(57)【要約】核酸鋳型分子を非特異的に増幅する方法が提供される。前記方法は、例えば、培養不可能な微生物のゲノムをシークエンシングするために、または癌細胞におけるコピー数多型を特定するために、シークエンシングするための核酸鋳型分子（複数可）を増幅するために使用することができる。開示される方法の態様は、核酸鋳型分子を非特異的に増幅することを含むことができ、これは、生物試料から得られた核酸鋳型分子を微小液滴中に封入すること、多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを微小液滴中に導入すること及びＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で微小液滴をインキュベートすることであって、前記インキュベーションは、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を産生するのに有効である。【選択図】図１
2018525004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料から得られた核酸鋳型分子を微小液滴中に封入すること、
多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを前記微小液滴に導入すること、及び
ＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で前記微小液滴をインキュベートすることであって、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、前記インキュベートすること、
を含む、核酸鋳型分子の非特異的増幅方法。
【請求項２】
前記微小液滴が、前記導入ステップ及びインキュベートステップより前に、１つより多い核酸鋳型分子を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＤＡ試薬がΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微小液滴が約０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの内容積を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記封入することが１つまたは複数の生物試料から得られた複数の核酸鋳型分子を複数の微小液滴中に封入することを含み、前記導入することがＭＤＡ試薬及び複数のＭＤＡプライマーを前記複数の微小液滴のそれぞれに導入することを含み、前記インキュベートすることがＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で前記複数の微小液滴をインキュベートすることであって、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、前記インキュベートすること、を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の微小液滴のそれぞれが０個または１個及び１個より多くない核酸鋳型分子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微小液滴を形成するために、前記核酸鋳型分子、ＭＤＡ試薬及びＭＤＡプライマーが液滴ディスペンサーに装填される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数のステップがマイクロ流体制御下で実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微小液滴が振盪エマルジョンを介して生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微小液滴がマイクロ流体エマルジョンを介して生成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸鋳型分子を提供するために前記生物試料の１つまたは複数の核酸が断片化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記断片化が酵素的断片化、加熱及び超音波処理のうちの１つを介する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸鋳型分子を提供するために前記生物試料の１つまたは複数の細胞が溶解される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を介して前記ＭＤＡ増幅産物の配列を決定することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＤＡ増幅産物が単一のＭＤＡ増幅産物を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＤＡ増幅産物が複数の異なるＭＤＡ増幅産物を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物試料が１つまたは複数の細胞を含む、請求項１〜１２及び１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の細胞が１つまたは複数の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出成分を各微小液滴に導入するステップであって、前記検出成分の検出がもう１つのＭＤＡ増幅産物の存在を示す前記ステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出成分が蛍光の変化に基づいて検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各微小液滴の内容積がほぼ等容積である、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
各微小液滴の内容積が有意に異なる容積である、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
微小液滴の数が核酸鋳型分子の数に対応する、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
増幅される核酸鋳型分子の数が生成される微小液滴の数を制御することによって変えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
各微小液滴に含まれる前記核酸鋳型分子に由来する所定量のＭＤＡ増幅産物を得るために、各微小液滴のサイズが変えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
１０ｆｇ以下の前記核酸鋳型分子が前記微小液滴に封入される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
５ｆｇ以下の前記核酸鋳型分子が前記微小液滴に封入される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記封入すること及び導入することが単一ステップで生じる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
生物試料から単離した核酸集団に対するコピー数多型（ＣＮＶ）解析の実施方法であって、
前記核酸集団を断片化すること、
前記断片化した核酸集団を複数の微小液滴に封入すること、
多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを前記複数の微小液滴のそれぞれに導入すること、
ＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で前記微小液滴をインキュベートすることであって、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、前記インキュベートすること、
前記ＭＤＡ増幅産物をシークエンシングして、前記核酸集団中の１つまたは複数の核酸配列のコピー数を決定すること
を含む、前記実施方法。
【請求項３０】
前記核酸集団がゲノムＤＮＡを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ゲノムＤＮＡが単一細胞から単離される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記単一細胞が癌細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記微小液滴のそれぞれが、前記導入ステップ及びインキュベートステップより前に、１つより多い核酸鋳型分子を含まない、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＭＤＡ試薬がΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記微小液滴が約０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの内容積を有する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数の微小液滴のそれぞれが０個または１個及び１個より多くない核酸鋳型分子を含む、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記微小液滴を形成するために、前記核酸鋳型分子、ＭＤＡ試薬及びＭＤＡプライマーが液滴ディスペンサーに装填される、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
１つまたは複数のステップがマイクロ流体制御下で実施される、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記微小液滴が振盪エマルジョンを介して生成される、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記微小液滴がマイクロ流体エマルジョンを介して生成される、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記断片化が酵素的断片化、加熱及び超音波処理のうちの１つを介する、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸鋳型分子を提供するために前記生物試料の１つまたは複数の細胞が溶解される、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
各微小液滴に関する前記ＭＤＡ増幅産物が単一のＭＤＡ増幅産物を含む、請求項２９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
各微小液滴に関する前記ＭＤＡ増幅産物が複数の異なるＭＤＡ増幅産物を含む、請求項２９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物試料が１つまたは複数の細胞を含む、請求項２９〜４２及び４４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つまたは複数の細胞が１つまたは複数の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
各微小液滴の内容積がほぼ等容積である、請求項２９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
各微小液滴の内容積が有意に異なる容積である、請求項２９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
微小液滴の数が核酸鋳型分子の数に対応する、請求項２９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
増幅される核酸鋳型分子の数が生成される微小液滴の数を制御することによって変えられる、請求項２９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
各微小液滴に含まれる前記核酸鋳型分子に由来する所定量のＭＤＡ増幅産物を得るために、各微小液滴のサイズが変えられる、請求項２９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記封入すること及び導入することが単一ステップで生じる、請求項２９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
微小液滴を含む組成物であって、
ａ．核酸鋳型分子、ならびに
ｂ．ｉ．前記核酸鋳型分子を非特異的に増幅することができるポリメラーゼ酵素を含む複数のＭＤＡ試薬、及び
ｉｉ．複数のＭＤＡプライマー
を含むＭＤＡ混合物
を含む、前記組成物。
【請求項５５】
