(57)【要約】  ゲラニルゲラニル二リン酸とコパリル二リン酸（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸を形成させること、およびＣＰＰをスクラレオールシンターゼ酵素と接触させて（＋）−マノオールを形成させることを含む（＋）−マノオールを製造する方法であって、ＣＰＰシンターゼが、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、前記方法が本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）−マノオールを製造するための方法であって、以下：
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸とコパリル二リン酸（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸を形成させること、ここで、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む；
ｂ．ＣＰＰとスクラレオールシンターゼ酵素とを接触させて（＋）−マノオールを形成させること；ならびに
ｃ．任意に、（＋）−マノオールを単離すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドと同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドと同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化学もしくは生化学合成または両方の組み合わせを用いて、（＋）−マノオールを（＋）−マノオール誘導体に加工することをさらに含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
誘導体は、アルコール、アセタール、アルデヒド、酸、エーテル、ケトン、ラクトン、アセテートまたはエステルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
誘導体は、カパロール、カパラール、（＋）−マノオールオキシ、Ｚ−１１、γ−アンブロールおよびアンブロックスからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（＋）−マノオール誘導体は、カパロールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（＋）−マノオール誘導体は、カパラールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
（＋）−マノオール誘導体は、マノオールオキシである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
（＋）−マノオール誘導体は、Ｚ−１１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
（＋）−マノオール誘導体は、γ−アンブロールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
（＋）−マノオール誘導体は、アンブロックスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞または非ヒト生物を、コパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、およびスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換するための方法であって、ここで、コパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつここで、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２１】
細胞は、原核細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞は、細菌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞は、真核細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
真核細胞は、酵母細胞または植物細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＰＰシンターゼをコードする核酸とスクラレオールシンターゼをコードする核酸とを含む発現ベクターであって、前記ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、前記発現ベクター。
【請求項２６】
ＣＰＰ酵素をコードする核酸は、配列番号３からなる核酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の配列同一性のヌクレオチド配列を有し、スクラレオールシンターゼ酵素をコードする核酸は、配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％および１００％の類似性を示すヌクレオチド配列を有する、請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２０から２４までのいずれか１項に記載の方法により生成された宿主細胞または非ヒト生物。
【請求項２８】
ＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む非ヒト宿主生物または細胞であって、ここで、ＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、前記非ヒト宿主生物または細胞。
【請求項２９】
スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の非ヒト宿主生物または細胞。
【請求項３０】
請求項２５または２６に記載の発現ベクターを含む、請求項２７から２９までのいずれか１項に記載の宿主生物または細胞。
【請求項３１】
ＧＧＰＰを生成することができる、請求項２７から３０までのいずれか１項に記載の宿主生物または細胞。
【請求項３２】
請求項２７から３１までのいずれか１項に記載の宿主生物または細胞を培養することを含む、（＋）−マノオールを製造するための方法。
【請求項３３】
宿主生物または細胞は、ＧＧＰＰを生成することができる、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、コパリル二リン酸シンターゼおよびスクラレオールシンターゼを用いて（＋）−マノオールを製造する生化学的方法が提供される。
【０００２】
背景
テルペンは、大多数の生物（微生物、動物および植物）において見られる。これらの化合物は、イソプレン単位と呼ばれる５個の炭素単位で構成されており、それらの構造中に存在しているこれらの単位の数によって分類される。したがって、モノテルペン、セスキテルペンおよびジテルペンは、それぞれ１０個、１５個および２０個の炭素原子を含むテルペンである。セスキテルペンは、例えば、植物界に広く見られる。多くのテルペン（例えばセスキテルペン）分子は、その風味および香気特性、ならびにその化粧品効果、薬効および抗菌効果について公知である。多数のテルペン（例えばセスキテルペン）炭化水素およびテルペノイド（例えばセスキテルペノイド）が同定されている。
【０００３】
テルペンの生合成産物は、テルペンシンターゼと呼ばれる酵素を含む。これらの酵素は、非環式テルペン前駆体を１つ以上のテルペン産物に変換する。特に、ジテルペンシンターゼは、前駆体のゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）の環化によりジテルペンを生成する。ＧＧＰＰの環化は、しばしば２つの酵素ポリペプチドを必要とし、それらは、２つの逐次酵素反応において組み合わせて作用するＩ型およびＩＩ型のジテルペンシンターゼである。ＩＩ型ジテルペンシンターゼは、ＧＧＰＰの末端二重結合のプロトン付加により開始されるＧＧＰＰの環化／転位に触媒作用を及ぼし、環式ジテルペン二リン酸中間体をもたらす。次に、この中間体は、イオン化開始環化に触媒作用を及ぼすＩ型ジテルペンシンターゼによりさらに変換される。
【０００４】
ジテルペンシンターゼは、植物およびその他の生物中に存在しており、基質、例えばゲラニルゲラニル二リン酸を用いるが、それらは、異なる産物プロファイルを有する。ジテルペンシンターゼをコードする遺伝子およびｃＤＮＡは、クローン化されており、相応する組換え酵素が特徴づけられている。
【０００５】
コパリル二リン酸シンターゼおよびスクラレオールシンターゼは、植物中で生じる酵素である。したがって、生化学的方法で、これらの酵素および変異体を見いだし、かつそれらの酵素および変異体を用いて、（＋）−マノオールを製造することが望ましい。
【０００６】
概要
本明細書では、（＋）−マノオールを製造する方法であって、以下：
ａ）  ゲラニルゲラニル二リン酸とコパリル二リン酸（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸を形成させること、ここで、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む；
ｂ）  （９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸ＣＰＰとスクラレオールシンターゼとを接触させて（＋）−マノオールを形成させること；ならびに
ｃ）  任意に、（＋）−マノオールを単離すること
を含む方法が提供される。
【０００７】
また本明細書では、ポリペプチドであって、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むポリペプチドも提供される。
【０００８】
また本明細書では、上述のポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【０００９】
また本明細書では、核酸であって、配列番号３に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。
【００１０】
また本明細書では、宿主細胞または非ヒト生物を、コパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドおよびスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換するための方法も提供され、ここで、コパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。また本明細書では、前記方法で生成された宿主細胞または非ヒト生物も提供される。
【００１１】
また本明細書では、ＣＰＰシンターゼをコードする核酸およびスクラレオールシンターゼをコードする核酸を含む発現ベクターも提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【００１２】
また本明細書では、ＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む非ヒト宿主生物または細胞も提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【００１３】
また本明細書では、本発明による宿主生物または細胞を培養することを含む（＋）−マノオールを製造するための方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から（＋）−マノオールへの酵素経路
