(57)【要約】  本発明は、新たなネコカプシドタンパク質、そのカプシドタンパク質を含む生きた弱毒化ネコカリシウイルス、そのカプシドタンパク質を含む生きた組換えキャリアウイルスおよび生きた弱毒化ハイブリッドネコカリシウイルス、かかる生きた弱毒化ネコカリシウイルス、生きた組換えキャリアウイルスおよび生きた弱毒化ハイブリッドネコカリシウイルスを含むワクチン、ならびにかかるウイルスの調製方法に関する。【選択図】図６−７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つ、または以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１つを含む、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質。
【請求項２】
配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つまたは以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１つを含むカプシドタンパク質を含む、生きた弱毒化ＦＣＶ。
【請求項３】
請求項１に記載のカプシドタンパク質をコードする領域を含むことを特徴とする、ＤＮＡ断片。
【請求項４】
カプシドタンパク質をコードする領域が好適なプロモーターの制御下に置かれていることを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡ断片。
【請求項５】
キャリアウイルスが、請求項１に記載のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質をコードする領域を好適なプロモーターの制御下に含むことを特徴とする、生きた弱毒化組換えキャリアウイルス（ＬＡＲＣＶ）。
【請求項６】
ＬＲＣＶがミクソーマウイルスまたはネコヘルペスウイルスである、請求項５に記載の生きた弱毒化組換えキャリアウイルス。
【請求項７】
ＦＣＶに対するネコの防御における使用のための、請求項５または６に記載の生きた弱毒化組換えキャリアウイルス。
【請求項８】
請求項１に記載のカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）または請求項３に記載のＤＮＡ断片を含み、そして弱毒化ＦＣＶからのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）を含むことを特徴とする、生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ。
【請求項９】
ＦＣＶ株が、ＦＣＶ株Ｆ９からのＯＲＦ１を含むことを特徴とする、請求項８に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ。
【請求項１０】
ＦＣＶに対するネコの防御における使用のための、請求項８または９に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ。
【請求項１１】
請求項２に記載の生きた弱毒化ＦＣＶ、請求項５もしくは６に記載のＬＡＲＣＶ、または請求項８もしくは９に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを含む、細胞培養物。
【請求項１２】
請求項２に記載の生きた弱毒化ＦＣＶおよび／または請求項５もしくは６に記載の生きた組換えキャリアウイルスおよび／または請求項８もしくは９に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ、ならびに薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、ＦＣＶに対するネコの防御のためのワクチン。
【請求項１３】
少なくとも１つの他のネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスおよび／または少なくとも１つの他の免疫原性構成成分および／または前記ネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスの前記他の免疫原性構成成分をコードする遺伝材料を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの他のネコ病原性微生物またはネコ病原性ウイルスが、ネコ汎白血球減少症（ｆｅｌｉｎｅ  ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ）ウイルス、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよびネコヘルペスウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ａ．弱毒化ＦＣＶの全ＯＲＦ１領域および隣接するＯＲＦ２領域の５’部分を含む第一のＦＣＶ増幅産物の調製、
ｂ．ＯＲＦ１領域の３’部分および隣接する全ＯＲＦ２／／ＯＲＦ３領域を含み、ここでＯＲＦ２は請求項１に記載のＦＣＶカプシドタンパク質をコードするＯＲＦ２である、第二のＦＣＶ増幅産物の調製、
ｃ．オーバーラップ伸長を用いた第一および第二の増幅産物のアセンブリ、
ｄ．感染性ＦＣＶの作成、
ｅ．感染性ＦＣＶでの感受性細胞の感染
ｆ．感染性の後代ＦＣＶの回収
のステップを含む、請求項８に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを得る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなネコカリシウイルスカプシドタンパク質、そのカプシドタンパク質を含む生きた弱毒化ネコカリシウイルス、そのカプシドタンパク質を含む生きた組換えキャリアウイルスおよび生きた弱毒化ハイブリッドネコカリシウイルス、かかる生きた弱毒化ネコカリシウイルス、生きた組換えキャリアウイルスおよび生きた弱毒化ハイブリッドネコカリシウイルスを含むワクチン、ならびにかかるウイルスの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、カリシウイルス科のベシウイルス属に属する一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは高度に伝染性であり、ネコにおいて上部呼吸器疾患（ＵＲＤ）および口の潰瘍を引き起こす。このウイルスはまた、慢性の歯肉炎および口内炎にも関連している。より近年、高い死亡率、浮腫性および潰瘍性の皮膚病変ならびに黄疸を引き起こす、一般にＶＳ−ＦＣＶと呼ばれる病原性の全身性ネコカリシウイルスが出現した。ＦＣＶの伝染は、主として鼻または口の分泌物との接触による（Ｓｃｈｅｒｋ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（２０１３）  １５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｆｉｌｅ）。
【０００３】
カリシウイルス科のゲノムおよびゲノム組成は当該技術分野で周知である。全般的概要は、とりわけＣｌａｒｋｅ，Ｊ．らにより公表されている（Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３０９−３１６（２０００））。ネコカリシウイルスの最初の完全ゲノム配列は１９９２年に既に公表され（Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：４４３−４４８（１９９２））、後年、さらに多くのネコカリシウイルスの完全ゲノム配列が公表されており（とりわけＯｋａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＡ，Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ  ２０１３，ｖｏｌ．１，ｉｓｓｕｅ  ３，ｅ００３４９−１３，Ｇｅｎｏｍｅａ．ａｓｍ．ｏｒｇにより）、とりわけＧｅｎｂａｎｋを通じて利用可能である。
【０００４】
ＦＣＶのゲノムは、わずか３つのオープンリーディングフレーム；ＯＲＦ１、２および３を含む。ＯＲＦ１は大きな非構造ポリタンパク質をコードする。ＯＲＦ３は、短い３’末端ＯＲＦであり、ゲノムＲＮＡのカプシド形成に関与すると思われるマイナーなタンパク質をコードする。
【０００５】
ＯＲＦ２は、ＦＣＶカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームである。カプシドタンパク質は、宿主内で防御免疫応答を誘起するタンパク質であることが知られている。それゆえに、カプシドタンパク質は、ＦＣＶ感染に対するネコの防御のためのワクチン開発の標的タンパク質である。
【０００６】
ＦＣＶの株は、世界的に、ただ１つの血清型および優勢的に１つの血清群を構成する。しかしながら、株間に相当の遺伝的およびそれゆえに抗原的なバリエーションがある。この高いレベルの抗原的バリエーションは、ネコにおいてＦＣＶに対する幅広い防御を得ることを難しくしており：相同株を使ったワクチン接種は非常に効率がよいが、１つの株の別の株に対する交差防御のレベルはかなり変わりやすい（Ｃｏｙｎｅ  Ｃ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ８６：１１３５６−１１３６７（２０１２））。
【０００７】
今現在、改変生ワクチンおよび不活化ワクチンが利用可能であり、それらは通常、全身投与される。元来、単一ワクチンであるように用いられるワクチンは、大半が株ＦＣＶ  Ｆ９またはＦＣＶ  ２５５に基づくものである。しかしながら、それらは全て、上で確認した問題：幅広い交差防御の欠如にさらされている。
【０００８】
現在、この問題は、２つの異なるＦＣＶ株、例えばＦＣＶ  ４３１およびＦＣＶ  Ｇ１などを含む二価ワクチンを投与することにより、ある程度、少なくとも部分的に回避されている。かかる（不活化）二価ワクチンは、現在、米国および欧州の両方において商業的に利用可能である（Ｐｏｕｌｅｔ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：３６４７−３６５４（２００８）、Ｃｈｅｎｇｊｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １２：１２９−１３７（２０１０））。
【０００９】
弱毒化生ワクチンおよび不活化ワクチンの代替がＭｃＣａｂｅ  Ｖ．Ｊ．らにより開発され、彼らはＦＣＶカプシドタンパク質を発現する生きた弱毒化組換えキャリアウイルス（ＬＡＲＣＶ）、この場合はミクソーマウイルスを構築し、この組換えミクソーマウイルスをＬＡＲＣＶワクチンとしてネコに成功裏に投与した。かかる組換えミクソーマキャリアベースのワクチンは、キャリアが弱毒化され、ネコの中で複製せず、ＦＣＶカプシドタンパク質をコードするＦＣＶ  ＯＲＦを保有するだけであるという利点を持つ。したがって、ワクチン接種後にＦＣＶまたはキャリアウイルスが環境中に流出することはない。
【００１０】
ＦＣＶカプシドタンパク質を発現する生きた弱毒化組換えキャリアウイルスの別の例は、Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．ら（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．  ６０：７１７−７２３（１９９８））により記載されるネコヘルペスウイルスキャリアである。このキャリアもまたＦＣＶに対するネコのワクチン接種において用いられた。
【００１１】
しかしながら、安全であり、かつ幅広い交差防御レベルを示す弱毒化生ＦＣＶワクチンまたは組換えキャリアベースのワクチンは、未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｒｋ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（２０１３）  １５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｆｉｌｅ
【非特許文献２】Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３０９−３１６（２０００）
【非特許文献３】Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：４４３−４４８（１９９２）
