(57)【要約】本開示は、多重特異性抗原結合分子、およびその使用を提供する。多重特異性抗原結合分子には、標的分子と特異的に結合する第1抗原結合領域、および内部移行エフェクタータンパク質と特異的に結合する第2抗原結合領域が含まれる。本開示の多重特異性抗原結合分子は、いくつかの実施形態において、標的分子および内部移行エフェクタータンパク質の両方と結合することができる二重特異性抗体であり得る。本開示のある実施形態において、本開示の多重特異性抗原結合分子による標的分子および内部移行エフェクタータンパク質との同時結合は、標的分子単独の結合よりも大幅に標的分子の活性の減弱をもたらす。本開示の他の実施形態において、標的分子は腫瘍関連抗原であり、本開示の多重特異性抗原結合分子による腫瘍関連抗原および内部移行エフェクタータンパク質との同時結合は、腫瘍細胞の標的化死滅を引き起こすかまたは促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは腫瘍細胞の死滅を促進する方法であって、腫瘍細胞を多重特異性抗原結合タンパク質と接触させることを含み、
（a）前記多重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍標的（T）と特異的に結合する第1抗原結合領域、および内部移行エフェクタータンパク質（E）と特異的に結合する第2抗原結合領域を含み；
（b）前記腫瘍細胞は、TおよびEの両方を発現し；
（c）前記Tおよび前記Eは各々、前記細胞において低レベルで発現され；
（d）前記Tは、前記多重特異性抗原結合タンパク質の非存在下において、急速なリソソーム輸送を受けず；
（e）前記Eは、前記多重特異性抗原結合タンパク質の非存在下において、急速なリソソーム輸送を受け；ならびに、
（f）前記Tは、前記多重特異性抗原結合タンパク質の存在下において、急速なリソソーム標的化および分解を受ける、
方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞を細胞傷害性薬剤と接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞傷害性薬剤が、前記Tに特異的に結合する抗原結合タンパク質とコンジュゲートした薬物、毒素、または放射性同位元素を含む、抗体薬物コンジュゲート（ADC）である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ADCの抗原結合部分が、前記多重特異性抗原結合領域の前記第1抗原結合領域によって認識されるT上のエピトープとは重複しないT上のエピトープと結合する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記ADCの前記抗原結合タンパク質が、抗体である、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞傷害性薬剤が、放射性同位元素、毒素、または薬物である、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物が、カリチアマイシン、アウリスタチン、またはメイタンシンベースの薬物からなる群から選択される、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記多重特異性抗原結合タンパク質のEに対する結合親和性が、前記多重特異性抗原結合タンパク質のTに対する結合親和性より低い、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的分子が、膜タンパク質または可溶性タンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分子が、アレルゲン、アレルゲン結合タンパク質、サイトカイン、サイトカイン結合タンパク質、サイトカイン受容体、wntタンパク質、wnt結合タンパク質、frizzledタンパク質、増殖因子、増殖因子結合タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、リポタンパク質、リポタンパク質結合タンパク質、リポタンパク質受容体、ホルモン、ホルモン結合タンパク質、ホルモン受容体、膜チャネル、リガンド開口型イオンチャネル、電位開口型イオンチャネル、病原体またはその断片、およびGPI修飾タンパク質からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的分子が、AFP、ALK、BAGEタンパク質、β-カテニン、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、炭酸脱水酵素IX、カスパーゼ-8、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、サイクリン-B1、CYP1 B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGEタンパク質（例えば、GAGE-1、GAGE-2）、GD2、GD3、GloboH、グリピカン-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGEタンパク質（例えば、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、およびMAGE-12）、MART-1、メソテリン、ML-IAP、Mud、Muc16（CA-125）、MUM 1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ES01、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA（FOLH 1）、RAGEタンパク質、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、サバイビン、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ、およびウロプラキン-3からなる群から選択される腫瘍関連標的である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記内部移行エフェクターが、1つ以上のジロイシンモチーフを含む細胞質領域を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記内部移行エフェクターが、配列番号12のアミノ酸配列を含む細胞質領域を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記内部移行エフェクターが、プロラクチン受容体（PRLR）である、請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的分子が、受容体型チロシンタンパク質キナーゼである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分子がHER2である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、抗HER2×PRLR二重特異性抗体である、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記ADCが、抗HER2二価単一特異性抗体または抗PRLR二価単一特異性抗体とコンジュゲートした、メイタンシンベースの薬物を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が、乳がん細胞である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記乳がん細胞が、T47D細胞である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
以下を含む、医薬組成物:
（a）（i）急速に内部移行される細胞表面受容体および（ii）ゆっくりと内部移行される細胞表面受容体と結合する、多重特異性抗原結合タンパク質であって、前記急速に内部移行される細胞表面受容体および前記ゆっくりと内部移行される細胞表面受容体が、同一細胞上に発現する、多重特異性抗原結合タンパク質；ならびに、
（b）細胞傷害性薬剤。
【請求項２３】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記急速に内部移行される細胞表面受容体が、1つ以上のジロイシンモチーフを含む細胞質領域を含む、請求項22または23に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記急速に内部移行される細胞表面受容体が、配列番号12のアミノ酸配列を含む細胞質領域を含む、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記急速に内部移行される細胞表面受容体が、プロラクチン受容体（PRLR）である、請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ゆっくりと内部移行される細胞表面受容体が、受容体型チロシンタンパク質キナーゼである、請求項22〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記受容体型チロシンタンパク質キナーゼがHER2である、請求項27に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、抗HER2×PRLR二重特異性抗体である、請求項28に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記細胞傷害性薬剤が、抗HER2二価単一特異性抗体または抗PRLR二価単一特異性抗体とコンジュゲートした、メイタンシノイドベースの薬物を含む、請求項22〜29のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、治療用タンパク質の技術分野に関し、そして特に、インビトロまたはインビボにおいて1つ以上の標的分子を、不活化する、遮断する、減弱する、除去する、および／またはその濃度を減少させることができる治療用タンパク質の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療的処置はしばしば、細胞上でまたは細胞の近くで作用する1つ以上の標的分子の不活化または遮断を必要とする。例えば、抗体に基づく治療はしばしば、細胞の表面にて発現する特定の抗原、または可溶性リガンドと結合することによって機能し、結果として抗原の通常の生物活性を妨害する。例えば種々のサイトカイン（例えば、IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33など）またはそれら各々の受容体に対する抗体およびその他の結合構築物は、広範囲のヒトの病気および疾患の治療に有用であることが示されている。このタイプの治療薬は典型的に、細胞シグナル伝達を減弱または抑制するため、サイトカインとその受容体との間での相互作用を遮断することによって機能する。しかしながら、特定の状況においては、標的分子と別の成分との物理的相互作用を遮断することを必ずしも伴わない方法で、標的分子の活性を不活化または抑制することが、治療に有益であり得る。標的分子のそのような非遮断減弱が達成され得る1つの方法として、細胞外または細胞表面における標的分子の濃度を減少させることを挙げることができる。所与の標的分子の量または濃度を減少させるための遺伝子および核酸に基づく戦略は、当該技術分野において周知であるものの、そのような戦略はしばしば、治療環境において相当な技術的問題および意図せぬ副作用を伴う。したがって、治療目的のために種々の標的分子の不活化または減弱を促進するための代替的な非遮断戦略が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は、標的分子と内部移行エフェクタータンパク質との物理的結合を促進することまたは導くことによって、標的分子を減弱または不活化するという考えに、少なくとも部分的に基づいている。このタイプの物理的分子間結合を通じて、標的分子を、内部移行エフェクタータンパク質と共に細胞内へ内部移行させ、細胞内部の分解機構によって処理することができるか、またはそうでなければ減弱する、隔離する、もしくは不活化することができる。この機構は、標的分子とその結合パートナーとの相互作用を遮断する必要なく標的分子の活性を不活化または減弱するための、新規かつ進歩的な戦略を代表する。
【０００４】
したがって、本発明は、標的分子（T）および内部移行エフェクタータンパク質（E）と同時に結合することができる多重特異性抗原結合分子を提供する。より具体的には、本発明は、第1抗原結合領域（D1）および第2抗原結合領域（D2）を含む多重特異性抗原結合分子を提供する。D1はTと特異的に結合し、D2はEと特異的に結合する。そして、多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合は、D1単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱する。Tの活性減弱の増強は、Eとのその物理的結合を通じたTの強制的な内部移行／分解によるものであり得る；しかしながら、作用のその他の機構も考えられ、かつ本発明の範囲から逸脱するものではない。
【０００５】
加えて本発明は、標的分子（T）の活性を不活化または減弱するための多重特異性抗原結合分子の使用方法を提供する。特に本発明は、Tおよび内部移行エフェクタータンパク質（E）を多重特異性抗原結合分子と接触させることによって、Tの活性を不活化または減弱する方法を提供する。多重特異性抗原結合分子には第1抗原結合領域（D1）および第2抗原結合領域（D2）が含まれる。D1はTと特異的に結合し、D2はEと特異的に結合する。そして、多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合は、D1単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱する。
【０００６】
本発明の特定の実施形態において、D1および／またはD2には、少なくとも1つの抗体可変領域が含まれる。例えば、多重特異性抗原結合分子は、いくつかの実施形態において、二重特異性抗体であってもよく、D1には、Tと特異的に結合する抗体重鎖および軽鎖可変領域（HCVR／LCVR）対が含まれ、D2には、Eと特異的に結合するHCVR／LCVR対が含まれる。あるいは、D1および／またはD2には、標的分子（T）および／または内部移行エフェクタータンパク質（E）と特異的に相互作用するペプチドまたはポリペプチドが含まれ得る。例えば、標的分子が細胞表面受容体である場合、D1には細胞表面受容体である標的分子と特異的に結合するリガンドの一部が含まれ得る。同様に、内部移行エフェクタータンパク質が細胞表面内部移行受容体である場合、D2には細胞表面内部移行受容体と特異的に結合するリガンドの一部が含まれ得る。特定の実施形態において、D1にはTと特異的に結合する抗体可変領域が含まれ、D2にはEと特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドが含まれる。さらに別の実施形態において、D1にはTと特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドが含まれ、D2にはEと特異的に結合する抗体可変領域が含まれる。しかしながら、あらゆる構成において、最終結果は、TおよびEが、直接的または間接的に、多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合を介して、物理的に連結することができるということである。
【０００７】
他の目的および利点は、以下の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】パネルA〜Dは、本発明における多重特異性抗原結合分子に関する、4つの一般的な例示的作用機構の略図を提供する。図示されている各構成において、D1は、第1抗原結合領域である；D2は、第2抗原結合領域である；Tは、標的分子である；Eは、内部移行エフェクタータンパク質である；およびRは、Eと結合すると内部移行する受容体である。パネルAは、TおよびEの両方が膜結合性である状況を描写している。パネルBは、Tが可溶性であり、Eが膜結合性である状況を描写している。パネルCは、Tが膜結合性であり、そしてEが、EとRとの相互作用を介して細胞と相互作用し、細胞内へ内部移行される可溶性タンパク質である状況を描写している。パネルDは、Tが可溶性であり、そしてEが、EとRとの相互作用を介して細胞と相互作用し、細胞内へ内部移行される可溶性タンパク質である状況を描写している。
【図２】異なる時間（0、15、30、および60分）DKK1-mFc多重特異性抗原結合分子と共にインキュベーションした後の、2つの異なる細胞（細胞-1はFcγR1を単独で発現、細胞-2はKrm2およびFcγR1を発現）に対して行った免疫沈降実験の結果を示す。
【図３】種々の濃度のIL-4での、抗IL-4R／抗CD63多重特異性抗原結合タンパク質（「抗体コンジュゲート」）または対照構築物（「対照1」および「対照2」）の存在下および非存在下におけるStat6-lucレポーターHEK293細胞によって生じた、相対的なIL-4誘導発光を示す。
【図４】CD63発現がレポーター細胞株中においてCD63に対するsiRNAにより顕著に減少した点を除き、図3に示した実験と同じ方法で実施した実験の結果を示す。
【図５】レポーター細胞を多重特異性抗原結合タンパク質（「抗体コンジュゲート」）または対照構築物（「対照1」および「対照2」）と共に、ゼロ時間（パネルAおよびB）、2時間（パネルCおよびD）または一晩（パネルEおよびF）インキュベーションした後、IL-4リガンドを加えた点を除き、図3および図4に示した実験と同じ方法で実施した実験の結果を示す。上段の棒グラフ（パネルA、C、およびE）は、正常レベルのCD63を発現する細胞（「非トランスフェクト」）にて行われた実験の結果を示し、下段の棒グラフ（パネルB、D、およびF）は、CD63発現がレポーター細胞株中においてCD63に対するsiRNAにより有意に減少した細胞にて行われた実験の結果を示す。
【図６】レポーター細胞を抗IL-4R／抗CD63多重特異性抗原結合タンパク質（「抗体コンジュゲート」）または対照構築物（「対照1」および「対照2」）と共に、15分間（パネルA）、30分間（パネルB）、1時間（パネルC）、または2時間（パネルD）インキュベーションした後、IL-4リガンドを加えた点を除き、図3および図4に示した実験と同じ方法で実施した実験の結果を示す。
【図７】Stat6-lucレポーター細胞を、抗IL-4R×抗CD63二重特異性抗体（「二重特異性抗体」）または対照構築物（IL-4Rとのみ結合する、抗IL-4R単一特異性もしくは偽二重特異性抗体）の種々の希釈物の存在下において10pMのIL-4で処理した、実験の結果を示す。
