(57)【要約】  中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体を発現するように変換されている、細胞を開示する。さらに、上記細胞を生み出す方法および上記細胞を使用する方法も開示する。さらに、上記細胞を生み出す方法および上記細胞を使用する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、前記細胞は寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体を発現するように変換されている、細胞。
【請求項２】
中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、前記細胞は寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように変換されている、細胞。
【請求項３】
中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、前記細胞は寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように変換されており、前記ＣＡＲが共刺激ドメインを含んでいる、細胞。
【請求項４】
中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、前記細胞は寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように変換されており、前記ＣＡＲが少なくとも２つの共刺激ドメインを含んでいる、細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離細胞を生じさせる方法であって、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールまたは前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞表面受容体をコードしているポリヌクレオチドで、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する細胞を変換することを含み、前記細胞が寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものである、方法。
【請求項６】
前記方法が生体外で成し遂げられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、前記ポリヌクレオチドを含むベクターで変換される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが遺伝子組換えＴ細胞受容体（ｔｇ−ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしている、請求項５または７に記載の方法。
【請求項９】
前記中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する細胞が抗第三者細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞表面受容体が、遺伝子組換えＴ細胞受容体（ｔｇ−ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１に記載の単離細胞または請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲが、抗体または抗原結合断片である抗原結合ドメインを含む、請求項２〜４もしくは１０のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５もしくは１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗原結合断片がＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項１１に記載の単離細胞または方法。
【請求項１３】
前記ＣＡＲがＣＤ３ζを含む、請求項２〜４もしくは１０のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５もしくは１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＡＲが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０から構成される群から選択される少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項２〜４もしくは１０のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５もしくは１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＡＲが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０から構成される群から選択される少なくとも２つの共刺激ドメインを含む、請求項２〜４もしくは１０のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５もしくは１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞表面受容体または前記ＣＡＲが、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原、アレルギー抗原および自己免疫抗原から構成される群から選択される抗原と結合する、請求項１〜４もしくは９〜１５のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍抗原が固体腫瘍と関連している、請求項１６に記載の単離細胞または方法。
【請求項１８】
前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連している、請求項１６に記載の単離細胞または方法。
【請求項１９】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ｇｐ１００、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＲＴ−１、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、クラウディン−６、受容体チロシン−タンパク質キナーゼ細胞外ドメイン（ＥｒｂＢ２−ＥＣＤ）、受容体チロシン−タンパク質キナーゼ細胞内ドメイン（ＥｒｂＢ２−ＩＣＤ）、ヒストンＨ１．２、ヒストンＨ４、チロシナーゼ、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＡＩＭ−２ａ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ−Ｂ、ＥｐｈＡ２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、ＧｎＴ−Ｖ、ＨＳＴ−２（ＦＧＦ−６）、Ｌｉｖｉｎ（ＭＬ−ＩＡＰ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１５、ＲＡＧＥ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＡＲＴ−２、ＳＯＸ１０、サバイビン、サバイビン−２Ｂｇ、ＴＲＧ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＣＡＭＥＬおよびＮＹ−ＥＳＯ−１から構成される群から選択される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の単離細胞または方法。
【請求項２０】
前記ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＴＡＸ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、水痘ウイルス、脳炎ウイルス、サイトメガロウイルス、エボラウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）、ロタウイルス、おたふく風邪ウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス−３（ＨＡＤＶ−３）、アデノウイルス−５（ＨＡＤＶ−５）、アデノ随伴ウイルス６（ＡＡＶ６）、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）、カンジダ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から構成される群から選択されるウイルスのものである、請求項１６に記載の単離細胞または方法。
【請求項２１】
前記自己免疫抗原が、１型糖尿病、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチ、クローン病、セリアックおよび脳卒中から構成される群から選択される疾患と関連している、請求項１６に記載の単離細胞または方法。
【請求項２２】
前記細胞がさらに、前記細胞における少なくとも１つの内因性免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制すべく遺伝子改変されている、請求項１〜４もしくは９〜１５のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項５〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫チェックポイント遺伝子が、ＰＤ遺伝子またはＣＴＬＡ遺伝子から構成される群から選択される、請求項２２に記載の単離細胞または方法。
【請求項２４】
前記細胞が中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有するとともに寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものであり、前記細胞が、
（ａ）抗原反応性細胞の富化を可能にすべくＩＬ−２１の存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１つ以上の第三者抗原と接触させること；ならびに
（ｂ）前記中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む抗第三者細胞の増殖を可能にすべく、ステップ（ａ）の結果として生じる前記細胞をＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で培養し、それにより、Ｔｃｍ表現型を有する細胞であって、寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができる、細胞を生じさせること
を含む方法によって生じるものである、請求項５〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
（ｃ）ステップ（ｂ）の結果として生じる前記細胞を単一細胞懸濁液中へと分離させること
をさらに含む、方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に活性細胞を選抜することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性細胞を選抜することが、ＣＤ１３７＋および／またはＣＤ２５＋の細胞を選抜することによって成し遂げられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔｃｍ表現型が、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋の特徴を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離細胞または請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも５０％の単離細胞がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、前記ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のうち少なくとも５０％が前記特徴を有している、請求項２８に記載の単離細胞または方法。
【請求項３０】
請求項１〜４、９〜２３または２８〜２９のいずれか１項に記載の単離細胞を含む、細胞集団。
【請求項３１】
請求項３０に記載の細胞集団と、薬学的に活性なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項３２】
処置を必要とする被験体の疾患を処置する方法であって、請求項３０に記載の細胞集団を前記被験体に治療上有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項３３】
処置を必要とする被験体の疾患を処置するために使用される、治療上有効な量の請求項３０に記載の細胞集団。
【請求項３４】
前記疾患が、悪性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、真菌性疾患、原性動物性疾患、寄生虫性疾患、アレルギー性疾患および自己免疫疾患から構成される群から選択される、請求項３２に記載の方法または請求項３３に記載の細胞集団。
【請求項３５】
前記悪性疾患が固体腫瘍または腫瘍転移である、請求項３４に記載の方法または細胞集団。
【請求項３６】
前記悪性疾患が血液悪性腫瘍である、請求項３４に記載の方法または細胞集団。
【請求項３７】
前記血液悪性腫瘍が白血病またはリンパ腫を含む、請求項３６に記載の方法または細胞集団。
【請求項３８】
前記悪性疾患が、リンパ腫、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、神経芽腫、結腸癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、滑膜細胞癌および膵臓癌から構成される群から選択される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法または細胞集団。
【請求項３９】
前記ウイルス性疾患が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＴＡＸ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から構成される群から選択される、請求項３４に記載の方法または細胞集団。
【請求項４０】
前記自己免疫疾患が、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、狼瘡、セリアックおよび脳卒中から構成される群から選択される、請求項３４に記載の方法または細胞集団。
【請求項４１】
前記細胞集団が被験体とは非同系である、請求項３２もしくは３４〜４０のいずれか１項に記載の方法または請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項４２】
前記投与の前に被験体を亜致死的、致死的または超致死的な調整プロトコル下で調整することをさらに含む、請求項３２または３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
亜致死的、致死的または超致死的な調整プロトコルをさらに含む、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項４４】
前記亜致死的、致死的または超致死的な調整が、全身照射（ＴＢＩ）、部分身照射、骨髄破壊的前処置、骨髄非破壊的前処置、共刺激遮断、化学療法剤および抗体免疫療法から構成される群から選択される、請求項４２に記載の方法または請求項４３に記載の細胞集団。
【請求項４５】
前記投与が、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸内および腸内から構成される群から選択される経路によって成し遂げられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体がヒト被験体である、請求項３２もしくは３４〜４５のいずれか１項に記載の方法または請求項３３〜４５のいずれか１項に記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、細胞表面受容体を発現するように変換された、遺伝子改変された寛容誘導性中枢性メモリーＴリンパ球に関し、より詳しくは、限定されないが、免疫療法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、癌またはウイルス感染症を処置するためにリンパ球（例えばＴ細胞）を患者に投与する治療手順である。
【０００３】
この手法は、腫瘍またはウイルスに特異的なＴ細胞を生体外で生成すること、およびそれを患者に注入することを必要とする。Ｔ細胞の許容性を支援するために通常は患者をさらに、調整プロトコル、例えば、前処置プロトコル（例えば照射または化学療法）および／またはリンパ球増殖因子（例えばＩＬ−２）の投与により処置する。腫瘍特異的リンパ球を生じさせるための多くの方法が記述されており、２つの主要な手法は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖、または遺伝子操作を用いるＴ細胞の指向性変更である。
【０００４】
ある手法によれば、腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を患者自身の腫瘍塊（例えばメラノーマまたは腎臓癌）から単離し、生体外で増殖させ、患者へ再び注入し戻す。ＴＩＬは、腫瘍上に存在する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する患者自身の細胞の混交集団であるため、有望な細胞源である。しかしながら、それらは、Ｔ細胞を腫瘍塊から単離できる場合に適用可能であるに過ぎない。
【０００５】
この手法は、転移性メラノーマを処置するのに有望であった。
【０００６】
他の手法によれば、遺伝子改変を用いて遺伝子組換えＴＣＲ鎖またはキメラ受容体を使用することによってリンパ球の指向性を腫瘍へと変更する。現在のところ、標的認識をモノクローナル抗体の一本鎖可変領域ドメイン（ｓｃＦｖ）に頼るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の、レトロウイルスまたはレンチウイルスまたは電気穿孔による移入が、治療用Ｔ細胞（それぞれＣＡＲ−Ｔ細胞またはＴＣＲ−Ｔ細胞）の安定的製造のために典型的に用いられている［Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（２０１４）７：１０４９−１０６８］。
【０００７】
ＴＣＲ遺伝子組換え細胞（ＴＣＲ−Ｔ）は、標的抗原の認識に特異的なＨＬＡ分子を必要とするものであり（つまり、ＨＬＡ制限）、細胞内タンパク質を認識する能力を有して一連の様々な標的腫瘍関連抗原またはウイルス抗原を提供する。ＴＣＲ−Ｔ細胞の治療の質はそれらのアビディティに依存する。より高いアビディティを生むためにいくつかの方策が実施されており、それには例えば、関連エピトープで免疫したヒトＨＬＡ遺伝子組換えマウスに由来する選抜ＴＣＲの使用、および／またはＨＬＡ／エピトープ複合体と相互作用するＴＣＲα／β鎖の可変領域のＣＤＲ領域２または３における目的突然変異の挿入が挙げられる［上記のＦｕｊｉｗａｒａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（２０１４）］。
【０００８】
他方、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨＬＡ制限を受けない。キメラ受容体（キメラ抗体受容体−ＣＡＲ）の構築物は典型的に、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインからなる。元々のキメラ受容体（すなわち「第一世代」）は、ＣＤ３ζ鎖からの細胞内領域と融合したｓｃＦｖ断片からなっていた。
【０００９】
「第二世代」キメラ受容体も生み出され、それは、種々の共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質側末端に追加してＴ細胞にさらなるシグナルを供給するものであった。前臨床研究から、「第二世代」ＣＡＲがＴ細胞の抗腫瘍活性を向上させたことが指し示された。近年、潜在性をさらに増強するために多数のシグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータ−ＣＤ２８−４−１ＢＢまたはＣＤ３ゼータ−ＣＤ２８−ＯＸ４０を組み合わせた「第三世代」ＣＡＲが生み出された。
【００１０】
種々の腫瘍抗原を標的とする腫瘍特異的ＣＡＲは、多種多様な癌の処置のために臨床で試験が行われているところである。これらの癌および標的とされるそれらの抗原の例としては、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、膠芽腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ球性白血病すなわちＣＬＬ、および急性リンパ球性白血病すなわちＡＬＬ（両者ともにＣＤ１９）が挙げられる。卵巣、前立腺、乳房、腎臓、結腸、神経芽腫などを含む固体腫瘍に対する活性を実証するＣＡＲについては調査中である。ＨＩＶなどのウイルスを内包している細胞を攻撃するウイルス特異的ＣＡＲも開発された。例えば、Ｇｐ１００に特異的なＣＡＲをＨＩＶの処置のために使用する臨床試験が開始された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ，Ｉｂｉｄ）。
【００１１】
主な目的は、骨髄移植に依拠することなく完全または部分的に一致しない同種異系細胞を使用して遺伝子改変Ｔ細胞を含めたＡＣＴを適用することである。
【００１２】
養子細胞療法のためにＴ細胞を改変する様々な手法が検討されており、いくつかは、Ｇｉｌｈａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１５）２６：２７６−２８５；ＳｈａｒｐｅおよびＭｏｕｎｔ、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ（２０１５）８：３３７−３５０ならびにＧｏｕｂｌｅら、Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２４（２１）４６８９に記載されている。
【００１３】
移植片対宿主（ＧＶＨ）活性のない寛容誘導性細胞の生成のためおよび、移植片移植におけるその使用のために、種々の手法が検討されており、いくつかを以下にまとめて示す。
【００１４】
ＧＶＨ活性のないｖｅｔｏＣＴＬを生み出すために開発された１つの手法がＲｅｉｓｎｅｒおよび協力者によって記述されており、その中でＣＴＬは外来性ＩＬ−２の非存在下で第三者刺激物質によって刺激された。この手法は、活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球前駆体（ＣＴＬｐ）のみが初代培養においてＩＬ−２欠乏に耐え抜くことができるという観察結果に基づくものであった（ＩＬ−２の枯渇は非誘導性Ｔ細胞のアポトーシスを引き起こす）。この方法は抗第三者ｖｅｔｏＣＴＬからＧＶＨ反応性を失わせることが試験管内および生体内において示された［国際公開第２００１／０４９２４３号パンフレット、Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：１９４３−１９５０；Ａｖｉｎｅｒら、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）６６：６４４−６５２］。これらの抗第三者ｖｅｔｏＣＴＬを（移植片と共に）受容者に導入することによって、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を誘導することなく移植片拒絶が阻止された（国際公開第２００１／０４９２４３号パンフレット）。
【００１５】
国際公開第２０１０／０４９９３５号パンフレットには、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する非ＧＶＨＤ誘導性の抗第三者細胞を含む単離細胞集団が開示されており、当該細胞は、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができる。
【００１６】
国際公開第２０１３／０３５０９９号パンフレットには、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する抗第三者細胞を含む単離細胞集団を生じさせる新たな方法が開示されており、当該細胞は、寛容誘導性細胞でありかつ／または抗疾患活性が付与されており、移植後にリンパ節へ帰巣することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００１／０４９２４３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４９９３５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１３／０３５０９９号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（２０１４）７：１０４９−１０６８
【非特許文献２】Ｇｉｌｈａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１５）２６：２７６−２８５；
【非特許文献３】ＳｈａｒｐｅおよびＭｏｕｎｔ、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ（２０１５）８：３３７−３５０
【非特許文献４】Ｇｏｕｂｌｅら、Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２４（２１）４６８９
【非特許文献５】Ｂａｃｈａｒ−Ｌｕｓｔｉｇら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：１９４３−１９５０
【非特許文献６】Ａｖｉｎｅｒら、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）６６：６４４−６５２
【発明の概要】
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体を発現するように変換されている、細胞が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように変換されている、細胞が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように変換されており、ＣＡＲが共刺激ドメインを含んでいる、細胞が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように変換されており、ＣＡＲが少なくとも２つの共刺激ドメインを含んでいる、細胞が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離細胞を生じさせる方法であって、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしているポリヌクレオチドで、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する細胞を変換することを含み、当該細胞が、寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものである、方法が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離細胞を含む、細胞集団が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の細胞集団と、薬学的に活性なキャリアとを含む、医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、処置を必要とする被験体の疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の細胞集団を被験体に治療上有効な量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、処置を必要とする被験体の疾患を処置するために使用される、治療上有効な量の本発明のいくつかの実施形態の細胞集団が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は生体外で成し遂げられる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、ポリヌクレオチドを含むベクターで変換される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、遺伝子組換えＴ細胞受容体（ｔｇ−ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしている。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する細胞は、抗第三者細胞である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞表面受容体は、遺伝子組換えＴ細胞受容体（ｔｇ−ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、抗体または抗原結合断片である抗原結合ドメインを含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合断片は、ＦａｂまたはｓｃＦｖである。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲはＣＤ３ζを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０から構成される群から選択される少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０から構成される群から選択される少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞表面受容体またはＣＡＲは、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原、アレルギー抗原および自己免疫抗原から構成される群から選択される抗原と結合する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍抗原は固体腫瘍と関連している。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍抗原は血液悪性腫瘍と関連している。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ｇｐ１００、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＲＴ−１、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、クラウディン−６、受容体チロシン−タンパク質キナーゼ細胞外ドメイン（ＥｒｂＢ２−ＥＣＤ）、受容体チロシン−タンパク質キナーゼ細胞内ドメイン（ＥｒｂＢ２−ＩＣＤ）、ヒストンＨ１．