【図２】ＧＧＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素変換のＧＣＭＳ分析（Ａ：組換えＳｍＣＰＳ酵素を使用、Ｂ：組換えＳｓＳｃＳ酵素を使用、Ｃ：単一アッセイにおけるＳｍＣＰＳとＳｓＳｃＳ酵素の組み合わせ）
【図３】ＳｍＣＰＳ、ＳｓＳｃＳおよびメバロン酸経路酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用して製造した（＋）−マノオールのＧＣＭＳ分析（Ａ：大腸菌培養培地の抽出物のトータルイオンクロマトグラム、Ｂ：（＋）−マノオール標準のトータルイオンクロマトグラム、Ｃ：クロマトグラムＡにおける主ピーク（保持時間１４．５５分）の質量スペクトル、Ｄ：（＋）−マノオール標準試料の質量スペクトル）
【図４】ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から（＋）−マノオールおよびスクラレオールへの酵素経路
【００１５】
詳細な説明
使用した略語
ｂｐ            塩基対
ｋｂ            キロ塩基
ＤＮＡ          デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        相補的ＤＮＡ
ＣＰＰ          コパリル二リン酸
ＤＴＴ          ジチオトレイトール
ＦＰＰ          ファルネシル二リン酸
ＧＧＰＰ        ゲラニルゲラニル二リン酸
ＧＣ            ガスクロマトグラフ
ＩＰＴＧ        イソプロピル−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド
ＬＢ            溶原培地
ＭＳ            質量分析計
ＭＶＡ          メバロン酸
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ          リボ核酸
ｍＲＮＡ        メッセンジャーリボ核酸
ｍｉＲＮＡ      マイクロＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ      低分子干渉ＲＮＡ
ｒＲＮＡ        リボソームＲＮＡ
ｔＲＮＡ        転移ＲＮＡ
【００１６】
定義
「ポリペプチド」という用語は、連続して重合したアミノ酸残基、例えば少なくとも１５残基、少なくとも３０残基、少なくとも５０残基のアミノ酸配列を意味する。本明細書において提供されるいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、酵素、またはその断片、またはその変異体であるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
「単離された」ポリペプチドという用語は、その自然環境から当該技術分野で公知の任意の方法または方法の組み合わせにより取り出されたアミノ酸配列を指す。
【００１８】
「タンパク質」という用語は、共有ペプチド結合によって結合している任意の長さのアミノ酸配列を指し、その用語には、自然起源であるかまたは合成であるかにかかわらず、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドおよび全長タンパク質が含まれる。
【００１９】
「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、（＋）−マノオールの形成に触媒作用を及ぼすための、ＣＰＰシンターゼおよびスクラレオールシンターゼの活性の能力を指す。ＣＰＰシンターゼの「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」は、例えば、ＧＧＰＰからの（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸の形成に触媒作用を及ぼすためのＣＰＰシンターゼの能力を指してよい。スクラレオールシンターゼの「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」は、例えば、（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸からの（＋）−マノオールの形成に触媒作用を及ぼすためのスクラレオールシンターゼの能力を指してよい。
【００２０】
スクラレオールシンターゼは、図４に示されるようなラブデンジオール二リン酸（ＬＰＰ）からのスクラレオールの形成に触媒作用を及ぼす能力を有する酵素、例えば自然起源の酵素を指してよい。ＬＰＰは、ラブデンジオール二リン酸シンターゼ（ＬＰＳ）の作用によりＧＧＰＰから生成されうる（図４参照）。本発明で使用する場合、そのようなスクラレオールシンターゼは、前述の通り、（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸からの（＋）−マノオールの形成に触媒作用を及ぼすための能力も有する。例えばスクラレオールシンターゼの変異体、断片および切断型が本発明で使用されてよいが、ただし、これらは、（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリル二リン酸からの（＋）−マノオールの形成に触媒作用を及ぼす能力も有するものであることが理解されるであろう。さらに、そのような例えばスクラレオールシンターゼ酵素の変異体、断片または切断型が、本発明での使用に対するそれらの適性を損なうことなく、ＬＰＰからのスクラレオールの形成に触媒作用を及ぼす能力のいくつかまたはすべてを失っている可能性があることが理解されるであろう。
【００２１】
「核酸配列」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの配列の意味と互換的に使用される。核酸配列は、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、または任意の長さのリボヌクレオチドであってよく、遺伝子のコード配列および非コード配列、エクソン、イントロン、センスおよびアンチセンス相補的配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、組換え核酸配列、単離および精製された自然起源のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、断片、プライマーおよび核酸プローブを含む。当業者は、ＲＮＡの核酸配列が、ＤＮＡ配列と同一であるが、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置き換えられている点が異なることを認識している。
【００２２】
「単離された核酸」または「単離された核酸配列」は、核酸または核酸配列が自然に生じる環境とは異なる環境にある核酸または核酸配列であると定義される。核酸に適用される、本明細書で使用される「自然起源」という用語は、自然界の細胞内に見られる核酸を指す。例えば、生物内、例えば生物の細胞内に存在している核酸配列、自然界の供給源から単離することができる核酸配列、および研究室で人間によって意図的に改変されていない核酸配列が、自然起源のものである。
【００２３】
「組換え核酸配列」は、１つより多い供給源からの遺伝子材料を一緒にして、自然に生じず、そうでなければ生物内に見られない核酸配列を作り出す研究室的方法（分子クローニング）の使用によってもたらされる核酸配列である。
【００２４】
「組換えＤＮＡ技術」は、組換え核酸配列を作製するための分子生物学の手法を指し、例えば、ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ編集のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｓ、２００２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載の通りである。
【００２５】
「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ分子中に、例えば細胞内のｍＲＮＡ中に転写される領域を含み、好適な調節領域、例えばプロモーターに作動可能に結合されたＤＮＡ配列を意味する。したがって、１つの遺伝子は、いくつかの作動可能に結合した配列、例えばプロモーター、５’リーダー配列、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのコード領域、イントロン、エクソン、および／または３’非翻訳配列、例えば転写終結部位を含む３’非翻訳配列を含む。
【００２６】
「キメラ遺伝子」は、通常、種において自然界で見られない任意の遺伝子、特に、自然界で互いに関連していない核酸配列の１つ以上の部分が存在している遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、自然界では転写領域の一部もしくはすべて、または他の調節領域と関連していない。「キメラ遺伝子」という用語は、プロモーターまたは転写制御配列が、１つ以上のコード配列に、またはアンチセンス、すなわちセンス鎖の逆相補鎖、もしくは逆方向反復配列（センスおよびアンチセンス、ここで、ＲＮＡ転写物は、転写に応じて二本鎖ＲＮＡを形成する）に作動可能に結合した発現構築物を含むものであると理解される。「キメラ遺伝子」という用語は、新しい遺伝子を生成するために１つ以上のコード配列の一部の組み合わせによって得られた遺伝子も含む。
【００２７】
「３’ＵＴＲ」または「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」または「３’末端」とも呼ばれる）は、遺伝子のコード配列の下流に見られる核酸配列であって、例えば、転写終結部位および（大部分であるが、しかしすべてではない真核性ｍＲＮＡにおける）ポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＵＡＡＡまたはその変異体を含む核酸配列を指す。転写の終了後、ｍＲＮＡ転写物は、ポリアデニル化シグナルの下流で切断されてよく、またポリ（Ａ）テールが付加されてよく、これは、翻訳の場所、例えば細胞質へのｍＲＮＡの輸送に関与するものである。
【００２８】
「遺伝子の発現」は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を含む。過剰発現は、類似の遺伝的背景の形質転換されていない細胞または生物における生成の程度を超過する、トランスジェニック細胞または生物におけるｍＲＮＡ、ポリペプチドおよび／または酵素活性の程度により測定される遺伝子産物の生成を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、異種のまたは外来性のＤＮＡを宿主細胞へ送達するための分子生物学的手法および組換えＤＮＡ技術を用いて操作された核酸分子を意味する。発現ベクターは、一般的に、ヌクレオチド配列の適切な転写に求められる配列を含む。コード領域は、通常、対象のタンパク質をコードするが、ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどをコードすることもできる。
