(57)【要約】本発明は、標的細胞の表面上のヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び、該ポリヌクレオチド若しくはベクターで形質転換された、またはこれらをトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセス、該抗体構築物の医学的使用、及び該抗体構築物を含むキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性抗体構築物であって、標的細胞の表面上のヒト及びマカクＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する第１の結合ドメインならびにＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを含み、前記第１の結合ドメインが、配列番号１５７に示されるポリペプチド及び配列番号１５８に示されるポリペプチドを含む、前記二重特異性抗体構築物。
【請求項２】
前記抗体構築物が、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ、及びそれらの形式のオリゴマーからなる群より選択される形式である、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項３】
前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３イプシロン、及び、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３イプシロンに結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体構築物。
【請求項４】
以下を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体構築物：
（ａ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・任意に、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｂ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・任意に、配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１０４〜１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・任意に、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｃ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・アミノ酸配列
2018524997.tif 000030
（式中、Ｘ１は、ＹまたはＨである）を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・アミノ酸配列
2018524997.tif 000031
を有するポリペプチド、ならびに、
・任意に、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｄ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１５８のアミノ酸を有するポリペプチド、
・配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、Ｃ末端のセリン残基、
・配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｅ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１５８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１４２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、Ｃ末端のセリン残基、
・配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｆ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｇ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｈ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、または、
（ｉ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｊ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１、２、４、５、６、８、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１８１〜１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン
を含むポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１６０に示されるポリペプチドを含む、またはそれからなる、請求項４に記載の抗体構築物。
【請求項６】
前記請求項のいずれか１項に記載の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項７に記載のベクターで形質転換された、またはこれらをトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体構築物の産生のためのプロセスであって、請求項８に記載の宿主細胞を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記抗体構築物の発現を可能にする条件下で培養すること、及び、産生された抗体構築物を培養物から回収することを含む、前記プロセス。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項９に記載のプロセスに従って産生された抗体構築物を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍若しくはがん疾患または転移性がん疾患の予防、処置、または改善に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体構築物または請求項９に記載のプロセスに従って産生された抗体構築物。
【請求項１２】
腫瘍若しくはがん疾患または転移性がん疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜５のいずれかに１項に記載の抗体構築物または請求項９に記載のプロセスに従って産生された抗体構築物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記腫瘍またはがん疾患が、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、中枢神経系癌、または前記のいずれかに由来する転移性がん疾患からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法または請求項１１に記載の抗体構築物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体構築物、請求項８に記載のプロセスに従って産生された抗体構築物、請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、及び／または請求項８に記載の宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞の表面上のヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物に関する。さらに、本発明は、抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ポリヌクレオチド若しくはベクターで形質転換された、またはこれらをトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセス、該抗体構築物の医学的使用、及び該抗体構築物を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲ遺伝子増幅を伴う遺伝子再構成により引き起こされるいくつかのＥＧＦＲ多様体の１つである。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける２６７アミノ酸のインフレーム欠失からなる。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ヒトがんにおける表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体の最も一般に生じる多様体である。遺伝子増幅のプロセス中、２６７アミノ酸の欠失は、細胞外ドメインに生じ、モノクローナル抗体に対する腫瘍特異的ネオエピトープとして機能することができる新しいジャンクションが形成される。ＥＧＦ受容体のこの多様体は、リガンドに依存しない構成的シグナル伝達を介した腫瘍の進行に寄与する。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、任意の正常組織で発現されることは知られていない。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現の優れた腫瘍選択性は、ＢｉＴＥ抗体構築物で標的化するための理想的な抗原としてＥＧＦＲｖＩＩＩを確立する。ＥＧＦＲｖＩＩＩの腫瘍の進行への寄与は、がん細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩの発現への依存性を示唆し、それ故、標的としての適合性をさらにサポートする。
【０００３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、２種類の悪性中枢神経系腫瘍、すなわち、多形膠芽腫及び退形成星細胞腫に、頻繁に発現されることが示されている。両方の疾患に対し、重大な満たされていない医療ニーズが存在する。これは、多形膠芽腫の場合２年間で１３．６％、及び退形成星細胞腫の場合５年間で２５．９％である標準治療下での不十分な全生存期間により例証される。現在、多形膠芽腫に対する標準治療は、腫瘍の外科的切除からなり、これは、ほとんどの場合、腫瘍のびまん性成長パターン及び脳の機能的に必須な領域を保存する必要性により妨げられる。手術に、アジュバント照射及び化学療法が続く。今日の標準治療に従って処置された多形膠芽腫及び退形成星細胞腫では、再発が通常であり、事実上全ての患者において最終的に致死的転帰がみられる。
【０００４】
多形膠芽腫及び退形成星細胞腫におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路を構成的に活性化し、多形膠芽腫及び退形成星細胞腫における悪化した予後と関連する。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩが、ＣＤ１３３と同時発現され、多形膠芽腫における癌幹細胞の集団を規定することが記載されている（Ｅｍｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１４，７４（４）：１２３８−４９（非特許文献1））。さらに、細胞間抗原移動の機序により、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、抗原陰性腫瘍細胞の細胞表面に移動させることができることが実証されている。この機序により、いくつかの多形膠芽腫の場合に示されているＥＧＦＲｖＩＩＩの発現異質性は、特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＢｉＴＥ抗体構築物を使用する場合に、処置有効性の障害として克服され得、これは、細胞間抗原移動により達成される潜在的に低レベルの標的抗原を補う非常に有効な細胞傷害性の作用様式を提供する。
【０００５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現はまた、他のいくつかの腫瘍実体において説明されている（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ＣＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８  （１９９５）（非特許文献2）；Ｇｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．９８（３）：３５７−６１  （２００２）（非特許文献3）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５５３６−９  （１９９５）（非特許文献4）；Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏ，ＩＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３（１４）：３２１７−２０  （１９９３）（非特許文献5）；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，ＥＯ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８２（１）：１８６−９４  （２０００）（非特許文献6））。それ故、ＥＧＦＲｖＩＩＩの精巧な腫瘍選択性を考慮すると、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＢｉＴＥ抗体構築物での処置は、他の選択されたがんの型または亜型において有益であり得る。可能性として、処置のためのがんの型、亜型、または患者の選択は、腫瘍におけるＥＧＦＲｖＩＩＩの発現について試験する種々の方法により導くことができ得る。
【０００６】
依然として、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、中枢神経系などのＥＧＦＲＶＩＩＩの過剰発現に関連する固形腫瘍疾患の処置に対するさらなる利用可能な選択肢を有する必要性があるので、腫瘍標的細胞の表面上のＥＧＦＲＶＩＩＩに向けられた結合ドメイン及びＴ細胞の表面上のＣＤ３に向けられた第２の結合ドメインを有する二重特異性抗体構築物の形態で、この問題を解決するための手段及び方法が本明細書では提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｍｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１４，７４（４）：１２３８−４９
【非特許文献２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ＣＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０−３１４８  （１９９５）
【非特許文献３】Ｇｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．９８（３）：３５７−６１  （２００２）
【非特許文献４】Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５５３６−９  （１９９５）
【非特許文献５】Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏ，ＩＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３（１４）：３２１７−２０  （１９９３）
【非特許文献６】Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ，ＥＯ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８２（１）：１８６−９４  （２０００）
【発明の概要】
【０００８】
従って、第１の態様では、本発明は、標的細胞の表面上のヒト及びマカクＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する第１の結合ドメインならびにＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物を提供し、第１の結合ドメインは、配列番号１５７に示されるポリペプチド及び配列番号１５８に示されるポリペプチドを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形の言及を含むことを留意しなければならない。従って、例えば、「試薬」への言及は、そのような異なる試薬のうちの１つ以上を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法で修正または代用することができる当業者らに既知の同等のステップ及び方法への言及を含む。
【００１０】
別途表記のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素の全てを指すと理解されるべきである。当業者らは、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を理解し、または確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明に包含されることが意図される。
【００１１】
本明細書で使用される「及び／または」という用語は、「及び」、「または」、及び「該用語により接続される要素の全てまたは他の任意の組み合わせ」の意味を含む。
【００１２】
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の±２０％以内、好ましくは、±１５％以内、より好ましくは、±１０％以内、最も好ましくは、±５％以内を意味する。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体にわたって、文脈に別途要求のない限り、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及び「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの変形、ならびに「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された完全体若しくはステップまたは完全体若しくはステップの群の包含を意味するが、他の任意の完全体若しくはステップまたは完全体若しくはステップの群の除外を意味しないと理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」若しくは「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で代用することができ、または本明細書で使用される場合、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語で代用することができる場合がある。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲の要素に特定されない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に物質的に影響を与えない材料またはステップを排除するものではない。
【００１５】
本明細書の各例では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかで置き換えられてもよい。
【００１６】
「抗体構築物」という用語は、構造及び／または機能が、抗体の、例えば、全長または全免疫グロブリン分子の、構造及び／または機能に基づく分子を指す。従って、抗体構築物は、その具体的な標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明による抗体構築物は、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、好ましくは、６つ全てのＣＤＲの存在により、定義されてもよい。本発明による構築物が基礎とする抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を含む。
【００１７】
本発明による「抗体構築物」の定義の範囲内には、ラクダ科抗体及び生物工学的またはタンパク質工学的方法またはプロセスにより生成される他の免疫グロブリン抗体も含む全長抗体または全抗体がある。これらの全長抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体であってよい。さらに、「抗体構築物」の定義の範囲内には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、などの全長抗体のフラグメントまたは「ｒ  ＩｇＧ」（「半抗体」）がある。本発明による抗体構築物は、抗体多様体とも呼ばれる抗体の修飾されたフラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、次のような構造：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２−ＣＨ３）、または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２により例証される「ミニボディ」、トリアボディまたはテトラボディなどのマルチボディ、及びナノボディなどの単一ドメイン抗体または他のＶ領域若しくはドメインと独立して、抗原若しくはエピトープと特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ若しくはＶＬであり得る１つの可変ドメインのみを含む単一可変ドメイン抗体であることもある。
【００１８】
結合ドメインは通常、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよいが、両方を含む必要はない。例えば、Ｆｄフラグメントは、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持する。抗体フラグメント、抗体多様体、または結合ドメインの形式のさらなる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１  ：５４４−５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、（例えば、ｓｃＦＶ−ライブラリーに由来する）後者が好ましい。本発明による抗体構築物の実施形態の例は、例えば、ＷＯ００／００６６０５、ＷＯ２００５／０４０２２０、ＷＯ２００８／１１９５６７、ＷＯ２０１０／０３７８３８、ＷＯ２０１３／０２６８３７、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＵＳ２０１４／０３０８２８５、ＵＳ２０１４／０３０２０３７、ＷＯ２０１４／１４４７２２、ＷＯ２０１４／１５１９１０、及びＷＯ２０１５／０４８２７２に記載されている。
【００１９】
さらに、「抗体構築物」という用語の定義は、一価構築物、二価構築物、及び多原子価／多価構築物を含み、従って１つの抗原構造のみに特異的に結合する単一特異性構築物、ならびに、異なる結合ドメインを介して、複数の、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の、構築物に特異的に結合する二重特異性及び多特異性／多重特異性構築物を含む。さらに、「抗体構築物」という用語の定義は、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子、ならびに鎖が同一（ホモ二量体、ホモ三量体、若しくはホモオリゴマー）または異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、若しくはヘテロオリゴマー）のいずれかであることができる、複数のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上で特定された抗体及びその多様体または誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．２０１０、ならびにＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９に記載される。
【００２０】
本発明の抗体構築物は、好ましくは、「インビトロで生成された抗体構築物」である。この用語は、上記定義による抗体構築物を指し、可変領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）の全部または一部は、非免疫細胞選択、例えば、インビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ、または抗原に結合する能力について候補配列を試験することができる他の任意の方法で生成される。従って、この用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再構成のみによって生成される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学の使用により作製された抗体である。
【００２１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築物という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、通常は様々な決定基（またはエピトープ）に対し向けられる様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、高度に特異的であり、抗原上の単一の抗原部位または決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、従って、他の免疫グロブリンにより汚染されない点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
【００２２】
モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養により産生された抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例えば、使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５  （１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４  （１９８３），７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
【００２３】
次に、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定するために、ハイブリドーマは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングすることができる。関連する抗原の任意の形態を、免疫原、例えば、組換え抗原、天然形態、そのいずれかの多様体またはフラグメント、ならびにその抗原性ペプチドとして使用されてもよい。ＢＩＡｃｏｒｅ系で用いられるような表面プラズモン共鳴を、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３イプシロンなどの標的抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増加させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７  （１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３  （１９９５），７−１３）。
【００２４】
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８  （１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７  （１９９１）に記載されている。
【００２５】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、関連する抗原を、非ヒト動物、例えば、齧歯動物（例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、またはラット）を免疫するために使用することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きなフラグメントを有する、マウス抗体産生が欠損したマウス株を操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体が、産生及び選択され得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、及びＷＯ９６／３３７３５を参照のこと。
【００２６】
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得ることもでき、次に、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術を使用して、改変、例えば，ヒト化、脱免疫化、キメラ等を行うこともできる。改変された抗体構築物の例としては、非ヒト抗体のヒト化多様体、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６  （１９９２）  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，１０８３２−  １０８３７  （１９９１）を参照のこと）ならびに改変エフェクター機能（複数可）を有する抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号、上記引用文のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２０１０）、ならびに上記引用文のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）が挙げられる。
【００２７】
免疫学では、親和性成熟は、Ｂ細胞が免疫応答の過程で抗原に対する親和性が増加した抗体を産生するプロセスである。同じ抗原への反復曝露により、宿主は、連続的により大きな親和性の抗体を産生することになる。天然プロトタイプのように、インビトロでの親和性成熟は、変異及び選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟は、抗体、抗体構築物、及び抗体フラグメントを最適化するためにうまく使用されている。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原、またはエラープローンＰＣＲを使用して導入される。さらに、遺伝子多様性は、鎖シャッフリングにより増加させることができる。ファージディスプレイのような提示方法を使用して、２または３ラウンドの変異及び選択により通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントがもたらされる。
【００２８】
抗体構築物のアミノ酸置換多様性の好ましいタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択された得られる多様体（複数可）は、それらが生成される親抗体と比較して向上した生物学的特性を有するであろう。そのような置換多様体を生成するための簡便な手段は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を含む。要約すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生成するために変異させる。このようにして生成された抗体多様体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、繊維状ファージ粒子から一価型で提示される。次に、ファージディスプレイされた多様体は、本明細書に開示されているように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異導入を、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために実施することができる。代替的または追加的に、結合ドメイン及び例えばヒトＥＧＦＲＶＩＩＩの間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であることがある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述の技術による置換の候補である。そのような多様体が生成されると、多様体のパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択されてもよい。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体構築物は、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来し、または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である一方、鎖（複数可）の残りは、所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来し、または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、及びそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５  （１９８４））。本明細書での目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長動物（例えば、旧世界ザル、サルなど）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長動物化」抗体を含む。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１  ，１９８５；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５，Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；及びＧＢ２１７７０９６を参照のこと。
【００３０】
