(57)【要約】  本発明は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、特にオメガ３（ω３）クラスの脂肪酸に富む脂質を含有する原生生物を増殖する方法に関し、当該方法は、セレン含有化合物を含有する培養培地中で原生生物を培養する工程を含み、またこの方法によって取得されたＰＵＦＡに富む脂質を含有する原生生物にも関する。  また、本発明は、ＰＵＦＡに富む脂質を生産する方法にも関し、当該方法は、本発明の増殖方法の後、当該原生生物を、バイオマスからＰＵＦＡに富むセレン含有脂質を抽出することによって処理する方法を実施する工程を含む。  最後に、本発明は、そうして抽出されたセレン含有脂質、又は前記増殖方法によって得られたセレン含有バイオマスのいずれかを含有する、任意の食用、美容用又は医薬製品に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する脂質を含有する原生生物を増殖する方法であって、１つ以上のセレン含有化合物を含有する培養培地中で原生生物を培養する工程を含み、
当該培養培地中の当該セレン含有化合物の濃度が、当該培養培地中のセレンの濃度が１〜８ｍｇ／Ｌとなるように設定される、方法。
【請求項２】
前記セレン含有化合物が、２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸又はその塩、亜セレン酸塩、セレン酸、セレン酸塩、セレノシステイン、セレノメチオニン、セレノシスタチオニン、セレノホモシステイン及びセレノ−アデノシルセレノマチオニンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セレン含有化合物が、２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸又はその塩、亜セレン酸塩、セレン酸及びセレノメチオニンからなる群から選択される、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類がStramenopiles門に属する、好ましくはThraustochytrids又はLabyrinthulids科に属する、なおもより好ましくはSchizochytrium、Ulkenia、Aurantiochytrium又はThraustochytrium属に属する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微細藻類がAlveolata門に属する、好ましくはDinoflagellata科に属する、なおもより好ましくはCrypthecodinium属に属する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微細藻類が、Schizochytrium limacinum又はSchizochytrium mangrovei種の混合栄養性海洋性微細藻類、又はCrypthecodinium cohnii種の微細藻類である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記混合栄養性微細藻類が、Schizochytrium limacinum種の微細藻類又はCrypthecodinium cohnii種の微細藻類である、請求項５又は６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
高度不飽和脂肪酸、特にオメガ３クラスの重量が全脂質の重量に対して５５〜８０重量％を占める脂質を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の増殖方法によって取得された原生生物。
【請求項９】
請求項８に記載の原生生物を含有する食用又は美容製品。
【請求項１０】
高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する脂質を生産する方法であって、以下の工程：
−請求項１〜７のいずれか１項に記載の原生生物を増殖する方法を実施して、高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する脂質を含有する原生生物を取得する工程；及び
−増殖した原生生物を、バイオマスから高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する脂質を抽出することによって処理する方法を実施して、高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する脂質、及び脂質が除去されたセレン含有バイオマスを取得する工程；
を含む、生産方法。
【請求項１１】