【００３０】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、任意の直鎖状または環状の組換えベクターを含み、これには、ウィルスベクター、バクテリオファージおよびプラスミドが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、発現系にしたがって好適なベクターを選択することができる。１つの実施形態では、発現ベクターは、少なくとも１つの制御配列に作動可能に結合される本明細書における実施形態の核酸と、任意に、少なくとも１つの選択マーカーとを含み、前記制御配列は、転写、翻訳、開始および終結を制御し、例えば転写のプロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、またはｍＲＮＡのリボソーム結合部位である。ヌクレオチド配列は、制御配列が、本明細書における実施形態の核酸に機能的に関連する場合に「作動可能に結合」している。「制御配列」は、本明細書における実施形態の核酸配列の発現レベルを決定する核酸配列を指し、制御配列に作動可能に結合した核酸配列の転写の速度を調節できる。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写因子、プロモーターエレメントなどを含む。
【００３１】
「プロモーター」は、コード配列の発現を、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に必要な他の因子のための結合部位を提供することによって制御する核酸配列を指し、転写因子結合部位、リプレッサーおよび活性化タンパク質結合部位が含まれるが、これらに限定されない。プロモーターという用語の意味には、「プロモーター制御配列」という用語も含まれる。プロモーター制御配列には、転写、ＲＮＡプロセシングまたは関連するコード核酸配列の安定性に影響を与えうる上流および下流のエレメントが含まれてよい。プロモーターには、天然由来および合成の配列が含まれる。コード核酸配列は、通常、転写開始部位で始まる転写の方向に対してプロモーターの下流に位置している。
【００３２】
「構成的プロモーター」という用語は、作動可能に結合された、核酸配列の連続的な転写を可能にする調節されていないプロモーターを指す。
【００３３】
本明細書で使用される通り、「作動可能に結合」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に「作動可能に結合」されている。例えば、プロモーター、もっと厳密に言えば転写制御配列は、それがコード配列の転写に作用する場合、コード配列に作動可能に結合している。作動可能に結合とは、結合しているＤＮＡ配列が、一般的に隣接していることを意味する。プロモーター配列に関連付けられたヌクレオチド配列は、形質転換されるべき植物に関して相同または異種であってよい。前記配列は、完全に合成されているか、または部分的に合成されていてもよい。起源にかかわらず、プロモーター配列に関連付けられた核酸配列は、本明細書における実施形態のポリペプチドへの結合後に結合するプロモーターの特性にしたがって発現されるか、または発現停止されている。関連付けられた核酸は、生物を通して常にもしくは代替的に特定の時点で、または特定の組織、細胞または細胞コンパートメントにおいて、発現または抑制されるのが望ましいタンパク質をコードすることができる。そのようなヌクレオチド配列は、特に、それによって変化または形質転換される宿主細胞または生物に所望の表現形質を付与するタンパク質をコードする。より具体的には、関連付けられたヌクレオチド配列は、生物内の（＋）−マノオールシンターゼの生成をもたらす。
【００３４】
「標的ペプチド」は、タンパク質を細胞内オルガネラ、すなわちミトコンドリアもしくはプラスチド、または細胞外空間に向かわせるアミノ酸配列、またはポリペプチド（分泌シグナルペプチド）を指す。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ末端、例えばＮ−末端をコードする核酸配列と融合されてよいか、または天然のターゲティングポリペプチド（ｎａｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を置き換えるために使用されてよい。
【００３５】
「プライマー」という用語は、鋳型核酸配列にハイブリダイズされ、鋳型に相補的な核酸配列の重合に用いられる短い核酸配列を指す。
【００３６】
本明細書で使用される通り、「宿主細胞」または「形質転換細胞」という用語は、少なくとも１つの核酸分子、例えば、転写に応じてＣＰＰシンターゼタンパク質およびスクラレオールシンターゼタンパク質を生じるか、または（＋）−マノオールを一緒に生成する、所望のタンパク質または核酸配列をコードする組換え遺伝子を持つ（ｈａｒｂｏｒ）ように変えられた細胞（または生物）を指す。
【００３７】
宿主細胞は、特に細菌細胞、真菌細胞または植物細胞である。宿主細胞は、宿主細胞の核またはオルガネラゲノムに組み込まれている組換え遺伝子を含んでよい。代替的に、宿主は、組換え遺伝子を染色体外に含んでよい。相同配列には、オーソロガスまたはパラロガス配列が含まれる。系統発生法を含むオーソロガスまたはパラロガスの同定方法、配列類似性およびハイブリダイゼーション法は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【００３８】
パラログは、類似の配列および類似の機能を有する２つ以上の遺伝子を生じさせる遺伝子重複によってもたらさされる。一般的に、パラログは、共にクラスター形成し、遺伝子の重複により関連する植物種内で形成される。パラログは、ペアワイズＢｌａｓｔ分析を使用する類似遺伝子の群において、またはプログラム、例えばＣＬＵＳＴＡＬを使用する遺伝子ファミリーの系統発生解析の間において見出される。パラログでは、コンセンサス配列は、関連遺伝子内にあり、遺伝子の類似の機能を有する配列に対して識別された特性であってよい。
【００３９】
オーソログ、またはオーソロガス配列は、互いに類似の配列であり、それというのも、それらが、共通祖先に由来する種に見られるからである。例えば、共通祖先を有する植物種は、類似の配列および機能を有する多くの酵素を含むことが知られている。当業者は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＢＬＡＳＴプログラムを使用して、１つの種についての遺伝子ファミリーの多遺伝子系図（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ  ｔｒｅｅ）を構築することによって、オーソロガス配列を同定して、オーソロガスの機能を予見することができる。
【００４０】
「選択可能マーカー」という用語は、発現に応じて、選択可能マーカーを含む１つまたは複数の細胞を選択するために使用することができる任意の遺伝子を指す。選択可能マーカーの例は、以下に記載されている。当業者は、種々の抗生物質選択可能マーカー、殺菌剤選択可能マーカー、栄養要求性選択可能マーカーまたは除草剤の選択可能マーカーが、種々の標的の種に適用できることを知るであろう。
【００４１】
「生物」という用語は、任意の非ヒト多細胞または単細胞生物、例えば植物、または微生物を指す。特に、微生物は、細菌、酵母、藻類または真菌である。
【００４２】
「植物」という用語は、再生植物体、または植物の一部、または植物器官、例えば根、茎、葉、花、花粉、胚珠、胚芽、果実などを生じさせる植物プロトプラスト、植物組織、植物細胞組織培養物を含む植物細胞を含むものと互換的に使用される。任意の植物は、本明細書における実施形態の方法を実施するために使用することができる。
【００４３】
本明細書の記載および添付の特許請求の範囲に関して、「または」の使用は、特に記載がない限り「および／または」を意味する。同様に、「（１つを）含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「（複数を）含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「（１つを）含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」「（複数を）含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、制限を意図するものではない。
【００４４】
さらに、種々の実施形態の説明が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用している箇所において、当業者は、いくつかの詳細な事例では、実施形態が「実質的に〜からなる」または「からなる」という言葉を使用して代替的に説明されうることを理解する。
【００４５】
本明細書における１つの実施形態は、宿主細胞または非ヒト生物を、コパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で、およびスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換するための方法を提供し、ここで、コパリル二リン酸活性を有するポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。特に、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本明細書における１つの実施形態は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を生成可能であり、かつコパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドを発現するように形質転換され、そしてスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現するためにさらに形質転換される非ヒト宿主生物または細胞を培養することを含む方法を提供し、ここで、コパリル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。特に、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【００４７】
さらに本明細書において、ＣＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現ベクターが提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、さらに、その発現ベクターは、スクラレオールシンターゼ酵素をコードする核酸を含む。特に、スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。特別な実施形態では、２つの酵素は、同一の細胞内で形質転換された２つの異なるベクター上にあってよい。さらなる実施形態では、２つの酵素は、２つの異なる細胞内で形質転換された２つの異なるベクター上にあってよい。
【００４８】
さらに本明細書において、ＣＰＰシンターゼをコードする少なくとも１つの核酸およびスクラレオール酵素をコードする少なくとも１つの核酸を持つように形質転換された非ヒト宿主生物または細胞が提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特に、スクラレオールシンターゼは、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４９】
１つの実施形態では、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
１つの実施形態では、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