抗体、抗体構築物、抗体フラグメント、または抗体多様体は、例えばＷＯ９８／５２９７６またはＷＯ００／３４３１７に開示された方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）により改変され得る。要約すると、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができる；これらのペプチドは、（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に規定されるような）潜在的Ｔ細胞エピトープを表す。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング」と称されるコンピュータモデリングアプローチを適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースは、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載されているようにＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフについて検索することができる。これらのモチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、それにより、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することにより、または、好ましくは、単一のアミノ酸置換により除去することができる。通常は、保存的置換が行われる。多くの場合、排他的ではないが、ヒト生殖系列抗体配列の位置に共通のアミノ酸が使用されてもよい。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６  （５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８で開示される。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、英国ケンブリッジにより編集された）ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリを提供する。これらの配列は、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲのためのヒト配列の供給源として使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されているように、コンセンサスヒトフレームワーク領域を使用することもできる。
【００３１】
「ヒト化」抗体、抗体構築物、多様体、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリンに由来する(ａ)最小配列（複数可）を含有するほとんどヒト配列の抗体または免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（同様に、ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ハムスター、またはウサギなどの非ヒト（例えば、齧歯動物）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基と取り替えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基と取り替えられる。さらに、本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基を含むこともある。これらの改変は、抗体性能をさらに改良及び最適化するために行われる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）通常は、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含み得る。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５  （１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９  （１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６  （１９９２）を参照のこと。
【００３２】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの等価な配列で交換することにより生成することができる。ヒト化抗体またはそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；ならびにＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；及びＵＳ６，４０７，２１３により提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全部または一部をコードする核酸配列を単離、操作及び発現することを含む。そのような核酸は、上記のような所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ及び他の供給源から得られてもよい。次に、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡは、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００３３】
ヒト化抗体は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を使用して産生され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体を調製するために使用され得る例示的なＣＤＲ移植法について記載する（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で交換されてもよく、またはＣＤＲの一部のみが、非ヒトＣＤＲと取り替えられてもよい。ヒト化抗体の所定の抗原への結合に必要とされるＣＤＲの数を取り替えるだけでよい。
【００３４】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、及び／または逆変異の導入により最適化することができる。そのような変更された免疫グロブリン分子は、当該技術分野で既知のいくつかの技術のいずれかにより行うことができる（例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２，及びＥＰ２３９４００）。
【００３５】
「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築物」、及び「ヒト結合ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１）（上記引用文）により記載されるものを含む、当該技術分野で既知のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域またはドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体構築物、及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体構築物、または結合ドメインは、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異導入またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい。ヒト抗体、抗体構築物または結合ドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基と取り替えられる少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の位置を有することができる。本明細書で使用されるヒト抗体、抗体構築物、及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術またはシステムを使用することにより誘導することができる抗体の人為的及び／または遺伝的に改変されたヒト配列のみを含む完全ヒト抗体をも意図する。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明の抗体構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築物である。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書で開示される抗体構築物を記載するために使用される場合、その産生環境の構成要素から同定、分離、及び／または回収されている抗体構築物を意味する。好ましくは、抗体構築物は、その産生環境からの他の全ての構成要素と会合せず、または実質的に会合しない。組換えトランスフェクションされた細胞から得られたものなどの、その産生環境の汚染構成要素は、通常、ポリペプチドの診断または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでもよい。抗体構築物は、例えば、所与の試料中の合計タンパク質の少なくとも約５重量％または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、状況に応じて、合計タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成するし得ると理解される。増加した濃度レベルで作製されるように、誘導可能なプロモーターまたは高発現プロモーターの使用により、著しく高い濃度のポリペプチドが作製され得る。定義は、当該技術分野で既知の多種多様な生体及び／または宿主細胞における抗体構築物の産生を含む。好ましい実施形態では、抗体構築物は、（１）回転カップシークエネーターの使用により少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（２）均質性までクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用した非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質になるまで、精製されることになる。しかし、通常、単離抗体構築物は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
【００３７】
本発明に関連する「結合ドメイン」という用語は、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に（特異的に）結合／相互作用／認識するドメイン、本明細書では、それぞれＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＣＤ３の特徴を示す。（ＥＧＦＲＶＩＩＩを認識する）第１の結合ドメインの構造及び機能、好ましくは、（ＣＤ３を認識する）第２の結合ドメインの構造及び／または機能も、抗体、例えば、全長または全免疫グロブリン分子、の構造及び／または機能に基づいている。本発明によれば、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。第２の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／または第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列を移植するよりもむしろ、ファージディスプレイまたはライブラリースクリーニング法により産生され、または入手可能であると想定される。
【００３８】
本発明によれば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカーまたはグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含んでもよい。タンパク質（そのフラグメント、好ましくは、生物学的に活性なフラグメント、及び通常３０個未満のアミノ酸を有するペプチド）は、共有結合ペプチド結合を介して互いに結合され（てアミノ酸の鎖を生じ）る２個以上のアミノ酸を含む。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、通常３０を超えるアミノ酸からなる一群の分子について記載する。ポリペプチドは、二量体、三量体、及びより高次のオリゴマーなどの多量体、すなわち、複数のポリペプチド分子からなるもの、をさらに形成し得る。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても非同一であってよい。結果として、そのような多量体の、対応するより高次の構造は、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は、天然に存在する形態では、２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖及び２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、修飾が、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾によりもたらされる、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質をも指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、本明細書で言及する場合、ペグ化されるなど、化学的に修飾されることもある。そのような修飾は、当該技術分野で周知であり、以下で本明細書に記載されている。
【００３９】
好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する結合ドメイン及び／またはＣＤ３に結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体構築物は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ）などの非ヒト可変領域及び／または定常領域を保有する抗体または抗体構築物に関連する問題の一部を回避する。そのような齧歯動物由来タンパク質の存在は、抗体または抗体構築物の迅速なクリアランスをもたらすことができ、または患者による抗体または抗体構築物に対する免疫応答の発生をもたらすことができる。齧歯動物由来抗体または抗体構築物の使用を避けるために、ヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築物は、齧歯動物が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯動物に導入することにより生成することができる。
【００４０】
ＹＡＣ中にメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローン及び再構築する能力ならびにマウス生殖系列にそれらを導入する能力は、非常に大きなまたは粗くマッピングされた遺伝子座の機能的構成要素を解明することならびにヒト疾患の有用なモデルを生成することへの強力なアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物と置換するためのそのような技術の使用は、開発中のヒト遺伝子産物の発現及び制御、それらの他の系との情報交換、及び疾患誘導及び進行へのそれらの関与に関するユニークな洞察を提供することができ得る。
【００４１】
そのような方策の重要な実際的な適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活化されているマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することにより、プログラムされた発現及び抗体の集合の基礎となる機序ならびにＢ細胞発生におけるそれらの役割を研究する機会を提供する。さらに、そのような方策は、ヒト疾患における抗体治療の約束を果たすことへの重要なマイルストーンである、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生の理想的供給源を提供することができる。完全ヒト抗体または抗体構築物は、マウスまたはマウス誘導体化モノクローナル抗体に固有の免疫原性及びアレルギー応答を最小にし、それにより、投与される抗体／抗体構築物の有効性及び安全性を増加させることが期待される。完全ヒト抗体または抗体構築物の使用は、反復する化合物投与を必要とする炎症、自己免疫、及びがんなどの慢性及び再発性のヒト疾患の処置における実質的な利点を提供することを期待することができる。
【００４２】
この目的への１つのアプローチは、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを有するマウス抗体産生が欠損したマウス株を、そのようなマウスがマウス抗体の不存在下でヒト抗体の大きなレパートリーを産生することを予期して操作することであった。大きなヒトＩｇフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体産生及び発現の適切な制御を保存するであろう。抗体の多様化及び選択、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠如についてのマウス機構を利用することにより、これらのマウス株における再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対する高親和性抗体を生じるはずである。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを、容易に産生及び選択することができ得る。この一般的な方策は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス株の生成に関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１  （１９９４）を参照のこと）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株は、コアの可変及び定常領域配列を含む、ヒト重鎖遺伝子座及びκ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂのサイズの生殖系列配置フラグメントを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）で操作された。ＹＡＣを含有するヒトＩｇは、抗体の再構成及び発現の両方のために、マウス系と適合性があることが判明し、不活化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することができた。これは、Ｂ細胞の発生を誘導する能力、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生する能力、及び抗原特異的ヒトｍＡｂを生成する能力により実証された。これらの結果は、より多くのＶ遺伝子、さらなる制御エレメント、及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座のより大きな部分の導入が、感染及び免疫化に対するヒトの体液性応答の特徴である完全なレパートリーを実質的に再現し得ることをも示唆した。Ｇｒｅｅｎらの研究は最近、ヒト重鎖遺伝子座及びκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖系列配置ＹＡＣフラグメントの導入により、ヒト抗体レパートリーの約８０％を超える導入へ広がった。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６  （１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号を参照のこと。
【００４３】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの製造は、米国特許出願第０７／４６６，００８号、同第０７／６１０，５１５号、同第０７／９１９，２９７号、同第０７／９２２，６４９号、同第０８／０３１，８０１号、同第０８／１１２，８４８号、同第０８／２３４，１４５号、同第０８／３７６，２７９号、同第０８／４３０，９３８号、同第０８／４６４，５８４号、同第０８／４６４，５８２号、同第０８／４６３，１９１号、同第０８／４６２，８３７号、同第０８／４８６，８５３号、同第０８／４８６，８５７号、同第０８／４８６，８５９号、同第０８／４６２，５１３号、同第０８／７２４，７５２号、及び同第０８／７５９，６２０号；ならびに米国特許第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；同第６，０７５，１８１号、及び同第５，９３９，５９８号、ならびに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号、同第３０６８５０６Ｂ２号、及び同第３０６８５０７Ｂ２号でさらに検討及び詳述される。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６  （１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５  （１９９８）、ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、及びＷＯ０３／４７３３６も参照のこと。
【００４４】
代替のアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他のものは、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、外因性Ｉｇ遺伝子座が、Ｉｇ遺伝子座由来の部分（個々の遺伝子）を包含することにより模倣される。従って、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、及び第２定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物への挿入のための構築物に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらによる米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙによる米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，６２５，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，７７０，４２９号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号；及び同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓによる米国特許第５，５９１，６６９号及び同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓらによる米国特許第５，６１２，２０５号；同第５，７２１，３６７号；及び同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎによる米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、同第０７／５７５，９６２号、同第０７／８１０，２７９号、同第０７／８５３，４０８号、同第０７／９０４，０６８号、同第０７／９９０，８６０号、同第０８／０５３，１３１号、同第０８／０９６，７６２号、同第０８／１５５，３０１号、同第０８／１６１，７３９号、同第０８／１６５，６９９号、同第０８／２０９，７４１号に記載される。ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、及びＷＯ９８／２４８８４、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照のこと。さらにＴａｙｌｏｒら（１９９２）、Ｃｈｅｎら（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）、Ｃｈｏｉら（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎら（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）を参照のこと。
【００４５】
Ｋｉｒｉｎは、マイクロセル融合により、染色体の大部分または染色体全体が導入されているマウス由来のヒト抗体の生成も実証した。欧州特許出願第７７３２８８号及び第８４３９６１号を参照のこと。Ｘｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の潜在的な生成のための技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスが、ヒトリンパ細胞、例えば、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞で再構成される。次に、マウスは抗原で免疫され、抗原に対する免疫応答を生成することができる。米国特許第５，４７６，９９６号；同第５，６９８，７６７号；及び同第５，９５８，７６５号を参照のこと。
【００４６】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は、産業界がキメラ抗体または別の方法でヒト化抗体を調製することを可能にした。しかし、ある特定のヒトの抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に、抗体の長期にわたるまたは複数回投与の利用で観察されることが予想される。従って、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念及び／または影響を低下させるために、ＥＧＦＲＶＩＩＩに対するヒト結合ドメイン及びＣＤ３に対するヒト結合ドメインを含む抗体構築物を提供することが望ましいであろう。
【００４７】
本発明による「を（特異的に）結合する」、「を（特異的に）認識する」、「に（特異的に）向けられる」、及び「と（特異的に）反応する」という用語は、結合ドメインが、標的分子（抗原）上の所与のエピトープまたは所与の標的部位、本明細書では、それぞれＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＣＤ３、と相互作用し、または特異的に相互作用することを意味する。
【００４８】
「エピトープ」という用語は、抗体若しくは免疫グロブリン、または抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体、フラグメント若しくは多様体などの結合ドメインは、特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、抗原性があり、従って、エピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」または「抗原決定基」とも呼ばれる場合がある。従って、結合ドメインは「抗原相互作用部位」である。該結合／相互作用は、「特異的認識」を定義することも理解される。
【００４９】
「エピトープ」は、タンパク質の３次折りたたみにより並置された近接アミノ酸または非近接アミノ酸の両方により形成することができる。「線状エピトープ」は、アミノ酸１次配列が認識されたエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、固有の配列中に、通常、少なくとも３または少なくとも４、より一般的には、少なくとも５または少なくとも６または少なくとも７、例えば、約８〜約１０個のアミノ酸を含む。
【００５０】
線状エピトープとは対照的に、「立体配座エピトープ」は、エピトープを含むアミノ酸の１次配列が、認識されるエピトープの唯一の規定構成要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の１次配列が結合ドメインにより必ずしも認識されないエピトープ）である。通常は、立体配座エピトープは、線状エピトープと比較して増加した数のアミノ酸を含む。立体配座エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくは、ペプチド若しくはタンパク質またはそのフラグメント、の３次元構造を認識する（本発明の文脈では、結合ドメインのうちの１つに対する抗原構造は、ＥＧＦＲＶＩＩＩタンパク質に含まれる）。例えば、タンパク質分子が３次元構造を形成するように折りたたまれるする場合、立体配座エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／またはポリペプチドバックボーンが並置されて、抗体がエピトープを認識することが可能になる。エピトープの立体配座を決定する方法は、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光法、及び部位特異的スピン標識及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
エピトープマッピングのための方法は、次に説明される：ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩタンパク質の領域（近接するアミノ酸ストレッチ）が、非ヒト及び非霊長動物のＥＧＦＲＶＩＩＩ抗原（例えば、マウスＥＧＦＲＶＩＩＩであるが、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどのような他のものも考えられ得る）の対応する領域と交換され／取り替えられる時に、結合ドメインが、使用される非ヒト、非霊長動物ＥＧＦＲＶＩＩＩに対し交差反応性がない限り、結合ドメインの結合の減少が起こると予想される。該減少は、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩタンパク質のそれぞれの領域への結合と比較して、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％；より好ましくは、少なくとも６０％、７０％、または８０％、最も好ましくは、９０％、９５％、または１００％でさえある（ここで、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩタンパク質のそれぞれの領域への結合は１００％に設定される）。
【００５２】
抗体構築物または結合ドメインによる認識に対する標的抗原の具体的な残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、アラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＫＬ  ＆  Ｗｅｉｓｓ  ＧＡ．Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７を参照のこと）、分析されるべき各残基が、例えば、部位特異的変異導入を介して、アラニンと取り替えられる。アラニンが、それにもかかわらず他のアミノ酸のうちの多くが有する２次構造参照を模倣する、嵩張らず化学的に不活性なメチル官能基のために、使用される。バリンまたはロイシンなどの嵩高いアミノ酸を、変異した残基のサイズの保存が望まれる場合に使用することができる。アラニンスキャニングは、長期間使用されている成熟技術である。
【００５３】
結合ドメイン及びエピトープまたはエピトープを含む領域の間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原（本明細書では、それぞれ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対する相当の親和性を示し、一般には、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との有意な反応性を示さないことを意味する。「相当の親和性」は、約１０−６Ｍ（ＫＤ）またはそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは、約１０−１１〜１０−９Ｍである時に、特異的であるとみなされる。結合ドメインが標的と特異的に反応するかまたは結合するかは、とりわけ、該結合ドメインの標的タンパク質または抗原との反応を、該結合ドメインの、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と比較することにより、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＥＧＦＲＶＩＩＩのまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に本質的または実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、ＥＧＦＲＶＩＩＩの以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。
【００５４】
「本質的に／実質的に結合しない」または「結合することができない」という用語は、本発明の結合ドメインが、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合しないこと、すなわち、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原と３０％を超える、好ましくは、２０％を超える、より好ましくは、１０％を超える、特に好ましくは、９％、８％、７％、６％、または５％を超える反応性を示さない（ここで、ＣＤ３またはＥＧＦＲＶＩＩＩは１００％に設定される）ことを意味する。
【００５５】
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列の特定のモチーフによりもたらされると考えられる。従って、結合は、１次、２次、及び／または３次構造の結果ならびに該構造の２次修飾の結果として達成される。抗原相互作用部位のその特異抗原との特異的相互作用は、該部位の抗原への単純な結合をもたらし得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用は、代替的または追加的に、例えば、抗原の立体配座の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因した、シグナルの開始をもたらし得る。
【００５６】
本発明の二重特異性抗体構築物のエピトープは、ＥＧＦＲのスプライス変異ＥＧＦＲｖＩＩＩへの変異から生じるＥＧＦＲのアミノ酸残基５及び２７４の間のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ジャンクションに位置する。この変異は、成熟ＥＧＦＲ配列の残基２〜７３３を除去する一方、単一のグリシン残基を導入する（図１を参照のこと）。
【００５７】
本発明の一実施形態では、第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン、及び、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）、またはコモンリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３イプシロンに結合することも好ましい。
【００５８】
「可変」という用語は、配列内の可変性を示し、特定の抗体（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）の特異性及び結合親和性を決定することに関与する抗体の部分または免疫グロブリンドメインを指す。可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の対合は、共に単一の抗原結合部位を形成する。
