(57)【要約】  癌細胞表面の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及びＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するポリペプチドを開示する。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞などの、キラー細胞の表面に発現される。一部の例では、ＴＡＡはＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩである。また、開示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、開示するポリヌクレオチドを含むベクター、及び開示するベクターを含む宿主細胞も開示する。また、開示するポリペプチドを含む二価抗体も開示する。また、開示する抗体を含む医薬組成物も開示する。また、開示する二重特異性抗体を使用して被験体で癌を治療する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＧ２Ｄ受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方に結合するポリペプチドであって、前記ＴＡＡがＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩのいずれかである、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体又はその断片（「ＮＫＧ２Ｄ抗体」）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＮＫＧ２Ｄ抗体が一本鎖可変断片である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＮＫＧ２Ｄ抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインとを含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩのいずれかに結合する抗体又はその断片（「ＣＳ−１抗体」又は「ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体」）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＳ−１抗体が一本鎖可変断片である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＣＳ−１抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインとを含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が一本鎖可変断片である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインとを含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
非免疫原性リンカーを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記非免疫原性リンカーが配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
以下の式：
ＶＬＮ−ＶＨＮ−−ＶＬＴ−ＶＨＴ、
ＶＨＮ−ＶＬＮ−−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＮ−ＶＨＮ−−ＶＨＴ−ＶＬＴ、又は
ＶＨＮ−ＶＬＮ−−ＶＬＴ−ＶＨＴ
（式中、
「ＶＨＴ」は、ＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な重鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＴ」は、ＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＮ」は、ＮＫＧ２Ｄに特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＮ」は、ＮＫＧ２Ｄに特異的な重鎖可変ドメインであり、
「−」は、ペプチドリンカー又はペプチド結合から構成され、
「−−」は、ペプチドリンカー又はペプチド結合から構成される）
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
二重特異性抗体であって、請求項１２に記載のポリペプチドを含み、前記ＶＬＮ及び前記ＶＨＮが、ＮＫＧ２Ｄに対する抗原結合部位を形成するように二量体化されており、前記ＶＨＴ及び前記ＶＬＴが、ＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗原結合部位を形成するように二量体化されている、二重特異性抗体。
【請求項１４】
第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域を含む二重特異性抗体を含む単一ポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体であって、
前記第１の抗原結合領域は、ヒト免疫エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄに特異的に結合することにより、ヒト免疫エフェクター細胞の活性を漸増することができ、
前記第２の抗原結合領域は、標的細胞上のＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することができる、二重特異性抗体。
【請求項１５】
前記第１の部分が２つの抗体可変ドメインを含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
前記第２の部分が２つの抗体可変ドメインを含む、請求項１４又は１５に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
前記第１及び第２の部分がヒト抗体由来である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
前記第１の抗原結合領域が、配列番号５のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
前記第２の抗原結合領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
前記第２の抗原結合領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、配列番号２０のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
前記抗体が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を医薬的に許容される担体中に含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、被験体における癌の治療方法。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
異種発現コントロール配列に操作可能に連結した請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
ＮＫＧ２Ｄ受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体又はその断片（「ＮＫＧ２Ｄ抗体」）であって、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む、ＮＫＧ２Ｄ抗体と、
ＴＡＡに結合する抗体又はその断片（「ＴＡＡ抗体」）と、を含む、ポリペプチド。
【請求項２８】
以下の式：
ＶＬＮ−ＶＨＮ−−ＶＬＴ−ＶＨＴ、
ＶＨＮ−ＶＬＮ−−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＮ−ＶＨＮ−−ＶＨＴ−ＶＬＴ、又は
ＶＨＮ−ＶＬＮ−−ＶＬＴ−ＶＨＴ
（式中、
「ＶＨＴ」は、ＴＡＡに特異的な重鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＴ」は、ＴＡＡに特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＮ」は、ＮＫＧ２Ｄに特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＮ」は、ＮＫＧ２Ｄに特異的な重鎖可変ドメインであり、
「−」は、ペプチドリンカー又はペプチド結合から構成され、
「−−」は、ペプチドリンカー又はペプチド結合から構成される）
を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリペプチドを含み、前記ＶＬＮ及び前記ＶＨＮが、ＮＫＧ２Ｄに対する抗原結合部位を形成するように二量体化されており、前記ＶＨＴ及び前記ＶＬＴが、ＴＡＡに対する抗原結合部位を形成するように二量体化されている、二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月２０日に出願された米国仮出願第６２／１１８，５６１号、及び２０１５年２月２３日に出願された米国仮出願第６２／１１９，６４５号の利益を主張するものであり、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
２０１４年には、新たに診断された癌症例が１６０万件あり、報告された死亡は５８５，７２０件であった。現在の治療は、主に化学療法、放射線、手術、及び骨髄移植に依存している。しかしながら、これらは重篤な副作用を伴うことがあり、いくつかの症例では、癌は治療に影響されない。したがって、新たな治療方法が緊急に必要とされる。癌免疫療法は、リンパ球からの腫瘍溶解活性の誘発に非常に特異的かつ有効であるため、有望である。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ又は二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ及びＢｉＫＥ）などの融合タンパク質は、腫瘍細胞とＴ細胞との結合を（又はナチュラルキラー細胞との結合をそれぞれ）形成する癌免疫療法である。ＢｉＴＥ又はＢｉＫＥタンパク質は、異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を有し、その一方は腫瘍特異的分子に結合し、もう一方はリンパ球表面の受容体に結合する。ＢｉＴＥ及びＢｉＫＥ療法は、従来の抗体療法と比べて腫瘍細胞溶解の効果が１００〜１０，０００倍高いと予想される。しかしながら、ＢｉＴＥ療法は、特異的にＴ細胞表面のＣＤ３受容体を標的とし、ＢｉＫＥ療法は、ナチュラルキラー細胞表面の受容体を標的とする。現在のところ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びγδＴ細胞などの、すべてのキラー免疫細胞をクロストリガーする二重特異性エンゲージャタンパク質は設計されていない。
【発明の概要】
【０００３】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及びＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するポリペプチドを開示する。ポリペプチドは、ＴＡＡに結合する抗体又はその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＡはＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩであり得る（したがって、抗体又は断片は「ＣＳ−１抗体」又は「ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体」である）。ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体又はその断片（「ＮＫＧ２Ｄ抗体」）を更に含み得る。したがって、ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄ抗体及びＣＳ−１抗体又はＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ抗体及び／又はＮＫＧ２Ｄ抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体である。
【０００４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＴＡＡ抗体及びＮＫＧ２Ｄ抗体を発現する核酸により発現される融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ抗体及びＮＫＧ２Ｄ抗体は、開示するポリペプチドを形成するように化学的に結合された別個のペプチドである。
【０００５】
ポリペプチドのいくつかの実施形態では、ＴＡＡ抗体及びＮＫＧ２Ｄ抗体は、非免疫原性リンカーにより結合される。非免疫原性リンカーは、ヒト筋肉アルドースタンパク質、その断片、その変異体、又はそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含み得る。
