(57)【要約】本発明は、植物、動物、布帛、およびそれからの製品における微生物汚染または感染を低減するための組成物および方法を提供する。本発明は、ヒト感染を低減するための組成物および方法も提供する。特に、本発明は、１つの成分中の静菌性、殺菌性、静真菌性、または殺真菌性酵素と、別の成分中の酵素用の基質とを含む固体磁気ナノ粒子を提供する。組成物は、休止状態であり、水和および酸素に曝すと活性になる。
2018524283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．過酸化水素生成酵素およびフリーラジカル生成酵素を含む磁気ナノ粒子の自己組織化メソ多孔性凝集体を有する第１の成分と；
ｂ．前記過酸化水素生成酵素用の第１の基質および前記フリーラジカル生成酵素用の第２の基質を有する第２の成分と
を含む固体抗菌性組成物であって；
前記組成物が本質的に不活性であり、水和または酸素への前記第１および第２の成分の曝露により、前記組成物が活性化され、前記過酸化水素生成酵素用の前記基質が過酸化水素へと酸化され、前記過酸化水素が、前記フリーラジカル生成酵素用の基質として働き、静菌または殺菌活性を有する前記フリーラジカルが生成される固体抗菌性組成物。
【請求項２】
前記活性が、静菌性または殺菌性である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項３】
前記活性が、殺ウイルス性である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項４】
前記活性が、殺真菌性である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項５】
ａ．フリーラジカル生成酵素を含む磁気ナノ粒子の自己組織化メソ多孔性凝集体を有する第１の成分と；
ｂ．前記フリーラジカル生成酵素用の基質および過酸化水素源を有する第２の成分と
を含む液体抗菌性組成物であって；
前記組成物が本質的に不活性であり、前記第１および第２の成分を混合することにより、前記組成物が活性化され、前記過酸化水素源が、前記フリーラジカル生成酵素用の基質として働き、静菌または殺菌活性を有する前記フリーラジカルが生成される液体抗菌性組成物。
【請求項６】
前記第１の成分が、過酸化水素生成酵素をさらに含み、前記過酸化水素源が、前記過酸化水素生成酵素用の基質である、請求項５に記載の液体抗菌性組成物。
【請求項７】
前記活性が、静菌性または殺菌性である、請求項５または６に記載の抗菌性組成物。
【請求項８】
前記活性が、殺ウイルス性である、請求項５または６に記載の抗菌性組成物。
【請求項９】
前記活性が、殺真菌性である、請求項５または６に記載の抗菌性組成物。
【請求項１０】
前記第１および第２の成分が層である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項１１】
前記層のうちの１つが、他の前記層の内部にある、請求項１０に記載の抗菌性組成物。
【請求項１２】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体が、酸化鉄組成物を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項１３】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体が、磁気ナノ粒子の少なくとも９０％が、少なくとも３ｎｍおよび３０ｎｍ以下のサイズを有する磁気ナノ粒子サイズ分布、および磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体の少なくとも９０％が、少なくとも１０ｎｍおよび５００ｎｍ以下のサイズを有する凝集粒子サイズ分布を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項１４】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体が、少なくとも１０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記フリーラジカル生成酵素および過酸化水素生成酵素が、飽和容量の１００％以下で磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体に含まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記過酸化水素生成酵素が、オキシダーゼである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項１７】
前記オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼまたはアルコールオキシダーゼである、請求項１６に記載の抗菌性組成物。
【請求項１８】
前記過酸化水素生成酵素用の前記基質が、β−Ｄ−グルコースまたはアルコールである、請求項１〜４または６〜９のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項１９】
前記フリーラジカル生成酵素が、ペルオキシダーゼである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項２０】
前記ペルオキシダーゼが、ラクトペルオキシダーゼである、請求項１９に記載の抗菌性組成物。
【請求項２１】
前記ペルオキシダーゼが、ミエロペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、または甲状腺ペルオキシダーゼである、請求項１９に記載の抗菌性組成物。
【請求項２２】
前記ペルオキシダーゼ用の前記基質が、チオシアネート、ヨウ化物、または臭化物である、請求項１９に記載の抗菌性組成物。
【請求項２３】
前記フリーラジカル生成酵素が、次亜チオシアン酸塩、次亜ヨウ素酸塩、または次亜臭素酸塩を生成する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項２４】
前記フリーラジカル生成酵素が、前記内層中にある、請求項１１に記載の抗菌性組成物。
【請求項２５】
セルラーゼ酵素をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項２６】
前記セルラーゼ酵素が、エキソセルラーゼまたはエンドセルラーゼである、請求項２５に記載の抗菌性組成物。
【請求項２７】
前記セルラーゼ酵素が、前記抗菌性組成物の外層に組み込まれる、請求項２５に記載の抗菌性組成物。
【請求項２８】
前記第１の成分が、水溶性セルロース誘導体または水溶媒和性セルロース誘導体であるマトリックス材料をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項２９】
前記第２の成分が、水溶性セルロース誘導体または水溶媒和性セルロース誘導体であるマトリックス材料をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項３０】
前記マトリックス材料が、カルボキシメチルセルロースである、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項３１】
アルギネート誘導体またはキトサン誘導体をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む農産物。
【請求項３３】
請求項５〜９のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む液体殺有害生物剤製品。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む種子粉衣。
【請求項３５】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む改良種子。
【請求項３６】
前記種子が、野菜、果実、花および農作物からなる群から選択される、請求項３５に記載の改良種子。
【請求項３７】
前記野菜種子が、トマト、エンドウマメ、タマネギ、ニンニク、パセリ、オレガノ、バジル、コリアンダー、ニンジン、キャベツ、トウモロコシ、キュウリ、ダイコン、コショウ、ブロッコリー、カリフラワー、キュウリ、ホウレンソウ、ケール、チャード、アーティチョーク、およびレタスからなる群から選択される、請求項３６に記載の改良種子。
【請求項３８】
前記果実種子が、柑橘類、トマト、オレンジ、レモン、ライム、アボカド、クレメンタイン、リンゴ、カキ、西洋ナシ、モモ、ネクタリン、液果類、イチゴ、ラズベリー、ブドウ、ブルーベリー、ブラックベリー、サクランボ、アンズ、ウリ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、ズッキーニ、ナス、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ココナツ、グァバ、マンゴー、パパイヤ、メロン、ハネデューメロン、カンタロープ、スイカ、バナナ、プランテイン、パイナップル、マルメロ、ナナカマド、ビワ、プラム、スグリ、ザクロ、イチジク、オリーブ、核果類、堅果類、ピーナッツ、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ブラジルナッツ、ピスタチオ、およびマカダミアナッツからなる群から選択される、請求項３６に記載の改良種子。
【請求項３９】
前記農作物が、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、キャノーラ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、ヤムイモ、レンズマメ、インゲンマメ、キャッサバ、コーヒー、干し草、ソバ、オートムギ、オオムギ、ナタネ、スイッチグラス、エレファントグラス、ビート、サトウキビ、およびコメからなる群から選択される、請求項３６に記載の改良種子。
【請求項４０】
前記花種子が、一年生植物、多年生植物、球根、花をつける木質茎、カーネーション、バラ、チューリップ、ケシ、キンギョソウ、ユリ、キク、アイリス、アルストロメリア、ピンポンマム、フジ、およびストレリチアからなる群から選択される、請求項３６に記載の改良種子。
【請求項４１】
前記種子が、トマト種子である、請求項３６に記載の改良種子。
【請求項４２】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む動物の敷料。
【請求項４３】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む創傷包帯。
【請求項４４】
前記創傷包帯が包帯である、請求項３８に記載の創傷包帯。
【請求項４５】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を含む布帛。
【請求項４６】
植物製品の生産量を改善する方法であって、前記植物の植え付けまたは発芽の前またはその間に、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の改良種子を、水和および酸素化に曝す工程を含む方法。
【請求項４７】
動物製品の生産量を改善する方法であって、前記動物による使用の前または使用中に、請求項４２に記載の動物の敷料を、水和および酸素に曝す工程を含む方法。
【請求項４８】
前記水和が、前記動物の尿による、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物製品が、生きた動物、乳汁、肉、脂肪、卵、体液、血液、血清、抗体、酵素、レンネット、骨、動物副産物、および動物排泄物からなる群から選択される、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、カモ、ガチョウ、バッファロー、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、は虫類、両生類、オウム、インコ、オカメインコ、カナリア、ハト、コバト、および昆虫からなる群から選択される、請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
敗血症を低減する方法であって、請求項４４に記載の創傷包帯を創傷に施す工程を含む方法。
【請求項５２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を製造する方法であって、前記第１の成分を、水溶性セルロース誘導体、水溶媒和性セルロース誘導体、アルギネート誘導体、およびキトサン誘導体からなる群から選択されるマトリックス材料とともに配合する工程と、前記第２の成分を、水溶性セルロース誘導体、水溶媒和性セルロース誘導体、アルギネート誘導体、およびキトサン誘導体からなる群から選択されるマトリックス材料とともに配合する工程とを含む方法。
【請求項５３】
前記第１の成分が、噴霧乾燥、凍結乾燥、円筒乾燥、パルス燃焼式乾燥、または回転式種子粉衣にさらに供される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の成分が、噴霧乾燥、凍結乾燥、円筒乾燥、パルス燃焼式乾燥、または回転式種子粉衣にさらに供される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
微生物有害生物の増殖を低減するかまたはなくす方法であって、請求項５〜９のいずれか一項に記載の液体抗菌性組成物を含む物質を噴霧する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／１６３，０３２号、および２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５，７１３号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願は両方とも全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、植物、動物、布帛、およびそれからの製品における微生物汚染または感染を低減するための組成物および方法を提供する。本発明は、ヒト感染を低減するための組成物および方法も提供する。特に、本発明は、１つの成分中の静菌性、殺菌性、静真菌性、および殺真菌性酵素と、別の成分中の酵素用の基質とを含む固体磁気ナノ粒子を提供する。組成物は、休止状態であり、水和および酸素に曝すと活性になる。
【背景技術】
【０００３】
汚染性および感染性微生物は、世界的に、農産物および動物製品の生産量、品質、および安全性を著しく低下させる。結果として生じる経済的損失は、米国だけで年間数百億ドル規模である。さらに、動物の感染を低減するための現行の方法は、食物連鎖内に留まり、多剤耐性の「スーパー耐性菌」をもたらす、抗生物質の有害な過剰使用に依存している。これらの細菌は、医学的に重要な抗生物質の存在下で生存するように選択されており、人の健康にとって重大な脅威である。
【０００４】
種子は、農場、州、および国を越えて、植物病害を拡散し得る。このような病害の制御は、種子から開始し得る。種子処理は、細菌、ウイルス、および真菌などの病原体から種子を保護するべきである。したがって、高品質の無病種子が、より高い植物生産量および食品安全性を得るに当たって重要な部分である。
【０００５】
例えば、米国におけるトマトの生産は、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）によって引き起こされる病害である細菌性斑点病（ＢＬＳ）にひどく脅かされている。細菌性斑点病（ＢＬＳ）は、非常に大きな経済的損失をもたらす深刻な病害であり、この病原体は、フロリダ（Ｆｌｏｒｉｄａ）だけで生鮮トマト分野に毎年８，７００万ドルもの損失をもたらすことが報告されている。ＢＬＳは、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の主な種：Ｘ．エウベシカルトリア（Ｘ．ｅｕｖｅｓｉｃａｒｔｏｒｉａ）、Ｘ．ペルホランス（Ｘ．ｐｅｒｆｏｒａｎｓ）（すなわち、Ｘ．アクソノポディス病原型ベシカトリア（Ｘ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ））、Ｘ．ベシカトリア（Ｘ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）およびＸ．ガードネリ（Ｘ．ｇａｒｄｎｅｒｉ）によって引き起こされ、外来系統が最近導入された。
【０００６】
