(57)【要約】  本発明は、抗コチニン抗体が連結したキメラ抗体受容体、およびその使用に関連する。キメラ抗体受容体をその表面上に提示しているＴ細胞は、それと共に添加されたコチニン標識されたコンジュゲートの標的分子に対して特異的なインターフェロンガンマを分泌し、その標的分子を発現している細胞の細胞死を誘導する。それに加えて、コチニンで標識された細胞毒性物質を投与することにより、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死が誘導され、そして必要ならば、コチニンで標識された細胞毒性物質を投与して既に投与されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を除去することができ、それによってＴ細胞の過剰活性に依る免疫副作用を抑制することができる。よって抗コチニン抗体が連結したキメラ抗原受容体は、癌の治療のために効果的に使用されることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗コチニン抗体と連結したキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体は、
抗コチニン抗体またはその断片；
ヒンジドメイン；
膜貫通ドメイン；および
シグナル伝達ドメイン、
を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記断片が、抗コチニン抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、請求項１のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記抗コチニン抗体またはその断片が、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２３から２５のアミノ酸配列により表される重鎖可変領域；または、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２６から２８のアミノ酸配列により表される軽鎖可変領域、を含む請求項１のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記抗コチニン抗体の断片が配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項３のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＩｇＧ１ヒンジドメイン、Ｉｇ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８細胞外領域、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）細胞外領域、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
ＣＤ８ヒンジドメインが配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項５のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）タンパク質の膜貫通領域である、請求項１のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通領域を含む、請求項７のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記ＣＤ２８の膜貫通領域が配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項８のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７８（誘導性Ｔ細胞共刺激分子、ＩＣＯＳ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、またはＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）である、請求項１のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８とＣＤ３ゼータの細胞質領域である、請求項１０のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）とＣＤ３ゼータの細胞質領域である、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記ＣＤ２８の細胞質領域が、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１１のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記ＣＤ３ゼータの細胞質領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項１１または請求項１２のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記キメラ抗原受容体が、配列番号１５または配列番号１７のアミノ酸配列を有する、請求項１のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
請求項１のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１８】
前記発現ベクターがウイルスベクターである請求項１７の発現ベクター。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１８の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１６の核酸分子を含むウイルス。
【請求項２１】
請求項２０のウイルスが形質導入された細胞。
【請求項２２】
前記細胞がＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージである、請求項２１の細胞。
【請求項２３】
請求項２１の細胞；および
コチニンがコンジュゲートした結合分子；
を含む、キメラ抗原受容体細胞。
【請求項２４】
結合分子がペプチド、核酸、タンパク質、または化学物質である、請求項２３のキメラ抗原受容体細胞。
【請求項２５】
前記核酸がアプタマーである、請求項２４のキメラ抗原受容体細胞。
【請求項２６】
前記タンパク質が抗体またはホルモンである、請求項２４のキメラ抗原受容体細胞。
【請求項２７】
前記キメラ抗原受容体細胞が、キメラ抗原受容体の抗コチニン抗体部分とコチニンの間の抗原−抗体結合によって形成される、請求項２３のキメラ抗原受容体細胞。
【請求項２８】
キメラ抗原受容体細胞の調製が；
１）コチニンがコンジュゲートした結合分子を請求項２１の細胞へ添加することを含む工程；および
２）コチニンがコンジュゲートした結合分子に結合したキメラ抗原受容体細胞を選択することを含む工程、
を含む請求項２３のキメラ抗原受容体細胞。
【請求項２９】
特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、活性成分として請求項２３のキメラ抗原受容体細胞を含む医薬組成物。
【請求項３０】
前記状態または疾患が癌である、請求項２９の医薬組成物。
【請求項３１】
前記癌が固形癌または血液悪性腫瘍である、請求項３０の医薬組成物。
【請求項３２】
前記固形癌が、肺癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、胸腺癌、胃癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌からなる群から選択される、請求項３１の医薬組成物。
【請求項３３】
前記血液悪性腫瘍が、リンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫である、請求項３３の医薬組成物。
【請求項３４】
請求項２３のキメラ抗原受容体細胞を被験体に投与することを含む、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための方法。
【請求項３５】
前記状態または疾患が癌である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
被験体の中でキメラ抗原受容体細胞を作製するための方法であって、
１）請求項２１の細胞を前記被験体に投与すること；および
２）コチニンがコンジュゲートした結合分子を前記被験体に投与すること、
を含む方法。
【請求項３７】
キメラ抗原受容体細胞の細胞死を誘導するための方法であって、
１）請求項２１の細胞とコチニンがコンジュゲートした結合分子を被験体に投与すること；および
２）コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を前記被験体に更に投与すること、
を含む方法。
【請求項３８】
前記細胞毒性剤が、デュオカルマイシン、ＳＮ−３８、カリケアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ドキソルビシン、ピロロベンゾジアゼピン、ＤＭ４、またはＤＭ１である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬キットであって：
請求項２３のキメラ抗原受容体細胞を活性成分として、薬学的および治療上有効な量で含む第１の成分；および
コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を活性成分として、薬学的および治療上有効な量で含む第２の成分、
を含む医薬キット。
【請求項４０】
前記状態または疾患が癌である請求項３９の医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗コチニン抗体と連結したキメラ抗体受容体、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド、アプタマー、抗体などの物質は優れた効果を有する生物学的な治療剤として開発され得るが、そのような物質は体内で容易に分解し、腎臓を通じて迅速に排出され得るので、インビボで短い半減期を有する。そのような問題を解決するために、そのような物質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコンジュゲートさせることにより、それのインビボでの半減期を増加させる研究が行われてきた（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  Ｆ．Ｍ＆Ｐａｓｕｔ  Ｇ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，１０，１４５１−１４５８，２００５）。しかしながら、ＰＥＧをコンジュゲートさせる過程において様々な分子複合体が形成し、ＰＥＧとコンジュゲートさせる結合分子に依って最適化された条件を確立しなければならないという制限がある。加えてそのような分子は、その標的物体が細胞（例えば癌細胞等）であるときには、細胞毒性を有さないか又は弱いという不利益を有する。よって近年、抗体と細胞毒性剤のコンジュゲート（抗体−薬剤コンジュゲート）が開発されてきている。
【０００３】
一方キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗体の部分、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインから成る。ＣＡＲを発現しているＴ細胞およびナチュラルキラー細胞などの免疫細胞（ＣＡＲ細胞）は、ＣＡＲの抗体部分を用いて標的細胞（例えば癌細胞等）上に発現している表面分子を特異的に認識し、標的細胞に対して細胞毒性を示す。よってＣＡＲ細胞は遺伝的に改変された細胞療法の形で利用され、特にＣＡＲを発現しているＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）は、ＣＤ１９が発現している血液悪性腫瘍に対して高い治療効果を示したと報告された。
【０００４】
しかしながら、従来のＣＡＲ細胞は単一の標的分子のみを認識するという制限を有するために、ハプテンに対するＣＡＲ細胞が研究されてきた。これらの細胞はＣＡＲを発現し、ＣＡＲの抗体部位を用いて特定のハプテンを認識する。そしてペプチド、アプタマー、抗体、低分子量化学物質等の標的分子と結合する能力を有する分子はハプテンとコンジュゲートされ、これらの抗ハプテンＣＡＲ細胞と複合化（complexed with）される。これによって、１つの型のＣＡＲ細胞が種々の標的分子と結合することが可能な、多標的化ＣＡＲ細胞を調製することができる。
【０００５】
キメラ抗体受容体を発現している細胞が非標的細胞と結合することを避けるために、ハプテンは元来インビボに存在しない物質であることが好ましい。加えてハプテンは、結合分子と効率的なコンジュゲーションをするための化学官能基を有さなければならない。