２、ヒストンＨ４、チロシナーゼ、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＡＩＭ−２ａ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ−Ｂ、ＥｐｈＡ２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、ＧｎＴ−Ｖ、ＨＳＴ−２（ＦＧＦ−６）、Ｌｉｖｉｎ（ＭＬ−ＩＡＰ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１５、ＲＡＧＥ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＡＲＴ−２、ＳＯＸ１０、サバイビン、サバイビン−２Ｂｇ、ＴＲＧ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＣＡＭＥＬおよびＮＹ−ＥＳＯ−１から構成される群から選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＴＡＸ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、水痘ウイルス、脳炎ウイルス、サイトメガロウイルス、エボラウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）、ロタウイルス、おたふく風邪ウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス−３（ＨＡＤＶ−３）、アデノウイルス−５（ＨＡＤＶ−５）、アデノ随伴ウイルス６（ＡＡＶ６）、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）、カンジダ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から構成される群から選択されるウイルスのものである。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫抗原は、１型糖尿病、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチ、クローン病、セリアックおよび脳卒中から構成される群から選択される疾患と関連している。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞はさらに、細胞における少なくとも１つの内因性免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制すべく遺伝子改変されている。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫チェックポイント遺伝子は、ＰＤ遺伝子またはＣＴＬＡ遺伝子から構成される群から選択される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する細胞であって、寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができる、細胞は、（ａ）抗原反応性細胞の富化を可能にすべくＩＬ−２１の存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１つ以上の第三者抗原と接触させること；ならびに（ｂ）前記中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む抗第三者細胞の増殖を可能にすべく、ステップ（ａ）の結果として生じる前記細胞をＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で培養し、それにより、Ｔｃｍ表現型を有する細胞であって、寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものである、細胞を生じさせること、を含む方法によって生じる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法はさらに、（ｃ）ステップ（ｂ）の結果として生じる前記細胞を単一細胞懸濁液中へと分離させることを含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法はさらに、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に活性細胞を選抜することをさらに含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、活性細胞を選抜することは、ＣＤ１３７＋および／またはＣＤ２５＋の細胞を選抜することによって成し遂げられる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔｃｍ表現型は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋の特徴を含む。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも５０％の単離細胞がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のうち少なくとも５０％が当該特徴を有している。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は、悪性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、真菌性疾患、原性動物性疾患、寄生虫性疾患、アレルギー性疾患および自己免疫疾患から構成される群から選択される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性疾患は固体腫瘍または腫瘍転移である。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性疾患は血液悪性腫瘍である。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、血液悪性腫瘍は白血病またはリンパ腫を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、悪性疾患は、リンパ腫、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、神経芽腫、結腸癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、滑膜細胞癌および膵臓癌から構成される群から選択される。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ウイルス性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＴＡＸ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から構成される群から選択される。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、狼瘡、セリアックおよび脳卒中から構成される群から選択される。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞集団は被験体とは非同系である。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、投与の前に被験体を亜致死的、致死的または超致死的な調整プロトコル下で調整することをさらに含む。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、使用のための治療上有効な量は、亜致死的、致死的または超致死的な調整プロトコルをさらに含む。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、亜致死的、致死的または超致死的な調整は、全身照射（ＴＢＩ）、部分身照射、骨髄破壊的前処置、骨髄非破壊的前処置、共刺激遮断、化学療法剤および抗体免疫療法から構成される群から選択される。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与は、気管内、気管支内、肺胞内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、心臓内、筋肉内、漿膜内、粘膜内、経粘膜、経鼻、直腸内および腸内から構成される群から選択される経路によって成し遂げられる。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、被験体はヒト被験体である。
【００６４】
特段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての技術的かつ／または科学的な用語は、本発明の属する技術分野において通常の技量を有する者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されているのと同様または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験において使用することはできるが、典型的な方法および／または材料を以下に記載する。係争の際には、定義を含めた特許明細書によって立証されよう。さらに、材料、方法および実施例は単に例示であるに過ぎず、必ずしも限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
添付図を参照して本明細書中に本発明のいくつかの実施形態を例としてのみ記載する。これから詳しく具体的に言及する図面に関して、示されている詳細は例としてのものであり、本発明の実施形態を例示的に述べることを目的としたものであることを強調しておく。この点に関して、記載を図面と併せて理解することにより、本発明の実施形態がいかにして実施され得るかが当業者にとって明白になる。
【図１Ａ】図１Ａは、同種異系ＢＭの誘導特性の非存在下でＴｃｍ細胞が寛容を誘導する能力を研究するためのモデルの模式図である。Ｔｃｍ細胞の生存および増殖をＦＡＣＳによって分析し、さらにＴｃｍ細胞による宿主ＣＴＬ活性の下方制御について５１Ｃｒを使用して試験した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、同種異系ＢＭの誘導特性の非存在下でＴｃｍ細胞が寛容を誘導する能力を研究するためのモデルの模式図である。Ｔｃｍ細胞の生存および増殖をＦＡＣＳによって分析し、さらにＴｃｍ細胞による宿主ＣＴＬ活性の下方制御について５１Ｃｒを使用して試験した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、同種異系ＢＭの誘導特性の非存在下でＴｃｍ細胞が寛容を誘導する能力を研究するためのモデルの模式図である。Ｔｃｍ細胞の生存および増殖をＦＡＣＳによって分析し、さらにＴｃｍ細胞による宿主ＣＴＬ活性の下方制御について５１Ｃｒを使用して試験した。
【図２Ａ】図２Ａは、同系骨髄移植（ＢＭＴ）の環境下で養子移入されたＦ１−Ｔｃｍ細胞の存続を示すグラフである。図１Ａに概略で示しているとおりにＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスに移植をした。各群の１匹のマウスについての代表的な散布図であり、マウスの末梢全血中のＴｃｍ細胞の割合を示しており、それは、移植後６０日目にαＨ２Ｄｄ（提供者）およびαＨ２Ｋｂを使用するＦＡＣＳによって分析してＦ１（Ｈ２ＤｄＸＨ２Ｋｂ）Ｔｃｍ細胞を同定したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、同系骨髄移植（ＢＭＴ）の環境下で養子移入されたＦ１−Ｔｃｍ細胞の存続を示すグラフである。図１Ａに概略で示しているとおりにＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスに移植をした。各群の１匹のマウスについての代表的な散布図であり、マウスの末梢全血中のＴｃｍ細胞の割合を示しており、それは、移植後６０日目にαＨ２Ｄｄ（提供者）およびαＨ２Ｋｂを使用するＦＡＣＳによって分析してＦ１（Ｈ２ＤｄＸＨ２Ｋｂ）Ｔｃｍ細胞を同定したものである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、同系骨髄移植（ＢＭＴ）の環境下で養子移入されたＦ１−Ｔｃｍ細胞の存続を示すグラフである。図１Ａに概略で示しているとおりにＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスに移植をした。各群の１匹のマウスについての代表的な散布図であり、マウスの末梢全血中のＴｃｍ細胞の割合を示しており、それは、移植後６０日目にαＨ２Ｄｄ（提供者）およびαＨ２Ｋｂを使用するＦＡＣＳによって分析してＦ１（Ｈ２ＤｄＸＨ２Ｋｂ）Ｔｃｍ細胞を同定したものである。
【図３】図３は、Ｔｃｍ細胞が多クローン性宿主Ｔ細胞（ＨＴＣ）母集団から抗提供者Ｔ細胞を特異的に消滅させるがその一方で他のＨＴＣが細胞傷害活性を提示するのを容認することを示すグラフである。図１Ａに概要で示しているとおりにマウスに移植をした。移植後６０日目にマウスを屠殺し、脾臓およびリンパ節（ＬＮ）を採取してＣＤ８＋の細胞を選抜した（さらに、Ｔｃｍを排除するためにＨ−２Ｄｄについて負の選択をした）。これらのナイーブＨＴＣを、それらがＣ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）標的を殺傷する能力についてクロム放出アッセイで試験した。バーは、次のとおりの殺傷効果を表している：ＢＭのみを受けているマウスに由来するＨＴＣ（黒色バー、「ＢＭのみ→Ｃ３Ｈ」）もしくはＴｃｍも受けているマウスに由来する細胞（暗灰色バー、「ＢＭ＋Ｔｃｍのみ→Ｃ３Ｈ」）によるＣ３Ｈ標的の殺傷、またはＢＭのみを受けているマウスに由来するＨＴＣ（白色バー、「ＢＭのみ→ＢＡＬＢ」）もしくはＴｃｍも受けているマウスに由来するＴ細胞（明灰色バー、「ＢＭ＋Ｔｃｍ→ＢＡＬＢ」）によるＢＡＬＢ／ｃ標的の殺傷。結果は、各群について１２ウェルから得られた殺傷率の平均±ＳＤとして表されている。行った２つの独立した実験のうちの代表的な実験を表示している。（＊＊）は０．０１未満のｐ値に相当する。（＊＊＊）は０．００１未満のｐ値に相当する。
【図４】図４は、同系のＴ細胞除去骨髄（ＴＤＢＭＴ）と共に亜致死的な５．５ＧｙのＴＢＩを受けたマウスにおいてＣＢ６Ｆ１由来のＴｃｍ細胞が存続することを示すグラフである。図１Ｂ中に表しているように、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ２Ｄｄ）マウスに亜致死的な（５．５Ｇｙ）照射および移植を行った。移植後４０、８０および１３２日目に、αＨ２Ｄｄ（宿主）およびαＨ２Ｋｂを使用するＦＡＣＳによって末梢血を分析してＨ２ｄｂＦ１−Ｔｃｍ細胞を同定した。散布図は各マウスのＣＢ６Ｔｃｍ細胞の割合を示し、各点は、適切な群に属する１匹のマウスのＴｃｍ細胞集団を表しており、各群の平均およびＳＤが示されている。
【図５】図５は、ＴＤＢＭＴなしでＴｃｍ細胞の生存を可能にする照射量の較正を示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ２Ｄｄ）マウスを第−１日目に２／４／５．５／６．５Ｇｙで亜致死的に照射した。第０日目にマウスは、養子移入される５×１０６または９×１０６個のＦ１ＣＢ６（Ｈ−２ｄｂ）Ｔｃｍ細胞をマウスの尾静脈に受けた。散布図はＢａｌｂ／ｃ宿主マウスの末梢全血中のＣＢ６Ｔｃｍ細胞の割合を表しており、それは、移植後４２日目にαＨ２Ｄｄ（宿主）およびαＨ２Ｋｂを使用するＦＡＣＳによって分析してＨ２ｄｂＦ１−Ｔｃｍ細胞を同定したものである。平均およびＳＤが、または各群が示されている。
【図６Ａ】図６Ａは、完全に同種異系であるＴｃｍ細胞が５．５ＧｙのＢａｌｂ／ｃマウスにおいて長期間存続することを示すグラフである。図１Ｃに概略で示しているようにＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスに移植をした。Ｔｃｍ細胞は、ＣＢ６−Ｆ１（Ｈ−２ｄｂ）起源またはＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）起源のものであった。示されている日にマウスから採血し、αＨ２Ｄｄ（宿主）およびαＨ２Ｋｂ（提供者）を使用するＦＡＣＳによってＴｃｍ細胞集団を分析してＨ２ｄｂＦ１−Ｔｃｍ細胞およびＨ２ｂＡｌｌｏ−Ｔｃｍ細胞を同定した。図６Ａは、Ｂａｌｂ／ｃ宿主におけるＴｃｍ細胞の割合を表す散布図である。各点は、適切な群に属する１匹のマウスのＴｃｍ細胞集団を表し、各群の平均およびＳＤが示されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、完全に同種異系であるＴｃｍ細胞が５．５ＧｙのＢａｌｂ／ｃマウスにおいて長期間持続することを示すグラフである。図１Ｃに概略で示しているようにＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスに移植をした。Ｔｃｍ細胞は、ＣＢ６−Ｆ１（Ｈ−２ｄｂ）起源またはＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）起源のものであった。示されている日にマウスから採血し、αＨ２Ｄｄ（宿主）およびαＨ２Ｋｂ（提供者）を使用するＦＡＣＳによってＴｃｍ細胞集団を分析してＨ２ｄｂＦ１−Ｔｃｍ細胞およびＨ２ｂＡｌｌｏ−Ｔｃｍ細胞を同定した。図６Ｂは、末梢血中のＴｃｍ細胞集団の長期に亘る低下を示す時間曲線グラフである。
【図７】図７は、完全に同種異系であるＴｃｍ細胞が、５．５ＧｙのＢａｌｂ／ｃマウスにおいて存続し、追加の提供者Ｔ細胞の生着を促進することを示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスは、第−１日目に５．５ＧｙのＴＢＩを受け、第０日目にＣＢ６−Ｆ１（Ｈ−２ｄｂ）由来またはＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）由来の５×１０６個のＴｃｍ細胞を受けた。Ｔｃｍ細胞注射後８９日目に、マウスを２ＧｙのＴＢＩで照射し、次の日にマウスは２×１０６個のＣＤ４５．１＋、ＯＴ１＋、ＲＡＧ＋ＣＤ８＋細胞を受けた。散布図は、Ｔｃｍ細胞移植後１２０日目およびＯＴ−１細胞移植後３０日目の採血を示す。
【図８】図８は、亜致死的に照射されたＢａｌｂ／ｃマウスの末梢血中のＯＴ−１細胞の分析を示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｂ）マウスは、第−１日目に５．２５ＧｙのＴＢＩを受け、続いて第０日目に、示されている個数のＣＢ６（Ｈ−２ｄｂ）由来またはＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）由来のＴｃｍ細胞を伴うかまたは伴わずしてＣＤ８＋ＯＴ−１＋ＣＤ４５．１＋ＲＡＧ−細胞を受けた。Ｔｃｍ細胞注射後６０日目にマウスの末梢血を試験してＦＡＣＳ分析を用いてＯＴ−１細胞の存在を検出した。散布図は、全てのＣＤ８＋Ｈ−２ｂ＋細胞のうちの、種々の群のＯＴ−１細胞の割合を示す。
【図９】図９は、強度減弱前処置Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルに移植した、ＯＴ−１マウスから調製したＴｃｍ細胞の、生着および生存を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、細胞表面受容体を発現するように変換された、遺伝子改変された寛容誘導性の中枢性メモリーＴリンパ球に関し、より詳しくは、他を排除するものではないが、免疫療法における上記Ｔリンパ球の使用に関する。
【００６７】
本発明の原理および機能は、図面およびそれに付随する記載を参照してよりよく理解され得る。
【００６８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明がその適用において以下の記載に明示されているかまたは実施例で例示されている細部に必ずしも限定されないことは理解されるべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実施されることができる。さらに、本明細書において採用されている表現および用語は説明を目的とするものであり、限定としてみなされるべきでない。
【００６９】
リンパ球および抗原提示細胞を使用する細胞に基づく療法は、免疫療法に有望な手法である。自家または非自家の供給源からの養子細胞移入（ＡＣＴ）は、免疫誘導した細胞の移入を含めて、宿主の中に免疫学的な機能および特性を移入する目標を提案する。ＡＣＴのために以前に採用された１つの方法は、（例えばＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を発現している）遺伝子改変Ｔ細胞であって、細胞の特異性の指向先を標的抗原に変更した、細胞を含む。しかし、（移植受容者による）移植片拒絶および／または（移植細胞による）移植片対宿主疾患の課題は、これらの細胞の治療的潜在能を追求するために克服する必要のある課題であり続けている。
【００７０】
本発明者らは、本発明を実施化するなかで、移植片対宿主反応性のない抗第三者中枢性メモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞が固有のｖｅｔｏ寛容誘導活性を有しており、かつそれ自体で寛容を造血前駆細胞の非存在下で誘導できる、ということを明らかにした。本発明者らはさらに、抗第三者Ｔｃｍ細胞が、Ｔ細胞受容体（例えば遺伝子組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体）を発現するように遺伝子改変されることができ、かつ、移植片対宿主潜在能を有さずｖｅｔｏ活性を誘導すると同時に疾患に対抗するために使用されることができる、ということを発見した。
【００７１】
本明細書において以下およびそれに続く実施例の節で示すように、本発明者らは、同種異系提供者型の抗第三者Ｔｃｍ細胞が、骨髄移植を伴うかまたは伴わない場合に長期（例えば１２０日超、それぞれ図２Ａ〜Ｂおよび図６Ａ〜Ｂ）に亘って宿主内で存在し続けることができる、ということを示した。さらに、抗第三者Ｔｃｍ細胞はｖｅｔｏ活性を発揮した（図３）。したがって、抗第三者Ｔｃｍ細胞の適用は、単独（つまり、ＢＭ前駆体の非存在下）で免疫療法、特に腫瘍抗原、病原体（例えばウイルス抗原）および自己抗原を標的化するための免疫療法に有用となるツールを提供する。したがって、これらの結果は、異種Ｔ細胞エフェクター機能を発現する任意の細胞提供者に由来する遺伝子改変性の寛容原性抗第三者Ｔｃｍ細胞をさらに実体化し、それゆえに、疾患抗原を標的化するとともに移植片拒絶および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を回避する免疫療法のための普遍的な製品をもたらす。
【００７２】
まとめると、これらの細胞は、移植片対宿主潜在能を有さず、移植片拒絶を有さず、全く一個の細胞で特異抗原を標的化する、という解決策を提供する。これらの細胞は、自家細胞を処置に使用する必要性またはそれとともに造血細胞を移植する必要性をなくす。しかも、これらの細胞は、細胞に基づく療法を「患者毎基準で」作る必要性を克服し、「既製の」治療用製品を作製することを可能にする。
【００７３】
したがって、本発明の一態様によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する単離細胞であって、寛容誘導性細胞であり、移植後にリンパ節へ帰巣することができ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体を発現するように変換されている、細胞が提供される。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、「単離細胞」という用語は、その天然の環境から（例えば組織から、例えば人体から）分離された細胞を指す。
【００７５】
本明細書中で使用する「中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型」という語句は、リンパ節に帰巣するＴ細胞障害性細胞のサブセットを指す。Ｔｃｍ表現型を有する細胞は、ヒトでは、典型的にはＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ４５ＲＡ−の特徴を含む。Ｔｃｍ細胞が当該特徴マーカーの全てを単一の細胞上に発現してもよいし、当該特徴マーカーの一部のみを単一の細胞上に発現してもよい、ということは理解されよう。
【００７６】
Ｔｃｍ細胞は、通常は移植後にリンパ節へ帰巣する。
【００７７】
いくつかの実施形態によれば、本発明のＴｃｍ細胞は、移植後に、例えば末梢リンパ節および腸間膜リンパ節など任意のリンパ節へ帰巣し得る。これらの細胞の帰巣性は、それらの寛容効果をそれらが迅速かつ効率的に発揮するのを可能にする。
【００７８】
本明細書中で使用する「寛容誘導性細胞」という語句は、それらと受容者の細胞（例えば、受容者のＴ細胞）とが接触したときに受容者の細胞の応答性を、寛容誘導性細胞の投与がない場合の受容者の細胞の応答性よりも低くする細胞を指す。寛容誘導性細胞としては、例えば、国際公開第２００１／０４９２４３号および第２００２／１０２９７１号において以前に記載されたようなｖｅｔｏ細胞（すなわち、宿主Ｔ細胞と接触した際にそのアポトーシスを引き起こすＴ細胞）が挙げられる。
【００７９】
一実施形態によれば、本発明のＴｃｍ細胞は、非ＧＶＨＤ誘導性細胞でもある。
【００８０】
本明細書中で使用する「非ＧＶＨＤ」という用語は、移植片対宿主誘導反応性が実質的に低減されているかまたは全くないことを指す。したがって、本発明の細胞は、移植された被験体の移植後３０〜１００日目の生存率、体重および全体的外見によって明らかにされる移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を顕著に引き起こさないように作り出される。
【００８１】
一実施形態によれば、本発明の細胞は、宿主に対する反応性が、抗第三者Ｔｃｍ細胞でないＴ細胞の移植と比べて少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減される。
【００８２】
一実施形態によれば、Ｔｃｍ表現型を含む本発明の細胞は、遺伝子改変されている。
【００８３】
一実施形態によれば、本発明の細胞は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体を発現するように変換されている。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、「変換され」という用語は、「トランスフェクトされ」または「形質転換され」という用語と互換的に使用され得、外来性の（異種）核酸を細胞内へ移入または導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされ」または「形質転換され」または「変換され」ている細胞は、外来性の核酸でトランスフェクト、形質転換または変換された細胞である。当該細胞には、初代細胞およびその子孫またはその細胞株が含まれる。
【００８５】
本明細書中で使用する「細胞表面受容体」という用語は、リガンド（例えば抗原）に結合するとともに細胞の活性化を媒介する、細胞膜上に提示される組換えまたは合成の分子を指す。
【００８６】
本明細書中で使用する「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を惹起する分子として定義される。当業者であれば、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含めた任意の巨大分子、ならびに炭水化物、脂質およびＤＮＡが抗原としての働きをすることを理解するであろう。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原は、本明細書において以下にさらに詳しく記載するが、悪性疾患に関連するもの、すなわち、腫瘍抗原（例えば腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原）、ウイルスタンパク質抗原、細菌タンパク質抗原、真菌タンパク質抗原、アレルギー反応に関連する抗原（すなわちアレルギー抗原）、または自己免疫関連抗原（例えば、「自己」抗原）である。
【００８８】
本発明の細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む。
【００８９】
「Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュール」という用語は、受容体の配置されたＴ細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する元となる受容体の細胞内部分を指す。Ｔ細胞の正常なエフェクター機能には、例えば、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ）の分泌、抗原特異的な細胞傷害性、および細胞増殖が含まれ得る。したがって、本発明のＴ細胞受容体シグナル伝達モジュールは、エフェクター機能シグナルを変換し、特別な機能を行うように細胞を仕向ける、タンパク質の一部を指す。
【００９０】
一実施形態によれば、細胞表面受容体は、遺伝子組換えＴ細胞受容体（ｔｇ−ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子組換えＴ細胞受容体」または「ｔｇ−ＴＣＲ」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異性、すなわち主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示される抗原ペプチド（すなわち抗原）の認識能を有する、組換えまたは合成の分子を指す。
【００９２】
本発明のｔｇ−ＴＣＲは、典型的には、２本の鎖（すなわちポリペプチド鎖）、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＴＣＲのガンマ鎖、ＴＣＲのデルタ鎖、またはそれらの組み合わせ（例えば、αβ鎖、またはγδ鎖）を含む。ｔｇ−ＴＣＲのポリペプチドは、本明細書において上に記した抗原特異性およびＴ細胞エフェクター機能をｔｇ−ＴＣＲが有することを条件として、任意のアミノ酸配列を含むことができる。抗原特異性がＴＣＲヘテロ二量体によって（つまり、αβ鎖またはγδ鎖によって）決まることは理解されよう。
【００９３】
２本の鎖の各々が典型的には２つの細胞外ドメイン、すなわち可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域とからなることは理解されよう。
【００９４】
一実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲの可変領域を含む。具体的な実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変領域を含む。別の具体的な実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲのγ鎖およびδ鎖の可変領域を含む。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲの可変領域は、抗原に特異的に結合することのできる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはＣＤＲ４のいずれかから選択され得る。具体的な実施形態によれば、ＣＤＲは一本の鎖上に存在し、好ましくは、ＣＤＲはｔｇ−ＴＣＲの両方の鎖上に存在する。
【００９６】
一実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲの定常領域を含む。具体的な実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常領域を含む。別の具体的な実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲのγ鎖およびδ鎖の定常領域を含む。