【００５９】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布せず；重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成するための３次元空間における６つのＣＤＲの足場を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、４つのＦＲＭ領域は、概ねβシート立体配置をとり、３つの超可変領域により連結され、３つの超可変領域は、βシート構造に接続し、一部の場合では、βシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭに近接して一緒に、かつ他の鎖の超可変領域と共に保持され、抗原結合部位の形成に寄与する（上記引用文のＫａｂａｔらを参照のこと）。
【００６０】
「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」という用語は、３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３）の結合特性を構成し、かつ３つが重鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）の結合特性を構成する相補性決定領域を指す。ＣＤＲは、抗体の抗原との特異的相互作用に関与している残基の大部分を含有し、従って、抗体分子の機能的活性に寄与する：それらは、抗原特異性の主要な決定因子である。
【００６１】
正確な定義上のＣＤＲ境界及び長さは、異なる分類及び番号付けシステムに従う。それ故、ＣＤＲは、本明細書に記載の番号付け方式を含むＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触または他の任意の境界定義によって参照され得る。異なる境界にもかかわらず、これらの方式のそれぞれは、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重複を有する。それ故、これらの方式によるＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界領域が異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間配列可変性に基づくアプローチ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ）、ならびに／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されるＡｂＭの定義である。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルク）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓを参照のこと。２つの残基同定技術が、重複するが同一領域ではない領域を規定する限り、それらは、ハイブリッドＣＤＲを定義するために組み合わせることができる。しかし、いわゆるＫａｂａｔ方式による番号付けが好ましい。
【００６２】
通常は、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖コンフォメーションを指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つが利用可能な立体配座の限られたレパートリーしか有さないことが見出されている。各カノニカル構造は、ポリペプチドバックボーンの捻れ角を特徴とすることができる。それ故、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分における高いアミノ酸配列可変性にもかかわらず、非常に類似した３次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、とられたループ構造及びそれを取り囲むアミノ酸配列の間に関係がある。特定のカノニカルクラスの立体配座は、ループの長さ、及びループ内の重要な位置に存在するアミノ酸残基、ならびに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内に存在するアミノ酸残基により決定される。それ故、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
【００６３】
「カノニカル構造」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔによりカタログ化されているような、抗体の線状配列に関する考察を含むこともある（上記引用文のＫａｂａｔら）。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（方式）は、本明細書の他の箇所でも述べられるように、一貫した仕方で抗体可変ドメインのアミノ酸残基を番号付けするための広く採用される規格であり、本発明に適用される好ましいスキームである。さらなる構造的考察を、抗体のカノニカル構造を決定するために使用することもできる。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けにより完全には反映されていないそれらの相違は、Ｃｈｏｔｈｉａらの番号付け方式により記載することができ、かつ／または他の技術、例えば、結晶学及び２次元または３次元計算モデリングにより明らかにすることができる。従って、所与の抗体配列は、とりわけ、（例えば、ライブラリーに様々なカノニカル構造を含むことを望むことに基づく）適切なシャーシ配列を同定することを可能にするカノニカルクラス内に入れられてもよい。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け及び上記引用文のＣｈｏｔｈｉａらにより記載されるような構造の考察及び抗体構造のカロニカル態様に対する解釈は、文献に記載されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元立体配置は、当該技術分野において周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照のこと。
【００６４】
軽鎖のＣＤＲ３、特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内の抗原結合における最も重要な決定基を構成し得る。一部の抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３は、抗原及び抗体の間の主要な接触領域を構成するようである。ＣＤＲ３のみが変化するインビトロ選択方式を、抗体の結合特性を変化させ、またはどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定するために、使用することができる。従って、ＣＤＲ３は通常、抗体結合部位内の分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基ほど短く、または２６個を超えるアミノ酸であることができる。
【００６５】
古典的全長抗体または免疫グロブリンでは、各軽鎖（Ｌ）は１つの共有ジスルフィド結合により重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合により互いに連結される。ＶＨに最も近いＣＨドメインは通常、ＣＨ１と表記される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害性、及び補体活性化などの種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば、細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。
【００６６】
会合及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、非常に変動し、これらの種々の遺伝子は、１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。従って、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列から全体的または部分的に誘導された少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。配列（複数可）は、重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメント、ならびに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再構成により生成され得る。あるいは、配列（複数可）は、再構成が起こる応答、例えば、インビトロ刺激、において細胞から生成することができる。あるいは、配列（複数可）の一部または全部は、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異導入、及び他の方法により得ることができ、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照のこと。レパートリーは、１つの配列のみを含んでもよく、または遺伝子的に多様なコレクションの配列を含む複数の配列を含んでもよい。
【００６７】
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、「少なくとも二重特異的」である抗体構築物を指し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは、１つの抗原または標的（本明細書では、ＥＧＦＲＶＩＩＩ）に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原または標的（本明細書では、ＣＤ３）に結合する。従って、本発明による抗体構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の「二重特異性抗体構築物」という用語は、三重特異性抗体構築物などの多重特異性抗体構築物も包含し、後者は、３つの結合ドメインまたは３つを超える（例えば、４つ、５つ・・・の）特異性を有する構築物を含む。
【００６８】
本発明による抗体構築物が（少なくとも）二重特異性であることを考えると、それらは自然に発生せず、それらは、天然の産物とは顕著に異なる。従って、「二重特異性」抗体構築物または免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体構築物は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法により産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１  （１９９０）を参照のこと。
【００６９】
本発明の抗体構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、またはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも、含んでいなくてもよい。本発明による「ペプチドリンカー」という用語は、本発明の抗体構築物の１つの（可変及び／または結合）ドメインならびに別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列が互いに連結されているアミノ酸配列を含む。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、いかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号及び同第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載されているものがある。ペプチドリンカーは、他のドメインまたはモジュールまたは領域（例えば、半減期延長ドメイン）を本発明の抗体構築物に結合させるために使用することもできる。
【００７０】
リンカーが使用される場合に、このリンカーは、好ましくは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立して、異なる結合特異性を保持することができることを保証するのに十分な長さ及び配列である。本発明の抗体構築物中の少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーのために、ごくわずか数のアミノ酸残基、例えば、１２以下のアミノ酸残基、しか含まないペプチドリンカーが好ましい。従って、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。想定された５未満のアミノ酸を有するペプチドリンカーは、４、３、２、または１アミノ酸（複数可）を含み、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。該「ペプチドリンカー」との関連で特に好ましい「単一」アミノ酸は、Ｇｌｙである。従って、該ペプチドリンカーは、単一アミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）またはそのポリマー、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ｘは、１以上の整数（例えば、２または３）である。好ましいリンカーは、配列番号１〜９に示されている。２次構造の促進の不存在を含む該ペプチドリンカーの特性は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）  ３７，９２６６−９２７３），Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９２）  ２９，２１−３０）及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ  （１９９５）  ９（１），７３−８０）に記載されている。さらにいかなる２次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。該ドメインの互いへの連結は、実施例に記載されるように、例えば、遺伝子工学により、提供することができる。融合され、かつ機能的に連結された二重特異性一本鎖構築物を調製し、かつ哺乳動物細胞または細菌においてそれらを発現させる方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【００７１】
本明細書に上で記載されるように、本発明は、抗体構築物が、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、これらの形式のいずれかのダイアボディ及びオリゴマーからなる群より選択される形式である好ましい実施形態を提供する。
【００７２】
特に好ましい実施形態によると、及び添付の実施例に記載されるように、本発明の抗体構築物は、「二重特異性一本鎖抗体構築物」、より好ましくは、二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することができ、先に記載されるように、合成リンカーによる組換え法を使用して、それらを連結することができる；（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。これらの抗体フラグメントは、当業者らに既知の従来の技術を使用して得られ、それらのフラグメントは、全抗体または全長抗体と同じ仕方で機能について評価される。従って、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常、約１０〜約２５個のアミノ酸、好ましくは、約１５〜２０個のアミノ酸、の短いリンカーペプチドで接続されている、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためのグリシン、ならびに溶解性のためのセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができるか、またはその逆で接続することができるかのいずれかである。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００７３】
二重特異性単鎖分子は、当該技術分野で既知であり、ＷＯ９９／５４４４０、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５，Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７，Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３，Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の産生について記載された技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号、上記引用文のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２０１０）、ならびに上記引用文のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照のこと）は、選択された標的（複数可）を特異的に認識する一本鎖抗体構築物を産生するように適合させることができる。
【００７４】
（例えば、上記のようなリンカーで）２つのｓｃＦｖ分子を連結することにより、二価（二原子価とも呼ばれる）または二重特異性一本鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖ）を操作することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは、二価（すなわち、それは同じ標的エピトープに対して２つの価数を有する）と呼ばれるであろう。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、好ましくは、二重特異性と呼ばれることになる。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖を生成して、タンデムｓｃＦｖを生じることにより行うことができる（例えば、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４を参照のこと）。別の可能性は、２つの可変領域が一緒にフォールディングするには短すぎる（例えば、約５個のアミノ酸）リンカーペプチドを有するｓｃＦｖ分子を作成して、ｓｃＦｖを二量体化させることである。このタイプは、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｕｌｙ  １９９３）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９０  （１４）：６４４４−８．を参照のこと）。
【００７５】
本発明の抗体構築物のさらなる好ましい実施形態によれば、標的抗原ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３のいずれかに結合する結合ドメインの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、上記ペプチドリンカーを介して直接接続されないが、結合ドメインは、抗体について記載したような二重特異性分子の形成のために形成される。従って、ＣＤ３結合ドメインのＶＨ鎖は、そのようなペプチドリンカーを介して、ＥＧＦＲＶＩＩＩ結合ドメインのＶＬ鎖に融合され得る一方、ＥＧＦＲＶＩＩＩ結合ドメインのＶＨ鎖は、そのようなペプチドリンカーを介して、ＣＤ３結合ドメインのＶＬに融合される。
【００７６】
単一ドメイン抗体は単に、他のＶ領域またはドメインとは独立して、特異抗原に選択的に結合することができる１つだけの（単量体）抗体可変ドメインを含む。ラクダ科動物に見出される重鎖抗体から最初の単一ドメイン抗体が開発され、それはＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚も、ＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有する。代替のアプローチは、一般的な免疫グロブリン由来の、例えば、ヒトまたは齧歯動物由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それにより、単一ドメインＡｂとしてのＶＨまたはＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディが、標的エピトープに特異的に結合することも示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ、または単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
【００７７】
従って、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体からなるモノクローナル抗体構築物である。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ」は、上記のような少なくとも１つの単一ドメイン抗体及び上記のような１つのｓｃＦｖ分子からなるモノクローナル抗体構築物である。ここでも、リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。
【００７８】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種（それ自体が白血球の一種）である。Ｔ細胞のいくつかのサブセットがあり、それぞれが、異なる機能を有する。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合される抗原を認識することに関与し、２本の異なるタンパク質鎖からなる。９５％のＴ細胞では、ＴＣＲは、アルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原性ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と関与する時、Ｔリンパ球は、関連する酵素、共受容体、特化されたアダプター分子、及び活性化または放出される転写因子により媒介される一連の生化学的事象により活性化される。
【００７９】
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖からなる。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成するために、かつＴリンパ球において活性化信号を生成するために、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）、及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、免疫受容体チロシン系活性化モチーフまたは略してＩＴＡＭとして知られている単一の保存モチーフを含有し、これはＴＣＲのシグナル伝達能力にとって不可欠である。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトにおいて、染色体１１に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によりコードされるポリペプチドである。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。
【００８０】
多重特異性、少なくとも、二重特異性の抗体構築物によりＴ細胞の動員を介して標的細胞のリダイレクトされた溶解は、細胞溶解性シナプス形成ならびにパーフォリン及びグランザイムの送達を含む。関与するＴ細胞は、シリアル標的細胞溶解することができ、ペプチド抗原プロセシング及び提示、またはクローン性Ｔ細胞分化を妨害する免疫回避機序により影響されない；例えば、ＷＯ２００７／０４２２６１を参照のこと。
【００８１】
ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物により媒介される細胞傷害性は、種々の手段で測定することができる。実施例１を参照のこと。エフェクター細胞は、例えば、刺激富化（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞または未刺激（ヒト）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とすることができる。標的細胞がマカク由来のものであるか、またはマカクＥＧＦＲＶＩＩＩを発現するかマカクＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされた場合、エフェクター細胞はまた、マカク由来のもの、例えば、マカクＴ細胞株、例えば、４１１９ＬｎＰｘ、とすべきである。標的細胞は、ＥＧＦＲＶＩＩＩ（の少なくとも細胞外ドメイン）、例えば、ヒトまたはマカクＥＧＦＲＶＩＩＩを発現するべきである。標的細胞は、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、例えば、ヒトまたはマカクＥＧＦＲＶＩＩＩを安定的または一時的にトランスフェクションされた細胞株（例えば、ＣＨＯ）とすることができる。あるいは、標的細胞は、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７またはＤＫ−ＭＧなどのＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性天然発現細胞株とすることができる。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面上のより高いレベルのＥＧＦＲＶＩＩＩを発現する標的細胞株ではより低いと予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比は通常、約１０：１であるが、変動する可能性もある。ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害性活性は、５１クロム放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）またはＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイ（約４８時間のインキュベーション時間）で測定することができる。アッセイインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者に周知であり、ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ、及びＥＣＩＳ技術を含むＡＴＰベースアッセイを含む。
【００８２】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物により媒介される細胞傷害性活性は、好ましくは、細胞に基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定される。５１クロム放出アッセイで測定され得る。それは、最大有効濃度の半分の濃度（ベースライン及び最大値の中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体構築物の濃度）に対応するＥＣ５０値により表される。好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、５０００ｐＭ以下若しくは４０００ｐＭ以下、より好ましくは、３０００ｐＭ以下若しくは２０００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、１０００ｐＭ以下若しくは５００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、４００ｐＭ以下若しくは３００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、２００ｐＭ以下、さらにより好ましくは１００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、５０ｐＭ以下、さらにより好ましくは、２０ｐＭ以下若しくは１０ｐＭ以下、最も好ましくは、５ｐＭ以下である。
【００８３】
上記の所与のＥＣ５０値は、異なるアッセイで測定することができる。刺激／富化ＣＤ８＋Ｔ細胞が、未刺激ＰＢＭＣと比較して、エフェクター細胞として使用される場合、ＥＣ５０値がより低いと予想することができることを、当業者は認識している。標的細胞が、低標的発現ラットと比較して多数の標的抗原を発現する場合、ＥＣ５０値がより低いことをさらに予想することができる。例えば、刺激／富化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞がエフェクター細胞として使用される（かつ、ＣＨＯ細胞などのＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされた細胞またはＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７若しくはＤＫ−ＭＧのいずれかが標的細胞として使用される）場合、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは、１０００ｐＭ以下、より好ましくは、５００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、２５０ｐＭ以下、さらにより好ましくは、１００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、５０ｐＭ以下、さらにより好ましくは、１０ｐＭ以下、最も好ましくは、５ｐＭ以下である。ヒトＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用される場合、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは、５０００ｐＭ以下または４０００ｐＭ以下（特に、標的細胞が、ＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７またはＤＫ−ＭＧである場合）、より好ましくは、２０００ｐＭ以下（特に、標的細胞が、ＣＨＯ細胞などのＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされた細胞である場合）、より好ましくは、１０００ｐＭ以下または５００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、２００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、１５０ｐＭ以下、さらにより好ましくは、１００ｐＭ以下、最も好ましくは、５０ｐＭ以下、またはそれ未満である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株が、エフェクター細胞として使用され、かつＣＨＯ細胞などのマカクＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされた細胞株が、標的細胞株として使用される場合、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物のＥＣ５０値は、好ましくは、２０００ｐＭ以下若しくは１５００ｐＭ以下、より好ましくは、１０００ｐＭ以下若しくは５００ｐＭ以下、さらにより好ましくは、３００ｐＭ以下若しくは２５０ｐＭ以下、さらにより好ましくは、１００ｐＭ以下、最も好ましくは、５０ｐＭ以下である。
【００８４】
好ましくは、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、ＣＨＯ細胞などのＥＧＦＲＶＩＩＩ陰性細胞の溶解を誘導／媒介せず、または本質的に誘導／媒介しない。「溶解を誘導しない」、「本質的に溶解を誘導しない」、「溶解を媒介しない」、または「本質的に溶解を媒介しない」という用語は、本発明の抗体構築物が、ＥＧＦＲＶＩＩＩ陰性細胞の３０％を超える、好ましくは、２０％を超える、より好ましくは、１０％を超える、特に好ましくは、９％、８％、７％、６％、または５％を超える溶解を誘導または媒介しないこと（ここで、ＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７またはＤＫ−ＭＧ（上記を参照のこと）の溶解は１００％に設定される）を意味する。これは通常、５００ｎＭまでの抗体構築物の濃度に適用される。当業者は、苦もなく細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書は、細胞溶解を測定する具体的な指示を教示する。
【００８５】
個々のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォーム及び二量体アイソフォームの間の細胞傷害活性の差異は、「効力差」と呼ばれる。この効力差は、例えば、分子の単量体形態及び二量体形態のＥＣ５０値の間の比率として計算することができる、実施例１．８を参照のこと。本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の効力差は、好ましくは、５以下、より好ましくは、４以下、さらにより好ましくは、３以下、さらにより好ましくは、２以下、さらに好ましくは、１以下、最も好ましくは、０．３以下である。
【００８６】
本発明の抗体構築物の第１及び／または第２の（またはそれ以上の）結合ドメイン（複数可）は、好ましくは、哺乳動物の霊長目のメンバーに異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１１９５６７に記載されている。一実施形態によれば、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩ及びヒトＣＤ３への結合に加えて、第１及び／または第２の結合ドメインはそれぞれ、新世界霊長動物（例えば、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ、またはＳａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）、旧世界霊長動物（例えば、ヒヒ及びマカク）、テナガザル、オランウータン、ならびに非ヒトであるヒト亜科（ｈｏｍｉｎｉｎａｅ）を含む（がこれに限定されない）霊長動物のＥＧＦＲＶＩＩＩ／ＣＤ３に結合することにもなる。標的細胞の表面上のヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、少なくともマカクＥＧＦＲＶＩＩＩにも結合し、かつ／またはＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、少なくともマカクＣＤ３にも結合すると想定される。好ましいマカクは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（Ｒｈｅｓｕｓ）も想定される。
【００８７】
