(57)【要約】  本発明は、対象における膵癌を診断するための方法であって、(a)前記対象の少なくとも1つの試料中で、(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1個の診断アミノ酸;(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン;および(iv)CA19-9を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップと、(b)診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって膵癌を診断するステップとを含む、前記方法に関する。さらに、本発明は、対象が膵癌に罹患する確率を決定するための方法、ならびに前記方法と関連するデバイスおよび使用に関する。【選択図】図２
2018518683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における膵癌を診断するための方法であって、
(a)前記対象の少なくとも1つの試料中で、
(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1つの診断アミノ酸;
(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;
(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン;および
(iv)CA19-9
を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップと、
(b)診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較し、それにより膵癌が診断されることとなるステップとを含み、
前記対象が、少なくとも40歳、好ましくは少なくとも50歳の対象である、前記方法。
【請求項２】
前記対象が、膵癌に罹患するリスクがある対象、好ましくは、新規発症糖尿病を有する対象、および/もしくは慢性膵炎に罹患している対象である;または前記対象が膵癌に罹患すると疑われる対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、低いCA19-9値を有する対象であり、好ましくは、低いCA19-9値が、42U/mL未満、好ましくは、37U/mL未満の血中CA19-9値である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記膵癌が切除可能な腫瘍ステージを有する膵癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
(i)前記診断アミノ酸がプロリンである;
(ii)前記診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)もしくはセラミド(d18:2,C24:0)である;および/または
(iii)前記診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記スフィンゴミエリン(35:1)が、スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)とスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)の合計;スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0);またはスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるプロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記診断バイオマーカー群が、少なくとも1つの診断エタノールアミン脂質をさらに含み、前記診断エタノールアミン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、またはリソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるCA19-9、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)、ヒスチジン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、プロリン、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(41:2)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、およびトリプトファンを含む、好ましくは、それらからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
診断バイオマーカーの量と参照との前記比較が、前記量またはそれから算出された値を1つ以上のカットオフ値と比較することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が体液の試料であり、好ましくは、前記試料が血液、血漿、血清または尿試料、より好ましくは、血液試料、最も好ましくは、血漿試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィー、好ましくは、逆相クロマトグラフィー、より好ましくは、逆相液体クロマトグラフィーにより、前記少なくとも1つの診断セラミド、好ましくは、前記少なくとも1つの診断スフィンゴミエリンから、前記少なくとも1つの診断アミノ酸を分離するさらなるステップを含み、前記さらなるステップがステップ(a)に先行する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
(a)対象の試料中で、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の診断バイオマーカー群の量を定量的に決定するステップ、
(b1)ステップ(a)のそれぞれの量について、所定の診断バイオマーカー特異的減数を前記量から最初に減算した後、得られる値を所定の診断バイオマーカー特異的除数で除算することにより、スケーリングされた量を算出するステップ、
(b2)(i)(b1)のそれぞれのスケーリングされた量に、診断バイオマーカー特異的重み値を割り当てることによって、重み付けされた量を提供するステップ、
(ii)全ての診断バイオマーカーについて前記重み付けされた量を合計し、重み付けされた量の合計を提供するステップ、
(iii)好ましくは、バイアス値を、ステップ(ii)の重み付けされた量の合計に割り当てて、バイアス補正された合計を提供するステップ、
(iv)好ましくは、ステップ(iii)のバイアス補正された合計を、好ましくは、0〜1の値にスケーリングするステップ
により、予測スコアを算出するステップ、および
(b3)ステップ(b2)で決定された予測スコアに基づいて、対象が膵癌に罹患する確率を決定するステップ
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
診断バイオマーカーの前記量と参照との比較が、決定されるCA19-9の量が約5U/ml未満である場合、より小さい重み、好ましくは0の重みを、CA19-9の量に割り当てることを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
a)請求項１〜１３のいずれか一項に記載の診断バイオマーカー群の少なくとも低分子診断バイオマーカーのための少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであり、少なくとも1つの検出器によって検出される少なくとも前記低分子診断バイオマーカーの量を決定するために適合された前記分析ユニットと、それに機能し得る形で連結された、
b)低分子診断バイオマーカー、および好ましくは、CA19-9の決定された量の、参照との比較を実行するための明白に埋め込まれたコンピュータプログラムコードと、前記診断バイオマーカーのための前記参照を含むデータベースとを含むコンピュータを含む評価ユニットと
を含み、それによって、対象が膵癌に罹患するかどうかを診断する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を実行するための診断デバイス。
【請求項１６】
膵癌を診断するための対象の試料中での請求項１〜９のいずれか一項に記載の診断バイオマーカー群の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における膵癌を診断するための方法であって、(a)前記対象の少なくとも1つの試料中で、(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1個の診断アミノ酸;(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン;および(iv)CA19-9を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップと、(b)診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって膵癌を診断するステップとを含む、前記方法に関する。さらに、本発明は、対象が膵癌に罹患する確率を決定するための方法、ならびに前記方法と関連するデバイスおよび使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌は、全ての固形腫瘍のなかでも予後が最悪であり、その5年生存率は5%未満であるが、発生率は増加している(Everhart 2009, Gastroenterology 136:1134-11449)。特異的バイオマーカーのポイントオブケア利用のための革新的な手段および技術ならびに膵癌の早期診断、予後層別化および鑑別診断のための新規分子イメージング手段の確立に対する広く認知された要求がある。初期段階の腫瘍の適時の外科的切除は、この悲惨な疾患の処置の現在唯一の有効な手段であるため、これらの領域における進歩は、この悪性腫瘍の予後を改善するために極めて重要である。
【０００３】
この癌の型の死亡率は、欧州および西側世界における任意の癌の型のうちでも最も高い。人々は、早期検出のための手段がないため、診断後まもなく死亡する。初期症状は稀であり、特徴的ではない。かくして、膵管腺癌(PDAC)は、一般的には進行段階の疾患において診断される。今まで、PDACを検出するための最良のイメージング技術は、内視鏡超音波(EUS)、スパイラル断層撮影(CT)、磁気共鳴内視鏡的逆行性胆管膵管造影(MRCP)または内視鏡的逆行性胆道膵管造影(ERCP)(Dewitt 2006, Gastroenterol Hepatol. (4):717-25)である。不幸なことに、膵臓内の新生物病変を検出するためのこれらの技術の解像度は、3〜10mmの範囲である。かくして、それらは治癒可能な段階で膵新生物を検出することができない。CA19-9などの従来の腫瘍マーカーの血清濃度は、膵癌患者のサブセットにおいては増加している(Fry 2008, Langenbecks Arch Surg. (393): 883-90)。しかしながら、今までのところ、利用可能なマーカーは全て、感度および腫瘍特異性を欠いている(Gupta et al., 1985, Cancer 56 (277-283))。かくして、非常に小さい、初期段階のPDACおよびその前駆病変(PanINおよびIPMN)ならびに進行腫瘍の予後サブグループの検出に対する診断感度を増加させるための新しい手法が緊急に必要である。
【０００４】
慢性炎症と悪性腫瘍の発生との関連は、長年にわたって認識されてきた。膵癌については、この関連は最近になってやっと確認されたものであり、コンセンサス会議は、非侵襲性前駆病変としての膵上皮内新生物の新しい分類に同意した(Hruban 2004, Am J Surg Path (28): 977-987)。慢性膵炎は、進行的および不可逆的であることが多い形態学的変化を特徴とする無菌性炎症疾患の再発発作と定義され、典型的には、疼痛および膵機能の恒久的障害を引き起こす。慢性膵炎は、100000人集団あたりの発生率は8.2、有病率は27.4であり、任意抽出の剖検標本における頻度は0.04%〜5%であり、消化管のよくある障害である。様々な病因が慢性膵炎の発生の原因となる。慢性膵炎に罹患している患者が膵癌で死亡するリスクの増加が、1993年に6カ国の臨床センターから採用された慢性膵炎を有する2015人の患者の多施設歴史的コホート研究としてAB Lowenfelsおよび共同研究者によって行われた国際共同研究において示された。この研究により、慢性膵炎を有する患者における膵癌の累積リスクが、10年後で1.8%および20年後で4%であり、標準化された発生率が14.4であることがわかった。最小で2年フォローアップした患者について、膵癌のリスクは、一般的な集団のそれよりも16.5倍高かった(Lowenfels 1993, N Engl J Med (328): 1433-1437)。1996年に、第7染色体上の陽イオントリプシノゲン遺伝子の第3エクソン(7q35)における単一の点突然変異が遺伝性膵炎および複数の親族と関連することがわかった時に強化された、慢性膵炎と膵癌との関連に関する検索がその後同定および報告された。ごく最近、EUROPAC研究グループが、遺伝性膵炎における臨床および遺伝的特徴に関するその研究を提示した。European Registry of Hereditary Pancreatitisから得られたデータを用いる多層比例ハザードモデルにおいて、このグループは、14カ国の112家族(418人の罹患した個体)を提示した(Howes 2004, Clinical Gastroenterology and Hepatology (2): 252-261)。膵癌の累積リスク(95%CI)は、症状の開始から70年で44.0%(8.0%〜80.0%)であり、標準化された発生率は67%(50%〜82%)であった。以前の研究もまた、膵癌の生涯リスク推定値が40%であることを示した(Lowenfels 2001, JAMA 286: 169-170, Lowenfels 1997, J Natl Cancer Inst 89: 442-44656)。
【０００５】
膵癌では、イメージング試験は治癒可能な段階で初期の膵悪性腫瘍を検出することができない。かくして、高リスクコホートにおける膵悪性腫瘍の検出が非常に望ましい。
【０００６】
膵臓関連疾患に罹患している患者における代謝的変化に関する報告は少ない。Schraderら(Schrader 2009, Pancreas 38: 416-421)は、膵癌および慢性膵炎を有する患者が、血清アミノ酸レベルの有意な変化を示すことを示唆している。細胞の細胞表面上のスフィンゴ脂質が、細胞シグナリングに積極的に参加することが示唆された(Pitson 2011, Trend Biochem Sci 36:97-107)。セラミドは、癌細胞においてアポトーシスを誘導することが知られている。低レベルのスフィンゴミエリンは、ゲムシタビン処置に対する応答性が低いことを示唆する(Modrak 2009, Mol Cancer Res 7:890-896)。さらなる単一の代謝バイオマーカーは、WO 2011/151252およびWO 2013/079594に報告されている。
【０００７】
CA19-9の血中レベルは、膵癌を有する多くの患者において上昇する。CA19-9レベルは、感度と特異度の両方に関して膵癌の診断的価値が限られている。膵癌診断のためのCA19-9の感度は、結腸癌、胃癌、および肝臓癌などの他の消化管癌、ならびに乳癌および他の婦人科癌、肺癌、および気管支癌に起因する偽陽性によって損なわれる。膵炎などの良性疾患も、偽陽性のCA19-9レベルをもたらす。膵癌診断のためのCA19-9の特異度は、Lewis a/b抗原について陰性であり、したがって、CA19-9を発現しない偽陰性患者によってさらに損なわれる。
【０００８】
結論として、5年生存率が0.5〜5%である膵癌は、全てのヒト腫瘍の多くの悲惨な予後を担い、世界の癌関連死における第4の主因である。かくして、それは、大きな社会経済的影響がある疾患である。膵炎からのその差別化を含む正確な診断および初期腫瘍の適時の外科的切除は、現在、患者の予後の改善のための唯一の現実的な可能性を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 2011/151252
【特許文献２】WO 2013/079594
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Everhart 2009, Gastroenterology 136:1134-11449
【非特許文献２】Dewitt 2006, Gastroenterol Hepatol. (4):717-25
【非特許文献３】Fry 2008, Langenbecks Arch Surg. (393): 883-90
【非特許文献４】Gupta et al., 1985, Cancer 56 (277-283)
【非特許文献５】Lowenfels 1993, N Engl J Med (328): 1433-1437
【非特許文献６】Howes 2004, Clinical Gastroenterology and Hepatology (2): 252-261
【非特許文献７】Lowenfels 2001, JAMA 286: 169-170, Lowenfels 1997, J Natl Cancer Inst 89: 442-44656
【非特許文献８】Schrader 2009, Pancreas 38: 416-421
【非特許文献９】Pitson 2011, Trend Biochem Sci 36:97-107
【非特許文献１０】Modrak 2009, Mol Cancer Res 7:890-896
【発明の概要】
【００１１】
本発明に内在する技術的課題を、上記必要性に従うための手段および方法の提供と見ることができる。この技術的課題は、特許請求の範囲および以下の本明細書で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【００１２】
したがって、本発明は、対象における膵癌を診断するための方法であって、
(a)前記対象の少なくとも1つの試料中で、
(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1個の診断アミノ酸;
(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;
(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン;および
(iv)CA19-9
を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップと、
(b)診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって膵癌を診断するステップと
を含む、前記方法に関する。
【００１３】
以下で用いられる場合、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」もしくは「含む(include)」またはその任意の文法的変形は、非排他的様式で用いられる。かくして、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴の他に、本文脈で記載される実体中にさらなる特徴が存在しない状況と、１つ以上のさらなる特徴が存在する状況との両方を指してもよい。例として、表現「AがBを有する(has)」、「AがBを含む(comprise)」および「AがBを含む(include)」は、Bの他に、A中に他の要素が存在しない状況(すなわち、Aが専ら、排他的にBからなる状況)と、Bの他に、要素C、要素CとDまたはさらなる要素などの、1つ以上の要素が実体A中に存在する状況との両方を指してもよい。
【００１４】
さらに、以下で用いられる場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より特に」、「具体的には」、「より具体的には」または同様の用語は、選択可能性を制限することなく、任意選択の特徴と共に用いられる。かくして、これらの用語によって誘導される特徴は、任意選択の特徴であり、いかなる意味でも特許請求の範囲を制限することを意図しない。本発明は、当業者であれば認識できるように、代替的な特徴を使用することによって実行することができる。同様に、「本発明の実施形態において」または類似する表現によって導入される特徴は、本発明の代替的な実施形態に関するいかなる制限もなく、本発明の範囲に関するいかなる制限もなく、また、そのような方法で導入される特徴と、本発明の他の任意選択または非任意選択の特徴とを組み合わせる可能性に関するいかなる制限もなく、任意選択の特徴であることが意図される。本明細書で用いられる用語「約」とは、示される値から+/-20%、好ましくは、+/-10%、より好ましくは、+/-5%、さらにより好ましくは、+/-2%、最も好ましくは、+/-1%異なる値を指す。
【００１５】
本発明の方法は、好ましくは、in vitroでの方法である。さらに、それは、上に明確に記載されたものに加えたステップを含んでもよい。例えば、さらなるステップは、例えば、ステップ(a)のための試料予備処理、ステップ(b)における決定された量から誘導される値を算出すること、または特に、膵癌が診断される場合、対象にステップ(b)の後に進むように推奨することに関するものであってもよい。さらに、1つ以上の前記ステップを、自動化された装備によって実行することもできる。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「膵癌」または「膵臓がん」は、膵細胞、好ましくは、膵上皮細胞に由来する新生物に関する。かくして、好ましくは、本明細書で用いられる膵癌は、膵管腺癌である。膵癌に伴う症状は、StedmenまたはPschyremblなどの医学の標準的な教科書から周知であり、腹痛、腰痛、悪心、嘔吐、およびいくつかの場合、黄疸を含む。好ましくは、膵癌は、切除可能な膵癌、すなわち、好ましくは、対象からの腫瘍の、好ましくは完全な切除を可能にする腫瘍ステージにある膵癌である。より好ましくは、前記膵癌は、腫瘍ステージIA〜IIBの膵癌である。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「診断すること」とは、対象が膵癌に罹患しているか、いないかを評価することを指す。当業者であれば理解できるように、そのような評価は、あるのが好ましいが、通常は調査される対象の100%について正確ではない。しかしながら、この用語は、対象の統計的に有意な部分を正確に評価する、かくして、診断することができることを必要とする。当業者であれば、ある部分が統計的に有意であるかどうかを、様々な周知の統計評価手段、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、Studentのt検定、Mann-Whitney検定などを用いて、苦もなく決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%である。p値は、好ましくは、0.2、0.1または0.05である。
【００１８】
用語「診断すること」は、好ましくは、膵癌またはその症状の個々の診断ならびに患者の連続的モニタリングを含む。モニタリング、すなわち、様々な時点での膵癌またはそれに伴う症状の存在または非存在を診断することは、膵癌に罹患することが知られる患者のモニタリングならびに膵癌を発症するリスクがあることが知られる対象のモニタリングを含む。さらに、モニタリングを用いて、患者の処置が成功であるかどうか、または少なくとも膵癌の症状をある特定の治療によって時間と共に改善することができるかどうかを決定することもできる。
【００１９】
さらに、用語「診断すること」はまた、好ましくは、膵癌を示差的に診断すること、より好ましくは、膵癌と膵炎とを区別することにも関する。本明細書で用いられる場合、膵炎は、膵臓の炎症を指す。通常、膵炎の原因は、小腸よりもむしろ膵臓中の、膵酵素、例えば、トリプシンの活性化を指す。膵炎は、突然発症し、数日間続く急性疾患として、または長年にわたって持続する慢性疾患として生じ得る。好ましくは、本発明に従って記載される膵炎は、慢性膵炎である。膵炎の典型的な症状を、上記の標準的な教科書に見出すことができ、多くは背部に放射状に広がる重症の上腹部疼痛、悪心および嘔吐を包含する。膵癌と慢性膵炎との区別は、好ましくは、膵炎に罹患することが知られる、または疑われる対象の少なくとも1つの試料に、本発明の方法を適用すること、およびバイオマーカーの測定された量を、参照と比較することによって、膵癌を診断することによって達成される。さらに好ましい実施形態においては、膵癌の前記診断は、膵炎に罹患することが知られるか、または疑われる人が、膵癌にさらに罹患するかどうかの区別をもたらす。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「対象（被験体）」とは、動物、好ましくは、哺乳動物に関する。より好ましくは、対象は、霊長類、最も好ましくは、ヒトである。好ましくは、対象は、見かけ上健康な対象である。
【００２１】
好ましくは、対象は、膵癌に罹患するリスクがある対象である。膵癌を発症する危険因子は、当業界で、例えば、Brand RE et al., Gut. 2007;56:1460-9、またはDel Chiaro et al., World J Gastroenterol 2014; 20:12118-12131から公知であり、遺伝的因子、慢性疾患、新規発症糖尿病および年齢を含む;かくして、好ましくは、膵癌に罹患するリスクがある対象は、遺伝的素因、好ましくは、Peutz-Jeghers症候群、BRCA1陽性を含む家族性膵癌、または膵炎を発症する遺伝的素因を有する対象である。また好ましくは、膵癌に罹患するリスクがある対象は、少なくとも40歳、最も好ましくは、少なくとも50歳の対象である。より好ましくは、膵癌に罹患するリスクがある対象は、新規発症糖尿病を有する対象である;および／または膵癌に罹患するリスクがある前記対象は、慢性膵炎に罹患する対象である。用語「新規発症糖尿病」は、当業者には公知であり、好ましくは、WHOの指針、より好ましくは、125mg/dLを超える8hの空腹時血糖値に従って、糖尿病と以前に診断されたことがない、好ましくは、糖尿病の症状を以前に実証されたことがない対象における対象の診断に関する。
