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４５Ｈ５０Ｆ３Ｎ８Ｏ８ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は９１８．３、実測値ｍ／ｚ＝１８３６．６（２Ｍ＋）だった。
（実施例１０）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２８９】
2018525015.tif 000342
【０５０８】
ＤＣＭ（１９０ｍＬ）中のオキシ塩化リン（１７．７ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）の冷却溶液（氷／水浴）に、２，６−ルチジン（１０１ｍＬ、８６４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、次いでＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（８３．５ｇ、１７３ｍｍｏｌ）を少量ずつ１５分間かけて添加し（開始温度０〜１０℃）、撹拌した。３０分後、４−アミノピペリジンモノトリフルオロアセトアミド（４８．９ｇ、約１９０ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下添加し（開始温度０〜８℃）、撹拌した。１時間後、ＤＩＰＥＡ（５０ｍＬ）を滴下添加し（開始温度０〜１０℃）、１時間撹拌した。反応物をクエン酸溶液（５００ｍＬ×３、１０％ｗ／ｖ水溶液）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、粘性オイルに濃縮し、カラムに直接ロードした。［ＳｉＯ２カラム（３３０ｇ）、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液（１：０から０：１への勾配）］でのクロマトグラフィーは、表題化合物（９１．３ｇ、収率７０％）を白色のフォームとして与えた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４３Ｈ４８Ｎ７Ｏ８ＰについてのＥＳＩ／ＭＳ計算値は９３０．９、実測値ｍ／ｚ＝９５４．４（Ｍ＋Ｎａ）だった。
【０５０９】
実施例１１から１４を、上に記載の手順Ａを介して調製した。
（実施例１１）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（１−（２，２，２−トリフルオロアセチル）ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９０】
2018525015.tif 000343
（実施例１２）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−モルホリノピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９１】
2018525015.tif 000344
（実施例１３）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルビス（３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロピル）ホスホルアミドクロリデート
【化２９２】
2018525015.tif 000345
（実施例１４）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル［１，４’−ビピペリジン］−１’−イルホスホノクロリデート
【化２９３】
2018525015.tif 000346
下の実施例１５から２０を、上に記載の手順Ｂを介して調製した。
（実施例１５）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９４】
2018525015.tif 000347
（実施例１６）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９５】
2018525015.tif 000348
（実施例１７）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−フェニルピペラジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９６】
2018525015.tif 000349
（実施例１８）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９７】
2018525015.tif 000350
（実施例１９）
（６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチルメチル（３−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−メチルアセトアミド）プロピル）ホスホルアミドクロリデート
【化２９８】
2018525015.tif 000351
（実施例２０）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート
【化２９９】
2018525015.tif 000352
（実施例２１）
（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホン酸ジクロリド塩酸塩
【０５１０】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のオキシ塩化リン（５．７０ｍＬ、５５．６ｍｍｏｌ）の冷却（氷／水浴）溶液に、２，６−ルチジン（１９．４ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）および４−（１−ピロリジニル）−ピペリジン（８．５８ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）を添加し、１時間撹拌した。懸濁物を濾過し、固形物を過剰のジエチルエーテルで洗浄し、表題のピロリジン（１７．７ｇ、収率９１％）が白色固体として生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ１９Ｈ３０Ｎ５Ｏ４ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は４２３．２、実測値ｍ／ｚ＝４２２．２（Ｍ−１）だった。
【化３００】
2018525015.tif 000353
（実施例２２）
（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メチル（４−（ピロリジン−１−イル）ピペリジン−１−イル）ホスホノクロリデート塩酸塩
【化３０１】
2018525015.tif 000354
【０５１１】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の実施例２１からのジクロロホスホルアミデート（１７．７ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）の撹拌冷却（氷／水浴）溶液にＭｏ（Ｔｒ）Ｔ（２）（２４．５ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）、２，６−ルチジン（１７．７ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．４０１ｍＬ、５．０６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）を１０分間かけて滴下添加した。懸濁物を撹拌しながら浴を周囲温度に温めた。６時間後、懸濁物をジエチルエーテル（１Ｌ）に注ぎ、１５分間撹拌し、濾過し、固形物を追加のエーテルで洗浄し、白色固体（４５．４ｇ）が生じた。粗産生物をクロマトグラフィー［ＳｉＯ２カラム（１２０グラム）、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶離液（１：０から６：４への勾配）］によって精製し、合わせた画分をジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ、１５分間撹拌し、濾過し、生じた固形物を追加のエーテルで洗浄し、白色固体として表題化合物（２３．１ｇ、収率６０％）が生じた。１−（４−ニトロフェニル）ピペラジン誘導体Ｃ４８Ｈ５７Ｎ８Ｏ７ＰについてＥＳＩ／ＭＳ計算値は８８８．４、実測値ｍ／ｚ＝８８７．６（Ｍ−１）だった。
（実施例２３）
修飾アンチセンスオリゴマーの設計および製造ならびに例示的な修飾アンチセンスオリゴマー
