(57)【要約】【課題】細胞に基づく療法の問題に対処すること【解決手段】本開示は一般に、組織性及びニューロン性の修復、再生及び／又は回復を促すために強化された細胞に基づく治療アプローチによって哺乳動物被験体を治療する方法に関する。哺乳動物被験体を治療するのに有用な薬物及び該薬物の製造方法（ここで、組成物は、同じ種のドナー哺乳動物の同種哺乳動物羊膜上皮細胞に由来するエクソソームを含む）も本開示によって包含される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体を治療する方法であって、前記方法が、同じ種のドナー哺乳動物に由来する同種哺乳動物羊膜上皮細胞に由来する哺乳動物羊膜エキソソームの全身又は局所投与を含む、方法。
【請求項２】
治療される前記哺乳動物被験体がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療される前記哺乳動物被験体が非ヒト哺乳動物である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
治療される前記非ヒト哺乳動物被験体が、ウマ、イヌ及びラクダからなる群から選択される競走用動物である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト被験体が、中枢神経系、末梢神経系、全身血管系、又は創傷治癒のための細胞性又はニューロン性の修復、再生又は回復を誘導するために治療される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト被験体が、肺、心臓、肝臓、腎臓若しくは膵臓の細胞若しくは組織、虚血再潅流損傷後の細胞、創傷、脳若しくは脊髄の損傷を修復する、再生する若しくは回復させるために、又は活性化された線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を抑制するために治療されている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト被験体が、肺、肝臓、心臓、腎臓又は膵臓の線維性の疾患、状態又は障害のために治療されている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト被験体が、神経変性疾患又は神経変性状態のために治療されている請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記神経変性疾患又は神経変性状態が脱鞘疾患である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱鞘疾患が、多発性硬化症、視神経炎、デビック病、横断性脊髄炎、急性播種性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィ又は副腎脊髄ニューロパシーである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
神経変性疾患又は神経変性状態が、運動ニューロン疾患、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト被験体が、気管支肺異形成症、嚢胞性線維症、肺線維症、肝線維症、慢性肺感染症、喘息、アレルギー性鼻炎及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される疾患又は状態のために治療されている請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記羊膜エキソソームが、肺の感染症及び線維症を元に戻し、且つ初代肺線維芽細胞を元に戻す請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記羊膜エキソソームが、サイトカイン−サイトカイン受容体、Ｗｎｔ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ及びＴＧＦβのシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記競走用動物が、運動誘導性肺出血について治療されている請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記羊膜エキソソームが、不死化された哺乳動物羊膜上皮細胞株のバンクに由来する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記羊膜エキソソームが、不死化された哺乳動物羊膜エキソソームに由来する凍結乾燥羊膜エキソソームのバンクから選択される請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物羊膜エキソソームと１以上の薬学上許容できる担体、賦形剤及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記哺乳動物羊膜エキソソームがヒト羊膜エキソソームである請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
哺乳動物被験体における細胞性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復のための薬物の製造における哺乳動物羊膜エキソソームの使用。
【請求項２１】
前記哺乳動物羊膜エキソソームがヒト羊膜エキソソームである請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
羊膜上皮細胞の使用によってヒト被験体を含む哺乳動物被験体を治療するための改善された細胞に基づく治療用プロトコールであって、前記改善が、不死化された羊膜上皮細胞株から羊膜エキソソームを単離することと、組織性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復を必要とする前記被験体に全身又は局所投与することとを含む、プロトコール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（出願データ）
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる、「治療の方法」と題する２０１５年６月１２日に出願されたオーストラリア仮特許出願番号２０１５９０２２１４及び「治療方法」と題する２０１６年４月１２日に出願されたオーストラリア仮特許出願番号２０１６９０１３４９に由来する優先権に関連するものであり、それを主張する。
【０００２】
（技術分野）
本開示は一般に、組織性及びニューロン性の修復、再生及び／又は回復を促すための強化された細胞に基づく治療アプローチによる哺乳動物被験体における治療の方法に関する。哺乳動物被験体の治療に有用な薬物及び薬物の製造方法も本開示によって包含される。
【背景技術】
【０００３】
本明細書にて著者によって参照される出版物の書誌事項の詳細は本説明の末尾にアルファベット順に収集されている。
【０００４】
本明細書における任意の従来技術への言及は、この従来技術が任意の国での共通する一般常識の一部を形成するという承認又は提案の形態として解釈されることはなく、且つ解釈されるべきではない。
【０００５】
現代医学は、化学療法及び抗生剤のような生物学的薬剤の特定によって大きく前進している。しかしながら、多数の薬物は多元的な機能を有し、一部は的外れな生理的効果に影響を及ぼす。細胞に基づく療法は現代医学の次の支柱として提案されている（Ｆｉｓｈｂａｃｋら．（２０１３），Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：１７９，ｐｓ７）。
【０００６】
細胞に基づく療法の律速因子の１つは一貫性のない製品の可能性である。これは幹細胞に関与する試験で強調されている。間葉幹細胞は（ＭＳＣ）は、たとえば、文献にて十分に性状分析され、臨床試験レベルを達成している一方で、一般に使用には連続継代を必要とする。このことは、細胞をいつ、どうように使用できるかということに対して有害に影響を及ぼす可能性があり、影響を及ぼすことが多い。
【０００７】
この課題に反論するアプローチの１つは保存された間葉前駆細胞を使用することであった。これによって回収と治療との間の遅延が少なくとも回避される。しかしながら、これはドナー間での細胞の効力の変動を招来し、連続継代の悪影響の問題に対処していない。
【０００８】
この問題に対処する暫定的な措置は「マスター」細胞バンクを有することである。再び、これは、老化及びエピジェニック／核型の変化が生じる前に細胞が経験できる継代の数には限界があるという不可避の問題を克服していない（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇら．（２０１１），Ａｇｉｎｇ，（Ａｌｂａｎｙ  ＮＹ），３：８７３−８８８）。反復投薬後には免疫拒絶のリスクもある。
【０００９】
