(57)【要約】本発明は、次の構造：Ａ−Ｘ−Ｂを含む核酸構築物であって、式中、ＡおよびＢは、第１のおよび第２の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする核酸配列であり；Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、第１のまたは第２のＰＯＩのいずれかが細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質である、核酸構築物を提供する。一局面において、上記膜貫通タンパク質は、上記細胞内保持シグナルを含むエンドドメインを含む。別の局面において、上記細胞内保持シグナルは、上記膜貫通タンパク質を分泌経路に向かわないように方向付ける。さらに別の局面において、上記細胞内保持シグナルは、上記膜貫通タンパク質を膜結合細胞内コンパートメントへと方向付ける。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
ＡおよびＢは、第１の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）および第２のＰＯＩをコードする核酸配列であり；
Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
前記第１のＰＯＩまたは前記第２のＰＯＩのいずれかが細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質である、核酸構築物。
【請求項２】
前記膜貫通タンパク質が前記細胞内保持シグナルを含むエンドドメインを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記細胞内保持シグナルが前記膜貫通タンパク質を分泌経路に向かわないように方向付ける、請求項１または２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記細胞内保持シグナルが前記膜貫通タンパク質を膜結合細胞内コンパートメントへと方向付ける、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記細胞内保持シグナルが前記膜貫通タンパク質をリソソーム、エンドソームまたはゴルジコンパートメントへと方向付ける、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記細胞内保持シグナルが、次の群：エンドサイトーシスシグナル；ゴルジ保持シグナル；ｔｒａｎｓ−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）リサイクリングシグナル；小胞体（ＥＲ）保持シグナル；およびリソソームソーティングシグナルから選択される、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記細胞内保持シグナルが、チロシンベースソーティングシグナル、ジロイシンベースソーティングシグナル、酸性クラスターシグナル、リソソーム回避シグナル、ＮＰＦＸ’（１，２）Ｄ型シグナル、ＫＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’シグナル（式中Ｘ’は任意のアミノ酸である）である、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記細胞内保持シグナルが、ＮＰＸ’Ｙ、ＹＸ’Ｘ’Ｚ、［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｌ［ＬＩ］、ＤＸ’Ｘ’ＬＬ、ＤＰ［ＦＷ］、ＦＸ’ＤＸ’Ｆ、ＮＰＦ、ＬＺＸ’Ｚ［ＤＥ］、ＬＬＤＬＬ、ＰＷＤＬＷ、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’の群から選択される配列を含み；式中Ｘ’は任意のアミノ酸であり、Ｚ’はかさ高い疎水性側鎖を有するアミノ酸である、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記細胞内保持シグナルが、表２から６に示される任意の配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記細胞内保持シグナルが、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＹＲＰ）−１細胞内保持シグナルまたはアデノウイルスＥ３／１９Ｋ保持シグナルを含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記細胞内保持シグナルが、配列ＮＱＰＬＬＴＤ（配列番号３５）、ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号３６）またはＤＥＫＫＭＰ（配列番号３７）を含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記細胞内保持シグナルが、前記膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに対して近位である、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記細胞内保持シグナルが、前記膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに対して遠位である、請求項１から１１のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１４】
Ｘが、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位をコードする核酸配列である、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１５】
Ｘが、アフトもしくはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドをコードする、請求項１４に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記膜貫通タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記第１のＰＯＩおよび前記第２のＰＯＩのそれぞれが膜貫通タンパク質であり、前記膜貫通タンパク質の少なくとも１つが、請求項３から１１のいずれかに記載の細胞内保持シグナルを含む、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記第１のＰＯＩおよび前記第２のＰＯＩの１つまたは両方が、１回貫通型膜貫通タンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記第１のＰＯＩおよび前記第２のＰＯＩの１つまたは両方が、Ｉ型膜貫通タンパク質である、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａ、ＢおよびＣは、第１の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）、第２のＰＯＩおよび第３のＰＯＩをコードする核酸配列であり；
ＸおよびＹは、同じまたは異なっていてよい核酸配列であり、それぞれが切断部位をコードし、
前記ＰＯＩの少なくとも２つが細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質である、核酸構築物。
【請求項２１】
膜貫通タンパク質であり、細胞内保持シグナルを含む前記少なくとも２つが：
（ａ）異なる細胞内保持シグナルを含む；および／または
（ｂ）前記核酸が細胞において発現される場合に、細胞表面での前記少なくとも２つのＰＯＩの相対発現に差があるように前記ＰＯＩ中の異なる位置に位置している前記細胞内保持シグナルを有する、
請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【請求項２４】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の核酸構築物または請求項２２もしくは２３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２５】
膜貫通タンパク質をコードする核酸配列中に細胞内保持シグナルを含めることによって、第２のタンパク質を伴って単一の核酸構築物から発現される前記膜貫通タンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法。
【請求項２６】
前記核酸配列が、請求項１から２１のいずれかにおいて規定される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一のベクターから共発現されるポリペプチドの相対発現を調節するための構築物および手法に関する。具体的には本発明は、第２のポリペプチドを伴って単一のベクターから共発現される膜貫通タンパク質の発現を調節することに関する。
【背景技術】
【０００２】
同じ細胞の複数回の形質導入が困難で費用がかかり予測不可能であることから、異なるタンパク質を同じベクターから発現することがしばしば望ましい。したがってさまざまな方法が単一のベクターからの２つのタンパク質の共発現を可能にするために開発された（図１を参照されたい）。
【０００３】
最初の試みは、同じカセット内の２つの異なるプロモーターを使用した。これは、別々のタンパク質をそれぞれコードする２つの別々の転写物をもたらす。これは、多くの原因により困難な手法である。重要な課題は、一方のプロモーターが優位になり、第２のプロモーターのサイレンシングを生じる「プロモーター干渉」である。加えて異なるプロモーターは、異なる細胞コンテキストにおいて異なって作動し、これは各導入遺伝子の相対的発現の調和のとれた「調整」を達成することを困難にする。
【０００４】
代替的手法は、配列内リボソーム侵入配列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）を使用することである。ここで単一の転写物が生成される。転写物中のＩＲＥＳ配列は、２つの導入遺伝子のオープンリーディングフレームの間に置かれ、ｍＲＮＡキャップ構造を模倣する。それによりリボソームは、５’キャップまたはＩＲＥＳのいずれかで翻訳を開始し、２つの別々のタンパク質の発現をもたらす。この手法の重要な制限は、相対的発現を制御できないことである。３’転写物は、典型的には５’のものより少なく発現されるが、発現の比を予測および調整することは困難である。
