(57)【要約】ホモシスチン尿症ならびに関連疾患および障害の治療における改変ヒトシスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）を使用する酵素補充療法のための組成物および方法が提供される。
2018532763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるホモシスチン尿症を治療する方法であって、単離ヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＰＥＧ化されており、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で少なくとも週１回投与される、方法。
【請求項２】
前記ＰＥＧが、低分子量直鎖ＰＥＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧが、高分子量４アーム分枝鎖ＰＥＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記用量が、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、および約５ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記用量が、約０．４ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドが、ベタインと同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ベタインが、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチド前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドが、少なくとも週２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドが、ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＧＬ４−４００ＭＡ、およびＭＥ−０５０ＧＳからなる群から選択される少なくとも１つによりＰＥＧ化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象におけるシスタチオニンおよびシステインの少なくとも一方を増加させる方法であって、単離ヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＰＥＧ化されているとともに、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で少なくとも週１回投与される、方法。
【請求項１２】
前記ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドが、少なくとも週２回投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、ヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＥＧが、低分子量直鎖ＰＥＧである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＥＧが、高分子量４アーム分枝鎖ＰＥＧである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドが、ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＧＬ４−４００ＭＡ、およびＭＥ−０５０ＧＳからなる群から選択される少なくとも１つによりＰＥＧ化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記用量が、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、および約５ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記用量が、約０．４ｍｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
シスタチオニンの量が、０．００８μＭ超に増加される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
シスタチオニンの量が、０．００５〜０．３５μＭに増加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
システインの量が、１４０μＭ超に増加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
システインの量が、２００μＭ〜４００μＭに増加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドが、ベタインと同時投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
ベタインが、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドの投与前に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
対象におけるホモシステイン、メチオニン、およびＳ−アデノシルホモシステインの少なくとも１つを減少させる方法であって、単離ヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＰＥＧ化されているとともに０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で少なくとも週１回投与される、方法。
【請求項２６】
前記ＰＥＧが、低分子量直鎖ＰＥＧである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＥＧが、高分子量４アーム分枝鎖ＰＥＧである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記用量が、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、および約５ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記用量が、約０．４ｍｇ／ｋｇである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ホモシステインの量が、１００μＭ未満である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ホモシステインの量が、約１０μＭである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
メチオニンの量が、５０μＭ未満である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
メチオニンの量が、約３０μＭである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｓ−アデノシルホモシステインの量が、０．１４μＭ未満に減少される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
Ｓ−アデノシルホモシステインの量が、約０．０１５μＭに減少される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
単離ｈｔＣＢＳが、ベタインと同時投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
ベタインが、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチド前に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
肝疾患を治療する方法であって、単離ヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＰＥＧ化されており、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で少なくとも１日１回、少なくとも４週間投与される、方法。
【請求項３９】
前記ＰＥＧが、低分子量直鎖ＰＥＧである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＥＧが、高分子量４アーム分枝鎖ＰＥＧである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記用量が、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、および約５ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記用量が、約０．４ｍｇ／ｋｇである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
肝実質への損傷が低減される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
対象におけるホモシスチン尿症を治療する方法であって、配列番号３のアミノ酸１５位における突然変異を含む単離ヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されている、方法。
【請求項４５】
前記突然変異が、システインについてのセリンの置換である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、ヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２４ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される用量で投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約０．９ｍｇ／ｋｇ、および約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約１．１ｍｇ／ｋｇからなる群の範囲から選択される用量で投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
骨粗鬆症、薄毛、または眼球異常からなる群から選択される少なくとも１つの疾患、障害、または病態を治療する方法であって、配列番号３のアミノ酸１５位における突然変異を含む単離ヒトトランケートシスタチオニンＢシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されている、方法。
【請求項５０】
前記対象が、メチオニン制限食に供されていない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が、メチオニン制限食に供されている、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、血清ホモシステイン（Ｈｃｙ）濃度を有意に低減させ、その下流代謝産物、例えば、シスタチオニンおよびシステインのレベルを復帰させるためのヒトシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）、またはその改変型（例えば、ヒトトランケートＣＢＳ（ｈｔＣＢＳ）またはそのバリアント）を使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）に関する。さらに、ＣＢＳ、ｈｔＣＢＳまたはそれらの改変型、例えば、ｈｔＣＢＳ突然変異体Ｃ１５Ｓを用いるＥＲＴは、疾患、例えば、ホモシスチン尿症およびホモシステイン再メチル化障害の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）はトランススルフレーション経路における最初の酵素であり、セリンおよびホモシステイン（Ｈｃｙ）のシスタチオニンへの縮合を触媒し、それは次いでシスタチオニンγ−リアーゼ（ＣＧＬ）によりシステインに加水分解される。システム生物学において、生物学的系の堅牢性は摂動に直面して適切に機能するその能力として定義され、系におけるエレメントの冗長性は、そのような堅牢性が達成される機序の１つである（非特許文献１）。しかしながら、生物学的トランススルフレーション系は大部分が構成要素の冗長性を欠き、それによりこの系が突然変異摂動を受けやすいと考えられている。例えば、ＣＢＳ酵素は、ホモシステインを処理してシスタチオニンにし得る唯一の構成要素である。経路を進む最初の代謝産物であるホモシステインは再メチル化経路を介してメチオニンに代替的に変換され得、これによりホモシステイン負荷が緩和するので、制限された系の冗長性が部分的には存在する。さらに、下流産物のシステインは、食事から直接得ることができる。これにもかかわらず、これらの経路は代謝産物の正常レベルを維持するそれらの能力が制限され、ＣＢＳ機能の欠落は未治療のままである場合、ヒト患者について有害な結果となる。ＣＢＳの不活性化は、シスタチオニンβ−シンターゼ欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）（より一般には古典的ホモシスチン尿症と称される）をもたらす。
【０００３】
ＣＢＳＤＨを治療するための制限された治療選択が存在し、現在の治療選択はホモシステインを低減させるが、シスタチオニン（Ｃｔｈ）もシステイン（Ｃｙｓ）も正常化する傾向はなく、したがって、それらの治療選択は堅牢で有効な治療選択の提供に不適切であり得る。したがって、ホモシスチン尿症を有する個体のためのより有効な治療方針が当分野において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】キタノ，Ｈ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ）著、２００４年、ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第５巻、ｐ．８２６〜８３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＣＢＳＤＨの治療のための組成物およびその組成物を使用する方法を提供することにより、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ＰＥＧ化されていてもよいヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）およびそのバリアントを含む酵素補充療法に好適な組成物を提供する。ｈｔＣＢＳ組成物は、ホモシステインレベルを低減させ、下流代謝産物シスタチオニンおよびシステインのレベルを上昇させるために使用することができ、病態および疾患、例えば、ホモシスチン尿症（例えば、ＣＢＳＤＨ）およびホモシステイン再メチル化障害を治療するために使用することができ、肝病変を改善するために使用することもできる。
【０００７】
本明細書において、単離ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することにより、対象におけるホモシスチン尿症を治療する方法が提供される。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、低分子量または高分子量ＰＥＧによりＰＥＧ化されていてよい。ある実施形態において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、コンジュゲーションのために種々の形状および異なる化学構造を有するＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されていてよい。一部の実施形態において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週１回投与することができる。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、５〜７．５ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週２回投与することができる。さらに、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ベタイン、または他の公知のＣＢＳＤＨ治療物と同時投与することができる。
【０００８】
本明細書において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することにより、対象における代謝産物、例えば、限定されるものではないが、シスタチオニンおよびシステインの量を増加させる方法が提供される。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、低分子量または高分子量ＰＥＧによりＰＥＧ化されていてよい。一部の実施形態において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週１回投与することができる。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、５〜７．５ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週２回投与することができる。さらに、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ベタインと同時投与することができる。シスタチオニンの量は、０．００５〜０．３５μＭに増加させることができる。システインの量は、１４０μＭ超（例えば、２００μＭ〜４００μＭ）に増加させることができる。
【０００９】
本明細書において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することにより、対象における代謝産物、例えば、限定されるものではないが、ホモシステイン、メチオニンＳ−アデノシルホモシステイン、およびＳ−アデノシルメチオニンの量を減少させる方法が提供される。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、低分子量または高分子量ＰＥＧによりＰＥＧ化されていてよい。一部の実施形態において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができる。例えば、用量は、約０．４ｍｇ／ｋｇである。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、５〜７．５ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週２回投与することができる。さらに、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ベタインと同時投与することができる。ホモシステインの量は、１００μＭ未満（例えば、約１０μＭ）に減少させることができる。メチオニンの量は、５０μＭ未満（例えば、約３０μＭ）に減少させることができる。Ｓ−アデノシルホモシステインの量は、０．１４μＭ未満（例えば、約０．０１５μＭ）に減少させることができる。
【００１０】
本明細書において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することにより、対象における肝疾患を治療する方法が提供される。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、低分子量または高分子量ＰＥＧによりＰＥＧ化されていてよい。一部の実施形態において、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週１回投与することができる。例えば、用量は、約０．４ｍｇ／ｋｇである。ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、５および７．５ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができ、少なくとも週２回投与することができる。
【００１１】
本明細書における本発明のある実施形態は、対象におけるホモシスチン尿症を治療する方法であって、配列番号３のアミノ酸１５位における突然変異を含む単離ヒトトランケートシスタチオニンβシンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含み、単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されている方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、突然変異は、システインについてのセリンの置換（Ｃ１５Ｓ）である。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、組成物を、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される用量で投与する。例えば、用量は、約０．４ｍｇ／ｋｇである。
【００１３】
一部の実施形態において、疾患、障害、または病態は、選択される骨粗鬆症、脱毛症、薄毛、または眼球異常であり、本方法は、配列番号３のアミノ酸１５位における突然変異を含む単離ヒトトランケートシスタチオニンβ−シンターゼ（ｈｔＣＢＳ）突然変異ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記単離ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されている。
【００１４】
本発明の組成物および方法などの追加の実施形態は、下記の詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかである。上記および下記の詳細な説明から認識することができるとおり、本明細書に記載のそれぞれの特徴部、およびそのような特徴部の２つ以上のあらゆる組合せが本開示の範囲内が含まれるが、そのような組合せに含まれる特徴部が相互に矛盾しないことを条件とする。さらに、任意の特徴部または特徴部の組合せは、本発明の任意の実施形態から具体的に排除することができる。本発明の追加の態様および利点は、特に添付の実施例および図面とともに考慮する場合、下記の詳細な説明および特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】血漿中およびインビボでの酵素保持を示す図。図１Ａは、血漿中の酵素保持時間が維持されることを示し、インビボ活性の急速損失がクリアランスの結果であることを示唆する。
【図１Ｂ】血漿中およびインビボでの酵素保持を示す図。図１Ｂは、酵素保持時間がインビボであり、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳについて向上することを示す。図１Ｂのマウス番号１およびマウス番号２は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図１Ｂとしても記載されている。
【図２】非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳの反復投与が、ＨＯマウスにおけるホモシステインレベルの変化もシスタチオニンレベルの変化ももたらさないことを示す図。
【図３】ＭＥ２００ＭＡＢと命名された選択直鎖２０ｋＤａ  ＰＥＧ分子を用いるＰＥＧ化の経時的変化を示す図。
【図４Ａ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳの長期反復注射がホモシステイン、シスタチオニンおよびシステイン血漿および組織レベルに有意に影響することを示す図。
【図４Ｂ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳの長期反復注射がホモシステイン、シスタチオニンおよびシステイン血漿および組織レベルに有意に影響することを示す図。
【図４Ｃ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳの長期反復注射がホモシステイン、シスタチオニンおよびシステイン血漿および組織レベルに有意に影響することを示す図。
【図４Ｄ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳの長期反復注射がホモシステイン、シスタチオニンおよびシステイン血漿および組織レベルに有意に影響することを示す図。
【図５Ａ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。図５Ａは、内容が参照により全体として内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図５Ａとしても記載されている。
【図５Ｂ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。図５Ｂは、内容が参照により全体として内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図５Ｂとしても記載されている。
【図５Ｃ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。図５Ｃは、内容が参照により全体として内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図５Ｃとしても記載されている。
【図５Ｄ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。
【図５Ｅ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。
【図５Ｆ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。図５Ｆは、内容が参照により全体として内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図６Ａとしても記載されている。
【図５Ｇ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。図５Ｇは、内容が参照により全体として内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図７Ａおよび図７Ｂとしても記載されている。
【図５Ｈ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳがタンパク質凝集を防止し、主に二量体を形成し、再現可能なＰＥＧ化パターンを示すことを説明する図。図５Ｈは、内容が参照により全体として内容が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図６Ｃとしても記載されている。
【図６Ａ】注射１、４および２４時間後のホモシステインおよびその代謝産物に対するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）の効果を示す図。
【図６Ｂ】注射１、４および２４時間後のホモシステインおよびその代謝産物に対するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）の効果を示す図。
【図６Ｃ】注射１、４および２４時間後のホモシステインおよびその代謝産物に対するＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）の効果を示す図。
【図７Ａ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびベタインによる処理が、相乗的に低減させ、ＨＯマウスにおける低いホモシステインレベルおよびシスタチオニンに対するその効果を維持することを示す図。
【図７Ｂ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）およびベタインによる処理が、相乗的に低減させ、ＨＯマウスにおける低いホモシステインレベルおよびシスタチオニンに対するその効果を維持することを示す図。
【図８Ａ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）投与がＣＢＳ完全ノックダウンマウスを早期致死からレスキューし、肝病変を改善することを示す図。
【図８Ｂ】ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体（ＰＥＧＣ１５Ｓとも称される）投与がＣＢＳ完全ノックダウンマウスを早期致死からレスキューし、肝病変を改善することを示す図。
【図９Ａ】マレイミドＰＥＧ分子（ＭＥ−２００ＭＡ０ＢまたはＭＥ−４００ＭＡ）またはＮＨＳエステルＰＥＧ分子（ＭＥ−２００ＧＳ）によりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓについての異なるＰＥＧ化種のプロファイルを示す図。
【図９Ｂ】マレイミドＰＥＧ分子（ＭＥ−２００ＭＡ０ＢまたはＭＥ−４００ＭＡ）またはＮＨＳエステルＰＥＧ分子（ＭＥ−２００ＧＳ）によりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓについての異なるＰＥＧ化種のプロファイルを示す図。
【図１０Ａ】ＨＯマウスへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）または４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−４００ＭＡ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）の単回皮下（ＳＣ）注射後の比活性および血漿代謝産物レベルおよびＣＢＳ活性を示す図。
【図１０Ｂ】ＨＯマウスへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）または４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−４００ＭＡ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）の単回皮下（ＳＣ）注射後の比活性および血漿代謝産物レベルおよびＣＢＳ活性を示す図。
【図１０Ｃ】ＨＯマウスへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）または４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−４００ＭＡ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）の単回皮下（ＳＣ）注射後の比活性および血漿代謝産物レベルおよびＣＢＳ活性を示す図。
【図１０Ｄ】ＨＯマウスへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）または４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−４００ＭＡ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）の単回皮下（ＳＣ）注射後の比活性および血漿代謝産物レベルおよびＣＢＳ活性を示す図。
【図１０Ｅ】ＨＯマウスへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）または４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＭＥ−４００ＭＡ  ＰＥＧによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）の単回皮下（ＳＣ）注射後の比活性および血漿代謝産物レベルおよびＣＢＳ活性を示す図。
【図１１Ａ】ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢまたはＭＥ−４００ＭＡのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓの投与後のＫＯマウスにおける生存率および代謝産物レベルの変化を示す図。
【図１１Ｂ】ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢまたはＭＥ−４００ＭＡのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓの投与後のＫＯマウスにおける生存率および代謝産物レベルの変化を示す図。
【図１１Ｃ】ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢまたはＭＥ−４００ＭＡのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓの投与後のＫＯマウスにおける生存率および代謝産物レベルの変化を示す図。
【図１２Ａ】ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡまたはＭＥ−２００ＧＳのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓが継続的に投与されたＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスの群における顔面脱毛症の発症の完全な予防および遅延を示す図。
【図１２Ｂ】ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡまたはＭＥ−２００ＧＳのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓが継続的に投与されたＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスの群における顔面脱毛症の発症の完全な予防および遅延を示す図。
【図１２Ｃ】ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡまたはＭＥ−２００ＧＳのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓが継続的に投与されたＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスの群における顔面脱毛症の発症の完全な予防および遅延を示す図。
【図１２Ｄ】ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡまたはＭＥ−２００ＧＳのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓが継続的に投与されたＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスの群における顔面脱毛症の発症の完全な予防および遅延を示す図。
【図１２Ｅ】ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡまたはＭＥ−２００ＧＳのいずれかによりＰＥＧ化されているＣ１５Ｓが継続的に投与されたＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスの群における顔面脱毛症の発症の完全な予防および遅延を示す図。
【図１３Ａ】ＰＢＳ処理ＫＯマウスおよび健常対照と比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスにおける改善された肝疾患を示す図。
【図１３Ｂ】ＰＢＳ処理ＫＯマウスおよび健常対照と比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスにおける改善された肝疾患を示す図。
【図１４Ａ】電子顕微鏡観察により観察された図１３Ａ〜Ｂの肝試料を示す図。
【図１４Ｂ】電子顕微鏡観察により観察された図１３Ａ〜Ｂの肝試料を示す図。
【図１５Ａ】ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプの異なるモデルを使用した、血漿中のＣＢＳ活性および硫黄アミノ酸代謝産物に対するＨＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与の効果を示す図。
【図１５Ｂ】ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプの異なるモデルを使用した、血漿中のＣＢＳ活性および硫黄アミノ酸代謝産物に対するＨＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与の効果を示す図。
【図１５Ｃ】ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプの異なるモデルを使用した、血漿中のＣＢＳ活性および硫黄アミノ酸代謝産物に対するＨＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与の効果を示す図。
【図１５Ｄ】ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプの異なるモデルを使用した、血漿中のＣＢＳ活性および硫黄アミノ酸代謝産物に対するＨＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与の効果を示す図。
【図１６Ａ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１６Ｂ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１６Ｃ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１６Ｄ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１６Ｅ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１６Ｆ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１６Ｇ】ＫＯマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１７Ａ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１７Ｂ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１７Ｃ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１７Ｄ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１７Ｅ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１７Ｆ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与の二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡまたはＤＸＡ）試験の結果を示す図。
【図１８Ａ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与後のＩ２７８ＴマウスにおけるＮＭＲメタボロミクスを使用して分析され、健常ヘテロ接合性および罹患ホモ接合性対照と比較した選択肝代謝産物の濃度を示す図。
【図１８Ｂ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与後のＩ２７８ＴマウスにおけるＮＭＲメタボロミクスを使用して分析され、健常ヘテロ接合性および罹患ホモ接合性対照と比較した選択肝代謝産物の濃度を示す図。
【図１９Ａ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける眼球異常に対する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与の効果を示す図。