【００２２】
好ましくは、対象は、膵癌に罹患することが疑われる対象である。対象が膵癌に罹患しているかもしれないという疑いは、好ましくは、膵癌と関連することが当業者に公知である少なくとも1つの臨床症状から生じる。かくして、好ましくは、膵癌に罹患することが疑われる対象は、より好ましくは、腹痛、腰痛、悪心、嘔吐、およびいくつかの場合、黄疸からなる一覧から選択される、好ましくは、膵癌の少なくとも1つの臨床症状を有する対象である。また好ましくは、膵癌に罹患することが疑われる対象は、膵癌と慢性膵炎との示差的診断を要する対象であり、すなわち、好ましくは、膵癌に罹患することが疑われる対象は、膵癌または慢性膵炎に罹患することが疑われる対象である。また好ましくは、膵癌に罹患することが疑われる対象は、健康な対象と比較して高い、好ましくは、37U/mLを超える、より好ましくは、500U/mL、最も好ましくは、1000U/mLを超える血中CA19-9濃度を有する対象である。
【００２３】
好ましくは、対象は、低いCA19-9値を有する対象である。好ましくは、低いCA19-9値は、42U/mL未満、好ましくは、37U/mL未満の血中CA19-9値である。当業者であれば理解できるように、Lewis a/b抗原陰性対象は、低いCA19-9値(Tian et al., 1992 Annals of Surgery 215 350-355)または検出限界以下のCA19-9値、好ましくは、0の値を有する。かくして、好ましくは、低いCA19-9値を有する対象は、Lewis a/b抗原陰性対象である。
【００２４】
好ましい実施形態においては、対象は、腹部嚢胞性病変を有する対象、好ましくは、不明確な腹部膨張病変と診断された対象である。別の好ましい実施形態においては、対象は、膵嚢胞性病変を有する対象、好ましくは、不明確な膵膨張病変と診断された対象である。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「試料（サンプル）」とは、体液、好ましくは、血液、血漿、血清、唾液もしくは尿の試料、または組織もしくは臓器、特に、胆管からの洗浄によって誘導される試料を指す。より好ましくは、試料は、血液、血漿、血清または尿試料である。さらにより好ましくは、試料は、血液もしくは血漿試料であるか、または血清もしくは血漿試料、最も好ましくは、血漿試料である。好ましくは、試料が血液試料である場合、本発明の方法は、前記血液試料から血清または血漿試料を取得するさらなるステップを含む。好ましくは、試料は、クエン酸血漿試料、ヘパリン血漿試料、またはEDTA血漿試料である。より好ましくは、試料は、EDTA血漿試料である。生物学的試料を、本明細書の他の場所に特定されるように対象から誘導することができる。上記の様々な型の生物学的試料を取得するための技術は、当業界で周知である。例えば、血液試料を採血によって取得することができるが、組織または臓器試料を、例えば、生検によって取得するべきである。好ましくは、試料は、空腹時試料であり、特に、空腹時血液、血漿または血清試料である。かくして、好ましくは、試料は、空腹時の対象から取得される。空腹時の対象は、特に、試験しようとする試料を取得する前に、水以外の、食物および飲料を控えた対象である。好ましくは、空腹時の対象は、試験しようとする試料を取得する前に少なくとも8時間にわたって、水以外の食物および飲料を控えている。より好ましくは、試料は、一晩の絶食後に対象から得られたものである。好ましくは、前記絶食は、試料採取の少なくとも1時間前まで、より好ましくは、試料採取の少なくとも30分前まで、さらにより好ましくは、試料採取の少なくとも15分前まで、最も好ましくは、試料が採取されるまで継続している。
【００２６】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」とは、本明細書に記載される疾患または効果の指標として役立つ分子種を指す。前記分子種は、対象の試料中に見出される代謝物自体であってもよい。さらに、バイオマーカーはまた、前記代謝物に由来する分子種であってもよい。そのような場合、実際の代謝物は、試料中で、または決定プロセスの間に化学的に改変され、そのような改変の結果として、化学的に異なる分子種、すなわち、分析物は、所定の分子種である。そのような場合、分析物は実際の代謝物であり、それぞれの医学的状態の指標と同じ能力を有することが理解されるべきである。
【００２７】
さらに、本発明によるバイオマーカーは、1つの分子種に対応する必要はない。むしろ、バイオマーカーは、化合物の立体異性体または鏡像異性体を含んでもよい。さらに、バイオマーカーはまた、異性体分子の生物学的クラスの異性体、またはそのサブグループの和であってもよい。前記異性体は、いくつかの場合、同一の分析特性を示し、したがって、以下に記載される添付の実施例で適用されるものを含む様々な分析方法によって識別可能でないか、または識別されない。しかしながら、好ましくは、異性体は、少なくとも同一の和の公式のパラメータを共有し、かくして、例えば、脂質の場合、脂肪酸と他の長鎖脂肪族部分、例えば、スフィンゴ塩基部分との和における同一の鎖長および同一の二重結合数を共有する。
【００２８】
用語「診断バイオマーカー」は、本発明のバイオマーカー、すなわち、本明細書の他の場所に特定され、表1に示されるような、本発明の診断アミノ酸、診断セラミド、診断スフィンゴミエリン、および診断エタノールアミン脂質に関する、ならびにCA19-9に関する総称として本明細書で用いられる。本明細書で用いられる場合、用語「低分子診断バイオマーカー」は、CA19-9を除く上記で特定された診断バイオマーカーに関する;すなわち、本明細書の他の場所に特定され、表1に示されるような、本発明の診断アミノ酸、診断セラミド、診断スフィンゴミエリン、および診断エタノールアミン脂質に関する総称として用いられる。当業者であれば理解できるように、本発明の方法は、さらなるバイオマーカーを決定することを含んでもよい。本明細書で用いられる用語「さらなるバイオマーカー」とは、本発明の診断バイオマーカーとは異なるバイオマーカーを指す。それにも拘わらず、バイオマーカーに関する本明細書で提供される定義は、特に指定のない限り、変更すべきところは変更して、診断バイオマーカーにも適用される。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「代謝物」とは、対象の代謝により産生される、またはそれによって消費される化合物を指す。この用語は、特定の代謝物の少なくとも1つの分子から、前記特定の代謝物の複数の分子までに関する。代謝物群は、それぞれの代謝物について、少なくとも1つの分子から複数の分子までが存在してもよい、複数の化学的に異なる分子を意味することがさらに理解されるべきである。本発明による代謝物は、生物などの、生物学的材料によって含まれるものを含む、全てのクラスの有機または無機化合物を包含する。好ましくは、本発明によるCA19-9以外の代謝物は、低分子化合物である、すなわち、好ましくは、CA19-9以外の代謝物は、生物学的大分子ではない、より好ましくは、CA19-9以外の代謝物は、小さい有機分子である。より好ましくは、CA19-9以外の代謝物は、2000u(2000Da; 1u = 1.66x10-27kg)未満、好ましくは、1500u未満の分子量を有する化合物である。かくして、好ましくは、2000u未満、より好ましくは、1500u未満の分子量を有する本発明の診断バイオマーカーは、本発明の低分子診断バイオマーカーである。上記によれば、2000u未満、より好ましくは、1500u未満の分子量を有する本発明のバイオマーカーについて、用語「低分子のさらなるバイオマーカー」が用いられる。
【００３０】
本発明の膵癌を診断するための方法は、診断バイオマーカーの量を決定すること、または診断バイオマーカー群の量を決定することを含む。当業者であれば理解できるように、本発明の診断バイオマーカーを、好ましくは、特異的アッセイにおいてそれぞれの診断バイオマーカーを決定することにより、単一のバイオマーカーとして決定することができる;そのような場合、診断バイオマーカー群のそれぞれの診断バイオマーカーは、特異的試料から決定される;より好ましくは、少なくとも2つ、最も好ましくは、少なくとも3つの診断バイオマーカーは同じ試料から決定されることが想定される。特に、CA19-9を、好ましくは、診断アミノ酸、診断セラミド、および/または診断スフィンゴミエリンを決定するのに用いられる試料と同一であるか、または異なってもよい試料から決定することができる。好ましくは、CA19-9および前記試料を決定するために用いられる前記試料または残りの診断バイオマーカーを決定するために用いられる試料は、長くても1年、より好ましくは、長くても3ヶ月、さらにより好ましくは、長くても2ヶ月、最も好ましくは、長くても1ヶ月の時間枠内に得られる。かくして、好ましくは、用語「CA19-9の量を決定すること」は、例えば、好ましくは、前記対象が膵癌に罹患することが疑われるかどうかを決定するために、前記対象について以前に決定されたCA19-9の濃度値を提供することを含む。好ましくは、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、または少なくとも10種のバイオマーカーが、同じ試料から一般的なアッセイ、すなわち、出力として前記バイオマーカー数に関する測定値を提供するアッセイにおいて決定される。当業者は、いくつかのバイオマーカーが、好ましくは、特異的アッセイにおいて決定される、例えば、複雑な構造を有するバイオマーカー、特に、CA19-9が、好ましくは、免疫学的アッセイ、例えば、好ましくは、ラジオイムノアッセイ（RIA)において決定されることを知っている。
【００３１】
実施形態において、本発明の診断バイオマーカー群の診断バイオマーカーは、同じ試料が、好ましくは、少なくとも2つのサブ試料に分割され、一方のサブ試料中、低分子診断バイオマーカーが決定され、第2のサブ試料中、CA19-9が決定される、前記同じ試料から決定される。さらなる実施形態においては、低分子診断バイオマーカーは第1の試料中で決定され、CA19-9は第2の試料中で決定され、好ましくは、前記試料は、同時に、または好ましくは、上記で特定されたように異なる時間に取得される。さらなる実施形態においては、膵癌を診断する方法において、CA19-9は決定されない;そのような場合、対象は、低いCA19-9値を有する対象であることが知られるか、または疑われる対象、より好ましくは、本明細書の他の場所に特定されるように、Lewis a/b抗原陰性である対象である。
【００３２】
上記を考慮して、本発明の対象において膵癌を診断するための方法は、好ましくは、
(a1)前記対象の少なくとも1つの試料中で、
(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1つの診断アミノ酸;
(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;および
(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン
を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップ;
(a2)前記対象の試料中で、診断バイオマーカーCA19-9の量の値を提供するステップ;ならびに
(b)(a1)および(a2)の前記診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって、膵癌を診断するステップ
を含む方法を含む。
【００３３】
さらに、上記を考慮して、本発明の対象において膵癌を診断するための方法は、好ましくは、
(a)前記対象の少なくとも1つの試料中で、
(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1つの診断アミノ酸;
(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;および
(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン
を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップ;ならびに
(b)前記診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって、膵癌を診断するステップ
を含む方法を含む。
【００３４】
本発明による方法においては、少なくとも4種の診断バイオマーカーの少なくとも量を決定するべきである。本明細書で用いられる用語「少なくとも4種の診断バイオマーカー」は、4種または4種を超えることを意味する。したがって、4、5、6、7、8、9、10、11種、またはさらに多い診断バイオマーカーの量を決定してもよい(本明細書の他の場所に特定されるように、参照と比較する)。好ましくは、4〜11種の診断バイオマーカーの量を決定する(参照と比較する)。
【００３５】
本発明によれば、診断バイオマーカー群が少なくとも1つの診断アミノ酸バイオマーカー、少なくとも1つの診断セラミドバイオマーカー、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリンバイオマーカー、およびCA19-9を含むように、前記群の診断バイオマーカーが選択される。好ましくは、診断バイオマーカーの前記群は、少なくとも1つの診断エタノールアミン脂質をさらに含む。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「診断アミノ酸」は、プロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンに関する;好ましくは、診断アミノ酸は、プロリンである;別の実施形態においては、好ましくは、診断アミノ酸は、トリプトファンである。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「診断セラミド」は、セラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)に関する;好ましくは、診断セラミドは、セラミド(d18:1,C24:0)である;別の実施形態においては、好ましくは、診断セラミドは、セラミド(d18:2,C24:0)である。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「診断スフィンゴミエリン」は、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)である;好ましくは、診断スフィンゴミエリンは、スフィンゴミエリン(35:1)である;別の実施形態においては、好ましくは、診断スフィンゴミエリンは、スフィンゴミエリン(41:2)である。好ましい実施形態においては、診断スフィンゴミエリンは、スフィンゴミエリン(35:2)である。
【００３９】
当業者であれば理解できるように、用語「スフィンゴミエリン(35:1)」は、スフィンゴイド部分および脂肪酸部分における炭素原子の合計が共に35であり、スフィンゴミエリンが1個の二重結合を含む、前記スフィンゴミエリンに関する。好ましくは、前記二重結合がスフィンゴイド塩基中に存在する場合、前記二重結合は、trans二重結合であり、前記二重結合が脂肪酸部分に存在する場合、前記二重結合は、cis二重結合である。したがって、診断バイオマーカースフィンゴミエリン(35:1)は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)およびスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)である;またはスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)である。より好ましくは、診断バイオマーカースフィンゴミエリン(35:1)は、スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)およびスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)である。さらにより好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)は、スフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)である。
【００４０】
同様に、用語「スフィンゴミエリン(41:2)」は、スフィンゴイド部分および脂肪酸部分における炭素原子の合計が共に41であり、スフィンゴミエリンが2個の二重結合を含む、前記スフィンゴミエリンに関する。好ましくは、二重結合がスフィンゴイド塩基中に存在する場合、前記二重結合は、trans二重結合であり、二重結合が脂肪酸部分に存在する場合、前記二重結合は、cis二重結合である。2個の二重結合がスフィンゴイド塩基中に存在する場合、これらの前記二重結合のうちの1個は、好ましくはtrans二重結合であり、これらの二重結合のうちの第2の1個は、transまたはcis構成のいずれかであってもよい;すなわち、好ましくは、2個の二重結合がスフィンゴイド塩基中に存在する場合、その1個はtrans二重結合である。したがって、診断バイオマーカースフィンゴミエリン(42:1)は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)、およびスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0)である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)およびスフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)である;またはスフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)およびスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0)である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)およびスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0)である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)である;またはスフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)である;またはスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0)である。より好ましくは、診断バイオマーカースフィンゴミエリン(42:1)は、スフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0)である;さらにより好ましくは、それはスフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)である。
【００４１】
好ましい実施形態においては、用語「スフィンゴミエリン(35:2)」は、スフィンゴイド部分および脂肪酸部分中の炭素原子の合計が共に35であり、スフィンゴミエリンが2個の二重結合を含む、前記スフィンゴミエリンに関する。好ましくは、診断バイオマーカースフィンゴミエリン(35:2)は、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、スフィンゴミエリン(d17:1,C18:1)、スフィンゴミエリン(d17:2,C18:0)、および/またはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:1)である。より好ましくは、診断バイオマーカースフィンゴミエリン(35:2)は、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、スフィンゴミエリン(d17:1,C18:1)、スフィンゴミエリン(d17:2,C18:0)、およびスフィンゴミエリン(d18:1,C17:1)からなる一覧から選択される少なくとも3個、さらにより好ましくは、少なくとも2個のスフィンゴミエリンである。最も好ましくは、スフィンゴミエリン(35:2)は、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)である。
【００４２】
用語「CA19-9」は、例えば、Gupta et al., 1985, Cancer 56 (277-283)から、「炭水化物抗原19-9」または「消化管癌関連抗原19-9」としても当業者に公知である。例えば、血液由来試料中のCA19-9を特異的に決定するための試験は、商業的に入手可能である。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「診断エタノールアミン脂質」は、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)またはリソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)に関する;好ましくは、診断エタノールアミン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)である;別の実施形態においては、好ましくは、診断エタノールアミン脂質は、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)である。
【００４４】
好ましくは、診断バイオマーカー群中の、診断アミノ酸はプロリンである、および/または診断スフィンゴミエリンはスフィンゴミエリン(35:1)もしくはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)である。より好ましくは、診断バイオマーカー群中の、診断アミノ酸はプロリンであり、診断スフィンゴミエリンはスフィンゴミエリン(35:1)である。さらにより好ましくは、診断バイオマーカー群は、診断バイオマーカープロリン、セラミド(d18:1,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる;または診断バイオマーカー群は、診断バイオマーカープロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる。別の実施形態においては、好ましくは、診断バイオマーカー群中の、診断アミノ酸はトリプトファンである。より好ましくは、診断バイオマーカー群中の、診断アミノ酸はトリプトファンであり、診断セラミドはセラミド(d18:1,C24:0)である。
【００４５】
好ましくは、診断バイオマーカー群は、少なくとも1種の診断エタノールアミン脂質をさらに含む。より好ましくは、診断バイオマーカー群は、診断バイオマーカープロリン、セラミド(d18:1,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる。別の実施形態においては、より好ましくは、診断バイオマーカー群は、診断バイオマーカープロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる。
【００４６】
好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネルの少なくとも1つの診断バイオマーカー、すなわち、好ましくは、表9のパネル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。好ましい実施形態においては、診断バイオマーカーは、表9および表17のパネル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、および106からなる一覧から選択されるパネルのものである。
【００４７】
好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、2、6、7、11、82、9、89、44、10、58、46、66、13、31、30、92、86、48、81または90の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。別の好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、6、7、11、82、9、89、44、10、58、46、66、13、31、30、92、86、48、81または90の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。さらにより好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、7、82、89、44、58、46、66、13、31、30、92、48または90の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。
【００４８】