前記微小液滴が単一核酸鋳型分子より多くを含まない、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記微小液滴が検出成分をさらに含む、請求項５４または請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記微小液滴が前記核酸鋳型分子から生成された１つまたは複数のＭＤＡ増幅産物をさらに含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記微小液滴が約０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの内容積を有する、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ポリメラーゼ酵素がΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ＭＤＡ試薬がマグネシウム試薬を含む、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記微小液滴中の前記核酸鋳型分子の初期量が約０．００１ｐｇ〜約１０ｐｇである、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記微小液滴中の前記核酸鋳型分子の初期量が約０．０１ｐｇ〜約１ｐｇである、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記微小液滴中の前記核酸鋳型分子の初期量が約０．１ｐｇ〜約１ｐｇである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物が複数の単分散微小液滴を含む、請求項５４〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記組成物が複数の多分散微小液滴を含む、請求項５４〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記微小液滴が複数の核酸鋳型分子を含む、請求項５４及び５６〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記微小液滴が１０ｆｇより多い前記核酸鋳型分子を含まない、請求項５４〜６０及び６４〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記微小液滴が５ｆｇより多い前記核酸鋳型分子を含まない、請求項６７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年８月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／２０６，２０２号の利益を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立科学財団によって与えられた助成金番号ＤＢＩ１２５３２９３、米国国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＨＧ００７２３３、Ｒ０１ＥＢ０１９４５３及びＡＲ０６８１２９、国防総省によって与えられた助成金番号ＨＲ００１１−１２−Ｃ−００６５及びＨＲ００１１−１２−Ｃ−００６６、ならびに宇宙・海軍戦闘システムセンター（Ｓｐａｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｖａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって与えられた助成金番号Ｎ６６００１−１２−Ｃ−４２１１のもとで政府の支援により実施された。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
少量の核酸、例えばＤＮＡを効率的にシークエンスする能力は、培養不可能な微生物のゲノムのアセンブリーから癌関連変異の特定に及び用途にとって重要である。シークエンシングするのに十分な量の核酸を得ることは、限られた出発材料をかなり増幅しなければならない。しかし、既存の方法はエラーまたはカバレッジの不均一性をもたらすことが多く、これによって、シークエンシングデータの質が低下する。
【０００４】
単一細胞シークエンシングは微生物生態学において貴重なツールであり、海洋（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）“Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｏｒｇａｎｉｓｍａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｉｓｔｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３２，７１４−７１７）からヒトの口（Ｍａｒｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ‘ｄａｒｋ  ｍａｔｔｅｒ’ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ａｎｄ  ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ＴＭ７  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｕｔｈ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０４，１１８８９−１１８９４）に及ぶ群集の解析を増強した。微生物の大部分は培養することができないので（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＩＩＩ，Ｃ．Ａ．Ｈ．ａｎｄ  Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．（２００６）“Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４，６５７−６５８）、シークエンシングするのに十分な量のＤＮＡを得るには、単一細胞ゲノムのかなり増幅が必要になる。しかし、これを達成するための既存の方法は増幅の偏りの傾向があり、これによって、シークエンシングが非効率的になり、且つ費用が高くなる。したがって、少量のＤＮＡを均一に増幅する新しい方法を開発するための努力が続けられている。
【０００５】
１つの方法は、非特異的増幅を可能にするようにＰＣＲ反応を改変することである。例えば、プライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）及び縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）は、大部分のＤＮＡ配列の非特異的アニーリング及び増幅を可能にするための改変したプライマー及び熱サイクル条件を使用する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，５８４７−５８５１、Ｔｅｌｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ：ｇｅｎｅｒａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ．”Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３，７１８−７２５）。しかし、増幅の偏りは、これらの方法にとって大きな課題のままであり、生成物は、一般的には、元の鋳型を十分にカバーせず、且つカバレッジのかなりの変動を有する（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．（１９９６）“Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ａｌｌｏｗｓ  ｈｕｎｄｒｅｄｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｏｎ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｎａｎｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．”Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３，１４６７６−１４６７９、Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９，５２６１−５２６６）。多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｏｐｉｎｇ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅｓ）（ＭＡＬＢＡＣ）は、ループで自己アニールするアンプリコンを生じさせるプライマーを用いてこの偏りを低減し、これは、優勢生成物の指数関数的増幅を抑制し、鋳型全体にわたって増幅を等しくする（Ｚｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３８，１６２２−６）。それにもかかわらず、この反応に必要とされる特殊化したポリメラーゼは、サイクルを通して伝搬するエラーをコピーする傾向があり、その結果エラー率が増大する（同上）。
【０００６】
多置換増幅（ＭＤＡ）は、非常に正確な酵素であるΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１９−２７２６）を使用して、最低限のエラーで非特異的増幅を可能にする。さらに、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼはワトソン−クリック塩基対鎖をずらし、これによって、熱誘導性変性なしで鋳型分子の指数関数的増幅を可能にする（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９，５２６１−５２６６）。それにもかかわらず、混入ＤＮＡの増幅（Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．”Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１，３３４２−３３４７）及び単一細胞ゲノムの非常に不均等な増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｎｄ  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｐｒｉｍｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１１，１０９５−１０９９、Ｈｏｓｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｉ
ｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１３，９５４−９６４）という、２つの大きな問題がＭＤＡに存続する。これらの問題は、ＭＤＡ増幅した材料をシークエンスする場合に多数の課題をもたらし、こうした課題には、不完全なヒトゲノムアセンブリー、ゲノムカバレッジにおけるギャップ及び複製配列の偏った数が含まれ、これらは、癌におけるコピー数多型の評価などの様々な用途において生物学的に関連性がある。その単純性及び正確性の理由から、ＭＤＡ増幅の偏りを低減するためのいくつかのストラテジーが用いられ、これには、トレハロースで反応を増強すること（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ  ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５，１５４９９−１５５０４）、反応量を低減すること（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２，１７３３２−１７３３６）、及び分離したプールにおける多様性を低減するためにナノリットルスケールのマイクロ流体チャンバーを使用すること（Ｍａｒｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  ｒｅａｃｔｏｒｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．”ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，３，１７０２−１７０８，Ｇｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）“Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ．”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，１１２６−３２）が含まれる。これらの方法はＭＤＡに付随する問題を軽減するのに役立つが、低投入量の材料の堅牢で均一な増幅は課題のままである。
【０００７】
本開示は、当技術分野における上記の欠点に対処するのに役立つ方法及び関連組成物を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
核酸鋳型分子を非特異的に増幅する方法が提供される。ある種の態様では、方法は、シークエンシングするために、例えば、培養不可能な微生物のゲノムをシークエンシングするために、または癌細胞におけるコピー数多型を特定するためにシークエンシングするために、核酸鋳型分子（複数可）を増幅するのに使用することができる。
【０００９】
本開示の方法は、生物試料からの核酸、例えばゲノムＤＮＡを増幅する方法を含む。マイクロ流体を使用して、生物試料の成分、例えばゲノムＤＮＡを０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの容積の範囲の内容積を有する微小液滴に封入することができる。次いで、本明細書でより十分に記載するように、各微小液滴に封入した成分を増幅及びアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、核酸鋳型分子は、各微小液滴が０個または１個のいずれかの核酸鋳型分子を含むように微小液滴に封入される。言い換えれば、いくつかの実施形態では、核酸鋳型分子は微小液滴あたり１の比またはそれ以下で封入される。非常に少ない分子、例えば、１０以下、５以下、例えば単一分子を区画化及び増幅することは、均一なカバレッジをともなう正確な配列データを得ることに対していくつかの利点を与える。分子が互いに分離されているので、各反応は、いつ開始するかに関係なく、飽和まで進行し、すなわち、バルクで偏りの主な原因なのが確率過程である（Ｒｏｄｒｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，４．）。本明細書でより詳細に述べるように、これらの利点は正確性を大いに高める。
【００１０】