抽出の後に、高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する抽出された脂質の精製が行われる、請求項１０に記載の高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する脂質を生産する方法。
【請求項１２】
高度不飽和脂肪酸を全脂質に対し５５〜８０重量％含有する、請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の方法によって取得された脂質。
【請求項１３】
全質量に対して１ｐｐｍ超、なおもより好ましくは２ｐｐｍ超のセレンを含有する、請求項１２に記載の脂質。
【請求項１４】
請求項１３に記載のセレン含有脂質を含有する食用又は美容用製品。
【請求項１５】
人間又は動物の栄養補給のための請求項１４に記載の食用製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度不飽和脂肪酸、特にオメガ３（ω３）クラスの脂肪酸に富む脂質を含有する原生生物、好ましくは微細藻類を増殖する方法に関し、当該方法は、セレン含有化合物を含有する培養培地中で原生生物を培養する工程を含み、またこの方法によって取得された増殖した原生生物にも関し、また高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を生産する方法にも関し、当該方法は、本発明の増殖方法を実施する工程を含む。
【０００２】
本発明は、微生物、特に原生生物、特に微細藻類による脂肪酸の生産の一般的分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
「原生生物」は、動物、真菌及び植物以外の真核生物を指す。この群は高度に異種的であり、単純、単細胞生物と呼ばれる１つの細胞の生物（殆どの場合）、又は特定化された組織を有しない多細胞生物を含む。ある種の原生生物は独立栄養性であり、従属栄養性のものもある（例えば微細藻類を食べる原生動物(protozoa)、又はSchizochytrium属若しくはCrypthecodinium属の微細藻類）。
【０００４】
高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、生物系における脂質の主要な成分の部分を形成する。ＰＵＦＡは、１分子あたり１８個以上の炭素原子を含有する炭化水素含有鎖で形成され、カルボキシル基によって終結し、２つ以上の炭素−炭素二重結合を有する。
【０００５】
ＰＵＦＡは、それらの炭素原子の数、不飽和結合（炭素−炭素二重結合）の数、及びカルボキシル基に向かい合った基から出発して最初の不飽和結合の位置に従って分類される。従って、高度不飽和脂肪酸Ｃ  Ｘ：Ｙ  ωＺは、Ｘ個の炭素原子を有し、Ｙ個の不飽和結合を有し、最初の不飽和結合がＺ番目の位置、即ち位置番号Ｚにある脂肪酸である。ここでＸ、Ｙ及びＺはそれぞれ整数であり、Ｘは１８以上である。
【０００６】
最も重要な２つのＰＵＦＡのクラスは、オメガ３（ω３）及びオメガ６（ω６）クラスである。
【０００７】
ω３クラスのＰＵＦＡは、α−リノレン酸（Ｃ  １８：３  ω３）、エイコサペンタエン酸（又はＥＰＡ）（Ｃ  ２０：５  ω３）及びドコサヘキサエン酸（又はＤＨＡ）（Ｃ  ２２：６  ω３）を含む。
【０００８】
ＤＨＡは、位置３、６、９、１２、１５及び１８に全部で６個の不飽和結合を有している。
【０００９】
一般に、ＰＵＦＡは、膜の完全性の維持、膜の透過性の維持、及び細胞炭素の貯蔵において、全ての生物の増殖及び生存に必須である。したがって、それらの合成に必要な酵素を有しない哺乳類は、食料からそれらを見出さなければならない。
【００１０】
人間において、ＰＵＦＡは、脳、心臓及び他の多くの臓器及び組織の発達及び最適な機能において本質的な役割を果たす。特に、ω３クラスのＰＵＦＡは、それらが心臓血管疾患や免疫及び炎症性障害のリスクを減少するため、長期的な人間の健康に最も有益な化合物とされている。またそれらは脳の機能、ホルモン系、及び炎症系にも作用し得る。特にＤＨＡは、視覚的及び神経学的レベルで良好な胎児及び幼児の発達を可能とし、数年来、食用製品、特に幼児用の食品の様々な製剤において重要性を増している。
【００１１】
