(57)【要約】  組換えポリペプチドを作成するための方法であって、前記方法が、（ａ）（ｉ）前記組換えポリペプチドアスホターゼアルファ（配列番号１）を発現可能な細胞及び（ｉｉ）このような発現を行うのに適している培養培地であって、前記培養培地が約２５μＭ〜約３００μＭの亜鉛を含む、前記培養培地を含む、１００Ｌ〜２５，０００Ｌの流加バイオリアクターを提供すること、（ｂ）前記組換えアスホターゼアルファを発現するのに好適な条件下で前記細胞を培養すること、を含み、前記培養培地のｐＨが約６．７〜約７．１であり、ならびに前記培養培地の亜鉛濃度が約２５μＭ〜約３００μＭの亜鉛の濃度で維持されるように、亜鉛が前記培養培地内に加えられる、前記方法。【選択図】図５３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチドを作成するための方法であって、
ａ．ｉ．前記組換えポリペプチドアスホターゼアルファ（配列番号１）を発現可能な細胞、及び
ｉｉ．このような発現を行うのに適している培養培地であって、前記培養培地が約２５μＭ〜約３００μＭの亜鉛を含む、前記培養培地、を含む、１００Ｌ〜２５，０００Ｌの流加バイオリアクターを提供すること、
ｂ．前記組換えアスホターゼアルファを発現するのに好適な条件下で前記細胞を培養すること、を含み、前記培養培地のｐＨが約６．７〜約７．１であり、ならびに前記培養培地の亜鉛濃度が約２５μＭ〜約３００μＭの亜鉛の濃度で維持されるように亜鉛が前記培養培地内に加えられる、前記方法。
【請求項２】
前記培養培地の亜鉛濃度が約２５μＭ〜約１５０μＭの亜鉛の濃度で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地の亜鉛濃度が約６０μＭ〜約１５０μＭの亜鉛の濃度で維持される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地の亜鉛濃度が約２８μＭの亜鉛の濃度で維持される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地のｐＨが約６．８〜約７．０で維持される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地のｐＨが約６．９で維持される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
亜鉛が、前記培養培地内に少なくとも１つのボーラスで連続的にまたは半連続的に添加される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの供給ボーラス（複数可）を、培養中、前記培養培地に加えることを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも４つの供給ボーラスが前記培養培地に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記供給ボーラスの添加が前記組換えポリペプチドの比活性を改善する、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも約２．５×１０６生細胞の細胞密度に達するまで第１の温度で前記細胞を培養すること、及び組換えポリペプチド発現のため前記第１の温度より低い第２の温度へシフトすることを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の温度が約３５℃〜約３７．５℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の温度が約２９℃〜約３５℃である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の温度が約３７℃であり、前記第２の温度が約３０℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の温度が約３６．５℃であり、前記第２の温度が約３３℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、ＣＨＯ、ＮＳ０／１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ−７、ヒト胚腎臓株（懸濁培養の増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞）、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＣＶｌ、ＶＥＲＯ−７６、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４細胞及びＨｅｐ  Ｇ２細胞を含む群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項によって作成される組換えポリペプチド。
【請求項１９】
哺乳動物細胞で作成される組換えポリペプチドであって、前記組換えポリペプチドがアスホターゼアルファ（配列番号１）を含み、及び
ａ．約０．９〜約３．５シアル酸モル／タンパク質モノマーモルの間の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）、
ｂ．約５．２〜約６．７の間の等電点電気泳動（ＩＥＦ）、
ｃ．図４１または図４２で示す主要なグリカン構造、
ｄ．図３８または図３９で示す、２−ＡＢ標識化オリゴ糖クロマトグラムプロファイル、
ｅ．図４０または図４４〜４９で示す、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦグリコペプチドフィンガープリントプロファイル、
ｆ．約８８〜１０８ｋＤａ及び生成された組換えポリペプチドの総量の約８５％以上の分子量を有する、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの主バンド、
ｇ．約１９４〜約２７３ｋＤａ及び生成された組換えポリペプチドの総量の約８５％以上の分子量を有する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの主バンド、
ｈ．サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、約９５．０％以上の組換えポリペプチドの二量体、及び約５．０％以下の凝集物、
ｉ．逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を介した約９５．０％以上の純度、
ｊ．アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を介した約９０．０％以上のメインピーク、約６．０％以下の酸性ピーク、及び約４．０％以下の塩基性ピーク、
ｋ．約７５〜約１２５％の割合のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結合、
ｌ．約６２０単位／ｍｇ〜約１２５０単位／ｍｇの生成物の比活性（ｐＮＰＰ）、
ｍ．無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）加水分解アッセイの約１３μＭ〜約６９μＭのＫｍ、
ｎ．無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）加水分解アッセイの約６５ｓ−１〜約１６５ｓ−１のＫｃａｔ、
ｏ．キャピラリー電気泳動のすべてのピークについて約６．４５〜約６．９５のｐＩ範囲、
ｐ．脱グリコシル後、図３４Ａで示すようなＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のピーク、
ｑ．還元及び脱グリコシル後、図３４Ｂで示すようなＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のピーク、
ｒ．図３５で示すＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のピーク、
ｓ．図３６で示すリン酸化プロファイル、
ｔ．図３７Ａで示す、負イオンＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のシアル化グリカンプロファイル、
ｕ．図３７Ｂで示す、正イオンＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上の中性グリカンプロファイル、
ｖ．約０．０３〜約０．１５の組換えポリペプチドの１モル当たりのマグネシウムのモル比、
ｗ．約０．５〜約１．５の組換えポリペプチドの１モル当たりのカルシウムのモル比、及び
ｘ．約０．５〜約３．０の組換えポリペプチドの１モル当たりの亜鉛のモル比、を含む群から選択される少なくとも１つの特性を有する、前記組換えポリペプチド。
【請求項２０】
半分子当たり約０．７〜約１．１９の遊離システインを有する、請求項１８または請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
約１３．５％〜約３５．７％の割合でＳｅｒ９３にてリン酸化を有する、請求項１８、１９または２０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
ＡＥＸクロマトグラムの約９０．０％以上のメインピーク、約６．０％以下の酸性ピーク及び約４．０％以下の塩基性ピークを有する、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
ＡＥＸクロマトグラムの約９３．７％以上のメインピーク、約４．９％以下の酸性ピーク及び約３．４％以下の塩基性ピークを有する、請求項２２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
約０．９〜約３．５シアル酸モル／タンパク質モノマーモルの間の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
１モノマー当たり約１．２〜約３．０シアル酸モル／モルの平均総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する、請求項２４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２６】
１モノマー当たり約１．９〜約２．７シアル酸モル／モルの平均総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）値を有する、請求項２５に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２７】
１モノマー当たり約１．８５〜約２．２８シアル酸モル／モルの平均総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）値を有する、請求項２６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２８】
約０．１５未満のマグネシウムのモル比を有する、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２９】
約０．０５〜約０．１０のマグネシウムのモル比を有する、請求項２８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３０】
約０．１２のマグネシウムのモル比を有する、請求項２８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３１】
サイズ排除ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９５．０％の前記組換えポリペプチドの二量体、及び約５．０％以下のポリペプチド凝集物を含む、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３２】
特にサイズ排除ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９６．８％の前記組換えポリペプチドの二量体、及び約３．２％以下のポリペプチド凝集物を含む、請求項３１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３３】
特にサイズ排除ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９７．６％の前記組換えポリペプチドの二量体、及び約２．４％以下の凝集物を含む、請求項３２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３４】
特にＲＰ−ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９５．０％の純度を含む、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３５】
ＲＰ−ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９７．６％の純度を含む、請求項３４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３６】
約７５〜約１２５％の割合のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結合を含む、請求項１８〜３５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３７】
約８５％〜約９７％の平均ヒドロキシアパタイト結合％を含む、請求項３６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３８】
約９０％〜約９１％の平均ヒドロキシアパタイト結合％を有する、請求項３７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３９】
約６２０〜約１２５０単位／ｍｇの比活性（ｐＮＰＰ）を有する、請求項１８〜３８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４０】
約９０４．０〜約９０７．７Ｕ／ｍｇの平均比活性（ｐＮＰＰ）を有する、請求項３９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４１】
前記組換えポリペプチドが、配列番号１の配列、または配列番号１に完全に相補的な配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８〜４０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４２】
前記流加リアクターが２００Ｌ〜２０，０００Ｌである、請求項１８〜４１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４３】
前記流加リアクターが２，０００Ｌ〜２０，０００Ｌである、請求項４２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１８〜４３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、組成物を含む、医薬製剤。
【請求項４５】
対象の無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の開裂を増加させるための、請求項１８〜４３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドまたは請求項４４に記載の医薬製剤の使用方法。
【請求項４６】
アルカリホスファターゼ欠乏に関連する病態を患っている対象を治療する方法であって、前記方法が、請求項１８〜４３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドまたは請求項４４に記載の医薬製剤の治療に有効な量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
アルカリホスファターゼ欠乏に関連する前記病態が、低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）または神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）が周産期、乳児、若年性または成人ＨＰＰである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
アルカリホスファターゼ欠乏に関連する前記病態が、骨及び歯の非石灰化骨基質及び／または低石灰化によって特徴づけられる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記非石灰化骨基質がくる病及び／または骨軟化症を引き起こす、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象がヒトである、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
添付の配列表に表示されているアミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２に記載のとおり、アミノ酸用の標準的な３文字コードを使用して示される。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル（２０１６年８月１６日作成、ファイル名０３５１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ及びサイズ６，６０４バイト）として提出され、それは本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本開示は組換えポリペプチドを産生する方法に関し、前記方法は、（ａ）（ｉ）組換えポリペプチドアスホターゼアルファ（配列番号１）を発現可能な細胞及び（ｉｉ）このような発現を行うのに適している培養培地であって、前記培養培地が約２５μＭ〜約３００μＭの亜鉛を含む、前記培養培地を含む、１００Ｌ〜２５，０００Ｌの流加バイオリアクターを提供すること、（ｂ）組換えアスホターゼアルファを発現するのに好適な条件下で細胞を培養すること、を含み、培養培地のｐＨは約６．７〜約７．１であり、ならびに培養培地の亜鉛濃度が約２５μＭ〜約３００μＭの亜鉛の濃度で維持されるように、亜鉛は前記培養培地内に加えられる。
【背景技術】
【０００３】
低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）は、機能的な組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）を生成しないという結果になる、致命的、遺伝的及び極めてまれな代謝障害である。骨及び歯の低石灰化を特徴とする非石灰化骨基質の蓄積（例えばくる病、骨軟化症）を引き起こす。成長骨が適切に石灰化しないとき、成長への障害は、影響は関節及び骨の外観を損なうという結果である。この結果はそれにより、運動能力、呼吸機能に影響を及ぼして、死に至ることさえあり得る。ＨＰＰの異なる形態は、周産期、乳児性、若年性及び成人ＨＰＰを含むことが発見された。近年、ほとんどは症状発現の年齢に基づき、周産期、良性出生前、乳児性、若年性、成人及び歯ＨＰＰを含む、６つの病型に定義されている。アスホターゼアルファは、不完全な内因性ＴＮＳＡＬＰレベルに対応するようにデザインされた、承認済みのファースト・イン・クラスの標的化された酵素補充療法である。ＴＮＳＡＬＰによるＨＰＰ治療については、Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６６：９０４−１３を参照のこと。
【０００４】
アスホターゼアルファ（ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標）、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、ヒトＴＮＳＡＬＰの触媒ドメイン、ヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメイン及び骨標的ドメインとして使用したデカアスパラギン酸ペプチド（すなわち、Ｄ１０）からなる可溶性融合糖タンパク質である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アスホターゼアルファは、デカアスパラギン酸ペプチドを欠く可溶性ＴＮＳＡＬＰより高い親和性でヒドロキシアパタイトに結合し、したがってアスホターゼアルファのＴＮＳＡＬＰ部分が、過剰な局所的無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）を効率的に分解させて、正常な石灰化を修復できる。ピロホスフェート加水分解は石灰化を促進し、その効果は非臨床試験で評価される種の間で類似している。最初の有効性試験は、ＨＰＰのマウスモデル（Ａｋｐ２−／−マウス）で実施された。ＴＮＳＡＬＰ遺伝子を不活性化することによって作成された（Ｎａｒｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．２０８：４３２−４６）Ａｋｐ２−／−マウスモデルは、非石灰化骨基質の蓄積を含む、ヒトの状態の多くの一般的な特徴を共有する。
【発明の概要】
【０００５】
特異的な特徴（例えば、特定のグリカン構造、特定の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）値など）を有するアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）の組成物、及びこのような特異的な特徴を有するアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）を作成するために利用される製造工程が、本明細書に開示されている。このようなアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、例えば対象、例えばヒト対象の減少したアルカリホスファターゼタンパク質レベル及び／または機能（例えば、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の不十分な開裂）と関連する状態の治療のための療法での使用に適している、
【０００６】
一態様で、本開示は、アルカリホスファターゼ機能を有する組換えポリペプチドを作成する方法を提供する。種々の実施形態において、アルカリホスファターゼ機能は、当該技術分野において周知のアルカリホスファターゼの任意の機能（例えば、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−ホスフェート（ＰＬＰ）を含む、天然基質に対する酵素活性）を含み得る。このような組換えポリペプチドは、アスホターゼアルファ（配列番号１）を含むことができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、組換えポリペプチドを作成するために前記培養培地に亜鉛を加えることを更に含む。亜鉛は、組換えポリペプチドの活性及び／または安定性を改善するのに役立つことができる。いくつかの実施形態では、前記培養培地の約１〜約３００μＭの亜鉛濃度を提供するために、亜鉛を加えることができる。一実施形態において、培養培地の約１０〜約１５０μＭ（例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μＭ）の亜鉛濃度を提供するために、亜鉛を加えることができる。いくつかの実施形態で、約２５μＭ〜約１５０μＭまたは約６０μＭ〜約１５０μＭの培養培地の亜鉛濃度を提供するために、亜鉛は加えられる。１つの特定の実施形態で、約３０、６０または９０μＭの亜鉛の培養培地の亜鉛濃度を提供するために、亜鉛は加えられる。１つの特定の実施形態で、約２８μＭの培養培地の亜鉛濃度を提供するために、亜鉛は加えられる。いくつかの実施形態では、亜鉛は前記培養培地内に、ボーラスで、連続的に、または半連続的に加えられる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示した方法は、組換えポリペプチドを作成するために前記培養培地のｐＨを管理することを更に含む。例えばｐＨは、約６．８〜約７．０に設定されることができる。１つの特定の実施形態で、ｐＨは約６．９に設定される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている方法は、培養及び／またはポリペプチド生成の間、少なくとも１つの余分な新たな培養培地ボーラス供給を、最初の細胞含有培養培地に加えることを更に含む。新しい培養培地のこのような追加は、生成された組換えポリペプチドの活性（例えば比活性）を改善することができる。一実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの供給ボーラス（複数可）を、培養中、培養培地に加える。１つの特定の実施形態で、少なくとも４つの供給ボーラスを加える。いくつかの実施形態では、供給ボーラスの添加（複数可）は、組換えポリペプチドの比活性を改善する。組換えポリペプチドを生成するために本明細書に開示される細胞は、当該技術分野において周知の任意の細胞（例えば、哺乳動物細胞）であり得る。いくつかの実施形態で、ＣＨＯ、ＮＳＯ／１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ−７、ヒト胚腎臓株（懸濁培養の増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞）、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＣＶｌ、ＶＥＲＯ−７６、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４細胞及びＨｅｐ  Ｇ２細胞を含む群から、細胞は選択される。いくつかの実施形態で、細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
いくつかの実施形態で、細胞は、細胞増殖のために一定時間の第１の温度で増殖し、それからポリペプチド発現のための第２の温度へシフトする。例えばいくつかの実施形態において、少なくとも約２．５×１０６生細胞の細胞密度に達するまで第１の温度で細胞を培養すること、次いで組換えポリペプチド発現のため第１の温度より低い第２の温度へシフトすることを更に含む、方法が開示されている。例えばいくつかの実施形態では、第１の温度は約３５℃〜約３７．５℃である。いくつかの実施形態において、第２の温度は約２９℃〜約３５℃である。いくつかの実施形態において、第１の温度は約３７℃及び第２の温度は約３０℃である。いくつかの実施形態において、第１の温度は約３６．５℃及び第２の温度は約３３℃である。
【００１１】