【図１９Ｂ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける眼球異常に対する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与の効果を示す図。
【図１９Ｃ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける眼球異常に対する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与の効果を示す図。
【図１９Ｄ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける眼球異常に対する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与の効果を示す図。
【図１９Ｅ】Ｉ２７８Ｔマウスにおける眼球異常に対する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与の効果を示す図。
【図２０Ａ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳにより処理され、常用食または代謝産物制限食のいずれかで維持されるＩ２７８Ｔマウスにおける血漿代謝産物レベルを示す図。
【図２０Ｂ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳにより処理され、常用食または代謝産物制限食のいずれかで維持されるＩ２７８Ｔマウスにおける血漿代謝産物レベルを示す図。
【図２０Ｃ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳにより処理され、常用食または代謝産物制限食のいずれかで維持されるＩ２７８Ｔマウスにおける血漿代謝産物レベルを示す図。
【図２０Ｄ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳにより処理され、常用食または代謝産物制限食のいずれかで維持されるＩ２７８Ｔマウスにおける血漿代謝産物レベルを示す図。
【図２１Ａ】４（ＩＶ）、８（ＳＣ）、および２４（ＳＣ）ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣボーラス投与後の雄および雌ラットにおける２０ＮＨＳ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を示す図。
【図２１Ｂ】４（ＩＶ）、８（ＳＣ）、および２４（ＳＣ）ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣボーラス投与後の雄および雌ラットにおける２０ＮＨＳ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を示す図。
【図２１Ｃ】８ｍｇ／ｋｇの用量における合計９回の注射を受ける個々の野生型スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットについての初回注射後および定常状態レベルにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を示す図。
【図２２Ａ】２または６ｍｇ／ｋｇの用量の単回ＩＶまたはＳＣ注射後の野生型カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるＣｔｈの血漿濃度および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を示す図。
【図２２Ｂ】２または６ｍｇ／ｋｇの用量の単回ＩＶまたはＳＣ注射後の野生型カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるＣｔｈの血漿濃度および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を示す図。
【図２３Ａ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの１、３、または１０ｍｇ／ｋｇ用量の複数回ＳＣ投与後の野生型カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における比活性およびシスタチオニン（Ｃｔｈ）の血漿レベルを示す図。
【図２３Ｂ】２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの１、３、または１０ｍｇ／ｋｇ用量の複数回ＳＣ投与後の野生型カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における比活性およびシスタチオニン（Ｃｔｈ）の血漿レベルを示す図。
【図２４Ａ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【図２４Ｂ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【図２４Ｃ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【図２４Ｄ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【図２４Ｅ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【図２４Ｆ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【図２４Ｇ】本明細書におけるマウス、ラット、およびサルモデルについての結果に基づきヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳの有効用量を推定するためのアロメトリックスケーリング結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、シスタチオニンβ−シンターゼ欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）を治療するための組成物および方法が提供される。非限定的な例として、ＣＢＳＤＨは、ＣＢＳまたはそのバリアントの酵素補充により治療することができる。
【００１７】
ＣＢＳの不活性化は、より一般には古典的ホモシスチン尿症と称されるシスタチオニンβ−シンターゼ欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）をもたらす。ＣＢＳＤＨは、顕著に上昇した血漿総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）およびメチオニンレベル、ならびにシスタチオニンおよびシステインの大幅に低減した濃度を特徴とする常染色体劣性障害であり；これは最も一般的な硫黄アミノ酸異常である。未治療の場合、ＣＢＳＤＨは、種々の様々な器官系における疾患、障害および／または病態ならびに重度の表現型変化をもたらす。ＣＢＳＤＨからの疾患、障害および／または病態の非限定的な例としては、精神遅滞、精神障害、中枢神経系疾病、例として、発作、未治療および部分治療個体における高い割合の死亡率をもたらす血栓塞栓性合併症を受けやすい傾向を有する心血管疾患、ならびに視覚系（例えば、進行性近視および水晶体転位、水晶体偏位）、ならびに骨格系（例えば、マルファン様体型、骨粗鬆症、脊柱側弯、繊細で色が淡い毛髪および脆弱毛、薄い皮膚）を冒す一連の結合組織障害が挙げられる。
【００１８】
ＣＢＳＤＨに関連する病因性突然変異の性質における機能的三分説が存在する。突然変異の１つの群は、高用量ビタミンＢ６療法によりＣＢＳ酵素機能を部分的に復帰させることができる「ピリドキシン応答性」として分類される。この治療は有効であり得るが、それらの個体における病理学的イベントを常に緩和するわけではなく、イベントの一部は徐々にそれらの個体においても生じる。臨床背景において、「ビタミンＢ６応答性」は、個体に１００〜５００ｍｇのＢ６の経口用量が付与された２４時間後に生じるＨｃｙの２０％の相対的降下として定義され、Ｂ６応答性個体は異常に高いホモシステインレベルを依然として有し得ることを意味する。機能的突然変異の第２の群は、Ｓ−アデノシルメチオニンによる翻訳後上方調節に応答する能力が異常である「Ｃ末端ＣＢＳ突然変異体」により表される。このクラスの突然変異を有する個体は、通常、精神遅滞および表現型の結合組織の特徴を欠く。このクラスは、４０歳前の特発性血栓イベント後の血漿Ｈｃｙレベルの計測後に検出される（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２００２年、ヒューマン・ミューテーション（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．）第１９巻、ｐ．６４１〜５５）。ＣＢＳＤＨ突然変異の最後の群は、最も重度の疾患形態を表す「古典的ホモシスチン尿症」である。個体のこれらの後者の２つの群について、隔離ビタミンＢ６療法は血清Ｈｃｙレベルを有効に低下させない。これらの突然変異群は表現型区別を示し得るが、同様に治療することができる。
【００１９】
最も一般的な突然変異ＣＢＳアレルは、ピリドキシン応答性ホモシスチン尿症に関連する８３３Ｔ＞Ｃ（Ｉ２７８Ｔ）である。したがって、Ｂ６応答性個体は、ホモシスチン尿症患者集団のほぼ半数を占める（バーバ（Ｂａｒｂｅｒ）およびスパエス（Ｓｐａｅｔｈ）、１９６９年；ムッド（Ｍｕｄｄ）ら、１９８５年）。しかしながら、これらのＢ６応答性個体のうち多くは部分応答者にすぎず、Ｂ６非応答性個体と組合せで、追加の治療選択が必要とされる。残念ながら、このような治療選択は、現在、システインが補給された厳密な低タンパク質食に従うことによるメチオニンの取り込みの低減（目下、必須）およびホモシステインを再メチル化してメチオニンに戻し得るメチルドナーのベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）の使用を介するホモシステイン濃度の減少に制限されている。したがって、ＣＢＳ（例えば、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ）を使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）が、Ｂ６部分および非応答性患者の両方のための最良の治療法であり得る。
【００２０】
ＣＢＳ機能不全の結果として、ホモシステイン（Ｈｃｙ）レベルはＣＢＳＤＨ患者において大幅に変わる。健常個体において、総Ｈｃｙレベルは約５〜１５μＭの範囲内であり（ステイブラー（Ｓｔａｂｌｅｒ）ら著、２００２年、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、第５１巻、ｐ．９８１〜９８８）、その９８％はジスルフィドの形態であり、またはタンパク質結合している。ｔＨｃｙの２％のみが、ＣＢＳの基質として機能し得る遊離（非タンパク質結合）還元ホモシステインとして存在する（マンスール（Ｍａｎｓｏｏｒ）ら著、１９９２年、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２００巻、ｐ．２１８〜２２９；ムッド（Ｍｕｄｄ）ら著、２０００年、アーテリオスクラー・トロンボシス・アンド・バスキュラー・バイオロジー（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２０巻、ｐ．１７０４〜１７０６）。このバランスはＣＢＳＤＨ患者において大幅に変わり、遊離還元ホモシステインはそれらの患者において観察されるｔＨｃｙ値の１０〜２５％に達する（最大約４００μＭ）（マンスール（Ｍａｎｓｏｏｒ）ら著、１９９３年、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、第４２巻、ｐ．１４８１〜１４８５）。
【００２１】
より高いｔＨｃｙレベル（例えば、野生型レベルの５４倍超）も、疾患、障害および／または病態、例えば、限定されるものではないが、マウスにおける顔面脱毛症、骨粗鬆症および平均生存率の低減を引き起こし得る。非限定的な例として、野生型と比較して少なくとも５４倍高いｔＨｃｙを有するモデルマウスは、いくつかの疾患、障害および／または病態、例として、顔面脱毛症、骨粗鬆症および平均生存率の低減を実証した。しかしながら、このような徴候は、正常値の約３０倍のｔＨｃｙレベルを有するマウスにおいて観察されず、したがって、ホモシステイン上昇は、閾値レベルを超えた場合のみ病原性であり得るにすぎない（グプタ（Ｇｕｐｔａ）ら著、２００９年、ＦＡＳＥＢジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）、第２３巻、ｐ．８８３〜８９３）。ヒトにおけるＣＢＳＤＨの多施設観察試験において、種々の治療組合せがＣＢＳＤＨ患者において正常ホモシステインレベルを復帰させ得ず、Ｂ６非応答者は正常集団の上限よりも３〜５倍高いホモシステインレベルを示し続けるが、それらの患者における血栓塞栓症のリスクが有意に低減することが見出された（ヤップ（Ｙａｐ）ら著、２００１年、アーテリオスクラー・トロンボシス・アンド・バスキュラー・バイオロジー（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２１巻、ｐ．２０８０〜２０８５）。まとめると、これらのデータは、ＣＢＳＤＨの臨床的顕在化を改善するため、ｔＨｃｙの不完全な還元はそれが閾値レベル未満である場合に疾患を治療するために十分であり得ることを示す。
【００２２】
低メチオニン食は、患者におけるホモシステインレベルのいくらかの代謝制御の確立および維持において有効であり得る一方、その効果は、特に診断の遅れた患者において食事順守の欠落により妨げられ得、特に幼児において症状の発生を伴うホモシステインの付随増加をもたらす（ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら著、１９９８年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．）、第１５７巻、補遺２、ｐ．７１〜７６）。食事順守の不成功は、血清Ｈｃｙ増加、血管および結合組織中の合併症、例として、致命的および身体機能を奪うイベントの再発、ならびに重度の副作用、例えば、脳浮腫（過剰な血清Ｍｅｔ濃度から）または重度の栄養失調（必須アミノ酸の欠落から）のリスクを引き起こす。最も有効な治療方針は、ビタミンＢ６応答性ホモシスチン尿症にピリドキシンを付与する場合に明らかなとおり、酵素活性を増加させることである。この方針は、突然変異状態に起因してビタミンＢ６非応答性個体について可能ではない。ベタインは、あまり従順でない患者において代謝制御を達成するのに役立ち得、食事とのその組合せは最良の利用可能な治療を表し得る。しかしながら、Ｂ６非応答者のための現在の治療法はシスタチオニンを増加させず、システイン補給は適切なレベルを維持することを保証することができる。したがって、これらの個体における酵素活性の増加は、外因性酵素の送達、すなわち、酵素補充療法（ＥＲＴ）に依存し得る。
【００２３】
かなりの証拠が、トランススルフレーションにおける中間体としての役割とは無関係にシスタチオニンについて考えられる機能を示唆している。シスタチオニンが果たす役割は、ＣＢＳ欠損ホモシスチン尿症の特定のトランスジェニックマウスモデルの研究により示唆されている。古典的ホモシスチン尿症のこのモデルにおいて、マウスｃｂｓ遺伝子は不活性化され、ヒトＣＢＳプロモータの制御下でヒトＣＢＳトランス遺伝子の低レベルの発現時に生存し；したがって、これは「ヒューマンオンリ（ｈｕｍａｎ  ｏｎｌｙ）」（ＨＯ）と命名された。ＨＯマウスは、Ｈｃｙ、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびＳ−アデノシルホモシステインの血漿および組織レベルの両方において重度の上昇、ならびにシステインの血漿および肝臓レベルの付随減少を示す。しかしながら、古典的ホモシスチン尿症の従来のＣＢＳノックアウトモデル（母マウスがベタインに供されていても、重度の成長遅延および肝障害を罹患し、ほとんどが出生後３週間以内に死亡するＣＢＳノックアウトマウス（ＫＯ）としても公知（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１０年ｂ、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、第１０１巻、ｐ．１５３〜１６２））（母マウスがベタインにより処理されていても重度の成長遅延および肝障害を罹患し、肝脂肪変性、線維症、出生後３週間以内の新生児死亡を招く）とは対照的に、ＨＯマウスは軽度の肝障害を示し、ＨＯマウスの約９０％が少なくとも６ヵ月間生存する（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１２年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２８７巻、ｐ．３１９９４〜３２００５、その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。尾採血測定は、ＨＯマウスが、ヒトにおいて生じる疾患を再現する様式でベタイン処理により有意に改善される凝固亢進状態であることを示す（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１０年ｂ、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、第１０１巻、ｐ．１５３〜１６２；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＨＯマウスは高レベルのｔＨｃｙを有するが、ささいな結果のみを罹患する。ＫＯ（約１μＭ）と比較してＨＯマウス（約１０μＭ）において有意に上昇するシスタチオニンのレベルを除き、それら２つのネズミモデル間の代謝産物レベルの差はほとんどなく、またはない。したがって、シスタチオニンが肝および腎脂質蓄積、組織損傷および長期の小胞体ストレスにより誘導されるアポトーシス細胞死に対する保護効果を提供し得ることが示唆されている。
【００２４】
シスタチオニンは、システインプロドラッグとして機能することによりアセトアミノフェン誘導肝損傷のマウスモデルにおいて保護効果を提供し得る。シスタチオニンがこの化合物をシステインに変換し得ないａ２３細胞において顕著な保護効果を与える観察を加味するとシスタチオニンのシステインへの変換を遮断することにより高シスタチオニン血症を誘導するための実験におけるＣＧＬ不活性化化合物Ｄ，ｌ−２−アミノ−４−ペンチン酸の使用は、観察される保護効果がシステイン合成のための前駆体として作用するシスタチオニンの結果でないことを示す。
【００２５】
シスタチオニンは、正常に機能する脳に重要であり得る。シスタチオニンが正常哺乳動物脳中で特異的に蓄積して細胞保護物質として機能すること、およびその合成の停止が上昇したＨｃｙおよび／またはその誘導体の毒性損傷に対する神経組織の感受性を増加させることによりホモシスチン尿症における精神遅滞に寄与し得ることが考えられる（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１２年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２８７巻、ｐ．３１９９４〜３２００５）。脳内のシスタチオニンの濃度のかなりの領域差が存在し、灰質よりも白質中で濃度が高く、考えられる髄鞘形成の役割を示唆する。シスタチオニンは、ヒトおよびサル脳の後頭葉中で下等動物種の全脳よりも高レベルで見出されており、シスタチオニンの役割は、げっ歯類脳よりも霊長類脳において重要であると示唆されている（ボルペ（Ｖｏｌｐｅ）およびラスター（Ｌａｓｔｅｒ）著、１９７２年、バイオロジー・オブ・ザ・ネオネート（Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｎａｔｅ）、第２０巻、ｐ．３８５〜４０３；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００２６】
多数の間接的な一連の証拠が、シスタチオニンまたはその誘導体のいずれかについての考えられる生理学的役割を支持する。霊長類脳および中枢神経系（ＣＮＳ）において、ＣＢＳおよびＣＧＬ間の相対活性レベルの不均衡が存在し、シスタチオニンの蓄積をもたらすと考えられる。同様に、胚発生の間、ＣＢＳは、成体組織中でいかなる検出可能なＣＢＳも発現しない複数の組織、例えば、心臓および肺中で発現される。一連のデータは、ＣＧＬが早期哺乳動物発生の間に発現されないことを示す。例えば、ヒト肝試料において、ＣＧＬ活性は出生後組織中でのみ検出される一方、胎児、早産児および満期新生児肝組織における活性は本質的には検出不能である。まとめると、これらの結果は、ある発生段階において、および成体神経組織において、ＣＢＳは、システイン合成における中間体としての役割と異なるシスタチオニンの産生のために特異的に発現されることを示す（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１２年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２８７巻、ｐ．３１９９４〜３２００５；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。シスタチオニンγ−リアーゼ（ＣＧＬ）およびＣＢＳ発現にわたる厳密な制御が哺乳動物発生の間に生じるという知識に基づくと、それらの観察は一緒になって、システインの前駆体であることに加えシスタチオニンについての考えられる保護的役割を示唆する。
【００２７】
シスタチオニンからのシステイン生合成は、ＣＧＬにより触媒される。シスタチオニンは細胞内部に存在し、血漿タンパク質として存在しないと考えられる。したがって、本明細書に記載のＰＥＧ化ヒトトランケート（ｈｔＣＢＳ）酵素の注射時に産生されるシスタチオニンはＣＧＬの細胞内基質としても機能し得ると考えられる。さらに、ｔＨｃｙのレベルの低減はシステイン−ホモシステインアダクト（尿中に急速にクリアランスされ得る）の形成を妨害し得、より高レベルの血漿中の遊離システインを生成することが考えられ得る（グプタ（Ｇｕｐｔａ）ら著、２０１４年、ＦＡＳＥＢジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）、第２８巻、ｐ．７８１〜７９０）。
【００２８】
本発明の種々の態様は、目下のところ、以下により完全に記載される。しかしながら、このような態様は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態を限定するものとして解釈すべきでなく；むしろ、それらの実施形態は、本開示が詳細で完全であり、その範囲を当業者に十分に伝達するように提供される。
【００２９】
ＣＢＳ酵素
ＣＢＳ遺伝子は、ヒト第２１染色体上にｑ２２．３において存在する（スコブビー（Ｓｋｏｖｂｙ）ら著、ヒューマン・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、第６５巻、ｐ．２９１〜２９４、１９８４年；ムンケ（Ｍｕｎｋｅ）ら著、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、第４２巻、ｐ．５５０〜５５９、１９８８年；それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ヒトＣＢＳをコードする核酸配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列はジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号Ｌ１９５０１を介して利用可能であり、それらの配列は内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，５２３，２２５号明細書にも開示されている。ＣＢＳをコードするゲノムＤＮＡの核酸配列は、配列データ、例えば、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）およびコロラド大学デンバー校ウェブページ（クラウス（Ｋｒａｕｓ）研究室）におけるデータを介しても公的に利用可能である。
【００３０】
理論により拘束されるものではないが、ＣＢＳ遺伝子によりコードされるタンパク質は、ホモ四量体として作用して、トランススルフレーション経路の第１のステップであるホモシステインのシスタチオニンへの変換を触媒する。コードされるタンパク質はＳ−アデノシル−メチオニンによりアロステリックに活性化され、補因子としてピリドキサールリン酸を使用する。複数の択一的にスプライシングされる転写物バリアントが、この遺伝子について見出されている。
【００３１】
ＣＢＳは、トランスメチル化、トランススルフレーションおよび再メチル化経路の交差における機能により、メチオニンからの硫黄のシステインへの一方向の流れを支配する。これは、セリンがピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）依存的にホモシステインと縮合してシスタチオニンを形成するβ−置換反応を触媒する（マイルズ（Ｍｉｌｅｓ）およびクラウス（Ｋｒａｕｓ）著、２００４年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ．２９８７１〜２９８７４；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。次いで、シスタチオニンは、シスタチオニンγリアーゼ（ＣＧＬ）によりシステインに変換され得る。したがって、ＣＢＳ酵素の適切な機能はシステインおよびメチオニン代謝の両方の調節に重要であり（ムッド（Ｍｕｄｄ）ら著、２００１年、「トランススルフレーションの障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）」、遺伝性疾患の代謝および分子基礎（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｃ．Ｒ．スクリバー（Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒ）、Ａ．Ｌ．ベウデット（Ａ．Ｌ．Ｂｅｕｄｅｔ）、Ｗ．Ｓ．スリ（Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ）、Ｖ．Ｄ．、Ｃ．Ｂ．、Ｋ．Ｋ．Ｗ．、およびＶ．Ｂ．編（ニューヨーク：マグロウヒル）、ｐ．２００７〜２０５６；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、したがって、ＣＢＳ活性の減弱またはその欠落は、ＣＢＳ欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）の生化学的および臨床的顕在化をもたらす。
【００３２】
ＣＢＳの不活性化は、より一般には古典的ホモシスチン尿症と称されるシスタチオニンβ−シンターゼ欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）をもたらす。古典的ホモシスチン尿症は、１９６２年にカールソン（Ｃａｒｓｏｎ）およびネイル（Ｎｅｉｌｌ）により最初に記載され（カールソン（Ｃａｒｓｏｎ）およびネイル（Ｎｅｉｌｌ）著、１９６２年、アーカイブズ・オブ・ディジーズ・イン・チャイルドフッド（Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ）、第３７巻、ｐ．５０５〜５１３；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、最も一般的な硫黄アミノ酸代謝の先天異常として認識される。ホモシスチン尿症の根本的な原因であるシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）酵素の欠損は、その直後に発見された（ムッド（Ｍｕｄｄ）ら著、１９６４年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１４３巻、ｐ．１４４３〜１４４５；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００３３】
ミスセンス突然変異は、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）欠損の最も一般的な原因を表す。これらの突然変異の多くは、生物学的機能を欠くミスフォールドタンパク質をもたらす。化学シャペロン（例えば、エタノール、ジメチルスルホキシド、またはトリメチルアミン−Ｎ−オキシドなど）の存在は、タンパク質フォールディングおよび突然変異タンパク質の活性を軽減またはさらには復帰させ得ることもある。８つのＣＢＳ突然変異酵素（Ｐ４９Ｌ、Ｐ７８Ｒ、Ａ１１４Ｖ、Ｒ１２５Ｑ、Ｅ１７６Ｋ、Ｐ４２２Ｌ、Ｉ４３５Ｔ、およびＳ４６６Ｌ）が精製および特徴付けされ、化学シャペロンを用いて、それらのタンパク質フォールディングを改善することによりレスキューされ得た。ヘムにより完全飽和されている四量体突然変異酵素は、野生型ＣＢＳと同一の、またはそれよりも高い比活性を有した。熱安定性計測は、精製突然変異体が野生型ＣＢＳと同等の、またはそれよりも熱安定性であることを実証した。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン刺激または熱活性化に対する応答は変動した。両方の刺激に対するＲ１２５ＱおよびＥ１７６Ｋの応答の欠落は、それらの特異的立体構造が活性化状態に達し得ないことを示した。粗製抽出物中の分子シャペロン、特にＤｎａＪのレベルの増加は、ＣＢＳ突然変異体のフォールディングに対する化学シャペロンのかなりの間接的な効果を示した（マジタン（Ｍａｊｔａｎ）ら著、２０１０年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２８５巻、第２１号、ｐ．１５８６６〜１５８７３；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００３４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で既に試験された２７個のＣＢＳ突然変異のミスフォールディングの程度が、それらの突然変異の立体構造をレスキューするシャペロンの能力について、哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞のよりフォールディング許容性の条件下で試験されている。哺乳動物細胞中の突然変異の発現は、細菌中の発現と比較して活性中央値を１６倍および四量体の量を３．２倍増加させた。続いて、シャペロン様活性を有する３つの化合物に対する７つの選択突然変異の応答が試験された。アミノオキシ酢酸および４−フェニル酪酸は弱い効果を示したにすぎなかった。対照的に、アルギン酸ヘムは、突然変異ＣＢＳタンパク質四量体の形成を実質的に増加させ（最大６倍）、７つの突然変異のうち５つ（ｐ．Ａ１１４Ｖ、ｐ．Ｋ１０２Ｎ、ｐ．Ｒ１２５Ｑ、ｐ．Ｒ２６６Ｋ、およびｐ．Ｒ３６９Ｃ）の触媒的活性をレスキューした（最大９倍）。アルギン酸ヘムの最大効果は、ビタミンＢ６によるインビボ処理に非応答性である突然変異ｐ．Ｒ１２５Ｑについて観察された。さらに、ｐ．Ｒ１２５Ｑ突然変異のヘム応答性は、この遺伝子バリアントについてホモ接合性の患者に由来する線維芽細胞において確認された。これらのデータに基づき、ヘム応答性ＣＢＳ突然変異の区別される群が提案され、ＣＢＳのヘムポケットがホモシスチン尿症のための新規治療法を設計するための重要な標的であると予測された（マレノフスカ（Ｍｅｌｅｎｏｖｓｋａ）ら著、２０１４年、ジャーナル・オブ・インヘリテッド・メタボリック・ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．）、第３８巻、第２号；その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００３５】
生化学的には、ＣＢＳＤＨは高度に上昇した血中レベルのホモシステイン、メチオニンおよびＳ−アデノシル−ホモシステイン（「ＳＡＨ」または「ＡｄｏＨｃｙ」としても公知）と、それに伴う低レベルのシステインおよびシスタチオニンを特徴とする。未治療ホモシスチン尿症の臨床的顕在化の一部としては、血栓塞栓症、結合組織疾病、例えば、水晶体の転位、マルファン様特徴および骨粗鬆症、認識機能障害および他の徴候が挙げられる（クラウス，Ｊ．（Ｋｒａｕｓ，Ｊ．）、およびコジック，Ｖ．（Ｋｏｚｉｃｈ，Ｖ．）著、２００１年、「シスタチオニンβ−シンターゼおよびその欠損（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」、健常および疾患におけるホモシステイン（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｊ．Ｄ．カーメル  Ｒ（Ｊ．Ｄ．Ｃａｒｍｅｌ  Ｒ）編（ニューヨーク：ケンブリッジ大学プレス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ｐ．２２３〜２４３；ムッド（Ｍｕｄｄ）ら著、２００１年、「トランススルフレーションの障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）」、遺伝性疾患の代謝および分子基礎（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｃ．Ｒ．スクリバー（Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒ）、Ａ．Ｌ．ベウデット（Ａ．Ｌ．Ｂｅｕｄｅｔ）、Ｗ．Ｓ．スリ（Ｗ．Ｓ．Ｓｌｙ）、Ｖ．Ｄ．、Ｃ．Ｂ．、Ｋ．Ｋ．Ｗ．、およびＶ．Ｂ．編（ニューヨーク：マグロウヒル）、ｐ．２００７〜２０５６）。
【００３６】
ホモシスチン尿症を治療する初期の試みは、メチオニン取り込みを減少させ、したがって、毒性ホモシステインの蓄積を回避するための食事制限を用いた（コムロワー（Ｋｏｍｒｏｗｅｒ）ら著、１９６６年、アーカイブズ・オブ・ディジーズ・イン・チャイルドフッド（Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ）、第４１巻、ｐ．６６６〜６７１）。後に、ＰＬＰ−補因子前駆体、ピリドキシン（ビタミンＢ６）の補給が患者の半数をわずかに下回る数についての臨床的顕在化を和らげ、それらのサブセットが部分応答者にすぎないことが見出された（バーバ（Ｂａｒｂｅｒ）およびスパエス（Ｓｐａｅｔｈ）著、１９６９年、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．）、第７５巻、ｐ．４６３〜４７８；ムッド（Ｍｕｄｄ）ら著、１９８５年、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、第３７巻、ｐ．１〜３１）。「Ｂ６応答者」は、その残りの生涯にわたり補給ビタミンＢ６を摂取することが必要である。多くの場合、完全なＢ６応答性患者さえ、代謝制御を達成し得るためのより軽度のタンパク質制限食を要求する（ピッカー，Ｊ．Ｄ．（Ｐｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｄ．）、およびレビー，Ｈ．Ｌ．（Ｌｅｖｙ，Ｈ．Ｌ．）著、２００４年、シスタチオニンβシンターゼ欠損により引き起こされるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｂｅｔａ−Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ジーンレビューズ（ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ）、Ｒ．Ａ．パゴン（Ｒ．Ａ．Ｐａｇｏｎ）、Ｍ．Ｐ．アダム（Ｍ．Ｐ．Ａｄａｍ）、Ｔ．Ｄ．バード（Ｔ．Ｄ．Ｂｉｒｄ）、Ｃ．Ｒ．ドラン（Ｃ．Ｒ．Ｄｏｌａｎ）、Ｃ．Ｔ．フォング（Ｃ．Ｔ．Ｆｏｎｇ）、およびＫ．スティーブンス（Ｋ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）編（シアトル（ワシントン）：ワシントン大学シアトル校；それらのそれぞれの内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。残りのサブセット、非応答者は極度の制限食に供され、多くの患者は従うのが不十分である（ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）ら著、１９９８年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．）、第１５７巻、補遺２、ｐ．７１〜７６；その内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。食事は、ホモシステインからジメチルグリシンおよびメチオニンを産生するための酵素ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＢＨＭＴ）のためのメチルドナーとして機能し得るベタインとともにメチオニン不含およびシステインリッチアミノ酸混合物と組み合わせられる（フィンケルシュタイン（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ）著、１９９０年、ジャーナル・オブ・ヌトリショナル・バイオケミストリー（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１巻、ｐ．２２８〜２３７）。グルタチオンはシステインから合成され、したがってシステインの添加は酸化ストレスを低減させるために重要である。ほとんどの患者は、トリメチルグリシン、および通常用量の葉酸補給物によっても治療される。これは、厳重食とともにホモシステインレベルを低下させることにより代謝制御を改善する。
【００３７】
ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）は、ホモシステインがメチオニンに戻る変換を促進することにより、すなわち、葉酸誘導体と独立する再メチル化経路（主に肝臓および腎臓中で活性である）を介してフラックスを増加させることによりホモシステインの濃度を低減させるために使用される。次いで、ほんのわずかな再形成メチオニンが、体タンパク質中への取り込みにより徐々に除去される。タンパク質に変換されないメチオニンは、Ｓ−アデノシル−メチオニンに変換され、それは次いで再度ホモシステインを形成する。したがって、ベタインは除去されるべきメチオニンの量が小さい場合に最も有効である。したがって、治療はベタインおよび低メチオニン食の両方を含む。古典的ホモシスチン尿症において、血漿メチオニンレベルは、通常、３０マイクロモル／Ｌの正常範囲を超えて増加し、潜在的に毒性のレベル（４００マイクロモル超／Ｌ）に達し得るためその濃度をモニタリングすべきである。
【００３８】
Ｂ６非応答者および部分応答者に、代謝異常を改善する治療法を提供するために長きにわたり追求されてきたＣＢＳＤＨのための代替治療方針は、循環中の毒性ホモシステインの蓄積を低減させ、シスタチオニンおよびシステインのレベルを増加させる。このような代謝変化はＣＢＳＤＨ症状の発症を回復させ、または遅延させ得、この罹患個体の群が無制限の食事または軽度にのみ制限された食事を満喫し、それらの生活の質を顕著に改善することを可能とし得る。これらの利益を提供するため、治療法は、この病態、すなわち、異常なＣＢＳレベルおよび／または機能の根本をなすコア欠損を改善しなければならない。したがって、酵素補充療法（ＥＲＴ）の形態のＣＢＳの全身導入は、ホモシスチン尿症患者に有益であるはずである。
【００３９】
理論により拘束されるものではないが、ＣＢＳ投与に起因する細胞外ホモシステインの顕著な減少は、濃度勾配を生成し、細胞内空間から細胞外空間へのホモシステインのフラックスを誘引し、投与される酵素はさらにそれを処理することができ、したがって、細胞外ＣＢＳがホモシステイン「シンク」として機能し得ると考えられる。
【００４０】
