(57)【要約】  ミトコンドリアDNA内に標的変化(例えば、欠失)を作製するための材料および方法が記載されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアDNAを細胞内で改変するための方法であって、該ミトコンドリアDNA内の選択配列に標的化した組換えDNAエンドヌクレアーゼを該細胞に導入することを含む、該方法。
【請求項２】
前記組換えDNAエンドヌクレアーゼが、突然変異がない対応DNAエンドヌクレアーゼと比較して、減弱したエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えDNAエンドヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えDNAエンドヌクレアーゼが、以下(a)〜(c)、すなわち
(a)ミトコンドリア標的化配列を含む第1部分、
(b)前記DNAエンドヌクレアーゼを前記ミトコンドリアDNA内の前記選択配列に標的化するアミノ酸配列を含む第2部分、および
(c)前記選択配列の位置またはその付近で前記ミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含む第3部分
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記第1部分が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2からのミトコンドリア標的化配列を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記第2部分が、組み合わせた形で、前記選択ミトコンドリアDNA配列に標的化される、反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列および転写活性化因子様エフェクター(TALE)骨格を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼドメインが、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分から得たものである、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
前記改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が真核生物内に存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入が、前記DNAエンドヌクレアーゼ、または前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を、前記真核生物に注入することを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がin vitroで存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入が、前記のDNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に形質転換することを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞に、前記ミトコンドリアDNA内の第2選択配列に標的化した第2組換えDNAエンドヌクレアーゼを導入することをさらに含み、ここで第1 DNAエンドヌクレアーゼおよび該第2 DNAエンドヌクレアーゼは前記ミトコンドリアDNA内の異なる配列に標的化されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
組換えポリペプチドであって、以下(a)〜(c)、すなわち
(a)ミトコンドリア標的化配列を含む第1部分、
(b)該ポリペプチドを選択ミトコンドリアDNA配列に標的化するアミノ酸配列を含む第2部分、および
(c)該選択配列の位置またはその付近でミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含む第3部分
を含む、上記組換えポリペプチド。
【請求項１６】
前記第1部分が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2から得たミトコンドリア標的化配列を含む、請求項15に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第2部分が、組み合わせた形で、前記選択ミトコンドリア配列に標的化される、反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列およびTALE骨格を含む、請求項15に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ヌクレアーゼドメインが、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分から得たものである、請求項15に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記の改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記の改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項15に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２２】
請求項21に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項22に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２４】
ミトコンドリアDNAを細胞内で改変するための方法であって、以下(a)および(b)、すなわち
(a)該ミトコンドリアDNA内の第1選択配列に標的化した第1組換えDNAエンドヌクレアーゼ、および
(b)該ミトコンドリアDNA内の第2選択配列に標的化した第2組換えDNAエンドヌクレアーゼ、ただし、該第2組換えDNAエンドヌクレアーゼは、突然変異がない対応DNAエンドヌクレアーゼと比較して、減弱したエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を含むものとする、
を前記細胞に導入することを含む、上記方法。
【請求項２５】
前記第2組換えDNAエンドヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼが各々、以下(a)〜(c)、すなわち
(a)ミトコンドリア標的化配列を含む第1部分、
(b)前記ミトコンドリアDNA内の前記の第1および第2選択配列にそれぞれ前記DNAエンドヌクレアーゼを標的化するアミノ酸配列を含む第2部分、ならびに
(c)前記選択配列の位置またはその付近で前記ミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含む第3部分
を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第1部分が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2から得たミトコンドリア標的化配列を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第2部分が、組み合わせた形で、前記の第1および第2選択ミトコンドリアDNA配列にそれぞれ標的化される、反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列およびTALE骨格を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼドメインが、FokIエンドヌクレアーゼ、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分から得たものである、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
前記第2 DNAエンドヌクレアーゼの前記第2部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記第2 DNAエンドヌクレアーゼの前記第2部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が真核生物内に存在する、請求項24に記載の方法。
【請求項３３】
前記導入が、前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼ、または前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を、前記真核生物に注入することを含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がin vitroで存在する、請求項24に記載の方法。
【請求項３５】
前記導入が、前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を前記細胞に形質転換することを含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞に、前記ミトコンドリアDNA内の第3選択配列に標的化した第3組換えDNAエンドヌクレアーゼを導入することをさらに含み、ここで前記第1 DNAエンドヌクレアーゼ、前記第2 DNAエンドヌクレアーゼ、および該第3 DNAエンドヌクレアーゼは前記ミトコンドリアDNA内の異なる配列に標的化されており、かつここで該第3組換えDNAエンドヌクレアーゼは、突然変異がない対応DNAエンドヌクレアーゼと比較して、減弱したエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３７】
前記第3組換えDNAエンドヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼが各々、以下(a)〜(c)、すなわち
(a)ミトコンドリア標的化配列を含む第1部分、
(b)前記ミトコンドリアDNA内の前記の第1および第2選択配列にそれぞれ前記DNAエンドヌクレアーゼを標的化するアミノ酸配列を含む第2部分、ならびに
(c)前記選択配列の位置またはその付近で前記ミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含む第3部分
を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第1部分が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2から得たミトコンドリア標的化配列を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第2部分が、組み合わせた形で、前記の第1および第2選択ミトコンドリアDNA配列にそれぞれ標的化される、反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列、およびTALE骨格を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼドメインが、FokIエンドヌクレアーゼ、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分から得たものである、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
前記第3 DNAエンドヌクレアーゼの前記第2部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記第3 DNAエンドヌクレアーゼの前記第2部分が、非改変FokIエンドヌクレアーゼの450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む改変FokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が真核生物内に存在する、請求項36に記載の方法。
【請求項４５】
前記導入が、前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼ、または前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を、前記真核生物に注入することを含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がin vitroで存在する、請求項36に記載の方法。
【請求項４７】
前記導入が、前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を前記細胞に形質転換することを含む、請求項46に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第62/288,614号(2016年1月29日出願)、および米国仮出願第62/195,875号(2015年7月23日出願)に基づく優先権の利益を主張するものであり、これらの文献はいずれも参照によりその全内容が本明細書中に組み込まれるものとする。
【０００２】