従って、ω３クラスのPUFAの市場は、２０１４年に２０億ドルを超えた。市場研究「Omega-3 PUFA Market by Type (DHA, EPA, ALA), Source [Marine (Fish, Algal, Krill, Others), Plant (Flaxseed, Chia Seed, Others)], Application (Dietary supplement, Functional F&B, Pharma, Infant Formula, Others) & Geography - Global Trend & Forecast to 2019」によると、この市場は、２０１９年には４０億ドルに拡大が見込まれている。青魚（鰊、鰯、鯖等）や幾つかの植物油（菜種、ナッツ、大豆等）等の食品は、天然にそれらのPUFAに富む。しかしながら、魚油は現在ＰＵＦＡの主要な産業上の供給源となっているが、それらは特にＤＨＡにおける需要の拡大にこれ以上対応出来ない。実際に、高品質の魚油の継続的な需要は乱獲の文脈で見られるべきであり、漁獲に対する厳格な規制の強化をもたらし、全体的な魚油の生産量が低下する。また、魚油の生産は、特にこれらの魚油の好ましくない味及び臭気、それらの酸化安定性の低さ、及びそれらのコレステロール及び毒性産物の含有により、精製の問題も有している。従って、それらの使用は、特に食品添加物市場において、限定的である。
【００１２】
その結果、この増大する市場において、ＰＵＦＡの生産のために、代替的な供給源が使用され始めている：微生物、特に微細藻類。実際に、後者は、それらの非常な多様性及びそれらの代謝的可塑性により、様々な産業、特に食品及び医薬品産業において、ＰＵＦＡの重要な供給源となっている。これらの微生物の中でも、原生生物界の微細藻類が重要であり、例えばThraustochytrids科はSchizochytrium属を含み、Dinoflagellata (Dinoflagellates)科はCrypthecodinium属を含む。
【００１３】
微細藻類の脂肪酸組成は通常は魚油よりも単純であるため、所望の脂肪酸を濃縮するのに必要な工程の数を減少できる。微細藻類Schizochytrium及びCrypthecodiniumは、乾燥重量の４０〜５０％に上る量の脂質を生産し、全脂質の４０〜４０％がＰＵＦＡである。これらのＰＵＦＡは主にトリグリセリドの形態で貯蔵される。更に、これらの海洋性微細藻類はコレステロールを含有しないため不快な臭気を有さず、故に魚油の欠点を有しない。またそれらは植物由来の天然製品として消費者に歓迎される。また、全ての培養パラメーターをモニタリングすることによって、培養装置中で大スケールで微細藻類を生産することも可能である。その結果、微細藻類は、現在、魚油の代替として、ＰＵＦＡの供給源の先端である。
【００１４】
ＤＨＡは、幼児及び未熟児用の製剤において、また食品添加物として、特に使用される。それは、混合栄養性海洋性微細藻類Crypthecodinium及びSchizochytriumを用いた水中培養物に由来してもよい。
【００１５】
微細藻類の培養条件は、ＰＵＦＡ収量に顕著な影響を有する。しかしながら、取得されるバイオマスの量が大幅に変化するにも拘らず、このバイオマスに対するＥＰＡ及びＤＨＡの比率が常に一定であるのは注目すべきである。微細藻類中の脂質及びカロテノイド等の高付加価値の分子を増大し、その生産を改善するために探求されているルートの１つは、これらの微細藻類の培地に化合物を添加することである。
【００１６】
従って、特許出願US2013/0217085は、培地にグリシンベタイン又はトレハロースを添加すると、Schizochytrium、特にSchizochytrium limacinumからの高度不飽和脂肪酸の発酵収率を顕著に増大し得ることを教示している。また、「Da Silva et al., “Effect of n-dodecane on Crypthecodinium cohnii fermentations and DHA production”, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33 pp 408-416, 2006」に報告されているように、Crypthecodinium cohniiの培地へのn-ドデカン（酸素担体）の添加により、ＤＨＡの生産が全脂質の５１％に達する。
【００１７】
しかしながら、非生物由来（即ち植物由来ではない）化合物の使用による消費者に与える負のイメージはさておき、これらの化合物の添加はコストが掛かり、それらは最終のバイオマス中に見られるため、微細藻類の精製の問題を有している。
【００１８】
一方、特許出願WO 2015/150716は、ＤＨＡの生産のための、ナトリウムを実質含有せず塩化物を実質含有しない培地中で、Aurantiochytrium属の微細藻類、特にAurantiochytrium mangrovei属の原生生物を培養する方法を記載している。使用している株は、Aurantiochytrium mangrovei及びAurantiochytrium limacinum属のThraustochytridsの株である。セレンは、多くの他の元素の中で、培地中に非常に少量、ナトリウムの担体として任意で存在し得ることが言及されている（亜セレン酸ナトリウム1 mg/L以下、即ち0.46 mg/L以下）。更に、Schizochytrium sp.株は、本発明の明示的部分ではない。
【００１９】