【発明の開示】
【０００６】
技術的な課題
コチニンはニコチンの主たる代謝産物であり、インビボで生合成されず（ｄｅ  ｎｏｖｏ  生合成）生理学的な活性を示さない。加えて哺乳動物におけるコチニンの代謝過程はよく知られており、コチニンの血清半減期は短く１６時間であると報告されている（Ｂｅｎｏｗｉｔｓ  Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，３ｒｄ  Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２９-６０，２００９）。よって、喫煙を止めてから数日後にはコチニンは既に体内に存在しないために、喫煙者の場合でさえもコチニンをハプテンとして使用することができる。それに加えてカルボニル官能基を有するコチニンは入手が容易であるので、結合分子へのコチニンのコンジュゲーションは促進される。
【０００７】
そこで抗コチニン抗体の一部とコチニンがコンジュゲートした結合分子を含むＴ細胞を調製することにより、本発明者らは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はコチニンがコンジュゲートした結合分子を特異的に認識し、インターフェロンガンマを分泌し、標的細胞の細胞死を誘導することを確認した（図１）。
【０００８】
加えて近年、抗腫瘍ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性の増加と共に、そのような遺伝的に改変されたＴ細胞の過剰反応性に依る免疫毒性が、有害副作用として強調されてきている。よってその有害副作用が生じたときに、そのような細胞の細胞死を誘導することにより、これらのＴ細胞によって引き起こされる重大な有害副作用を解決するための手段が研究されている。抗ハプテンＣＡＲの場合には、ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入された患者の体内で免疫毒性の副作用が生じたときに、ハプテンがコンジュゲートした結合分子の代わりにハプテンがコンジュゲートした細胞毒性剤を注入することにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞死を誘導することができ、なぜならば、ハプテンがコンジュゲートした細胞毒性剤は抗ハプテンＣＡＲ  Ｔ細胞のみに結合するからである。よってこのシステムは、ハプテンがコンジュゲートした細胞毒性剤を、Ｔ細胞により引き起こされた有害副作用を解決するための安全対策として使用できるという、追加の利点を提供する（図２）。従って本発明者らは、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤により、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死が誘導されることを確認することによって本発明を達成した。
【０００９】
よって抗コチニン抗体と連結したＣＡＲを提供することが本発明の課題である。
【００１０】
本発明の他の課題は、ＣＡＲをコードする核酸分子、それを含む発現ベクターとウイルス、およびそのウイルスを形質導入した細胞を提供することである。
【００１１】
更に本発明の他の課題は、コチニンがコンジュゲートした結合分子を細胞内に更に含むＣＡＲ細胞を提供することである。
【００１２】
更に本発明の他の課題は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することであり、その医薬組成物は活性成分としてＣＡＲ細胞を含む。
【００１３】
更に本発明の他の課題は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための方法を提供することであり、その方法はＣＡＲ細胞を被験体に投与することを含む。
【００１４】
更に本発明の他の課題は、ＣＡＲ細胞の細胞死を誘導するための方法を提供することである。
【課題の解決】
【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明は抗コチニン抗体と連結したＣＡＲを提供し、そのＣＡＲは抗コチニン抗体またはその断片、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【００１６】
加えて本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。
【００１７】
加えて本発明は、その核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００１８】
加えて本発明は、その核酸分子を含むウイルスを提供する。
【００１９】
加えて本発明は、そのウイルスが形質導入された細胞を提供する。
【００２０】
加えて本発明は、コチニンがコンジュゲートした結合分子を細胞内に含む、ＣＡＲ細胞を提供する。
【００２１】
加えて本発明は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供し、その医薬組成物は活性成分としてＣＡＲ細胞を含む。
【００２２】
加えて本発明は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための方法を提供し、その方法は被験体にＣＡＲ細胞を投与することを含む。
【００２３】
加えて本発明は、被験体の中でＣＡＲ細胞を調製するための方法を提供し、その方法は、細胞を被験体に投与すること；および、被験体にコチニンがコンジュゲートした結合分子を投与することを含む。
【００２４】
加えて本発明は、ＣＡＲ細胞の細胞死を誘導するための方法を提供し、その方法は、細胞とコチニンがコンジュゲートした結合分子を被験体に投与すること；および、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を更に被験体に投与することを含む。
【００２５】
更に本発明は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬キットを提供し、その医薬キットは、ＣＡＲ細胞を活性成分として薬学的および治療上有効な量で含む第１の成分；および
コチニンと細胞毒性剤の複合体を活性成分として薬学的および治療上有効な量で含む第２の成分、を含む。
【本発明の有利な効果】
【００２６】
本発明の抗コチニン抗体と連結したＣＡＲをその表面に提示するＴ細胞は、コチニンがコンジュゲートした結合分子の標的を特異的に認識し、インターフェロンガンマを分泌し、標的分子を発現している細胞の細胞死を誘導する。加えてコチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を投与することにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞死が誘導される。従って必要なときには、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を投与することにより、前投与したＣＡＲ  Ｔ細胞を除去することが可能であり、それによってＴ細胞の過剰反応性に依る有害な免疫副作用を抑制することができる。よって抗コチニン抗体と連結したキメラ抗原受容体を、特定の細胞が増殖した状態または疾患を治療するために有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、コチニンがコンジュゲートした結合分子を標的細胞に依って変更することにより、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の標的を切り替えることができることを示す略図である。
【図２】図２は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死を誘導するのに、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤が使用されることを示す略図である。
【図３】図３は、（Ａ）抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体遺伝子（Ｃｏｔ−２８Ｚ）と、本発明の１態様に従って調製したそれを発現しているウイルスベクター（ｐＭＰ−Ｃｏｔ−２８Ｚ）の構造、および、（Ｂ）フローサイトメーターにより、その表面にキメラ抗原受容体を提示しているＴ細胞を解析した結果を示すグラフ、を示している。
【図４】図４は、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞と、本発明の１態様に従って調製したコチニンがコンジュゲートした抗ＶＥＧＦアプタマー（Ｃｏｔ-Ｍａｃｕｇｅｎ）とを混合したものを、標的分子であるＶＥＧＦタンパク質と反応させたときに、Ｔ細胞により分泌されるインターフェロンガンマの量を示すグラフである。
【図５】図５は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞と、本発明の１態様に従って調製したコチニンとコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体（抗ＨＥＲ２−Ｃｏｔ）を混合したものを、ＨＥＲ２陽性または陰性の癌細胞に添加したときに、Ｔ細胞により分泌されるインターフェロンガンマの量を示すグラフである。
【図６】図６は、（Ａ）キメラ抗原受容体Ｔ細胞と、本発明の１態様に従って調製したコチニンとコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ｃｏｔ）とを混合したものが、ＨＥＲ２陽性の腫瘍特異的なインターフェロンガンマを産生することを確認したグラフ、および、（Ｂ）Ｔ細胞表面上に発現したキメラ抗原受容体をフローサイトメーターにより解析した結果を示すグラフ、である。
【図７】図７は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞と、本発明の１態様に従って調製されたコチニンとコンジュゲートした抗ＣＤ２０抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ２０−ｃｏｔ）とを混合したものを、ＣＤ２０陽性または陰性腫瘍細胞に添加したときに、Ｔ細胞により分泌されるインターフェロンガンマの量を示すグラフである。
【図８】図８は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞と、本発明の１態様に従って調製されたコチニンとコンジュゲートした抗ＨＬＡ抗体（ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ｃｏｔ）とを混合したものを、ＨＬＡ陽性または陰性腫瘍細胞に添加したときに、Ｔ細胞により分泌されるインターフェロンガンマの量を示すグラフである。
【図９】図９は、（Ａ）染色された標的細胞が様々な強度を有する蛍光を示すことを示しているグラフと、（Ｂ）調製されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞と、本発明の１態様に従ったコチニンとコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体標的細胞に添加し、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の標的細胞特異的な細胞死の効果をフローサイトメーターにより解析した結果を示すグラフ、である。
【図１０】図１０は、コチニンとコンジュゲートした細胞毒性剤による、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死誘導効果を示すグラフである（Ａ：コチニン−デュオカルマイシン単独コンジュゲート、Ｂ：コチニン−ＤＭ１複合コンジュゲート（２×コチニン−４×ＤＭ１）、およびＣ：コチニン−デュオカルマイシン複合コンジュゲート（２×コチニン−４×デュオカルマイシン））。
【図１１】図１１は、本発明の１態様において使用される細胞毒性剤の構造を示す略図のセットである。（Ａ）コチニン−デュオカルマイシン単独コンジュゲート、（Ｂ）コチニン−ＤＭ１複合コンジュゲート、および（Ｃ）コチニン−デュオカルマイシン複合コンジュゲート
【本発明を実施する最良の態様】
【００２８】
以下本発明について詳細に述べる。
【００２９】
本発明は抗コチニン抗体と連結したキメラ抗原受容体を提供し、そのキメラ抗原受容体は抗コチニン抗体またはその断片、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含んでいる。
【００３０】
抗コチニン抗体と連結したキメラ抗原受容体は、抗コチニン抗体またはその断片、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインが、この順番でＮ末端からＣ末端の方向で連結した型にすることができる。
【００３１】
