(57)【要約】プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質と細胞周期調節タンパク質とを含む融合タンパク質、ならびに融合タンパク質を用いて細胞周期に応じて染色体の配列を修飾し、及び／または遺伝子の発現を調節する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質と細胞周期調節タンパク質とを含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する、または前記プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が非ヌクレアーゼ活性する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ヌクレアーゼ活性を有する前記プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲが関連する（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むキメラタンパク質から選択される請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼがさらにガイドＲＮＡを含み、前記ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼがさらに一本鎖ガイドＤＮＡを含む請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
非ヌクレアーゼ活性を有する前記プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメイン、転写リプレッサドメイン、ヒストンアセチル転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヒストンメチル転移酵素ドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、ＤＮＡメチル転移酵素ドメイン、またはＤＮＡ脱メチル化酵素ドメインから選択される修飾ドメインとを含むキメラタンパク質である請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されている、ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されているメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガータンパク質または転写活性因子様エフェクターから選択される請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されているＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがさらにガイドＲＮＡを含み、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されている前記ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼがさらに一本鎖ガイドＤＮＡを含む請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記細胞周期調節タンパク質が、ジェミニン、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、ＣＤＣ２０またはセキュリンから選択される請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
さらに、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞浸透性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、及び／または少なくとも１つのリンカーを含む請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＣａｓ９ヌクレアーゼまたはその誘導体であり、前記細胞周期調節タンパク質がジェミニンである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号１４を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
発現制御配列に操作可能に連結される請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記発現制御配列が、構成的なプロモータ配列、細胞周期調節プロモータ配列、その誘導体またはその断片である請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記発現制御配列が、１以上の細胞周期調節マイクロＲＮＡによって標的とされる３’非翻訳領域である、または前記発現制御配列が、細胞周期調節マイクロＲＮＡの逆相補鎖をコードする請求項１３に記載の核酸。
【請求項１６】
真核細胞における翻訳のためにコドンが最適化される請求項１２〜１５のいずれかに記載の核酸。
【請求項１７】
前記核酸がベクターの一部である請求項１２〜１６のいずれかに記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１９】
前記核酸が染色体外である、または前記核酸が染色体に組み込まれる請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記融合タンパク質がＭ期において及び／またはＭ期からＧ１期までの移行期において分解される請求項１８または１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、幹細胞、非ヒト一細胞胚、無脊椎動物細胞、植物細胞または単細胞真核生物である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
細胞周期に応じて染色体の配列を修飾する及び／または染色体の配列の発現を調節する方法であって、前記方法が、
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の核酸と、任意で、前記染色体の配列における標的部位との実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドとを細胞に導入することを含み、その際、
細胞周期のある部分において、融合タンパク質が前記染色体の配列を修飾し、及び／または前記染色体の配列の発現を調節するように前記融合タンパク質が細胞周期のその部分において発現される、前記方法。
【請求項２３】
前記融合タンパク質の前記プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、前記染色体の配列における標的部位にて二本鎖切断を導入する標的指向性エンドヌクレアーゼであり、前記二本鎖切断の修復が、細胞周期調節タンパク質に融合されていない対応する標的指向性エンドヌクレアーゼに比べて高められる相同組換え修復（ＨＤＲ）の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に対する比を有する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的指向性エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ系、ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含む融合タンパク質から選択される請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼとガイドＲＮＡとを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ系がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼと一対のガイドＲＮＡを含み、且つ前記ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ系がアルゴノートエンドヌクレアーゼと一本鎖ガイドＤＮＡとを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、幹細胞、非ヒト一細胞胚、無脊椎動物細胞、植物細胞または単細胞真核生物である請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
細胞周期に応じて染色体の配列を修飾する、または染色体の配列の発現を調節する組成物及び方法。
【背景技術】
【０００２】
背景
プログラム可能なエンドヌクレアーゼは真核生物における標的とされるゲノムの操作または修飾にとってますます重要なツールになってきている。たとえば、ＲＮＡ誘導型のクラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲが関連する（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のようなプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、特定の染色体の配列を標的とし、標的部位にて二本鎖切断を導入するように操作される。二本鎖切断は相同組換え修復（ＨＤＲ）法または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）法によって修復することができる。しかしながら、ＨＤＲのＮＨＦＪに対する比は特定の哺乳類及び植物の細胞型では低く、ＨＤＲの成分は細胞周期の特定の期の間に活性化されることが立証されている（Ｍａｙｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０１０，１１（３）：１９６−２０７）。
【０００３】
従って、細胞周期の特定の期に対して標的化ヌクレアーゼの発現を制約する手段についての必要性がある。たとえば、標的指向性エンドヌクレアーゼが細胞周期のＳ／Ｇ２期のみの期間で発現されれば、ＨＤＲのＮＨＦＪに対する比は有意に上昇してもよい。標的指向性エンドヌクレアーゼの細胞周期が調節する発現の考えられる二次的な利益は、所望の結果を達成するのにＨＤＲを必要とするゲノム編集過程における的外れなＮＨＥＪが介在する誤差の低減である。従って、Ｍ／Ｇ１期の期間での標的指向性エンドヌクレアーゼの発現を減らすことによって、集団における各細胞にて的外れのヌクレアーゼ活性についての機会の有意な割合が低下するであろうし、以前の研究は、標的化ヌクレアーゼの発現の持続時間の低下が的を得たものの的外れなものに対する比を高めることができること示している（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２０１４，２４（６）：１０１２−１０１９）。
【発明の概要】
【０００４】
要約
本開示の種々の態様の中では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質及び細胞周期調節タンパク質を含む融合タンパク質の提供である。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はヌクレアーゼ活性を有し、それはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むキメラタンパク質から選択される。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼはさらにガイドＲＮＡを含み、ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼはさらに一本鎖のガイドＤＮＡを含む。他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は非ヌクレアーゼ活性を有し、その際、それはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインと非ヌクレアーゼ修飾ドメインとを含むキメラタンパク質である。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されているＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されているメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性因子様エフェクターから選択することができ、非ヌクレアーゼドメインは、転写活性化ドメイン、転写リプレッサドメイン、ヒストンアセチル転移酵素ドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヒストンメチル転移酵素ドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、ＤＮＡメチル転移酵素ドメイン、またはＤＮＡ脱メチル化酵素ドメインから選択することができる。特定の実施形態では、細胞周期調節タンパク質はジェミニン、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、ＣＤＣ２０またはセキュリンから選択される。種々の実施形態では、融合タンパク質はさらに、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞浸透性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、及び／または少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその誘導体であり、細胞周期調節タンパク質はジェミニンである。別の実施形態では、融合タンパク質は配列番号１４を含む。
【０００５】