さらに好ましい実施形態においては、対象は、慢性膵炎に罹患している対象であり、前記診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、2、6、7、4、12、14、43、19、13、16、41、21、50、44、47、46、48、3、または5の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。別の好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、6、7、4、12、14、43、19、13、16、41、21、50、44、47、46、48、3、または5の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;さらにより好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、7、4、12、14、43、19、13、16、41、21、50、44、47、46または48を含む、好ましくは、それらからなる。さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル13、66、46、104、58、10、44、89、9、82、2、または11の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;さらにより好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9の13、66、46、58、44、89、82、または2の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。
【００４９】
さらに好ましい実施形態においては、前記対象は、新規発症糖尿病に罹患している対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、2、6、7、13、9、43、12、10、11、47、21、14、49、48、4、19、46、82または52の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;別の好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、6、7、13、9、43、12、10、11、47、21、14、49、48、4、19、46、82または52の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;さらにより好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、7、13、43、12、47、21、14、49、48、4、19、46、82または52の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。
【００５０】
さらに好ましい実施形態においては、前記対象は、低いCA19-9値を有する対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、2、6、7、9、13、12、または3の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;別の好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、6、7、9、13、12、または3の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;さらにより好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、7、13または12の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。
【００５１】
別の好ましい実施形態においては、膵癌は、切除可能な膵癌であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、2、6、7、3、4、5、9、10、12、13、14、15、16、18、19、11、21、22または30の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;別の好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、6、7、3、4、5、9、10、12、13、14、15、16、19、11、21または30の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる;さらにより好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、表9のパネル2、7、4、12、13、14、16、19、21または30の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。
【００５２】
さらに好ましいのは、プロリンを含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル1〜21、38〜55、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、セラミド(d18:1,C24:0)を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル1〜11、16〜18、22〜25、30〜33、38〜46、56〜67、80〜91、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、プロリンおよびセラミド(d18:1,C24:0)を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル1〜11、16〜18、38〜46、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。好ましい実施形態においては、試験しようとする対象は、40歳を超える年齢であり、表9のパネル1〜21、38〜55、および104からなる一覧から、または表9のパネル1〜11、16〜18、22〜25、30〜33、38〜46、56〜67、80〜91、および104からなる一覧から、または表9のパネル1〜11、16〜18、38〜46、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーを決定する。
【００５３】
さらに好ましいのは、セラミド(d18:2,C24:0)を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル12〜15、19〜21、26〜29、34〜37、47〜55、68〜79、92〜103、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、プロリンおよびセラミド(d18:2,C24:0)を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル12〜15、19〜21、47〜55、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。
【００５４】
さらに好ましいのは、スフィンゴミエリン(35:1)を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル1〜15、22、26、30、34、56、57、58、68、69、70、80、81、82、92、93、94、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、プロリン、セラミド(d18:1,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびCA19-9を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル1〜11および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、プロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびCA19-9を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル12〜15および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。好ましい実施形態においては、試験しようとする対象は、40歳を超える年齢であり、1〜15、22、26、30、34、56、57、58、68、69、70、80、81、82、92、93、94、および104からなる一覧から、または表9のパネル1〜11および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーが決定される。
【００５５】
さらに好ましいのは、少なくとも1種の診断エタノールアミン脂質を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル2〜6、8〜11、13〜15、38〜103、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。好ましい実施形態においては、試験使用とする対象は40歳を超える年齢であり、表9のパネル2〜6、8〜11、13〜15、38〜103、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーが決定される。
【００５６】
さらに好ましいのは、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル2、9〜11、13、43、44、46〜49、58、65〜67、70、71、78、79、82、88〜90、92、95〜97、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、プロリン、セラミド(d18:1,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、およびCA19-9を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル2、9、10、11、および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。さらに好ましいのは、プロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)およびCA19-9を含む診断バイオマーカー群、好ましくは、表9のパネル13および104からなる一覧から選択されるパネルの診断バイオマーカーである。
【００５７】
好ましい実施形態においては、表9のパネル1、18、22、23、25、または61の診断バイオマーカーを含む診断バイオマーカー群は、少なくとも1種のさらなる診断バイオマーカーを含む。また、好ましい実施形態においては、試料は、前記対象が絶食していた間に前記対象から得られた試料であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。また、好ましい実施形態においては、対象は、膵癌に罹患するリスクがある対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。また、好ましい実施形態においては、対象は、新規発症糖尿病を有する対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。また、好ましい実施形態においては、対象は、慢性膵炎に罹患している対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。また、好ましい実施形態においては、対象は、低いCA19-9値を有する対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。また、好ましい実施形態においては、対象は、膵癌に罹患することが疑われる対象であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。また、好ましい実施形態においては、膵癌は、切除可能な腫瘍ステージを有する膵癌であり、診断バイオマーカー群は、表9のパネル1、18、22、23、25または61の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる。
【００５８】
最も好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、診断バイオマーカーCA19-9、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)、ヒスチジン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、プロリン、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(41:2)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、およびトリプトファンを含む、好ましくは、それらからなる。
【００５９】
さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、合計パラメータ、すなわち、2種以上の代謝物について決定された半定量的または好ましくは、定量的な量を合計することによって得られたパラメータを含む。本明細書で用いられる合計パラメータは、［A+B]、すなわち、AとBとの和として示される。
【００６０】
かくして、好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、2種以上のアミノ酸の合計パラメータ、好ましくは、ヒスチジンとプロリンの、ヒスチジンとトリプトファンの、および/またはプロリンとトリプトファンの半定量的または好ましくは、定量的な量を含む合計パラメータを含む。さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、ヒスチジン、プロリン、およびトリプトファンの半定量的、または好ましくは、定量的な量を含む、好ましくは、からなる合計パラメータを含む。
【００６１】
さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、2種以上のスフィンゴミエリンの合計パラメータ、好ましくは、(i)スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)およびスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、(ii)スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)およびスフィンゴミエリン(35:1)、(iii)スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)およびスフィンゴミエリン(41:2)、(iv)スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)およびスフィンゴミエリン(35:1)、(v)スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)およびスフィンゴミエリン(41:2)、(vi)スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、およびスフィンゴミエリン(35:1)、(vii)スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、およびスフィンゴミエリン(41:2); (viii)スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびスフィンゴミエリン(41:2)、(ix)スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびスフィンゴミエリン(41:2)の半定量的、または好ましくは、定量的な量を含む合計パラメータを含む。好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、およびスフィンゴミエリン(41:2)の半定量的または好ましくは、定量的な量を含む、好ましくは、それらからなる合計パラメータを含む。
【００６２】
さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、2種以上のセラミドの合計パラメータ、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)およびセラミド(d18:2,C24:0)の半定量的、または好ましくは、定量的な量を含む、好ましくは、それらからなる合計パラメータを含む。
【００６３】
さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、リソホスファチジルエタノールアミンの比パラメータまたはリソホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの比、好ましくは、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)とホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)の半定量的、または好ましくは、定量的な量を含む、好ましくは、それらからなる比パラメータ、すなわち、好ましくは、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)/ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)比を含む。本明細書で用いられる場合、比パラメータは、［A/B]、すなわち、Bで除算したAの比として示される。
【００６４】
かくして、好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、CA19-9、［ヒスチジン+プロリン+トリプトファン］、［スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)+スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)+スフィンゴミエリン(35:1)+スフィンゴミエリン(41:2)]、および[セラミド(d18:1,C24:0)+セラミド(d18:2,C24:0)]を含む、好ましくは、それらからなる。さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー群は、CA19-9、［ヒスチジン+プロリン+トリプトファン］、［スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)+スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)+スフィンゴミエリン(35:1)+スフィンゴミエリン(41:2)]、[セラミド(d18:1,C24:0)+セラミド(d18:2,C24:0)]、および[リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)/ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)]を含む、好ましくは、それらからなる。
【００６５】
上記のように、本発明の方法は、同様にさらなるバイオマーカーを決定することを含んでもよい。上記のように、さらなるバイオマーカーは、診断バイオマーカーではない。そのような場合、実施形態においては、決定されるそれぞれのさらなるバイオマーカーは、前記方法の偽陽性率および/または偽陰性率を少なくとも0.1%、好ましくは、1%低下させる。さらなる実施形態においては、決定されるそれぞれのさらなるバイオマーカーは、前記方法のAUC値を有意に増加させる。したがって、本発明の方法は、好ましくは、診断の改善に寄与しないバイオマーカーを決定することを回避する。好ましくは、診断バイオマーカー群は、スフィンガニン-1-リン酸(d18:0)を含まない;および/または前記診断バイオマーカー群は、ヒスチジンを含む、診断バイオマーカー群は、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)を含まない。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、特に、バイオマーカーの「量を決定すること」という用語は、所定の試料であるバイオマーカーの少なくとも1つの特徴的特徴を決定することを指す。本発明による特徴的特徴は、バイオマーカーの生化学的特性を含む物理的および/または化学的特性を特徴付ける特徴である。そのような特性は、例えば、分子量、粘度、密度、電荷、スピン、光学活性、色、蛍光、化学発光、元素組成、化学構造、他の化合物と反応する能力、生物学的読出し系における応答(例えば、リポーター遺伝子の誘導)を惹起する能力などを含む。前記特性に関する値は、特徴的特徴として役立ち、当業界で周知の技術によって決定することができる。さらに、特徴的特徴は、標準的な操作、例えば、乗算、除算または対数算法などの数学的計算によってバイオマーカーの物理的および/または化学的特性の値から誘導される任意の特徴であってもよい。最も好ましくは、少なくとも1つの特徴的特徴は、前記少なくとも1つのバイオマーカーおよびその量の決定および/または化学的同定を可能にする。したがって、特徴値は、好ましくは、特徴値が誘導されるバイオマーカーの存在量に関する情報も含む。例えば、バイオマーカーの特徴値は、質量スペクトルにおけるピークであってもよい。そのようなピークは、バイオマーカーの特徴的情報、すなわち、m/z情報を含有し、ならびに強度値は試料中の前記バイオマーカーの存在量(すなわち、その量)に関連する。
【００６７】
以前に考察したように、試料に含まれるバイオマーカー、好ましくは、診断バイオマーカーを、好ましくは本発明に従って、半定量的または定量的に決定することができる。半定量的決定のためには、好ましくは、バイオマーカーの相対量を、本明細書で上記された特徴的特徴について決定された値に基づいて決定する。バイオマーカーの正確な量を決定することができないか、または決定するべきではない場合に、相対量を決定することができる。前記の場合、バイオマーカーが存在する量が、第2の量の前記バイオマーカーを含む第2の試料に関して増加もしくは減少するかどうかを決定することができる;またはバイオマーカーが存在する量が、内部対照分析物に関して増加もしくは減少するかどうかを決定することができる。好ましくは、前記バイオマーカーを含む前記第2の試料は、本明細書の他の場所で特定される計算された参照である。より好ましくは、バイオマーカー、特に、診断バイオマーカーは、定量的に決定される、すなわち、好ましくは、決定は、バイオマーカーの絶対量または濃度を測定することである。
【００６８】
試料は、好ましくは、それを本発明の方法のために用いる前に予備処理される。以下により詳細に記載されるように、前記予備処理は、化合物を遊離させる、もしくは分離する、または過剰の材料もしくは廃棄物を除去するのに必要とされる処理を含んでもよい。好適な技術は、遠心分離、抽出、分画、限外濾過、分離(例えば、常磁性ビーズへの結合および磁力の適用による)、タンパク質沈降、次いで、濾過ならびに化合物の精製および/または濃縮を含む。さらに、他の予備処理は、好ましくは、化合物分析にとって好適な形態または濃度の化合物を提供するために実行される。例えば、ガスクロマトグラフィー結合質量分析が、本発明の方法において用いられる場合、前記ガスクロマトグラフィーの前に化合物を誘導体化することが必要である。好適かつ必要な予備処理は、本発明の方法を実行するために用いられる手段に依存し、当業者には周知である。以前に記載された予備処理された試料も、本発明に従って用いられる用語「試料」に含まれる。
【００６９】
好ましくは、試料の予備処理は、試料により含まれる、化合物、特に、上記の低分子診断バイオマーカーのその後の分離を可能にする。目的の分子、特に、上記のバイオマーカーを、使用と、好適な抽出溶媒とを混合することを含む抽出ステップにおいて抽出することができる。抽出溶媒は、試料中のタンパク質を沈降させることによって、好ましくは、そうでなければ上記のバイオマーカーのその後の分析を阻害するタンパク質夾雑物の遠心分離に基づく除去を容易にすることができるべきである。好ましくは、本明細書に記載の少なくとも低分子診断バイオマーカーは、抽出溶媒中に可溶性である。より好ましくは、抽出溶媒は、非相分離性、すなわち、1相溶媒である。さらにより好ましくは、抽出溶媒は、非相分離性のタンパク質沈降溶液、好ましくは、ジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、第3級ブチルメチルエーテル(tBMEまたはMTBE、2-メトキシ-2-メチルプロパンとしても知られる)、エタン酸エチル、およびイソオクタンからなる群から選択される第1の溶媒と、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群から選択される第2の溶媒とを含む混合物である。より好ましくは、非相分離性のタンパク質沈降溶液は、特に、約2:1(v/v)〜約3:2(v/v)の比、好ましくは、約2:1(v/v)または約3:2(v/v)の比の、メタノールおよびDCMを含む。より好ましくは、非相分離性のタンパク質沈降溶液は、2:1(v/v)の比のメタノール:ジクロロメタンを含む。
【００７０】
好ましくは、本明細書に記載のバイオマーカーの量の決定は、上記で特定された化合物分離ステップおよびその後の質量分析ステップによって達成される。かくして、本発明の方法において用いられる決定は、好ましくは、分析ステップの前に化合物分離ステップを用いることを含む。好ましくは、前記化合物分離ステップは、試料により含まれる、代謝物、特に、診断バイオマーカーの時間分離分離をもたらす。好ましくは、本発明に従って用いられる分離のための好適な技術は、したがって、液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除またはアフィニティクロマトグラフィーなどのあらゆるクロマトグラフィー分離技術を含む。さらに、好ましくは、電子スプレー/MS/MSと組み合わせた、イオン移動度クロマトグラフィーによる決定が想定される。これらの技術は、当業界で周知であり、当業者であれば苦もなく適用することができる。最も好ましくは、LCおよび/またはHPLCは、本発明の方法によって想定されるクロマトグラフィー技術である。バイオマーカーのそのような決定のための好適なデバイスは、当業界で周知である。好ましくは、クロマトグラフィーは、最も好ましくは、C18逆相カラム上での、逆相クロマトグラフィー、より好ましくは、逆相液体クロマトグラフィーである。