４つの同一の単量体から構成される四量体として存在する天然ヒトＣＢＳの構造および活性化方式は、ＥＲＴとして使用することが困難であり得る。この酵素の形態は高い凝集傾向を有し、それは精製労力に対する大きな制限をもたらす（クラウス（Ｋｒａｕｓ）およびローゼンベルク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）著、１９８３年、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）、第２２２巻、ｐ．４４〜５２；その内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。さらに、ＣＢＳ活性化は、Ｃ末端調節領域により酵素に付与される自己阻害を和らげるためのＣ末端テールへのＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）の結合を要求する。
【００４１】
Ｃ末端調節領域が除去されたトランケート組換えヒトＣＢＳ（ｈｔＣＢＳ）が提供される（配列番号３）。一実施形態において、ｈｔＣＢＳは突然変異していてよく、アミノ酸１５位におけるシステインがセリンに変化している（ｈｔＣＢＳ突然変異体またはＣ１５Ｓ）（配列番号１３）。
【００４２】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素は、インビボの酵素の薬物動態および薬力学特性を改善した。治療タンパク質は、小分子とは異なり、非経口経路を介して送達され、治療効力は、それらの吸収、分布、代謝および排泄（「ＡＤＭＥ」）により大きく影響を受け得る（バグメイスター（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ）ら著、２０１２年、ワールド・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３巻、ｐ．７３〜９２；その内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。高分子量化合物、例えば、酵素は、制限された組織浸透能を有し、したがって、それらが少なくとも１つの機序により循環から除去されるまで主に血漿中に存在する。
【００４３】
一実施形態において、ＥＲＴのためのｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、硫黄アミノ酸代謝に対する定常および顕著な効果を送達するために十分な期間、血漿中の高い活性を維持する。ＥＲＴ効力の向上は、インビボの保持時間を増加させるためのタンパク質に対する追加の修飾を要求し得る。これは、対象における保持時間を拡張するためのタンパク質の表面上へのＰＥＧ化、ポリ−エチレン−グリコール（ＰＥＧ）部分の添加により達成することができる。ＰＥＧ化は、タンパク質分解、免疫応答および抗原性を最小化する一方、タンパク質安定性およびサイズを増加させ、腎排泄を低減させることが見出された（カング（Ｋａｎｇ）ら著、２００９年、エキスパート・オピニオン・オン・エマージング・ドラッグズ（Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ）、第１４巻、ｐ．３６３〜３８０；その内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００４４】
シスタチオニンからのシステイン生合成は、ＣＧＬによってのみ触媒される。シスタチオニンは細胞内部にのみ存在し、血漿タンパク質として存在しない。したがって、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素の注射時に産生されるシスタチオニンは、ＣＧＬの細胞内基質としても機能し得ることが考えられる。さらに、および相互に矛盾するものではなく、近年示唆されたとおり、低減したレベルのｔＨｃｙはシステイン−ホモシステインアダクト（尿中に急速にクリアランスされ得る）の形成を妨害し得、より高いレベルの血漿中の遊離システインを生成することも考えられる（グプタ（Ｇｕｐｔａ）ら著、２０１４年、ＦＡＳＥＢジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）、第２８巻、ｐ．７８１〜７９０）。システイン補給を用いないシステインレベルの正常化は、ＥＲＴにおける現在記載されているｈｔＣＢＳおよびｈｔＣＢＳ突然変異体の別の潜在的な利点である。
【００４５】
一実施形態において、システインレベルの正常化は、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素の投与後に観察することができる。代謝産物レベルの変化に加え、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異体の投与の別の好ましい効果は、罹患ＣＢＳＤＨ患者の肝疾患および生存率に対する顕著な影響であると予測することができる。
【００４６】
ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳを使用する方法
一実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、ＣＢＳＤＨを治療するために使用することができる。ＣＢＳＤＨに関連する病因性突然変異の３つの群（１）ピリドキシン応答性突然変異、（２）Ｃ末端ＣＢＳ突然変異体および（３）古典的ホモシスチン尿症が存在する。
【００４７】
一実施形態において、ｈｔＣＢＳおよびｈｔＣＢＳ突然変異酵素補給は、ＣＢＳＤＨを治療するために使用することができる。ｈｔＣＢＳおよびｈｔＣＢＳ突然変異酵素は、当分野において公知の方法または本明細書に記載の方法によりＰＥＧ化されていてよい。非限定的例として、ＰＥＧは、低分子量（例えば、２ｋＤａ）ＰＥＧまたは高分子量（例えば、４０ｋＤａ）４アーム分枝鎖ＰＥＧであり得る。例えば、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、以下のＰＥＧ分子の１つ：ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＭＥ−０５０ＧＳ、ＧＬ４−４００ＭＡ、およびＭＥ−２００ＧＳによりＰＥＧ化されている。例えば、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドＰＥＧコンジュゲートは、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートである。
【００４８】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体を使用する方法は、ピリドキシン応答性突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ピリドキシン応答性突然変異を有する対象を治療するために単独でまたは現行の治療法（例えば、ビタミンＢ６またはベタイン）との組合せで使用することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ピリドキシン応答性突然変異を有する対象における病理学的イベントを緩和し、または低減させるために使用することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ビタミンＢ６療法に対する部分応答者であるピリドキシン応答性突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。別の非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ビタミンＢ６療法に対する非応答者であるピリドキシン応答性突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。
【００４９】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体を使用する方法は、Ｃ末端ＣＢＳ突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、Ｃ末端ＣＢＳ突然変異を有する対象を治療するために単独でまたは現行の治療法（例えば、ビタミンＢ６またはベタイン）との組合せで使用することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、Ｃ末端ＣＢＳ突然変異を有する対象における血清Ｈｃｙレベルを低下させるために使用することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ビタミンＢ６療法に対する部分応答者であるＣ末端ＣＢＳ突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。別の非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ビタミンＢ６療法に対する非応答者であるＣ末端ＣＢＳ突然変異を有する対象を治療するために使用することができる。
【００５０】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体を使用する方法は、古典的ホモシスチン尿症を有する対象を治療するために使用することができる。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、古典的ホモシスチン尿症を有する対象を治療するために単独でまたは現行の治療法（例えば、ビタミンＢ６またはベタイン）との組合せで使用することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、古典的ホモシスチン尿症を有する対象における血清Ｈｃｙレベルを低下させるために使用することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ビタミンＢ６療法に対する部分応答者である古典的ホモシスチン尿症を有する対象を治療するために使用することができる。別の非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ビタミンＢ６療法に対する非応答者である古典的ホモシスチン尿症を有する対象を治療するために使用することができる。ある実施形態において、対象は、ヒト、ラット、マウス、および非ヒト霊長類である。ある実施形態において、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、骨粗鬆症、薄毛または眼球異常からなる群から選択される少なくとも１つの疾患、障害、病態、または臨床症状を治療するために使用される。
【００５１】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、ＣＢＳＤＨに伴う症状、疾患または障害を低減させるために使用することができる。症状、疾患または障害は、器官系におけるものまたは重度の表現型変化であり得る。ＣＢＳＤＨからの疾患、障害および／または病態の非限定的な例としては、精神遅滞、精神障害、中枢神経系疾病、例として、発作、未治療および部分治療個体における高い割合の死亡率をもたらす血栓塞栓性合併症を受けやすい傾向を有する心血管疾患、ならびに視覚系（例えば、進行性近視および水晶体転位、水晶体偏位）、ならびに骨格系（例えば、マルファン様体型、骨粗鬆症、脊柱側弯、繊細で色が淡い毛髪および脆弱毛、薄い皮膚）を冒す一連の結合組織障害が挙げられる。
【００５２】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、疾患、障害および／または病態、例えば、限定されるものではないが、血栓塞栓症、結合組織疾病、例えば、水晶体の転位、マルファン様特徴、骨粗鬆症、および認識機能障害を治療するために使用することができる。
【００５３】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素は、肝疾患の効果を低減させ、および／または肝疾患を治療し得る。肝疾患は、ＣＢＳＤＨを有する対象におけるものであり得る。したがって、肝疾患の効果の治療および／または低減は、ＣＢＳＤＨ患者の生存の割合を増加させ得る。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、肝実質損傷を低減させるために使用することができる。
【００５４】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、シスタチオニンを増加させ、肝疾患または損傷を治療し、またはそれらの効果を低減させるために使用することができる。
【００５５】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素を使用する本明細書に記載の組成物および方法（例えば、酵素補充療法（ＥＲＴ））は、疾患顕在化およびホモシスチン尿症を特徴付ける代謝異常を改善し得る。一部の実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素は、毒性代謝産物を少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間モジュレートする。追加の実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素は、疾患顕在化を少なくとも３ヵ月、６ヵ月、１２ヵ月、または２４ヵ月間改善する。
【００５６】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異酵素を使用するＥＲＴは、ホモシスチン尿症の予防および治療ならびに／またはその症状の改善を可能とし、そのような厳密なタンパク質排除食を維持する必要性を和らげるＣＢＳＤＨ患者のための有効な治療法を提供する。あるいは、対象はＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを投与され、対象はタンパク質排除食またはＭｅｔ制限食に供されている。
【００５７】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、シスタチオニンを増加させ、ホモシスチン尿症対象における精神遅滞の効果を治療または低減させるために使用することができる。シスタチオニンの量は、脳の一領域または区域、例えば、限定されるものではないが、後頭葉灰質および白質中で増加させることができる。
【００５８】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ホモシスチン尿症対象の脳中の神経組織の感受性を増加させるために使用することができる。シスタチオニンの量は、脳の一領域または区域、例えば、限定されるものではないが、後頭葉灰質および白質中で増加させることができる。
【００５９】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ＣＢＳＤＨを有する対象の寿命を拡張するために使用することができる。
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ホモシスチン尿症の治療のためのＣＢＳ酵素補充療法（ＥＲＴ）の一部として使用される。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳおよびｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、欠損酵素のその天然細胞内コンパートメント中への導入を必要とし得ない。
【００６０】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、ホモシステインレベルを５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％  ５５％、６０％、６５％、６７％、６９％、７０％、７４％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超だけ減少させる。非限定的な例として、ホモシステインの減少は、約６９％の減少であり得る。非限定的な例として、ホモシステインの減少は、約６７％の減少であり得る。非限定的な例として、ホモシステインの減少は、約５２％の減少であり得る。非限定的な例として、ホモシステインの減少は、約３３％の減少であり得る。
【００６１】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、慣習的なベタイン治療前、その後、またはそれと同時に投与することができる。組合せ療法は、ホモシステインレベルに対する相乗効果をもたらし得る。
【００６２】
一実施形態において、対象へのＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、硫黄アミノ酸の細胞外および細胞内平衡を変更し得る。
一実施形態において、細胞外および細胞内平衡の変更は、血漿ホモシステインの減少、例えば、限定されるものではないが、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％  ５５％、６０％、６５％、６７％、６９％、７０％、７４％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超の減少であり得る。非限定的な例として、血漿ホモシステインの減少は、約７５％の減少であり得る。
【００６３】
一実施形態において、細胞外および細胞内平衡の変更は、シスタチオニンの増加、例えば、限定されるものではないが、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５１０％、５２０％、５３０％、５４０％、５５０％、５６０％、５７０％、５８０％、５９０％、６００％、６１０％、６２０％、６３０％、６４０％、６５０％、６６０％、６７０％、６８０％、６９０％、７００％、７１０％、７２０％、７３０％、７４０％、７５０％、７６０％、７７０％、７８０％、７９０％、８００％、８１０％、８２０％、８３０％、８４０％、８５０％、８６０％、８７０％、８８０％、８９０％、９００％、９１０％、９２０％、９３０％、９４０％、９５０％、９６０％、９７０％、９８０％、９９０％、１０００％または１０００％超の増加であり得る。非限定的な例として、シスタチオニンの増加は約９００％であり得る。
【００６４】
一実施形態において、細胞外および細胞内平衡の変更は、肝臓の組織病理学的変化の改善および生存率増加において反映されるシステイン濃度の正常化であり得る。
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ＣＢＳＤＨを有する対象におけるｔＨｃｙレベルを低減させるために使用することができる。ｔＨｃｙレベルは、野生型レベルの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０  ２１、２２、２３、２４、１５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜３０、２〜４０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜３０、３〜４０、３〜５０、４〜６、４〜１０、４〜２０、４〜３０、４〜４０、４〜５０、５〜７、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、６〜８、６〜１０、６〜２０、６〜３０、６〜４０、６〜５０、７〜１０、７〜２０、７〜３０、７〜４０、７〜５０、８〜１０、８〜２０、８〜３０、８〜４０、８〜５０、９〜１０、９〜２０、９〜３０、９〜４０、９〜５０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、３０〜４０、３０〜５０または４０〜５０倍に低減させることができる。非限定的な例として、ｔＨＣＹレベルは、野生型レベルの約３０倍に低減される。非限定的な例として、ｔＨＣＹレベルは、野生型レベルの約３〜５倍に低減される。
【００６５】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ｔＨｃｖレベルを低下させ、したがって、高いｔＨＣＹレベル（例えば、野生型レベルの５４倍超）に関連する疾患、障害および／または病態を治療し、またはそれらの効果を低減するために使用することができる。高いｔＨＣＹレベルに関連する疾患、障害および／または病態の非限定的な例としては、顔面脱毛症、骨粗鬆症、水晶体の転位、および平均生存率の低減が挙げられる。
【００６６】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、システイン補給なしでシステインレベルを正常化するために使用することができる。
【００６７】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、対象におけるホモシステインの濃度を低減させるためにベタインとの組合せで使用することができる。ホモシステインは、組合せ療法を使用して対象において約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％  ５５％、６０％、６５％、６７％、６９％、７０％、７４％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超低減させることができる。非限定的な例として、ホモシステインは、７７％低減させることができる。非限定的な例として、ホモシステインは、７６％低減させることができる。非限定的な例として、ホモシステインは、７４％低減させることができる。非限定的な例として、ホモシステインは、４０％低減させることができる。
【００６８】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、代謝産物レベルの変化、例えば、増加および／または減少を引き起こすために使用することができる。
【００６９】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、代謝産物レベルの変化、例えば、増加を引き起こすために使用することができる。非限定的な例として、代謝産物は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％  ５５％、６０％、６５％、６７％、６９％、７０％、７４％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５１０％、５２０％、５３０％、５４０％、５５０％、５６０％、５７０％、５８０％、５９０％、６００％、６１０％、６２０％、６３０％、６４０％、６５０％、６６０％、６７０％、６８０％、６９０％、７００％、７１０％、７２０％、７３０％、７４０％、７５０％、７６０％、７７０％、７８０％、７９０％、８００％、８１０％、８２０％、８３０％、８４０％、８５０％、８６０％、８７０％、８８０％、８９０％、９００％、９１０％、９２０％、９３０％、９４０％、９５０％、９６０％、９７０％、９８０％、９９０％、１０００％または１０００％超増加させることができるシスタチオニンおよびシステインであり得る。非限定的な例として、シスタチオニンの量は、０．００８μＭ超、０．０１、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、または０．３５μＭに増加させることができ、またはシスタチオニンは、０．０５〜０．３５μＭになるように増加させることができる。別の非限定的な例として、システインの量は、１４０超、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００になるように増加させることができ、またはシステインは、２００μＭ〜４００μＭになるように増加させることができる。
【００７０】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、代謝産物レベルの変化、例えば、減少を引き起こすために使用することができる。非限定的な例として、代謝産物は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５２％  ５５％、６０％、６５％、６７％、６９％、７０％、７４％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ減少させることができるホモシステイン、メチオニンおよびＳ−アデノシルホモシステインであり得る。非限定的な例として、ホモシステインの量は、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１μＭになるように減少させることができる。非限定的な例として、メチオニンの量は、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１μＭになるように減少させることができる。別の非限定的な例として、Ｓ−アデノシルホモシステインの量は、約０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９５、０．０９、０．０８５、０．０８、０．０７５、０．０７、０．０６５、０．０６、０．０５５、０．０５、０．０４５、０．０４、０．０３５、０．０３、０．０２５、０．０２、０．０１５、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、０．００１または０．００１μＭ未満になるように減少させることができる。
【００７１】
一実施形態において、本明細書に記載のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、対象におけるホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシル−メチオニンおよびＳ−アデノシル−ホモシステインのレベルを低減させるために使用することができる。
【００７２】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、対象におけるシステインおよびシスタチオニンのレベルを増加させるために使用することができる。
【００７３】
さらなる態様において、本発明は、ヒトシスタチオニンシンターゼを組換え産生し、精製する方法に関する。本方法は、ヒトＣＢＳ酵素またはそのトランケートもしくは突然変異バリアントをコードする核酸配列を発現ベクター中にクローニングするステップを含む。非限定的な例として、酵素および方法は、内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号に記載のとおりであり得、具体的には、配列番号０１、配列番号０２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６に記載のとおりであり得る。
【００７４】
投与および投薬
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、非経口投与により対象に投与することができる。
【００７５】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）注射により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、皮下投与により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、静脈内投与により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、腹腔内投与により対象に投与することができる。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、浸透圧ポンプにより対象に投与することができる。
【００７６】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、対象に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０回超投与することができる。
【００７７】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１年間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、または１８ヵ月間ごとに反復することができる。
【００７８】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、数分間、数時間、数日間または数週間空けた投与系列であり得る。投与系列の回数は、２、３、４、５または６回であり得る。非限定的な例として、対象は、２４時間空けて３回投与で投与される。別の非限定的な例として、対象は、１２時間空けて５回投与で投与される。
【００７９】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体の投与は、第１の投与系列および第２の投与系列間の間隔を有する投与系列の投薬スケジュールに従い得る。投与間の間隔は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、または１８ヵ月であり得る。投与系列の回数は、２、３、４、５または６回であり得る。非限定的な例として、対象に、５回の第１投与系列を１２時間空けて投与することができ、次いで第１投与の１４日後、対象に５回の第２投与系列を１２時間空けて投与する。別の非限定的な例として、対象に、２つの投与系列を８週間の期間にわたり投与し、第１の系列は、２週間、週２回、１回の投与であり、第２の投与系列は、６週間、週３回である。
【００８０】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、対象にベタインを投与した後に少なくとも１回投与することができる。ベタイン投与およびＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ間の時間は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１２ヵ月間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、または１８ヵ月間であり得る。非限定的な例として、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳは、対象にベタインを投与して１４日後に投与することができる。別の非限定的な例として、対象にベタインを投与した後に２回投与で対象に投与することができる。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ベタイン投与の１４および１５日後に投与することができる。
【００８１】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、ベタインとの組合せで対象に投与することができる。組合せは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回または１５回超投与することができる。
【００８２】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体は、対象が最初にベタインを受けた後にベタインとの組合せで対象に投与することができる。組合せ治療および最初のベタイン投与間の時間は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１２ヵ月間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、または１８ヵ月間であり得る。非限定的な例として、組合せは、対象に最初にベタインを投与して１４日後に投与することができる。別の非限定的な例として、対象に最初にベタインを投与した後に２回投与で対象に投与することができる。組合せは、ベタイン投与の１４および１５日後に投与することができる。
【００８３】
一実施形態において、対象に投与されるＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体の用量は、５〜８ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇであり得る。ある実施形態において、用量は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２４ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される。例えば、用量は、約２ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約２４ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態において、用量は、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される。例えば、用量は、約０．４ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、メチオニン制限食に供されている対象に投与する。あるいは、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、メチオニン制限食に供されていない対象に投与する。
【００８４】
一実施形態において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異ポリペプチドは、ＣＢＳＤＨを治療するための別の治療薬と同時投与することができる。本明細書において使用される「同時投与する」は、２つ以上の構成成分の投与を意味する。同時投与のためのこれらの構成成分としては、限定されるものではないが、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ突然変異体、ベタインまたはビタミンＢ６が挙げられる。同時投与は、同時または投与間の時間差、例えば、１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間、２０分間、２１分間、２２分間、２３分間、２４分間、２５分間、２６分間、２７分間、２８分間、２９分間、３０分間、３１分間、３２分間、３３分間、３４分間、３５分間、３６分間、３７分間、３８分間、３９分間、４０分間、４１分間、４２分間、４３分間、４４分間、４５分間、４６分間、４７分間、４８分間、４９分間、５０分間、５１分間、５２分間、５３分間、５４分間、５５分間、５６分間、５７分間、５８分間、５９分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、１．５日間、２日間または３日間超の時間差での２つ以上の構成成分の投与を指す。
【００８５】
定義
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、単一ポリマーおよび同一または異なるポリマーの２つ以上を含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤および同一または異なる賦形剤の２つ以上などを含む。
【００８６】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限および下限間のそれぞれの介在値ならびにその記述範囲内の任意の他の記述または介在値が本開示内に包含され、具体的に開示されることが意図される。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が記述される場合、１μｍ以上の値の範囲および８μｍ以下の値の範囲だけでなく、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、および７μｍも明示的に開示されることが意図される。
【００８７】
「コード配列」は、（ｉ）タンパク質のアミノ酸配列に翻訳されるｍＲＮＡ；または（ｉｉ）機能的ＲＮＡ、例えば、干渉ＲＮＡまたはアンチセンス分子をコードする核酸の部分（例えば、遺伝子）を指す。
【００８８】
「組換え体」は、例えば、細胞、核酸、ポリペプチド、発現カセットまたはベクターに関して使用される場合、新たな部分の導入もしくは既存の部分の変更により改変されており、もしくはそれらと同一であるが、合成材料から産生され、もしくはそれに由来する材料、またはその材料の天然もしくは天然形態に対応する材料を指す。例えば、組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え）含む形態内で見出されない遺伝子（すなわち、「外因性核酸」）を発現し、または他では異なるレベルにおいて発現され、典型的には、過少発現され、もしくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００８９】
組換え技術としては、例えば、発現系、例えば、発現ベクター中への挿入のためのタンパク質またはアンチセンス配列をコードする組換え核酸、例えば、ｃＤＮＡの使用を挙げることができ；得られる構築物を細胞中に導入し、細胞は、適宜、核酸、およびタンパク質を発現する。組換え技術は、融合タンパク質の発現、タンパク質の構成的発現、またはタンパク質の誘導性発現のための１つの発現カセットまたはベクター中への異なる資源からのコードまたはプロモータ配列への核酸のライゲーションも包含する。
【００９０】
用語「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ヒトが挙げられる。
【００９１】
「関連する」は、疾患、病態または表現型の発生または顕在化との一致を指す。関連は、限定されるものではないが、変更が種々の疾患および病態についての下地を提供し得るハウスキーピング機能を担う遺伝子、規定の疾患、病態または表現型に関与する経路の一部であるものおよび疾患、病態または表現型の顕在化に間接的に寄与するものに起因し得る。
【００９２】
「生理学的条件」または「生理学的溶液」は、インタクトな哺乳動物細胞中の、または生存哺乳動物の組織空間もしくは器官中の条件に実質的に類似するイオン強度、ｐＨ、および温度を有する水性環境を指す。典型的には、生理学的条件は、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５〜７．６、および約２２〜３７摂氏度の温度を有する水溶液を含む。一般に、生理学的条件は、生物学的巨大分子の分子間会合に好適な結合条件である。例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３７摂氏度の生理学的条件が一般に好適である。
【００９３】
「薬学的に許容可能な賦形剤または担体」は、場合により、本発明の組成物中に含めることができ、患者に対する顕著な有害毒性効果を引き起こさない賦形剤を指す。特に、本開示において、このようなものは、活性化合物（本明細書において、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ）と会合させて哺乳動物対象の体内に取り込むことができ、対象に対する顕著な有害毒性効果を示さない賦形剤を指す。
【００９４】
本明細書において使用される用語「賦形剤」または「ビヒクル」は、それ自体は治療剤でなく、治療剤の送達のための担体として使用され、対象、例えば、哺乳動物への投与に好適であり、または取扱もしくは貯蔵特性を改善するため、もしくは経口投与に好適な区別される製品、例えば、カプセル剤または錠剤への組成物の投与単位の形成を許容もしくは容易にするために医薬組成物に添加される任意の物質を意味する。賦形剤およびビヒクルは、非毒性であり、組成物の他の構成成分との有害的な相互作用を示さない当分野において公知の任意のそのような材料、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などを含む。投与は、経口投与、吸入、腸内投与、摂食または静脈内注射による摂取を意味し得る。賦形剤としては、標準的な医薬賦形剤を挙げることができ、ヒトおよび／または動物消費用の食料および飲料、飼料または餌配合物または他の食材を調製するために使用することができる任意の構成成分を挙げることもできる。
【００９５】