【００９７】
内因性のＴＣＲ（すなわち、変換される細胞内で生じるＴＣＲ）とｔｇ−ＴＣＲ鎖との間での混合型二量体の形成を回避するために、本発明のｔｇ−ＴＣＲは、ネズミ科（例えばマウス）のＴＣＲの定常領域を含み得る。ｔｇ−ＴＣＲの特異的な対形成性を高めるために用い得る別の手法は、ｔｇ−ＴＣＲ鎖（例えばα鎖およびβ鎖）の定常領域内に追加のシステイン残基を導入することであり、これによって追加のジスルフィド結合が形成される。あるいは、ｔｇ−ＴＣＲ鎖の対形成に有利に働き、しかもｔｇ−ＴＣＲ反応性を高める、ｔｇ−ＴＣＲ鎖（例えばα鎖およびβ鎖）定常領域における重要な相互作用アミノ酸の突然変異逆位を導入してもよい。これに代えて、またはこれに加えて、例えば内因性ＴＣＲを特異的に下方制御するために使用される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、内因性ＴＣＲの下方制御を実施してもよい。さらなる詳細については、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇおよびＭｏｒｇａｎ、Ａｄｖ  ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．（２０１２）６４（８）：７５６−７６２を参照されたい。
【００９８】
既に述べたように、ｔｇ−ＴＣＲは、ＭＨＣ依存的な様式で抗原を認識する。
【００９９】
本明細書中で使用する場合、「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」という語句は、一群の関連遺伝子座によってコードされた抗原の複合体を指し、それは総称して、マウスにおいてＨ−２と呼ばれ、ヒトにおいてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。ＭＨＣ抗原の２つの主たる部類であるクラスＩおよびクラスＩＩは各々、組織タイプおよび移植片適合性を決定する役割を担う一組の細胞表面糖タンパク質を含む。
【０１００】
本発明では主なＭＨＣクラスＩ分子を考えに入れている。
【０１０１】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、ほぼ全ての細胞の表面に発現される。これらの分子は、内因的に合成されたタンパク質から主に生じるペプチドをαβＴ細胞受容体との相互作用によってＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する際に機能する。ヒトにおいてはいくつかのＭＨＣハプロタイプ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５およびＨＬＡ−Ｃｗ８が存在し、それらの配列は、ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ（ドット）ｂｍｅ（ドット）ｎｗｕ（ドット）ｅｄｕにあるｋａｂｂａｔデータベースに見出すことができる。ＭＨＣハプロタイプに関するさらなる情報は、Ｐａｕｌ，Ｂ．、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓに見出すことができる。
【０１０２】
ｔｇ−ＴＣＲの選択は、標的細胞の表面を定義する抗原の種類および数に依存する。例えば、ｔｇ−ＴＣＲは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するように選択され得る。したがって、例えば、ｔｇ−ＴＣＲによる認識のための抗原として作用し得る細胞表面マーカーには、ウイルス、細菌および寄生虫による感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連するものが含まれ得る。例は以下に示されている。
【０１０３】
好結果なｔｇ−ＴＣＲを生み出すためには、まず適切な標的配列を同定する必要がある。それゆえ、抗原反応性のＴ細胞（例えば、腫瘍反応性のＴ細胞）からＴＣＲを単離してもよく、または、これが可能でない場合には代わりの技術を採用することができる。典型的な実施形態によれば、遺伝子組換え動物（例えば、ウサギまたはマウス、好ましくはヒトＨＬＡ遺伝子組換えマウス）をヒト抗原ペプチド（例えば、腫瘍抗原またはウイルス抗原）で免疫して、ヒト抗原に対するＴＣＲを発現しているＴ細胞を生み出す［例えば、Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２（１０）：９６２−７０に記載されているとおり］。別の典型的実施形態によれば、疾患（例えば腫瘍）の寛解を経験している患者から抗原特異的なＴ細胞（例えば、腫瘍特異的なＴ細胞）を単離し、そこから反応性ＴＣＲ配列を単離する［例えば、ｄｅ  Ｗｉｔｔｅら、Ｂｌｏｏｄ（２００６）１０８（３）：８７０に記載されているとおり］。
【０１０４】
別の典型的な実施形態によれば、試験管内での技術を採用して既存のＴＣＲの配列を変更し、低反応性の抗原特異的ＴＣＲと標的抗原とのアビディティを増強する（そのような方法は以下に記載されている）。
【０１０５】
一実施形態によれば、本発明のｔｇ−ＴＣＲは、抗原ペプチド−ＨＬＡ複合体を高いアビディティ（すなわち、ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣ複合体との間での単量体相互作用の物理的強度）で認識するように選択される。
【０１０６】
高い機能的アビディティを有する（つまり、効果的に抗原に応答する）細胞を生成することは、当業者に既知の任意の方法を用いて達成することができる。したがって、一例によれば、ｔｇ−ＴＣＲのアビディティを高めることは、ｔｇ−ＴＣＲの親和性（すなわち、ＴＣＲとそのリガンドとの結合の強度）を高めることまたは、細胞表面でのｔｇ−ＴＣＲの発現を増加させることによって達成される。１つの典型的な実施形態によれば、ＴＣＲ親和性を高めることは、ｔｇ−ＴＣＲ遺伝子の改変によって行われる。例えば、ｔｇ−ＴＣＲの１つの可能な改変としては、ｔｇ−ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３）に対する改変が挙げられる。したがって、変換された細胞においてｔｇ−ＴＣＲの親和性を高めかつ抗原特異的な反応性を増強するために、ＣＤＲ鎖（例えばα鎖またはβ鎖）において一重または二重のアミノ酸置換を利用してもよい。別の典型的な実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲの機能的アビディティを高めることは、ｔｇ−ＴＣＲ鎖の定常ドメインの中の規定のＮ−グリコシル化モチーフを除去することによって行われる。別の典型的な実施形態によれば、親和性を高めることは、コドン最適化によって行われる。
【０１０７】
したがって、ｔｇ−ＴＣＲの稀なコドンを、高発現するヒト遺伝子において最も頻繁に分布しているコドンで置き換える。最適化プロセス中に、ＡＴまたはＧＣに富むシス作用性の配列範囲、不可解なスプライシングモチーフ、およびＲＮＡ不安定化モチーフをさらに取り除いてもよい。さらなる情報については、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる上記のＺｈａｎｇおよびＭｏｒｇａｎ、Ａｄｖ  ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．（２０１２）を参照されたい。
【０１０８】
一実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲのシグナル伝達モジュールは、単一のサブユニットを含んでいてもよいし、複数のシグナル伝達ユニットを含んでいてもよい。したがって、本発明のｔｇ−ＴＣＲは、ＴＣＲと共同で作用して抗原受容体係合後にシグナル変換を開始する共受容体を用いるものであってもよいし、同じ機能的能力を有するその任意の派生体または変異型を用いるものであってもよい。
【０１０９】
一実施形態によれば、ＴＣＲシグナル伝達モジュールは、ＣＤ３複合体（例えばＣＤ３鎖、例えば、ＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／εおよび／またはゼータ鎖、例えばζ／ζもしくはζ／η）を含む。
【０１１０】
これに加えて、またはこれに代えて、ＴＣＲシグナル伝達モジュールは、追加のシグナルをＴ細胞に供給する共刺激タンパク質受容体を含んでもよい。これらについては本明細書において以下に詳しく述べる。
【０１１１】
一実施形態によれば、ｔｇ−ＴＣＲは、本明細書において以下に詳しく記載する膜貫通ドメインを含み得る。
【０１１２】
細胞をＴＣＲで変換する方法については、本明細書において以下に詳しく記載する。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という語句は、特定抗原に対する細胞性免疫活性を呈するキメラタンパク質を生み出すために所望の抗原に対する特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメイン（すなわち、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュール）とを併せ持つ組換えまたは合成の分子を指す。
【０１１４】
したがって、本発明のＣＡＲは通常、抗原結合部分と、膜貫通ドメインと、抗原に対するＴ細胞の効率的応答に必要な細胞内ドメイン（すなわち細胞質ドメイン）とを含む。
【０１１５】
抗原結合部分
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、抗原結合部分とも呼ばれる標的特異的な結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンド（すなわち抗原）の種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンド（すなわち抗原）を認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲにおいて抗原部分ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーには、ウイルス、細菌および寄生虫による感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連するものが含まれ得る。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合することのできる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。そのようなＣＤＲは、抗原から得ることができる。
【０１１７】
本発明において使用する用語「抗体」は、完全な分子およびその機能的断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆｖ，直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体および、抗原に結合することのできる抗原断片から形成される多特異的な抗体を包含する。これらの機能的抗体断片は、次のとおりに定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有する断片であり、全抗体を酵素パパインで消化して完全な軽鎖と１つの重鎖の一部とを生じさせることによって作ることができる；（２）Ｆａｂ’は、全抗体をペプシンで処理した後に還元して完全な軽鎖と重鎖の一部とを生じさせることによって得ることのできる、抗体分子の断片であり；１つの抗体分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、後の還元を伴うことなく全抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる、抗体の断片であり；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって繋ぎ合わさった２つのＦａｂ’断片の二量体である；（４）Ｆｖは、２本の鎖として発現された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子操作された断片として定義される；（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝学的に融合された一本鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーで連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する、遺伝子操作された分子である；（６）ＣＤＲペプチドは、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである；そして（７）単一ドメイン抗体（ナノボディとも呼ばれる）は、特定抗原に結合する遺伝子操作された単一の単量体型可変抗体ドメインである。ナノボディは分子量がたった１２〜１５ｋＤａしかなく、それは通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さい。
【０１１８】
本明細書中で使用する「抗体重鎖」は、天然に生じる配座において全ての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
【０１１９】
本明細書中で使用する「抗体軽鎖」は、天然に生じる配座において全ての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖は、２つの主な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１２０】
本明細書中で使用する「合成抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて生み出された抗体、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現された抗体を意味する。当該用語はまた、抗体をコードしており抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子の合成によって生み出された抗体、または当該抗体を規定しているアミノ酸配列を意味するとも解釈されるべきでもあり、ここで、当該ＤＮＡまたは当該アミノ酸配列は、当該技術分野において利用可能かつ周知であるＤＮＡ合成技術またはアミノ酸配列合成技術を用いて得られたものである。
【０１２１】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を作る方法は、当該技術分野において周知である（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８８を参照されたい）。
【０１２２】
本発明に係る抗体断片は、抗体のタンパク質分解的加水分解、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物またはその他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。抗原断片は、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパインによる消化によって得ることができる。例えば、ペプシンによる抗体の酵素的開裂によって抗体断片を生じさせることができ、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓ断片が得られる。この断片は、チオール還元剤を使用して、場合によってはジスルフィド結合の開裂により生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用して、さらに開裂させることができ、３．５ＳＦａｂ’一価断片が得られる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的開裂は２つの一価Ｆａｂ’断片と１つのＦｃ断片とを直接生じさせる。これらの方法は例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号ならびにそれらの中の参考文献に記載されており、当該特許は参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９）］も参照されたい。完全な抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、抗体を開裂させるその他の方法、例えば、重鎖を分離して一価軽重鎖断片を形成すること、断片のさらなる開裂、またはその他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技法を用いてもよい。
【０１２３】
Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との会合物を含む。この会合物は、Ｉｎｂａｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、６９：２６５９−６２（１９７２０］に記載されているように、非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合で連結するかまたはグルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋することができる。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーで連結されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドで連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。その構造遺伝子を発現ベクターの中に挿入し、次いでそれを大腸菌などの宿主細胞の中に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインに架橋するリンカーペプチドを有する一本のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えば、［ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７−１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１−７７（１９９３）；ならびに、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，９４６，７７８号］に記載されている。
【０１２４】
ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメーラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙの［Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６−１０  （１９９１）］を参照されたい。
【０１２５】
ひとたび抗体のＣＤＲが同定されれば、従来の遺伝子工学技法を用いて、本明細書に記載の抗体のいずれかの形態または断片をコードする発現可能なポリヌクレオチドを合成することおよび様々な関連生成物を生成するために多数あるうちの１つの方法で改変することができる。
【０１２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤＲは、抗原に特異的に結合するαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する。
【０１２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤＲは、抗原に特異的に結合するγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する。
【０１２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤＲは、抗原に特異的に結合する、（本明細書において上に詳しく述べた）操作された親和性増強型のαβＴ細胞受容体またはγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤＲは、抗原に特異的に結合する、向上した安定性またはその他の任意の生物物理学的特性を有する操作されたαβＴ細胞受容体またはγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する。
【０１３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤＲは、抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗体に由来する。ＴＣＲＬおよびそれを生み出す方法の例は、国際公開第０３／０６８２０１号、第２００８／１２０２０３号、第２０１２／００７９５０号、第２００９１２５３９５号、第２００９／１２５３９４号に記載されており、それらの各々は全て本明細書に完全に組み込まれる。
【０１３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子を含む。
【０１３２】
細胞質ドメイン
本発明のＣＡＲ分子の細胞質ドメイン（「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュール」とも呼ばれる）は、ＣＡＲの配置された細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。
【０１３３】
大抵は細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの切り詰めた部分を使用する限りにおいて、そのような切り詰めた部分は、それがエフェクター機能シグナルを変換する限り完全鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを変換するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切り詰めた部分を包含することが意図される。
【０１３４】
本発明のＣＡＲ分子に使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列、および共同で作用して抗原受容体係合後にシグナル変換を開始する共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の派生体または変異型、ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
【０１３５】
ＴＣＲ単独によって生じたシグナルはＴ細胞の完全な活性化のために不十分であり、第二次または共刺激性のシグナルも必要であるということが知られている。それゆえ、Ｔ細胞活性化は、２つの別個の部類の細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲによって抗原依存性の第一次活性化を開始するもの（第一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原非依存的な様式で作用して第二次または共刺激性のシグナルを供給するもの（第二次細胞質シグナル伝達配列）とによって媒介されることができる。
【０１３６】
第一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の第一次活性化を刺激するように調節するかあるいは阻害するように調節する。刺激するように作用する第一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１３７】
本発明において特に使用される第一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、例えば、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本発明のＣＡＲにおいて細胞質シグナル伝達配列は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
【０１３８】
好ましい実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含むように、または本発明のＣＡＲとの関連において有用な他の任意の望ましい（１つ以上の）細胞質ドメインと組み合わされるように、設計されることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分と共刺激シグナル伝達領域とを含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそれらの抗原とは別の、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要な細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。したがって、本発明では共刺激シグナル伝達エレメントとして主に４−１ＢＢを例示しているが、その他の共刺激エレメントは本発明の範囲内である。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域とゼータ鎖部分とを含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲ分子の一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそれらの抗原とは別の、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要な細胞表面分子である。
【０１４０】
「共刺激リガンド」には、当該用語が本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合してそれにより、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを載せたＭＨＣ分子との結合によって供給される第一次シグナルに加えてＴ細胞応答（限定されないが例えば、増殖、活性化、分化など）を媒介するシグナルをもたらす、抗原提示細胞［例えば、ａＡＰＣ（人工抗原提示細胞）、樹状細胞、Ｂ細胞など］上の分子が含まれる。共刺激リガンドとしては、限定されないが例えば、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドはまた、数ある中でも、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子（限定されないが例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド）に特異的に結合する抗体を包含する。
【０１４１】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドに特異的に結合してそれによってＴ細胞による共刺激応答（限定されないが例えば、増殖）を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。
【０１４２】
「共刺激シグナル」とは、本明細書中で使用する場合、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの第一次シグナルと組み合わさってＴ細胞増殖および／または重要分子の上方制御もしくは下方制御を引き起こすシグナルを指す。
【０１４３】
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合によって誘導されてそれによりシグナル変換事象（限定されないが例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル変換）を媒介する、一次応答を意味する。刺激は、特定分子の発現の変更、例えば、ＴＧＦ−βの下方制御および／または細胞骨格構造の再構築などを媒介することができる。
【０１４４】
「刺激分子」は、当該用語が本明細書中で使用される場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドに特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【０１４５】
本明細書中で使用する「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在するときにＴ細胞上の同族結合パートナー（本明細書中では「刺激分子」と呼ばれる）に特異的に結合することができてそれによってＴ細胞による一次応答（限定されないが例えば、免疫応答の活性化、開始、増殖など）を媒介することができる、リガンドを意味する。刺激リガンドは当該技術分野において周知であり、数ある中でも、ペプチドを載せたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【０１４６】
細胞質ドメインに関して、本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子は、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを単独で含むように、または本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子との関連において有用な他の任意の望ましい（１つ以上の）細胞質ドメインと組み合わされるように、設計されることができる。一実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計されることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインとしては、限定はされないが例えば、ＣＤ３−ゼータ、４−１ＢＢおよびＣＤ２８のシグナル伝達モジュールならびにそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ（ＣＤ２４７、ＣＤ３ｚ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＤＡＰ１０、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）、およびＬｓｋから構成される群から選択されるポリペプチドのうちの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、例えば少なくとも６つを含む。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ鎖［「ＣＤ３−ＺＥＴＡ」および「ＣＤ３ｚ」としても知られるＣＤ２４７分子；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００７２５．１およびＮＰ＿９３２１７０．１］を含み、それは内因性ＴＣＲからのシグナルの第一次伝達物質である。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、Ｔ細胞に追加のシグナルを供給するためにＣＡＲの細胞質尾部に様々な共刺激タンパク質受容体を含む（「第二世代」ＣＡＲ）。例としては、限定されないが、ＣＤ２８［例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２３０００６．１、ＮＰ＿００１２３０００７．１、ＮＰ＿００６１３０．１］、４−１ＢＢ［「ＣＤ１３７」としても知られる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２］、ＩＣＯＳ［誘導性Ｔ細胞共刺激分子、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６２２４．１］、ＤＡＰ１０［造血細胞シグナル変換物質、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１００７４７０、ＮＰ＿０５５０８１．１］およびＬｓｋ［ＬＣＫ原癌遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０３６２３６．１、ＮＰ＿００５３４７．３］が挙げられる。前臨床研究から、「第二世代のＣＡＲ設計がＴ細胞の抗腫瘍活性を向上させることが指し示された。
