(57)【要約】  本発明は、リンパ球、好ましくは、細菌（好ましくは、リステリア モノサイトゲネス）を樹状細胞からトランスインフェクションさせたリンパ球（好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞）であり、前記細菌は腫瘍ペプチドを含むリンパ球に関する。また、固形腫瘍（好ましくは、黒色腫）の治療および／または処置のためのリンパ球の使用、この目的のためのキットまたはデバイスに関する。さらに、これらのトランスインフェクション法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原を含む細菌をトランスインフェクションさせたリンパ球であって、
前記トランスインフェクションさせたリンパ球は主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ−Ｉ）において前記腫瘍抗原を含む、リンパ球。
【請求項２】
前記リンパ球が、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＢ細胞である、請求項１に記載のリンパ球。
【請求項３】
前記細菌が、L. monocytogenes、Salmonella enterica、Mycobacterium bovis、Staphylococcus aureusおよびEscherichia coliからなるリストから選択される、請求項１または２に記載のリンパ球。
【請求項４】
前記トランスインフェクションが、抗原提示細胞から行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載のリンパ球。
【請求項５】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項４に記載のリンパ球。
【請求項６】
前記リンパ球が異種または自家系である、請求項１から５のいずれか１項に記載のリンパ球。
【請求項７】
前記リンパ球がヒト由来である、請求項１から６のいずれか１項に記載のリンパ球。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のリンパ球を含む細胞集団。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載のリンパ球または請求項８に記載の細胞集団を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
薬剤の製造のための、請求項１から７のいずれか１項に記載のリンパ球の使用または請求項８に記載の細胞集団の使用。
【請求項１１】
腫瘍の予防または処置、および／または、腫瘍抗原に対する免疫反応の刺激のための薬剤の製造のための、請求項１から７のいずれか１項に記載のリンパ球の使用または請求項８に記載の細胞集団の使用。
【請求項１２】
前記腫瘍が、黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、乳腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫からなるリストから選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれか１項に記載のリンパ球または請求項８に記載の細胞集団を含む、キットまたはデバイス。
【請求項１４】
腫瘍の予防または処置、および／または、腫瘍抗原に対する免疫反応の刺激のための、請求項１３に記載のキットまたはデバイスの使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が、黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、胸部腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍および胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫からなるリストから選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
以下の工程を含む、リンパ球をトランスインフェクションするためのインビトロの方法：
（ａ）生物学的試料から、抗原提示細胞およびリンパ球を単離する工程、
（ｂ）前記抗原提示細胞を分化させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の抗原提示細胞に細菌を感染させる工程であって、前記細菌が腫瘍抗原を含む、工程、
（ｄ）工程（ｃ）の感染させた抗原提示細胞に、２４〜７２時間、３５〜３８℃の温度で工程（ａ）のリンパ球を接触させ、トランスインフェクションさせる工程。
【請求項１７】
さらに、工程（ｄ）のトランスインフェクションさせたリンパ球を選択する工程（ｅ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、L. monocytogenes、Salmonella enterica、Mycobacterium bovis、Staphylococcus aureusおよびEscherichia coliからなるリストから選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンパ球が、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＢ細胞である、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リンパ球は、前記リンパ球が異種または自家系である、請求項１６から２０のいずれか１項に記載のリンパ球。
【請求項２２】
工程（ｄ）において、前記温度が３７℃で４８時間である、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔概要〕
本発明はリンパ球に関する。リンパ球は、好ましくは、樹状細胞から細菌（好ましくは、リステリア モノサイトゲネス）をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞であり、前記細菌は、腫瘍抗原を含んでいる。本発明は、薬学の分野に含まれ得る。
【０００２】
〔技術分野〕
がんおよび感染症に対する反応におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、樹状細胞（ＤＣ）により主に引き起こされ、樹状細胞は、最も効果的かつ生理的に関連が強い抗原提示細胞（ＡＰＣ）であると考えられている（Joffre et al., 2012）。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、プロフェッショナルＡＰＣの表面で主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ−Ｉ）に曝された外因性抗原によって活性化される必要がある。このプロセスは、クロスプレゼンテーションとして知られている（Joffre et al., 2012）。これまで、クロスプレゼンテーションは、先天性免疫のプロフェッショナル食細胞（主に、最も効果的なＡＰＣであると考えられているＤＣ）によってのみ行われると考えられてきた。抗原提示は、免疫シナプス（ＩＳ）の形成の間に起こる。免疫シナプスとは、Ｔ細胞を認識する抗原に保持されたＡＰＣとの当該Ｔ細胞との接触（Ｔ細胞は活性化される）により形成される構造である（Saito and Batista, 2010）。ＩＳの形成により、Ｔ細胞の活性化が誘導されるが、これは、適切な獲得性免疫応答に不可欠である。
【０００３】
最近の研究において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、トランスインフェクションと呼ばれるプロセスにおいてＤＣに感染した細菌を、ＩＳの形成の間に捕捉できることがわかった（Cruz-Adalia et al., 2014）。ＩＳを介したこのようなトランスインフェクションは、直接の感染よりも数倍効果的である。加えて、トランスインフェクションさせたＴ（ｔｉＴ）細胞は、プロフェッショナル食細胞よりも効果的に取り込んだ細菌を殺し、大量の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、インターフェロン−γおよびＴＮＦ−α）を分泌することがわかった。これらの特性により、マウスにおいて、リステリア モノサイトゲネスによる感染に対する防御を与える。
【０００４】
古典的な形式の腫瘍処置（例えば、放射線治療、化学療法、および例えば抗体（例えば、抗ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４）での生物学的治療）（Wolchok and Chan, 2014）に勝る、白血球の養子免疫伝達に関する治療が増えてきている（Chen and Mellman, 2013）。
【０００５】
抗腫瘍全身性免疫の誘導には、腫瘍関連抗原（いったん活性化されると、腫瘍細胞を殺す）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を必要とする。臨床試験の結果は、ＤＣの抗腫瘍特性を支持している（Restifo et al., 2012）。ＤＣは、最も優れた抗原提示細胞であると考えられている。ＤＣは、悪性細胞を最終的に排除するＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するため、ＭＨＣ−Ｉの腫瘍抗原を捕捉し、加工し、クロスプレゼンテーションしなければならない。それゆえ、ＤＣは、インビボにおいて抗腫瘍免疫反応を生成できるため、（養子免疫伝達による）がんに対するワクチンとしても使用されている。最近、養子免疫伝達によって細胞を注入する、持続的かつ完全な臨床応答を提供できる化学療法に耐性がある白血病患者が存在しており（Kalos and June, 2013）、長期間持続できる腫瘍免疫治療を達成できることを示している。
【０００６】
腫瘍細胞を免疫破壊から逃れさせる種々のメカニズムが記載されている。腫瘍は抗原を発現しているが、宿主免疫系によって排除されない。これは、抗原が効率的に提示されず、それゆえ、十分強い免疫応答またはがんの対象における継続的な選択を引き起こさないためであり得る。ゆえに、腫瘍細胞が免疫認識を逃れることができる。抗腫瘍治療においては、それゆえに、特定の腫瘍抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させる腫瘍に対する応答を向上させる新たな手段の登場が必要とされている。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明において、腫瘍抗原を発現する細菌（概念の証拠としてL. monocytogenesを用いた）をトランスインフェクションさせたリンパ球の、腫瘍治療における使用を明示する。攻撃性が高い黒色腫（Ｂ−１６ ＯＶＡ）の実験モデルにおいて、外因性抗原（当該抗原は、腫瘍にも存在する）を発現している細菌をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞でのマウスへの接種により、腫瘍形成に対する防御が与えられることが示される。さらに、トランスインフェクションさせたＣＤ４＋リンパ球は、例えばＭＨＣ−Ｉを介したクロスプレゼンテーションにより、ＣＤ８＋細胞の細胞傷害性リンパ球をＡＰＣとして直接活性化し、驚くべきことに、これまで知られているどのＡＰＣよりも優れた提示細胞（プレゼンター）であることが示される。
【０００８】
本発明では、ｔｉＴ細胞は抗原を提示できることを実証している。リステリア−ＯＶＡ(オボアルブミンを発現しているリステリア モノサイトゲネス(Pope et al., 2001))をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞は、マウスＯＴ−Ｉ（すべてのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、Ｈ−２ＫｂにおいてＯＶＡのペプチド（２５７−２６４；SIINFEKL）を認識するトランスジェニックマウス（Clarke et al., 2000））由来のＣＤ８＋ナイーブ細胞を強く活性化できることを実証しており（図１）、それゆえ真のＡＰＣである。ｔｉＴ細胞は捕捉した細菌を内部加工できることや、抗原提示はＤＣに依存しない、すなわち、抗原はドナーＤＣ由来ではなく、ｔｉＴ細胞によるクロスプレゼンテーションに由来することも証明されている。これらの結果により、従来のＣＤ４＋リンパ球（獲得免疫のパラダイムである）は、これまで先天性免疫の細胞に特有であると考えられてきた役割を果たすことができることが示される。
【０００９】
