(57)【要約】  抗原が第１の核酸によってコードされ得、ＣＤ４０Ｌが第２の核酸によってコードされ得る、抗原及びＣＤ４０Ｌを含むワクチンが開示される。対象における免疫応答の増大方法も開示され、本方法は、それを必要とする対象に本ワクチンを投与することを含む。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、インフルエンザ抗原、及び熱帯熱マラリア原虫抗原からなる群から選択される抗原がさらに開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原またはその免疫原性断片をコードする第１の核酸配列と、ＣＤ４０Ｌまたはその免疫原性断片をコードする第２の核酸配列と、を含むワクチンであって、ＣＤ４０Ｌをコードする前記第２の核酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、または１１の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を含む、前記ワクチン。
【請求項２】
ＣＤ４０Ｌをコードする前記第２の核酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、または１１のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記第１の核酸配列が、前記抗原の免疫原性断片をコードし、前記第２の核酸配列が、ＣＤ４０Ｌの免疫原性断片をコードする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記抗原が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、及びそれらの免疫原性断片からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ＨＩＶ抗原が、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記インフルエンザ抗原が、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載のワクチン。
【請求項７】
前記熱帯熱マラリア原虫抗原が、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ＨＰＶ抗原が、Ｅ６抗原、Ｅ７抗原、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載のワクチン。
【請求項９】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸が発現ベクターの形態である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が同じ発現ベクターに存在する、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が異なる発現ベクターに存在する、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１４】
免疫応答の誘導を必要とする対象における免疫応答の誘導方法であって、前記対象に請求項１〜１３のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含み、それにより、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が前記対象において発現され、免疫応答が前記対象において誘導される、前記方法。
【請求項１５】
前記ワクチンの投与が、筋肉内投与または皮内投与を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンの投与が、電気穿孔を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫応答が、前記対象の皮膚組織及び／または筋肉組織において誘導される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫応答が、対象における細胞性免疫応答、体液性免疫応答、または細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両方を含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原及びＣＤ４０Ｌを含むワクチン、及びかかるワクチンの投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、個体における免疫応答を刺激し、特定の疾患に対する保護及び／または治療を提供するために使用される。いくつかのワクチンは、免疫応答を誘導するための抗原を含む。強い免疫応答を誘発する抗原もあれば、弱い免疫応答を誘発する抗原もある。抗原に対する弱い免疫応答は、ワクチンにアジュバントを含めることにより増強することができる。アジュバントには、例えば、アルミニウム塩、油乳剤、細菌または他の病原体の殺菌成分、サイトカイン等の多くの異なる形態がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
サイトカインは、他の細胞の挙動に影響を及ぼす細胞によって作られるタンパク質であり、多くのアジュバントとは異なり、特定の免疫応答を調節することができる。かかるサイトカインの１つは、Ｂ細胞を含む抗原提示細胞に見られる共刺激分子であるＣＤ４０である。ＣＤ４０タンパク質は、免疫系の抗原提示細胞の受容体であり、様々な免疫応答の媒介に必須である。ＣＤ４０リガンドは、Ｔ細胞の表面上に見られ、その受容体タンパク質であるＣＤ４０に結合している。ＣＤ４０受容体及びＣＤ４０リガンドが相互作用すると、一連の化学シグナルが誘発され、抗体を産生するようＢ細胞に指示する。ＣＤ４０リガンドは、Ｔ細胞が免疫系の他の細胞と相互作用することを可能にする役割も果たし、Ｔ細胞分化に関与する。ワクチンは、多くの異なる様式（例えば、注射、経口的等）で多くの異なる組織（例えば、筋肉内、皮内等）にも投与される。しかしながら、全ての送達方法が等しいわけではない。個体集団内におけるより高いコンプライアンスを可能にする送達方法がある一方で、ワクチンの免疫原性及び／または安全性に影響を及ぼし得る送達方法もある。したがって、抗原同一性及び投与経路に関係なく抗原応答を増大させる安全かつより効果的なアジュバントの開発が、当該技術分野で依然として必要とされている。
【課題を解決する手段】
【０００４】
本発明は、抗原が第１の核酸によってコードされ得、ＣＤ４０Ｌが第２の核酸によってコードされ得る、抗原及びＣＤ４０Ｌを含むワクチンを対象とする。好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列から成り、いくつかの好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列から成る。
【０００５】
本ワクチンの第１の核酸及び第２の核酸は、発現ベクターをさらに含み得る。本ワクチンは、上述の抗原と同じ配列が核酸配列によってコードされた抗原ペプチドと、上述のＣＤ４０Ｌと同じ配列が核酸配列によってコードされたＣＤ４０Ｌペプチドとをさらに含み得る。本ワクチンの抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、またはそれらの断片からなる群から選択される。ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。熱帯熱マラリア原虫抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含み得る。
【０００６】
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。第２の核酸は、発現ベクターをさらに含み得る。
【０００７】
本発明は、対象における免疫応答の増大方法をさらに対象とし、本方法は、それを対象とする対象に本明細書に記載のワクチンを投与することを含み、本ワクチンの投与は、筋肉内投与及び皮内投与のうちの少なくとも一方を含む。本ワクチンは、電気穿孔によっても投与され得る。本方法は、対象の皮膚組織及び筋肉組織のうちの少なくとも一方における免疫応答を増大させ、対象における免疫応答を約１０％〜約６００％または約１０％〜約２５０％増大させる。ＣＤ４０Ｌアジュバントワクチンでのワクチン接種方法は、それを必要とする対象における免疫応答を少なくとも約１．２０倍または少なくとも約１．５倍増大させ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】（Ａ）異なるＣＤ４０Ｌアイソフォームの図を示す。マウス配列を使用し、その後にさらに修飾して、変異形アイソフォームを作製した。各インサートは、ＲＮＡであり、コドン最適化されており、効率的なＩｇＥリーダー配列を含み、その後、これらを、発現がＣＭＶプロモーター下で制御されたｐＶＡＸベクターにクローニングした。
【図１Ｂ】（Ｂ）２９３Ｔトランスフェクト細胞由来の細胞溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【０００９】
【図２Ａ】（Ａ）免疫化スケジュール（ＨＩＶコンセンサスクレードｃエンベロープのみ（２．５μ）またはＣＤ４０Ｌの異なる形態と組み合わせてのいずれかで３週間毎に免疫化）を示す。
【図２Ｂ】（Ｂ）ワクチン接種の１週間後に決定したコンセンサスクレードｃ  ｇｐ１２０に対する終点結合力価を示す。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＨＩＶエンベロープコンセンサスクレードｃでの免疫化後の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、具体的には、ペプチドで５時間刺激した後に細胞内染色したワクチン接種マウスから単離された脾細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αサイトカイン産生の測定結果を示す。
【００１０】
【図３Ａ】（Ａ）免疫化スケジュール（２回免疫化した後に８週間安静にさせ、その後に屠殺した）を示す。
【図３Ｂ】（Ｂ）コンセンサスクレードｃ  ｇｐ１２０に対する終点結合力価（記憶段階中に決定）を示す。
【図３Ｃ】（Ｃ）刺激した後に細胞内染色したワクチン接種マウスから単離された脾細胞を示す。
【００１１】
【図４Ａ】（Ａ）免疫化スケジュール（ＨＰＶ  １６  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームのうちの１つと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した）を示す。
【図４Ｂ】（Ｂ）最終ワクチン接種の１週間後のＩＦＮ−γ産生のＥＬＩＳｐｏｔ決定を示す。
【図４Ｃ】（Ｃ）Ｅ７／Ｅ６ペプチドで刺激した後に細胞内染色したワクチン接種マウスから単離された脾細胞を示す。
【図４Ｄ】（Ｄ）０日目にマウスに５×１０４個のＴＣ  １細胞を移植した。４、１１、１８、及び２５日目にマウスにワクチン接種した。
【図４Ｅ】（Ｅ）移植後に腫瘍測定を毎週行った。
【００１２】
【図５Ａ】（Ａ）免疫化スケジュール（コンセンサスインフルエンザＨ１ＨＡ抗原のみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームのうちの１つと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した）を示す。
【図５Ｂ】（Ｂ）最終ワクチン接種の１週間後のＨ１ＨＡ（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ）に対する終点結合力価を示す。
【図５Ｃ】（Ｃ）免疫化後の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、具体的には、Ｈ１ＨＡコンセンサスペプチドで刺激した後に細胞内染色したワクチン接種マウスから単離された脾細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αサイトカイン産生の測定結果を示す。
【００１３】
【図６Ａ】（Ａ）異なるＣＤ４０Ｌアイソフォームの図を示す。マウス配列を使用し、その後にさらに修飾して、野生型形態、切断不可能形態（表面上でのみ発現する）、及び可溶性成熟形態を作製した。各インサートは、ＲＮＡであり、コドン最適化されており、その後、これらを、発現がヒトＣＭＶプロモーター下で制御されるｐＶＡＸベクターにクローニングした。
【図６Ｂ】（Ｂ）２９３Ｔトランスフェクト細胞由来の細胞溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【００１４】
【図７Ａ】成熟ＣＤ４０ＬがＣＤ８  Ｔ細胞応答を増大させることを示す。（Ａ）マウスをＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した。
【図７Ｂ】（Ｂ）最終ワクチン接種の１週間後、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳｐｏｔにより決定した。
【図７Ｃ−１】（Ｃ）ワクチン接種マウスから単離された脾細胞をＥ７／Ｅ６ペプチドで刺激し、その後、細胞内染色した。
【図７Ｃ−２】（Ｃ）ワクチン接種マウスから単離された脾細胞をＥ７／Ｅ６ペプチドで刺激し、その後、細胞内染色した。
【図７Ｄ】（Ｄ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答の多機能性を評価した。
【００１５】
【図８Ａ】Ｅ７エピトープ（Ｈ−２Ｄｂ  ＨＰＶ１６  Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ））に対する四量体特異的応答が成熟ＣＤ４０Ｌの包含に伴い増大することを示す。（Ａ）マウスをＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した。最終ワクチン接種の１週間後、脾臓及びＰＢＭＣにおける四量体特異的応答を決定した。
【図８Ｂ】（Ｂ）末梢における四量体特異的応答を経時的に評価した。マウスを３週間間隔で２回免疫化し、連続して採血した。
【図８Ｃ】（Ｃ）１１日目のピーク四量体応答でのＣＤ４  Ｔ細胞の役割を決定するために、マウスにＣＤ４枯渇抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを与え、その後、ワクチン接種した。血液における四量体特異的応答を経時的に評価した（１１日間及び２８日間の両方）。
【図８Ｄ】（Ｄ）リンパ球をＥ７タンパク質の優性エピトープであるＨＰＶ  Ｅ７（Ｈ−２Ｄｂ  ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）四量体で染色した。四量体＋であるＣＤ８＋細胞の代表的なフロープロット。細胞を、単細胞、リンパ球、ＣＤ８＋生細胞にゲートした。
【００１６】
【図９Ａ】１１日目（ピーク四量体応答）のＣＤ８  Ｔ細胞応答が多数のサイトカイン及び脱顆粒マーカーを発現することを示す。（Ａ）マウスをＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで免疫化した。１１日後、マウスを屠殺し、Ｔ細胞応答を細胞内サイトカイン染色により評価した。
【図９Ｂ】（Ｂ）抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ、１０７ａ、及びＴｂｅｔの発現。
【図９Ｃ】（Ｃ）ＰＢＭＣ及び脾細胞の両方における四量体特異的応答。
【図９Ｄ】（Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の多機能性、ならびに多機能性パーセント。
【００１７】
【図１０Ａ】ＣＤ８  Ｔ細胞応答が維持されて記憶されたことを示す。マウスをＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した。最終ワクチン接種の８週間後、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を（Ａ）ＩＣＳにより決定した。
