(57)【要約】  本発明は、上皮細胞バリア機能に対する化合物の調節効果を測定するための改善された方法に関する。該方法は、試験化合物を個々に又は組み合わせてハイスループットスクリーニングすることを可能とする。上皮バリア機能を改善する化合物又は上皮バリア機能に負の影響を及ぼす化合物を、本明細書に記載の方法を用いて分析することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮バリア機能に対する試験化合物の調節効果をインビトロにおいて決定するための方法であって、該方法は、
ａ）複数の中空マイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体システムを準備する工程（ここで、該チャネルは少なくとも部分的にゲルで充填されている）；
ｂ）上皮細胞をマイクロ流体チャネルに導入し、そして上皮細胞がゲルと接触することを可能とする工程；
ｃ）マイクロ流体チャネルに導入された上皮細胞を培養し、これによりマイクロ流体チャネル内で細胞がゲル上で頂端側及び基底外側を有する細胞層を形成することを可能とし、好ましくはこれにより細胞が頂端側及び基底外側を有する細管構造を形成することを可能とする工程；
ｄ）マイクロ流体チャネル内の上皮細胞に、プローブ及び試験化合物を与える工程（ここで、該プローブ及び該試験化合物は、独立して、頂端側、基底外側、又は頂端側と基底外側の両方に与えられる）；
ｅ）様々な時点において、マイクロ流体チャネル内若しくはゲル内のプローブ、又はマイクロ流体チャネル内とゲル内の両方におけるプローブによって与えられるシグナルを決定する工程
を含む、該方法。
【請求項２】
前記方法がさらに、
ｆ）工程ｅ）で得られたシグナルから、試験化合物及び／又はプローブを上皮細胞に与えた時点から、マイクロ流体チャネル内及び／又はゲル内の予め決定された蛍光の数値又は予め決定された蛍光の数値の変化が達成された時点までに、あるいはマイクロ流体チャネル及びゲル内の予め決定された蛍光の比率の数値又は予め決定された蛍光の比率の数値の変化が達成された時点までに経過した時間を決定する工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、１つを超える濃度の試験化合物について実施され、好ましくは工程ｆ）が１つを超える濃度の試験化合物について決定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上皮バリア機能に対する試験化合物の効果が、培養上皮細胞を含む１つを超えるマイクロ流体チャネルにおいて同時に決定され、好ましくは上皮バリア機能に対する１つを超える濃度の試験化合物の効果が同時に決定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
独立して、上皮バリア機能に対する１つを超える試験化合物の効果が、培養上皮細胞を含む複数のマイクロ流体チャネルの少なくとも一部において同時に決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄ）より前に又は工程ｄ）と同時に、バリア機能が破壊される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物が、プローブより前に、後に、又は同時にのいずれかで細胞に与えられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）で培養された細胞は単層を形成し、好ましくは該単層は実質的にプローブが頂端側から基底外側へと、及び／又は頂端側から基底外側へと拡散することを可能としない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）における２つの連続した時点が互いに１秒間から２４時間以内である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｅ）における様々な時点が１０分間から４週間の間隔内（境界値を含む）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ゲルの隣に、ゲルと接触しているさらなるチャネルが存在し、該チャネルは、培養上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルと直接接触していない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記のさらなるチャネル内にゲルからプローブを除去する流動が存在し、そして好ましくは工程ｅ）のゲル内のプローブによって与えられたシグナルの決定は、前記のさらなるチャネル内に存在する流動中のシグナルの測定を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）において様々な種類の上皮細胞が同じマイクロ流体チャネル内に導入され、及び／又は、工程ｂ）において様々なマイクロ流体チャネルに、様々な種類の上皮細胞が与えられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ゲルが基底膜抽出物、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ−リジン、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はその組合せであり、そして好ましくはゲルは人工膜又は拡散バリアを含まず、及び／又は、ゲルは細胞層と直接接触し、この２つを隔てる物理膜を全く有さない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上皮細胞が動物上皮細胞、動物上皮細胞株の細胞、動物上皮初代細胞、哺乳動物上皮細胞、哺乳動物上皮細胞株の細胞、哺乳動物の上皮初代細胞、ヒト上皮細胞、ヒト上皮細胞株の細胞、又はヒト上皮初代細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｅ）のプローブによって与えられるシグナルの決定が、画像撮影装置、顕微鏡、自動顕微鏡、ハイコンテント画像撮影装置、プレートリーダー、又はマルチモードリーダーを使用した測定を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マイクロ流体デバイスが、マイクロ流体チャネルへの及び／又はゲルへの及び／又はさらなるチャネルへの連続的な光路を提供する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
調節効果が、上皮バリア機能を破壊又は修復することである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｄ）において試験化合物が与えられる前にプローブが上皮細胞に与えられ、そして好ましくはプローブが与えられた後に、マイクロ流体チャネル内若しくはゲル内に、又はマイクロ流体チャネル内とゲル内の両方に与えられたシグナルが、様々な時点において及び試験化合物が与えられる前に決定される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
マイクロ流体システムが少なくとも３個、好ましくは１０個超、さらにより好ましくは約４０個、９６個、２５６個、３８４個のマイクロ流体チャネルを含み、好ましくは上皮細胞を含む少なくとも３個、好ましくは１０個超、さらにより好ましくは約４０個、９６個、２５６個、３８４個のマイクロ流体チャネルが同時に、順次、又は平行して測定される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
様々なサイズのプローブが工程ｄ）において与えられ、好ましくは各々の異なるサイズのプローブは異なる蛍光標識で標識されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プローブが与えられた側（基底外側又は頂端側）に超過圧力が加えられ、好ましくは超過圧力は、他方の側における又は他方の側に相当するレザバーにおける流体の量と比較して、プローブが与えられた側への又はプローブが与えられた側に相当するレザバーへのより多量の流体の添加によって実現される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ゲルが、主としてより親水性の高いチャネル内のピラー、リッジ、溝、疎水性パッチ又はより親水性の低いパッチなどの毛管圧技術を用いてマイクロ流体チャネル内に構造化される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
１つ以上のプローブが、上皮細胞に、試験化合物の添加と一緒に又は添加後の時点で与えられ、そして１つ以上のプローブは好ましくは光学的手段によって第一のプローブから識別可能である、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行技術
上皮組織は、４種類の基本的な組織（上皮組織、結合組織、筋肉組織、及び神経組織）の中の１つを含む。上皮細胞は、動物（脊椎動物及び無脊椎動物の両方）並びに植物において認められ、そして生物の生理機能において中心的な役割を果たす。
【０００２】
上皮細胞は、生体の空洞及び管腔の外側及び内側の両方を覆う。内皮（血管、心臓、及びリンパ管の内壁）及び中皮（心膜、胸膜、及び腹膜の壁を形成している）は特殊な形状の上皮である。
【０００３】
上皮細胞は、身体内部に対する守衛として作用する上皮バリアを形成する。該細胞及び該細胞が形成するバリアは、生体の空洞内部と空洞外部を隔離し、そして生体が特定の物質を選択的に吸収及び排泄するための手段を提供する。上皮バリア及び上皮細胞はその理由のために、化学物質及び栄養分の吸収、経細胞輸送、感覚の検知、老廃物の排泄、及び微生物による感染に対する防御などの様々な生物学的プロセスにおいて重要である。全ての上皮は通常、細胞外線維基底膜によって、根底にある組織から隔離されている。
【０００４】
一例として、上皮は、肺胞又は気嚢をはじめとする肺の構造を形成し、そして胃及び小腸、腎臓及び膵臓などの大半の臓器を覆う。それらはまた食道を覆い、そして胆管及び唾液腺などの管及び腺に見られる。それらは味蕾を形成し、鼻、耳、及び眼及び皮膚を覆う。
【０００５】
内皮は、血管及びリンパ管の内表面を覆う内皮細胞の薄層であり、管腔内に循環している血液又はリンパと、残りの血管壁との間に界面、例えば血液脳関門を形成している。
【０００６】
中皮細胞は、生体の漿液腔及び内臓を覆う特殊な舗道のような単層細胞を形成する。中皮と呼ばれるこの層の主な機能は、滑りやすく非粘着性の保護表面を提供することである。しかしながら、中皮細胞は、漿液腔を横断する体液及び細胞の輸送、抗原提示、炎症及び組織修復、凝固及び線溶、及び腫瘍細胞接着を含む他の中心的な役割を果たす。
【０００７】
上皮細胞は、多くの識別可能な特徴によって特徴付けられる。上皮細胞は、上皮と呼ばれる組織のシート内で互いに結合している。これらのシートは、密着結合、接着結合、デスモゾーム結合、及びギャップ結合をはじめとする数種類の相互作用を通して互いにまとまっている。密着結合は、２つの領域間の分極に関連した、上皮細胞の頂端（上部）領域と基底（下部）領域の間の線引きとして作用する。上皮は、基底層と呼ばれる基底膜によって基底側上で支持されている。
【０００８】
記載のように、１つの特徴的な特色は、分極化した上皮細胞の形質膜を頂端部分と基底外側部分とに分離する密着結合の形成である。細胞の頂端部分は、インビトロにおいて、例えば組織培養プレート上で増殖させた細胞単層内に正しい方向に置かれた場合、細胞の露出部分、すなわち細胞の上部である。体内の上皮細胞シートの状況では、頂端表面は、上皮によって覆われた管腔に曝されるだろう。細胞の基底外側表面は、底部すなわち基底部と側部すなわち外側部分から構成される。組織培養プレート上で増殖させた細胞の状況では、細胞の基底外側膜は、組織培養プレートと接触している細胞の部分であり、そして細胞の外側部分は密着結合より下に位置している。体内の上皮細胞シートの状況では、細胞の基底外側表面は、上皮に覆われた生体の内部に曝されるだろう。様々なタンパク質が頂端膜又は基底外側膜に特異的に局在する。
【０００９】
重要性を考えると、上皮細胞（内皮細胞及び中皮細胞を含む）が様々な生物学的プロセスを研究するために広く使用されることは驚くべきことではない。該細胞は、分子細胞生物学、（微生物による）発病、薬理学、及び毒性学のような分野における研究に適している。
【００１０】
上皮細胞及びバリア機能を研究するために多くのモデルシステムが開発されている。上皮細胞の研究には通常、上皮細胞の頂端表面又は基底外側表面と接触する培養培地にアクセスできる又は改変できる能力が必要とされる。標準的な組織培養装置ではこの種の操作は可能ではないので、特殊な細胞培養装置が開発されている。大半のインビトロモデルシステムに使用される主な装置は、透過性の組織培養プレートインサート、例えばトランスウェル（登録商標）（コーニング社、ローウェル、マサチューセッツ州）である。これらの装置は、組織培養プレートのウェルに挿入することのできる人工的で透過性の増殖用支持体を提供する。透過性の増殖用支持体の表面を横断して分極した細胞単層を培養することによって、それは、組織培養ウェルの頂端チャンバーと基底外側チャンバーとを分離するための選択的バリアとして機能するだろう。
【００１１】
このようなモデルシステムは、新規医薬の開発、様々な疾患の解明、及び薬剤の毒性作用の解明において重要な役割を果たしている。
【００１２】
例えば、薬物開発プロセス中、可能性ある治療剤又は薬物候補は、認可を得てその後市販される前に、その目的とする用途に対して安全かつ有効であることが実証されなければならない。様々な薬物が上皮バリア機能を負に調節することが知られている（例えば、Youmba et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2012;54:463-70参照）。他方で、例えばバリアを一過的に開くことによって、上皮細胞のバリア機能を調節する化合物は、全身循環への及び臓器への薬物の送達を改良するのに有用であり得る（Deli, Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1788 (4) 2009, 892-910）。同様に、一過性に血液脳関門を開くことは、脳への薬物の送達において有用であり得る。さらに、このようなシステムは、バリア機能に対する全種類の化合物（食物、化粧品、及び飲料に見られる化合物、並びに細菌を含む）の作用を解明するのに重要である。例えば、クロストリジウム・ディフィシル毒素は、細胞膜ミクロドメインにおける密着結合タンパク質の局在を変化させることによって上皮バリア機能を破壊し（Nusrat et al. Infect Immun. 2001 Mar;69(3):1329-36）、一方、他の成分は上皮バリア機能を高め得るか又は補い得る。
【００１３】
現在の上皮細胞モデルシステムは薬物の発見にとって有用であるが、これらのシステムで細胞を用いて作業することは、この研究には高度に均一な細胞単層が必要とされるために困難であることが判明した。実験研究は、正しい細胞型を選択すること、複数の均一の細胞単層を生成すること、そして細胞単層の完全性が実験を実施するのに十分であることを確実にすることを必要とする。さらに、これら全てが、実験的に許容される結果が繰り返し発生することを可能とするために十分に確立されていなければならない。これらの困難が、所望の上皮細胞モデルシステムの開発を、数か月又は数年間の研究を必要とする気力をくじくようなプロセスにし得る。
【００１４】
したがって、多数の異なる化合物についての上皮バリア機能に関するデータを迅速に提供することのできる新規なハイスループットスクリーニングアッセイの開発に高い関心がある。それ故、本発明の目的は、上皮バリア機能に対する化合物の効果のより良い解明がもたらされる改良されたアッセイを提供することである。