細菌感染は、葉および果実に個別の斑点（病変）を生じ、これにより、作物の生産量が減少される。宿主組織の細菌細胞侵入は、植物全体をしおれさせ、植物が光合成し、果実を実らせる能力を著しく低下させる。果実の斑点は、トマト果実中にそれほど深く貫通しないが、生鮮トマトの価値を低下させる。これは、消費者が一般に、隆起した疥癬状の黒色の斑点で覆われた果実および野菜を食べたがらないためである。さらに、二次感染を生じさせ、果実の腐敗を引き起こす病変に定着し得る様々な真菌および他の細菌がある。キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）は、熟した果実におけるＢＬＳの小数の事例を引き起こし得るが、作物の損失の大部分は、初期感染によって引き起こされ、初期感染は、落花および熟していない果実の落下につながる。
【０００７】
植物病原体は、種子、苗（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、球根および他の繁殖材料を含む繁殖材料の伝染によって広まることが多い。種子汚染は、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）（ＢＬＳの発生を引き起こす）の主な原因であるが、ボランティア宿主植物が別の感染源である。キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）は、１６．５ヶ月間超、おそらくさらに長い年数にわたって種子上および種子内で生存することができることが示されている。子葉、または胚葉は、汚染された種皮を有する種子から出てくるときに感染する。ごくわずかな種子が汚染されている場合でも、それらは、感染した苗が隣接する苗を感染させることになり、苗は成熟した植物より感染しやすいため、農場に破壊的な打撃を与えることがある。
【０００８】
植物病原体の防除は、高い生産量を維持するために、銅塩などの合成化学薬品に大きく依存している。しかしながら、人々は、農薬残留物が人の健康および環境に与える影響への高まる懸念を示している（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．５６（２）：１６７−７７（２００６）；Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｏｘ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  ９（６）：４４１−５６（２００６））。研究により、合成農薬を使用する農業従事者は、頭痛、疲労、不眠症、目まいおよび手の振戦を含むより多くの神経障害を抱えていることが示されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ／ｔｏｐｉｃｓ／ａｇｅｎｔｓ／ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ／）。農薬は、先天性異常、神経損傷、癌、精子の運動性の低下および急性中毒も引き起こし得る（Ｍｏｓｅｓ，ＡＡＯＨＮ  Ｊ．，３７（３）：１１５−３０（１９８９）；Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．，Ｏｃｃｕｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  ９（１）：３０−３９（２００３）；Ｃａｒｏｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１１６（４）：５５９−６５（２００８）；米国環境保護庁（Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ），２０１４，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ／ｆｏｏｄ／ｒｉｓｋｓ．ｈｔｍ）。
【０００９】
細菌性植物病原体はまた、抗生物質を用いて防除される。合成殺菌剤は、特に、人が摂取する作物に関する重大な懸念事項である。作物への合成殺菌剤の連続的な施用による抗生物質耐性細菌の発生は、ひいては生命に関わるヒト感染を引き起こし得る抗生物質耐性細菌の蓄積をもたらす。
【００１０】
したがって、植物病原体を防除するためのより安全で有効な代替手段に対する極めて大きなニーズがある。さらに、細菌性病原体からの作物の保護は、合成化学薬品および抗生物質を使用することができない有機栽培作物にとって特に難題である。
【００１１】
ヒトおよび家畜における抗生物質耐性は、新薬の開発によって抑えられ得ない速度で発達し、拡散している。家畜への抗生物質の定期的な投与の広く行き渡った実施は、この脅威の原因になる。世界で生産される抗生物質の約半分は、農業に使用されている。この使用の大半は、より速い成長を促進し、疾病を治療するよりむしろ予防する。家畜によって媒介される耐性微生物は、汚染された食品の摂取によって、動物との直接の接触から、または例えば汚染された水もしくは土壌中での環境による伝播によって、ヒトに伝播し得る。
【００１２】
例えば、乳腺炎は、乳房組織の損傷をもたらす、乳頭管の毒素放出細菌による感染に応答した乳腺の炎症反応である。これは、血管透過性を増大させ、乳汁産生の減少および乳組成の変化をもたらす。例えば、血液成分、血清タンパク質、および酵素が、乳汁中に漏出する。また、カゼイン、ラクトース、および脂肪の質の低下がある（Ｈａｒｍｏｎ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ７７（７）：２１０３−２１１２（１９９４）；Ｏｓｔｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｅｄｇｅ  Ａｃｔａ  Ｖｅｔ  Ｓｃａｎｄ  ４１（１）：６３−７７（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｍａｓｔｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｏｗｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２００９））。
【００１３】
乳腺炎は、「伝染性（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ）」および「環境性（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ）病原体の両方によって引き起こされる。伝染性病原体は、乳汁中のみに存在する細菌であり、搾乳工程中に感染していない乳房に伝播する。環境性病原体は、環境中に存在し、搾乳の間に乳房を感染させる。近年、乳腺炎を引き起こす細菌の疫学が変化した。主な伝染性病原体である、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は、多くの群れから根絶されたが、他の主要な伝染性病原体である、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、広く行き渡ったままであった。しかしながら、最も重要な変化は、環境性病原体（例えば、Ｓｔｒ．ウベリス（Ｓｔｒ．ｕｂｅｒｉｓ）、Ｓｔｒ．ディスガラクティエ（Ｓｔｒ．Ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．））によって引き起こされる乳腺炎が、著しく増加していることである（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｓｗｉｓｈｅｒ  ２００９；Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｌ．Ｂａｉｌｅｙ  ２００９）。
【００１４】
米国農務省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）によれば、乳腺炎は、米国のウシにおける抗生物質の使用の原因である主要な疾病である。（Ｋｅｒｒ，Ｄｒｙｉｎｇ−Ｏｆｆ  Ｌａｃｔａｔｉｎｇ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ，Ｓｍａｌｌ  Ｆａｒｍｓ  Ｖ（２０１０））。抗生物質のこの大量使用を考えると、乳腺炎は、人の健康上のリスクの増大に大きく寄与している。
【００１５】
同様に、鶏肉産業は、医学的に重要な薬剤分類に属する抗生物質を含む低レベルの予防的抗生物質をその動物に定期的に供給する。これは、疾病を回避することを企図しており、鳥類を大きくする。しかしながら、この慣行は、人の食物連鎖に行き着き得る薬剤耐性細菌を選択する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本明細書に記載される理由のため、微生物感染および家畜の汚染を制御する新規な方法に対する大きなニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、植物、動物、布帛、およびそれからの製品における微生物汚染または感染を低減するための組成物および方法を提供する。本発明は、ヒト感染を低減するための組成物および方法も提供する。特に、本発明は、１つの成分中の安定化された抗菌性酵素と、別の成分中の酵素用の基質とを含む固体磁気ナノ粒子を提供する。組成物は、休止状態であり、水和および酸素に曝すと活性になる。その後、酵素用の基質は、微生物およびウイルスの増殖を停止させるか、またはそれらを死滅させる過酸化水素およびフリーラジカルに転化される。
【００１８】
本発明は、安全で強力な酸化剤を用いた農業、工業、および医療上の微生物管理の新規な方法を提供する。本発明は、多くの感染性および腐敗性生物に対して有効である。
【００１９】
したがって、本発明は、過酸化水素生成酵素およびフリーラジカル生成酵素を含む磁気ナノ粒子の自己組織化メソ多孔性凝集体を有する第１の成分と；前記過酸化水素生成酵素用の第１の基質および前記フリーラジカル生成酵素用の第２の基質を有する第２の成分とを含む固体抗菌性組成物であって；前記組成物が本質的に不活性であり、水和または酸素への前記第１および第２の成分の曝露により、前記組成物が活性化され、前記過酸化水素生成酵素用の前記基質が過酸化水素へと酸化され、前記過酸化水素が、前記フリーラジカル生成酵素用の基質として働き、静菌または殺菌活性を有する前記フリーラジカルが生成される固体抗菌性組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、フリーラジカル生成酵素を含む磁気ナノ粒子の自己組織化メソ多孔性凝集体を有する第１の成分と；前記フリーラジカル生成酵素用の基質および過酸化水素源を有する第２の成分とを含む液体抗菌性組成物であって；前記組成物が本質的に不活性であり、前記第１および第２の成分を混合することにより、前記組成物が活性化され、前記過酸化水素源が、前記フリーラジカル生成酵素用の基質として働き、静菌または殺菌活性を有する前記フリーラジカルが生成される液体抗菌性組成物も提供する。
【００２１】
本発明のある実施形態において、抗菌性固体または液体組成物は、静菌性、殺菌性、殺ウイルス性、または殺真菌性である。
【００２２】
固体抗菌性組成物のある実施形態において、前記第１および第２の成分は層である。好ましい実施形態において、前記層のうちの１つは、他の層の内部にある。より好ましい実施形態において、フリーラジカル生成酵素は、前記内層中にある。
【００２３】
固体抗菌性組成物のある実施形態において、前記第１の成分は、水溶性セルロース誘導体または水溶媒和性セルロース誘導体であるマトリックス材料をさらに含む。固体抗菌性組成物の他の実施形態において、前記第２の成分は、水溶性セルロース誘導体または水溶媒和性セルロース誘導体であるマトリックス材料をさらに含む。好ましい実施形態において、前記マトリックス材料は、カルボキシメチルセルロースである。他の好ましい実施形態において、固体抗菌性組成物は、アルギネート誘導体またはキトサン誘導体をさらに含む。
【００２４】
本発明のある実施形態において、磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、酸化鉄組成物を有する。他の実施形態において、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、磁気ナノ粒子の少なくとも９０％が、少なくとも３ｎｍおよび３０ｎｍ以下のサイズを有する磁気ナノ粒子サイズ分布、および磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体の少なくとも９０％が、少なくとも１０ｎｍおよび５００ｎｍ以下のサイズを有する凝集粒子サイズ分布を有する。他の実施形態において、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、少なくとも１０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する。
【００２５】
本発明のある実施形態において、フリーラジカル生成酵素および過酸化水素生成酵素は、飽和容量の１００％以下で磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体に含まれる。
【００２６】
ある実施形態において、過酸化水素生成酵素は、オキシダーゼである。好ましい実施形態において、オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼまたはアルコールオキシダーゼである。他の実施形態において、前記過酸化水素生成酵素用の基質は、β−Ｄ−グルコースまたはアルコールである。
【００２７】
本発明のある実施形態において、フリーラジカル生成酵素は、ペルオキシダーゼである。好ましい実施形態において、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。他の好ましい実施形態において、ペルオキシダーゼは、ミエロペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、または甲状腺ペルオキシダーゼである。他の実施形態において、ペルオキシダーゼ用の基質は、チオシアネート、ヨウ化物、または臭化物である。他の好ましい実施形態において、フリーラジカル生成酵素は、次亜チオシアン酸塩、次亜ヨウ素酸塩、または次亜臭素酸塩を生成する。
【００２８】
本発明のある実施形態において、抗菌性組成物は、セルラーゼ酵素をさらに含む。好ましい実施形態において、セルラーゼ酵素は、エキソセルラーゼまたはエンドセルラーゼである。他の好ましい実施形態において、セルラーゼ酵素は、前記抗菌性組成物の外層に組み込まれる。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載される抗菌性組成物を含む農産物を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書に記載される抗菌性組成物を含む、液体殺有害生物剤、種子粉衣、および改良種子を提供する。
【００３０】
より好ましい実施形態において、本発明は、野菜、果実、花および農作物からなる群から選択される改良種子を提供する。
【００３１】
より好ましい実施形態において、前記野菜種子は、トマト、エンドウマメ、タマネギ、ニンニク、パセリ、オレガノ、バジル、コリアンダー、ニンジン、キャベツ、トウモロコシ、キュウリ、ダイコン、コショウ、ブロッコリー、カリフラワー、キュウリ、ホウレンソウ、ケール、チャード、アーティチョーク、およびレタスからなる群から選択される。
【００３２】
他のより好ましい実施形態において、前記果実種子は、柑橘類、トマト、オレンジ、レモン、ライム、アボカド、クレメンタイン、リンゴ、カキ、西洋ナシ、モモ、ネクタリン、液果類、イチゴ、ラズベリー、ブドウ、ブルーベリー、ブラックベリー、サクランボ、アンズ、ウリ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、ズッキーニ、ナス、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ココナツ、グァバ、マンゴー、パパイヤ、メロン、ハネデューメロン、カンタロープ、スイカ、バナナ、プランテイン、パイナップル、マルメロ、ナナカマド、ビワ、プラム、スグリ、ザクロ、イチジク、オリーブ、核果類、堅果類、ピーナッツ、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ブラジルナッツ、ピスタチオ、およびマカダミアナッツからなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、前記種子は、トマト種子である。
