(57)【要約】  本発明は、以下の：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せ、例えば（ｉ）エキセナチド若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せを提供する。上記組合せは、心保護のために、並びに虚血及び／又は再灌流傷害を治療及び／又は予防するために好適である。本発明のさらなる態様は、本発明に従う上記組合せを含む医薬製品及び医薬組成物、並びにこれを使用する治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤、及び（iii）アルドステロンアンタゴニスト、のうちの少なくとも２つを含む組合せ。
【請求項２】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストを含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
インスリンモジュレーター及び免疫抑制剤を含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤、及び（iii）アルドステロンアンタゴニストを含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項５】
インスリンモジュレーターが、エキセナチド及びその機能的誘導体及びアナログ、並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の組合せ。
【請求項６】
免疫抑制剤が、シクロスポリン及びその機能的誘導体及びアナログ、並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１、３、４及び５のいずれかに記載の組合せ。
【請求項７】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、ＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項５に記載の組合せ。
【請求項８】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド、及びデュラグルチド（LY2189265）から選択される、請求項５に記載の組合せ。
【請求項９】
シクロスポリン機能的誘導体又はアナログが、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）、好ましくはＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）から選択される、請求項６に記載の組合せ。
【請求項１０】
アルドステロンアンタゴニストが、スピロノラクトン、エプレレノン、カンレノン、カンレノ酸カリウム、フィネレノン及びプロレノン、並びに適用可能である場合これらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１、２及び４のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１１】
アルドステロンアンタゴニストが、カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログである、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１２】
ベータブロッカー、レニン−アンギオテンシン阻害剤、スタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）、血小板の活性化又は凝集の阻害剤、ホスホジエステラーゼ−３阻害剤、カルシウム増感剤、抗酸化剤、及び抗炎症剤から選択される少なくとも１つのさらなる有効活性成分（ＡＰＩ、active pharmaceutical ingredient）を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
非経口投与、好ましくは静脈内投与に好適な形態の、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤、及び（iii）アルドステロンアンタゴニスト、のうちの少なくとも２つを含む医薬製品。
【請求項１６】
以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログ、のうちの少なくとも２つを含む医薬製品。
【請求項１７】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、ＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項１６に記載の医薬製品。
【請求項１８】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド、及びデュラグルチド（LY2189265）から選択される、請求項１６又は１７に記載の医薬製品。
【請求項１９】
シクロスポリン機能的誘導体又はアナログが、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）、好ましくはＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）から選択される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の医薬製品。
【請求項２０】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の組合せ又は請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害、好ましくは心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項２０に記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項２２】
構成成分が、静脈内投与のためのものである、請求項２０又は２１に記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項２３】
構成成分が、再灌流中の投与のためのものである、請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項２４】
構成成分が、再灌流前の投与のためのものである、請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項２５】
構成成分が、再灌流後の投与のためのものである、請求項２０〜２２のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項２６】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、請求項１５〜１９のいずれかに記載の医薬製品であって、構成成分が、同時の、連続の、若しくは別々の投与のためのものである、前記医薬製品。
【請求項２７】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害、好ましくは心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項２６に記載の使用のための医薬製品。
【請求項２８】
構成成分が、非経口投与、好ましくは静脈内投与のためのものである、請求項２６又は２７に記載の使用のための医薬製品。
【請求項２９】
構成成分が、再灌流中の投与のためのものである、請求項２６〜２８のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項３０】
構成成分が、再灌流前の投与のためのものである、請求項２６〜２８のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項３１】
構成成分が、再灌流後の投与のためのものである、請求項２６〜２８のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項３２】
構成成分が、同時投与のためのものである、請求項２６〜３１のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項３３】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上を治療及び／若しくは予防する、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための方法であって、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤、及び（iii）アルドステロンアンタゴニスト、のうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３４】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上を治療及び／若しくは予防する、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための方法であって、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログ、のうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３５】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、ＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド、及びデュラグルチド（LY2189265）から選択される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
シクロスポリン機能的誘導体又はアナログが、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）、好ましくはＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）から選択される、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害、好ましくは心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項３３〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
構成成分が、非経口で、好ましくは静脈内に投与される、請求項３３〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
構成成分が、再灌流中に投与される、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
構成成分が、再灌流前に投与される、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
構成成分が、再灌流後に投与される、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
対象に構成成分を同時に投与するステップを含む、請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤、及び（iii）アルドステロンアンタゴニスト、のうちの少なくとも２つの使用。
【請求項４５】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログ、のうちの少なくとも２つの使用。
【請求項４６】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、ＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド、及びデュラグルチド（LY2189265）から選択される、請求項４５又は４６に記載の使用。
【請求項４８】
シクロスポリン機能的誘導体又はアナログが、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）、好ましくはＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）から選択される、請求項４５〜４７のいずれかに記載の使用。
【請求項４９】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害、好ましくは心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項４４〜４８のいずれかに記載の使用。
【請求項５０】
構成成分が、非経口で、好ましくは静脈内に投与される、請求項４４〜４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５１】
構成成分が、再灌流中に投与される、請求項４４〜５０のいずれかに記載の使用。
【請求項５２】
構成成分が、再灌流前に投与される、請求項４４〜５０のいずれかに記載の使用。
【請求項５３】
構成成分が、再灌流後に投与される、請求項４４〜５０のいずれかに記載の使用。
【請求項５４】
対象に構成成分を同時に投与するステップを含む、請求項４４〜５３のいずれかに記載の使用。
【請求項５５】
移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤、及び（iii）アルドステロンアンタゴニスト、のうちの少なくとも２つを含む組合せの使用。
【請求項５６】
移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくはその機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログ、のうちの少なくとも２つを含む組合せの使用。
【請求項５７】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、ＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
エキセナチド機能的誘導体又はアナログが、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）から選択される、請求項５５又は５６に記載の使用。
【請求項５９】
シクロスポリン機能的誘導体又はアナログが、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）、好ましくはＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811）から選択される、請求項５５〜５８のいずれかに記載の使用。
【請求項６０】
虚血及び／又は再灌流傷害が、心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項５５〜５９のいずれかに記載の使用。
【請求項６１】
構成成分が、移植前に投与される、請求項５５〜６０のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む新しい組合せ、例えば（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せを提供する。上記組合せは、心保護のために、並びに／又は虚血及び／若しくは再灌流傷害を治療及び／若しくは予防するために好適である。
【０００２】
さらなる態様は、本発明に従う上記組合せを含む医薬製品及び医薬組成物並びにこれを使用する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ，acute myocardial infarction）は、世界的に、死亡及び罹患の主因である。各年に、米国のみで７８５，０００人（ＳＴＥＭＩ  ５００．０００）が新規のＡＭＩを有すると見積もられており、約１分毎に１人のアメリカ人が罹患している（Roger et al., Circulation, 2012, 125: e2-e220）。欧州では男性の６人に１人及び女性の７人に１人が心筋梗塞で死亡する（ESC Guidelines for the management of acute MI in patients presenting with ST-elevation, Eur. Heart J., 2012, 33:2569-2619）。
【０００４】
現在、血栓溶解剤療法又は初回経皮的冠動脈形成術（ＰＰＣＩ，primary percutaneous coronary intervention）のいずれかを使用した時宜を得た心筋再灌流は、急性ＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ，ST-segment elevation myocardial infarction）患者の選択療法である（Worner et al., Rev Exp Cardiol., 2013, 66: 5-11）。これらの介入は、心筋梗塞（ＭＩ，myocardial infarct）を制限し、左心室収縮機能を保存し、心不全の開始を低減する。
【０００５】
しかしながら、死亡率は、これらの患者で依然としてかなり高く、入院死亡率は６〜１４％の範囲に及ぶ（Mandelzweig et al., Eur. Heart J., 2006, 27: 2285-2293）。さらに、罹患率は依然としてかなり高く、ＭＩは慢性心不全の主因であり、患者の約５〜６％は３０日以内に次の心血管事象を有し、約２．７％は１年で再入院する（Lagerqvist et al., N. Engl. J. Med., 2014, 371:1111-20）。
【０００６】
逆説的に、心筋再灌流は心筋救済に重要であるが、その代償として、虚血領域に酸素及び栄養素を提供することは、それ自体が心筋傷害及び心筋細胞死を誘発し得る。これは「心筋再灌流傷害」と呼ばれる現象であり、その不可逆的な結果は微小血管閉塞及び心筋梗塞を含む（Yellow and Hausenloy, N. Engl. J. Med., 2007, 357: 1121-1135）。虚血再灌流傷害は最終梗塞領域の約５０％の原因であると見積もられている（Yetgin et al., Neth. Heart J., 2010; 28, 389-392）。再灌流傷害を低減するための心保護療法（すなわち、抗酸化剤、カルシウムチャネル遮断薬及び抗炎症剤）を臨床に移行させる以前の試みは、失敗に終わった（Frohlich et al., Eur. Heart J., 2013, 34:1714-1724）。現在、再灌流したＳＴＥＭＩ患者において心筋再灌流傷害を予防するための承認された有効な療法はなく、心保護の重要な標的として残っている。
【０００７】
１９９０年代の先駆的な研究は、致死的な心筋再灌流傷害の重要なメディエーターとしてミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ，mitochondrial permeability transition pore）を最初に示唆した。再灌流の最初の数分のＭＰＴＰ（ミトコンドリア内膜の非選択的チャネル）の開放は、ミトコンドリアのＣａ２＋オーバーロード、酸化的ストレス、生理学的ｐＨの復元及びＡＴＰ枯渇を引き起こす（Heusch et al, Basic Res Cardiol, 2010, 105: 151-154）。これらの事象は、酸化的リン酸化を脱共役させることにより心筋細胞死を誘発する。
【０００８】
遊離ラジカルによる膜タンパク質の変化は、心筋再灌流損傷の発展における重要な要因の中の１つである。大量の活性酸素種（ＲＯＳ，reactive oxygen species）は、圧倒的な細胞内因性抗酸化防御を引き起こす。これは、他にも効果はあるが特に、脂質膜の過酸化及び膜統合性の喪失を引き起こし、これは壊死及び細胞死をもたらす（Zweier and Talukder, Cardiovasc Res, 2006, 70: 181-190）。再灌流の開始の際に豊富な酸素が再導入されるため、再流の最初の数分以内に、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル及びペルオキシナイトライトを含む追加の毒性酸素誘導体のバーストが引き起こされる。さらに、また、酸化的ストレスは、再灌流で一酸化窒素（血管拡張化合物）のバイオアベイラビリティを低減し、ＮＯドナーの投与は、動物モデルにおいて心保護的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Roger et al., Circulation, 2012, 125: e2-e220
【非特許文献２】ESC Guidelines for the management of acute MI in patients presenting with ST-elevation, Eur. Heart J., 2012, 33:2569-2619
【非特許文献３】Worner et al., Rev Exp Cardiol., 2013, 66: 5-11
【非特許文献４】Mandelzweig et al., Eur. Heart J., 2006, 27: 2285-2293
【非特許文献５】Lagerqvist et al., N. Engl. J. Med., 2014, 371:1111-20
【非特許文献６】Yellow and Hausenloy, N. Engl. J. Med., 2007, 357: 1121-1135
【非特許文献７】Yetgin et al., Neth. Heart J., 2010; 28, 389-392
【非特許文献８】Frohlich et al., Eur. Heart J., 2013, 34:1714-1724
【非特許文献９】Heusch et al, Basic Res Cardiol, 2010, 105: 151-154