好適例として、産科の監視及び新生児医療における顕著な改善に伴って、多数の未熟児が生存し、「未熟児疾患」の有病率の上昇を生じている。特に消耗性の状態の１つは、超早産児の不治の慢性肺疾患である気管支肺異形成症（ＢＰＤ）である。それは、肺胞の発生異常と停止及び肺毛細管構造の破壊を特徴とする。ＢＰＤは新生児の罹患率及び死亡率での主要な症例である。ＢＰＤを克服した人は成人早期での閉塞性肺疾患の深刻なリスク（Ｄｏｙｌｅら，（２００６），Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１１８：１０８−１１３）、及び一般的な慢性健康障害及び認知低下（Ｌｏｄｈａら．（２０１４），ＰＬｏＳＯＮＥ：ｅ９０８４３）の深刻なリスクもある。間葉幹細胞が上記で要点を述べた理由でＢＰＤの考えられる細胞に基づく療法として提案されている一方で、広く異なる機能的有効性を持つ多数の細胞が存在する可能性があり、それは情緒的ストレスを引き起こすこととは別に他の治療選択を遅らせ得る。
【００１０】
肺毛細管構造への損傷の問題はヒト早産児に限定されるだけではない。動物の競走産業、特に競馬産業は運動誘導性の肺出血（ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ：ＥＩＰＨ）の問題に直面している。一部の管轄では、たとえば、競争後２回を超えて鼻血を示すウマは生涯さらなる競走を禁止される。このことは衝撃的な経済的損失を生じる。ＥＩＰＨを防ぐこと又は治療することに対する化学療法のアプローチはパフォーマンスの強化という点で倫理的な問題を引き起こす可能性があり、また、どのような事象においても、そのようなアプローチが毛細管破裂を再生する可能性は低い。
【００１１】
ヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）の有益な効果は文書で記録されている（たとえば、Ｈｏｄｇｅｓら．（２０１２），Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｒｏｌ．２０６：４４８ｅ８−４４８ｅ１５；Ｍｕｒｐｈｙら．（２０１２），Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，Ｉ：１４７７−１４９２；Ｖｏｓｄｏｇａｎｅｓら．（２０１３），Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１５：１０２１−１０２９；Ｙａｗｎｏら．（２０１３），Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３５：２７２−２８２）。しかしながら、作用のそのメカニズムを決定する必要性がある。
【００１２】
従って、細胞に基づく療法の問題に対処する必要があり、代替の戦略が必要とされることは明らかである。
【発明の要約】
【００１３】
本発明によれば、細胞のコミュニケーションのための小胞媒体は、哺乳動物の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）から放出されると特定されている。本明細書では「羊膜エキソソーム」と呼ばれる小胞は、後期エンドソームに由来するナノメートルサイズの細胞外小胞（５０〜１００ｎｍ）であり、細胞表面から放出される。
【００１４】
本明細書で教示されるのは、哺乳動物羊膜上皮細胞に基づく治療法の改善された形態である。改善は、上皮細胞によって放出され、内在性の修復メカニズムを活性化することによって回復効果を発揮するナノサイズの羊膜エキソソームの使用を含む。羊膜エキソソームは、免疫細胞に直接作用し、とりわけ、Ｔ細胞の増殖を低下させ、マクロファージの貪食作用を高め、幹細胞を活性化し、活性化された線維芽細胞でのコラーゲンの産生を阻害することが本明細書で示されている。羊膜エキソソームは、タンパク質（たとえば、サイトカイン）及び遺伝分子（たとえば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡ）の形態でのエキソソーム積み荷（ｃａｒｇｏ）のプロフィールを放出することが本明細書で提案されている。
【００１５】
エキソソームの生物発生には後期エンドソームの境界膜の内向きの出芽による腔内小胞の形成が関与する。次いで後期エンドソームは原形質膜と融合してエキソソームを放出する。エキソソームはいったん分泌されると、親細胞のごく近傍に位置する標的細胞によって取り込まれ得る、又は循環を介して遠位に移動し得る。メカニズム上、エキソソームは親細胞の物質を含有する複合体ベクターとして作動する。それらは、その後、標的細胞に移行されるタンパク質及び遺伝物質を含有することができる。
【００１６】
従って、本発明は細胞に基づく療法への強化されたアプローチの開発に基礎を置いている。本開示は、哺乳動物の羊膜上皮細胞から放出され、免疫調節性で再生促進性及び回復性の効果を有する羊膜エキソソームの使用を教示する。羊膜エキソソームは、Ｔ細胞増殖を減らし、マクロファージの貪食作用を高め、有益なプロテオーム分子及びｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡのような遺伝分子の放出を介して内在性幹細胞を活性化する、免疫細胞に対する効果を発揮する。羊膜エキソソームは本明細書では、創傷治癒を含む組織の修復、再生及び回復を促す、細胞の維持を促進する、神経変性及び損傷の影響を改善すること及び修復や神経再生を促進することを含む神経保護を誘導することが提案されている。羊膜エキソソームはまた活性化された線維芽細胞におけるコラーゲンの産生も抑制する。エキソソームはさらに、腎臓、肝臓、膵臓、心臓及び肺の損傷を改善することと同様にこれらの臓器の線維化した状態（たとえば、肝臓又は肺の線維症）の治療を含む、たとえば、虚血性再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の傷害又は臓器の損傷のような全身血管系（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）における疾患又は有害事象に続いて修復及び再生を促進することが提案されている。エキソソームはまた髄鞘形成を促進することにおいても有用なので、たとえば、多発性硬化症のような脱髄性の疾患又は障害の治療に有用であることが提案されている。
【００１７】
羊膜エキソソームは、ヒトだけでなく、非ヒト哺乳動物においても有益な効果を有する。従って、本発明はヒト及び動物への応用に及ぶ。ヒト被験体に由来するＡＥＣは本明細書では「ｈＡＥＣ」と呼ばれる。
【００１８】
動物応用の例は、ウマ、競走用イヌ及びラクダを含む競走用動物の運動誘導性肺出血の治療である。
【００１９】
羊膜エキソソームは、バイオリアクターにて哺乳動物の羊膜上皮細胞を培養し、馴化培養培地から羊膜エキソソームを単離することによって大量に生産することができる。上皮細胞は不死化された細胞株として維持することができる。羊膜エキソソームは必要とされるときに単離することができ、又は凍結乾燥状態で保存することができる。
【００２０】
本発明の革新的な特徴は、羊膜エキソソームを使用するために哺乳動物羊膜上皮細胞の適合性ドナーを特定する必要がないことである。エキソソームは有害な免疫反応を誘導しない。むしろ、ドナーは妊娠ステージ及び／又は新生児若しくは妊娠満期の赤ん坊の健康のような他の特徴に基づいて選択される。しかしながら、一実施形態では、羊膜エキソソームは妊娠の終端期の患者のｈＡＥＣに由来する。羊膜上皮細胞は、羊膜上皮細胞がそうであるような様々な生理的状態について組織性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復を促進することが少なくとも得意である羊膜エキソソームを産生する。しかしながら、細胞に基づく療法には短所はない。従って、本発明の態様は、所望の状態を治療するのに有用な羊膜エキソソームを産生する羊膜上皮細胞を特定するためのドナーの選択である。このことは羊膜上皮細胞のバンクの生成を導くことができる。次いで、治療される疾患又は状態に基づいて細胞の特定のバッチを選択することができる。
【００２１】
羊膜エキソソームを含む医薬組成物、羊膜エキソソームを含む治療用キット、及び／又は好適なドナー又は羊膜上皮細胞株をスクリーニングするための試薬及びバイオリアクターキットも本開示の教示によって包含される。
【００２２】
本明細書で教示されるのは、強化された又は改変された細胞に基づく療法である。従って、本明細書で可能になるのは、羊膜上皮細胞の使用によってヒト被験体を含む哺乳動物を治療するための改善された細胞に基づく療法のプロトコールであり、改善は、不死化された羊膜上皮細胞から羊膜エキソソームを単離することと、再髄鞘形成の促進を含む、組織性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復を必要とする被験体に全身又は局所投与することとを含む。
【００２３】
一部の図面は着色した表示又は実体を含有する。着色した写真は要請に応じて特許権保有者から又は適切な特許庁から入手可能である。特許庁から入手するのであれば手数料が課せられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、（Ａ）典型的なカップ型の形態及びおよそ１００ｎｍの直径を示す羊膜エキソソームの電子顕微鏡写真；（Ｂ）エキソソームの生物発生のマーカーであるＡｌｉｘ及びＴＳＧ１０１の発現を表す写真を示す図である。Ａｌｉｘ及びＴＳＧ１０１はエキソソームの生体マーカーである。