【０００６】
ＮＫＧ２Ｄ受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＮＫＴ細胞により発現され、これらはまとめて本明細書で一般に「キラー細胞」と呼ばれ得る。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、タンパク質に結合すると、キラー細胞を活性化し得る。このような活性化には、キラー細胞が細胞傷害性になることが挙げられ得る。
【０００７】
ＣＳ−１は、多発性骨髄腫細胞により発現される抗原である。ＥＧＦＲタイプＩＩＩ変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、その細胞外ドメインに欠損を有し、それによって神経膠芽腫、並びに乳癌、卵巣癌、前立腺癌、及び肺癌に見られる新たな腫瘍特異的標的が形成される。
【０００８】
したがって、開示するポリペプチドは、特定の癌により発現されるＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＴＡＡと、キラー細胞により発現されるＮＫＧ２Ｄ受容体とに結合できる。開示するポリペプチドは、癌細胞により発現されるＴＡＡとキラー細胞により発現されるＮＫＧ２Ｄ受容体とに同時に結合でき、それによって癌細胞とキラー細胞との間に橋を形成する。このような橋は、腫瘍細胞及びキラー細胞間の免疫溶解性シナプスの形成を促進し得る。キラー細胞は、免疫シナプス上にパーフォリン及び／又はグランザイムを放出し、それによって多発性骨髄腫細胞の死滅を誘発し得る。死滅には、癌細胞の細胞溶解が挙げられ得る。このように、開示するポリペプチドは、キラー細胞の動員（recruitment）及び活性化により標的とする癌細胞の死滅を達成する。
【０００９】
また、多発性骨髄腫、神経膠芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、及び肺癌などの、癌の治療が必要な被験体で癌を治療する方法も開示する。方法は、上記のポリペプチドを被験体に投与することを含み得る。いくつかの症例では、ポリペプチドは治療有効量で投与される。
【００１０】
本発明の１つ若しくは２つ以上の実施形態の詳細が、添付の図面及び以下の説明において記載される。本発明の他の特性、目的、及び利点は、説明及び図面から、並びに請求項から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗ＣＳ−１三重特異性細胞傷害性リンパ球エンゲージャ（ＴｒｉＣＬＥ）ポリペプチドの設計の模式図である。抗ＣＳ−１一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖは、ヒト筋肉アルドース（ＨＭＡ）リンカーにより結合される。ＶＨ：重鎖、ＶＬ：軽鎖、（Ｇ４Ｓ）３：グリシン−セリンリンカー、６ＸＨｉｓ：ヒスチジンの６反復体。
【図２】精製タンパク質が抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥを含むｓｃＦｖであることを確認するウエスタンブロットを示す。
【図３】抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥの存在下におけるＮＫ細胞株ＮＫＬの多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株Ｈ９２９に対する細胞傷害性のグラフである。５０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲のＴｒｉＣＬＥの漸増用量を、２０：１のエフェクター比でＮＫＬ：Ｈ９２９の共培養に添加した。
【図４Ａ】ＣＳ１＋細胞株に対するＴｒｉＣＬＥの結合を示す。０．２×１０６のＨ９２９細胞をＴｒｉＣＬＥと共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、二次抗体結合タンパク質Ｌ−ビオチンで染色した後、フローサイトメトリー分析のために抗ビオチンＰＥ抗体で染色した。ヒストグラムは、３回の独立した試験の典型である。
【図４Ｂ】一次抗体としての抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥの平均蛍光強度を比較したグラフを示す。
【図５Ａ】ＴｒｉＣＬＥによるＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞の活性化を示す。５μｇ／ｍＬのＴｒｉＣＬＥを休止ヒトＰＢＭＣに４時間添加した後、細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１４、及びＣＤ６９について室温で２０分間染色した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【図５Ｂ】抗ＣＤ３抗体がＴｒｉＣＬＥに相乗作用を与え、キラー細胞の３つのすべてのサブセットの活性化を高めたことを示す。
【図５Ｃ】活性化ヒトＰＢＭＣの細胞傷害性が、３種類の多発性骨髄腫細胞ＭＭ１．ｓ、Ｈ９２９、及びＲＰＭＩ−８２２６に対してＴｒｉＣＬＥにより高められたことを示す。非線形回帰曲線からＥＣ５０を計算した。
【図５Ｄ】抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥが、２４時間及び４８時間でのＣＤ５６枯渇エフェクター細胞を使用して、細胞傷害性を誘発したことを示す。＊＊＊ｐ＜０．００１
【図６Ａ】抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥの図式表示を示す。ＶＨ：重鎖、ＶＬ：軽鎖、（Ｇ４Ｓ）３：グリシン−セリンリンカー、ＨＭＡ：ヒト筋肉アルドース。全配列をｐＧＥＸ６ｐ１ｍベクターにクローン化した。
【図６Ｂ】抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥによるＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞の活性化を示す。５μｇ／ｍＬのＴｒｉＣＬＥを休止ヒトＰＢＭＣに４時間添加した後、細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１４、及びＣＤ６９について室温で２０分間染色した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【図６Ｃ】活性化ヒトＰＢＭＣの細胞傷害性が、３種類の多発性骨髄腫細胞ＧＢＭ１１２３に対してＴｒｉＣＬＥにより高められたことを示す。非線形回帰曲線からＥＣ５０を計算した。結果は３人の個別ドナーから得られた。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。図６Ｃは示す
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ＴＡＡ及びＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するポリペプチド。ポリペプチドは、ＴＡＡに結合する抗体又はその断片を含み得る。図１Ａの模式図で表されるものなどの一実施形態では、ＴＡＡはＣＳ−１であり得る（したがって、抗体又は断片は「ＣＳ−１抗体」である）。ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体又はその断片（「ＮＫＧ２Ｄ抗体」）を更に含み得る。ポリペプチドは、ＣＳ−１抗体及びＮＫＧ２Ｄ抗体を含み得る。ＣＳ−１抗体及び／又はＮＫＧ２Ｄ抗体は、一本鎖可変断片であり得る。
【００１３】
開示するポリペプチドは、すべての強力なキラー細胞の細胞傷害性を漸増し（recruiting）、腫瘍細胞（又はウイルス感染細胞）を死滅させ、オフターゲットの副作用なしに優れた効能をもたらすことにより、従来の抗ＣＤ１６  ＢｉＫＥ又は抗ＣＤ３  ＢｉＴＥとは異なる。いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄトリガー分子及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の操作された融合タンパク質を含む。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、特に細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞に高発現される活性化分子である。ＮＫＧ２Ｄ受容体が、例えば、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、抗体、又は他のリガンドにより係合されると、その活性化モチーフは、ＤＡＰ１０などの他のアダプタータンパク質のリン酸化（phosphylation）を誘発し、次に一連の細胞活性化及び細胞傷害性の実行を誘発するであろう。参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１５０８７０号は、ヒトＮＫＧ２Ｄに特異性を有する抗体及び癌治療におけるその使用方法について記載している。
【００１４】
開示するポリペプチドは、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、及び腫瘍細胞を標的とするその能力に関して、三重特異性細胞傷害性リンパ球エンゲージャ（ＴｒｉＣＬＥ）と呼ばれる。
【００１５】
また一方で、ＴＡＡは癌細胞に発現される。特定のＴＡＡは癌特異性である。例えば、ＣＳ−１は、多発性骨髄腫細胞に発現されるＴＡＡである。ＣＳ１は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーに属する細胞表面受容体である。ＣＳ１が正常細胞ではなくＭＭ細胞で高発現することから、ＣＳ１はＭＭ治療の魅力的な標的になる。エロツズマブを用いた前臨床データは、ＣＳ１に対し、エロツズマブが、ＰＢＭＣ又は精製ＮＫ細胞と共にインキュベートされると、ヒトＭＭ細胞株の細胞溶解を誘発する強い能力を示すことを示した。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、その細胞外ドメインに欠損を有し、それによって神経膠芽腫、並びに乳癌、卵巣癌、前立腺癌、及び肺癌に見られる新たな腫瘍特異的標的の形成を生じる。ｓｃＦｖの抗原特異性により、融合タンパク質は特異的にＮＫＧ２Ｄ及びＴＡＡ分子に係合でき、現在の治療方法より副作用を少なくすることができる。
【００１６】
開示するポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して操作され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＴＡＡ抗体及びＮＫＧ２Ｄ抗体を発現する核酸により発現される融合タンパク質である。操作された融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、細菌発現ベクターに組み込まれ得る。開示するポリペプチドは、容易に産生され、再び折り畳まれ、アニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて精製され得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ抗体及びＮＫＧ２Ｄ抗体は、開示するポリペプチドを形成するように化学的に結合された別個のペプチドである。
【００１７】
抗ＴＡＡ抗体及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のｓｃＦｖは、非免疫原性リンカーで結合され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒト筋肉アルドースタンパク質由来であってよく、又はその変異体であってよい。
【００１８】
開示するポリペプチドがＴＡＡを発現する癌細胞を有する被験体に投与されると、抗ＴＡＡ  ｓｃＦｖは一方のアームで癌細胞表面に結合し、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖはもう一方のアームでキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。係合により、癌及びキラー細胞が架橋され、免疫溶解性シナプスが形成されるであろう。キラー細胞は、シナプス上にパーフォリン及びグランザイムを放出し、それによって細胞膜を破壊し、癌細胞の細胞死を誘発し得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＡＡ  ｓｃＦｖは抗ＣＳ−１である。別の特定の実施形態では、抗ＴＡＡ  ｓｃＦｖは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである。したがって、開示するポリペプチドは、キラー細胞を多発性骨髄腫細胞、神経膠芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、及び肺癌に結合させることができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドを含む（即ち、抗体の代わりに）。このようなリガンドは、ＭＩＣ又はＵＬＢＰファミリーのものであってよい。例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ若しくはＭＩＣＢであってよく、又はＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、若しくはＵＬＢＰ６であってよい。
