(57)【要約】  過去のウイルス／レトロウイルス感染の残遺物の低減された量を有する哺乳動物細胞および哺乳動物細胞株ならびにその製造法および使用法が開示される。【選択図】図４Ａ
2018537986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された細胞、好ましくは操作されたＣＨＯ−Ｋ１を含む操作されたＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞株の操作された細胞であって、
前記細胞のゲノムであって、前記ゲノムの一部である１個または複数個の、一般に、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、９０個または１００個を超える内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメント中に１個または複数個の核酸の
欠失、
付加、および／または
置換
を含む１つまたは複数の変化を含む、ゲノム、
を含む、操作された細胞。
【請求項２】
前記ＥＲＶエレメントが、コアラ伝染性ウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＥＲＶを含む、ガンマレトロウイルスＥＲＶ由来であり、かつ前記１つまたは複数の変化が、１つまたは複数の、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％超または１００％の前記ＥＲＶの放出を抑制するか完全に抑えるように適応される、請求項１に記載の操作された細胞。
【請求項３】
前記１つまたは複数の（ＥＲＶ）エレメントが、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／またはｅｎｖ遺伝子である、またはこれに由来する、好ましくはＭＡ（基質）、ＣＡ（カプシド）、ＮＣ（ヌクレオカプシド）、ｐｐ１２またはｐ６などのタンパク質をコードするさらなるドメインをコードする、前記ｇａｇ遺伝子に由来し、かつ／あるいはＥＲＶの長い末端反復配列（ＬＴＲ）である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項４】
前記１個または複数個のＥＲＶエレメントが、Ｇａｇ（グループ抗原）タンパク質、Ｐｏｌ（逆転写酵素）タンパク質および／またはＥｎｖ（エンベロープ）タンパク質をコードする、請求項３に記載の操作された細胞。
【請求項５】
前記欠失、付加または置換が、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個または２００個を超える核酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項６】
前記変化が、標的化組込みの形態の付加であり、かつ前記１個または複数個の（ＥＲＶ）エレメントが、１つまたは複数のｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／またはｅｎｖ遺伝子、好ましくはｇａｇ遺伝子である、またはこれに由来し、かつ前記遺伝子の配列が、好ましくはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのマーカータンパク質をコードする、導入遺伝子の標的化組込みに供された、ならびに／あるいは前記変化（１つまたは複数）が、ドミナントネガティブ表現型を生じる場合の、請求項１〜５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項７】
前記ＥＲＶエレメントが、ｇａｇ遺伝子に由来し、かつ少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはすべての前記エレメントが、前記変化を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項８】
前記変化が、前記ＥＲＶエレメントのコンセンサス配列中にあり、前記コンセンサス配列が、少なくとも５塩基対、１０塩基対、１５塩基対または２０塩基対の長さ、好ましくは１５〜２５塩基対または３０〜５０塩基対の長さである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項９】
ＥＲＶを全く放出しない、または実質的に全く放出しない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１０】
組換え経路の１つまたは複数のタンパク質をコードする、阻害するまたは活性化する異種核酸配列、ならびに／あるいは組換え経路、好ましくはＨＲ、さらにより好ましくはＮｂｓ１、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５１、リガーゼ１および／またはリガーゼ３の１つまたは複数のタンパク質の発現を抑制する１つまたは複数の配列またはタンパク質をコードする異種核酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１１】
前記異種核酸配列が、前記細胞のゲノム中に組み込まれないベクターとして存在する、請求項１０に記載の操作された細胞。
【請求項１２】
好ましくはベクター上に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの１つまたは複数のマーカータンパク質をコードする異種ドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１３】
導入遺伝子をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１４】
前記導入遺伝子が、前記ゲノム中に好ましくは組み込まれるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのマーカータンパク質および／または生物学的治療薬をコードするマーカー遺伝子である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記１つまたは複数の変化が、非ミリストイル化アミノ酸との、ｇａｇ遺伝子または前記ｇａｇ遺伝子に由来するＥＲＶエレメントなどの、１つまたは複数の前記ＥＲＶエレメント中のミリストイル化モチーフ内の１つまたは複数のミリストイル化アミノ酸の置換であり、かつ前記操作された細胞が、少なくとも一過的に：
Ｐａｄ５１、Ｌｉｇ３、Ｅｒｃｄ、Ｐｏｌｄ３などのＨＲタンパク質および／またはＭＭＥＪタンパク質をコードする一過的に発現されるベクターの形態でなどの、配列、ならびに／あるいは
ｓｉＭＲｅ１１などの、ｓｉＲＮＡ配列またはそれをコードするベクターなどの、配列
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、ＰＰＹＰモチーフを含む、ｇａｇ遺伝子または前記ｇａｇ遺伝子に由来するＥＲＶエレメントなどの、１個または複数個の前記ＥＲＶエレメントを含むＣＨＯ細胞であり、かつ（ｉ）前記ＰＰＹＰモチーフをコードする配列および／または（ｉ）中の配列に隣接する最大２０個の核酸の配列が、前記変化を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１７】
前記操作された細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ１つまたは複数の配列番号１、２、３、４またはそれと９０％もしくは９５％超の配列同一性を有する配列中に、好ましくは前記の配列のＥＲＶエレメント内に欠失、付加、および／または置換を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１８】
前記操作された細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ配列番号３０などの、ＥＲＶグループ１コンセンサス配列またはそれと９０％超の配列同一性を有する配列中に欠失、付加、および／または置換を有し、かつ前記欠失、付加、および／または置換を有する前記配列が、機能的Ｇａｇタンパク質をコードしない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の操作された細胞。
【請求項１９】
改善されたゲノム編集のための方法であって、
（ｉ）細胞、好ましくは目的の細胞中にＥＲＶエレメント、好ましくはｇａｇ遺伝子であるまたはこれに由来するＥＲＶエレメントのコンセンサス配列などの、標的核酸配列中に一本鎖または二本鎖のブレーキ（ｂｒａｋｅ）を導入するための異種系を導入することと、さらに
（ｉｉ）前記細胞中に
（ａ）１つまたは複数の組換え経路の１つまたは複数のタンパク質をコードするまたは活性化する異種核酸配列、ならびに／あるいは
（ｂ）ｓｉＲＮＡなどの、１つまたは複数の配列、あるいは１つまたは複数の組換え経路の前記１つまたは複数のタンパク質の発現を抑制するタンパク質をコードする異種配列
を導入することと
を含み、前記（ｉ）の異種系ならびに／あるいは（ｉｉ）（ａ）および／または（ｉｉ）（ｂ）の配列が、前記目的の細胞中で好ましくは少なくとも一過的に発現される、
方法。
【請求項２０】
前記異種配列が、組換え経路の１つまたは複数のタンパク質、特に相同組換え（ＨＲ）の１つまたは複数のタンパク質、特にＲａｄ５１をコードするまたは活性化する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＦＰなどのマーカー遺伝子が、相同組換えを介して前記標的核酸配列中に挿入され、かつ前記マーカー遺伝子を含む細胞が、好ましくは選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記（ａ）の異種核酸配列が、Ｎｂｓ１および／またはＭｒｅ１１などの、ＭＮＲ複合体のタンパク質をコードするまたは活性化し、かつ／あるいは前記（ｂ）の異種配列が、Ｒａｄ５１などの前記ＨＲ経路の１つまたは複数のタンパク質の発現を抑制する配列またはタンパク質をコードする、請求項１９または請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
欠失または挿入が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を介して前記１個または複数個のＥＲＶエレメント中に導入される、請求項１９または請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記異種配列が、組込み型ベクターまたは非組込み型ベクターの一部である、請求項１９または請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
標的核酸配列中に一本鎖または二本鎖のブレーキ（ｂｒａｋｅ）を導入するための非天然に起こる系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である、またはこれに基づく、請求項１９または請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞がＣＨＯ細胞であり、かつ１個または複数個の前記ＥＲＶエレメント中のミリストイル化モチーフ内の１つまたは複数のミリストイル化アミノ酸が、非ミリストイル化アミノ酸で置換され、Ｐａｄ５１、Ｌｉｇ３、Ｅｒｃｄ、Ｐｏｌｄ３などのＨＲタンパク質および／またはＭＭＥＪタンパク質をコードする配列、ならびに／あるいはｓｉＭＲｅ１１などの、ｓｉＲＮＡ配列またはそれをコードするベクターなどの配列の一過的発現の間に好ましくは実施される、請求項１９または請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、１個または複数個の前記ＥＲＶエレメント中にＰＰＹＰモチーフを含むＣＨＯ細胞であり、かつ（ｉ）前記ＰＰＹＰモチーフをコードする配列および／または前記（ｉ）中の配列に隣接する最大２０個の核酸の配列が、変化を含み、Ｒａｄ５１などのＨＲタンパク質の発現を抑制するＲＮＡ配列の一過的発現の間に好ましくは実施される、請求項１９または請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
操作された細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１を含む、操作されたＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であって、前記細胞のゲノムが、１個または複数個、一般に１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、９０個または１００個を超える内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメント中に１個または複数個の核酸の
（ａ）欠失、
（ｂ）付加、および／または
（ｃ）置換
を含む１つまたは複数の変化を含み、かつ請求項１９〜２７に記載のいずれか１つの方法によって作製される、操作された細胞。
【請求項２９】
（ｉ）１つの容器中にＣＲＩＳＰＲなどの、少なくとも１つのヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの非組込み型ベクターと、
（ｉｉ）同じ容器または別の容器中にＥＲＶエレメント中のモチーフを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡまたは前記１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉｉ）同じ容器または別の容器中に１つもしくは複数のｓｉＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｉＲＮＡをコードする配列と、
別の容器中に細胞内に（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を供給する方法の指示書と
を含む、キット。
【請求項３０】
前記ＥＲＶエレメント中の前記モチーフを標的とする前記１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする前記配列および／または前記１つまたは複数のｓｉＲＮＡをコードする配列が、ベクターの一部である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記ベクターが、前記（ｉ）の非組込み型ベクターである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記ＥＲＶエレメントが、Ｇａｇタンパク質をコードする、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
前記モチーフが、ミリストイル化モチーフまたはＰＰＸＹモチーフ、特にＰＰＹＰモチーフである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡが、前記ＨＲ経路の遺伝子に対し指向される、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１５年１２月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／３８７，３７５号の権益を主張するものであり、上記出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
現在、治療薬の組換えタンパク質製造に使用される安定で高収量の哺乳動物細胞株が多数ある。工程の最適化および改善により細胞株の開発が８〜１２か月から４か月に短縮されると同時に、タンパク質を産生する哺乳動物細胞株の収量および安定性も改善されてきた。
【０００３】
しかし、安全性プロファイルがさらに優れた哺乳動物細胞株ｓを供給することが未だ必要とされている。
【０００４】
特に、組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞株を分析し実証するためのより効率的な方法を考案し、それにより候補薬物開発のスループット、速度および効果を増大させ、規制に関わるバリデーションにかかるコストおよびタンパク質治療薬に対する予測不可能で望ましくない影響を抑えることが一般に必要とされている。さらに、操作手順の中でより効率的な細胞特徴付け工程を実施することにより、検出されなかった細胞株混入物（例えば、マイコプラズマまたは外来ウイルス性因子）が原因で製造施設が閉鎖されるという危険性が低減されると考えられる。
【０００５】
特徴付けされた哺乳動物細胞株および生物体は必ず、レトロウイルスを含む過去のウイルスの感染の残遺物を含み、それによりウイルス遺伝子が細胞ゲノム中に組み込まれている。これらのウイルス残遺物は多くの場合、損なわれ変異されているが、それらのいくつかは、それでもなお発現されたままであり、例えば電子顕微鏡を用いて検出可能なウイルス様粒子を生じる。