【図１０Ｂ】ＣＤ８  Ｔ細胞応答が維持されて記憶されたことを示す。マウスをＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した。最終ワクチン接種の８週間後、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を（Ｂ）四量体染色により決定した。
【００１８】
【図１１Ａ】ＨＰＶ＋ＭＴ  ＣＤ４０ＬがＨＰＶのみを上回って腫瘍クリアランスを著しく増大させることを示す。（Ａ）マウス（ｎ＝１０）に５×１０４個のＴＣ１細胞を移植した。１週間後、マウスを、以下：ｐＶＡＸ骨格（ナイーブ）、ＨＰＶのみ、またはＨＰＶ＋様々なＣＤ４０Ｌ構築物のうちの１つで免疫化した。腫瘍成長を週２回監視した。
【図１１Ｂ】（Ｂ）個々のマウスの経時的な腫瘍体積。
【図１１Ｃ】（Ｃ）ナイーブ、ＨＰＶのみ、及びＨＰＶ＋ＭＴ  ＣＤ４０Ｌの生存曲線。
【００１９】
【図１２Ａ】図７に記載のマウスで観察された体液性応答及びＣＤ４応答を示す。
【図１２Ｂ】図７に記載のマウスで観察された体液性応答及びＣＤ４応答を示す。
【図１２Ｃ】図７に記載のマウスで観察された体液性応答及びＣＤ４応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＣＤ４０Ｌをアジュバントとして使用することにより対象における抗原に対する免疫応答を増大させるために使用され得るワクチンに関する。
【００２１】
いくつかの例では、抗原のみを含むワクチンと比較して抗原源または投与経路にかかわらずより高い免疫応答が対象において誘発されるため、ＣＤ４０Ｌは、汎用アジュバントとして機能することができる。ＣＤ４０Ｌは、ウイルス抗原及び寄生虫抗原、例えば、それぞれ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原及び熱帯熱マラリア原虫抗原の両方の免疫応答をさらに増強させ得る。いくつかの例では、ＣＤ４０Ｌは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生の増加によって実証されるように、筋肉組織及び皮膚組織の両方における免疫応答をさらに増強させ得る。
【００２２】
１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先される。好ましい方法及び材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは均等な方法及び材料も、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００２３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、及びそれらの変形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為または構造の可能性を除外しない制約のない移行句、用語、または単語であるよう意図されている。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本発明は、明白に記載されているかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む」、「からなる」、及び「から実質的になる」他の実施形態も企図する。
【００２４】
本明細書における数値範囲の列挙の場合、それらの間に介在する同程度の正確さを有する各数値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６及び９に加えて、数値７及び８が企図され、範囲６．０〜７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が、明示的に企図される。
【００２５】
本明細書で使用される「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のワクチンに添加される任意の分子を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「断片」とは、哺乳動物における免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載するタンパク質断片をコードする種々のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であってもよい。
【００２７】
本明細書で使用される「免疫応答」とは、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答もしくは体液性応答、またはこれらの両方の形態であり得る。
【００２８】
本明細書で使用される「核酸」は、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の一部を含み得る。核酸は、ゲノム及びｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む、塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成法または組み換え法によって得ることができる。
【００２９】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続しているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子内でそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で公知の通り、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適合させることができる。
【００３０】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」とは、アミノ酸の連結した配列を意味し得、天然、合成、または天然及び合成の改変もしくは組み合わせであり得る。
【００３１】
本明細書で使用される「プロモーター」とは、細胞における核酸の発現をもたらすか、活性化するか、または増強することができる合成分子または天然に存在する分子を意味する。プロモーターは、その発現をさらに増強し、かつ／またはその空間的発現及び／もしくは一時的発現を変化させる１つ以上の特定の転写制御配列を含み得る。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはレプレッサ要素を含み得、それは、転写開始部位から数千もの塩基対に位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、遺伝子の発現を構造的または差次的に制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用される「治療」または「治療する」とは、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するか、または完全に排除する手段による疾患からの動物の保護を意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現前に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の臨床的出現後に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００３３】
本明細書で使用される「対象」とは、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望むか、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。それは、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであり得る。
【００３４】
核酸に関して本明細書に使用される「変異形」とは、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部、（ｉｉｉ）参照核酸またはその相補体と実質的に同一の核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照核酸、その相補体、またはそれと実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
【００３５】
変異形は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドとしてさらに定義され得る。「生物学的活性」の代表的な例としては、特異的抗体によって結合される能力または免疫応答を促進する能力が上げられる。変異形は、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸の疎水性親水性インデックスを考慮することによって、特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性インデックスは、その疎水性及び荷電の考慮に基づく。類似の疎水性親水性インデックスを有するアミノ酸が、置換することができ、タンパク質の機能を依然として保持できることは、当該技術分野で公知である。一態様では、±２の親水性インデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を利用して、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドにおいてアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性及び免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な指標を計算することができる。当該技術分野で理解される通り、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行われ得る。アミノ酸の疎水性インデックス及び親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、及び他の性質により明らにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
【００３６】
変異形は、完全な遺伝子配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列の全長またはその断片にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異形は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００３７】
本明細書で使用される「ベクター」とは、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
【００３８】
２．ワクチン
抗原及びアジュバントを含むワクチンが本明細書に提供される。ワクチンは、個体における抗原提示及び抗原に対する全体的な免疫応答を増大させることができる。抗原及びアジュバントの組み合わせは、抗原を単独で含むワクチンよりも効率的に免疫系を誘導する。ワクチンは、筋肉及び皮膚等の異なる組織に投与された場合に免疫応答をさらに誘導することができる。
【００３９】
本発明のワクチンは、ワクチン自体が疾病または死亡を引き起こさないように安全であること；ウイルスまたは細菌等の生病原体への曝露から生じる疾病に対する保護作用があること；細胞の感染を予防するために中和抗体を誘導すること；細胞内病原体に対する保護Ｔ細胞応答を誘導すること；ならびに投与し易さ、少ない副作用、生物学的安定性、及び用量当たりの低コストを提供すること等の、有効なワクチンに要求される特徴を有し得る。本ワクチンは、以下に記載されるように抗原とアジュバントを組み合わせることにより、これらの特徴のうちのいくつかまたは全てを達成することができる。
【００４０】
ａ．アジュバント
本ワクチンは、アジュバントを含んでもよい。アジュバントは、核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異形、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ペプチド結合によってアジュバントに連結されたリンカーまたはタグ配列をコードするさらなる配列も含み得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらの変異形、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４１】
（１）ＣＤ４０Ｌ
アジュバントは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、その断片、その変異形、またはそれらの組み合わせであってもよい。ＣＤ４０Ｌ（別名、ＣＤ１５４）は、活性化Ｔ細胞によって発現され、応答細胞にいくつかの異なる影響を及ぼし得る活性化リガンドとしての役目を果たす。ＣＤ４０Ｌは、活性化Ｔ細胞によって発現されると、細胞質内で合成され、その細胞の表面に運ばれ、そこで、ＣＤ４０Ｌが細胞膜内に挿入される。挿入後、このタンパク質は、関連酵素によって細胞表面から切断され、その可溶形態で生物学的に活性な状態で留まる。先天性免疫及び適応免疫の両方におけるその役割のため、ｐＣＤ４０Ｌの共送達により、ＤＮＡワクチン設定におけるワクチン応答が増大し得る。
【００４２】
ＣＤ４０Ｌは、ＩＦＮ−γ産生を刺激することができる。ＩＦＮ−γは、抗ウイルス特性、免疫調節特性、及び抗腫瘍特性を有し、最大３０個の遺伝子において転写を変化させることができ、様々な生理学的応答及び細胞応答を生じさせる。これらの効果は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性を促進すること、正常細胞にクラスＩ  ＭＨＣ分子の発現を増加させること、マクロファージにおける抗原提示及びリソソーム活性を増加させること、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を誘導すること、ならびに液性（抗体）応答におけるＴｈ２の分化を抑制しながら、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞に関して細胞性免疫におけるＴｈ１の分化を促進することを含む。本ワクチンにＣＤ４０Ｌを含めることにより、ＣＤ４０Ｌを含まないワクチンと比較して、ＩＦＮ−γ産生を少なくとも約１．２０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍誘導することができる。本ワクチンにＣＤ４０Ｌを含めることにより、ＣＤ４０Ｌを含まないワクチンと比較して、ＩＦＮ−γ産生を少なくとも約１．２０倍誘導することができる。本ワクチンにＣＤ４０Ｌを含めることにより、ＣＤ４０Ｌを含まないワクチンと比較して、ＩＬ−２産生を少なくとも約少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍誘導することもできる。本ワクチンにＣＤ４０Ｌを含めることにより、ＣＤ４０Ｌを含まないワクチンと比較して、ＴＮＦ−α産生を少なくとも約少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、及び少なくとも約１０倍誘導することもできる。ＣＤ４０Ｌは、対象における抗原に対する免疫応答を増大またはブーストすることができる。抗原については、後により詳細に記載する。いくつかの例では、ＣＤ４０Ｌは、抗原に対する免疫応答を約１０％〜約５００％増大させることができる。あるいは、ＣＤ４０Ｌは、抗原に対する免疫応答を増大させることができ、約１０％〜約２５０％増大し得る。なお他の代替実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、抗原に対する免疫応答を増大させることができ、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％、５００％、５１０％、５２０％、５３０％、５４０％、５５０％、５６０％、５７０％、５８０％、５９０％、または６００％増大し得る。
【００４３】
他の実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、免疫応答の増大またはブーストを必要とする対象に投与されるワクチン由来の特定の抗原に対する免疫応答を少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増大またはブーストすることができる。