【００２０】
別の実施形態では、開示するポリペプチドは、ＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＴＡＡに結合するリガンドを含む（即ち、抗体の代わりに）。
【００２１】
また、開示するポリペプチドをコードする２つの核酸構築物、例えば、ｐＧＥＸ６ｐ１ｍ−ＴｒｉＣＬＥ及びｐＥＴ２１ｄ−ＴｒｉＣＬＥも本明細書で開示する。構築物は、細菌、哺乳類、又は真菌細胞を使用する、タンパク質の高収率翻訳に使用され得る。翻訳は、強力なＴ７プロモータにより推進され得る。ｐＧＥＸ６ｐ１ｍ及びｐＥＴ２１ｄ発現ベクターは、効率的なタンパク質翻訳を支持するために発見されてきたが、本発明の範囲は、本明細書で開示する融合タンパク質をコードする配列と対になる他の発現ベクターを含む。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。例えば、用語「１つの（ａ）細胞」は、これらの混合物を含む、複数の細胞を含む。
【００２３】
用語「約」及び「およそ」は、当業者に理解されるように、「近似」していると定義される。１つの非限定実施形態では、この用語は１０％以内であると定義される。別の非限定実施形態では、この用語は５％以内であると定義される。更に別の非限定実施形態では、この用語は１％以内であると定義される。
【００２４】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」は、互換的に使用され、１個のアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ酸のアルファアミノ基に結合した２個以上のアミノ酸を含む天然又は合成分子を指す。用語「タンパク質」は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸、例えばペプチド同配体などを含み、２０遺伝子にコードされるアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの自然プロセス、又は当該技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかにより、修飾され得る。
【００２５】
用語「タンパク質ドメイン」は、タンパク質の一部分、タンパク質の複数部分、又は構造的一体性を示すタンパク質全体を指し、この判断は、タンパク質の一部分、タンパク質の複数部分、又はタンパク質全体のアミノ酸組成に基づき得る。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「ペプチド模倣体」は、標準的なペプチド化学のいくつかの改変を含むペプチドの模倣物質を意味する。ペプチド模倣体は、典型的に元のペプチドのいくつかの特性を向上させており、例えば、安定性の向上、有効性の向上、送達の向上、半減期の向上などが挙げられる。既知のポリペプチド配列に基づくペプチド模倣体の作製方法は、例えば、米国特許第５，６３１，２８０号、同第５，６１２，８９５号、及び同第５，５７９，２５０号に記載されている。ペプチド模倣体の使用は、所定の位置で非アミド結合を用いて非アミノ酸残基を組み込むことを伴い得る。本発明の一実施形態は、ペプチド模倣体であり、この化合物は、結合、ペプチド骨格、又は好適な模倣体で置換されたアミノ酸成分を有する。好適なアミノ酸模倣体であり得る非天然アミノ酸のいくつかの非限定的な例としては、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酩酸、Ｌ−γ−アミノ酩酸、Ｌ−α−アミノイソ酩酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、及びＢｏｃ−Ｌ−チオプロリンが挙げられる。
【００２７】
用語「融合タンパク質」は、１個のポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されたペプチド結合を介して２個以上のポリペプチドが結合することにより形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学結合により形成されてもよく、又は単一の連続した融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現されてもよい。一本鎖融合タンパク質は、単一の連続したポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、分子生物学の従来技術を使用して調製され、単一核酸中にフレームで２つの遺伝子を結合し、次いで融合タンパク質が産生される条件下で適切な宿主細胞で核酸を発現させ得る。
【００２８】
用語「抗体」は、標的抗原に選択的に結合する、天然又は合成の抗体を指す。この用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。完全な免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、そうした免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、及び標的抗原に選択的に結合するヒト又はヒト化バージョンの免疫グロブリン分子も含まれる。
【００２９】
用語「タンパク質断片」又は「抗体断片」は、全長タンパク質又は抗体の機能部分を指す。抗体断片と呼ぶとき、断片は、一般に標的結合又は可変領域である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が挙げられる。抗体の「機能的断片又は類似体」という語句は、全長抗体と同じような質的生物活性を有する化合物である。例えば、抗ＣＳ−１抗体の機能的断片又は類似体は、癌細胞表面でＣＳ−１分子に結合できるものである。本明細書で使用するとき、抗体に関する「機能的断片」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、及びＦ（ａｂ’）２断片を指す。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強力な非共有結合性会合における１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面で標的結合部位を画定することは、この構造におけるものである。全体として、６つのＣＤＲが、抗体に対する標的結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（ｓｃＦｖ、即ち標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体より親和性は低いが、標的を認識して結合する能力を有する。
【００３０】
用語「ＣＤＲ」及びその複数形の「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を意味し、その３つが軽鎖可変領域の結合特性を形成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を形成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体の抗原との特異的相互作用に関与する残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する（それらは抗原特異性の主な決定子である）。
【００３１】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが標的結合に望ましい構造を形成するのを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「特異的に結合する」は、ポリペプチド（抗体を含む）又は受容体に言及するとき、タンパク質及び他の生物製剤の不均質な集団においてタンパク質若しくはポリペプチド又は受容体の存在の決定要因である結合反応を意味する。したがって、指定条件（例えば、抗体の場合は免疫学的測定条件）下で、規定のリガンド又は抗体は、試料中に存在する他のタンパク質に、又はリガンド若しくは抗体が生物中で接触できる他のタンパク質に多量に結合しないとき、その特定の「標的」に「特異的に結合する」（例えば、抗体は内皮抗原に特異的に結合する）。一般に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、第２の分子に対する親和性（Ｋａ）が約１０５Ｍ−１より大きい（例えば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、及び１０１２Ｍ−１以上）。いくつかの実施形態では、Ｋａは１０−６〜１０−９Ｍ−１であり得る。他の実施形態では、Ｋａは１０−９〜１０−１２Ｍ−１であり得る。
【００３３】
「リガンド」は、本明細書で使用するとき、一般に標的細胞上の受容体と反応できるか、又はさもなければ受容体を認識できる若しくは受容体に結合できる、すべての分子を指す。
【００３４】
開示するポリペプチド構築物の共有結合修飾も意図され、これらは一般に翻訳後に実施されるが、必ずしも翻訳後とは限らない。例えば、開示するポリペプチドの共有結合修飾のいくつかの種類は、ポリペプチド構築物の特異的アミノ酸残基を、選択した側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入され得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドのグリコシル化パターンが変更される。当該技術分野で周知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在の有無）、又はタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生物の両方に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にＮ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位を生じる。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つをヒドロキシアミノ酸に付加することを意味し、ヒドロキシアミノ酸は、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンも使用できるが、最も一般的にはセリン又はスレオニンである。炭水化物部分の数を増やす別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は、Ｎ及びＯ結合型グリコシル化のグリコシル化能を有する宿主細胞でタンパク質の産生を必要としない点で有利である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドは、１つ又は２つ以上の標識を更に含む。標識基は、立体障害の可能性を減らすために様々な長さのスペーサーアームを介して開示するポリペプチドに結合され得る。様々なタンパク質の標識方法は、当該技術分野で周知である。一般に、標識は、標識を検出するアッセイに基づいて様々なクラスに分類されており、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）同位体標識であって、放射性同位体又は放射性核種などの、放射性同位体又は重同位体であり得る（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５ｌ、１３１Ｉ）；ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）酸化還元活性部分；ｄ）光学色素（発色団、リン光体、及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない）、例えば、蛍光性基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基、及び「小分子」蛍石又はタンパク性蛍石のいずれかであり得るフルオロフォア；ｅ）酵素群（例えば、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）；ｆ）ビオチン化基；ｇ）二次リポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）；及びｈ）ＰＥＧ化。
【００３７】
