(57)【要約】  本発明は、ＶＩＩＩ型コラーゲンのａ１鎖のＣ末端エピトープまたはＶＩＩＩ型コラーゲンの成熟形態のａ１鎖のＮ末端エピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナー、および試料中のＶＩＩＩ型コラーゲンの成熟ａ１鎖のＣ末端エピトープまたはＮ末端エピトープを検出または定量するためのイムノアッセイ方法を提供する。
2018525400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖のＣ末端エピトープまたはＶＩＩＩ型コラーゲンの成熟形態のα鎖のＮ末端エピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナー。
【請求項２】
Ｃ末端アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨに含まれる前記Ｃ末端エピトープと特異的に結合する、請求項１に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項３】
前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ延長伸長バージョンである
【化１】
2018525400.tif 000007
を認識せず、それに結合もしない、請求項２に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項４】
前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ短縮バージョンである．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰ−ＣＯＯＨを認識せず、それに結合もしない、請求項２に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項５】
アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨへの前記抗体の親和性の、伸長アミノ酸配列
【化２】
2018525400.tif 000008
への前記抗体の親和性に対する比、および／または短縮アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰ−ＣＯＯＨへの前記抗体の親和性に対する比が、１０対１より大きい、請求項２に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項６】
前記比が、１０００対１より大きい、請求項５に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項７】
Ｎ末端アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．に含まれる前記Ｎ末端エピトープと特異的に結合する、請求項１に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項８】
前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延長伸長バージョンである
【化３】
2018525400.tif 000009
を認識せず、それに結合もしない、請求項７に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項９】
前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ短縮バージョンであるＮＨ２−ＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．を認識せず、それに結合もしない、請求項７に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．への前記免疫学的結合パートナーの親和性の、前記伸長アミノ酸配列
【化４】
2018525400.tif 000010
への前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する比、および／または前記短縮アミノ酸配列ＮＨ２−ＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．への前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する比が、１０対１より大きい、請求項７に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１１】
前記比が、１０００対１より大きい、請求項１０に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１２】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１３】
