(57)【要約】アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを使用して状態を処置するための医療機器、システム、および方法が開示される。例えば、医療機器を、アンチトロンビン−ヘパリン（ＡＴＨ）でコーティングして、血栓形成性の低減をもたらすことができる。様々な状態はこのようにしてＡＴＨで処置することができる。上記方法は、上記ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの溶液と接触させるステップを含み、上記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートが前記ポリマー表面を直接コーティングし得る。
2018524067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートでコーティングする方法であって、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートと前記ポリマー表面との間の連結基を伴わずに、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートが前記ポリマー表面を直接コーティングするように、前記ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの溶液と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記ポリマー表面が、ポリウレタン表面、ポリエチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリテトラフルオロエチレン表面、ポリジメチルシロキサン表面、エチレンアクリル酸コポリマー表面、Ｄａｃｒｏｎ表面、ポリエステル−ポリウレタン表面、ポリウレタン−ポリカーボネート表面、ポリ塩化ビニル表面、シリコーン表面、ポリジメチルシロキサン表面、ステンレス鋼表面、チタン表面、ラテックスゴム表面、ニチノール表面、ナイロン表面、ポリエチレンテレフタレート表面、ポリスチレン表面、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー表面が、ポリウレタン表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー表面が、静脈内カテーテル、動脈内カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、中心静脈カテーテル、スワン−ガンツカテーテル、冠状動脈ステント、動静脈シャント、機械弁、人工臓器、透析カテーテル、透析用血液回路ライン、透析膜、体外膜酸素添加ライン、体外膜酸素添加膜、および血液保存容器からなる群から選択される医療機器の表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマー表面が、カテーテルの内腔の内部表面であり、前記ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの溶液と接触させるステップが、前記カテーテルの前記内腔に前記溶液を引き込むこと、および前記カテーテルを前記溶液と所定の期間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、５分間から４８時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液をインキュベーション後に排出するステップ、および前記内腔内の残留溶液から溶媒を蒸発させるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー表面が、カテーテルの外部表面であり、前記ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの前記溶液と接触させるステップが、前記カテーテルを前記溶液に浸漬すること、および前記カテーテルを前記溶液と所定の期間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記期間が、５分間から４８時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液をインキュベーション後に排出するステップ、および前記カテーテル上の残留溶液から溶媒を蒸発させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
血栓形成性が低減した医療機器であって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートとポリマー表面との間の連結基を伴わずに、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートでコーティングされた前記ポリマー表面を含む、医療機器。
【請求項１２】
前記ポリマー表面が、ポリウレタン表面である、請求項１１に記載の医療機器。
【請求項１３】
前記医療機器が、静脈内カテーテル、動脈内カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、中心カテーテル、スワン−ガンツカテーテル、冠状動脈ステント、動静脈シャント、機械弁、人工臓器、透析カテーテル、透析用血液回路ライン、透析膜、体外膜酸素添加ライン、体外膜酸素添加膜、ｉｎ  ｖｉｖｏプロテーゼ、および血液保存容器からなる群から選択される、請求項１１に記載の医療機器。
【請求項１４】
医療機器のポリマー表面を凍結乾燥コーティングする方法であって、
前記医療機器の前記ポリマー表面を、連結基の非存在下で、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートおよび溶媒を含むアンチトロンビン−ヘパリン溶液と接触させるステップ、
過剰なアンチトロンビン−ヘパリン溶液を前記ポリマー表面から排出するステップ、ならびに
少なくとも部分減圧下で前記ポリマー表面から溶媒を蒸発させるステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
哺乳動物において血栓形成を阻害することにより医学的状態を処置する方法であって、前記哺乳動物に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み、前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート中のヘパリン鎖の少なくとも９８％が、３，０００ダルトン超の分子量を有する、方法。
【請求項１６】
前記医学的状態が、呼吸窮迫症候群であり、前記用量の前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップが、前記哺乳動物の肺に前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物において木質性結膜炎を処置する方法であって、前記哺乳動物の眼に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
哺乳動物において機械的換気からの傷害を予防または処置する方法であって、前記哺乳動物の肺に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
哺乳動物において木質性歯肉炎を処置する方法であって、前記哺乳動物の歯肉に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む、静脈内または動脈内カテーテルをフラッシュおよびロックするための溶液。
【請求項２１】
静脈内または動脈内カテーテル、
前記カテーテルを通してフラッシュされるように構成されたフラッシュおよびロック溶液であって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含むフラッシュおよびロック溶液、ならびに
前記フラッシュおよびロック溶液を前記カテーテルに注入するように構成されたシリンジ
を含む、フラッシュおよびロックシステム。
【請求項２２】
カテーテルの開通性を維持する方法であって、
前記カテーテルの内開口部が静脈または動脈の内側に開放し、前記カテーテルの外開口部が対象の外側に開放するように、前記カテーテルを前記対象の前記静脈または動脈に挿入するステップ、
前記カテーテルに前記カテーテルの前記外開口部を通してアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む溶液を注入するステップ、および
前記アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む前記溶液の少なくとも一部が前記カテーテル内に残るように、前記カテーテルの前記外開口部を密閉するステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
アンチトロンビン、ヘパリン、およびフィブリンを含む、血餅を処置するための組成物であって、前記ヘパリンの少なくとも５０重量％がアンチトロンビンにコンジュゲートされてアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成し、前記フィブリンの少なくとも一部がアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに結合している、組成物。
【請求項２４】
前記フィブリンの少なくとも５０重量％が、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに結合している、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
凝固または血液凝固は、血液が液体からゲル状態に変化するプロセスである。これは、止血または身体が損傷した血管からの血液損失を停止するプロセスの一部である。血液凝固はヒトの身体の公知の機能であるが、血液凝固は、手術および静脈内または動脈内カテーテル法などの医療手順中に困難な問題をもたらす場合がある。また、集団のかなり多くの部分が血液凝固障害を経験する場合があり、この障害では不必要な血餅が危険な健康リスクをもたらす。
【背景技術】
【０００２】
侵襲的手順、例えば心肺バイパス（ＣＰＢ）は、大量のフィブリン微小塞栓を誘発し、これは脳内に定着する場合があり、長期認知機能障害をもたらす可能性がある。ＣＰＢは、心血管疾患を処置するために世界中で行われている。小児科領域でのＣＰＢの使用は、専門的かつ繊細な作業である。毎年、カナダでは約７５０回、米国または欧州では７，５００回の小児科手術が行われている。成人の手術を含めると、毎年世界中で、８００，０００回を超える手術が行われている。カナダでの１回のＣＰＢ手術のコストの見積もりは、１０，０００ドル超である。現在、ヘパリンがＣＰＢにおける選択薬であり、１年当たりのコストは約５０ドル／ＣＰＢ、または年間で４０，０００，０００ドルである。ヘパリンは、ＣＰＢ中に血栓塞栓が脳に移行することを防ぐことはできず、これは急性および慢性認知機能障害と関連付けられる。また、血栓塞栓は、多くの他の侵襲的手術における危険因子である。ＣＰＢ後の制御不能な出血は、かかる高リスク患者のケアについての主要な関心事である。
【０００３】
静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）は、所望されない血液凝固を伴う別の状態である。ＶＴＥは、毎年１０００人当たり１〜２人に影響し、通常、脚の深部静脈血栓症（ＤＶＴ）または肺塞栓症（ＰＥ）の形態である。発症率は、４０歳未満の個体についての１０，０００人中１人から、６０歳超の個体については１００人中１人に増大する。米国では毎年、約１００万人の個体がＤＶＴを発症し、さらなる５００，０００人がＰＥを発症し、そのうち３０％は致命的である。全体として、すべてのＶＴＥ症例の約３分の２が、入院を必要とする。成人好中球減少性がんを有する６６，０００人の患者の研究では、ＶＴＥを発症しなかった患者（７．９８％）と比較して、ＶＴＥを発症したがん患者（１４．８５％）では、入院患者死亡率が実質的により高かった。また、ＶＴＥは、がん手術後のすべての死亡の４６．３％についての原因であると言われた。英国では、政府は、ＶＴＥのために毎年２５，０００件超の死亡が起こり、これは乳がん、ＨＩＶ、および交通事故による死亡の合計数を超えると見積もった。ＶＴＥ症例は、一般集団の加齢、ならびに手術、経口避妊薬、長距離移動、およびより高レベルの肥満などの危険因子への曝露の増大のために上昇することが予期される。
【０００４】
プラスミノーゲン欠乏症は、よく認識されている障害であり、この欠乏症では、プラスミノーゲンの低減したレベルが粘膜表面上に偽膜の発達を引き起こす。１つのかかる状態は、木質性結膜炎である。木質性結膜炎は、有害な血液凝固が関与する疾患の別の例である。ホモ接合性プラスミノーゲン欠乏症を引き起こす突然変異を有する小児患者は、凝固から形成され、フィブリン血餅形成を引き起こす、眼全体にわたる膜の表現型発現（木質性結膜炎）を有する。これらの眼の偽膜病変は、本質的に完全な視力障害の程度まで重度であり得る慢性的な眼科問題を引き起こす場合がある。２００３年現在、この疾苦を有する１００人を超える小児が世界中で報告されているが、近年より多くの小児が特定されてきている。現在の処置は、頻繁な角膜掻爬である。しかしながら、これらの手術操作は永続的な軽減を与えるものではなく、表面内皮層のリモデリングは眼の機能に影響する永久損傷を与える場合がある。この疾患の長期進行は、断続的な物理的除去を伴ってさえも、影響される小児において、身体的発育の低減および学習プロセスの障害をもたらす場合がある。したがって、個体が生じる顕著な身体的苦痛の他に、これはこの小児の全人生を通してその健康に強く影響する非常に深刻な問題である。これらの患者の視力を守り得る非侵襲的方法が考案され得るなら、それは非常に望ましいであろう。木質性結膜炎により影響される患者の数についての現在の値は、公知でない。しかしながら、１９９６年の研究は、ヘテロ接合性Ｉ型プラスミノーゲン欠乏症の有病率は０．２５％（９６１１人の対象中２５人）であることを発見しており、これは１  ０００  ０００人当たり１．６人のホモ接合性／合計ヘテロ接合性有病率と一致する。副腎皮質ステロイド、ヒアルロニダーゼ、および抗生物質での局所的処置は、可変的成功を示している。木質性の塊を切除するための手術介入が通常行われているが、状態の再発を防ぐことはあまりなく、繰返し手順を必要とする。
【０００５】
呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）は、肺内の線維症に関与する、よくある障害である。すべての幼児の約１％が１５００グラム未満の体重で生まれ、これら幼児の大多数がＲＤＳを患う。１０００グラム未満の出生体重の幼児はＲＤＳの非常に大きな発症率を有し、これらの幼児の５０〜８０％は死亡するか、または気管支肺異形成症（ＢＰＤ：ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）を発症する。実際に、ＲＤＳは、今もなお早産新生児の死亡率および疾病率の主要な原因である。界面活性剤の使用は、重症度を減少させ、未熟児のＲＤＳの死亡率をわずかに改善したが、今もなお顕著なＲＤＳ／ＢＰＤ発症率およびＢＰＤ重症度がある。小児および成人の両方の場合、感染、環境因子、および遺伝成分が、急性ＲＤＳエピソードを引き起こす場合があり、これは肺組織および構造のリモデリングに関与する慢性機能障害性疾患状態に進行する。
【０００６】
肺損傷は、クオリティ・オブ・ライフに重要な影響を有する事象であり、顕著な死亡率リスクを与える場合がある。示されている肺傷害の根底にある原因は、急性および慢性因子の両方から生じることが示されている。最近、高い肺ストレスのための機械的損傷が肺傷害発生の顕著な誘因であるという認識が増してきている。機械的換気を通して得られる呼吸補助処置は、急性ＲＤＳ患者において局所的傷害の進行を刺激し得る外傷を与える場合がある。低い１回換気量は結果の改善を与え得るが、死亡率は容認できないほど高いままである。実際に、人工呼吸器は、それ自体で直接、肺損傷を与える場合があり、報告は今や、換気に関連付けられる肺傷害の生物学的マーカーを強調している。臨床的な肺損傷を引き起こす基礎的な経路の陰で、新しい連動機構との関連が益々認識されている。ごく最近、最初の肺傷害により誘発された凝固が、急性ＲＤＳの肺炎症および線維症の発症に寄与するという強い証拠が出現している。凝固組織因子（ＴＦ）のアップレギュレーションは、ＲＤＳ発症と関連付けられるマーカーである。ここしばらくの間、ＲＤＳ／ＢＰＤ中のフィブリン関連損傷は肺からのその迅速なクリアランスのために必ずしも明らかではないが、肺胞フィブリン堆積は、幼児をＢＰＤ合併症にかかりやすくし得ることが公知である。それにもかかわらず、架橋結合フィブリン血餅の非存在下でさえも、低レベルのフィブリンモノマー生成物は界面活性剤の機能を妨害し、線維芽細胞の動員による肺胞表面リモデリングおよび線維症を補助する。同様に、また、換気誘発肺傷害と凝固との間の関係が認識されている。ここでもまた、換気による侵襲から結果として生じるＴＦ発現の増大は、肺損傷における進行を引き起こす血栓性合併症の因子として示唆されている。高い１回換気量の換気処置は、それ自体、新生児においてＴＦと関連付けられる肺性および全身性凝固を誘発する場合がある。
【０００７】
また、血液凝固は、カテーテルおよびステントなどの血液と接触する機器で問題を引き起こす場合がある。これらの機器は、表面誘発血栓症のために機器故障を起こす傾向がある。血液凝固は、中心静脈アクセスカテーテルで顕著な臨床問題である。カテーテルは、規則的かつ長期の静脈アクセスを必要とする様々な状態を有する多くの患者で、採血および薬物の送達のために使用される。理想的には、何ヶ月間か、またはさらには何年間か、カテーテルを原位置に残すことが可能であるべきであるが、カテーテルは血液凝固することがよく知られている。実際に、小児の場合、血栓症の大多数はカテーテル関連である。例えば、新生児における静脈および動脈血栓症の８９％は血管内カテーテルに関与し、小児における大動脈血栓症の７８％はカテーテル関連である。ある研究は、カテーテルの存在は小児における血栓症の最も高いリスク因子であることを結論付けた。全体として、静脈カテーテルを受容するすべての年齢の患者について、最大２６％がカテーテル関連血栓性合併症を有する。表面誘発血栓症の機構は完全には解明されていないが、表面が血液と接触した後すぐにタンパク質吸着が起こり、続いて血小板粘着および活性化、ならびに白血球活性化が起こり、これは最終的に血餅の形成をもたらすと考えられている。カテーテル内腔の内側に形成した血栓は、カテーテルを、採血または流体および薬物療法送達のための使用に適さないものにする。カテーテルの外側上に形成する血餅は、深部静脈血栓症および塞栓症を引き起こす場合があり、血管の完全性を損傷する場合があり、疼痛および膨張を引き起こす。これらの状況の両方は、患者にとっての不快をもたらし、患者ケアを崩壊させ、ケアに必要とされるリソースを増大させる。閉塞したカテーテルの処置は、血栓溶解治療またはカテーテルの置換のいずれかを含む。これは、患者にとっての不便および不快の増大、ならびにそれらの処置に対するコストの増大をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）置換は非常に侵襲的な手順であり、これは患者に疼痛および入院の延長を経験することをもたらし、置換手術のために、医師が他の患者を診る十分な時間を有することを妨げる。また、患者はＣＶＣ故障のために処置を中断されるか、または停止されるので、患者ケアは悪い状態になる。また、ＣＶＣ上の血餅は離脱し、血流を通して身体の他の部分に移行し、重度の合併症を引き起こす場合がある。それゆえ、これらの血餅は、入院の延長、本質的な患者処置の中断、認知神経機能障害、およびさらには死亡を引き起こす場合がある。