開示される方法の態様は、核酸鋳型分子を非特異的に増幅することを含むことができ、これは、生物試料から得られた核酸鋳型分子を微小液滴中に封入すること、多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを微小液滴中に導入すること、ならびにＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で微小液滴をインキュベートすることであって、核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、インキュベートすることを含む。ある種の態様では、封入することは、１つまたは複数の生物試料から得られた複数の核酸鋳型分子を複数の微小液滴中に封入することを含み、導入することは、ＭＤＡ試薬及び複数のＭＤＡプライマーを複数の微小液滴のそれぞれに導入することを含み、インキュベートすることは、ＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で複数の微小液滴をインキュベートすることであって、核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、インキュベートすることを含む。ある種の態様では、ＭＤＡ増幅産物は、単一のＭＤＡ増幅産物または複数の異なるＭＤＡ増幅産物を含む。ある種の態様では、生物試料は１つまたは複数の細胞を含む。
【００１１】
方法の態様は、生物試料から単離した核酸集団に対するコピー数多型（ＣＮＶ）解析の実施方法を含むこともでき、これは、核酸集団を断片化すること、断片化した核酸集団を複数の微小液滴に封入すること、多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを複数の微小液滴のそれぞれに導入すること、ＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で微小液滴をインキュベートすることであって、核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、インキュベートすること、及びＭＤＡ増幅産物をシークエンシングして、核酸集団中の１つまたは複数の核酸配列のコピー数を決定することを含む。いくつかの実施形態では、断片化ステップは封入ステップより前に実施されない。
【００１２】
本開示のある種の態様は、単一核酸鋳型分子、ならびに核酸鋳型分子を非特異的に増幅することができるポリメラーゼ酵素及び複数のＭＤＡプライマーを含むＭＤＡ混合物を含む微小液滴を含む組成物を含むことができる。
【００１３】
本方法の実施において、いくつかの変形形態を用いることができる。例えば、幅広い様々なＭＤＡベースのアッセイを用いることができる。そうしたアッセイで使用されるプライマーの数及び性質は、実施されるアッセイの種類、生物試料の性質及び／または他の因子に少なくとも部分的に基づいて変わり得る。ある種の態様では、微小液滴に添加することができるプライマーの数は１〜１００個もしくはそれ以上でもよく、及び／または約１〜１００個もしくはそれ以上の異なる核酸配列に結合するプライマーを含むことができる。
【００１４】
微小液滴はそれ自体、サイズ、組成物、内容物などを含めて、変わり得る。微小液滴は、一般に、約０．００１〜１０００ピコリットルまたはそれ以上の内容積を有し得る。さらに、微小液滴は界面活性剤及び／または粒子によって安定化されてもよいし、されなくてもよい。
【００１５】
試薬を微小液滴に添加する手段は、大きく変わり得る。１ステップで、または複数のステップ、例えば、２以上のステップ、４以上のステップもしくは１０以上のステップで試薬を添加することができる。ある種の態様では、より十分に本明細書に記載するように、液滴合体、ピコインジェクション、複数の液滴合体などを含めた技法を使用して試薬を添加することができる。ある種の実施形態では、注入流体それ自体が電極として働く方法によって試薬を添加する。注入流体は、それをそのようなものとして使用することを可能にする、１または複数の種類の溶解した電解質を含むことができる。注入流体それ自体が電極として働く場合は、液滴に試薬を添加するためにマイクロ流体チップ中に金属電極がある必要性がなくなり得る。ある種の実施形態では、注入流体は電極として働かないが、金属電極の代わりに１つまたは複数の液体電極が利用される。
【００１６】
様々な異なった検出成分を使用して、ＭＤＡ生成物の有無を検出する様々な方法を用いることができる。目的の検出成分としては、限定されないが、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、シアニン及びその誘導体、クマリン及びその誘導体、カスケードブルー及びその誘導体、ルシファーイエロー及びその誘導体、ＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体などが挙げられる。例示的フルオロフォアとしては、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、アレクサフルオル−３５５、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５３２、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル−５５５、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル６６０、アレクサフルオル６８０、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ピコグリーン、リボグリーンなどが挙げられる。検出成分は、ビーズ（例えば、磁気ビーズまたは蛍光ビーズ、例えばルミネックスビーズ）などを含むことができる。ある種の態様では、検出は、繰り返し画像化することができるように、核酸増幅の間、固定された位置に微小液滴を保持することを含むことができる。ある種の態様では、検出は、１つまたは複数の微小液滴中の１つまたは複数の細胞を固定及び／または透過処理することを含むことができる。
【００１７】
本明細書に開示される方法に適切な対象、例えば、解析のための生物試料が得られる適切な対象としては、哺乳動物、例えばヒトが挙げられる。対象は、疾患状態の臨床症状を示すもの、または疾患と診断されたものでもよい。ある種の態様では、対象は、癌と診断されたもの、癌の臨床症状を示すもの、または１つもしくは複数の因子、例えば、家族歴、環境曝露、遺伝子変異（複数可）、生活様式（例えば、食事及び／もしくは喫煙）、１つもしくは複数の他の疾患状態の存在などにより癌を発症する危険性があると判定されたものでもよい。
【００１８】
本発明は、添付の図面と併せて読めば、以下の詳細な説明から最もよく理解することができる。以下の図が図面に含まれる
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】区画化されたＭＤＡがどのようにシークエンシングカバレッジを高めるかを示す図である。パネルＡ：バルク多置換増幅（バルクＭＤＡ）を介する核酸鋳型分子（複数可）の増幅。パネルＡに図示するように、非区画化増幅はΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの指数関数的活性を束縛せず、これは、シークエンシングの偏りをもたらす。パネルＢ：振盪エマルジョンＭＤＡを介する核酸鋳型分子（複数可）の増幅。パネルＢに図示するように、振盪エマルジョンにおける反応の区画化はシークエンシングカバレッジを高める。しかし、エマルジョンの多分散性は、いくらかのシークエンシングの偏りをもたらす。パネルＣ：デジタル液滴ＭＤＡ（ｄｄＭＤＡ）による核酸鋳型分子（複数可）の増幅。パネルＣに図示するように、マイクロ流体デバイスを使用して生じた反応の区画は、反応の高い均一性により、さらに大きなシークエンシングカバレッジをもたらす。
【図２】デジタル液滴ＭＤＡの実証及び非特異的ＤＮＡ定量化に対するその有用性を示す図である。パネルＡ：３濃度の投入材料についての、デジタル液滴ＭＤＡ（ｄｄＭＤＡ−上部の列）及びデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ−下部の列）にかけた液滴の蛍光顕微鏡画像。Ｅｖａ  Ｇｒｅｅｎ（ｄｄＭＤＡ）及びＴａｑｍａｎプローブ（ｄｄＰＣＲ）を使用して蛍光を得た。デジタルＭＤＡとＰＣＲ定量化の間の相違は、特異的なＰＣＲ増幅と比較した際のＭＤＡの非特異的性質に対応する。パネルＢ：観察された液滴対予測された液滴の割合。蛍光性液滴の割合は全ゲノムのポアソン封入（Ｐｏｉｓｓｏｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）を仮定して予測される。ｄｄＰＣＲは、ゲノムあたり１つの陽性液滴を封入するが、ｄｄＭＤＡはＤＮＡセグメントあたり１つの陽性液滴を封入する。これは、核酸の非特異的定量化を可能にし、混入及び試料の断片化の計算を可能にする。
【図３】カバレッジの均一性に対する区画化増幅の効果を示す図である。パネルＡ：各塩基に対するリード数を全ゲノムに対する平均リード数で割ったものと定義される（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ．”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，１４，Ｒ５１）相対カバレッジをゲノム位置に対してプロットした。相対カバレッジは、３つのシナリオ（非増幅Ｅ．ｃｏｌｉ（上部）、標準的なバルクＭＤＡ（中央）及びデジタル液滴ＭＤＡ（下部））について測定し、１０ｋｂｐのビンに統合した。パネルＢ：非増幅Ｅ．ｃｏｌｉ、バルクＭＤＡ及びデジタル液滴ＭＤＡについての相対カバレッジの関数としての確率密度。カバレッジ分布は非増幅Ｅ．ｃｏｌｉについてごくわずかなカバーが不十分なリードを有するが、バルクＭＤＡは、ＭＤＡの既知の特性である非常に低いカバレッジを有するかなりの割合の塩基を示す。デジタル液滴ＭＤＡはこれらの分布の混合のように見え、これは、カバレッジが高められたことを示すものである。
【図４】ＰｉｃｏＰＬＥＸ  ＷＧＡとｄｄＭＤＡの比較を示す図である。パネルＡ：ｄｄＭＤＡを使用して増幅した０．５ｐｇ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡと比較した、ＰｉｃｏＰＬＥＸ  ＷＧＡキットを使用して増幅した０．５ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡのゲノム位置の関数としての相対カバレッジ。データポイントを１０ｋｂのビンに統合した。パネルＢ：ＰｉｃｏＰＬＥＸ  ＷＧＡ及びｄｄＭＤＡについての相対カバレッジの関数としての推定密度。示すように、ＰｉｃｏＰＬＥＸ  ＷＧＡは、ｄｄＭＤＡと比較して、最小のカバレッジを有する塩基の比率が高いように思われる。
【図５】５ピコグラム（約１０００Ｅ．ｃｏｌｉゲノム）、０．５ピコグラム（約１００Ｅ．ｃｏｌｉゲノム）及び０．０５ピコグラム（約１０Ｅ．ｃｏｌｉゲノム）から増幅したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの標準的なバルクＭＤＡ（パネルＡ）、振盪エマルジョンＭＤＡ（パネルＢ）及びデジタル液滴ＭＤＡ（パネルＣ）の相対カバレッジを示す図である。データポイントを１０ｋｂのビンに統合した。２試料を解析から除外した（バルクＭＤＡ３は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに整列したシークエンスしたＤＮＡは５％未満であり、一方で、ｄｄＭＤＡ３は正しくインデックスが付けられず、それにより、いかなるシークエンシングデータももたらさなかった）。
【図６】３つの投入ＤＮＡ濃度に対する３つの異なるＭＤＡ方法についての偏りの比較を示す図である。右のプロットは、３つの投入ＤＮＡ濃度すべてについて平均した、バルクＭＤＡの測定値に対して正規化した各メトリックを示す。パネルＡ：投入ＤＮＡ濃度に対してプロットされる、平均カバレッジの１０％未満でカバーされる塩基の割合と定義されるドロップアウト率。パネルＢ：相対カバレッジの二乗平均平方根として測定したカバレッジスプレッド。パネルＣ：∫ｐ  ｌｏｇ（ｌ／ｐ）（式中、ｐはゲノムの規定されたウインドウ内でリードを観察する確率である）と定義される、情報エントロピー。
【図７】単一Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のｄｄＭＤＡがカバレッジの均一性を有意に高めることを示す図である。パネルＡ：ゲノム位置に対してプロットした、各塩基に対するリード数を全ゲノムに対する平均リード数で割ったものと定義される相対カバレッジ。相対カバレッジは、１０ｋｂｐのビンに統合した、バルクＭＤＡを介して増幅した２つの細胞（第１のパネル）及びｄｄＭＤＡを介して増幅した２つの細胞（第２のパネル）について測定される。カバレッジプロット中のギャップは、所与の１０ｋｂｐのビンの完全なドロップアウトを示す。パネルＢ：バルクＭＤＡを介して増幅した２つの細胞及びｄｄＭＤＡを介して増幅した２つの細胞についての相対カバレッジの関数としての確率密度。バルクＭＤＡによって増幅した２つの細胞は、非常に低いカバレッジを有するかなりの割合の塩基を示すが、ｄｄＭＤＡによって増幅した細胞ははるかに均一なカバレッジを示す。
【図８】振盪エマルジョンＭＤＡとｄｄＭＤＡの間の液滴サイズ分布の比較を示す図である。パネルＡ：代表的な振盪エマルジョン反応及びｄｄＭＤＡ反応の明視野顕微鏡画像。パネルＢ：マイクロメートルで測定される、液滴の正規化した直径分布。パネルＣ：ピコリットルで測定される、液滴の正規化した容積分布。
【図９】本明細書に記載の方法で使用することができる例示的マイクロ流体デバイスの図解及び顕微鏡画像を示す図である。
【図１０】図４に記載されている定義に対する式を示す図である。ドロップアウトメトリックは、平均カバレッジの１０％未満でカバーされる塩基の割合を示す。カバレッジスプレッドは、相対カバレッジの二乗平均平方根と定義される。情報エントロピーは、所与の確率とその底２の対数の積の和と定義される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