【非特許文献４】Ｏｋａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＡ，Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ  ２０１３，ｖｏｌ．１，ｉｓｓｕｅ  ３，ｅ００３４９−１３，Ｇｅｎｏｍｅａ．ａｓｍ．ｏｒｇ
【非特許文献５】Ｃｏｙｎｅ  Ｃ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ８６：１１３５６−１１３６７（２０１２）
【非特許文献６】Ｐｏｕｌｅｔ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：３６４７−３６５４（２００８）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎｇｊｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １２：１２９−１３７（２０１０）
【非特許文献８】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．  ６０：７１７−７２３（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、安全で、なお幅広い交差防御レベルを示すＦＣＶワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚くべきことに、そのカプシドタンパク質が多くのＦＣＶ野外株に対して著しく幅広い交差防御スペクトルを示す、従来知られていなかったＦＣＶ株が存在することが見出された。この株の代表のカプシドタンパク質の例は、配列番号３４において表される。そのカプシドタンパク質配列が配列番号３４において示される、この新規ＦＣＶ株の代表は、さらにＦＣＶ株Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈと呼ばれる。
【００１５】
表１は、本発明による新規ＦＣＶ株に対して産生された抗血清の、３１の他のＦＣＶ株との交差中和性を示す。ウイルス力価におけるｌｏｇ１０の低減が示される。＞１．５  ｌｏｇ１０の力価低減は有意であると考えられる。
【００１６】
この表から得られるように、新規ＦＣＶ株Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに対して産生された抗血清は、驚くべきことに、試験された３１のＦＣＶ株のなかから２６株を中和している。一般的に用いられるＦ９株との比較を行った。表１中に見ることができるように、Ｆ９に対して産生された抗血清は、試験された２２のＦＣＶ株のなかからの３株について有意な力価低減を示すのみであることが見られる。
【００１７】
この新たなＦＣＶ株のカプシドタンパク質のアミノ酸配列は２４個の他のＦＣＶカプシドタンパク質の公知のアミノ酸配列と比較されており、この配列が公知のＦＣＶカプシドタンパク質とかなり顕著に異なることを結論付けることができる。図５から見ることができるように、新たな株のカプシドタンパク質と公知のＦＣＶ株のそれとの間の全体的な配列同一性は、約８７％である。加えて、新たなカプシドタンパク質のいくつかの固有のアミノ酸は、Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６であることが同定されている。加えて、アミノ酸４４７−４５２の配列ＫＬＥＹＥＮ、およびアミノ酸４８９−４９３の配列ＧＶＩＳＤもまた固有である。
【００１８】
配列番号３４のアミノ酸配列およびこのタンパク質をコードするＤＮＡについて、この株の個々の代表間にマイナーな天然のバリエーションが存在し得ることが理解される。まず第一に、ヌクレオチドレベルにおいて、それらがコードするアミノ酸配列中に気づかれないままのヌクレオチドの変化が起こり得ることを説明する、いわゆる「２番目および３番目の塩基におけるゆらぎ」があり：例えばトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＧおよびＴＣＣは全てロイシンをコードする。加えて、アミノ酸配列中にマイナーなバリエーションを導き得る、ヌクレオチドレベルのマイナーなバリエーションがＦＣＶの代表間にあり得る。これらのバリエーションは、全体的な配列中のアミノ酸の相違（１または複数）に、または前記配列中のアミノ酸（１または複数）の欠失、置換、挿入、逆位または付加に反映され得る。生物学的および免疫学的な活性を本質的に変えないアミノ酸置換は、例えばＮｅｕｒａｔｈらにより“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）中に記載されている。関連のあるアミノ酸間でのアミノ酸の置き換えまたは進化においてしばしば起こっている置き換えは、なかでも、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照されたい）。他のアミノ酸置換としては、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度のタンパク質比較法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）および同一のタンパク質間の機能的類似性を決定する方法を開発した。本発明の例示的実施形態のかかるアミノ酸置換体、並びに、欠失および／または挿入を持つバリエーションは、得られるタンパク質がそれらの免疫反応性を保持しているかぎり、本発明の範囲内にある。これは、本発明によるＦＣＶカプシドタンパク質が、異なる野外分離株から分離されたときに、同等の免疫学的交差反応性を有するタンパク質をなお表しながらも約９０％の同一性レベルを持ち得る理由を説明するものである。
【００１９】
それゆえに、本発明の第一の実施形態は、配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。
【００２０】
カプシドタンパク質は、配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と、好ましさが増す順に、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持ってもよい。
【００２１】
本発明および／またはその実施形態の別の実施形態は、配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つカプシドタンパク質を含む生きた弱毒化ＦＣＶに関する。
【００２２】
本発明および／またはその実施形態の別の実施形態は、本発明および／またはその任意の実施形態によるカプシドタンパク質を含む生きた弱毒化ＦＣＶに関する。
【００２３】
ＦＣＶは、配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と、好ましさが増す順に、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つカプシドタンパク質を持ってもよい。
【００２４】
加えて、本発明は、以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１つを含むネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１または複数を含む。好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多くを含む。
【００２５】
加えて、本発明は、以下のアミノ酸Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４またはＳ５４５のうちの少なくとも１つを含むネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４またはＳ５４５のうちの少なくとも１または複数を含む。好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４またはＳ５４５のうちの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多くを含む。
【００２６】
加えて、本発明は、以下のアミノ酸Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８またはＩ５２４のうちの少なくとも１つを含むネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８またはＩ５２４のうちの少なくとも１または複数を含む。好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８またはＩ５２４のうちの少なくとも１、２、３、４、５個またはそれより多くを含む。
【００２７】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０およびＭ１００を含む。
【００２８】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｉ３１７を含む。
【００２９】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８およびＮ４０４を含む。
【００３０】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１およびＮ４５２を含む。
【００３１】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｇ４８４、Ｇ４８９およびＩ４９１を含む。
【００３２】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８およびＩ５２４を含む。
【００３３】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｓ５４５を含む。
【００３４】
好適には、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｓ６３４、Ｆ６３５およびＰ６３６を含む。
【００３５】
本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、上で指示されたアミノ酸の群の組み合わせを含むことが明確に予想される。例えば、本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４およびＩ３１７を含む。別の例は、以下のアミノ酸Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４およびＳ５４５を含む本発明および／またはその実施形態によるネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。
【００３６】
加えて、本発明は、アミノ酸４４７−４５２がＫＬＥＹＥＮであり、および／またはアミノ酸４８９−４９３がＧＶＩＳＤであるネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。好適には、本発明は、アミノ酸４４７−４５２がＫＬＥＹＥＮであり、およびアミノ酸４８９−４９３がＧＶＩＳＤであるネコカリシウイルスカプシドタンパク質に関する。好適には、アミノ酸４４７−４５２がＫＬＥＹＥＮであり、および／またはアミノ酸４８９−４９３がＧＶＩＳＤであるネコカリシウイルスカプシドタンパク質はまた、以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｇ４８４、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５またはＰ６３６のうちの少なくとも１つを含む。
【００３７】
本発明および／またはその実施形態の別の実施形態は、配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、および以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１つを持つカプシドタンパク質を含む生きた弱毒化ＦＣＶに関する。
【００３８】
例えばＯＲＦ２またはその断片のような本発明によるカプシドタンパク質またはこのカプシドタンパク質をコードする領域は、ＦＣＶに対するネコの防御のためのワクチンの調製において、いくつかの方法で用いられ得る。