【０５１２】
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製：ジクロロメタン中の化合物１１の冷却懸濁物（６ｍＬ／ｇの１１）に、水中の炭酸カリウム（３．２当量）溶液（４ｍＬ／ｇの炭酸カリウム）を添加した。この２相混合物に、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３当量）溶液（２ｇ／ｇのクロロギ酸フェニル）を、ゆっくりと添加した。反応混合物を、２０℃へと温めた。反応が完了したら（１〜２時間）、層を分離した。有機層を、水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５を、アセトニトリルからの結晶化により単離した。
【０５１３】
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇの水素化ナトリウム）中に懸濁させた。この懸濁物に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。結果として得られるスラリーを、９５℃へと加熱した。反応が完了したら（１〜２時間）、混合物を、２０℃へと冷却した。この混合物に、３０％のジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。生成物を含有する有機層を、水性ＮａＯＨ、水性コハク酸、および飽和水性塩化ナトリウムで、逐次洗浄した。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化により単離した。
【０５１４】
テール型酸（Ｔａｉｌ  ａｃｉｄ）３７の調製：テトラヒドロフラン中の化合物３６の溶液（７ｍＬ／ｇの３６）に、無水コハク酸（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を、５０℃へと加熱した。反応が完了したら（５時間）、混合物を、２０℃へと冷却し、水性ＮａＨＣＯ３により、ｐＨ８．５へと調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を、水性層へと抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物を、水性クエン酸により、ｐＨ３へと調整した。生成物を含有する有機層を、クエン酸緩衝液と、飽和水性塩化ナトリウムとの、ｐＨ＝３の混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、単離せずに、化合物３８の調製において使用した。
【０５１５】
３８の調製：化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）を添加し、次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を、５５℃へと加熱した。反応が完了したら（４〜５時間）、混合物を、２０℃へと冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで、逐次洗浄した。ジクロロメタン溶液に、アセトンへの溶媒交換、次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を施し、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからの、飽和水性塩化ナトリウムへの沈殿により単離した。粗生成物を、水中で、複数回にわたり、再スラリー化させて、残留するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
【０５１６】
活性化「テール」の、アンカーロード樹脂への導入は、固相合成におけるサブユニットの組込みのために使用される手順により、ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施した。
【０５１７】
モルホリノベースのオリゴマーの合成のための固体支持体の調製：この手順は、粗い多孔性（４０〜６０μｍ）のガラスフリット、オーバーヘッド撹拌機、および、フリットを介してＮ２を沸騰させるかまたは真空抽出を可能とする、Ｔｅｆｌｏｎ製の三方止め栓を伴う、シラン化、ジャケット付きのペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）内で実施した。
【０５１８】
以下の手順における樹脂処理／洗浄ステップは、２つの基本的な操作からなる：樹脂流動化または撹拌床樹脂反応器および溶媒／溶液抽出。樹脂の流動化のために、フリットを通ってＮ２の逆流（ｆｌｏｗ  ｕｐ）を可能とするように、止め栓を位置付け、指定の樹脂処理／洗浄液を、反応器へと添加し、樹脂を透過化させ、完全に湿潤させた。次いで、混合を開始し、指定の回数にわたり、樹脂スラリーを混合した。溶媒／溶液抽出のために、混合およびＮ２の流れを停止させ、真空ポンプを始動させ、次いで、樹脂処理／洗浄液を排出して廃棄することを可能とするように、止め栓を位置付けた。そうでないことが注記されない限りにおいて、樹脂処理／洗浄液の全容量は、樹脂１ｇ当たり１５ｍＬであった。
【０５１９】
シラン化、ジャケット付きのペプチド容器内のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；窒素置換に基づき、１ｇ当たり約１．０ｍｍｏｌのロード；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ、ＵＫ、型番：１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；樹脂１ｇ当たり２０ｍｌ）を添加し、樹脂を、混合しながら、１〜２時間にわたり膨潤させた。膨潤溶媒（ｓｗｅｌｌ  ｓｏｌｖｅｎｔ）の排出後、樹脂を、ジクロロメタン（２×１〜２分間）、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中に５％のジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分間）、およびジクロロメタン（２×１〜２分間）で洗浄した。最終洗浄液を排出した後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン中の、ジスルフィドアンカー３４溶液（０．１７Ｍ；樹脂１ｇ当たり１５ｍＬ、約２．５当量）で処理し、樹脂／試薬混合物を、４５℃で６０時間にわたり加熱した。反応が完了したら、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分間）およびジクロロメタン（６×１〜２分間）で洗浄した。樹脂を、ジクロロメタン中に１０％（ｖ／ｖ）のジエチルジカーボネート溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分間）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分間）で洗浄した。樹脂３９を、Ｎ２流下で、１〜３時間にわたり、次いで、真空下で、一定の重量（±２％）まで乾燥させた。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％。
【０５２０】
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂のローディングの決定：樹脂のローディング（潜在的に利用可能な反応性部位の数）は、分光アッセイにより、樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数について決定する。
【０５２１】
公知の重量（２５±３ｍｇ）の乾燥樹脂を、２５ｍｌのシラン化メスフラスコへと移し、ジクロロメタン中に２％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸約５ｍＬを添加する。内容物を、静かな回旋により混合し、次いで、３０分間にわたり静置する。容量を、ジクロロメタン中に２％（ｖ／ｖ）の、さらなるトリフルオロ酢酸により、２５ｍＬへと増量し、内容物を、完全に混合した。容積型ピペット（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｉｐｅｔｔｅ）を使用して、トリチル含有溶液（５００μＬ）のアリコートを、１０ｍＬのメスフラスコへと移し、容量を、メタンスルホン酸により、１０ｍＬへと増量する。
【０５２２】