本開示の別の態様は上述の融合タンパク質をコードする核酸を包含する。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は発現制御配列に操作可能に連結される。特定の実施形態では、発現制御配列は構成的なプロモータ配列、細胞周期調節プロモータ配列、その誘導体または断片である。他の実施形態では、発現制御配列は、１以上の細胞周期調節マイクロＲＮＡによって標的とされる３’非翻訳領域であり、または発現制御配列は細胞周期調節マイクロＲＮＡの逆相補鎖をコードする。さらに他の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は真核細胞における翻訳のためにコドンが最適化される。さらに他の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸はベクターの一部である。
【０００６】
本開示のさらなる態様は上述の融合タンパク質または上述の核酸を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、核酸は染色体外である。他の実施形態では、核酸は染色体に組み込まれる。種々の実施形態では、細胞はヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、幹細胞、非ヒト一細胞胚、無脊椎動物細胞、植物細胞または単細胞真核生物である。一部の実施形態では、融合タンパク質は細胞周期のＭ期の間に、及び／またはＭ期からＧ１期への移行期に分解される。
【０００７】
本開示の別の態様は、細胞周期に応じて染色体の配列を修飾する及び／または染色体の配列の発現を調節する方法を包含する。方法の１つは、上述の融合タンパク質をコードする核酸と、任意で、染色体の配列における標的部位との実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドとを細胞に導入することを含む。融合タンパク質は、細胞周期の一部で発現されるので、融合タンパク質は細胞周期のその一部の間に染色体の配列を修飾し、及び／または染色体の配列の発現を調節する。融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が染色体の配列における標的部位にて二本鎖切断を導入する標的指向性エンドヌクレアーゼである実施形態では、二本鎖切断の修復は、細胞周期調節タンパク質に融合されていない対応する標的指向性エンドヌクレアーゼに比べて上昇している相同組換え修復（ＨＤＲ）の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に対する比を有する。
【０００８】
本開示の他の態様及びイテレーションは以下で詳述される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃａｓ９−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質をコードする発現ベクターのマップを示す図である。ｔＥＦ１ａ＝切り詰められたヒト伸長因子−１プロモータアルファ；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素；ＬＴＲ＝長い末端反復。
【００１０】
【図２Ａ】Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質を発現しているＵ２ＯＳ細胞の示した時点での蛍光画像（上）及び微分コントラスト画像（下）を示す図である。
【００１１】
【図２Ｂ】Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質（太い矢印で示す）が発現される細胞周期の期を示す図である。
【００１２】
【図３Ａ】Ｕ２ＯＳ細胞におけるＣｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイの結果を示す図である。レーン１、ＤＮＡマーカー；レーン２、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−Ｇｅｍのプラスミドのみで形質移入した細胞；レーン３、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−Ｇｅｍのプラスミド＋ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡで形質移入した細胞；レーン４、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−Ｇｅｍのプラスミド＋ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡ＋ＡＡＶＳ１−ｓｓＯＤＮで形質移入した細胞；レーン５、Ｃａｓ９プラスミドのみで形質移入した細胞；レーン６、Ｃａｓ９プラスミド＋ＡＡＶＡ１−ｇＲＮＡで形質移入した細胞；レーン７、Ｃａｓ９プラスミド＋ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡ＋ＡＡＶＳ１−ｓｓＯＤＮで形質移入した細胞。
【００１３】
【図３Ｂ】Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＦＬＰアッセイの結果を示す図である。レーン１、ＤＮＡマーカー；レーン２、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−Ｇｅｍのプラスミドのみで形質移入した細胞；レーン３、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−Ｇｅｍのプラスミド＋ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡで形質移入した細胞；レーン４、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−Ｇｅｍのプラスミド＋ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡ＋ＡＡＶＳ１−ｓｓＯＤＮで形質移入した細胞；レーン５、Ｃａｓ９プラスミドのみで形質移入した細胞；レーン６、Ｃａｓ９プラスミド＋ＡＡＶＡ１−ｇＲＮＡで形質移入した細胞；レーン７、Ｃａｓ９プラスミド＋ＡＡＶＳ１−ｇＲＮＡ＋ＡＡＶＳ１−ｓｓＯＤＮで形質移入した細胞。
【００１４】
【図４】Ｋ５６２細胞にてＧａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンがＨＤＲ／ＮＨＥＪの比を高めたことを示す図である。Ｃａｓ９（１に設定された比）及びＧａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンのＨＤＲ／ＮＨＥＪの相対的な比をプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本開示は、細胞周期の特定の期におけるゲノムの修飾または調節のために特定の染色体の配列を標的とするための組成物及び方法を提供する。本明細書で提供されるのは、（ｉ）細胞周期調節タンパク質に操作可能に連結されたプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を含む融合タンパク質、（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸、（ｉｉｉ）上述の核酸を含み、細胞周期の間にそのレベルが変動する融合タンパク質を発現する細胞、及び（ｉｖ）融合タンパク質を用いて特定の染色体の配列を標的とし、細胞周期の特定の期においてゲノムの修飾または調節に介在する方法である。
【００１６】
（Ｉ）融合タンパク質
本開示の態様の１つは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質と細胞周期調節タンパク質とを含む融合タンパク質を提供する。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体の特定の標的配列に結合し、標的配列にてまたはその近傍でＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾するタンパク質である。従って、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＤＮＡ結合ドメインと修飾ドメインとを含む。ＤＮＡ結合ドメインはプログラム可能であり、異なるＤＮＡ配列を認識し、結合するようにそれを設計するまたは操作することができることを意味する。細胞周期調節タンパク質はそのレベルが細胞周期の間に変動するタンパク質である。たとえば、細胞周期調節タンパク質の合成及び／または分解は細胞周期に応じて調節される。従って、細胞周期調節タンパク質を含む融合タンパク質のレベルも細胞周期の間に変動することができる。
【００１７】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は細胞周期調節タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結することができ、それによって融合タンパク質を形成する。本明細書で開示されている融合タンパク質はさらに、追加のドメイン、たとえば、１以上の核局在化シグナル、１以上の細胞浸透性ドメイン、または１以上のマーカードメイン、及び／または１以上のリンカーを含むことができる。
【００１８】
（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
本明細書で開示されている融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインと修飾ドメインとを含む。
【００１９】
プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは様々なＤＮＡ配列を認識し、結合するように設計するまたは操作することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡの結合にはタンパク質と標的ＤＮＡとの間の相互作用が介在する。従って、ＤＮＡ結合ドメインはタンパク質の操作によって対象とするＤＮＡ配列を結合するようにプログラムすることができる。他の実施形態では、ＤＮＡの結合にはタンパク質及び標的ＤＮＡと相互作用するガイド核酸が介在する。そのような例では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、適当なガイド核酸を設計することによって対象とするＤＮＡ配列に対して標的とされ得る。
【００２０】
一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はヌクレアーゼ修飾ドメインを含むので、ヌクレアーゼ活性を有する。従って、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は標的部位にてＤＮＡを切断する標的指向性エンドヌクレアーゼである。切断は二本鎖または一本鎖であることができる。切断は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復の方法によって修復することができる。ヌクレアーゼドメイン（または標的指向性エンドヌクレアーゼ）を含むプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の例には、限定しないで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むキメラタンパク質が挙げられる。ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、セクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）にて以下で詳述される。
【００２１】
他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡ及び／またはＤＮＡに関連するタンパク質（複数可）の構造及び／または活性を修飾するように、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は非ヌクレアーゼ修飾ドメイン（たとえば、転写調節ドメイン、ヒストンアセチル化ドメイン等）を含む。従って、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインと非ヌクレアーゼドメインとを含むキメラタンパク質である。そのようなタンパク質はセクション（Ｉ）（ａ）（ｖｉｉｉ）にて以下で詳述される。
【００２２】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、野生型または天然に存在するＤＮＡ結合及び／または修飾のドメイン、天然に存在するＤＮＡ結合及び／または修飾のドメインの修飾された型、合成または人工のＤＮＡ結合及び／または修飾のドメイン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００２３】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであることができる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓはガイドＲＮＡによって、それがＤＮＡにて二本鎖切断を導入する標的配列に導かれる。
【００２４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、種々の細菌及び古細菌に存在するＩ型（すなわち、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、またはＩＦ）、ＩＩ型（すなわち、ＩＩＡ、ＩＩＢ、またはＩＩＣ）、ＩＩＩ型（すなわち、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）、またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ系に由来することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（たとえば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．（たとえば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｓｐ．、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、またはＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｓｐ．に由来することができる。