試料中のＶＩＩＩ型コラーゲンの成熟α１鎖のＣ末端エピトープまたはＮ末端エピトープを検出または定量するためのイムノアッセイ方法であって、前記末端エピトープを含む試料と請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナーとを接触させるステップと、前記免疫学的結合パートナーの結合量を判定するステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記試料が、生体液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体液が、血清、血漿、尿または羊水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法により判定されたＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖の前記Ｃ末端またはＮ末端エピトープの量を、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖の前記Ｃ末端またはＮ末端エピトープの標準正常値と相関させて、正常値からのその変化を評価するステップをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖のＣ末端エピトープまたはＮ末端エピトープの量を判定するためのアッセイキットであって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナーと、以下の：
−  ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−  ビオチン化ペプチド：ビオチン−Ｌ−ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨ（式中、Ｌは任意選択のリンカーである）でありうる、前記免疫学的結合パートナーと反応するペプチド
−  ビオチン化ペプチド：ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ−Ｌ−ビオチン（式中、Ｌは任意選択のリンカーである）でありうる、前記免疫学的結合パートナーと反応するペプチド
−  サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための、任意選択でビオチン化された二次抗体
−  Ｃ末端配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨを含むキャリブレーターペプチド
−  Ｎ末端配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．を含むキャリブレーターペプチド  
−  抗体ＨＲＰ標識キット
−  抗体放射標識キット
−  アッセイ可視化キット
のうちの少なくとも１つと
を含むアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＩＩＩ型コラーゲンα１鎖のＣ末端に存在するエピトープに結合する抗体、および前記エピトープを検出するイムノアッセイに関する。
【０００２】
本発明はまた、成熟（すなわち、シグナル配列除去後の）ＶＩＩＩ型コラーゲンα１鎖のＮ末端に存在するエピトープに結合する抗体、および前記エピトープを検出するイムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＶＩＩＩ型コラーゲンは、内皮細胞、ケラチノサイト、マスト細胞、微小血管内皮細胞および一部の腫瘍細胞の産物である。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、強膜、皮膚および糸球体など多岐にわたる様々な細胞外マトリックス中にも存在する。ＶＩＩＩ型コラーゲンの機能は不明確であるが、最近の研究は、脈管構造におけるこのコラーゲンの重要性に光を当てている。特に重大なことは、平滑筋細胞遊走におけるそのアップレギュレーション、また平滑筋細胞表現型の維持における潜在的役割であろう。このコラーゲンが、様々な細胞の基質となり、血管新生における内皮細胞、血管内膜侵入における平滑筋細胞、および線維性状態における筋線維芽細胞の移動を助長することができるという推測［１］は興味深い。
【０００４】
ＶＩＩＩ型コラーゲンは、短鎖非線維性コラーゲンであり、角膜内皮細胞のデスメ膜（角膜内皮細胞と角膜実質を隔てる基底膜）の主成分である。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、血管内皮の一部であり、細動脈および細静脈中に存在し、したがって心臓、脳、肝臓、肺、筋肉などにおいて見いだされるが、軟骨における軟骨細胞の周囲においても見いだされる［１］。ヒトα１プロコラーゲン遺伝子は、３番染色体上に位置し、その一方でヒトα２プロコラーゲン遺伝子は、１番染色体上に位置する。各α鎖は、おおよそ６０ｋＤａの分子量を有する［２］。以前に、ＶＩＩＩ型コラーゲンは、２本のα１鎖および１本のα２鎖からなるヘテロ三量体として記載された［３］が、インビトロの研究により、α１またはα２どちらかのホモ三量体も形成されることがあることが証明された［４］。加えて、これらのホモ三量体はペプシン耐性であり、また、免疫組織化学研究により、それらは必ずしも角膜、視神経、大動脈および臍帯に共局在するとは限らないことが証明された［５］。
【０００５】
ＶＩＩＩ型コラーゲンは、大動脈および角膜内皮細胞はもちろん、肺動脈内皮細胞および微小血管内皮細胞によっても合成される。すべての内皮細胞がＶＩＩＩ型コラーゲンを発現するとは限らず、したがってこのコラーゲンが大血管および小血管に存在しないこともある［６］。ヒトマスト細胞が正常および病的状態でＶＩＩＩ型コラーゲンを産生することも証明されており、血管新生、組織再構築および線維化の一因となると推測されている［７］。
【０００６】