開示するポリペプチドは、例えば、分子の分離に有用である、又は分子の適応された薬学動態プロフィルに関連する、追加ドメインも含み得る。ポリペプチドの分離に有用なドメインは、ペプチドモチーフ又は二次導入部分から選択されてよく、分離カラムなどの分離方法で捕獲され得る。このような追加ドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡＴ−タグ、ＨＡ−タグ、ＴＡＰ−タグ、ＧＳＴ−タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ−タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−タグ）、Ｆｌａｇ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、及びそれらの変異体（例えば、Ｓｔｒｅｐｌｌ−タグ）及びＨｉｓ−タグとして知られる、ペプチドモチーフを含む。いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドは、Ｈｉｓ−タグドメインを含み、これは一般に分子のアミノ酸配列中の連続したＨｉｓ残基の反復として知られ、好ましくは６つのＨｉｓ残基からなる。
【００３８】
アミノ酸配列修飾も意図される。例えば、ポリペプチドの結合親和性を高めること、生物学的特性を変更すること、又は機能獲得型変異を導入することが望ましいことがある。アミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更をポリペプチドの核酸に導入することにより、又はペプチド合成により、調製される。
【００３９】
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、典型的に、アラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｉｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｈｅ又はＩ）：ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リシン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸などの、その分野で認識される定義を有するアミノ酸を指すが、所望により修飾、合成、又は希アミノ酸を使用してもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負帯電側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正帯電側鎖を有するもの（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は非帯電極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）として分類され得る。
【００４０】
アミノ酸修飾としては、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列中の残基からの除去、及び／又はそれらへの挿入、及び／又はそれらの置換が挙げられる。除去、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物が所望の特性を有するという前提で、最終構築物を得るように実施される。アミノ酸の変更はまた、グリコシル化部位の数又は位置の変更などの、開示するポリペプチドの翻訳後プロセスも変更し得る。
【００４１】
例えば、各ＣＤＲで１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸を挿入又は除去してよい（当然のことながら、その長さに基づく）。開示するポリペプチドの挿入変異体としては、酵素に対する開示するポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端への融合、又は開示するポリペプチドの血中半減期を向上させるポリペプチドへの融合が挙げられる。
【００４２】
置換変異誘発に最も興味深い部位としては、重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられる。置換は、本明細書で記載するとき、好ましくは保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲ又はＦＲの長さに基づいて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸を置換してよく、その一方でフレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸を置換してよい。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の１、２、又は３個を置換することが考えられる。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５、又は６個を置換することが考えられる。
【００４３】
変異誘発に好ましい位置である抗体構築物の特定の残基又は領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）に記載されるように「アラニン系統的変異導入法」と呼ばれる。ここで、抗体構築物内の残基又は標的残基の群は、同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を及ぼすように中性又は負帯電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換される。
【００４４】
置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、次いで置換位置に更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位又は領域は既定されるが、突然変異の性質自体を既定する必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の実行を分析又は最適化するために、標的コドン又は領域でアラニン系統的変異導入法又はランダム変異導入法を実施してよく、発現した抗体構築物変異体を所望の活性の最適な組み合わせでスクリーニングする。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を行う技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発が挙げられる。突然変異体のスクリーニングは、標的抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
【００４５】
また、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換（即ち、縮重変異体）、アミノ酸をコードする各コドン（即ち、ＤＮＡ及びＲＮＡ）の不安定位置内の置換、ペプチドのＣ末端に付加されたアミノ酸、又は参照配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％の相同性を有するペプチドを有する、開示するポリペプチドの変異体も開示する。
【００４６】
用語「配列同一性パーセント（％）」又は「相同性」は、必要に応じて最大パーセントの配列同一性を得るために、配列のアライニング及びギャップの導入後に、参照核酸配列中のヌクレオチド又はアミノ酸と同一である候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。
【００４７】
一般に重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲの１つ若しくは２つ以上又はすべてでアミノ酸が置換されている場合、後に得られる「置換」配列は、「元」のＣＤＲ配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％同一であることが好ましい。これは、「置換」配列と同一である度合は、ＣＤＲの長さに基づくことを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するには、その置換配列と８０％同一であり得る。したがって、抗体構築物のＣＤＲは、その置換配列に対して異なる程度の同一性を有してよく、例えば、ＣＤＲＬ１は８０％を有し得るのに対し、ＣＤＲＬ３は９０％を有し得る。
【００４８】
一部の例では、置換（又は置き換え）は保存的置換である。しかしながら、抗体構築物が、第１の結合ドメインを介してＮＫＧ２Ｄに結合し、第２の結合ドメインを介してＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＴＡＡに結合するその能力を保持する限り、任意の置換が考えられる。
【００４９】
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当該技術分野で周知の標準的技術を使用して決定され、これには以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：局所的配列同一性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、配列同一性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、類似性の検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４）、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａ／．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５により記載され、好ましくはデフォルト設定を使用し、又は検査による、Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメータに基づくＦａｓｔＤＢにより計算される：１のミスマッチペナルティ、１のギャップペナルティ、０．３３のギャップサイズペナルティ、及び３０の結合ペナルティ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １２７〜１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、逐次的ペアアラインメントを使用して関連配列の群から複数の配列アラインメントを作成する。また、アラインメントの作成に使用されるクラスタリング相関を示す３つをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、逐次的アラインメント方法（Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０）の簡略化を使用しており、この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３により記載されるものとほぼ同じである。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップレングスウエイト、及びウエイテッドエンドギャップが挙げられる。
【００５０】
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３〜５７８７に記載されている。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｆ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０〜４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分はデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ｌｌ。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動的値であり、特定の配列の構成と所望の配列を検索している特定のデータベースの構成とに基づいてプログラム自体により設定されるが、値を調整して感度を増してもよい。
【００５１】
更なる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｆ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２により報告されたようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴである。Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し；閾値Ｔパラメータを９に設定し；ギャップなし延長（ungapped extensions）をトリガーするための２ヒット法は、１０＋ｋのｋａコストのギャップ長をチャージし；Ｘｕは１６に設定し；Ｘｇはデータベース検索ステージでは４０、アルゴリズムの出力ステージでは６７に設定される。ギャップアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアによりトリガーされる。
【００５２】