別の態様において、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれか一つによって生成される、組換えポリペプチドを提供する。このような生成された組換えポリペプチドは、本明細書に開示される生成方法から生じる、特異的な特徴のうちの少なくとも１つを有することができる。このような特徴は、（ａ）約０．９〜約３．５シアル酸モル／タンパク質モノマーモルの間の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）、（ｂ）約５．２〜約６．７の間の等電点電気泳動（ＩＥＦ）、（ｃ）図４１または図４２で示す主要なグリカン構造、（ｄ）図３８または図３９で示す、２−ＡＢ標識化オリゴ糖クロマトグラムプロファイル、（ｅ）図４０または図４４〜４９で示す、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦグリコペプチドフィンガープリントプロファイル、（ｆ）約８８〜１０８ｋＤａ及び生成された組換えポリペプチドの総量の約８５％以上の分子量を有する、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの主バンド、（ｇ）約１９４〜約２７３ｋＤａ及び生成された組換えポリペプチドの総量の約８５％以上の分子量を有する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの主バンド、（ｈ）サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、約９５．０％以上の組換えポリペプチドの二量体、及び約５．０％以下の凝集物、（ｉ）逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を介した約９５．０％以上の純度、（ｊ）アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を介した約９０．０％以上のメインピーク、約６．０％以下の酸性ピーク、及び約４．０％以下の塩基性ピーク、（ｋ）約７５〜約１２５％の割合のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結合、（ｌ）約６２０〜約１２５０単位／ｍｇの生成物の比活性（ｐＮＰＰ）、（ｍ）無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）加水分解アッセイの約１３〜約６９μＭのＫｍ、（ｎ）無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）加水分解アッセイの約６５〜約１６５ｓ−１のＫｃａｔ、（ｏ）キャピラリー電気泳動のすべてのピークについて約６．４５〜約６．９５のｐＩ範囲、（ｐ）脱グリコシル後、図３４Ａで示すようなＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のピーク、（ｑ）還元及び脱グリコシル後、図３４Ｂで示すようなＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のピーク、（ｒ）図３５で示すＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のピーク、（ｓ）図３６で示すリン酸化プロファイル、（ｔ）図３７Ａで示す、負イオンＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上のシアル化グリカンプロファイル、（ｕ）図３７Ｂで示す、正イオンＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル上の中性グリカンプロファイル、（ｖ）約０．０３〜約０．１５の組換えポリペプチドの１モル当たりのマグネシウムのモル比、（ｗ）約０．５〜約１．５の組換えポリペプチドの１モル当たりのカルシウムのモル比、及び（ｘ）約０．５〜約３．０の組換えポリペプチドの１モル当たりの亜鉛のモル比、を含む群から選択される、少なくとも１つを含むことができる。
【００１２】
一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、半分子当たり約０．７〜約１．１９の遊離システインを有する。
【００１３】
一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約１３．５％〜約３５．７％の割合でＳｅｒ９３にてリン酸化を有する。
【００１４】
一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、ＡＥＸクロマトグラムで９０．０％以上のメインピーク、６．０％以下の酸性ピーク、及び４．０％以下の塩基性ピークを有する。１つの特定の実施形態において、作成した組換えタンパク質は、ＡＥＸクロマトグラムで９３．７％以上のメインピーク、４．９％以下の酸性ピーク、及び３．４％以下の塩基性ピークを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約０．９〜約３．５シアル酸モル／タンパク質モノマーモルの間の総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を有する。一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、１モノマー当たり約１．２〜約３．０シアル酸モル／モルの平均総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）値を有する。一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、１モノマー当たり約１．９〜約２．７シアル酸モル／モルの平均総シアル酸含量値を有する。１つの特定の実施形態において、作成した組換えタンパク質は、１モノマー当たり約１．８５〜約２．２８シアル酸モル／モルの平均総シアル酸含量値を有する。
【００１６】
一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約０．１５未満のマグネシウムイオンの結合モル比を有する。いくつかの実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約０．０５〜約０．１０のマグネシウムのモル比を有する。１つの特定の実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約０．１２のマグネシウムイオンの結合モル比を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、生成された組換えタンパク質は、すなわちサイズ排除ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９５．０％の組換えポリペプチドの二量体、約５．０％以下のポリペプチド凝集物を含む。一実施形態において、生成された組換えタンパク質は、すなわちサイズ排除ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９６．８％の組換えポリペプチドの二量体、及び約３．２％以下のポリペプチド凝集物を含む。１つの特定の実施形態において、生成された組換えタンパク質は、すなわちサイズ排除ＨＰＬＣで測定されるように、少なくとも約９７．６％の組換えポリペプチドの二量体、及び約２．４％以下のポリペプチド凝集物を含む。
【００１８】
一実施形態において、生成された組換えタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定した際９５．０％以上の純度を有する。１つの特定の実施形態において、生成された組換えタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定した際９７．６％以上の純度を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、生成された組換えタンパク質は、約７５〜約１２５％の割合のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結合を有する。一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約８５％〜約９７％の平均ヒドロキシアパタイト結合％を有する。１つの特定の実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約９０％〜約９１％の平均ヒドロキシアパタイト結合％を有する。
【００２０】
一実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約６２０〜約１２５０単位／ｍｇの比活性（ｐＮＰＰ）を有する。１つの特定の実施形態において、作成した組換えタンパク質は、約９０４．０〜約９０７．７Ｕ／ｍｇの平均比活性（ｐＮＰＰ）を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列、または配列番号１に完全に相補的な配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２２】
本明細書に開示した組換えポリペプチドは、工業的または商業的規模の下で作成されることができる。例えばいくつかの実施形態において、流加リアクターは、２００Ｌ〜２０，０００Ｌである。いくつかの実施形態において、流加リアクター２，０００Ｌ〜２０，０００Ｌである。
【００２３】
別の態様において本開示は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせた、本明細書に開示した組換えポリペプチドを含む組成物を含む、医薬製剤を提供する。
【００２４】
別の態様において、本開示は、対象の無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の開裂を増加させるために、組換えポリペプチドすなわち本明細書で示す医薬製剤の使用方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本開示は、アルカリホスファターゼ欠乏に関連する病態を患っている対象に、組換えポリペプチドすなわち本明細書で示す医薬製剤の治療に有効な量を投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。このようなアルカリホスファターゼ欠乏に関連する病態は、例えば低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）及び神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）を含む。このような低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）は、周産期、乳児、若年性、成人ＨＰＰの任意の一つであり得る。このような病態は、骨及び歯の非石灰化骨基質及び／または低石灰化によって特徴づけられ得る。例えばこのような非石灰化骨基質は、くる病及び／または骨軟化症に至る可能性がある。
【００２６】
いくつかの実施形態で、そのような対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態で、そのような対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】タンパク質生成において温度シフトの有無にかかわらず、代表的な製造工程（＃１）の間の細胞増殖（パネルＡ、左）及び生存度（パネルＡ、右）、ならびに全体のグルコース（パネルＢ、左）及びラクテート（パネルＢ、右）濃度の比較を示すグラフである。対照は、温度シフトのある、２つの実施の平均結果を表す。
【図２】温度シフトの有無にかかわらず、例示の製造工程（＃１）を使用して生成したアスホターゼアルファの結合可能なタンパク質Ａの力価（パネルＡ）、容量活性（パネルＢ）及び比活性（パネルＣ）の比較を示すグラフである。対照は、温度シフトのある、２つの実施の平均結果を表す。
【図３】温度シフトの有無にかかわらず、例示の製造工程（＃１）を使用して生成したアスホターゼアルファのＡＥＸ（アニオン交換クロマトグラフィー）酸性ピーク（％）（パネルＡ）及びＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）凝集物（％）（パネルＢ）測定値の比較を示すグラフである。
【図４】温度シフトの有無にかかわらず、例示の製造工程（＃１）を使用して生成したアスホターゼアルファの非還元ＬｏＣ（ラボオンチップ、パネルＡ）、還元ＬｏＣ（パネルＢ）及びＴＳＡＣ（総シアル酸含量、パネルＣ）の比較を示すグラフである。
【図５】温度シフトの有無にかかわらず、例示の製造工程（＃１）で生成したアスホターゼアルファの中性グリカンプロファイル（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型すなわちＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる）を示すグラフである。参照は、以前の２０Ｋ工程によって生成された標準アスホターゼアルファを表す。
【図６】生成したアスホターゼアルファの凝集物レベル（パネルＡ）及びＴＳＡＣ（パネルＢ）上のシフトする生成温度の影響を示すグラフである。エラーバーは、各条件下の標準偏差を表す。
【図７】培養の１０日または１２日後、例示の工程＃２によって生成したアスホターゼアルファのＴＳＡＣ値上の培養ｐＨの影響を示すグラフである。
【図８】例示の工程＃２のアスホターゼアルファＴＳＡＣの培地供給添加（グリコース（ｇｌｃ）の異なる濃度で表される、パネルＡ）、及び供給添加モード（パネルＢ）の影響を示すグラフである。
【図９】例示の工程＃２のアスホターゼアルファ活性の亜鉛補充の影響（パネルＡ、９日目に補充した亜鉛）、ならびに細胞増殖（パネルＢ）及び生存度（パネルＣ）の亜鉛濃度の影響を示すグラフである。
【図１０】例示の工程＃３のアスホターゼアルファＴＳＡＣのｐＨ及び生成温度（パネルＡ）、タンパク質Ａ力価（パネルＢ）ならびに容量活性（パネルＣ）の影響を示すグラフである。
【図１１】例示の工程＃３の容量活性の増殖温度（パネルＡ）及びアスホターゼアルファの断片化（パネルＢ、ＳＥＣで測定）の影響を示すグラフである。
【図１２】例示の工程＃３のアスホターゼアルファ凝集物の生成温度及びｐＨ（パネルＡ、ＳＥＣで測定）、酸性ピーク％（パネルＢ、ＡＥＸで測定）、アスホターゼアルファの断片化（パネルＣ、ＳＥＣで測定）、ならびに塩基性ピーク％（パネルＤ、ＡＥＸで測定）の影響を示すグラフである。
【図１３】容量活性の播種密度及び温度シフトのタイミング（パネルＡ）、ならびにアスホターゼアルファの断片化（パネルＢ、ＳＥＣで測定）の影響を示すグラフである。播種は、例示の工程＃３の播種密度を表す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】例示の工程＃３のアスホターゼアルファ容量活性の培地供給（量及びタイミング）（パネルＡ）、凝集物（パネルＢ、ＳＥＣで測定）、酸性ピーク％（パネルＣ、ＡＥＸで測定）、塩基性ピーク％（パネルＤ、ＡＥＸで測定）、ならびにＴＳＡＣ（パネルＥ）の影響を示すグラフである。
【図１４Ｃ−１４Ｅ】図１４Ａ−１４Ｂの続きである。
【図１５】例示の工程＃４の１０日目までの細胞増殖（パネルＡ）及び生存度（パネルＢ）の培養培地ｐＨの影響を示すグラフである。
【図１６】例示の工程＃４の１０日目までの細胞増殖（パネルＡ）及び生存度（パネルＢ）の生成温度の影響を示すグラフである。
【図１７】例示の工程＃４の１０日目までの培養培地のグルコース濃度（パネルＡ）及びラクテート濃度（パネルＢ）の培養培地ｐＨの影響を示すグラフである。
【図１８】例示の工程＃４の１０日目までの培養培地のグルコース濃度（パネルＡ）及びラクテート濃度（パネルＢ）の生成温度の影響を示すグラフである。
【図１９】例示の工程＃４の１０日目までのタンパク質Ａ力価（パネルＡ）、容量活性（パネルＢ）、特異的タンパク質Ａ生産性（パネルＣ）及び比活性（パネルＤ）の培養培地ｐＨの影響を示すグラフである。
【図２０】例示の工程＃４のタンパク質Ａ力価（パネルＡ）、容量活性（パネルＢ）、特異的タンパク質Ａ生産性（パネルＣ）及び比活性（パネルＤ）の生成温度の種々の影響を示すグラフである。
【図２１】例示の工程＃４のアスホターゼアルファＴＳＡＣの培養培地ｐＨ（パネルＡ）及び生成温度（パネルＢ）の影響を示すグラフである。
【図２２】例示の工程＃４の生成したアスホターゼアルファのＡＥＸ酸性ピークの培養培地ｐＨ（パネルＡ）及び生成温度（パネルＢ）の影響を示すグラフである。
【図２３】例示の工程＃４のアスホターゼアルファ凝集物（ＳＥＣで測定）の培養培地ｐＨ（パネルＡ）及び生成温度（パネルＢ）の影響を示すグラフである。
【図２４】例示の工程＃４の生成したアスホターゼアルファのＬｏＣメインピーク（％、非還元条件）測定値の培養培地ｐＨ（パネルＡ）及び生成温度（パネルＢ）の種々の影響を示すグラフである。
【図２５】例示の工程＃４の生成したアスホターゼアルファ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦで測定）の中性グリカンプロファイルの培養培地ｐＨの影響を示すグラフである。上パネルは、３３℃で１０日間、異なる培養培地ｐＨで生成したアスホターゼアルファのすべてのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦピークを示す。各ピーク値は、下パネルで計算して比較した。
【図２６】例示の工程＃４の生成したアスホターゼアルファ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦで測定）の中性グリカンプロファイルの生成温度の影響を示すグラフである。上パネルは、１０日間、種々の生成温度のｐＨ６．９で生成したアスホターゼアルファのすべてのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦピークを示す。各ピーク値は、下パネルで計算して比較した。
【図２７】例示の工程＃４のアスホターゼアルファ品質のｉＣＥ２８０分析における、キャピラリー等電点電気泳動ピーク％の、培養培地ｐＨ（パネルＡ）及び生成温度（パネルＢ）の影響を示すグラフである。
【図２８】種々の工程での細胞増殖（パネルＡ）及び生存度（パネルＢ）を比較するグラフである（青線：１回のボーラス培地供給による対照工程（２つのバイオリアクター槽で実施）、赤線：４回の培地供給による改善された工程（６つのバイオリアクター槽で実施）、灰色の線：標準としてこれまでの２０Ｋ工程（２０のバイオリアクター槽で実施））。灰色の実線は２０Ｋ工程の平均を表し、点線は平均±１×標準偏差を表す。
【図２９】種々の工程でのグルコース利用（パネルＡ）及びラクテート作成（パネルＢ）を比較するグラフである（青線：１回のボーラス培地供給による対照工程（２つのバイオリアクター槽で実施）、赤線：４回の培地供給による改善された工程（６つのバイオリアクター槽で実施）、灰色の線：標準としてこれまでの２０Ｋ工程（２０のバイオリアクター槽で実施））。灰色の実線は２０Ｋ工程の平均を表し、点線は平均±１×標準偏差を表す。
【図３０】種々の工程で生成したアスホターゼアルファのタンパク質Ａ力価（パネルＡ）及び比活性（パネルＢ）を比較するグラフである（青線：１回のボーラス培地供給による対照工程（２つのバイオリアクター槽で実施）、赤線：４回の培地供給による改善された工程（６つのバイオリアクター槽で実施）、灰色の線：標準としてこれまでの２０Ｋ工程（２０のバイオリアクター槽で実施））。灰色の実線は２０Ｋ工程の平均を表し、点線は平均±１×標準偏差を表す。
【図３１】種々の工程での活性力価（パネルＡ）及び総容量活性（パネルＢ）を比較するグラフである（青線：１回のボーラス培地供給による対照工程（２つのバイオリアクター槽で実施）、赤線：４回の培地供給による改善された工程（６つのバイオリアクター槽で実施）、灰色の線：標準としてこれまでの２０Ｋ工程（２０のバイオリアクター槽で実施））。灰色の実線は２０Ｋ工程の平均を表し、点線は平均±１×標準偏差を表す。
【図３２】対照工程（灰色：１回のボーラス培地供給）及び改善した工程（濃い灰色：４回の培地供給）からのアスホターゼアルファ比活性を比較するグラフである。
【図３３】以前の工程Ｙ（下側の線：更なる亜鉛補給なし）及び更に改善した工程（上側の線：３０〜９０μＭの亜鉛補給状態の平均及び１４日まで延長した培養時間を示す）からのアスホターゼアルファ比活性を比較するグラフである。
【図３４】脱グリコシル後の生成したアスホターゼアルファ（パネルＡ）、及び還元かつ脱グリコシルした生成したアスホターゼアルファ（パネルＢ）のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルデータを示すグラフである。
【図３５】生成したアスホターゼアルファのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルを示すグラフである。図３５は出現順にそれぞれ、配列番号１の残基８３〜１０５として「ＴＹＮＴＮＡＱＶＰＤＳＡＧＴＡＴＡＹＬＣＧＶＫ」、配列番号１の残基９３〜９７として「ＳＡＧＴＡ」、及び配列番号１の残基９９〜１０４として「ＡＹＬＣＧＶ」を開示する。
【図３６】アスホターゼアルファ上のリン酸化部位のＭＳ／ＭＳ定量を示すグラフである。
【図３７】生成したアスホターゼアルファのシアル化グリカンの負イオンＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル（パネルＡ）、及び中性グリカンの正イオンＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトル（パネルＢ）を示すグラフである。
【図３８】アスホターゼアルファのオリゴ糖の蛍光クロマトグラムを示すグラフである。
【図３９】アスホターゼアルファ標準品の蛍光クロマトグラムを示すグラフである。
【図４０】アスホターゼアルファから生成されるグリコペプチドの質量スペクトルを示すグラフである。
【図４１】アスホターゼアルファの主なグリカンの推定構造の表示である（Ｃ７１０８Ｈ１１００８Ｏ２２０６Ｓ５６（タンパク質部分二量体）、またはＣ３５５４Ｈ５５０６Ｏ１１０３Ｓ２８（モノマー））。グリカン当たりのＮｅｕＡｃ（ＦＡ２Ｇ２、ＦＡ２Ｇ１及びＡ２Ｇ２）の数は、推定数である。
【図４２】アスホターゼアルファのグリコシル化部位上の推定されるグリカン構造の表示である。
【図４３】アスホターゼアルファの代表的なエレクトロフェログラムを示すグラフである。
【図４４】２０Ｋ及び２Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファのグリコペプチド質量フィンガープリントを示すグラフである（Ｔ１５〜１６のＮ１２３）。２Ｋバッチ番号：＃３５、＃３６及び＃３８、２０Ｋバッチ番号：＃４０、＃４２及び＃３４。
【図４５】２０Ｋ及び２Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファのグリコペプチド質量フィンガープリントを示すグラフである（Ｔ２６〜２７のＮ２１３）。２Ｋバッチ番号：＃３５、＃３６及び＃３８、２０Ｋバッチ番号：＃４０、＃４２及び＃３４。
【図４６】２０Ｋ及び２Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファのグリコペプチド質量フィンガープリントを示すグラフである（Ｔ３３のＮ２５４）。２Ｋバッチ番号：＃３５、＃３６及び＃３８、２０Ｋバッチ番号：＃４０、＃４２及び＃３４。
【図４７】２０Ｋ及び２Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファのグリコペプチド質量フィンガープリントを示すグラフである（Ｔ３５のＮ２８６）。２Ｋバッチ番号：＃３５、＃３６及び＃３８、２０Ｋバッチ番号：＃４０、＃４２及び＃３４。
【図４８】２０Ｋ及び２Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファのグリコペプチド質量フィンガープリントを示すグラフである（Ｔ４５〜４６のＮ４１３）。２Ｋバッチ番号：＃３５、＃３６及び＃３８、２０Ｋバッチ番号：＃４０、＃４２及び＃３４。
【図４９】２０Ｋ及び２Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファのグリコペプチド質量フィンガープリントを示すグラフである（Ｔ５５のＮ５６４）。２Ｋバッチ番号：＃３５、＃３６及び＃３８、２０Ｋバッチ番号：＃４０、＃４２及び＃３４。
【図５０】２Ｋ及び２０Ｋバッチから生成されるアスホターゼアルファの亜鉛（パネルＡ）、マグネシウム（パネルＢ）及びカルシウム（パネルＣ）のＩＣＰ金属イオンモル比を比較するグラフである。
【図５１】図５１Ａ：種々のｐＨ条件下で、培養時間を通して生細胞密度（ＶＣＤ）を比較するグラフである。図５１Ｂ：種々のｐＨ条件下で、培養時間を通して細胞生存度を比較するグラフである。
【図５２】図５２Ａ：所要培養時間を通してバイオリアクターのグルコース濃度を示すグラフである。図５２Ｂ：所要培養時間を通してバイオリアクターのラクテート濃度を示すグラフである。
【図５３】種々のｐＨ条件下で、比活性プロファイルを比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
「約」「およそ」：本明細書で使用する場合、１つ以上の特定の細胞培養条件に適用される際「約」及び「およそ」という用語は、その培養条件（複数可）について述べた参照値に類似する値の範囲を指す。ある特定の実施形態で、「約」という用語は、その培養条件（複数可）について述べた参照値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％以下内に含まれる値の範囲を指す。
【００２９】
「アミノ酸」：本明細書で使用する場合「アミノ酸」という用語は、ポリペプチドの形成で通常使用される２０の天然起源アミノ酸のいずれか、またはそのアミノ酸の類似体もしくは誘導体を指す。本開示のアミノ酸は、細胞培養に培地で提供されることができる。培地で提供されるアミノ酸は、塩として、または水和物の形態で提供され得る。
【００３０】
「バッチ培養」：本明細書で使用する場合「バッチ培養」という用語は、細胞を培養するときに最終的に使用される、培地（以下の「培地」の定義を参照）及び細胞それ自体を含むすべての成分が培養工程の開始時に提供される、細胞の培養方法を意味する。バッチ培養は通常ある時点で停止し、培地中の細胞及び／または成分が採取されて、所望により精製される。
【００３１】
「バイオリアクター」：本明細書で使用する場合「バイオリアクター」という用語は、細胞培養（例えば、哺乳動物細胞の培養）の増殖に使用される容器を意味する。バイオリアクターは、細胞の培養に有用であればサイズは問わない。通常バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００Ｌ以上、またはその間の任意の容量であってもよい。バイオリアクターの内部条件は、限定されないがｐＨ及び温度が挙げられ、通常培養期間中に制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で、培地中に懸濁した哺乳動物または他の細胞培養液を保持するのに好適な任意の材料からなることができ、それはガラス、プラスチックまたは金属を含む。本明細書中で使用する場合「生産用バイオリアクター」という用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の製造で使用する、最終のバイオリアクターを指す。大規模な細胞培養の生産用バイオリアクターの容量は通常、少なくとも５００Ｌであり、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００Ｌ以上、またはその間の容量であってもよい。当業者は本開示を実施する際に使用する適切なバイオリアクターを知っており、それを選択することができるだろう。
【００３２】
「細胞密度」：本明細書で使用する場合「細胞密度」という用語は、規定量の培地に存在する細胞の数を意味する。
【００３３】
「細胞生存度」：本明細書で使用する場合「細胞生存度」という用語は、所定の培養条件または実験変動下で生存する培養液中の細胞の能力を指す。本明細書で使用する場合、前記用語は、その時点にて培養液中で生存及び死滅する細胞の総数に関して、特定の時間で生きている細胞の部分も指す。
【００３４】
「培養」及び「細胞培養」：本明細書で使用する場合、これらの用語は、細胞集団の生存及び／または増殖に適した条件下で、培地（以下の「培地」の定義を参照）中にて懸濁される細胞集団を指す。当業者には明らかであるように、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団及びその集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指し得る。
【００３５】