１つの実施形態では、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
１つの実施形態では、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
１つの実施形態では、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３に対して９９％または１００％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３と同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００５５】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００５６】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１に対して少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００５７】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００５８】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１に対して少なくとも９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１と同一であるアミノ酸配列を示すポリペプチドを含む。
【００５９】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６０】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２に対して少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６１】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２に対して少なくとも９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６２】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２に対して少なくとも９９％または１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６３】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６４】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼ酵素をコードする核酸は、配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００６５】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６６】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６７】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６８】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６９】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号４と同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７０】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７１】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７２】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９８％、９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７３】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９９％または１００％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７４】
１つの実施形態では、スクラレオールシンターゼは、配列番号５と同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７５】
別の実施形態では、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターが本明細書において提供される。発現ベクターは、本明細書に記載の１つ以上の核酸を含んでよい。
【００７６】
別の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸を持つように形質転換され、それによって、本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドを異種発現するか、または過剰発現する非ヒト宿主生物または細胞が本明細書において提供される。
【００７７】
１つの実施形態では、本明細書において提供される非ヒト宿主生物は、植物、原核生物または真菌である。
【００７８】
１つの実施形態では、本明細書において提供される非ヒト宿主は、微生物、特に細菌または酵母である。
【００７９】
１つの実施形態では、本明細書において提供される非ヒト生物は、大腸菌および前述の酵母は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００８０】
１つの実施形態では、本明細書において提供される非ヒト生物は、サッカロミセス・セレビジエである。
【００８１】
１つの実施形態では、前記細胞は、原核細胞である。
【００８２】
別の実施形態では、前記細胞は、細菌細胞である。
【００８３】
１つの実施形態では、前記細胞は、真核細胞である。
【００８４】
１つの実施形態では、真核細胞は、酵母細胞または植物細胞である。
【００８５】
１つの実施形態では、（＋）−マノオールを製造するプロセスは、（＋）−マノオールを少なくとも９８％または９８．５％の純度で製造する。
【００８６】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法は、化学もしくは生化学合成または両方の組み合わせを使用して、当該技術分野で一般に知られている方法を用いて、（＋）−マノオールを誘導体に加工することをさらに含む。
【００８７】
１つの実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、炭化水素、アルコール、アセタール、アルデヒド、酸、エーテル、ケトン、ラクトン、アセテートおよびエステルからなる群から選択されるものである。
【００８８】
本発明の任意の実施形態によれば、前述の（＋）−マノオール誘導体は、１個、２個または３個の酸素原子を任意に含むＣ10〜Ｃ25化合物である。
【００８９】
さらなる実施形態では、前記誘導体は、マノオールアセテート（（３Ｒ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−１−ペンテン−３−イルアセテート）、コパロール（（２Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ペンテン−１−オール）、コパロールアセテート（（２Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ペンテン−１−イルアセテート）、コパラール（（２Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ペンテナール）、（＋）−マノオールオキシ（４−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ブタノン）、Ｚ−１１（（３Ｓ，５ａＲ，７ａＳ，１１ａＳ，１１ｂＲ）−３，８，８，１１ａ−テトラメチルドデカヒドロ−３，５ａ−エポキシナフト［２，１−ｃ］オキセピン）、γ−アンブロール（２−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］エタノール）およびＡｍｂｒｏｘ（登録商標）（（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン）からなる群から選択されるものである。
【００９０】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法は、（＋）−マノオールと、好適な反応系とを接触させて、前述の（＋）−マノオールを好適な（＋）−マノオール誘導体に変換することをさらに含む。前述の好適な反応系は、酵素的性質（例えば、１つ以上の酵素を必要とする）または化学的性質（例えば、１つ以上の合成化学物質を必要とする）の反応系であってよい。
【００９１】
例えば、（＋）−マノオールを、文献、例えば米国特許第７，２９４，４９２号明細書（US7,294,492）に記載のプロセスを用いて、酵素によってマノオールオキシまたはγ−アンブロールに変換することができ、ここで、前述の特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
さらに別の実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、コパロール、およびＣ1〜Ｃ5カルボン酸とのそのエステルである。
【００９３】
さらに別の実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、Ｃ1〜Ｃ5カルボン酸との（＋）−マノオールエステルである。
【００９４】
１つの実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、コパラールである。
【００９５】
１つの実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、マノオールオキシである。
【００９６】
さらに別の実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、Ｚ−１１である。
【００９７】
１つの実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、γ−アンブロールであるか、またはその混合物およびＣ1〜Ｃ5カルボン酸とのそのエステルであり、特に、γ−アンブロールおよびそのエステルである。
【００９８】
さらなる実施形態では、（＋）−マノオール誘導体は、Ａｍｂｒｏｘ（登録商標）、スクラレオリド（３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン−２（１Ｈ）−オンおよびあらゆるそのジアステレオマーおよび立体異性体としても公知）、３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチルドデカヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］クロメン−３−オールまたは３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチル−４ａ，５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ，１０ｂ−デカヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］クロメンおよびあらゆるそれらのジアステレオマーおよび環状ケトン型立体異性体および開環型立体異性体、（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール  ＤＯＬ、γ−アンブロールである。