抗コチニン抗体はコチニンに結合する抗体であり、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または組換え抗体のいずれか１つであってもよい。加えて抗体は、全長型の抗体またはその断片であってもよい。ここで抗体の断片は、コチニンに結合することができる抗コチニン抗体の部分を含んでもよい。抗体の断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、またはｓｃＦｖであってもよい。
【００３２】
抗コチニン抗体またはその断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含んでもよく、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号２３〜２５のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、あるいはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含んでもよく、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列によって表されてもよい。特に上記で述べた抗コチニン抗体またはその断片は、それぞれ配列番号２３〜２５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでいる重鎖可変領域、および、それぞれ配列番号２６〜２８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでいる軽鎖可変領域を含んでもよい。本発明の１態様において、抗コチニン抗体は配列番号１のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ断片であってもよい。加えて抗コチニン抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００３３】
本発明による抗コチニン抗体またはその断片は、米国特許番号８，００８，４４８の中で述べられている方法を改変することによって作製することができる。
【００３４】
ヒンジドメインは、抗コチニン抗体またはその断片と膜貫通ドメインを接続させるためのドメインであり、システイン残基を含んでもよい。システイン残基はヒンジドメインと抗体の結合に関連することがある。例えばヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＩｇＧ１ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメイン、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）細胞外ドメイン、またはそれらの組み合わせであってもよい（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１５（２３）：７５７；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００６（２９）：２８４；Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，３（７）：８１５−２６；Ｂｌｏｏｄ，２０１３（１２２）：２９６５）。ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有してもよい。加えてＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００３５】
膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体のヒンジドメインとシグナル伝達ドメインを接続してもよい。膜貫通ドメインは細胞の細胞膜を貫通するものであって、キメラ抗原受容体またはその断片の抗コチニン抗体は細胞表面に位置し、シグナル伝達ドメインは細胞内に位置するようにしてもよい。膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８またはＫＩＲタンパク質の膜貫通ドメインであってもよい（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２０１４（２５７）：１０７；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０（１８４）：６９３８；Ｂｌｏｏｄ，２０１３（１２２）：２９６５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００６（２９）：２８４；Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，３（７）：８１５-２６）。本発明の１態様において、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通領域と細胞質領域を含んでもよく、そのドメインは配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有してもよい。加えて膜貫通ドメインは配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００３６】
シグナル伝達ドメインは抗コチニン抗体またはその断片により提供されるシグナルを受け取り、キメラ抗原受容体が結合する細胞の中へシグナルを伝える役割を果たす。シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７８（誘導性Ｔ細胞共刺激分子、ＩＣＯＳ）、ＣＤ２８，ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、またはＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）であってもよい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４（１７２）：１０４；Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１３（２１）：２２６８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００９（１０６）：３３６０；Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，３（７）：８１５−２６）。特にシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８とＣＤ３ゼータの細胞質領域、またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）とＣＤ３ゼータの細胞質領域であってもよい。
【００３７】
本発明の１態様においてシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８とＣＤ３ゼータの細胞質領域であってもよい。ＣＤ２８の細胞質領域は、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を有してもよく、ＣＤ３ゼータの細胞質領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を有してもよい。加えてシグナル伝達ドメインは、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００３８】
更に本発明のキメラ抗原受容体は、上記で述べたような抗体とドメインの改変された型を含んでもよい。ここで改変は、野生型抗体とドメインのアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸を、その抗体とドメインの機能を改変することなく、置換、欠失、または付加することによって行われてもよい。通常、置換はアラニンであってもよく、または、全タンパク質の電荷、極性、または疎水性に影響しない保存的アミノ酸置換により行われてもよい。本発明の１態様において、キメラ抗原受容体は配列番号１５または配列番号１７のアミノ酸配列を有してもよい。加えてキメラ抗原受容体は、配列番号１５または配列番号１７のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００３９】
加えて本発明は、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を提供する。
【００４０】
本発明の核酸分子は、上記で述べた、抗コチニン抗体またはその断片（配列番号２）、ヒンジドメイン（配列番号４）、膜貫通ドメイン（配列番号６または８）、およびシグナル伝達ドメイン（配列番号１０、１２、または１４）をコードしてもよい。ここで本発明によるキメラ抗原受容体をコードする核酸分子は、配列番号１６または配列番号１８のヌクレオチド配列であってもよい。ここでヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の抗体またはドメインを発現することができる、他の置換されたヌクレオチド配列を含んでもよい。加えて核酸分子は、その抗体またはそのドメインをコードする核酸分子を、上記で述べたような改変された型で含んでもよい。
【００４１】
加えて本発明はその核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００４２】
発現ベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。本発明の１態様において、発現ベクターはレトロウイルスベクターであってもよい。発現ベクターは、本発明によるキメラ抗原受容体が発現し、かつ分泌されるように、当業者によって調製されてもよい。
【００４３】
発現ベクターは、シグナル配列またはリーダー配列を更に含んでもよい。本発明の１態様においてリーダー配列は、免疫グロブリンカッパーリーダー配列であってもよい。免疫グロブリンカッパーリーダー配列は配列番号１９のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。
【００４４】
本発明はその核酸分子を含むウイルスもまた提供する。
【００４５】
ウイルスはそのゲノム中に、本発明によるキメラ抗体受容体をコードする核酸分子を含んでもよい。よってウイルスが形質導入された細胞は本発明によるキメラ抗体受容体を発現し、抗コチニン抗体またはその断片はその表面に位置する。ウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであってもよい。本発明の１態様においてウイルスはレトロウイルスであってもよい。
【００４６】
上記で述べた発現ベクターを、ウイルスエンベローブタンパク質をコードする核酸分子を含んでいる発現ベクターと共に細胞に形質導入することによって、ウイルスが得られる。ここで形質導入は従来の方法によって行うことができる。形質導入のために使用されるエンベローブタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、エコトロピックなエンベローブ、Ｍｏｋｏｌａ、Ｒａｂｉｅｓ、ＭＬＶ−Ａｍｐｈｏ、ＭＬＶ−１０Ａ１、ＬＣＭＶ−ＷＥ、ＬＣＭＶ−Ａｒｍ５３ｂエンベローブ、ネコ内在性ガンマレトロウイルスＲＤ１１４エンベローブおよびその変異体、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベローブおよびその変異体、ＭＬＶ  ４０７０Ａエンベローブ、または、ｇｐ１２０／ｇｐ４１であってもよい（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，２０１６（３）：１６０１７；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４：１２２-１３１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１６（３）：１６０１７）。
【００４７】
加えて本発明は、上記で述べたウイルスにより形質導入された細胞を提供する。
【００４８】
細胞を、本発明に従ったキメラ抗原受容体を発現することができる核酸を含むウイルスにより形質導入してもよい。形質導入された細胞は細胞の表面に位置する抗コチニン抗体またはその断片を有してもよく、抗原−抗体結合を介してコチニンが抗体またはその断片に結合したときには、細胞内シグナル伝達を介して細胞活性を誘導する。ここで細胞はＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージであってもよい。本発明の１態様において、細胞はＴ細胞であってもよい。
【００４９】
加えて本発明は、コチニンがコンジュゲートした結合分子を更に含むキメラ抗原受容体細胞を提供する。
【００５０】
コチニンがコンジュゲートした結合分子において、その結合分子が抗体であるときには、コチニンのカルボキシル基と抗体のアミン基の間に結合を介して複合体を形成してもよい。