「流加培養」：本明細書で使用する場合「流加培養」という用語は、培養工程の開始後のある時点で追加の成分を培地に与える細胞の培養方法を意味する。提供される成分は通常、培養工程中に枯渇した細胞のための栄養補助剤を含む。一般的に流加培養をある時点で停止し、培地中の細胞及び／または成分を採取して、所望により精製する。流加培養は、対応する流加バイオリアクターで実施することができる。
【００３６】
「断片」：本明細書で使用する場合「断片」という用語はポリペプチドを指し、そのポリペプチドに特有または特徴的な所与のポリペプチドの分離した部分として定義される。本明細書で使用する場合、前記用語は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する所与のポリペプチドの分離したいずれの部分も意味する。いくつかの実施形態において、保持される活性量は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。種々の実施形態で、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。他の実施形態において、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。一実施形態において、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。本明細書で使用する場合、前記用語は、完全長ポリペプチドで見いだせる少なくとも既成の配列エレメントを含む、所与のポリペプチドのいずれの部分も指す。いくつかの実施形態において、配列エレメントは、完全長ポリペプチドの少なくとも４〜５のアミノ酸に及ぶ。いくつかの実施形態において、配列エレメントは、完全長ポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のアミノ酸に及ぶ。
【００３７】
「積算生細胞密度」：本明細書で使用する場合「積算生細胞密度」という用語は、培養期間にわたる生細胞の平均密度に、培養が行われた経過時間を掛けたものを指す。製造されたポリペプチド及び／またはタンパク質の量の推測は、培養期間にわたって存在する生細胞の数に比例し、積算生細胞密度は、培養期間にわたって製造されたポリペプチド及び／またはタンパク質の量を推定するのに有用なツールである。
【００３８】
「培地」「細胞培養培地」及び「培養培地」：本明細書で使用する場合、これらの用語は、増殖する哺乳動物細胞に栄養を与える栄養分を含む溶液を意味する。一般的に、これらの溶液は、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに最小限の増殖及び／または生存に細胞が必要とする微量元素を提供する。溶液は、ホルモン及び成長因子を含む、最小の割合を超える成長及び／または生存を高める成分も含むことができる。溶液は、例えば細胞生存及び増殖に最適なｐＨならびに塩濃度に調製される。培地は更に、「限定培地」、タンパク質、加水分解物または未知の組成物の成分を含有しない無血清培地であり得る。限定培地は動物由来の成分を含まず、全成分は周知の化学構造を有する。
【００３９】
「代謝廃棄物」：本明細書で使用する場合「代謝廃棄物」という用語は、特に望ましい組換えポリペプチドもしくはタンパク質の発現または活性に関係して細胞培養にある程度有害な正常または正常でない代謝プロセスの結果として、細胞培養によって生じる化合物を指す。例えば代謝廃棄物は、細胞培養の増殖もしくは生存度に有害となり得る、製造される組換えポリペプチドもしくはタンパク質の量を減少させ得る、発現されるポリペプチドもしくはタンパク質の折り畳み、安定性、グリコシル化もしくは他の翻訳後修飾を変化させ得る、またはいくつかの他の方法では、細胞及び／または組換えポリペプチドもしくはタンパク質の発現もしくは活性にとって有害になり得る。例示的な代謝廃棄物として、グルコース代謝の結果として産生されるラクテート、及びグルタミン代謝の結果として産生されるアンモニウムが挙げられる。一実施形態において、方法は、細胞培養の代謝廃棄物の産生を緩やかにし、減少させ、または取り除くために選択される。
【００４０】
「浸透圧」及び「浸透圧モル濃度」：浸透圧は、水溶液に溶解した溶質粒子の浸透圧の程度である。溶質粒子は、イオン及び非イオン化分子を含む。浸透圧は、１ｋｇの溶液中に溶解した浸透圧的に活性な粒子の濃度（すなわちオスモル）として表される（３８℃の１ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏは１９ｍｍのＨｇの浸透圧と同等である）。一方「浸透圧モル濃度」は、１リットルの溶液に溶解した溶質粒子の数を指す。本明細書で用いる場合、「ｍＯｓｍ」という略語は、「ミリオスモル／溶液ｋｇ」を意味する。
【００４１】
「灌流培養」：本明細書で使用する場合「灌流培養」という用語は、培養工程の開始後に、追加の成分が連続的にまたは半連続的に培養に提供される、細胞の培養方法を意味する。提供される成分は通常、培養工程中に枯渇した細胞のための栄養補助剤を含む。培地中の細胞及び／または成分の部分は通常、連続的または半連続的に採取され、所望により精製される。
【００４２】
「ポリペプチド」：本明細書で使用する場合「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸の連続的な鎖を指す。前記用語は任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者であれば、この用語が長い鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して結合される２つのアミノ酸を含む最小の鎖を指すこともできることを理解するであろう。
【００４３】
「タンパク質」：本明細書で使用する場合「タンパク質」という用語は、個別単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個に機能する単位であり、別個の機能する単位を形成するために、他のポリペプチドとの永久的な物理的結合を必要としない場合、本明細書で使用する場合「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同じ意味で使用される。
【００４４】
「組換えで発現したタンパク質」及び「組換えポリペプチド」：本明細書で使用する場合、これらの用語は、そのポリペプチドを発現するように遺伝学的に操作されている宿主細胞から発現されるポリペプチドを意味する。組換えで発現したポリペプチドは、哺乳動物の宿主細胞内で正常に発現したポリペプチドと同一または類似してもよい。組換えで発現したポリペプチドは、宿主細胞に対して外来、すなわち宿主細胞内で正常に発現されるペプチドに対して異種でもあり得る。あるいは、ポリペプチドの部分が哺乳動物の宿主細胞内で正常に発現されるペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を含有し、他の部分は宿主細胞に対して外来であるという点で、組換えで発現したポリペプチドはキメラであり得る。
【００４５】
「播種する」：本明細書で使用する場合「播種する」という用語は、細胞培養をバイオリアクターまたは別の容器に提供する工程を指す。細胞は、別のバイオリアクターまたは容器で事前に増殖され得る。あるいは細胞は凍結されて、バイオリアクターまたは容器に提供する直前に解凍してもよい。この用語は、単細胞を含有する任意の数の細胞を指す。
【００４６】
力価：本明細書で使用する場合「力価」という用語は、所定量の培地容量によって分割された細胞培養によって製造される組換えで発現したポリペプチドまたはタンパク質の総量を指す。力価は通常、１ミリリットルの培地当たりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラムの単位で表される。
【００４７】
本明細書で使用する頭字語は、例えば、ＶＣＤ：生細胞密度、ＩＶＣＣ：生細胞濃度積分、ＴＳＡＣ：総シアル酸含量、ＨＰＡＥ−ＰＡＤ：パルスアンペロメトリー検出を備えた高速アニオン交換クロマトグラフィー、ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー、ＡＥＸ：アニオン交換クロマトグラフィー、ＬｏＣ：ラボオンチップ、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型を含む。
【００４８】
本開示は、組換えタンパク質を発現する細胞（例えば限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞）の培養方法を提供する。本開示は、細胞培養によるアルカリホスファターゼ（例えばアスホターゼアルファ）の作成のための製造システムを提供する。ある特定の実施形態で、細胞増殖、生存度及び／またはタンパク質生成または品質に有害である１つ以上の代謝産物の生成を最小化するシステムが提供される。特定の実施形態において、細胞培養は、バッチ培養、流加培養または連続培養である。本開示の他の実施形態を以下で詳細に説明する。しかし、これらの実施形態の様々な変更が本開示の範囲内に包含されることを、当業者は理解するであろう。
【００４９】
タンパク質
本開示は、細胞培養のアルカリホスファターゼ、アスホターゼアルファ、タンパク質の発現に関する。ある特定の実施形態で、このようなアスホターゼアルファは、本明細書で開示される方法により製造された後、アルカリホスファターゼ関連の疾患もしくは障害を治療するまたは予防するために使用することができる。例えばこのようなアスホターゼアルファは、減少した及び／または機能不全の内在性アルカリホスファターゼを有する、または過剰発現する（例えば、正常レベルを超える）アルカリホスファターゼ物質を有する対象に投与し得る。いくつかの実施形態で、本開示のアスホターゼアルファは組換えタンパク質である。いくつかの実施形態で、アスホターゼアルファは融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のアスホターゼアルファは、細胞型、組織（例えば、結合、筋肉、神経、または上皮組織）または器官（例えば、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、骨、軟骨、靭帯、腱など）を特異的に標的とする。アスホターゼアルファは、配列番号１で示すように７２６のアミノ酸をそれぞれ有する、２つのｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０ポリペプチドからなる可溶なＦｃ融合タンパク質である。下線を引いたアスパラギン（Ｎ）残基は、潜在的なグリコシル化部位（すなわち、Ｎ１２３、２１３、２５４、２８６、４１３及び５６４）に対応する。太下線を引いたアミノ酸残基（Ｌ４８６〜Ｋ４８７＆Ｄ７１５〜Ｉ７１６）は、それぞれｓＡＬＰとＦｃ、ならびにＦｃとＤ１０ドメインの間のリンカーに対応する。
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【００５０】
各ポリペプチドまたはモノマーは、５つの部分からなる。アミノ酸Ｌ１〜Ｓ４８５を含有する第１部分（ｓＡＬＰ）は、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶な部分であり、それは触媒機能を含む。第２部分は、リンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６〜Ｋ４８７を含む。アミノ酸Ｄ４８８〜Ｋ７１４を含有する第３部分（Ｆｃ）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、ヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４部分は、リンカーとしてＤ７１５〜Ｉ７１６を含む。第５部分はアミノ酸Ｄ７１７〜Ｄ７２６（Ｄ１０）を含み、それは、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合するのを可能にする、骨を標的とする部分である。更に各ポリペプチド鎖は、６つの潜在的なグリコシル化部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を含む。Ｃｙｓ１０２は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、Ｃｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８、及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２の間に４つの鎖内ジスルフィド結合を含む。２つのポリペプチド鎖は、両鎖のＣｙｓ４９３の間、及び両鎖のＣｓ４９６の間の２つの鎖内ジスルフィド結合により接続される。これらの共有結合的な構造的特徴に加えて、哺乳動物のアルカリホスファターゼは、亜鉛の２つの部位、マグネシウムの１つの部位及びカルシウムの１つの部位を含む、各ポリペプチド鎖上の４つの金属結合部位を有すると考えられる。
【００５１】
アスホターゼアルファ
一実施形態において、アルカリホスファターゼタンパク質（例えば、骨標的化ｓＡＬＰ融合タンパク質）は、アスホターゼアルファ（すなわちｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０、配列番号１）である。具体的には、アスホターゼアルファは、７２６のアミノ酸のポリペプチド長を有する複合可溶性糖タンパク質である。アスホターゼアルファは、３つのドメインからなるＦｃ融合タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、アスホターゼアルファは、（１）ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）の可溶性触媒ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０５１８６）、（２）ヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７）、及び（３）骨標的ドメインとして使用したデカアスパラギン酸ペプチド（Ｄ１０）（Ｎｉｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ８８：２４４−２５５）を含む。タンパク質は、２つのタンパク質一次配列からホモ二量体へと会合する。この融合タンパク質は、６つの確認された複合Ｎ−グリコシル化部位を含む。これらのＮ−グリコシル化部位のうちの５つはｓＡＬＰドメインに、及び１つはＦｃドメインにある。アスホターゼアルファに存在する別の重要な翻訳後修飾は、酵素及びＦｃドメイン構造を安定化するジスルフィド架橋の存在である。合計４つの分子内ジスルフィド架橋は１モノマー当たりに存在し、２つの分子間ジスルフィド架橋は二量体中に存在する。アルカリホスファターゼドメインの１つのシステインは、遊離である。
【００５２】
アスホターゼアルファは、低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）の治療用に酵素補充療法として使うことができる。ＨＰＰ患者において、ＴＮＳＡＬＰをコードする遺伝子の機能欠損変異体（複数可）は、ＴＮＳＡＬＰ酵素活性の欠乏の原因となり、それは基質（例えば無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ））の上昇した循環濃度を引き起こす。ＨＰＰ患者へのアスホターゼアルファの投与は、ＰＰｉを切断して、カルシウムと組み合わさるように無機ホスフェートを放出し、それによってヒドロキシアパタイト結晶形成及び骨石灰化を促進して、正常な骨格表現型を回復させる。アスホターゼアルファ及び治療でのその使用に関する更なる詳細については、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００５１０３２６３号及び同第ＷＯ２００８１３８１３１号を参照し、その教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態で、アスホターゼアルファは、神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）の治療のための酵素補充療法として使用できる。アスホターゼアルファ及びＮＦ１の治療のその使用（他のアルカリホスファターゼの使用と共に）に関する更なる詳細については、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１３／０５８８３３号を参照し、それはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
製造工程
アルカリホスファターゼタンパク質（例えば、アスホターゼアルファ）は、当該技術分野において周知の標準的方法を使用して、哺乳動物または他の細胞によって作成することができる。このような細胞は、培養皿、ガラスフラスコまたはバイオリアクターで増殖させることができる。細胞培養及び組換えタンパク質の作成のための特定の方法は、例えばＮｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｙｅｒ，１９９１  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１２−１４３及びＲｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｃｈ２００８，２０−２５に記載のとおり、当技術分野において周知である。代表的なバイオリアクターは、バッチ、流加及び連続反応器を含む。いくつかの実施形態で、アルカリホスファターゼタンパク質は、流加バイオリアクターで作成される。
【００５４】
細胞培養工程の物理化学的環境の潜在的可変性は、例えば、ｐＨ、温度、細胞培養培地成分、原材料のロット間変動、培地の濾過材料、バイオリアクターのスケールの違い、ガス処理の方法（空気、酸素及び二酸化炭素）などの変化を含有する。本明細書にて開示するように、製造したアルカリホスファターゼタンパク質のグリコシル化プロファイルは、１つ以上のパラメーターの変更の影響を受ける可能性がある。
【００５５】
細胞培養工程の開発
細胞培養の組換えタンパク質生成において、必要な転写調節エレメントを有する組換え遺伝子は、最初に宿主細胞に導入される。通常、レシピエント細胞に選択的優位性を付与する第２遺伝子が導入される。選択剤（通常、遺伝子導入の数日後に適用される）の存在下で、選択遺伝子を発現するそのような細胞だけが生存する。選択において多く使われる２つの遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（ヌクレオチド代謝に関与する酵素）及びグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）である。両方の場合で、選択は、非形質転換細胞の増殖を防止する、適切な代謝物質（ＤＨＦＲについてはヒポキサンチン及びチミジン、ＧＳについてはグルタミン）がない場合、発生する。一般に組換えタンパク質の効果的な発現において、バイオ医薬品がコードする遺伝子及び選択遺伝子が同じプラスミドにあるかどうかは、重要ではない。
【００５６】
選択の後、生存する細胞は、単細胞として第２の培養容器に移されることができ、培養液はクローン集団を作成するために増殖する。最終的に個々のクローンは、組換えタンパク質発現について評価され、最高の産生株が更なる培養及び分析のために保持される。これらの候補から、適切な成長及び生成特性を有する１つの細胞株が、組換えタンパク質を生成するために選択される。それから生成ニーズによって決定された培養工程が確立される。
【００５７】
細胞
ポリペプチドを作成するために培養され得る、任意の哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞型は、本開示に従って利用できる。使用し得る哺乳動物細胞の非限定例としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，１９８０Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ受託番号８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶｌ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養の増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶｌ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−Ｉ５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が含まれる。特定の実施形態で、ポリペプチド及びタンパク質の培養ならびに発現は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から生じる。
【００５８】
更に、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の数の市販及び非市販の組換え細胞株は、本開示に従って利用できる。当業者は、組換え細胞株が異なる栄養必要量を有し得る及び／または最適な増殖及びポリペプチドもしくはタンパク質の発現について異なる培養条件を有し得ることを十分に理解するであろうし、必要に応じて条件を変更することができるであろう。
【００５９】
上述のとおり、多くの場合、細胞は、高レベルのタンパク質もしくはポリペプチドを作成するために選択される、または操作される。多くの場合、例えば目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の導入によって、及び／または目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内因性または導入された）の発現を制御する制御エレメントの導入によって、細胞は高レベルのタンパク質を作成するために遺伝子操作される。
【００６０】
温度シフト
細胞培養工程、特に非連続工程（例えば、バイオリアクターの流加培養工程）の実施時間は、実施中に通常低下する細胞の残留する生存度によって通常制限される。したがって細胞生存度の時間を延長することは、組換えタンパク質作成を改善するために求められている。細胞死が培養上清にシアリダーゼを放出することができ、それは発現したタンパク質のシアル酸含量を低減することができるので、生成物の品質上の懸念は、生細胞密度の減少を最小化して、高い細胞生存度を維持することへの動機づけも提供する。タンパク質精製の懸念は、生細胞密度の減少を最小化して、高い細胞生存度を維持することに対して、更に別の動機づけを提供する。細胞片及び培養液中の死細胞含量は、培養実行終了後、タンパク質生成物を分離して及び／または精製するその能力にマイナスの影響を与えることができる。したがって細胞を培養液中により長時間生存可能に保つことによって、細胞によって作成される所望の糖タンパク質の質の劣化及び最終的な減少の原因となり得る、細胞タンパク質及び酵素（例えば、細胞プロテアーゼ及びシアリダーゼ）による培養培地の汚染の減少がある。
【００６１】
多くの方法は、細胞培養液中の高い細胞生存度を得るために適用されることができる。１つは、標準温度で最初の培養後、培養温度を下げることを含有する。例えば、Ｒｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：４２３−４２７を参照のこと。一般的に、目的のタンパク質を発現することが可能な哺乳動物または他の種類の細胞は、標準温度下で最初に増殖して、細胞数を増加させる。各細胞型におけるこのような「標準」温度は、通常、約３７℃（例えば、例えば３５．０℃、３５．５℃、３６．０℃、３６．５℃、３７．０℃、３７．５℃、３８．０℃、３８．５℃及び／または３９．０℃を含む、約３５℃〜約３９℃）である。１つの特定の実施形態で、アスホターゼアルファを作成する温度は、最初は約３７℃に設定される。適度に高い細胞密度に達するとき、細胞培養液全体の培養温度はそれからタンパク質作成を促進するためにシフトされる（例えば、下げられる）。ほとんどの場合、温度を下げることは、細胞周期の非増殖Ｇ１部分に向けて細胞をシフトし、前の高い温度環境と比べると、それは細胞密度及び生存度を増加させることができる。更に低温は、細胞タンパク質生成率を増加させて、タンパク質翻訳後修飾（例えばグリコシル化）を容易にして、新しく生成されたタンパク質の分裂または凝集を減少させて、タンパク質折り畳み及び３Ｄ構造の形成を促進して（したがって活性を維持する）、及び／または新しく生成されたタンパク質の分解を減少させることで、組換えタンパク質生成も促進することができる。いくつかの実施形態では、低温は、約３０℃〜約３５℃（例えば、３０．０℃、３０．５℃、３１．０℃、３１．５℃、３２．０℃、３２．５℃、３３．０℃、３３．５℃、３４．０℃、３４．５℃及び／または３５．０℃）である。他の実施形態において、アスホターゼアルファを作成するための温度は、最初に約３５．０℃〜約３９．０℃に設定されて、それから約３０．０℃〜約３５．０℃にシフトする。一実施形態において、アスホターゼアルファを作成する温度は、最初は約３７．０℃に設定されて、それから約３０℃にシフトする。別の実施形態では、アスホターゼアルファを作成する温度は、最初は約３６．５℃に設定されて、それから約３３℃にシフトする。更に別の実施形態では、アスホターゼアルファを作成する温度は、最初は約３７．０℃に設定されて、それから約３３℃にシフトする。そのうえ更なる実施形態において、アスホターゼアルファを作成する温度は、最初は約３６．５℃に設定されて、それから約３０℃にシフトする。他の実施形態において、温度をシフトする複数（例えば、１つ以上）のステップを適用できる。例えば温度は、約３７℃から最初は３３℃に、それから更に３０℃まで下げられ得る。
【００６２】
異なる温度にシフトする前に、培養液を特定温度に維持するための時間は、細胞生存度及び目的のタンパク質を作成する能力を維持しつつ、十分な（または所望の）細胞密度を得るために決定されることができる。いくつかの実施形態で、細胞培養は、異なる温度にシフトする前に、生細胞密度が約１０５細胞／ｍＬ〜約１０７細胞／ｍＬ（例えば、１×１０５、１．５×１０５、２．０×１０５、２．５×１０５、３．０×１０５、３．５×１０５、４．０×１０５、４．５×１０５、５．０×１０５、５．５×１０５、６．０×１０５、６．５×１０５、７．０×１０５、７．５×１０５、８．０×１０５、８．５×１０５、９．０×１０５、９．５×１０５、１．０×１０６、１．５×１０６、２．０×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、３．５×１０６、４．０×１０６、４．５×１０６、５．０×１０６、５．５×１０６、６．０×１０６、６．５×１０６、７．０×１０６、７．５×１０６、８．０×１０６、８．５×１０６、９．０×１０６、９．５×１０６、１×１０７細胞／ｍＬ以上）に達するまで、最初の温度で増殖する。一実施形態において、細胞培養は、異なる温度にシフトする前に、生細胞密度が約２．５〜約３．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで、最初の温度で増殖する。別の実施形態では、細胞培養は、異なる温度にシフトする前に、生細胞密度が約２．５〜約３．２×１０６細胞／ｍＬに達するまで、最初の温度で増殖する。更に別の実施形態では、細胞培養は、異なる温度にシフトする前に、生細胞密度が約２．５〜約２．８×１０６細胞／ｍＬに達するまで、最初の温度で増殖する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、細胞培養は、タンパク質作成のため３０℃にシフトする前に、生細胞密度が約２．５〜２．８×１０６細胞／ｍＬに達するまで、３７℃で増殖する。他の実施形態において、細胞培養は、タンパク質作成のため３０℃にシフトする前に、生細胞密度が約２．５〜３．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで、３７℃で増殖する。