「浸透剤」、「薬物」、または「薬理学的に活性な薬剤」または任意の他の類似用語は、限定されるものではないが、（１）生物に対する予防効果を有することおよび不所望な生物学的効果を予防すること、例えば、感染の予防、（２）疾患により引き起こされる病態を軽減すること、例えば、疾患の結果として引き起こされる疼痛もしくは炎症を軽減すること、ならびに／または（３）生物から疾患を軽減、低減、もしくは完全に排除することのいずれかを例として挙げることができる所望の生物学的または薬理学的効果を誘導する当分野において既に公知の方法による、ならびに／または本開示において教示される方法による投与に好適な任意の化学または生物学的材料または化合物、例として、ペプチドを意味する。効果は局所的であり得、例えば、局所麻酔効果の提供、または全身性であり得る。本開示は、新規浸透剤に関するものでも、新たなクラスの活性剤に関するものでもない。むしろ、本開示は、技術水準に存在し、または活性剤として後に確立され得、本開示による送達に好適な薬剤または浸透剤の送達の方式に限定される。
【００９６】
用語「約」は、特に、所与の量に関して、５パーセントの範囲のずれを包含することを意味する。
「任意選択」または「場合により」は、続いて記載される状況が、存在してもしなくてもよく、生じても生じなくてもよく、その結果、記載がその状況が存在し、または生じる場合およびその状況が存在もせず、生じもしない場合を含むことを意味する。
【００９７】
ある特徴部または実体の「実質的に不存在」または「実質的に有さない」は、特徴部または実体のほぼ完全にまたは完全に不存在であることを意味する。例えば、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳが投与された対象について、観察可能な副作用の実質的な不存在は、このような副作用が検出不能であり、または無視可能な程度、例えば、未治療患者において観察される同一の副作用の頻度または強度のいずれかと比較して約５０％以上だけ低減する程度または頻度でのみ生じることを意味する。
【００９８】
本組成物に関する用語「薬理学的有効量」または「治療有効量」は、治療すべき対象における血流中または作用部位（例えば、細胞内）における所望レベルを提供するため、および／または所望の生理学的、生物物理学的、生化学的、薬理学的または治療応答、例えば、ホモシスチン尿症の顕在化の改善を提供するための活性剤（または活性剤を含有する組成物）の非毒性であるが十分な量を指す。要求される正確な量は対象ごとに変動し、多数の因子、例えば、活性剤、組成物の活性、用いられる送達デバイス、組成物の物理的特徴、意図される患者使用（すなわち、１日当たりの投与用量の回数）、ならびに患者の検討事項、例えば、対象の種、年齢、および全身状態、治療される病態の重症度、対象により摂取される追加の薬物、投与方式などに依存する。これらの因子および検討事項は、本明細書において提供される情報に基づき当業者により容易に決定することができる。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、本明細書において提供される情報に基づき定型的な実験を使用して当業者により決定することができる。
【００９９】
用語「生物学的活性」は、当業者により典型的に核酸またはタンパク質に帰属される任意の生物学的活性を指す。生物学的活性の例は、酵素活性、二量体化、フォールドまたは別のタンパク質もしくは核酸分子に結合する能力などである。
【０１００】
用語「核酸」は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、それとしては、メッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス、相補）鎖であり得る。
【０１０１】
本明細書において使用される「バリアント」は、公的配列データベース、例えば、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）における配列により例示される野生型核酸またはアミノ酸配列と同一でないが、その全長にわたり顕著な相同性（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有する核酸、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書において使用される「タンパク質、ポリペプチドまたはそれらのペプチド断片」は、全長タンパク質または通常、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するその一部を意味するが、ジペプチド、トリペプチドおよびテトラペプチドも本開示により企図および包含される。
【０１０２】
本明細書において使用される「突然変異体」は、グリコシル化、タンパク質安定化および／またはリガンド結合に関する特性または機能を変更するように設計または遺伝子操作される突然変異タンパク質である。
【０１０３】
所与の細胞、ポリペプチド、核酸、形質または表現型に関する本明細書において使用される用語「天然」または「野生型」は、天然において典型的に見出される形態を指す。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、それらの慣習的な意味を有し、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合により共有結合している少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために互換的に使用される。さらに、本明細書に記載のポリペプチドは規定の長さに限定されない。この定義内に、Ｄ−およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物が含まれる。この用語はまた、天然存在および非天然存在の両方のポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当分野において公知の他の修飾を指さず、排除もしない。ポリペプチドは、タンパク質全体、またはその下位配列であり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、免疫応答を誘発し得るエピトープ、すなわち、抗原決定基を含むアミノ酸下位配列も指し得る。
【０１０４】
「に対応する位置」は、別の参照核酸分子またはタンパク質中の位置に対する核酸分子またはタンパク質中の目的の位置（すなわち、塩基番号または残基番号）を指す。対応する位置は、例えば、配列間の同一性が９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超になるように、配列を比較およびアラインしてマッチするヌクレオチドまたは残基の数を最大化することにより決定することができる。次いで、目的の位置に、参照核酸分子において割り当てられる番号を付与する。例えば、遺伝子Ｘの特定の多型が配列番号Ｘのヌクレオチド２０７３において生じる場合、別のアレルまたは単離株中の対応するヌクレオチドを同定するため、配列をアラインし、次いで２０７３と一致する位置を同定する。種々のアレルが異なる長さであり得るため、２０７３と命名される位置は、ヌクレオチド２０７３であるとは限らないが、その代わり、参照配列中の位置に「対応する」位置である。
【０１０５】
「配列同一性の割合」および「相同性の割合」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較を指すために本明細書において互換的に使用され、２つの最適にアラインされた配列を比較窓にわたり比較することにより決定され、比較窓中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、マッチ位置の数を比較窓中の位置の総数により割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算することができる。あるいは、割合は、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列中で生じ、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いてアラインされる位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、マッチ位置の数を比較窓中の位置の総数により割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認識する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）著、アドバンシズ・イン・アプライド・マスマティクス（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．）、第２巻、ｐ．４８２、１９８１年のローカルホモロジーアルゴリズムにより、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第４８巻、４４３、１９７０年のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８５巻、ｐ．２４４４、１９８８年の類似性検索方法により、それらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視調査（一般に、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．オースベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、カレント・プロトコルズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ有限会社（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）およびジョン・ウィリー・アンド・サンズ有限会社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）のジョイントベンチャー（１９９５年、補遺）（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ））参照）により実施することができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・モ���キュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３〜４１０およびアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９７７年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、ｐ．３３８９〜３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターのウェブサイトを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同一長さのワードとアラインした場合にある程度の正の値の閾値スコアＴにマッチし、またはそれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、上記を参照）。これらの最初の隣接ワードヒットはそれらを含有する、より長いＨＳＰを見出す探索を開始するための「シード」として作用する。次いで、累積的アラインメントスコアを増加させることができる限り、それぞれの配列に沿って両方向へ文字ヒットを延長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基対のためのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基のためのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを使用する。ワードヒットのそれぞれの方向への延長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少した場合；１以上の負のスコアの残基のアラインメントの蓄積に起因してその累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列が終わりに達した場合に停止する。ブラスト（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ブラストＮ（ＢＬＡＳＴＮ）プログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ブラストＰ（ＢＬＡＳＴＰ）プログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３および期待値（Ｅ）１０、ならびにブロサム６２（ＢＬＯＳＵＭ６２）スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８９巻、ｐ．１０９１５、１９８９年を参照）を使用する。
【０１０６】
上記アルゴリズムおよびプログラムの全てが配列アラインメントおよび％配列同一性の決定に好適である一方、本明細書における開示の目的のため、％配列同一性の決定は、典型的には、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ）中のベストフィット（ＢＥＳＴＦＩＴ）またはギャップ（ＧＡＰ）プログラム（アクセルリス（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、マディソン、ウィスコンシン）を使用して、提供されるデフォルトパラメータを使用して実施する。
【０１０７】
用語「ＮＨ２末端修飾」は、本明細書に記載のペプチドを指すために使用することができる。アミノ酸末端に対応する本発明のペプチド化合物の末端は、存在する場合、「フリー」形態（例えば、Ｈ２Ｎ−）であり得、あるいは、式Ｒ２Ｃ（Ｏ）−またはＲ２Ｓ（Ｏ）２−（式中、Ｒ２は、既に定義のとおりである）の基によりアシル化されていてよい。一実施形態において、Ｒ２は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ５〜Ｃ１０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ１６）アリールアルキル、５〜１０員ヘテロアリールまたは６〜１６員ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される。
【０１０８】
別の実施形態において、アミノ末端は、化合物に規定の特性、例えば、低い抗原性を付与するように設計されるブロッキング基により「ブロック」されていてよい。このようなブロッキング基の非限定的な例としては、ポリアルキレンオキシドポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。化合物、特にペプチドおよびタンパク質に規定の特性を付与するために有用な種々のポリマーは当分野において公知であり、それらはそのようなポリマーを化合物に付着させるために好適な化学物質である。具体的な非限定的な例は、開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６４３，５７５号明細書；同第５，７３０，９９０号明細書；同第５，９０２，５８８号明細書；同第５，９１９，４５５号明細書；同第６，１１３，９０６号明細書；同第６，１５３，６５５号明細書；および同第６，１７７，０８７号明細書に見出すことができる。
【０１０９】
用語「カルボキシ末端修飾」は、本明細書に記載のペプチドに関連して使用することができる。Ｃ末端に対応するペプチド化合物の末端は、存在する場合、非誘導体化カルボキシル基の形態であり得、それは遊離酸として、もしくは塩、例えば、ナトリウム、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩もしくは無機もしくは有機イオンの他の塩としてのいずれかであり、または誘導体化カルボキシル、例えば、エステル、チオエステルもしくはアミドの形態であり得る。このような化合物の誘導体化形態は、カルボキシル末端を有する化合物を適切なアルコール、チオールまたはアミンと反応させることにより調製することができる。好適なアルコール、チオールまたはアミンとしては、例として、限定されるものではないが、式Ｒ２ＯＨのアルコール、式Ｒ２ＳＨのチオールおよび式Ｒ２ＮＨ２、Ｒ２Ｒ２ＮＨまたはＮＨ３のアミンが挙げられ、それぞれのＲ２は、他のものと独立して、既に定義のとおりである。
【０１１０】
用語「ＬまたはＤ型アミノ酸」は、本明細書に記載のペプチドに関連して使用することができる。当業者により認識されるとおり、本発明の化合物を構成する種々のＸｎ残基は、それらのＣα炭素についてのＬ−またはＤ−立体配座のいずれかであり得る。一実施形態において、特定の化合物のＣα炭素の全ては、同一の立体配座である。本発明の一部の実施形態において、化合物は、１つ以上のＣα炭素についての規定のキラリティを含み、および／または化合物に規定の特性を付与するように規定の位置における非ペプチド結合を含む。例えば、全部または一部がＤ−アミノ酸により構成されるペプチドがそれらの対応するＬ−ペプチド相当物よりもプロテアーゼに耐性であることは周知である。したがって、一実施形態において、化合物は、全部または一部がＤ−アミノ酸により構成されるペプチドである。あるいは、プロテアーゼに対する良好な安定性を有する化合物としては、規定の位置における逆極性のペプチド結合を含むペプチドアナログを挙げることができる。例えば、トリプシン様プロテアーゼに対する安定性を有する化合物としては、それぞれのＬ−ＡｒｇまたはＬ−Ｌｙｓ残基前の逆極性のペプチド結合を有するペプチドアナログが挙げられ；キモトリプシン様プロテアーゼに対する安定性を有する化合物としては、それぞれの小および中サイズのＬ−脂肪族残基またはＬ−非極性残基前の逆極性のペプチド結合を有するペプチドアナログが挙げられる。別の実施形態において、プロテアーゼに対する安定性を有する化合物としては、全部が逆極性のペプチド結合から構成されるペプチドアナログが挙げられる。プロテアーゼに対する安定性を有する他の実施形態は、当業者に明らかである。化合物の追加の具体的な実施形態は、本明細書において記載される。
【０１１１】
本明細書において使用される用語「長期投与」は、６週間以上の期間にわたるＰＥＧ部分にコンジュゲートしているＣＢＳ酵素、ｈｔＣＢＳ、またはｈｔＣＢＳ突然変異体（例えば、Ｃ１５Ｓ突然変異を有する）の投与を指す。
【０１１２】
本明細書において使用される用語「連続投与」は、ＳＣ注射または移植浸透圧ポンプを介する試験過程全体にわたるＰＥＧ部分にコンジュゲートしているＣＢＳ酵素、ｈｔＣＢＳ、またはｈｔＣＢＳ突然変異体（例えば、Ｃ１５Ｓ突然変異を有する）の反復投与を指す。
【０１１３】
本明細書において使用される用語「Ｉ２７８Ｔ」、「Ｉ２７８Ｔホモ接合性」、または「Ｉ２７８Ｔ−／−ホモ接合性」マウスは、内因性マウスｃｂｓ遺伝子がノックアウトされており、ホモシスチン尿症に関連するＣＢＳアレル中の最も一般的な突然変異８３３Ｔ＞Ｃ（Ｉ２７８Ｔ）を有するヒトＣＢＳトランス遺伝子がｃＤＮＡクローンとしてマウスゲノムに統合されたプラスミド上に亜鉛誘導性プロモータの制御下で挿入されたマウスモデルを指す。
【０１１４】
（実施例）
以下の実施例は、事実上説明的なものであり、決して限定的なものではない。
実施例１．実験手順
Ａ．ＰＥＴ２９Ａ（＋）ベクター中の配列最適化トランケートヒトＣＢＳの構築
開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号において既に記載のとおり、細菌発現について全長（５５１ａａ）ヒトＣＢＳコード配列を最適化し、ジェンスクリプト米国有限会社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ）（ニュージャージ、米国）によるＥｃｏＲＶ制限酵素により消化した後のｐＵＣ５７ベクター中にクローニングした。次いで、プライマーＡ１およびＡ２を使用するＰＣＲによりＣＢＳ配列を増幅させてトランケート酵素（ａａ１〜４１３）をコードする配列を生成した。次いで、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩによりＰＣＲ産物を消化し、同一酵素により消化されたｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター中にライゲートした。ｐＥＴ−２８ａ（＋）の最適なＮｃｏＩ部位中へのクローニングは、ＣＢＳ野生型配列と比較してＧからＣへの突然変異をもたらす。プライマーＢ１およびＢ２を利用する部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア、米国）を使用して野生型配列（ｈｔＣＢＳ）を再生成した。プライマーＣ１およびＣ２を使用することにより同一方針を使用してＣ１５Ｓ突然変異体（ＴからＡへの突然変異；ヒトＣＢＳＣ１５）を生成した。シーケンシングにより全ての配列を確認した。ＤＥ３細菌中への形質転換およびＩＰＴＧによる誘導を要求するｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター中の上流Ｔ７プロモータにより、トランケートＣＢＳの発現を制御する。表１は、プライマーおよびそれらの配列識別子を記載する。
【０１１５】
【表１】
2018532763.tif 000003
【０１１６】
Ｂ．発現および精製
ＤＥ３細菌、すなわち、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中に、トランケートヒトＣＢＳをコードする配列を保有するｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターを形質転換し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを有する５ｍｌのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中で、回転シェーカ上で２７５ＲＰＭにおいて３７℃においてカナマイシン耐性クローンからの細菌を一晩増殖させた。３０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを有する１００ｍｌのテリフィックブロス（ＴＢ）培地に１ｍｌの一晩培養物を添加し、一晩増殖させた。次いで、０．００１％のチアミン−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．００２５％のピリドキシン−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．３ｍＭのδ−ＡＬＡ  ｐＨ８．０、１５０μＭの塩化鉄、３０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１リットルのＴＢ培地に、その１０ｍｌを添加した。次いで、ＯＤ６００が約０．６〜０．７の値に達するまで３０℃において回転シェーカ上で２７５ＲＰＭにおいて培養物を増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導した。さらに１６時間、発酵を継続した。４℃における１０分間の６０００ＲＣＦ遠心分離により細胞を回収し、氷冷０．９％のＮａＣｌにより洗浄し、上記のとおり再遠心分離し、−８０℃において冷凍した。次いで、細胞ペレットに、１グラムのペレット当たり４．４５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭのＰＬＰ）を添加し、ダウンス型ホモジナイザ中でそれをホモジナイズし、リゾチーム（最終２ｍｇ／ｍｌ）により処理し、ロッキングプラットフォーム上で４℃において１時間インキュベートし、超音波処理して粘度を低減させ、５３０００ＲＣＦにおいて遠心分離した。次いで、−８０℃において可溶性分画を含む上清を貯蔵した。多段階クロマトグラフィー手順を介して溶解物をプロセシングした。コアプロセスは、アニオン性交換捕捉カラム（ＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）−ＦＦ）と、それに続く親和性カラムからなる。これは、約９０％の純度を達成する。１または２つのポリッシングクロマトグラフィーステップの使用により、＞９９％の最終純度が達成される。最終カラム溶出物は、ＰＢＳ中に透析した。
【０１１７】
Ｃ．酵素活性アッセイ
基質としてのＣ１４標識セリンを用いる放射性同位体アッセイにより、ＣＢＳ活性を測定した。０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．６、１０ｍＭのＬ−セリン、０．５ｍＭのＰＬＰ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび０．３μＣｉ（純粋酵素用）または０．４５μＣｉ（血漿用）のＬ−［Ｃ１４（Ｕ）］−セリンを含有する８５μｌの反応混合物に、希釈緩衝液（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．６、１ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＰＬＰ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中の１０μｌ（合計４９０ｎｇ）の純粋ｈｔＣＢＳまたは１０μｌの血漿を、添加した。３７℃において５分間、試料をインキュベートし、５μｌの０．２ＭのＨｃｙ（最終濃度１０ｍＭ）の添加により反応を開始させた。３７℃におけるインキュベーションの３０分後、グレード３ＣＨＲワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）（ニュージャージ、米国）紙上にアッセイ混合物の２０μｌのアリコートをアプライした。それぞれの反応時間が３０分間になるようにアッセイ開始および得られた混合物のサンプリングを調整した。下降ペーパークロマトグラフィを使用して標識基質（Ｓｅｒ）から放射性産物（Ｃｔｈ）を単離した。２−プロパノール／ギ酸／Ｈ２Ｏ（７５：５．７：１８．９  ｖ／ｖ）中の一晩の下降ペーパークロマトグラフィにより、Ｃ１４−セリンから、この反応から形成されたＣ１４−シスタチオニンを分離した。５ｍｌのオプティ−フルオル（Ｏｐｔｉ−ｆｌｕｏｒ）シンチレーションカクテル（パーキンエルマ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、マサチューセッツ、米国）中に浸したストリップにクロマトグラムを切断し、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＬＳ−３８０１シンチレーションカウンタでカウントすることにより、マーカシスタチオニンの区域中の放射能（マーカレーンをニンヒドリンにより染色することにより検出される）を測定した。ブランクとして酵素不含試料を使用してバックグラウンド放射能をモニタリングし、次いでそれぞれの試料から差し引いた。純粋な酵素について、比活性値はＣＢＳ１ｍｇ当たりの酵素単位（１μｍｏｌのシスタチオニン／時間を産生する酵素の量）として表現し、血漿試料について、血漿１μｌ当たりの単位として表現する。薬物動態（ＰＫ）試験において、これはｍＵ／μｌ血漿と命名された。
【０１１８】
Ｄ．ゲル内活性アッセイ
ネイティブＰａｇｅ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア、米国）を使用してタンパク質試料を分離した。次いで、染色溶液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ＝８、２０ｍＭのＬ−システイン、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＰＬＰおよび０．２の硝酸鉛）中で１５〜３０分間、ゲルをインキュベートした。７％の酢酸中でゲルを浸すことにより反応を停止させた。
【０１１９】
Ｅ．代謝産物濃度の測定
（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら著、１９９３年、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、第４２巻、ｐ．１４４８〜１４６０）に既に記載のとおり安定同位体希釈液体クロマトグラフィー質量分析により、血漿代謝産物ホモシステイン、シスタチオニンおよびシステインを測定した。（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１０年ｂ、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、第１０１巻、ｐ．１５３〜１６２）に記載のとおり、合計の非タンパク質結合ホモシステインおよび他のアミノチオールの、ならびに組織中のアミノ酸の計測を実施した。安定同位体希釈液体クロマトグラフィー質量分析により代謝産物を測定した。
【０１２０】
Ｆ．ＰＥＧ化
ＮＯＦコーポレーション（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（東京、日本）からポリエチレングリコール分子を購入した。製造業者の説明書に従ってＰＥＧ化を実施した。例えば、ｈｔＣＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）のＳＨ基へのＰＥＧマレイミド誘導体のカップリングは、１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ＝６．５中で４℃において一晩実施した。ＰＥＧ分子およびＣＢＳタンパク質間のモル比は、１０：１または５：１であった。
【０１２１】
あるいは、ＰＥＧ化は、２０ｋＤａ  ＮＨＳ−エステルＰＥＧ（ＭＥ−２００ＧＳ）と、ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ突然変異を有するトランケートヒトＣＢＳ）とのコンジュゲーションにより達成した。以下のプロトコルはＰＥＧ化手順を概略する。
【０１２２】
クロマトグラフィーにより精製されたｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを緩衝液交換し、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２中で配合し、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。−８０℃において酵素アリコートを貯蔵し、時折混合しながら３７／４２℃の水浴中で解凍した。酵素アリコートをスピンダウンして生成泡状物を除去し（存在する場合）、必要とされるまで氷上で保持した。
【０１２３】
ＰＥＧ化モル比は１：１０（ｈｔＣＢＳＣ１５Ｓサブユニット当たり）であり、それは１００ｍｇのｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ当たり４３１ｍｇのＭＥ−２００ＧＳになる。無菌エンドトキシンフリーの５０ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブ中で計算量のタンパク質、水、および２×緩衝液（酵素の濃度が１０ｍｇ／ｍｌよりも高い場合にのみ必要とされる）を混合した。例えば、２０ｍｇ／ｍｌの２００ｍｇのｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、１０ｍｌのタンパク質、１２ｍｌの滅菌水、および１０ｍｌの１００ｍＭのＮａ−Ｐ  ｐＨ７．２緩衝液を要求した。チューブは３２ｍｌの総容量を含有し、それを氷上で保持した。別個のチューブ中で、混合、ボルテックス、または短時間の３７／４２℃の水浴中の任意選択の加温により滅菌水またはＤＭＳＯ中で８６２ｍｇのＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧを溶解させた。ＰＥＧは急速に溶解し、澄明で高粘度溶液になった。溶解ＰＥＧを含有するチューブ中に、注入またはピペッティングのいずれかにより希釈酵素を素早く移した。チューブを強く密封し、直ちにボルテックスに１０〜１５秒間供して均一混合物を生成した。室温においてロッキングプラットフォーム上で４〜６時間、または４℃において一晩、チューブをインキュベートした。
【０１２４】
Ｇ．酵素貯蔵
ＰＢＳ  ｐＨ７．４を使用してＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを配合し、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、典型的には、１０〜２５ｍｇ／ｍｌ濃度に濃縮した。−８０℃において（１．２ｍｌ）アリコート中で酵素を貯蔵した。それぞれの投薬日について、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度へのＰＢＳ中への希釈により使い捨て新鮮酵素溶液を調製した。投薬の消費時に残留するいかなる溶液も廃棄した。
【０１２５】
Ｈ．動物手順
全ての動物手順は、ＡＡＡＬＡＣ認可（番号００２３５）、公衆衛生局保証（番号Ａ３２６９−０１）およびＵＳＤＡライセンス許諾（番号８４−Ｒ−００５９）機関であるコロラド大学デンバー校ＩＡＣＵＣにより承認された。ジャクソン・ラボラトリ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（メイン、米国）からＣ５７６ＢＬ／６ＪおよびＣＢＳノックアウト（ＫＯ）マウスを入手した。実験室内で事前にヒューマンオンリ（ＨＯ）マウスを生成した（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１０年ｂ、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、第１０１巻、ｐ．１５３〜１６２）。押出成形標準食２９１８（ハーラン（Ｈａｒｌａｎ）、カリフォルニア、米国）に供して動物を維持し、食料および水へのアクセスは無制限とした。
【０１２６】
ホモ接合性について代表的な仔マウスを定型的に分析した。ゲルを有するキャピジェクト（Ｃａｐｉｊｅｃｔ）Ｔ−ＭＬＨＧリチウムヘパリン（１２．５ＩＵ）チューブ（テルモ・メヂィカル・コーポレーション（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージ、米国）中への血液回収に、顎下腺採血用の使い捨てランセットを使用した。次いで、１２００Ｇにおいて１０分間、チューブを遠心分離し、次いで１．５ｍｌチューブに血漿を回収し、−８０℃において貯蔵した。
【０１２７】
ゲノタイピング：ホモ接合性ｑＰＣＲにより代表的な仔マウスを定型的に分析した。ＤＮイージー血液組織キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ヒルデン、独国）により尾生検物を生成した。ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）１０００（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、デラウェア、米国）によりＤＮＡ品質をモニタリングした。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ）（カリフォルニア、米国）遺伝子発現マスターミックス（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ）（品目番号４３６９０１６）を使用してトリプリケートでシングルプレックスでＤＮＡの２０ｎｇの試料をランさせた。標準曲線法を使用してアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ）７５００ファスト・インスツルメント（Ｆａｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）上で増幅を実施した。ホモ接合性１コピーキャリブレータとしてアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’）Ｔｅｒｔ（品目番号４４５８３６６）またはＴｆｒｃ（品目番号４４５８３６８）コピー数参照アッセイを使用した。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ）アッセイＭｒ００２９９３００を使用してＮｅｏ遺伝子を検出した。
【０１２８】
ゲージ内で野生型スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットを収容し、標準的条件下で維持し、食料および水へのアクセスを無制限とした。
野生型カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を６つに区切られたペン中で収容し、食料および水へのアクセスを無制限とした。１２時間の明／暗サイクル、温度、および湿度を連続的にモニタリングし、制御した。野生の聴覚バックグラウンド音声および充実した可視的自然映像の両方の形態が充実した追加の環境を毎日提供した。試験前に全てのサルを全身健康についてスクリーニングした。
【０１２９】
Ｉ．試料回収
ｈｔＣＢＳのＰＥＧ化形態、例えば、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの注射後、種々の時点においてゲルを有するキャピジェクト（Ｃａｐｉｊｅｃｔ）Ｔ−ＭＬＨＧリチウムヘパリンチューブ（１２．５ＩＵ）（テルモ・メディカル・コーポレーション（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージ、米国）中に、顎下腺サンプリング用に設計された使い捨てランセットを使用して有意識下の試験動物の顎下腺静脈から血液を回収した。１２００Ｇにおける１０分間の遠心分離後に血液試料から血漿を回収し、−８０℃において１．５ｍＬチューブ中で貯蔵した。
【０１３０】
Ｊ．薬物動態
血中の酵素の経時的変化の間に生じる吸収、分布および排泄期に対応する一連の指数項に曲線を分解する非コンパートメント曲線ストリッピングモデルを使用して薬物動態（ＰＫ）パラメータを計算した。曲線ストリッピングアプローチは、薬物の堆積期が見かけの一次キネティクスに従うことを想定し、それは片対数プロットの末端部における線形性により証明される。これらの計算は、それぞれの投与経路についての平均血漿酵素活性を使用してＰＫソリューションズ（ＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）２．０（サミット・ソリューションズ（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、モントローズ、コロラド）と呼ばれるモデリングプログラムを使用して行った。ＳＣまたはＩＰ経路についての曲線下面積（ＡＵＣ）をＩＶ投与後に観察されたＡＵＣにより割ることによりバイオアベイラビリティを計算した。
【０１３１】
Ｋ．ＮＨＳ  ＰＥＧ化マッピングのための試料の調製
ＨＰＬＣ水（サーモフィッシャ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））によりそれぞれの試料（３００μｇ）を、非ＰＥＧ化ＣＢＳ対照を含め、８０μＬに希釈した。次いで、０．２４ＭのＣＡＰＳ緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））ｐＨ１１．５により試料を１：１（ｖ／ｖ）で混合し、３７℃において２２時間インキュベートしてＰＥＧを除去した。アミコン超３０Ｋ遠心フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に脱ＰＥＧ化試料を移し、３２０μＬの８ＭのグアニジンＨＣＩ溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加した。フィルタを１３，０００ｒｐｍにおいて１０分間スピンした。このプロセスを２回繰り返して試料を８ＭのグアニジンＨＣｌ中に緩衝液交換し、残留遊離ＰＥＧを除去した。
【０１３２】
１ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）と試料を合わせて１００ｍＭのトリスの最終濃度にした。１０ｍＭのＤＴＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））により５６℃において４５分間、試料を還元し、冷却した。ヨードアセトアミドを３０ｍＭの最終濃度まで添加し、暗所で室温において１時間、試料をインキュベートした。次いで、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）溶液により試料を希釈して１Ｍのグアニジン濃度に到達させた。エンドペプチダーゼ消化に還元／アルキル化試料Ａｓｐ−Ｎを使用した。