【非特許文献１０】Zweier and Talukder, Cardiovasc Res, 2006, 70: 181-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在、再灌流傷害、特に心筋再灌流傷害の有効な治療が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、心保護的であり、再灌流傷害の予防及び／又は治療に好適である、新しい組合せを提供する。本発明の組合せ及び他の態様は、単一の活性医薬剤を使用する療法と比較して、より有効であり、優れた臨床転帰を提供する治療を提供する。
【００１２】
第１の態様は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【００１３】
第２の態様は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【００１４】
第３の態様は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
第４の態様は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つ並びに薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００１６】
第５の態様は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【００１７】
第６の態様は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【００１８】
第７の態様は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、上記に定義される組合せ又は医薬組成物に関する。
【００１９】
第８の態様は、構成成分が、同時の、連続の、若しくは別々の投与のためである、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、上記に定義される医薬製品に関する。
【００２０】
第９の態様は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上を治療及び／若しくは予防する、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための方法であって、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【００２１】
第１０の態様は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上を治療及び／若しくは予防する、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための方法であって、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【００２２】
第１１の態様は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【００２３】
第１２の態様は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【００２４】
第１３の態様は、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【００２５】
第１４の態様は、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に示される好ましい実施形態は、適宜、上記に挙げる本発明の態様のいずれかに適用可能である。
【００２７】
インスリンモジュレーター
一実施形態では、本発明の組合せは、インスリンモジュレーターを含む。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「インスリンモジュレーター」という用語は、インスリン活性を直接的又は間接的に増大又は減少することができ、次にインスリン仲介生理学的応答を増大又は減少し得る剤を指す。
【００２９】
好ましい態様では、本組合せ、方法、組成物及び使用は、本質的な特徴としてインスリンモジュレーターを含む。
【００３０】
一実施形態では、インスリンモジュレーターは、ＧＬＰ−１アゴニスト、ＤＰＰ−４阻害剤、ＰＰＡＲアゴニスト、インスリン及びこれらのアナログから選択され得る。
【００３１】
ＧＬＰ−１アゴニストの例として、エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）並びにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００３２】
ＤＰＰ−４阻害剤の例として、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、アログリプチン、トレラグリプチン、ゲミグリプチン、デュトグリプチン及びオマリグリプチン（MK-3102）並びにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００３３】
ＰＰＡＲアゴニストの例として、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、シプロフィブレート、ベザフィブレート、フェノフィブレート、サログリタザル、アレグリタザル、ムラグリタザル及びテサグリタザル並びにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００３４】
インスリンアナログの例として、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンデテミル、インスリンデグルデク、インスリングラルジン及びこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００３５】
したがって、一実施形態では、インスリンモジュレーターは、エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド、デュラグルチド（LY2189265）、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、アログリプチン、トレラグリプチン、ゲミグリプチン、デュトグリプチン、オマリグリプチン（MK-3102）、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、シプロフィブレート、ベザフィブレート、フェノフィブレート、サログリタザル、アレグリタザル、ムラグリタザル、テサグリタザル、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンデテミル、インスリンデグルデク、インスリングラルジン及びこれらの薬学的に許容される塩から選択され得る。
【００３６】
一実施形態では、インスリンモジュレーターは、エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド、デュラグルチド（LY2189265）及びこれらの薬学的に許容される塩から選択されるＧＬＰ−１アゴニストである。好ましくは、ＧＬＰ−１アゴニストは、エキセナチドである。
【００３７】
エキセナチド
好ましい一実施形態では、インスリンモジュレーターは、エキセナチド及びその機能的誘導体及びアナログ並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「エキセナチド」という用語は、以下の配列：
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２
の３９ｍｅｒペプチドを指す。
【００３９】
エキセナチド（同義語はエキセンジン４である）は元々、１９９２年にＥｎｇによりアメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum）の唾液から単離されている。これは、ヒトペプチドグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１，glucagon-like peptide-1）と同様の血糖調節効果を有するインスリン分泌促進薬である。
【００４０】
エキセナチドは、栄養素摂取に応答して放出される腸インクレチンホルモンであるヒトグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）を模倣する（Goke et al., J. Biol. Chem., 1993, 268: 19650-19655）。それは、ＧＬＰ−１受容体を介してインスリン分泌特性及びインスリン様特性を発揮する。ＧＬＰ−１受容体は、心臓及び血管内皮を含む多くの器官で広く発現されている（Bullock et al., Endocrinology, 1996, 137: 2968-2978、Nystrom et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004, 287: E1209-E1215）。現在、エキセナチドは、２型糖尿病を有する患者の治療のための抗糖尿病薬として承認されている。この適応症での推奨される用量は、最初に１日当たり５μｇ（マイクログラム）を２回であり、臨床応答に基づいて１カ月後に１日当たり１０μｇを２回まで増大する。
【００４１】
ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼ−４による迅速な分解のために非常に短い循環半減期（２分未満）を有するので、療法剤として無効である。エキセナチドは、ＧＬＰ−１と５０％相同であるが、ジペプチジルペプチダーゼ−４切断部位がないので、ヒトにおいて２．４時間の半減期を有する。
【００４２】
エキセナチドは、膵臓ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を向上させ、不適切に上昇したグルカゴン分泌を抑制し、胃内容排出を遅延させる。エキセナチドは、ヒトにおいて５０ｐｇ／ｍＬ（１２ｐＭ）の最小有効濃度を有し、非常に強い。現在のエキセナチドでの療法は、１日２回の注射（Byetta（登録商標））を含む。また、遅延放出製剤（Bydureon（登録商標））は、１週間に１回の注射について承認されている。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、エキセナチドの機能的アナログは、同様の構造を有するが、ある特定の態様の点でエキセナチドとは異なる化合物を指し得る（例えば、それは、他のもので置換される、１個又は２個以上の原子、官能基、アミノ酸残基又はサブ構造が異なり得る）。機能的アナログは、同様の薬理学的特性を示し、構造的に関連し得る。
【００４４】
一実施形態では、エキセナチドの機能的誘導体又はアナログは、半減期を延長するように改変したエキセナチドの形態、例えばエキセナチドのコンジュゲートである。
【００４５】
好ましい一実施形態では、エキセナチドの機能的誘導体又はアナログは、ペグ化エキセナチドである。例えば、好ましい一実施形態では、機能的誘導体又はアナログは、４０ｋＤａのＰＥＧでモノペグ化したエキセナチドである。ペグ化エキセナチドは、本分野で既知の方法により調製することができる。例として、エキセナチドのペグ化形態は、国際公開第２０１３／０５９３２３号パンフレット（Prolynx LLC社）で説明されている。また、エキセナチドは、他の分子、例えばタンパク質にコンジュゲートすることができる。
【００４６】
特に好ましい一実施形態では、エキセナチドの機能的誘導体又はアナログは、例えば商品名Bydureon（登録商標）で市販されている、延長放出形態である。別の好ましい実施形態では、エキセナチドの機能的誘導体又はアナログは、例えばKim JY et al, Biomaterials, 2013 Nov;34(33):8444-9で説明されている、維持送達のための多層ナノ粒子の形態である。
【００４７】
別の特に好ましい実施形態では、エキセナチドは、商品名Byetta（登録商標）として市販されているものなどの、注射可能形態である。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、エキセナチドの機能的誘導体又はアナログは、ＧＬＰ受容体アゴニストを指し得る。エキセナチドの好適な機能的誘導体又はアナログは、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）を含む。
【００４９】
一実施形態では、エキセナチドの機能的アナログは、１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に交換されている、並びに／又は１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が欠失している、並びに／又は１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が付加及び／若しくは挿入されている、改変エキセナチドを意味する。
【００５０】
一実施形態では、機能的エキセナチドアナログは、エキセナチドに対する１０個未満のアミノ酸改変（置換、欠失、付加（挿入を含む）及びこれらの任意の組合せ）、あるいはエキセナチドに対する９、８、７、６、５、４、３又は２個未満の改変を含む。
【００５１】
一実施形態では、機能的エキセナチドアナログは、エキセナチドに対する１０個のアミノ酸改変（置換、欠失、付加（挿入を含む）及びこれらの任意の組合せ）、あるいはエキセナチドに対する９、８、７、６、５、４、３、２又は１個の改変を含む。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、エキセナチドの機能的誘導体は、その塩、異性体、エナンチオマー、溶媒和物、多形体、プロドラッグ及び代謝物を含む。
【００５３】
免疫抑制剤
一実施形態では、本発明の組合せは、免疫抑制剤を含む。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「免疫抑制剤」という用語は、対象において免疫応答を部分的に、又は完全に抑制することができる剤を指す。
【００５５】
一実施形態では、免疫抑制剤は、グルココルチコイド、細胞分裂阻害剤、サイトカイン（例えばインターフェロン、インターロイキン、ケモカイン）、免疫抑制性抗体、カルシニューリン阻害剤及びＴＮＦ結合タンパク質から選択される。
【００５６】
一実施形態では、免疫抑制剤は、代謝拮抗薬、カルシニューリン阻害剤及びＴＮＦ結合タンパク質から選択される。
【００５７】
代謝拮抗薬の例として、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン及びフルオロウラシル並びにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００５８】
カルシニューリン阻害剤の例として、シクロスポリン、シクロスポリンＧ、Ｎ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811としても知られる）、タクロリムス及びピメクロリムス並びにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００５９】
ＴＮＦ結合タンパク質の例として、インフリキシマブ、エタネルセプト及びアダリムマブ並びにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００６０】
したがって、一実施形態では、免疫抑制剤は、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、シクロスポリン、シクロスポリンＧ、Ｎ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811としても知られる）、タクロリムス、ピメクロリムス、インフリキシマブ、エタネルセプト及びアダリムマブ並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される。
【００６１】
一実施形態では、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤である。一実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリン、シクロスポリンＧ、Ｎ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811としても知られる）、タクロリムス及びピメクロリムス並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される。好ましくは、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンである。
【００６２】
別の実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリン、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811としても知られる）並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される。
【００６３】
別の実施形態では、カルシニューリン阻害剤は、シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩である。
【００６４】
また、本発明は、上記免疫抑制剤の機能的誘導体及びアナログ、特に剤の半減期を延長するように改変したもの、例えば剤のコンジュゲートを包含する。
【００６５】
シクロスポリン
本明細書で使用されるとき、「シクロスポリン（cyclosporine）」又は「シクロスポリン（cyclosporin）」（シクロスポリンＡとしても知られる）という用語は、（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ，１８Ｓ，２１Ｓ，２４Ｓ，３０Ｓ，３３Ｓ）−３０−エチル−３３−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−４−ヘキセン−１−イル］−６，９，１８，２４−テトライソブチル−３，２１−ジイソプロピル−１，４，７，１０，１２，１５，１９，２５，２８−ノナメチル−１，４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１−ウンデカアザシクロトリトリアコンタン−２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデコンの分類（ＩＵＰＡＣ）名を有する、天然トリポクラジウム・インフラタム（Tolypocladium inflatum）環状非リボソームペプチドを指す。
【００６６】
シクロスポリンは、同種移植後の器官拒絶を予防するために広く使用されている免疫抑制剤である。この適応症について、この適応症で推奨されるIV用量は、最初に５〜６ｍｇ／ｋｇ／日である。それは、腎構造及び機能に対して有害効果を有するにもかかわらず、器官移植を管理するための重要なツールである。また、シクロスポリンは、乾癬、アトピー性皮膚炎、壊疽性膿皮症、慢性自己免疫性蕁麻疹及びリウマチ性関節炎の治療で有効であることが示されている。これらの適応症では、推奨される最初の経口用量は、１日当たり２回の投与に分けられる２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。しかしながら、この薬物と関連付けられる高度の毒性のために、シクロスポリンは典型的に、これらの状態の重度の症例に指示される。移植患者については、シクロスポリンは一般的に、腎機能の緊密なモニタリングを伴って、間欠的又は周期的にのみ投与される。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、シクロスポリンの機能的誘導体又はアナログに関する。一実施形態では、シクロスポリンの機能的誘導体又はアナログは、半減期を延長するように改変したシクロスポリンの形態、例えばシクロスポリンのコンジュゲートである。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、シクロスポリンの機能的誘導体として、その塩、異性体、エナンチオマー、溶媒和物、多形体、プロドラッグ及び代謝物が挙げられる。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、シクロスポリンの機能的アナログは、同様の構造を有するが、ある特定の態様の点でシクロスポリンとは異なる化合物を指し得る（例えば、それは、他のもので置換される、１個又は２個以上の原子、官能基、アミノ酸残基又はサブ構造が異なり得る）。機能的アナログは、同様の薬理学的特性を示し、構造的に関連し得る。
【００７０】
一実施形態では、シクロスポリンの機能的誘導体又はアナログは、シクロスポリンＧ、Ｎ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811としても知られる）、タクロリムス及びピメクロリムス並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される。別の実施形態では、シクロスポリンの機能的誘導体又はアナログは、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン（NIM811としても知られる）並びにこれらの薬学的に許容される塩から選択される。
【００７１】
シクロスポリンＧは、Ｌ−ノルバリンがα−アミノ酪酸を置換するアミノ酸２位においてシクロスポリンＡとは異なる（一般的に、Wenger, R.M. 1989, Synthesis of cyclosporine and analogues: structural and conformational requirements for immunosuppressive activity. Progress in Allergy, 38: 46-64を参照のこと）。