血管新生、組織再構築および線維化は、腫瘍の形成および進行の重要な部分である［８］。肺は、表面積が大きく、基底膜および間質マトリックスが付随し、肺疾患を有する患者では、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶＩ型コラーゲンならびにエラスチンなどのマトリックスタンパク質が増加していることが周知である［９〜１３］。ほとんどの悪性腫瘍において腫瘍血管新生が見受けられるので、ＶＩＩＩ型コラーゲンは、がんに関連している可能性がある。腫瘍血管新生は、細胞増殖および転移などの腫瘍形成事象に間接的に関与する。前記腫瘍形成事象は、酸素および栄養素と腫瘍老廃物との交換に依存するためである［１４］。血管新生中に、内皮細胞は、増殖および遊走するように誘導されるとともに、シグナル経路を活性化するようにも誘導され、その結果、細胞形態変化および血管新生性出芽が駆動される［１５］。さらに、腫瘍血管は、散発的な血管新生および漏出性血管の形成につながる組織再構築の変化のため、休止状態になることができないことが多い。血管新生と同様に、線維化は、多くの悪性腫瘍において観察されうる現象である。がん線維化は、線維増生としても公知である。線維増生では、コラーゲンを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の発現の増加および変化を示す、永続的に活性化され続けるがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の蓄積が観察される［１６］。線維増生は、腫瘍発生および進行に関与する重要かつ能動的な過程として明らかになりつつあり、とりわけ、がん細胞の遊走を促進することができる［１７］。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、血管再構築および血管新生に関連する疾患、例えば、線維症およびがんと診断された患者からの血清試料中のＶＩＩＩ型コラーゲンを定量することである。
【０００８】
ヒトコラーゲンアルファ−１（ＶＩＩＩ）の配列を配列番号１に示す。シグナルペプチド１−２７（ＭＡＶＬＰＧＰＬＱＬ  ＬＧＶＬＬＴＩＳＬＳ  ＳＩＲＬＩＱＡ）は切断されて、成熟アルファ−１タンパク質鎖２８−７４４が生じる。したがって、成熟アルファ−１タンパク質鎖のＮ末端の配列は、ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．であり、Ｃ末端の配列は、．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨである。
【０００９】
本発明者らは、成熟ＶＩＩＩ型−α１鎖のＣ末端を標的にするモノクローナル抗体およびＥＬＩＳＡキットを今般開発した。本発明者らは、このキットおよびそれを用いて測定される反応性を、本明細書では「Ｃ８−Ｃ」と呼ぶ。
【００１０】
本発明者らは、Ｃ８−Ｃのレベルが、様々なタイプのがんとともに、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺扁平上皮癌において、対照と比較して上昇することを確立した。
【００１１】
本発明は、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖のＣ末端エピトープと反応する免疫学的結合パートナーを、今般提供するものである。
【００１２】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、Ｃ末端アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨに含まれる前記Ｃ末端エピトープと特異的に結合する。
【００１３】
本明細書で使用する用語「免疫学的結合パートナー」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、抗体の特異的結合断片、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２も含む。したがって、前記免疫学的結合パートナーは、特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体またはその断片であってもよい。
【００１４】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭＡ−ＣＯＯＨである前記Ｃ末端アミノ酸配列の伸長バージョンを認識せず、それに結合もしない。
【００１５】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰ−ＣＯＯＨである前記Ｃ末端アミノ酸配列の短縮バージョンを認識せず、それに結合もしない（または認識せず、それに結合もしない）。
【００１６】
好ましくは、アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨへの前記抗体の親和性の、伸長アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭＡ−ＣＯＯＨへの前記抗体の親和性に対する比、および／または短縮アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰ−ＣＯＯＨに対する比は、１０対１より大きい。
【００１７】