【０００９】
集団の加齢は、冠状動脈疾患、心不全、および卒中の発症率の増大をもたらすことが予想される。それゆえ、血液凝固関連疾患、医療機器における不必要な血液凝固、および医療手順中の血液凝固により引き起こされる問題は増大することが予想され、これはヘルスケア産業における莫大な財政的負担を生成し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、本開示の実施例に従う、ＩＩａのＡＴＨおよび非共有結合ＡＴ＋Ｈ阻害の二次速度定数（ｋ２）値のグラフである。図１Ｂは、本開示の実施例に従う、ＸａのＡＴＨおよび非共有結合ＡＴ＋Ｈ阻害の二次速度定数（ｋ２）値のグラフである。
【００１１】
【図２】図２は、本開示の実施例に従う、内皮存在下での、ＡＴＨおよびＡＴ＋ＨによるＩＩａ誘発フィブリン形成の阻害の遅滞時間のグラフである。
【００１２】
【図３】図３Ａは、本開示の実施例に従う、ヘパラン硫酸（ＨＳ）に結合したＩＩａにより誘発されたフィブリン形成の阻害の遅滞時間のグラフである。図３Ｂは、本開示の実施例に従う、トロンボモジュリン（ＴＭ）に結合したＩＩａにより誘発されたフィブリン形成の阻害の遅滞時間のグラフである。
【００１３】
【図４】図４Ａは、本開示の実施例に従う、１時間の高い換気量の機械的換気を伴う、または伴わない、肺内ＰＢＳ緩衝液で処置したラットからの血漿試料の凝血時間のグラフである。図４Ｂは、本開示の実施例に従う、１時間の高い換気量の機械的換気を伴う、または伴わない、肺内ＡＴＨで処置したラットからの血漿試料の凝血時間のグラフである。
【００１４】
【図５】図５は、本開示の実施例に従う、緩衝液（対照）またはＡＴＨのいずれかとインキュベートした細胞培地のウェスタンイムノブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
図は、いくつかの実施形態の例示にすぎず、それにより本技術の範囲を限定するものではないことに留意すべきである。
【００１６】
ここで、例示的な実施形態を参照し、特定の用語を使用して同実施形態を説明する。しかし、それによって意図される本開示の範囲が限定されるものではないことは理解され得る。当業者および本開示を手にする者であれば想到するであろう、本明細書に記載されている本発明の特徴の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書に記載されている技術の原理の追加適用は、本開示の範囲内と考えられるべきである。さらに、特定の実施形態が開示され、記載される前に、本開示は、特定のプロセスに限定されず、本明細書で開示されている材料自体がある程度変動できることは理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態について記載する目的のみに使用され、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義されるので、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１７】
本技術についての説明および主張において、以下の専門用語が使用されることになる。
【００１８】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうではないことを明確に指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「添加剤」への言及は、そのような成分の１つまたは複数への言及を含み、「溶液」は、そのような材料の１つまたは複数への言及を含み、「混合するステップ」は、そのようなステップの１つまたは複数を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「実質的な」は、材料の数量もしくは量、またはその具体的な特性に関して使用される場合、材料または特性が提供するとされている効果を得るのに十分な量を指す。許容可能な偏差の正確な程度は、一部のケースでは、具体的な文脈に左右され得る。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「約」は、同定された特定の性質について典型的な実験誤差に基づく偏差の程度を指す。「約」という用語が提供する範囲は、特別な文脈および特定の性質に依存し、当業者は容易に識別することができる。「約」という用語は、そうでなければ特定の値を与えられ得る均等物の程度を拡張または限定することを意図しない。さらに、別に示さない限り、「約」という用語は、範囲および数値データに関する以下の説明と一致して、明白に「正確に」を含む。
【００２１】
濃度、寸法、量および他の数値データは、ある範囲の形で本明細書に提示され得る。そのような範囲の形は、便宜上、簡潔に表現するために使用されているにすぎないことは理解されるべきであり、範囲の端点として明示されている数値を含むだけではなく、各数値および部分的範囲が明示されているように、その範囲内に包含される、すべての個々の数値または部分的範囲も含むと柔軟に解釈されるべきである。例えば、約１から約２００の範囲は、明示された端点の１および２００を含むだけではなく、個々の数、例えば２、３、４、および部分的範囲、例えば１０から５０、２０から１００なども含むと解釈されるべきである。
【００２２】
本明細書で使用される場合、複数の項目、構造的要素、組成要素および／または材料は、便宜上共通の列記として提示され得る。しかし、これらの列記は、列記の各要素が、別々および特有の要素として、個々に識別されているように受け取られるべきである。したがって、そのような列記の個々の要素は、反対の指示なしに共通のグループにおけるそれらの提示だけに基づく同列記の他のいずれかの要素の事実上の等価物と受け取られるべきではない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ヘキソース」は、６個の炭素原子を有する炭水化物（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）を指す。ヘキソースは、アルドヘキソース、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、イドース、グロース、タロース、アロースおよびアルトロースであってよく、これらの開鎖形態は、アルデヒド基を含有する。あるいは、ヘキソースは、ケトース、例えばフルクトース、ソルボース、アルロースおよびタガトースであってよく、これらの開鎖形態は、ケトン基を含有する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ウロン酸」は、炭水化物の第一級ヒドロキシル基の酸化により形成されるカルボン酸を指し、典型的には、それらが由来する炭水化物にちなんで名付けられる。したがって、グルコースのＣ６ヒドロキシルの酸化は、グルクロン酸を生じ、ガラクトースのＣ６ヒドロキシルの酸化はガラクツロン酸を生じ、イドースのＣ６ヒドロキシルの酸化はイズロン酸を生じる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ヘキソサミン」は、少なくとも１つのヒドロキシ基、典型的にはＣ２ヒドロキシ基が、アミンにより置き換えられているヘキソース誘導体を指す。アミンは、任意選択でアルキル化、典型的にはアセチル基によりアシル化（例えばムラミン酸を用いて）、スルホン化（Ｎ−硫酸化）、スルホニル化、リン酸化、ホスホニル化などされていてもよい。ヘキソサミンの代表的な例は、グルコサミン、ガラクトサミン、タガトサミン、フルクトサミン、それらの修飾した類似体などを含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「グリコサミノグリカン」は、ヘキソサミンおよびウロン酸を含有する、大規模な反復二糖単位の直鎖を指す。ヘキソサミンおよびウロン酸の正確な種類は大きく異なることがあり、それぞれの代表的な例は上の定義で得られる。二糖は、アルキル化、アシル化、スルホン化（Ｏ−またはＮ−硫酸化）、スルホニル化、リン酸化、ホスホニル化などにより任意選択で修飾され得る。そのような修飾の程度は、変動させてよく、ヒドロキシ基上であってもアミノ基上であってもよい。ごく通常では、Ｃ６ヒドロキシルおよびＣ２アミンは硫酸化される。鎖の長さは変動させてよく、グリコサミノグリカンは、２００，０００ダルトン超、典型的には１００，０００ダルトンまで、より典型的には５０，０００ダルトン未満の分子量を有し得る。グリコサミノグリカンは、典型的には、ムコ多糖として見出される。代表的な例は、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸、Ｎ−アセチル単糖含有ポリマー（例えばＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＮ−アセチルムラミン酸）など、ならびにガム、例えばアラビアガム、ガムトラガカントなどを含む。
【００２７】
「ヘパリン」は、ヘキスロン酸および２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースの交互配列から主になる硫酸化多糖である。ヘパリンおよび関連化合物のデルマタン硫酸は、血栓症および関連疾患の予防における臨床的使用のための抗凝固物質として十分に働く。それらは、ヘキソサミンおよびウロン酸を含有する硫酸化反復二糖単位の直鎖であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーのメンバーである。ＧＡＧ（例えばヘパリンおよびデルマタン硫酸）を使用した抗凝固は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、例えばアンチトロンビンＩＩＩ（本明細書では単に「アンチトロンビン」または「ＡＴ」と呼ばれる）およびヘパリン補因子（ＨＣＩＩ）により凝固酵素（重大なものはトロンビンである）を阻害するそれらの触媒作用で進行する。触媒によるセルピンの結合は、それらの作用のために起こり、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の直鎖状炭水化物鎖に沿った特異的配列で発生する。ヘパリンは、五糖配列を介したＡＴへの結合により作用し、したがって、様々な凝固酵素（トロンビンの場合は、ヘパリンも酵素に結合する）の阻害を増強する。また、ヘパリンは、セルピンＨＣＩＩに結合することによりトロンビンの阻害も増強できる。デルマタン硫酸は、六糖配列を介してＨＣＩＩに特異的に結合することにより作用し、したがって、トロンビンの阻害のみを増強する。グリコサミノグリカン（特にヘパリン）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで他の分子に結合できるか、または、様々な機構により作用部位から外れ得るので、ＧＡＧが共有結合でセルピンと持続的につながり続けることは有利であり得る。さらに詳細には、高い生物学的活性（例えば抗凝固活性）および改善した薬物動態学的性質を保つ、ヘパリンおよび関連したグリコサミノグリカンの共有結合コンジュゲート、ならびにそれらの調製のための簡単な方法を提供することが望ましいであろう。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、アルブミン、グロブリン（例えば、免疫グロブリン）、ヒストン、レクチン、プロタミン、プロラミン、グルテリン、ホスホリパーゼ、抗生物質タンパク質および硬タンパク質、ならびにコンジュゲートしているタンパク質、例えばリンタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、核タンパク質を含むが、それらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「セルピン」は、セリンプロテアーゼ阻害剤を指し、例えばアンチトロンビンおよびヘパリン補因子ＩＩなどの化学種が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「アミン」は、第一級アミン、ＲＮＨ２、第二級アミン、ＲＮＨ（Ｒ’）、および第三級アミン、ＲＮ（Ｒ’）（Ｒ”）を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、ＮＨまたはＮＨ２基を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「イミン」は、Ｃ＝Ｎ基およびその塩を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、哺乳動物における状態および／または疾患の「処置」または「処置すること」という用語は、状態もしくは疾患を防止すること、すなわち、疾患のいかなる臨床症状も避けること；状態もしくは疾患を阻害すること、すなわち、臨床症状の発現もしくは進行を停止すること；および／または状態または疾患を緩和すること、すなわち、臨床症状の回復を引き起こすことを意味する。処置は、医学的手順の前、最中または後での投与を伴う、医学的手順に関連する本開示の組成物の使用も含む。
【００３４】
上記に説明する背景に従って、本開示は、血液凝固が関与する状態を処置するための方法および組成物を対象とする。一例では、ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートでコーティングする方法は、ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの溶液と接触させるステップを含み得る。アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートとポリマー表面との間の連結基を伴わずに、直接ポリウレタン表面をコーティングすることができる。
【００３５】
別の例では、血栓形成性が低減した医療機器は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートとポリマー表面との間の連結基を伴わずに、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートでコーティングしたポリマー表面を含み得る。
【００３６】
さらなる例では、医療機器のポリマー表面を凍結乾燥コーティングする方法は、医療機器のポリマー表面を、連結基の非存在下で、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートおよび溶媒を含むアンチトロンビン−ヘパリン溶液と接触させるステップを含み得る。その後、過剰なアンチトロンビン−ヘパリン溶液は、ポリマー表面から排出してもよい。その後、溶媒を、少なくとも部分減圧下でポリマー表面から蒸発させてもよい。
【００３７】
追加の例は、哺乳動物において血栓形成を阻害することにより医学的状態を処置する方法を含む。本方法は、哺乳動物に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート中のヘパリン鎖の少なくとも９８％は、３，０００ダルトン超の分子量を有する。
【００３８】
別の例では、哺乳動物において木質性結膜炎を処置する方法は、哺乳動物の眼に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得る。
【００３９】
さらに別の例では、哺乳動物において機械的換気からの傷害を処置する方法は、哺乳動物の傷害を負った肺に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得る。
【００４０】
別の例では、哺乳動物において木質性歯肉炎を処置する方法は、哺乳動物の歯肉に所定の用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得る。
【００４１】
別々の例では、静脈内または動脈内カテーテルをフラッシュおよびロックするための溶液は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含み得る。
【００４２】
別の例は、カテーテルの開通性を維持する方法を含む。本方法は、カテーテルの内開口部が静脈または動脈の内側に開放し、カテーテルの外開口部が対象の外側に開放するように、カテーテルを対象の静脈または動脈に挿入するステップを含み得る。カテーテルにカテーテルの外開口部を通してアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む溶液を注入することができる。その後、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む溶液の少なくとも一部がカテーテル内に残るように、カテーテルの外開口部を密閉してもよい。
【００４３】
さらに別の例では、血餅を処置するための組成物は、アンチトロンビン、ヘパリン、およびフィブリンを含み得る。ヘパリンの少なくとも５０重量％は、アンチトロンビンにコンジュゲートしていてアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成し得る。フィブリンの少なくとも一部は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに結合していてもよい。
【００４４】
別の例では、状態または疾患を処置する方法は、それを必要とする哺乳動物に、本技術の例に従って調製されたアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得る。さらに詳細には、これらの処置は、そのような処置を必要とする対象、例えばヒトに、本開示のヘパリンおよびアンチトロンビンコンジュゲートを投与することによって実行され得る。本明細書に記載されているコンジュゲート組成物を使用して処置できる状態および疾患は、心筋梗塞および数々の血栓状態を含む。これらは、数例を挙げれば、新生児呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群、肺の原発癌、非ホジキンリンパ腫、線維性肺胞炎および肺移植で見出されるフィブリン沈着を含む。また、本組成物は、後天性ＡＴ欠乏状態、例えば新生児呼吸窮迫症候群、Ｌ−アスパラギナーゼにより誘導される欠乏、心肺バイパス法により誘導される欠乏、敗血症または先天性ＡＴ欠乏状態も処置できる。先天性ＡＴ欠乏のケースでは、ＡＴに加えてヘパリンを必要とするヘテロ接合体において、ＡＴが０．２５単位／ｍｌ未満のレベルである生命に関わる血栓性合併症は、米国において毎年乳児１または２名までに発生することがある。本開示において処置される状態および疾患は、過剰なトロンビン生成または活性により特徴付けられるものを含む。そのような状態は、対象が外傷を負っている場合、例えば手術患者において発生することが多い。創傷または手術によって引き起こされる外傷は、血管損傷および血液凝固の二次活性化をもたらす。これらの望ましくない影響は、一般的なまたは整形外科手術、婦人科手術、心臓もしくは血管手術または他の手術手技の後で発生し得る。過剰なトロンビンは、自然疾患、例えば心臓発作を引き起こし得るアテローム性動脈硬化症、卒中または四肢の壊疽の進行も悪化させ得る。したがって、本技術の方法および組成物を使用して、不安定狭心症、急性心筋梗塞（心臓発作）、脳血管障害（卒中）、肺塞栓症、深部静脈血栓症、動脈血栓症などを含む、いくつかの心血管系合併症を処置、防止または阻害できる。本技術の組成物および方法を使用して、透析中の血液凝固を低下または防止でき、心臓切開手術手技中の血管内凝固を低下または防止できる。さらに詳細には、本開示の態様では、止血を妨害する医学的状態（例えば、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症など）による血栓が発生する危険性の高い患者におけるトロンビンの生成または活性を防止または阻害するための方法および組成物が提供される。別の態様では、医学的手順、例えば心臓手術、血管手術または経皮冠動脈インターベンション後に血栓が発生する危険性の高い患者に対する方法および組成物が提供される。実施形態では、本開示の方法および組成物は、心肺バイパス法手術に使用される。組成物は、医学的手順の前、最中または後で投与され得る。