一般に、個々の変異ＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性、又は同一性は、本明細書に示す配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には、好ましくは相同性又は同一性を高めて少なくとも６５％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％又は８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％である。同様に、本明細書で同定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体構築物のコード配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。特異的方法は、デフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを使用し、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションはそれぞれ１及び０．１２５に設定される。
【００５３】
一般に、個々の変異ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示すヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性、又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、好ましくは相同性又は同一性を高めて少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、及びほぼ１００％である。したがって、「変異ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対して規定の相同性、類似性、又は同一性を有するものであり、これらに限定されないが、親ＣＤＲの特異性及び活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％などの、生物学的機能を共有する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドは、以下の式を有する二重特異性一本鎖抗体である。
ＶＬＮ−ＶＨＮ−−ＶＬＴ−ＶＨＴ、
ＶＨＮ−ＶＬＮ−−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＮ−ＶＨＮ−−ＶＨＴ−ＶＬＴ、又は
ＶＨＮ−ＶＬＮ−−ＶＬＴ−ＶＨＴ、
式中、「ＶＨＮ」は、ＮＫＧ２Ｄに特異的な重鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＮ」は、ＮＫＧ２Ｄに特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＴ」は、腫瘍細胞抗原に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＴ」は、腫瘍細胞抗原に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「−」は、ペプチドリンカー又はペプチド結合から構成され、
「−−」は、ペプチドリンカー又はペプチド結合から構成される。
【００５５】
上記の式は方向を指定しておらず、したがっていずれの末端もアミノ末端又はカルボキシ末端になり得ることが意図されることに留意されたい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞抗原はＣＳ−１又はＥＧＦＲｖＩＩＩである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＶＨＮは配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬＮは配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＴは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＬＴは配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＴは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＶＬＴは配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、「−」リンカーは配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、「−−」リンカーは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれに関しても、指定した配列は、ポリペプチドの結合親和性を高め、生物学的特性を変更し、又は機能獲得型変異を導入するように修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態では、上記の配列は、結合親和性を維持又は向上する１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）を含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
二重特異性抗体は、抗体可変ドメインのみを使用して構築され得る。非常に有効かつ比較的簡単な方法は、ＶＨ及びＶＬドメイン間のリンカー配列を、折り重なって互いに結合できないほど短くすることである。リンカー長を３〜１２残基に減らすことは、ｓｃＦｖ分子の単量体構成を防止し、６０ｋＤａの非共有結合性ｓｃＦｖ二量体「ディアボディ」の形成を伴う分子間ＶＨ−ＶＬ対合に有利である。ディアボディ型も組換え二重特異性抗体の生成に使用でき、これは、別の抗体のＶＬドメインに短いリンカーで結合されたある抗体由来のＶＨドメインからなる、２つの一本鎖融合生成物の非共有結合性会合により得られる。リンカー長を更に３残基未満に減らすと、三量体（「トリアボディ」、約９０ｋＤａ）又は四量体（「テトラボディ」、約１２０ｋＤａ）が形成され得る。操作された抗体、特に単一ドメイン断片の評価に関しては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６〜１１３６を参照されたい。このような操作された抗体のすべてを、本明細書で提供する融合ポリペプチドに使用することができる。
【００６０】
Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  Ｔａｎｄａｂ（登録商標）は、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）分子の作製方法を教示するために参照により組み込まれる、国際公開第１９９９０５７１５０  Ａ３号又は米国特許出願公開第２００６０２３３７８７号に記載されるように実質的に調製され得る。
【００６１】
操作された抗体の抗原認識部位又は可変領域全体は、任意の所望の抗原（例えば、ＣＳ−１）に対する１つ又は２つ以上の親抗体に由来し得る。親抗体としては、自然発生抗体又は抗体断片、自然発生抗体から応用された抗体又は抗体断片、所望の抗原に特異的なことが知られている抗体又は抗体断片の配列を使用して新たに構築された抗体が挙げられ得る。親抗体に由来し得る配列は、重鎖及び／又は軽鎖可変領域及び／又はＣＤＲ、フレームワーク領域、又はそれらの他の部分を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトに投与されると免疫原性が低くなるように改変され得る。このような改変は、最も近いヒト生殖系列配列に相当するように（生殖系列化）、フレームワーク領域のアミノ酸のキメラ化、ヒト化、ＣＤＲ移植、脱免疫化、及び／又は突然変異として周知の技術のうちの１つ又は２つ以上を含み得る。したがって、改変された二重特異性抗体は、より長期間投与可能なまま、このような改変がいずれもされていない相当する二重特異性抗体より、免疫応答に関する副作用が減少するか又はなくなるであろう。当業者は、望ましくない宿主免疫応答の誘発を防ぐために、抗体を改変する必要性の有無及び改変する程度を決定する方法を理解するであろう。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「キラー細胞」は、細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞であり得る。
【００６４】
一般に、リンカーは、タンパク質を結合すること、又はタンパク質間のいくつかの最小距離若しくは他の空間的関係を保持すること以外、特異的な生物学的活性を有していない。しかしながら、リンカーの構成アミノ酸は、分子の折り畳み、正味荷電、又は疎水性などの、分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択され得る。ｓｃＦｖ抗体の作製に好適なペプチドリンカー（−）は、Ｋｕｍａｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２００７  ３５（２）：１５８〜１６５；Ａｌｂｒｅｃｈｔ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６  ３１０（１〜２）：１００〜１６；Ｆｅｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３  ２８２（１〜２）：３３〜４３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  ９（１）：１０２〜８；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１  ２０３：４６〜８８；Ｂｉｒｄ  ＲＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８  ２４２（４８７７）：４２３〜６；Ｔａｋｋｉｎｅｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９１  ４（７）：８３７〜４１；Ｓｍａｌｌｓｈａｗ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９９  １２（７）：６２３〜３０；Ａｒｇｏｓ  Ｐ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  ２１１（４）：９４３〜５８；及びＷｈｉｔｌｏｗ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９３  ６（８）：９８９〜９５に記載されており、これらの文献は、これらのリンカーと、様々なリンカーを使用して異なる標的に対するｓｃＦｖ抗体を作製する方法とを教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
ｓｃＦｖ分子の結合に使用されるペプチドリンカーの特定の長さは、構築物全体の半減期、免疫原性、及び活性を決定する上で重要である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、又はそれ以上の長さである。いくつかの実施形態では、リンカー配列（−−）は、ヒト筋肉アルドースタンパク質の断片（配列番号１０）、又はその変異体を含む。リンカーは、好ましくはＶＨ−ＶＬ鎖の適切な折り畳み及び会合を妨げない程度に長いが、更なる免疫原性を引き起こす程長くない。
【００６６】
本明細書で開示するタンパク質又は断片はまた、単一ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ鎖を結合するために、少なくとも１つの更なるリンカーを含み得る。例えば、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）を３〜５回反復したサイズが異なり得る、グリシン−セリンリンカーであってよい。例えば、配列番号８は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）を３回反復したものであり、アミノ酸１５個の長さのリンカーを生じる。単一ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ鎖を結合するための他の可能な配列としては、ＣＨＩドメインの最初の６個のアミノ酸、及び／又は親水性アルファチューブリンペプチド配列を含む、人工リンカーが挙げられる。
【００６７】
また、本明細書で開示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも開示する。また、開示するポリヌクレオチドを含むベクターも開示する。ベクターは、（外来）遺伝物質を細胞内に導入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般に、操作されたベクターは、複製開始点、マルチクローニング部位、及び選択可能マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、挿入部分（導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」として働くより大きな配列とを含む、ヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列である。最新のベクターは、導入遺伝子挿入及び骨格以外に、プロモータ、遺伝マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的配列、タンパク質精製タグといった更なる特徴を包含し得る。発現ベクターは、導入遺伝子を標的細胞で発現させるためであり、一般にコントロール配列を有する。用語「コントロール配列」は、特定の宿主生物で操作可能に連結したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えば、プロモータと、任意追加的にオペレータ配列と、リボソーム結合部位とを含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサを使用するために周知である。