最終溶液中のトリチルカチオン含量は、４３１．７ｎｍにおけるＵＶ吸光度により測定し、樹脂のローディングは、適切な容量、希釈率、消衰係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）、および樹脂重量を使用して、樹脂１グラム当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）により計算する。アッセイは、三連で実施し、平均ローディングを計算する。
【０５２３】
本実施例における樹脂のローディング手順により、約５００μｍｏｌ／ｇのローディングを有する樹脂を提供する。ジスルフィドアンカーの組込みステップを、室温で２４時間にわたり実施する場合、μｍｏｌ／ｇ単位で３００〜４００のローディングが得られた。
【０５２４】
テールローディング：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂を調製するための設定および容量と同じ設定および容量を使用して、テールを、固体支持体へと導入することができる。アンカーロード樹脂をまず、酸性条件下で脱保護し、結果として得られる材料を中性化させてから、カップリングした。カップリングステップのために、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有するＤＭＩ中の、３８の溶液（０．２Ｍ）を使用した。４５℃で２時間後、樹脂３９を、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中に５％のジイソプロピルエチルアミンで２回にわたり洗浄し、ＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に、安息香酸無水物（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器ジャケットを、室温へと冷却し、樹脂を、２５％のイソプロパノール／ジクロロメタン中に５％のジイソプロピルエチルアミンで、２回にわたり洗浄し、ＤＣＭで、８回にわたり洗浄した。樹脂４０を濾過し、高真空下で乾燥させた。樹脂４０に対するローディングは、テールローディングにおいて使用した、元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９のローディングであると規定する。
【０５２５】
固相合成：モルホリノベースのオリゴマーは、Ｇｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（型番：３９８０２７０）内で調製した。カラムを合成器に静置するときに、カラムの周囲に、水流のためのチャネルを伴うアルミニウム製のブロックを入れた。ＡＭＳ−４２２は、代替的に、試薬／洗浄液を添加し、指定された時間にわたり保持し、真空を使用して、カラムを排気する。
【０５２６】
最大で約２５サブユニットの長さの範囲のオリゴマーでは、ローディングを、樹脂１ｇ当たり約５００μｍｏｌとする、アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より大型のオリゴマーでは、ローディングを、樹脂１ｇ当たり３００〜４００μｍｏｌとする、アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’テールを伴う分子が所望される場合も、同じローディング指針により、テールでローディングした樹脂を選択する。
【０５２７】
以下の試薬溶液を調製した。
脱トリチル化溶液：４：１ジクロロメタン／アセトニトリル中に、１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；中性化溶液：３：１のジクロロメタン／イソプロパノール中に、５％のジイソプロピルエチルアミン；カップリング溶液：所望の塩基型および連結型を有する、０．１８Ｍ（または２０サブユニットより長くなったオリゴマーには、０．２４Ｍ）の活性化モルホリノサブユニット、ならびに１，３−ジメチルイミダゾリジノン中に、０．４ＭのＮエチルモルホリン。ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、異なる試薬溶液の洗浄を隔てる、一過性洗浄液として使用した。
【０５２８】
ブロックを４２℃に設定した合成器上で、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）を含有する各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを添加し、室温で、３０分間にわたり静置した。２ｍＬのジクロロメタンで、２回にわたる洗浄の後、以下の合成サイクルを使用した。
【表４】
2018525015.tif 000355
【０５２９】
各カラムが、適正な配列の、適正なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を受容するように、個々のオリゴマーの配列を、合成器へとプログラムした。カラム内のオリゴマーが、その最終的なサブユニットの組込みを完了したら、カラムを、ブロックから取り出し、０．８９Ｍの４−エチルモルホリンを含有する、４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中に０．３２Ｍ）を含むカップリング溶液により、最終サイクルを、手動で実施した。
【０５３０】
樹脂からの切断ならびに塩基および保護基の除去：メトキシトリチル化の後、樹脂を、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで、８回にわたり洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中に、０．１Ｍの１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍのトリエチルアミンを含む、１ｍＬの切断溶液を添加し、カラムに蓋をし、室温で、３０分間にわたり静置した。この時間の後、溶液を、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルへと排出した。大幅に縮んだ樹脂を、３００μＬの切断溶液で、２回にわたり洗浄した。溶液に、４．０ｍＬの濃縮アンモニア水（−２０℃で保存された）を添加し、バイアルにきつく蓋をし（テフロン（登録商標）加工のねじ蓋により）、混合物を回旋にかけて、溶液をミックスした。バイアルを、４５℃のオーブンに、１６〜２４時間にわたり入れて、塩基および保護基の切断を行った。
【０５３１】
粗生成物の精製：バイアルに入れた（ｖｉａｌｅｄ）アンモノリシス溶液を、オーブンから取り出して、室温へと冷却した。溶液を、２０ｍＬの０．２８％の水性アンモニアで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含有する、２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％のアンモニアに、Ｂ：０．２８％のアンモニア中に１Ｍの塩化ナトリウムを伴う；６０分間でＢを０〜１００％とする）を使用して、メトキシトリチルを含有するピークを溶出させた。合わせた画分をプールし、所望される生成物に応じて、さらに加工した。
【０５３２】
モルホリノベースのオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐによる精製からプールされた画分を、１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５へと低下させた。初期の混合の後、試料を、室温で４分間にわたり静置し、この時間に、それらを、２．８％のアンモニア／水で、ｐＨ１０〜１１へと中性化させる。生成物は、固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
【０５３３】
ＳＰＥカラムのパッキングおよびコンディショニング：Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）（３ｍＬ）を、２０ｍＬのフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２〜１０１１））へとパッキングし、樹脂を、３ｍＬの以下のもの：０．２８％のＮＨ４ＯＨ／８０％のアセトニトリル；０．５ＭのＮａＯＨ／２０％のエタノール；水；５０ｍＭのＨ３ＰＯ４／８０％のアセトニトリル；水；０．５のＮａＯＨ／２０％のエタノール；水；０．２８％のＮＨ４ＯＨですすいだ。
【０５３４】
ＳＰＥの精製：脱メトキシトリチル化からの溶液を、カラムへとロードし、樹脂を、０．２８％の水性アンモニア３〜６ｍＬで、３回にわたりすすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）を、カラムの下に置き、生成物を、０．２８％の水性アンモニア中に、４５％のアセトニトリル２ｍＬで２回にわたる洗浄により溶出させた。