【００３９】
本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ断片は、例えば、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質を含む非ＦＣＶ組換えキャリアウイルスの調製のために用いられ得る。これはまた、下に記載されるハイブリッドＦＣＶの調製のためにも用いられ得る。
【００４０】
それゆえに、本発明の第三の実施形態は、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を含むことを特徴とするＤＮＡ断片に関する。
【００４１】
組換えキャリアが本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ断片のためのキャリアとして用いられる場合、カプシドタンパク質の発現は、通常、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ断片を、好適な異種プロモーターの制御下に置くことにより得られる。
【００４２】
好適なプロモーターは、宿主細胞；この場合は真核細胞、より具体的にはネコ細胞の中でプロモーターの下流に位置するコーディング領域の転写を駆動する能力があるプロモーターである。ＦＣＶカプシドタンパク質の発現に適した多数のプロモーターが当該技術分野で公知であり、これらはその効率的な発現レベルが認められている。かかるプロモーターとしては、古典的プロモーター、例えば（ヒト）サイトメガロウイルス前初期プロモーター（Ｓｕｎ−Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：８−１７（１９９９），Ｓｅｅｄ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーター（Ｄｏｎｏｆｒｉｏ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２４６−１２５４，（２００６））、マウスサイトメガロウイルス前初期（ＭＣＭＶｉｅ１）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス初期（ＭＣＭＶｅ１）プロモーター、ＳＶ４０前初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，１９８２）、ヒートショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）およびＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ；Ｔａｋａｋｉ，Ｓ；Ａｒａｋｉ，Ｋ；Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｆ；Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ａ；Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ；Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｇｅｎｅ  ７９（２）：２６９−２７７（１９８９）およびＮｉｗａ，Ｈ；Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ；Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ  １０８（２）：１９３−１９９（１９９１））などが挙げられる。
【００４３】
好適には、カプシドタンパク質をコードする領域は、好適なプロモーターの制御下に置かれる。
【００４４】
本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ断片は、例えばプラスミドであり得る。このプラスミドは、環状または線状の形態であり得る。
【００４５】
本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質により提供される幅広い防御を考慮すると、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を生きた組換えキャリアウイルスにおいて用いることは魅力的である。
【００４６】
かかる生きた弱毒化組換えキャリアウイルス（ＬＡＲＣＶ）は、宿主動物、この場合はネコの種に感染する能力があり、外来遺伝子、この場合は本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質コードする領域を好適なプロモーターの制御下に保有する能力がある組換えウイルスである。
【００４７】
ＬＡＲＣＶおよびそれらの使用は、とりわけＳｏｕｚａ，Ａ．Ｐ．Ｄ．らにより、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ，３８：５０９−５２２（２００５）中で概説されている。かかる生きた組換えキャリアウイルスの例は：ポックスウイルス（とりわけワクシニアウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ミクソーマウイルスおよびより近年はアルファウイルスである。
【００４８】
それゆえに、本発明の第四の実施形態は、プロモーターの制御下にある、本発明によるカプシドタンパク質をコードする領域を含む生きた弱毒化組換えキャリアウイルス（ＬＡＲＣＶ）に関する。
【００４９】
かかる弱毒化された生きた組換えキャリアウイルスの例は、ＭｃＣａｂｅらにより提供され、彼らはＦＣＶ株Ｆ９（上記参照）のカプシドタンパク質のためのＬＡＲＣＶとしてのミクソーマウイルスの使用を記載している。
【００５０】
ＦＣＶカプシドタンパク質を発現する生きた弱毒化組換えキャリアウイルスの別の例は、ＦＣＶカプシドタンパク質を発現するネコヘルペスウイルスキャリア、例えばＹｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．ら（上記参照）により記載されているものなどである。
【００５１】
好適には、生きた弱毒化組換えキャリアウイルスは、ミクソーマウイルスまたはネコヘルペスウイルスである。
【００５２】
本発明および／またはその実施形態の別の実施形態は、ＦＣＶの感染に対するネコの防御における使用のための、本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化組換えキャリアウイルスに関する。
【００５３】
カプシドタンパク質およびそのコーディング領域はまた、ＦＣＶに対するネコの防御のための別のアプローチを可能にし得る。このアプローチは、ハイブリッドＦＣＶに関する。
【００５４】
ＦＣＶ感染に対するネコの防御のための弱毒化生ワクチンが存在することは、当該技術分野において公知である。かかる生きた弱毒化ＦＣＶの例はＦＣＶ株Ｆ９であり、これは全身投与されたときに安全な生ワクチンを提供することが知られている。しかしながら、上で言及したように、ＦＣＶ株は全般的に、およびＦ９株もまた、他のＦＣＶ株でのネコの感染に対して幅広い交差防御を提供しない。
【００５５】
ここに、驚くべきことに、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域ならびに弱毒化ＦＣＶからのＯＲＦ１を含むハイブリッドＦＣＶ株は、高レベルの安全性および幅広い交差防御の両方を提供することが見出された。
【００５６】
別の実施形態は、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードする領域を含み、そして弱毒化ＦＣＶからのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の弱毒化物をコードする領域を含むことを特徴とする、生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶに関する。
【００５７】
好適には、本発明および／またはその実施形態の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶは、本発明および／またはその実施形態によるカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）を含み、そして弱毒化ＦＣＶからのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）を含む。
【００５８】
ハイブリッドカリシウイルスの構築方法は、当該技術分野で周知である。ネコカリシウイルスについて、Ｎｅｉｌｌらは、別個のＦＣＶ株間のカプシドタンパク質ドメイン交換を記載した（Ｎｅｉｌｌ，Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７４：１０７９−１０８４（２０００））。ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡコンストラクトのトランスフェクション後の細胞からの組換えウイルス回収のためのさらなる方法は、２００２年にＴｈｕｍｆａｒｔ  Ｊ．Ｏ．およびＭｅｙｅｒｓ  Ｇ．により既に記載された（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ７６：６３９８−６４０７（２００２））。Ａｕｂｒｙ，Ｆ．らは、近年、サブゲノム増幅産物を用いて一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスをなおより早く作成する方法を記載している（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ９５：２４６２−２４６７（２０１４））。
【００５９】
弱毒化ウイルスは、例えば、本発明および／またはその実施形態によるウイルスを突然変異誘発剤の存在下で増殖させること、およびその後の後代レベルおよび／または複製速度の減少を示すウイルスの選択により得られ得る。多くのかかる剤が当該技術分野で公知である。
【００６０】
別のしばしば用いられる弱毒化方法は、インビトロでの連続継代である。このプロセスの間に、ウイルスは連続継代のために用いられた細胞株に馴化する。その結果として、それらは、その後、再度ワクチンとして自然宿主に投与されたときに弱毒化の挙動を示す。
【００６１】
弱毒化ウイルスを得るなお別の方法は、それらを、それらの自然の生息場所の温度から外れた温度下での増殖に供することである。温度感受性変異株（Ｔｓ変異株）の選抜方法は、当該技術分野で周知である。かかる方法は、ウイルスを変異誘発物質の存在下で増殖させること、その後の最適以下の温度および最適温度での増殖、細胞層上での後代ウイルスの滴定、ならびに最適温度においてより遅く増殖するプラークの肉眼での選抜を含む。かかる小さいプラークは、増殖が遅く、それゆえに所望の生きた弱毒化ウイルスを含む。
【００６２】
弱毒化された一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスの作成のためのより直接的で予想可能な方法は、例えばＷｅｅｋｓ，Ｓ．Ａ．らによりＪ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：３１６１８−３１６２２（２０１４）中に記載されている。
【００６３】
当業者は、オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）からの弱毒化物または既に利用可能である弱毒化ＦＣＶ株からのＯＲＦ１をコードする領域を用いてもよい。かかる生きた弱毒化ウイルスの周知の例は、ＦＣＶ株Ｆ９である。Ｋａｌｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＪＶＲ（１９７５）３６：３５３−３５６は、ワクチンとしての株ＦＣＶ−Ｆ９の性質を記載した。Ｂｉｔｔｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｂｉｄ．（１９７６）３７：２７５−２７８も参照されたい。
【００６４】
好適には、本発明および／またはその実施形態は、オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）からの弱毒化物またはＦＣＶ株Ｆ９から得られるオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）をコードする領域を含む、本発明による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶに関する。