【００４５】
ここで、本開示で説明する組成物および処置で使用されるアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに戻って、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、抗血栓薬としてヘパリンを上回るいくつかの利点を提供する。
【００４６】
アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート（ＡＴＨ）は、アンチトロンビン（ＡＴ）へのヘパリン鎖の共有結合による付着により調製することができる。ヘパリンは、ヘミアセタールとアルデヒド形態との間の平衡で共存するアルドース末端を含有する。ヘパリンは、ヘパリン上のアルドース末端アルデヒドとアンチトロンビン上のリシルまたはＮ末端アミノとの間で自発的に形成される単一のシッフ塩基の還元により、アンチトロンビンにコンジュゲートすることができる。ヘパリンは、コンジュゲート前に修飾されず（活性が低下していない）、任意のアンチトロンビンのブロックされていない活性化基または架橋を伴わずに、分子の一端で一特異的部位に連結する。
【００４７】
反応は典型的に、約４．５〜約９のｐＨで、または約５〜約８で、またはさらには約７〜約８で行われる。反応は一般的に、水性媒体中で行われる。しかしながら、有機媒体、とりわけ極性親水性有機溶媒、例えばアルコール、エーテル、およびホルムアミドなどは、必要な場合は、反応物の溶解性または反応性を上昇させるために、約４０％までの割合で用いられる。非求核緩衝液、例えばリン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩なども用いられ得る。
【００４８】
ＡＴのアミンと、ヘパリンの末端アルドース残基との縮合により形成されるイミンは、対応するアミンに還元することができる。この還元は、イミン形成と同時に、または続いて達成され得る。数々の還元剤を使用することができ、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化シアノホウ素ナトリウムなどの水素化物還元剤は、有用である特別な例である。一般に、ジスルフィド結合を還元しない任意の還元剤を使用することができる。
【００４９】
あるいは、中間体イミンの還元が望ましくない場合、イミンは、中間体イミンのアマドリ転移を可能にするために、十分な期間、典型的には約１日から１ヶ月、より典型的には約３日から２週間インキュベートされ得る。本発明により提供される方法によりコンジュゲートしたヘパリンの末端アルドース残基は、末端アルドース残基上のＣ２ヒドロキシ基、すなわち、ヘパリンにコンジュゲートさせるＡＴのアミンとの縮合により２−ヒドロキシイミンに変換される２−ヒドロキシカルボニル部分を所有してもよい。アマドリ転移では、最初の縮合により形成されるα−ヒドロキシイミン（Ｃ１はイミン、Ｃ２はヒドロキシ）は、エノール化および再プロトン化によるα−ケトアミン（Ｃ２はケト、Ｃ１はアミン）を形成するように転移し得る。得られたα−カルボニルアミンは、前駆体α−ヒドロキシイミンよりも熱力学的に好ましく、したがって、ヘパリン鎖の崩壊が最小限の安定な付加体が得られる。したがって、ヘパリンは、ヘパリンの末端アルドース残基のＣ１で、アミン連結を経由して、アミンを含有するＡＴ鎖に共有結合によってコンジュゲートすることができる。共有結合複合体は、単に緩衝液中でヘパリンおよびＡＴを混合し、ヘパリンアルドース末端とＡＴリシルまたはＮ末端アミノ基との間のアマドリ転移によりケト−アミンを自発的に形成させることにより、形成することができる。したがって、アマドリ転移は、ヘパリンのＡＴへのコンジュゲートを調製するために使用することができる。これは特に穏やかかつ単純なコンジュゲート方法であり、グリコサミノグリカンの修飾を最小限にし、したがって、その生物学的活性の保持を最大限にする。
【００５０】
アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、一部のケースでは、未分画ヘパリンを使用して調製することができる。他のケースでは、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、低分子量ヘパリン鎖が除去されたヘパリンを使用して調製することができる。ヘパリンは、幅広い分子量の分子を含有する未分画形態で、容易に利用できることが知られている。ヘパリンをアンチトロンビンとコンジュゲートさせる前に、３，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン分子の大半からすべてを除去することにより、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの活性を向上させることができる。追加の実施形態では、５，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン分子は、アンチトロンビンとのコンジュゲート前に、大半から完全に除去できる。
【００５１】
低分子量ヘパリン分子が除去されたヘパリンを使用して形成されたアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートは、他のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートとは組成として異なる。低分子量ヘパリン鎖は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート（ＡＴＨ）を合成するために、ＡＴとの反応前にヘパリンから除去してよい。したがって、ＡＴＨには、ＡＴにコンジュゲートしている低分子量ヘパリン鎖はない。
【００５２】
低分子量ヘパリン鎖は、ＡＴＨを形成するためにヘパリンとＡＴを反応させる前に、市販のヘパリンから除去してよい。これにより、ＡＴとの反応前に低分子量ヘパリンを除去しない未分画ヘパリンから形成されるＡＴＨとは、組成として異なるＡＴＨが生成される。さらに、未分画ヘパリンからＡＴＨを形成し、次いで、その後低分子量ＡＴＨを除去しても、本開示のＡＴＨと同一の生成物が生成されない。いかなる特定の理論にも束縛されないが、低分子量ヘパリン鎖（例えば３，０００ダルトン未満または５，０００ダルトン未満）は、ＡＴにコンジュゲートさせるために、より長い鎖のヘパリンと競合すると考えられる。超低分子量ヘパリン鎖は、ＡＴと反応するアルドース末端の比率が高い。したがって、超低分子量ヘパリン鎖は、より素早くＡＴとコンジュゲートし、より高分子量のヘパリン鎖に勝る傾向がある。しかし、超低分子量ヘパリン鎖がＡＴに結合すると、鎖は、トロンビン、および凝固カスケードに関与する酵素の第Ｘａ因子に結合するのに十分な部位または長さを含有しない。第Ｘａ因子およびトロンビンに対する阻害活性は、ヘパリン分子の最低の分子量範囲に劇的に下落する。したがって、これらの超低分子量ヘパリン鎖から形成されるＡＴＨは、血栓形成を防止するための活性は本質的にゼロである。商用のヘパリンは、相対的に低い割合の、５，０００ダルトンを下回るヘパリン鎖を含有するが、これらの超低分子量ヘパリン鎖は、ＡＴとのとても高い反応性を有するので、形成される著しい量のＡＴＨが超低分子量ヘパリン鎖を含有する。
【００５３】
コンジュゲーションの前に超低分子量ヘパリンが最初に除去されない場合、この集団における、より高分子量のヘパリンの比率に対するより高い比率の反応性末端は、分子量ス
ペクトル全体にわたって、程度の差はあれ他のヘパリン分子に勝る傾向がある（アルドース末端の比率は、ヘパリンの分子量範囲全体にわたって継続的に変動するので）。これは、最終ＡＴＨに対して副作用を有する恐れがある。第１に、ＡＴＨは、活性を示さないきわめて短いヘパリン鎖を含有するＡＴＨ分子の有意な集団を含有するであろう。第２に、残りのＡＴＨ分子（この超低分子量範囲の外のＡＴＨ）は、不活性な低分子量ヘパリン鎖と競合するアルドース末端が少なかった、離散した分子量範囲におけるヘパリン鎖の比率が低いヘパリンの集団を含有する。この低アルドース型ヘパリンは、きわめて長い鎖の中に存在する傾向があるが、ＡＴへの連結を必要とするヘパリン鎖の長さおよびアルドース末端の間の直接的関係によって完全には定義されない。
【００５４】
さらに、少なくとも１８個の単糖単位を有するヘパリンも、トロンビンの阻害においてより有効であり得る。少なくとも１８個の単糖単位はアンチトロンビンおよびトロンビンの両方を結合するために使用される。ヘパリンがアンチトロンビンおよびトロンビンに結合する機構は、鋳型または架橋機構と呼ばれる。ヘパリンは、ＡＴに結合し、ＡＴを、凝固プロテアーゼにきわめて反応性である構造的形態にアロステリックに変換することにより立体配座活性化によるその効果を発揮することができる。あるいは、ヘパリンは、阻害剤および酵素の両方に結合することにより鋳型として作用し得、したがって、分子を反応のために局在させる。この機構において、ヘパリンによるＡＴの立体配座活性化が発生するが、ヘパリンが酵素に同時に結合することで、したがって、活性化された阻害剤に対する凝固因子のアプローチを補助することにより、さらなる反応速度の向上が達成される。特定の最小限の鎖の長さである１８個の単糖により、低分子量のヘパリン分画内でトロンビンに対する活性のきわめて急激な下落が生じる理由が説明できる。モノ硫酸化ウロン酸−ジ硫酸化グルコサミンヘパリン二糖の構造から、すなわち、塩形態で見出されるナトリウムまたは他のイオンなしで、１８個の単糖（９個の二糖）鎖のＭＷは、約４５００ダルトンになるであろう。
【００５５】
ややより低分子量のヘパリン鎖は、第Ｘａ因子を阻害するのに有用であり得る。ヘパリン中の特定の五糖配列は、ＡＴに結合でき、第Ｘａ因子を阻害するためにＡＴを活性化できる。特定の五糖配列は、それ自体を医薬品「Ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ」として利用可能になったが、配列はヘパリン鎖でも同様に発生し得る。単糖の配列は、式Ｉに示されている：
【化１】
2018524067.tif 000003
したがって、この五糖配列を含有する１８個未満の単糖を有するヘパリン鎖は、鎖が、ＡＴおよびトロンビンに結合するのに十分に長くないとしても、ＡＴを活性化して、第Ｘａ因子を阻害できることがある。
【００５６】
最長のヘパリン鎖は、一部のケースでは、最高の阻害活性を有し得る。しかし、一部の中型および低分子量ヘパリン鎖は、他の血漿タンパク質および血小板への望ましくない結合が有意に少ないことがある。したがって、これらの中型ヘパリン鎖は、トロンビンおよび第Ｘａ因子の阻害に対してより選択的であり得、望ましくない副作用、例えば血小板との結合および他の材料の結合による血小板機能不全を引き起こさない。
【００５７】
コンジュゲーションの後に、より高い分子量のＡＴＨを単離して、きわめて長い鎖のＡＴＨを得ても、コンジュゲーションの前にヘパリンを（実質的にまたは完全に）分離する本技術と比較してより望ましくなく、そして別個の生成物を提供する。例えば、この部分母集団における２つの五糖の高活性分子の比率は変わり得、その理由は、コンジュゲーションに関して超低分子量ヘパリンと競合する、これらの高活性鎖の異なる能力のためである。さらに、高分子量のＡＴＨをコンジュゲーションの後に単離することにより、中型およびより小さいサイズのヘパリン鎖を有し、活性でもあり、他の望ましい特性、例えば血漿タンパク質および血小板への非選択的結合の抑制を有するＡＴＨ分子が取り除かれる。
【００５８】
あるいは、反応混合物中でＡＴ対ヘパリンの比を増加させることにより、すべてのアルドース末端ヘパリン鎖を、ＡＴと反応させようとする試みは成功しにくく、その理由は、ＡＴのＡＴＨへの変換は、数倍の過剰濃度および定型的な最高濃度で、アルドースを含有するヘパリンを用いてさえも、６０重量％までしか得られないことが多くの実験により示されているためである。ヘパリン対ＡＴの比率をより一層低下させると、ＡＴＨ収率をさらに低下させるだけであり、活性な長い鎖が生成物中にすべて組み込まれる見込みはない。
【００５９】
一部の実施形態では、血栓形成を防止するための組成物は、３，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン鎖の実質的にすべてが除去されている商用のヘパリンから形成されたＡＴＨを含有し得る（例えば、少なくとも９８重量％の残ったヘパリン鎖は、３，０００ダルトン超の分子量を有し得る）。他の実施形態では、５，０００ダルトン未満の分子量を有するヘパリン鎖は、実質的に除去できる、または除去できる。したがって、ＡＴＨ生成物は、３，０００ダルトン（または５，０００ダルトン）の分子量から、商用ヘパリンに含有される最大分子量までに及ぶヘパリン鎖を含有し得る。ある例では、この範囲の分子量は、３，０００ダルトンから５０，０００ダルトン、または５，０００ダルトンから５０，０００ダルトンであってよい。さらなる例では、ヘパリン鎖の少なくとも一部は、中分子量範囲であってよい。例えば、ＡＴＨ中のヘパリン鎖の少なくとも一部は、３，０００ダルトンから３０，０００ダルトン、３，０００ダルトンから２０，０００ダルトン、３，０００ダルトンから１５，０００ダルトン、３，０００ダルトンから１０，０００ダルトン、５，０００ダルトンから３０，０００ダルトン、５，０００ダルトンから２０，０００ダルトン、５，０００ダルトンから１５，０００ダルトンまたは５，０００ダルトンから１０，０００ダルトンの分子量を有し得る。したがって、ＡＴＨは、３，０００ダルトンまたは５，０００ダルトンを下回る分子量を有するヘパリン鎖を含まなくても実質的に含まなくてもよい。
【００６０】
商用のヘパリンは、典型的には、１，０００ダルトンまたはそれ未満から５０，０００ダルトンまたはそれ超の範囲の分子量を有するある範囲のヘパリン鎖を含有し得る。最低分子量の分画、例えば３，０００または５，０００ダルトンを下回る分子量を有する鎖は、任意の適切な方法により除去できる。低分子量鎖を除去する方法の非限定的な例は、透析、透析濾過、ゲル濾過および電気泳動を含む。透析または透析濾過は、高塩条件下で行われ得る。例えば、透析または透析濾過のための高塩条件は、約１Ｍ  ＮａＣｌから約４
Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度を含み得る。ＮａＣｌ以外の塩も使用してよい。高塩濃度は、適切な孔径を有する膜を通した短い鎖の移動を補助できる。ゲル濾過は、サイズによって分子を分離するために、適切な媒体を使用して行うことができる。特定の一例では、ゲル濾過は、１，０００から２００，０００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を分離するためのゲル媒体であるＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００で行うことができる。商用のヘパリンは、ゲル媒体のカラムでゲル濾過でき、最大分子量の鎖を含有する最初の分画、および徐々に少なくなる分子量を含有する後続の分画を有する一連の分画を溶出できる。各分画におけるヘパリンの分子量は判定してよく、望ましい分子量を有する分画はプールしてよい。この方法を使用して、３，０００または５，０００ダルトンの閾値を下回る分子量を有するヘパリンを含有する分画は、排除できる。必要に応じて、ある閾値を上回るヘパリン鎖も排除できる。例えば、５０，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、１５，０００ダルトンまたは１０，０００ダルトンを上回るヘパリンを含有する分画は、必要に応じて排除できる。次いで、望ましい範囲の分子量を有するプールした分画は、ＡＴＨを合成するために使用できる。
【００６１】
上記の、超低分子量ヘパリン鎖を除去する方法は、例示にすぎないことに留意すべきであり、限定するとみなされるべきではない。本開示では、ある閾値の分子量を下回るヘパリン鎖を除去するために、商用のヘパリンを加工する任意の方法を使用してよい。
【００６２】
本開示の様々な実施形態では、本明細書で説明する処置および方法は、低分子量ヘパリンを除去したＡＴＨを使用して、あるいは、未分画ヘパリンから形成したＡＴＨを使用して行うことができる。
【００６３】
ＡＴＨは、ＡＴを、ここでは超低分子量鎖がないヘパリンとコンジュゲートさせることにより形成され得る。ヘパリンをＡＴとコンジュゲートさせる例示的な方法は、米国特許第７，０４５，５８５号で開示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法を適用して、本明細書に記載されている超低分子量鎖が除去されているヘパリンを使用して、ＡＴＨを形成することができる。ヘパリンは、単純な一段法によりＡＴとコンジュゲートさせることができ、これは、アミン含有部分（例えば、以下に限定されないが、アミン含有オリゴ糖（多糖）、アミン含有脂質、タンパク質、核酸および任意のアミン含有生体異物）のアミンの、ヘパリン鎖の末端アルドース残基への直接共有結合を示す。ＡＴＨの形成に関して、アミン含有部分は、ＡＴに存在するが、他のタンパク質を、同一の方法を使用してコンジュゲートできる。本明細書で提供される穏和な非破壊的方法は、タンパク質の生物学的活性の最大限の保持を可能にし、中間体スペーサー基の必要がないタンパク質の直接連結を可能にする。
【００６４】
一実施形態では、ヘパリンは、アミンおよびヘパリンの末端アルドースまたはケトース残基の間でのイミン形成に適しているｐＨで、ＡＴとインキュベートする。末端アルドースおよびケトース残基は、一般的に、閉環した環状ヘミアセタールまたはヘミケタール形態、および対応する開環したアルデヒドまたはケトン等価物の間の平衡で存在する。一般的に、アミンは、イミン（シッフ塩基）を生成するために開環した形態と反応することが可能である。典型的には、開環形態の対応するアルデヒドがアミンに対してより反応性であるため、アルドースはより反応性である。したがって、アミンおよびヘパリンの末端アルドース残基の共有結合コンジュゲートの形成は、アミンを含有するＡＴをヘパリンに付着させる方法を提供する。
【００６５】
反応は、典型的には、約４．５〜約９、より典型的には約５〜約８、およびより一層典型的には約７〜約８のｐＨで実行される。反応は、一般的に水性媒体中で行われる。しかし、有機媒体、とりわけ極性親水性有機溶媒、例えばアルコール、エーテルおよびホルムアミドなどは、必要な場合は、反応物の溶解度または反応性を上昇させるために、約４０％までの比率で用いられ得る。非求核性緩衝液、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸水素塩なども用いられ得る。
【００６６】