核酸鋳型分子を非特異的に増幅する方法が提供される。ある種の態様では、その方法は、シークエンシングするために、例えば、培養不可能な微生物のゲノムをシークエンシングするために、または癌細胞におけるコピー数多型を特定するためにシークエンシングするために、核酸鋳型分子（複数可）を増幅するのに使用することができる。
【００２１】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、変わり得ることを理解されたい。本明細書で使用される術語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限を意図したものではないことも理解されたい。
【００２２】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈において別段明記しない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解されよう。記載された範囲の任意の記載された値または介在値とその記載された範囲の任意の他の記載された値または介在値の間のより小さな範囲は、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立に、範囲内に含まれてもよいし、または除外されてもよく、記載された範囲内の任意の特に除外された限界値を条件として、より小さい範囲にいずれかの限界値が含まれる場合、いずれの限界値も含まれない場合または両方の限界値が含まれる場合の各範囲も本発明内に包含される。記載された範囲がその限界値の一方または両方を含む場合は、そうした含まれる限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００２３】
別段規定されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法及び材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの潜在的及び例示的な方法及び材料を次に記載することができる。本明細書で言及するありとあらゆる刊行物は、刊行が引用されるものと関連する方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する限り、本開示は組み込まれる刊行物のいかなる開示にも優先することが理解されよう。
【００２４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において別段明記しない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ  ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ（１つの微小液滴）」への言及は、複数のそのような微小液滴を含み、「ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ（その微小液滴）」への言及は、１つまたは複数の微小液滴への言及を含むなどである。
【００２５】
特許請求の範囲は、随意であり得るいかなる要素も除外するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求要素の記述に関連する「ｓｏｌｅｌｙ（単に）」、「ｏｎｌｙ（のみ）」などのような排他的な術語の使用、または「否定的な」制限の使用に対する先行詞として働くことが意図される。
【００２６】
本明細書で言及するありとあらゆる刊行物は、刊行物が引用されるものに関連する方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する限り、本開示は組み込まれる刊行物のいかなる開示にも優先することが理解されよう。さらに、提供される任意のそのような刊行日は実際の刊行日と異なる可能性があり、個別に確認する必要がある場合がある。
【００２７】
本明細書で論じる刊行物は、単にその開示が本出願の出願日より前であるという理由で提供される。本明細書のいずれの記載も、先行発明によって本発明がこのような刊行物に先行する権利がないことを認めると解釈されるべきでない。さらに、提供される刊行日は実際の刊行日と異なる可能性があり、個別に確認する必要がある場合がある。このような刊行物が本開示の明確なまたは暗黙の定義と矛盾する用語の定義を提示する可能性がある限り、本開示の定義を優先する。
【００２８】
本開示を読む際に当業者に明らかなように、本明細書に記載され、例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特色から容易に分離することができ、またはその特色と組み合わせることができる、別々の構成要素及び特色を有する。任意の記載される方法は、記載される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
【００２９】
本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法及び材料も本発明の実施で使用することができるが、いくつかの潜在的及び例示的な方法及び材料を次に記載する。
【００３０】
方法
上記で概要を述べたように、本発明の態様は、生物試料からの核酸の増幅方法を含む。そのような方法は、１つまたは複数の核酸配列、例えば１つまたは複数の細胞、例えば１つまたは複数の腫瘍または非腫瘍細胞に由来する１つまたは複数の核酸のシークエンシング及び／または定量化を容易にするために利用することができる。目的の態様は、核酸集団、例えば、単一細胞、例えば腫瘍細胞、例えば循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）から単離したゲノム核酸の集団に対するコピー数多型解析の実施方法を含む。
【００３１】
本明細書で使用する場合、語句「生物試料」は、試料の種類が１つまたは複数の核酸を含む、生物起源の様々な試料の種類を包含する。例えば、「生物試料」の定義は、血液及び生物起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本または組織培養物またはそれらに由来する細胞及びそれらの後代を包含する。この定義は、試薬による処理、可溶化、またはある種の成分、例えばポリヌクレオチドの富化などによって、入手した後に任意の方法で操作された試料も含む。用語「生物試料」は臨床試料も包含し、培養細胞、細胞上清、細胞可溶化物、細胞、血清、血漿、生体液及び組織試料も含む。
【００３２】
本明細書でより十分に記載するように、様々な態様において、本方法は、そのような生物試料から核酸を増幅するのに使用することができる。特に興味深い生物試料としては、細胞（例えば、循環性腫瘍細胞）を挙げることができる。
【００３３】
用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれか）のポリマー形態を指す。この用語は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの修飾形態を包含する。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーを挙げることができる。核酸分子は直鎖状でもよいし、環状でもよい。核酸は様々な構造的形態のうちのいずれかを有してもよく、例えば、一本鎖、二本鎖または両方の組み合わせでもよく、さらに、高次分子内または分子間２次／３次構造、例えば、ヘアピン、ループ、３本鎖領域などを有してもよい。
【００３４】
用語「核酸配列」または「オリゴヌクレオチド配列」は、隣接する一続きのヌクレオチド塩基を指し、特定の文脈では、ヌクレオチド塩基がオリゴヌクレオチド中に現れる場合に互いに対するヌクレオチド塩基の特定の配置も指す。
【００３５】
用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合則によって関連付けられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「５’−ＡＧＴ−３’」は、配列「５’−ＡＣＴ−３’」に相補的である。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチする「部分的」でもよく、または核酸間の「完全な」もしくは「全体的な」相補性でもよい。核酸鎖の間の相補性度は、規定された条件下での核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を与え得る。これは、核酸間の結合に依存する方法にとって特に重要である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関連して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間の相補度、関与する条件のストリンジェンシー及び形成されるハイブリッドのＴｍのような因子の影響を受ける。「ハイブリダイゼーション」方法は、ある核酸の別の相補的核酸、すなわち相補的ヌクレオチド配列を有する核酸へのアニーリングを含む。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件で行われる。相補的配列の長さ及びＧＣ含量は、標的核酸に対する標的部位の特異的ハイブリダイゼーションを得るのに必要である、ハイブリダイゼーション条件の熱融解点Ｔｍに影響を及ぼす。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で行うことができる。語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、一般的には核酸の複合混合物中で、その標的サブ配列にハイブリダイズし、検出可能なまたは有意なレベルで他の配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境で違うであろう。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約６〜約８のｐＨにおいて、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１Ｍ未満、例えば、約０．００１Ｍ〜約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が約２０℃〜約６５℃の範囲であるものである。ストリンジェントな条件は、限定されないがホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することもできる。
【００３８】
対応するヌクレオチド間ですべてが水素結合を完全に形成した二本鎖分子の形成は、「マッチした」または「完全にマッチした」と呼ばれ、対応しないヌクレオチドの単一またはいくつかの対を有する二本鎖は、「ミスマッチした」と呼ばれる。一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の任意の組み合わせが、適切な実験条件下で二本鎖分子（ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡ）を形成することができる。
【００３９】
語句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、分子が特定のヌクレオチド配列のみに対して結合、二本鎖形成またはハイブリダイズすることを指す。
【００４０】
当業者は、同様のストリンジェンシーの条件を提供するために代替のハイブリダイゼーション及び洗浄条件が利用可能であることを容易に認識し、パラメーターの組み合わせが、任意の単一パラメーターの程度よりもはるかに重要であることを認識するであろう。
【００４１】
「置換」は、例となるヌクレオチド配列、例えばＷＴヌクレオチド配列と比べて異なるヌクレオチドによる、１つまたは複数のヌクレオチドの置き換えから生じる。
【００４２】
「欠失」は、例となるヌクレオチド配列、例えばＷＴヌクレオチド配列と比べて１つまたは複数のヌクレオチド残基が欠けているヌクレオチド配列の変化と定義される。ポリヌクレオチド配列に関連して、欠失は、改変されるポリヌクレオチド配列からの２、５、１０、２０まで、３０まで、または５０まで、またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。
【００４３】
「挿入」または「付加」は、例となるヌクレオチド配列と比べて１つまたは複数のヌクレオチド残基の付加をもたらした、ヌクレオチド配列中の変化である。ポリヌクレオチド配列に関連して、挿入または付加は、１０まで、２０まで、３０まで、または５０まで、またはそれ以上のヌクレオチドでもよい。
【００４４】