【図２】図２は、（Ａ）羊膜エキソソームがｈＡＥＣ馴化培地に類似してＴ細胞増殖を阻害すること；（Ｂ）羊膜エキソソームがマクロファージの貪食作用を高めることを表すグラフを示す図である（ｎ＝３）。
【図３】図３は、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）のマウスモデルにて羊膜エキソソームによって組織：気腔の比率が改善されることを表すグラフを示す図である。
【図４】図４は、Ｅ１６での羊膜内ＬＰＳ注射、出生４日目でのエキソソーム／細胞の注射及び屠殺時点（×印）を示す、実施例３で使用された実験時間を模式的に示す図である。
【図５】図５は、（Ａ）妊娠満期（ｔｅｒｍ）エキソソームの方が妊娠満期前（ｐｒｅｔｅｒｍ）エキソソームよりも免疫抑制性であること；（Ｂ）ｐＨＲｏｄｏ標識によって示されるように妊娠満期エキソソームの方がマクロファージの貪食作用を良好に高めることができることを表すグラフを示す図である（１群当たりｎ＝３のドナー）。
【図６】図６は、ブレオマイシン誘導性肺線維症マウスモデルにて羊膜エキソソームが確立された肺の炎症及び線維症を元に戻す（ｒｅｖｅｒｓｅ）ことを表すグラフを示す図である（Ａ）；（Ｂ）６〜８カ月齢のメスＣ５７ＢＬ６マウス。ブレオマイシンの負荷の７日後、鼻内で投与された１０μｇ又は５０μｇの妊娠満期ｈＡＥＣ由来のエキソソーム。
【図７】図７は、羊膜エキソソームがインビトロでヒト初代肺線維芽細胞の活性化を元に戻すことを表すグラフを示す図である。５ｍｇ／ｍＬの形質転換増殖因子βの存在下で培養すると、エキソソームは２４時間以内にα平滑筋アクチンのタンパク質レベルを低下させた。
【図８Ａ】図８Ａは、羊膜エキソソームがサイトカイン−サイトカイン受容体シグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、羊膜エキソソームがサイトカイン−サイトカイン受容体シグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、羊膜エキソソームがサイトカイン−サイトカイン受容体シグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、羊膜エキソソームがＷｎｔシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、羊膜エキソソームがＷｎｔシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図１０】図１０は、羊膜エキソソームがＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図１１】図１１は、羊膜エキソソームがＴＧＦβシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有することを示す模式図である。黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【図１２】図１２は、（Ａ）健常対照のｈＡＥＣ、妊娠満期エキソソーム及び妊娠満期前のエキソソームの間での組織気腔比率（％）を含む羊膜エキソソームの肺再生効果を示すグラフであり、（Ｂ，Ｃ）写真である。「妊娠満期」エキソソームは妊娠の終了時でのｈＡＥＣから単離されたエキソソームである。「妊娠満期前」エキソソームは妊娠満期に先立って単離される。
【図１３】図１３は、（Ａ〜Ｃ）羊膜エキソソームがｈＡＥＣと同様に肺にて再生を引き起こすことを示す写真図である。暗染色はエラスチン陽性の先端部の証拠である。
【図１４】図１４は、線維芽細胞エキソソームではなく羊膜エキソソームが肺にて内在性幹細胞の応答を引き起こすことを表すグラフを示す図である。この応答はｈＡＥＣによって誘導される応答より有意に大きい。
【図１５】図１５は、肝臓組織切片のＣＣＬ４＋生理食塩水に対比させたＣＣＬ４＋エキソソームのシリウスレッド染色（Ａ）及びα平滑筋アクチビン（α−ＳＭＡ）による免疫組織化学分析を用いて証明されたように、羊膜エキソソームが肝臓において抗線維症性であったことを表すグラフを示す図である。
【図１６】図１６は、妊娠満期前ｈＡＥＣに対比させた妊娠満期ｈＡＥＣに由来するエキソソーム間でのプロテオームレベルでの差異を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ｈＡＥＣと間葉幹細胞全体（ＭＳＣ）の間での細胞成分の比較を示すグラフである。濃灰色：ｈＡＥＣのエキソソーム全体薄灰色：ＭＳＣ全体でのエキソソーム（Ａｎｄｅｒｓｏｎら．（２０１６），Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｙ／１０．１００２／ｓｔｅｍ．２２９８）。
【図１８】図１８は、ｈＡＥＣとＭＳＣ全体（Ａｎｄｅｒｓｏｎら．（２０１６），上記）の間での生物学的過程の比較を示すグラフである。濃灰色：ｈＡＥＣのエキソソーム全体薄灰色：ＭＳＣ全体でのエキソソーム（Ａｎｄｅｒｓｏｎら．（２０１６），上記）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書の全体を通して文脈が必要としない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」又はたとえば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」のような変形は、述べられた要素又は整数又は方法工程、あるいは要素又は整数又は方法工程の群の包含を暗示するが、任意の要素又は整数又は方法工程又は要素又は整数又は方法工程の群の排除を暗示しないように理解されるであろう。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り複数の態様を含む。従って、たとえば、「（ａ）疾患又は状態」への言及は単一の疾患又は状態と同様に２以上の疾患又は状態を含み；「（ａｎ）エキソソーム」への言及は単一のエキソソームと同様に２以上のエキソソームを含み；「開示」は本開示によって教示される単数の及び複数の態様を含む；等である。本明細書で教示され、且つ可能になる態様は用語「本発明」によって包含される。「疾患」又は「状態」は「障害」も含む。そのような態様はすべて本発明の幅広さの範囲内で可能になる。本明細書で意図される任意の変異体及び誘導体は本発明の「形態」によって包含される。
【００２７】
本開示は、細胞、組織、神経経路及び内分泌経路の修復、再生及び回復の文脈の範囲内に一般に入る多数の疾患及び状態について哺乳動物被験体の治療を促す強化された細胞に基づく療法を教示する。本開示は、哺乳動物の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）を培養するのに使用された馴化培地から単離される羊膜エキソソームが有益な免疫調節性の生理的及び生化学的なプロフィールを有することを教示する。本質的には、哺乳動物の羊膜エキソソームは、Ｔ細胞増殖を低下させ、マクロファージの貪食作用を高め、プロテオーム分子及びｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡのような遺伝分子の放出を介して内在性幹細胞を活性化する、免疫細胞に対する効果を発揮する。それらはまた活性化された線維芽細胞におけるコラーゲンの産生も抑制する。重要なことに、羊膜エキソソームは免疫原性ではないので、同種（アロジェネイク（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ））の羊膜エキソソームを使用することができる。
【００２８】
羊膜エキソソームは、確立された肺の炎症及び肺線維症も元に戻し（ｒｅｖｅｒｓｅ）、初代肺線維芽細胞の活性化も元に戻す。これはまた、たとえば、肝臓、膵臓、心臓及び腎臓のような他の臓器の線維症にも適用される。加えて、それらは、サイトカイン−サイトカイン受容体シグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路、ＴＧＦβシグナル伝達経路、ならびに多様な範囲の生理的及び神経学的な過程に含まれるシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡを含有する。
【００２９】
本明細書は、哺乳動物の羊膜エキソソームが、細胞、臓器を含む組織、神経経路、全身血管系の成分の修復、再生及び回復を誘導すると共に創傷治癒を促進することを誘導することを教示する。羊膜エキソソームは、脳及び脊髄の修復、再生及び回復を促すこと、神経変性状態の修復を促進すること、外傷、疾患又は薬物乱用に続く臓器の損傷の回復を誘導すること、脳卒中、又は外傷性脳損傷のような脳への他の損傷ののちの修復を促すことが本明細書で提案されている。エキソソームは、脱鞘疾患、たとえば、多発性硬化症、視神経炎、デビック（Ｄｅｖｉｃ’ｓ）病、横断性脊髄炎、急性播種性脳脊髄炎、及び副腎白質ジストロフィ及び副腎脊髄ニューロパシーのような脱鞘の疾患、状態又は障害の治療にて再髄鞘形成を促すことが提案されている。一実施形態における羊膜エキソソームは肺損傷の修復を促す。これは、ヒト新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の治療で重要である。それは、たとえば、ウマ、競走用イヌ（たとえば、グレイハウンド）及びラクダのような競走用動物における運動誘導性肺出血（ＥＩＰＨ）の治療にて動物応用も有する。