合衆国政府の助成による研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所から交付された助成金番号GM063904による政府の支援を受けて成されたものである。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本文書は、ミトコンドリアDNA内に標的変化を作製するための材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ミトコンドリアは真核細胞の必須成分であり、またそれらの機能の欠損は多様な疾患と関連している。ミトコンドリアDNA(mtDNA)の変化がどのように真核系に影響を及ぼすかをよりよく理解することは、少なくとも一部にはmtDNAゲノムを操作するための選択肢が限られているため、困難であった。
【発明の概要】
【０００５】
本文書は、少なくとも部分的には、DNAの切断を引き起こす配列特異的DNAエンドヌクレアーゼ(例えば、減弱化転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)を利用すればmtDNAゲノム内に標的欠失を作製できるという知見に基づいている。プログラム可能なDNA結合ドメインに融合した場合、これらの配列特異的DNAエンドヌクレアーゼを任意のDNA配列に標的化することができる。本明細書中に記載した通り、この部位特異的な系をミトコンドリアDNAに標的化することで、約5 kbの標的欠失がin vitroでヒト細胞培養物において首尾よく作製され、また約5および6 kbの標的欠失がin vivoでDania rerio(ゼブラフィッシュ)において作製された。DNA配列解析により、該欠失は前記の標的化したエンドヌクレアーゼに特異的であり、かつin vitro系とin vivo系の両方で安定であることが明らかとなった。このことは、ミトコンドリアに特異的なDNA編集の最初の実証である。
【０００６】
第1の態様では、本文書は、ミトコンドリアDNAを細胞内で改変(修飾)するための方法であって、該ミトコンドリアDNA内の選択配列に標的化した組換えDNAエンドヌクレアーゼを細胞に導入することを含む該方法を特徴とする。前記組換えDNAエンドヌクレアーゼは、突然変異がない対応DNAエンドヌクレアーゼと比較して、減弱したエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を有しうる。前記組換えDNAエンドヌクレアーゼはニッカーゼ活性を有しうる。前記DNAエンドヌクレアーゼは、(a)ミトコンドリア標的化配列を含有する第1部分、(b)前記DNAエンドヌクレアーゼを前記ミトコンドリアDNA内の前記選択配列に標的化するアミノ酸配列を含有する第2部分、および(c)前記選択配列の位置またはその付近で前記ミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含有する第3部分、を含みうる。前記第1部分は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2ミトコンドリア標的化配列を含みうる。前記第2部分は、組み合わせた形で、前記選択ミトコンドリアDNA配列に標的化される、転写活性化因子様エフェクター(TALE)骨格、および反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列を含みうる。前記ヌクレアーゼドメインは、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分(例えば、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位もしくは450位に相当する（対応する）アミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を有するFokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分)から得たものでありうる。前記細胞は真核生物内に存在しうるものであり、また前記導入は、前記DNAエンドヌクレアーゼ、または前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を、前記真核生物に注入することを含みうる。前記細胞はin vitroで存在しうるものであり、また前記導入は、前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に形質転換することを含みうる。前記方法は、前記細胞に、前記ミトコンドリアDNA内の第2選択配列に標的化した第2組換えDNAエンドヌクレアーゼを導入することをさらに含みうるものであり、ここで第1 DNAエンドヌクレアーゼおよび該第2 DNAエンドヌクレアーゼは前記ミトコンドリアDNA内の異なる配列に標的化されている。
【０００７】
別の態様では、本文書は、組換えポリペプチドであって、(a)ミトコンドリア標的化配列を含有する第1部分、(b)該ポリペプチドを選択ミトコンドリアDNA配列に標的化するアミノ酸配列を含有する第2部分、および(c)該選択配列の位置またはその付近でミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含有する第3部分、を含む該組換えポリペプチドを特徴とする。前記第1部分は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2ミトコンドリア標的化配列を含有しうる。前記第2部分は、組み合わせた形で、前記選択ミトコンドリアDNA配列に標的化される、TALE骨格、および反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列を含有しうる。前記ヌクレアーゼドメインは、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分(例えば、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位もしくは450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を有するFokIエンドヌクレアーゼまたはその一部分)から得たものでありうる。
【０００８】
本文書はまた、本明細書中に記載したキメラDNAエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに該核酸を含有するベクター、ならびに該ベクターを含有する宿主細胞を特徴とする。
【０００９】
さらに別の態様では、本文書は、ミトコンドリアDNAを細胞内で改変するための方法を特徴とし、ここで該方法は、(a)該ミトコンドリアDNA内の第1選択配列に標的化した第1組換えDNAエンドヌクレアーゼ、および(b)該ミトコンドリアDNA内の第2選択配列に標的化した第2組換えDNAエンドヌクレアーゼ、を該細胞に導入することを含み、ここで該第2組換えDNAエンドヌクレアーゼは、突然変異がない対応DNAエンドヌクレアーゼと比較して、減弱したエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を含む。前記第2組換えDNAエンドヌクレアーゼはニッカーゼ活性を有しうる。前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼは各々、(a)ミトコンドリア標的化配列を含有する第1部分、(b)前記ミトコンドリアDNA内の前記の第1および第2選択配列にそれぞれ前記DNAエンドヌクレアーゼを標的化するアミノ酸配列を含有する第2部分、ならびに(c)前記選択配列の位置またはその付近で前記ミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含有する第3部分、を含みうる。前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第1部分は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2からのミトコンドリア標的化配列を含有しうる。前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第2部分は、組み合わせた形で、前記の第1および第2選択ミトコンドリアDNA配列にそれぞれ標的化される、TALE骨格、および反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列を含有しうる。前記ヌクレアーゼドメインは、FokIエンドヌクレアーゼ、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分から得たものでありうる。前記第2 DNAエンドヌクレアーゼの前記第2部分は、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を有する改変FokIエンドヌクレアーゼもしくはその部分、または非改変FokIエンドヌクレアーゼの450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む改変FokIエンドヌクレアーゼもしくはその部分を含有しうる。前記細胞は真核生物内に存在しうる。前記導入は、前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼ、または前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を、前記真核生物に注入することを含みうる。前記細胞はin vitroで存在しうる。前記導入は、前記の第1および第2 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を前記細胞に形質転換することを含みうる。
【００１０】
幾つかの実施形態では、前記方法は、前記ミトコンドリアDNA内の第3選択配列に標的化した第3組換えDNAエンドヌクレアーゼを前記細胞に導入することをさらに含みうるものであり、ここで前記第1 DNAエンドヌクレアーゼ、前記第2 DNAエンドヌクレアーゼ、および該第3 DNAエンドヌクレアーゼは前記ミトコンドリアDNA内の異なる配列に標的化されており、かつここで該第3組換えDNAエンドヌクレアーゼは、突然変異がない対応DNAエンドヌクレアーゼと比較して、減弱したエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を含有する。前記第3組換えDNAエンドヌクレアーゼはニッカーゼ活性を有しうる。前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼは各々、(a)ミトコンドリア標的化配列を含有する第1部分、(b)前記ミトコンドリアDNA内の前記の第1、第2、および第3選択配列にそれぞれ前記DNAエンドヌクレアーゼを標的化するアミノ酸配列を含有する第2部分、ならびに(c)前記選択配列の位置またはその付近で前記ミトコンドリアDNAを切断するヌクレアーゼドメインを含有する第3部分、を含みうる。前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第1部分は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2からのミトコンドリア標的化配列を含有しうる。前記の各DNAエンドヌクレアーゼの第2部分は、組み合わせた形で、前記の第1、第2、および第3選択ミトコンドリアDNA配列にそれぞれ標的化される、TALE骨格、および反復可変二ヌクレオチドを含む複数の縦列反復配列を含有しうる。前記ヌクレアーゼドメインは、FokIエンドヌクレアーゼ、改変FokIエンドヌクレアーゼ、またはその一部分から得たものでありうる。前記第3 DNAエンドヌクレアーゼの前記第2部分は、非改変FokIエンドヌクレアーゼの483位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を有する改変FokIエンドヌクレアーゼもしくはその部分、または非改変FokIエンドヌクレアーゼの450位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン酸からアラニンへの置換を有する改変FokIエンドヌクレアーゼもしくはその部分を含有しうる。前記細胞は真核生物内に存在しうる。前記導入は、前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼ、または前記の第1、第2、および第3 DNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を、前記真核生物に注入することを含みうる。前記細胞はin vitroで存在しうる。前記導入は、前記の第1、第2、および第3のエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上の核酸を、前記細胞に形質転換することを含みうる。
【００１１】
他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の熟練者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載したものと類似または等価の方法および材料は本発明を実施するために使用しうるが、適切な方法および材料は後述されている。本明細書中に記載した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全内容が組み込まれるものとする。矛盾がある場合には、定義も含め、本明細書を優先するものとする。加えて、前記の材料、方法および実施例は単なる例示であって限定するものではない。