【０１５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、効力をさらに増大させるために多数のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４−１ＢＢまたはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０を含む。「ＯＸ４０」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３３１８．１を指す（「第３世代」ＣＡＲ）。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ｚを含む。「ＣＤ１３７」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２を指す。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）を含む。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲはＣＤ３ゼータ鎖を含む。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０から構成される群から選択される少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０から構成される群から選択される少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。
【０１５６】
膜貫通ドメイン
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し（つまり、それらの（１つ以上の）膜貫通領域を少なくとも含み）得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの、主として疎水性である残基を含むであろう。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。
【０１５７】
場合により、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは長さ２〜１０アミノ酸のものが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成し得る。グリシン−セリンの対は特に好適なリンカーを提供する。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子内に含まれる膜貫通ドメインは、ＣＡＲ内のドメインの１つと自然に会合する膜貫通ドメインである。本発明のいくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるべく、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを回避するために、アミノ酸置換によって選択または改変されることができる。
【０１５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインはＣＤ８αヒンジドメインである。
【０１６０】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ分子の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲ分子の細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインが組み込まれていてもよい。本明細書中で使用する「スペーサードメイン」という用語は、通常、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメインかまたは細胞質ドメインかのどちらか一方に連結する機能をする任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、３００アミノ酸まで、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含み得る。
【０１６１】
既に述べたように、本発明の細胞の細胞表面受容体（例えば、ｔｇ−ＴＣＲおよび／またはＣＡＲ）は、抗原（例えば、標的細胞）に結合する。
【０１６２】
一実施形態によれば、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原、アレルギー関連抗原および／または自己免疫抗原を含み得る。
【０１６３】
本明細書中で使用する場合、「腫瘍抗原」という語句は、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性の免疫応答を誘発する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、治療される癌の詳しい種類に依存するであろう。
【０１６４】
一実施形態によれば、腫瘍抗原は固体腫瘍に関連する。
【０１６５】
一実施形態によれば、腫瘍抗原は血液悪性腫瘍に関連する。
【０１６６】
本発明において言及する腫瘍抗原の種類には、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が含まれる。「ＴＳＡ」とは、腫瘍細胞に特有でありかつ体内の他の細胞には存在しないタンパク質抗原またはポリペプチド抗原を指す。「ＴＡＡ」は、腫瘍細胞によって発現されるタンパク質抗原またはポリペプチド抗原を指す。例えば、ＴＡＡは、腫瘍細胞の１つ以上の表面タンパク質もしくはポリペプチド、核タンパク質、または糖タンパク質、またはその断片であり得る。
【０１６７】
本明細書において述べる抗原は、単なる例として挙げられている。この列挙は排他的なものではなく、さらなる例は当業者であればすぐに分かるであろう。
【０１６８】
腫瘍抗原は当該技術分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ−ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫抗原１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメソテリンが挙げられる。
【０１６９】
これらの分子には、組織特異抗原、例えば、メラノーマでのＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、ならびに前立腺癌での前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。その他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子のグループに属する。もう１つのグループの標的抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児性の抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有である真性腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７のようなＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、成功例が限られているがモノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されてきた。
【０１７０】
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、例えば以下のものが挙げられる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および腫瘍特異的多系統抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過剰発現した胎児性抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現した癌遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する独特の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。その他の大きなタンパク質系抗原としては、例えば、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトタンパク質、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ  ２７．２９１＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合性タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが挙げられる。
【０１７１】
腫瘍抗原のさらなる例としては、限定されないが例えば、Ａ３３、ＢＡＧＥ、Ｂｃｌ−２、β−カテニン、ＣＡｌ２５、ＣＡ１９−９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳ−１、サイクリンＢ１、ＤＡＧＥ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦＲ、エフリンＢ２、エストロゲン受容体、ＦＡＰ、フェリチン、葉酸結合タンパク質、ＧＡＧＥ、Ｇ２５０、ＧＤ−２、ＧＭ２、ｇｐ７５、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、Ｋｉ−６７、ＬＲＰ、メソテリン、ｐ５３およびＰＲＡＭＥが挙げられる。さらなる腫瘍抗原は、参照によって本明細書に組み込まれるｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ  Ｖ、Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｎ、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  Ｂ．、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ（２０１３）、ｗｗｗ（ドット）ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ（ドット）ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／に提供されている。
【０１７２】
具体的な実施形態によれば、腫瘍抗原としては、限定されないが例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＧＤ−２、ｇｐ１００、ｐ５３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３などが挙げられる。
【０１７３】
一実施形態によれば、標的抗原はＣＤ１９である。
【０１７４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原は、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＴＡＸ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（Ａｄｖ）、風邪ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、単純ヘルペス、日本脳炎、麻疹、ポリオ、狂犬病、呼吸器合胞体、風疹、天然痘、帯状疱疹、ロタウイルス、西ナイルウイルス、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルス）および／またはジカウイルスなどの任意のウイルスに由来するものであり得る。
【０１７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ウイルス抗原としては、限定されないが例えば、Ｉ型ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１）転写因子（ＴＡＸ）、インフルエンザマトリックスタンパク質エピトープ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のエピトープ、ＨＩＶ−１  ＲＴ、ＨＩＶ  Ｇａｇ、ＨＩＶ  Ｐｏｌ、インフルエンザ膜タンパク質Ｍ１、インフルエンザヘマグルチニン、インフルエンザノイラミニダーゼ、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザマトリックスタンパク質（Ｍ１）、インフルエンザイオンチャンネル（Ｍ２）、インフルエンザ非構造タンパク質ＮＳ−１、インフルエンザ非構造タンパク質ＮＳ−２、インフルエンザＰＡ、インフルエンザＰＢ１、インフルエンザＰＢ２、インフルエンザＢＭ２タンパク質、インフルエンザＮＢタンパク質、インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リン酸化マトリックスタンパク質（ｐｐ６５）、ＴＡＸ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＢＶｐｒｅ−Ｓタンパク質８５−６６、ＨＴＬＶ−１  ｔａｘ１１−１９、ＨＢＶ表面抗原１８５−１９４から構成される群から選択されるポリペプチドに由来するウイルスエピトープが挙げられる。
【０１７６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原は細菌抗原である。細菌抗原は、限定されないが例えば、炭疽菌；グラム陰性桿菌、クラミジア、ジフテリア、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、マラリア、結核菌、百日咳毒素、肺炎球菌、リケッチア、ブドウ球菌、連鎖球菌および破傷風などの任意の細菌に由来するものであり得る。
【０１７７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌抗原としては、限定されないが例えば、炭疽菌抗原、限定されないが例えば炭疽菌保護抗原；グラム陰性桿菌抗原、限定されないが例えばリポ多糖；インフルエンザ菌抗原、限定されないが例えば莢膜多糖；ジフテリア抗原、限定されないが例えばジフテリア毒素；結核菌抗原、限定されないが例えば、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａの主要な分泌タンパク質および抗原８５Ａ；百日咳毒素抗原、限定されないが例えば、ヘマグルチニン、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３およびアデニル酸シクラーゼ；肺炎球菌抗原、限定されないが例えばニューモリシンおよび肺炎球菌莢膜多糖；リケッチア抗原、限定されないが例えばｒｏｍｐＡ；連鎖球菌抗原、限定されないが例えばＭタンパク質；破傷風抗原、限定されないが例えば破傷風毒素が挙げられる。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原はスーパーバグ抗原（例えば、多剤耐性細菌）である。スーパーバグの例としては、限定されないが、エンテロコッカス・フェシウム、クロストリジウム・ディフィシレ、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌および腸内細菌科（大腸菌、肺炎桿菌、腸内細菌属を含む）が挙げられる。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原は真菌抗原である。真菌の例としては、カンジダ、コクシジオデス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、リーシュマニア、マラリア原虫、原生動物、寄生虫、住血吸虫、白癬、トキソプラズマおよびクルーズトリパノソーマが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、真菌抗原としては、限定されないが例えば、コクシジオデス抗原、限定されないが例えば小球抗原；クリプトコッカス抗原、限定されないが例えば莢膜多糖；ヒストプラズマ抗原、限定されないが例えば熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）；リーシュマニア抗原、限定されないが例えばｇｐ６３およびリポホスホグリカン；熱帯熱マラリア原虫、限定されないが例えば、分裂小体表面抗原、胞子小体表面抗原、スポロゾイト周囲タンパク抗原、生殖母体／配偶子表面抗原、原虫性およびその他の寄生虫性の抗原、例えば血液段階抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ；住血吸虫抗原、限定されないが例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびパラミオシン；白癬菌抗原、限定されないが例えばトリコフィチン；トキソプラズマ抗原、限定されないが例えばＳＡＧ−１およびｐ３０；ならびにクルーズトリパノソーマ抗原、限定されないが例えば７５−７７ｋＤａ抗原および５６ｋＤａ抗原が挙げられる。
【０１８１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原は、アレルギー症状に関連する細胞によって発現される抗原である。アレルギー抗原の例としては、限定されないが例えば、花粉抗原、例えば、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ドクムギ花粉抗原、動物由来抗原（例えば、チリダニ抗原およびネコ抗原）、組織適合性抗原、およびペニシリン、ならびにその他の治療薬が挙げられる。
【０１８２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原は、自己免疫疾患に関連する自己抗原である。
【０１８３】
本明細書中で使用する「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答から生じる疾患として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切な過剰応答の結果である。
【０１８４】
自己免疫疾患の例としては、限定されないが、数ある中でも、アジソン病、脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、セリアック病、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、Ｉ型糖尿病、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、ウェゲナー肉芽腫症、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑、粘液浮腫、貧血、喘息、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、および脳卒中が挙げられる。
【０１８５】
本明細書中で使用する「自己抗原性ペプチド」という語句は、内因性タンパク質（すなわち、自己タンパク質）または摂取タンパク質（例えば、食物によるもの）に由来する抗原であって、それに対する炎症応答を自己免疫性炎症応答の一部として誘発する抗原を指す。
【０１８６】
「内因性」、「自己」という語句は、自己免疫応答が誘発された個体に言及する相対的な表現であることに留意すべきである。
【０１８７】
自己抗原としては、限定されないが例えば、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質（細胞表面受容体を含む）が挙げられる。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己抗原性ペプチドは、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病および脳卒中から構成される群から選択される疾患に関連する。
【０１８９】
多発性硬化症自己抗原には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）などのミエリンタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
関節リウマチ関連自己抗原には、コラーゲンＩＩ（ＣＯＬ２Ａ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ１）、アグリカンコアタンパク質前駆体（ＡＣＡＮ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１６（ＭＭＰ１６）、テネイシン（ＴＮＸＢ）および異種核リボ核タンパク質Ａ２（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１）に由来する自己抗原性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９１】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）自己抗原には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）およびベータ細胞自己抗原性ペプチドを含めた、膵島で発現される抗原が含まれるが、これに限定されない。
【０１９２】
セリアック（腹腔）自己抗原としては、グリアジン（例えば、アルファグリアジン、ガンマグリアジン）および熱ショックタンパク質２０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
クローン病、潰瘍性大腸炎または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の自己抗原としては、ＦＡＭ８４Ａ、顆粒膜糖タンパク質２（ＧＰ２）、ＣＵＢおよび透明帯様ドメイン１（ＣＵＺＤ１）、補体Ｃ３、カタラーゼおよびアルファ−エノラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、脳卒中関連自己抗原には、ミエリン塩基性タンパク質、神経フィラメントおよびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＭＯＧ−３５−５５）のＮＲ２Ａ／２Ｂサブタイプなどの脳抗原に由来する自己抗原性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離細胞を生じさせる方法が提供され、当該方法は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体をコードしているポリヌクレオチドで、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する細胞を変換することを含み、当該細胞は、寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものである。
【０１９６】
一実施形態によれば、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有し、寛容誘導細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができる細胞は、抗第三者細胞である。
【０１９７】
本明細書中で使用する「抗第三者細胞」という語句は、１つ以上の第三者抗原に対して差し向けられる（つまり、Ｔ細胞認識によって差し向けられる）リンパ球（すなわち、Ｔリンパ球）を指す。
【０１９８】
本明細書中で使用する「１つ以上の第三者抗原」という語句は、以下に詳細に示すように、提供者にも受容者にも存在していない可溶性または不溶性（例えば膜結合性）の１つ以上の抗原を指す。
【０１９９】
例えば、第三者抗原は、第三者の細胞、細胞抗原（例えば細胞表面抗原）、ウイルスの抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）もしくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の抗原（すなわちウイルス抗原）、または細菌の抗原（すなわち細菌抗原）、例えばフラジェリンであることができる。ウイルス抗原または細菌抗原は、それに感染しているかさもなければウイルスタンパク質／細菌タンパク質を発現させられた細胞（例えば、細胞株）によって提示されることができる。
【０２００】
自家もしくは非自家の抗原提示細胞、または人工運搬体もしくは人工抗原提示細胞は、それに融合または搭載された短い合成ペプチドを提示するため、またはタンパク質抽出物もしくは精製タンパク質を提示するために、使用されることができる。そのような短いペプチド、タンパク質抽出物または精製タンパク質は、ウイルスもしくは細菌に由来するペプチドであってもよいし、他のいかなる抗原を表すペプチドであってもよい。
【０２０１】
専用ソフトウェアを使用してウイルス配列またはその他の配列を解析し、免疫原性短鎖ペプチド、すなわち、クラスＩのＭＨＣまたはクラスＩＩのＭＨＣとの関連で提示可能であるペプチドを同定することができる。
【０２０２】
第三者細胞は、受容者に関して同種異系であるかまたは異種であるかのどちらか一方とすることができる（以下にさらに詳しく説明する）。同種異系の第三者細胞の場合、第三者細胞に対して作り出された抗第三者細胞が移植片または受容者抗原に対して反応性でないように、第三者細胞は、提供者のＨＬＡ抗原とは異なるがしかし受容者ＨＬＡ抗原と交差反応性ではないＨＬＡ抗原を有する。
【０２０３】
本発明の一実施形態によれば、同種異系または異種の第三者細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、脾臓またはリンパ節から精製された細胞、サイトカインによって動員されたＰＢＬ、試験管内で増殖させた抗原提示細胞（ＡＰＣ）、試験管内で増殖させた樹状細胞（ＤＣ）、および人工抗原提示細胞から構成される群から選択される、刺激細胞である。
【０２０４】
本発明の人工ＡＰＣは、外来ペプチドを投与されなくとも第三者ペプチドまたは第三者ＭＨＣと共に自家ＭＨＣを呈するように、操作され得る。したがって、一実施形態によれば、人工ＡＰＣは、第三者ＭＨＣ決定基および共刺激分子でトランスフェクトされたＫ５６２腫瘍細胞［以前に例えばＳｕｈｏｓｋｉ  ＭＭら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２００７）１５（５）：９８１−８に記載されたとおり］または、上記と同じくトランスフェクトされた線維芽細胞を含む。
【０２０５】
第三者抗原は、細胞、ウイルスもしくは細菌の表面上に提示されること、またはそこから誘導および／もしくは精製されることができる。さらに、ウイルス性または細菌性の抗原は感染細胞上に提示されることができ、細胞性抗原は、リポソームなどの人工運搬体上または人工抗原提示細胞（例えば、１つ以上の第三者抗原でトランスフェクトされた白血病細胞株または線維芽細胞株）上に提示されることができる。
【０２０６】
第三者抗原はさらに、自家提示細胞もしくは非自家提示細胞によって提示されるかまたは人工運搬体上もしくは人工抗原提示細胞上に提示される、合成ペプチドを含み得る。
【０２０７】
さらに、第三者抗原は、例えば、様々な供給源から抽出または精製されたタンパク質であることができる。本発明による第三者抗原として働くことができる精製タンパク質の例はオボアルブミンである。その他の例も想定される。
【０２０８】
細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、ウイルスペプチド提示細胞または細菌ペプチド提示細胞を第三者抗原として利用することは特に有益である、というのも、そのような第三者抗原は多種多様な抗原決定基を含み、それゆえ多様な母集団の抗第三者細胞の形成を導き、それがさらに、Ｔ細胞のより速やかな再構築を必要とする場合（例えば、致死的もしくは亜致死的な照射または化学療法手順の後）にそのような再構築の役に立ち得るからである。
【０２０９】
さらに、抗第三者細胞を第三者抗原に対して差し向ける場合、その細胞に抗疾患活性を付与する。「抗疾患活性」という用語は、Ｔｃｍ細胞の罹患細胞に対する活性（例えば殺傷能力）を指す（例えば癌細胞、例えば、移植片対白血病すなわちＧＶＬの活性）。この活性は、典型的には、ＬＦＡ１−Ｉ／ＣＡＭ１結合によって媒介されるＴＣＲ非依存的殺傷に起因するものである［Ａｒｄｉｔｔｉら、Ｂｌｏｏｄ（２００５）１０５（８）：３３６５−７１．Ｅｐｕｂ  ２００４年７月６日］。
【０２１０】
一実施形態によれば、第三者細胞は樹状細胞を含む。
【０２１１】
一実施形態によれば、第三者細胞は成熟樹状細胞を含む。
【０２１２】
Ｔｃｍ細胞を誘導するための刺激細胞として使用され得る第三者樹状細胞を生じさせる方法は、当技術分野で周知である。したがって、非限定的な例として、第三者非同系細胞提供者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が取得され得る［例えば、Ｔｃｍ細胞が同系、例えば自家である場合、樹状細胞（ＤＣ）は被験体に関して非同系、例えば、同種異系であってもよく；他方、Ｔｃｍ細胞が非同系、例えば同種異系である場合、ＤＣは、ＨＬＡが被験体ともＴｃｍ細胞とも一致しない非同系、例えば同種異系の提供者から選択される］。次いで、単球が、プラスチック接着によって単離され得、ヒト血清（例えば、１％ヒト血清）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＧＭ−ＣＳＦ（例えば、８００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＣ細胞培地（例えば、Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ培地）（例えば、ドイツ、ハンブルグのＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手可能）を使用して培養され得る。約２４〜７２時間（例えば４８時間）培養した後に、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば１６００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（例えば２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＣ培地を添加してもよい。１２〜３６時間（例えば２４時間）後に非付着性細胞が採集され得、大きい細胞（ほとんどが未熟ＤＣ）が、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば、８００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−４（例えば２０ｎｇ／ｍｌ）、（例えば、１０ｎｇ／ｍｌで、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来の）ＬＰＳ、およびＩＦＮγ（例えば、１００ＩＵ／ｍｌ）（例えば、ドイツ、ハンブルグのＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手可能）を含有する新鮮な培地中に再懸濁され得、播種および一晩のインキュベートがなされ得る。翌日、非付着性細胞が破棄され得、付着性のＤＣが、氷上で約１５〜３０分間（例えば、２０分間）インキュベートされた後に例えば冷ＰＢＳ／１％ＨＳを使用して穏やかに取り外され得、それにより、成熟ＤＣから構成される大きい細胞が得られる。