【００３０】
従って、本明細書で可能になる本発明は、哺乳動物被験体を治療する方法であり、該方法は同じ種のドナー哺乳動物に由来する同種哺乳動物羊膜上皮細胞に由来する哺乳動物羊膜エキソソームの全身又は局所投与を含む。
【００３１】
「哺乳動物被験体」への言及には治療を必要とする哺乳動物が含まれる。一実施形態では、哺乳動物被験体はヒトである。用語「ＡＥＣ」は「羊膜上皮細胞」を意味する。ヒトに由来する場合、ＡＥＣは「ｈＡＥＣ」と呼ばれる。
【００３２】
従って、本明細書は、ヒト被験体を治療する方法にて指導的であり、該方法は、ヒトドナーに由来するヒト同種羊膜上皮細胞に由来するヒト羊膜エキソソームの全身又は局所投与を含む。
【００３３】
別の実施形態では、哺乳動物被験体は、たとえば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、アルパカ、ラマ、イヌ、ネコ又はラクダのような、しかし、これらに限定されない、非ヒト哺乳動物である。
【００３４】
一実施形態では、哺乳動物被験体は治療を必要とする。用語「治療」は、細胞、組織、及びニューロンや内分泌の経路を含む生理的経路の修復、再生又は再生の促進、及び／又は回復を包含する。例には、虚血性再潅流損傷又は脳卒中、内部及び表面の創傷、潰瘍及び瘢痕に続くそのような血管を含む毛細血管、動脈及び静脈のような循環血管を含む臓器、神経変性の状態、ならびに脳及び脊髄に対する損傷（外傷性脳損傷及び脊髄損傷を含む）の修復、再生及び／又は回復が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。エキソソームはまた、肺、肝臓、心臓、腎臓及び膵臓の線維化した疾患、状態又は障害のような臓器線維症の治療のために提案されている。エキソソームはまた、たとえば、多発性硬化症、視神経炎、デビック病、横断性脊髄炎、急性播種性脳脊髄炎、及び副腎白質ジストロフィ及び副腎脊髄ニューロパシーのような脱髄の疾患、状態又は障害の治療での使用についても意図される。羊膜エキソソームは、疾患又は状態を治療する臨床応用、ならびに皮膚の再生又は瘢痕又は創傷治癒を促進する化粧剤において有用である。
【００３５】
本発明を作用のいずれか１つの理論又は様式に限定するように意図することはない一方で、哺乳動物の羊膜エキソソームは、羊膜上皮細胞からのコミュニケーションのための小胞媒体を表し、有益な分子の混合物を提供して修復、再生及び回復を促すプロテオーム分子及び遺伝分子を放出することが本明細書で提案されている。プロテオーム分子及び遺伝分子のプロフィールは羊膜上皮細胞が得られるドナーの妊娠段階に応じて異なることも提案されている。従って、本明細書は、様々な妊娠段階の様々なドナーに由来する不死化した哺乳動物の羊膜上皮細胞のバンクを作り出すことを教示する。次いで上皮細胞は、治療される被験体における疾患又は状態に基づいて、且つ羊膜エキソソームが産出するプロテオーム分子及び遺伝分子のプロフィールに基づいてバンクから選択される。本明細書は、治療される疾患又は状態に応じて、特定のプロテオーム及び／又は遺伝子的プロフィールを有する羊膜エキソソームが好まれてもよいことを教示する。
【００３６】
従って、本明細書で教示される別の態様は哺乳動物被験体を治療する方法であり、該方法は、
（ｉ）必要に応じて、ドナーを特定することと、
（ｉｉ）培養にて上皮細胞によって産生される羊膜エキソソームのプロテオーム及び／又は遺伝子的プロフィールに基づいて特定のドナー又はあるドナーから不死化された羊膜上皮細胞を選択することと、
（ｉｉｉ）選択された不死化羊膜上皮細胞から馴化培地を生成することと、
（ｉｖ）馴化培地から羊膜エキソソームを単離することと、
（ｖ）羊膜エキソソームを哺乳動物被験体に全身又は局所投与することとを含む。
【００３７】
一実施形態では、哺乳動物被験体はヒト被験体である。従って、本明細書で教示される別の態様は、ヒト被験体を治療する方法であり、該方法は、
（ｉ）必要に応じて、ドナーを特定することと、
（ｉｉ）培養にて上皮細胞によって産生される羊膜エキソソームのプロテオーム及び／又は遺伝子的プロフィールに基づいて特定のドナー又はあるドナーから不死化された羊膜上皮細胞を選択することと、
（ｉｉｉ）選択された不死化羊膜上皮細胞から馴化培地を生成することと、
（ｉｖ）馴化培地から羊膜エキソソームを単離することと、
（ｖ）羊膜エキソソームをヒト被験体に全身又は局所投与することとを含む。
【００３８】
別の実施形態では、哺乳動物の羊膜エキソソームが単離され、それらのプロテオームプロフィール及び遺伝プロフィールが予め決定され、選択された哺乳動物羊膜エキソソームのバンクがそのプロフィールに基づいて生成される。次いで特定の羊膜エキソソームが治療での使用のために選択される。
【００３９】
従って、本明細書は、哺乳動物被験体を治療する方法について指導的であり、該方法は、
（ｉ）必要に応じて、ドナーを特定することと、
（ｉｉ）エキソソームによって放出される作用物質のプロテオーム及び／又は遺伝子的プロフィールに基づいて特定のドナー又はあるドナーから羊膜エキソソームを選択することと、
（ｉｉｉ）羊膜エキソソームを哺乳動物被験体に全身又は局所投与することとを含む。
【００４０】
一実施形態では、哺乳動物被験体はヒトである。
【００４１】
従って、本明細書で教示されるのは、ヒト被験体を治療する方法であって、該方法は、
（ｉ）必要に応じて、ドナーを特定することと、
（ｉｉ）エキソソームによって放出される作用物質のプロテオーム及び／又は遺伝子的プロフィールに基づいて特定のドナー又はあるドナーから羊膜エキソソームを選択することと、
（ｉｉｉ）羊膜エキソソームをヒト被験体に全身又は局所投与することとを含む。
【００４２】
羊膜エキソソームは治療法で使用される場合、薬物、作用物質、治療剤、細胞に基づく療法に由来する作用物質、有効成分等とも呼ばれてもよい。「治療法」への言及には臨床上の治療法及び美容上の治療法の双方が含まれる。
【００４３】
本明細書でさらに教示されるのは、哺乳動物被験体にて細胞性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復を誘導する方法であり、該方法は、細胞性又はニューロン性の修復を誘導するのに十分な時間且つ条件下での同種羊膜エキソソームの哺乳動物被験体への全身又は局所投与を含む。
【００４４】
一実施形態では、本明細書では、ヒト被験体における細胞性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復を誘導する方法が可能になり、該方法は細胞性又はニューロン性の修復を誘導するのに十分な時間且つ条件下での同種羊膜エキソソームのヒト被験体への全身又は局所投与を含む。
【００４５】
さらなる実施形態では、本明細書で意図されるのは、哺乳動物被験体にて細胞性又はニューロン性の修復、再生及び／又は回復のための薬物の製造における哺乳動物の羊膜エキソソームの使用である。
【００４６】
一実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００４７】
従って、本明細書はさらに、ヒト被験体における細胞性又はニューロン性の修復のための薬物の製造におけるヒト羊膜エキソソームの使用を教示する。本明細書はさらに、たとえば、多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない脱鞘性の疾患、状態又は障害の治療のための薬物の製造におけるヒト羊膜エキソソームの使用を教示する。
【００４８】
本明細書で教示されるのは、羊膜上皮細胞に由来する羊膜エキソソームの単離された試料である。これには、ヒト羊膜エキソソーム羊膜上皮細胞に由来するヒト羊膜エキソソームの単離された試料が含まれる。改善された細胞に基づく治療プロトコールにてこれらの羊膜エキソソームを使用することが提案されている。従って、本発明は、哺乳動物被験体を治療するのに使用するために選択される同種哺乳動物羊膜エキソソームを含む医薬組成物に及び、医薬組成物はさらに１以上の化粧上許容できる担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。
【００４９】
一実施形態では、哺乳動物被験体はヒト被験体である。
【００５０】
従って、本発明はヒト被験体を治療するのに使用するためのヒト同種羊膜エキソソームを含む医薬組成物を教示し、医薬組成物はさらに１以上の薬学上許容できる担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。
【００５１】
加えて、組成物は、ヒト被験体を治療するのに使用するためのヒト同種羊膜エキソソームを含む化粧品組成物であってもよく、化粧品組成物ははさらに１以上の薬学上許容できる担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。
【００５２】
