(57)【要約】本発明は、コラーゲン粒子の製造方法を開示する。各コラーゲン粒子は、約10-250μmの粒子サイズを有し、且つそのコラーゲン線維の完全性が比較的インタクトである。
2018523467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステップ(1)〜（7）を含むコラーゲン粒子の製造方法であって、
ステップ(1)において、約0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を脱細胞化処理し、
ステップ(2)において、ステップ（1）の脱細胞化した動物皮膚を界面活性剤を含有する水溶液で処理し、
ステップ(3)において、ステップ(2)の水溶液で処理した動物皮膚をプロテアーゼで処理し、
ステップ(4)において、ステップ(3)のプロテアーゼで処理した動物皮膚をヌクレアーゼで処理し、
ステップ(5)において、ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を脱イオン化処理し、
ステップ(6)において、ステップ(5)の脱イオン化した動物皮膚を化学的除去処理することで、コラーゲンマトリックスを製造し、
ステップ(7)において、ステップ(6)の前記コラーゲンマトリックスを造粒処理することで、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造する、コラーゲン粒子の製造方法。
【請求項２】
前記ステップ(1)において、約0.1-1mmの厚さを有する前記動物皮膚を、超臨界流体(SCF)により約100-500barの圧力、30-50℃の温度で、約20分間〜5日処理する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素(scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかである請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記SCFは、scCO2である請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記SCFは、scN2Oである請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記温度は、約37℃、前記圧力は、約350Barである請求項3に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ(2)の水溶液の非イオン性界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレート、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー、ノノキシノール、 セチルアルコール、及びアルキルポリグルコシドからなる群より選択される請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液は、アニオン性界面活性剤をさらに含み、前記アニオン性界面活性剤は、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、及びアルケニル-ナフタレンからなる群より選択される請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液は、塩をさらに含む請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ(3)の前記プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、アクチニダイン、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、ペプチダーゼ、フィシン、カルパイン、カスパーゼ、又はそれらの組合せのいずれかである請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ(4)の前記ヌクレアーゼは、DNAヌクレアーゼ又はRNAヌクレアーゼである請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ(4)の産物を、さらに前記ステップ(2)の水溶液で処理する請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ(2)の水溶液の前記非イオン性界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレート、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー、ノノキシノール、セチルアルコール、及びアルキルポリグルコシドからなる群より選択される請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶液は、アニオン性界面活性剤をさらに含み、前記アニオン性界面活性剤は、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、及びアルケニル-ナフタレンからなる群より選択される請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶液は、塩をさらに含む請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ(5)の脱イオン化処理は、前記ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を過酸化水素溶液で1時間処理することを含む請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ(6)において、前記ステップ(5)の脱イオン化した動物皮膚を、超臨界流体(SCF)により約100-500barの圧力、30-50℃の温度で約20分間〜5日処理することで、残留化学物質を除去する請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素(scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかである請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記SCFは、scCO2である請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記SCFは、scN2Oである請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記SCFは、共溶媒と共に前記ステップ(5)の脱イオン化した動物皮膚に適用される請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