【００６８】
また、開示するポリヌクレオチド又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞も開示する。本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」又は「レシピエント細胞」は、ベクター、外来性核酸分子、及び開示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのレシピエント；及び／又はポリペプチド自体のレシピエントであり得るか又はレシピエントであった、任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことが意図される。それぞれの物質の細胞への導入は、形質転換、トランスフェクションなどの方法により行われる。用語「宿主細胞」はまた、単一細胞の子孫又は潜在的子孫を含むことが意図される。自然、偶発的、若しくは意図的突然変異のいずれかにより、又は環境の影響により、世代継承で特定の変異が起こり得るため、このような子孫は、実際には、親細胞と（形態学的に、又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体において）完全に同じではあり得ないが、本明細書で使用するとき、依然として用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞としては、原核又は真核細胞が挙げられ、また、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞、例えば、昆虫細胞及び哺乳類細胞（例えば、マウス、ラット、マカク、又はヒト）も挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
開示するポリペプチドは、細菌で産生され得る。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、開示するポリペプチドに好ましいクローニング又は発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、即ち一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物中で最も一般的に使用される。しかしながら、多くの他の属、種、及び株が一般的に使用可能及び本明細書で有用であり、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２  ２２６号）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３  ０７０号）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４  ２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；及び糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒが挙げられる。
【００７０】
グリコシル化ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株及び変異株並びに対応する宿主由来の許容昆虫宿主細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉが、同定されている。トランスフェクション用の様々なウイルス株が公的に入手可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異株及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が挙げられる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ、及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として使用され得る。植物細胞培養物でのタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に周知である。
【００７１】
好適な宿主細胞には脊椎動物細胞も挙げられ、脊椎動物細胞の培養（組織培養）における増殖は常法になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養液での増殖のためにサブクローンされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；子ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｆ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，１４１３  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４〜６８）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００７２】
また、本明細書で開示するポリペプチドの産生方法も開示し、この方法は、開示するポリペプチドを発現させる条件下で本明細書に開示する宿主細胞を培養する工程と、培養物からポリペプチドを回収する工程とを含む。
【００７３】
組換え技術を使用するとき、開示するポリペプチドは、組織内で、細胞膜周辺腔で、又は培質中に直接分泌して、産生され得る。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒子破片（宿主細胞又は溶解した断片のいずれか）を、例えば、遠心分離又は限外濾過により除去する。ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌されてもよい。簡単に言うと、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分以上融解される。細胞破片は、遠心分離により除去され得る。ポリペプチドが媒質中に分泌される場合、このような発現系から得られた上澄み液は、一般に市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮される。前述の工程のいずれかに、タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含んでもよく、外来性汚染物の増殖を防ぐために抗生物質を含んでもよい。
【００７４】
宿主細胞から調製された開示するポリペプチドは、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを使用して回収又は精製され得る。他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安沈殿も、回収するポリペプチドに基づいて使用可能である。開示するポリペプチドがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。
【００７５】
アフィニティクロマトグラフィーを使用してもよい。親和性リガンドが付着するマトリックスは、ほとんどの場合にアガロースであるが、他のマトリックスも使用可能である。制御された細孔性ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで得られるより速い流速と短い処理時間を可能にする。
【００７６】
また、本明細書で開示するポリペプチドを医薬的に許容される担体中に含む、医薬組成物も開示する。「医薬的に許容される」とは、生物学的に又はその他の点で望ましくなくない物質を意味し、即ち、物質は、望ましくない生物学的効果をいずれも引き起こすことなく、又は物質が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸又はベクターと共に被験体に投与され得る。担体は、当業者に周知であるように、活性成分の分解を最小限にするため、及び被験体における任意の有害な副作用を最小限にするため、当然選択される。
【００７７】
本明細書で開示する化合物は、非経口投与用に処方され得る。非経口製剤は、当該技術分野で周知の技術を使用して、水性組成物として調製され得る。典型的には、このような組成物は、注射製剤、例えば、溶液又は懸濁液；注射前に再構成媒質を添加して溶液又は懸濁液を調製するように使用するのに好適な固形；乳剤、例えば、油中水（ｗ／ｏ）型乳剤、水中油（ｏ／ｗ）型乳剤、及びそれらのマイクロエマルション、リポソーム、又はエマルソームとして調製され得る。
【００７８】
担体は、例えば、水、エタノール、１つ又は２つ以上のポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、植物油などの油（例えば、落花生油、コーン油、ゴマ油など）、及びそれらの組み合わせを含む、溶剤又は分散媒であり得る。
【００７９】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持により、及び／又は界面活性剤の使用により、維持され得る。多くの場合に、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【００８０】
活性化合物の遊離酸又は塩基又は薬学的に許容される塩としての溶液及び分散液は、水又は他の溶剤又は分散媒中で調製され、１つ又は２つ以上の医薬的に許容される賦形剤と適切に混合されてよく、これらの賦形剤としては、界面活性剤、分散剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
好適な界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、両性、又は非イオン性界面活性剤であり得る。好適なアニオン性界面活性剤としては、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン、及び硫酸イオンを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。アニオン性界面活性剤の例としては、長鎖アルキルスルホン酸及びアルキルアリールスルホン酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、例えば、ビス−（２−エチルチオキシル）−スルホコハク酸ナトリウム；及びアルキル硫酸塩、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム化合物、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ポリオキシエチレン及びココナツアミンが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の例としては、モノステアリン酸エチレングリコール、ミリスチン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ポリグリセリル−４−オレエート、ソルビタンアシレート、スクロースアシレート、ＰＥＧ−１５０ラウレート、ＰＥＧ−４００モノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、及びポリオキシエチレン水添獣脂アミドが挙げられる。両性界面活性剤の例としては、Ｎ−ドデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアンホ酢酸、ラウリルベタイン、及びラウリルスルホベタインが挙げられる。
【００８２】
製剤は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含み得る。好適な保存剤としては、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。製剤はまた、活性薬剤の分解を防ぐために酸化防止剤も含み得る。
【００８３】
製剤は、典型的には再構成時に非経口投与用にｐＨ３〜８に中和される。好適な緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及びクエン酸緩衝液が挙げられが、これらに限定されない。
【００８４】
水溶性ポリマーは、多くの場合に非経口投与用の製剤に使用される。好適な水溶性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、及びポリエチレングリコールが挙げられが、これらに限定されない。
【００８５】
無菌注射剤は、必要量の活性化合物を、必要に応じて１つ又は２つ以上の上記の賦形剤と共に適切な溶剤又は分散媒に加え、次いで濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、分散液は、様々な滅菌した活性成分を、塩基性分散媒と上記成分のうちの必要な他の成分とを含む無菌ビヒクルに加えることにより調製される。無菌注射剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め無菌濾過した活性成分及び任意の所望の追加成分の溶液からそれらの粉末を得る、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末は、粒子が事実上多孔質になるように調製されてよく、それによって粒子の溶解を向上させ得る。多孔質粒子の作製方法は、当該技術分野で周知である。