【００３３】
他のより好ましい実施形態において、前記農作物は、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、キャノーラ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、ヤムイモ、レンズマメ、インゲンマメ、キャッサバ、コーヒー、干し草、ソバ、オートムギ、オオムギ、ナタネ、スイッチグラス、エレファントグラス、ビート、サトウキビ、およびコメからなる群から選択される。
【００３４】
他のより好ましい実施形態において、前記前記花種子は、一年生植物、多年生植物、球根、花をつける木質茎、カーネーション、バラ、チューリップ、ケシ、キンギョソウ、ユリ、キク、アイリス、アルストロメリア、ピンポンマム、フジ、およびストレリチアからなる群から選択される。
【００３５】
本発明は、植物製品の生産量を改善する方法であって、前記植物の植え付けまたは発芽の前またはその間に、本明細書に記載される改良種子を水和および酸素化に曝す工程を含む方法を提供する。
【００３６】
本発明は、本明細書に記載される抗菌性組成物を含む動物の敷料（ｂｅｄｄｉｎｇ）を提供する。
【００３７】
本発明は、動物製品の生産量を改善する方法であって、前記動物による使用の前または使用中に、本明細書に記載される動物の敷料を、水和および酸素に曝す工程を含む方法をさらに提供する。好ましい実施形態において、前記水和は、前記動物の尿による。好ましい実施形態において、前記動物製品は、生きた動物、乳汁、肉、脂肪、卵、体液、血液、血清、抗体、酵素、レンネット、骨、動物副産物、および動物排泄物からなる群から選択され得る。他の好ましい実施形態において、前記動物は、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、カモ、ガチョウ、バッファロー、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、は虫類、両生類、オウム、インコ、オカメインコ、カナリア、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、コバト（ｄｏｖｅ）、および昆虫からなる群から選択され得る。
【００３８】
本発明は、本明細書に記載される抗菌性組成物を含む創傷包帯を提供する。好ましい実施形態において、創傷包帯は包帯である。他の実施形態において、本発明は、敗血症を低減する方法であって、本明細書に記載される創傷包帯を創傷に施す工程を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明は、本明細書に記載される抗菌性組成物を含む布帛を提供する。
【００４０】
本発明は、本明細書に記載される固体抗菌性組成物を製造する方法であって、前記第１の成分を、水溶性セルロース誘導体、水溶媒和性セルロース誘導体、アルギネート誘導体、およびキトサン誘導体からなる群から選択されるマトリックス材料とともに配合する工程と、前記第２の成分を、水溶性セルロース誘導体、水溶媒和性セルロース誘導体、アルギネート誘導体、およびキトサン誘導体からなる群から選択されるマトリックス材料とともに配合する工程とを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、前記第１の成分または前記第２の成分は、噴霧乾燥、凍結乾燥、円筒乾燥、パルス燃焼式乾燥、または回転式種子粉衣にさらに供される。
【００４１】
本発明は、微生物有害生物の増殖を低減するかまたはなくす方法であって、本明細書に開示される液体抗菌性組成物を含む物質を噴霧する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】固体抗菌性集合体および種子粉衣として使用されるときのその機能の略図。
【図２】遊離および固定化ダイズペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ（ＳＢ１＋ＧＯＸ−１）の速度が、指示薬としてのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄの酸化を用いて比較される。固定化により、フリーラジカルの生産効率が、遊離酵素の３倍増加された。
【図３】Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｅａｄ蛍光アッセイによって測定した５分後の溶液中の５×１０６個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に対するＬＰ系の有効性。様々な濃度のグルコースまたはＨ２Ｏ２を測定した。（Ａ）ＬＰ／ＧＯＸ固定化（斜線）対遊離（実線）。（Ｂ）ＬＰ固定化（斜線）対遊離（実線）。
【図４】固体集合体中のＳＢＰおよびＧＯＸが、インビトロでキサントモナス属（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ）を効率的に死滅させた。（Ａ）ＢＮＣ固定化酵素を、セルロースフィルム−懸濁基質と接触させた。（Ｂ）混合、水和、および増殖している細菌単層への曝露により、これらの集合体は、２４時間後にかなりの増殖阻害を示した。
【図５】７日後の固体集合体で粉衣されたトマト種子の発芽。発芽の阻害が観察されなかった。試験および対照種子は、８５％の発芽を示した。発芽率は、コムギアッセイにおいて１００％であった。
【図６】機械が、本発明の抗菌性組成物を用いて改良種子を製造する一実施形態の概略図。
【図７】固体抗菌性組成物および動物の敷料コーティングとして使用されるときのその機能の略図。
【図８】機械が、本発明の抗菌性組成物を用いて改良された動物の敷料を製造する一実施形態の概略図。
【図９】カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型１４１７１に対する０．１倍〜１０倍の酵素濃度の影響。
【図１０】カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型に対する基質濃度の影響。図１０Ａは、分析中の酵素集合体の配置を概略的に示す。図１０Ｂは、全ての基質濃度における増殖阻害を示す。
【図１１】病原性真菌トマト苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）に対する０．１倍〜１０倍の酵素濃度の影響。
【図１２】本発明の種子粉衣によってシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびクラビバクター属（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）病原体から保護されたトマト種子。酵素層は、１倍の酵素配合物および１倍の基質配合物を含んでいた。種子は、３連であった。図１２Ａは、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）１４０４５−８ｂを示す。図１２Ｂは、クラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）０６９０を示す。
【図１３】種子粉衣は、距離依存的にフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の２つの病原性種からトマト種子を保護した。種子粉衣は、１倍の酵素配合物および１倍の基質配合物を含んでいた。種子を３連で平板培養し、真菌接種材料から異なる距離で配置した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、植物、動物、布帛、およびそれからの製品における微生物汚染または感染を低減するための組成物および方法を提供する。これは、１つの成分中の自己組織化磁気ナノ粒子中の過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素およびフリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素と、別の成分中の酵素用の基質とを含む固体の多成分組成物によって初めて達成される。これらの磁気固定化酵素は、安定かつ不活性な固体または液体組成物中にあり得る。したがって、それらは、製品に組み込む前または後に貯蔵され得る。抗菌活性が必要とされるとき、これらの多成分組成物は、水和および／または酸素への曝露によって活性化される。ＨＰＰ酵素は、過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンを生成するように基質に作用する。ＦＲＰ酵素は、フリーラジカルを生成するように過酸化水素および１つまたは複数のさらなる基質に作用する。過酸化水素およびフリーラジカルは、抗菌特性を有する。代替的な実施形態において、過酸化水素は、過酸化水素生成酵素およびその基質の代わりに提供される。
【００４４】
封入されたペルオキシダーゼを含む自己組織化メソ多孔性ナノクラスターは、非常に活性でかつ堅固である。この技術は、組織の３つの統合されたレベルにおける、生化学、ナノテクノロジー、および生物工学の強力なブレンドである：レベル１は、磁気メソ多孔性ナノクラスターの合成のための磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）を用いたペルオキシダーゼおよびオキシダーゼ酵素の自己集合である。このレベルは、酵素を固定し、安定させるために、分子の自己封入（ｓｅｌｆ−ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）の機構を使用する。レベル２は、他のマトリックスへのＭＮＰの安定化である。レベル３は、レベル１＋２の送達のための製品の調整および包装である。酵素に吸着された磁気ナノ粒子の集合体は、本明細書において「バイオナノ触媒」（ＢＮＣ）とも呼ばれる。
【００４５】
ＭＮＰ固定化は、非常に活性でかつコスト効率の高いペルオキシダーゼを提供する。ペルオキシダーゼは、非常に強力な酵素であるが、過剰な過酸化物の存在下における強い阻害のため、工業環境に配備するのが難しいことで有名である。ＮＰは、過酸化活性を増大し、それらの阻害を低下させ、それにより、ＮＰは、工業的に有用になる。さらに、ＭＮＰは、温度、イオン強度およびｐＨなどの動作条件のより広い範囲を可能にする。（ＭＮＰのサイズおよび磁化は、ＮＰの形成および構造に影響を与え、その全てが、封入された酵素の活性に大きな影響を与える。様々な反応条件下でのそれらの驚くべき回復力により、ＭＮＰは、他の作用物質が現在使用されている場合、改良された酵素的または触媒的作用物質として使用され得る。さらに、ＭＮＰは、酵素が適用可能であるとまだ見なされていないかまたは判断されていない場合、他の用途に使用され得る。
【００４６】
ＢＮＣは、磁気ナノ粒子間の格子間の隙間であるメソ細孔を含有する。酵素は、好ましくは、ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部中に埋め込まれるかまたは固定される。本明細書において使用される際、「磁気」という用語は、永久磁性、超常磁性、常磁性、強磁性、およびフェリ磁性挙動を含むあらゆるタイプの有用な磁気特性を包含する。
【００４７】
磁気ナノ粒子またはＢＮＣは、ナノスケール、すなわち、一般に５００ｎｍ以下のサイズを有する。本明細書において使用される際、「サイズ」という用語は、磁気ナノ粒子が大体またはほぼ球形であるとき、磁気ナノ粒子の直径を指し得る。磁気ナノ粒子が、大体またはほぼ球形でない（例えば、ほぼ卵形または不規則である）場合、「サイズ」という用語は、最も長い寸法または磁気ナノ粒子の３次元の平均のいずれかを指し得る。「サイズ」という用語はまた、磁気ナノ粒子の集団にわたるサイズの平均（すなわち、「平均サイズ」）を指し得る。
【００４８】
異なる実施形態において、磁気ナノ粒子は、正確に、約、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、もしくは１ｎｍ以下、または未満のサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つによって境界される範囲内のサイズを有する。
【００４９】
ＢＮＣにおいて、個別の磁気ナノ粒子は、上に示されるサイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、初晶）であると見なされ得る。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体は、ナノ粒子よりサイズが大きく、一般に、少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。異なる実施形態において、凝集体は、正確に、約、少なくとも、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、もしくは８００ｎｍ超、以下、または未満のサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つによって境界される範囲内のサイズを有する。［００３６］
【００５０】
典型的に、一次および／または凝集磁気ナノ粒子またはそのＢＮＣは、サイズの分布を有し、すなわち、それらは、一般に、サイズが分散され、狭くまたは広く分散される。異なる実施形態において、一次または凝集体サイズの任意の範囲が、一次または凝集体サイズの全範囲の大きなまたは小さな割合を占め得る。例えば、ある実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、少なくとも約１、２、３、５、もしくは１０ｎｍおよび約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ以下）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、少なくとも約５、１０、１５、もしくは２０ｎｍおよび約５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍ以下）は、一次粒径の全範囲の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５、もしくは１０ｎｍ未満、または約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約２０、１０、もしくは５ｎｍ未満、または約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下または未満を占める。
【００５１】
磁気ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）またはそのＢＮＣは、それらを構成する個々の初晶の量に応じて、多孔性の相当の欠如を含む任意の多孔度を有し得る。特定の実施形態において、凝集体は、格子間のメソ細孔（すなわち、充填配置によって形成される、一次磁気ナノ粒子間に位置するメソ細孔）を含有することによってメソ多孔性である。メソ細孔は、一般に、少なくとも２ｎｍかつ５０ｎｍ以下のサイズである。異なる実施形態において、メソ細孔は、正確にまたは約、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍの細孔径、または上記の例示的な細孔径のいずれか２つによって境界される範囲内の細孔径を有し得る。粒径の場合と同様に、メソ細孔は、典型的に、サイズの分布を有し、すなわち、それらは、一般に、サイズが分散され、狭くまたは広く分散される。異なる実施形態において、メソ細孔径の任意の範囲が、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の大きなまたは小さな割合を占め得る。例えば、ある実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、少なくとも約２、３、もしくは５、および８、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｎｍ以下）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４、もしくは５ｎｍ未満、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下または未満を占める。
【００５２】