【００１５】
発明の説明
定義
本発明の方法、組成物、使用、及び他の態様に関する様々な用語が、明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用されている。このような用語には、特記されない限り、本発明が属する技術分野のその通常の意味が与えられる。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供された定義と一致した意味で解釈される。本明細書に記載のものと類似した又は等価なあらゆる方法及び材料を、本発明を試験するための実践に使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００１６】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」：これらの単数形の用語は、内容により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の対象物も含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。
【００１７】
「約」及び「およそ」：これらの用語は、量、持続時間などの測定可能な数値に言及される場合に、具体的な数値からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、なぜなら、このような変動は開示された方法を実施するのに適切であるからである。
【００１８】
「含む」：この用語は、包括的でかつ変更可能であり、そして排他的ではないと解釈される。具体的には、該用語及びその変化形は、特定の特色、工程、又は成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特色、工程、又は成分の存在を除外すると解釈されるべきではない。
【００１９】
「例示的な」：この用語は、「一例、実例、又は例示としての役目を果たす」ことを意味し、そして本明細書に開示された他の設定を除外すると解釈されるべきではない。
【００２０】
「マイクロ流体システム」：この用語は、ピコリットル未満からミリリットル未満、又はミリリットルの範囲などの少容量の液体を含有、流動、処理、若しくは別様に操作するように設計されたデバイス、又はデバイスの流体成分を指す。いくつかの例示的な実施態様では、マイクロ流体チャネルなどのマイクロ流体機構の横断面の最大寸法は１mm未満、５００μm未満、１００μm未満、５０μm未満、又は２５μm未満であり得る。
【００２１】
「発光プローブ」：この用語は、発光するあらゆるプローブ又は分子を指す。発光の種類としては、生物発光、化学発光、電気化学発光、電子発光、及び光ルミネセンスが挙げられる。プローブはそれ自体が発光していてもよく、発光は、発光プローブの関与する化学反応若しくは酵素反応の結果であってもよく、又は、光を用いてプローブを励起し、その後、様々な波長におけるプローブによる発光の結果であってもよい。後者は、蛍光としても知られている。蛍光は、発光の一種でありかつ光子の吸収の結果であるので、それは一種の光ルミネセンスである。本発明の脈絡において、「発光プローブ」という用語の下に比色定量プローブも含まれる。
【００２２】
プローブ：この用語は、その有無を検出（定性的に及び／又は定量的に）することのできるシステム、組成物、又は分子、例えば検出可能な分子、マーカー、又は物質を指す。本発明の脈絡において、プローブは、上皮バリア機能を測定するために使用される。プローブを準備し、そして頂端側、基底外側、又は両側においてプローブによって作られたシグナルを測定することによって、上皮バリア機能の測定値が得られる。例えば、プローブが細胞層の片側に与えられる場合、他方の側におけるプローブの出現は、該プローブが細胞層を横断したことを示す。出現率の上昇は、細胞層上への「漏出」の増加を示す。換言すれば、プローブは、本発明の脈絡において、検出可能であるもの；例えば、シグナルを与えるか又は誘導してシグナルを与えることができるものを指す。当業者は、本発明の脈絡において、これは、例えば上皮層の細胞の頂端側、基底外側における、又はさらにはこれらの細胞内における、その検出を可能とする、あらゆる種類の物質、分子、又はシステムであり得ることを理解する。例えば、プローブの分布のモニタリング、又は検出可能なプローブの再分布率に基づいて、上皮バリア機能を決定し得る。例えば、先行技術から証明され得るように、プローブはまた、「検出可能な」マーカー、物質、マーカー物質、試薬、標識、又は分子とも称され得る。容易に検出及び決定され得るプローブの例としては、発光物質及び化合物、色素、フルオロフォア、放射性化合物、センサー分子などが挙げられるがこれらに限定されない。しかしながら、その存在が頂端側及び／又は基底外側（又は細胞内）において検出され得る他の分子も想定される。当業者は、プローブによって与えられたシグナルの検出が、使用されるプローブ又はマーカー物質の種類に依存するだろうことを理解する。例えば、プローブが蛍光プローブである場合、蛍光が決定され得る。例えば、プローブが放射性プローブである場合、放射能が決定され得る。例えば、プローブが酵素基質である場合、プローブは、試料に酵素アッセイを実施することによって決定され得る。当業者は、プローブによって与えられたシグナルが、使用されるプローブの種類に依存するであろうことを理解する。当業者は、本開示が、本発明の脈絡において適切に使用され得る限りは、使用されるプローブの種類に特に限定されないことを理解する。
【００２３】
好ましくは、プローブは光学的プローブであり、すなわち、プローブによって作られるか又は与えられるシグナルは、光学的手段を使用して（例えば吸収、蛍光、又は化学発光を測定して）検出され得る。光学的モニタリングを可能とする周知のプローブとしては、発光プローブ（蛍光プローブを含む）、色素、及び比色定量プローブが挙げられるがこれらに限定されない。プローブはまた、細胞の片側（頂端側又は基底外側）に与えられたセンサー分子又は組成物と、細胞の他方の側に与えられたさらなる分子又は組成物からなり得、センサー分子又は組成物は、それがさらなる分子又は組成物と接触するようになると、好ましくは光学的に検出可能である。検出されたシグナルは、さらなる分子又は組成物が細胞を横断したことを示し、上皮バリア機能の指標となる。
【００２４】
発明の詳細な説明
上皮バリア機能に対する試験化合物の調節効果をインビトロにおいて決定するための方法を開示する。上皮バリアは、固定された静的な構造ではない。それらは、様々な異なる刺激に応答してより漏出するようになったり又はあまり漏出しなくなったりし得る。疾患プロセス及び薬剤は、バリア壁をより漏出性とする場合がり、そしてこのような漏出部位は例えば密着結合部であることが多い（Mullin et al. (2005) Drug Discov. Today, 10:395-408）。
【００２５】
透過性は、ある刺激に対しては増加し及び／又は別の刺激に対しては減少するという動的な現象であるので、あらゆる所与の上皮組織における上皮バリアの基礎状態は一般的に、より密着性となるように調節されている場合もあり、又はより漏出性となるように調節されている場合もある。
【００２６】
一般的に、漏出の増加は有害であるが、漏出の減少は生理学的に又は免疫学的にのいずれかで生物の利点となるように作用する。
【００２７】
本発明の方法により今回、上皮バリア機能に対する、化合物の負の効果又は正の効果を決定、測定、分析、予測、又は確立することが可能となる。いくつかの実施態様では、該方法により、上皮バリア機能に対する化合物の調節効果に関する詳細な洞察を得ることが可能となる。該方法により、上皮バリア機能に対するその効果に対する様々な化合物、化合物の濃度、又は様々な条件を比較することが可能となる。特に該方法により、時間の関数として上皮バリア機能に対する化合物の調節効果を研究又は確立することが可能となる。本発明の方法により、細胞層（又は単層）で起こっている様々な漏出現象、例えば密着結合の破壊、細胞層／細胞膜におけるピンホールの出現、不完全な単層の付着に起因する側面からの漏出を識別することが可能となり；これらは全て、当技術分野における方法、例えばトランスウェルシステムを用いては不可能である。重要なことには、本発明の方法は、上皮バリア機能に対する調節効果をリアルタイムでモニタリングすることを可能とし；リアルタイムモニタリングは、漏出するまでの時間の決定を可能とし；これは、細胞層の上皮バリア機能に対して化合物が及ぼす効果について、蛍光強度よりもはるかに良好な数値である。なぜなら、後者は、液体レベルに起因して加えられた圧力などの態様も含むからである。
【００２８】
本発明の方法は、実験をリアルタイム画像撮影によって追跡することができるので使用がより簡単であり、一方、トランスウェルシステムを用いると、アリコートを経時的にウェルから採取して、トランスウェルシステムから離れて測定しなければならない。さらに、本発明の方法は、マイクロ流体チャネルにおいて小容量を扱うので、蛍光の非常に僅かな変化でさえ観察することができ；これは、大量の流体中では少量の蛍光が消失するトランスウェルシステムとは対照的である。
【００２９】
いくつかの実施態様では、本発明の方法を用いて得られた結果は、化合物の毒性作用の指標となる。いくつかの実施態様では、本発明の方法を用いて得られた結果は、一過性に上皮バリアを開く（すなわち一過性にバリア機能を減少させる）際の試験化合物の有用性の指標となる。いくつかの実施態様では、本発明の方法を用いて得られた結果は、化合物がその毒性作用を発揮する可能性のある機序（どのように及びどれだけ迅速に）の指標となる。いくつかの実施態様では、本発明の方法を用いて得られた結果は、試験化合物の効果を改善するバリア機能の指標となる。
【００３０】
前記方法は、信頼性があり、簡単で、かつ非常に再現性が高く、その方法は特にスクリーニング目的に適したものとなる。さらに、本発明の方法は、得られた結果がバリア機能に対する化合物の効果を示すかどうか、又は結果が、実験の不備な点に因り偽であるとして拒絶されるべきであるかどうかを迅速に同定することを可能とする。本発明の方法は、リアルタイムな測定を可能とする。
【００３１】
前記方法は、マイクロ流体システム内で培養された細胞の上皮層の片側（頂端側又は基底外側）から上皮層の他方の側へのプローブ（又は、プローブが本明細書に記載のようなセンサー及びさらなる分子若しくは組成物を含む場合には、さらなる分子又は組成物の移動）の移動（受動的又は能動的；例えば実際に、超過圧力を加えることにより、上皮バリアを通した他方の側への化合物の流入を増加させ得る；ゲルはゲルを通した間質流を可能とする）の測定に依拠する。測定は経時的に、及び試験化合物の非存在下又は存在下において実施される。輸送率、又は経時的な輸送量、又は特に一定レベルの輸送（比較的又は絶対的な）が達成されている期間は、該方法に使用される上皮細胞に対する試験化合物の効果への新たな洞察を提供する。
【００３２】
上皮バリア機能に対する試験化合物の調節効果をインビトロにおいて決定するための方法が記載され、該方法は、以下の段階又は工程を含む：
ａ）複数の中空マイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体システムを準備する工程（ここで、該チャネルは少なくとも部分的にゲルで充填されている）；
ｂ）上皮細胞をマイクロ流体チャネルに導入し、そして上皮細胞がゲルと接触することを可能とする工程；
ｃ）マイクロ流体チャネルに導入された上皮細胞を培養し、これによりマイクロ流体チャネル内で細胞がゲル上で頂端側及び基底外側を有する細胞層を形成することを可能とし、好ましくはこれにより細胞が頂端側及び基底外側を有する細管構造を形成することを可能とする工程；
ｄ）マイクロ流体チャネル内の上皮細胞に、プローブ及び試験化合物を与える工程（ここで、該プローブ及び該試験化合物は、独立して、頂端側、基底外側、又は頂端側と基底外側の両方に与えられる）；
ｅ）様々な時点において、マイクロ流体チャネル内若しくはゲル内のプローブ、又はマイクロ流体チャネル内とゲル内の両方のプローブによって与えられるか又は作られるシグナルを決定する工程。
【００３３】
特に様々な時点にわたる、工程ｅ）において決定されたシグナルの絶対値、数値の変化、又は数値の比は、上皮細胞のバリア機能に対する該化合物の効果についての非常に再現性の高い指標であることが驚くべきことに判明した。数値は、例えば、上皮細胞又は上皮バリアに対する該化合物の毒性作用を表現するために使用され得る。
【００３４】
第一の工程において、複数の中空マイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体システムを準備する。明らかに、マイクロ流体システムは、上皮細胞の培養にとって適している必要がある。さらに、マイクロ流体システムは頂端側又は基底外側のいずれか、しかし好ましい実施態様では、一旦マイクロ流体システム中で培養されたら上皮細胞の頂端側及び基底外側の両方へのアクセスを提供しなければならない。
【００３５】
細胞培養に適したマイクロ流体システムは当業者に公知であり、ピコリットル未満からミリリットル未満、又はミリリットルの範囲などの少容量の液体を含有、流動、処理、又は別様に操作するように設計されたデバイス、又はデバイスの流体成分を指す。
【００３６】
本発明の方法に使用されるマイクロ流体システムは、インビトロにおける細胞培養の支持体に適し、そして例えば受動的水平化のような受動的手段によって又はシリンジポンプのような能動的ポンプを使用することによって流動を与える、マイクロ流体チャネルのシステムによって、生細胞へ有効な支持体を提供し得る。流動は生細胞のための支持体システムに関し、この生細胞に流体が送達されるか、又はこの生細胞において流体が例えば圧力ポンプ、圧力タンク、真空ポンプなどの外部陽圧源又は陰圧源の使用によっていくつか又は全てのチャネルから抽出される。有効な支持体は、生細胞のための支持体システムに関し、ここでいくつか又は全てのチャネルが能動的なマイクロ流体の流動を受ける。能動的なマイクロ流体システムは、流体の循環が、重力、毛細管現象、表面張力などの天然に起こる機序によって駆り立てられて流動を駆動する受動的なマイクロ流体の流動を使用したシステムと対比をなし得る。本発明の方法におけるマイクロ流体システムは、流動を提供し得るか、又は流動がなくても作動し得る。
【００３７】
使用されるマイクロ流体システムは、マイクロ流体チャネル内で培養された細胞に流動を与え得、該細胞はマイクロ流体チャネルのシステム全体に存在し、これにより適切な流体環境が細胞に提供される。
【００３８】
マイクロ流体システムは、実質的に均一な内径のチャネルを含んでいても、又は、流体の流動の動態によって要求されるような、収縮及び拡大を含む、様々な内径を有するチャネルを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の方法に使用されるマイクロ流体システムは、いずれかの特定のマイクロ流体システムに特に限定されない。例示的なマイクロ流体デバイスは、S.J. Trietsch, G.D. Israels, J. Joore, T. Hankemeier, P. Vulto, Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture, Lab Chip 2013, vol. 13, no. 18, pp. 3548-3554, Edinson Lucumi Moreno, Siham Hachi, Kathrin Hemmer, Sebastiaan J. Trietsch, Aidos S. Baumuratov, Thomas Hankemeier, Paul Vulto, Jens C. Schwamborn and Ronan M. T. Fleming, Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture, Lab Chip, Vol. 15, No. 11, pp. 2419-2428、国際公開公報第２０１２１２０１０２、国際公開公報第２０１４０３８９４３号、Mu et al, Lab on a Chip, 2013, 13, 1612-1618、又はJang et al, integr biol, 2013, 5, 1119に記載されている。しかしながら、後者の２つは、ハイスループットスクリーニングを可能とせず、そしてあまり好ましくない。