【００２５】
好適なＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定例には、Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆタンパク質、Ｃｍｒタンパク質、Ｃｓａタンパク質、Ｃｓｂタンパク質、Ｃｓｃタンパク質、Ｃｓｅタンパク質、Ｃｓｆタンパク質、Ｃｓｍタンパク質、Ｃｓｎタンパク質、Ｃｓｘタンパク質、Ｃｓｙタンパク質、Ｃｓｚタンパク質、及びそれらの誘導体または変異体が挙げられる。具体的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃｐｆ１タンパク質またはそれらの誘導体であることができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であることができる。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉのＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であることができる。代わりの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａのＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）であることができる。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａのＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）であることができる。
【００２６】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ認識及び／またはＲＮＡ結合のドメインを含み、それはガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインも含む。たとえば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様のヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様のヌクレアーゼドメインを含むことができ、Ｃｐｆ１タンパク質はＲｕｖＣ様のドメインを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、リボヌクレアーゼドメイン、タンパク質／タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、と同様に他のドメインも含むことができる。
【００２７】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と会合することができる。ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと相互作用してそれをＤＮＡにおける標的部位に導く。標的部位は、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接することを除いて配列の限定を有さない。たとえば、Ｃａｓ９のためのＰＡＭ配列には、３’−ＮＧＧ、３’−ＮＧＧＮＧ、３’−ＮＮＡＧＡＡＷ及び３’−ＡＣＡＹが挙げられ、Ｃｐｆ１のためのＰＡＭ配列には、５’−ＴＴＮが挙げられる（Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＹはＣまたはＴのいずれかとして定義される）。各ｇＲＮＡは標的配列に対して相補性である配列を含む（たとえば、Ｃａｓ９のｇＲＮＡはＧＮ１７〜２０ＧＧを含むことができる）。ｇＲＮＡはまた、ステムループ構造及び一本鎖領域を形成する足場配列も含むことができる。足場領域はｇＲＮＡのどれも皆同一であることができる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは単一分子であることができる（すなわち、ｓｇＲＮＡ）。他の実施形態では、ｇＲＮＡは２つの別々の分子であることができる。当業者はｇＲＮＡの設計及び構築に精通しており、たとえば、ｇＲＮＡの設計ツールはインターネットでまたは商業的供給源から入手可能である。
【００２８】
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ
他の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが修飾されてＤＮＡの一本鎖のみを切断することを除いて上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに類似する。従って、ガイドＲＮＡと組み合わせた単一のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓニッカーゼはＤＮＡにて一本鎖の切断またはニックを作り出すことができる。或いは、一対のオフセットｇＲＮＡと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓニッカーゼはＤＮＡにて二本鎖切断を作り出すことができる。
【００２９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは１以上の突然変異及び／または欠失によってニッカーゼに変換することができる。たとえば、Ｃａｓ９ニッカーゼはヌクレアーゼドメインの１つにて１以上の突然変異を含むことができ、その際、１以上の突然変異はＲｕｖＣ様ドメインにおけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ及び／またはＤ９８６Ａであることができ、または１以上の突然変異はＨＮＨ様ドメインにおけるＨ８４０Ａ（またはＨ８３９Ａ）、Ｎ８５４Ａ及び／またはＮ８６３Ａであることができる。
【００３０】
（ｉｉｉ）ｓｓＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼ
代わりの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は一本鎖ＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼである。アルゴノート（Ａｇｏｓ）はガイドとして５’−リン酸化された短い一本鎖核酸を用いて核酸標的を切断するエンドヌクレアーゼのファミリーである。一部の原核生物のＡｇｏｓは一本鎖ガイドＤＮＡを用い、ＤＮＡにて二本鎖切断を作り出す（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，Ｍａｙ，２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５４７）。ｓｓＤＮＡ誘導型Ａｇｏエンドヌクレアーゼは一本鎖ガイドＤＮＡと会合することができる。
【００３１】
Ａｇｏエンドヌクレアーゼは、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｓｐ．、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｓｐ．、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｓｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ  ｓｐ．、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐ．、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ  ｓｐ．、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐに由来することができる。一部の実施形態では、ＡｇｏエンドヌクレアーゼはＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉのＡｇｏ（ＮｇＡｇｏ）であることができる。他の実施形態では、ＡｇｏエンドヌクレアーゼはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＡｇｏ（ＴｔＡｇｏ）であることができる。その上さらなる実施形態では、ＡｇｏエンドヌクレアーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＰｆＡｇｏ）であることができる。
【００３２】
一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）はＤＮＡにおける標的部位に対して相補性である。標的部位は配列制限を有さず、ＰＡＭを必要としない。ｇＤＮＡは一般に長さ約１５〜３０ヌクレオチドに及ぶ。一部の実施形態では、ｇＤＮＡは長さ約２４ヌクレオチドであることができる。ｇＤＮＡは５’リン酸基を含んでもよい。当業者はｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの設計及び構築に精通している。
【００３３】
（ｉｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
さらに他の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であることができる。ＺＦＮはＤＮＡ結合ジンクフィンガー領域とヌクレアーゼドメインとを含む。ジンクフィンガー領域は約２〜７のジンクフィンガー、たとえば、約４〜６のジンクフィンガーを含むことができ、各ジンクフィンガーは３つのヌクレオチドを結合する。ジンクフィンガー領域はＤＮＡ配列を認識し、結合するように操作することができる。ジンクフィンガーの設計ツールまたはアルゴリズムはインターネットでまたは商業的な供給源から入手可能である。好適なリンカー配列を用いてジンクフィンガーを一緒に連結することができる。
【００３４】
ＺＦＮはヌクレアーゼドメインも含み、それはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。ヌクレアーゼドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの非限定例には、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインはＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼに由来することができる。ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼは、通常、認識／結合部位から離れた幾つかの塩基対であり、そのようなものとして、分離可能な結合及び切断のドメインを有する部位でＤＮＡを切断する。これらの酵素は一般に、一時的に会合して二量体を形成し、交互の位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。好適なＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼの非限定例には、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、及びＳａｐＩが挙げられる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であることができる。ＩＩ−Ｓ型ヌクレアーゼドメインを修飾して２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量体化を促すことができる。たとえば、ＦｏｋＩの切断ドメインは特定のアミノ酸残基を変異させることによって修飾することができる。非限定例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、及び５３８位のアミノ酸残基は修飾の標的である。たとえば、修飾されたＦｏｋＩドメインの１つはＱ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、及び／またはＮ４９６Ｄの突然変異を含むことができ、他の修飾されたＦｏｋＩドメインはＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、及び／またはＨ５３７Ｒの突然変異を含むことができる。
【００３５】
（ｖ）転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ
代わりの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であることができる。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに連結されている転写活性因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する高度に保存された反復で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥは植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓによって分泌されて宿主植物細胞にて遺伝子の転写を変化させるタンパク質である。任意の対象とするＤＮＡ配列を標的とするように調節タンパク質の設計を介してＴＡＬＥの反復アレイを操作することができる。ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインはセクション（Ｉ）（ａ）（ｉｖ）にて上述されたようなヌクレアーゼドメインであることができる。具体的な実施形態では、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩ（Ｓａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，７（１）：１７１−１９２）に由来する。
【００３６】