【００６５】
実施例セクションにおいて、上記の本発明および／またはその実施形態によるハイブリッドＦＣＶの調製方法は、詳細に記載される。
【００６６】
本発明のやはり別の実施形態は、ＦＣＶの感染に対するネコの防御における使用のための、本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶに関する。
【００６７】
生きた組換えキャリアウイルスの培養に適した哺乳動物細胞は、当該技術分野で公知である。かかる細胞は、公知のＬＡＲＣＶ、例えばポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ミクソーマウイルスおよびより近年はアルファウイルスなどの増殖をサポートする細胞である。ＦＣＶカプシドタンパク質を発現する弱毒化組換えミクソーマベースのキャリアウイルスは、例えばＲＫ１３細胞上で増殖し得る。ＦＣＶカプシドを発現する弱毒化組換えネコヘルペスウイルスベースのキャリアウイルスは、例えばＣｒａｎｄｅｌｌ−Ｒｅｅｓネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞上で増殖し得る。
【００６８】
同じく、生きた弱毒化ＦＣＶおよび生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶの培養に適した細胞は、当該技術分野で公知である。ＦＣＶを増殖させるために最も一般的な細胞は、ＣＲＦＫ細胞である。
【００６９】
それゆえに、本発明のやはり別の実施形態は、本発明および／もしくはその実施形態による生きた弱毒化ＦＣＶ、本発明によるＬＲＣＶまたは本発明による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを含む細胞培養物に関する。
【００７０】
上で示されるように、本発明および／またはその実施形態によるＦＣＶカプシドタンパク質は、種々の異なるＦＣＶ株に対して幅広い交差防御レベルを提供する。
【００７１】
この理由のため、本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ＦＣＶ、本発明および／またはその実施形態による生きた組換えキャリアウイルスならびに本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶは、ＦＣＶに対するネコの防御のためのワクチンに非常に適したベースを提供する。
【００７２】
それゆえに、本発明のなお別の実施形態は、ＦＣＶに対するネコの防御のためのワクチンに関し、かかるワクチンは、本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ＦＣＶならびに薬学的に許容される担体、および／または、本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化組換えキャリアウイルスならびに薬学的に許容される担体、および／または、本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶならびに薬学的に許容される担体を含む。
【００７３】
この点での防御は、幅広い意味で解釈されるべきであり：ＦＣＶに対するネコの防御は、疾患を予防するためのワクチン接種、疾患の徴候を減らすためのワクチン接種および疾患が診断された後の治療的ワクチン接種を含むものと考えられる。
【００７４】
本発明による使用のためのワクチンにおける使用に適した薬学的に許容される担体の例は、滅菌水、生理食塩水、水系のバッファー、例えばＰＢＳなどである。加えて、本発明によるワクチンは、他の添加物、例えば安定剤および／または抗酸化剤などを含み得る。
【００７５】
上で言及されるように、野外から分離されたＦＣＶの病原性は比較的高く：ネコカリシウイルス感染は上部呼吸器感染の原因であり、病原性ＦＣＶは中咽頭に投与されたときに、発熱、眼鼻の排出物、歯肉口内炎、舌炎、体重減少および悪い身体状態を引き起こす。ＦＣＶの病原性全身性形態は、発熱、血管炎、浮腫、肢上の潰瘍性病変、黄疸および死を引き起こす（ＦＣＶ  Ｆ９のワクチン株でさえも中咽頭に投与されたときに歯肉口内炎を引き起こすという散発的な情報がある）。
【００７６】
本明細書中で定義される生きた弱毒化ウイルスは、野外から分離されたウイルスと比較したときに病原性レベルが減少したウイルスである。本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ウイルス、生きた弱毒化ハイブリッドウイルスまたはＬＲＣＶでのワクチン接種は、野生型ＦＣＶでワクチン接種されていない動物の感染と比較したときに、発熱期間、口の潰瘍、体重減少および／またはウイルスが排泄される日数の面で感染の重症度を少なくとも低減させる（臨床的な徴候および症状の低減）。
【００７７】
通常、生きた弱毒化ＦＣＶ、ＬＲＣＶおよび生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶベースのワクチンは、アジュバントを添加せずに用いられ得る。それでもなお、そのように必要とされる場合は、アジュバントはワクチンの中に包含され得る。アジュバントは、宿主の免疫応答を非特異的にブーストする免疫刺激物質である。アジュバントは、親水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、または疎水性アジュバント、例えばミネラルオイルベースのアジュバントであり得る。
【００７８】
本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ＦＣＶ、ＬＲＣＶおよび生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶベースのワクチンは、安定剤を含み得る。安定剤は、本発明および／またはその実施形態によるワクチンに、例えばそれを分解から保護するため、貯蔵寿命を増大させるため、または凍結乾燥効率を改善するために加えられ得る。有用な安定剤は、とりわけＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９５０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５９，ｐ．５０９）、脱脂乳、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコース、乳糖、タンパク質、例えばアルブミンもしくはカゼインまたはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばアルカリ金属リン酸などである。凍結乾燥組成物を再構成するため、それは生理学的に許容される希釈剤中に懸濁される。かかる希釈剤は、例えば単純に滅菌水、または生理的食塩水であり得る。より複雑な形態において、凍結乾燥ワクチンは、エマルション、例えばＥＰ１，１４０，１５２中に記載されるものの中に懸濁され得る。
【００７９】
本発明および／またはその実施形態によるワクチンの標的生物への適用のための投薬スキームは、単回または複数回用量であり、免疫学的に有効であるような量の適用であり得る。
【００８０】
本発明および／またはその実施形態によるウイルスに基づく本発明によるワクチンについての「免疫学的有効量」を構成するものは、所望の効果に依存する。本明細書中で用いられる用語「免疫学的有効量」は、免疫されていないネコにおいて野生型ＦＣＶの感染により引き起こされる病理学的作用と比較したときに野生型ＦＣＶウイルスの感染により引き起こされる病理学的作用を減少させる程度にネコにおける免疫応答を誘導するのに必要な、本発明による生きた弱毒化ＦＣＶ、生きた弱毒化キャリアウイルスまたは生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶの量に関する。
【００８１】
処置が「免疫学的に有効」であるかを、例えばワクチン接種された動物に実験的チャレンジ感染を投与し、次に標的動物の臨床的疾患徴候、血清パラメーターを決定することまたは病原体の再分離を測定すること、その後にこれらの知見をワクチン接種されていないネコのチャレンジ後に観察される知見と比較することにより決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８２】
投与されるウイルスの量は、投与経路、あるいはアジュバントの存在および投与の時期に依存する。
【００８３】
本発明および／またはその実施形態による生きた弱毒化ＦＣＶまたは生きた弱毒化ハイブリッドウイルスを含む生ワクチンの好ましい量は、例えば組織培養感染量（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）として表される。例えば、生きた弱毒化ウイルスについて、１０２から１０８  ＴＣＩＤ５０／動物用量の間の用量範囲が好都合に用いられ得て；好ましくは１０４から１０６  ＴＣＩＤ５０の間の範囲が用いられる。
【００８４】
ワクチン中のミクソーマウイルスに基づく生きた組換えキャリアウイルスの好ましい量は、１０４〜１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲内である。ワクチン中のネコヘルペスウイルスに基づく生きた組換えキャリアウイルスの好ましい量もまた、１０４〜１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲内である。
【００８５】
いくつかの投与の方法が適用され得て、全て当該技術分野で公知である。本発明によるワクチンは、好ましくは、注射、好ましくは筋肉内注射を介してネコに投与される。投与プロトコールは、標準的なＦＣＶまたは生きた組換えキャリアウイルスのワクチン接種の慣行に従って最適化することができる。
【００８６】
イエネコは、通常、いくつかの疾患に対してワクチン接種される。投与の容易さの理由のため、およびまた経済的な理由のため、いくつかのワクチンを同時に、好ましくは組み合わせワクチンとして投与することが望ましい。そこで、かかる組み合わせワクチンは、本発明および／もしくはその実施形態による生きた弱毒化ＦＣＶならびに／または本発明および／もしくはその実施形態による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶならびに／または本発明および／もしくはその実施形態による生きた組換えキャリアウイルスを含み、これに加えて少なくとも１つの他のネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスおよび／または少なくとも１つの他の免疫原性構成成分および／または前記ネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスの前記他の免疫原性構成成分をコードする遺伝材料を含む。
【００８７】
それゆえに、この実施形態の好ましい形態は、ＦＣＶに対するネコの防御のためのワクチンに関し、ここでかかるワクチンは、本発明による生きた弱毒化ＦＣＶおよび薬学的に許容される担体、および／または、本発明による生きた組換えキャリアウイルスおよび薬学的に許容される担体、および／または、本発明による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶおよび薬学的に許容される担体、ならびに、少なくとも１つの他のネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスおよび／または少なくとも１つの他の免疫原性構成成分および／または前記ネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスの前記他の免疫原性構成成分をコードする遺伝材料を含む。
【００８８】
この実施形態のより好ましい形態において、少なくとも１つの他のネコ病原性微生物またはネコ病原性ウイルスは、ネコ汎白血球減少症（ｆｅｌｉｎｅ  ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ）ウイルス、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよびネコヘルペスウイルスよりなる群から選択される。
【００８９】
