(57)【要約】  本発明は、医薬製剤、特にFVIII製剤に関する。本発明は更に、そのような組成物を生成するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーズドライFVIII医薬製剤であって、前記製剤は、wt FVIIIと比較して増加されたインビボ循環半減期を有するFVIII分子を含み、前記製剤は、再構成後、250〜10,000IU/mLの前記FVIII分子、2〜7mg/mLのNaCl、0.5〜5.0mg/mLのCaCl2・2H2O、及び50〜110mg/mLのスクロースを含む水性の等張製剤である、医薬製剤。
【請求項２】
前記製剤は、いかなる保存料も含まない、請求項1に記載の医薬製剤。
【請求項３】
前記製剤は、0.5〜5mg/mLのヒスチジン、0.5〜15mg/mLのメチオニン、及び0.05〜0.4mg/mLの界面活性剤を更に含み、再構成された前記製剤の体積は0.3〜1.2mLであり、オスモル濃度は350〜500mOsm/kgである、請求項1又は2に記載の医薬製剤。
【請求項４】
前記FVIII分子は、15〜25のアミノ酸のBドメインリンカーを有するBドメイン切断型分子であり、前記FVIII分子は、配列番号1のSer750アミノ酸残基と結合したO-グリカンを介して半減期を延長する部分と結合しており、前記FVIII分子は、PEG及びヘパロサンから選択される水溶性ポリマーと結合している、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項５】
前記FVIII分子は融合分子であり、前記融合分子の融合パートナーは、アルブミン、Fcドメイン、及びFcレセプターから成るリストから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記製剤は、250〜10,000IU/mL、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.0mg/mLのNaCl、80mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び3mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項７】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び0.5〜2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項８】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIIIの前記FVIII分子、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、90mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4mg/mLのNaCl、80〜100mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4〜6mg/mLのNaCl、100mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4mg/mLのNaCl、70〜90mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び1〜5mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、1〜4mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、7mg/mLのNaCl、100mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、1.5mg/mlのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び0.5〜1mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
前記製剤の30℃における3か月の保存後の酸化したFVIII軽鎖分子の量は、FVIIIの総量の5%未満である、請求項1から13のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
前記製剤は、10mMのヒスチジン溶液中で再構成され、再構成された前記製剤の体積は最大1mLである、請求項1から14のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
再構成前の前記フリーズドライ製剤は、本質的にフリーズドライ前の充填体積に相当する体積を有する薬学的にエレガントなフリーズドライケークである、請求項1から15のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
30℃における3か月の保存後の酸化したFVIII軽鎖分子の量は、FVIIIの総量の5%未満である、請求項1から16のいずれか一項に記載のフリーズドライFVIII医薬製剤。
【請求項１８】
請求項1から17のいずれか一項に記載のフリーズドライ医薬製剤を作製するための方法であって、(i)低圧下において液体製剤を脱気する工程、(ii)脱気した前記製剤を不活性ガスで圧力平衡化する工程、及び(iii)脱気した前記製剤をフリーズドライする工程を含む、方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法によって得られる医薬製剤。
【請求項２０】
前記製剤は、皮下投与用である、請求項1から17及び19のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
前記製剤は、静脈内投与用である、請求項1から18のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
血友病Aの処置に使用するための請求項1から18のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製剤、特にFVIII製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、遺伝性出血障害であり、患者において血餅の形成は普通に起こるが、二次的なトロンビン形成が欠如しているため血餅が不安定である。この疾患は、例えば、血液から単離された若しくは組み換えで生成された第FVII因子(FVII)、第VIII因子(FVIII)、又は第IX因子(FIX)等の凝固因子の静脈(iv)注射によって処置される。iv凝固因子製剤は、使用前に水、生理的食塩水又はバッファー中で再構成されるフリーズドライ製剤である。現在の血友病の処置の推奨は、従来の必要に応じた処置から予防、好ましくは、増加されたインビボ循環半減期を有する長時間作用型FVIIIバリアントを使用した予防へと変わってきている。
【０００３】
凝固因子の静脈内(iv)注入、特に頻繁なiv注入は不便で、ストレスが多く、痛みがあると考えられ、患者に傷をつける且つ/又は感染症のリスクと関連づけられる場合さえある。一部の血友病患者は、静脈のアクセスが不良であり、また多くは小さい乳幼児である。静脈内投与は、更に低いコンプライアンスと関連づけられる場合がある。
【０００４】
一方、皮下(sc)投与は、通常、使いやすく、痛みがないか、又はほぼ痛みがないと考えられる。更に、FVIIIのsc投与は、患者に例えば、毎日の投与に関連して比較的高い一定のトラフFVIIIレベルをもたらすと考えられる。しかしながら、凝固因子(例えば、FVIII)のsc投与は、今までのところ、皮下投与に関連したタンパク質の低い(低すぎる)バイオアベイラビリティのため、並びに製剤に関連する他の種類の障害のため適していなかった。
【０００５】
現在利用可能なFVIII iv製剤は、一般に比較的高いオスモル濃度(約4〜5mLの比較的大きな再構成体積と組み合わせて約400〜600mOsm/kg)、高い塩含有量、比較的低い炭水化物含有量(例えば、糖/スクロース)、比較的大きい注射体積(4〜5mL)、及び比較的低い薬物濃度(50〜750IU/mL)を有することを特徴とする。
【０００６】
対照的に、sc投与用医薬製剤は、好ましくは比較的低い注射体積を有していなければならない。sc製剤の注射体積は、2mL以下、好ましくは1.5mL以下、最も好ましくは1mL以下に制限されるべきである。
【０００７】
sc投与用製剤は、好ましくは、例えば、等張、又は等張に近いiv製剤と比較して低いオスモル濃度を有するべきである。高張製剤(例えば、高い塩含有量を含む製剤)は、注射部位反応及び/又はsc投与に関連した痛みの原因となる場合もある。皮下注射に関連づけられる痛み及び局所刺激は、比較的高い注射体積と組み合わさり、高すぎる、又は低すぎる張性によって引き起こされる可能性がある。したがって、現在利用可能なiv FVIII製剤は、皮下投与には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2009108806
【特許文献２】WO09108806
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jankowski MAら、Haemophilia 2007、13:30〜37頁
【非特許文献２】Lind Pら、Eur J Biochem 1995、232:19〜27頁
【非特許文献３】D'Amiciら、Electrophoresis 2010、31:2730〜2739頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、FVIII医薬製剤であって、前記製剤は、wt FVIIIと比較して増加されたインビボ循環半減期(「長時間作用型FVIII」)を有するFVIII分子を含み、前記製剤は、(sc投与に適した体積に)再構成後、水性の本質的に等張な製剤であり、前記製剤は、250〜10,000IU(/mL)の前記FVIII分子、2〜7mg/mLのNaCl、3.4〜34mMのCaCl2(0.5〜5.0mgのCaCl2・2H2O/mL)、50〜110mg/mLのスクロース、及び任意に0.5〜15mg/mLのメチオニンを含む、医薬製剤に関する。
【００１１】
本発明は、そのような組成物を生成するための方法並びにそのような方法によって生成される生成物並びにその治療的使用に更に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
市販されている組み換え型FVIII製品の大部分(例えば、NovoEight(登録商標)、Refacto(登録商標)、Kogenate(登録商標)、Advate(登録商標)等)はフリーズドライ製品である。これらのFVIII製剤は、比較的大きな再構成体積で比較的大きな注射体積のiv注入用に設計されてきた。フリーズドライiv FVIII製品は、一般に4〜5mLの注射用の滅菌水(WFI)又は食塩/緩衝水溶液のいずれかの中で再構成される。再構成後、得られた再構成されたFVIII製剤/溶液は、約400〜600mOsm/kgのオスモル濃度を有する。これは、iv注入に関して安全性への懸念のないやや高張から高張のiv溶液と説明することができ、製剤は血流中ですぐに希釈される。
【００１３】
再構成されたiv FVIII製品中の薬物の濃度は相対的に低く、約50〜750IU/mL(おおよそ5〜80μg/mLに相当する)であるため、目標の用量を提供するために比較的大きな体積が注入される。
【００１４】
現在利用可能なiv注入用のFVIII製剤は、一般にsc投与には適していない。これは、主に注射体積及び張性(オスモル濃度)に関する安全性の制約によるためである。sc注射1回当たりの体積の限度は、通常約1〜2mL、好ましくは1mL未満である。sc投与用の製剤は、好ましくは等張、又は等張に近くなければならない。大きな注射体積及び高張性の組み合わせは、安全なsc注射剤とは見なされない。オスモル濃度は主に溶解した構成成分(タンパク質及び賦形剤)の重量モル濃度によって制御されるため、現在利用可能な組み換え型iv FVIII製品にとって再構成体積を1mLに低減するのは望ましくない。それは、これが約1〜1.5Osm/kgのオスモル濃度(1000〜1500mOsm/kg)の極めて高張の溶液をもたらすであろうためである。更に、商業的に入手可能なFVIII製品は、通常sc投与時の注射部位反応/刺激症状に対するリスクを増加させる可能性があるポリソルベート80/「Tween(登録商標)80」等の界面活性剤を含む。
【００１５】
sc投与に関するFVIIIのバイオアベイラビリティは非常に低いが、本発明者らは、最近、驚くべきことにwt FVIIIのsc投与と比較して、長時間作用型FVIII分子のscバイオアベイラビリティ(例えば、ある特定のFVIII融合タンパク質、複合FVIII等)が高いことを発見した。本発明者らは、ここで、長時間作用型FVIII分子が製剤化され、フリーズドライされた後、許容されるFVIII濃度及び約350〜500mOsm/kgのオスモル濃度(等張に近いか、若しくはやや高張)を有しながら約1mL(1mL以下、例えば、0.8mL、0.5mL、又は0.3mL)の体積に再構成され得ることを更に発見した。しかしながら、本発明者らはまた、一部のsc FVIII製剤に関して、FVIII軽鎖が酸化される傾向があることも発見した。sc FVIII製剤の提供に関連したその他の障害は、安定した長時間作用型FVIIIを含み、1mL以下での再構成時にオスモル濃度が低い(等張若しくは等張に近い)見た目のよいフリーズドライ製剤を提供することであった。
【００１６】
フリーズドライ製剤中の賦形剤は、製剤化されたタンパク質の必要な安定化をもたらすマトリクスを形成しなければならない。一部の賦形剤は、フリーズドライ中に結晶を形成する傾向がある。結晶の自己相互作用する性質は、製剤中の結晶化した賦形剤の安定化及び凍結保護特性を低下させる場合もある。崩壊、又は部分的に崩壊したフリーズドライケークをもたらす可能性のあるフリーズドライ中の融解は回避されなければならない。好ましくは、フリーズドライケークは、フリーズドライ前の製剤の(充填)体積に相当する体積を有していなければならない。
【００１７】
フリーズドライ製剤は、好ましくは、安定した均質で、見た目のよい、及び/又は軽い/多孔性のフリーズドライケークを形成しなければならない(そのような特性は、「薬学的にエレガントな(pharmaceutically elegant)」フリーズドライケークと称されることが多く、これは、当業者に周知の概念である)。フリーズドライ製剤は、更に好ましくは容易に再構成されなければならず、溶解したFVIIIタンパク質は、「使用期間」(再構成から投与の間の時間枠)中、安定でなければならない。
【００１８】
本発明者らは、本明細書において、現在利用可能なFVIII iv製剤と比較してナトリウム塩の量が有意に低減され、炭水化物又は糖の量(好ましくは、例えば、スクロース等の非還元性二糖)、及び好ましくは抗酸化剤(特にメチオニン)もまた有意に増加されたsc投与用のFVIII製剤を提供する。
【００１９】
ナトリウム塩の量を低減し、同時にスクロース/炭水化物の量(オスモル濃度を低下させるために)を低減すると、フリーズドライ中にFVIII凝集(例えば、HMWP、高分子量タンパク質)が起こることがわかった。しかしながら、本明細書において、「低塩製剤」中の糖/炭水化物(好ましくはスクロース)の量を増加させると、タンパク質凝集体含有量が少なく(SE-HPLCによってHMWP%として測定される)、フリーズドライ及び保存中の凝集の増加が少ない等張の(又は等張に近い)製剤の調製を可能にしたことが示されている。高いスクロース含有量は、FVIIIのためのマトリクスを安定化させ、結果として有利な特性を有する薬学的にエレガントなフリーズドライケークが得られた。更に、高いスクロース濃度が再構成後のFVIII分子を安定化させることもわかった。
【００２０】
しかしながら、高濃度のスクロース及び低濃度の塩を含む製剤の化学的安定性は、低下したことがわかった。この問題は、酸化したFVIII軽鎖の含有量の増加として観察された。本発明者らは、スクロースベースの製剤にメチオニンを添加することによって、及びプロセスの一部として脱気を含めることによって酸化したFVIIIの量を低減することができた。