【図８】HEK293細胞を、図示する種々の単一特異性および二重特異性抗体に加え、mycタグおよびpH感受性標識（低pHで蛍光信号を生じる）により標識されたSOST構築物で処理した、実験の結果を示す。結果は1細胞あたりの蛍光斑点（すなわち、標識された小胞）の数によって表す。パネルAは、氷上にて3時間インキュベーションした後の結果を示し、パネルBは、37℃で1時間インキュベーションした後の結果を示し、そしてパネルCは、37℃で3時間インキュベーションした後の結果を示す。
【図９】HEK293細胞を、抗CD63×抗LPS二重特異性抗体、対照抗体、またはLPSのみに加えて、大腸菌（E.coli）（パネルA）またはS.ミネソタ（S.minnesota）（パネルB）由来の蛍光標識されたリポ多糖（LPS）で種々の時間、処理し、続いて非内部移行（すなわち、表面結合）フルオロフォアをクエンチした、実験の結果を示す。したがって、蛍光信号は種々の条件下において内部移行したLPSを反映する。結果は1細胞あたりの蛍光斑点（すなわち、標識された小胞）の数によって表す。
【図１０】Alexa488標識FelD1-mycv-myc-hisの平均蛍光を任意単位で示す。青色のヒストグラムは細胞表面標識を示す。赤色のヒストグラムは内部移行した標識を示す。X軸上の群1は、抗HLA-B×抗FelD1二重特異性抗体で処理した細胞を表す；群2は、抗HLA-B親二価単一特異性抗体で処理した細胞を表す；群3は、IgGアイソタイプ対照による処理を表す。パネルAは、MHC1を発現しないC1RネオBリンパ芽球様細胞による、FelD1-mmh-488の結合および内部移行を示す。パネルBは、MHC1を発現するC1RネオBリンパ芽球様細胞による、FelD1-mmh-488の結合および内部移行を示す。
【図１１】4℃から37℃へと細胞を移行してから0〜60分の時点で細胞表面上に残存するPRLRまたはHER2の量を計測することによって、T47D細胞上のプロラクチン受容体（PRLR）およびHER2の内部移行を示す。時間毎の残存する表面受容体のパーセントを示す。四角形はPRLRを表し、三角形はHER2を表す。
【図１２】T47D細胞中における、プロラクチン受容体（PRLR）およびHER2とリソソームとの共局在を示す。時間毎のリソソームと関連する受容体のパーセントを示す。四角形はPRLRを表し、三角形はHER2を表す。
【図１３】PRLRおよびHER2の切断型ならびにキメラを模式的に示す。
【図１４】種々のPRLRおよびHER2の構築物およびキメラを発現するHEK293細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。各パネルの左側に位置するサブパネルは、内部移行前の4℃の細胞を示す。各パネルの右側に位置するサブパネルは、37℃で1時間後の細胞を表す。パネルAは全長PRLR（PRLR FL）を発現する細胞を表す。パネルBは全長HER2（PRLR FL）を発現する細胞を表す。パネルCは、PRLRectoHER2cytoTM構築物を発現する細胞を示す。パネルDは、HER2ectoPRLRcytoTM構築物を発現する細胞を示す。
【図１５】種々のPRLR構築物および切断型を発現するHEK293細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。パネルAは、4℃で1時間経過後の、PRLRについて染色された全長PRLRを発現する細胞を示す。パネルBは、37℃で1時間経過後の、PRLRについて染色された全長PRLRを発現する細胞を示す。パネルCは、4℃で1時間経過後の、PRLRについて染色された、細胞質領域の42残基を有する切断型PRLRを発現する細胞を示す。パネルDは、37℃で1時間経過後の、PRLRについて染色された、細胞質領域の42残基を有する切断型PRLRを発現する細胞を示す。パネルEは、4℃で1時間経過後の、PRLRについて染色された、細胞質領域の21残基のみを有する切断型PRLRを発現する細胞を示す。パネルFは、37℃で1時間経過後の、PRLRについて染色された、細胞質領域の21残基のみを有する切断型PRLRを発現する細胞を示す。
【図１６】全長PRLRを発現する細胞（パネルA）、細胞質領域の42残基が残っている切断型PRLRを発現する細胞（パネルB）、および細胞質領域の21残基が残っている切断型PRLRを発現する細胞（パネルC）の、細胞可溶化物のウェスタンブロットを示す。上段のサブパネルは抗PRLR抗体で染色されている。下段のサブパネルは、ローディングコントロールのためベータアクチンについて染色されている。
【図１７】PRLR-DM1またはHER2-DM1のいずれかによる処理後の、PRLRまたはHER2またはPRLRectoHER2cytoTM（パネルA）、PRLRまたはHER2ectoPRLRcytoTM（パネルB）の表面発現レベルに対する初期有糸分裂中の細胞のパーセンテージを示す。
【図１８】CHX処理後0時間および4時間での、種々のPRLR構築物、切断型、および置換型を発現する細胞可溶化物全体のウェスタンブロットを示す。上段のパネルはPRLRについて染色されており、下段のパネルはローディングコントロールのためベータアクチンについて染色されている。
【図１９】CHX処理後、0時間、1時間、2時間、および4時間で全長PRLRの発現を誘導された、HEK293細胞の細胞可溶化物全体のウェスタンブロットを示す。上段のパネルはHER2について染色されており、下段のパネルはPRLRについて染色されている。
【図２０】CHX処理後、0時間、2時間、および4時間でPRLRの細胞質切断型の発現を誘導された、HEK293細胞の細胞可溶化物全体のウェスタンブロットを示す。上段のパネルはHER2について染色されており、下段のパネルはPRLRについて染色されている。
【図２１】HER2×PRLR二重特異性抗体で処理されたT47D細胞中におけるHER2とリソソームとの共局在を示す。時間毎のHER2受容体と関連するリソソームのパーセントを示す。四角形はHER2×PRLR二重特異性抗体で処理された細胞を表し、三角形は非結合性対照抗体で処理された細胞を表す。
【図２２】1nM、10nM、または30nMのPRLR-ADC（A）、HER2-ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（B）、HER2-ADC単独（C）、非結合性対照ADC（D）、または未処理（E）で処理された、細胞周期停止T47D／HER2細胞のパーセンテージ（Y軸）を示すヒストグラムである。
【図２３】以下の薬物の量の増加に対してHER2を発現する生存T47D細胞のパーセンテージを示す、ドットブロットである：PRLR-ADC（A；四角形）、HER2-ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（B；ひし形）、HER2-ADC単独（C；上向き三角形）、非結合性対照ADC（D；丸）、または非結合性対照ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（E；下向き三角形）。
【図２４】抗HLAB×抗FelD1二重特異性抗体、リン酸緩衝食塩水、抗FelD1二価単一特異性抗体、および抗HLAB二価単一特異性抗体による処理から種々の時間（15分、6時間、1日、2日、3日、4日、および6日）が経過した後の、抗FelD1抗体により調査されたマウス血清のウェスタンブロットパネルを示す。
【図２５】初期値に対して正規化した、ベースラインレベルを超えてマウス血清から除去されたFelD1-Fcの比率（Y軸）を示すヒストグラムを示す。項1は、抗HLAB×抗FelD1二重特異性抗体による処理を示す；項2は、抗FelD1二価単一特異性抗体による処理を示す；および項3は、抗HLAB二価単一特異性抗体による処理を示す（X軸）。
【図２６】HEK293細胞へのpHrodo（登録商標）-hHJV-mmh取り込みを示すヒストグラムである。Y軸は、pHrodo（登録商標）信号の積分強度（任意単位）を示す。X軸において、抗Myc::PCSK9は、抗体なし（無地のバー）、α-Myc::PCSK9FL（塗り潰されたバー）、α-Myc::PCSK9LC（水平線模様のバー）、およびα-Myc::PCSK9SC（点描柄のバー）によるHJV取り込みの効果を示す；抗HJV::PCSK9は、抗体なし（無地のバー）、α-HJV-N::PCSK9FL（塗り潰されたバー）、α-HJV-N::PCSK9LC（水平線模様のバー）、およびα-HJV-N::PCSK9SC（点描柄のバー）によるHJV取り込みの効果を示す；抗体なし対照はバックグラウンド取り込みである。
【図２７】hHLAB遺伝子導入マウスを、抗HJV-遮断性二価単一特異性抗体（1）；抗Myc::PCSK9全長融合タンパク質（2）；抗HJV-非遮断性二価単一特異性抗体（3）；および抗HJV非ブロッカー::PCSK9全長融合タンパク質（4）で処理した1週間後の、マイクログラム/デシリットル血清単位での血清鉄レベル（Y軸）を示すドットブロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
本発明について記述する前に、本発明が、記述された特定の方法および実験条件に限定されず、そのためこのような方法および条件が変化する場合があることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００１０】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書にて使用される場合、用語「約」とは、特定の言及される数値に関して使用される場合、値が言及された値から1%以下まで変動し得ることを意味する。例えば、本明細書にて使用される場合、「約100」という表現には、99および101、ならびに間の全ての値（例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など）が含まれる。
【００１１】
本明細書に記述したものと類似または同等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。本明細書にて言及される全ての特許、特許出願、および非特許出版物は、参照によりそれらの全体が本発明に組み込まれる。
【００１２】
多重特異性抗原結合分子
本発明者は驚くべきことに、標的分子の活性は、標的分子と内部移行エフェクタータンパク質とを多重特異性抗原結合分子を介して連結することによって、減弱することができることを発見した。
【００１３】
したがって、本発明は、第1抗原結合領域（本明細書において「D1」とも称される）および第2抗原結合領域（本明細書において「D2」とも称される）を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。D1およびD2は、各々異なる分子と結合する。D1は「標的分子」と特異的に結合する。標的分子はまた、本明細書において「T」と称される。D2は「内部移行エフェクタータンパク質」と特異的に結合する。内部移行エフェクタータンパク質はまた、本明細書において「E」と称される。本発明によれば、多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合は、D1単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱する。本明細書にて使用される場合、多重特異性抗原結合分子と関連した「同時結合」という表現は、TおよびEの物理的結合を促進するのに生理的に適切な条件下において、少なくとも一定期間、多重特異性抗原結合分子が標的分子（T）および内部移行エフェクタータンパク質（E）の両方に接触することができることを意味する。多重特異性抗原結合分子とTおよびE成分との結合は、逐次的であってもよい；例えば、多重特異性抗原結合分子は最初にTと結合し、次いでEと結合してもよく、または最初にEと結合し、次いでTと結合してもよい。あらゆる現象において、TおよびEが両方とも多重特異性抗原結合分子によって一定期間（結合の順番に関わらず）結合される限り、多重特異性抗原結合分子は、本開示の目的のため、TおよびEと「同時に結合する」ものと見なされるであろう。理論に縛られることなく、Tの不活化の増強は、Eとのその物理的結合によるTの細胞内における内部移行および分解性リルーティング（degradative rerouting）によって起こると考えられている。本発明による多重特異性抗原結合分子は、したがって、標的分子を直接遮断することなく、または標的分子の機能と拮抗することなく、標的分子の活性および／または細胞外濃度を不活化および／または減少するのに有用である。
【００１４】
本発明によれば、多重特異性抗原結合分子は単一の多機能性ポリペプチドであってもよいか、または互いに共有結合的にまたは非共有結合的に関連する2つ以上のポリペプチドの多量体であってもよい。本開示によって明らかとなる通り、TおよびE分子と同時結合する能力を有するあらゆる抗原結合構築物は、多重特異性抗原結合分子と見なされる。本発明におけるあらゆる多重特異性抗原結合分子、またはその変形例は、当業者に周知である、標準的な分子生物学的手法（例えば、組換えDNAおよびタンパク質発現技術）を用いて構成することができる。
【００１５】
抗原結合領域
本発明の多重特異性抗原結合分子には、少なくとも2つの別々の抗原結合領域（D1およびD2）が含まれる。本明細書にて使用される場合、「抗原結合領域」という表現は、所望の特定の抗原と特異的に結合することができる、あらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場型（scaffold-type）分子、ペプチドディスプレイ分子（peptide display molecule）、またはポリペプチド含有構築物を意味する。用語「特異的に結合する」または同様の用語は、本明細書にて使用される場合、抗原結合領域が、一般的な試験条件下において500pM以下の解離定数（KD）によって特徴付けられる特定の抗原と複合体を形成し、その他の無関係な抗原とは結合しないことを意味する。「無関係な抗原」とは、互いに95%未満のアミノ酸同一性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
【００１６】
本発明と関連して使用することができる抗原結合領域の例示的な分類には、抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディー（peptibody）、特定の抗原と特異的に相互作用する受容体分子、特定の抗原と特異的に結合する受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質、抗原結合足場（antigen-binding scaffold）（例えば、DARPin、HEAT反復タンパク質、ARM反復タンパク質、テトラトリコペプチド反復タンパク質、および天然の反復タンパク質に基づくその他の足場など[例えば、Boersma and Pluckthun, 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857、およびそこに引用される参考文献を参照のこと]）、ならびにそれらのアプタマーまたは部分が包含される。
【００１７】
標的分子または内部移行エフェクタータンパク質が受容体分子である特定の実施形態において、「抗原結合領域」とは、本発明の目的のため、リガンドまたは受容体に特異的であるリガンドの一部を含むか、またはこれらからなることができる。例えば、標的分子（T）がIL-4Rである場合、多重特異性抗原結合分子のD1成分は、IL-4リガンドもしくはIL-4Rと特異的に相互作用することができるIL-4リガンドの一部を含んでいてもよい；または内部移行エフェクタータンパク質（E）がトランスフェリン受容体である場合、多重特異性抗原結合分子のD2成分は、トランスフェリンもしくはトランスフェリン受容体と特異的に相互作用することができるトランスフェリンの一部を含んでいてもよい。
【００１８】
標的分子または内部移行エフェクタータンパク質が特定の受容体によって特異的に認識されるリガンド（例えば、可溶性標的分子）である特定の実施形態において、「抗原結合領域」は、本発明の目的のため、受容体または受容体のリガンド結合部分を含むか、またはこれらからなることができる。例えば、標的分子（T）がIL-6である場合、多重特異性抗原結合分子のD1成分はIL-6受容体のリガンド結合領域を含んでいてもよい；または内部移行エフェクタータンパク質（E）が、間接的に内部移行されるタンパク質（この用語は本明細書の別の場所にて定義される通りである）である場合、多重特異性抗原結合分子のD2成分はEに特異的な受容体のリガンド結合領域を含んでいてもよい。
【００１９】
2つの分子が互いに特異的に結合するかどうかを判定する方法は、当該分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法、および同様の方法が挙げられる。例えば、本発明に関連して使用される場合、抗原結合領域には、表面プラズモン共鳴アッセイにて測定したときに、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約30pM未満、約20pM未満、約10pM未満、約5pM未満、約4pM未満、約2pM未満、約1pM未満、約0.5pM未満、約0.2pM未満、約0.1pM未満、または約0.05pM未満のKDで、特定の抗原（例えば、標的分子[T]もしくは内部移行エフェクタータンパク質[E]）またはその一部と結合するポリペプチドが含まれる。
【００２０】
用語「表面プラズモン共鳴法」とは、本明細書にて使用される場合、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を、例えばBIAcore（登録商標）システム（GEヘルスケア内Biacoreライフサイエンス部門、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて検出することにより、リアルタイムの相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００２１】
用語「KD」とは、本明細書にて使用される場合、特定のタンパク質-タンパク質相互作用（例えば、抗体-抗原相互作用）の平衡解離定数を意味する。本明細書にて開示されるKD値は、表面プラズモン共鳴アッセイによって25℃で測定されたKD値を指す。
【００２２】
抗体および抗体の抗原結合断片