【０２１３】
一実施形態によれば、第三者細胞は、照射された樹状細胞を含む。
【０２１４】
例えば、一実施形態によれば、ＤＣは約５〜１０Ｇｙ、約１０〜２０Ｇｙ、約２０〜３０Ｇｙ、約２０〜４０Ｇｙ、約２０〜５０Ｇｙ、約１０〜５０Ｇｙで照射される。具体的な実施形態によれば、ＤＣは、約１０〜５０Ｇｙ（例えば、３０Ｇｙ）で照射される。
【０２１５】
国際公開第２０１０／０４９９３５号パンフレット、第２０１２／０３２５２６号パンフレットおよび第２０１３／０３５０９９号パンフレット（それらは参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている、抗第三者Ｔｃｍ細胞を生成するいかなる方法も、本発明に従って用いることができる。
【０２１６】
一実施形態によれば、Ｔｃｍ表現型を有する抗第三者細胞を生成することは、（ａ）抗原反応性細胞の富化を可能にすべくＩＬ−２１の存在下または非存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１つ以上の第三者抗原と接触させること；ならびに（ｂ）中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にすべく、ステップ（ａ）の結果として生じる細胞を抗原不含環境中でＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で培養することを含む、方法によって行われ得る。
【０２１７】
一実施形態によれば、ステップ（ａ）においてＰＢＭＣをＩＬ−２１の非存在下で１つ以上の第三者抗原と接触させる。
【０２１８】
一実施形態によれば、ステップ（ａ）においてＰＢＭＣをＩＬ−２１の存在下で１つ以上の第三者抗原と接触させる。
【０２１９】
一実施形態によれば、ステップ（ａ）から得られた細胞を抗原不含環境中でＩＬ−１５のみの存在下で培養する。場合によってＩＬ−２１および／またはＩＬ−７を添加してもよい。
【０２２０】
本発明の抗第三者Ｔｃｍ細胞は、典型的には、最初に、ＩＬ−２１を補充した培養物中（例えば、それ以外のサイトカインを含まない、つまり追加のサイトカインを全く添加しない培養物中）で同系（例えば、自家）または非同系（例えば、以下にさらに詳しく説明するように、非自家、例えば、同種異系または異種）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を（例えば上記のような）１つ以上の第三者抗原と接触させることによって生じる。このステップは、典型的には、約１２〜２４時間、約１２〜３６時間、約１２〜７２時間、２４〜４８時間、２４〜３６時間、約２４〜７２時間、約４８〜７２時間、１〜２日間、２〜３日間、１〜３日間、２〜４日間、１〜５日間、２〜５日間、２〜６日間、１〜７日間、５〜７日間、２〜８日間、８〜１０日間または１〜１０日間に亘って行われ、抗原反応性細胞の富化を可能にする。
【０２２１】
具体的な実施形態によれば、ＩＬ−２１を補充した培養物（それ以外のサイトカインを含まない培養物）中で同系または非同系のＰＢＭＣを（上記のような）１つ以上の第三者抗原と接触させることを、１〜５日間（例えば３日間）に亘って成し遂げる。
【０２２２】
ＩＬ−２１を補充した培養物中で同系または非同系ＰＢＭＣを（上記のような）１つ以上の第三者抗原と接触させることは、典型的には、約０．００１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜３０００ＩＵ／ｍｌ  ０．１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．００１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、５００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、７５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜５００ＩＵ／ｍｌ、５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜５００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜２５０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１００ＩＵ／ｍｌ、３０〜１００ＩＵ／ｍｌ、５０〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜５０ＩＵ／ｍｌ、１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、２０〜５０ＩＵ／ｍｌ、３０〜５０ＩＵ／ｍｌ、１〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０ＩＵ／ｍｌ、２０〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜２０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌ、または１〜１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２１の存在下で行われる。
【０２２３】
具体的な実施形態によれば、ＩＬ−２１の濃度は５０〜１５０ＩＵ／ｍｌ（例えば１００ＩＵ／ｍｌ）である。
【０２２４】
具体的な実施形態によれば、同系または非同系のＰＢＭＣを１つ以上の第三者抗原と接触させることは、サイトカイン不含の（つまりＩＬ−２１のみを補充した）培養物中で成し遂げられ、そのような培養条件は、１つ以上の第三者抗原による刺激および活性化を受ける細胞（つまり、抗原反応性細胞）のみの生存および富化を可能にする、というのも、これらの細胞はそれらの生存を可能にするサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を分泌するからである（残りの細胞は全てこれらの培養条件下で死滅する）。
【０２２５】
ＰＢＭＣに対する１つ以上の第三者抗原（例えば、樹状細胞）の比は、典型的には、約１：２〜約１：１０、例えば、約１：４、約１：６、約１：８または約１：１０である。
【０２２６】
具体的な実施形態によれば、ＰＢＭＣに対する１つ以上の第三者抗原（例えば、樹状細胞）の比率は、約１：２〜約１：８（例えば、１：５）である。
【０２２７】
次に、Ｔｃｍ表現型を含む細胞の増殖を可能にするために抗第三者細胞を、抗原不含環境中でＩＬ−２１、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下培養する。このステップは、典型的には、約１２〜２４時間、約１２〜３６時間、約１２〜７２時間、２４〜４８時間、２４〜３６時間、約２４〜７２時間、約４８〜７２時間、１〜２０日間、１〜１５日間、１〜１０日間、１〜５日間、５〜２０日間、５〜１５日間、５〜１０日間、１〜２日間、２〜３日間、１〜３日間、２〜４日間、２〜５日間、２〜８日間、２〜１０日間、４〜１０日間、４〜８日間、６〜８日間、８〜１０日間、７〜９日間、７〜１１日間、７〜１３日間、７〜１５日間、１０〜１２日間、１０〜１４日間、１２〜１４日間、１４〜１６日間、１４〜１８日間、１６〜１８日間または１８〜２０日間に亘って行われる。具体的な実施形態によれば、抗第三者細胞は、抗原不含環境中でＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で約７〜１１日間（例えば、８日間）に亘って培養される。
【０２２８】
このステップは、典型的には、ＩＬ−２１が約０．００１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．００１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、５００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、７５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜５００ＩＵ／ｍｌ、５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜５００ＩＵ／ｍｌ  ２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜２５０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１００ＩＵ／ｍｌ、３０〜１００ＩＵ／ｍｌ、５０〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜５０ＩＵ／ｍｌ、１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、２０〜５０ＩＵ／ｍｌ、３０〜５０ＩＵ／ｍｌ、１〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０ＩＵ／ｍｌ、２０〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜２０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌ、または１〜１０ＩＵ／ｍｌの濃度であるＩＬ−２１の存在下で行われる。
【０２２９】
具体的な実施形態によれば、ＩＬ−２１の濃度は５０〜１５０ＩＵ／ｍｌ（例えば、１００ＩＵ／ｍｌ）である。
【０２３０】
このステップはさらに、ＩＬ−１５が約０．００１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１２５〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．００１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１２５〜１０００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、５００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、７５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜５００ＩＵ／ｍｌ、５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜５００ＩＵ／ｍｌ、１２５〜５００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１２５〜２５０ＩＵ／ｍｌ、１００〜２５０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１００ＩＵ／ｍｌ、３０〜１００ＩＵ／ｍｌ、５０〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜５０ＩＵ／ｍｌ、１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、２０〜５０ＩＵ／ｍｌ、３０〜５０ＩＵ／ｍｌ、１〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０ＩＵ／ｍｌ、２０〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜２０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌ、または１〜１０ＩＵ／ｍｌの濃度であるＩＬ−１５の存在下で行われる。具体的な実施形態によれば、ＩＬ−１５の濃度は１００〜１５０ＩＵ／ｍｌ（例えば、１２５ＩＵ／ｍｌ）である。
【０２３１】
このステップはさらに、ＩＬ−７が約０．００１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０００ＩＵ／ｍｌ、３０〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、１０００〜３０００ＩＵ／ｍｌ、０．００１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．０１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、３０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、５００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、７５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１０〜５００ＩＵ／ｍｌ、３０〜５００ＩＵ／ｍｌ、５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜５００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜２５０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜１００ＩＵ／ｍｌ、１０〜１００ＩＵ／ｍｌ、３０〜１００ＩＵ／ｍｌ、５０〜１００ＩＵ／ｍｌ、１〜５０ＩＵ／ｍｌ、１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、２０〜５０ＩＵ／ｍｌ、３０〜５０ＩＵ／ｍｌ、１〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜３０ＩＵ／ｍｌ、２０〜３０ＩＵ／ｍｌ、１０〜２０ＩＵ／ｍｌ、０．１〜１０ＩＵ／ｍｌ、または１〜１０ＩＵ／ｍｌの濃度であるＩＬ−７の存在下で行われる。具体的な実施形態によれば、ＩＬ−７の濃度は１０〜５０ＩＵ／ｍｌ（３０ＩＵ／ｍｌ）である。
【０２３２】
本発明者らは、精励した実験およびスクリーニングを通じて、移植片対宿主（ＧＶＨ）反応性細胞を欠きかつ／または抗疾患（例えば、ＧＶＬ）反応性細胞が増強されている中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む抗第三者細胞の増殖を向上させるために利用され得る数多くの基準を収集した。
【０２３３】
一実施形態によれば、ＩＬ−２１の存在下で１つ以上の第三者抗原と接触させる前に、ＰＢＭＣから付着性細胞を除去する。
【０２３４】
一実施形態によれば、ＩＬ−２１の存在下で１つ以上の第三者抗原と接触させる前に、ＰＢＭＣからＣＤ４＋および／またはＣＤ５６＋細胞を除去する。
【０２３５】
一実施形態によれば、ＩＬ−２１の存在下で１つ以上の第三者抗原と接触させる前に、ＰＢＭＣからＣＤ４５ＲＡ＋細胞を選抜する。
【０２３６】
ＣＤ４＋および／またはＣＤ５６＋細胞の除去は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、例えば、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕捉ＥＬＩＳＡ標識の使用など）によって行われ得る。そのようなステップは、培養内のＣＤ８＋細胞の純度を高めるため（つまり、細胞培養物中の他のリンパ球、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＮＫ細胞を排除するため）、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させるために、有益であり得る。
【０２３７】
一実施形態によれば、ＰＢＭＣは、非付着性細胞を含む。
【０２３８】
一実施形態によれば、ＰＢＭＣはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【０２３９】
一実施形態によれば、ＰＢＭＣはナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【０２４０】
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の選抜は、ＣＤ４５ＲＡ＋を発現している細胞および／またはＣＤ４５ＲＯ−を発現している細胞の選抜によって成し遂げられ得、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、例えば親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕捉ＥＬＩＳＡ標識の使用など）によって、行われ得る。
【０２４１】
一実施形態によれば、ＰＢＭＣはＣＤ４５ＲＡ＋細胞を含む。
【０２４２】
本発明の教示に従って行われ得る付加的なステップには、１つ以上の第三者抗原を取り外す前（つまり、抗原不含環境を作り出す前）にＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下でＰＢＭＣ細胞を１つ以上の第三者抗原と共に培養することが含まれる。
【０２４３】
このステップは、典型的には、約１２〜２４時間、約１２〜３６時間、約１２〜７２時間、２４〜４８時間、２４〜３６時間、約２４〜７２時間、約４８〜７２時間、１〜２日間、２〜３日間、１〜３日間、２〜４日間、１〜５日間または２〜５日間に亘って行われ、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の用量を上記と同じにして成し遂げられる。具体的な実施形態によれば、ＰＢＭＣ細胞をＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で１つ以上の第三者抗原と共に培養することは、１２時間〜４日間（例えば、１〜２日間）に亘って行われる。
【０２４４】
これに加えて、またはこれに代えて、活性細胞の選抜および単離を可能にする追加の２段階プロセスを行ってもよい。そのような選抜ステップは、ＰＢＭＣが被験体に対して非同系である状況において潜在的な宿主反応性Ｔ細胞（例えば、アロ反応性細胞）を除去するのに役立つ（以下にさらに詳しく説明する）。
【０２４５】
このように、活性細胞を単離することを２段階式手法で行ってもよい。第１段階では、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で細胞を培養する前に、活性細胞を選抜する。この第１段階は、典型的には、ＩＬ−２１の存在下でＰＢＭＣを１つ以上の第三者抗原に最初に接触させた後に、行われる。この選抜プロセスは、第三者抗原によって活性化された（例えば、以下に説明するような活性化マーカーを発現する）細胞のみを選び取るものであり、ＰＢＭＣと１つ以上の第三者抗原との最初の接触から典型的には約１２〜２４時間、約２４〜３６時間、約１２〜３６時間、約３６〜４８時間、約１２〜４８時間、約４８〜６０時間、約１２〜６０時間、約６０〜７２時間、約１２〜７２時間、約７２〜８４時間、約１２〜８４時間、約８４〜９６時間、約１２〜９６時間の後に行われる。
【０２４６】
具体的な実施形態によれば、選抜プロセスは、ＰＢＭＣと１つ以上の第三者抗原との最初の接触から約１２〜２４時間（例えば、１４時間）の後に成し遂げられる。
【０２４７】
活性細胞を単離することは、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕捉ＥＬＩＳＡ標識などの使用）によって成し遂げられ得、また、限定されないがＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＦＳＥ、ＣＤ１３７などの細胞表面マーカーまたは、限定されないがＩＦＮ−γおよびＩＬ−２などの非細胞表面マーカーを含む、任意の活性化マーカーを目的として成し遂げられ得る。活性細胞を単離することはまた、当該分野で既知の任意の（例えば、ＦＡＣＳによる）方法を用いる、形態に基づく精製（例えば、大きい細胞の単離）によって成し遂げてもよい。典型的には、活性細胞をＣＤ８＋細胞の発現に関しても選抜する。さらに、活性細胞を効率的に単離するために上記の方法の任意の組み合わせを利用してもよい。
【０２４８】
本発明の一実施形態によれば、活性細胞の選抜は、ＣＤ１３７＋および／またはＣＤ２５＋細胞の選抜によって成し遂げられる。
【０２４９】
第２段階での活性細胞の単離は、典型的には、培養の最後（つまり、抗原不含環境中でＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７と共に培養した後）に行われる。この段階は、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）と照射された宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば樹状細胞）との接触後に活性化された細胞を除去することによって、アロ反応性細胞を除去する。既に述べたように、活性細胞の単離は、親和性に基づく精製（例えば、ＭＡＣＳビーズ、ＦＡＣＳ選別機および／または捕捉ＥＬＩＳＡ標識の使用など）によって成し遂げられ得、また、限定されないがＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＦＳＥ、ＣＤ１３７などの細胞表面マーカーまたは、限定されないがＩＦＮ−γおよびＩＬ−２などの非細胞表面マーカーを含む、任意の活性化マーカーを目的として成し遂げられ得る。
【０２５０】
本発明の一実施形態によれば、アロ反応性細胞を除去することは、ＣＤ１３７＋および／またはＣＤ２５＋細胞の除去および／またはＩＦＮγ捕捉によって成し遂げられる。
【０２５１】
以下は、本発明のいくつかの実施形態に従って用いることができる例示的なプロトコルである。
【０２５２】
本発明の１つの実施形態によれば、中枢性メモリー表現型を有する単離細胞を生じさせる方法であって、当該細胞が寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものであり、当該方法が、（ａ）抗原反応性細胞の富化を可能にすべくＩＬ−２１の存在下で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１つ以上の第三者抗原と（例えば１２時間〜５日間）接触させること、ならびに（ｂ）中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む抗第三者細胞の増殖を可能にすべく、ステップ（ａ）の結果として生じる細胞を抗原不含環境中でＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で（例えば５〜２０日間）培養することを含む、方法が提供される。
【０２５３】
一実施形態によれば、方法はさらに、（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた細胞を単一細胞懸濁液中へと分離させることを含む。
【０２５４】
一実施形態によれば、方法はさらに、ステップ（ａ）の前にＰＢＭＣから付着性細胞を除去するステップを含む。
【０２５５】
一実施形態によれば、方法はさらに、ステップ（ａ）の前にＰＢＭＣからＣＤ４＋および／またはＣＤ５６＋細胞を除去するステップを含む。
【０２５６】
一実施形態によれば、方法はさらに、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に活性細胞を選抜するステップを含む。
【０２５７】
一実施形態によれば、方法はさらに、活性化細胞の選抜をＣＤ１３７＋および／またはＣＤ２５＋細胞の選抜によって成し遂げることを含む。
【０２５８】
本発明の一実施形態によれば、中枢性メモリー表現型を有する単離細胞を生じさせる方法であって、当該細胞が寛容誘導性細胞であり、かつ移植後にリンパ節へ帰巣することができるものであり、当該方法が、（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を得るべく、ＣＤ４＋および／またはＣＤ５６＋細胞を除去することのできる薬剤で非付着性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を処理すること；（ｂ）抗原反応性細胞の富化を可能にすべくＩＬ−２１の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を第三者樹状細胞と（例えば１２時間〜５日間）接触させること；（ｃ）ステップ（ｂ）から得られた細胞をＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で第三者樹状細胞と共に（例えば、１２時間〜３日間）培養すること；ならびに（ｄ）中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を含む細胞の増殖を可能にすべく、ステップ（ｃ）から得られた細胞を抗原不含環境中でＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で（例えば、５〜２０日間）培養することを含む、方法が提供される。
【０２５９】
一実施形態によれば、方法はさらに、ステップ（ｄ）から得られた細胞を単一細胞懸濁液中へと分離させることを含む。
【０２６０】
一実施形態によれば、Ｔｃｍ表現型を含む抗第三者細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋の特徴を含む。
【０２６１】
抗第三者細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％さえもがＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であることは理解されよう。具体的な実施形態によれば、抗第三者細胞は、約７０〜９０％のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を含む。
【０２６２】
ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％さえもがＴｃｍ細胞特徴を有することは理解されよう。具体的な実施形態によれば、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約３０〜８０％がＴｃｍ細胞特徴を有する（例えば、４０〜５０％）。
【０２６３】
一実施形態によれば、細胞の少なくとも５０％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞であり、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のうち少なくとも５０％が当該特徴を有する。
【０２６４】
このように、中枢性メモリーＴリンパ球（Ｔｃｍ）表現型を有する本発明の細胞は天然に存在せず、天然の産物ではない。これらの細胞は、典型的には、生体外での操作（すなわち、特定のサイトカインの存在下での１つ以上の第三者抗原への曝露）によって生成する。
【０２６５】
既に述べたように、本発明のＴｃｍ細胞は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達モジュールを含む細胞表面受容体をコードするポリヌクレオチドで変換されている。
【０２６６】
本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を指す。
【０２６７】
「単離」という用語は、天然環境から、例えば、細胞から、または組織から、例えば人体から少なくとも部分的に分離させることを指す。
【０２６８】
単離ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の組換え方法を用いて得ることができ、例えば、標準的技法を用いて、その遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、それを含むことが分かっているベクターからその遺伝子を誘導すること、またはそれを含有している細胞および組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、対象遺伝子をクローニングするのではなく合成的に製造することができる。
【０２６９】
本発明のいくつかの実施形態によるポリヌクレオチドは、細胞表面受容体（例えば、ｔｇ−ＴＣＲおよび／またはＣＡＲ）の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達モジュールをコードする核酸配列を含む単一のポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、２つ以上のポリヌクレオチドを使用してもよく、うち１つのポリヌクレオチドが、例えば細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含んでもよく、もう１つのポリヌクレオチドが、シグナル伝達モジュールをコードする核酸配列を含んでもよい。
【０２７０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の分子をコードする核酸配列と、宿主細胞での単離ポリヌクレオチドの転写を導くためのシス作用性調節エレメントとを含む単離ポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【０２７１】
したがって、本発明の細胞表面受容体（例えば、ｔｇ−ＴＣＲまたはＣＡＲ分子）をコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、細胞表面受容体（例えば、ｔｇ−ＴＣＲまたはＣＡＲ）ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター配列）に機能可能に連結すること、およびその構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。
【０２７２】
本発明の核酸構築物はさらに、エンハンサー、転写および翻訳の開始配列、転写および翻訳のターミネーターおよびポリアデニル化シグナル、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、ならびに３’ＬＴＲまたはその一部；単一のｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳などを可能にする追加のポリヌクレオチド配列、例えば配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびキメラプロモーター性ポリペプチドをゲノムに組み込むための配列；発現されるペプチドの安定性、産生、精製、収率または毒性を増強するように操作された配列を含んでいてもよい。
【０２７３】
エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、開始部位から３０〜１１０ｂｐ上流の領域にプロモーターエレメントが位置している。但し、数多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含有していることが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は融通が利くことが多く、結果として、エレメントが互いに関して逆転または移動している場合にプロモーター機能は維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまで、５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに応じて個々のエレメントは協働的または独立的に機能して転写を活性化することができるようである。
【０２７４】