（ｖｉ）メガヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼ
さらに他の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はメガヌクレアーゼまたはその誘導体である。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち、一般に約１２塩基対から約４５塩基対に及ぶ認識配列を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要件の結果として、認識配列は一般に所与のゲノムで１回のみ発生する。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーはゲノムの研究及びゲノムの操作のための有益なツールになっている。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩまたはその変異体である。当業者に周知の技法を用いてその認識配列を修飾することによって特定の染色体の配列に対してメガヌクレアーゼを標的とすることができる。
【００３７】
代わりの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はレアカットエンドヌクレアーゼまたはその誘導体である。レアカットエンドヌクレアーゼはその認識配列がゲノムにて稀にしか生じない、好ましくはゲノムにて１回しか生じない部位特異的なエンドヌクレアーゼである。レアカットエンドヌクレアーゼは７−ヌクレオチド配列、８−ヌクレオチド配列、またはさらに長い認識配列を認識してもよい。レアカットエンドヌクレアーゼの非限定例には、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｂｆＩ、及びＦｓｅＩが挙げられる。
【００３８】
（ｖｉｉ）ヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質
さらに追加の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ヌクレアーゼドメインとプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインとを含むキメラタンパク質であることができる。ヌクレアーゼドメインは、セクション（Ｉ）（ａ）（ｉｖ）で上述されたもの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン（たとえば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様のヌクレアーゼドメイン、またはＣｐｆ１のヌクレアーゼドメイン）、Ａｇｏヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン、またはメガヌクレアーゼもしくはレアカットエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインのいずれかであることができる。
【００３９】
キメラタンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性をすべて欠くように修飾されたプログラム可能なエンドヌクレアーゼ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、Ａｇｏヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼ）であることができる。或いは、キメラタンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、たとえば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥのようなプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質であることができる。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が突然変異及び／または欠失によって削除された触媒上不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであることができる。たとえば、触媒上不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、及び／またはＤ９８６Ａの突然変異を含み、且つＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ（またはＨ８３９Ａ）、Ｎ８５４Ａ及び／またはＮ８６３Ａの突然変異を含む、触媒上不活性の（効力のない）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であることができる。或いは、触媒上不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインにて匹敵する突然変異を含む触媒上不活性の（効力のない）Ｃｐｆ１タンパク質であることができる。他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が突然変異及び／または欠失によって削除された触媒上不活性のＡｇｏエンドヌクレアーゼであることができる。さらに他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が突然変異及び／または欠失によって削除された、触媒上不活性のメガヌクレアーゼであることができ、たとえば、触媒上不活性のメガヌクレアーゼはＣ末端の切り詰めを含むことができる。
【００４０】
（ｖｉｉｉ）非ヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質
代わりの実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインとプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインとを含む融合タンパク質であることができる。好適なプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインはセクション（Ｉ）（ａ）（ｖｉｉ）にて上述されている。好適な非ヌクレアーゼドメインの例には転写調節ドメインまたは後成的修飾ドメインが挙げられる。
【００４１】
一部の実施形態では、非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の非ヌクレアーゼドメインは転写調節ドメインであることができる。転写調節ドメインは、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサドメインであることができる。一般に、転写活性化ドメインは転写制御要素及び／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等）と相互作用して遺伝子の転写を増やす及び／または活性化し、転写リプレッサドメインは前記タンパク質と相互作用して遺伝子の転写を減らすまたは抑制する。好適な転写活性化ドメインには限定しないで、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＮＦκＢｐ６５の活性化ドメイン、ｐ５３の活性化ドメイン１及び２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）の活性化ドメイン、Ｅ２Ａの活性化ドメイン、ヒト熱ショック因子１（ＨＳＦ１）に由来する活性化ドメイン、またはＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）の活性化ドメインが挙げられる。好適な転写リプレッサドメインの非限定例には、誘導性ｃＡＭＰ早期リプレッサ（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連のボックスＡ（ＫＲＡＢ−Ａ）リプレッサドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサドメイン、Ｓｐ１様のリプレッサ、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサ、ＩｋＢリプレッサ、またはＭｅＣＰ２が挙げられる。転写活性化ドメインまたは転写リプレッサドメインはＤＮＡ結合タンパク質に遺伝的に融合することができ、または非共有結合のタンパク質／タンパク質、タンパク質／ＲＮＡまたはタンパク質／ＤＮＡの相互作用を介して結合することができる。
【００４２】
他の実施形態では、非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の非ヌクレアーゼドメインは後成的修飾ドメインであることができる。一般に、後成的修飾ドメインはヒストンの構造及び／または染色体の構造を修飾することによって遺伝子発現を変化させる。好適な後成的修飾ドメインには限定しないで、ヒストンアセチル転移酵素ドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヒストンメチル転移酵素ドメイン、ヒストン脱メチル化酵素ドメイン、ＤＮＡメチル転移酵素ドメイン、及びＤＮＡ脱メチル化酵素ドメインが挙げられる。
【００４３】
（ｂ）細胞周期調節タンパク質
融合タンパク質はまた、細胞周期調節タンパク質、その誘導体または断片も含む。細胞周期調節タンパク質は細胞周期の間、そのレベルが変動するタンパク質である。好適な細胞周期調節タンパク質には、細胞周期のＭ期及び／または早期Ｇ１期における分解について標的とされるものが挙げられる。好適な細胞周期調節タンパク質の非限定例には、ジェミニン、サイクリンＡ（たとえば、サイクリンＡ１またはサイクリンＡ２）、サイクリンＢ（たとえば、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、またはサイクリンＢ３）、サイクリンＤ（たとえば、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、またはサイクリンＤ３）、ＣＤＣ２０（細胞分裂周期２０）、及びセキュリンが挙げられる。具体的な実施形態では、細胞周期調節タンパク質はジェミニン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０５６９７９）であり、それは細胞周期のＳ期とＧ２期において発現され、中期／後期の移行期において後期促進複合体によって分解される（約２５ｋＤａの）ＤＮＡ複製阻害剤である。
【００４４】
（ｃ）任意の追加のドメイン
融合タンパク質はさらに少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞浸透性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、及び／または少なくとも１つのリンカーを含むことができる。
【００４５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナルを含むことができる。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸の区間を含む。核局在化シグナルは当該技術で既知である（たとえば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１−５１０５を参照のこと）。たとえば、一実施形態では、ＮＬＳは、たとえば、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）のような単部分配列であることができる。別の実施形態では、ＮＬＳは二部分配列である。さらに別の実施形態では、ＮＬＳはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）であることができる。ＮＬＳは融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部の位置に位置することができる。
【００４６】
他の実施形態では、融合タンパク質は少なくとも１つの細胞浸透性ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞浸透性ドメインはＨＩＶ−１のＴＡＴタンパク質に由来する細胞浸透ペプチド配列であることができる。例として、ＴＡＴ細胞浸透配列はＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）であることができる。別の実施形態では、細胞浸透性ドメインは、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来する細胞浸透性ペプチド配列であるＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５）であることができる。さらに別の実施形態では、細胞浸透性ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号６またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７）であることができる。追加の実施形態では、細胞浸透性ドメインは、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号８）、単純ヘルペスウイルスに由来する細胞浸透ペプチドであるＶＰ２２、またはポリアルギニンペプチド配列であることができる。細胞浸透性ドメインは融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部の位置に位置することができる。
【００４７】