本発明の一態様では、第１の結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに結合し、かつマカクＥＧＦＲＶＩＩＩ、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＥＧＦＲＶＩＩＩ、より好ましくは、表面マカク細胞上に発現されるマカクＥＧＦＲＶＩＩＩにさらに結合する。好ましいＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＥＧＦＲＶＩＩＩは、配列番号２３４に示される。第１の結合ドメインのマカクＥＧＦＲＶＩＩＩに対する親和性は、好ましくは、１５ｎＭ以下、より好ましくは、１０ｎＭ以下、さらにより好ましくは、５ｎＭ以下、さらにより好ましくは、１ｎＭ以下、さらにより好ましくは、０．５ｎＭ以下、さらにより好ましくは、０．１ｎＭ以下、最も好ましくは、０．０５ｎＭ以下またはさらに０．０１ｎＭ以下である。
【００８８】
（例えば、ＢｉａＣｏｒｅまたはＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定されるような）マカクＥＧＦＲＶＩＩＩのヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに対する結合の、本発明による抗体構築物の親和性ギャップ［ｍａＥＧＦＲＶＩＩＩ：ｈｕＥＧＦＲＶＩＩＩ］は、好ましくは、１００未満、好ましくは、２０未満、より好ましくは、１５未満、さらに好ましくは、１０未満、さらにより好ましくは、８未満、より好ましくは、６未満、最も好ましくは、２未満である。マカクのＥＧＦＲＶＩＩＩのヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに対する結合の、本発明による抗体構築物の親和性ギャップに対する好ましい範囲は、好ましくは、０．１及び２０の間、より好ましくは、０．２及び１０の間、さらにより好ましくは、０．３及び６の間、さらにより好ましくは、０．５及び３の間または０．５及び２．５の間、最も好ましくは、０．５及び２の間または０．６及び２の間である。
【００８９】
本発明の抗体構築物の一実施形態では、第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン及びＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ、またはＳａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓＣＤ３イプシロンに結合する。好ましくは、第２の結合ドメインは、これらのＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する。第２の結合ドメインは、ヒト及びＭａｃａｃａ  ＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合することも想定される。ＣＤ３イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７内に含まれる。さらにより具体的には、エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕを含む。Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ及びＳａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓは双方ともに、マーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）のファミリーに属する新世界霊長動物である一方、Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓは、オマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ）のファミリーに属する新世界霊長動物である。
【００９０】
Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインが、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１７に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１８に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１１９に示されるＣＤＲ−Ｌ３；ならびに、
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５３に示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５４に示されるＣＤＲ−Ｌ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５５に示されるＣＤＲ−Ｌ３
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが、本発明の抗体構築物にとって特に好ましい。
【００９１】
本発明の抗体構築物の代替の好ましい実施形態では、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号４９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８６に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０２に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０３に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０４に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２０に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２１に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２２に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３８に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１３９に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４０に示されるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５６に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５７に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５８に示されるＣＤＲ−Ｈ３；ならびに、
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７４に示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７５に示されるＣＤＲ−Ｈ２、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７６に示されるＣＤＲ−Ｈ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
【００９２】
Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２に示されるＶＬ領域からなる群より選択されるＶＬ領域を含むことが、本発明の抗体構築物にとってさらに好ましい（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５、３９、１２５、１２９、１６１、または１６５も参照のこと）。
【００９３】
Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインは、配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１に示されるＶＨ領域からなる群より選択されるＶＨ領域を含むことが代替的に好ましい（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７、または１８１も参照のこと）。
【００９４】
より好ましくは、本発明の抗体構築物は、
（ａ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７または２１に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５または１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３５または３９に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号３３または３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５３または５７に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号５１または５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号７１または７５に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号６９または７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８９または９３に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号８７または９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０７または１１１に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１０５または１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２５または１２９に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１２３または１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４３または１４７に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１４１または１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１６１または１６５に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１５９または１６３に示されるＶＨ領域；ならびに、
（ｊ）ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７９または１８３に示されるＶＬ領域、及びＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号１７７または１８１に示されるＶＨ領域
からなる群より選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを特徴とする。
【００９５】
さらに、本発明の抗体構築物に関連して好まれるのは、配列番号１０２に示されるＶＬ領域及び配列番号１０１に示されるＶＨ領域を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインである。
【００９６】
本発明の抗体構築物の好ましい実施形態によれば、結合ドメイン及び特に、（Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する）第２の結合ドメインは、次の形式を有する：ＶＨ領域及びＶＬ領域の対は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域は、リンカー配列のＮ末端に位置し、ＶＬ領域は、リンカー配列のＣ末端に位置することが好ましい。
【００９７】
上記の本発明の抗体構築物の好ましい実施形態は、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメインを特徴とする（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７も参照のこと）。
【００９８】
本発明の抗体構築物は、標的分子ＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＣＤ３に結合するその機能に加えて、さらなる機能を有することも想定される。この形式では、抗体構築物は、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合を介して標的細胞を標的とし、ＣＤ３結合を介して細胞傷害性Ｔ細胞活性を媒介し、ＮＫ細胞のようなエフェクター細胞、標識（蛍光など）、毒素若しくは放射性核種などの治療薬、及び／または血清半減期を延長する手段などの動員を介して抗体依存性細胞傷害性を媒介する完全機能性Ｆｃ定常ドメインなどのさらなる機能を提供することによる３機能性または多機能性抗体構築物である。
【００９９】
本発明の抗体構築物の血清半減期を延長するための手段の例としては、抗体構築物に融合され、またはこれらに別の方法で結合されたペプチド、タンパク質、またはタンパク質のドメインが挙げられる。ペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインの群は、血清アルブミンなどの人体において好ましい薬物動態プロファイルを有する他のタンパク質に結合するペプチドを含む（ＷＯ２００９／１２７６９１を参照のこと）。そのような半減期延長ペプチドの代替的概念は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＷＯ２００７／０９８４２０を参照のこと）に結合するペプチドを含み、それらは本発明の構築物において使用することもできる。タンパク質または完全タンパク質のより大きなドメインを結合する概念は、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの多様体若しくは変異体（ＷＯ２０１１／０５１４８９、ＷＯ２０１２／０５９４８６、ＷＯ２０１２／１５０３１９、ＷＯ２０１３／１３５８９６、ＷＯ２０１４／０７２４８１、ＷＯ２０１３／０７５０６６を参照のこと）、またはそのドメインの融合、ならびに免疫グロブリン及びその多様体の定常領域（Ｆｃドメイン）の融合を含む。Ｆｃドメインのそのような多様体は、二量体または多量体の所望の対合を可能にするために、Ｆｃ受容体結合（例えば、Ｆｃγ受容体）を破壊するために、または他の理由のために、最適化／修飾されてもよい。人体における小型タンパク質化合物の半減期を延長することが当該技術分野で知られているさらなる概念は、本発明の抗体構築物などの化合物のペグ化である。
【０１００】
好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、次のように記載される。
（ａ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・任意に、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｂ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・任意に、配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１０４〜１３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・任意に、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｃ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・アミノ酸配列
2018524997.tif 000003
を有し、Ｘ１がＹまたはＨであるポリペプチド、ならびに、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・アミノ酸配列
2018524997.tif 000004
を有するポリペプチド、ならびに、
・任意に、配列番号１０に示されるものなどのＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｄ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１５８のアミノ酸を有するポリペプチド、
・配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、Ｃ末端のセリン残基、
・配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｅ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１７、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、及び配列番号１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１５８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１４２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１８、配列番号２７、配列番号３６、配列番号４５、配列番号５４、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号９９、及び配列番号１０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、Ｃ末端のセリン残基、
・配列番号１４３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｆ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｇ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１４７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｈ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１４８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、ならびに、Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに、
・配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド、または、
（ｉ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに、
・配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｊ）Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号１５９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
・配列番号１、２、４、５、６、８、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１８１〜１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン
を含むポリペプチド。
【０１０１】
上記のように、本発明のいくつかの好ましい抗体構築物は、アルブミンまたはアルブミン多様体などの別の部分との融合により改変される。これらの融合構築物が、それらの特性、特に、標的親和性または細胞傷害活性について特徴付けられる場合、類似した融合構築物または非修飾二重特異性抗体構築物が、類似する（またはさらに良好な）特性を有することを予想することができることを、当業者は認識するであろう。例えば、アルブミンと融合した二重特異性抗体構築物が、相当のまたは望ましい細胞傷害活性または標的親和性を有する場合、同じ／類似したまたはさらに高い細胞傷害活性／標的親和性が、アルブミンを含まない構築物について観察されることを予想することができる。
【０１０２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体構築物は、（２つの結合ドメインに加えて）、２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインを含み、それぞれは、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、該２つのポリペプチド（またはポリペプチド単量体）は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。好ましくは、該第３のドメインは、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。該第３のドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号１８１〜１８８に示される。該２つのポリペプチド単量体のそれぞれは、好ましくは、配列番号１７３〜１８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、またはそれらの配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物の第１及び第２の結合ドメインは、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、及び９からなる群より選択されるペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される。
【０１０３】
本発明に従うと、「ヒンジ」は、ＩｇＧヒンジ領域である。この領域は、Ｋａｂａｔの番号付けを使用して類推することにより特定することができる、Ｋａｂａｔ位置２２３〜２４３を参照のこと。上記に従うと、「ヒンジ」に対する最小要件は、Ｋａｂａｔ番号付けによるＤ２３１〜Ｐ２４３のＩｇＧ１配列ストレッチに対応するアミノ酸残基である。ＣＨ２及びＣＨ３という用語は、免疫グロブリン重鎖定常領域２及び３を指す。これらの領域は同様に、Ｋａｂａｔ番号付けを使用して類推することにより特定することができる（ＣＨ２の場合、Ｋａｂａｔ位置２４４〜３６０及びＣＨ３の場合、Ｋａｂａｔ位置３６１〜４７８を参照のこと）。それらのＩｇＧ１のＦｃ領域、ＩｇＧ２のＦｃ領域、ＩｇＧ３のＦｃ領域、ＩｇＧ４のＦｃ領域、ＩｇＭのＦｃ領域、ＩｇＡのＦｃ領域、ＩｇＤのＦｃ領域、及びＩｇＥのＦｃ領域に関して免疫グロブリンの間にいくつかの変動があることが理解される（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９−２１７  （１９９３）を参照のこと）。Ｆｃ単量体という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域を指す。Ｆｃ単量体は、これらのドメインＮ末端に、可撓性ヒンジを含むこともできる。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃ部分は免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３、ならびに最初の２つのドメインとＣＨ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリンのＦｃ部分の境界は変化することがあるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、ＩｇＧ４に対して、それぞれ、（ヒンジドメインの）残基Ｄ２３１〜（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）Ｐ４７６、またはＤ２３１〜Ｌ４７６を含むために定義することができ、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。
【０１０４】
従って、本発明の抗体構築物は、Ｎ末端からＣ末端の順序で、
（ａ）第１の結合ドメイン、
（ｂ）配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（ｃ）第２の結合ドメイン、
（ｄ）配列番号１、２、４、５、６、８、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（ｅ）（ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む）第３ドメインの第１ポリペプチド単量体、
（ｆ）配列番号１９２、１９３、１９４、及び１９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
（ｇ）（ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む）第３ドメインの第２ポリペプチド単量体
を含み得る。
【０１０５】
本発明の抗体構築物がＮ末端からＣ末端の順序で、
・配列番号１５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第１の結合ドメイン、
・配列番号１〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
・配列番号１９、配列番号２８、配列番号３７、配列番号４６、配列番号５５、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、及び配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合ドメイン（ＷＯ２００８／１１９５６７の配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５、または１８７も参照のこと）、
・配列番号１、２、４、５、６、８、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに、
・配列番号１８１〜１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン
を含むことも好まれる。
【０１０６】
従って、好ましい実施形態では、本発明の抗体構築物は、配列番号１８９または１９０に示されるポリペプチドを含む、またはそれからなる。
【０１０７】
本発明の抗体構築物の一実施形態では、抗体構築物は、配列番号１６０に示されるポリペプチドを含む、またはそれからなる。
【０１０８】
抗体構築物の共有結合修飾は、本発明の範囲内にも含まれ、一般に、（常にではないが）翻訳後に行われる。例えば、抗体構築物のいくつかの種類の共有結合修飾は、選択された側鎖またはＮ末端残基若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と、抗体構築物の具体的なアミノ酸残基を反応させることにより、分子に導入される。
【０１０９】
システイニル残基は最も一般には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても誘導化される。
【０１１０】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０のジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。その理由は、この物質がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で実施される。リジニル及びアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０１１１】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンのうちの１つまたはいくつかの従来の試薬との反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、反応がアルカリ性条件で実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リシンの基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応することがある。
【０１１２】
芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関与するチロシル残基の特異的な修飾が行われてもよい。最も一般には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製するための１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化され、上記のクロラミンＴ法が好適である。
【０１１３】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、Ｒ及びＲ’は、任意に、異なるアルキル基、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に転換される。
【０１１４】
二官能性薬剤による誘導体化は、様々な方法に使用するために水不溶性サポートマトリックスまたは表面に、本発明の抗体構築物を架橋するのに有用である。一般に使用される架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に記載されるようなシアンブロミド活性化炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックス及び反応性基質が、タンパク質固定化のために用いられる。
【０１１５】
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基に脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る。
【０１１６】
他の修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１１７】
本発明の範囲内に含まれる抗体構築物の共有結合修飾の別のタイプは、タンパク質のグリコシル化パターンを変更することを含む。当該技術分野で知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下に検討される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在若しくは不存在）、またはタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生体の配列の両方に依存し得る。特定の発現系が以下に記載される。
【０１１８】
ポリペプチドのグリコシル化は通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ−結合は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）のトリペプチド配列は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般には、セリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用され得る。
【０１１９】
グリコシル化部位の抗体構築物への付加は、それが（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより好都合に達成される。変更は、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）開始配列への１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換により行われ得る。容易にするために、抗体構築物のアミノ酸配列は、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが生成されるように予め選択された塩基でポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより、ＤＮＡレベルでの変化により改変されることが好ましい。
【０１２０】
抗体構築物上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的または酵素的カップリングによる。これらの手順は、Ｎ結合型グリコシル化及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中でのタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合モードに応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニン、若しくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合されてもよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１２１】
出発抗体構築物上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、タンパク質のトリフルオロメタンスルホン酸の化合物または同等の化合物への曝露を必要とする。この処理は、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖が切断される一方、ポリペプチドはインタクトのまま残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により記載されるような様々なエンド−グリコシダーゼ及びエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により記載されるような化合物ツニカマイシンの使用により妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド連結の形成をブロックする。
【０１２２】
本明細書では、抗体構築物の他の修飾も検討される。例えば、抗体構築物の別の種類の共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載される仕方で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーなどの種々のポリオールを含むがこれに限定されない種々の非タンパク質性ポリマーに抗体を連結させることを含む。さらに、アミノ酸置換は、当該技術分野で知られているように、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの添加を容易にするために、抗体構築物内の種々の位置で行われてもよい。
【０１２３】