【００２１】
通常のフリーズドライプロセスは、凍結される水性サンプルの低圧/減圧条件への曝露を含み、これにより、凍結した水が昇華し(固相→気相)、(酸素及び水を含む)気体が除去される。それゆえ、圧力平衡時に、バイアル中に存在する気体が窒素で交換される場合もある。したがって、一般にフリーズドライそれ自体がフリーズドライ製品のタンパク質酸化を制限するのに十分であると考えられてきた。
【００２２】
本発明者らは、本明細書においてフリーズドライプロセスの凍結工程の前のフリーズドライヤー中で行う低塩/高スクロースFVIII製剤(任意に約1〜10mg/mLのメチオニンを含む)の脱気は、(例えば)保存中の酸化(特にFVIII軽鎖の酸化)に関して改善されたFVIII安定性をもたらすという驚くべき発見をした。フリーズドライプロセスに先立つ脱気は、FVIIIの物理的安定性(凝集傾向及び鎖分離)を損なう影響はないようである。したがって、(安定で活性なFVIIIを提供する)安定したフリーズドライFVIII製剤は、脱気工程を含むフリーズドライプロセスによって調製することができる。
【００２３】
凍結前の脱気/酸素の除去は、例えば、約4〜5℃又は室温(例えば、20℃)等の40℃未満の温度で約5〜60分間(例えば、20分間)低圧(例えば、100mbar)を適用することによってフリーズドライヤー中で実施されるのが好ましい。圧力は、窒素等の不活性ガスを用いて約1気圧(1013mbar)に平衡化される。この脱気手順は、FVIII安定性を向上させるため及び/又はFVIIIの酸化を低減するために凍結工程に先立って1回、好ましくは2回、3回、4回又は5回実施されるのが好ましい。
【００２４】
定義
等張のとは、通常、透水膜、例えば、細胞膜によって分離された2つの溶液間の浸透圧勾配がほとんどないか、又は全くないことを意味する。ヒト血漿は、約300mOsm/kgのオスモル濃度を有するため、等張溶液は、一般に約300mOsm/kgのオスモル濃度、よって約300mOsm/L溶液のモル浸透圧濃度を有する(オスモル濃度及びモル浸透圧濃度は、低い賦形剤濃度では同様の値を有する)。オスモル濃度は、水の化学ポテンシャル及び溶質、例えば、糖、タンパク質、アミノ酸、解離電解質の重量モル濃度と直接的に相関がある。オスモル濃度は、溶質添加の影響を定量する水/水溶液の基本的な物理特性であり、これは、凝固点降下によって、又は蒸気圧浸透圧測定によって求めることができる。
【００２５】
(現行のiv製剤と比較して)sc製剤のオスモル濃度(及び注射体積)を低減することの主な目的は、望ましくない注射部位反応を回避すること、又は低減することである。文献調査は、約280〜450mOsm/kgのオスモル濃度を有する溶液がsc投与に関連して等張と認識されることを示し、したがって、「等張の製剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、約280〜450mOsm/kgの製剤を包含し、そのような製剤は、iv投与及び例えば、sc投与等の血管外投与の両方に適している。オスモル濃度>300mOsm/kgを有する溶液の忍容性はまた、注射体積にも依存し、注射体積が大きいと注射部位反応のリスクを高め、例えば、600mOsm/kgのオスモル濃度及び0.5mLの目的の注射体積を有する溶液は安全だと見なすことができる。等張の製剤は、本明細書中で使用される場合、約280〜600mOsm/kg、或いは、300〜600、400〜600、500〜600、300〜500、350〜500、400〜500、300〜400、320〜400、340〜400、350〜400、280〜380、300〜380、320〜380、340〜380、350〜380、280〜360、300〜380、300〜360、300〜350、320〜380、350〜380、280〜600、300〜600、400〜600、500〜600、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、又は600mOsm/kgの製剤を包含する。
【００２６】
第VIII因子:第VIII因子(FVIII)は、肝類洞内皮細胞(LSEC)を含み、場合によっては肝細胞も含む内皮細胞によって主に産生される大きな複合糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含む2351のアミノ酸をコードし、相同性によって定義されるいくつかの異なるドメインを含む。3つのAドメイン、固有のBドメイン、及び2つのCドメインが存在する。ドメインの順序は、NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHと列挙されうる。A1(a1領域)及びA2(a2領域)の小さな酸性領域C末端並びにA3ドメイン(a3領域)のN末端がトロンビン及びフォン・ヴィレブランド因子(VWF)を含む他の凝固タンパク質とのFVIIIの相互作用において重要な役割を果たす。
【００２７】
細胞のプロセシングの間、フューリンはa3領域の前を切断する。得られたA1-a1-A2-a2-B鎖を重鎖(HC)と呼び、a3-A3-C1-C2を軽鎖(LC)と呼ぶ。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって連結される。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
内因性FVIII分子は、さまざまな大きさのBドメインを有する分子のプールとしてインビボにおいて循環し、最も短いものは、740位に、すなわちA2-a2のC末端にC末端を有し、したがってBドメインを含まない。さまざまな長さのBドメインを有するFVIII分子はすべて、プロコアグラント活性を保持する。トロンビンによる活性化時、FVIIIは、A1-a1のC末端の372位、A2-a2のC末端の740位、及びa3からA3の間の1689位で切断され、後者の切断は、VWFに対する親和性の損失を伴いa3領域を遊離させる。活性化FVIII分子を、FVIIIaと呼ぶ。この活性化は、活性化血小板のようなリン脂質表面及び活性化第IX因子(FIXa)とのFVIIIaの相互作用を可能にし、すなわち、テナーゼ複合体が形成され、それが第X因子(FX)の効率的な活性化を可能にし、トロンビン生成及び最終的にフィブリン、安定した止血性血餅(haemostatic clot)の形成をもたらす。
【００３０】
「野生型(wt)/未変性FVIII」は、配列番号1(アミノ酸1〜2332)に示される完全長配列由来のヒトFVIII分子であり、その対立遺伝子バリアントを含む。Bドメインの除去/切断は、FVIIIの組み換え産生に対する利点であると考えられる場合が多い。
【００３１】
配列番号1:wtヒトFVIII(Ser750残基は太字及び下線で示される)
【００３２】
【化１Ａ】
2018532783.tif 000003
【００３３】
【化１Ｂ】
2018532783.tif 000004
【００３４】
「Bドメイン切断型」及び「Bドメイン除去型」(BDD)FVIIIという用語は、本明細書では同義に使用される。FVIIIのBドメインは、配列番号1のアミノ酸741〜1648にわたる。Bドメインは、いくつかの異なる部位においてタンパク質内分解(endo-proteolysis)を受け、上記で、及びJankowski MAら、Haemophilia 2007、13:30〜37頁及びD'Amiciら、Electrophoresis 2010、31:2730〜2739頁において説明されるような循環血漿中FVIII分子の大きな不均一性を引き起こす。BドメインはFVIIIの細胞内発現に関与するが、高度にグリコシル化されたBドメインの細胞外における正確な機能はあったとしてもわかっていない。わかっていることは、Bドメインが凝固カスケードにおけるFVIII活性に必須ではないということである。したがって、組み換えFVIIIが、Bドメイン除去型/切断型バリアントの形態で高い頻度で産生される。一実施形態において、FVIIIタンパク質は、以下の配列を有する21のアミノ酸残基リンカー(Bドメインリンカー)配列を含むFVIII分子をコードする発現ベクターによって産生され得る:配列番号2:
【００３５】
【化２】
2018532783.tif 000005
【００３６】
O-グリカンは、配列番号2の下線を引いたSに結合し、この残基は、配列番号1の位置S750に対応する。別の実施形態において、本明細書におけるFVIIIタンパク質は、以下の配列を有するリンカー配列を含む:配列番号3:
【００３７】
【化３】
2018532783.tif 000006
【００３８】
別の実施形態において、本明細書におけるFVIIIタンパク質は、以下の配列を有するリンカー配列を含む:配列番号4:
【００３９】
【化４】
2018532783.tif 000007
【００４０】
別の実施形態において、本明細書におけるFVIIIタンパク質は、配列番号1に示されるSer750残基に結合したO-グリカンを含むBドメイン除去型/切断型FVIIIバリアントである。他の多くのO-グリカンは、FVIII分子のBドメインに結合していると考えられるが、これらの他のO-グリカンの正確な位置はまだ確認されていない。
【００４１】
増加されたインビボ循環半減期を有するFVIII(長時間作用型FVIII):本発明によるFVIII分子は、長時間作用型FVIIIタンパク質、FVIIIの延長されたインビボ循環半減期(「長時間作用型FVIII」)を実現するために一般に例えば、融合パートナーと融合した、半減期を延長する部分と複合体を形成した等の組み換えタンパク質である。wt FVIIIのインビボ半減期は約12〜14時間であり、本発明によるFVIII分子(長時間作用型FVIII)は、(少なくとも)10%、好ましくは(少なくとも)15%、より好ましくは(少なくとも)20%、より好ましくは(少なくとも)25%、より好ましくは(少なくとも)30%、より好ましくは(少なくとも)40%、より好ましくは(少なくとも)50%、より好ましくは(少なくとも)60%、より好ましくは(少なくとも)70%、より好ましくは(少なくとも)80%、より好ましくは(少なくとも)90%、より好ましくは(少なくとも)100%増加されたインビボ循環半減期を有する。インビボ循環半減期は、例えば、適した動物モデルにおいて測定されてもよい。
【００４２】
「半減期を延長する部分」は、「側鎖」、「置換基」等と呼ばれる場合もある。増加されたインビボ循環半減期を有するFVIII分子は、「遅延性FVIII分子」又は「長時間作用型FVIII分子」と言及される場合もある。半減期を延長する部分としては、さまざまな種類のポリペプチド、ペプチド化合物、高分子化合物、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリシアル酸(PSA)、多糖(例えば、デキストラン、デンプン、ヘパロサン等)が挙げられる。或いは、半減期を延長する部分は、本質的に主に疎水性であってもよく、例えば、脂肪酸、ジ脂肪酸(difatty acid)等の親油性構成成分を含む(親油性部分は、「アルブミンバインダー(albumin binder)」と呼ばれる場合もある)。半減期を延長する部分は、FVIII分子と半減期を延長する部分との間にリンカーを更に含んでもよい。
【００４３】
長時間作用型FVIII分子はまた、組み換え法又は化学的/酵素的結合により融合パートナーと融合していてもよい。融合パートナーの例としては、アルブミン、抗体Fcドメイン、Fcレセプター、FVIII Bドメインフラグメント、合成ペプチド等が挙げられる。半減期を延長する部分は、例えば、化学的及び/又は酵素的方法を使用してFVIII分子中に存在するグリカンに結合する。いくつかのグリカンがFVIII、特にBドメイン中に存在する。一実施形態において、半減期を延長する部分は、配列番号1のアミノ酸ナンバリングに従ってS750残基に結合したO-結合型グリカンを介してBドメイン除去型/切断型FVIII分子と複合体を形成する。好ましくは、半減期を延長する部分は、例えば、WO2009108806に開示されている酵素的複合糖質法(glyco-conjugating method)を使用してFVIIIと複合体を形成する。
【００４４】
本発明によるFVIII融合パートナーのアミノ酸配列:
【００４５】
配列番号5(FVIIIアミノ酸741〜966)「226」アミノ酸FVIII Bドメイン:
【００４６】
【化５】
2018532783.tif 000008
【００４７】
配列番号6 -  ヒト血清アルブミン:
【００４８】
【化６】
2018532783.tif 000009
【００４９】
配列番号7:ヒトFcγRI(CD64)の細胞外領域:
【００５０】
【化７】
2018532783.tif 000010
【００５１】
配列番号8:ヒトIgG1 Fcドメイン:
【００５２】
【化８】
2018532783.tif 000011
【００５３】
配列番号9:ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG C末端)のベータ鎖のC末端の28アミノ酸:
【００５４】
【化９】
2018532783.tif 000012
【００５５】
配列番号10:配列A/XTEN(さまざまな長さを有する反復配列が使用されてもよい):
【００５６】
【化１０】
2018532783.tif 000013
【００５７】
生物活性:本発明による製剤に含まれるFVIII分子は、凝固カスケードにおいて、ヒトFVIIIと機能的に類似するか、又は同等の様式で機能し、活性化血小板におけるFIXaとの相互作用によりFXaの形成を誘導して血餅の形成を支えることができる。FVIII活性は、当該技術分野において周知の技術を使用してインビトロで評価することができる。血餅分析、FX活性化アッセイ(発色アッセイと呼ばれることも多い)、トロンビン生成アッセイ及び全血トロンボエラストグラフィーはそのようなインビトロ技術の例である。本発明の製剤に使用するためのFVIII分子は、例えば、発色アッセイ(FVIII活性アッセイ)において例えば、ヒトFVIIIと比較した場合、未変性のヒトFVIIIの活性の少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、100%又は更には100%超である特定のFVIII活性を有してもよい。
【００５８】
FVIIIの分解
FVIII製剤中に存在する第VIII因子は、酸化、凝集並びに非共有結合的に結合した2つのタンパク質サブユニットである重鎖(HC)と軽鎖(LC)の間の解離を含むいくつかのメカニズムによって分解される可能性がある。
【００５９】
FVIII(例えば、結合型のBドメイン除去型FVIII)の酸化は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって測定することができる。RP-HPLCの間、非共有結合性相互作用は不安定であるため、LC及びHCは、別々のピークとして溶出する。観察されるLCの酸化は、主に軽鎖に存在するメチオニン残基の酸化によるものである。酸化したLCは、クロマトグラムに別々のピークとして検出される。LCの酸化は、FVIIIタンパク質の総量と比較した酸化した軽鎖(LC)のパーセンテージとして定量される(本明細書では酸化したLC%、酸化型%、又はox型%とも言及される)。
【００６０】
FVIII(例えば、結合型のBドメイン除去型/切断型FVIII)の凝集は、周知の技術、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)によって評価することができる。凝集したFVIIIは、(結合したHC-LCから成る単量体のFVIIIを含有する)主ピークよりも短い保持時間を有する1つのピーク又は2つのピークとしてSE-HPLCによって検出される。凝集したFVIIIは、HMWP%(高分子量タンパク質%)としてクロマトグラムのピークの全面積と比較したこのピーク/これらのピークの積分によって定量される。遊離型LCは、主ピークの後に溶出する別々のピークとして出現するため、HC-LC解離もまた、SE-HPLCによって検出することができる。