実施例セクションにおいて、本発明による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶの構築の詳細な例が提供される。基本的に、この方法は、各々完全長のウイルスゲノムの一部を含む第一および第二の増幅産物を、好ましくはオーバーラップ伸長を用いてアセンブルして、完全長のウイルスゲノムを含む増幅産物をもたらすステップを含む。好適には、第一のＦＣＶ増幅産物は弱毒化ＦＣＶの全ＯＲＦ１領域および隣接するＯＲＦ２領域の５’部分を含み、第二のＦＣＶ増幅産物はこのＯＲＦ１領域の３’部分および隣接する全ＯＲＦ２／／ＯＲＦ３領域を含み、ここでＯＲＦ２は本発明および／またはその実施形態によるＦＣＶカプシドタンパク質をコードするＯＲＦ２である。それゆえに、両増幅産物中に存在するＯＲＦ１領域の５’部分およびＯＲＦ２領域の３’部分にまたがったオーバーラップ領域が存在する。これは、オーバーラップ伸長を通じた第一および第二の増幅産物のアセンブリを可能にする。
【００９０】
したがって、なお別の実施形態は、
ａ．弱毒化ＦＣＶの全ＯＲＦ１領域および隣接するＯＲＦ２領域の５’部分を含む第一のＦＣＶ増幅産物の調製、
ｂ．ＯＲＦ１領域の３’部分および隣接する全ＯＲＦ２／／ＯＲＦ３領域を含み、ここでＯＲＦ２は本発明によるＯＲＦ２である、第二のＦＣＶ増幅産物の調製、
ｃ．オーバーラップ伸長を用いた第一および第二の増幅産物のアセンブリ、
ｄ．感染性ＦＣＶの作成、
ｅ．感染性ＦＣＶでの感受性細胞の感染
ｆ．感染性の後代ＦＣＶの回収
のステップを含む、本発明による生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを得る方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＦＣＶゲノムの５’末端から５３４９ｂｐ、またはＦＣＶ  Ｆ９ゲノムおよびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈゲノムの３’末端からそれぞれ２４２２ｂｐおよび２４１６ｂｐにわたる増幅産物を、ＦＣＶ  ｃＤＮＡからＰＣＲで増幅した。
【図２】ＦＣＶ  Ｆ９（配列番号６０）、Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ（配列番号５９）、ＦＫ（配列番号６２）およびＫＦ（配列番号６１）の完全長オーバーラップ伸長アセンブリを作成し、１％アガロースゲル上で分けた。ＦＣＶ  Ｆ９およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈは、それらのそれぞれの５’および３’増幅産物から、オーバーラップの設計を実証するための対照として作った。
【図３】完全長の組換えＦＫおよびＫＦ  ＦＣＶ  ＤＮＡをＰＣＲで増幅し、１％アガロースゲル上で分けた。
【図４】ＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに感染したＣｒＦＫ細胞におけるＦＣＶの典型的ＣＰＥ（細胞変性作用）の例。
【図５】公表されているＦＣＶ配列（配列番号３６〜５８）に対するＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ（配列番号３４）およびＦ９（配列番号３５）カプシドタンパク質配列のアラインメント。アミノ酸のナンバリングはヌクレオチドレベルでのものである。
【図６】組換えＦＣＶ  ＦＫ（配列番号６１）およびＫＦ株（配列番号６２）に対するＦＣＶ  Ｆ９（配列番号５９）およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ株（配列番号６０）の配列アラインメント。
【図７】公表されているＦＣＶ配列（配列番号３６〜５８）に対するＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ（配列番号３４）およびＦ９（配列番号３５）カプシドタンパク質配列のアラインメント。アミノ酸のナンバリングはアミノ酸レベルでのものである。
【図８】示されたＭＣＳのＮｃｏＩサイトにおいて変異を有するｐ２２ｍ−ＧＦＰプラスミドのマップ。
【図９】ｐ２２−ＧＦＰプラスミド由来のｐ２２ｍ−ＧＦＰおよびｐ２２ｍ−４ａコンストラクトの比較。
【図１０】ハイライトされたｐＭＣＰＫインサートを有するＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈクローンの全ゲノムの図。
【００９２】
［実施例］
実施例１：
ネコにおいて株ＦＣＶ  Ｆ９およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに対して産生された過免疫血清を用いて、いくつかのＦＣＶ株の中和指数を決定した。実験は、下のセクション８中に記載されるとおりに実施する。データを表１中に示す。この表から、Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに対して産生された血清は多くの他のＦＣＶ株に対して幅広い交差防御を持つことが明らかになる。Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに対する血清について、顕著なＬｏｇ１０低減（すなわち＞１．５）が、３１のＦＣＶ株のなかから１６株に対して見られる。表１はまた、通例的に用いられるＦ９株の交差防御がはるかに少ないことを示す。Ｆ９に対して産生された血清は、２２のＦＣＶ株のなかから３株について顕著なＬｏｇ１０低減（すなわち＞１．５）を示す。なお、Ｆ９血清により中和されるまたは少なくとも顕著に低減される２つのＦＣＶ株、３８０９、６４２０、ＣＶ−２１は、Ｆ９様ウイルスである。それゆえに、Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈは、Ｆ９が提供するものよりもはるかに多くのＦＣＶ株についての交差防御を提供するだけでなく、非Ｆ９株についての交差防御をも提供する。
【００９３】
表１：血清によるＬｏｇ１０低減
【表１】
2018537996.tif 000003
【００９４】
実施例２
ハイブリッドＦＣＶクローンの構築
１．細胞培養
全ての細胞株は、組織培養フラスコ中、３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。
【００９５】
Ｃｒａｎｄｅｌｌ−Ｒｅｅｓネコ腎臓（ＣｒＦＫ）細胞は、５％胎児ウシ血清、０．１５％炭酸水素ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２μｇ／ｍｌのファンギゾンを補充した培地Ｍ６Ｂ８中で増殖させた。
【００９６】
ＢｓＲＴ７細胞は、５％胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌジェネテシン（Ｇ４１８）を補充した培地ＤＭＥＭ中で維持した。トランスフェクション前の細胞播種時にジェネテシンを取り除いた。
【００９７】
２．ウイルス分離
中咽頭／鼻のスワブをネコから採取し、培地Ｍ６Ｂ８中に移した。スワブを短時間ボルテックスし、ウイルス懸濁液をコンフルエントなＣｒＦＫ細胞上に接種し、ＦＣＶに特異的なＣＰＥが観察されるまで３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。感染させたフラスコを凍結融解して細胞を溶解させ、清澄化して細胞デブリを取り除き、一定分量ずつ−７０℃で保存した。
【００９８】
３．ＦＣＶの増殖
適切なウイルス希釈液をコンフルエントなＣｒＦＫ単層に吸収させて感染させた。細胞は、ＦＣＶに特異的なＣＰＥが観察されるまで３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。感染させたフラスコを凍結融解して細胞を溶解させ、清澄化して細胞デブリを取り除き、一定分量ずつ−７０℃で保存した。
【００９９】
４．ＲＮＡ分離
清澄化したウイルス懸濁液を、１３１５００×ｇ、４℃で、ＳＷ２８ローターを用いて約１６時間遠心分離した。得られたペレットからＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを５０μｌ  ＲＮａｓｅフリー水中に溶出し、一定分量に分け、使用するまで−７０℃で保存した。
【０１００】
５．ｃＤＮＡ合成
ＦＣＶ  ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のための鋳型として用いた。ｃＤＮＡは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（登録商標）キット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ならびにプライマーＦｒ２Ｆ（配列番号３２）およびＦｒ４Ｒ（配列番号３３）を用いて合成した。
【０１０１】
６．ウイルス滴定
増殖培地中のウイルスの連続１０倍希釈液（１００μｌ／ウェル、５ウェル／希釈液）を用いて、９６ウェルプレート中のコンフルエントなＣｒＦＫ細胞単層を感染させた。感染したＣｒＦＫ細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で５日間までインキュベートし、ＦＣＶ特異的なＣＰＥについて調べた。ＣＰＥが存在したウェルの数を記録し、Ｒｅｅｄ  Ｍｕｅｎｃｈ法を用いて力価を産出した。力価をＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。
【０１０２】
７．ＦＣＶ抗体の調製
ＦＣＶ株に対する抗体をネコにおいて産生させた。３匹のネコからなる各処理群を別々に飼育した。ネコを中咽頭経路または皮下注射のいずれかにより感染させた。ネコに、中咽頭（ｏｒｏ−ｐｈｒｙｎｇｅａｌ）経路により２回目のウイルス用量を過免疫した。２回目の接種から３週間後、ネコから血漿を採取した。
【０１０３】
８．ウイルス中和アッセイ
ウイルスの段階希釈液を、等容量の一定量の血漿希釈物または増殖培地と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。ウイルスまたはウイルス血清混合物を、９６ウェルプレート中のコンフルエントなＣｒＦＫ細胞上に接種した（５ウェル／希釈液）。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２で５日間インキュベートした。観察された力価の差を算出することにより、中和指数を決定した。
【０１０４】
９．ＦＣＶ  ｃＤＮＡからオーバーラップしたＤＮＡ増幅産物を作成するためのプライマーの設計
ＦＣＶゲノムの５’側から５３４９ｂｐにわたる増幅産物を作成するためのＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、オリゴヌクレオチドプライマー対ＦＫＰ１Ｆ（配列番号５）およびＦＫＰ１Ｒ（配列番号６）ならびに表４中に記載されるＰＣＲ条件を使って実施した。同様に、ＦＣＶ  Ｆ９の３’末端から２４２２ｂｐおよびＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈの３’末端から２４１６ｂｐにわたる増幅産物を作成するためのＰＣＲ反応もまた、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、オリゴヌクレオチドプライマー対ＦＫＰ２Ｆ（配列番号７）およびＦＫＰ２Ｒ（配列番号８）を使って、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）および表５中に記載されるＰＣＲ条件を用いて実施した。
【０１０５】
１０．ＰＣＲ反応物からのＤＮＡの精製
増幅された全てのＤＮＡは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を用いて、２回のカラム洗浄を用いて精製した。溶出したＤＮＡの濃度および純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて決定した。
【０１０６】
１１．完全長ＦＣＶを作成するためのＦＣＶ増幅産物の結合
方法セクション９中に記載されるとおりに作成し、方法セクション１０中に記載されるとおりに精製した０．１、０．２５または０．５ｐｍｏｌの各ＦＣＶ増幅産物を使って、等モルの混合物を作った。十分な量の、典型的に５μＬのかかる混合物を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いた表６中に記載されるオーバーラップ伸長ＰＣＲのための鋳型として用いた。