【００４４】
ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、任意の数の生物、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、マカク（Ｍａｃａｃａｃ  ｍｕｌａｔｔａ）、及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のものであり得る。ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、コドン使用頻度及び対応するＲＮＡ転写物に関して最適化され得る。ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、発現のためにコドン及びＲＮＡ最適化され得る。ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列も含み得る。ＩｇＥリーダー配列は、核酸のＣＤ４０Ｌの５’に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、または含有しない。
【００４５】
マウスＣＤ４０Ｌは、配列番号７、９、及び／または１１の最適化された核酸配列であり得、これらは、それぞれ、配列番号８、１０、及び／または１２をコードする。いくつかの実施形態では、マウスＣＤ４０Ｌは、配列番号７、９、及び／または１１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。マウスＣＤ４０Ｌは、配列番号８、１０及び／または１２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００４６】
マカクＣＤ４０Ｌは、配列番号１３の最適化された核酸配列であり得、これは、それぞれ、配列番号１４をコードする。いくつかの実施形態では、マカクＣＤ４０Ｌは、配列番号１３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。マカクＣＤ４０Ｌは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００４７】
ヒトＣＤ４０Ｌは、配列番号１、３、及び／または５の最適化された核酸配列であり得、これらは、それぞれ、配列番号２、４、及び／または６をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４０Ｌは、配列番号１、３、及び／または５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態では、ヒトＣＤ４０Ｌ配列は、配列番号２、４、及び／または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態は、配列番号１、３、５、７、９、１１、及び／または１３の断片に関する。断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、及び／または１３の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を構成し得る。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００４９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、及び／または１３の断片と同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、及び／または１３と９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌ核酸配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌ核酸配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌ核酸配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌ核酸配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００５０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び／または１４の断片が提供され得る。断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び／または１４の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列を含まない。
【００５１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び／または１４の断片と同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び／または１４と９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌタンパク質配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌタンパク質配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌタンパク質配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるＣＤ４０Ｌタンパク質配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列を含まない。
【００５２】
ｂ．抗原
本ワクチンは、抗原またはその断片もしくは変異形を含み得る。抗原は、対象における免疫応答を誘導する任意のものであり得る。精製抗原は、通常、単独では免疫原性が強くないため、上述のようにアジュバントと組み合わせられる。抗原によって誘導される免疫応答は、アジュバントと組み合わせた場合にブーストまたは増大させることができる。かかる免疫応答は、液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、アジュバントと抗原の組み合わせは、対象における細胞性免疫応答をブーストまたは増大させることができる。
【００５３】
抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異形、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ペプチド結合によって抗原に連結されたリンカーまたはタグ配列をコードするさらなる配列も含み得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらの変異形、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００５４】
抗原は、任意の数の生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物由来のタンパク質、核酸、またはその断片、またはその変異形、またはそれらの組み合わせに含有されてもよい。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態では、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。好ましくは、抗原は、インフルエンザまたはＨＩＶに関連し得る。
【００５５】
いくつかの抗原は、強い免疫応答を誘導することができる。他の抗原は、弱い免疫応答を誘導することができる。抗原は、上述のようにアジュバントと組み合わせた場合により高い免疫応答を誘発することができる。
【００５６】
（１）ウイルス抗原
抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異形であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科：Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ，  Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ，  Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅのうちの１つのウイルスに由来し得る。ウイルス抗原は、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、デング熱ウイルス、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（口腔ヘルペス）、単純ヘルペスウイルス２型（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名は水疱瘡）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ヒトＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、チクングニアウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、または発癌性ウイルスに由来し得る。
【００５７】
（ａ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
ＣＤ４０Ｌは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、またはその断片、またはその変異形と会合または組み合わせられてもよい。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、及び／または他の癌を引き起こす、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、及び５８型に由来し得る。ＨＰＶ抗原は、性器疣贅を引き起こし、頭頸部癌の原因として知られている、ＨＰＶ６及び１１型に由来し得る。
【００５８】
ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型のＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７ドメインであってもよい。例えば、ＨＰＶ１６型（ＨＰＶ１６）の場合、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、それらの断片、変異形、または組み合わせを含み得る。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ  ６  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ  １１  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ  １８  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ３１  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ３３  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ５２  Ｅ６及び／もしくはＥ７、またはＨＰＶ  ５８  Ｅ６及び／もしくはＥ７、それらの断片、変異形、または組み合わせであってもよい。
【００５９】
（ｂ）ＲＳＶ抗原
ＣＤ４０Ｌは、同様に、ＲＳＶ抗原またはその断片、またはその変異形と会合または組み合わせられてもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書で「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」、及び「Ｆタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間に保存することができる。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異形の単量体、二量体、または三量体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異形であってもよい。
【００６０】
ＲＳＶ  Ｆの融合後形態は、免疫動物において高力価の中和抗体を誘発し、動物をＲＳＶへの曝露から保護する。本発明は、特許請求されるワクチンにおけるこの免疫応答を利用する。本発明によれば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前形態または融合後形態であってもよい。
【００６１】
ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書で「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」、及び「Ｇタンパク質」）、またはその断片もしくは変異形でもあり得る。ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で異なる。抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３、またはそれらの断片もしくは変異形由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質であってもよい。ＲＳＶ抗原は、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異形であってもよい。
【００６２】
他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはその断片もしくは変異形であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ヒトＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはその断片もしくは変異形でもあり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、さらに、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリンタンパク質（「Ｐ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質タンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形でもあり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。
【００６３】
なお他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ疎水性小（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形でもあり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ＲＳＶ抗原は、さらに、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。ヒトＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはその断片もしくは変異形であってもよい。
【００６４】
さらなる実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質の最適化されたアミノ酸配列を有し得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶゲノムによってコードされるタンパク質のうちのいずれか１つ等の、ヒトＲＳＶタンパク質または組み換え抗原であってもよい。
【００６５】
他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株のヒトＲＳＶゲノム、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはそれらの断片、またはそれらの変異体であり得るが、これらに限定されない。