【００９９】
前述の誘導体（例えばトリエン炭化水素、アセテートまたはコパロール）の取得方法の具体例は、実施例に詳述されている。
【０１００】
例えば、本発明により得られるマノオールは、欧州特許出願公開第２１２２５４号明細書（EP212254）にしたがって、マノオールオキシ（ケトン、公知の方法による）にして、次にアンブロール（アルコール）およびアンブロックス（エーテル）にすることができる。
【０１０１】
特定のセスキテルペンの合成に触媒作用を及ぼすためのポリペプチドの能力は、本明細書において提供される実施例に詳述される酵素アッセイを実施することにより確認することができる。
【０１０２】
ポリペプチドは、切断されたポリペプチドを含むことも意図されているが、ただし、それらは、それらの（＋）−マノオールシンターゼ活性およびそれらのスクラレオールシンターゼ活性を維持する。例えば、切断されたＣＰＰシンターゼポリペプチドは、本明細書で上記に定義されている通り、ＣＰＰシンターゼの活性を有する。例えば、切断されたスクラレオールシンターゼポリペプチドは、本明細書で上記に定義されている通り、スクラレオールシンターゼの活性を有する。
【０１０３】
本明細書で以下に意図される通り、本明細書に記載の配列を改変することによって得られたヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、例えば任意の種類の突然変異、例えば欠失変異、挿入変異または置換変異を導入することによって実施することができる。そのような方法の例は、変異体ポリペプチドおよびそれらを作製するための方法に関連する説明の部分に挙げられている。
【０１０４】
２つのペプチドまたはヌクレオチド配列の間の同一性の百分率は、これらの２つの配列のアライメントが行われた場合に２つの配列において同一であるアミノ酸またはヌクレオチド残基の数の関数である。同一の残基は、アライメントの所定の位置で２つの配列において同じである残基として定義される。配列同一性の百分率は、本明細書で使用される通り、２つの配列の間で同一の残基の数を選び、それを最短の配列における残基の総数で除して、１００を乗じることにより、最適なアライメントから計算される。最適なアライメントは、同一性の百分率が可能な限り高いアライメントである。ギャップは、最適なアライメントを得るために、アライメントの１つ以上の位置で一方または両方の配列に導入されてよい。これらのギャップは、その場合、配列同一性の百分率の計算について同一ではない残基として考慮される。アミノ酸または核酸配列の同一性の百分率を決定するためのアライメントは、コンピュータプログラム、および例えば、ワールドワイドウェブ上で入手可能な公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用してさまざまな方法で実現することができる。好ましくは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）から、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手可能な、デフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１９９９、１７４：２４７〜２５０、１９９９）を、タンパク質または核酸配列の最適なアライメントを得るために、かつ配列同一性の百分率を計算するために使用することができる。
【０１０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＧＰＰと接触されるポリペプチドは、標準タンパク質または酵素抽出技術を用いて、前記ポリペプチドを発現する任意の生物から抽出することにより得ることができる。宿主生物が、本明細書における実施形態のポリペプチドを培養培地に放出する単細胞の生物または細胞である場合、ポリペプチドは、培養培地から、例えば遠心分離、任意にそれに続く洗浄工程および好適な緩衝液への再懸濁によって容易に採取することができる。前記生物または細胞が、その細胞内にポリペプチドを蓄積する場合、ポリペプチドは、細胞の分裂または溶解、およびさらに細胞溶解物からのポリペプチドの抽出により得ることができる。
【０１０６】
別の特定の実施形態によれば、前述の実施形態のいずれかの方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。本明細書において提供されるこれらの実施形態は、その方法をｉｎ  ｖｉｖｏで、ポリペプチドをあらかじめ単離せずに実施することが可能であるため、特に有利である。反応は、前述のポリペプチドを発現するように形質転換された生物または細胞内で直接起こる。
【０１０７】
したがって、例えば、（＋）−マノオールは、本明細書に記載の宿主細胞または生物を培養することによってＧＧＰＰから製造することができる。
【０１０８】
生物または細胞は、ポリペプチドを「発現する」ように意図されているが、ただし、生物または細胞は、前述のポリペプチドをコードする核酸を持つように形質転換され、この核酸が、ｍＲＮＡに転写されて、ポリペプチドが、宿主生物または細胞内に見られる。「発現する」という用語は、「異種発現」および「過剰発現」を含み、後者は、形質転換されていない生物または細胞において測定されるｍＲＮＡ、ポリペプチドおよび／または酵素活性の程度を超えた、または上回る程度を指す。非ヒト宿主生物または細胞を形質転換するための好適な方法のさらに詳細な説明は、そのような形質転換された非ヒト宿主生物または細胞のために設けられた本明細書の後半の一部に記載することにする。
【０１０９】
特定の生物または細胞は、本明細書に記載の核酸による形質転換の前か、または前述の核酸とともに、ＦＰＰを自然に生成する場合か、またはＦＰＰを自然に生成しないがＦＰＰを生成するように形質転換される場合に、「ＦＰＰを生成することができる」ことが意図される。天然に存在する生物または細胞よりも多い量のＦＰＰを生成するために形質転換された生物または細胞も、「ＦＰＰを生成することができる生物または細胞」に包含される。生物、例えば微生物を形質転換して、ＦＰＰを生成するための方法は、当該技術分野ですでに公知である。例えば、微生物は、形質転換されてよい。
【０１１０】
特定の生物または細胞は、本明細書に記載の核酸による形質転換の前か、または前述の核酸とともに、ＧＧＰＰを自然に生成する場合か、またはＧＧＰＰを自然に生成しないがＧＧＰＰを生成するように形質転換される場合に、「ＧＧＰＰを生成することができる」ことが意図される。天然に存在する生物または細胞よりも多い量のＧＧＰＰを生成するために形質転換された生物または細胞も、「ＧＧＰＰを生成することができる生物または細胞」に包含される。生物、例えば微生物を形質転換して、ＧＧＰＰを生成するための方法は、当該技術分野ですでに公知である。
【０１１１】
本明細書における実施形態の方法をｉｎ  ｖｉｖｏで実施するのに好適な非ヒト宿主生物は、任意の非ヒト多細胞または単細胞の生物であってよい。特定の実施形態では、本明細書における実施形態をｉｎ  ｖｉｖｏで実施するために使用される非ヒト宿主生物は、植物、原核生物または真菌である。任意の植物、原核生物または真菌を使用することができる。特に有用な植物は、大量のテルペンを自然に生成するものである。さらに特定の実施形態では、本明細書における実施形態の方法をｉｎ  ｖｉｖｏで実施するために使用される非ヒト宿主生物は、微生物である。任意の微生物を使用することができるが、さらにより特定の実施形態によれば、前述の微生物は、細菌または酵母である。最も特に、前述の細菌は、大腸菌であり、前述の酵母は、サッカロミセス・セレビジエである。
【０１１２】
これらの生物のいくつかは、ＧＧＰＰを自然に生成しないか、または少量のみ生成する。本明細書における実施形態の方法を実施するのに好適であるためには、これらの生物は、前述の前駆体を生成するように形質転換されるか、または前述の前駆体を大量に生成するように形質転換されなければならない。それらは、上に説明した通り、前述の実施形態のいずれかに記載の核酸による改変の前か、または同時に形質転換されうる。
【０１１３】
生物は、例えば、ＧＧＰＰシンターゼをコードする核酸で形質転換されてよい。核酸は、本明細書に記載の通り、ＣＰＰシンターゼをコードする核酸またはスクラレオールシンターゼをコードする核酸と同一または異なる発現ベクターに含まれてよい。ＧＧＰＰシンターゼは、例えば、配列番号７のアミノ酸配列を含んでよい。ＧＧＰＰシンターゼをコードする核酸は、例えば、配列番号８の核酸配列を含んでよい。本明細書および本発明の実施例に記載の形質転換法が使用されてよい。
【０１１４】
生物は、ＦＰＰをもたらすメバロン酸経路の一部または全体をコードする１つ以上の核酸で形質転換されてよい。本発明の実施例に記載の方法が使用されてよい。
【０１１５】
単離された高等真核細胞を、完全な生物の代わりに、宿主として使用して、本明細書における実施形態の方法をｉｎ  ｖｉｖｏで実施できる。好適な真核細胞は、任意の非ヒト細胞であってよいが、特に植物または真菌細胞である。
【０１１６】
別の特定の実施形態によれば、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて使用されるか、または本明細書に記載の核酸によってコードされる、ＣＰＰシンターゼ活性およびスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、遺伝子操作によって得られた変異体であってよいが、ただし、前述の変異体は、そのＣＰＰシンターゼ活性およびそのスクラレオールシンターゼ活性を維持する。変異体ＣＰＰシンターゼポリペプチドは、例えば、本明細書の上記に定義されたＣＰＰシンターゼの活性を有する。変異体スクラレオールシンターゼポリペプチドは、例えば、本明細書の上記に定義されたスクラレオールシンターゼの活性を有する。
【０１１７】
本明細書で使用される通り、ポリペプチドは、本明細書で同定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはペプチド断片、および切断または変異体ポリペプチドであると意図されるが、ただし、それらは、本明細書で定義されるそれらのＣＰＰシンターゼ活性およびそれらのスクラレオールシンターゼ活性を維持する。
【０１１８】
「活性を維持する」とは、例えば、ポリペプチドが、変異していないか、または切断されていないポリペプチドの本来の活性の少なくとも一部、例えば活性の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％を維持することを意味してよい。変異体または切断されたポリペプチドは、いくつかの場合では、変異していないか、または切断されていないポリペプチドと比べて活性が増加している。
【０１１９】
変異体ポリペプチドの例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象からか、または本明細書に記載のポリペプチドのタンパク質分解的切断から生じる天然に存在するタンパク質である。タンパク質分解に起因する多様性は、例えば、本明細書における実施形態のポリペプチドからの１つ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解除去により、異なる種類の宿主細胞での発現に応じたＮ−末端またはＣ−末端の相違を含む。以下に記載される、本明細書における実施形態の核酸の自然突然変異または人為突然変異により得られる核酸によってコードされるポリペプチドも、本明細書における実施形態に包含される。