より一般的には、アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨへの前記免疫学的結合パートナーの親和性の、前記伸長アミノ酸配列への前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する比は、好ましくは１０対１より大きく、好ましくは５０対１より大きく、好ましくは１００対１より大きく、好ましくは５００対１より大きく、好ましくは１０００対１より大きく、および最も好ましくは１０，０００対１より大きい。
【００１８】
同様に好ましくは、アミノ酸配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨへの前記免疫学的結合パートナーの親和性の、前記短縮アミノ酸配列への前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する比は、１０対１より大きく、好ましくは５０対１より大きく、好ましくは１００対１より大きく、好ましくは５００対１より大きく、好ましくは１０００対１より大きく、および最も好ましくは１０，０００対１より大きい。
【００１９】
本発明者らは、α１鎖のＮ末端を標的にするモノクローナル抗体およびＥＬＩＳＡキットも今般開発した。本発明者らは、このキットおよびそれを用いて測定される反応性を本明細書では「Ｃ８−Ｎ」と呼ぶ。
【００２０】
したがって、本発明は、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖のＮ末端エピトープと反応する免疫学的結合パートナーも今般提供する。
【００２１】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、Ｎ末端アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．に含まれる前記Ｎ末端エピトープと特異的に結合する。
【００２２】
前記免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体であってもよく、またはポリクローナル抗体であってもよい。免疫学的結合パートナーは、下でさらに説明するような結合特異性を有する抗体断片であってもよい。
【００２３】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、ＮＨ２−ＡＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．である前記Ｎ末端アミノ酸配列の伸長バージョンを認識せず、それに結合もしない。
【００２４】
好ましくは、前記免疫学的結合パートナーは、ＮＨ２−ＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．である前記Ｎ末端アミノ酸配列の短縮バージョンを認識せず、それに結合もしない（または認識せず、それに結合もしない）。
【００２５】
より好ましくはさらに、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．．への前記抗体の親和性の、伸長アミノ酸配列ＮＨ２−ＡＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．への前記抗体の親和性に対する比、および／または短縮アミノ酸配列ＮＨ２−ＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．に対する比は、１０対１より大きい。
【００２６】
より一般的には、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．への前記免疫学的結合パートナーの親和性の、前記伸長アミノ酸配列への前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する比は、好ましくは１０対１より大きく、好ましくは５０対１より大きく、好ましくは１００対１より大きく、好ましくは５００対１より大きく、好ましくは１０００対１より大きく、および最も好ましくは１０，０００対１より大きい。
【００２７】
同様に好ましくは、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．への前記免疫学的結合パートナーの親和性の、前記短縮アミノ酸配列への前記免疫学的結合パートナーの親和性に対する比は、１０対１より大きく、好ましくは５０対１より大きく、好ましくは１００対１より大きく、好ましくは５００対１より大きく、好ましくは１０００対１より大きく、および最も好ましくは１０，０００対１より大きい。
【００２８】
本発明は、試料中のＶＩＩＩ型コラーゲンの成熟α１鎖のＣ末端エピトープまたはＮ末端エピトープを検出または定量するためのイムノアッセイの方法であって、前記末端エピトープを含む試料と上記の免疫学的結合パートナーとを接触させるステップ、および前記免疫学的結合パートナーの結合量を判定するステップを含む方法を含む。
【００２９】
前記方法を使用して、生体液（ｂｉｏｆｌｕｉｄ）中のまたは細胞培養物の上清中のＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖の前記Ｃ末端またはＮ末端エピトープの量を定量することができる。
【００３０】
前記生体液は、例えば、血清、血漿、尿、痰または羊水でありうる。
【００３１】
前記イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でありうる。
【００３２】