第一の態様において、本発明は、腫瘍抗原を含む細菌をトランスインフェクションさせたリンパ球に関する。以降、「本発明のリンパ球」と称する。
【００１０】
本発明の第一の態様の好ましい実施形態において、リンパ球は、ＣＤ４＋リンパ球またはＢリンパ球である。
【００１１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、さらには、ＣＤ３、および共受容体ＣＤ４を発現しているリンパ球がＣＤ４＋Ｔ細胞である、と理解される。これらは、Ｔヘルパーリンパ球とも称される。
【００１２】
Ｂ細胞受容体：ＢＣＲを発現しているリンパ球がＢ細胞であると理解される。Ｂ細胞マーカーとして使用される他の分子は、ＣＤ１９およびＣＤ２０である。
【００１３】
本発明において記載される細菌は、グラム陽性およびグラム陰性の両方であってよく、細菌は、病原性であっても非病原性であってもよい。さらに好ましい実施形態において、細菌は、L. monocytogenes、Salmonella enterica、Mycobacterium tuberculosis群の細菌、Staphylococcus aureusおよびEscherichia coliからなるリストより選択され、好ましくは、L. monocytogenesである。M. tuberculosis群の細菌の中には、M. tuberculosis、M. bovis (BCG)、M. africanum、M. caprae、M. pinnipedii、M. canettiおよびM. microtiが含まれる。特定の実施形態では、L. monocytogenesである。
【００１４】
本発明において用語「がん」は、固形腫瘍および血液腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄異形成症候群）を含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の第一の態様のリンパ球は、樹状細胞からトランスインフェクションさせる。より好ましい実施形態において、リンパ球は、リンパ球のトランスインフェクションに使用された樹状細胞と同じ対象由来であり、両方の細胞は好ましくは腫瘍を有する対象由来である（当該腫瘍は、抗原ペプチドを含む腫瘍である）。
【００１６】
トランスインフェクションは、リンパ球（ＴまたはＢ）が、予め感染させた細菌をＡＰＣ（好ましくはＤＣ）から捕捉するプロセスを意味する。
【００１７】
ＡＰＣ（すなわち抗原提示細胞）は、その機能が、抗原を捕捉し、加工し、その名前が示唆するように、組織適合性複合体を介して先天性免疫系の細胞に抗原を提示することである免疫系の細胞であると理解される。本発明において、ＡＰＣは好ましくは樹状細胞である。
【００１８】
抗原提示に特化した樹状細胞（その由来は、骨髄であってもリンパであってもよい）はＡＰＣである理解される。これは（マウスにおいて）ＣＤ１１ｃを発現し、いくつかのサブタイプ（胸腺由来のＤＣ、従来のＤＣまたは形質細胞様ＤＣ）が存在し、それぞれがサブタイプ特異的マーカーを有する。本発明の基となる実験では、ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）の存在下で成長した骨髄由来である。これらの細胞のマーカーは、ＣＤ１１ｃ＋、ＧＲ−、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＭＨＣ−ＩＩ＋であった。ヒトに関しては、好ましいＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４での処置後の末梢血由来である。
【００１９】
他のより好ましい実施形態において、細菌は腫瘍抗原を含んでいる。当該腫瘍抗原は、腫瘍抗原の同定方法について提起している最近の研究で強調されているように、任意の腫瘍の悪性細胞において、特定の様式で発現している任意の抗原であり得る（Schumacher and Schreiber, 2015; Yadav et al., 2014）。例えば、抗原は、黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、乳腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん（明細胞、腎細胞がんを含む）、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん（小細胞および大細胞）、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫のペプチドにおいて特定される抗原である。腫瘍は、いかなるステージであってもよく、転移性であってもよい。これらの腫瘍由来の抗原は、当業者に知られている（Schumacher and Schreiber, 2015; Yadav et al., 2014）。好ましくは、腫瘍は、新生抗原（腫瘍細胞の変異から生じ、それ故に、体内の他の細胞には見られない抗原）を有している。これらは、胎児の抗原（成体の臓器の細胞では見られない）においても見られ得る。黒色腫由来の抗原タンパク質は、特に限定されないが、例えば、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｇｐ１００、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥファミリータンパク質（黒色腫関連抗原）：ＧＡＧＥおよびＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤｋ４における変異、およびβカテニン、ＭＵＭ−１、ｐ１５である。
【００２０】
がんに特異的なものが腫瘍抗原であると理解され、任意のサイズのものであり得、正常な体細胞には存在しない。
【００２１】
特定の腫瘍に特異的な抗原（例えば「黒色腫に特異的な抗原」）について述べるとき、高い頻度で腫瘍（例えば黒色腫）に結合する、任意のサイズの抗原を含んでいる。
【００２２】
本発明の第１の態様の他のさらに好ましい実施形態において、リンパ球は異種（heterorologo）または自家系（autologo）である。
【００２３】
本発明の第１の態様の他のさらに好ましい実施形態において、ＡＰＣ（好ましくは樹状細胞）は、自家系または異種であり、トランスインフェクションさせたリンパ球と同じ個体由来であってもよく、異なる個体由来であってもよい。
【００２４】
本発明において、リンパ球と称するとき、リンパ球の断片およびそれらの派生物（ｔｉＴとＴＩＬ（腫瘍に侵入し、それゆえに腫瘍抗原に対する親和性を有するＴ細胞）との接触を促進する任意の修飾）も表す。
【００２５】
本発明のリンパ球は、哺乳類のリンパ球であり、好ましくは、任意の人種、年齢または性別のヒト由来のリンパ球である。
【００２６】
本発明では、リンパ球と称するときは、リンパ球の集団も表す。
【００２７】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のリンパ球を含む細胞集団に関する。
【００２８】
本発明において、用語「細胞集団」は、本発明のリンパ球を含む細胞の混合物であり、好ましくは血液細胞の混合物である。
【００２９】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様のリンパ球または本発明の第２の態様の細胞集団を含む薬学的組成物に関する。
【００３０】
薬学的組成物は、好ましくはワクチンである。
【００３１】
本明細書中、用語「薬学的組成物」は、ヒトまたは動物において、疾患の予防、診断、緩和、処置または治療に使用される任意の物質を表す。本発明の薬学的組成物は、単独で使用されてもよく、他の薬学的組成物との組み合わせで使用されてもよい。用語「薬学的組成物」と「薬剤」とは、本発明において交換可能に使用される。本発明の文脈において、薬学的組成物または薬剤は、本発明のリンパ球を治療的に効果的な量含むことにより特徴づけられ、それゆえ、組織／細胞標的においてリンパ球が機能を発揮する。
【００３２】
本発明において、用語「治療的に効果的な量」は、所望の効果を実現するように算出されるリンパ球の量を表し、一般には、治療組成物の場合は、化合物の特徴、これらの投与経路、投与様式および投与頻度、他の要因（例えば、年齢、対象の状態、変化または疾患の重症度など）により決定され得る。
【００３３】
用語「担体」は、賦形剤として、本明細書において含まれる本発明の任意の成分を、特定の体積または重量に希釈するための薬学的組成物または薬剤において使用される物質を表す。ビヒクル機能は、他の成分の混和を促進し、よりよい投与量および投与となるようにすること、または組成物に粘度および形態を付与することである。提示物が液体である場合、薬学的に許容可能な担体は、希釈剤である。本発明の薬学的に許容可能な組成物において使用され得る薬学的に許容可能な担体は、当業者に知られている。
【００３４】
他の特定の実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤中で固形または水性懸濁液として、調製される。
【００３５】
本発明により提供される治療組成物は、任意の適切な投与経路（選択された投与経路について適切な薬学形態において、組成物は製剤される）により投与され得る。特定の実施形態において、本発明により提供される治療組成物の投与は、非経口での投与（例えば、動脈内投与、静脈内投与）、経口投与、腹膜内投与または皮下投与であり、好ましくは、静脈内投与である。
【００３６】
治療効果を最適化するため、組成物は、処置の期間中、一または複数の投与量で投与され得る。なお、ｔｉＴの単回投与は、ＤＣの繰り返し投与よりも効果が高い。
【００３７】
本発明の第４の態様は、薬剤（好ましくは、腫瘍の予防または処置のため、および／または、腫瘍抗原に対する免疫応答の刺激のための薬剤）の製造のための、本発明の第１の態様のリンパ球または本発明の第２の態様の細胞集団の使用に関する。
【００３８】
それゆえ、本発明の他の態様は、薬剤（好ましくは、腫瘍の予防または処置のため、および／または、腫瘍抗原に対する免疫応答の刺激のための薬剤）の製造のための、本発明の第１の態様のリンパ球または本発明の第２の態様の細胞集団に関する。
【００３９】
用語「予防」は、本発明において理解される場合、腫瘍の出現を防御または低減することである。用語「処置」は、腫瘍による損傷を治療、緩和、低減すること、当該損傷に対抗すること、腫瘍の攻撃性を低減すること、腫瘍の分散を低減または防御すること、個体の状態を安定化させることに関する。
【００４０】
本発明において、処置または予防される腫瘍は任意の腫瘍であり、例えば、以下のリストから選択される：黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、乳腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん（明細胞、腎細胞がんを含む）、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん（小細胞および大細胞）、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫。好ましくは、黒色腫である。
【００４１】
本発明において、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激する工程は、ＣＤ８＋リンパ球を刺激する工程を含む。この反応は、当業者に知られているアッセイ（例えば、ELISPOＴ（酵素免疫スポット）、細胞内サイトカイン染色アッセイ、四量体アッセイ、抗原特異的反応の検出、細胞増殖アッセイのトラッキング、フローサイトメトリーにより検出される細胞活性（ＣＤ２５、ＣＤ６９）のマーカーの存在）によって測定され得る。ｔｉＴリンパ球で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性能力を定量することもできる。
【００４２】
本発明のリンパ球は、当業者に知られている他の処置（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１に対する抗体での処置、放射線治療法または化学治療法）との組み合わせで使用されてもよい。
【００４３】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様のリンパ球または本発明の第２の態様の細胞集団を含むキットまたはデバイスに関する。
【００４４】