一部のケースでは、ＡＴのアミンと、ヘパリンの末端アルドース残基の縮合により形成されるイミンは、対応するアミンに還元される。この還元は、イミン形成と同時に、または続いて達成され得る。数々の還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化シアノホウ素ナトリウムを含む水素化物還元剤が使用され得る。一例では、ジスルフィド結合を還元しない任意の還元剤が使用され得る。
【００６７】
あるいは、中間体イミンの還元が望ましくない場合、イミンは、中間体イミンのアマドリ転位を可能にするために、十分な期間、典型的には約１日から１ヶ月、より典型的には約３日から２週間インキュベートされ得る。本開示により提供される方法によりコンジュゲートしたヘパリンの末端アルドース残基は、末端アルドース残基上のＣ２ヒドロキシ基、すなわち、ヘパリンにコンジュゲートさせるＡＴのアミンとの縮合により２−ヒドロキシイミンに変換される２−ヒドロキシカルボニル部分を頻繁に所有する。炭水化物では特に一般的であるアマドリ転位では、最初の縮合により形成されるα−ヒドロキシイミン（Ｃ１はイミン、Ｃ２はヒドロキシ）は、エノール化および再プロトン化によるα−ケトアミン（Ｃ２はケト、Ｃ１はアミン）を形成するように転位し得る。得られたα−カルボニルアミンは、前駆体α−ヒドロキシイミンよりも熱力学的に好ましく、したがって、ヘパリン鎖の崩壊が最小限の安定な付加体が得られる。したがって、この実施態様では、本技術は、ヘパリンの末端アルドース残基のＣ１で、アミン連結を経由して、アミンを含有するＡＴに共有結合によってコンジュゲートしたヘパリン鎖を提供する。必要に応じて、得られるコンジュゲートは、放射標識（例えば、ＮａＢ３Ｈ４）などの標識試薬でのＣ２カルボニル基の還元により、還元もしくは標識してもよく、または第２の化学種、例えば蛍光標識にコンジュゲートさせてもよい。
【００６８】
上記説明は、ヘパリンおよびＡＴに焦点を合わせているが、様々な異なるアミン含有化学種は、本明細書で開示されている方法により、様々なグリコサミノグリカンにコンジュゲートできる。第一級アミンは、小分子、例えば薬物もしくは蛍光もしくは色素原標識、または高分子、例えば、タンパク質（抗体、酵素、受容体、増殖因子など）、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの混合したポリマー）、脂質もしくは多糖に存在し得る。一般的に、タンパク質が、グリコサミノグリカンにコンジュゲートしている場合、連結は、リシン残基のε−アミノ基により生じる。あるいは、Ｎ末端アミノ酸残基のα−アミノ基によっても連結は達成され得る。さらに、アミン官能性を高分子に導入するために、当業者に公知の多くの他の方法が使用できる。
【００６９】
特に、本技術は、長い半減期および血液凝固の考慮が有用であり得る、様々な他の治療的に有用なタンパク質に適用することができる。これらは、血液酵素、抗体、ホルモンなど、ならびに関連したプラスミノーゲン活性化物質、例えば組織プラスミノーゲン活性化物質、ストレプトキナーゼ、およびこれらの誘導体を含む。特に、本技術は、ヘパリンまたはデルマタン硫酸と、アンチトロンビン、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）、またはヘパリン補因子ＩＩの類似体とのコンジュゲートを提供する。
【００７０】
本開示の方法は、生物学的活性を最大限保持するグリコサミノグリカンコンジュゲートを提供する。特に、インタクトなコンジュゲートしていないヘパリンアンチトロンビン活性の＞６０重量％、典型的には＞９０重量％、より典型的には＞９５重量％、最も典型的には＞９８重量％を有する、ヘパリンまたはデルマタン硫酸とＡＴまたはＨＣＩＩのコンジュゲートが提供される。本技術の方法は、アンチトロンビンまたはヘパリン補因子ＩＩにコンジュゲートしているインタクトなヘパリン分子を提供する。したがって、コンジュゲーション前のヘパリンの断片化または他の改変に関連する生物学的活性の損失は避けられる。本技術のヘパリンコンジュゲートは、インタクトなヘパリンからの調製であるため、その抗凝固活性を保つ。したがって、本明細書で開示されている方法を使用して、まず、ヘパリンにコンジュゲートさせることが求められている化学種（またはグリコサミノグリカンが使用されるものなら何でも）に連結基およびスペーサーを付着させ、続いて、これをヘパリンに付着させることにより活性なヘパリンコンジュゲートを調製できる。反応性アミノ基を他の分子および固相担体に組み込む多数の方法は、参照により組み込まれるImmunoTechnology  Catalog  and  Handbook、Pierce  Chemical  Company（１９９０年）に記載されている。それにより、反応性アミノ基を所有する、または現在公知の、もしくは将来公知になる任意の方法によりそのようなアミノ基を含有するように改変することが可能である任意の化学種は、本明細書で開示されている方法により、グリコサミノグリカン、例えばヘパリンに共有結合によってコンジュゲートでき、そのようなすべてのコンジュゲートは、本開示により意図される。
【００７１】
上に記載したように、本技術は、天然の（腸粘膜から単離された）ヘパリン、ならびにデルマタン硫酸が、ヘミアセタールおよびアルデヒド形態の間の平衡として存在し得るアルドース末端を有する分子を既に含有することを利用する。したがって、ヘパリンまたはデルマタン硫酸は、ヘパリンまたはデルマタン硫酸におけるアルドース末端アルデヒドおよびセルピンにおけるアミノの間で自発的に形成される単一のシッフ塩基の還元により、アンチトロンビンセルピンにコンジュゲートできる。ヘパリンまたはデルマタン硫酸は、コンジュゲーションの前に修飾されず（活性が低下していない）、セルピンのブロックされていない活性化基または架橋を伴わずに、分子の一末端の一特異的部位に連結する。
【００７２】
本開示の別の態様では、共有結合複合体は、ヘパリンおよびＡＴを緩衝液中で単に混合すること、およびヘパリンアルドース末端およびＡＴアミノ基の間でアマドリ転位によってケト−アミンを自発的に形成させることにより生成できる。したがって、本技術は、アマドリ転位を使用して、グリコサミノグリカンと、アミン含有化学種、特にタンパク質とのコンジュゲートを調製する方法を提供する。これは、特に穏和で簡単なコンジュゲーションの方法であり、これは、グリコサミノグリカンの改変を最小にし、したがってその生物学的活性の保持を最大にする。
【００７３】
本技術の別の態様は、グリコサミノグリカンの末端アルドース残基においてアミン含有化学種で末端標識された、グリコサミノグリカン、特にヘパリンの共有結合コンジュゲートを提供する。例えば、ヘパリンおよびＡＴは、互いに直接的に連結することができ、その結果、ヘパリンにおけるＡＴに対する活性な五糖配列は、結合するために近接する。これは、ＡＴが活性な配列に結合できる場合にのみ、ヘパリンがＡＴを介して阻害を促進するので、共有結合ヘパリン−ＡＴ複合体を製造する根本的理由の１つである。コンジュゲートにおけるＨ（ヘパリン）が内因性ＡＴを化学量論的に活性化するが、外因性ＡＴを触媒的に活性化するという特有の性質をＡＴＨが有することは注目すべきである。典型的には、１つのアミン含有化学種は、各グリコサミノグリカンに付着する。しかし、アミン含有化学種対グリコサミノグリカンの比は、反応物のモル比または反応時間を調整することにより１を下回って低下し得ることは明らかになり得る。
【００７４】
グリコサミノグリカンは、様々な形態および分子量で利用できる。例えば、ヘパリンは、ブタの腸またはウシの肺から単離されるムコ多糖であり、分子のサイズおよび化学構造に関して不均一である。これは、主に、（１−４）連結２−アミノ−２−デキソキシ−α−Ｄ−グルオピラノシル（gluopyranosyl）およびα−Ｌ−イドピラノシルウロン酸の残
基と比較的少量のβ−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸残基からなる。ヒドロキシルおよびアミン基は、硫酸化およびアセチル化により様々な程度に、誘導体化される。
【００７５】
ヘパリン分子は、それらの五糖含有量に基づいても分類できる。約３分の１のヘパリンは、ＡＴに対する親和性が高い特有の五糖の１つのコピーを有する鎖を含有する一方、はるかに小さい比率（合計ヘパリンの約１％と推定される）は、親和性が高い五糖の複数のコピーを含有する鎖からなる。残り（約６６％）のヘパリンは、五糖を含有しない。したがって、いわゆる「標準のヘパリン」は、３つの化学種、すなわち、五糖のコピーを欠く「親和性が低い」ヘパリンと、五糖の少なくとも１つのコピーを含有する化学種を豊富に含む「親和性が高い」ヘパリンと、五糖の複数のコピーを含有する約１％の分子を指す「親和性がきわめて高い」ヘパリンとの混合物を構成する。これらの３つの化学種は、定型的なクロマトグラフの方法、例えばアンチトロンビン親和性のカラムを通したクロマトグラフィーを使用して互いに分離できる。
【００７６】
本明細書で開示されているゆるやかな糖化プロセスを使用して、ヘパリンおよび少なくとも１つの第一級アミノ基（例えば、ＡＴ）を含有する化学種の間でコンジュゲートを形成する１つの利点は、２つの五糖を有するヘパリン鎖に対する明らかな選択である。したがって、例えば、本開示の方法により調製されるＡＴＨは、２つの五糖を含有するヘパリン種を豊富に含むと思われる。標準のヘパリン（約１％の２つの五糖ヘパリンを含有する）が、出発原料として使用される場合、通常、生じるＡＴＨの１０％超は、２つの五糖ヘパリンを含み、より多くは約２０％超、頻繁には３５％超および多くは約５０％超のＡＴＨが２つの五糖ヘパリンを含む。
【００７７】
このような豊化が、ＡＴＨのいくつかの有用な性質の原因になり得る。本技術のＡＴＨは、それがコンジュゲートするＡＴを化学量論的手法で活性化するが、外因性ＡＴを触媒的手法で活性化する。したがって、ＡＴＨ複合体内のヘパリンは、全身性抗凝固物質としてＡＴＨが投与される場合、および表面をコーティングするためにＡＴＨが使用され、これらを非血栓形成性にする場合の両方で、触媒的に作用する。本技術の方法により、きわめて高い特定の抗因子ＩＩａ活性を有するＡＴＨ複合体が生成される。さらに、ＡＴＨ複合体における第２の五糖鎖は、外因性ＡＴ分子と相互作用することができ、それにより、コンジュゲートしているヘパリンは、触媒活性を有することができる。さらに、ＡＴＨ複合体におけるヘパリンは、ＡＴＨ複合体がプロテーゼ表面に結合する場合、五糖が循環するＡＴ分子に結合および活性化できるように配向され得る。
【００７８】
目的のヘパリンコンジュゲート（例えば、ＡＴＨ）は、少なくとも１つの第一級アミノ基（例えば、ＡＴ）を含有する化学種を、精製したきわめて親和性が高いヘパリン（すなわち、２つの五糖基を含有する）と、またはきわめて親和性が高いヘパリンを豊富に含む分画とインキュベートすることによっても生成できることは理解されるであろう。
【００７９】
本技術は、主にヘパリンに関して例証されているが、すべてのグリコサミノグリカンは、末端アルドース残基を所有するという条件で、それらの分子量および誘導体化に関わりなく、本明細書で開示されている方法によりコンジュゲートできることは明らかである。すべてのそのようなグリコサミノグリカンのコンジュゲートおよび本明細書の方法によるそれらの調製は、本開示の範囲内である。例えば、リン酸塩、スルホン酸塩などにより誘導体化されるヘパリンのコンジュゲート、ならびにヘパリンの分子量より低いまたは高い分子量を有するグリコサミノグリカンは、本開示の範囲内である。
【００８０】
本開示のさらなる態様では、血栓形成を防止するための組成物を製造する方法は、ＡＴを対象の体外のヘパリンとコンジュゲートさせるステップであってアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成するステップを含み得、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート中で得られるアンチトロンビンの量は、合成に使用される開始アンチトロンビンに対して６０重量％超、６５重量％超、７５重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超である。収率は、様々な方法により増加させることができる。一例では、ＡＴは、上記の方法によりヘパリンにコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーションの後で、結合していないＡＴがあれば、リサイクルし、ヘパリンとの別のコンジュゲーション反応に使用することができる。ＡＴをヘパリンとインキュベートする各ステップの後で、結合していないＡＴは、リサイクルし、追加のＡＴＨを製造するために使用することができる。
【００８１】
別の例では、ＡＴＨの収率は、アマドリ転位触媒を使用することにより増加させることができる。アマドリ転位の速度を増加させることができる触媒の非限定的な例は、２−ヒドロキシピリジン、第三級アミン塩、マロン酸エチル、フェニルアセトン、酢酸、ならびに他の酸を含む。特定の例では、ＡＴおよびヘパリンは、水中で、またはきわめて両親媒性の溶媒、例えばホルムアミド中で、加熱しながら、２−ヒドロキシピリジンの存在下で反応させることができる。さらなる例では、ＡＴおよびヘパリンは、トリメチルアミンまたはトリメチルアミン塩の存在下で反応させることができる。
【００８２】
アマドリ転位の速度は、アマドリ転位を促進する溶媒系によっても増加させることができる。溶媒の非限定的な例は、水と、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、エタノール、ジメチルスルホキシド、ピリジン、酢酸、トリメチルアミン、トリエチルアミン、アセトニトリルおよびそれらの組合せの混合物を含む。ヘパリンおよびＡＴは、これらの溶媒系中で反応して、アマドリ転位を促進してＡＴＨを形成できる。
【００８３】
ヘパリンアルドースをアミン含有分子にコンジュゲートさせる速度を増加させるための追加の方法は、連結剤を使用することを含む。連結剤は、一方の末端にヘパリンのアルドースに対して反応性の基を有し、他の末端に、ＡＴへの連結、または次いでＡＴに連結できる第２の連結剤への連結に使用できる異なる基を有するヘテロ二官能性剤であってよい。特定の一例では、連結剤は、一方の末端にアミノ基、他の末端にヒドラジンを含有し得る、例えば２−アミノエチルヒドラジンである。この連結剤は、ヘパリンと反応させて、ヘパリンのアルドースアルデヒドと共にヒドラゾンを形成できる。生成物は、いずれかの未反応の連結剤と共に、分子量３，０００または５，０００ダルトン未満のヘパリン鎖を除去する膜により透析または透析濾過できる。次いで、ヘパリン−ヒドラゾン生成物は、大過剰の第２の連結剤と反応できる。第２の連結剤は、各末端で活性化されたカルボキシル基を所有するホモ二官能性試薬、例えばコハク酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル（縮合剤、例えばカルボニルジイミダゾールまたはカルボジイミドを使用して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでコハク酸をエステル化することにより調製される）であってよく、その結果、ヒドラジン連結剤におけるアミノ基は、第２の連結剤における活性化されたカルボキシルの１つのみと反応する。反応混合物は、未反応の第２の連結剤を除去するために透析または透析濾過できる。この時点で、生成物は、アミノ−ヒドラジン連結剤ならびに第２の連結剤で改変したヘパリンである。この生成物は、緩衝Ｈ２Ｏ中でＡＴとインキュベートすることができ、その結果、ＡＴにおけるアミノ基を、第２の連結剤における第２の活性化させたカルボキシル基と反応させて、ＡＴ−ヘパリンコンジュゲートを形成し、ＡＴおよびヘパリンは、連結剤および第２の連結剤により連結する。
【００８４】
ＡＴＨを形成した後で、保存のためにＡＴＨは凍結乾燥（フリーズドライ）させてよい。一実施形態では、ＡＴＨは、水のみを含有する溶液中で調製し、次いで凍結乾燥できる。別の実施形態では、ＡＴＨは、水およびアラニンを有する溶液中で、０．０１〜０．０９モルの濃度で調製し、次いで凍結乾燥できる。さらに別の実施形態では、ＡＴＨは、水およびマンニトールを含有する溶液中で調製し、次いで凍結乾燥できる。これらの方法のそれぞれは独立して使用でき、各方法は、その独自の利点を提供することができる。これらの方法のいずれかを使用した凍結乾燥後、ＡＴＨは、再構成し、凍結乾燥前のその活性と比較して、トロンビンを阻害する有意量のその活性を保つことができる。いくつかのケースでは、ＡＴＨは、トロンビンを阻害するためのその活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％を保つことができる。ＡＴＨを凍結乾燥させる他の方法の使用、例えば、凍結乾燥前に１モル超の塩を含有する溶液中でのＡＴＨの調製により、ＡＴＨの活性は破壊され得ることが見出されている。
【００８５】
ＡＴＨが凍結乾燥されているかいないかを問わず、ＡＴＨは、溶液の総体積に対して９〜１１ｍｇ／ｍＬのＡＴＨを含有する水溶液として調製できる。１１ｍｇ／ｍＬより高いＡＴＨ濃度を有する溶液を形成すると、元に戻すことが困難または不可能なＡＴＨの凝集が引き起こされ得ることが見出された。しかし、安定な水溶液は、９〜１１ｍｇ／ｍｌのＡＴＨ濃度を用いて調製できる。この溶液は、本明細書に記載されている状態のいずれかを処置する目的で、対象に投与するために製剤化できる。溶液は、対象への投与に適している様々な添加剤も含み得る。
【００８６】
診療において、本技術のヘパリンコンジュゲートは、臨床的使用のための市販のヘパリンと同一の手段で、および同一形態の医薬調製物で一般的に使用され得る。したがって、本技術によって提供されるヘパリンコンジュゲートは、注射（静脈内、皮下など）もしくは静脈内注入のための水性溶液に、または皮膚および粘膜を介した投与のための軟膏調製物に組み込まれ得る。予防的および治癒的の両方の、現在公知の、または将来利用でき、ヘパリン治療が指し示される任意の形態の治療は、本技術により提供されるヘパリンコンジュゲートを用いて実践され得る。
【００８７】
本技術のヘパリンコンジュゲートは、新生児および成人呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の処置に特に有用性を見出す。非共有結合ヘパリン−ＡＴ複合体の使用と対照的に、本技術の共有結合ヘパリンコンジュゲートの使用は、ＡＴからの解離による肺腔中でのヘパリンの損失を防止する。このケースでは、生理学的緩衝液中の共有結合複合体の溶液は、カテーテルまたはプファーを経由して気道を下って肺中へと噴霧化したスプレーとして送達され得る。その大きなサイズのため、ＡＴＨは、より長い時間にわたり肺胞に留まるであろう。ＡＴＨは、特発性肺線維症の処置にも有用である。
【００８８】
循環における長期の使用は、生理学的緩衝液中の複合体の静脈内または皮下注射によって実行され得る。本技術の共有結合コンジュゲートは、血栓性合併症、例えば心肺バイパス法、体外分子酸化などにより特徴付けられる後天性ＡＴ欠乏状態の処置にも使用され得るが、これは、共有結合複合体の半減期が長いほど、処置およびモニタリングを少なくすることができるためである。さらに、本開示は、深部静脈血栓症の危険性がある成人患者の予防的処置を提供する。
【００８９】