そのような方法は、前記方法により判定されたＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖の前記Ｃ末端またはＮ末端エピトープの量を、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖の前記Ｃ末端またはＮ末端エピトープの標準正常値と相関させて、正常値からのその変化を評価するステップをさらに含むことができる。
【００３３】
このバイオマーカーを使用することにより、病状の診断を支援することができ、または、どの患者が、急速な状態悪化を被る可能性が高く、妥当な処置の臨床試験に参入させるのにより妥当な患者であるとするかについての診断を提供することができる。そのような病状および／または状態は、線維症およびがんを含む。線維性状態は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を（これらに限定されないが）含み、がんは、乳がん、結腸がん、黒色腫、肺非扁平上皮癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵がん、前立腺がんおよび肺扁平上皮癌（ＳＣＬＣ）を（これらに限定されないが）含む。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα１鎖のＣ末端エピトープまたはＮ末端エピトープの量を判定するためのアッセイキットであって、本発明の免疫学的結合パートナーと、
−  ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−  ビオチン化ペプチド：ビオチン−Ｌ−ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨ（式中、Ｌは任意選択のリンカーである）でありうる、前記免疫学的結合パートナーと反応するペプチド
−  ビオチン化ペプチド：ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ−Ｌ−ビオチン（式中、Ｌは任意選択のリンカーである）でありうる、前記免疫学的結合パートナーと反応するペプチド
−  サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための、任意選択でビオチン化された二次抗体
−  Ｃ末端配列．．ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ−ＣＯＯＨを含むキャリブレーターペプチド
−  Ｎ末端配列ＮＨ２−ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ．．．．を含むキャリブレーターペプチド
−  抗体ＨＲＰ標識キット
−  抗体放射標識キット
−  アッセイ可視化キット
のうちの少なくとも１つと
を含むアッセイキットを提供する。
【００３５】
添付の図面を参照して本発明をさらに説明し、例証することにする。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】２つのモノクローナル抗体のペプチド特異性試験からの結果を示す図である。
【図２】ヒト血清中のモノクローナル抗体１３Ｇ５の反応性についての試験からの結果を示す図である。
【図３】ヒト血清中のモノクローナル抗体１３Ｇ５の反応性についてのさらなる試験からの結果を示す図である。
【図４】ヒト血清中のモノクローナル抗体１３Ｇ５の反応性についてのさらなる試験からの結果を示す図である。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
＜Ｃ８−Ｃアッセイのための抗体開発（クローン１３Ｇ５）＞
本発明者らは、特異的エピトープモノクローナル抗体を生成するための免疫原性ペプチドとして、ＶＩＩＩ型コラーゲンα１鎖の最後の１０個のアミノ酸（７３５’ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ’７４４）を使用した。モノクローナル抗体の開発に使用した方法は、以前［１８］に記載された通りであった。簡単に言うと、４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、５０μｇの免疫原性ペプチドを含有する２００μｌの乳化抗原で皮下免疫した。２週間間隔で、フロイント不完全アジュバント中のもので、安定した血清力価レベルが達成されるまで逐次的に免疫処置を行い、２回目の免疫処置以降マウスから採血した。各採血時、血清力価を検出し、最高の抗血清力価および最良の自然反応性（ｎａｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するマウスを融合のために選択した。選択したマウスを１カ月間休ませ、その後、１００μＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中の５０μｇの免疫原性ペプチドで静脈内追加免疫し、その３日後、細胞融合のために脾臓を単離した。
【００３８】
融合手順は、別の所［１９］で説明されている。簡単に言うと、マウス碑細胞をＳＰ２／０骨髄腫融合パートナー細胞と融合した。融合細胞を、９６ウェルプレートにて培養し、ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。ここで、標準的な限界希釈法を用いてモノクローナルな増殖を促進した。選択ペプチドに特異的な細胞株であって、伸長ペプチド（ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭＡ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｈｉｎａ）と交差反応性でない細胞株を選択し、サブクローニングした。最後に、ＩｇＧカラムを使用してそれらの抗体を精製した。