【０５３５】
生成物の単離：溶液を、ドライアイス内で凍結させ、バイアルを凍結乾燥機に入れて、綿毛状の白色粉末をもたらした。試料を、水中に溶解させ、シリンジを使用して、０．２２ミクロンのフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍシリンジフィルターに、０．２ミクロンのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を伴う）を通して濾過し、ＵＶ分光光度計上で、光学濃度（ＯＤ）を測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定したほか、試料を解析のために分注した。次いで、凍結乾燥させるために、溶液を、Ｗｈｅａｔｏｎバイアルに戻した。
【０５３６】
ＭＡＬＤＩによる、モルホリノベースのオリゴマーについての解析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、使用して、精製物中の画分の組成を決定したほか、オリゴマーの正体の証拠（分子量）ももたらした。マトリックスとしての、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、またはアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液による希釈後に、試料を試行にかけた。
【０５３７】
以下の表５は、合成した本開示の修飾アンチセンスオリゴマーの非限定例を提供する。これらの例において、ターゲティング配列の配列番号の各Ｘはチミン（Ｔ）であり、ターゲティング配列の配列番号の各Ｙはシトシン（Ｃ）である。さらに、それぞれの太字かつ下線の塩基は、そのサブユニットと先行するサブユニットとの間に修飾の列に示される種類のサブユニット間連結を有するサブユニットを示し、そうでなければ、サブユニット間連結はジメチルアミノホスホロジアミデート連結である。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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＊「Ａｃ」は、ペプチドのアミノ末端にコンジュゲートしたＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）−部分を示す
（実施例２４）
ＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率
【０５３８】
インビトロのエクソン７包含率を測定するための例示的方法を本明細書に記載する。ＰＭＯベースのオリゴマーを、アンチセンスオリゴマーがＳＭＮ２エクソン７包含を増強するかどうかを判定するために試験した。表１に示すそれぞれのアンチセンスオリゴマーを下に記載するヌクレオフェクションプロトコルを使用して細胞に導入した。エクソン７包含率を下に提供する逆転写酵素ＰＣＲプロトコルおよび可視化技術を使用して算出した。エクソン７含有ＳＭＮ２タンパク質の発現がアンチセンスオリゴマーによって誘導されたことを確認するために、ウエスタンブロット分析を下に記載するプロトコルに従って実施した。
ＰＭＯベースのオリゴマーのＳＭＡ細胞へのヌクレオフェクション
【０５３９】
ＰＭＯベースのオリゴマーをヌクレアーゼ不含有水（ＤＥＰＣによる処理なし）中の１〜２ｍＭ保存溶液として調製し、それから適切な希釈物をヌクレオフェクションのために作製した。ＳＭＡを有する個体由来の患者由来線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＧＭ０３８１３）を、１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地で培養した。細胞を実験の３〜５日前に継代し、ヌクレオフェクションのときにおよそ８０％コンフルエントであった。線維芽細胞をトリプシン処理し、計数し、９０ｒｃｆで１０分間遠心分離した。１ウエルあたり細胞１〜５×１０５個をＰ３ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。ＰＭＯベースのオリゴマー溶液および細胞を次いでＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ  １６ウエルストリップの各ウエルに加え、プログラムＣＡ−１３７でパルスした。細胞を室温、１０分間インキュベートし、２４ウエルプレートに２回反復で移し、３７℃の細胞インキュベーターに入れた。インキュベーション２４時間後、全ＲＮＡをＧＥ  Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ９６  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で製造者の推奨プロトコルに従って処置細胞から単離した。単離したＲＮＡ試料を分析前に−８０℃で保存した。
逆転写酵素ＰＣＲ
【０５４０】
ＳＭＮ２対立遺伝子を増幅するために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写酵素ＰＣＲを実施した。ヌクレオフェクトした細胞から単離した４００ｎｇのＲＮＡを逆転写し、次の遺伝子特異的プライマーで増幅した：フォワードプライマー５’−ＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴ−３’（配列番号３３）およびリバースプライマー５’−ＣＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＡＴＧＣＣ−３’（配列番号３４）。逆転写および増幅のためのＰＣＲ条件は、次の通り設定した：逆転写、５５℃、２０分間；ＲＴ不活性化、９４℃、２分間；変性、９４℃、２分間；アニーリング、５９℃、４５秒間；伸長、６８℃、１分間；変性／アニーリング／伸長を４５サイクル繰り返した。エクソン７が適切に含まれる場合、増幅産物のサイズは、４９４ｂｐであるはずである。エクソン７排除物の増幅産物のサイズは、４３４ｂｐのはずである。ｃＤＮＡ試料は、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
増幅産物の可視化
【０５４１】
エクソン７包含率を算出するためにｃＤＮＡ試料を可視化し、試料中の増幅産物のモル濃度を測定した。ｃＤＮＡ試料を調製し、ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に製造者のプロトコルに従ってロードした。簡潔には、ｃＤＮＡ試料を融解し、製造者による提供のＤＮＡ色素と混合した。試料をＬａｂＣｈｉｐにロードして、調製したＬａｂＣｈｉｐをＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｃａｌｉｐｅｒ）に挿入した。ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸは各増幅産物のモル濃度を増幅産物に対応するバンドの強度に基づいて算出する。
ウエスタンブロット分析
【０５４２】
ＰＭＯオリゴマーを上に記載のＳＭＡ患者由来線維芽細胞にヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション２４時間後、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解した。各溶解物を１４，０００ｘｇで１０分間遠心下降させた。細胞デブリのペレットを遠心分離後に廃棄し、上清だけをさらなる分析のために回収した。２０ｕｇの各タンパク質試料をＴＧＸ  ｓｔａｉｎ  ｆｒｅｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）にロードし、タンパク質電気泳動によって分離した。ゲルをＰＶＤＦ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に移し、ＳＭＮタンパク質を抗ＳＭＮ抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。ＳＭＮタンパク質がエクソン７によってコードされる部分を含有する場合、タンパク質のサイズは３８ｋＤａである。アクチンを抗アクチン抗体（Ａｂｃａｍ）でブロッティングすることによってローディング対照として測定した。
重複領域をターゲティングするＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率