薬学上許容できる担体は、たとえば、羊膜エキソソームを安定化するように作用する生理的に許容できる化合物を含油することができる。生理的に許容できる化合物には、たとえば、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、たとえば、アスコルビン酸又はグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、又は水若しくは生理食塩水を含む賦形剤、又は他の安定剤、及び／又は緩衝液を挙げることができる。界面活性剤は、羊膜エキソソームの吸収を安定化する、又は高める又は低下させるために使用することができる（リポソーム担体を含む）。薬学上許容できる担体及び製剤化は技量のある熟練者には既知であり、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている。たとえば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０），第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，（‘Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ’’）を参照のこと。
【００５３】
他の生理的に許容できる化合物には、羊膜エキソソーム製剤にて微生物の増殖又は活動を妨げるのに有用である保存剤が挙げられる。種々の保存剤が周知であり、たとえば、アスコルビン酸が挙げられる。当業者は、生理的に許容できる化合物を含む薬学上許容できる担体の選択は、たとえば、本発明の羊膜エキソソームの投与の経路、及びエキソソームによって産出されるタンパク質及び核酸の特定の生理的な又は生化学的な性質に左右されることを十分に理解することになる。
【００５４】
医薬組成物の形態での羊膜エキソソームの投与は、当業者に既知の好都合な手段によって、且つ疾患又は状態又は損傷の部位に応じて実施されてもよい。投与の経路には、呼吸的に、気管内に、鼻咽頭に、静脈内に、腹腔内に、胸腔内に、皮下に、頭蓋内に、皮内に、筋肉内に、眼内に、クモ膜下に、脳内に、鼻内に、直腸内に、局所に投与すること、貼付剤、包帯及びインプラントが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、羊膜エキソソームは、たとえば、重篤な火傷の被験体に噴霧することができる。
【００５５】
注射使用に好適な医薬形態には、無菌の水溶液又は水性分散液が挙げられる。
【００５６】
分散液に形態での無菌の注射溶液は一般に、羊膜エキソソームを含有する無菌の媒体に種々の無菌化した有効成分を組み込むことによって調製される。
【００５７】
非経口投与については、羊膜エキソソームを医薬担体と共に製剤化し、懸濁液として投与してもよい。好適な担体の実例は、水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、又は動物、植物若しくは合成起源の油である。担体は他の成分、たとえば、保存剤、緩衝液等も含有してもよい。羊膜エキソソームがクモ膜下に投与される場合、それらは脳脊髄液で製剤化されてもよい。
【００５８】
経粘膜又は経皮での投与については、作用物質を送達するのに、浸透されるバリアに対して適当な浸透剤を使用することができる。そのような浸透剤は当該技術で一般に既知であり、たとえば、経粘膜投与については、胆汁塩及びフシジン酸誘導体である。加えて界面活性剤を用いて浸透を促すことができる。経粘膜投与は鼻スプレー又は坐薬の使用を介することができる。たとえば、Ｓａｙａｎｉ及びＣｈｉｅｎ，（１９９６），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１３：８５−１８４．
【００５９】
本発明の羊膜エキソソームは、エキソソームを内部で時間をかけて送達することができる持続送達又は持続放出のメカニズムで投与することもできる。たとえば、羊膜エキソソームの持続送達が可能である生分解性のミクロスフェア又はカプセル又は他の生分解性のポリマー構造を本発明の製剤に含むことができる（たとえば、Ｐｕｔｎｅｙ及びＢｕｒｋｅ，（１９９８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１５３−１５７）。
【００６０】
本発明の医薬組成物を調製することにおいて、種々の製剤化技法を用い、操作してインビボ分布を変えることができる。インビボ分布を変える多数の方法が当業者に既知である。そのような方法の例には、たとえば、タンパク質、脂質（たとえば、リポソーム）、炭水化物又は合成ポリマーのような物質で構成される小胞におけるエキソソームの保護が挙げられる。薬物動態の一般的な議論については、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎのものを参照のこと。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、投与の方法に応じた種々の単位剤形にて投与することができる。そのような投与量は通常、実際忠告的であり、特定の治療背景に応じて調整される。これを達成するのに適する羊膜エキソソームの量は「有効量」として定義される。この使用についての投与量スケジュール及び有効量、すなわち、「投薬計画」は、疾患又は状態の段階、疾患又は状態の重症度、患者の健康の一般的な状態、患者の身体状況、年齢、医薬製剤及び濃度、又は羊膜エキソソームの選択を含む種々の因子に左右されるであろう。患者のための投薬計画を作ることにおいて、投与の方式も考慮に入れられる。投薬計画は医薬組成物のクリアランスの速度等も考慮に入れなければならない。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ｅｇｌｅｔｏｎ及びＤａｖｉｓ，（１９９７），Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１８：１４３１−１４３９；Ｌａｎｇｅｒ，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３を参照のこと。一実施形態では、０．０５μｇから１００μｇ単位までの間の羊膜エキソソームが投与される。これには、０．１μｇ〜５０μｇ及び０．１μｇ〜２０μｇ及びその間のいずれかの量が含まれる。
【００６２】
これらの方法によれば、羊膜エキソソーム又はそれを含む医薬組成物は、１以上の他の作用物質との併用で同時投与されてもよい。「同時投与される」への本明細書での言及は、同一製剤若しくは２つの異なる製剤での同一の若しくは異なる経路を介した同時投与、又は同一の若しくは異なる経路による順次投与を意味する。「順次」投与への本明細書での言及は、羊膜エキソソームと別の作用物質の投与間での秒、分、時間又は日の時間差を意味する。同時投与は任意の順で生じてもよい。同時投与され得る作用物質の例にはサイトカインが挙げられる。一般に、別の作用物質の選択は治療される疾患又は状態が前提となる。
【００６３】
或いは、ターゲティング療法を用いて、抗体又は細胞特異性リガンドのようなターゲティングシステムの使用によって羊膜エキソソームを細胞の種類又は身体の位置に送達してもよい。たとえば、治療が必要な部位での局所治療を促進するターゲティングは種々の理由で望ましくてもよい。
【００６４】
本明細書でさらに教示されるのは、羊膜エキソソームの産出である。好都合なことに、これは、回分培養リアクター又は連続流培養リアクターの形態であってもよいバイオリアクターにて達成される。一般に、羊膜上皮細胞が不死化され、バイオリアクターにおける増殖培地に播種するのに使用される。次いで得られた馴化培地を回収し、羊膜エキソソームを単離し、即時使用のために製剤化される、又は、後の使用のためにたとえば、凍結乾燥によって保存される。
【００６５】
キットも本明細書では意図される。キットは治療用であってもよく、又は診断用であってもよい。治療用のキットは選択されたバッチの凍結乾燥された羊膜エキソソームと１以上の他の薬学上許容できる担体、賦形剤及び／又は希釈剤、及び／又は別の活性剤とを含んでもよい。診断用のキットは羊膜エキソソームのバッチのプロテオームプロフィール又は遺伝プロフィールを決定する試薬を含んでもよい。
【実施例】
【００６６】
本明細書で教示される態様が今や以下の非限定の実施例によってさらに記載される。
【００６７】
実施例１：羊膜エキソソームの産出
羊膜エキソソームを単離するためにプロトコールを開発する（図１）。これは、羊膜エキソソームの初めての記載であり、その生物活性の検証である。ｈＡＥＣの初代単離物を無血清培地（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ，Ｌｏｎｚａ）で９６時間培養したのち、細胞を取り除き、１１０，０００ｇでの連続超遠心を介したエキソソームの単離のために馴化培地を処理する。在胎期間にかかわらず、１００万個のｈＡＥＣ当たりおよそ１．５〜２μｇの精製エキソソームが一貫して精製される。アポトーシス小体を混入させることなく、これをバイオリアクター型の培養で規模拡大することができる。
【００６８】