【０１３３】
１００μｇの還元およびアルキル化試料に２μｇのＡｓｐ−Ｎを添加した（酵素：タンパク質比＝１：５０（ｗ：ｗ））。３７℃において一晩、消化を実施した。
Ｌ．組織病理学的分析のための試料の調製
１７〜１９日目、ＰＢＳ注射またはＰＥＧ化ｈｔＣＢＳコンジュゲート、例えば、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスを屠殺し、光学顕微鏡検査による組織学的分析のために肝細胞を加工した。組織学的評価は盲検様式で実施した。肝臓を摘出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒドにより２４時間固定した。組織学的観察のための組織ブロックをトリミングし、エタノール系、次いでアセトン、アセトン−キシレン混合物、およびキシレンにより脱水し、次いでパラフィン中で包埋した。並行して、非極性脂質の検出のため、ドライアイスにより冷却した石油エーテル中で、パラホルムアルデヒドにより固定された小組織ブロック（約４ｍｍ×２ｍｍ）を急速凍結させ、−５０℃において貯蔵した。キシレン中で４μｍ厚のパラフィン切片を脱パラフィン化し、イソプロピルアルコールステップ後にエタノール（９６％、７０％、６０％）により再水和した。ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）により組織切片を染色して組織病理学的変化を評価した。線維症の検出のためにマッソントリクローム染色を実施した。脂肪症は、１０μｍ厚であり、ライカ・クライオミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）（ＣＭ１８５０）により切断された固定凍結切片中の非極性脂質の検出のためのオイルレッドＯ染色を使用して確認した。オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）デジタルカメラ（ＤＰ７０）を備えるニコン（Ｎｉｋｏｎ）光学顕微鏡（Ｅ８００）により、切片を視認し、撮影した。
【０１３４】
電子顕微鏡観察のため、肝臓のそれぞれの３分の１を１〜２ｍｍ厚のスライスに切断することにより電子顕微鏡観察のために加工し、後固定で３％のグルタルアルデヒド中に浸漬させた。続いて、エポン−アラルダイト混合物中に試料を包埋し、二重染色し、ＪＥＯＬ１２００電子顕微鏡を３０００倍の倍率において使用して試験した。
【０１３５】
Ｍ．二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）
ＤＥＸＡ分析に、小動物、例えば、マウスの走査のために具体的に設計されたＰＩＸＩｍｕｓＩＩ  ＤＥＸＡスキャナ（ＧＥルナ・メディカル・システムズ（ＧＥ  Ｌｕｎａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））を使用した。この装置により、末端組織抽出手順前のマウスの体組成（除脂肪量、脂肪量および骨密度）の迅速で効率的な測定が可能となった。ＤＥＸＡ計測の４時間前にマウスを絶食させて胃腸管から食料を除去した。次いで、６０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１５ｍｇ／ｋｇのキシラジンのＩＰボーラス注射を使用してマウスを麻酔し、ＤＥＸＡ装置中のトレイ上に配置した。計測を行った後（３〜５分間）、ＤＥＸＡ装置からマウスを取り出し、最終手順、例えば、組織抽出において使用した。
【０１３６】
Ｎ．顕微鏡観察による観察のための眼球試料の調製
１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（４％のＰＦＡ）中の４％のパラホルムアルデヒドによりマウスを灌流固定に供して眼球壁を保存した。眼球を手術により慎重に摘出し、４％のＰＦＡ中に浸し、眼球後部中で視神経直下で小さい穴を慎重に作製して４℃において一晩、固定剤が眼球の内部に浸透し、構造を固定するのを可能とした。濾過１×ＰＢＳｐＨ７．４を使用して試料を３回洗浄した。洗浄後、眼球後部を毛様体上皮の位置まで慎重に切除して毛様体小帯を露出させた。８％のＢＳＡブロッキング溶液中で振とうさせながら２時間、試料を配置した。ブロッキング後、試料に４％のＢＳＡ中で１：５０希釈されたＭＡＧＰ１抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加し、４℃において一晩貯蔵した。翌日、１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４を使用して試料を６回洗浄し、試料にアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８二次抗体（１：２００、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加し、室温において浸とうさせながら２時間インキュベートした。試料を６回洗浄し、メチルグリーン（核染色）により１５分間対比染色した。
【０１３７】
４％のアガロースを含有する溶液を加熱し、カバースリップガラス入りのペトリ皿中に注ぎ、室温において凝固させておいた。凝固ゲルは、眼球のためのイメージングチャンバとして機能した。ゲル中で小さな穴を作製し、それは眼球のための堅牢なチャンバとして機能した。毛様体小帯を観察するため、チャンバを１×ＰＢＳにより満たし、穴中に染色眼球試料を配置し、水晶体の後面をゲル床に接触させた。倒立ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を１０倍の倍率および０．７倍の拡大率において使用して３次元画像を生成した。
【０１３８】
実施例２．ｈｔＣＢＳ保持時間
Ａ．非修飾ｈｔＣＢＳは循環中の短い保持時間を示す
循環に投与される薬理学的活性物質の薬物動態特性は、ＡＤＭＥの天然機序により大きく影響を受ける。注射分子の急速なクリアランスは、治療効力に大きく影響し得、したがって、より長い循環半減期が望まれ、それは順次、副作用を最小化するより低頻度の投与またはより小用量につながり得る。血漿循環中のｈｔＣＢＳの薬物動態を測定するため、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）経路を介してＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５ｍｇ／ｋｇの単回用量を注射した。ＩＶまたはＩＰ経路を介するｈｔＣＢＳの投与は、注射の最初の４時間後の間に最大比活性値を示した（それぞれ最大１２３および７６ｍＵ／μＬの観察ピーク血漿レベル；表２は、曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す）。血漿試料から計算された薬物動態パラメータ（表２）は、ｈｔＣＢＳについての半減期が２．７時間であったことを示し、ほぼ６つの半減期後（２０時間未満）にｈｔＣＢＳレベルが検出不能であるはずであることを示唆する。
【０１３９】
ｈｔＣＢＳのバイオアベイラビリティはＳＣ経路について５０％であり、ＳＣ送達がこの治療アプローチについての臨床オプションであり得ることを示唆した。ＳＣおよびＩＰについてのより低速な見かけの半減期（表２）は、排泄期の間に生じている低速な吸収期により説明することができ、それにより平均滞留時間および見かけの半減期が拡張されるが、本発明の目的のため、かなり長い半減期が望まれ、したがってｈｔＣＢＳのＰＥＧ化誘導体を試験した。
【０１４０】
【表２】
2018532763.tif 000004
【０１４１】
インビボでのｈｔＣＢＳ活性の急速な降下は循環からのクリアランスの促進が原因であり得、循環中の環境への導入時のｈｔＣＢＳの酵素活性の損失も原因であり得る。この損失を試験するため、インビトロで野生型またはＨＯマウスのマウス血漿中で３７℃において９６時間までｈｔＣＢＳをインキュベートし、２４時間ごとに活性を計測した。図１Ａにおいて示されるとおり、活性の有意な損失は、いずれのマウスモデルの血漿においても７２時間のインキュベーションまで記録されなかった。活性の２５％の小幅損失がインキュベーションの９６時間後に記録された。さらに、図１Ｂに示されるとおり、ＳＣ注射動物からの血漿のウエスタンブロット（ＷＢ）分析により、ｈｔＣＢＳの量が時間に応じて減少し、したがってクリアランスが血漿中の活性の損失ではなく循環中のｈｔＣＢＳ活性の急速損失の原因であることが明らかになった。
【０１４２】
Ｂ．ｈｔＣＢＳのＰＥＧ化はインビボ血漿半減期を向上させる
ＣＢＳの薬物動態に対するＰＥＧ分子の影響を決定するため、低分子量（２ｋＤａ）直鎖ＰＥＧにより、ならびに高分子量（４０ｋＤａ）４アーム分枝鎖ＰＥＧ（それぞれＭＥ０２０ＭＡおよびＧＬ４−４００ＭＡと命名）によりｈｔＣＢＳをＰＥＧ化した。表３に示されるとおり、ＰＥＧ化は酵素の比活性に影響を及ぼさなかった。表３は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、対応する比活性値は、ＰＥＧ化が酵素の活性に影響を与えないことを示す。マウスにＡに記載のとおりＳＣ注射し（ｎ＝４〜５）、ＭＥ２００ＭＡ−またはＧＬ４−４００ＭＡ−ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳを非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳと比較した。
【０１４３】
【表３】
2018532763.tif 000005
【０１４４】
ＳＣおよびＩＶ経路を介してＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ（ＰＥＧｈｔＣＢＳ）の５ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量を投与し、異なる時点においてＣＢＳ活性をモニタリングした。それぞれの注射経路について２つの実験群（それぞれｎ＝５）を使用した。第１群から０、１、８および２４時間において、ならびに第２群から１、４、１０、４８時間において注射後に血液を回収した。
【０１４５】
ＧＬ４−４００ＭＡ  ＰＥＧｈｔＣＢＳについて図１Ｂ（下段パネル）に示されるとおり、血漿中の活性はＰＥＧ化タンパク質について非ＰＥＧ化相当物と比較して有意に拡張された。表４に示されるとおり、半減期は、非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳについての２．７時間から、ＭＥ０２０ＭＡおよびＧＬ４−４００ＭＡ  ＰＥＧ化についての１６．７および３０．４時間にそれぞれ増加した。
【０１４６】
【表４】
2018532763.tif 000006
【０１４７】
これは、ＰＥＧ化形態について単回投与後の曝露時間が５〜１０倍長いことを意味する。さらに、ＳＣ投与後のバイオアベイラビリティは５０〜８０％に及び、ＳＣ経路が臨床試験に妥当であることを示唆した。
【０１４８】
実施例３．ｈｔＣＢＳの投与ならびにホモシステイン、シスタチオニンおよびシステインの血清レベル。
ＣＢＳＤＨのためのｈｔＣＢＳの使用の最終目的は、毒性ｔＨｃｙ負荷を低下させること、シスタチオニンおよびシステインレベルを上昇させることである。これらの変化は、ＣＢＳＤＨ症状の発症を予防、回復または遅延させることが予期される。しかしながら、ホモシスチン尿症研究は、長きにわたり好適な動物モデルの欠落により阻まれてきた。マウス遺伝子について完全なノックアウトであるマウスは、出生後２〜３週間以内に死亡する。ＨＯ（ヒューマンオンリ）マウスは、他のノックアウトマウスと異なる。それというのも、マウス遺伝子がノックアウトされていることに加え、それらはそれらの成体期までの生存を可能とする低レベルのヒト遺伝子を発現するためである（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１０年ｂ、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、第１０１巻、ｐ．１５３〜１６２）。ＨＯマウスは、Ｈｃｙ、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびＳ−アデノシルホモシステインの重度の上昇を示し、付随的なシステインの血漿および肝レベルの減少を呈する。したがって、これらのマウスは、いくつかの態様において、ヒトにおいて生じる疾患を再現する特徴を示す。
【０１４９】
Ａ．ｈｔＣＢＳ投与はｔＨｃｙおよびシスタチオニン濃度を改善しない
非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳを５ｍｇ／ｋｇにおいて１週目および３週目（治療のセット間は１０日間）で５日連続で投与したＨＯマウスは、血清ホモシステインレベルの変化を実証しなかった。図２は、ＨＯマウスにおける平均ホモシステインおよびシスタチオニンレベルを示す。非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳによる代謝モジュレーションのこの欠落は、ポリエチレングリコール分子の共有結合によりｈｔＣＢＳを修飾する必要性をさらに裏付ける。
【０１５０】
内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号に記載のとおりＰＥＧのいくつかの異なる化学物質を試験し（表５参照）、このデータは、２０ｋＤａ未満のＰＥＧによりＰＥＧ化されているＣＢＳが高分子量のＰＥＧによりＰＥＧ化されているＣＢＳよりも血漿中の活性の急速な損失を実証することを示す。その理由のため、さらなる分析のためにＭＥ２００ＭＡ０Ｂと命名された直鎖２０ｋＤａのＰＥＧを選択した。図３は、ＭＥ２００ＭＡ０ＢによるｈｔＣＢＳ  ＰＥＧ化の経時的変化を示すクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを提示する。ＰＥＧの添加によりＰＥＧ反応を開始させ、分析すべき示される時点においてチューブから試料を抜き取った。
【０１５１】
【表５】
2018532763.tif 000007
【０１５２】
Ｂ．反復ＰＥＧｈｔＣＢＳ投与はｔＨｃｙおよびシスタチオニン濃度を改善し、正常システインレベルを復帰させる。
ＨＯマウスを使用してＰＥＧｈｔＣＢＳ投与の長期効果をモニタリングした。ＰＥＧｈｔＣＢＳ酵素は、７．５ｍｇ／ｋｇの用量において、最初の２週間については週２回（月曜日および木曜日）、および次の６週間については週３回（月曜日、水曜日および金曜日）、８匹のＨＯマウスに投与した。注射の２４時間（火曜日）および７２時間（月曜日）後に血液試料を回収した（図４Ａ〜４Ｃ）。図４Ａは、血漿ｔＨｃｙが０時間における２１２μＭから、注射２４時間後に６２〜１０３μＭの範囲内の平均に低減し、最終の毎週の注射７２時間後に１４１〜１８９μＭの範囲であったことを示す。２８日目以降、注射７２時間後の値は０時間の値よりも有意に低かった（Ｐ≦０．０２）。シスタチオニンおよびシステインレベルも同様に好ましい影響を受けた。注射２４時間後、シスタチオニンは６μＭから３０μＭほど高くまで増加し、システインは一定して２００μＭ超であった（図４Ｃ）。興味深いことに、２４日目以降、シスタチオニン濃度の変動は、処理の最初の３週間と比較してほとんど目立たなかった。血漿代謝産物レベルの分析に加え、注射マウスからの肝臓、腎臓および脳組織試料も同様に分析して非タンパク質結合ホモシステイン（遊離およびジスルフィド結合形態）のレベルを測定した。図４Ｄに示されるとおり、長期注射動物において、肝臓、腎臓、および脳組織についてそれぞれ４４％、６３％および４７％の低減が実証された。したがって、ＰＥＧｈｔＣＢＳの長期反復注射はホモシステイン、シスタチオニンおよびシステイン血漿レベルに有意に影響する。
【０１５３】
実施例４．ｈｔＣＢＳ突然変異体（Ｃ１５Ｓ）は選択的な凝集およびＰＥＧ化パターンを示す
Ａ．Ｃ１５Ｓ突然変異ｈｔＣＢＳは凝集および均等なＰＥＧ化パターンを示さない
ｈｔＣＢＳ酵素は全長タンパク質と比較して凝集傾向が低いことが既に報告されたが（フランク（Ｆｒａｎｋ）ら著、２００６年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４５巻、ｐ．１１０２１〜１１０２９）、それは四量体およびより高次の凝集物を依然として形成する。これは免疫防御機序を刺激し得、例えば、アミロイド沈着（デスーザ（Ｄ’Ｓｏｕｚａ）ら著、２０１４年、「アミロイド：ジ・インターナショナル・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・アンド・クリニカル・インベスティゲーション、ジ・オフィシャル・ジャーナル・オブ・ジ・インターナショナル・ソサエティ・オブ・アミロイドーシス（Ａｍｙｌｏｉｄ：ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）」、第２１巻、ｐ．７１〜７５）をもたらし得るだけでなく、精製、取扱、およびコンシステンシーにも影響し得る。図５Ａ（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図５Ａとして既に開示）は、ｈｔＣＢＳの異なるバッチが異なる二量体／四量体比を示し、より高次の凝集物の程度が変動したことを示すクーマシー染色ネイティブＰＡＧＥを示す。図５Ｂ（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図５Ｂとして既に開示）は、ゲル内活性アッセイであり、それらの凝集物がＣＢＳ活性を示すことを実証した。図５Ｃ（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図５Ｃとして既に開示される）は、凝集が非一貫性ＰＥＧ化産物を引き起こすことを示す。ＰＥＧ化は、変動するＰＥＧ化の程度を反映すると仮定される２つの区別されるバンドをもたらした。それというのも、凝集が利用可能なＰＥＧ化部位を隠蔽するように作用し得るためである。したがって、バッチ２８（図５Ａ）のより目立つ凝集に起因して、そのＰＥＧ化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、より目立つ下方バンド、すなわち、より低ＰＥＧ化のものをもたらした一方（図５Ｃ）、四量体および二量体の両方から構成されるバッチ１１２（図５Ａ）のＰＥＧ化は、バッチ２８と比較して目立つ上方バンドをもたらした（図５Ｃ）。図５Ｄは、還元剤トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いる両方の酵素バッチのインキュベーションが四量体およびより高次の凝集物のほとんどを二量体形態に変換させたことを示すクーマシー染色ネイティブゲルを示す。これらのデータは、凝集がｈｔＣＢＳの表面上の露出システインにより駆動されることを意味する。したがって、ＴＣＥＰ処理は、より広範なＰＥＧ化ももたらすことが考えられた。それというのも、より多くの二量体がより高いＭＷ形態から生成され、ｈｔＣＢＳの表面上の追加のＰＥＧ化部位の露出を生じさせるためである。実際、図５Ｅに示されるとおり、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の上方／下方ＰＥＧ化バンド間の比は、ＴＣＥＰの不存在下でのＰＥＧ化と比較してＴＣＥＰ処理後に上方バンドに有意にシフトする。したがって、ｈｔＣＢＳ凝集は、少なくとも部分的に、分子内ジスルフィド架橋の形成により駆動されると考えられる。したがって、Ｃ１５をセリンに突然変異させ、Ｃ１５ＳｈｔＣＢＳ突然変異体を生成した；Ｃ１５は、ＣＢＳの表面上の最も反応性のシステインであることが以前示された（フランク（Ｆｒａｎｋ）ら著、２００６年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４５巻、ｐ．１１０２１〜１１０２９）。図５Ｆ（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図６Ａとして既に開示）は、２つの主要バンド（二量体および四量体）がｈｔＣＢＳについて観察される一方、Ｃ１５ＳｈｔＣＢＳ突然変異体が単一バンドを示すクーマシー染色ネイティブゲルを示し、それは予測されるとおり、ＴＣＥＰによる処理によっては影響を受けない。この観察は、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）によりさらに立証された。ヤッラ（Ｙａｒｒａ）ＳＥＣ−３０００、３００＊７．８ｍｍサイズ排除カラム（フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、カリフォルニア、米国）上でＣＢＳ調製物を分離した。カラムを較正し、１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ＝６．８中で１ｍｌ／分の流量において室温において操作した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析、図５Ｇ（内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２０７７０号の図７Ａおよび図７Ｂの一部として既に開示）は、ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（図５Ｇ、左パネル）およびｈｔＣＢＳ二量体／四量体比（図５Ｇ、右パネル）の差を示す。二量体Ｃ１５Ｓ  ｈｔＣＢＳ突然変異体についての単一ピークは８．６２分において溶出した一方、ｈｔＣＢＳについての主要ピークは７．９分において溶出し、四量体に対応した。図４Ｈは、異なるバッチ間のｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＰＥＧ化の再現性およびｈｔＣＢＳとの比較を示すクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｃ１５Ｓ  ｈｔＣＢＳ中の凝集物の不存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で現れるほぼ単独で１つのＰＥＧ化バンドを有する異なるバッチ間のより一貫したＰＥＧ化パターンをもたらした。インビボおよびインビトロの両方でのＰＥＧｈｔＣＢＳおよびＰＥＧＣ１５Ｓ間の直接比較は、性能の差を示さなかった。
【０１５４】
注射１、４および２４時間後における代謝産物に対するＰＥＧＣ１５Ｓの効果も試験した（図６Ａ〜図６Ｃ）。７．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧＣ１５ＳまたはＰＢＳが注射されたＨＯマウス（ｎ＝５）におけるｔＨｃｙ（図６Ａ）、シスタチオニン（図６Ｂ）、およびシステイン（図６Ｃ）のレベルを注射１、４および２４時間後に計測した。データは平均±ＳＥＭとして提示し、対応のないスチューデントｔ検定を使用して２つの群間でそれぞれの時点を比較する。＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、および＊＊＊ｐ≦０．００１。ｔＨｃｙおよびシステインに対する効果は注射２４時間後にのみ観察されたが（図６Ａおよび図６Ｃ）、シスタチオニンの有意な増加は注射１および４時間後に既に観察された（図６Ｂ）。
【０１５５】
実施例５．ＰＥＧＣ１５Ｓおよびベタインはインビボで相乗的に機能する
ベタインおよび組合せ療法の効果を評価するため、ベタイン、ＰＥＧＣ１５Ｓ、およびベタイン＋ＰＥＧＣ１５Ｓ処理の組合せを実施し、トランススルフレーション経路の代謝産物を比較した。
【０１５６】
１８日間の実験全てにわたり飲料水中２％のベタインによりベタインおよびベタイン＋ＰＥＧＣ１５Ｓ群を処理し、１４および１５日目にこの群に７．５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧＣ１５Ｓを注射した。ＰＥＧＣ１５Ｓ単回処理群は常用水に供して維持し、同様に１４および１５日目に注射した。図７Ａに示されるとおり、１４日間のベタイン処理は、ベタイン処理群についてｔＨｃｙの２９％および３２％の減少をもたらした。ベタイン単回処理群は、それらのｔＨｃｙのレベルを１８日目まで維持した。ベタインのバックグラウンドに対するＰＥＧＣ１５Ｓの注射は、１５、１６、１７および１８日目にそれぞれ７４％、７７％、７６％および４０％のより目立つ低減をもたらした。ＰＥＧＣ１５Ｓによる処理は単独で、１５、１６、１７および１８日目にそれぞれ６９％、６７％、５２％および３３％の低減をもたらした。これらのデータによれば、ベタイン処理を用いるまたは用いないＰＥＧＣ１５Ｓの注射は、ベタイン処理単独よりもかなり優れている。さらに、ベタイン＋ＰＥＧＣ１５Ｓの組合せは、ＰＥＧＣ１５Ｓ単独による処理よりも優れた。図７Ｂに示されるとおり、これらの２つの群間の差は２回目の注射の４８時間後に統計的に有意になった（１７日目）。したがって、ＰＥＧＣ１５Ｓとベタインとの組合せは、長期間のより低いｔＨｃｙレベルの維持を可能とする。
【０１５７】
ベタイン処理単独は、１８日間の実験全体にわたりシスタチオニンの増加をもたらさなかった。対照的に、ＰＥＧＣ１５Ｓ（ベタインを用いるまたは用いない）により処理された２つの群について増加が観察された。興味深いことに、ＰＥＧＣ１５Ｓとベタインとの組合せは、１６日目以降から始まる増加をもたらし、それはＰＥＧＣ１５Ｓ単独療法を受けた群において有意に低かった。これは、ＰＥＧＣ１５Ｓ単独による処理がホモシステインをセリンとの縮合に導いてシスタチオニンを形成するという事実に起因する。ベタインとの組合せは、利用可能なホモシステインの一部を再メチル化経路に導いてメチオニンを産生するので、ＰＥＧＣ１５Ｓがシスタチオニンへの変換に利用可能なホモシステインは、より少量であり得る。
【０１５８】
実施例６．ＰＥＧＣ１５ＳはＫＯマウスを早期死亡からレスキューし、肝疾患を改善する
Ａ．早期死亡の低減
完全なＣＢＳノックアウトマウス（ＫＯ）の大多数は、出生後２〜３週間以内に死亡する。ＰＥＧＣ１５Ｓを週２回注射されたＫＯマウス対ＰＢＳを注射されたマウスのカプランメイヤー生存曲線をプロットした。２１日目までベタイン水でマウスを維持し、ＫＯ仔マウスをレスキューする注射酵素の能力を試験した。ＫＯ仔マウスにＰＥＧＣ１５ＳまたはＰＢＳを週２回注射した。２１日目（離乳日）まで飲料水中のベタインで全てのマウスを維持した。図８Ａに示されるとおり、２１日目、ＰＢＳ注射群においてマウスの１８％のみが生存し、対照的に酵素が注射されたマウスの９３％が生存した。ＰＢＳ注射動物は２４日目まで生存しなかった一方、酵素注射群については８６％の生存率が記録された。２４日目以降、酵素注射動物の数も降下し始め、２９日目に４５％、３５日目に３３％の生存率であったが、追加の以下の実施例に示されるとおり、異なるＰＥＧ分子および投薬レジメンの使用はそれらの結果に大きく影響することが観察された（例えば、図１１Ａおよび１１Ｃ）。
【０１５９】
Ｂ．肝疾患
ＫＯマウスが重度の肝損傷を罹患することは既に実証された（マクリーン（Ｍａｃｌｅａｎ）ら著、２０１０年ａ、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．）、第１０１巻、ｐ．１６３〜１７１；ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら著、１９９５年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第９２巻、ｐ．１５８５〜１５８９）。したがって、ＫＯマウスの生存延長は、ＣＢＳ処理後の肝疾患の改善と相関させることができる。したがって、ＰＥＧＣ１５Ｓを３５日間注射された動物からの肝切片の組織学的分析を実施した。３６日目に動物を屠殺し、光学顕微鏡観察による組織学的分析のために肝試料を加工した。ＰＢＳ注射動物は３５日目まで生存しなかったが、死亡直後の２匹の動物から肝試料を採取し、加工した。実験は盲検様式で実施した。肝臓を摘出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒドにより２４時間固定した。組織学的観察のための組織ブロックをトリミングし、エタノール系、次いでアセトン、アセトン−キシレン混合物およびキシレンにより脱水し、次いでパラフィン中で包埋した。並行して、非極性脂質の検出のため、ドライアイスにより冷却された石油エーテル中で、パラホルムアルデヒドにより固定された小組織ブロック（約４ｍｍ×２ｍｍ）を急速冷凍させ、−５０℃において貯蔵した。キシレン中で４μｍ厚のパラフィン切片を脱パラフィン化し、イソプロピルアルコールステップ後にエタノール（９６％、７０％、６０％）により再水和した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により組織切片を染色して組織病理学的変化を評価した。線維症の検出のためにマッソントリクローム染色を実施した。脂肪症は、１０μｍ厚であり、ライカ・クライオミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）（ＣＭ１８５０）により切断された固定凍結切片中の非極性脂質の検出のためのオイルレッドＯ染色を使用して確認した。オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）デジタルカメラ（ＤＰ７０）を備えるニコン（Ｎｉｋｏｎ）光学顕微鏡（Ｅ８００）により、切片を視認し、撮影した。
【０１６０】
図８Ｂは、３５日目に屠殺された２匹のＰＥＧＣ１５Ｓ注射ＫＯマウスの肝組織学的観察と１７および２４日目に死亡した２匹のＰＢＳ注射ＫＯ動物からの肝臓を示す（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）。肝実質の低倍率画像（図８Ｂ、左列）は、ＰＥＧＣ１５Ｓ注射ＫＯ−１およびＫＯ−２においては、わずかに不規則な肝細胞板を伴う中程度の変化および軽度から中程度の脂肪症を示し、これとは対照的にＰＢＳ注射ＫＯにおいては、肝細胞の巨大な分散壊死（図８Ｂ、ＫＯ−３、矢印により標識）および複数の分散した壊死を有するびまん性脂肪症（図８Ｂ、ＫＯ−４、矢印により標識された壊死）を示す。肝細胞の細胞質中の非極性脂質についての特異的染色を挿入図として示す。高倍率画像（右列）は、ＰＥＧＣ１５Ｓ注射ＫＯにおける高頻度有糸分裂（矢印により標識し、挿入図として詳細を示す）および目立つ核小体を有する拡張した多形核の存在を実証する。ＰＢＳ注射ＫＯにおける肝実質の高倍率画像は、わずかな炎症性浸潤を有するコンフルエントな肝細胞壊死（図８Ｂ、ＫＯ−３、矢印により標識）または目立つ吸収炎症反応を伴う複数の分散壊死（図８Ｂ、ＫＯ−４、矢印により標識）を実証する。残りの肝実質は、ＰＢＳ注射ＫＯにおける微小胞性および巨胞性脂肪症を示す（ＰＴ＝門脈管、ＣＶ＝中心静脈）。
【０１６１】
ＰＢＳ注射動物は、目立つ微小胞性から巨胞性脂肪症および肝細胞の顕著な死滅を特徴とし、最小の線維症を伴うまたは伴わない重度の肝障害を発生させた。傑出した炎症吸収反応を伴う肝小葉全体にわたり分散した肝細胞の複数の単細胞またはオリゴ細胞壊死が１匹の動物において見出された一方、わずかな炎症性浸潤を有する主に門脈周囲帯中の肝細胞の巨大な密集性壊死が他の動物における特性の多くを占めた。肝実質再生の徴候は、両方の動物において最小であった。２匹のＰＥＧＣ１５Ｓ注射動物は、肝臓の中程度の変化を示し、実質損傷の徴候はわずかであったが、再生が目立ち、治療法の受容時に試験者により正確に認識された。肝実質再生を示す変化（肝小葉のわずかに不規則なアーキテクチャ、肝細胞の好塩基性細胞質、高頻度の有糸分裂および二核肝細胞、核多形および目立つ核小体を伴う拡張）は、最も目立った特徴であった。全体形態は、肝細胞における増殖、転写および翻訳の増加と一致した。これに加え、肝細胞の希少な病巣壊死および微小胞タイプの軽度の脂肪症が検出され、線維症は最小であった。
【０１６２】
実施例７．２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの生化学的特徴付け
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの生化学的特徴は、その分子のインビボ投与の効果に関する試験前に決定した。
【０１６３】
Ａ．Ｎ−末端シーケンシングおよびインタクト質量分析
Ｎ末端シーケンシングを使用して非修飾ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの５つのバッチを分析した。得られた配列は全てのバッチについて同一であり、参照配列と比較し、それらは全て、最初のメチオニン残基を欠いた。ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＮ末端が、野生型ＣＢＳの配列に見出されるとおりＰＳＥＴＰであり、ＭＰＳＥＴＰでないことが観察された。
【０１６４】
ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのデコンボリュートした質量スペクトルにより測定されたインタクト質量は、５つのバッチにおける４５２９０Ｄａにおける１つの主要ピークのみを同定することによりＮ末端シーケンシングからの結果を補強した。この値は、Ｎ末端メチオニンを有さないｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ単量体の分子質量（理論分子量：４５２８９．７Ｄａ）に一致する。
【０１６５】
ソフトウェアのジェネイアス（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ）９．１．５（フリーバージョン）により、ジェネイアス（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ）アラインメントタイプ「エンドギャップを用いるグローバルアラインメント（Ｇｌｏｂａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）」およびコストマトリックスブロサム６２（Ｃｏｓｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｌｏｓｕｍ６２）を使用して配列アラインメントをさらに実施してヒト、ラット、サル、およびマウスにおけるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのタンパク質配列を比較した。結果は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＮ末端が、ヒト、サル、ラットおよびマウスにおける野生型トランケートＣＢＳの配列に見出されるとおりＰＳＥＴＰであり、ＭＰＳＥＴＰでないことを裏付けた。ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、トランケートサルＣＢＳと、１つのギャップ（開始コドンにおける）を含め９６％の配列同一性を共有することが観察された。配列間の以下の差が、本明細書において使用されるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳおよびユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）／スイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）：Ｑ５８Ｈ５７に基づくトランケートサルＣＢＳ中で観察された。アミノ酸位置（配列のアラインメントに基づく）１８位Ｒ→Ｌ（本明細書において使用されるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ→トランケートサル配列）、２５位Ｋ→Ｑ、３２位Ｓ→Ｌ、３４位Ｅ→Ｇ、６９位Ａ→Ｖ、７１位Ａ→Ｅ、９０位Ｖ→Ｉ、１３３位Ｄ→Ａ、１５７位Ａ→Ｔ、２４２位Ｑ→Ｒ、３５４位Ｖ→Ｍ、および４０３位Ｔ→Ｖ。
【０１６６】
ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、トランケートラットＣＢＳと５つのギャップ（ラット配列中）を含め８４％の配列同一性を共有することが観察された。配列間の以下の差が、本明細書において使用されるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳおよびユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）／スイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）：Ｐ３２２３２に基づくトランケートラットＣＢＳ中で観察された。アミノ酸位置（配列のアラインメントに基づく）４位Ｅ→Ｇ（本明細書において使用されるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ→トランケートラット配列）、６位Ｐ→Ｓ、８位Ａ→Ｃ、１０位Ｖ→Ｄ、１２位Ｐ→Ｓ、１３位Ｔ→Ａ、１５位Ｓ→Ｃ、１７〜２４位ＨＲＳＧＰＨＳＡ→ＱＤＬＥＶＱＰＥ、２６位Ｓ→Ｑ、３２〜３４位ＳＰＥ→ＡＳＧ、３８〜４２位ＡＫＥＰＬ→Ｒ−−−Ｖ、４５位Ｒ→Ｓ、４８位Ａ→Ｔ、６０〜６２位ＡＳＥ→ＭＡＤ、６６位Ｈ→Ｙ、６９位Ａ→Ｖ、７１位Ａ→Ｔ、８２位Ｋ→Ｒ、８６位Ｄ→Ｎ、９４位Ｋ→Ｒ、９６位Ｇ→Ｓ、９８〜９９位ＫＦ→ＮＡ、１３３位Ｄ→Ａ、１６１位Ｒ→Ｋ、１７５位Ｓ→Ｍ、２３５位Ｔ→Ｄ、２３８位Ｄ→Ｅ、２４８位Ｌ→Ｖ、２５５位Ｖ→Ａ、２７６位Ｒ→Ｋ、３００位Ｔ→Ａ、３１８位Ｔ→Ａ、３２２位Ｋ→Ｒ、３２９〜３３１位ＥＥＡ→ＤＤＳ、３３３位Ｔ→Ａ、３４０および３５０位Ａ→Ｓ、３５３〜３５４位ＴＶ→ＡＭ、３６５位Ｑ→Ｋ、３８３位Ｔ→Ｓ、３８９位Ｒ→Ｋ、３９７位Ｌ→Ｍ、４０１位Ｄ→−、４０３〜４０４位ＴＥ→ＳＶ、および４０６位Ｋ→Ｒ。
【０１６７】
ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、トランケートラットＣＢＳと５つのギャップ（マウス配列中）を含めて８４％の配列同一性を共有することが観察された。配列の以下の差が、本明細書において使用されるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳおよびユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）／スイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）：Ｑ９１Ｗ９に基づくトランケートマウスＣＢＳ中で観察された。アミノ酸位置（配列のアラインメントに基づく）４位Ｅ→Ｇ（本明細書において使用されるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ→トランケートマウス配列）６位Ｐ→Ｓ、８位Ａ→Ｃ、１０位Ｖ→Ｄ、１２〜１３位ＰＴ→ＳＡ、１５〜２１位ＳＰＨＲＳＧＰ→ＧＦＱＨＬＤＭ、２４位Ａ→Ｅ、２６〜２７位ＧＳ→ＲＱ、３２〜３４位ＳＰＥ→ＰＳＧ、３７〜４２位ＥＡＫＥＰＬ→ＤＲ−−−Ｖ、４８位Ａ→Ｔ、５９〜６２位ＰＡＳＥ→ＡＭＡＤ、６６位Ｈ→Ｙ、６９〜７１位ＡＰＡ→ＶＬＴ、８２位Ｋ→Ｒ、８６位Ｄ→Ｎ、９６位Ｇ→Ｓ、９８〜９９位ＫＦ→ＮＡ、１３３位Ｄ→Ａ、１６１位Ｒ→Ｋ、１７５位Ｓ→Ｍ、２３５位Ｔ→Ｄ、２３８位Ｄ→Ｅ、２５５位Ｖ→Ａ、２７６位Ｒ→Ｋ、３００位Ｔ→Ａ、３１８位Ｔ→Ａ、３３０〜３３１位ＥＡ→ＤＳ、３３３位Ｔ→Ａ、３５０位Ａ→Ｓ、３５３〜３５４位ＴＶ→ＡＭ、３８３位Ｔ→Ｓ、３８９位Ｒ→Ｋ、３９７位Ｌ→Ｍ、４０１位Ｄ→−、４０３〜４０４位ＴＥ→ＳＶ、４０６位Ｋ→Ｒ、および４１１位Ｈ→Ｒ。
【０１６８】
上記結果は、ラットおよびマウス配列が本明細書の実施例において使用される２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓと比較して同一の差の多くを共有することを示す。トランケートサル配列は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの配列と最大の類似性を共有した。
【０１６９】
Ｂ．ＰＥＧＣ１５ＳのＮＨＳエステルＰＥＧ化マッピング