さらなる手法は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（および関連ウイルス）が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から複数のタンパク質を発現できるようにする口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチドの役割の特徴付けに続いて提供された（Donnellyら；J.  Gen.  Virol.；８２巻、１０２７〜１０４１頁（２００１年））。２Ａペプチド（およびホモログ）は、ＯＲＦの翻訳直後に非常に高い効率で切断され、単一のＯＲＦからの複数のペプチドの発現を可能にする。同じＯＲＦ中の異なるペプチド間で切断する２Ａペプチドの使用に伴う課題は、発現が１：１の比に限定されることである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１年）；８２巻、１０２７〜１０４１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、上に記載の不利益を伴わずに単一のベクターから１つより多いタンパク質を発現するための代替方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、膜貫通タンパク質が第２のタンパク質と共に、翻訳後に、続いて切断されて両タンパク質が分離されるポリタンパク質として共発現される場合に、膜貫通タンパク質への細胞内保持シグナルの組み込みが、細胞表面への輸送を低減することによっておよび／または細胞表面でのその半減期を低減することによって、膜貫通タンパク質の細胞表面発現を第２のタンパク質と比較して調節できるようになるという測定に基づいている。これは導入遺伝子の対に限定される必要はなく、ポリタンパク質として最初に翻訳される複数のタンパク質の相対発現の制御を可能にするために使用されてよい。
【０００８】
本明細書において使用される「ポリタンパク質」は、単一の核酸構築物から単一の実体として翻訳されるが、次いで分離され、別々の実体（例えば別々のタンパク質）として機能するポリペプチド配列を含むポリペプチド配列を指す。
【０００９】
したがって第一態様では本発明は、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
ＡおよびＢは、第１のおよび第２の目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸配列であり；
Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
第１のまたは第２のＰＯＩのいずれかが細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質である、核酸構築物を提供する。
【００１０】
細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質に対して異種である、すなわち膜貫通タンパク質（またはその一部）の「野生型」バージョンには存在せず、組換え手段によって導入される。細胞内保持シグナルは、合成または別の生物もしくは別のタンパク質から誘導可能であってよい。
【００１１】
膜貫通タンパク質のエンドドメインは、細胞内保持シグナルを含んでよい。
【００１２】
細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質を分泌経路に向かわないように、および／またはリソソーム（lysozomal）、エンドソームもしくはゴルジコンパートメントなどの膜結合細胞内コンパートメントへと方向付けてよい。
【００１３】
細胞内保持シグナルは、例えばチロシンベースソーティングシグナル、ジロイシンベースソーティングシグナル、酸性クラスターシグナル、リソソーム回避シグナル、ＮＰＦＸ’（１，２）Ｄ−型シグナル、ＫＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’シグナル（Ｘ’は任意のアミノ酸である）であってよい。
【００１４】
細胞内保持シグナルは：ＮＰＸ’Ｙ、ＹＸ’Ｘ’Ｚ’、［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｌ［ＬＩ］、ＤＸ’Ｘ’ＬＬ、ＤＰ［ＦＷ］、ＦＸ’ＤＸ’Ｆ、ＮＰＦ、ＬＺＸ’Ｚ［ＤＥ］、ＬＬＤＬＬ、ＰＷＤＬＷ、ＫＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’；の群から選択される配列を含んでよく、式中Ｘ’は任意のアミノ酸であり、Ｚ’はかさ高い疎水性側鎖を有するアミノ酸である。
【００１５】
細胞内保持シグナルは、表１から５に示す配列のいずれかを含んでよい。
【００１６】
細胞内保持シグナルは、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＹＲＰ）−１細胞内保持シグナルを含んでよい。細胞内保持シグナルは、ＴＹＲＰ−１細胞内ドメインを含んでよい。細胞内保持シグナルは、配列ＮＱＰＬＬＴＤ（配列番号３５）を含んでよい。
【００１７】
細胞内保持シグナルは、アデノウイルスＥ３／１９Ｋ細胞内保持シグナルを含んでよい。細胞内保持シグナルは、Ｅ３／１９Ｋサイトゾルドメインを含んでよい。細胞内保持シグナルは、配列ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号３６）；またはＤＥＫＫＭＰ（配列番号３７）を含んでよい。
【００１８】
細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに対して近位または遠位であってよい。
【００１９】
Ｘは、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位をコードする核酸配列であってよい。
【００２０】
Ｘは、アフトもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドをコードする核酸配列であってよい。
【００２１】
膜貫通タンパク質は、任意のトランスジェニックで発現される膜貫通タンパク質であってよい。
【００２２】
膜貫通タンパク質は：４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８および関連分子などの興奮性受容体；またはＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＩＲ１、ＣＤ２２および関連分子などの抑制性受容体；またはＩＬ１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒおよび関連分子などのサイトカイン受容体分子；またはＮ−ＣＡＭ、Ｖ−ＣＡＭ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＬＦＡ−１、ＣＤＨ１−３、セレクチンもしくはインテグリンなどのホーミング分子；の一覧から選択されてよい。
【００２３】
膜貫通タンパク質は、自殺遺伝子またはマーカー遺伝子などの合成タンパク質であってよい。
【００２４】
膜貫通タンパク質は、Ｔ細胞受容体のαおよび／またはβ鎖であるか、またはそれを含み得る。
【００２５】
膜貫通タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。
【００２６】
第１のおよび第２のＰＯＩのいずれかまたは両方は膜貫通タンパク質であってよく；膜貫通タンパク質のいずれかまたは両方は、本明細書で規定される細胞内保持シグナルを含んでよい。
【００２７】
第１のおよび第２のＰＯＩのいずれかまたは両方は、Ｉ型膜貫通タンパク質などの１回貫通型膜貫通タンパク質であってよい。
【００２８】
細胞表面で発現される細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質の量は、細胞内保持シグナルを含まない同じ核酸構築物から発現される膜貫通タンパク質と比較して例えば９０％、７０％、５０％または３０％未満であってよい。
【００２９】
本発明は、２つより多い目的のタンパク質をコードする核酸構築物も提供する。例えば一実施形態では本発明は、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａ、ＢおよびＣは、第１の、第２のおよび第３の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする核酸配列であり；
ＸおよびＹは同じまたは異なっていてよい核酸配列であり、それぞれが切断部位をコードし、
ＰＯＩの少なくとも２つが細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質である、核酸構築物を提供する。
【００３０】
本実施形態では少なくとも２つのＰＯＩは：
（ａ）異なる細胞内保持シグナルを含んでよい；および／または
（ｂ）核酸が細胞において発現される場合に細胞表面で少なくとも２つのＰＯＩの相対発現に差があるように、ＰＯＩ中の異なる位置に位置する細胞内保持シグナルを有してよい。
【００３１】
第二の態様では本発明は、本発明の第一の態様による核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００３２】
ベクターは、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであってよい。
【００３３】
第三の態様では本発明は、本発明の第一の態様による核酸構築物または本発明の第二の態様によるベクターを含む細胞を提供する。
【００３４】
本発明は、膜貫通タンパク質をコードする核酸配列中に細胞内保持シグナルを含めることによって、第２のタンパク質を伴ってポリタンパク質として単一の核酸から発現される膜貫通タンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法にさらに関する。
【００３５】