類似の効果を発揮する羊膜エキソソームの能力を調べた。羊膜エキソソームは明らかな用量効果（０．１μｇ対１μｇ）により、ｈＡＥＣ馴化培地と同程度にＴ細胞の増殖を抑制する。ｈＡＥＣ馴化培地からのエキソソームの枯渇（ＥｘＤ  ＣＭ）は、この効果を無効にした（図２Ａ）。このことは、羊膜エキソソームがＴ細胞抑制の主要なメディエータであることを示している。羊膜エキソソームはマクロファージの貪食活性を直接高めることができた（図２Ｂ）。これらの知見はｈＡＥＣ馴化培地の免疫調節効果はエキソソームに大きく起因することを示している。
【００６９】
実施例２：羊膜エキソソームの活性
羊膜エキソソームがインビボで機能的であるかどうかを判定した。羊膜エキソソーム１μｇのアリコートを出生後４日目のＢＰＤマウスに静脈内注射し、出生後１４日目に組織：気腔の比率の評価を行った。羊膜エキソソームは肺胞単純化を元に戻すことにおいて有効だった（図３）。羊膜エキソソームは、ＢＰＤマウスにて炎症を解消しながら、肺胞単純化を減らし、内在性幹細胞を動員することによって、それらが肺構造に対する有害な変化を防ぐ又は元に戻す主要な役割を担っている。
【００７０】
要約すると、データは、羊膜エキソソームが親細胞と同様の方法で宿主の免疫事象及び肺の修復を調節することを示している。羊膜エキソソームはｈＡＥＣのインビボでの再生能を総括（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）できることが提案されている。羊膜エキソソームへの積み荷の性質をあらわにすることによって、それらを用いて広範囲の免疫調節効果及び回復促進性の効果を発揮することができる。
【００７１】
ＢＰＤのマウスモデルを用いて、羊膜エキソソームの新生児投与が、ｈＡＥＣで処理した動物のそれに匹敵するレベルまでＢＰＤマウスにおける肺構造を回復させ、肺幹細胞の微小環境を活性化し、炎症を調節することができることを決定する。これが長期の生理的な結果（たとえば、肺高血圧症及び肺機能）での改善を生じるであろうことがさらに決定される。羊膜エキソソームのプロテオーム含量及びｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ含量を分析してｈＡＥＣが介在する修復に関連する特異的な経路を特定する。
【００７２】
実施例３：ＢＰＤマウスにおける羊膜エキソソームの回復効果
データは、羊膜エキソソームがインビトロ及びインビボで免疫調節効果及び再生促進効果を発揮することを示している。修復の間に羊膜エキソソームが細胞のクロストークにどのように影響を与えるのかを理解するために、及びＢＰＤの動物モデルにてｈＡＥＣの回復効果を総括するのに羊膜エキソソームだけで十分なのかどうかを判定するために、ｈＡＥＣの最適化された用量に対して２つの用量（１μｇと１０μｇ）の羊膜エキソソームの効果を比較する。線維芽細胞及び線維芽細胞エキソソームを対照として使用する。
【００７３】
ＢＰＤのマウスモデルを使用するが、それは、ヒトＢＰＤへの２つの主要な寄与因子（周産期の炎症と出生後の酸素過剰症）を組み合わせて肺修復に対する妊娠満期と妊娠満期前の羊膜エキソソームの効果を評価する。齧歯類を用いてＢＰＤのような複雑な疾患をモデル化することには限界がある一方で、このモデルは詳細な分子解析に適している。齧歯類の研究によって、用量効果の評価、及び青年期や成人の転帰を調査する長期試験に対する相対的な値頃感が可能になる。手短には、微細構築したガラス針（内径：７０〜８０μｍ）と微細注入器（ＩＭ−３００，Ｎａｒａｓｈｉｇｅ）を用いてＥ１６でのマウス胎児における各羊膜嚢に５μＬの生理食塩水中０．２μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を注入する。いったん生まれると、新生児マウス仔及び授乳母を酸素過剰（６５％酸素）チャンバー又は室内の空気のいずれかに入れる。授乳母を４８時間ごとに変えて、酸素毒性を防ぐ。出生前の炎症と出生後の酸素過剰のこの組み合わせはヒトＢＰＤに類似する肺損傷を引き起こす（Ｖｏｓｄｏｇａｎｅｓら．（２０１３），Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１５：１０２１−１０２９；Ｎｏｌｄら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１０：１４３８４−１４３８９）。出生後４日目に治療を与える。Ｅ１６での羊膜内ＬＰＳ注入、出生後４日目でのエキソソーム／細胞の注入及び屠殺時点を示す実験的タイムライン（×）を図４に示す。
【００７４】
羊膜内注入について記載されたのと同じ器具及びさらに広いガラス針（内径：１００〜１２０μｍ）を用いて表在側頭静脈を介してエキソソーム又は細胞を静脈内に注入する。最終注入容量は１０μＬであり、それは４日齢のマウスに上手く忍容される。免疫学的変化及び肺幹細胞の動員及び肺の修復を評価するためにマウス仔を出生後７日目及び１４日目に屠殺する。次いで、離乳後、動物の２つのコホートを室内の空気に移し、４週齢及び１０週齢で調べて、長期の転帰、たとえば、青年期及び早期成人における肺高血圧症、循環器及び呼吸器の機能に対する新生児治療の効果を評価する。
【００７５】
ｈＡＥＣは妊娠満期（３７〜４０週）のヒトの妊娠状態から単離する。初代単離物を実験に使用する。６人のドナーに由来するｈＡＥＣを同等にプールして動物実験すべてに対して均一な集団を提供する。ｈＡＥＣを受け取る動物は出生後４日目に１００，０００個のｈＡＥＣの単回注射を受ける。羊膜エキソソームについては、プールしたｈＡＥＣの一部を培養培地（２５ｍＬ当たり１０００万個、Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ，Ｌｏｎｚａ）に９６時間入れる。次いで馴化培地からエキソソームを単離する。単離されたペレットのエキソソームの性質について、エキソソームのマーカー（ＴＳＧ１０１及びＡｌｉｘ）に対するウエスタンブロット、ならびに電子顕微鏡によりサイズおよび区別を行う。エキソソームを生理食塩水に再浮遊させ、出生後４日目に１μｇ又は１０μｇのいずれかの用量で投与する。
【００７６】
ヒトの肺線維芽細胞は肺の修復を支援せず、対照細胞型として好適性がある（Ｍｏｏｄｌｅｙら．（２０１０），Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ｉ．：６４３−６５１）。上述と同様の培養プロトコールを用いて得られたヒトの肺線維芽細胞及び線維芽細胞エキソソームを投与する。線維芽細胞はｈＡＥＣと同じ投与量で投与され、線維芽細胞エキソソームは高い投与量（１０μｇ）で投与される。実験群を表１に記載する。
【００７７】
【表１】
2018518534.tif 000002
【００７８】
免疫的変化
肺を回収し、以前記載された（Ｎｏｌｄら．（２０１３）上記；Ｔａｎら．（２０１５），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．６：８）ようにフローサイトメトリー用に処理する。ＣＤ４５＋分画を選別し、表面マーカーと細胞内サイトカインの染色の組み合わせを用いてＴ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ１７Ａ、ＦｏｘＰ３）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩ）、好中球（ＣＤ１１ｃ、Ｌｙ６Ｇ）、Ｂ細胞（Ｂ２２０）及びＮＫ細胞（ＮＫ１．１）の数、表現型及び活性化状態に対する変化を評価する。気管支肺胞洗浄液を回収し、以前記載された（Ｎｏｌｄら．（２０１３）上記）ような、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサイトカインの変化を測定する。
【００７９】
肺の幹細胞／前駆細胞の動員
ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／Ｓｃａ−１＋／ＥｐＣａｍ＋（Ｌｅｅら．（２０１４），Ｃｅｌｌ，１５６：４４０−４５５）の基準に基づいてフローソーティングによってＢＡＳＣ集団に対する変化を測定する。これは、上記の免疫細胞の試験に由来する細胞のＣＤ４５＋分画を使用する。ＡＴ２はＣＤ３１−／Ｓｃａ１−／自己蛍光高のフローソーティングに基づいて選別される。単一細胞デジタルＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ，ｑｄＰＣＲ  ３７Ｋ）を用いて転写プロフィールの差異を判定する。細胞溶解、ＲＮＡの単離、事前増幅及びｃＤＮＡへの変換が発生するであろう９６穴のマイクロ流体プレート（Ｃ１単一細胞Ａｕｔｏｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）にてフローソーティングした単一細胞を捕捉する。次いで試料をデジタルＰＣＲ用のマイクロ流体カードに負荷する。ＳＩＮＧｕＬＡＲ  ｖ２．０解析ツールセットを用いてデータを解析する。ＢＡＳＣ及びＡＴ２の微小環境活性化経路が十分には記載されていないので、カスタマイズされた４８：４８ｄｅｌｔａＧｅｎｅアッセイにより、最近記載されたＢＭＰ１／ＮＦＡＴｃ１／トロンボスポンジン−１軸（Ｌｅｅら．（２０１４）上記）を含む幹細胞の多能性、活性化、動員及び分化をカバーする。
【００８０】
肺胞の単純化
組織：気腔の比率を測定する定量的画像解析を行って実験群すべてにわたって肺胞の単純化の程度を判定する。