さらに他の実施形態では、融合タンパク質は少なくとも１つのマーカードメインを含むことができる。マーカードメインの非限定例には蛍光タンパク質、精製タグ及びエピトープタグが挙げられる。一部の実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質であることができる。好適な蛍光タンパク質の非限定例には、緑色蛍光タンパク質（たとえば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（たとえば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（たとえば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ、）、シアン蛍光タンパク質（たとえば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍオレンジ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−オレンジ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−オレンジ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグ及び／またはエピトープタグであることができる。例となるタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、直列親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は少なくとも１つのリンカーを含むことができる。たとえば、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質、細胞周期調節タンパク質及び他の任意のドメインは１以上のリンカーを介して連結され得る。リンカーは柔軟性であることができる（たとえば、小型の非極性アミノ酸（たとえば、Ｇｌｙ）または極性アミノ酸（たとえば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）を含む）。柔軟性リンカーの非限定例には、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号９）、（ＧＧＧＧＳ）１−４（配列番号１０）及び（Ｇｌｙ）６−８が挙げられる。或いは、リンカーは、たとえば、（ＥＡＡＡＫ）１−４（配列番号１１）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２−５Ａ（配列番号１２）、ＰＡＰＡＰ、（ＡＰ）６−８，及び（ＸＰ）ｎのように剛性であることができ、その際、Ｘはアミノ酸であるが、好ましくはＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕである。好適なリンカーの例は当該技術で周知であり、リンカーを設計するプログラムは容易に入手可能である（Ｃｒａｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２０００，１３（５）：３０９６−３１２）。代わりの実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質、細胞周期調節タンパク質及び他の任意のドメインは直接連結することができる。
【００４９】
（ｅ）具体的な融合タンパク質
具体的な実施形態では、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＣａｓ９タンパク質（すなわち、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ）であり、細胞周期調節タンパク質はジェミニンである。他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。融合タンパク質はさらに核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／または蛍光タンパク質（ＦＰ）を含むことができる。具体的な融合タンパク質の非限定例を以下で提示する：
具体的な融合タンパク質（ＮＨ２−ＣＯＯＨ）
Ｃａｓ９−ジェミニン
ジェミニン−Ｃａｓ９
Ｃａｓ９−ＮＬＳ−ジェミニン
Ｃａｓ９−ジェミニン−ＮＬＳ
ジェミニン−ＮＬＳ−Ｃａｓ９
ジェミニン−Ｃａｓ９−ＮＬＳ
ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ジェミニン
ＮＬＳ−ジェミニン−Ｃａｓ９
Ｃａｓ９−ＮＬＳ−ＦＰ−ジェミニン
Ｃａｓ９−ＮＬＳ−ジェミニン−ＦＰ
Ｃａｓ９−ジェミニン−ＦＰ−ＮＬＳ
Ｃａｓ９−ジェミニン−ＮＬＳ−ＦＰ
Ｃａｓ９−ＦＰ−ジェミニン−ＮＬＳ
Ｃａｓ９−ＦＰ−ＮＬＳ−ジェミニン
ジェミニン−ＮＬＳ−ＦＰ−Ｃａｓ９
ジェミニン−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＦＰ
ジェミニン−ＦＰ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９
ジェミニン−ＦＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ
ジェミニン−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−ＦＰ
ｇジェミニン−Ｃａｓ９−ＦＰ−ＮＬＳ
ＺＦＮ−ジェミニン
ＺＦＮ−ＮＬＳ−ジェミニン
ジェミニン−ＺＦＮ
ジェミニン−ＮＬＳ−ＺＦＮ
ＺＦＮ−ジェミニン−ＦＰ
ＺＦＮ−ＦＰ−ジェミニン
ジェミニン−ＺＦＮ−ＦＰ
ジェミニン−ＦＰ−ＺＦＮ
ＺＦＮ−ＮＬＳ−ジェミニン−ＦＰ
ＺＦＮ−ＮＬＳ−ＦＰ−ジェミニン
ジェミニン−ＮＬＳ−ＺＦＮ−ＦＰ
ジェミニン−ＮＬＳ−ＦＰ−ＺＦＮ
【００５０】
（ＩＩ）融合タンパク質をコードする核酸
本開示の別の態様はセクション（Ｉ）で上述されている融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。融合タンパク質をコードする核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡである。別の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸はＤＮＡである。融合タンパク質をコードするＤＮＡはベクターの一部であることができる（以下を参照のこと）。
【００５１】
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は真核細胞にて融合タンパク質の発現を調節する少なくとも１つの配列に操作可能に連結することができる。特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は構成的な転写制御配列に操作可能に連結することができる。他の実施形態では、コードしている核酸は、融合タンパク質の細胞周期に応じた発現を可能にする１以上の配列に操作可能に連結することができる。従って、融合タンパク質をコードする配列は、細胞周期に応じて（活性化するまたは抑制的な）転写因子によって調節される転写制御配列、その誘導体もしくは断片（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２，１３：１９７７−２０００）に、及び／または細胞周期に応じてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と相互作用する配列（Ｂｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１１，１８１２：５９２−６０１）に操作可能に連結することができる。
【００５２】
好適な真核生物の構成的なプロモータ制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモータ、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモータ、アデノウイルス主要後期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶプロモータ、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、伸長因子−１プロモータアルファ（たとえば、切り詰めたヒト伸長因子−１プロモータアルファ）、ユビキチンプロモータ、アクチンプロモータ、チューブリンプロモータ、免疫グロブリンプロモータ、その誘導体、その断片、または前述のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
細胞周期調節プロモータ制御配列、その誘導体、またはその断片はその発現が細胞周期に応じて調節される遺伝子に由来することができる。たとえば、プロモータ制御配列は、細胞周期のＧ２期の間に発現されるまたは活性化される活性化転写因子のためのコンセンサス結合配列、または逆に、細胞周期のＧ１期もしくはＳ期において発現されるまたは活性化される抑制性転写因子のためのコンセンサス結合配列であることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、Ｇ２活性化転写因子に応答する配列に、及びＧ１／Ｓ抑制性転写因子に応答する配列に連結することができる。
【００５４】
Ｇ２の間に発現される遺伝子の非限定例には、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＩＩアルファ）、ＣＤＫＮ２Ｃ（サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤２Ｃ）、ＣＣＮＡ２（サイクリンＡ２）、ＣＣＮＦ（サイクリンＦ）、ＣＤＣ２（細胞分裂周期２）、ＣＤＣ２５Ｃ（細胞分裂周期２５Ｃ）、ＣＫＳ１（サイクリン−依存性キナーゼ調節サブユニット１）、及びＧＭＮＮ（ジェミニン）が挙げられる。Ｓ期の間に発現される遺伝子の例には限定しないで、ＢＲＣＡ１（乳癌１型感受性タンパク質）、ＣＤＣ４５Ｌ（細胞分裂周期４５−様）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、ＲＲＭ１（リボヌクレオチド還元酵素Ｍ１）、ＲＲＭ２（リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２）、及びＴＹＭＳ（チミジル酸合成酵素）が挙げられる。Ｇ１／Ｓにおいて発現される遺伝子の非限定例には、ＣＣＮＥ１（サイクリンＥ１）、ＣＣＮＥ２（サイクリンＥ２）、ＣＤＣ２５Ａ（細胞分裂周期２５Ａ）、ＣＤＣ６（細胞分裂周期６）、Ｅ２Ｆ１（Ｅ２Ｆ転写因子１）、ＭＣＭ２（ミニ染色体維持複合体成分２）、ＭＣＭ６（ミニ染色体維持複合体成分６）、ＮＰＡＴ（核タンパク質、血管拡張性失調症遺伝子座）、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）、ＳＬＢＰ（ステム／ループ結合タンパク質）、ＭＳＨ２（ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質）、及びＮＡＳＰ（核自己抗原精子タンパク質）が挙げられる。Ｇ２／Ｍにおいて発現される遺伝子の例には、ＢＩＲＣ５（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有５）、ＢＵＢ１（有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼ）、ＢＵＢ１Ｂ（有糸分裂チェックポイントセリン／スレオニンキナーゼＢ）、ＣＣＮＢ１（サイクリンＢ１）、ＣＣＮＢ２（サイクリンＢ２）、ＣＥＮＰＡ（動原体タンパク質Ａ）、ＣＥＮＰＦ（動原体タンパク質Ｆ）、ＣＤＣ２０（細胞周期依存性２０タンパク質）、ＣＤＣ２５Ｂ（細胞分裂周期２５Ｂ）、ＣＤＫＮ２Ｄ、ｐ１９（サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤２Ｄ）、ＣＫＳ２（サイクリン−依存性キナーゼ調節性サブユニット２）、Ｅ２Ｆ５（Ｅ２Ｆ転写因子５）、ＰＬＫ（Ｐｏｌｏ−様キナーゼ）、ＲＡＣＧＡＰ１（Ｒａｃ  ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質１）、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ（ラブキネシン−６／Ｒａｂ６−ＫＩＦＬ／ＭＫｌｐ２）、ＳＴＫ１５（セリン／スレオニンキナーゼ１５またはオーロラキナーゼ）、及びＳＴＬ６（セリン／スレオニンキナーゼ６またはオーロラキナーゼＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
或いは、融合タンパク質をコードする核酸は、細胞周期に応じてｍｉＲＮＡと相互作用する配列に操作可能に連結することができる。たとえば、細胞周期調節配列は、細胞周期の特定の期（複数可）の間にその発現がｍｉＲＮＡによって阻害される（すなわち、翻訳を阻止する及び／または転写物を不安定化することによって）遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）またはその断片であることができる。Ｇ１期の間にその発現がｍｉＲＮＡによって阻害される遺伝子転写物には、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６が挙げられる。或いは、細胞周期調節配列は、細胞周期調節ｍｉＲＮＡの逆相補鎖をコードすることができる。従って、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡの逆相補鎖を含む（融合タンパク質の）転写物との間の相互作用はＲＮＡが誘導するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を活性化し、（融合タンパク質の）転写物の分解をもたらす。Ｇ１期の間に発現されるｍｉＲＮＡの非限定例にはｍｉＲ−１７／２０、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２９、及びｍｉＲ−１３７が挙げられる。
【００５６】
他の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの試験管内の合成のためのプロモータ制御配列に操作可能に連結することができる。一般に、プロモータ配列はファージＲＮＡポリメラーゼによって認識される。たとえば、プロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６のプロモータ配列、またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６のプロモータ配列の変異であることができる。一実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた試験管内でのｍＲＮＡの合成のためにＴ７プロモータに操作可能に連結される。