前記共溶媒は、エタノールである請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記温度は、約37℃であり、前記圧力は、約350Barである請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ(7)の造粒処理は、液体窒素の存在下で前記ステップ(6)のコラーゲンマトリックスを切断又は粉砕することにより実施され、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2015年8月11日に出願された米国仮特許出願第62/203904号の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、コラーゲンの製造方法の分野に関し、特に、コラーゲン粒子を製造するための改良された方法に関する。該コラーゲン粒子は、細胞増殖のための生物学的足場としての使用に適している。該生物学的足場は、例えば、整形手術(例えば、美容手術)若しくは軟組織充填(例えば、顔の筋肉やしわを滑らかにすること)に用いられる注射用皮膚充填剤、又は創傷治癒を促進するための創傷被覆材である。
【背景技術】
【０００３】
コラーゲンは、皮膚などの結合組織の線維の主成分として脊椎動物に生じる不溶性の線維性タンパク質である。従来のコラーゲン製造プロセスは、時間がかかり、非効率的であり、コラーゲンの完全性を破壊することがあるため、該プロセスで製造したコラーゲンは、生物学的足場として適用されず、美容手術又は創傷治癒用のインプラントとして使用できない。さらに、市販されているコラーゲン（例えば、Zyderm及びZyplast（商品名））は、ウシの皮膚に由来し、すべての患者に適用することはできない。これは、ウシのコラーゲンが非常に多くの宿主、特に、自己免疫疾患の病歴を有する宿主に重度のアレルギー反応を引き起こすためである。また、ウシコラーゲンは注射部位に長期間留まることができないため、定期的に補充をするために注射する必要がある。ウシのコラーゲンの留まる時間の短さは、ウシ皮からコラーゲンを抽出するときに、コラーゲンの完全性が破壊されることでコラーゲンが宿主に吸収されやすくなるためであると考えられている。
【０００４】
コスモデルマ（Cosmoderm）やコスモプラスト（Cosmoplast）などのヒト由来のコラーゲンは、開発されているが、供給源（例えば、環状切除によるヒトの包皮)に限りがあるので非常に高価である。或いは、患者は、脂肪吸引手術によって抽出された自身の脂肪組織からコラーゲンを取得し、即時使用のために注射可能な形態に加工し、又は将来の使用のために保存することができる。しかし、この場合にも、ウシのコラーゲンの場合と同様に、コラーゲンの完全性が単離操作により破壊されることがある。
【０００５】
従って、当分野では、コラーゲンを製造するための改良された方法が必要である。該改良された方法によれば、単離操作の過程においてコラーゲンの天然構造及び立体配座が保持されるため、製造されたコラーゲンは、宿主細胞が増殖するための三次元足場として働くことができ、宿主細胞に対して有意な免疫応答を誘発することがない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、上述の問題を克服するために、動物の皮膚(例えば、ブタやウシの皮膚)からコラーゲン粒子、特に天然立体配座を保持できるコラーゲン粒子を製造する方法を開示する。
【０００７】
従って、本開示の第1の態様は、コラーゲン粒子の製造方法を提供する。該方法は、以下のステップ(1)〜(7)を含み、
ステップ(1)において、約0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を脱細胞化処理し、
ステップ(2)において、ステップ(1)の脱細胞化した動物皮膚を非イオン性界面活性剤を含有する水溶液で処理し、
ステップ(3)において、ステップ(2)の水溶液で処理した動物皮膚をプロテアーゼで処理し、
ステップ(4)において、ステップ(3)のプロテアーゼで処理した動物皮膚をヌクレアーゼで処理し、
ステップ(5)において、ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を脱イオン化処理し、
ステップ(6)において、ステップ(5)の脱イオン化した動物皮膚を化学的除去処理することで、コラーゲンマトリックスを製造し、
ステップ(7)において、ステップ(6)のコラーゲンマトリックスを造粒処理することで、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造する。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、ステップ(1)において、約0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を、超臨界流体(SCF)により約100-500barの圧力、30-50℃の温度で約20分間〜5日処理する。
【０００９】
上記SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素(scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール又は超臨界アセトンのいずれかであり得る。一例では、上記SCFはscCO2である。別の例では、上記SCFはscN2Oである。
【００１０】
好ましい一実施形態によれば、上記脱細胞化処理は、温度が約37℃、圧力が約350Barの条件下で20分間実施される。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、ステップ(2)において、ステップ(1)の脱細胞化した動物皮膚を界面活性剤を含有する水溶液で処理する。該界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレート(例えば、Triton Xシリーズ)、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー、ノノキシノール、セチルアルコール、及びアルキルポリグルコシドからなる群より選択される。必要に応じて、該水溶液は、アニオン性界面活性剤をさらに含み得る。該アニオン性界面活性剤は、例えば、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、又はアルケニル-ナフタレンである。 さらに、必要に応じて、該水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を含み得る。好ましい一例では、上記アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、ステップ(3)のプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、アクチニダイン、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、ペプチダーゼ、フィシン、カルパイン、カスパーゼ、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、ステップ(4)において、ステップ(3)のプロテアーゼで処理した動物皮膚を、ヌクレアーゼであるDNAヌクレアーゼ又はRNA ヌクレアーゼで処理する。