【００７２】
アルドステロンアンタゴニスト
一実施形態では、本発明の組合せは、アルドステロンアンタゴニストを含む。
【００７３】
好ましい態様では、本発明の組合せ、方法、組成物及び使用は、本質的な特徴としてアルドステロンアンタゴニストを含む。
【００７４】
急性心筋梗塞及びそれに続く血行力学変化は、複雑な神経ホルモン活性化をもたらす。レニン−アンギオテンシン−アルドステロン経路は、かかる神経ホルモン活性化の１つの基礎となるものである。アルドステロンは、急性心筋梗塞後の提示ではその最も高いレベルにあり、急性内皮機能不全、ＮＯ活性の阻害、内皮酸化的ストレスの増大、血管緊張の増大、カテコールアミンの組織による再捕捉の阻害、血管平滑筋細胞及び心筋細胞壊死の急激な発生、血管内のコラーゲン沈着、心筋肥大並びに線維症を含む、広いスペクトルの有害な心血管効果を促進することが報告されている（Struthers, Am Heart J, 2002, 144: S2-S7、Zannad and Radauceanu, Heart Fail Rev, 2005, 10: 71-78）。さらに、それは、転帰が悪いことが予測されると分かっている（Beygui et al, Circulation, 2006, 114: 2604-2610）。
【００７５】
アルドステロンアンタゴニスト又は抗ミネラロコルチコイドは、ミネラロコルチコイド受容体でアルドステロン作用に拮抗する利尿薬である。この薬物の群は多くの場合、慢性心不全の管理に使用されている。また、このクラスのメンバーは、（追加の抗アンドロゲン作用のために）高アルドステロン症（コン症候群を含む）及び女性型多毛症の管理で使用されている。ほとんどの抗ミネラロコルチコイドは、ステロイド系スピロラクトンである。
【００７６】
ミネラロコルチコイド受容体の拮抗作用は、腎臓のネフロンの集合尿細管におけるナトリウム再吸収を阻害する。これは、ナトリウム／カリウム交換を妨害し、尿カリウム排出を低減し、水分排出をわずかに増大させる（利尿）。うっ血性心不全では、アルドステロンアンタゴニストは、相加的な利尿効果のために他の薬物に加えて使用され、浮腫及び心臓仕事量を低減する。
【００７７】
現在のガイドラインは、ＥＰＨＥＳＵＳ試験の結果に基づいて、心筋梗塞後の心不全を示す患者において、ミネラロコルチコイド受容体アンタゴニストの使用を推奨する。
【００７８】
急性心筋梗塞の動物モデル及びクリニックにおけるいくつかの研究は、再灌流傷害の予防及びＳＴＥＭＩ患者における心機能の改善におけるアルドステロン遮断の利益を示している。
【００７９】
アルドステロンアンタゴニストの例として、スピロノラクトン（このクラスの最初の、及び最も広く使用されているメンバー）、エプレレノン（標的に対してスピロノラクトンよりもはるかに選択的であるが、いくらか、より弱く、より有効でない）、カンレノン及びカンレノ酸カリウム、フィネレノン（非ステロイド性であり、エプレレノン又はスピロノラクトンのいずれかより強く、より選択的である）並びにプロレノンが挙げられる。
【００８０】
特に好ましい一実施形態では、アルドステロンアンタゴニストは、カンレノ酸カリウムである。
【００８１】
また、一部の薬物は、それらの主要な作用機構に二次的な抗ミネラロコルチコイド効果を有する。例として、プロゲステロン、ドロスピレノン、ゲストデン及びベニジピンが挙げられる。
【００８２】
また、本発明は、アルドステロンアンタゴニストの機能的誘導体及びアナログ、特に剤の半減期を延長するように改変したもの、例えばアルドステロンアンタゴニストのコンジュゲートを包含する。
【００８３】
カンレノ酸カリウム
カンレノ酸のカリウム塩としても知られるカンレノ酸カリウム（potassium canrenoate）又はカンレノ酸カリウム（canrenoate potassium）は、スピロラクトン群のアルドステロンアンタゴニストである。スピロノラクトンと同様に、それはプロドラッグであり、体内でカンレノンに代謝される。カンレノ酸カリウムは典型的に、高アルドステロン症又は低カリウム血症の治療のために２００ｍｇ／日〜６００ｍｇ／日の範囲の用量で静脈内に与えられる。
【００８４】
カンレノ酸カリウムは、分類（ＩＵＰＡＣ）名カリウム３−［（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−３−オキソ−２，８，９，１１，１２，１４，１５，１６オクタヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル］プロパノエート、式Ｃ２２Ｈ２９ＫＯ４を有し、以下の化学構造を有する。
【００８５】
【化１】
2018537522.tif 000002
【００８６】
また、本発明は、カンレノ酸カリウムの機能的誘導体及びアナログ、特に剤の半減期を延長するように改変したもの、例えばカンレノ酸カリウムのコンジュゲートを包含する。
【００８７】
組合せ
一態様では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【００８８】
以下に説明する好ましい実施形態は、方法、使用、製品及び組成物を含む、本発明の他の態様に準用して適用する。
【００８９】
非常に好ましい一実施形態では、本組合せは、インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストを含む。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、本組合せは、インスリンモジュレーター及び免疫抑制剤を含む。
【００９１】
別の実施形態では、本組合せは、免疫抑制剤及びアルドステロンアンタゴニストを含む。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、本組合せは、（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストを含む。
【００９３】
一実施形態では、インスリンモジュレーターは、インスリンモジュレーターの上記に挙げる実施形態のいずれかに従って定義される。
【００９４】
一実施形態では、免疫抑制剤は、免疫抑制剤の上記に挙げる実施形態のいずれかに従って定義される。
【００９５】
一実施形態では、アルドステロンアンタゴニストは、アルドステロンアンタゴニストの上記に挙げる実施形態のいずれかに従って定義される。
【００９６】
別の態様では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩及び（iii）カンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログを含む組合せに関する。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩、（ii）シクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ、Ｎ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン、タクロリムス及びピメクロリムスのうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩並びに（iii）カンレノ酸カリウム、カンレノン、スピロノラクトン、エプレレノン、フィネレノン及びプロレノン又は適用可能である場合これらの薬学的に許容される塩（例えばカンレノン、スピロノラクトン、エプレレノン、フィネレノン及びプロレノンの薬学的に許容される塩）のうちの少なくとも１つ、のうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩並びに（iii）カンレノ酸カリウム、カンレノン、スピロノラクトン、エプレレノン、フィネレノン及びプロレノン又は適用可能である場合これらの薬学的に許容される塩のうちの少なくとも１つを含む組合せに関する。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩、（ii）シクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリンのうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩並びに（iii）カンレノ酸カリウム、カンレノン、スピロノラクトン、エプレレノン、フィネレノン及びプロレノン又は適用可能である場合これらの薬学的に許容される塩のうちの少なくとも１つ、のうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド又はその薬学的に許容される塩並びに（ii）シクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ、Ｎ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリン、タクロリムス及びピメクロリムスのうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩の組合せに関する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド又はその薬学的に許容される塩並びに（ii）シクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ及びＮ−メチル−４−イソロイシンシクロスポリンのうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩の組合せに関する。
【０１０３】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩並びに（ii）シクロスポリンＡ又はその薬学的に許容される塩の組合せに関する。
【０１０４】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド又はその薬学的に許容される塩、（ii）シクロスポリンＡ又はその薬学的に許容される塩及び（iii）カンレノ酸カリウムの組合せに関する。
【０１０５】
薬物の組合せの効果は、本質的に予測不可能であり、多くの場合、ある薬物が他の薬物の効果を部分的に、又は完全に阻害する傾向がある。本発明は、（ｉ）インスリンモジュレーター、例えばエキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、（ii）免疫抑制剤、例えばシクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩及び（iii）アルドステロンアンタゴニスト、例えばカンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せは、同時に、別々に、又は連続して投与されたとき、これらの２つの剤の間でいかなる顕著な、又は劇的な有害相互作用ももたらさないことを示す。予想外に任意のかかる拮抗相互作用がないことは、本組合せの臨床適用のために重要である。
【０１０６】
さらに、本発明に従う好ましい組合せは驚くべきことに、剤の最適用量がこれらの剤について承認されている適応症で推奨される用量より低く、及び／又は再灌流傷害について文献中で報告されている用量より低い（カンレノ酸カリウムを除く全ての場合で）といった具合に、個々の構成成分の効果の増強を示す。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の活性薬剤の組合せ（上記の（ｉ）、（ii）及び（iii）を参照のこと）は、単独で投与される各薬物と比較して向上した効果を生成する。
【０１０８】
さらに、別の実施形態では、本発明の活性薬剤の組合せ（上記の（ｉ）、（ii）及び（iii）を参照のこと）は、例えば再灌流傷害、特に心筋再灌流傷害の治療及び／又は予防において、予想外の相乗効果を生成する。
【０１０９】
２つ又は３つ以上の薬物の組合せは、様々なタイプの薬物相互作用をもたらし得る。薬物相互作用は、２つの薬物の組み合わせた効果が単独で与えられる各剤の効果の合計と等しい場合、相加的であると言われる。薬物相互作用は、２つの薬物の組み合わせた効果が単独で与えられる各薬物の効果を超える場合、相乗的であると言われる（Goodman and Gilmans' “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 12th Edition）。
【０１１０】
組合せ療法は、心血管疾患、がん及び感染性疾患を含む多くの疾患環境において、重要な治療様式である。最近の科学的進歩により、これら及び他の複雑な疾患の根底にある病態生理学的プロセスの理解が増大した。この理解の増大により、治療応答を改善するか、抵抗性の発達を最小限にするか、又は有害事象を最小限にするための、多数の療法標的を対象とする薬物の組合せを使用する新しい療法アプローチの開発にさらに拍車がかかった。組合せ療法が顕著な療法的利点を提供する環境では、２つ又は３つ以上の薬物の新しい組合せの開発への関心が増大している。
【０１１１】
有利なことには、相乗的組合せは、より低い用量の各構成成分が存在することを可能にし、これにより療法の毒性を減少させ、一方で同じ療法効果又は向上した療法効果を生成及び／又は維持し得る。したがって、特に好ましい実施形態では、各構成成分は、治療的量より少ない量で存在する。
【０１１２】
「治療有効量より少ない量」という用語は、各剤単独での治療について療法効果を生成するのに典型的に必要とされる量より低い量を意味する。
【０１１３】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）インスリンモジュレーター及び（iii）アルドステロンアンタゴニストを含む相乗的組合せに関する。
【０１１４】
一実施形態では、インスリンモジュレーターは、インスリンモジュレーターの上記に挙げる実施形態のいずれかに従って定義される。
【０１１５】
一実施形態では、アルドステロンアンタゴニストは、アルドステロンアンタゴニストの上記に挙げる実施形態のいずれかに従って定義される。
【０１１６】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩並びに（iii）カンレノ酸カリウム、カンレノン、スピロノラクトン、エプレレノン、フィネレノン及びプロレノン又は適用可能である場合これらの薬学的に許容される塩のうちの少なくとも１つの相乗的組合せに関する。
【０１１７】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド又はその薬学的に許容される塩及び（iii）カンレノ酸カリウムの相乗的組合せに関する。
【０１１８】
一実施形態では、本発明は、（ｉ）エキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、リラグルチド、タスポグルチド及びデュラグルチド（LY2189265）のうちの少なくとも１つ又はその薬学的に許容される塩並びに（iii）カンレノ酸カリウムの相乗的組合せに関する。
【０１１９】
追加の有効活性成分
一実施形態では、上記に説明する組合せは、少なくとも１つのさらなる有効活性成分（ＡＰＩ，active pharmaceutical ingredient）を含む。
【０１２０】
一実施形態では、上記に説明する組合せは、ベータブロッカー、レニン−アンギオテンシン阻害剤、スタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）、血小板活性化又は凝集の阻害剤、ホスホジエステラーゼ−３阻害剤、カルシウム増感剤、抗酸化剤及び抗炎症剤から選択される少なくとも１つのさらなるＡＰＩをさらに含み得る。
【０１２１】
ベータブロッカーの例として、プロプラノロール、メトプロロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール及びチモロールが挙げられる。
【０１２２】
レニン−アンギオテンシン阻害剤として、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＡＴ１受容体阻害剤及びレニン阻害剤が挙げられる。
【０１２３】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤の例として、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル及びホシノプリルが挙げられる。
【０１２４】
アンギオテンシンＡＴ１受容体アンタゴニストの例として、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、フィマサルタン及びテルミサルタンが挙げられる。
【０１２５】
レニン阻害剤の例として、レミキレン及びアリスキレンが挙げられる。
【０１２６】
カルシウム増感剤の例として、レボシメンダン及びそのアナログが挙げられる。
【０１２７】
スタチンの例として、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンが挙げられる。
【０１２８】
血小板活性化又は凝集阻害剤の例として、プロスタサイクリン（エポプロステノール）及びそのアナログ及び誘導体（例えばトレプロスチニル、イロプロスト）、不可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばアスピリン、トリフルサル）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ，adenosine diphosphate）受容体阻害剤（例えばクロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン）、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばシロスタゾール）、プロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１，protease-activated receptor-1）アンタゴニスト（例えばボラパクサール）、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤（例えばアブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン）、アデノシン再取り込み阻害剤（例えばジピリダモール）並びにトロンボキサン合成酵素阻害剤及びトロンボキサン受容体アンタゴニスト（例えばテルトロバン）を含むトロンボキサン阻害剤が挙げられる。
【０１２９】
ホスホジエステラーゼ−３（ＰＤＥ−３，phosphodiesterase-3）阻害剤の例として、アムリノン、ミルリノン及びこれらのアナログが挙げられる。
【０１３０】
抗酸化剤の例として、アスコルビン酸、リポ酸、グルタチオン及びメラトニンが挙げられる。
【０１３１】
抗炎症剤の例として、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、グルココルチコイド（例えばヒドロコルチゾン）及び非ステロイド性抗炎症薬（例えばイブプロフェン）が挙げられる。
【０１３２】
一実施形態では、上記の組合せは、プロプラノロール、メトプロロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール、チモロール、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、ホシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、フィマサルタン、テルミサルタン、レミキレン及びアリスキレンから選択される少なくとも１つのさらなるＡＰＩを含む。
【０１３３】
別の実施形態では、上記の組合せは、カルベジロール、メトプロロール、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、フィマサルタン、テルミサルタン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、ホシノプリル、レミキレン及びアリスキレンから選択される少なくとも１つのさらなるＡＰＩを含む。
【０１３４】
別の実施形態では、上記の組合せは、カルベジロール及びメトプロロールから選択される少なくとも１つのさらなるＡＰＩを含む。
【０１３５】
薬学的に許容される塩
本発明の活性医薬剤は、薬学的に許容される塩として存在し得る。
【０１３６】
本発明の剤の薬学的に許容される塩は、その好適な酸添加塩又は塩基塩を含む。好適な薬学的塩の概略は、Berge et al., J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)で見ることができる。塩は、例えば強無機酸、例えば鉱酸、例えば硫酸、リン酸若しくはハロゲン化水素酸で；強有機カルボン酸、例えば（例えばハロゲンにより）置換されていないか、若しくは置換されている１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸、例えば酢酸で；飽和若しくは不飽和ジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸若しくはテトラフタル酸で；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸若しくはクエン酸で；アミノ酸、例えばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸で；安息香酸で；又は有機スルホン酸、例えば（例えばハロゲンにより）置換されていないか、若しくは置換されている（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルスルホン酸若しくはアリールスルホン酸、例えばメタンスルホン酸若しくはｐ−トルエンスルホン酸で形成される。
【０１３７】
エナンチオマー／互変異性体