本技術のＡＴＨコンジュゲートは、複合体化していないＡＴおよび標準のヘパリンを上回る多数の利点を有する。ＡＴがヘパリンに共有結合により連結されるので、ＡＴＨの血漿タンパク質への非特異的結合は、標準のヘパリンで発生するよりも少なく、標準のヘパリンに対して存在するよりもＡＴＨに対する用量反応で、少ない個体間変化を生じるであろう。ヒトにおける静脈内注射後のＡＴＨのより長い半減期は、持続した抗凝固効果が、複合体化していないＡＴおよび標準のヘパリンに必要とされるよりも少ない頻度でＡＴＨを投与することによって得られる得ることを意味する。ＡＴＨは、ＡＴよりもはるかに有効なトロンビンおよび第Ｘａ因子の不活性化因子であり、ＡＴ欠乏を有する患者においてＡＴよりもはるかに低い濃度で使用される場合に有効であり得る。さらに、ＡＴＨは、フィブリンに結合したトロンビンに接近し、阻害できる。最終的に、プロテーゼ表面（例えば、血管内グラフト）に連結（例えば、共有結合により連結）された場合、ＡＴＨは、共有結合により連結したＡＴまたは共有結合により連結したヘパリンまたは共有結合により連結したヒルジンよりも、ｉｎ  ｖｉｖｏではるかに大きな抗血栓性活性を示した。
【００９０】
未熟児は、補助換気での処置を必要とする重度の肺疾患である呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の高い発生率を有する。長期間の補助換気は、血漿凝固タンパク質を肺の肺胞腔中に移動させる、肺傷害の結果としての気管支肺異形成（ＢＰＤ）の発症を引き起こす。これは、トロンビンおよび続くフィブリンの生成を招く。肺組織および空気腔内のフィブリンが広範に存在することが、ＲＤＳで死亡する乳児で一貫して観察される。空気腔内のこのフィブリンゲルは、肺の空気腔からの流体の運搬を害し、持続的で、悪化する肺水腫をもたらす。本技術は、「抗血栓環境」を維持し、かつ／または肺組織内のフィブリン溶解を向上させ、それによって肺の空気腔中のフィブリン負荷を減少させることによって、肺胞内フィブリン形成を防止することによる、肺組織におけるそのようなフィブリン媒介性疾患の処置を提供する。
【００９１】
ヘパリンコンジュゲートは、気道を経由して、予防的に（乳児が初めて呼吸をする前に）、肺の空気腔に直接送達され得る。これは、抗血栓剤が、潜在的なフィブリン沈着部位に直接的に利用可能であること、および全身性抗血栓症治療法に関連する出血の危険性が避けられることを確実にする。さらに、抗血栓剤は、最初の傷害に付随する換気補助の開始前に肺に既に存在し、すなわち、肺の空気腔への投与薬物の通過が肺傷害の後まで生じない全身性アンチトロンビン投与とは異なる。ヘパリンはＡＴに共有結合により付着されるので、これは肺の空気腔に留まる。これは、ＲＤＳおよびＢＰＤを防止するために現在投与される界面活性剤への付加的治療でもあり得る。「肺界面活性剤」は、肺の空気腔に通常存在する石鹸のような物質を意味し、その主な役割は空気腔の虚脱の防止、ならびに気体の移送の補助である。コンジュゲートは、気管内チューブを経由して、または吸入エーロゾルとして繰り返しても送達され得る。付加的治療は、吸入器（例えば、ベクロメタゾンジプロピオネートなどの抗炎症性ステロイド）、他の抗喘息剤、例えばクロモリンナトリウム（１，３−ビス（２−カルボキシクロモン−５−イルオキシ）−２−ヒドロキシプロパンの二ナトリウム塩、（「ＩＮＴＡＬ」））、および気管支拡張剤、例えばアルブテロール硫酸による喘息薬物でも実践され得る。
【００９２】
上昇したトロンビン活性および／またはフィブリン沈着に関連する様々な他の疾患は、本開示のコンジュゲートの投与により処置できる。成人呼吸窮迫症候群に関与する炎症のプロセスは、新生児ＲＤＳと根本的に同様であり、記載されている抗血栓性治療により処置できる。自発的肺線維症は、肺の空気腔において凝固／線維素溶解カスケードの活性化を有することも示されている。肺の線維性疾患は、がん化学療法に関連する副作用であることが多く、本技術の共有結合ヘパリンコンジュゲートのＲＤＳ抗血栓性投与は、肺線維症を防止するためにがん化学療法の前に予防的に投与され得る。投与は、フィブリン形成がないことを確実にするために化学療法の後で繰り返される。アンチトロンビン活性の低下および敗血症におけるトロンビン活性の増大も、十分に立証される。敗血症は、成人ＲＤＳを発生させる最も一般的な危険因子である。したがって、本開示のヘパリンコンジュゲートを使用して、敗血症性ショックに関連する死亡率を低下させることができる。
【００９３】
本開示のコンジュゲートは、治療有効投与量で、すなわち、それを必要とする哺乳動物に投与される場合は、上に記載した処置を達成する（例えば、哺乳動物における血栓症を抑制する、あるいは処置する、またはクロット形成後トロンビンを不活化する、または血栓増大を阻害する）のに十分な量で投与できる。本明細書に記載されている活性化合物および塩の投与は、類似した有用性を示す作用剤のための、認められている投与様式のいずれかを経由してよい。
【００９４】
一般的に、許容される１日用量は、１日につきレシピエントの体重１キログラム当たり約０．００１から５０ｍｇ、１日につき体重１キログラム当たり約０．０５から２５ｍｇ、または１日につき体重１キログラム当たり約０．０１から１０ｍｇの用量である。したがって、７０ｋｇのヒトに投与するために、処置される個体および疾患状態に応じて、投与量の範囲は、１日につき約０．０７ｍｇから３．５ｇ、１日につき約３．５ｍｇから１．７５ｇ、または１日につき約０．７ｍｇから０．７ｇであってよい。ＡＴＨのケースでは、長い半減期により、標準のヘパリンより少ない頻度で化合物を投与できる（例えば、１週間に１回または２回）。
【００９５】
投与は、任意の認められる全身または局所経路を経由してよく、例えば、非経口、静脈内、経鼻、気管支吸入（すなわちエーロゾル製剤）、経皮的または局所経路を経由し、固体、半固体または液体剤形の形態で、例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁液剤、エーロゾル剤、エマルション剤など、例えば、正確な投与量の単純な投与に適している単位剤形であってよい。通常、水性製剤が使用できる。コンジュゲートは、非毒性、不活性、薬学的に許容される担体媒体中で、約３〜８のｐＨで、または約６〜８のｐＨで製剤化できる。一般的に、水性製剤は、培地または灌流媒体と適合できる。組成物は、従来の医薬担体または賦形剤、およびグリコサミノグリカンのコンジュゲートを含み、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバントなどを含み得る。担体は、石油、動物、植物、または合成起源の油を含む様々な油、例えば、落花生油、大豆油、ミネラル油、ゴマ油などから選択され得る。水、生理食塩水、水性デキストロースまたはマンニトール、およびグリコールは、特に、注入可能な溶液のための適切な液体担体の例である。適切な医薬担体は、デンプン、セルロース、滑石、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。他の適切な医薬担体およびそれらの製剤は、E.  W.  Martin著Remington's  Pharmaceutical  Science（１９８５年）に記載されている。
【００９６】
必要に応じて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなども含有していてよい。
【００９７】
本開示の化合物は、ＡＴＨとの組み合わせた医薬賦形剤を含む医薬組成物として投与することができる。製剤におけるＡＴＨのレベルは、当業者により用いられる全範囲内、例えば全体の製剤に対して約０．０１重量％（％ｗ）から約９９．９９％ｗの薬物、および約０．０１％ｗから９９．９９％ｗの賦形剤で、異なっていてよい。一例では、製剤は、約３．５〜６０重量％の医薬活性化合物であり得、残りは適切な医薬賦形剤であってもよい。
【００９８】
また、本発明は、ＡＴＨを使用した様々な状態のための処置に拡張する。一部の例では、これは、処置方法、ＡＴＨを含有する組成物、およびＡＴＨを含む医療機器を含む。本明細書で説明するように、ＡＴＨは、ヘパリンを上回るいくつかの利点を提供することができる。ヘパリン類似物質抗凝固物質は、血栓性疾患を治療および予防するために通常使用される。ヘパリン類似物質は、血漿プロテアーゼ阻害剤アンチトロンビンの抗凝固活性を触媒することにより機能する。未分画ヘパリン（ＵＦＨ）およびその低分子量誘導体（ＬＭＷＨ）は、短い半減期、可変性の抗凝固応答、トロンビン（特に血餅結合トロンビン）の阻害での限定された有効性、出血の誘発、および血小板減少症の誘発を含む、いくつかの欠点がある。
【００９９】
ＡＴＨは、治療剤として使用される場合、これらの問題の多くを解決することができる。伝統的なヘパリン類似物質と比較して、ＡＴＨは、増大した半減期、血漿タンパク質および内皮細胞への結合の減少、ならびに動物モデルにおける出血リスクの増大を伴わない抗血栓効率の増大を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＡＴＨは、非共有結合ＡＴおよびＵＦＨ混合物（ＡＴ＋Ｈ）と比較して顕著に増大した速度で、直接いくつかの凝固因子を阻害する。また、ＡＴＨは、ＡＴ＋Ｈと比較して血餅結合トロンビンの阻害でより有効である。
【０１００】
本発明の一部の実施形態では、ＡＴＨは、医療機器に対してコーティングを形成するために使用することができる。一実施形態では、ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートでコーティングする方法は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートとポリマー表面との間の連結基を伴わずに、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートがポリウレタン表面を直接コーティングするように、ポリマー表面をアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートの溶液と接触させるステップを含み得る。
【０１０１】
ポリマー表面に分子を共有結合により付着する公知の方法は、ＡＴＨを医療機器のポリマー表面に付着するために使用することができる。例えば、ポリマー表面を最初に、酸化剤または還元剤での処理により活性化してもよく、その後、連結基を活性化した表面に付着してもよい。その後、ＡＴＨをモノマーに連結することができる。一例では、ポリウレタン表面は、次亜塩素酸ナトリウムまたは水素化アルミニウムリチウムとの反応により活性化する。その後、アリルグリシジルエーテルを、連結基として働くように表面上にグラフト化する。その後、ＡＴＨを連結基に連結する。
【０１０２】
ＡＴＨは、このように連結基を使用して表面に付着することができるが、驚くべきことに、ＡＴＨは、任意の連結基を伴わずに、ポリマー表面と直接結合することもできることが発見された。したがって、本発明は、ポリマー表面を活性化するか、または表面に連結基を付着することなく、ポリマー表面をＡＴＨでコーティングする単純な方法を提供する。一部の例では、ポリマー表面は、単に浸漬または他の方法によりＡＴＨ溶液と接触してもよい。ＡＴＨは、表面に直接付着し、洗剤での洗浄後でさえも付着したままであることができる。この方法は、医療機器の血栓形成性を低減させるために、血液と接触することになる医療機器をコーティングするために有用であり得る。
【０１０３】
ポリマー表面は、医療機器の製造で使用される任意のポリマーからなってもよい。一部の実施形態では、ポリマー表面は、ポリウレタン表面、ポリエチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリテトラフルオロエチレン表面、ポリジメチルシロキサン表面、およびエチレンアクリル酸コポリマー表面、Ｄａｃｒｏｎ表面、ポリエステル−ポリウレタン表面、ポリウレタン−ポリカーボネート表面、ポリ塩化ビニル表面、シリコーン表面、ラテックスゴム表面、ニチノール表面、ナイロン表面、ポリエチレンテレフタレート表面、ポリスチレン表面、またはこれらの組合せであってもよい。他の実施形態では、ポリマー表面として、Ｉｏｐｌｅｘ材料および他のハイドロゲル、例えば２−ヒドロキシエチルメタクリレートまたはアクリルアミドに基づくもの、ならびにＢｉｏｍｅｒ（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐ．）およびＡｖｃｏｔｈａｎｅ（Ａｖｃｏ−Ｅｖｅｒｒｅｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むポリエーテルポリウレタン尿素（ＰＥＵＵ）を挙げることができる。
【０１０４】
ポリマー表面は、血液と接触することになる医療機器の一部であってもよい。一部の実施形態では、医療機器は、静脈内カテーテル、動脈内カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、中心静脈カテーテル、スワン−ガンツカテーテル、冠状動脈ステント、動静脈シャント、大静脈フィルター、透析カテーテル、透析用血液回路ライン、透析膜、体外膜酸素添加ライン、体外膜酸素添加膜、ｉｎ  ｖｉｖｏプロテーゼ、ペースメーカーリード、縫合、血液フィルター、機械弁、人工臓器、または血液保存容器であってもよい。血液と接触することになり、血液凝固を低減させることが望ましいであろう任意の内部または外部医療機器は、ＡＴＨでコーティングされる可能性があり得る。
【０１０５】
特定の実施形態では、医療機器は、ＡＴＨコーティングを有するカテーテルであってもよい。カテーテルは、表面誘発血栓症のためによく故障する。ヘパリンのような従来の抗凝固物質でのこれらの機器のコーティングは、限定された改善を提供し得るが、血餅による機器の閉塞は重大な問題であるままである。ＡＴＨでコーティングした機器は、非常に優れた抗血栓性質を示し、任意の血栓性閉塞が起こることなく、使用することができる。
【０１０６】
一例では、カテーテルは、カテーテルをＡＴＨ溶液に浸漬することによりＡＴＨでコーティングすることができる。カテーテルの内部は、シリンジを使用してカテーテルの内腔に溶液を引き込むことによりＡＴＨ溶液と接触させることができる。その後、カテーテルを所定の期間インキュベートして、ＡＴＨがカテーテルのポリマー表面に結合することを可能にすることができる。この期間は、例えば０．１〜４８時間、１〜４８時間、１〜２４時間、２〜８時間、またはＡＴＨがポリマー表面に結合するのに十分な別の期間であってもよい。その後、カテーテルをＡＴＨ溶液から除去してもよく、過剰なＡＴＨ溶液をカテーテルから排出してもよく、ＡＴＨ溶液の残りのコーティングを乾燥させてもよい。乾燥は、溶媒が、カテーテルをコーティングするＡＴＨ溶液から蒸発するのに十分な任意の期間であり得る。一実施形態では、カテーテルを、静止室温空気中で乾燥させてもよい。乾燥時間は、例えば１〜４８時間、１〜２４時間、１〜８時間、または１〜２時間であってもよい。他の実施形態では、カテーテルは、送風機からの流動空気、静止もしくは流動加熱空気（例えば約６０℃まで加熱した空気）、静止もしくは流動除湿空気、静止もしくは流動窒素、静止もしくは流動希ガス、または部分もしくは完全減圧で乾燥させてもよい。流動、除湿、もしくは加熱空気または他の気体を使用する場合、乾燥時間はより短い場合がある。また、部分または完全減圧が使用される場合、乾燥時間は実質的により短い場合がある。例えば、乾燥時間は、１分〜４８時間、１分〜２４時間、１分〜１時間、１〜３０分、または別の十分な乾燥時間であってもよい。乾燥すると、カテーテルはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用してもよく、または医療適用での使用のために滅菌してもよい。１つの滅菌方法は、カテーテルを、気体透過膜を有する密閉容器中に入れ、エチレンオキシドへの曝露によりカテーテルおよび容器を滅菌することを含み得る。
【０１０７】
カテーテルまたは他の医療機器をＡＴＨでコーティングする様々な方法を使用することができる。例えば、医療機器をＡＴＨ溶液中に浸し、ＡＴＨを医療機器の表面に結合させるのに十分な期間インキュベートしてもよい。別の例では、医療機器を流動ＡＴＨ溶液と接触させる、フロースルー法を使用することができる。特定の一例では、医療機器はカテーテルであってもよく、ＡＴＨ溶液は、ＡＴＨ溶液がカテーテルの外部および内部表面の両方を通過して流動するようにカテーテルの周囲を流動してもよい。ＡＴＨ溶液は連続再生利用され、ＡＴＨがカテーテル表面に結合するのに十分な期間カテーテルを通過して流動してもよい。
【０１０８】
多数の医療機器は、ＡＴＨ溶液の単一のバッチ内で同時にコーティングすることができる。例えば、溶液中でのインキュベーションのために任意の数の医療機器を浸すために、十分な体積のＡＴＨ溶液を調製してもよい。加えて、ＡＴＨ溶液は、多数のバッチの医療機器を順にコーティングするために使用することができる。医療機器表面に形成されるＡＴＨのコーティングは、約１分子のみの厚さであり得るので、医療機器をコーティングした後に、溶液中のＡＴＨのほとんどは溶液中に残っている。一例として、ＡＴＨ１分子の厚さの層は、約２ピコモルのＡＴＨ／表面ｃｍ２を含有し得る。しかしながら、１００ｍＬの１ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ溶液は、全部で１．６９×１０６ピコモルのＡＴＨを含有する。それゆえ、この溶液は、多くの医療機器に対して１分子の厚さのコーティングを形成するのに十分なＡＴＨを含有する。一実施形態では、１つのバッチのＡＴＨ溶液を調製してもよく、その後、複数の医療機器をこのＡＴＨ溶液中に浸し、インキュベートしてもよい。インキュベーション後、医療機器を除去し、過剰なＡＴＨ溶液をＡＴＨ溶液のバッチに戻してもよい。その後、同じバッチのＡＴＨ溶液を別の複数の医療機器をコーティングするために再使用することができる。ＡＴＨ溶液の単一のバッチのみで多数の医療機器をコーティングするために、このプロセスを多数回繰返してもよい。一部のケースでは、ＡＴＨ溶液の新しいバッチを調製する前に、このプロセスを、最大５回、最大１０回、最大２０回、またはさらには最大５０回繰返してもよい。
【０１０９】
連続フロースルー法では、溶液中のすべてのＡＴＨが最終的に使用されるように、ＡＴＨ溶液は無期限に再生利用される可能性があり得る。例えば、一連の医療機器を溶液中でコーティングするとき、ＡＴＨ溶液を再生利用することができる。ＡＴＨ溶液中のＡＴＨ濃度が閾値未満、例えば０．１ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ、０．５ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ、０．８ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ、または０．９ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬに落ちた場合、この例では追加のＡＴＨを溶液に添加し得る。
【０１１０】
特定の例では、５０カテーテルの群をＡＴＨでコーティングすることができる。これは、すべての５０個のカテーテルを一度に収容するために２００ｍＬの１ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ緩衝溶液中で、これらのカテーテルを浸漬コーティングすることにより達成することができる。あるいは、カテーテルは、ＡＴＨ溶液の単一のバッチを使用して５個または１０個を一度に浸漬コーティングすることができる。したがって、必要なＡＴＨ溶液のバッチは、２００ｍＬから４０ｍＬまたは２０ｍＬに低減してもよい。
【０１１１】
ＡＴＨでコーティングしたカテーテルおよび他の医療機器は、ヘパリンでコーティングした機器よりかなり長く開通したままであり得る。例えば、ＡＴＨでコーティングしたカテーテルは、任意の抗凝固物質を使用することなく、最大１年間、静脈または動脈内で開通したままであり得る。一部のケースでは、ＡＴＨでコーティングしたカテーテルは、１週間から１年間、１ヶ月間から６ヶ月間、２ヶ月間から６ヶ月間、または他の延長された時間、静脈または動脈内で開通したままであり得る。一部のケースでは、ＡＴＨでコーティングした医療機器は、無期限に、または少なくとも機器の使用持続期間中、血餅を含まないままであり得る。したがって、血餅形成のために患者内の機器を除去および置き換える必要がない。ヘパリンが大きな割合の不活性ヘパリン鎖を含有し得る一方で、ＡＴＨの増大した能力は、少なくとも部分的には、ＡＴＨが実質的に１００％活性な抗凝固物質であり得るという事実のためである場合がある。
