(57)【要約】  本発明は、生態系のままの微生物叢、特に糞便と、マルトデキストリン及びトレハロースを含む凍結保護物質の混合物とを含む凍結乾燥された組成物、上記凍結乾燥された組成物を含むカプセル剤、その使用、並びにその製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥物の形で生態系のままの微生物叢を保存するための凍結保護物質の混合物の使用であって、前記凍結保護物質の混合物が、マルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）を、３５／６５から４５／５５の間の範囲のＭ／Ｔ重量比で含むことを特徴とする、使用。
【請求項２】
前記生態系のままの微生物叢は、糞便からなる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
生態系のままの微生物叢と、凍結保護物質の混合物とを含む凍結乾燥された組成物であって、前記凍結保護物質の混合物は、３５／６５から４５／５５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で使用されたマルトデキストリン及びトレハロースを含むことを特徴とする、凍結乾燥された組成物。
【請求項４】
（ｉ）前記生態系のままの微生物叢（ＭＩＩＥ）が糞便からなり、（ｉｉ）その糞便の重量割合が、凍結乾燥された組成物の１５％〜３５％に相当し、かつ凍結保護物質の混合物の重量割合が、凍結乾燥された組成物の８５％〜６５％に相当し、（ｉｉｉ）マルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）が、４０／６０のＭ／Ｔ重量比で使用される、請求項３に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の凍結乾燥された組成物を含む、胃液耐性カプセル剤。
【請求項６】
前記凍結乾燥された組成物は、少なくとも１種の流動性賦形剤と混合されることを特徴とする、請求項５に記載の胃液耐性カプセル剤。
【請求項７】
腸内微生物叢の不均衡に関連する疾患又は障害の治療において使用するための、請求項３若しくは４に記載の凍結乾燥された組成物、又は請求項５若しくは６に記載の胃液耐性カプセル剤。
【請求項８】
再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の場合の経口抗生物質治療のための代替として使用するための、請求項７に記載の凍結乾燥された組成物又は胃液耐性カプセル剤。
【請求項９】
請求項５又は６に記載の胃液耐性カプセル剤の製造方法であって、
ａ．  生態系のままの微生物叢を採集する工程と、
ｂ．  前記生態系のままの微生物叢を、マルトデキストリン及びトレハロースを３５／６５から４５／６５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で含む凍結保護物質の混合物で希釈する工程と、
ｃ．  工程ｂで得られた混合物を凍結乾燥する工程と、
ｄ．  工程ｃにおいて得られた凍結乾燥物を噴霧して、粉体形にする工程と、
ｅ．  任意に、該凍結乾燥物の流動を改善する１種以上の賦形剤を添加する工程と、
ｆ．  胃液耐性カプセルの包被に、前記凍結乾燥された混合物を充填する工程と、
ｇ．  該カプセルをシールする工程と、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記生態系のままの微生物叢は、糞便からなり、かつ前記凍結保護物質の混合物は、マルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）の４０／６０のＭ／Ｔ重量比の混合物からなる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥物の形で生態系のままの微生物叢（microbiota in its ecosystem）（ＭＩＩＥ）を保存する分野に関する。特に、本発明は、糞便中微生物叢をヒト移植の目的のために数ヶ月間までの間保存することができる凍結乾燥された糞便組成物に関する。本発明はまた、上記組成物の、特に経口投与のためのカプセル剤の形でのヒト又は動物における治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの研究により、ディスバイオシスと呼ばれる糞便中微生物叢のその生態系における不均衡を伴う或る特定の病理、例えばクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症及びその再発の治療管理のために糞便中微生物叢移植（ＦＭＴ）が重要であることが実証されている（非特許文献１）。ＦＭＴは、既に高い水準の臨床的証拠と関係付けられており、したがってこの目的のために上記技術を実施することは、最近の欧州の推奨（非特許文献２）及び北米の推奨（非特許文献３）において述べられている。原因が分かっていない又は未知であるディスバイオシスのその他の病的状況、例えば炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、多剤耐性細菌、又は神経学的発達障害における上記技術の実施も想定されている（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００３】
医学界による近年の熱狂、及び生まれつつある患者の需要にもかかわらず、目下のところＦＭＴを実施するための標準化された手順は存在せず、供与者を選択する方法、糞便を調製する方法、又は投与経路を選択する方法も存在しない。
【０００４】
一般的に、供与者は、臨床試験に基づいて広範囲の病原体、例えば細菌、ウイルス又は寄生虫についての供与前に行われるスクリーニング後に選択され、こうして、潜在的供与者のうち２０％未満の検証率がもたらされる（非特許文献６）。これは、病原体の結果を得るのが遅くなることに加えて、利用可能な供与物の数を厳しく限定する。
【０００５】
ＦＭＴの投与を調節する様式は、多種多様である。糞便中微生物叢は、経鼻胃プローブ若しくは経鼻十二指腸プローブによって、結腸内視鏡検査の過程において、又は直腸浣腸によって投与することができ（非特許文献５）、各々の方法は、その独自の利点及び不利点を有する。例えば、経鼻胃又は経鼻十二指腸の進路は、治療される人の気分を悪くすることがあり、そして嘔吐又は摂食の危険性を引き起こすことがあり、上記プローブの挿入の間にはＸ線監視が必要とされる。結腸プローブの使用は、それが投与の間に粘膜の観察を可能とすることに関心が持たれているが、それはまた、重大な病的状態の要因及び高い費用を伴う。最後に、直腸浣腸法は、より実施が容易であり、かつ費用がより安いが、投与された物質が治療される個体により保持されることを保証するのが困難である。これらの問題は、調製物の官能的特性に関連する患者側の抵抗感により悪化する。
【０００６】
クロストリジウム・ディフィシル腸炎に関する「Groupe Francais de Transplantation Fecale」（フランスの糞便移植に関するグループ）からの（非特許文献７）、そしてＡＮＳＭによる臨床試験による（非特許文献８）最近の推奨は、便通後６時間以内に投与を行うことに関連している。供与物への到達を容易にするために、保存された糞便調製物は−８０℃で凍結され、したがって容易に利用可能なものが提案されている。それらの効力は、新鮮な材料を用いた移植で確認される効力と同様である（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。これらの凍結された調製物は、微生物叢を凍結の作用から保護するために、凍結保護物質を含有する溶液で希釈する必要がある。移植のための糞便の凍結に関する文献に記載される唯一の凍結保護物質は、１０％の濃度のグリセロールである。グリセロールを含有する凍結された調製物で行われた移植の効果は、その調製後５ヶ月間までの間は維持される（非特許文献１０）。