【００１２】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細を添付図面および後述の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、かかる説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、ヘテロ二量体a-mitoTALEヌクレアーゼタンパク質の構造(上部)ならびに配列(下部；配列番号1および2)を示す図である。該タンパク質は、ゼブラフィッシュidh2ミトコンドリア標的化配列(構造中の斜線四角、配列中のボールド体のテキスト)、反復可変2残基(RVD)(構造およびテキスト中の黒い四角)を含有する配列が挿入されているGoldyTALE骨格(点描四角、配列中のイタリック体)、ならびにFokI/aFokI二量体配列(構造中の灰色の四角、配列中の下線付きテキスト)を含む。該FokI配列の483位にある丸で囲んだアスパラギン酸は、このタンパク質のaFokI部分中のAspからAlaへの突然変異の位置を示している。AspからAlaへの突然変異を有する配列は配列番号97に記載されている。
【図２−１】図2A〜2Cは、a-mitoTALEヌクレアーゼを使用すればゼブラフィッシュにおいてmtDNA欠失が作製されうることを示す図である。図2Aはゼブラフィッシュのミトコンドリアゲノムの図であり、PCRプライマー部位の場所とa-mitoTALEヌクレアーゼにより作製された欠失の場所が示されている。図2Bは、nd5およびcoIIに標的化したa-mitoTALEヌクレアーゼを注入したゼブラフィッシュ由来(右レーン)、または非注入ゼブラフィッシュ由来(中央レーン)のPCR産物を含有するアガロースゲルの写真である。前記a-mitoTALEヌクレアーゼの注入は、前記mtDNAに欠失をもたらした。
【図２−２】図2Cは、同一ペアのa-mitoTALEヌクレアーゼにより作製された5つの異なる欠失を含有するゼブラフィッシュmtDNAの配列を示す図であり、この図から該mtDNAゲノム内の該欠失の開始および終了位置が確認される。前記a-mitoTALEヌクレアーゼの標的部位を枠で囲む。Danio mtDNAゲノム配列、配列番号3および8；欠失1、配列番号4および9；欠失2、配列番号5および10；欠失3、配列番号3および11；欠失4、配列番号6および12；欠失5、配列番号7および12。
【図３−１】図3A〜3Cは、a-mitoTALEヌクレアーゼを使用すれば培養ヒト細胞においてmtDNA欠失を作製しうることを示す図である。図3Aはヒトのミトコンドリアゲノムの図であり、PCRプライマー部位の場所とa-mitoTALEヌクレアーゼを介した欠失の場所が示されている。図3Bは、ND5およびA8に標的化したa-mitoTALEヌクレアーゼを注入した細胞由来(右レーン)、または非注入細胞由来(中央レーン)のPCR産物を含有するアガロースゲルの写真である。前記a-mitoTALEヌクレアーゼの注入は、前記mtDNAに欠失をもたらした。
【図３−２】図3Cは、同一ペアのa-mitoTALEヌクレアーゼにより作製された5つの異なる欠失を含有するmtDNAの配列を示す図であり、この図から該mtDNAゲノム内の該欠失の開始および終了位置が確認される。前記a-mitoTALEヌクレアーゼの標的部位を枠で囲む。ヒトmtDNAゲノム配列、配列番号13および17；欠失1、完全欠失および配列番号18；欠失2、配列番号14および19；欠失3、配列番号15および完全欠失；欠失4、完全欠失および配列番号19；欠失5、配列番号16および完全欠失。
【図４】図4は、ヘテロ二量体d-mitoTALEニッカーゼタンパク質の構造(上部)ならびに配列(下部；配列番号1および2)を示す図である。該タンパク質は、ゼブラフィッシュidh2ミトコンドリア標的化配列(構造中の斜線四角、配列中のボールド体のテキスト)、反復可変2残基(RVD)(構造およびテキスト中の黒い四角)を含有する配列が挿入されているGoldyTALE骨格(点描四角、配列中のイタリック体)、ならびにFokI/dFokI二量体配列(構造中の灰色の四角、配列中の下線付きテキスト)を含む。該FokI配列の450位にある枠で囲んだアスパラギン酸は、このタンパク質の該dFokI部分中のAspからAlaへの突然変異の位置を示しており、この突然変異により該FokIエンドヌクレアーゼドメインは触媒的に不活性となる。AspからAlaへの突然変異を有する配列は配列番号98に記載されている。
【図５−１】図5A〜5Eは、mitoTALEエンドヌクレアーゼとmitoTALEニッカーゼの同時送達が、mitoTALEニッカーゼのみと比較して、欠失するmtDNAゲノムの数を増大させうることを示す図である。図5Aは、ゼブラフィッシュのミトコンドリアゲノムの図であり、PCRプライマー部位の場所とmitoTALEニッカーゼを介した欠失の場所が示されている。
【図５−２】図5Bは、nd5およびatp8に標的化したmitoTALEニッカーゼ(上部右パネル)、nd4に標的化したmitoTALEヌクレアーゼ(下部左パネル)、該mitoTALEヌクレアーゼと該mitoTALEヌクレアーゼとの組み合わせ(下部右パネル)を注入した細胞由来、または非注入細胞(上部左パネル)由来のPCR産物を含有するアガロースゲルの一連の写真である。図5Cは、ニッカーゼおよびヌクレアーゼの併用注入による欠失ミトコンドリアゲノムの倍変化をプロットしたグラフであり、該ヌクレアーゼを含めた場合のヘテロプラスミーシフトが示されている。
【図５−３】図5Dおよび5Eは、同一ペアのmitoTALEニッカーゼにより作製された9つの異なる欠失を含有するmtDNAの配列を示す図であり、この図から該mtDNAゲノム内の該欠失の開始および終了位置が確認される。該mitoTALEニッカーゼの標的部位を枠で囲む。ヒトmtDNAゲノム配列、配列番号20および26；欠失1、配列番号21および27；欠失2、完全欠失および配列番号28；欠失3、配列番号21および29；欠失4、配列番号22および30；欠失5、配列番号23および31；欠失6、配列番号22および32；欠失7、配列番号23および32；欠失8、配列番号24および33；欠失9、配列番号25および33。
【図５−４】図5Dおよび5Eは、同一ペアのmitoTALEニッカーゼにより作製された9つの異なる欠失を含有するmtDNAの配列を示す図であり、この図から該mtDNAゲノム内の該欠失の開始および終了位置が確認される。該mitoTALEニッカーゼの標的部位を枠で囲む。ヒトmtDNAゲノム配列、配列番号20および26；欠失1、配列番号21および27；欠失2、完全欠失および配列番号28；欠失3、配列番号21および29；欠失4、配列番号22および30；欠失5、配列番号23および31；欠失6、配列番号22および32；欠失7、配列番号23および32；欠失8、配列番号24および33；欠失9、配列番号25および33。
【図６】図6は、ゼブラフィッシュのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ2(idh2)ミトコンドリア標的化配列(MTS)(上部；配列番号54)、および注入したゼブラフィッシュ胚の画像(下部)を示す図である。GBT268(zfishbook.com)から得たMTSをMitoProt(ihg.gsf.de/ihg/MitoProt.html)を使用して特徴付けし、さらにゼブラフィッシュ胚における特性評価のためにRFPに融合した。1細胞胚に、ミトトラッカーグリーンを、idh2MTS-RFP融合物と共に、およびidh2MTS-RFP融合物は使用せずに注入した。9時間後、胚をZeiss Lightsheet Z.1で画像化した。
【図７Ａ】図7A〜7Dは、mitoTALE-ニッカーゼを使用したnd4の単一遺伝子欠失を実証する図である。図7Aは、mtDNAおよびnd4の境界内部にあるmitoTALE-ニッカーゼの標的部位を、重鎖(H)または軽鎖(L)へのTALE結合、およびH鎖(下)またはL鎖(上)に対するFokI活性と共に示した概略図である。dFokIは触媒的に不活性であった。欠失はPCRを使用して検出し(点線によって示されるサイズ近似値)、プライマー(矢印)は両ニック部位の外側に配置した。
【図７Ｂ】図7Bは、nd4 mitoTALE-ニッカーゼを注入した動物から得たmtDNAに対してPCRを使用して検出した、nd4の欠失を示すゲルの画像である(右レーン)。全長非欠失nd4 mtDNAも同様に増幅した(中央レーン)。
【図７Ｃ】図7Cは、10種の欠失接合部のヌクレオチド配列を、括弧内に示す各欠失のサイズと共に示した図である。下線付きの配列は、該欠失接合部がnd4ニッカーゼ-1結合部位内またはスペーサー内にあったことを表している。
【図７Ｄ】図7Dは、nd4の周囲のmtDNA領域を、黒い棒線として示される欠失の場所と共に示した概略図である。
【図８Ａ】図8A〜8Dは、mitoTALE-ニッカーゼを使用した4977 mtDNA「共通欠失」の分子モデリングを実証する図である。図8Aは、nd5およびatp8に標的化したmitoTALE-ニッカーゼを、重鎖(H)または軽鎖(L)へのTALE結合、およびH鎖(下部パネル)またはL鎖(上部パネル)に対するFokI活性と共に示した図である。dFokIは触媒的に不活性である。欠失はPCRを使用して検出し、プライマー(矢印)は両ニック部位の外側に配置した。
【図８Ｂ】図8Bは、ブリッジPCRを使用し、nd5およびatp8ニッカーゼを注入した動物から得たmtDNAを用いて検出した、該nd5ニッカーゼと該atp8ニッカーゼの間の配列の欠失を示すゲルの画像である。
【図８Ｃ】図8Cは、10種の欠失接合部のヌクレオチド配列を、括弧内に示す各欠失のサイズと共に示した図である。下線は該欠失接合部が前記nd5ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあったことを表しており、また点線下線は該欠失接合部が前記atp8ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあったことを表している。
【図８Ｄ】図8Dは、前記のatp8およびnd5ニッカーゼ結合部位の周囲の領域の概略図である。黒い棒線は欠失の場所を示している。atp6とnd5の間の全てのmtDNAが欠失した。
【図９−１】図9A〜9Fは、mitoTALEヌクレアーゼを使用したニッカーゼ誘導欠失のヘテロプラスミーシフトを実証する図である。図9Aは、Δnd5/atp8-mtDNAの欠失領域内で設計され、その結果WT-mtDNAには標的化されるがΔnd5/atp8-mtDNAにはそのヌクレアーゼ結合配列が欠損しているため標的化されない、nd4を標的とするmitoTALE-ヌクレアーゼの概略図である。
【図９−２】図9Bは、示されている通り、atp8およびnd5 mitoTALE-ニッカーゼならびに／またはnd4 mitoTALE-ヌクレアーゼを注入したゼブラフィッシュから得たmtDNAを使用したブリッジPCR実験で得たゲルの画像を含有する図である。ブリッジPCRにより、個々の胚(レーンA〜E)からatp8ニック部位とnd5ニック部位の間の欠失が検出された。
【図９−３】図9Cは、全長mtDNAおよびΔnd5/atp8-mtDNAを同時に検出するための長範囲PCRアッセイで得たゲルの画像である。図9Dは、前記のatp8およびnd5ニッカーゼのみにより、または前記nd4ヌクレアーゼとの併用により誘導されるヘテロプラスミーの割合を概算するための3プライマーPCRアッセイで得たゲルの画像である。図9A中のニック部位に隣接するプライマーによりΔnd5/atp8-mtDNAが検出され、一方でnd5の外側のプライマーおよびnd5の内側のプライマーによりWT-mtDNAが検出された。
【図９−４】図9Eは、ニッカーゼ、ヌクレアーゼ、または両方を注入した個々の魚胚における、非注入動物と比較したmtDNA倍変化の散布ドットプロットである。エラーラインは標準偏差(中央のバーより上および下のバー)ならびに平均(中央ライン)を表している。ニッカーゼのみ、ヌクレアーゼのみ、およびニッカーゼとヌクレアーゼの両方を注入した動物のmtDNA倍変化はいずれも、非注入動物と比較すると有意に低かった(p＜0.05)。
【図９−５】図9Fは、6ヶ月齢のゼブラフィッシュ成魚のヒレの生検から得た、PCRアッセイで得たゲルの画像(上部)および括弧内の欠失サイズを有する配列(下部)を含有する図である。下線付き配列は欠失接合部が前記nd5ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあったことを示しており、一方で点線下線は欠失接合部が前記atp8ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあったことを示している。
【図１０】図10は、mitoTALE-ニッカーゼとmitoTALEヌクレアーゼの両方を注入した胚から得た配列データを、括弧内に示す欠失サイズと共に含有する図である。下線付き配列は欠失接合部がnd5ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあったことことを示しており、一方で点線下線は欠失接合部がatp8ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあったことを示している。
【図１１Ａ】図11Aおよび11Bは、哺乳動物細胞における、mitoTALEヌクレアーゼを使用したニッカーゼ誘導欠失を示す図である。図11Aは、示されている通り、ATP8およびND5 mitoTALE-ニッカーゼならびに／またはND4 mitoTALE-ヌクレアーゼを注入した293細胞から得たmtDNAを使用したPCR実験で得たゲルの画像である。PCRにより、前記のATP8ニッカーゼ、ND5ニッカーゼ、およびND4ヌクレアーゼをコトランスフェクトした場合に、ATP8ニック部位とND5ニック部位の間の欠失が検出された。