【００６４】
ｐＨ
細胞培養の増殖培地のｐＨの変更は、細胞タンパク質分解活性、分泌及びタンパク質作成レベルに影響を及ぼすことができる。細胞株の大部分は、ｐＨ約７〜８でよく増殖する。細胞増殖の最適ｐＨは種々の細胞株で比較的ほとんど変化しないが、いくつかの通常の線維芽細胞株はｐＨ７．０〜７．７で最も機能し、形質転換細胞は通常７．０〜７．４で最も機能する（Ｅａｇｌｅ，１９７３Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐＨ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ８２：１−８）。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを作成するための培養培地のｐＨは、ｐＨ約６．５〜７．７（例えば、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７，００、７，０５、７、１０、７、１５、７，２０、７，２５、７．３０、７．３５、７．３９、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５及び７．７０）である。いくつかの実施形態において、アスホターゼアルファを作成するための培養培地のｐＨは、ｐＨ約７．２０〜７．６０である。他の実施形態において、アスホターゼアルファを作成するための培養培地のｐＨは、ｐＨ約６．９〜７．１である。１つの特定の実施形態において、アスホターゼアルファを作成するための培養培地のｐＨは、ｐＨ約６．９である。別の実施形態では、アスホターゼアルファを作成するための培養培地のｐＨは、ｐＨ約７．３０である。更に別の実施形態では、アスホターゼアルファを作成するための培養培地のｐＨは、ｐＨ約７．３９である。
【００６５】
本明細書に引用したすべて文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本開示は、理解の明瞭化のために図解及び例を用いてある程度詳しく記載されているが、一定の小さな変更及び改変が実施されることは、当業者にとって明らかである。したがって記載及び例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１．アスホターゼアルファの一般的な製造工程
本明細書に記載されるように、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ（ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０）を作成する製造工程が開発された。
【表１】
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【００６８】
アスホターゼアルファを発現する安定的なＣＨＯ細胞株は、ＧＳ遺伝子発現系を使用して増殖された。二次クローンは限界希釈クローニングの一過程の高生成の一次クローンに由来し、最終的な細胞株が選択された。
【００６９】
代表的な製造工程（工程Ｘ）を本明細書に記載する。マスターセルバンクのバイアルを解凍し、バイアルのすべての量を再懸濁した。すべての量は、増殖のための２５０ｍＬの振とうフラスコへ移された。試料は、毎日計数及び生存度試験のために（その後すべての増殖ステップのためにも）とられた。細胞は複数のステップにより増殖して、１，０００Ｌのシードバイオリアクター（Ｎ−３低レベル）、１，０００Ｌのシードバイオリアクター（Ｎ−２高レベル）及び４，０００Ｌのシードバイオリアクター（Ｎ−１）、それから２０，０００Ｌの生産用バイオリアクターに接種された。アスホターゼアルファの作成後、採取精製工程を用いて、滅菌濾過によって無傷細胞及び細胞片を除去した。それから採取を、濃縮及び緩衝剤希釈のために限外濾過した（Ｐｏｓｔ  Ｈａｒｖｅｓｔ  ＵＦ）。更なる工程は、例えば、ウイルス不活性化（化学的にウイルス粒子を不活性化するため）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ポストＨＩＣ  ＵＦ／ＤＦ（ＵＦ／ＤＦ２）、ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅミックスモードクロマトグラフィー、ウイルス濾過（サイズ排除によって）、製剤（ＵＦ／ＤＦ３）及びバルクフィルを含んだ。例えば２，０００Ｌ規模の工程、及びその後２０，０００Ｌの生産規模にスケールアップしたものを含む、複数の製造工程を実施した。２，０００Ｌ（２Ｋ）と２０，０００Ｌ（２０Ｋ）の工程の典型的な違いを表２及び表３にまとめる。２，０００Ｌ（２Ｋ）規模の工程は、より顕著な誘導期及びより変化する後期生存度を有した（データは示さず）。
【表２】
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【表３】
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【００７０】
２Ｋ工程及び２０Ｋ工程の総収率、ならびに対応する生成したアスホターゼアルファの特性を比較した。製品特性を比較するために用いる分析法は、例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び他の方法を含み、生成したアスホターゼアルファの比活性、タンパク質濃度、ｐＨ及び総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）を測定する。更に、例えば残留ＤＮＡ、残留タンパク質Ａ、宿主細胞タンパク質、バイオバーデン、及び異なる工程から作成されたアスホターゼアルファのエンドトキシンを測定するために、不純物及び安全性試験も実施した。２Ｋ及び２０Ｋ規模のバッチからの薬物原料を比較するために、３つの追加の試験（すなわち、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びオリゴ糖類マッピング）も実施した。これらの３つの試験結果は、これらのバッチについて同等なプロファイルを示した。結論として、２，０００Ｌと２０，０００Ｌ規模間のアスホターゼアルファの質は、バッチ全体で同等だった。
【００７１】
実施例２．アスホターゼアルファの生産性及び品質の温度シフトの影響
ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０を作成するために採用されて実施される異なる製造工程の中で、温度シフトは一般的に、生産性及び最終的なアスホターゼアルファの品質に影響を及ぼすことがわかる。増殖温度（比較的高温）から生成温度（比較的低温）への温度シフトを、すべての工程で実施した。
【００７２】
温度シフト対シフトなしの効果を比較するために、生産バイオリアクターが走らせる二連のｓＴＮＡＬＰ−Ｆｅ−Ｄ１０生産用バイオリアクター実施を実行し、そこで温度シフトはあった、またはなかった。ザルトリウス２Ｌ及び１０Ｌバイオリアクターが、異なる製造工程に使用された。この例示の工程において、表４にまとめたように、生産用バイオリアクターで使用する原料は、例えば生産培地、１０％の炭酸ナトリウム、ＣＨＯ供給及びグルタミン原液を含有した。ＳＦＭ４ＣＨＯとは、ＣＨＯの無血清培地を意味する。
【表４】
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【００７３】
方法
細胞培養実験デザイン
例示の工程においてアスホターゼアルファ生産性及び品質特性上の温度シフトの影響を評価するために、２ブロックの実験を行った。表５に示すように、２つのバイオリアクターの実施（すなわち＃１及び＃２）は温度シフト（３７℃から３０℃）と共に実施されて、２つの他の実施（すなわち＃３及び＃４）は３７度からの温度シフトなしで行われた。
【表５】
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【００７４】
細胞密度及び生存度は、細胞カウンター（すなわち、ＶｉＣｅｌｌ  ＶＲ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数した。ｐＨ及びオフラインガスはｐＨＯｘを使用して測定され、グルコース及びラクテートを含む主要な代謝物はセンサー（Ｎｏｖａ  Ｐｒｏｆｉｌｅ１００，Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して測定された。酵素活性は、酵素活性測定の前に、３回の代わりに、各試料を１度だけ希釈する変形版による標準方法を使用して測定された。
【００７５】
採取及び精製法
１０日目（２４０±４時間）の５０マイクロリットルの試料を、注射器を使用してすべてのバイオリアクターから採取した。遠心分離（３０００×ｇ、５分）による細胞除去の後、上清を、０．２２μｍボトルの上面フィルターを使用して浄化して、精製前に−８０℃で保存した。ハイスループットタンパク質Ａ精製の単回ステップを、この実験で適用した。試料は、分析的及びタンパク質特性評価分析の前に、低塩濃度緩衝液（５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
【００７６】
分析的及びタンパク質特性評価方法
本実験で分析する品質特性は、アスホターゼアルファ凝集物、断片化、電荷分布、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）及び中性グリカン種レベルを含んだ。凝集物レベルは、ＳＥＣで定量化した総タンパク質に対する凝集物ピークの割合により推定した。断片レベルは、ＬｏＣで定量化した総タンパク質に対する断片の割合により推定した。電荷分布は、ＡＥＸでそれぞれ定量化した総タンパク質に対する塩基性ピーク、メインピーク及び酸性ピークの割合により推定した。総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）はＨＰＡＥ−ＰＡＤによって定量化された。中性グリカン種の検出はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって実施された。
【００７７】
結果
細胞培養の実施
工程＃１で、温度設定値は、生細胞密度（ＶＣＤ）が２５〜３２×１０５細胞／ｍＬに達した後、５時間以内に３７℃から３０℃へシフトした。温度シフトなしで、細胞培養はより高いピークＶＣＤに達するが、より急速な生存度低下が起こった（図１Ａ）。より高い全体のグルコース消費が、同様に温度シフトなしの条件下で観察された（図１Ｂ）。グルコースのボーラス添加を、本工程の説明に従って、温度シフトなし条件下で５日目及び８日目に適用した。興味深いことに、温度シフト条件より、温度シフトなしでかなり低い比率で、ラクテートはやはり消費された（図１Ｂ）。
【００７８】
温度シフトなし条件下のより高いピークＶＣＤは、結合可能タンパク質Ａ力価の早めの生成をもたらした（図２Ａ）。温度シフトなし条件下のより急速な生存度低下と共に、類似の結合可能タンパク質Ａ力価は、両方の条件下で１０日目に得られた。結合可能な特異的タンパク質Ａ生産性全体は、温度シフト条件において６．４ｐｇ／細胞／日であり、温度シフトなし条件において６．７ｐｇ／細胞／日だった。興味深いことに、同様の結合可能タンパク質Ａ力価は両方の条件下で観察されたが、温度シフトなし条件下の容量活性は温度シフト条件よりかなり低かった（図２Ｂ）。更に、温度シフトなし条件下の比活性は、培養期間の全体を通して温度シフト条件より著しく低かった（図２Ｃ）。３７℃から３３℃への温度シフトが工程＃１の比活性を維持するために最適であることを、このデータは示す。工程＃１で定量化されるすべての品質特性を、表６にまとめる。
【表６】
2018523481.tif 000009
【００７９】
酸性種の生成が、温度シフト条件と比較して、温度シフトなしでは少なかったことを、ＡＥＸの結果は示した（図３Ａ）。しかし温度シフトなしの条件下で、より著しく高い凝集物がＳＥＣの結果によって定量化された（図３Ｂ）。温度シフトなしの条件下で、非還元ＬｏＣ平均ピークの割合はより高く（図４Ａ、更に表６の「ＬｏＣ（メイン％、ＮＲ）」列）、その一方で、還元ＬｏＣ平均ピークの割合は低かった（図４Ｂ、更に表６の「ＬｏＣ（メイン％、Ｒ）」列）。
【００８０】
シアリル化は、温度シフトなしの条件下で、約１倍著しく増加した（図４Ｃ）。
【００８１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる中性グリカンの分析は、温度シフトなしの条件下で検出される高次のマンノース種または非定型グリカン種がないことを示した（図５）。しかし温度シフトなしの条件は、より少量のＡ２（温度シフトのある対照条件下で優勢な非フコシル化されたグリカン種）、より高いフコシル化（ＦＡ２対Ａ２のより高い比）及びＦＡ３Ｇ３、ＦＡ４Ｇ３、ＦＡ４Ｇ１Ｌ１及びＦＡ４Ｇ４Ｌ１を含む高次グリカンの増加をもたらした（図５）。
【００８２】
工程＃１のアスホターゼアルファ生産性及び品質で温度シフトのないことの影響を、表７にまとめる。温度シフトなしで、生成されたアスホターゼアルファは、非常に低い比活性を有した。一方、温度シフトなしの条件下で、より生成温度は、より高いシアリル化及びより高いフコシル化をもたらした。
【表７】
2018523481.tif 000010
【００８３】
実施例３．代表的な工程＃２の最初の上流工程パラメーターの評価
この実施例は、代表的なアスホターゼアルファ製造工程＃２の上流の製造工程パラメーターの最初の評価、及び生成されたアスホターゼアルファの重要な品質特性に影響を与えるその可能性についてまとめる。いくつかの上流の工程パラメーターは、凝集物％、断片化％、シアリル化、グリコシル化、電荷分布及び比活性を含む。
【００８４】
細胞培養
この実験で参照されるすべての製造工程は、振とうフラスコまたはバイオリアクターで実施された。解凍後、細胞は、生産バイオリアクターの接種前に、一連の振とうフラスコ及びスピナーフラスコによって増殖した。生産用バイオリアクター（２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌまたは２００Ｌ）は、特に指示がない限り、容積当たりの一定の電力、及び分当たり液体体積当たりの散布ガス容積（ＶＶＭ）を使用して、評価された。生産用バイオリアクターの温度は、３６．５℃にて０〜約１２０時間制御されて、特に指示がない限り、約１２０時間で３３．０℃にシフトした。溶存酸素の設定値は、３０％に維持された。培養を１０日目（２４０時間±６時間）に採取する場合、１ボーラス当たりのＣＰＮ供給の約２．７％（ｖ／ｖ）を９６時間（ｈｒ）、１４４時間及び１９２時間に加えて、一方で培養を１０日目より後に採取する場合、追加のボーラス供給は２４０時間に付与された。
【００８５】
採取及び精製
生産用バイオリアクターから採取した試料を、５分間の３０００×ｇでの遠心分離後、０．２２μｍの濾過によって浄化した。浄化して濾過した採取物の精製を実施して、精製の程度は本実験及び試料試験基準によって決定した。１つのクロマトグラフィーステップ（タンパク質Ａ）または２つの連続的なクロマトグラフィーステップ（タンパク質Ａ、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ））の精製を、試験したほとんどの試料で実施した。更に試料は、分析試験の前に低塩濃度緩衝液（５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
【００８６】
分析的特性評価
本実験で参照される品質特性は、より広範な品質測定基準（例えば純度、効力及び構造）のサブセットと同定された。記載されている品質サブセットは、凝集物％、断片化％、電荷分布、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）、中性グリカンのプロファイル及び比活性を含む。凝集物及び断片レベルの両方は、ゲル透過ＨＰＬＣ（ＧＰ−ＨＰＬＣ）を使用して定量化される相対的ピーク面積で測定された。更に断片レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたラボオンチップ（ＬｏＣ）キャピラリー電気泳動を使用して測定された。電荷分布は、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを使用して推定した。ＴＳＡＣは、パルスアンペロメトリー検出を備えた高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）によって定量化された。中性グリカン種の検出は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析により実施した。比活性は、パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）系アルカリホスファターゼ酵素アッセイに従って測定した。
【００８７】
結果
１．増殖及び生成温度
生成物断片化の温度の影響が説明されてきた。３６．５℃で増殖した選択した細胞クローンによって作成されるアスホターゼアルファについて、アスホターゼアルファの主バンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した９５．９％であり、ほぼ４％は断片として算出された。温度が５日目に３６．５℃から３３．０℃にシフトするとき、同じクローンはアスホターゼアルファ断片をほとんど生成しなかった（計算した主バンド＞９９％）。他の二次クローンは、３６．５℃から３３．０℃の温度シフトを介して、断片減少の非常に類似した傾向を示したが、すべての二次クローンが、断片レベルを１％未満に低下させることができたわけではない。したがって増殖温度及び生成温度は、断片化に影響を与えることができる。更に温度シフトを行うことに関連するタイミングは、アスホターゼアルファの品質にも影響を与え得る。
【００８８】
ＧＰ−ＨＰＬＣにより検出されるより高い凝集物レベルは、２Ｌのバイオリアクターの二次クローンのスクリーニング中、より低い生成温度下で観察された。温度をシフトしない（すなわち、３６．５℃で維持する）とき、１０の二次クローンによって生成される物質と比較して、温度が３３℃にシフトするとき、６の二次クローンによって生成されるアスホターゼアルファの凝集物レベルを、図６Ａは示した。３６．５℃から３３．０℃への温度シフトが凝集物レベルの増加を引き起こし得ることを、これらのデータは示唆する。
【００８９】
更にＴＳＡＣの温度シフトの影響は、一次クローンの選択及び最初の工程の開発中に検討された（図６Ｂ）。一次クローンは、２Ｌのバイオリアクターのシアリル化またはＴＳＡＣの生成温度の影響（５日目以降）を調べるために用いた。この実験で、生成温度は、条件１の下で５日目に３６．５℃から３０．０℃に、条件２の下で５日目に３６．５℃から３３．０℃にシフトし、対照は温度シフトなしで実施した。生存度が６０％と８０％ｏの間のとき試料を採取して、その培養は生存度に応じて採取前に１１〜１８日間実施された。図６Ｂに示すように、温度シフトを実施することは、類似の生存度下で一定温度下の対照と比較して、より低いＴＳＡＣをもたらし、低温にシフトすることはより低いＴＳＡＣに一致した。本明細書で所望の最低のＴＳＡＣ値は、１．８である。シアリル化（またはＴＳＡＣ）が生成物の電荷プロファイルを変えて、中性グリカンを負に帯電したグリカンに変換するので、これらの３つの品質特性（生成温度、凝集物及びＴＳＡＣ）は密接に関係していると見なされる。
【００９０】
２．ｐＨ
６．９０〜７．００のｐＨ設定値を変えることが増加したＴＳＡＣをもたらすことを、予備結果は示した（図７）。選択した二次クローンを用いて、ｐＨ設定値がそれぞれ６．９０及び７．００の２つの２Ｌバイオリアクターを、アスホターゼアルファシアリル化のｐＨの影響を調べるために使用した。試料は、それぞれ１０日目及び１２日目にバイオリアクターから採取された。ｐＨ６．９０条件下で、ＴＳＡＣが１０日目の１．９から１２日目の１．４へ下がることが観察された。ＴＳＡＣ値が低下する同じ傾向がｐＨ７．００条件下で観察されたが、両日（１０日目２．６及び１２日目２．１）のｐＨ７．００未満でのＴＳＡＣ値は、より低いｐＨ条件下のものより高かった。ＴＳＡＣが培養期間によって低下し、より低いｐＨ設定値がより低いＴＳＡＣ値をもたらすことを、これらのデータは示唆した。
【００９１】
３．培地供給添加
最初のボーラス添加を遅らせること、または培地のグルコース濃度を上昇させることが、対照条件と比較してより著しく高いＴＳＡＣをもたらし得ることを、予備データは示した（図８Ａ）。
【００９２】
更に、培地供給がどのように送達されるか（連続的またはボーラス添加）も、ＴＳＡＣに影響を及ぼした。連続的添加モードと比較して、供給がボーラスモードで加えられるとき、より著しく高いＴＳＡＣが観察されたことを、２Ｌ及び１０Ｌ規模の両方からのデータは示した（図８Ｂ）。したがってＣＰＮ供給は、ボーラスとして補充されたと確定される。上部滴加で、または表面下（浸漬）添加によって加えられるときに、ＴＳＡＣへの影響は観察されなかった。
【００９３】
４．硫酸亜鉛の添加
構造及び活性を維持するのを助けるので、亜鉛イオンがアルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）安定性にとって必須であることは、周知である。例えば、２つの亜鉛原子は１つの胎盤アルカリホスファターゼ分子と結合する（Ｈｅｌｅｎｅ  Ｌｅ  Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．２００１Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：９１５８−９１６５）。この比率に基づいて、小規模モデルで開発した代表的な製造工程によって作成した１ｇ／Ｌのアスホターゼアルファの力価において、約２０μＭの亜鉛はアスホターゼアルファの活性に必要である。
【００９４】
細胞培養が経過すると、結合可能なタンパク質Ａアスホターゼアルファが連続的に作成されたことが観察されたが、対応する容量活性はタンパク質Ａ力価と一致せず、それは作成されたタンパク質が不活性であることを示した（図９Ａ）。更に、容量活性は５日目〜９日目に減少するが、タンパク質活性は９日目の硫酸亜鉛補充に応じて直ちに回復した。このデータは、亜鉛が生産培地に補充される必要があることを示唆した。この実験で、硫酸亜鉛濃度は、９日目のボーラス添加により２５μＭ増加した。タンパク質Ａ力価が９日目に約１０００ｍｇ／Ｌであることを考慮すると、この亜鉛ボーラス添加は、少なくとも２：１だけ亜鉛イオン対アスホターゼアルファの比を増大させた。
【００９５】
以下の実験で、細胞増殖及び生存度の硫酸亜鉛の細胞毒性濃度は、バッチモードのミニバイオリアクターシステムを使用して調べられ、異なる濃度の硫酸亜鉛を０日目に培養培地に加えた。硫酸亜鉛濃度が３００μＭ未満のとき、増殖または生存度への影響はほとんど観察されなかった（図９Ｂ及び図１７Ｃ）。しかし、亜鉛濃度が５００μＭ以上の条件で、増殖及び生存度は劇的に影響を受けた。したがって総亜鉛補充の最適濃度は、５００μＭ未満であった。したがって０日目に補充される最適亜鉛濃度が、約２５μＭと約３００μＭの間であり得ると推定された（細胞増殖／生存度及びタンパク質機能問題両方を考慮する）。事実、１５０μＭの亜鉛濃度は３００μＭより更に良好であり得て、それは前者が５日目後により少ない細胞増殖阻害をもたらすからである（図９Ａ）。２０μＭの亜鉛が機能的なアスホターゼアルファを生成するのに理論的に十分である（すなわち、活性酵素当たりの２つの亜鉛イオン）が、実際の亜鉛補充がアルカリホスフェート（例えば、アスホターゼアルファ、ＴＮＡＬＰ、ＰＡＬＰ、ＧＣＡＬＰ、ＩＡＰまたはその融合／変異型タンパク質）製造工程で著しくより高い亜鉛濃度（例えば１５０μＭ）を必要とし得ることも予想外である。
【００９６】
５．播種密度
一般的に、より高い播種密度はより高いピークの生細胞密度をもたらし、それは主に生産培地のある特定の栄養成分制約が原因である。供給及び温度シフトが培養期間に基づく際、他の上流工程パラメーター（特に温度シフトのタイミング）とともに播種密度は、アスホターゼアルファの品質に場合により影響を与えることができる。
【００９７】
６．採取のタイミング
本例示の工程の採取のタイミングは２４０±６時間だった。ＴＳＡＣの採取タイミングの影響が示されている（例えば図７を参照）。更に採取タイミングは生存度（例えば図１４を参照）と関連していると考えられており、培養の最後近くでの生存度低下は、採取タイミングがアスホターゼアルファの品質に場合により影響を与えることを示す。
【００９８】
播種密度の管理、温度、ｐＨ、ＤＯ、ガス処理の方法、撹拌、ＣＰＮ供給、グルコース添加、ガラクトース添加、亜鉛添加及び採取タイミングを含む、種々の上流工程パラメーターが評価された。凝集物％、断片化％、シアリル化、グリコシル化、電荷分布及び比活性を含む、更なる上流の工程パラメーターは、例えば以下で論じるとおり、評価された。
【００９９】
温度は、凝集物、断片化及びシアリル化に強い影響を及ぼした。ｐＨもアスホターゼアルファのシアリル化に影響を与えた。ガス処理の方法または／及び撹拌は、生存度に影響を与えると思われた。ＣＰＮ供給添加は、シアリル化に影響を及ぼすと思われた。亜鉛添加は酵素活性を維持するのに重要であることを示し、亜鉛添加の量（１５０μＭ）は示した実験に基づいて決定された。採取のタイミングは、生存度及び培養終了時に近づくと低下するＴＳＡＣと関連することがわかった。
【０１００】
実施例４．代表的な工程＃３の更なる上流工程パラメーターの評価
本実施例は、生産用バイオリアクター工程パラメーターのスクリーニングのために実施した、上流工程の更なる特性決定についてまとめる。最初の評価において、生成培養のｐＨ、温度、播種密度、ガス処理の方法、撹拌、ＣＰＮ供給、グルコース添加、ガラクトース添加及び採取タイミングを含む、上流工程パラメーターのリストを、本例示の工程で試験した。
【０１０１】
頭字語
ＣＰＰ：重要な工程パラメーター、重要な品質特性に影響を及ぼし、したがって工程が所望の品質を作成するのを確実にするために、モニタされて制御される工程パラメーター（工程入力）
ＣＱＡ：重要な品質特性
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬｏＱ：定量限界
Ｐ／Ｖ：容積当たりの電力
【０１０２】
材料及び方法
最初の実験で影響の可能性があると示された工程パラメーターを、更に調べた。６ブロックのバイオリアクターを、以下の工程特性決定試験で行った（表８）。各工程パラメーターの３レベルは、製造及び工程パラメーター範囲試験の制御能力を考慮した現在の設定値（対照）として中央値レベルで試験した。ブロック１〜５において、２つの複製対照を有する３レベル完全実施計画を実施した。ブロック６で、高度Ｐ／Ｖ及び散布ＶＶＭプラス２つの対照の４つの組み合わせを行った。
【表８】
2018523481.tif 000011
【０１０３】
細胞培養
本実験で参照されるすべての製造工程は、２Ｌまたは１０Ｌバイオリアクターで実施された。解凍後、細胞を、生産用バイオリアクターの接種前に、一連の振とうフラスコ及びスピナーフラスコによって増殖させた。生産用バイオリアクター（２Ｌまたは１０Ｌ）は、特に指示がない限り、Ｐ／Ｖ及び散布ＶＶＭを使用して評価された。対照条件下で、細胞培養工程のパラメーターは以下のとおりである。培養ｐＨ設定値は、０．０５の不感帯を有する６．９０だった。温度は、３６．５℃にて０〜１２０時間制御されて、１２０時間で３３℃にシフトした。溶存酸素の設定値は、３０％に維持された。最初のＰ／Ｖは１７Ｗ／ｍ３（０〜９６時間）であり、９６時間の第１のボーラス供給添加の前に８１Ｗ／ｍ３にシフトした。ボーラス当たり２．６７％（ｖ／ｖ）のＣＰＮ供給は、９６時間、１６８時間及び１９２時間に添加された。グルコースを≦２ｇ／Ｌで維持した。グルコースが２ｇ／Ｌを下回る場合．毎日のボーラス添加は、グルコース濃度を１．８〜２．０ｇ／Ｌの範囲に上昇させるために適用された。ガラクトースは、培養の全体にわたって、０日目及び４日目２．０ｇ／Ｌ、ならびに５日目〜９日目は毎日１．０ｇ／Ｌ補充された。培養の一部を１０日目（２４０±４時間）及び１１日目（２６４±４時間）に採取した。