【０００７】
この材料を充填して−８０℃で貯蔵されたカプセル剤の経口投与は、満足のいく結果で報告された（非特許文献１２、非特許文献１３）。したがって、この種類の調製物は、治療中の人、具体的には患者への投与を容易にする製剤的アプローチのための新たな見通しを開く。しかしながら、その調製物は、最近になっても未だに非常に経験的な生産を伴い、−８０℃での保管を必要とし、それにより貯蔵上の問題が引き起こされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Van Nood E. et al., 2013
【非特許文献２】Debast SB. et al., 2014
【非特許文献３】Surawicz CM. et al., 2013
【非特許文献４】Vrieze A. et al., 2013
【非特許文献５】Kelly CR. et al., 2015
【非特許文献６】Borody T. et al., 2015
【非特許文献７】Sokol H. et al., 2015
【非特許文献８】ANSM, 2015
【非特許文献９】Hamilton MJ. et al., 2012
【非特許文献１０】Youngster I. et al., 2014a
【非特許文献１１】Lee et al., 2016
【非特許文献１２】Youngster I. et al., 2014b
【非特許文献１３】Younster et al., 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、調製及び貯蔵が容易になる一方で、貯蔵期間の間に糞便中微生物叢の当初の質が保たれる糞便調製物についての満たされていない要求が存在する。そのような糞便調製物は、心地よく、かつ非侵襲性の投与経路を通じて少ない容量の初期投与を可能にする製剤形で利用可能である必要があるはずである。
【００１０】
このような状況において、本発明者らは、糞便調製物の製造、利用可能性、及び長期貯蔵を容易にする一方で、治療を受ける人にとっての許容性及び快適性を改善するために凍結保護物質の最適化された混合物で希釈された凍結乾燥された糞便組成物を開発した。
【００１１】
凍結乾燥は、細菌株の保存のために医薬品産業で使用される保存法である。凍結乾燥は特に、一般的にＭＩＩＥのような、そして特に糞便のような複雑な混合物の場合に、種々の細菌属の生存力及び平衡状態を維持するために最適な条件において行われるべきである。適切な凍結保護物質の使用は、凍結されたときに細菌の完全な生存又は少なくとも部分的な生存を保証する。
【００１２】
生きている生物、特に細菌のための凍結保護物質の分子の３つのカテゴリーが存在する：
−高分子量を有し、かつ細胞外媒体中で保たれる、タンパク質及び多糖類のような分子であって、凍結段階の間に細胞からの水分流出を促進し、それにより細胞内の氷の結晶の形成を制限する、分子。細胞外媒体の粘度を増加させることにより、これらの分子は、結晶成長も低下させる。
−細胞壁を通過することが可能な分子、例えばアミノ酸及びオリゴ糖類。
−細胞壁及び細胞質膜を透過する分子、例えばＤＭＳＯ及びグリセロール（Carvalho A.S. et al., 2004）。
【００１３】
２番目のカテゴリー及び３番目のカテゴリーの浸透剤は、細胞内脱水を制限し、細胞内の凍結温度を下げ、それにより塩濃度が下がり、浸透圧性ショックが減少する（Beal C. et al., 2015）。
【００１４】
糞便中微生物叢の生きている生物の保存を最適化するために、本発明者らは、幾つかの凍結保護物質を、個別に又は組み合わせて使用して評価した。凍結された物質で行われるＦＭＴのために一般的に使用される１０％のグリセロール（非特許文献９、非特許文献１０）は、凍結乾燥物の製造に適していないように思われる。試験された凍結保護物質のなかでも、マルトデキストリン及びトレハロースの２つが幾分有望であった。トレハロースは良好な結果をもたらすが、マルトデキストリン及びトレハロースの混合物で得られた結果は、微生物叢の生存力の維持（図１及び図２）の点と、その多様性の維持（図５）の点との両方で更に改善される。多様性の維持は、ＦＭＴの目的が受容者の腸内生態系における種々の個体群間での均衡を厳密に修復することであるため、特に重要である。微生物叢に対するマルトデキストリン及びトレハロースの混合物の保護効果は、凍結乾燥後に少なくとも３ヶ月間にわたり認められ、その後に７ヶ月間の間でさえも認められる（図３、図６、及び図７）。さらに、マルトデキストリン及びトレハロースの混合物は、クロストリジウム・レプツム（Clostridium leptum）群の細菌のような極度の酸素感受性（ＥＯＳ）を示す細菌の生存力を維持するためにより好ましい（図４及び図８）。さらに、糞便中微生物叢の機能的能力の代表である短鎖脂肪酸のような細菌性代謝物の濃度が維持され、それどころか、本来の糞便と比較した場合に凍結乾燥物において増大することさえある（図９）。最後に、凍結乾燥物の抗クロストリジウム・ディフィシル活性は、一方が毒素原性（菌株６３０）であり、もう一方が、非毒素原性（ＰＣＤ１菌株）である２種のクロストリジウム・ディフィシル菌株についての細菌増殖の阻止によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証される（図１０）。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明は、凍結乾燥形において生態系のままの微生物叢（ＭＩＩＥ）を保存するための凍結保護物質の混合物の使用であって、上記凍結保護物質の混合物が、マルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）を、３５／６５から４５／５５の間の範囲のＭ／Ｔ重量比で含むことを特徴とする、使用に関する。
【００１６】
マルトデキストリンは、細胞壁を透過しない多糖型凍結保護物質であるが、トレハロースは、細胞壁を透過するオリゴ糖型凍結保護物質である。
【００１７】
用語「生態系のままの微生物叢」すなわちＭＩＩＥとは、体内に天然に存在する微生物叢と比較してその組成が不変である微生物叢を説明するものである。微生物叢及びその生態系は、複雑かつ濃厚な混合物であって、主に細菌、菌類、ウイルス、及びバクテリオファージから構成されているが、細胞片、腸細胞及び粘膜固有層細胞により分泌される多くのペプチド及びタンパク質とそれらの排出／分泌産物、例えば分泌型ＩｇＡ、カルプロテクチン、サイトカイン、及びディフェンシン型のその他の抗炎症性ペプチド又は抗微生物性ペプチド、短鎖脂肪酸のような代謝物を含む分泌される又は分泌されない細菌性産物、バクテリオシン、並びに微生物叢の細菌又はその他の微生物により産生される任意のその他の生物学的に活性な分子、粘液、単糖型及び多糖型の炭水化物化合物、並びに微量元素から構成されている。したがって、ＭＩＩＥは、生きているとみなすことができ、多くの分子性相互作用及び細胞性相互作用が生ずる複雑なマトリックスである。
【００１８】
ＭＩＩＥは、本発明によるマルトデキストリン及びトレハロースの混合物を使用することにより凍結乾燥形で貯蔵することができる。例としては、本方法により保存することができるＭＩＩＥは、以前は腸内フローラとしても知られていた腸内微生物叢、糞便中に含まれる糞便中微生物叢、及び以前は膣内フローラと呼ばれていた膣内微生物叢である。これらの微生物叢の例の各々は、当業者に良く知られている優勢細菌群によって特徴付けられる。