適するプロモーターの一例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を導くことができる、強力な恒常的プロモーター配列である。適するプロモーターの別の例は、伸長増殖因子−１．アルファ（ＥＦ−１．アルファ）である。しかしながら、その他の恒常的プロモーター配列、限定されないが例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、限定されないが例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを使用してもよい。さらに、本発明は、恒常的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として考えられる。誘導性プロモーターの使用は、ポリヌクレオチド配列の発現が望まれる場合に機能可能に連結されるポリヌクレオチド配列のそのような発現をオンにすること、または発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる、分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、数多くの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、単離ポリヌクレオチドは、ベクター、限定されないが例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ派生物、動物ウイルスおよびコスミドにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、例えば、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。
【０２７６】
哺乳動物発現ベクターの例としては、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、およびそれらの派生物が挙げられる。
【０２７７】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルスに由来する調節エレメントを含有する発現ベクターを使用することもできる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルス由来のベクターにはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターにはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。その他のベクターの例としては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥが挙げられる他、ＳＶ−４０早期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に効果的と示されたその他のプロモーターによる誘導下でのタンパク質の発現を可能にする任意のベクターが挙げられる。
【０２７８】
現在好ましい生体内または試験管内での核酸移入技法としては、ウイルス性または非ウイルス性の構築物、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によるトランスフェクションが挙げられる。組換えウイルスベクターは、水平感染および標的化の特異性などの利点を提供する。ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクションおよび電気穿孔などの他の方法に勝るいくつかの利点を提供する、というのも、ウイルスの感染性ゆえにより高いトランスフェクション効率を得ることができるからである。
【０２７９】
ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）ならびにその他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適するベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限酵素部位、および１つ以上の選択マーカーを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０２８０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の核酸構築物はウイルスベクターである。
【０２８１】
レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、長期の遺伝子導入を達成するのに適したツールである、というのも、それらは、導入遺伝子の長期の安定した組み込みおよび娘細胞でのその増殖を可能にするからである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を変換することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターに勝る付加的利点を有する。
【０２８２】
さらに、レンチウイルスベクターは、より大きい遺伝子の挿入能を提供し、さらに免疫原性が低いという付加的利点も有する。あるいは、ガンマレトロウイルスベクターを使用してもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、良好な変換効率を有し、ベクター関連の毒性を有さない［例えば、上記のＺｈａｎｇおよびＭｏｒｇａｎ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．（２０１２）を参照されたい］。
【０２８３】
例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに好都合な土台を提供する。選択した遺伝子をベクターに挿入し、当該技術分野において既知の技法を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、生体内または生体外のどちらかで被験体の細胞へ送達することができる。
【０２８４】
細胞表面受容体（例えば、ｔｇ−ＴＣＲまたはＣＡＲ）ポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される核酸構築物は選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のどちらか、またはその両方を含有することができ、その結果、ウイルス感染を通じてトランスフェクトまたは感染させるために探索された細胞の母集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーをＤＮＡの別個の部分に保持させて共トランスフェクション手順に使用してもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子は、宿主細胞での発現を可能にするために適切な調節配列と隣接して配置され得る。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどといった抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０２８５】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するためおよび、調節配列の機能性を評価するために、使用される。一般に、レポーター遺伝子は、受容者生物もしくは受容者組織に存在していない、またはそれらによって発現されない遺伝子であって、いくつかの簡単に検出できる特性、例えば酵素活性によって発現を明らかにされるポリペプチドをコードしている、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現については、ＤＮＡを受容者細胞に導入した後の適切な時点で検査する。適するレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼもしくは分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｌら、２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ４７９：７９−８２）。適する発現系は周知であり、既知の技法を用いて調製してもよいし、商業的に入手してもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小限の５’隣接領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域がレポーター遺伝子と関連付けられ得、薬剤をプロモーター駆動による転写の調節能力に関して評価するために使用され得る。
【０２８６】
種々の方法を用いて、本発明の核酸構築物を宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫の細胞に導入することができる。そのような方法は、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、メリーランド州ボルチモア（１９８９）、Ｃｈａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａら、ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  ＡｒｂｏｒＭｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、マサチューセッツ州ボストン（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載されており、また、物理的、化学的または生物学的手段（例えば、安定的または一時的なトランスフェクション、リポフェクシン、電気穿孔、および組換えウイルスベクターによる感染）を含む。さらに、正−負の選択方法については米国特許第５，４６４，７６４号および第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０２８７】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、例えば、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、電気穿孔などが挙げられる。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を生成させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０２８８】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する化学的手段としては、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズならびに、脂質に基づく系、例えば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームが挙げられる。送達用運搬体として試験管内および生体内で使用するための典型的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０２８９】
対象ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法としては、例えば、（上記のような）ＤＮＡおよびＲＮＡのベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒトの細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となった。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス１、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来するものとすることができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０２９０】
非ウイルス性送達システムを利用する場合、典型的な送達用運搬体はリポソームである。
【０２９１】
「リポソーム」は、封入された脂質の二重膜または凝集物の生成によって形成された多様な一重膜および多重膜の脂質運搬体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重膜と内部の水性媒体とを有する小胞状構造を有するものとして特徴付けることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた多重の脂質層を有する。それは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させたときに自然に形成される。
【０２９２】
脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再配置を受け、脂質二重膜間に水および溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈら、１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、普通の小胞状構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造をとっていてもよいし、単に脂質分子の不均一な凝集物として存在していてもよい。また、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−核酸複合体も考えられる。
【０２９３】
核酸を宿主細胞の中へ（生体内、生体外または試験管内で）導入するために脂質製剤の使用が考えられる。別の態様において、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入されていてもよいし、リポソームの脂質二重層内に散在していてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドとの両方に会合した連結分子を介してリポソームに付着していてもよいし、リポソーム内に閉じ込められていてもよいし、リポソームと複合体化していてもよいし、脂質を含有する溶液中に分散していてもよいし、脂質と混ざり合っていてもよいし、脂質と結合していてもよいし、脂質中の懸濁液として含有されていてもよいし、ミセルによって含有または複合化されていてもよいし、あるいは脂質と会合していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中での特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造、ミセル、または「崩壊した」構造で存在していてもよい。それらはまた、大きさまたは形状の一様でない凝集物を形成している可能性を有して単に溶液中に散在していてもよい。脂質は、天然起源または合成の脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質中に天然に存在する脂肪滴ならびに、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体（例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒド）を含有する化合物の部類が含まれる。
【０２９４】
使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａから得ることができ；リン酸ジエチル（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレーンビュー）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）；およびその他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミングハム）から得てもよい。これに加えて、またはこれに代えて、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４−６５（１９９６）］の脂質を使用することができる。クロロホルム中またはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で貯蔵することができる。クロロホルムは、メタノールよりも速やかに蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。
【０２９５】
本発明に従って使用され得る別の例示的な非ウイルス性送達システムは、トランスポゾンに基づく非ウイルス性遺伝子送達システム、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙやＰｉｇｇｙＢａｃである。
【０２９６】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用する方法にかかわらず、組換えＤＮＡ配列の宿主細胞中での存在を確認するために様々なアッセイが行われ得る。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、特定ペプチドの存否を例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によって、または本発明の範囲内に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって検出することが挙げられる。
【０２９７】
細胞表面受容体（例えば、ｔｇ−ＴＣＲおよび／またはＣＡＲ）で変換された細胞をさらに、細胞内で少なくとも１つの内因性免疫学的チェックポイント遺伝子の発現を抑制するように遺伝子改変してもよいことは理解されよう。
【０２９８】
免疫学的チェックポイント遺伝子は、ＰＤ遺伝子またはＣＴＬＡ遺伝子を含み得る。
【０２９９】
本明細書中で使用する用語「免疫学的チェックポイント遺伝子」は、免疫応答の大きさを調節するように作用する抑制プロセス（例えば、フィードバックループ）、例えば、制御されない有害な免疫応答の伝播を緩和する免疫抑制フィードバックループに関与する任意の遺伝子を指す。
【０３００】
免疫学的チェックポイント遺伝子の非限定的な例としては、広範なＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーおよびそれらのリガンドならびに共抑制経路に関与する遺伝子（例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）が挙げられる。
【０３０１】
したがって、一実施形態によれば、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４を標的とするヌクレアーゼまたは転写リプレッサーを、（参照によって本明細書に組み込まれる）米国特許出願第２０１４０１２０６２２号で述べられているとおりに利用することができる。
【０３０２】
これに加えて、またはこれに代えて、Ｔ細胞の活性化または機能を調節する免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ−１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＫＩＲ、ＩＤＯ、ＣＤ１９、ＯＸ４０，４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８および／またはＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）を、変換細胞において免疫チェックポイント調節因子の使用によって調節（例えば、必要に応じて上方制御または下方制御）してもよい。
【０３０３】
具体的な実施形態によれば、免疫チェックポイント調節因子は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１、ＣＤ４０アゴニスト、４−１ＢＢアゴニスト、ＧＩＴＲアゴニストおよびＯＸ４０アゴニストから構成される群から選択される。
【０３０４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離細胞を含む細胞集団が提供される。
【０３０５】
本発明のいくつかの実施形態の単離細胞または細胞集団は、それ自体で、または適切なキャリアもしくは賦形剤と混ざり合った医薬組成物で、投与することができる。
【０３０６】
本明細書中で使用する「医薬組成物」は、本明細書に記載の１つ以上の活性成分と、その他の化学成分、例えば生理学的に適するキャリアおよび賦形剤との配合物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０３０７】
本明細書において、用語「活性成分」は、生物学的効果を説明できる本発明のいくつかの実施形態の細胞を指す。
【０３０８】
これより以下、互換的に使用され得る「生理学的に許容可能なキャリア」および「薬学的に許容可能なキャリア」という語句は、生物に対して著しい刺激をもたらさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を無効にしない、キャリアまたは希釈剤を指す。佐薬はこれらの語句のもとに包含される。
【０３０９】
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および種々の澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３１０】
薬物の処方および投与の技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見出すことができ、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３１１】
適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸内または非経口送達、例えば、筋肉内、皮下および髄内への注射ならびにクモ膜下腔内、直接的脳室内、心臓内、例えば、右心内腔内または左室内腔内、一般的な冠動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内への注射が含まれ得る。
【０３１２】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来の手法としては、例えば：脳神経外科的方略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の採用を試みる薬剤の分子操作（例えば、自身ではＢＢＢを横切ることができない薬剤と、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドとの組み合わせを含む、キメラ融合タンパク質の産生）；薬剤の脂質溶解性を高めるべく考案された薬理学的方略（例えば、脂質またはコレステロールキャリアに対する水溶性薬剤の結合）；（頸動脈へのマンニトール溶液の注入、またはアンジオテンシンペプチドのような生物学的活性剤の使用に起因する）高浸透圧的破壊によるＢＢＢの完全性の一時的破壊が挙げられる。しかしながら、これらの方略の各々には限界があり、それには例えば、侵襲的外科手技に関連する固有の危険性、内因性輸送系に固有の限界によって課せられる大きさの限界、ＣＮＳの外で活性となる可能性のあるキャリアモチーフを含むキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、およびＢＢＢが破壊されている脳の領域内で起こる可能性のある脳損傷（それはこの方略を最適未満の送達方法にする）、といったことが挙げられる。
【０３１３】
あるいは、例えば医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することにより、全身的ではなく局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０３１４】
一実施形態によれば、投与経路としては、例えば、注射、摂取、輸血、埋め込みまたは移植が挙げられる。本明細書に記載の組成物は、患者に対して皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に、投与することができる。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射によって投与される。医薬組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射されてもよい。
【０３１５】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当該技術分野において周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、浮揚、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
【０３１６】
したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含めて１つ以上の生理学的に許容可能なキャリアを使用して従来の方法で調合され得る。適する製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０３１７】
注射用には、医薬組成物の活性成分を水溶液、好ましくは生理学的に適合した緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液または生理的塩緩衝液の中に配合してもよい。経粘膜投与のためには、浸透させるバリアに適する浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は、当該分野において一般的に知られている。
【０３１８】
経口投与のためには、活性化合物を当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に医薬組成物を調合することができる。そのようなキャリアは、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。経口用の薬理学的製剤は、固体賦形剤を使用して作ることができ、場合によっては、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物を処理して錠剤または糖衣錠コアを得る。適する賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含めた糖；セルロース製剤、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム；および／または生理学的に許容可能なポリマー、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて崩壊剤を添加してもよく、それには例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが挙げられる。
【０３１９】
糖衣錠コアには適切なコーティングを施す。この目的のためには濃縮糖溶液が使用され得、場合によってそれはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適する有機溶媒または溶媒混合物を含有していてもよい。識別のため、または活性化合物用量の種々の組み合わせを特徴付けるために、色素または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０３２０】
経口で使用することができる医薬組成物は、ゼラチン製の押込式カプセルおよび、ゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とでできた軟質密封カプセルを含む。押込式カプセルは、活性成分と混ざってラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤および（場合によって）安定剤を含有し得る。ソフトカプセルでは、活性成分を脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁させ得る。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用のあらゆる製剤は、選択された投与経路に適した投与量でなければならない。
【０３２１】
頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で調合した錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０３２２】
鼻腔吸入による投与では、本発明のいくつかの実施形態による使用のための活性成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提供の形態で送達されることが好都合である。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。分注器で使用するための、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジを調合してもよい。
【０３２３】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えばボーラス注射または連続点滴による非経口投与のために調合してもよい。
【０３２４】
注射用製剤は、単位用量形態、例えばアンプルで提供してもよいし、場合によって保存料を添加して多回投与容器で提供してもよい。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用剤を含有してもよい。
【０３２５】
非経口投与のための医薬組成物には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性の注射用懸濁液として調合してもよい。適する親油性の溶媒またはビヒクルとしては、例えば、ゴマ油などの脂肪油または、オレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。
【０３２６】
水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有し得る。場合によって懸濁液はさらに、高濃度の溶液の調製を可能にすべく、活性成分の溶解性を高める適切な安定化剤または薬剤を含有してもよい。
【０３２７】
あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質不含滅菌水溶液で戻すための粉末形態であってもよい。
【０３２８】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、例えば従来の坐薬基剤、例えばカカオバターまたはその他のグリセリドを使用して直腸用組成物、例えば坐薬または停留浣腸として調合されてもよい。
【０３２９】
本発明との関連において使用に適する医薬組成物は、意図された目的を達成するのに有効な量の活性成分を含有する組成物を含む。より具体的には、治療上有効な量は、病状の症候を予防、緩和もしくは改善するため、または処置される被験体の生存期間を延長するために有効な活性成分の量を意味する。
【０３３０】
治療上有効な量の決定は、特に本明細書において提供する詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３３１】
「治療量」を示す場合、投与する本発明の組成物の正確な量は、医師が患者（被験者）の年齢、体重、疾患状態、例えば、腫瘍の大きさ、感染の程度または転移の程度、および症状の個人別の差異を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載の細胞を含む医薬組成物は１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重（その範囲内のあらゆる整数値を含む）の投与量で投与され得る。
【０３３２】