【０１０４】
採取及び精製
生産用バイオリアクターから採取した試料を、５分間の３０００×ｇでの遠心分離後、０．２２μｍのフィルターによって浄化した。浄化して濾過した採取物の精製を実施した。精製の程度は本実験及び試料試験基準によって決定した。一ステップ（タンパク質Ａ）または２つの連続ステップ（タンパク質Ａ及びＨＩＣ）の精製を実施した。更に試料は、分析試験の前に低塩含有緩衝液（５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
【０１０５】
分析的特性評価
本実験で参照する品質特性は、凝集物％、断片化％、電荷分布、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）及び中性グリカン種レベルを含む。凝集物及び断片レベルの両方は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して定量化される相対的ピーク面積により決定した。更にアスホターゼアルファの純度（メインピーク）も、ラボオンチップ（ＬｏＣ）キャピラリー電気泳動を使用して測定した。電荷分布は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を使用して推定した。ＴＳＡＣは、パルスアンペロメトリー検出を備えた高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）によって定量化された。中性グリカン種の検出は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって実施された。容量活性は、パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）系アルカリホスファターゼ酵素アッセイに従って測定した。
【０１０６】
統計解析及びデータの可視化
生産性及び各品質特性に影響を与える試験した工程パラメーターの可能性は、統計ソフトウェアパッケージＪＭＰ（Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して評価した。３つの連続パラメーター（２つの試験工程パラメーターにおいてそれぞれ３レベル、採取において２レベル）を分析した。両側ｔ検定によって計算した個々ｐ値が報告され、０．０５が有意閾値に選ばれた。ＪＭＰによって生成された等高線図は、試験したパラメーターの各品質特性への潜在的影響を可視化するために使用した。
【０１０７】
結果
本例示の工程の各ＣＱＡにおける許容可能な範囲がまだ調査中だったので、例示の実験範囲が作成されて、比較のために使用した（表９）。１０日目の結果全てから生じたデータソースは、本実験で得た。ＳＥＣによる断片及び凝集物ならびにＡＥＸによる塩基性及び酸性ピークを含む不純物測定において、平均プラス標準偏差の２倍を、上の閾値として使用した。ＳＥＣで測定した断片及びＡＥＸで測定した塩基性ピークにおける計算した上の閾値が、ＳＥＣ及びＡＥＸアッセイのＬｏＱ（１％）より低い場合、上の閾値は両方の特性について１％に設定された。ＴＳＡＣについて、平均±標準偏差の２倍を実験範囲として使用した。
【表９】
2018523481.tif 000012
【０１０８】
各ＣＱＡの各工程パラメーターの直接の影響の意義を表１０にまとめる。Ｐ／Ｖ及び散布ＶＶＭ影響のｐ値は、検出力の不足のため計算されなかった。ｐ値≦０．０５は、統計的に有意であると考えられている。
【表１０】
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【０１０９】
表１１は、試験した工程パラメーター最小最大レベルで得た平均の品質特性値についてまとめている。例えばグルコース及びガラクトース添加実験で、３つのバイオリアクターはグルコース添加閾値として１．５ｇ／Ｌを使用し、各々は異なるガラクトース添加レベルを有した。グルコース閾値条件１．５ｇ／ＬのＣＱＡ値は、その３つのバイオリアクターから平均を使用して計算した。以下の項で、特に言及されない限り、１０日目のデータを品質の考察のために使用する。
【表１１】
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【０１１０】
１．ｐＨ
生成されたアスホターゼアルファのＴＳＡＣに影響を与えるｐＨを、従来の結果は示した。アスホターゼアルファの生産性及び品質の培養ｐＨならびに生成温度の影響の可能性を、２Ｌのバイオリアクターで更に調べた。３つの培養ｐＨレベル（６．７５、６．９０及び７．１０）及び３つの生成温度レベル（３０．０℃、３３．０℃及び３５．０℃）を含む完全実施計画を行い、すべての条件からの試料を、２４０±４時間及び２６４±４時間でそれぞれ採取した。二ステップ精製（ＰｒｏＡ＋ＨＩＣ）は分析的解析の前に行った。
【０１１１】
試験した範囲６．７５〜７．１０の培養ｐＨ設定値は、試験したすべてのＣＱＡが表９で指定した小規模実験範囲内にあったという点で、重要な工程パラメーター（ＣＰＰ）であるとは考えられなかった。しかしｐＨは、いくつかの試験した品質特性に著しく影響を及ぼすことが示された。６．７５〜７．１０のｐＨ設定値の上昇は、３３℃の対照生成温度シフト後に１．９から２．７に増加するＴＳＡＣをもたらした（図１０Ａ）。ｐＨは、ＳＥＣで測定した断片化及びＡＥＸで測定した塩基性ピークにも著しい影響を及ぼした（表１０）が、その影響は０．２％以下であり（表１１）、それはＨＰＬＣによるアッセイ偏差の０．５％未満だった。更に対照条件下（ｐＨ６．９０及び生成温度３３．０℃）で、タンパク質Ａ力価及び容量活性の両方の観点から最高の生産性が得られた（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。
【０１１２】
ＣＱＡで６．７５〜７．１０の範囲のｐＨ設定値の影響が、実験範囲内にすべてあることを、データは示し、それは生成培養ｐＨがＣＰＰである可能性が低いことを示唆した。種々の実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２またはそれより高いｐＨ設定値で生成される。
【０１１３】
２．温度
温度が、凝集物、断片化及びＴＳＡＣを含む、いくつかのパラメーターに強い影響を及ぼすことを、従来の結果は示した。以前の工程は１２０時間で３６．５℃から３３．０℃の温度シフトを使用したので、温度の影響調査は、３つのパラメーター、増殖温度（０〜１２０時間）、生成温度（採取までの１２０時間）及び温度シフトのタイミングで分析した。この３つの温度関連のパラメーターは別に更に調べられて、以下にまとめた。
【０１１４】
２．１増殖温度
増殖温度の影響は、２ＬのバイオリアクターのＤＯ設定値と共に検討した。３レベルの増殖温度（３５．０℃、３６．５℃及び３７．５℃）を異なる試験条件下で０〜１２０時間維持して、続いて１２０時間に３３．０℃に温度シフトした。すべての条件からの試料は、２４０±４時間及び２６４±４時間に採取した。一ステップ精製（ＰｒｏＡ）を分析的解析の前に行った。増殖温度は、増殖速度及び生存度に影響を与える。より高い増殖温度は初期段階のより速い増殖率に相関して、温度シフト後に迅速な増殖率の低下が続き、それは下のピークのＶＣＤをもたらした。更に、より高い増殖温度による培養は、採取日に２〜４％低い最終的な生存度も有した。興味深いことに、増殖温度は著しく生産性に影響を与えて、容量活性は３６．５℃の増殖温度でピーク値を得た（図１１Ａ）。
【０１１５】
アスホターゼアルファの品質への影響としては、増殖温度は、ＳＥＣの測定で断片化のみに重要な影響を及ぼすことが示された（図１１Ｂ）。３５．０℃から３７．５℃に増殖温度を上昇させることは、０．３％から０．８％に上昇した断片レベルをもたらした。このような測定値がすべてＳＥＣアッセイのＬｏＱ（１％）未満であったことに注意する。
【０１１６】
増殖温度によるＣＱＡの影響がすべて実験範囲内だったので（表９及び表１１）、３５．０℃〜３７．５℃の範囲内の増殖温度はＣＰＰである可能性が低い。種々の実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、３３．０℃、３３．５℃、３４．０℃、３４．５℃、３５．０℃、３５．５℃、３６．０℃、３６．５℃、３７．０℃、３７．５℃、３８．０℃または３８．５℃の増殖温度で作成される。１つの特定の実施形態で、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、３５．０℃、３６．５℃、３７．０℃または３７．５℃の増殖温度で作成される。
【０１１７】
２．２生成温度
ＣＱＡの生成温度の影響（３０．０℃、３３．０℃及び３５．０℃）は、２Ｌのバイオリアクターの培養ｐＨ設定値と共に検討した。一ステップ精製（ＰｒｏＡ）を分析的解析の前に行った。
【０１１８】
生成温度は、ＣＱＡに、特にＳＥＣで測定したＴＳＡＣ、凝集物及び断片化ならびにＡＥＸで測定した酸性ピークに著しい影響を与える（表１０及び表１１）。３０．０℃から３５．０℃に生成温度を上昇させることは、１．６から２．７への平均ＴＳＡＣの増加をもたらし（図１０Ａ）、その一方で３５．０℃〜３０．０℃の生成温度を低下させることは、３．８％から８．２％のＳＥＣで測定した凝集物の大幅な増加をもたらした（図１２Ａ）。更にＡＥＸで測定される酸性ピークは、生成温度を低下させると共に３．７％から８．５％に増加した（図１２Ｂ）。３０．０℃より高い生成温度が、低ＴＳＡＣのリスクを低下させて、増加した凝集物／酸性ピークを防ぐために、おそらく有益であることを、このデータは示唆した。一方で、ＳＥＣで測定した生成温度及び断片化（図１２Ｃ）、ならびにＡＥＸで測定した塩基性ピーク（図１２Ｄ）の間に極めて微妙な正相関があるように見える。３５℃より低い生成温度がアスホターゼアルファの断片化のリスクを低下させるために好ましい可能性があることを、このデータは示唆した。
【０１１９】
生産性への影響の観点から、生成温度は、タンパク質Ａ力価及び容量活性に最大の影響を及ぼすように見える（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。３０．０℃〜３５．０℃の範囲で、生成温度を上昇させることは、生産性を増加させることと関連している。しかし、ｐＨ７．１０未満で、生成温度はｐＨと相互作用して生産性に影響を与え、そこで最高容積生産性は３３．０℃の生成温度で生じる。容量活性及びタンパク質Ａ力価の両方に関するピーク生産性は、３３．０℃以上の生成温度下で、ｐＨ６．９０にて観察された。生成温度がいくつかのＣＱＡに重要な影響を及ぼす（表１０）ことが示されたが、その影響は依然として実験範囲内だった（表９及び表１１）。したがって３０．０℃〜３５．０℃の範囲の生成温度は、ＣＰＰである可能性が低い。種々の実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、２９．０℃、２９．５℃、３０．０℃、３０．５℃、３１．０℃、３１．５℃、３２．０℃、３２．５℃、３３．０℃、３３．５℃、３４．０℃、３４．５℃、３５．０℃、３５．５℃、３６℃またはそれより高い温度の生成温度で作成される。１つの特定の実施形態で、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、３０．０℃、３０．５℃または３５．０℃の生成温度で作成される。
【０１２０】
３．温度シフトのタイミング
ＣＱＡの温度シフトのタイミングの影響は、２Ｌのバイオリアクターの播種密度と共に検討した。３つの温度シフト時間（１０８時間、１２０時間及び１３２時間）を試験し、すべての条件からの試料は、２４０±４時間及び２６４±４時間に採取した。一ステップ精製（タンパク質Ａ）を分析的解析の前に行った。
【０１２１】
温度シフトのタイミングは、容量活性に微妙な影響を及ぼした（図１３Ａ）。高い播種密度で、１０８時間から１３２時間まで温度シフトのタイミングを遅延させることは、容量活性を減少させると思われる。しかし、低い播種密度で、最大の容量活性は、その後の温度シフト条件下で観察される。
【０１２２】
アスホターゼアルファの品質に関して、温度シフトのタイミングは、ＳＥＣで測定されるように、断片化にだけ著しい影響を与えることを示した（図１３Ｂ）。最新の温度シフト条件（１３２時間）下で、平均断片レベルは０．８％であり、断片化の小規模な実験範囲（＜１．０％）に近かった。したがって、より狭い温度シフトの時間ウインドウは、断片化のリスクを低下させるために、おそらく有益である。
【０１２３】
温度シフトのタイミングによるＣＱＡの影響がすべて実験範囲内だったので（表９及び表１１）、１０８時間から１３２時間の範囲の温度シフトのタイミングはＣＰＰである可能性が低い。
【０１２４】
種々の実施形態では、増殖（例えば、接種）の出発点後、温度シフトが約１００時間、１０５時間、１０８時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３２時間、１３５時間、１４０時間、１４５時間または１５０時間に生じる工程によって、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は作成される。１つの特定の実施形態で、温度シフトが約１０８時間、１２０時間または１３２時間に生じる工程によって、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は作成される。種々の実施形態では、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約２００時間、２１０時間、２２０時間、２３０時間、２４０時間、２５０時間、２６０時間、２６４時間、２７０時間、２８０時間、２８８時間（すなわち、１２日）または１２日以上の時点で採取される。１つの特定の実施形態で、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は、約２４０、２６４または２８８時間の時点で採取される。
【０１２５】
４．培地供給
以前の結果は、培地供給の添加がシアリル化に影響を与えることを示した。この例示の工程の対照として、培地の３つのボーラスを４日目、６日目及び８日目の生成用バイオリアクターに加え、総量は最初の培養液量の８％（ｖ／ｖ）に等しかった。ボーラス数は変更せずに、３つの供給量は、６７％、１００％（対照）及び１３３％で試験した。ボーラス添加のタイミングに関して、３つの方法、（１）３日目、５日目及び７日目、（２）４日目、６日目及び８日目（対照）、（３）５日目、７日目及び９日目を調べた。すべてのバイオリアクターは、２Ｌのバイオリアクターで行われ、すべての条件からの試料は、２４０±４時間及び２６４±４時間に採取した。一ステップ精製（タンパク質Ａ）を分析的解析の前に行った。
【０１２６】
培地供給量及び開始タイミングは生産性に直接影響を与えなかったが、それらの相互作用は、容量活性に微妙な影響を及ぼすと思われた（図１４Ａ）。対照条件下で、最大の容量活性が得られた。３３％少ない供給が提供されるとき、供給開始を遅延させることは低い容量活性をもたらした。
【０１２７】
より多く（１３３％）及びより早い（３日目の第１ボーラス）供給条件下で観察した上昇した酸性ピーク（１０．１％）ならびに凝集物（９．５％）は、小規模の実験範囲（酸性ピークは１０．２％及び凝集物は９．６％、表９）に近く、少なくとも１つのパラメーターが、大規模で、例えばボーラス当たりの培地供給量の１５％の変化及び／または比較的短い添加時間ウインドウ（９６±３時間、１４４±３時間及び１９２±３時間））で、より強力に制御されることを必要とすることを示す。培地供給の添加によるＣＱＡの影響がすべて実験範囲内だったので（表９及び表１１）、６７％〜１３３％の範囲の培地供給量及び供給のタイミング（９６±２４時間、１４４±２４時間及び１９２±２４時間）はＣＰＰである可能性が低い。
【０１２８】
種々の実施形態では、培養培地の余分なボーラスが生産用バイオリアクターに加えられる工程によって、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は生成される。例えば培養培地の１、２、３、４、５、６以上のボーラスを加えることができる。１つの特定の実施形態で、培養培地の３つのボーラスを添加する。種々の実施形態で、培養培地のこのような余分のボーラスは、様々な量で加えることができる。例えば培養培地のこのようなボーラスは、生産用バイオリアクターの培養培地の最初の量の約２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、６０％、６７％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１２５％、１３０％、１３３％、１４０％、１５０％、１６０％、１６７％、１７０％、１７５％、１８０％、１９０％、２００％以上の量で加えることができる。１つの特定の実施形態で、培養培地のこのようなボーラスは、最初の量の約３３％、６７％、１００％または１３３％の量で加えることができる。種々の実施形態では、余分なボーラスのこのような添加は、細胞増殖またはタンパク質生成期間中の様々な時間に生じることができる。例えばボーラスは、本工程の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目またはそれ以降に加えることができる。１つの特定の実施形態において、培養培地のこのようなボーラスは、２日に１回（例えば、（１）３日目、５日目及び７日目に、（２）４日目、６日目及び８日目に、または（３）５日目、７日目及び９日目に）添加することができる。実際には、培養培地のボーラス補充の頻度、量、時点及び他のパラメーターは、上記の制限に従って自由に組み合わされて、実験実施で測定されることができる。
【０１２９】
５．播種密度
本実験で、ＣＱＡの播種密度の影響は、２Ｌのバイオリアクターの温度シフトのタイミングと共に検討した。３つの播種密度（４．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ及び８．０×１０５細胞／ｍＬ）を試験し、すべての条件からの試料は、２４０±４時間及び２６４±４時間に採取した。一ステップ精製（タンパク質Ａ）を分析的解析の前に行った。
【０１３０】
温度シフトのタイミングは、生産性に非常に強い影響を及ぼす。図１３Ａに示すように、播種密度を４．０×１０５細胞／ｍＬから８．０×１０５細胞／ｍＬに増加することは、平均で８０６Ｕ／ｍＬから１０１２Ｕ／ｍＬに容量活性を増加することに至った。
【０１３１】
アスホターゼアルファの品質に関して、播種密度は、ＳＥＣで測定されるように、断片化に著しい影響を与えることを示しただけであった（図１３Ｂ）。最高の播種密度条件（８．０×１０５細胞／ｍＬ）下で、平均断片レベルは０．８％であり、断片化の小規模な実験範囲（＜１．０％）に近かった。したがってより狭い播種密度範囲は、大規模で断片生成のリスクを低下させるために有益であり得る。
【０１３２】
播種密度によるＣＱＡの影響が実験範囲だったので（表９及び表１１）、４．０×１０５細胞／ｍＬから８．０×１０５細胞／ｍＬの範囲の播種密度はＣＰＰである可能性が低い。種々の実施形態で、細胞が約１．０×１０５細胞／ｍＬ、１．５×１０５細胞／ｍＬ、２．０×１０５細胞／ｍＬ、２．５×１０５細胞／ｍＬ、３．０×１０５細胞／ｍＬ、３．５×１０５細胞／ｍＬ、４．０×１０５細胞／ｍＬ、４．５×１０５細胞／ｍＬ、５．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬ、６．０×１０５細胞／ｍＬ、６．５×１０５細胞／ｍＬ、７．０×１０５細胞／ｍＬ、７．５×１０５細胞／ｍＬ、８．０×１０５セル／ｍＬ、８．５×１０５細胞／ｍＬ、９．０×１０５細胞／ｍＬ、９．５×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０６細胞／ｍＬ、１．５×１０６細胞／ｍＬ、２．０×１０６細胞／ｍＬまたはそれより高い密度で播種される工程によって、アルカリホスファターゼ（例えば、アスホターゼアルファ）は作成される。１つの特定の実施形態において、このような工程で、細胞は、約４．０×１０５細胞／ｍＬ、５．５×１０５細胞／ｍＬまたは８．０×１０５細胞／ｍＬの密度で播種される。
【０１３３】
６．採取のタイミング
採取のタイミングを遅延させることが生存度及びＴＳＡＣの低下と関連していることを、従来のデータは示したので、採取のタイミングは他のＣＱＡに影響を及ぼす可能性がある。すべての工程の特性決定の実験において、試料は、すべてのバイオリアクターから１０日目（２４０±４時間）及び１１日目（２６４±４時間）に採取された。１０の２Ｌバイオリアクターは、工程の特性決定の実験の複数のブロックの対照条件としての役割を果たした。すべてが現在の工程パラメーター設定による同じ条件下で実行されたので、それらにより、アスホターゼアルファ生産性及び品質に関する採取タイミングの調査が可能になった。その１０の２Ｌバイオリアクターからの分析結果を、表１２に表示する。２つのバイオリアクター（＃１８及び＃１９）からの試料が二ステップ精製（ＰｒｏＡ＋ＨＩＣ）によって精製されて、他の８つのバイオリアクターから（＃１０〜＃１７）のものはＰｒｏＡだけによって精製された。ＴＳＡＣに影響を与えずに、ＨＩＣが試料の純度を増加させることができるという点に留意すべきである。
【表１２】
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【０１３４】
各個別の実験で、採取のタイミングが統計解析の第３のパラメーターとして扱われた。個々の研究に示すように、採取を１０日から１１日に遅延させることは、約１０〜１５％の増加したタンパク質Ａ力価及び容量活性をもたらした。
【０１３５】
ＴＳＡＣの採取のタイミングの著しい影響は、すべての５つの個別の実験で観察された。採取を１日遅延させることは、平均でタンパク質のモル当たり約０．３〜０．４モルのシアル酸のＴＳＡＣ低下をもたらしたが、両方の条件下のＴＳＡＣは、表９に示すように小規模の実験範囲（１．５〜２．９）内のままだった。ＴＳＡＣへの採取タイミングの重要な影響の理由から、早めの採取は、ＴＳＡＣを増加させるために実行され得る。
【０１３６】
ＳＥＣで測定した凝集物及びＡＥＸで測定される酸性ピークに関しては、採取タイミングは５つの実験中３つで統計学的に有意な影響を及ぼすことが示された（表１３）。
【０１３７】
しかしいずれのＣＱＡに対する影響の規模も、各個別の実験の対照条件と比較して１％未満であり、重要なものではなかった。更にすべての値は、表９で明記された小規模の実験範囲に入った（凝集物≦９．６％及び酸性ピーク≦１０．２％）。
【０１３８】
断片レベルは、５つの実験研究中１つで採取タイミングに影響を受けた（表１３に示す）。しかし、採取を１日遅延することは、２つの対照条件下でわずかに０．１〜０．２％高い断片をもたらし、１１日目の断片レベルはＳＥＣアッセイのＬｏＱ（１％）未満のままだった。同様に塩基性ピークのレベルは、ｐ値０．０３で、１０日目の０．２〜０．３％から１１日目の０．４％に上昇した（表１３）。しかし両方の値は、ＡＥＸアッセイのＬｏＱ（１％）よりはるかに下方のままだった。したがって１０日目（２４０±４時間）〜１１日目（２６４±４時間）の範囲の採取タイミングは、ＣＰＰである可能性が低い。
【表１３】
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【０１３９】
結論
この実験で試験した工程パラメーターは、培養ｐＨ設定値、温度、播種密度、培地供給及びタイミング、グルコース添加、ガラクトース添加及び採取タイミングを含む。表１４は、工程パラメーターで使用したそれぞれについてまとめている。
【表１４】
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【０１４０】
実施例５．例示の工程＃４におけるアスホターゼアルファ品質特性のｐＨ及び生成温度の影響の高解像度調査
以前の評価に関して、例示の製造工程のアスホターゼアルファ生産性及び品質特性への培養ｐＨ及び生成温度（≧１２０時間）の影響の高解像度試験を、この実験は提供する。試験したシナリオは、１）異なるｐＨレベル（すなわち、６．７０、６．８０、６．９０、７．００及び７．１０）及び３３℃の同じ生成温度、ならびに２）異なる生成温度（すなわち、３１．０℃、３２．０℃、３３．０℃、３４．０℃及び３５．０℃）及び６．９０の同じｐＨ設定値を、含む。すべての条件からの試料は２４０±４時間で採取され、タンパク質Ａ精製材料を、いくつかの品質特性（例えば、断片化％、凝集物％、電荷分布、総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）及び中性グリカン範囲）について試験した。６．７０〜７．１０の範囲のｐＨ設定値及び３１．０℃〜３５．０℃の範囲の生成温度で実施する本工程がすべてのＣＱＡを維持することを、本実験は確認した。
【０１４１】
細胞培養
本実験で行われるすべての試験は、Ｍｏｂｉｕｓ３Ｌの使い捨てバイオリアクター（ＣＲ０００３Ｌ２００、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。本実験で使用した工程パラメーターのリストを、表１５に示す。更に４つの追加の培養ｐＨ条件を対照生成温度（３３．０℃）で試験し、４つの追加の温度を対照培養ｐＨ（６．９０）で試験した（表１６）。
【表１５】
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【表１６】
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【０１４２】
細胞密度及び生存度は、ＶｉＣｅｌｌ  ＶＲを使用して計数した。ｐＨ及びオフラインガスはｐＨＯｘを使用して測定され、グルコース及びラクテートを含む主要な代謝物はＮｏｖａ  Ｐｒｏｆｉｌｅ１００（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して測定された。酵素活性は、酵素活性測定の前に、３回の代わりに、各試料を１度だけ希釈する変形版による標準方法を使用して測定された。
【０１４３】
採取及び精製
１０日目（２４０±４時間）の５０マイクロリットルの試料を、注射器を使用してすべてのバイオリアクターから採取した。遠心分離（３０００×ｇ、５分）による細胞除去の後、上清を、０．２２μｍボトルの上面フィルターを使用して浄化して、精製前に−８０℃で保存した。ハイスループットプレートベース精製（タンパク質Ａ）の単回ステップを、この実験で適用した。試料は、分析的及びタンパク質特性評価分析の前に、低塩濃度緩衝液（５ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
【０１４４】
分析的及びタンパク質特性評価
本実験で分析する重要な品質特性は、凝集物％、断片化％、電荷分布、ＴＳＡＣ及び中性グリカン分布を含んだ。凝集物レベルは、ＳＥＣで定量化した総タンパク質に対する凝集物ピークの割合により推定した。断片レベルは、ＳＥＣ及びＬｏＣで定量化した総タンパク質に対する断片の割合により推定した。電荷分布は、ＡＥＸでそれぞれ定量化した総タンパク質に対する塩基性ピーク、メインピーク及び酸性ピークの割合により推定した。シアリル化レベル（またはＴＳＡＣ）はＨＰＡＥ−ＰＡＤによって定量化された。中性グリカン種の検出はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって実施された。等電点電気泳動はｉＣＥ２８０システムを使用して実施した。
【０１４５】
結果
細胞培養の実施
前述のように、培養ｐＨ及び生成温度の両方は、細胞培養の実施に影響を及ぼす。低ｐＨ条件（ｐＨ＝６．７０）は最低の増殖率及び最低の最大ＶＣＤをもたらし、採取日（１０日目）に１１．１×１０６細胞／ｍＬ（図１５Ａ）の最大濃度に達する。より高いｐＨ条件（ｐＨ＝７．００及び７．１０）は、１０日目に他の条件より１〜２％低い生存度になった（図１５Ｂ）。
【０１４６】