最後に、文献WO 2013/010090は、脂質含量の高い組成物、及びそれらを生産する方法を記載する。脂質含量は乾燥重量に対し６７％以上である。藻類は、好ましくはChlorella属、Schizochytrium属又はCrypthecodinium属の株又は種である。培養培地に拘らず、酵母抽出物、好ましくはSaccharomyces cerevisiaeを含有し、当該培養培地は、セレン含有化合物を含有する。培養培地のセレン含量は非常に高く、即ち培養培地中に7.5 g/Lの酵母に対し１０〜１００％、即ちセレニウムを75〜750 mg/L含有する。
【００２０】
従って、バイオマスからの抽出を単純化しつつ、微細藻類を用いて、ＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸の生産を増大することの需要が、依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、培地中にセレン含有化合物を添加して、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、特にω３クラス脂肪酸、特にＤＨＡに富む脂質の生産を増大する方法を提案して、本分野の欠点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明において、「ＰＵＦＡに富む」とは、全重量に対し（全脂質に対するＰＵＦＡ）、55%〜80%、好ましくは60〜75%のＰＵＦＡを含有することを意味する。
【００２３】
実際に、驚くべきことに、出願人は、原生生物の培地にセレン含有化合物を添加すると、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸、特にＤＨＡに富む脂質の生産が改善しつつ、バイオマスのこれらの脂質中に存在する飽和脂肪酸の量が減少することを見出した。
【００２４】
従って、本発明の目的は、ＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸、特にＤＨＡの、原生生物、好ましくは微細藻類、より好ましくは混合栄養性海洋性微細藻類による生産を最適化して、本分野の現在提案される方法の代替となるがより低コストで実施が容易な方法を開発することである。
【００２５】
従って、第一の態様において、本発明の主題は、高度不飽和脂肪酸、特にオメガ３（ω３）クラス脂肪酸に富む脂質を含有する原生生物を増殖する方法であり、当該方法は、１つ以上のセレン含有化合物を含有する培地中で原生生物を培養する工程を含み、
当該培地中のセレン含有化合物は、セレンが1〜8mg/Lの濃度で存在するように設定される。
【００２６】
前記セレン含有化合物は、好ましくは、２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸又はその塩、亜セレン酸塩、セレン酸、セレン酸塩、セレノシステイン、セレノメチオニン、セレノシスタチオニン、セレノホモシステイン及びセレノ−アデノシルセレノマチオニンからなる群から選択される。
【００２７】
前記セレン含有化合物は、２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸（２−ヒドロキシ−４−メチルセレノブタン酸）又はその塩、亜セレン酸塩、セレン酸及びセレノメチオニンからなる群から選択される。
【００２８】
２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸は、一般に、Ｌ，Ｄ又はＤ，Ｌ型である。
【００２９】
２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸の塩は好ましくはカルシウム、亜鉛又はマグネシウム塩である。
【００３０】
本発明の特に有利な態様において、高度不飽和脂肪酸に富む脂質は、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）に富む。
【００３１】
本発明において、「ＤＨＡに富む」とは、全脂質に対しＤＨＡの重量が45%〜70%、好ましくは48〜60%であることを意味する。
【００３２】
他に言及無い限り、全てのパーセンテージは重量％である。
【００３３】
本発明において、原生生物は、Chromalveolata界の微細藻類である。
【００３４】
本発明の長所の１つは、ＰＵＦＡの増大が、原生生物によって生産される飽和脂肪酸の枯渇（あるいは減少）を伴うことである。そのため、培地がセレン含有化合物を含有しない以外は全て同一である場合と比較して、脂質含量は同一又はより多い。これは、従来技術のＰＵＦＡに富む原生生物を用いて得られる飽和脂肪酸の含量と比較して、原生生物は、一般に、飽和脂肪酸含量が減少しており、即ち、一般に、全脂質に対し４０〜６８％となる。
【００３５】
いずれか１つの理論に拘束されることは望まないが、出願人は、飽和脂肪酸含量の減少は、不飽和脂肪酸の生産の利益のために起こる。