【０００６】
ＣＨＯ細胞は、それらが異種遺伝子の発現に安定な宿主であり得、長年にわたって安全性が確認されており、ヒト様の翻訳後修飾を有するタンパク質を産生し、かつバイオリアクター中の無血清合成培地中で付着に依存しない迅速な増殖に順応させるのが比較的容易であることから、最も広く用いられている。それでも、バイオリアクターでの培養のために極めて効率的なクローン細胞株を開発し実証文書により裏付けることは時間がかかりかつ多大な労力を要することが多く、依然として一連の障壁および低タンパク質収量という問題を抱えている。
【０００７】
ＣＨＯ細胞は、他の細胞株に比べて治療用タンパク質を生産するうえで安全であると考えられる。それでも、それらはまた感染性ウイルス粒子の残遺物を含み、これらの残遺物はＣＨＯ細胞によるウイルス粒子を引き起こすため規制に関わる文書の提示を必要とする（Ｌｉｅ，Ｙ．Ｓ．ら，１９９４）。さらに、組み込まれたプロウイルスゲノムは、低頻度であるが、組換えや変異を起こしそれにより特性を変化させる可能性がある。
【０００８】
発現されるウイルス残遺物がそのゲノムから除かれ、したがって治療用タンパク質を生産のためのより安全な哺乳動物細胞宿主をもたらすＣＨＯ細胞が、非常に望ましい。
【０００９】
タンパク質生産に用いられる細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のゲノムを特徴付けるためのハイスループットＤＮＡシーケンシング（次世代ＤＮＡシーケンシングまたはＮＧＳ）に基づく技術の最近の発展は、導入遺伝子の組込み部位の特徴付けの成功をもたらした（Ｋｏｓｔｙｒｋｏら，２０１６）。
【００１０】
本発明を説明するためおよび、特に、実施に関してさらに詳述するために本明細書で用いられる、特許および特許出願を含む刊行物およびその他の資料は、参照により組み込まれる。刊行物は便宜上、後に続く文章中で著者および日付によって参照され、付録の参考文献一覧に著者のアルファベット順で記載される。
【００１１】
治療薬生産施設で使用される細胞内に外来性因子が継続的に検出されれば、ＦＤＡなどの規制当局から、遺伝的によりよく特徴付けされた生産細胞株を使用するよう圧力がかかる。ＦＤＡは外来性因子を定義しており、細胞のゲノム内に組み込まれるレトロウイルスをこれに含めている（ＦＤＡ’ｓ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０を参照されたい）。しかし、現在、様々なＣＨＯ細胞亜株のゲノムの完全な組み立てのため、およびそのゲノム配列の解析および解釈のために必要とされる分析ツールおよびバイオインフォマティクスツールがないことが多い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ−１ｂ】内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の生成（ａ）および宿主ゲノム内に潜伏した後の同ウイルスの脱出（ｂ）を示す図である。レトロウイルスの増殖には、逆転写酵素およびウイルスサイクルの他の成分をコードする遺伝子の組込みが必要である。ＥＲＶはほぼ動物界のみにみられる。
【図２Ａ】ＥＳＣＲＴ（輸送のためのエンドソーム選別複合体）複合体（ＥＳＣＲＴ−０、ＥＳＣＲＴ−Ｉ、ＥＳＣＲＴ−ＩＩ、およびＥＳＣＲＴ−ＩＩＩとして知られる細胞質タンパク質複合体とＡＬＩＸを含むいくつかのアクセサリータンパク質とを含む）の成分および、それによりウイルス粒子放出をもたらすウイルスｐ６タンパク質の相互作用を示す図である。
【図２Ｂ】翻訳されるｇａｇ（グループ特異的抗原）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から隠れマルコフモデリング（ＨＭＭ）により決定した、出芽を可能にするＥＲＶの様々なアミノ酸モチーフ（「出芽モチーフ」）を示す図である。
【図３】ｇａｇ領域にコードされるｐｐ１２でＨＭＭ（隠れマルコフモデル）により出芽モチーフ（図１Ｃを参照されたい）を決定する方法を示す図である。ガンマレトロウイルスに共通であることがわかっているＰＰＸＹモチーフに基づき、グループ１およびグループ２のＣＨＯ細胞ＥＲＶ由来の重複するＰＰＹＰモチーフを決定し、変異誘発の標的とした。また、列挙される通り比較した配列の最初の塩基対の番号も示される。
【図４Ａ】ＣＨＯ−Ｍと呼ばれるＣＨＯ−Ｋ１細胞由来細胞株の細胞ゲノムの配列（ＰａｃＢｉｏ（登録商標によるシーケンシングおよびゲノム組立て作業から得た）と、典型的なレトロウイルスエレメント（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ＬＴＲ（長い末端反復配列））由来の配列との比較に基づき、細胞のゲノム中でどのようにＥＲＶエレメントを見つけられるかを模式的に示す図である。本発明者らのＰａｃＢｉｏ（登録商標）ＣＨＯ−Ｍ細胞ゲノムから７７のヒットが得られた。これらのヒットをのちのコンセンサス配列の検討および決定のために選択した。
【図４Ｂ】コンセンサス配列のさらなる決定および解析の様々な段階ならびに公開されているチャイニーズハムスターゲノムとの比較を示す図である。
【図４Ｃ】ＣＨＯ−Ｍ細胞のゲノム中で同定された特異的ガンマレトロウイルスＥＲＶ様配列の実験的検証を示す図である。ＥＲＶの検証は、組込みが予測されるウイルスゲノムのどちらかの側でＣＨＯゲノム配列にハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いて実施した（バイオインフォマティクス解析を用いて見つかったＣ型ガンマレトロウイルス配列の検証）。ゲル上で、長い方の配列（上側の３つの丸）は組み込まれたゲノムを有する対立遺伝子であり、ウイルス組込みのない対立遺伝子はゲル上をより速く移動する（下側の３つの丸）。
【図５】潜在的に危険なＥＲＶ、したがって例えば細胞／ゲノムのストレスにより覚醒する可能性のあるＥＲＶを、どのように決定できるかを示す図である。ストレスは、様々な時間に、様々な種類の培養中に、かつ／または複数回の形質移入の後に加わり得る。エピジェネティックデータは、ＥＲＶエレメントが転写されるか否かを示唆する（ｉＲＮＡの評価およびメチル化状態を含むエピジェネティックデータ）。これらのストレス期間中に、感染性ＥＲＶは覚醒する可能性が高く、検出され得る。
【図６】ガイドＲＮＡ（一本鎖ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとも呼ばれる）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を示す図であり、（ａ）Ｃａｒｒｏｌら（２０１３）による系および（ｂ）Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒら（２０１４）による系を示し、これらの系では、二本鎖ブレーキ（ＤＳＢ）によって遺伝子標的化（ＧＴ）が誘発され、ヌクレアーゼがＧＴを促進することを示している。部位指向型ＤＳＢはＧＴを最大１００００倍に増大するが、望ましくないオフターゲット変異も誘発し得る。ヌクレアーゼ活性は１０〜８０％の間で変化する。
【図７】ＤＳＢの修復に関して競合する３種類の主な修復経路、すなわち、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）を示す図である。修復の経路はゲノム編集の結果に影響を及ぼし、それにより欠失、遺伝子変換または元の配列の効果的な回復が起こり得る。
【図８】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いる、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞ゲノム中のＧＦＰの一部をコードするドナープラスミドからの機能的ＧＦＰコード配列の回復を示す図である。結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９＋ドナー（ａ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９単独（ｂ）、およびドナー単独（ｃ）について示される。ＧＦＰ再構成にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナープラスミドが必要である（（ａ）での形質移入細胞中でＧＦＰの約０．４％が修復される）ことがわかる。ＤＧ４４系では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９単独またはドナープラスミド単独で測定可能なＧＦＰはなかった。
【図９】様々な修復経路に影響を及ぼす遺伝子の発現抑制／ノックダウン（ｓｉＲＮＡを介する）による、図８（ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞）のドナープラスミドを介する遺伝子修正の％を示す図である。ＮＨＥＪ経路の遺伝子の発現抑制は修正の％を増大する（リガーゼ４およびＸＲＣＣ４の発現抑制／ノックダウンによる２０％の増大）。ＨＤＲ（相同性指向型修復経路、ＨＲおよびＭＭＥＪ）での遺伝子の発現抑制／ノックダウンは大部分の修正の％を減少する。ＨＤＲでの特定の遺伝子の発現抑制は修正の％を増大する（Ｎｂｓ４、ＭＲＮ複合体の一部）。（ｘ軸は、修復経路に従って整理した、使用した様々なサイレンシングＲＮＡを示し、＊は有意差を表す）。
【図１０】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いる、ＣＨＯ−Ｍ（ＣＨＯ−Ｋ１バリアント）細胞ゲノム中のＧＦＰの一部をコードするドナープラスミドからの機能的ＧＦＰ−コード配列の回復を示す図である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナープラスミドでの形質移入は０．７％の修復されたＧＦＰをもたらす。ＣＨＯ−Ｍ細胞はしたがって、ＤＧ４４細胞より修復されやすい。
【図１１】異なる修復経路に影響を及ぼす遺伝子の発現抑制／ノックダウン（ｓｉＲＮＡを介する）による図１０（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）のドナープラスミド組込みの％を示す図である。ＨＤＲ（相同性指向型修復経路、ＨＲおよびＭＭＥＪ）での遺伝子の発現抑制は遺伝子修正の％を減少した。図はまた、検討した３種類のクローンからの結果の高い再現性を示す。Ｒａｄ５１の発現抑制（ｓｉＲａｄ５１を介する）、ひいては修復経路であるＨＲの低下／停止は、全３種類のクローンでＧＦＰ陽性細胞を有意に減少させたが、ｓｉＸｒｃｃ４によるＮＨＥＪの低下／停止は、ＧＦＰ陽性細胞の百分位数に実質的に全く影響を及ぼさなかった。
【図１２Ａ】異なる修復経路に影響を及ぼす遺伝子の発現抑制（ｓｉＲＮＡを介する）による図１０（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）からの遺伝子修正の増大または減少を示す図である。ＨＲ（相同修復）での遺伝子の発現抑制は、修正の％を部分的に減少し（Ｒａｄ５１の発現抑制／ノックダウン）、修正の％を部分的に増大する（Ｍｒｅ１１のサイレンシング／ノックダウン）。（ｘ軸は、修復経路に従って整理した、使用した異なるサイレンシングＲＮＡを示し、＊は有意差を表す）。
【図１２Ｂ】律速的なＨＲタンパク質および／またはＭＭＥＪタンパク質の発現増大が遺伝子修正を用量依存性に刺激することを示す図である。図からわかるように、空ベクターを基準レベルの１とした場合、示される律速タンパク質を生じる発現ベクターの特定の量は、遺伝子修正を０．０５倍超、０．１倍超、０．２倍、０．３倍、０．４倍または０．５倍増大させる（それぞれの遺伝子をアップレギュレートする）。
【図１３】細胞のゲノム内に組み込まれてガンマレトロウイルス関連ＥＲＶを形成すると考えられる３つのクラスのガンマレトロウイルスを示す図である。図は、ＧＡＬ配列、ＰＯＬ配列、ＥＮＶ配列、ＬＴＲ配列を検索する（カバレッジ８０％、配列同一性８０％）ＰＡＣＢＩＯシーケンシングにより得たＣＨＯゲノムを解析した際に、存在し活性であることが見出された各クラス（Ｉ〜ＩＩＩ）内のウイルスを示す。１５９種類のＩＡＰ（嚢内Ａ型粒子）配列および１４４種類のＣ型マウスＥＲＶ様配列（太く丸で囲った部分）ならびにＧＡＬＶ（テナガザル白血病ウイルス）に関連する６種類の配列が見出された。
【図１４】ＣＨＯゲノム由来のガンマレトロビスス（ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｓｕｓ）様ＥＲＶの７７種類のＧＡＧ／ＰＯＬ／ＥＮＶ連結配列（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に基づく近接結合コンセンサス系統樹を示す図である。グループ１とグループ２は、本明細書の他の箇所に記載される通りに区別される。
【図１５】ＣＨＯ−Ｍ細胞から特徴付けられたＣＨＯガンマレトロウイルス様ＥＲＶ転写産物の選択からのＧＡＧ  ＲＮＡのアライメントを示す図である。アライメントされた配列の下の印は、ＧＡＧオープンリーディングフレームにおける変異を表す。両グループともよく保存されており、チャイニーズハムスターの進化で最近起こった組込みを構成する。
【図１６】ＣＨＯ−Ｍ細胞で同定された具体的なＥＲＶエレメントのＣｐＧ  ＤＮＡメチル化状態を示す図である。これらの具体例では５’ＬＴＲ  ＥＲＶは低メチル化状態にあり、これらは転写されるＥＲＶに対応することを示唆する。
【図１７】ＣＨＯゲノム由来のガンマレトロウイルス様ＥＲＶの１２１種類のＧＡＧ配列に基づく近接結合コンセンサス系統樹を示す図である。グループ１および２はともに転写活性のあるＥＲＶを含む。グループ２中の囲まれた配列は、活性であると見出されたが、停止コドンを含み、グループ１中の複数の囲まれた配列は、活性でありかつコード配列中に停止コドンを含ないと見出された。ＧａｇおよびＰｏｌのｃＤＮＡ解析は、機能的ＥＲＶの存在と一致した。発現する可能性のあるＥＲＶを黒い四角で囲む。それらの配列に基づき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロセシングに関するグループ１のウイルスのコンセンサス配列を決定した。
【図１８】標的としてＰＰＹＰモチーフおよびミリストイル化モチーフのいずれかを用いる（いずれもＥＲＶ出芽に干渉する）、図１７の配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＥＲＶ不活性化に用いた戦略を示す図である。矢印は二本鎖切断が行われたた場所を示す。ｓｇＲＮＡの設計については「材料および方法」を参照されたい。
【図１９】ＥＲＶ不活性化のための２種類の実験手順を示す図であり、一方はＨＤＲ修復経路を阻害せず、他方は、ここではＲａｄ５１  ｓｉＲＮＡを介して、ＨＤＲ修復経路を阻害する。ＥＲＶ破壊を、エンドポイントＰＣＲまたはリーディングフレームを決定するシーケンシングによる分析で、ｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）により検証した。
【図２０】非特異的陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞のレベルに相対的な、Ｒａｄ５１  ｍＲＮＡレベルおよび相同組換え修復活性に及ぼす３種類の個々のＲａｄ５１標的化ｓｉＲＮＡの形質移入の効果を示す図である。四角：値を１に設定した非特異的陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞のレベルに相対的な、Ｒａｄ５１  ｍＲＮＡレベル（ｘ軸）および相同組換え修復活性（ｙ軸）に及ぼす３種類のＲａｄ５１標的化ｓｉＲＮＡの混合物（ｓｉＲａｄ５１  ３×）の形質移入の効果。黒丸：Ｒａｄ５１およびＨＲ阻害に対して３種類のｓｉＲＮＡの混合物と同様の効果を示す、３種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲａｄ５１＿１、ｓｉＲａｄ５１＿２、ｓｉＲａｄ５１＿３）をそれぞれ個別に用いて実施した同様のアッセイ。図からわかるように、Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡは効率的で特異的である。
【図２１】ｃＤＮＡ  ＰＣＲアッセイで特異的ｓｇＲＮＡとともに使用したときのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の効果を示す図であり、ＥＲＶ特異的プライマーを用いてＥＲＶ発現の減少を示す。第一および第二のＣＲＩＳＰＲ実験は再現性を示し、第三の実験は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９処理前の追加のＲＡＤ５１  ｓｉＲＮＡが媒介する阻害の効果を示す。ＰＰＹＰ５  ｓｇＲＮＡおよびＲＡＤ５１ノックダウンにより大幅なＥＲＶ  ｍＲＮＡシグナル減少が観察された（上のゲル）。下のグラフでは、上にＥＲＶグループ１のコンセンサス配列が示され（配列番号３０）、中央に対照（未処理細胞）グループ１のＰＰＹＰモチーフ配列が示され（配列番号３１）、下にＰＰＹＰ７  ｓｇＲＮＡ処理細胞から得られたアウトオブフレーム欠失の例が示される（配列番号３２）。