より高い生成温度は、増加した増殖（図１６Ａ）及び、培養終了時に近づくとより迅速に低下する生存度とも関係していた（図１６Ｂ）。より低い生成温度は下方ピークＶＣＤを生じさせたが、３３．０℃の対照設定値に相当する生存度を生じさせた。
【０１４７】
培養ｐＨを増加させることは、グルコースのより迅速な消費も引き起こし（図１７Ａ）、ならびに（温度シフトの前に）培養の初期中のラクテートのより多い生成及び培養期間全体にわたるラクテートのより多い全体の蓄積の両方を引き起こした（図１７Ｂ）。
【０１４８】
培養細胞を、増殖温度を生成温度へシフトする前に、５日間（１２０時間）増殖させた。グルコース及びラクテート両方のプロファイルは、０日目と５日目の間にかなり一致していた（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。温度シフトの後、より高い生成温度は、グルコースのより高い消費と関係していた。ラクテートの最大濃度のわずかな低下は、他の条件と比較して、３３．０℃の生成温度条件下で観察された。更に３５．０℃の生成温度は、他のすべての条件と比較して、培養の９日目及び１０日目の間、著しく減少したラクテート消費を示した。
【０１４９】
３０．０℃と３５．０℃の間の生成温度及び６．７５と７．１０の間の培養ｐＨの範囲において、生成温度が、タンパク質Ａ力価及び比活性の両方に対し、培養ｐＨより劇的な効果を有することが、以前に観察された。しかし本実験の低ｐＨ条件（６．７０）は、対照条件（ｐＨ＝６．９０）と比較して、３５％の低下をもたらすタンパク質Ａ力価への劇的な影響（図１９Ａ）、及び他のすべての試験したｐＨ条件と比較して非常に低い容量活性（図１９Ｂ）を有するように思われた。培養ｐＨは、特異的タンパク質Ａ生産性に影響を及ぼすように見えなかった（図１９Ｃ）。しかし、低ｐＨ条件は最高の比活性を生成して（図１９Ｄ）、培養ｐＨを減少させることと比活性を増加させることの間の一般的な傾向が観察された。
【０１５０】
低い生成温度条件（３１．０℃及び３２．０℃）は、対照条件と比較して、タンパク質Ａ力価の大幅な低下（それぞれ２６％及び２１％）を引き起こした（図２０Ａ）。更に上昇した生成温度は、より高い容量活性（図２０Ｂ）及びわずかに増加した特異的タンパク質Ａ生産性（図２０Ｃ）と関連した。生成温度を変えることから比活性への影響は観察されなかった（図２０Ｄ）。
【０１５１】
培養ｐＨ及び生成温度の影響を調べた本実験及び以前の作業からのすべての品質特性を、表１７にまとめる。
【表１７】
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【０１５２】
以前の実験の場合、ＴＳＡＣは、培養ｐＨ及び生成温度の影響を受けた（図２１）。ＴＳＡＣの小規模な実験範囲は１．５〜２．９であり、より高いＴＳＡＣはこの範囲内でより望ましかった。培養ｐＨまたは生成温度を上昇させることは、生成物のＴＳＡＣを増加させることを示した。一方で、６．７０から７．１０に培養ｐＨ設定値を上昇させることは、およそ１．５から２．６〜２．８までのＴＳＡＣ増加をもたらし、それは小規模の実験範囲内だった。他方で、３０．０℃から３５．０℃に生成温度を上昇させることは、およそ１．４から２．６〜２．８までのＴＳＡＣ増加をもたらした。３０．０℃の生成温度下のＴＳＡＣ値（１．４）が小規模実験範囲の下限（１．５）より低かったので、３０．０℃の生成温度は、生産用バイオリアクターで回避されることが望ましい。ＴＳＡＣが、培養ｐＨまたは生成温度を上昇させることによって、またはその両方を上昇させることによって増加できることをこのデータは示す。
【０１５３】
不純物のレベルは、ＡＥＸを使用する酸性ピークの割合で現在測定されるように、図２２に示される。生成温度を上昇させることは、生成物の酸性ピークの割合を低下させた。培養ｐＨは、ＡＥＸ酸性のピークで測定される不純物と相関するように見えなかった。生成温度がＡＥＸ酸性ピークの割合への影響を示したが、すべての値は精製で許容可能な限度の範囲内だった（≦１０．２％）。ＡＥＸ塩基性ピークは一貫して、実験したすべての条件でアッセイのＬｏＱについて１％未満だった。
【０１５４】
以前の実験は、ＳＥＣで測定されるように、ＡＥＸ酸性ピークと凝集物割合の間の強い相関を示した。図２３に示すように、この傾向は本実験でも維持された。より高い生成温度は、より低い凝集物割合をもたらした。すべての凝集物割合は、小規模の実験範囲内であった（≦９．６％）。培養ｐＨは、凝集物割合に強い影響を及ぼさない。ＳＥＣで測定されるアスホターゼアルファの断片は、すべての条件において、アッセイのＬｏＱについて１％未満だった。
【０１５５】
ＬｏＣで測定したメインピーク割合は、生成温度によって著しく影響を受けることが以前確認された。増加する生成温度と非還元メインピーク割合の間の正相関が見いだされた（図２４Ｂ）。ＬｏＣメインピーク割合（非還元）に対する培養ｐＨの明白な影響は見いだせなかった（図２４Ａ）。還元ＬｏＣ分析は、すべての条件について１００％メインピークを確認した。
【０１５６】
実施例２の例示の工程で記載したＢＤＳ材料と比較すると、新しい中性種はいずれの条件でも観察されなかった。しかし、プロファイルのシフトは、低ｐＨ条件とより高いｐＨの間で見られ、より高次のグリコフォームは、より高い培養ｐＨで生成される物質から観察された（図２５）。より高い生成温度（３４．０℃及び３５．０℃）で生成される物質に存在するより高次のグリコフォームを有する生成温度で、類似の傾向が観察された（図２６）。
【０１５７】
ｉＣＥ２８０クロマトグラムからのピーク測定は、ピーク６として最高の塩基性ピークを同定すること、及び逆の番号順にピーク５〜２として次の４つのピークを同定することによって実施した。次に、ピーク１が、ピーク２の後の次のピークのｐＩ未満で同定されたすべてのピーク割合からなっていた。確認されたピークの得られたｐＩ値を表１８に示す。培養培地ｐＨ及び生成温度の両方は、キャピラリー等電点電気泳動結果に影響を及ぼすように見える（図２７）。培養ｐＨまたは生成温度を上昇させることは、ピーク１として同定した低いｐＩピークの割合の増加をもたらした。更に、高いｐＩピーク（ピーク５及び６）の関連する割合は、培養ｐＨまたは生成温度の増加と共に低下した。これらの因子は、ｐＨまたは生成温度の増加と関連するより酸性の種への一般的なシフトを示した。このシフトは、増加したｐＨ及び生成温度と関連した増大したシアリル化に関連し得て、それは酸性種のより大きな割合をもたらす。
【表１８】
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【０１５８】
結論
以前特定したように、測定されたすべてのＣＱＡが小規模範囲内にあったという点で、培養ｐＨ（６．７０〜７．１０）及び生成温度（３１．０〜３５．０℃）がＣＰＰである可能性が低いことを示す以前の結果を、この実験は確認する。培養ｐＨ及び生成温度の両方は、多くの細胞培養性能パラメーター及び品質特性に影響を与える。特に培養ｐＨまたは生成温度を上昇させることは、増加した最大ＶＣＤをもたらすが、培養の後期の生存度の急速な低下も引き起こす。
【０１５９】
培養ｐＨ及び生成温度の両方は、タンパク質Ａ力価及び容量活性に関して生産性に影響を与えることができる。６．７０の培養ｐＨは、低タンパク質Ａ力価及び容量活性をもたらした。培養ｐＨ設定値を上昇させることは、減少した比活性をもたらした。したがって培養ｐＨがタンパク質Ａ力価への好ましい影響を及ぼすが、６．８０〜７．１０の範囲のｐＨ下の容量活性に関しては違いがほとんどなかった。更に生成温度を上昇させることは、増加したタンパク質Ａ力価及び容量活性をもたらすが、比活性に影響を及ぼさなかった。
【０１６０】
培養ｐＨまたは生成温度を上昇させることは、より高いＴＳＡＣ値ももたらした。後者のパラメーターを増加させることは、凝集物及び酸性ピークの形成も減少させた。最後に培養ｐＨ及び生成温度の両方は、生成物の等電点電気泳動プロファイルをシフトするように見える。６．７０〜７．１０の範囲のｐＨ及び３１．０℃〜３５．０℃の範囲の生成温度が許容可能であり、両方の工程パラメーターの厳格なコントロールは、大型化（例えば、１０，０００Ｌの大型化した工程）の際に工程の耐性及び整合性を維持するために推奨される。
【０１６１】
実施例６．余分な供給補充によって、活性アスホターゼアルファ力価を改善すること
これまで実施例で説明したように、アスホターゼアルファ（ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０）を作成するための以前の例示の工程は、採取時に約０．１ｇ／Ｌの活性アスホターゼアルファ力価を有する低生成工程であった。代わりの製造工程を、工程改善のために本明細書で例示する。上流及び下流の両方の工程を評価した。
【０１６２】
上流の細胞培養工程パラメーターによるアスホターゼアルファの性質及び生産性への影響の可能性は、以前の実験で評価した。他の任意の重要な品質特性（ＣＱＡ）に影響を与えずに力価及び／または容量活性を改善するために、金属補充（Ｚｎ２＋／Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋）、温度シフトのタイミング、ＣＨＯ供給量及び採取のタイミングを含む、細胞培養パラメーターが評価された。金属補充が対照条件より著しく低いＴＳＡＣをもたらすことを以前の実験からのデータが示し、したがって更なる評価で除外された。５４時間から７８時間に温度シフトのタイミングを遅延させることは、より低い比活性及びより高いタンパク質Ａ力価をもたらした。その結果、後の温度シフト条件下の全体の容量活性は、同一のままだった。１×（２日目の５ｍｌ／Ｌ）から４×（２、４、６及び８日目の５ｍｌ／Ｌ）にＣＨＯ供給ボーラス投与量を増やすことは、他の試験した品質特性（例えば、ＴＳＡＣ、電荷分布及び中性グリカン分布）への悪影響を及ぼさずに、容量活性の著しい増加をもたらした。１０日目から１２日目に採取日を遅延させることは、より高い生産性（例えば、容量活性、タンパク質Ａ力価及び比活性）ならびにわずかにより低いＴＳＡＣと関連していた。このデータに基づいて、ＣＨＯ供給量の増加は、１０Ｌ規模の更なる評価のための本実験で選択された。
【０１６３】
材料及び方法
アスホターゼアルファ（ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０）生成のための上流工程は、以下のシードトレイン及び細胞培養工程：５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の細胞の接種材料解凍、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の接種材料増殖（フラスコ／ローラー期）、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の接種材料増殖（細胞バッグ期）、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の接種材料増殖（１００Ｌ−低レベル）、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の接種材料増殖（１００Ｌ−高レベル）、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の１０００Ｌシードバイオリアクター（Ｎ３−低レベル）、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の１０００Ｌシードバイオリアクター（Ｎ２−高レベル）、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の４０００Ｌシードバイオリアクター（Ｎ１）、５．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度の２００００Ｌ生産用バイオリアクター（Ｎ１）、によって実施した。本実験で、対照及び改善したバイオリアクター工程におけるバイオリアクターの接種材料として使用する、小規模シードトレイン工程は、接種材料解凍、継代１（１×１００ｍＬ振とうフラスコ、５×１０５細胞／ｍＬの標的播種）、継代２（２×１００ｍＬ振とうフラスコ、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種）、継代３（２×１Ｌスピナー、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種）、継代４（２×１５Ｌスピナー、３．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種）、８×１０Ｌのバイオリアクター、５．５×１０５細胞／ｍＬの標的播種を含む。本実験で使用した１０Ｌバイオリアクターは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵ  ＩＩバイオリアクターシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＭＦＣＳ／ｗｉｎ３．０Ｍｏｄｕｌｅ  Ｓｈｅｌｌ３．０（レベル３２）データ収集ソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）だった。生産用バイオリアクターで使用する原材料のリストは、ＣＭ６９増殖培地、１００μＭのＭＴＸ（メトトレキサート）、２００ｍＭのＬ−グルタミン、ＣＭ７０培養培地、Ｓｉｇｍａ  ＣＨＯ供給、１０％の炭酸ナトリウム及びＦｏａｍＡｗａｙ  ＡＯＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含んだ。
【０１６４】
アスホターゼアルファ（ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０）クローン（細胞株Ｘ）の開発ワーキングセルバンクからの細胞バイアルは解凍されて、Ｎ−１段階によるシードトレインによって継代培養した（以前使用した２０，０００Ｌ工程の４０００Ｌの播種バイオリアクターに等しい）。Ｎ−１培養は、１５Ｌの作業体積を有する２つの１５Ｌスピナーで実施した。両方のＮ−１培養液が接種に使用された。撹拌は、２０Ｌ／時間の総ガス流による２００ｒｐｍに設定した。酸素及び炭酸ガスの発生は、測定した溶存酸素及びｐＨに従って調節した。８つの１０Ｌのバイオリアクターは接種されて、１０日目に採取した。２つのバイオリアクターは対照供給方法（１つの供給）を使用して供給され、一方で、６つの他のものは、改善した供給方法（２、４、６及び８日目の複数の供給）を使用して供給された。表１９は、これらのバイオリアクターで使用する細胞培養工程パラメーターについてまとめる。
【表１９】
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【０１６５】
２０，０００Ｌ規模の製造工程は、ＶＣＤベース供給方法を使用する（約２５．０〜３２．０×１０５細胞／ｍＬのＶＣＤでの単回ボーラス、通常培養の２日目頃）。この実験で、接種後５８時間に行われて、２０Ｋのバイオリアクターで製造データから算出した平均倍増時間２４．５時間に基づいてＶＣＤ基準（２５．０〜３２．０×１０５細胞／ｍＬ）を満たすように、温度シフトのタイミングはプログラムされた。工程を単純化して、供給のタイミングのより厳格な管理を許容するために、この変化を実施した。
【０１６６】
結果
すべてのバイオリアクターの細胞培養性能を、図２８〜図３１にまとめる。
【０１６７】
現在の改良された工程の増殖力学及び生存度を、対照及び以前の２０，０００Ｌ工程と比較した。培養中にＶＣＤは、対照及び２０，０００Ｌ工程と類似していた（図２８Ａ、エラーバーは±１×標準偏差を表す）。対照工程及び改善した工程＃４下の細胞生存度は、同程度の比率で低下し、それは以前の２０，０００Ｌ規模工程下の比率より急速である（図２８Ｂ）。最終的な生存度は、対照及び改善した工程でそれぞれ７３％及び７０％であり、一方で２０，０００Ｌ工程は通常約８０％のままである。これは、おそらく振動速度による、１０Ｌシステムに伴うスケーリング問題であるように見える。これは、第２の材料生成ブロックで試験されて、その実施データは、生存度低下が、撹拌速度と、一般的ＣＨＯ細胞型に設定されているＶｉＣｅｌｌ細胞計数器の設定の組み合わせが原因の可能性が高いことを示し、それは、以前の工程の細胞型（１１〜３０μＭ）より幅広く許容可能な細胞直径範囲（５〜５０μＭ）を有した。
【０１６８】
グルコース利用及びラクテートの消費プロファイルを、図２９に示す。改善した工程は、対照に類似するグルコース利用及びラクテートプロファイルを示した。
【０１６９】
培養全体にわたるアスホターゼアルファのタンパク質Ａ力価及び比活性を、図３０に示す。対照及び改善工程両方のタンパク質Ａ力価は、同等だった。しかし、それらは両方とも、通常２０，０００Ｌ工程で見られる力価より低かった。本実験で使用した電力対容積比が、製造で使用するものより３０％高いことがわかったので、これは、生存度によって見られる規模の違いにある程度起因している可能性がある（製造規模で使用したＰ／Ｖ比のサブシーケンス受理により確認）。改善工程の比活性（単位／タンパク質ｍｇ）は、対照より平均１７％高かった（５３２Ｕ／ｍｇ対４５６Ｕ／ｍｇ）。同じ量のタンパク質の量が各工程で生成される一方で、培養が更に供給されるとき、生成されるタンパク質がより活性だったことを、タンパク質Ａ力価データと一緒にとったこれらのデータは示す。
【０１７０】
活性力価及び総容量活性（図３１に示す）は、改善工程が１０Ｌ規模の対照工程よりおよそ２２〜２４％多くの活性を生成することを示す。改善工程は、２０，０００Ｌ規模で見られるものとほぼ同じ活性力価を生成したが、対照工程は約１９％低かった。
【０１７１】
結論
実験は、改善された製造工程（１０Ｌ規模）の細胞培養性能を明らかにし、それは、約２２〜２４％の活性力価の増加をもたらしつつ、生成物のタンパク質Ａ力価を維持する、増加した供給量を利用する。対照と改善工程の間のアスホターゼアルファ比活性の比較を、図３２に示す。明らかに、６つのすべての反復した改善工程条件（それぞれ、３つの余分な供給を添加）は、対照より高い比活性を示した。
【０１７２】
約９μＭの塩化亜鉛だけを含む基礎培地と比較して、各ボーラス供給は１．２ｍＭの塩化亜鉛を含んだ。したがって、各ボーラス供給は、全培養の約６μＭの亜鉛濃度（０．５ｖ／ｖ）の増加をもたらした。いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、余分の供給補充による比活性の増加が少なくとも部分的に亜鉛補充によると推察される。
【０１７３】
実施例７．亜鉛補充によるアスホターゼアルファ活性の更なる改善
これまでの実施例で開示した製造工程に基づいて、新規の実験は、上流工程のパラメーターを更に最適化するために実施した。例示の工程Ｚ及びＺ’は、表２０に要約されて比較される。
【表２０】
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【０１７４】
更なる最適化は、以前の工程Ｙに基づいて実施された。例えば、新しい工程Ｚ’は、培養培地内に約３０〜９０μＭの硫酸亜鉛を補充して、約２４０時間（すなわち、１０日）から約２８８時間（すなわち、１２日）全体の培養時間を増やすことを含んだ。小規模の振とうフラスコ実験は、工程Ｚ’の３つの変異型を試験するために行われた（それぞれ３０、６０または９０μＭ亜鉛を補充する）。３０μＭの補充は、培養培地内にフロントローディングによってなされた。６０及び９０μＭの補充は、２及び６日目に２つの等しいボーラス（６０μＭ条件）または２、６及び１０日目に３つの等しいボーラス（９０μＭ条件）で亜鉛を補充することを含んだ。図３３に示すように、亜鉛補充（赤い線、異なる亜鉛濃度の３つの実験の平均を示す）は、対照工程Ｙ（青い線）と比較すると、アスホターゼアルファ比活性を効果的に改善した。この増加は、２８８時間（すなわち、１２日）の時間枠頃にそのピークに到達して、その後減少した。
【０１７５】
実施例８．製造したアスホターゼアルファの特性決定
複数の直交分析法による製造したアスホターゼアルファの代表的な特性決定を、本明細書に例示する。生成されたアスホターゼアルファの同一性、純度、サイズ、構造、グリコシル化及び電荷プロファイルを評価するために、これらの方法を使用した。いくつかの方法は、ロット間の整合性を確実にするためにも用いた。更に生成物関連の物質及び生成物関連の不純物も特性決定した。
【０１７６】
アスホターゼアルファの構造解明
オリゴ糖の除去後の分子量のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析
オリゴ糖の除去後のアスホターゼアルファのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の解析を、アスホターゼアルファの同一性を確立するために用いた。更に、アスホターゼアルファの理論上の分子量と実質的に異なる分子量の翻訳後の改変の任意の有意なレベルの存在も、この方法によっても検出される。オリゴ糖の除去は、ジスルフィド結合の還元の有無にかかわらず、ＰＮＧａｓｅＦを用いたアスホターゼアルファの消化によって達成された。試料を脱塩して、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸と２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸の９０：１０の混合物と混合した。試料を空気乾燥し、それからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計を用いて分析した。質量スペクトルは正イオンモードで得られた。計器は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して外部から調整した。脱グリコシル後のアスホターゼアルファの質量スペクトルを図３４Ａに示す。ｍ／ｚが１６１，１４０、８０，５７１及び５３，７４８のピークは、それぞれ単独で、二重にまたは三重に荷電した分子に対応する。１６１，１４０Ｄａの測定された分子量は、器具の１％の精度限界の範囲内で計算上の分子量（１６１，１３５．２Ｄａ）と一致した。還元及びオリゴ糖の除去後のアスホターゼアルファの質量スペクトルを図３４Ｂに示す。ｍ／ｚが８０，５４５、４０，２６７及び２６，８０８のピークは、それぞれ単独で、二重にまたは三重に荷電した分子に対応する。８０，５４５Ｄａの測定された分子量は、器具の１％の精度限界の範囲内で計算上の分子量８０，５７７．７Ｄａと一致した。結果は、アスホターゼアルファの同一性を確認して、グリコシル化以外の翻訳後修飾の有意なレベルの欠如を示した。
【０１７７】
分析用超遠心法（ＡＵＣ）
アスホターゼアルファの凝集物、二量体及び存在する場合断片、ならびに純度の割合を測定するために、ＡＵＣを用いた。更にアスホターゼアルファ二量体の分子量を測定し、それは独特なアミノ酸配列及び翻訳後修飾のため、分子の特徴である。それは、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に対する直交法であると考えられる。アスホターゼアルファ試料は、約２５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて、約１ｍｇ／ｍＬに希釈された。分析用超遠心分離器は、沈降速度分析を行うために用いた。石英窓を備えるダブルセクターセルが使われた。ローターは２０℃の真空下で平衡させ、約１時間後、ローターは３６，０００ＲＰＭまで加速した。２８０ｎｍの吸光スキャンを、ほぼ６時間４．５分間隔で得た。データを最初に分析して、ＤＣＤＴを使用して見かけの分子量を決定して、ｃ（ｓ）方法（ＳＥＤＦＩＴソフトウェア）を使用して二量体、高分子量及び低分子量種の割合を決定した。アスホターゼアルファの分子量は２１１ｋＤａであり、純度は代表バッチで９６．８％だった。
【０１７８】
完全分子量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
アスホターゼアルファの分子量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定は、すべての翻訳後修飾、主にグリコシル化を含む、分子サイズを測定する。アスホターゼアルファ試料を脱塩して、２，５−ジヒドロキシ安息香酸と２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸の９０：１０の混合物から作成した基質と混合した。試料を空気乾燥し、それからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計を用いて分析した。質量スペクトルは正イオンモードで得られた。計器は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して外部から調整した。アスホターゼアルファの質量スペクトルを図３５に示す。ｍ／ｚが１８０，１５７、９０，２２３及び６０，５４０のピークは、それぞれ単独で、二重にまたは三重に荷電した分子に対応する。厳格な計器設定によって生じる断片化のため、他の低い大量のピークが形成された。１８０，１５７Ｄａの測定された分子量は、周知のアミノ酸配列に基づく１６１，１３５．２Ｄａの計算上の分子量より著しく高い。この結果は、アスホターゼアルファの広範な翻訳後修飾、主にグリコシル化を示し、その理由は、脱グリコシルしたアスホターゼアルファのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＥＳＩ−ＴＯＦ分析が改変の有意なレベルを検出しなかったからである。
【０１７９】
サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
ＳＥＣ−ＭＡＬＳはサイズに基づいてタンパク質を分離し、それから各ピークの分子量を決定するために用いる。アスホターゼアルファは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより分析された（データは示さず）。７．０〜８．２分の保持時間ウインドウのピークの計算上の分子量は１９４．１Ｄａであり、それは、周知のアミノ酸配列及び広範囲なグリコシル化に基づくアスホターゼアルファの計算上の分子量と一致し、更にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより観察される分子量とも一致する。
【０１８０】
金属分析
誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）は亜鉛及びマグネシウムの含量を決定するために使用し、誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）はカルシウムの濃度を決定するために使用した。アスホターゼアルファ試料は、最初に濃硝酸の添加による、次に過酸化水素の添加による熱によるマイクロ波加熱分解を使用して消化された。それから試料は、亜鉛及びマグネシウムについてはＩＣＰ−ＭＳ計器及びカルシウムについてはＩＣＰ−ＡＥＳ計器を使用して分析した。確定したモル比（イオンのモル／アスホターゼアルファモノマーのモル）は、亜鉛で２．２７、カルシウムで０．９７及びマグネシウムで０．１２だった。亜鉛及びカルシウムの比率は、文献（Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．２０００Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９９：１３０３−１３１１及びＭｏｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７６：３１１７１−３１１７８）での報告された比率と一致した。Ｍｏｍｅｔら（２００１）は、カルシウムがＴＮＡＬＰのマグネシウム結合部位を占拠し得ることを教示し、したがってアスホターゼアルファ分子のマグネシウムの比率が１未満であり得ることを示唆する。しかし、０．１２のマグネシウムの試験した比率は依然として驚くほど低い。
【０１８１】
リン酸化部位の決定