【０５４３】
イントロン７中の重複領域をターゲティングするＰＭＯベースのオリゴマーを、この化合物がインビトロのエクソン７包含を誘導する効率を測定するために試験した。イントロン７の−７／−１４領域をターゲティングするさまざまな量のＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮおよびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ８量体オリゴマー（化合物ＰＭＯ−１、ＰＭＯ−ＡＰＮ−２およびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−２）ならびにイントロン７の−１０／−２７領域をターゲティングするＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮおよびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ１８量体オリゴマー（化合物ＰＭＯ−３、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６およびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−８）をＳＭＡ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３８１３）にヌクレオフェクトした。インビトロのエクソン７包含率を各ＰＭＯベースのオリゴマーについて上に記載の通り算出した。図３および表６に要約の通り、−１０／−２７領域をターゲティングする化合物は、−７／−１４領域をターゲティングするものと比べて１００倍効力があった。ＰＭＯ−ＡＰＮおよびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ修飾は、両標的領域においてＰＭＯ修飾と比べてエクソン７包含を誘導する効力をさらに増強した。
【表６】
2018525015.tif 000359
異なる領域をターゲティングするＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率
【０５４４】
イントロン７中の領域をターゲティングするＰＭＯベースのオリゴマーを試験し、この化合物がインビトロのエクソン７包含を誘導する効率を上に記載の通り算出した。イントロン７の−１０／−２９領域をターゲティングするさまざまな量のＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮおよびＰＭＯ−Ｐｌｕｓオリゴマー（化合物ＰＭＯ−４、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１７およびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−９）をＧＭ０３８１３線維芽細胞にヌクレオフェクトした。並行して、イントロン７の−１３７／−１５９領域または−１４９／−１７４領域をターゲティングするさまざまな量のＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮおよびＰＭＯ−ＰＬＵＳオリゴマー（化合物ＰＭＯ−７、ＰＭＯ−９、ＰＭＯ−ＡＰＮ−２９、ＰＭＯ−ＡＰＮ−３１およびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−１１およびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−１３）を同様にヌクレオフェクトした。インビトロのエクソン７包含率を各ＰＭＯベースのオリゴマーについて上に記載の通り算出した。図４および表７に示す通り、−１０／−２７領域をターゲティングするオリゴマーは、他の化合物と比べてはるかにより効力があった。ＰＭＯ−ＡＰＮおよびＰＭＯ−Ｐｌｕｓ修飾はイントロン７の−１０／−２９領域をターゲティングする化合物の効力をさらに増強した一方で、これらの化学修飾の増強効果は、イントロン７の−１４９／−１７４領域をターゲティングする化合物よりはるかに低かった。驚くべきことに、これらの化学修飾は、イントロン７の−１３７／−１５９領域をターゲティングするオリゴマーでエクソン７包含よりもエクソン７スキッピング（エクソン７包含の代わりにエクソン７排除）の増大を生じた。
【表７】
2018525015.tif 000360
異なる長さを有するＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率
【０５４５】
さまざまな長さを有するＰＭＯベースのオリゴマーを、この化合物がインビトロのエクソン７包含を誘導する効率を測定するために試験した。異なる長さを有するさまざまな量のＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ、およびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙオリゴマー（化合物ＰＭＯ−２−４、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１１、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−８、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−９、ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−２およびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−３）をＧＭ０３８１３線維芽細胞にヌクレオフェクトした。インビトロのエクソン７包含率を各ＰＭＯベースのオリゴマーについて上に記載の通り算出した。図５Ａおよび表８に修飾１８量体および２０量体のヌクレオフェクションによるエクソン７包含率を要約する。試験した用量範囲内では、修飾１８量体および２０量体は、インビトロのエクソン７包含を誘導する同様の効力を示した。同様に、図５Ｂおよび表９に示す通り、インビトロのエクソン７包含を誘導する同様の効力が修飾１８量体および２５量体で観察された。前記と同様に、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ修飾を有する化合物は、ＰＭＯ化合物よりも優れていた。
【表８】
2018525015.tif 000361
【表９】
2018525015.tif 000362
異なる修飾を有するＰＭＯベースのオリゴマーのインビトロのエクソン７包含率
【０５４６】
ＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙで修飾されたＰＭＯベースのオリゴマーを、化学修飾のインビトロのエクソン７包含への効果を分析するために試験した。２’−ＯＭｅ修飾オリゴマーをＰＭＯベースのオリゴマーと並行して試験した。上に記載のプロトコルに従って、さまざまな量のＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ、ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙおよび２’−ＯＭｅオリゴマー（化合物ＰＭＯ−３、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−８、ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−３および２’−ＯＭｅ−２）をＧＭ０３８１３線維芽細胞にヌクレオフェクトした。インビトロのエクソン７包含率を各化合物について上に記載の通り算出した。図６および表１０に示す通り、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰＬＵＳまたはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙで修飾された化合物は、ＰＭＯで修飾された化合物と比べてエクソン７包含を誘導する効力の顕著な改善を示した。さらに、ＰＭＯまたは次世代ＰＭＯで修飾された全ての化合物は、２’−ＯＭｅオリゴマーの効力をはるかに超える大きな効力の改善を示した。
【表１０】
2018525015.tif 000363
【０５４７】