【図２２】図２１に示される第一のＣＲＩＳＰＲ実験（試料１）および第二の（試料２）ＣＲＩＳＰＲ実験から得た、未処理ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  ＷＴ）からの、またはＰＰＹＰ６  ｓｇＲＮＡプログラムＣａｓ９ヌクレアーゼで処理したＣＨＯ細胞からの、増幅したＧＡＧ  ＥＲＶ配列のシーケンシング電気泳動図を示す図である。Ｃａｓ９切断部位が垂直線で示され、その後で処理細胞について配列の混合物を観察し、ＧＡＧ配列の５０％以上が変異したことを示す。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、一実施形態では、操作された細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｍ細胞などの操作されたＣＨＯ−Ｋ１を含む、操作されたＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞株の操作された細胞であって、
その細胞のゲノムを含み、ゲノムが、上記ゲノムの一部である１個または複数個の、一般に１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、９０個または１００個を超える内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメントに１個または複数個の核酸の
欠失、
付加／組込み、および／または
置換
を含む１つまたは複数の変化を含む、
操作された細胞に関する。
【００１４】
ＥＲＶエレメントは、コアラ伝染性ウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のＥＲＶを含むガンマレトロウイルスＥＲＶ由来であり得る。１つまたは複数の変化は、好ましくは、１つまたは複数の、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％超または１００％の上記ＥＲＶの放出を抑制するか完全に抑える、または上記ＥＲＶを抑制するか完全に抑えるよう適応され得る。
【００１５】
１個または複数個の変化した（ＥＲＶ）エレメントは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／またはｅｎｖ遺伝子である、またはこれに由来し、好ましくはＭＡ（基質）、ＣＡ（カプシド）、ＮＣ（ヌクレオカプシド）およびｐｐ１２またはｐ６などのタンパク質をコードする別のドメインをコードする、ｇａｇ遺伝子に由来し、かつ／あるいはＥＲＶの長い末端反復配列（ＬＴＲ）であり得る。
【００１６】
１個または複数個のＥＲＶエレメントは、特にＧａｇ（グループ抗原）タンパク質、Ｐｏｌ（逆転写酵素）タンパク質および／またはＥｎｖ（エンベロープ）タンパク質をコードし得る。
【００１７】
付加／挿入、欠失または置換は、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個または２００個を超える核酸を含み得る。
【００１８】
変化は１つまたは複数の（ＥＲＶ）エレメントを標的にしてよく、それは１つまたは複数のｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子および／またはｅｎｖ遺伝子、好ましくはｇａｇ遺伝子、であってよく、またはこれに由来してよく、その遺伝子の配列は例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのマーカータンパク質をコードする導入遺伝子、の標的化組込みに供される、またはドミナントネガティブ表現型を生じるアミノ酸置換に供されてよい。
【００１９】
ＥＲＶエレメントはｇａｇ遺伝子に由来してよく、および少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれより多いまたは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％あるいはすべてのエレメントが上記変化を含み得る。
【００２０】
変化はＥＶＲエレメントのコンセンサス配列中であってよく、コンセンサス配列は少なくとも５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対の長さ、好ましくは、１５〜２５塩基対または３０〜５０塩基対の長さであってよい（図２１Ｂを比較されたい）。
【００２１】
操作された細胞は、ＥＲＶを全く放出しない、または実質的に全く放出しない。
【００２２】
細胞はまた、組換え経路の１つまたは複数のタンパク質をコードする、阻害するまたは活性化する異種核酸配列、ならびに／あるいは組換え経路の１つまたは複数のタンパク質、好ましくはＮｂｓ１、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５１、リガーゼ１および／またはリガーゼ３の発現を抑制する１つまたは複数の配列またはタンパク質をコードする異種核酸配列を含み得る。
【００２３】
異種核酸配列は、好ましくは細胞のゲノム中に組み込まれないベクターとして存在する／ベクターにより発現され得る。
【００２４】
操作された細胞はまた、好ましくはベクター上に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの１つまたは複数のマーカータンパク質をコードする、異種ドナーＤＮＡをさらに含み得る。操作された細胞は導入遺伝子をさらに含み得る。導入遺伝子は、ゲノム中に組み込まれたベクターから好ましくは発現し得るＧＦＰなどのマーカータンパク質および／または生物学的治療薬をコードするマーカー遺伝子であり得る。
【００２５】
１つまたは複数の変化は、ｇａｇ遺伝子またはｇａｇ遺伝子に由来するＥＲＶエレメントなどの、１つまたは複数のＥＲＶエレメント中のミリストイル化モチーフ内の１つまたは複数のミリストイル化アミノ酸の、非ミリストイル化アミノ酸との置換であるかそれを含み得る。
【００２６】
この目的のために、Ｐａｄ５１、Ｌｉｇ３、Ｅｒｃｄ、Ｐｏｌｄ３などのＨＲタンパク質および／またはＭＭＥＪタンパク質をコードする一過的に発現されるベクターの形態でなどの配列、ならびに／あるいはｓｉＭＲｅ１１などのｓｉＲＮＡ配列またはそれをコードするベクターなどの配列を少なくとも一過的に細胞に供給する／細胞で発現することにより、上記細胞がＨＲ／ＭＭＥＪ発現を増大するよう改変される（図１２Ａおよび１２Ｂを参照されたい）。
【００２７】
ｇａｇ遺伝子またはｇａｇ遺伝子に由来するＥＲＶエレメントなどのＥＲＶエレメント（１つまたは複数）は、ＰＰＹＰモチーフを含み得、かつ（ｉ）ＰＰＹＰモチーフをコードする配列および／または（ｉ）中の配列に隣接する最大２０個または３０個の核酸の配列は変化を含み得る。
【００２８】
操作された細胞はＣＨＯ細胞であり得、１つまたは複数の配列番号１、２、３、４またはそれと９０％もしくは９５％超の配列同一性を有する配列中に、好ましくは上記配列のＥＲＶエレメント内に１つまたは複数の欠失、付加、および／または置換を有し得る。
【００２９】
操作された細胞はＣＨＯ細胞であり得、配列番号３０などのＥＲＶグループ１コンセンサス配列中に、またはそれと９０％超の配列同一性を有する配列中に１つまたは複数の欠失、付加、および／または置換を有し得、ここで欠失、付加、および／または置換を有する配列は、もはや機能的Ｇａｇタンパク質をコードしない。
【００３０】
本発明はまた、改善されたゲノム編集の方法であって、
（ｉ）細胞、好ましくは目的の細胞の標的核酸配列、例えばＥＲＶエレメント、好ましくはｇａｇ遺伝子であるまたはこれに由来するＥＲＶエレメントのコンセンサス配列などに一本鎖または二本鎖のブレーキ（ｂｒａｋｅ）を生じるための非天然に起こる／異種の系を供給するまたは導入することと、さらに
（ｉｉ）細胞中に
（ａ）１つまたは複数の組換え経路の１つまたは複数のタンパク質をコードするまたは活性化する異種核酸配列、ならびに／あるいは
（ｂ）１つまたは複数の組換え経路の１つまたは複数のタンパク質の発現を抑制する／減少させる、ｓｉＲＮＡまたはタンパク質などの、１つまたは複数の配列をコードする異種配列
を供給または導入することと
を含み、ここで（ｉ）の上記異種の系ならびに／あるいは（ｉｉ）（ａ）および／または（ｉｉ）（ｂ）の配列が、目的の細胞中で好ましくは一過的に発現される、
方法に関する。
【００３１】
異種配列は、組換え経路の１つまたは複数のタンパク質、特に相同組換え（ＨＲ）経路の１つまたは複数のタンパク質、特にＲａｄ５１、Ｎｂｓ１、Ｍｒｅ１１、リガーゼ１および／またはリガーゼ３をコードする、活性化するまたは不活性化し得る。
【００３２】
ＧＦＰなどのマーカー遺伝子を相同組換えにより標的核酸配列中に挿入し得る。マーカー遺伝子を含む細胞を好ましくは選択する。
【００３３】
上の（ａ）の異種配列は、Ｎｂｓ１および／またはＭｒｅ１１など、ＭＮＲ複合体のタンパク質をコードする、活性化するまたは不活性化し得、かつ／あるいは、（ｂ）の上記異種配列は、Ｒａｄ５１、Ｎｂｓ１、Ｍｒｅ１１、リガーゼ１および／またはリガーゼ３などの相同組換え（ＨＲ）経路の１つまたは複数のタンパク質の発現を抑制する配列またはタンパク質をコードし得る。
【００３４】
欠失または挿入は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）により１個または複数個のＥＲＶエレメント中に導入され得る。
【００３５】
異種配列は、組込み型ベクターまたは好ましくは非組込み型ベクターの一部である、または同ベクターから発現され得る。
【００３６】
標的核酸配列中に一本鎖または二本鎖のブレーキ（ｂｒａｋｅ）を導入する非天然に起こる／異種の系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である、またはこれに基づくものであり得る。
【００３７】
１個または複数個のＥＲＶエレメント中のミリストイル化モチーフ内の１つまたは複数のミリストイル化アミノ酸は、非ミリストイル化アミノ酸で置換され得る。ＰＰＹＰモチーフをコードする配列および／または同モチーフに隣接する最大１０個、２０個または３０個の核酸の配列は、変化を含み得る。
【００３８】
例えばＲａｄ５１などのＨＲタンパク質の発現を抑制する配列は、細胞中で一過的にのみ発現され得る。
【００３９】
本発明はまた、操作された細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む操作されたＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞に関し、この細胞は、特に標準培養条件下および／またはストレス培養条件下で、好ましくはウイルス粒子を放出せず／実質的に全く放出せず、およびこの細胞のゲノムが１個または複数個、一般に１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、９０個または１００個を超える内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）エレメント中に１個または複数個の核酸の
（ａ）欠失、
（ｂ）付加／組込み、および／または
（ｃ）置換
を含む１つまたは複数の変化を含み、かつ本明細書に記載されるいずれか１つの方法によって好ましくは作製される。
【００４０】
本発明はまた、
（ｉ）１つの容器中にＣＲＩＳＰＲなどの、少なくとも１つのヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの非組込み型ベクターと、
（ｉｉ）同じ容器または別の容器中にＥＲＶエレメント中のモチーフを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡまたはその１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉｉ）同じまたは別の容器中に１つもしくは複数のｓｉＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｉＲＮＡをコードする配列と、
別の容器中に細胞内に（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を供給する方法の指示書と
を含む、キットに関する。
【００４１】
ＥＲＶエレメント中のモチーフを標的とする１つもしくは複数のガイドＲＮＡをコードする配列および／または１つもしくは複数のｓｉＲＮＡをコードする配列は、ベクターの一部であり得る。本明細書に記載されるいずれかのベクターは、一過的にのみ発現され得、かつ／または（ｉ）の非組込み型ベクターであり得る。ＥＲＶエレメントはＧａｇタンパク質をコードし得る。モチーフはミリストイル化モチーフまたはＰＰＸＹモチーフ、特にＰＰＹＰモチーフであり得る。ｓｉＲＮＡ（１つまたは複数）は、ＨＲ経路の遺伝子に対し指向され得る。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
（本発明の様々な実施形態および好ましい実施形態の説明）
本発明により操作された細胞を産生するよう操作される細胞、好ましくは哺乳動物細胞／真核細胞は、細胞培養条件下で維持することが可能である。標準的な細胞培養条件は、例えば組換えタンパク質の産生に使用される完全合成培地中で、３０〜４０℃、好ましくは３７℃または約３７℃である。このタイプの細胞の非限定的な例は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）細胞およびＳＵＲＥ  ＣＨＯ−Ｍ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１の派生物）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）などの非霊長類真核細胞である。霊長類真核宿主細胞としては、例えば、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）および２９３［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３］ならびに３Ｔ３［ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３］およびサル腎臓ＣＶ１系［ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０］、ＳＶ４０で形質転換されたもの（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）が挙げられる。操作されたという用語は、例えば、例えば形質転換配列による形質移入によりおよび／または変異により改変された細胞を意味する。当業者には容易に理解されるように、これらの細胞は、本明細書に記載される通りの操作の前であっても、非天然の細胞である。上記の細胞、特に種々のＣＨＯ細胞は、生物工学用途で治療用タンパク質の産生などによく用いられ、本明細書では目的の細胞と呼ぶ。当業者には容易に理解されるように、上記以外の細胞であっても、生物工学用途で特に例えば治療用タンパク質の発現に用いられる限り、目的の細胞であり得る。
【００４３】
レトロウイルスゲノム内でコードされる３種類の主要なタンパク質は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖである。ｇａｇ遺伝子にコードされるＧａｇ（グループ抗原）はポリタンパク質であり、これは、レトロウイルスのコアを決定する核タンパク質コア粒子を含む、マトリックスタンパク質および他のコアタンパク質へとプロセシングされる。Ｐｏｌは、ｐｏｌ遺伝子にコードされる逆転写酵素であり、ＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼ機能を有する。その活性により、組み込まれる前の形態のウイルスの二本鎖ＤＮＡが生じ、インテグラーゼ機能を介して宿主ゲノム中への組込みが起こり、またＲＮアーゼ機能を介して宿主のゲノム中への組み込み後に逆転写が起こる。Ｅｎｖはｅｎｖ遺伝子にコードされるエンベロープタンパク質であり、ウイルスの脂質層中に存在し、ウイルスの指向性を決定する。
【００４４】