【０１１２】
特定の実施形態では、凍結乾燥コーティングを使用して、医療機器のポリマー表面をＡＴＨでコーティングすることができる。ポリマー表面は、連結基の非存在下でＡＴＨ溶液と接触させてもよい。過剰なＡＴＨ溶液は、ポリマー表面から排出してもよい。その後、溶媒は、少なくとも部分減圧下でポリマー表面から蒸発させてもよい。これにより、ポリマー表面上にＡＴＨ乾燥コーティングを形成することができる。一部のケースでは、凍結乾燥コーティングは、他のコーティング法からのコーティングと比較してより優れた均一性を有する場合がある。
【０１１３】
カテーテルおよび他の医療機器をＡＴＨでコーティングすることの他に、本発明はさらに、カテーテルのフラッシュおよびロック溶液に拡張する。血液凝固を防ぐために、多くの施設での標準の実施は、カテーテルを希釈ヘパリン溶液でフラッシュおよびロックすることであるが、しかしながら、カテーテルの開通性を維持するためのヘパリンフラッシュの効果について文献では明白な賛成意見がない。抗凝固物質として、ヘパリンは、アンチトロンビンの十分な血漿レベルに対するその依存性、および市販のヘパリン調製物の３分の１のみが抗凝固活性を有するという事実を含む、いくつかの制限を有する。新生児および特に未熟児は、成人と比較して顕著に低減した血漿アンチトロンビン濃度を有するので、アンチトロンビンに対するヘパリン機能の依存性は、幼い小児においては特別な関心事である。
【０１１４】
ヘパリンコーティングは、表面をより抗血栓性にするために頻繁に使用される。しかしながら、これらの表面は、表面からのヘパリンの浸出、不均一な置換、および製品の可変性の抗凝固活性のために理想的ではない。標準の未分画ヘパリンの３分の２は抗凝固に必要な五糖配列を含有しないので、これは修飾表面上に付着され得る抗凝固活性のレベルを限定する。加えて、非抗凝固ヘパリン鎖はそれでも表面上へのタンパク質の堆積を促進する場合があり、これは血栓形成を向上させ得る。これらの問題は、ＡＴＨを使用することにより避けることができる。
【０１１５】
一実施形態では、静脈内または動脈内カテーテルをフラッシュおよびロックするための溶液は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含み得る。
【０１１６】
別の実施形態では、フラッシュおよびロックシステムは、静脈内または動脈内カテーテル、カテーテル全体を通してフラッシュするように構成されたフラッシュおよびロック溶液であって、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含むフラッシュおよびロック溶液、ならびにフラッシュおよびロック溶液をカテーテルに注入するように構成されたシリンジを含み得る。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、カテーテルの開通性を維持する方法は、カテーテルの内開口部が静脈または動脈の内側に開放し、カテーテルの外開口部が対象の外側に開放するように、カテーテルを対象の静脈または動脈に挿入するステップ、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む溶液をカテーテルの外開口部を通してカテーテルに注入するステップ、およびアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを含む溶液の少なくとも一部がカテーテル内に残るように、カテーテルの外開口部を密閉するステップを含み得る。
【０１１８】
フラッシュおよびロック溶液がこのようにカテーテルで使用される場合、カテーテルはロック後、ＡＴＨ溶液と接触したままである。カテーテルがＡＴＨ溶液と接触している間に、ＡＴＨは上記に説明するようにカテーテルの表面に結合することができる。したがって、ＡＴＨ溶液を使用してカテーテルをフラッシュおよびロックする度に、カテーテルはさらにＡＴＨでコーティングされ得る。フラッシュおよびロック溶液がカテーテルを通して注入される場合、ＡＴＨはカテーテルの内部表面および先端の両方に結合することができる。これは、カテーテルの内腔内およびカテーテルの先端での血栓形成を防ぐことができる。
【０１１９】
ＡＴＨは、０．０１〜１０ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ、０．１〜１ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬの量、または別の有効な量でフラッシュおよびロック溶液中に存在することができる。溶液の他の構成成分は、水、塩化ナトリウム、および緩衝液を含み得る。
【０１２０】
ＡＴＨ中のヘパリン部分は既に永久に結合したＡＴ分子を有するので、血漿タンパク質および細胞表面との相互作用に完全に使用可能なヘパリン鎖は、ヘパリンより少ない。ＡＴＨは、ヘパリンと比較して、血漿タンパク質および内皮表面（ＨＵＶＥＣ単層）にあまり結合しない。ＡＴＨコーティングが血小板に結合する場合、ヘパリンコーティングとは異なり、ＡＴＨは血小板を活性化しない。それゆえ、ＡＴＨコーティングを有するカテーテルは、ヘパリンコーティングしたカテーテルが血栓を形成し、閉塞し得るような場合に、血栓を含まないままである。血小板がうっ血または他の生物物理学的現象のために活性化された場合でさえも、ＡＴＨは活性化血小板表面上のプロトロンビナーゼ複合体および付随するトロンビン生成の阻害においてヘパリン（ＵＦＨ）より優れている。ヘパリンと比較した抗凝固物質としてのＡＴＨの高い優位性のために、ＡＴＨは凝固開始の予防において、より非常に有効であり得る。このことは、ヘパリンが、血漿からのＡＴも存在しない限り、カテーテルの先端内で活性化凝固因子を阻害できない一方で、ＡＴＨは既に凝固因子を直接阻害し得る非常に反応性のＡＴ分子を有するという事実により特に強調される。
【０１２１】
加えて、ＡＴＨは、より非常に高い抗Ｘａもしくは抗ＩＩａ活性、または因子ＸａもしくはトロンビンのＡＴ阻害の触媒を有する。実際に、ＡＴＨは、ＡＴ＋Ｈ（ヘパリン）よりトロンビン阻害率において４倍超強いことが分かっている。ヘパリンに対して、ＡＴＨについて同様の多数倍高い抗因子Ｘａ触媒活性が示されている。また、ＡＴＨは、ＡＴの添加を伴わずにそれ自体で凝固因子を直接阻害することができ、これはヘパリンにはできないことである。ＡＴＨは凝固カスケードのすべての凝固因子を直接阻害することができる。対照的に、ヘパリンの抗凝固機構においてＡＴが必要なことは非常に十分に記されている。ヘパリンと異なり、ＡＴＨは容易にフィブリン血餅に結合したトロンビンを阻害し、プロトロンビナーゼなどのリン脂質表面複合体に結合した因子Ｘａを阻害することができる。実際に、ＡＴＨが血餅表面上のトロンビンを阻害した後、ＡＴＨ複合体は結合したままであり、ＡＴＨの活性ヘパリン鎖のために血餅表面を抗凝固物質に変換する。これらおよび他の利点のために、ＡＴＨはフラッシュおよびロック溶液における使用に有用である。ＡＴＨのより非常に高い強さおよび他の利点のために、ヘパリン溶液と比較して、ロック溶液中でより非常に低い濃度のＡＴＨしか必要とされない。例えば、ＡＴＨは、未分画ヘパリンと比較して、少なくとも５倍高い抗Ｘａ触媒阻害活性を有する場合がある。
【０１２２】
クエン酸塩は、ときにフラッシュおよびロック溶液で使用される。フラッシュおよびロック溶液としてのクエン酸塩と比較して、ＡＴＨはより低濃度でより長期間カテーテルの開通性を維持することができる。クエン酸塩は、血液中のカルシウムをキレート化することにより、凝固が起こることを防ぐ。しかしながら、クエン酸塩がカルシウムイオンに結合すると、さらなるカルシウムに結合することにより凝固を防ぐことはもはやできない。したがって、クエン酸塩が飽和されると、血流からのさらなるカルシウムは血液凝固カスケードを開始する。他方で、ＡＴＨは血漿中のＡＴの存在を通して阻害を触媒し続けることができる。したがって、ＡＴＨは飽和されたり、消費されたりすることなく、働き続ける。
【０１２３】
ＡＴＨは、ＡＴ＋ヘパリンより３．２倍速く（ＡＴの添加を伴わずに）トロンビンを直接阻害することができる。ＡＴＨは、ＡＴ＋ヘパリンより２８倍速く組織因子を伴う因子ＶＩＩａ複合体を阻害することができる。これらの差に基づいて、ヘパリンと比較して、３．２×２８＝８９．６のより低いＡＴＨ濃度が、凝固カスケードの阻害について同等の反応スピードを与えることができる。したがって、ＡＴＨ濃度は、ＡＴＨロック溶液の存在から起こるカテーテル表面のＡＴＨでの非共有結合コーティングを考慮しない場合でさえも、フラッシュおよびロック溶液中で使用されるヘパリン濃度より少なくとも８９．６倍低い場合がある。
【０１２４】
ヘパリンを含有する現在のフラッシュおよびロック溶液は、中心静脈カテーテルの２０％がブロックされ、置換を必要とすることをもたらす。ＡＴＨをフラッシュおよびロック溶液で使用する場合、これらの２０％のＣＶＣは、置換を必要とすることなく開通性を維持することができる。
【０１２５】
合併症のためのカテーテルの置換は、米国のみで平均すると１日当たり１０，０００ユニットになる。ＡＴＨフラッシュおよびロック溶液を使用することは、必要なカテーテル置換の数を低減することができる。これは置換コストを減少させ、患者のクオリティ・オブ・ライフを増大させ（入院期間がより短い）、処置日数の喪失（例えばがん治療が、置換ＣＶＣ手術が計画されるのを待つ間保留されること）を防ぎ、手術コストを低減し、医師が他の患者を診る時間を増大させる。
【０１２６】
一例では、ＡＴＨを、ステントおよびＣＶＣの両方の表面を永久にコーティングするために使用し、これをその後動物モデルで試験した。ＡＴＨコーティングしたステントおよびＣＶＣは、ヘパリンでコーティングしたステントおよびＣＶＣ、ならびにコーティングしていないステントおよびＣＶＣと比較して、顕著に低減した血餅形成を示した。
【０１２７】
利用可能な、どの異なるタイプおよびブランドのＣＶＣについても抗凝固物質でコーティングすることが実行可能というわけではないので、多くの施設は、カテーテルと関連付けられる血液凝固を防ぐためにカテーテルを抗凝固溶液でフラッシュすることを選択する。ＡＴＨを含有するフラッシュおよびロック溶液を使用することは、ヘパリン溶液を使用することより有効であり得る。
【０１２８】
また、本発明は、ＡＴＨを使用して状態を治療する方法に拡張する。ＡＴＨは、血栓形成の阻害を必要とする様々な状態を処置するために使用することができる。一部のケースでは、未分画ヘパリンから形成したＡＴＨを使用することができる。他のケースでは、ＡＴＨは、低分子量ヘパリン鎖を除去したヘパリンから形成することができる。一実施形態では、哺乳動物において血栓形成を阻害することにより医学的状態を処置する方法は、哺乳動物にある用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲート中のヘパリン鎖の少なくとも９８％は３，０００ダルトン超の分子量を有する。
【０１２９】
一部の実施形態では、ＡＴＨは、血栓塞栓性合併症のリスクを低下させるために侵襲的手順中に投与することができる。侵襲的手順、例えば心肺バイパス（ＣＰＢ）は、大量のフィブリン微小塞栓を誘発し、これは脳に定着する場合があり、長期認知機能障害をもたらす可能性がある。ＡＴＨは、心肺バイパス（ＣＰＢ）中のブタの頸動脈で高強度過渡信号（ＨＩＴＳ）を顕著に低減させることが示されている。ＨＩＴＳの低減は、ＣＰＢ中の血栓塞栓性合併症のより低いリスク、および手術後の関連する神経学的機能障害の低減を示し得る。ＵＦＨ＋ＡＴ処置と比較して、ＡＴＨでの減少したＨＩＴＳは、（ＣＰＢ中または後の）出血の顕著な増大を伴わずに達成された。フィブリン血餅に結合したトロンビンを阻害するＡＴＨの優れた能力、およびヘパリンと比較して増大した半減期が、ＣＰＢ中のその改善された性能の原因であり得る。
【０１３０】
予防のために（治療が必要な血餅を有しない血栓形成促進性の患者で）、ＡＴＨは、キログラム当たり１ユニット（抗因子Ｘａ活性について）（ユニット／ｋｇ）から１０００ユニット／ｋｇまでの範囲の投与量で静脈内投与することができ、典型的な用量は約１００ユニット／ｋｇである。ＡＴＨが、ＡＴＨのＡＴ構成成分についてミリグラム当たり１３０ユニット（ユニット／ｍｇ）の抗因子Ｘａ活性を有する場合、ＡＴＨ投与量は約０．００８ｍｇから約８ｍｇまでの範囲であってもよく、典型的な用量は約０．８ｍｇである。また、投与量は、ＡＴＨ中のＡＴ対ヘパリンの比が５９ｍｇ対１８ｍｇであることを使用して、ＡＴＨのヘパリン構成成分のｍｇについて決定することができる。ＡＴＨのヘパリンより長い静脈内半減期のために、ＡＴＨは頻繁に投与される必要がない。したがって、ＡＴＨは、可能性として１日１回から１週間に１回まで与えられる場合があり、１日１回がより普通である。
【０１３１】
血餅の分解のために、ＡＴＨは、キログラム当たり５０ユニット（抗因子Ｘａ活性について）（ユニット／ｋｇ）から２０００ユニット／ｋｇまでの範囲の投与量で静脈内投与することができ、典型的な用量は約３００ユニット／ｋｇである。ＡＴＨが（ＡＴＨのＡＴ構成成分について）１３０ユニット／ｍｇの抗因子Ｘａ活性を有する場合、ＡＴＨ投与量は約０．４ｍｇから約１５ｍｇまでの範囲であってもよく、典型的な用量は約２．３ｍｇである。ＡＴＨのヘパリンより長い静脈内半減期のために、それは頻繁に投与される必要がない。したがって、ＡＴＨは１日３回から１週間に２回まで与えられる場合があり、１日２回がより普通である。血餅の大きさが十分に減じられたら、ＡＴＨでの処置は用量および頻度を低減するか、または中止してもよい。
【０１３２】
手術中の予防的投与のために、投与量は手術の種類に依存する場合があり、より侵襲的な手順はより高いＡＴＨ投与量を必要とする。最も侵襲的な、損傷を与える手術の１つはバイパス手術であり、これは（ＡＴＨのＡＴ構成成分について）１から６ｍｇ／体重ｋｇのＡＴＨ投与量で処置することができる。一部のケースでは、３ｍｇ／ｋｇのＡＴＨ用量をバイパス手術中に使用することができる。
【０１３３】
ＡＴＨは、単純な等張塩（例えば０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）および生理学的に許容される緩衝液（例えばｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ）を含有する溶液の形態で静脈内に送達することができる。他のタンパク質、可溶化剤、補助剤、または他の添加剤は必要ないが、任意選択で、ＡＴＨ機能に顕著に有害な効果を有しなければ含めることができる。
【０１３４】
ＡＴＨは、全身性抗凝固物質としてヘパリンを上回るいくつかの利点を提供することができる。抗凝固物質に伴う１つの問題は出血である。出血は、血中の抗凝固物質が多すぎることから生じ得る。ＡＴＨは高い抗凝固活性を有するが、ヘパリンと比較して出血が低減されている。また、ＡＴＨは、ヘパリンを上回る他の利点を有する。ＡＴＨ中のＡＴは常に活性化されており、ＡＴへのヘパリン結合のための律速ステップが取り除かれている。加えて、ＡＴＨは、ヘパリンより速い速度で、活性化凝固因子、例えばトロンビンを直接阻害する。ヘパリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで血漿および細胞表面タンパク質に非選択的に結合し得るが、しかしながら、かかる非選択的結合はＡＴＨでは低減されている。さらに、ＡＴＨはヘパリンより長い静脈内半減期を有する。最後に、共有結合したＡＴはＡＴＨヘパリン鎖のかなりの部分を覆うので、血小板との有害な相互作用は低減され、そのため正常な血小板機能が維持される。
【０１３５】
本発明の別の実施形態では、ＡＴＨは木質性結膜炎を処置するために使用することができる。哺乳動物において木質性結膜炎を処置する方法は、哺乳動物の眼にある用量のアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを投与するステップを含み得る。
【０１３６】
眼の血栓症による網膜静脈閉塞は、網膜血管疾患からの視力障害／喪失の原因として糖尿病性網膜症に次ぐ第２の原因である。プラスミノーゲン欠損症の場合、木質性結膜炎は、眼を覆うフィブリン膜で起こり、視覚を不鮮明にする。プラスミノーゲン点眼薬でのこの血栓問題の処置は、阻害剤のために中程度であり、ヘパリン点眼薬はヘパリンが活性化する血漿アンチトロンビンの可変性の存在のために部分的にのみ有効である。ＡＴＨは、ヘパリンと異なり、その大きなサイズのために血管腔の外側に隔離され得る。また、ＡＴＨはアンチトロンビンを含有するので、ヘパリン抗凝固物質が働くためのこの薬剤を提供することを患者のシステムに頼らない。したがって、ＡＴＨは、眼の血栓症をより有効に処置または予防することができる。一例では、木質性結膜炎は、ＡＴＨを含有する点眼薬を毎日投与することにより処置することができる。ＡＴＨは、０．０１〜１０ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ、０．１〜２ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬ、または約１ｍｇ  ＡＴＨ／ｍＬの濃度で点眼薬中に存在し得る。
【０１３７】
別の実施形態では、コンタクトレンズを、ＡＴＨでコーティングすることができる。コーティングされたレンズは、その後、眼の血栓症を予防するために患者の眼に装着され得る。
【０１３８】
木質性歯肉炎は、プラスミノーゲン欠損症に関連する別の状態である。ＡＴＨは、木質性歯肉炎を処置するために使用することができる。一実施形態では、ＡＴＨ溶液を、歯肉中のフィブリン形成を予防するために定期的に患者の歯肉に局所的に適用してもよい。
【０１３９】
さらなる実施形態では、ＡＴＨは、肺内の血液凝固障害を処置するために使用することができる。これらは、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、および例えば機械的換気のための急性肺傷害を含み得る。胎児肺内皮（ＦＤＬＥ）細胞についての血漿中の実験は、ＡＴＨが、同等の用量のＡＴ＋ＵＦＨより大きく、トロンビン生成を阻害することを確認した。この結果は、ＡＴＨが肺内凝固の予防または処置で使用され得ることを示す。ＡＴＨの気管内滴下注入は、４８時間超の間、洗浄液中の高い抗凝固活性をもたらす場合があり、全身的には測定可能な活性はない。さらに、ＡＴＨは、線維芽細胞と比較して内皮を選択的に増殖させる傾向を示す。したがって、ＡＴＨは、ＲＤＳ、ＢＰＤ、および換気誘発肺疾患に寄与する主要な因子を緩和するのに必要な多くの特徴を有する。
【０１４０】