本発明の第６の態様は、腫瘍の予防または処置のため、および／または、任意の腫瘍の腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するための、本発明の第５の態様のキットまたはデバイスの使用に関する。腫瘍は、例えば、以下のリストであるが、これらに限定されない：黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、乳腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん（明細胞がん、腎細胞がんを含む）、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん（小細胞および大細胞）、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫。好ましくは、黒色腫である。
【００４５】
本発明のキットは、本明細書に記載されている方法を行うために必要な成分を含んでいる。キットはまた、本発明のリンパ球により生成される免疫応答を評価するために必要な成分を含んでいる。特に限定されないが、このキットは、緩衝液、酵素、混入を防ぐための試薬等を含んでいる。実行および最適化に必要とされる支持体および容器も含み得る。また、さらに、正の対照または負の対照を含んでいてもよい。また、これらの使用を行うための説明書を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の第７の態様は、以下の工程を含む、リンパ球をトランスインフェクションするためのインビトロの方法に関する。
（ａ）抗原提示細胞（好ましくは樹状細胞）を、対象の好ましくは末梢血から（例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を加えることによって）単離し、生物学的試料からリンパ球（好ましくはＢリンパ球および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を単離する工程、
（ｂ）前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）を分化させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の抗原提示細胞に細菌を感染させる工程であって、前記細菌が腫瘍抗原を含む、工程、
（ｄ）工程（ｃ）の抗原提示細胞を、３５〜３８℃で（好ましくは３７℃で数時間（好ましくは２４〜７２時間））、工程（ａ）のリンパ球に接触させ、リンパ球のトランスインフェクションを促す工程。
【００４７】
他の特定の実施形態において、トランスインフェクションさせたリンパ球を単離する工程（ｅ）をさらに含む。
【００４８】
本発明の第７の態様の好ましい実施形態において、細菌は、グラム（＋）およびグラム（−）の両方であってよく、細菌は、病原性であっても非病原性であってもよい。さらに好ましい実施形態において、細菌は、L. monocytogenes、Salmonella enterica、Mycobacterium tuberculosis群の細菌、Staphylococcus aureusおよびEscherichia coliからなるリストより選択され、好ましくは、細菌はL. monocytogenesである。Mycobacterium tuberculosis群の細菌は、M. tuberculosis、M. bovis (BCG)、M. africanum、M. caprae、M. pinnipedii、M. canettiおよびM. microtiであり得る。好ましくは、L. monocytogenesである。
【００４９】
本発明の第７の態様の他の好ましい実施形態において、細菌は腫瘍抗原を含む。腫瘍抗原は、以下のリストから選択される腫瘍であってもよい：黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、乳腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん（明細胞がん、腎細胞がんを含む）、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん（小細胞および大細胞）、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫。
【００５０】
本発明の第７の態様の他の好ましい実施形態において、リンパ球は異種または自家系細胞である。
【００５１】
用語「インビトロ」は、対象の体外で行われる、本発明の方法を表す。すなわち、対象由来の生物学的試料において行われる。
【００５２】
本明細書中、用語「生物学的試料」は、リンパ球（ＣＤ４＋Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球）を含む任意の試料を表す。特に限定されないが、本目的のために用いられる、当業者により知られている任意の方法によって得られる、個体由来の生物学的液体または組織を含む。生物学的試料は、特に限定されないが、液体試料（例えば、血液または血清）であってもよい。本明細書中、生物学的試料はそのままでも凍結されていてもよい。
【００５３】
用語「腫瘍抗原」および「腫瘍ペプチド」は、交換可能に使用される。
【００５４】
本発明の他の実施形態は、本発明の薬学的組成物の薬学的に治療的の量の投与を含むことを特徴とする、腫瘍の予防または処置、および／または、腫瘍抗原に対する免疫応答の刺激のための方法に関する。好ましくは、腫瘍は以下からなるリストから選択される：黒色腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、乳腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、大腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、胃がん、肝臓腫瘍、腎臓がん（明細胞がん、腎細胞がんを含む）、膀胱がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん（小細胞および大細胞）、甲状腺がん、膠芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、脳髄神経芽細胞腫、脳神経芽細胞腫、骨髄芽細胞腫、頭頸部芽細胞腫、骨芽細胞腫、結合組織芽細胞腫。好ましくは、腫瘍は新生抗原を有している。特に、黒色腫においては、免疫系を刺激する種々の抗原が知られており、特に限定されないが、例えば、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｇｐ１００、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥファミリータンパク質（黒色腫関連抗原）：ＧＡＧＥおよびＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤｋ４における変異、およびβカテニン、ＭＵＭ−１、ｐ１５である。
【００５５】
本発明において、用語「sujeto」、「individuo」および「paciente」は、交換可能に使用される。
【００５６】
本明細書（添付された請求項を含む）中、単語の単数形（「un」「una」および「el」など）は、文脈が明記されない限りは、対応する複数の対象を含む。
【００５７】
明細書および請求項のすべてにおいて、単語「含む」およびその変形は、他の技術的特徴、添加物、要素または工程を排除することを意図しない。当業者にとって、本発明の他の目的、効果および特徴は、記載の一部および本発明の実施の一部から明らかであり得る。以下の実施例および図は説明のために提供され、本発明の限定を意図しない。
【００５８】
〔図面の簡単な説明〕
図１．トランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｔｉＣＤ４＋Ｔ）は、インビトロにおいて、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞に対してＭＨＣ−Ｉを介して細菌抗原を提示する。（ａ）．リステリア−ＷＴ（野生型菌株；上のパネル）またはリステリア−ＯＶＡ（オボアルブミンを発現している菌株；下のパネル）をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋ｔｉＴを、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（Ｈ−２Ｋｂにおいてオボアルブミンのペプチド（ＯＶＡｐ−Ｉ  ２５７−２６４；SIINFEKL (配列番号１)）を認識する）でインキュベートした。ヒストグラムは、「CellTrace（登録商標） Violet」でラベルしたＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光を示す。細胞分裂（活性化細胞の特徴）は、左側の集団として観察される（各細胞分裂において色素が希釈される）。灰色に塗られたヒストグラムは、不活性のＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の蛍光を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋ｔｉＴ／ＣＤ８＋細胞間の接触後、２４時間、４８時間および７２時間において解析された。（ｂ）．リステリア−ＷＴ（細い線）またはリステリア−ＯＶＡ（太い黒線）でインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２５またはＣＤ６９の発現を示す。灰色に塗られたヒストグラムは、不活性のＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の蛍光を示す。（ｃ）．ヒストグラムは、抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体、水溶性ｐＯＶＡを取り込ませたＤＣ、リステリア−ＯＶＡに感染させたＤＣ、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の、２日目または３日目の増殖を示す。なお、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞で活性化されたときのＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、リステリア−ＯＶＡに感染させたＤＣで活性化されたときよりもはるかに高い。グレーで塗られたヒストグラムは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光を示す。（ｄ）．ヒストグラムは、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋との結合後のＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスまたはＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光（CellTrace（登録商標） Violet）を示す。
【００５９】
図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ａ）．リステリア−ＷＴまたはリステリア−ＯＶＡ（ＯＶＡペプチド（ＯＶＡｐ−Ｉ）を取り込ませたＤＣから捕捉された）をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋ｔｉＴ細胞でのインキュベーション後２日目または３日目の、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。（ｂ）．Ｈ−２Ｋｂ＋ＤＣから捕捉されたリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋ｔｉＴ細胞（Ｈ−２Ｋｂ−またはＨ−２Ｋｂ＋）、または、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞（灰色）でインキュベーションされたＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。なお、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ−ＩのＨ２Ｋｂ（ｂ＋）ハプロタイプにおいて抗原が提示されるときのみ、活性化され得る。（ｃ）．Ｈ−２Ｋｂ−（Ｈ−２Ｋｋ／ｋ）であるＤＣでのトランスインフェクションを除き、ｂと同様に、４８時間の間に結合を形成させた。（ｄ）．Ｈ−２Ｋｂ−からＤＣにより捕捉されたリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｈ−２Ｋｂ＋：黒線、Ｈ−２Ｋｂ−：灰色）によるＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡの発現（特定の抗体を用いて検出された）。（ｅ）．（ｆ）．活性から２４時間（Ｅ）または４８時間（Ｆ）、水溶性ＯＶＡｐを取り込ませたＤＣまたはリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞で活性化された、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞におけるＴａｐ１の発現を示すウェスタンブロット。ＥＲＫ２およびラミンＢは対照として使用された。（ｇ）．リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔａｐ１ＫＯマウスまたはその同系ＷＴ由来）との結合後、３日目または４日目における、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。