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの３つのロットのＰＥＧ化部位をマッピングした：ＲＣ−６−６７Ａ（６．３ｍｇ／ｍｌ）、ＲＣ−６−６７Ｂ（６．７ｍｇ／ｍｌ）、およびＲＣ−８−１４（３．８ｍｇ／ｍｌ）。アルカリ中で試料を脱ＰＥＧ化し、還元し、アルキル化し、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼにより消化し、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳにより分析した。
【０１７０】
Ｘブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）ＢＥＨ１３０  Ｃｌ８  ３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））を６０℃のカラム温度において用いて水中０．１％のＴＦＡ（サーモフィッシャ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））の移動相Ａおよびアセトニトリル（バーディック・アンド・ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ））中０．１％のＴＦＡ（サーモフィッシャ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））の移動相Ｂ中の３３μｇのインジェクション量について逆相クロマトグラフィーを実施した。表６は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）についての勾配を示す。
【０１７１】
【表６】
2018532763.tif 000008
【０１７２】
アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）較正調整ミックスを使用してＬＣ／ＵＶ／ＭＳ前にＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析計（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、モデル６５３８）を高分解能４ＧＨｚおよび３３０〜３２００ｍ／ｚのＭＳスキャン範囲を有するポジティブイオンモードに設定した。電圧を以下のとおり設定した：フラグメンタ−２５０Ｖ、スキマ−６５Ｖ、および八重極ＲＦ電圧７５０Ｖ。ガス温度は３５０℃であった。試験が進行し得る前に全ての質量を±１ｐｐｍ以内に較正した。ダイナミックマス軸較正も、参照標準の連続注入により全てのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験全体にわたり用いた。ロックマスイオンを用いた：９２２．００９７９８。
【０１７３】
対照として非ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓタンパク質を並行して処理した。ペプチドマップは、３０個全てのリジン残基を含め、４つの試料のそれぞれについてアミノ酸配列の９７．８％をカバーすることが観察された。１〜２つのＰＥＧリンカーの質量付加に基づきＰＥＧ化されたものとして１２個のペプチドが同定され、ＰＥＧ化の程度は、それらの３つのロットについて４．５〜５．５ＰＥＧ／ＣＢＳサブユニットの範囲内であると推定された。
【０１７４】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＰＥＧ化部位占有分析において最適化された条件（ｐＨ１１．５、３７℃、２２時間）下で試料を最初に脱ＰＥＧ化した。脱ＰＥＧ化後、事前にＰＥＧ化された部位が、ペプチドマッピングにより同定することができる式：Ｃ５Ｈ６Ｏ３（１１４．０３１７Ｄａのモノアイソトピック分子量）を有するリンカーとともに残る。上記のとおり脱ＰＥＧ化試料を還元し、アルキル化し、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼにより消化し、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳにより分析した。
【０１７５】
ＰＥＧ化の程度は、以下の計算を使用して推定した：：ペプチド当たりのＰＥＧの数＝（存在量（１＊リンカー）＋２×存在量（２＊リンカー））／（存在量（リンカーなし）＋存在量（１＊リンカー）＋存在量（２＊リンカー））。表７はＬＣ／ＵＶ／ＭＳ結果を提供する。
【０１７６】
【表７】
2018532763.tif 000009
【０１７７】
リジン２５、３０、２１１、２４７、２７１、および４０５〜４０６が、３つ全ての２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓバッチにおいてある程度までＰＥＧ化されているとして明確に同定された。リジン７２および７５；８２および８３；９４、９７〜９８、ならびに１０２；３２２および３２５；ならびに３９４および３９８の群のそれぞれは同一ペプチド内に存在し、本明細書の分析によっては、どのリジンがどの程度にＰＥＧ化されているのか決定することができなかった。
【０１７８】
Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ（ＡｓｐおよびＧｌｕのＮ末端）に特異的でない一部のペプチド開裂も観察され、例えば、１０７Ａ〜Ｋ１１９および３３３Ａ〜Ｋ３４８であり、それらは脱ＰＥＧ化の間のタンパク質の塩基性加水分解が原因であり得る。顕著な割合の脱アミド化が一部のペプチドについて観察され、それも脱ＰＥＧ化反応に使用されるアルカリ条件が原因であり得る。
【０１７９】
実施例８．マレイミドＰＥＧ化の生化学的特徴付け
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびネイティブＰＡＧＥゲルを実施してＭＥ−４００ＭＡおよびＭＥ−２００ＧＳにコンジュゲートしているｈｔＣＢＳについてのＰＥＧ化パターンの再現性を比較した。結果は、区別されるＰＥＧ−ＣＢＳ種間の変動比を示し、ＭＥ−４００ＭＡのマレイミドＰＥＧ分子を使用した場合に不完全なＰＥＧ化を示した。ＮＨＳエステルＰＥＧ  ＭＥ−２００ＧＳについてのＰＥＧ化の変動程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９Ａ）およびネイティブＰＡＧＥゲル（図９Ｂ）上で分離不能なＰＥＧ化種の高分子量「スメア」を生成した。
【０１８０】
ＭＥ−２００ＧＳによるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＰＥＧ化とは異なり、ＭＥ−４００ＭＡによるｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＰＥＧ化は、ネイティブＰＡＧＥ上で分離した場合に３つの規定の種を生じさせることが観察された（図９Ｂ）。最も重い種は、ＭＥ−２００ＧＳによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの第２の種と同時溶出することが観察された。最も重い種の正確なアイデンティティは、決定されなかった。それというのも、他の種と比較して相対的に少量のこの種および分離の欠落は、詳細な薬力学（ＰＤ）特徴付けを除外したためである。第２の種は、他ではホモＰＥＧ化種として公知の天然二量体中のそれぞれのサブユニットに付着している１つのＰＥＧを担持することが同定された。最も軽いＰＥＧ化種は、他ではヘテロＰＥＧ化またはヘミＰＥＧ化種として公知の二量体当たり１つのＰＥＧのみを担持することが観察された。
【０１８１】
Ａ．ＰＥＧＣ１５ＳのマレイミドＰＥＧ化マッピング
ペプチドマッピングの最初のステップは、ＭＥ−４００ＭＡによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの２つの試料：ＲＣ−６−１３プール１およびＲＣ−６−１３プール２中のそれぞれのシステイン含有ペプチドを説明することであった。ＲＣ−６−１３プール１（ＢＳＬ試料番号１１２７）は、ホモＰＥＧ化種を表す（同一残基上でＰＥＧ化されている可能性が最も高い）。ＲＣ−６−１３プール２（ＢＳＬ試料番号１１２８）はヘミＰＥＧ化種を表し、したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ＰＥＧ化および非修飾バンドのほぼ等しい比率が観察された。この実施例は、最もアクセス可能なシステイン（Ｃ１５）がセリンにより置き換えられている場合、ＭＥ−４００ＭＡの付着の局在を決定した。
【０１８２】
参照タンパク質（ＵｎＰＥＧ  ＲＣ−６−０９透析濾過液）に対して、および同時に２つのＰＥＧ化タンパク質（ＲＣ−６−１３プール１／ＲＣ−６−１３プール２）に対してＬｙｓ−Ｃ消化を実施した。８つのシステイン含有ペプチドが、還元／アルキル化ＬＣ／ＭＳペプチドマップから同定された。７つのシステイン含有ペプチドは、以下の表８に示されるとおり３つ全ての試料における類似の相対存在量を生じさせ、それら７つのシステインペプチドはＰＥＧ化された可能性が低いことを示した。
【０１８３】
１つのシステイン含有ペプチドのみが、２つのＰＥＧ化試料のそれぞれにおいて有意に減少した相対存在量を有することが観察された。表８は、それぞれの試料中の非ＰＥＧ化ペプチドの相対存在量を提供する。
【０１８４】
【表８】
2018532763.tif 000010
【０１８５】
ペプチド２７２〜３２２は、２つのシステイン残基を含有することが観察された。ＰＥＧ化残基は、Ｌｙｓ−Ｃペプチド２７２〜３２２上に残留するＣｙｓ２７２および／またはＣｙｓ２７５において観察された。Ｃｙｓ２７２および／またはＣｙｓ２７５がＰＥＧ化されているか否かをさらに区別するため、２つの残基を異なるペプチドに分離し、試薬２−ニトロ−５−チオ−シアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）により参照（ＵｎＰＥＧ  ＲＣ−６−０９透析濾過液）および２つのＰＥＧ化タンパク質（ＲＣ−６−１３プール１／ＲＣ−６−１３プール２）を処理した。ＮＴＣＢがＮ末端でフリーシステイン残基に開裂するため、ＰＥＧ化システインはシアニル化最終産物を形成せず、したがって開裂を遮断する。
【０１８６】
７つのシステイン含有ペプチドが、ＮＴＣＢ処理Ｃ８ＬＣ−ＭＳペプチドマップから同定された。化学消化効率が酵素消化と比較して相対的に低かったため、標的ペプチドピークは、クロマトグラムにおいて小さく、副反応も観察された（結果は示さず）。手作業によるイオン検索を使用してシステイン関連ペプチドピークを局在化させ、定量した。参照タンパク質と比較して、１つのシステイン含有ペプチドのみが、ＲＣ−６−１３プール１試料の有意な減少を示した。残基２４４〜２７１として同定されたペプチドは、部位２７２がブロックされたことを表し、２４４〜２７１ペプチドについての収量を低下させた。２つのシステイン含有ペプチドは、ＲＣ−６−１３−プール２試料について相対存在量の減少を示したが；比はそれら２つの間で近い。両方のシステインがＰＥＧ化に関与すること、またはピーク存在量が低すぎて確かな結論を導くことができないことが考えられる。表９の結果は、ＰＥＧ化残基がＣｙｓ２７２上で存在する証拠を提供するが、Ｃｙｓ２７５がＰＥＧ化の局在として完全には除外されなかった。
【０１８７】
【表９】
2018532763.tif 000011
【０１８８】
実施例９．ＨＯマウスにおける４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓおよび２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態および薬力学
本実施例は、２０ｋＤａ直鎖ＮＨＳエステル活性化ＰＥＧ（ＭＥ−２００ＧＳ）または４０ｋＤａ直鎖マレイミド活性化ＰＥＧ（ＭＥ−４００ＭＡ）のいずれかによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）特性を特徴付けし、比較する。ＤＥＡＥセファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）上でＰＥＧＣ１５Ｓのそれぞれを精製し、１×滅菌ＰＢＳ中でバイオマックス（ＢｉｏＭａｘ）（登録商標）１００カートリッジ上のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を使用して緩衝液交換した。
【０１８９】
ＭＥ−４００ＭＡにより修飾されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）を７ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＭＥ−４００ＭＡにより修飾されているホモＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ピーク１）を４．３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＭＥ−４００ＭＡにより修飾されているヘミ／ヘテロＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ピーク２）を５．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＭＥ−２００ＧＳにより修飾されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ）を６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１９０】
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて、ＨＯマウスに５、１０もしくは１５ｍｇ／ｋｇ用量の用量をＳＱ投与し、または１０ｍｇ／ｋｇの用量をＩＶ投与した。４００ＭＡ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて、ＨＯマウスは、３つの形態の１つのＳＣまたはＩＶのいずれか１０ｍｇ／ｋｇの単回投与を受けた：（ｉ）全ての種の混合物（個々の形態の分離を試みなかった（ミックス））、（ｉｉ）ホモＰＥＧ化種（ピーク１）、および（ｉｉｉ）ヘテロ／ヘミＰＥＧ化種（ピーク２）。
【０１９１】
本実施例において雄および雌ＨＯマウスの両方を使用し、それぞれの群は３〜４匹のマウスを含有した。それぞれの投与経路に「Ａ」および「Ｂ」と命名されたマウスの２つの群を使用して任意の１匹のマウスから採取される血液量を最小化した。ＳＣ投与について、Ａ群から注射０．５、３、２４、および７２時間後において、ならびにＢ群から注射１、６、４８、９６時間後において血液を回収した。ＩＶ投与について、Ａ群から注射０．２５、１、６、および４８時間後において、ならびにＢ群から注射０．５、３、２４、および７２時間後において血液を回収した。
【０１９２】
Ａ．薬物動態
時間活性曲線から計算されたＰＫパラメータは、ＭＥ−２００ＧＳコンジュゲートについて表１０に、およびＭＥ−４００ＭＡコンジュゲートについて表１１に概略する。片対数プロットは静脈内群について線形であり、したがって、ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ酵素の全ての形態が一次キネティクスにより血漿からクリアランスされたことを裏付けた（データ示さず）。
【０１９３】
ＳＣまたはＩＰ経路についての曲線下面積（ＡＵＣ）を、ＩＶ投与後に観察されたＡＵＣにより割ることによりバイオアベイラビリティを計算した。表１０は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＩＶおよびＳＣ投与後のＰＫパラメータを提供する。
【０１９４】
【表１０】
2018532763.tif 000012
【０１９５】
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて、曲線下面積は、５、１０、および１５ｍｇ／ｋｇ用量についてそれぞれ３０６２、４７８８および５７５４であった。細胞外（ＳＣ）投薬後に全身循環に到達したｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ酵素の分画は、５ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ  ＳＣ用量群において８２．６％であったが、１０および１５ｍｇの用量群において６４．６％および５１．６％に減少した。したがって、増加は用量比未満であり、それはＡＵＣ、ｃｍａｘ、およびバイオアベイラビリティの増加の比率において反映される。これらの結果は、用量増加に伴う２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの全吸収のわずかな減少により説明される可能性が高い。
【０１９６】
ＩＶ投与群における排出半減期は４８時間であり、それは血漿中の薬物濃度の半分が４８時間ごとに消えることを意味した。データは、対数スケールで時間についての濃度としてプロットした場合、完全に線形であり、相関係数は＞０．９８であり、これは２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについての排出半減期の厳密な推定であることを示唆した。ＳＣ投与群における半減期測定値は変動し、１７．５〜１３７時間の範囲であった。これらの推定は、低速の二相吸収／分布期により複雑化される。単一酵素分子の平均循環時間（ＭＲＴ）は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて４４〜１９４時間の範囲に計算された。
【０１９７】
４８時間の投薬間隔および１７．５時間の半減期を想定して１０ｍｇ／ｋｇのＳＣデータセットから定常状態（一定ピークおよびトラフレベル）に到達する時間をモデリングした。絶対定常状態に到達する時間は３４３時間（すなわち、２日間ごとの約７回のＳＣ注射後）と推定されたが、ピークおよびトラフ血漿レベルの変化は１４４時間までで定常状態レベルに極めて近かった。定常状態において、ピークおよびトラフレベルは、２日間ごとに１回ＳＣ投与された１０ｍｇ／ｋｇ用量の後に１６２および８５ｍＵ／μＬであるとシミュレートした。しかしながら、極めて類似のレベルは、注射１４４時間後、すなわち、２日間ごとのＰＥＧ化酵素の３回のＳＣ投与後に到達された。
【０１９８】
図１０Ａにおいて、ホモＰＥＧ化種（ｈｔＣＢＳ二量体当たり２つのＰＥＧ部分）を表すピーク１、ヘミＰＥＧ化種（ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ二量体当たり単一のＰＥＧ部分）を表すピーク２についての４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの血漿レベルを比較した。ミックスを実線として表し、四角は回収点を示す。ピーク１は点線により表し、丸は回収点を示し、ピーク２は点線により表し、菱形は回収点を示す。
【０１９９】
表１１は、１０ｍｇ／ｋｇの４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＳＣおよびＩＶ投与後に計算されたＰＫパラメータを提供する。
【０２００】
【表１１】
2018532763.tif 000013
【０２０１】
混合４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて計算されたバイオアベイラビリティは、５５．２％であると観察された。Ｔｍａｘは、ｃｍａｘ（初回ピーク血漿レベル）の時間である。排出半減期は、ＩＶデータセットから３９時間であると計算された。ＰＫパラメータは、ピーク１（ヘミＰＥＧ化）およびピーク２（ホモＰＥＧ化）と命名された個々のＰＥＧ化種について大幅に異なることはなかった。
【０２０２】
Ｂ．ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＭＥ−２００ＧＳおよびＭＥ−４００ＭＡ  ＰＥＧ化形態の比較
ＰＫパラメータは、本明細書において比較されたｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの２つのＰＥＧ化形態（ＭＥ−２００ＧＳおよびＭＥ−４００ＭＡ）について認識可能に異なるとは観察されなかった。それぞれの酵素の１０ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＳＣ投与についての比活性対時間曲線は、図１０Ｂに示されるとおり、類似することも観察された。ＩＶ投薬後の活性は実線として示し、ＳＣ投与後のものは点線として示す。丸（ＩＶ）および三角（ＳＣ）は２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを投与されたマウスについての回収時間を表し、菱形（ＩＶ）および四角（ＳＣ）は４００ＭＡ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを投与されたマウスについての回収時間を表す。
【０２０３】
しかしながら、図１０Ｃに示される代謝産物プロファイルは、単回１０ｍｇ／ｋｇＳＣ投与後のホモシステイン（丸）およびシステイン（四角）の血漿レベルの正常化に関して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓがより有効であったことを示す。図１０Ｃのグラフの三角により表されるシスタチオニンのレベルは、２つのコンジュゲート間で有意に異なることはなかった。一般に、応答は活性アッセイにより計測される血漿レベルに従う。
【０２０４】
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについての応答は、より急速に生じることが観察され、４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓに対する応答と比較して延長されることが観察された。両方のＰＥＧ化酵素は、ＳＣ投与後の６時間、ＨｃｙおよびＣｙｓの血漿レベルをほぼ同程度に改善することが観察され、Ｈｃｙの血漿レベルは、４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与２４時間後からの漸次的正常化および７２時間後の注射前レベルへの完全な復帰と比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与７２時間後まで減少したままであることが観察された。類似パターンが、両方のＰＥＧ化酵素についてのＣｙｓの血漿レベルにより反映された。
【０２０５】
投薬増加がＣＢＳのいずれの形態のＰＤプロファイルも有意に改善することは観察されず、酵素の最大効力は、その血漿レベル濃度により支配されるだけでなく、酵素キネティクス、基質利用可能性、および濃度などの因子によっても影響を受けることを示唆した。
【０２０６】
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓと比較してＳＣ投与後に最も好ましいプロファイルを提供することが観察された。具体的には、循環中の半減期は４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについての３９時間と比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて４７時間（すなわち、２０％長い半減期）であり、等量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＳＣ投与後のバイオアベイラビリティは、混合物についての５５．２％と比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて６４．６％（すなわち、１７％良好なバイオアベイラビリティ）であった。
【０２０７】
Ｃ．２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの異なる用量の比較
ＰＤ応答は、一般に、ピーク血漿レベルに正比例して生じ、半減期に比例して減少することが観察された。しかしながら、ピーク応答の用量関係は、５ｍｇ／ｋｇにおいて最大レベルに接近することが観察され、その結果、１０または１５ｍｇ／ｋｇの用量が図１０Ｄに示されるホモシステインおよびシスタチオニンレベルの両方により決定されたとおりピーク効力のわずかな増加をもたらすことが観察された。排出の波状パターンが排出期のそれぞれにおいて観察され、それはそれぞれの曲線において同一であり、その結果、血漿活性は４８時間においてトラフに到達し、次いで７２時間においてリカバーし（または類似であり）、結局９６時間において再度降下する結果となった。ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＳＣ投薬後に観察されたこの異常な排出パターンは、早期の急速およびより低速の後期の吸収期からなる二相吸収期のクリアランスに起因し得ると考えられる。
【０２０８】
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投薬増加は、図１０Ｅにおいて示されるとおり、５ｍｇ／ｋｇと比較して１０ｍｇ／ｋｇの用量について血漿中のほぼ２倍高いＣＢＳ活性を示すが、高用量の１５ｍｇ／ｋｇについては線形でないことが観察された。それぞれの代謝産物について、１０および１５ｍｇ／ｋｇ用量群のＰＤ応答間の識別可能な差が存在する。実際、高用量群における時点の多くが、５ｍｇ／ｋｇ用量群のもの未満の傾向である応答を産生することが観察された。これらの差は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの用量増加について観察されたより低いバイオアベイラビリティ（単位用量当たりの吸収減少）によっては説明されなかった。まとめると、５および１０ｍｇ／ｋｇ間の単回用量は、ＨＯマウスモデルにおける最大効力応答を産生することが観察された。
【０２０９】
実施例１０．ＨＯマウスにおける長期投与間のＰＥＧＣ１５Ｓの薬力学
本実施例は、ＨＯマウスにおいて長期外因投与されるＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−２００ＧＳ、ＧＬ４−４００ＭＡ、ＭＥ−４００ＭＡ、またはＭＥ−０５０ＧＳのいずれかによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬力学的効力および潜在的免疫原性応答を評価し、比較する。マウスゲノム中にヒトタンパク質を遺伝子操作し、ＨＯマウスの場合のように新生児動物中で発現させる場合、免疫応答は、ヒト応答に対する臨床的関連性を有する可能性がより高い。産業界のためのガイダンス、治療タンパク質産物の免疫原性評価（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＣＥＢＲ（２０１４年８月）参照。ＨＯマウスは少量のヒトＣＢＳタンパク質を発現し、完全ノックアウトまたは野生型マウスよりもＰＥＧｈｔＣＢＳ酵素に対するそれらの適応免疫応答に関してヒト患者に類似する可能性が高い。
【０２１０】
１つの実験セットにおいて、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−２００ＧＳ、ＧＬ４−４００ＭＡ、またはＭＥ−４００ＭＡのいずれかによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを評価した。６つのＨＯマウス群を使用してそれらの試験を実施した：２つの群は２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受け（第１および３群）、１つの群は２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受け（第４群）、１つの群はＧＬ４−４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受け（第５群）、２つの群は４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受けた（第６および７群）。これらの試験において雄および雌ＨＯマウスの両方を使用した（１群当たり合計ｎ＝６〜８匹のマウス）。
【０２１１】
第１群について、マウスは２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの２期間の５日間毎日の皮下注射を受け、それは１、２、３、４、および５日目（１週目）ならびに１５、１６、１７、１８、および１９日目（３週目）であった。この実験についての用量は５ｍｇ／ｋｇ／日であった。この実験に生理食塩水対照群（第２群）を含めた。全ての他の群は、３期間の５日間毎日の皮下注射を受け、それは１、２、３、４、および５日目（１週目）および１５、１６、１７、１８、および１９日目（第３目）；ならびに２９、３０、３１、３２および３３日目（５週目）であった。これらの実験についての用量は７．５ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０２１２】
別個の実験セットにおいて、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢまたはＭＥ０５０ＧＳによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを評価した。雄および雌ＨＯマウス（１Ｍ／５Ｆ）の２つの群は、２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（第８群）または０５０ＧＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ（第９群）のいずれかの３期間の５日間毎日の皮下注射を受け、それは、１、２、３、４、および５日目（１週目）；１５、１６、１７、１８、および１９日目（第３週）；ならびに２９、３０、３１、３２および３３日目（第５週）であった。用量は７．５ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０２１３】
全ての実験セットにおいて、それぞれの５日間投薬サイクルに続き、１０日間「ウオッシュアウト期間」を設けた。投薬週（１、３、および５週目）の月曜日、水曜日、および金曜日、ならびにそれぞれの１０日間ウオッシュアウト期間の初日（月曜日）に顎下腺ランセットを使用して血液をサンプリングした。全ての採血手順および皮下注射を午後３時に実施して日周変動に起因するアーティファクトを回避した。採血および注射の両方を実施する日は、酵素投与前に採血手順を実施した。
【０２１４】
それぞれのＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートに対するＨＯマウスにおける薬力学的応答は、トランススルフレーション経路に関連する代謝産物ホモシステイン、シスタチオニン、およびシステインの血漿レベルのベースラインおよび処理後の定量によりそれぞれの投薬期間について評価した。定量は、実施例１に記載のとおり、安定同位体希釈液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により実施した。ホモシステイン、シスタチオニン、およびシステインの最大変化パーセントを、それぞれの投与週についてベースライン値と比較して計算した。
【０２１５】
ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ：２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを用いて３つの独立試験を実施した（第１、３および８群）。第１群において、Ｈｃｙの血漿レベルは、投薬の１週目の間にベースラインレベルと比較して６８％だけ降下するが、間に１０日間のウオッシュアウト期間を有する３週目の間に第２系列の２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ注射の間にベースラインレベルと比較して２４％だけ降下するにすぎないことが観察された（表１２）。効力の類似の降下は、第２の注射ラウンドの間のＣｔｈおよびＣｙｃレベルの両方の上昇の減衰により示唆された（表１３および表１４）。第２の試験（第３群）は、異なるナイーブＨＯマウスセットを用いて効力の減衰が観察されるか否かを決定するために実施した。第３群の総Ｈｃｙレベルは、第１の注射サイクルの間にベースラインの８２％未満に降下することが観察された。３週目および５週目の間の第２および第３の注射サイクルの間、Ｈｃｙレベルはそれぞれベースライン値の５７％および５０％に降下するにすぎないことが観察された。同様に、第８群に投与された２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの追加のロットは、Ｈｃｙの血漿レベルを投薬１週目においてベースラインレベルと比較して８０％だけ減少させるが、投薬３週目の間にベースライン値の６１％だけ減少させるにすぎないことが観察された。投薬５週目の間、Ｈｃｙの血漿レベルは、ベースライン値の５０％に降下することが観察された（表１２）。効力の類似の降下は、１週目と比較した３週目および５週目の注射の間のＣｓｙレベルの上昇の減衰により示唆された（表１３および表１４）。類似の効力の減衰傾向は第１群、第３群、第８群において観察されたが、応答の減衰の大きさは第３群および第８群と比較して第１群において大幅であることが観察された。
【０２１６】
ＭＥ−２００ＧＳ：実験第４群における２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与は、投薬１週目においてＨｃｙの血漿レベルをベースラインレベルと比較して７７％だけ減少させ、投薬３週目の間に７０％、および投薬５週目の間に６６％だけ減少させることが観察された（表１２）。類似の効力の降下は、１週目と比較した投薬３週目および５週目の間のＣｔｈおよびＣｙｓレベルの上昇の減衰により示された（表１３および表１４）。しかしながら、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて、投薬の３週目および５週目において観察された効力の降下は他のＰＥＧ  ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートと比較して最小であり、統計的に非有意であった。
【０２１７】
ＧＬ４−４００ＭＡ：第５群におけるＧＬ４−４００ＭＡ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与は、投薬１週目においてベースラインレベルと比較してＨｃｙの血漿レベルの平均７５％の減少をもたらしたが、投薬３週目の間に４１％、投薬５週目の間に３４％の減少をもたらしたにすぎなかった（表１２）。類似の効力の降下は、１週目と比較した投薬の３週目および５週目の間のＣｔｈおよびＣｙｓレベルの上昇の減衰により示された（表１３および表１４）。
【０２１８】
ＭＥ−４００ＭＡ：４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを用いて２つの独立実験を実施した（第６および７群）。第６群において、Ｈｃｙレベルの減少パーセントは、１週目においてベースラインレベルと比較して７３％であり、続いて投薬３週目および５週目の間にそれぞれ６５％および５９％に降下することが観察された。効力の降下の大きさは、３期間の投薬の間のＨｃｙレベルの減少の減衰により示されるとおり、第７群においてより大幅であった（表１２）。類似の効力の減衰傾向は、第６群および第７群についてのＣｔｈおよびＣｙｓレベルの変化において観察された（表１３および表１４）。
【０２１９】
ＭＥ−０５０ＧＳ：第９群における０５０ＧＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与は、Ｈｃｙの血漿レベルを投薬１週目においてベースラインレベルと比較して７５％だけ減少させるが、投薬３週目の間にベースラインレベルの５９％だけ減少させるにすぎないことが観察された。投薬５週目の間、Ｈｃｙの血漿レベルは、ベースラインレベルの４２％に減少することが観察された（表１２）。類似の効力降下は、１週目と比較した投薬３週目および５週目の間のＣｔｈおよびＣｙｓレベルの上昇の減衰により示された（表１３および表１４）。
【０２２０】
表１２、表１３、および表１４は、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの異なる形態のそれぞれの期間の皮下注射後の血漿ホモシステイン、シスタチオニン、およびシステイン代謝産物レベルの変化パーセントを提示する。これらの表において、ベースライン値は平均±標準誤差（ＳＥＭ）としてμＭで提示し、変化はそれぞれの５日間投薬サイクル（１週目、３週目および５週目）についてのベースラインからの平均最大変化パーセントとして提示する。ｎ．ｄ．は、「未測定」を意味する。表１２は、ＰＥＧＣ１５Ｓによる長期処理後の総ホモシステインの変化パーセントを提供する。
【０２２１】
【表１２】
2018532763.tif 000014
【０２２２】
表１３は、ＰＥＧＣ１５Ｓによる長期処理後のシスタチオニンの変化パーセントを提供する。
【０２２３】
【表１３】
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【０２２４】
表１４は、ＰＥＧＣ１５Ｓによる長期処理後のシステインの変化パーセントを提供する。
【０２２５】
【表１４】
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【０２２６】
これらの試験の結果は、全ての群における血漿ＣｔｈおよびＣｙｓの増加と一致して血漿Ｈｃｙレベルの減少を示し、ＰＥＧ−Ｃ１５Ｓ処理に応答する代謝産物の正常化を示唆する。全ての群において、最大効力は投薬１週目の間に観察された。Ｈｃｙレベルは、表１２に示されるとおり、全ての実験群についてベースライン未満に有意に減少させる（約６８％〜約８２％）ことが観察された。ＣｔｈおよびＣｙｓレベルのピーク増加パーセントも、表１３および表１４に示されるとおり、１週目の間に最大であった。薬力学応答の大きさは、３週目の間およびさらには５週目の後続のＰＥＧ−Ｃ１５Ｓ注射サイクルの間に降下した。全体として、最大および最も持続的な薬力学的応答は２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて観察された。
【０２２７】
効力の減衰は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを除き全ての試験コンジュゲートについて、投薬３週目の間に投与されたＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ投薬の第２期間の間に観察された。さらなる効力降下は、３週目と比較して５週目の間に実施された第３の投薬サイクルの間に観察された。それらの試験において抗体形成は直接計測されなかったが、反復投与後の効力のこの低速降下は適応免疫の古典的な表れである。したがって、減衰についての適した説明は、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＡ−４００ＭＥ、ＧＬ４−４００ＭＡ、またはＭＥ−０５０ＧＳによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓに指向される免疫応答であった。
【０２２８】
試験されたコンジュゲートのうち、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓが最も堅牢で長期の効力を有することが観察された。ＭＥ−２００ＧＳは、他のＰＥＧと比較してｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ上の免疫原性エピトープをより効率的にマスクし得ることが仮定される。したがって、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ形態は、試験された種々のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートの最も強力で最小の免疫原性の形態であることが観察された。
【０２２９】
実施例１１．ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−４００ＭＡ、またはＭＥ−２００ＧＳによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、ＫＯマウスを早期死亡からレスキューする