コアラ伝染性ウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含む、ガマレトロウイルス（ｇａｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）属由来のウイルスなどの内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）は、例えばハムスターゲノムおよびその近縁種のゲノムを含むあらゆる動物ゲノム中にみられる外来性因子である。ＥＲＶはゲノム中で維持され、それらがゲノム中に組み込まれる細胞にとって、遺伝的多様性の源および他のウイルス病原体からの防御をもたらすことを含む、いくつかの利点を有し得る。しかし、ＥＲＶは感染性になることもある。癌および／またはエピジェネティックな修飾はＥＲＶの覚醒を増大させることがある。Ｌｅｗｉｓらは、１１５種類のウイルスのデータベースとの相同性の比較に基づき、ＣＨＯ細胞中の４０３種類の予想されるレトロウイルスタンパク質を同定した。Ｌｅｗｉｓらは、それらのｍＲＮＡの４０％が発現されると報告し、したがってその多くが依然としてレトロウイルス成分を合成している可能性を示唆する（Ｌｅｗｉｓら，２０１３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）。ここでは、マウスレトロウイルスＣ型配列を比較ツールとして用いた（１９９４年の公表文献から入手したデータ）。ＳＩＢ（スイスバイオインフォマティクス研究所）が主催するＶｉｒａｌｚｏｎｅのウェブサイト（２０１５年１２月）に記載されるように、このグループには４つの種がある。これらはまたマウスのゲノム中で高頻度でみられ、マウスで癌を引き起こすことが知られている。しかし、当業者に理解されるように、多数の他のレトロウイルスの配列を、目的の細胞中のＥＲＶの検索に用いることができる。本発明による操作された細胞は、その由来であるＣＨＯ−Ｋ１細胞などの細胞のゲノムと大部分が同一であるゲノムを含み得る。しかし、これらのゲノムの一部である、少なくとも１つまたは複数の、多くの場合多数のＥＲＶエレメントは、本明細書に記載される変化を含む。
【００４５】
本発明によるＥＲＶエレメントは主として、対応する非組込みウイルス中で機能的実体をもたらすＥＲＶ核酸配列の区域を表す。当業者に理解されるように、組込まれたウイルスＤＮＡ中で、これらの区域の一部が破壊されている、または欠失していることが多い。したがって、この定義には、以下に記載され図２Ｂに示されるあらゆる遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）および副次的にその一部が含まれ、細胞のゲノム中に存在する切り詰められたおよび／または改変されたものも含まれる。ＥＲＶエレメントは、ｇａｇ遺伝子がそれらの供給源である場合、例えばｇａｇに由来すると言われるが、それらは必ずしも完全に機能的なＧａｇタンパク質をコードするわけではない。Ｇａｇタンパク質をコードすると言われるＥＲＶエレメントは、機能的なＧａｇタンパク質をコードする。
【００４６】
ｇａｇ遺伝子はＧａｇ前駆体タンパク質を生じ、これはスプライスされないウイルスｍＲＮＡから発現される。Ｇａｇ前駆体タンパク質は、ウイルスの成熟過程中に、一般にＭＡ（基質）、ＣＡ（カプシド）、ＮＣ（ヌクレオカプシド）と呼ばれるタンパク質とさらなるタンパク質ドメイン（例えば、マウス白血病ウイルスでのｐｐ１２またはＨＩＶでのｐ６）の４つのより小型のタンパク質へと、ウイルスがコードするプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）により切断される。
【００４７】
ＭＡポリペプチドは、Ｎ末端の、前駆体タンパク質のミリストイル化末端から生じる。ＭＡ分子の大部分はビリオン脂質二重層の内表面に結合したままであり、粒子を安定化する。
【００４８】
ＣＡタンパク質はウイルス粒子の円錐形のコアを形成する。
【００４９】
ＧａｇのＮＣ領域は、レトロウイルスのいわゆるパッケージングシグナルを特異的に認識する役割を担っている。パッケージングシグナルは、ウイルスＲＮＡの５’末端付近に位置する４つのステムループ構造を含み、ビリオン中への異種ＲＮＡの取り込みを媒介するのに十分である。ＮＣは、２つの亜鉛フィンガーモチーフを介する相互作用によりパッケージングシグナルに結合する。
【００５０】
もう１つのタンパク質ドメインは、前駆体タンパク質Ｇａｇとアクセサリータンパク質Ｖｐｒの間の相互作用を媒介し、集積するビリオン中へのＶｐｒの取り込みをもたらす。ＨＩＶ中のｐ６領域はまた、感染細胞からの出芽ビリオンの効率的な放出に必要な、いわゆる後期ドメインを含む（ＨｏｐｅおよびＴｒｏｎｏ，２０００）。
【００５１】
ウイルスのプロテアーゼ（Ｐｒｏ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、ＲＮアーゼＨ、および逆転写酵素（ＲＴ）はＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質という枠内で発現する。Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体は一般に、リボソームフレームシフト事象によって生成し、この事象は特異的なシス作用性ＲＮＡモチーフ（Ｇａｇ  ＲＮＡの遠位領域中のヘプタヌクレオチド配列とそれに続く短いステムループ）により誘発される。リボソームがこのモチーフと遭遇すると、翻訳を妨げることなく約５％の確率でｐｏｌリーディングフレームにシフトする。このリボソームフレームシフトの頻度は、ＧａｇとＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体が約２０：１の比で産生される理由を説明する。
【００５２】
ウイルス成熟中に、ウイルスがコードするプロテアーゼがＰｏｌポリペプチドをＧａｇから切断し、さらにそれを消化してプロテアーゼ、ＲＴ、ＲＮアーゼＨ、およびインテグラーゼ活性に分離する。このような切断は必ずしも効率的に起こるわけではなく、例えば、ＲＴタンパク質の約５０％が単一ポリペプチド（ｐ６５）としてＲＮアーゼＨに結合したままである（ＨｏｐｅおよびＴｒｏｎｏ，２０００）。
【００５３】
ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素をコードする。逆転写の過程中に、ポリメラーゼによりビリオン中に存在する一本鎖ゲノムＲＮＡ二量体の二本鎖ＤＮＡのコピーが生じる。ＲＮアーゼＨが第一のＤＮＡ鎖から元のＲＮＡ鋳型を除去し、ＤＮＡの相補鎖の合成を可能にする。ポリメラーゼの主な機能的種はヘテロ二量体である。放出されるビリオンのカプシド内にあらゆるｐｏｌ遺伝子産物がみられる。
【００５４】
ＩＮタンパク質は、感染細胞のゲノムＤＮＡ中へのプロウイルスＤＮＡの挿入を媒介する。この過程はＩＮの３つの異なる機能を介する。
【００５５】
Ｅｎｖタンパク質は単独でスプライスされたｍＲＮＡから発現される。Ｅｎｖは最初、小胞体で合成され、ゴルジ複合体の中を移動しながらグリコシル化を受ける。Ｅｎｖのグリコシル化は一般に、感染性に必要とされる。細胞内プロテアーゼがこのタンパク質を膜貫通ドメインと表面ドメインとに切断する（ＨｏｐｅおよびＴｒｏｎｏ，２０００）。
【００５６】
ゲノムのＥＲＶには、ウイルス様粒子の形態で細胞から放出されるものもあれば、そうでないものもある。しかし一般的には、放出されるＥＲＶの方が感染性となる可能性が高い。このため、一般的には、本明細書に記載されるように、好ましくは標準的な培養条件下またはストレスのかかる培養条件下で、ＥＲＶを全く発現できないおよび放出できない、または実質的に全く発現できないおよび放出できないように細胞を操作するのが有利である。そのように操作された細胞を含む細胞培養物が、本明細書に記載されるＥＲＶ放出減少法を実施していない対応物に比べ５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、好ましくは５％のＥＲＶを放出する場合、実質的にＥＲＶは全く放出されない。このような対応物は、例えば市販のＣＨＯ−Ｋ１細胞であろう。全く発現しない、または実質的に全く発現しないとは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、好ましくは５％の未変異Ｇａｇ  ｍＲＮＡ配列がＰＣＲおよびシーケンシング解析によって検出できることを意味する。全く放出されないとは、例えば図２１に示される、またはＱＩＡＧＥＮ社のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標）で得られる、ｃＤＮＡ  ＰＣＲアッセイによる評価で、検出可能なウイルス配列の放出が全く、または実質的に全く起こらないことを意味する。当業者にまた理解されるように、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のＥＲＶエレメント中にタンパク質／ペプチド産生を不活性化する核酸配列の変化を含むよう操作された細胞も有利であり、かつ本発明の一部である。実際に、ある特定の実施形態では、目的の細胞のゲノムの一部である１個または複数個のＥＲＶエレメントを１つまたは複数の変異によってのみ変化させて、必要に応じて、細胞内でＥＲＶが果たすと考えられる有益な役割を維持することが有利である。しかし、のちに記載するように、本発明の特定の実施形態は、特に高コピー数のＥＲＶ（１細胞当たり３０個、４０個または５０個のＥＲＶ）に適しており、改変細胞がそれぞれのＥＲＶ成分の発現を全く示さないようにすることができる。
【００５７】
異種核酸配列は、本発明に従って操作する前の細胞にはみられない核酸配列であるが、関連するタイプの核酸配列は細胞中に非常によく存在し得る。本発明に関連して使用される導入遺伝子は、そのような異種核酸配列であり、特に所与の成熟タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列（本明細書ではタンパク質をコードするＤＮＡとも呼ばれる）、前駆体タンパク質またはタンパク質をコードしない機能性ＲＮＡ（非コードＲＮＡ）をコードするデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列である。導入遺伝子を単離し細胞内に導入して導入遺伝子産物を得る。本発明によるいくつかの好ましい導入遺伝子は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのマーカータンパク質をコードする。このような導入遺伝子を用いて、ＥＲＶエレメント中への組込み、したがってＥＲＶエレメントの変化／不活性化の成功を検出できる。その他の導入遺伝子は、例えば、問題の細胞により最終的に産生されるであろうタンパク質、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＦｃ融合タンパク質ならびに他のタンパク質、特に治療活性を有するタンパク質（「生物学的治療薬」）をコードするものである。本発明では、付加は、標的化組込みなどの組込みを含む。しかし、当業者には、組込み過程中にレシピエントゲノム中の特定のヌクレオチドが失われる可能性のあることが理解されよう。上記の組込みは本発明の一部であり、付加と見なされる。
【００５８】
本明細書で使用される導入遺伝子という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡとの関連において、ＲＮＡ転写開始シグナル、プロモーターまたはエンハンサーなどの転写されない隣接領域を含まない。他の好ましい導入遺伝子としては、機能性ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。したがって、導入遺伝子という用語は、この関連において、形質移入（本発明との関連では、形質導入、すなわち、ウイルスベクターによる導入も含む）により真核宿主細胞などの細胞中に導入され目的の産物（「導入遺伝子発現産物」、例えば「異種タンパク質」）をコードするＤＮＡ配列に言及する際に使用される。導入遺伝子は、シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドコード配列に機能的に結合していてよく、シグナルペプチドは次に、小胞体および／または細胞質膜を横断する移行および／または分泌を媒介および／または促進し、かつ分泌前または分泌時に除去される。
【００５９】
プロモーター配列または単にプロモーターは、１つまたは複数の核酸配列の発現のため宿主細胞によって認識される核酸配列である。プロモーター配列は、ポリヌクレオチドの発現を調節する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示す変異体プロモーター、切り詰められたプロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む任意の核酸配列であり得、宿主細胞に対して同種または異種である細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてよい。本発明によるプロモーターは、誘導性プロモーターおよび非誘導性プロモーターを含む。プロモーターが核酸に対してその機能を発揮する場合、その核酸配列はそのプロモーターの制御下にある。本発明の細胞／ベクターは、そのようなプロモーターをしばしば含む。
【００６０】
核酸配列の変化とは、本発明に従って操作する前の細胞中では起こらない付加／挿入、欠失および／または置換などの変化である。
【００６１】
本明細書で使用される「ゲノム編集」は、ゲノム配列の改変（「編集」）を指し、少なくとも１つヌクレオチドの欠失、少なくとも１つヌクレオチドの付加／挿入、または少なくとも１つヌクレオチドの置換を含み得る。本明細書では、編集されるゲノム配列を標的核酸配列と呼ぶ。標的化挿入とは、予め定められた特定の標的部位で起こる挿入である。ゲノム編集ツールは、例えばヌクレアーゼまたはニッカーゼにより、ゲノム中に二本鎖または一本鎖の切断を導入し、少なくとも部分的には、このような切断を修復する細胞内組換え機構に依存する（のちの記載を参照されたい）。これらのツールは一般に、配列特異的ＤＮＡ結合モジュールも含む。ＺＦＮ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）は、特定のゲノム位置で変異性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同指向修復（ＨＤＲ）を刺激するＤＮＡ二本鎖切断を導入することにより、多岐にわたる遺伝子改変を可能にする。
【００６２】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的にスペーサーが入った短い回文型の反復配列）系の配列特異性は低分子ＲＮＡにより決定される。ＣＲＩＳＰＲ座位は、バクテリオファージおよび他の移動性遺伝子エレメントのゲノムと適合する「スペーサー」配列によって隔てられる一連の反復配列からなる。反復配列とスペーサーのアレイは長い前駆体として転写され、反復配列内でプロセシングされて、ＣＲＩＳＰＲ系によって切断される標的配列（プロトスペーサーとしても知られる）を特定する小型のｃｒＲＮＡを生じる。切断には多くの場合、標的領域のすぐ下流にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られる配列モチーフが存在する必要がある。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は通常、反復配列とスペーサーのアレイに隣接し、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）の生合成および標的化を担う酵素的機構をコードする。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡガイドを利用して切断部位を特定するｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９へのｃｒＲＮＡガイドの搭載はｃｒＲＮＡ前駆体のプロセシング中に起こり、前駆体に対する低分子ＲＮＡアンチセンス、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＲＮアーゼＩＩＩを必要とする。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを用いるゲノム編集とは対照的に、Ｃａｓ９の標的特異性の変更はタンパク質工学を必要とせず、ｓｇＲＮＡとも呼ばれる短鎖ｃｒＲＮＡガイドの設計のみを必要とする。
【００６３】
これまでに、３種類の異なるＣａｓ９ヌクレアーゼのバリアントがゲノム編集プロトコールで採用されてきた。最初のものは野生型Ｃａｓ９であり、これは二本鎖ＤＮＡを部位特異的に切断し、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機構の活性化をもたらし得る。ＤＳＢは、細胞内の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって修復され、標的座位を破壊する挿入および／または欠失（挿入欠失）を生じ得る。あるいは、標的座位に相同なドナー鋳型（図７を参照されたい）が供給される場合、ＤＳＢは相同指向修復（ＨＤＲ）経路によって修復され、精度の高い置換変異を起こさせる。