【００５１】
ハプテンであるコチニンは、コチニンとコンジュゲートした結合分子の性質を変えることなく、コチニンを特異的に認識する抗体と結合してもよい。特に結合分子は、ペプチド、核酸、タンパク質、または化学物質であってもよい。核酸はアプタマーであってもよく、タンパク質は抗体またはホルモンであってもよい。本発明の１態様において、アプタマーは抗ＶＥＧＦアプタマーであってもよい。加えて本発明の１態様において、抗体は抗ＨＲＥ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、または抗ＨＬＡ抗体であってもよい。
【００５２】
キメラ抗原受容体細胞は、その細胞に連結した抗コチニン抗体またはその断片を有してもよい。コチニンコンジュゲートが抗コチニン抗体またはその断片に結合するときに、それらは細胞活性を誘導してもよい。ここで細胞とコチニンがコンジュゲートした結合分子の結合は、キメラ抗原受容体またはその断片の抗コチニン抗体とコチニンの間の抗原抗体結合であってもよい。加えて細胞活性は、細胞傷害性Ｔ細胞による細胞死誘導活性であってもよい。
【００５３】
キメラ抗原受容体細胞は、コチニンがコンジュゲートした結合分子を細胞に添加する工程（細胞には抗コチニン抗体またはその断片と連結したキメラ抗原受容体が発現している）と、結合分子と複合体を形成したキメラ抗原受容体細胞を選択する工程を介して調製されてもよい。
【００５４】
加えて本発明は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、活性成分としてキメラ抗原受容体細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００５５】
医薬組成物の活性成分として使用されるキメラ抗原受容体細胞は、上記で述べた通りである。
【００５６】
状態または疾患は癌であってもよく、癌は固形癌または血液悪性腫瘍であってもよい。ここで固形癌は肺癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、胸腺癌、胃癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌であってもよい。加えて血液悪性腫瘍はリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫であってもよい。
【００５７】
医薬組成物はその医薬組成物の全重量に基づき、活性成分として、１０〜９５重量％の本発明のキメラ抗原受容体細胞を含んでもよい。上記で述べた活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、同じまたは類似する機能を示す１以上の型の活性成分を更に含んでもよい。
【００５８】
上記で述べた活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、投与のために１以上の型の薬学的に許容される担体を更に含んでもよい。
【００５９】
加えて本発明は、キメラ抗原受容体細胞を被験体に投与することを含む、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための方法を提供する。
【００６０】
キメラ抗原受容体細胞は上記で述べた通りである。加えて状態または疾患は癌であってもよく、特定の癌は上記で述べた通りである。
【００６１】
本発明によるキメラ抗原受容体細胞の投与量は、疾患の型、疾患の重篤度、活性成分の型と含量および医薬組成物中に含まれる他の成分、剤型の型および年齢、体重、全般的な健康、性別、患者の食事、投与時間、投与経路、治療時間、および同時に使用される薬剤などの様々な因子によって調整されてもよい。しかしながら、望まれる効果のために本発明による医薬組成物中に含まれるキメラ抗原受容体細胞の有効量は、１×１０５〜１×１０１１細胞／ｋｇであってもよい。ここで投与は１日に１回行われてもよく、１日数回に分けてもよい。
【００６２】
加えて本発明のキメラ抗原受容体細胞は、本技術分野で知られている様々な方法によって被験体に投与されてもよい。被験体は哺乳動物、特にヒトであってもよい。投与経路は、投与方法、体液の量および粘度などを考慮して、当業者が適切に選択してもよい。
【００６３】
加えて本発明は被験体中でキメラ抗原受容体細胞を作製する方法を提供し、その方法は、被験体に細胞を投与すること；および、コチニンがコンジュゲートした結合分子を被験体に投与することを含む。
【００６４】
細胞は、本発明によるキメラ抗原受容体を発現することができる核酸を含むウイルスによって形質導入され、上記で述べた通りである。加えてコチニンがコンジュゲートした結合分子は上記で述べた通りである。
【００６５】
被験体は哺乳動物、特にヒトであってもよく、上記で述べたように当業者によって適切に行われることができる。
【００６６】
加えて本発明はキメラ抗原受容体細胞の細胞死を誘導するための方法を提供し、その方法は、細胞とコチニンがコンジュゲートした結合分子を被験体に投与すること；および、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を被験体に更に投与することを更に含む。
【００６７】
キメラ抗原受容体細胞は上記で述べた通りである。キメラ抗原受容体細胞を使用した抗癌治療の場合には、細胞の過剰反応性に依る免疫毒性が副作用として起こることがある。よってそのような副作用を解決するために、コチニンがコンジュゲートした結合分子に加えて、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を追加して投与することにより、キメラ抗原受容体細胞の細胞死を誘導することができる。
【００６８】
上記で述べた細胞毒性剤は、それが細胞死を誘導することができる物質である限り使用することができる。特に細胞毒性剤は、デュオカルマイシン、ＳＮ−３８、カリケアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ドキソルビシン、ピロロベンゾジアゼピン、ＤＭ４、またはＤＭ１であってもよい。本発明の１態様において、細胞毒性剤はデュオカルマイシンまたはＤＭ１であってもよい（ＡＳＣＯ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ２０１４（３２）：２５５８；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１１（１７）：３１５７−６９；Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，２０１５（５６）：２８６３−６９；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１４（３２）：３６１９−２５；Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｎｃｏｌ．，２０１５（３３）：２５０３；Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，２０１３（２０１３）：８９８１４６；Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１５（７）：３０２ｒａ１３６；Ｍｏｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２０１４（１３）：１５３７−４８；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００８（２６）：２１４７−５４）。
【００６９】
コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤の投与は上記で述べたような様々な因子によって調整することができる。本発明による医薬組成物中に含まれるキメラ抗原受容体細胞の有効量は、本技術分野の当業者によって適切に決定され得る。ここで投与は１日に１回行われてもよく、１日数回に分けてもよい。
【００７０】
更に本発明は、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬キットを提供し、その医薬キットは、キメラ抗原受容体細胞を活性成分として、薬学的および治療上有効な量で含む第１の成分；および、コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を活性成分として、薬学的および治療上有効な量で含む第２の成分を含む。
【００７１】
本発明の医薬キットにおいて状態または疾患の予防または治療のために、第１の成分と第２の成分を連続して投与してもよい。第１の成分と第２の成分を連続投与する場合には、第１の成分の投与の後に免疫毒性副作用が現れたときまたはキメラ抗原受容体細胞が不死化したときに、第２の成分を投与してもよい。
【００７２】
状態または疾患は癌であってもよく、特定の癌は上記で述べた通りである。
発明の様式
以下において本発明を下記の実施例を用いて詳細に述べる。下記の実施例は単に本発明を例示することを意図するものであり、本発明の範囲はそれに限定されるものではない。
【００７３】
［実施例］
例１
抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスの調製
１−１．構築物の調製
まず、抗コチニン抗体のｓｃＦｖ断片、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインをそれぞれコードする核酸を含むプラスミドを、以下の方法によって調製した。
【００７４】
具体的に言えば、抗コチニン抗体のｓｃＦｖ断片を、マウスＩｇカッパリーダー配列を含むプライマーを使用して鋳型プラスミドから従来の様式でＰＣＲによって増幅した。鋳型は、ＳｆｉＩ制限酵素で切断した抗コチニンｓｃＦｖ断片をｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）にライゲートすることによって得たプラスミドであった（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、２０１０、４１１〜１２３８）。一方、ｃ−ｍｙｃタグ、ヒトＣＤ８ヒンジ領域、マウスＣＤ２８の膜貫通領域および細胞質領域、ならびにヒトＣＤ３ゼータの細胞質領域を含む、キメラ抗原受容体の骨格部分を、鋳型であるｐＬｘＳＮ−ｓｃＦｖ−抗ＣＥＡ−ＣＤ２８−ゼータプラスミド（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｄａｒｃｙ博士、ＰｅｔｅｒＭａｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに使用したプライマーの具体的な配列を以下の表１に示す。
【００７５】
【表１】
2018523487.tif 000003
【００７６】
２つの得られたＰＣＲ産物をライゲートして、抗コチニンキメラ抗原受容体のｃＤＮＡを調製した。調製されたｃＤＮＡおよびｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏベクター（Ｋ１０６２−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳ）をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩで切断し、共にライゲートした。その結果、抗コチニン抗体のｓｃＦｖ断片およびキメラ抗原受容体の骨格ドメインをコードするｃＤＮＡを、ピューロマイシン耐性遺伝子が元々位置している場所であるｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクターのＰＧＫプロモーターの下流の位置内にクローニングした。調製された構築物を、ヌクレオチド配列決定分析を介して確認し、ｐＭＰ−Ｃｏｔ−２８Ｚと名付けた（図３Ａ）。
【００７７】
１−２．レトロウイルスの調製
例１−１で調製されたレトロウイルス構築物を、ウイルスエンベロープタンパク質としての水胞性口内炎インディアナウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードするｃＤＮＡを含有するｐＭＤ２．Ｇプラスミド（＃１２２５９、Ａｄｄｇｅｎｅ、ＵＳ）と共に、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＧＰ（ＡＴＣＣ、ＵＳ）細胞株内にトランスフェクトした。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（カタログ＃１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して製造者のプロトコルに従って行った。４８時間後、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレトロウイルスを含有する培養上清を採取し、レトロウイルスでの感染のために、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ（ＡＴＣＣ、ＵＳ）細胞株とインキュベートした。感染の３から５日後、蛍光標識された抗ｍｙｃ抗体染色が陽性のＰｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞をフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を使用して選択して、レトロウイルス生産細胞株を確立した。この細胞株から生産されたレトロウイルス培養上清を、遠心分離フィルター装置（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、１００ｋＤａカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）を使用して１０倍濃縮した。