膜貫通タンパク質中へ細胞内保持シグナルを含めると、細胞表面で発現される膜貫通タンパク質の量が低減される。そのように第２のポリペプチドを含むポリタンパク質由来の膜貫通タンパク質の相対発現レベルは、調節され得る。膜貫通タンパク質が細胞表面でだけ活性（または細胞表面で主に活性）である場合、タンパク質の相対的な細胞表面発現を低減すると、その相対活性も低減される。
【００３６】
本発明は、連結されたポリペプチドとして発現され、切断部位によって分離される３つまたはそれを超えるタンパク質の相対発現およびさまざまな活性の保持シグナルによって決定される相対表面発現を調節するために拡張されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、同じベクターから異なるタンパク質を発現するために利用される方法を示す図であり、（ａ）同じカセット内の２つの異なるプロモーターは、それぞれ別々のタンパク質をもたらす２つの異なる転写物を生じる。（ｂ）配列内リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）の使用は、２つの別々のタンパク質に翻訳される単一の転写物をもたらす。（ｃ）ＦＭＤＶ２Ａペプチドの使用は、迅速に２つの別々のタンパク質に切断される単一の転写物および単一のポリタンパク質を生じる。
【００３８】
【図２−１】図２は、ＴＹＲＰ１エンドドメインが、複合体エンドドメインを有する膜貫通タンパク質が保持されるように方向付けることができることを示す図である。Ｔｙｒｐ１は、Ｉ型膜貫通タンパク質、５３７ａａ長である。タンパク質を細胞内コンパートメント内に保持するジロイシンモチーフは、細胞質ドメイン上の黒四角として示される。（Ａ）Ｔｙｒｐ１（ｗｔ）。野生型Ｔｙｒｐ１は、ペプチドシグナル、内腔ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる。細胞質ドメインはジロイシン保持シグナルを含有する。（Ｂ）Ｔｙｒｐ１（ｗｔ）−ＳＧリンカー−ｅＧＦＰ。この構築物は、セリン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンリンカーを介してｅＧＦＰに単純に融合された野生型Ｔｙｒｐ１を含有する。Ｔｙｒｐ１−Ｌ−ｅＧＦＰは、細胞質近位Ｔｙｒｐ１を表している。（Ｃ）Ｔｙｒｐ１内腔（ＬＭ）−膜貫通（ＴＭ）−ＳＧリンカー−ｅＧＦＰ−Ｔｙｒｐ１細胞質（ＣＰ）。この構築物は、ＳＧリンカー−ｅＧＦＰが膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入されていることから、細胞質−遠位Ｔｙｒｐ１を構成する。Ｄ：Ｔｙｒｐ１内腔（ＬＭ）−膜貫通（ＴＭ）−ＳＧリンカー−ｅＧＦＰ。保持シグナルを含有する細胞質ドメインが除外されたことから、この構築物は陽性対照として役立つ。すべての構築物は、ＩＲＥＳ．ＣＤ３４と共発現される。形質導入ＳｕｐＴ１細胞の染色は、細胞内および表面染色で、下左／右にそれぞれ示されている。
【図２−２】同上
【図２−３】同上
【００３９】
【図３−１】図３は、初代細胞におけるＴＹＲＰ１保持シグナルの機能性を示す図である。ＦＭＤ−２Ａ様ペプチドを使用して抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３３ＣＡＲを共発現する構築物が生成された。この構築物の２つの改変体も生成された：第１の改変体では、ＴＹＲＰ１由来ジロイシンモチーフがＴＭドメインに対してすぐ近位の抗ＣＤ１９ＣＡＲエンドドメインに挿入された；第２の改変体では同じＴＹＲＰ１ジロイシンモチーフが抗ＣＤ１９ＣＡＲエンドドメインのカルボキシ末端に付着された。ＰＢＭＣは、血液から単離され、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して刺激された。２日後、細胞はレトロネクチンコートプレート上でさまざまなＣＤ１９：ＣＤ３３ＣＡＲ構築物を含有しているレトロウイルスで形質導入された。５日目に構築物によって翻訳された２つのＣＡＲの発現レベルは、組換えＣＤ１９−ＦｃおよびＣＤ３３−Ｆｃ融合体を使用するフローサイトメトリーを介して評価された。Ａ．共発現を可能にするように構築された合成遺伝子の模式図を示す；Ｂ．３つの構築物によって生成されたタンパク質の続く対の模式図を示す；Ｃ．フローサイトメトリーによる２つの受容体の発現を示す。元の構築物では、両方のＣＡＲは等しく発現される。抗ＣＤ１９ＣＡＲのエンドドメイン中の遠位でのジロイシンモチーフの組み込みでは、ＣＤ３３ＣＡＲ発現は一定のままであるがＣＤ１９発現は中程度のレベルに降下する。抗ＣＤ１９ＣＡＲのエンドドメイン中の近位でのジロイシンモチーフの組み込みでは、ＣＤ３３ＣＡＲ発現は一定のままであるが、ＣＤ１９発現は低レベルに降下する。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【００４０】
【図４】図４は、Ｅ３／１９Ｋのサイトゾルテール由来の保持シグナルを示す図である。ＦＭＤ−２Ａ様ペプチドを使用して抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３３ＣＡＲを共発現する構築物が生成された。この構築物の２つの改変体も生成された：第１の改変体では、そのゴルジ／ＥＲ保持能力のために必須であることが見出されたＥ３／１９Ｋ由来の最後の６ａａ（ＤＥＫＫＭＰ）は、抗ＣＤ３３ＣＡＲエンドドメインのカルボキシ末端に付着され；第２改変体では、アデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質のサイトゾルテール全体は抗ＣＤ３３ＣＡＲエンドドメインのカルボキシ末端に付着された。
【００４１】
【図５】図５は、Ｅ３／１９Ｋ保持シグナルの機能性を示す図である。図４に示す構築物は、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、構築物によって翻訳された２つのＣＡＲの発現レベルは、組換えＣＤ１９−ＦｃおよびＣＤ３３−Ｆｃ融合体を使用してフローサイトメトリーを介して評価された。全長アデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質またはＤＥＫＫＭＰモチーフが抗ＣＤ３３受容体に置かれた場合に明確な保持が観察された。抗ＣＤ１９受容体発現レベルは影響を受けなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
ＡおよびＢは、第１のおよび第２の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする核酸配列であり；
Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
第１のまたは第２のＰＯＩのいずれかが細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質である、核酸構築物を提供する。
【００４３】
膜貫通タンパク質
本発明は、膜貫通表面タンパク質の相対発現の調節を可能にする。膜貫通表面タンパク質は、細胞内保持シグナルが存在しない場合は細胞表面で発現されるタンパク質である。細胞表面で発現される場合、膜貫通タンパク質の少なくとも１つのドメインは外細胞質（exoplasmic）（すなわち細胞の外部）にある。
【００４４】
膜貫通タンパク質は、１回貫通型膜貫通タンパク質であってよい、すなわち単一の膜貫通ドメインを含んでよい、または複数の膜貫通ドメインを含んでよい。
【００４５】
膜貫通タンパク質は、トポロジーによって、すなわちＮおよびＣ末端ドメインの位置に関して分類できる。Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型膜貫通タンパク質が１回貫通型分子である一方で、ＩＶ型膜貫通タンパク質は複数回貫通型分子である。Ｉ型膜貫通タンパク質は輸送停止アンカー(stop-transfer  anchor)配列で脂質膜に係留され、それらのＮ末端ドメインを合成の際にＥＲ内腔（および細胞外空間、成熟形態が細胞膜に位置する場合）へと標的化する。ＩＩおよびＩＩＩ型はシグナルアンカー配列で係留され、ＩＩ型はＣ末端ドメインでＥＲ内腔へと標的化され、一方ＩＩＩ型はそれらのＮ末端ドメインがＥＲ内腔へと標的化されている。ＩＶ型はＩＶ−Ａにさらに分類され、それらのＮ末端ドメインはサイトゾルへと標的化され、ＩＶ−Ｂは内腔へと標的化されたＮ末端ドメインを有する。
【００４６】
本発明の膜貫通タンパク質（複数可）は、Ｉ〜ＩＶ型のいずれかであってよい。
【００４７】
膜貫通ドメインは、膜で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であってよい。これは、典型的にはいくつかの疎水性残基からなるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは、膜貫通部分を供給するために使用されてよい。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および長さはＴＭＨＭＭアルゴリズム（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）を使用して当業者によって決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜に及ぶ十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であることを考慮すると、人工的に設計されたＴＭドメインも使用されてよい（ＵＳ７０５２９０６  Ｂ１は合成膜貫通構成成分を記載している）。
【００４８】
膜貫通ドメインは、ＣＤ２８由来であってよく、良好な安定性をもたらす。
【００４９】
Ｉ型膜貫通タンパク質の構造およびプロセシングは、当技術分野において周知である。そのようなタンパク質は、典型的には細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内エンドドメインを含み、細胞膜を通る単一のα−ヘリックスを有する１回貫通型分子である。
【００５０】
Ｉ型膜貫通タンパク質は小胞体（ＥＲ）によって迅速に認識されるシグナルペプチドを典型的には有し、したがって翻訳中のタンパク質は迅速にＥＲへと再方向付けされる。疎水性ヘリックスは、タンパク質をＥＲの膜にロックし、次いで係留する。