【００１９】
好ましい実施の形態においては、保存するＭＩＩＥは、糞便からなる。
【００２０】
本発明によれば、用語「凍結乾燥」とは、或る物を凍結させ、その後に真空中で氷を、液体状態を経ることなく気化させる（昇華と呼ばれる現象）ことによりその物から水を除去する方法を説明するものである。この技術は、当業者に良く知られている。凍結乾燥サイクルには、３つの主要な段階が存在する。
−その物を−２０℃〜−８０℃の温度で冷凍する凍結（水は氷に変わる）。
−間隙にある遊離した氷を昇華させる段階である真空中での一次乾燥。
−乾燥物の表面に捉えられた水分子を脱離により抜き取る最終乾燥。
【００２１】
本発明においては、用語「糞便」は、食物の吸収、その消化、及びその腸管を通過した後に得られる排泄物を説明するために使用される。糞便は、通常は、その重量の７５％〜８５％の水と、その重量の１５％〜２５％の乾燥物（剥離した腸細胞、及び粘膜固有層細胞由来の免疫細胞とそれらの排出／分泌産物、例えば分泌型ＩｇＡ、カルプロテクチン、サイトカイン、及びその他の抗炎症性ペプチド又は抗微生物性ペプチド等、微生物叢の構成要素（細菌、ウイルス、菌類、バクテリオファージ）、及び短鎖脂肪酸のような代謝物を含む分泌される又は分泌されない細菌性産物、バクテリオシン、並びに微生物叢の細菌又はその他の微生物により産生される任意のその他の生物学的に活性な分子、粘液、植物の不消化性部分に由来する繊維及びセルロースを含む細胞片、脂質、鉄、微量元素等）からなる。本発明によれば、糞便という用語は、健康な個体により排泄されたばかりの糞便を説明するものである。ヒトからの供与者の選択及び糞便の調製は、Kapel N. et al., 2014による表題「Practical implementation of faecal transplantation」の文献における「Groupe Francais de Transplantation Fecale」の推奨（非特許文献７）において、そしてＡＮＳＭの推奨（２０１５年）において定義されるプロトコル及び条件に従って行うことができる。
【００２２】
本発明による凍結乾燥形において糞便を保存するために使用される凍結保護物質の混合物においては、マルトデキストリン（Ｍ）が、トレハロース（Ｔ）と一緒に、３５／６５から４５／５５までの範囲の、好ましくは４０／６０のＭ／Ｔ重量比で使用される。
【００２３】
本発明の好ましい実施の形態によれば、混合物中に存在する凍結保護物質は、もっぱらマルトデキストリン及びトレハロースのみである。
【００２４】
本発明のもう一つの実施の形態によれば、混合物中に存在する凍結保護物質は、マルトデキストリン及びトレハロース、並びにマンニトール、ソルビトール、フルクトース、グルコース、マルトース、スクロース、ゼラチン、デンプン、ウシ胎児血清、及び乳から選択される少なくとも１種のその他の凍結保護物質を含む。
【００２５】
本発明はまた、生態系のままの微生物叢（ＭＩＩＥ）と、凍結保護物質の混合物とを含む凍結乾燥された組成物であって、上記凍結保護物質の混合物が、３５／６５から４５／５５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で、好ましくは４０／６０の重量比で使用されたマルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）を含む、組成物に関する。
【００２６】
本発明による組成物においては、マルトデキストリンが、トレハロースと一緒に、３５／６５から４５／５５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で、好ましくは４０／６０の重量比で使用される。
【００２７】
本発明の好ましい実施の形態によれば、凍結乾燥された組成物中に存在する凍結保護物質は、もっぱらマルトデキストリン及びトレハロースのみである。
【００２８】
本発明のもう一つの実施の形態によれば、凍結乾燥された組成物中に存在する凍結保護物質は、マルトデキストリン及びトレハロース、並びにマンニトール、ソルビトール、フルクトース、グルコース、マルトース、スクロース、ゼラチン、デンプン、ウシ胎児血清、及び乳から選択される少なくとも１種のその他の凍結保護物質を含む。
【００２９】
本発明による凍結乾燥された組成物は、それぞれ凍結乾燥された組成物の、それぞれ１５％〜３５％及び８５％〜６５％の重量分で、好ましくは１８％〜２８％及び８２％〜７２％の重量分でＭＩＩＥ及び凍結保護物質の混合物を含有する。これらの重量分は、特に糞便の場合に変動し得る、ＭＩＩＥの試料の水和度、並びにその脂質含量、繊維含量、及び細胞片含量を含む様々なパラメーターに応じて変動し得る。当業者であれば、凍結乾燥される組成物を最適化するために上記重量分を適合させるであろう。
【００３０】
このように、本発明者らは、糞便と、マルトデキストリン及びトレハロースを含む凍結保護物質の混合物とを含む組成物の凍結乾燥が、少なくとも６ヶ月間の長期間にわたって糞便中微生物叢の生存力及び生物多様性を維持することを可能にすることを実証した。本発明者らは、凍結乾燥物中の細菌性代謝物の産生を維持することができることも実証した。さらに、本発明者らは、該凍結乾燥物がクロストリジウム・ディフィシルの増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻止する能力を実証した。
【００３１】
本発明による用語「微生物叢の生存力」は、糞便中微生物叢の生きている部分に関連するものである。
【００３２】
「糞便中微生物叢の生物多様性」は、ＭＩＩＥ中の種々の微生物個体群により表される。その構成個体群の保存は、微生物叢中の微生物の代表的な群の安定性を調査することによって評価することができる。
【００３３】
好ましい実施の形態においては、本発明は、糞便と、マルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）を３５／６５から４５／５５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で、好ましくは４０／６０の重量比で含む凍結保護物質の混合物とを含む凍結乾燥された組成物に関する。
【００３４】
ＭＩＩＥが糞便からなるこの好ましい実施の形態においては、糞便の重量割合は、凍結乾燥された組成物の１５％〜３５％に相当し、凍結保護物質の混合物の重量割合は、凍結乾燥された組成物の８５％〜６５％に相当する。
【００３５】
ＭＩＩＥが糞便からなる更により好ましい実施の形態においては、糞便の重量割合は、凍結乾燥された組成物の１５％〜３５％に相当し、凍結保護物質の混合物の重量割合は、凍結乾燥された組成物の８５％〜６５％に相当し、かつ凍結保護物質の混合物は、マルトデキストリン（Ｍ）及びトレハロース（Ｔ）を３５／６５から４５／５５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で、好ましくは４０／６０の重量比で含む。
【００３６】
ファーミキューテス門及びバクテロイデス門に属する優勢細菌群の間の均衡を保存することにより細菌量、並びにその生存力及びその多様性を維持することに加えて、本発明による組成物は、細菌株混合物よりも大きな利点を特徴としている（Allen-Vercoe E. et al., 2013）。それどころか、本発明による糞便組成物は、糞便中微生物叢をその当初の天然の生態系（糞便中生態系）に保持することを可能にする。こうして、種々の成分間の相互作用、及びこの複雑な材料の機能的能力は保存され、そしてＦＭＴを受ける個体は、新鮮な糞便の移植又は細菌濾液の投与と同じ利点を有する（Ott et al., 2016）。