【００３６】
本発明の製造方法の第一の態様において、これらの微細藻類は、Stramenopiles門に属する、好ましくはThraustochytrids又はLabyrinthulids科に属する、なおもより好ましくはSchizochytrium、Ulkenia、Aurantiochytrium又はThraustochytrium属に属する。好ましくは、この場合、これらの微細藻類は、Stramenopiles門に属する、好ましくはThraustochytrids科に属する、なおもより好ましくはSchizochytrium、Ulkenia、又はThraustochytrium属に属する。
【００３７】
本発明の製造方法の第二の態様において、これらの微細藻類は、Alveolata門に属する、好ましくはDinoflagellata科に属する、なおもより好ましくはCrypthecodinium属に属する。
【００３８】
本発明の特に好ましい態様において、前記微細藻類は、Schizochytrium limacinum又はSchizochytrium mangrovei混合栄養性海洋性微細藻類種、又はCrypthecodinium cohnii種微細藻類、好ましくはSchizochytrium limacinum混合栄養性海洋性微細藻類種、又はCrypthecodinium cohnii微細藻類種である。しかしながら、Crypthecodinium setense, Schizochytrium aggregatum, Ulkenia profunda, Ulkenia radiata, Ulkenia visurgensis, Aurantiochytrium mangrovei, Aurantiochytrium limacinum, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium pachyderma, Thraustochytrium aggregatum及び／又はThraustochytrium striatumの微細藻類種、好ましくはCrypthecodinium setense, Schizochytrium aggregatum, Ulkenia profunda, Ulkenia radiata, Ulkenia visurgensis, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium pachyderma, Thraustochytrium aggregatum及び／又はThraustochytrium striatumの微細藻類種も、本発明において使用され得る。
【００３９】
本発明において、「Ａ及び／又はＢ」は、Ａ又はＢ又はＡ及びＢを意味する。
【００４０】
本発明のセレン含有化合物の存在はさておき、培地は、特に関与する種において、当業者に周知である。即ち、原生生物の増殖に必要な化学的要素（窒素；鉱物塩；炭素；等）を培地中に含有する。
【００４１】
２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸の場合、特に、セレンを用いて光合成微生物を増殖するためにこの酸を使用している本願出願人の特許US9017985が、この酸を使用する条件では参考となり得る。
【００４２】
本発明の増殖方法は、セレンが1〜8 mg/L、例えば5 mg/Lの濃度で存在するように、前記セレン含有化合物の培地中の濃度が設定される。幾つかのセレン含有化合物が存在する場合、培地中の合計のセレン濃度がそのようになるように各化合物の濃度が考慮される。
【００４３】
前記増殖方法は、一般に９６時間〜２００時間の期間実施され、例えば１８７時間実施される。
【００４４】
本発明は、本発明の増殖方法に従い取得された、高度不飽和脂肪酸、特にオメガ３（ω３）クラス脂肪酸に富む脂質が増大した原生生物に関する。
【００４５】
本発明の特に有利な様式において、これらの原生生物はセレンにも富み、即ちそれらは、全重量に対し５〜８００ｐｐｍ（重量）のセレンを含有する。
【００４６】
本発明の増殖方法によって得られるＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質が増大した原生生物は、美容又は栄養剤としても有用である。このＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質セレン含有バイオマスは、人間又は動物、好ましくは動物の栄養にとって特に有利である。
【００４７】
従って、本発明は、本発明の増殖方法に従い増殖させて得た、ＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質が増大したこれらの原生生物の、栄養又は美容における使用にも関する。その結果、本発明は、本発明の増殖方法に従い増殖させて得た、ＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質が増大したこれらの原生生物を含有する食用又は美容製品に関する。