【００１４】
必要に応じて、ステップ(4)の産物をステップ(2)の水溶液でさらに処理することができる。該水溶液は、オクチルフェノールエトキシレート(例えば、Triton Xシリーズ)、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー、ノノキシノール、セチルアルコール、及びアルキルポリグルコシドからなる群より選択される非イオン性界面活性剤を含む。好ましい一例では、上記水溶液は、1％Triton X-100を含む。さらに、必要に応じて、上記水溶液は、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、及びアルケニル-ナフタレン等のアニオン性界面活性剤を含み得る。さらに、必要に応じて、上記水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩を含み得る。好ましい一例では、上記アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、ステップ(5)において、ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を過酸化水素溶液で1時間処理する。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、ステップ(6)において、化学的除去処理は、ステップ(5)の脱イオン化した動物皮膚を、超臨界流体により約100-500barの圧力、30-50℃の温度で約20分間〜5日処理することを含む。
【００１７】
超臨界流体は、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素(scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかであり得る。一例では、上記SCFはscCO2である。別の例では、上記SCFはscN2Oである。
【００１８】
好ましい実施形態によれば、上記化学的除去処理は、共溶媒の存在下で、温度が約37℃、圧力が約350Barの条件で、60分間実施される。一例では、上記共溶媒は、エタノールであり、1:10の体積比でSCFと併用される。
【００１９】
さらなる実施形態によれば、ステップ(7)において、造粒処理は、ステップ(6)のコラーゲンマトリックスを切断又は粉砕して、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造することにより実施される。このように製造されたコラーゲン粒子は、コラーゲンで構成され、それらの天然の構造及び立体配座が保持されることにより、被験体に適用された後、細胞が増殖可能な三次元生体足場として働くことができる。
【００２０】
従って、本開示の第2の態様は、被験体の皮膚病状を治療する方法を提供する。上記皮膚病状は、皮膚上の創傷、しわ及び/又は凹みである。上記方法は、十分な量の本発明の方法で製造されたコラーゲン粒子を被験体の皮膚下に投与するステップを含むことにより、皮膚病状を減軽又は改善できる。上記皮膚病状は、皮膚上の創傷、しわ及び/又は凹みであり得る。創傷の例は、手術傷(例えば、切り傷)、潰瘍、及び体での他の損傷（例えば、皮膚又は組織が割れたり、切られたり、穿孔されたり、又は引き裂かれたりすることによる損傷）を含むが、これらに限定されない。皮膚(例えば、顔の皮膚)上のしわ及び/又は凹みの例は、眉間のしわ、口周りのしわ、額のしわ、目尻のしわ、ほうれい線、及びにきび又はけがによる顔の瘢痕を含むが、これらに限定されない。好ましい一実施形態において、コラーゲン粒子は、被験体の軟組織を増補するための皮膚充填剤として用いられ、針（例えば、32ゲージ以下の針）で注射することにより被験体に投与される。他の実施形態において、コラーゲン粒子は、創傷被覆材として用いられ、アプリケーターで創傷上に均一に広げることにより被験体に投与される。
【００２１】
従って、本開示の第3の態様は、美容手術中に上記の皮膚病状を治療するためのキットを提供する。該キットには、容器、コラーゲン粒子、及び説明書が含まれる。上記コラーゲン粒子は、本発明の方法により製造され、そのコラーゲン線維の完全性が比較的インタクトで、各粒子が約10-250μmの直径を有する。上記説明書は、容器に関連し、本開示のコラーゲン粒子の使用方法を使用者に指示する。上記説明書は、パンフレット、テープ、CD、VCD又はDVDの形式であり得る。
【００２２】
以下、本開示の1つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも例示的なものであり、特許請求する本発明のさらなる説明を提供することが意図されることを理解されたい。
【００２４】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、明細書の一部を構成し、本発明の様々な態様の様々な例示的なシステム、方法、及び他の例示的な実施形態を示す。本説明は、添付の図面に照らして以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。
【図１】図1は、本開示の一実施形態に係る本発明のコラーゲン粒子をそれぞれ(A)50 X及び(B)20,000Xの倍率で撮影した電子顕微鏡(EM)の写真である。
【図２】図2は、本開示の一実施形態に係る、3T3細胞を(A)12時間及び(B)72時間再細胞化した後の本発明のコラーゲン粒子のEM写真である。ここで、EM写真は、それぞれ(A)2,000X及び(B)4,000Xの倍率で撮影したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。
【００２６】
文脈で別途明記示されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
【００２７】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００２８】