【００５７】
代わりの実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、細菌細胞または真核細胞における融合タンパク質の試験管内発現のためにプロモータ配列に操作可能に連結することができる。好適な細菌プロモータには限定しないで、Ｔ７プロモータ、ｌａｃオペロンプロモータ、ｔｒｐプロモータ、それらの変異及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な真核生物プロモータ制御配列の非限定例には、サイトメガロウイルス前初期プロモータ（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモータ、伸長因子アルファ（ＥＦ１）プロモータ、切り詰めたヒト伸長因子−１プロモータアルファ（ｔＥＦ１ａ）、アデノウイルス主要後期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、ユビキチンプロモータ、アクチンプロモータ、チューブリンプロモータ、免疫グロブリンプロモータ、それらの断片、または前述のいずれかの組み合わせのような構成的プロモータ、及び、たとえば、熱ショック、金属、ステロイド、抗生剤またはアルコールによって調節されるもののような調節されたプロモータ制御配列が挙げられる。
【００５８】
追加の態様では、融合タンパク質をコードする核酸は、ポリアデニル化シグナル（たとえば、ＳＶ４０のポリＡシグナル、ウシ成長因子（ＢＧＨ）のポリＡシグナル等）及び／または少なくとも１つの転写終結配列（たとえば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節要素）にも操作可能に連結することができる。
【００５９】
種々の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸はベクターの中に存在することができる。好適なベクターには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ−染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクターが挙げられる。一実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡはプラスミドベクターに存在する。好適なプラスミドベクターの非限定例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ及びそれらの変異体が挙げられる。ベクターは、追加の発現制御配列（たとえば、エンハンサ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、転写後調節要素、等）、選択できるマーカー配列（たとえば、抗生剤耐性遺伝子）、複製開始点、等を含むことができる。追加の情報は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３または“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１にて見いだすことができる。
【００６０】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターは１以上のガイドＲＮＡをコードする核酸も含むことができる。
【００６１】
融合タンパク質をコードする核酸は、対象とする真核細胞におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドンを最適化することができる。たとえば、コドンは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、サカナ、両生類、植物、酵母、昆虫等における発現のために最適化することができる（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／におけるコドン使用頻度のデータベースを参照のこと）。コドン最適化のためのプログラムは無料ソフトとして利用可能である。市販のコドン最適化プログラムも利用可能である。
【００６２】
（ＩＩＩ）融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞
本開示のさらに別の態様はセクション（Ｉ）にて上記で詳述した融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を含む細胞を包含する。好適な核酸はセクション（ＩＩ）で上述されている。
【００６３】
融合体をコードする核酸は細胞にて染色体外であることができる。或いは、融合体をコードする核酸は染色体に組み込むことができる（すなわち、ゲノムＤＮＡに組み込まれる）。組込みは無作為であることができ、または標的化することができる。たとえば、レンチウイルス系、レトロウイルス系、または標的化されたエンドヌクレアーゼ系（たとえば、ＺＦＮ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）を用いて核酸を組み込むことができる。核酸を細胞に導入する手段は当該技術で周知であり、一部はセクション（ＩＶ）（ａ）にて以下に記載されている。
【００６４】
一実施形態では、細胞は、構成的な真核生物プロモータ（たとえば、ｔＥＦ１ａ）に操作可能に連結される融合タンパク質をコードする核酸を含む。別の実施形態では、細胞は、細胞周期調節プロモータに操作可能に連結される融合タンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、細胞周期調節プロモータは、Ｇ２プロモータ、Ｓプロモータ、またはＧ１／Ｓプロモータであることができる。細胞周期調節プロモータは、細胞に対して外来性であることができる（すなわち、融合タンパク質をコードする配列と共に導入される）。或いは、細胞周期調節プロモータは、細胞に対して内在性であることができる（すなわち、融合タンパク質をコードする配列は内在性の細胞周期調節プロモータ配列の近傍に組み込むように標的にされる）。さらに他のイテレーションでは、細胞はｍｉＲＮＡによって細胞周期に応じて調節される配列に操作可能に連結される融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【００６５】
通常、融合タンパク質の細胞周期調節タンパク質は、融合タンパク質が細胞周期のＭ期において及び／またはＭ期からＧ１期の移行期において分解されるように選択される。一部の実施形態では、細胞は細胞周期の後期Ｇ１期、Ｓ期、及び／またはＧ２期において融合タンパク質を発現する。たとえば、操作可能に連結される細胞周期調節配列は、細胞周期のＳ期及び／またはＧ２期において融合タンパク質の発現を最適化するように選択することができる。
【００６６】
細胞の種類は変化することができ、変化するであろう。種々の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、幹細胞、非ヒト一細胞胚、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞または単細胞真核生物であることができる。細胞は初代細胞または細胞株細胞であることができる。
【００６７】
一部の実施形態では、細胞はヒト細胞であることができる。好適なヒト細胞株細胞の非限定例には、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５９４細胞、ヒトＡ−４３１細胞及びヒトＫ５６２細胞が挙げられる。
【００６８】
他の実施形態では、細胞は非ヒト哺乳類細胞であることができる。好適な非ヒト哺乳類細胞の非限定例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胚性線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚性間葉Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞；マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳腺ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞；ラット膠芽細胞種９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞種Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞；及びアフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞が挙げられる。哺乳類細胞株のさらに広範なリストはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）にて見いだされてもよい。
【００６９】
さらに他の実施形態では、細胞は幹細胞であることができる。好適な幹細胞には限定しないで、胚性幹細胞、ＥＳ−様幹細胞、胎児性幹細胞、成人幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、分化多能性幹細胞、寡能成幹細胞、及び単能成幹細胞が挙げられる。幹細胞は哺乳類起源であることができる。
【００７０】
代わりの実施形態では、細胞は非ヒト一細胞胚であることができる。一細胞胚を含む好適な哺乳類胚には限定しないで、マウス、ラット、ハムスター、齧歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ及び霊長類の胚が挙げられる。好適な非哺乳類胚には、両生類、魚類、鳥類、非脊椎動物が挙げられる。
【００７１】
さらなる実施形態では、細胞は植物細胞であることができる。植物細胞は、研究で使用される植物（たとえば、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ）または食物植物（たとえば、コーン、コムギ、コメ、ジャガイモ、キャッサバ、ダイズ、イモ、ソルガム等）に由来することができる。
【００７２】
（ＩＶ）染色体の配列を修飾するまたは染色体の配列の発現を調節する方法
本開示の別の態様は、本明細書で開示されている融合タンパク質を用いて、細胞周期の特定の期において染色体の配列を修飾する（すなわち、編集する）及び／または染色体の配列の発現を調節する方法を包含する。融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する（すなわち、標的指向性エンドヌクレアーゼである）実施形態では、染色体の配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、及び／またはそれらの組み合わせによって修飾することができる。従って、標的とされる染色体の配列は、ノックアウトすることができ、ノックイン配列を獲得することができ、または遺伝子修正もしくは遺伝子変換を受けることができる。融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が非ヌクレアーゼ活性を有する実施形態では、標的とされる染色体の配列は、標的とされる配列の転写において変化を受けることができ、及び／またはＤＮＡ及び／または関連するタンパク質の構造において変化を受けることができる。
【００７３】
方法は、セクション（Ｉ）に記載されているような少なくとも１つの融合タンパク質、またはセクション（ＩＩ）に記載されているような少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含む。融合タンパク質（複数可）または融合タンパク質（複数可）をコードする核酸を導入することができる細胞の好適な種類はセクション（ＩＩＩ）にて上記で詳述されている。
【００７４】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである実施形態では、方法はさらに、１以上のガイドＲＮＡまたは１以上のガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞に導入することを含む。同様に、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡ誘導型アルゴノートエンドヌクレアーゼである実施形態では、方法はさらに、一本鎖ガイドＤＮＡを細胞に導入することを含むことができる。
【００７５】
さらに、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する（すなわち、標的指向性エンドヌクレアーゼである）実施形態では、方法はさらに、染色体の配列における標的部位との実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチド（以下で詳述されるような）を細胞に導入することを含むことができる。
【００７６】
（ａ）細胞に導入すること
融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸、任意のガイド核酸及び任意のドナーポリヌクレオチドは種々の手段によって細胞に導入することができる。一部の実施形態では、細胞に形質移入することができる。好適な形質移入法には、リン酸カルシウムが介在する形質移入、ヌクレオフェクション（またはエレクトロポレーション）、カチオンポリマー形質移入（たとえば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ウイロゾーム形質移入、ビリオン形質移入、リポソーム形質移入、カチオンリポソーム形質移入、免疫リポソーム形質移入、非リポソーム脂質形質移入、デンドリマー形質移入、熱ショック形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペイルフェクション、ソノポレーション、光学形質移入、及び専売薬剤で促進される核酸の取り込みが挙げられる。形質移入法は当該技術で周知である（たとえば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３または“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照のこと）。他の実施形態では、分子は微量注入によって細胞または胚に導入される。たとえば、分子は一細胞胚の前核に注入することができる。