【０１０７】
１２．完全長の感染性ＦＣＶ  ＤＮＡの作成
十分な量の、典型的に１から５μＬの間の、上のセクション５中に記載されるとおりに調製したｃＤＮＡ反応物またはセクション１１中に記載されるとおりに調製したオーバーラップ伸長ＰＣＲ反応物を鋳型として用いて、完全長の感染性ＦＣＶ  ＤＮＡを作成した。Ｔｈ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を、オリゴヌクレオチドプライマー対ＭＢＬ  ４４６（配列番号１）およびＭＢＬ  ４４７（配列番号２）またはＦＣＶＴ７ｆ（配列番号３）およびＦＣＶｐＡｒ（配列番号４）、ならびにそれぞれ表７および８中に記載されるＰＣＲ条件と一緒に用いた。
【０１０８】
１３．完全長の感染性ＦＣＶ  ＤＮＡのＢｓＲＴ７細胞へのトランスフェクション
セクション１中に記載されるとおりに２４ウェルプレート中で約５０〜７０％コンフルエンスまで培養したＢｓＲＴ７細胞を、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ３０００を用いて、セクション１２中に記載されるとおりに作成した完全長の感染性ＦＣＶ  ＤＮＡでトランスフェクトした。１ウェルあたり、典型的に３μｇのＤＮＡを用いた。細胞をＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体と共に７２時間までインキュベートした。
【０１０９】
１４．トランスフェクトされたＢｓＲＴ７細胞からの溶解液でのＣｒＦＫ細胞の感染
トランスフェクトされたＢｓＲＴ７細胞を凍結融解により溶解した。細胞溶解液を用いて、コンフルエントなＣｒＦＫ細胞単層を感染させた。
【０１１０】
１５．ＦＣＶの免疫蛍光染色
ＦＣＶを感染させたＣｒＦＫ細胞をメタノールで固定し、ＰＢＳで洗浄した。固定された細胞を順次、ポリクローナル抗ＦＣＶ血清および抗ネコＦＩＴＣ抗体コンジュゲートまたはマウスモノクローナル抗体ＮＣＬ−１Ｇ９（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）および抗マウスＦＩＴＣ抗体コンジュゲートと共にインキュベートした。Ｉ３フィルターを有するＤＭ１Ｌ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を用いて蛍光を観察した。
【０１１１】
１６．ＦＣＶの配列解析
完全長のＦＣＶ  ＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）および表４中に記載されるＰＣＲ条件と一緒に、ｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドプライマーＭＢＬ  ４４６（配列番号１）およびＭＢＬ  ４４７（配列番号２）を用いて作った。得られた完全長のＦＣＶ  ＤＮＡを方法セクション１１中に記載されるとおりに精製し、表３からのオリゴヌクレオチドプライマーの任意の組み合わせを用いてシークエンスした。ＤＮＡ試料はＧＡＴＣ−ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫによりシークエンスした。３０〜１００ｎｇ／μｌのプラスミドまたは１０〜５０ｎｇ／μｌのＰＣＲ産物を、１０ｐｍｏｌ／μｌのシークエンシングプライマーと共に送った。
【０１１２】
表１  完全長の感染性ＦＣＶ  ＤＮＡを作成するためのＰＣＲプライマー
【表２】
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【０１１３】
表２  ＦＣＶ増幅産物を作成するために用いられるＰＣＲプライマー
【表３】
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【０１１４】
表３  組換えＦＣＶゲノムの全長をシークエンスするためのＰＣＲプライマー
【表４】
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【０１１５】
表４  ５’末端から５３４９ｂｐにわたるＦＣＶの増幅産物を作成するためのＰＣＲ条件
【表５】
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【０１１６】
表５  ３’末端から２４２２ｂｐにわたるＦＣＶの増幅産物を作成するためのＰＣＲ条件
【表６】
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【０１１７】
表６  完全長ＦＣＶ  ＤＮＡ鋳型を作成するための、ＦＣＶ増幅産物を結合させるオーバーラップ伸長ＰＣＲを行うＰＣＲ条件
【表７】
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【０１１８】
表７  ｃＤＮＡから完全長のＦＣＶ  ＤＮＡを増幅し、５’  Ｔ７プロモーターおよび３’ポリＡトラクトを付加するためのＰＣＲ条件
【表８】
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【０１１９】
表８  オーバーラップ伸長ＰＣＲ鋳型材料から完全長のＦＣＶ  ＤＮＡを増幅し、５’  Ｔ７プロモーターおよび３’ポリＡトラクトを付加するためのＰＣＲ条件
【表９】
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【０１２０】
２．Ｍｙｘｏ−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈコンストラクトの調製
ｐＭＣＰＫ（Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ  ＦＣＶ分離株の主要なカプシドタンパク質の加工された部分）を、ｐ２２ｍ−ＧＦＰ（ｐ２２−ＧＦＰの誘導体）プラスミドのＭＣＳ（マルチクローニングサイト）上のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩサイトを用いてクローニングした。図８を参照されたい。
【０１２１】
ｐＭＣＰＫに余分なＣ末端ＡＡ（アミノ酸）が付加されることを避けるため、ｐ２２−ＧＦＰ内のＭＣＳのＮｃｏＩサイト中の開始コドンからの翻訳を、点変異（ＣＣＡＴＧＧ−＞ＣＣＡＴＣＧ、図１）を導入することにより取り除いた。部位特異的な突然変異誘発を用いて、以下のプライマーを用いたｐ２２−ＧＦＰプラスミドの変異を行った：
ｐ２２ｓｄｍＦ：５’−ＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡ−３’  配列番号６３
ｐ２２ｓｄｍＲ：５’−ＧＴＧＣＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧ−３’  配列番号６４
ＰＣＲプログラム：３０’’＠９８℃、２０×［１０’’＠９８℃、１０’’＠５８．３℃、２’＠７２℃］、５’＠７２℃、∞＠４℃、およびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，ｃａｔ：Ｍ０５３０Ｌ）。
【０１２２】
ＸＬ１０  ｇｏｌｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｃａｔ：２００３１５）への形質転換の前に、ＤｐｎＩ消化で反応物から鋳型のｐ２２−ＧＦＰプラスミドを除去した。得られたＥ．Ｃｏｌｉコロニーのうちのいくつかを取り、ミニプレップ培養を準備し、抽出されたプラスミドＤＮＡ（ＱｉａＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、ｃａｔ：２７１０４）をＮｃｏＩで消化することによりスクリーニングした。１％アガロースゲル上で、線状化プラスミドに対応する固有のバンドは、成功した変異を示した（ｐ２２ｍ−ＧＦＰプラスミド中にただ一つ残っているＮｃｏＩサイトがＧＦＰ遺伝子の上流に存在するため）。消化後の線状化プラスミドに加えて３４２ｂｐの断片は、２つのＮｃｏＩサイトの存在、したがってインタクトなｐ２２−ＧＦＰプラスミドの存在を示した。シークエンシングを続いて用いて、変異を確認した。
【０１２３】
インサートのｐＭＣＰＫは、以下のプライマー：
（ＫＡｐＢａｍＨＩＦ：
５’ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＣＣＣＣ−３’、配列番号６５
ＫｐＸｈｏＩｎＲ：
５’−ＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＧＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＣＣＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＧＧＣ−３’  配列番号６６、
を使ったＰＣＲを用いて作られたが、これはｐＭＣＰＫの５’末端におけるＫｏｚａｃ配列中に開始コドンを包含する。用いられたＰＣＲプログラムは：３０’’＠９８℃、３５×［１０’’＠９８℃、１０’’＠５５℃、４０’’＠７２℃］、５’＠７２℃、∞＠４℃であり、鋳型はＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ  ＦＣＶに感染したＣＲＦＫ細胞から分離されたトータルＲＮＡから調製されたｃＤＮＡであった。１％アガロースゲル上で正しい増幅産物サイズを確認した後、ＰＣＲ反応物中のインサートＤＮＡを精製し（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット）、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで、ｐ２２ｍ−ＧＦＰプラスミドとともに消化した。ライゲーションすると、この手法は、ＧＦＰインサートならびに５’および３’ＲＨＤＶリピートフランク（ｒｅｐｅａｔ  ｆｌａｎｋ）とｐＭＣＰＫとの置き換えをもたらす（図２）。消化されたインサートおよびプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上にロードし、１６６４ｂｐ（インサート）および４０３１ｂｐ（プラスミド骨格）のバンドを切り出し、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｇｅｌ抽出キット（ｃａｔ：４００７６６）を用いて精製した。骨格およびインサートを４℃で一晩ライゲーションし、２ｕＬのこのライゲーション液を続いてＸＬ１０  ｇｏｌｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ｃａｔ：２００３１５）中に形質転換した。ミニプレップ培養を準備し、抽出されたＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの両方で消化することによりスクリーニングした。インサートの同一性は、ｐＭＣＰＫインサートを作成したものと同じＰＣＲ反応（上を参照されたい）およびその後にシークエンシングを用いることで確認した。コンストラクトｐ２２ｍ−４ａをその後のステップ中での使用のために選んだ。
【０１２４】
１ｍＬのＭ６Ｂ８＋５％  ＦＢＳ培地中で希釈した５０ｕＬのＭＲ２４材料を、約８０％コンフルエントなＲＫ１３細胞を有する６ｃｍディッシュに５時間にわたって適用した後、吸着されなかった全てのＭＲ−２４ウイルスを洗い流し、追加で３ｍＬの同培地を補充し、約４．５ｕｇのｐ２２ｍ−４ａプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を用いてトランスフェクトした。約１７時間後、細胞の一部を穏やかなスクレイピングにより収集し、培地と一緒に保管した。プレート上に残った細胞の半分を固定し（１００％  ＥｔＯＨ）、ＦＣＶ抗血清、その後にＦＩＴＣ標識抗ネコ抗体で免疫蛍光染色し、ｐＭＣＰＫの発現を確認した。ｐ２２ｍ−４ａでトランスフェクトしただけの対照細胞またはＭＲ−２４に感染させただけの対照細胞は染色されなかったことから、染色された細胞は、ｐＭＣＰＫ発現増強、および、ＭＲ−２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈを与えるｐ２２ｍ−４ａとＭＲ−２４との間の可能な組換えを示した（組換えＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈウイルスの図について図１０を参照されたい）。