本開示は、とりわけ、新規なコラーゲン粒子の製造方法、該方法により製造された新規なコラーゲン粒子、及びこのようにして製造されたコラーゲン粒子の新規な使用に関する。
【００２９】
本開示の第1の態様は、新規なコラーゲン粒子の製造方法を開示する。該方法では、コラーゲンの天然構造及び立体配座が保持されるため、本発明のコラーゲン粒子を宿主に注射することにより、宿主組織細胞の増殖のために最適なマイクロ環境を提供することができる。
【００３０】
従って、本発明の方法は、少なくとも以下のステップを含む。
ステップ(1)において、約0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を脱細胞化処理し、
ステップ(2)において、ステップ(1)の脱細胞化した動物皮膚を非イオン性界面活性剤を含有する水溶液で処理し、
ステップ(3)において、ステップ(2)の水溶液で処理した動物皮膚をプロテアーゼで処理し、
ステップ(4)において、ステップ(3)のプロテアーゼで処理した動物皮膚をヌクレアーゼで処理し、
ステップ(5)において、ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を脱イオン化処理し、
ステップ(6)において、ステップ(5)の脱イオン化した動物皮膚を化学的除去処理することで、コラーゲンマトリックスを製造し、
ステップ(7)において、ステップ(6)のコラーゲンマトリックスを造粒処理することで、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造する。
【００３１】
本発明の方法を開始する前に、好ましくは皮むきにより動物から得られた動物皮膚を洗浄し、脱毛し、脱脂する。好ましくは、本開示に適用される動物は家畜である。上記家畜は、ブタ、ウシ、乳牛、ブルズ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウサギ、アヒル、ガチョウ、及びニワトリを含むが、これらに限定されない。脱毛処理及び脱脂処理は、既知の機械的又は化学的方法のいずれかにより実施することができる。例えば、毛は、動物皮膚(例えば、ブタの皮)を酸で処理することにより除去することができ、脂肪は、動物皮膚を酵素（例えば、リパーゼ）若しくは化学物質（例えば、洗剤）で処理すること、又は機械的に切断することにより除去することができる。
【００３２】
次に、脱毛・脱脂した動物皮膚の表層をデルマトームで除去して、約0.1〜1mm（例えば、約0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 mm）;好ましくは、約0.2〜0.6mm（例えば、0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mm）;最も好ましくは、約0.3 mmの厚さを有する動物皮膚を製造する。このようにして得られた動物皮膚を本発明の方法に使用する。
【００３３】
必要に応じて、0.1〜1mmの厚さを有する製造された動物皮膚をアルカリ剤により0〜55℃の温度で約0.1〜24時間処理して、残留毛及び/又は脂肪を除去する。本発明の方法に適用するアルカリ剤の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、尿素、硫化ナトリウム、カルシウムチオアセテート等を含むが、これらに限定されない。好ましくは、動物皮膚は約0.1〜0.6mmの厚さのブタ皮であり、4℃で約0.1〜1Nの水酸化ナトリウム溶液で約1時間処理する。 
【００３４】
ステップ(1)において、0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を脱細胞化処理する。該脱細胞化処理は、コラーゲンを組織足場としてより良く働かせるように、コラーゲンの物理的及び生化学的特性を維持しながら、動物皮膚から細胞材料を除去する目的で行われる。従って、ステップ(1)において、0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を以下の圧力で超臨界流体(SCF)により処理する。該圧力は、約100-500bar（例えば、100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500bar）;好ましくは、約150-450bar（例えば、150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450bar）;より好ましくは約200-400bar（例えば、200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400bar）である。さらに、ステップ(1)は、30-50℃（例えば30,31,32,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50℃）;好ましくは、35-45℃（例えば、35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45℃）の温度で、約20分間〜5日（例えば、20,30,40,50,60分間;2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24時間;2,3,4,5日）実施される。いくつかの例では、0.1-1mm の厚さを有する動物皮膚をSCFで約1〜24時間処理する。他の例では、0.1-1mm の厚さを有する動物皮膚をSCFで約2〜5日処理する。
【００３５】
上記SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素(scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかであり得る。一例では、SCFはscCO2である。scCO2は、約350barで37℃のような温和な臨界条件を有するので、体温(即ち、37℃)又はそれに近い温度で生体物質を除去することができる。別の好ましい例では、SCFはscN2Oである。
【００３６】