【００６１】
FVIII分解(主に酸化及び凝集)は、すべてのプロセス(例えば、取り扱い及びフリーズドライ)中に起こり、ここでは医薬組成物のフリーズドライ後及び保存の間にも続くこともあることに留意すべきである。本発明による組成物は、好ましくはフリーズドライ後に10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、5℃で2年間、30℃で12か月、40℃で3か月の保存後に15%、14%、13%、12%、11%未満、又はそれ以下の分解されたFVIIIの含有量を有するべきである。本発明による組成物は、好ましくは30℃において酸化型(酸化したFVIII LC)に関して1か月当たり1パーセント点未満、及びHMWP(タンパク質凝集)に関して0.5パーセント点の分解速度を有するべきである。
【００６２】
冷蔵条件(例えば、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、0〜10℃、0〜5℃、又は0〜4℃)は、本発明による組成物のより長い保存可能期間(例えば、最大1又は2年以上)をもたらす。本発明による医薬組成物の保存可能期間は、室温(25〜30℃)で少なくとも3か月である。
【００６３】
医薬製剤:本明細書における医薬製剤は、長時間作用型FVIIIを含むさまざまな化学物質/賦形剤を含み、最終医薬製品を構成する。本明細書における医薬製剤は、水性製剤であり、これは、水又は水溶液(例えば、バッファー)中におけるフリーズドライ製剤の再構成後に少なくとも75%の水、好ましくは少なくとも80%の水、好ましくは少なくとも85%の水、好ましくは少なくとも90%、91%、92、93%、94%、95%、96%の水(%w/w)を含むことを意味する。
【００６４】
したがって、本明細書における製剤は、それを必要とする患者への投与に先立って再構成される凍結乾燥/フリーズドライ製剤である。再構成は、実質的に投与前のいかなる時間において行われてもよいが、大半の実施形態では、再構成は、患者への製剤の投与の1日若しくは1日未満前、12時間若しくは12時間未満前、6時間若しくは6時間未満前、5時間若しくは5時間未満前、4時間若しくは4時間未満前、3時間若しくは3時間未満前、2時間若しくは2時間未満前、1時間若しくは1時間未満前、30分若しくは30分未満前、20分若しくは20分未満前、10分若しくは10分未満前、又は5分若しくは5分未満前に行われる。したがって、製剤は、薬局、診療所、又は病院で購入又は手渡される前に水溶液/水/バッファー中で再構成された製剤であってもよい。再構成された製剤は、好ましくは低温で維持される(例えば、40℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃以下)。
【００６５】
再構成後、本明細書において提供される製剤は、例えば、静脈内又は血管外投与(例えば、筋肉内、皮内及び皮下投与)用を意図した非経口製剤として使用するのに適している。本明細書に記載されるとおり、ある特定の利点は、本明細書における血管外(好ましくは、皮下)投与用の製剤の使用と関連づけられる。
【００６６】
本発明による医薬製剤の1つのバイアルは、好ましくは、患者への1回の投与量の投与として使用される。皮下投与に関連して、簡単で使いやすく、ほぼ痛みのない投与計画を使用してFVIIIの比較的安定したトラフレベルを提供するために、1日当たり1患者につき1投与量が使用されるのが好ましい。ただし、他の投与計画が利用されてもよく(例えば、週に1回、週に2回、1日おき、3日に1回、1日に2回、1日に3回等)、投与計画はまた、患者固有の必要性、例えば、身体的活動が増加/低減した期間、身体的条件に従って調節されてもよい。
【００６７】
(再構成された)本発明の製剤中の長時間作用型第VIII因子の濃度は、一般的に約250〜10,000IU/mLのFVIII、1000〜10,000、2000〜10,000、3000〜10,000、4000〜10,000、5000〜10,000、6000〜10,000、7000〜10,000、8000〜10,000、若しくは500〜10,000、又は500〜5000IU/mLのFVIII、例えば、1000〜3000、1500〜3000、2000〜3000、2500〜3000、2000〜3000、2500〜3000、1000〜2500、1000〜2000、500〜2500、500〜2000、250〜3000、250〜4000、250〜5000、250〜6000、500〜6000、1000〜6000、2000〜6000、3000〜40000、500〜8000、500〜7000、若しくは5000〜6000IU/mLのFVIIIの範囲である。好ましくは、製剤中の第VIII因子の濃度は、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、若しくは3000、3500、4000、4500、5000 5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、又は10,000IU/mLのFVIIIである。
【００６８】
FVIIIの濃度はまた、g/mLのFVIII単位で測定されてもよいが、FVIII活性/mLの測定値の方が活性成分の有効量をより正確に反映する。1IU/U(国際単位/単位)は、1mLのプールされた新しい正常なヒト血漿に見出される(活性)FVIIIの量と定義される。「IU」及び「U」という用語は、本明細書では同義に使用される。
【００６９】
1バイアルが、本明細書における1用量に相当する場合が多い。本明細書における濃度又はFVIII強度は、U/mLとして表される場合が多く、フリーズドライ前のバイアル中の充填体積が1mLより少ない場合、それに伴ってバイアル当たりの強度は低くなる。
【００７０】
塩:本発明による製剤は、ナトリウム塩及びカルシウム塩、好ましくは、NaCl及びCaCl2・2H2Oを含む。本発明による製剤は、再構成された溶液において低い総塩濃度:約3〜12mg/mL(好ましくは約5〜10mg/mL)を有する。或いは、再構成された溶液中の総塩含有量は、約3〜11、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜11、4〜10、4〜9、4〜8、4〜7、4〜6、4〜5、5〜11、5〜10、5〜9、5〜8、5〜7、5〜6、6〜11、6〜10、6〜9、6〜8、6〜7、7〜11、7〜10、7〜9、7〜8、8〜11、8〜10、8〜9、9〜11、9〜10、又は10〜11mg/mLの全塩、或いはmg/mLの全塩(又はmg/バイアルの塩(投与量単位))である。
【００７１】
約1〜10mg/mLの量で存在するナトリウム塩は、好ましくはNaClであり、例えば、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜10、4〜9、4〜8、4〜7、4〜6、4〜5、5〜10、5〜9、5〜8、5〜7、5〜6、6〜10、6〜9、6〜8、6〜7、7〜10、7〜9、7〜8、8〜10、8〜9、又は9〜10mg/mL等のNaClである。好ましくは、NaClの濃度は、約1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5又は10.0mg/mLのNaClである。NaClのモル重量は、1モル当たり58.44gであり、したがって1〜10mg/mLのNaClは約17〜171mMに相当する。1ml未満の充填体積が使用される場合、NaCl/バイアルの総量は容易に算出することができ、例えば、NaClが5mg/mlの量で存在し、バイアル中の充填体積が約0.5mlである場合、1バイアル当たりのNaClの量は約2.5mg/バイアル又はmg/用量である。
【００７２】
NaClはFVIIIを可溶化して安定化させる効果があることがわかっているため、現行のFVIII製剤には比較的高い濃度でNaClが使用される。NaClの別の利点は、例えば、比較的低い濃度でも有毒であり得るカリウム塩とは対照的に、比較的多い量のNaClをいかなる副作用を引き起こすことなく非経口的に投与できることである。
【００７３】
カルシウム塩(好ましくはCaCl2・2H2O)は、本明細書における製剤中に約0.5〜5.0mg/mL、例えば、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、又は1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、0.5〜5、1〜5、1.5〜5、2〜5、2.5〜5、3〜5、3.5〜5、4〜5、0.5〜4、1〜4、1.5〜4、2〜4、2.5〜4、3〜4、0.5〜3、1〜3、1.5〜3、又は2〜3mg/mL等のCaCl2・2H2Oの量で存在する。CaCl2・2H2Oのモル重量は147.03g/モルであり、したがって、0.5〜5mg/mLのCaCl2・2H2Oは3.4〜34mMに相当する。
【００７４】
1ml未満の充填体積が使用される場合、CaCl2・2H2O/バイアルの総量は容易に算出することができ、例えば、CaCl2・2H2Oが5mg/mlの量で存在し、バイアル中の充填体積が約0.5mlである場合、1バイアル当たりのCaCl2・2H2Oの量は約2.5mg/バイアル又はmg/用量である。
【００７５】
二価カチオン、例えば、Ca2+の存在は、HCとLCの間の非共有結合性相互作用の安定化、及びFVIII凝集の予防、ひいてはFVIII活性の維持に重要である。別のカルシウム塩、例えば、酢酸カルシウム(CaOAc2)、及び当業者に既知のその他の塩が本発明に使用されてもよいであろう。約0.5又は0.4mg/mLよりも低いカルシウム塩濃度が凝集の増加と関連づけられることが本明細書において示される。
【００７６】
炭水化物/サッカライド及びポリオール:本明細書における製剤は、比較的高い濃度の炭水化物又はサッカライド又は糖を含み、特にモノ及び/又はジサッカライドのみならず(又は代わりに)糖アルコール及び/又はポリサッカライドを含む。モノサッカライドの例としては、グルコース(デキストロース)、フルクトース(レブロース)、ガラクトース、マンノース等が挙げられる。本明細書におけるジサッカライドの例としては、スクロース、ラクトース、及びトレハロースが挙げられる。ポリサッカライドの例としては、デキストラン、ラフィノース、スタキオース、デンプンが挙げられる。糖アルコールの例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトール)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール、25(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、及びポリエチレングリコールが挙げられる。炭水化物/糖は、本明細書におけるフリーズドライ製剤中の主要な構成成分を提供するのみならず、凍結中及び乾燥/水除去中、及び保存中における溶液中のFVIIIを安定化させることに寄与する。すべての糖アルコールがFVIII製剤に適している訳ではない。例えば、マンニトール濃度が高いと、フリーズドライ中のFVIII分子が不安定になる場合もある。マンニトール濃度が高いフリーズドライ製剤ではタンパク質凝集体の量の増加が検出された。この不安定化するマンニトールの影響は、安定化賦形剤/炭水化物、例えば、スクロースによって打ち消されることが観察された。
【００７７】
本明細書における製剤は、再構成された製剤中に30〜110mg/mLの炭水化物(30〜100mg/mLのスクロースは87〜292mMに相当する)、例えば、30〜90、30〜85、30〜80、30〜75、30〜70、30〜60、30〜50、40〜100、40〜90、40〜80、40〜85、40〜75、40〜70、40〜60、40〜50、50〜100、50〜90、50〜85、50〜80、50〜75、50〜70、50〜60、60〜100、60〜90、60〜85、60〜80、60〜75、60〜70、70〜100、70〜90、70〜85、70〜80、75〜80、40〜110、50〜110、60〜110、70〜110、80〜110、90〜110、100〜110、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、又は110mg/mL等のスクロース(炭水化物)を含む。スクロースのモル質量は342.30g/モルである。その他の炭水化物/糖、例えば、トレハロース等の非還元ジサッカライドも本発明による製剤中に存在してもよく、これは、ストレス試験中のタンパク質凝集(GP-BDD-FVIIIの凝集)を妨げることがわかった。他の実施形態では、スクロースが本明細書における製剤中に存在する唯一の炭水化物/糖である。
【００７８】
1ml未満の充填体積が使用される場合、スクロースの総量は容易に算出することができ、例えば、スクロースが100mg/mlの濃度で存在し、バイアル中の充填体積が約0.5mlである場合、1バイアル当たりのスクロースの量は約50mg/バイアル又はmg/用量である。
【００７９】
バッファー:本明細書における製剤は、バッファー/緩衝系を含んでもよい。バッファーは、凍結乾燥組成物/製剤の一部である場合もあり、及び/又はその再懸濁/再構成に関連して凍結乾燥製剤に添加される場合もある。緩衝物質/系は、安息香酸、グリシルグリシン、ヒスチジン又はヒスチジンの誘導体、ヘペス、グリシン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、ビシン、トリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、或いはそれらの混合物から成る群から選択されてもよい。本発明の一実施形態において、緩衝物質の濃度は、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、1〜100mM、例えば、1〜50mM又は1〜25mM又は1〜20mM又は5〜20mM又は5〜15mM、10〜20mM、10〜30mMである。
【００８０】
本発明の一実施形態において、製剤は、ヒスチジン、好ましくはL-ヒスチジンを含む。その一実施形態において、再構成された製剤中のヒスチジン/L-ヒスチジンの濃度は、1〜10mg/mL(6.4〜64.5mMに相当する)、例えば、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜10、4〜9、4〜8、4〜7、4〜6、4〜5、5〜10、5〜9、5〜8、5〜7、5〜6、6〜10、6〜9、6〜8、6〜7、7〜10、7〜9、7〜8、8〜10、又は9〜10mg/mL等である。ヒスチジンのモル質量は、約155g/モルである。バッファー溶液は、本明細書におけるフリーズドライ製剤を再構成するために使用することもできる。ヒスチジンが、ストレス試験中にタンパク質凝集(GP-BDD-FVIIIの凝集)を妨げることがわかった。対照的に、アルギニン及びグルタミンのような他のアミノ酸並びにスクシナートのような他のバッファー薬剤は、こうしたストレス試験においてGP-BDD-FVIIIに対して効果がないことが確認された。
【００８１】
本明細書における(再構成後の)製剤のpHは、約6.0〜7.0、6.0〜7.5、又は6.2〜6.8、又は6.3〜6.7、或いは6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5である。したがって、本明細書における製剤は中性に近いpHを有しており、これは、例えば、注射、例えば、皮下投与用を意図した製剤に対して望ましい。
【００８２】