エクソン７包含が誘導されると、エクソン７コード部分を含むＳＭＮ２タンパク質の発現レベルもそれにより増大されるはずである。ＰＭＯベースのオリゴマーが実際にインビトロでエクソン７包含を誘導することを確認するためにウエスタンブロット分析を上に記載の通り実施した（図７Ａおよび７Ｂ）。０．１μＭの低濃度で、ＰＭＯ、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ化合物は、ＳＭＡ患者由来線維芽細胞において正常線維芽細胞におけるＳＭＮ１発現のレベルに匹敵するエクソン７コード部分を含むＳＭＮ２タンパク質の発現を誘導できた。
（実施例２５）
ＰＭＯベースのオリゴマーのインビボ投与
【０５４８】
ＰＭＯベースのオリゴマーの治療有効性および安全性を適切な動物モデルで試験した。ＳＭＡの処置におけるＰＭＯベースのオリゴマーの有効性を分析するための例示的な方法を提供する。ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスを、寿命、体重増加、握力および立直り反射について下のプロトコルに従ってモニタリングおよび試験した。本明細書で記載される他の例示的な方法は、ＰＭＯベースのオリゴマーのインビボ投与における組織像、毒性および免疫原性応答を評価することに関する。表１１は、次のインビボ試験で使用したＰＭＯベースのオリゴマーを要約している。
【表１１】
2018525015.tif 000364
ＳＭＡマウスモデル
【０５４９】
多様なＳＭＡマウスモデルが当技術分野において公知である（例えば、Ｓｃｈｒａｎｋら、１９９７年；Ｈｓｉｅｈ−Ｌｉら、２０００年；Ｍｏｎａｎｉら、２０００年を参照されたい）。マウスにおけるＳＭＡ表現型の重症度は、マウスに存在するＳＭＮ遺伝子のコピー数に依存する。例えば、ｍＳＭＮ遺伝子の１コピーを欠失しているヘテロ接合性マウスは、ヒトのＩＩＩ型ＳＭＡを模倣する。ＳＭＮノックアウトマウスは、胚性致死性である。ヒトのＩ型またはＩＩ型ＳＭＡに類似したマウス株を作製するために、ヒトＳＭＮ２をマウスに導入することができる。例えば、Ｔａｉｗａｎｅｓｅ−ＳＭＡマウスモデルは、ＳＭＮ−ヌルバックグラウンドにおいてヒトＳＭＮ２遺伝子の４コピーを有する（Ｓｍｎ−／−、ｈＳＭＮ２ｔｇ／ｔｇ）。Ｔａｉｗａｎｅｓｅマウスは、ヒトでのＩ型またはＩＩ型ＳＭＡに類似する中程度から重症のＳＭＡ表現型を呈する。「ｓＳＭＡ」株マウス（Ｓｍｎ−／−、ｈＳＭＮ２＋／＋）は、２コピーのヒトＳＭＮ２遺伝子だけを保有しており、Ｔａｉｗａｎｅｓｅマウスよりも重症の表現型を生じる。別の重症のＳＭＡマウス株は、ＳＭＮΔ７マウス（Ｓｍｎ−／−、ｈＳＭＮ２＋／＋、ＳＭＮΔ７＋／＋）である。ＳＭＮΔ７マウスの平均寿命は、およそ１５〜２０日間である。ＳＭＮΔ７マウスは、ヒトＩ型ＳＭＡ患者に類似した症状および神経病理を示す。
ＰＭＯベースのオリゴマーの投与
【０５５０】
ＰＭＯベースのオリゴマーを、以前記載された通りＳＭＮΔ７マウスに脳室内（ＩＣＶ）注射を介して送達した（Ｐａｓｓｉｎｉら、２００１年）。インビボで試験した全てのＰＭＯベースのオリゴマーを注射の前に５μｇ／μｌの濃度で生理食塩水に溶解した。インビボでＰＭＯベースのオリゴマーをスクリーニングするための典型的投与量は２０μｇであり、日齢Ｐ１（出生翌日）にＩＣＶ注射によって送達した。各マウスに、２μｌのＰＭＯベースのオリゴマー溶液の注射を各側脳室に与え、マウス１匹あたり合計４μｌとした。インビボで使用される投与量は、数を増やしてもよく、一度にまたは複数回の注射で送達され得る。他の例示的な送達方法は、皮下注射、筋肉内注射、末梢顔面静脈注射、眼注射、くも膜下腔内注射および尾静脈注射を含む。送達方法のいずれかの１つが、マウスに異なる日齢でＰＭＯベースのオリゴマーを複数回投与するために組み合わされてよい。
【０５５１】
ヒトにおけるＳＭＡ発症の分子機構に基づいて、早期のＣＮＳ処置が頑強な効果をもたらすと期待されることが理解される。ＩＣＶ注射がＰＭＯベースのオリゴマーを脳および脊髄に直接送達し、若年齢で投与できることから、ＩＣＶ注射は、ニューロン内のＳＭＮレベルを回復させるための好ましい方法であり得る。血液脳関門の外の自律神経系においてＳＭＮ発現を増大させることがＳＭＡ関連症状の重症度を軽減できる可能性もある。
ＰＭＯベースのオリゴマーの投与におけるＳＭＡ関連症状の分析
【０５５２】
ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスを寿命および体重についてモニタリングし、筋力および運動機能について試験した。ＳＭＡマウスモデルはヒトＳＭＡ患者において同様に観察されるＳＭＡ関連症状を呈するので、マウスのＳＭＡ関連症状および表現型を測定するさまざまな試験が、当技術分野において公知である（Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１年）。ＳＭＡマウスモデルの最も注目すべき表現型は、寿命の減少である。野生型マウスの典型的寿命は、およそ２年である。しかし、ＳＭＡ表現型の重症度に応じてＳＭＡマウスモデルの寿命の平均中央値は、５〜２５日間の間で変動しうる。それにより、生理食塩水処置マウスと比べてＰＭＯベースのオリゴマー処置マウスの寿命をモニタリングすることは、ＳＭＡの処置におけるオリゴマーの有効性を評価するための良好な測定であり得る。体重増加などの他の生体測定結果ならびに、オープンフィールド試験および歩行時の歩き方（ｗａｌｋｉｎｇ  ｇａｉｔ）を含む行動的生体測定結果は、処置マウスの健康を評価するために同様に分析され得る。ＭＲＩによって測定される除脂肪率および体脂肪率などの身体組成は、試験を通して同様に分析されてよい。
【０５５３】
ＳＭＡマウスモデルの他の表現型は、筋力および運動機能の衰弱などの神経筋機能障害を含む。神経筋機能を定量的に測定するために、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスを、１４日目に開始して、握力試験に供した。各マウスの前肢をワイヤグリッドに置き、次いでマウスをメッシュに沿って水平に穏やかに引いた。メッシュを握るためにマウスがかけた力のピーク量を力変換器（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でグラムで測定した。前肢および後肢の評価は、同時の試験で実施してもよいし、別々の試験で実施してもよい。最初の注射後の４日目に始めて、立直り反射を以前に記載のプロトコル（Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１年）に従って同様に測定した。簡潔には、立直り反射を、背臥位に置かれた後にマウスが４本の全ての肢を軸とした体位に変わるのに要する時間を測定することによって判定した。立ち直りに要する時間は、神経筋力に反比例する。トレッドミルの使用および車輪運動などの他の試験を、ＰＭＯベースのオリゴマーの投与における全般的な筋力の改善を測定するために使用できる。筋肉サイズ、筋緊張、圧痛、不随意運動の頻度および心血管系機能の測定を含む身体検査を、ＳＭＡマウスモデルにおいてＰＭＯベースのオリゴマーの全身効果を分析するために追加的に行う。
ＰＭＯベースのオリゴマーによる処置における分子分析および細胞分析
【０５５４】
分子および細胞アッセイをＰＭＯベースのオリゴマーのインビボでの生理学的効果を分析するために行う。ＰＭＯベースのオリゴマーをマウスに投与した後、脳、脊髄および末梢器官などの組織由来の生検試料を、実験を通して定期的に回収する。処置マウスを実験の最後に屠殺し、そのような組織をさらなる分析のために秤量し、回収する。そのようなアッセイは、当技術分野において慣用的に使用され、例示的な方法は本明細書に記載されている。
【０５５５】
ＰＭＯベースのオリゴマーが実際にエクソン７包含をインビボで誘導することを確認するために、脳、脊髄および末梢器官などの組織におけるエクソン７包含率を測定する。全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを上に記載の逆転写ＰＣＲによって生成する。増幅産物を可視化し、エクソン７包含率を上に記載の通り算出する。生検試料をさらに処理して、エクソン７コード部分を含むＳＭＮ２タンパク質の量を、上に記載のプロトコルに従ってウエスタンブロット分析によって測定する。
【０５５６】
脊髄生理に対するＰＭＯベースのオリゴマーの効果を定量的に分析する。例えば、処置ＳＭＡマウスの脊髄に存在する運動ニューロンの数を計数し、対照マウスと比較する。脊髄中の運動ニューロンを分析するための方法は、当技術分野において公知である（Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１年）。簡潔には、マウスから単離された脊髄の試料をパラホルムアルデヒドで固定し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）で染色する。複数の横断切片を生成し、ニューロンを可視化するためにコリンアセチルトランスフェラーゼなどの運動ニューロンに特異的なマーカーに対する抗体で染色する。