上記の通り、「抗原結合領域」（D1および／またはD2）は、抗体または抗体の抗原結合断片を含むことができるか、またはこれらからなることができる。用語「抗体」とは、本明細書にて使用される場合、特定の抗原（例えば、TまたはE）と特異的に結合するまたは相互作用する少なくとも1つの相補性決定領域（CDR）を含む、あらゆる抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」には、4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続した2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖、ならびにそれらの多量体（例えば、IgM）を含む、イムノグロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてはHCVRまたはVHと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3の3つのドメインを含む。軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてはLCVRまたはVLと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン（CL1）を含む。VHおよびVL領域はさらに、相補性決定領域（CDR）と称される超可変性の領域に細分化し、フレームワーク領域（FR）と称されるより保存的な領域と共に散在することができる。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRによって構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本発明の異なる実施形態において、本発明の抗体のFR（またはその抗原結合部分）は、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよく、または自然にもしくは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸共通配列は2つ以上のCDRの比較分析に基づいて定義されてもよい。
【００２３】
本発明の多重特異性抗原結合分子のD1および／またはD2成分は、完全抗体分子（full antibody molecules）の抗原結合断片を含んでいても、またはこれらからなっていてもよい。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」および同様の用語には、本明細書にて使用される場合、あらゆる天然の、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子改変された、抗原と特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変領域および任意で定常領域をコードするDNAの操作および発現を含むタンパク質消化または組換え遺伝子工学技術といった、あらゆる好適な標準的方法を用いて、完全抗体分子から得てもよい。その様なDNAは周知であるか、および／または、例えば、商業的供給源、DNAライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に利用可能であるか、または合成することができる。DNAは、化学的にあるいは分子生物学的手法を用いて配列および操作して、例えば、1つ以上の可変領域および／もしくは定常領域を好適な構成に配置する、またはコドンを導入するか、システイン残基を作成するか、修飾するか、アミノ酸を加えるかもしくは削除するなどしてもよい。
【００２４】
抗原結合断片の非限定的な例として以下が挙げられる:（i）Fab断片；（ii）F(ab')2断片；（iii）Fd断片；（iv）Fv断片；（v）単鎖Fv（scFv）分子；（vi）dAb断片；および（vii）抗体の高頻度可変領域（例えば、CDR3ペプチドといった単離された相補性決定領域（CDR））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、または拘束性（constrained）FR3-CDR3-FR4ペプチド。ドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失（domain-deleted）抗体、キメラ抗体、CDR移植（CDR-grafted）抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ミニボディ（minibody）、ナノボディ（nanobody）（例えば、一価のナノボディ、二価のナノボディなど）、小モジュラー免疫医薬（small modular immunopharmaceutical）（SMIP）、およびサメ可変IgNAR領域といった、その他の操作された分子もまた本明細書において使用される「抗原結合断片」という表現に包含される。
【００２５】
抗体の抗原結合断片は典型的に、少なくとも1つの可変領域を含み得る。可変領域はあらゆる大きさまたはアミノ酸組成であってもよく、一般的に1つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、または該配列と共にインフレームである少なくとも１つのCDRを含み得る。VLドメインと関連したVHドメインを有する抗原結合断片において、VHドメインおよびVLドメインは、互いに対してあらゆる好適な配置で位置していてもよい。例えば、可変領域は二量体であってもよく、VH-VH、VH-VL、またはVL-VL二量体を含有していてもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のVHまたはVLドメインを含有していてもよい。
【００２６】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも1つの定常領域と共有結合した少なくとも1つの可変領域を含有していてもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内にて見出され得る、可変領域および定常領域の非限定的な例示的構成として、以下が挙げられる:（i）VH-CH1；（ii）VH-CH2；（iii）VH-CH3；（iv）VH-CH1-CH2；（v）VH-CH1-CH2-CH3；（vi）VH-CH2-CH3；（vii）VH-CL；（viii）VL-CH1；（ix）VL-CH2；（x）VL-CH3；（xi）VL-CH1-CH2；（xii）VL-CH1-CH2-CH3；（xiii）VL-CH2-CH3；および（xiv）VL-CL。上にリスト化した例示的構成のいずれかを含む、可変領域および定常領域のあらゆる構成において、可変領域および定常領域は互いに直接結合していてもよく、または完全もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって結合していてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変領域および／または定常領域間の可動性または半可動性連鎖をもたらす、少なくとも2個（例えば、5、10、15、20、40、60個以上）のアミノ酸からなってもよい。らに、抗原結合断片は、上にリスト化したあらゆる可変領域および定常領域構成のホモ二量体またはヘテロ二量体（またはその他の多量体）を、互いにおよび／または1以上の単量体のVHまたはVLドメインと非共有結合性会合で（例えば、ジスルフィド結合によって）、含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の多重特異性抗原結合分子は、ヒト抗体および／もしくは遺伝子組換えヒト抗体、またはその断片を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。用語「ヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。にもかかわらず、ヒト抗体は、例えばCDRおよび特定のCDR3において、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ランダムもしくはインビトロでの部位特異的変異によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されていない。
【００２８】
本発明の多重特異性抗原結合分子は、遺伝子組換えヒト抗体またはその抗原結合断片を含んでいてもよいか、またはこれらからなっていてもよい。用語「遺伝子組換えヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、遺伝子組換え手段によって、調製される、発現する、作成される、または単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞（以下で詳述する）中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組替え体から単離され抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下で詳述する）、ヒトイムノグロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照のこと）、または抗体ヒトイムノグロブリン遺伝子配列から他のDNA配列へスプライスすることを含むあらゆるその他の手段によって調製される、発現する、作成される、もしくは単離される抗体などを含むように意図される。その様な遺伝子組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。特定の実施形態において、しかしながら、その様な遺伝子組換えヒト抗体はインビトロでの突然変異誘発（または、ヒトIg配列にトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞の突然変異誘発）に供されるため、組替え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し、関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。
【００２９】
二重特異性抗体
ある特定の実施形態によれば、本発明の多重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である；例えば、二重特異性抗体は、標的分子（T）と特異的に結合する抗原結合腕、および内部移行エフェクタータンパク質（E）と特異的に結合する抗原結合腕を含む。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知であり、本発明の多重特異性抗原結合分子を構築するのに使用してもよい。本発明に関して使用することのできる例示的な二重特異性抗体のフォーマットとしては、非限定的に、例えば、scFvベースまたはダイアボディ二重特異性のフォーマット（diabody bispecific format）、IgG-scFv融合体、二重可変領域（DVD）-Ig、クアドローマ（Quadroma）、ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、CrossMab、CrossFab、（SEED）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Duobody）、IgG1／IgG2、二重作用Fab（DAF）-IgG、およびMab2二重特異性フォーマット（例えば、Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11、およびそこで引用される参考文献を、前述のフォーマットの考察のために参照されたい）が挙げられる。
【００３０】
多量体形成成分
本発明の多重特異性抗原結合分子はまた、特定の実施形態において、1つ以上の多量体形成成分を含んでいてもよい。多量体形成成分は、抗原結合領域（D1およびD2）間の会合を維持するように機能することができる。本明細書にて使用される場合、「多量体形成成分」とは、同一のもしくは同様の構造または構成の第2多量体形成成分と会合する能力を有する、あらゆる巨大分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成成分は、イムノグロブリンCH3ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成成分の非限定的な例として、イムノグロブリンのFc部分（例えば、以下のアイソタイプ、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、ならびに各アイソタイプ群におけるあらゆるアロタイプから選択されるアイソタイプのFcドメイン）が挙げられる。特定の実施形態において、多量体形成成分は断片であるか、または少なくとも1つのシステイン残基を含有する1〜約200のアミノ酸長のアミノ酸配列である。その他の実施形態において、多量体形成成分はシステイン残基であるか、または短システイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとして、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、またはコイルドコイル・モチーフを含むか、これらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗原結合分子は、2つの多量体形成ドメインM1およびM2を含む。D1はM1に付着し、D2はM2に付着している。M1およびM2の会合は、単一の多重特異性抗原結合分子におけるD1とD2との互いの物理的結合を促進する。特定の実施形態において、M1およびM2は互いに同一である。例えば、M1は特定のアミノ酸配列を有するFcドメインであってもよく、M2はM1と同一のアミノ酸配列を有するFcドメインである。あるいは、M1およびM2は1つ以上のアミノ酸位置において互いに異なっていてもよい。例えば、M1は第1イムノグロブリン（Ig）CH3ドメインを含んでいてもよく、M2は第2Ig CH3ドメインを含んでいてもよい。第1および第2のIg CH3ドメインは少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なっており、少なくとも1つのアミノ酸の差異は、同一のM1およびM2配列を有する参照構築物と比べて、標的指向化する構築物とタンパク質Aの結合を減少させる。一実施形態において、M1のIg CH3ドメインはタンパク質Aを結合し、M2のIg CH3ドメインは、H95R修飾（IMGTエクソンナンバリングによる；H435RはEUナンバリングによる）などのタンパク質A結合を減少させるかまたは破壊する突然変異を含有する。M2のCH3はさらに、Y96F修飾（IMGTによる；Y436FはEUによる）を含んでいてもよい。M2のCH3にて見出され得るさらなる修飾として、以下を挙げることができる：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、およびV82I（IMGTによる；IgG1 Fcドメインの場合においては、D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、およびV422IはEUによる）；IgG2 Fcドメインの場合においては、N44S、K52N、およびV82I（IMGT；N384S、K392N、およびV422IはEUによる）；ならびに、IgG4 Fcドメインの場合においては、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、およびV82I（IMGTによる；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、およびV422IはEUによる）。
【００３２】
内部移行エフェクタータンパク質（E）
本発明に関して、多重特異性抗原結合分子のD2成分は内部移行エフェクタータンパク質（「E」）と特異的に結合する。内部移行エフェクタータンパク質は、細胞内へ内部移行することができるタンパク質であるか、そうでなければ逆行性膜輸送に関与もしくは寄与するタンパク質である。いくつかの例において、内部移行エフェクタータンパク質は経細胞輸送を受けるタンパク質である；すなわち、タンパク質は細胞の一方の側で内部移行され、細胞の他方の側へ（例えば、頂端から基底へ）輸送される。多くの実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質は細胞表面発現タンパク質または可溶性細胞外タンパク質である。しかしながら、本発明はまた、内部移行エフェクタータンパク質がエンドソーム、小胞体、Golgi、リソソームなどの細胞内区画内で発現する実施形態についても考慮する。例えば、逆行性膜輸送（例えば、初期／リサイクリングエンドソームからトランス-Golgiネットワークへの経路）に関与するタンパク質は、本発明における種々の実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質として作用してもよい。あらゆる現象において、D2と内部移行エフェクタータンパク質の結合は、多重特異性抗原結合分子全体およびそれらと関連するあらゆる分子（例えば、D1によって結合された標的分子）もまた、細胞内へ内部移行させる。以下で説明する通り、内部移行エフェクタータンパク質は、細胞内へ直接内部移行されるタンパク質、および細胞内へ間接的に内部移行されるタンパク質を含む。
【００３３】
細胞内へ直接内部移行される内部移行エフェクタータンパク質は、細胞性内部移行を受ける、少なくとも1つの細胞外ドメインを有する膜結合性分子（例えば、膜貫通タンパク質、GPIアンカータンパク質など）を含み、好ましくは細胞内分解経路および／または再循環経路を介してプロセシングされる。細胞内へ直接内部移行される内部移行エフェクタータンパク質の特定の非限定例として、例えば、CD63、MHC-I（例えば、HLA-B27）、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL-受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質-2（APLP2）、アペリン（apelin）受容体（APLNR）、MAL（VIP17として知られる、Myelin And Lymphocyteタンパク質）、IGF2R、液胞型H+ ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体（例えば、SCARA1-5、SCARB1-3、CD36）などが挙げられる。
【００３４】
特定の実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質はプロラクチン受容体（PRLR）である。PRLRは、特定の治療への応用の標的であるだけでなく、その高速の内部移行および代謝回転に基づいて有効な内部移行エフェクタータンパク質でもあることが発見された。内部移行エフェクタータンパク質としてのPRLRの可能性は、例えば、国際出願第2015／026907号に記載されており、とりわけ抗PRLR抗体がインビトロにてPRLR発現細胞により効果的に内部移行されることが示されている。