用語「ドロップ」、「液滴」及び「微小液滴」は本明細書で互換的に使用されて、第１の流体相と非混和性である第２の流体相（例えば油）で囲まれた第１の流体相、例えば水相（例えば水）を少なくとも含む、小さな、一般に球状の構造体を指す。いくつかの実施形態では、本開示による液滴は、第２の非混和性流体相、例えば水相流体（例えば水）で囲まれた第１の流体相、例えば油を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の流体相は、非混和相担体流体である。したがって、本開示による液滴は、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンとして提供することができる。本開示による液滴は、多重エマルジョン、例えば二重またはより高レベルのエマルジョンとして形成することができる。いくつかの実施形態では、本液滴は、寸法、例えば、１．０μｍ〜１０００μｍ（両端を含む）、例えば、１．０μｍ〜７５０μｍ、１．０μｍ〜５００μｍ、１．０μｍ〜１００μｍ、１．０μｍ〜１０μｍまたは１．０μｍ〜５μｍ（両端を含む）の、またはおよそこれらの直径を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の別個の実体は、寸法、例えば、１．０μｍ〜５μｍ、５μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜５００μｍ、５００μｍ〜７５０μｍまたは７５０μｍ〜１０００μｍ（両端を含む）の、またはおよそこれらの直径を有する。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の別個の実体は、約１ｆＬ〜１ｎＬ（両端を含む）、例えば、１ｆＬ〜１００ｐＬ、１ｆＬ〜１０ｐＬ、１ｆＬ〜１ｐＬ、１ｆＬ〜１００ｆＬまたは１ｆＬ〜１０ｆＬ（両端を含む）の範囲の容積を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の別個の実体は、１ｆＬ〜１０ｆＬ、１０ｆＬ〜１００ｆＬ、１００ｆＬ〜１ｐＬ、１ｐＬ〜１０ｐＬ、１０ｐＬ〜１００ｐＬまたは１００ｐＬ〜１ｎＬ（両端を含む）の容積を有する。本開示による液滴は、一般に、約０．００１ピコリットル〜約１０，０００ピコリットルの容積、例えば、約１ピコリットル〜約１０００ピコリットル、または約１ピコリットル〜約１００ピコリットルに及ぶ内容積を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示による液滴は、約０．００１ピコリットル〜約０．０１ピコリットル、約０．０１ピコリットル〜約０．１ピコリットル、約０．１ピコリットル〜約１ピコリットル、約１ピコリットル〜約１０ピコリットル、約１０ピコリットル〜約１００ピコリットル、約１００ピコリットル〜約１０００ピコリットルまたは約１０００ピコリットル〜約１０，０００ピコリットルに及ぶ容積を有する。本開示による液滴は、細胞、核酸（例えばＤＮＡ）、酵素、試薬及び様々な他の成分を封入するのに使用することができる。液滴という用語は、マイクロ流体デバイス中で、マイクロ流体デバイス上で、もしくはマイクロ流体デバイスによって生成された、及び／またはマイクロ流体デバイスから流れた、もしくはマイクロ流体デバイスによって加えられた液滴を指すのに使用することができる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「担体流体」は、本明細書に記載の１つまたは複数の液滴を含むように構成または選択された流体を指す。担体流体は、１種または複数の物質を含むことができ、且つ１つまたは複数の特性、例えば粘性を有することができ、これによって、担体流体が、マイクロ流体デバイスまたはその一部、例えば送達オリフィスを通って流れることが可能になる。いくつかの実施形態では、担体流体は、例えば油または水を含み、液相または気相中に存在し得る。適切な担体流体は、本明細書でより詳細に記載される。
【００４６】
特許請求の範囲で使用する場合、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」及び「を特徴とする」と同義である用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、包括的または非制限的であり、付加的な列挙されていない要素及び／または方法ステップを除外しない。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、指定された要素及び／またはステップが存在するが、他の要素及び／またはステップを追加してもよく、依然として関連する主題の範囲に入ることを意味する専門用語である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、語句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」は、具体的に列挙されていないいかなる要素、ステップ及び／または成分も除外する。例えば、語句「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ（からなる）」は、プリアンブルの直後ではなく請求項のボディの条項中に現れる場合は、これは、その条項に記載される要素のみを限定し、他の要素は全体として請求項から除外されない。
【００４８】
本明細書で使用する場合、語句「から本質的になる」は、指定の材料及び／またはステップ、これに加えて開示及び／または請求される主題の基本的及び新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに、関連した開示または請求の範囲を限定する。
【００４９】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「から本質的になる」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」に関しては、これらの３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。
【００５０】
本開示が対処する当技術分野における必要性の例は、核酸鋳型分子の均一な増幅に対する必要性である。現在利用可能なＭＤＡ方法は、相当な増幅の偏りをもたらし得る。その結果、そこから得られたシークエンシングの結果は、不正確で信頼できないことが多い。例えば、従来の方法に従って用意した増幅したゲノムのデータは、特定の細胞のゲノム中に存在するＤＮＡを正確に表さない可能性がある。本明細書に記載の方法の態様及び組成物によれば、ゲノムＤＮＡをかなりより均一な方法で増幅することができ、その結果、生物試料、例えば細胞中に存在するゲノム核酸のより正確な表現を決定することができる。
【００５１】
本開示は、デジタル液滴多置換増幅（ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ｄｄＭＤＡ）に部分的に関する。「ｄｄＭＤＡ」は、一般に、単一の液滴反応区画（例えば微小液滴）中に核酸鋳型分子（複数可）の増幅反応を区画化すること（これは、一般に、核酸鋳型分子のパラレルまたは均一な増幅をもたらす）を指す。いくつかの実施形態では、増幅反応は、単一（または非常に少ない、例えば１０個以下、例えば５個以下）の核酸鋳型分子を単一の微小液滴中で増幅することを指す。他の実施形態では、増幅反応は、単一核酸鋳型分子中の複数の核酸鋳型分子を増幅することができる。核酸鋳型分子が互いに物理的に分離されているので、分子を他の分子とリソースのために競合することなしに飽和まで増幅させることができる。これは、全ゲノム配列の概して均一な表現をもたらす。いくつかの実施形態では、各単一核酸鋳型分子は、他の核酸鋳型分子から物理的に分離されており、その結果、微小液滴の外側で起こっていることに関係なく、核酸鋳型分子の増幅が起こる。さらに、単一核酸鋳型分子を単一の微小液滴中に閉じ込めることは、同様のリソース（例えば、プライマー、試薬、ポリメラーゼ酵素）を共有する必要をなくす。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ｄｄＭＤＡ反応は、ピコリットルの内部容積を有する反応チャンバー（例えば微小液滴）中で区画化された核酸鋳型分子を増幅する。いくつかの例では、核酸鋳型分子の反応を区画化することは、激しく振盪して、増幅される核酸鋳型分子を含む溶液を油で乳化することによって、達成され得る。適切な界面活性剤が存在する場合は、油中に懸濁した安定な水性液滴が生成され、それらのそれぞれが単一核酸鋳型分子を増幅する。あるいは、他の例では、微小液滴中で反応を区画化することは、マイクロ流体乳化技法を使用することによって達成され得る。
【００５３】
本明細書に記載のように、増幅の「偏り」は、一般に、選択したゲノム配列の不等または不均衡な増幅を指す。そのような増幅の偏りは、ゲノム配列の不正確な表現を与えることによって、次世代シーケンシングデータの質及び量を一般に低減させる。
【００５４】
本明細書に記載のように、用語「核酸鋳型分子」は、一般に、本明細書に記載のＭＤＡ反応の鋳型として使用される核酸分子を指す。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を指すことができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子はＲＮＡ分子から生成することができ、続いて、本明細書に記載のＭＤＡ反応の核酸鋳型分子として働くことができる。この技法は、例えば、１つまたは複数のＲＮＡウイルスのゲノムをシークエンスするのに使用することができる。
【００５５】
一実施形態によれば、方法は、核酸鋳型分子を非特異的に増幅することができる。これに関連して使用される場合、用語「非特異的に」は、一般に、特定のＤＮＡ配列に対して偏りまたは選好性なしに核酸鋳型分子を増幅することを指す。その結果、非特異的増幅は、例えば細胞のゲノムの概して均一な増幅をもたらす。
【００５６】
ＭＤＡ増幅産物が特定の液滴中に存在するかどうかを決定するために、例えば、サイバーグリーンもしくはエチジウムブロマイドのようなインターカレート色素で溶液を染色すること、ＭＤＡ増幅産物を固体基材、例えばビーズ（例えば、磁気ビーズもしくは蛍光ビーズ、例えばルミネックスビーズ）にハイブリダイズすること、またはＦＲＥＴなどの分子間反応を介してそれを検出することによる、ドロップ中の液体を探るアッセイを介して、ＭＤＡ増幅産物を検出することができる。これらの色素、ビーズなどは、ＭＤＡ増幅産物（複数可）の有無を検出するのに使用される任意の成分を指すために本明細書で広く一般的に使用される用語である「検出成分」のそれぞれの例である。
【００５７】
いくつかの例では、本明細書に記載の方法及び組成物は、ゲノムＤＮＡの偏りがない増幅及びシークエンシングを介して培養不可能な微生物を研究するのに使用することができる。他の例では、本明細書に記載の方法及び組成物は、個々の癌細胞のゲノムＤＮＡを増幅及びシークエンシングすることによってＣＮＶを解析するのに使用することができる。他の例では、本明細書に記載の方法及び組成物は、解析用の法医学的ＤＮＡを増幅するのに使用することができる。他の例では、本明細書に記載の方法及び組成物は、シークエンシング用の貴重な試料（例えば古代ＤＮＡ）からＤＮＡを増幅するのに使用することができる。例えば、法医学的調査は通例のＤＮＡ解析の感度限界をはるかに下回る試料の増幅及びシークエンシングを必要とする。これらの解析方法にｄｄＭＤＡを組み入れることは、全ゲノム増幅の均一性を高めることができ、したがって、ドラフトゲノム及び次のデータ解析を向上させる。他の例では、本明細書に記載の方法及び組成物は、限られたＤＮＡ試料を増幅するのに有用であり得る。さらに、個々の腫瘍細胞に対するｄｄＭＤＡは、疾患の進行及び進展を追跡するために、癌関連変異のより正確な配列またはコピー数多型データを提供することができる。
【００５８】
溶解
本明細書に提供する方法による増幅のために、１つまたは複数の細胞からゲノムＤＮＡを得る目的で、細胞（複数可）を破裂させ、それによってそのゲノムを放出させることができる条件下で、１種または複数の溶解剤を利用することができる。適切なプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ、または細胞毒などの、任意の好都合な溶解剤を用いることができる。特定の実施形態では、トリトンＸＩ００などの界面活性剤及び／またはプロテイナーゼＫを含む溶解バッファーとともに細胞をインキュベートすることができる。細胞（複数可）を破裂させることができる特定の条件は、使用される特定の溶解剤によって変動する。例えば、プロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫが溶解剤として組み込まれる場合、細胞（複数可）を約３７〜６０℃に少なくとも約２０分間加熱して、細胞を溶解することができ、プロテイナーゼＫが細胞タンパク質を消化できるようにすることができ、その後、これを約９５℃に約５〜１０分間加熱して、プロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫを不活性化することができる。
【００５９】
ある種の態様では、細胞溶解は、さらにまたは代わりに、溶解剤の添加を含まない技法に依拠することができる。例えば、溶解は、細胞の穿穴、剪断、摩耗などを引き起こすための様々な幾何学的機構を用いることができる機械的な技法によって達成され得る。音波的技法などの他の種類の機械的な破損を使用することもできる。さらに、熱エネルギーを使用して細胞を溶解することもできる。細胞溶解を引き起こす任意の好都合な手段を本明細書に記載の方法で用いることができる。
【００６０】
標的成分から核酸を効果的に増幅するために、マイクロ流体システムは、試料を増幅モジュールに供給する前に核酸を遊離させるための細胞溶解モジュールまたはウイルスタンパク質外殻破壊モジュールを含むことができる。細胞溶解モジュールは、細胞溶解を引き起こすための化学的、熱的及び／または機械的手段に依拠し得る。細胞膜が脂質二重層からなるので、界面活性剤を含む溶解バッファーは脂質膜を可溶化することができる。一般的には、溶解バッファーは、細胞がソーティングまたは他の上流プロセスの間に早まって溶解されないように、外部ポートを介して溶解チャンバーに直接導入される。
【００６１】
オルガネラの完全な状態が必要である場合は、化学的溶解方法は不適切である場合がある。ある種の用途では、剪断及び摩損による細胞膜の機械的な崩壊が適切である。機械的な技法に依拠する溶解モジュールは、このモジュールに入る細胞の穿穴、剪断、摩耗などを引き起こすための様々な幾何学的機構を用いることができる。音波的技法などの他の種類の機械的な破損も適切な溶解物をもたらすことができる。さらに、熱エネルギーを使用して、細菌、酵母及び胞子などの細胞を溶解することもできる。加熱は細胞膜を破壊し、細胞内物質が放出される。マイクロ流体システム中で細胞下分画を可能にするために、溶解モジュールは、動電学的技法またはエレクトロポレーションを用いることもできる。エレクトロポレーションは、原形質膜の変化をもたらし、膜電位差を破壊する外部電界を用いることによって、細胞膜に一過的または永続的な穴を作出する。マイクロ流体エレクトロポレーションデバイスでは、膜を永続的に破壊することができ、細胞膜の穴が維持されて、放出される所望の細胞内物質を放出することができる。