【００５１】
上述のとおりＩ型膜貫通タンパク質は、脂質膜に輸送停止アンカー配列で係留されている。輸送停止配列は、ポリペプチドのさらなるトランスロケーションを停止し、膜貫通アンカーとして作用する。
【００５２】
本明細書において使用される用語Ｉ型膜貫通タンパク質は、Ｉ型膜貫通ドメインおよび輸送停止アンカー配列を含み、外因性細胞内保持シグナルの非存在下で細胞表面で発現されるように標的化されている任意のタンパク質を包含する。
【００５３】
本発明における使用のために好適である種々の１型膜貫通タンパク質は、当技術分野において公知である。そのようなタンパク質として、これだけに限らないが抑制受容体、刺激受容体、サイトカイン受容体およびＧタンパク質が挙げられる。
【００５４】
膜貫通タンパク質（複数可）は、Ｔ細胞受容体αまたはβ鎖であってよい。
【００５５】
膜貫通タンパク質（複数可）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。
【００５６】
ＣＡＲは、抗原結合ドメインをＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常形態は、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて接続されている抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質のものである。
【００５７】
抗原結合ドメインは、抗体もしくは抗体模倣物から誘導されてよく、またはリガンドなど抗原に特異的に結合する別の実体であってよい。
【００５８】
これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導され、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合されている１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化を生じる。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現する場合、それらは標的抗原を発現している標的細胞を認識し、死滅させる。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入手法が種々のがんの処置のために現在臨床試験中である。
【００５９】
シグナル伝達エンドドメインが別の分子上に存在することも可能である。本発明と関連して用語「ＣＡＲ」は、膜貫通ドメインに接続された抗原結合ドメインを含む分子も包含する。そのようなＣＡＲは、Ｔ細胞活性化を刺激するように細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用できる。
【００６０】
本発明では核酸配列ＡまたはＢのいずれかは、細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質をコードする核酸配列であってよい。
【００６１】
目的の大部分の膜貫通タンパク質は、細胞膜にある場合にかぎり活性であるまたは主に活性である。したがってある割合のタンパク質を細胞内に保持させることは、細胞表面でのタンパク質の相対発現を低減し、それによりタンパク質の相対活性を低減する。
【００６２】
シグナル配列
膜貫通タンパク質は、膜貫通タンパク質が細胞内で発現される場合に新生タンパク質が小胞体（ＥＲ）へと方向付けられるようにシグナル配列も含んでよい。
【００６３】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含有する場合がある。シグナルペプチドは、トランスロケーションの際のポリペプチドの適切なトポロジーを強化することに役立つ正に荷電したアミノ酸の短いストレッチで始まる場合がある。シグナルペプチドの末端にシグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸のストレッチが典型的にはある。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーションの際またはその完了後のいずれかで切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成する。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。
【００６４】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってよい。
【００６５】
切断部位
本核酸構築物は、第１のおよび第２のポリペプチドが別々の実体として発現され得るように、第１のおよび第２のポリペプチドをコードする核酸配列の間に位置する切断部位をコードする配列を含む。
【００６６】
切断部位は、第１のおよび第２のＰＯＩを含むポリペプチドが分離され得るようにする任意の配列であってよい。
【００６７】
用語「切断」は本明細書において便宜的に使用されるが、切断部位は古典的切断以外の機序によって第１のおよび第２のＰＯＩを個々の実体に分離させることができる。例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（下記を参照されたい）について、種々のモデルが、「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解（autoproteolysis）または翻訳効果の原因を説明するために提案されている（Donnellyら（２００１年）J.  Gen.  Virol.  ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。そのような「切断」の正確な機序は、切断部位が第１のおよび第２のポリペプチドをコードする核酸配列間に位置する場合に、第１のおよび第２のポリペプチドが別々の実体として発現されるようにする限り、本発明の目的のために重要ではない。
【００６８】
切断部位はフューリン切断部位であってよい。
【００６９】
フューリンは、サブチリシン様プロプロテインコンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な産生物にプロセシングするプロプロテインコンバターゼである。フューリンは、対合した塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断できるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリン基質の例として、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜１型マトリクスメタロプロテイナーゼ、プロ神経増殖因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブランド因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列のすぐ下流（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）でタンパク質を切断し、ゴルジ装置で豊富である。
【００７０】
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であってよい。
【００７１】
ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって融合タンパク質の制御された切断のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（式中「＼」は切断されるペプチド結合を示す）である。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼも哺乳動物細胞において発現されなければならない。
【００７２】
切断部位は、自己切断ペプチドをコードしてよい。
【００７３】
「自己切断ペプチド」は、第１のおよび第２のＰＯＩを含むポリペプチドおよび自己切断ペプチドが産生されると、それがいかなる外部の切断活性も必要とすることなく別個の分離した第１のおよび第２のポリペプチドに直ちに「切断される」または分離されるように機能するペプチドを指す。
【００７４】
自己切断ペプチドは、アフトまたはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドであってよい。アフト（aptho）およびカルジオウイルスの主な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短いセクションであり、これは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共にそれ自体のＣ末端での「切断」を媒介できる自律的エレメントを表す。
【００７５】
長いカルジオウイルスタンパク質のＣ末端１９アミノ酸は、２ＢのＮ末端プロリンと共に、アフトウイルスＦＭＤＶ２ａ配列とほぼ等しい効率で「切断」を媒介する。カルジオウイルスは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）およびタイラーマウス脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）を含む。
【００７６】
ＥＭＣＶおよびＦＭＤＶ２Ａの変異解析は、モチーフＤｘＥｘＮＰＧＰが「切断」活性に本質的に関与していることを明らかにした（Donellyら（２００１年）上記）。
【００７７】
本発明の切断部位は、アミノ酸配列：
Ｄｘ１Ｅｘ２ＮＰＧＰ、を含んでよく、式中ｘ１およびｘ２は任意のアミノ酸である。Ｘ１は次の群：Ｉ、Ｖ、ＭおよびＳから選択されてよい。Ｘ２は次の群：Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、ＱおよびＦから選択されてよい。
【００７８】
例えば切断部位は、表１に示すアミノ酸配列の１つを含んでよい。
【表１−１】
2018514208.tif 000002
【表１−２】
2018514208.tif 000003
【００７９】
２Ａ配列に基づく切断部位は、例えば長さ１５〜２２アミノ酸であってよい。配列は、２Ａタンパク質のＣ末端を含んでよく、プロリン残基（２ＢのＮ末端プロリンに相当する）が続く。