【図１１Ｂ】図11BはPCR産物の配列決定の結果を示す図であり、この図から各ニック部位に近接したヒトmtDNA欠失が確認される。図11Bに示す、突然変異体である配列番号93および95内のダッシュは、欠失した配列を示している。枠で囲んだ配列は、ニッカーゼ部位(フォワードTAL部位、リバースTAL部位、および15 bpのスペーサー配列を含む)を示している。欠失接合部がA8ニック部位からどの程度離れているかを実証するために、A8側に119 bpのギャップを示す(図11B、下部配列)。
【図１２】図12は、mitoTALE-ニッカーゼおよびヌクレアーゼを使用した二成分mtDNA工学ツールキットの概略図である。標的化mitoTALE-ニッカーゼを使用してミトコンドリアネットワーク内に標的欠失を播種した後、得られたデザイナーミトコンドリアゲノムを、mitoTALEヌクレアーゼによるヘテロプラスミーシフトを通じて別々に増大させた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
ミトコンドリアゲノムは二本鎖DNAを含有しているが、それが環状でありかつはるかに小さく、13のタンパク質、22のtRNA、および2つのrRNAをコードする37の遺伝子を含むわずか約16,500塩基対を含有するという点で核ゲノムとは異なる。該ミトコンドリアゲノムの約3パーセントのみが非コードDNAである。ミトコンドリアにコードされているタンパク質はいずれも、細胞に酸化的リン酸化系の酵素複合体のサブユニットを産生するよう指示している。
【００１５】
各細胞は多数のミトコンドリアを含有しており、また各ミトコンドリアは数十コピーのミトコンドリアゲノムを含有している。該ミトコンドリアゲノムは核ゲノムより約100倍高い突然変異率を有し、このことが同一細胞内のミトコンドリアDNAの不均一集団(「ヘテロプラスミー」と称される)をもたらしている。
【００１６】
mtDNAにおける突然変異は数多くの臨床的障害と関連があると考えられている。成人では、これらの臨床的障害として、神経疾患(例えば、偏頭痛、卒中、てんかん、認知症、ミオパチー、末梢神経障害、複視、運動失調、言語障害、および感音性難聴)、胃腸疾患(例えば、便秘、過敏性腸、および嚥下障害)、心臓病(例えば、心不全、心ブロック、および心筋症)、呼吸器疾患(例えば、呼吸不全、夜間低換気、反復性誤嚥、および肺炎)、内分泌疾患(例えば、糖尿病、甲状腺疾患、副甲状腺疾患、および卵巣不全)、眼科疾患(例えば、視神経萎縮症、白内障、眼筋麻痺、および眼瞼下垂)が挙げられる。小児では、mtDNA突然変異と関連があると考えられている障害として、神経疾患(例えば、てんかん、ミオパチー、精神運動遅滞、運動失調、痙縮、ジストニア、および感音性難聴)、胃腸疾患(例えば、嘔吐、発育不全、および嚥下障害)、心臓病(例えば、両心室肥大型心筋症およびリズム異常)、呼吸器疾患(例えば、中枢性低換気および無呼吸)、血液疾患(例えば、貧血および汎血球減少症)、腎疾患(例えば、尿細管障害)、肝疾患(例えば、肝不全)、内分泌疾患(例えば、糖尿病および副腎不全)、ならびに眼科疾患(例えば、視神経萎縮症)が挙げられる。mtDNA突然変異を特定の配列に標的化させることにより、かかる臨床症状を実験系でモデル化することができる。例えば、ゼブラフィッシュは、他の脊椎動物との顕著な生物学的類似性およびゲノム類似性を有する主要な硬骨魚モデル系であり、また本明細書中に記載したものを含むin vivo 遺伝的および分子的ツールを使用してヒトの生態および疾患を研究する上で有用でありうる。
【００１７】
本文書により、mtDNAを操作する(例えば、標的欠失を介するなどして改変する)ための材料および方法が提供される。mtDNAにおける変化がどのように真核系に影響を与えるかを研究することは、mtDNAゲノムを操作するための選択肢が限られているために、困難な場合がある。本文書により、mtDNAゲノム中の欠失は、幾つかの実施形態で、かかるミトコンドリアゲノムを標的とする改変TALEヌクレアーゼ系を使用して誘導しうることが開示される。該TALEヌクレアーゼ系は、ミトコンドリア標的化配列に連結されたGoldyTALEヌクレアーゼの通常形態と減弱化形態のヘテロ二量体を含みうるものであり、該ヘテロ二量体の特定の減弱化GoldyTALEヌクレアーゼメンバーに応じて、本明細書中ではa-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼと称される。幾つかの実施形態では、この部位特異的なヘテロ二量体ヌクレアーゼ系は、mtDNAが亜ミトコンドリア的に存在する場合、ミトコンドリアマトリックスに標的化することができる。本明細書中の実施例に記載したように、約5〜6 kbの欠失がin vitroでヒト細胞培養物において作製され、またin vivoでもDanio rerio(ゼブラフィッシュ)において作製された。該欠失は安定でかつPCRにより検出可能であり、また配列決定により、そのアンプリコンが、特定の欠失に関して、ヒトおよびゼブラフィッシュのミトコンドリアDNA(それぞれ)と一致することが明らかとなった。
【００１８】
本明細書中に提供される方法は、例えば、個別化医療用の研究ツールとして、ミトコンドリアDNA欠失を認める患者の細胞および／または動物アバターを作製するために、使用することができる。加えて、このアプローチは、特にミトコンドリアの研究における他の用途を有しうる。
【００１９】
本明細書中に提供される材料および方法を利用して、in vitroまたはin vivoでエンドヌクレアーゼ切断部位に正確に遺伝子変化を導入することができる。例えば、幾つかの実施形態では、該方法を利用して、特定のミトコンドリア遺伝子中に、それらの遺伝子における突然変異を特徴とする臨床的障害を模倣するために、欠失を導入することができる。かかる遺伝子変化はキメラDNAニッカーゼポリペプチドを使用して誘導すること可能であり、該キメラDNAニッカーゼポリペプチドは、(a)該キメラ分子をミトコンドリアに指向させるミトコンドリア標的配列、(b)該分子を該ミトコンドリア内の特定のDNA配列に標的化するよう設計された領域、および(c)選択した標的配列の位置またはその付近で該ミトコンドリアDNA中に一本鎖切断を生じるヌクレアーゼを含む。
【００２０】
適切なミトコンドリア標的配列としては、例えば、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2タンパク質と関連があるミトコンドリア標的化配列、ならびにヒトCOX8A MTS、ヒトSOD2 MTSが挙げられる。他の有用な標的化配列としては、他の文献に記載されているものが挙げられる(例えば、ClarosおよびVincens, Eur. J. Biochem. 241:779-786, 1996を参照されたい)。
【００２１】
幾つかの実施形態では、前記のキメラヌクレアーゼポリペプチドの領域(この分子を特定のDNA配列に標的化する領域)は、TALE分子由来の配列を含みうる。あるいは、前記のキメラDNAヌクレアーゼを選択配列に標的化する前記領域は、ジンクフィンガータンパク質(例えば、マウス転写因子Zif268由来のジンクフィンガーDNA結合ドメイン；PorteusおよびBaltimore, Science 300:763, 2003)またはメガヌクレアーゼ(例えば、ドデカペプチドファミリー(LAGLIDADG；配列番号34；WO 2004/067736を参照されたい)に属するメガヌクレアーゼなどの、野生型もしくは変異型ホーミングエンドヌクレアーゼ)に由来するものでありうる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、TALE由来のDNA標的化配列は特に有用でありうる。TALEは病原菌により植物に注入される植物病原性細菌のポリペプチドであり、その際、TALEは核へと移動して転写因子として機能することにより、特定の植物遺伝子をオンにする(例えば、Guら、Nature 435:1122, 2005；Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503, 2006；Kayら、Science 318:648, 2007；Sugioら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720, 2007；およびRomerら、Science 318:645, 2007を参照されたい)。特異性は、エフェクター−可変数の不完全な、典型的には34アミノ酸の反復配列に依存する(Schornackら、J. Plant Physiol. 163:256, 2006)。多型は主に反復配列の12位および13位に存在し、それらは反復可変二残基(RVD)と称されている。興味深いことに、TALEの該RVDは、それらの標的部位中のヌクレオチドに直接的、直線的な様式で、1つのRVDが1つのヌクレオチドに、多少の縮重を伴いかつ明らかな前後関係の依存もなく、対応している。TALEの主要なアミノ酸配列はそれが結合するヌクレオチド配列を決定しているため、標的部位をTALEに対して予想することが可能であり、またTALEを特定のヌクレオチド配列への結合のために操作および作製することもできる。
【００２３】
さらに、TALEをエンドヌクレアーゼに連結することにより、細胞に存在する予め選択した標的ヌクレオチド配列を認識させるために配列特異的TALEヌクレアーゼを設計および作製することができる。幾つかの場合、標的ヌクレオチド配列をヌクレアーゼ認識部位についてスキャンすることが可能であり、また特定のヌクレアーゼを該標的配列に基づいて選択することができる。幾つかの場合、TALEヌクレアーゼを操作することにより、特定の細胞の(例えば、mtDNA)配列に標的化することができる。所望のTALEヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、任意の適切な発現ベクター内に挿入することが可能であり、また以下にさらに説明するように、1つ以上のプロモーターまたは他の発現制御配列に機能しうる形で連結することができる。
【００２４】
TALEヌクレアーゼの具体例およびさらなる説明は、例えば、米国特許第8,586,363号(この文献は参照によりその全内容が本明細書中に組み込まれるものとする)に見出すことができる。幾つかの場合、TALEヌクレアーゼは、野生型TALポリペプチドと比較して短縮された足場を有するように、このポリペプチドのTAL部分のN-および／またはC-末端領域にトランケーションを有しうる。改変された足場を有する例示的なTALEヌクレアーゼは、例えば、PCT公報第WO2013/191769号(この文献は参照によりその全内容が本明細書中に組み込まれるものとする)に記載の＋63 TALEヌクレアーゼである。前記TAL部分は、かかるN-およびC-末端足場トランケーションと組み合わせて1つ以上の追加の変異(例えば、置換、欠失、または付加)も含みうることに注意されたい。例えば、TALEヌクレアーゼは、(例えば、足場内および／または反復配列領域内の)1つ以上のアミノ酸置換と組み合わせて前記TAL部分のN-およびC-末端トランケーションを有しうる。
【００２５】
一般に、mitoTALEヌクレアーゼポリペプチドに関しては、TALE配列を上記のようにミトコンドリア標的化配列に融合することが可能であり、またヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部、例えば、FokIなどのII型制限エンドヌクレアーゼから得た非特異的切断ドメイン(Kimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1156-1160, 1996)にも融合することができる。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglI、およびAlwIを挙げることができる。幾つかの場合、一部のエンドヌクレアーゼ(例えば、FokI)が二量体として機能するという事実(Bitinaiteら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:10570-10575, 1998)を、TALEの標的特異性を向上させるために利用することができる。例えば、幾つかの場合、別個のFokI単量体を、異なるDNA標的配列を認識するTALE配列に融合することが可能であり、それら2つの認識部位が極めて近接している場合にのみ、かかる不活性単量体を合わせて機能的な酵素を作製する。前記ヌクレアーゼを活性化するためにDNA結合を必要とすることで、高度に部位特異的な制限酵素を作製することができる。しかし、幾つかの実施形態では、機能するために二量体化を必要としないヌクレアーゼに単一のTALEが融合されるように、単量体TALEヌクレアーゼを構築することができる。かかるヌクレアーゼの1つは、2つの単量体が単一ポリペプチドとして発現される、一本鎖変異型のFokIである(Minczukら、Nucleic Acids Res. 36:3926-3938, 2008を参照されたい)。
【００２６】
二本鎖DNAをより低い効率で切断するヌクレアーゼか、または一本鎖DNAを切断することにより二本鎖切断ではなくニックを作製するヌクレアーゼを作製するために、FokI配列を変異させることでその活性を変化させうることに注意されたい。例えば、FokIエンドヌクレアーゼの483位または450位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基と置き換えることが可能であり、その結果、二本鎖DNAを完全に切断するのではなくニックを入れるか、または二本鎖DNAを切断するもののその効率が非突然変異誘発FokIよりも低いヌクレアーゼが得られる。幾つかの実施形態では、a-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼは、一方の単量体が野生型FokIアミノ酸配列を含有し、他方の単量体がD483AまたはD450A突然変異を有するFokIアミノ酸配列を含有する、FokIヘテロ二量体を含みうる。