【００７７】
（ｂ）細胞を培養すること
方法はさらに、融合タンパク質が細胞周期の一部において発現されるように適当な条件下で細胞を維持することを含む。融合タンパク質が細胞に存在する場合、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは染色体の配列における標的とされる部位に融合タンパク質を向け、その際、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は染色体の配列を修飾するこができる、及び／または染色体の配列の発現を調節することができる。
【００７８】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的指向性エンドヌクレアーゼである実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは染色体の配列における標的とされる部位で二本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、相同組換え修復（ＨＤＲ）法によって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復法によって修復することができる。ＮＨＥＪがエラーを起こし易いので、切断の修復の間にヌクレオチドの挿入及び／またはヌクレオチドの欠失（すなわち、インデル）が発生し得る。従って、ドナーポリヌクレオチドも染色体の配列への標的とされる組込みのために細胞に導入される実施形態では、ＮＨＥＪによる切断の修復は標的とされる組込みを妨害することができる。しかしながら、Ｇ２においてはＨＤＲのＮＨＥＪに対する比がさらに高くてもよいので、細胞周期のこの期に対して融合タンパク質の活性を制約することは、ＨＤＲによるゲノム編集の効率を高めてもよいし、及び／または的外れなＮＨＥＪか介在する効果を減らしてもよい。たとえば、Ｓ期及びＧ２期において融合タンパク質が存在し、且つＭ期及び／またはＭ／Ｇ１移行期において分解される実施形態では、ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復を出来るだけ減らすことができる。そのような状況では、ＨＤＲ／ＮＨＥＪの比は、細胞周期調節タンパク質に融合されていない対応する標的指向性エンドヌクレアーゼに比べて上昇している。ＨＤＲ／ＮＨＥＪの比は、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、または１．７倍を超えて高めることができる。
【００７９】
一般に、細胞は細胞の増殖及び／または維持に適する条件下で維持される。好適な細胞培養の条件は当該技術で周知であり、たとえば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４；Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  ＰＮＡＳ，１０４：３０５５−３０６０；Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１；及びＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ.（２００７），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９８−１３０６にて記載されている。当業者は、細胞を培養する方法が当該技術で既知であり、細胞の種類に応じて変化することができ、変化するであろうことを十分に理解している。あらゆる場合において日常の最適化を用いて特定の細胞種について最良の技法を決定してもよい。
【００８０】
（ｃ）任意のドナーポリヌクレオチド
ドナーポリヌクレオチドは、染色体の配列における標的部位との実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは一般にドナー配列も含む。ドナー配列は外来性の配列であることができる。本明細書で使用されるとき、「外来性」の配列は、細胞にとってネイティブではない配列、または細胞のゲノムにおけるネイティブな位置が異なる染色体の位置にある染色体の配列を指す。たとえば、ドナー配列は外来性のタンパク質をコードする遺伝子を含むことができ、それはプロモータ制御配列に操作可能に連結することができるので、細胞への組込みの際、細胞は組み込まれた遺伝子によってコードされているタンパク質を発現する。或いは、その発現が内在性のプロモータ制御配列によって調節されるように外来性のタンパク質のコーディング配列を染色体の配列に組み込むことができる。外来性遺伝子の染色体の配列への組込みは「ノックイン」と呼ばれる。他の実施形態では、外来性の配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコーディング配列、等であることができる。
【００８１】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、標的とされる部位にてまたはその近傍で染色体の配列の一部と本質的に同一であるが、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む配列であることができる。従って、ドナー配列は標的とされる部位にて野生型配列の修飾された型を含むので、染色体の配列との組込みまたは交換の際、標的とされる染色体の位置での配列は少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む。たとえば、変化は１以上のヌクレオチドの挿入、１以上のヌクレオチドの欠失、１以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせであることができる。修飾された配列の組込みの結果、細胞は標的とされる染色体の配列から修飾された遺伝子産物を生じることができる。
【００８２】
当業者によって十分に理解され得るように、ドナー配列の長さは変化することができ、変化するであろう。たとえば、ドナー配列は長さ数個のヌクレオチドから数百のヌクレオチドまで、数十万のヌクレオチドまで変化することができる。
【００８３】
一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列には、上流の配列及び下流の配列が隣接し、それは、染色体の配列における標的とされる部位の、それぞれ上流及び下流に位置する配列と実質的な配列同一性を有する。これらの配列類似性のために、ドナーポリヌクレオチドの上流及び下流の配列は、ドナー配列が染色体の配列に組み込まれ（交換され）得るように、ドナーポリヌクレオチドと標的とされる染色体の配列との間での相同組換えを可能にする。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、上流の配列は、標的とされる部位の上流の染色体の配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流の配列は、標的とされる部位の下流の染色体の配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書で使用されるとき、語句「実質的な配列同一性」は少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。従って、ドナーポリヌクレオチドにおける上流及び下流の配列は、標的とされる部位に対する上流または下流の配列との約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。例となる実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流及び下流の配列は、標的とされる部位に対する上流または下流の染色体の配列との約９５％または１００％の配列同一性を有することができる。一実施形態では、上流の配列は標的とされる部位のすぐ上流に位置する（すなわち、標的とされる部位に隣接する）染色体の配列との実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、上流の配列は、標的とされる部位から約１００ヌクレオチド上流の範囲内に位置する染色体の配列との実質的な配列同一性を共有する。従って、たとえば、上流の配列は、標的とされる部位から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、または約８１〜約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体の配列との実質的な配列同一性を共有することができる。一実施形態では、下流の配列は標的とされる部位のすぐ下流に位置する（すなわち、標的とされる部位に隣接する）染色体の配列との実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、下流の配列は、標的とされる部位から約１００ヌクレオチド下流の範囲内に位置する染色体の配列との実質的な配列同一性を共有する。従って、たとえば、下流の配列は、標的とされる部位から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、または約８１〜約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体の配列との実質的な配列同一性を共有することができる。
【００８５】
各上流または下流の配列は長さ約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドに及ぶ。一部の実施形態では、上流及び下流の配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００のヌクレオチドを含むことができる。例となる実施形態では、上流及び下流の配列は、長さ約５００から約１５００のヌクレオチドに及ぶことができる。
【００８６】
標的とされる染色体の配列との配列類似性を持つ上流及び下流の配列を含むドナーポリヌクレオチドは線状または環状であることができる。ドナーポリヌクレオチドが環状である実施形態では、それはベクターの一部である（上記で詳述された）ことができる。たとえば、ベクターはプラスミドベクターであることができる。
【００８７】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって共通して理解されている意味を有する。以下の参考文献は本発明で使用されている用語の多数の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ならびにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用されるとき、以下の用語は特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
【００８８】
本開示またはその好まれる実施形態（複数可）の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は要素の１以上があることを意味するように意図される。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｈａｖｉｎｇ」は、リストのした要素以外の追加の要素があってもよいことを含み、意味するように意図される。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、用語「内在性配列」は細胞に対してネイティブである染色体の配列を指す。
【００９０】
用語「外来性」は本明細書で使用されるとき、細胞に対してネイティブではない配列、または細胞のゲノムにおけるそのネイティブな位置が異なる染色体の位置にある染色体の配列を指す。
【００９１】
「遺伝子」は本明細書で使用されるとき、そのような調節性配列がコーディング配列及び／または転写された配列に隣接していようといまいと、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソン及びイントロンを含む）、と同様に遺伝子産物の生産を調節するすべてのＤＮＡ領域を指す。従って、遺伝子には、プロモータ配列、ターミネータ、たとえば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位のような翻訳調節配列、エンハンサ、サイレンサ、インシュレータ、境界要素、複製開始点、マトリクス連結部位及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００９２】
用語「異種の」は、対象とする細胞に対して内在性ではなく、またはネイティブではない実体を指す。たとえば、異種タンパク質は、たとえば、外来性に導入された核酸配列のような、外来性供給源に由来するまたは元々由来したタンパク質を指す。場合によっては、異種タンパク質は対象とする細胞によって正常では産生されない。
【００９３】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、線状または環状の構造にて及び一本鎖または二本鎖の形態でのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的では、これらの用語はポリマーの長さに関して限定として解釈されるべきではない。用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体と同様に塩基、糖及び／またはリン酸部分（たとえば、ホスホロチオエート主鎖）で修飾されているヌクレオチドを包含する。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合するであろう。
【００９４】