【００７８】
例２
抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体をその表面上に提示している細胞毒性Ｔ細胞の調製
例１−２で調製されたウイルスを使用して、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体をその表面上に提示している細胞毒性Ｔ細胞を調製した。
【００７９】
まず、脾細胞をＢ６マウスから単離し、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）で被覆した細胞培養容器に分配して、ウェル当たり２．５×１０6個細胞とした。細胞に、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（３７．５１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を含む全部で１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を添加し、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。２４時間後、２μＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）を６ｍｇ／ｍＬで含む１ｍＬの濃縮されたレトロウイルスを細胞に添加し、遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＳ）を使用して９０分、２５００ｒｐｍでの遠心分離によって、形質導入した。ポリブレンを使用して、レトロウイルスの形質導入率を増大させた。その後、１ｍＬの培養上清を取り出し、１ｍＬの濃縮されたレトロウイルスおよび１μＬのポリブレンをそこに添加し、レトロウイルスを、上記と同一の条件下での遠心分離によって形質導入した。その後、１ｍＬの培養液を取り出し、２０Ｕ／ｍＬのインタロイキン−２（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）を含む１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した。
【００８０】
４８時間後、ウイルス形質導入したＴ細胞の培地を、２０Ｕ／ｍＬのインタロイキン−２を含有する培地で置きかえ、７２時間、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。その後、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体の形質導入率を、蛍光標識された抗ｃ−ｍｙｃ抗体染色が陽性の細胞集団のパーセンテージをフローサイトメーターを使用して測定することによって判定し、それは約５０から７０％であった（図３Ｂ）。一方、対照群である、緑色蛍光タンパク質が導入されたＴ細胞は、約８０％の形質導入率を示した。こうして調製された抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体をその表面上に提示しているＴ細胞を、調製後２４時間以内に以下の実験で使用した。
【００８１】
例３
コチニンおよび結合分子の複合体の調製
３−１．コチニンと抗体の複合体の調製
結合分子として、コチニンコンジュゲートを、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｉｏｇｅｎ、ＵＳ）、抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳ）、抗インフルエンザウイルス血球凝集素抗体であるＣＴ３０２（Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ、Ｋｏｒｅａ）、および抗ＨＬＡ抗体であるＷ６／３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を使用して調製した。コチニンのコンジュゲーションは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）カップリング方法によって行った。
【００８２】
まず、上記の抗体をＰＢＳに２５μＭの濃度まで溶解した。一方、トランス−４−コチニンカルボン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＬのＭＥＳ緩衝液［０．１ＭのＭＥＳ（２−［モルフォリノ］エタンスルホン酸）および０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０］に５ｍＭの濃度まで溶解した。５０ｍＭの濃度のＥＤＣおよび１２５ｍＭの濃度のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）を溶液に添加し、次いで、撹拌しながら室温で１５分混合して、コチニン−ＮＨＳエステルが形成された活性溶液を調製した。水酸化ナトリウム溶液を添加して、コチニン−ＮＨＳエステルとタンパク質のアミン基との間の最適な反応のために上記の活性溶液のｐＨを７以上に調節し、１ｍＬのこの活性溶液を、２５μＭの濃度のコチニンとコンジュゲートさせるための同容積の抗体と混合した。混合物を撹拌しながら室温で３時間反応させて、ＥＤＣカップリング反応を介して生じたコチニン−抗体コンジュゲートを得た。こうして得たコチニン−抗体コンジュゲートは、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）を使用してＰＢＳで透析したか、またはＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）を使用して緩衝溶液をＰＢＳで置きかえた。
【００８３】
３−２．コチニンとアプタマーの複合体の調製
コチニン−ペガプタニブコンジュゲートを、固相オリゴペプチド合成方法によって得た、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を認識するアプタマーであるペガプタニブから調製した。
【００８４】
詳細には、ペガプタニブＲＮＡアプタマー（５’−ｐＣｆｐＧｍｐＧｍｐＡｒｐＡｒｐＵｆｐＣｆｐＡｍｐＧｍｐＵｆｐＧｍｐＡｍｐＡｍｐＵｆｐＧｍｐＣｆｐＵｆｐＵｆｐＡｍｐＵｆｐＡｍｐＣｆｐＡｍｐＵｆｐＣｆｐＣｆｐＧｍ−ｐ−ｄＴ−３−３’、配列番号３４）を、オリゴペプチド合成装置を使用して３’末端から５’末端まで合成し、アミノＣ６リンカーを５’末端に付着させた。コチニンとの化学的コンジュゲーションを、アミノＣ６リンカーのための活性エステル架橋方法を使用して行い、次いで、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８カラム（５μｍ、１０×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳ）を使用して逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（＞９５％純度）。その質量を、質量分析計（ＳＴ  Ｐｈａｒｍ、Ｋｏｒｅａ）を使用して判定した（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、２０１０（４１１）：１２３８；Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２０１２（４４）：５５４）。
【００８５】
合成されたペガプタニブコチニンコンジュゲートを、ピロ炭酸ジエチルを含有する蒸留水に懸濁し、これを９５℃で５分変性させ、室温で３０分冷却し、次いで−２０℃で保管した。
【００８６】
比較例１
抗癌胎児性抗原ｓｃＦｖ断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の調製
抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）ｓｃＦｖ断片と連結したキメラ抗原受容体遺伝子を、ｐＬｘＳＮ−ｓｃＦｖ−抗ＣＥＡ−ゼータプラスミド（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｄａｒｃｙ博士、ＰｅｔｅｒＭａｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を鋳型として使用して、上記の表１に列挙したプライマーを使用するＰＣＲ方法によって得た。得られた遺伝子およびｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏベクター（Ｋ１０６２−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩでそれぞれ切断し、共にライゲートした。調製された構築物をｐＭＰ−Ｃ２８Ｚと名付けた。この構築物を使用して、レトロウイルスを例１および２の条件および方法の下で調製し、レトロウイルスを形質導入されたＴ細胞を調製した。
【００８７】
比較例３
緑色蛍光タンパク質を発現するＴ細胞の調製
緑色蛍光タンパク質を発現するＴ細胞を調製するために、ｐＭＩＧ−ｗプラスミド（Ｙｏｓｅｆ  Ｒｅｆａｅｌｉ博士、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｅｗｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＳ）に含まれる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩでのプラスミドの消化によって得た。消化されたＧＦＰ遺伝子断片を、比較例２で調製されたｐＭＰ−Ｃ２８ＺプラスミドのＮｃｏＩ／ＳａｌＩ部位に、このプラスミドに含まれていた抗癌胎児性キメラ抗原受容体遺伝子を除去した後に挿入した。調製された構築物はｐＭＰ−ＧＦＰと名付けた。その後、この構築物を使用して、例１および２の条件および方法の下でレトロウイルスを生産し、レトロウイルスが形質導入されたＴ細胞を生産した。
【００８８】
試験例１
コチニン−ペガプタニブコンジュゲートを使用する、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の活性化の確認
上記の例３−２で調製されたコチニン−ペガプタニブコンジュゲートを使用して、このコンジュゲートが血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を認識し、それによってキメラ抗原受容体細胞の活性化を誘発するかどうかを調べた。
【００８９】
まず、５μｇ／ｍＬのＶＥＧＦタンパク質を９６ウェルプレートに添加し、次いで、プレートを一晩、４℃で置いて、プレートをＶＥＧＦで被覆した。被覆されたプレートを、２０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｋｏｒｅａ）で２回洗浄し、１００ｎＭのコチニン−ペガプタニブコンジュゲートを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。反応後、プレートをＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、次いで、例２で調製されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加してウェル当たり１×１０5個細胞とし、細胞を３７℃、５％ＣＯ2下で２４時間培養した。次いで、培地内に分泌されたインターフェロンガンマの量を、ＥＬＩＳＡキット（カタログ＃５５５１３８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を使用して製造者のプロトコルに従って測定し、結果を図４に示す。対照群として、ＶＥＧＦで被覆されたプレートに何も添加しなかった群（ＶＥＧＦのみ）、ＶＥＧＦで被覆されていないプレートにＴ細胞のみを添加した群（Ｔ細胞のみ）、ＶＥＧＦで被覆されたプレートにＴ細胞のみを添加した群（ＶＥＧＦ＋Ｔ細胞）、ならびに、ＶＥＧＦで被覆されたプレートに対照アプタマー（５’−ｄＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’、配列番号３６）およびＴ細胞を添加した群（ＶＥＧＦ＋対照アプタマー＋Ｔ細胞）を使用した。