【００２７】
幾つかの実施形態では、キメラDNAニッカーゼは、群生性等間隔短回文反復配列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats(CRISPR)関連系(Cas)ポリペプチドに融合したミトコンドリア標的化配列を含みうる。その天然の環境においては、このCRISPR/Cas系は、侵入外来核酸に対する免疫を細菌および古細菌に付与する(Jinekら、Science 337:816-821, 2012)。該CRISPR/Cas系は真核生物のRNA干渉と機能的に類似しており、DNAまたはRNA切断を指示するためにRNA塩基対合を利用する。このプロセスは、(a)侵入核酸により運搬される配列と塩基対を形成する低分子RNA、および(b)該低分子RNAに相補的な核酸を切断する特殊なクラスのCasエンドヌクレアーゼ、に依存する。幾つかの実施形態では、Cas9エンドヌクレアーゼ(例えば、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9エンドヌクレアーゼ)を使用することができる。該CRISPR/Cas系は、動物および植物細胞を含む高等真核生物のゲノムにおいて標的二本鎖DNAの切断を引き起こすために再プログラムすることができる(Maliら、Science 339:823-826, 2013；およびLiら、Nature Biotechnol. 31(8):688-691, 2013)。さらに、DNA切断に関与するCasタンパク質中の特定のアミノ酸を改変することにより、該CRISPR/Cas系はDNAニッカーゼとして機能することができる(Jinekら、上掲)。例えば、D10AまたはH840A突然変異を有するCas9ヌクレアーゼタンパク質は、ニッカーゼ活性を有しうる。
【００２８】
前記Cas9タンパク質を特定の配列に指向させるには、Cas/RNA複合体を標的DNA配列に指向させるのに役立つcrRNAおよびtracrRNA配列が必要である(Makarovaら、Nat. Rev. Microbiol., 9(6):467-477, 2011)。単一標的化RNAの改変は、Casタンパク質のヌクレオチド標的を変更するのに十分でありうる。幾つかの場合、crRNAおよびtracrRNAを、Cas活性を指向させるために単一cr/tracrRNAハイブリッド(「ガイドRNA」またはgRNAとも称される)として操作することができる。従って、キメラCasニッカーゼを、1つ以上のmtDNA配列に標的化した1つ以上のcrRNAおよびtracrRNA配列(または1つ以上のgRNA配列)と共に細胞に導入することで、該キメラCasニッカーゼがミトコンドリア標的化配列を含みかつ該gRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAがミトコンドリアRNA標的化配列に連結されている場合(例えば、Sieberら、Nucl. Acids Res. doi:10.1093/nar/gkr380, 2011を参照されたい)、該gRNA/crRNAおよびtracrRNAならびに該Casニッカーゼを選択mtDNA配列に指向させることができる。
【００２９】
真核細胞(例えば、培養中の細胞、またはゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、もしくはイヌなどの非ヒト脊椎動物を含む真核生物内の細胞)のmtDNAを変化させるための方法は、1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つ以上)の組換えDNAヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼ(例えば、a-mitoTALEヌクレアーゼおよび／またはmitoTALEニッカーゼ)を該細胞に、1つ以上のヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼポリペプチドを導入することにより、または1つ以上のヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼポリペプチドをコードする核酸を導入することにより、導入することを含みうる。例えば、a-mitoTALEヌクレアーゼは、前記のキメラポリペプチドをコードする核酸ベクターとして、またはポリペプチドそれ自体として細胞に導入することができる。任意の適切なa-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼを本明細書中に記載した方法に使用することができる。幾つかの実施形態では、例えば、配列番号1および2(図1、下部パネル)に基づく、または配列番号1および2を含むTALE足場を有するa-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼを使用することができる。幾つかの場合、2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つ以上)のa-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼを細胞または生物に導入することが可能であり、各a-mitoTALEヌクレアーゼおよびニッカーゼは異なる配列を標的とする。かかる方法により、細胞内または生物内のミトコンドリアDNAに複数のニックを生じさせることが可能であり、また幾つかの場合(例えば、下記実施例のような場合)、ゲノムmtDNA配列の数kbの欠失を生じさせることが可能である。
【００３０】
幾つかの実施形態では、1つ以上のa-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼを、減弱した活性をもたないmitoTALEヌクレアーゼと組み合わせて細胞に導入することができる。本明細書中の実施例5に記載したように、かかる分子の組み合わせを含む方法は、ミトコンドリアDNA欠失のレベルの上昇、およびa-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼのみを使用して達成されるヘテロプラスミーのレベルと比較したヘテロプラスミーの増大をもたらしうる。従って、方法は、細胞に、a-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼをコードする1つ以上の核酸ベクターを、mitoTALEヌクレアーゼをコードする核酸ベクターと組み合わせて導入することを含みうるものであり、または該a-mitoTALEヌクレアーゼ、mitoTALEニッカーゼ、およびmitoTALEヌクレアーゼポリペプチドを細胞に導入してもよい。幾つかの実施形態では、該mitoTALEヌクレアーゼを、欠失のために該a-mitoTALEヌクレアーゼまたはmitoTALEニッカーゼにより標的化されるmtDNAの領域内の配列に標的化してもよい。
【００３１】
mtDNAに標的化される、単離されたキメラDNAヌクレアーゼおよびニッカーゼの核酸およびポリペプチドもまた本明細書中に提供される。該用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用する場合、翻訳後修飾(例えば、リン酸化またはグリコシル化)にかかわらず、2つ以上のサブユニットアミノ酸の複合物を指す。該サブユニットは、ペプチド結合または例えば、エステルもしくはエーテル結合などの他の結合により連結されていてもよい。該用語「アミノ酸」は、D/L光学異性体を含む天然および／または非天然すなわち合成アミノ酸を指す。
【００３２】
ポリペプチドに関する「単離された」または「精製された」とは、該ポリペプチドが、自然界では該ポリペプチドと通常一緒に見出される細胞成分(例えば、他のポリペプチド、脂質、糖質、および核酸)からある程度まで分離されていることを意味する。精製されたポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要バンドを生じうる。精製されたポリペプチドは、少なくとも約75％純粋(例えば、少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、または100％純粋)でありうる。精製されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出により、化学合成により、または宿主細胞もしくはトランスジェニック植物における組換え体生産により取得することが可能であり、また例えば、アフィニティークロマトグラフィ、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。精製の程度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高性能液体クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、任意の適当な方法を利用して測定することができる。
【００３３】
前記用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は互換的に用いられ、また該用語はRNAとDNAの両方、例えばcDNA、ゲノムDNA、合成(例えば、化学合成)DNA、および核酸アナログを含有するDNA(またはRNA)を指す。ポリヌクレオチドはあらゆる3次元構造を有しうる。核酸は、二本鎖または一本鎖(すなわち、センス鎖またはアンチセンス一本鎖)でありうる。ポリヌクレオチドの非限定的具体例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸アナログが挙げられる。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「単離された」は、核酸に関する場合、ゲノム、例えば、植物ゲノムに存在する、該ゲノム中の該核酸の片側または両側に通常隣接する核酸を含む他の核酸から分離されている核酸を指す。該用語「単離された」は、核酸に関して本明細書中で使用する場合、天然に存在しないあらゆる配列も含むが、これはこうした天然に存在しない配列が自然界では見出されず、かつ天然に存在するゲノムにおいて直接隣接している配列をもたないからである。
【００３５】
単離された核酸は、例えばDNA分子でありうるが、ただし天然に存在するゲノムにおいて該DNA分子に直接隣接していることが通常見出される核酸配列のうちの1つは除去されているかまたは存在しない。従って、単離された核酸としては、限定するものではないが、他の配列から独立した別個の分子として存在するDNA分子(例えば、化学合成核酸、あるいはcDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されるゲノムDNA断片)、ならびにベクター、自律複製プラスミド、ウイルス(例えば、パラレトロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス)に組み込まれたDNA、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAが挙げられる。加えて、単離された核酸として、組換え核酸、例えば、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるDNA分子も挙げることができる。例えば、cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムDNA制限消化物を含有するゲル切片中の何百〜何百万もの他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【００３６】
核酸は、例えば、化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により作製することができる。PCRとは、標的核酸を増幅する手順または技術を指す。PCRを利用することにより、DNAならびにRNA由来の特定の配列、例えば全ゲノムDNAまたは全細胞RNA由来の配列を増幅することができる。様々なPCR法が、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, DieffenbachおよびDveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。一般に、対象とする領域またはそれを越える領域の末端から得た配列情報を用いることにより、増幅すべき鋳型の逆鎖と配列が同一であるかまたは類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。部位特異的ヌクレオチド配列修飾を鋳型核酸に導入できる、様々なPCR戦略もまた利用可能である。
【００３７】
単離された核酸は、突然変異誘発により取得することもできる。例えば、供与体核酸配列を、標準的な技術、例えばPCRを介したオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発を利用して突然変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Ausubelら (編), 1992を参照されたい。
【００３８】