また、本発明は、適切な場合、活性医薬剤の全てのエナンチオマー及び互変異性体を含む。当業者は、光学特性（１つ又は２つ以上のキラル炭素原子）又は互変異性特徴を有する化合物を認識する。対応するエナンチオマー及び／又は互変異性体は、本分野で既知の方法により単離／調製することができる。
【０１３８】
立体及び幾何異性体
本発明の活性医薬剤の一部は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在してもよく、例えばそれらは１つ又は２つ以上の不斉及び／又は幾何中心を有してもよく、そのため２つ又は３つ以上の立体異性形及び／又は幾何形で存在し得る。本発明は、それらの阻害剤の全ての個々の立体異性体及び幾何異性体並びにこれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲で使用される用語は、これらの形態が適切な機能的活性を（必ずしも同じ程度までではないが）保持する限り、上記形態を包含する。
【０１３９】
また、本発明は、活性医薬剤又はその薬学的に許容される塩の全ての好適な同位体変形を含む。本発明の剤又はその薬学的に許容される塩の同位体変形は、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有するが、通常天然で見られる原子量とは異なる原子量を有する原子により置換されているものとして定義される。本剤及びその薬学的に許容される塩に組み込まれ得る同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体、例えばそれぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌが挙げられる。本剤及びその薬学的に許容される塩のある特定の同位体変形、例えば３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬物及び／又は基質組織分布研究において有用である。トリチウム標識、すなわち、３Ｈ及び炭素−１４、すなわち、１４Ｃ同位体は、それらの調製及び検出性の容易さのために特に好ましい。さらに、重水素、すなわち、２Ｈなどの同位体での置換は、より大きな代謝安定性から生じるある特定の療法的利点、例えば増大したインビボ半減期又は減少した投与量必要性を与えることができ、それゆえ、一部の状況で好ましい場合がある。本発明の剤及び本発明のその薬学的に許容される塩の同位体変形は一般的に、好適な試薬の適切な同位体変形を使用して、従来手技により調製することができる。
【０１４０】
溶媒和物
また、本発明は、本発明の活性医薬剤の溶媒和形を含む。特許請求の範囲で使用される用語は、これらの形態を包含する。
【０１４１】
多形体
本発明はさらに、様々な結晶形、多形及び（無）水和形の本発明の活性医薬剤に関する。化学化合物が、かかる化合物の合成的調製において使用される溶媒からの精製及び又は単離方法をわずかに変化させることにより、かかる形態のいずれかで単離することができることは医薬産業内において十分に確立されている。
【０１４２】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せ；並びに薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。別の態様では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩及び（iii）カンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せ；並びに薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０１４３】
本発明の化合物（それらの薬学的に許容される塩を含む）は単独で投与することができるが、それらは一般的に、特にヒトの療法のためには、医薬担体、賦形剤又は希釈剤との混合物で投与される。医薬組成物は、ヒト医薬及び獣医学的医薬において、それぞれ、ヒト又は非ヒト動物使用のためであり得る。
【０１４４】
本明細書で説明する医薬組成物の様々な異なる形態について好適なかかる賦形剤の例は、A Wade and PJ Wellerにより編集された“Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 2nd Edition, (1994)で見ることができる。
【０１４５】
療法的使用に許容される担体又は希釈剤は、医薬分野で周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.  (A. R. Gennaro edit. 1985)で説明されている。
【０１４６】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準の医薬の実施について選択することができる。投与経路の例として、非経口（例えば静脈内、筋内、皮内、腹腔内又は皮下）、経口、吸入、経皮（局所）、眼内、イオン導入及び経粘膜投与が挙げられる。
【０１４７】
一実施形態では、本医薬組成物は、非経口投与（例えば静脈内、動脈内、髄腔内、筋内、皮内、腹腔内又は皮下）用である。好ましくは、本組成物は、滅菌又は滅菌可能溶液から調製される。
【０１４８】
別の実施形態では、本医薬組成物は、静脈内、筋内又は皮下投与用である。別の実施形態では、本医薬組成物は、静脈内投与用である。
【０１４９】
非経口、皮内又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の構成成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩；及び浸透圧の調節のための剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含み得る。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調節することができる。
【０１５０】
注射使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即座の調製のための滅菌粉末を含み得る。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）を含む。全ての場合で、非経口投与のための組成物は、無菌でなければならず、注射器での注射が容易である程度まで流体であるべきである。それは、製造及び保存条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。
【０１５１】
滅菌注射用溶液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙される成分のうちの１つ又は組合せを伴って適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基礎的な分散媒体及び上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体に組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、典型的な調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、これは事前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を産生し得る。また、本発明は、活性薬剤を含むリポソーム製剤及びナノ粒子製剤を包含する。かかる製剤は、それらの調製のための方法と共に、当業者によく知られている。
【０１５２】
医薬製品
別の態様では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩及び（iii）カンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１５４】
一実施形態では、本医薬製品は、治療過程に必要な全ての備品（例えば薬物のバイアル、希釈剤のバイアル、シリンジ及び針）を含有する部品のキットである。
【０１５５】
一実施形態では、キットは、各活性薬剤についての別々の容器を含む。上記容器は、アンプル、使い捨てシリンジ又は多用量バイアルであってもよい。
【０１５６】
別の実施形態では、キットは、各活性薬剤の組み合わせた調製物を含む容器を含む。
【０１５７】
キットはさらに、再灌流傷害の治療及び／又は予防のための使用説明書を含んでもよい。
【０１５８】
医療使用
一態様では、本発明は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１５９】
一態様では、本発明は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１６０】
別の態様では、本発明は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せを含む医薬組成物に関する。
【０１６１】
別の態様では、本発明は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せを含む医薬組成物に関する。
【０１６２】
別の態様では、本発明は、構成成分が、同時の、連続の、若しくは別々の投与のためである、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１６３】
別の態様では、本発明は、構成成分が、同時の、連続の、若しくは別々の投与のためである、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又は機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１６４】
別の態様では、本発明は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター及び（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【０１６５】
別の態様では、本発明は、虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【０１６６】
一実施形態では、本発明は、再灌流傷害の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、再灌流傷害の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明は、再灌流傷害の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せを含む医薬組成物に関する。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明は、再灌流傷害の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せを含む医薬組成物に関する。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明は、構成成分が、同時の、連続の、又は別々の投与のためである、再灌流傷害の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明は、構成成分が、同時の、連続の、又は別々の投与のためである、再灌流傷害の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明は、再灌流傷害の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明は、再灌流傷害の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【０１７４】
一実施形態では、本発明は、虚血の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１７５】
一実施形態では、本発明は、虚血の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せに関する。
【０１７６】
別の実施形態では、本発明は、虚血の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せを含む医薬組成物に関する。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明は、虚血の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せを含む医薬組成物に関する。
【０１７８】
別の実施形態では、本発明は、構成成分が、同時の、連続の、又は別々の投与のためである、虚血の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明は、構成成分が、同時の、連続の、又は別々の投与のためである、虚血の治療及び／又は予防における使用のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む医薬製品に関する。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明は、虚血の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、虚血の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つの使用に関する。
【０１８２】
本明細書で使用されるとき、「再灌流傷害」という用語は、虚血期間後に組織に血液供給が戻るときに引き起こされる組織への損傷を指す。血液からの酸素及び栄養素がないことにより、循環の復元が、正常な機能の復元よりもむしろ、酸化的ストレスの誘発を通して炎症、ミトコンドリア機能不全及び酸化的損傷をもたらす状態が創出される。再灌流傷害は、自然に起こる事象、例えば動脈封鎖又は計画された事象、例えばいくつかの外科的介入のいずれかの後に起こり得る。心筋再灌流傷害は、例えば心筋梗塞後、又は心臓移植の結果として起こり得る。
【０１８３】
一実施形態では、虚血及び／又は再灌流傷害は、脳、心臓、肺、腎臓又は虚血及び／若しくは再灌流傷害になりやすい他の器官／組織の虚血及び／又は再灌流傷害であってもよい。
【０１８４】
一実施形態では、虚血及び／又は再灌流傷害は、心臓の虚血及び／又は再灌流傷害、好ましくは心筋虚血及び／又は心筋再灌流傷害である。
インスリンモジュレーター、免疫抑制剤及びアルドステロンアンタゴニストは、（投薬レジメンの部分としての）同時の、連続の、又は別々の投与のためであってもよい。
【０１８５】
エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩及びカンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、（投薬レジメンの部分としての）同時の、連続の、又は別々の投与のためであってもよい。
【０１８６】
本明細書で使用されるとき、「同時に」は、２つの剤が同時進行で投与されることを意味するために使用される。
【０１８７】
本明細書で使用されるとき、「連続して」は、活性薬剤が同時進行で投与されないが、１つが他方の後に投与されることを意味するために使用される。したがって、「連続の」投与は、最初に投与される剤の循環半減期が、１つの剤及び他方が治療有効量で両方とも同時進行で存在するようなものである限り、１つの剤が他方の後５分、１０分又はおよそ数時間以内に投与されることを可能にし得る。これらの構成成分の投与間の時間遅延は、これらの構成成分の正確な性質、それらの間の相互作用及びそれらの各々の半減期によって変化する。
【０１８８】
「連続して」とは対照的に、「別々に」は、１つの剤及び他方の投与間の間隙が顕著であること、すなわち、最初に投与される剤は、第２の剤が投与されたときもはや、治療有効量で血流中に存在しない場合があることを意味するために本明細書で使用される。
【０１８９】
一実施形態では、本組合せの構成成分は、同時投与のためである。
【０１９０】
治療方法
別の態様では、本発明は、虚血及び／又は再灌流傷害を治療及び／又は予防する方法であって、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを、対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１９１】
別の態様では、本発明は、虚血及び／又は再灌流傷害を治療及び／又は予防する方法であって、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１９２】
一実施形態では、本発明は、再灌流傷害を治療及び／又は予防する方法であって、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１９３】
一実施形態では、本発明は、再灌流傷害を治療及び／又は予防する方法であって、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明は、虚血を治療及び／又は予防する方法であって、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明は、虚血を治療及び／又は予防する方法であって、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを、それを必要とする対象に同時に、連続して、又は別々に投与するステップを含む方法に関する。
【０１９６】
一実施形態では、本方法は、脳、心臓、肺、腎臓又は虚血及び／若しくは再灌流傷害になりやすい他の器官／組織の虚血及び／又は再灌流傷害を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０１９７】
一実施形態では、本方法は、脳、心臓、肺、腎臓又は再灌流傷害になりやすい他の器官／組織の再灌流傷害を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０１９８】
一実施形態では、本方法は、脳、心臓、肺、腎臓又は虚血になりやすい他の器官／組織の虚血を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０１９９】
別の実施形態では、本方法は、心臓の虚血及び／又は再灌流傷害、好ましくは心筋虚血及び／又は心筋再灌流傷害を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０２００】
別の実施形態では、本方法は、心臓の再灌流傷害、好ましくは心筋再灌流傷害を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０２０１】
特に好ましい一実施形態では、本方法は、急性心筋梗塞を治療及び／又は予防するステップに関する。急性心筋梗塞は、再灌流傷害の最も一般的な臨床徴候の１つである。
【０２０２】
別の実施形態では、本方法は、新生児仮死を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０２０３】
新生児仮死（又は周産期仮死）は、出生過程中に、通常脳への、身体的損害を引き起こすほど長く続く、新生児への酸素の欠乏から生じる医学的状態である。新生児仮死の最も一般的な原因は、例えば不十分な循環若しくは灌流、呼吸努力の減損又は不十分な換気のための、分娩中の母体の血圧降下又は乳児の脳への血流に対する他の妨害である。
【０２０４】
新生児仮死は、乳児の器官（心臓、肺、肝臓、消化管、腎臓）のほとんどに低酸素損傷を引き起こし得るが、脳損傷は最も重大であり、おそらく即座に、又は完全に治癒することが最も少ない。より深刻な症例では、乳児は生存するが、発育遅延若しくは知的障害などの知能又は痙縮などの身体のいずれかとして現れる脳への損傷を伴う。重度の周産期仮死を患う乳児は通常、紫藍症（チアノーゼ）、不十分な灌流、不十分な応答性、不十分な筋緊張及び不十分な呼吸努力を有する。過度の仮死は、心停止及び死亡を引き起こし得る。新生児仮死は、満期で出生した新生児１０００人当たり２〜１０人で、早産で出生した新生児についてはより多い例で起こる。ＷＨＯは、出生時仮死のために１年当たり４００万件の新生児死亡が起こり、５歳以下の小児の死亡の３８％になると見積もっている。
【０２０５】
別の実施形態では、本方法は、心臓の虚血、好ましくは心筋虚血を治療及び／又は予防するステップに関する。
【０２０６】
一実施形態では、対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０２０７】
一実施形態では、本方法は、対象に構成成分を非経口で（例えば静脈内に、筋内に、皮内に、腹腔内に又は皮下に）投与するステップを含む。
【０２０８】
別の実施形態では、本方法は、対象に構成成分を静脈内、筋内又は皮下投与するステップを含む。
【０２０９】
別の実施形態では、本方法は、対象に構成成分を静脈内投与するステップを含む。
【０２１０】
各構成成分は、他の構成成分と同じ又は異なる経路により投与することができる。好ましくは、構成成分は、同じ経路により投与される。
【０２１１】
一実施形態では、請求される組合せは、心臓移植前に、及び／又は心臓移植中に、及び／又は心臓移植後にドナー対象及び／又はレシピエント対象に投与される。例えば一部の実施形態では、本組合せは、心臓器官が第２の対象への移植のために除去される第１の対象に投与され得る。加えて又はあるいは、一部の実施形態では、本組合せは、第２の対象への導入前に、抽出された心臓器官に投与される。加えて又はあるいは、一部の実施形態では、本組合せ療法は、心臓移植前に、心臓移植中に、及び／又は心臓移植後に第２の対象に投与される。
【０２１２】