【００９０】
図４に示すように、インターフェロンガンマの分泌が、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞にコチニン−ペガプタニブコンジュゲートを添加した群（ＶＥＧＦ＋Ｃｏｔ−ペガプタニブ＋Ｔ細胞）において有意に増大したことが確認された。
【００９１】
試験例２
コチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを使用する、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の活性化の確認
例３−１で調製されたコチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを使用して、このコンジュゲートが細胞表面上に提示されているＨＥＲ２を認識することによってキメラ抗原受容体細胞の活性化を誘発するかどうかを判定した。
【００９２】
まず、ＨＥＲ２陽性細胞であるＡＵ５６５細胞株およびＨＥＲ２陰性細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を、９６ウェル丸底プレートのウェルに分配してウェル当たり３×１０4個細胞とし、一晩、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。培養上清を取り出した後、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）に１００μＬのコチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを１０μｇ／ｍＬの濃度まで添加し、同一条件下で１時間培養した。その後、培地を取り出し、細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、例２で調製されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加してウェル当たり３×１０5個細胞とし、２４時間、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。次いで、培地内に分泌されたインターフェロンガンマの量を、ＥＬＩＳＡキットを使用して製造者のプロトコルに従って測定し、結果を図５に示す。対照群として、腫瘍細胞を培養していないプレートにキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（Ｔ細胞のみ）、腫瘍細胞を培養したプレートに何も添加しなかった群（腫瘍のみ）、腫瘍細胞を培養したプレートにキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（腫瘍＋Ｔ細胞）、細胞を培養したプレートにインフルエンザウイルス血球凝集素特異的抗体（ＣＴ３０２）およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（ＣＴ３０２）、腫瘍細胞を培養したプレートにコチニン−コンジュゲート型ＣＴ３０２抗体およびキメラ受容体Ｔ細胞を添加した群（ＣＴ３０２−Ｃｏｔ）、ならびに、細胞を培養したプレートに遊離抗ＨＥＲ２抗体およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（抗ＨＥＲ２）を使用した。
【００９３】
図５に示すように、インターフェロンガンマの分泌が、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞にコチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを添加した群（抗ＨＥＲ２−Ｃｏｔ）において有意に増大したことが確認された。
【００９４】
試験例３
抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の抗原特異的活性化の確認
コチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートと複合した抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞によって誘発されるインターフェロンガンマの分泌が、コチニンと連結した抗体に特異的であるかどうかを判定するために、以下の実験を行った。
【００９５】
実験は、ＨＥＲ２陽性細胞であるＡＵ５６５細胞のみを使用したことを除いて、試験例２と同一の条件および方法の下で行った。表面上に何も発現していないＴ細胞、比較例１で調製されたＴ細胞、または例２で調製されたＴ細胞を、腫瘍細胞を培養していないプレートにＴ細胞のみを添加した群（Ｔ細胞のみ）、腫瘍細胞を培養したプレートにＣＴ３０２抗体およびＴ細胞を添加した群（ＣＴ３０２）、腫瘍細胞を培養したプレートにＣＴ３０２抗体とコンジュゲートしたコチニンおよびＴ細胞を添加した群（ＣＴ３０２−Ｃｏｔ）、細胞を培養したプレートに遊離抗ＨＥＲ２抗体およびＴ細胞を添加した群（抗ＨＥＲ２）、ならびに、腫瘍細胞を培養したプレートに抗ＨＥＲ２抗体とコンジュゲートしたコチニンおよびＴ細胞を添加した群（抗ＨＥＲ２−Ｃｏｔ）と組み合わせてそれぞれ添加した。結果として、分泌されたインターフェロンガンマの量をＥＬＩＳＡ方法によって測定し、図６Ａに示す。
【００９６】
図６Ａに示すように、インターフェロンガンマの分泌が、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞にコチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを添加した群（抗ＨＥＲ２−Ｃｏｔ）において有意に増大したことが確認された。したがって、インターフェロンガンマの分泌が、コチニンとコンジュゲートした結合分子によって特異的に誘発されたことが見出された。
【００９７】
試験例４
Ｔ細胞の表面上に提示されたキメラ抗原受容体の発現の確認
キメラ抗原受容体の発現を、それぞれ例２および比較例１で調製された、表面上にいかなるキメラ抗原受容体も発現しないＴ細胞および抗コチニン抗体断片または抗ＣＥＡ抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞における、ｃ−ｍｙｃタグ染色の陽性度を測定することによって判定した。
【００９８】
まず、例２または比較例１で調製された、表面上にいかなるキメラ抗原受容体も発現しないＴ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を分配して、ウェル当たり４×１０5個細胞とした。分配された細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％ＮａＮ3を添加したＰＢＳ緩衝溶液で２回洗浄し、抗ｍｙｃ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を、緩衝溶液内で１：４００の比で希釈した後に添加した。混合物を２０分、冷凍下で反応させ、ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した。１：１０００の比のストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）、１：５００の比の抗ＣＤ８−ｐｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）、および１：１０００の比の抗ＣＤ４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を添加した、５０μＬのＰＢＳを添加した後、混合物を２５分、冷凍下で反応させた。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を全部で３００μＬのＰＢＳ内に再懸濁した。ｃ−ｍｙｃ陽性細胞を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を使用して分析し、結果を図６Ｂに示す。抗体で処理していない群（未染色）および二次抗体であるストレプトアビジン−ＰＥのみで処理した群（対照）を、Ｔ細胞の対照群として使用した。
【００９９】
図６Ｂに示すように、例２および比較例１で調製されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞が抗コチニン抗体断片または抗ＣＥＡ抗体断片を発現したことが確認された。
【０１００】
試験例５
コチニン−抗ＣＤ２０抗体コンジュゲートを使用する抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の活性化の確認
例３−１で調製されたコチニン−抗ＣＤ２０抗体コンジュゲートを使用して、コンジュゲートが細胞表面上のＣＤ２０を認識することによってキメラ抗原受容体細胞の活性化を誘発するかどうかを判定した。具体的に言えば、実験は、ＡＵ５６５細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の代わりに、ＣＤ２０陰性細胞であるＪｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞株、およびＣＤ２０陽性細胞であるＲａｊｉ細胞株を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地内で培養したことを除いて、試験例２と同一の条件および方法の下で行い、分泌されたインターフェロンガンマの量を、培養の４８時間後に得た培養液において判定した。結果として、分泌されたインターフェロンガンマの量を図７に示す。細胞を培養していないプレートにキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（Ｔ細胞のみ）、腫瘍細胞を培養したプレートに何も添加しなかった群（腫瘍のみ）、ならびに、細胞を培養したプレートに抗ＣＤ２０抗体およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（抗ＣＤ２０）を、対照群として使用した。
【０１０１】
図７に示すように、インターフェロンガンマの分泌が、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞にコチニン−抗ＣＤ２０抗体コンジュゲートを添加した群（抗ＣＤ２０−Ｃｏｔ）において有意に増大したことが確認された。
【０１０２】
試験例６
コチニン−抗ＨＬＡ抗体コンジュゲートを使用する、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の活性化の確認
例３−１で調製されたコチニン−抗ＨＬＡ抗体コンジュゲートを使用して、このコンジュゲートが細胞表面上のＨＬＡを認識することによってキメラ抗原受容体細胞の活性化を誘発するかどうかを判定した。具体的に言えば、実験は、ＡＵ５６５細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の代わりに、ＨＬＡ陰性細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞株、およびＨＬＡ陽性細胞であるＨＬＡ７またはＨＬＡ２０細胞株を、２０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ培地内で培養したことを除いて、試験例２と同一の条件および方法の下で行い、分泌されたインターフェロンガンマの量を、培養の４８時間後に得た培養液において判定した。
【０１０３】
一方、ＨＬＡ７およびＨＬＡ２０細胞株を以下の方法によって調製した。具体的に言えば、１０ｍＬの末梢血および同量のＰＢＳの混合溶液を１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）に分配し、４００×ｇで３０分、設定「０」のブレーキで遠心分離した。遠心分離後、最上層の血漿を取り出し、５ｍＬの末梢血単核球層を採取した。３０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地をそこに添加し、遠心分離を同一条件下で１０分行った。上清を取り出し、同量のＲＰＭＩ−１６４０培地を添加して、洗浄をもう一度行った。沈殿した細胞を、２０％ウシ胎児血清を含む２ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞数を計数した。１×１０7個細胞をＴ２５フラスコに分配し、全部で６ｍＬの培養培地を添加し、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。２ｍＬのエプスタイン・バーウイルス（ＶＲ−１４９２、ＡＴＣＣ、ＵＳ）をそこに添加し、同一条件下で培養した。２時間の培養の後、１μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）を添加し、同一条件下で４日培養した。培養の４日目に、２ｍＬの培養培地を添加し、７日目に継代培養した。エプスタイン・バーウイルスを形質導入されたＢ細胞が、継代培養を継続することによって１０から２０日にわたりコロニーを形成すると、２つのコロニーを採取して継代培養を継続させた。こうして調製された２つの不死化Ｂ細胞株を、それぞれＨＬＡ７およびＨＬＡ２０と名付けた。