本文書（本明細書）により、1つ以上のキメラDNAヌクレアーゼまたはニッカーゼ(例えば、a-mitoTALEヌクレアーゼ)分子をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸ベクタ-もまた提供される。「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、その中に他のDNAセグメントを挿入することにより、この挿入セグメントの複製を引き起こしてもよい。一般に、ベクターは、適切な調節エレメントと関連付けた場合に複製する能力を有する。適切なベクター骨格としては、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、BAC、YAC、またはPACなどの、当技術分野で日常的に用いられているものが挙げられる。該用語「ベクター」には、クローニングおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組込みベクターが含まれる。「発現ベクター」は、1つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、また「発現制御配列」は別のDNA配列の転写および／または翻訳を制御および調節するDNA配列である。適切な発現ベクターとしては、限定するものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。多数のベクターおよび発現系が、Novagen(Madison, WI)、Clontech(Palo Alto, CA)、Stratagene(La Jolla, CA)、およびInvitrogen/Life Technologies(Carlsbad, CA)などの企業から市販されている。
【００３９】
本明細書中に提供される核酸は、転写もしくは翻訳の開始および速度、ならびに／または転写産物もしくはポリペプチド産物の安定性もしくは移動性に影響を与えるヌクレオチド配列である「調節領域」(「調節エレメント」または「発現制御配列」とも称される)を含みうる。調節領域としては、限定するものではないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導エレメント、プロモーター調節エレメント、タンパク質結合配列、5’および3’非翻訳領域(UTR)、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、ならびにコード配列内に存在しうる他の調節領域、例えば分泌シグナル、ミトコンドリア標的化配列、およびプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「機能しうる形で連結されている」とは、発現制御配列が対象のコード配列の発現を効果的に制御するように遺伝子構築物に組み込まれていることを意味する。コード配列は、RNAポリメラーゼが該コード配列をRNAに転写できる場合、細胞において発現制御配列に「機能しうる形で連結」されていてかつその「制御下」にあり、該RNAがmRNAであれば、その後該コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳されうる。従って、調節領域は、改変された標的核酸が発現されることが望まれる植物細胞、植物、または植物組織において転写をモジュレート、例えば、調節、促進または駆動することができる。
【００４１】
プロモーターは、典型的には転写が開始する位置の上流100ヌクレオチド以内(通常はRNAポリメラーゼIIの開始部位の付近)のDNA分子の領域から構成される発現制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼならびに転写を開始およびモジュレートするための他のタンパク質の認識および結合に関与している。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、典型的には、そのポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を該プロモーターの1〜約50ヌクレオチド下流に配置することが必要である。しかし、プロモーターは、該翻訳開始部位の約5,000ヌクレオチドも上流、または転写開始部位の約2,000ヌクレオチドも上流に配置することができる。プロモーターは、典型的には、少なくともコア(基本)プロモーターを含む。プロモーターはさらに、少なくとも1つの調節エレメント、例えば上流エレメントを含んでいてもよい。かかるエレメントは、上流活性化領域、および場合によっては、ポリヌクレオチドの転写に影響を及ぼす他のDNA配列、例えば合成上流エレメントを含む。
【００４２】
含めるプロモーターの選択は、効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベル、および細胞または組織特異性を含むがこれらに限定されない、幾つかの要因によって決まる。例えば、それぞれ特定の組織、臓器、および細胞型でのみ、または主にそこで転写をもたらす組織特異的、臓器特異的および細胞特異的プロモーターを使用することができる。あるいは、構成的プロモーターは、発生を通じて、大部分または全ての組織において機能しうる形で連結された核酸の転写を促進することができる。他のクラスのプロモーターとしては、限定するものではないが、誘導プロモーター、例えば外部刺激(例えば、化学薬品、発生刺激、または環境刺激)に応答して転写をもたらすプロモーターが挙げられる。
【００４３】
本明細書中に提供されるベクターはさらに、例えば、複製起点、および／または足場付着領域(SAR)を含みうる。加えて、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出(例えば、精製または局在化)を容易にするために設計されたタグ配列を含みうる。緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-myc、赤血球凝集素、またはFlag(商標)タグ(Kodak, New Haven, CT)配列などのタグ配列は、典型的にはコードされたポリペプチドとの融合物として発現される。かかるタグは、該ポリペプチド内の、カルボキシルまたはアミノ末端位を含む任意の場所に挿入することができる。
【００４４】
前記用語「ベクター(vector)」または「ベクター(vectors)」は、核酸分子であって、該核酸分子が連結されている別の核酸を輸送する能力を有するものを指す。本文書における「ベクター」としては、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクターまたは染色体性、非染色体性、半合成もしくは合成核酸からなりうる直鎖状もしくは環状のDNAもしくはRNA分子が挙げられるが、それらに限定されない。好適なベクターは、自律複製する能力を有するもの(エピソームベクター)および／またはそれらが連結される核酸を発現する能力を有するもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者には公知であり、市販されている。
【００４５】
組換え核酸構築物は、細胞(例えば、植物細胞または動物細胞)の形質転換に適したベクターに挿入されたポリヌクレオチド配列を含みうる。組換えベクターは、例えば、標準的な組換えDNA技術(例えば、Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい)を利用して作製することができる。
【００４６】
ベクターは、真核細胞または非ヒト生物(例えば、単子葉植物および双子葉植物を含む植物、または魚、齧歯動物、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、および霊長類を含む動物)に、様々な方法のうちのいずれか(例えば、注入、直接取込み、粒子衝撃(projectile bombardment)、リポソーム、または電気穿孔)により導入することができる。本明細書中の実施例に記載したように、例えば、1つ以上の(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、もしくは7つ以上の)mitoTALEヌクレアーゼ、a-mitoTALEヌクレアーゼ、もしくはmitoTALEニッカーゼ、または1つ以上のヌクレアーゼと1つ以上のニッカーゼとの組み合わせ(例えば、2つのmitoTALEニッカーゼとa-mitoTALEヌクレアーゼもしくはmitoTALEヌクレアーゼ)をコードするDNAまたはRNAは、細胞に形質転換するか、またはゼブラフィッシュなどの生物(例えば、ゼブラフィッシュ胚)に微量注入することができる。該細胞(もしくはその子孫)または該生物は、欠失が標的配列(複数可)の位置またはその付近で作製されたかどうかを判定し、かつかかる欠失全てのサイズを評価するために、例えば、PCRおよび配列決定技術を利用して評価することができる。幾つかの実施形態では、形質転換された生物(例えば、胚)を発生させることが可能であり、またその結果得られる生物を、欠失が維持されているかどうかを判定するために評価することができる。
【００４７】
本発明を下記実施例中でさらに説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４８】
実施例1−ヘテロ二量体a-mitoTALEヌクレアーゼタンパク質の構造および配列
a-mitoTALEヌクレアーゼのタンパク質構造を図1の上部パネルに示す。ヘテロ二量体サブユニットを有する該mitoTALEヌクレアーゼ系(a-mitoTALEヌクレアーゼ)は、GoldyTALE骨格(Bedellら、Nature 491:114-118, 2012)に融合させたゼブラフィッシュのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ2(idh2)ミトコンドリア標的化配列を含む。該a-mitoTALEヌクレアーゼのタンパク質配列を図1の下部パネルに示す。前記ゼブラフィッシュidh2ミトコンドリア標的化配列の配列はボールド体で、前記GoldyTALE骨格の配列はイタリック体で、FokIドメインの配列は下線で示す。減弱したFokIを作製するため、単一のアスパラギン酸からアラニンへの点突然変異を、FokIに対して483位(図1中、丸で囲んだ部分)に作製した。このタンパク質は、前記GoldyTALE配列内に挿入されたRVDを含有する一連の縦列反復配列により完成し、該縦列反復配列内の該RVDはこの構築物を特定のゲノム遺伝子座に指向させる。RVD含有反復配列の配列は示さないが、それらの位置を図1の両パネル中に黒い四角で示す。選択DNA配列に標的化したTALE分子を設計するための方法は当分野で公知である。例えば米国特許第8,586,363号(この文献はその記載内容が全て参照により本明細書中に組み込まれるものとする)を参照されたい。
【実施例２】
【００４９】
実施例2−a-mitoTALEヌクレアーゼにより作製されたゼブラフィッシュにおけるmtDNA欠失
ゼブラフィッシュのミトコンドリアゲノム中のnd5(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5)およびcoII(チトクロムｃオキシダーゼサブユニットII)遺伝子を標的化するために、a-mitoTALEヌクレアーゼを作製した(図2A、黒い棒線)。予想される欠失サイズは約6 kbであった。欠失が生じた場合にのみPCR産物が検出されるように、プライマーを予想される欠失の方向に向けた(点線矢印)。実際に、a-mitoTALEヌクレアーゼの1細胞ゼブラフィッシュ胚への注入および胚発生から4日後のDNAの単離の後に、PCRによりmtDNA欠失の存在を確認した。非注入魚(図2B、中央レーン)は予想サイズのバンドを示さなかったが、一方でa-mitoTALEヌクレアーゼ-注入魚は予想サイズのバンドを示した(図2B、右レーン、矢印)。PCR産物がmtDNAであることを確認するために、幾つかのバンドの配列を決定した。これにより、同一のa-mitoTALEヌクレアーゼ対は、複数の魚に注入した場合に、一定範囲の欠失をもたらすことが明らかとなった。5つの例を、枠で囲んだ本来のa-mitoTALEヌクレアーゼ結合部位およびスペーサーと共に図2Cに示す。コロンは欠失したヌクレオチドを表している。欠失サイズはおおよそ6 kbであったが、該サイズは差異という点では最大で数百個のヌクレオチドが異なっていた。
【実施例３】
【００５０】
実施例3−a-mitoTALEヌクレアーゼにより作製したヒト細胞培養物におけるmtDNA欠失
ヒト293T細胞中のミトコンドリアND5(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5)およびA8(ATPアーゼサブユニット8)遺伝子を標的化するために、a-mitoTALEヌクレアーゼを同様に作製した(図3A、黒い棒線)。予想される欠失サイズは約5 kbであった。欠失が生じた場合にのみPCR産物が検出されるように、プライマーを予想される欠失(点線矢印)の方向に向けた。a-mitoTALEヌクレアーゼでトランスフェクトし、さらにDNA単離前に37℃で2〜7日間インキュベートした細胞が、予想サイズのバンド(図3B、右レーン、矢印；バンドは2日間のインキュベーション後に観察された)により明示されたように、mtDNA欠失を示したことを、PCRにより確認した。対照的に、GFPでトランスフェクトした細胞はそうしたバンドを示さなかった。PCR産物がmtDNAであることを確認するために、幾つかのバンドの配列を決定した。これらの研究から、一定範囲の欠失サイズが同一a-mitoTALEヌクレアーゼ対により誘導されることが明らかとなった。5つの例を、枠で囲んだ本来のa-mitoTALEヌクレアーゼ結合部位およびスペーサーと共に図3Cに示す。コロンは欠失したヌクレオチドを表している。一定範囲の欠失サイズが観察され、該サイズは最大で数百個のヌクレオチドが異なっていた。
【実施例４】
【００５１】