【００４０】
例えば国際公開公報第２０１２１２０１０２号に記載のデバイスは、（ａ）容積内に形成された少なくとも２つのフェーズガイドによって少なくとも第一、第二、及び第三の副容積へと内部で分割され、そして（ｂ）容積内のメニスカス又はバルク液体の移動を参考に判断した場合に、比較的上流及び比較的下流である部分を含む、中空容積を含む。少なくとも第一、第二、及び第三の流体管を含むデバイスは、容積の上流外部とそれぞれの該副容積との間の流体連通を許容するように接続され；そして少なくとも１つのさらなる管は、容積の下流外部と該副容積との間の流体連通を許容するように接続されている。第一の該副容積は、ゲル又はゲル様物質内の細胞又はそれによって支持された細胞を含有し得；そして第二の副容積は、第一と第二の副容積との間で物質の輸送を許容するように第一の副容積と連通し、そして少なくとも１つのゲル又はゲル様物質を含んでいる。そこに記載されたいくつかの実施態様では、第三の副容積は、第一と第三の副容積との間で物質の輸送を許容するように少なくとも第一の副容積と連通し、第三の副容積は灌流液を含有している。
【００４１】
好ましいマイクロ流体プレート又はシステムは、複数のマイクロ流体ネットワーク及びマイクロ流体ネットワークへとアクセスできる入口を含む。各マイクロ流体ネットワークは、毛管圧バリアを含む。各々の入口は、底面を有する入口チャンバーによって形成される。
【００４２】
実際に、流体を分配するための末端を有する分配部分を有する流体ディスペンサーが、液体及び／又はゲル及び／又はゲル前駆体をマイクロ流体ネットワークに挿入するために使用され、これにより毛管圧バリアを用いて液体／ゲル／ゲル前駆体の少なくとも１つを停止又はパターニングする。マイクロ流体プレートは、流体若しくはそれらの内容物を研究するために、又は流体若しくはそれらの内容物との間の相互作用を評価するために使用され得る。
【００４３】
毛管圧バリアは、例えば、マイクロ流体ネットワークのマイクロ流体チャンバーを第一チャンバー部及び第二チャンバー部へと分離することができる。細胞などの生命に基づいた粒子を有する液体、ゲル、又はゲル前駆体は、流体ディスペンサーの分配部によって入口に放出され得る。該液体又はゲル（前駆体）は入口からマイクロ流体チャンバーの第一チャンバー部へと流動し、そして毛管圧バリアの存在に因り、停止するか、その前進が制御されるか、又はパターニングされる。液体又はゲル（前駆体）は、毛管力によって、重力又は他の作動力によって、マイクロ流体ネットワークを通って輸送され得る。
【００４４】
このような毛管圧バリアの使用例は、マイクロ流体ネットワークを、例えばゲルなどの第一の流体で選択的に充填することである。マイクロ流体ネットワークが前記の第一の流体で充填される程度は、ネットワーク中の流体の前進を停止する毛管圧バリアによって決定される。ゲル化時にマイクロ流体ネットワークの残りは第二の流体で充填され得、これにより、２つの流体間の交換が起こるか又は流体又はそれらの成分間の反応が起こる。その例は、培地の灌流にフランキングする細胞外マトリックスゲル内の３次元細胞培養液に示される。これは、S.J. Trietsch, G.D. Israels, J. Joore, T. Hankemeier, P. Vulto, Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture, Lab Chip 2013, vol. 13, no. 18, pp. 3548-3554に十分に記載されている。
【００４５】
毛管圧バリアの他の使用例は、C. Phurimsak, E. Yildirim, M.D. Tarn, S.J. Trietsch, T. Hankemeier, N. Pamme, P. Vulto,  Phaseguide assisted liquid lamination for magnetic particle-based assays, Lab Chip, 2014, vol. 14, no. 13, pp. 2334-2343, P. Vulto, G. Dame, U. Maier, S. Makohliso, S. Podszun, P. Zahn, G.A. Urban, A microfluidic approach for high efficiency extraction of low molecular weight RNA, Lab Chip, 2010, vol. 10, no. 5, pp. 610-6, Edinson Lucumi Moreno, Siham Hachi, Kathrin Hemmer, Sebastiaan J. Trietsch, Aidos S. Baumuratov, Thomas Hankemeier, Paul Vulto, Jens C. Schwamborn and Ronan M. T. Fleming, Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture, Lab Chip, Vol. 15, No. 11, pp. 2419-2428、米国特許第０２００７０２８０８５６Ａ１号、米国特許第０２００４０２４１０５１Ａ１号、米国特許第０００００４７６１３８１Ａ号、米国特許第０００００６２７１０４０Ｂ１号、国際公開公報第２００６０７４６６５号、米国特許第６６０１６１３Ｂ２号、米国特許第６６３７４６３Ｂ１号に示されている。毛管圧バリアは、疎水性パッチ又はストライプ、向こう側のネットワーク材料に対してより親水性の低いパッチ又はストライプ、チャネル幅の拡大、チャネル又はチャンバーに裏打ちされた１つ以上のピラー又は柱、チャネル又はチャンバー基材内の溝、チャンバー容積中への材料の突出などのいずれか１つであり得る。
【００４６】
特に好ましいのはミメタス社のオルガノプレート（http://mimetas.com/products.php）である。
【００４７】
これらは、多種多様な生理学的に妥当な臓器及び組織モデルの培養及びスクリーニングを可能とする、マイクロ流体に基づいた培養プレートである。
【００４８】
このようなマイクロ流体システムのマイクロ流体ネットワークは一般的に、チャネル、チャンバー、複数のチャネル又はチャンバー又はその組合せを含み、少なくとも１つのチャネル又はチャンバーの少なくとも１つの寸法はしばしば、及び好ましくは１mm未満である。
【００４９】
マイクロ流体ネットワークは典型的には、底面の基材、マイクロ流体ネットワークを含む層、及び上面の基材を含む、水平に重層された装置として構築される。マイクロ流体層はまた、上面及び底面の基材の一方又は両方の中又は上にパターニングされ得る。マイクロ流体ネットワークは、ポリマー又はガラスの上面及び底面の基材を含む。マイクロ流体ネットワークは、ネットワークをいずれかの基材にエッチングすることによって、又はいずれかの基材の上面にあるポリマー層においてパターニングすることによって構築され得る。特定の実施態様では、上面又は底面の基材の少なくとも１つは、ガラス又は親水性ポリマーから構築されているので、流体の輸送は毛管圧のみによって達成され得る。マイクロ流体プレート（システム）は、フォトリソグラフィ技術、熱エンボス技術、ソフトエンボス技術、エッチング技術、複製成形技術、又は射出成型技術を使用して構築され得る。
【００５０】
チャネルの壁は、ガラス、ポリマー、例えばポリスチレン、ＰＭＭＡ、ＣＯＣ、エラストマー、例えばシリコンゴム、ポリジメチルシロキサン、セラミック、金属を含むがこれらに限定されないあらゆる種類の材料であり得る。
【００５１】
チャネルは、少なくとも部分的には、ゲル、好ましくはヒドロゲルによって充填される。当業者は、ゲルが本発明の脈絡において上皮細胞の培養を可能とする限りにおいて、細胞培養技術に日常的に使用されるゲルをはじめとする、様々な種類のゲルが適し、そして本発明の脈絡において使用され得ることを理解する。実際に、実験は、本明細書において具体的に記載されたゲルなどの様々なゲルが使用され得ることを示す。実際に、当業者は、適切なゲルを選択するのに困難を全く有さないであろう。ゲルは、上記のようなチャネルに与えられ得る。ゲルが与えられた後、さらなる流体の導入前に、ゲル化が引き起こされる。この流体は典型的には、栄養分及び酸素を提供する増殖培地である。この流体を介して、細胞を導入することができ、これによりそれらの細胞をゲルに対して沈着させ、そして細胞が細胞層を形成することを可能とする。これらの細胞を培養すると、それらは典型的には細管を形成し、これを、細管の管腔を通る流動を用いて灌流することができる。したがって、ゲルがチャネルに与えられるので、よってゲル化後、上皮細胞が、培地、例えば培養培地を用いてチャネル内に導入され得、これにより細胞は細胞と接触し、そしてゲル上で細胞層（例えば細管／管）を形成することが可能となり、これにより頂端側及び基底外側が作られる。
【００５２】
例えば、ゲル前駆体（典型的には細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲル、例えばコラーゲン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、基底膜抽出物、例えばマトリゲル又は合成ゲルに由来）を、エッペンドルフコンビチップアドバンス（登録商標）（エッペンドルフＡＧ、ドイツ、カタログ番号００３０ ０８９．４０５）と組み合わせたピペット（典型的にはリピートピペット、例えばエッペンドルフマルチピペット（登録商標）Ｍ４（エッペンドルフＡＧ、ドイツ、カタログ番号４９８２ ０００．０１２）を用いてマイクロ流体プレートの入口に導入し得る。ゲル前駆体はさらに、細胞懸濁液を生じる細胞を含有していてもよいが、細胞は後で与えられてもよい。ゲル前駆体は、マイクロ流体プレートの入口に放出される。ゲル前駆体は、重量によって潜在的に支えられている毛管力によってマイクロ流体ネットワークに輸送される。ゲルは続いてフェーズガイドによって停止し、これは本質的にマイクロ流体チャンバーの全幅にわたる毛管圧バリアである。第二の流体の導入前に、ゲル前駆体のゲル化を引き起こす。この第二の流体は典型的には、栄養分及び酸素を提供する増殖培地である。流動の場合、増殖培地はまた、細胞によって産生されるような老廃代謝物を除去又は希釈し得る。
【００５３】
上記の例と同じような方法で、細胞を第二の流体に導入することができ、これによりゲルに対してそれらを沈着させることができる。これらの細胞を培養すると、それらは典型的には細管を形成し、これは、細管の管腔を通る流動を用いて灌流され得る。
【００５４】
さらに別の例では、複数のゲルは互いに隣接してパターニングされ得る。ゲル前駆体を注入し、毛管圧バリアによって前駆体の前進を停止させ、そして様々なネットワーク部において該前駆体のゲル化を順次引き起こすことによって、複数のゲルがパターニングされ得る。第一のゲル前駆体への第一の細胞型の懸濁、続いて、第二のゲル前駆体への第二の細胞型の懸濁により、いわゆる重層した共培養液が得られ、ここでは細胞型は互いに隣接して培養される。
【００５５】
ゲルは好ましくはチャネル壁と接触している／チャネル壁に対して沈着している。
【００５６】
ゲルは、定常状態の場合には全く流動を示さない、実質的に希薄で架橋されたシステムであると定義されている。ゲルはしばしば、流体によってその全容積のすみずみまで膨張する非流体のコロイド状ネットワーク又はポリマーネットワークである。ヒドロゲル又はアクアゲルは、膨潤剤が水であるゲルである。本発明の方法の脈絡において、ゲル材料は、好ましくは水に不溶性であるが２次元又は３次元の支持体構造を有するために水を含んでいる水分含有ゲルであり得る。本発明において、使用されるゲルは、該ゲル内及びゲル上における、物質、特にプローブ（又は本明細書に定義されているようなさらなる化合物）及び／又は試験化合物（以下参照）の拡散を可能とする。例としては、マトリゲル及びコラーゲンを基剤としたゲルが挙げられる。
【００５７】
本発明において使用されるゲルは、層が上記の特性を有しかつゲル上での上皮細胞層の形成（以下に詳述）が可能である限り、特に限定されない。一般的に使用されるゲルとしては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、マトリゲル及び／又はアガロースを含む生物起源のゲル、並びにいくつかの足場、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ペプチド、ＰＬＬＡ（ポリ−Ｌ−乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸・グリコール酸共重合体）に基づいた合成ゲルが挙げられる。
【００５８】
光硬化性ゲルのリソグラフィーパターニング、例えばピラー、疎水性パッチ又はフェーズガイドを使用した毛管力に基づいたパターニング、及び選択的沈着を含むがこれらに限定されない、いくつかの技術を使用して、ゲルをパターニング、すなわち、ゲルを用いてマイクロ流体チャネルの一部を充填することができる。
【００５９】
中空マイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体システムに（このようなチャネルは少なくとも一部がゲルで充填されている）、上皮細胞を与える。細胞がマイクロ流体チャネル内のゲルと接触することができる限り、任意の適切な手段によってチャネル内に細胞を導入してもよい。
【００６０】
本発明の脈絡において、上皮細胞という用語はまた、上皮細胞、内皮細胞、又は中皮細胞も指し、後者の２つは特殊な形状の上皮細胞である。チャネル内に導入された細胞の数は、適切な培地中での培養後にゲル上に細胞が細胞層を形成することを可能とするべきであり、そして使用される細胞の種類、使用されるゲルの種類、及び使用される培地の種類に依存する。当業者は、これらの必要条件を満たすためにどのような条件が必要とされるか又はどのようにこれらを確立するかを熟知している。
【００６１】
一旦細胞がマイクロ流体チャネルに導入されると、細胞は成長、増殖、又は分裂することが可能となり、これにより細胞がゲル上で頂端側及び基底外側を有する細胞層を形成することが可能となる。本発明の脈絡において、細胞の頂端側は、マイクロ流体チャネルの内部に面した側であり、一方、基底外側は、ゲルと面している（又はゲルと接触している）細胞の側である。本発明の脈絡において、細胞の基底外側に面している側はまた、基底外側として示され、一方、細胞の頂端側に面している側は頂端として示される。
【００６２】
好ましい実施態様では、マイクロ流体チャネル内において本明細書に定義されているような頂端側及び基底外側が明確な細管構造を細胞が形成するのに十分な時間をかけて細胞を培養する。
【００６３】
細胞を、選択された具体的な細胞に適した培地及び条件下で、並びに当業者には周知である方法を使用して培養する。
【００６４】
頂端側及び基底外側を有する細胞層の形成に関して、好ましい実施態様では、該層はコンフルエントである。本発明の脈絡において、コンフルエンスは、マイクロ流体チャネル内のゲル材料の表面に関して表現される。コンフルエンスは、マイクロ流体デバイス内に接着している細胞の数の推定値として一般的に使用される用語であり、細胞によって覆われた表面の比率を指す。例えば、５０％コンフルエンスとは、ゲル表面のほぼ半分が覆われていることを意味する。層がコンフルエントであると言われる場合、ゲル表面の約１００％が細胞によって覆われ、そして細胞が単層として増殖する余地がこれ以上全く残されていない。
【００６５】