用語「ヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準のヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及びウリジン）またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は天然に存在するヌクレオチド（たとえば、イノシン）または天然に存在しないヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分における修飾の非限定例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、及びチオール基の付加（または除去）、と同様に塩基の炭素原子及び窒素原子の他の原子による置換（たとえば、７−デアザプリン）が挙げられる。ヌクレオチド類似体にはジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルフォリノも挙げられる。
【００９５】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は相互交換可能に使用されてアミノ酸残基のポリマーを指す。
【００９６】
核酸及びアミノ酸の配列同一性を決定する技法は当該技術で既知である。通常、そのような技法には、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること及び／またはそれによってコードされているアミノ酸配列を決定することと、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列とこれらの配列を比較することとが含まれる。ゲノムの配列はこの方法で決定し、比較するこができる。一般に、同一性はそれぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のヌクレオチドとヌクレオチドのまたはアミノ酸とアミノ酸の正確な対応を指す。その同一性百分率を決定することによって２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を比較するこができる。２つの配列の同一性百分率は、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、短い方の配列の長さで割り、１００を乗じた２つの並べた配列間の正確な一致の数である。核酸配列のための近似配列比較は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって提供されている。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３  （１９８６）によって標準化されたスコア化マトリクスを用いることによってアミノ酸配列にこのアルゴリズムを適用することができる。配列の同一性百分率を決定するためのこのアルゴリズムの例となる実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」の実用的用途におけるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供されている。配列間の同一性百分率または類似性を算出するのに好適な他のプログラムは当該技術で一般に知られおり、たとえば、別の配列比較プログラムは初期設定パラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。たとえば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定パラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥによる選別；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用することができる。これらのプログラムの詳細はＧｅｎＢａｎｋのウェブサイトにて見いだすことができる。
【００９７】
本発明の範囲から逸脱することなく、上述の細胞及び方法において種々の変更を為し得るので、上記の記載及び以下で与えられる実施例に含有される事項はすべて限定的な意味ではなく説明として解釈されるべきである。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は本開示の特定の実施形態を詳述する。
【００９９】
実施例１：ジェミニンに連結されたＣａｓ９の調製
Ｃａｓ９の発現を細胞周期のＳ／Ｇ２期に限定するために、Ｍ期にて分解されるタンパク質であるジェミニンにＣａｓ９を融合した。このためにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びジェミニンに融合させ、Ｃａｓ９はＮ末端にあった（図１）。融合体は、ＧＦＰドメインに隣接する核局在化シグナル（ＮＬＳ）とリンカー（たとえば、２×ＧＳリンカー）も含んだ（たとえば、Ｃａｓ９−ＮＬＳ−リンカー−ＧＦＰ−リンカー−ジェミニン）。融合体のＤＮＡ配列を表１に提示し、タンパク質配列を表２に提示する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２】
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【０１００】
実施例２：Ｃａｓ−ＧＦＰ−ジェミニン融合体の解析
真核細胞での発現のために、Ｃａｓ９−ジェミニン融合タンパク質をコードする配列をｔＥＦ１アルファプロモータ配列に操作可能に連結した（図１を参照のこと）。レンチウイルス形式の使用によって安定な細胞株またはＣａｓ９−Ｇｅｍ融合体を発現する細胞のプールした集団の創製が可能になる。最初の実験は、既知のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的部位でのＣａｓ９−ＧｅｍとＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を比較してジェミニンの融合体がヌクレアーゼ活性に対する効果を有するかどうかを判定するであろう。試験用の実施例の標的部位には、ＫＲＡＳ（５’−ＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−３’；配列番号１５）、ＨＰＲＴ１（５’−ＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧＧ−３’；配列番号１６）及びその他（下線を引いたＰＡＭ）が挙げられる。形質移入した細胞集団をｇＲＮＡで処理し、顕微鏡及びＦＡＣＳによって解析してＧＦＰの発現を観察し、ＧＦＰ−ジェミニン融合体について前に観察された（Ｓａｋａｕｅ−Ｓａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）ようにＧＦＰシグナルがＧ２／Ｓ細胞周期のタイミングに対応するかどうかを評価するであろう。ヌクレアーゼ感受性のレポータープラスミドを用いて、実験は、Ｃａｓ９切断活性を観察し、切断活性とＣａｓ9−ＧＦＰ−ジェミニンの発現とが細胞周期のＧ２期で同期化するかどうかを評価するようにも試みられるであろう。
【０１０１】
代わりのまたは合わせたアプローチとして、Ｃａｓ９またはＣａｓ９−ジェミニンを細胞周期のＧ２期に存在する転写因子に関連するプロモータの制御下に置くことができる。プロモータ活性の正確なタイミングは、高いＨＲ／ＮＨＥＪの比及び低下した的外れ効果のような有益な効果を達成するのに決定的であってもよいので、幾つかの異なるプロモータ領域が公開された文献から選択されるであろう（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。例のプロモータ配列はヒト遺伝子ＴＯＰ２Ａ（ｈｇ３８＿ｃｈｒ１７：４０３８０８６１−４０３９０５４９）について表３にて以下でリストにされている。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０１０２】
実施例３：Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質の発現は細胞周期依存性である
Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質の発現がヒト細胞にて細胞周期依存性であるかどうかを判定するために、４μｇのＣａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンのプラスミドＤＮＡによるＡｍａｘａヌクレオフェクションによってＵ２ＯＳ細胞に形質移入した。ヌクレオフェクションの２４時間後、ＧＦＰ陽性細胞を細胞選別によって単離し、次いでμ−スライド８穴ガラス底の培養皿にてさらに２４時間培養した。Ｈａｍａｍａｔｓｕカメラを装備したＮｉｋｏｎ顕微鏡によってＧＦＰの蛍光シグナルを捕捉し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエアを介してタイムラプス撮影を行った。ＧＦＰ蛍光の強度は細胞周期依存性だった。初期時点では、ＧＦＰの蛍光は単一細胞で検出され（図２Ａ、０時間、７時間）、次いでＭ期及びＧ１期（微分干渉コントラスト画像法によって検出されるような（図２Ａ、８時間、１０時間、１２時間を参照）ではそれは消失し、Ｓ期での２つの娘細胞にて徐々に出現した（図２Ａ、２４時間を参照）。Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質の細胞周期依存性の発現を図２Ｂにて図で表す。このように、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質は、細胞周期のＳ期、Ｇ２期及び早期Ｍ期において発現され、蓄積され、有糸分裂後期または早期Ｇ１期において分解について標的とされる。
【０１０３】
実施例４：Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンはＵ２ＯＳ細胞にてＨＤＲ／ＮＨＥＪの比を高めた。
相同組換え（ＨＲ）は一般に細胞周期のＳ期及びＧ２期に制約される。従って、Ｇ１期において標的指向性エンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断（ＤＳＢ）は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される可能性がある。Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合タンパク質の発現はＳ／Ｇ２／Ｍに限定されるので、この融合体で導入されるＤＳＢは相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復されるはずであり、それによってＨＤＲ／ＮＨＥＪの比を高めるはずである。
【０１０４】
この仮説を調べるために、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニン融合体及びＣａｓ９の活性をＵ２ＯＳ細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座で比較した。細胞１００万個当たり４μｇのＡＡＶＳ１−ｓｇＲＮＡプラスミドＤＮＡ及び３００ピコモルのＡＡＶＳ１−ｓｓオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と共に４μｇのＣａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンのプラスミドＤＮＡまたはＣａｓ９のみのプラスミドＤＮＡによるＡｍａｘａヌクレオフェクションによって細胞に形質移入した。ＡＡＶＳ１−ｓｇＲＮＡの標的配列は
【化１】
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（配列番号２３；ＰＡＭ部位に下線を引く）である。ＡＡＶＳ１−ｓｓＯＤＮの配列は
【化２】
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（配列番号２４）（ｇＲＮＡの標的配列に下線を引き、単一変異体（Ｇ＞Ｔ）を作って制限酵素部位を作り出したが、ＳｐｅＩ制限部位に二重下線を引く）。形質移入の４８時間後にゲノムＤＮＡを回収し、順行プライマー５’−ＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号２５）及び逆行プライマー５’−ＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＴＡＡＧＣＡＡＡＣＣ−３’（配列番号２６）によるＰＣＲによって標的領域を増幅した。ＮＨＥＪはＣｅｌ−１アッセイによって測定し、ＨＤＲはＲＦＬＰアッセイによって測定した。
【０１０５】
図３Ａ及び３Ｂで示すように、Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンは８．６％のインデルと共に４．７％のＨＤＲ比率を達成することができたが、Ｃａｓ９は１２．６％のインデルと共に１．１％のＨＤＲ比率を達成できたに過ぎなかった。これらの結果はＣａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンがＵ２ＯＳ細胞にてＨＤＲ／ＮＨＥＪの比を有意に高めることを示した。
【０１０６】
実施例６：Ｃａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンはＫ５６２細胞にてＨＤＲ／ＮＨＥＪの比を高めた。
他の細胞株におけるＣａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンの活性を調べるために、基本的に実施例５にて上述されているようにＣａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンまたはＣａｓ９のプラスミドＤＮＡでＫ５６２細胞に形質移入した。ＮＨＥＪ及びＨＤＲは上述のように測定した。図４は複製試料に由来するＨＤＲ及びＮＨＥＪに対する相対比を提示している。Ｋ５６２細胞にてＣａｓ９−ＧＦＰ−ジェミニンはＨＤＲ／ＮＨＥＪの比を約１．７倍高めた（１に設定されたＣａｓ９のＨＤＲ／ＮＨＥＪの比）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018518969.tif 000018
2018518969.tif 000019