【００８０】
変異研究は、天然に存在する２Ａ配列に加えて一部の改変体も活性であることを示した。切断部位は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有し、２つまたはそれを超える別々のタンパク質へのポリタンパク質配列の「切断」を誘導する能力を保持している、天然に存在する２Ａポリペプチド由来の改変体配列に相当する場合がある。
【００８１】
切断配列は、全てある程度活性であることが示されている次のものから選択されてよい（Donnellyら（２００１年）上記）：
【化１】
2018514208.tif 000004
【００８２】
ＤｘＥｘＮＰＧＰの配列に基づいて「モチーフ、「２Ａ様」配列は、アフトまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスならびにトリパノソーマ種および細菌性配列内の反復配列において見出された（Donnellyら（２００１年）上記）。切断部位は：
【化２】
2018514208.tif 000005
などのこれらの２Ａ様配列の１つを含んでよい。
【００８３】
切断部位は、
【化３】
2018514208.tif 000006
として示す２Ａ様配列を含んでよい。
【００８４】
５から３９アミノ酸の間のＮ末端「伸長」を含むことが活性を増加させることができることが示された（Donnellyら（２００１年）上記）。具体的には切断配列は、次の配列の１つ、または例えば切断部位活性を保持して５つまでのアミノ酸変更を有するその改変体を含んでよい：
【化４】
2018514208.tif 000007
【００８５】
細胞内保持シグナル
本発明の核酸構築物は、細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質をコードする配列を含む。
【００８６】
タンパク質標的化またはタンパク質ソーティングは、それによりタンパク質が細胞中またはその外の適切な目的地に輸送される生物学的機構である。タンパク質は、小器官の内部空間、さまざまな細胞内膜、細胞膜または分泌を介して細胞の外部へと標的化され得る。この送達工程は、タンパク質それ自体に含有される配列情報に基づいて実行される。
【００８７】
真核細胞の粗面小胞体（ＥＲ）で合成されたタンパク質は、それらの最終目的地への輸送のために細胞外経路（exocytic  pathway）を使用する。特別なソーティングシグナルを持たないタンパク質は、ＥＲからゴルジおよびｔｒａｎｓ−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を介して細胞膜にベクトル的に輸送される。他のタンパク質は、エンドソームおよびリソソームなどの細胞外経路の特定の小器官への取り込みのための標的化シグナルを有する。
【００８８】
リソソームは、そこで内因性および内部移行する高分子が内腔ヒドロラーゼ（hydolase）によって分解される酸性小器官である。内因性高分子は、そこからそれらがエンドソームに、次いでリソソームに輸送されるＴＧＮにおいてソートされることによってリソソームに達する。
【００８９】
タンパク質を正しい細胞内位置にソートするために細胞によって使用される標的化シグナルは、本発明によって活用され得る。シグナルは、次の種類に大まかに分類できる：
ｉ）エンドサイトーシスシグナル
ｉｉ）ゴルジ保持シグナル
ｉｉｉ）ＴＧＮリサイクリングシグナル
ｉｖ）ＥＲ保持シグナル
ｖ）リソソームソーティングシグナル
【００９０】
「細胞内保持シグナル」は、それを含むタンパク質を細胞表面膜または細胞の外部ではなく細胞内コンパートメントへと方向付けるアミノ酸配列を指す。
【００９１】
細胞内保持シグナルは、細胞内保持シグナルを含まない対応する対照膜貫通タンパク質と比較して細胞の表面上に発現される膜貫通タンパク質の量の低減を生じる。
【００９２】
言い換えると、細胞内保持シグナルを含む翻訳された膜貫通タンパク質が細胞表面に発現される割合は、対応する量の、細胞内保持シグナルを含まない翻訳された対応する対照膜貫通タンパク質における割合より少ない。
【００９３】
例えば、細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質の細胞の表面に発現される量は、細胞内保持シグナルを含まない対応する対照膜貫通タンパク質の量の７５％未満、５０％未満、２５％未満または１０％未満である場合がある。
【００９４】
プロテアーゼによって次に切断されるポリタンパク質を発現する構築物は、ポリタンパク質からのペプチドの発現が１：１の比に限定されるという事実によって一般に限定される。しかし本発明では、膜貫通タンパク質中の細胞内保持シグナルを含めることは、細胞表面上でのその発現が調節され得る（例えば細胞内保持シグナルを含まない対応する対照膜貫通タンパク質と比較して低減される）ことを意味する。このように、細胞内保持シグナルを含む細胞表面上に発現される膜貫通タンパク質とポリタンパク質中に発現される第２のタンパク質の発現とを比較した比は、１：１．５〜１：２、１：２〜１：３、１：３〜１：４、１：４〜１：５または１：５を超える、例えば約１：１．５であり得る。
【００９５】
細胞の表面に発現される膜貫通タンパク質の量は、当技術分野において公知である方法、例えばフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を使用して決定され得る。
【００９６】
細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質をＥＲからのトランスロケーションの際に分泌経路に向かわないように方向付けることができる。
【００９７】
細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質を細胞内コンパートメントまたは複合体へと方向付けることができる。細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質を膜結合細胞内コンパートメントへと方向付けることができる。
【００９８】
例えば細胞内保持シグナルは、タンパク質をリソソーム、エンドソームまたはゴルジコンパートメント（ｔｒａｎｓ−ゴルジネットワーク、「ＴＧＮ」）へと方向付けることができる。
【００９９】
正常細胞内では、生物発生またはエンドサイトーシス経路から生じたタンパク質は、逐次的なセットのソーティング決定に続いて適切な細胞内コンパートメントにソートされる。細胞膜ではタンパク質は、細胞表面に留まるまたはエンドソームに内部移行される、のいずれかであり得る。ＴＧＮでは選択は、細胞膜に移行するまたはエンドソームに向けられる、のいずれかである。エンドソームではタンパク質は、細胞膜に再生されるまたはリソソームに行く、のいずれかであり得る。これらの決定は、タンパク質それ自体の上のソーティングシグナルによって管理されている。
【０１００】
リソソームは、老廃物および細胞残渣を分解する酸性ヒドロラーゼ酵素を含有する細胞小器官である。リソソーム周囲の膜は、消化酵素がそれらが必要とするｐＨで作用できるようにする。リソソームは自己貪食空胞（ファゴソーム）と融合し、それらの酵素を自己貪食空胞に与え、それらの内容物を消化する。
【０１０１】
エンドソームは、真核細胞内の膜結合コンパートメントである。それは、細胞膜からリソソームへのエンドサイトーシス膜輸送経路のコンパートメントであり、物質が分解性リソソームに達する前にソートされるための環境を提供している。エンドソームは、形質膜陥入された物質がそれらに達するまでにかかる時間に応じて初期エンドソーム、後期エンドソームまたはリサイクリングエンドソームとして分類される場合がある。本発明において使用される細胞内保持シグナルは、タンパク質を後期エンドソームのコンパートメントへと方向付けることができる。
【０１０２】
ゴルジ装置は、細胞性内膜系の一部であり、ゴルジ装置はタンパク質をそれらの目的地に送られる前に細胞内にパッケージングする；それは、分泌のためのタンパク質のプロセシングにおいて特に重要である。
【０１０３】
公知のタンパク質に存在するソーティングシグナルおよびそれらの配列および／または分子内位置を変更する影響を調査する研究からもたらされた相当な知識体系がある（BonifacinoおよびTraub（２００３年）Ann.  Rev.  Biochem.  ７２巻：３９５〜４４７頁；BraulkeおよびBonifacino（２００９年）Biochimica  and  Biophysica  Acta  １７９３巻：６０５〜６１４頁；Griffith（２００１年）Current  Biology  １１巻：Ｒ２２６〜Ｒ２２８頁；MellmanおよびNelson（２００８年）Nat  Rev  Mol  Cell  Biol.  ９巻：８３３〜８４５頁；Dell’AngelicaおよびPayne（２００１年）Cell  １０６巻：３９５〜３９８頁；Schaferら（１９９５年）EMBO  J.  １４巻：２４２４〜２４３５頁；Trejo（２００５年）Mol.  Pharmacol.  ６７巻：１３８８〜１３９０頁）。多数の研究は、目的のタンパク質の細胞内位置を変更するために目的のタンパク質に１つまたは複数のソーティングシグナルを挿入することが可能であることを示している（Pelham（２０００年）Meth.  Enzymol.  ３２７巻：２７９〜２８３頁）。
【０１０４】
したがって、所望の局所化特性を有するソーティングシグナルを選択し、タンパク質の細胞内位置を方向付けるために目的のタンパク質内にそれを含めることは完全に可能である。本出願に関連して、細胞膜での発現が所望の量だけ低減しているソーティングシグナルを選択することは可能である。
【０１０５】
目的の新生タンパク質でのソーティングシグナルの最適な位置は、膜貫通タンパク質の型（すなわちＩ〜ＩＶ型）およびＣ末端が膜の内腔側にあるまたは細胞質側にあるかどうかに依存する可能性がある（GoderおよびSpiess（２００１年）FEBS  Lett  ５０４巻：８７〜９３頁）。これは、その天然タンパク質でのソーティングシグナルの位置を考慮することによって容易に決定され得る。
【０１０６】
エンドサイトーシスシグナルの例は、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体由来のものを含む。
【０１０７】