【０１２５】
ＭＲ−２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ組換えミクソーマウイルスの濃縮は、滴定の連続繰り返し、発現したｐＭＣＰＫの免疫蛍光検出および濃縮した試料の希釈を通じて行った。簡潔には、ＲＫ−１３細胞を播種したひと続きの９６ウェル組織培養ディッシュに、感染／トランスフェクションからのウイルスを希釈の範囲で感染させた。３日後、全ての９６ウェルディッシュを凍らせ、初回ストックとして保持した。第二のひと続きのＲＫ−１３播種９６ウェルディッシュに、次いで初回ストックからの材料（各ウェルから５〜１０μｌ）を感染させた。２〜３日後、これらの重複ディッシュを氷冷メタノールで特定し、最初にネコ抗ＦＣＶポリクローナル抗血清で、次にヤギ抗ネコＩｇＧ  ＦＩＴＣ標識二次抗体で染色した。蛍光を発する感染部分を含有するウェルを同定し、初回ストックディッシュ上の対応するウェルを取り、次いで希釈し、これを用いて第二のひと続きの９６ウェルディッシュを感染させ、これが２回目のストックとなった。この手法を、ウイルスストックが大多数組換えウイルスを含有するまで繰り返した。最終的な精製は、３回の単一フォーカス分離により達成した。３つの最も良好に染色されるクローン（すなわちＢ８、Ａ９およびＡ１０）を拡大し、クローンＡ９をさらなる実験において用いて、クローン純粋性（すなわちバックグラウンド中で増殖する野生型ＭＲ２４の欠如）およびインサート（すなわちｐＭＣＰＫ）の配列安定性を決定した。ＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  ＣｒｏｕｃｈをＲＫ１３細胞中で５回、各回において０．００１ＭＯＩで接種することにより継代した。
【０１２６】
ｐＭＣＰＫインサートの安定性を決定するため、継代１からのＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ  ＤＮＡおよび継代５からのＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ  ＤＮＡを比較した。ｐ２２ｍ−４ａ対ＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ−継代１、または、ＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ−継代１対ＭＲ−２４−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ−継代５のいずれにおいても変異は検出されなかったが、このことは、ｐ２２ｍ−４ａ中のｐＭＣＰＫがＭＲ２４を成功裏に組換え、５回のウイルス継代にわたって安定なままであることを示す。
【０１２７】
まとめると、これらの実験は、ＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈの加工された主要カプシドタンパク質（ｐＭＣＰＫ）がＭＲ２４−Ｋａｌｅｍ  ＣｒｏｕｃｈクローンＡ９のＭＧＦサイト中に挿入されていて、ここから発現することを示す。
【０１２８】
結果
１．ＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈの分離および増殖
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈは、２０１０年１２月にジャージー（Ｊｅｒｓｅｙ）におけるＦＣＶ大流行の際に取られたスワブから分離された。Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈという名前の２年６月齢の去勢したオスを起源とするスワブは、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｓｔ  Ｓａｖｉｏｕｒ、ジャージーにより採取された。スワブを短時間ボルテックスし、ウイルス懸濁液をコンフルエントなＣｒＦＫ細胞上に接種し、ＦＣＶに特異的なＣＰＥが観察されるまで３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。感染させたフラスコを凍結融解して細胞を溶解させ、清澄化して細胞デブリを取り除き、−７０℃で保存した。ウイルスの力価は１０６．９１  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【０１２９】
分離株のヌクレオチド配列を決定した。この配列を配列番号６０においてアノテーションする。
【０１３０】
カプシドタンパク質のアミノ酸配列を、パブリックドメインで利用可能な他のＦＣＶ配列とアラインした。配列アラインメントを図５および７中にアノテーションする。
【０１３１】
２．組換えＦＣＶウイルスの作成
２．１．ＦＣＶ増幅産物の調製
方法セクション５中に記載されるとおりに作ったＦＣＶ  Ｆ９またはＫａｌｅｍ  ＣｒｏｕｃｈのｃＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、オリゴヌクレオチドプライマー対ＦＫＰ１Ｆ（配列番号９）およびＦＫＰ１Ｒ（配列番号１０）、ならびに表４中に記載される条件を使ったＰＣＲ反応中で鋳型として用い、ＦＣＶゲノムの５’末端から５３４９ｂｐにわたる増幅産物を作成した。同様に、オリゴヌクレオチドプライマー対ＦＫＰ２Ｆ（配列番号１１）およびＦＫＰ２Ｒ（配列番号１２）、ならびに、表５中に記載されるＰＣＲ条件を用いて、ＦＣＶ  Ｆ９の３’末端から２４２２ｂｐ、および、ＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈの３’末端から２４１６ｂｐ、にわたる増幅産物を作成した。これらの増幅産物および５μＬのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、１×ＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、１２０Ｖで１時間かけた電気泳動を行うことにより分けた。予想されるサイズのバンドを図１中に示す。
【０１３２】
２．２．オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いたＦＣＶ増幅産物のアセンブリ
結果セクション２中で作成したＦＣＶ増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を用いて精製した。これらの増幅産物を用いてハイブリッドウイルスを作った：ハイブリッドウイルスＦＫは、Ｆ９骨格中にＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈカプシドを含み、ハイブリッドウイルスＫＦは、Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ骨格中にＦ９カプシドを含む。
【０１３３】
ＦＣＶ  ＦＫおよびＫＦの鋳型ＤＮＡを作るため、０．１から０．５ｐｍｏｌの間の各増幅産物を含有する等モルの混合物を、ＦＣＶ  Ｆ９  ５’末端およびＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ  ３’末端の増幅産物、またはＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ  ５’末端およびＦＣＶ  Ｆ９  ３’末端の増幅産物のいずれかを使って作った。これらの混合物を、表６中に記載される条件を使ったオーバーラップ伸長ＰＣＲ反応中で鋳型として用いた。アセンブルされたＦＫおよびＫＦのＤＮＡ増幅産物の予想されるサイズは、それぞれ７６８５ｂｐおよび７７０２ｂｐであった。これらの試料中のアセンブルされたＤＮＡおよび５μＬのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、１×ＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、１２０Ｖで１時間かけた電気泳動を行うことにより分けた。得られたアセンブルされたＦ９、Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ、ＦＫおよびＫＦのＤＮＡを図２中に示す。
【０１３４】
２．３．感染性ＦＣＶウイルスの作成
感染性ＦＣＶ  ＦＫまたはＫＦのＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにオリゴヌクレオチドプライマー対ＦＣＶＴ７ｆ（配列番号３）およびＦＣＶｐＡｒ（配列番号４）を用いて、表８中に記載されるＰＣＲ条件を使って作った。感染性ＦＣＶ  ＦＫおよびＫＦのＤＮＡの予想されるサイズは、それぞれ７７２８ｂｐおよび７７３７ｂｐである。これらの試料中の感染性ＦＣＶのＤＮＡおよび５μＬのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、１×ＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、１２０Ｖで１時間かけた電気泳動を行うことにより分けた。ＦＫおよびＫＦの完全長感染性ＤＮＡを、それぞれ図３のパートＡおよびＢ中に示す。
【０１３５】
２．４．感染性ＦＣＶウイルスの回収
感染性ＦＣＶ  ＦＫおよびＫＦのＤＮＡを、完全長のＰＣＲ反応物から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を用いて精製し、２４ウェルプレート上に増殖させた５０〜９０％コンフルエントなＢｓＲＴ７細胞に対して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ３０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、方法セクション１３中に記載されるとおりにトランスフェクトした。トランスフェクトしたＢｓＲＴ７細胞をトランスフェクション複合体と共に通例的な増殖条件下で２４〜７２時間インキュベートした後、凍結融解により溶解させた。各ウェルからのＢｓＲＴ７溶解液を次いで、ＣｒＦＫ細胞を５０から１００％の間のコンフルエンシーまで増殖させたウェルにアプライした。ＢｓＲＴ７細胞溶解液の存在下で増殖させたＣｒＦＫ細胞を、通例的な増殖条件下で、方法セクション１中に記載されるとおりにインキュベートした。ウイルスの存在を、図４中に示されるものと同様に、典型的にＣｒＦＫ細胞単層中でのプラーク形成により検出した。
【０１３６】
２．５．ＦＣＶ  ＦＫウイルスおよびＫＦウイルスの配列
組換えＦＣＶウイルスをシークエンスした。これらの配列を、図６中においてＦＣＶ  Ｆ９およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈの配列と比較した。組換えＦＫウイルスは配列番号６１で表示され、Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈカプシドを含む。組換えＫＦウイルスは配列番号６２で表示され、Ｆ９カプシドを含む。
【０１３７】
２．６  ネコにおけるＭｙｘｏ−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈコンストラクトの有効性
実験デザイン：
１５匹の８〜１１週齢の短毛イエネコを２群に分けた。１０匹のネコの群は、皮下に２回、３週間の間をあけて上記の組換えＭｙｘｏ−Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈコンストラクト（継代５）（１０６．２３  ＴＣＩＤ５０／用量）をワクチン接種され、そして５匹の対照ネコの群である。２回目のワクチン接種の４週間後、ネコをスワブし、対照のワクチン接種されていないネコのうちの２匹の鼻腔内に病原性ＦＣＶ株Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ（１０４．０  ＴＣＩＤ５０／ネコ）をチャレンジし、接触チャレンジのために残りのネコと混ぜた。全てのネコをチャレンジ後１日目からチャレンジ後１７日めまで毎日スワブした。体重および体温といった臨床的知見を記録した。臨床的知見を下のようにスコアリングした。表８を参照されたい（発熱および苦痛を緩和するために解熱剤を投与した。以前の実験において、解熱剤の投与はウイルス排泄に対する効果がないことが明らかになった）。