【００６０】
図３．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ａ）．ヒストグラムは、トランスインフェクションの前（黒線）およびトランスインフェクションの後（灰色線）のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨ−２Ｋｂ発現を示す。灰色に塗られたヒストグラムは、負の対照の蛍光を示す。（ｂ）．トランスインフェクションの前（黒線）およびトランスインフェクションの後（灰色線）の、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８６の発現。灰色に塗られたヒストグラムは、負の対照の蛍光を示す。（ｃ）．トランスインフェクションから２４時間後（線は動かない）、４８時間後（線は右に動く）の、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞、およびトランスインフェクションさせなかったＴ細胞（灰色に塗られたヒストグラム）のＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡｐ−１の発現。（ｄ）および（ｅ）．ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞で１時間インキュベーションされた、リステリア−ＷＴ（ｄ）およびリステリア−ＯＶＡ（ｅ）をトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の共焦点画像。ＣＤ３蛍光およびアクチンを示す。バーは１０μｍを示す。（ｆ）．リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ（太線）またはｐＯＶＡを取り込ませたスプレノサイト（点線）により活性化されたＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（ＣＴＬ）の相対的な特異的細胞傷害性。種々の割合のＥＬ−４（標的細胞）：ＣＴＬ（０．５：１、１：１、２：１、５：１）を用いて特異的細胞傷害性を測定した。
【００６１】
図４．ｔｉＣＤ４＋細胞は、インビボで細胞傷害性エフェクターＴ細胞を活性化する。（ａ）．ヒストグラムは、リステリア−ＷＴまたはリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞を接種されたレシピエントマウス（ＣＤ４５．２）に注射されたＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞の蛍光（CellTrace（登録商標） Violet）を示す。２×１０６のｔｉＣＤ４＋細胞（左パネル）または５×１０６のｔｉＣＤ４＋細胞（右パネル）。（ｂ）．野生型Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｈ−２Ｋｋマウスの細胞での照射後、骨髄は再構成されている）に注射され、CellTrace Violetで染色された、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞のインビボでの増殖。ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋ Ｔ細胞（４×１０６細胞／１匹）を、ＡＮＤマウスのＨ−２Ｋｂ（右パネル）またはＨ−２Ｋｋ（左パネル）を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞（４×１０６細胞／１匹）、およびＭＣＣペプチド（１５μｇ／１匹）と共に移植した。リステリア−ＯＶＡもマウスに感染させた（１０３細菌／１匹）。感染から５日後、脾臓を単離し、移植されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーにより検出した（上のパネル）。下のパネルは、ＯＴ−Ｉマウス（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４−）から移植されたＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。（ｃ）．（５×１０５の）Ｂ１６ ＯＶＡ黒色腫細胞（オボアルブミンを発現している）をレシピエントマウスの右脇腹に皮下注射した。すべての群（９匹／１群）にＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（１０３／１匹）を接種した。第１群では、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共に；第２群では、リステリア ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞５×１０５と共に；第３群では、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせた５×１０５のｔｉＣＤ４＋細胞と共に接種した。腫瘍のサイズを２日ごと（５日目から１３日目）および３日ごと（それ以降）にモニタリングした。
【００６２】
図５．Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉し、細菌抗原をクロスプレゼンテーションする。（ａ）．（３０分間）ＤＣ−Ｂ細胞相互作用をさせる状況、または、このような相互作用を防ぐポリカーボネート障壁（トランスウェル）の存在において、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）で修飾されたマウスのＤＣにL. monocytogenesを感染させ、ＭＤ４トランスジェニックマウスのＢ細胞（当該マウスのＢ細胞は、ＨＥＬを認識するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を有する）でインキュベートした。結合の形成後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を再度単離し、古典的ゲンタマイシン生存アッセイを行った。ＣＦＵ（コロニー形成ユニット；細胞内細菌）は、５０，０００の各ＣＤ４＋Ｔ細胞で見られる。φはＢ細胞における細菌の直接感染である。（ｂ）．L. monocytogenesを感染させ、ＨＥＬで修飾したＤＣを、ＭＤ４マウスのＢ細胞でインキュベートした。結合の形成後、Ｂ細胞を再度単離し、ゲンタマイシン耐性アッセイにより（種々の時間における）細胞内細菌の生存を定量した。時間０にデータを標準化させた。細菌の適応度の対照として、ＨｅＬａ細胞を並行して感染させた。（ｃ）．リステリア−ＯＶＡのトランスインフェクション前（左パネル；ナイーブＢ細胞）および１日後（右パネル）のＢ細胞におけるＣＤ８６の発現。両方のパネルにおいて、ＩｇＭの発現（ＦＬ−１チャネル）対ＣＤ８６の発現（ＦＬ−２チャネル）が示されている。（ｄ）．リステリア−ＷＴ（上パネル）またはリステリア−ＯＶＡ（下パネル）のトランスインフェクションにより捕捉されているｔｉＢ細胞との接触から３日後の、CellTrace Violetでラベルされた、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の増殖。左パネルは、CellTrace Violetの蛍光対ＣＤ２５発現（Ｔ細胞活性のマーカー）を示している。（ｅ）．リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＢ細胞（上線）またはＯＶＡｐ−Ｉペプチドで修飾されたスプレノサイト（下線）で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の相対的な特異的細胞傷害性。種々の割合のＥＬ−４（標的細胞）：ＣＴＬを測定した。
【００６３】
〔実施例〕
発明者らが行ったアッセイにより、以下に本発明を説明するが、これは、本発明の物の有効性を示している。
【００６４】
トランスインフェクションと呼ばれるプロセスにより、Ｔ細胞がＤＣから細菌を捕捉できるという魅力的な発見（Cruz-Adalia et al., 2014）は、トランスインフェクションさせた（ｔｉ）Ｔ細胞は、真のＡＰＣとして振る舞うことができる可能性があるかという問いを投げかけた。これは危険な問いであった。なぜなら、もし正しい場合は、免疫学のドグマ（先天性免疫と獲得性免疫との明確な役割の区別）を破ることになり得、免疫系の機能の仕方の基本的な理解における大躍進となり得るからである。
【００６５】
この問いに答えるため、予め細菌を感染させた骨髄の樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）を用いることにより、リステリア−ＯＶＡ（オボアルブミンを発現しているL. monocytogenes）またはリステリア−ＷＴ（ＯＶＡを発現していない野生型の同形菌株）をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（本明細書中、「ｔｉＣＤ４＋Ｔ」細胞と呼ばれる）の純粋な集団を（セルソーターを用いて）作製した。ＯＴ−Ｉトランスジェニックマウスから単離されたＣＤ８＋ナイーブＴ細胞でインキュベートすることにより、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原を提示する能力を試験した。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｈ−２Ｋｂにおいて、オボアルブミンのペプチド（ＯＶＡｐ−Ｉ  ２５７−２６４；SIINFEKL、配列番号１）を認識する。「CellTrace（登録商標） Violet」で染色したＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーの解析は、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞と接触したＣＤ８＋Ｔ細胞でのみ、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞との接触から２日後に始まるＣＤ８＋Ｔ細胞の潜在的な増殖（CellTrace（登録商標） Violet蛍光の左への移動）を示す（図１ａ）。この高増殖性集団は、高レベルのＣＤ８（ＣＤ８＋ｈｉｇｈ）を発現している（図１ａ）。しかし、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞でＣＤ８＋Ｔ細胞をインキュベートしたとき、ＣＤ８＋Ｔ細胞は増殖しない（図１ａ）。これらのデータによると、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現は、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞でインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞においてのみ検出され、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞でインキュベートしたときには検出されなかった（図１ｂ）。リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、水溶性ＯＶＡペプチドを取り込ませたＢＭ−ＤＣによる誘導、さらには、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でのポリクローナル活性により誘導された増殖よりも、さらに強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、リステリア−ＯＶＡを感染させたＢＭ−ＤＣによる生成よりもさらに強かった（図１ｃ）。一方で、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ抗原を全く認識しない）の増殖を誘導できない（図１ｄ）。ところが、前記ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、非常に強力な、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導し（図１ａ、ｃ、ｄ）、これらのデータは、観察された効果が抗原特異的であることを示している。