新生児および成人のＲＤＳは、様々な大きさの血漿タンパク質の空気腔への漏れにより特徴付けられ、これは間質性および肺胞内トロンビン生成、続いてフィブリン堆積を引き起こす。フィブリン形成を引き起こす凝固は、肺傷害の重要なエフェクターであることを明白に示す、強く、説得力のある証拠が存在する。正常な肺内には存在しないが、発展中のびまん性肺胞障害中の肺胞および間質性区画中のフィブリンの存在は、ＲＤＳの明白な特徴である。界面活性剤療法の導入以来、ＲＤＳ患者で直接観察されるフィブリンの量は低減している。しかしながら、ＲＤＳでは顕著な肺トロンビン活性が存在するので、架橋結合フィブリンポリマーの不足は、いくつかの固形腫瘍と同様に、フィブリンが肺から迅速に取り除かれ得るという事実から生じ得る。実際に、肺内線維素溶解の改善は、線維症を減少することが示され、さらに肺傷害におけるフィブリン活性を証明した。ＲＤＳ／ＢＰＤ患者の肺におけるフィブリンターンオーバーは、局所的に崩壊しており、急性ＲＤＳにおけるものと同様であった。加えて、脈管構造および肺動脈におけるフィブリン堆積は、ＲＤＳの増大した肺血管抵抗性の発生における血管収縮機構の存在を示す。肺胞内フィブリン堆積は、明白な短期および長期有害効果を有し得る。フィブリンは界面活性剤の機能を顕著に損なうことが発見されている一方で、フィブリン分解生成物は肺胞−毛細血管膜透過性の増大、したがってさらに空気腔への血漿タンパク質の漏れの増大に結び付けられている。肺胞内腔における凝固および線維素溶解システムの両方の活性化のさらなる証拠は、ＲＤＳ患者からの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の過剰な凝血原活性および不十分な線維素溶解活性の両方の存在から得られる。肺へのタンパク質の漏れは、それ自体、血液凝固、補体、および多形核リンパ球の全身性の活性化と関連付けられている。線維芽細胞は、フィブリンにより動員され、フィブリンを含有する領域で分裂増殖し、肺組織の、例えば線維症における不適切なリモデリングを引き起こす。
【０１４１】
フィブリンは、フィブリノーゲンのトロンビン切断により生成され、続いて架橋結合される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの凝固開始は、主に活性な組織因子（ＴＦ）の出現から生じることが示されている。ＦＤＬＥおよび胎児混合肺細胞での血漿トロンビン生成を調べる実験は、肺内皮または線維芽細胞の凝血原活性は細胞表面結合ＴＦによるＶＩＩａ活性化のためであることを示している。実際に、ＴＦは、培養肺がん細胞において唯一の凝固アクチベーターとして同定されている。さらなるデータは、未熟新生児が空気腔内でＴＦ様血栓活性を有することを示している。予備的な特徴として、未熟または胎児状態の、より発達していない肺は、全身循環から空気腔に入る分子について、成人より透過性である。したがって、ＴＦまたは他の凝固活性についての任意の肺病巣は、新生児においては凝固カスケードの因子に接触する機会をより有し、ＲＤＳで見られるフィブリン堆積および合併症を引き起こす。したがって、発達状態は、個体の血栓形成促進性損傷へのかかりやすさに影響し得る。他の急性傷害は生物学的または機械的因子から生じる場合があり、これは凝固病理と関連付けられ得る。例えば、感染の場合、有害な結果を引き起こす肺のトロンビン生成の顕著な証拠がある。より最近では、いくつかの物理的機構がトロンビン生成およびフィブリン堆積を誘発することが実証されている。ここしばらくの間に、機械的人工換気の延長を必要とする患者（特に若年者）は、肺組織構造への損傷の証拠を示すことが観察されることが知られてきた。さらに、肺の凝固および循環性凝固が換気の結果として報告されており、これは全身性ＡＴの投与により鈍らせることができる。さらに、換気性容量損傷は、ガス交換の悪化を引き起こす肺傷害を生じ、これはヘパリンで改善された。ここでもまた、血栓症と関連付けられる換気誘発損傷は若年患者で特に顕著であるという、いくつかの推定が存在する。実験は、ラットにおける高い１回換気量の換気が、循環および肺気道の両方への機能的ＴＦの放出を引き起こすことを示している。ＴＦおよびトロンビン生成は、新生児動物でのみ誘発され、成体動物では誘発されなかった。これは、非常に高い１回換気量で、かつ呼気終末陽圧換気を伴わない場合、ＴＦ関連凝固活性はヒト成人でのみ発現されたという他の発見と一致する。ラット新生児における血栓活性ピークの出現は、１５分経たないうちに起こり、１時間にわたる期間持続した。フィブリン堆積と肺の生存との間の関連のために、急性（換気性）または慢性（ＢＰＤ）傷害中のＴＦ凝血原活性の制御は、肺機能障害および悪い組織改変に対する抵抗性に利益を与え得る。興味深いことに、また、損傷の制御は、肺組織透過性を弱めるようであり、これはフィブリンおよび他の血漿タンパク質の存在をもたらし、これらは界面活性剤の機能を阻害する。実際に、ＴＦ活性を中和することができる薬剤は、肺細胞機能障害を引き起こす経路をブロックし、肺傷害中の中程度の組織リモデリングは患者で、特に小児集団内で、結果を多いに向上させ得る。
【０１４２】
ＡＴＨは、ＵＦＨによる肺のフィブリン堆積の処置で見られる制限の多くに取り組むことができる。ＡＴＨは、トロンビンに対する直接的な非触媒性阻害活性を有し、これは非共有結合ＡＴ＋ＵＦＨ混合物より４〜１０倍速い。ＡＴＨによる直接的なトロンビン阻害の速い速度は、トロンビン生成のフィードバック活性化に関与する低レベルのトロンビンの中和を確実にすることができ、血漿ＡＴ濃度がトロンビン阻害に不十分であり得る浮腫流体中に存在し得る。加えて、ＡＴとトロンビンとの反応を触媒するＡＴＨの強い能力は、それが肺胞腔に拡散する任意のＡＴを利用することも可能にし得る。速い流体相トロンビン阻害とは別に、ＡＴＨは、非共有結合ＡＴ・ＵＦＨでの反応に抵抗性であるフィブリン結合トロンビンを阻害することができる。血餅結合トロンビンの阻害は、ＡＴＨによる静脈血餅の低減に寄与し、出血性副作用の顕著な増大を伴わない。ＦＤＬＥ表面上で、ＡＴＨは、同様の用量のＡＴ＋ＵＦＨと比較して、血漿トロンビン生成の阻害で非常に優れていることが証明された。さらに、ＡＴＨと未分画および低分子量ヘパリンとの比較は、ＡＴＨが、より強く、成人、小児、または新生児血漿のいずれかでトロンビン生成を阻害することができることを示している。ウサギおよび新生児ラットにおけるＡＴＨの気管内投与は、少なくとも２から４日後、全身性の抗原または活性のいずれ存在を伴わずに、洗浄液中で高レベルの抗凝固活性が検出され得ることを実証した。したがって、ＡＴＨは、急性肺傷害のリスクを有する未熟児の肺への単回投与後に、全身性副作用を伴わずに、肺フィブリン堆積を長期にわたり阻害することができる速いかつ強い抗凝固物質として使用することができる。ＡＴＨは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮対線維芽細胞増殖に対して興味深い差次的効果を発揮し、これはＡＴによる影響と反している。ポリウレタンカテーテルおよび腔内グラフト上に固定化されたＡＴＨの広範な調査は、このコンジュゲートがｉｎ  ｖｉｔｒｏでトロンビンに対する顕著により大きな阻害活性、およびｉｎ  ｖｉｖｏで抗凝固活性を有することを示している。肺胞マトリックスに結合したＡＴＨは、このように、過剰な局所的トロンビン生成および他の細胞と比較して線維芽細胞蓄積を制御することを補助し得る。
【０１４３】
特に、ＡＴＨは、機械的換気を提供する場合に投与することができる。機械的換気は、特に未熟新生児の肺を傷つける場合がある。それゆえ、機械的換気前または機械的換気中に新生児の肺にＡＴＨを投与することにより、肺内のフィブリン形成による合併症を避けることができる。延長された期間、肺に抗凝固効果を提供するために、単回用量のＡＴＨは十分であり得る。例えば、単回用量は、一部のケースでは、６時間から１週間続き得る。
【０１４４】
また、本発明は、ＡＴＨをフィブリンと共に含む特定の組成物に拡張する。ＡＴＨを、体外でフィブリンとインキュベートしてもよく、これによりフィブリンはＡＴＨに結合する。この組成物を、その後、血餅を処置するために使用することができる。本組成物は、注射されるか、またはさもなければ投与され、血餅を標的化することができる。本組成物中のＡＴＨ：フィブリン複合体は、血餅中に存在する他のフィブリンに結合する傾向がある。ＡＴＨ：フィブリン複合体が血餅表面に結合した場合、血餅表面は正味の抗凝固性質を帯びる。これは血餅の成長を停止させ、血餅を崩壊させる。
【０１４５】
一実施形態では、血餅を処置するための組成物は、アンチトロンビン、ヘパリン、およびフィブリンを含み得る。ヘパリンの少なくとも５０重量％は、アンチトロンビンにコンジュゲートしていてアンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートを形成し得る。フィブリンの少なくとも一部は、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに結合していてもよい。一部のケースでは、フィブリンの少なくとも５０重量％が、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに結合していてもよい。割合は、より高くてもよく、例えば、組成物中のフィブリンの９０〜１００重量％が、アンチトロンビン−ヘパリンコンジュゲートに結合していてもよい。
【０１４６】
ＡＴＨ：フィブリン複合体の組成物は、ＡＴＨ溶液をフィブリン溶液と混合することにより調製することができる。フィブリンが溶液中で重合しないように、フィブリンは、十分に希釈されるか、またはグリシン−プロリン−アルギニン−プロリンアミドなどのフィブリン重合阻害剤を含有してもよい。組成物が患者の体内に追加の活性フィブリンを導入しないように、フィブリンがＡＴＨに結合した後、必要に応じて、ＡＴＨ：フィブリンは任意の非結合フィブリンから分離してもよい。
【実施例】
【０１４７】
以下の実施例は、本開示の、現在最もよく知られている実施形態を例証する。しかし、以下は、本技術の原理の適用の例示または例証にすぎないことは理解されるべきである。多数の改変および代替組成物、方法および系は、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、当業者により考案され得る。添付の特許請求の範囲は、そのような改変および構成を包括することが意図されている。したがって、本開示は、上で詳細に記載されているが、以下の実施例は、本開示の実用的な実施形態と現在みなされるものに関連するさらなる詳細を提供する。
【０１４８】
（実施例１）
ＡＴＨとポリウレタンカテーテルとの直接インキュベーションを以下のように行った。放射標識ＡＴＨ（１２５Ｉ−ＡＴＨ、Ｎａ１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、  Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＯＮから）およびヨードビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｏｔｔａｗａ、ＯＮから）を使用して製造業者の指示に従って放射標識したＡＴＨ）を添加したＡＴＨ溶液を調製し、その後、非活性化カテーテルとのインキュベーションに使用した。２つのカテーテル（Ｓｏｌｏｍｏｎ製、１５ｃｍ長、７Ｆｒｅｎｃｈのポリウレタンカテーテル）を、５３ｍＬの１／１０希釈ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬ  ＡＴＨ／１２５Ｉ−ＡＴＨ溶液を含有するシリンダーに浸した。取り付けられたシリンジにより流体を各カテーテルの内側に引き込み、固定されたシリンジによりその場に保持した。その後、カテーテルを、撹拌棒で撹拌しながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、カテーテルをインキュベーション溶液から除去し、洗浄のために別の容器に移した。カテーテルを６０ｍＬ体積の、ａ）０．１５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０、ｂ）２Ｍ  ＮａＣｌ  ０．１５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０、ｃ）０．１％ＳＤＳ  ０．１５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０（この溶液中で３回洗浄する）、ｄ）０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．０２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４、およびｅ）Ｈ２Ｏ中で逐次的に洗浄した。各洗浄中、洗浄溶液を撹拌棒で撹拌し、シリンジで洗浄溶液をカテーテルの内側で５０回上下させた。洗浄後、０．５ｃｍの試料セグメント（１カテーテル当たり３個）を切断し、ガンマ放射活性カウントを取って、カテーテルに結合したままの放射標識ＡＴＨの量を決定した。各部分は総表面積が約１ｃｍ２であった（内側＋外側）。結果を表１に示す。
【表１】
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【０１４９】
「計算されたピコモルＡＴＨ」の値は、１分当たり６６，３００カウントが１ピコモルのＡＴＨに相当する換算係数に従って計算した。表面ＡＴＨの量についての（アッセイにより検出されたＡＴについての）同族カテーテルからの０．５ｃｍのセグメントのＥＬＩＳＡアッセイは、カテーテル上の総ＡＴＨ量もまたピコモルの１０分の１のオーダーであったことを確証した。
【０１５０】
この実験は、驚くべきことに、溶液中の遊離ＡＴＨは非修飾カテーテルの表面に強く結合し得ることを示す。また、これは、ＡＴＨフラッシュおよびロック溶液は、ＡＴＨが表面に結合するので、カテーテル表面でカテーテルを抗凝固することを補助し得ることを示す。これは、カテーテル表面に結合しないヘパリンとは異なる。ＡＴＨは、緩衝液、洗剤、および高塩濃度での多数回の洗浄後、結合したままであった。対照的に、ヘパリンは、ポリウレタン表面に結合することは発見されていない。
【０１５１】
（実施例２）
乾燥しながらのＡＴＨとポリウレタンカテーテルとの直接インキュベーションは、以下のように行うことができる。以下の実施例は、ＡＴＨまたはポリマー表面いずれかの事前修飾または活性化なしに、非修飾共有結合アンチトロンビン−ヘパリン（ＡＴＨ）がどのように非反応性不活性ポリマー表面上にコーティングされ得るかを詳細に例示する。適切な緩衝液（４．０から１０．０の範囲のｐＨを有し、および一部のケースでは、約７．４である）中のＡＴＨ溶液を、０．０１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの範囲、および一部のケースでは、約１ｍｇ／ｍＬのＡＴＨ濃度（ＡＴ部分について）で調製する。最大２０個のカテーテル（例えば１５ｃｍ長ポリウレタンカテーテル）を、５３ｍＬのＡＴＨ溶液を含有するシリンダー中に浸す。取り付けられたシリンジにより流体を各カテーテルの内側に引き込み、固定されたシリンジによりその場に保持する。その後、カテーテルを撹拌棒で撹拌しながら室温で２４時間インキュベートする。２４時間のインキュベーション後、シリンジを取り外し、カテーテルをインキュベーション溶液から除去し、各カテーテルを、下端部がセルロースフィルター紙に接触するように垂直に保持し、流体を所定の期間（典型的に約１分）、カテーテルの内側および外側から重力により排出する。その後、カテーテルを、下端部をいかなる固体表面に接触させずに、垂直に掛けて乾燥させる（溶媒の蒸発）。最大４８時間（一部のケースでは、約１８時間）の乾燥は、室温で静止空気、室温で静止窒素ガス、室温で静止希ガス、摂氏６０℃まで加熱した開放大気気体、または減圧（凍結乾燥のため）のいずれかで行うことができる。乾燥すると、カテーテルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するか、または患者における将来の使用もしくは他の医療適用のために密閉袋（気体透過性である膜を有する）に入れ、酸化エチレンへの曝露により滅菌する。
【０１５２】
（実施例３）
血管を裏打ちする内皮細胞（人工血管表面）上の凝固因子のＡＴＨ阻害の有効性。ＡＴＨによる凝固因子阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査は主に、血漿または精製タンパク質を含有する緩衝溶液中で行われている。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、内皮表面は様々な方法で、例えばトロンビン活性を変えるトロンビンのタンパク質受容体結合部位（例えばトロンボモジュリン（ＴＭ））を提供すること、および抗凝固グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子（例えばヘパラン硫酸（ＨＳ））を発現することで、凝固を調節し得る。この研究の目的は、内皮の存在下でＡＴＨおよびＡＴ＋Ｈ抗凝固活性を比較することであった。
【０１５３】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＥＢＭ−２培地、およびＥＧＭ−２ＭＶ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔは、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入した。最小必須培地（ＭＥＭ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＩＩａおよびＸａは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ、ＵＳＡ）からであった。ヒト正常プール血漿および精製ヒトＡＴは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ａｎｃａｓｔｅｒ、ＯＮ、ＣＡ）からであった。ヘパリン、ヘキサジメトリンブロミド（ポリブレン）、ヘパラン硫酸、およびゼラチンは、Ｓｉｇｍａ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、ＣＡ）から購入した。フィブリノーゲン（プラスミノーゲン、フィブロネクチン、ＦＸＩＩＩ除去）および組換えヒトトロンボモジュリンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）からであった。Ｓ−２２３８およびＳ−２２２２は、Ｄｉａｐｈａｒｍａ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨ、ＵＳＡ）からであった。ＡＴＨは以前に説明したように生成した。すべての他の試薬は試薬等級の質のものであった。
【０１５４】
ＨＵＶＥＣを、２％ゼラチンでコーティングした組織培養処理したプラスチック製品（Ｐｒｉｍａｒｉａ、ＢＤ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、ＣＡ）上で滅菌条件下にて培養した。実験のために、細胞を９６ウェルプレート中に２００００〜４００００細胞／ｍＬで播種し、ＥＧＭ−２ＭＶ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔで補完したＥＢＭ−２培地中で、加湿空気〜５％ＣＯ２大気中にてコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を継代２から５の間で使用した。
【０１５５】