細胞層、例えば単層が、ゲルと接触している部分に関してコンフルエントである場合、単層は漏れ密性であることが判明した。実際に、上皮バリア機能は、本明細書に開示された方法の脈絡において、プローブ（又はプローブシステムの一部）が上皮細胞層の一方の側（頂端側又は基底外側）から上皮細胞層の他方の側（それぞれ基底外側、頂端側）へと拡散又はドリフトする割合に基づいて定義され得る。完全に機能する上皮バリア機能を有している場合、この割合は０に近づき、一方、上皮バリア機能が全く存在しなければ、割合は細胞が全く存在しない所与のシステムの割合に近づくか又はその割合になるであろう。当業者は、所与の環境下においては頂端側と基底側の圧力の差に因る間質流が輸送に影響を及ぼし、したがって実験を実施する場合には考慮され得ることを知っている。これらの極限値の間のあらゆる数値が、様々なレベルの上皮バリア機能の指標となり、数値が０に近づくことはより機能的な上皮バリア機能の指標となる。
【００６６】
換言すれば、これらの条件下においてプローブ（又はプローブシステムの一部）は、例えば頂端側に添加された場合、細胞の頂端側から基底外側へと移動若しくは拡散若しくはドリフトしないか又はほんの非常に僅かにしか移動若しくは拡散若しくはドリフトせず、このことは完全に機能的な上皮バリアの指標となる。プローブは、頂端側に与えられた場合、ゲル内に蓄積しないだろう。
【００６７】
本発明の脈絡において、上皮細胞層は、プローブ（又は、本明細書に定義されているように、センサーの使用の場合にはさらなる化合物）が与えられた側（この例では、基底外側）とは反対側（例えば頂端側）に約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約１％未満のシグナルが、添加から５、１０、２０、又は３０分後に出現する場合に漏れ密性であると判断され得る。好ましい実施態様では、１％未満のシグナルが５分間の期間に出現する場合、上皮層は漏れ密性であると判断される。この数字は、一部には、使用されるプローブ並びに使用される細胞の種類に依存するだろう。
【００６８】
しかしながら、本発明の方法では、層は、少なくともゲルと接触している部分については、プローブに対して殆ど漏れ密性である必要があることは要求されないことが驚くべきことに判明した。実際に、一定レベルの漏出は、実験開始時から許容され得る。換言すれば、本発明の方法では、実験開始時に、プローブが、試験化合物の非存在下において、ある程度まで、漏れ密性ではない上皮層の結果として、例えばゲルに対する層内の細胞の低下したコンフルエンス度の結果として、片方の側から他方の側へと移動することは許容可能である。
【００６９】
事実、いくつかの実施態様では、このような漏れ密性ではない上皮細胞が好ましい。なぜなら、これにより、例えば片方の側から他方の側へのプローブの拡散／移動割合の減少を経時的に測定することによって、それらの上皮バリア増強特性に関して化合物を研究又はスクリーニングすることが可能となるからである。
【００７０】
上皮バリア機能が実験開始時にこのように破壊されていてもよい程度は主に、実験の目標に依存する。明らかに、片方の側から他方の側へのプローブの拡散（本明細書に定義されているように、本発明の脈絡において、及び本明細書のあらゆる実施態様において、センサーシステムがプローブとして使用される場合、さらなる分子又は組成物の移動も含む）は、所与のシステムにおいて細胞が全く存在しない下での割合と等しくあるべきではない。いくつかの実施態様では、好ましくは実験開始時及びあらゆる試験化合物が細胞に与えられる前の移動又は拡散は、全く細胞が存在しない下での同システムにおいて観察された移動／拡散の割合の最大５０％、４０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、又はそれ以下である。
【００７１】
いくつかの実施態様において得ることのできる細管構造に関して、好ましくは細管構造は、ゲルに対して限局している又はゲルと接触している細管構造の少なくとも一部についてコンフルエントである。
【００７２】
本明細書の開示に基づいて、当業者は、ゲル上に形成された細胞層の漏れ密性ではないことに関して何が依然として受け入れられるかを理解しているだろう。同時に、該方法により、したがって、細胞層が、低下した若しくはさらには存在しない上皮バリア機能のために、適切に使用され得るかどうか、又は拒絶されるべきかどうかを迅速に決定又は確立することが可能となる。
【００７３】
細胞が、細胞層及びそれと共に頂端側及び基底外側を形成することを可能とさせた後、マイクロ流体チャネル内の細胞にプローブを与える。プローブは、頂端培地又は基底外側培地のいずれかに、頂端培地と基底外側培地の両方に与えられ得る。後者は例えば、２つの異なるかつ識別可能なプローブの添加を含み得る。好ましくはプローブは光学プローブであり、すなわち、光学的手段を用いてモニタリングされ得る。好ましくは光学プローブは、発光プローブである。本明細書に記載のように、発光プローブは、それ自体が発光するか、又は発光プローブの関与する化学反応若しくは酵素反応の結果として光を放出若しくは発生するか、又は励起時に発光（蛍光）する、任意のプローブを含む。例えば発光プローブが発光するために補因子又は基質を必要とする場合、このような補因子又は基質が、頂端側、基底外側のいずれか又は両方の培地に添加され得る。補因子又は基質を使用する場合には、プローブは実際にそれ自体が発光する必要はないが、発光プロセスの重要な部分であるべきであり、例えば補因子の蛍光部分は、発光プローブの存在下において消光され得ないことを留意すべきである。
【００７４】
補因子又は基質が、プローブとは反対側の細胞層に選択的に与えられる場合、拡散又はドリフトしたプローブの測定値は、頂端側の光と基底側の光との間の比とは対照的に、発生した光の絶対量であろう。なぜなら、補因子又は基質の存在しない側では光は全く発生しないであろうからである。
【００７５】
細胞に、試験しようとする化合物も与える。化合物は、プローブとは独立的に、細胞の頂端側、基底外側、又は頂端側と基底外側の両方に与えられる。化合物（試験物質）はプローブと同時に、又はプローブが細胞に与えられる前若しくは後に加えられ得る。該化合物は、上皮バリア機能の調節能について試験しようとする物質であり得る。上皮バリア機能の調節は、上皮バリア機能の向上、バリア機能の低下、又は上皮バリア機能の補充（該化合物は上皮バリア機能それ自体を向上させないが、例えば上皮細胞層のコーティング剤として作用し、これによりこのような上皮バリア機能を補充する）を含み得る。上皮バリア機能に関する化合物の活性は、すでに公知であっても、未知であってもよい。試験しようとする化合物は、抗体、低分子阻害剤、薬物、天然若しくは合成粘膜保護剤、サイトカイン、増殖因子、抗酸化剤、抗プロテアーゼ、天然若しくは合成の上皮分泌物、界面活性剤の模倣物、又は任意の他の介入を含み得るがこれらに限定されない。
【００７６】
上記に示されているように、特に関心が高いのは、上皮バリア機能を向上、補充、又は低下させるであろう又はそうすることが疑われる化合物である。
【００７７】
本発明の方法の次の段階の間に、プローブ又はプローブシステムによって作られた又は与えられたシグナルが、様々な時点において決定される。シグナルは、頂端側、基底外側、又は頂端側と基底外側の両方において決定され得る。例えば、プローブが基底外側に与えられる場合、頂端側へのプローブの移動は、頂端側におけるシグナルを測定することによって測定され得、シグナルの増加は、頂端側への拡散を示す。しかしながら、この例において、頂端側への拡散又はドリフトは、いくつかの実施態様では、基底外側におけるシグナルを測定することによっても決定され得、シグナルの減少は、頂端側への拡散を示す。シグナルはまた、両方の区画において、すなわち、頂端側又は基底外側の培地又はゲルの両方において測定されてもよい。以下に詳細に説明されるであろうように、基底外側におけるシグナルの測定は、ゲル内のシグナルの測定を含み得るが、基底外側のゲルにアクセスする培地中のシグナルの測定も含み得、プローブはゲルから蓄積され得る。本発明の脈絡において、ゲル内の基底外側シグナルの測定はこのように、ゲル内、又は該培地内、又はその両方の両測定を含む。
【００７８】
シグナルを測定するのに使用された方法は、本発明の方法において使用された具体的なプローブに依存する。使用されたプローブに依存して、当業者は、どのような方法を使用すべきかを知っている。例えば、蛍光プローブの場合、プローブの蛍光は、任意の適切な手段を使用して決定される。
【００７９】
好ましくは、プローブは光学プローブであり、好ましくは発光プローブであり、好ましくは蛍光プローブである。プローブ、光学プローブ、発光プローブ、蛍光プローブは、さらなる分子又は組成物と一旦接触するとシグナルを与えるセンサー分子又は組成物も含み得ることを留意する。片方の側にセンサーを、他方の側にさらなる分子又は組成物を与えることによって、さらなる分子又は組成物と接触した時に、センサーによって作られる／与えられるシグナルを測定することによって漏出を検出することができる。
【００８０】
シグナルは好ましくは、２つ以上の時点において決定される。実際には、第一の時点において、試験化合物の非存在下におけるシグナルを決定し、これにより、第一の対照値を得ることができる。本発明の実施において、そして１つ以上のチャネル上の上皮バリア機能に対する試験化合物の効果の試験と同時に、細胞層を含む１つ以上のチャネルを対照として使用し、すなわち、プローブによって与えられたシグナルが経時的にそして同じ条件下であるが試験化合物の非存在下において決定又は測定されるだろう。実際に、本発明の全ての実施態様に適用可能であることには、培地は、物質への培養液の曝露時間を改変するために処理後に交換することができる。さらに、通常であって必ずしもではないが、インキュベーション条件に問題があるかどうかを決定するために試験培養液と一緒に対照又は標準物質を流す。対照は、破壊されておらず試験しようとする物質を用いて処理されていないという以外は試験に使用したのと同一の細胞培養液である。
【００８１】
得られる結果は様々な方法で使用され得る。例えば、上皮バリア機能に対する化合物の調節効果は、頂端側、基底外側、又はその両方におけるシグナルの経時的な絶対的又は相対的な変化として表現され得る。あるいは、結果は、同じ条件下で実施されたが試験化合物の非存在下において実施された対照実験と比較され得る。また、様々な濃度の試験化合物を比較し得る（例えば、１、２、３、４、５、、、１０個の異なる濃度）。また、基底外側のシグナルと比較して頂端側のシグナル及びその逆でのシグナル（しかし、相対的な変化だけでなく絶対的な数値も）を表現することも可能である。データはまた、時間単位のシグナルの（絶対的、相対的な）変化として表現されてもよい。
【００８２】
プローブが上皮細胞層を横断して拡散又はドリフトする割合をさらに分析して、特定のプローブについての細胞層の見かけの透過性（Ｐapp）を算出することができる。この数値は、上皮層のバリア機能の一般的に認められている記述語である。この数値を計算するために、例えば、支持ゲルに対する細胞層を通るプローブの拡散又はドリフトをモニタリングし、そして細胞を含まないゲルを有する対照デバイスにおいて観察された拡散又はドリフトに対してそれを修正することができる。このような計算のために使用することのできる式は、
【数１】
2018522586.tif 000002
であり、ここで、ｔは時間であり、Ａは、プローブが横断することのできる細胞層の面積であり、Ｖｒｅｃｅｉｖｅｒはプローブが向かって拡散又はドリフトするデバイスの部分の容積であり、Ｃｒｅｃｅｉｖｅｒは、プローブが向かって拡散又はドリフトするデバイスの部分におけるプローブ濃度であり、及びＣｄｏｎｏｒ,ｉｎｉｔｉａｌは、区画（これからプローブが拡散して出て行く）内のプローブの初期濃度である。
【００８３】
細胞層の透過性とゲルの透過性を分離するために、式：
【数２】
2018522586.tif 000003
を使用することができる。
【００８４】
ここで、Ｐａｐｐ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄは、ゲルの上面における細胞のＰａｐｐであり、Ｐｍｏｎｏｌａｙｅｒは細胞層のＰａｐｐであり、そしてＰcell freeは、細胞を含まないゲルを有する対照デバイスのＰａｐｐである。この式は
【数３】
2018522586.tif 000004
へと再編成することができる。
【００８５】
この方法を使用するために、プローブのドリフト又は拡散を、シグナルの増加が依然としてほぼ線形である期間にモニタリングすべきである。例えば、実験は、様々な化合物又は様々な濃度の化合物に対して様々な単層を様々な時間をかけて曝露することを含み得る。この曝露後に、プローブを単層及び対照デバイスに加えることができ、そしてプローブのドリフトを５〜６０分間かけてモニタリングすることができる。次いで、上記の式の適用により、様々な処理後の細胞単層の見かけの透過性が算出されるだろう。
【００８６】
いくつかの実施態様では、様々な化合物を、同じチャネル内で順に試験する。このような実施態様では、特定のチャネル内の細胞をまず第一の化合物と接触させ、そしていくらか時間が経過した後、試験しようとする追加の化合物を加えるか、又は細胞をまず第一の化合物と接触させ、その後、第一の化合物を除去し、そして試験しようとする第二の化合物をチャネル内の同細胞に与える。
【００８７】
本発明の方法はまた、化合物の混合物を試験することを可能とする。このような実施態様では、化合物の混合物は、細胞を含むマイクロ流体チャネルに与えられる。
【００８８】
いくつかの実施態様では、連続流の培地が、細胞単層とは反対側のゲルに沿って及び単層に沿って与えられ得る。このような流動は、ゲルを完全に横断して拡散又はドリフトするあらゆるプローブを除去することができる。好ましい実施態様では、ゲルの背後の流動及び容積は、ゲルに溶解しているプローブの濃度が決して有意なレベルに達しないようなものであり、定常的なシンク状況を効果的に作り出す。さらなる実施態様では、連続流がまた、細胞層の反対側にももたらされる。好ましくは、プローブを含有している流体の流動及び容積は、プローブの濃度が、細胞層を横断する拡散又はドリフトに因り有意に決して減少しないものであり、定常的な発生源を効果的に作り出す。定常的な発生源及び定常的なシンクの両方が存在し、実はゲルを通る拡散又はドリフトが定常である場合、ゲル内のプローブの濃度に影響を及ぼす唯一の因子は、細胞層を横断する拡散又はドリフトである。これは、ゲル領域内のプローブの濃度を単に測定することによって、プローブの流動を、したがって、細胞層のバリア機能を直接推定することを可能とする。プローブ濃度の経時的な増加が測定されるいくつかの他の実施態様とは対照的に、定常流を使用して定常的な発生源及びシンクを達成するこの実施態様は、任意の時点におけるバリア機能の直接的かつ動的な測定を可能とする。
【００８９】
好ましい実施態様では、好ましくは異なる濃度の、様々な試験化合物又は試験化合物の混合物、例えば２、３、４、５、、、１０個の異なる試験化合物の混合物が比較され得る。特に、後者は、薬理学、栄養学、及び／又は美容学の分野における適用に重要であり得る。一例として、患者は今日、同時に又は同日中に様々な医薬品を服用することが多い。上皮バリア機能に対するこのような組合せの効果を理解することは重要であり得る。例えば、喘息では、一方では、肺の上皮バリア機能を向上又は補充するために医薬品が投与され得、他方で、このような患者は、このような改善を意図せず無効にするか又は中和する医薬を受けている場合がある。
【００９０】
一般的に、プローブが添加された側とは反対側において所与のプローブによってもたらされた又は作られたシグナルの増加は、完全に漏れ密性ではない上皮バリアの指標となる。増加が強くなればなるほど、上皮バリア機能は低くなる。
【００９１】