ＵＰＬＣ−ＭＳｅは、リン酸化の部位及び割合を決定するために用いた。最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのアスホターゼアルファは、ｐＨ８．６にて０．２Ｍのトリス中の６Ｍの塩酸グアニジンの存在下で、１時間３７℃にて４０ｍＭのＤＴＴを使用して、変性して還元した。還元した試料は、ヨード酢酸の添加によってアルキル化して最終濃度５０ｍＭになり、室温にて３０分間インキュベーションした。それから試料を、透析チューブを使用して、分画分子量１０ｋＤａで、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに緩衝液交換した。試料を、３７℃にて２４時間、トリプシン：タンパク質の最終比（ｗ：ｗ）１：５０で、トリプシンを使用して消化した。逆相Ｃ１８カラム及びＱ−ＴＯＦ質量分光計を備えるＵＰＬＣシステムを、消化した試料を分析するために使用した。Ｓｅｒ９３を含有するトリプシンペプチドは、リン酸化及び非リン酸化の両方が確認された。図３６に示すようにＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｙ１２及びｙ１３イオンによって観察したように、＋８０Ｄａ、リン酸化により添加したリン酸塩の質量によって、Ｓ９３がシフトされることを証明した。リン酸化の相対的な割合は、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）ピーク面積を使用して３３．９％として決定された。
【０１８２】
遊離グリカンのＭＡＬＤＩ分析
遊離グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を使用して、オリゴ糖種及びその相対的な割合を決定した。オリゴ糖は、ＦＮＧａｓｅＦ消化によってアスホターゼアルファ標準品から放出された。放出されたグリカンは、先端炭素逆相カラムを使用して精製された。放出されたグリカンはｓＤＨＢ基質と１：１で混合されて、それからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。分析は、シアル酸を有するグリカンについて負イオンモードで、次に中性グリカンについて正イオンモードで実施した。負イオンモードを使用して得た質量スペクトルを図３７Ａに示す。正イオンモードを使用して得た質量スペクトルを図３７Ｂに示す。観察された分子量を一般に周知のオリゴ糖の理論上の分子量と適合させることによって、オリゴ糖種は決定される。すべてのグリカンの総ピーク強度で、個々のピーク強度を分割することによって、相対的な割合は決定された。主要なオリゴ糖を表２１及び表２２にまとめる。分子量に基づいて、シアル酸の構造は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡ）であると決定された。
【表２１】
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【表２２】
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【０１８３】
２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）標識化したオリゴ糖のプロファイリング
アスホターゼアルファから放出されたオリゴ糖は、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）によって標識化され、それから蛍光検出を有する順相ＨＰＬＣにより分析されて、種々のオリゴ糖の種類及び相対的な割合を決定した。アスホターゼアルファ試料は、１時間３７℃にてジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して還元されて、それから一晩３７℃にてＰＮＧａｓｅＦを用いて消化し、Ｎ−結合オリゴ糖を放出した。消化した試料からのタンパク質は沈殿し、低温エタノール及び遠心分離によって放出されたグリカンから分離された。放出されたグリカンを含有する上清は、真空遠心分離器を用いて乾燥して、１％のギ酸を使用して再構成されて、室温にて４０分間インキュベートして、それから再び乾燥した。それから、製造業者の指示事項（Ｌｕｄｇｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に従うことによって、２−ＡＢ標識化試薬を使用して試料を標識化した。標識化したグリカンは、グリカンＳカートリッジ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を使用して除去されて、それから３３０ｎｍの励起波長及び４２０ｎｍの発光波長による蛍光検出を備えるＨＰＬＣを使用して分析された。アスホターゼアルファの分析からの蛍光クロマトグラムを図３８に示す。分画収集、分子量の質量分析及び前記分子量を一般に周知のオリゴ糖構造の分子量と適合させることによって、ピークの同一性を確定した。２−ＡＢ標識化により識別されるオリゴ糖を表２３にまとめる。アスホターゼアルファ標準品の分析から得られるクロマトグラムを、図３９に示す。
【表２３】
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【０１８４】
グリコペプチドのプロファイリング
グリコペプチドのプロファイルは、部位特異的オリゴ糖分布を決定するために使用した。最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのアスホターゼアルファ試料を、ｐＨ８．６にて０．２Ｍのトリス中の６Ｍの塩酸グアニジンの存在下で、１時間３７℃にて４０ｍＭのＤＴＴを使用して、変性して還元した。還元した試料は、ヨード酢酸の添加によってアルキル化して最終濃度５０ｍＭになり、室温にて３０分間インキュベーションした。それから試料を、透析チューブを使用して、分画分子量１０ｋＤａで、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに緩衝液交換した。試料を、３７℃にて２４時間、トリプシン：タンパク質の最終比（ｗ：ｗ）１：５０で、トリプシンを使用して消化した。逆相Ｃ１８カラム及びＱ−ＴＯＦ質量分光計を備えるＵＰＬＣシステムを、消化した試料を分析するために使用した。データを正イオンモードで得た。溶出時間ウインドウにわたる質量スペクトルは、各グリコペプチドで平均した。６つのグリコペプチドは、アスホターゼアルファのモノマー当たりの６つのグリコシル化部位に対応する、アスホターゼアルファのトリプシン消化から生成した。ペプチド部分が保持時間を決定する主要因子なので、グリコペプチドはその独自のアミノ酸配列に基づき分離され、したがって部位特異的オリゴ糖分布を得ることができる。グリコペプチドの質量スペクトルを、図４０に示す。各グリコシル化部位と関連するオリゴ糖種を、表２４にまとめる。
【表２４】
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【０１８５】
観察した分子量及び他の分析結果（例えば、質量スペクトルデータ、及び２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）標識化オリゴ糖プロファイリングデータ）に基づき、アスホターゼアルファの主要なグリカン（相対量≧４％）の構造は、図４１及び図４２で決定した。
【０１８６】
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）
ｃＩＥＦはその等電点に基づいてタンパク質を分離して、アスホターゼアルファの電荷変異体を監視するために使用した。尿素、メチルセルロース、スクロース、ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ及びｐＩマーカーを含有する緩衝液中の最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのアスホターゼアルファ試料を、キャピラリー電気泳動システムを使用して分析した。試料を１５００Ｖで０．１分間、それから３０００Ｖで１４分間集束した。分離したタンパク質変異体を２８０ｎｍのＵＶ吸収を使用して検出した。アスホターゼアルファの代表バッチからのエレクトロフェログラムを図４３に示す。６つのピークをｃＩＥＦで観察した。一般的にピーク１は、幅広いｐＩ範囲を有する。追加の肩をピーク４及び５で観察した。アスホターゼアルファが電荷に関して不均質性が高いことを、本結果は証明して、それは、各部位で種々の数及び濃度のシアル酸を有する複数のグリコシル化部位の存在のため、予想された。代表バッチのアスホターゼアルファの各ピークのｐＩ及びその相対的な割合を、表２５にまとめる。
【表２５】
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【０１８７】
生成物関連物質
翻訳後修飾に起因するアスホターゼアルファの構造的不均一性は、ＣＨＯ細胞株にて発現されるため、予想される。上述のとおりに、アスホターゼアルファの不均一性は電荷変異体として得られ、ｃＩＥＦにより分析されるとき、６つのピークが観察される。アスホターゼアルファの電荷プロファイルの均一パターンは、臨床及びＰＶバッチで示されている。代表的な材料を使用して、ＡＵＧ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ及びＡＥＸにより決定されるように、アスホターゼアルファは最低９６％の純度であり、ｃＩＥＦにより観察される複数のピークが、生成されたアスホターゼアルファを十分に代表して、すべてのピークが生成物関連の物質であることを示唆する。
【０１８８】
生成物関連不純物
生成物関連の不純物は、活性、有効性及び安全性に関して所望のアスホターゼアルファと同等の特性を有しない分子変異体である（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｑ６Ｂ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｕｇｕｓｔ  １９９９，ＩＣＨ）。生成物関連の不純物は３つのアッセイにより観察されており、各不純物の特性を表２６にまとめる。
【表２６】
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【０１８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの特性決定
アスホターゼアルファは、非還元性及び還元性の両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、バンド１が未変化アスホターゼアルファに対応し、バンド２が１つの酵素アームだけを有する未変化アスホターゼアルファに対応し、バンド３がアスホターゼアルファの還元体（モノマー）に対応することを示唆する（データは示さず）。
【０１９０】
予想どおり、酵素部分及びＩｇＧ１−Ｆｃ部分の両方からのペプチドは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドから観察された。この結果は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの見かけの分子量に加えて、主バンドが還元体のアスホターゼアルファに対応することを示す。バンド特性決定を、表２７にまとめる。
【表２７】
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【０１９１】
ＳＥＣピークの特性決定
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、高分子量種（凝集物）、アスホターゼアルファ二量体及び低分子量種を分離することによる純度アッセイとして使用した。通常のＳＥＣクロマトグラムで、最も大量のピークは、アスホターゼアルファホモ二量体に相当する。メインピークの前に溶出したピークは、高分子量種に相当する。メインピーク後で溶出したピークは、低分子量種に相当する。高分子量種及びメインピークに相当する分画を収集して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてインゲル消化及び質量分析によって分析した。周知のアミノ酸配列に由来する理論上の分子量と観察されたペプチド分子量を適合させることは、メインピークの８６．６％及び高分子量種の７０．７％の配列包括度を明らかした。したがって高分子量種が生成物関連の不純物を表すと結論づけられる。
【０１９２】
特性決定ＡＥＸピーク
ＡＥＸを使用してアスホターゼアルファの電荷変異体を監視した。出発原料と共に５つのＡＥＸ分画は、ＧＰ−ＨＰＬＣによって、ならびに非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された（データは示さず）。ＡＥＸ塩基性ピークが、主にアスホターゼアルファ及びおそらく少ない割合の高分子量種を含むことを、データは示唆する。ＡＥＸ酸性ピークは、アスホターゼアルファ高分子量種を含む。塩基性及び酸性種は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によるペプチドフィンガープリント法によって確認されるように、生成物に関連する。
【０１９３】
アスホターゼアルファは、複数の分析技術を使用して十分に特性決定されてきた。その同一性は、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＥＳＩ−ＭＳによる分子量分析により確認された。生成されたアスホターゼアルファの純度は、ＡＵＧ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＧＰ−ＨＰＬＣ及びＡＥＸによって監視された。アスホターゼアルファのサイズは、オリゴ糖による分子のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析によって評価された。更にアスホターゼアルファの分子量分析は、ＡＵＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても実施された。アスホターゼアルファの均一な高分子量はこのような直交法によって観察されており、複数部位で分子の広範囲なグリコシル化を示唆し、それはグリコシル化の分析によって確認された。アスホターゼアルファの高次構造は、遠ＵＶ及び近ＵＶ  ＣＤの両方によって決定した。分子の流体力学的サイズはＡＵＣ及びＳＥＣ−ＭＡＬＳの両方の分析から決定されることもでき、アスホターゼアルファが共有結合二量体として存在することを、それは更に確認した。少量の凝集物が、ＳＥＣ、ＡＵＣ及びＳＥＣ−ＭＡＬＳにより検出された。天然型ジスルフィド結合構造及び１０２の遊離システインの位置は、非還元ペプチドマップのＬＣ−ＭＳ分析により確認された。１つのみの主要な遊離システインの存在は、遊離スルフヒドリルの総量の評価によって更に確認された。ＬＣ−ＭＳ分析は、活性部位セリン残基が部分的にリン酸化されることを証明した。文献で報告されるように、亜鉛、カルシウム及びマグネシウムを含む３つの金属は、アスホターゼアルファ薬物原料で検出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用する遊離グリカン分析、２−ＡＢ標識化オリゴ糖の順相ＨＰＬＣ分析、グリコペプチドのＬＣ−ＭＳ分析及び総シアル酸測定によって、アスホターゼアルファのグリコシル化は広範囲に分析した。アスホターゼアルファのモノマー当たりの６つすべてのグリコシル化部位が、オリゴ糖の不均一母集団と関連することがわかった。電荷プロファイル、シアル酸の存在下で主に生じる不均一性は、ｃＩＥＦによって分析され、６つのピークが観察された。生成物関連の物質は、ｃＩＥＦによって６つのピークを観察することにより得られる。低レベルの生成物関連不純物を、ＳＥＣ、ＡＥＸ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。
【０１９４】
実施例９．２，０００Ｌ（２Ｋ）及び２０，０００Ｌ（２０Ｋ）規模で製造したアスホターゼアルファの比較性
本実施例で、アスホターゼアルファ薬物原料は、２，０００Ｌ（２Ｋ）及び２０，０００Ｌ（２０Ｋ）工程を使用して製造された。異なる規模で生成されるアスホターゼアルファ間の比較を示すために、２Ｋ（＃３５、＃３６及び＃３８）工程を使用して生成したアスホターゼアルファの３つのバッチ、及び２０Ｋ工程（＃４０、＃４２及び＃３４）を使用して生成したアスホターゼアルファの３つのバッチは、表２８に記載の方法を用いて、可能な場合並行してその物理化学的特性を分析した。２Ｋ及び２０Ｋの特定のバッチは臨床使用に基づいて選択され、以前試験したバッチは、２Ｋ及び２０Ｋバッチすべてのバッチ間の整合性を証明した。
【０１９５】
試験した物理化学的特性は、アスホターゼアルファ純度、電荷変異体、サイズ、同一性、構造、グリコシル化及び活性を確定した。試験結果は表２９にまとめられている。製造比較は、並行での強制分解実験を使用して更に評価され、上述した２Ｋ及び２０Ｋのバッチの分解経路及び動力学を比較した。試料は４０℃にて０、１４、２４及び４８時間インキュベートされて、表３０に表示されている方法によって分析された。温度強制分解実験の試験結果を、表３１にまとめる。
【０１９６】
すべての結果は、２Ｋ及び２０Ｋ工程を使用して製造されたアスホターゼアルファは類似点があることを示す。
【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【０１９７】
純度
分析用超遠心法（ＡＵＣ）
分析用超遠心分離で測定されるモノマー濃度％は、２Ｋと２０Ｋバッチの間で同等だった。すべての値は、２０Ｋ平均９６．８％及び２Ｋ平均９５．６％で９４．５％〜９７．６％の範囲だった。以前ＩｇＧ１抗体の分析で示されるように（Ｐｅｋａｒ  ａｎｄ  Ｓｕｋｕｍａｒ２００７Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ：  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６７：２２５−２３７を参照）、差はＡＵＣのアッセイ変動性内であり、それは同程度の分子量を有する糖タンパク質でもある。ＧＰ−ＨＰＬＣデータ（下に示す）は、モノマーの同等な％を示し、それは更に、ＡＵＣにより検出されるバッチ中のわずかな違いがアッセイ内変動性（例えば器具細胞間の差）に起因したことを更に示す。２．５（秒）の小さい追加のピークは例示の工程＃３５から生成されるアスホターゼアルファで検出されて、それはｃ（ｓ）分析の人為的産物だった。アスホターゼアルファの二量体に相当する、＃３５ピークのシフト（約１１（秒））は、方法の誤差限界内で考慮される。アスホターゼアルファＡＵＣデータは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒによって得た。この方法は、アスホターゼアルファモノマーと、二量体または大きな種、及び連続沈降係数分布に基づくその相対％からなる凝集物を区別する。
【０１９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＬｏＣ（ラボオンチップ）
非還元及び還元の両方についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＬＡＢＣＨＩＰ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ＧＸＩＩタンパク質Ａアッセイで測定した主バンド％は、２Ｋバッチと２０Ｋバッチの間で同等だった。表２９にまとめるように、平均主バンド％は、３つ２Ｋバッチで１００．０％（非還元）及び９９．８％（還元）、２０Ｋバッチで１００．０％（非還元）及び９９．８％（還元）だった。更に非還元及び還元分析のエレクトロフェログラムで示されるように、同等のバンドパターンは２Ｋ及び２０Ｋバッチで観察された。本試験はその分子量に基づいてタンパク質を分離して、主バンドパーセントとして表される未変化タンパク質の純度の分析を提供する。アッセイは、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｑｕｉｃｋ  Ｇｕｉｄｅ，ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｋｉｔ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（２０１０年３月改定）に従って実施した。
【０１９９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
３つの２Ｋバッチ及び３つの２０Ｋバッチは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して並行して分析した。デンシトメトリーによる分析で、非還元及び還元の両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥですべてのバッチについて１００％を占める主バンドを得た。主バンドに加えて、アスホターゼアルファ二量体より高い見かけの分子量を有する定量下限未満のかすかなバンドを、すべてのバッチで観察した。１つのバンドだけが、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってすべてのバッチで観察された。本試験はその分子量に基づいてタンパク質を分離して、主バンドパーセントとして表される未変化タンパク質の純度の分析を提供する。タンパク質試料は、ゲル上に分離されて、可視化のためのクーマシーブルー染色で染色して、脱染して、デンシトメトリーによって分析した。アスホターゼアルファ、分解生成物及び工程関連不純物の分子量は、周知の分子量標準との比較によって推定された。分離したタンパク質の定量的測定は、走査及び濃度測定分析による分析によって実施した。
【０２００】
ＧＰ−ＨＰＬＣ
アスホターゼアルファの純度は、ＧＰ−ＨＰＬＣによって並行して分析した。２Ｋ平均（９６．５％）及び２０Ｋ平均（９８．６％）を、表２９に示す。２０Ｋバッチのアスホターゼアルファ％は、２Ｋバッチよりわずかに高い。しかし、バッチデータは類似の二量体％を示し、主に材齢などの試料履歴の違いに起因する、２Ｋバッチのわずか低い二量体％を示唆する。ＧＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムも、２Ｋ及び２０Ｋバッチからの同等の生成物を示した。同じ保持時間の同じピークは、同じ種が観察されたことを示す。本方法は、アスホターゼアルファとより大きな種及びより小さい断片を識別する。
【０２０１】
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
すべての２Ｋバッチ及び２０ＫバッチのＡＥＸによるメインピーク％は、表２９に示すように９３．６２％〜９６．８４％の狭い範囲内だった。メインピーク面積の２Ｋ平均は９４．１７％、２０Ｋ平均は９６．３８％だった。わずかに高いメインピーク％は、後半の抽出ピークの減少により、２０Ｋバッチで観察された。２０Ｋバッチのメインピークでわずかに高レベルは、生成物のより高い純度を示す。ＡＥＸクロマトグラムは、同じ保持時間で２Ｋ及び２０Ｋバッチの重なるピークを示し、すべてのバッチからの生成物が同じ種を有したことを示唆した。本方法は、純表面アニオン荷電が上昇する順序に、タンパク質を分離する。分離したタンパク質は、２８０ｎｍの紫外線吸光度により検出されて、それからピーク面積％として定量化される。
【０２０２】
電荷プロファイル
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）
アスホターゼアルファがｃＩＥＦで分析されるとき、２Ｋ及び２０Ｋバッチの各ピークのピークプロファイル及び相対％は同等だった。すべての試料は、等電点（ｐＩ）約６．５７〜約６．８５の範囲の６つの突出ピークを示し、これらのピークは左から右にピーク１、２、３、４、５及び６と呼ばれる。各荷電変異種について２Ｋ及び２０Ｋバッチで検出されるピーク面積は、表２９に示すように同等である。２Ｋ及び２０ＫバッチのｃＩＥＦピーク％間の比較は、表３２に示すように、すべてのバッチのＴ検定分析を使用して確認した（すべてのｐ値＞０．０５であり、観察したロット間の差は有意ではないことを示す）。２Ｋ及び２０ＫバッチのｃＩＥＦエレクトロフェログラムは、同じｐＩ範囲の相似ピークプロファイルを示した。ｃＩＥＦは、タンパク質アイソフォームｐＩに基づいて荷電変異種の半定量分離を提供する。分離したタンパク質を２８０ｎｍでの吸光度で検出した。
【表３２】
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【０２０３】
分子サイズ
サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
２Ｋ及び２０ＫのバッチのＳＥＣ−ＭＡＬＳで測定されるアスホターゼアルファの分子量は、同等だった。表２９に示すように、２Ｋバッチの平均分子量は１８９．２ｋＤａであり、２０Ｋバッチの平均分子量は１８９．２ｋＤａである。類似のピークプロファイルは、ＵＶクロマトグラムのすべてのバッチで観察された（バッチ＃３６からの試料はその利用可能性のために後日実施されて、他の試料によるピークプロファイルとの不完全一致をもたらした）。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ法はＳＥＣカラムを合わせて、ＭＡＬＳ計器を用いてサイズによってタンパク質種を分離して、ピークの分子量を決定する。光散乱信号及び屈折率（ＲＩ）によって決定されるような、高分子量種の分子量の高い変化（表２９に表示）は、少量の種の決定方法のより高い変化による。ＵＶクロマトグラムに基づいて、アスホターゼアルファに対する高分子量種の相対保持時間は、６つのバッチのすべてで類似しており、それは高分子量種の分子量も同程度であることを示す。
【０２０４】
完全分子量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳ）
表２９に示すように、２Ｋバッチの平均分子量は１８０，９０２Ｄａであり、２０Ｋバッチの平均分子量は１８０，０１９Ｄａであった。２０Ｋバッチ及び２Ｋバッチの分子量は、外部から較正したＭＡＬＤＩ−ＴｏＦの１％の質量精度内であり、したがって同等である。２Ｋ分子量のわずかに高い傾向は、わずかに多い量の大きなオリゴ糖（例えばシアル酸を有するオリゴ糖）の存在に起因すると思われる。アスホターゼアルファの２Ｋ及び２０ＫバッチについてのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ完全分子量（ＩＭＷ）スペクトルも、同じピークプロファイルを検出した。バッチ＃３６は、異なる器具較正を使用して別個の機会に分析されたが、比較の完全性のために含まれた。スペクトルに存在する付加質量は、アッセイにより誘発された断片化及び／または複数の荷電イオンに起因する。同定した種で観察される強度の違いは、マトリックス結晶化及びレーザー効果の結果である。本方法は、分子量を基準にして分子を同定する。試験試料は固相抽出されて、ｓＤＨＢマトリックス液と混合して、ＭＡＬＤＩ標的に共沈した。本乾燥試料は、ＴｏＦ質量分析計にレーザーでイオン化された。ｍ／ｚスペクトルは各試料から収集され、未変化ｍ／ｚは分子量に変換された。
【０２０５】
同一性
脱グリコシル／還元＆脱グリコシル分子量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳ）
ＮＩＳＴ分子量及び１０のジスルフィド結合を形成する２０のシステインを有する同位体割合を使用して、７２６のアミノ酸の２つの同一のポリペプチドアミノ酸配列の一次アミノ酸配列から、脱グリコシルしたアスホターゼアルファの分子量は計算された。脱グリコシルしたアスホターゼアルファの分子量は、１６１，１３５．２０Ｄａであると計算された。
【０２０６】