【００６６】
（ｃ）インフルエンザ抗原
ＣＤ４０Ｌは、インフルエンザ抗原、またはその断片、またはその変異形と会合または組み合わせられてもよい。インフルエンザ抗原は、哺乳動物において１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原である。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、それらの変異形、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含み得る。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株由来のコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ２の複数の株由来のコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の異なるセットの複数の株由来の２つの異なるコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはインフルエンザＢの複数の株由来のコンセンサス配列であってもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＢに由来し得る。
【００６７】
インフルエンザ抗原は、免疫応答が誘導され得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含有することもできる。抗原は、免疫原性部位の全レパートリーと、インタクトなインフルエンザウイルス中に存在するエピトープとを提供することができる。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株由来のヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。抗原は、２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列またはその一部を組み合わせることによって得ることができる、ハイブリッドコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列の各々は、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の異なるセットの複数のインフルエンザＡウイルス株に由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株由来のヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であってもよい。あるいは、インフルエンザ抗原は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列またはコンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質であるコンセンサスヘマグルチニン抗原であってもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、各々が互いに異なる組の配列に由来する２つの異なるコンセンサスＨ１配列の一部を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であってもよい。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の一例は、Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質である。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質等の、インフルエンザＢ株由来のヘマグルチニン配列に由来するコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。
【００６９】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、１つ以上のさらなるアミノ酸配列要素をさらに含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出され得る固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグをさらに含んでもよい。かかる免疫原性タグの一例は、コンセンサスヘマグルチニンＣ末端上で連結させることができる９アミノ酸インフルエンザＨＡタグである。いくつかの実施形態では、コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列、そのＣ末端にＨＡタグをさらに含んでもよい。
【００７０】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはその断片及び変異形からなるコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、非インフルエンザタンパク質配列と、インフルエンザタンパク質配列またはその断片及び変異形とを含む、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。
【００７１】
コンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＨ１アミノ酸配列からなり得るタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方等の追加の要素をさらに含むタンパク質が挙げられる。
【００７２】
コンセンサスＨ２タンパク質の例としては、コンセンサスＨ２アミノ酸配列からなり得るタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むタンパク質が挙げられる。
【００７３】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＵ２アミノ酸配列からなり得るタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むタンパク質が挙げられる。
【００７４】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢヘマグルチニンタンパク質の例としては、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列からなり得るか、または該例は、ＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグを含み得るタンパク質が挙げられる。
【００７５】
コンセンサスヘマグルチニンタンパク質は、コンセンサスヘマグルチニン核酸、その変異形、またはその断片によってコードされ得る。異なる株及び変異形からの複数の異なるヘマグルチニン配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサスヘマグルチニンタンパク質とは異なり、コンセンサスヘマグルチニン核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質配列が由来する複数の異なるヘマグルチニン配列中の特定のアミノ酸配列をコードするために使用される配列とは異なり得る。コンセンサス核酸配列は、コドン最適化及び／またはＲＮＡ最適化されてもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、５’非翻訳領域にコザック配列を含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでもよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ヘマグルチニンコード配列の５’である。Ｎ末端リーダーは、分泌を容易にすることができる。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであってもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端に存在してもよく、それをコードする配列は、ＨＡコード配列の３’である。免疫原性タグは、それに対して容易に入手可能な抗体が存在する固有のエピトープを提供するため、タンパク質の発現を検出及び確認するためのアッセイにおいてかかる抗体を使用することができる。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端のＨタグであってもよい。
【００７６】
（ｄ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
ＣＤ４０Ｌは、ＨＩＶ抗原、またはその断片、またはその変異形と会合または組み合わせられてもよい。ＨＩＶ抗原は、免疫原について改変されたコンセンサス配列を含み得る。構築物の免疫原性を増大させるためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子修飾が、修飾されたコンセンサス配列に含まれてもよい。新規の免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強力で広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計されてもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＡエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＡコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【００７８】
他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢエンベロープタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【００７９】
なお他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＣコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＣエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＣコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【００８０】
さらなる実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＤコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＤエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＤコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−ＲｅｖコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖコンセンサスタンパク質配列であってもよい。
【００８２】
他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ  ＤＮＡ配列構築物のＧａｇコンセンサスＤＮＡ配列、ＧａｇコンセンサスサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはコンセンサスＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤタンパク質配列であってもよい。
【００８３】
なお他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ＭＰｏｌ  ＤＮＡ配列またはＭＰｏｌタンパク質配列であってもよい。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、またはそれらの組み合わせの核酸またはアミノ酸配列であってもよい。
【００８４】
（２）寄生虫抗原
抗原は、寄生虫抗原またはその断片もしくは変異形であってもよい。寄生虫は、原虫、蠕虫、または外部寄生虫であってもよい。蠕虫（すなわち、ミミズ）は、扁形動物（例えば、吸虫及び条虫）、鉤頭虫、または線虫（例えば、蟯虫）であってもよい。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ、及びコダニであってもよい。
【００８５】
寄生虫は、以下の疾患：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、らせん虫感染症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、及び鞭虫症を引き起こす任意の寄生虫であってもよい。
【００８６】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、パラゴニムス−肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、コダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であってもよい。
【００８７】
（ａ）マラリア抗原
ＣＤ４０Ｌは、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原もしくはＰＦ免疫原）、またはその断片、またはその変異形と会合または組み合わせられてもよい。抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫に由来し得る。マラリアを引き起こす寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であり得る。熱帯熱マラリア原虫抗原としては、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原が挙げられ得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１のうちの１つ以上をコードするプラスミド等の核酸分子であってもよい。免疫原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。免疫原は、発現を改善させるためのコンセンサス配列及び／または改変を含む。
【００８９】
他の実施形態では、マラリア抗原は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける全ての全長熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２配列（合計２８個の配列）の編集から設計されたＳＳＰ２とも称されるＴＲＡＰのコンセンサス配列であってもよい。コンセンサスＴＲＡＰ免疫原（すなわち、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原）は、シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含み得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。
【００９０】
なお他の実施形態では、マラリア抗原は、Ａｇ２とも称され、かつ高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＣｅｌＴＯＳであってもよい。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ抗原（すなわち、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原）は、シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含み得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。
【００９１】