【００３９】
＜Ｃ８−Ｃアッセイプロトコル＞
アッセイ開発に使用したＥＬＩＳＡプレートには、Ｒｏｃｈｅから入手したストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号１１９４０２７９）を用いた。すべてのＥＬＩＳＡプレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＣＡ、ＵＳＡ）製のＥＬＩＳＡリーダー、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍで分析した。本発明者らは、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ｌｉｎｋ  ＨＲＰ標識キットを、その製造業者（Ｉｎｎｏｖａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の説明書に従って使用して、選択モノクローナル抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ、０．４６ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０８ｍＭ  フェノールレッド、３４ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３６％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ  Ｌ５、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン化合成ペプチド：ビオチン−ＫＫＫＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｈｉｎａ）で９６ウェルストレプトアビジンプレートを被覆し、３０分間、２０℃でインキュベートした。アッセイ緩衝液で希釈した２０μＬの標準ペプチドまたは試料を適切なウェルに添加し、その後、１００μＬのＨＲＰ結合モノクローナル抗体１３Ｇ５を添加し、２０時間、４℃でインキュベートした。最後に、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号４３８ＯＨ）を添加し、プレートを１５分間、２０℃で暗所においてインキュベートした。上記インキュベーションステップすべてが、３００ｒｐｍでの振盪を含んだ。各インキュベーションステップ後、プレートを洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で５回洗浄した。１００μＬの停止用液（１％Ｈ２ＳＯ４）の添加によりＴＭＢ反応を停止させ、６５０ｎｍを参照として用い、４５０ｎｍで測定した。
【００４０】
＜Ｃ８−Ｃ技術的評価＞
検出下限（ＬＬＯＤ）を２１個のゼロ試料（すなわち緩衝液）から決定し、平均＋３ｘ標準偏差として算出した。各実験が試料の二重判定からなる、８ＱＣ試料の１２回の独立した実験により、アッセイ内変動およびアッセイ間変動を判定した。希釈回収率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を４つの血清試料および４つのＥＤＴＡ血漿試料において判定し、１００％試料からの希釈試料の回収パーセンテージとして算出した。技術的な検証についてのデータは、表１に示される。
【００４１】
【表１】
2018525400.tif 000003
【００４２】
［実施例２］
＜Ｃ８−Ｎのための抗体開発＞
モノクローナル抗体を実施例１の場合と同様の方法で生成した。
【００４３】
本発明者らは、特異的エピトープモノクローナル抗体を生成するための免疫原性ペプチドとして、ＶＩＩＩ型コラーゲンα１鎖のシグナルペプチドの後の最初の１０個のアミノ酸（２８’ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ’３７）を使用した。クローン７Ｆ１０および１６Ｆ４を生成した。
【００４４】
図１は、Ｎ末端に対するモノクローナル抗体７Ｆ１０および１６Ｆ４、ならびにＣ末端に対するモノクローナル抗体１３Ｇ５および１６Ａ５のペプチド特異性試験からの結果を、選択ペプチド、伸長ペプチド、ナンセンスペプチド、ヒトのプール血清、ヒトのプール血漿およびラットのプール尿の２倍系列希釈物により生成されたＯＤシグナルとして、示すものである。Ｃ８−Ｃに使用したペプチド：選択ペプチド＝ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭ、伸長ペプチド＝ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭＡ、およびナンセンスペプチド＝ＹＬＳＧＰＦＭＳＹＬ。Ｃ８−Ｎに使用したペプチド：選択ペプチド＝ＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ、伸長ペプチド＝ＡＧＡＹＹＧＩＫＰＬＰ、およびナンセンスペプチド＝ＧＹＩＹＡＧＬＫＰＰ。
【００４５】
ＥＬＩＳＡの性質のため、低いＯＤほど強い反応性に相当する。
【００４６】
［実施例３］