次に、ステップ(2)において、ステップ(1)の脱細胞化した動物皮膚を非イオン性界面活性剤を含有する水溶液で洗浄して、残留細胞物質を除去する。水溶液に使用できる適切な非イオン性界面活性剤の例は、オクチルフェノールエトキシレート(例えば、Triton Xシリーズ)、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー、ノノキシノール、セチルアルコール、アルキルポリグルコシド等を含むが、これらに限定されない。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレート、即ち、Triton Xシリーズ（Triton X-15、Triton X-35、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-114等を含むが、これらに限定されない）である。本開示のいくつかの実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、Triton X-100であり、約0.1-10％(wt％)（例えば、0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9又は10％(wt％)）の濃度で水溶液に存在する。好ましくは、水溶液における非イオン性界面活性剤の濃度は、約0.5-5％(wt％)（例えば、0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4又は5％(wt％)）である。好ましい一実施形態によれば、水溶液に約1％(wt)のTriton X-100が含まれる。
【００３７】
必要に応じて、上記水溶液は、アニオン性界面活性剤をさらに含み得る。アニオン性界面活性剤は、例えば、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、及びアルケニル-ナフタレンである。さらに、必要に応じて、水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を含み得る。好ましい一例では、アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。
【００３８】
次に、ステップ(3)において、ステップ(2)の水溶液で洗浄した動物皮膚をプロテアーゼで酵素的に消化する。該ステップの酵素消化処理は、温和であるため、コラーゲン線維の天然構造及び立体配座を保持できる。ステップ(4)に適用される適切なプロテアーゼの例は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、アクチニダイン、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、ペプチダーゼ、フィシン、カルパイン、カスパーゼ、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。一例では、プロテアーゼはペプシンであり、別の例では、プロテアーゼはトリプシンとキモトリプシンとの混合物である。好ましくは、プロテアーゼは、約0.001-0.1％(wt％)（例えば、0.001,0.002,0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1％(wt％)）、より好ましくは、約0.002-0.05％(wt)（例えば、0.002,0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05％(wt％)）の濃度で存在する。好ましい一実施形態によれば、ステップ(2)の水溶液で洗浄した動物皮膚を約0.05％(wt％)のペプシンで約8-24時間（例えば、8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24時間）、好ましくは、約12〜20時間（例えば、12,13,14,15,16,17,18,19,20時間）消化する。
【００３９】
ステップ(4)において、ステップ(3)の産物をヌクレアーゼで処理する。該ヌクレアーゼは、DNA ヌクレアーゼ又はRNA ヌクレアーゼ、好ましくは、非特異的DNA/RNA ヌクレアーゼであり得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、ステップ(3)の産物をヌクレアーゼにより37℃で約1時間処理する。
【００４０】
必要に応じて、ステップ(4)の産物をグリコシド加水分解酵素、例えば、α-ガラクトシダーゼでさらに処理して、ステップ(3)のヌクレアーゼで処理した産物から残留ガラクトシル部分を除去する。
【００４１】
さらに、必要に応じて、ステップ(4)の産物を上記の水溶液でさらに処理して、残留細胞物質を除去することができる。好ましくは、水溶液は、1％Triton X-100を含み、アニオン性界面活性剤、例えば、SDSをさらに含み得る。
【００４２】
次に、ステップ(5)において、ステップ(4)の産物を脱イオン化処理する。該脱イオン化処理は、ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を過酸化水素溶液で約0.5-5時間（例えば、約0.5,1,1.5,2,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5時間）処理することを含む。好ましくは、過酸化水素は、約0.1-3％(wt％)(例えば、約0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.5,2,2.5又は3％(wt％)）の濃度で溶液に存在する。好ましい一実施形態によれば、ステップ(4)の産物を1％過酸化水素溶液で約1時間処理する。
【００４３】
次に、ステップ(6)において、 ステップ(5)の産物を化学的除去処理する。該化学的除去処理は、ステップ(5)の脱イオン化した産物を超臨界流体で処理することを含む。ステップ(2)に記載の条件と同様に、本ステップにおいて、同一又は異なる超臨界流体を用いて、約100-500barの圧力、30-50℃の温度で約20分間〜5日処理することができる。一例では、SCFはscCO2である。別の例では、SCFはscN2Oである。好ましい一実施形態によれば、SCFは、共溶媒とともにステップ(5)の産物に適用され、化学的除去処理は、温度が約37℃、圧力が約350barの条件で約60分間処理する。共溶媒は、C1-4アルコールであり得る。該C1-4アルコールは、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、sec-ブタノール、t-ブタノール及びシクロブタノールを含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい例では、共溶媒は、エタノールであり、1:20〜1:4（例えば、1:20,1:19,1:18,1:17,1:16,1:15,1:14,1:13,1:10,1:9,1:8,1:7,1:6,1:5,1:4）の体積比でSCFと併用される。好ましい一実施形態において、エタノールは、1:19の体積比でSCFと併用される。別の実施形態において、エタノールは、1:10の体積比でSCFと併用される。さらに別の実施形態において、エタノールは、1:4の体積比でSCFと併用される。
【００４４】