さらなる実施形態では、マラリア抗原は、高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＡｍａ１であってもよい。マラリア抗原は、いくつかの例では、シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含む、Ａｍａ１のコンセンサス配列（すなわち、ＣｏｎＡｍａＩ免疫原）であってもよく、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含んでもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、マラリア抗原は、いくつかの例では、シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドを含む、コンセンサスＣＳ抗原（すなわち、コンセンサスＣＳ免疫原）であってもよく、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含んでもよい。
【００９３】
他の実施形態では、マラリア抗原は、本明細書に記載のＰＦタンパク質のうちの２つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質は、互いに直接隣接して連結されるか、または間にスペーサーまたはもう１つのアミノ酸を伴って連結される、コンセンサスＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、及びＣｏｎＡｍａ１免疫原のうちの２つ以上を含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。２つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ及びＬＳＡ１；ＣＳ及びＴＲＡＰ；ＣＳ及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ及びＡｍａ１；ＬＳＡ１及びＴＲＡＰ；ＬＳＡ１及びＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１及びＡｍａ１；ＴＲＡＰ及びＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰ及びＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含み得る。３つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含み得る。４つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含み得る。５つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含み得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端に連結されたシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結された複数のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーが融合タンパク質のＰＦ免疫原間に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＰＦ免疫原間のスペーサーは、タンパク質分解切断部位であってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ワクチンが投与され、かつ／または取り込まれるよう意図されている細胞に見られるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解切断部位であってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーが融合タンパク質のＰＦ免疫原間に含まれてもよく、スペーサーは、ワクチンが投与され、かつ／または取り込まれるよう意図されている細胞に見られるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解切断部位であり、融合タンパク質は、切断時に各コンセンサスＰＦ免疫原のシグナルペプチドがコンセンサスＰＦ免疫原を細胞外に移動させるように、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結された複数のシグナルペプチドを含む。
【００９５】
（３）細菌抗原
抗原は、細菌抗原またはその断片もしくは変異形であってもよい。最近は、以下の門：Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａのうちのいずれか１つに由来し得る。
【００９６】
細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であってもよい。細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌であってもよい。細菌は、中温菌、好中球菌、好極限性細菌、好酸球菌、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であってもよい。
【００９７】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染性細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌、または破傷風菌であってもよい。細菌は、マイコバクテリア、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであってもよい。
【００９８】
（４）真菌抗原
抗原は、真菌抗原またはその断片もしくは変異形であってもよい。真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、皮膚糸状菌、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍであってもよい。
【００９９】
ｃ．ベクター
本ワクチンは、抗原をコードする核酸を含む１つ以上のベクターと、アジュバントとを含んでもよい。１つ以上のベクターは、抗原及びアジュバントを発現させることが可能であり得る。１つ以上のベクターは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである、発現構築物であってもよい。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が、細胞転写及び翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、多くの場合、エンハンサー及びプロモーター領域として作用し、かつ発現ベクターに運ばれる遺伝子の効率的な転写をもたらす制御配列を含有するように操作されている。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、ひいてはタンパク質を発現する。
【０１００】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子との間の距離の調節、ならびに転写終結配列及びＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入等の発現シグナルを有してもよい。
【０１０１】
（１）発現ベクター
ベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であってもよい。環状プラスミド及び線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。ベクターは、終止シグナルに作動可能に連結されてもよい、抗原をコードするヌクレオチド配列またはアジュバントをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを有し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含有することもできる。対象となるヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであってもよく、すなわち、その成分のうちの少なくとも１つが、その他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外的刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であってもよい。
【０１０２】
（２）環状及び線状ベクター
ベクターは、細胞ゲノムへの取り込みによって標的細胞を形質転換することができるか、または染色体外に存在し得る、環状プラスミドであってもよい（例えば、複製起点を有するプラスミドの自律増殖）。
【０１０３】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであってもよく、または抗原もしくはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することができ、かつ細胞が配列を免疫系によって認識される抗原もしくはアジュバントに翻訳することを可能にする任意の他の発現ベクターであってもよい。
【０１０４】
電気穿孔により対象に効率的に送達され、かつ１つ以上の所望の抗原または１つ以上の所望のアジュバントを発現することができる、線状核酸ワクチンまたは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、いずれのリン酸主鎖も持たない任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、１つ以上の抗原または１つ以上のアジュバントをコードすることができる。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含有してもよい。抗原またはアジュバントの発現は、プロモーターによって制御されてもよい。ＬＥＣは、いずれの抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸主鎖も含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現または所望のアジュバント発現と無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１０５】
ＣＤ４０Ｌベクターは、プラスミド内に一緒に配置されてもよく、または図１Ａに概略的に示されるように別個に配置されてもよい。
【０１０６】
ＬＥＣは、直線化され得る任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原またはアジュバントを発現することが可能であり得る。プラスミドは、アジュバントＣＤ４０Ｌを発現することが可能であり得、例えば、第１のプロモーターの制御下にあるｐ１９サブユニットと、第２のプロモーターの制御下にあるｐ４０サブユニットとを有する二重プロモータープラスミドである。第１のプロモーター及び第２のプロモーターは、同じプロモーターであっても同じプロモーターでなくてもよい。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または抗原をコードするかもしくはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することが可能であり、かつ細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにする任意の他の発現ベクターであるか、またはアジュバントであってもよい。
【０１０７】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）及びｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【０１０８】
（３）プロモーター、イントロン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル
ベクターは、プロモーターを有してもよい。プロモーターは、遺伝子発現を駆動すること及び単離核酸の発現を制御することが可能ないずれのプロモーターであってもよい。かかるプロモーターは、本明細書に記載の抗原配列またはアジュバント配列を転写する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用配列要素である。異種核酸の発現を導くために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、その天然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけベクターにおける転写開始部位から離れて位置してもよい。しかしながら、プロモーター機能を喪失することなく、この距離の変動は受け入れられ得る。
【０１０９】
プロモーターは、抗原をコードする核酸配列に作動可能に連結されてもよく、転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルであってもよい。プロモーターは、アジュバントをコードする核酸配列に作動可能に連結されてもよく、転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルであってもよい。
【０１１０】
プロモーターは、ＣＭＶ  プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に効果的であることが示されている別のプロモーターであってもよい。
【０１１１】
ベクターは、エンハンサーと、機能的なスプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するイントロンとを含んでもよい。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結部位を含有してもよい。終結部位は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られてもよいか、または異なる遺伝子から得られてもよい。
【０１１２】
ｄ．ワクチンの賦形剤及び他の成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、ＣＤ４０Ｌ以外のアジュバント、担体、または希釈剤等の機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０１１３】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度でワクチン中に存在し得る。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａ等のＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレン等の小胞体も含み得、ヒアルロン酸も、遺伝子構築物と一体化させて使用投与され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０号を参照）として当該技術分野で公知の他のリポソーム等のリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【０１１４】
薬学的に許容される賦形剤は、ＣＤ４０Ｌに加えて、アジュバントであり得る。追加のアジュバントは、別のプラスミドに発現されるか、またはワクチンにおいて上述のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される、他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を有し、かつＩｇＥ由来のシグナルペプチドを任意に含むＣＤ８６からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１１５】
ＣＤ４０Ｌに加えてアジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能的断片をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１１６】