【００６６】
まとめると、これらのデータは、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞に細菌抗原をクロスプレゼンテーションできることを示唆している。この点に関し、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞が、プロフェッショナルＡＰＣにおいて行われるクロスプレゼンテーションの種々のステージをどの程度再現できるのか疑問に思った。種々のステージとは、内因性抗原加工、ＭＨＣ−Ｉを介した抗原提示、共刺激性分子の発現、標準的な免疫シナプスの形成を介した標的Ｔ細胞との相互作用である。
【００６７】
ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原提示は、ＤＣの表面からのＭＨＣ／抗原複合体の捕捉、またはｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞自身の内因性加工に起因し得る。これら２つの可能性を見極めるため、ＢＭ−ＤＣのリステリア−ＷＴまたはリステリア−ＯＶＡをＣＤ４＋Ｔ細胞にトランスインフェクションし、ＯＶＡペプチド（ＯＶＡｐ／ＯＴ−Ｉ；ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を認識する細胞）を予め取り込ませ、その後、この（再度精製した）ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を刺激するために使用した。この構成において、ＤＣ細胞から捕捉される抗原は、両方の実験条件において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比較可能な活性を導き得る。しかし、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は非常に強いＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を誘導するが、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は誘導しないことが観察される（図２ａ）。ハプロタイプＨ−２Ｋｋ（ＭＨＣ−Ｉ）のみを発現しているトランスジェニックマウスのｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる追加実験（それゆえに、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞またはＨ−２Ｋｂを発現している同系のｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激できず、Ｈ−２Ｋｂを発現しているＤＣから、両方の細胞タイプの細菌を捕捉する）により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の大部分がｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞内の抗原提示に起因することが確認される（図２ｂ）。
【００６８】
ＢＭ−ＤＣによる抗原提示に対して起こり得る寄与（例えば、混入）は、Ｈ−２Ｋｋのみを発現しているＤＣのリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｈ−２ＫｂまたはＨ−２Ｋｋ）で、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞をインキュベートすることによって、完全に排除された。Ｈ−２Ｋｂを発現しているｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞のみが、ＭＣＨ−Ｉ Ｈ−２Ｋｂ分子においてＯＶＡ抗原を提示するＣＤ８＋Ｔ細胞における増殖（図２ｃ）を誘導した（図２ｄ）。ウェスタンブロット解析もまた、活性化およびトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔａｐ１（ＭＨＣ−Ｉを介した抗原提示に関するタンパク質）の発現を増加させることを示した（図２ｅ、ｆ）。さらに、Ｔａｐ１ ＫＯマウスから単離されたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌の捕捉後、抗原提示細胞としての能力が著しく低下することを示した（図２ｇ）。すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、抗原提示細胞がＷＴマウスのｔｉＣＤ４＋であったときに観察されるものと比較して、抗原提示細胞がＴａｐ１ ＫＯマウスのｔｉＣＤ４＋であったときにおいて、著しく減った。
【００６９】
トランスインフェクション後、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉ（Ｈ−２Ｋb）、（細菌由来の）ＯＶＡ抗原に結合したＨ−２Ｋｂおよび共刺激性分子のリガンド（例えばＣＤ８６）の発現を増加させることもわかった（図３ａ〜ｃ）。これは、ＭＨＣ−Ｉにおける腫瘍性抗原提示を支持する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞結合の形成（図１ｃ）、免疫シナプス（ＩＳ）の形成の指標、ＡＰＳによるＴ細胞活性化のマーカーを伴った。成熟ＩＳの構造は、超分子活性複合体（supramolecular activation complexes；ＳＭＡＣ）と呼ばれる同心円状複合分子からなる。中央部ＳＭＡＣ（Central SMAC；ｃＳＭＡＣ）は、ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体を含み、周辺部位（ｐＳＭＡＣ）は、接着分子およびＦ−アクチンを含んでいる環状構造を形成する（Saito and Batista, 2010）。免疫蛍光分析により、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞は、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞とともに成熟ＩＳを形成することが確認される（図３ｅ）。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞結合は、ＣＤ３分子、ＴＣＲ複合体の一部を含み、ｃＳＭＡＣにリクルートされ、ｐＳＭＡＣでのアクチンの大規模な蓄積を示す；リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたときは、これらの構造の徴候は（検出される数少ない細胞接触において）全く見られなかった（図３ｄ）。まとめると、これらのデータは、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、プロフェッショナルＡＰＣであり、腫瘍性クロスプレゼンテーションによりＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを明らかにしている。
【００７０】
リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、当該ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＯＶＡｐ／ＯＴ−Ｉを発現しているＥＬ−４標的細胞を排除できるため、当該ＣＤ８＋Ｔ細胞に細胞傷害能力を与える（図３ｆ）。さらに、インビボにおいて、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を活性化できるかどうかを調べた。この目的のため、ＯＴ−Ｉ／ＣＤ４５．１マウスからＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を単離し、生体外において「CellTrace（登録商標） Violet」で染色し、ＢＬ６／ＣＤ４５．２マウスに移植した。それから、反応を誘発するために、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞を注射した。脾臓から単離されたＣＤ４５．１のＣＤ８＋Ｔ細胞は、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞に反応して、増殖するが、リステリア−ＷＡをトランスインフェクションさせた場合は増殖しないことが分かった（図４ａ）。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、免疫系の生理学的活性の間にインビボにおいて抗原をクロスプレゼンテーションするかどうか解析した。そのために、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスの骨髄にハプロタイプＨ−２Ｋｋの幹細胞前駆細胞を移植した（これらのマウスのＡＰＣは、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞に対して抗原をクロスプレゼンテーションできないだろう）。１か月後、ＡＮＤマウス（Ｈ−２ＫｂまたはＨ−２Ｋｋ）のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および（トランスインフェクションを助けるための（Cruz-Adalia et al., 2014））ＭＣＣペプチドとともにレシピエントマウスに移植した。また、リステリア−ＯＶＡを静脈注射でレシピエントマウスに感染させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｈ−２Ｋｂ）を受容したマウスだけが、ＯＴ−ＩのＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞を活性化できた（図４ｂ）。これにより、細菌感染の経過の間のＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原提示能力が確かめられた。
【００７１】
ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の治療的可能性をさらに調べるため、攻撃性が高い黒色腫のマウスモデルを用いて、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍の形成を防ぐことができるかを試験した。Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞株（Borroto et al., 2014）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。１日後、ＯＴ−ＩのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を単回注射により移植した。第１群では、ＰＢＳと共に；第２群では、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞と共に；第３群では、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞と共に移植した。対照群（ビヒクルで処置された細胞またはリステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞）のすべてのマウスは、Ｂ１６−ＯＶＡ細胞の注射から最初の１１日間に腫瘍が発達した（図４ｃ）。リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞での処置は、９匹中６匹において腫瘍形成を防ぎ、他のマウスにおいては、腫瘍の出現を遅らせた。すなわち、抗原提示細胞として働くｔｉＣＤ４＋細胞のワクチン接種（単回接種）により、９匹中７匹において黒色腫に対する防御を与えた（図４ｃ）。これらの結果は、腫瘍に対してＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を活性化させるために、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞によるクロスプレゼンテーションをインビボにおいて使用できることを示す。
【００７２】