【００４８】
従って、本発明の増殖方法に従い増殖させて得た、ＰＵＦＡ、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質が増大した原生生物は、特に、人間又は動物の栄養にも使用され得る。
【００４９】
しかしながら、そのような使用は、バイオマスからＰＵＦＡに富む脂質を抽出する処理の後、又はバイオマスからＰＵＦＡに富む脂質を抽出し、その抽出された脂質を精製した後に実施される場合もある。
【００５０】
この他の使用は、本発明の他の長所が、驚くべきことに、前記脂質が、セレンにも富む、即ち全重量に対し１ｐｐｍ超、より好ましくは２ｐｐｍ超（重量に対し）のセレンを含有するため、尚もより有用である。全ての場合において、それらは一般に全重量に対し３０ｐｐｍ未満のセレンを含有する。脂質中に比較的多くのセレンが存在することは、本発明の方法の他の特徴である。従って、「セレン含有微細藻類脂質」又は「セレン含有脂質」という用語を使用し得る。
【００５１】
抽出は、当業者に知られた任意の抽出方法、例えば１つ以上の有機溶媒による抽出や、超臨界状態の二酸化炭素による抽出等によって実施され得る。
【００５２】
従って、第二の側面において、本発明の主題は、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を生産する方法であって、当該方法は、以下の工程：
−本発明の高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を含有する原生生物を増殖する方法を実施して、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を増大した原生生物を取得する工程；及び
−バイオマスから高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を抽出することによって、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む（セレン含有）脂質、及び脂質が除去されたセレン含有バイオマスを取得する、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質が増大した原生生物を処理する方法を実施する工程；
を含む。
【００５３】
この抽出の後に得られるＰＵＦＡに富む脂質が除去されたセレン含有バイオマスは、特に人間又は動物の栄養、好ましくは動物の栄養に、有利に使用され得る。
【００５４】
高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質が増大した原生生物を処理する方法は、バイオマスから高度不飽和脂肪酸に富む脂質を抽出する工程からなり、最もしばしば、好ましくは、その後、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む抽出された（バイオマスから分離された）脂質の精製が行われる。この処理工程の後、一般に、得られた脂質のプロフィールの解析が行われる。
【００５５】
バイオマスから脂質を抽出する方法は当業者に知られており、例えば下記例において特定される。
【００５６】
従って、第三の側面において、本発明の主題は、本発明の製造方法に従い得られた高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質であり、これは、有利な場合、セレンにも富み、故に「セレン含有脂質」でもある。
【００５７】
当該脂質は、人間又は動物の栄養源としてそのまま使用されてもよい。
【００５８】
従って、本発明の高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を製造する方法は、本発明の増殖方法を実施する工程を含み、この増殖方法は、上記で説明したのと同じ特徴を有する。
【００５９】
最後に、本発明は、本発明の製造方法によって取得された、高度不飽和脂肪酸、特にω３クラス脂肪酸に富む脂質を含有する、食用又は美容製品に関する。
【００６０】
本発明は、下記実施例及び添付の図面を参照してより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、１８７時間インキュベーション後のSchizochytrium limacinumの全脂質中の高度不飽和脂肪酸の重量パーセントを示すグラフである。
【００６２】
【図２】図２は、１８７時間インキュベーション後のSchizochytrium limacinumの全脂質中のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の重量パーセントを示すグラフである。