磁気ナノ粒子は、当該技術分野において公知の組成物のいずれかを有し得る。ある実施形態において、磁気ナノ粒子は、磁性であるゼロ価の金属部分であるかまたはそれを含む。このようなゼロ価の金属のいくつかの例としては、コバルト、ニッケル、および鉄、ならびにそれらの混合物および合金が挙げられる。他の実施形態において、磁気ナノ粒子は、コバルト、ニッケル、もしくは鉄、またはそれらの混合物の酸化物などの、磁性金属の酸化物であるかまたはそれを含む。ある実施形態において、磁気ナノ粒子は、明確なコアおよび表面部分を有する。例えば、磁気ナノ粒子は、鉄、コバルト、またはニッケル元素で構成されるコア部分および金、白金、パラジウム、または銀の層などの、金属酸化物または貴金属コーティングなどの、不動態化層で構成される表面部分を有し得る。他の実施形態において、金属酸化物磁気ナノ粒子またはその凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆される。貴金属コーティングは、例えば、磁気ナノ粒子表面上の電荷数を減少させ得、それにより、溶液中の分散性を有益に高め、ＢＮＣのサイズを良好に制御し得る。貴金属コーティングは、酸化、浸出によるかまたはシトレート、マロネート、もしくはタートレートなどの有機酸をキレートするときはキレートによる可溶化から磁気ナノ粒子を保護し、生化学反応または過程に使用される。不動態化層は、任意の好適な厚さ、特に、少なくとも、約、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、または１０ｎｍ以下、または未満、またはこれらの値のいずれか２つによって境界される範囲内の厚さを有し得る。
【００５３】
本発明に有用な磁性材料は、当該技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイトまたは磁鉄鉱）、コバルト、およびニッケルなどの鉱石を含む強磁性体および強磁性材料を含む。他の実施形態において、希土類磁石が使用される。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素などが挙げられる。さらに他の実施形態において、磁石は、複合材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライト、およびアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態において、磁気ナノ粒子は、酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、当該技術分野において公知の磁性または超常磁性酸化鉄組成物、例えば、マグネタイト（ＦｅｓＯ／Ｏ、赤鉄鉱（α−Ｆｅ２θ  ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｃ＞３）、または式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａが二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、またはそれらの組合せ）であり、Ｂが三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋、またはそれらの組合せ）である）で表されるスピネルフェライトのいずれかであり得る。
【００５４】
個別の磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な磁性度を有する。例えば、磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ骨格集合体は、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｅｍｕ／ｇ以下の飽和磁化（Ｍｓ）を有し得る。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−骨格集合体は、好ましくは、５ｅｍｕ／ｇ以下（ｎｏ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）（すなわち、以下（ｕｐ  ｔｏ））または未満、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇ、もしくは０．１ｅｍｕ／ｇ以下または未満の残留磁化（Ｍｒ）を有する。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−骨格集合体の表面磁場は、約または少なくとも、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ガウス（Ｇ）、または上記の値のいずれか２つによって境界される範囲内の磁場であり得る。微粒子が含まれる場合、微粒子はまた、上記の磁気強度のいずれかを有し得る。
【００５５】
磁気ナノ粒子またはその凝集体は、得られるＢＮＣを生成するために、用途に応じて、飽和レベル以下または未満の好適な量の酵素を吸着するように作製され得る。異なる実施形態において、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｐｍｏｌ／ｍ２以下、または未満の酵素を吸着し得る。あるいは、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、飽和レベルの約、少なくとも、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％以下、または未満である量の酵素を吸着し得る。
【００５６】
本発明の抗菌性集合体は、幅広い病原体に対して有効であり得る。ある実施形態において、病原体としては、アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）、カンジダツス・リベリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）、カンジダツス・ファイトプラズマ・ソラニ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｏｌａｎｉ）、クラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、ディッケヤ・ダダンチ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）、エルウィニア・プシディ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｐｓｉｄｉｉ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ペクトバクテリウム・ベータバスキュロラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｅｔａｖａｓｃｕｌｏｒｕｍ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム亜種ベータバスキュロラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｂｅｔａｖａｓｃｕｌｏｒｕｍ）、ペクトバクテリウム・ワサビアエ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗａｓａｂｉａｅ）、ファイトプラズマ（Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ）、シュードモナス・アミグダリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）、シュードモナス・アスプレニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｓｐｌｅｎｉｉ）、シュードモナス・カリカパパヤエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）、シュードモナス・シクホリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス・コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・コルゲート（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔｅ）、シュードモナス・フィクセレクタエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）、シュードモナス・フラベッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フスコバギナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）、シュードモナス・ヘリアンチ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ）、シュードモナス・マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、シュードモナス・オリジハビタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）、シュードモナス・パレロニアナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｌｅｒｏｎｉａｎａ）、シュードモナス・パパベリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｐａｖｅｒｉｓ）、シュードモナス・サロモニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｏｍｏｎｉｉ）、シュードモナス・サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｍａｔｏ）、シュードモナス・ツルビネラエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂｉｎｅｌｌａｅ）、シュードモナス・ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、キジラミ萎黄いおう病菌（Ｐｓｙｌｌｉｄ  ｙｅｌｌｏｗｓ）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、スピロプラズマ・シトリ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｃｉｔｒｉ）、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ）、およびキシレラ・ファスティディオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）などの病原性植物細菌種が挙げられる。
【００５７】
他の実施形態において、抗菌性集合体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉ  ａｓｐ．）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ヘモフィラス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）、およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ．）を含む非植物病原体細菌に対して有効である。
【００５８】
他の実施形態において、抗菌性集合体は、アスシジウム属（Ａｓｃｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．）、ナラタケ属（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｓｐ．）、アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌｏａｒｉｓ）、ヤケイロタケ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ｓｐ．）、ボトリティス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ    ｓｐ．）、セラトバシジウム属（Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、セルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、クリシミキサ属（Ｃｈｒｙｓｉｍｙｘａ  ｓｐ．）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐ．）、コレオスポリウム属（ｃｏｌｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、シリンドロクラジウム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．）、シトスポラ属（Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、ジアポルテ属（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐ．）、ディディメラ属（Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ  ｓｐ．）、ドレクスレラ属（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｓｐ．）、エリシフェ属（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｓｐ）、エキソバシジウム属（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、ジムノスポランギウム属（Ｇｙｍｎｏｓｐｒａｇｉｕｍ  ｓｐ．）、ヘリコバシジウム属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、カワウソタケ属（Ｉｎｏｎｏｔｕｓ  ｓｐ．）、レプトスファエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）、レウコストマ属（Ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａ  ｓｐ．）、ホウライタケ属（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ  ｓｐ．）、ミクロスパエラ属（Ｍｉｃｒｏｓｐａｅｒａ  ｓｐ．）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、ミコスファエレラ属（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｓｐ．）、オイディウム属（Ｏｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、パサロラ属（Ｐａｓｓａｌｏｒａ  ｓｐ．）、ペスタロチオプシス属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ファエオラムラリア属（Ｐｈａｅｏｒａｍｕｌａｒｉａ  ｓｐ．）、フォーマ属（Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．）、フィロスチカ属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃａ  ｓｐ．）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｓｐ．）、シュードセルコスポラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、プッチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉ  ａｓｐ．）、ピレノフォラ属（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐ．）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、クモノスカビ属（ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、スファセロマ属（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ  ｓｐ．）、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｓｐ．）、スティグミナ属（Ｓｔｉｇｍｉｎａ  ｓｐ．）、チレチア属（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｓｐ．）、チフラ属（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐ．）、ウロマイセス属（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐ．）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）など��属を含む植物病原体真菌に対して有効である。