まとめると、細菌抗原のクロスプレゼンテーションは、先天性免疫系のＡＰＣのみの仕事だと考えられていたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（獲得性免疫系のパラダイムと考えられている）によっても効果的に行われることを初めて示している。また、抗原提示の新たな方法をがん免疫治療の手段として使用できるという証拠も示している。ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性は顕著である。ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞では、単回注射によりＢ−１６（非常に攻撃的な黒色腫）に対する防御を提供する一方、ＤＣに基づくワクチンは、複数回接種が必要とされ、そのため、ｔｉＣＤ４＋モデルのような正の効果は達成されない（Mayordomo et al., 1995）。
【００７３】
さらに、Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉できることも示している。Ｂ細胞による、感染したＤＣからの細菌の捕捉のプロセスは、感染したＤＣとの結合形成後のＢ細胞を再度単離して、その後、標準的なゲンタマイシン生存アッセイを行うことにより定量化した。この方法により、大量の結合を解析することが可能となる。ＤＣ−Ｂ細胞接触を妨げる物理的障壁（ポリカーボネートフィルター）を用いて、細胞間接触の必要性を試験し、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）を修飾されたＤＣを用いて抗原提示の役割を試験した（なお、ＭＤ４トランスジェニックマウス（当該マウスのＢ細胞は、ＨＥＬを認識するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を有する）から単離されたＢ細胞を用いる）。Ｂ細胞による最も多く細菌の捕捉は、（感染させた）ＤＣとＢ細胞との物理的接触しており、当該ＤＣがＨＥＬで修飾されていたときに観察された（図５ａ）。これは、免疫学的シナプスを介したトランスインフェクションと矛盾がなく、また、ＣＤ４＋Ｔ細胞において観察されたものに似ている（Cruz-Adalia et al., 2014）。ＤＣ−Ｂ細胞接触が妨げられているとき、Ｂ細胞による細菌の捕捉がかなり少なく、Ｂ細胞における細菌の直接感染（負の対照）において観察されるものに似ている。Ｂ細胞純度が９７％より大きかった実験のみ考慮しており、混入細胞のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）は結果から除いた。Ｂ細胞に捕捉された細菌の最終結果を決定するため、ＨＥＬで修飾されたＤＣにL. monocytogenesを感染させ、ＭＤ４マウスのＢ細胞と結合させた。結合の形成後、Ｂ細胞を再度単離し、ゲンタマイシン生存アッセイによりＣＦＵ（Ｂ細胞内の細胞内細菌）を解析した。ここで、Ｂ細胞は種々の時間において回収された。意外にも、Ｂ細胞は非常に素早く（かつ、効果的に）捕捉された細菌を殺した（図５ｂ）。結合の形成後１時間で、９０％以上の内部の細菌が破壊された。細菌の適応度の対照として、ＨｅＬａ細胞を感染させた後にＣＦＵを測定した（図５ｂ）。
【００７４】
リステリア−ＯＶＡのトランスインフェクションは、ＭＨＣ−Ｉ（Ｈ−２Ｋｂ）の増加した発現、ＯＶＡｐ−Ｉ抗原に結合するＨ−２Ｋｂの蓄積（示していない）およびＢ細胞でのＣＤ８６共刺激性受容体の発現（図５ｃ）を含んでいる。これらの結果は、トランスインフェクションさせたＢ（ｔｉＢ）細胞による抗原のクロスプレゼンテーションの役割と矛盾していない。
【００７５】
リステリア−ＯＶＡまたはリステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせた、ＭＤ４マウスのｔｉＢ細胞集団を作製した。ＯＴ−Ｉトランスジェニックマウスから単離したＣＤ８＋ナイーブＴ細胞でインキュベートすることによって、ｔｉＢ細胞の抗原提示能力を解析した。フローサイトメトリー分析により、ｔｉＢ細胞がリステリア−ＯＶＡを捕捉したときだけではあるが、ｔｉＢ細胞への曝露後３日において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強い増力が示された（図５ｄ）。リステリア−ＷＴを捕捉したｔｉＢでインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞は、増殖しなかった（図５ｄ）。活性化マーカーであるＣＤ２５の発現は、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＢでインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞において、検出されたが、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＢ細胞を用いたときは検出されなかった（図５ｄ）。リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＢ細胞は、リステリア−ＯＶＡを感染させた水溶性ペプチドＯＶＡｐ−Ｉを取り込ませたＤＣ由来の骨髄（ＢＭ−ＤＣ）、または、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でのポリクローナルなＣＤ８＋Ｔ細胞自体の活性化よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をさらにより強く誘導する。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力も解析したところ、この細胞傷害活性は、ＯＶＡｐ−Ｉペプチドで修飾したスプレノサイトで刺激したときよりも、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＢ細胞で刺激したときの方が高いことがわかった（図５ｅ）。ＯＶＡｐ−Ｉで修飾したＥＬ−４リンパ腫細胞を除去する能力として、細胞傷害活性を解析した。これらのデータは、Ｂ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に振る舞い、トランスインフェクションによって細菌を捕捉し、抗原をクロスプレゼンテーションし、認識される抗原を発現している腫瘍を除去することができる、ＣＤ８＋Ｔ細胞の効果的な活性を誘導する、という仮説を支持する。
【００７６】
［材料および方法］
細菌：リステリア モノサイトゲネス−ＯＶＡ（ｐＰＬ２−ＬＬＯ−ＯＶＡ）、ＯＶＡタンパク質を発現しているリステリア菌株、ＷＴの同系株 L. monocytogenes 10403S。
【００７７】
マウス：（１）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、（２）ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）においてＯＶＡペプチド３２３〜３３９に特異的なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現しているＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）４２５Ｃｂｎ／Ｊ ＯＴ−ＩＩマウス。（３）Ｈ−２ＫｂにおいてＯＶＡペプチド２５７−２６４に特異的なＴＣＲを発現している、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／ＪＯＴ−Ｉマウス。（４）Ｉ−Ｅｋにおいてmoth cytochrome c 88-103 (ANERADLIAYLKQATK)（ＭＣＣｐ）を認識しており、Ｈ−２Ｋｂ、Ｈ−２Ｋｋまたは両方のハプロタイプを発現しているＡＮＤ−ＴＣＲトランスジェニックマウス。（５）Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＩｇｈｅｌＭＤ４）４Ｃｃｇ／Ｊ、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）に特異的なＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現している９９％以上のＢ細胞を有する、（ＭＤ４）トランスジェニックマウス。８〜１２週齢のオスまたはメスのマウスを実験に用いた。ＣＮＢ−ＣＳＩＣの動物施設の特定の病原体がいない（ＳＰＦ）施設においてマウスを飼育した。スペインおよびヨーロッパのガイドラインに従い、ＦＥＬＡＳＡガイドラインの下、実験手順を行った。
【００７８】
［初期細胞］
Inaba et al., 1992に記載されるように、樹状細胞（ＤＣ）を作製した。簡潔に説明すると、骨髄由来（８〜２０週のＣ５７ＢＬ／６マウスの脛節および腿節由来）の細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下で成長させ、１０日目においてＣＤ１１ｃ、ＩＡ／ＩＥおよびＧｒ１についてフローサイトメトリーで細胞を試験し、細胞がきちんと分化したことを確かめた。これらを使用の前の日にＬＰＳで成熟させた。
【００７９】
Cruz-Adalia et al., 2014に記載されるように、ネガティブ磁気分離によって、リンパ節および脾臓から、ＯＴ−ＩＩマウスの初期ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を得た。
【００８０】
［細胞株］
１０％ ＦＣＳ、０．１Ｕ／ｍｌ ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Lonza）および０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールで補完したＲＰＭＩ １６４０（Fisher Scientific）中で、ＥＬ−４リンパ球系統を維持した。０．４ｍｇ／ｍｌ ジェネティシンを含むＲＰＭＩ １６４０において黒色腫Ｂ１６ ＯＶＡ系統を維持した。接種前４８時間において抗生物質で洗浄した。
【００８１】
［抗体］
使用した抗体は、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＩＡ／ＩＥ、抗Ｇｒ１（BDおよびImmunostep）；ＣＤ４５．１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＩｇＭ、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ ＤＸ５、ＣＤ２５およびＣＤ１６／ＣＤ３２に対するビオチン化抗体（BDおよびImmunostep）；抗チューブリンＦＩＴＣ共役抗体（Santa Cruz）であった。アロフィコシアニンでラベルした、SIINFEKL／Ｈ−２Ｋｂ（配列番号１／Ｈ−２Ｋｂ）に特異的なモノクローナル抗体２５−Ｄ１．１６をeBioscienceから購入した。抗ＴＡＰ−１（Ｍ−１８）、抗ＥＲＫ−２および抗ラミンＢをSanta Cruzから購入した。AlexaFluor488、AlexaFluor647またはAlexaFluor568を共役させた、抗マウスのヤギ二次抗体および抗ハムスターのヤギ二次抗体をLife Technologiesから購入した。ペルオキシダーゼを共役させた、抗マウスＩｇＧのヤギ二次抗体および抗ラビットＩｇＧのヤギ二次抗体をThermo Scientificから購入した。
【００８２】
［試薬］
ＯＶＡｐ／ＯＴ−ＩＩペプチド（ＯＶＡ ３２３−３３９; ISQAVHAAHAEINEAGR, 配列番号３）およびＯＶＡｐ／ＯＴ−Ｉ（ＯＶＡ ２５７−２６４, SIINFEKL (配列番号１））をthe Center for Molecular Biology Severo Ochoa (CBMSO-CSIC)で作製した。マウスＧＭ−ＣＳＦはPeprotechより。ペプチド（ＭＣＣｐ）８８−１０３（ANERADLIAYLKQATK；配列番号２）をGenScriptより購入した。ＬＰＳ（Sigma-Aldrich）、ストレプトアビジン結合微粒子（MiltenyiBiotec）、ストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ（BD）およびAlexa Fluor 568−ファロイジン（Life Technologies）。ポリ−Ｌ−リジン（Sigma-Aldrich）、CellTrace（登録商標） Violet（Life Technologies）およびeBiosciencesの7-AADの生死判別染色試薬。
【００８３】
［ＣＤ４＋Ｔ細胞のトランスインフェクション］