【０１０４】
結果として、分泌されたインターフェロンガンマの量を図８に示す。腫瘍細胞を培養していないプレートにキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（Ｔ細胞のみ）、腫瘍細胞を培養したプレートに何も添加しなかった群（腫瘍のみ）、ならびに、細胞を培養したプレートに遊離抗ＨＬＡ抗体およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（抗ＨＬＡ）を、対照群として使用した。
【０１０５】
図８に示すように、インターフェロンガンマの分泌が、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞にコチニン−抗ＨＬＡ抗体コンジュゲートを添加した群（抗ＨＬＡ−Ｃｏｔ）において有意に増大したことが確認された。
【０１０６】
試験例７
コチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートおよび抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞による標的細胞特異的なアポトーシスの影響の確認
例３−１で調製された抗コチニン抗体断片およびコチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートと連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞を使用して、キメラ抗原受容体Ｔ細胞が、細胞表面上のＨＥＲ２を認識することによってＨＥＲ陽性腫瘍細胞の細胞死を誘発するかどうかを判定した。
【０１０７】
まず、ＨＥＲ２陽性細胞であるＡＵ５６５細胞株およびＨＥＲ２陰性細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を分配して、１００ｍｍの細胞培養容器内に２×１０6個細胞とした。分配された細胞を試験例２と同一の培地および条件の下で培養した。培養された細胞を計数し、細胞を調製してＡＵ５６５細胞株は１ｍＬ当たり２×１０7個細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は１ｍＬ当たり２×１０7個細胞とし、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）をそこにそれぞれ１μＭおよび１００ｎＭの濃度まで添加した。室温で８分反応させて各細胞株を異なる蛍光強度に染色した後、その結果をフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を使用して判定し、図９Ａに示す。
【０１０８】
図９Ａに示すように、ＡＵ５６５細胞株を弱い蛍光強度（ＣＦＳＥlow）に染色し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を強い蛍光強度（ＣＦＳＥhigh）に染色した。
【０１０９】
染色された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、洗浄された細胞株をそれぞれ１．５×１０6個細胞の１：１の比で混合し、９６ウェルプレートに分配した。分配された細胞を接着させ、１μｇ／ｍＬのコチニン−抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートをそこに添加し、室温で１時間反応させた。反応後、細胞株を培養培地で洗浄し、計数し、５ｍＬ試験管内に置いて５×１０4個細胞とした。ここに抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加し、４時間または２２時間、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。ここで、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（作用細胞株、Ｅ）対ＡＵ５６５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（標的細胞株、Ｔ）の比は、０：１、５：１、または１０：１に設定した。培養後、死細胞を区別するために、０．２５μｇの７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を１×１０6個細胞当たり添加し、室温で１０分反応させ、次いで、フローサイトメーターによって分析した。ここで、７−ＡＡＤ陰性細胞およびＣＦＳＥ陽性細胞を分画し、分析した。分析の結果として、標的細胞の細胞死の比を以下の方程式１に従って計算し、結果を図９Ｂに示す。
【０１１０】
【数１】
2018523487.tif 000004
【０１１１】
図９Ｂに示すように、ＨＥＲ２陽性細胞株であるＡＵ５６５の細胞死が、添加されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞の量に比例して増大したことが確認された。したがって、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞がコチニンとコンジュゲートした結合分子に特異的に細胞死を誘発することが見出された。
【０１１２】
試験例８
コチニン−細胞傷害物質コンジュゲートによるキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死誘発効果の確認
コチニン−細胞傷害物質コンジュゲートはＣｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって調製され、このコンジュゲートが例２で調製されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死を誘発するかどうかを、以下の方法によって判定した。
【０１１３】
具体的に言えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を９６ウェルプレートに分配して５×１０5個細胞とし、培養培地で培養した。０、０．１、１、１０、１００、または１０００ｎＭのコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートをそこに添加し、４８時間、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。添加したコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートには、コチニン−デュオカルマイシン単一コンジュゲート、コチニン−ＤＭ１複合コンジュゲート（２×コチニン−４×ＤＭ１）、またはコチニン−デュオカルマイシン複合コンジュゲート（２×コチニン−４×デュオカルマイシン）を使用した（図１１）。培養後、生存細胞を７−ＡＡＤで染色し、７−ＡＡＤまたはｍｙｃタグで染色された細胞をフローサイトメーターによって分析した。分析の結果として、コチニン−細胞傷害物質コンジュゲートに起因するキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞毒性を、以下の方程式２を使用して計算し、結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。比較例２で調製されたＴ細胞を対照群として使用した。
【０１１４】
【数２】
2018523487.tif 000005
【０１１５】
図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、非常に低用量のコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートが、比較例２のＴ細胞と比較して、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死を誘発し得ることが確認された。
【０１１６】
上記の結果から、少量のコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートを使用して、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死が誘発され得ることが見出された。
【図１】
2018523487.tif 000006
【図２】
2018523487.tif 000007
【図３】
2018523487.tif 000008
【図４】
2018523487.tif 000009
【図５】
2018523487.tif 000010
【図６】
2018523487.tif 000011
【図７】
2018523487.tif 000012
【図８】
2018523487.tif 000013
【図９】
2018523487.tif 000014
【図１０】
2018523487.tif 000015
【図１１】
2018523487.tif 000016
【配列表】
2018523487000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月11日(2018.5.11)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は抗コチニン抗体と連結したキメラ抗原受容体、およびその使用に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
キメラ抗原受容体を発現している細胞が非標的細胞と結合することを避けるために、ハプテンは元来インビボに存在しない物質であることが好ましい。加えてハプテンは、結合分子と効率的なコンジュゲーションをするための化学官能基を有さなければならない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ウイルスはそのゲノム中に、本発明によるキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含んでもよい。よってウイルスが形質導入された細胞は本発明によるキメラ抗原受容体を発現し、抗コチニン抗体またはその断片はその表面に位置する。ウイルスはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであってもよい。本発明の１態様においてウイルスはレトロウイルスであってもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
具体的に言えば、抗コチニン抗体のｓｃＦｖ断片を、マウスＩｇカッパリーダー配列を含むプライマーを使用して鋳型プラスミドから従来の様式でＰＣＲによって増幅した。鋳型は、ＳｆｉＩ制限酵素で切断した抗コチニンｓｃＦｖ断片をｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）にライゲートすることによって得たプラスミドであった（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、２０１０、４１１〜１２３８）。一方、ｃ−ｍｙｃタグ（配列番号２１）、ヒトＣＤ８ヒンジ領域、マウスＣＤ２８の膜貫通領域および細胞質領域、ならびにヒトＣＤ３ゼータの細胞質領域を含む、キメラ抗原受容体の骨格部分を、鋳型であるｐＬｘＳＮ−ｓｃＦｖ−抗ＣＥＡ−ＣＤ２８−ゼータプラスミド（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｄａｒｃｙ博士、ＰｅｔｅｒＭａｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに使用したプライマーの具体的な配列を以下の表１に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
詳細には、ペガプタニブＲＮＡアプタマー（５’−ｐＣｆｐＧｍｐＧｍｐＡｒｐＡｒｐＵｆｐＣｆｐＡｍｐＧｍｐＵｆｐＧｍｐＡｍｐＡｍｐＵｆｐＧｍｐＣｆｐＵｆｐＵｆｐＡｍｐＵｆｐＡｍｐＣｆｐＡｍｐＵｆｐＣｆｐＣｆｐＧｍ−ｐ−ｄＴ−３−３’、配列番号３５）を、オリゴペプチド合成装置を使用して３’末端から５’末端まで合成し、アミノＣ６リンカーを５’末端に付着させた。コチニンとの化学的コンジュゲーションを、アミノＣ６リンカーのための活性エステル架橋方法を使用して行い、次いで、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８カラム（５μｍ、１０×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳ）を使用して逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（＞９５％純度）。その質量を、質量分析計（ＳＴ  Ｐｈａｒｍ、Ｋｏｒｅａ）を使用して判定した（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、２０１０（４１１）：１２３８；Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２０１２（４４）：５５４）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