本明細書に記載のＫＯマウスモデルにおいて生存試験を実施して種々のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートの効力を比較した。
【０２３０】
Ａ．２１／３５日目までのＫＯ仔マウスの生存
ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ（ｎ＝２４）、ＭＥ−４００ＭＡ（ｎ＝３１＝１３Ｆ＋１８Ｍ）、またはＭＥ−２００ＧＳ（ｎ＝２８＝１４Ｆ＋１４Ｍ）によりＰＥＧ化されている７．５ｍｇ／ｋｇのｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを週３回注射されたＫＯマウス、および対照としてＰＢＳを注射されたＫＯマウス（ｎ＝４４）の群のカプランメイヤー生存曲線をプロットした。授乳中の母マウスをベタイン水で維持し、離乳後、ベタインを有さない常用水に供して仔マウス（２１日目）を配置した。ＫＯ仔マウスをレスキューする注射酵素の能力を試験した。
【０２３１】
図１１Ａに示されるとおり、２１日目、ＰＢＳ注射群においてマウスの約２０％のみが生存し、それとは対照的に２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＭＡ）を注射されたものの約９２％および４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５（Ｃ１５Ｓ／４００ＭＡ）または２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ／２００ＧＳ）を注射されたものの約９７％が生存した。
【０２３２】
Ｂ．週末ウオッシュアウト後（トラフ）および最後の注射の２４時間後（ピーク）の代謝産物レベル
実施例１の実験手順を使用して週末ウオッシュアウト後（トラフ）および最後の注射の２４時間後（ピーク）に約４〜５週齢における生存ＫＯマウスにおける代謝産物レベルを計測した。
【０２３３】
計測されたレベルは、図１１Ｂに示されるとおり、同様に処理された健常ＫＯ＋／−リッターメイトにおけるレベルと比較した。４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスにおけるＨｃｙの血漿レベルは、投与７２時間後における２５６±８μＭ（ＭＥ−４００ＭＡ）（それぞれの代謝産物についての左端のバー）から投与２４時間後における１４５±６μＭ（ＭＥ−４００ＭＡ  ２４ｈ）（それぞれの代謝産物についての左側から２番目のバー）の範囲であった。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスにおけるＨｃｙの血漿レベルは、投与７２時間後における１７９±１０μＭ（ＭＥ−２００ＧＳ）（左側から３番目のバー）から投与２４時間後における９６±８μＭ（ＭＥ−２００ＧＳ  ２４ｈ）（左側から４番目のバー）の範囲であった。したがって、両方のｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートについての最大応答は投与２４時間後に観察され、投与７２時間後に降下することが観察された。いずれかのコンジュゲートによる処理は、毒性Ｈｃｙの血漿レベルを約半分だけ有意に（ｐ＜０．００１）減少させることが観察された。対照的に、処理健常ヘテロ接合性リッターメイトにおけるホモシステインの血漿レベルは、両方の時点において約５μＭであることが観察された。
【０２３４】
Ｃｔｈのレベルは、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓコンジュゲートにより処理されたＫＯマウスにおいて５７および７７μＭの範囲内で観察された。これらの血漿レベルは、非処理ヘテロ接合性マウスにおいて観察されたものよりもほぼ１２倍高かった。Ｃｔｈのピークおよびトラフ血漿レベル間の差は小さいことが観察され、それはシスタチオニンレベルに対する酵素の薬力学的効果が７２時間を超えて持続し得、および／またはＣｔｈが、他の代謝産物と比較して血漿からより低速でクリアランスされ得、より大きな差が観察された証拠である。４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスの両方における投与７２時間後のＣｙｓの血漿レベルは、健常ヘテロ接合性リッターメイト（１５１±６）と比較してそれぞれ８３±４および１０６±６μＭに有意に（ｐ＜０．００１）減少することが観察された。Ｃｙｓの血漿レベルは、両方のコンジュゲートについての投与２４時間後に処理ＫＯマウスにおいて増加することが観察され、循環硫黄代謝産物の部分的な正常化を示す。Ｃｙｓの血漿レベルは、４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ投与の２４時間後に１５７±６μＭに、および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ投与の２４時間後に１７６±６μＭに増加することが観察された。メチオニン血漿レベルは、健常ヘテロ接合性対照と比較してＫＯマウスにおいてわずかに上昇し、トラフおよびピークレベル間で有意に変化しなかった。
【０２３５】
Ｃ．初回または連続処理後の寿命
ＫＯマウスの新生児死亡を予防するための初回の３５日間（５週間）の長期処理後、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓにより処理されたＫＯマウスを２つの群に分けた。一方の群（５Ｗ）は、初回処理を別として、いかなる処理も受けることを停止させた一方、他方の群（連続）は、１２０日齢まで同一のレジメンを用いて継続した（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ、週３回）。
【０２３６】
４ヵ月までのＫＯ仔マウスのこれらの群の生存率を観察し、図１１Ｃにプロットした。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ）を連続投与された全てのＫＯマウスは、図１１Ｃにおいて示されるとおり、少なくとも１１９日間生存した。初回の３５日後の処理の終了は、１１９日齢における約８５％の生存率をもたらした。
【０２３７】
Ｄ．ＣＢＳ処理ＫＯマウスと＋／−健常マウスの総重量および重量増加
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを７．５ｍｇ／ｋｇの用量において週３回投与されたＫＯマウス（雄ｎ＝１６および雌ｎ＝１１）の総重量および重量増加の量を測定し、同様に処理された＋／−健常リッターメイト（雄ｎ＝１４および雌ｎ＝１３）と比較した。２１日目から３６日目まで離乳後のマウスにおいて総重量および重量増加を計測した。
【０２３８】
ヘテロ接合性雄マウスは、約１０．５ｇ〜約１８ｇの範囲の２３〜３５日目からの最大総重量を有することが観察されたが、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯ雄マウスは２１日目に最大総重量（１０ｇ）を有した。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯ雌マウスは、約１０ｇ〜約１４ｇの範囲の２３日後の最低総重量を有した。
【０２３９】
健常雄マウス（ｎ＝１４）は、約２ｇ〜約９．５ｇの範囲の２３日目において開始する重量増加の最大量も有した。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯ雄マウス（ｎ＝１６）および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯ雌マウス（ｎ＝１１）における重量増加の量は、両方の対照群についての重量増加の量よりも有意に低かった。
【０２４０】
実施例１２．ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、Ｉ２７８Ｔマウスモデルにおける顔面脱毛症を遅延させ、予防し、回復させる
ホモシスチン尿症のＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスモデルは、他のホモシスチン尿症マウスモデルと異なり、典型的な代謝産物プロファイルに加えて特異的表現型形質、例えば、顔面脱毛症を示すことが観察された。顔面脱毛症は、顔面および頭部の体毛の損失として定義される。顔面脱毛症の発症は約９０日間（Ｗ１２）であり、典型的には、約１２０日齢（Ｗ１７）において完全に発生した。
【０２４１】
顔面脱毛症は、ホモシスチン尿症および関連代謝産物プロファイルに関連することが仮定されており；したがって、酵素補充療法（ＥＲＴ；ＰＥＧ−ＣＢＳ）の施与は、進行を減速させ、発症を予防し／遅延させ、および／または既に引き起こされた損傷を回復させることによりこの表現型をレスキューするはずである。
【０２４２】
Ａ．顔面脱毛症の発症の遅延
顔面脱毛症のいかなる徴候も示さない３Ｗ齢マウスを２つの群に分けた。第１群（ｎ＝３匹の雄）に、２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを７．５ｍｇ／ｋｇで６週間の期間、週３回注射した。実験前に身体外観を記録し、週１回モニタリングし、次いで６Ｗ注射レジメン後に週２回モニタリングした。代謝産物レベルは、実験前および最後の注射の２４時間後、すなわち、６Ｗ注射レジメン後に確認した。
【０２４３】
３Ｗ齢からの６週間の期間の２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与は、図１２Ａにおいて顔面脱毛症の発症を遅延させることが観察された。Ｉ２７８Ｔ罹患（−／−）または健常（＋／−）マウスは、その週齢において区別不能であることが観察され、−／−マウスは、顔面脱毛の徴候を有さなかった。非処理Ｉ２７８Ｔ＋／−健常ヘテロ接合性マウスは、３８Ｗまでに顔面脱毛症を完全に発生したことが観察された非処理Ｉ２７８Ｔ−／−罹患ホモ接合性マウスと異なり、１９Ｗにおける顔面体毛の損失を罹患することは観察されず、３４Ｗにおける軽度脱毛のみであった。典型的には、顔面脱毛症は１２Ｗにおいて明らかになり、１７Ｗ齢までに完全に発生した。
【０２４４】
６週間の２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与（注射の間のマウスの週齢は４Ｗ〜１０Ｗであった）は、４Ｍ齢において顔面脱毛の徴候を示さず、７Ｍ齢において初期徴候のみを示すことが観察されるＩ２７８Ｔ−／−罹患ホモ接合性マウスにより証明されるとおり、処理の継続時間（６週間）とほぼ同一の時間、脱毛症の発症を遅延させることが観察された。これらの結果は、６週間の２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与がＩ２７８Ｔマウスにおける顔面脱毛症の発症を遅延させた証拠を提供する。
【０２４５】
Ｂ．顔面脱毛症の発生の完全予防
第２群（ｎ＝３；２匹の雄、１匹の雌）に７．５ｍｇ／ｋｇの２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを連続注射し、３Ｗ齢から４１Ｗ齢まで皮下投与した。重量を最初に週１回モニタリングした。実験前に身体外観を記録し、週１回または初回６Ｗ注射レジメン後に週２回モニタリングした。代謝産物レベルは、実験前および初回６Ｗ注射レジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）の最後の注射の２４時間後に確認し、次いで週１回または週２回追跡した。
【０２４６】
Ｉ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスへの２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与は、図１２Ｂに示されるとおり、Ｗ１９、Ｗ２４、Ｗ３１、およびＷ３５齢において観察されるマウスにおける顔面脱毛症の発症および発生を完全に予防することが観察された。このように処理されたマウスの身体外観は、健常Ｉ２７８Ｔ＋／−ヘテロ接合性マウスについて典型的に観察されたものと類似し、６週間の期間のみ処理されたＷ３６齢以上における非処理Ｉ２７８Ｔ−／−対照およびＩ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスの両方の身体外観と有意に異なる。
【０２４７】
図１２Ｃにおける代謝産物計測は、２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与が処理前のレベル（約３００μＭ）と比較してＨｃｙレベルの有意な減少および総Ｈｃｙの約１００μＭのレベルにおける安定化をもたらしたことを示す（中段線）。Ｃｙｓレベル（上段線）は処理により正常化し（約１３０μＭ〜約２４０μＭ）、全体にわたり約２３０μＭのレベルにおいて維持した。
【０２４８】
Ｃ．顔面脱毛症が完全に発生した後の表現型の回復／正常化
少なくとも１２０Ｄ（Ｗ１７）齢であり、視認可能で完全に発生した顔面脱毛症を有するＩ２７８Ｔマウスを、２つの群に分けた。約１年齢までＡ群（ｎ＝６；３匹の雄、および３匹の雌）に４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを週３回注射し、Ｂ群（ｎ＝４；２匹の雄、２匹の雌）に２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを週３回注射した。処理開始前に代謝産物レベルを計測し、試験の間、注射２４時間後に計測し、重量および身体外観を最初に週１回モニタリングし、後に週２回モニタリングした。
【０２４９】
Ｉ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスにおける顔面脱毛症の回復（他では表現型の正常化として公知）のため、顔面脱毛症表現型を既に完全に発現しているマウスの処理を開始した。試験開始時における動物の週齢はＷ２４〜Ｗ２８齢の範囲であり、それは顔面脱毛症の発症についての典型的な週齢（１２０ＤまたはＷ１７）を上回る。
【０２５０】
週３回のＰＥＧ−ＣＢＳコンジュゲートのいずれかの連続投与は、図１２Ｄに示されるとおり、顔面脱毛症を有意に改善したとはいえ、その投与は非処理非罹患Ｉ２７８Ｔ＋／−ヘテロ接合性対照と比較して顔面脱毛症を完全には正常化しなかった。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓよりも良好に機能することが観察された。それというのも、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓにより処理された全ての動物が処理に応答した一方（４匹のうち４匹）、６匹の動物のうち５匹のみが４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓによる処理に応答したためである。さらに、マウスの主観的観察は、マウスの毛並みの厚みおよび光沢が２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを投与されたものについてより良好であったことを提供する。
【０２５１】
さらに、図１２Ｅの代謝産物計測は、両方のＰＥＧ−ＣＢＳ分子が有効であった一方、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｂ群）が４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ａ群）よりもＨｃｙレベルをかなり減少させ、Ｃｙｓレベルを増加させることが観察されたことを示す。
【０２５２】
Ｄ．結論
ＰＥＧ−ＣＢＳの投与は、ＰＥＧ部分に関わらず、上記のとおり非処理Ｉ２７８Ｔ−／−ホモ接合性マウスに典型的な表現型形質である顔面脱毛症の改善をもたらした。６週間のＥＲＴ施与は、顔面脱毛症の発症の遅延をもたらした。顔面脱毛症の発症前のマウスへの連続ＥＲＴ施与はその発生を完全に予防し、そのような動物は非罹患健常Ｉ２７８Ｔ＋／−ヘテロ接合性マウスと区別不能であった。顔面脱毛症が既に完全に発生したマウスへの連続ＥＲＴ施与は、それらの身体外観の有意な改善をもたらした。全ての場合において、顔面脱毛症に対する好ましい効果は、血漿代謝産物レベルの少なくとも部分的な（Ｈｃｙ）または完全な（Ｃｙｓ）正常化に伴い、またはそれらにより引き起こされた。
【０２５３】
実施例１３．２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、ＫＯマウスにおける肝疾患を改善する
２日齢から７．５ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳまたはＰＢＳを週３回皮下（ＳＣ）注射され、１７〜１９日齢において安楽死させたＫＯマウスからの肝切片について組織学的分析を実施し、日齢が一致する＋／−健常対照マウスの肝臓と比較した。
【０２５４】
Ａ．光学顕微鏡観察
１７〜１９日目に動物を安楽死させ、光学顕微鏡による組織学的分析のために肝試料を加工した。図１３Ａに示されるとおり、ＰＢＳ注射ＫＯマウスの肝実質は、矢印により示される中程度から重度の脂肪症、病巣肝細胞壊死、および吸収炎症反応を示す肝小葉のわずかに不規則なアーキテクチャを有することが観察された。同様に図１３Ａに示されるとおり、健常ヘテロ接合性マウスの肝実質および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスは、規則的な肝臓のアーキテクチャおよび最小の核大小不同を有することが観察された。
【０２５５】
図１３Ａに示される同一の肝切片のより高倍率により提供されるより完全な詳細を図１３Ｂに示し、差込図は脂質についてのオイルレッドＯ染色を示す。ＰＢＳ注射ＫＯマウスは、微小胞性および巨胞性脂肪症、核大小不同、肝細胞の病巣壊死、および吸収炎症反応を有することが観察された。これらの特徴は矢印により示す。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスの肝実質は、両方とも良好なクロマチンおよび目立たない核小体を示す規則的にサイズ化および形状化された２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯおよび健常ヘテロ接合性マウスの核により証明されるとおり、最小の核大小不同を有することが観察された。処理および健常マウスの肝細胞の細胞質に見られる区別される脂肪滴は、オイルレッドＯ染色を使用して検出可能であった（図１３Ｂの挿入図参照）
Ｂ．電子顕微鏡観察
３０００倍の倍率における電子顕微鏡観察も使用して健常ヘテロ接合性（＋／−）マウス、ＰＢＳ処理ＫＯマウス、および４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスからの肝組織も観察した。図１４Ａに電子顕微鏡観察の取り込み画像を示す。図１４Ａにおいて、黒色矢印は粗面小胞体（ＥＲ）を示し、白色矢印はミトコンドリア（ＭＴ）を示す。黒色アスタリスクは細胞質グリコゲンを示し、二重黒色アスタリスクは核を示す。白色アスタリスクは脂肪滴を示す。
【０２５６】
＋／−マウスは、正常な細胞質組成と正常な形態を有する核とを有する二核肝細胞を有することが観察された。粗面ＥＲの嚢は細く、規則的に組織化されていることが観察され、ＭＴは正常にサイズ化および形状化されることが観察された。核は規則的および正色素性であり、目立たない核小体を示すことが観察された。
【０２５７】
ＰＢＳ処理ＫＯマウスは、脂肪症、増加した数の細胞質オルガネラ、および肝細胞の不規則な多染色体核を有することが観察された。細胞質は、オルガネラが豊富であること、および多数の脂肪滴（白色アスタリスク）および水腫状のＭＴを含有することが観察された。核は、粗クロマチン、不規則な輪郭、および目立つ核小体を有することが観察された。
【０２５８】
４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスは、肝細胞の正常な細胞質組成および規則的な正色素性核を有することが観察された。＋／−マウスと同様に、ＥＲの嚢は細く、規則的に組織化されていることが観察され、ＭＴは正常にサイズ化および形状化されており、核は良好なクロマチンを伴い正常に出現した。
【０２５９】
８０００倍の倍率における電子顕微鏡観察画像は、図１４Ｂに示されるとおり、より詳細にこれらの知見を裏付けた。図１４Ｂにおいて、黒色矢印は小胞体（ＥＲ）を示し、白色矢印はミトコンドリア（ＭＴ）を示す。黒色アスタリスクは細胞質グリコゲンを示す。４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理および＋／−マウスはスリムであり、正常に組織化された粗面ＥＲ嚢および規則的なＭＴを有することが観察された。ＰＢＳ処理ＫＯマウスは、嚢および小胞が豊富であることが観察された。ＥＲ嚢は、一定せずに増加する幅を有することが観察された。ＭＴは多形態であり、膨張しており、無秩序な稜を示すことが観察された。
【０２６０】
Ｃ．１８〜１９日齢におけるＫＯマウスにおける血漿および組織中の代謝産物レベルの比較
野生型マウス（対照）、非処理ホモ接合性−／−罹患ＫＯマウス、および４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスの群において血漿および組織代謝産物を計測した。処理群に、４００ＭＡ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの皮下注射を、２日齢から７．５ｍｇ／ｋｇの用量において週３回施与した。最後の注射の２４時間後に血漿および組織を回収した。表１５は、血漿中のＨｃｙ、Ｃｙｓ、Ｃｔｈ、およびＭｅｔのレベルを示す。
【０２６１】
【表１５】
2018532763.tif 000017
【０２６２】
表１６は、肝組織中のＨｃｙ、Ｃｙｓ、Ｃｔｈ、およびＭｅｔのレベルを示す。
【０２６３】
【表１６】
2018532763.tif 000018
【０２６４】
表１７は、腎組織中のＨｃｙ、Ｃｙｓ、Ｃｔｈ、およびＭｅｔのレベルを示す。
【０２６５】
【表１７】
2018532763.tif 000019
【０２６６】
表１８は、脳組織中のＨｃｙ、Ｃｙｓ、Ｃｔｈ、およびＭｅｔのレベルを示す。
【０２６７】
【表１８】
2018532763.tif 000020
【０２６８】
実施例１４．ＨＯマウスにおけるアルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプを使用する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続投与の効果
アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプは、新鮮およびナイーブＨＯマウスにおいて長期の期間、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの安定した制御送達を提供する。反復皮下注射に代えて１時間当たりの酵素の容量を連続分注するマイクロ浸透圧アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）ポンプの４つの異なるモデル：モデル１００２（０．２５μｌ／ｈ）、モデル２００２（０．５μｌ／ｈ）、モデル２００４（０．２５μｌ／ｈ）、およびモデル２００６（０．１５μｌ／ｈ）を使用してＭＥ−２００ＧＳによりＰＥＧ化されているｈｔＣＢＳ  Ｃｌ５Ｓを投与した。
【０２６９】
鎮痛のため術前および術後に、アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）ポンプの移植手術の前後４８時間、自由裁量で水瓶中のタイレノール（ＴＹＬＥＮＯＬ）（登録商標）（２ｍｇ／ｍｌ）も動物に投与した。さらに、動物は、５ｍｇ／ｋｇのカルプロフェンを２４時間ごとに、術後４８時間、皮下で受けた。術中麻酔のため、吸入により５％のイソフルランを投与し、術中は２〜３％において維持した。マウスを麻酔した一方、それらは、生物学的安全キャビネット中で無菌条件下で移植された医薬グレードアルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプをそれぞれ受けた。ポンプを頸部の腹側上の弛緩皮膚区域中で皮下移植した。ポンプ移植前、マウスを剃毛し、皮膚区域をベタジン（ＢＥＴＡＤＩＮＥ）（登録商標）により前処理した。ポンプ移植は、無菌鋏により作製される小さな外科的切開（５ｍｍ）を要求した。切開を創傷クリップにより密封し、皮膚が完全に治癒した１週間後にそれを除去した。ポンプモデル１００２および２００２について１、３、６、９、１２、１５、１９、および２０日目において血液試料を採取した。ポンプのモデル２００４および２００６は、ポンプの指定のサイフサイクル（モデル２００４および２００６についてそれぞれ４および６週間）の終了時に外科的に摘出した。したがって、それぞれのポンプについて血液試料の回収を調整した：試験３０日目に留置されたモデル２００４について１、３、５、１２、１９、２６、３１、３２、３３、および３６日目、ならびに試験４４日目に留置されたモデル２００６について１、３、５、１２、１９、２６、３３、４０、４５、４６、４７および５０日目。血漿中のＣＢＳ活性の測定ならびにＨｃｙ、Ｃｔｈ、およびＣｙｓレベルの計測に血漿試料を使用した。
【０２７０】
モデル１００２および２００２についての投与酵素は、２１μｇ／μｌの濃度の、６７３．９＋１３．２Ｕ／ｍｇの比活性を有する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓであった。これらの実験において、モデル１００２は、１４日間の期間、０．２５±０．０１μｌ／時間の平均ポンピング速度を有し、平均充填容量は１１０．７±６．５μｌであった。酵素の投与の速度は、５．２５μｇ／時間の酵素であり、それは８５Ｕ／日に等しい１２６μｇ／日または約３．５Ｕ／時間と同等である。
【０２７１】
モデル２００２は、１４日間の期間、０．４８±０．０２μｌ／時間の平均ポンピング速度を有し、平均充填容量は２０７±７μｌであった。投与の速度は、０．５μｇ／時間の酵素であり、それは１６８Ｕ／日に等しい２５２μｇ／日または約７Ｕ／時間と同等である。
【０２７２】
図１５Ａは、モデル１００２またはモデル２００２アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプのいずれかが移植されたＨＯマウス間のＨｃｙおよびＣｙｓの血漿レベルを比較するグラフである。両方の群の血漿中の代謝産物レベルの重複が観察された。図１５Ｂは、モデル１００２またはモデル２００２アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプのいずれかを用いる連続投与後の血漿中の２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を比較するグラフである。モデル２００２ポンプが移植されたＨＯマウスの血漿中のＣＢＳ活性は、モデル１００２が移植されたマウスと比較してほぼ２倍であることが観察された。しかしながら、モデル２００２ポンプが移植されたマウスの血漿中のＣＢＳ活性の量の２倍は、モデル１００２ポンプが移植されるとともにモデル２００２群と比較してほぼ半分の血漿ＣＢＳ活性を有するマウスにおいて達成されたものと類似する血漿代謝産物の改善をもたらした。
【０２７３】
モデル２００４および２００６についての投与酵素は、１８μｇ／μｌの濃度の、６２３．２＋１６．４Ｕ／ｍｇの比活性を有するＭＥ−２００ＧＳ  ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓであった。モデル２００４は、２８日間の期間、０．２３＋０．０１μｌ／時間の平均ポンピング速度を有し、平均充填容量は２３７．７＋４．６μｌであった。酵素の投与の速度は４．５μｇ／時間の酵素であり、それは６７Ｕ／日に等しい１０８μｇ／日または約２．８Ｕ／時間と同等である。アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプモデル２００４は３０日目に留置した。
【０２７４】
モデル２００６は、４２日間の期間、０．１５＋０．０１μｌ／時間の平均ポンピング速度を有し、平均充填容量は２３７．２＋３．０μｌであった。酵素の投与の速度は２．７μｇ／時間の酵素であり、それは、４０Ｕ／日に等しい６５μｇ／日または約１．７Ｕ／時間と同等である。アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプモデル２００６は４４日目に留置した。
【０２７５】
図１５Ｃおよび図１５Ｄは、モデル２００４またはモデル２００６アルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標）浸透圧ポンプのいずれかにより２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを投与されたマウスの血漿中の代謝産物レベルおよびＣＢＳ活性を比較するグラフをそれぞれ示す。モデル２００４がモデル２００６ポンプよりも６７％多い酵素を分注するにもかかわらず、両方のマウス群は類似の血漿代謝産物プロファイルを有することが観察された。Ｈｃｙの血漿レベルは２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウス中でかなり低減するが、Ｃｙｓ血漿レベルの増加は小幅にすぎなかったことが観察された。
【０２７６】
実施例１５．２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの長期連続投与はＫＯおよびＩ２７８Ｔマウスにおいて骨粗鬆症を予防する
実施例１のプロトコルを使用する二重エネルギーｘ線吸収測定（ＤＥＸＡ）を使用してＫＯおよびＩ２７８Ｔマウスにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの長期連続投与の効果を分析した。
【０２７７】
Ａ．ＫＯマウスにおける骨石灰化および体組成
３つのマウス群についてＤＥＸＡにより骨密度（ＢＭＤ）および骨塩量（ＢＭＣ）を分析した：＋／−健常ヘテロ接合性対照（ｎ＝４Ｍ＋６Ｆ）、罹患ＫＯ対照（ｎ＝５Ｍ＋１３Ｆ）、および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ）処理ＫＯマウス（ｎ＝６Ｍ＋１５Ｆ）。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスに、２日目から約５ヵ月まで７．５ｍｇ／ｋｇを週３回皮下（ＳＣ）投与した。全ての−／−ＫＯマウスを初回５Ｗ（２〜３５日齢）について処理して新生児死亡を予防した。
【０２７８】
図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、および図１６Ｅは、それぞれ、３つのマウス群間のＢＭＤ（ｇ／ｃｍ２）、ＢＭＣ（ｇ）、全質量（ｇ）、除脂肪量（ｇ）、および脂肪含量（％）を比較するグラフである。表１９は、２つの対照群と比較した処理群の差についての有意性を決定するために使用されるＰ値を提供する。
【０２７９】
【表１９】
2018532763.tif 000021
【０２８０】
閾値として０．０５のＰ値を設定して有意性を決定した。処理群は、両方の対照群よりも有意に高いＢＭＤを有した。処理群は、ノックアウト対照よりも有意に高いＢＭＣ、全質量、除脂肪量、および脂肪含量も有した。したがって、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳによるＫＯマウスの処理は深刻な骨粗鬆症を完全に予防し、体組成（全質量、除脂肪量および脂肪含量）を改善した。
【０２８１】
Ｂ．ＫＯマウスにおける血漿代謝産物
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスにおいて、試験過程にわたり週２回、Ｈｃｙ、Ｃｔｈ、およびＣｙｓの血漿レベルを計測し、図１６Ｆに示す。４１日目（真のゼロ時間を表すのではなく、注射７２時間後の代謝産物レベルを表す）において最初に血液試料を採取し、次いで、４５日目において開始して２週間ごとに試料を採取した。Ｈｃｙのレベル（中段線）は、４５日目における約１８０μＭから、４５日目における約９０μＭに減少し、試験全体にわたりそれらのレベルにおいて安定したままであることが観察された。Ｃｙｓのレベル（上段線）は、処理により４５日目における１００μＭ未満から４５日目における約２００μＭに正常化し、試験過程にわたり持続した。Ｃｔｈのレベル（下段線）は、試験の継続時間全体にわたり約５０μＭで変動した。
【０２８２】
上記のものと同一のマウス／群を使用して血漿代謝産物を測定した。図１６Ｇに示されるとおり、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理ＫＯマウスへの最後の注射２４時間後に代謝産物Ｈｃｙ、Ｃｔｈ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔのエンドポイントレベルを計測し（それぞれの代謝産物についての右側のバー）、非処理健常＋／−（左側のバー）および罹患−／−ＫＯマウス（中央のバー）と比較した。表２０は、２つの対照群と比較した処理群における代謝産物レベルの差についての有意性を決定するために使用されるＰ値を提供する。
【０２８３】
【表２０】
2018532763.tif 000022
【０２８４】
閾値として０．０１のＰ値を設定して有意性を決定した。非処理ＫＯマウスと比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受けたＫＯマウスにおいてＨｃｙのレベルは有意に降下することが観察され、Ｃｔｈレベルは有意に増加することが観察され、Ｃｙｓレベルは正常化された。Ｍｅｔレベルは、非処理ＫＯマウスにおいてわずかに上昇するが、群間で有意に異なることはないことが観察された。
【０２８５】
したがって、ＫＯマウスへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与は、非処理−／−ＫＯマウスと比較してＨｃｙ、Ｃｔｈ、およびＣｙｓ血漿レベルを有意に改善することが観察された。Ｃｙｓの血漿レベルは、健常＋／−マウス値に正常化された（すなわち、それと有意に異なることはなかった）。代謝産物データは、ＤＥＸＡにより決定された表現型と相関することが観察された。
【０２８６】
Ｃ．Ｉ２７８Ｔマウスにおける骨石灰化および体組成
３つのＩ２７８Ｔマウス群についてＤＥＸＡにより骨密度（ＢＭＤ）および骨塩量（ＢＭＣ）を分析した：＋／−健常ヘテロ接合性対照（ｎ＝１０Ｍ＋１１Ｆ）、−／−罹患ホモ接合性Ｉ２７８Ｔ対照（ｎ＝６Ｍ＋８Ｆ）、および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝６Ｍ＋６Ｆ）。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ）処理Ｉ２７８Ｔマウスに、６ヵ月齢から１３ヵ月齢まで７．５ｍｇ／ｋｇを週３回皮下（ＳＣ）投与した。図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄ、および図１７Ｅは、それぞれ、３つのマウス群間のＢＭＤ（ｇ／ｃｍ２）、ＢＭＣ（ｇ）、全質量（ｇ）、除脂肪量（ｇ）、および脂肪含量（％）を比較するグラフである。表２１は、対照群と比較した処理群の差の有意性を決定するために使用されるＰ値を提供する。
【０２８７】
【表２１】
2018532763.tif 000023
【０２８８】
閾値として０．０５のＰ値を設定して有意性を決定した。全てのＤＥＸＡにより決定されたパラメータは、健常ヘテロ接合性マウスと比較して罹患Ｉ２７８Ｔマウスにおいて有意に減少した。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳによるＩ２７８Ｔマウスの処理は、非処理Ｉ２７８Ｔマウスと比較して除脂肪量の量を除く全てのパラメータの有意な相関をもたらした。実際、骨石灰化（ＢＭＤ）値は、健常ヘテロ接合性対照と２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウスとの間で区別不能であることが観察された。したがって、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳによるＩ２７８Ｔマウスの処理も深刻な骨粗鬆症を予防し、体組成（全質量、除脂肪量および脂肪含量）を改善した。
【０２８９】
Ｄ．Ｉ２７８Ｔマウスにおける血漿代謝産物
上記のものと同一のマウス／群において血漿代謝産物を測定し、互いに比較した。図１７Ｆに、代謝産物Ｈｃｙ、Ｃｔｈ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔの血漿レベルを示す。左側のバーは＋／−健常対照についての代謝産物のレベルを表し、中央のバーは−／−罹患対照についての代謝産物のレベルを表す。右側のバーにより２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスにおけるそれぞれの代謝産物のレベルを表す。表２２は、＋／−健常対照、−／−罹患対照、および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウス間の血漿代謝産物レベルの差についての有意性を決定するために使用されるＰ値を示す。
【０２９０】
【表２２】
2018532763.tif 000024
【０２９１】
閾値として０．０１のＰ値を設定して有意性を決定した。非処理罹患Ｉ２７８Ｔ対照と比較して２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受けたＩ２７８ＴマウスにおいてＨｃｙのレベルは有意に減少することが観察され、Ｃｔｈレベルは有意に増加することが観察され、Ｃｙｓレベルは有意に改善されたが、正常化されなかった。Ｍｅｔレベルは非処理罹患Ｉ２７８Ｔマウスにおいてわずかに上昇し、処理後のＩ２７８Ｔマウスにおいて＋／−ヘテロ接合性マウスレベルに有意に正常化された。
【０２９２】
これらの結果は、処理Ｉ２７８Ｔ群において＋／−レベルへのＣｙｓレベルの正常化が観察されなかったことを除きＫＯマウスを用いるＤＥＸＡ試験における結果に類似する。したがって、Ｉ２７８Ｔマウスへの連続長期２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ投与は、非処理−／−ホモ接合性罹患マウスと比較してＨｃｙ、Ｃｔｈ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ血漿レベルを有意に改善した。これらの代謝産物データは、ＤＥＸＡにより評価された表現型を補強することが観察された。
【０２９３】
したがって、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの長期連続投与はＫＯおよびＩ２７８Ｔマウスモデルの両方において骨粗鬆症を予防し、体組成を改善し、ホモシスチン尿症に関連する代謝産物レベルを改善するために有効である。
【０２９４】
実施例１６．２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの連続長期投与はＩ２７８Ｔマウスにおいて肝代謝産物および機能を改善し、炎症を低減させ、血漿脂質を正常化する
Ｉ２７８Ｔマウスへの２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与は、肝グルコース代謝、酸化還元状態、およびメチル化潜在性ならびに脂質代謝を改善することが観察された。肝機能は非罹患であることが観察され、炎症サイトカインおよび血漿脂質は処理により正常化されることが観察された。
【０２９５】
Ａ．Ｉ２７８Ｔマウスにおける肝機能および脂質代謝に対する２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの長期投与の効果