【０１２０】
アミノ末端およびカルボキシル末端での追加のペプチド配列の融合から生じるポリペプチド変異体を、本明細書における実施形態の方法において使用することもできる。特に、そのような融合は、ポリペプチドの発現を高めることができ、タンパク質の精製において有用でありうるか、または所望の環境もしくは発現系におけるポリペプチドの酵素活性を改善することができる。そのような追加のペプチド配列は、例えば、シグナルペプチドであってよい。したがって、本明細書において、変異体ポリペプチド、例えば別のオリゴペプチドもしくはポリペプチドとの融合により得られた変異体ポリペプチド、および／またはシグナルペプチドに結合した変異体ポリペプチドを使用する方法が包含される。他の機能性タンパク質、例えばテルペン生合成経路からの他のタンパク質との融合から生じたポリペプチドは、有利には、本明細書における実施形態の方法で使用することもできる。
【０１２１】
前述の通り、本明細書における実施形態のポリペプチドをコードする核酸は、前記方法がｉｎ  ｖｉｖｏで実施される場合に使用されることが意図される非ヒト宿主生物または細胞を改変するための有用な手段である。
【０１２２】
したがって、本明細書において、前述の実施形態のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【０１２３】
本明細書における実施形態の核酸は、一本鎖型または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を含むものと定義することができる。「ヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を、別個の断片の形態でまたはより大きい核酸の構成要素として含むものとも理解されるべきである。本明細書における実施形態の核酸は、所定の単離されたヌクレオチド配列も含み、これらには、実質的に内因性物質が混入されていないものが含まれる。本明細書における実施形態の核酸は、切断されていてよいが、ただし、それは、前述の通り、本明細書に包含されるポリペプチドをコードするものである。
【０１２４】
１つの実施形態では、ＣＰＰシンターゼをコードする本明細書における実施形態の核酸は、植物、例えばタンジン（Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、もしくは別の種に自然に存在しているものであるか、または配列番号３を改変することによって得られるものであってよい。
【０１２５】
さらなる実施形態では、スクラレオールシンターゼをコードする本明細書における実施形態の核酸は、植物、例えばクラリセージ（Ｓａｌｖｉａ  ｓｃｌａｒｅａ）、もしくは別の種に自然に存在しているものであるか、または配列番号６を改変することによって得られるものであってよい。
【０１２６】
突然変異は、これらの核酸の任意の種類の突然変異、例えば点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異および／またはフレームシフト突然変異であってよい。変異体核酸は、そのヌクレオチド配列を特異的な発現系に適合させるために作製されてよい。例えば、細菌発現系は、アミノ酸が特定の特別のコドンによってコードされる場合、ポリペプチドをより効率的に発現することが公知である。
【０１２７】
遺伝コードの縮重のため、１つより多いコドンが同じアミノ酸配列をコードすることがあり、多数の核酸配列は、同じタンパク質またはポリペプチドをコードすることができ、ここで、すべてのこれらのＤＮＡ配列が本明細書における実施形態に包含される。適宜、ＣＰＰシンターゼおよびスクラレオールシンターゼをコードする核酸配列は、宿主細胞における発現の増加のために最適化することができる。例えば、本明細書における実施形態のヌクレオチドは、特に発現の改善のための宿主に対するコドンを用いて合成されうる。
【０１２８】
本明細書における実施形態の方法をｉｎ  ｖｉｖｏで実施するのに好適な宿主生物または細胞を形質転換するための他の重要な手段は、本明細書における実施形態の任意の実施形態による核酸を含む発現ベクターである。したがって、そのようなベクターも本明細書において提供される。発現ベクターは、例えば、本明細書に記載の通り、ＣＰＰシンターゼをコードする１つ以上の核酸、スクラレオールシンターゼをコードする核酸、またはＧＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む。
【０１２９】
本明細書における実施形態の少なくとも１つの核酸を持つように形質転換され、その結果、本明細書における実施形態の少なくとも１つのポリペプチドを異種発現または過剰発現する組換え非ヒト宿主生物または細胞も、本発明の実施形態の方法を実施するためのきわめて有用な手段である。したがって、そのような非ヒト宿主生物および細胞も本明細書において提供される。
【０１３０】
前述の実施形態のいずれかに記載の核酸は、非ヒト宿主生物および細胞を形質転換するために使用されてよく、発現されたポリペプチドは、前述のポリペプチドのいずれかであってよい。
【０１３１】
本明細書における実施形態の非ヒト宿主生物は、任意の非ヒト多細胞または単細胞生物であってよい。特定の実施形態では、非ヒト宿主生物は、植物、原核生物または真菌である。任意の植物、原核生物または真菌は、本明細書において提供される方法により形質転換されるのに好適である。特に有用な植物は、大量のテルペンを自然に生成するものである。
【０１３２】
さらに特定の実施形態では、非ヒト宿主生物は、微生物である。任意の微生物は、本明細書において使用されるのに好適であるが、さらにより特定の実施形態によれば、前述の微生物は、細菌または酵母である。最も具体的には、前述の細菌は、大腸菌であり、前述の酵母は、サッカロミセス・セレビジエである。
【０１３３】
単離された高等真核細胞を、完全な生物の代わりに、形質転換することもできる。高等真核細胞は、本明細書では、酵母細胞を除く任意の非ヒト真核細胞を意味する。特定の高等真核細胞は、植物細胞または真菌細胞である。
【０１３４】
変異体は、ポリペプチド骨格に共有結合または非共有結合された改変基の付着により、本明細書における実施形態のポリペプチドとは異なっていてもよい。
【０１３５】
変異体は、導入されたＮ結合型またはＯ結合型グリコシル化部位、および／またはシステイン残基の付加により本明細書に記載のポリペプチドとは異なるポリペプチドも含む。当業者は、アミノ酸配列を改変する、および生物活性を保護する方法を認識するであろう。
【０１３６】
本明細書において提供される実施形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含むが、これらに制限されない。
【０１３７】
遺伝子（本明細書における実施形態のポリヌクレオチドも含む）は、入手可能なヌクレオチド配列情報、例えば添付の配列表で見られる情報に基づいて、および当該技術分野で公知の方法によってクローン化することができる。これらは、例えば、そのような遺伝子のフランキング配列を表すＤＮＡプライマーの設計を含み、そのうち、１つは、センス配向（ｓｅｎｓｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ）で作出され、センス鎖の合成を開始するものであり、もう１つは、逆相補的手法で作り出され、アンチセンス鎖を産生するものである。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼ鎖反応で使用されるものは、そのような実験を実施するために一般的に使用される。あるいは、遺伝子を表すＤＮＡ配列は、化学的に合成されて、続いて、例えば適合する細菌、例えば大腸菌によって増加されうるＤＮＡベクター分子に導入されてよい。
【０１３８】
本明細書において、配列番号３および配列番号６の突然変異により得られた核酸配列が提供され、そのような突然変異は、日常的に行うことができる。１つ以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、挿入、および／または置換がこれらのＤＮＡ配列に導入されうることは当業者には明らかである。
【０１３９】
ＣＰＰシンターゼおよびスクラレオールシンターゼタンパク質をコードする本明細書における実施形態の核酸配列は、ＣＰＰシンターゼおよびスクラレオールシンターゼを宿主細胞または宿主生物中で生成するために、発現ベクターに挿入されてよく、および／または発現ベクターに挿入されたキメラ遺伝子に含まれてよい。導入遺伝子を宿主細胞のゲノム中に挿入するためのベクターは、当該技術分野で公知であり、プラスミド、ウィルス、コスミドおよび人工染色体を含む。キメラ遺伝子が挿入されているバイナリベクターまたは共組込み型ベクター（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）は、宿主細胞を形質転換するためにも使用される。
【０１４０】
本明細書において提供される実施形態は、ＣＰＰシンターゼおよびスクラレオールシンターゼをそれぞれ別個にコードする核酸を含み、関連する核酸配列、例えばプロモーター配列に作動可能に結合している組換え発現ベクターを提供する。
【０１４１】
代替的に、プロモーター配列は、すでにベクター内に存在していてよいため、転写される核酸配列は、プロモーター配列の下流のベクターに挿入される。ベクターは、一般的に、複製起点、多重クローニング部位、および選択可能マーカーを有するように操作される。
【０１４２】
実施例
例１
ジテルペンシンターゼ遺伝子
２つのジテルペンシンターゼ（ＩＩ型およびＩ型ジテルペンシンターゼ）が、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のマノオールへの変換に必要である。これらの例では、ＩＩ型ジテルペンシンターゼの場合、タンジン由来のコパリル二リン酸（ＣＰＰ）シンターゼ（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＢＶ５７８３５．１）を使用した。大腸菌における最適な発現のために、ｃＤＮＡのコドン出現頻度を最適化し、最初の５８個のコドンを除去して、開始コドンＡＴＧを加えた。Ｉ型ジテルペンシンターゼの場合、クラリセージ（ＳｓＳｃＳ）由来のスクラレオールシンターゼを使用した（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＥＴ２１２４６．１、国際公開第２００９０９５３６６号（WO2009095366））。ｃＤＮＡのコドン出現頻度を大腸菌発現のために最適化し（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ９４０２５）、５０個の最初のＮ末端コドンを除去した。これらの２つのｃＤＮＡのそれぞれを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成して、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識部位に隣接させたｐＪ２０８プラスミドにおいてクローン化した（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ９４０２５、ＵＳＡ）。
【０１４３】