一実施形態では、請求される組合せは、心原性ショックを有する対象への投与のためである。心原性ショックは、心臓の心室の有効な機能の一次不全のための不十分な血液循環から生じる生死にかかわる医学的状態である。この状態は、心筋梗塞のために入院した患者の２〜１０％で起こり、これらの患者の中で主要な死亡原因である（Holmes et al, 1995, J Am Coll Cardiol, 26: 668-674）。より具体的には、心原性ショックは、心臓ポンプ不全により開始される、酸素送達の不全、全身性ＡＴＰ欠乏及び多器官機能障害を伴う複雑なプロセスの結果である（Okuda, 2006, Shock, 25: 557-570）。これは循環性ショックの一種であるため、組織の灌流は、酸素及び栄養素についての要求を満たすには不十分である。この状態は、酸素枯渇（低酸素症）及び栄養素枯渇（例えば低血糖）からますますより広汎性の細胞死に関連する。このため、それは、心臓ポンプ機能の急な停止である心停止（又は循環停止）（並びに呼吸停止及び意識喪失）を引き起こし得る。心原性ショックは、十分な左心室充満圧にもかかわらず、組織の低灌流を伴う低血圧の維持により定義される。組織の低灌流の徴候として、低尿産生（３０ｍＬ／時間未満）、四肢の冷え及び意識レベルの変化が挙げられる。いくつかの大規模な試験は、冠血行再建が、患者生存を改善するための最も重要な策であることを示した（Hochman et al, 1999, N Engl J Med, 341: 625-634）。しかしながら、急激な血行再建にもかかわらず心原性ショックを発症した患者は、おそらく再灌流傷害によるものであり、結果として生じる梗塞サイズに関連付けられると考えられる予後不良を有する。実際に、低体温法は、心筋梗塞で組織保護を提供することが示されており、前臨床研究は、実験的に誘発した心筋梗塞における梗塞サイズを低減する上で有益な結果を示している（Dae et al, 2002, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 282: H1584-H1591）。したがって、ブタモデルでは、軽度の療法的低体温法は、心原性ショックにおける急性死亡率を低減し、血行動態パラメータを改善した（Gotberg et al, 2010, Resuscitation, 81: 1190-1196）。
【０２１３】
一実施形態では、請求される組合せは、心停止を有する対象への投与のためである。心停止は、心臓の有効な収縮の不全のための有効な血流の突然の停止である。心停止の最も一般的な原因は、冠動脈疾患である。心停止の治療は、即時の心肺蘇生法（ＣＰＲ，cardiopulmonary resuscitation）であり、衝撃を与えられる律動が存在する場合は、除細動法である。米国では、病院外での心停止は、１年に１０，０００人当たり約１３人で起こる（３２６，０００症例）。院内心停止は、追加の２０９，０００人で起こる（Kronic et al, Circulation, 2015, 132: S397-S413）。質の高い心肺蘇生法を提供することに加えて、蘇生後症候群の管理を最適化することは心停止患者の長期転帰を改善するために決定的に重要である。この症候群（「蘇生後症候群」）では、３つの主要な重点領域：（１）心停止後脳傷害；（２）心停止後心筋機能不全及び再灌流傷害；並びに（３）全身虚血再灌流応答がある。蘇生後ケアは生存者の長期生存並びに心筋及び神経回復及び機能に影響し得ることが現在明らかである（Kern, 2015, Circ J, 79: 1156-1163）。虚血再灌流中のミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）開放の阻害は、心臓及び他の全身器官の傷害を改善し得る。実際に、心停止の動物モデルにおいて、心停止後心筋機能不全及び生存が、シクロスポリン治療により改善され得ることが示されている（Huang et al, 2011, Resuscitation, 82S: S41-S47）。
【０２１４】
一実施形態では、請求される組合せは、発作を有する対象への投与のためである。発作は、脳への血流の乏しさが細胞死をもたらすときである。２つの主要なタイプの発作：血流の欠乏のための虚血性及び出血のための出血性がある。それらは、脳の部分が適切に機能しないことをもたらす。発作の徴候及び症状は、数ある中で、身体の片側について動かすか、若しくは感じることができないこと、理解若しくは発話の困難、世界が回転しているように感じること又は片側の視覚の喪失を含み得る。虚血性発作は典型的に、血管の封鎖により引き起こされる。虚血性発作の治療は、問題のある狭窄を有する者では、脳への動脈を開放する手術（再灌流）を含む。虚血性発作は、３〜４時間半以内に検出された場合、血栓を破壊し得る薬物療法により治療可能であり得る。２０１３年では、発作は、冠動脈疾患に次いで２番目に頻繁な死亡原因であり、６４０万件の死亡（全体の１２％）の原因であった。
【０２１５】
虚血性発作及び急性心筋梗塞は、機能についての転帰を改善するために緊急再灌流を必要とする（Patel and Saver, 2013, Stroke, 44: 94-98）。静脈内組織型プラスミノーゲンアクチベーターは長い間、急性虚血性発作を有する患者において、証明された臨床的利益を有する唯一の再灌流療法であった。急性心筋梗塞でそうであるように、急性虚血性発作において再灌流を復元する血管内方法は、患者を虚血／再灌流傷害の増大に曝露し、これにより、共に再灌流傷害のマーカーと考えられる出血性の変質及び重度の血管原性浮腫を促進することにより再開通の利点を妨げ得る（Bai and Lyden, 2015, Int J Stroke, 10: 143-152）。実験的証拠は、脳虚血再灌流傷害（心筋再灌流傷害で起きる）は、虚血の前処理及び後処理により減衰することができることを示す。加えて、実験的証拠は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）は心筋及び脳虚血再灌流傷害の両方において重要な役割を果たすこと（Schinzel et al, 2005, Proc Natl Acad Sci USA, 102: 12005-12010）、並びにシクロスポリンＡ（ＭＰＴＰ開放阻害剤）は動物モデルにおいて脳虚血再灌流傷害を予防し得ること（Leger et al, 2011, Exp Neurol, 230: 58-66、Borlongan et al, 2005, Life Sci, 76: 1503-1512）を示唆する。
【０２１６】
一実施形態では、対象は、血管閉塞傷害又は心臓虚血再灌流傷害のリスクにある（又はこれらにかかりやすい）。
【０２１７】
一実施形態では、請求される組合せは、薬物（例えばアントラサイクリン）の心毒性効果に対して対象において心保護を提供することにおける使用のため、又は提供する方法のためである。心毒性薬の例は、Bovelli et al (Annals of Oncology 21 (Supplement 5): v277-v282, 2010)で説明されている。
【０２１８】
本明細書で使用されるとき、「心保護」という用語は、例えば心筋傷害を予防、低減又は遅延させることにより、心臓を保護することを指す。心毒性薬は、心臓心不全と関連付けられる薬物、虚血又は血栓塞栓症と関連付けられる薬物、高血圧と関連付けられる薬物、他の毒性効果、例えばタンポナーデ及び心内膜心筋線維症、出血性心筋炎、徐脈性不整脈、レイノー現象、自律神経障害、ＱＴ延長若しくは多形性心室頻拍又は肺線維症と関連付けられる薬物を含む。心毒性薬の例として、アントラサイクリン／アントラキノロン、シクロホスファミド、トラスツズマブ及び他のモノクローナル抗体ベースのチロシンキナーゼ阻害剤、代謝拮抗薬（フルオロウラシル、カペシタビン）、微小管阻害薬（パクリタキセル、ドセタキセル）、シスプラチン、サリドマイド、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ブスルファン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、三酸化ヒ素、ブレオマイシン、メトトレキセートが挙げられる。
【０２１９】
一実施形態では、本構成成分は、同時投与される。
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、同時投与される。
【０２２０】
一実施形態では、本構成成分は、連続して、又は別々に投与される。
【０２２１】
３つの構成成分の組合せについて、全ての３つの構成成分を同時投与してもよく、又は任意の２つの構成成分を同時投与し、第３の構成成分を別々に、若しくは連続して投与してもよい。あるいは、全ての３つの構成成分を任意の順序で別々に、又は連続して投与してもよい。
【０２２２】
一実施形態では、（ｉ）は、（ii）を連続して、又は別々に投与する前に投与される。
【０２２３】
別の実施形態では、（ii）は、（ｉ）を連続して、又は別々に投与する前に投与される。
【０２２４】
一実施形態では、（ｉ）は、（iii）を連続して、又は別々に投与する前に投与される。
【０２２５】
一実施形態では、（iii）は、（ｉ）を連続して、又は別々に投与する前に投与される。
【０２２６】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、連続して、又は別々に投与される。
【０２２７】
一実施形態では、本構成成分は、個々の構成成分についての治療有効量で各々投与される。
【０２２８】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、個々の構成成分についての治療有効量で各々投与される。
【０２２９】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」という用語は、所望の療法的及び／又は予防的効果を達成するのに十分な量、例えば虚血及び／若しくは再灌流傷害又は虚血及び／若しくは再灌流傷害と関連付けられる１つ若しくは２つ以上の症状の予防又はこれらの減少をもたらす量を指す。
【０２３０】
療法適用又は予防適用に関して、対象に投与される組成物の量は、疾患の種類及び重症度に、並びに個体の特徴、例えば健康全般、年齢、性別、体重及び薬物への耐性に依存する。また、それは疾患の重症度及び種類に依存する。当業者は、これら及び他の要因によって適切な投与量を決定することができる。また、本組成物は、１つ又は２つ以上の追加の療法剤との組合せで投与することができる。
【０２３１】
一実施形態では、本構成成分は、個々の構成成分についての治療有効量より少ない量で各々投与される。
【０２３２】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、個々の構成成分についての治療有効量より少ない量で各々投与される。
【０２３３】
一実施形態では、本構成成分は、対象の再灌流前に投与される。
【０２３４】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、対象の再灌流前に投与される。
【０２３５】
一実施形態では、本構成成分は、対象の再灌流中に投与される。
【０２３６】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、対象の再灌流中に投与される。
【０２３７】
一実施形態では、本構成成分は、対象の再灌流後に投与される。
【０２３８】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、対象の再灌流後に投与される。
【０２３９】
一実施形態では、本構成成分は、対象の再灌流前に、及び／又は再灌流中に、及び／又は再灌流後に投与される。
【０２４０】
一実施形態では、（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩、及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログは、対象の再灌流前に、再灌流中に、及び再灌流後に投与される。
【０２４１】
本方法の一部の実施形態では、対象は、対象の再灌流前に、再灌流中に、及び再灌流後に連続して（ｉ）を投与され、再灌流前にボーラス用量として（ii）を投与される。
【０２４２】
本方法の一部の実施形態では、対象は、対象の再灌流前に、再灌流中に、及び再灌流後に連続して（ii）を投与され、再灌流前にボーラス用量として（ｉ）を投与される。
【０２４３】
本方法の一部の実施形態では、対象は、対象の再灌流前に、再灌流中に、及び再灌流後に連続して（ｉ）、（ii）及び（iii）を投与される。
【０２４４】
本方法の一部の実施形態では、本構成成分のうちの１つ又は２つ以上の追加の投与は、再灌流後に起こり得る。好ましくは、この繰返し投与は、少なくとも２回、より好ましくは２〜１００回行われるか、又は持続点滴の形態であってもよい。
【０２４５】
本方法の一部の実施形態では、対象は、再灌流前にボーラス用量として構成成分を投与される。
【０２４６】
本方法の一部の実施形態では、対象は、再灌流中にボーラス用量として構成成分を投与される。
【０２４７】
本方法の一部の実施形態では、対象は、再灌流後にボーラス用量として構成成分を投与される。
【０２４８】
本明細書で使用されるとき、「再灌流」は、血流が減少又は遮断された任意の器官又は組織への血流の復元である。例えば、血流は、虚血又は低酸素により影響を受けた任意の器官又は組織へ復元することができる。血流の復元（再灌流）は、当業者に既知の任意の方法により起こり得る。例えば、虚血心組織の再灌流は、血行再建から生じ得る。
【０２４９】
一実施形態では、再灌流は、血行再建手技により達成される。一実施形態では、血行再建手技は、経皮的冠動脈形成術；バルーン血管形成術；バイパス移植片の挿入；ステントの挿入；方向性冠動脈粥腫切除術；１つ又は２つ以上の血栓溶解剤（単数又は複数）での治療；及び閉塞の除去からなる群から選択される。
【０２５０】
一実施形態では、１つ又は２つ以上の血栓溶解剤は、組織プラスミノーゲンアクチベーター；ウロキナーゼ；プロウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；プラスミノーゲンのアシル化形；プラスミンのアシル化形；及びアシル化ストレプトキナーゼ−プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【０２５１】
投与量
当業者は、過度の実験を行うことなく、対象に投与する本組成物のうちの１つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的に、医師は、個々の患者に最も好適であろう実際の投与量を決定し、それは、使用される特定の化合物の活性、その化合物の作用の代謝安定性及び長さ、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与の様式及び時間、排出速度、薬物の組合せ、特定の状態の重症度並びに個々の継続中の療法を含む様々な要因に依存する。本明細書で開示される投与量は、平均的な症例の例である。もちろん、より高い、又はより低い投与量範囲が利点を有する個々の場合があってもよく、かかる場合は本発明の範囲内である。
【０２５２】
本発明の非常に好ましい一実施形態では、本組合せ中のインスリンモジュレーター（例えばエキセナチド）の用量は一般的に、その現在承認されている療法に関して単剤療法で典型的に使用される用量より低く、及び／又は再灌流傷害の文献で報告されている一般的な用量より低い。
【０２５３】
本発明の非常に好ましい一実施形態では、本組合せ中の免疫抑制剤（例えばシクロスポリン）の用量は一般的に、その現在承認されている療法に関して単剤療法で典型的に使用される用量より低く、及び／又は再灌流傷害の文献で報告されている一般的な用量より低い。
【０２５４】
本願において特許請求する組合せで使用される場合、エキセナチドは好ましくは、約０．００１〜約１．５μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００５〜約０．１５μｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０２５５】
本願において特許請求する組合せで使用される場合、カンレノ酸カリウムは好ましくは、約０．０３〜約１０、好ましくは約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１〜約５ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約１〜約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０２５６】
本願において特許請求する組合せで使用される場合、シクロスポリンは好ましくは、約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約５ｍｇ／ｋ、さらにより好ましくは約０．０１〜約２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０２５７】
非常に好ましい一実施形態では、本組合せは、各々の構成成分の所定の投与量を含む固定用量組合せ（例えば約０．００５〜約０．０５μｇ／ｋｇエキセナチド及び約１〜約３ｍｇ／ｋｇカンレノ酸カリウム、より好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇエキセナチド及び１ｍｇ／ｋｇカンレノ酸カリウム）である。
【０２５８】
非療法的使用
別の態様では、本発明は、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【０２５９】
別の態様では、本発明は、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【０２６０】
一実施形態では、本発明は、移植前又は移植中の生体外器官における、再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【０２６１】
一実施形態では、本発明は、移植前又は移植中の生体外器官における、再灌流傷害の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【０２６２】
一実施形態では、本発明は、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）インスリンモジュレーター、（ii）免疫抑制剤及び（iii）アルドステロンアンタゴニストのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。一実施形態では、本発明は、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血の治療及び／又は予防のための、以下の構成成分：（ｉ）エキセナチド若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；（ii）シクロスポリン若しくは機能的誘導体若しくはアナログ又はこれらの薬学的に許容される塩；及び（iii）カンレノ酸カリウム又はその機能的誘導体若しくはアナログのうちの少なくとも２つを含む組合せの使用に関する。
【０２６３】
生体外（身体から除去された）器官は、血流の欠乏のために再灌流傷害を受けやすい場合がある。それゆえ、本発明の組合せは、除去された器官において再灌流傷害を予防するために使用することができる。好ましくは、この器官は、心臓、肝臓又は腎臓、より好ましくは心臓である。
【０２６４】
一部の実施形態では、除去された器官は、本発明の組合せを含有する、本分野で一般的に使用される溶液などの標準の緩衝液中に入れられる。例えば、除去された心臓は、エキセナチド及びシクロスポリンを含有する心臓麻痺性溶液中に入れることができる。標準の緩衝液中で有用なエキセナチド、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムの濃度は、当業者が容易に決定することができる。かかる濃度は、例えば約０．１ｎＭ〜約１０μＭ、好ましくは約１ｎＭ〜約１０μＭであってもよい。
【０２６５】
［実施例］
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、何ら限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２６６】
急性心筋梗塞傷害のウサギモデルにおけるエキセナチド及びシクロスポリンの組合せによる治療の効果
複数の試験が、エキセナチドを用いた治療によって、急性心筋梗塞（ＡＭＩ，acute myocardial infarction）及び／又は経皮的冠動脈インターベンション／血管形成術（ＰＣＩ，percutaneous coronary intervention）後、臨床的に起こり得る虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ，ischemia-reperfusion）傷害の結果として生じる心筋傷害の軽減／緩和が可能であることを示唆している。エキセナチド（０．１５０μｇ／Ｋｇ  IVボーラス投与）は、再灌流発生前に投与する場合、心筋温存効果を有すると思われる。さらに、複数の試験が、シクロスポリン−Ａ（ＣｓＡ，cyclosporine-A）を用いた治療によって、ＡＭＩ及び／又はＰＣＩ後、臨床的に起こり得るＩ／Ｒ傷害の結果として生じる心筋傷害の軽減／緩和が可能であることを示唆している。ＣｓＡ（２．５ｍｇ／Ｋｇ  IVボーラス投与）は、再灌流発生前に投与する場合、心筋温存効果を有すると思われる。本試験は、急性Ｉ／Ｒ傷害の臨床シナリオを模倣した状況における、エキセナチド及びＣｓＡの組合せによる心保護効果を検討するために計画された。該試験は、虚血発生後（しかし、再灌流前）のエキセナチド及びＣｓＡの組合せによる治療が、エキセナチド又はシクロスポリンのみによる治療と比較し、より顕著な心筋保護効果をもたらすという仮定のもと、実施された。
【０２６７】
本試験には、ニュージーランドホワイトウサギを使用した。該ウサギは、８週齢を超える雄で、体重は２．９〜３．８Ｋｇであった。試験を開始する前に、倫理委員会及び獣医当局からの承認を得た。動物室の環境管理は、温度を２２°〜２８℃、相対湿度を３０％〜７０％に維持するよう設定された。室内の温度及び湿度を毎時間記録し、毎日モニタリングした。動物室の換気は、１時間におよそ１０〜１５回行った。照明時間は、１２時間点灯及び１２時間消灯であった。所定の観察を毎日行った。施設に到着以降、公認の標準ウサギ飼料を、１日におよそ１８０ｇ与えた。