【００８６】
ペプチドは、誘導体の経口送達が有効であるように化学的に修飾され得る。一般に、意図される化学修飾は、少なくとも１つの部分を成分分子自体に結合させることであり、この部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は腸から血流への取り込みを可能にする。また、成分の全体的な安定性を向上させ、体内での循環時間を向上させることが望ましい。例えば、ＰＥＧ化は、医薬用途に好ましい化学修飾である。使用され得る他の部分としては、プロピレングリコール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソラン、及びポリ−１，３，６−チオキソカンが挙げられる。
【００８７】
経口製剤に関しては、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸（jejunem）、若しくは回腸）、又は大腸であり得る。当業者は、胃で溶解せず、しかも十二指腸又は他の腸内で物質を放出する、利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、ペプチド（又は誘導体）を保護するか、又は胃内環境を越えて腸内などでペプチド（又は誘導体）を放出するかのいずれかにより、胃内環境の悪影響を避けるであろう。
【００８８】
完全な胃内耐性を保証するために、コーティングは少なくともｐＨ５．０まで不透過性にすることができる。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、及びＳｈｅｌｌａｃである。これらのコーティングを混合フィルムとして使用してもよい。
【００８９】
コーティング又はコーティング混合物はまた、胃に対する保護を意図しない、錠剤に使用してもよい。これには、糖衣、又は錠剤を飲み込みやすくするコーティングが挙げられ得る。カプセルは、乾燥治療（即ち、粉末）の送達のためにハードシェル（ゼラチンなど）から構成されてよく、液体ではソフトゼラチンシェルを使用してよい。カシェ剤のシェル材料は、薄いデンプン又は他の食用紙であり得る。ピル、トローチ剤、成型錠剤、又は粉薬錠剤に関しては、湿潤集塊技術を使用してよい。
【００９０】
ペプチドの水性環境への溶解を補助するために、湿潤剤として界面活性剤を添加し得る。界面活性剤には、アニオン性洗剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられ得る。カチオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを使用してよく、これらを含み得る。界面活性剤として製剤に含まれ得る潜在的非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート２０、４０、６０、６５、及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質又は誘導体の製剤中に単体又は異なる割合の混合物のいずれかとして存在してよい。
【００９１】
ペプチドの取り込みを潜在的に高める添加剤は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸である。
【００９２】
放出制御経口製剤が望ましいことがある。ペプチドは、拡散又は浸出機構のいずれかにより放出を可能にする不活性基質に加えられてよい（例えば、ゴム質）。徐々に変質する基質も製剤に組み込まれ得る。いくつかの腸溶コーティングも遅延放出効果を有する。別の放出制御形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものであり、即ち、薬剤は半透膜中に封入されており、半透膜は、単一の小孔から浸透圧効果により水が浸入して薬剤を押し出すことができる。
【００９３】
他のコーティングを製剤に使用してもよい。これらには、コーティングパンに適用され得る様々な糖が含まれる。ペプチドをフィルムコート錠に提供してもよく、この場合に使用される材料は２つの群に分けられる。第１の群は、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポロビドン、及びポリエチレングリコールを含む。第２の群は、フタル酸の一般的なエステルである腸溶性材料から構成される。
【００９４】
材料の混合物を使用して、最適なフィルムコーティングを提供してもよい。フィルムコーティングは、パンコーター若しくは流動層で、又は圧縮コーティングにより行われ得る。
【００９５】
また、癌の治療が必要な被験体で癌を治療する方法も開示し、これは本明細書で開示するポリペプチドを被験体に投与することを伴う。いくつかの症例では、ポリペプチドは治療有効量で投与される。
【００９６】
医薬組成物などの、本明細書で開示する組成物は、局所治療又は全身治療が望まれているかどうか、及び治療する領域に応じて、多数の方法で投与され得る。例えば、開示する組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、又は経皮的に投与され得る。組成物は、例えば、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、眼科用に、膣内に、直腸に、鼻腔内に、局所的に投与されてよく、これには、局所鼻腔内投与又は吸入による投与が含まれる。
【００９７】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に注射を特徴とする。注射剤は、溶液若しくは懸濁液、注射前に液体で懸濁する溶液に好適な固形、又は乳剤のいずれかとして、従来の形態で調製されてよい。見直された非経口投与の方法は、一定用量が維持されるように徐放系又は持続放出系の使用を伴う。
【００９８】
本明細書で開示する組成物は、癌のリスクがある患者又は被験体に予防的に投与され得る。したがって、方法は、本明細書で開示する組成物の投与の前に癌のリスクがある被験体を識別することを更に含み得る。
【００９９】
必要とされる組成物の正確な量は、被験体の人種、年齢、体重及び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸又はベクター、組成物の投与様式などに依存して、被験体によって異なるであろう。したがって、すべての組成物の正確な量を指定することは不可能である。しかしながら、適量は、本明細書の教示に鑑みて、通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。例えば、組成物を投与するための有効用量及びスケジュールは、経験的に判定され得、かかる判定を行うことは、当該技術分野の技術内である。組成物の投与用量範囲は、疾患が引き起こされる症状に所望の効果を生じるほど大きいものである。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般に、用量は、年齢、状態、性別、及び患者の疾患の程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかとともに変動し、当業者によって判定することができる。用量は、いずれかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整することができる。用量は、毎日、１日、又は数日間、変更することができ、かつ１つ若しくは２つ以上の用量の投与において投与することができる。指針は、所与のクラスの医薬製品に対する適切な用量に関する文献において見出すことができる。例えば、抗体の適切な用量選択における指針は、抗体の治療用途に関する文献に見出すことができ、これには例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３〜３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５〜３８９が挙げられる。典型的な単独使用の抗体の一日用量は、上記の因子に基づいて、一日につき体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜最大１００ｍｇ又はそれ以上の範囲であり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、開示するポリペプチドは、体重１ｋｇ当たり約０．１ｎｇ〜約１００ｇ、体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜約５０ｇ、体重１ｋｇ当たり約１００ｎｇ〜約１ｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約５０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、及び体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇの非経口投与に相当する用量で投与される。あるいは、治療有効量を得るために投与されるポリペプチドの量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、又はそれ以上である。
【０１０１】
「被検体」という用語は、投与又は治療の標的である任意の個体を指す。被検体は、脊椎動物、例えば、哺乳類であり得る。このため、被検体は、ヒト又は獣医学的患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある被検体を指す。
【０１０２】
開示する方法の癌は、未制御の増殖、浸潤、又は転移を起こす被験体の任意の細胞であり得る。いくつかの態様では、癌は、現在放射線療法が使用される、任意の新生物又は腫瘍であり得る。あるいは、癌は、標準的な方法を使用する放射線療法の影響を十分に受けない、新生物又は腫瘍であり得る。したがって、癌は、肉腫、リンパ腫、白血病、癌種、芽腫、又は胚細胞腫瘍であり得る。開示する組成物を治療に使用できる癌の代表的な非限定的リストには、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌種、大腸癌、造血性癌；精巣癌；結腸及び直腸癌、前立腺癌、及び膵臓癌が挙げられる。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態について説明されている。それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく種々の修正を加えてもよいことが理解される。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥの作製及びその特徴
材料及び方法
抗ＣＳ１及び抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥのクローニング。ＴｒｉＣＬＥをインシリコ（in silco）で設計し、遺伝子断片として合成した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。遺伝子断片を発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ６ｐ−１及びｐＥＴ２１ｄ）にクローンした。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１及び２は、それぞれｐＥＴ２１ｄ−ＴｒｉＣＬＥ及びｐＧＥＸ６ｐ−１−ＴｒｉＣＬＥのヌクレオチド配列を提供する。
【０１０５】
タンパク質の産生。３０℃で一晩１００μＭ  ＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質の発現を誘発した。その後、細菌細胞を採取し、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４及びプロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液中で超音波処理により溶解させた。ＴｒｉＣＬＥタンパク質をＨｉｓＴＲＡＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で精製し、再び折り畳み、遠心分離フィルターユニットを使用してＰＢＳ／グリセリンで透析した。ＴｒｉＣＬＥの濃度を測定し、試験用に希釈した。
【０１０６】
フローサイトメトリー。ＴｒｉＣＬＥの結合親和性をフローサイトメトリーの使用により試験した。２×１０−５の多発性骨髄腫細胞株（例えば、ＭＭ１．ｓ）又は神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株を使用して、一次染色試薬としてＴｒｉＣＬＥで染色した後、ｓｃＦｖの存在を検出するためにビオチン標識タンパク質Ｌを使用し、フローサイトメトリーによりＰＥ結合抗ビオチン抗体で検出した。ヒト末梢血単核細胞における他の表現型検査に関して、次の抗体を使用した：ＣＤ５６−ＡＰＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ３−ＡＰＣＨ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ６９−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０１０７】