【００６４】
Ｃａｓ９系は、ニッカーゼ活性のみを有する、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａとして知られる変異型を開発することにより、精度が高くなるようさらに操作された。このことは、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａが１つのＤＮＡ鎖のみを切断し、ＮＨＥＪを活性化しないことを意味する。代わりに、相同な修復鋳型を供給すると、ＤＮＡ修復は高忠実度のＨＤＲ経路のみを介して行われ、それにより挿入欠失変異が減少する。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａはこのため多数の用途において、隣接するＤＮＡニックが生じるよう設計される対のＣａｓ９複合体により座位を標的化する場合に、標的特異性の点でさらに魅力的である。
【００６５】
本発明との関連において、ＥＲＶエレメントの特異的配列またはコンセンサス配列は、例えば上記の系の１つにより切断部位を特定するよう決定される。このような特異的配列またはコンセンサス配列は、好ましくは５〜５０塩基対の長さ、好ましくは１０〜５０塩基対、１５〜２５塩基対、２５〜５０塩基対または３０〜５０塩基対の長さである。コンセンサス配列は、切断がなおも実施され得る限り、例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのミスマッチ（互いに６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える相補性を有する）を含み得る。例えば、図２１を参照されたい。上記の系は非天然系または異種系と呼ばれ、これは、上記の系が、本発明に従って操作する前の細胞の一部であるのではなく、細胞に導入されることを意味する。
【００６６】
本発明によるベクターは、このベクターにより発現される導入遺伝子などの別の核酸を運搬できる核酸分子であり、別の核酸がそれに連結され、一般にはその中に組込まれている。例えば、プラスミドは１つのタイプのベクターであり、レトロウイルスまたはレンチウイルスは別のタイプのベクターである。本発明の好ましい実施形態では、形質移入の前にベクターを直線化する。発現ベクターは異種調節エレメントを含む、またはその発現ベクターにより運ばれる導入遺伝子などの核酸配列の転写および／または発現を促進するよう設計されるそのような調節エレメントの制御下にある。調節エレメントはエンハンサーおよび／またはプロモーターを含み、本明細書に記載される様々な他のエレメントも含む。非ウイルスベクターのうちトランスポゾンは、宿主ゲノム内の複数の座位にＤＮＡ配列の単一コピーを高頻度で組み込むそれらの能力のため特に魅力的である（組込み型ベクター）。ウイルスベクターとは異なり、いくつかのトランスポゾンは細胞内遺伝子付近に優先的に統合しないと報告されており、それらはしたがって有害な変異を導入する可能性が低い。さらに、トランスポゾンは作製および取扱いが容易であり、一般に、逆方向反復配列に隣接するカーゴＤＮＡを含むトランスポゾンドナーベクターと、トランスポザーゼ発現ヘルパープラスミドまたはｍＲＮＡとからなる。内在性トランスポゾンのコピーに干渉することなく様々な細胞株中でＤＮＡを動員するトランスポゾン系がいくつか開発された。例えば、最初にキャベツシャクトリムシのガから単離されたＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンは、カーゴＤＮＡを様々な哺乳動物細胞中に効率的に転移させる。
【００６７】
本発明との関連で、ベクター、特に非組込み型ベクターもまた、遺伝子または機能性ＲＮＡの一過的発現のために使用され得る。一過的発現は、限られた長さの時間の間の発現であり、発現の時間はベクターの設計および培養条件に左右される。しかし、一過的発現は、少なくとも２４時間であるが一般には７日以下の期間にわたる発現を意味する。
【００６８】
カーゴＤＮＡがプラスミドベクター上の導入遺伝子付近に位置する場合、カーゴＤＮＡを望ましくないエピジェネティック効果から保護するためエピジェネティックな調節エレメントを使用できる。例えば、強力なヒトＭＡＲ１−６８により例示されるように、ヘテロクロマチンサイレンシングを防ぎながらカーゴＤＮＡのゲノム組込みおよび転写を増大させるための、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）と呼ばれるエレメントが提案された。これらのエレメントはまた、インスレーターとして作用し、それにより近隣の細胞内遺伝子の活性化を防ぐことができる。ＭＡＲエレメントはこのため、プラスミドまたはウイルスベクターにおいて持続的な高発現を媒介するのに使用されてきた。一過的遺伝子発現には、プラスミドまたは非組込み型レンチウイルス（ＮＩＬ）ベクターなどの非組込み型ベクター（エピソームベクターと呼ばれることもある）を使用し得る。これらのベクターは、宿主細胞内で安定にまたは一過的に維持され複製され得る。
【００６９】
ベクターのベクター配列は、導入遺伝子などの「他の」核酸およびＭＡＲエレメントなどの遺伝子エレメントをすべて除いたベクターのＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列である。
【００７０】
配列同一性という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を指す。一般に、配列は最大の一致が得られるように整列される。「同一性」そのものは当該技術分野で認められた意味を有し、公開済みの技術を用いて算出できる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい）。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定する方法は多数存在するが、「同一性」という用語は、配列中の所与の位置において一致するヌクレオチドまたはアミノ酸を定義するものとして当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。
【００７１】
ＤＮＡｓｉｓソフトウェア（日立ソフトウェア、サンブルーノ、カリフォルニア州）などの既知のコンピュータプログラムを最初の配列アライメントに用い、次いでＥＳＥＥバージョン３．０  ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェア（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）を多重配列アライメントに用いる従来の方法で、任意の特定の核酸分子が、例えば配列番号１、２、３もしくは４のガンマレトロウイルス様配列またはその一部（例えば、図１８に開示される配列を参照されたい）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかを決定できる。
【００７２】
ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、マディソン、ウィスコンシン州、５３７１１）などの既知のコンピュータプログラムを用いる従来の方法で、アミノ酸配列が、例えば配列番号１、２、３もしくは４、またはその一部により発現されるタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかを決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性が最大のセグメントをみつける。
【００７３】
ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いて特定の配列が例えば本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、参照核酸配列または参照アミノ酸配列の長さ全体にわたる同一性の割合が算出され、かつ参照配列中の総ヌクレオチド数の最大５％まで相同性でのギャップが許容されるようパラメータを設定する。
【００７４】
クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間で最適な全体マッチを決定するための別の好ましい方法はグローバル配列アライメントとも呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムを土台とするＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定できる。配列アライメントでは、クエリ配列と対象配列はともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列はＵをＴに変換することにより比較できる。上記グローバル配列アライメントの結果はパーセント同一性で表される。パーセント同一性を算出するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアライメントで用いられる好適なパラメータは以下の通りである：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方。
【００７５】
例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と９５％の「同一性」を有するポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個当たり平均で最大５つの点変異を含み得ること以外は、参照配列と同一である。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るのに、参照配列中の最大５％のヌクレオチドが欠失されるか別のヌクレオチドで置換されてよい、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％の複数のヌクレオチドが参照配列中に組み込まれてよい。クエリ配列は、配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載される任意の特定のフラグメントであり得る。
【００７６】
配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｉａｓｔｎおよびｔｂｉａｓｔｘと関連した使用のために、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）が、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、ベセスダ、メリーランド州）を含むいくつかの入手源およびインターネット上から入手できる。それはＮＣＢＩのウェブサイトで、このプログラムを用いて配列同一性および配列類似性を求める方法の説明とともに、アクセスできる。
【００７７】
本発明は、本明細書に開示される配列およびその任意のフラグメント、特にＰＰＹＰモチーフの左側および右側４０ｂｐｓ、３０ｂｐｓまたは２０ｂｐｓに及ぶフラグメントと８０％、８５％、９０％もしくはそれを超える、９５％もしくはそれを超える、９８％の配列同一性または完全な配列同一性を有する核酸分子および／またはアミノ酸分子を含む。
【００７８】
組換え経路
ＤＮＡ組換え経路としても知られる組換え経路は、ＤＮＡ損傷の修復、例えば染色体二本鎖切断（ＤＳＢ）後のＤＮＡ分子末端の結合を、および染色体ＤＮＡ分子と非染色体ＤＮＡ分子との間のＤＮＡ配列の交換または融合、例えば減数分裂時の染色体乗換えまたはリンパ球細胞の免疫グロブリン遺伝子の再構成など、を引き起こす細胞内経路である。主な組換え経路は、相同組換え経路（ＨＲ）、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）ならびにマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）および代替的末端結合（Ａｌｔ−ＥＪ）経路である。
【００７９】
本発明との関連で言えば、１つまたは複数の経路の特定の要素のノックアウトが相補的核酸配列を介してしばしば生じる。ＤＮＡまたはＲＮＡなどの、ある核酸配列は、例えば２つの一本鎖ＤＮＡ鎖または２つの一本鎖ＲＮＡ鎖のヌクレオチドが安定な水素結合、例えばグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間の水素結合などを形成できる場合、もう一方のＤＮＡまたはＲＮＡに対して相補的である。細胞中で、相補的な塩基対形成によって、例えば、細胞が世代から世代へと情報を複製できる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では、相補的な塩基対形成は特定の標的遺伝子のサイレンシングまたは完全なノックアウトを可能にする。ｓｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列またはｍｉＲＮＡ配列は基本的に、一本鎖ＲＮＡ鎖（例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖）をＲＮＡ、特に宿主細胞のｍＲＮＡと並べることにより標的遺伝子の発現を特異的に低下またはノックアウトする。２つの核酸鎖の間の相補性の度合いは、完全な相補性（各ヌクレオチドはその相手と向かい合う）〜部分的な相補性（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）と様々であり得る。相補性の度合いは複合体の安定性を決定し、ひいては例えば遺伝子のノックアウトの成功率を決定する。このため、完全な相補性または少なくとも９５％相補性が好ましい。
【００８０】
相同組換え（ＨＲ）、ＮＨＥＪおよびＭＭＥＪの機序
導入遺伝子は組換え機構を用いて二本鎖切断部分で宿主ゲノム中に統合する。
二本鎖切断（ＤＳＢ）は生物学的に最も有害なタイプのゲノム損傷であり、細胞死または多種多様な遺伝子再構成を引き起こす可能性がある。正確な修復が、遺伝情報の維持および伝搬に成功するために不可欠である。２種類の主なＤＳＢ修復機構ＮＨＥＪおよびＨＲがある。ＭＭＥＪと呼ばれる３つ目の機構は多くの場合、これらの２つの主要なＤＳＢ修復機構が機能しないときに作用する。相同組換えは、互いに相同性を有するＤＮＡ配列の間で遺伝子を交換する過程であり、主として細胞周期のＳ／Ｇ２期に作動し、一方ＮＨＥＪは、通常は配列相同性のない２つの切断されたＤＮＡ末端を単につなぎ合わせ、細胞周期のあらゆる相で機能するが、有糸分裂細胞のＧ０〜Ｇ１期およびＳ期初期で特に重要である。脊椎動物では、ＤＳＢの性状および細胞周期の相に応じて、ＨＲ、ＮＨＥＪおよびＭＭＥＪがＤＳＢ修復に異なって寄与する。
【００８１】
ＮＨＥＪ：基本的機序
ＮＨＥＪ過程の分子機序は概念的には単純であると思われ：１）１組の酵素が切断されたＤＮＡ分子を捕捉し、２）２つのＤＮＡ末端をつなぎ合わせる分子架橋が形成され、３）切断された分子が再び連結される。このような反応を実施するために、哺乳動物細胞中のＮＨＥＪ機構は、２種類のタンパク質複合体である、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニット）と結合したヘテロ二量体Ｋｕ８０／Ｋｕ７０およびＤＮＡリガーゼＩＶとその補因子ＸＲＣＣ４（Ｘ線補完チャイニーズハムスター遺伝子４）のならびにＡｒｔｅｍｉｓおよびＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子；またはＣｅｒｎｕｎｎｏｓ）などの、多数のタンパク質因子を含む。ＮＨＥＪは、通常は配列相同性のない２つの切断されたＤＮＡを単につなぎ合わせ、わずかな挿入および／または欠失が生じることから、変異性ＤＳＢ修復であるとしばしば考えられる。ＮＨＥＪは細胞周期全体にわたってＤＳＢの修復の機構をもたらすが、有糸分裂細胞のＧ０−Ｇ１期およびＳ期初期で特に重要である。ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復は、細菌から哺乳動物に及ぶ生物体中で観察され、それが進化の過程で保存されてきたことを示唆する。
【００８２】