【００３７】
用語「糞便中生態系」とは、本発明によれば、糞便を構成するあらゆるもの、すなわち細菌、ウイルス、菌類及びバクテリオファージだけでなく、短鎖脂肪酸のような代謝物を含む分泌される又は分泌されない細菌性産物、バクテリオシン、並びに微生物叢の細菌又はその他の微生物によって産生されるすべてのその他の生物学的に活性な分子、及び剥離した又はアポトーシス状態にある腸細胞（エンテロサイト、粘膜固有層の免疫細胞）、並びにそれらの排出／分泌産物（分泌型ＩｇＡ、カルプロテクチン、サイトカイン、及びその他の抗炎症性ペプチド又は抗微生物性ペプチド等）、単糖及び多糖の炭化水素要素、例えば植物の不消化性部分に由来する繊維及びセルロース、タンパク質及び脂質残留物、微量元素、粘液等をも意味する。
【００３８】
本発明の組成物は、経口投与のために特に非常に適している。
【００３９】
上記組成物は、治療される個体に応じて、例えば再水和若しくは噴霧の使用を必要としない胃液耐性カプセル剤又は錠剤又は顆粒剤の形で存在してもよい。
【００４０】
本発明の特定の実施の形態によれば、凍結乾燥された組成物は、カプセル剤又は胃液耐性錠剤の形で存在する。この形態は、ヒトにおける経口投与のために特に適している。用語「胃液耐性のカプセル剤又は錠剤」とは、本発明によれば、胃液に耐性である経口の製剤形及び腸溶形を意味する。
【００４１】
そのような配合物はまた、凍結乾燥された組成物を、治療を受ける被験体に投与するのに適したものにする医薬品に許容可能な担体を含み得る。この担体は、好ましくは不活性であり、どの場合においても、生態系のままの微生物叢の生存性及び多様性を維持することが可能であり、かつ凍結乾燥された組成物を適切な部位で放出することが可能である。
【００４２】
このように、本発明はまた、上記の凍結乾燥された組成物を含む胃液耐性カプセル剤に関する。
【００４３】
手動により又は工業的に行われる上記カプセル剤の充填は、容量測定的に行われる。この目的のためには、凍結乾燥物が粉体化され、分注されるべき粉体が、カプセル剤の一定の充填を保証するために良好な流動性を示すことが必要である（Le Hir et al., 2016）。
【００４４】
粉体の流動特性は、規格寸法を特徴とする漏斗の開口部を通して試験試料が流動するために必要とされる時間を測定する、欧州薬局方（欧州薬局方、２０１６年）の試験「２．９．１６．Ｆｌｏｗ」により評価することができる。１００ｇの粉体につき１０秒以下の時間が優れた流動とみなされる。それに対して、流動しない粉体の流出時間は、「無限大」と評価される。これは、そのままの糞便の凍結乾燥物の場合であり、したがって、その形ではカプセル剤の充填のために使用することはできない。
【００４５】
この制限を克服するために、本発明者らは、糞便の凍結乾燥物の流動を改善することができる流動性希釈剤及び流動性滑沢剤のような流動性賦形剤を補った、上述の凍結乾燥された組成物を含むカプセル剤を開発した。
【００４６】
本発明による凍結乾燥物を含むカプセル剤において使用される流動性賦形剤は、無機賦形剤、例えばリン酸二カルシウム、マルトデキストリン、タルク、親水性コロイダルシリカ、及び疎水性コロイダルシリカから選択される。
【００４７】
したがって、本発明によれば、上記胃液耐性カプセル剤は、流動性滑沢剤及び／又は直接圧縮のための流動性希釈剤から選択される少なくとも１種の流動性賦形剤と混合されて、上記定義による凍結乾燥された組成物を含む。
【００４８】
特定の実施の形態によれば、上記流動性賦形剤は、この目的のために一般的に満たされる量で使用される流動性滑沢剤であり、好ましくは、凍結乾燥物と混合される滑沢剤の量は、凍結乾燥物及び滑沢剤の混合物の重量の０．１％から１％までの範囲であり、有利には、滑沢剤の量は、凍結乾燥物及び滑沢剤の混合物の重量の０．５％である。
【００４９】
上記流動性滑沢剤は、タルク、疎水性コロイダルシリカ、又は親水性コロイダルシリカから選択することができ、疎水性コロイダルシリカを使用することが有利である。
【００５０】
特定の実施の形態によれば、上記流動性賦形剤は、この目的のために一般的に満たされる品質で使用される直接圧縮のための希釈剤であり、好ましくは、凍結乾燥物と混合される希釈剤の量は、凍結乾燥物及び希釈剤の混合物の重量の１０％から９０％までの範囲であり、有利には、凍結乾燥物及び希釈剤の混合物の重量の１５％から７５％の間又は２５％から５０％の間である。
【００５１】
上記直接圧縮のための希釈剤は、リン酸二カルシウム、又は微粉マルトデキストリン（nebulized maltodextrin）から選択され得る。
【００５２】
もう一つの特定の実施の形態によれば、上記流動性賦形剤は、上記定義の流動性滑沢剤及び直接圧縮のための希釈剤を、示された割合で含む。
【００５３】
例えば、ＭＩＩＥ凍結乾燥物及び流動性賦形剤の混合物は、
−全混合物の重量の０．１％〜１％、有利には０．５％の割合の疎水性コロイダルシリカと、
−全混合物の重量の０．１％〜１％、有利には０．５％の割合の親水性コロイダルシリカ、及び全混合物の重量の１０％〜９０％、有利には１５％から７５％の間、有利には２５％から５０％の間の割合のリン酸二カルシウムと、
−全混合物の重量の０．１％〜１％、有利には０．５％の割合のタルク、及び全混合物の重量の１０％〜９０％、有利には１５％から７５％の間の割合の微粉マルトデキストリンと、
から構成される。
【００５４】
このような状況において、凍結乾燥された組成物から製造された胃液耐性カプセル剤の開発は、調製物の官能的特性の点で、移植材料の利用可能性の点で、調製物の保存の点で、そして治療を受ける人の心地よさの点で大きな進歩である。
【００５５】
凍結乾燥は、糞便中に存在する水を除去することができる。実に、通常の糞便は、一般的に７５％から８５％の間の割合の水を含む。凍結乾燥後に、５０ｇの糞便は、約７．５ｇ〜１２．５ｇの凍結乾燥された微生物叢に相当し、それに凍結保護物質の混合物が添加される。
【００５６】
したがって、糞便の投与に関連する従来の方法と比べて、新鮮な糞便であろうと凍結された糞便であろうと、胃液耐性カプセル剤中に含まれ得る凍結乾燥形での投与は、標準化された調製法を捗らせ、そして治療を受ける人による許容性を改善する。このように、凍結乾燥物の形での経口投与が医療実務において十分に確立されれば、罹患率を低下させることができ、そして糞便移植の費用を減らすことができる。実に、凍結乾燥された調製物としてのＦＭＴの経口投与は、専門職員を必要とし、かつ日帰り入院を必要とする技術的プロセスを、新鮮な糞便又は凍結された糞便からの調製物の経鼻十二指腸、結腸内視鏡検査、又は直腸による投与のための現在の場合のようには、もはや伴わないこととなる。凍結されたカプセル剤の投与と比較して、凍結乾燥物の形の投与は、製造及び貯蔵法を容易にすることとなり、それにより調製物の標準化は改善される。さらに、凍結乾燥された配合物の使用は、ＦＭＴ装置の利用しやすさを改善することとなり、それは、例えば再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の状況において起こり得る緊急事態に対応する場合に重要な点である。
【００５７】
したがって、本発明はまた、凍結乾燥により糞便を保存する方法であって、上記定義の凍結保護物質の混合物の使用を伴う、方法に関する。本方法は、上記の微生物叢の生存力及び多様性の継続を保証することにより、凍結乾燥された糞便の保存を、少なくとも３ヶ月間にわたり、そして７ヶ月間までの時間にわたり、更にそれ以上の間にわたり可能にする。
【００５８】