酸化防止剤/還元剤:本明細書における製剤は酸化防止剤を含む(含んでもよい)。酸化防止剤は、調製、フリーズドライ又は保存中のタンパク質酸化を妨げるか、又は低減するために使用される。本発明の一実施形態において、メチオニン(又は他の含硫アミノ酸若しくは含硫アミノ酸類似体)等の還元剤は、(主にメチオニン残基からメチオニンスルホキシドへの)酸化を阻害/低減するために添加されてもよい。添加される量は、酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。本発明の一実施形態において、製剤は、メチオニン、例えば、L-メチオニンを含む。その一実施形態において、再構成された製剤中のメチオニン/L-メチオニンの濃度は、0.5〜100mM、又は1.5〜100mM、例えば、0.5〜15、0.5〜10、0.5〜5、1〜15、1〜10、1〜5、2.0〜20.0、5.0〜20.0、10〜20、15〜20、10〜50、15〜50、20〜50、20〜100、30〜100、50〜100、50〜90、50〜80、1.5〜15、2.0〜15、5〜15、10〜15、1.5〜10.0、2.0〜10.0、5〜10、1.5〜5.0、2.0〜5.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、50、60、70、80、90、若しくは100mM等の、例えば、メチオニン等の酸化防止剤である。1.5〜100mMのメチオニンは、再構成された製剤中の約0.22〜15mg/mLのメチオニン、或いはg/バイアルのメチオニン(投与量単位)に相当する。メチオニンのモル質量は、約149.21g/モルである。代替的な酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸が使用されてもよいであろう。
【００８３】
他の賦形剤:本明細書における製剤は、追加の賦形剤を更に含んでもよい。本発明による医薬製剤に使用するための標準的な賦形剤の例は、保存料、例えば、フェノール、クレゾール、m-クレゾール、ベンジルアルコール及びフェノキシエタノール、並びに界面活性剤である。しかしながら、発明者らは少量でも標準的な保存料(例えば、クレゾール及びフェノール)がFVIII分子の不安定化をもたらす可能性もあることを発見したため、本明細書における製剤は、好ましくは基本的にはいかなる保存料も含まない。
【００８４】
本発明における使用に適した一般的な界面活性剤(括弧[ ]内に商標名を示す)は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ポリソルベート20[Tween 20]、ポリソルベート40[Tween 40]、ポリソルベート80[Tween 80]、ポロクサマー、例えば、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマー[Pluronic F68/poloxamer 188]、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル[Triton X-100]又はポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル[Brij 35]である。医薬製剤に界面活性剤を使用することは当業者に知られている。タンパク質製剤に関連して、例えば、ポリソルベート(例えば、Tween 20)等のマイルドな界面活性剤(例えば、非イオン性界面活性剤)の使用が一般に好ましい。一実施形態において、界面活性剤、例えば、Tween 20等、は、再構成された製剤中に0.00〜1.00、0.01〜0.10、0.01〜0.05、0.05〜0.10、0.05〜1.00、0.1〜1.0、0.2〜1.0、0.3〜1.0、0.4〜1.0、0.5〜1.0、0.6〜1.0、0〜7〜1.0、0.8〜1.0、0.9〜1.0、0.05〜0.80、0.1〜0.8、0.2〜0.8、0.3〜0.8、0.4〜0.8、0.5〜0.8、0.6〜0.8、0.7〜0.8、0.05〜0.50、0.1〜0.5、0.2,〜0.5、0.3〜0.5、0.4〜0.5、0.00、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、又は1.0mg/mLの界面活性剤の量で存在する。本発明に関連して、比較的少ない量の界面活性剤0.05〜0.4が好ましい。
【００８５】
酸化防止/脱気:酸化防止効果は、本明細書における製剤との接触部から酸素(空気)を追い出すこと(脱気)によって達成することができる。脱気は、本明細書におけるフリーズドライ工程の開始前に例えば、大気圧との平衡を伴ってか、又は伴わずに行われてもよい。FVIII/長時間作用型FVIIIの酸化に対する感受性は、大気の排除によって、又は酸素(空気)の置換によって完全に又は部分的に制御できる。これは、凍結及びフリーズドライの前に、液体製剤を例えば、窒素、ヘリウム又はアルゴンで飽和させることによって達成することができる。酸素(空気)の置換は、例えば、「脱気」プロセスとして行われてもよく、この場合、溶液は、(i)不活性ガス(アルゴン、ヘリウム又は窒素)への曝露及び/又は(ii)低圧、大気圧より低い圧力への曝露の1つ以上のサイクルに供される。本明細書における製剤は、例えば、バイアルを0.1バールに曝露した(フリーズドライ/FDチャンバー中)後の、N2(g)による圧力平衡化によって滅菌ろ過されても、バイアルに分配されても、脱気されてもよい。N2(又は別の不活性ガス)下におけるバイアルの密封(チャンバー中)に先立って、1、2、3、4、又は5サイクル実施されてもよい。
【００８６】
或いは、本明細書における製剤は、酸素を含まない雰囲気中で製剤を製造することによって及び酸素を含まない水中に賦形剤を溶解させること/再構成することによって脱気されてもよい。このタイプの製剤は、その後、フリーズドライされ、好ましくは、酸素を含まない条件下、例えば、封をしたバイアルを不活性ガスで満たすことによって保存される。
【００８７】
酸化防止剤の使用は、大気の排除/脱気と組み合わされてもよい。更に、本明細書における製剤は、大気の排除及び/又は酸化防止剤の使用と組み合わせて光から保護されてもよい。したがって、本発明はまた、本明細書中で定義されるフリーズドライされた、又は再構成された製剤、及び任意に不活性ガスを含む気密性のある容器(例えば、バイアル又はカートリッジ(ペン型アプリケータ用のカートリッジ等))を提供する。不活性ガスは、窒素、ヘリウム又はアルゴンから成る群から選択することができる。「気密性のある容器」という用語は、酸素(空気)の透過性が低い容器を意味する。容器(例えば、バイアル若しくはカートリッジ若しくはシリンジ)は、一般的に、任意にゴムセプタム又は他の閉鎖手段によって閉じられたガラス又はプラスチック、特にガラスでできており、医薬製剤の完全性を維持しながら、例えば、針を貫通させることができる。別の実施形態において、容器は、積層物(例えば、金属(アルミニウム等)積層プラスチック袋)等の封をした袋、例えば、封をしたプラスチック袋に同封したバイアル又はカートリッジである。
【００８８】
本発明はまた、血友病Aを処置する方法も包含し、この方法は、本発明による製剤をそれを必要とする対象に投与する工程を含む。「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、あらゆるヒト患者、又は非ヒト脊椎動物を含む。「処置すること」又は「処置」という用語は、本明細書中で使用される場合、それを必要とするあらゆるヒト又は他の脊椎動物対象の医学的治療を指す。前記対象は、医師、又は獣医師による身体的診察を受けたことが期待され、その医師、又は獣医師は、本明細書における製剤の使用が前記ヒト又はその他の脊椎動物の健康に有益であることを示す暫定診断又は確定診断を下した。そのような処置の時期及び目的は、対象の健康の現状により個体ごとに変化することもある。したがって、前記処置は、予防的、一時的、対症的及び/又は治療的である場合もある。本発明に関して、予防的、一時的、対症的及び/又は治療的処置は本発明の別々の態様を表す場合もある。
【００８９】
血友病Aの臨床的重症度は、血液中のFVIIIの機能単位の濃度によって決定され、軽症、中等症、又は重症と分類される。重症の血友病は、正常なレベルの<1%に対応する、<0.01U/mLの凝固因子レベルによって定義され、中等症及び軽症患者はそれぞれ1〜5%及び>5%のレベルを有する。
【００９０】
フリーズドライ前後のタンパク質濃度:フリーズドライ前(充填体積)及びフリーズドライ後(再構成体積)の本明細書における製剤の体積は、例えば、1:1、又は1:1に近くてもよい。一実施形態において、再構成前対再構成後の体積は、約1.0:1.1、1.0〜1.2、1.0〜1.2、1.0〜1.3、1.0〜1.4、1.0〜1.5、1.0〜1.6、1.0〜1.7、1.0〜1.8、1.0〜1.9、1.0〜2.0、1.0〜2.5、1.0〜3.0、1:0.9、1:0.8、1:07、1:0.6、1:0.5、1:0.4又は1:0.3であってもよい。
【００９１】
フリーズドライ製剤:本発明による医薬製剤は、使用前に滅菌した水又は水溶液(例えば、バッファー)中で再構成されるフリーズドライ製剤である。再構成前の本明細書におけるフリーズドライ製剤は、構造が均一な外観であり、素早く容易に再構成される(「薬学的にエレガントな」フリーズドライケーク)。フリーズドライケークのマトリクス又は原末は、主にフリーズドライされた賦形剤から成り、フリーズドライされたマトリクスは更に、本質的にフリーズドライ前にバイアルに充填された溶液の体積に相当する体積を有する。
【００９２】
再構成された製剤の総体積は、再構成溶液(バッファー/水)の体積に非常に近いため、再構成体積に対する総体積の調節は本発明においては行われない。例えば、本明細書における製剤が1mlのバッファー/水中で再構成される場合、再構成された製剤の総体積は1mlに非常に近い、例えば、約1.01〜1.05mlになり、したがって、本明細書における計算は、それらの軽微な差を考慮しない。
【００９３】
実施形態のリスト:
本発明のすべての態様及び実施形態は組み合わされてもよいと理解され、決して限定するよう理解されるべきではない。
【００９４】
実施形態1:(フリーズドライ又は再構成されたフリーズドライ)FVIII医薬製剤であって、前記製剤は、wt FVIIIと比較して増加されたインビボ循環半減期を有するFVIII分子を含み(「長時間作用型FVIII」)、再構成後の前記製剤は等張の(又は等張に近い)水性製剤であり、前記製剤は、250〜10.000IU/mLの前記FVIII分子を含み(好ましくは1000、1500、2000、2500、3000、4000、又は5000IU/mL)、2〜7mg/mLのNaCl、0.5〜5.0mg/mLのCaCl2・2H2O、及び50〜110mg/mLのスクロースを含む、医薬製剤。或いは、本発明による製剤中のスクロースは、完全に又は部分的にトレハロースで置換されてもよい。
【００９５】
実施形態2:再構成後に0.5〜15、0.5〜10、0.5〜5、1〜5、又は2〜4mgのヒスチジン、或いは、mg/mLのヒスチジンを更に含む、本発明による医薬製剤。本発明による医薬製剤は、任意に0.5〜15、0.5〜10、0.5〜5、1〜5、又は2〜5mgのメチオニン(或いは、再構成後にmg/mLのメチオニン)を更に含む。
【００９６】
実施形態3:0.05〜0.5mgの界面活性剤、或いは、再構成後に0.1〜0.5mg/mLの界面活性剤を更に含む、本発明による医薬製剤。界面活性剤は、好ましくは、非イオン性(マイルドな)界面活性剤、例えば、Tween(登録商標)20等である。
【００９７】
実施形態4:再構成された製剤の体積は、約0.2〜1.5mL、好ましくは0.3〜1.5、好ましくは0.4〜1.5、好ましくは0.5〜1.5、好ましくは0.5〜1.0、好ましくは0.5〜1.2、好ましくは0.4〜1.0、好ましくは0.4〜1.2、好ましくは0.8〜1.2mL、例えば、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、又は1mLであり、(再構成された)製剤のオスモル濃度は、約280〜400又は300〜500mOsm/kgである、本発明による医薬製剤。本製剤は、(純粋な及び/又は滅菌した)水或いはバッファー中で再構成されてもよい。好ましくは、再構成された本発明による医薬製剤の1回の投与量(好ましくは、ガラスバイアル中)は、患者への1回の投与/注射のために使用される。
【００９８】
実施形態5:前記FVIII分子は、15〜25のアミノ酸のBドメインリンカー(好ましくは17〜22のアミノ酸、好ましくは19〜21のアミノ酸)を含むBドメイン切断型分子であり、前記FVIII分子は、配列番号1のSer750残基と対応するセリンアミノ酸残基と結合したO-グリカンを介して半減期を延長する部分と結合している、本発明による医薬製剤。好ましくは、FVIII Bドメインリンカーの配列は、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4として記載される。S750残基を介した複合糖質化(glyco-conjugation)は、例えば、酵素的又は化学的方法を使用して実施されてもよい。FVIII分子の酵素的複合糖質化は、例えば、WO09108806に記載されている。
【００９９】
実施形態:6:前記FVIII分子は、水溶性ポリマーと結合している、本発明による医薬製剤。
【０１００】
実施形態7:前記水溶性ポリマーはPEGである、本発明による医薬製剤。PEGポリマーのサイズは、好ましくは約20〜100kDa、より好ましくは約30〜50kDa、例えば、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100kDa等である。
【０１０１】
実施形態8:前記水溶性ポリマーは、ヘパロサンである、本発明による医薬製剤。ヘパロサンポリマーのサイズは、好ましくは約20〜150kDa、50〜150kDa、50〜100kDa、より好ましくは30〜50kDa、より好ましくは70〜90kDa、例えば、20、30、40、50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、100、120、140、又は150kDa等である。
【０１０２】
実施形態9:前記FVIII分子は、融合タンパク質(融合パートナーと融合したFVIII)である、本発明による医薬製剤。
【０１０３】
実施形態10:前記融合分子の融合パートナーは、アルブミン、Fcドメイン、Fcレセプター、及び約200〜400アミノ酸のFVIII Bドメインフラグメントから成るリストから選択される、本発明による医薬製剤。
【０１０４】
実施形態11:250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.0mg/mLのNaCl、80mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び3mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、本発明による医薬製剤。
【０１０５】
実施形態12:250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び0.5〜1mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、本発明による医薬製剤。
【０１０６】
実施形態13:250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、90mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、本発明による医薬製剤。
【０１０７】
実施形態14:250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4mg/mLのNaCl、100mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、本発明による医薬製剤。
【０１０８】
実施形態15:1000〜10,000IU/mLのFVIII、1〜4mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、7mg/mLのNaCl、100mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、本発明による医薬製剤。
【０１０９】
実施形態16:250〜10,000IU/mLのFVIII、1.5mg/mlのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び0.5〜1mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、本発明による医薬製剤。