【０１３８】
表８：臨床的徴候のスコアリングの概要
【表１０】
2018537996.tif 000013
【０１３９】
結果：
ワクチン接種前（−１日目）、ネコに抗体はなかった。強い抗体陽転は、ワクチン接種後のネコにおいて観察されなかった（４８日目）。強い抗体陽転は、チャレンジ後のネコにおいて観察された（６６日目）。
【０１４０】
表９：抗体の力価
【表１１】
2018537996.tif 000014
【０１４１】
実験開始時またはチャレンジ前日のネコからウイルスを分離することができなかった。群１および２の全てのネコからウイルスを分離することができ、実質的なチャレンジを指示した両群に属するネコにおいてＦＣＶに関連した臨床的徴候が観察された。
【０１４２】
表１０：臨床スコア
【表１２】
2018537996.tif 000015
2018537996.tif 000016
【０１４３】
表１１：群ごとの臨床的徴候：
【表１３】
2018537996.tif 000017
【０１４４】
このデータに対するＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定は、合計スコア（Ｐ＝０．０３７）および発熱スコア（Ｐ＝０．０２０）についてワクチン接種されたネコと対照ネコとの間に統計的に有意な差を示し、このことは、Ｍｙｘｏ−Ｋａｌｅｍ  ＣｒｏｕｃｈコンストラクトはＦＣＶチャレンジ感染に対して免疫を誘導すること（チャレンジ後のネコにおける臨床スコアの低減）が可能であることを示した。
【０１４５】
実験デザイン
２．７  ＦＣＶのＦＫおよびＫＦハイブリッドウイルスに対する過免疫血清を産生させるための試験
この試験は、２２９から４３２日齢の間の短毛のイエネコ６匹から構成された。これらを３匹のネコの２群に分割し、群間で雄ネコを比較的均等に分割した。各群を別々に飼育した。馴化後、群１に属するネコの皮下に１０４．６  ＴＣＩＤ５０／用量のＦＣＶ株ＦＫを接種した。群２に属するネコの皮下に１０４．６  ＴＣＩＤ５０／用量のＦＣＶ株ＫＦを接種した。
【０１４６】
全てのネコは次いで、２週間後（１４日目）に、同じウイルスの１０５  ＴＣＩＤ５０／用量での２回目の用量を鼻腔内に受けた。２回目の接種の３週間後に血清を採取した。
【０１４７】
血清を熱不活化し、ウイルス中和試験を行った。ウイルスの中和は、ＣｒＦＫ細胞に対するウイルス誘導性の細胞変性作用（ＣＰＥ）の低減により評価した。３２〜３１６  ＴＣＩＤ５０のウイルスの５倍の複製物を等容量の血清段階希釈液（１：４で開始）と混合した。ウイルス／血清混合物を次いで３７℃で少なくとも６０分間インキュベートした。１００μｌのウイルス−血清混合物を次いで、１００μｌの増殖培地中のＣｒＦＫ細胞を播種した９６ウェル組織培養ディッシュに加えた。インキュベーションを５日間続けた。ＶＮ力価を、ウイルス誘導性ＣＰＥが完全になくなった最も高い血清希釈の逆数として表す。
【０１４８】
結果
表１２：初回接種（ｓ．ｃ．）後のＶＮ力価
【表１４】
2018537996.tif 000018
【０１４９】
ＮＴ：試験せず
表１３：２回目の接種（ｉ．ｎ．）後のＶＮ力価
【表１５】
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【０１５０】
このデータは、組換えウイルスＦＫおよびＫＦはネコにおいて免疫原性があることを示す。ネコにおいて発生した抗体は機能的（中和性）であった。抗体の交差反応性は、ハイブリッド株ＫＦ（Ｆ９カプシド）でのネコの接種は株Ｆ９に対するものであるが株Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに対するものではないウイルス中和抗体を誘導し、一方でハイブリッド株ＦＫ（Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈカプシド）での接種は株Ｆ９およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈの両方に対するウイルス中和抗体の誘導をもたらしたというように、ＦＣＶ株Ｆ９とＦＣＶ株Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈとの間に観察されるヒエラルキーに類似したヒエラルキーを示した。
【０１５１】
２．８  中和指数
ネコにおいて株ＦＣＶ  Ｆ９およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈに対して産生された過免疫血清を用いて、組換えＦＣＶ株ＫＦおよびＦＫの中和指数を決定した。データを表７中に示す。
【０１５２】
表から、ＦＣＶ株ＦＫは、抗ＦＣＶ  Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ過免疫血清により実際に強く中和され、ＦＣＶ株ＫＦは、抗ＦＣＶ  Ｆ９過免疫血清により実際に強く中和されることが明らかになっている。
【０１５３】
表１４  組換えＦＣＶ  ＦＫおよびＫＦに対するＦＣＶ  Ｆ９およびＫａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈ抗血清の中和指数
【表１６】
2018537996.tif 000020
【０１５４】
表１４ならびにＦＫおよびＫＦワクチン接種ネコから作成した血清から得られたデータ（表１３）は、ウイルス中和に一方向のヒエラルキーがあることを実証している。Ｆ９およびＫＦ（Ｆ９カプシド）抗血清は、Ｋａｌｅｍ  ＣｒｏｕｃｈまたはＦＫ（Ｋａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈカプシド）ウイルスを効率的に中和しないが、Ｋａｌｅｍ  ＣｒｏｕｃｈおよびＦＫ（Ｃａｌｅｍ  Ｃｒｏｕｃｈカプシド）をワクチン接種されたネコからの血清は自己を中和し、またＦ９およびＫＦ（Ｆ９カプシド）ウイルスを顕著に中和する。
【図１】
2018537996.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
2018537996.tif 000035
【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月22日(2018.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つ、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質。
【請求項２】
以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１つを含み、ここでナンバリングは配列番号３４に従うものである、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質。
【請求項３】
配列番号３４において与えられるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を持つカプシドタンパク質を含む、生きた弱毒化ＦＣＶ。
【請求項４】
以下のアミノ酸Ｋ８９、Ｍ９０、Ｍ１００、Ｉ３１７、Ｌ３９０、Ａ３９１、Ｖ３９２、Ｑ３９６、Ｓ３９７、Ｋ３９８、Ｎ４０４、Ｔ４２６、Ｔ４３１、Ｓ４３８、Ｓ４３７、Ｄ４４０、Ｅ４４５、Ｋ４４７、Ｌ４４８、Ｅ４５１、Ｎ４５２、Ｇ４８４、Ｇ４８９、Ｉ４９１、Ｎ５１６、Ｓ５１７、Ｅ５１８、Ｉ５２４、Ｓ５４５、Ｓ６３４、Ｆ６３５、Ｐ６３６のうちの少なくとも１つを含むカプシドタンパク質を含む、生きた弱毒化ＦＣＶ。
【請求項５】
請求項１または２に記載のカプシドタンパク質をコードする領域を含むことを特徴とする、ＤＮＡ断片。
【請求項６】
カプシドタンパク質をコードする領域が好適なプロモーターの制御下に置かれていることを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項１または２に記載のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質をコードする領域を好適なプロモーターの制御下に含むことを特徴とする、生きた弱毒化組換えキャリアウイルス（ＬＡＲＣＶ）。
【請求項８】
ＬＲＣＶがミクソーマウイルスまたはネコヘルペスウイルスである、請求項７に記載の生きた弱毒化組換えキャリアウイルス。
【請求項９】
ＦＣＶに対してネコを防御するための薬剤の製造における、請求項７または８に記載の生きた弱毒化組換えキャリアウイルスの使用。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の生きた弱毒化組換えキャリアウイルスを含む、ＦＣＶに対してネコを防御するための組成物。
【請求項１１】
請求項１もしくは２に記載のカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）または請求項５に記載のＤＮＡ断片を含み、そして弱毒化ＦＣＶからのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）を含むことを特徴とする、生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ。
【請求項１２】
ＦＣＶ株Ｆ９からのＯＲＦ１を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ。
【請求項１３】
ＦＣＶに対してネコを防御するための薬剤の製造における、請求項１１または１２に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶの使用。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを含む、ＦＣＶに対してネコを防御するための組成物。
【請求項１５】
請求項３もしくは４に記載の生きた弱毒化ＦＣＶ、請求項７もしくは８に記載のＬＡＲＣＶ、または請求項１１もしくは１２に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを含む、細胞培養物。
【請求項１６】
請求項３もしくは４に記載の生きた弱毒化ＦＣＶおよび／または請求項７もしくは８に記載の生きた組換えキャリアウイルスおよび／または請求項１１もしくは１２に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶ、ならびに薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、ＦＣＶに対するネコの防御のためのワクチン。
【請求項１７】
少なくとも１つの他のネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスおよび／または少なくとも１つの他の免疫原性構成成分および／または前記ネコ病原性微生物もしくはネコ病原性ウイルスの前記他の免疫原性構成成分をコードする遺伝材料を含むことを特徴とする、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの他のネコ病原性微生物またはネコ病原性ウイルスが、ネコ汎白血球減少症（ｆｅｌｉｎｅ  ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ）ウイルス、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコパルボウイルス、狂犬病ウイルスおよびネコヘルペスウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
ａ．弱毒化ＦＣＶの全ＯＲＦ１領域および隣接するＯＲＦ２領域の５’部分を含む第一のＦＣＶ増幅産物の調製、
ｂ．ＯＲＦ１領域の３’部分および隣接する全ＯＲＦ２／／ＯＲＦ３領域を含み、ここでＯＲＦ２は請求項１または２に記載のＦＣＶカプシドタンパク質をコードするＯＲＦ２である、第二のＦＣＶ増幅産物の調製、
ｃ．オーバーラップ伸長を用いた第一および第二の増幅産物のアセンブリ、
ｄ．感染性ＦＣＶの作成、
ｅ．感染性ＦＣＶでの感受性細胞の感染
ｆ．感染性の後代ＦＣＶの回収
のステップを含む、請求項１１または１２に記載の生きた弱毒化ハイブリッドＦＣＶを得る方法。
【国際調査報告】
2018537996.tif 000043
2018537996.tif 000044
2018537996.tif 000045
2018537996.tif 000046