実施例4−ヘテロ二量体mitoTALEニッカーゼタンパク質の構造および配列
より「伝統的な」mitoTALEニッカーゼを、FokI配列の450位のアスパラギン酸をアラニンと置き換えることにより作製した。このヘテロ二量体mitoTALEニッカーゼの図を図4に示す。このタンパク質は、ゼブラフィッシュidh2ミトコンドリア標的化配列(構造中の斜線四角、配列中のボールド体のテキスト)、反復可変2残基(RVD)(構造およびテキスト中の黒い四角)を含有する配列が挿入されているGoldyTALE骨格(点描四角、配列中のイタリック体)、ならびにFokI/dFokI二量体配列(構造中の灰色の四角、配列中の下線付きテキスト)を含む。該FokI配列の450位の枠で囲んだアスパラギン酸は、FokIエンドヌクレアーゼドメインを触媒的に不活性にする、AspのAlaへの突然変異の位置を示している。
【実施例５】
【００５２】
実施例5−mitoTALEニッカーゼおよびmitoTALEヌクレアーゼの同時注入により誘導されるヘテロプラスミーの増大
欠失させるミトコンドリア配列に標的化したmitoTALEエンドヌクレアーゼと組み合わせてmitoTALEニッカーゼを使用することの効果を判定するために、実験を行った。図5Cに示すように、これらの研究により、mitoTALEヌクレアーゼの同時送達は、mitoTALEニッカーゼのみと比較して欠失するmtDNAゲノムの数を増大させうることが明らかとなった。nd5およびatp8遺伝子に標的化したmitoTALEニッカーゼ(図5A、黒い棒線)ならびにnd4遺伝子に標的化したmitoTALEヌクレアーゼ(図5A、網目の棒線)を、ゼブラフィッシュに別々に、または組み合わせて注入した。注入したゼブラフィッシュから単離したDNAを使用した短範囲PCR(Short range PCR)により、mitoTALEニッカーゼとmitoTALEヌクレアーゼとの組み合わせを使用した場合、欠失するゲノムの割合がより高いことが明らかとなった(図5B、矢印)。
【００５３】
この変化を定量化するため、リアルタイムPCRを行うことにより欠失を検出し、さらに産物を核遺伝子に対して正規化した(図5C)。前記mitoTALEニッカーゼと前記mitoTALEヌクレアーゼの同時送達は、mitoTALEニッカーゼのみの送達と比較して、欠失させるmtDNAゲノムの数が約20倍増加した。従って、前記ヌクレアーゼを含めた場合にヘテロプラスミーシフトが生じた。
【００５４】
加えて、前記mtDNAの配列を決定することにより、前記mtDNAゲノム内の欠失の開始および終了位置を確認した。nd4ヌクレアーゼと組み合わせたnd5およびatp8 mitoTALEニッカーゼ対により作製された、9つの異なる欠失が生じた(図5Dおよび5E)。
【実施例６】
【００５５】
実施例6−二成分の操作を利用したデザイナーミトコンドリアゲノム
方法
mitoTALE-ニッカーゼおよびmitoTALEヌクレアーゼの組み立て:idh2のミトコンドリア標的化配列(図6)をpT3TS29にクローニングし、その後核局在化配列を除去したGoldyTALEヌクレアーゼ(Bedellら、上掲)に融合した。mitoTALE-ニッカーゼを作製するため、GoldyTALEヌクレアーゼのFokIドメイン中にD450A置換を作製した(WaughおよびSauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9596-9600, 1993)。ゲノム内の特定の配列を標的化するため、FusXアセンブリシステム(Maら、Hum.Gene Ther. 2016, doi:10.1089/hum.2015.172)を利用してRVDをGoldyTALE骨格内にクローニングした。使用したRVDは、HD＝C、NN＝G、NI＝A、NG＝Tであった。ニッカーゼおよびヌクレアーゼにより標的化される部位は次の通りであった:ゼブラフィッシュnd5フォワードmitoTALE-ニッカーゼ、5’-AGGGCTAATGATAGT-3’(配列番号35)；ゼブラフィッシュnd5リバースmitoTALE-ニッカーゼ、5’-GCTAGATGTGGTTGG-3’(配列番号36)；ゼブラフィッシュatp8フォワードmitoTALE-ニッカーゼ、5’-TCCTTACTATTATTC-3’(配列番号37)；ゼブラフィッシュatp8リバースmitoTALE-ニッカーゼ、5’-TAGGTTGAATGTGAT-3’(配列番号38)；ゼブラフィッシュnd4フォワードmitoTALEヌクレアーゼ、5’-TATATTCGAAGCTAC-3’(配列番号39)；ゼブラフィッシュnd4リバースmitoTALEヌクレアーゼ5’-CGGGTAATAATGATT-3’(配列番号40)；ゼブラフィッシュnd4フォワードmitoTALE-ニッカーゼ-1、5’-TTACACCTAATTCCT-3’(配列番号41)；ゼブラフィッシュnd4リバースmitoTALE-ニッカーゼ-1、5’-AAGTTCTGGTTTTAA-3’(配列番号42)；ゼブラフィッシュnd4フォワードmitoTALE-ニッカーゼ-2、5’-GACTAAAATGAACCT-3’(配列番号43)；およびゼブラフィッシュnd4リバースmitoTALE-ニッカーゼ-2、5’-ACGAGTTAGAAGCAT-3’(配列番号44)。前記RVDが前記GoldyTALE骨格内にクローニングされ次第、微量注入のためにmRNAを作製した。各ヌクレアーゼまたはニッカーゼ発現プラスミドをSacIを用いて37℃で2〜3時間消化し、合成mRNAを作製し(T3 mMessage mMachine kit, Ambion)、さらに製造業者の指示に従ってフェノール／クロロホルムで抽出した。
【００５６】
ゼブラフィッシュmtDNA欠失スクリーニング:12.5 pgの各mitoTALE-ニッカーゼアームを、1細胞ゼブラフィッシュ胚に微量注入した。追加の50 pgの前記mitoTALEヌクレアーゼを該mitoTALE-ニッカーゼ注入後に注入した。3および5日後、個々のゼブラフィッシュ幼生を1.7 mLの微小遠心管に集めてから、DNAを、40μLの抽出用緩衝液(50 mMのTris-HCl pH 8.5、1 mMのEDTA、0.5％のTween-20、200μg/mLのプロテイナーゼK)で55℃にて3〜4時間、2時間に一度ボルテックスしながら抽出し、抽出が完了した後に17,000xgで1分間遠心分離した(Artusoら、Biochim Biophys Acta 1817:1002-1011, 2012)。1 mLのDNA抽出物をその後Platinum Taq PCRマスターミックス(Invitrogen)に添加した。nd4欠失をスクリーニングするため、次のサーモサイクラー・パラメータ:95℃で5分間、(95℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間)×35、および72℃で5分間、を使用した。使用したプライマーは、フォワードプライマー5’-GGTCCGCCCGCCTACCATTTTC-3’(配列番号45)、リバースプライマー5’-CCAGGTGATGAATAAGGCGATTGAGGT-3’(配列番号46)であった。nd5/atp8欠失をスクリーニングするため、次のサーモサイクラー・パラメータ:95℃で5分間、(95℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で1分間)×35、および72℃で5分間、を使用し、また使用したプライマーは、フォワードプライマー5’-GACGCGGTACCCGGACGATTAAACCA-3’(配列番号47)、リバースプライマー5’- GCAATAATGCTTCCTCAGGCAAGCCGT-3’(配列番号48)であった。いずれの場合も、5〜10μLのPCR産物を1.5〜2％ゲルで電気泳動し、さらに配列決定のためにQiaex IIゲル抽出キット(Qiagen)を使用して抽出し、次いで配列決定のためにTOPO PCRクローニングキット(Invitrogen)を使用してクローニングした。
【００５７】
Δnd5/atp8-mtDNA突然変異体の長範囲PCR(Long-Range PCR):1μLの個々の幼生DNA抽出物を、企業から提供された5x 緩衝液中の標準的なMyTaq Red DNAポリメラーゼ(Bioline)と共に最終反応液量を25 uLとして使用した。この反応を95℃まで10分間加熱し、次いで72℃まで冷却してから、前記ポリメラーゼを添加(0.1 uL／反応)するまで維持した。その後、長範囲PCRを、次のサーモサイクラー・パラメータ:95℃で5分間、(95℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で8分間)×35、および72℃で10分間、を用いて実施した。10μLの反応物を、画像化のために0.8％アガロースゲルで電気泳動した。使用したプライマーは、フォワードプライマー5’-GACGCGGTACCCGGACGATTAAACCA-3’(配列番号47)、リバースプライマー5’-GCAATAATGCTTCCTCAGGCAAGCCGT-3’(配列番号48)であった。
【００５８】
ヘテロプラスミー定量化のための3プライマーPCR:ヘテロプラスミー評価のために使用したプロトコルは、他に記載されている方法を改変したものである(Sciaccoら、Hum. Mol. Genet. 3:13-19, 1994)。この方法は、3つのプライマーを同時にPCR反応に使用することで同一反応において野生型とΔnd5/atp8-mtDNAの両方を検出するものであり、その際、それらを定量的に比較することができる。2つのプライマー、フォワードプライマー5’-GACGCGGTACCCGGACGATTAAACCA-3’(配列番号47)、およびリバースプライマー5’-GCAATAATGCTTCCTCAGGCAAGCCGT-3’(配列番号48)は、予測される欠失部位に隣接していた(各125 pmole)。第3のリバースプライマー5’-AACTCTTGGTGCAACTCCAAGTAGAAG-3’(配列番号49)(31.25 pmole)は、欠失する領域の内側に配置した。予測される欠失部位に隣接する前記の2つのプライマーは、欠失するゲノム(約770 bp)を増幅するためだけに設計したが、欠失する領域の内側の前記リバースプライマーおよび外側のフォワードプライマーは野生型ゲノム(1421 bp)を増幅するだろう。企業から提供された5x 緩衝液中のMyTaq Red DNAポリメラーゼを、PCR反応のために、25μLの最終液量まで使用した(Bioline)。該反応を95℃まで10分間加熱し、次いで72℃まで冷却してから、該ポリメラーゼを添加するまで維持した(0.1 uL／反応)。次のラン:95℃で5分間、(95℃で15秒間、62℃で15秒間、72℃で1分間)×30、72℃で5分間、をサーマルサイクラーで実行した。10μLの反応物を1％アガロースゲルで電気泳動してから、その画像を撮影し、さらにバンド強度をImage Jで解析した。％ヘテロプラスミーの計算は(ΔmtDNA)／(ΔmtDNA＋WT mtDNA)とした。
【００５９】
相対的mtDNAコピー数を測定するためのRT-PCR:ゼブラフィッシュにおいてmtDNAコピー数を測定するために使用したプロトコルは、他に記載されている方法(Artusoら、上掲)を改変したものである。mtDNAを標的とするプライマーはmt-nd1遺伝子内にあり(フォワードプライマー5’-AGCCTACGCCGTACCAGTATT-3’(配列番号50)、リバースプライマー5’-GTTTCACGCCATCAGCTACTG -3’(配列番号51))、また参照核DNAプライマーはpolg遺伝子内にあった(フォワードプライマー5’-GAGAGCGTCTATAAGGAGTAC-3’(配列番号52)、リバースプライマー5’-gagctcatcagaaacaggact-3’(配列番号53))。RT-PCR反応は以下:1X SensiFAST SYBR Lo-ROXミックス(Bioline)、300 nMのフォワードおよびリバースプライマー、1μLのDNA抽出物ならびに10 uLの最終液量を得るための水、からなるものであった。この反応はCFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Biorad)で実施し、またそのサイクル条件は次の通り:95℃で10分間、(95℃で10秒間、55℃で10秒間、72℃で4秒間)×40、次いでただ1つのPCR産物の存在(これはその後5μLのPCR産物を1.5％アガロースゲルで電気泳動することにより立証した)を保証するための融解曲線解析、とした。核DNAおよびミトコンドリアDNAの反応は、実験間(inter-run)変動性の理由を説明するために同一反応中で実施した。解析のため、該核DNA Ct値(リアルタイムPCRの最中にシグナルをバックグラウンドと区別するための蛍光閾値を超えるのに必要とされるPCRサイクルの回数；この値により、前記PCRプライマーが標的とする試料中のDNAの量を定量化する)を個々の試料のミトコンドリアDNA Ct値から引くことにより、各試料のΔCtを決定した。非注入動物から得た該ΔCt値の平均をとり、これを算出した各試料のΔCtから引くことにより、各試料のΔΔCtを決定した。次に、倍変化を各試料について算出し(2-ΔΔCt)、各実験群の該倍変化の平均をとり、標準誤差を決定した。前記polg(核DNA)の増幅後に23を超えるCt値を有する試料は、外れ値として除外した(全168試料中7)。2つのさらなる試料は、mtDNA倍変化が2より大きく、それらが外れ値と思われたため、ニッカーゼおよびヌクレアーゼ処理群から除去した。統計的有意性を評価するため、スチューデントt検定を、倍変化の値、対応のない、不等分散および非ガウス分布を示すランダム値に対して実施した。散布ドットプロットを作成し、GraphPad Prismソフトウェアを使用して統計的検定を実施した。