【００５９】
他の実施形態において、本発明は、モザイクウイルス（Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）、モットルウイルス（Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）、ベゴモウイルス（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、カーラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）、カーモウイルス（Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ）、クリニウイルス（Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ファバウイルス（Ｆａｂａｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、マクロモウイルス（Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ）、マクルラウイルス（Ｍａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓ）、ネクロウイルス（Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ポテクスウイルス（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）、テヌイウイルス（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）、およびトスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）などの植物ウイルスを含む植物ウイルスに対して有効である。
【００６０】
磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な細孔容積を有する。例えば、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、もしくは１ｃｍ３／ｇ以下、または未満の細孔容積、または上記の値のいずれか２つによって境界される範囲内の細孔容積を有し得る。［００５２］磁気ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁気ナノ粒子またはその凝集体は、約、少なくとも、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｍ２／ｇ以下、または未満の比表面積を有し得る。
【００６１】
ＭＮＰ、それらの構造、組織、好適な酵素、および使用が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットに記載されている。
【００６２】
ある実施形態において、本発明は、過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素を提供する。特定の実施形態において、ＨＰＰ酵素は、ＥＸ  １．１．３亜属のものであり得るオキシダーゼである。特定の実施形態において、オキシダーゼは、ＥＣ  １．１．３．３（リンゴ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．４（グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．５（ヘキソースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．６（コレステロールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．７（アリール−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．８（Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．９（ガラクトースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１０（ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１１（Ｌ−ソルボースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１２（ピリドキシン４−オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１３（アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１４（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１５（２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１６（エクジソンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１７（コリンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１８（第二級アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１９（４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２０（長鎖アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２１（グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２２、ＥＣ  １．１．３．２３（チアミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２４（Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２５、ＥＣ  １．１．３．２６、ＥＣ  １．１．３．２７（ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２８（ヌクレオシドオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２９（Ｎアシルヘキソサミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３０（ポリビニルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３１、ＥＣ  １．１．３．３２、ＥＣ  １．１．３．３３、ＥＣ  １．１．３．３４、ＥＣ  １．１．３．３５、ＥＣ  １．１．３．３６、ＥＣ  １．１．３．３７  Ｄ−アラビノノ−ｌ，４−ラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３８（バニリルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３９（ヌクレオシドオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２形成性）、ＥＣ  １．１．３．４０（Ｄ−マンニトールオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１．３．４１（キシリトールオキシダーゼ）であり得る。
【００６３】
本発明は、固体抗菌性組成物の一連の成分のうちの１つの中にフリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素を提供する。ある実施形態において、ＦＲＰは、ペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼは、生体系において広く見られ、フェノールから芳香族アミンに及ぶ幅広い芳香族化合物を酸化するために、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水へと還元する酸化還元酵素のサブセットを形成する。
【００６４】
ペルオキシダーゼは、亜属ＥＣ  １．１１．１に属する。特定の実施形態において、ＥＣ  １．１１．１酵素は、ＥＣ  １．１１．１酵素は、より詳細には、例えば、ＥＣ  １．１１．１．１（ＮＡＤＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．２（ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．３（脂肪酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．４、ＥＣ  １．１１．１．５（シトクロム−ｃペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．６（カタラーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．７（ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．８（ヨウ化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．９（グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１０（塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１１（Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１２（リン脂質−ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１３（マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１４（ジアリールプロパンペルオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１１．１．１５（ペルオキシレドキシン）であり得る。
【００６５】
他の実施形態において、ペルオキシダーゼはまた、機能によってさらに特定されてもよく、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、または万能ペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼはまた、真菌、微生物、動物、または植物ペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、クラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ピーナッツペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、カブペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、トマトペルオキシダーゼ、オオムギペルオキシダーゼ、またはペルオキシダシンとして特定され得る。これらの特定の実施形態において、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。
【００６６】
ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ（ＬＰ／ＧＯＸ）抗菌系は、乳汁、唾液、涙液、および粘液などの体液中に天然に存在する（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００））。この系は、哺乳動物および高等生物に無害な２つの天然化合物であるチオシアネート（ＳＣＮ−）およびヨウ化物（Ｉ−）を用いる（Ｗｅｌｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５８７（２０１１））。ＬＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で、それぞれ次亜チオシアン酸塩（ＯＳＣＮ−）および次亜ヨウ素酸塩（ＯＩ−）へのチオシアネートおよびヨウ化物イオンの酸化を触媒する。この系中のＨ２Ｏ２は、酸素の存在下で、β−Ｄ−グルコースに対するＧＯＸの活性によって提供される。これらのフリーラジカル化合物は、ひいては、微生物の細胞膜中のスルフヒドリル基を酸化し（Ｐｕｒｄｙ，Ｔｅｎｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），１１８７（１９８３）；Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００）、これは、膜透過性の低下（Ｗａｎ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３６２，３５５−３６２（２００１））および最終的に微生物細胞死につながる。次亜チオシアン酸塩および次亜ヨウ素酸塩の２０μＭ程度の濃度が、細胞増殖の阻害をもたらすことができる（Ｂｏｓｃｈ，ｖａｎ  Ｄｏｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＬＰ／ＧＯＸ系は、それ自体でチオシアネートに有効であり；ヨウ化物と組み合わされるとき、生物静力学的および殺生物的活性を促進し、かつグラム陰性菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ））、グラム陽性菌（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．））、および真菌（例えば、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３（３），８００−８０７（１９７６）；Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００）；Ｗｅｌｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５８７（２０１１））を含む感受性標的範囲を拡大する相乗効果がある。さらに、ＬＰ／ＧＯＸ系は、２つの段階で機能する：（１）細胞膜における次亜チオシアン酸塩および次亜ヨウ素酸塩の生成および作用、および次に、これらの化合物を使い果たしたとき、（２）過剰なＨ２Ｏ２が増大し、細胞構造におけるそれ自体の酸化的損傷を成立させる（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７６）。上記の参考文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【００６７】
酵素系は、歯磨き粉および乳汁の防腐剤（ａｎｔｉ−ｓｐｏｉｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などのバイオフィルム制御産業において展開され、承認されている。この系は、概して非特異的であり、わずかな反応要件で堅固である。１つの研究により、２ヶ月に１回の再接種を１８ヵ月間行った後のグラム（−）および（＋）細菌およびＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する持続的な生物静力学的および殺生物的活性が判明した（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００））。有効なｐＨ範囲は、３〜７であり、ｐＨ５でピークＬＰ活性を有する（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７６；Ｐｕｒｄｙ，Ｔｅｎｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）。より高い活性は、典型的に、ｐＨ３で細菌に対して見られるが、これは、低いｐＨによる増殖の阻害に起因する可能性が高い（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７６）。ｐＨ以外に、ＬＰ／ＧＯＸ系の活性のための唯一の厳しい要件は、酸素の存在であり、酸素なしでは、ＧＯＸは、グルコースからＨ２Ｏ２を生成することができない。上記の参考文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【００６８】