本発明により保存された凍結乾燥された糞便は、同種異系ＦＭＴ又は自家ＦＭＴの部分として投与され得る。さらに、ＦＭＴは、同じ種の２個体間で糞便を移行することであっても、又は所与の時点で当初は健康な供与体であったが、後日に治療を受ける側の人となっている同一個体に投与することであってもよい。このように、健康な個体は、自身の供与物でできた糞便調製物を含む凍結された組成物を、その個体がそれを必要とする時に後に使用することができる。
【００５９】
本発明のもう一つの目的は、医薬として使用するための、上記の凍結乾燥された組成物又は胃液耐性カプセル剤に関する。
【００６０】
したがって、本発明は、腸内微生物叢の不均衡に関連する疾患又は障害の治療において使用するための、上記の凍結乾燥された組成物又は胃液耐性カプセル剤に関する。
【００６１】
さらに、腸内微生物叢は、継続的に自身を調節する均衡の取れた生態系である。様々な攻撃が、この均衡を壊す恐れがある。ディスバイオシスは、過剰な有害微生物及び／又は宿主に有用な微生物の相対的不足から生ずる微生物叢の多様性の損失若しくは不均衡である。したがって、本発明による凍結乾燥された組成物の示された使用は、ディスバイオシスに関連する使用と同じである。したがって、語句「腸内微生物叢の不均衡に関連する疾患又は障害」は、クロストリジウム・ディフィシル腸炎及びその再発、慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、多剤耐性細菌の存在、便秘、旅行者下痢症、胃腸感染症、自己免疫病、憩室症、１型糖尿病及び２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、リウマチ様関節炎、強直性脊椎炎及び仙腸骨炎、慢性疲労症候群、口臭、アレルギー、座瘡、不眠症、鬱病及び神経精神病、例えばパーキンソン病及び自閉スペクトラム症を含むと解釈される。
【００６２】
好ましい実施の形態においては、本発明による凍結乾燥された組成物は、クロストリジウム・ディフィシル腸炎の治療に使用される。このような状況においては、凍結乾燥された生成物中で保存される細菌性代謝物の存在は、Ｃ．ディフィシルとの格闘において主要な有益効果を有し得る。
【００６３】
上記凍結乾燥された組成物は、炎症性腸疾患、多剤耐性細菌、１型糖尿病及び２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満、及び自閉スペクトラム症の治療において使用することもできる。
【００６４】
微生物叢に関係する環境の保存は、ＦＭＴの治療効果に大きく貢献し得る。
【００６５】
本発明による凍結乾燥された組成物又は胃液耐性カプセル剤は、経口抗生物質治療、例えばメトロニダゾール又はバンコマイシン治療（クロストリジウム・ディフィシル感染症を治療するために使用される第一線治療）のための、特に被験体が繰り返しの抗生物質処置に不感受性となっている再発性クロストリジウム・ディフィシル腸炎の治療のための代替として使用することもできる。
【００６６】
本発明による凍結乾燥されたＭＩＩＥの組成物は、ヒト又は動物に投与されるように設計される。
【００６７】
多剤耐性細菌の発生の危険性を制限する抗生物質療法を伴う行動計画が増加傾向にある状況において、そのような凍結乾燥された組成物の使用は、獣医学における、特に有機栽培における選択肢を与える。このように、本発明による凍結乾燥された組成物は、ヒトにおいて使用することができるが、また動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、齧歯類、ウサギ目の動物、肉食動物、ウマ科の動物、鳥類、爬虫類、及び特にブタ、ウシ、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、及びウマにおいても使用することができる。ＦＭＴは、長年にわたり経験的に使用されてきた、獣医学において大きな発展を遂げた方法であり、凍結乾燥された糞便の形でのその投与は、その実施を明らかに容易にするであろう。
【００６８】
その動物への投与を容易にするために、ＭＩＩＥの凍結乾燥された組成物は、再水和も噴霧も必要ない顆粒の形で調製され得る。当業者であれば、治療を受ける動物に応じて、それができる限り適したものとなるように、製剤形を適合させるであろう。
【００６９】
本発明のもう一つの目的は、本発明によるＭＩＩＥの凍結乾燥された組成物の作製方法であって、
−ＭＩＩＥ、特に糞便を採集する工程と、
−ＭＩＩＥを、上記の凍結保護物質の混合物により、３５／６５から４５／５５までの範囲のＭ／Ｔ重量比で、好ましくは４０／６０のＭ／Ｔ重量比で希釈する工程と、
−先の工程で得られた混合物を凍結乾燥させ、凍結乾燥された組成物を得る工程と、
を含む、方法に関する。
【００７０】
特定の実施の形態によれば、凍結乾燥は、−２０℃から−８０℃までの範囲の凍結温度を、数十分間から数時間までの時間にわたり適用することによって行うことができる。好ましい実施の形態においては、凍結工程は、−８０℃で３０分間にわたり行われる。当業者であれば、これらの条件を適合させるであろう。
【００７１】
上述のように、ＭＩＩＥ及び凍結保護物質の混合物は、凍結乾燥された組成物の全重量のうち、１５％〜３５％の重量割合のＭＩＩＥ、及び８５％〜６５％の重量割合の凍結保護物質を含むようなものであり、好ましい重量分は、１８％から２８％までの範囲、及び８２％から７２％までの範囲である。これらの重量分は、ＭＩＩＥの試料の水和度、並びにその脂質含量、繊維含量、及び細胞片含量を含む様々なパラメーターに応じて変動し、特に糞便の場合に変動し得る。当業者であれば、凍結乾燥される組成物を最適化するために重量分を適合させるであろう。
【００７２】
特定の実施の形態においては、本発明は、本発明による凍結乾燥された組成物を含む胃液耐性カプセル剤の作製方法であって、
−凍結乾燥された組成物を調製する工程と、
−凍結乾燥物を噴霧して、粉体形にする工程と、
−任意に、凍結乾燥物の流動を改善する１種以上の賦形剤を添加する工程と、
−胃液耐性カプセル剤の包被に、上記凍結乾燥された混合物を充填する工程と、
−上記カプセル剤をシールする工程と、
を含む、方法に関する。
【００７３】
特定の実施の形態を、以下の実施例に記載する。実施例は、本発明を説明し、それをより理解しやすくすることを目的とするに過ぎず、本発明に何らかの制限をするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本来の糞便中での増殖後に回収され、ＮａＣｌ（９‰）で希釈された、又は６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースを含むマルトデキストリン凍結保護物質混合物（ＭＴ）で希釈された主要細菌群及び酵母を表す図である。図１に示される結果は、糞便３に関して得られた結果に相当する。
【図２】凍結保護物質：５％のマルトデキストリン（Ｍ）、５％のトレハロース（Ｔ５）、１０％のトレハロース（Ｔ１０）、６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物（ＭＴ）、又は乳（Ｌ）の性質に基づく、当初の糞便に関する凍結乾燥物の再構成後の生細菌量を表す図である。
【図３】凍結保護物質：５％のトレハロース（Ｔ５）、１０％のトレハロース（Ｔ１０）、並びに６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物（ＭＴ）の性質に基づく、経時的な細菌量の展開を表す図である。ＪＯは、凍結乾燥前を表し、ＭＯは、凍結乾燥後であり、Ｍ４は、凍結乾燥の４ヶ月後であり、かつＭ７は、凍結乾燥の７ヶ月後である。
【図４】凍結保護物質：マルトデキストリン５％（Ｍ）、トレハロース５％（Ｔ５）、１０％のトレハロース（Ｔ１０）、６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物（ＭＴ）の性質に基づく、ＭＯでのＥＯＳ細菌のパーセンテージを表す図である。ＪＯは、凍結乾燥前を表し、ＭＯは、凍結乾燥後である。