【００７１】
好ましくは、質量分析、特に、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)、直接注入質量分析またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析(FT-ICR-MS)、キャピラリー電気泳動質量分析(CE-MS)、高速液体クロマトグラフィー結合質量分析(HPLC-MS)、四重極型質量分析、MS-MSまたはMS-MS-MSなどの任意の連続結合質量分析、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)、熱分解質量分析(Py-MS)、イオン移動度質量分析または飛行時間質量分析(TOF)が用いられる。より好ましくは、LC-MS、特に、LC-MS/MSが、以下に詳細に記載されるように用いられる。上記の技術は、例えば、Nissen 1995, Journal of Chromatography A, 703: 37-57、米国特許第4,540,884号または米国特許第5,397,894号に開示されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
質量分析技術の代替として、またはそれに加えて、化合物の決定のために以下の技術を用いることができる:核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴イメージング(MRI)、フーリエ変換赤外分析(FT-IR)、紫外線(UV)分光法、屈折率(RI)、蛍光検出、放射化学的検出、電気化学的検出、光散乱(LS)、分散Raman分光法またはフレームイオン検出(FID)。好ましい実施形態においては、バイオマーカーを、特定のリガンド、例えば、アプタマー、抗体などへのその結合によって決定することもできる。これらの技術は、当業者には周知であり、苦もなく適用することができる。
【００７３】
本発明の方法は、好ましくは、自動化によって支援するべきである。例えば、試料のプロセッシングまたは予備処理を、ロボットにより自動化することができる。データプロセッシングおよび比較は、好ましくは、好適なコンピュータプログラムおよびデータベースによって支援される。本明細書の以前に記載された自動化は、高効率手法における本発明の方法の使用を可能にする。
【００７４】
実施形態においては、本明細書で用いられる質量分析は、四重極型MSを包含する。最も好ましくは、前記四重極型MSは、以下のように実行される:a)質量分析装置の第1の分析四重極中でのイオン化により作出されるイオンの質量/電荷商(m/z)の選択、b)衝突ガスを充填し、衝突チャンバとして作用するさらなるその後の四重極に加速電圧を印加することによるステップa)で選択されたイオンの断片化、c)さらなるその後の四重極中でのステップb)における断片化プロセスにより作出されたイオンの質量/電荷商の選択、それにより、方法のa)〜c)を少なくとも1回実行する。
【００７５】
より好ましくは、前記質量分析は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)MS、特に、HPLC-MS/MSなどの、液体クロマトグラフィー(LC)MSである。本明細書で用いられる液体クロマトグラフィーは、液体または超臨界相中の化合物(すなわち、代謝物)の分離を可能にする全ての技術を指す。液体クロマトグラフィーは、移動相中の化合物が固定相を通過することを特徴とする。化合物が異なる速度で固定相を通過する時、それぞれ個々の化合物はその特異的な保持時間(すなわち、化合物が系を通過するのに必要とされる時間)を有するため、それらは時間で分離されるようになる。本明細書で用いられる液体クロマトグラフィーはまた、HPLCも含む。液体クロマトグラフィーのためのデバイスは、例えば、Agilent Technologies, USAから商業的に入手可能である。例えば、HPLCを、例えば、C8、C18またはC30固定相を有する商業的に入手可能な逆相分離カラムを用いて実行することができる。当業者であれば、HPLCまたは本明細書に記載の任意の他のクロマトグラフィー法のための好適な溶媒を選択することができる。クロマトグラフィーデバイスから出現する溶出液は、上記のバイオマーカーを含むべきである。
【００７６】
当業者であれば、液体クロマトグラフィーのための溶出のための好適な溶媒を決定することができる。実施形態においては、HPLC分離における勾配溶出のための溶媒は、極性溶媒と脂質溶媒とからなる。好ましくは、極性溶媒は、水と、酸改質剤を含む水混和性溶媒との混合物である。水と完全に混和する好適な有機溶媒の例としては、C1〜C3-アルカノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、C3〜C4-ケトン、例えば、アセトンおよびアセトニトリルならびにその混合物が挙げられるが、メタノールが特に好ましい。好ましくは、脂質溶媒は、上記の有機溶媒の少なくとも1種と、ジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、第3級ブチルメチルエーテル(tBMEまたはMTBE)、エタン酸エチル、およびイソオクタンからなる群から選択される疎水性溶媒との混合物である。酸改質剤の例は、ギ酸または酸性酸である。勾配溶出のための好ましい溶媒は、実施例のセクションに開示される。
【００７７】
本発明に従って適用することもできるガスクロマトグラフィーは、原理的には、液体クロマトグラフィーと同等に機能する。しかしながら、固定相を通過する液体移動相中に化合物(すなわち、代謝物)を有するよりもむしろ、化合物は気体容量中に存在する。化合物は、固定相として固相支持体材料を含有してもよいカラムまたは固定相として働く、もしくは固定相で被覆された壁を通過する。再度、それぞれの化合物は、カラムを通過するのに必要とされる特定の時間を有する。
【００７８】
さらに、ガスクロマトグラフィーだけでなく、液体クロマトグラフィー、特に、逆相液体クロマトグラフィーの場合も、好ましくは、化合物はクロマトグラフィーの前に誘導体化されることが想定される。誘導体化のための好適な技術は、当業界で周知である。好ましくは、本発明による誘導体化は、好ましくは、極性化合物のメトキシ化およびトリメチルシリル化ならびに好ましくは、非極性(すなわち、親油性)化合物のトランスメチル化、メトキシ化およびトリメチルシリル化に関する。より好ましくは、誘導体化は、非タンパク質画分中の代謝物を、疎水性側鎖を導入する試薬と接触させることを含む、さらにより好ましくは、からなる。好ましくは、疎水性側鎖を導入する前記試薬は、アミノ基、好ましくは、第1級および第2級アミノ基を誘導体化する試薬である。より好ましくは、疎水性側鎖を導入する前記試薬は、5-(ジメチルアミノ)ナフタレン-1-スルホニルクロリド(ダンシルクロリド、CAS登録番号605-65-2)である。好ましくは、低分子診断バイオマーカーのうち、それぞれ、ヒスチジンは二重ダンシル化されており、プロリン、トリプトファン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、およびホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)はモノダンシル化されている。
【００７９】
質量分析のために、試料中の分析物をイオン化して、荷電分子または分子断片を生成する。その後、イオン化分析物、特に、イオン化バイオマーカー、またはその断片の質量対電荷比を測定する。かくして、質量分析ステップは、好ましくは、決定しようとするバイオマーカーをイオン化するイオン化ステップを含む。勿論、試料/溶出液中に存在する他の化合物も同様にイオン化する。バイオマーカーのイオン化を、適切と見なされる任意の方法、特に、電子衝撃イオン化、高速原子衝撃、電子スプレーイオン化(ESI)、大気圧化学イオン化(APCI)、マトリックスレーザー支援脱離イオン化(MALDI)によって実行することができる。好ましくは、イオン化ステップは、大気圧化学イオン化(APCI)によって実行される;好ましい実施形態においては、イオン化ステップを、APCIによって実行して、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(41:2)およびスフィンゴミエリン(35:2)の指定の下で本明細書に記載される特定のスフィンゴミエリンの少なくとも1つを分解する。より好ましくは、イオン化ステップ(質量分析のため)は、電子スプレーイオン化(ESI)によって実行される。したがって、質量分析は、好ましくは、ESI-MSである(またはタンデムMSを実行する場合:ESI-MS/MS)。電子スプレーは、化学結合を破壊することなくイオンの形成をもたらすソフトイオン化法である。電子スプレーイオン化(ESI)は、高い電圧を試料に印加して、エアロゾルを作出する電子スプレーを用いてイオンを生成するための質量分析において用いられる技術である。それは、イオン化された場合にこれらの分子が断片化する傾向を克服するため、大分子からイオンを生成するのに特に有用である。好ましくは、電子スプレーイオン化は、陽イオンモードの電子スプレーイオン化である。かくして、イオン化は、好ましくは、プロトン化(またはNH4+、Na+、またはK+、特に、NH4+などの正に荷電したイオンを用いる付加物形成）である。したがって、好適な陽イオン、好ましくは、プロトン(H+)が、決定しようとするバイオマーカー(および勿論、試料中、すなわち、クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の任意の化合物)に付加される。したがって、診断バイオマーカーの量の決定は、プロトン化されたバイオマーカーの量の決定であってもよい。
【００８０】
当業者であれば、イオン化ステップが質量分析ステップの開始時に実行されることを知っている。タンデムMSが実行される場合、イオン化、特に、電子スプレーイオン化が、第1の質量分析ステップ中に実行される。
【００８１】
好ましくは、バイオマーカーのイオン化を、クロマトグラフィーカラム(特に、LCまたはHPLCカラム)から溶出する液体を、電子スプレーに直接供給することにより実行することができる。あるいは、画分を回収し、古典的ナノ電子スプレー-質量分析設定において後に分析することができる。
【００８２】
上述の通り、質量分析ステップは、分離ステップ、特に、クロマトグラフィーステップの後に実行される。実施形態においては、クロマトグラフィーカラム(例えば、LCまたはHPLCカラム)から出現する溶出液を予備処理した後、それを質量分析ステップにかけることができる。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態においては、診断バイオマーカー、好ましくは、低分子診断バイオマーカーは、1回の測定で一緒に決定される。特に、1回のLC-MS(またはLC-MS/MS)、HPLC-MS(HPLC-MS/MS)測定(すなわち、実行)において一緒に量を決定することが想定される。好ましくは、診断バイオマーカーの量は、本明細書の他の場所に記載される実施例に記載のように決定される。
【００８４】
例えば、血液、血清、または血漿試料(特に、血漿試料)を分析することができる。試料は、新鮮な試料または凍結試料であってもよい。凍結される場合、試料を好適な時間にわたって好適な温度で解凍してもよい。次いで、試料のアリコートをマイクロ遠心管に移し、本明細書の他の場所に特定される好適な希釈剤で希釈する。内部標準を、希釈前、希釈時、または希釈後に添加してもよい。好ましくは、前記内部標準中には、ただ3つ、より好ましくは、ただ2つの標準化合物が含まれる。好ましくは、前記内部標準は、L-アラニンd4およびセラミド(d18:1,17:0)を含む、より好ましくは、からなる。その後、抽出を行う(例えば、ボルテックスを用いて5分間)。その後、試料を遠心分離してもよい(例えば、約20.000gで)。上清のアリコート(例えば、200μl)を、バイオマーカーの定量のために用いることができる。
【００８５】
好ましい実施形態においては、少なくとも1つの内部標準化合物を試料に添加することができる。本明細書で用いられる用語「内部標準化合物」とは、試料に添加され、決定される化合物を指す(すなわち、内部標準化合物の量が決定される)。少なくとも1つの内部標準化合物を、試験使用とする試料の抽出の前、間、または後に添加することができる。実施形態においては、少なくとも1つの内部標準化合物を添加した後、試料のアリコートと、抽出溶媒とを混合する。好ましくは、少なくとも1つの内部標準化合物を、好適な溶媒中に別々に溶解した後、試料に添加し、次いで、抽出溶媒に添加する。実施形態においては、抽出溶媒は、メタノール/ジクロロメタン(2:1 v/v)などの、本明細書の他の場所に記載される抽出溶媒である。
【００８６】
好ましくは、内部標準化合物は、本質的に存在しない、または試験しようとする試料中に存在しない化合物、特に、脂質である。かくして、化合物は、好ましくは、試験しようとする試料中に天然には存在しない。好ましくは、内部標準は、本発明によるそれぞれの脂質バイオマーカーと非常に類似する。より好ましくは、少なくとも1つの内部標準化合物は、L-アラニンd4またはセラミド(d18:1,17:0)である。さらにより好ましくは、L-アラニンd4とセラミド(d18:1,17:0)の両方が、内部標準化合物として用いられる。
【００８７】
上記のように、内部標準化合物を、好適な溶媒(内部標準化合物を含む溶液であり、好適な溶媒は、本明細書では「内部標準溶液」とも呼ばれる)中に溶解することができる。好ましくは、溶媒は、ジメチルスルホキシド、メタノール、ジクロロメタンおよび水を含むか、またはそれである。より好ましくは、溶媒は、約12:2:1:1、v/v/v/vの比、さらにより好ましくは、12.3:2.2:1.1:1、v/v/v/vの比の、ジメチルスルホキシド、メタノール、ジクロロメタンおよび水を含む混合物である。好ましくは、内部標準溶液は、約12:2:1:1、v/v/v/vの比、さらにより好ましくは、12.3:2.2:1.1:1、v/v/v/vの比の、ジメチルスルホキシド、メタノール、ジクロロメタンおよび水、ならびに約50/1〜100/1の比(L-アラニンd4/セラミド(d18:1,17:0)、w/w)、より好ましくは、約80/1の比(L-アラニンd4/セラミド(d18:1,17:0)、w/w)、最も好ましくは、79.5/1の比(L-アラニンd4/セラミド(d18:1,17:0)、w/w)の範囲の内部標準化合物を含む、またはからなる。
【００８８】
好ましくは、内部標準溶液を試験しようとする試料に添加した後、本明細書の他の場所に記載の抽出溶媒を用いて試料を抽出し、遠心分離によって試料からタンパク質を除去する。かくして、抽出ステップは、好ましくは、内部標準溶液を添加した試料に対して実行するべきである。
【００８９】
L-アラニンd4を内部標準化合物として用いる場合、(かくして予備処理された)試料に添加される内部標準溶液中の内部標準化合物の濃度は、好ましくは、1〜200μg/ml、より好ましくは、10〜15μg/ml、最も好ましくは、12〜13μg/mlの範囲内にある。
【００９０】
セラミド(d18:1,17:0)を内部標準化合物として用いる場合、(かくして予備処理された)試料に添加される内部標準溶液中の内部標準化合物の濃度は、好ましくは、0.05〜0.5μg/ml、より好ましくは、0.1〜0.2μg/ml、最も好ましくは、0.150〜0.160μg/mlの範囲内にある。
【００９１】
実施形態において、用いられる内部標準溶液の容量は、予備処理前の試料の容量の5倍であり、例えば、20μlの血漿および100μlの内部標準溶液が用いられる。この場合、抽出溶媒の容量は、内部標準溶液で予備処理される試料の容量の少なくとも5倍、例えば、700μlである。
【００９２】
内部標準の量の決定は、好ましくは、本明細書に記載の少なくとも3種のバイオマーカーの量の正規化を可能にするべきである。好ましくは、診断バイオマーカーの決定されたピーク面積を、少なくとも1つの内部標準化合物のピーク面積で除算する。
【００９３】
特に、試験試料(試験しようとする対象からの試料だけでなく、較正試料も)に関する補正因子を算出することができる。この補正因子を用いて、デバイスの変動、固有のシステムエラーなどに関する少なくとも3種のバイオマーカーのピーク面積を補正することができる。ピーク面積として決定されたそれぞれのバイオマーカーについて、バイオマーカーピーク面積と内部標準ピーク面積との面積比を決定することができる。
【００９４】
好ましくは、少なくとも1つの標準化合物の決定は、診断バイオマーカーの量の決定を阻害しない。好ましい実施形態においては、内部標準溶液は、試料を含まない溶液であり、より好ましくは、標準化合物および上記で特定された溶媒からなる溶液である。かくして、好ましい実施形態においては、本発明は、上記で特定された内部標準溶液に関する。
【００９５】
好ましい実施形態においては、定量的決定は、好ましくは、脱脂質化された血漿および好ましくは、試料について本明細書で特定された抽出溶媒を含む、外部較正を用いて較正される。好ましくは、定量標準化合物、好ましくは、表1に記載される定量標準化合物の適切な濃度を提供し、前記定量標準の適切な希釈系列を用いて較正曲線を確立する。好ましくは、用いられる定量標準の最高濃度は、スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)については5.3475μg/ml、スフィンゴミエリン(d18:1,C24:1)については12.177μg/ml、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22;6)については3.125μg/ml、セラミド(d18:1,C24:0)については2.932μg/ml、セラミド(d18:1,C24:1)については0.912μg/ml、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)については1.24μg/ml、L-プロリンについては25.45μg/ml、L-トリプトファンについては27.5μg/ml、および/またはL-ヒスチジンについては12.75μg/mlである。
【００９６】
かくして、好ましい実施形態においては、本発明はまた、(i)スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)、スフィンゴミエリン(d18:1,C24:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22;6)、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:1,C24:1)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、L-プロリン、L-トリプトファン、および/またはL-ヒスチジンから選択される少なくとも1つの定量標準化合物を含む少なくとも1つの溶液;ならびに(ii)本明細書の上記で特定された脱脂質化された血漿および/または内部標準溶液を含むキットにも関する。好ましくは、前記溶液中の前記定量標準化合物の濃度は、本明細書の上記に示された濃度である。当業者であれば理解できるように、キットが2種以上の定量標準化合物を含む場合、定量標準化合物は、好ましくは、別々の溶液としてキット中に提供される。さらに好ましい実施形態においては、本発明は、対象における膵癌を診断するための上記キットの使用に関する。さらに、さらに好ましい実施形態においては、本発明は、本発明の方法における上記キットの使用に関する。
【００９７】
上記に示されたように、CA19-9の量の決定は、本発明の方法の文脈において記載される他の診断バイオマーカーの量の決定とは異なっていてもよい(他の診断バイオマーカーの量は、好ましくは、クロマトグラフィーおよび質量分析を含む方法によって決定される、本明細書の他の場所を参照されたい)。好ましくは、CA19-9の量は、血液、血清または血漿試料中で決定される。好ましくは、量は、CA19-9に特異的に結合する少なくとも1つの抗体、決定しようとするマーカー(CA19-9)と複合体を形成する少なくとも1つの抗体を用いて決定される。その後、形成された複合体の量を測定する。複合体は、マーカーと抗体とを含む(複合体の検出を可能にするために標識してもよい)。
【００９８】
CA19-9が決定される試料は、本明細書に記載の他の診断バイオマーカーが決定される試料の予備処理とは異なる予備処理を必要とするか、または必要としてもよいことが理解されるべきである。例えば、このマーカーが決定される試料に含まれるタンパク質を、沈降させる必要がなくてもよい。これは、当業者によって考慮される。しかしながら、好ましくは、他の診断バイオマーカーおよびCA19-9の量を、同じ試料から誘導されるアリコート中で測定する。あるいは、他の診断バイオマーカーおよびCA19-9の量を、対象に由来する別々の試料から誘導されるアリコート中で測定してもよい。
【００９９】
実施形態においては、本発明の方法は、交絡因子に関する補正を実行することをさらに含んでもよい。好ましくは、本発明による対象の試料中で決定される値または比は、年齢、体格指数(BMI)、性別または元々存在する疾患、例えば、腎不全および/または肝不全について調整される。あるいは、年齢、BMI、および/または性別について同様に調整された値または比から、参照を誘導することができる(実施例を参照されたい)。そのような調整を、調査しようとする対象とこれらのパラメータに関して本質的に同一である個々の対象の対象群から、参照および基礎となる値または比を誘導することによって行うことができる。あるいは、調整を、統計的計算によって行ってもよい。かくして、交絡因子に関する補正を実行することができる。好ましい交絡因子は、年齢、BMI(体格指数)および性別である。
【０１００】
別の実施形態においては、交絡因子に関する補正を実行しない。好ましくは、交絡因子である年齢、BMIおよび性別に関する補正を実行しない。体格指数および性別などのある特定の患者の特徴の知識がない場合であっても診断を行うことができるため、これは有利であり得る。かくして、実施形態においては、体格指数および/または性別は未知である(かくして、診断のために考慮しない)。
【０１０１】
診断方法と関連する用語「参照」は、当業界で周知である。本発明による参照は、膵癌の診断を可能にするべきである。当業者であれば、好適な参照を苦もなく確立することができる。用語「参照」は、好ましくは、医学的状態、すなわち、本明細書に記載の疾患の存在もしくは非存在、疾患状態もしくは効果と相関させることができる特徴的特徴の値、または前記値から誘導される計算値もしくは複数の計算値を指す。好ましくは、参照は、データベースなどの好適なデータ記憶媒体中に保存され、かくして、将来の評価にとって利用可能でもある。
【０１０２】
好ましくは、参照は、膵癌に罹患することが知られる対象もしくは対象群から決定および/もしくは算出された値であるか、または見かけ上健康な対象もしくは対象群から決定および/もしくは算出された値、すなわち、「参照量」である。
【０１０３】
適用される参照は、本発明の方法において決定されるそれぞれの診断バイオマーカーに関する個々の参照であってもよい。したがって、本発明の方法のステップa)に記載のそれぞれの診断バイオマーカーの量を、それぞれの診断バイオマーカーに関する参照量と比較する。例えば、4種の診断バイオマーカーがステップa)において決定される場合、4種の参照量(第1のバイオマーカーに関する参照量、第2のバイオマーカーに関する参照量、第3のバイオマーカーに関する参照量、および第4のバイオマーカーに関する参照量)がステップb)において適用される。診断バイオマーカーの量と、参照量との比較に基づいて、膵癌の診断、すなわち、本明細書に記載の対象が膵癌に罹患するか否かが確立される。当業者であれば、参照量が決定ステップにおいて決定された量である必要はないが、当業者には周知の数学的計算によってそれから誘導された値であってもよいことを理解できる。好ましくは、参照量は、本発明と関連して記載されるバイオマーカー、好ましくは、診断バイオマーカーに関する閾値であり、それによって、閾値よりも高い(またはマーカーによっては、低い)、調査しようとする試料中に見出される値は、膵癌の存在を示すが、より低い(またはマーカーによっては、より高い)値は、膵癌の非存在を示す。
【０１０４】
診断アルゴリズム、すなわち、診断を得るために適用される計算規則の特定のセットは、参照に依存してもよい。参照量が、例えば、膵癌に罹患することが知られる対象または対象群から誘導される場合、膵癌の存在は、好ましくは、参照と本質的に同一である試験試料中の量によって示される。参照量が、例えば、見かけ上健康な対象または対象群から誘導される場合、膵癌の存在は、好ましくは、参照と比較して異なる(例えば、増加(「アップ」)または減少(「ダウン」)している)試験試料中の診断バイオマーカーの量によって示される。
【０１０５】
本発明の上記方法によれば、参照量(または複数の参照量)は、好ましくは、膵癌に罹患することが知られる対象または対象群に由来する試料から得られた参照量(または複数の参照量)である。そのような場合、本質的に同一である少なくとも1つの試験試料中に見出されるそれぞれの診断バイオマーカーに関する値は、疾患、すなわち、膵癌の存在を示す。さらに、参照量はまた、好ましくは、膵癌に罹患することが知られていない対象または対象群、好ましくは、見かけ上健康な対象または対象群に由来するものであってもよい。そのような場合、参照量に関して変化する、好ましくは、表1に示される方向に変化する試験試料中に見出されるそれぞれの診断バイオマーカーの値は、疾患の存在を示す。あるいは、参照量に関して本質的に同一である試験試料中に見出されるそれぞれの診断バイオマーカーの値は、疾患の非存在を示す。同じことが、計算された参照、最も好ましくは、調査しようとする対象を含む個体の集団における診断バイオマーカーの相対値または絶対値に関する平均値または中央値についても変更すべきところは変更して適用される。集団の前記個体のバイオマーカーの絶対値または相対値を、本明細書の他の場所に特定されるように決定することができる。好適な参照値、好ましくは、平均値または中央値を算出する方法は、当業界で周知である。以前に記載された対象の集団は、複数の対象、好ましくは、少なくとも5、10、50、100、1,000または10,000の対象を含むべきである。本発明の方法によって診断される対象および前記複数の対象のうちの対象は、同じ種のものであることが理解されるべきである。