【００６３】
【図３】図３は、１８７時間インキュベーション後のSchizochytrium limacinumの全脂質中の飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の重量パーセントを示すグラフである。
【００６４】
【図４】図４は、１８７時間インキュベーション後のCrypthecodinium cohniiの全脂質中の高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の重量パーセントを示すグラフである。
【実施例】
【００６５】
図１〜４は、下記実施例１及び２に説明されている。
【００６６】
下記実施例は、本発明を例示するが、その範囲を限定しない。
【００６７】
実施例１：２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸（ＨＭＳｅＢＡ）；亜セレン酸塩；セレン酸；又はセレノメチオニンを個別に含有する培地中でのSchizochytrium原生生物の培養
この培養は、高度不飽和脂肪酸、特にＤＨＡの生産を改善するために実施された。
【００６８】
Schizochytriumは原生生物であり、より正確には混合栄養性Thraustochytride微細藻類である。
【００６９】
Schizochytrium limacinum ATCC- MYA1381株を、ATCC bank (www.atcc.org)より取得した。
【００７０】
Schizochytrium limacinumの増殖特性及び脂質生産は、様々な形態のセレンの存在下で測定され、そのような添加物を添加しない場合（対照、図面では「Ｓｅ無し」と記載される）と比較された。
【００７１】
株の前培養は、表１に示す組成の標準液体培地中で実施された。その後、５０ｍＬの開始培養が、633 M3 chytrid agar (www.atcc.org)上で単離したコロニーから250 mL Erlenフラスコ中で開始され、２５℃±１℃、混合栄養、４８時間、標準液体培地中で培養した。そして、１００ｍＬの播種物が、これらの「開始」培養から５００ｍＬ  Ｅｒｌｅｎフラスコ中で開始され、初期濃度は1.0x106 cells/m/L、培養条件は後者と同一で４日間とした。培養中は１００ｒｐｍの軌道撹拌により連続的に通気された。
【００７２】
セレン含有化合物による増殖用の培養は、初期濃度1.0x106 cells/mLの播種から開始され、最終体積は４００ｍＬ、2.0 L Erlenフラスコ中、２５℃±１℃、混合栄養、１８７℃で行われた。培養中は１００ｒｐｍの軌道撹拌により連続的に通気された。増殖はＴ０で濃縮セレン溶液をセレン含有化合物の供給源に拘らず最終濃度が培地中セレン５ｍｇ／Ｌとなるように添加することによって実施された。図１〜３において、Tetrahedron社製0.0125 g/Lの２−ヒドロキシ−４−メチルセレノ酪酸溶液を「ＨＭＳｅＢＡ」、0.0110 g/Lの亜セレン酸ナトリウムを「亜セレン酸塩」、0.0082 g/Lのセレン酸を「セレン酸」、0.0124 g/Lのセレノメチオニンを「ＳｅＭｅｔ」と記載する。
【００７３】
そして培養７２時間及び１８７時間でSchizochytrium limacinumバイオマスを回収した。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
人工海水は通常の市販品であり；この場合AQUARIUM SYSTEMS社製「Instant Ocean Salt」であった。その組成を情報によって以下に示す: Na+ (0.35 g/L); K+ (0.01 g/L); Mg2+ (0.04 g/L); Ca2+ (0.01 g/L); Sr+ (0.00054 g/L); Cl (0.641 g/L); S (SO42-) (0.07 g/L); P (PO4) (0.000157 mg/L); N (NO3) (0.002 mg/L); N (NH4) (0.006 mg/L); Si (SiO3) (0.0105 mg/L); Li (0.0124 mg/L); Si (0.0148 mg/L); Mo (0.0057 mg/L); Ba (0.00385 mg/L); V (0.0048 mg/L); Ni (0.00329 mg/L); Cr (0.0129 mg/L); Al (0.214 mg/L); Cu (0.00377 mg/L); Zn (0.00108 mg/L); Mn (0.00218 mg/L); Fe (0.000442 mg/L); Cd (0.000890 mg/L); Pb (0.0144 mg/L); Co (0.00253 mg/L); Ag (0.00819 mg/L); Ti (0.00106 mg/L).