ＬＰ／ＧＯＸは、細菌および真菌を含む微生物用の殺有害生物剤として記載されている（全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，４４７，８１１号明細書を参照）。したがって、ある実施形態において、本明細書に記載される本発明は、固体または液体配合物中の磁気固定化殺有害生物剤を提供する。殺有害生物剤は、フリーラジカルを生成するペルオキシダーゼ酵素を含む。ある実施形態において、ペルオキシダーゼ酵素は、ラクトペルオキシダーゼである。殺有害生物剤は、グルコースを酸化する酵素を含み得る過酸化物源をさらに含む。
【００６９】
本発明は、不活性な磁気固定化酵素を提供する。酵素は、それらが水、酸素、基質、またはそれらの任意の組合せに曝されないため、不活性であり得る。本発明の好ましい実施形態において、磁気固定化酵素は、油基剤中である。これにより、使用前の酵素活性が抑制される。固定化酵素の活性化は、水和および／または酸素への曝露の際に起こる。より好ましい実施形態において、磁気固定化酵素は、水中油型乳剤を形成するために水溶液中で油を乳化するための作用物質を含む油基剤中である。別のより好ましい実施形態において、油は、鉱油、植物油、または動物油である。例示的な鉱油としては、パラフィン油および灯油タイプの油が挙げられる。例示的な動物油としては、ニシン油およびサバ油などの魚油が挙げられる。植物油の例は、ピーナッツ油、ゴマ油、ナタネ油、アマニ油、ヒマシ油、大豆油、トウモロコシ胚芽油、および綿実油である。
【００７０】
他の実施形態において、表面上の磁気固定化酵素の分配をさらに促進するために、当該技術分野において公知の１つまたは複数の展着剤が、組成物または油基剤にさらに加えられ得る。ある実施形態において、展着剤は、非イオン性（ｎｏｎ−ｉｏｎｏｇｅｎｉｃ）表面張力低下物質である。好ましい実施形態において、展着剤は、エトキシ化アルコールおよびホスファチジル脂質である。
【００７１】
他の実施形態において、１つまたは複数の接着剤が加えられ得る。接着剤は、磁気固定化酵素が、雨または他の条件によって植物から洗い流されるのを防ぐのに役立ち得る。接着剤は、当該技術分野において周知である。例は、デンプン、キサンタンガム、アラビアゴムおよびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などのゴムである。
【００７２】
組成物は、噴霧、散布、霧化、オーバーヘッド噴霧、散水、浸漬、および細流かんがいによって適用され得る。組成物を適用するための特に有利な方法は、小規模の方法（ミストシステム）および大規模の方法の両方によって噴霧している。細流かんがいは、ロックウールおよび他の増殖基質上の培養系に使用され得る。本発明に係る磁気固定化酵素はまた、細流かんがいシステムを消毒するのに使用され得る。最後の両方の場合、油基剤の存在は、最適活性のために厳密に必要なわけではない。組成物を含む浴への浸漬が、植物部位、特に、球根、塊茎、果実などの収穫可能な部位の処理に特に好適である。
【００７３】
磁気固定化酵素は、様々な形態で商業的に利用可能にされ得る。好ましい実施形態において、ペルオキシダーゼ活性は、製品の保存期間を増大するため、できるだけ長く遅らせられる。酵素活性は、水和（すなわち水）および酸素への曝露の際に開始する。本発明の場合、グルコースオキシダーゼ／グルコース系は、過酸化水素供与体である。より好ましい実施形態において、過酸化水素供与体は、ペルオキシダーゼとは別々に提供される。さらに、油基剤および展着剤はまた、必要に応じて、別々に包装され得る。
【００７４】
別の実施形態において、組成物を形成するためのキットが提供され、キットは、ペルオキシダーゼ（例えばラクトペルオキシダーゼ）および過酸化水素供与体（例えばグルコースオキシダーゼおよびグルコース）を含む任意選択的に濃縮された酵素組成物を含む。好ましい実施形態において、キットは、チオシアネート、ヨウ化物、油、乳化剤、または展着剤をさらに含み得る。より好ましい実施形態において、成分は、使用前に互いに混合される。別の実施形態において、キットは、使用前または使用と同時の希釈または水和のために濃縮形態の１つまたは複数の成分を含み得る。
【００７５】
β−Ｄ−グルコースがＨ２Ｏ２に酸化されるか、またはセルロース由来の糖がＨ２Ｏ２に酸化される実施形態において、セルラーゼ酵素に、本発明の組成物が提供される。ある実施形態において、種子粉衣は、セルラーゼをさらに含む。
【００７６】
ある実施形態において、セルラーゼは、エキソセルラーゼ、エンドセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、または当該技術分野において公知のそれらの組合せである。エンドセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）は、新しい鎖端を生成する非晶質部位において内部結合をランダムに切断する。エキソセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）は、エンドセルラーゼによって生成される露出された鎖の末端から２〜４つの単位を切断し、四糖類または二糖類（セロビオースなど）をもたらす。２つの主なタイプのエキソセルラーゼ［またはセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）］があり−ＣＢＨＩは、還元末端から前進的に（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅｌｙ）機能し、ＣＢＨＩＩは、セルロースの非還元末端から前進的に機能する。セロビアーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）またはβ−グルコシダーゼは、エキソセルラーゼ製品を個々の単糖類へと加水分解する。酸化的セルラーゼは、例えばセロビオースデヒドロゲナーゼ（受容体）として、ラジカル反応によってセルロースを解重合する。セルロースホスホリラーゼは、水の代わりにホスフェートを用いてセルロースを解重合する。
【００７７】
他の実施形態において、エンドセルラーゼは、ＥＣ  ３．２．１．４、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ、セルラーゼＡ、セルロシンＡＰ、エンドグルカナーゼＤ、アルカリセルラーゼ、セルラーゼＡ３、セルデキストリナーゼ、９．５セルラーゼ、アビセラーゼ、パンセラーゼＳＳ、および１，４−（１，３、１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ）を含み得る。セルラーゼ酵素は、典型的に、真菌、細菌、およびセルロースの原生動物）によって産生される。エンドグルカナーゼの別名は：エンド−１，４−β−グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅ）、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ、およびセルデキストリナーゼである。
【００７８】
ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、本発明に使用される酵素を発現する組み換え細胞を使用する。組み換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において公知である。ある実施形態において、細胞は、酵素を発現するプラスミドなどの発現ベクターにより形質転換される。他の実施形態において、ベクターは、例えば、転写開始、転写終結、翻訳開始および翻訳終結のための、１つまたは複数の遺伝子シグナル（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ）を有する。本明細書において、酵素をコードする核酸は、好適な宿主生物へと適切に形質転換されるときにそれが発現されるようにベクター中でクローン化され得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において周知であるように、細菌、真菌、植物、または動物に由来し得る。
【００７９】
ある実施形態において、本発明は、マトリックス材料がバイオポリマーであると規定している。例としては、多糖類（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、およびアルギン酸）、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸が挙げられる。他の実施形態において、マトリックス材料は、水溶性セルロース誘導体、水溶媒和性セルロース誘導体、アルギネート誘導体、およびキトサン誘導体である。
【００８０】
ある実施形態において、マトリックスは、セルロースを含む。セルロースは、数百から何千ものβ（１→４）結合Ｄ−グルコース単位の線状鎖からなる多糖である、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎを有する有機化合物である。本発明に使用されるセルロースは、植物、藻類、または微生物源から得られるかまたはそれに由来し得る。ある実施形態において、本発明は、当該技術分野において公知のセルロース誘導体を提供する。セルロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）は、当該技術分野において公知の試薬と部分的にまたは完全に反応され得る。好ましい実施形態において、セルロース誘導体は、セルロースエステルおよびセルロースエーテル（−ＯＲ）である。より好ましい実施形態において、セルロース誘導体は、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸酪酸セルロース（ＣＡＢ）、ニトロセルロース（硝酸セルロース）、硫酸セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）である。
【００８１】
ある実施形態において、マトリックスは、カルボキシメチルセルロースを含む。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）またはセルロースガム［１］は、セルロース骨格を構成するグルコピラノースモノマーのヒドロキシル基のいくつかに結合されたカルボキシメチル基（−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）を有するセルロース誘導体である。それは、当該技術分野において公知の技術を用いて、例えば、セルロースとクロロ酢酸とのアルカリ触媒反応によって合成される。極性（有機酸）カルボキシル基は、セルロースを、可溶性かつ化学反応性にする。ＣＭＣの機能特性は、セルロース構造の置換度（すなわち、いくつのヒドロキシル基が置換反応に関与しているか）、ならびにセルロース骨格構造の鎖長およびカルボキシメチル置換基のクラスター度に応じて決まる。
【００８２】
ある実施形態において、マトリックスは、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含む。ＨＰＣは、水溶性および有機溶解性の両方を有するセルロースの誘導体である。ＨＰＣは、繰り返しグルコース単位中のヒドロキシル基のいくつかが、プロピレンオキシドを用いてヒドロキシプロピル化されて、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３基を形成するセルロースのエーテルである。グルコース単位当たりの置換ヒドロキシル基の平均数は、置換度（ＤＳ）と呼ばれる。完全置換は、３のＤＳを提供するであろう。付加されるヒドロキシプロピル基がヒドロキシル基を含むため、これは、ＨＰＣの調製の際にエーテル化され得る。これが起こるとき、グルコース環当たりのヒドロキシプロピル基のモル数である、モル置換度（ＭＳ）は、３より高くなり得る。セルロースは非常に結晶性であるため、ＨＰＣは、水への良好な溶解度を達成するために約４のＭＳを有さなければならない。ＨＰＣは、疎水性基および親水性基の組合せを有するため、４５℃で下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有する。ＬＣＳＴ未満の温度で、ＨＰＣは、水に容易に溶解し；ＬＣＳＴ超で、ＨＰＣは溶解しない。ＨＰＣは、水中のその濃度に応じて、液晶および多くの中間相を形成する。このような中間相は、等方性、異方性、ネマチックおよびコレステリック中間相を含む。最後の中間相は、紫色、緑色および赤色などの多くの色を与える。
【００８３】
ある実施形態において、マトリックスは、メチルセルロースを含む。メチルセルロース（Ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（またはメチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ））は、セルロースから誘導される。メチルセルロースは、純粋形態で親水性の白色の粉末であり、（温水ではなく）冷水に溶解されて、透明の粘性溶液またはゲルを形成する。メチルセルロースは、天然に存在せず、セルロースを、苛性アルカリ溶液（例えば、水酸化ナトリウムの溶液）とともに加熱し、それを塩化メチルで処理することによって合成的に生成される。後続の置換反応において、ヒドロキシル残基（−ＯＨ官能基）は、メトキシド（−ＯＣＨ３基）で置換される。
【００８４】
置換されるヒドロキシル基の数に応じて、様々な種類のメチルセルロースが調製され得る。セルロースは、３つのヒドロキシル基をそれぞれが露出する多くの結合されたグルコース分子からなるポリマーである。所与の形態のメチルセルロースの置換度（ＤＳ）は、グルコース当たりの置換ヒドロキシル基の平均数として定義される。したがって、理論上の最大値は、３．０のＤＳであるが、より典型的な値は、１．３〜２．６である。
【００８５】
ある実施形態において、マトリックスは、アルギネートを含む。アルギン酸、およびアルギンとも呼ばれるアルギネートは、褐藻類の細胞壁中に広く分布しているアニオン性多糖である。水と結合されるとき、それは粘性のゴムを形成する。抽出された形態で、それは、水を素早く吸収し；水中でそれ自体の重量の２００〜３００倍を吸収することができる。それは、フィラメント、顆粒または粉末形態で販売されている。本発明は、公知のアルギネートおよびアルギネート由来材料のマトリックス材料を提供する。好ましい実施形態において、アルギネート由来材料としては、アルギネート−ポリリジン−アルギネート（ＡＰＡ）、アルギネート／ポリ−ｌ−リジン／ペクチン／ポリ−１−リジン／アルギネート（ＡＰＰＰＡ）、アルギネート／ポリ−１−リジン／ペクチン／ポリ−ｌ−リジン／ペクチン（ＡＰＰＰＰ）、およびアルギネート／ポリ−Ｌ−リジン／キトサン／ポリ−ｌ−リジン／アルギネート（ＡＰＣＰＡ）、アルギネート−ポリメチレン−コ−グアニジン−アルギネート（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層のＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル−ビニルクロリド（ＰＡＮ−ＰＶＣ）が挙げられる。
【００８６】
ある実施形態において、マトリックスは、キトサンを含む。キトサンは、ランダムに分布したβ−（１−４）−結合Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化単位）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）で構成される線状多糖である。キトサン中のアミノ基は、約６．５のｐＫａ値を有し、これは、ｐＨおよび％ＤＡ−値に左右される電荷密度を有する酸性ないし中性の溶液中でプロトン化をもたらす。これにより、キトサンが水溶性になり、粘膜などの負に帯電した表面に容易に結合する生体接着剤になる。それは、甲殻類（カニおよびエビなど）の外骨格および真菌の細胞壁の構成要素であるキチンを、水酸化ナトリウムにより脱アセチル化することによって商業的に生成される。キトサンは、種子処理およびバイオ殺有害生物剤として農業に使用される。ワイン生産において、キトサンは、腐敗を防ぐのにも役立つ清澄剤として使用される。キトサンはまた、出血を減少させるためにおよび抗菌剤として包帯に使用される。キトサンはまた、薬剤を経皮的に送達するのを助けるのに使用される。