【０１０６】
バイオマーカーおよび参照に関する、特徴的特徴に関する値、定量的決定の場合、強度値、またはそれから誘導される値が本質的に同一である場合、試験試料のバイオマーカーの値および参照量は、本質的に同一である。本質的に同一であるとは、2つの値の間の差異が、好ましくは、有意ではなく、強度に関する値が、少なくとも参照値の1〜99パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、40〜60パーセンタイルの区間に入る、好ましくは、参照値の50、60、70、80、90または95パーセンタイルに入ることを特徴とするべきであることを意味する。2つの量または値が本質的に同一であるかどうかを決定するための統計的検定は、当業界で周知であり、本明細書の他の場所にも記載されている。他方、2つの値に関する観察された差異は、統計的に有意であるべきである。相対または絶対値における差異は、好ましくは、参照値の45〜55パーセンタイル、40〜60パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、1〜99パーセンタイルの区間の外側で有意である。好ましい実施形態においては、特徴的特徴の値はまた、本明細書の他の場所に記載される「エラスティックネット」のような分類アルゴリズムのスコアなどの計算された出力であってもよい。
【０１０７】
より好ましくは、参照は、例えば、本明細書の以下で特定されるような、2つの対象または群間を区別する参照スコアまたはカットオフ値として、診断しようとする特性において異なることが知られる前記2つの対象または対象群、例えば、膵癌に罹患することが知られる対象または対象群および見かけ上健康な対象または対象群から誘導される。当業者であれば、区別するべき他の対象群を、例えば、カットオフ値を確立するために同様に用いることができることを理解できる。好ましくは、膵癌に罹患することが知られる対象群は、慢性膵炎に罹患することが知られる対象群と区別される;または膵癌に罹患することが知られる対象群は、非膵対照と区別される;または膵癌に罹患することが知られる対象群は、慢性膵炎に罹患することが知られる対象群および/または非膵対照と区別される;または膵癌に罹患することが知られる対象群は、好ましくは、慢性膵炎患者、非膵対照、糖尿病患者、および/もしくは非糖尿病対象を含む全ての非癌対象と区別される;または膵癌に罹患することが知られる対象群は、糖尿病対象と区別される。さらに、2つ以上のカットオフ値を提供することができる、例えば、2つのカットオフ値を決定することができ、ここで、第1および第2のカットオフの間隔は、好ましくは、診断しようとする疾患に罹患するリスクの増大の診断を規定することができ、例えば、患者のより密接なモニタリングを保証する。
【０１０８】
用語「比較すること」は、好ましくは、診断バイオマーカーの決定された値、またはスコア(以下を参照されたい)が、参照と本質的に同一であるか、またはそれとは異なるかどうかを決定することを指す。上記の比較に基づいて、対象を、膵癌に罹患するか否かについて評価することができる。本明細書に記載の診断バイオマーカーについて、変化の方向の種類(すなわち、より高い、またはより低い相対および/または絶対量または比をもたらす「アップ」または「ダウン」または増加または減少)は、実施例のセクションの表1に示される。適用しようとする参照または複数の参照に対して診断アルゴリズムを調整することができることが理解されるべきである。本明細書に提供される診断に基づいて好適な参照値および/または診断アルゴリズムを確立することができる当業者であれば、これを考慮に入れる。比較は、好ましくは、自動化によって支援される。例えば、2つの異なるデータセット(例えば、特徴的特徴の値を含むデータセット)の比較のためのアルゴリズムを含む好適なコンピュータプログラムを用いることができる。そのようなコンピュータプログラムおよびアルゴリズムは、当業界で周知である。上記にも拘わらず、比較を手動で実行することもできる。
【０１０９】
本発明の方法のステップb)の文脈においては、本発明の方法のステップa)に記載の診断バイオマーカー群の量を、参照と比較するべきである。本明細書で用いられる場合、用語「診断バイオマーカーの前記量と参照とを比較すること」は、好ましくは、1対1ベースで、前記量を、対応する参照と比較することに関する。
【０１１０】
表1から誘導することができるように、参照量と比較して増加したホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22;6)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、および/またはスフィンゴミエリン(41:2)の量は、膵癌の存在(およびかくして、膵癌の診断）を示すが、参照値と比較して減少した、または本質的に同一の量は、膵癌の非存在を示すべきである。好ましくは、前記参照量は、健康な対照の対象(すなわち、膵癌に罹患することが知られていない対象)、または健康な対照の対象から誘導される参照量である。好ましい実施形態においては、前記用語は、前記値から誘導される1以上の計算値を、好ましくは、本明細書の他の場所に特定される参照集団から変更すべきところは変更して算出された参照値または複数の参照値と比較することに関する。それにより、本明細書に記載の疾患の存在または非存在が診断される。
【０１１１】
また、表1から誘導することができるように、参照量と比較して減少したヒスチジン、プロリン、トリプトファン、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、および/またはリソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)の量は、膵癌の存在(およびかくして、膵癌の診断)を示すべきであるが、参照量と比較して増加した、または本質的に同一の量は、膵癌の非存在を示すべきである。好ましくは、前記参照量は、健康な対照の対象(すなわち、膵癌に罹患することが知られていない対象)、または健康な対照の対象から誘導される参照量である。
【０１１２】
CA19-9について、この診断バイオマーカーの量の増加は、膵癌の存在(およびかくして、膵癌の診断)を示すが、量の減少または本質的に同一であることは、膵癌の非存在を示す。
【０１１３】
より好ましくは、用語「診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較すること」は、本発明の方法のステップa)に記載の診断バイオマーカーの量に基づいてスコア(特に、単一のスコア)を算出すること、および前記スコアを、参照スコア、または好ましくは、カットオフと比較することに関する。好ましくは、スコアは、対象に由来する試料中の診断バイオマーカーの量に基づく。算出されたスコアは、診断バイオマーカーの量に関する情報を組み合わせる。スコアを、膵癌を診断するための分類パラメータと見なすことができる。特に、当業者であれば、単一のスコアに基づいて、および参照スコアとの比較に基づいて診断を提供することができる。参照スコアは、好ましくは、試験しようとする対象における膵癌の存在と膵癌の非存在との区別を可能にする値、特に、カットオフ値である。好ましくは、参照スコアは、単一の値である。かくして、当業者であれば、個々の診断バイオマーカーの量に関する全情報を解釈する必要はない。
【０１１４】
かくして、本発明の好ましい実施形態においては、本発明の方法のステップb)に記載された診断バイオマーカーの量と参照との比較は、ステップa)に記載された診断バイオマーカーの決定された量に基づいてスコアを算出するステップb1)、およびかくして算出されたスコアを参照スコアと比較するステップb2)を包含する。あるいは、この比較の結果をスコア(特に、単一のスコア)の算出のために用いる場合、および前記スコアを参照スコアと比較する場合、それぞれの診断バイオマーカーの量を参照と比較する。
【０１１５】
本明細書の他の場所に記載されるように、上記方法は、ステップa)において、CA19-9の量の決定をさらに含んでもよい。CA19-9の量は、ステップb)において算出されるスコアに寄与し得る。したがって、方法は、好ましくは、以下のステップ:
a)本明細書に記載の対象の試料中で、上記の低分子診断バイオマーカーの量およびCA19-9の量を決定するステップ;ならびに
b1)低分子診断バイオマーカーの決定された量およびステップa)に記載のCA19-9の量に基づくスコアを算出するステップ、ならびに
b2)かくして、算出されたスコアを参照スコアと比較することによって、膵癌を診断するステップ
を含む。
【０１１６】
あるいは、CA19-9の量は、ステップb1)で算出されたスコアに寄与しなくてもよい。したがって、前記方法は、好ましくは、以下のステップ:
a)本明細書に記載の対象の試料中で、上記の低分子診断バイオマーカーの量およびCA19-9の量を決定するステップ;ならびに
b1)低分子診断バイオマーカーの決定された量に基づくスコアを算出するステップ、および
b2)かくして、算出されたスコアを参照スコアと比較し、CA19-9の量を参照と比較することによって、膵癌を診断するステップ
を含む。
【０１１７】
好ましくは、スコアは、好適なスコアリングアルゴリズムに基づいて算出される。前記スコアリングアルゴリズムは、好ましくは、決定されるバイオマーカーの量に基づいて、対象が本明細書に記載の疾患に罹患するか否かの区別を可能にするべきである。好ましくは、前記スコアリングアルゴリズムは、本明細書に記載の膵癌に罹患している患者および膵癌に罹患していない患者に由来する試料中の、ステップa)に記載の個々のバイオマーカーの量に関する情報を比較することによって、予め決定されたものである。したがって、ステップb)はまた、スコアリングアルゴリズムを決定または実行するステップb0)を含んでもよい。好ましくは、このステップは、ステップb1)およびb2)の前に実行される。
【０１１８】
好ましくは、参照スコアは、対象が本明細書に記載の膵癌に罹患するか否かの区別を可能にするべきである。好ましくは、診断は、試験対象のスコアが参照スコアの上または下であるかどうかを評価することによって行われる。かくして、実施形態においては、正確な参照スコアを提供する必要はない。好ましくは、参照スコアは、上記スコアと同じマーカーを指す。参照スコアは、対象における膵癌の存在と非存在との区別を可能にする「カットオフ」値であってもよい。
【０１１９】
膵癌に罹患している対象群を、膵癌に罹患しない対象群から区切るカットオフ値を、当業界で周知のアルゴリズムによって、例えば、いずれかの群に見出されるバイオマーカーの量に基づいて算出することができる。典型的には、カットオフ値は、好ましくは、感度、特異度、および調査しようとする対象のある特定の集団における疾患に関する期待される、既知の(例えば、文献から)または推定される(例えば、前向きコホート研究に基づく)有病率に基づいて決定することができる。好ましくは、受信者操作特性(ROC)を、カットオフ値を決定するために用いることができる(Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577)。ROC技術を適用するための方法は、当業者には周知であり、本発明の方法において好ましく用いられるカットオフ値は、疾患に罹患している対象と、疾患に罹患していない対象との識別を可能にするカットオフ値である。高感度をもたらす参照スコアは、より低い特異度をもたらし、逆もまた同様であることが理解される。かくして、感度および特異度を、本発明の方法の意図される使用事例に応じて調整することができる。実施形態においては、感度および特異度は、偽陰性群が最小であり、リスクが高い対象を効率的に排除するように調整される(すなわち、除外);別の実施形態においては、感度および特異度は、偽陽性群が最小であり、対象を、リスクが高いと効率的に評価するように調整される(すなわち、包含)。さらなる実施形態においては、最適化された精度に関する参照スコアを、当業者には周知の方法を用いて、例えば、「Youden Index」を最大化することにより取得することができる。さらに、曲線下面積(AUC)値をROCプロットから誘導し、カットオフ独立、バイオマーカーの全体的な性能に関する示唆を与えることができる。さらに、ROC曲線のそれぞれの点は、ある特定のカットオフ値での感度と特異度の対を表す。
【０１２０】
実施形態においては、参照スコアは、参照スコアと比較した試験対象のスコアの値の増加は、膵癌の存在を示す、および/または参照スコアと比較した試験対象のスコアの値の減少は、膵癌の非存在を示す。特に、スコアは、カットオフ値であってもよい。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態(例えば、方法、デバイス、使用などの)においては、参照スコアは、単一のカットオフ値である。好ましくは、前記値は、試験対象を、膵癌に罹患している対象群または膵癌に罹患していない対象群に割り当てることを可能にする。好ましくは、参照スコアよりも低い対象のスコアは、前記対象における膵癌の非存在を示す(およびかくして、膵癌を除外するために用いることができる)が、参照スコアより大きい対象のスコアは、前記対象における膵癌の存在を示す(およびかくして、膵癌を包含させるために用いることができる)。
【０１２２】
本発明の別の好ましい実施形態(例えば、方法、デバイス、使用などの)においては、参照スコアは、参照スコア範囲である。この文脈では、膵癌の存在を示す参照スコア範囲、膵癌の非存在を示す参照スコア範囲、または2つの参照スコア範囲(すなわち、膵臓癌の存在を示す参照スコア範囲と、膵癌の非存在を示す参照スコア範囲)を適用することができる。膵癌を除外するべきである場合、膵癌の非存在を示す参照スコア範囲を適用することができる。膵癌を包含させるべきである場合、膵癌の存在を示す参照スコア範囲を適用することができる。対象が膵癌に罹患するか否かを診断するべきである場合、上記の2つの参照スコア範囲を適用することができる。好ましくは、対象のスコアを、参照スコア範囲(または複数の範囲)と比較する。好ましくは、スコアが膵癌の非存在を示す参照スコア範囲内にある場合、膵癌の非存在が診断される。あるいは、スコアが膵癌の存在を示す参照スコア範囲内にある場合、膵癌の存在が診断される。
【０１２３】
当業者であれば、好適なスコアリングアルゴリズムを、ステップa)に記載の診断バイオマーカーを用いて苦もなく決定することができる。例えば、スコアリングアルゴリズムは、膵癌に罹患している、および膵癌に罹患していない対象のコホートにおける診断バイオマーカーの量に関する情報を使用する数学的関数であってもよい。スコアリングアルゴリズムを決定するための方法は、当業界で周知であり、Significance Analysis of Microarrays、Tree Harvesting、CART、MARS、Self Organizing Maps、Frequent Item Set、Bayesian networks、Prediction Analysis of Microarray (PAM)、SMO、Simple Logistic Regression、Logistic Regression、Multilayer Perceptron、Bayes Net、Naive Bayes、Naive Bayes Simple、Naive Bayes Up、IB1、Ibk、Kstar、LWL、AdaBoost、ClassViaRegression、Decorate、Multiclass Classifier、Random Commit-tee、j48、LMT、NBTree、Part、Random Forest、Ordinal Classifier、Sparse Linear Programming (SPLP)、Sparse Logistic Regression (SPLR)、Elastic net、Support Vector Machine、Prediction of Residual Error Sum of Squares (PRESS)、Penalized Logistic Regression、Mutual Informationが挙げられる。好ましくは、スコアリングアルゴリズムは、本明細書の他の場所に記載の交絡因子に関する補正あり、またはなしで決定される。実施形態においては、スコアリングアルゴリズムは、診断バイオマーカーと共にエラスティックネットを用いて決定される。
【０１２４】
本発明の方法の好ましい実施形態においては、異なる参照スコアは、試料中で決定されるCA19-9の濃度の値に基づいて提供される。好ましくは、対象がLewis陽性対象であることを示すCA19-9の値、好ましくは、5U/mlを超える値、好ましくは、2U/mlを超える値が決定される場合、参照値は上記で特定されたように決定される;対象がLewis陰性対象であることを示すCA19-9の値、好ましくは、5U/ml以下の値、好ましくは、2U/ml以下の値が決定される場合、参照値はCA19-9濃度より有意に少ない重み、好ましくは、0の重みに起因して決定される。また好ましくは、異なる重みは、以下のクラスのCA19-9濃度:0U/ml以下の検出限界から2U/mlまでの、2U/mlを超えるものから15U/mlまでの、および15U/mlを超えるCA19-9濃度に起因する。より好ましくは、異なる重みは、以下のクラスのCA19-9濃度:0U/ml以下の検出限界から2U/mlまでの、2U/mlを超えるものから12U/mlまでの、および12U/mlを超えるCA19-9濃度に起因する。
【０１２５】
さらに好ましい実施形態においては、本発明の代謝バイオマーカーに加えて、対象のデータ、例えば、年齢、性別など、および/またはBMI、体重、血圧、血液型のような臨床パラメータ、および/または喫煙、アルコール消費、食事などの生活スタイルの危険因子を含む対象のスコアを算出する。
【０１２６】
実施形態においては、例えば、Rパッケージglmnet(例えば、Zou, H. and Hastie, T., 2003: Regression shrinkage and selection via the elastic net, with applications to microarrays. Journal of the Royal Statistical Society: Series B, 67, 301-320; Friedman, J., Hastie, T., and Tibshirani, R, 2010: Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. J. Stat. Softw. 33により開示されている)に実装されたようなエラスティックネットアルゴリズムを用いることによって適合されたロジスティック回帰モデルを用いて、対象のスコアを算出する。
【０１２７】
好ましくは、スコアは、本明細書の他の場所に特定される予測スコアとして算出される。
【０１２８】
好ましくは、膵癌診断の分類子は、好ましくは、Zou and Hastie ((2005) Regularization and variable selection via the elastic net, Journal of the Royal Statistical Society, Series B, 67, 301-320)により記載されたように、診断バイオマーカーの所定の群上でエラスティックネットアルゴリズムを訓練することによって得られる。
【０１２９】
好ましい実施形態においては、カットオフ値を、診断バイオマーカーから得られた値と比較する;より好ましくは、前記カットオフ値は、性別特異的カットオフであり、一例として、好ましくは、表16に記載の性別特異的カットオフ値である。さらに好ましい実施形態においては、診断バイオマーカーの量と参照との比較は、本明細書の他の場所で特定される、対象に関する予測スコアを算出するステップを含む;一例として、例えば、好ましくは、表13〜15のパラメータおよび診断バイオマーカーを用いることができる。
【０１３０】
前記方法を、対象が上記疾患に対する治療から利益を得るか、またはそれを必要とするかどうかを決定するために適用することもできることが理解される。そのような方法を、「積極的監視（能動的監視）」のような治療手法において適用することができる。この手法では、例えば、あまり進行していない膵炎に罹患している対象を、短い間隔で規則的に上記の膵癌を診断するための方法にかけて、膵癌の発症を早期に検出する。膵癌が検出可能になった後にのみ、本明細書の以下で特定されるように、対象を、外科手術または照射などの好適な治療によって処置する。かくして、「積極的監視」は、治療をすぐには要しない対象における治療の有害な副作用を防止する。この段階での治療を回避することによって、治療の有害な副作用を同様に回避することができることが理解される。
【０１３１】
有利には、バイオマーカーCA19-9と、特定の、手で選択されたバイオマーカーとの組合せが、膵癌を診断する診断性能を改善することが本発明の基礎となる研究において見出された。特に、バイオマーカー群、例えば、CA19-9を除いて、1回のLC-MS/MSの実行で決定することができ、かくして、信頼できる診断にとって必要とされる努力を少なくする、本発明の診断バイオマーカーを選択することができることが見出された。さらに、特定のバイオマーカー群を用いて、特定の患者サブグループ、例えば、低いLewis a/b抗原を有する患者、新規発症糖尿病を有する患者、もしくは慢性膵炎を有する患者における膵癌の予測、または腫瘍がまだ切除可能である初期ステージの膵癌の診断も可能であることが見出された。
【０１３２】
上で為された定義は、変更すべきところは変更して以下にも適用される。以下でさらに為されるさらなる定義および説明も、本明細書に記載の全ての実施形態について変更すべきところは変更して適用される。
【０１３３】
本発明はさらに、対象における膵癌を処置する方法であって、本発明の膵癌を診断する方法に従って前記対象における膵癌を診断すること、および前記対象における前記膵癌を処置することを含む、前記方法に関する。
【０１３４】
本発明はさらに、対象における膵癌を処置する方法であって、本発明の膵癌を診断する方法に従って膵癌の診断を提供すること、および前記対象における前記膵癌を処置することを含む、前記方法に関する。
【０１３５】
用語「処置すること（治療すること）」とは、本明細書に記載の疾患もしくは障害またはそれに伴う症状を、有意な程度で改善することを指す。本明細書で用いられる前記処置はまた、本明細書に記載の疾患または障害に関する健康の全体的な回復も含む。本発明に従って用いられる処置は、処置される全ての対象において有効でなくてもよいことが理解されるべきである。しかしながら、この用語は、本明細書に記載の疾患または障害に罹患する対象の統計的に有意な部分を上手く処置することができることを必要とするべきである。当業者であれば、ある部分が統計的に有意であるかどうかを、本明細書の他の場所に示される様々な周知の統計評価手段を用いて苦もなく決定することができる。
【０１３６】
本明細書で用いられる用語「膵癌を処置すること」とは、膵癌を治癒もしくは改善することを目指す、または前記疾患の進行を防止することを目指す治療手段ならびにモニタリング手段の選択およびモニタリング頻度および入院を含むモニタリングなどの患者の健康管理手段を指す。好ましくは、前記処置することは、外科手術、癌治療の投与、患者モニタリング、積極的監視、および入院からなる群から選択される手段を含む。より好ましくは、前記処置することは、外科および/または癌治療の投与を含む。好適な癌治療は、低用量および高用量の照射、ならびに全身化学療法、例えば、細胞増殖抑制剤のみ、または他の薬物と組み合わせた細胞増殖抑制剤を含む。好ましい外科手術に基づく治療は、膵頭十二指腸切除術、膵体尾部切除術、膵全切除術または膵部分切除術、および緩和的ブリッジング手順などの、膵臓またはその一部の切除を含む。薬物に基づく治療は、好ましくは、限定されるものではないが、白金誘導体、例えば、オキサリプラチン、フルオロピリミジン、ピリミジン類似体、ゲムシタビン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、サントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、標的化抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤などの、抗腫瘍特性を有する1種以上の薬物の投与を含む。特に好ましい薬物としては、限定されるものではないが、ゲムシタビン単独、またはエルロチニブおよび/もしくはオキサリプラチンと組み合わせたゲムシタビンが挙げられる。本発明の方法のより好ましい実施形態においては、前記方法は、前記治療手段または患者健康管理手段を対象に適用するステップも含む。
【０１３７】
本発明はさらに、試料中の、バイオマーカー、好ましくは、診断バイオマーカー、より好ましくは、低分子診断バイオマーカーを検出する方法であって、
(a)非相分離性のタンパク質沈降溶液を前記試料に添加するステップ、
(b)沈降したタンパク質を除去するステップ、
(c)クロマトグラフィーによって非タンパク質性画分中の前記バイオマーカーを分離するステップ、および
(d)バイオマーカーを検出するステップ
を含む、前記方法に関する。
【０１３８】
本発明のバイオマーカーを検出する方法は、好ましくは、in vitroでの方法である。さらに、それは、上に明示的に記載されたものに加えたステップを含んでもよい。例えば、さらなるステップは、例えば、ステップ(a)のための試料を取得すること、またはステップ(d)で得られる値から誘導される値を算出することに関するものであってもよい。さらに、1つ以上の前記ステップを、自動化された装備によって実行してもよい。好ましくは、前記方法においては、CA19-9ではない本発明の少なくとも1種の診断バイオマーカーを決定する。より好ましくは、CA19-9を除く、本発明の少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、または少なくとも7種の診断バイオマーカー、好ましくは、表9のパネルの低分子診断バイオマーカーを決定する。好ましくは、表9のパネルの少なくとも低分子診断バイオマーカーを決定する。好ましくは、バイオマーカーを検出するための方法は、本発明による膵癌を診断する方法において用いられる。好ましい実施形態においては、バイオマーカーを検出する方法は、試料中のアミノ酸および脂質を検出するための方法である。