Cruz-Adalia et al. 2014に記載されたように、リステリア−ＯＶＡまたはリステリア−ＷＴをマウスＯＴ−ＩＩのＣＤ４＋Ｔ細胞にトランスインフェクションさせた。簡潔に説明すると、（トランスインフェクションを増加させるために）ＯＶＡｐ（ＯＴ−ＩＩ）を感染させ捕捉させたＢＭ−ＤＣは、ＯＴ−ＩＩマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞と共役を形成した。いくつかの実験において、ＭＨＣ−Ｉハプロタイプ（Ｈ−２Ｋｂ／ｋまたはＨ−２Ｋｂネガティブ、Ｈ−２Ｋｋ／ｋ）を発現しているＡＮＤマウスから、ＢＭ−ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。これらの実験において、ＢＭ−ＤＣにＭＣＣｐを捕捉させ、トランスインフェクションを増大させた。ＤＣ／Ｔの共役から３時間後、ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を培地に加え、細胞外細菌を除去した。２４時間後（いくつかの実験では４８時間後）、セルソーティング（FACS Synergy; iCyt）によりｔｉＣＤ４＋細胞を精製した。
【００８４】
［ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖アッセイ］
ｔｉＣＤ４＋細胞の精製した集団を、ＯＴ−Ｉマウスから単離されたＣＤ８＋ナイーブＴ細胞でインキュベートした。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞をCellTrace（登録商標） Violetで予め染色し、フローサイトメトリー（FACSAria; BD）によりこれらの増殖を評価した。それぞれの細胞分裂において、増殖している集団では染色が見られず、ヒストグラムでは左側への移動として観察された。生きている細胞（色素７ＡＡＤで染色されない）のみを解析した。
【００８５】
インビボでのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を解析するため、CellTrace（登録商標） Violetで染色した５×１０６のＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（マウスＣＤ４５．１＋ＯＴ−Ｉ由来）をレシピエントマウス（ＣＤ４５．２＋Ｃ５７ＢＬ／６）に静脈注射した。２４時間後、ｔｉＣＤ４＋細胞をマウスに移植した。３日後、脾臓を単離し、フローサイトメトリーによりＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を解析した。
【００８６】
［蛍光顕微鏡検査法］
ｔｉＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を１時間置き、共役を形成させた後、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞をCellTrace（登録商標） Violetで予め染色した。所定の抗体での染色の前に、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で試料を浸透させた。フルオロリン酸塩に共役させたファロイジンを用いて、Ｆ−アクチンを検出した。６３倍レンズを備えたLeica TCS SP5を用い、Leica LAS AFで制御することにより、共焦点顕微鏡により試料を可視化した。ＩｍａｇｅＪ（NIH Bethesda, MD）を用いて、画像を解析した。
【００８７】
［細胞傷害性アッセイ］
ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクターおよびリンパ球（ＣＴＬ）の両方を、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞で活性化させたＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（ＯＴ−Ｉ）から調製した。正の対照として、ＯＶＡｐを取り込ませたスプレノサイトで活性化させたＯＴ−Ｉ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した。
【００８８】
０．５μＭ ＯＶＡｐ／ＯＴ−Ｉで１時間、ＥＬ−４細胞をインキュベートした（対照は、インキュベートしなかった）。ＰＢＳ洗浄の後、ＯＶＡｐを取り込ませたＥＬ−４細胞をCellTrace（登録商標） Violet（５μＭ）で染色した。一方、ＯＶＡｐを取り込ませなかったＥＬ−４細胞をCellTrace（登録商標） Violet（０．５μＭ）で染色した。培養培地での洗浄の後、両方の集団を、種々の比率のＣＴＬ（５：１、２：１、１：１、０．５：１）（ＥＬ４／ＣＴＬ）で混合し、インキュベートした。４時間後、試料をフローサイトメトリーで解析した。特異的細胞傷害性を算出するため、以下の式を用いた：１−（ＥＬ−４ Cell Violethighの％／ＥＬ−４ Cell Violetlowの％）×１００（Lang et al., 2005)。負の対照（ＣＴＬでインキュベートしていないＥＬ−４細胞）を相対的に引くことで、細胞傷害性を算出する。
【００８９】
［腫瘍（Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫）に対する防御アッセイ］
前のセクションに記載したように、リステリア−ＷＴ(負の対照)またはリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。トランスインフェクションの２４時間後に、ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞をセルソーティングにより再度単離し、ＰＢＳに懸濁する。上述のようにＯＴ−ＩのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を磁気カラムにより精製し（Cruz-Adalia et al., 2014）、ＰＢＳに再度懸濁した。５×１０５のＢ１６−ＯＶＡ細胞をレシピエントマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の右脇腹に皮下注射した。その後、マウスを３群に分け、単回注射において静脈により（ｉｖ）移植した。第１群：ＰＢＳ；第２群：リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせた５×１０５のｔｉＣＤ４＋細胞；第３群：リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞。すべての群のすべてのマウスも、ＯＴ−Ｉ由来の１０３個のＣＤ８＋Ｔ細胞と共に、ｔｉＣＤ４＋またはＰＢＳビヒクルに皮下注射された（ｉｖでも）。キャリパー目盛板を用いて腫瘍成長を２〜３日ごとにモニタリングし、長さと幅とを掛け算することにより、面積を決定した。実験群をランダムに割り当て、二重盲検法（腫瘍を測定した人間は、マウスがいずれの群に属しているか知らない）により実験を行った。実験動物に関するＥＵおよびＦＥＬＡＳＡの指示の終点の基準、およびスペインの現行の法律に従って、腫瘍が３００ｍｍ２に達したときにマウスを犠牲にした。
【００９０】
〔参考文献〕
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】図１．トランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｔｉＣＤ４＋Ｔ）は、インビトロにおいて、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞に対してＭＨＣ−Ｉを介して細菌抗原を提示する。ａ．リステリア−ＷＴ（野生型菌株；上のパネル）またはリステリア−ＯＶＡ（オボアルブミンを発現している菌株；下のパネル）をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋ｔｉＴを、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（Ｈ−２Ｋｂにおいてオボアルブミンのペプチド（ＯＶＡｐ−Ｉ  ２５７−２６４； SIINFEKL (配列番号１)）を認識する）でインキュベートした。ヒストグラムは、「CellTrace（登録商標） Violet」でラベルしたＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光を示す。細胞分裂（活性化細胞の特徴）は、左側の集団として観察される（各細胞分裂において色素が希釈される）。灰色に塗られたヒストグラムは、不活性のＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の蛍光を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４＋ｔｉＴ／ＣＤ８＋細胞間の接触後、２４時間、４８時間および７２時間において解析された。
【図１Ｂ】図１．トランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｔｉＣＤ４＋Ｔ）は、インビトロにおいて、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞に対してＭＨＣ−Ｉを介して細菌抗原を提示する。ｂ．リステリア−ＷＴ（細い線）またはリステリア−ＯＶＡ（太い黒線）でインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２５またはＣＤ６９の発現を示す。灰色に塗られたヒストグラムは、不活性のＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の蛍光を示す。
【図１Ｃ】図１．トランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｔｉＣＤ４＋Ｔ）は、インビトロにおいて、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞に対してＭＨＣ−Ｉを介して細菌抗原を提示する。ｃ．ヒストグラムは、抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体、水溶性ｐＯＶＡを取り込ませたＤＣ、リステリア−ＯＶＡに感染させたＤＣ、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の、２日目または３日目の増殖を示す。なお、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞で活性化されたときのＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、リステリア−ＯＶＡに感染させたＤＣで活性化されたときよりもはるかに高い。グレーで塗られたヒストグラムは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光を示す。
【図１Ｄ】図１．トランスインフェクションさせたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｔｉＣＤ４＋Ｔ）は、インビトロにおいて、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞に対してＭＨＣ−Ｉを介して細菌抗原を提示する。ｄ．ヒストグラムは、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋との結合後のＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスまたはＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光（CellTrace（登録商標） Violet）を示す。
【図２Ａ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ａ）．リステリア−ＷＴまたはリステリア−ＯＶＡ（ＯＶＡペプチド（ＯＶＡｐ−Ｉ）を取り込ませたＤＣから捕捉された）をトランスインフェクションさせたＣＤ４＋ｔｉＴ細胞でのインキュベーション後２日目または３日目の、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。
【図２Ｂ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ｂ）．Ｈ−２Ｋｂ＋ＤＣから捕捉されたリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたＣＤ４＋ｔｉＴ細胞（Ｈ−２Ｋｂ−またはＨ−２Ｋｂ＋）、または、リステリア−ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞（灰色）でインキュベーションされたＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。なお、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ−ＩのＨ２Ｋｂ（ｂ＋）ハプロタイプにおいて抗原が提示されるときのみ、活性化され得る。