【００３５】
Eが直接内部移行されるエフェクタータンパク質である実施形態において、多重特異性抗原結合分子のD2成分は、例えば、抗体もしくはEと特異的に結合する抗体の抗原結合断片、またはリガンドもしくはエフェクタータンパク質と特異的に相互作用するリガンドの一部であり得る。例えば、EがKremen-1またはKremen-2である場合、D2成分はKremenリガンド（例えば、DKK1）もしくはそのKremen結合部分を含んでいてもよいか、またはこれらからなっていてもよい。別の例として、EがASGR1などの受容体分子である場合、D2成分は、受容体に特異的なリガンド（例えば、アシアロオロソムコイド[ASOR]もしくはベータGalNAc）またはその受容体結合部分を含んでいてもよいか、またはこれからなっていてもよい。
【００３６】
細胞内へ間接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質は、それら自身は内部移行しないが、細胞内へ直接内部移行される第2タンパク質またはポリペプチドと結合した後または会合した後に細胞内へ内部移行される、タンパク質およびポリペプチドを含む。細胞内へ間接的に内部移行されるタンパク質は、例えば、内部移行細胞表面発現受容体分子と結合することができる可溶性リガンドを含む。内部移行細胞表面発現受容体分子とのその相互作用を介して細胞内へ（間接的に）内部移行される可溶性リガンドの非限定的な例としては、トランスフェリンが挙げられる。Eがトランスフェリン（または別の間接的に内部移行されるタンパク質）である実施形態において、D2とEとの結合、およびEとトランスフェリン受容体（または別の内部移行細胞表面発現受容体分子）との相互作用は、多重特異性抗原結合分子全体およびそれらと関連するあらゆる分子（例えば、D1によって結合される標的分子）を、Eおよびその結合パートナーの内部移行と同時に細胞内へ内部移行させる。
【００３７】
Eが、可溶性リガンドなどの間接的に内部移行されるエフェクタータンパク質である実施形態において、多重特異性抗原結合分子のD2成分は、例えば、抗体もしくはEと特異的に結合する抗体の抗原結合断片、または受容体もしくはエフェクタータンパク質と特異的に相互作用する受容体の一部であり得る。例えば、Eがサイトカインである場合、D2成分は対応するサイトカイン受容体またはそのリガンド結合部分を含んでいてもよいか、またはこれからなっていてもよい。
【００３８】
標的分子（T）
本発明に関して、多重特異性抗原結合分子のD1成分は標的分子（「T」）と特異的に結合する。標的分子は、活性または細胞外濃度が減弱される、減少される、または除去されることが望ましい、あらゆるタンパク質、ポリペプチド、またはその他の巨大分子である。多くの例において、D1が結合する標的分子は、タンパク質またはポリペプチドである[すなわち、「標的タンパク質」]；しかしながら、本発明はまた、標的分子（「T」）が、炭水化物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リポ多糖、またはD1が結合するその他の非タンパク質ポリマーもしくは分子である実施形態も含む。本発明によれば、Tは、細胞表面発現標的タンパク質または可溶性標的タンパク質であり得る。多重特異性抗原結合分子による標的との結合は、細胞外または細胞表面の状況において発生し得る。しかしながら、特定の実施形態において、多重特異性抗原結合分子は、細胞内部で、例えば小胞体、Golgi、エンドソーム、リソソームなどの細胞内成分内で、標的分子と結合する。
【００３９】
細胞表面発現標的分子の例としては、細胞膜に付着する、または結合する細胞外部分を伴う、細胞表面発現受容体、膜結合リガンド、イオンチャネル、およびあらゆる他の単量体または多量体ポリペプチド成分が挙げられる。非限定的に、本発明の多重特異性抗原結合分子によって標的指向化され得る例示的な細胞表面発現標的分子には、例えば、サイトカイン受容体（例えば、IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33などに対する受容体）、ならびにPRLRなどのその他の1型膜貫通受容体、GCGRなどのG-タンパク質共役受容体、Nav1.7、ASIC1、またはASIC2などのイオンチャネル、MHC-I（例えば、HLA-B*27）などの非受容体表面タンパク質、などを含む細胞表面標的が含まれる。
【００４０】
Tが、細胞表面発現標的タンパク質である実施形態において、多重特異性抗原結合分子のD1成分は、例えば、抗体もしくはTと特異的に結合する抗体の抗原結合断片、またはリガンドもしくは細胞表面発現標的タンパク質と特異的に相互作用するリガンドの一部であり得る。例えば、TがIL-4Rである場合、D1成分はIL-4またはその受容体結合部分を含んでいてもよいか、またはこれらからなっていてもよい。
【００４１】
可溶性標的分子の例として、サイトカイン、増殖因子、ならびにその他のリガンドおよびシグナル伝達タンパク質が挙げられる。本発明の多重特異性抗原結合分子によって標的指向化され得る非限定的な例示的可溶性標的タンパク質には、例えば、IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33、SOST、DKK1などが含まれる。可溶性標的分子にはまた、例えば、アレルゲンなどの非ヒト標的分子（例えば、Fel D1、Betv1、CryJ1）、病原体（例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、S.アウレウス（S. aureus）など）、および病原性分子（例えば、リポ多糖[LPS]、リポテイコ酸[LTA]、タンパク質A、毒素など）もまた含まれる。Tが可溶性標的分子である実施形態において、多重特異性抗原結合分子のD1成分は、例えば、抗体もしくはTと特異的に結合する抗体の抗原結合断片、または受容体もしくは可溶性標的分子と特異的に相互作用する受容体の一部であってもよい。例えば、TがIL-4である場合、D1成分はIL-4Rまたはそのリガンド結合部分を含んでいてもよいか、またはこれらからなっていてもよい。
【００４２】
標的分子には、本明細書の別の箇所にて解説する、腫瘍関連抗原もまた含まれる。
【００４３】
pH依存的結合
本発明は、第1抗原結合領域（D1）および第2抗原結合領域（D2）を含む多重特異性抗原結合分子を提供する。抗原結合領域の一方または両方（D1および／またはD2）は、その抗原（TまたはE）とpH依存的な手段で結合する。例えば、抗原結合領域（D1および／またはD2）は、中性pHと比べ酸性pHにおいて、その抗原との結合減少を示し得る。あるいは、抗原結合領域（D1および／またはD2）は、中性pHと比べ酸性pHにおいて、その抗原との結合増大を示し得る。pH依存的結合特性を有する抗原結合領域は、例えば、中性pHと比べて酸性のpHにおいて、特定の抗原との結合減少（または結合増大）に対して抗体の集合をスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、アミノ酸レベルでの抗原結合領域の修飾はpH依存的特性を有する抗原結合領域を産生し得る。例えば、抗原結合領域（例えば、CDR内）の1つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基によって置換することによって、中性pHと比べ酸性pHにおいて減少した抗原結合を有する抗原結合領域を得ることができる。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明には、中性pHにおいてそれら各々の抗原と結合するD1および／またはD2成分のKDよりも、少なくとも約3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍、またはさらに何倍も大きいKD値で、酸性pHにおいてそれら各々の抗原（TまたはE）と結合するD1および／またはD2成分を含む、多重特異性抗原結合分子が含まれる。pH依存性結合はまた、中性pHと比較して酸性のpHにおいて、その抗原に対する抗原結合領域の半減期によって表すことができる。例えば、本発明には、中性pHにおいてそれら各々の抗原と結合するD1および／またはD2成分の半減期よりも、少なくとも約5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60倍、または何倍も短い半減期で、酸性pHにおいてそれら各々の抗原（TまたはE）と結合するD1および／またはD2成分を含む、多重特異性抗原結合分子が含まれる。
【００４５】
中性pHと比べ酸性pHにおいて減少した抗原結合を伴うD1および／またはD2成分を含む本発明の多重特異性抗原結合分子は、動物対象に投与される場合、ある特定の実施形態において、pH依存的結合特性を示さない比較可能な分子と比べて、循環からのより低速なクリアランスを示し得る。本発明の本態様によれば、中性pHと比べ酸性pHにおいて減少した抗原結合を有しない比較可能な抗原結合分子と比べて循環からの少なくとも2倍低速なクリアランスを示す、中性pHと比べ酸性pHにおいてTおよび／またはEに対する減少した抗原結合を有する多重特異性抗原結合分子が提供される。クリアランス速度は抗体の半減期によって表すことができ、低速なクリアランスは長い半減期と相関する。
【００４６】
本明細書にて使用される場合、「酸性pH」という表現は、6.0以下のpHを意味する。「酸性pH」という表現には、約6.0、5.95、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0以下のpH値が含まれる。本明細書で使用される場合、「中性pH」という表現は、約7.0〜約7.4のpHを意味する。「中性pH」という表現には、約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、および7.4のpH値が含まれる。
【００４７】
標的分子活性の減弱
本明細書の別の場所で述べ、以下の本明細書の実施例において実証するように、本発明者は、多重特異性抗原結合分子による標的分子（T）および内部移行エフェクタータンパク質（E）との同時結合が、多重特異性抗原結合分子の第1抗原結合領域（D1）成分単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱することを発見した。本明細書にて使用される場合、「D1単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱する」という表現は、Eを発現する細胞を用いて測定することができるアッセイにおいて多重特異性抗原結合分子の存在下において測定したT活性の水準が、D1を単独で含有する対照構築物（すなわち、第2抗原結合領域（D2）と物理的に結合していない）の存在下において測定したT活性の水準よりも、少なくとも10%低いことを意味する。例えば、D1を単独で含有する対照構築物の存在下において測定したT活性の水準よりも、多重特異性抗原結合分子の存在下において測定したT活性の水準が、約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%低くてもよい。
【００４８】
多重特異性抗原結合分子がD1ドメイン単独による標的分子の結合よりも大幅に標的分子の活性を減弱するかどうかを判定する非限定的な例証的アッセイフォーマットが、本明細書の以下の実施例1および2で示される。実施例1において、例えば、「T」はインターロイキン-4受容体（IL-4R）であり、「E」はCD63である。実施例1の多重特異性抗原結合分子は、ストレプトアビジン／ビオチンリンカーを介して抗CD63 mAbと連結した抗IL-4R mAbを含む2抗体コンジュゲートである。したがって、この例示的構築物における「D1」は抗IL-4R抗体の抗原結合領域（HCVR／LCVR対）であり、「D2」は抗CD63抗体の抗原結合領域（HCVR／LCVR対）である。実施例1および2の実験では、IL-4R活性が外来性IL-4リガンドの添加によって刺激された場合にレポーター信号が生成される、細胞ベースのアッセイフォーマットを使用した。多重特異性抗原結合分子の存在下において検出されたIL-4誘導レポーター活性の量は、無関係な対照イムノグロブリンと接続された抗IL-4R抗体（対照1）、または抗CD63抗体と組み合わせるが物理的には接続されない抗IL-4R抗体（対照2）のいずれかを含有する、対照構築物の存在下において検出されたIL-4誘導レポーター活性の量と比較された。したがって対照構築物は、TがD1単独（すなわち、D1は多重特異性抗原結合分子それ自体の一部ではない）によって結合される状況を作成する。多重特異性抗原結合分子の存在下において観測された標的分子活性の程度（レポーター信号によって表される）が、D2成分と物理的に連結しないD1成分を含む対照構築物（例えば、対照1または対照2）の存在下において観測された標的分子活性の量より少なくとも10%少ない場合、本開示の目的のために、「多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合が、D1単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱する」と結論付けられる。
【００４９】
D1単独によるTの結合は、いくつかの実施形態において、Tの活性の部分的な減弱をもたらし得る（レポーター細胞の抗IL-4R抗体単独[すなわち、対照1および2]による処理が未処理細胞と比較してIL-4シグナル伝達の小規模な減弱を引き起こす、実施例1の場合について）。その他の実施形態において、D1単独によるTの結合は検出可能なTの活性の減弱をもたらし得ない；すなわち、Tの生物活性はD1単独によるTの結合によって影響され得ない。あらゆる現象において、しかしながら、本発明の多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合は、Tの活性を、D1単独によるTの結合よりも大幅に減弱し得る。
【００５０】
本明細書に例証される代替的なアッセイフォーマットおよびアッセイフォーマットの変形例は、当業者に明らかであり、あらゆる所与の多重特異性抗原結合分子が指向し得る特異的な標的分子およびエフェクタータンパク質の性質を考慮している。あらゆるその様なフォーマットを本発明において使用して、多重特異性抗原結合分子によるTおよびEとの同時結合がD1単独によるTの結合よりも大幅にTの活性を減弱するかどうかを判定することができる。
【００５１】
腫瘍標的指向化
本発明の別の態様において、多重特異性抗原結合分子は腫瘍細胞を標的指向化するのに有用である。本発明のこの様態によれば、D1が結合する標的分子「T」は腫瘍関連抗原である。ある特定の例において、腫瘍関連抗原は、通常内部移行されない抗原である。D2が結合する内部移行エフェクタータンパク質「E」は、腫瘍特異性であってもよいか、または個人の腫瘍および非腫瘍細胞の両方において発現してもよい。本明細書の別の場所において言及した内部移行エフェクタータンパク質はいずれも、本発明の抗腫瘍適用を目標としてもよい。
【００５２】
本明細書にて使用される場合、用語「腫瘍関連抗原」には、腫瘍細胞の表面にて優先的に発現するタンパク質またはポリペプチドが含まれる。「優先的に発現する」という用語は、本文脈において使用する場合、抗原が、非腫瘍細胞上における抗原の発現レベルよりも少なくとも10%（例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、150%、200%、400%、またはそれ以上）高いレベルで、腫瘍細胞上において発現されることを意味する。特定の実施形態において、標的分子とは、腎腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、乳腺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、膠芽腫細胞、頭頸部腫瘍細胞、およびメラノーマ細胞からなる群から選択される腫瘍細胞の表面上において優先的に発現する抗原である。特定の腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、例えば、AFP、ALK、BAGEタンパク質、β-カテニン、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、炭酸脱水酵素IX、カスパーゼ-8、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、サイクリン-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2／Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGEタンパク質（例えば、GAGE-1、GAGE-2）、GD2、GD3、GloboH、グリピカン-3、GM3、gp100、Her2、HLA／B-raf、HLA／k-ras、HLA／MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGEタンパク質（例えば、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、およびMAGE-12）、MART-1、メゾテリン、ML-IAP、Muc1、Muc16（CA-125）、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA（FOLH1）、RAGEタンパク質、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、サバイビン、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ、およびウロプラキン-3が挙げられる。
【００５３】
多重特異性抗原結合分子は、本発明の本態様によれば、薬物、毒素、放射性同位元素、または細胞の生存率に対して有害なその他の物質とコンジュゲートしていてもよい。あるいは、薬物または毒素は、細胞を直接殺しはしないが、細胞に他の外部物質による死滅に対するより高い感受性を与える物質であってもよい。腫瘍標的指向化に関するさらに他の実施形態において、本発明の多重特異性抗原結合分子は、それ自体は薬物、毒素、または放射性同位元素とはコンジュゲートしていないが、代わりに、標的（T）に特異的な第2抗原結合分子（本明細書では「随伴（accomplice）分子」と称する）と組み合わせて投与され、随伴分子は、薬物、毒素、または放射性同位元素とコンジュゲートしている。その様な実施形態において、多重特異性抗原結合分子は、随伴分子によって認識されるエピトープとは別個であるおよび／または重複していない（すなわち、標的に対する多重特異性抗原結合分子および随伴分子の同時結合を可能にする）、標的分子（T）上のエピトープと好ましくは結合し得る。
【００５４】