ＴＧＮ−エンドソームリサイクリングを生じるシグナルの例は、ＣＩ−およびＣＤ−ＭＰＲ、ソーティリン、ＬＤＬ−受容体関連タンパク質ＬＲＰ３およびＬＲＰ１０およびβ−セクレターゼ、ＧＧＡ１−３、ＬＩＭＰ−ＩＩ、ＮＣＰ１、ムコリピン（mucolipn）−１、シアリン（sialin）、ＧＬＵＴ８およびインバリアント鎖などのタンパク質由来のものを含む。
【０１０８】
ＴＧＮ保持シグナルの例は、ＴＧＮに局在化されている次のタンパク質由来のものを含む：プロホルモンプロセシング酵素フューリン、ＰＣ７、ＣＰＤおよびＰＡＭ；ヘルペスウイルス３の糖タンパク質ＥおよびＴＧＮ３８。
【０１０９】
ＥＲ保持シグナルの例は、ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸまたはＫＸＫＸＸなどのＣ末端シグナルおよびカリウムチャネルのＲＸＲ（Ｒ）モチーフを含む。公知のＥＲタンパク質は、アデノウイルスＥ１９タンパク質およびＥＲＧＩＣ５３を含む。
【０１１０】
リソソームソーティングシグナルの例は、ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２、ＣＤ６３、ＣＤ６８、エンドリン（endolyn）、ＤＣ−ＬＡＭＰ、シスチノシン（cystinosin）、糖リン酸交換体（sugar  phosphate  exchanger）２および酸性ホスファターゼなどのリソソーム膜タンパク質において見出されるものを含む。
【０１１１】
細胞内保持シグナルは、アデノウイルスＥ１９タンパク質由来であってよい。細胞内保持シグナルは、Ｅ３ｇｐ  １９ｋＤａ；Ｅ１９またはＧＰ１９Ｋとしても公知であるタンパク質Ｅ３／１９Ｋ由来であってよい。細胞内保持シグナルは、配列番号３６としても示されるＥ３／１９Ｋの全長サイトゾルテールまたは配列番号３７として示されるこのテールの最後の６アミノ酸を含んでよい。本発明者らは、最後の６アミノ酸が保持のために特に重要であることを示した（実施例３および図５）。
【化５】
2018514208.tif 000008
【０１１２】
調整能力（tunability）
１つまたは複数のタンパク質（複数可）の相対発現は、
ａ）タンパク質分子中の細胞内保持シグナルの位置を変更すること；および／または
ｂ）特定の細胞内保持シグナルを選択すること
などの種々の方法による本発明の方法を使用して良好に調整され得る。
【０１１３】
選択肢ａ）は、下により詳細に考察される。
選択肢ｂ）に関して、さまざまな細胞内保持シグナルは、真核細胞内の別個の細胞内位置にソートされる多数の天然に存在するタンパク質から利用可能である。天然に存在するタンパク質（次のセクションを参照されたい）に見出される１つまたは複数のモチーフを含み、同様のソーティングシグナル機能を有する「合成」細胞内保持シグナルを使用することもできる。
【０１１４】
シグナル強度のカスケードは、ソーティングシグナルが関連タンパク質を送る細胞内位置に応じて利用可能である。大まかに言うと、タンパク質の相対発現を低下させることに関して、ソーティングシグナルによって方向付けられる位置が「細胞内」であるほどシグナルは「強い」。
【０１１５】
ソーティングシグナルがタンパク質をリソソームコンパートメントへと方向付ける場合、タンパク質は細胞によって内部移行および分解され、細胞表面への比較的わずかな逃避を生じる。リソソームに侵入するとタンパク質は分解され、系から失われる。したがってＬＡＭＰ１などのリソソームソーティングシグナルは、細胞表面での相対発現を低減することに関して「最強」である。
【０１１６】
ソーティングシグナルがタンパク質をＥＲ内に保持されるように方向付ける場合、ごく少ない割合のタンパク質だけが細胞表面に達する。それによりＥＲ−ＧＩＣ−５３およびＫＫＦＦシグナルなどのＥＲ保持またはリサイクリングシグナルは、細胞表面での相対発現を低減することに関して２番目に強い。
【０１１７】
ソーティングシグナルがタンパク質をエンドソーム、ゴルジまたはＴＧＮコンパートメントへと方向付ける場合、次いでタンパク質はＴＧＮ、エンドソームコンパートメントおよび細胞膜の間である程度再循環される可能性がある。これらのシグナルは、相当な割合のタンパク質が細胞膜にまだ達することから発現のさらに限定された低減レベルをもたらす。
【０１１８】
一般に、公知のソーティングシグナルで見られる発現の低減は次のとおり要約され得る：
【０１１９】
リソソームソーティングシグナル＞ＥＲ保持／リサイクリングシグナル＞ＴＧＮ保持／リサイクリングシグナル＞エンドサイトーシスシグナル
【０１２０】
タンパク質内のさまざまなソーティングシグナルおよび／またはソーティングシグナルのさまざまな位置を使用する調整能力は、それぞれそれら自体の相対発現を有する複数のタンパク質の発現を、検討する際に特に有用である。例えば、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
を有する核酸構築物であって
式中
Ａ、ＢおよびＣはポリペプチドをコードする核酸配列であり；
ＸおよびＹは切断部位をコードする核酸配列である
核酸構築物を検討されたい。
【０１２１】
核酸構築物は、３つのタンパク質Ａ、ＢおよびＣをコードし、そのいずれかまたはすべては膜貫通タンパク質であってよい。例えばＢおよびＣは細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質であってよい。Ａ、ＢおよびＣについて相対レベルがＡ＞Ｂ＞Ｃであるように発現されることが望ましい場合、核酸配列Ａは細胞内保持シグナルを有さない場合があり、核酸配列Ｂは少ない割合のタンパク質Ｂが細胞中に保持される（すなわち細胞表面に発現されない）ようにする細胞内保持シグナルを有する場合があり、核酸配列Ｃは大部分のタンパク質Ｃが細胞中に保持される様にする細胞内保持シグナルを有する場合がある。
【０１２２】
下に説明するとおり、異なる量の細胞表面発現をもたらす、差次的な量の細胞内保持は：
（ａ）タンパク質に対して異なる細胞内保持シグナルを使用すること；および／または
（ｂ）タンパク質において異なる位置に位置する細胞内保持シグナルを有すること
によって達成され得る。
【０１２３】
シグナル型
細胞内保持シグナルを含み、細胞内コンパートメントへと方向付けられる多数のタンパク質が当技術分野において公知である。
【０１２４】
細胞内保持シグナルは、リソソーム、エンドソームまたはゴルジコンパートメント中に存在するタンパク質由来の保持シグナルであってよい。
【０１２５】
細胞内保持シグナルは、当技術分野において周知である（例えばBonifacinoおよびTraub；Annu.  Rev.  Biochem.；２００３年；７２巻；３９５〜４４７頁を参照されたい）。
【０１２６】
細胞内保持シグナルは、チロシンベースソーティングシグナル、ジロイシンベースソーティングシグナル、酸性クラスターシグナル、リソソーム回避シグナル、ＮＰＦＸ’（１，２）Ｄ型シグナル、ＫＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’シグナル（式中Ｘ’は任意のアミノ酸である）であってよい。
【０１２７】
チロシンベースソーティングシグナルは、細胞膜からの膜貫通タンパク質の迅速な内部移行およびタンパク質のリソソームへの標的化を媒介する（BonifacinoおよびTraub；上記）。チロシンベースソーティングシグナルの２つの型は、ＮＰＸ’ＹおよびＹＸ’Ｘ’Ｚ’コンセンサスモチーフ（式中Ｚ’はかさ高い疎水性側鎖を有するアミノ酸である）によって表される。
【０１２８】
ＮＰＸ’Ｙシグナルは、Ｉ型膜貫通タンパク質の迅速な内部移行を媒介することが示されており、それらはＬＤＬ受容体のメンバー、インテグリンβおよびβアミロイド前駆体タンパク質ファミリーなどのファミリーに存在する。
【０１２９】
ＮＰＸ’Ｙシグナルの例は表２に提供されている。
【表２−１】
2018514208.tif 000009
【表２−２】
2018514208.tif 000010
【０１３０】
ＹＸ’Ｘ’Ｚ’型シグナルは、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体などのエンドサイトーシス受容体、ＣＩ−およびＣＤ−ＭＰＲなどの細胞内ソーティング受容体、ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２などのリソソーム膜タンパク質、ならびにＴＧＮ３８およびフューリンなどのＴＧＮタンパク質、ならびに抗原プロセシングコンパートメント（例えばＨＬＡ−ＤＭ）および細胞傷害性顆粒（例えばＧＭＰ−１７）などの特殊化したエンドソーム−リソソーム小器官に局在化されたタンパク質において見出される。ＹＸ’Ｘ’Ｚ’型シグナルは、細胞膜からのタンパク質の迅速な内部移行に関与している。しかしそれらの機能は、同じモチーフが膜貫通タンパク質のリソソームおよびリソソーム関連小器官への標的化に関与していることから、エンドサイトーシスに限定されない。
【０１３１】
ＹＸ’Ｘ’Ｚ’型シグナルの例は表３に提供される。
【表３】
2018514208.tif 000011
【０１３２】
ジロイシンベースソーティングシグナル（［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’ＬＬ［ＬＩ］）は、多数のＩ型、ＩＩ型および複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ）膜貫通タンパク質のソーティングにおいて非常に重要な役割を演じている。ジロイシンベースソーティングシグナルは、膜貫通タンパク質の迅速な内部移行およびリソソーム分解ならびにタンパク質の後期エンドソーム−リソソームコンパートメントへの標的化に関与している。このシグナルの構成的に活性な形態を含有する膜貫通タンパク質は、後期エンドソームおよびリソソームに主に局在化される。
【０１３３】
［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’ＬＬ［ＬＩ］ソーティングシグナルの例は、表４に提供されている。
【表４】
2018514208.tif 000012
【０１３４】
ＤＸ’Ｘ’ＬＬシグナルは、ジロイシンベースソーティングシグナルの異なる型を構成する。これらのシグナルは、ＣＩ−およびＣＤ−ＭＰＲ、ソーティリン、ＬＤＬ−受容体関連タンパク質ＬＲＰ３およびＬＲＰ１０ならびにβ−セクレターゼなどのいくつかの膜貫通受容体およびＴＧＮとエンドソームとの間で循環する他のタンパク質に存在する。