【０２６８】
エキセナチドペプチド［バイエッタ（登録商標）、１０μｇ／注射量（４０μｌ）、Eli Lilly Nederland B.V.社］及びシクロスポリンＡ［ＣｓＡ、サンディミュン（登録商標）（５０ｍｇ／ｍｌ）Novartis Pharma A.G.社、Switzerland］を、単剤療法又は組合せ療法のいずれかにおいて、被験物（test articles）として使用する。エキセナチド（通常の生理食塩水中０．１５μｇ／Ｋｇ）及び／又はＣｓＡ（通常の生理食塩水中２．５ｍｇ／Ｋｇ）の投与溶液を、ウサギに投与する直前に調製した。通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を、対照として使用した。
【０２６９】
急性心筋梗塞及び初回経皮的冠動脈インターベンションの臨床状況において、予測される投与経路を模倣するため、前記被験物／対照物を、全身麻酔下で静脈内に投与した。末梢静脈（ウサギ耳介静脈）を介した静脈内ボーラス投与を行った。
【０２７０】
前記試験は、所定のプラセボ及び偽対照計画に従った。要約すると、８０匹の健康で順応させた雄ウサギを、３つの試験群の１つに無作為に割り付けた。Ａ群（ｎ＝４、偽）は、通常の生理食塩水（ＮＳ，normal saline；IV）による治療を受けた偽−施術時間−対照を含む；Ｂ群（ｎ＝１８、対照／プラセボ）は、通常の生理食塩水（ＮＳ；IV）による治療を受けたＩ／Ｒ動物を含む；Ｃ群（ｎ＝１８、エキセナチド、０．１５μｇ／Ｋｇ）は、エキセナチドによる治療を受けたＩ／Ｒ動物を含む；Ｄ群（ｎ＝１８、シクロスポリン、２．５ｍｇ／Ｋｇ、IV）は、ＣｓＡによる治療を受けたＩ／Ｒ動物を含む；Ｅ群（ｎ＝２２、エキセナチド＋シクロスポリン、IV）は、エキセナチド及びＣｓＡによる治療を受けたＩ／Ｒ動物を含む。
【０２７１】
Ｉ／Ｒ群（Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ群）では、ウサギに、４０分間心臓の局所虚血（冠動脈閉塞）を起こし、次に１２０分間（２時間）再灌流させた。すべてのケースにおいて、治療（ＮＳ、又はエキセナチド若しくはＣｓＡ又はエキセナチドとＣｓＡの静脈内ボーラス投与）は、虚血発生の３０分後（再灌流開始の１０分前）に実施された。すべてのケースにおいて、心血管機能を、虚血前及び虚血中、加えて再灌流の１２０分（２時間）後までモニタリングした。実験を、再灌流の２時間後に中止し（試験の終了）、この時点における不可逆的な心筋傷害（組織形態計測による梗塞サイズ）を評価し、これを前記試験の主要評価項目とした。該試験計画を表１に要約する。
【０２７２】
【表１】
2018537522.tif 000003
【０２７３】
麻酔／手術準備。全身麻酔の導入は、ケタミン（約３５〜５０ｍｇ／Ｋｇ）とキシラジン（約５〜１０ｍｇ／Ｋｇ）の混合物を、筋肉内（ＩＭ，intramuscularly）に投与して行った。実験手順全体を通して、自律神経機能を保持し、麻酔を維持するため、動物には、必要に応じて追加の麻酔を投与した（ケタミン約１０〜１５ｍｇ／３０分又はペントバルビタールナトリウム約１５〜２０ｍｇ／Ｋｇ）。追加の麻酔薬及び通常の生理食塩水／被験物を投与するため、静脈カテーテルを末梢静脈（例えば、耳の耳介静脈）に配置した。麻酔作用の評価は、（ｉ）動物の角膜反射の完全消失、（ii）動物の呼吸中枢の完全抑制及び動物の自発的呼吸によって生じた気流へのいかなる抵抗もない完全な機械的換気、及び（iii）血行動態パラメータの安定性によって行う。ＰａＣＯ２値を、おおよそ生理的範囲内に維持するため、カフ付き気管チューブを、気管切開（腹側正中切開）を介して配置し、これを使用して従量式動物用ベンチレータ（１回換気量が約１２．５ｍｌ／Ｋｇで約４０呼吸／分）を介し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２混合ガスで肺を機械的に換気した。実験手順全体を通して、心電図、動脈圧、心拍数及びカプノグラムを、継続的にモニタリングした。温度プローブを直腸に挿入し、加温パッドを使用して体温を維持した。最後に、血液採取のため、動脈カテーテルを末梢動脈（例えば、耳）に配置した。
【０２７４】
続いて、前記動物を左側横臥位にし、左開胸術を用いて外科的に開胸した。左第４肋間隙を介して開胸した。鼓動している心臓を露出させ、その心膜を切開した。心耳下にある回旋動脈の最初の大きな前外側枝（the first large anterolateral branch）、及び各動物の冠動脈の解剖学的構造によって必要であれば、回旋動脈自体を、３−０号絹製縫合糸で囲んだ。この部分で冠動脈を閉塞させると、通常、前外側及び心尖の心室壁における広い領域が虚血する。該縫合糸の末端を、ポリエチレンチューブの小片に通して、スネアを形成した。小さなクランプを用いて冠動脈壁に固定された、該チューブに通した糸を引くことで、虚血を生じさせた。虚血によって、心電図上のＳＴ上昇が生じ、心筋の色変化が生じた（すなわち、チアノーゼ）。３０分間の虚血後、該動物に、媒体（通常の生理食塩水）、エキセナチド、ＣｓＡ、又はエキセナチド及びＣｓＡの組合せのいずれかを、IVボーラス用量で投与した。該治療後、虚血をさらに１０分間継続させた（すなわち、合計虚血時間は４０分間）。虚血期間の終了時、冠動脈のスネアを開放し、前述の虚血心筋を２時間まで再灌流した。偽の施術を行った動物では、虚血−再灌流の発生時に、血管のスネアを操作したが、締め付けも緩めもしなかったことに留意すべきである。
【０２７５】
血行動態変数及び直腸温度をモニタリングし、６つの所定の時点：麻酔後（ベースライン）、虚血開始直前（閉塞前）、虚血３０分（媒体／被験物投与）、加えて再灌流の３０、６０及び１２０分後の時点で記録した。さらに、エキセナチド若しくはＣｓＡ又はその組合せを投与した場合及び投与しない場合の、Ｉ／Ｒ傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）の程度を確定／数値化するため、梗塞領域を評価した。
【０２７６】
血液試料。２つのデータ収集時点：ベースライン及び再灌流の１２０分後の時点で、静脈全血試料（３ｍｌ未満）を採取し、心臓バイオマーカー分析を介して心筋傷害を評価した。最も貴重で信頼性が高く、臨床的に使用されているバイオマーカーとして、心臓トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ，cardiac troponin-I）を測定した。ｃＴｎＩを、生化学分析装置（Triage（登録商標）Cardiac Panel、Alere San Diego社、CA, USA）を使用して確定した。
【０２７７】
組織病理／組織形態計測。前記計画の完了時、Ｉ／Ｒ傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）を評価した。要約すると、再灌流の終了後、心臓を摘出し、装置に接続して、血液を除去するため、通常の生理食塩水で２分間灌流した。次に、冠動脈結紮を、同じ部位で再度締め付け、５ｍＬの緑色の蛍光ポリマーマイクロスフェア溶液（８ｍｇ／ｍｌ；直径３〜８μｍ；Fluoro-Max（商標）、Thermo Scientific社、CA, USA）を注入して、虚血中、正常に灌流される領域（非虚血領域）を分離し、心筋のリスク領域（ＡＡＲ，area-at-risk、虚血領域）の輪郭を描いた。心臓を−２０℃で２４時間保存し、その長軸に対して垂直に（心尖から基部まで）３ｍｍ厚さにスライスした。続いて、該スライスを、２％トリフェニル−テトラゾリウム−クロライド（ＴＴＣ，triphenyl-tetrazolium-chrolide、Sigma社、St. Louis, MO, USA）中、３７℃で２０分間インキュベートし、１０％非緩衝ホルマリン溶液中で固定した。
【０２７８】
固定後、全左心室領域（ＬＶ，left ventricular）、リスク領域（ＡＡＲ）、及び梗塞領域（ＩＦ，infarct）の輪郭を描き／デジタル的に測定した。波長が３６６ｎｍのＵＶライトを用いて、各スライド中の虚血領域（ＡＡＲ）を、梗塞ゾーン（ＩＦ）及び非虚血領域から分離した。すべての領域をアセテートシートに透写した。続いて、該透写図を画像解析プログラム（Image J；National Institutes of Health）に読み込ませ、コンピュータ支援面積測定を実施して、左心室（ＬＶ）、リスク領域（ＡＡＲ）及び梗塞（ＩＦ）の全体的なサイズを確定した。各スライドにおいて、ＡＡＲを、ＬＶ領域の百分率（ＡＡＲ／ＬＶ）として表記し、ＩＦを、ＡＡＲの百分率（ＩＦ／ＡＡＲ）として表記した。すべてのケースにおいて、定量的組織形態計測は、治療割付け／試験計画について盲検下の人員によって実施された。
【０２７９】
データ分析／統計。上記の実験手順から得られたデータを表にし、エクセルワークシートを用いて算出した。統計分析は、ＳＰＳＳバージョン２１．０（SPSS社、IL, USA）を用いて行った。値は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表記する。前記３群間の数値変数の統計的比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ，analysis of variance）モデルを、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正分析と共に用いて分析された。算出した０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると判断された。
【０２８０】
動物観察／結果。血行動態変数、平均動脈圧及び心拍数は、表２に示される。ベースライン値は、すべての群で同程度であった。本発明者らのウサギモデルで通常認められる通り、手術及び閉塞後、並びに最も顕著には再灌流終了時に、動脈圧は低下する。この圧力変数において、群間に有意差はなかった。すべての群は、経時的に同様のパターンをたどった。
【０２８１】
【表２】
2018537522.tif 000004
【０２８２】
前記ＬＶサイズ及びＡＡＲサイズは、治療したすべての動物において同程度であり、これは、最初の左心室及び虚血領域について、群間に有意差がなかったことを示唆している。エキセナチド又はＣｓＡの投与によって、梗塞サイズは、対照と比較して縮小したが、エキセナチド及びＣｓＡの組合せの投与では、梗塞サイズが、より良好に縮小した。同様に、エキセナチド又はＣｓＡは、ｃＴｎＩ放出を、それぞれ、４８％及び３６％減少させたのに対し、エキセナチド及びシクロスポリンの組合せ療法は、ｃＴｎＩ放出を６１％（６２．６±１０．７、ｐ値０．００１未満）減少させた。
【０２８３】
表３に、本試験で検討された各群における、心臓トロポニンＩレベル、並びに左心室に対するリスク領域、左心室に対する梗塞領域、及びリスク領域に対する梗塞領域の割合を示すデータを表記する。
【０２８４】
【表３】
2018537522.tif 000005
【０２８５】
これらの結果は、急性心筋虚血及び再灌流傷害の標準化されたウサギモデルに対する、エキセナチド及びＣｓＡの組合せ療法が、再灌流開始の１０分前にIVボーラス（それぞれ、０．１５μｇ／Ｋｇ及び２．５ｍｇ／Ｋｇ）として投与する場合、エキセナチド又はＣｓＡの単剤療法群と比較し、心筋梗塞サイズのより大幅な縮小を可能にしたことを示す。したがって、これらの結果は、心筋再灌流傷害の療法において、シクロスポリン及びエキセナチドの組合せ投与がシクロスポリン又はエキセナチドのいずれかのみによる療法よりも、有益及び有利であり、より優れた臨床転帰をもたらすことを初めて実証する。このように、エキセナチド及びＣｓＡの組合せは、哺乳動物対象における虚血−再灌流傷害を予防及び治療する方法において、極めて有用である。
【実施例２】
【０２８６】
急性心筋梗塞傷害のラットモデルにおけるエキセナチド及びシクロスポリンの組合せによる治療の用量依存的効果
本試験は、様々な用量で、また心筋再灌流傷害のラットモデルにおいて、エキセナチド、ＣｓＡ及びそれらの組合せの心保護効果を検討するために計画された。該試験は、虚血発生後及び再灌流前のエキセナチド及びＣｓＡの組合せ療法によって、追加の動物モデルにおける梗塞サイズがさらに縮小することもあるという仮定のもと、実施された。
【０２８７】
本試験には、ウィスターラットを使用した。該ラットは、雄で、体重は２６６〜３７０ｇであった。試験を開始する前に、倫理委員会及び獣医当局からの承認を得た。該動物は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する最新のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals DHEW (NIH)及び指令2010/63/EUで推奨されるサイズに従った、ＨＥＰＡ濾過空気を用いて換気しているケージの中で、個別に飼育された。動物室の環境管理は、温度を２２°〜２８℃、相対湿度を３０％〜７０％に維持するよう設定された。該ケージの下に敷いた寝わら材料は、少なくとも週３回取り替えた。動物室の換気は、１時間におよそ１０〜１５回行った。照明時間は、１２時間点灯及び１２時間消灯であった。所定の観察を毎日行った。該動物は、試験前の少なくとも３日間、飼育施設に馴化させた。標準的な実験ラット用固形飼料及び濾過した水道水を自由に与えた。
【０２８８】
エキセナチド（バイエッタ（登録商標）、Eli Lilly Nederland B.V.社）及びＣｓＡ（サンディミュン（登録商標）、Novartis Pharma A.G.社、Switzerland）を、単剤療法又は組合せ療法のいずれかにおいて、被験物として使用する。エキセナチド及び／又はＣｓＡの投与溶液を、ラットに投与する直前に調製した。通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を、対照として使用した。
【０２８９】
前記試験は、所定のプラセボ対照計画に従った。要約すると、１３０匹の健康で順応させた雄ラットを、１０の試験群の１つに無作為に割り付けた。すべての動物に、３０分間心臓の局所虚血（冠動脈閉塞）を起こし、次に１２０分間（２時間）再灌流させた。すべてのケースにおいて、治療（ＮＳ、又はエキセナチド若しくはＣｓＡ又はそれらの組合せの静脈内ボーラス投与）は、虚血発生の２０分後（再灌流開始の１０分前）に実施された。すべてのケースにおいて、心血管機能を、虚血前及び虚血中、加えて再灌流の１２０分（２時間）後までモニタリングした。実験を、再灌流の２時間後に中止し（試験の終了）、この時点における不可逆的な心筋傷害（組織形態計測による梗塞サイズ）を評価し、これを該試験の主要評価項目とした。該試験計画を表４に要約する。
【０２９０】
【表４】
2018537522.tif 000006
【０２９１】
麻酔／手術準備。ペントバルビタールの腹腔内（ＩＰ）注射（Ｅｕｔｈａｚｏｌ、Produlab Pharma b.v.社、Raamsdonksveer, The Netherlands；６０ｍｇ／Ｋｇのボーラス用量、実験の間、必要に応じて１５〜２０ｍｇ／Ｋｇを追加）によって、雄ウィスターラットに麻酔を施した。該ラットの体重を測り、胃及び胸部の毛を剃った。体温維持のため、一定温度の加温パッドを使用した。げっ歯類用ベンチレータに接続したプラスチック製カニューレを、気管に挿管した。該動物を室内空気で換気した（６．２ｍｌ／Ｋｇ、７０±５呼吸／分）。該準備の安定性を確保するため、実験全体を通して、血圧、表面誘導ＥＣＧ、及び中核体温をモニタリングした。血圧測定のため、右頚動脈にカニューレを挿入し、被験物を投与するため、右頚静脈にカニューレを挿入した。第５肋間隙で開胸術を行い、心臓を露出させた。５−０号Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸を、左冠動脈下行枝の周囲に配置した。次に、該結紮糸をプラスチックチューブの小片に通して配置し、止血鉗子を使用して、所定の位置でスネアをしっかりと引き、該冠動脈を３０分間閉塞した。冠動脈閉塞の３０分後、該スネアを解放して再灌流を開始し、１２０分間継続した。
【０２９２】
血行動態変数をモニタリングし、６つの所定の時点：麻酔後（ベースライン）、虚血開始直前（閉塞前）、虚血２０分（媒体／被験物投与）、加えて再灌流の３０、６０及び１２０分後の時点で記録した。さらに、エキセナチド若しくはＣｓＡ又はエキセナチド及びＣｓＡによる治療を行った場合及び行わなかった場合の、Ｉ／Ｒ傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）の程度を確定／数値化するため、梗塞領域に加えて心臓バイオマーカーを評価した。
【０２９３】
組織病理／組織形態計測。１２０分間の再灌流期間の終了時に、心臓を摘出し、梗塞サイズを確定した。要約すると、左冠動脈前下行枝を再閉塞し、リスク領域ゾーンの輪郭を描くため、大動脈に１００ｃｍＨ２Ｏの一定圧力をかけて、０．３％（ｗ／ｖ）エバンスブルー色素（Sigma-Aldrich社）４ｍｌを用い、該心臓を灌流した。非虚血灌流組織領域（non-ischemic perfused tissue area）は青く染色されるが、リスクゾーンは染色されないままであった。染色した心臓を速やかに凍結し（−２０℃で少なくとも２時間）、２ｍｍ厚さにスライスし、各スライスを、５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した１％（ｗ／ｖ）ＴＴＣ（Merck Biosciences社）１．５ｍｌ中、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、スライスを１０％ホルマリン溶液に移して５分間置いた。
【０２９４】
固定後、全左心室領域（ＬＶ）、リスク領域（ＡＡＲ）、及び梗塞領域（ＩＦ）の輪郭を描き／デジタル的に測定した。スライスをガラスプレートの間に配置し、該心臓スライスの両側からデジタル写真を撮った。画像の染色状態が異なる領域を、デジタル面積測定法（Infarctsize（商標）2.5、Pharmahungary社、Szeged, Hungary）によって数値化した。すべての画像の評価は、該試験全体を通して、盲検様式で熟練者によって実施された。各スライドにおいて、ＡＡＲを、ＬＶ領域の百分率（ＡＡＲ／ＬＶ）として表記し、ＩＦを、ＡＡＲの百分率（ＩＦ／ＡＡＲ）として表記した。
【０２９５】
データ分析／統計。上記の実験手順から得られたデータを表にし、エクセルワークシートを用いて算出した。統計分析は、ＳＰＳＳバージョン２１．０（SPSS社、IL, USA）を用いて行った。値は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表記する。評価項目の測定値（すなわち、梗塞サイズ、ＡＡＲ）の平均値間の差は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析され、続いて、適切であれば、各群と対照を比較するため、Ｔｕｋｅｙ事後検定によって分析された。連続変数（すなわち、血行動態データ）の平均値間の差は、反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって分析され、続いて、Ｔｕｋｅｙ事後検定によって分析された。算出した０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると判断された。
【０２９６】
動物観察／結果。血行動態変数、平均動脈圧及び心拍数は、表５に示される。ベースライン値は、すべての群で同程度であった。本発明者らのラットモデルで通常認められる通り、手術及び閉塞後、並びに最も顕著には再灌流終了時に、動脈圧は低下する。この圧力変数において、群間に有意差はなかった。すべての群は、経時的に同様のパターンをたどった。
【０２９７】
【表５】
2018537522.tif 000007
2018537522.tif 000008
【０２９８】
前記ＬＶサイズ及びＡＡＲサイズは、治療したすべての動物において同程度であり、これは、最初の左心室及び虚血領域について、群間に有意差がなかったことを示唆している。エキセナチド又はＣｓＡの投与は、用量依存的効果を示した。具体的には、エキセナチド及びＣｓＡのより低い用量を用いて動物を治療することによって、梗塞サイズが、対照と比較して有意に縮小したが、より高い用量では効果が認められなかった。興味深いことに、エキセナチド及びＣｓＡの低用量での組合せを投与することによって、梗塞サイズがより良好に縮小した。それぞれ、用量０．０３μｇ／Ｋｇのエキセナチドは、梗塞領域を２７％（４５．９±１．４；ｐ値０．０５未満）縮小し、０．５ｍｇ／ＫｇのＣｓＡは、２６．６％（４６．２±３．７；ｐ値０．０５未満）縮小するのに対し、エキセナチド及びＣｓＡの組合せ療法は、対照（６２．９±３．７）と比較し、梗塞領域を３９．１％（３８．３±２．７；ｐ値０．０５未満）縮小した。
【０２９９】
表６に、前記試験の各群における、左心室に対するリスク領域、及びリスク領域に対する梗塞領域の割合を示すデータを表記する。
【０３００】
【表６】
2018537522.tif 000009
【０３０１】
これらの結果は、急性心筋虚血及び再灌流傷害の追加の標準化された動物（ラット）モデルに対する、エキセナチド及びＣｓＡの組合せ療法が、エキセナチド又はＣｓＡの単剤療法と比較し、心筋梗塞サイズのより大幅な縮小も可能にしたことを示す。しかし、本ラットモデルにおいて、心保護効果は、実施例１のウサギモデルと比較し、より低い用量で明瞭であり、これは、異なる動物種では、エキセナチド若しくはＣｓＡ又はそれらの組合せに対し、異なる反応を示す可能性があることを示唆している。虚血の期間が、ウサギモデルでより長かったという事実も、該２つの動物種に認められた効果の違いに関する説明となる可能性がある。それにもかかわらず、これらの結果は、心筋再灌流傷害の療法において、ＣｓＡ及びエキセナチドの組合せ投与がシクロスポリン又はエキセナチドのいずれかのみによる療法よりも、有益及び有利であり、より優れた臨床転帰をもたらすことを再度実証する。このように、エキセナチド及びＣｓＡの組合せは、哺乳動物対象における虚血−再灌流傷害を予防及び治療する方法において、極めて有用である。
【実施例３】
【０３０２】