本ワクチンは、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日出願の米国特許第０２１，５７９号に記載の遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでもよい。
【０１１７】
ワクチンは、使用される投与様式に従って配合され得る。注射可能なワクチン薬学的組成物は、滅菌されており、パイロジェン及び微粒子を含まない場合がある。等張性配合剤または溶液が使用され得る。等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられ得る。本ワクチンは、血管収縮剤を含んでもよい。等張溶液としては、リン酸緩衝食塩水が挙げられ得る。ワクチンは、ゼラチン及びアルブミン等の安定化剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオン等、安定化剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定させることができる。
【０１１８】
３．ワクチン接種方法
本発明は、ワクチンの異なる投与経路による対象における免疫応答の増大方法も対象とする。免疫応答の増大は、対象における疾患を治療及び／または予防するために使用され得る。
【０１１９】
本方法は、本明細書に開示されるワクチンを対象に投与することを含み得る。本ワクチンを投与された対象は、抗原を単独で投与された対象と比較して増大またはブーストされた免疫応答を有し得る。いくつかの実施形態では、本ワクチンを投与された対象における免疫応答は、少なくとも約１０％〜少なくとも約６００％増大し得る。あるいは、本ワクチンを投与された対象における免疫応答は、少なくとも約１０％〜少なくとも約２５０％増大し得る。なお他の代替実施形態では、本ワクチンを投与された対象における免疫応答は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％、２０５％、２１０％、２１５％、２２０％、２２５％、２３０％、２３５％、２４０％、２４５％、２５０％、２５５％、２６０％、２６５％、２７０％、２７５％、２８０％、２８５％、２９０％、２９５％、３００％、３０５％、３１０％、３１５％、３２０％、３２５％、３３０％、３３５％、３４０％、３４５％、３５０％、３５５％、３６０％、３６５％、３７０％、３７５％、３８０％、３８５％、３９０％、３９５％、４００％、４０５％、４１０％、４１５％、４２０％、４２５％、４３０％、４３５％、４４０％、４４５％、４５０％、４５５％、４６０％、４６５％、４７０％、４７５％、４８０％、４８５％、４９０％、４９５％、５００％、５０５％、５１０％、５１５％、５２０％、５２５％、５３０％、５３５％、５４０％、５４５％、５５０％、５５５％、５６０％、５６５％、５７０％、５７５％、５８０％、５８５％、５９０％、５９５％、または６００％増大し得る。
【０１２０】
他の実施形態では、投与されるワクチンは、対象における免疫応答を少なくとも約１．２０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増大またはブーストすることができる。
【０１２１】
ワクチン用量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／体重ｋｇ／時間であってもよく、２μｇ〜１０ｍｇ活性成分／体重ｋｇ／時間であってもよい。本ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与されてもよい。効果的な治療のためのワクチン服用回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回であってもよい。
【０１２２】
ａ．投与
本ワクチンは、製薬技術の当業者に周知の標準的技術に従って製剤化することができる。かかる組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、及び状態、ならびに投与経路等の要因を考慮に入れて、医療技術の当業者に周知の投与量で、かかる技術によって投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウス等の哺乳動物であってもよい。
【０１２３】
本ワクチンは、予防的または治療的に投与され得る。予防的投与において、本ワクチンは、免疫応答を誘導するのに十分な量で投与され得る。治療的投与において、本ワクチンは、それを必要とする対象に、治療効果を誘発するのに十分な量で投与される。これを達成するための適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に効果的な量は、例えば、投与されるワクチン投与計画の特定の組成、投与様式、疾患の段階及び重症度、患者の一般的健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。
【０１２４】
本ワクチンは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，５８０，８５９号、１９９６年１２月３日発行）、Ｆｅｌｇｎｅｒ（米国特許第５，７０３，０５５号、１９９７年１２月３０日発行）、及びＣａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，６７９，６４７号、１９９７年１０月２１日発行）（これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような当該技術分野で周知の方法によって投与され得る。本ワクチンのＤＮＡは、例えば、ワクチン銃を使用して個体に投与することができる粒子またはビーズに複合化することができる。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを理解している。
【０１２５】
本ワクチンは、様々な経路を介して送達され得る。典型的な送達経路としては、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達が挙げられる。他の経路としては、経口投与、鼻腔内、及び膣内経路が挙げられる。特に本ワクチンのＤＮＡについて、本ワクチンは、個体の組織の間質空間に送達され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，７０３，０５５号、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。本ワクチンは、筋肉に投与することもできるか、または皮内もしくは皮下注射を介して投与することもできるか、または経皮的に投与する（イオン導入法による等）こともできる。本ワクチンの表皮投与も使用され得る。表皮投与は、表皮の最外層を機械的または化学的に刺激して、刺激物に対する免疫応答を刺激することを含み得る（Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６７９，６４７号（この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０１２６】
本ワクチンは、鼻腔投与用に製剤化することもできる。担体が固体である場合、経鼻投与に好適な製剤は、鼻から吸い込む様式で、すなわち、鼻の近くに維持された粉末の容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される、例えば約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み得る。製剤は、鼻腔スプレー、点鼻薬、または噴霧器によるエアロゾル投与によるものであってもよい。製剤は、本ワクチンの水性または油性溶液を含み得る。
【０１２７】
本ワクチンは、懸濁液、シロップ剤、またはエリキシル剤等の液体製剤であり得る。本ワクチンは、滅菌懸濁液または乳濁液等の、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射剤の投与）のための製剤でもあり得る。
【０１２８】
本ワクチンは、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマー基質に組み込まれ得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７０３，０５５号、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉｔｏ  ＩＩＩ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９３）（これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなってもよく、比較的単純に作製及び投与される、無毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【０１２９】
本ワクチンは、米国特許第７，６６４，５４５号（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法等による電気穿孔により投与され得る。電気穿孔は、米国特許第６，３０２，８７４号、同第５，６７６，６４６号、同第６，２４１，７０１号、同第６，２３３，４８２号、同第６，２１６，０３４号、同第６，２０８，８９３号、同第６，１９２，２７０号、同第６，１８１，９６４号、同第６，１５０，１４８号、同第６，１２０，４９３号、同第６，０９６，０２０号、同第６，０６８，６５０号、及び同第５，７０２，３５９号（これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法及び／または装置により得る。電気穿孔は、低侵襲性デバイスにより実行されてもよい。
【０１３０】
低侵襲性電気穿孔デバイス（「ＭＩＤ」）は、上述のワクチン及び関連流体を身体組織に注入するための装置であり得る。デバイスは、中空針、ＤＮＡカセット、及び流体送達手段を備えてもよく、デバイスは、体組織に針を挿入している間に同時に（例えば、自動的に）ＤＮＡを該体組織に注入するために流体送達手段を作動させて使用するように構成される。これは、針が挿入されている間にＤＮＡ及び関連する流体を徐々に注入する能力によって、体組織中に流体のより均一な分布をもたらすという利点を有する。注入中に経験される疼痛は、注入されるＤＮＡがより広い領域にわたって分布されるために軽減され得る。
【０１３１】
ＭＩＤは、針を使用することなく、ワクチンを組織に注入することができる。ＭＩＤは、ワクチンを小さな流れまたは噴流として注入することができ、かかる力を用いると、ワクチンは、組織表面を貫通して下層の組織及び／または筋肉に進入する。小さな流れまたは噴流の原動力は、一瞬のうちに微小開口部を通る二酸化炭素等の圧縮ガスの膨脹によって提供されてもよい。低侵襲性電気穿孔デバイス及びそれらの使用方法の例は、公開米国特許出願第２００８０２３４６５５号、米国特許第６，５２０，９５０号、米国特許第７，１７１，２６４号、米国特許第６，２０８，８９３号、米国特許第６，００９，３４７号、米国特許第６，１２０，４９３号、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許第７，３２８，０６４号、及び米国特許第６，７６３，２６４号（これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３２】
ＭＩＤは、疼痛を伴わずに組織を貫通する液体の高速噴流を形成する注射器を備えてもよい。かかる無針注射器は市販されている。本明細書で利用され得る無針注射器の例としては、米国特許第３，８０５，７８３号、同第４，４４７，２２３号、同第５，５０５，６９７号、及び同第４，３４２，３１０号（これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。
【０１３３】
直接的または間接的な電気輸送に好適な形態の所望のワクチンは、通常、ワクチンを組織内に浸透させるのに十分な力を用いて、薬剤の噴流の送達を始動させるために組織表面に注射器を接触させることにより、無針注射器を使用して治療されるべき組織内に導入（例えば、注入）することができる。例えば、治療されるべき組織が粘膜、皮膚、または筋肉である場合、薬剤は、角質層を通って真皮層内にまたは下層の組織及び筋肉に浸透させるのに十分な力で、それぞれ、粘膜表面または皮膚表面に向けて発射される。
【０１３４】
無針注射器は、全ての種類の組織、特に皮膚及び粘膜にワクチンを送達するのに非常に適している。いくつかの実施形態では、無針注射器は、表面及び対象の皮膚または粘膜内にワクチンを含有する液体を推進するために使用されてもよい。本発明の方法を使用して治療することができる種々の種類の組織の代表的な例は、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１３５】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針電極を有してもよい。例えば、長方形または正方形のパターンに設定された複数電極アレイにおいて複数対の電極間でパルスを発生させることにより、一対の電極間のパルシングよりも優れた改善された結果を提供する。例えば、米国特許第５，７０２，３５９号、表題「Ｎｅｅｄｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓ」には、複数の対の針が治療的処置中にパルスされ得る針のアレイが開示されている。参照により完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれるその出願において、針は、環状アレイに配置されるが、対向する針電極間でパルシングを可能にするコネクタ及び切替装置を有する。組み換え発現ベクターを細胞に送達するための一対の針電極が使用されてもよい。かかるデバイス及びシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。あるいは、通常の注射針に似た単一針を用いてＤＮＡの注入及び電気穿孔を可能にし、現在使用されているデバイスによって送達されるよりも低い電圧のパルスを印加し、そのため患者が経験する電気刺激を軽減する、単一針デバイスが使用されてもよい。
【０１３６】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを備えてもよい。アレイは、同じ直径または異なる直径の２本以上の針を備えてもよい。針は、均一または不均一に離間されてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ、または０．０１５インチ〜０．０２０インチであってもよい。針は、０．０１７５インチの直径であってもよい。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上離間されてもよい。
【０１３７】
ＭＩＤは、パルス発生器と、ワクチン及び電気穿孔パルスを単一ステップで送達する２本以上の針を有するワクチン注射器とからなり得る。パルス発生器は、フラッシュカードで操作されるパーソナルコンピュータを介したパルス及び注入パラメータの柔軟なプログラミング、ならびに電気穿孔及び患者データの包括的な記録及び格納を可能にし得る。パルス発生器は、短期間の間に様々な電圧パルスを送達することができる。例えば、パルス発生器は、１００ミリ秒の期間に１５電圧パルスを３回送達することができる。かかるＭＩＤの例は、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥｌｇｅｎ  １０００システムであり、米国特許第７，３２８，０６４号（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３８】