【０１３５】
ＤＸ’Ｘ’ＬＬソーティングシグナルの例は表５に提供される。
【表５】
2018514208.tif 000013
【０１３６】
ソーティングモチーフの別のファミリーは、ＣＫＩＩによるリン酸化のための部位を含有している酸性残基のクラスターによって提供される。この種類のモチーフは、プロホルモンプロセシング酵素フューリン、ＰＣ６Ｂ、ＰＣ７、ＣＰＤおよびＰＡＭならびにヘルペスウイルス３の糖タンパク質Ｅを含む、定常状態でＴＧＮに局在化される膜貫通タンパク質においてしばしば見出される。
【０１３７】
酸性クラスターシグナルの例は表６に提供されている。
【表６】
2018514208.tif 000014
【０１３８】
ＫＤＥＬ受容体は、ＥＲゴルジ中間体コンパートメント中、または初期ゴルジ中のタンパク質に結合し、それらをＥＲに戻す。一般的な哺乳動物シグナルはＫＤＥＬであるが、ＫＤＥＬ受容体は配列ＨＤＥＬにより緊密に結合することが示されている（Scheelら；  J.  Biol.  Chem.  ２６８巻；７４６５頁（１９９３年））。細胞内保持シグナルはＨＤＥＬであってよい。
【０１３９】
ＫＫＸ’Ｘ’およびＫＸ’ＫＸ’Ｘ’シグナルは、Ｉ型膜タンパク質の細胞質側に位置し得る回収シグナル（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｉｇｎａｌ）である。これらのシグナルの配列要件は、TeasdaleおよびJackson（Annu.  Rev.  Cell  Dev.  Biol.；１２巻；２７頁（１９９６年））によって詳細に提供されている。
【０１４０】
細胞内保持シグナルは：ＮＰＸ’Ｙ、ＹＸ’Ｘ’Ｚ、［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｌ［ＬＩ］、ＤＸ’Ｘ’ＬＬ、ＤＰ［ＦＷ］、ＦＸ’ＤＸ’Ｆ、ＮＰＦ、ＬＺＸ’Ｚ［ＤＥ］、ＬＬＤＬＬ、ＰＷＤＬＷ、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’の群から選択されてよく；式中Ｘ’は任意のアミノ酸であり、Ｚ’はかさ高い疎水性側鎖を有するアミノ酸である。
【０１４１】
細胞内保持シグナルは、表２から６に示すいずれの配列であってもよい。
【０１４２】
細胞内保持シグナルはチロシナーゼ関連タンパク質（ＴＹＲＰ）−１細胞内保持シグナルを含んでよい。細胞内保持シグナルはＴＹＲＰ−１細胞内ドメインを含んでよい。細胞内保持シグナルは配列
【化６】
2018514208.tif 000015
を含んでよい。
【０１４３】
ＴＹＲＰ１は、メラノソーム（特殊化したリソソーム）に＞９９％の効率で保持される、十分に特徴付けられたメラノソーム（melansomal）タンパク質である。ＴＹＲＰ１は、内腔ドメイン（１〜４７７ａａ）、膜貫通ドメイン（４７８〜５０１）および細胞質ドメイン（５０２〜５３７）を有する５３７アミノ酸膜貫通タンパク質である。細胞質ドメインに存在するジロイシンシグナルは、タンパク質の保持を生じる。このジロイシンシグナルは、
【化７】
2018514208.tif 000016
に示す配列を有する。
【０１４４】
細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質のエンドドメイン中にあってよい。言い換えると細胞内保持シグナルは、タンパク質が細胞表面に正しく発現された場合に細胞膜の細胞内側にある膜貫通タンパク質のドメイン中にあってよい。
【０１４５】
膜貫通タンパク質のエンドドメインは、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも５００アミノ酸を含んでよい。
【０１４６】
細胞内保持シグナルを含むエンドドメインは、膜貫通タンパク質のカルボキシ末端に位置してよい。具体的には膜貫通タンパク質がペプチドのアミノ末端にシグナル配列を含む場合、細胞内保持シグナルを含むエンドドメインはカルボキシ末端に位置してよい。
【０１４７】
細胞内保持シグナルは、膜貫通ドメインに対して近位、例えば直接接続されていてよい。細胞内保持シグナルは、膜貫通ドメインに対して遠位、例えばエンドドメインのカルボキシ末端にあってよい。保持シグナルの位置付けは、その活性を調節し、２つのタンパク質の相対発現の「調整」を可能にする。例えばＴＹＲＰ１ジロイシンモチーフの場合、実施例に示すとおり近位配置は低レベル表面発現をもたらし、一方遠位配置は中程度の表面発現をもたらす。
【０１４８】
目的のポリペプチド
本明細書で規定される構築物中の核酸配列のＡもしくはＢ；またはＡ、ＢもしくはＣのいずれかまたはすべては、細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質をコードしてよい。
【０１４９】
他の核酸配列は、任意の目的のポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする場合がある。例えば他のＰＯＩは、核タンパク質、細胞質タンパク質または膜結合コンパートメントに局在化されたタンパク質などの細胞内タンパク質；分泌性タンパク質または膜貫通タンパク質であってよい。
【０１５０】
本明細書で規定される構築物中の核酸配列のＡもしくはＢ；またはＡ、ＢもしくはＣのいずれかまたはすべては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしてよい。実施例に記載の核酸構築物は、２つのキメラ抗原受容体をコードする。
【０１５１】
実施例に記載される核酸構築物は、種々の構成成分をそれらが列挙されている順に含む次のポリタンパク質をコードする。
【０１５２】
１．抗ＣＤ１９ＣＡＲ上に近位ｔｙｒｐ−１保持を有する抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび抗ＣＤ３３ＣＡＲを含むポリタンパク質
ヒトＣＤ８ａ由来シグナルペプチド：
MSLPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号３８）
ｓｃＦｖ  ａＣＤ１９：
【化８】
2018514208.tif 000017
リンカー：
ＳＤ
ヒトＣＤ８ａＳＴＫ：
【化９】
2018514208.tif 000018
ヒトＣＤ２８ＴＭ：
【化１０】
2018514208.tif 000019
ヒトＴｙｐｒ−１細胞内ドメイン（保持シグナル）：
【化１１】
2018514208.tif 000020
ヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン：
【化１２】
2018514208.tif 000021
２Ａペプチド：
【化１３】
2018514208.tif 000022
マウスＩｇカッパ由来シグナルペプチド：
【化１４】
2018514208.tif 000023
ｓｃＦｖ  ａＣＤ３３：
【化１５】
2018514208.tif 000024
リンカー：
ＤＰＡ
ＦｃＲｇ会合を妨げる変異を有するヒトＩｇＧ１由来のヒンジおよびＦｃ（ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ）：
【化１６】
2018514208.tif 000025
リンカー：
【化１７】
2018514208.tif 000026
ヒトＣＤ１４８ＴＭ：
【化１８】
2018514208.tif 000027
ヒトＣＤ１４８細胞内ドメイン：
【化１９】
2018514208.tif 000028
【０１５３】
２．抗ＣＤ１９ＣＡＲ上に遠位ｔｙｒｐ−１保持を含む抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび抗ＣＤ３３ＣＡＲを含むポリタンパク質
ヒトＣＤ８ａ由来シグナルペプチド：
【化２０】
2018514208.tif 000029
ｓｃＦｖ  ａＣＤ１９：
【化２１】
2018514208.tif 000030
リンカー：
ＳＤ
ヒトＣＤ８ａＳＴＫ：
【化２２】
2018514208.tif 000031
ヒトＣＤ２８ＴＭ：
【化２３】
2018514208.tif 000032
ヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン：
【化２４】
2018514208.tif 000033
ヒトＴｙｐｒ−１細胞内ドメイン（保持シグナル）：
【化２５】
2018514208.tif 000034
２Ａペプチド：
【化２６】
2018514208.tif 000035
マウスＩｇカッパ由来シグナルペプチド：
【化２７】
2018514208.tif 000036
ｓｃＦｖ  ａＣＤ３３：
【化２８】
2018514208.tif 000037
リンカー：
ＤＰＡ
ＦｃＲｇ会合を妨げる変異を有するヒトＩｇＧ１由来ヒンジおよびＦｃ（ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ）：
【化２９】
2018514208.tif 000038
リンカー：
【化３０】
2018514208.tif 000039
ヒトＣＤ１４８ＴＭ：
【化３１】
2018514208.tif 000040
ヒトＣＤ１４８細胞内ドメイン：
【化３２】
2018514208.tif 000041
【０１５４】
３．抗ＣＤ３３ＣＡＲ上にＥ３／１９Ｋ保持を有する抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび抗ＣＤ３３ＣＡＲを含むポリタンパク質
ヒトＣＤ８ａ由来シグナルペプチド：
【化３３】
2018514208.tif 000042
ｓｃＦｖ  ａＣＤ１９：
【化３４】
2018514208.tif 000043
リンカー：
ＳＤ
ヒトＣＤ８ａＳＴＫ：
【化３５】
2018514208.tif 000044
ヒトＣＤ２８ＴＭ：
【化３６】
2018514208.tif 000045
ヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン：
【化３７】
2018514208.tif 000046
２Ａペプチド：
【化３８】
2018514208.tif 000047
マウスＩｇカッパ由来シグナルペプチド：
【化３９】
2018514208.tif 000048
ｓｃＦｖ  ａＣＤ３３：
【化４０】
2018514208.tif 000049
リンカー：
ＤＰＡ