ＤＳＢ形成後にＮＨＥＪ修復経路で重要な段階は、切断されたＤＮＡ末端を物理的に並べることである。ＮＨＥＪは、切断されたＤＮＡ分子の両端へのＫｕ７０／８０ヘテロ二量体タンパク質複合体の結合により開始されて、両末端を捕捉し、つなぎ止め、かつ他のＮＨＥＪの重要な因子の集積のための足場を作る。ＤＮＡと結合したＫｕヘテロ二量体複合体は、ＰＩＫＫ（プロテインキナーゼのホスホイノシチド３キナーゼ様ファミリー）に属する４６０ｋＤａのタンパク質であるＤＮＡ−ＰＫｃｓをＤＳＢに動員し、そのセリン／トレオニンキナーゼ機能を活性化する。ＤＳＢをはさんで２つのＤＮＡ−ＰＫｃｓ分子が相互作用し、２つの切断されたＤＮＡ末端の間に分子架橋を形成し、それらの分解を阻害する。次いで、ＤＮＡ末端同士が直接連結されるが、ＤＳＢから生じた末端の大部分は、連結の前に適切にプロセシングされる必要がある。切断の性状に応じて、切断部位周辺にあるギャップを埋め、損傷を受けたＤＮＡまたは二次構造を除去することにより、適合するオーバーハングを生じさせるために様々な組合せのプロセシング酵素の作用が必要とされ得る。ＮＨＥＪ過程のこの段階は、ＮＨＥＪ修復と関連するヌクレオチドの時々起こる損失の原因であると考えられる。哺乳動物でのＮＨＥＪの重要な末端プロセシング酵素の１つは、酵素のメタロ−β−ラクタマーゼスーパーファミリーに属するＡｒｔｅｍｉｓであり、同酵素は、放射性感受性の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）患者の大部分での変異遺伝子として発見された。Ａｒｔｅｍｉｓは、ＤＮＡ含有ｄｓ−ｓｓ転移およびＤＮＡヘアピンに対する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性エンドヌクレアーゼ活性の両方を有する（Ｍａら，２００２）。その活性はまたＡＴＭにより制御される。したがって、Ａｒｔｅｍｉｓは複数のＤＮＡ損傷応答に関与している可能性があると思われる。しかし、Ａｒｔｅｍｉｓ欠損細胞でＤＳＢ修復の大きな欠陥は観察されなかったことから、一部のＤＮＡ損傷のみがＡｒｔｅｍｉｓによって修復されると思われる。
【００８３】
修復を可能にするためにＤＮＡギャップを埋めなければならない。ＤＳＢへのヌクレオチド付加はポリメラーゼμおよびポリメラーゼλに限られる。ＸＲＣＣ４との相互作用により、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）もＤＮＡ末端に動員されて、ＤＮＡの重合および連結の両方が起こる。最後に、ＮＨＥＪは、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＸＬＦを含む複合体により行われる段階である、ＤＮＡ末端の連結により完了する。ＮＨＥＪはＸＲＣＣ４とリガーゼＩＶの不在下でも起こり得るため、他のリガーゼがＤＮＡリガーゼＩＶに部分的に置き換わることもある。さらに、ＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶはＮＨＥＪ以外で役割をもたず、それとは対照的に、ＫＵは転写、アポトーシス、および微小環境に対する応答などの他の過程でも作用することが、研究により示された。
【００８４】
ＮＨＥＪは様々な方法で低下されまたは停止され、その多くが上に挙げたタンパク質（例えば、ヘテロ二量体Ｋｕ８０／Ｋｕ７０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、特にＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、ＡｒｔｅｍｉｓおよびＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子；またはＣｅｒｎｕｎｎｏｓ）、ＰＩＫＫ（プロテインキナーゼのホスホイノシチド３キナーゼ様ファミリー）に直接影響を及ぼす。しかし、ＮＨＥＪは多くの用途で望ましくないものであり、二本鎖切断の不正確な修復が、その二本鎖切断が起こる遺伝子の機能性を一般的に破壊するが、このことは多くの場合、本発明との関連で必要とされる全てである。このため、本発明はＮＨＥＪの増大が望ましい実施形態も含まれる。
【００８５】
ＨＲ：基本的機序
相同組換え（ＨＲ）は極めて精度の高い修復機構である。相同な染色分体が、切断された鎖の修復のための鋳型として役割を果たす。ＨＲは、細胞周期のうち姉妹染色分体が利用可能なＳ期およびＧ２期に起こる。古典的なＨＲは主に３つの段階：１）切断された末端の５’の切除、２）相同ＤＮＡ二本鎖による鎖の侵入および交換、および３）組換え中間体の解離、を特徴とする。鎖の侵入を行う能力によって、様々な経路がＤＳＢ修復を完了でき、合成依存的鎖対合（ＳＤＳＡ）経路、古典的二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）、切断により誘導される複製（ＢＩＲ）、および別法として単鎖対合（ＳＳＡ）経路がこれに含まれる。全てのＨＲ機構は相互に関連し、多くの酵素的段階を共有する。
【００８６】
全てのＨＲ反応の第一段階は、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＮ（以前はナイミーヘン染色体不安定症候群１のＮＢＳ１））およびＣｔＩＰ（ＣｔＢＰ相互作用タンパク質）を用いるヌクレアーゼによる５’末端の切断ＤＮＡ鎖の切除に対応する。その結果得られる３’一本鎖ＤＳＢの相同配列を検索できる。相同二本鎖の侵入は、ＲＡＤ５１リコンビナーゼタンパク質で覆われた３’ｓｓ−ＤＮＡからなるヌクレオフィラメントにより行われる。ＲＡＤ５１−フィラメントの組立てには、ヘテロ三量体ｓｓＤＮＡ結合タンパク質であり真核生物中のｓｓＤＮＡに関係のあるＤＮＡ代謝過程に関与する、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）が必要である。次いで、ＲＡＤ５１が、ＲＰＡ分子と置き換わりＲＡＤ５１の搭載を促進する環状構造を有するＲＡＤ５２と相互作用する。Ｒａｄ５２は酵母での組換え過程に重要である。しかし、脊椎動物では、ＲＡＤ５２ではなくＢＲＣＡ２（乳癌２型感受性タンパク質）が鎖の侵入および交換に重要な役割を果たしているように思われる。ＲＡＤ５１／ＲＡＤ５２相互作用は、ＲＡＤ５４により安定化される。ＲＡＤ５４はまた、Ｄループ形成後の組換え中間体の成熟に何らかの役割を果たしている。一方、ＢＲＣＡ１（乳癌１）は、ＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメイン１）およびＢＡＣＨ１（ＢＴＢおよびＣＮＣホモロジー１）と相互作用して、それぞれリガーゼＤＳＢ修復作業およびヘリカーゼＤＳＢ修復作業を行う。ＢＲＣＡ１はまた、ＣＤＫ依存的にＣｔＩＰと相互作用し、ＤＮＡ損傷に応答してユビキチン化を受ける。したがって、ＢＲＣＡ１、ＣｔＩＰおよびＭＲＮ複合体は、細胞周期のＳ期およびＧ２期のＨＲ媒介性ＤＮＡ修復の活性化において何らかの役割を果たしている。
【００８７】
ヌクレオフィラメントの侵入は置換ループ（Ｄループ）と呼ばれるヘテロ二本鎖の形成をもたらし、侵入鎖による二本鎖のうちの１本の鎖の置き換えおよび他方の鎖との対形成を含む。次いで、いくつかのＨＲ経路が、相同配列を鋳型に用いてＤＳＢ周辺の配列と置き換わり、修復を完了し得る。用いられる機構によって、相同鋳型と切断ＤＮＡ分子との間の相互交換（乗換え）がＨＲ修復と関係する場合もあれば、そうでない場合もある。乗換えは、ゲノム再構成またはヘテロ接合性喪失などの、重要な遺伝的影響を及ぼし得る。
【００８８】
５種類のＲａｄ５１パラログ：Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄもまた相同組換えに関与する。Ｒａｄ５１パラログは２種類の複合体を形成し：ＢＣＤＸ２と呼ばれる複合体はＲａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１ＤおよびＸｒｃｃ２を含み、もう一方はＲａｄ５１ＣおよびＸｒｃｃ３（ＣＸ３）を含む。第一の複合体はＲａｄ５１−ＤＮＡ複合体の形成および／または安定化に関与すると考えられている。２つ目の複合体の役割は、分岐点移動およびホリデイジャンクションの解離であると思われる。
【００８９】
既に報告されているように、ＮＨＥＪに比してＨＲを相対的に増大させること（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２３１４４９号を参照されたい）を用いて、導入遺伝子発現を増強および／または促進できる。
【００９０】
ＨＲを低下または停止させることの利点もまた既に記載されている（全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１１８６１９号および米国特許出願公開第２０１５０３６１４５１号）。ＨＲは様々な方法で低下または停止させることができ、その多くが上に挙げたタンパク質に直接影響を及ぼす（表Ｃも参照されたい；ただし、ＨＤＲの様々な経路の間に明確な差違がないことに留意されたい）。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡが、低下または停止を行うために一般的に用いられる。
【００９１】
マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）
他の組換え経路が機能しない場合または不活性である場合、別の、変異性の修復機構、すなわちＭＭＥＪによりＤＳＢを修復できる。この経路は、十分に特徴づけられる必要が依然としてあり、代替的末端結合（ａｌｔ−ＥＪ）と呼ばれることもあるが、これらの２つの過程が同じ機構に基づくかどうかは明らかではない。この経路をＮＨＥＪと区別する最も特徴的な特性は、切断されたＤＮＡ鎖のアライメントの際に５〜２５ｂｐのマイクロホモロジーを用いることであり、その結果、ＮＨＥＪ経路とは対照的に、標的ゲノム中のより長い一続きの核酸、例えば２０ｂｐ、４０ｂｐ、６０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐを超える核酸が欠失し、このことは本発明の多くの実施形態で有利である。
【００９２】
ＭＭＥＪは細胞周期のいずれの時点でも起こり得、ＮＨＥＪおよびＨＲの中心的因子、すなわちＫｕ７０遺伝子、リガーゼＩＶ遺伝子およびＲａｄ５２遺伝子に依存しない。代わりに、ＭＭＥＪの開始はそれ独自のタンパク質のセットに依存し、その最も重要なものは、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１（酵母ではＸｒｓ２）を含みＨＲの最初の段階にも関与するとされる（Ｍａら，２００３）、ＭＲＮ複合体（酵母ではＭＲＸ）の成分である。ＭＲＮ複合体以外にも多数の他の因子、例えば、ＣＴＢＰ相互作用タンパク質、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）、リガーゼＩＩＩ／Ｘｒｃｄ複合体、リガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼθ（ＹｕおよびＭｃＶｅｙ，２０１０）およびＥＲＣＣ１／ＸＰＦ複合体が、ＭＭＥＪおよび、関連するＤＮＡ合成依存性ＳＤ−ＭＭＥＪ機構に関与すると考えられている。しかし、さらに多くのタンパク質がこの過程に関与している可能性もある。
【００９３】
他のＤＮＡ末端結合タンパク質（ＫｕまたはＲａｄ５１など）の不在下でＤＳＢはＰＡＲＰ１により認識され、これが次いでＭＭＥＪを介してそれらの修復を開始することが示唆されている。この修復過程は、ＨＲと同様に、５’末端から３’末端への切除で始まり、それが切断部位の両側に短いホモロジー領域を露出させる。このプロセシング段階は、ＭＲＮ複合体によって行われ、ＣｔｌＰによって調節される。相補的な領域（３’ｓｓＤＮＡフラグメントに存在する）は共に対を形成し、非相補的なセグメント（フラップ）は、おそらくＥＲＣＣ１／ＸＰＦ複合体により除去される。次いで、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼθまたはδ）によりギャップ（存在する場合）が埋められ、リガーゼＩまたはリガーゼＩｌｌ／Ｘｒｃｃ１複合体により切断が結合される。
【００９４】
最も頻繁にみられることであるが、ＤＮＡ末端にマイクロホモロジー領域が存在しない場合、精度の高いＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ポリメラーゼθ）を用いて、さらに遠位の修復された分子のフラグメントが複製され得る。この複製された領域が次いでＤＮＡ末端の整列に関与し、それが生じた結合部での挿入をもたらす。このさらに複雑なマイクロホモロジー媒介修復の変形は、合成依存性ＭＭＥＪ（ＳＤ−ＭＭＥＪ）と呼ばれている。
【００９５】
ＭＭＥＪは、代替的な組換え修復経路としての役割を果たすと考えられていたが、それがＢリンパ球でのＩｇＨのクラススイッチ組換え過程で極めて効率的であることが示されており、それが単なるバックアップ機構にとどまらない可能性を示唆する。また、いくつかのＤＳＢ、例えば不整合なオーバーハングまたは平滑末端（それらはＮＨＥＪおよび／またはＨＲの標的には適さない）は、ＭＭＥＪによってより効率的に修復されるという可能性も考えられる。
【００９６】
図１２Ｂは、律速的なＨＲタンパク質および／またはＭＭＥＪタンパク質の発現増大が用量依存的に遺伝子修正を刺激することを示す。図からわかるように、空ベクターを基準レベルの１とした場合、示される律速タンパクを生じる発現ベクターの特定の量は０．０５倍超、０．１倍超、０．２倍、０．３倍、０．４倍または０．５倍、遺伝子修正を増大させる、したがってアップレギュレートする。しかし、当業者に理解されるように、例えば表Ｃに示されるいずれかのタンパク質がしたがってアップレギュレートされ得る。
【００９７】
ウイルスなどの考え得る予想外の外来性因子の検出
ＣＨＯゲノムなどの目的の細胞のゲノム中のあらゆるウイルス様要素の特徴付けは、預託されたマスター細胞株からの潜在的な新たな外来性因子の特徴付けを可能にする。この方法は、細胞株により生産される任意の生物学的治療薬の規制承認に必要とされる、産生細胞クローンの特徴付けに現在適用されている多数のアッセイの多くと置き換わり得る。この特徴付けはまた、生産ロットの分析でルーチンに用いることができる。例えば相同組換えを介する標的化遺伝子編集による効率的なＣＨＯゲノム編集を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞などのＣＨＯ細胞を含む、培養される目的の細胞のゲノム中に存在する発現したレトロウイルスエレメントを除去し、その結果ウイルスゲノム量を減少させ得る。
【００９８】
現在、相同組換え機構に依存する遺伝子編集または導入遺伝子の標的化組込みのための商業サービスがいくつかある。それらは、例えば、米国のＳＡＦＣ−ＳＡＮＧＡＭＯ、フランスのＣＥＬＬＥＣＴＩＳ、およびイギリスのＨＯＲＩＺＯＮのＺｎフィンガーヌクレアーゼ、Ｔａｌｅｎヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびアデノウイルスベクターを含む。しかし、上記のツールのうちＺｎフィンガーおよびＴａｌｅｎの２つは、編集されるゲノム配列それぞれに対して特異的なヌクレアーゼおよび／またはベクターを設計する必要があるため、未だ入手および使用が困難であり、一方で３つ目のヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ）は使用可能性が未だ極めて不明確である。さらに、相同組換えは細胞中で未だにかなり非効率的であり、多数の候補細胞株のスクリーニングを必要とする。このため、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子を欠失させるには、複数回の変異誘発ならびに細胞クローンの単離および特徴付けをしばしば必要とする。このため、これらの現在の技術は多くの場合、例えばＣＨＯゲノム中に分散した複数の発現ウイルス遺伝子残遺物を除去するのに必要な、細胞内ゲノムの系統的操作を可能にするには時間およびコストがかかり過ぎる。ＣＨＯ細胞中の代謝経路および組換え機構の操作は、組換え経路の１つによるより効率的なゲノム編集法への道を開き、ここでほとんどの場合、相同組換えが好ましい。
【００９９】
発現されるＥＲＶエレメントを同定するため、ＰＡＣＢＩＯ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）技術を用いて、約１２０倍のカバレッジでＣＨＯ細胞株（例えば、ＳＥＬＥＸＩＳ社のＣＨＯ−Ｋ１由来ＣＨＯ−Ｍ細胞）のゲノム配列を決定した。ゲノムシーケンシングは、例えばＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ（商標）ロングリードシーケンサーで実施できる。
【０１００】
ＣＨＯゲノムは６．１ＭｂのＮ５０サイズを示す約７２００のコンティグに組み立てられた。
【０１０１】
ＣＨＯゲノム中の発現ＥＲＶエレメントの同定および特徴付け
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用い、少なくとも８０％の配列保存で、ウイルスのＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶエレメントのコード配列、ならびにウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）の有無を検索して、既知のマウスレトロウイルス配列に配列類似性を示すＣＨＯゲノム配列を同定した。
【０１０２】