一部の実施形態では、本発明の抗体構築物の共有結合修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗体構築物に結合されてもよい。タンパク質を標識するための種々の方法が当該技術分野で既知であり、本発明を実施することに使用することができる。「標識」または「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、検出されるべきアッセイに応じて、様々なクラスに分類され、次の例は以下を含むが、それらに限定されない：
ａ）放射性または重同位体、例えば、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）であり得る同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）
ｃ）レドックス活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基、及び「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかである可能性があるフルオロフォアなどの（発色団、蛍リン光体、及び蛍光団を含むが、これらに限定されない）光学色素
ｅ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）２次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、２次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
【０１２４】
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光特性により検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅグリーン、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、Ｏｒｅｇｏｎグリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ−フィリコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）、ＦＩＴＣ、ローダミン、ならびにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を含むが、これらに限定されない。蛍光団を含む好適な光学色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
【０１２５】
好適なタンパク質性蛍光標識は、ＧＦＰのＲｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）、及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号；同第５，４１８，１５５号；同第５，６８３，８８８号；同第５，７４１，６６８号；同第５，７７７，０７９号；同第５，８０４，３８７号；同第５，８７４，３０４号；同第５，８７６，９９５号；同第５，９２５，５５８号）を含む緑色蛍光タンパク質も含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定された（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）。ロイシンジッパーはその後、様々な異なるタンパク質において見出されている。既知のロイシンジッパーの中には、二量化または三量化する天然のペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺サーファクタントタンパクＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載されている。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能する修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。１つのアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドに融合されたＥＧＦＲＶＩＩＩ抗体フラグメントまたは誘導体を含む組換え融合タンパク質は、好適な宿主細胞中に発現され、形成する可溶性オリゴマーのＥＧＦＲＶＩＩＩ抗体フラグメントまたは誘導体は、培養上清から回収される。
【０１２７】
本発明の抗体構築物は、例えば、分子の単離において有益であり、または分子の適合された薬物動態学的プロファイルに関連するさらなるドメインも含み得る。抗体構築物の単離に有益なドメインは、ペプチドモチーフまたは２次導入された部分から選択されてもよく、これは単離法、例えば、単離カラム、で捕捉することができる。そのようなさらなるドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその多様体（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）ならびにＨｉｓタグとして知られているペプチドモチーフを含む。特定されたＣＤＲを特徴とする本明細書に開示の抗体構築物は全て、好ましくは、一般に分子のアミノ酸配列における連続Ｈｉｓ残基の繰り返しとして知られているＨｉｓタグドメイン、好ましくは、５つの、より好ましくは、６つのＨｉｓ残基（ヘキサ−ヒスチジン）を含む。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体構築物のＮ末端またはＣ末端に位置してもよく、好ましくは、Ｃ末端に位置する。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１０）が、本発明による抗体構築物のＣ末端にペプチド結合を介して連結されている。
【０１２８】
本発明の抗体構築物の第１の結合ドメインは、標的細胞の表面上のヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する。ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩの好ましいアミノ酸配列は、番号２３１、２３２、及び２３３に代表される。従って、本発明による第１の結合ドメインは、自然に発現する細胞若しくは細胞株により、かつ／またはＥＧＦＲＶＩＩＩで形質転換され若しくはＥＧＦＲＶＩＩＩを（安定的に／一時的に）トランスフェクションされた細胞若しくは細胞株により、発現される時、好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する。好ましい実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅまたはＳｃａｔｃｈａｒｄなどのインビトロ結合アッセイにおいて、ＥＧＦＲＶＩＩＩが「標的」または「リガンド」分子として使用される場合、第１の結合ドメインは、ＥＧＦＲＶＩＩＩにも結合する。「標的細胞」は、表面上にＥＧＦＲＶＩＩＩを発現する任意の原核細胞または真核細胞とすることができ、好ましくは、標的細胞は、卵巣癌細胞、膵癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、及びトリプルネガティブ乳癌細胞などのヒトまたは動物の体の一部である細胞である。
【０１２９】
ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは、２０ｎＭ以下、より好ましくは、１０ｎＭ以下、さらにより好ましくは、５ｎＭ以下、さらにより好ましくは、２ｎＭ以下、さらにより好ましくは、１ｎＭ以下、さらにより好ましくは、０．６ｎＭ以下、さらにより好ましくは、０．５ｎＭ以下であり、最も好ましくは、０．４ｎＭ以下である。親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイまたはＳｃａｔｃｈａｒｄアッセイにおいて、例えば、実施例に記載されるように、測定することができる。親和性を決定する他の方法も当業者に周知である。例えば、添付の実施例を参照のこと。
【０１３０】
本明細書に記載の抗体構築物のアミノ酸配列修飾も企図される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／または他の生物学的特性を向上させることが望ましいことがある。抗体構築物のアミノ酸配列多様体は、抗体構築物核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製される。以下に記載されるアミノ酸配列修飾の全ては、未修飾親分子の所望の（ＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＣＤ３に結合する）生物学的活性を依然として保持する抗体構築物をもたらすはずである。
【０１３１】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は通常、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロライン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；及びバリン（ＶａＩまたはＶ）からなる群より選択されるアミノ酸などの当該技術分野で認識される定義を有するアミノ酸を指すが、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または希なアミノ酸が、所望されるように使用されてもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＶａＩ）；負荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、ＧＩｎ、ＧＩｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有するものとして分類することができる。
【０１３２】
アミノ酸修飾は、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内での残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するように行われるが、最終構築物が所望の特性を有することを条件とする。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗体構築物の翻訳後プロセスを変化させることもある。
【０１３３】
例えば、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸が、（もちろん、長さに応じて）ＣＤＲのそれぞれに挿入または欠失され得る一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸は、ＦＲのそれぞれに挿入または欠失され得る。好ましくは、アミノ酸配列の挿入は、長さが１，２，３，４，５，６，７，８，９，または１０残基から１００残基以上を含有するポリペプチドまでの範囲にあるアミノ末端融合物及び／またはカルボキシ末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。本発明の抗体構築物の挿入多様体は、酵素の抗体構築物のＮ末端またはＣ末端への融合、または抗体構築物の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１３４】
置換変異導入にとって最も関心ある部位は、特に、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ、特に、超可変領域を含むが、重鎖及び／または軽鎖におけるＦＲ改変も企図される。置換は、好ましくは、本明細書に記載の保存的置換である。好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が、ＣＤＲで置換され得る一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸が、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、フレームワーク領域（ＦＲ）で置換され得る。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの１、２、または３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、または６個が置換されることが想定される。
【０１３５】
変異導入の好ましい位置である抗体構築物の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５  （１９８９）でＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓにより記載されているような「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。ここで、抗体構築物内の標的残基の残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなど荷電残基）が特定され、アミノ酸のエピトープとの相互作用に影響を与えるために、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）と取り替えられる。
【０１３６】
次に、置換に対する機能的感度を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、または置換部位のためにさらなる多様体または他の多様体を導入することにより改良される。従って、アミノ酸配列多様性を導入するための部位または領域は予め決定されているが、変異それ自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を分析または最適化するために、標的コドンまたは領域で、アラニンスキャニングまたはランダム変異導入が行われてもよく、発現された抗体構築物多様体は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を作製するための技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異導入及びＰＣＲ変異導入が周知である。変異体のスクリーニングは、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
【０１３７】
一般に、アミノ酸が、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲの１つ以上または全てにおいて置換される場合、その後得られた「置換」配列が、「当初」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％または６５％、より好ましくは、７０％または７５％、さらにより好ましくは、８０％または８５％、特に好ましくは、９０％または９５％同一であることが好ましい。これは、それが「置換された」配列と同一である程度までＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個のアミノ酸が置換されるために、その置換された配列と８０％同一であることが好ましい。従って、抗体構築物のＣＤＲは、それらの置換された配列に対して異なる程度の同一性を有し得、例えば、ＣＤＲＬ１は、８０％を有することがある一方、ＣＤＲＬ３は、９０％を有することがある。
【０１３８】
好ましい置換（または取り替え）は、保存的置換である。しかし、抗体構築物が第１結合ドメインを介してＥＧＦＲＶＩＩＩに結合する能力及び第２の結合ドメインを介してＣＤ３若しくはＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持し、かつ／またはそのＣＤＲが、その上、置換された配列に対する同一性を有する（「当初」ＣＤＲ配列に対し少なくとも６０％または６５％、より好ましくは、７０％または７５％、さらにより好ましくは、８０％または８５％、特に好ましくは、９０％または９５％同一である）限り、（非保存的置換または下記の表１に列挙される「例示的置換」からの１つ以上を含む）任意の置換が想定される。
【０１３９】
保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下の表１に示される。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１の「例示的置換」と呼ばれる、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるようなより実質的な変化が導入されてもよく、産物は、所望の特性についてスクリーニングされる。
【０１４０】
（表１）アミノ酸置換
2018524997.tif 000005
【０１４１】
本発明の抗体構築物の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス構造としての、置換の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することへの影響が著しく異なる置換を選択することにより達成される。天然の残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１４２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴うことになる。抗体構築物の好適な立体配座を維持することに関与しない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止するために、一般にセリンで置換されてもよい。逆に、システイン結合（複数可）を、（特に、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）安定性を向上させるために抗体に添加してもよい。
【０１４３】
アミノ酸配列の場合、配列同一性及び／または類似性は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似方法に対する研究、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、ウィスコンシン州マディソン）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載されているベストフィット配列プログラムを含むがこれらに限定されない当該技術分野において標準的な既知の技術を使用することにより、好ましくは、デフォルト設定を使用して、または調査により、決定される。好ましくは、同一性パーセントは、次のパラメータに基づいて、ＦａｓｔＤＢで計算される：“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １２７−１４９  （１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．の１のミスマッチペナルティ；１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；及び３０の結合ペナルティ。
【０１４４】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを使用して関連配列の群から複数の配列アラインメントを作り出す。また、アラインメントを作り出すために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の簡略化したものを使用し、方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３により記載されると類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルトギャップウェイト、０．１０のデフォルトギャップ長ウェイト、及び加重エンドギャップを含む。
【０１４５】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用し、その大部分はデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、次の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成及び目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体により確立されるが、値は、感度を増加させるために調整され得る。
【０１４６】
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２により報告されるギャップＢＬＡＳＴである。ギャップＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し；閾値Ｔパラメータは、９に設定され；ギャップのない延長部をトリガーする２ヒット法は、ｋの１０＋ｋに対する電荷ギャップの大きさ；Ｘｕは１６に設定され、Ｘｇはデータベース検索段階の場合４０に、かつアルゴリズムの出力段階の場合に６７に設定される。ギャップアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによりトリガーされる。
【０１４７】
一般には、個々の多様体のＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示された配列に対し少なくとも６０％であり、より典型的には、好ましくは、少なくとも６５％または７０％、より好ましくは、少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％の相同性または同一性の増加を有する。同様に、本明細書中で同定された結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体構築物のコード配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基の百分率として定義される。具体的な方法は、オーバーラップスパン及びオーバーラップ率がそれぞれ１及び０．１２５であるデフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【０１４８】
一般には、個々の多様体のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列及び本明細書に示されるヌクレオチド配列の間の核酸配列相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、及びほぼ１００％の相同性または同一性の増加を有する。従って、「多様体のＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対し特定の相同性、類似性、または同一性を有するものであり、親ＣＤＲの特異度及び／または活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むが、これらに限定されない生物学的機能を共有する。
【０１４９】
一実施形態では、本発明による抗体構築物のヒト生殖系列に対する同一性の百分率は、７０％以上または７５％以上、より好ましくは、８０％以上または８５％以上、さらにより好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、またはさらに９６％以上である。ヒト抗体の生殖系列遺伝子産物に対する同一性は、治療中の患者の薬物に対する免疫応答を誘発する治療タンパク質のリスクを低減する重要な特徴であると考えられている。Ｈｗａｎｇ及びＦｏｏｔｅ（“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６  （２００５）  ３−１０）は、薬物抗体構築物の非ヒト部分の低減が、治療中の患者において抗薬物抗体を誘導するリスクの減少をもたらすことを示す。網羅的な数の臨床的に評価された抗体薬物及びそれぞれの免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変非ヒトＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりも、タンパク質の免疫原性を低下させる（患者の平均５．１％）という傾向が示される。従って、ヒト配列に対するより高い程度の同一性は、抗体構築物の形態のＶ領域ベースのタンパク質治療薬にとって望ましい。生殖系列の同一性を決定するこの目的のために、ＶＬのＶ領域を、ベクターＮＴＩソフトウェア及び同一のアミノ酸残基をＶＬのアミノ酸残基の合計数で除することによりパーセントで計算されたアミノ酸配列を使用して、ヒト生殖系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインすることができる。高い多様性及び既存のヒト生殖系列ＶＨ  ＣＤＲ３のアラインメントパートナーの欠如のためにＶＨ  ＣＤＲ３が除外され得ることを除いて、ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）について、同じことが可能である。次に、組換え技術を、ヒト抗体生殖系列遺伝子に対する配列同一性を増加させるために使用することができる。
【０１５０】
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体構築物は、標準的な研究規模条件下で、例えば、標準的な二段階精製プロセスにおいて、高い単量体収率を示す。好ましくは、本発明による抗体構築物の単量体収量は、０．２５ｍｇ／Ｌ（上清中）以上、より好ましくは、０．５ｍｇ／Ｌ以上、さらにより好ましくは、１ｍｇ／Ｌ以上、最も好ましくは、３ｍｇ／Ｌ（上清中）以上である。
【０１５１】
同様に、二量体抗体構築物アイソフォームの収量、従って、抗体構築物の単量体百分率（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））を決定することができる。単量体及び二量体抗体構築物の生産性及び計算された単量体百分率は、例えば、ローラーボトル中での標準化された研究規模の産生による培養上清をＳＥＣ精製するステップで得ることができる。一実施形態では、抗体構築物の単量体百分率は、８０％以上、より好ましくは、８５％以上、さらにより好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上である。
【０１５２】
一実施形態では、抗体構築物は、好ましくは、５以下または４以下、より好ましくは３．５以下または３以下、さらにより好ましくは、２．５以下または２以下、最も好ましくは１．５以下または１以下の血漿安定性（血漿なしのＥＣ５０に対する血漿ありのＥＣ５０の比率）を有する。抗体構築物の血漿安定性は、３７℃で２４時間、ヒト血漿中で構築物をインキュベーションし、続いて、５１−クロム放出細胞傷害性アッセイでＥＣ５０を測定することにより試験することができる。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激された富化ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であることができる。標的細胞は、例えば、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞とすることができる。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比は、１０：１として選択することができる。この目的に使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡでコーティングされたシリンジで収集された健常ドナーの血液に由来する。細胞構成要素が遠心により除去され、上部血漿相が回収され、続いてプールされる。対照として、抗体構築物は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中の細胞傷害性アッセイの前に希釈される。血漿安定性は、ＥＣ５０（血漿インキュベーション後）のＥＣ５０（対照）に対する比率として計算される。実施例７を参照のこと。
【０１５３】
本発明の抗体構築物の単量体の二量体への転換が低いことがさらに好ましい。転換は、異なる条件下で測定し、高性能サイズ排除クロマトグラフィーで分析することができる。実施例５を参照のこと。例えば、抗体構築物の単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内で７日間３７℃、２５０μｇ／ｍｌの濃度で行うことができる。これらの条件下で、本発明の抗体構築物は、２．５％以下、より好ましくは、２％以下、さらに好ましくは、１．５％以下、さらに好ましくは、１％以下、より好ましくは、０．５％以下、最も好ましくは、０．２５％以下である二量体百分率を示すことが好ましい。ＥｖＩＩＩ−２ベースの二重特異性抗体構築物は、１．５６％の二量体転換率を示すが、本発明のＥｖＩＩＩ−１ベースの二重特異性抗体構築物は、この特性について最も好ましい限界の上の境界での転換率を示す。
【０１５４】
本発明の二重特異性抗体構築物は、多数の凍結／融解サイクルの後に非常に低い二量体転換を呈することも好ましい。例えば、抗体構築物単量体は、二量体抗体構築物に転換されていた最初に単量体の抗体構築物の百分率を決定するために、例えば、一般的な製剤緩衝液中で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整され、３回の（−８０℃で３０分間凍結し、続いて、３０分間室温で解凍する）凍結／解凍サイクル、続いて、高性能ＳＥＣに供される。二重特異性抗体構築物の二量体百分率は、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に、好ましくは、２．５％以下、より好ましくは、２％以下、さらに好ましくは、１．５％以下、さらに好ましくは、１％以下、最も好ましくは、０．５％以下である。ＥｖＩＩＩ−２ベースの二重特異性抗体構築物は、好ましい範囲を満たさないが（２．５３％の二量体）、本発明のＥｖＩＩＩ−１ベースの二重特異性抗体構築物は、この特性に対し最も好ましい限界の上の境界での転換率（０．５９％の二量体）を示す。
【０１５５】
本発明の二重特異性抗体構築物は、好ましくは、４５℃以上または５０℃以上より好ましくは、５１℃以上、５２℃以上、５３℃以上、または５４℃以上、さらにより好ましくは、５６℃以上または５７℃以上、最も好ましくは、５８℃以上または５９℃以上の凝集温度の良好な熱安定性を示す。熱安定性パラメータは、次のように抗体凝集温度の点で測定することができる：２５０μｇ／ｍｌの濃度の抗体溶液を、単回使用のキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置内に入れる。測定された半径を一定に取得しながら、試料を０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃に加熱する。タンパク質及び凝集の融解を示す半径の増加が、抗体の凝集温度を計算するために使用される。実施例６を参照のこと。
【０１５６】
あるいは、温度融解曲線を、抗体構築物の固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定することができる。これらの実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、米国マサチューセッツ州）のＶＰ−ＤＳＣ装置を使用して実施される。抗体構築物を含有する試料のエネルギー吸収は、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較して２０℃〜９０℃で記録される。抗体構築物は、例えば、ＳＥＣランニングバッファー中で２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調整される。それぞれの融解曲線を記録するために、全体の試料温度を段階的に増加させる。各温度Ｔにおいて、試料及び製剤緩衝液参照のエネルギー吸収が記録される。試料から参照を引いたエネルギー吸収Ｃｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）における差を、それぞれの温度に対してプロットする。溶融温度は、エネルギー吸収の最初の最大値での温度として定義される。
【０１５７】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、（精製された単量体抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、一晩インキュベーションした後にＯＤ３４０により測定された場合に）濁度が０．２以下、好ましくは、０．１５以下、より好ましくは、０．１２以下、さらにより好ましくは、０．１以下またはさらに０．０９以上、最も好ましくは、０．０８以下または０．０７以上であることも想定される。実施例７を参照のこと。二重特異性抗体構築物ＥｖＩＩＩ−２が、（精製された単量体抗体構築物を２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、一晩インキュベーションをした後にＯＤ３４０により測定される場合に）ほぼ３のかなり高い濁度を示すが、ＥｖＩＩＩ−１ベースの二重特異性抗体構築物は、明らかに医薬製剤に実行可能なタンパク質化合物に対する所望のスペクトル内にある；例７の表３を参照のこと。
【０１５８】
さらなる実施形態では、本発明による抗体構築物は、酸性ｐＨで安定である。抗体構築物が、ｐＨ５．５（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うのに必要なｐＨ）などの非生理的ｐＨで挙動する耐性が高いほど、負荷されたタンパク質の合計量と比較して、イオン交換カラムから溶出した抗体構築物の回収量は高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの抗体構築物の回収は、好ましくは、３０％以上、より好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、さらにより好ましくは、６０％以上、さらにより好ましくは、７０％以上、さらにより好ましくは、８０％以上、さらにより好ましくは、９０％以上、さらにより好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９９％以上である。
【０１５９】
本発明の二重特異性抗体構築物は、治療効果または抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。これは、例えば、進行した段階のヒト腫瘍異種移植片モデルの以下の例に開示されるような研究において評価することができる：
【０１６０】