【０５５７】
心臓および筋肉を当技術分野において公知の方法（Ａｖｉｌｉａら、２００７年；Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１０年；Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１年）に従って同様に組織学的に分析する。例えば、心臓ならびに大腿四頭筋および肋間筋を含む筋肉を回収し、パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈ＆Ｅで染色する。組織の横断切片に基づいて、これらの組織における筋肉繊維の平均厚を測定する。これらの組織の神経筋接合部の構造は、神経フィラメント中鎖およびアセチルコリン受容体などの特異的マーカーに対する抗体で可視化することができる。
非ヒト霊長類へのＰＭＯベースのオリゴマーの投与
【０５５８】
カニクイザルなどの非ヒト霊長類をＰＭＯベースのオリゴマーの送達実行可能性を分析するために使用する。くも膜下腔内およびＩＣＶ注射などのさまざまな注射選択肢が、当技術分野において公知である（例えば、Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１年；Ｓｍｉｔｈら、２００６年を参照されたい）。これらの方法は、両方の投与経路が非ヒト霊長類およびヒトにおいて治療剤を送達するために日常的に使用されていることから、臨床的に実行可能である。くも膜下腔内注射のためにカニクイザルを麻酔し、くも膜下腔内留置カテーテルを埋め込む。ＩＣＶ注射のために、右（もしくは左または両方の）大脳側脳室にカニューレを埋め込むための定位脳手術を各サルに実施する。ＰＭＯベースのオリゴマーの注入を受ける前にサルを数日間埋め込み手術から回復させる。さまざまな用量のＰＭＯベースのオリゴマーを１日または複数日かけて注入する。初回注入の５〜２０日後、全てのサルを屠殺し、上に記載のさらなる分析のために組織を回収する。
ＰＭＯベースのオリゴマーの安全性分析
【０５５９】
ＰＭＯベースのオリゴマーのインビボでの安全性を当技術分野において公知のさまざまな方法（例えば、Ｈｕａら、２０１０年を参照されたい）によって評価する。慢性炎症がＳＭＡなどの神経変性疾患と関連していることから、神経炎症に関する多様なバイオマーカーを、ＰＭＯベースのオリゴマーの投与における脳、脊髄、心臓および筋肉などの組織内の炎症性応答を分析するために使用する。例示的なバイオマーカーは、同種移植炎症因子−１、腫瘍壊死因子−αおよびインターロイキン−１βを含む。免疫細胞浸潤もＣＤ４およびＣＤ８などの特異的免疫細胞マーカーで測定することができる。これらの組織における反応性酸素種は、当技術分野において公知の方法（Ｄｉｋａｌｏｖら、２００７年）に従って同様に測定することができる。
【０５６０】
炎症マーカーに加えて、毒性に関連する他の生理学的パラメーターを、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスまたは非ヒト霊長類において測定できる。動物に、望ましい生物学的応答、すなわち１００％のインビボのエクソン７包含率を誘発する最大用量を超えて、各化合物の単一用量または複数用量を負荷する。さまざまな用量の化合物で処置した動物を、任意の急性応答についてモニタリングする。局所注射部位も同様にモニタリングする。血圧および心拍数などの心血管系パラメーターならびに血清および尿の生化学をＰＭＯベースのオリゴマーの潜在的な任意の急性または慢性効果を検出するために測定する。遺伝毒性を当技術分野において公知のプロトコル（例えば、Ｓａｚａｎｉら、２０１０年）に従って同様に評価する。化合物の薬物動態および薬力学も、当技術分野において公知のプロトコル（Ｈｅａｌｄら、２０１５年）に従って治療用量を推定するために各処置動物の血清を試料採取することによって測定する。
ＳＭＮΔ７マウスへのＰＭＯベースのオリゴマーの投与
【０５６１】
初期スクリーニング方法として、ＳＭＮΔ７マウスをインビボ実験に使用した。日齢Ｐ１（出生翌日）において、マウスを上に記載のＩＣＶ注射によって生理食塩水または２０μｇのＰＭＯベースのオリゴマー（化合物ＰＭＯ−３、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−８およびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−３）で処置した。全ての注射は、Ｐａｓｓｉｎｉら（２００１年）に記載のものと同様に３０．５ゲージハミルトンシリンジで実施した。日齢が一致する野生型マウスの群も参照として同時にモニタリングした。日齢６３において、全ての残っているマウスを上に記載のとおりのさらなる分子および細胞分析のために屠殺した。表１２は、各実験群のために使用した遺伝子型、処置、用量およびマウスの数を要約している。
【表１２】
2018525015.tif 000365
ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスの生存
【０５６２】
図８Ａおよび表１３に示す通り、ＰＭＯベースのオリゴマーによる処置は、ＳＭＮΔ７マウスの寿命中央値を顕著に増大させた。各実験群のＰ値は、ログランクマンテル−コックス検定によって算出した。生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスは２１日を超えて生存しなかった一方で、全ての試験したオリゴマーは生存中央値を３４〜４２日間に延ばすことができた。さらに、オリゴマーで処置したマウスの８〜４６％は、６３日齢でも依然として生きていた。さらに、ＰＭＯオリゴマーで処置したマウスは、生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスと比べてそれらが十分身繕いされ、自発的で、より活発であることから、警戒性および一般的健康の改善を呈した。
【表１３】
2018525015.tif 000366
ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスの体重
【０５６３】
実験の間、体重を毎日記録した（図８Ｂ）。６３日目の各実験群の平均体重を表１４に要約する。ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスは、野生型群に匹敵するほど、実験を通して体重が顕著に増大していた。驚くべきことに、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓまたはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙオリゴマーで処置したマウスは、ＰＭＯオリゴマーよりも顕著に多く体重が増加し、これらの化学修飾がインビボでＳＭＡ関連症状を処置するオリゴマーの有効性をさらに増大させたことを実証している。
【表１４】
2018525015.tif 000367
筋力および運動機能へのＰＭＯベースのオリゴマーの効果
【０５６４】
筋力および運動機能に対するＰＭＯベースのオリゴマーの効果を分析するために、オリゴヌクレオチドで処置したマウスの立直り反射を上に記載のプロトコルに従って実験を通して定期的に測定した。図９Ａおよび表１５に示す通り、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスは、生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスと比較して立直り反射の顕著な改善を呈した。オリゴマーで処置した全てのマウスは、２８日後に野生型に匹敵する反射を示した。驚くべきかつ予想外なことに、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓまたはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙオリゴマーで処置したマウスは、ＰＭＯオリゴマーで処置したマウスより７日早く、２１日目に野生型と同様に行動し始めた。
【０５６５】