【００８７】
他の実施形態において、マトリックス材料は、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム、（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＪＶｊｉＶ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、シリカ封入物（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）、および硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−コ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）であり得る。
【００８８】
ある実施形態において、本発明は、特に、種子粉衣に使用される抗菌性組成物を提供する。本明細書に開示される酵素系に応答する病原体に弱い任意の種子に有益であろう。ある実施形態において、種子は、野菜、果実、農作物、および花の種子であり得る。他の実施形態において、本発明は、特に、工業的または商業的に関連する家畜およびそれから得られる製品のための敷料に使用される抗菌性組成物を提供する。多くの家畜が、当該技術分野において公知である。他の実施形態において、本発明は、特に、創傷包帯に使用される抗菌性組成物を提供する。多くの創傷包帯が、当該技術分野において公知である。本発明は、本明細書に開示される酵素系に応答する病原体または汚染物質に耐える布帛を提供する。布帛は、本明細書に記載される抗菌性組成物を含む。
【００８９】
本発明のある実施形態は、ヒト感染を低減するための組成物および方法を提供する。これは、１つの成分中の磁気ナノ粒子中の過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素およびフリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素と、別の成分中の酵素用の基質とを含む多成分組成物によって初めて達成される。固体組成物は、安定かつ不活性である。したがって、それらは、製品に組み込む前または後に貯蔵され得る。抗菌活性が必要とされるとき、多成分組成物は、水和によって活性化される。ＨＰＰ酵素は、過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンを生成するように基質に作用する。ＦＲＰ酵素は、フリーラジカルを生成するように過酸化水素および１つまたは複数のさらなる基質に作用する。過酸化水素およびフリーラジカルは、抗菌特性を有する。
【００９０】
本明細書に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の実施例が記載されている。これらの実施例は、例示目的のためのものであるに過ぎず、本発明を限定するものと決して解釈されるものではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００９１】
実施例１−磁気ナノ粒子固定化ＨＰＰおよびＦＲＰ酵素の最適化
ダイズペルオキシダーゼ系（ＳＢＰ）、フリーラジカル生成酵素（ＦＲＰ）を、ＢＮＰにおける触媒として使用した。ＢＮＰは、フェノールをポリフェノールに転化することによって溶液からフェノールを除去し、ポリフェノールは、ろ過または遠心分離によって除去された。ＳＢＰのための最適条件（すなわち、ＢＮＰ濃度およびｐＨ）を、以下のように決定した。
【００９２】
ダイズペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ（ＳＢＰ／ＧＯＸ）酵素系を組み合わせて、ナノ粒子クラスター中で共固定した（ｃｏ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）。基質緩衝液中の過酸化水素の必要性をなくすために、酸素およびβ−Ｄ−グルコースの存在下で、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）を用いて、組み合わされたペルオキシダーゼ触媒に過酸化水素を提供することができる。修正されたハイスループットのマイクロプレートベースのアッセイを用いて、異なる量のＧＯＸを含むペルオキシダーゼ触媒（ＨＲＰ、ＳＢＰまたはそれらの組合せ）をスクリーニングした。５０ｍＭのグルコースを、Ｈ２Ｏ２生成に使用した。総ペルオキシダーゼ濃度を、スクリーニングのために６０ｎＭに保持し、異なる濃度のＧＯＸを試験した（６００ｎＭ、６０ｎＭ、および６ｎＭのＧＯＸ）。２４０ｍｇ／ｍｌの材料中で固定された等量のＳＢＰ：ＨＲＰ：ＧＯＸからなる三酵素系は、１０倍および０．１倍のＧＯＸ：ペルオキシダーゼ系と比較して、最も高いフリーラジカル生成活性を有していた。
【００９３】
上で決定される最適化された条件を用いて、Ｈ２Ｏ２を生成するためにグルコースを用いたペルオキシダーゼ活性は、遊離系と比較して活性の３倍の増加を示した。この系は、効率的な固定化酵素クラスターを形成するための任意のペルオキシダーゼのためのスクリーニング条件（ｐＨ、イオン強度、濃度および時間）を狭めるのに使用される。
【００９４】
三酵素系の最良の調製条件ならびにＳＢＰ、ＨＲＰ、およびＧＯＸの比率を決定した後、この系を、過酸化水素を生成するための１０、５０、および１００ｍＭのグルコースのβ−Ｄ−グルコース濃度（図２）に対してスクリーニングした。フェノール濃度を１ｍＭに増加させた。未反応のフェノールが、遠心分離による重合ペレットの除去の後、ＯＤ２７０で測定された。３時間後、１０ｍＭのグルコースは、最も高い活性を示した。これは、フリーラジカル基質と比べて非常に高い濃度のグルコースが必要でないことを示唆している。グルコースは、他の基質と比較して過剰に保つべきであるが、この系中のその濃度は、おそらく、フリーラジカル生成基質との化学量論的反応のために１０ｍＭ未満の濃度にさらに低下され得る。
【００９５】
上述される系を用いて、最適化ラクトペルオキシダーゼ（「ＬＰ」または「ＬＣＰ」）固定化条件を決定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を死滅させるための液体媒体中の最適化ＬＰ／ＧＯＸ条件を、酸化剤として過酸化水素を用いて設定し（ＬＣＰ、図３Ａ）、またはＬＣＰおよびＧＯＸを、酸化剤としてグルコースを用いて設定した（ＬＣＰ：ＧＯＸ、図３Ｂ）。異なる比率のＬＰ：ＧＯＸを、それぞれ１２５ｎＭ：２５ｎＭ、１２５ｎＭ：１２．５ｎＭの１２５ｎＭ：６．２５ｎＭで試験した。
【００９６】
混合された酵素を、１２５、２５０または５００μｇ／ｍｌの磁気ナノ粒子により固定した。新鮮な５０μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（最終濃度１０６個の細胞／ｍｌ）を、９６ウェルマイクロプレート中で分配し、３０μｌの固定化酵素溶液、２０μｌのＳＣＮ（０．０２Ｍ）／２０μｌのＨ２Ｏ２（酸化剤としてペルオキシダーゼ：１Ｍ、０．１Ｍ、０．０１Ｍ）または２０μｌのＳＣＮ（０．０２Ｍ）／２０μｌのグルコース（酸化剤としてグルコース：１Ｍ、０．１Ｍ、０．０１Ｍ）とともにインキュベートした。１００μｌの１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を、２００μｌの最終体積になるように加えた。対照は、非固定化酵素、単独の試薬、および対照を１００％死滅させるための７０％のエタノールを含んでいた。全ての処理を３連で行った。
【００９７】
インキュベーションの後、マイクロプレートを遠心分離して、細胞を回収した。次に、細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色のために蛍光プレートに移した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ−７００７）は、２つの異なる核酸プローブを提供し、これを用いて、無傷の細胞膜を有する生細菌を、損傷した膜を有する死細菌と迅速に区別した。蛍光カウント値を、蛍光プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて測定した。生細胞および死細胞（エタノール処理の後）の検量線を用いて、死細胞の数を定量化した。処理の有効性を、固定化酵素配合物への５分間の曝露後の死細菌に対する生細菌の比率として評価した。
【００９８】
固定化ＬＰ単独（１２５ｎＭの酵素：５００μｇ／ｍｌのＮＰ）の最も高い有効性は、２０μｌの０．１ＭのＨ２Ｏ２（１０ｍＭの最終濃度）を用いた場合であることが分かり、約６８％の細胞が５分で死滅した（図３Ａ）。固定化ＬＰ：ＧＯＸ（１２５ｎＭのＬＰ：２５ｎＭのＧＯＸ：５００μｇ／ｍｌのＮＰ）を、２０μｌの１Ｍのグルコース（１００ｍＭの最終濃度）とともに使用したとき、有効性は、５分で１００％であった（図３Ｂ）。全ての場合において、固定化酵素が、それらの非固定化同等物より高い有効性を有することが分かった。
【００９９】
実施例２−固体抗菌性ＬＰ／ＧＯＸ集合体の生成
ＦＲＰ基質を含むＬＰ／ＧＯＸ系を、酸素の存在下でＧＯＸがグルコースを消費し、Ｈ２Ｏ２を生成するのを防ぐことによって活性を安定させた固体抗菌性集合体中で区分した。配合物が濡らしたときのみ活性化され、基質が酵素へと拡散させられるように、区分された試薬を、多層コーティング集合体（レベル２）へと配合した。ＬＰ／ＧＯＸは、静菌および抗菌活性のためのハイポラジカル（ｈｙｐｏｒａｄｉｃａｌ）を生成する非特異的抗菌系である。これは、土壌伝染性の植物病原体の作用による生育し得る種子の喪失を防ぐ本明細書に記載される新規な植物種子粉衣中で適用され得る。
【０１００】
各層につき２ｍｍのディスクを、層１または層２の２０μｌの溶液を完全に乾燥させることによって作製した。水で活性化されるディスクは、固定化酵素、基質、およびそれらを一緒に保持するセルロースマトリックスで構成されていた。第１の層は、固定化ＬＣＰ／ＧＯＸ、基質ＫＩおよびＫＳＣＮ、および青色食用着色剤を含有していた。第２の層は、グルコース、ＫＩ、ＫＳＣＮ、および黄色食用着色剤を含有していた。前者は、青色酵素／基質ドットであり、後者は、黄色基質のみのドットである。両方とも、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の粘性の溶液中で調製し、この溶液を、（容易な除去のため）ワックスフィルム上にピペットで取り、２４時間乾燥させたところ、それらのそれぞれの成分の小さい濃縮されたディスクが残った。黄色および青色ドットは、水分によって活性化される「サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）」状に積層される。
【０１０１】
【表１】
2018524283.tif 000003
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
【表３】
2018524283.tif 000005
【０１０４】
乾燥形態で、集合体は、安定かつ非反応性であった。しかしながら、水和の際、基質（Ｏ２、グルコース、ＫＩおよびＫＳＣＮ）は、固定化酵素に拡散した。水で活性化される集合体は、ペトリ皿上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）培養物に対する殺菌活性のために全ての成分を組み合わせたものである。
【０１０５】
植物病原体に対する水で活性化される配合物の有効性を、抗生物質ディスク拡散アッセイと同様の方法を用いて決定した。ディスク拡散アッセイにおいて、公知の濃度の抗菌物質に浸漬した小さい紙ディスクを、微生物培養寒天プレート上に置き、次に、それをインキュベートして、叢（ｌａｗｎ）を形成する。増殖阻害の領域のサイズは、特定の微生物に対する特定の抗菌物質の抗菌効果の大きさに相関され得る。層１および２を、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ）ａａ  ＣＵ６９２３を接種されたばかりのライマメ寒天上で互いに積み重ねた（図４Ａ）。次に、プレートを室温で２４時間インキュベートした。酵素を含有しない陰性対照は、クリアランスを示さなかった。対照的に、固定化酵素を含むディスクは、細菌増殖なしの約１ｃｍの透明の領域によって示されるようにキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）を死滅させ、その増殖を防いだ。酵素含有配合物を用いて、細菌増殖の完全な阻害が、２４時間後に、および最大で５週間にわたって観察された（図４Ｂ）。同様の結果が、ミューラー・ヒントン寒天上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物について見られたが、より小さくかつより不明確なクリアランス領域を有していた。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がカタラーゼ（＋）生物であるためであり得る。それは、反応中に生成された過酸化水素の一部を消費して、ＬＣＰ／ＧＯＸ系によるより少なくかつより遅いハイポラジカル生成をもたらし得る。したがって、カタラーゼ（＋）生物は、より高い濃度の酵素および基質を必要とし得る。
【０１０６】
実施例３−ＬＰ／ＧＯＸ種子粉衣
種子を、連続する２層系中の本明細書に開示される抗菌性組成物で粉衣した。ポリマーの濃度は、必要とされる粉衣の厚さに基づいて変化し得る。固定化酵素の濃度は、所望の抗菌活性の有効性および持続時間に基づいて変化し得る。
【０１０７】
固体抗菌性ＬＰ／ＧＯＸ集合体は、以下のプロトコルにしたがって、プラント安全性であることが示された：１ｍＬの黄色グルコース／基質混合物を、５００μＬの青色酵素／基質混合物と組み合わせた。同じことを、１ｍＬの黄色および５００μＬの青色対照で行った。混合物をボルテックスした。鉗子を用いて、２０個のトマト種子をそれぞれ、酵素および対照混合物に浸漬し、一晩乾燥させた。次に、種子を、３つのセクション：粉衣された酵素＋、粉衣された酵素−、非粉衣で印を付けられた空の滅菌培養皿の底部で、湿ったろ紙上に置いた。７日後、種子を発芽について調べた。
【０１０８】
酵素粉衣は、７日後に種子発芽を阻害しなかった（図５）。試験および対照種子は、８５％の発芽を示した。同じアッセイにおいてコムギを用いて、発芽率は１００％であった（データは示されていない）。
【０１０９】
小さい種子バッチの例において、１ｇの種子を、まず、１０ｍｌの層１配合物中で１分間浸漬し、真空オーブン中で、低温（例えば、約４０℃）で乾燥させる。次に、乾燥された種子を層２配合物に浸漬し、真空オーブン中で、低温（例えば、約４０℃）で乾燥させる。この粉衣方法は、酵素、試薬および粘度について配合物を最適化するのに使用され得る。粘度は、乾燥後に、種子上に残されるポリマーの量に関連している。
【０１１０】
種子粉衣のより大きいバッチ（例えば、１ｇ、１０ｇ超、または最大で５ｋｇまたはそれ以上の種子）の例において、当該技術分野において公知の市販の種子コーティング機が使用され得る（図６）。例示的な種子コーティング機は、垂直な円筒状の固定子および水平な円盤状の回転子を含み得る。回転子は、種子を回転させ、それによって、種子を固定子まで上昇させ、ここで、それらは速度を落とし、混合チャンバの中心へと再度急降下する。混合チャンバの中心は、粉衣材料の分散を確実にする回転ディスクを含み得る。あるいは、低粘度溶液の場合、スプレーノズルが、溶液を噴霧または霧化してもよい。
【０１１１】
ある実施形態において、混合相および乾燥相が用いられ得る。まず、酵素を含有する溶液を、約１対２の比率（酵素重量：種子重量）で回転している種子に展着する。乾燥空気ジェット乾燥機が、種子を乾燥させるのに使用され得る。乾燥に必要とされる時間は、種子および蒸発する水の量に基づいて変化し得る。種子が完全に乾燥されたとき、グルコース、他の基質、または他の試薬を含有する層２の溶液を、約１対２の比率（溶液重量：種子重量）で回転している種子に展着する。乾燥空気ジェット乾燥機が、回転している種子を乾燥させるのに使用され得る。得られる種子粉衣を最適化するために、種子に対する層溶液の比率は、当該技術分野において公知のように変化され得る。
【０１１２】