【０１１０】
実施形態17:再構成後の前記製剤は、2.5〜3.5mg/mLのヒスチジン、例えば、3.1mg/mLのヒスチジン等を含む、本発明による医薬製剤。
【０１１１】
実施形態18:再構成後の前記製剤は、3〜4mg/mLのNaCl、例えば、3.5mg/mLのNaCl等を含む、本発明による医薬製剤。
【０１１２】
実施形態19:再構成後の前記製剤は、0.3〜1.0mg/mLのCaCl2・2H2O、例えば、0.5mg/mLのCaCl2・2H2O等を含む、本発明による医薬製剤。
【０１１３】
実施形態20:再構成後の前記製剤は、2〜3mg/mLのメチオニン、例えば、2.5mg/mLのメチオニン等を含む、本発明による医薬製剤。
【０１１４】
実施形態21:再構成後の前記製剤は、60〜80mg又は70〜80mg/mLのスクロース、例えば、70mg/mLのスクロース等を含む、本発明による医薬製剤。
【０１１５】
実施形態22:再構成後の前記製剤は、0.2〜0.4mg/mLの非イオン(及び/又はマイルドな)界面活性剤、例えば、0.4mg/mLのポリソルベート20(Tween(登録商標)20)等を含む、本発明による医薬製剤。
【０１１６】
実施形態23:酸化したFVIII軽鎖分子の量は、FVIIIの総量の10%未満、好ましくは9%未満、好ましくは8%未満、好ましくは7%未満、好ましくは6%未満、好ましくは5%未満、好ましくは4%未満、好ましくは3%未満、好ましくは2%未満又は好ましくは1%未満である、本発明による医薬製剤。好ましくは、酸化したFVIII軽鎖生成物の量は、20〜30℃における3か月、4か月、5か月又は6か月間の保存後に測定される。
【０１１７】
実施形態24:本製剤は、0.5〜15mM(好ましくは0.5〜5mM)のヒスチジン溶液中で再構成される、本発明による医薬製剤。再構成された製剤の体積は、好ましくは約0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1ml、1.2ml、1.3ml、1.4mL、又は1.5mLである。
【０１１８】
実施形態25:再構成後の前記製剤は、250〜10.000IU/mLのFVIII、3.5mg/mLのNaCl、0.5〜1.0mg/mLのCaCl2 2H2O、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLのTween20/ポリソルベート20、350〜400mOsm/kgを含み、前記製剤は、10mMのヒスチジン溶液中で再構成される、本発明による医薬製剤。
【０１１９】
実施形態26:再構成前のフリーズドライ製剤は、薬学的にエレガントなフリーズドライケークである、本発明による医薬製剤。フリーズドライケークは、好ましくは、ガラスバイアル等の投与バイアルの底部に配置される。フリーズドライケークの体積は、好ましくは、本質的にフリーズドライ前の充填体積に相当する。
【０１２０】
実施形態27:(フリーズドライ又は再構成されたフリーズドライ) FVIII医薬製剤であって、前記製剤は、wt FVIIIと比較して増加されたインビボ循環半減期を有するFVIII分子を含み、前記製剤は、再構成後、水性で等張の製剤であり、前記製剤は、(再構成後)250〜10.000IU/mLの前記FVIII分子、低いNaCl濃度(例えば、再構成後1〜5mg/mLのNaCl)、高い糖/スクロース濃度(例えば、再構成後60〜80mg/mLのスクロース)、約0.5〜1mg/mLのCaCl2(2H2O)を含み、酸化したFVIII軽鎖分子の量は、FVIIIの総量の10%、好ましくは5%、好ましくは1%未満である、医薬製剤。再構成された製剤の総体積は、好ましくは約1mL以下、例えば、0.3又は0.5mLである。好ましくは、30℃における3か月の保存後の酸化したFVIII軽鎖の量は、5%未満である。
【０１２１】
実施形態28:本発明による(フリーズドライ又は再構成されたフリーズドライ)医薬製剤を作製するための方法であって、前記方法は、(液体)製剤の低圧(1気圧よりも著しく低い、例えば、0.01〜0.50気圧)への曝露による液体製剤の脱気の工程に続く液体製剤のフリーズドライ前の不活性ガスによる圧力平衡を含む、方法。凍結及びフリーズドライ前の液体製剤の脱気の工程は、1回、2回、3回、4回、又は更には5回以上、約1〜120分間、好ましくは1〜60分間、好ましくは1〜45分間、好ましくは1〜40分間、好ましくは1〜30分間、好ましくは1〜20分間、好ましくは1〜15分間、好ましくは1〜10分間、好ましくは5〜120分間、好ましくは5〜60分間、好ましくは5〜45分間、好ましくは5〜40分間、好ましくは5〜30分間、好ましくは5〜20分、好ましくは5〜15分間、好ましくは10〜120分間、好ましくは10〜60分間、好ましくは10〜45分間、好ましくは10〜40分間、好ましくは10〜30分間、好ましくは10〜20分、好ましくは10〜15分間、好ましくは15〜120分間、好ましくは15〜60分間、好ましくは15〜45分間、好ましくは15〜30分間、好ましくは15〜20分間、又は好ましくは20〜40分間実施されてもよい。フリーズドライ製剤は、患者への投与に先立って、水、又は水溶液/バッファー中で再構成される。製剤、及び好ましくは再構成に使用される溶液も、脱気及びフリーズドライに先立って滅菌ろ過工程に供されるのが好ましい。
【０１２２】
実施形態29:本発明による(フリーズドライ又は再構成されたフリーズドライ)医薬製剤を作製するための方法であって、前記方法は、基本的に酸素を含まない水(例えば、脱気水)に賦形剤(FVIII、糖、塩等)を溶解させて、続いて得られた液体製剤をフリーズドライする工程を含む、方法。この方法は、好ましくは、実質的に酸素のない雰囲気(例えば、N2)中で行われる。
【０１２３】
実施形態30:本発明による方法によって生成されるか、若しくは得られる、又は得ることができる医薬製剤。
【０１２４】
実施形態31:血管外、好ましくは、皮下投与用を意図した、本発明による医薬製剤。皮下投与用を意図した製剤は、好ましくは、1か月に1回、1か月に2回、1週間に1回、1週間に2回、1日に1回、1日に2回、又は1日に3回投与される。
【０１２５】
実施形態32:静脈内投与用を意図した、本発明による医薬製剤。静脈内投与用を意図した製剤は、好ましくは、1か月に1回、2週間に1回、1週間に1回、1週間に2回、1週間に3回、1日に1回、1日に2回、又は1日に3回或いは要求に応じて投与される。
【０１２６】
実施形態33:1日に1回又は週に1回の投与用を意図した、本発明による医薬製剤。
【０１２７】
実施形態34:血友病Aの処置に使用するための本発明による医薬製剤。
【０１２８】
実施形態35:血友病、好ましくは、血友病Aの処置の方法であって、前記方法は、本発明による医薬製剤のそれを必要とする患者への投与を含む、方法。
【実施例】
【０１２９】
本明細書における実施例全体をとおして、以下のフリーズドライヤーを使用した:Steris Lyovac FCM10、Usifroid SMH 45S又はGenesis 25 LSQ EL-85。フリーズドライ製剤の見た目又は安定性の差がフリーズドライ装置のタイプ(フリーズドライヤーのタイプ)に関連する可能性はなかった。
【０１３０】
(実施例1)
脱気手順:
脱気:液体製剤を含むバイアルをフリーズドライヤーの棚に置き、棚を5℃に冷却した。その後、100mBarまで圧力を下げ、この圧力を20分間保持した。その後、窒素を用いて900mBarまで圧力を上げ、この圧力を20分間保持した。その後、再び100mBarまで圧力を下げ、圧力を100mBarで20分間保持した。その後、窒素を用いて大気圧まで圧力を上げ、フリーズドライを開始した。
【０１３１】
脱気前の製剤中の酸素含有量は約320マイクロモル/Lであった。この脱気手順後の製剤中の酸素含有量(フリーズドライの開始の前)は約30マイクロモル/Lであった。脱気前後の酸素濃度の差は、本明細書における脱気手順が製剤中の酸素含有量を低減する効果的な方法であることを示す。
【０１３２】
また、脱気手順を最初に棚を冷却することなく室温で実施したところ、同様の結果であり、脱気後の酸素含有量を約30マイクロモル/Lと測定した。
【０１３３】
(実施例2)
試験化合物の生成:
複合糖質化されたBドメイン切断型/除去型FVIIIは、例えば、WO09108806の実施例1に開示されているとおりに生成することができる。
【０１３４】
(実施例3)
逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)による酸化した軽鎖のパーセンテージの決定:
糖PEG化(glycopegylated)されたBドメイン除去型第VIII因子(実施例2に従って生成したGP-BDD-FVIII)の化学的安定性をRP-HPLCによって評価した。この方法を、1つのサンプル中のタンパク質の総量と比較した、酸化した軽鎖(LC)のパーセンテージを定量するために使用した。例えば、フリーズドライ前に脱気を伴う、及び伴わない、さまざまな条件下において、生成したGP-BDD-FVIIIの化学的安定性を比較するために酸化したLC%を使用した。さまざまな製剤中におけるGP-BDD-FVIIIの化学的安定性を比較するために酸化したLC%を更に使用した。
【０１３５】
逆相HPLC分析のために、ジメチルブチルジメチルシランC4カラムを使用した(DMeBuDMeSi、FEF Chemicals社、デンマーク)。孔サイズ:300Å、粒径:5μm、カラム寸法2.1×250mm。移動相A:0.15% TFA、移動相B:0.14% TFA、80% MeCN。流量:0.5mL/分。グラジエント:時間/%B:0/35 28/80.5 29/100 34/100 35/35。
【０１３６】
(実施例4)
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)によるFVIII HMWP%の決定:
GP-BDD-FVIIIの物理的安定性、凝集傾向をSE-HPLCによって評価した。この方法を、1つのサンプル中のタンパク質の総量と比較した、凝集したタンパク質/高分子量タンパク質のパーセンテージ(HMWP%)を定量するために使用した。さまざまな製剤中のGP-BDD-FVIIIの物理的安定性を比較するためにHMWP%を使用した。SE-HPLC分析(実施例6〜14、21)のためにSepax Zenix、SEC-300カラムを使用した。孔サイズ:300Å、カラム寸法:300×7.8mm、溶出バッファー:10mMのビストリスプロパン、500mMのNaCl、10mMの酢酸カルシウム、10%の2-プロパノール、pH6.8、流量:0.3mL/分、ランタイム60分。HMWP%は、クロマトグラムの総積分ピーク面積と比較した、主ピーク前に溶出するピーク/複数のピークの積分ピーク面積のパーセンテージとして定量する。
【０１３７】
SE-HPLC分析のために(実施例15〜18、20、22〜24において)Sepax、SRT SEC-500カラムを使用した。孔サイズ:500Å、カラム寸法:300×7.8mm、溶出バッファー:10mMのトリス、300mMのNaCl、10mMの塩化カルシウム、5%の2-プロパノール、pH7、流量:0.3mL/分、ランタイム60分。HMWP%は、クロマトグラムの総積分ピーク面積と比較した、主ピーク前に溶出するピーク/複数のピークの積分ピーク面積のパーセンテージとして定量する。
【０１３８】
(実施例5)
濃縮方法
GP-BDD-FVIIIの濃度は、主ピーク/GP-BDD-FVIIIモノマーのピークの面積に基づいて求めることができる。SE-HPLCクロマトグラムのこのピーク面積を、既知の濃度の基準材料を使用して標準曲線と比較する(直交法によって求めた)。濃度決定に使用されるSE-HPLC法は、実施例4に記載されるものと同一である。
【０１３９】
(実施例6)
脱気の効果
糖PEG化されたBドメイン除去型第VIII因子(GP-BDD-FVIII)を含む製剤を以下の組成を用いて調製した:1000IU/mLのGP-BDD-FVIII、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、0.22mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20。その製剤をバイアルに分けた。これらのバイアルを以下の2群に分けた。1群はフリーズドライに先立って脱気に供し、1群は、先行する脱気を行わずにフリーズドライした。同じフリーズドライプログラムを使用してすべてのバイアルをフリーズドライした(Table 6.1(表2)を参照)。
【０１４０】
脱気手順:凍結工程前にフリーズドライヤー中で脱気を行った。+20℃で20分間低圧(100mbar)を適用することによって液体から酸素を除去した。窒素ガスにより圧力を1気圧(1013mbar)に平衡化した。凍結工程の前に脱気手順を繰り返した。
【０１４１】
【表２】
2018532783.tif 000014
【０１４２】
先行する脱気を行った、及び行わないフリーズドライ後のフリーズドライ製剤を1.1mLの10mMヒスチジン、pH6.0で再構成し、(実施例3に記載されているとおり)酸化型に関してRP-HPLCによって分析した。酸化したLCのパーセンテージをフリーズドライの直後(T=0において)、並びに30℃及び40℃での3週間後(フリーズドライ製剤の保存)に求めた、Table 6.2(表3)のデータを参照のこと。
【０１４３】
【表３】
2018532783.tif 000015
【０１４４】
したがって、GP-BDD-FVIIIの酸化は、フリーズドライに先立つ脱気時に著しく低減される。T=0(フリーズドライの直後)並びに特に30℃及び40℃での3週間の保存後に酸化したLCの低いパーセンテージが検出された(Table 6.2(表3)に示すデータ)。
【０１４５】
(実施例7)
脱気の効果
糖PEG化されたBドメイン除去型第VIII因子(GP-BDD-FVIII)を含む製剤を以下の組成を用いて調製した:1000IU/mLのGP-BDD-FVIII、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20。この製剤は、実施例6に記載されている製剤と類似しているが、10倍を超えるメチオニンを更に含む。
【０１４６】
その製剤をバイアルに分け、同じフリーズドライプログラム(Table 6.1(表2)を参照)を使用してフリーズドライした。フリーズドライに先立ってこれらのバイアルを以下の2つの群に分けた。一方の群は、フリーズドライに先立って脱気し、他方の群は、脱気に供さなかった。
【０１４７】
脱気手順:凍結工程前に実施例6に記載されているとおりにフリーズドライヤー中で脱気を行った。
【０１４８】
先行する脱気を行った、及び行わないフリーズドライ後のフリーズドライ製剤を1.1mLの10mMヒスチジン、pH6.0で再構成し、酸化型に関して分析した。RP-HPLCによって、フリーズドライの直後(T=0)、並びに30℃及び40℃における1か月後(フリーズドライ製剤の保存)の酸化したLCのパーセンテージを求めた。Table 7.1(表4)のデータを参照のこと。
【０１４９】
【表４】
2018532783.tif 000016
【０１５０】
GP-BDD-FVIIIの酸化はフリーズドライに先立つ脱気時に著しく低減されることが観察された。T=0(フリーズドライの直後)、並びに特に30℃及び40℃における1か月の保存後に酸化したLCの低いパーセンテージが検出された(Table 7.1(表4)に示すデータ)
【０１５１】
Table 6.2(表3)及びTable 7.1(表4)のデータの比較は、メチオニンが0.22mg/mL(実施例6で調査した製剤)から2.5mg/mL(実施例7で調査した製剤)に増やされた場合、酸化型の含有量が低減されることを示す。しかしながら、最もメチオニン濃度が高い製剤(2.5mg/mL、16.8mM)でも、FVIII酸化を許容できるレベル(例えば、酸化型5%未満)に維持するためには依然として脱気が必要である。
【０１５２】
(実施例8)
メチオニン添加:
LCの酸化に対するメチオニンの効果を調査するために、糖PEG化されたBドメイン除去型第VIII因子(GP-BDD-FVIII)を含む一連の製剤を調製した。製剤は以下の組成を有するものとした:1000IU/mLのGP-BDD-FVIII、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20。これらの製剤は、結果Table 8.1(表5)及びTable 8.2(表6)に示すとおりにメチオニン濃度を変化させた。
【０１５３】
製剤をTable 6.1(表2)に示すフリーズドライプログラムによってフリーズドライした。製剤は、先行する脱気を行わずにフリーズドライした。
【０１５４】
【表５】
2018532783.tif 000017
【０１５５】
GP-BDD-FVIIIの酸化がメチオニン濃度を増加させた際に著しく低減されたことが観察され、Table 8.1(表5)のデータによって示された。酸化したGP-BDD-FVIIIの最も低いレベルは、10mg/mLのメチオニンを含む安定性サンプルに対して観察された。
【０１５６】
更に、10mg/mLのメチオニンを含む製剤を除いて(加速安定性試験の)すべての時点で調査したGP-BDD-FVIII製剤中のHMWP%が低かったことが観察され、Table 8.2(表6)のデータによって示された。この製剤、#4は、フリーズドライ後(T=0において)及び3週間の保存後に予想外の高いHMWP値を有した。追加のメチオニン濃度を含む追加の実験を実施例16で行った。
【０１５７】
【表６】
2018532783.tif 000018
【０１５８】
(実施例9)
オスモル濃度を低下させるための賦形剤濃度の低下
(オスモル濃度を低下させるために)賦形剤濃度を低下させた場合のGP-BDD-FVIIIの物理的安定性に対する影響を調査するために2つの異なる製剤を作製した。2つの製剤(#1及び#2)中の賦形剤の組成についてはTable 9.1(表7)に記載する。
【０１５９】
【表７】
2018532783.tif 000019
【０１６０】
2つの製剤(Table 9.1(表7)に記載した#1及び#2)をTable 9.2(表8)に記載したフリーズドライプログラムに従ってフリーズドライした。
【０１６１】
【表８】
2018532783.tif 000020
【０１６２】
SE-HPLC分析(HMWP%の決定)に先立って、フリーズドライ製剤を1.2mLのヒスチジンバッファー、pH6.0(フリーズドライ前のバイアルの充填体積の3倍)中で再構成した。製剤#1及び製剤#2(Table 9.1(表7))のSE-HPLC分析からの結果をTable 9.3(表9)に示す。
【０１６３】
NaCl及びスクロースの両方の濃度が低下した場合に、保存中のHMWP形成(GP-BDD-FVIII凝集)の有意な増加が観察された。
【０１６４】
【表９】
2018532783.tif 000021
【０１６５】
(実施例10)
高塩+低スクロース又は低塩+高スクロース
フリーズドライ中のHMWP形成に対するスクロース及びNaClの影響を調査するために一連のさまざまな製剤を調製した。製剤間の主な変化は、NaCl及びスクロースの濃度であった。製剤の組成をTable 10.3(表12)に示す。
【０１６６】
NaCl濃度及びスクロース濃度の変化ゆえ、見た目の良いフリーズドライケークを維持するために異なるフリーズドライプログラムを必然的に使用し、このフリーズドライケークは、フリーズドライ中に崩壊しなかった。製剤#1、製剤#2、製剤#3及び製剤#4にはTable 10.1(表10)に記載されているフリーズドライプログラムを使用したのに対して、製剤#5及び製剤#6はTable 10.2(表11)に記載されているフリーズドライプログラムを使用してフリーズドライした。
【０１６７】
【表１０】
2018532783.tif 000022
【０１６８】
【表１１】
2018532783.tif 000023
【０１６９】
比較的類似したオスモル濃度(オスモル濃度<450mOsm/kg)及び再構成後に類似したタンパク質濃度を有するよう製剤を設計した。したがって、フリーズドライ前に、異なる再構成体積及びタンパク質濃度を必然的に使用した。
【０１７０】
比較的高いNaCl濃度を有する製剤に関して、フリーズドライ前に36〜30mg/mLのNaClを含む製剤#1、製剤#2、製剤#3及び製剤#4は再構成中に3×希釈を必要とした(これは、再構成体積がフリーズドライ前のバイアル中の充填体積よりも3倍大きいことを意味する)。フリーズドライ前に<450mOsm/kgのオスモル濃度を有する製剤(例えば、8mg/mLのNaClを有する#5及び3.5mg/mLのNaClを有する#6)に関して、再構成体積は充填体積と一致した。すべての製剤を10mMのヒスチジンバッファー、pH6.0によって再構成した。
【０１７１】
フリーズドライ前、並びにフリーズドライ直後の製剤中のHMWPのパーセンテージをSE-HPLCによって求めた。その結果をTable 10.3(表12)に示す。
【０１７２】
【表１２】
2018532783.tif 000024
【０１７３】
Table 10.3(表12)のデータは、HMWP値の比較的小さな変動を示す。これは、スクロース濃度を70mg/mLまで増加させたとき(製剤#6)、フリーズドライ中にGP-BDD-FVIII安定性を損なうことなく、NaClを10分の1に低下させることができる(製剤#1及び製剤#2は、フリーズドライ前に36mg/mLのNaClを含む)ことを示している。対照的にNaCl濃度及びスクロース濃度の両方の低下は、フリーズドライ及び保存中のGP-BDD-FVIIIの安定性を低下させることがわかった(実施例9に提示するデータ)。
【０１７４】
フリーズドライケークは、崩壊した#5を除いて見た目が良かった。さまざまなスクロース濃度及びNaCl濃度におけるフリーズドライケーク構造の安定性を調査するために追加の試験を行った(実施例19)。
【０１７５】
このデータは、タンパク質安定剤としてスクロースを使用する場合、オスモル濃度を低下させるためにNaCl濃度を低下させてもよく、それにより、1:1の再構成を可能にすることを示す。なお、水1mL当たり1mgのスクロースは、1mgのNaClと比較して、オスモル濃度の増加がはるかに小さく、それは、その高分子量と、塩ではない(そのため、それぞれがオスモル濃度の増加に寄与する個々のイオンに解離しない)という事実のためである。
【０１７６】
(実施例11)
マンニトール添加
マンニトールがNaCl(及びスクロース)の可能な代替品として使用できるかどうかを調査するために、3つの異なるマンニトール含有製剤(F9a、F9b、及びF9d)を調製した。フリーズドライ中のHMWP形成に対するマンニトールの効果を調査した。GP-BDD-FVIII製剤は、表11.3に示したとおりに賦形剤を含むものとした。製剤は、フリーズドライ製剤中でマトリクスを生成する主要な構成成分としてスクロース及びマンニトールを含むものとした(乾物のパーセンテージ単位)。再構成後に<400mOsm/kgのオスモル濃度を有するよう製剤を設計した。
【０１７７】
Table 11.1(表13)及びTable 11.2(表14)に記載されている2つの異なるフリーズドライプログラムを用いて製剤を試験した。
【０１７８】
【表１３】
2018532783.tif 000025
【０１７９】
【表１４】
2018532783.tif 000026
【０１８０】
HMWPデータ(Table 11.4(表16))は、試験した両方のフリーズドライプログラム(Table 11.1(表13)及びTable 11.2(表14))に関して、マンニトール含有製剤が、マンニトールを含まない製剤と比較して高いHMWPのパーセンテージを有したことを示している(Table 10.3(表12)に提示したデータを参照)。
【０１８１】
マンニトール含有製剤(Table 11.3(表15)のF9a、F9b、F9d)に関して、低スクロース(10mg/mLのスクロース+25mg/mLのマンニトール)と比較して高スクロース(20mg/mLのスクロース+20mg/mLのマンニトール)は、より低いHMWPのパーセンテージをもたらすことがわかった。これは、スクロースがフリーズドライ中に安定化賦形剤であることを示す実施例10の観察結果と一致する。
【０１８２】
【表１５】
2018532783.tif 000027
【０１８３】
【表１６】
2018532783.tif 000028
【０１８４】
(実施例12)
GP-BDD-FVIIIに対するトレハロースの安定効果
トレハロースの安定効果の可能性を調査するために4つの製剤を調製した(製剤#63、64、65、66)。製剤は、0.5mg/mLのGP-BDD-FVIII(約5000U/mL)、3.5mg/mLのNaCl、2mg/mLのCaCl2・2H2O、1.6mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、15mg/mLのスクロース、0.2mg/mLのtween 20、pH7を含むものとした。製剤は、以下のとおりトレハロース濃度が異なった:60mg/mL、80mg/mL、90mg/mL及び100mg/mL。
【０１８５】
これらの製剤は、フリーズドライしなかったが、熱に曝露した間のGP-BDD-FVIIIの物理的安定性を比較するために液体サンプルとして50℃で30分間ストレスを与えた。これらのサンプルを、熱に曝露する前後のHMWP%の定量のためにSE-HPLCによって分析した。そのデータをTable 12.1(表17)に示す。
【０１８６】
【表１７】
2018532783.tif 000029
【０１８７】
(トレハロースの濃度を増加させると)トレハロースの明らかな安定効果が、ストレスを与えたサンプル中の低いHMWP%として観察された。
【０１８８】
(実施例13)
GP-BDD-FVIIIに対するヒスチジンの安定効果
ヒスチジンの潜在的な安定効果を調査するために3つの製剤を調製した(製剤#54、55、56)。製剤は、0.5mg/mLのGP-BDD-FVIII(約5000U/mL)、3.5mg/mLのNaCl、2mg/mLのCaCl2・2H2O、2.5mg/mLのメチオニン、70mg/mLのスクロース、0.2mg/mLのtween 20、pH7を含むものとした。製剤は、以下のとおりヒスチジン濃度が異なった:3mg/mL、5mg/mL及び7mg/mL。
【０１８９】
これらの製剤は、フリーズドライしなかったが、熱に曝露した間のGP-BDD-FVIIIの物理的安定性を比較するために液体サンプルとして50℃で30分間ストレスを与えた。これらのサンプルを、熱に曝露する前後のHMWP%の定量のためにSE-HPLCによって分析した。そのデータをTable 13.1(表18)に示す。
【０１９０】
【表１８】
2018532783.tif 000030
【０１９１】
(ヒスチジンの濃度を増加させると)ヒスチジンの明らかな安定効果が、ストレスを与えたサンプル中の低いHMWP%として観察された。対照的に、同じストレス条件に曝露した同様の製剤中でアルギニン、グルタミン及びスクシナートの効果は観察されなかった。
【０１９２】
(実施例14)
2つの異なる脱気手順の効果
60分間の脱気時間を適用して、フリーズドライプロセスの開始の前に窒素による大気圧への平衡化を伴う/伴わない脱気手順のGP-BDD-FVIIIの酸化に対する効果を調査した。Table 25.1(表42)に記載されているプログラムに従ってすべての製剤をフリーズドライした。GP-BDD-FVIII製剤は、2000IU/mLのGP-BDD-FVIII、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、70mg/mLのスクロース、及び0.4mg/mLのポリソルベート20を含む。
【０１９３】
液体製剤を含むバイアルをフリーズドライヤーの棚に置き、棚を5℃に冷却した。2つの別々のフリーズドライヤー中で以下の手順に従って凍結工程に先立って製剤を脱気した:フリーズドライヤー1:+20℃で60分間、低圧(100mbar)を適用することによって液体から酸素を除去した。窒素ガスにより圧力を1気圧(1013mbar)に平衡化した。凍結工程前に一度だけ脱気手順を実施した。
【０１９４】
フリーズドライヤー2:+20℃で60分間、低圧(100mbar)を適用することによって液体から酸素を除去した。凍結工程前に一度だけ脱気手順を実施した。圧力を大気圧にまで上げることなく脱気手順の直後に凍結工程を開始した。
【０１９５】
【表１９】
2018532783.tif 000031
【０１９６】
データは、60分の脱気時間の使用が、2×20分間の脱気時間と比較して高い酸化型の含有量をもたらすことを示す。更に、データは、大気圧への平衡化が実施されるかどうかは酸化型の含有量に対して重要でないことを示す。
【０１９７】
(実施例15)
糖HEP化(Glyco-HEPylated)BDD-FVIIIを含むsc製剤
一実験において、さまざまな強度のさまざまな長時間作用型FVIII分子をフリーズドライし、調査した。調査した長時間作用型FVIIIタンパク質は、GP-BDD-FVIII及び同じBDD FVIII分子のHEP化したもの(糖HEP化Bドメイン除去型FVIII、GH-BDD-FVIII)であった。
【０１９８】
前の実施例とは異なり、この実施例のタンパク質は、製剤化作業に先立って精製し、高塩バッファー中で保存した:12mg/mLのスクロース、36mg/mLのNaCl、1mg/mLのCaCl2、6mg/mLのL-ヒスチジン、0.22mg/mLのメチオニン、0.4mg/mLのTween 80。このタンパク質を70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、0.4mg/mLのポリソルベート20を含むバッファーにバッファー交換した。このタンパク質を、約9000IU/mL(原液)に濃縮した。さまざまな強度(250IU/mL、2000IU/mL、6000IU/mL)のFVIII分子を、9000IU/mLの原液の希釈により調製した。
【０１９９】
すべてのタンパク質溶液を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。凍結工程に先立ってフリーズドライヤー中で以下の手順に従って製剤を脱気した:+20℃で20分間、低圧(100mbar)を適用することによって液体から酸素を除去した。窒素ガスにより圧力を1気圧(1013mbar)に平衡化した。この手順を凍結工程前に2回繰り返した。
【０２００】
【表２０】
2018532783.tif 000032
【０２０１】
フリーズドライに先立ってバイアルを1mLの製剤で満たした。フリーズドライ後に、フリーズドライ製剤を1mLの10mMヒスチジンバッファーによって再構成し、SE-HPLCによって分析して凝集したタンパク質の含有量(HMWP%)を定量した。これらのデータをTable 15.2(表21)に示す。
【０２０２】
【表２１】
2018532783.tif 000033
【０２０３】
さまざまな長時間作用型FVIII分子(GP-BDD-FVIII及びGH-BDD-FVIII)を製剤化し、高い強度(6000IU/mL)、高濃度のスクロースを含み、オスモル濃度が低い(350〜400mOsm/kg、フリーズドライ前及び再構成後)(sc)製剤にフリーズドライすることができることが確認された。
【０２０４】
(実施例16)
脱気、メチオニン添加及びFVIII LCの酸化の低減
一実験において、1000IU/mLのGP-BDD-FVIII、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20を含むフリーズドライ製剤を、以下のさまざまな濃度のメチオニンとともに調製した:0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10mg/mL。
【０２０５】
1mLの充填体積の製剤でフリーズドライバイアルを満たした。この製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。すべての製剤を、先行する脱気を伴う及び伴わないの両方でフリーズドライした。凍結工程に先立ってフリーズドライヤー中で実施例15に記載されている手順に従って脱気を行った。
【０２０６】