例２
発現プラスミド
ｃＤＮＡをコードする改変させたＣＰＰシンターゼ（ＳｍＣＰＳ２）およびスクラレオールシンターゼ（ＳｓＳｃＳ）を、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、それぞれ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＳｍＣＰＳ２発現プラスミドおよびｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔ発現プラスミドを提供するｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドにライゲートした。
【０１４４】
ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼとともに、ＳｍＣＰＳ２およびＳｓＳｃＳ酵素を共発現させて他のプラスミドを構築した。ＧＧＰＰシンターゼの場合、ＧＧＰＰシンターゼ（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＡ２４８１９．１）をコードするパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来のＣｒｔＥ遺伝子（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ３８４２４．１）を使用した。ＣｒｔＥ遺伝子を、コドン最適化ならびに３’末端および５’末端のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ９４０２５、ＵＳＡ）の付加により合成し、そしてｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドのＮｃｏＩとＢａｍＨＩ部位の間にライゲートして、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥプラスミドを得た。ｃＤＮＡをコードする改変させたＳｍＣＰＳ２を、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＣｒｔＥプラスミドにライゲートし、このようにして、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２構築物を得た。次に、切断したＳｓＳｃＳをコードする最適化ｃＤＮＡ（Ｓａ１１３２ｏｐｔ）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いてｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２プラスミドに導入した。このクローニングの場合、ｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔを、フォワードプライマーＳｍＣＰＳ２−１１３２Ｉｎｆ＿Ｆ１として５’−ＣＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＣＧ−３’、およびリバースプライマー１１３２−ｐＥＴ＿Ｉｎｆ＿Ｒ１として５’−ＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴ−３’を用いるＰＣＲ増幅における鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化したプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２中で、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いてライゲートし、新規のプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃＳを得た。このプラスミドＣｒｔＥ遺伝子は、ｐＥＴＤｕｅｔプラスミドの第一のＴ７プロモーターの制御下にあり、ｃＤＮＡをコードするＣＰＰシンターゼおよびスクラレオールシンターゼは、第二のＴ７プロモーターの制御下にバイシストロン性の構築物中で組織化される。
【０１４５】
例３
大腸菌における異種発現および酵素活性
発現プラスミド（ｐＥＴＤｕｅｔ−ＳｍＣＰＳ２またはｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔ）を用いて、Ｂｌ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を形質転換させた。形質転換させた細胞の単コロニーを使用して、２５ｍｌのＬＢ培地に接種した。３７℃で５時間から６時間インキュベートした後、培養物を２０℃のインキュベーターに移して、平衡のために１時間放置した。次に、０．１ｍＭのＩＰＴＧの添加によりタンパク質の発現を誘導し、培養物を２０℃で一晩インキュベートした。翌日、その細胞を、遠心分離により回収し、０．１容量の５０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７、１０％グリセリン、１ｍＭのＤＴＴに再懸濁し、そして超音波処理によって溶解した。その抽出物を遠心分離（２０，０００ｇで３０分）により清澄化し、可溶性タンパク質を含む上澄みをさらなる実験に使用した。
【０１４６】
例４
ｉｎ  ｖｉｔｒｏジテルペンシンターゼ活性分析
酵素アッセイを、５０ｍＭのＭＯＰＳＯ  ｐＨ７、１０％グリセロール（２０ｍＭのＭｇＣｌ2および５０μＭから２００μＭまでの精製ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を補ったもの）の最終容量１ｍＬ中の５０μｌから１００μｌまでのタンパク質抽出物を用いてテフロンで封止したガラス管内で実施した（Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ６４５（１）、１６１〜１６７、１９９３に記載の通りに作製）。その管を５時間から４８時間まで３０℃でインキュベートして、酵素産物を１容量のペンタンで２回抽出した。窒素フラックス下で濃縮させた後、抽出物をＧＣ−ＭＳで分析し、対照タンパク質（空のプラスミドで形質転換させた細胞から得られたもの）の抽出物と比較した。ＧＣ−ＭＳ分析を、ＤＢ１カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍの膜厚、Ａｇｉｌｅｎｔ）を備え、５９７５シリーズの質量分析計と連結させたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０シリーズのＧＣシステムで実施した。キャリアガスは、１ｍｌ／分の一定流量のヘリウムであった。インジェクションは、インジェクター温度を２６０℃に設定したスプリットレスモードであり、オーブン温度は、１０℃／分で１００℃から２２５℃まで、３０℃／分で２８０℃までにプログラムした。産物の同定を、標準試料のリテンションインデックスおよび質量スペクトルの一致に基づいて確認した。
【０１４７】
これらの条件において、および（それぞれ、ＳｍＣＰＳまたはＳｓＳｃＳ酵素を異種発現する）プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＳｍＣＰＳ２またはｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔで形質転換させた大腸菌細胞由来の組換えタンパク質では、ジテルペン分子の産物は、溶媒抽出物中で検出されなかった（二リン酸含有ジテルペンは、これらの条件では検出されない）。次に同様のアッセイを実施したが、単一アッセイにおいて、組換えＳｍＣＰＳおよびＳｓＳｃＳを含む２つのタンパク質抽出物を組み合わせた。これらのアッセイでは、１つの主産物を形成し、質量スペクトルおよびリテンションインデックスを標準試料とマッチングすることによって（＋）−マノオールであることを同定した。
【０１４８】
例５
大腸菌細胞を用いるｉｎ  ｖｉｖｏでのマノオールの製造
全細胞の培養物を用いるマノオールのｉｎ  ｖｉｖｏでの製造を、大腸菌細胞を用いて評価した。内因性ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）プールの程度、細胞のジテルペンにおける生産性を増加させるために、ＦＰＰをもたらす異種の完全なメバロン酸経路を、同じ細胞内で共発現させた。この経路の酵素を、２つのプロモーターの制御下で２つのオペロンにおいて組織化されたすべての遺伝子を含む単一のプラスミドを用いて発現させた。この発現プラスミドの構築は、特許の国際公開第２０１３０６４４１１号（WO2013064411）またはＳｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４、１８９００〜１８９０３に記載されている。簡潔に言えば、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ａｔｏＢ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ｍｖａＳ）、およびスタフィロコッカス・アウレウスＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）およびサッカロミセス・セレビジエＦＰＰシンターゼ（ＥＲＧ２０）の遺伝子からなる第一の合成オペロンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲートしてｐＡＣＹＣ−２９２５８を得た。メバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ２）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＭｖａＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）を含む第二のオペロンを、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３４）から増幅させ、ｐＡＣＹＣ−２９２５８の第二のマルチクローニング部位にライゲートして、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６を得た。したがって、このプラスミドは、アセチル−ＣｏＡからＦＰＰをもたらす生合成経路のすべての酵素をコードする遺伝子を含む。
【０１４９】
ＫＲＸ大腸菌細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６およびｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃＳプラスミドで同時形質転換させた。形質転換させた細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）のＬＢアガロースプレート上で選択した。単一コロニーを用いて、同じ抗生物質を添加した５ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。その培地を３７℃で一晩インキュベートした。翌日に、同一の抗生物質を補った２ｍＬのＴＢ培地に０．２ｍＬの一夜培養物を接種した。３７℃で６時間インキュベートした後、培養物を２８℃に冷却して、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、０．２％のラムノース、および１：１０の容量のデカンをそれぞれの管に加えた。培養物を４８時間、２８℃でインキュベートした。次に、培養物を２容量のＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）で２回抽出し、有機相を５００μＬに濃縮して、前述の例４に記載の通りＧＣ−ＭＳにより分析したが、１００℃で１分保ち、その後、１０℃／分の温度勾配で２２０℃まで、および２０℃／分の温度勾配で３０００℃までのオーブン温度であったことが異なる。この培養条件では、マノオールが、唯一のジテルペン産物として、３００ｍｇ／Ｌから５００ｍｇ／Ｌまでの収率で製造された（図３）。