ＭＩＤは、身体または植物内の選択された組織の細胞へのＤＮＡ等の高分子の導入を促進するモジュール電極システムである、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＰＡ）デバイス及びシステムであり得る。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、及び電源を備えてもよい。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。次いで、選択された組織への皮下注射針により高分子が送達される。プログラム可能な定電流制御器が作動し、定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間において高分子の細胞内への導入を促進する。定電流パルスにより組織内の電力散逸を制限することによって、細胞の過熱による細胞死が最小限に抑えられる。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）デバイス及びシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３９】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ  １０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり得る。Ｅｌｇｅｎ  １０００システムは、中空針及び流体送達手段を提供するデバイスを備えてもよく、該装置は、体組織に針を挿入している間に同時に（例えば、自動的に）本明細書に記載の所望のワクチンを該体組織に注入するために流体送達手段を作動させて使用するように構成される。針が挿入されている間に流体を徐々に注入する能力によって、体組織を通して流体のより均一な分布がもたらされることは利点である。また、注入中に経験される疼痛は、注入される流体の体積がより広い領域にわたって分布されるために軽減されると考えられる。
【０１４０】
さらに、流体の自動注入が、注入される流体の実際量の自動監視及び登録を容易にする。このデータは、必要に応じて文書化の目的で制御装置によって格納されてもよい。
【０１４１】
注入の速度は、直線的または非直線的のいずれかであってもよいこと、ならびに、注入は、治療されるべき対象の皮膚を通して針が挿入された後、及びそれらが体組織内にさらに挿入されている間に実行され得ることを理解されたい。
【０１４２】
本発明の装置によって流体を注入することができる好適な組織としては、腫瘍組織、皮膚、または肝組織が挙げられるが、筋肉組織であってもよい。
【０１４３】
装置はさらに、体組織への針の挿入を誘導するための針挿入手段を備える。流体注入の速度は、針の挿入速度によって制御される。これは、挿入の速度が所望の注入の速度と一致し得るように針の挿入と流体の注入の両方を制御することができるという利点を有する。このことは、ユーザによる装置の操作も容易にする。必要に応じて、体組織に自動的に針を挿入するための手段が提供されてもよい。
【０１４４】
ユーザは、流体の注入を開始する時を選択することができる。しかしながら、理想的には、針の先端が筋肉組織に到達したときに注入が開始され、装置は、流体の注入を開始するのに十分な深さまで針が挿入された場合に感知するための手段を含んでもよい。これは、針が所望の深さ（通常、筋肉組織が始まる深さ）に到達したときに流体の注入が自動的に開始するよう促すことができることを意味する。筋組織が始まる深さは、例えば、４ｍｍの値等の予め設定された針の挿入深さであると解釈されてもよく、それは針が皮膚層を通過するのに十分であると見なされる。
【０１４５】
感知手段は、超音波プローブを備えてもよい。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するための手段を備えてもよい。この場合、該手段は、それ自体では体組織内の針の深さを記録することはできないかもしれないが、むしろ、針が異なる種類の体組織から筋肉内へと移動した場合にインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように構成される。これらの代替手段のいずれも、注入が開始し得ることを感知する比較的正確で操作が単純な手段を提供する。針の挿入の深さは、必要に応じてさらに記録されてもよく、針挿入の深さが記録されながら注入される流体の体積が決定されるように流体の注入を制御するために使用することができる。
【０１４６】
装置は、針を支持するための基部と、その中に基部を受容するための筐体とをさらに備えてもよく、基部が筐体に対して第１の後方位置にある場合、筐体内で針が後退し、基部が筐体内で第２の前方位置にある場合、針が筐体から伸長するように、基部は筐体に対して移動可能である。筐体は、患者の皮膚上に並べることができ、次いで、筐体を基部に対して移動させることによって針を患者の皮膚内に挿入することができるため、これはユーザにとって有利である。
【０１４７】
上述のように、針が皮膚に挿入されると流体が針の長さにわたって均一に分布されるように、制御された流体の注入速度を達成することが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように構成されるピストン駆動手段を備えてもよい。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータによって作動させることができる。しかしながら、ピストン駆動手段は、筐体に対して軸方向に移動させられる基部によって作動されてもよい。流体送達の代替手段が提供されてもよいことを理解されたい。したがって、例えば、制御されたまたは制御されない速度での流体送達のために圧搾できる密封容器が、シリンジ及びピストンシステムの代わりに提供されてもよい。
【０１４８】
上述の装置は、あらゆる種類の注入に使用することができる。しかしながら、電気穿孔の分野において特に有用であることが想定されるため、針に電圧を印加するための手段をさらに備えてもよい。これは、注入のためだけではなく、電気穿孔中の電極としても針が使用されることを可能にする。このことは、注入される流体と同じ領域に電場が印加されることを意味するため、これは特に有利である。従来、電気穿孔には、以前に注入された流体と電極を正確に位置に合わせることが非常に困難であるため、ユーザがより広い領域にわたって必要とされるよりも多くの体積の流体を注入し、注入された物質と電場との重複を確実にするためにより高い領域にわたって電場を印加する傾向があるという問題があった。本発明を使用すると、電場と流体との間の良好な適合を達成しながら、注入される流体の体積及び印加される電場の大きさの両方を減少させることができる。
【０１４９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
【実施例】
【０１５０】
３．実施例
各々が異なる形態のＣＤ４０Ｌをコードする合成遺伝子を構築し、プラスミド骨格ｐＧＸ０００１にクローニングした。ＷＴ  ＣＤ４０Ｌ（ＷＴまたは野生型）変異形は、ＣＤ４０Ｌの膜結合形態も可溶化形態もいずれも発現される天然ＣＤ４０リガンド遺伝子のコドン及びＲＮＡ最適化バージョンであった。ＭＴ  ＣＤ４０Ｌ（ＭＴまたは成熟／可溶性）変異形は、遺伝子の膜貫通領域が除去されて、最初にタンパク質を細胞膜に挿入することなく細胞がタンパク質を直接放出することを可能にするＣＤ４０Ｌ配列のコドン及びＲＮＡ最適化改変体であった。ＵＣ  ＣＤ４０Ｌｍ（ＵＣまたは切断不可能）変異形は、変異がＣＤ４０Ｌ配列の切断ドメイン内に起こり、それにより、タンパク質が細胞膜から切断され、それが発現される細胞に結合した状態で留まることができなくなったＣＤ４０Ｌ配列のコドン及びＲＮＡ最適化改変体であった。各インサートは、効率的なＩｇＥリーダー配列も含んだ。その後、インサートを、発現がＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター下で制御されたｐＶＡＸベクターにクローニングした（図１Ａ）。
【０１５１】
全てのプラスミドがインビトロで発現したことが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション及び細胞溶解物のウエスタンブロットによって決定された（図１Ｂ）。
【０１５２】
実施例１
筋肉内免疫化
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝５／群）を、本ワクチンを筋肉内経路により投与したときにＣＤ４０Ｌがアジュバントとして機能することができるかを決定するためのモデル系として使用した。本ワクチンは、いずれもそれぞれのプラスミドによってコードされた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープコンセンサスクレードｃタンパク質抗原及びＣＤ４０Ｌを含んだ。
【０１５３】
５つのマウス群を利用した。第１のマウス群を、ｐＶａｘ骨格（ナイーブ）で免疫化した。第２のマウス群を、２．５μｇのＨＩＶエンベロープコンセンサスクレードｃ（ＨＩＶ抗原）で免疫化した。第３のマウス群を、ＨＩＶ抗原と１５μｇのＵＣ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第４のマウス群を、ＨＩＶ抗原と１５μｇのＭＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第５のマウス群を、ＨＩＶ抗原と１５μｇのＷＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。
【０１５４】
全てのマウスを、電気穿孔（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔デバイス、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＰＡ）を使用して筋肉内経路により免疫化した。これらのマウスを３回（０週目、３週目、及び６週目）免疫化し、最終免疫化の１週間後（７週目）（図２Ａ）に屠殺し、細胞分析のために脾細胞を採取し、血液も採取して、誘導された抗体力価を決定した。細胞内サイトカイン染色を行って、免疫化後の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αサイトカイン産生を測定した。
【０１５５】
図２Ｃに示されるように、任意の形態のＣＤ４０Ｌの存在は、ＨＩＶエンベロープコンセンサスクレードｃでの免疫化に応答して生成されたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−α産生を著しく変化させなかった。応答頻度がサイトカイン産生の各測定における全ての他の群において１％に近付いたが、サイトカインを産生した抗原特異的Ｔ細胞のパーセントは、ＣＤ４０Ｌのいくつかの形態を含めることによって高まった（図２Ｃ）。ＩＦＮ−γが、ＨＩＶ抗原のみ（およそ６．５％）と比較して、ＨＩＶ抗原＋ＵＣ  ＣＤ４０Ｌ（およそ５．０％）、ＨＩＶ抗原＋ＭＴ  ＣＤ４０Ｌ（およそ９．０％）、及びＨＩＶ抗原＋ＷＴ  ＣＤ４０Ｌ（およそ８．０％）のワクチン接種後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞において上昇した。ＨＩＶ抗原＋ＭＴで免疫化したマウスは、ＨＩＶ抗原のみで免疫化したマウス（ｐ＜０．０５）及びＨＩＶ抗原＋ＵＣで免疫化したマウス（ｐ＜０．００１）と比較して著しくより高いＩＦＮ−γ産生を有した。ＷＴ  ＣＤ４０Ｌで免疫化したマウスは、ＵＣ  ＣＤ４０Ｌを受けた群（ｐ＜０．０５）と比較して抗原特異的ＩＦＮ−γ産生の著しい増加を有した。ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ−２について、応答は、全ての免疫化群においておよそ１％であった。しかしながら、ＨＩＶ抗原＋ＭＴで免疫化した群は、ＨＩＶ抗原のみ（ｐ＜０．０１）及びＨＩＶ抗原＋ＵＣ  ｐ＜０．０５）群と比較して著しくより高いＩＬ−２産生を有した。ＨＩＶ抗原のみで免疫化したマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞からのＴＮＦ−α産生がおよそ３％の頻度を示した一方で、ＨＩＶ抗原＋ＭＴ、ＨＩＶ抗原＋ＵＣ、及びＨＩＶ抗原＋ＷＴは、それぞれ、５．０％、３．０％、及び５．０％までの増加を示した。ＨＩＶ抗原＋ＭＴまたはＨＩＶ抗原＋ＷＴで免疫化したマウスは各々、ＨＩＶのみで免疫化したマウスと比較して著しく増加したＴＮＦ−α産生を有した（それぞれ、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）。これらのＨＩＶ抗原＋ＭＴ群またはＨＩＶ抗原＋ＷＴ群は、ＨＩＶ抗原＋ＵＣ群と比較して著しくより高い応答（それぞれ、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）も有した（図２Ｃ）。ＨＩＶ抗原のみ及びＨＩＶ＋ＣＤ４０Ｌの３つ全ての形態（ＭＴ、ＵＣ、またはＷＴ）での免疫化は、ナイーブのみと比較して高力価抗体応答を誘発した（図２Ｂ）。ＨＩＶ抗原＋ＭＴまたはＨＩＶ抗原＋ＷＴで免疫化したマウスは各々、ＨＩＶのみ（ｐ＜０．０５）及びＨＩＶ＋ＵＣ（ｐ＜０．０５）と比較して著しくより高い抗体応答を有した。全体的に、ＣＤ４０ＬのＭＴ形態は、ＣＤ４０Ｌの他の形態（ＵＣまたはＷＴ）と比較して抗体力価を増加させた。
【０１５６】
実施例２
筋肉内免疫化
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝５／群）を、本ワクチンを筋肉内経路により投与したときにＣＤ４０Ｌがアジュバントとして機能することができるかを決定するためのモデル系として使用した。本ワクチンは、それぞれのプラスミドによってコードされたヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７タンパク質及びＣＤ４０Ｌを含んだ。
【０１５７】
５つのマウス群を利用した。第１のマウス群を、ｐＶａｘ骨格（ナイーブ）で免疫化した。第２のマウス群を、ＨＰＶ１６型Ｅ６／Ｅ７タンパク質（ＨＰＶ抗原）をコードする１０μｇのプラスミドで免疫化した。第３のマウス群を、ＨＰＶ抗原と１５μｇのＵＣ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第４のマウス群を、ＨＰＶ抗原と１５μｇのＭＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第５のマウス群を、ＨＰＶ抗原と１５μｇのＷＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。
【０１５８】
全てのマウスを、電気穿孔（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）  電気穿孔デバイス、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して筋肉内経路により免疫化した。マウスを、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームのうちのいずれか１つと組み合わせてのいずれかで２回（０週目及び３週目）免疫化し、最終免疫化の１週間後（４週目）に屠殺した。最終ワクチン接種の１週間後、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳｐｏｔにより決定した。加えて、ワクチン接種マウスから単離された脾細胞をＥ７／Ｅ６ペプチドで刺激し、細胞内染色して、免疫化後の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２サイトカイン産生を測定した（図４Ｃ）。０日目にマウスに５×１０４個のＴＣ  １細胞を移植した。４、１１、１８、及び２５日目に（図４Ｄ）、マウスにＨＰＶのみまたは可溶性ＣＤ４０Ｌと組み合わせてのいずれかをワクチン接種した。移植後、腫瘍測定を毎週行った。腫瘍へのＴＣ１細胞移植時に治療的ワクチン接種の有効性が増大したことが決定された（図４Ｅ）。
【０１５９】
実施例３
筋肉内免疫化
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝５／群）を、本ワクチンを筋肉内経路により投与したときにＣＤ４０Ｌがアジュバントとして機能することができるかを決定するためのモデル系として使用した。本ワクチンは、いずれもそれぞれのプラスミドによってコードされた、コンセンサスインフルエンザＨ１ＨＡ（Ｆｌｕ）抗原）及びＣＤ４０Ｌを含んだ。
【０１６０】
５つのマウス群を利用した。第１のマウス群を、ｐＶａｘ骨格（ナイーブ）で免疫化した。第２のマウス群を、コンセンサスインフルエンザＨ１ＨＡ  Ｆｌｕ抗原（Ｆｌｕ抗原）をコードする１μｇのプラスミドで免疫化した。第３のマウス群を、Ｆｌｕ抗原と１５μｇのＵＣ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第４のマウス群を、Ｆｌｕ抗原と１５μｇのＭＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第５のマウス群を、Ｆｌｕ抗原と１５μｇのＷＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。