【００７６】
酵母抽出物は、Merck社製の標準的な市販品である。
【００７７】
培養のモニタリング
バイオマスの全濃度は乾燥重量を測定してモニターされた（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦＣフィルター上で濾過し、７０℃及び-0.8 bar (80 kPa)真空下で２４時間以上乾燥した後計量した）。
【００７８】
全脂質を定量するため107 cells/mLを抽出した。脂質抽出方法は当業者に知られており、Bligh E.G. & Dyer W.J., A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol 37 1959 911 917に記載されているが、この方法は微細藻類細胞用に些か改変した。従って、各測定において、新しく回収した約１０ｍＬの培養物（バイオマス及び培地）を脱イオン水で洗浄して細胞外の塩を除去した後に凍結乾燥し、ガラス管の中に置き、１０分間３６００ｇ４℃で遠心分離した。その後、上澄みを除去し、細胞を含有するペレットを凍結乾燥した。抽出は、単相CHCl3/MeOH（クロロホルム／メタノール）の混合比率2/1 (V/V)の混合物６ｍＬで実施された。脂質の完全な抽出を保証するため管を暗黒下６時間揺動器上で撹拌し、−２０℃で保存した後、抽出された全脂肪酸の量及びプロフィールを決定するため、ＧＣ−ＦＩＤ（炎イオン化検出と伴うガスクロマトグラフィー）により解析した。
【００７９】
得られた結果を図１、２及び３に示す。図１、２及び３は、それぞれ１８７時間インキュベーションしたSchizochytrium limacinumにおける、全脂質中のＰＵＦＡのパーセンテージ、ＤＨＡのパーセンテージ及びＳＦＡのパーセンテージがｙ軸に、セレン含有供給源をｘ軸に示している。
【００８０】
培地中の５ｍｇ／Ｌのセレン含有化合物の存在は、使用されたセレン含有種に拘らず、対照よりも顕著にＰＵＦＡのパーセンテージを高くすることを可能にすることを示した（５３％に対し６７％以上）。最も興味深い結果は亜セレン酸塩である（７３％）。
【００８１】
また、培地中の５ｍｇ／Ｌのセレン含有化合物の存在は、使用されたセレン含有種に拘らず、対照よりも顕著にＤＨＡのパーセンテージを高くすることを可能にすることを示した（４１％に対し５０％以上）。最も興味深い結果は亜セレン酸塩である（５４％）。
【００８２】
最後に、培地中の５ｍｇ／Ｌのセレン含有化合物の存在は、使用されたセレン含有種に拘らず、対照よりも顕著にＳＦＡのパーセンテージを低くすることを可能にすることを示した（４４％に対し３１％以上）。最も興味深い結果は亜セレン酸塩である（２１％）。
【００８３】
実施例２．セレノメチオニンを含有する培地中でのCrypthecodinium cohniiの培養
この培養は、高度不飽和脂肪酸、特にＤＨＡの生産を改善するために実施された。
【００８４】
実施例１と同様の方法で行われたが、原生生物はSchizochytrium limacinumに代えてCrypthecodinium cohniiを用い、単一のセレン供給源が使用された：セレノメチオニン（「ＳｅＭｅｔ」）。
【００８５】
Crypthecodinium cohniiは原生生物であり、より正確には混合栄養性微細藻類である。Crypthecodinium cohnii CCMP 316株はNCMA bank (https://ncma.bigelow.org)から取得した。
【００８６】
得られた結果を図４に示す。図４は、それぞれ１８７時間インキュベーションしたCrypthecodinium cohniiにおける、全脂質中の化合物のパーセンテージをｙ軸に、各化合物（ＰＵＦＡ、ＤＨＡ及びＳＦＡ）をｘ軸に示し、セレノメチオニンの存在下（「ＳｅＭｅｔ有り」）又はセレン含有化合物の非存在下（「ＳｅＭｅｔ無し」）で比較されている。
【００８７】
培地中の５ｍｇ／Ｌのセレノメチオニンの存在は、対照よりも顕著にＰＵＦＡのパーセンテージを高くすることを可能にすることを示した（２５％に対し３５％）。
【００８８】
培地中の５ｍｇ／Ｌのセレノメチオニンの存在は、対照よりも顕著にＤＨＡのパーセンテージを高くすることを可能にすることを示した（２４％に対し３４％）。
【００８９】
最後に、培地中の５ｍｇ／Ｌのセレノメチオニンの存在は、対照よりも顕著にＳＦＡのパーセンテージを低くすることを可能にすることを示した（６４％に対し５３．５％）。
【００９０】
更に、セレノメチオニンの使用により、乾燥重量中の全脂質含量の増大が示された。実際に、対照培地に対しセレン含有培地を使用して３４％多くの量の脂質が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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