【００８１】
宿主幹細胞微小環境の活性化
終末細気管支でのＢＡＳＣについて免疫組織化学染色（ＳＰＣ＋ＣＣ１０＋）を行って肺幹細胞微小環境の活性化状態（Ｌｅｅら．（２０１４）上記）を判定する。
【００８２】
目的は、肺の構造及び内在性肺幹細胞の動員に対する変化が肺機能の長期の改善及び二次合併症の低下にまで及ぶかどうかを知ることである。
【００８３】
生理的な試験
回復した青年期（４週齢）及び若年成熟（１０週齢）のマウスにて肺機能の試験及び心エコー検査を行う。
【００８４】
心エコー検査
マウスを３％のイソフルランで麻酔し、１〜２％で継続させて３５０〜４５０ｂｐｍの心拍を達成する。Ｖｅｖｏ  ２１００超音波（Ｍｏｎａｓｈ  Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ）及び４０ＭＨｚの線形変換器を用いて、前方に角度をつけた左胸骨傍の長軸断面に沿った肺動脈加速時間のＰＷドップラー測定を行う。右胸骨傍の長軸断面に沿ったＭモードを適用することによって右心室壁の厚さを測定する。侵襲性の肺機能検査について同じ群のマウスを使用する。それらは、インライン超音波ネブライザー、人工呼吸器、及び連結された圧変換器（ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ，ＳＣＩＲＥＱ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）に接続する１８Ｇのカニューレで気管切開される。気道抵抗及びコンプライアンスは漸増濃度のメタコリン（１〜３０ｍｇ／ｍＬ、サイクル当たり３分間）にマウスを曝露することによって評価する。強制呼気容量、肺活量及び深呼気量を得る。制約のない全身の容積脈波記録法とは異なって、これは動物の訓練を必要とせず、人工呼吸における短い中断を可能にして、その間に事前に定義された圧力又は容積の波形を測定する測定操作を実行する。これは、たとえば、過剰なデッドスペース及び測定不正確さのような容積脈波記録法にて直面する従来の難題を克服する。
【００８５】
羊膜エキソソームは、ＢＰＤマウスにてマクロファージの分極化を引き起こす、Ｔｅｒｇの発現を誘導する、及び好中球や樹状細胞の活性化を低下させるその能力で有益な効果を有するであろうことが提案されている。免疫的な変化は、１μｇの対照ｈＡＥＣに比べて１０μｇ用量の羊膜エキソソームによる方が重大であることが提案されている。そのようなものとして、肺胞単純化の反転は高用量の羊膜エキソソームを受け取っている動物の方が大きい。これは長期の生理的結果における改善に変換できるので、用量依存性の、右脳室壁の肥厚の軽減、肺高血圧症の改善及び正常な肺機能の回復があるであろう。ｈＡＥＣ又は羊膜エキソソームを健常マウスに与えた場合、変化は予想されない。線維芽細胞又は線維芽細胞エキソソームは免疫細胞、肺修復又は長期の生理的結果に対する効果を有するとは提案されていない。
【００８６】
実施例４：羊膜エキソソームにおける独特のメディエータ
ｈＡＥＣドナーの在胎期間はその回復能に対して重大な影響を有することができる（Ｌｉｍら．（２０１３），Ｐｌａｃｅｎｔａ，３４：４８６−４９２）。妊娠満期と妊娠満期前のｈＡＥＣから回収されたエキソソームへの積み荷の間での比較を行う。準備では、妊娠満期及び妊娠満期前のドナーに由来する羊膜エキソソームが投与され、肺胞単純化は妊娠満期ドナーに由来する羊膜エキソソームを受け取った動物でのみ元に戻されることが示されるので、免疫調節及び再生の経路を活性化する能力は妊娠満期前の羊膜エキソソームでは有意に損なわれていることを示している。当初の存在／非存在のプロテオーム解析をエキソソームへの積み荷で実施すると、妊娠満期及び妊娠満期前のドナーについてそれぞれ２４２及び２１の独特のタンパク質が特定されている。遺伝子オントロジーの解析を用いて、妊娠満期羊膜エキソソームが、創傷治癒、アポトーシス、血管発生、急性炎症、及び上皮細胞の発生に関連する細胞のシグナル伝達のメディエータを含有したことが見極められる。
【００８７】
プロテオーム解析については、羊膜エキソソーム（妊娠満期及び妊娠満期前；各群当たりｎ＝１０）の溶液中トリプシン消化を行い、それに続いて液体クロマトグラフィと絶対的定量のための質量分光分析（ＷＥＨＩ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を行う。データは、ナノＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）に連結されたＮａｎｏ−ＥＳＩソース（Ｐｒｏｘｅｏｎ）に適合させたＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極オービトラップｍ質量分光計を用いて取得する。ピークのリストは単一ＭＡＳＣＯＴで走らせた各ＬＣ−ＭＳ／ＭＳについて融合させ、ヒトＲｅｆ−Ｓｅｑタンパク質データベースに対して検索する（１％の偽発見率）。Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  Ｐｉｌｏｔ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）及びＳｐｏｔｆｉｒｅ（ＴＩＢＣＯ）を用いて定量的プロテオミクスのデータを解析する。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き順位検定を用いて存在量の差異を評価する。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースを出して機能、細胞内局在化に基づいてタンパク質を分類し、創傷治癒、細胞の生存及び免疫調節に関与する遺伝子を特定する。
【００８８】
核酸の解析については、ｃＤＮＡ末端のＭａｓｓｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＡＣＥ，ＧｅｎＸｐｒｏ  ＧｍｂＨ）を用いてデジタル遺伝子発現のプロファイリングを実施する。これによって、たとえば、普通マイクロアレイでは失われる受容体及び転写因子のようなＲＮＡＳｅｑ（１００万転写物当たり１〜２０コピー）よりも約２０倍深いところでの転写物の捕捉及び定量化比率を可能にする。ＭＡＣＥは、エキソソームに由来する小分子ＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの配列決定を行うように最適化され、各ｃＤＮＡ分子にタグを付けることによってｑＰＣＲとＲＮＡＳｅｑの利益を組み合わせる。それは、ｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの相互作用に影響を与える代替のポリアデニル化を特定するので、転写物の安定性及び生物学的関連性を決定する。対ごとの比較のための遺伝子オントロジー濃縮分析及び遺伝子セット濃縮分析を行う。
【００８９】
妊娠満期と妊娠満期前の羊膜エキソソームの間には独特の分子特徴があり、それはそれらの回復促進性効果及び再生効果に関連する。
【００９０】
実施例５：再生促進性効果
羊膜エキソソームの再生促進性効果を気管支肺異形成症の新生児マウスモデルで実証した。妊娠満期又は妊娠満期前の羊膜組織に由来するエキソソームの投与に続いて肺胞プルーニングが観察された（図１２Ａ〜Ｄ）。用語「ＢＰＤ」は気管支肺異形成症のマウスモデル動物を意味する。
【００９１】
実施例６：エキソソームの作用のメカニズム
肺の再生を誘導する能力について、妊娠満期由来のヒトエキソソームをヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）と並べて調べた。結果を図１３Ａ〜Ｃにて示す。妊娠満期エキソソームは、図１３にて暗く染まった（エラスチン陽性）先端部で見られるように二次中隔稜（ｓｅｐｔａｌ  ｃｒｅｓｔｓ）を回復した。
【００９２】
加えて、図１４は羊膜エキソソームが肺における内在性幹細胞の応答を引き起こすことを示している。実際、羊膜エキソソームはｈＡＥＣよりも２倍を超えて有効だった。
【００９３】
観察されたのはまた、羊膜エキソソームが外来性の肺幹細胞の増殖での増強を直接刺激することができることだった。これは対照に比べて、エキソソームに曝露された肺胞、気管支および混合肺組織で生じた。
【００９４】
実施例７：エキソソームは肝臓にて抗線維化性である
四塩化炭素の週３回の腹腔内注射を１２週間行うことによって８〜１２週齢の成熟マウスにて肝線維症を誘導した。８週目にエキソソーム（１μｇ）を週２回注射した。結果を図１５Ａ及びＢにて示す。シリウスレッドアッセイ及びα平滑筋アクチン（ＳＭＡ）発現アッセイを用いて生物線維性細胞を判定した。αＳＭＡは線維芽細胞の収縮性で役割を担う。αＳＭＡの発現は標準のアッセイを用いて判定し、シリウスレッド及びαＳＭＡの陽性の面積を視野当たりで測定した。炎症性マクロファージタンパク質ＣＣＬ４を使用した。ＣＣＬ４＋エキソソームは、ＣＣＬ４＋生理食塩水の対照に比べて視野当たりで有意に少ない線維性の細胞を生じた（図１５Ａ及びＢ）。
【００９５】
実施例８：プロテオームの積み荷