フリーズドライ後、1か月の保存のためにバイアルを3つの異なる温度、-80℃、+30℃及び+40℃で保存した。保存後にフリーズドライ製剤を1mLのヒスチジンバッファー、pH6.0によって再構成し、SE-HPLCによって直接分析して、凝集したタンパク質の含有量(HMWP%)を定量した。再構成した製剤のアリコートを、タンパク質酸化(酸化型%)の定量のためのRP-HPLC分析まで-80℃で保存した。データをTable 16.1(表22)(HMWP%)、Table 16.2(表23)(フリーズドライに先立って脱気を行っていない製剤中の酸化型%)及びTable 16.3(表24)(脱気を行った製剤中の酸化型%)に示す。
【０２０７】
【表２２】
2018532783.tif 000034
【０２０８】
調査した全メチオニン濃度範囲においてフリーズドライ前後ともに、凝集したタンパク質の低いパーセンテージ(HMWP%<3%)が観察された。しかしながら、フリーズドライ後、最も高いメチオニン濃度を含む製剤中で最も多量のHMWPが観察された。このデータは、HMWP形成を制限することに関する最適なメチオニン濃度が、0.25〜7.5mg/mLの間であることを示している。このデータは更に、フリーズドライに先立つ脱気がGP-BDD-FVIII凝集に対して影響がないことを示している。
【０２０９】
【表２３】
2018532783.tif 000035
【０２１０】
Table 16.2(表23)のデータは、フリーズドライ後のFVIII酸化(酸化型%)は、保存温度が高くなると増加すること(データの垂直比較)、及びこの酸化は、メチオニンの濃度が高くなると低減されること(データの水平比較)を示している。
【０２１１】
30℃及び40℃での保存時、フリーズドライに先立つ脱気は、GP-BDD-FVIII酸化を低減するためには必須である(とりわけメチオニン濃度が低い場合)。Table 16.2(表23)のデータ(フリーズドライ前に脱気を行っていない製剤)とTable 16.3(表24)(脱気を行った製剤)のデータとの比較から、脱気がFVIII酸化を低減することは明らかである。GP-BDD-FVIIIの酸化は主に高温での保存中に起こるが、フリーズドライ中又は製剤が脱気されておらず、メチオニンを5mg/mL未満含む場合-80℃でも観察されている。
【０２１２】
このデータは、調査したフリーズドライ製剤の保存安定性に脱気及びメチオニンが必須であることを示している。
【０２１３】
これらの一連のデータの1データ点は疑問視される可能性がある。(フリーズドライ前に脱気し、30℃で1か月保存した)10mg/mLのメチオニンを含む製剤中の酸化型の含有量が予想よりも高く、これは、例えば、標識化中に取り扱いに誤りがあったというのが妥当と思われる。
【０２１４】
【表２４】
2018532783.tif 000036
【０２１５】
(実施例17)
CaCl2の安定効果
一実験において、GP-BDD-FVIII、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20を含むフリーズドライ製剤を、以下のさまざまなCaCl2の濃度とともに調製した:1.2mM、2.3mM、4.1mM、6.8mM、12.2mM(0.17mg/mL、0.34mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL及び1.8mg/mLのCaCl2・2H2O)。製剤は、0.11mg/mL又は0.17mg/mLのいずれかのGP-BDD-FVIIIを含むものとした(データTable 17.1(表25)によって示す)。
【０２１６】
1mLの充填体積の製剤でフリーズドライバイアルを満たした。この製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。すべての製剤は先行する脱気に供した。凍結工程に先立ってフリーズドライヤー中で実施例15に記載されている手順に従って脱気を行った。
【０２１７】
フリーズドライ後、1か月の保存のためにバイアルを3つの異なる温度、-80℃、+30℃及び+40℃で保存した。保存後にフリーズドライ製剤を1mLのヒスチジンバッファー、pH6.0によって再構成し、SE-HPLCによって直接分析して、凝集したタンパク質の含有量(HMWP%)を定量した。
【０２１８】
【表２５】
2018532783.tif 000037
【０２１９】
CaCl2の増加は、フリーズドライ中及びフリーズドライGP-BDD-FVIII製剤の保存中にGP-BDD-FVIIIを安定化させ、この試験ではCaCl2を1.2から12.2mMまで高め、データは、6.8mMのCaCl2(1mg/mLのCaCl2・2H2O)又は更に高い製剤中では、GP-BDD-FVIII凝集がフリーズドライ及び高温での1か月の保存による影響を受けないことを示す。
【０２２０】
(実施例18)
Tween 20濃度の変化
一実験において、2000IU/mLのGP-BDD-FVIII、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、3.4mMのCaCl2を含むフリーズドライ製剤を、以下のさまざまな濃度のtween 20(ポリソルベート20)とともに調製した:0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL及び0.4mg/mL。
【０２２１】
1mLの充填体積の製剤でフリーズドライバイアルを満たした。フリーズドライの前に実施例15に記載されている手順に従って製剤の脱気を行った。この製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。
【０２２２】
フリーズドライ後、1か月の保存のためにバイアルを3つの異なる温度、-80℃、+30℃及び+40℃で保存した。保存後にフリーズドライ製剤を1mLのヒスチジンバッファー、pH6.0によって再構成し、直接SE-HPLCによって分析して、タンパク質濃度(GP-BDD-FVIII、mg/mLで)及び凝集したタンパク質の含有量(HMWP%)を定量する。再構成した製剤のアリコートを、RP-HPLC分析によってタンパク質酸化(酸化型%)の定量まで-80℃で保存した。データをTable 18.1(表26)(HMWP%)、Table 18.2(表27)(タンパク質濃度)及びTable 18.3(表28)(酸化型%)に示す。
【０２２３】
【表２６】
2018532783.tif 000038
【０２２４】
【表２７】
2018532783.tif 000039
【０２２５】
【表２８】
2018532783.tif 000040
【０２２６】
HMWP、タンパク質濃度及びタンパク質酸化は、0.1〜0.4mg/mLの調査した濃度範囲内のTween 20濃度の変化によっては影響されない。
【０２２７】
(実施例19)
フリーズドライケーク構造に対するNaClとスクロースの比の影響
一実験において、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20を含むフリーズドライプラセボ製剤を、下記表によって示したさまざまな濃度のCaCl2、NaCl及びスクロースとともに調製した。フリーズドライケークの見た目を調査するために製剤を作製した。
【０２２８】
1mLの充填体積の製剤でフリーズドライバイアルを満たした。この製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。先行する脱気工程は、実施しなかった。
【０２２９】
フリーズドライ後にバイアルを5℃で保存した。フリーズドライ後及び2年間の保存後にバイアルを視覚的に調べてフリーズドライケークの見た目を評価した。結果をTable 19.1(表29)及びTable 19.2(表30)に提示する。
【０２３０】
【表２９Ａ】
2018532783.tif 000041
【０２３１】
【表２９Ｂ】
2018532783.tif 000042
【０２３２】
フリーズドライ及び保存後のバイアルの視覚的な調査は、スクロースの濃度を68〜116mg/mLに高めると、見た目の良いフリーズドライケークの数が増加することを示している(NaCl及びCaCl2とは無関係)。低いスクロース濃度48〜58mg/mLでは、NaCl濃度が4.5〜6.5mg/mLの「高い」ときにFD(フリーズドライ)ケークの崩壊が観察される(結果をTable 19.1(表29)に提示する)。したがって、NaCl>5.5mg/mL及び「低い」スクロース濃度≦58mg/mLの組み合わせ(Table 19.1(表29))が安定したFDケーク構造をもたらす訳ではない(見た目の良いFDケークをもたらす訳ではない)。
【０２３３】
スクロース/NaCl比を増加させるとFDケーク構造が改善する。88mg/mLのスクロースを含みNaClを含まない製剤、81mg/mLのスクロース及び0.75mg/mLのNaClを含む製剤、73mg/mLのスクロース及び1.5mg/mLのNaClを含む製剤、68mg/mLのスクロース及び2.5mg/mLのNaClを含む製剤では崩壊したFDケークは観察されなかった。3.4〜13.6mM(0.5〜2mg/mLのCaCl2・2H2O)の範囲のCaCl2の外観に対する効果は観察されなかった(Table 19.2(表30))
【０２３４】
【表３０】
2018532783.tif 000043
【０２３５】
(実施例20)
GP-BDD-FVIII製剤及び安定性
一実験において、0.2mg/mL及び0.4mg/mLのGP-BDD-FVIIIを含むフリーズドライ製剤を調製した。賦形剤の内容は以下のとおりである:70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、3.4mMのCaCl2、0.4mg/mLのTween 20。1mLの充填体積の製剤でフリーズドライバイアルを満たした。この製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。すべての製剤はフリーズドライに先立って脱気した。凍結工程に先立ってフリーズドライヤー中で実施例15に記載されている手順に従って脱気を行った。
【０２３６】
数か月間の安定性を調査するために、フリーズドライ後に3つの異なる温度、+5℃、+30℃及び+40℃でバイアルを保存した。意図した保存期間(1か月、3か月又は6か月)後にフリーズドライ製剤を1mLのヒスチジンバッファー、pH6.0によって再構成し、直接分析した。3つの異なる分析方法には、以下のものが含まれる:タンパク質凝集の定量(HMWP%)のためのSE-HPLC、タンパク質酸化/FVIII LCの酸化(酸化型%)の定量のためのRP-HPLC及び製剤のFVIII活性を定量するための発色FVIIIアッセイ。このアッセイでは、第IXa因子、Ca2+及びリン脂質の存在下における第X因子の活性化でFVIIIはコファクターとして働く。第Xa因子は発色基質(S-2765)を加水分解し、発色団、pNAが放出され、415nmにおける吸光度がプレートリーダーで測定される。第Xa因子及び形成されたpNAの量は、分析サンプル中の第VIII因子の含有量に比例する。この直線的相関性を使用して、同時に分析する参照との比較によってサンプル中の活性第VIII因子の含有量を確かめる。
【０２３７】
これらの分析を下記データ表、Table 20.1(表31)(FVIII活性)、Table 20.2(表32)(HMWP%)、Table 20.3(表33)(酸化型%)に示したとおりにフリーズドライ前、フリーズドライ後、及び保存後に実施した。
【０２３８】
【表３１】
2018532783.tif 000044
【０２３９】
調査した製剤は、30℃での少なくとも6か月の保存に対して完全に活性のGP-BDD-FVIIIを提供する。
【０２４０】
【表３２】
2018532783.tif 000045
【０２４１】
【表３３】
2018532783.tif 000046
【０２４２】
調査した製剤は、異なる強度(タンパク質濃度)でGP-BDD-FVIIIの安定性を提供する。調査したGP-BDD-FVIIIの両強度は、フリーズドライ中、及びフリーズドライ後に安定であることが観察された。0.2mg/mLの医薬品(約2000IU/mLに相当する)及び0.4mg/mLの医薬品(約4000IU/mLに相当する)を比較した場合、フリーズドライGP-BDD-FVIIIの安定性に差は観察されていない。30℃では3か月以内に酸化型が約1パーセント点増加し、40℃ではこの値は約1.2〜1.3パーセント点である。
【０２４３】
更に、FVIII活性データは、(sc投与に適した)フリーズドライ製剤中のGP-BDD-FVIIIは、30℃での少なくとも6か月の保存の間、完全に活性である。
【０２４４】
(実施例21)
Fabフラグメントを用いて複合糖質化されたFVIIIを含むsc製剤
一実験において、さまざまなFVIII分子をフリーズドライし、調査した。調査したFVIIIタンパク質は、GP-BDD-FVIII及びFab-BDD-FVIIIであった(GP-BDD-FVIIIのPEGポリマー及びGH-BDD-FVIIIのHEPポリマーと同じ位置に抗体のFabフラグメントを結合させた)。
【０２４５】
フリーズドライ作業に先立って、3mg/mLのスクロース、18mg/mLのNaCl、0.25mg/mLのCaCl2・2H2O、1.5mg/mLのL-ヒスチジン、0.1mg/mLのTween 80、pH7.3を含むバッファー中で1124U/mLのFab-BDD-FVIIIを冷凍保存した。12mg/mLのスクロース、36mg/mLのNaCl、1mg/mLのCaCl2・2H2O、6mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのTween 80、pH6.9を含むバッファー中で5412のGP-BDD-FVIIIを冷凍保存した。両タンパク質を70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2・2H2O、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、0.4mg/mLのTween 80を含むバッファーにバッファー交換した。バッファー交換後にGP-BDD-FVIIIを希釈し、その結果、両タンパク質は700IU/mLの強度を有し、SE-HPLCによって約0.07mg/mLのタンパク質濃度を確認した。
【０２４６】
1mLの充填体積の2つの製剤でフリーズドライバイアルを満たした。この製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。両製剤は、フリーズドライに先立って脱気した。凍結工程に先立ってフリーズドライヤー中で実施例15に記載されている手順に従って脱気を行った。
【０２４７】
フリーズドライ後、バイアルをHMWP%の定量のためのSE-HPLC分析に使用した。
【０２４８】
【表３４】
2018532783.tif 000047
【０２４９】
HMWP%に対する影響はほんの小さなもので、両方の遅延性FVIII分子が、脱気され、フリーズドライされ、容易に再構成される(1:1  充填体積:再構成体積)sc関連製剤として製剤化することができた。
【０２５０】
(実施例22)
スクロースの効果
一実験において、フリーズドライ製剤#3、製剤#4、製剤#5、製剤#6、製剤#7及び製剤#8は、2000IU/mLのGP-BDD-FVIII、3.5mg/mLのNaCl、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.1mg/mLのポリソルベート20、1mg/mLのCaCl2・2H2O及びさまざまな量のスクロース、40mg/mL(#3)、60mg/mL(#4)、70mg/mL(#5)、80mg/mL(#6)、90mg/mL(#7)、110mg/mL(#8)を含むものとした。製剤#1は、2000IU/mLのGP-BDD-FVIII、17mg/mLのスクロース、36mg/mLのNaCl、0.6mg/mLのメチオニン、6mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20及び1mg/mLのCaCl2・2H2Oを含むものとした。Table 22.1(表35)を参照のこと。