【００６２】
断片化
核酸分子（複数可）を別々の断片に分離または単離するために、断片化を実施することができる。核酸分子の断片化は、熱による加熱、電磁波照射、超音波処理、音波剪断、制限消化、針による剪断、ポイント−シンク剪断（ｐｏｉｎｔ−ｓｉｎｋ  ｓｈｅａｒｉｎｇ）またはフレンチプレッシャーの使用によって、達成され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、核酸鋳型分子を単離するために、封入ステップより前に生物試料の細胞を断片化することができる。
【００６４】
ある種の態様では、ＭＤＡによって増幅してＭＤＡ生成物を生成するより前に液滴に供給される核酸鋳型分子の量は、わずか１００フェムトグラム、例えば５０フェムトグラム以下、１０フェムトグラム以下または５フェムトグラム以下でもよい。いくつかの実施形態では、ＭＤＡによって増幅してＭＤＡ生成物を生成するより前に液滴に供給される核酸鋳型分子の量は、約１フェムトグラム〜約５フェムトグラム、約５フェムトグラム〜約１０フェムトグラム、約１０フェムトグラム〜約５０フェムトグラムまたはそれ以上でもよい。
【００６５】
多置換増幅
上記で概要を述べたように、本発明の方法の実施において、例えば次世代シークエンシングによる下流解析のために、一般に偏りがなく非特異的な方法で核酸、例えばゲノムＤＮＡを増幅するために、ＭＤＡを使用することができる。
【００６６】
本開示による方法の例示的実施形態は、生物試料から得られた核酸鋳型分子を微小液滴中に封入すること、微小液滴にＭＤＡ試薬及び複数のＭＤＡプライマーを導入すること、及びＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で微小液滴をインキュベートすることであって、核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、例えば、核酸鋳型分子がＭＤＡ試薬及び複数のＭＤＡプライマーと混合され、例えばマイクロ流体デバイスの流動集束要素（ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を使用して乳化される場合、封入ステップ及び導入ステップは、単一ステップとして生じる。
【００６７】
本明細書に記載のＭＤＡベースのアッセイの条件は、１つまたは複数の様式で変わり得る。例えば、微小液滴に添加する（または封入する）ことができるＭＤＡプライマーの数は変わり得る。用語「プライマー」は１つまたは複数のプライマーを指し、精製された制限消化物のように自然に生じようと、合成的に生成されようと、１つの核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれたときに相補鎖に沿った合成の開始点として働くことができる、オリゴヌクレオチドを指す。そのような条件は、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補助因子である、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む）中に、適切な温度で、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸及び重合誘導剤、例えば適切なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Φ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔポリメラーゼ）が存在することを含む。プライマーは、増幅の最大効率のために、好ましくは一本鎖である。ＭＤＡに関連して、ランダムヘキサマープライマーが通常は利用される。
【００６８】
本明細書で使用する場合、核酸配列の相補体は、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対をなすように核酸配列を整列させたときに「逆平行の関係」にある、オリゴヌクレオチドを指す。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対またはマッチしない塩基を含んでいてもよい。核酸技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド中のシトシン及びグアニン塩基の濃度パーセント、イオン強度及びミスマッチ塩基対の発生率を含めた、いくつかの変数を考慮すれば、二本鎖の安定性を経験的に決定することができる。
【００６９】
微小液滴に添加する（または封入する）ことができるＭＤＡプライマーの数は、約１〜約５００個またはそれ以上、例えば、約２〜１００プライマー、約２〜１０プライマー、約１０〜２０プライマー、約２０〜３０プライマー、約３０〜４０プライマー、約４０〜５０プライマー、約５０〜６０プライマー、約６０〜７０プライマー、約７０〜８０プライマー、約８０〜９０プライマー、約９０〜１００プライマー、約１００〜１５０プライマー、約１５０〜２００プライマー、約２００〜２５０プライマー、約２５０〜３００プライマー、約３００〜３５０プライマー、約３５０〜４００プライマー、約４００〜４５０プライマー、約４５０〜５００プライマーまたは約５００プライマー以上に及び得る。
【００７０】
そのようなプライマー及び／または試薬を１ステップでまたは１ステップより多くで微小液滴に添加することができる。例えば、プライマーを２ステップ以上、３ステップ以上、４ステップ以上または５ステップ以上で添加することができる。溶解剤が利用される場合、プライマーを１ステップで添加するか１ステップ超で添加するかどうかに関係なく、溶解剤の添加後に、溶解剤の添加より前に、溶解剤の添加と同時にプライマーを添加することができる。溶解剤の添加の前または後に添加する場合は、溶解剤の添加とは別のステップでＭＤＡプライマーを添加することができる。
【００７１】
いったんプライマーを微小液滴に添加すると、ＭＤＡにとって十分な条件下で微小液滴をインキュベートすることができる。微小液滴は、プライマー（複数可）を添加するのに使用されるものと同じマイクロ流体デバイスでインキュベートすることができ、または別のデバイスでインキュベートすることができる。ある種の実施形態では、ＭＤＡ増幅にとって十分な条件下での微小液滴のインキュベートは、細胞溶解に使用されるものと同じマイクロ流体デバイスで実施される。微小液滴のインキュベートは様々な形態をとることができ、例えば、一定温度、例えば３０℃で、例えば約８〜約１６時間にわたって微小液滴をインキュベートすることができる。
【００７２】
ＭＤＡ増幅産物の生成に関する本明細書に記載の方法は特異的プローブの使用を必要としないが、本発明の方法は、１つまたは複数のプローブを微小液滴に導入することを含むこともできる。核酸に関して本明細書で使用する場合、用語「プローブ」は、標的領域中の配列とのプローブ中の少なくとも１つの配列の相補性により標的核酸中の配列と二本鎖構造を形成する、標識オリゴヌクレオチドを一般に指す。プローブは、好ましくは、ＭＤＡ反応をプライムするのに使用される配列（複数可）に相補的な配列を含まない。添加されるプローブの数は、約１〜５００、例えば、約１〜１０プローブ、約１０〜２０プローブ、約２０〜３０プローブ、約３０〜４０プローブ、約４０〜５０プローブ、約５０〜６０プローブ、約６０〜７０プローブ、約７０〜８０プローブ、約８０〜９０プローブ、約９０〜１００プローブ、約１００〜１５０プローブ、約１５０〜２００プローブ、約２００〜２５０プローブ、約２５０〜３００プローブ、約３００〜３５０プローブ、約３５０〜４００プローブ、約４００〜４５０プローブ、約４５０〜５００プローブまたは約５００プローブ以上であり得る。プローブ（複数可）は、１つまたは複数のプライマー（複数可）の添加より前に、添加に引き続いてまたは添加後に微小液滴に導入することができる。
【００７３】
ある種の実施形態では、ＭＤＡベースのアッセイは、細胞中に存在するある種のＲＮＡ転写産物の存在を検出するために、または１つもしくは複数のＲＮＡウイルスのゲノムをシークエンスするのに使用することができる。そのような実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを使用してＭＤＡ試薬を微小液滴に添加することができる。ＭＤＡ試薬の添加（または封入）より前にまたは後に、逆転写を可能にする条件、続いて本明細書に記載のＭＤＡを可能にする条件の下で微小液滴をインキュベートすることができる。微小液滴は、ＭＤＡ試薬を添加するのに使用されるものと同じマイクロ流体デバイスでインキュベートすることができ、または別のデバイスでインキュベートすることができる。ある種の実施形態では、ＭＤＡを可能にする条件下での微小液滴のインキュベートは、１つまたは複数の細胞を封入及び／または溶解するのに使用されるものと同じマイクロ流体デバイスで実施される。
【００７４】
ある種の実施形態では、ＭＤＡのために微小液滴に添加される試薬は、ＭＤＡ増幅産物を検出することができる蛍光ＤＮＡプローブをさらに含む。任意の適切な蛍光ＤＮＡプローブを使用することができ、これには、限定されないが、サイバーグリーン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、モレキュラービーコン及びスコーピオンプローブが含まれる。ある種の実施形態では、微小液滴に添加される試薬は、１種より多いＤＮＡプローブ、例えば、２種の蛍光ＤＮＡプローブ、３種の蛍光ＤＮＡプローブまたは４種の蛍光ＤＮＡプローブを含む。複数種の蛍光ＤＮＡプローブの使用により、単一反応において、ＭＤＡ増幅産物の同時測定が可能になる。
【００７５】
微小液滴の種類
本発明の方法の実施において、微小液滴の組成物及び性質は変わり得る。例えば、ある種の態様では、微小液滴を安定化させるために界面活性剤を使用することができる。したがって、微小液滴は界面活性剤によって安定化したエマルジョンを含むことができる。ドロップ中で実施される所望の反応を可能にする任意の好都合な界面活性剤を使用することができる。他の態様では、微小液滴は界面活性剤または粒子によって安定化されない。
【００７６】
使用される界面活性剤は、いくつかの因子、例えばエマルジョンのために使用される油及び水相（または他の適切な非混和相、例えば、任意の適切な疎水性相及び親水性相）に依存する。例えば、フルオロカーボン油中で水性液滴を使用する場合、界面活性剤は親水性ブロック（ＰＥＧ−ＰＰＯ）及び疎水性フッ素化ブロック（Ｋｒｙｔｏｘ  ＦＳＨ）を有し得る。しかし、油が炭化水素油に切り替えられる場合、例えば、界面活性剤ＡＢＩＬ  ＥＭ９０のような疎水性炭化水素ブロックを有するように、界面活性剤が代わりに選択される。界面活性剤の選択において、界面活性剤を選ぶ際に考慮され得る望ましい特性としては、以下の１つまたは複数を挙げることができる：（１）界面活性剤が低粘性を有すること、（２）界面活性剤がデバイスを構築するのに使用されるポリマーと非混和性であるので、デバイスを膨張させないこと、（３）生体適合性、（４）アッセイ試薬が界面活性剤に可溶性でないこと、（５）ガスが出入りすることを可能にするという点において、界面活性剤が好ましいガス溶解度を示すこと、（６）界面活性剤が、ＭＤＡに使用される温度または液滴が曝露されることになる任意の他の反応の温度よりも高い沸点を有すること、（７）エマルジョンの安定性、（８）界面活性剤が所望のサイズのドロップを安定化すること、（９）界面活性剤が担体相に可溶性であり、液滴相に可溶性でないこと、（１０）界面活性剤が限られた蛍光特性を有すること、及び（１１）広範な温度にわたって界面活性剤が担体相に可溶性のままであること。
【００７７】
イオン性界面活性剤を含めて、他の界面活性剤も想定することができる。３５℃を超える温度での液滴の安定性を高めるポリマーを含めて、ドロップを安定化するために他の添加物も油中に含むことができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、適切な界面活性剤はＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤である。そのような界面活性剤は、振盪エマルジョンＭＤＡ方法で利用することができる。いくつかの実施形態では、微小液滴、例えば、振盪エマルジョン微小液滴の調製で使用するのに適切な油はフッ素化油ＨＦＥ−７５００である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、核酸鋳型分子を複数のエマルジョン微小液滴に封入することができ、複数のエマルジョン微小液滴のそれぞれは、非混和性シェルで取り囲まれた第１の混和相流体を含み、複数のエマルジョン微小液滴は第２の混和相担体流体中に位置する。いくつかの実施形態では、例えば、制御された数の細胞、ウイルス及び／または核酸を複数のエマルジョン微小液滴中に封入するために、封入より前に試料を希釈することができる。本明細書に記載の方法の１つまたは複数を使用して、核酸増幅試薬、例えばＭＤＡ試薬を封入時に複数のエマルジョン微小液滴に添加することができ、または後で、複数のエマルジョン微小液滴に添加することができる。次いで、複数のエマルジョン微小液滴を核酸増幅条件にかける。いくつかの実施形態では、複数のエマルジョン微小液滴が核酸鋳型分子を含む場合、複数のエマルジョン微小液滴が検出可能な程度に標識される、例えば、増幅ＤＮＡのＳｙｂｒ染色などの蛍光発生的アッセイの結果として蛍光標識されるように、標識を添加する。増幅核酸を回収するために、マイクロ流体技法（例えば、誘電泳動、膜バルブなど）または非マイクロ流体技法（例えばＦＡＣＳ）を使用して、検出可能な程度に標識された複数のエマルジョン微小液滴をソートすることができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、微小液滴は、微小液滴内に封入または区画化された核酸鋳型分子ならびにＤＮＡポリメラーゼ酵素、複数のＭＤＡ試薬及び複数のＭＤＡプライマーを含むＭＤＡ混合物を含む。