本発明の方法を用いて、上皮バリア機能に対する化合物の効果に関して、より詳細な情報を得ることが今回可能となった。１つの理由は、本発明の方法に使用される上皮細胞が、透過性の組織培養プレートインサート、例えばトランスウェル（登録商標）（コーニング社、ローウェル、マサチューセッツ州；このようなインサートは、組織培養プレートのウェルに挿入され得る人工的な透過性の増殖支持体を提供する）の使用に主に依拠する当技術分野の方法と比較して、インビボの状態をより代表するモデルを示すことである。第二の理由は、シグナルを１回の実験で細胞層についてリアルタイムで多くの時点においてモニタリングすることができるからである。第三の理由は、本発明の方法を用いて、化合物が上皮バリア機能を調節する機序の特徴を同定することが可能となったことである。例えば、本発明の方法により、試験化合物の効果が、細胞に化合物を与えた直後に観察可能であるかどうか、又は、化合物を加えた瞬間からバリア機能の調節が起こるまでの間に時間差があるかどうかを確立することが可能となる。さらに、本発明の方法を、生存／死滅効果よりも、細胞に対する化合物のより微妙な効果を確立するのに使用することができる。化合物の添加時における上皮バリア機能、すなわち境界の完全性の測定は、このような生存／死滅評価よりもはるかにより微妙である毒性の数値をもたらす。試験化合物は、例えば、細胞（しかし全ての細胞ではない）を死滅させるだけでなく、細胞層の密着結合を妨害する可能性があるか、又は細胞層若しくは細管構造の自己再生能を抑制若しくは低減する可能性がある。
【００９２】
本発明の方法を用いて解決される問題は、流動システム、すなわち本発明の方法に使用されるようなマイクロ流動システムを扱う場合に、生存／死滅分析では定量することが不可能ではなくても困難であるものである。流動の存在下では、死滅細胞は洗い流されると同時に、上皮バリアは、細胞の死滅を補う一定の再生能を有する。したがって、バリア完全性の測定は、機能消失、再生能、又は細胞死に関する明確な指標を与え、これは本発明の方法を使用すると測定が簡単である。
【００９３】
実際に、境界完全性に影響を及ぼす毒性作用は、即時的な事象ではなく、特定の時点で起こり得ることも判明した。また、境界の完全性が損なわれた時点は、添加された化合物の濃度に関連することも判明した。事実、化合物の濃度は、細胞死対再生能の比、又は時間の関数としての密着結合に影響を及ぼすと本発明者らによって信じられている。したがって、化合物の投与から、バリア完全性の消失の有害な作用を測定することのできる時点までの時間は、特定の濃度における化合物の毒性作用に対する重要な尺度である。本発明の方法の非常に好ましい実施態様では、それ故、該方法はさらに：
ｆ）工程ｅ）で得られたシグナルから、試験化合物及び／又はプローブを上皮細胞に与えた時点から、マイクロ流体チャネル内及び／又はゲル内の予め決定された蛍光の数値又は予め決定された蛍光の数値の変化が達成された時点までに、あるいはマイクロ流体チャネル（頂端側）及びゲル（基底外側）内の予め決定された蛍光の比率の数値又は予め決定された蛍光の比率の数値の変化が達成された時点までに経過した時間を決定する工程
を含む。
【００９４】
この好ましい実施態様では、試験化合物及び／又はプローブを上皮細胞に与えてから、特定の予め決定されたシグナルの数値又は数値の変化が、頂端側、基底外側のいずれか、又は頂端側と基底外側の両方において達成される瞬間までの時間を、試験された濃度の試験化合物について計算する。
【００９５】
このようにして得られた数値は「漏出までの時間」の尺度であり、そして、例えば、試験化合物及び／又はプローブの添加の時間を、様々な試験された濃度の試験化合物について予め決定された数値と比較することによって、様々な試験条件間で比較し得る。説明されているように、このようなデータは、特定の濃度の化合物の毒性作用に対する重要な尺度であり、そして本発明の方法を用いて初めて可能となった。予め決定された数値は、使用される細胞の種類に依存し、そして経験的に決定され得る。例えば、予め決定された数値は、基準化合物を用いて得られた結果に基づき得るか、又は対照を用いて得られた結果に基づき得る。例えば、基準化合物Ａについては、所与の濃度において頂端側のシグナルと基底外側のシグナルとの間に一定の比（例えば、チャネル内の培地中のシグナルとゲル内のシグナルの比）が例えば２０分後に達成されることが知られている場合、このような比を、他の化合物の調節効果を試験するための基準として使用し得る。さらに、様々な濃度の試験化合物についての漏出までの時間を本発明の方法を用いて比較することができる。
【００９６】
実際に、本発明の方法のいくつかの実施態様では、該方法は、１つを超える濃度の試験化合物に対して実施され、好ましくは工程ｆ）は、１つを超える濃度の試験化合物について決定される。これらの実施態様では、様々な濃度の試験化合物を比較し得る（例えば、１、２、３、４、５、、、１０個の異なる濃度）。さらに、及びいくつかの実施態様では、様々な試験化合物又は試験化合物の混合物、例えば２、３、４、５、、、１０個の異なる試験化合物の混合物を好ましくは様々な濃度で比較し得る。
【００９７】
また、上皮バリア機能に対する試験化合物の効果が、好ましくは同時に、すなわち同じ実験内で、培養上皮細胞を含む１つを超えるマイクロ流体チャネルにおいて決定され、好ましくは上皮バリア機能に対する１つを超える濃度の試験化合物の効果が同時に、すなわち、１回の同じ実験内で決定される、本発明の方法も提供される。実際に、様々なチャネルに与えられたシグナルは、このような実施態様において順次測定され、上皮バリア機能に対する試験化合物の効果は好ましくは同時に決定される。
【００９８】
本発明の方法を用いて、１回の同じ実験において経時的に様々な条件下で試験化合物の調節効果を決定することが可能となった。いくつかの実施態様では、それ故、試験化合物は、同じ実験の１つを超えるマイクロ流体チャネル（又はチャネルネットワーク）に与えられる。いくつかの実施態様では、異なるチャネルに与えられる試験化合物の濃度は同じであり、他の実施態様では、異なるチャネルに与えられる試験化合物の濃度はチャネルにより異なる。本発明の方法は、１回の実験において、したがって全てが同じ条件下で得られた上皮細胞層を使用して、細胞層を含む１つ以上のチャネルから得られた、経時的な上皮バリア機能に対する１つの濃度における化合物の効果、経時的な様々な濃度の化合物の効果の決定を可能とする。これは、良好な品質及び代表的なデータの提供を可能とする。
【００９９】
当業者は、ユーザーの要望に依存して、本発明の方法はまた、１回の同じ実験において（すなわち同時に）、経時的に１つ又は様々な濃度の様々な化合物を試験するために使用され得ることを理解するだろう。いくつかの実施態様では、それ故、独立して、上皮バリア機能に対する１つを超える試験化合物の効果が、同時に、すなわち、同じ実験において、培養上皮細胞を含む複数のマイクロ流体チャネル（又はチャネルネットワーク）の少なくとも一部において決定される、本発明の方法が提供される。
【０１００】
このような実施態様では、同一条件下であるが、好ましくは同じマイクロ流体システム内の異なるチャネル内で増殖させた細胞を、様々な試験化合物（すなわち、所与の場合においては、試験化合物の混合物、又は１つのチャネル内の細胞は様々な化合物に順次曝露される）を用いて処理し、そして効果を経時的に、好ましい実施態様では様々な濃度において決定する。
【０１０１】
本明細書に記載のように、好ましくはゲルと接触している細胞層は漏れ密性であり、すなわち、プローブは片方の側から他方の側へと（例えば頂端側から基底外側へ）拡散若しくは移動しないか又はほんの僅かしか拡散若しくは移動しないが、これは本発明の方法にとって必要ではない。事実、いくつかの実施態様では、一定（限定された）レベルの拡散が好ましい。なぜなら、化合物が上皮バリア機能を回復させることによって（プローブの拡散の減少によって測定される）上皮バリア機能を調節することができるかどうかを研究することが可能となるからである。あるいは、工程ｄ）の前に又は同時にバリア機能が破壊される本発明の方法も提供される。
【０１０２】
本発明によると、（好ましくは反復）破壊を、（好ましくはコンフルエントな）細胞層において起こし得る。破壊を形成するための１つの方法は、細胞層内の細胞の一部を凍結させることによるか、又は例えばレーザー光、特定の化合物、超音波若しくは音響シグナル、気泡若しくは破裂、研磨ビーズを使用したこのような部分の別様な破壊によるか、又は本発明者ら自身の実験に基づくか若しくは文献に基づいて、細胞層を再現性よく破壊することが示された化合物を添加することによる。
【０１０３】
次に、試験化合物を加えて試験を開始する。通常、処理は、培養液の破壊直後であるが、時には培養液を、破壊前に、試験しようとする物質を用いて処理して、特定の種類の効果を決定する。この手順の目的のために、処理は、試験する化合物に培養液を曝露する任意の手段であり得る。具体的な処理法は、物質の特性に依存して変更される。
【０１０４】
物質が破壊の閉鎖を抑制、刺激、又は別様に奏功するレベルの決定は、本明細書に記載のような、例えば連続希釈液を使用して、様々な量の物質の効果を比較することによって達成される。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、プローブが細胞層に与えられる前に、試験化合物が細胞に与えられる。いくつかの実施態様では、プローブが細胞層に与えられた後に、試験化合物が細胞に与えられる。いくつかの実施態様では、プローブが細胞層に与えられるのと同時に試験化合物が与えられる。以前に示されているように、好ましくは細胞は細管又は管の形状である。このような細管又は管は、血管若しくはリンパ管又は近位尿細管のよう細管を扱う場合にはより生理学的に妥当な状態を表現する。理由は、細胞が経験する機械的刺激は、インビボのものと類似し、そしてそれらは明瞭な管腔側を有し、それを通してそれらは流動を経験し得るからである（しかし厳密には必要ではない）。試験化合物及びプローブの両方が同じ側に与えられてもよいが（すなわち、頂端側、基底外側、又はその両方）、それらはまた異なる側に与えられてもよい（例えば、試験化合物は基底外側に与えられ、一方、試験しようとする化合物は頂端側に与えられるか、又はそう所望する場合には頂端側と基底外側に与えられる）。それ故、試験化合物がプローブより前、後、又は同時に細胞に与えられる本発明の方法が提供される。試験化合物を与える時刻からプローブを与える時刻までの時間は、実験装置に依存して変更され得る。いくつかの実施態様では、時間間隔は、１、５、１０、又は３０分間未満である。他の実施態様では、時間間隔は、約１０、３０、６０秒間、又は約５、１０、３０、６０分間、又は約１、２、６、１２、２４若しくは４８時間である。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、１種類を超えるプローブが細胞に与えられる。いくつかの実施態様では、プローブは、試験化合物が与えられた後に与えられる。いくつかの実施態様では、さらなるプローブが、第一プローブ及び試験化合物が与えられた後に、例えば、試験化合物及び第一プローブが細胞に与えられてからしばらく経過した後に与えられる。このような実施態様は、例えば、まず第一プローブを用いて上皮細胞層（細管を含む）の破壊又は修復を検出し、続いて、第一の試験化合物を除去した後、又は試験化合物への曝露期間後に第二のプローブによる破壊の修復（細胞による適応などの尺度）を決定することを目指した実験において使用され得る。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、１つを超える試験化合物が細胞に与えられる。化合物の混合物を試験して、例えば、試験混合物中の１つの化合物が混合物中の別の化合物と相互作用し、これにより、上皮バリア機能に対するその効果を調節するかどうかを決定し得る。混合物中の試験化合物はまた、バリア機能に対して相乗的に作用し得るか、又は互いに拮抗し得る。
【０１０８】
実際に、細胞層は必ずしも漏れ密性である必要はなく、プローブの幾分かの拡散が、実験開始時（すなわち、試験化合物が加えられる時）には許容されるが、好ましい実施態様では、細胞層は漏れ密性であり、すなわち、試験化合物の非存在下において細胞に与えられた場合に、事実上全く又は実質的に全くプローブの拡散は観察されない。それ故、本発明はまた、工程ｃ）で培養された細胞が単層を形成し、好ましくは単層は実質的にプローブが頂端側から基底外側へと及び／又は頂端側から基底外側へと拡散することを可能としない、本発明の方法を提供する。本発明の脈絡において、上皮細胞層は、シグナルの約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約１％未満、０．１％未満、０．０１％未満が片方の側（例えば頂端側）から別の側（この例では基底外側）へと、添加から５、１０、２０又は３０分間以内に拡散する場合に漏れ密性であると判断され得る。この数字は一部には使用されるプローブ並びに使用される細胞の種類に依存するだろう。いくつかの実施態様では、好ましくは実験開始時、及び任意の試験化合物が細胞に与えられる前の拡散又はドリフトは、全く細胞が存在しない下での同じシステムにおいて観察された拡散率の最大５０％、４０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、又はそれ以下である。実際には、プローブの側に（僅かな）超過圧力の流体が加えられることが多く、これにより「化合物の漏出」を加速させ、したがってより明瞭なシグナルを示す。これは、ゲルには間質流が存在するために可能である。例えば、試験化合物とプローブを含む１００μlの培地を、細胞層／細管の管腔側と連通するレザバーに添加し得、そして僅か２０μlの培地を、細管の他方の側に連通するレザバーに添加し得る。したがって、管腔側に僅かな超過圧力が作り出され、バリアの破壊が起こる時に明瞭なシグナルが生じる。
【０１０９】
本明細書において開示されているように、工程ｅ）は、マイクロ流体チャネル内又はゲル内、又はマイクロ流体チャネル内とゲル内の両方におけるプローブによって与えられたシグナルの様々な時点における決定を含む。当業者は、様々な時点における決定とは、（実験／方法の最中の）少なくとも２つの時点におけるプローブ（マーカー物質とも呼ばれる）が、例えば、細胞の頂端側及び／又は基底外側（又はさらには細胞内）において決定されることを示すことを理解する。換言すれば、プローブ（プローブによって与えられるシグナル）が経時的に、及び少なくとも２つの異なる瞬間において決定される。当業者は、例えば実験又はアッセイの目的に依存して、１回目の測定／決定の時期、２回の測定の時間間隔、全測定回数、１回の測定時間、全体の測定期間などを変更し得ることを理解する。例えば、１回目の測定を、試験化合物の添加前、試験化合物の提供から１秒後、１時間後、１２時間後、１日後、３日後などに実施し得る。例えば、１秒間毎、１分間毎、及び１時間毎、６時間毎、毎日、毎週、又は毎月、及び所望であればそれらの間及びそれらを超えるあらゆる頻度で測定し得る。例えば、１秒間以下又は１秒間以上、１分間以下又は以上、１時間以下又は以上、６時間以下又は以上、１日間、１週間、又は１か月以下又は以上測定し得る。例えば、２回の測定の時間間隔は、１秒間以下または以上、又は１分間以下又は以上、１時間以下又は以上、６時間以下又は以上、１日間、１週間又は１か月間以下又は以上などであり得る。
【０１１０】
工程ｅ）における２つの連続的な時点が互いに１秒間から２４時間以内である、本発明の方法も提供される。プローブによって与えられるシグナルは、本発明の方法において、様々な時点において決定される。２つの時点の間隔は変更され得る。例えば、１番目の時点から２番目の時点までの間隔は５秒間であり得、２番目の時点から３番目の時点までの間隔は１０分間である。原則的に、２つの時点の時間間隔は、任意の適切な間隔であり得る。しかしながら、実際に、時間間隔は、各時点において信頼性のあるデータが得られるように選択されるべきである。例えば、初回の観察点の時間間隔は比較的短くてもよく、一方、より後の時点の時間間隔は比較的長くてもよい。しかしながら、得られた実験データから、上皮バリア機能の変化が２つの時点の時間間隔が比較的長い間隔において起こるようであるならば、上皮バリア機能の変化をより正確に決定するために、該間隔においてより短い時間間隔を用いて実験を繰り返してもよい。典型的には、２つの時点の時間間隔は、互いに１秒間から２４時間、例えば１秒間から２０分間であり得る。ここでも、各々の２つの時点の間隔は同じであるべきではないか、又は所与の範囲内であるべきではないことを留意する。