モノクローナル抗体１３Ｇ５を使用して、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から得たＣＯＰＤと診断された患者からの血清試料（ｎ＝１３）、ＩＰＦと診断された患者からの血清試料（ｎ＝１０）および扁平上皮肺癌と診断された患者からの血清試料（ｎ＝１０）におけるＣ８−Ｃを測定し、非罹患対照と比較した。結果を図２に示す。
【００４７】
結果を平均±平均についての標準誤差（ＳＥＭ）として示す。平均値の差をノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡ検定により比較した。すべての統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で行った。０．０５未満のＰ値を有意と見なした。
【００４８】
Ｃ８−Ｃのレベルは、これらすべての臨床状態において上昇することが判明した。
【００４９】
［実施例４］
より大きいＣＯＰＤコホートにおいてＣ８−Ｃを評価した。Ｈｖｉｄｏｖｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｈｖｉｄｏｖｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から得たＣＯＰＤと診断された患者からの血清試料（ｎ＝６８）においてＣ８−Ｃの濃度を測定し、非罹患対照（ｎ＝２０）と比較した。
【００５０】
図３は、Ｃ８−Ｃの濃度が、ＣＯＰＤと診断された患者において対照と比較して有意に上昇したことを示す（ｐ＜０．０００１）。
【００５１】
［実施例５］
モノクローナル抗体１３Ｇ５を使用して、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）から得た乳がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝１３）、結腸がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝７）、胃がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝９）、黒色腫がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝７）、ＮＳＣＬＳと診断された患者からの血清試料（ｎ＝１２）、卵巣がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝１０）、膵がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝５）、前立腺がんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝１４）およびＳＣＬＣがんと診断された患者からの血清試料（ｎ＝８）におけるＣ８−Ｃレベルを測定し、非罹患対照（ｎ＝４３）と比較した。Ｃ８−Ｃアッセイでは試料を１：２希釈した。結果を図４に示す。
【００５２】
Ｃ８−Ｃのレベルは、これらすべての臨床状態おいて上昇されることが判明した。
【００５３】
＜考察＞
本発明者らが知る限り、これは、ＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端に対するモノクローナル抗体の評価のための新規競合ＥＬＩＳＡの開発および検証を記載する初めての開示である。このアッセイが技術的に堅牢であり、これにより、ＬＬＯＤ、アッセイ内およびアッセイ間変動、ならびに許容可能な希釈回収率および分析物安定性への干渉について低い値を示すことを明らかにした。ヒト、ラット、マウスおよびウシのＶＩＩＩ型コラーゲンＣ末端の配列アラインメントは、種間の１００％相同性を示す。モノクローナル抗体１３Ｇ５は、Ｃ末端配列ＳＦＳＧＹＬＬＹＰＭに対して特異的である。アッセイは、伸長ペプチド（追加のアミノ酸１個）もナンセンスペプチドも検出しなかった。これは、モノクローナル抗体がＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端に対して特異的であることを示す。Ｃ８−Ｃ競合ＥＬＩＳＡは、ヒトマトリックスと齧歯動物マトリックスの両方における評価に役立ち、これにより良好なトランスレーショナル科学が可能になる。
【００５４】
利用可能な他の商業用ＶＩＩＩ型コラーゲンアッセイは、正確なエピトープが不明であるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のどちらかを利用するので、今般記載するＣ８−Ｃアッセイは、他の市販のアッセイとは異なる。Ｋａｐｏｏｒらは、デスメ膜に由来する５０ｋＤ断片からのＶＩＩＩ型コラーゲンの三重らせんドメインに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を作製した［２０、２１］。免疫処置に使用した断片は、ペプシン耐性であるが、コラゲナーゼに対しては耐性でない［２１］。組織内では、タンパク質の形成と分解を繊細にバランスさせることで、再構築が絶えず進行している。線維症またはがんなどの疾患では、組織代謝回転が増加し、バランスが形成にシフトし、その結果、マトリックスタンパク質の純増加に至るが、マトリックスタンパク質の分解もまた増加されることに注目することが重要である。このことを考えると、ＶＩＩＩ型コラーゲンが組織再構築中にコラゲナーゼにより切断されることは、非常に理にかなっている。Ｃ８−Ｃアッセイにおいて活用したＮＢ６８３−１３Ｇ５抗体には、該抗体が、たった１０個のアミノ酸からなる小さい配列に対して特異的であり、これにより、プロテアーゼ分解によって生成される小さい断片であっても該抗体により確実に検出されるという利点がある。ＫａｐｏｏｒらおよびＳａｗａｄａらにより生成された抗体は、分解される可能性が高い極めて大きいペプチドを認識し［２１、２２］、したがって、ＶＩＩＩ型コラーゲンのより小さいプールが検出される。