関連する実施形態において、本発明には、以下の項目を含む抗腫瘍配合および治療方法もまた含まれる：（a）腫瘍関連抗原と特異的に結合する、毒素または薬物コンジュゲート抗原結合分子；ならびに（b）（i）内部移行エフェクタータンパク質と特異的に結合する（例えば、低親和性で）第1結合ドメインおよび（ii）毒素または薬物コンジュゲート抗原結合分子と特異的に結合する第2結合ドメインを含む、多重特異性抗原結合分子。本実施形態において、多重特異性抗原結合分子は毒素または薬物コンジュゲート抗原結合分子を内部移行エフェクタータンパク質と連結させるように機能し、それによって腫瘍関連抗原を内部移行エフェクタータンパク質と物理的に連結するように機能する。毒素標識抗腫瘍関連抗原抗体の、その内部移行エフェクタータンパク質との結合を介した内部移行は、標的にした腫瘍細胞の死滅を結果的にもたらす。
【００５５】
本発明の腫瘍標的指向化の態様のある特定の実施形態によれば、多重特異性抗原結合分子（または随伴抗体）は、カリチアマイシン、エスペラミシン、メトトキサレート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ARA-C、ビンデシン、マイトマイシンC、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、5-フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、オラタキセル、ドセタキセル、ドラスタチン10、アウリスタチンE、アウリスタチンPHE、およびメイタンシンベース化合物（例えば、DM1、DM4など）からなる群から選択される、1つ以上の細胞傷害性薬物とコンジュゲートしていてもよい。多重特異性抗原結合分子（または随伴抗体）はさらに、または代替的に、ジフテリア毒素、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素A、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質などの毒素とコンジュゲートしていてもよい。多重特異性抗原結合分子（または随伴抗体）はさらに、または代替的に、225Ac、211At、212Bi、213Bi、186Rh、188Rh、177Lu、90Y、131I、67Cu、125I、123I、77Br、153Sm、166Ho、64Cu、121Pb、224Raおよび223Raからなる群から選択される1つ以上の放射性同位元素とコンジュゲートしていてもよい。したがって、本発明の本態様には、抗体薬物コンジュゲート（ADC）または抗体放射性同位元素コンジュゲート（ARC）である多重特異性抗原結合分子が含まれる。
【００５６】
腫瘍死滅適用に関して、D2成分は、ある特定の状況下において、内部移行エフェクタータンパク質「E」と低親和性で結合してもよい。したがって、多重特異性抗原結合分子は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を優先的に標的とし得る。本明細書にて使用される場合、「低親和性」結合とは、内部移行エフェクタータンパク質（E）に対するD2成分の結合親和性が、標的分子（T）に対するD1成分の結合親和性より、少なくとも10%弱い（例えば、15%弱い、25%弱い、50%弱い、75%弱い、90%弱いなど）ことを意味する。特定の実施形態において、「低親和性」結合とは、約25℃での表面プラズモン共鳴アッセイによる測定における約10nM〜約1μM以上のKD値で、内部移行エフェクタータンパク質（E）と相互作用するD2成分を意味する。
【００５７】
多重特異性抗原結合分子の内部移行エフェクタータンパク質および腫瘍関連抗原との同時結合は、多重特異性抗原結合分子の腫瘍細胞内への優先的な内部移行をもたらし得る。例えば、多重特異性抗原結合分子が、薬物、毒素、または放射性同位元素とコンジュゲートしている場合（または多重特異性抗原結合分子が、薬物、毒素、もしくは放射性同位元素とコンジュゲートさせた随伴抗体と組み合わせて投与されている場合）、多重特異性抗原結合分子との結合を介した腫瘍細胞内への腫瘍関連抗原の標的化内部移行は、極度に特異的な腫瘍細胞死滅をもたらし得る。
【００５８】
医薬組成物および投与方法
本発明には、多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移送、送達、耐用能、および同様のものを提供するその他の薬剤と共に、製剤化することができる。
【００５９】
本発明にはまた、標的分子（T）の活性を不活化または減弱するための方法も含まれている。本発明の方法には、標的分子を本明細書に記載の通りの多重特異性抗原結合分子と接触させることが含まれる。特定の実施形態において、本発明の本態様に基づく方法には、多重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を、標的分子を、不活化する、減弱する、またはそうでなければその細胞外濃度を減少することが望ましいおよび／または有益である患者へ投与することが含まれる。
【００６０】
種々の送達系が当該技術分野において周知であり、本発明の医薬組成物を患者へ投与するのに使用することができる。本発明に基づき使用することができる投与の方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の医薬組成物は、例えば、点滴またはボーラス投与によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸、および腸管粘膜など）を通じた吸収によって、あらゆる好都合な経路により投与してもよく、その他の生物活性物質と一緒に投与してもよい。投与は全身性または局所性であってもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジを用いて、皮下または静脈内に送達することができる。加えて、皮下投与に関して、ペン型送達デバイス（pen delivery device）を患者へ本発明の医薬組成物を送達するのに使用することができる。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作成し使用するかを当業者へ完全に開示するために提供されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定することを意図していない。使用した数字（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保するために努力がなされているが、一部の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は大気圧でまたは大気圧付近での℃（摂氏）である。
【００６２】
実施例１ 内部移行エフェクタータンパク質との連結を介した細胞表面受容体の分解を誘導するための多重特異性抗原結合分子の使用
最初の実証実験では、（a）内部移行エフェクター分子および（b）細胞表面受容体標的分子を結合できる、多重特異性抗原結合分子を作成した。本実施例において、内部移行エフェクタータンパク質はKremen-2（Krm2）であり、細胞表面受容体標的分子はFc受容体（FcγR1[Fc-gamma-R1]）である。
【００６３】
Kremen分子（Krm1およびKrm2）は、WNT経路シグナル伝達分子LRP5およびLRP6の内部移行および分解を誘導することによって、WNTシグナル伝達を仲介する細胞表面タンパク質として知られている。LRP5／6の内部移行は可溶性相互作用タンパク質DKK1を介して達成される。特に、DKK1は細胞表面上においてKremenをLRP5／6と連結し、この連結によって、Kremenの内部移行はLRP5およびLRP6の内部移行および分解を操作する（Li et al., PLoS One 5(6):e11014を参照のこと）。
【００６４】
本発明者は、DKK1のKremen結合特性およびKremenの内部移行特性を活用してFcγR1の内部移行を誘導しようと努力してきた。FcγR1のKremen媒介内部移行／分解を促進するため、マウスFcに融合したDKK1（DKK1-mFc、配列番号1のアミノ酸配列を有する）からなる、多重特異性抗原結合分子が構成された。本明細書の別の場所にて説明した通り、多重特異性抗原結合分子は、標的分子と特異的に結合する第1抗原結合領域（D1）および内部移行エフェクタータンパク質と特異的に結合する第2抗原結合領域（D2）を含む分子として定義される。本実証実験において、「第1抗原結合領域」とは標的分子FcγR1と特異的に結合するmFc成分であり、「第2抗原結合領域」とは内部移行エフェクタータンパク質Kremenと特異的に結合するDKK1成分である。
【００６５】
実験はまず、DKK1-mFcがKremen依存的様式で細胞内にエンドサイトーシスすることができるかどうかを判定するために実施された。本実験について、2つの細胞株を使用した：細胞-1（FcγR1を発現するがKremen-2は発現しないように操作されたHEK293細胞株）および細胞-2（FcγR1およびKremen-2の両方を発現するように操作されたHEK293細胞株）。DKK1-mFc培養上清の1:10希釈物を各々の細胞株に加え、37℃で90分インキュベートさせた。90分間のインキュベーションの後、細胞をAlexa-488-標識抗マウスIgG抗体で染色して、DKK1-mFc分子を検出した。蛍光顕微鏡を使用して、DKK1-mFcが細胞-1（Kremen欠如）内部には実質的に局在しないことを確認した；しかしながら、相当な量のDKK1-mFcが、Kremen-2を発現する細胞-2中において検出された。したがってこれらの結果は、多重特異性抗原結合分子DKK1-mFcをKremen依存的様式で細胞内に内部移行させることができることを示す。
【００６６】
次に、時間経過実験を実施して、DKK1-mFcがKremen依存的様式でFcγR1分解を誘導できるかどうかを判定した。実験プロトコルの簡単な説明は以下の通りである：細胞-1（FcγR1のみを発現）および細胞-2（Kremen-2およびFcγR1を発現）を2mg／mlのNHS-Sulfo-ビオチンで15分間氷上において処理して、全ての細胞表面発現タンパク質を標識した。その後、細胞を洗浄し、400μlの培地中に再懸濁し、4つの100μlアリコットに分割した。これらのアリコットはDKK1-mFcにより37℃で種々の期間（0分、15分、30分、および60分）処理した。DKK1-mFcインキュベーションに続いて、細胞をペレット状にし、プロテアーゼインヒビターで処理した。異なるインキュベーション時点由来の細胞の可溶化液をFcγR1免疫沈降法に供した。FcγR1免疫沈降法について、マウス抗FcγR1抗体を細胞可溶化物へ加え、4℃で1時間インキュベートした。その後、タンパク質-Gビーズを加え、混合物を4℃で1時間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、タンパク質を溶出し、SDS-PAGEに供した。タンパク質を膜に移し、HRP標識ストレプトアビジンでプローブして、相対量の表面露出FcγR1タンパク質が各試料中に残存することを明らかにした。結果を図2に示す。
【００６７】
図2に図示するように、細胞-1試料（FcγR1を発現するがKremen-2は発現しない）中における表面露出FcγR1タンパク質の量は、細胞がDKK1-mFcに曝露していた時間の長さに関わらず、比較的一定のままであった。対照的に、細胞-2試料（Kremen-2およびFcγR1の両方を発現）中における表面露出FcγR1タンパク質の量は、DKK1-mFcによるインキュベーション時間の増加に伴い実質的に減少した。したがって、本実験はDKK1-mFcがKremen-2依存的様式で細胞表面発現FcγR1の分解を誘導することを実証している。
【００６８】
総合的に考えると、前述の結果は、細胞表面標的分子（FcγR1）および内部移行エフェクタータンパク質（Kremen-2）と同時結合する多重特異性抗原結合分子は、エフェクタータンパク質依存的様式で標的分子の分解を誘導することができることを示している。
【００６９】
実施例2 IL-4R活性をIL-4RおよびCD63に対して特異性を有する多重特異性抗原結合分子を使用して減弱させる
実証実験のさらなるセットにおいて、細胞表面発現標的分子（すなわち、IL-4R）および細胞表面発現内部移行エフェクタータンパク質（すなわち、CD63）と同時結合するこのとのできる、多重特異性抗原結合分子を構築した。これらの実験の目的は、IL-4Rを、分解のためにリソソーム中に内部移行され標的指向化されるエフェクター分子（ここでは、CD63）と物理的に連結することによって、細胞におけるIL-4R活性をより大幅に減弱することができるかどうかを判定することである。換言すれば、本実施例は、細胞中のIL-4Rの内部移行および分解性リルーティングを引き起こすために、CD63の通常の内部移行および分解を使用することができるのかどうかを試験するために設計された。
【００７０】
まず、IL-4RおよびCD63の両方と結合することができる多重特異性抗原結合分子を構築した。特に、ストレプトアビジンコンジュゲート抗IL-4R抗体およびビオチン化抗CD63抗体を1:1の比率で組合せて、抗IL-4R:抗CD63コンジュゲート（すなわち、IL-4RおよびCD63の両方と特異的に結合する多重特異性抗原結合分子）を作成した。本実施例にて使用した抗IL-4R抗体は、IL-4R細胞外ドメインに対して産生された完全ヒトmAbである。（抗IL-4R抗体は、配列番号3を有する重鎖可変領域および配列番号4を有する軽鎖可変領域を含む）。本実施例において使用した抗CD63抗体は、Biolegend（カリフォルニア州サンディエゴ）、カタログ番号312002番より入手したマウス抗ヒトCD63 mAbクローンMEM-259である。
【００７１】
2つの対照構築物もまた作成した：対照1＝1:1の比率でビオチン化対照マウスIgG1カッパ抗体と組み合わせたストレプトアビジンコンジュゲート抗IL-4R抗体；および対照2＝1:1の比率で非ビオチン化抗CD63抗体と組み合わせたストレプトアビジンコンジュゲート抗IL-4R抗体。本実施例について実験用および対照構築物として使用した抗IL-4R抗体は、特異的にIL-4Rと結合し、IL-4媒介シグナル伝達を部分的にのみ遮断するとして知られる抗体である。
【００７２】
本実施例で使用した実験用細胞株は、STAT6ルシフェラーゼレポーター構築物およびさらなるSTAT6を含むHEK293細胞株（「HEK293／STAT6-luc細胞」）である。本実験において使用した細胞は、IL-4RおよびCD63の両方をその表面に発現する。あらゆるインヒビターの非存在下においてIL-4で処理した場合、この細胞株は、IL-4媒介シグナル伝達の範囲を反映する用量依存的な検出可能化学発光シグナルを生じる。
【００７３】
最初の実験において、実験用の抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子、または対照構築物をHEK293／STAT6-luc細胞に加えたため、培地における抗IL-4R抗体の最終濃度は12.5nMであった。実験用および対照構築物（図3）の存在下および非存在下においてIL-4の濃度を増加させて、レポーター信号を測定した。図3で分かるように、抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子（「抗体コンジュゲート」）は、いずれの対照構築物よりも顕著に大幅にIL-4媒介シグナル伝達を阻害した。
【００７４】
図3にて観測された効果がCD63に依存していたことを確認するために、CD63に対するsiRNAを用いるレポーター細胞株においてCD63発現が顕著に減少したことを除いて、上記のものと同様の実験を実施した。CD63発現の顕著な減少に伴い、抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子の増強した阻害活性は観測されなくなった（図4）。この結果は、IL-4媒介シグナル伝達を減弱する抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子の能力が、多重特異性分子のIL-4RおよびCD63との同時結合、ならびに結果として抗体-IL-4R-CD63複合体全体の内部移行および分解によるものであることを示唆している。
【００７５】
次に、抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子または対照構築物をHEK293／STAT6-lucレポーター細胞株と種々の期間インキュベートさせた後にIL-4を加える、同様の実験を行った。そのような実験の最初のセットでは、分子をレポーター細胞株と0時間（すなわち、IL-4と同時に添加する）、2時間、または一晩インキュベートさせ、その後50pMのIL-4を加えた。ルシフェラーゼ活性をIL-4添加の6時間後に測定した。結果は図5の上段パネル（「非トランスフェクト」）に示す。実験のさらなるセットにおいて、実験用または対照分子をレポーター細胞株と15分、30分、1時間、または2時間インキュベートさせ、その後50pMのIL-4を加えた点を除いて、同様のプロトコルを実施した。結果を図6に示す。
【００７６】
図5および図6にて要約した結果は、抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子がIL-4媒介シグナル伝達を阻害することができ、この阻害効果はより長いインキュベーション時間に伴い増強されるということを示す。実験の最初のセットのように、抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子の阻害効果がCD63発現に依存していたことを、CD63 siRNAを用いて確認した（図5下段パネル「CD63 siRNA」）。
【００７７】
要約すると、本実施例は、標的分子（ここでは、IL-4R）および内部移行エフェクタータンパク質（ここでは、CD63）の両方と同時結合することが、それによって細胞内における標的分子の内部移行および分解性リルーティングを引き起こすことができる多重特異性抗原結合分子の使用を通じて、標的分子活性の阻害に関するさらなる実証実験を提供する。つまり、例示的多重特異性抗原結合分子によるIL-4RおよびCD63との同時結合は、対照構築物単独によるIL-4Rの結合よりも実質的に大幅に（すなわち、10%より大きい）IL-4Rの活性を減弱した。
【００７８】
実施例3 抗IL-4R×抗CD63二重特異性抗体はCD63依存的様式でIL-4R活性を減弱する
本明細書の実施例2の実験は、CD63依存的様式でIL-4媒介シグナル伝達を阻害する抗IL-4R／抗CD63多重特異性分子を示す。これらの実験において、多重特異性抗原結合分子は、ビオチンストレプトアビジン結合を介して連結していた2つの別々のモノクローナル抗体（抗IL-4Rおよび抗CD63）からなる。実証実験の多重特異性抗原結合分子はその他の多重特異性抗原結合分子フォーマットへ一般化することができるという観測の結果を確認するために、真性の二重特異性抗体を構築した。
【００７９】