【図５】凍結保護物質：５％のトレハロース（Ｔ５）、１０％のトレハロース（Ｔ１０）、並びに６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物（ＭＴ）の性質に基づく、その調製直後の、本来の糞便中、及び凍結乾燥物中に見られる主要細菌群を表す図である。図５に表される結果は、糞便３に関して得られた結果を示す。
【図６】凍結保護物質：５％のトレハロース（Ｔ５）、１０％のトレハロース（Ｔ１０）、並びに６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物（ＭＴ）の性質に基づく、その調製後（ＭＯ）の、本来の糞便中、及び凍結乾燥物中に見られる主要細菌群を表す図である。それらの結果は、凍結乾燥直後、並びに４℃で３ヶ月間貯蔵した後（＋３）及び４℃で８ヶ月間貯蔵した後（＋８）で表される。図６に表される結果は、糞便３に関して得られた結果を示す。
【図７】本来の糞便（ＮＳ）と比較した、３種の糞便試料（Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６）中の主要細菌群の生存力に対する、凍結乾燥（Ｌ７２ｈ）の影響、並びに凍結乾燥物の３ヶ月間にわたる保管（Ｌ３Ｍ）及び６ヶ月間にわたる保管（Ｌ６Ｍ）の影響を表す図である。（Ａ）種々の偏性嫌気性の細菌個体群の効果。（Ｂ）種々の任意に好気性／嫌気性の細菌個体群に対する効果。
【図８】本来の糞便（ＮＳ）と比較した、様々な糞便試料（Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６）中の極度の酸素感受性（ＥＯＳ）細菌の生存力に対する、凍結乾燥（Ｌ７２ｈ）の影響、並びに凍結乾燥物の３ヶ月間にわたる保管（Ｌ３Ｍ）及び６ヶ月間にわたる保管（Ｌ６Ｍ）の影響を表す図である。
【図９】本来の糞便（ＮＳ）及び凍結乾燥された糞便（Ｌ７２Ｈ）に対して行われたガスクロマトグラフィーによる細菌性代謝物の発生の評価を示す図である。
【図１０】本来の糞便（Ｓ又はＮＳ）及び凍結乾燥された糞便（Ｌ７２ｈ）の抗クロストリジウム・ディフィシル効果の評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７５】
実施例１
１．  材料及び方法
１．１．  糞便試料採取
凍結乾燥条件の選択は、健康な無関係のボランティアによって提供され、かつ排泄直後にインキュベーション用の試料ポット内に備え付けられたＧＥＮｂａｇＡｎａｅｒ（商標）システムの存在のもとに置かれた、３つの糞便の研究を基礎としている。試料は、排泄後に、１時間未満で研究所に直接送られた。各々の糞便の一部は、直接分析のためのコントロールとしてＧＥＮｂａｇＡｎａｅｒ（商標）を用いて保管される。
【００７６】
１．２．  凍結保護物質の選択
この研究のために使用される凍結保護物質は、
−１０％のグリセロール（Ｇ）、
−滅菌された脱脂粉乳の１０％再構成物（Ｌ）、
−５％濃度のマルトデキストリン（Ｍ）、
−５％濃度のトレハロース（Ｔ５）及び１０％濃度のトレハロース（Ｔ１０）、
−６．７％濃度のマルトデキストリン及び１０％濃度のトレハロースの混合物、又はそれらの４０／６０のＭ／Ｔ重量比の混合物（ＭＴ）、
−コントロールとしての９‰濃度のＮａＣｌ溶液（それは一般的に、新鮮な排泄物の希釈に使用される）、
である。
【００７７】
各々の溶液を、滅菌ポット中に詰め、使用するまで＋４℃で貯蔵した。
【００７８】
１．３．  糞便の凍結乾燥物の調製
糞便を、凍結保護物質溶液で１０倍希釈し、使い捨ての心棒を取り付けたＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（商標）型ホモジナイザーを使用して均質化した。懸濁された溶液を、本来の糞便試料３００ｍｇにつき３ｍｌに相当する容量を有する凍結乾燥バイアルに入れた。
【００７９】
試験される各々の条件につき、そして３種の分析される糞便の各々につき、各々の希釈された糞便及び凍結乾燥されていない糞便の微生物叢中の細菌の生存力に対する、種々の凍結保護物質の効果を評価するために、ＧＥＮｂａｇＡｎａｅｒ（商標）システムの存在のもとで懸濁液バイアルを直ちに入れた。
【００８０】
残りのバイアルは、直ちに−８０℃に置く。３０分間の凍結後に、上記バイアルを、既に２４時間にわたり自動的サイクル下でトラップが冷却された凍結乾燥器（ＦｒｅｅＺｏｎｅ（商標）、６リットル、凍結乾燥システム、モデル７７５３０、Labcono Corporation社、米国、ミズーリ州、カンザスシティ）に入れる。この凍結乾燥期間が完了したら、それらのバイアルを真空下で密封し、アルミニウム蓋で固定する。
【００８１】
各々の糞便及び各々の凍結保存の条件につき、バイアルの１つの連続物を、微生物叢の分析のために微生物学研究所に送り、そして２つの連続物を、安定性試験のために４℃で３ヶ月〜４ヶ月及び７ヶ月〜８ヶ月にわたり貯蔵する。
【００８２】
１．４．  凍結乾燥条件に基づく微生物叢の生存力のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
微生物学的研究の第１工程は、微生物叢の多様性及びその生存力の維持に対する種々の凍結保護物質の存在下での希釈の効果を試験するために凍結乾燥されていない希釈された糞便を分析することであった。この目的のために、１０％の乳（Ｌ）、１０％のグリセロール（Ｇ）、５％のマルトデキストリン（Ｍ）、５％のトレハロース（Ｔ）、１０％のトレハロース（Ｔ１０）、並びに６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物、すなわちそれらの４０／６０のＭ／Ｔ重量比の混合物（ＭＴ）で作製された特定量の希釈物を、糞便の凍結乾燥物の調製後に直ちに嫌気生活下に置き、そして微生物培養を直ちに行った。
【００８３】
本過程の第２工程は、凍結乾燥物の研究に関連するものであった。分析は、調製後の週の間と、その後に４℃での３ヶ月〜４ヶ月及び７ヶ月〜８ヶ月の貯蔵後とで行った。各々の凍結乾燥物を、各々のバイアル中に最初に存在していた希釈された糞便の容量に相当する３ｍｌの滅菌ペプトン水で再構成する。
【００８４】
偏性好気性の微生物叢及び偏性嫌気性の微生物叢の分析のために、凍結乾燥されていない糞便及び凍結乾燥物の再構成物を、１０対１０で希釈し、選択培地及び非選択培地上に播種した（Rouge et al., 2010）。３７℃で好気的にインキュベートされた培地及び３７℃で嫌気性装置（Ｎ２／ＣＯ２／Ｈ２：８０／１０／１０）内にてインキュベートされた培地を、表１に示す。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
極度の酸素感受性（ＥＯＳ）細菌、例えばクロストリジウム・レプツム群の細菌の定量を、酸素の存在下又は酸素の不存在下に異なる培養により行った。この目的のために、新鮮な糞便試料（ＴＯ）及び様々な凍結乾燥された試料のペプトン水中での再水和物を、非常に栄養価の高い非選択培養培地（酵母エキスで栄養強化され、セロビオース、マルトース及びシステインが補われた脳−心臓培地に相当するＹＢＨＩ）で連続希釈した。この培地は、培養が極めて困難な細菌、例えばフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Faecalibacterium prausnitzii）の培養を可能にするように開発された。偏性嫌気性条件における特別な希釈が完了したら、それらが酸素の存在への耐性能力又は非耐性能力を、２つの平皿における、その一方を好気性雰囲気に６０分間曝し、もう一方を曝さない並行培養により評価した。この方法は、凍結乾燥後の種々の時間での種々の試料における偏性嫌気性の生細菌のパーセンテージの評価を可能にする。