【０１１１】
工程ｅ）における様々な時点が、１０分間から４週間（例えば２８日間）までの期間内（境界値を含む）である、本発明の方法も提供される。実験を継続し得、そして多くの異なる時点において測定を行ない得るが、一般的に、上皮バリア機能に対する化合物の調節効果、特に毒性作用は、試験化合物の添加後かなり急速に起こることが判明した。それ故、いくつかの実施態様では、様々な時点においてシグナルが決定される全期間は、１０分間から４週間（例えば２８日間）（境界値を含む）であり得る。
【０１１２】
それに関して、１回目の測定は、化合物及び／又はプローブが細胞に与えられた直後に必ずしも行なわれる必要がないことを留意されたい。示されているように、試験化合物は、例えば、プローブが与えられる数分前又は数時間前に細胞に与えられ得、例えば、これにより試験化合物は上皮バリア機能に関してその作用を発揮することが可能となる。このような実施態様では、１回目の測定は、試験化合物の添加から数時間後に行なわれ得、そして例えば１０分間から４週間（例えば２８日間）続け得る。
【０１１３】
ゲルの隣に、ゲルと接触しているさらなるチャネルが存在し、該チャネルは、培養上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルと直接接触していない、本発明の方法も提供される。
【０１１４】
前記のさらなるチャネルはゲルと直接接触しているが、該ゲル（及び該ゲル上に単層を形成している細胞）によって培養上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルとは隔離されている。したがって、さらなるチャネルは基底外側の一部であり、そして本明細書に記載のように、プローブによって与えられるシグナルを測定するために、又は試験化合物若しくは他の化合物を細胞の基底外側に添加するために使用され得る。試験化合物及びプローブは、ゲルを通って拡散し、これにより、細胞の基底外側に到達することができるか、又はゲルを通って拡散し、これにより、さらなるチャネル内の液体に到達することができる。
【０１１５】
前記のさらなるチャネル内にゲルからプローブを除去する流動が存在し、そして好ましくはゲル内の工程ｅ）のプローブによって与えられるシグナルの決定が、前記のさらなるチャネル内及び／又はゲル内に存在する流動中のシグナルの測定を含む、上記の方法も提供される。
【０１１６】
一般的に、及び本明細書に記載の様々な実施態様について、マイクロ流体デバイス内においていくつかの方法で測定を行なうことができる。例えば、
１）チャネル内、すなわち、プローブが与えられた側（ドナー側）に定常流が適用され得る。このような実施態様では、これは、例えば基底外側又は頂端側における定常的なプローブ発生源を引き起こす。このような実施態様における測定は、好ましくは、他方の側で得られたシグナルに基づいて行なわれる。
【０１１７】
２）あるいは、ドナー側において流動を全く使用しない、すなわち、定常的なプローブ発生源は全くない。このような静的な実施態様では、他方の側へのプローブの拡散（すなわち、マイクロ流体チャネル内の、基底外側／ゲル／さらなるチャネルへの、又は頂端側／培地への）により、プローブが与えられたチャネル内のプローブのレベルは減少し、得られたデータを解釈する場合には考慮されなければならない。
【０１１８】
３）アクセプター側（すなわち、反対側に添加された場合、プローブが拡散し得る頂端側又は基底外側（基底外側に対して頂端；頂端に対して基底外側））には全く流動は適用されなくてもよい。これにより、経時的にこのような側にプローブの蓄積がもたらされ、したがって、これは測定された時間間隔にわたる漏出の積分である。この実施態様は、特に、基底外側（すなわちゲル）がアクセプター側として使用された場合に使用され得る。
【０１１９】
４）アクセプター側に定常流が適用されてもよい。これは、アクセプター側への蓄積（及び、ドナー側へのプローブの再分布の可能性）を引き起こさない。その場合、時点毎の漏出、又は時点毎の漏出時間がアクセプター側において（例えば、以下に考察されているようなさらなるチャネルと組み合わせたゲル内において）決定され得る。
【０１２０】
好ましい実施態様では、流動が、ドナー側又はアクセプター側のいずれか、又はその両方に適用される。別の好ましい実施態様では、流動は片方の側に適用され、他方の側には適用されない。好ましい実施態様では、流動は基底外側に適用される。別の実施態様では、流動は頂端側に適用される。１つの実施態様では、流動はドナー側のみに適用される。さらなる実施態様では、試験化合物は、流動が全く適用されない側に添加される。さらなる実施態様では、試験化合物は、流動が適用される側に添加される。さらなる実施態様では、流動が適用される側に試験化合物が添加される場合、流動は、該化合物が与えられる側において定常濃度をもたらす。別の実施態様では、流動が適用される側に試験化合物が添加される場合、試験化合物の初回の提供後に、流動は、試験化合物を含まないか又はより低い濃度で含み；試験化合物が与えられる側において該化合物の濃度の減少を引き起こす。またさらなる実施態様では、試験化合物の初回の提供後に、流動は、様々な濃度の又は漸増濃度の該化合物を含み、したがって、試験化合物が与えられる側において様々な濃度又は上昇した濃度の試験化合物が引き起こされる。
【０１２１】
本発明の方法は、１つの試験化合物又は様々な試験化合物の、及び／又は様々な濃度の調節効果を経時的に決定することを可能とするだけでなく、様々な上皮細胞又は様々な組成の上皮細胞層に対する、１つ以上の濃度の、１つの試験化合物又は様々な試験化合物の調節効果を経時的に繰り返し試験することを可能とする。したがって、工程ｂ）において様々な種類の上皮細胞が同じマイクロ流体チャネルに導入され、及び／又は、工程ｂ）において様々なマイクロ流体チャネルに様々な種類の上皮細胞が与えられる、本発明の方法も提供される。当業者は、１種類を超える上皮細胞を含むマイクロ流体デバイスの調製法を熟知している。この実施態様は、例えば、上皮細胞型に特異的な試験化合物の効果を検出することを可能とする。
【０１２２】
本発明の方法に使用されるゲルは、与えられた上皮細胞型が、ゲル上で、頂端側及び基底外側を有する細胞層を形成し得る限りにおいてどのような適切なゲルであってもよい。例えば、ゲルは、合成ポリマー、天然ポリマー、又はバイオポリマー、例えばアガロース、ゼラチン、デキストラン、キトサン、シリカゲルなどを含み得る。
【０１２３】
しかしながら、好ましい実施態様では、ゲルは、１つ以上の増殖用基質及び／又は分化用基質、例えばコラーゲン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ−リジン、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、類似の組織培養基質、又はその組合せを含む。
【０１２４】
別の実施態様では、ゲルは、基底膜抽出物、ヒト若しくは動物組織若しくは細胞の培養液に由来する細胞外マトリックス、動物組織に由来する細胞外マトリックス、合成細胞外マトリックス、ヒドロゲル、コラーゲン、軟寒天、卵白、及び市販の製品、例えばマトリゲルを含む。基底膜は、インビボにおいて上皮細胞の根底にある薄い細胞外マトリックスであり、そして細胞外マトリックス、例えばタンパク質及びプロテオグリカンからなる。重層又は単層の上皮細胞層は、バリアとして外界からの外来性物質の侵入を防ぐが、基底膜それ自体もまた物理的バリアとして作用する。したがって、上皮組織を含む上皮細胞は、基底膜と協力して固相バリアを形成し、内部の生命活動を保護する。
【０１２５】
それらはコラーゲンＩＶ型、ラミニン、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び数多くの他の少数派な成分から構成される（Quaranta et al, Curr. Opin. Cell Biol. 6, 674-681, 1994）。インタクトな基底膜だけでなくこれらの成分は単独で生物学的に活性であり、そして細胞接着、遊走、及び多くの場合において増殖及び分化を促進する。基底膜に基づいたゲルの一例は、マトリゲル（米国特許第４８２９０００号）と呼ばれる。この材料は、上皮細胞の基底層としてインビトロにおいて非常に生物学的に活性である。
【０１２６】
本発明の方法に使用するに適した多くの異なるゲルが市販され、そしてこれには、マトリゲルｒｇｆ、ＢＭＥ１、ＢＭＥ１ｒｇｆ、ＢＭＥ２、ＢＭＥ２ｒｇｆ、ＢＭＥ３（全てマトリゲルの変種）コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、コラーゲンＩ型とＩＶ型の混合物、又はコラーゲンＩ型及びＩＶ型とコラーゲンＩＩ型及びＩＩＩ型の混合物、ピュラマトリックス、ヒドロゲル、セルタック（商標）、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、マトリゲル（登録商標）マトリックス、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、オステオポンチン、ポリ−リジン（ＰＤＬ、ＰＬＬ）、ＰＤＬ／ＬＭ及びＰＬＯ／ＬＭ、ピュラマトリックス（登録商標）又はビトロネクチンを含むものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
１つの好ましい実施態様では、マトリックス成分は、市販のコーニング（登録商標）マトリゲル（登録商標）マトリックス（コーニング社、ＮＹ１４８３１、米国）として得られる。
【０１２８】
マトリゲル（登録商標）マトリックスは、基底膜の豊富な腫瘍であるエンゲルブレス・ホルム・スワーム（「ＥＨＳ」）マウス腫瘍から抽出される。主要なマトリックス成分はラミニン、コラーゲンＩＶ型、エンタクチン、及びヘパリン硫酸プロテオグリカン（「ＨＳＰＧ」）である。マトリックスはまた、増殖因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（コラゲナーゼ）、及び他のプロテイナーゼ（プラスミノーゲンアクチベーター）、並びにいくつかのまだ組成が明らかになっていない細胞外マトリックス成分も含有する。室温において、マトリゲル（登録商標）マトリックスはゲル化して再構成された基底膜を形成する。
【０１２９】
したがって、本発明の方法の好ましい実施態様において、ゲルが、基底膜抽出物、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ−リジン、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン又はその組合せを含む方法、及び好ましくはゲルが、２つを隔てる物理的な膜を全く有さずに細胞層と直接接触している方法が提供される。
【０１３０】
当技術分野における方法とは対照的に、本発明は、透過性支持体を有する組織培養インサート、例えば本明細書にすでに記載されているトランスウェル（登録商標）インサートの使用に依拠しない。このようなインサートは通常、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、又はポリエチレンテレフタレート、並びに、他の類似した物質から製造される。このような支持体はそこで拡散バリアを形成する。なぜなら、材料（これからこれらのインサートが調製される）が例えば、本発明の方法に使用されるプローブに近づけないからである。ゲルが細胞層と直接接触することを可能としかつ細胞層とゲルとの間に物理的かつ不透過性の膜を形成しない本発明の方法のゲルを使用することによって、このような不透過性かつ非天然の層の存在の負の効果は回避されることが驚くべきことに判明した。これは特に、不透過性材料を含むこのような支持体又はインサートを使用して支持体を提供しそしてそこで細胞の少なくとも一部に対して物理的バリアを作り出すことに依拠するアッセイと比較した場合、上皮バリア機能に対する化合物の調節効果のより高感度な測定を提供することが判明した。
【０１３１】
本発明の方法は、様々な種類及び分類の上皮細胞を示す本明細書の例から証明され得るような、そしてマイクロ流体システムのチャネル内において培養できる、あらゆる種類の上皮細胞（内皮細胞及び中皮細胞を含む）のために使用され得る。細胞は、動物上皮細胞、動物上皮細胞株の細胞、動物上皮初代細胞、哺乳動物上皮細胞、哺乳動物上皮細胞株の細胞、哺乳動物上皮初代細胞、ヒト上皮細胞、ヒト上皮細胞株の細胞、又はヒト上皮初代細胞であり得る。上皮細胞の例は、本明細書に使用される用語によって包含され、これには前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、β細胞を含む膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸及び小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頚部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、下垂体細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載のように、該細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト及びヒト霊長類などの任意の哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の動物に由来し得る。本発明の培地に特に適した哺乳動物細胞としては、乳腺、前立腺、肝臓、膵臓、腎臓、気管支、及び気管などであるがこれらに限定されない組織に由来する初代細胞であり得る、ヒトを起源とする上皮細胞が挙げられる。さらに、形質転換された細胞又は樹立された細胞株も使用してもよい。本発明に使用される細胞は、疾患を有さないか又は遺伝子的に改変されていない正常で健康な細胞であっても、あるいは、該細胞は疾患を有しているか又は遺伝子的に改変されていてもよい。
【０１３２】
本発明の脈絡において、細胞株は、持続的に増殖しているか又は不死化された細胞を指す。時には「不死化細胞株」とも称される細胞株は、通常は無限に増殖しないであろうが、突然変異に因り、正常な細胞老化を逃れその代わりに分裂を受け続けることができる、多細胞生物に由来する細胞個体群である。該用語は当業者には周知である。したがって、細胞株の細胞は、このような細胞株に属する細胞を示す。本発明の方法に適した上皮細胞株の例としては、ＬＬＣ−ＰＫ１（ブタ腎細胞）細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎細胞、例えばＭＤＣＫ１細胞、ＭＤＣＫＩＩ細胞、Ａ５４９、ＨＭＥＣ−１、ＥＣＶ３０４、ＥａＨｙ９２６、Ｃａｃｏ−２細胞、ＣＥＢＢｅ１細胞、ＨＴ−２９細胞、Ｔ８４細胞、及びＳＫ−ＣＯ１５細胞、又は遺伝子工学操作された上皮細胞のような派生細胞、及び多くのその他の細胞が挙げられる。
【０１３３】
本発明の脈絡において、初代細胞は、生存組織（例えば生検材料）から直接採取された細胞であり、そしてインビトロにおいて増殖のために樹立されている。これらの細胞は、非常に僅かな集団倍加しか受けていないので、それ故、持続的な（腫瘍又は人工的に不死化された）細胞株と比較してそれらが由来する組織の主要な機能的成分をより表現し、したがって、インビボ状態をより表現するモデルを示す。
【０１３４】
初代上皮細胞及び上皮細胞株の細胞の両方が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）をはじめとする様々な業者から得られる。
【０１３５】