研究の１日目に、５×１０６細胞のヒトＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性がん細胞株（例えば、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７またはＤＫ−ＭＧ）が、メスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側腹部に皮下注射される。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達すると、インビトロで拡大されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、動物の腹膜腔に約２×１０７細胞を注射することによりマウスに移植される。ビヒクル対照群１のマウスは、エフェクター細胞を受けず、Ｔ細胞単独の腫瘍成長への影響を監視するために、ビヒクル対照群２（受容エフェクター細胞）との比較のための非移植対照として使用される。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達する時に、抗体の処置が開始する。処置開始日における各処置群の平均腫瘍サイズは、他の任意の群と統計的に異なってはならない（分散分析）。マウスは、約１５〜２０日間、静脈内ボーラス注射により、０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物で処置される。腫瘍は、研究中にキャリパーにより測定され、進行は、腫瘍体積（ＴＶ）の群間比較により評価される。腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、Ｔ／Ｃ％＝１００×（分析グループの中央値ＴＶ）／（対照グループ２の中央値ＴＶ）としてＴＶを計算することにより決定される。
【０１６１】
当業者は、依然として有意義かつ再現性のある結果に到達しながら、注射される腫瘍細胞の数、注射部位、移植されるヒトＴ細胞の数、投与されるべき二重特異性抗体構築物の量、及びタイムラインなどの、この試験のある特定のパラメータをどのように変更または適応させるかを知っている。腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、好ましくは、７０以下または６０以下、より好ましくは、５０以下または４０以下、さらにより好ましくは、３０以下または２０以下、最も好ましくは、１０以下または５以下またはさらに２．５以下である。
【０１６２】
本発明はさらに、本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。
【０１６３】
ポリヌクレオチドは、鎖中に共有結合した１３個以上のヌクレオチド単量体からなる生体ポリマーである。ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、明確な生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、線状及び環状であることができる。それは、好ましくは、宿主細胞に含まれるベクターに含まれることが好ましい。該宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドで形質転換され、またはこれをトランスフェクションされた後に、抗体構築物を発現することができる。その目的のために、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、制御配列と作動可能に連結される。
【０１６４】
遺伝コードは、遺伝物質（核酸）内にコードされた情報がタンパク質に翻訳される一連のルールである。生細胞内で生物学的にデコードすることは、アミノ酸を運ぶために、かつ一度にｍＲＮＡの３個のヌクレオチドを読み取るために、ｔＲＮＡ分子を使用して、ｍＲＮＡにより特定された順序でアミノ酸を連結するリボソームにより達成される。コードは、コドンと呼ばれるこれらのヌクレオチドトリプレットの配列が、タンパク質合成中に、どのアミノ酸が次に付加されるかを特定する仕方を定義する。いくつかの例外はあるものの、核酸配列中の３ヌクレオチドのコドンが、単一のアミノ酸を特定する。大部分の遺伝子がまったく同じコードでコードされるので、この特定のコードは、多くの場合、基準または標準遺伝コードと称される。遺伝コードは、所与のコード領域に対するタンパク質配列を決定するが、他のゲノム領域が、これらのタンパク質が産生される時及び場所に影響を及ぼすことができる。
【０１６５】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１６６】
ベクターは、細胞に（外来）遺伝物質を移入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含するが、それらに限定されない。一般に、作成されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを含む。ベクターそれ自体は一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「バックボーン」として働くより大きな配列を含むヌクレオチド配列、一般にＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及びバックボーンの他の追加の特徴、すなわちプロモーター、遺伝マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的配列、タンパク質精製タグを包含し得る。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、特に、標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に、制御配列を有する。
【０１６７】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意に、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１６８】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合に、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が近接し、分泌リーダーの場合に、近接し、かつリーディングフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実施に従って使用される。
【０１６９】
「トランスフェクション」は、標的細胞に、（ベクターを含む）核酸分子またはポリヌクレオチドを慎重に導入するプロセスである。その用語は、真核細胞における非ウイルス性の方法に主に使用される。形質導入は多くの場合、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介移入を記載するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは通常は、物質の取り込みを可能にするために、細胞膜に一時的な孔または「穴」を開くことを含む。トランスフェクションは、細胞膜と融合し、かつ内部にカーゴを蓄積させるリポソームを生成するために、エレクトロポレーション、セルスクイージング（Ｃｅｌｌ  Ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、または物質とカチオン性脂質を混合することにより、リン酸カルシウムを使用して行うことができる。
【０１７０】
「形質転換」という用語は、（ベクターを含む）核酸分子またはポリヌクレオチドを、バクテリアに、かつ植物細胞を含む非動物の真核細胞にも、非ウイルス性移入することを説明するために使用される。従って、形質転換は、その周囲からの細胞膜（複数可）を介した直接吸収、その後の外因性遺伝物質（核酸分子）の取り込みから生じる、細菌または非動物の真核細胞の遺伝子改変である。形質転換は、人工的手段により生じさせることができる。形質転換が起こるためには、細胞または細菌は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時間制限された応答として生じ得る能力の状態になければならない。
【０１７１】
さらに、本発明は、ポリヌクレオチド／核酸分子若しくは本発明のベクターで形質転換された、またはこれらをトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。
【０１７２】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、レシピエントベクター、外因性核酸分子、及び本発明の抗体構築物をコードするポリヌクレオチド、ならびに／またはレシピエント抗体構築物それ自体とすることができ、またはこれらを有する任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図される。それぞれの細胞への物質の導入は、形質転換、トランスフェクションなどの手段で行われる。「宿主細胞」という用語は、単一細胞の後代または潜在的な後代を含むことも意図される。自然変異、偶発的変異、若しくは意図的変異、または環境的な影響のいずれかに起因する、ある特定の改変が後継世代で起こることがあるために、そのような後代は、実際には、（形態学において、またはゲノム若しくは合計ＤＮＡ補体において）親細胞と完全に同一でないことがあるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含み、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞、例えば、昆虫細胞及び哺乳類細胞、例えば、マウス、ラット、マカクまたはヒト、も含むがこれらに限定されない。
【０１７３】
本発明の抗体構築物は、細菌中で産生することができる。発現後、本発明の抗体構築物は、可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び／またはサイズ排除を介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で、発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行うことができる。
【０１７４】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、本発明の抗体構築物のための好適なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般に使用される。しかし、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラウム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキサヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２  ２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３  ０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４  ２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状菌、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ならびにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）などの多くの他の属、種、及び株は、本明細書で一般に利用可能で、有用である。
【０１７５】
本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に適する宿主細胞は、多細胞生体に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び多様体ならびにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（幼虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１多様体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株は、公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明よる本明細書のウイルスとして使用され得る。
【０１７６】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ、及びタバコの植物細胞培養物を、宿主として使用することもできる。植物細胞培養におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者らに既知である。例えば、Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  （１９８９）  ３４２：７６−７８，Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９０−７９４，Ａｒｔｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ８：７４５−７５０，及びＦｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：９７９−９８６を参照のこと。
【０１７７】
しかし、関心は、脊椎動物細胞において最大であり、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の繁殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養物における成長のためにサブクローニングされた、２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６  ：５９  （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６  （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１  （１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、１４１３  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）  ３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１７８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセスを提供し、該プロセスは、本発明の宿主細胞を、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で培養すること、及び、産生された抗体構築物を培養物から回収することを含む。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、「培養する」という用語は、培地中の好適な条件下での細胞のインビトロ維持、分化、成長、増殖、及び／または繁殖を指す。「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されない本発明の抗体構築物の産生に関与する任意のステップを含む。
【０１８０】
組換え技術を使用する場合、抗体構築物は、細胞内、ペリプラズム空間で産生され、または培地中に直接分泌されることができる。抗体構築物が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、例えば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかである微粒子破片が除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７  （１９９２）は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。要約すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍される。細胞破片は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬が、タンパク質分解を阻害するために上述のステップのいずれかに含まれ得、抗生物質が、偶発性の汚染物質の成長を防止するために含まれてもよい。
【０１８１】
宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して回収または精製することができる。タンパク質精製の他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトグラフィーフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。本発明の抗体構築物がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。
【０１８２】
アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成することができるよりも速い流速及びより短い処理時間を可能にする。
【０１８３】
さらに、本発明は、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って産生された抗体構築物を含む医薬組成物を提供する。抗体構築物の均質性が、８０％以上、より好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、若しくは８５％以上、さらに好ましくは、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、若しくは９０％以上、さらにより好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、若しくは９５％以上、最も好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上であることが、本発明の医薬組成物とって好ましい。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくは、ヒト患者、への投与に適する組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、本発明の抗体構築物（複数可）の１つまたは複数を、好ましくは、治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、及び／またはアジュバントの好適な製剤をさらに含む。組成物の許容される成分は、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。本発明の医薬組成物は、液体、凍結、及び凍結乾燥組成物を含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。一般に、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意の及び全ての水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、エマルション、例えば、油／水エマルション、様々な種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒体、及びコーティングを意味し、それらは薬学的投与、特に、非経口投与と適合する。医薬組成物中のそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野に周知であり、そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化することができる。
【０１８６】
ある特定の実施形態は、本発明の抗体構築物ならびにこのセクション及び本明細書の他の箇所に説明的に記載されるさらなる１つ以上の賦形剤を含む医薬組成物を提供する。この点に関して、賦形剤を、本発明において、多種多様な目的、例えば、製剤の物理的、化学的、若しくは生物学的特性の調整、例えば、粘性の調整、ならびに／または本発明が有効性を向上させ、かつ／若しくはそのような製剤を安定化するプロセス、ならびに例えば、製造中、輸送中、保存中、使用前調製中、投与中、及びそれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び腐敗に対するプロセスのために使用することができる。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸着、または浸透を変更、維持、または保存する目的のための製剤材料を含有してもよい（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。そのような実施形態では、好適な製剤材料としては、以下が挙げられ得るが、それらに限定されない。
・荷電アミノ酸、好ましくは、リシン、リシンアセテート、アルギニン、グルタメート、及び／またはヒスチジンを含む、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２−フェニルアラニンなどのアミノ酸、
・抗菌剤、例えば、抗菌剤及び抗真菌剤、
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム、または、亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、
・生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨで、通常は約５〜約８または９のｐＨ範囲内に組成物を維持するために使用される緩衝液、緩衝液系、及び緩衝剤（緩衝液の例は、ボレート、ビカルボナート、トリス−ＨＣｌ、シトレート、ホスフェートまたは他の有機酸、スクシナート、ホスフェート、ヒスチジン、及びアセテートである）、例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５のアセテート緩衝液、
・非水性溶媒、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチル、
・水、アルコール／水溶液、エマルション、または生理食塩水及び緩衝媒体を含む懸濁液を含む水性媒体、
・生分解性ポリマー、例えば、ポリエステル、
・増量剤、例えば、マンニトールまたはグリシン、
・キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
・等張剤及び吸収遅延剤、
・錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）
・充填剤、
・単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、炭水化物は、非還元糖、好ましくは、トレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトール、またはキシリトールであってよい。
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質性担体、例えば、ヒト若しくはウシ血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、好ましくは、ヒト由来のもの、
・着色剤及び香味剤、
・硫黄含有還元剤、例えば、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤、
・乳化剤、
・親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）
・塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、
・防腐剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなど（例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素である）、
・金属錯体、例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体、
・溶媒及び共溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、
・糖及び糖アルコール、例えば、トレハロース、スクロース、オクタスルフェート、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール、ならびに多価糖アルコール、
・懸濁剤、
・界面活性剤または湿潤剤、例えば、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール、界面活性剤は、好ましくは、１．２ＫＤ超の分子量を有する洗剤及び／または好ましくは、３ＫＤ超の分子量を有するポリエーテルであってよく、好ましい洗剤の非限定例は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、及びＴｗｅｅｎ８５であり、好ましいポリエーテルの非限定例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、及びＰＥＧ５０００である。
・安定性増強剤、例えば、スクロースまたはソルビトール、
・張性増強剤、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール、
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油を含む非経口送達ビヒクル、
・液体及び栄養補充液、電解質補充液を含む静脈内送達ビヒクル（例えば、リンゲルデキストロースにベースにしたような）。
【０１８８】
医薬組成物の異なる成分（例えば、上に列挙したもの）が異なる効果を有することができ、例えば、アミノ酸が緩衝剤、安定剤及び／または抗酸化剤として作用することができること、マンニトールが増量剤及び／または張性増強剤として作用することができること、塩化ナトリウムが送達ビヒクル及び／または張性増強剤として作用することができることなどは、当業者らには明らかである。
【０１８９】
本発明の組成物は、組成物の意図される使用に応じて、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。そのような薬剤は、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖阻害薬として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬物、循環系に作用する薬物、及び／または当該技術分野で既知のサイトカインなど薬剤であってよい。本発明の抗体構築物は、併用療法に、すなわち、別の抗がん剤と組み合わせて、適用されることも想定される。
【０１９０】
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投薬量に応じて、当業者により決定されるであろう。例えば、上掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照のこと。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗体構築物の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水性または非水性のいずれかの性質であってよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、注射用の水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってよく、場合により、非経口投与のための組成物に一般的な他の材料が補充されてもよい。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の抗体構築物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の処方薬（上掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することにより保存用に調製されてもよい。さらに、特定の実施形態では、本発明の抗体構築物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【０１９１】
非経口投与が検討される場合、本発明に使用される治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の所望の抗体構築物を含む発熱性物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態で提供されてもよい。非経口注射のための特に好適なビヒクルは、本発明の抗体構築物が適切に保存された滅菌等張液として製剤化される滅菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製は、デポー注射により送達することができる生成物の制御放出または持続放出を提供し得る、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの薬剤を含む所与の分子の製剤化を含むことができる。ある特定の実施形態では、循環における持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸が使用され得る。ある特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスが、所望の抗体構築物を導入するために使用されてもよい。
【０１９２】
持続的または制御された送達／放出製剤中の本発明の抗体構築物を含む製剤を含むさらなる医薬組成物が、当業者らに明らかであろう。リポソーム担体、生体侵食性微小粒子または多孔性ビーズ、及びデポー注射などの様々な他の持続的または制御された送達手段を製剤化するための技術も当業者らに既知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載している国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。徐放性調製物は、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル、の形態の半透性ポリマーマトリックスを含んでもよい。徐放性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開ＥＰ０５８４８１に開示されているような）ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，ｓｕｐｒａ）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開ＥＰ１３３，９８８）を含んでもよい。徐放性組成物は、当該技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかにより調製することができるリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開ＥＰ０３６，６７６；同ＥＰ０８８，０４６及び同ＥＰ１４３，９４９を参照のこと。
【０１９３】
抗体構築物は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）、またはマクロエマルション中で、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に閉じ込められ得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０１９４】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は通常、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜に通して濾過することにより達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれかで行われてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存することができる。非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル、に入れられる。
【０１９５】
本発明の別の態様は、国際特許出願ＷＯ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載される、医薬組成物として使用することができる、本発明の製剤の自己緩衝性抗体構築物を含む。タンパク質の安定化ならびにこの点に関して有用な配合材料及び方法に対する様々な解説、例えば、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１  （１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ”  ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４  （２００２）、及びＲａｎｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５  （２００２）があり、特に、本発明による自己緩衝性タンパク質製剤のための賦形剤及びそれのプロセスに関連する部分、特に、獣医学及び／またはヒト医療用途のためのタンパク質医薬品及びプロセスに関する部分を参照のこと。
【０１９６】
例えば、本発明による製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するために、ならびに／または組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解性及び／若しくは物理的安定性を向上させるために、塩を、本発明の特定の実施形態に従って使用してもよい。周知のように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、かつタンパク質の荷電極性基を遮蔽して、静電相互作用、吸引性の反発相互作用の強度を低減させることにより、タンパク質の天然状態を安定化させることができる。イオンは、特に、タンパク質の変性ペプチド結合（−ＣＯＮＨ）に結合することにより、タンパク質の変性状態を安定化させることもできる。さらに、タンパク質中の荷電及び極性基とのイオン相互作用は、分子間の静電相互作用を低減させ、それにより、タンパク質の凝集及び不溶性を防止または低減することもできる。
【０１９７】
イオン種は、タンパク質への効果が著しく異なる。本発明に従って医薬組成物を製剤化する際に使用することができる、イオン及びタンパク質へのその効果のカテゴリーによる順位付けがいくつか開発されている。１つの例は、溶液中のタンパク質の立体配座安定性への影響により、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を順位付けするＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列である。安定化溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは一般に、溶液からタンパク質を沈殿させるために高濃度（例えば、１モル超の硫酸アンモニウム）で使用される（「塩析」）。カオトロープは一般に、タンパク質を変性させ、かつ／または可溶化するために使用される（「塩溶」）。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な有効性は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列におけるイオンの位置を定義する。