１０ｋｇを超えるより大きいバッチの場合、連続種子粉衣機が、粉衣の間に種子の乾燥を促進するために使用され得る。種子は、当該技術分野において公知の機械的手段（例えばコンベヤベルト）を介して、１つの粉衣機から別の粉衣機へと移動される。前記移動に使用される時間は、次の粉衣の前の乾燥に使用され得る（図６）。
【０１１３】
当業者は、さらなる層または成分が、それが抗菌性組成物の活性化を防止しない限り、プロセス中の任意の時点で粉衣された種子に加えられ得ることを認識するであろう。さらなる粉衣工程は、乾燥剤（例えばタルク）、着色剤（例えば染料）、殺有害生物剤（例えば殺虫剤）、植物に有益な細菌（例えば植物の成長を促進する根圏細菌（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ）胞子）、または他の化学物質（例えば殺真菌剤、肥料、主要栄養素および微量栄養素）などの、他の有機、無機および生物学的添加剤を含み得る。種子の下塗り（例えば予備水和（ｐｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ））は、第１の層の粉衣の際に種子に行き渡らせる水の量を制御することによって最適化され得る。
【０１１４】
種子粉衣の有効性が、生育チャンバにおいて試験され、生育チャンバにおいて、粉衣された種子が、最小限の素寒天上で、標的病原体（例えばトマトの場合はキサントモナス属（ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ））の存在下で生育される。粉衣された種子は、病原体が接種された寒天表面上で発芽するように置かれる。種子の周りの阻害の領域の直径は、配合物の有効性を示す。
【０１１５】
あるいは、種子は、制御された生育チャンバ（１４時間の昼間、１０時間の夜間、６０％の湿度、２２℃）中で、約１０ｇの接種された土壌（土壌のｇ当たり約１０５個の病原体細胞）中で生育される。土壌の有効性は、苗の発芽（発芽率）、植物における病原体の存在または発生、および発芽後の死亡率を測定することによって試験される。
【０１１６】
実施例４−ＬＰ／ＧＯＸ動物の敷料コーティング
本発明の１つの実施例において、動物の敷料が、粉砕されたトウモロコシ穂軸（図７、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｎｒａｄ，Ｉｏｗａ）を用いて、本明細書に開示される固体抗菌性集合体で被覆される。「木のような（ｗｏｏｄ−ｌｉｋｅ）」材料は、水中でそれ自体の重量を吸収することができる一方、より軟質の髄（ｐｉｔｈ）および軸は、水中でそれらの重量の最大で４．５倍を吸収することができる。材料は、機械的抵抗性があり、生分解性であり、堆肥化可能であり、再生可能である。直径が３．２ｍｍ未満の粒子（例えばＧｒｅｅｎＴｒｕ１／８”）が、主に小動物の敷料に使用される。それは、木質の環部分から作製され、良好な吸収特徴を有する。ＧｒｅｅｎＴｒｕ  １０２０トウモロコシ穂軸は、大量のトウモロコシ穂軸粒子が必要とされる「担体」用途（殺有害生物剤および肥料）に現在使用されている。
【０１１７】
トウモロコシ穂軸粒子を、グルコース（１００ｍＭ）、４℃のＫＩおよびＫＳＣＮ（それぞれ０．５ｍＭ）および５０％の保水容量（ＷＨＣ）の０．５％のポリマーに２４時間浸漬し、次に、１０％の水分になるまで、５０〜１００℃で空気乾燥させる。「充填された」粒子は、反応試薬の容器として働く。充填された粒子を、本明細書に開示される固定化酵素系および最適なＣＭＣ濃度を含有するコーティング配合物に浸漬する。被覆された粒子を、２４時間乾燥させる。
【０１１８】
機能化された敷料粒子の有効性が、液体および固体細菌培養物において示される。固体培養物の場合、被覆された材料の１０個の粒子を、標的細菌が接種されたペトリ皿に置く。粒子を、１０μｌの水または人工的なウシの尿（２％の尿素、ｐＨ６）で活性化する。粒子の周りの非増殖領域（環）の直径を、阻害効率のために測定する。
【０１１９】
溶液中で、１個の粒子を、１ｍｌの細菌培養物（１０５、１０６、１０７および１０８個の細菌）に加える。生細胞および死細胞のパーセンテージを、５分、１時間、２４時間、および４８時間の時点で、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）キットを用いて、上述されるように測定する。
【０１２０】
材料コーティングのより大きいバッチ（例えば、１ｇ、１０ｇ超、または最大で５ｋｇまたはそれ以上のトウモロコシ穂軸材料）の場合、上述される市販のコーティング機が使用され得る（図８）。まず、材料に、１：１の比率（１ｇの溶液に対して１ｇの材料）で、グルコース（５０〜１００ｍＭ）および試薬（それぞれ０．５ｍＭのＫＳＣＮおよびＫＩ）および０．５％のポリマー（ＣＭＣ）を含有する溶液を噴霧する。次に、材料を、５０〜１００℃の温度で乾燥させる。ある実施形態において、空気ジェット流が使用され得る。次に、固定化酵素を含有する溶液を、１対２の比率（溶液重量：材料重量）で材料に展着する。例えば、これは、２％のポリマーおよび０．５ｍＭのＫＳＣＮおよびＫＩであり得る。ポリマーの濃度は、必要とされるコーティングの厚さに基づいて変化する。固定化酵素の濃度は、所望の抗菌活性の有効性および持続時間に基づいて変化する。酵素濃度を、敷料および病原体向けに最適化される。最終材料を、約１０％以下の水分含量になるまで乾燥させる。乾燥に必要とされる時間は、材料および蒸発する水の量に基づいて変化する。
【０１２１】
１０ｋｇ超のより大きいバッチの場合、連続粒子コーターが、コーティングの間に種子の乾燥を促進するために使用され得る。乾燥時間が次のコーティングの前に提供されるように、種子は、１つのコーターから別のコーターへと（例えばコンベヤベルトを介して）機械的に移動される。
【０１２２】
実施例５−ウシラクトペルオキシダーゼおよびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ種子粉衣
本発明の別の実施例において、ＬＰ／ＧＯＸを、１：１０のＬＰ対ＧＯＸの比率で配合した。ＧＯＸは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７１４１）に由来した。ＬＰは、ウシ乳汁（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６１３２８）に由来した。ここで、酵素の１倍の組成物を、３８．７ｎＭのラクト−ペルオキシダーゼおよび３８７ｎＭのグルコースオキシダーゼおよび３００μｇ／ｍｌのＮＰを用いて配合した。組成物は、０．３ｍＭのＫＩおよび０．５ｍＭのＮＨ４ＳＣＮも有していた。酵素をまず共固定した。簡潔に述べると、酵素を一緒に混合し、次に、１ｍｌの最終体積になるまで、超音波処理されたＮＰ（４０％の電力で１分間）に加えた。次に、管を、１１００ｒｐｍで１時間振とうする。
【０１２３】
２０μｌのドットを寒天プレート上に置くことによって、固定化酵素集合体を、０．１倍、０．２倍、１倍、５倍、および１０倍の濃度で作製した。集合体中のカルボキシメチル−セルロースポリマー（ＣＭＣ）の量を、４％で一定に保持し、配合物を、食用着色剤（ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １およびｒｅｄ  ４０、ｍｌ当たり１０μｌ）で青色に着色した。各ドットは、室温で一晩、または減圧下で１時間乾燥された２０μｌの配合物を含有していた。
【０１２４】
１倍の基質配合物は、４％のＣＭＣ、０．３ｍＭのＫＩ、０．５ｍＭのＮＨ４ＳＣＮおよび５０ｍＭのグルコースを含有していた。ＣＭＣの量を４％で一定に保持しながら、基質の量を増加させることによって、異なる基質濃度（１倍、５倍、１０倍、および２０倍）を分析した。配合物を、食用着色剤（ＦＤ＆Ｃ  ｙｅｌｌｏｗ  ５、ｍｌ当たり１０μｌ）で黄色に着色した。各ドットは、室温で一晩または減圧下で１時間乾燥された２０μｌの配合物を含有していた。
【０１２５】
酵素集合体は、細菌増殖を効率的に阻害した。細菌を、液体培養物または固体寒天プレート（寒天１５ｇ／Ｌ）中のＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇのＮａＣｌ／Ｌ）で増殖させた。配合物を、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型、シュードモナス・シリンガエ変種トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｖａｒ．ｔｏｍａｔｏ）、およびクラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）の野生分離株で試験した。細菌（ｍｌ当たり１０６個の細菌に調整された４８時間液体培養物）を、ガラスビーズ手順を用いて、プレート当たり約６．６×１０５個の細菌で、寒天プレート上で平板培養して、細菌叢を形成した。接種後、酵素を含有する乾燥ディスクを表面に置き、基質を含む乾燥ディスクをそれらの上に加えた。ＣＭＣが再水和するにつれ、食用着色剤を含む基質が拡散し、それによって、ディスクが緑色に変化した。あるいは、粉衣された種子を寒天の表面に置いた。プレートを室温で４８〜９６時間インキュベートし、平板培養を３連で行った。図９に示されるように、カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）が、用量依存的に酵素集合体によって効率的に阻害された。阻害の量（ｈａｌｏ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、酵素の濃度とともに増加した。同様に、図１０は、最も低い基質濃度でさえ、カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の阻害を示す。
【０１２６】
酵素集合体は、真菌増殖を効率的に阻害した。真菌を、ポテトデキストロース寒天で増殖させた。真菌株の１つのプラグ（７ｍｍの直径）がプレートの中心になるように、新鮮なプレートに接種した。プレートの接種の後、酵素希釈物を含有する乾燥ディスクを寒天の表面に加え、基質を含む乾燥ディスクをそれらの上に加えた。ＣＭＣが再水和するにつれ、食用着色剤を含む基質が撹拌し、それによって、ディスクが緑色に変化した。ディスクを、接種材料から同じ距離で加えたところ、菌糸体の増殖が観察された。図１１は、酵素濃度の増加とともにトマト苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）の用量依存的な阻害を示す。
【０１２７】
酵素集合体は、トマト種子を効率的に保護した。トマト種子（変種ラトガース（ｖａｒ．Ｒｕｔｇｅｒｓ））を、まず種子を酵素配合物に浸漬し、第１の層を真空乾燥させ、種子を基質配合物に浸漬し、種子を室温で２回目の真空乾燥させることによって、手作業で粉衣した。１０〜１３μｌの各溶液を、各粉衣工程で、種子に付着させた。種子を一晩乾燥させ、さらなる使用まで４℃で貯蔵した。図１２は、粉衣された種子が、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびクラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）感染から効率的に保護されたことを示す。
【０１２８】
本発明のさらなる実証において、粉衣された種子を、フザリウム・エクイセチ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ）およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）を含有する接種材料プラグから異なる距離で置いた。トマト苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）および紋枯病菌（ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）も分析した（データは示されていない）。真菌を室温でインキュベートし、平板培養を３連で行った。図１３は、３、５、および７日後のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の距離依存的な阻害を示す。
【０１２９】
拡散。共固定化ラクトペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含有する配合物は、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クラビバクター属（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、クサレカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、およびフザリウム属（ｆｕｓａｒｉｕｍ）から農業材料を効率的に保護する。対照は、染料または基質単独では、細菌または真菌に効果を与えないことを示した。強い殺菌効果が、水和されたポリマーによって形成された透明の衛生処理（ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ）領域（図９〜１１）または粉衣された種子の周りに形成された領域（図１２〜１３）で、全ての細菌に対して観察された。衛生処理の領域は、最も酵素濃度依存的であることが示された（図２）。基質の濃度は、短期間の衛生処理にほとんど効果を与えなかったが、より長い期間にわたって効果を維持する際に決定要因になるかもしれない。また、固定化グルコースオキシダーゼ単独では、過酸化水素の生成によりわずかなレベルの殺菌活性を有していた。しかしながら、抗菌効果は、共固定化ウシラクトペルオキシダーゼの存在によって著しく増加された。
【０１３０】
真菌病原体フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・エクイセチ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）およびトマト苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）の場合、非常に強い陰性の化学反発（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）が観察された。図１１および１３に示されるように、菌糸体の増殖は、異方性であり、酵素配合物（ドットまたは粉衣された種子）を含有する領域に近づくほど遅くなる。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびクサレカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）で、２週間超にわたって保護が観察された。試験される酵素および基質の範囲で、紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に対する有意な効果は観察されなかった。
【０１３１】
酵素が、０．１倍の濃度でさえ、非常に有効であったため、約１ｇのウシラクトペルオキシダーゼを用いて、３０３０万個のトマト種子を、および１ｇのグルコースオキシダーゼを用いて、３０３万個のトマト種子を粉衣および保護することができる。同様に、１ｋｇのヨウ化カリウムおよびチオシアン酸アンモニウムは、それぞれ９億１２００万個および１１億９３００万個の種子を粉衣および保護するのに十分である。１リットルのウシ乳汁が、約３３ｍｇのラクトペルオキシダーゼを含有するため、１リットルの乳汁は、真菌および細菌病原体から約１００万個のトマト種子を保護するのに十分なラクトペルオキシダーゼを抽出するように処理され得る。平均で、１頭のウシは、１日に約２０リットルの乳汁を生産する。各リットルは、約２０００万個のトマト種子を粉衣するのに十分なラクトペルオキシダーゼを含有する。組成物は、他の種子を粉衣するのに使用され得；種子当たりに使用される溶液の量は、トマト種子に使用される量と比較して、種子の表面積に比例する。
【０１３２】
本明細書に開示され、または言及される全ての刊行物および特許文献は、全体が参照により援用される。上記の説明は、例示および説明の目的で示されているに過ぎない。本明細書は、本発明を、開示される正確な形態に限定することは意図されていない。本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によって規定されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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