図１３に示されるように、３つのクラスのガンマレトロウイルスが同定され、そのいずれもが、目的の細胞にみられるＥＲＶまたはＥＲＶエレメントに寄与し得る。ここでは、発現して機能性タンパク質を産生するＥＲＶエレメントに特に注目する。ウイルスの、特に目的の細胞内のレトロウイルスの配列および／または微生物様配列のデータベースが出発点となる。目的の細胞の各ＲＮＡ配列の対応するデータベースは、どのＤＮＡエレメントが実際に発現され機能性タンパク質をコードするのかに関する情報を与える。
【０１０３】
関連するＤＮＡエレメントのデータベース構築
目的の細胞、例えば生物学的治療薬の産生に使用される細胞のゲノム中の過去のウイルスおよびレトロウイルスの組込みならびにレトロトランスポジション事象に由来する分散した反復配列、特に依然として発現されるエレメントを同定する。
【０１０４】
発現ＥＲＶエレメントを同定する第一段階として、約１２０倍のカバレッジでＣＨＯ細胞株（ＳＥＬＥＸＩＳ社のＣＨＯ−Ｋ１由来ＣＨＯ−Ｍ）のゲノム配列を決定した。これには、ＰＡＣＢＩＯ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）技術を用いた。このような広範囲にわたるシーケンシングは、例えば初代ロングリードシーケンサーのＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ（商標）で実施できる。しかし、当業者に理解されるように、他の単分子ＤＮＡシーケンシング技術および装置も同じように十分に用いることができる。得るべき関連する座位の特異的ＰＣＲ増幅および標的化ＤＮＡシーケンシング、例えばＣＨＯ−Ｍゲノム配列バージョン３．０を実施した。
【０１０５】
ＣＨＯ−Ｍゲノムを６．１ＭｂのＮ５０サイズを示す約７２００のコンティグに組み立てた。
【０１０６】
そのスクリーニングが現在ＦＤＡなどの機関により要請される外来性因子のリストに基づく、潜在的な外来性微生物汚染物質に関するＤＮＡ指標配列またはｃＤＮＡ指標配列のデータベースを構築するため、既知のマウスレトロウイルス配列に配列類似性を示すゲノム配列を同定した。
【０１０７】
ＣＨＯ−Ｍゲノムスキャフォールド内のそれらの位置をマッピングするため、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用い、少なくとも８０％の配列保存で、ウイルスのＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶのコード配列を検索して、既知のマウスレトロウイルス配列（例えば、Ｌｉｅら，２０１４のＭＬ２Ｇ配列）に配列類似性を示すＣＨＯ−Ｍゲノム配列を同定した。これらの各コード配列について別個にＢｌａｓｔアライメントを実行した。さらに、同じく閾値８０％でＢｌａｓｔにより、ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）の存在を調べた。ＭＬ２Ｇ配列とウイルスのＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶとの間の平均の配列同一性は、９２％であると決定された。ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶとマウス白血病ウイルスとの間の平均の配列同一性は６６％である。いくつかの場合には、ＥＲＶは不完全であり、特定のＥＲＶエレメントのみが認められた。
【０１０８】
同定されたＥＲＶの配列は、嚢内Ａ型粒子（ＩＡＰ）クラスＩＩレトロウイルスの１５９種類のメンバー、１４４種類のＣ型ガンマレトロウイルス（クラスＩ  ＥＲＶ）、および８種類の他のガンマレトロウイルス、特にＧＡＬＶを含んだ（これらのウイルス配列の主要なクラスおよび系統学的関係については図１３を参照されたい）。ＣＨＯ細胞中のマウスＣ型レトロウイルス配列の典型的な検索の概略を図４Ａに示す。
【０１０９】
Ｃ型ガンマレトロウイルスのＥＲＶ配列をさらに検討し、見つかったＥＲＶエレメントの数を表Ａに示す：
【表１】
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【０１１０】
アライメントにより配列を見つけた後、プライマーを設計し、これらのプライマーを用いて、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングを用いる実験的検証のために、対応する配列を探索した。隣接する配列を遺伝子、特異的組込みの印、ＤＮＡメチル化および発現などについて探索した。
【０１１１】
解析したＥＲＶ配列の７７配列のみがＥＲＶを産生するためのエレメント（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子）をすべて有した。それらをさらに解析し、その結果を図１４に示す。これらの７７種類のＥＲＶ配列を系統学的にも解析し、２つのグループ、すなわちグループ１（５２）およびグループ２（１４）のＥＲＶに分類できた。これらのグループ内では９７〜９９％の配列同一性があり、２つのグループ間では８４〜９７％の配列同一性があった。２つのグループはＬＴＲが異なっていた。ＧＡＧコード配列はよく保存されていた。
【０１１２】
配列比較は、２回のレトロウイルスの爆発的感染がチャイニーズハムスターの進化の過程で比較的最近に起こり、これらのよく保存され機能的であると考えられるＥＲＶが生じた可能性を示す（図１５）。
【０１１３】
さらに、ＧＡＧ機能に重要なＰＰＸＹ関連ＰＰＹＰモチーフをコードするＤＮＡ配列も存在することがわかった。グループ１のＥＲＶは、ゲノム中に１〜１２の差または３０ｂｐの組込みを示し、グループ２のＥＲＶは、関連する機能的ｇａｇ遺伝子と比較してｇａｇ遺伝子中に０〜６の差を示した。
【０１１４】
同定されたＤＮＡエレメントが発現する可能性の検討
どのＥＲＶエレメント（１つまたは複数）が転写され得るかを評価するため、ＰＡＣＢＩＯ配列データ（Ｓｕｚｕｋｉら，（２０１６））を用いてそれらのＣｐＧ  ＤＮＡメチル化状態を解析した。これにより、図１６に例示するように、発現を許容するクロマチン構造および転写活性のあるＬＴＲプロモーター配列について予想される通り、そのＬＴＲ配列が低メチル化されたいくつかのＥＲＶが同定された。
【０１１５】
ＲＮＡデータベースの構築
ＣＨＯ−Ｍマスター細胞などの預託細胞の複数の独立したｍＲＮＡ調製物のシーケンシングおよび解析をさらに実施して、ゲノムおよび／または指標となる外来配列データベースに位置するＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）配列のデータベースを構築し得る。生成物は、発現されるレトロウイルス／ウイルス、レトロトランスポゾンならびに細菌マーカー遺伝子およびファミリーの収集物であり、各種のエレメントの相対的発現レベルの表をもたらす。
【０１１６】
ゲノムＤＮＡにもミトコンドリアゲノムＤＮＡにも帰属できない大量のＲＮＡ配列を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより実験的に検証する。実験的に検証される配列を、トランススプライシングが起こった可能性について調べる。残りの正体不明の配列を、ウイルス配列、原核生物配列および真核真核配列の入手可能なゲノムとの相同性についてスクリーニングして、同定済みの微生物種にそれらを場合により帰属させる。関連するヒットを発現配列のデータベースに加える。
【０１１７】
同定されたＤＮＡエレメントにより発現されるＲＮＡのＲＮＡデータベースの具体的な構築の例
ここでは、特定のＥＲＶエレメントの転写を全ＣＨＯの逆転写、ここではＣＨＯ−ＭのｃＤＮＡ、細胞ＲＮＡおよびＰＣＲ増幅を用いて作成したＧＡＧのｃＤＮＡの配列との直接比較により、さらに評価した。これは、グループ１および２のＥＲＶエレメントがいずれも転写的に活性であったことを示した。ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列の比較はさらに、グループ２のＥＲＶの１つは転写されたが、停止コドンにより機能的なＧＡＧタンパク質を発現できなかったことを示した（図１７）。一方で、同定されたグループ１のＥＲＶ配列のいくつかは発現され、それらのＲＮＡ配列は未熟な停止コドンをもたず、それらはしたがって機能的ＧＡＧタンパク質の発現を媒介するようであった。近接するＰＯＬコード配列の解析は、それらも機能的であることを明らかにし、ＣＨＯ細胞からのレトロウイルス粒子の発現および放出の極めて有力な候補として複数の発現され、保存されたＥＲＶの同定に至った。これらの機能的なグループ１のＥＲＶの全コンセンサスＤＮＡ配列を配列番号１に示し、一方ここで同定されたグループ２のＥＲＶのコンセンサス配列、ＩＡＰエレメントおよびその他のガンマレトロウイルス配列を配列番号２、３および４に記載する。
【０１１８】
全ゲノム／エピソームのシーケンシングからの外来性エレメントの特徴付け：
（ｉ）全ゲノムおよびエピソームのシーケンシングからの新規な移動性遺伝子エレメント、および外来性エレメント、ならびに（ｉｉ）既知の微生物様遺伝子の発現レベルの有意な変化は、外来性因子による細胞培養物の混入の指標となり得ることから、これらを迅速に同定するバイオインフォマティクスパッケージを提供する。混入を染色体再構築から識別する必要がある。
【０１１９】
ここでは、小さいゲノム変化（転位またはウイルスゲノム組込みなど）と大きい染色体再構築（大きい染色体転座または重複事象など）または他の培養細胞による汚染とを識別するために、ゲノム比較プログラムを用いて自動化工程を考案する。
【０１２０】
ＣＨＯ−Ｍ細胞などの預託細胞およびそれに由来する細胞クローンから得たゲノム配列およびＲＮＡ配列を用い、従来の手段により外来性因子が存在しないことを既に確認されたクローンを用いて、上記の識別工程のパラメータを決定する。
【０１２１】
上記の工程を上で得られたデータベースとともに用いて、新規なＣＨＯ細胞クローンの単離中に起こる可能性のあるゲノム変化を同定する。関連するヒットをＰＣＲおよび小規模ＤＮＡシーケンシングにより実験的に検証する。
【０１２２】
同様の解析を、例えばＣＨＯ−Ｍ細胞クローンのトランスクリプトームを用いて実施する。新たなＲＮＡ配列、またはその発現レベルが有意に変化したＲＮＡ配列を、バイオインフォマティクス解析を用いて同定する。ヒットをＲＴ−ｑＰＣＲにより実験的に検証する。
【０１２３】
検出工程を、バイオインフォマティクスモデリングにより感度に関して最初に検証し、次いでＣＨＯ−Ｍの核酸調製物と既知量のレトロウイルス様配列または細菌（例えば、マイコプラズマ）配列および参照物質でスパイクイン実験を行う。これにより、所与の深度（またはゲノムカバレッジ）の「次世代シーケンシング」により明らかにできる、細胞ゲノム当量当たりのウイルスゲノム数に関して感度閾値が得られる。
【０１２４】
ＣＨＯ細胞のゲノムおよび／またはトランスクリプトームのより効率的な編集のための工程
組換え活性に関与するタンパク質のノックダウンまたは過剰発現を介するＨＲおよびＨＤＲの標的化導入遺伝子組込みおよびＣＨＯ細胞ゲノムからの除去のための、定量的アッセイを提供する。
【０１２５】
ここでは、単一ゲノムを組み込んだＧＦＰ導入遺伝子を含む複数の独立した指標ＣＨＯ細胞株を構築し（例えば、転移ベクターを介して）、導入遺伝子組込みを定量的ＰＣＲおよび組込み部位のマッピングにより検証する。指標プラスミドを、ＧＦＰコード配列の末端に対応する配列でｄｓＲｅｄ発現カセットを挟むことにより構築する。ＧＦＰ配列の自然変異およびｄｓＲｅｄ発現カセットの非標的化組込みの頻度を、蛍光定量的アッセイおよびｑＰＣＲアッセイを用いて、適切な標的化組込みに対し記録する。あるいは、１つまたは複数の欠失ＧＦＰコード配列を細胞ゲノム中に組み込み、ＨＲまたはＨＤＲが関連する機構を用いてそれらを修復して、機能的ＧＦＰコード配列および蛍光細胞を回復する。
【０１２６】
効率的なＨＲ機構を妨害し得る制限活性を同定するため、上記のアッセイをＭＭＥＪタンパク質およびＮＨＥＪタンパク質の一過的なｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンの後に用いる。同様のアッセイをＣａｓ９およびＧＦＰ標的化ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現ベクターの存在下で実施してＨＤＲを評価する。同時に、ＣＨＯのＨＲタンパク質およびＨＤＲタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローン化し、発現ベクター中に組み込む。これらのｃＤＮＡをｄｓＲｅｄ指標プラスミドと同時形質移入して、ＣＨＯ−Ｍ細胞中でＨＲまたはＨＤＲの効率を制限する活性を同定する。
【０１２７】
上記のノックダウンまたは過剰発現の組み合わせを実施して、ＨＲ様事象の頻度を改善する（図９〜１２を参照されたい）。最も効率的な組合せを、ｉ）上記の単一活性のアッセイの結果、ｉｉ）ＣＨＯ−Ｍ細胞中の特定の組換え遺伝子のｍＲＮＡレベル、ならびにｉｉｉ）組換え経路およびタンパク質が形成する多量体構造での相対的位置、に基づき評価し選択する。ＣＨＯゲノムから発現配列を効率的に削除する過程を同定するため、これらの組合せをアッセイしてＧＦＰ内に組み込まれたｄｓＲｅｄ配列を除去し、機能的ＧＦＰを回復する。
【０１２８】
感染性因子であるＤＮＡ残遺物またはＲＮＡ残遺物を除去するＣＨＯ−Ｍの遺伝子編集またはエピジェネティック編集
ここでは、ＣＨＯ細胞株から発現するウイルスゲノム残遺物を除去または発現抑制する。機能的ウイルス配列、好ましくはウイルス粒子放出を媒介するｇａｇ配列を破壊するよう最適化した上記の方法を用いて、上で決定されたＣＨＯ−Ｍにより発現されるウイルス様エレメントおよびレトロウイルス様エレメントをＨＲまたはＨＤＲにより標的化する。代わりに、または同時に、ＨＲまたはＨＤＲを媒介する機構を阻害して、ＤＮＡ切断部位での欠失を促進する修復機構、例えばＮＨＥＪおよびＭＭＥＪが関連する機構によるウイルス配列中のＤＳＢの修復を促進し、ウイルス粒子放出に必要なｇａｇ配列を削除する。
【０１２９】
ゲノム編集を複数ラウンド実施し、定量的ＰＣＲによりゲノムウイルス配列およびＲＮＡ配列の減少を追跡する。各ラウンド後に細胞分裂のタイミングを特徴づけて、追加的なゲノム変化が細胞の代謝特性を損なわないことを確認する。
【０１３０】
ＣＨＯ−Ｍ細胞集団などの適切に操作された細胞を、それらの安定性およびマーカータンパク質（例えば、ＧＦＰ）または治療用タンパク質（例えば、免疫グロブリン）を発現する能力について試験する。サブクローンを作製し、同じようにアッセイする。本明細書に記載される検出方法を用いて、適切なサブクローンに追加的な外来性因子が存在する可能性がないことを裏付ける。
【０１３１】
ＣＨＯ−Ｍサブクローンなどの最も効率的な細胞のゲノム配列を決定し組み立てて、ゲノム変化および外来性ウイルス様配列の減少を裏付ける。
【０１３２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集法を用いてグループ１の発現ＥＲＶを特異的に切断し変異させるため、ＧＡＧ配列のＰＰＹＰモチーフまたはミリストイル化配列（図１８および配列番号５〜１２）付近の配列を優先的に認識するガイドＲＮＡを設計した。ノックアウト法にはＰＰＹＰモチーフを選択し、それにより、非ＨＲ  ＤＮＡ修復機構がＧＡＧコード配列での欠失を引き起こし、それはウイルス粒子出芽を媒介する機能型のこのタンパク質の発現を阻害し得る。ミリストイル化モチーフは、ＨＩＶ出芽にＨＩＶ１  ＧＡＧタンパク質のミリストイル化が必要であることがわかっている（Ａｂｄｕｓｅｔｉｒ  Ｃｅｒｆｏｇｌｉｏら（２０１４））ことを踏まえ、ホモロジー指向型ＨＲ  ＤＮＡ修復によってミリストイル化アミノ酸が修飾不可能な対応物に置換されるよう標的化し、非機能性でありかつおそらく残存している未変異ＧＡＧタンパク質の機能を阻害し得るドミナントネガティブ型のＧＡＧを生じさせた。図６に示されるように、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、単量体型のＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９に適合するよう設計した（Ｃａｒｒｏｌ  ２０１３）。
【０１３３】
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターをｄｓＲｅｄ発現ベクターと共にＣＨＯ細胞中に同時形質移入し、効率的に形質移入され導入遺伝子を発現する細胞を濃縮するためにｄｓＲｅｄ発現細胞を選別した（図１９）。あるいは、Ｒａｄ５１発現を減少させ相同組換え機構によるＤＮＡ修復を抑えるために、Ｒａｄ５１を標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物で細胞を形質移入した。Ｒａｄ５１ノックダウンの効率を、Ｒａｄ５１のｍＲＮＡレベルおよび相同組換え修復による変異ＧＦＰ導入遺伝子の機能回復の阻害の両方から評価し、設計したｓｉＲＮＡはいずれもＲａｄ５１発現およびＨＲを特異的に阻害したことが示された（図２０）。