【００８７】
２．  結果
２．１．  凍結乾燥前の微生物叢の多様性及び生存力に対する、種々の凍結保護物質の効果
様々な評価された凍結保護物質での、特にＭＴ混合物での糞便希釈は、細菌量に対して大きな影響を及ぼさず、本来の糞便又は９％のＮａＣｌで希釈された糞便（新鮮な糞便でのＦＭＴのために使用される調製物に相当する）と比較して、培養可能な微生物叢の種々の主要属の均衡に影響しなかった（図１）。微生物叢の主要な群は、生存したままである。
【００８８】
２．２．  使用される凍結保護物質に基づく微生物叢の生存力に対する凍結乾燥の効果
全細菌量を、凍結乾燥後の週の間に、又はＭＯで評価した。結果は、図２に表されている。試験された３種の凍結保護物質、すなわち５％のトレハロース溶液（Ｔ５）、１０％のトレハロース溶液（Ｔ１０）、並びに６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの混合物（ＴＭ）は、凍結乾燥の間に、培養可能な細菌の全細菌量の９０％より高い安定性を与えることが可能であり、この結果は、本来の糞便中、又は凍結乾燥前に９％のＮａＣｌで希釈された糞便中に存在する量と比較して約１ｌｏｇの損失に相当する。
【００８９】
凍結乾燥後７ヶ月間まで測定された全細菌量は、ほとんど変化していない（図３）。
【００９０】
さらに、これらの３種の凍結保護物質は、凍結乾燥の間にＥＯＳ細菌の効果的な保存を可能にする（図４）。
【００９１】
２．３．  使用される種々の凍結保護物質に基づく微生物叢の多様性に対する凍結乾燥の効果
上記のように試験された３種の凍結保護物質のうち、６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの凍結保護物質混合物（又は４０／６０の重量比の混合物）は、糞便３について、或る特定の偏性嫌気性の属における約１ｌｏｇ〜２ｌｏｇの減少にもかかわらず（図５）（示されていないが、その他の糞便については４ｌｏｇまで）、糞便中微生物叢を構成する主要属を生きた状態で維持するという最良の結果を与えるものである。それに対して、１０％のグリセロール溶液は、好気性の属及び嫌気性の属の両方についてあまり保護作用を有さない（結果は示されていない）。
【００９２】
偏性嫌気性の属（クロストリジウム属の１菌種及びバクテロイデス属の１菌種）は、研究が凍結乾燥後１週間以内に行われる場合に優勢のままである（図６）。凍結乾燥物の４℃での保管は、ほとんど影響を及ぼさず、４℃での貯蔵の３ヶ月後にバクテロイデス属の１菌種に関して約１．５ｌｏｇの更なる損失を示し、クロストリジウム属の１菌種に関して８ヶ月で１ｌｏｇの損失を示す（図６）。どの場合でも、微生物叢の優勢な属は、その保管の間に優勢のままである。
【００９３】
ビフィドバクテリウム属の１菌種が豊富な糞便２で得られた結果は、ＭＴ混合物における凍結乾燥後６ヶ月間までは、その群の安定性を示していた（結果は示されていない）。
【００９４】
まとめると、これらの結果は、ＭＴ混合物が、凍結乾燥された糞便中微生物叢の最良の保存を、生存力及び多様性の両方の点で、凍結乾燥後６ヶ月間までの時間にわたり可能にするものであることを示している。
【００９５】
実施例２
１．  材料及び方法
実施例１に記載される方法に従って、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６と呼ばれる３つの更なる糞便試料を、６．７％のマルトデキストリン及び１０％のトレハロースの凍結保護物質混合物（又は４０／６０のＭ／Ｔ重量比の混合物）の存在下で希釈し、次いで凍結乾燥した。
【００９６】
２．  結果
２．１．  ６ヶ月間の貯蔵後の凍結乾燥物における細菌生態系の安定性
２．１．１．  ６ヶ月間の貯蔵後の凍結乾燥物における細菌の生存力及び多様性の分析
偏性嫌気性の個体群を、代表的な細菌群：ビフィドバクテリウム属の複数菌種及びバクテロイデス属の複数菌種の計数に基づき分析した。
【００９７】
ビフィドバクテリウム属の複数菌種に関して、優勢な微生物叢の必須部分はそのままであり、６ヶ月間の保管期間の間に大きな変化は無い。
【００９８】
バクテロイデス属の複数菌種に関しては、６ヶ月間の期間にわたり約１．５ｌｏｇ〜４ｌｏｇの損失をもたらす個体間の変動が存在していた。
【００９９】
種々の試料からの任意の好気性−嫌気性の個体群を、ラクトバシラス属の複数菌種、エンテロコッカス属の複数菌種、及び腸内細菌科の細菌群の計数に基づき分析した。これらの属及び細菌群の、凍結乾燥してから６ヶ月間の保管期間を経た後の安定性及び生存力を確認する。
【０１００】
これらの結果は、この凍結乾燥法が、主要な細菌群の間の均衡全体に変化をもたらすことなく、様々な標的とする細菌個体群の生存力を大部分保持し、かつその保存が６ヶ月間の保管期間にわたり安定なままであることを示している（図７）。
【０１０１】
２．１．２．  極度の酸素感受性細菌の研究
糞便中微生物叢の特有の特徴の１つは、凍結乾燥法により影響され得る、極度の酸素感受性（ＥＯＳ）細菌の存在である。
【０１０２】
これらのＥＯＳ細菌は、すべての分析される試料において本来の糞便の場合も、糞便の凍結乾燥物の場合も両方で検出される（図８）。これらのＥＯＳ細菌を、嫌気性細菌の全量に対するパーセンテージとして表現する場合に（ＣＦＵ／ｍｌ）、その水準は、保管期間（試料に応じて３ヶ月間〜６ヶ月間）全体にわたって安定なままであり、そして偏性嫌気性の細菌の量は、保管法により影響されない。これらの結果は、凍結乾燥が、極度の酸素感受性を示す細菌個体群に影響しないことを示している。
【０１０３】
２．２．  凍結乾燥物中の細菌生態系の機能の安定性
２．２．１．  凍結乾燥物中の代謝物の検出
細菌性代謝物、すなわち短鎖脂肪酸の産生を、７２時間凍結乾燥物において、本来の糞便と比較して評価した。３種の分析された試料のうち、凍結乾燥は、発酵産物の保存をもたらし、その際、短鎖脂肪酸の濃度は、糞便試料に応じて、酢酸塩及びプロピオン酸塩の場合は２倍〜４倍増大し、酪酸塩の場合には２倍〜６倍増大した。細菌性代謝物は、揮発性であるが、凍結乾燥物中に存在する。その濃度の増大は、代謝物の濃縮をもたらす凍結乾燥の結果であると考えられる（図９）。
【０１０４】
２．２．２．  凍結乾燥物中の抗クロストリジウム・ディフィシル効果の検出
本来の糞便及び凍結乾燥物における抗クロストリジウム・ディフィシル効果を、１種の毒素原性菌株（菌株６３０）及び１種の非毒素原性菌株（菌株ＰＣＤ１）を含む２種のクロストリジウム・ディフィシル菌株の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。それらの菌株の増殖が阻止されると、接種領域の周りに青白い円が見られる。これは、接種円である。
【０１０５】
抗クロストリジウム・ディフィシル効果について既知の様々なコントロールを、ポジティブコントロールとして系統的に使用した。したがって、酢酸（ＡＡ）及び乳酸（ＡＬ）を、種々の濃度（３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ）で使用した。各々の平皿において、阻止円は、酢酸及び／又は乳酸の存在下で観察された。
【０１０６】
純粋な菌株、すなわち、阻止円の発生を引き起こさないラクトバシラス菌株及びビフィドバクテリウム（ＣＢ）菌株を、コントロールとして使用した。
【０１０７】