他の態様では、微小液滴は検出成分をさらに含むことができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、微小液滴は、単一核酸鋳型分子を含む。他の実施形態では、単一の微小液滴中に区画化された複数の核酸鋳型分子が存在し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、微小液滴は、導入ステップ及びインキュベートステップより前に、１つより多い核酸鋳型分子を含まない。他の実施形態では、微小液滴は、導入ステップ及びインキュベートステップより前に、複数の核酸鋳型分子を含むことができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、増幅される核酸鋳型分子の数は、生成される微小液滴の数を制御することによって変えることができる。他の実施形態では、核酸鋳型分子に由来する所定量のＭＤＡ増幅産物を得るために、微小液滴のサイズを変えることができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＭＤＡ増幅産物を提供するための微小液滴を生成するために、マイクロ流体方法と非マイクロ流体方法の両方を利用することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、（増幅より前の）核酸鋳型分子の出発量は少なく、例えば、１０ｆｇ以下（例えば、５ｆｇ以下または１ｆｇ以下）の核酸鋳型分子が微小液滴に封入される。いくつかの実施形態では、約１０ｆｇ〜約１ｆｇ（例えば、約５ｆｇ〜１ｆｇ）が増幅より前に微小液滴に封入される。いくつかの実施形態では、微小液滴は、蛍光レポーターなどの検出成分を含むこともできる。蛍光レポーターは、特定の微小液滴が増幅を受けるときを示すことができる。ｄｄＰＣＲと対照的に、ｄｄＭＤＡは、特定の核酸鋳型分子（複数可）のみを増幅するために、特異的なプライマー及びプローブに依拠しない。いくつかの実施形態では、ｄｄＭＤＡは、ＭＤＡ反応内で増幅可能なあらゆるゲノム断片に対しておよそ１つの蛍光液滴をもたらす。ｄｄＭＤＡは特異的プローブを必要としないので、ｄｄＭＤＡ方法は、既知及び未知の両方のゲノム配列の定量化を可能にする。これらの利点は、クリーンルーム及び地球外環境などの少量設定でＤＮＡを定量化することについて、ｄｄＭＤＡを価値のあるものにする。ｄｄＰＣＲとともに使用する場合、ｄｄＭＤＡはＤＮＡ増幅中の断片化及び混入を検出するのにも効果的である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、微小液滴は、封入された核酸鋳型分子から生成されたアンプリコンを含むことができる。本明細書に記載する場合、「アンプリコン」は、天然または人工の増幅の生成物である、生成物の増幅産物を一般に指す。アンプリコンという用語は、ゲノム配列、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ配列の１つまたは複数のコピーを一般に指すことができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、微小液滴の内容積は、約０．０１ｐＬ以下、約０．１ｐＬ以下、１ｐＬ以下、約５ｐＬ以下、１０ｐＬ以下、１００ｐＬ以下または１０００ｐＬ以下でもよい。いくつかの実施形態では、微小液滴の内容積は、約１ｆＬ以下、約１０ｆＬ以下または１００ｆＬ以下でもよい。いくつかの実施形態では、微小液滴の内容積は、ピコリットルからフェムトリットルの間の範囲（例えば、約０．００１ｐＬ〜約１０００ｐＬ）の液体容量を包含する。いくつかの実施形態では、微小液滴の内容積は、厳密にナノリットルレベル未満（例えば、厳密にピコリットル、厳密にフェムトリットルまたはこれらの組み合わせ）にまで及ぶ。
【００８８】
いくつかの実施形態では、微小液滴中の核酸鋳型分子（複数可）の初期濃度は約０．００１ｐｇ〜約１０ｐｇ、例えば、約０．０１ｐｇ〜約１ｐｇまたは約０．１ｐｇ〜約１ｐｇである。
【００８９】
いくつかの例では、多分散微小液滴または単分散微小液滴として微小液滴を作出することができる。
【００９０】
微小液滴への試薬添加
本方法の実施において、１つまたは複数のステップ（例えば、約２、約３、約４または約５またはそれ以上のステップ）において、いくつかの試薬を微小液滴に添加する必要があり得る。微小液滴へ試薬を添加する手段は、いくつかの様式で変わり得る。目的のアプローチとしては、限定されないが、Ａｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８８，２６４１０５（２００６）、Ｐｒｉｅｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８９，１３４１０１（２００６）、Ａｂａｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ９，２０１０  ｖｏｌ．１０７  ｎｏ．４５  １９１６３−１９１６６、及びＳｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７８（１４），ｐｐ  ４８３９−４８４９によって記載されるものが挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
例えば、試薬（複数可）を含む第２の微小液滴と微小液滴を合わせることを含む方法によって、微小液滴に試薬を添加することができる。特に本明細書に記載の方法を含めた任意の好都合な手段によって、第２の微小液滴に含まれる試薬（複数可）を添加することができる。この液滴を第１の微小液滴と合わせて、第１の微小液滴と第２の微小液滴の両方の内容物を含む微小液滴を作出することができる。
【００９２】
液滴合体またはピコインジェクションなどの技法を使用して、１種または複数の試薬を、さらにまたは代わりに添加することができる。液滴合体では、標的ドロップ（すなわち、微小液滴）を試薬（複数可）を含む微小液滴に沿って流動させて、微小液滴に添加することができる。２つの微小液滴を、それらが互いに接触するが、他の微小液滴と触れないように流動させることができる。次いで、これらのドロップを電極または電界を加える他の手段を通過させることができ、ここでは、電界が微小液滴を不安定化することができ、その結果、これらは一緒に合わせられる。
【００９３】
試薬は、さらにまたは代わりに、ピコインジェクションを使用して添加することもできる。このアプローチでは、標的ドロップ（すなわち、微小液滴）を、添加される試薬（複数可）を含むチャネルを流して通過させることができ、ここでは、試薬（複数可）は加圧状態にある。しかし、界面活性剤の存在により、電界の非存在下で、微小液滴は注入されることなく流れて通過することになり、これは、微小液滴をコーティングする界面活性剤が、流体（複数可）が侵入するのを防ぐことができるからである。しかし、微小液滴がインジェクターを通過する際に微小液滴に電界が加えられる場合、試薬（複数可）を含む流体が微小液滴に注入されることになる。微小液滴に添加される試薬の量は、いくつかの異なるパラメーターによって制御することができ、例えば、注入圧及び流動ドロップの速度を調整することによる、電界のオン及びオフを切り替えることによるなどである。
【００９４】
他の態様では、１種または複数の試薬を、さらにまたは代わりに、２つの液滴を一緒に合わせること、または液体をドロップに注入することに依拠しない方法によって、微小液滴に添加することができる。むしろ、非常に小さなドロップの流れの中に試薬を乳化するステップ、及びこれらの小さなドロップを標的微小液滴と合わせるステップを含む方法によって、１種または複数の試薬を微小液滴に添加することができる。そのような方法は、「複数ドロップの合体を介する試薬添加」と本明細書で言及するものとする。これらの方法は、標的ドロップと比較して添加されるドロップのサイズが小さいので、小さなドロップは標的ドロップよりはやく流動し、それらの後ろに集まるという事実を利用する。次いで、例えば電界を加えることにより、収集物を合わせることができる。このアプローチは、さらにまたは代わりに、異なる流体の小さなドロップのいくつかの共流を使用することによって複数の試薬を微小液滴に添加するのに使用することができる。小さなドロップと標的ドロップを効果的に合わせることを可能にするためには、標的ドロップを含むチャネルよりも小さく小さなドロップを作製することが重要であり、標的ドロップに「追い付く」ための時間を小さなドロップに与えるように、標的ドロップを注入するチャネルと電界を加える電極の間の距離を十分に長くすることも重要である。このチャネルが短すぎると、すべての小さなドロップが標的ドロップと合わさるとは限らず、所望されるよりも少ない試薬が添加される。ある程度まで、電界の大きさを増大させることによりこれを補正することができるが、これは、さらに遠く離れているドロップを合わせる傾向がある。同じマイクロ流体デバイス上に小さなドロップを作製することに加えて、これらは、さらにまたは代わりに、別のマイクロ流体ドロップメーカーを使用して、またはホモジナイゼーションを介してオフラインで作製することができ、次いで標的ドロップを含むデバイスにそれらを注入する。
【００９５】
したがって、ある種の態様では、試薬は、液滴流中に試薬を乳化すること（ここでは、液滴は微小液滴のサイズより小さい）、微小液滴とともに液滴を流動させること、及び液滴を微小液滴と合わせることを含む方法によって、微小液滴に添加される。液滴流に含まれる液滴の直径は、微小液滴の直径の約７５％もしくはそれ未満の範囲で変化してもよく、例えば、流動液滴の直径は、微小液滴の直径の約７５％もしくはそれ未満、微小液滴の直径の約５０％もしくはそれ未満、微小液滴の直径の約２５％もしくはそれ未満、微小液滴の直径の約１５％もしくはそれ未満、微小液滴の直径の約１０％もしくはそれ未満、微小液滴の直径の約５％もしくはそれ未満、または微小液滴の直径の約２％またはそれ未満である。ある種の態様では、２個以上の液滴、３個以上、４個以上または５個以上などの複数の流動液滴を微小液滴と合わせることができる。そのような合併は、限定されないが、電界を加えること（電界は流動液滴を微小液滴と合わせるのに有効である）を含めた任意の好都合な手段によって達成され得る
【００９６】
上記の方法の変形形態として、流体は噴流していてもよい。すなわち、流動液滴に添加されるように流体を乳化するのではなく、この流体の長い噴流を形成し、標的微小液滴の側面に沿って流動させることができる。次いで、例えば電界を加えることによって、これら２つの流体を合わせることができる。結果は、レイリープラトー不安定性のために、合わせる前におおよその標的微小液滴のサイズの微小液滴に自然に破壊し得る微小液滴が存在するバルジを有する噴流である。いくつかの変形形態が企図される。例えば、噴流を容易にするために、ゲル化剤及び／または界面活性剤などの１種または複数の薬剤を噴流流体に添加することができる。さらに、噴流を可能にするように連続流体の粘性を調整することができる（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｕｔａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．９９，０９４５０２（２００７）によって記載されていることなど）。
【００９７】
他の態様では、溶液中に溶解した電解質を活用することによって、注入流体それ自体を電極として使用する方法を使用して、１種または複数の試薬を添加することができる。
【００９８】
別の態様では、試薬が添加されるドロップ（すなわち、「標的ドロップ」）を添加される試薬（「標的試薬」）を含むドロップの内側に包むことによって、早期に形成されたドロップ（例えば微小液滴）に試薬を添加する。ある種の実施形態では、そうした方法は、最初に、適切な疎水性相、例えば油のシェルに標的ドロップを封入して二重エマルジョンを形成することによって行われる。次いで、標的試薬を含むドロップで二重エマルジョンを封入して、三重エマルジョンを形成する。標的ドロップと標的試薬を含むドロップとを混合するために、次いで、限定されないが、電界を加えること、液滴の界面を不安定化する化学物質を添加すること、圧縮部及び他のマイクロ流体形状を通って三重エマルジョンを流動させること、機械的撹拌もしくは超音波を与えること、温度を上昇もしくは低下させること、または磁場によって引かれた場合に二重エマルジョンの界面を破裂させることができる磁気粒子をドロップ封入することを含めた任意の適切な方法を使用して、二重エマルジョンを押し開ける。これらの方法及び関連した方法は公開ＰＣＴ出願ＷＯ２０１４／０２８３７８に記載されており、その開示は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
ＭＤＡ生成物の検出
本方法の実施において、ＭＤＡ増幅産物を検出することができる方法は様々であり得る。当技術分野で既知の蛍光色素の使用を含めた様々な異なる検出成分を本方法の実施において使用することができる。蛍光色素は、一般的にはファミリーに分けることができ、例えば、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、シアニン及びその誘導体、クマリン及びその誘導体、カスケードブルー及びその誘導体、ルシファーイエロー及びその誘導体、ＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体などである。例示的フルオロフォアとしては、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、アレクサフルオル−３５５、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５３２、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル−５５５、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル６６０、アレクサフルオル６８０、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ピコグリーン、リボグリーンなどが挙げられる。フルオロフォア及びその使用の説明は、中でも、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，９ｔｈ  ｅｄ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．、Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００３），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３／２００４  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．、Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、及びＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡに見出すことができる。