最後のステップ(7)において、ステップ(6)の産物を造粒処理することで、注射投与に適した所望のコラーゲン粒子を製造する。造粒処理は、液体窒素の存在下でステップ(6)の産物(即ち、コラーゲンマトリックス)を切断、粉砕又は剪断することにより実施され、約10-250μm（例えば、約10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,170,175,180,185,190,195,200,205,210,220,225,230,235,240,245,250μm）の粒子サイズを有するコラーゲン粒子を製造する。好ましい一実施形態において、コラーゲン粒子は、約50-100μm（例えば、約50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100μm）のサイズを有する。別の実施形態において、コラーゲン粒子は、約100-150μm（例えば、約100,105,110,115,120,125,130,135,140,145,150μm）のサイズを有する。さらに別の実施形態において、コラーゲン粒子は、約150-250μm（例えば、約150,155,160,170,175,180,185,190,195,200,205,210,220,225,230,235,240,245,250μm）のサイズを有する。このように製造したコラーゲン粒子は、天然の構造及び立体配座が保持されるコラーゲン線維を有することを特徴とする。それによって、本開示のコラーゲン粒子は、細胞が増殖可能な生体足場として機能し得る。
【００４５】
このように製造されたコラーゲン粒子は、皮膚充填剤として使用され、32ゲージ以下（例えば、32, 30, 29, 28, 27, 26s, 26, 25, 24, 23, 22s, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8又は7ゲージ）の針により被験体の所望の部位(例えば、顔)に投与されることができる。一例では、本発明のコラーゲン粒子は、30ゲージの針により注射される。別の例では、本発明のコラーゲン粒子は、27ゲージの針により注射される。
【００４６】
或いは、このように製造されたコラーゲン粒子は、創傷被覆材として用いられ、アプリケーターで創傷上に均一に広げることにより被験体に投与される。創傷は、手術傷(例えば、切り傷)、潰瘍、及び体での他の損傷（例えば、皮膚又は組織が割れたり、切られたり、穿孔されたり、又は引き裂かれたりすることによる損傷）、並びに顔の皮膚上のしわ及び/又は凹みを含むが、これらに限定されない。顔の皮膚上のしわ及び/又は凹みは、眉間のしわ、口周りのしわ、額のしわ、目尻のしわ、ほうれい線、及びにきび又はけがによる顔の瘢痕を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の方法は、従来技術の方法とは異なり、製造過程においてコラーゲンマトリックスを安定させるために架橋剤を使用するか、又は塩を添加する必要がなく、このように製造されたコラーゲンマトリックスからコラーゲン線維を抽出する必要もなく、その代わりに、本開示で製造された完全なコラーゲンマトリックスをそのまま造粒処理することにより、各粒子の直径が約10-250μmの所望のコラーゲン粒子を製造する。本発明の方法により製造されたコラーゲン粒子のそれぞれは、コラーゲン線維で構成され、コラーゲン線維の完全性が保持されるため、本開示のコラーゲン粒子は、宿主細胞が増殖するための生物学的足場としての使用に適している。
【００４８】
従って、本開示のさらなる態様は、被験体の皮膚病状を治療する方法を提供する。上記皮膚病状は、皮膚上の創傷、しわ及び/又は凹みである。上記方法は、十分な量の本開示のコラーゲン粒子を被験体の皮膚下に投与するステップを含むことにより、皮膚病状を減軽又は改善できる。本発明のコラーゲン粒子は、創傷治癒を促進すること、皮膚のしわ及び/又は凹みを滑らかにすることに適用される。特に、該創傷は、手術傷(例えば、切り傷)、潰瘍、及び体での他の損傷（例えば、皮膚又は組織が割れたり、切られたり、穿孔されたり、又は引き裂かれたりすることによる損傷）を含むが、これらに限定されない。顔の皮膚上のしわ及び/又は凹みは、眉間のしわ、口周りのしわ、額のしわ、目尻のしわ、ほうれい線、及びにきび又はけがによる顔の瘢痕を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
当業者に本発明を使用するためのツールを提供するために、本開示のコラーゲン粒子は、上記皮膚病状の治療に使用するためのキットに包装される。一実施形態において、本発明は、本発明のコラーゲン粒子を用いた美顔手術用キットを提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明のコラーゲン粒子を使用して被験体の創傷を治療するためのキットを提供する。
【００５０】
上記キットには、容器、コラーゲン粒子、及び説明書が含まれる。上記コラーゲン粒子は、本発明のいずれかの実施例に説明した手順に従って製造され、そのコラーゲン線維の完全性が比較的インタクトで、各粒子が約10-250μmの直径を有する。上記説明書は、容器に関連し、本開示のコラーゲン粒子の使用方法を指示する。上記説明書は、パンフレット、テープ、CD、VCD又はDVDの形式であり得る。
【００５１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。これらの実施例は、典型的には使用されるものであるが、その代わりに、当業者に知られている他の手順、方法、又は技術が使用されることができる。
実施例
材料及び方法
細胞培養
【００５２】
NIH-3T3線維芽細胞を高グルコースのDMEM（10％ウシ胎仔血清(FBS)、100単位/ mlのペニシリン、及び100 mg/mlストレプトマイシン含有）で、37℃、加湿雰囲気、5％CO2の条件で培養した。
【００５３】
コラーゲン粒子での再細胞化
【００５４】
3T3細胞を80％コンフルエントまで増殖させ、次いで酵素処理（0.25％トリプシン/1mM EDTA）により回収し、500xgで5分間遠心分離した。回収した細胞を培地に再懸濁し、1x103細胞/mLの濃度でSCF処理コラーゲン粒子に接種し、粒子を24ウェル培養プレートに入れ、細胞を表面に確実に付着させるようにインキュベーター内で12時間、24時間、48時間又は72時間培養した。次いで、3T3細胞が増殖したコラーゲン粒子を2.5％グルタルアルデヒドに1.5時間浸漬し、1％四酸化オスミウムに1.5時間浸漬し、次いでアルコールに浸漬して脱水した。
【００５５】
動物
【００５６】
発熱性物質試験及び皮内刺激試験にはニュージーランドホワイトウサギ（それぞれ0.5kg又は2kgを超える）を使用し、皮膚感作試験にはICRマウス(BioLASCO Taiwan Co., Ltd;それぞれ約17-23gの重さ)及びモルモット(それぞれ約300-500gの重さ)を使用した。ウサギ(1匹/ケージ)、マウス(5匹/ケージ)、及びモルモット(5匹/ケージ)を、飼料と水が自由に取れるように動物施設に飼養した。動物施設の温度及び湿度をそれぞれ18-26℃及び30-75％に維持した。ニュージーランドホワイトウサギの体温を毎日記録し、体温が39.8℃を超えず、最高体温と最低体温の差が1℃以下のウサギを発熱物質試験の対象とした。各試験が始まる前に全ての動物を隔離し、順化させておいた。