【０２５１】
【表３５】
2018532783.tif 000048
【０２５２】
1mLの充填体積の製剤でフリーズドライバイアルを満たした。すべての製剤を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライし、バイアルの半分を実施例15に記載されるように先行する脱気に供した。
【０２５３】
フリーズドライ後、バイアルを視覚的に調べ、3つの異なる温度、-80℃、+30℃及び+40℃で3週間の保存のために保存した。製剤#3を含むフリーズドライバイアルを除くほぼすべてのバイアルが見た目の良いフリーズドライケークを含んでいたことが観察された。製剤#3を含む大半のバイアルは、崩壊又は部分的に崩壊したフリーズドライケークを含んでいた。
【０２５４】
保存後、フリーズドライ製剤を1mLのミリQ水によって再構成し、オスモル濃度を測定するために凝固点浸透圧測定(freeze point osmometry)によって直接分析した(Table 22.2(表36))。再構成した製剤のアリコートを、酸化したタンパク質(酸化型%)の定量のためのRP-HPLC分析まで、HMWP%を定量するためのSE-HPLC分析のために-80℃で3週間保存した。これらのHPLCデータをTable 22.3(表37)、Table 22.4(表38)、Table 22.5(表39)に示す。
【０２５５】
【表３６】
2018532783.tif 000049
【０２５６】
【表３７】
2018532783.tif 000050
【０２５７】
製剤#1のオスモル濃度は非常に高く、この製剤はsc投与に適していない。
【０２５８】
GP-BDD-FVIIIのSE-HPLCクロマトグラムは、フリーズドライ及び保存の前後の両方で分析したすべての製剤に関して極めて類似していた。フリーズドライに関連づけられる最も大きなクロマトグラフィーの変化は、(低スクロース濃度と組み合わせて高いNaCl濃度を含む)F1に対して観察された。HMWP%の最も大きな増加はF1に対して観察された。
【０２５９】
40mg/mLのスクロースを含む製剤F3は崩壊した。F4〜F8製剤間のSE-HPLCクロマトグラムの類似点は、調査した製剤が1.55mg/mlのL-ヒスチジン、1mg/mLのCaCl2、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl及び0.1mg/mLのtween 20を含む場合、スクロース(60〜110mg/mL)が、フリーズドライ製剤中のHMWP%(Table 22.3(表37)に示す)、モノマー%及びLMWP%に影響を及ぼさないことを示した。
【０２６０】
【表３８】
2018532783.tif 000051
【０２６１】
【表３９】
2018532783.tif 000052
【０２６２】
驚くべきことに、このデータは、脱気が、NaCl濃度が高濃度(例えば、36mg/mL)から低濃度(例えば、3.5mg/mL)に低下された製剤に対してのみ必要とされることを示す。表22.4(表38)と表22.5(表39)のデータを比較した場合、酸化型%間における軽微な差のみが製剤#1に対して観察されている。
【０２６３】
対照的に、Table 22.4(表38)とTable 22.5(表39)のデータの比較は、その他の試験(実施例6及び実施例7)においても観察されるとおり、タンパク質酸化に関する製剤#3〜製剤#8に対する脱気の効果を顕著に示している。製剤がフリーズドライに先立って脱気が行われていない場合、30℃及び40℃での保存後に、これらの製剤中のGP-BDD-FVIII酸化型のパーセンテージに大きな増加が観察されている。
【０２６４】
驚くべきことに、FVIIIの酸化型の含有量は、スクロース濃度と相関関係にある(主に40℃で保存した製剤に関して)。スクロースの含有量が高い程、酸化型の含有量が高い。この傾向は、フリーズドライに先立って脱気を行っていない、40℃で保存した製剤で最も顕著である。スクロースは、ここでフリーズドライ製剤中において酸化型FVIIIの量を増加させることが示されている。しかしながら、スクロースは、脱気時に安定化賦形剤として使用することができ、これが、小さな体積に再構成した後の低いオスモル濃度を可能にする。
【０２６５】
(実施例23)
使用時の安定性/再構成後の安定性
この実施例は、実施例22に記載されているのと同じ製剤を調査することにより前の実施例(実施例22)に関連し、更に再構成後のHMWP形成に焦点を置いた。(実施例22に記載されているとおりに)40℃で3週間保存し、再構成し、再構成後に-80℃で保存した(実施例22に記載されている)フリーズドライGP-BDD-FVIII製剤#1、製剤#3〜製剤#8を解凍し、40℃で置いた後、40℃で4時間後のHMWP定量のためにSE-HPLCによって分析した。
【０２６６】
【表４０】
2018532783.tif 000053
【０２６７】
このデータは、HMWPが(再構成した製剤の)40℃での保存の間にやや増加していること、及びスクロース濃度を高めると、この増加がより少ないことを示す。これは、高いNaCl濃度(及び高いオスモル濃度)を有する製剤の使用時の安定性と比較して、高濃度のスクロースを含むsc GP-BDD-FVIII製剤の使用時の安定性が高いことを示唆する
【０２６８】
(実施例24)
充填体積/再構成体積:0.3、0.5及び0.8mL
一実験において、250、1500及び3500IU/mLのGP-BDD-FVIIIを含むフリーズドライ製剤を、70mg/mLのスクロース、3.5mg/mLのNaCl、2.5mg/mLのメチオニン、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、0.4mg/mLのポリソルベート20及び0.5mg/mLのCaCl2・2H2Oとともに調製した。
【０２６９】
上記の製剤を有するフリーズドライバイアルを、異なる体積(充填体積)、0.3mL、0.5mL、0.8mLを用いて充填した。
【０２７０】
すべてのタンパク質溶液を、Table 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。すべての製剤を先行する脱気を伴いフリーズドライした。脱気手順については実施例15に記載されている。
【０２７１】
フリーズドライ後、すべてのバイアルを視覚による検査によって評価し、どのバイアルでもケーク崩壊が観察されなかったことが確認された。すべてのフリーズドライ製剤を、その後、10mMのヒスチジンによってそれぞれの充填体積と同じ体積(0.3、0.5又は0.8mL)により再構成した。再構成した製剤をSE-HPLCによって分析してHMWPパーセンテージを定量し、データをTable 24.1(表41)に提示する。
【０２７２】
【表４１】
2018532783.tif 000054
【０２７３】
Table 24.1(表41)のデータは、フリーズドライ中に形成されるHMWP%に対して充填体積(バイアル当たりの体積)の影響がないことを示す。
【０２７４】
このデータは更に、250IU/mLを含む製剤中のフリーズドライ前後のHMWP%が(更に高い強度と比較して)より少ないことを示す。しかしながら、1500IU/mL及び3500IU/mLに関するHMWP%は類似している。これは、実施例20の観察結果によるものである。
【０２７５】
(実施例25)
代替的な脱気手順
GP-BDD-FVIIIの酸化に対する脱気手順の効果を調査した。この例において、GP-BDD-FVIII製剤は、2000IU/mLのGP-BDD-FVIII、3.5mg/mLのNaCl、0.5mg/mLのCaCl2、1.55mg/mLのL-ヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、70mg/mLのスクロース、及び0.4mg/mLのポリソルベート20を含む。液体製剤を含むバイアルをフリーズドライヤーの棚に置き、棚を5℃に冷却した。すべての製剤をtable 15.1(表20)に記載されているプログラムに従ってフリーズドライした。凍結工程に先立ってフリーズドライヤー中で以下の手順に従って製剤を脱気した:+20℃での10分間の低圧(100mbar)を適用することによって液体から酸素を除去した。窒素ガスにより圧力を1気圧(1013mbar)に平衡化した。凍結工程の前に脱気手順を繰り返した。
【０２７６】
脱気及びフリーズドライ後、フリーズドライ製剤を1.1mLの10mMヒスチジン、pH6.0によって再構成し、酸化型に関してRP-HPLCによって分析した(実施例3に記載されているとおり)。フリーズドライ前(BFD)、フリーズドライの直後(T=0において)、並びに30℃及び40℃での保存後に、酸化したLCのパーセンテージを求めた。table 25.1(表42)のデータを参照のこと。
【０２７７】
【表４２】
2018532783.tif 000055
【０２７８】
データは、脱気を行っていない同様の製剤(実施例7のデータ)と比較して、2×10分間の脱気手順が30℃並びに40℃での3週間の保存後の酸化型の含有量を低減させることを示す。
【配列表】
2018532783000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月3日(2018.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーズドライFVIII医薬製剤であって、前記製剤は、wt FVIIIと比較して増加されたインビボ循環半減期を有するFVIII分子を含み、前記製剤は、再構成後、250〜10,000IU/mLの前記FVIII分子、1〜3mg/mLのNaCl、0.5〜3.0mg/mLのCaCl2・2H2O、及び50〜110mg/mLのスクロースを含む水性の等張製剤である、医薬製剤。
【請求項２】
前記製剤は、いかなる保存料も含まない、請求項1に記載の医薬製剤。
【請求項３】
前記製剤は、0.5〜5mg/mLのヒスチジン、0.5〜15mg/mLのメチオニン、及び0.1〜1.0mg/mLの界面活性剤を更に含み、再構成された前記製剤の体積は0.3〜1.2mLであり、オスモル濃度は300〜400mOsm/kgである、請求項1又は2に記載の医薬製剤。
【請求項４】
前記FVIII分子は、15〜25のアミノ酸のBドメインリンカーを有するBドメイン切断型分子であり、前記FVIII分子は、配列番号1のSer750アミノ酸残基と結合したO-グリカンを介して半減期を延長する部分と結合しており、前記FVIII分子は、PEG及びヘパロサンから選択される水溶性ポリマーと結合している、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項５】
前記FVIII分子は融合分子であり、前記融合分子の融合パートナーは、アルブミン、Fcドメイン、及びFcレセプターから成るリストから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記製剤は、250〜10,000IU/mL、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.0mg/mLのNaCl、80mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び3mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項７】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び0.5〜2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項８】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIIIの前記FVIII分子、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、90mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4mg/mLのNaCl、80〜100mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4〜6mg/mLのNaCl、100mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、3.1mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、4mg/mLのNaCl、70〜90mg/mLのスクロース、0.1〜0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び1〜5mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、1〜4mg/mLのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、7mg/mLのNaCl、100mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び2mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、1.5mg/mlのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、3.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び0.5〜1mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
前記製剤は、250〜10,000IU/mLのFVIII、2〜4mg/mlのヒスチジン、2.5mg/mLのメチオニン、1.5mg/mLのNaCl、70mg/mLのスクロース、0.4mg/mLの非イオン性界面活性剤、及び1.5mg/mLのCaCl2・2H2Oを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
前記製剤の30℃における3か月の保存後の酸化したFVIII軽鎖分子の量は、FVIIIの総量の5%未満である、請求項1から14のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
前記製剤は、10mMのヒスチジン溶液中で再構成され、再構成された前記製剤の体積は最大1mLである、請求項1から15のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
再構成前の前記フリーズドライ製剤は、本質的にフリーズドライ前の充填体積に相当する体積を有する薬学的にエレガントなフリーズドライケークである、請求項1から16のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
30℃における3か月の保存後の酸化したFVIII軽鎖分子の量は、FVIIIの総量の5%未満である、請求項1から17のいずれか一項に記載のフリーズドライFVIII医薬製剤。
【請求項１９】
請求項1から18のいずれか一項に記載のフリーズドライ医薬製剤を作製するための方法であって、(i)低圧下において液体製剤を脱気する工程、(ii)脱気した前記製剤を不活性ガスで圧力平衡化する工程、及び(iii)脱気した前記製剤をフリーズドライする工程を含む、方法。
【請求項２０】
請求項19に記載の方法によって得られる医薬製剤。
【請求項２１】
前記製剤は、皮下投与用である、請求項1から18及び20のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
前記製剤は、静脈内投与用である、請求項1から18及び20のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
血友病Aの処置に使用するための請求項1から18及び20から22のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【国際調査報告】
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