【００５５】
ＶＩＩＩ型コラーゲンは、血管損傷後に増加されることが証明されており、損傷後に起こる組織再構築の一部である［２３］。加えて、ＶＩＩＩ型コラーゲンは、出芽中には内皮細胞に局在しており、内皮細胞が血管新生因子に曝露されるとＶＩＩＩ型コラーゲンの４〜６倍増加が見られる［２４］。ＶＩＩＩ型コラーゲンの遺伝子発現が腫瘍関連間質において増加されることは公知であり、肝癌細胞において増加されることは証明されている［２５］。本発明者らの知るところでは、ＶＩＩＩ型コラーゲンの濃度がＣＯＰＤおよびＳＣＣ肺がんと診断された患者の循環器において上昇することを明らかにするのは、本発明者らが初めてである。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）がＣＯＰＤにおいてアップレギュレートされることは一般に認知されており、その一方で血管再構築が起こることは周知である。最近、ＣＯＰＤを有する患者において血管新生が増加されることが認知された［２６、２７］。ＣＯＰＤ患者について観察されたＣ８−Ｃの濃度上昇を確認するために、ＣＯＰＤ患者のより大きいコホートを評価した。ＣＯＰＤ患者からの血清において対照と比較してＣ８−Ｃ濃度の有意な上昇（ｐ＜０．０００１）が見られることが判明した。より正確には、ＣＯＰＤ患者からの血清において対照と比較してＣ８−Ｃ濃度の７倍増加が見られた。
【００５６】
加えて、ＶＩＩＩ型コラーゲンの濃度は、乳がん、結腸がん、黒色腫がん、ＮＳＣＬＣがん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんおよびＳＣＬＣがんと診断された患者において有意に上昇したが、胃がんと診断された患者では有意に上昇しなかった。すなわち、胃がんを除いて、様々ながんタイプの中で５〜１２倍の増加が見られた。ＶＩＩＩ型コラーゲンの発現が一部のタイプの脳腫瘍およびいくつかの癌の血管において増加されることは以前に証明されている［２８］。加えて、ＶＩＩＩ型コラーゲンは、内皮細胞および平滑筋細胞により、特に血管損傷後に発現され、ならびに腫瘍細胞により発現される。インテグリンα２β１は、Ｉ〜ＶＩＩＩ型コラーゲンの公知の受容体であり［２９］、研究により、原発腫瘍における細胞と比較して転移性細胞において増加されることが証明されている［３０］。この受容体は、腫瘍の進行およびいくつかのがんタイプへの侵入に関連している。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、β１受容体により平滑筋細胞（ＳＭＣ）遊走を制御することができ［２９］、ＳＭＣは、線維性疾患および腫瘍微小環境における重要なプレイヤーである［３１］。胃がんは、血清中のＣ８−Ｃの濃度増加を示さない唯一のがん形態であった。文献には胃がん組織においてＥＣＭ再構築が進行していると述べられている［３２］が、これらのデータは、不特定のコラーゲン代謝またはＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型コラーゲンに基づいている。本発明の発明者らは、胃がんと診断された患者の血清中の低いＣ８−Ｃ濃度を説明することができる、胃におけるまたは胃関連がんにおけるＶＩＩＩ型コラーゲンの存在を確認するいかなる文献も、見つけることができなかった。
【００５７】
結論として、技術的に堅牢なＶＩＩＩ型コラーゲンアッセイを開発し、ＣＯＰＤおよび様々なタイプのがんと診断された患者からの血清中のＶＩＩＩ型コラーゲンの濃度が有意に上昇することを明らかにするのは、本発明の発明者らが初めてである。抗体ＮＢ６８３−１３Ｇ５を生成し、Ｃ８−Ｃ競合ＥＬＩＳＡに組み入れ、前記抗体がＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端部分に対して特異的であることを見いだした。
【００５８】
本明細書では、明確な別段の指示がない限り、「または（もしくは）」という語は、条件の一方のみを満たすことを求めるオペレータ「排他的論理和」とは対照的に、述べられている条件のどちらかまたは両方を満たすときに真値を返すオペレータという意味で使用される。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味することにではなく「包含（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という意味で使用される。上で是認されているすべての先行教示は、参照により本明細書に組み入れられている。本明細書におけるいずれの先行発行文献についての是認も、その教示が本書の日付にオーストラリアまたは他の地において共通の一般知識であったことを容認するものとも、表すものとも解釈すべきでない。
【００５９】
参考文献
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【表２Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2018525400.tif 000016