【０１３４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９処理が発現ＥＲＶを適切に標的としたかどうかを直接評価するため、ＧＡＧ  ＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲで増幅した。独立した形質移入実験（図２１の第一および第二のＣＲＩＳＰＲ実験）において、予想通り、ＧＡＧ  ＲＮＡは対照細胞から容易に検出されたが、ＰＰＹＰ５  ｓｇＲＮＡ  Ｃａｓ９で処理した細胞は一貫して低レベルまたは検出不可能なレベルを生じた。ＰＰＹＰ６をプログラムしたＣａｓ９およびＰＰＹＰ１３をプログラムしたＣａｓ９での処理は、単独で用いた場合ＧＡＧのＲＮＡレベルを有意に変えなかったため、Ｒａｄ５１活性のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンがＨＲ機構による切断ｇａｇ遺伝子の効率的な修復を阻害し、それにより欠失を起こしやすい代替的ＤＮＡ修復経路を導く場合に予想されるように、そのようなノックダウンがこれらのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９処理の効果を増大させ得るかどうかを評価した。Ｒａｄ５１を事前にノックダウンすることにより、ＰＰＹＰ６またはＰＰＹＰ１３とＣａｓ９による処理でＧＡＧのｍＲＮＡシグナルが消失したことから、このことが当てはまるのがわかった（図２１の第三のＣＲＩＳＰＲ実験）。
【０１３５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓまたはその他のヌクレアーゼベースの変異誘発系を用いて遺伝子を変異させるこれまでの試みは、低コピーの遺伝子に対してでさえコードされるｍＲＮＡの消失をもたらさなかった。哺乳動物ゲノムにみられるように、細胞中に３０超、４０超、またはさらに５０超のコピー数で存在するＥＲＶを含む、高コピー数のＥＲＶの場合はさらに困難であることが予想された。このため、ＰＰＹＰ５  ｓｇＲＮＡ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼで処理した細胞中でレトロウイルスＲＮＡが検出されないことが観察されたのは非常に驚くべきことであった（図２１の第一のＣＲＩＳＰＲ実験）。６２の関連する内在性レトロウイルスエレメントのＰＯＬ遺伝子を欠失または変異させるこれまでの試みは、一過的形質移入を用いてブタ細胞からされらの遺伝子を除去できず、転移ベクターまたはウイルスベクターを用いるＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９エレメントの安定な発現に至った（Ｙａｎｇら，２０１５）。とはいえ、１７日間の継続的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの活性は細胞の３７％の最大標的化頻度をもたらしたのみであり、おそらくこれは、長期間にわたるＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳの活性が有害なオフターゲット切断効果を引き起こしたためである。
【０１３６】
実施した実験は、Ｒａｄ５１などのＨＲタンパク質のノックダウンを用いて、ｓｉＲＮＡの形質移入なしではみられない頻度での有害な欠失によりＧＡＧ遺伝子不活性化の頻度を増大できることを示す。
【０１３７】
１つの例としてＲａｄ５１のノックダウンを提供するが、当業者は、他のＨＲタンパク質のノックダウンが同等の結果を与えることを理解するであろう。したがって、他のＨＲタンパク質をノックダウンしたＣＨＯ細胞も本発明の範囲内である。また、５３ＢＰ１、ＣｔＩＰ、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、リガーゼＩＩＩ、Ｐｏｌｄ３（ＤＮＡポリメラーゼデルタサブユニット３）、ＸｐｆおよびＢｌｍ（ブルーム症候群ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ）をノックダウンした細胞（図９を参照されたい）が本発明に具体的に含まれる。表Ｃは、ノックダウンされ得るＨＲタンパク質およびノックダウンまたは過剰発現され得る他の組換え経路のタンパク質の例を提供する。ただし、当業者に理解されるように、表Ｃは単純化したものであり、表Ｃに挙げたタンパク質のいくつかは二重の機能を有し（例えば、リガーゼＩＩＩ）、異なるカテゴリーに記載され得ることもある。
【０１３８】
いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、Ｃａｓ９により切断されるＥＲＶは、多数の他のＥＲＶの１つを相同鋳型とする相同組換えによって修復され得、この修復はＲａｄ５１などの、ホモロジーに基づく経路のタンパク質の不活性化により抑制され得る。これに対し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の発現の前にＲａｄ５１発現をノックダウンするいくつかのこれまでの試みは、ホモロジー指向型ＤＮＡ修復経路の増大をもたらし、これは、遺伝子不活性化を引き起こす欠失が好ましい場合にはむしろ回避されなければならない（Ｄａｖｉｓ，ＬおよびＭａｉｚｅｌｓ，Ｎ．２０１４および２０１６）。他の研究は、Ｒａｄ５１の過剰発現が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性またはＴＡＬＥＮ媒介性のＤＮＡ切断に続く標的化遺伝子組込み（すなわち、ノックイン）実験でホモロジー指向型ＤＮＡ修復を増大し得ることを見出した（Ｓｏｎｇら（２０１６））。ここでは、様々な種類のＣＨＯ細胞でＲＡＤ５１がＨＤＲ遺伝子修正に有利に働くこと（図９および１２）、および相同組換え活性の阻害をＥＲＶ特異的ＤＮＡヌクレアーゼとともに用いると、ＥＲＶの変異が大幅に増大し得ることが示された。このため、複数の対立遺伝子を不活性化する場合、したがって高コピー数ＥＲＶの場合、特にＨＲ経路のｓｉＲＮＡノックダウンを、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法と組み合わせる実施形態が、本発明のまた別の実施形態であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９単独の使用よりも好ましいことが多い。
【０１３９】
全体をまとめると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の非常に高い変異誘発活性は、最新技術と比較して驚くべき高い。いかなる特定の理論にも限定されるわけではないが、その理由として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが不活性なＥＲＶではなく発現されるＥＲＶを特異的に標的とすることが考えられる。しかし、これは最も効率的な状況でウイルスＲＮＡが検出不可能なレベルに減少したことを説明できない。したがって、特異的ＤＮＡ切断事象が発現ＥＲＶの転写サイレンシングを引き起こすという可能性も考えられる。
【０１４０】
最後に、未熟停止コドンを有する非コード変異ＲＮＡは多くの場合、ナンセンス介在ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）機構により細胞内で分解される（ＢａｋｅｒおよびＰａｒｋｅｒ（２００４））。このため、次に、ＰＰＹＰ  ｓｇＲＮＡが、ＮＭＤ媒介性のＧＡＧ  ＲＮＡ分解を引き起こすと考えられるアウトオブフレーム変異を媒介するかどうかを評価した。１つの例として、グループ１のＥＲＶのＰＰＹＰモチーフから１１個のヌクレオチドを欠失させることによって生じる、そのようなフレームシフトを図２１に示す。
【０１４１】
図２２は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓで処理したＣＨＯ細胞のポリクローナル集団に含まれるＧＡＧ遺伝子のＰＣＲ増幅およびシーケンシングの結果を示す。結果は、中程度に活性なＰＰＹＰ６  ｓｇＲＮＡを使用しｓｉＲＡＤ５１処理を実施しない場合でも、ＧＡＧコード配列の大部分がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ成分の発現ベクターの一過的形質移入後に変異したことを明確に示している。
【０１４２】
全体をまとめると、ＣＨＯ細胞内在性ＥＲＶを標的とする提案されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いて、ウイルス粒子放出を媒介するＧＡＧタンパク質の発現を完全になくす、または減少させることが可能であり、これには、長期間にわたるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの発現または、それらの発現ベクターの細胞ゲノム中への安定な組込みは必要なく、かつ細胞培養に対するそれらの潜在的な悪影響はない、という結論が導かれた。したがって、この方法を用いて、そのようなレトロウイルスタンパク質を発現できない、より安全なＣＨＯ細胞株を作製できる。
【０１４３】
材料および方法
細胞株
編集された細胞株はＳＵＲＥ  ＣＨＯ−Ｍ細胞株（商標）（ＳＥＬＥＸＩＳ社、スイス）（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１２９，０６２号および同第８，２５２，９１７号ならびに米国特許出願公開第２０１１００６１１１７号、同第２０１２０２３１４４９号および同第２０１３０１４３２６４号を参照されたい）であった。
【０１４４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系
ゲノム編集用に、本発明者らは、哺乳動物コドン最適化した化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いた。一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を、既に記載されている（Ｆｕら，２０１３）通りに哺乳動物ｇＲＮＡ発現ベクターＭＬＭ３６３６中にクローン化した。高いノックアウト効率を得るため、１標的部位当たり複数個のｓｇＲＮＡ標的部位を検討した（ＰＰＹＰ：ｎ＝５；Ｍｙｒ：ｎ＝３）。ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ  Ｒパッケージ（Ｚｈｕら，２０１４）を用いて、本発明者らの自社ＣＨＯ−Ｍゲノムを参照配列として、最小のオフターゲット部位を有するＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡを同定した。ｓｇＲＮＡ配列を、標的部位付近、より厳密にはＭｙｒモチーフおよびＰＰＹＰモチーフにハイブリダイズするよう設計して、これらの座位にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による変異誘発が起こる可能性を最大限に高めた。ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ  Ｒパッケージ（Ｚｈｕら，２０１４）を用いて、５’２０ｎｔ  ＮＧＧ  ３’配列構造を含み、かつ変異誘発部位から最大２５ｂｐ離れた位置でＤＳＢを媒介する、可能性のあるｓｇＲＮＡ配列を得た。可能性のある全ｓｇＲＮＡ配列で、ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ（Ｚｈｕら，２０１４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｃａｎ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ（ＳＳＣ；ダナ・ファーバー研究所のｃｒｉｓｐｒのウェブサイト）およびｓｇＲＮＡスコア１．０（ダナ・ファーバー研究所のｃｒｉｓｐｒのウェブサイト）を含む様々なスコアリングツールを用いて、ｓｇＲＮＡの効率を予測した。さらに、ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ  Ｒパッケージ（Ｚｈｕら，２０１４）を用いて、本発明者らの自社ＣＨＯ−Ｍゲノムを参照ゲノムとして用い最小のターゲット部位を有するＥＲＶ特異的ｓｇＲＮＡを同定した。１標的部位当たり複数個のｓｇＲＮＡ配列を最終的に選択し検討して（Ｍｙｒ：ｎ＝３，ＰＰＹＰ：ｎ＝５）、変異能が最も大きいｓｇＲＮＡを同定した。Ｃａｓ９（番号４３８６１）およびｇＲＮＡ発現プラスミド（番号４３８６０）はＡＤＤＧＥＮＥ社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から入手可能である。
【０１４５】
【表２】
2018537986.tif 000004
【０１４６】
ＲＮＡ干渉
Ｒａｄ５１  ＣＨＯ相同に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をＭＩＣＲＯＳＹＮＴＨ社（バルガッハ、スイス）により設計および合成した。３種類の特異的Ｒａｄ５１  ｓｉＲＮＡの混合物を用いてＲａｄ５１のｍＲＮＡレベルを抑制してオフターゲット効果を最小限に抑えた。ＢＬＡＳＴ解析は他の標的に対する相同性を除外した。対照として３種類の非標的化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｅｇ）の混合物を用いた。
【０１４７】
ＣＨＯ−Ｍゲノムの改変
Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を製造業者のプロトコール通りに用いてＣＨＯ−Ｍ細胞に形質移入を実施した。簡潔に述べれば、４０００００個の細胞を１００ｎＭのｓｉＲＮＡ混合物で形質移入し、４８時間後に、７０００００個の細胞を、ｄｓＲｅｄをコードするプラスミドを形質移入対照に用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系で再び形質移入した。形質移入細胞を濃縮するために、フローサイトメトリーを用いて形質移入から４８〜７２時間後に、約１０００００個のｄｓＲｅｄ陽性細胞を多クローン的に選別した。
【０１４８】
当業者に理解されるように、上の記載は限定的ではなく、本発明の特定の実施形態の例を提供する。当業者は、上記の指示に従い、本明細書に具体的に記載されていない多種多様な代替物を考案することが可能である。
【０１４９】
表Ｃは、３種類の経路それぞれにおけるいくつかの重要な遺伝子を列挙する（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２３１４４９号も参照されたい）。同表には、ＭＤＣ１およびＭＨＳ２などのＤＮＡ修復タンパク質も含まれる。ＭＤＣ１は、ＤＮＡ損傷に応答してＳ期中期およびＧ２／Ｍ期の細胞周期チェックポイントを活性化するのに必要とされる。一方、ＭＤＣ１は、クロマチン中にＲａｄ５１を保持することによりＲａｄ５１媒介性相同組換えにおいても機能する（配列については、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１１８６１９号、米国特許出願公開第２０１５０３６１４５１号を参照されたい）。
【０１５０】
【表３】
2018537986.tif 000005
【０１５１】
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【図１】
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【図２Ａ】
2018537986.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2018537986.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図５】
2018537986.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2018537986.tif 000019
【図１２Ａ】
2018537986.tif 000020
【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2018537986.tif 000029
【図２１】
2018537986.tif 000030
【図２２】
2018537986.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月3日(2018.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018537986000001.app
【国際調査報告】
2018537986.tif 000032
2018537986.tif 000033
2018537986.tif 000034