例えば、受容者に注入する細胞の数は、１×１０４／Ｋｇ体重よりも多くすべきである。受容者に注入する細胞の数は、典型的には、１×１０３／Ｋｇ体重〜１×１０４／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４／Ｋｇ体重〜１×１０５／体重Ｋｇの範囲、１×１０４／Ｋｇ体重〜１×１０６／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４／Ｋｇ体重〜１０×１０７／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４／Ｋｇ体重〜１×１０８／Ｋｇ体重の範囲、１×１０３／Ｋｇ体重〜１×１０５／Ｋｇ体重の範囲、１×１０４／Ｋｇ体重〜１×１０6／Ｋｇ体重の範囲、１×１０６／Ｋｇ体重〜１０×１０７／ｋｇ体重の範囲、１×１０５／ｋｇ体重〜１０×１０７／ｋｇ体重の範囲、１×１０６／体重ｋｇ〜１×１０８／体重ｋｇの範囲、または１×１０６／ｋｇ体重〜１×１０９／ｋｇ体重の範囲とすべきである。具体的な実施形態によれば、受容者に注入する細胞の数は、１×１０６／Ｋｇ体重〜１０×１０８／Ｋｇ体重の範囲とすべきである。
【０３３３】
これらの投与量で本発明のいくつかの実施形態の細胞組成物を複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技法を用いて投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８参照）。特定の患者にとって最適な投与量および処置計画は、医学分野において技量を有する者であれば患者を疾患の徴候についてモニタリングしてそれに応じて処置を調節することによって容易に決定することができる。
【０３３４】
例えば、病状に対する活性成分（例えば、本発明のいくつかの実施形態の細胞）の効果は、処置される患者の生体試料中のマーカー、例えば、ホルモン、グルコース、ペプチド、炭水化物などのレベルを周知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなど）を用いてモニタリングすること、または周知の方法（例えば、超音波、ＣＴ、ＭＲＩなど）を用いて腫瘍の大きさをモニタリングすることによって、評価することができる。
【０３３５】
本発明の方法において使用するいかなる製剤についても、治療上有効な量または用量は、初めに試験管内および細胞培養でのアッセイによって見積もることができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するために、動物モデルで用量を定式化することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０３３６】
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療上の有効性は、試験管内、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。これらの試験管内および細胞培養でのアッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト用の投与量範囲を定式化する際に用いることができる。
【０３３７】
投与量は、採用する剤形および利用する投与経路に応じて変動し得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、個々の医師が患者の症状を考慮して選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、ｐ．１参照）。
【０３３８】
投与の量および間隔は、活性成分のレベルが生物学的作用を誘導または抑制するのに十分（最小有効濃度、ＭＥＣ）となるように、個別に調節され得る。ＭＥＣは各製剤ごとに異なるが、試験管内でのデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを用いて血漿濃度を測定することができる。
【０３３９】
処置する症状の重度および応答性に応じて、投薬は単回または複数回の投与とすることができ、処置過程は、数日〜数週間または、治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の軽減が達成されるまで、継続させる。
【０３４０】
投与する組成物の量は、当然、処置される被験体、苦痛の重度、投与様式、処方する医師の判断などに依存するであろう。
【０３４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の治療剤は、病状を処置するために作られた他の（１つ以上の）薬物と併せて被験体に提供することができる［併用療法（例えば、前、同時または後での）］。
【０３４２】
本発明の特定の実施形態では、本発明のいくつかの実施形態の細胞は、限定されないが、抗ウイルス剤（例えば、ガンシクロビル、バラシクロビル、アシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドフォビル、マリバビル、レフルノミド）；化学療法剤（例えば、抗腫瘍剤、限定されないが例えば、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、ブスルファン、メクロレタミンすなわちムスチン（ＨＮ  ２）、ウラムスチンすなわちウラシルマスタード、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ベンダムスチン、ニトロソウレア類  カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、トリアゼン類（ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド）、ダカルバジン、テモゾロミド、マイレラン、ブスルフェクス、フルダラビン、ジメチルミレランまたはシタラビン）；ＭＳの処置のための薬剤（例えば、ナタリズマブ）；または乾癬の処置のための薬剤（例えばエファリツマブ）を用いた処置を含めて、任意の数の関連処置様式と併せて患者に投与することができる。
さらなる実施形態では、本発明のいくつかの実施形態の細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸エステルおよびＦＫ５０６）、抗体、またはその他の免疫破壊剤と組み合わせて使用してもよい（以下にさらに詳しく述べる）。
【０３４３】
さらなる実施形態において、本発明のいくつかの実施形態の細胞組成物は、骨髄移植と併せて（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。
【０３４４】
さらなる実施形態では、本発明のいくつかの実施形態の細胞組成物は、例えば、フルダラビンなどの化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えばＯＫＴ３やＣＡＭＰＡＴＨを用いるＴ細胞破壊療法の後に、患者に投与される。
【０３４５】
別の実施形態において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞破壊療法の後に投与される。
【０３４６】
併用療法は、処置される患者における本発明の薬剤の治療効果を高め得る。
【０３４７】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ以上の単位投与形態を収容したパックまたは分注装置、例えばＦＤＡ承認されたキットで提供され得る。パックは、金属箔またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたは分注装置には、投与のための指示書を添付してもよい。パックまたは分注器にはさらに、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式での容器と関連付けた通知書であって、組成物の形態またはヒトへの投与または獣医学的投与についての機関による承認を反映する通知書を備え付けてもよい。そのような通知書は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベルであってもよいし、承認された製品挿入物であってもよい。また、適合する医薬キャリア中に配合された本発明の製剤を含む組成物を調製して適切な容器に入れて、示された症状の処置のためのラベルを（上にさらに詳しく述べているように）付けてもよい。
【０３４８】
キットは、金属箔またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたは分注装置には、投与のための指示書を添付してもよい。パックまたは分注器にはさらに、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式での容器と関連付けた通知書であって、組成物の形態またはヒトへの投与または獣医学的投与についての機関による承認を反映する通知書を備え付けてもよい。そのような通知書は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベルであってもよいし、承認された製品挿入物であってもよい。また、適合する医薬キャリア中に配合された本発明の製剤を含む組成物を調製して適切な容器に入れて、示された症状の処置のためのラベルを（上にさらに詳しく述べているように）付けてもよい。
【０３４９】
一実施形態によれば、キットはさらに、化学療法剤（例えば、上で詳しく述べた抗腫瘍剤）を含む。
【０３５０】
一実施形態によれば、キットはさらに、（上で詳しく述べたような）抗ウイルス剤を含む。
【０３５１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、処置を必要とする被験体の疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の細胞集団を被験体に治療上有効な量で投与してそれによって被験体を処置することを含む、方法が提供される。
【０３５２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、処置を必要とする被験体の疾患を処置するために使用される、治療上有効な量の本発明のいくつかの実施形態の細胞集団が提供される。
【０３５３】
「処置する」という用語は、病状（疾患、障害または症状）の進展を抑止、防止もしくは阻止することおよび／または病状の軽減、寛解もしくは退化をもたらすことを指す。当業者であれば、様々な方法論およびアッセイを用いて病状の進展を評価できること、および同様に、様々な方法論およびアッセイを用いて病状の軽減、寛解または退化を評価し得ることを理解するであろう。
【０３５４】
本明細書中で使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、好ましくは、病状に罹患している任意の年齢または性別のヒトを含む。
【０３５５】
病状は、悪性疾患（癌）、感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原生動物感染症または寄生虫感染症）、アレルギーおよび／または自己免疫疾患であることができるが、これらに限定されない。
【０３５６】
癌性疾患
本発明のいくつかの実施形態の方法によって処置することができる悪性疾患（癌とも呼ばれる）は、任意の固体もしくは非固体の腫瘍および／または腫瘍転移であることができる。
【０３５７】
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより詳しい例は、扁平上皮細胞癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、メラノーマ、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃の癌、すなわち胃癌（消化器癌を含む）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、カルチノイド癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、中皮腫、多発性骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、および様々な種類の頭頸部癌（例えば、脳腫瘍）を含むが、これらに限定されない。本発明の処置を受けることのできる癌性症状には転移性癌が含まれる。
【０３５８】
一実施形態によれば、悪性疾患は血液悪性腫瘍である。血液学的悪性腫瘍の例としては、限定されないが、白血病［例えば、急性リンパ性、急性リンパ芽球性、急性前駆Ｂ細胞リンパ芽球性、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性、単球性、急性骨髄性、急性骨髄様、好酸球増加を有する急性骨髄様、Ｂ細胞、好塩基球性、慢性骨髄様、慢性、Ｂ細胞、好酸球増加性、フレンド、顆粒球性または骨髄細胞性、有毛細胞性、リンパ球性、巨核芽球性、単球性、単球性マクロファージ、骨髄芽球性、骨髄様、骨髄単球性、形質細胞、前駆Ｂ細胞、前骨髄球性、亜急性、Ｔ細部、リンパ系腫瘍、骨髄悪性腫瘍の素因、急性非リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）］、およびリンパ腫［例えば、ホジキン病、非ホジキン性リンパ腫、バーキット、皮膚Ｔ細胞、組織球性、リンパ芽球性、Ｔ細胞、胸腺性、Ｂ細胞、例えば、低悪性度／濾胞性；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大疾患ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンストレームマクログロブリン血症］が挙げられる。
【０３５９】
具体的な実施形態によれば、悪性疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、神経芽腫、結腸癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、滑膜細胞癌または膵臓癌である。
【０３６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病状は固体腫瘍である。
【０３６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病状は腫瘍転移である。
【０３６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病状は血液悪性腫瘍である。
【０３６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病状は、白血病またはリンパ腫である。
【０３６４】
本発明のいくつかの実施形態の方法によって処置することができる悪性疾患の例を以下の表１および２に列挙する。
【０３６５】
表１：ｔｇ−ＴＣＲ変換細胞を利用し場合によって前処置計画を伴う臨床用途
【表１】
2018524987.tif 000002
【０３６６】
表２：ＣＡＲ変換細胞を利用し場合によって前処置計画を伴う臨床用途
【表２】
2018524987.tif 000003
【０３６７】
具体的な実施形態によれば、悪性疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、神経芽腫、結腸癌、大癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、滑膜細胞癌および膵臓癌である。
【０３６８】
感染症
感染症の例には、慢性感染症、亜急性感染症、急性感染症、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原生動物疾患、寄生虫疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ病およびプリオン病が含まれるが、これらに限定されない。
【０３６９】
本発明の教示に従って処置することができる感染症を引き起こすウイルス性病原体の具体的な種類としては、限定されないが、レトロウイルス、サーコウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アレナウイルスおよびフィロウイルスが挙げられる。
【０３７０】
本発明の教示に従って処置することができるウイルス感染症の具体例としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘発性後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、インフルエンザ、ライノウイルス感染症、ウイルス性髄膜炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス感染症、麻疹、パピローマウイルス感染症／疣贅、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、黄熱、エボラウイルス感染症および狂犬病が挙げられる。
【０３７１】
具体的な実施形態によれば、ウイルス性疾患は、免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＴＡＸ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から構成される群から選択される。
【０３７２】
アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の例には、喘息、皮疹、蕁麻疹、花粉アレルギー、チリダニアレルギー、毒アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、昆虫刺咬アレルギー、動物垢アレルギー、有棘植物アレルギー、ドクヅタアレルギーおよび食物アレルギーが含まれるが、これらに限定されない。
【０３７３】
自己免疫疾患
自己免疫疾患としては、限定されないが例えば、心血管疾患、リウマチ疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が挙げられる。
【０３７４】
自己免疫性心血管疾患の例としては、限定されないが、アテローム性動脈硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ、１９９８；７、付録２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ、１９９８；７、付録２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７、付録２：Ｓ１０７−９）、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小型血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型巣状壊死性半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．  Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（パリ）、２０００年５月；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導性心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９年６月１７日；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．  Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９年４〜６月；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９６年５月１５日；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８年１月；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７年３月；７４（３）：１３９）、シャガス病における心臓自己免疫（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６年１０月１５日；９８（８）：１７０９）、および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Ｃｒｏｐｏｓｓｉ  ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１１（１）：９）が挙げられる。
【０３７５】
自己免疫性リウマチ疾患の例には、関節リウマチ［Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ（２０００）１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  ＲおよびＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）１８；９１（２）：４３７−４３８］および強直性脊椎炎［Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ（２００１）３（３）：１８９］が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７６】
自己免疫性腺疾患の例には、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺症候群が含まれるが、これらに限定されない。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６年１０月；３４、付録：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００年６月；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３年３月；９２（１）：７７）、自発自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００年１２月１５日；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９年８月；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９年８月；５７（８）：１７５９）、卵巣自己免疫（Ｇａｒｚａ  ＫＭら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８年２月；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年３月；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７年１２月；５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１９９１年３月１日；７７（５）：１１２７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７７】
自己免疫性胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００年１月；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００年１月１６日；１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７８】
自己免疫性皮膚疾患の例としては、限定されないが例えば自己免疫性水疱性皮膚症、例えば、限定されないが、尋常性類天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉性天疱瘡が挙げられる。
【０３７９】
自己免疫性肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０年３月；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６年１１月；９１（５）：５５１）；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９年６月；１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００年８月；３３（２）：３２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８０】
自己免疫性神経疾患の例としては、限定されないが、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１年１月；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９０年１２月；２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００年４月；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００年４月；３１９（４）：２０４）；傍腫瘍性神経症候群、小脳萎縮症、傍腫瘍性小脳萎縮症および全身硬直症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ  ２００１年３月２７日；９８（７）：３９８８）；傍腫瘍性全身硬直症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群および自己免疫性多発性内分泌障害（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（パリ）２０００年１月；１５６（１）：２３）、免疫不全神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８年５月１３日；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９４年５月；５７（５）：５４４）および神経変性疾患が挙げられる。
【０３８１】
自己免疫性筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００年９月；１２３（１）：９２）および平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９年６月；５３（５−６）：２３４）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８２】
自己免疫性腎疾患の例には、腎炎および自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０年８月；１（２）：１４０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８３】
生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、反復胎児喪失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  付録２：Ｓ１０７−９）が挙げられるが、これに限定されない。
【０３８４】
自己免疫性結合組織疾患の例には、耳疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４年８月；１５７（１）：２４９）および内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７年１２月２９日；８３０：２６６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８５】
自己免疫性全身性疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年３月；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９年６月；１６９：１０７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８６】
具体的な実施形態によれば、自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアックおよび脳卒中から構成される群から選択される。
【０３８７】
既に述べたように、本発明の細胞は、いかなる細胞提供者から得ることもできる。したがって、処置される被験体はヒト被験体であることができ、他方で細胞は、同系（例えば、自家）または非同系（例えば、受容者に関して同種異系または異種）の提供者から得ることができる。
【０３８８】
本明細書中で使用する場合、「同系」細胞という用語は、被験体と本質的に遺伝的に同一である細胞、または被験体の本質的に全てのリンパ球を指す。同系細胞の例には、被験体由来（当該技術分野では「自家」とも呼ばれる）、被験体のクローン由来、または被験体と同一の双生児に由来する細胞が含まれる。
【０３８９】
本明細書中で使用する場合、「非同系」細胞という用語は、被験体または被験体の本質的に全てのリンパ球と本質的に遺伝的に同一ではない細胞、例えば同種異系細胞または異種細胞を指す。
【０３９０】
本明細書中で使用する「同種異系」という用語は、被験体と同じ種である被験体に関して実質的に非クローン性である提供者に由来する細胞を指す。通常、同一種の非近交系非接合性双生哺乳動物は互いに同種異系である。同種異系細胞が、被験体に関してＨＬＡが同一であることも、部分的にＨＬＡが同一であることも、ＨＬＡが非同一である（すなわち、１つ以上の異なるＨＬＡ決定基を提示する）こともあり得ることは理解されよう。
【０３９１】
本明細書中で使用する「異種」という用語は、被験体の実質的割合のリンパ球の種とは異なる種の抗原を実質的に発現する細胞を指す。通常は、異なる種の異系交配哺乳動物は互いに異種である。
【０３９２】
本発明は、異種細胞が様々な種に由来することを想定している。したがって、一実施形態によれば、細胞は、任意の哺乳動物に由来し得る。細胞の適切な種起源は、主要な飼育動物または家畜および霊長類を含む。このような動物には、ブタ類（例えばブタ）、ウシ類（例えばウシ）、ウマ類（例えばウマ）、ヒツジ類（例えばヤギ、ヒツジ）、ネコ類（例えばＦｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、イヌ類（例えばＣａｎｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）および霊長類（例えば、チンパンジー、アカゲザル、マカクザル、マーモセット）を含むがそれらに限定されない。
【０３９３】
異種起源の細胞（例えば、ブタ起源）は、好ましくは、ブタ内在性レトロウイルスのような、人畜共通感染症がないことが知られている供給源から得られる。同様に、ヒト由来の細胞または組織は、好ましくは実質的に病原体を含まない供給源から得られる。
【０３９４】
一実施形態によれば、細胞は被験体と非同系である。
【０３９５】
一実施形態によれば、細胞は被験体と同種異系である。
【０３９６】
一実施形態によれば、細胞は被験体と同系（例えば、自家）である。
【０３９７】
本発明の一実施形態によれば、被験体はヒトであり、細胞はヒト由来（例えば、非自家）である。
【０３９８】
一実施形態によれば、被験体はヒトであり、細胞は異種起源（例えばブタ起源）由来である。
【０３９９】
当技術分野で既知の任意の方法を用いて、移植のための細胞を得ることができる。したがって、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＤＣ）は、提供者からの末梢血を採取することによって得ることができる。末梢血を採取する方法は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、提供者からの全血５００〜１０００ｍｌの採取および抗凝固剤（例えば、ヘパリンまたはクエン酸塩）を含む容器への採取または、個体の末梢血を装置に通して主要な構成要素（例えば単核細胞、例えばリンパ球、単球または樹状細胞）を生成し、その他の構成要素を被験者の循環系に戻す手順であるアフェレーシスによる採取を含む。あるいは、細胞は、細胞の試験管内または生体外での培養によって得ることができる。本発明の細胞は、新鮮または凍結（例えば、低温保存）調製物であってもよいことが理解されよう。
【０４００】