２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓによる長期処理後のＩ２７８Ｔマウスにおいて血漿バイオマーカを計測して肝機能、炎症、および血漿脂質レベルを分析した。３つのＩ２７８Ｔマウス群を分析した：＋／−健常ヘテロ接合性対照（ｎ＝３）、−／−罹患ホモ接合性対照（ｎ＝３）、および２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウス（ｎ＝３）。２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスに、６ヵ月齢から１３ヵ月齢まで７．５ｍｇ／ｋｇを週３回皮下（ＳＣ）投与した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の酵素活性；サイトカインＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ２０）、ＩＬ−１３、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−αの濃度；ならび血漿脂質（総、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール、ならびにトリグリセリド）の濃度を血漿中で計測した（結果示さず）。肝機能は、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＡＬＰ血漿活性が参照範囲内であるため、非罹患であることが観察された。炎症性サイトカイン、特にＩＬ−１２（ｐ４０）およびＩＬ−１３は非処理Ｉ２７８Ｔマウスにおいて上昇し、処理群については正常化されることが観察された。血漿脂質パネルは、非処理Ｉ２７８Ｔマウスが健常＋／−対照と比較して有意に高い総、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロールを有する一方、かなり減少したトリグリセリドを有することを示した。脂質プロファイルは、２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウスにおいて完全に正常化された。
【０２９６】
Ｂ．Ｉ２７８Ｔマウスにおける肝代謝に対する２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの長期投与の効果
上記のバイオマーカに加え、核磁気共鳴（ＮＭＲ）メタボロミクスを実施して同一マウスの肝組織を分析してＩ２７８Ｔマウスに対する２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓによる長期処理の効果を調査した。親水性および親油性溶媒中に肝組織からの代謝産物を抽出し、ＮＭＲを使用して別個に定量した。
【０２９７】
図１８Ａに、グリコゲン、グルコース、グルタチオン（ＧＳＨ）、総グルタチオン、および親水性部分のメチル基の濃度を示す。左側のバーは＋／−健常対照における濃度を表し、中央のバーは−／−罹患対照における濃度を表す。右側のバーにより２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスにおける濃度を表す。図１８Ｂに、疎水性部分について、総不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ｔ−脂肪酸、（ＣＨ２）ｎ脂質、および総脂質を示す。左側のバーは＋／−健常対照における濃度を表し、中央のバーは−／−罹患対照における濃度を表す。右側のバーにより２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスにおける濃度を表す。Ｉ２７８Ｔマウスへの２００ＭＡ０Ｂ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与は、肝グルコース代謝、酸化還元状態、およびメチル化潜在性ならびに脂質代謝を改善することが観察された。
【０２９８】
実施例１７．２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓによる長期処理はＩ２７８Ｔマウスにおいて眼球異常を改善する
Ｉ２７８Ｔ（＋／−）健常ヘテロ接合性対照マウス、非処理−／−罹患ホモ接合性対照マウス、および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理−／−ホモ接合性Ｉ２７８Ｔマウスにおいて血漿中の代謝産物レベルの変化を計測した。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（Ｃ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ）処理マウスに、２日齢から４ヵ月齢まで７．５ｍｇ／ｋｇを週３回皮下（ＳＣ）投与した。図１９Ａに６週間から４ヵ月までの血漿代謝産物レベルの変化を示す。マウスを２日齢から処理したため、注射７２時間後に開始してレベルを計測した。
【０２９９】
予測されるとおり、非処理ホモ接合性Ｉ２７８Ｔ対照は、図１９Ａに示されるとおり、健常ヘテロ接合性対照と比較して有意に上昇したＨｃｙレベルおよび低減したＣｙｓレベルを有した。非処理ホモ接合性Ｉ２７８ＴマウスにおけるＨｃｙレベルは、試験の間、約４００μＭ〜４４０μＭで変動し、それは機能的ＣＢＳの欠落に起因するＨｃｙの連続的蓄積の証拠である。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理Ｉ２７８Ｔマウスにおいて、Ｈｃｙレベルは２３０μＭから約７０μＭまで減少し、残りの試験全体にわたりこのレベルを維持した。さらに、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの活性は試験全体にわたり約５０μＭまでの血漿Ｃｔｈの蓄積をもたらし、より重要なことに、約２３０μＭへの血漿Ｃｙｓレベルの正常化をもたらし、それは試験全体にわたり維持された。
【０３００】
Ｉ２７８Ｔマウスからの眼球を分析し、３つの群間で比較した。図１９Ｂおよび図１９Ｃにおいてそれぞれ健常ヘテロ接合性対照および非処理−／−罹患Ｉ２７８Ｔ対照を比較し、非処理ホモ接合性対照は、子午線真上の水晶体赤道部において終結し、水晶体後面上で成長しなかったより少数の薄い小帯線維を有することが観察された。図１９Ｄおよび図１９Ｅに示される２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ処理マウスからの試料において、小帯線維の密度の濃縮および水晶体の背面上への小帯線維の「再成長」の徴候が観察された。これらの観察は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓによる長期処理がＩ２７８Ｔホモ接合性マウスにおける眼球異常に対する好ましい効果を有した証拠である。
【０３０１】
実施例１８．２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与およびＭｅｔ制限食の組合せはＩ２７８ＴマウスにおいてＨｃｙレベルを正常化する
Ｉ２７８Ｔマウスにおいて食餌試験を実施し、それらを分析した。１０週齢のマウスの血漿代謝産物：＋／−Ｉ２７８Ｔ（対照）、−／−Ｉ２７８Ｔ（陰性対照）、および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＰＢＳ（ＯＴ−５８）により処理された−／−マウス。それぞれの群をさらに下位群に分け：１群を常用食（８．２ｇ／ｋｇのＭｅｔ  ＴＤ．０１０８４食＋亜鉛水）（ＲＥＧ）に供し、１群をメチオニン制限食（０．５ｇ／ｋｇのＭｅｔ  ＴＤ．１１０５９１食＋ベタイン水）（ＭＲＤ）に供した。Ｗ５の週齢において処理を開始した。
【０３０２】
図２０Ａは、６つの群間のＨｃｙのレベルを示す。高レベルのＨｃｙ（３５６μＭ、Ｉ２７８Ｔマウスを使用する上記実験と一致）は、ＲＥＧ食の−／−マウスにおいて観察された。Ｈｃｙのレベルは、ＲＥＧ食の処理群においてかなり低い（５１μＭ）ことが観察された。比較的高いレベルのＨｃｙ（４１μＭ）もＭＲＤ食の−／−マウスにおいて観察され、それはＯＴ−５８処理により正常化された（ＭＲＤの＋／−における４μＭに対する２μＭ）。
【０３０３】
図２０Ｂは、６つの群間のＣｔｈのレベルを示す。高レベルのＣｔｈが両方の食餌の−／−ＯＴ−５８処理マウスにおいて観察され、ＲＥＧについては１１３μＭであり、それに対してＭＲＤ食については１０μＭであり、そのレベルは基質利用可能に起因してＲＥＧ食のマウスにおいてより高かった。ＲＥＧ食とＭＲＤ食の間の類似傾向が残りの群について観察され、それは高レベルのＣｔｈ（特にＲＥＧの−／−におけるもの）が予想される食餌から生じる証拠である。
【０３０４】
図２０Ｃは、６つの群間のＣｙｓのレベルを示す。ＣｙｓレベルはＲＥＧ食の−／−マウスにおいてのみかなり減少することが観察された一方、ＭＲＤ食および／またはＯＴ−５８処理はＣｙｓの血漿レベルを正常化することが観察された。
【０３０５】
図２０Ｄは、６つの群間のＭｅｔのレベルを示す。Ｍｅｔの血漿レベルは、ＲＥＧ食の−／−マウスにおいて高い（１３１３μＭ）ことが観察され、それは標準食のＩ２７８Ｔマウスにおいて既に観察された。このような高レベルのＭｅｔは、１７〜１９日齢の非処理ＣＢＳ  ＫＯマウスにおいてのみ既に観察された。ＰＢＳ注射を受けたＲＥＧ食の−／−Ｉ２７８Ｔマウスにおける高いＭｅｔレベルは、動物施設により提供されるＳＴＤ食と比較してこの実験において対照食として使用されるＲＥＧ食中のより高い含量のＭｅｔの結果である可能性が高かった。
【０３０６】
これにもかかわらず、ＲＥＧ食の−／−マウスにおけるＯＴ−５８処理は、Ｍｅｔのレベルをかなり減少させる（２０１μＭから６６μＭ）ことが観察されたが、レベルを正常化しなかった。ＭＲＤ食のマウスにおけるＭｅｔレベルは、正常または正常よりも低いことが観察され、処理からのわずかな効果を示したにすぎなかった。
【０３０７】
したがって、Ｍｅｔ制限食および２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与の組合せは、Ｉ２７８Ｔマウスにおける代謝産物レベルを正常化することが観察された。ホモシスチン尿症対象における２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ（ＯＴ−５８）と非制限（単に緩和されるだけでない）食の同時投与は、Ｈｃｙの５０μＭへの低減をもたらした。
【０３０８】
実施例１９．ラットにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態
Ａ．単回投与薬物動態
ラットにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態を評価するため、野生型スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットに静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）経路を介して単回用量の２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを注射した。表２３に示されるもののように、同一のまたは極めて類似する試験設計を使用して３つの別個の単回投与ＰＫ試験を組み合わせた。第３（反復投与）のＰＫ試験（第７〜９群）の設計は、最初の投与後のデータ抽出およびしたがって単回投与ＰＫ試験（第１〜６群）とのその組合せを可能とするように調整した。表２３に列記される指定時間において血漿を回収し、実施例１に詳述される方法を使用してＣＢＳ活性について分析した。
【０３０９】
【表２３】
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【０３１０】
４（ＩＶ）、８（ＳＣ）、および２４ｍｇ／ｋｇ（ＳＣ）の単回ＩＶまたはＳＣボーラス投与後の雄および雌ラットにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの比活性を、図２１Ａおよび図２１Ｂに示す。雄および雌ラットへのＩＶ注射を介する２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与からの結果は、ほぼ重ね合わせ可能であった。しかしながら、ＳＣ経路を介して、かなりの差が８または２４ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの単回投与後の雄および雌間で観察された。図２１Ａ（４ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）および図２１Ｂ（８ｍｇ／ｋｇおよび２４ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ）の結果から計算された雄および雌におけるＩＶおよびＳＣ経路の両方についてのＰＫパラメータを表２４に示す。ラットにおけるＳＣからの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのバイオアベイラビリティは強力に性依存的であり、雌（約３６％）よりも雄は吸収が低く（１９〜２１％）、バイオアベイラビリティはＨＯマウスにおいて観察されたもの（５２〜８３％）と比較してラットにおいてかなり低かった。
【０３１１】
【表２４】
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【０３１２】
Ｂ．反復投与薬物動態
長期毒性試験を実施するための種としてラットをさらに評価するため、４ｍｇ／ｋｇ（低）、８ｍｇ／ｋｇ（中）、または２４ｍｇ／ｋｇ（高）の２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのいずれかの４８時間ごとの合計９回のＳＣ注射を受ける３つのスプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット群において２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態を測定した。表２３に試験設計を概略する。実験は２４日間の長さにわたり実施した。血漿を回収し、実施例１に詳述される方法を使用してＣＢＳ活性について分析した。
【０３１３】
図２１Ｃに示されるとおり、経時的にプロットされた反復投与ＰＫ試験についてのＣＢＳ比活性を中用量の８ｍｇ／ｋｇで例示する（類似の現象は低用量（４ｍｇ／ｋｇ）および高用量（２４ｍｇ／ｋｇ群）について観察された）。矢印は注射を示す。ＣＢＳ活性の蓄積は血漿中で観察されず、最初の６回の注射が観察された後にピークＣＢＳ活性のかなりの降下が観察された。血漿中のＣＢＳ活性の予測定常状態レベルを達成することができないラットの不測の不能性は、雌よりも雄において深刻であることが観察され、それはそれらのバイオアベイラビリティの減少に起因する可能性が最も高い（上記単回投与ＰＫデータ参照）。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの後続の投与におけるＣＢＳ活性のかなりの減衰は免疫応答に起因する可能性が高く、それはラットが長期毒性試験に好適な種でない証拠であった。
【０３１４】
実施例２０．サルにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態および薬力学
長期毒性試験のための非ヒト霊長類モデルを評価するため、およびアロメトリックスケーリングを介してヒト有効用量を推定するため、野生型カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの薬物動態および薬力学試験を実施した。
【０３１５】
Ａ．サルにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの単回投与薬物動態および薬力学
単回投与ＰＫ試験について、それぞれの４（ｎ＝２Ｍ＋２Ｆ）匹のサルの３つの実験群を使用して実験を実施した。第１群は、ＩＶ注射を介して２ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを受けた。ＩＶ注射０、０．０８３、０．１６、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、７２、１２０、および１９２時間後において血液を回収した。第２および第３群は、ＳＣ注射を介して２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのいずれかを受けた。ＳＣ注射０、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１９２、２４０、および３３６時間後において血液を回収した。ＣＢＳ活性について回収された血漿を分析し、実施例１に記載の方法を使用して硫黄アミノ酸代謝産物（ホモシステイン、シスタチオニンおよびシステイン）レベルを測定した。
【０３１６】
２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの単回の２ｍｇ／ｋｇ用量のＩＶ投与または２ｍｇ／ｋｇもしくは６ｍｇ／ｋｇ用量のＳＣ投与を受けた後のサルにおけるＣＢＳ比活性経時曲線を図２２Ａに示す。単回注射後のＩＶおよびＳＣ投与の両方について計算されたＰＫパラメータを表２５をまとめる。サルにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのバイオアベイラビリティは約８０％であると計算され、それは５ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量が投与されたＨＯマウスにおけるバイオアベイラビリティ（８３％）とほぼ同一である。サルにおける血漿からの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの排出半減期は、ＩＶデータセットから６７時間、およびＳＣデータセットからの７３時間であると計算された。ｃｍａｘは、２ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量において４０．８ｍＵ／μＬおよび６ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量において１１４．９ｍＵ／μＬであると計算された。
【０３１７】
表２５は、サルにおいて２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓを用いて実施された単回投与実験から得られたＰＫパラメータを列記する。
【０３１８】
【表２５】
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【０３１９】
注射されたサルは健常野生型であり、天然で低いＨｃｙレベル（ホモシスチン尿症のネズミモデルにおいて１５０〜５００μＭと比較して３〜５μＭ）を有したため、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの単回ＩＶまたはＳＣ投与後の薬力学的効果は、予測されなかった。ＨｃｙおよびＣｙｓの血漿レベルの有意な変化は、注射されたサルにおいて観察されなかった。しかしながら、Ｃｔｈの有意なスパイクが、初回レベルと比較してＩＶ投与８時間後、ならびにＳＣ投与８および４８時間後の血漿中で観察され、それは非罹患健常サルにおいてもＰＤ効果の証拠であった（図２２Ｂ）。Ｃｔｈ血漿レベルのスパイクは、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与から生じた可能性が高い。それというのも、ＣＢＳはＣｔｈを形成することが公知の唯一の酵素であるためである。さらに、ＣＢＳ酵素は通常、血漿中で循環し、機能しない。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの投与により血漿中で形成されるＣｔｈは、ＣｙｓまたはＨｃｙよりも低速でクリアランスされることが観察された。したがって、代謝産物、特にＣｔｈを多回投与試験においてさらにモニタリングして観察されたＰＤ効果がより顕著であるか用量依存的であるかを決定した。
【０３２０】
Ｂ．サルにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの反復投与薬物動態および薬力学
４匹のサル（メイン下位群における１Ｍ＋１Ｆおよびリカバリー下位群における１Ｍ＋１Ｆ）の３つの群が１ｍｇ／ｋｇ（低）、３ｍｇ／ｋｇ（中）、または１０ｍｇ／ｋｇ（高）の２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのいずれかの７２時間ごとの合計６回連続のＳＣ用量を受ける反復投与実験を実施した。メイン下位群において最初の注射の０、３２、７２、１０４、１４４、１７６、２１６、２４８、２８８、３２０、３６０、３９２、および４０８時間後においてサルから血液を回収した一方、リカバリー下位群の動物から最初の注射の４３２、４５６、４８０、５２８、および６９６時間後の追加の時間において採血した。血漿を回収し、実施例１に記載の方法を使用してＣＢＳ活性および硫黄アミノ酸（ホモシステイン、シスタチオニン、システイン、ランチオニン、およびホモランチオニン）レベルについて分析した。
【０３２１】
３日間ごとの６回連続のＳＣ注射後の低（１ｍｇ／ｋｇ）、中（３ｍｇ／ｋｇ）および高（１０ｍｇ／ｋｇ）用量群について２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ比活性経時曲線を、図２３Ａに示す。カニクイザルへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの皮下投与は、１６日間にわたる３日間ごとの所与の６回投与後のＣＢＳ活性の予測可能で用量依存的な血漿レベルをもたらした。ラット反復投与ＰＫ試験の結果と対照的に、ＣＢＳ活性の減衰は、野生型サルへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの反復投与後に検出されなかった。酵素のそれぞれの後続の投与は、血漿中のＣＢＳ活性の完全に予測可能な蓄積をもたらし、本質的に最初の３回投与後に定常状態レベルに到達した。さらなる投薬は定常状態を維持することが観察され、排出速度は吸収速度と同等であり、一定ピークおよびトラフ血漿レベルをもたらした。定常状態における平均ピーク血漿濃度（ｃｍａｘ−ｓｓ）は３６〜３９ｍＵ／μｌの範囲の用量について正規化し、トラフ血漿レベルは２３〜２８ｍＵ／μｌの範囲の定常状態における用量について正規化した（ｃｍｉｎ−ｓｓ）。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの排出速度は対数線形であることが観察され、したがって、一次キネティクスを裏付け、その結果、血漿２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ活性の半数の減少に要求される時間は一定であった（データ示さず）。排出半減期は、１６日目における最後の投与後にリカバリー動物において推定され、４９〜６４時間であり、すなわち、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの単回ＳＣ投与後にサルにおいて観察された半減期（７３時間）に類似し、それは複数回投与が排出速度を変化させない証拠であった。
【０３２２】
バイオマーカのシスタチオニンの血漿レベルは、非罹患健常サルにおいても２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ活性を示すことが見出された（単回投与サルデータ参照）。低（１ｍｇ／ｋｇ）、中（３ｍｇ／ｋｇ）、高（１０ｍｇ／ｋｇ）用量について７２時間空けて６回の注射を受けたサルにおける結果を図２３Ｂに提示する。Ｃｔｈのレベルは、血漿中の２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ活性のピークおよびトラフと十分相関し、用量依存的であることも観察された。ホモシステインおよびシステインについて用量群間で明らかな差は観察されなかった（データ示さず）。
【０３２３】
ＣＢＳにより産生されるチオエーテルのシスタチオニンに加え、選択時点における反復投与試験からのサル血漿試料中で、硫化水素産生の代理マーカとして選択された２つのチオエーテルのランチオニンおよびホモランチオニンを計測した。硫化水素は、多くの生理学的プロセスにおいて新たに出現した重要なシグナリング分子であり、したがって、治療用途について近年集中的に試験されている。
【０３２４】
表２６は、ＳＣ経路における異なる用量における２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの反復投与後の野生型サルにおけるシスタチオニン、ランチオニン、およびホモランチオニンの血漿レベルを提示する。最初の注射の０時間（投与前）、１７６時間および３９２時間後における代謝産物レベルを報告する。データを平均±標準誤差（ＳＥＭ）としてμＭで提示する（ｎ＝４）。
【０３２５】
【表２６】
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【０３２６】
野生型サルへの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの反復投与はシスタチオニンおよびランチオニンの血漿レベルを増加させることが観察されたが、ホモランチオニンのレベルは有意に影響を受けなかった。シスタチオニンおよびランチオニンの増加は用量に正比例して観察され、用量依存性はシスタチオニンよりもランチオニンについて顕著であることが観察された。
【０３２７】
Ｃ．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｃ１５Ｓ活性アッセイ
内部標準としてのシスタチオニンＭ＋８（１３Ｃ２Ｄ６）を使用するＣＢＳ活性の産物としてのシスタチオニンＭ＋４の測定のためにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して開発された生物分析的方法が開発され、サルおよびヒト血漿試料の両方についてバリデートされており、したがって、それを使用して薬物動態および毒性試験ならびに臨床試験からの試料中のＣＢＳ活性を測定することができる。以下の改変で本質的に実施例１に記載のとおり酵素アッセイを実施した。重水素化Ｄ，Ｌ−ホモシステインＭ＋４を使用して反応混合物中で未標識Ｌ−セリンとの反応を開始させた。３７℃における３０分間のインキュベーション後、６ＮのＨＣｌを使用する酸性化により酵素反応を停止させ、ＥＺ：ファースト（ｆａａｓｔ）キット（フェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、米国）を使用して反応の標識産物（シスタチオニンＭ＋４）を抽出した。手短に述べると、チューブ中で氷上で５０μｌの試料（較正標準、ＱＣ試料または酵素反応）を混合し、１００μｌの内部標準溶液（シスタチオニンＭ＋８、０．２５ｎｇ／μｌ）および２５０μｌの水により光から保護した。ミックスをＭＣＸカートリッジカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））により抽出した。溶出媒体（メタノール中６Ｎのアンモニア）を４５℃において蒸発乾固させた。乾燥残留物をＥＺ：ファースト（ｆａａｓｔ）キットの溶出媒体中で溶解させ、誘導体化し、キットの製造業者のプロトコルに従って脂質−脂質抽出した。抽出プレートにより固相抽出を自動化してスループットを増加させ、時間を節約した。酵素の起源（血漿試料中に存在するｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳもしくはＣ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳまたは対照または血漿試料中の微量の内因性サル／ヒトＣＢＳ）にかかわらず、計測可能な濃度のシスタチオニンＭ＋４が観察された。較正範囲にはかなり留意した。それというのも、発生した測定値は、定量された濃度範囲（５．００〜１５００ｎＭ）のより高い部分に存在したためである。
【０３２８】
以下の表１２〜１４は、基質としてＤ，Ｌ−ホモシステインＭ＋４を使用するＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、および基質としてＬ−［１３Ｃ−Ｕ］−セリンを使用する放射アッセイにより測定されたＣ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ比活性の比較を示す。酵素の比活性をｍＵ／μｌで提示する。「ｎ．ｄ．」は、「未測定」を意味する。表２７は、２ｍｇ／ｋｇの単回用量がＩＶ注射されたカニクイザルからの血漿試料のセットにおけるＣ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ比活性の比較を示す。
【０３２９】
【表２７】
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【０３３０】
表２８は、２ｍｇ／ｋｇの単回用量がＳＣ注射されたカニクイザルからの血漿試料のセットにおけるＣ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ比活性の比較を示す。
【０３３１】
【表２８】
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【０３３２】
表２９は、６ｍｇ／ｋｇの単回用量がＳＣ注射されたカニクイザル（実施例２０に関する）からの血漿試料のセットにおけるＣ１５Ｓ／ＭＥ−２００ＧＳ比活性の比較を示す。
【０３３３】
【表２９】
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【０３３４】
実施例２１．動物からヒトへのＰＫ／ＰＤデータの外挿
ほとんどの場合、薬物動態応答を誘発するために要求される薬物の血漿レベルは、受容体または酵素標的の種特異的配列変動に起因して種にわたり異なる。例えば、ヒトタンパク質に対する抗体は、標的タンパク質配列の種差に起因してネズミおよびヒト標的タンパク質についての極めて異なる親和性を有し得る。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの場合、生物学的標的は種にわたり同一であるアミノ酸、Ｈｃｙである。さらに、標的組織への薬物の分布は種にわたり変動し得、種特異的生物分布に起因して薬物血漿レベルにより容易に予測することができない。しかしながら、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ／Ｃ１５Ｓについての「標的組織」は、血漿中の薬物動態パラメータの種間比較からの外挿ヒト値の予測に高程度の確実性を与える血漿である。
【０３３５】
本明細書の試験は７．５ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量を使用してマウスにおいて実施し、用量応答試験は、５ｍｇ／ｋｇの用量がバイオマーカ：Ｈｃｙ、ＣｔｈおよびＣｙｓの血漿レベルのモジュレーションに関して効力を最大化することを実証した。５ｍｇ／ｋｇの用量を使用し、ヒト（７０ｋｇ）およびマウス（０．０２５ｋｇ）間の体表面積の差を補正することにより、０．４ｍｇ／ｋｇの用量が有効ヒト等価用量（ＨＥＤ）であると推定された。この用量において、ピーク血漿レベルはマウスにおいて５０ｍＵ／μＬであり、ＡＵＣは３０６０ｍＵ−ｈ／ｍＬであった。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓ活性についての基質（Ｈｃｙおよびセリン）が種にわたり同一であり、作用部位は血液プール自体であったため、それらのパラメータは、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ臨床試験における効力に要求される標的ヒト血漿レベルの正確な推定値を提供する。
【０３３６】
薬物動態試験は、ＣＢＳＤＨのネズミ動物モデル、正常スプラーグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット、および正常カニクイザルにおいて種々の用量レベルにおける単回および複数回ＳＣ注射のいずれかの後に実施した。さらに、３つ全ての種において２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５ＳのＩＶ投与後に単回投与薬物動態試験を実施してＳＣ投与後の３つ全ての種におけるバイオアベイラビリティを評価した。ＳＣ投与後のマウス、ラットおよびサルモデルにおける用量について補正された薬物動態パラメータのバイオアベイラビリティ（Ｆ％）のまとめを、表に提供する。
【０３３７】
【表３０】
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【０３３８】
これらの結果によれば、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓは、３つ全ての種においてＳＣ投与後に血流中に低速で吸収された。吸収半減期は、単回ＳＣ注射後のマウスにおいて５〜１２時間、ラットにおいて１０〜１６時間、およびサルにおいて８〜１０時間の範囲で種にわたり類似しており、それは個々の動物において２４時間〜４８時間の範囲のＴｍａｘ値に導いた。排出半減期（Ｔ１／２）は、マウスにおいて２０時間であり、ラットにおいて４４．５時間であり、サルにおいて７３時間であった。ＳＣ投与後に血液中に吸収される２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの割合（Ｆ％）は、マウス（５ｍｇ／ｋｇ用量）およびサル（１、３または１０ｍｇ／ｋｇの用量）モデルの両方において＞８０％であった。しかしながら、血液中に吸収される２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの割合は、雄ラットにおいて２０％であり、雌ラットにおいて３６％にすぎなかった。表３０において、ラットにおけるＡＵＣ／用量およびＣｍａｘ／用量を８０％のバイオアベイラビリティ（表３０の括弧の値）に補正して同一のＦ％において種間比較を行った。
【０３３９】
種間比較は、３つ全ての種（マウス、ラットおよびサル）において８０％のバイオアベイラビリティを想定する体表面積スケーリングに基づき実施して対数体重および種々のＰＫパラメータ（ＡＵＣ／用量、用量当たりのＣｍａｘおよびＴ１／２）の対数間に線形相関が存在したか否かを決定した。これらのパラメータの線形相関は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについての薬物動態パラメータが体表面積にスケーリングされ、したがって、ヒト値を予測する可能性が高いことを示した。線形相関により、前臨床データからの臨床用量および投薬レジメンの予測を行うことが可能となる。
【０３４０】
線形相関は、２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについて種にわたり薬物動態パラメータＡＵＣ、ＣｍａｘおよびＴ１／２について観察された。図２４Ａ（ＡＵＣ／用量）、図２４Ｂ（Ｃｍａｘ／用量）、および図２４Ｃ（Ｔ１／２）に示されるとおり、優れた線形相関は、用量について補正された関連ＰＫパラメータに対するそれぞれの種の対数体重間で観察された。それぞれのパラメータについてヒト（７０ｋｇ）についての対数体重に外挿することにより、ヒト対象についてＡＵＣ／用量、Ｃｍａｘ／用量、およびＴ１／２を計算した。表３０に予測ヒト値を提供する。
【０３４１】
ヒトにおける外挿／予測半減期は、約１７５時間または７．３日間であった。ヒト予測有効用量はアロメトリックスケーリングによりマウスにおける有効用量（５ｍｇ／ｋｇ）から計算し、７０ｋｇのヒトにおいて０．４ｍｇ／ｋｇであった。３４ｍＵ／μＬ（１ｍｇ／ｋｇ当たり）の予測ヒトｃｍａｘおよび４８〜７２時間のＴｍａｘ範囲を使用して、ヒトにおける単回投与ＰＫ曲線について仮定曲線を構築し、それを図２４Ｄに示す。Ｅ切片は４３．０７９ｍｇ／μＬであり、半減期は１７６．７３７時間であった。マウスおよびサルからのデータも、図２４Ｄにおいて比較目的のために示す。表３１は、ヒトについて推定された外挿濃度を提供する。
【０３４２】
【表３１】
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【０３４３】
図２４Ｄに由来するＰＫパラメータから、ヒトにおける一次キネティクスを想定する複数回投与ＰＫ曲線をモデリングし、それを図２４Ｅに示す。
Ａ．ヒトにおける仮定反復投与ＰＫ曲線
図２４Ｆは、定常状態血漿レベルへの接近の間、週１回投与される１ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量におけるヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについての予測ＰＫ値ならびに定常状態における予測ピークおよびトラフレベル（淡灰色）を示す。図２４Ｇは、定常状態血漿レベルへの接近の間に週２回投与される１ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量におけるヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓについての予測ＰＫ値ならびにこの投薬間隔におけるヒトにおける予測ピークおよびトラフレベル（淡灰色）を示す。表３２は、週１回および週２回投与される０．３３、０．６６、および１ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量におけるヒトにおける２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの予測ピークおよびトラフ血漿レベルを比較する（ヒトにおける８０％のバイオアベイラビリティを想定）。
【０３４４】
【表３２】
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【０３４５】
これらの計算から、定常状態における３１〜４５ｍＵ／μＬの範囲の血漿レベルをもたらすために、ヒト患者に週１回ＳＣ投与される０．６６ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓの用量が予測された。同様に、週２回投与される０．３３の用量は、定常状態における３５〜４１ｍＵ／μＬの範囲の血漿レベルをもたらすことが予測された（約８回の投与後）。これらの予測は、マウスおよびサルの両方で観察されたとおり８０％の皮下バイオアベイラビリティを想定する。２０ＮＨＳ  ＰＥＧ−ｈｔＣＢＳ  Ｃ１５Ｓのこれらの用量は、マウスのもの（５０ｍＵ／μＬのピークレベル）に類似する血漿レベルについての有効範囲でピークおよびトラフ血漿レベルを産生することも予測される。さらに、これらの用量は、ネズミ試験単独から予測された０．４ｍｇ／ｋｇのヒト有効用量に対応する。前臨床種にわたる体重およびＰＫパラメータの線形相関により、アロメトリックスケーリング（体表面積スケーリング）が、値を種にわたり比較することによりヒトにおけるＰＫパラメータＡＵＣ、Ｃｍａｘおよび排出半減期を予測することが可能となった。
【０３４６】
ヒトにおける有効用量を（マウスデータおよび３つ種にわたるアロメトリックスケーリングから直接）予測する方法の両方は、有効用量予測（ＨＥＤ）に関して一致することが観察された。したがって、８０％のバイオアベイラビリティを想定すると、週２回投与される０．３３ｍｇ／ｋｇまたは週１回投与される０．６６ｍｇ／ｋｇの提案用量が、ヒト臨床試験における有効用量である可能性が高い。
【０３４７】
関連分野の上記の実施例およびそれに関する限定は、説明的であり、排他的でないものとする。関連分野についての他の限定は、本明細書および図面の試験の精読時に当業者に明らかになる。
【０３４８】
多数の例示的態様および実施形態を上記に考察してきたが、当業者は、ある改変、置換、付加およびそれらの下位の組合せを認識する。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および以下に導入される特許請求の範囲は、全てのそのような改変、置換、付加および下位の組合せをそれらの真の主旨および範囲内に存在するものとして含むものと解釈されることが意図される。
【０３４９】
本出願において引用または特定される全ての特許、特許出願、特許刊行物、科学論文などは、本出願が関連する技術水準をより完全に記載するために参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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