図１６は、妊娠満期エキソソームと妊娠満期前ｈＡＥＣとの間でのプロテオームの積み荷がほぼ同じであることを示す。妊娠満期前ｈＡＥＣに対比させた妊娠満期ｈＡＥＣのプロテオームの積み荷の間ではさらに大きな差異があった。調べたタンパク質を表２ａ及び２ｂにてリストにする。ｈＡＥＣと総ＭＳＣの間での有用な細胞成分の比較を図１７に示す。図１８はｈＡＥＣと総ＭＳＣの間での生物学的過程も比較する。
【００９６】
【表２ａ】
2018518534.tif 000003
【００９７】
【表２ｂ】
2018518534.tif 000004
【００９８】
実施例９：エキソソームは髄鞘形成を促進する
多発性硬化症の動物モデルにて羊膜エキソソームを調べる。エキソソームは再髄鞘形成を促進し、多発性硬化症と同様に、たとえば、視神経炎、デビック病、横断性脊髄炎、急性播種性脳脊髄炎、及び副腎白質ジストロフィ及び副腎脊髄ニューロパシーのような他の状態の治療に有用であることが期待される。
【００９９】
実施例１０：エキソソームの活性
ヒト羊膜上皮細胞の馴化培地から単離されたエキソソームは免疫調節効果及び再生促進効果を有する。羊膜エキソソームは（他の因子の中でも）高いレベルのＨＬＡ−Ｇを含有する。
【０１００】
羊膜エキソソームの免疫抑制性の有効性はドナーの在胎期間に対応する。これは在胎期間に関連するドナーの潜在力に対応し、我々はそれを（Ｌｉｍら、（２０１３）上記）にて以前公開している。
【０１０１】
羊膜エキソソームは気管支肺異形成症の新生児マウスモデルにて肺の損傷を元に戻す。静脈内に注射されたエキソソームは生理食塩水に比べて組織：気腔の比率を有意に改善し、我々のインビトロのものに一致して、妊娠満期の羊膜エキソソームはＢＰＤが関連する肺損傷を軽減するその能力で妊娠満期前のエキソソームより優れていた。これは、肺の内在性幹細胞の微小環境、すなわち、気管支肺胞管接合部の活性化に関連する。結果を図５に示す。羊膜エキソソームは肺線維症及び他の臓器の線維症の治療に有用であることが提案されている。
【０１０２】
羊膜エキソソームは、ブレオマイシンで誘導した肺線維症のマウスモデルにて確立された肺の炎症及び線維症を元に戻す。ブレオマイシン負荷の７日後の羊膜エキソソームの鼻内投与は肺における活性化された筋線維芽細胞（α平滑筋アクチン陽性）の比率を有意に低下させた。このことは、肺におけるコラーゲン沈着の低下に一致した。結果を図６に示す。
【０１０３】
羊膜エキソソームは、インビトロで初代ヒト肺線維芽細胞の活性化を直接元に戻す。５ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子βの存在下で培養すると、羊膜エキソソームは２４時間以内にα平滑筋アクチンのタンパク質レベルを低下させた。結果を図７にて示す。
【０１０４】
羊膜エキソソームは図８にて示すようにサイトカイン−サイトカイン受容体シグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有し、その際、黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【０１０５】
羊膜エキソソームは図９にて示すようにＷｎｔシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有し、その際、黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【０１０６】
羊膜エキソソームは図１０にて示すようにＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有し、その際、黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【０１０７】
羊膜エキソソームは図１１にて示すようにＴＧＦβシグナル伝達経路を標的とするｍｉＲＮＡを含有し、その際、黄色のボックスは１以上のｍｉＲＮＡによる標的を示す。
【０１０８】
羊膜エキソソームはたとえば、ｈＡＥＣのようなＡＥＣよりも少なくとも効果的なので、様々な生理的過程及び神経過程にて細胞性の及び分子上の修復メカニズムを誘導する大きな能力を有することは明らかである。
【０１０９】
当業者は、本明細書に記載されている本開示が具体的に記載されているもの以外の変化及び改変を受け易いことを十分に理解するであろう。本開示はそのような変化及び改変のすべてを意図することが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書で言及されている又は示されている工程、特徴、組成物及び化合物を個々に又はまとめて可能にし、且つ工程又は特徴又は組成物又は化合物の任意の２以上の任意の組み合わせ及び組み合わせのすべても可能にする。
【０１１０】
文献情報
Ａｎｄｅｒｓｏｎら  （２０１６）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｓｔｅｍ．２２９８
Ｄｏｙｌｅら  （２００６）  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１８：  １０８−１１３
Ｅｇｌｅｔｏｎ及びＤａｖｉｓ  （１９９７）  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：１４３１−１４３９
Ｆｉｓｈｂａｃｋら  （２０１３）  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：１７９  ｐｓ７）
Ｈｏｄｇｅｓら  （２０１２）  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｒｏｌ  ２０６：  ４４８ｅ８−４４８ｅ１５
Ｌａｎｇｅｒ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３
Ｌｅｅら  （２０１４）  Ｃｅｌｌ  １５６：４４０−４５５
Ｌｉｍら  （２０１３）  Ｐｌａｃｅｎｔａ  ３４：  ４８６−４９２
Ｌｏｄｈａら  （２０１４）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ：  ｅ９０８４３
Ｐｕｔｎｅｙ及びＢｕｒｋｅ  （１９９８）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：１５３−１５７
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０），  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ．
Ｍｏｏｄｌｅｙら  （２０１０）  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ｉ：６４３−６５１
Ｍｕｒｐｈｙら  （２０１２）  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２１：１４７７−１４９２
Ｎｏｌｄら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０：１４３８４−１４３８９
Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇら  （２０１１）  Ａｇｉｎｇ  （Ａｌｂａｎｙ  ＮＹ）  ３：８７３−８８８    
Ｓａｙａｎｉ及びＣｈｉｅｎ  （１９９６）  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １３：８５−１８４
Ｔａｎら  （２０１５）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ６：８
Ｖｏｓｄｏｇａｎｅｓら  （２０１３）  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １５：１０２１−１０２９
Ｙａｗｎｏら  （２０１３）  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３５：２７２−２８２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2018518534.tif 000013
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
2018518534.tif 000015
【図９Ｂ】
2018518534.tif 000016
【図１０】
2018518534.tif 000017
【図１１】
2018518534.tif 000018
【図１２】
2018518534.tif 000019
【図１３】
2018518534.tif 000020
【図１４】
2018518534.tif 000021
【図１５】
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【図１６】
2018518534.tif 000023
【図１７】
2018518534.tif 000024
【図１８】
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【国際調査報告】
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