偽一次条件（阻害剤：酵素比＝１０：１）下での不連続アッセイにより、ＩＩａおよびＸａのＡＴＨおよび非供給結合ＡＴ＋Ｈ阻害の二次速度定数（ｋ２）値を、３７℃で測定した。ＩＩａ、Ｘａ、ＡＴ、ＵＦＨ、およびＡＴＨを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４および０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３０００を含有する基礎培地（ＭＥＭ）（ＭＥＭＰＨ）中に希釈した。ＩＩａまたはＸａを、コンフルエントのＨＵＶＥＣ単層を含有する９６ウェルプレートのウェル中で、ＡＴ＋ＨまたはＡＴＨとインキュベートした。単層をＭＥＭＰＨで洗浄し、その後、反応構成要素を添加した。非共有結合ＡＴ＋Ｈ混合物中のＨ：ＡＴのモル比は、ＩＩａおよびＸａとの反応についてそれぞれ、２３：１および１０：１であった。これらのＨ：ＡＴ比は、以前にＨＵＶＥＣの非存在下で阻害の最大ｋ２値を生成することが発見された。様々な時間間隔でインキュベートした後、０．４ｍｇ／ｍＬの適切な発色性基質（ＩＩａについてＳ−２２３８、またはＸａについてＳ−２２２２）を含有するＴＳＰ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００  ｐＨ７．４）中の１．２５ｍｇ／ｍＬのポリブレンの添加により反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、各ウェル中の残留酵素活性を、時間にわたるＡ４０５の変化として測定した。ポリブレン／基質添加前の残留酵素活性対阻害時間のプロットからの傾きの負値を取り、傾きについてのこの負値を阻害剤（すなわちＡＴＨまたはＡＴ）濃度で割ることにより、ｋ２値を計算した。また、未処理Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｏ−Ｂｉｎｄ平底９６ウェルプレート（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して、同一のアッセイを比較のためにプラスチック表面（ＨＵＶＥＣなし）で行った。
【０１５６】
別々の実験で、ＨＵＶＥＣ単層を含有するウェルをＭＥＭＰＨで洗浄し、２０μＬの２ｎＭ  ＩＩａ（ＭＥＭＰＨ中に希釈した）を多数のウェルに添加した。３７℃での３分間のインキュベーション後、１ｍｇ／ｍＬヒトフィブリノーゲンおよび様々な濃度のＡＴ＋ＨまたはＡＴＨ（０〜１．２５ｎＭの、ＡＴＨまたは２３：１のＨ：ＡＴ比を有するＡＴ）を含有する８０μＬのＭＥＭＰＨをすべてのウェルに同時に添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４分光光度計を使用してＯＤ３５０を測定することにより、３７℃でのフィブリン血餅形成を比濁法によりモニターした。血餅形成までの遅滞時間を、ＯＤ３５０が０．００５に達する時間として定義した。ＯＤ３５０が９０分後に０．００５に達しなかった場合、遅滞時間は９０分として割り当てた。また、比較のためにアッセイをプラスチック（ＨＵＶＥＣなし）上で行った。プラスチック上で行ったいくつかのアッセイで、３分間のインキュベーションステップ前に、２ｎＭ  ＩＩａを１０ｎＭトロンボモジュリン（ＴＭ）または５μＭヘパラン硫酸（ＨＳ）と混合した。
【０１５７】
結果を平均値±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性の分析を行い、ｐ＜０．０５を有意であると考えた。スチューデントのｔ検定は、ウィンドウズ（登録商標）版Ｍｉｎｉｔａｂ  １３を使用して行った。
【０１５８】
非共有結合ＡＴ＋ＨまたはＡＴＨによるＩＩａおよびＸａの、ヘパリンで触媒される阻害に対する内皮の効果を評価するために、ＨＵＶＥＣ単層の非存在下または存在下でのこれらのプロテアーゼの阻害速度についてｋ２値を決定した。図１Ａおよび１Ｂは、内皮の存在下でのＡＴ＋ＨおよびＡＴＨによる凝固因子阻害速度を示す。プラスチック表面ウェルまたはＨＵＶＥＣ単層で覆ったウェルのいずれかにおけるＡＴＨおよびＡＴ＋ＨによるＩＩａ（Ａ）およびＸａ（Ｂ）の阻害について、ｋ２値を決定した。不連続法を使用して偽一次条件下でｋ２値を測定した。ＡＴ＋Ｈ混合物中のＨ：ＡＴのモル比は２３：１（Ａ）および１０：１（Ｂ）であり、これは以前にＩＩａおよびＸａの阻害についてそれぞれ、最大ｋ２値を与えることが示されている。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ≧５）を表す。ＨＵＶＥＣの非存在下で、ＡＴＨによるＩＩａおよびＸａ阻害のｋ２値は、非共有結合ＡＴ＋Ｈによる阻害のｋ２値より高かった（図１Ａおよび１Ｂ）。増大の程度は、ＩＩａについて最も大きく、２．３倍であった。内皮が存在する場合、ＩＩａおよびＸａのＡＴＨ阻害は、ここでもまた、ＡＴ＋Ｈによるより速かった（図１Ａおよび１Ｂ）。プラスチックと比較して、内皮細胞上でのＡＴＨおよびＡＴ＋Ｈの両方についての絶対ｋ２値は、ＩＩａの場合有意に減少し（ｐ＜０．０５）（図１Ａ）、Ｘａについてわずかに、有意でなく減少した（ｐ＞０．１）（図１Ｂ）。
【０１５９】
ＩＩａ阻害を、フィブリン形成アッセイによりさらに調査し、ここではＩＩａをＨＵＶＥＣ単層の存在ありまたはなしのウェル中でインキュベートし、続いてウェルにフィブリノーゲンおよび抗凝固物質を添加した。図２は、内皮の存在下での、ＡＴ＋ＨおよびＡＴＨによるＩＩａ誘発フィブリン形成の阻害を示す。ＩＩａをプラスチックまたはＨＵＶＥＣコーティングしたウェル中でインキュベートし、その後、精製フィブリノーゲン、ＣａＣｌ２、およびＡＴ＋ＨまたはＡＴＨの混合物を添加した。ＩＩａの最終濃度は０．４ｎＭであった。最終阻害剤（ＡＴまたはＡＴＨ）濃度はＸ軸に示され、ＡＴ＋Ｈ混合物中のＨ：ＡＴのモル比は２３：１であった。フィブリン形成を比濁法でモニターし、遅滞時間はＯＤ３５０＝０．００５に達する時間を表す。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ≧５）を表す。図２は、速度実験とは対照的に、内皮の存在はＡＴＨまたはＡＴ＋ＨいずれかによるＩＩａフィブリノーゲン切断活性の阻害に対して効果を有しなかったことを示す。速度実験と同様に、ＡＴＨは、ＩＩａによるフィブリン形成の予防においてＡＴ＋Ｈより有効であった。
【０１６０】
内皮表面上で主要なＩＩａ結合部位を構成する２つの分子は、ＨＳおよびＴＭである。これらの分子のいずれかへのＩＩａ結合が抗凝固活性に影響したかどうかを決定するために、可溶性ＨＳまたはＴＭをＩＩａと事前インキュベートし、ＡＴＨまたはＡＴ＋Ｈの非存在下または存在下でフィブリン形成を評価した。ＨＳはＩＩａ誘発フィブリン形成に影響しなかった（ＨＳの存在下および非存在下でそれぞれ、開始時間＝９７．３±６．６秒対９５．４±６．４秒、ｎ＝９）。ＴＭの存在はフィブリン形成を有意に遅延させ、開始時間は、ＴＭの非存在下の９７．９±６．４秒と比較して、１２２．４±１．７秒であった（ｐ＝０．００３、ｎ≧８）。図３Ａおよび３Ｂは、ＨＳまたはＴＭに結合したＩＩａにより誘発されたフィブリン形成の阻害を示す。ＩＩａを過剰なＨＳ（Ａ）またはＴＭ（Ｂ）と混合し、その後図２について説明するようにフィブリン形成アッセイをプラスチックウェル中で行った。ＩＩａ、ＨＳ、およびＴＭの最終濃度は、それぞれ０．４ｎＭ、１μＭ、および４ｎＭであった。最終阻害剤（ＡＴまたはＡＴＨ）濃度はＸ軸上に示され、ＡＴ＋Ｈ混合物中のＨ：ＡＴのモル比は２３：１であった。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ≧４）を表す。ＡＴＨは、ＨＳ（図３Ａ）およびＴＭ（図３Ｂ）の両方の存在下で、ＡＴ＋Ｈと比較してその優れた抗凝固機能を維持した。
【０１６１】
（実施例４）
ＡＴＨ溶液を使用したカテーテルのフラッシュロック。ＡＴＨ溶液を、ｐＨ７．４に設定した緩衝液（例えば０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ）を伴うまたは伴わない０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中に調製する。この溶液中のＡＴＨ濃度は、抗因子Ｘａ活性について約１．５Ｕ／ｍＬであるが、一部のケースでは、０．０１Ｕ／ｍＬから１００Ｕ／ｍＬ抗因子Ｘａ活性の範囲であり得る。ＡＴＨ溶液を、滅菌空気流を伴うラミナーフローフード内での、０．２μｍの孔を有する滅菌フィルターを通した濾過により滅菌する。なおも滅菌環境内で、滅菌濾過したＡＴＨ溶液を、後に使用直前の滅菌シリンジ中への引き込みのために隔膜を含有する滅菌瓶内に密閉するか、または測定量をキャップした滅菌シリンジ中に取り込む。
【０１６２】
カテーテルを対象または患者の静脈もしくは動脈に挿入した後、約２ｍＬ（一部のケースでは、０．１ｍＬから５０ｍＬの総体積）の上記に説明したように調製した滅菌ＡＴＨ溶液を含有するシリンジをカテーテルの外部端に接続し、シリンジ中のすべてのＡＴＨ溶液をカテーテルに注入し、続いて滅菌キャップでカテーテルを密閉する。
【０１６３】
１時間から７日間の範囲の期間後、血液試料を採血することができるか、または薬物療法を注入することができるように、キャップを除去して、シリンジで置き換えてもよい。採血または薬物療法注入後、血液試料または薬物療法送達シリンジを、以前のものと同様のＡＴＨ溶液を含有する別のシリンジで置き換えて、ＡＴＨ溶液を注入し、続いて以前と同様にカテーテルをキャップする。カテーテルが除去されるまで、このプロセスを必要な限り繰返す。
【０１６４】
（実施例５）
木質性結膜炎の処置。ＡＴＨ溶液を、ｐＨ７．４に設定した緩衝液（例えば０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ）を伴うまたは伴わない０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中に調製する。この溶液中のＡＴＨ濃度は典型的に、（ＡＴ含有量について）約１ｍｇ／ｍＬであるが、０．００１ｍｇ／ｍＬから１１ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。ＡＴＨ溶液を、滅菌空気流を伴うラミナーフローフード内での、０．２μｍの孔を有する滅菌フィルターを通した濾過により滅菌する。
【０１６５】
血管系の外側の組織表面上の木質性結膜炎の形成を防ぐための処置を必要とする患者には、規則的に一定分量のＡＴＨ含有溶液を施す。眼の木質性結膜炎の場合、１滴またはそれ超（およその１滴の体積は約１０μｌから１００μｌ）の上記に説明するＡＴＨ溶液を、特定の患者の疾患の重症度によって、１日当たり１回またはそれ超適用する。このプロセスを、患者の生涯の処置について進行型で繰返す。
【０１６６】
（実施例６）
最近の予備的データは、ＡＴＨがｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮対線維芽細胞増殖に対して興味深い差次的効果を発揮することを示唆し、これはＡＴによる影響と反する（以下の表２を参照のこと）。ポリウレタンカテーテルおよび腔内グラフト上に固定化されたＡＴＨの広範な調査は、ＡＴＨコンジュゲートがｉｎ  ｖｉｔｒｏでトロンビンに対する顕著により大きな阻害活性、およびｉｎ  ｖｉｖｏで抗凝固活性を有することを示している。これらの結果は、肺胞マトリックスに結合したＡＴＨは、過剰な局所的トロンビン生成および他の細胞と比較した線維芽細胞蓄積を制御することを補助し得ることを示唆する。
【表２】
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【０１６７】
ラット新生児肺細胞一次培養物を、２４ウェルプレートのウェル中で、アンチトロンビン（ＡＴ）または共有結合ＡＴ−ヘパリン（ＡＴＨ）のいずれかで補完したＭＥＭ培地中にて、湿った５％ＣＯ２／９５％空気大気中で３７℃にて１日にわたり増殖させた。細胞をその後、トリプシンを使用して単層から放出させ、血球計数器を使用して総細胞数を決定した。結果を、補完していないＭＥＭ培地中の対照培養物に対する細胞数のパーセント変化の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表す。同じ群の細胞におけるＡＴでの結果に対するＡＴＨでの結果の有意な差が示される（＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれＰ＝０．００２、Ｐ＝０．０２６、およびＰ＝０．０２７を意味する）。ＡＴ単独は内皮の分裂増殖を有意に阻害し、線維芽細胞の分裂増殖は阻害しなかったが、ＡＴＨは優先的に線維芽細胞と比較して内皮の増殖を向上させた。
【０１６８】
（実施例７）
急性ストレス／傷害の状態下の肺のＡＴＨ処置の調査。通常呼吸または１時間の高い換気量の機械的換気のいずれかにランダム化した新生児動物において、気管内ＡＴＨを使用して予備的実験を行った。図４は、１時間の高い換気量の機械的換気を伴う、または伴わない、肺内ＡＴＨまたはＰＢＳ緩衝液のいずれかで処置した２〜６日齢のラットから採取したクエン酸塩添加血からの再石灰化血漿試料の凝血時間を示す。凝固アッセイは、緩衝液を注入した対照と比較して、ＡＴＨは換気と関連付けられる全身性組織因子（ＴＦ）活性から血漿凝固時間の低減を除去したことを強く示した（図４を参照のこと）。ＴＦ関連肺トロンビン生成およびフィブリン形成は明らかであるので、ＡＴＨコンジュゲートによる重要なＶＩＩａ−ＴＦ複合体の直接的な中和は、血漿阻害剤が低密度である肺内の凝固活性化をブロックし得る。
【０１６９】
（実施例８）
（ＲＤＳまたは機械的換気からの肺損傷を防ぐための）肺内のＡＴＨ注入の可能性を測定するために、ＡＴＨの、空気腔崩壊を防ぎ、ガス移送を改善するための界面活性剤レベルを増大させる肺細胞界面活性剤生成に対する効果を決定するための実験を行った。以下の予備データを回収した（図５を参照のこと）。胎児肺内皮（ＦＤＬＥ）を２０日齢のラット胎児から単離し、２４ウェル培養プレートのウェル中で培養した。培養培地を１００μｇ／ｍＬのＡＴＨまたは対照緩衝液のいずれかで補完した。図５は、緩衝液またはＡＴＨ（１００μｇ／培養培地ｍＬ）のいずれかとインキュベートした、ラット胎児肺内皮（ＦＤＬＥ）細胞が生成した細胞培地の、界面活性剤タンパク質Ｃについて検査したウェスタンイムノブロットを示す。細胞培地のウェスタンイムノブロットは、ＡＴＨ（１００μｇ／培養培地ｍＬ）とインキュベートしたＦＤＬＥ細胞により生成された界面活性剤タンパク質Ｃの増大を示した。
【０１７０】
（実施例９）
血餅処置のためのＡＴＨ：フィブリン抗凝固物質。以下は、患者において血餅を標的化するために注射され、血餅表面が正味の抗凝固性質を有するようにさせることができる、フィブリンモノマーに結合したＡＴＨの調製方法の提案である。ＡＴＨ：フィブリン複合体は、重合フィブリンを含有する血餅上のフィブリンのように、他のフィブリンがかなりの濃度で存在する場合それに結合する傾向があるので、ＡＴＨ：フィブリンの使用は、ＡＴＨ単独の注射と比較して低濃度で使用され得る非常に有効な血餅中和剤になり得る。既にフィブリンに結合したＡＴＨとは異なり、遊離のＡＴＨはフィブリン血餅の他に、他の標的上で終了する場合があり、それゆえ、より非常に高い濃度で投与する必要があり得る。以下は、フィブリンモノマーに結合したＡＴＨを調製し、それを、血餅を含有する患者に投与する方法である。
【０１７１】
酢酸中のフィブリンモノマーのストック溶液を以下のように調製する。市販されているフィブリノーゲン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用する。以前の実験で、溶液中の可溶性フィブリンのストックを調製するために以下のプロトコールを使用した。最初に、１５ｍＬの１３０μＭフィブリノーゲン（分子質量３４００００ダルトン）を５ｍＬのゼラチンアガロース（Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）と３０分間２回インキュベートし、続いて遠心分離して、フィブリノーゲン含有上清を回収することにより、あらゆる汚染フィブロネクチンを市販のフィブリノーゲンから除去した。１０ｍｇ／ｍＬの吸光度＝１５．１を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によりフィブリノーゲン濃度を決定した（式  補正Ａ２８０＝Ａ２８０−１．７×Ａ３２０を使用して、３２０ｎｍでの光散乱について補正後）。可溶性フィブリンモノマーを以下の方法により調製した。精製フィブリノーゲン（６０〜１００μＭ）を２ｎＭトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ、ＵＳＡ）と３７℃で４〜６時間インキュベートし、続いて２０００ｇで５分間遠心分離した。フィブリンポリマーペレットを透析バッグ（１２０００〜１４０００分子量カットオフ）中に入れ、Ｈ２Ｏ（４℃）に対して透析して、フィブリノペプチドＡおよびＢを除去し、その後、フィブリンが溶解するまで（約８時間）０．０２Ｍ酢酸に対してさらに透析した。２８０ｎｍでの吸光度により、ならびに３４００００の分子量および１０ｍｇ／ｍＬの吸光度＝１４．０を使用して、溶液中の可溶性フィブリン濃度を得た。典型的に、１００μＭの可溶性フィブリンを得、−８０℃で保存した。
【０１７２】
ＡＴＨに結合するためのフィブリンの溶液を調製するために、６体積の０．０２Ｍ酢酸中の可溶性フィブリンを、中性条件下でフィブリン重合をブロックするために、４体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（１０ｍＭ  ＧＰＲＰ−ＮＨ２を含有する）（Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で中和する。得られた中和４００００ｎＭ可溶性フィブリンモノマーはさらに希釈するか、またはＡＴＨと混合するまでその濃度で維持してもよい。フィブリン：ＡＴＨのある範囲のモル比を有する溶液を調製することができるが、ＡＴＨは、最大でフィブリンに対してわずかにモル過剰の（約１０％）およそ等しいモル濃度でフィブリンに（ＧＰＲＰ−ＮＨ２の存在下で約７．５のｐＨで）添加することができる。典型的な実験では、１体積の０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．６％ポリエチレングリコール８０００  ｐＨ７．４（ＴＳＰ）（０．０１Ｍ  ＧＰＲＰ−ＮＨ２を含有する）中の４００００ｎＭのＡＴＨを、等体積の中和４００００ｎＭ中和フィブリン溶液と迅速に混合する。得られた混合物は、ＡＴＨ：フィブリン溶液１と呼ばれ、２００００ｎＭ  ＡＴＨ＋２００００ｎＭ可溶性フィブリンモノマーを含有する。
【０１７３】
ＡＴＨ＋フィブリン溶液は、血餅の凝血原活性を中和するために、血餅を有する患者に静脈内注射することができ、これにより身体自体の天然の線維素溶解系が血餅をうまく消化して、それを除去することができる。患者に送達されるべきＡＴＨ：フィブリン製品の用量は、患者における血栓症の程度または凝固活性もしくは血餅サイズによって広く変化し得る。上記に説明するＡＴＨ：フィブリン溶液を使用して、０．０１ｍＬ／体重ｋｇから１０ｍＬ／体重ｋｇのいずれでも静脈内注射により投与することができ、０．５ｍＬ／体重ｋｇが最も一般的である。ＡＴＨ＋フィブリンモノマー溶液を調製する他の選択肢として、０．０２Ｍ酢酸中の１００μＭフィブリンを０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．６％ポリエチレングルコール８０００  ｐＨ７．４（ＴＳＰ）で、フィブリンが非常に迅速に重合しない１００ｎＭ未満の濃度に迅速に希釈することが挙げられる。等体積の同じ濃度のＡＴＨをその後、希釈フィブリン溶液に迅速に混合し、得られた混合物を０．１ｍＬ／体重ｋｇから１０ｍＬ／体重ｋｇの範囲の用量で注射し、２ｍＬ／体重ｋｇが普通である。
【０１７４】
上で言及されている構成は、本開示の原理に対する適用の例証であることは理解されるべきである。したがって、本技術は、例示的な実施形態に関連して上で記載されているが、当業者には、多数の改変および代替の構成は、特許請求の範囲に明記されている本開示の原理および概念から逸脱することなく行われ得ることが明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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