工程ｅ）のプローブによって与えられたシグナルの決定が、画像撮影装置、顕微鏡、自動顕微鏡、ハイコンテント画像撮影装置、プレートリーダー、又はマルチモードリーダーを使用した測定を含む。
【０１３６】
シグナルを測定するのに適した方法及び装置は、当業者には周知であり、当業者が適切な方法を選択するのに何の問題もないだろう。ハイコンテント画像撮影装置は、例えば、モレキュラーデバイス社（サニーベール、米国）又はその他の会社から得ることができる。
【０１３７】
マイクロ流体デバイスが、マイクロ流体チャネルへの及び／又はゲルへの及び／又はさらなるチャネルへの連続的な光路を提供する、本発明の方法も提供される。これは、頂端側、基底外側のいずれか、又はその両側におけるシグナルの連続的な測定を可能とするだろう。
【０１３８】
調節効果は、本発明に記載のマイクロ流体システムにおける細胞層の上皮バリア機能を高める効果であり得るか、又は細胞層の上皮バリア機能を低下させる効果であり得る。調節効果が上皮バリア機能を破壊又は修復することである、本発明の方法がそこに提供される。それに関して、当初は化合物は、上皮バリア機能を減少させたが（アクセプター側（この場合、ゲル内／基底外側）におけるシグナルの変化によって証明されるように）、後の時点では上皮バリア機能は、該化合物の存在下においてさえ再度改善されたことを示した実験が実施されたことを注記することは興味深い。これは、本発明の方法が、当技術分野における方法と比較してバリア機能に対する化合物の調節効果をより正確に検出することを可能とすることを示す。
【０１３９】
工程ｄ）において試験化合物が与えられる前にプローブが上皮細胞に与えられる、並びに好ましくはプローブが与えられた後に、マイクロ流体チャネル内若しくはゲル内、又はマイクロ流体チャネル内とゲル内の両方においてプローブによって与えられたシグナルが、様々な時点において及び試験化合物が与えられる前に決定される、本発明の方法も提供される。
【０１４０】
このような実施態様は、対照として、比較のためのデータを提供するのに、又はバリア機能に対する試験化合物の効果を決定するために細胞層を使用することができるかどうかを決定するのに有用である。例えば、試験化合物を伴わない測定によりすでに、プローブが高度に輸送されていると判明した場合には、細胞層は、本発明の方法にさらに使用するのに拒絶され得る。同時に、この実施態様は、「バックグラウンド」活性の決定を可能とする。
【０１４１】
本発明の方法を用いて、多くの異なる試験条件を一斉に／同時に（すなわち１回の同じ実験内で）測定することが今回可能となり、これによりスクリーニング法が可能となる。当業者は、「一斉に」又は「同時に」という用語は本明細書において同じ実験内を示すと理解する。同じ実験内のシグナルの測定は、所望であれば順次又は平行して実施されてもよい。
【０１４２】
それ故、本発明の方法は、上皮細胞を含む複数のマイクロ流体チャネルを使用して同時に実施され得る。好ましい実施態様では、該方法は、マイクロ流体システムが少なくとも３個、好ましくは１０個を超える、さらにより好ましくは約４０、９６、２５６、３８４個のマイクロ流体チャネルを含む方法、好ましくは少なくとも３個、好ましくは１０個を超える、さらにより好ましくは約４０個、９６個、２５６個、３８４個の上皮細胞層又は細管を含むマイクロ流体チャネルが同時に、順次、又は平行して測定される方法である。
【０１４３】
本発明の方法に使用するプローブは、本明細書に定義されているような上皮バリア機能を決定する際に適切に使用され得る任意のプローブであり得る。上皮細胞層を横断する拡散を調べる際に使用されるこのようなプローブは当業者には周知である。このようなプローブの周知の例としては、ルシファーイエロー、蛍光標識されたデキストラン又はイヌリン、例えば、様々な分子量の、フルオレセイン又はローダミンをコンジュゲートさせたデキストラン又はイヌリン、ＦＩＴＣをコンジュゲートさせたデキストラン、ＴＲＩＴＣをコンジュゲートさせたデキストラン、及びＦＩＴＣをコンジュゲートさせたイヌリンが挙げられる。使用される典型的な分子量は、ＦＩＴＣデキストランについては６ｋＤＡ、７５ｋＤＡ、１５０ｋＤａ、又は４００ｋＤＡであるが、他の分子量も使用され得る。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、１つを超えるプローブが使用され、ここでは例えば各プローブは、様々なサイズによって及び／又は様々な検出標識によって特徴付けられる。例えば、様々な蛍光基、例えばＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ナノドット、ローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ）などにコンジュゲートさせた、様々なサイズのデキストラン又はイヌリンが使用され得る。
【０１４５】
明らかに任意の種類のレポーター分子を、本発明の方法の脈絡において使用することができ、例えば、任意のフルオロフォア（例えばアレクサフルオル（登録商標）３５０、アレクサフルオル（登録商標）６４７、オレゴングリーン（登録商標）、アレクサフルオル（登録商標）４０５、アレクサフルオル（登録商標）６８０、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、アレクサフルオル（登録商標）４８８、アレクサフルオル（登録商標）７５０、Ｃｙ（登録商標）３、アレクサフルオル（登録商標）５３２、パシフィックブルー（商標）、パシフィックオレンジ（商標）、アレクサフルオル（登録商標）５４６、クマリン、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、アレクサフルオル（登録商標）５５５、ボディパイ（登録商標）ＦＬ、テキサスレッド（登録商標）、アレクサフルオル（登録商標）５６８、パシフィックグリーン（商標）、Ｃｙ（登録商標）５、アレクサフルオル（登録商標）５９４、ＤＮＡステイン、ＤＡＰＩ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３、ヨウ化プロピジウム、量子ドット（登録商標）プローブ、量子ドット（登録商標）５２５、量子ドット（登録商標）５６５、量子ドット（登録商標）６０５、量子ドット（登録商標）６５５、量子ドット（登録商標）７０５、量子ドット（登録商標）８００、蛍光タンパク質標識、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、蛍光発現タンパク質、ＣＦＰ、ＧＦＰ（ｅｍＧＦＰ）、ＲＦＰ（タグＲＦＰ））などを用いて蛍光標識されたプローブである。
【０１４６】
適切な非蛍光発光プローブとしては、ＧＳＨ−Ｇｌｏ、ＭＡＯ−Ｇｌｏ、Ｐｇｐ−Ｇｌｏ、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、ウイルスＴｏｘ、ＧｌｏＮＡＤ、（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ、ＧＳＨ−Ｇｌｏなどが挙げられる。
【０１４７】
比色定量プローブとしては、ＡＥＣ、ＡＥＣ＋、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＤＡＢ＋、フクシン＋、パーマネントレッド、アラマーブルー、ＭＴＴ、グリースなどが挙げられる。
【０１４８】
当業者は、本発明の方法に使用するのに適したプローブの選択法を熟知している。
【０１４９】
上記に関して、好ましい実施態様では、様々なサイズのプローブが工程ｄ）に与えられ、好ましくは各々の異なるサイズのプローブが、異なる蛍光標識を用いて標識されている。
【０１５０】
プローブが与えられた側（基底外側又は頂端側）に超過圧力が加えられ、好ましくはプローブが与えられた側に、又はプローブが与えられた側に相当するレザバーに、他方の側／又は他方の側に相当するレザバー内の流体の量と比較してより多量の流体を添加することによって超過圧力が実現される、本発明の方法も提供される。
【０１５１】
マイクロ流体チャネル内にゲルが、主としてより親水性の高いチャネル内のピラー、リッジ、溝、疎水性パッチ又はより親水性の低いパッチなどの毛管圧技術を用いて構造化される、本発明の方法も提供される。
【０１５２】
１つ以上のプローブが、試験化合物及び第一のプローブの添加と一緒に又は添加後の時点で上皮細胞に与えられ、そして１つ以上のプローブは好ましくは光学的手段によって第一のプローブとは識別可能である、本発明の方法、好ましくは出願されているような請求項１９の方法も提供される。
【０１５３】
今回一般的に本発明を記載したので、説明のために提供されたのであって、本発明を制限するものではない、以下の実施例への参照を通してより容易に同じことが理解されるであろう。
【０１５４】
実施例
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、マイクロ流体プラットフォーム内の細胞外マトリックスに対するバリアの播種を示す。Ａ）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して細胞を播種する図解。２レーンのマイクロ流体プラットフォームにおいて、ＥＣＭをゲルチャネル内に播種する。ＥＣＭを硬化させた後、細胞を、培養チャネル内の培養培地中に播種する。プレートを、細胞が重量によってＥＣＭの上面に沈殿することができるように横倒しにしてインキュベートする。細胞を付着させた後、灌流を開始する。細胞型依存性の細胞バリアが、ＥＣＭに対して形成されるか、又は細管構造を形成している全ての培地灌流チャネルを覆う。Ｂ）培地灌流チャネル内の細管構造の形成例。ブタ近位尿細管細胞ＬＬＣ−ＰＫ１を、培地灌流チャネル内のＥＣＭに対して播種する。播種から１日後、ＥＣＭに対して横たわっている細胞層を、位相差顕微鏡によって観察する。４日目に細胞は、培地灌流チャネルの４つ全ての側面に対して増殖している。６日目にコンフルエントな単層があたり一面に形成される。
【図２】図２は、２レーンのマイクロ流動チップ内のバリアの３次元共焦点画像を示す：イヌ近位尿細管細胞ＭＤＣＫを、図１に記載されているような２レーンのマイクロ流体デバイス内のＥＣＭに対して播種した。バリア形成が位相差顕微鏡によって観察された後、細胞を、生細胞を緑色の蛍光で標識する生存判定色素のカルセイン−ＡＭ（ライフテクノロジーズ社、Ｃ１４３０）を用いて染色した。固定後、細胞をアクチンレッド（ライフテクノロジーズ社、Ｒ３７１１２）を用いて染色し、そして共焦点顕微鏡（ライカ社、ＴＣＳ ＳＰ５ＳＴＥＤ）によって画像撮影した。３次元映像を、３次元ビューアー富士プラグイン（Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772）を使用して作成した。薄片は、ＥＣＭに対するコンフルエントな細胞バリアの形成を示す。バリアの頂端側は、培地灌流チャネルを通してアクセスできるが、基底側はゲルチャネルから自由にアクセスできる。
【図３】バリア完全性アッセイ：例えば図１及び２に記載のように培養された細胞バリアの完全性は、灌流チャネル内の培地を、５００μg/mLのＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDa（シグマ社、４６９４６）を含有している培地と交換することによって探索され得る。Ａ）細胞バリアが漏れ密性である場合、蛍光シグナルは灌流チャネル内に含有され、一方、ゲルチャネル内に細胞を全く含まずＥＣＭだけを有するマイクロ流体チップでは、蛍光シグナルはＥＣＭに進入し、そして数分以内に飽和するだろう。灌流液及びゲルチャネル内の蛍光シグナルを、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用して、例えばＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（モレキュラーデバイス社）を用いてリアルタイムでモニタリングすることができる。Ｂ）ＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaの蛍光シグナル強度を、富士分析ソフトウェア（Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772）を使用して上の灌流チャネル内及びゲルチャネル内において定量した。Ｃ）ゲルチャネルの強度を、上の灌流チャネルの強度で割り、そして比を、蛍光レポーターの添加開始後の時間に対してプロットした。細胞バリアの非存在下ではＥＣＭは、色素添加後から数分以内で飽和するが、細胞バリアがインタクトである限りでは０に近い比が維持される。
【図４】図４は、スタウロスポリンに曝露したＬＬＣ−ＰＫ１のバリア完全性アッセイを示す：ブタ尿細管細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１（ＡＴＣＣ、ＣＬ−１０１、継代数２１０）を、コラーゲンＩ型ＥＣＭ（Cultrex、Amsbio社、３４４７−０２０−０１、４mg/mL）に対して２００μmの３レーンのオルガノプレート（商標）の上の灌流チャネルに１０×１０６個の細胞/mlで播種した。６０μlの培地を、上の灌流チャネルの入口及び出口の培地に加えた。ＥＣＭの上面に細胞が沈殿することができるように、プレートを横倒しにして一晩インキュベートした。播種後１日目に、６０μLの培地が、下の灌流チャネルの入口及び出口の培地に添加され、そしてプレートをインキュベーター中に水平にして置いた。播種後４日目に、プレートを、連続的な培地の灌流のために振盪プラットフォーム上に配置した（７°の角度、８分毎に傾ける）。播種後６日目に、ＬＬＣ−ＰＫ１細管の漏れ密性を、上の灌流チャネル内の培地を、５００μg/mlのＦＩＴＣ−デキストラン１５０kD（シグマ社、４６９４６）を含有している培地と交換することによって試験した。容積は、上の灌流チャネルでは６０μL/４０μL、中央のＥＣＭチャネルでは０μL/０μL、下の灌流チャネル内では４０μL/４０μLの標準的な培養培地であった。添加から１５分後にＥＣＭ内にＦＩＴＣ−デキストランシグナルを示さなかった細管は漏れ密性であると判断され、そしてスタウロスポリンへの曝露のために選択された。上の灌流チャネル内の培地を、５００μg/mlのＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaと０、１、５、又は１０μMのｐａｎ−キナーゼ阻害剤のスタウロスポリン（シグマ社、Ｓ４４００）とを含有している培地と交換した。容積は、上の灌流チャネルでは６０μL/４０μL、中央のＥＣＭチャネルでは０μL/０μL、下の灌流チャネル内では４０μL/４０μLの標準的な培養培地であった。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーション条件下でＥＶＯＳ ＦＬ ａｕｔｏ（ライフテクノロジーズ社）に配置した。マイクロ流体チップを、４倍対物レンズを用いて１５分毎に１６時間かけて位相差で及び蛍光的に（ＦＩＴＣ）画像撮影した。代表的な時点が示されている。スタウロスポリンに全く曝露されない場合、ＬＬＣ−ＰＫ１細管は、全実験期間にわたり漏れ密性を維持する。漸増濃度のスタウロスポリンを用いると、ＬＬＣ−ＰＫ１バリアの完全性は、より早期の時点で破壊する。
【図５】図５は、スタウロスポリンに曝露したＬＬＣ−ＰＫ１のバリア完全性アッセイの定量を示す。ＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaの蛍光シグナル強度を、富士分析ソフトウェア（Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772）を使用して、図４の上の灌流チャネル内及びゲルチャネル内において定量した。ゲルチャネルの強度を、上の灌流チャネルの強度で割り、そして比を、スタウロスポリンへの曝露開始後の時間に対してプロットした。比の増加は、ゲルチャネル内の蛍光シグナルの増加を示し、ＬＬＣ−ＰＫ１バリア完全性の破壊を示す。