まず、例２または比較例１で調製された、表面上にいかなるキメラ抗原受容体も発現しないＴ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を分配して、ウェル当たり４×１０5個細胞とした。分配された細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％ＮａＮ3を添加したＰＢＳ緩衝溶液で２回洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を、緩衝溶液内で１：４００の比で希釈した後に添加した。混合物を２０分、冷凍下で反応させ、ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した。１：１０００の比のストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）、１：５００の比の抗ＣＤ８−ｐｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）、および１：１０００の比の抗ＣＤ４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を添加した、５０μＬのＰＢＳを添加した後、混合物を２５分、冷凍下で反応させた。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を全部で３００μＬのＰＢＳ内に再懸濁した。ｃ−ｍｙｃ陽性細胞を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳ）を使用して分析し、結果を図６Ｂに示す。抗体で処理していない群（未染色）および二次抗体であるストレプトアビジン−ＰＥのみで処理した群（対照）を、Ｔ細胞の対照群として使用した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
具体的に言えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を９６ウェルプレートに分配して５×１０5個細胞とし、培養培地で培養した。０、０．１、１、１０、１００、または１０００ｎＭのコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートをそこに添加し、４８時間、５％ＣＯ2および３７℃の条件下で培養した。添加したコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートには、コチニン−デュオカルマイシン単一コンジュゲート、コチニン−ＤＭ１複合コンジュゲート（２×コチニン−４×ＤＭ１）、またはコチニン−デュオカルマイシン複合コンジュゲート（２×コチニン−４×デュオカルマイシン）を使用した（図１１）。培養後、生存細胞を７−ＡＡＤで染色し、７−ＡＡＤまたはｃ−ｍｙｃタグで染色された細胞をフローサイトメーターによって分析した。分析の結果として、コチニン−細胞傷害物質コンジュゲートに起因するキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞毒性を、以下の方程式２を使用して計算し、結果を図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃに示す。比較例２で調製されたＴ細胞を対照群として使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃに示すように、非常に低用量のコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートが、比較例２のＴ細胞と比較して、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死を誘発し得ることが確認された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
上記の結果から、少量のコチニン−細胞傷害物質コンジュゲートを使用して、抗コチニン抗体断片と連結したキメラ抗原受容体Ｔ細胞の細胞死が誘発され得ることが見出された。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
抗コチニン抗体と連結したキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体は、
抗コチニン抗体またはその断片；
ヒンジドメイン；
膜貫通ドメイン；および
シグナル伝達ドメイン、
を含む、キメラ抗原受容体。
［２］
前記断片が、抗コチニン抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、［１］のキメラ抗原受容体。
［３］
前記抗コチニン抗体またはその断片が、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２３から２５のアミノ酸配列により表される重鎖可変領域；または、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２６から２８のアミノ酸配列により表される軽鎖可変領域、を含む［１］のキメラ抗原受容体。
［４］
前記抗コチニン抗体の断片が配列番号１のアミノ酸配列を有する、［３］のキメラ抗原受容体。
［５］
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＩｇＧ１ヒンジドメイン、Ｉｇ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８細胞外領域、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）細胞外領域、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］のキメラ抗原受容体。
［６］
ＣＤ８ヒンジドメインが配列番号３のアミノ酸配列を有する、［５］のキメラ抗原受容体。
［７］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）タンパク質の膜貫通領域である、［１］のキメラ抗原受容体。
［８］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通領域を含む、［７］のキメラ抗原受容体。
［９］
前記ＣＤ２８の膜貫通領域が配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有する、［８］のキメラ抗原受容体。
［１０］
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７８（誘導性Ｔ細胞共刺激分子、ＩＣＯＳ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、またはＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）である、［１］のキメラ抗原受容体。
［１１］
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８とＣＤ３ゼータの細胞質領域である、［１０］のキメラ抗原受容体。
［１２］
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）とＣＤ３ゼータの細胞質領域である、［１０］に記載のキメラ抗原受容体。
［１３］
前記ＣＤ２８の細胞質領域が、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を有する、［１１］のキメラ抗原受容体。
［１４］
前記ＣＤ３ゼータの細胞質領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、［１１］または［１２］のキメラ抗原受容体。
［１５］
前記キメラ抗原受容体が、配列番号１５または配列番号１７のアミノ酸配列を有する、［１］のキメラ抗原受容体。
［１６］
［１］のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子。
［１７］
［１６］の核酸分子を含む発現ベクター。
［１８］
前記発現ベクターがウイルスベクターである［１７］の発現ベクター。
［１９］
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、［１８］の発現ベクター。
［２０］
［１６］の核酸分子を含むウイルス。
［２１］
［２０］のウイルスが形質導入された細胞。
［２２］
前記細胞がＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージである、［２１］の細胞。
［２３］
［２１］の細胞；および
コチニンがコンジュゲートした結合分子；
を含む、キメラ抗原受容体細胞。
［２４］
結合分子がペプチド、核酸、タンパク質、または化学物質である、［２３］のキメラ抗原受容体細胞。
［２５］
前記核酸がアプタマーである、［２４］のキメラ抗原受容体細胞。
［２６］
前記タンパク質が抗体またはホルモンである、［２４］のキメラ抗原受容体細胞。
［２７］
前記キメラ抗原受容体細胞が、キメラ抗原受容体の抗コチニン抗体部分とコチニンの間の抗原−抗体結合によって形成される、［２３］のキメラ抗原受容体細胞。
［２８］
キメラ抗原受容体細胞の調製が；
１）コチニンがコンジュゲートした結合分子を［２１］の細胞へ添加することを含む工程；および
２）コチニンがコンジュゲートした結合分子に結合したキメラ抗原受容体細胞を選択することを含む工程、
を含む［２３］のキメラ抗原受容体細胞。
［２９］
特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、活性成分として［２３］のキメラ抗原受容体細胞を含む医薬組成物。
［３０］
前記状態または疾患が癌である、［２９］の医薬組成物。
［３１］
前記癌が固形癌または血液悪性腫瘍である、［３０］の医薬組成物。
［３２］
前記固形癌が、肺癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、胸腺癌、胃癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌からなる群から選択される、［３１］の医薬組成物。
［３３］
前記血液悪性腫瘍が、リンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫である、［３３］の医薬組成物。
［３４］
［２３］のキメラ抗原受容体細胞を被験体に投与することを含む、特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための方法。
［３５］
前記状態または疾患が癌である、［３４］の方法。
［３６］
被験体の中でキメラ抗原受容体細胞を作製するための方法であって、
１）［２１］の細胞を前記被験体に投与すること；および
２）コチニンがコンジュゲートした結合分子を前記被験体に投与すること、
を含む方法。
［３７］
キメラ抗原受容体細胞の細胞死を誘導するための方法であって、
１）［２１］の細胞とコチニンがコンジュゲートした結合分子を被験体に投与すること；および
２）コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を前記被験体に更に投与すること、
を含む方法。
［３８］
前記細胞毒性剤が、デュオカルマイシン、ＳＮ−３８、カリケアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ドキソルビシン、ピロロベンゾジアゼピン、ＤＭ４、またはＤＭ１である、［３７］の方法。
［３９］
特定の細胞が増殖した状態または疾患を予防または治療するための医薬キットであって：
［２３］のキメラ抗原受容体細胞を活性成分として、薬学的および治療上有効な量で含む第１の成分；および
コチニンがコンジュゲートした細胞毒性剤を活性成分として、薬学的および治療上有効な量で含む第２の成分、
を含む医薬キット。
［４０］
前記状態または疾患が癌である［３９］の医薬キット。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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