【０１６１】
全てのマウスを、電気穿孔（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔デバイス、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して筋肉内経路により免疫化した。マウスを２回（０週目及び３週目）免疫化し、最終免疫化の１週間後（４週目）に屠殺した（図５Ａ）。細胞内サイトカイン染色を行って、免疫化後の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２サイトカイン産生を測定した（図５Ｃ）。
【０１６２】
細胞内サイトカイン染色により計測された応答は、ＩＦＮ−γが、ナイーブ群（０．０％）と比較してワクチン接種マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で上昇したことを明らかにした。図５Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞から産生されたＩＦＮ−γが、Ｆｌｕのみ（およそ０．０８％、ｐ＜０．００１）と比較してＦｌｕ抗原＋ＭＴ（およそ０．４％）での免疫化後に著しく増加したことを示す。さらに、Ｆｌｕ抗原＋ＭＴ免疫化マウスにおけるＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｆｌｕ抗原＋ＵＣ（０．２％、ｐ＜０．０１）及びＦｌｕ抗原＋ＷＴ（０．２％、ｐ＜０．０１）と比較して著しく上昇した。Ｆｌｕ抗原＋ＭＴ免疫化マウス（およそ０．２５％）由来のＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｆｌｕ抗原のみ、Ｆｌｕ抗原＋ＵＣ、及びＦｌｕ抗原＋ＷＴ（それぞれ、全ておよそ０．０８％、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、及びｐ＜０．０１）と比較して著しく増加した（図５Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−２について、Ｆｌｕ抗原のみ（およそ０．０７％）が、Ｆｌｕ抗原＋ＵＣ（およそ０．２３％、ｐ＜０．０１）、Ｆｌｕ抗原＋ＭＴ（およそ０．２８％、ｐ＜０．００１）、及びＦｌｕ抗原＋ＷＴ（およそ０．２０％、ｐ＜０．０５）よりも著しく低かった（図５Ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＩＬ−２産生レベルが低く、Ｆｌｕ抗原＋ＷＴ（０．１２％）のみがナイーブ（０．０１％、ｐ＜０．０５）よりも著しく高かった（図５Ｃ）。全ての他の群（Ｆｌｕ抗原のみ、ＵＣ、及びＭＴ）について、有意差はなかった。最後に、Ｆｌｕ抗原＋ＭＴ免疫化マウス（およそ０．４５％）のＣＤ４＋Ｔ細胞から産生されたＴＮＦ−αは、Ｆｌｕのみ（およそ０．１％、ｐ＜０．００１）及びＦｌｕ抗原＋ＷＴ（およそ０．３％、ｐ＜０．０５）での免疫化よりも著しく高かった。Ｆｌｕ抗原＋ＷＴ免疫化群及びＦｌｕ抗原＋ＵＣ免疫化群は、Ｆｌｕ抗原のみと比較して著しくより高いＣＤ４＋Ｔ細胞中ＴＮＦ−αレベルを有した（両方ともにｐ＜０．０１）。ＣＤ８＋Ｔ細胞について、ＴＮＦ−αは、全ての他の群（ナイーブｐ＜０．００１、Ｆｌｕ抗原のみｐ＜０．００１、Ｆｌｕ抗原＋ＵＣ  ｐ＜０．０１、及びＦｌｕ抗原＋ＷＴ  ｐ＜０．０１）と比較してＦｌｕ抗原＋ＭＴ（およそ０．７％）での免疫化後に著しく上昇した。
【０１６３】
Ｆｌｕ抗原ワクチン及びＦｌｕ抗原ワクチン＋ＣＤ４０Ｌの３つ全ての形態での免疫化は、ナイーブのみと比較して高力価抗体応答を誘発した。いずれの群間にも有意差はなかったが、ＣＤ４０Ｌ野生型形態は、ＣＤ４０Ｌの他の形態と比較して増加した抗体レベルへの傾向を有した。
【０１６４】
筋肉内免疫化の上述のデータは、ＣＤ４０Ｌが、筋肉内経路により投与されたときに、アジュバントとして機能する驚くべき能力を有することを示した。ＣＤ４０Ｌは、抗原の正体または源に関係なく筋肉組織における細胞性免疫応答を増強させた。プラスミドは各々、定電流インビボ電気穿孔を使用して１つ以上のプラスミドコードワクチン抗原と共送達されたときに、コードされた抗原（複数可）に対する抗原特異的細胞性免疫応答を増大させ（インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定）、コードされた抗原（複数可）に対する抗原特異的体液性免疫応答も増大させた（抗原のみの送達によってもたらされる応答と比較したＩｇＧ抗体アイソタイプを調べるＥＬＩＳＡによって測定）。
【０１６５】
実施例４
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝５／群）を、ＨＩＶコンセンサスクレードｃ  ｇｐ１２０のみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで２回（０週目及び３週目）免疫化した後に、８週間安静にさせ、その後、屠殺した。図３Ａ、３Ｂ（コンセンサスクレードｃ  ｇｐ１２０に対する終点結合力価（記憶段階中に決定））、及び３Ｃ（刺激した後に細胞内染色したワクチン接種マウスから単離された脾細胞）は、ＣＤ４０Ｌのいくつかの変異形態が記憶段階時にワクチン誘導応答を維持または増強することを示す。
【０１６６】
実施例５
筋肉内免疫化
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝５／群）を、本ワクチンを筋肉内経路により投与したときにＣＤ４０Ｌがアジュバントとして機能することができるかを決定するためのモデル系として使用した。本ワクチンは、図６Ａ及び６Ｂに示されるように、いずれもぞれぞれのプラスミドによってコードされる、発癌性タンパク質Ｅ６及びＥ７を発現するヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ）ワクチン及びＣＤ４０Ｌを含む。全てのマウスを、電気穿孔（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔デバイス、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＰＡ）を使用して筋肉内経路により免疫化した。
【０１６７】
５つのマウス群を利用した。第１のマウス群を、ｐＶａｘ骨格（ナイーブ）で免疫化した。第２のマウス群を、１０μｇのＨＰＶ（ＨＰＶ抗原）で免疫化した。第３のマウス群を、ＨＰＶ抗原と１５μｇのＵＣ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第４のマウス群を、ＨＰＶ抗原と１５μｇのＭＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。第５のマウス群を、ＨＰＶ抗原と１５μｇのＷＴ  ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで免疫化した。
【０１６８】
これらのマウスを３週間間隔で２回（０週目及び３週目）免疫化し、最終免疫化の１週間後（４週目）に屠殺し（図７Ａ）、脾細胞を採取し、単離し、Ｅ６／Ｅ７ペプチドで刺激し、その後、細胞分析のために細胞内染色し、血液も採取して、誘導された抗体力価を決定した。図７Ｂに示されるように、最終ワクチン接種の１週間後に、ＥＬＩＳｐｏｔにより決定されたＩＦＮ−γ産生は、ＨＰＶ抗原＋ＭＴで免疫化したマウスに対して増加した。細胞内サイトカイン染色を行って、免疫化後の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αサイトカイン産生を測定した（図７Ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の多機能性も円グラフとともに評価し、４、３、２、または１機能を発現する細胞のパーセントを示した（修正ＡＮＯＶＡによって決定された有意性、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１）（図７Ｄ）。ＩＦＮ−γは、ＨＰＶ抗原のみと比較してＨＰＶ抗原＋ＭＴ  ＣＤ４０Ｌのワクチン接種後にＣＤ８＋Ｔ細胞において上昇した。ＨＰＶ抗原＋ＭＴで免疫化したマウスは、ＨＰＶ抗原のみで免疫化したマウスと比較して著しくより高いＩＦＮ−γ産生を有した。ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ−２について、ＨＰＶ抗原＋ＭＴで免疫化した群は、ＨＰＶ抗原のみと比較して著しくより高いＩＬ−２産生を有した。ＨＰＶ抗原のみで免疫化したマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞からのＴＮＦ−α産生が１％未満の頻度を示した一方で、ＨＰＶ抗原＋ＭＴは、２％を超える増加を示した。ＨＰＶ抗原＋ＭＴで免疫化したマウスは、ＨＰＶのみで免疫化したマウスと比較して著しく増加したＴＮＦ−α産生を有した。
【０１６９】
最終ワクチン接種の１週間後（４週目）、脾臓及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における四量体特異的応答を決定した。結果は、脾臓及びＰＢＭＣにおけるＥ７エピトープ（Ｈ−２Ｄｂ  ＨＰＶ１６  Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ））に対する四量体特異的応答がＭＴ  ＣＤ４０Ｌの包含に伴い増加することを示す（図８Ａ）。加えて、末梢における四量体特異的応答を経時的に評価し、マウスを３週間間隔で２回（０日目及び２１日目）免疫化し、連続して採血して、ＰＢＭＣを単離及び染色した（修正ＡＮＯＶＡによって決定された有意性、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１）（図８Ｂ）。１１日目のピーク四量体応答でのＣＤ４  Ｔ細胞の役割を決定するために、マウスにＣＤ４枯渇抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを与え、その後、ワクチン接種した。血液における四量体特異的応答を経時的に評価した（図８Ｃ）。
【０１７０】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝５／群）をワクチン接種し、ワクチン接種の１１日後にマウスを屠殺し、免疫応答を評価した。第１のワクチン接種後の１１日目のＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ピーク四量体応答）は、多数のサイトカイン及び脱顆粒マーカーの発現を示した。ＨＰＶ抗原＋ＭＴで免疫化したマウスは、図９Ａ及び９Ｂに示されるように、ＨＰＶ抗原のみ（ｐ＜０．０５）で免疫化したマウスと比較して抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞における著しくより高いＩＦＮ−γ、１０７ａ、及びＴｂｅｔ産生を有した。図９Ｃは、ＰＢＭＣ及び脾細胞の両方における四量体特異的応答の著しい増大を示す。
【０１７１】
図１０Ａ及び１０Ｂは、ＣＤ８応答が維持されて記憶されたことを示す。マウスをＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ＤＮＡのみまたはＣＤ４０Ｌアイソフォームと組み合わせてのいずれかで２回免疫化した。最終ワクチン接種の８週間後（１１週目）、ＣＤ８  Ｔ細胞応答をＩＣＳ及び四量体染色により決定した。
【０１７２】
体液性応答及びＣＤ４応答も評価し、図１２Ａ、１２Ｂ、及び１２Ｃに示す。
【０１７３】
実施例６
腫瘍クリアランス
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ｎ＝１０）に５×１０４個のＴＣ１細胞を移植した。１週間後、マウスを、以下：ｐＶＡＸ骨格（ナイーブ）、ＨＰＶのみ、またはＨＰＶ＋様々なＣＤ４０Ｌ構築物のうちの１つで免疫化し、その後、１４、２１、及び２８日目にブーストした（図１１Ａ）。全てのマウスを、電気穿孔（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔デバイス、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＰＡ）を使用して筋肉内経路により免疫化した。腫瘍成長を週２回監視した。図１１Ｂは、個々のマウスの経時的な腫瘍体積を示す。図１１Ｃは、ナイーブ、ＨＰＶのみ、及びＨＰＶ＋ＭＴ  ＣＤ４０Ｌの生存曲線を示す。結果は、腫瘍成長及びＨＰＶ＋ＭＴ  ＣＤ４０Ｌの有意差が、ＨＰＶのみ（ＨＰＶ  ｐ＜０．０００１）、ＵＣ  ＣＤ４０Ｌ（ｐ＜０．０００１）、及びＷＴ  ＣＤ４０Ｌ（ｐ＜０．０５））と比較して腫瘍クリアランスを著しく増大させることを示す。治療的ワクチン接種として使用した場合、成熟ＣＤ４０Ｌは、ＨＰＶワクチン接種のみと比較してＴＣ１移植モデルにおけるワクチン有効性を増加させる。
【０１７４】
上記の詳細な説明及び付随する実施例は、例示であるに過ぎず、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されるべきではないことを理解されたい。
【０１７５】
開示される実施形態に対する種々の変更及び改変は、当業者には明白であろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含むが、これらに限定されない、かかる変更及び改変は、その主旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１Ａ】
2018510156.tif 000002
【図１Ｂ】
2018510156.tif 000003
【図２Ａ】
2018510156.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018510156.tif 000008
【図３Ｃ】
2018510156.tif 000009
【図４Ａ】
2018510156.tif 000010
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2018510156.tif 000013
【図４Ｅ】
2018510156.tif 000014
【図５Ａ】
2018510156.tif 000015
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2018510156.tif 000018
【図６Ｂ】
2018510156.tif 000019
【図７Ａ】
2018510156.tif 000020
【図７Ｂ】
2018510156.tif 000021
【図７Ｃ−１】
2018510156.tif 000022
【図７Ｃ−２】
2018510156.tif 000023
【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
2018510156.tif 000025
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2018510156.tif 000027
【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
2018510156.tif 000029
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
2018510156.tif 000033
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
2018510156.tif 000038
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2018510156.tif 000040
【配列表】
2018510156000001.app
【国際調査報告】
2018510156.tif 000041
2018510156.tif 000042
2018510156.tif 000043