【０１９８】
遊離アミノ酸は、増量剤、安定化剤、及び抗酸化剤、ならびに他の標準的な用途として、本発明の種々の実施形態に従って本発明の製剤の抗体構築物に使用することができる。リシン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、正確なケーキ構造及び特性を保証するための凍結乾燥に有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質凝集を阻害するのに有用であることがある。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
【０１９９】
ポリオールは、糖、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトール、及び例えば、グリセロール及びプロピレングリコールなどの多価アルコール、ならびに本明細書で考察する目的で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、物理的及び化学的分解プロセスからタンパク質を保護するために、液体及び凍結乾燥製剤の両方に有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の張度を調整することにも有用である。本発明の選択された実施形態に有用なポリオールには、マンニトールがあり、一般に、凍結乾燥製剤中のケーキの構造安定性を保証するために使用される。それは、ケーキの構造的安定性を保証する。マンニトールは一般に、凍結防止剤、例えば、スクロース、と共に使用される。ソルビトール及びスクロースは、張度を調整するための、かつ製造プロセス中の輸送またはバルクの調製中の凍結融解ストレスから保護するための安定剤として、好ましい薬剤のうちに挙げられる。グルコース及びラクトースなどの（遊離アルデヒドまたはケトン基を含有する）還元糖は、表面リシン及びアルギニン残基を糖化することができる。従って、それらは一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中にはない。さらに、そのような反応種を形成する糖、例えば、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、糖化を結果的に生じるショ糖も、この点に関しては本発明の好ましいポリオールの中にはない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化することに有用であり、かつ凍結保護剤として有用であり、この点に関して本発明において使用することができる。
【０２００】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、空気−液体界面、固体−液界面、及び液体−液体界面での表面への吸着ならびに変性及びそれに伴う凝集しやすいことがある。これらの効果は一般に、タンパク質濃度と反比例する。これらの有害な相互作用は一般に、タンパク質濃度と反比例し、通常は、物理的撹拌、例えば、製品の輸送及び取り扱い中に生じるもの、により悪化する。界面活性剤は日常的に、表面吸着を防止、最小化、または低減するために使用される。これに関して本発明における有用な界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８を含む。界面活性剤は、タンパク質立体配座の安定性を制御するためにも一般に使用される。この点に関する界面活性剤の使用は、任意の所与の界面活性剤が通常いくつかのタンパク質を安定化させ、他のものを不安定化させることになるので、タンパク質特異的である。
【０２０１】
ポリソルベートは、酸化分解をしやすく、多くの場合、供給される時に、タンパク質残基の側鎖、特に、メチオニン、の酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を含有する。従って、ポリソルベートは、慎重に使用されるべきであり、使用される時に、最低有効濃度で用いられるべきである。これに関して、ポリソルベートは、賦形剤が最低有効濃度で使用されるべきであるという一般的規則を例証する。
【０２０２】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、１つ以上の抗酸化剤をさらに含む。ある程度まで、医薬製剤におけるタンパク質の有害な酸化は、適切なレベルの周囲酸素及び温度を維持することにより、かつ光への曝露を避けることにより、防止することができる。タンパク質の酸化的分解を防止する抗酸化賦形剤を使用することもできる。これに関する有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤がある。本発明による治療用タンパク質製剤に使用される抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の貯蔵寿命を通じてその活性を維持する。ＥＤＴＡは、この点に関して本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質に損傷を与える可能性がある。例えば、特にグルタチオンなどの還元剤は、分子内ジスルフィド結合を破壊する可能性がある。従って、本発明で使用される抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質を損傷する可能性を排除し、または十分に低減するように選択される。
【０２０３】
本発明による製剤は、タンパク質補因子であり、特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要な亜鉛などの、タンパク質配位複合体を形成するのに必要な金属イオンを含んでもよい。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害することもできる。しかし、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的プロセスも触媒する。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用することができる。（１００ｍＭまでの）Ｃａ＋２イオンは、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加させることができる。しかし、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化させる可能性がある。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化させることができ、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２により不安定化させることができ、その凝集は、Ａｌ＋３イオンにより増加させることができる。
【０２０４】
本発明の製剤の抗体構築物の実施形態は、１つ以上の防腐剤をさらに含む。防腐剤は、同じ容器から複数の抽出を含む複数回投与の非経口製剤を開発する場合に必要である。それらの主な機能は、微生物の成長を阻害し、薬物製品の貯蔵寿命または使用期間を通じて製品の無菌性を保証することである。一般に使用される防腐剤には、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ−クレゾールを含む。防腐剤は、小分子非経口での使用の長い歴史があるが、防腐剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。防腐剤は、ほとんどの場合、タンパク質に不安定化（凝集）効果を有しており、これは、複数回投与のタンパク質製剤での使用を制限する主な要因となっている。現在まで、ほとんどのタンパク質薬は、一回使用のみに対し製剤化されている。しかし、複数回投与製剤は、可能な場合、患者の便宜を可能にするさらなる利点及び増加した流通性を有する。良好な例は、保存された製剤の開発が、より好都合で多目的な注射ペンプレゼンテーションの商品化をもたらしているヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のものである。ｈＧＨの保存された製剤を含有する少なくとも４つのそのようなペンデバイスが、現在市販されている。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールと共に製剤化される。保存された剤形の製剤化及び開発中に、いくつかの側面を考慮する必要がある。薬物製品中の有効な防腐剤濃度は、最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なうことなく抗菌効果を与える濃度範囲を有する剤形中の所与の防腐剤を試験することを必要とする。
【０２０５】
予想され得るように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、防腐剤なしで凍結乾燥し、使用時に希釈剤を含有する防腐剤で再構成することができる。これは、防腐剤がタンパク質と接触する時間を短縮し、関連する安定性リスクを有意に最小化する。液体製剤では、製品の貯蔵寿命（約１８〜２４ヶ月）全体にわたって防腐剤の有効性及び安定性が維持されるべきである。注意すべき重要な点は、活性薬剤及び全ての賦形剤構成成分を含有する最終製剤において、防腐効果が実証されるべきであるということである。
【０２０６】
本明細書中に開示される抗体構築物は、免疫リポソームとして製剤化されることもある。「リポソーム」は、薬物の哺乳動物への送達に有用な様々な種類の脂質、リン脂質及び／または界面活性剤からなる小胞である。リポソームの構成成分は一般に、生物学的膜の脂質配置と同様に、二層形成で配置される。抗体構築物を含有するリポソームは、当該技術分野で既知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８  （１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０  （１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；ならびにＷＯ９７／３８７３１に記載されるもの、により調製される。循環時間の向上したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用した逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために所定の孔径のフィルターを通して押し出される。本発明の抗体構築物のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド相互交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８  （１９８２）に記載されるようなリポソームにコンジュゲートすることができる。化学療法剤は、任意に、リポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１  （１９）  １４８４  （１９８９）を参照のこと。
【０２０７】
医薬組成物は、製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、結晶として、または脱水若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保存されてもよい。そのような製剤は、使用する準備ができている形態、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで、保存されてもよい。
【０２０８】
本明細書で定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、ＷＯ９９／５４４４０の次の実施例に、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０  （２００５），１−１２）により記載されているような細胞傷害性アッセイにより測定することができる。本明細書中で使用される「有効性」または「インビボ有効性」は、例えば、標準化されたＮＣＩの奏効基準を使用して、本発明の医薬組成物による治療の奏効を指す。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功またはインビボ有効性は、組成物の意図された目的に対する有効性、すなわち、組成物がその所望の効果、すなわち、病理学的細胞、例えば、腫瘍細胞、の枯渇、を引き起こす能力を指す。インビボの有効性は、白血球数、特異形態、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引を含むがこれらに限定されない、それぞれの疾患エンティティに対する確立された標準的方法により監視されてもよい。さらに、種々の疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法が使用されてもよい。さらに、コンピュータ支援された断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに基づく奏効評価［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ  ＴＡ，Ｖｏｓｅ  Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ，Ｈｏｐｐｅ  Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９  Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射断層撮影スキャン、白血球数、特異形態、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、及び種々のリンパ腫特異的臨床化学パラメータ（例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼ）ならびに他の確立された標準的方法が使用されてもよい。
【０２０９】
本発明の医薬組成物などの薬物の開発における別の主要な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、薬物候補の薬物動態プロファイル、すなわち、特定の薬物が所与の状態を処置する能力に影響を与える薬物動態パラメータのプロファイルを確立することができる。薬剤のある特定の疾患エンティティを処置するための能力に影響を及ぼす薬剤の薬物動態パラメータは、半減期、分布容積、肝臓初回通過代謝、及び血清結合度が含まれるが、それらに限定されない。所与の薬剤の有効性は、上述のパラメータのそれぞれにより影響される可能性がある。
【０２１０】
「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的プロセス、例えば、代謝、排泄などにより排泄される時間を意味する。「肝臓初回通過代謝」は、最初に肝臓に接触した時に、すなわち、肝臓を最初に通過する時に、代謝されるべき薬物の性質を意味する。「分布容積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織、ならびに器官などのような、体の種々の区画にわたる薬物の保持の程度ならびにこれらの区画内の薬剤の分布を意味する。「血清の結合度」は、薬剤の生物活性の低減または喪失をもたらす、アルブミンなどの血清タンパク質と相互作用し、かつこれらに結合する薬物の性質を意味する。
【０２１１】
薬物動態パラメータは、投与された薬物の所与の量について、生物学的利用能、遅れ時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの発症、及び／またはＣｍａｘも含む。「生物学的利用能」は、血液区画中の薬物の量を意味する。「遅れ時間」は、薬物の投与及び血液または血漿中での検出及び測定可能性の間の時間遅延を意味する。「Ｔｍａｘ」は、薬物の最大血中濃度に達する時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物が最大に得られる血中濃度である。生物学的効果に必要とされる薬物の血液または組織濃度に達する時間は、全てのパラメータの影響を受ける。上で概説したような非チンパンジー霊長動物における前臨床動物試験で決定され得る異種間特異性を示す二重特異性抗体構築物の薬物動態パラメータも、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０  （２００５），１−１２）による刊行物に記載されている。
【０２１２】
一実施形態は、腫瘍若しくはがん疾患または転移性がん疾患の予防、処置、または改善に使用される、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って生成された抗体構築物を提供する。
【０２１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、該腫瘍またはがん疾患は、固形腫瘍疾患である。
【０２１４】
本明細書に記載の製剤は、それを必要とする患者の、本明細書に記載されるような病状の処置、改善、及び／または予防に、医薬組成物として有用である。「処置」という用語は、治療的処置及び防止的または予防的手段の両方を指す。処置は、疾患、疾患の症状、またはに罹患しやすい性質を治癒し、回復させ、緩和し、軽減し、変更し、治療し、改善し、好転させ、または影響を及ぼす目的で、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に罹患しやすい性質を有する患者の身体、単離された組織、または細胞に、製剤を適用または投与することを含む。
【０２１５】
本明細書で使用される「改善」という用語は、本発明の抗体構築物を、それを必要とする対象に投与することにより、以下の本明細書に明記されるような腫瘍またはがん若しくは転移性がんを有する患者の疾患状態の任意の好転を指す。そのような好転は、患者の腫瘍またはがん若しくは転移性がんの進行を遅延または停止させることとして理解されることもある。本明細書で使用される「予防」という用語は、本発明による抗体構築物を、それを必要とする対象に投与することより、以下の本明細書に明記されるような腫瘍またはがん若しくは転移性がんを有する患者の発症または再発を回避することを意味する。
【０２１６】
「疾患」という用語は、本明細書に記載の抗体構築物または医薬組成物での処置から恩恵を受けることになる任意の状態を指す。これは、哺乳動物を問題の疾患に罹患しやすくさせる病的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患を含む。
【０２１７】
「新生物」は組織の異常な成長であり、通常は、（常にではないが）塊を形成する。塊を形成する時も、それは、一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物または腫瘍は、良性で潜在的に悪性（前がん性）または悪性であり得る。悪性新生物は一般に、がんと呼ばれる。それらは通常、周囲の組織に浸潤し、かつこれを破壊し、転移を形成することがある。すなわち、それらは、身体の他の部分、組織、または器官に広がる。従って、「転移性がん」という用語は、元の腫瘍のものよりも他の組織または器官への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的のために、それらも、「腫瘍」または「がん」という用語に包含される。
【０２１８】
本発明の好ましい実施形態では、腫瘍またはがん疾患は、固形腫瘍疾患であり、転移性がん疾患は、上述のいずれにも由来し得る。
【０２１９】
本発明に関連して好ましい腫瘍またはがん疾患は、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、中枢神経系の癌からなる群より選択される。より好ましくは、腫瘍またはがん疾患は、多形膠芽腫（ＧＢＭ）または退形成星細胞腫である。転移性がん疾患は、上述のいずれにも由来し得る。
【０２２０】
本発明は、腫瘍若しくはがん疾患または転移性がん疾患を処置または改善するための方法も提供し、方法は、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスに従って産生された抗体構築物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【０２２１】
「必要とする対象」または「処置を必要とする」という用語は、すでに障害を有するもの及び障害が予防されるべきものを含む。必要な対象または「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
【０２２２】
本発明の抗体構築物は一般に、とりわけ、生物学的利用能及び持続性の範囲の、具体的な投与経路及び投与方法、具体的な投薬量及び投与頻度、特定の疾患の具体的な処置について設計されるであろう。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で製剤化される。
【０２２３】
従って、製剤及び組成物は、任意の好適な投与経路による送達のために、本発明に従って設計され得る。本発明の文脈では、投与経路は以下を含むが、それらに限定されない：
・局所経路（例えば、経皮、吸入、経鼻、眼内、耳介／耳、膣内、粘膜）；
・経腸経路（例えば、口腔、胃腸、舌下、唇下、口内、経直腸）；及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、経鼻、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）。
【０２２４】
本発明の医薬組成物及び抗体構築物は、例えば、ボーラス注射などの注射または連続注入などの注入による、非経口投与、例えば、皮下または静脈内送達、に対して特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与されてもよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号；同第４，４３９，１９６号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４８７，６０３号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；及び同第５，３９９，１６３号に記載されている。
【０２２５】
特に、本発明は、好適な組成物の継続的な投与を提供する。非限定例として、継続的または実質的に継続的な、すなわち、連続投与は、治療薬の患者の体内への流入を計量するための、患者が装着した小型ポンプシステムにより実現されてもよい。本発明の抗体構築物を含む医薬組成物は、該ポンプシステムを使用することにより、投与することができる。そのようなポンプシステムは一般に、当該技術分野で既知であり、一般に、注入されるべき治療薬を含有するカートリッジの定期的な交換に頼っている。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する時、それ以外では継続的な治療薬の患者の体内への流れの一時中断が結果として起こり得る。そのような場合では、カートリッジ取り替え前の投与段階及びカートリッジ取り替え後の投与段階は、依然として、そのような治療薬の１つの「継続投与」を共に構成する本発明の薬学的手段及び方法の意味の範囲内と考えられるであろう。
【０２２６】
本発明の抗体構築物の連続的または継続投与は、リザーバから流体を動かすための流体駆動機序及び駆動機序を作動させるための作動機序を含む流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムにより静脈内または皮下であってよい。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通し、患者の体内に好適な組成物を送達するための針またはカニューレを含んでもよい。該ポンプシステムは、静脈、動脈、または血管とは独立して、患者の皮膚に直接固定または取り付けられてもよく、それにより、ポンプシステム及び患者の皮膚の間の直接接触を可能にする。ポンプシステムは、２４時間から数日間まで、患者の皮膚に取り付けることができる。ポンプシステムは、小さな体積のリザーバを有する小型のものであってよい。非限定例として、投与されるべき好適な医薬組成物のためのリザーバの体積は、０．１及び５０ｍｌの間であり得る。
【０２２７】
連続投与は、皮膚に装着し、間隔で取り替えるパッチにより経皮であることもある。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。最初に消耗されたパッチの交換が、例えば、最初に消耗されたパッチに直接隣接する皮膚上に、かつ最初に消耗されたパッチを取り外す直前に、新しい次のパッチとの取り替えと同時に都合よく達成することができるので、経皮投与は、特に継続投与に適することに注意を要する。流れの中断の問題または電源セル障害は発生しない。
【０２２８】
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥された材料は、投与前に、まず適切な液体中で再構成される。凍結乾燥された材料は、例えば、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、またはタンパク質が凍結乾燥前に存在していた同じ製剤中で再構成されてもよい。
【０２２９】
本発明の組成物は、例えば、非チンパンジー霊長動物、例えば、マカク、に対し本明細書に記載の異種間特異性を示す本発明の抗体構築物の漸増用量を投与することによる漸増試験により、決定することができる好適な用量で対象に投与することができる。上述の通り、本明細書に記載の異種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、非チンパンジー霊長動物における前臨床試験において、及びヒトの薬物として、同一の形態で有利に使用することができる。投薬レジメンは、主治医及び臨床因子により決定されるであろう。医学分野で周知であるように、任意の１人の患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全体的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。
【０２３０】
「有効用量」または「有効投薬量」という用語は、所望の効果を達成し、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。「治療上有効な用量」という用語は、すでに疾患に罹患する患者における疾患及びその合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量として定義される。この使用に有効な量または用量は、患者の、処置されるべき状態（適応症）、送達される抗体構築物、治療の状況及び目的、疾患の重症度、以前の治療、患者の病歴及び治療薬の奏効、投与の経路、患者の大きさ（体重、身体表面、若しくは器官の大きさ）及び／または状態（年齢及び全体的な健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の一般的な状態に依存するであろう。適切な用量は、それが１回または一連の投与の中で患者に投与することができるように、かつ最適な治療効果を得るために、主治医の判断に応じて調整することができる。
【０２３１】
典型的な投薬量は、上述の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であってよい。具体的な実施形態では、投薬量は、１．０μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、任意に、１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【０２３２】
本発明の抗体構築物の治療的有効量は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度若しくは持続時間の増加、または疾患苦痛に起因する機能障害若しくは能力低下の予防をもたらす。ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現腫瘍を処置するために、治療的有効量の本発明の抗体構築物、例えば、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ／抗ＣＤ３抗体構築物は、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を、未処置の患者と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。化合物が腫瘍成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルにおいて評価されてもよい。
【０２３３】
医薬組成物は、単独の治療薬として、または必要に応じて追加の治療法、例えば、抗がん治療薬、例えば、他のタンパク質性及び非タンパク性薬物、と組み合わせて投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義されるような本発明の抗体構築物を含む組成物と同時に、または適時に規定された間隔及び用量で該抗体構築物の投与の前または後に別々に投与されてもよい。
【０２３４】
本明細書で使用される「有効かつ非毒性用量」という用語は、主要な毒性作用がなく、若しくは本質的がなく、病的細胞の枯渇、腫瘍消失、腫瘍収縮、または疾患の安定化を引き起こすのに十分に高い、発明の抗体構築物の許容範囲内の用量を指す。そのような有効な非毒性用量は、例えば、当該技術分野で記載されている用量漸増試験により決定され得、重篤な有害な副作用（用量制限毒性、ＤＬＴ）を誘発する用量未満とすべきである。
【０２３５】
本明細書で使用される「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象に現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副作用は、一般に、薬物の忍容性の欠如及び／または投与後の局所寛容の欠如を指し得る。毒性は、薬物により引き起こされる催奇性または発癌性の影響を含み得る。
【０２３６】
本明細書で使用される「安全性」、「インビボ安全性」、または「忍容性」という用語は、薬物の投与直後に（局所寛容）、かつ長期適用の間に、重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与を定義する。「安全性」、「インビボ安全性」、または「耐容性」は、例えば、処置及び経過観察期間中に規則的な間隔で、評価することができる。測定は、臨床評価、例えば、器官症状及び検査室異常のスクリーニングを含む。臨床的評価を実施してもよく、正常所見のずれは、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／またはＭｅｄＤＲＡ基準に従って記録／コード化される。器官症状は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に記載されているような基準、例えば、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心臓不整脈、凝固などを含み得る。試験され得る検査室パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロフィール及び尿検査、ならびに他の体液、例えば、血清、血漿、リンパ液または脊髄液、分泌液などの検査を含む。従って、安全性は、例えば、身体検査、イメージング技術（すなわち、超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ））、技術デバイス（すなわち、心電図）を伴う他の手段、バイタルサインにより、検査室パラメータを測定すること及び有害事象を記録することにより、評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法における非チンパンジー霊長動物の有害事象は、組織病理学的及び／または組織化学的方法により試験されてもよい。
【０２３７】
上記の用語は、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｊｕｌｙ  １６，１９９７でも言及されている。
【０２３８】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体構築物、本発明のプロセスに従って作製された抗体構築物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、及び／または本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
【０２３９】
本発明の文脈において、「キット」という用語は、２つ以上の構成要素を意味し、それらのうちの１つは、容器、受容器、または別の方法で一緒にパッケージされる、本発明の抗体構築物、医薬組成物、ベクター、または宿主細胞に対応する。従って、単一のユニットとして市販することができるキットは、特定の目標を達成するのに十分な製品及び／または器具のセットとして記載することができる。
【０２４０】
キットは、投与のための適切な投薬量の本発明の抗体構築物または医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ、及び材料（好ましくは、防水性で、例えば、プラスチックまたはガラス）の１つ以上の受容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含んでもよい（上記を参照のこと）。キットは、（例えば、小冊子または取扱説明書の形態の）使用のための注意書き、本発明の抗体構築物を投与するための手段、例えば、シリンジ、ポンプ、注入器など、本発明の抗体構築物を再構成するための手段、及び／または本発明の抗体構築物を希釈するための手段をさらに含有してもよい。
【０２４１】
本発明は、単回用量の投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥／凍結乾燥抗体構築物を含む第１の受容器及び水性製剤を含む第２の受容器も含有する。本発明のある特定の実施形態では、単一チャンバー及び複数チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含有するキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】Ｎ末端で２６７個のアミノ酸が欠失した膠芽腫に見られる腫瘍特異的ＥＧＦＲ変異体であるＥＧＦＲｖＩＩＩの概略図。
【図２】標的結合剤ＥｖＩＩＩ−２及びその誘導体の共有結合Ｖ領域ＥｖＩＩＩ−１との配列比較。
【図３】標準的な研究規模の産生後のＥｖＩＩＩ−１及びＥｖＩＩＩ−２の精製。
【図４】ＥｖＩＩＩ−１及びＥｖＩＩＩ−２単量体：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５】フローサイトメトリーにより示されるＥｖＩＩＩ−１及びＥｖＩＩＩ−２二重特異性抗体構築物の交差反応性：ヒト及びマカクＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３への結合
【図６】ＥｖＩＩＩ−１及びＥｖＩＩＩ−２二重特異性抗体構築物の、ＥＧＦＲｖＩＩＩをトランスフェクションされた細胞ならびにヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７への結合