【００６０】
結果
DSBは急速なmtDNA分解の引き金となることが知られており、またmtDNA疾患の患者の細胞およびマウスモデルにおいてヘテロプラスミーの有害な影響と戦うために戦略的に使用されている(Bayona-Bafaluyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:14392-14397, 2005；Alexeyevら、Gene Ther. 15:516-523, 2008；Minczukら、上掲；Reddyら Cell 161:459-469, 2015；およびBacmanら、Nat. M編19:1111-1113, 2013)。この技術的課題に取り組むため、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え修復(HDR)の代わりとなる編集戦略を利用してmtDNA配列の標的化操作のための系を開発した。ゼブラフィッシュを迅速なin vivo試験系として使用したのは、その保存されたmtDNAゲノム(Broughtonら、Genome Res. 11:1958-1967, 2001)と、ゲノム編集ツールの効率的かつ定量的送達のための微量注入の容易さからである。mtDNA工学におけるTALEの使用は、in vivoタンパク質捕捉法(Clarkら、Nat. Methods 8:506-515, 2011)から開発された、単一の有効なミトコンドリア標的化配列(図6)を必要とする。この強力なゼブラフィッシュ・ミトコンドリア標的化配列を、ヌクレアーゼとニッカーゼの両形態のGoldyTALE骨格(Bedellら 上掲)に融合し、後者は、得られるmitoTALE-ニッカーゼは単一遺伝子欠失、ならびに分子的にヒト疾患のモデルとなるより大きなmtDNA突然変異を作製するためにmtDNAゲノムを直接操作することができるであろうという仮説のもと、そのFokI二量体の片方に突然変異を誘発して触媒的に不活性にする(D450A23、図7A)ことにより作製した。
【００６１】
ミトコンドリアDNA機能試験のために、1.2 kbのタンパク質をコードする遺伝子nd4の初期標的化を利用して、このアプローチが単一遺伝子欠失を生じうるかどうかを試験した。2つのmitoTALE-ニッカーゼを該nd4遺伝子の境界のすぐ内側に配置することで、欠失が注入胚の50％においてPCRにより容易に検出された(図7B)。このPCR産物の配列を決定し、mtDNA欠失が該mitoTALE-ニッカーゼ部位およびその付近に標的化されたことを確認した(図7Cおよび7D)。nd4は、このアプローチを利用するとあらゆる場合において欠失し、近接するDNAも同様に欠失した(図7D)。
【００６２】
多くのmtDNA疾患は、多重遺伝子欠失を繰り返すことにより引き起こされる。例えば、カーンズ・セイヤー症候群(KSS)などの疾患に見出される「共通欠失」は、nd5とatp8の間に位置する4977塩基対の欠失である(Moraesら、N. Engl. J. Med. 320:1293-1299, 1989；およびSchonら、Science 244:346-349, 1989)。この疾患を分子的にモデル化するために、mitoTALE-ニッカーゼをこれらの遺伝子内に配置し、さらに欠失をブリッジPCRおよび配列決定により検出した(図8A)。該ブリッジPCRは、2つのプライマーを該mitoTALE-ニッカーゼ部位の外側に配置し、かつ短い伸長時間を低く維持して全長野生型産物(5642 bp、図8A)の増幅を回避することにより、欠失mtDNA(約770 bp)を選択的に増幅するように設計した。この方法を利用すると、注入した動物のほぼ30％において欠失が検出され、また配列検証により、該mitoTALE-ニッカーゼ標的化部位の付近に欠失接合部(Δnd5/atp8-mtDNAゲノムと命名、図8Bおよび8C)が確認された。得られた欠失は、前記のnd4欠失と比較すると相対的により正確であり、配列決定した欠失接合部の5/10は該mitoTALE-ニッカーゼ結合部位またはスペーサー内にあった(図8Cおよび8D)。興味深いことに、これらの欠失のnd5接合部側はatp8側よりもより正確であった(図8D)。
【００６３】
ヌクレアーゼは、該ヌクレアーゼが結合する部位を有するゲノムを選択的に標的化および切断し、その結果それらの分解を駆動することにより、mtDNAヘテロプラスミーをシフトさせるのに有効である(Hashimotoら、Mol. Ther. 23:1592-1599, 2015)。この戦略がWT-mtDNAを選択的に標的化してニッカーゼにより誘導される播種(seeded)Δnd5/atp8-mtDNAゲノムを優先的に増やしうるかどうかを判定するために、完全なヌクレアーゼ(mitoTALEヌクレアーゼ)をnd4に対して設計し、WT-mtDNA中のnd5およびatp8 mitoTALE-ニッカーゼ標的部位の間に配置した(図9A)。nd5 mitoTALE-ニッカーゼ、atp8 mitoTALE-ニッカーゼ、およびnd4 mitoTALEヌクレアーゼの同時送達により、標準的なブリッジPCR条件を使用して検出可能な欠失を含む注入動物は90％を超えた(図9B)。これらの欠失は、ニッカーゼのみを注入した動物と配列が類似していた(図10)。ブリッジPCRを補完するための第2検出系として、長範囲PCRを利用することにより、任意の付随する欠失と一緒に野生型mtDNAを共増幅した(図9C)。該長範囲PCRにより、注入および非注入動物の両方においてWT-mtDNAが増幅されたが、一方でΔnd5/atp8-mtDNAゲノムはmitoTALE-ニッカーゼを同時注入した場合にのみ増幅された(図9C)。特に、突然変異-関連アンプリコンは、該mitoTALEヌクレアーゼを同様に注入した場合に、より大量に増幅された(図9C)。mitoTALE-ニッカーゼのみを注入した魚のヘテロプラスミーを、mitoTALE-ニッカーゼとmitoTALEヌクレアーゼの両方を注入したものと比較して定量化するために、3プライマーPCRの変法を利用した(Sciaccoら、Hum. Mol. Genet. 3:13-19, 1994)(図9A)。このアプローチでは、ブリッジPCRに陽性を示すmitoTALE-ニッカーゼのみを注入した動物におけるヘテロプラスミーの割合は、非注入動物に関するヘテロプラスミーの割合と区別できず(図9D)、このことは、初期播種過程中のΔnd5/atp8-mtDNAゲノムのコピー数が比較的低いことを示している。しかし、mitoTALEヌクレアーゼを追加的に注入し、かつブリッジPCRに陽性を示す動物は、ヘテロプラスミーの割合が実質的に増加した(約2％から約10％；図9D)。これらのデータは、該mitoTALEヌクレアーゼを導入した後のWT-mtDNAゲノムと比較した、Δnd5/atp8-mtDNAゲノムの数の増加を強く示唆していた。mtDNA枯渇についても評価したところ、前記のニッカーゼおよびヌクレアーゼを注入した後に中程度の正味損失(約20％)が認められた(図9E)。最後に、前記Δnd5/atp8-mtDNAゲノムの長期維持について、注入から6ヶ月後の注入動物のヒレを切り取る生検(fin-clipping biopsies)により評価した。欠失はmitoTALE-ニッカーゼとmitoTALEヌクレアーゼの両方を注入した動物の4/15に存在しており、その配列は注入胚で見出されるものと類似していた(図9F)。
【００６４】
同様の実験を、293細胞を使用し、A8ニッカーゼ、ND5ニッカーゼ、ND4ヌクレアーゼ、A8ニッカーゼとND5ニッカーゼの両方、またはA8ニッカーゼ、ND5ニッカーゼ、およびND4ヌクレアーゼの全てのトランスフェクションから5日後のDNA単離およびPCR解析により実施した。該ニッカーゼおよび／または該ヌクレアーゼは、Neon電気穿孔装置(Invitrogen)の100μLチップを使用して293T細胞にトランスフェクトした。100 ngの緑色蛍光タンパク質(GFP)を、効率的なトランスフェクションを保証するために各条件を用いてコトランスフェクトした。トランスフェクションは、500 ngのA8ニッカーゼ、500 ngのND5ニッカーゼ、1000 ngのND4ヌクレアーゼ、500 ngずつのA8およびND5ニッカーゼ、または500 ngずつのA8およびND5ニッカーゼと1000 ngのND4ヌクレアーゼ、またはGFP単独の送達により行った。細胞をトランスフェクション後の最初の20時間は30℃で増殖させた後、試料をトランスフェクションの4日後に採集するまで37℃に変更した。mtDNAはmtDNA単離キット(BioVision, Inc.)を使用して抽出した。各試料を50 ng／uLに希釈し、さらにMyTaq Redキット(Bioline)および1％アガロースゲルでの電気泳動を利用してPCRを実施することにより、mtDNA欠失を検出した。PCR産物を該ゲルから切り出し、Qiaex IIゲル単離キット(Qiagen)を使用して抽出し、その後配列決定用のTOPOベクター(Invitrogen)にクローニングした。標的配列およびプライマーは次の通りであった。
A8ニッカーゼ・フォワード標的配列:5’-ATTCCTCATCACCCA-3’(配列番号99)
A8ニッカーゼ・リバース標的配列:5’-AGGTGGTAGTTTGTG-3’(配列番号100)
ND5ニッカーゼ・フォワード標的配列:5’-CTCACCCTAACAGGT-3’(配列番号101)
ND5ニッカーゼ・リバース標的配列:5’-AATGTTAGTAAGGGT-3’(配列番号102)
ND4ヌクレアーゼ・フォワード配列:5’-CACAATCATGGCAAG-3’(配列番号103)
ND4ヌクレアーゼ・リバース配列:5’-GATAGTGGTTCACTG-3’(配列番号104)
フォワードプライマー:5’-CTCATGAGCTGTCCCCACATTAGGCTT-3’(配列番号105)
リバースプライマー:5’-GCGATGGAGGTAGGATTGGTGCTGTGG-3’(配列番号106)
【００６５】
PCR反応には、1μLの50ng／μL DNA (50 ng)、5μLのMyTaq Red用5x 緩衝液、0.5μLの20μMプライマーミックス、0.1μLのTaq(試料をサーモサイクラー内に置く場合に添加)、および18.4μLの水を含めた。サーモサイクラー条件には、95℃で10分間、Taqを添加する間は72℃で維持、(95℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で1分間)×35、次いで72℃で5分間、およびゲルを流すまで4℃で維持、を含めた。10μLの各PCR反応物を1％アガロースゲルで電気泳動した。
【００６６】
欠失は、A8ニッカーゼ、ND5ニッカーゼ、およびND4ヌクレアーゼをコトランスフェクトした場合にのみ、PCRにより検出された(図11A)。PCR産物の配列を決定することにより、各ニック部位に近接するヒトmtDNA欠失の場所を確認した。図11Bに示す配列内のダッシュは、欠失したヌクレオチドを示している。枠で囲んだ配列は、ニッカーゼ部位(例えば、フォワードTAL部位、リバースTAL部位、および15 bpのスペーサー配列)を示している。119 bpのギャップは、欠失接合部がA8ニック部位からどの程度離れているかを実証するためにA8側に示されている(図11B、下部配列)。
【００６７】
ミトコンドリアゲノムを正確に操作する能力は、この複雑な細胞小器官を理解する上で、またより精密な疾患モデルを作成するために、極めて重要である。本明細書中で検討した知見を踏まえると、ミトコンドリアDNA操作への2成分アプローチが有用であろう(図12)。１つ目の成分として、標的化mitoTALE-ニッカーゼを、所望の種欠失(seed deletion)を誘導するために使用する。2つ目の成分は、ヘテロプラスミーをシフトさせて前記の操作されたmtDNAゲノムを増大させるために、野生型ゲノム内の欠失する領域を標的とする適合mitoTALEヌクレアーゼを配置する。これは、前記mitoTALE-ニッカーゼの一過性発現後の前記mitoTALEヌクレアーゼの調節発現により、in vitroとin vivoの両方で達成することができる。かかるアプローチにより、示差的なヘテロプラスミーレベルを有する細胞の調整可能な産生が可能となるだろう。同様に、ヒト疾患を再現する複雑なin vivo動物モデル(ゼブラフィッシュから哺乳動物まで)を、本明細書中でゼブラフィッシュ試験系において実施したように、胚において標的mtDNA欠失を開始させるためのmitoTALE-ニッカーゼの１回限りの送達の後の、mitoTALEヌクレアーゼの時間的または空間的(臓器特異的)調節により、開発することができる。その上、この系は、突然変異がde novoで作製されかつその結果得られるヘテロプラスミーが調整可能であるため、重症疾患モデル(Fanら、Science 319:958-962, 2008)を作製するために前記の操作されたmtDNAに動物の生殖細胞系を通過させる必要性を回避できる場合がある。
【００６８】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の記載は例示することを意図したものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は添付の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２−１】
2018524992.tif 000003
【図２−２】
2018524992.tif 000004
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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