移植の状況に応じて、細胞の移植を容易にするために、本方法は、移植前に亜致死的、致死的または超致死的な状態で被験体を調整することをさらに含むことができる。
【０４０１】
本明細書中で使用する場合、本発明の被験体の調整に関連する場合、用語「亜致死」、「致死」および「超致死」はそれぞれ、通常の滅菌条件下で被験体の代表的な母集団に適用される場合に、典型的に、母集団の本質的に全てのメンバーに対して非致死的であるか；母集団の一部ではあるが全てではないメンバーに致死的であるか；または母集団の本質的に全てのメンバーに致死的である、骨髄毒性および／またはリンパ球毒性の処置を指す。
【０４０２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、亜致死的、致死的または超致死的な調整は、全身照射（ＴＢＩ）、全リンパ系照射（ＴＬＩ、すなわち、全てのリンパ節、胸腺および脾臓の曝露）、部分体照射（例えば、結腸、乳房などの特異的曝露）、骨髄破壊的前処置および／または非骨髄破壊的前処置を、例えば様々な併用（限定されないが例えば、共刺激遮断、化学療法剤および／または抗体免疫療法）と共に含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、調整は、上記調整プロトコルのいずれかの組み合わせを含む（例えば、化学療法剤およびＴＢＩ、共刺激遮断および化学療法剤、抗体免疫療法および化学療法剤など）。
【０４０３】
一実施形態によれば、ＴＢＩは、０．５−１Ｇｙ、０．５−１．５Ｇｙ、０．５−２．５Ｇｙ、０．５−５Ｇｙ、０．５−７．５Ｇｙ、０．５−１０Ｇｙ、０．５−１０Ｇｙ、１５Ｇｙ、１−１．５Ｇｙ、１−２Ｇｙ、１−２．５Ｇｙ、１−３Ｇｙ、１−３．５Ｇｙ、１−４Ｇｙ、１−４．５Ｇｙ、１−１．５Ｇｙ、１−７．５Ｇｙ、１−１０Ｇｙ、２−３Ｇｙ、２−４Ｇｙ、２−５Ｇｙ、２−６Ｇｙ、２−７Ｇｙ、２−８Ｇｙ、２−９Ｇｙ、２−１０Ｇｙ、３−４Ｇｙ、３−５Ｇｙ、３−６Ｇｙ、３−７Ｇｙ、３−８Ｇｙ、３−９Ｇｙ、３−１０Ｇｙ、４−５Ｇｙ、４−６Ｇｙ、４−７Ｇｙ、４−８Ｇｙ、４−９Ｇｙ、４−１０Ｇｙ、５−６Ｇｙ、５−７Ｇｙ、５−８Ｇｙ、５−９Ｇｙ、５−１０Ｇｙ、６−７Ｇｙ、６−８Ｇｙ、６−９Ｇｙ、６−１０Ｇｙ、７−８Ｇｙ、７−９Ｇｙ、７−１０Ｇｙ、８−９Ｇｙ、８−１０Ｇｙ、１０−１２Ｇｙまたは１０−１５Ｇｙの範囲の単回または分割照射線量を含む。
【０４０４】
具体的な実施形態によれば、ＴＢＩは、１〜７．５Ｇｙの範囲内の単回または分割照射線量を含む。
【０４０５】
１つの実施形態によれば、調整ステップは、骨髄破壊的条件下など超致死条件下で被験体を調整することによって行われる。
【０４０６】
あるいは、調整ステップは、被験体を骨髄減少的条件下または非骨髄破壊的条件下で調整するなど、致死または亜致死条件下で被験体を調整することによって達成され得る。
【０４０７】
一実施形態によれば、調整ステップは、骨髄破壊薬（例えば、ブスルファンまたはメルファラン）または非骨髄破壊薬（例えば、シクロホスファミドおよびまたはフルダラビン）で被験体を調整することによって成し遂げられる。
【０４０８】
被験体を調整するために使用され得る調整剤の例には、限定はしないが、照射、薬理学的薬剤、および寛容誘導細胞（本明細書に記載されるように）を含む。
【０４０９】
薬理学的薬剤の例には、骨髄毒性薬、リンパ球毒性薬および免疫抑制薬（以下に詳細に考察される）が含まれる。
【０４１０】
骨髄毒性薬の例としては、ブスルファン、ジメチルミレラン、メルファランおよびチオテパが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１１】
これに加えて、またはこれに代えて、本方法はさらに、細胞の移植の前、同時または後に免疫抑制計画で被験体を調整することを含み得る。
【０４１２】
適切な類の免疫抑制計画の例には、免疫抑制薬の投与、および／または免疫抑制的照射が含まれる。
【０４１３】
移植に適した免疫抑制計画を選択および投与するための十分な指針は、当該技術分野の文献において提供されている（例えば、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ＣＨ．およびＲｏｗｌａｎｄｓ  ＤＴ  Ｊｒ．、１９９２．ＪＡＭＡ．２６８，２９５２；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＲＭ．ら、１９９６、Ｌａｎｃｅｔ  ３４８、１２０８；Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ  Ｍ．およびＳｔｒｏｍ  ＴＢ．、１９９６、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１、３６５；Ｍｉｄｔｈｕｎ  ＤＥ．ら、１９９７．Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．７２、１７５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＶＡ．ら、１９９４．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．９７、１４；Ｈａｎｔｏ  ＤＷ．、１９９５．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．４６、３８１；Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ  ＡＭら、１９９７、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．１２６、８８２；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｆ．ら、１９９８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８、１６１；Ｄａｎｔａｌ  Ｊ．ら、１９９８、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１、６２３参照）。
【０４１４】
免疫抑制剤の例には、限定されないが、タクロリムス（ＦＫ−５０６またはフジマイシンとも呼ばれる、商品名：プログラフ、アドバグラフ、プロトピック）、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、プレドニゾン、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、エタネルセプト、ＴＮＦアルファブロッカー、炎症性サイトカインを標的とする生物剤、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナム酸塩、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメティン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害薬、トラマドール、ラパマイシン（シロリムス）およびラパマイシン類似体（例えば、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３）を含むが、これらに限定されない。これらの薬剤は、単独で、または組み合わせて投与することができる。
【０４１５】
本明細書中で使用する場合、用語「約」は±１０％を意味する。
【０４１６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」およびそれらの活用形は、「含むが限定はしない」ことを意味する。
【０４１７】
「から構成される」という用語は、「限定して含む」ことを意味する。
【０４１８】
用語「本質的に〜から構成される」は、追加の成分、ステップおよび／または部分によって請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴が実質的に変更されない場合にのみ、組成物、方法または構造がその追加の成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいことを意味する。
【０４１９】
本明細書で使用されるように、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形での言及を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて複数の化合物を含み得る。
【０４２０】
本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式で示されていることがある。範囲の形式の記載は、単なる便宜および簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６のような下位範囲ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは範囲の広さ関係なく適用される。
【０４２１】
本明細書において数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内に任意の引用数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指示番号と第２の指示番号との間の「範囲にある／範囲内である」、および第１の指示番号から第２の指示番号までの「範囲にある／範囲内である」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の指示番号とそれらの間の全ての分数および整数の数字を含む。
【０４２２】
本明細書中で使用する場合、用語「方法」とは、所定の課題を達成するための方法、手段、技法および手順、例えば、限定されないが、医学、薬理学的、生物学的、生化学的および医学的分野の実践者に知られている方法、手段、技法および手順から既知であるかまたは容易に開発される方法、手段、技法および手順を指す。
【０４２３】
明確にするために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態と組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に、または任意の適切な部分結合として、または本発明のその他の任意の記載された実施形態に適するように、提供されてもよい。種々の実施形態の文脈で記載されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしで機能不能でない限り、それらの実施形態に必須の特徴であると解釈されるべきでない。
【０４２４】
本明細書において上に記載され、請求項の項で請求される、本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に支持されている。
【実施例】
【０４２５】
これより以下の実施例について言及するが、これらの実施例は上記説明と共に本発明を非限定的に説明するものである。
【０４２６】
概して、本明細書中で使用する命名法および本発明において利用する実験手順には、分子的、生化学的および微生物学的な技法ならびに組換えＤＮＡ技法が含まれる。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１−４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に明記されている方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＩＩ、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１−３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい（これらは全て参照により、あたかも十分に明記されたかのように本明細書に組み込まれる。）。他の一般的な参考文献は、この文書の全体を通して提供されている。そこにある手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれている全ての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２７】
全体的な材料および実験手順
動物
雌の６〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ、ＣＢ６（Ｆ１）およびＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したか、またはＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅの動物施設で成育させた。全てのマウスを小さなケージに（各ケージに５匹ずつ）入れ、滅菌食品と酸性水を与えた。全ての研究は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０４２８】
宿主非反応性マウス抗第三者Ｔｃｍの調製
以前に［Ｏｐｈｉｒ  Ｅら、Ｂｌｏｏｄ（２０１０）１１５：２０９５−２１０４］に簡単に記載されているとおりに抗第三者Ｔｃｍを調製し、サイトカイン欠乏下で提供者マウスの脾細胞を、照射された第三者脾細胞に接触させ６０時間培養した。続いて、磁気粒子（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＣＤ８＋細胞の正の選択をし、無抗原環境下で培養した。２日ごとにｒｈＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。培養終了時（１６日目）に精製母集団を得るために、磁気活性化細胞選別［ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ］によってＣＤ６２Ｌ発現のあるＴｃｍ細胞の正の選択をした。
【０４２９】
骨髄移植
１．長い骨をＢａｌｂ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウス［ヌード型または野生型（ＷＴ）のどちらか］から採取した。骨を洗浄または粉砕することによって骨髄を抽出して単一の細胞懸濁液を得た。ＷＴマウスから採取したいくつかの調製物を、磁気活性化細胞選別によってＴ細胞除去に供した。骨髄の数を数え、正しい濃度にし、マウスに尾静脈へのｉ．ｖ．注射または眼窩内注射をした。
【０４３０】
２．移植前に、マウスを調整計画に供した。強度減弱前処置（ＲＩＣ）は、マウスを亜致死的照射量（受容者マウスが自発的に回復できる照射量）に供することか、またはマウスを低用量の骨髄破壊薬（例えば、ブスルファン）または非骨髄破壊薬（例えば、シクロホスファミド）に供することかのどちらか一方を含んでいた。ガンマ線機械かまたはＸ線（例えば、ＸＲＡＤ−３２０）かのどちらか一方を使用して全身照射（ＴＢＩ）を施した。薬物は、ｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．または経口で投与した。
【０４３１】
ＯＴ１＋細胞移植
ＯＴ−１遺伝子組換えマウスからリンパ節および／または脾臓を採取した。マウスは、ＣＤ４５．１遺伝子を保有しかつ／またはＲＡＧ−／−突然変異の素性を有するＯＴ−１マウスであった。あるいは、ＯＴ−１マウスは、同種異系現象の排除に有用な、宿主ＸＯＴ−１マウスの子孫であるＦ１−ＯＴ１マウスであった。単一細胞懸濁液を作製し、その後、磁気活性化細胞選別［ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ］によってＴ細胞精製に供した。得られたＯＴ−１  Ｔ細胞集団の純度をＦＡＣＳにより試験した。次いで、細胞を「新しい」細胞として注入するかさもなければ生体外で培養して、上記のＴｃｍ細胞を生じさせた（つまり、オボアルブミン発現マウス由来の照射脾細胞に対する第三者活性化によって生じさせた）。次いで、ＯＴ−１  Ｔｃｍ細胞を、本明細書において記載しているとおりに注射した。
【０４３２】
フローサイトメトリー分析
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析は、改造したＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを使用して行った。Ｖα２、Ｖβ５、Ｈ２Ｄｄ、Ｈ２Ｋｂ、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１９に特異的な標識抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ＢＤ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で細胞を染色した。
【０４３３】
ＣＴＬ活性アッセイ（５１Ｃｒアッセイ）
マウスを屠殺し、脾臓およびＬＮを採取し、ＣＤ８＋の細胞を選抜した（さらに、Ｈ−２Ｄｄに関して負の選択をして「Ｔｃｍ」を除外した）。これらのナイーブＨＴＣを、それらがＣ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）標的を殺傷する能力についてクロム放出アッセイで試験した。標的細胞として使用したＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ脾臓細胞は、２μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で４８時間前処理し、７０μＣｉ５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）に１時間暴露した。エフェクター細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ８＋選抜細胞から調製し、様々な希釈度でＢＡＬＢ／ｃまたはＣ３Ｈ脾臓細胞と接触させて６日間インキュベートすることを、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を含む９６ウェルプレートで各希釈度について１２回反復して行った。６日目に、滴定された数のエフェクター細胞および５×１０３個の５１Ｃｒ標識した標的を、様々なエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比でＶ字底プレート内で混合した。細胞傷害活性は、４時間５１Ｃｒ放出アッセイで測定した。特異的溶解のパーセンテージは、（実験時放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として計算した。培地単独で培養したかまたは１％ＳＤＳで溶解した場合の標的細胞による５１Ｃｒの放出をそれぞれ自然放出または総放出として定義した。
【０４３４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
ＰＢＭＣを患者および健常ボランティアの全血からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により単離した。示している場合には以前に記載されている血清学的方法［Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＨ  ＤＨＥＷ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ７６−５４５、１９７６、ｐ２２］によって細胞をクラスＩ  ＨＬＡに分類した。
【０４３５】
樹状細胞の生成
単球をプラスチック接着により単離し、１％のヒト血清と、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）と、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ハンブルク、ドイツ）とを補充した３ｍｌのＣｅｌｌｇｒｏ  ＤＣ培地を使用して６ウェルプレートで培養した。培養４８時間後、１．５ｍｌの培地を添加した（１６００ＩＵ／ｍｌの＋ＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４）。２４時間後、非付着性細胞を採集し、大きい細胞（ほとんどが未熟ＤＣ）の数を数え、ＧＭ−ＣＳＦ  ８００ＩＵ／ｍｌ、ＩＬ−４  ２０ｎｇ／ｍｌ、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来の１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、ドイツ、ダイセンホーフェン））およびＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００ＩＵ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地中に再懸濁させ、ウェル当たりＤＣ約１０６個で２ｍｌを播種し、一晩インキュベートした。翌日、非付着性細胞を捨て、氷上で２０分間インキュベートした後に冷ＰＢＳ／１％ＨＳを使用して付着ＤＣを静かに取り外した。成熟ＤＣから構成される大きい細胞の数を数えた。潜在的に混入している小数のＮＫ細胞またはメモリーＴ細胞の増殖を回避するために細胞を、３０Ｇｙで照射し、その後、Ｔ細胞刺激のために使用した。
【０４３６】
ＰＢＭＣからのナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の単離
ＣＤ８負選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して最初の負の選択によってナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。抗原を経験したＣＤ８＋Ｔ細胞は、その後にＣＤ４５ＲＯビーズおよびＬＤカラムを使用して除去した。
【０４３７】
抗第三者中枢性メモリーヒトＣＤ８  Ｔ細胞の生成
ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞を単離し、ＩＬ−２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＴ細胞培地中に再懸濁させた。４８ウェルプレートの１ウェル当たりＴ細胞を４×１０５個として１：４のＤＣ：Ｔ細胞比で、照射されたＤＣを添加した。各ウェルの総容量は５００μｌであった。
【０４３８】
培養開始から７２時間後に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を含む５００μｌのＴ細胞培地を添加し、続いて、結果の節において概説しているように２〜３日ごとに細胞への補給をした。
【０４３９】
統計解析
生存率データの解析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（対数順位検定）を用いて行った。平均の比較は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。
【０４４０】
実施例１
ＭＨＣ不一致Ｔｃｍは同系骨髄環境下で宿主マウスにおいて生存し、特異的ｖｅｔｏ活性を発揮する
ヒトにおいて同系骨髄移植（ＢＭＴ）は、致死的全身照射（ＴＢＩ）との関連で施される場合でさえ同種異系ＢＭＴよりもはるかに安全である、ということを考慮して、本発明者らはまず、養子移入させたＦ１−Ｔｃｍ細胞が、同系ＴＤＢＭＴと一緒に注入された場合に宿主抗提供者ＨＴＣの攻撃に耐え抜くか否かについて、判定することを試みた（図１Ａ〜Ｂ）。図２Ａ〜Ｂから分かるように、Ｆ１−Ｔｃｍは移植後６０日目に末梢血中に存続していた。Ｔｃｍ細胞は、ＣＤ８＋総画分の約１３％±１０を占めていた（データは示さず）。次に、Ｔｃｍが野生型多クローン性ＨＴＣ母集団内での抗原特異的クローンの消滅を引き起こす能力を評価するため、および残存するＨＴＣがその機能性を保持することを検証するために、クロム放出殺傷アッセイを採用した。結果は、Ｔｃｍ処置マウス由来のＨ２ｂＣＤ８＋ＨＴＣがＨ−２ｄ標的殺傷の著しい軽減を呈し、かつＨ−２ｋ標的殺傷の能力を保持した一方、Ｔｃｍで処置しなかったマウス（すなわちＢＭ単独群）がどちらの細胞タイプに対しても同様のレベルの殺傷を呈した、ということを示している（図３）。これらの結果は、Ｔｃｍが多クローン性ＨＴＣ母集団に対して特異的なｖｅｔｏ活性を発揮することを指し示しており、Ｔｃｍによって消滅しなかったクローンがその機能性を保持することを裏付けている。続いて、臨床実施により適する強度減弱前処置（ＲＩＣ）で調整したマウスにおいてこれらの実験を繰り返した。それゆえ、同系Ｔ細胞除去骨髄（ＴＤＢＭＴ）および同種異系（Ｂａｌｂ  ｘ  Ｂｌａｃｋ）Ｆ１  Ｔｃｍ（図１Ｃに示す）を注射された、５．５ＧｙのＴＢＩで亜致死的に照射されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける研究では、同様の結果が得られた（図４）。Ｔｃｍ細胞は、これらのマウスの末梢血中に１５ヶ月以上存在した（実験終了時。データは示さず）。したがって、ＭＨＣ不一致Ｔｃｍの生存率は、亜致死的な５．５Ｇｙ  ＴＢＩおよび自家ＢＭＴによる調整を含む非常に安全な手順のもとで誘導される。
【０４４１】
実施例２
ＭＨＣ不一致Ｔｃｍは宿主マウスにおいて骨髄移植片の非存在下で生存する
上記のデータに照らして、ＢＭの非存在下でＴｃｍ細胞単独が寛容を誘導する能力を評価した。そのようなプロトコルの行き届く範囲ははるかに広いであろう。具体的には、安全な調整下で抗第三者Ｔｃｍ細胞のみを投与することによる免疫寛容の誘導は、免疫低下状態の個体にとって有益となるだけでなく、非悪性の血液病（例えば貧血およびサラセミア）、自己免疫疾患の処置をおそらくは可能にすることができ、細胞療法を施すための土台を提供できるであろう。最初に、本発明者らは、宿主における寛容誘導を試験することのできるモデルを確立するために、Ｆ１起源のＴｃｍ細胞が生着する最小照射線量を定義することを試みた。この目的のために、ＣＢ６  Ｆ１−Ｔｃｍ細胞の養子移入の有り無し両方でＢａｌｂ／ｃマウスを様々な亜致死的調整の線量に曝露した。末梢全血をＨ２ｄｂ陽性Ｔｃｍ細胞に関して分析することにより、Ｔｃｍを検出できた（すなわち、Ｔｃｍ細胞が拒絶されなかった）最小照射線量が５．５Ｇｙ  ＴＢＩであったことが示された（図５）。よって、５．５Ｇｙの亜致死的ＴＢＩ線量のもとで生存する完全に同種異系のＣ５７ＢＬ／６由来Ｔｃｍの持続性を試験した（図１Ｃ中に描かれているとおり）。この実験は、同種異系起源の細胞がＧＶＨＤを誘導しないこと、および抗提供者Ｔ細胞の消滅を媒介しているのがアロ反応性ではなくｖｅｔｏ活性であることを検証することを意図したものであった。さらに、一旦ヒトに翻訳されれば、「既成の」寛容誘導性Ｔｃｍを生成するために、細胞はおそらく同種異系の非一致型の供給源から派生するであろう。結果は、Ｃ５７ＢＬ／６由来の同種異系Ｔｃｍが５．５Ｇｙで照射された（図１Ｃに描写されている）Ｂａｌｂ／ｃ宿主内で生存することができ、ＣＢ６  Ｆ１  Ｔｃｍを受けているマウスよりも末梢血中のＴｃｍパーセンテージがわずかに低いことを示した（図６Ａ〜Ｂ）。この結果は、Ｔｃｍ細胞の非常に遅い拒絶プロセスに起因している可能性がある。Ｔｃｍ細胞は、ゆうに１年超に亘って血中に存続するが、クロム放出アッセイで検出された抗宿主クローンの排除を考え合わせれば注射後の最初の数ヶ月に亘るそれらの数の減少は、Ｔｃｍが末梢性寛容を誘導することを強く示唆している。
【０４４２】
それゆえ、Ｔｃｍ単独の適用は、少なくとも数ヶ月間、細胞療法などの処置供与の機会の窓口を生み出すために使用される。
【０４４３】
実施例３
ＭＨＣ不一致Ｔｃｍは同じ提供者からの細胞の養子移入を支援する
Ｔｃｍ細胞を養子細胞療法に使用できるという仮説を試験するために、本発明者らは、オボアルブミンペプチドに対するＴＣＲを有する遺伝子組換えＯＴ１マウスを利用した。この文脈でＯＴ１遺伝子組換え細胞を使用する動機は、これらの細胞を、提供者Ｔ細胞の全母集団またはウイルス抗原もしくは腫瘍抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞でのドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）として知られる細胞療法のモデルとして使うことができるという考えに端を発する。
【０４４４】
最初に、ナイーブＣＤ８＋ＯＴ１＋ＣＤ４５．１＋Ｔ細胞を、Ｔｃｍの初期養子移入の９０日後にＴｃｍキメラマウスに注入した。主な目的は、生存しているＴｃｍ母集団が、新たに注入された同種異系細胞の生着を促進できるか否かを明らかにすることであった。ナイーブＴｇ細胞の注射前に、キメラマウスのＴｃｍ母集団をＦＡＣＳにより分析した。かくして、Ｃ５７ＢＬ／６  ＴｃｍまたはＣＢ６−Ｔｃｍを受けたマウスはそれぞれ２／５および９／１１がＴｃｍ母集団を維持した（図６ＡおよびＢ）。
【０４４５】
移植後９０日目にこれらのマウスを（いくつかのＴ細胞を除去して新しいＴ細胞を導入できるようにするために）２ＧｙのＴＢＩでさらに調整し、次いでマウスに２×１０６個のＯＴ１細胞（Ｈ−２ｂ）を注入した。興味深いことに、１２０日目（ＯＴ１細胞移植の３０日後）に評価したところ、ＯＴ１細胞は、移植前にＴｃｍ母集団を呈したマウスでのみ検出された（図７）。Ｔｃｍ母集団を提示しているマウスでは同じ提供者を起源とする細胞の追加が受け入れられ得るということを示しているこれらの予備的結果を、次のとおりに遺伝子組換えＯＴ−１細胞を採用してさらに実証した：二次的調整（以前に９０日目に採用した２ＧｙのＴＢＩ）が必要になるのを防ぐためにＣＤ８＋ＯＴ−１細胞を０日目にＴｃｍと共に移植し、細胞注入後の様々な時点で末梢血中のＯＴ１の存在をモニタリングした。
【０４４６】
図８に示すように、この実験の結果は次のことを示している：
１．Ｃ５７ＢＬ／６  Ｔｃｍおよび（ＢａｌｂｘＣ５７ＢＬ）Ｆ１  Ｔｃｍは、同種異系受容者において存続することができる。
２．Ｃ５７ＢＬ／６  Ｔｃｍは、同時注入された場合にはＣ５７ＢＬ／６  Ｔｃｍの背景（ＯＴ−１＋ＣＤ４５．１＋ＲＡＧ−）のもとに増殖したＣＤ８＋ＯＴ−１ナイーブ細胞の保護をもたらすことができ、さらにＯＴ−１細胞自体は循環系から消失する。
３．Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスのＭＨＣハプロタイプを発現するＣＢ６（Ｆ１）Ｔｃｍもまた、ＯＴ−１ナイーブ細胞の保護をもたらすことができる。
【０４４７】
実施例４
ＯＴ−１マウスの細胞から作り出された抗第三者Ｔｃｍ  ｖｅｔｏ細胞は生体内で生着および生存する
実験は、臨床実施により適する強度減弱前処置（ＲＩＣ）で調整したマウスにおいて行った。こうして、５．５ＧｙのＴＢＩで亜致死的に照射されたＢａｌｂ／ｃマウスに、ＯＴ−１マウス起源の様々な濃度の非同系Ｔｃｍ細胞を注射した（図９に示す）。Ｔｃｍ細胞は、これらのマウスの末梢血中に少なくとも３０日間存在した。したがって、ＭＨＣ不一致Ｔ細胞の生存は、安全なＲＩＣ手順のもとに誘導される。
【０４４８】
本発明をその特定の実施形態と共に記載してきたが、多くの代替、変更および変形が当業者にとって明白であろうことは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲の内にあるそのような代替、改変および変形を全て包含することが意図される。
【０４４９】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許または特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照によって本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示したのと同じ程度にそれらの全体が明細書に組み込まれる。さらに、本明細書におけるいかなる参考文献の引用または特定も、そのような参考文献を本発明の先行技術として利用できることを認めるものとして解釈されるべきでない。節の見出しを使用している限りにおいて、それらは必ずしも限定しているものと解釈されるべきでない。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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