【００５７】
実施例1  コラーゲン粒子の製造及び特性分析
1.1  コラーゲンマトリックスの製造
脱毛及び脱脂したブタの皮（0.2-0.4mm）を4℃で24時間乾燥させた後、scCO2により350bar、37℃で40-180分間処理して残留細胞物質を除去した。
【００５８】
次いで、室温(約22-28℃)で脱細胞化したブタの皮に超音波処理、洗浄、酵素消化及び洗浄を含む処理を施した。簡単に言えば、脱細胞化したブタの皮を1時間超音波処理し(0.1m Tris)、100rpmの速度で22時間振盪し、さらに1時間超音波処理した。その後、超音波処理したブタの皮を、水(10分間/洗浄;2回洗浄)、1％Triton X-100含有溶液(100rpmの速度で24時間振盪)、及び(10分間/洗浄;計2回洗浄)で順次洗浄して、不純物を除去し、コラーゲンマトリックスを製造した。次いで、コラーゲンマトリックスをペプシン溶液(0.01％ペプシン/0.5M 酢酸)で1時間処理し、その後、100rpmの速度で振盪しながら、水(10分間/洗浄、2回洗浄)で洗浄した。
【００５９】
次いで、コラーゲンマトリックスを37℃でDNA分解酵素溶液(0.3U/cm2)で1時間処理した後、室温(約22-28℃)で1％Triton X-100(100rpmの速度で24時間振盪)及び水(10分間/洗浄;2回洗浄)で洗浄した。次いで、コラーゲンマトリックスを1％H2O2溶液に入れ、65rpmの速度で1時間振盪し、室温(約22-28℃)で水(10分間/洗浄;2回洗浄)で洗浄し、37℃で約8-30分間真空乾燥させた。その後、さらに、scCO2により10％(vol％)エタノールの存在下で350bar、37℃で60分間処理した後、水で25℃で10分間再水和させ、37℃で約8-30分間真空乾燥させた。
【００６０】
1.2  コラーゲン粒子の製造
【００６１】
Freezer/Mill(6770/6870, 5-25サイクル)を用いて実施例1.1の再水和したコラーゲンマトリックスを切断し、粒子に粉砕した。このようにして製造したコラーゲン粒子にガンマ線（10〜50kGy）を照射し、使用するまで滅菌した状態で保存した。
【００６２】
電子顕微鏡(EM)結果は、このようにして製造されたコラーゲン粒子のそれぞれが比較的インタクトな繊維構造を有することを示した（図1）。
【００６３】
1.3 実施例1.2のコラーゲン粒子は、3T3細胞の増殖を支持する。
【００６４】
実施例1.2のコラーゲン粒子を、「材料及び方法」に記載された手順に従って再細胞化した。実施例1.2のコラーゲン粒子は、その多孔性により、優れた生物学的足場として新たに接種した3T3細胞の増殖を支持することができる(図2、パネルA)。72時間培養した後、粒子全体は3T3細胞で覆われた(図2、パネルB)。
【００６５】
実施例2  実施例1のコラーゲン粒子のアレルギーテスト
【００６６】
本発明のコラーゲン粒子が宿主に対しアレルギー反応を引き起こす潜在的な危険性を評価するために、実施例1.1のコラーゲンマトリックスからコラーゲン抽出物を製造し、次いで、関連する承認された手順、特にISO 10993-10, 11,に従って、種々のアレルギー試験（発熱物質試験、皮膚感作性試験、急性全身注射試験、及び皮内刺激試験を含む）を行った。
【００６７】
2.1  コラーゲン抽出物の製造
【００６８】
実施例1.1のコラーゲンマトリックス(3x4cm)を150rpmで撹拌しながら0.9％生理食塩水又は綿実油に50℃で72時間浸漬することで、生理食塩水中のコラーゲン抽出物又は綿実油中のコラーゲン抽出物を製造する。コラーゲンマトリックス/ 0.9％生理食塩水又は綿実油の表面積比は、約1 cm2/1mLであった。
【００６９】
2.2 発熱物質試験
【００７０】
発熱物質試験は、U.S. Pharmacopoeia National Formulary USP36/NF31(151)に記載のプロトコールに従って実施した。簡単に言えば、本試験には、6匹の雄ニュージーランドホワイトウサギ(>1.5 Kg;対照群:3匹、試験群:3匹)を使用し、10mL/Kgの実施例2.1のコラーゲン抽出物（生理食塩水中）を各ウサギの耳静脈に注射した。対照群のウサギに0.9％生理食塩水のみを注射した。投与は10分間で完了した。試験ウサギの体温は、それぞれコラーゲン抽出物の投与後の1時間、1.5時間、2時間、2.5時間及び3時間に測定した。
【００７１】
対照ウサギの体温はそれぞれ39.1℃、38.8℃及び38.8℃である（表1）。一方、コラーゲン抽出物の投与後、試験ウサギの体温のわずかな変動が観察されたが、その変動が許容範囲内にあると考えられ（表2）、実施例1のコラーゲンマトリックスに由来するコラーゲン抽出物が発熱物質を含まないことを示している。
【００７２】
表1. コラーゲン抽出物投与前の試験ウサギの体温 
2018523467.tif 000003
【００７３】
表2. コラーゲン抽出物投与後の試験ウサギの体温
2018523467.tif 000004
HBT:最高体温
CT:表1の試験動物の対照温度
【００７４】
2.3 皮膚感作性試験
【００７５】
皮膚感作性試験は、ISO 10993-10に記載のプロトコールに従って実施した。合計30匹の雄モルモットを4群、即ち、対照群-1(N=5)、対照群-2(N=5)、処理群-1(N=10)、及び処理群-2(N=10)にランダムに割り当てた。試験前に、電気シェーバーを用いて頚部から肩甲骨領域まで試験動物の背側の毛を切り取り、各動物の左側にA、B、Cの3つの脱毛領域を形成し、同様に右側にもA、B、Cの3つの脱毛領域を形成した。各領域のサイズは約2x2cm2である。
【００７６】
処理の1日目に、各群の動物の各脱毛領域に、表3又は4の「誘導(I)期」に示す対応する溶液0.1mLを皮内注射した。1週間後、該動物に刺激反応が発生しなかった場合に、該注射領域に10％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を適用し、次いで、表3又は4の「誘導(II)期」に示す溶液0.2mLに予め浸漬したパッチで同注射領域を覆った。「誘導（II）期」の処理から2週間後、動物の背側下部の毛を肩甲骨から臀部に切り取り、その後、該脱毛領域の適切な部位を選択し、表3又は4の「チャレンジ期」に示す溶液0.1mLに予め浸漬したパッチで覆った。
【００７７】
表3.
2018523467.tif 000005
FCA: フロイント完全アジュバント
【００７８】
表4.