通常の二重特異性抗体技術を使用して、IL-4Rに対して特異的な第1腕およびCD63に対して特異的な第2腕からなる二重特異性抗体を構築した。IL-4R特異的腕は、CD63特異的軽鎖と対になる抗IL-4R重鎖を含んだ。CD63特異的軽鎖は構築の利便性の目的のため、IL-4R特異的重鎖と単独で対にした；にもかかわらず、抗IL-4R重鎖と抗CD63軽鎖との対はIL-4Rに対して完全な特異性を残したままであり、CD63との結合を示さなかった。CD63特異的腕は、抗CD63重鎖と抗CD63軽鎖（IL-4R腕において使用したものと同一の軽鎖）との対を含有した。抗IL-4R重鎖（配列番号3を含む）は、実施例2において使用したように、完全長抗IL-4R抗体に由来した；しかしながら、抗CD63重鎖および軽鎖はH5C6に示された抗CD63抗体由来であり、Developmental Studies Hybridoma Bank（University of Iowa Department of Biology、アイオワ州アイオワシティ）より入手された。実施例2において使用した、完全長抗IL-4R抗体のように、本実施例にて使用した二重特異性抗体の抗IL-4R成分はそれ自身の中程度のIL-4R遮断活性のみを示した。
【００８０】
IL-4ルシフェラーゼアッセイを実施して、抗IL-4R×抗CD63二重特異性抗体の遮断活性を評価した。手短に、抗IL-4R×抗CD63二重特異性抗体または対照分子の段階希釈をHEK293／STAT6-lucレポーター細胞へ加えた（実施例2を参照のこと）。通常の条件下においては、IL-4で処理した場合、これらの細胞は検出可能なルシフェラーゼ信号を発する。この実験に関しては、その後10pMのIL-4を細胞に加え、ルシフェラーゼ活性を使用した抗体の各希釈について定量化した。このアッセイにおいて使用した対照は以下の通りである:（a）1つの腕でIL-4Rを結合し、非機能性の抗CD63腕を有する偽二重特異性抗体（すなわち、1つの抗IL-4R重鎖および1つの抗CD63重鎖を含有し、その両方が抗IL-4R軽鎖と対になる）；（b）抗IL-4R単一特異性抗体；および（c）バッファー（PBS）のみ（抗体なし）。結果を図7に示す。図7に示すように、使用した対照試料について、ルシフェラーゼ活性は抗体濃度が最も高いときでさえも相対的に高い値のままであり、一方で二重特異性抗体については、ルシフェラーゼ活性は抗体濃度の増加と共に顕著に減退した。これらの結果は、二重特異性抗体によるIL-4RおよびCD63との同時結合が実質的なIL-4R活性の阻害をもたらすことを確証させる。
【００８１】
実施例4 SOSTおよびCD63と同時結合する多重特異性抗原結合分子を用いるSOSTの内部移行
本実施例において、可溶性標的分子SOST（スクレロスチン）の内部移行を促進する多重特異性抗原結合分子の能力を評価した。これらの実験について、標的分子は、pHrodo（登録商標）部分（Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）およびmycタグによってタグ付けされたヒトSOSTタンパク質からなる融合タンパク質であった。pHrodo（登録商標）部分は、中性pHにおいて実質的に非蛍光性であり、エンドソームなどの酸性環境においては明るい蛍光色のpH感受性色素である。それゆえ、蛍光信号は、SOST融合タンパク質の細胞性内部移行の指標として使用することができる。これらの実験に対する多重特異性抗原結合分子は、以下により詳述するような、CD63（内部移行エフェクタータンパク質）およびSOST融合タンパク質（可溶性標的分子）の両方に結合特異性を有する二重特異性抗体であった。
【００８２】
実験は以下の通りに行った：手短に、HEK293細胞を10,000細胞／ウェルでポリ-D-リシンコート96ウェルプレート（Greiner Bio-One、ノースカロライナ州モンロー）に蒔いた。細胞を一晩静置させた後、培地を、抗体（5μg／mL、以下に記載の通り）、pHrodo（登録商標）-myc-タグ-SOST（5μg／mL）、ヘパリン（10μg／mL）、およびヘキスト33342を含有する培地と置き換えた。次いで、細胞を氷上で3時間または37℃で3時間のいずれかでインキュベートした。全ての細胞を2回洗浄し、その後PBS中で造影し、1細胞あたりの蛍光斑点の数および対応する蛍光強度を数えて、種々の抗体構築物の存在下におけるpHrodo-myc-タグ-SOSTの細胞性内部移行の範囲を確証した。
【００８３】
本実施例において使用した抗体は、以下の通りであった:（1）抗CD63単一特異性抗体（クローンH5C6、Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa Department of Biology、アイオワ州アイオワシティ）；（2）抗myc抗体（クローン9E10、Schiweck et al., 1997, FEBS Lett. 414(1):33-38）；（3）抗SOST抗体（米国特許第7,592,429号に「Ab-B」として記載される抗体の重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体）；（4）抗CD63×抗myc二重特異性抗体（すなわち、抗体H5C6由来の抗CD63腕および9E10由来の抗myc腕を含む多重特異性抗原結合分子）；（5）抗CD63×抗SOST二重特異性抗体1号（すなわち、抗体H5C6由来の抗CD63腕および「Ab-B」由来の抗SOST腕を含む多重特異性抗原結合分子）；ならびに（6）抗CD63×抗SOST二重特異性抗体2号（すなわち、抗体H5C6由来の抗CD63腕および米国特許第7,592,429号に「Ab-20」として記載される抗体由来の抗SOST腕を含む多重特異性抗原結合分子）。これらの実験において使用した二重特異性抗体は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」方法論（例えば、Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621を参照のこと）を用いて構築した。
【００８４】
内部移行実験の結果は図8に示した。図8は、種々の処理条件下において試験した1細胞あたりの斑点（標識された小胞）の数を示す。まとめると、これらの実験の結果は、CD63およびSOSTと同時に（直接またはmycタグを介してのいずれか）結合する二重特異性抗体構築物は、37℃での各時間における蛍光強度および1細胞あたりの蛍光斑点の数によって反映されるように、最大量のSOST内部移行をもたらしたことを示す。したがって、本実施例において使用される多重特異性抗原結合分子は、可溶性標的分子の内部移行を有効に誘導することが可能である。
【００８５】
実施例5 CD63およびSOSTと結合する多重特異性抗原結合分子で処理したマウスにおける骨密度の変化
実施例4に記載されるように、抗CD63×抗SOST多重特異性抗原結合分子は次に、マウスにおいて骨密度を増加させるその能力について試験する。5つの集団のマウス（1集団毎に約6匹のマウス）をこれらの実験において使用する。投与群は以下の通りである:（I）未処理ネガティブコントロールマウス；（II）それ自身で骨密度を増加させることで知られている遮断抗SOST単一特異性抗体で処理したマウス（ポジティブコントロール）；（III）CD63およびSOSTと特異的に結合するが、それ自身のSOST活性は遮断しない、またはそれ自身のSOST活性をわずかに遮断する二重特異性抗体で処理したマウス；（IV）抗CD63親抗体（すなわち、二重特異性抗体におけるものと同一の抗CD63抗原結合領域を含有する単一特異性抗体）で処理したマウス；ならびに（V）抗SOST親抗体（すなわち、二重特異性抗体におけるものと同一の抗SOST抗原結合領域を含有する単一特異性抗体）で処理したマウス。各集団におけるマウスへ投与した抗体の量は、約10〜25mg／kgである。
【００８６】
集団IIIにおけるマウス（抗SOST×抗CD63二重特異性抗体で処理）は、二重特異性抗体の抗SOST成分がそれ自身のSOST活性を遮断しない（骨密度の増加を示さないと予想されている、集団Vにおけるマウスによって確認される通り）が、集団IIのマウス（既知の遮断抗SOST抗体で処理）において観測される骨密度に少なくとも匹敵する、骨密度の増加を示し得ると期待されている。集団IIIのマウスに期待される骨密度の増加は、上記の実施例4の細胞性実験で観測されたように、SOSTのCD63媒介内部移行によって操作されるものと考えられている。
【００８７】
実施例6 LPSおよびCD63と同時結合する多重特異性抗原結合分子によって媒介されるリポ多糖（LPS）の細胞性内部移行
本実施例は、非タンパク質標的分子、すなわちリポ多糖（LPS）の内部移行を誘導するための、本発明の多重特異性抗原結合分子の使用について解説する。LPSは、グラム陰性菌の外膜の成分であって、敗血症性ショックの一因となることで知られている。抗LPS抗体は敗血症に対して可能性のある治療薬として研究されている。本実施例の実験は、多重特異性抗原結合分子がLPSの内部移行を促進する能力を評価するように設計された。
【００８８】
本発明において使用される多重特異性抗原結合分子は、LPS（標的）に対する一方の腕およびCD63（内部移行エフェクタータンパク質）に対するもう一方の腕を有する二重特異性抗体であった。抗LPS腕はWN1 222-5（DiPadova et al., 1993, Infection and Immunity 61(9):3863-3872; Muller-Loennies et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(28):25618-25627; Gomery et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci USA 109(51):20877-20882; US 5,858,728）として知られる抗体に由来する。抗CD63腕はH5C6抗体（実施例4を参照のこと）に由来した。抗LPS×抗CD63二重特異性抗体（すなわち、多重特異性抗原結合分子）は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」方法論（例えば、Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621を参照のこと）を用いて構築した。
【００８９】
以下の2つのLPS種がこれらの実験で用いられた：大腸菌LPSおよびサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）LPS。どちらの種も蛍光標識分子（ALEXA-FLUOR（登録商標）-488標識LPS、Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）として得られた。
【００９０】
実験は以下の通りに行われた：HEK293細胞を96ウェルPDLコートイメージングプレート上に蒔いた。一晩静置した後、培地を新鮮な培地と置き換えた。蛍光標識されたLPS（大腸菌由来またはS.ミネソタ由来のいずれか）を通常の培地に加えた。次に、抗LPS×抗CD63二重特異性抗体または偽Fcと対であった対照半抗体を、試料に加えた。続いて、種々の時間で37℃（1時間および3時間）、または氷上（3時間）インキュベートし、LPS処理試料由来の細胞を以下の通りプロセシングした：洗浄、抗ALEXA-FLUOR（登録商標）-488抗体によるクエンチ、洗浄および固定。抗ALEXA-FLUOR（登録商標）-488抗体で、非内部移行（すなわち、表面結合）フルオロフォア由来の蛍光をクエンチした。したがって、クエンチ抗体処理試料において観測されたあらゆる蛍光が内部移行LPSによるものである。種々の時点における、各試料由来の蛍光のレベルを測定した。
【００９１】
図9は、これらの実験の結果を1細胞あたりの標識された小胞の数によって表す。図9に示す通り、抗CD63×抗LPS二重特異性抗体で処理された細胞だけが、時間が経つにしたがって顕著な数の標識された小胞を示した。標識されたLPSおよび対照抗体で処理された細胞は蛍光性小胞をほどんど示さず、LPSがこれらの処理条件下においては内部移行しないことを示した。
【００９２】
したがって、本実施例は、抗LPS×抗CD63二重特異性抗体がLPSおよびCD63との同時結合を必要とする手段においてLPSの細胞内への内部移行をもたらすことを実証した。したがってこれらの結果は、敗血症などの疾患および障害の治療のためにLPSといった標的分子の細胞性内部移行を促進するための本発明の多重特異性抗原結合分子の使用を支持する。
【００９３】
実施例7 Her2およびPRLRと同時結合する多重特異性抗原結合分子により媒介されるHer2の細胞性内部移行および分解
本実施例には、腫瘍関連抗原（Her2）の内部移行および分解を誘導するための本発明の多重特異性抗原結合分子の使用を解説する3つの別々の実験が含まれる。腫瘍細胞の表面からのHer2の除去は、高Her2発現によって特徴付けられるがん（例えば、乳がん、胃がん、胃食道がんなど）のある特定の型を治療するための、望ましいアプローチであり得る。
【００９４】
本実施例の実験において使用された多重特異性抗原結合分子は、Her2（標的）に対する一方の腕、およびPRLR（内部移行エフェクタータンパク質）に対するもう一方の腕を有する二重特異性抗体であった。
【００９５】
実験1
最初の実験として、抗HER2×抗PRLR二重特異性抗体（本明細書では「Her2xPRLR bsAb1」と称する）のT47D乳がん細胞における内在性Her2を分解する能力を評価した。T47D乳がん細胞は低レベルのHER2を発現し、抗HER2治療（Horwitz et al.,, “Variant T47D human breast cancer cells with high progesterone-receptor levels despite estrogen and antiestrogen resistance,” Cell. 1982 Mar;28(3):633-42を参照のこと）に対して一般的に不応性である。
【００９６】
抗HER2腕は、トラスツズマブとして知られる抗体に由来した。抗PRLR腕は、完全長ヒト抗PRLR抗体に由来した。抗HER2×抗PRLR二重特異性抗体（すなわち、多重特異性抗原結合分子）は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」方法論（例えば、Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621を参照されたい）を用いて構築した。本発明で使用したその他の構築物は、トラスツズマブ（単一特異性抗体）、抗PRLR抗体（米国特許出願公開第2015／0056221号に記載される、H1H6958N2と称される単一特異性抗体であって、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および単一特異性対照抗体（無関係な非ヒト抗原に対する）であった。
【００９７】
この実験について、内在性レベルのHer2およびPRLR受容体を発現するT47D細胞は、10%のFBS（ATCC、30-2020）、10mMのHepes、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10ug／mlのインスリンで充填された、RPMI（Irvine Scientific、9160）において育成された。50ug／mlにてシクロヘキシミド（CHX）を使用して、タンパク質合成を止めた。T47D細胞を、シクロヘキシミドおよびトラスツズマブ（CHX／トラスツズマブ）、シクロヘキシミドおよびHer2xPRLR bsAb1（CHX／bsAb1）、シクロヘキシミドおよびPRLR抗体（CHX／PRLR抗体）、シクロヘキシミドおよび対照抗体（CHX／対照抗体）、またはシクロヘキシミド、PRLR抗体、ならびにトラスツズマブのいずれかによって、0、1、2、または4時間のいずれかの時間で処理した。
【００９８】
細胞を、氷上の、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビター（Thermo Fisher、1861280）で充填されたRIPAバッファー（100mMのTris-HCl、300mMのNaCl、2%のNP-40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、および0.2%のSDS）（Boston BioProducts BP-116X）中ですすぎ、続いて超音波処理（Qsonica Model Q55、3パルス）した。超音波で分解した可溶化液を、2倍のSDS試料バッファーで1:1の割合にて希釈し、95℃で10分間加熱し、その後13,000rpmで室温にて10分間の遠心分離にかけた。上清を4〜20%のNovexトリスグリシンゲルで分解し、PVDF膜にブロットした。
【００９９】
1:300の比率のHer2抗体（Dako、A0485）または1:250の比率のPRLR抗体（Life Technologies、35-9200）を使用して膜を一次標識し、続いて1:5000の比率のHRPコンジュゲート二次抗体で標識し、ECL（Amersham、RPN2106）によって化学発光検出した。ウェスタンブロットの定量化は、CareStreamソフトウェア（コダック）を用いてバンドの正味の強度を算出することによって行った。結果を表1に示す。値はバックグラウンドと比較して相対的な単位によって表す。
【０１００】
表1に示すように、シクロヘキシミドでタンパク質合成を阻害した際、使用した全ての処理でPRLRが急速で完全な分解を受けたことが示された；プロセスは試験したいかなる抗体によっても影響されなかった。対照的に、シクロヘキシミドの存在下において、Her2xPRLR bsAb1で処理した細胞中でHer2が分解されたが、トラスツズマブおよび抗PRLR抗体の混合物、単一PRLR抗体、トラスツズマブ、または対照抗体での処理の場合は分解されなかった。この結果は、細胞表面において、Her2xPRLR bsAb1がHer2からPRLRへ架橋し、その後Her2-bsAb1-PRLR複合体によって分解するのに役立つことを示唆している。
【０１０１】
（表１）
2018524358.tif 000002
【０１０２】
実験2
第2の実験では、インビトロにおけるHer2分解に対するHER2×PRLR多重特異性抗原結合タンパク質の用量依存効果、およびPRLRレベルに対する潜在的影響が研究された。2つの異なるHER2×PRLR二重特異性抗体（「Her2xPRLR bsAb1」および「Her2xPRLR bsAb2」）をこの実験では使用した。二重特異性抗体は両方ともノブ・イントゥ・ホール方法論を用いて構築された。抗HER2腕は二重特異性抗体の両方に対して同一であり、トラスツズマブとして知られる抗体に由来した。Her2xPRLR bsAb1およびHer2xPRLR bsAb2の抗PRLR腕は、2つの異なる完全長ヒト抗PRLR抗体に由来した。