細胞傷害性アッセイ。ＴｒｉＣＬＥの細胞傷害性アッセイを２４及び４８時間実施した。したがって、フロー計測細胞傷害性アッセイを使用した。簡単に言うと、２０：１のエフェクター対標的比でＮＫ細胞株ＮＫＬを多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞と混合した。ＴｒｉＣＬＥを５０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの指定漸増用量で共培養に添加し、２時間インキュベートした。対照としてＴｒｉＣＬＥあり又はなしのＮＫＬ単独及びＨ９２９単独を使用し、ＴｒｉＣＬＥの毒性を測定した。細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析して、各条件の生細胞及び死細胞の割合を測定した。
【０１０８】
配列：
ｐＥＴ２１ｄ−抗ＣＳ−１−ＴｒｉＣＬＥのＤＮＡ配列
【化１−１】
2018510623.tif 000002
【化１−２】
2018510623.tif 000003
【化１−３】
2018510623.tif 000004
【化１−４】
2018510623.tif 000005
【０１０９】
ｐＧＥＸ６ｐ１ｍ−抗ＣＳ−１−ＴｒｉＣＬＥのＤＮＡ配列
【化２−１】
2018510623.tif 000006
【化２−２】
2018510623.tif 000007
【化２−３】
2018510623.tif 000008
【０１１０】
抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖のＤＮＡ配列
【化３】
2018510623.tif 000009
【０１１１】
抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖のＤＮＡ配列
【化４】
2018510623.tif 000010
【０１１２】
抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖のタンパク質配列
【化５】
2018510623.tif 000011
【０１１３】
抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖のタンパク質配列
【化６】
2018510623.tif 000012
【０１１４】
ＳｃＦｖリンカー（Ｇ４Ｓ）３のＤＮＡ配列
【化７】
2018510623.tif 000013
【０１１５】
ＳｃＦｖリンカー（Ｇ４Ｓ）３のタンパク質配列
【化８】
2018510623.tif 000014
【０１１６】
ＨＭＡのＤＮＡ配列
【化９】
2018510623.tif 000015
【０１１７】
ＨＭＡのタンパク質配列
【化１０】
2018510623.tif 000016
【０１１８】
３’〜５’ＣＳ−１  ｓｃＦｖ軽鎖のＤＮＡ配列
【化１１】
2018510623.tif 000017
【０１１９】
３’〜５’ＣＳ−１  ｓｃＦｖ軽鎖のＤＮＡ配列
【化１２】
2018510623.tif 000018
【０１２０】
３’〜５’ＣＳ−１  ｓｃＦｖ重鎖のタンパク質配列
【化１３】
2018510623.tif 000019
【０１２１】
３’〜５’ＣＳ−１  ｓｃＦｖ軽鎖のタンパク質配列
【化１４】
2018510623.tif 000020
【０１２２】
ヒスチジンタグのＤＮＡ配列
【化１５】
2018510623.tif 000021
【０１２３】
ヒスチジンタグのタンパク質配列
【化１６】
2018510623.tif 000022
【０１２４】
３’〜５’ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ重鎖のＤＮＡ配列
【化１７】
2018510623.tif 000023
【０１２５】
３’〜５’ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ軽鎖のＤＮＡ配列
【化１８】
2018510623.tif 000024
【０１２６】
３’〜５’ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ重鎖のタンパク質配列
【化１９】
2018510623.tif 000025
【０１２７】
３’〜５’ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ軽鎖のタンパク質配列
【化２０】
2018510623.tif 000026
【０１２８】
ＴｒｉＣＬＥ
【化２１】
2018510623.tif 000027
【０１２９】
グリシン−セリンリンカー
【化２２】
2018510623.tif 000028
【０１３０】
ＴｒｉＣＬＥは、ｓｃＦｖ（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の重鎖及び軽鎖と、ヒト筋肉アルドースの２０アミノ酸リンカーと、抗ＣＳ−１抗体の重鎖及び軽鎖とを結合することにより、インシリコで設計された（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８（２０１４），９１７〜２７及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０（２０１４），３９８９〜４０００）。設計を図１に示す。抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖのＤＮＡ及びタンパク質配列を上記に示す（配列番号３〜６）。抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ及び抗ＣＳ１  ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖を結合するために、グリシン及びセリンの反復で構成されたリンカーを使用した（配列番号７及び８）。ＨＭＡのＤＮＡ及びタンパク質配列を配列番号９及び１０として示す。抗ＣＳ１  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列（配列番号１１及び１２）及びタンパク質配列（配列番号１３及び１４）を３’〜５’まで示した。配列全体にヒスチジン（配列番号１５〜１６）の６反復が続く。
【０１３１】
抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥの生化学的分析は、５６．６ｋＤａの分子量を有することを示し、７．９９のｐＩを有した。全アミノ酸組成を表１に示す。ＴｒｉＣＬＥのサイズは、タンパク質Ｌにより検出されるとき、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色及びウエスタンブロットを使用して標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された（図２）。ＴｒｉＣＬＥの吸光係数は、水中で１０２７２０Ｍ−１ｃｍ−１である。細菌における概算半減期は１０時間超である。
【０１３２】
【表１】
2018510623.tif 000029
【０１３３】
実施例２：抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥ活性化ＮＫ細胞の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞に対する細胞傷害性
図３は、抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥ存在下におけるＮＫ細胞株ＮＫＬの多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株Ｈ９２９に対する細胞傷害性のグラフである。５０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲のＴｒｉＣＬＥの漸増用量を、２０：１のエフェクター比でＮＫＬ：Ｈ９２９の共培養に添加した。
【０１３４】
実施例３：抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥは、多発性骨髄腫細胞を効率的に染色し得る
抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥをフローサイトメトリー用の染色試薬として使用したとき、多発性骨髄腫患者から単離された典型的な細胞株であるＭＭ１．ｓの８０％を染色することができた（図４Ａ）。アイソタイプ対照と比べると、平均蛍光強度が有意に上昇した。これは、ＣＳ１  ｓｃＦｖが機能的であったことを示唆する（図４Ｂ）。
【０１３５】
実施例４：抗ＣＳ−１  ＴｒｉＣＬＥは、ヒトキラー細胞を活性化し、特異的細胞傷害性を誘発した
ＴｒｉＣＬＥは、５μｇ／ｍＬにおいて、ＣＤ６９のアップレギュレーションにより示されるように、初代Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞をＰＢＭＣ中で４時間で活性化した（図５Ａ）。これは、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖが固定化され、細胞活性化を誘発するのに機能的であったことを示唆した。抗ＣＤ３抗体を同時に投与したとき、ＣＤ６９のアップレギュレーションが見られた（図５Ｂ）。ＴｒｉＣＬＥをＭＭ１．ｓ、Ｈ９２９、及びＲＰＭＩ−８２２６などの多発性骨髄腫細胞株の共培養で使用したとき、ＴｒｉＣＬＥ活性化ＰＢＭＣの細胞傷害性が上昇した（図５Ｃ）。ＭＭ１．ｓのＥＣ５０は３×１０−１２Ｍであった。ＣＳ１の発現が低い細胞株に関しては、Ｈ９２９細胞のＥＣ５０は１．２×１０−９Ｍであり、ＲＰＭＩ−８２２６のＥＣ５０は１．８×１０−９Ｍであった。ＴｒｉＣＬＥは、２４時間及び４８時間でのＣＤ５６枯渇エフェクター細胞を使用して、細胞傷害性を誘発した（図５Ｄ）。
【０１３６】
実施例５：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥは、ヒトキラー細胞を活性化し、特異的細胞傷害性を誘発した
図１Ａは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥの図式表示を示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖のＤＮＡ及びタンパク質配列を配列番号１７〜２０として示す。図６Ａは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥによるＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞の活性化を示す。５μｇ／ｍＬのＴｒｉＣＬＥを休止ヒトＰＢＭＣに４時間添加した後、細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１４、及びＣＤ６９について室温で２０分間染色した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。図６Ｂは、活性化ヒトＰＢＭＣの細胞傷害性が、３種類の多発性骨髄腫細胞ＧＢＭ１１２３に対して抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＴｒｉＣＬＥにより高められたことを示す。非線形回帰曲線からＥＣ５０を計算した。結果は３人の個別ドナーから得られた。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１。
【０１３７】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、開示される発明に属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用される刊行物及びそれらが引用される資料は、参照により具体的に組み込まれる。
【０１３８】
当業者であれば、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を理解するか、又は解明することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図１】
2018510623.tif 000030
【図２】
2018510623.tif 000031
【図３】
2018510623.tif 000032
【図４Ａ】
2018510623.tif 000033
【図４Ｂ】
2018510623.tif 000034
【図５Ａ】
2018510623.tif 000035
【図５Ｂ】
2018510623.tif 000036
【図５Ｃ】
2018510623.tif 000037
【図５Ｄ】
2018510623.tif 000038
【図６Ａ】
2018510623.tif 000039
【図６Ｂ】
2018510623.tif 000040
【図６Ｃ】
2018510623.tif 000041
【配列表】
2018510623000001.app
【国際調査報告】
2018510623.tif 000042
2018510623.tif 000043
2018510623.tif 000044