【０１３９】
本明細書に上記された通り、用語「非相分離性のタンパク質沈降溶液」は、溶液からタンパク質を沈降させるさらなる特性を有する、非相分離性、すなわち、単層の溶媒に関する。溶媒の混合物を含む、適切な溶媒は、当業界で公知である。好ましくは、非相分離性のタンパク質沈降溶液は、ジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、第3級ブチルメチルエーテル(tBMEまたはMTBE、2-メトキシ-2-メチルプロパンとしても知られる)、エタン酸エチル、およびイソオクタンからなる群から選択される第1の溶媒と、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよびジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群から選択される第2の溶媒とを含む混合物である。より好ましくは、非相分離性のタンパク質沈降溶液は、特に、約2:1(v/v)〜約3:2(v/v)の比、好ましくは、約2:1(v/v)または約3:2(v/v)の比のメタノールおよびDCMを含む。より好ましくは、非相分離性のタンパク質沈降溶液は、2:1(v/v)の比のメタノール:ジクロロメタンを含む。好ましくは、用語「非相分離性溶液」は、その1/5容量の水および/またはジメチルスルホキシド(DMSO)が添加された場合でも、ただ1つの液相を有する溶液に関する。好ましくは、少なくとも3倍容量、より好ましくは、少なくとも4倍容量、最も好ましくは、少なくとも5倍容量の非相分離性のタンパク質沈降溶液を、所与の容量の試料または希釈された試料に添加する。好ましくは、非相分離性のタンパク質沈降溶液を添加する前に、試料を少なくとも4倍、より好ましくは5倍希釈する。好ましくは、試料の前記希釈において用いられる希釈剤は、少なくとも50%(v/v)のDMSOを含む、より好ましくは、少なくとも70%(v/v)のDMSOを含む溶液、さらにより好ましくは12.3:2.2:1.1:1(v/v/v/v)の比の、DMSO:メタノール:ジクロロメタン:水の溶液である。
【０１４０】
沈降したタンパク質を除去するための方法は、当業者には公知であり、好ましくは、遠心分離および/または濾過、好ましくは、限外濾過を含む。
【０１４１】
かくして、好ましい実施形態においては、本発明のバイオマーカーを検出する方法は、試料を、上記の非相分離性のタンパク質沈降溶液で予備処理することを含む。好ましくは、前記代謝物は、そのような場合、電子スプレー-イオン化(ESI)、より好ましくは陽イオンESIを含む方法によって決定される。さらに好ましい実施形態においては、前記方法は、前記第1の非相分離性のタンパク質沈降溶液で予備処理された試料を、第2の非相分離性のタンパク質沈降溶液で予備処理することを含み、前記第2の非相分離性のタンパク質沈降溶液は、希釈剤として、好ましくは、メタノールおよび/またはジクロロメタン、好ましくは、ジクロロメタンを用いた、異なる比および/または好適な希釈率の、第1の非相分離性のタンパク質沈降溶液について上記された第1の溶媒と第2の溶媒とを含むが、そのような場合、好ましくは、第1の非相分離性のタンパク質沈降溶液と、第2の非相分離性のタンパク質沈降溶液とを用いて得られた抽出物を混合した後、代謝物を決定する。さらに好ましい実施形態においては、上記で特定された第1の抽出の後、第1のアリコートが得られ、沈降したタンパク質を含む残留抽出物を、同じ非相分離性のタンパク質沈降溶液を用いてさらに希釈し、沈降したタンパク質の除去の後、試料の第2のアリコートが得られる;そのような場合、好ましくは、高濃度で存在すると予想されるか、または知られる代謝物を、第2のアリコートから決定し、低濃度で試料中に存在すると予想されるか、または知られる代謝物を、第1のアリコートから決定する。さらに好ましい実施形態においては、試料を、非相分離性のタンパク質沈降溶液で少なくとも5倍(v/v)、好ましくは、少なくとも10倍(v/v)、より好ましくは、少なくとも100倍(v/v)希釈し、沈降したタンパク質を除去した後、第1のアリコートが得られ、少なくとも一部、好ましくは全部の非相分離性のタンパク質沈降溶液または全ての液体を、好ましくは、減圧下で、残留抽出物から除去する;そのような場合、高濃度で存在すると予想されるか、または知られる代謝物を、第1のアリコートから決定し、低濃度で試料中に存在すると予想されるか、または知られる代謝物を、第2のアリコートから決定する。好ましくは、そのような場合、前記代謝物は、電子スプレー-イオン化(ESI)、より好ましくは、陽イオンおよび/または陰イオンESIを含む方法によって決定される。
【０１４２】
好ましくは、バイオマーカーを検出する方法は、非タンパク質性画分中のバイオマーカーを、疎水性側鎖を導入する試薬と接触させた後、玄理グラフィーによって非タンパク質性画分中の前記バイオマーカーを分離するさらなるステップ、すなわち、好ましくは、疎水性誘導体化のステップを含む。好ましくは、前記誘導体化は、非タンパク質性画分中のバイオマーカーを、疎水性側鎖を導入する試薬、さらにより好ましくは、疎水性側鎖を導入するただ1つの試薬と接触させることを含む、さらにより好ましくは、それらからなる。好ましくは、疎水性側鎖を導入する前記試薬は、アミノ基、好ましくは、第1級および第2級アミノ基を誘導体化する試薬である。より好ましくは、疎水性側鎖を導入する前記試薬は、5-(ジメチルアミノ)ナフタレン-1-スルホニルクロリド(ダンシルクロリド、CAS登録番号605-65-2)である。
【０１４３】
好ましくは、バイオマーカーを検出する方法において、タンパク質沈降は、クロマトグラフィーによって非タンパク質性画分中のバイオマーカーを分離するステップの前の唯一の精製ステップである。別の実施形態においては、バイオマーカーを検出する方法においては、タンパク質沈降は、誘導体化のステップの前の唯一の精製ステップであり、次いで、クロマトグラフィーによって非タンパク質性画分中の分析物を分離するステップを行う。
【０１４４】
バイオマーカーを分離する、およびバイオマーカーを検出する方法は、当業界で周知であり、本明細書に上記されている。好ましくは、分離ステップは、逆相クロマトグラフィー、より好ましくは、逆相液体クロマトグラフィーを含む。好ましくは、代謝物の検出は、質量分析(MS)、好ましくは、MS/MSによって行われる。かくして、代謝物を検出する方法のステップc)およびd)は、好ましくは、LC-MS/MSを用いて実行される。
【０１４５】
また好ましい実施形態においては、本発明はまた、対象における膵癌を診断するための方法であって、前記対象の少なくとも1つの試料中で、診断バイオマーカー群の量を決定するステップが、上記のバイオマーカーを検出する方法のステップの後に行われる、前記方法にも関する。
【０１４６】
好ましい実施形態においては、膵癌を診断する方法は、
(a)対象の少なくとも1つの試料中の本発明による診断バイオマーカー群の量を半定量的または好ましくは、定量的に決定するステップ、
(b1)ステップ(a)で決定されたそれぞれの量について、前記量から所定の診断バイオマーカー特異的減数を最初に減算した後、得られた値を所定の診断バイオマーカー特異的除数で除算することにより、スケーリングされた量を算出するステップ、
(b2)(i)(b1)のそれぞれのスケーリングされた量に、診断バイオマーカー特異的重み値を割り当てることによって、重み付けされた量を提供するステップ、
(ii)全ての診断バイオマーカーについて前記重み付けされた量を合計し、重み付けされた量の合計を提供するステップ、
(iii)好ましくは、バイアス値を、ステップ(ii)の重み付けされた量の合計に割り当てて、バイアス補正された合計を提供するステップ、
(iv)好ましくは、ステップ(iii)のバイアス補正された合計を、好ましくは、0〜1の値にスケーリングするステップ
により、予測スコアを算出するステップ、および
(b3)ステップ(b2)で決定された予測スコアに基づいて、対象が膵癌に罹患する確率を決定するステップ
を含む。
【０１４７】
対象が膵癌に罹患する確率を決定するための方法のステップ(a)は、好ましくは、上記で特定された膵癌を診断するための方法のステップ(a)に対応する。好ましくは、前記量から所定の診断バイオマーカー特異的減数を最初に減算した後、得られた値を所定の診断バイオマーカー特異的除数で除算することによって、測定値をスケーリングする。かくして得られた値から、個々のバイオマーカーを重み付けし、決定された全てのバイオマーカーについて重み付けされた値を合計した後、好ましくは、バイアス値を前記合計に割り当て、好ましくは、バイアス補正された合計を、好ましくは、0〜1の値にスケーリングすることによって、予測スコアを算出する。好ましくは、測定値のスケーリングは、好ましくは、前記所定の診断バイオマーカー特異的減数を減算した後、測定値をlog10変換することを含む。より好ましくは、予測スコアは、以下の式(I)
【０１４８】
【数１】
2018518683.tif 000003
(式中、
p = 予測スコア;
e = オイラー数;
ω0 = バイアス値;
ωi = 診断バイオマーカーiに関する診断バイオマーカー特異的重み値;および
【０１４９】
【数２】
2018518683.tif 000004
= 診断バイオマーカーiに関するスケーリングされた量
である)
に従って、予測スコアを算出する。
【０１５０】
好ましくは、
【０１５１】
【数３】
2018518683.tif 000005
【０１５２】
は、最初に分析物特異的定数miを減算した後、分析物特異的定数siで除算することによってlog10変換された入力データxをスケーリングし、log10変換され、スケーリングされたデータ
【０１５３】
【数４】
2018518683.tif 000006
:
【０１５４】
【数５】
2018518683.tif 000007
を得ることによって算出される。
【０１５５】
好ましくは、特定の疾患に罹患している対象と、前記疾患に罹患していない対象との差異を最適化することによって、所定の診断バイオマーカー特異的減数、所定の診断バイオマーカー特異的除数、診断バイオマーカー特異的重み値、およびバイアス値の最適値を決定する。かくして、好ましくは、診断バイオマーカー群を、好ましくは、既知の疾患状態を有する2つの対象群から得られたデータ上で訓練する。例えば、好ましくは、前記対象群の1つは、膵炎に罹患している対象群であり、第2群は膵癌に罹患している対象群である;このように、膵炎と膵癌との区別のための最適化されたパラメータを得る。
【０１５６】
さらに、本発明は、対象における少なくとも1つの診断バイオマーカーを決定することによって膵癌を診断するための方法であって、
(a)前記対象の試料中で、表2〜7のいずれか1つから選択される少なくとも1つの診断バイオマーカーの量を決定するステップ;および
(b)前記診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって、膵癌を診断するステップ
を含む、前記方法に関する。
【０１５７】
少なくとも1つの診断バイオマーカーを決定することによって膵癌を診断するための方法は、好ましくは、in vitroでの方法である。さらに、それは、上に明示的に記載されたものに加えてステップを含んでもよい。例えば、さらなるステップは、例えば、ステップa)のための試料を取得すること、または少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、好ましくは、本発明の少なくとも1つの診断バイオマーカーを決定することに関するものであってもよい。さらに、1つ以上の前記ステップを、自動化された装備によって実行することができる。
【０１５８】
少なくとも1つの診断バイオマーカーを決定することによって膵癌を診断するための方法に関して具体的に定義されていない用語の定義に関しては、上記の膵癌を診断するための方法の文脈で提供される定義が参照され、それは別途注記しない場合、変更すべきところは変更して適用可能である。
【０１５９】
好ましい実施形態においては、前記方法において、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、およびスフィンゴミエリン(35:1)からなる一覧から選択される。
【０１６０】
さらに好ましい実施形態においては、対象は、慢性膵炎に罹患している対象であり、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、およびリソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)からなる一覧から選択される。
【０１６１】
さらに好ましい実施形態においては、対象は、新規発症糖尿病に罹患している対象であり、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、プロリン、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、ヒスチジン、スフィンゴミエリン(41:2)、トリプトファン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、セラミド(d18:1,C24:0)、およびセラミド(d18:2,C24:0)からなる一覧から選択される。
【０１６２】
さらに好ましい実施形態においては、膵癌は、切除可能な膵癌であり、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、プロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、トリプトファン、ヒスチジン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、およびスフィンゴミエリン(41:2)からなる一覧から選択される。
【０１６３】
さらに好ましい実施形態においては、膵癌は、切除可能な膵癌であり、対象は、慢性膵炎に罹患している対象であり、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、スフィンゴミエリン(35:1)、セラミド(d18:2,C24:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、セラミド(d18:2,C24:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、およびトリプトファンからなる一覧から選択される。
【０１６４】
さらに好ましい実施形態においては、膵癌は、切除可能な膵癌であり、対象は新規発症糖尿病に罹患している対象であり、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、プロリン、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、トリプトファン、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(41:2)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)およびヒスチジンからなる一覧から選択される。
【０１６５】
さらに好ましい実施形態においては、少なくとも1つの診断バイオマーカーは、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、およびスフィンゴミエリン(35:1)からなる一覧から選択される。
【０１６６】
少なくとも1つの診断バイオマーカーを決定することによって膵癌を診断するための方法の好ましい実施形態においては、スフィンゴミエリン(35:1)は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)とスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)との量の合計である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)の量である。
【０１６７】
さらに、本発明は、本発明の膵癌を診断するための方法を実行するための診断デバイスであって、
a)本発明による診断バイオマーカー群の少なくとも低分子診断バイオマーカーのための少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであり、少なくとも1つの検出器によって検出される少なくとも前記低分子診断バイオマーカーの量を決定するために適合された前記分析ユニットと、それに機能し得る形で連結された、
b)低分子診断バイオマーカー、および好ましくは、CA19-9の決定された量の、参照との比較を実行するための明白に埋め込まれたコンピュータプログラムコードと、前記診断バイオマーカーのための前記参照を含むデータベースとを含むコンピュータを含む評価ユニットと
を含み、それによって、対象が膵癌に罹患するかどうかを診断する、前記診断デバイスに関する。
【０１６８】
本明細書で用いられる用語「デバイス（装置）」は、少なくとも上記ユニットを含む。デバイスのユニットは、互いに機能し得る形で連結される。機能し得る様式で手段を連結する方法は、デバイス中に含まれるユニットの種類に依存するであろう。例えば、検出器がバイオマーカーの自動的な定性的または定量的決定を可能にする場合、前記自動的に機能する分析ユニットにより得られるデータを、例えば、評価ユニット中での評価を容易にするためのコンピュータプログラムによってプロセッシングすることができる。そのような場合、好ましくは、ユニットは、単一のデバイスに含まれる。好ましくは、デバイスは、バイオマーカーのための分析ユニットと、評価のために得られるデータをプロセッシングするため、および出力情報を確立するための評価ユニットとしてのコンピュータまたはデータプロセッシングデバイスとを含む。好ましくは、分析ユニットは、本発明による少なくとも診断バイオマーカーまたは診断バイオマーカー群のための少なくとも1つの検出器を含み、前記少なくとも1つの検出器は、前記試料中の前記マーカーの量を決定する。好ましいデバイスは、臨床専門医の特定の知識がなくても適用することができるもの、例えば、単に試料をロードすればよい電子デバイスである。デバイスの出力情報は、好ましくは、試料の品質に関する結論を引き出すことを可能にする数値であり、かくして、診断の信頼性またはトラブルシューティングに対する支援である。本発明のデバイスに従って用いられる好ましい参照は、上記で特定されたように、分析されるバイオマーカーに関する値またはそれから誘導される値である。好ましくは、前記デバイスは、膵癌を診断するためのデバイスである。好ましくは、デバイスは、入力データ、好ましくは、CA19-9の量の値を受信するように適合された入力ユニットをさらに含む。
【０１６９】
また好ましくは、デバイスのユニットを、機能し得る形で互いに連結されたいくつかのデバイスを含むシステム中に実装することができる。本発明のシステムのために用いられるユニットに応じて、前記手段を、前記手段間でのデータ伝送を可能にする手段、例えば、光ファイバーケーブル、および高効率データ伝送のための他のケーブルにより、それぞれの手段を他の手段と接続することによって機能し得る形で連結してもよい。それにも拘わらず、例えば、LAN(無線LAN、W-LAN)を介する、手段間の無線データ伝送も、本発明によって想定される。好ましいシステムは、バイオマーカーを決定するための手段を含む。本明細書に記載のバイオマーカーを決定するための手段は、クロマトグラフィーデバイスなどの、バイオマーカーを分離するための手段と、質量分析デバイスなどの、代謝物決定のための手段とを包含する。好適なデバイスは、上記に詳述されている。本発明のシステムにおいて用いられる化合物分離のための好ましい手段は、クロマトグラフィーデバイス、より好ましくは、液体クロマトグラフィー、HPLC、および/またはガスクロマトグラフィーのためのデバイスを含む。化合物決定のための好ましいデバイスは、質量分析デバイス、より好ましくは、GC-MS、LC-MS、直接注入質量分析、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析、連続結合質量分析(MS-MSまたはMS-MS-MSを含む)、ICP-MS、Py-MSまたはTOFを含む。分離および決定手段を、好ましくは、互いに結合する。最も好ましくは、LC-MSおよび/またはLC-MS/MSを、本明細書の他の場所で詳細に説明される本発明のシステムにおいて用いる。さらに、バイオマーカーの決定のための手段から得られる結果を比較および/または分析するための手段が含まれるべきである。結果を比較および/または分析するための手段は、少なくとも1つのデータベースと、測定された値と、対応する参照との比較のための実装されたコンピュータプログラムとを含んでもよい。上記システムおよびデバイスの好ましい実施形態も、以下で詳細に説明される。
【０１７０】
さらに、本発明は、膵癌に罹患する対象、またはそうでない対象を示す、表9の少なくとも1つのパネルの少なくともマーカーの特徴値を含むデータ収集物に関する。
【０１７１】
用語「データ収集物」とは、物理的および/または論理的に一緒にグループ化されていてもよいデータの収集物を指す。したがって、データ収集物を、単一のデータ記憶媒体または互いに機能し得る形で連結された物理的に分離されたデータ記憶媒体中に実装することができる。好ましくは、データ収集物は、データベースの手段によって実装される。かくして、本明細書で用いられるデータベースは、好適な記憶媒体上のデータ収集物を含む。さらに、データベースは、好ましくは、データベース管理システムをさらに含む。データベース管理システムは、好ましくは、ネットワークに基づく、階層的またはオブジェクト指向性のデータベース管理システムである。さらに、データベースは、連邦データベースまたは統合データベースであってもよい。より好ましくは、データベースを、配布された(連邦)システムとして、例えば、クライアント-サーバー-システムとして実装する。より好ましくは、検索アルゴリズムに、試験データセットを、データ収集物に含まれるデータセットと比較させるように、データベースを構築する。具体的には、そのようなアルゴリズムを用いることにより、データベースを、上記の膵癌を示す類似する、または同一のデータセットについて検索することができる(例えば、問合せ検索)。かくして、同一の、または類似するデータセットを、データ収集物中で同定することができる場合、試験データセットを、疾患の存在と関連付ける、または関連付けない。結果として、データ収集物から得られた情報を、例えば、上記の本発明の方法のための参照として用いることができる。より好ましくは、データ収集物は、上記の群のいずれか1つに含まれる全ての診断バイオマーカーの特徴値を含む。
【０１７２】
前記に照らせば、本発明は、上記のデータ収集物を含むデータ記憶媒体を包含する。
【０１７３】
本明細書で用いられる用語「データ記憶媒体（データ格納媒体）」は、CD、CD-ROM、ハードディスク、光学記憶媒体、またはディスケットなどの、単一の物理的実体に基づくデータ記憶媒体を包含する。さらに、この用語は、好ましくは、問合せ検索のための好適な方法で、上記のデータ収集物を提供するような様式で互いに機能し得る形で連結された物理的に分離した実体からなるデータ記憶媒体をさらに含む。
【０１７４】
本発明はまた、膵癌を診断するため、または膵癌を診断するための医薬組成物および/もしくは診断組成物の調製のための、対象の試料中での、
(i)本発明による診断バイオマーカー群;または
(ii)本発明による診断バイオマーカー
の使用に関する。
【０１７５】
本明細書で引用される全ての参考文献は、その全開示内容および本明細書に具体的に記載される開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１７６】
上記を考慮すれば、以下の実施形態が好ましい。
【０１７７】
1. 対象における膵癌を診断するための方法であって、
(a)前記対象の少なくとも1つの試料中で、
(i)診断アミノ酸がプロリン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、好ましくは、プロリンである、少なくとも1つの診断アミノ酸;
(ii)診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)またはセラミド(d18:2,C24:0)であり、好ましくは、セラミド(d18:1,C24:0)である、少なくとも1つの診断セラミド;
(iii)診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(41:2)またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)であり、好ましくは、スフィンゴミエリン(35:1)である、少なくとも1つの診断スフィンゴミエリン;および
(iv)CA19-9
を含む診断バイオマーカー群の量を決定するステップと、
(b)診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって膵癌を診断するステップとを含む、前記方法。
【０１７８】
2. 前記対象が少なくとも40歳、好ましくは少なくとも50歳の対象である、実施形態1に記載の方法。
【０１７９】
3. 前記試料が、前記対象から得られた試料であるが、前記対象が、好ましくは少なくとも8時間にわたって絶食していた、実施形態1または2に記載の方法。
【０１８０】
4. 前記対象が、膵癌に罹患するリスクがある対象である、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０１８１】
5. 膵癌に罹患するリスクがある前記対象が、新規発症糖尿病を有する対象である、実施形態4に記載の方法。
【０１８２】
6. 膵癌に罹患するリスクがある前記対象が、慢性膵炎に罹患している対象である、実施形態4に記載の方法。