【０１５０】
例６
組換え細胞を使用する（＋）−マノオールの製造、精製およびＮＭＲ分析
１リットルの大腸菌培養物を、例５に記載の条件で作製したが、デカン有機相は、固相抽出のために５０ｇ／Ｌ  Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４に置き換えた。培養培地をろ過して、樹脂を回収した。次に、樹脂を３カラム容量の水で洗浄して、３カラム容量のＭＴＢＥを用いて溶離した。次に、産物をヘプタン：ＭＴＢＥが８：２（ｖ／ｖ）で構成される移動相を使用してシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製した。マノオールの構造を、1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲにより確認した。旋光度を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００  ＭＨｚ分光計を使用して測定した。［α］D20＝＋２６．９°（０．３％、ＣＨＣｌ3）の値は、（＋）−マノオールの製造を確定するものであった。
【０１５１】
例７
上述の例で得たマノオールを、以下の実験部にしたがってそのエステルに変換した（下記は、そのアセテートへの例である）：
【化１】
2018527892.tif 000002
文献（Ｇ．Ｏｈｌｏｆｆ、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ４１、８４５（１９５８））によれば、３２．０ｇ（０．１１ｍｏｌ）の純粋な結晶性（＋）−マノオールを、２０．０ｇ（０．２５ｍｏｌ）の塩化アセチルで、１００ｍｌのジメチルアニリン中で５日間室温で処理した。混合物を７時間５０℃でさらに加熱して１００％の変換率を達成した。冷却後、反応混合物をエーテルで希釈し、引き続き、１０％のＨ2ＳＯ4、水性ＮａＨＣＯ3および水で洗浄して中性にした。乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）および濃縮後、産物を蒸留して（ｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｌｂ、Ｂ．ｐ．＝１６０℃、０．１ｍｂａｒ）、２０．０１ｇ（７９．４％）のマノオールアセテートが得られ、これをさらに精製せずに用いた。
ＭＳ：Ｍ+３３２（０）；ｍ／ｅ：２７２（２７），２５７（８３），１３７（６２），９５（９０），８１（１００）。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）：０．６７，０．８０，０．８７，１．５４ａｎｄ２．０１（５ｓ，３Ｈ  ｅａｃｈ），４．４９（ｓ，１Ｈ），４．８０（ｓ，１Ｈ），５．１１（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｍ，１Ｈ），５．９５（ｍ，１Ｈ）。
13Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）：１４．５（ｑ），１７．４（ｔ），１９．４（ｔ），２１．７（ｑ），２２．２（ｑ），２３．５（ｑ），２４．２（ｔ），３３．５（ｓ），３３．６（ｔ），３８．３（ｔ），３９．０（ｔ），３９．３（ｔ），３９．８（ｓ），４２．２（ｔ），５５．６（ｄ），５７．２（ｔ），８３．４（ｓ），１０６．４（ｔ），１１３．０（ｔ），１４２．０（ｄ），１４８．６（ｓ），１６９．９（ｓ）。
【０１５２】
例８
上述の例で得たマノオールアセテートを、以下の実験部にしたがってそのトリエンに変換した（下記は、そのスクラレンおよび（Ｚ＋Ｅ）−ビホルメンへの例である）：
【化２】
2018527892.tif 000003
４ｍｌのシクロヘキサン中での０．４ｇのマノオールアセテートの溶液に、室温で、０．０２９ｇ（０．０５当量）のＢＦ3・ＡｃＯＨ錯体を添加した。室温で１５分後、反応物を水性ＮａＨＣＯ3で急冷し、水で洗浄して中性にした。ＧＣ−ＭＳ分析は、炭化水素のみを示し、これは、スクラレン、（Ｚ）および（Ｅ）−ビホルメンと同定された。コパロールアセテートは、検出されなかった。
【０１５３】
より多くの触媒（０．１５当量）を用いた他の試験は、同じ結果をもたらした。
・スクラレン：ＭＳ：Ｍ+２７２（１８）；ｍ／ｅ：２５７（１００），１４９（１５），１０５（１５）。
・（Ｚ）および（Ｅ）−ビホルメン（同一のスペクトル）：ＭＳ：Ｍ+２７２（２９）；ｍ／ｅ：２５７（１００），１８７（２７），１６１（３３），１０５（３７）。
【０１５４】
例９
上述の例で得たマノオールを、以下の実験部にしたがってコパリルエステルに変換した（下記は、アセテートへの例）：
【化３】
2018527892.tif 000004
１００ｍｌのシクロヘキサン中での０．４７４ｇ（０．８２６ｍｍｏｌ、０．２７ｅｑ．）のＢＦ3・ＡｃＯＨの溶液に、室温で、４．４ｇの酢酸無水物および１２．１ｇの酢酸を添加した。室温で、１５ｍｌのシクロヘキサン中で１０．０ｇ（３３ｍｍｏｌ）の純粋結晶性マノオールを添加し（わずかに発熱性）、水浴を使用して温度を室温に保った。室温で３０分撹拌した後、ＧＣ対照群は、出発材料を示さなかった。反応混合物を、３００ｍｌの水性飽和ＮａＨＣＯ3で急冷して、通常通り処理した。粗混合物（９．９ｇ）をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ペンタン／エーテル９５：５）およびｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｌｂ蒸留法（Ｅｂ．＝１３０℃、０．１ｍｂａｒ）により精製して、４．３４ｇ（３７．１％）の２７／７３の（Ｚ）−コパリルアセテートおよび（Ｅ）−コパリルアセテートの混合物を得た。
・（Ｚ）−コパリルアセテート：
ＭＳ：Ｍ+３３２（０）；ｍ／ｅ：３１７（２），２７２（３５）＝，２５７（１００），１３７（４８），９５（６８），８１（７０）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：０．６７，０．８０，０．８７，１．７６ａｎｄ２．０４（５ｓ，３Ｈ  ｅａｃｈ），４．８６（ｓ，１Ｈ），５．３５（ｔ：Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）。
・（Ｅ）−コパリルアセテート
ＭＳ：Ｍ+３３２（０）；ｍ／ｅ：３１７（２），２７２（３３）＝，２５７（１００），１３７（５４），９５（６７），８１（７４）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：０．６８，０．８０，０．８７  １．７０ａｎｄ２．０６（５ｓ，３Ｈ  ｅａｃｈ），４．８２（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｔ：Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）。
13Ｃ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）：（（Ｚ／Ｅ）混合物上で記録されたスペクトル、有意なシグナルのみが示された）：６１．４（ｔ），１０６．２（ｔ），１１７．９（ｄ），１４３．１（ｓ），１４８．６（ｓ），１７１．１（ｓ）。
【０１５５】
例１０
上述の例で得たコパリルアセテートを、以下の実験部にしたがってコパロールに変換した：
【化４】
2018527892.tif 000005
コパリルアセテート（４．１７ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）、ＫＯＨペレット（３．３５ｇ、５９．７ｍｍｏｌ）、水（１．５ｇ）およびＥｔＯＨ（９．５ｍｌ）を混合して、３時間５０℃で撹拌した。通常の後処理の後、３．７ｇの粗（Ｚ＋Ｅ）−コパロールが得られ、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ペンタン／エーテル７：２）により精製した。溶媒を蒸発させた後、ｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｌｂ蒸発法（Ｅｂ＝１７０℃、０．１ｍｂａｒ）により３．２５ｇ（９２％）の２７／７３の（Ｚ）−コパロールおよび（Ｅ）−コパロールの混合物を得た。
・（Ｚ）−コパロール
ＭＳ：Ｍ+２９０（３）；ｍ／ｅ：２７５（１８），２７２（２７），２５７（８２），１３７（７１），９５（９３），８１（１００），６９（７０）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：０．６７，０．８０，０．８７ａｎｄ１．７４（４ｓ，３Ｈ  ｅａｃｈ）；４．０６（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｓ，１Ｈ），４．８６（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｔ：Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）。
・（Ｅ）−コパロール
ＭＳ：Ｍ+２９０（３）；ｍ／ｅ：２７５（２７），２７２（２２），２５７（７５），１３７（７５），９５（９１），８１（１００），６９（６８）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：０．６８，０．８０，０．８７ａｎｄ１．６７（４ｓ，３Ｈ  ｅａｃｈ）；４．１５（ｍ，２Ｈ），４．５１（ｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，１Ｈ），５．３９（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）： （（Ｚ／Ｅ）混合物上で記録されたスペクトル、有意なシグナルのみが示された）：）：５９．４（ｔ），１０６．２（ｔ），１２３．０（ｄ），１４０．６（ｓ），１４８．６（ｓ）。
【０１５６】
ＮＭＲ分析は、類似の化合物の公開されたスペクトルとよく一致している。例えば、Ｓ．Ｈａｓｅｃａｗａ、Ｙ．Ｈｉｒｏｓｅ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９（１１）、２４７９（１９８０）を参照。
【０１５７】
【表１】
2018527892.tif 000006
【表２−１】
2018527892.tif 000007
【表２−２】
2018527892.tif 000008
【表３】
2018527892.tif 000009
【表４】
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【表５】
2018527892.tif 000011
【図１】
2018527892.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2018527892000001.app
【国際調査報告】
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