２０Ｋバッチから及び２Ｋバッチからの脱グリコシルしたアスホターゼアルファの分子量はすべて、表２９に示すように計算した脱グリコシルした分子量（外部から較正されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量精度）の１％以内だった。表２９に示すように、２０Ｋバッチの平均分子量は１６０，８８１Ｄａであり、２Ｋバッチの平均分子量は１６１，０５０Ｄａであった。２Ｋ及び２０ＫバッチのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトルは、類似のピークプロファイルを検出した。スペクトルに存在する付加質量は、アッセイにより誘発された断片化、不完全な脱グリコシル及び／または複数の荷電イオンに起因する。同定した種で観察される強度の違いは、マトリックス結晶化及びレーザー効果の結果である。
【０２０７】
ＮＩＳＴ分子量及び同位体割合を使用して、７２６のアミノ酸のポリペプチドアミノ酸配列の一次アミノ酸配列から、還元かつ脱グリコシルしたアスホターゼアルファの分子量は計算された。還元かつ脱グリコシルしたアスホターゼアルファの分子量は、８０，５７７．６８Ｄａであると計算された。
【０２０８】
還元かつ脱グリコシルしたアスホターゼアルファの２０Ｋバッチの分子量値を２Ｋバッチと比較し、すべての値は、表２９に示すように計算した還元かつ脱グリコシルした分子量（外部から較正されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量精度）の１％以内だった。２Ｋバッチの平均は８０，５３０Ｄａであり、２０Ｋバッチの平均は８０，５３９Ｄａだった。２Ｋ及び２０ＫバッチのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトルは、同等のピークプロファイルを検出した。スペクトルに存在する付加質量は、アッセイにより誘発された断片化及び／または複数の荷電イオンに起因する。同定した種で観察される強度の違いは、マトリックス結晶化及びレーザー効果の結果である。本方法は、分子量を基準にして分子を同定する。試験試料は固相抽出されて、ｓＤＨＢマトリックス液と混合して、ＭＡＬＤＩ標的に共沈した。本乾燥試料は、ＴｏＦ質量分析計にレーザーでイオン化された。ｍ／ｚスペクトルは各試料から収集され、未変化ｍ／ｚは分子量に変換された。
【０２０９】
２Ｋ及び２０Ｋバッチ脱グリコシルしたアスホターゼアルファの分子量は同等であり、すべての値は、表２９に示すように計算した脱グリコシルした分子量（外部から較正したＥＳＩ−ＴＯＦーＭＳの質量精度）の１００ｐｐｍ以内だった。２Ｋバッチの平均分子量は１６１，１３７．３９Ｄａであり、２０Ｋバッチの平均分子量は１６１，１３７．２８Ｄａであり、値は、１６１，１３５．２０Ｄａの計算した脱グリコシルした分子量と一致した。２Ｋバッチのメインピークについて還元かつ脱グリコシルした分子量値は、２０Ｋバッチと同等であり、すべての値は、表２９に示すように計算した還元かつ脱グリコシルした分子量（外部から較正したＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳの質量精度）の１００ｐｐｍ以内だった。２Ｋバッチの平均分子量は８０，５７５．５２Ｄａであり、２０Ｋバッチの平均分子量は８０，５７４．７６Ｄａだった。値は、８０，５７７．６８Ｄａのアスホターゼアルファの計算した還元かつ脱グリコシルした分子量値と一致する。本方法は、完全分子量を基準にして分子を同定する。試験試料をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入し、水：有機溶媒勾配で溶出した。それから溶出液をＴｏＦ質量分析計にエレクトロスプレーして、クロマトグラフピークの上半分からのスペクトルは、完全分子量を提供するためにデコンボリュートした。
【０２１０】
３つの２０Ｋ及び３つの２Ｋバッチの誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって決定した亜鉛とマグネシウムイオンのモル比は、表２９に示すように同等だった。２０Ｋ及び２Ｋバッチの誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）によって決定したカルシウムイオンのモル比は、表２９に示すように同等だった。亜鉛とカルシウムのイオンモル比は文献とも一致し、２つの亜鉛と１つのカルシウムは、各アルカリホスファターゼ酵素モノマーと関連していた（Ｅ．Ｍｏｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．”ＪＢＣ，２７６：３１１７１−３１１７８、及びＢ．Ｓｔｅｃ，ＫＭ．Ｈｏｌｔｚ  ａｎｄ  ＥＲ．Ｋａｎｔｒｏｗｉｔｚ．２０００“Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ．”ＪＭＢ，２９９：１３０３−１３１１を参照）。すべてのバッチのマグネシウムイオンモル比は、驚くべきことに文献に報告されている期待値より低かった。ＩＣＰ−ＭＳのカルシウム同位体で観測されるアルゴンポリ原子干渉からＩＣＰ−ＡＥＳは損害を受けないので、ＩＣＰ−ＡＥＳがカルシウム分析のために選択された。アスホターゼアルファＩＣＰデータは市販のものを得た。本方法はマグネシウム、亜鉛及びカルシウムの量（μｇ／ｍＬ）を決定し、そこからアスホターゼアルファについてモルイオン比が計算された。
【０２１１】
ＵＰＬＣ−ＭＳｅを介したリン酸化部位同定及び定量
リン酸化の部位及び相対的な割合は、ＵＰＬＣ−ＭＳトリプシンペプチドマッピングによって測定された。アルカリホスファターゼは、セリン−ホスフェート中間体を形成できる活性部位のセリン残基を含むことが周知である（ｐｐ２８−２９ｏｆ  Ｍｉｌｌａｎ，Ｊｏｓｅ  Ｌｕｉｓ．２００６“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．”Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨを参照）。同じセリン残基９３が、表２９に示すように、３５．７％〜３１．２％の範囲の割合ですべてのバッチでリン酸化されるとわかった。リン酸化の割合が、アスホターゼアルファ比活性（ｐＮＰＰ）、ＨＡ結合、Ｋｍ及びＫｃａｔ（データは示さず）と相互に関連していないことがわかった。相関の欠如に基づいて、リン酸化された中間体は、アスホターゼアルファの活性の律速ステップではない。アスホターゼアルファのＳ９３のリン酸化部位の確認及び識別は、ＵＰＬＣ−ＭＳｅペプチドマッピングを介して確認した。アスホターゼアルファの理論上の配列及び予測されたトリプシン裂開が、分析のために使用された。得られたＬＣ−ＭＳｅデータは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｌｙｎｘ  ｖ．１．２を使用して収集して処理された。Ｂｉｏｐｈａｒｍａｌｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）は、一次配列から１３番目のトリプシンペプチドを確認し（Ｔ１３）、それはＳ９３、ａｃで末端保護されたＣｙｓ１０２を有する場合分子の酵素部分からの活性部位セリンを含有し、Ｓ９３はリン酸化及び非リン酸化の両方として存在する。ペプチドマップの一部として同定されると、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）は、これらのペプチドのそれぞれについて実施されて、除去されて、組み込まれた。得られたＥＩＣピーク面積から、リン酸化ペプチドピーク面積と総ピーク面積の比は、Ｓ９３でのリン酸化の相対的な割合をもたらす。リン酸化セリン側鎖に関連する＋８０Ｄａの確認は、図３６に示すように、推定したリン酸化Ｔ１３ペプチドにおいて生成するＭＳｅ断片化パターンを調べることによって行われた。ｙｌ２及びｙ１３イオンによって観察したように、Ｓ９３が、＋８０Ｄａ（リン酸化の質量）によってシフトされることを、この断片化パターンは確認した。アスホターゼアルファの各バッチは還元され、アルキル化して、それからトリプシンで消化処理された。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ及びＳｙｎａｐｔ  Ｑ−ＴｏＦ質量分析計を使用して、正イオンエレクトロスプレーモードで実施するＥＳＩ−Ｑ−ＴｏＦ−ＭＳによって、検出を実行した。
【０２１２】
グリコシル化
Ｎ−結合オリゴ糖の質量プロファイリング（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳ）
３つの２Ｋのバッチ及び３つの２０Ｋのバッチから放出されたオリゴ糖をＭＡＬＤＩ−ＴｏＦで分析し、結果を表２９に示す。同程度の相対的な割合の同じグリカン種は、２０Ｋバッチ及び２Ｋバッチで観察された。本方法は、分子量によって薬物原料と関連するグリカンを確認する。グリカンは、ＰＮＧａｓｅ−Ｆ消化及び次の酸性化を使用して薬物原料から酵素的に開裂した。それからグリカンを固相抽出して、スーパー３，４−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス液と混合して、ＭＡＬＤＩ標的に共沈した。本乾燥試料は、ＴｏＦ質量分析計にレーザーでイオン化された。ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）＋スペクトルを収集した。
【０２１３】
２−ＡＢ標識化Ｎ−結合オリゴ糖プロファイリング（ＨＰＬＣ）
グリコフォームの種類及び各グリコフォームの相対的な割合は、２−ＡＢ標識化及びＨＰＬＣ分析によって分析した。結果を表２９に示す。同じ保持時間及び同じ相対的な割合のピークが、すべてのバッチで観察されて（データは示さず）、オリゴ糖の同じ種類及び同じレベルを示唆する。バッチ＃３６試料を後日実施した。例えば主なグリコフォームＦＡ２の割合は、酵素活性に対してプロットされた。ＦＡ２パーセント、ならびに比活性（ｐＮＰＰ）、ＨＡ結合、Ｋｍ及びＫｃａｔ（データは示さず）の間に、相関は観察されなかった。
【０２１４】
本アッセイは、蛍光標識した遊離オリゴ糖の保持時間及びピーク面積を基準にして薬物分子と関連するオリゴ糖を決定することによって、グリコシル化パターンを特性決定した。薬物原料からの遊離オリゴ糖は酵素的に放出されて、還元的アミノ化によって２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）をタグ付加した。それから試料をＬｕｇｅｒカラムを備えるＨＰＬＣシステムに注入して、２ＡＢ標識化オリゴ糖を分離して、励起３３０ｎｍ励起、発光４２０ｎｍの蛍光検出器で検出した。各バッチのクロマトグラムを比較して、各分解されたピークのピーク面積は各バッチからのオリゴ糖の相対量を決定するために使用した。
【０２１５】
ＵＰＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳによるグリコペプチドプロファイル
各グリコシル化部位のオリゴ糖プロファイルは、ＵＰＬＣ−ＭＳによるグリコペプチドの分析によって評価した。組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）は、５つのＮ−グリコシル化部位を有する（ｐｐ５４−５５ｏｆ  Ｍｉｌｌａｎ，２００６Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨを参照）。アスホターゼアルファは、モノマー当たり合計６つのＮ−グリコシル化部位を提供するＦｃ領域の追加のＮ−グリコシル化を含有する。図４４〜図４９は、Ｔ１５−１６のＮ１２３、Ｔ２６−２７のＮ２１３、Ｔ３３のＮ２５４、Ｔ３５のＮ２８６、Ｔ４５−４６のＮ４１３及びＴ５５のＮ５６４のグリコペプチドフィンガープリントプロファイルを示す。合計したＮ−結合オリゴ糖のＵＰＬＣ−Ｑ−ＴｏＦ−ＭＳグリコペプチドフィンガープリントは、Ｎ−グリコシル化の詳細な特性決定を提供した。質量分析によるグリコペプチド種の同定及び各種の相対的定量化は、未加工のグリコペプチド質量フィンガープリントスペクトルで観察される複数の荷電状態を、各部位の１つだけ荷電して脱同位体化したスペクトルに変換することによって実施した。これらの形質転換の結果を表２９に示す。それは、グリコフォーム、及び各観察したＮ−結合オリゴ糖部位の総グリコフォームに対してグリコフォーム相対％≧５％に関与することについて観察される、すべての質量を示す。本アッセイで、アスホターゼアルファは還元され、アルキル化して、それからトリプシンで消化処理された。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ及びＳｙｎａｐｔ  Ｑ−ＴｏＦ質量分析計を使用して、正イオンエレクトロスプレーモードで実施するＥＳＩ−Ｑ−ＴｏＦ−ＭＳによって、検出を実行した。アスホターゼアルファの理論上の配列及び予測されたトリプシン裂開が、分析のために使用された。理論上のグリコペプチドの分子量は、ＮＩＳＴ分子量及び同位体割合を使用して計算した。グリコペプチドは、密接に関連した溶出時間による関連するグリコフォームの収集として観察されて、したがって完全なグリコペプチドの特定部位への補充が確実に観察されるようにするためのスペクトル総数を必要とする。部位特異的合計スペクトル（グリコペプチド質量フィンガープリント）は、試験した各バッチのアスホターゼアルファのＮ−結合オリゴ糖部位のそれぞれを含有する最も大量のペプチド種のそれぞれにおいて得られた。
【０２１６】
総シアル酸含量（ＴＳＡＣ）
総シアル酸含量をＨＰＡＥ−ＰＡＤで測定した。表２９に示すように、各バッチのシアル酸含量は、モノマー１モル当たり０．９〜３．５モルのシアル酸の規格内である。その比較的低量のためシアル酸含量の変化を考慮して、２Ｋバッチ及び２０Ｋバッチは同等だった。ＴＳＡＣ値、ならびに比活性（ｐＮＰＰ）、ＨＡ結合，Ｋｍ及びＫｃａｔの間に、相関は観察されなかった。
【０２１７】
活性
比活性（ｐＮＰＰ）
アスホターゼアルファの比活性を、３つの２Ｋバッチ及び３つの２０Ｋバッチで測定した。２０Ｋバッチの平均比活性は９８１．７Ｕ／ｍｇであり、３つの２Ｋバッチは８６１．７Ｕ／ｍｇだった。すべてのバッチの比活性は、６２０〜１２５０Ｕ／ｍｇの規格内であり、２０Ｋ及び２Ｋバッチは同等だった。本方法は、基質としてｐＮＰＰを使用してアスホターゼアルファ酵素活性の決定のために使用する。アスホターゼアルファは、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素からの１つのドメインを有する組換えタンパク質である。このドメインは触媒的活性であり、リン酸エステルを加水分解する。アッセイは、測定の持続時間の間、Ｖｍａｘに到達して、それを維持するために、酵素飽和で実施される。ｐＮＰＰは、黄色の着色生成物に加水分解される（４０５ｎｍで最大限吸光度）。反応速度は、酵素活性に正比例する。１単位（Ｕ）は、使用する方法の条件下で、１分当たりに形成されるｐＮＰＰの１μモルに相当する。ｐＮＰＰによる比活性（タンパク質ｍｇ当たりの酵素活性）は、酵素活性及びＡ２８０によるタンパク質濃度から計算した。結果を表２９に示す。
【０２１８】
ヒドロキシアパタイト結合
アスホターゼアルファ２ＫバッチのＨＡ結合アッセイによって測定したヒドロキシアパタイト結合％は、すべての値が８５〜９７％の範囲で２０Ｋバッチと同等だった。ＨＡ結合平均％は、２０Ｋ及び２Ｋバッチの両方とも９１％だった（表２９）。ＨＡ結合アッセイは、ヒドロキシアパタイトに結合するとき、ｐＮＰＰのアスホターゼアルファ複合体の酵素活性を測定する。アスホターゼアルファによって加水分解されるとき、合成基質、パラ−ニトロフェニルリン酸塩（ｐＮＰＰ）は、吸光度４０５ｎｍによって定量化できる黄色着色生成物を生じる。本アッセイは、反応の持続時間中に、Ｖｍａｘに達して、それを維持するために、基質飽和で実施した。
【０２１９】
生理的関連物質を使用した動力学的ＰＰｉ酵素アッセイ
動力学的パラメーターＫｍ及びＫｃａｔは、ＰＰｉ動力学的アッセイによって決定した。試料は、参照標準によって何回も一対一で測定した。比較のために、試料試験時点で測定した参照基準値のパーセントとしてＫｍ及びＫｃａｔをグラフで示す（表２９）。すべてのＫｍ値は、並行測定した参照基準値の３０％以内であり、同等と見なされる。すべてのＫｃａｔ値は、並行測定した参照標準の２０％以内であり、同等と見なされる。２Ｋバッチの参照のＫｍ％及び参照のＫｃａｔ％は、２０Ｋバッチと同等だった。ＰＰｉ動力学的アッセイは、ＰＰｉ、天然アルカリホスファターゼ基質を使用して精製したアスホターゼアルファの効力（酵素活性）を測定して、生理的条件（３７℃、ｐＨ７．４）下で、ＰＰｉ加水分解の動力学的定数Ｋｍ及びＫｃａｔを測定する。
【０２２０】
温度強制分解
更に２Ｋ及び２０Ｋバッチの比較性を確実にするために、並行強制分解実験が、分解経路及び動力学を比較するために実施された。表３３で詳述される３つの２Ｋバッチ（＃３５、＃３６及び＃３８）及び３つの２０Ｋバッチ（＃４０、＃４２及び＃３４）が実験に使用された。いくつかのバッチは、限定的なＢＤＳ試料利用可能性のため、製剤（ＤＰ）材料の使用を必要とした。
【０２２１】
バッチ＃３５、＃３６、＃４０、＃４２及び＃３４は、バッチ＃３８のタンパク質濃度に適合させるために、アスホターゼアルファ製剤緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を使用して４０ｍｇ／ｍＬまで希釈された。分解の実質的レベルを得て、分解動力学を確立するために、強制分解条件は、事前の強制分解条件スクリーニングに基づいて選ばれた。各試験アッセイの各時点（０、１４、２４及び４８時間）のためにアリコート（２００μＬ）を作成した。ＴＯアリコートを試験まで５℃で保持した。試料アリコートの残りを４０℃にて１４、２４及び４８時間インキュベートした。類似点を決定するために、表３０に示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＧＰ−ＨＰＬＣ、ＡＥＸ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ペプチドマッピング及び効力によって、試料を分析した。温度強制分解実験の試験結果を、３つの２０Ｋバッチ及び３つの２Ｋバッチについて表３１に示す。
【表３３】
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【０２２２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元及び還元）
Ｔ０及びＴ４８時間試料は、純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元及び還元）によって分析された。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる主バンド％は、表３１に示すように、Ｔ＝０のすべてのバッチで１００％であり、２０Ｋバッチで平均９７．３％及び２Ｋバッチで平均９６．８％に減少した。分解の傾向は、２０Ｋ及び２Ｋバッチで同等だった。高分子量種は、６つのすべてのバッチについてＴ４８時間試料で検出された。この種は、還元の際に消失した。ジスルフィド結合関連の凝集物の形成がすべてのバッチで分解経路だったことを、この結果は示唆する。余分のバンドはＴ＝０及びＴ＝４８時間で２０Ｋ及び２Ｋバッチの両方について還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察されず、ペプチド結合の分解を示さなかった。本試験はその分子量に基づいてタンパク質を分離して、主バンドパーセントとして表される未変化タンパク質の純度の分析を提供する。タンパク質試料は、ゲル上に分離されて、可視化のためのクーマシーブルー染色で染色して、脱染して、デンシトメトリーによって分析した。アスホターゼアルファ、分解生成物及び工程関連不純物の分子量は、周知の分子量標準との比較によって推定した。分離したタンパク質の定量的測定は、走査及び濃度測定分析による分析によって実施した。
【０２２３】
ＧＰ−ＨＰＬＣ
熱応力によって生じる凝集物及び断片を形成するための分解を、ＧＰ−ＨＰＬＣによって監視して、結果を表３１に示す。Ｔ＝０のすべてのバッチのピークプロファイルは、同じ種の存在を示唆して類似していた。熱応力は、大きな凝集物に相当する、およそ６分でピークが現れて、それは時間とともに増加した。Ｔ＝１４時間、Ｔ＝２４時間及びＴ＝４８時間ですべてのバッチのピークプロファイルは類似しており、それは類似の分解経路を示す。すべてのバッチの長期にわたるメインピークの減少の傾斜は、使用する材料が異なる年数だったという事実を考慮して同程度だった。同程度の傾斜は、類似の分解動力学を示す。
【０２２４】
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
アスホターゼアルファの分解はＡＥＸによっても監視されて、それは電荷に基づいてタンパク質を分離する。同じピークプロファイルはＴ＝０ですべてのバッチについて観察され、すべてのバッチに同じ種を示唆した。熱応力は、およそ２２〜２６分の保持時間ウインドウのピークの増加をもたらした。すべてのバッチの同等のピークプロファイルは、Ｔ＝１４時間、Ｔ＝２４時間及びＴ＝４８時間ですべてのバッチで観察されて、それは熱分解による同じ種の形成を示す。メインピークの減少によって監視される、分解の類似の傾斜は、Ｔ＝０（以前に開示されたように）でのわずかな差及び異なるバッチの年数差を考慮に入れて、すべてのバッチで観察された。
【０２２５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析されるとき、およそ２１．２〜２１．３分の保持時間ウインドウの平均ピークが、すべてのバッチで観察されて、すべてのバッチの同じ種を示した。メインピークは、Ｔ＝０ですべてのバッチで観察される唯一の主要なピークだった。熱応力は、メインピーク直後のピーク溶出の増加をもたらした。Ｔ＝１４、Ｔ＝２４及びＴ＝４８時間ですべてのバッチで観察される熱分解からの同じピークは、同じ分解経路を示唆する。メインピークの減少によってモニタされる分解動力学は、すべてのバッチの同程度の傾斜によって明示されるように、すべてのバッチで同等だった。
【０２２６】
ペプチドマッピング
２０Ｋ及び２ＫバッチのＴ０、Ｔ２４及びＴ４８時間試料は、化学的分解の可能性について評価するためペプチドマッピングにより分析された。すべての時点（Ｔ＝０時間及びＴ＝４８時間）で２０Ｋと２Ｋ間の観察された有意差はなかった。本方法は、塩酸グアニジン、ジチオスレイトール及びヨード酢酸によって、タンパク質を変性させ、還元して、アルキル化して、プロテアーゼトリプシンによる消化が続く。生じたペプチド断片は、勾配逆相ＨＰＬＣによって分離され、２１０ｎｍで検出される。
【０２２７】
比活性（ｐＮＰＰ）
アスホターゼアルファ２０Ｋバッチ及び２Ｋバッチの比活性活動（ｐＮＰＰ）は、各時点（Ｔ０、Ｔ１４、Ｔ２４及びＴ４８）で、４０℃のインキュベーション後、酵素アッセイで測定した。２０Ｋバッチの活性は、各時点で２Ｋバッチと同等だった。熱応力によって生じる活性の減少は、時間とともにすべてのバッチの類似した傾斜に続く。タンパク質ホスファターゼ、酵素は、タンパク質分子からリン酸塩（ＰＯ４３−）基の除去を制御する。ｐＮＰＰホスファターゼアッセイは、ホスファターゼ活性を検出して、２０Ｋ及び２Ｋバッチを比較するために使用した。本方法は、基質としてｐＮＰＰを使用してアスホターゼアルファ酵素活性の決定のために使用した。アスホターゼアルファは、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素からの１つのドメインを有する組換えタンパク質である。このドメインは触媒的活性であり、リン酸エステルを加水分解する。アッセイは、測定の持続時間の間、Ｖｍａｘに到達して、それを維持するために、酵素飽和で実施される。ｐＮＰＰは、黄色の着色生成物に加水分解される（４０５ｎｍで最大限吸光度）。反応速度は、酵素活性に正比例する。１単位（Ｕ）は、使用する方法の条件下で、１分当たりに形成されるｐＮＰＰの１μモルに相当する。ｐＮＰＰによる比活性（タンパク質ｍｇ当たりの酵素活性）は、酵素活性及びＡ２８０によるタンパク質濃度から計算する。
【０２２８】
２０Ｋ規模で製造したアスホターゼアルファ及び２Ｋ規模で製造したアスホターゼアルファの比較性を確立した。各規模からの３つのバッチは、物理化学的な方法を使用して、可能ならば並行して分析されて、アスホターゼアルファ純度、不純物、電荷変異体、サイズ、構造、グリコシル化、ジスルフィド結合、遊離チオール及び活性を評価した。更に並行強制分解実験は、分解経路及び動力学を評価するために実施された。２０Ｋ及び２Ｋ規模で製造された生成物が同等だったことを、結果は実証する。
【０２２９】
バッチの純度は、分析用超遠心分離法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＬｏＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＧＰ−ＨＰＬＣ及びＡＥＸにより評価された。結果は、すべてのバッチで同等の純度を示した。同程度にかなり少ない同じ種類の凝集物は、ＡＵＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＧＰ−ＨＰＬＣによってすべてのバッチで検出された。
【０２３０】
組換えタンパク質では一般的な電荷変異体は、ｃＩＥＦにより評価された。同程度の同じ種はすべてのバッチで観察されて、翻訳後修飾の均一なレベルを示唆した。
【０２３１】
バッチの分子サイズは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ及び完全ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分子量により評価された。同一性は、脱グリコシルした／還元及び脱グリコシルしたＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分子量、ならびに脱グリコシルした／還元及び脱グリコシルしたＥＳＩ−ＴｏＦ分子量により確認された。構造は、ＣＤ、ジスルフィド結合及び遊離チオール（ＬＣ／ＭＳ）、総遊離チオール分析、金属含量分析（ＩＣＰ−ＭＳ／ＩＣＰ−ＡＥＳ）ならびにリン酸化部位占拠によっても評価された。同等の分子量及び同等の流体力学サイズをすべてのバッチで得て、すべてのバッチのアスホターゼアルファの類似改変及び類似配座を示す。
【０２３２】
アスホターゼアルファのグリコシル化は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ遊離グリカン、２ＡＢ標識化オリゴ糖ｆＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳグリコペプチド分析及び総シアル酸含量により評価された。同程度の同じオリゴ糖種は、すべてのバッチで得られた。
【０２３３】
薬物原料の活性は、比活性（ｐＮＰＰ）、ＨＡ結合及びＰＰｉ活性により評価された。アスホターゼアルファの２０Ｋバッチがアスホターゼアルファの２Ｋバッチと同等であることを、結果は示した。
【０２３４】
最後に、２０Ｋ及び２Ｋバッチの同じ分解経路ならびに類似の分解動力学は、熱応力を使用して並行強制分解実験により観察された。
【０２３５】
要約すると、複数の直交法及び並行強制分解実験を使用して広範囲の特性決定により示されるように、アスホターゼアルファの２０Ｋバッチ及び２Ｋバッチは同等である。したがって２０Ｋバッチからの材料は、２Ｋバッチからの材料と同等に安全性及び効率を有する。
【０２３６】
実施例１０．２，０００Ｌ（２Ｋ）及び２０，０００Ｌ（２０Ｋ）規模で製造したアスホターゼアルファの追加の比較
アスホターゼアルファの７つのバッチが２０，０００Ｌ規模で生成されて、アスホターゼアルファの追加の５つのバッチが２，０００Ｌ規模を使用して生成された。両方の規模の生成物が分析されて、同等とわかった（データは示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１４Ｃ−１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018523481.tif 000108
2018523481.tif 000109