【０１８３】
7. 前記対象が、低いCA19-9値を有する対象である、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【０１８４】
8. 低いCA19-9値が、42U/mL未満、好ましくは、37U/mL未満の血中CA19-9値である、実施形態7に記載の方法。
【０１８５】
9. 前記対象が、Lewis a/b陰性の血液型である対象である、実施形態7または8に記載の方法。
【０１８６】
10. 前記対象が、膵癌に罹患することが疑われる対象である、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の方法。
【０１８７】
11. 膵癌に罹患することが疑われる前記対象が、好ましくは、腹痛、腰痛、悪心、嘔吐、および黄疸からなる一覧から選択される、膵癌の少なくとも1つの臨床症状を有する対象である、実施形態10に記載の方法。
【０１８８】
12. 膵癌に罹患することが疑われる前記対象が、膵癌または慢性膵炎に罹患することが疑われる対象である、実施形態10または11に記載の方法。
【０１８９】
13. 前記膵癌が、切除可能な腫瘍ステージを有する膵癌である、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【０１９０】
14. 前記診断アミノ酸がプロリンである、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０１９１】
15. 前記診断セラミドがセラミド(d18:1,C24:0)である、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の方法。
【０１９２】
16. 前記診断セラミドがセラミド(d18:2,C24:0)である、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の方法。
【０１９３】
17. 前記診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)である、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の方法。
【０１９４】
18. 前記診断アミノ酸がプロリンであり、前記診断セラミドがセラミド(d18:2,C24:0)である、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０１９５】
19. 前記診断アミノ酸がプロリンであり、前記診断スフィンゴミエリンがスフィンゴミエリン(35:1)またはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)である、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０１９６】
20. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるプロリン、セラミド(d18:1,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０１９７】
21. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるプロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０１９８】
22. 前記診断バイオマーカー群が、少なくとも1つの診断エタノールアミン脂質をさらに含み、前記診断エタノールアミン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)またはリソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)であり、好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)である、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０１９９】
23. 前記診断エタノールアミン脂質がホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)である、実施形態22に記載の方法。
【０２００】
24. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるプロリン、セラミド(d18:1,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０２０１】
25. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるプロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)およびCA19-9を含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０２０２】
26. 前記診断バイオマーカー群が、表9のパネルの少なくとも1つの診断バイオマーカー、好ましくは、表9のパネル1、2、6、7、11、82、9、89、44、10、58、46、66、13、31、30、92、86、48、81または90の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０２０３】
27. 前記対象が、慢性膵炎に罹患している対象であり、前記診断バイオマーカー群が、表9のパネル1、2、6、7、4、12、14、43、19、13、16、41、21、50、44、47、46、48、3、または5の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０２０４】
28. 前記対象が、新規発症糖尿病に罹患している対象であり、前記診断バイオマーカー群が、表9のパネル1、2、6、7、13、9、43、12、10、11、47、21、14、49、48、4、19、46、82または52の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０２０５】
29. 前記対象が、低いCA19-9値を有する対象であり、前記診断バイオマーカー群が、表9のパネル1、2、6、7、9、13、12、または3の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０２０６】
30. 前記膵癌が、切除可能な膵癌であり、前記診断バイオマーカー群が、表9のパネル1、2、6、7、3、4、5、9、10、12、13、14、15、16、18、19、11、21、22または30の診断バイオマーカーを含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０２０７】
31. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーであるCA19-9、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)、ヒスチジン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、プロリン、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(41:2)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、およびトリプトファンを含む、好ましくは、それらからなる、実施形態1〜30のいずれか1つに記載の方法。
【０２０８】
32. 前記スフィンゴミエリン(41:2)が、
スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)、スフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)、およびスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0);
スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)およびスフィンゴミエリン(d17:1,C24:1);
スフィンゴミエリン(d17:1,C24:1)およびスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0);
スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)およびスフィンゴミエリン(d18:2,C23:0);
スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1);
スフィンゴミエリン(d17:1,C24:1);または
スフィンゴミエリン(d18:2,C23:0)
である、実施形態1〜31のいずれか1つに記載の方法。
【０２０９】
33. 前記スフィンゴミエリン(35:1)が、
スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)およびスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0);
スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0);または
スフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)
である、実施形態1〜32のいずれか1つに記載の方法。
【０２１０】
34. 決定されたそれぞれのさらなるバイオマーカーが、前記方法の偽陽性率および/または偽陰性率を少なくとも0.1%減少させるか、またはAUCを有意に増加させる、実施形態1〜33のいずれか1つに記載の方法。
【０２１１】
35. 前記診断バイオマーカー群がスフィンガニン-1-リン酸(d18:0)を含まない、実施形態1〜34のいずれか1つに記載の方法。
【０２１２】
36. 前記診断バイオマーカー群がヒスチジンを含み、前記診断バイオマーカー群がスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)を含まない、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の方法。
【０２１３】
37. 診断バイオマーカーの量を決定することが、前記診断バイオマーカーの量を定量的に決定することである、実施形態1〜36のいずれか1つに記載の方法。
【０２１４】
38. 前記試料が、体液、好ましくは、血液、血漿、血清の試料、または尿試料、より好ましくは、血液試料、最も好ましくは、血漿試料である、実施形態1〜37のいずれか1つに記載の方法。
【０２１５】
39. 診断バイオマーカーの量と参照との前記比較が、前記量またはそれから算出された値を1つ以上のカットオフ値と比較することを含む、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の方法。
【０２１６】
40. 前記カットオフ値が、実施形態53〜55のいずれか1つに記載の方法に従って算出される、実施形態39に記載の方法。
【０２１７】
41. 前記カットオフ値が、性別特異的カットオフである、実施形態40に記載の方法。
【０２１８】
42. 前記方法が、ステップ(a)の前の沈降によって前記試料からタンパク質を除去するステップをさらに含む、実施形態1〜41のいずれか1つに記載の方法。
【０２１９】
43. 沈降によりタンパク質を除去する前記ステップが、非相分離性のタンパク質沈降溶液、好ましくは、2:1(v/v)の比のメタノール:ジクロロメタンを前記試料に添加することを含む、実施形態1〜42のいずれか1つに記載の方法。
【０２２０】
44. クロマトグラフィー、好ましくは、逆相クロマトグラフィー、より好ましくは、逆相液体クロマトグラフィーにより、前記少なくとも1つの診断セラミド、好ましくは、前記少なくとも1つの診断スフィンゴミエリンから、前記少なくとも1つの診断アミノ酸を分離するさらなるステップを含み、前記さらなるステップがステップ(a)に先行する、実施形態1〜43のいずれか1つに記載の方法。
【０２２１】
45. 試料中で、本発明の、バイオマーカーを検出する、好ましくは、診断バイオマーカーを検出する、より好ましくは、低分子診断バイオマーカーを検出する方法であって、
(a)非相分離性のタンパク質沈降溶液を前記試料に添加するステップ、
(b)沈降したタンパク質を除去するステップ、
(c)クロマトグラフィーによって非タンパク質性画分中の前記バイオマーカーを分離するステップ、および
(d)バイオマーカーを検出するステップ
を含む、前記方法。
【０２２２】
46. 前記試料が、血液、血漿、血清、または尿試料であり、好ましくは、血液試料、より好ましくは、血漿試料である、実施形態45に記載の方法。
【０２２３】
47. 前記非相分離性のタンパク質沈降溶液が、2:1(v/v)の比のメタノール:ジクロロメタンである、実施形態45または46に記載の方法。
【０２２４】
48. 前記試料を、少なくとも50%(v/v)のジメチルスルホキシド(DMSO)を含む、好ましくは、少なくとも70%(v/v)のDMSOを含む溶液、より好ましくは、12.3:2.2:1.1:1(v/v/v/v)の比のDMSO:メタノール:ジクロロメタン:水の溶液で希釈するステップをさらに含む、実施形態45〜47のいずれか1つに記載の方法。
【０２２５】
49. ステップ(c)の前に、前記バイオマーカーを、疎水性側鎖を導入する試薬と接触させるさらなるステップを含み、疎水性側鎖を導入する前記試薬が、アミノ基、好ましくは、第1級および第2級アミノ基を誘導体化する試薬である、実施形態45〜48のいずれか1つに記載の方法。
【０２２６】
50. 疎水性側鎖を導入する前記試薬が、5-(ジメチルアミノ)ナフタレン-1-スルホニルクロリド(ダンシルクロリド、CAS登録番号605-65-2)である、実施形態45〜49のいずれか1つに記載の方法。
【０２２７】
51. 対象における膵癌を処置する方法であって、
実施形態1〜44のいずれか1つに従って前記対象における膵癌を診断するステップ、および
前記対象における前記膵癌を処置するステップ
を含む、前記方法。
【０２２８】
52. 対象における膵癌を処置する方法であって、
実施形態1〜44のいずれか1つに従って膵癌の診断を提供するステップ、および
前記対象における前記膵癌を処置するステップ
を含む、前記方法。
【０２２９】
53. 実施形態1〜44のいずれか1つに記載の膵癌を診断するための方法であって、
(a)対象の少なくとも1つの試料中で、実施形態1〜44のいずれか1つに記載の診断バイオマーカー群の量を半定量的および/または定量的に、好ましくは、定量的に決定するステップ、
(b1)ステップ(a)で決定されたそれぞれの量について、所定の診断バイオマーカー特異的減数を前記量から最初に減算した後、得られる値を所定の診断バイオマーカー特異的除数で除算することにより、スケーリングされた量を算出するステップ、
(b2)(i)(b1)のそれぞれのスケーリングされた量に、診断バイオマーカー特異的重み値を割り当てることによって、重み付けされた量を提供するステップ、
(ii)全ての診断バイオマーカーについて前記重み付けされた量を合計し、重み付けされた量の合計を提供するステップ、
(iii)好ましくは、バイアス値を、ステップ(ii)の重み付けされた量の合計に割り当てて、バイアス補正された合計を提供するステップ、
(iv)好ましくは、ステップ(iii)のバイアス補正された合計を、好ましくは、0〜1の値にスケーリングするステップ
により、予測スコアを算出するステップ、および
(b3)ステップ(b2)で決定された予測スコアに基づいて、対象が膵癌に罹患する確率を決定するステップ
を含む、前記方法。
【０２３０】
54. 前記量が、ステップ(b)で前記量をスケーリングする前にlog10変換される、実施形態53に記載の方法。
【０２３１】
55. 前記予測確率が、以下の式(I)
【０２３２】
【数６】
2018518683.tif 000008
(式中、
p = 予測スコア;
e = オイラー数;
ω0 = バイアス値;
ωi = 診断バイオマーカーiに関する診断バイオマーカー特異的重み値;および
【０２３３】
【数７】
2018518683.tif 000009
= 診断バイオマーカーiに関するスケーリングされた量
である)
に従って算出される、実施形態53または54に記載の方法。
【０２３４】
56. 対象における膵癌を診断するための方法であって、
(a)前記対象の試料中で、表2〜7のいずれか1つから選択される少なくとも1つの診断バイオマーカーの量を決定するステップ;および
(b)前記診断バイオマーカーの前記量を、参照と比較することによって、膵癌を診断するステップ
を含む、前記方法。
【０２３５】
57. 前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、およびスフィンゴミエリン(35:1)からなる一覧から選択される、実施形態56に記載の方法。
【０２３６】
58. 前記対象が、慢性膵炎に罹患している対象であり、前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、スフィンゴミエリン(35:1)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、およびリソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)からなる一覧から選択される、実施形態56に記載の方法。
【０２３７】
59. 前記対象が、新規発症糖尿病に罹患している対象であり、前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、プロリン、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、ヒスチジン、スフィンゴミエリン(41:2)、トリプトファン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、セラミド(d18:1,C24:0)、およびセラミド(d18:2,C24:0)からなる一覧から選択される、実施形態56に記載の方法。
【０２３８】
60. 前記膵癌が、切除可能な膵癌であり、前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、プロリン、セラミド(d18:2,C24:0)、セラミド(d18:1,C24:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、トリプトファン、ヒスチジン、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、およびスフィンゴミエリン(41:2)からなる一覧から選択される、実施形態56に記載の方法。
【０２３９】
61. 前記膵癌が、切除可能な膵癌であり、前記対象が、慢性膵炎に罹患している対象であり、前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、スフィンゴミエリン(35:1)、セラミド(d18:2,C24:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、セラミド(d18:2,C24:0)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、およびトリプトファンからなる一覧から選択される、実施形態56に記載の方法。
【０２４０】
62. 前記膵癌が、切除可能な膵癌であり、前記対象が、新規発症糖尿病に罹患している対象であり、前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)、プロリン、スフィンゴミエリン(35:1)、スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、トリプトファン、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)、スフィンゴミエリン(41:2)、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)およびヒスチジンからなる一覧から選択される、実施形態56に記載の方法。
【０２４１】
63. 前記少なくとも1つの診断バイオマーカーが、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)、ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、およびスフィンゴミエリン(35:1)からなる一覧から選択され、好ましくは、前記スフィンゴミエリン(35:1)が、スフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)とスフィンゴミエリン(d17:1,C18:0)との量の合計である;またはスフィンゴミエリン(d18:1,C17:0)の量である、実施形態56〜62のいずれか1つに記載の方法。
【０２４２】
64. 実施形態53〜55のいずれか1つに記載のステップをさらに含む、実施形態56〜63のいずれか1つに記載の方法。
【０２４３】
65. 実施形態1〜44または53〜64に記載の方法を実行するための診断デバイスであって、
a)前記実施形態による診断バイオマーカー群の少なくとも低分子診断バイオマーカーのための少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであり、少なくとも1つの検出器によって検出される少なくとも前記低分子診断バイオマーカーの量を決定するために適合された前記分析ユニットと、それに機能し得る形で連結された、
b)低分子診断バイオマーカー、および好ましくは、CA19-9の決定された量の、参照との比較を実行するための明白に埋め込まれたコンピュータプログラムコードと、前記診断バイオマーカーのための前記参照を含むデータベースとを含むコンピュータを含む評価ユニットと
を含み、それによって、対象が膵癌に罹患するかどうかを診断する、前記診断デバイス。
【０２４４】
66. 膵癌を診断するため、または膵癌を診断するための医薬組成物および/もしくは診断組成物の調製のための、対象の試料中での、
(i)実施形態1〜44もしくは53〜55のいずれか1つに記載の診断バイオマーカー群;または
(ii)実施形態56〜64のいずれか1つに記載の診断バイオマーカー
の使用。
【０２４５】
67. 実施形態1〜44のいずれか1つに記載の、または実施形態53〜64のいずれか1つに記載の方法における、好ましくは、内部標準としての、L-アラニンd4とセラミド(d18:1,17:0)の少なくとも1つ、好ましくは、両方を含む混合物の使用。
【０２４６】
68. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーCA19-9、[ヒスチジン+プロリン+トリプトファン]、[スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)+スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)+スフィンゴミエリン(35:1)+スフィンゴミエリン(41:2)]、および[セラミド(d18:1,C24:0)+セラミド(d18:2,C24:0)]を含む、好ましくは、からなる、実施形態1〜44のいずれか1つに記載の方法。
【０２４７】
69. 前記診断バイオマーカー群が、診断バイオマーカーCA19-9、［ヒスチジン+プロリン+トリプトファン］、［スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)+スフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)+スフィンゴミエリン(35:1)+スフィンゴミエリン(41:2)]、[セラミド(d18:1,C24:0)+セラミド(d18:2,C24:0)]、および[リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)/ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)]を含む、好ましくは、からなる、実施形態1〜44のいずれか1つに記載の方法。
【０２４８】
70. 診断バイオマーカーの前記量と参照との比較が、決定されたCA19-9の量が約5U/ml未満である場合、CA19-9の量に対して、より小さい重み、好ましくは、0の重みを割り当てることを含む、実施形態1〜44または68〜69のいずれか1つに記載の方法。
【０２４９】
71. 前記方法が、
b1)ステップb)の非相分離性のタンパク質沈降溶液の第1のアリコートを得るステップ、
b2)ステップb1)の残りの非相分離性のタンパク質沈降溶液から、溶媒、好ましくは、液体の少なくとも一部を除去するステップ、
b3)必要に応じて、適切な溶媒中にステップb2)で得られた残留物を溶解させて、第2のアリコートを得るステップ、ならびに好ましくは、
第1のアリコートから、高濃度で存在すると予想されるか、または知られる代謝物を決定するステップ、および第2のアリコートから、低濃度で試料中に存在すると予想されるか、または知られる代謝物を決定するステップ
のさらなるステップを含む、実施形態45〜50のいずれか1つに記載の方法。
【０２５０】
72. ステップd)の前に、前記診断バイオマーカーを誘導体化すること、好ましくは、ダンシル化することをさらに含む、実施形態45〜50または71のいずれか1つに記載の方法。
【０２５１】
73. クロマトグラフィーによって非タンパク質性画分中の前記バイオマーカーを分離するステップが、逆相クロマトグラフィー、好ましくは、RP18-HPLCまたはRP18-UPLCによって非タンパク質性画分中の前記バイオマーカーを分離するステップを含む、実施形態45〜50または71〜72のいずれか1つに記載の方法。
【０２５２】
74. 前記バイオマーカーを検出するステップが、陽イオンおよび/または陰イオンESI、好ましくは、陽イオンESIを含む、実施形態45〜50または71〜73のいずれか1つに記載の方法。