本来の糞便（Ｓ又はＮＳ）の存在下、及び−８０℃で７２時間にわたり凍結させた糞便（Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３）の存在下に阻止円は見られないが、凍結乾燥物の存在下では阻止円が見られる（図１０）。
【０１０８】
これらの様々な実験結果は、酢酸及び乳酸、並びに分析されたすべての糞便の凍結乾燥物について、阻止領域が存在することを明らかにしている。したがって、Ｃ．ディフィシルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生の糞便による阻止能力は、凍結乾燥によって強化される。
【０１０９】
実施例２に示されるすべての結果は、少なくとも６ヶ月の期間にわたる凍結乾燥物中の微生物叢の安定性及び生存力を確証し、そして該細菌の機能的能力は、凍結乾燥物内で維持され、それと共に特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究モデルにおいて、対象となる細菌性代謝物が保存され、そして抗クロストリジウム・ディフィシル効果が保持される。
【０１１０】
実施例３
１．  材料及び方法
１．１．  糞便の凍結乾燥物
健康な供与者からの４つの糞便を、実施例１に記載される方法により処理して、４種の糞便の凍結乾燥物：Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７を得た。その際、Ｓ７は、実施例２と比べて追加的な糞便試料に相当する。
【０１１１】
１．２．  賦形剤の選択
希釈剤
希釈剤の選択は、不活性な性質であること、そして特に特定の腸内効果が存在しないことに基づいている。
【０１１２】
選択された希釈剤は、無機賦形剤、リン酸二カルシウム（無水のＥｎｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）、JRS Pharma社、ドイツ、ローゼンベルク）及び微粉マルトデキストリン（Ｅｍｄｅｘ（商標）、JRS Pharma社、ドイツ、ローゼンベルク）であり、後者の賦形剤型が、既に凍結乾燥物の組成中に存在する。これらの両方の純粋な賦形剤の密度及び流出時間は、それぞれ、無水のＥｎｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）の場合には０．７９ｇ／ｍＬ及び３秒１８／１００ｇ、並びにＥｍｄｅｘ（商標）の場合には０．６８ｇ／ｍＬ及び６秒０３／１００ｇである。
【０１１３】
滑沢剤
３種の流動性滑沢剤を選択した：タルク（Cooper社、フランス）、親水性コロイダルシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ（商標）２００  Ｐｈａｒｍａ、Kraemer & Martin GmbH社、ドイツ、ザンクト−アウグスティン）、及び疎水性コロイダルシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ（商標）Ｒ９７２、Degussa-Huls社、フランス、クールブヴォア）。
【０１１４】
１．３．  流出時間の測定、及び凍結乾燥物の賦形剤への混合
この試験は、欧州薬局方モノグラフ２．９．１６に従って、まずは凍結乾燥物単独で行い、次いで０．５％で使用される流動性滑沢剤を入れた後に行い、そして必要に応じて、試験される希釈剤を７５／２５、５０／５０、及び２５／７５の重量比で入れた後に行った。これらの混合物は、手動で得られた。
【０１１５】
良好な流動性を特徴とする最終混合物の密度を、すべての混合物について測定してから、１ｍＬに対して計算することにより報告した。
【０１１６】
１．４．  良好な流動を特徴とする混合物を含むカプセル剤の作製
０．９５ｍＬの大容量で比較的容易な摂取と両立可能なサイズ（２３．３ｍｍ長）に関連して１００番のカプセルを選択した。該カプセルに、カプセル充填剤及び良好な流動を特徴とする混合物を手動で充填した。
【０１１７】
２．  結果
２．１．  凍結乾燥物の流動特性及び密度の研究
表１は、凍結乾燥物に対して実施した試験結果を示している。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
単独で試験されたそのままの糞便の凍結乾燥物のどれも流動特性を有していない。したがって、そのままでカプセル中に入れることは不可能である。
【０１２０】
流動性滑沢剤のその役割にもかかわらず、０．５％で使用されたタルク及びＡｅｒｏｓｉｌ（商標）２００は、凍結乾燥物（Ｓ４及びＳ５）の流動性を改善することができなかった。
【０１２１】
Ｅｍｄｅｘ（商標）及び無水のＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）希釈剤は、流動の改善に効果的である。その改善は、凍結乾燥物Ｓ４−タルク／Ｅｍｄｅｘ（商標）混合物の場合は５０／５０の比率で生じ、凍結乾燥物Ｓ５−Ａｅｒｏｓｉｌ（商標）２００／無水のＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）混合物の場合は７５／２５の比率で生ずる。凍結乾燥物及び希釈剤の間の２５／７５の比率で、該混合物は、１３．７０ｇ（Ｓ４）の場合は０秒６９の流出時間で流動性になり、１０．８６ｇ（Ｓ５）の場合は０秒５７で流動性になる。
【０１２２】
最後に、０．５％で単独で使用されたＡｅｒｏｓｉｌ（商標）Ｒ９７２流動性滑沢剤は、凍結乾燥物Ｓ６の流動性（１．４６６ｇにつき０秒３０）及びＳ７の流動性（３．２９６ｇにつき０秒２６）のかなりの改善をもたらした。
【０１２３】
混合物の密度は、「凍結乾燥物／流動性滑沢剤／希釈剤」混合物の場合は０．５３ｇ／ｍＬから０．６４ｇ／ｍＬまでの範囲であり、「凍結乾燥物／流動性滑沢剤」混合物の場合は０．３３ｇ／ｍＬから０．４７ｇ／ｍＬまでの範囲である。
【０１２４】
２．２．  上記混合物のカプセル剤の作製
表２は、各々の試料について製造されたカプセル剤の数、及び各々のカプセル中に組み込まれた凍結乾燥物の質量を示している。最初に実施された原物の理論質量は、最終列に報告される。
【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
試料Ｓ６及びＳ７の場合が最も好ましい。それというのも、わずか０．５％の流動性滑沢剤が添加されただけで、凍結乾燥物の希釈は微々たるものであるからである。しかしながら、同じ容量で２９３ｍｇ（Ｓ６）又は４７１ｍｇ（Ｓ７）の乾燥物に相当し得る２つの試料の間で観察されるかなり重要な可変性が存在する。これは、２つの試料間の密度の差に由来する。
【０１２７】
試料Ｓ４及びＳ５に関して、凍結乾燥物の希釈はより重要である。それというのも、７５％の希釈剤が、０．５％の流動性滑沢剤に加えて添加されるからである。凍結乾燥物の質量は、同じ容量で、各々の試料の密度に対して、１２５ｍｇ（Ｓ４）の乾燥物から１５１ｍｇ（Ｓ５）の乾燥物まで変動する。
【０１２８】
この研究により、粉体化された糞便中微生物叢の凍結乾燥物は、流動特性を有さず、したがって単独でカプセル中に入れることはできないことが示されている。
【０１２９】
しかしながら、凍結乾燥物の流動特性は、７５％の希釈剤（Ｅｍｄｅｘ（商標）マルトデキストリン、無水リン酸二カルシウム、無水のＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標））、又は０．５％の流動性滑沢剤（疎水性コロイダルシリカ、Ａｅｒｏｓｉｌ（商標）Ｒ９７２）のいずれかと混合することによって改善することが可能である。
【０１３０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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