ＦｃＲｇ会合を妨げる変異を含むヒトＩｇＧ１由来ヒンジおよびＦｃ（ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ）：
【化４１】
2018514208.tif 000050
リンカー：
【化４２】
2018514208.tif 000051
ヒトＣＤ１４８ＴＭ：
【化４３】
2018514208.tif 000052
ヒトＣＤ１４８細胞内ドメイン：
【化４４】
2018514208.tif 000053
アデノウイルスＥ３／１９Ｋサイトゾルテール：
【化４５】
2018514208.tif 000054
【０１５５】
上記ポリタンパク質３ではＥ３／１９Ｋサイトゾルテールは、配列：ＤＥＫＫＭＰを有する切断型バージョンで置き換えられてよい。
【０１５６】
実施例に示すとおりｔｙｒｐ−１保持シグナルについて、低レベルの発現は上に示す配列中の「ヒトＣＤ２８ＴＭ」と「ヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン」との間に保持シグナルを配置することによって達成できる一方で、中程度のレベルの発現は「ヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン」と「２Ａペプチド」との間に保持シグナルを配置することによって達成できることが見出された。
【０１５７】
Ｅ３／１９Ｋ保持シグナルは、抗ＣＤ３３ＣＡＲのＣ末端に配置される場合に抗ＣＤ３３ＣＡＲの発現の低減を生じた。
【０１５８】
ベクター
本発明は、本発明の第一の態様による核酸構築物を含むベクターも提供する。
【０１５９】
そのようなベクターは、第１のおよび第２のポリペプチドを発現するように宿主細胞に核酸構築物を導入するために使用されてよい。
【０１６０】
ベクターは、例えばプラスミド、またはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクター、または合成ｍＲＮＡであってよい。
【０１６１】
ベクターは、哺乳動物細胞、例えばＴ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。
【０１６２】
細胞
本発明は、本発明の核酸構築物またはベクターを含む細胞であって、核酸配列によってコードされている第１のおよび第２のポリペプチドを発現する細胞をさらに提供する。
【０１６３】
細胞は、免疫細胞などの、細胞表面に膜貫通タンパク質を発現できる任意の真核細胞であってよい。
【０１６４】
タンパク質
本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含む膜貫通タンパク質であって、エンドドメインが本明細書で規定される外因性細胞内保持シグナルを含む膜貫通タンパク質も提供する。
【０１６５】
「外因性」は、細胞内保持シグナルが膜貫通タンパク質の野生型配列の一部ではないことを意味する。野生型配列は、天然に一般に存在するタンパク質のアミノ酸配列を指す。
【０１６６】
本発明者らは、膜貫通タンパク質のエンドドメイン中での外因性細胞内保持シグナルを含めると、膜貫通タンパク質の細胞内コンパートメントへの方向付けが生じることを実証した。それゆえ細胞表面に発現される膜貫通タンパク質の量は膜貫通ドメイン中に細胞内保持シグナルを含まない対応する膜貫通タンパク質と比較して低減されている。
【０１６７】
方法
さらなる態様では本発明は、膜貫通タンパク質をコードする核酸配列中に細胞内保持シグナルを含めることによって、第２のタンパク質を伴うポリタンパク質として単一の核酸構築物から発現される膜貫通タンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法に関する。
【０１６８】
本発明は、本発明を実施する当業者を支援するように役立つことが目的とされ、本発明の範囲を限定することをいかなる方法でも意図しない実施例の方法によってここにさらに記載される。
【実施例】
【０１６９】
（実施例１−ＴＹＲＰ１リソソーム保持シグナルの詳細な分析）
さらに複雑なエンドドメインの状況において、ポリペプチドの保持をもたらすチロシナーゼ−関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）保持シグナルの能力を多数の構築物を使用して決定した（図２）。野生型構築物を、増強型緑蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を加えたまたはｅＧＦＰがＴＹＲＰ１エンドドメインを置き換えた場合の構築物と比較した。ｅＧＦＰを加えた場合、天然エンドドメインの前または後ろのいずれかにそれを置き、それにより保持シグナルは、天然の位置（膜の直下）にあるまたはそれに対して遠位にある、いずれかであった。
【０１７０】
すべての構築物は、ＩＲＥＳ．ＣＤ３４と共発現される。形質導入されたＳｕｐＴ１細胞の染色は、細胞内染色および表面染色で図２に示されている。
【０１７１】
エンドドメインを置き換えると、非常にはっきりした表面発現が生じ、保持シグナルの後にｅＧＦＰを導入すると、表面発現はほとんど生じず、保持シグナルの前に導入すると、中程度の表面発現が生じることを見出した（図２）。
【０１７２】
（実施例２−別々のタンパク質を含む単一の発現カセットから共発現される膜貫通タンパク質の相対発現の調節）
２つのＣＡＲ膜貫通タンパク質をコードする発現カセットを、ＣＡＲタンパク質の１つが膜に対して近位または遠位のいずれかで導入されたＴＹＲＰ１由来リソソーム保持シグナルを有するように改変した。これら２つの新規改変体それぞれの細胞表面での発現を元の未改変ＣＡＲタンパク質のものと比較した。
【０１７３】
ＰＢＭＣを血液から単離し、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用して刺激した。２日後、細胞をレトロネクチンコートプレート上でＣＤ１９：ＣＤ３３ＣＡＲ構築物を含有するレトロウイルスで形質導入した。５日目に構築物によって翻訳された２つのＣＡＲの発現レベルを、フローサイトメトリーを介して評価し、細胞からＣＤ５６＋細胞を枯渇させた（主にＮＫ細胞）。６日目にＰＢＭＣを１：２のエフェクター対標的細胞比で標的細胞と共培養にした。８日目に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−ガンマ分泌について分析した。
【０１７４】
Ｔｙｒｐ１−ｅＧＦＰ融合体で観察されたパターンは、遠位保持シグナルを有する改変膜貫通タンパク質の発現ではいくらかの低減を、近位保持シグナルの場合は顕著な低減を伴って観察された。予測されるとおり、カセットからの第２の膜貫通タンパク質の発現は変化しなかった（図３）。
【０１７５】
（実施例３−アデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質由来保持シグナルを使用する発現の調節）
ヒトアデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）およびＭＨＣ−Ｉ関連ＡおよびＢ鎖（ＭＩＣＡ／Ｂ）分子の細胞表面輸送を抑止する小胞体／ゴルジのＩ型膜貫通糖タンパク質である。保持モチーフをアデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質のサイトゾルテールに応じて同定した。さらに詳細には最後の６ａａ  ＤＥＫＫＭＰが保持のために最も重要であることが見出された。最適な位置付けは、タンパク質のＣ末端であることが見出された。
【０１７６】
実施例２に記載の２つのＣＡＲ膜貫通タンパク質をコードする発現カセットをＣＡＲタンパク質の１つがアデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質由来の保持モチーフを有するように改変した。この実験では、発現カセット中の第２のＣＡＲ上の保持モチーフ（抗ＣＤ３３抑制ＣＡＲ）。
【０１７７】
構築物をアデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質のサイトゾルテール全体、またはそのゴルジ／ＥＲ保持能力のために必須であることが見出されたＥ３／１９Ｋ由来の最後の６ａａ（ＤＥＫＫＭＰ）だけのいずれかを含めて生成した（図４）。これらの構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、最初にキメラ可溶性ＣＤ１９ウサギＦｃおよびキメラ可溶性ＣＤ３３マウスＦｃタンパク質で染色した。次いでこれらの細胞を続いて抗ウサギＦｃ−ＦＩＴＣおよび抗マウスＦｃ−ＡＰＣで染色した（図５）。これらの細胞は、全長アデノウイルスＥ３／１９Ｋタンパク質またはＤＥＫＫＭＰモチーフが抗ＣＤ３３受容体上に配置される場合に明確な保持を示すが抗ＣＤ１９受容体発現レベルに影響を与えなかった。
【０１７８】
上記明細書に述べるすべての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載の方法および系の種々の改変および変法は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実行するために記載された様式の種々の改変は、分子生物学、細胞生物学または関連する分野の当業者に明らかであり、続く特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１（ａ）】
2018514208.tif 000055
【図１（ｂ）】
2018514208.tif 000056
【図１（ｃ）】
2018514208.tif 000057
【図２−１】
2018514208.tif 000058
【図２−２】
2018514208.tif 000059
【図２−３】
2018514208.tif 000060
【図３−１】
2018514208.tif 000061
【図３−２】
2018514208.tif 000062
【図３−３】
2018514208.tif 000063
【図４】
2018514208.tif 000064
【図５】
2018514208.tif 000065
【配列表】
2018514208000001.app
【国際調査報告】
2018514208.tif 000066
2018514208.tif 000067
2018514208.tif 000068
2018514208.tif 000069