【図６】図６は、異なる起源の尿細管細胞株を用いた、図４に記載したのと類似した実験を示す。ＭＤＣＫ（イヌ）細胞株を、コラーゲンＩ型ＥＣＭ（Cultrex、Amsbio社、３４４７−０２０―０１、４mg/mL）に対して４００μmの３レーンのオルガノプレート（登録商標）の上の灌流チャネルに１０×１０６個の細胞/mLで播種した。６０μLの培地を上の灌流チャネルの入口及び出口の培地に加えた。プレートを、細胞がＥＣＭの上面に沈殿することができるように横倒しにして３時間インキュベートした。播種から３時間後、６０μLの培地を、下の灌流チャネルの入口及び出口の培地に加え、そしてプレートを、連続的な培地の灌流のために振盪プラットフォーム上に配置した（７°の角度、８分毎に傾ける）。播種後５日目に、ＭＤＣＫ細管の漏れ密性を、上の灌流チャネル内の培地を、５００μg/mlのＦＩＴＣ−デキストラン１５０kD（シグマ社、４６９４６）を含有している培地と交換することによって試験した。容積は、上の灌流チャネルでは４０μL（入口）/３０μL（出口）、中央のＥＣＭチャネルでは０μL（入口）/０μL（出口）、下の灌流チャネル内では２０μL（入口）/２０μL（出口）の標準的な培養培地であった。添加から１５分後にＥＣＭ内にＦＩＴＣ−デキストランシグナルを示さなかった細管は漏れ密性であると判断され、そしてスタウロスポリンへの曝露のために選択された。上の灌流チャネル内の培地を、５００μg/mlのＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaと０、１、４、７又は１０μMのｐａｎ−キナーゼ阻害剤のスタウロスポリン（シグマ社、Ｓ４４００）とを含有している培地と交換した。容積は、上の灌流チャネルでは４０μL（入口）/３０μL（出口）、中央のＥＣＭチャネルでは０μL（入口）/０μL（出口）、下の灌流チャネル内では２０μL（入口）/２０μL（出口）の標準的な培養培地であった。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーション条件下でハイコンテントスクリーンＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬＳ（モレキュラーデバイス社）に配置した。マイクロ流体チップを、１時間毎に１５時間かけて、４倍対物レンズを用いて蛍光（ＦＩＴＣ）画像撮影した。代表的な時点が示されている。スタウロスポリンに全く曝露しない場合には、ＭＤＣＫ細管は全実験期間にわたり漏れ密性を維持する。漸増濃度のスタウロスポリンを用いると、ＭＤＣＫバリアの完全性は、より早期の時点で破壊する。
【図７】図７は、図６のスタウロスポリンに曝露された、ＭＤＣＫを用いてのバリア完全性アッセイの定量を示す。ＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaの蛍光シグナル強度を、富士分析ソフトウェア（Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772）を使用して図４の上の灌流チャネル内及びゲルチャネル内において定量した。ゲルチャネルの強度を、上の灌流チャネルの強度で割り、そして比を、スタウロスポリンへの曝露開始後の時間に対してプロットした。比の増加は、ゲルチャネル内の蛍光シグナルの増加を意味し、ＭＤＣＫバリア完全性の破壊を意味する。時間対漏出濃度の決定：強度比についての閾値を設定することができる、例えば０．４。各々の曝露された化合物濃度についてのこの比に相当する時点を、濃度に対してプロットする。ＩＣ５０値と同等である、漏出までの時間に基づいた化合物の特徴的な濃度を決定することができる。漏出までの時間の数値（例えば化合物の添加から２時間後）は、インビボにおける最大の妥当性を確実にするために検証実験に基づいて決定されなければならないだろう。この漏出時点までの時間は、全ての化合物について同じ数値に設定することができるか（ＩＣ５０値と同様に）、又は、例えば化合物の半減期に依存して作成され得る。
【図８】図８は、図７のグラフのさらなるデータの解釈を示す。細管が蛍光閾値の比（ここでは０．４と設定）を通過する時点で、細管は破壊したと判断される。バリア完全性の消失は、ここで示されているようないわゆる残存率プロット（カプランマイヤープロット）でプロットされ得る。このアプローチは、正確なＥＣ５０の決定のために不十分なデータ点しか得られない場合に特に有用である。その例が図１１に示される。
【図９】図９は、スタウロスポリンに曝露されたヒト腸管上における漏出までの時間のバリア完全性アッセイのためにあらゆる時点において抽出された用量反応曲線を示す。Ｃａｃｏ−２細胞株（シグマ社、ヒト大腸癌細胞）を、４００μmの３レーンのオルガノプレート（登録商標）に１０×１０６個の細胞/mLで播種し、細胞−ＥＣＭの付着のために横倒しにして２時間置き、そしてその後、持続的な培地灌流のために改変された振盪プラットフォームに配置した。播種から３日後、Ｃａｃｏ−２細管の漏れ密性を、上の灌流チャネル内の培地を、０．２５mg/mLのＴＲＩＴＣデキストラン１５０kDaを含有している培地と交換することによって試験した。ＥＣＭ区画への蛍光色素の漏出を３０分間全く示さなかった細管を漏れ密性であると判断し、そして化合物の曝露のために使用した。上の培地チャネル内の培地を、ＴＲＩＴＣ−デキストラン及び漸増濃度のアスピリンを含む培地と交換した。プレートを、温度とＣＯ２の制御された条件下でＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｉｃｒｏＸＬＳに配置し、そして１時間毎に１３時間かけて蛍光（ＴＲＩＴＣ）シグナルについて画像撮影した。用量反応曲線は、曝露されたＣａｃｏ−２細管のタイムラプスからあらゆる時点において抽出され得る。グラフパッドプリズム６（グラフパッドソフトウェア社、ラホヤ、ＣＡ州）を使用して、上及び下のプラトーを０％及び１００％の蛍光と想定して正規化された蛍光に対する、化合物の濃度の対数の非線形回帰に基づいた用量反応曲線にあてはめた。曝露時間が増えるにつれて、より低い化合物濃度へのシフトが観察される。
【図１０】図１０は、図９のＣａｃｏ−２細管の用量反応のＥＣ５０値の経時的な指数関数的な減少を示す。これは、時間に対して抽出されたＥＣ５０値をプロットした場合に観察される。抽出されたＥＣ５０値の９５％信頼区間は、３時間から１３時間の曝露の頑強なデータを示す。
【図１１】図１１は、アスピリンに曝露された腸管のバリア機能の消失を示す。Ｃａｃｏ−２細胞株（シグマ社、ヒト大腸癌細胞）を、４００μmの３レーンのオルガノプレート（登録商標）に１０×１０６個の細胞/mLで播種し、細胞−ＥＣＭの付着のために横倒しにして２時間置き、そしてその後、持続的な培地灌流のために改変された振盪プラットフォームに配置した。播種から３日後、Ｃａｃｏ−２細管の漏れ密性を、上の灌流チャネル内の培地を、０．２５mg/mLのＴＲＩＴＣデキストラン１５０kDaを含有している培地と交換することによって試験した。ＥＣＭ区画への蛍光色素の漏出を３０分間全く示さなかった細管を漏れ密性であると判断し、そして化合物の曝露のために使用した。上の培地チャネル内の培地を、ＴＲＩＴＣ−デキストラン及び漸増濃度のアスピリンを含む培地と交換した。プレートを、温度とＣＯ２の制御された条件下でＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｉｃｒｏＸＬＳに配置し、そして１時間毎に２４時間かけて蛍光（ＴＲＩＴＣ）シグナルについて画像撮影した。アスピリンは腸に対してあまり強力ではない毒質であるが、蛍光データは、４０mM及び１２．１２mMの濃度においてバリア機能の消失を示す。しかしながら、最大応答を示す濃度に関するデータの欠失は、正確なＥＣ５０の推定を妨害する。しかしながら、ここに示されたカプランマイヤー曲線は、より高濃度でのバリア機能の消失の非常に有意な傾向を示す（曲線の差及び傾向の有意性の両方についてＰ＜０．０００１）。オルガノプレート（登録商標）に基づいたアッセイでは、本発明者らは、４０及び１２mMの濃度の両方並びに３．７mMにおいてさえもバリア完全性の明瞭な消失を観察した。真の用量反応曲線を正確に当てはめることは全くできないが、１０時間の曝露で４０mMにおいて、及び２０時間の曝露で１２mMにおいて５０％の効果が観察された。
【図１２】図１２は、アンホテリシンＢ（amphotecerin B）に曝露されたヒト近位尿細管の薬物により誘発されるバリア完全性の消失についてのカプランマイヤープロットを示す。ヒト近位尿細管細胞（ＲＰＴＥＣ、シグマ社）を、４００μmの３レーンのオルガノプレート（登録商標）に２０×１０６個の細胞/mLで播種し、細胞−ＥＣＭの付着のために横倒しにして一晩置き、そしてその後、持続的な培地灌流のために改変された振盪プラットフォームに配置した。８日間培養後、播種された細管の９５％超が、管腔区画内の培地へのＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaの添加によって漏れ密性であることが示された。細管中の培地を、漸増濃度の腎毒物のアンホテリシンＢ（amphotecerin B）と蛍光ＦＩＴＣ−デキストランとを含有している培地と交換した。プレートを、温度とＣＯ２の制御された条件下でＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｉｃｒｏＸＬＳに配置し、そして１時間毎に６０時間かけて蛍光（ＴＲＩＴＣ）シグナルについて画像撮影した。ここに示される細管完全性の残存率は、曝露されていない細管（培地、ビヒクル対照１及びビヒクル対照２）と曝露された細管との間の有意差を示す。ＩＣは、３つの流出輸送体の阻害剤の阻害剤混液（inhibitor cocktail）を示す。
【図１３】図１３は、細管が、頂端側（管腔側）又は基底外側のみから毒性化合物に曝された場合の漏出時間の差を示す。３レーンのオルガノプレート（登録商標）は、細管構造の頂端側又は基底外側のみから化合物を加えるという特有の可能性を与える。拡散を通して細胞に受動的に進入することができる化合物（例えばスタウロスポリン）は、細胞による取り込みにおいて方向性を全く有さない。能動的に輸送される化合物は、例えば、細管の頂端側から基底外側へと又はその逆に特異的に化合物が移動することが腎ろ過機能の一部であるという近位尿細管の状況のように、経細胞輸送において方向性を有し得る。このことは、近位尿細管細胞によって能動的に輸送される毒性化合物は、曝露の場所に依存して異なる作用を及ぼし得ることを意味する。抗癌薬のシスプラチンは、上皮単層の基底側に発現しているＯＣＴ−２輸送体によって細胞によって取り込まれる。ＭＤＣＫ細胞を、コラーゲンＩ型ＥＣＭに対して２００μmの３レーンオルガノプレート（登録商標）の上のチャネルに１０×１０６個の細胞/mLで播種した。播種の３日後、ＭＤＣＫ細管を、上の培地チャネル内又は下の培地チャネル内のいずれかの培地を、シスプラチンを含む培地と交換することによって、頂端側又は基底側のいずれかから漸増濃度のシスプラチンに曝露させた。曝露開始時に、上のチャネル内の培地に、蛍光漏出マーカーであるＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaも供給した。プレートを、温度とＣＯ２の制御された条件下でＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭｉｃｒｏＸＬＳに配置し、そして３０分毎に１６時間かけて蛍光（ＴＲＩＴＣ）シグナルについて画像撮影した。基底側から曝露された細管についての漏出までの時間は、頂端側から曝露された細管よりも有意により早い。
【図１４】図１４ａは、漸増濃度のテノホビルに６日間曝露された近位尿細管のバリア完全性を示す。曝露後及び細管完全性についての蛍光の解読後、細管内の培地を、新鮮な毒性化合物を含む培地と交換し、そして図１４ａと同じ細管及び以前に曝露されていない細管の完全性を、図１４ｂに示されている７２時間の曝露後に決定した。
【図１５】図１５は、上の培地チャネル内で培養された近位尿細管を含む１つの３レーンのオルガノプレート（登録商標）内の２つの細管構造の共培養を記載し、これは、播種から９日後に、細管の管腔内の培地を交換することによって蛍光ＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDaを用いて探索された。下のチャネル内の細管は、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から構成され、その９日目における完全性をＴＲＩＴＣ−デキストラン１５０kDaを用いて探索する。中央チャネル内のＥＣＭへの蛍光プローブの漏出が図１５にプロットされている。
【図１６】図１６は、播種から様々な日数経過後におけるコラーゲンＩ型ＥＣＭに対する４００μmの２レーンオルガノプレート（登録商標）中で培養された内皮細管の漏れ密性を示し、これは、２５日間にわたる同細管の漏れ密性プロファイルを示す。漏れ密性は、２つの異なるサイズの蛍光標識されたデキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン１５０kDa及びＴＲＩＴＣ−デキストラン２０kDa）によって探索され、これは、サイズの異なる化合物に対するバリア機能の差を示す。
【０１５６】
今回本発明を完全に記載してきたので、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく並びに過度な実験を行なうことなく、様々な等価なパラメーター、濃度、及び条件内で同じことを実施することができることが当業者によって理解されるだろう。
【０１５７】
本発明は、その具体的な実施態様に関して記載してきたが、さらなる改変が可能であることが理解されるだろう。本出願は、一般的に本発明の原則に従い、そして本発明が属する技術分野において公知であるか又は日常的な慣習に該当するような、そして以下のような添付の特許請求の範囲において本明細書で以前に示された本質的な特色に適用され得るような本開示からのこのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変法、使用、又は適用を網羅することを意図する。
【０１５８】
ジャーナル論文又はアブストラクト、公表された又は対応する特許出願、特許、又は任意の他の参考文献をはじめとする、本明細書に引用された全ての参考文献は、全てが参照により本明細書に組み入れられ、これには、引用された参考文献に提示された全てのデータ、表、図、及び本文が含まれる。さらに、本明細書に引用された参考文献の中に引用された参考文献の全内容もまた、全体が参照により組み入れられる。
【０１５９】
公知の方法の工程、慣用的な方法の工程、公知の方法又は慣用的な方法への言及は、いずれにしても、関連技術分野における本発明のあらゆる態様、記載、又は実施態様が開示、教義、又は示唆されているということを認めるものではない。
【０１６０】
具体的な実施態様の前記は、本発明の一般的な性質をとても完全に明らかにするので、他者は、当技術分野の技能範囲内の知識（本明細書に引用された参考文献の内容も含む）を適用することによって、過度の実験を行なうことなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、様々な適用のためにこのような具体的な実施態様を容易に改変及び／又は適応させることができる。それ故、このような適応及び改変は、本明細書に提示された教義及び指針に基づいて、開示された実施態様と同等な意味及び範囲内であるものとする。本明細書の語法又は用語法は説明のためのものであり、制限するためのものではなく、よって、本明細書の用語法又は語法は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示された教義及び指針に鑑みて、当業者によって解釈されるものであることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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