【図２Ｃ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ｃ）．Ｈ−２Ｋｂ−（Ｈ−２Ｋｋ／ｋ）であるＤＣでのトランスインフェクションを除き、ｂと同様に、４８時間の間に結合を形成させた。
【図２Ｄ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ｄ）．Ｈ−２Ｋｂ−からＤＣにより捕捉されたリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｈ−２Ｋｂ＋：黒線、Ｈ−２Ｋｂ−：灰色）によるＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡの発現（特定の抗体を用いて検出された）。
【図２Ｅ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ｅ）．（ｆ）．活性から２４時間（Ｅ）または４８時間（Ｆ）、水溶性ＯＶＡｐを取り込ませたＤＣまたはリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞で活性化された、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞におけるＴａｐ１の発現を示すウェスタンブロット。ＥＲＫ２およびラミンＢは対照として使用された。
【図２Ｆ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ｅ）．（ｆ）．活性から２４時間（Ｅ）または４８時間（Ｆ）、水溶性ＯＶＡｐを取り込ませたＤＣまたはリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞で活性化された、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞におけるＴａｐ１の発現を示すウェスタンブロット。ＥＲＫ２およびラミンＢは対照として使用された。
【図２Ｇ】図２．ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞は、細菌抗原を加工する。（ｇ）．リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔａｐ１ＫＯマウスまたはその同系ＷＴ由来）との結合後、３日目または４日目における、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。
【図３Ａ】ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ａ）．ヒストグラムは、トランスインフェクションの前（黒線）およびトランスインフェクションの後（灰色線）のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨ−２Ｋｂ発現を示す。灰色に塗られたヒストグラムは、負の対照の蛍光を示す。
【図３Ｂ】ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ｂ）．トランスインフェクションの前（黒線）およびトランスインフェクションの後（灰色線）の、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８６の発現。灰色に塗られたヒストグラムは、負の対照の蛍光を示す。
【図３Ｃ】ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ｃ）．トランスインフェクションから２４時間後（線は動かない）、４８時間後（線は右に動く）の、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞、およびトランスインフェクションさせなかったＴ細胞（灰色に塗られたヒストグラム）のＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡｐ−１の発現。
【図３Ｄ】ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ｄ）および（ｅ）．ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞で１時間インキュベーションされた、リステリア−ＷＴ（ｄ）およびリステリア−ＯＶＡ（ｅ）をトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の共焦点画像。ＣＤ３蛍光およびアクチンを示す。バーは１０μｍを示す。
【図３Ｅ】ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ｄ）および（ｅ）．ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞で１時間インキュベーションされた、リステリア−ＷＴ（ｄ）およびリステリア−ＯＶＡ（ｅ）をトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞の共焦点画像。ＣＤ３蛍光およびアクチンを示す。バーは１０μｍを示す。
【図３Ｆ】ｔｉＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ナイーブＴ細胞とともに免疫シナプスを形成する。（ｆ）．リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋Ｔ（太線）またはｐＯＶＡを取り込ませたスプレノサイト（点線）により活性化されたＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（ＣＴＬ）の相対的な特異的細胞傷害性。種々の割合のＥＬ−４（標的細胞）：ＣＴＬ（０．５：１、１：１、２：１、５：１）を用いて特異的細胞傷害性を測定した。
【図４Ａ】ｔｉＣＤ４＋細胞は、インビボで細胞傷害性エフェクターＴ細胞を活性化する。（ａ）．ヒストグラムは、リステリア−ＷＴまたはリステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞を接種されたレシピエントマウス（ＣＤ４５．２）に注射されたＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞の蛍光（CellTrace（登録商標） Violet）を示す。２×１０６のｔｉＣＤ４＋細胞（左パネル）または５×１０６のｔｉＣＤ４＋細胞（右パネル）。
【図４Ｂ】ｔｉＣＤ４＋細胞は、インビボで細胞傷害性エフェクターＴ細胞を活性化する。（ｂ）．野生型Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｈ−２Ｋｋマウスの細胞での照射後、骨髄は再構成されている）に注射され、CellTrace Violetで染色された、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞のインビボでの増殖。ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋ Ｔ細胞（４×１０６細胞／１匹）を、ＡＮＤマウスのＨ−２Ｋｂ（右パネル）またはＨ−２Ｋｋ（左パネル）を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞（４×１０６細胞／１匹）、およびＭＣＣペプチド（１５μｇ／１匹）と共に移植した。リステリア−ＯＶＡもマウスに感染させた（１０３細菌／１匹）。感染から５日後、脾臓を単離し、移植されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーにより検出した（上のパネル）。下のパネルは、ＯＴ−Ｉマウス（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４−）から移植されたＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図４Ｃ】ｔｉＣＤ４＋細胞は、インビボで細胞傷害性エフェクターＴ細胞を活性化する。（ｃ）．（５×１０５の）Ｂ１６ ＯＶＡ黒色腫細胞（オボアルブミンを発現している）をレシピエントマウスの右脇腹に皮下注射した。すべての群（９匹／１群）にＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（１０３／１匹）を接種した。第１群では、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共に；第２群では、リステリア ＷＴをトランスインフェクションさせたｔｉＣＤ４＋細胞５×１０５と共に；第３群では、リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせた５×１０５のｔｉＣＤ４＋細胞と共に接種した。腫瘍のサイズを２日ごと（５日目から１３日目）および３日ごと（それ以降）にモニタリングした。
【図５Ａ】Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉し、細菌抗原をクロスプレゼンテーションする。（ａ）．（３０分間）ＤＣ−Ｂ細胞相互作用をさせる状況、または、このような相互作用を防ぐポリカーボネート障壁（トランスウェル）の存在において、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）で修飾されたマウスのＤＣにL. monocytogenesを感染させ、ＭＤ４トランスジェニックマウスのＢ細胞（当該マウスのＢ細胞は、ＨＥＬを認識するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を有する）でインキュベートした。結合の形成後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を再度単離し、古典的ゲンタマイシン生存アッセイを行った。ＣＦＵ（コロニー形成ユニット；細胞内細菌）は、５０，０００の各ＣＤ４＋Ｔ細胞で見られる。φはＢ細胞における細菌の直接感染である。
【図５Ｂ】Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉し、細菌抗原をクロスプレゼンテーションする。（ｂ）．L. monocytogenesを感染させ、ＨＥＬで修飾したＤＣを、ＭＤ４マウスのＢ細胞でインキュベートした。結合の形成後、Ｂ細胞を再度単離し、ゲンタマイシン耐性アッセイにより（種々の時間における）細胞内細菌の生存を定量した。時間０にデータを標準化させた。細菌の適応度の対照として、ＨｅＬａ細胞を並行して感染させた。
【図５Ｃ】Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉し、細菌抗原をクロスプレゼンテーションする。（ｃ）．リステリア−ＯＶＡのトランスインフェクション前（左パネル；ナイーブＢ細胞）および１日後（右パネル）のＢ細胞におけるＣＤ８６の発現。両方のパネルにおいて、ＩｇＭの発現（ＦＬ−１チャネル）対ＣＤ８６の発現（ＦＬ−２チャネル）が示されている。
【図５Ｄ】Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉し、細菌抗原をクロスプレゼンテーションする。（ｄ）．リステリア−ＷＴ（上パネル）またはリステリア−ＯＶＡ（下パネル）のトランスインフェクションにより捕捉されているｔｉＢ細胞との接触から３日後の、CellTrace Violetでラベルされた、ＯＴ−ＩマウスのＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の増殖。左パネルは、CellTrace Violetの蛍光対ＣＤ２５発現（Ｔ細胞活性のマーカー）を示している。
【図５Ｅ】Ｂ細胞はトランスインフェクションによって細菌を捕捉し、細菌抗原をクロスプレゼンテーションする。（ｅ）．リステリア−ＯＶＡをトランスインフェクションさせたｔｉＢ細胞（上線）またはＯＶＡｐ−Ｉペプチドで修飾されたスプレノサイト（下線）で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の相対的な特異的細胞傷害性。種々の割合のＥＬ−４（標的細胞）：ＣＴＬを測定した。
【図１Ａ（１）】
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【図１Ａ（２）】
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【図１Ａ（３）】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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