【０２５３】
以下の実施例は、単に本発明を例示するものである。それらは何であれ本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】図2〜5のグラフ表示に対する凡例を示す図である。
【図２】様々な疾患:1:膵癌;2:慢性膵炎;3:非膵対照(甲状腺切除およびヘルニア修復);4:糖尿病および他の併存疾患;5:糖尿病ではない他の併存疾患;6:小細胞肺癌;7:非小細胞肺癌(NSCLC);8:NSCLC腺癌;9:NSCLC大細胞癌;10:NSCLC扁平上皮癌;11:糖尿病および脂質異常症、多くは高血圧も;12:脂質異常症ではない糖尿病、半数を超えて高血圧も;13:併存疾患なし、62歳以下;14:併存疾患なし、63歳以上;15:前立腺癌;16:心血管疾患;17:慢性閉塞性肺疾患、半数は高血圧も;18:糖尿病ではない脂質異常症、半数を超えて高血圧も;19:他の併存疾患がある高血圧であるが、糖尿病または脂質異常症ではない;20:高血圧のみ;21:他の併存疾患、62歳以下;22:他の併存疾患、63歳以上;23:甲状腺障害に罹患する患者に由来する試料中のCA19-9濃度(U/ml)を示す図である。グラフ表示は図1に記載の通りである。
【図３】様々な疾患に関するCA19-9を含む(A)および含まない(B)、パネル1の予測スコアを示す図である。グラフ表示は図1に記載の通りであり、疾患は図2の凡例に記載の通りである。
【図４】様々な疾患に関するCA19-9を含む(A)および含まない(B)、パネル7の予測スコアを示す図である。グラフ表示は図1に記載の通りであり、疾患は図2の凡例に記載の通りである。
【図５】様々な疾患に関するCA19-9を含む(A)および含まない(B)、パネル28の予測スコアを示す図である。グラフ表示は図1に記載の通りであり、疾患は図2の凡例に記載の通りである。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０２５５】
患者の特徴、血漿の調製
膵癌、慢性膵炎および非膵対照(ヘルニア修復および甲状腺切除)を有する合計235人の患者を、臨床試験に登録した。この後ろ向き症例管理試験には、年齢、性別およびBMIを一致させた、膵管腺癌(PDAC)に罹患する77人の患者(そのうち40人は切除可能な腫瘍ステージ(IA〜IIB)にある)の試料、慢性膵炎(CP)患者の79の試料、79人の非膵対照患者の試料が含まれていた。膵癌患者の平均年齢は67歳であった。慢性膵炎患者の平均年齢は51歳であった。非膵対照患者の平均年齢は64歳であった。患者を一晩絶食させ、1つの臨床施設から連続して動員した。除外基準は、併発悪性疾患、試験への動員の2年以内の悪性疾患の治癒的処置、膵臓の併発嚢胞性疾患、妊娠またはインフォームドコンセントを得ることができない患者であった。
【０２５６】
さらに、一晩絶食させた、5つの異なる施設からの、年齢およびBMIを一致させた、52人の男性糖尿病患者および52人の男性非糖尿病患者の血漿試料を分析した。糖尿病患者の平均年齢は69歳であった。非糖尿病患者の平均年齢は69歳であった。全ての患者またはその法定代理人が、そのインフォームドコンセント文書を与え、地域の倫理審査委員会がプロトコールを認可した。採血管製造業者の指示書に従う採血および遠心分離の後、EDTA血漿をエッペンドルフチューブ中に収集し、さらなる分析のために-80℃で保存した。
【実施例２】
【０２５７】
バイオマーカーの分析
表9中のパネルとして列挙される診断バイオマーカー群の低分子診断バイオマーカーを、実施例3に記載のワンショットLC-MS/MS測定によって分析し、分析物を、多重反応モニタリング(MRM)トランジションによってさらに特徴付けた。それぞれの分析物は、2つ以上の代謝物を含有してもよく、それにより、同じ分析物に含まれる代謝物は少なくとも同一の合計式パラメータ、かくして、例えば、脂質の場合、脂肪酸および/または他の長鎖脂肪族部分、例えば、スフィンゴ塩基部分中の同一の鎖長および同一数の二重結合を有する。
【０２５８】
炭水化物抗原19-9(CA19-9)を、臨床化学実験室においてラジオイムノアッセイ(RIA)により血漿または血清中で分析した。健康な個体の血液中のCA19-9の正常範囲は、0〜37U/mL(1ミリリットルあたりの単位)である。
【実施例３】
【０２５９】
分析方法
ヒト血漿試料を調製し、以下のようにLC-MS/MS分析にかけた:20μlのヒト血漿を、100μlの内部標準混合物(アラニンd4:12.24μg/ml;セラミド(d18:1,C17:0):0.154μg/mlを、ジメチルスルホキシド、メタノール、ジクロロメタンおよび水(12:3:2.2:1.1:1、v/v/v/vの比)に溶解した)ならびに2:1(v/v)の比のメタノールおよびジクロロメタンを含有する抽出溶媒と混合した。
【０２６０】
試料を20℃で5分完全に混合した後、沈降したタンパク質を10分の遠心分離によって除去した。150μlの液体上清を、第1級および第2級アミン基のダンシル化を可能にするダンシルクロリドによるさらなる誘導体化のために適切なガラスバイアルに移した。このために、25μlの0.2mol/l重炭酸ナトリウムバッファー(水に溶解)、25μlの4mg/mlダンシルクロリド溶液(アセトニトリルに溶解)および50μlのジメチルスルホキシドを添加した。ダンシル化を、35℃で150分、一定の混合下で実行した。そのように得られた反応混合物を、LC-MS/MSによって分析した。
【０２６１】
LC/MS/MSシステムは、API 4000質量分析計(ABSCIEX, Toronto, Canada)と結合させたAgilent 1100 LCシステム(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)からなっていた。HPLC分析を、C18固定相(Phenomenex Ascentis Express C18, 2.7μm, 50 x 2.1mm)を有する市販の逆相分離カラム上で実施した。
【０２６２】
最大2μlの上記のそのように得られた反応混合物を注入し、600μl/分の流量(例えば、0%の溶媒Bから出発して、7分で100%の溶媒Bにする)でメタノール、水、ギ酸、2-プロパノールおよび2-メトキシ-2-メチルプロパンからなる溶媒混合物を用いる勾配溶出により分離した:
溶媒A:400gのメタノール、400gの水、1gのギ酸
溶媒B:400gの2-メトキシ-2-メチルプロパン、200gの2-プロパノール、100gのメタノール、1gのギ酸。
【０２６３】
質量分析を、多重反応モニタリング(MRM)を用いる陽イオンモードの電子スプレーイオン化(ESI)により実行した。ESIを用いた場合、等しい数の炭素および二重結合を有するスフィンゴミエリンは一緒に検出され、これらの同重体種はクロマトグラフィーによって分離されなかった。
【０２６４】
表1に列挙される診断バイオマーカーを、MRMを用いて測定することができる。それぞれのアミノ酸分析物を、クオンティファイアおよびクオリファイアMRMトランジションを用いて測定したが、表1に列挙される診断バイオマーカーの分析物はそれぞれのクオンティファイアのみを用いて測定する。
【０２６５】
市販の定量化標準を用いる全ての低分子バイオマーカーの定量的評価を、脱脂質化された血漿中での外部較正によって達成した。脱脂質化された血漿を用いて、マトリックスを、できるだけ現実の血漿に近いものとしてシミュレートした。市販の標準を用いない低分子バイオマーカーについては、同じ脂質クラスの市販の標準を、外部較正のために用いた。
【０２６６】
参照対照を、異なる量の市販のヒト血漿(12μl、20μl、28μl)の凍結乾燥によって調製して、現実のマトリックス条件下で低分子バイオマーカーの線形性を調べた。表1の全ての低分子バイオマーカーについて、凍結乾燥されたヒト参照対照の12μl/20μlおよび28μl/20μlの算出濃度の比は、それぞれ、0.5〜0.7および1.3〜1.5の値を誘導した。
【０２６７】
回復対照を、既知の標準濃度を、参照対照について用いたものと同じ市販のヒト参照対照血漿の凍結乾燥血漿試料に添加することによって調製した。凍結乾燥血漿試料を、試料調製まで冷凍庫で保存した。
【０２６８】
日間品質対照を、抽出溶媒および内部標準溶液を用いる市販のヒト参照対照血漿の複数の試料を抽出した後、ダンシル化を行うことによって調製した。全ての試料のダンシル化された反応混合物をプールし、それらを機器性能および試料調製の日々の品質制御のために用いるまで冷凍庫中、アリコートで保存した。
【０２６９】
方法精度に関する品質対照を、市販のヒト参照対照血漿の複数の試料を抽出することによって毎日調製し、試料バッチに同等に分配して測定した。
【０２７０】
【表１】
2018518683.tif 000010
【実施例４】
【０２７１】
データ分析、正規化および統計的評価
表1に列挙されたそれぞれの診断バイオマーカーについて、CP患者および非膵対照からなる対照と比較したPDAC患者における変化の方向を、必要に応じて、固定効果として、「疾患」、「年齢」、「性別」、「BMI」および「試料」を用いる単純線形モデル(ANOVA)により算出した。方向「上」は、バイオマーカーのレベルが、CP患者または非膵対照からなる対照と比較してPDAC患者においてより高いことを意味し、方向「下」は、バイオマーカーのレベルが、CP患者または非膵対照と比較してPDAC患者においてより低いことを意味する。統計分析の前に、比のlog10変換を行って、データの正規分布を確保した。ソフトウェアR2.8.1(パッケージnlme)を、ANOVAのために用いた。
【０２７２】
バイオマーカーパネル定義のためにその後用いた全ての低分子バイオマーカーの変化の方向およびANOVAの結果を、以下の表2〜7に与える。
【０２７３】
【表２】
2018518683.tif 000011
【０２７４】
【表３】
2018518683.tif 000012
【０２７５】
【表４】
2018518683.tif 000013
【０２７６】
【表５】
2018518683.tif 000014
【０２７７】
【表６】
2018518683.tif 000015
【０２７８】
【表７】
2018518683.tif 000016
【０２７９】
R (version 3.0.1)パッケージglmnet (version 1.9-8)に実装されたElastic Net algorithm (Zou and Hastie (2005) Regularization and variable selection via the elastic net, Journal of the Royal Statistical Society, Series B: 67, 301-320)を用いる分類を計算して、CA19-9を含むlog10変換されたデータ上のロジスティック回帰モデルを得た。L1およびL2ペナルティに等しい重みを与えた。CA19-9を含む対数変換されたバイオマーカーも中心化し、分析の前に単位分散に対してスケーリングした。このロジスティック回帰モデルにより、それぞれの患者が膵癌を有する予測確率の算出が可能となる。
【０２８０】
10倍相互検証を用いて、残りの倍数上の曲線下面積(AUC)の偏りのない推定値を得た。AUCに関する95%信頼区間を、Zhou, Obuchowski and McClish [Statistical Methods in Diagnostic Medicine (2011), 2nd Edition, by Zhou, Obuchowski and McClish]に記載された受信者操作特性(ROC)曲線の従法線モデルを用いて算出した。ロジット変換された予測スコアの従法線性の仮定を、QQプロットを用いて視覚的に調べた。その後、全データ上で分類子を再訓練することにより、最終的なモデル係数を決定した。
【実施例５】
【０２８１】
膵癌の診断のためのバイオマーカーパネル
膵癌対慢性膵炎、膵癌対非膵対照、および膵癌対(慢性膵炎と非膵対照)の診断を可能にするバイオマーカーパネルの診断バイオマーカーを、手動で選択し、多変量および単変量の両方でのその識別性能ならびに単一の分析手法におけるその同時分析の実現可能性に従って最適化した。次いで、これらの予め定義されたパネルを、ROC曲線分析と組み合わせたElastic Netアルゴリズムを用いてその識別性能について試験した。
【０２８２】
膵癌の診断のために同定されたバイオマーカーパネルは、CA19-9に加えて、表8Aに示されるそれぞれの代謝物クラス、アミノ酸、セラミド、およびスフィンゴミエリンに由来する少なくとも1つの低分子バイオマーカーを含む最も好ましいコアパネルからなる。頻繁には、バイオマーカーパネルは、CA19-9に加えて、表8Bに示されるそれぞれの代謝物クラス、アミノ酸、セラミド、およびスフィンゴミエリンに由来する少なくとも1つの低分子バイオマーカーを含んでいた。
【０２８３】
【表８】
2018518683.tif 000017
表8Aまたは8Bに示されたコアパネル構造は、以下のバイオマーカーから構成されていてもよい:
・アミノ酸:プロリン、および/またはトリプトファン、および/またはヒスチジン
・セラミド:セラミド(d18:1,C24:0)および/またはセラミド(d18:2,C24:0)
・スフィンゴミエリン:スフィンゴミエリン(35:1)、および/またはスフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、および/またはスフィンゴミエリン(d18:2,C17:0)、および/または(スフィンゴミエリン(41:2))
・エタノールアミン脂質:ホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)、および/またはリソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)および/またはリソホスファチジルエタノールアミン(C18:0)。
【０２８４】
本発明のそれぞれのバイオマーカーパネルを、以下の表9に示す。
【０２８５】
【表９】
2018518683.tif 000018
2018518683.tif 000019
2018518683.tif 000020
2018518683.tif 000021
2018518683.tif 000022
【０２８６】
全パネルを、実施例4に記載のように、膵癌対慢性膵炎;膵癌対非膵対照;膵癌対(慢性膵炎と非膵対照)のその識別性能について分析した。表9に示されたパネルは、以下の表10に列挙されるように機能した。診断性能は、全ての事例において、CA19-9のみと比較して増大した:CA19-9は単独で、それぞれ、0.83、0.87および0.85の、膵癌対慢性膵炎;膵癌対非膵対照;膵癌対(慢性膵炎と非膵対照)の識別性能のAUCをもたらした。切除可能な膵癌サブグループにおいて、CA19-9は単独で、それぞれ、0.80、0.86および0.84の、膵癌対慢性膵炎;膵癌対非膵対照;膵癌対(慢性膵炎と非膵対照)の識別性能のAUCをもたらした。低いCA19-9(<37U/ml)のサブグループにおいては、CA19-9は単独で、それぞれ、0.53、0.56および0.54の、膵癌対慢性膵炎;膵癌対非膵対照;膵癌対(慢性膵炎と非膵対照)の識別性能のAUCをもたらした。
【０２８７】
【表１０】
2018518683.tif 000023
2018518683.tif 000024
2018518683.tif 000025
【０２８８】
それぞれ、陽性クラスとして膵癌群ならびに陰性クラスとして慢性膵炎および/または非膵対照を用いて、Zou and Hastie ((2005) Regularization and variable selection via the elastic net, Journal of the Royal Statistical Society, Series B, 67, 301-320)により記載されたように所定のパネル上でエラスティックネットアルゴリズムを訓練することにより、膵癌診断の分類子を得た。過剰適合効果を軽減するために、当業者には周知である10倍相互検証を行った。結果として、それぞれの分類子について、それらが訓練されたクラスについて最適化された重み付けおよびスケーリングを得る。
【０２８９】
次いで、これらの分類子を、同じ、かつさらなる分類タスクにより試験し、これらのものは、慢性膵炎に対する膵癌、非膵対照に対する膵癌、(慢性膵炎と非膵対照)に対する膵癌、全ての非癌対象(慢性膵炎、非膵対照、糖尿病群、非糖尿病群)に対する膵癌、および糖尿病対象(慢性膵炎、非膵対照、糖尿病群に由来する)に対する膵癌である。これらの比較のそれぞれを、全データセット、または切除可能な膵癌群、または低CA19-9群のいずれかに適用した。
【０２９０】
膵癌対慢性膵炎、および膵癌対非膵対照、および膵癌対(慢性膵炎と非膵対照)の区別に対してパネルを訓練した後、得られたバイオマーカーを、訓練群、糖尿病サブグループならびに104の外部糖尿病および非糖尿病試料を含む全ての非癌対象におけるその性能について分析した(実施例1を参照)。さらに、これらのバイオマーカーパネルを、切除可能な膵癌を有する患者に由来する試料および低い(<37U/ml)CA19-9値を有する患者に由来する試料上で評価して、侵攻性が低い癌状態および偽陰性CA19-9レベルを与える潜在的なlewis a/b陰性対象についてその性能を分析した。表9からのパネルのAUCサブグループ性能を、以下の表11に示す。
【０２９１】
【表１１】
2018518683.tif 000026
2018518683.tif 000027
2018518683.tif 000028
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2018518683.tif 000046
2018518683.tif 000047
【実施例６】
【０２９２】
バイオマーカーパネルを用いた患者の分類
Log変換およびスケーリング
・入力データ:
・LC-MS/MSにより測定された分析物の絶対濃度:それぞれの分析物および患者試料について1つの値。   
・市販のラジオイムノアッセイ(RIA)により決定されたCA19-9の絶対濃度:患者試料あたり1つの値。     
・log10により全ての入力データを変換する。C19-9(U/ml)に関する数値を、LC-MS/MSにより測定された分析物のピーク面積比と同じ方法で処理する。   
・分析物特異的定数miを最初に減算した後、分析物特異的定数siで除算して、log10変換され、スケーリングされた入力データ
【０２９３】
【数８】
2018518683.tif 000048
を得ることによってlog10変換された入力データをスケーリングする:
【０２９４】
【数９】
2018518683.tif 000049
例えば、パネル6およびパネル7に関するスケーリングパラメータを、表12〜13に列挙する。
【０２９５】
【表１２】
2018518683.tif 000050
【０２９６】
【表１３】
2018518683.tif 000051
予測スコアの算出
・予測スコアを、分析物特異的重みωiおよびバイアスω0を用いてlog10変換され、スケーリングされた入力データ
【０２９７】
【数１０】
2018518683.tif 000052
に基づいてそれぞれの患者について算出する:
【０２９８】
【数１１】
2018518683.tif 000053
例えば、バイオマーカー6および7に関する重みパラメータを、表14〜15に列挙する。
【０２９９】
【表１４】
2018518683.tif 000054
【０３００】
【表１５】
2018518683.tif 000055
【０３０１】
予測スコアを、患者がPDACに罹患しているスコアと解釈し、分析されるデータセットにあるような疾患の有病率を推測することができる。それに応じたバイアスの適合化により、予測スコアを見かけの有病率を示す標的患者集団に適用することができる。算出された予測スコアは、0〜1の任意の値を取ってもよい。予測スコアと所定のカットオフとを比較することにより、患者を分類することができる。
【０３０２】
カットオフの決定
2つの異なる方法を用いることにより、カットオフ値を決定した。第1に、カットオフを、85%の固定された特異度で決定した。代替カットオフを、Youden指数法を用いて決定し、精度を最適化した。両方法を、それぞれ、全データセットまたは男性もしくは女性のみに適用した。例えば、バイオマーカーパネル6および7に関するカットオフ値を、表16に列挙する。
【０３０３】
【表１６】
2018518683.tif 000056
患者/試料の分類
【０３０４】
陽性または陰性の診断結果を、試料について得られた結果(または予測スコア)と、カットオフ値との比較から得る。カットオフ値より大きい、またはそれと等しい予測スコアは、陽性の診断結果と取り、カットオフ値より小さい予測スコアは、陰性の診断結果と取る。
【実施例７】
【０３０５】
さらなるバイオマーカーパネル
それぞれ、ロジスティック回帰モデルについて1つの特徴として一緒に1つのオントロジークラスの全ての代表の合計を処理することにより、2つのさらなるバイオマーカーパネル(パネル番号105および106)を生成した。
【０３０６】
より正確には、パネル105とパネル106の両方において、ヒスチジン、プロリン、およびトリプトファンの合計は1つの特徴を構成し、スフィンゴミエリン(d17:1,C16:0)、スフィンゴミエリン(d18:0,C17:0)、スフィンゴミエリン(35:1)およびスフィンゴミエリン(41:2)の合計は1つの特徴を構成し、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:2,C24:0)の合計は1つの特徴を構成する。
【０３０７】
さらに、リソホスファチジルエタノールアミン(C18:2)とホスファチジルエタノールアミン(C18:0,C22:6)との比を、パネル106における特徴として用いた。
【０３０８】
パネル105および106を、以下の表17に示されるように構成する。
【０３０９】
【表１７】
2018518683.tif 000057
両方のパネルに関する性能/分類結果を、以下の表18に示す。
【０３１０】
【表１８】
2018518683.tif 000058
【実施例８】
【０３１１】
バイオマーカーパネルを用いた患者の分類の改良/アルゴリズムの適合化
集団の5〜7パーセントは、特異的な、遺伝性のLewis a/b抗原陰性(ホモまたはヘテロ接合性のいずれか)のためCA19-9を産生しない。これらの患者について、CA19-9は常に、患者が癌を有するか否かに関係なく陰性の試験結果をもたらす。代謝マーカーは、同じ問題を有さない。この問題に対処するために、本発明者らの代謝物およびCA19-9を含むロジスティック回帰モデルと、それぞれの代謝物のみを用いる(CA19-9を含まない)さらなるモデルとの両方を訓練することを決定した。ある特定の特異度を得るために所与のパネルに関してアルゴリズムを最適化する場合、この手法により、2つのモデルについて異なるカットオフも得られる。
【０３１２】
したがって、患者の分類のために以下の規則を用いた:患者のCA19-9値がある特定の閾値より上である場合、それぞれのカットオフを有するCA19-9を含むモデルを用いた;そうでなければ、その特定のカットオフを有するCA19-9を含まないモデルを用いた。2つのモデルにより生成された2つの予測スコアが直接比較可能でないため、いくつかの方法でスコアを最初に整列させることにより、意味のあるAUCの算出が可能である。しかしながら、感度および特異度の算出は直接可能であり、また、この場合の適用のための適切な手段でもある。
【０３１３】
本発明者らの事例では、用いた閾値は2U/mlのCA19-9値であった。
【０３１４】
閾値を超えるCA19-9測定値を有する患者に対してCA19-9のみを含むモデルを最初に訓練することにより、手法をさらに改良することができる。
【０３１５】
【表１９】
2018518683.tif 000059
2018518683.tif 000060
2018518683.tif 000061
【実施例９】
【０３１６】
他の疾患に対する特異度の分析
他の疾患に対するバイオマーカー特異度を分析するために、実施例1に記載の試験に加えて、2つの試験を実行した(図1〜5および表20で「PDAC試験」および「糖尿病試験」と呼ばれる)。第1に、20の小細胞肺癌事例、52の非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌事例、18のNSCLC扁平上皮癌事例、4のNSCLC大細胞癌事例、および3のNSCLC(さらに特徴付けられていない)事例(図1〜5および表20で「肺癌試験」と呼ばれる)を含む、97人の絶食処置したナイーブな肺癌患者(男性および女性、47〜79歳の年齢)からのヒトEDTA血漿試料収集物を分析した。第2に、前立腺癌診断試験からのヒトEDTA血漿試料収集物から、絶食した男性前立腺癌および対照患者からの自己報告された併存疾患に従って445の試料を選択し、分析した(図1〜5および表20で「他の併存疾患試験」と呼ばれる)。
【０３１７】
全ての患者またはその法定代理人は、そのインフォームドコンセント文書を与え、地域の倫理審査委員会がプロトコールを認可した。採血管製造業者の指示書に従う採血および遠心分離の後、EDTA血漿をエッペンドルフチューブ中に収集し、さらなる分析のために-80℃で保存した。
【０３１８】
他の疾患/併存疾患に対する特異度の分析に関する試料の得られる全セットを、以下の表20に示した。
【０３１９】
【表２０】
2018518683.tif 000062
【０３２０】
本発明のバイオマーカーパネルの疾患特異度を評価するために上記の試料を用いて、分類スコアが、単一のマーカーとしてのCA19-9との比較において本発明のパネルに関しても顕著に高い特異度を示すことがわかった(図2〜5を参照)。この分析の結果を、以下の表21に本発明の全てのパネルについて示す。また、CA19-9を含まない予測スコアは、図2、3A、4Aおよび5A中の代表例に示されるように、単一のマーカーとしてのCA19-9と予測値において同等であった。
【０３２１】
【表２１】
2018518683.tif 000063
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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