【０１０３】
この実験では、内在性レベルのHer2およびPRLR受容体を発現するT47D細胞が、10%のFBS（ATCC、30-2020）、10mMのHepes、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10ug／mlのインスリンで充填されたRPMI（Irvine Scientific、9160）中で育成された。T47D細胞を、bsAb1またはbsAb2のいずれかによって、10ug／ml、3ug／ml、1μg／ml、0.3μg／ml、0.03μg／ml、または0μg／mlにて、6時間処理した。
【０１０４】
細胞を、氷上の、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビター（Thermo Fisher、1861280）で充填されたRIPAバッファー（100mMのTris-HCl、300mMのNaCl、2%のNP-40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、および0.2%のSDS）（Boston BioProducts BP-116X）中ですすぎ、続いて超音波処理（Qsonica Model Q55、3パルス）した。超音波で分解した可溶化液を、2倍のSDS試料バッファーで1:1の割合にて希釈し、95℃で10分間加熱し、その後13,000rpmで室温にて10分間の遠心分離にかけた。上清を4〜20%のNovexトリスグリシンゲルで分解し、PVDF膜にブロットした。
【０１０５】
1:300の比率のHer2抗体（Dako、A0485）、1:250の比率のPRLR抗体（Life Technologies、35-9200）、または1:10,000の比率のベータアクチン抗体（Genetex、GTX100313）を使用して膜を一次標識し続いて1:5000の比率のHRPコンジュゲート二次抗体で標識し、ECL（Amersham、RPN2106）によって化学発光検出した。
【０１０６】
ウェスタンブロットの定量化は、CareStreamソフトウェア（コダック）を用いてバンドの正味の強度を算出することによって行った。ローディングコントロールのため、以下の通りのアクチンに対する正規化を使用した：最高アクチン正味強度を有する試料を正規化対照として使用した。各試料のアクチンの正味の強度を正規化対照の値で割って、試料の相対値を得た。各標的タンパク質（Her2またはPRLR）の正味の強度を試料に対して算出した相対的アクチン値で割って、正規化したHer2またはPRLRの値（任意単位）を得た。結果を表2に示す。
【０１０７】
表2に示すように、Her2xPRLR bsAb1およびHer2xPRLR bsAb2の両方が、T47D細胞において用量依存的様式でHer2分解を誘導した。対照的に、PRLRのレベルは二重特異性抗体処理によって影響されなかった。この結果は、これらの細胞の表面上において恒常的な表面代謝回転を受けるPRLRと一致している。
【０１０８】
（表２）
2018524358.tif 000003
【０１０９】
実験3
前述の実験は、Her2xPRLR二重特異性抗体によるHer2分解が、PRLR（内部移行エフェクタータンパク質）およびHer2（標的タンパク質）と同時結合する二重特異性抗体を必要とすることを示唆した。この原理を確認するため、Her2内部移行活性においてHer2xPRLR bsAb1のPRLR結合腕またはHer2結合腕のいずれか遮断する効果を評価する、第3の実験を行った。
【０１１０】
本実験ついて、内在性レベルのHer2およびPRLR受容体を発現するT47D細胞が、10%のFBS（ATCC、30-2020）、10mMのHepes、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10ug／mlのインスリンで充填された、RPMI（Irvine Scientific、9160）において育成された。Her2xPRLR bsAb1（10μg／ml）は未処理のままにする（すなわち、両方の腕とも阻害されていない）か、または可溶性PRLRタンパク質構築物（PRLR遮断腕を遮断する「PRLR.mmh」）もしくは可溶性Her2タンパク質構築物（Her2遮断腕を遮断する「Her2.mmh」）のいずれかと、37℃で1時間（1:2モル比）インキュベートし、その後0、2、4、または6時間のいずれかでT47D細胞を加えた。
【０１１１】
インキュベーション期間の最後に、細胞を、氷上の、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビター（Thermo Fisher、1861280）で充填されたRIPAバッファー（100mMのTris-HCl、300mMのNaCl、2%のNP-40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、および0.2%のSDS）（Boston BioProducts BP-116X）中ですすぎ、続いて超音波処理（Qsonica Model Q55、3パルス）した。超音波で分解した可溶化液を、2倍のSDS試料バッファーで1:1の割合にて希釈し、95℃で10分間加熱し、その後13,000rpmで室温にて10分間の遠心分離にかけた。上清を4〜20%のNovexトリスグリシンゲルで分解し、PVDF膜にブロットした。
【０１１２】
1:300の比率のHer2抗体（Dako、A0485）または1:10,000の比率のベータアクチン抗体（Genetex、GTX100313）を使用して膜を一次標識し、続いて1:5000の比率のHRPコンジュゲート二次抗体で標識し、ECL（Amersham、RPN2106）によって化学発光検出した。
【０１１３】
ウェスタンブロットの定量化は、CareStreamソフトウェア（コダック）を用いてバンドの正味の強度を算出することによって行った。ローディングコントロールのため、以下の通りのアクチンに対する正規化を使用した：最高アクチン正味強度を有する試料を正規化対照として使用した。各試料のアクチンの正味の強度を正規化対照の値で割って、試料の相対値を得た。Her2バンドの正味の強度を算出した相対的アクチン値で割って、正規化したHer2値（任意単位）を得た。結果を表3に示す。
【０１１４】
表3に示すように、Her2xPRLR bsAb1媒介Her2分解は、T47D細胞中においてHer2xPRLR bsAb1のHer2またはPRLR腕のいずれかを遮断することによって完全に防止され、Her2分解が、Her2xPRLR bsAb1多重特異性抗原結合タンパク質によるHer2およびPRLRの同時結合により媒介される、PRLRとのその物理的結合を介して発生したことを示す。
【０１１５】
実施例8 Her2およびPRLRと同時結合する多重特異性抗原結合分子によって媒介されるトラスツズマブエムタンシンの増加した作用強度
本実施例は、抗体薬物コンジュゲート（「ADC」）の作用強度を増加させるための本発明の多重特異性抗原結合分子の使用を解説する。より具体的には、本実施例は、腫瘍関連抗原標的に特異的な第2抗原結合分子（または、本明細書では「随伴分子」と称する）と組み合わせて、内部移行エフェクタータンパク質に対する第1結合ドメインおよび腫瘍関連標的抗原に対する第2結合ドメインを含む、多重特異性抗原結合分子の使用を実証する。随伴分子はADCである。本明細書において以下で説明する実験では、内部移行エフェクタータンパク質はプロラクチン受容体（PRLR）であり、腫瘍関連抗原標的はHer2であり、随伴分子はHer2に特異的なADCである（すなわち、トラスツズマブエムタンシン（T-DM1））。
【０１１６】
トラスツズマブは、Her2の細胞外ドメインと結合する組換えヒト化モノクローナル抗体である。トラスツズマブおよびその対応するADC、トラスツズマブエムタンシン、またはT-DM1は、免疫組織化学（IHC 3+）によって評価される強Her2過剰発現を有する患者において有効に使用されている。しかしながら現在は、Her2 IHC2+およびHer2 IHC1+腫瘍を有する患者に対して利用可能である有効な治療は存在しない。
【０１１７】
（表３）
2018524358.tif 000004
【０１１８】
本実施例において、4つの異なる抗HER2×抗PRLR二重特異性抗体（本明細書では「Her2xPRLR bsAb36」、「Her2xPRLR bsAb37」、「Her2xPRLR bsAb42」、および「Her2xPRLR bsAb45」と称される）の、Her2発現細胞におけるT-DM1の殺細胞作用強度を増加させる能力を評価した。本実施例において使用した二重特異性抗体は、表4に概説したように、4つの異なる抗HER2腕および2つの異なる抗PRLR腕から構成された。
【０１１９】
（表４）
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【０１２０】
標準的な方法を使用して、抗HER2×抗PRLR二重特異性抗体（すなわち、多重特異性抗原結合分子）を構築した。対照実験もまた、対照ADC（すなわち、DM1とコンジュゲートした、無関係な非ヒトタンパク質に対する抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート）、または抗PRLR-DM1 ADC（米国特許出願公開第2015／0056221号においてH1H6958N2と称される抗体薬物コンジュゲートであって、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を用いて行われた。
【０１２１】
Her2xPRLR二重特異性抗体のT-DM1の殺細胞効果を増強する能力を評価するために、内在性レベルのPRLRを発現しかつHer2を中レベルまで過剰発現するT47D細胞（T47D／Her2）はまず、10%のFBS（ATCC、30-2020）、10mMのHepes、1mMのピルビン酸ナトリウム、および10ug／mlのインスリンで充填された、RPMI（Irvine Scientific、9160）において育成された。その後、細胞を96ウェルプレート上に3000細胞／ウェルで蒔いた。次の日、細胞は未処理のままにしておくか、または一定範囲の濃度の、T-DM1、もしくは対照ADC、もしくは抗PRLR-DM1のいずれかで、またはT-DM1と、10ug／mlのHer2xPRLR bsAb42、Her2xPRLR bsAb36、Her2xPRLR bsAb37、もしくはHer2xPRLR bsAb45のいずれかとの組合せで、3日間で3つ組で処理した。
【０１２２】
細胞生存率は以下の通りに評価した：処理から3日後の細胞を0.25%のPFA、0.1%のサポニン、2ug／mlのへキストで20分間固定した。ウェル全体の画像が、自動顕微鏡ImageXpressMICRO（10倍の画像）およびCell ProliferationHT MetzxPressTM Module（核カウント）を用いる分析に必要とされた。結果を表5に概説する。
【０１２３】
（表５）
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【０１２４】
表5に示したように、T-DM1の殺細胞作用強度は、本発明のHer2xPRLR二重特異性抗体の存在下において顕著に増強された。したがって、本実施例は、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の、通常は細胞によって急速には内部移行されない標的タンパク質に対する免疫複合体分子の作用強度および効力を増強する能力を実証する。
【０１２５】
T-DM1は高レベルのHER2を発現する腫瘍に対して活性があるが、一方で低レベルおよび中レベルのHER2を発現するそれらの細胞はT-DM1処理に抵抗性であり続けるとして知られる。対照的に、抗PRLR-ADCは、低レベルのPRLRを発現する乳腺腫瘍細胞の強い死滅を誘導することができる。抗PRLR-ADCとT-DM1との死滅効率の差は、恐らくそれらの各々の標的の内部移行率およびリソソーム輸送における違いによるものである。PRLRおよびHER2の細胞内移動を比較した。
【０１２６】
低表面レベルのPRLRおよびHER2を発現するそれらの細胞において、PRLRは、プロラクチンリガンドとはほぼ無関係であった急速な恒常的リソソーム輸送および分解を受けることが観測された。しかしながら、HER2は、急速な恒常的リソソーム輸送および分解を受けなかった。例えば、低レベルのPRLRおよびHER2を発現するT47D細胞は80%のPRLRを60分以内で内部移行する一方で、HERは内部移行しなかった（図11）。これらの実験において、T47D細胞は、氷上にてCF（登録商標）594標識抗PRLR一次抗体またはCF（登録商標）594標識抗HER2一次抗体のいずれかを用いてインキュベートした。内部移行プロセスは、予め温めてあった（37℃）培地を細胞へ加えることによって惹起した。指定した時間における細胞で、細胞を4%のパラホルムアルデヒドで固定して、内部移行を止め、次にAlexa Fluor（登録商標）488コンジュゲートヤギ抗ヒトFabで染色して、細胞表面（黄色）に残存する非内部移行抗体を検出した。共焦点スタックの全てのセクションに基づき、共局在を画素毎にクエンチした。結果は図11に図示する。
【０１２７】
同様に、PRLRがT47D細胞のリソソーム区画中に急速に内部移行されるのを観測した（が、HER2はそうでなかった）。CF（登録商標）594標識抗PRLR抗体またはCF（登録商標）594標識抗HER2抗体をフルオレセイン-3kDaデキストランによって予め標識してあったT47D細胞に加えた。抗体-受容体複合体を、37℃で指定の時間内部移行させ（図12のX軸）、その後4%のパラホルムアルデヒドで固定した。デキストラン標識リソソームで内部移行した抗体の共局在を決定した。結果は、図12に図示され、図11の内部移行データと原則的に一致する。
【０１２８】
PRLRの恒常的な代謝回転を支配する配列モチーフを、受容体細胞質領域における21アミノ酸領域についてマップした；PRLR代謝回転は、効率的なADC媒介細胞周期の停止および細胞死滅を可能にした。図13は、以下の実験で使用した種々のPRLRおよびHER2構築物（以下の項目を含む）を図示する:（1）全長PRLR（PRLR FL）、（2）全長HER2（HER2 FL）,（3）HER2の膜貫通（TM）および細胞質（Cyto）部分に融合したPRLRの細胞外（Ecto）ドメイン（PRLRectoHER2cytoTM）、（4）PRLRの膜貫通（TM）および細胞質（Cyto）部分に融合したHER2の細胞外（Ecto）ドメイン（HER2ectoPRLRcytoTM）、（5）削除されたアミノ酸301〜622（シグナルペプチド残存伴う未加工のタンパク質によって測定した）を有するPRLR（PRLR Cyto42）、ならびに（6）削除されたアミノ酸280〜622（シグナルペプチド残存伴う未加工のタンパク質によって測定した）を有するPRLR（PRLR Cyto21）。
【０１２９】
PRLR内部移行エフェクター配列をそのドメインのひとつ（細胞外、膜貫通、細胞質）にマップするため、HEK293細胞を24ウェル光学プレートで生育し、PRLR、HER2、HER2ectoPRLRcytoTM、またはPRLRectoHER2cytoTMをコードする哺乳類発現ベクターで、24時間一時的にトランスフェクトした。その後、トランスフェクト細胞を氷上にてCF（登録商標）594標識一次抗体の存在下においてインキュベートし、次いで37℃まで温め、さらに1時間インキュベートした。図14は、4℃にて装飾された細胞を図示し、構築物が内部移行を期待されない場合、37℃の後、それらの構築物を急速に内部移行させることができる場合、内部移行した。パネルAは、37℃における内部移行PRLR FL構築物を図示する。パネルBは、1時間以内の37℃での内部移行を本質的に失敗した、HER2 FL構築物を図示する。パネルCはPRLRecto-HER2cyto／TM構築物を図示し、これもまた、1時間以内の37℃での内部移行を本質的に失敗した。パネルDは、37℃における内部移行HER2ectoPRLRcyto／TM構築物を図示する。これらの結果は、PRLRの細胞質領域が内部移行エフェクター配列を提供することを示唆する。
【０１３０】
内部移行エフェクター配列をさらに、約280〜約300のPRLRアミノ酸残基（例えば、配列番号11の残基280〜300；残基
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）（PRLR Cyto21-42として知られる）にマップした。上記のように、標識された抗体〜氷〜37℃までの実験をHEK293細胞に対して実施した。図15は、PRLRの細胞質領域全体（PRLR FL）（パネルAおよびB）、膜近位42アミノ酸（PRLR Cyto42）（パネルCおよびD）、ならびに膜近位21アミノ酸（PRLR Cyto21）（パネルDおよびE）を含有するそれらの構築物の細胞取り込みを図示する。PRLR Cyto42構築物が急速に内部移行される一方で、PRLR Cyto21構築物はされない。これは、細胞膜に近位にあるアミノ酸21および42間のPRLR細胞質領域（Cyto21-42）がPRLRの内部移行および分解について必須の情報を含有していることを実証する。
【０１３１】
内部移行PRLR構築物が分解されるかどうか（すなわち、リソソームを標的にするかどうか）を判定するため、トランスフェクトHEK293細胞をシクロヘキシミド（CHX）によって種々の時点で温めて（0時間、2時間、4時間、6時間）処理し、タンパク質産生を停止した。全細胞可溶化物のウェスタンブロット（図16）によって実証されるように、PRLR Cyto21の分解は殆ど検出されない一方で、PRLR FLおよびPRLR Cyto42は急速に分解される。
【０１３２】
抗体薬物コンジュゲート（ADC）として抗細胞増殖薬を送達する内部移行エフェクターとしての、PRLR膜貫通および細胞質領域の有効性は、HEK293細胞におけるトランスフェクトで試験した。HEK293細胞は、テトラサイクリン制御様式にて、PRLR、HER2、またはPRLRectoHER2cyto／TMを発現するように操作されている（例えば、Lenti-X（商標）Tet-On（登録商標）System、Clontech、カリフォルニア州マウンテンビューを用いる）。トランスフェクト細胞を24時間、0.01ηg／ml、または0.003μg／ml、または0.7μg／mlのドキシサイクリンによって誘導して、異なる発現レベルの受容体を達成した。これらはフローサイトメトリーによって判定された。メルタンシン（DM1としても知られ、エムタンシンとしても知られる）（1ηM）（パネルA、図17）またはHER2-DM1（1ηM）（パネルB、図17）のいずれかとコンジュゲートしたPRLRを各々トランスフェクトした細胞に加え、別に24時間インキュベートした。細胞周期分析をホスホ-ヒストンH3（Ser10）抗体を用いて実施して、初期有糸分裂細胞を検出した。結果は図17に図示され、PRLRの膜貫通／細胞質領域が細胞内への薬物の輸送を効果的に仲介していることを実証している。