2018523467.tif 000006
【００７９】
チャレンジの24及び48時間後に脱毛領域における皮膚を観察し、刺激及び/又はアレルギー反応が発生した領域があるかどうかを調べた。その結果は、対照群又は処理群の動物のいずれも、試験領域に目に見える刺激サインがないことを示した。このように、本発明のコラーゲン抽出物は、試験モルモットの皮膚に遅延型過敏症を引き起こさなかった。
【００８０】
2.4 皮内刺激試験
【００８１】
刺激試験は、ISO 10993-10に記載のプロトコールに従って実施した。簡単に言えば、本試験には、6匹の雄ニュージーランドホワイトウサギ(>2 Kg;対照群:3匹、試験群:3匹)を使用した。試験前に、電気シェーバーを用いて試験動物の背側の毛を切り取った。処理日に、約0.2 mLの実施例2.1のコラーゲン抽出物（生理食塩水中）を各ウサギの左側の5つの部位に注射し、約0.2 mL の実施例2.1のコラーゲン抽出物（綿実油中）を各ウサギの右側の5つの部位に注射した。対照群のウサギに対して、同様の部位に0.2 mLの0.9％生理食塩水又は綿実油を注射した。投与の24、48及び72時間後に、動物を観察して、処理部位に皮膚反応が発生したかどうかを確認した。
【００８２】
対照動物又は処置動物のいずれにも、顕著な皮内刺激の臨床徴候又は死亡が発見されなかった。 従って、コラーゲン抽出物の単一局所適用は、ニュージーランドホワイトウサギに皮内刺激を引き起こさなかった。
【００８３】
2.5 急性全身注射試験
【００８４】
急性全身注射試験は、ISO 10993-11に記載のプロトコールに従って実施した。合計20匹の雄モルモットを4群、即ち、対照群-1(N=5)、対照群-2(N=5)、処理群-1(N=5)、及び処理群-2(N=5)にランダムに割り当てた。
【００８５】
処理の1日目に、処理群-1の動物に、コラーゲン抽出物（生理食塩水中;50mL/Kg)を単回静脈内注射した。一方、処理群-2の動物に、コラーゲン抽出物（綿実油中;50mL/Kg）を単回腹腔内注射した。対照群-1及び対照群-2の動物に、それぞれ0.9％生理食塩水及び綿実油を注射した。次いで、投与の4時間、24時間、48時間及び72時間後にそれぞれ動物について毒性反応を観察した。
【００８６】
対照動物又は処置動物のいずれにも、顕著な毒性臨床徴候又は死亡が発見されなかった。従って、コラーゲン抽出物の単一局所適用は、試験動物に毒性反応を引き起こさなかった。
【００８７】
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は1又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１】
2018523467.tif 000007
【図２】
2018523467.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月9日(2018.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステップ(1)〜（7）を含むコラーゲン粒子の製造方法であって、
ステップ(1)において、約0.1-1mmの厚さを有する動物皮膚を超臨界流体(SCF)により約100-500barの圧力、30-50℃の温度で、約20分間〜5日処理し、
ステップ(2)において、ステップ（1）のSCFで処理した動物皮膚を非イオン界面活性剤を含有する水溶液で処理し、前記非イオン界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレート、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー、ノノキシノール、 セチルアルコール、及びアルキルポリグルコシドからなる群より選択され、
ステップ(3)において、ステップ(2)の水溶液で処理した動物皮膚をプロテアーゼで処理し、前記プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、アクチニダイン、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、ペプチダーゼ、フィシン、カルパイン、カスパーゼ、又はそれらの組合せからなる群より選択され、
ステップ(4)において、ステップ(3)のプロテアーゼで処理した動物皮膚をヌクレアーゼで処理し、前記ヌクレアーゼは、DNAヌクレアーゼ又はRNAヌクレアーゼであり、
ステップ(5)において、ステップ(4)のヌクレアーゼで処理した動物皮膚を過酸化水素溶液で1時間処理し、
ステップ(6)において、ステップ(5)の過酸化水素で処理した動物皮膚を化学的除去処理することで、コラーゲンマトリックスを製造し、
ステップ(7)において、ステップ(6)の前記コラーゲンマトリックスを造粒処理することで、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造する、コラーゲン粒子の製造方法。
【請求項２】
前記SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素 (scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記SCFは、scCO2又はscN2Oである請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（2）の前記水溶液は、塩又はアニオン性界面活性剤をさらに含み、前記塩又はアニオン性界面活性剤は、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、及びアルケニル-ナフタレンからなる群より選択される請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ(4)の産物を、さらに前記ステップ(2)の水溶液で処理する請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液は、塩又はアニオン性界面活性剤をさらに含み、前記塩又はアニオン性界面活性剤は、ラウリルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、アルキルフェノキシベンゼンジスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アルキル-ナフタレンスルホン酸、及びアルケニル-ナフタレンからなる群より選択される請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ(6)において、前記ステップ(5)の過酸化水素で処理した動物皮膚を、前記SCFにより約100-500barの圧力、30-50℃の温度で約20分間〜5日処理することで、残留化学物質を除去する請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記SCFは、超臨界二酸化炭素(scCO2)、超臨界亜酸化窒素(scN2O)、超臨界水(scH2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかである請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記SCFは、scCO2又はscN2Oである請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記SCFは、共溶媒と共に前記ステップ(5)の過酸化水素で処理した動物皮膚に適用される請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記共溶媒は、エタノールである請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記SCFによる処理において、前記温度は、約37℃であり、前記圧力は、約350Barである請求項1又は7に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ(7)の造粒処理は、液体窒素の存在下で前記ステップ(6)のコラーゲンマトリックスを切断又は粉砕することにより実施され、約10-250μmのサイズを有するコラーゲン粒子を製造請求項1に記載の方法。
【国際調査報告】
2018523467.tif 000009
2018523467.tif 000010