急性心筋梗塞傷害のウサギモデルにおけるエキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せによる治療の効果
複数の試験が、カンレノ酸カリウムを用いた治療によって、ＡＭＩ及び／又はＰＣＩ後、臨床的に起こり得るＩ／Ｒ傷害の結果として生じる心筋傷害の軽減／緩和が可能であることを示唆している。本試験は、急性Ｉ／Ｒ傷害の臨床シナリオを模倣した状況における、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せによる心保護効果を検討するために計画された。該試験は、虚血発生後（しかし、再灌流前）のエキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せによる治療が、エキセナチド又はカンレノ酸カリウムのみによる治療と比較し、より顕著な心筋保護効果をもたらすという仮定のもと、実施された。
【０３０３】
本試験には、ニュージーランドホワイトウサギを使用した。該ウサギは、８週齢を超える雄で、体重は２．６〜３．８Ｋｇであった。すべての動物は、指令2010/63/UE European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposesに従い、米国国立衛生研究所によって発行されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（NIH Publication No. 85-23, revised 1985）に準拠して扱った。試験を開始する前に、倫理委員会及び獣医当局からの承認を得た。動物室の環境管理は、温度を２２°〜２８℃、相対湿度を３０％〜７０％に維持するよう設定された。室内の温度及び湿度を毎時間記録し、毎日モニタリングした。動物室の換気は、１時間におよそ１０〜１５回行った。照明時間は、１２時間点灯及び１２時間消灯であった。所定の観察を毎日行った。施設に到着以降、公認の標準ウサギ飼料を、１日におよそ１８０ｇ与えた。
【０３０４】
エキセナチド［バイエッタ（登録商標）、Eli Lilly Nederland B.V.社］及びカンレノ酸カリウム（Sigma-Aldrich社、Germany）を、単剤療法又は組合せ療法のいずれかにおいて、被験物として使用した。エキセナチド（通常の生理食塩水中０．１５μｇ／Ｋｇ）及び／又はカンレノ酸カリウム（通常の生理食塩水中１ｍｇ／Ｋｇ）の投与溶液を、ウサギに投与する直前に調製した。通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を、対照として使用した。
【０３０５】
急性心筋梗塞及び初回経皮的冠動脈インターベンションの臨床状況において、予測される投与経路を模倣するため、前記被験物／対照物を、全身麻酔下で静脈内に投与した。末梢静脈（ウサギ耳介静脈）を介した静脈内ボーラス投与を行った。
【０３０６】
前記試験は、所定のプラセボ対照計画に従った。要約すると、５２匹の健康で順応させた雄ウサギを、４つの試験群の１つに無作為に割り付けた。すべての群では、ウサギに、３０分間心臓の局所虚血（冠動脈閉塞）を起こし、次に１８０分間（３時間）再灌流させた。すべてのケースにおいて、治療（生理食塩水、又はエキセナチド若しくはカンレノ酸カリウム又はそれらの組合せの静脈内ボーラス投与）は、虚血発生の１５分後（再灌流開始の１５分前）に実施された。実験を、再灌流の３時間後に中止し（試験の終了）、この時点における不可逆的な心筋傷害（組織形態計測による梗塞サイズ）を評価し、これを該試験の主要評価項目とした。該試験計画を表７に要約する。
【０３０７】
【表７】
2018537522.tif 000010
【０３０８】
麻酔／手術準備。全身麻酔の導入は、ケタミン（約３５〜５０ｍｇ／Ｋｇ）とキシラジン（約５〜１０ｍｇ／Ｋｇ）の混合物を、筋肉内（ＩＭ）に投与して行った。実験手順全体を通して、自律神経機能を保持し、麻酔を維持するため、動物には、必要に応じて追加の麻酔を投与した（ケタミン約１０〜１５ｍｇ／３０分又はペントバルビタールナトリウム約１５〜２０ｍｇ／Ｋｇ）。追加の麻酔薬及び通常の生理食塩水／被験物を投与するため、静脈カテーテルを末梢静脈（例えば、耳の耳介静脈）に配置した。ＰａＣＯ２値を、おおよそ生理的範囲内に維持するため、カフ付き気管チューブを、気管切開（腹側正中切開）を介して配置し、これを使用して従量式動物用ベンチレータ（１回換気量が約１２．５ｍｌ／Ｋｇで約４０呼吸／分）を介し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２混合ガスで肺を機械的に換気した。
【０３０９】
続いて、前記動物を左側横臥位にし、左開胸術を用いて外科的に開胸した。左第４肋間隙を介して開胸した。鼓動している心臓を露出させ、その心膜を切開した。心耳下にある左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ，left anterior descending coronary artery）を、３−０号絹製縫合糸で囲んだ。この部分で冠動脈を閉塞させると、通常、前外側及び心尖の心室壁における広い領域が虚血する。該縫合糸の末端を、ポリエチレンチューブの小片に通して、スネアを形成した。小さなクランプを用いて冠動脈壁に固定された、該チューブに通した糸を引くことで、虚血を生じさせた。虚血によって、心筋の色変化が生じた（すなわち、チアノーゼ）。１５分間の虚血後、該動物に、媒体（通常の生理食塩水）又は表示の被験物のいずれかを、IVボーラス用量で投与した。該治療後、虚血をさらに１５分間継続させた（すなわち、合計虚血時間は３０分間）。虚血期間の終了時、冠動脈のスネアを開放し、前述の虚血心筋を３時間まで再灌流した。表示の治療を行った場合及び行わなかった場合の、虚血及び再灌流傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）の程度を確定／数値化するため、梗塞領域を評価した。
【０３１０】
組織病理／組織形態計測。前記計画の完了時、Ｉ／Ｒ傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）を評価した。要約すると、再灌流の終了後、心臓を摘出し、装置に接続して、血液を除去するため、通常の生理食塩水で２分間灌流した。次に、冠動脈結紮を、同じ部位で再度締め付け、５ｍＬの緑色の蛍光ポリマーマイクロスフェア溶液（８ｍｇ／ｍｌ；直径３〜８μｍ；Fluoro-Max（商標）、Thermo Scientific社、CA, USA）を注入して、虚血中、正常に灌流される領域を分離し、心筋のリスク領域（ＡＡＲ、虚血領域）の輪郭を描いた。心臓を−２０℃で２４時間保存し、その長軸（心尖から基部まで）に対して垂直に３ｍｍ厚さにスライスした。続いて、該スライスを、２％（ＴＴＣ、Sigma社）中、３７℃で２０分間インキュベートし、１０％非緩衝ホルマリン溶液中で固定した。
【０３１１】
固定後、全左心室領域（ＬＶ）、リスク領域（ＡＡＲ）、及び梗塞領域（ＩＦ）の輪郭を描き／デジタル的に測定した。波長が３６６ｎｍのＵＶライトを用いて、各スライド中の虚血領域（ＡＡＲ）を、梗塞ゾーン（ＩＦ）及び非虚血領域から分離した。すべての領域をアセテートシートに透写した。続いて、該透写図を画像解析プログラム（Image J；National Institutes of Health）に読み込ませ、コンピュータ支援面積測定を実施して、左心室（ＬＶ）、リスク領域（ＡＡＲ）及び梗塞（ＩＦ）の全体的なサイズを確定した。各スライドにおいて、ＡＡＲを、ＬＶ領域の百分率（ＡＡＲ／ＬＶ）として表記し、ＩＦを、ＡＡＲの百分率（ＩＦ／ＡＡＲ）として表記した。すべてのケースにおいて、定量的組織形態計測は、治療割付け／試験計画について盲検下の人員によって実施された。
【０３１２】
データ分析／統計。統計分析は、ＳＰＳＳバージョン２１．０（SPSS社、IL, USA）を用いて行った。値は、平均±誤差（ＳＥＭ）として表記する。前記３群間の数値変数の統計的比較は、一元配置ＡＮＯＶＡモデルを、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正分析と共に用いて分析された。算出した０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると判断された。
【０３１３】
動物観察／結果。
前記左心室（ＬＶ）の領域及び前記虚血領域（ＡＡＲ）は、すべての動物において同程度であり、試験群間に統計的な差はなかった。対照群では、虚血（３０分間）及び再灌流（１８０分間）の誘発によって、実験動物の心筋に顕著な傷害が生じ（４９．４７±３．９７％）、これは、前記モデルの十分な実施及び前記試験の実験手順の再現性を示唆している。エキセナチド単剤療法（０．１５０μｇ／Ｋｇ）によって、対照群と比較し、梗塞の範囲が３６．２％（３１．５５±３．３１％；ｐ値０．０５未満）縮小した。カンレノ酸カリウム投与の単剤療法（１ｍｇ／Ｋｇ）によって、対照群と比較し、梗塞領域が３０．５％（３４．３６±２．８３％；ｐ値０．０５未満）縮小した。エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せによる治療によって、対照群と比較し、梗塞の範囲が７３．１％（１３．３１±２．１４％；ｐ値０．００１未満）と飛躍的に縮小した。興味深いことに、該組合せの効果は、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの単剤療法それぞれと比較し、統計的にも有意であった（ｐ値０．０１未満）。
【０３１４】
表８に、本試験で検討された各群における、左心室に対するリスク領域及びリスク領域に対する梗塞領域の割合を示すデータを表記する。
【０３１５】
【表８】
2018537522.tif 000011
【０３１６】
これらの結果は、急性心筋虚血及び再灌流傷害の標準化されたウサギモデルに対する、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せ療法が、再灌流開始の１５分前にIVボーラス（それぞれ、０．１５μｇ／Ｋｇ及び１ｍｇ／Ｋｇ）として投与する場合、エキセナチド又はカンレノ酸カリウムの単剤療法群と比較し、心筋梗塞サイズの著しく大幅な縮小を可能にしたことを示す。さらに、大変興味深いことに、本結果によって、組合せによって得られた縮小は、それぞれの単剤療法による縮小の合計を上回るため、カンレノ酸カリウムとエキセナチドの組合せ療法によって、心筋傷害の範囲が、相乗的にも縮小したという有力な証拠が初めて得られた。したがって、これらの結果は、心筋再灌流傷害の療法において、カンレノ酸カリウム及びエキセナチドの組合せ投与がカンレノ酸カリウム又はエキセナチドのいずれかのみによる療法よりも、有益及び有利であり、より優れた臨床転帰をもたらすことを初めて実証する。このように、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せは、哺乳動物対象における虚血−再灌流傷害を予防及び治療する方法において、極めて有用である。
【実施例４】
【０３１７】
３剤組合せ療法：急性心筋梗塞傷害のウサギモデルにおけるエキセナチド、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムの組合せによる治療の効果
本試験は、急性Ｉ／Ｒ傷害の臨床シナリオを模倣した状況における、エキセナチド、シクロスポリン（ＣｓＡ）及びカンレノ酸カリウムの組合せによる心保護効果を検討するために計画された。該試験は、虚血発生後（しかし、再灌流前）のエキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの３剤組合せによる治療が、エキセナチド及びシクロスポリンの２剤による治療と比較し、より顕著な心筋保護効果をもたらすという仮定のもと、実施された。
【０３１８】
本試験には、ニュージーランドホワイトウサギを使用した。該ウサギは、８週齢を超える雄で、体重は２．６〜３．８Ｋｇであった。すべての動物は、指令2010/63/UE European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposesに従い、米国国立衛生研究所によって発行されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（NIH Publication No. 85-23, revised 1985）に準拠して扱った。試験を開始する前に、倫理委員会及び獣医当局からの承認を得た。動物室の環境管理は、温度を２２°〜２８℃、相対湿度を３０％〜７０％に維持するよう設定された。室内の温度及び湿度を毎時間記録し、毎日モニタリングした。動物室の換気は、１時間におよそ１０〜１５回行った。照明時間は、１２時間点灯及び１２時間消灯であった。所定の観察を毎日行った。施設に到着以降、公認の標準ウサギ飼料を、１日におよそ１８０ｇ与えた。
【０３１９】
エキセナチド（バイエッタ（登録商標）；Eli Lilly Nederland B.V.社）、ＣｓＡ（サンディミュン（登録商標）、Novartis Pharma A.G.社、Switzerland）及びカンレノ酸カリウム（Sigma-Aldrich社、Germany）を、２剤又は３剤組合せ療法のいずれかにおいて、被験物として使用する。エキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの投与溶液を、ウサギに投与する直前に調製した。通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を、対照として使用した。
【０３２０】
急性心筋梗塞及び初回経皮的冠動脈インターベンションの臨床状況において、予測される投与経路を模倣するため、前記被験物／対照物を、全身麻酔下で静脈内に投与した。末梢静脈（ウサギ耳介静脈）を介した静脈内ボーラス投与を行った。
【０３２１】
前記試験は、所定のプラセボ対照計画に従った。要約すると、５５匹の健康で順応させた雄ウサギを、４つの試験群の１つに無作為に割り付けた。すべての群では、ウサギに、３０分間心臓の局所虚血（冠動脈閉塞）を起こし、次に１８０分間（３時間）再灌流させた。すべてのケースにおいて、治療（生理食塩水又は被験物の組合せの静脈内ボーラス投与）は、虚血発生の１５分後（再灌流開始の１５分前）に実施された。実験を、再灌流の３時間後に中止し（試験の終了）、この時点における不可逆的な心筋傷害（組織形態計測による梗塞サイズ）を評価し、これを該試験の主要評価項目とした。該試験計画を表９に要約する。
【０３２２】
【表９】
2018537522.tif 000012
【０３２３】
麻酔／手術準備。全身麻酔の導入は、ケタミン（約３５〜５０ｍｇ／Ｋｇ）とキシラジン（約５〜１０ｍｇ／Ｋｇ）の混合物を、筋肉内（ＩＭ）に投与して行った。実験手順全体を通して、自律神経機能を保持し、麻酔を維持するため、動物には、必要に応じて追加の麻酔を投与した（ケタミン約１０〜１５ｍｇ／３０分又はペントバルビタールナトリウム約１５〜２０ｍｇ／Ｋｇ）。追加の麻酔薬及び通常の生理食塩水／被験物を投与するため、静脈カテーテルを末梢静脈（例えば、耳の耳介静脈）に配置した。ＰａＣＯ２値を、おおよそ生理的範囲内に維持するため、カフ付き気管チューブを、気管切開（腹側正中切開）を介して配置し、これを使用して従量式動物用ベンチレータ（１回換気量が約１２．５ｍｌ／Ｋｇで約４０呼吸／分）を介し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２混合ガスで肺を機械的に換気した。
【０３２４】
続いて、前記動物を左側横臥位にし、左開胸術を用いて外科的に開胸した。左第４肋間隙を介して開胸した。鼓動している心臓を露出させ、その心膜を切開した。心耳下にある左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を、３−０号絹製縫合糸で囲んだ。この部分で冠動脈を閉塞させると、通常、前外側及び心尖の心室壁における広い領域が虚血する。該縫合糸の末端を、ポリエチレンチューブの小片に通して、スネアを形成した。小さなクランプを用いて冠動脈壁に固定された、該チューブに通した糸を引くことで、虚血を生じさせた。虚血によって、心筋の色変化が生じた（すなわち、チアノーゼ）。１５分間の虚血後、該動物に、媒体（通常の生理食塩水）又は表示の被験物のいずれかを、IVボーラス用量で投与した。該治療後、虚血をさらに１５分間継続させた（すなわち、合計虚血時間は３０分間）。虚血期間の終了時、冠動脈のスネアを開放し、前述の虚血心筋を３時間まで再灌流した。表示の治療を行った場合及び行わなかった場合の、虚血及び再灌流傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）の程度を確定／数値化するため、梗塞領域を評価した。
【０３２５】
組織病理／組織形態計測。前記計画の完了時、Ｉ／Ｒ傷害の結果として生じた不可逆的心筋傷害（すなわち、梗塞）を評価した。要約すると、再灌流の終了後、心臓を摘出し、装置に接続して、血液を除去するため、通常の生理食塩水で２分間灌流した。次に、冠動脈結紮を、同じ部位で再度締め付け、５ｍＬの緑色の蛍光ポリマーマイクロスフェア溶液（８ｍｇ／ｍｌ；直径３〜８μｍ；Fluoro-Max（商標）、Thermo Scientific社、CA, USA）を注入して、虚血中、正常に灌流される領域を分離し、心筋のリスク領域（ＡＡＲ、虚血領域）の輪郭を描いた。心臓を−２０℃で２４時間保存し、その長軸（心尖から基部まで）に対して垂直に３ｍｍ厚さにスライスした。続いて、該スライスを、２％（ＴＴＣ、Sigma社）中、３７℃で２０分間インキュベートし、１０％非緩衝ホルマリン溶液中で固定した。
【０３２６】
固定後、全左心室領域（ＬＶ）、リスク領域（ＡＡＲ）、及び梗塞領域（ＩＦ）の輪郭を描き／デジタル的に測定した。波長が３６６ｎｍのＵＶライトを用いて、各スライド中の虚血領域（ＡＡＲ）を、梗塞ゾーン（ＩＦ）及び非虚血領域から分離した。すべての領域をアセテートシートに透写した。続いて、該透写図を画像解析プログラム（Image J；National Institutes of Health）に読み込ませ、コンピュータ支援面積測定を実施して、左心室（ＬＶ）、リスク領域（ＡＡＲ）及び梗塞（ＩＦ）の全体的なサイズを確定した。各スライドにおいて、ＡＡＲを、ＬＶ領域の百分率（ＡＡＲ／ＬＶ）として表記し、ＩＦを、ＡＡＲの百分率（ＩＦ／ＡＡＲ）として表記した。すべてのケースにおいて、定量的組織形態計測は、治療割付け／試験計画について盲検下の人員によって実施された。
【０３２７】
データ分析／統計。統計分析は、ＳＰＳＳバージョン２１．０（SPSS社、IL, USA）を用いて行った。値は、平均±誤差（ＳＥＭ）として表記する。前記３群間の数値変数の統計的比較は、一元配置ＡＮＯＶＡモデルを用い、続いて、Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＳＤ事後検定を用いて分析された。算出した０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると判断された。
【０３２８】
動物観察／結果。
前記左心室（ＬＶ）の領域及び前記虚血領域（ＡＡＲ）は、すべての動物において同程度であり、試験群間に統計的な差はなかった。エキセナチド及びＣｓＡ（それぞれ、０．１５０ｍｇ／Ｋｇ及び０．５ｍｇ／Ｋｇ）の２剤を組み合わせた治療によって、対照群（４９．４７±４）と比較し、梗塞領域が５０％縮小した（２４．７４±３．８％；ｐ値０．０５未満）。この治療にカンレノ酸カリウム（１ｍｇ／Ｋｇ）を追加することで、梗塞領域が７０．６％縮小し、これは対照群と比較してさらなる縮小であった（１４．５６±３％；ｐ値０．００１未満）。同様に、エキセナチド、カンレノ酸カリウム及びＣｓＡ１ｍｇ／Ｋｇの３剤を組み合わせた投与によって、対照群と比較し、梗塞領域が７４．８％縮小した（１２．４９±２．２％；ｐ値０．００１未満）。興味深いことに，これらの３剤組合せの効果は、エキセナチド及びＣｓＡの２剤組合せと比較し、統計的に有意であった（ｐ値０．０５未満）。しかし、エキセナチド、カンレノ酸カリウム及びＣｓＡ２．５ｍｇ／Ｋｇの３剤を組み合わせた投与によって、梗塞の範囲が４６．５％（２６．４８±２．９３％；ｐ値０．０５未満）縮小したが、エキセナチド及びＣｓＡの２剤の組合せと比較して統計的に有意ではなかった。
【０３２９】
表１０は、本試験で検討された各群における、左心室に対するリスク領域及びリスク領域に対する梗塞領域の割合を示すデータを表記する。
【０３３０】
【表１０】
2018537522.tif 000013
【０３３１】
これらの結果は、急性心筋虚血及び再灌流傷害の標準化されたウサギモデルに対する、エキセナチド及びＣｓＡの組合せ投与が、有益な効果をもたらすが、該治療にカンレノ酸カリウムを追加することで、該組合せによる心保護の著しい追加の相乗効果が実証されたことを示す。大変興味深いことに、本実施例によって、エキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの３剤組合せ療法が、エキセナチド及びＣｓＡの組合せによる治療と比較し、心筋傷害の範囲のより大幅な縮小をもたらすという有力な証拠が初めて得られた。したがって、これらの結果は、心筋再灌流傷害の療法において、エキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの３剤組合せ投与が単剤療法又は組合せ療法として投与されるＣｓＡ及びエキセナチドのいずれかよりも、有益及び有利であり、より優れた臨床転帰をもたらすことを初めて実証する。このように、エキセナチド、（少なくとも低用量の）ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの組合せは、哺乳動物対象における虚血−再灌流傷害を予防及び治療する方法において、極めて有用である。
【実施例５】
【０３３２】
急性心筋梗塞傷害のマウスモデルにおけるエキセナチド、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウム並びにそれらの２剤又は３剤組合せ療法の効果
本試験は、以下について検討するため計画された：