【図７】刺激ヒトＣＤ８Ｔ細胞の、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対する細胞傷害活性。１８時間の５１クロム放出アッセイ。エフェクター細胞：刺激富化ヒトＣＤ８Ｔ細胞。標的細胞：ＥＧＦＲｖＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比：１０：１。
【図８】刺激ヒトＣＤ８Ｔ細胞の、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７に対する細胞傷害活性：（ａ）１８時間の５１クロム放出アッセイ。エフェクター細胞：刺激富化ヒトＣＤ８Ｔ細胞。標的細胞：ｖＩＩＩ高陽性Ｕ８７細胞。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比：１０：１；（ｂ）１８時間ＦＡＣＳに基づくアッセイ。エフェクター細胞：刺激富化ヒトＣＤ８Ｔ細胞。標的細胞：ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩ高陽性Ｕ８７神経膠腫細胞。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比：１０：１。
【図９】刺激ヒトＣＤ８Ｔ細胞の、天然のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原を発現するヒト腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性：膠芽腫細胞株ＤＫ−ＭＧ：１８時間の５１クロム放出アッセイ。エフェクター細胞：刺激富化ヒトＣＤ８Ｔ細胞。標的細胞：ＤＫ−ＭＧ細胞。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比：１０：１。
【図１０】マカクＴ細胞株の、マカクＥＧＦＲｖＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対する細胞傷害活性：４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ。エフェクター細胞：マカクＣＤ３＋ＬｎＰｘ４１１９。標的細胞：マカクＥＧＦＲｖＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比：１０：１。
【図１１】ヒト血漿中で２４時間インキュベーションされた後の二重特異性抗体構築物の安定性：１８時間の５１Ｃｒに基づくアッセイ。エフェクター細胞：刺激富化ヒトＣＤ８Ｔ細胞。標的細胞：ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比：１０：１。示されるような抗体構築物。
【図１２】高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーＣＩＥＸで分析されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体構築物のタンパク質均質性。
【図１３】フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣで試験された二重特異性抗体構築物の表面疎水性。
【図１４】２５０μｇ／ｍｌ及び３７℃で７日間インキュベーションされた後の単量体から二量体への転換。ＨＰ−ＳＥＣによる分析。
【図１５】２５０μｇ／ｍｌ及び３７℃で３回凍結／融解サイクルした後の単量体から二量体への転換。ＨＰ−ＳＥＣによる分析。
【図１６】ＥｖＩＩＩ−１×ＣＤ３−ｓｃＦｃ構築物の、ヒトＥＧＦＲをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞株ＨＰＢａＬＬへのＦＡＣＳ結合分析。赤色の線は、２μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とのインキュベーション、続いてマウス抗Ｉ２Ｃ抗体及びＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ検出抗体と共にインキュベーションされた細胞を表す。黒色のヒストグラムラインは、陰性対照を表す：抗Ｉ２Ｃ抗体及びＰＥ標識検出抗体と共にインキュベーションされただけの細胞。
【図１７】エフェクター細胞としてのＣＤ５６枯渇未刺激ヒトＰＢＭＣ及び標的細胞としてのヒトＥＧＦＲをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞にリダイレクトされたＥｖＩＩＩ−１×ＣＤ３−ｓｃＦｃ構築物により誘発された細胞傷害活性（実施例１．２）。
【実施例】
【０２４３】
次の実施例は本発明を例示説明するものである。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によりのみ限定される。
【０２４４】
実施例１
細胞傷害活性
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現標的細胞にエフェクターＴ細胞をリダイレクトする効力を、５つのインビトロ細胞傷害性アッセイで分析した：
・ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に刺激ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をリダイレクトする効力を１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比１０：１）で測定した。図７
・ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、ＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７に刺激ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をリダイレクトする効力を、１８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ（エフェクター標的比１０：１）で測定した。図８
・ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、可溶性ＥＧＦＲＶＩＩＩの不存在下及び存在下でヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に未刺激ヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４−／ＣＤ５６−）中のＴ細胞をリダイレクトする際の効力を４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ（エフェクター標的比１０：１）で測定した。図６及び表６
・ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の、ＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７に未刺激ヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４−／ＣＤ５６−）中のＴ細胞をリダイレクトする効力を、４８時間のＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイで測定した。図８
・交差反応性ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物が、マカクＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に、マカクＴ細胞をリダイレクトすることができることを確認するために、エフェクターＴ細胞としてのマカクＴ細胞株ＬｎＰｘ４１１９を用いて、４８時間のＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ（エフェクター標的比１０：１）を実施した。図１０
【０２４５】
実施例１．１
刺激ヒトＴ細胞を用いるクロム放出アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞が富化されている刺激Ｔ細胞を、次に記載されるように得た。ペトリ皿（直径１４５ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、クレムスミュンスター）を、３７℃で１時間、１μｇ／ｍｌの最終濃度にて市販の抗ＣＤ３特異的抗体（ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）でコーティングした。結合していないタンパク質を、ＰＢＳで１回の洗浄ステップにより除去した。３〜５×１０７個のヒトＰＢＭＣを、２０Ｕ／ｍｌの安定化グルタミン／１０％のＦＣＳ／ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０中のプレコートしたペトリ皿に加え、２日間刺激した。３日目に、細胞を収集し、ＲＰＭＩ  １６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、細胞を上記と同じ細胞培地中で再度１日間培養した。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、製造者のプロトコルに従ってダイナルビーズを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞を枯渇させることにより富化した。
【０２４６】
カニクイザルＥＧＦＲＶＩＩＩまたはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ標的細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、５０％のＦＣＳを含む１００μｌの最終容量のＲＰＭＩ中１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒで、３７℃で６０分間標識した。続いて、標識された標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次に、細胞傷害性アッセイに使用した。アッセイを、１０：１のＥ：Ｔ比を有するＲＰＭＩが補充されて合計体積が２００μｌの９６ウェルプレート中で実施した。０．０１〜１μｇ／ｍｌの開始濃度の精製された二重特異性抗体構築物及びその３倍希釈液を使用した。アッセイのインキュベーション時間は、１８時間であった。細胞傷害性を、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加）及び自発的溶解（エフェクター細胞なし）の間の差異と比較して、上清中の放出されたクロムの相対値として決定した。全ての測定を、４重に行った。上清中のクロム活性の測定は、Ｗｉｚａｒｄ３”ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、独国ケルン）で行った。結果の分析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＰｒｉｓｍ５（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて行った。シグモイド用量反応曲線から解析プログラムにより計算されたＥＣ５０値を、細胞傷害活性の比較に使用した。
【０２４７】
実施例１．２
ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に、刺激ヒトエフェクターＴ細胞をリダイレクトする効力
標的細胞としてヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞、及び刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用して、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで、本発明によるＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。実施例１．１に記載されるように、実験を行った。
【０２４８】
ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、１桁のピコモル範囲で、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対して、非常に強力な細胞傷害活性を示した。
【０２４９】
実施例１．３
ＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト細胞株ヒト膠芽腫細胞株ＤＫ−ＭＧに、刺激ヒトエフェクターＴ細胞をリダイレクトする効力
標的細胞の供給源としてＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株ＤＫ−ＭＧ、及びエフェクター細胞として刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して、５１クロム（５１Ｃｒ）放出細胞傷害性アッセイで、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。実施例１．１に記載されるように、アッセイを実施した。
【０２５０】
エフェクター細胞としての刺激富化ヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球及び標的細胞としてのヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用いた５１クロム放出アッセイの結果に従うと、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、天然発現体標的細胞への細胞傷害活性も強力である；図９を参照のこと。
【０２５１】
実施例１．４
未刺激ヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
輸血用の血液を収集する血液バンクの副産物である富化されたリンパ球調製物（軟膜）からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。軟膜は、地元の血液バンクから供給され、ＰＢＭＣを採血の同じ日に調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で十分に洗浄した後、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、１００μＭのＥＤＴＡ）と共にインキュベーションすることにより、残った赤血球をＰＢＭＣから除去した。１００×ｇでＰＢＭＣを遠心分離する時の上清を介して、血小板を除去した。残りのリンパ球は、主に、Ｂリンパ球及びＴリンパ球、ＮＫ細胞、ならびに単球を包含する。１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に３７℃／５％のＣＯ２で、培養中のＰＢＭＣを保った。
【０２５２】
ＣＤ１４＋及びＣＤ５６＋細胞の枯渇
ＣＤ１４＋細胞の枯渇のため、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、＃１３０−０５０−２０１）を使用し、ＮＫ細胞の枯渇のため、ヒトＣＤ５６マイクロビーズ（ＭＡＣＳ、＃１３０−０５０−４０１）を使用した。ＰＢＭＣを計数し、３００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ単離緩衝液に懸濁させた［８０μＬ／１０７細胞、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２００１２−０４３）、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１０２７０−１０６）、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｅ−６５１１）］。ＣＤ１４マイクロビーズ及びＣＤ５６マイクロビーズ（２０μＬ／１０７細胞）を添加し、４〜８℃で１５分間インキュベーションした。細胞を、ＭＡＣＳ単離緩衝液（１〜２ｍＬ／１０７細胞）で洗浄した。遠心分離（上記を参照のこと）後に、上清を廃棄し、細胞を、ＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μＬ／１０８細胞）に再懸濁させた。次に、ＬＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０４２−４０１）を使用して、ＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞を単離した。必要になるまでインキュベーター内、３７℃で、ＲＰＭＩ完全培地、すなわち、１０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、＃Ｓ０１１５）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、＃Ｋ０２９３）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、＃Ｌ１６１３）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、＃Ｌ０４７３）、及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、＃Ａ２２１３）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、＃ＦＧ１２１５）中で、ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞なしのＰＢＭＣを培養した。
【０２５３】
標的細胞標識
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞溶解の分析のために、蛍光膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｖ２２８８６）を使用して、標的細胞としてのヒトＥＧＦＲＶＩＩＩまたはマカクＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を標識し、エフェクター細胞と区別した。要約すると、細胞を採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μＬ／１０６細胞）を含有するＰＢＳ中で１０６細胞／ｍＬに調整した。３７℃で３分間インキュベーションした後に、細胞を完全ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、細胞数を、１．２５×１０５細胞／ｍＬに調整した。０．５％（ｖ／ｖ）の等張性ＥｏｓｉｎＧ溶液（Ｒｏｔｈ、＃４５３８０）を使用して、細胞の活力を測定した。
【０２５４】
フローサイトメトリーに基づく分析
このアッセイを、ＥＧＦＲＶＩＩＩ二重特異性抗体構築物の連続希釈の存在下で、カニクイザルＥＧＦＲＶＩＩＩまたはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の溶解を定量するために設計した。等量のＤｉＯ標識標的細胞及びエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ１４＋細胞なしのＰＢＭＣ）を混合し、１０：１のＥ：Ｔ細胞比を得た。１６０μｌのこの懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに移した。ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の連続希釈物４０μＬ及び陰性対照二重特異性（無関係な標的抗原を認識するＣＤ３ベースの二重特異性抗体構築物）または追加の陰性対照としてのＲＰＭＩ完全培地を加えた。二重特異性抗体媒介細胞傷害性反応は、７％のＣＯ２加湿インキュベーター中で４８時間進行した。次に、細胞を新しい９６ウェルプレートに移し、１μｇ／ｍＬの最終濃度でヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加することにより、標的細胞膜の完全性の喪失を監視した。ＰＩは、通常生細胞から除外される膜不浸透性色素であるが、死細胞はそれを取り込み、蛍光発光により特定可能になる。
【０２５５】
試料を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ機器でフローサイトメトリーにより測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアにより分析した（双方ともにＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）。標的細胞を、ＤｉＯ陽性細胞として特定した。ＰＩ陰性標的細胞を、生きた標的細胞として分類した。細胞傷害性の百分率を、次の式に従って計算した。
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【０２５６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ）を使用して、細胞傷害性の百分率を対応する二重特異性抗体構築物濃度に対しプロットした。固定された勾配を有するシグモイド用量反応曲線を評価するための４つのパラメータロジスティック回帰モデルを用いて、用量反応曲線を分析し、ＥＣ５０値を計算した。
【０２５７】
実施例１．５
可溶性ＥＧＦＲＶＩＩＩの不存在下及び存在下で、ヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に、未刺激ヒトＰＢＭＣをリダイレクトする効力
標的細胞としてのヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞及びエフェクター細胞としての未刺激ヒトＰＢＭＣを使用したＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。上記実施例１．４に記載されているように、アッセイを実施した。
【０２５８】
予想通りに、ＥＣ５０値は一般に、エフェクター細胞として未刺激ＰＢＭＣを用いた細胞傷害性アッセイでは、刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した細胞傷害性アッセイと比較して高かった（実施例１．２を参照のこと）。
【０２５９】
実施例１．６
ＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７またはＤＫ−ＭＧ細胞に、未刺激ヒトＰＢＭＣをリダイレクトする効力
標的細胞の供給源としてのＥＧＦＲＶＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７またはＤＫ−ＭＧ及びエフェクター細胞としての未刺激ヒトＰＢＭＣを使用するＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性をさらに分析した。上記実施例１．４に記載されているように、アッセイを実施した。結果を、図８及び９に示す。
【０２６０】
実施例１．７
マカクＥＧＦＲＶＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞に、マカクＴ細胞をリダイレクトする効力
標的細胞としてのマカク（カニクイザル）ＥＧＦＲＶＩＩＩがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びエフェクター細胞の供給源としてのマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９５：３２５６−６１  （２０００））を使用したＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイで、ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の細胞傷害活性を分析した。マカクＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の標的細胞の標識化及び細胞傷害活性の５１Ｃｒ放出に基づく分析を上記のように行った。
【０２６１】
結果を、図１０に示す。細胞株４１１９ＬｎＰｘ由来のマカクＴ細胞を誘導して、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物により、マカクＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を効率的に死滅させた。
【０２６２】
実施例１．８
二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォーム及び二量体アイソフォームの間の効力差
個々のＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォーム及び二量体アイソフォームの間の細胞傷害活性の差異（効力差と称される）を決定するために、精製された二重特異性抗体構築物単量体及び二量体を用いて本明細書で上述したように（実施例１．１）、１８時間の５１−クロム放出細胞傷害性アッセイを実施した。エフェクター細胞は、刺激された富化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞であった。標的細胞は、ｈｕＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞であった。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比は、１０：１であった。効力差を、ＥＣ５０値間の比率として計算した。
【０２６３】
実施例２
ヒト血漿中で２４時間インキュベーションした後の安定性
精製された二重特異性抗体構築物を、２〜２０μｇ／ｍｌの最終濃度、ヒト血漿プール中１：５の比で、３７℃で９６時間インキュベートした。血漿インキュベーション後に、開始濃度が０．０１〜０．１μｇ／ｍｌで、かつエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が１０：１である、刺激富化ＣＤ８＋Ｔ細胞及びヒトＥＧＦＲＶＩＩＩをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用いた５１クロム放出アッセイ（実施例１．１に記載されるようなアッセイ）において、抗体構築物を比較した。インキュベーションされていない、新たに解凍された二重特異性抗体構築物を、対照として含めた。
【０２６４】
結果を図１１に示す：抗体構築物ＥｖＩＩＩ−２は、約２の血漿安定性（ＥＣ５０血漿／ＥＣ５０対照）を有していた。驚くべきことに、本発明の二重特異性抗体構築物は、ほとんど転換を示さなかった。
【０２６５】
実施例３
高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質均一性
本発明の抗体構築物のタンパク質均質性を、高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーＣＩＥＸで分析した。
【０２６６】
５０μｇの抗体構築物の単量体を、５０ｍｌの結合緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、３０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％のオクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）で希釈し、４０ｍｌのこの溶液を、Ａｋｔａ  Ｍｉｃｒｏ  ＦＰＬＣデバイス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、独国）に接続された１ｍｌのＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆカラム（ＹＭＣ、独国）にかけた。試料結合後に、さらなる結合緩衝液を用いる洗浄ステップを実施した。タンパク質溶出のために、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１０００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のオクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を使用して、５０％の緩衝液Ｂまで線形的に増加する塩勾配を、１０カラム体積にわたって適用した。全実行を、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、及び２１０ｎｍの光学的吸収で監視した。Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分により、分析を行った。
【０２６７】
結果を、図１２に示す。ほとんど全ての試験された抗体構築物は、９５％以上の非常に好ましい均質性（主ピークの曲線下面積（＝ＡＵＣ））を有する。
【０２６８】
実施例４
ＨＩＣブチルで測定した場合の表面疎水性
本発明の二重特異性抗体構築物の表面疎水性を、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣで試験した。
【０２６９】
５０μｇの抗体構築物単量体を、５００μＬの最終体積に一般的な製剤化緩衝液で希釈し（１０ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのリシンＨＣｌ、４％のトレハロース、ｐＨ７．０）、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、独国）に接続された１ｍｌのブチルセファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、独国）に適用した。全実行を、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、及び２１０ｎｍの光学的吸収で監視した。Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分により、分析を行った。溶出挙動を、タンパク質シグナルの上昇及び低下の面積及び速度を比較することにより評価し、それにより、ＢｉＴＥアルブミン融合体のマトリックスとの相互作用の強さを示した。
【０２７０】
抗体構築物は、良好な溶出挙動を有し、これは、大部分が迅速かつ完全であった。図１３を参照のこと。
【０２７１】
実施例５
２５０μｇ／ｍｌで（ｉ）３回の凍結／融解サイクル後、及び（ｉｉ）７日間インキュベーションした後の単量体から二量体への転換
二重特異性ＥＧＦＲＶＩＩＩ×ＣＤ３抗体単量体構築物を異なるストレス条件、続いて、高性能ＳＥＣにかけて、二量体抗体構築物に転換されている開始の単量体抗体構築物の百分率を決定した。
（ｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を、一般的な製剤緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、次に、−８０℃で３０分間凍結し、続いて、室温で３０分間解凍した。３回凍結／融解サイクルしの後に、二量体含有量をＨＰ−ＳＥＣで決定した。
（ｉｉ）２５μｇの単量体抗体構築物を、一般的な製剤緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、続いて、３７℃で７日間インキュベーションした。二量体含有量を、ＨＰ−ＳＥＣで決定した。
【０２７２】
高分解能ＳＥＣカラムＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ（東ソー、日本東京）を、Ａ９０５オートサンプラーを備えたＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した。カラム平衡化及びランニング緩衝液は、ｐＨ６．６に調整された１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４〜２００ｍＭのＮａ２ＳＯ４からなった。抗体溶液（２５μｇのタンパク質）を平衡化したカラムに適用し、溶出を７ＭＰａにて最大圧力で０．７５ｍｌ／分の流速で行った。全実行を、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ、及び２１０ｎｍの光学的吸収で監視した。Ａｋｔａ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア実行評価シートに記録された２１０ｎｍシグナルのピーク積分により、分析を行った。二量体ピークの面積を、単量体ピーク及び二量体ピークの合計面積で除すことにより、二量体含有量を計算した。
【０２７３】
結果を、以下の図１４及び１５に示す。本発明のＥＶＩＩＩ−１ｘＣＤ３二重特異性抗体構築物は、３回の凍結／解凍サイクル後に０．５９％の二量体百分率を呈し（図１５）、及び３７℃でインキュベーションした７日後に０．２６％の二量体百分率を示したが、発明のＥｖＩＩＩ−１×ＣＤ３二重特異性抗体構築物は、３回の凍結／解凍サイクルの７日後に１．５６％及びこれの後に２．５３％のより高い値を示した。
【０２７４】
実施例６
熱安定性
抗体の凝集温度を、次の通り測定した：２５０μｇ／ｍｌの抗体構築物溶液４０μｌを、使い捨てのキュベットに移し、Ｗｙａｔｔ動的光散乱デバイスＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）に入れた。測定された半径を一定に取得しながら、試料を、０．５℃／分の加熱速度で、４０℃から７０℃まで加熱した。ＤＬＳ装置と共に提供されたソフトウェアパッケージで、タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増加を使用して、抗体構築物の凝集温度を計算した。
【０２７５】
（表２）ＤＬＳ（動的光散乱）で決定される二重特異性抗体構築物の熱安定性
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【０２７６】
実施例７
２５００μｇ／ｍｌの抗体濃度での濁度
２５０μｇ／ｍｌの濃度の精製抗体構築物溶液１ｍｌを、２５００μｇ／ｍｌにスピン濃度ユニットで濃縮した。５℃で１６時間保存した後に、抗体溶液の濁度を、一般的な製剤緩衝液に対するＯＤ３４０ｎｍの光吸収測定により決定した。
【０２７７】
結果を、以下の表３に示す。本発明のＥｖＩＩＩ−１抗体構築物が０．０３以下の極めて良好な濁度を有したが、ＥｖＩＩＩ−２抗体構築物は、有意な濁度を示し、これは、医薬組成物中のそのような分子の製剤化において好ましくない特性を示した。
【０２７８】
（表３）一晩２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した後の抗体構築物の濁度
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【０２７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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