オリゴマーで処置したマウスの握力を上に記載のプロトコルに従って同様に定期的に試験したが、これを図９Ｂおよび表１６に示す。表１５および１６は、１４、２１、２８、４２および５６または６３日目に測定した各実験群の筋力および立直り反射を要約している。試験した全てのオリゴマーは、ＳＭＮΔ７マウスの筋力を増強した。立直り反射と一致して、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓまたはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙオリゴマーで処置したマウスは、野生型群と統計的に識別できなかった。ＰＭＯオリゴマーはマウスの筋力を増強したが、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ修飾はＰＭＯ修飾よりも顕著に有効であり、驚くべきことに強さを野生型マウスのものに正常化した。さらにより予想外かつ驚くべきことに、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ処置マウスの握力は、約２８日目に野生型へと正常化し、試験終了までの延長された生存期間を通して野生型と統計的に識別不能なままであった。このことは、上に記載のインビトロスクリーニングからは予測できなかった。
【表１５】
2018525015.tif 000368
【表１６】
2018525015.tif 000369
上記データについての単位は「力（ｇ）」である
＃：ｐ＜０．００１（生理食塩水で処置したＳＭＡマウスと比べて）
＊：ｐ＜０．０５（ＰＭＯ−３で処置したＳＭＡマウスと比べて）
＄：ｐ＜０．０５、＆：ｐ＜０．０１および％：  ｐ＜０．００１（生理食塩水で処置した野生型マウスと比べて）
ＮＴ：「非試験」（残りのマウスは、前肢壊死のため試験を実施できなかった）
インビボにおけるＳＭＮタンパク質発現に対するＰＭＯベースのオリゴマーの効果
【０５６６】
ＰＭＯベースのオリゴマーの投与がインビボでＳＭＮタンパク質の発現を誘導するかどうかを確認するために、ＰＭＯベースオリゴマーで処置したマウス由来の脊髄試料を日齢６３で回収した。陽性対照として、日齢が一致する野生型マウスも脊髄試料回収のために屠殺した。生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスを日齢１２で屠殺し、これらのマウス由来の脊髄試料を比較として回収した。脊髄試料由来のタンパク質抽出物を実施例２４に記載の方法に従って得た。各試料のＳＭＮタンパク質発現レベルを同様に実施例２４に記載のウエスタンブロット分析によって検出した。
【０５６７】
図１０Ａに示す通り、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウス由来の脊髄試料は、顕著により高いＳＭＮタンパク質発現レベルを示した。図１０Ｂは、図１０Ａに示すウエスタンブロット分析の定量を示している。驚くべきことに、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６で処置したマウスにおけるＳＭＮタンパク質発現レベルは、野生型マウスのものの約２５％であった。
（実施例２６）
異なる長さを有するＰＭＯベースのオリゴマーのインビボ効果
【０５６８】
ＰＭＯベースのオリゴマーの第２のセットのインビボ有効性をＳＭＮΔ７マウスにおいて実施例２５に記載の方法に従って試験した。簡潔には、日齢Ｐ１（出生翌日）に、マウスを生理食塩水または２０μｇのＰＭＯベースのオリゴマー（長さ１８ヌクレオチドの化合物ＰＭＯ−ＡＰＮ−１６および長さ２５ヌクレオチドの化合物ＰＭＯ−２、ＰＭＯ−ＡＰＮ−１１、ＰＭＯ−Ｐｌｕｓ−３、ＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ−２）で処置した。日齢が一致する野生型マウスの群も参照として同時にモニタリングした。表１７は、各実験群のために使用した遺伝子型、処置、用量およびマウスの数を要約している。
【表１７】
2018525015.tif 000370
ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスの生存
【０５６９】
図１１および表１８に示す通り、ＰＭＯベースのオリゴマーによる処置は、ＳＭＮΔ７マウスの寿命中央値を顕著に増大させた。各実験群のＰ値は、ログランクマンテル−コックス検定によって算出した。特に、ＰＭＯ−ＡＰＮ修飾オリゴマーは、生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスと比較してＳＭＮΔ７マウスの生存中央値をおよそ３倍にした。ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスは、生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスと比較して健康で、十分身繕いされ、自発的で、活発であった。
【表１８】
2018525015.tif 000371
ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスの体重
【０５７０】
各処置群の体重を投与後６３日間毎日記録した（図１２）。日齢６３での各処置群の体重を表１９に要約する。ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスは、野生型群に匹敵するほど、実験を通して体重が顕著に増大していた。実施例２５で考察した体重データと一致して、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓまたはＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙオリゴマーで処置したマウスは、対応するＰＭＯオリゴマーよりも顕著に多く体重が増加した。これらのデータは、これらの化学修飾がＰＭＯベースのオリゴマーのインビボ有効性をさらに増大させたことを再度証明している。
【表１９】
2018525015.tif 000372
筋力に対するＰＭＯベースのオリゴマーの効果
【０５７１】
実施例２５に記載の手順に従って、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したＳＭＮΔ７マウスの筋力を実験の間モニタリングした。図１３および表２０は、２８、３５、４２、４９、５６および６３日目に測定した各実験群の筋力を要約している。表１９に示す統計は、一元配置ＡＮＯＶＡチューキーの多重比較によって算出されている。驚くべきことに、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウスの平均筋力は、野生型マウス群のレベルに匹敵した。実施例２５に示す結果と同様に、ＰＭＯ−ＡＰＮ、ＰＭＯ−ＰｌｕｓおよびＰＭＯ−Ｒ６Ｇｌｙ修飾は、ＰＭＯ修飾と比べた場合に、長さ２５ヌクレオチドのオリゴマーの有効性を顕著に増強した。
【表２０】
2018525015.tif 000373
上記データについての単位は「力（ｇ）」である
＃：ｐ＜０．００１（生理食塩水で処置したＳＭＡマウスと比べて）
＊：ｐ＜０．０５（ＰＭＯ−２で処置したＳＭＡマウスと比べて）
＄：ｐ＜０．０５、＆：ｐ＜０．０１および％：ｐ＜０．００１（生理食塩水で処置した野生型マウスと比べて）
ＮＴ：非試験（残りのマウスは、前肢壊死のため試験を実施できなかった）
インビボでのＳＭＮタンパク質発現に対するＰＭＯベースのオリゴマーの効果
【０５７２】
ＰＭＯベースのオリゴマーの投与がインビボでＳＭＮタンパク質の発現を誘導するかどうかを確認するために、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウス由来の脊髄試料を日齢６３で回収した。陽性対照として、日齢が一致する野生型マウスも脊髄試料回収のために屠殺した。生理食塩水処置ＳＭＮΔ７マウスを日齢１２で屠殺し、これらのマウス由来の脊髄試料を比較として回収した。脊髄試料由来のタンパク質抽出物を実施例２４に記載の方法に従って得た。各試料のＳＭＮタンパク質発現レベルを同様に実施例２４に記載のウエスタンブロット分析によって検出した。
【０５７３】
図１４Ａおよび１４Ｂに示す通り、ＰＭＯベースのオリゴマーで処置したマウス由来の脊髄試料は、高いＳＭＮタンパク質発現レベルを示した。
【０５７４】
前出の詳細な記載および付随する実施例が単なる例示であり、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ規定される本発明の範囲に対する限定として解釈されないことが理解されるべきである。開示の実施形態へのさまざまな変更および改変は、当業者に明らかである。本発明の化学構造、置換体、誘導体、中間体、合成、製剤および／または使用方法に関するものを非限定的に含むそのような変更および改変は、その精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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