ｉ）追加の心筋再灌流傷害の動物（マウス）モデルにおけるエキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの単剤療法としての用量依存的効果。
ii）単剤療法での至適用量よりも低用量におけるエキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの２剤組合せ療法の効果。
iii）該２剤組合せに使用した各成分と同用量におけるエキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの３剤組合せ療法の効果。
【０３３３】
前記試験は、マウスモデルにおける、虚血発生後及び再灌流前のエキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムによる２剤組合せ療法によって、それぞれの単剤療法と比較し、梗塞サイズがさらに縮小し、エキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムによる３剤組合せ療法が、２剤組合せ療法と比較し、より有益及び有利であることを、さらに実証するため、実施された。
【０３３４】
本試験には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。マウスは、雄で、１３〜１５週齢であった。すべての動物は、指令2010/63/UE European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposesに従い、米国国立衛生研究所によって発行されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（NIH Publication No. 85-23, revised 1985）に準拠して扱った。試験を開始する前に、倫理委員会及び獣医当局からの承認を得た。動物室の環境管理は、温度を２２°〜２８℃、相対湿度を３０％〜７０％に維持するよう設定された。室内の温度及び湿度を毎時間記録し、毎日モニタリングした。動物室の換気は、１時間におよそ１０〜１５回行った。照明時間は、１２時間点灯及び１２時間消灯であった。所定の観察を毎日行った。標準的な実験マウス用固形飼料及び濾過した水道水を自由に与えた。
【０３３５】
エキセナチド（バイエッタ（登録商標）；Eli Lilly Nederland B.V.社）、ＣｓＡ（サンディミュン（登録商標）、Novartis Pharma A.G.社、Switzerland）及びカンレノ酸カリウム（Sigma-Aldrich社、Germany）を、単剤療法又は２剤若しくは３剤組合せ療法のいずれかにおいて、被験物として使用する。エキセナチド、ＣｓＡ及びカンレノ酸カリウムの投与溶液を、マウスに投与する直前に調製した。通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を、対照として使用した。
【０３３６】
急性心筋梗塞及び初回経皮的冠動脈インターベンションの臨床状況において、予測される投与経路を模倣するため、前記被験物／対照物を、全身麻酔下で静脈内に投与した。
【０３３７】
前記試験は、所定のプラセボ対照計画に従った。要約すると、１４９匹の健康で順応させた雄マウスを、２０の試験群の１つに無作為に割り付けた。すべての群では、マウスに、３０分間心臓の局所虚血（冠動脈閉塞）を起こし、次に１２０分間（２時間）再灌流させた。すべてのケースにおいて、治療（生理食塩水、又は被験物若しくはそれらの組合せの静脈内ボーラス投与）は、虚血発生の２０分後（再灌流開始の１０分前）に実施された。実験を、再灌流の２時間後に中止し（試験の終了）、この時点における不可逆的な心筋傷害（組織形態計測による梗塞サイズ）を評価し、これを該試験の主要評価項目とした。該試験計画を表１１に要約する。
【０３３８】
【表１１】
2018537522.tif 000014
2018537522.tif 000015
【０３３９】
麻酔／手術準備。ケタミン、キシラジン及びアトロピンの組合せ（ケタミン、キシラジン及びアトロピンの最終用量は、それぞれ１００、２０及び０．６ｍｇ／Ｋｇであった）の腹腔内注射（０．０１ｍｌ／Ｋｇ）によって、マウスに麻酔を施した。趾つまみ刺激に対する足反射の消失及び呼吸数によって、麻酔深度を評価した。１２０〜１５０呼吸／分及び呼気終末陽圧２．０（合計１回換気量が０．２ｍｌ；Flexivent rodent ventilator、Scireq社、Montreal, ON, Canada）での人工呼吸のため、気管切開を行った。次に、第４及び第５肋骨間で開胸し、心膜を慎重に押し退けて左前下行枝（ＬＡＤ）が見えるようにし、これを、左心耳の先端から１ｍｍ下に配置した８−０号ｐｒｏｌｅｎｅモノフィラメントポリプロピレン縫合糸を使用して結紮した。虚血を誘発するための結紮前の１２分間、心臓を安定化させた。虚血期間後、該結紮糸を解放して心筋を再灌流させた。実験全体を通して、加温パッドを用いて体温を３７±０．５℃で維持し、直腸内に挿入した熱電対を介してモニタリングした。
【０３４０】
組織病理／組織形態計測。再灌流後、ケタミン（２００ｍｇ／Ｋｇ）及びキシラジン（５０ｍｇ／Ｋｇ）の麻酔薬混合物（０．０２ｍｌ／Ｋｇ）の腹腔内注射によって、動物を屠殺し、速やかに心臓をマウスから摘出し、血液を除去するため、直接カニューレを挿入して１％ヘパリン生理食塩水２．５ｍｌで洗浄した。３７℃の１％ＴＴＣリン酸緩衝液５ｍｌを冠循環に注入した。該組織を同じ緩衝液中で５分間インキュベートした。蒸留水（２．５ｍｌ）で希釈した１％エバンスブルーを該心臓に注入した。心臓を−２０℃で２４時間保存し、次に房室間溝に平行な１ｍｍの切片にスライスし、次に４％ホルマリン中で一晩固定した。次に、スライスをガラスプレートの間で１ｍｍに圧縮し、Zeiss 459300顕微鏡を通してCannon Powershot A620 Digital Cameraで撮影し、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅプログラムを用いて測定した。リスクのある及び梗塞を起こした心筋組織の領域を自動的に体積へと変換した。梗塞及びリスク領域の体積をｃｍ３で表記した。各スライドにおいて、ＡＡＲを、ＬＶ領域の百分率（ＡＡＲ／ＬＶ）として表記し、ＩＦを、ＡＡＲの百分率（ＩＦ／ＡＡＲ）として表記した。すべてのケースにおいて、定量的組織形態計測は、治療割付け／試験計画について盲検下の人員によって実施された。
【０３４１】
データ分析／統計。すべての結果は、平均＋ＳＥＭとして表記される。前記群間の数値変数の比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正及びＴｕｋｅｙ事後分析と共に用いて分析された。分析は、Ｓｔａｔａ  １３．１  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Stata社、TX, USA）を使用して行われた。算出した０．０５未満のｐ値は、統計的に有意であると判断された。
【０３４２】
動物観察／結果。
前記左心室（ＬＶ）の領域及び前記虚血領域（ＡＡＲ）は、すべての動物において同程度であり、試験群間に統計的な差はなかった。対照群では、虚血（３０分間）及び再灌流（１２０分間）の誘発によって、実験動物の心筋に顕著な傷害が生じ（４７．４±１．９％）、これは、前記モデルの十分な実施及び前記試験の実験手順の再現性を示唆している。
【０３４３】
前記エキセナチド単剤療法（０．００１μｇ／ｋｇ〜１．５μｇ／Ｋｇ）によって、０．００５μｇ／ｋｇ及び０．０５μｇ／ｋｇの用量による、用量応答効果がもたらされ、これらの用量は、対照群と比較して梗塞サイズを、それぞれ３６．９％（２９．９±１．８％；ｐ値０．０５未満）及び３１．６％（３２．４±１．９％；ｐ値０．０５未満）縮小した。前記シクロスポリン単剤療法（０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／Ｋｇ）によって、０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．１５ｍｇ／ｋｇの用量による、用量応答効果がもたらされ、これらの用量は、対照群と比較して梗塞サイズを、それぞれ４３．７％（２６．７±２．８％；ｐ値０．０５未満）及び４９．４％（２４±１．９％；ｐ値０．０５未満）縮小した。前記カンレノ酸カリウム単剤療法（０．０３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ）によって、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量による、用量応答効果がもたらされ、これらの用量は、対照群と比較して梗塞サイズを、それぞれ３０％（３３．２±２．４％；ｐ値０．０５未満）及び５８．９％（１９．５±２．５％；ｐ値０．０５未満）縮小した。
【０３４４】
エキセナチド及びシクロスポリンの２剤組合せによって、対照群と比較し、梗塞の範囲が５２．５％（２２．５±２．３％；ｐ値０．０５未満）縮小した。しかし、この効果は、エキセナチド及びシクロスポリンそれぞれの単剤療法用量と比較して統計的に有意ではなかった。エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの２剤組合せによって、対照群と比較し、梗塞の範囲が７０．９％（１３．８±１．３％；ｐ値０．０１未満）縮小した。興味深いことに、該組合せの効果は、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムそれぞれの単剤療法用量と比較し、統計的にも有意であった（ｐ値０．０５未満）。しかし、エキセナチドをより高用量（１０ｍｇ／Ｋｇ）のカンレノ酸カリウムと組み合わせた場合、梗塞サイズが５２．３％（２２．６±２％）縮小し、これらは、それぞれの単独療法に対して統計的に有意ではなかった。シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムの２剤組合せによって、対照群と比較し、梗塞の範囲が６１．４％（１８．３±２．６％；ｐ値０．０５未満）縮小した。しかし、この効果は、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムそれぞれの単剤療法用量と比較し、統計的に有意ではなかった。最後に、エキセナチド、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムの３剤組合せによって、対照群と比較し、梗塞の範囲が５６．７％（２０．５±２％；ｐ値０．０５未満）縮小した。しかし、この効果は、エキセナチド、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムそれぞれの単剤療法用量と比較し、統計的に有意ではなかった。
【０３４５】
表１２に、本試験で検討された各群における、左心室に対するリスク領域及びリスク領域に対する梗塞領域の割合を示すデータを表記する。
【０３４６】
【表１２】
2018537522.tif 000016
2018537522.tif 000017
【０３４７】
これらの結果は、急性心筋虚血及び再灌流傷害の追加の標準化された動物（マウス）モデルに対する、エキセナチド、シクロスポリン及びカンレノ酸カリウムの組合せ療法が、再灌流開始の１０分前にIVボーラスとして投与する場合、エキセナチド又はＣｓＡ又はカンレノ酸カリウムの単剤療法群と比較し、心筋梗塞サイズのより大幅な縮小を可能にしたことを示す。大変興味深いことに、本結果によって、組合せによって得られた縮小は、それぞれの単剤療法による縮小の合計を上回るため、カンレノ酸カリウムとエキセナチドの組合せ療法によって、心筋傷害の範囲が、相乗的にも縮小したという有力な証拠が得られた。したがって、これらの結果は、心筋再灌流傷害の療法において、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せ投与が、それぞれの単剤療法又は他の２剤若しくは３剤組合せと比較し、最も大きな心保護効果をもたらすことを実証する。このように、エキセナチド及びカンレノ酸カリウムの組合せは、哺乳動物対象における虚血−再灌流傷害を予防及び治療する方法において、極めて有用である。
【０３４８】
本発明に対する様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求されている本発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定するべきでないことを理解されたい。実際に、関連する分野の当業者にとって明らかな、記載された形態に対する本発明を実施するための様々な修正は、本発明に包含されることを意図している。
【０３４９】
本発明は、適用可能な法律によって許容される通り、本明細書に添付された段落に記載された内容のすべての修正及び均等物を含む。
【０３５０】
本明細書で言及されている公報、特許出願及び特許を含むすべての参照は、その全体が、さらに各参照が、参照によって組み込まれることを個別に及び具体的に示され、本明細書にその全体が記載された場合と同程度に（法が許す最大の程度で）参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３５１】
本明細書における特許文献の引用及び組込みは、単に便宜上行われ、このような特許文献の妥当性、特許権、及び／又は法的強制力のいかなる見解も反映するものではない。
【０３５２】
すべての表題及び副題は本明細書において、単に便宜上使用されており、いかなる場合においても、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月25日(2018.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキセナチド又はその薬学的に許容される塩であるインスリンモジュレーターと、カンレノ酸カリウムであるアルドステロンアンタゴニストとを含む組合せ。
【請求項２】
ベータブロッカー、レニン−アンギオテンシン阻害剤、スタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）、血小板の活性化又は凝集の阻害剤、ホスホジエステラーゼ−３阻害剤、カルシウム増感剤、抗酸化剤、及び抗炎症剤から選択される少なくとも１つのさらなる有効活性成分（ＡＰＩ、active pharmaceutical ingredient）を含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４】
非経口投与に好適な形態の、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
静脈内投与に好適な形態の、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
エキセナチド又はその薬学的に許容される塩であるインスリンモジュレーターと、カンレノ酸カリウムであるアルドステロンアンタゴニストとを含む医薬製品。
【請求項７】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、請求項１又は２に記載の組合せ又は請求項３〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害である、請求項７に記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項９】
虚血及び／又は再灌流傷害が、心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項８に記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項１０】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、静脈内投与のためのものである、請求項７〜９のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項１１】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流中の投与のためのものである、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項１２】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流前の投与のためのものである、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項１３】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流後の投与のためのものである、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用のための組合せ又は医薬組成物。
【請求項１４】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防における使用のための、又は心毒性薬に対する心保護の提供における使用のための、請求項６に記載の医薬製品であって、インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、同時の、連続の、若しくは別々の投与のためのものである、前記医薬製品。
【請求項１５】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害である、請求項１４に記載の使用のための医薬製品。
【請求項１６】
虚血及び／又は再灌流傷害が、心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項１５に記載の使用のための医薬製品。
【請求項１７】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、非経口投与のためのものである、請求項１４〜１６のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項１８】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、静脈内投与のためのものである、請求項１７に記載の使用のための医薬製品。
【請求項１９】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流中の投与のためのものである、請求項１４〜１８のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項２０】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流前の投与のためのものである、請求項１４〜１８のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項２１】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流後の投与のためのものである、請求項１４〜１８のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項２２】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、同時投与のためのものである、請求項１４〜２１のいずれかに記載の使用のための医薬製品。
【請求項２３】
虚血及び／若しくは再灌流傷害、虚血発作、心停止、急性心筋梗塞、新生児仮死並びに心原性ショックのうちの１つ若しくは２つ以上の治療及び／若しくは予防のための、又は心毒性薬に対する心保護を提供するための医薬の製造における、エキセナチド又はその薬学的に許容される塩であるインスリンモジュレーターと、カンレノ酸カリウムであるアルドステロンアンタゴニストとの使用。
【請求項２４】
虚血及び／又は再灌流傷害が、脳、心臓、肺、腎臓の虚血及び／又は再灌流傷害である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
虚血及び／又は再灌流傷害が、心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、非経口で投与される、請求項２３〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、静脈内に投与される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流中に投与される、請求項２３〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流前に投与される、請求項２３〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、再灌流後に投与される、請求項２３〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
エキセナチド又はその薬学的に許容される塩であるインスリンモジュレーターと、カンレノ酸カリウムであるアルドステロンアンタゴニストとを含む組合せを含む、移植前又は移植中の生体外器官における、虚血及び／又は再灌流傷害の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項３２】
虚血及び／又は再灌流傷害が、心筋虚血、心筋再灌流傷害又は急性心筋梗塞である、請求項３１に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項３３】
インスリンモジュレーター及びアルドステロンアンタゴニストが、移植前に投与される、請求項３１又は３２に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【国際調査報告】
2018537522.tif 000018
2018537522.tif 000019
2018537522.tif 000020
2018537522.tif 000021