【０１３３】
細胞質領域、特にCyto21-24ドメインのアラニン変異は、内部移行に必要な残基をマップするのを助けるように実施される。Cyto21-42配列に含有される2つのジロイシンの部位特異的な変異誘発は、PRLR Cyto42のトランスフェクトHEK293細胞上における代謝回転を阻害する。T-REx（商標）HEK293細胞（すなわち、安定したTet-On発現細胞、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）は、PRLR Cyto42、PRLR Cyto21、PRLR Cyto42 L283A L284A、PRLR Cyto42 L292A L293A、またはPRLR Cyto42 L283A L284A L292A L293A（4LAとしても知られる）を発現するように、テトラサイクリン制御様式にて（例えば、Jump-In（商標）Cell Engineering Platform、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）操作されており、ドキシサイクリン（0.7μg／ml）によって24時間誘導され、CHX（50μg／ml）で0または4時間処理される。結果は図18のウェスタンブロット中に図示され、Cyto21-42を欠くそれらの構築物に関する、タンパク質分解における減少、またはジロイシン反復を示す。結果は、これらの残基がリソソームの標的指向化に重要であるという結論を支持する。
【０１３４】
さらなる実験はPRLR代謝回転を実証した。代謝回転は、その細胞質領域によって媒介され、受容体の両方がHER2（T）×PRLR二重特異性抗体を用いて架橋される場合にHER2をリソソーム分解に向かわせる推進力である。（HER2（T）とは、トラスツズマブ腕を表す）。二重特異性抗体およびその親単一特異性抗体の動態結合パラメータを、最初に評価した。二重特異性抗体は、その親抗体としてのHER2およびPRLRの両方の細胞外ドメインに対して同様の結合動態示す（表6）。
【０１３５】
PRLRの細胞質領域は、内在性HER2のHER2（T）×PRLR bsAb媒介分解に必要であると実証するために、T-REx（商標）HEK293細胞を、全長PRLR、または細胞質領域全体を欠く切断型PRLR（下段パネル）のいずれかを発現するように操作した。タンパク質は、テトラサイクリン制御様式にてJump-In（商標）Cell Engineering Platform（ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて発現した。細胞を0.7μg／mlのドキシサイクリンによって24時間誘導し、続いて指定の抗体（表6）と異なる回数組み合わされるCHXでインキュベートし、溶解し、ウェスタンブロットのために処理した。
【０１３６】
（表６）
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【０１３７】
図19は、全長PRLR構築物を発現する細胞由来の可溶化液のウェスタンブロットを図示する。HER2（T）×PRLR二重特異性抗体はHER2をリソソームへと効果的に向かわせる一方で、抗HER2（T）抗体はそうではなく、低発現HER2に対する内部移行エフェクターとしてのPRLRの有効性を実証することに注意されたい。図20は、細胞質切断型PRLR構築物を発現する細胞由来の可溶化液のウェスタンブロットを図示する。ここで、あらゆる処理下におけるPRLRまたはHER2の分解は一切言及されておらず、したがってPRLRの細胞質領域が、受容体およびリソソームに対するその分子カーゴを標的にする必要性が実証される。
【０１３８】
HER2xPRLR二重特異性抗体は、HER2のリソソーム輸送を誘導し、HER2-ADC誘導細胞周期停止を増強し、T47D細胞における細胞死滅を促進する。リソソーム標的指向化を判定するために、T47D細胞を非結合性対照抗体またはHER2×PRLR二重特異性抗体のいずれかで処理し、氷〜37℃エンドサイトーシスアッセイに供する。リソソームおよびHER2を染色し、HER2画素によって占有されるリソソームマーカー画素のパーセンテージを判定した。結果は図21に図示される。これは、対照における25%以下と比べて、50%〜60%以上のHER2が、HER2×PRLR二重特異性抗体によって60分以内の加熱でリソソームを標的にしたことを示す。
【０１３９】
HER2-DM1媒介細胞周期停止を増強するHER2×PRLR二重特異性抗体を判定するため、HER2を発現するT47D細胞を、1nM、10nM、または30nMの、PRLR-ADC（A）、HER2-ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（B）、HER2-ADC単独（C）、非結合性対照ADC（D）、または非処理（E）で処理した。初期有糸分裂細胞のパーセンテージを抗ホスホヒストン（Ser10）抗体、細胞周期停止指標で染色することによって判定した。結果は図22に示され、HER2-ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（B）はHER2-ADC単独（C）よりもさらに効果的に細胞を停止することが示される。
【０１４０】
HER2-DM1媒介細胞死滅を増強するHER2×PRLR二重特異性抗体を判定するため、HER2を発現するT47D細胞を図23にて示される以下の薬物で処理する：PRLR-ADC（A）、HER2-ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（B）、HER2-ADC単独（C）、非結合性対照ADC（D）、または非結合性対照ADC＋HER2×PRLR二重特異性抗体（E）。図23は結果を図示し、HER2×PRLR二重特異性抗体がHER2-ADCについて顕著にIC50を減少したということを示す。
【０１４１】
実施例9 hMHC-1インタナライザー（Internalizer）を用いた標的の高代謝回転率および分解
高代謝回転タンパク質を使用して、可溶性および膜貫通標的を分解した。多重特異性抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）は、標的分子を下記の「デストロイヤー」タンパク質と結合するように設計した：（i）急速に代謝回転することで知られる、（ii）二価抗体の高標的媒介クリアランスを実証する、および（iii）リソソームへ輸送される、またはリソソームから輸送されることで知られる。設計および製造の簡便さのために、通常の軽鎖、「デストロイヤー」タンパク質に対する重鎖、および標的に対する重鎖を含有する二重特異性抗体を作成した。重鎖のひとつはH95R修飾を含有した。
【０１４２】
本実施例において、選択したデストロイヤー分子は、主要組織適合遺伝子複合体I MHC-1、より具体的にはクラスI、Bアイソフォーム（HLA-Bとしても知られる）であった。HLAと密接に結合したモノクローナル抗体が急速に分解されることが、「デストロイヤー」分子の特徴である。見本の可溶性標的分子として、アレルゲンFelD1を標的分子として選択した。FelD1は、2つのジスルフィド結合ヘテロ二量体を含む四量体糖タンパク質である。可溶性FelD1の2つの形式（FelD1-myc-myc-his融合タンパク質（FelD1-mmh）およびFelD1-Fc融合タンパク質）が構築され試験された。
【０１４３】
実験の1つのセットにおいて、FelD1-mmhをAlexa488で標識して、標的の内部移行の追跡における補助とした。HLA-B特異的腕（デストロイヤーを結合する）およびFelD1特異的腕（標的を結合する）（α-HLAB27・α-FelD1）を含む二重特異性抗体を多重特異性抗原結合タンパク質として使用した。HLA-Bを発現するC1RネオBリンパ芽球様細胞を、10μg／mlのFelD1-mmh-Alexa488、および10μg／mlのα-HLAB27・α-FelD1でインキュベートした。細胞を一晩インキュベートし、FelD1標的タンパク質の内部移行のための時間を用意した。その後、細胞を抗Alexa488抗体（Alexa-Fluor-488-抗体-ポリクローナル／A-11094、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）、で染色し、Alexa488の蛍光をクエンチした。抗Alexa488抗体は、内部移行されている標識された標的はクエンチしないため、内部移行標的は細胞表面と関連する標的と区別することができる。ここで、蛍光をFACによって定量化した。
【０１４４】
図10は、表面結合標的および内部移行標的の、MHC1ネガティブ細胞の両方に対する、平均蛍光（FACによって定量化された任意単位）を示す。これは対照、およびMHC1ポジティブ細胞として作用する。使用した二重特異性抗体はα-HLAB27・α-FelD1であった。親α-HLAB27・α-HLAB27二価抗体および非特異的IgGアイソタイプを対照として使用した。MHC1（デストロイヤー）を発現するこれらの細胞について、α-HLAB27・α-FelD1と接触した細胞は、表面付着標的分子と比べて内部移行標的分子においておよそ4倍の増加を示す。本質的に、対照に対しては一切の効果が検出されなかった。結果を図10および以下の表7に示す。
【０１４５】
ヒトHLA-B対立遺伝子を発現するマウスの血清由来の、FelD1-Fcのα-HLAB27・α-FelD1媒介クリアランスを評価した。二重特異性抗体α-HLAB27・α-FelD1および対照（PBS、抗FelD1二価単一特異性、および抗HLAB27二価単一特異性）を、ヒトHLA-B対立遺伝子を発現するマウスへ皮下注射（10mg／kg）によって投与した。翌日、1.6mg／kgのFelD1-Fcを尾静脈注射によって投与した。（3:1の割合の抗体:標的を使用した）。血清試料を、15分、6時間、1日、2日、3日、4日、6日、および8日の時点で尾からの採血によって得た。FelD1レベルを検知し、抗FelD1抗体を用いたウェスタンブロットによって定量化した。α-HLAB27・α-FelD1二重特異性抗体処理は、FelD1の非存在下における抗HLAB27のクリアランス速度と類似し（すなわち、半減期33時間）、FelD1の非存在下におけるα-HLAB27・α-FelD1のクリアランス速度の2倍以上（すなわち、半減期65時間）である、30時間以下の半減期での高速のFelD1クリアランスを実証した。抗FelD1の投与はMHC1媒介クリアランスに影響しなかったが、Fc受容体に起因するやや遅いクリアランスが観測された。結果は図11および12に示される。
【０１４６】
（表７）平均蛍光単位（FelD1-mmh-Alexa288）
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【０１４７】
実施例10 APLP2／PCSK9システムを用いた標的の分解
プロタンパク質がコンバターゼサブチリシン／ケキシン9型（PCSK9）およびその細胞表面パートナー（例えば、LDLRおよびAPLP2; DeVay et al., “Characterization of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) trafficking reveals a novel lysosomal targeting mechanism via amyloid precursor-like protein 2 (APLP2),” 288(15) J. Biol. Chem. 10805-18 (Apr 12, 2013)を参照のこと）を抗体媒介標的破壊のためのエフェクターとして使用することができるかどうかを評価するために、抗標的PCSK9融合タンパク質を作成した。融合タンパク質は、PCSK9融合の代わりの抗PSCK9または抗APLP2結合腕を取り込む、二重特異性抗体のモデルとして見なすことができる。
【０１４８】
これらの実験について、一つには、インビボ読み取りの有効性、すなわち、処理の開始から1週間後の血清鉄における増加の測定が、簡単で信頼できるものであるという理由で、hemojuvelin（HJV）をモデル標的として使用した。HJVは骨形成タンパク質6（BMP6）に対する共受容体である。HJVを遮断することでBMP6シグナル伝達を抑制し、これは鉄輸送体フォロポーチンを順番に抑制するヘプシジンレベルを低下させる。究極的に、HJVの遮断は血清鉄を増加させる。（Core et al., “Hemojuvelin and bone morphogenetic protein (BMP) signaling in iron homeostasis,” 5 Front. Pharmacol. 104 (1-9), May 13, 2014.を参照のこと）。
【０１４９】
6つの抗体::PCSK9融合分子を産生した。これら各々には3x GGGSリンカー（配列番号6）を介する、3つの異なるPCSK9（例えば、配列番号5）の変異体うち1つに融合したhIgG1バックボーンにおける、抗HJV非遮断抗体（α-HJV-n）または抗Myc抗体（α-Myc）のいずれかが含まれる。第1の変異体はシグナル配列を有しないが、プロドメインを含む、全長PCSK9（全長「PCSK9FL]；配列番号7）である。第2の変異体は、C末端ドメインのみであり、PCSK9の触媒領域およびC末端ドメイン間のいくつかの内部リンカー配列（長C末端「PCSK9LC」；配列番号8）を含む。第3の変異体は、C末端ドメインの短い変異体であり、この内部リンカー配列は含まない（Short C-term 「PCSK9SC」；配列番号9）。C末端変異体は、APLP2とのみ結合し、LDL受容体とは結合しないことが気体されている。
【０１５０】
抗体::PCSK9融合は、CHO細胞中において発現し、CHO細胞によって分泌された。重鎖PCSK9融合および関連する抗体の同族軽鎖の両方を含有するプラスミドは、10cmまたは15cmのシャーレにおいてCHO-K1細胞内に共トランスフェクトされた。次いで、細胞を4〜5日間インキュベートして、抗体::PCSK9を産生および分泌をさせ、その後上清を収集し、0.2マイクロフィルターを通じたろ過によって滅菌した。融合タンパク質を含むCHO細胞上清は、続いて、可溶性HJVタンパク質インビトロを内部移行するその能力を試験した。
【０１５１】
フルオロフォアpHrodoでタグ付けされた可溶性HJVを以下の通りに調製した。myc-myc-6xhis（mmh）タグとGPGリンカーを介して融合したHJV外部ドメイン（配列番号10）をCHO上清中に発現させ、精製した。続いて、精製したタンパク質を、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）化学作用を用いてpHrodo（登録商標）で標識した（Thermo Fisher Scientific、Waltham）。
【０１５２】
HepG2細胞を、CHO上清を含有する50%抗体::PCSK9、5%のリポタンパク質欠損血清および1μg／mlのpHrodo（登録商標）標識hHJV-mmhを有する50%のHepG2培地を含む溶液でインキュベートした。HepG2細胞はLDLRおよびAPLP2の両方を発現し、主要タンパク質は内部移行PCSK9として知られているために、好都合なモデルである。しかしながら、PCSK9融合多重特異性抗原結合タンパク質を評価するために、当業者は、あらゆる細胞株（天然、誘導、異所的、形質転換、および同様のもの）を認めるであろう。ここで、PCSK9は内部移行されており、本アッセイにおいて結合によって、LDLRおよびAPLP2以外のパートナーを潜在的に使用することができる。細胞をアッセイの前日に1.5×105細胞／mLで蒔き、37℃でインキュベートした。内部移行をImageXpress（登録商標）ハイコンテンツ撮像装置（Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール）による造影によって24時間監視した。アッセイ全体を通じて、細胞におけるpHrodo（登録商標）-HJV-mmh蓄積により構築物および対照との差異は、24時間時点で最大を示す可能性が最も高い。内部移行蛍光をMetaXpress（登録商標）ソフトウェア（Molecular Devices）を用いて定量化した。
【０１５３】
α-HJV-N::PCSK9FLおよびα-Myc::PCSK9FLによるインキュベーションは、pHrodo（登録商標）タグHJV-mmhタンパク質の内部移行を、抗体のない対照と比べて増加させた。pHrodoタグHJV-mmhが2つのmyc-タグを含有するため、α-Myc::PCSK9FLはこのアッセイにおいてα-HJV-N::PCSK9FLと同様に作用することが期待される。興味深いことに、PCSK9 C末端ドメインを含有する融合タンパク質（すなわち、α-HJV-N::PCSK9LCおよびα-HJV-N::PCSK9SC）は、標識されたHJVタンパク質を内部移行することができず、これはおそらく減弱したLDLR結合によるものと思われる。結果を図26に示す。
【０１５４】
実施例11 APLP2／PCSK9システムを用いたインビボにおける標的の分解
親α-HJV-N二価単一特異性抗体（BMPとHJVとの結合を遮断しない）、α-HJV-B二価単一特異性抗体（BMPとHJVとの結合を遮断しない）、α-HJV-N::PCSK9FL融合タンパク質、およびα-Myc::PCSK9FL融合タンパク質を、インビボでHJVシグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して試験した。分子をハイドロダイナミック送達（HDD）によってマウスへ投与した。血清試料は1週間後に採取した。内在性HJVがmyc-myc-hisタグを有しないため、α-Myc::PCSK9FL融合タンパク質はインビボでのネガティブコントロールとして機能する。予期した通り、α-HJV-N二価多重特異性抗体（ポジティブコントロール）のHDDはネガティブコントロールより血清鉄において顕著な増加を導いた。α-HJV-N::PCSK9FL（試験分子）のHDDもまた、血清鉄において、遮断する抗体と同様の大きさの、顕著な増加を導いた。これは、この分子が内部移行するのに有効であり、インビボでHJV（図27）を隔離するかまたは破壊するかのいずれかに有効であることを示唆している。
【０１５５】
本発明は、本明細書にて解説する特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の変更は、上記の記述および添付の図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲に組み込まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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