【０１００】
コピー数多型
コピー数多型（ＣＮＶ）は、ゲノムにおける構造変動の形態である。本明細書に記載のように、ＣＮＶは一般に、１ｋｂｐより大きいゲノムのＤＮＡセグメントの変動を指す。いくつかの例では、ゲノムの変化は、ＤＮＡの１つまたは複数のセクションのコピー数の異常な変動またはある種の遺伝子については正常な変動であり得る。ＣＮＶは、欠失した（すなわち、通常数より少ない）ゲノムの大きな領域及び重複した（すなわち、通常の数より多い）ゲノムの大きな領域に対応する。ＣＮＶは様々であり得るが、短いＣＮＶほど一般に長いＣＮＶよりも検出するのが難しい。
【０１０１】
ＣＮＶ解析は、ＣＮＶを評価する（すなわち、特定のＤＮＡ配列のコピー数の変動を検出する）ために増幅ＭＤＡ生成物を解析することを一般に指す。
【０１０２】
ＣＮＶを解析するために、本明細書に記載のＭＤＡ方法と組み合わせて次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を利用することができる。ＣＮＶを検出するための特定のＮＧＳ技法としては、ＣＮＶ−ｓｅｑ、ＦＲＥＥＣ、ｒｅａｄＤｅｐｔｈ、ＣＮＶｎａｔｏｒ、ＳｅｇＳｅｑ、イベントワイズテスト（ｅｖｅｎｔ−ｗｉｓｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＥＷＴ）、ｒＳＷ−ｓｅｑ、ＣＮＡｎｏｒｍ、ｃＮＤ、ＣＮＡｓｅｇ、ＣＮＶｅｒ、ＣｏｐｙＳｅｑ、ＪｏｉｎｔＳＬＭ及びｃｎ．ＭＯＰＳを挙げることができる。ゲノム中のＣＮＶを特定するためのＮＧＳの他の例としては、ペアエンドマッピング（ＰＥＭ）ベースの方法及びカバレッジ深度（ＤＯＣ）ベースの方法が挙げられる。いくつかの例では、ＰＥＭベースの方法が、より小さいサイズのＣＮＶを検出するのに適し得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、小さなＤＮＡセグメント、例えば単一遺伝子に対して、ＣＮＶを実施することができる。他の実施形態では、複数の遺伝子に対してＣＮＶを実施することができる。
【０１０４】
いくつかの例では、ＣＮＶは癌などの特定の疾患と関係がある。癌患者が１種または複数の薬物で治療される場合、癌性細胞は、癌細胞を薬物療法に対して抵抗性を生じるように進化させることが多い選択圧にかけられる。進化するために、コピー数多型（ＣＮＶ）によって実証されるように、癌細胞は、薬物療法抵抗性につながり得る遺伝子変異の形成を受け、この場合、癌細胞のゲノムの領域がゲノム中に挿入（すなわち重複）または欠失を組み込むことができる。
【０１０５】
ＣＮＶ解析は、ゲノム中に特定の配列が出現する回数を数えることを試みる。最初の遺伝物質を癌患者の細胞から抽出し、ＣＮＶ解析を実施するのに十分な遺伝物質を生成するために増幅することができる。核酸集団、例えば単一細胞に由来する核酸集団におけるＣＮＶの正確な特徴づけを提供するために、本明細書に記載の方法を使用してゲノム材料を均一に増幅することができる。ＭＤＡ増幅産物を生成するために本明細書に記載のｄｄＭＤＡ方法を使用することによって、単一細胞に由来するＤＮＡを含めて、微量のＤＮＡを正確且つ均一に増幅することができる。
【０１０６】
ＣＮＶ解析の一例では、核酸集団は単一の癌細胞に由来する。ソーティング技法、例えば希釈または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のいずれかによって、最初に生物試料から癌細胞を単離し、個々の反応容器（例えばチューブ）に入れる。いったん単離したら、細胞を溶解し、そのゲノムをｄｄＭＤＡ方法に適したサイズ、例えば１０４ｂｐ〜１０６ｂｐの断片に断片化する。次いで、単離及び断片化した核酸鋳型分子をｄｄＭＤＡ方法にかけ、この方法は、微小液滴内に核酸鋳型分子（複数可）を封入することならびにＭＤＡ試薬、ＭＤＡプライマー及び適切なＤＮＡポリメラーゼを微小液滴中に添加することを含むことができる。いくつかの例では、微小液滴あたり少数の増幅産物が生成されるように、ＭＤＡ混合物を乳化する。その後、微小液滴をインキュベートして、核酸鋳型分子（複数可）からＭＤＡ増幅産物を生成する。例えば、バルクＭＤＡまたはエマルジョンＭＤＡを実施する場合、微小液滴を３０℃の温度で１６時間インキュベートする。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、微小液滴あたりの所定量の増幅物及び下流解析のための増幅ＤＮＡの総量をもたらすために、微小液滴のサイズを変えることができる。他の実施形態では、微小液滴あたりの所定量の増幅物及び下流解析のための増幅ＤＮＡの総量をもたらすために、必要に応じて微小液滴の数を変えて、分子あたりの所望量の増幅物を得ることができる。
【０１０８】
その後、いったんＭＤＡ増幅産物が生成されると、生成物を解析して、ＣＮＶを決定及び／または定量化することができる。いくつかの実施形態では、増幅産物のＤＮＡセグメントをヒトゲノムと整列させ、異なるリードを比較してヒトゲノム中の挿入または欠失を評価することによって、特定の配列が繰り返される回数を定量化するために、増幅産物のＤＮＡセグメントをシークエンスことができる。核酸集団におけるＣＮＶを解析するためのこの方法が、偏りが最低限の均一に増幅されたゲノム材料を利用するので、増幅産物におけるいかなる違いも単にＣＮＶに起因するはずであり、それによって、正確なＣＮＶ解析が可能になる。
【０１０９】
本明細書に記載の方法は癌細胞に由来するＤＮＡ  ＣＮＶ解析に関して記載されているが、ＣＮＶ解析の方法は、いくつかの他の疾患状態、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、クローン病、血友病、統合失調症などの解析にも関する。
【０１１０】
次世代シークエンシング
本明細書に記載のように、用語「次世代シーケンシング」は、一般に、標準的なＤＮＡシークエンシング（例えば、サンガーシークエンシング）よりも進歩したものを指す。標準的なＤＮＡシーケンシングは、実務者がＤＮＡ配列中のヌクレオチドの正確な順序を決定することを可能にするが、次世代シーケンシングは、何百万の塩基対のＤＮＡ断片を一斉にシークエンスすることができる並列シークエンシングも提供する。標準的なＤＮＡシーケンシングは、ＤＮＡ鋳型分子を増幅するために、一般に、一本鎖ＤＮＡ鋳型分子、ＤＮＡプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを必要とする。次世代シーケンシングはハイスループットシークエンシングを促進し、これによって、標準的なＤＮＡシーケンシングと比べて著しく短い期間で全ゲノムをシークエンスすることが可能になる。次世代シーケンシングは、病態の診断のための病因性変異の特定も促進することができる。次世代シーケンシングは、遺伝子配列の事前知識を必要とせずに、一回の解析で試料の全トランスクリプトームの情報を提供することもできる。
【０１１１】
いくつかの例では、シークエンシングは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞よりも大きなゲノムを含む哺乳動物細胞を含むことができる。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは４７０万塩基対を含む。これに対して、二倍体ヒトゲノムは複雑であり、６０億塩基対より多くを有する。その大きなゲノムサイズのため、一定の断片長に対してより多くの断片を生成しなければならず、ひいては、ポアソン封入の制限を確実にするために、より多くの液滴の生成を必要とする。例えば、１０ｋｂの断片サイズについては６００，０００断片が存在し、これは、ｄｄＭＤＡ反応に対して低装填率を保証するためには約６００万個の液滴を必要とする。しかし、システムには膨大な柔軟性があり、これは、十分にｄｄＭＤＡの能力内である。例えば、約３０μｍの液滴を使用する場合、６００万個の液滴エマルジョンが約１４０μＬのｄｄＭＤＡ試薬を必要とし、マイクロ流体流動集束で生成するのに約３０分かかり、これらの両方とも合理的である。さらに、液滴容積、断片長及び乳化方法は、実験について最適化するために、すべて変更することができる。例えば、よりハイスループットの液滴生成方法、例えば、並列液滴生成（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）“Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｒａｌｌｅｌｉｚｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ．”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，１２，８０２）、階層的液滴分割（Ａｂａｔｅ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．ａ（２０１１）“Ｆａｓｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｒｏｐ  ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ．”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，１１，１９１１−１９１５）及びバブル誘発液滴生成（Ａｂａｔｅ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．ａ（２０１１）“Ａｉｒ−ｂｕｂｂｌｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｄｒｏｐ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，１１，１７１３−１７１６）は、それぞれ、液滴生成において＞１０×のスループットを提供し、これらを組み合わせて使用することができる。
【０１１２】
適切な対象
様々な異なる対象から得た生物試料に本方法を適用することができる。多くの実施形態では、対象は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物目（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット及びラット）ならびに霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー及びサル）を含めた哺乳綱内の生物を記載するのに広く使用される。多くの実施形態では、対象はヒトである。本方法は、両方の性別の及び任意の発育段階（すなわち、新生児、幼児、若年、青年または成人）のヒト対象に適用することができ、ある種の実施形態では、ヒト対象は、若年、青年または成人である。本発明はヒト対象に適用することができるが、本方法は、限定されないが、鳥、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜及びウマなどの他の動物対象に対して（すなわち、「非ヒト対象」において）行うこともできることを理解されたい。したがって、本開示による評価を必要としている任意の対象が適切であることを理解されたい。
【０１１３】
さらに、適切な対象としては、癌などの状態と診断されたもの、及び診断されていないものが挙げられる。適切な対象としては、１つまたは複数の癌の臨床症状を示しているもの、及び示していないものが挙げられる。ある種の態様では、対象は、１つまたは複数の因子、例えば、家族歴、化学物質及び／または環境曝露、遺伝子変異（複数可）（例えば、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２変異）、ホルモン、感染因子、放射線被曝、生活様式（例えば、食事及び／または喫煙）、１つまたは複数の他の疾患状態の存在などが原因で、癌を発症する危険性があり得るものでもよい。
【０１１４】
上記でより十分に説明したように、様々な異なる種類の生物試料をそうした対象から得ることができる。ある種の実施形態では、全血が対象から採られる。必要に応じて、遠心分離、分画、精製などによって、本方法を実施するより前に全血を処理することができる。対象から採られる全血試料の量は、１００ｍＬ以下、例えば、約１００ｍＬ以下、約５０ｍＬ以下、約３０ｍＬ以下、約１５ｍＬ以下、約１０ｍＬ以下、約５ｍＬ以下または約１ｍＬ以下でもよい。
【０１１５】
デバイス
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の方法は、マイクロ流体デバイスを使用して実施することができる。マイクロ流体デバイスは、いくつかのマイクロチャネル、バルブ、ポンプ、リアクター、ミキサー及び微小液滴を生成するための他の成分を含むことができる。適切なデバイスは、例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１４／０２８３７８に記載されており、その開示は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、図７は、本明細書に記載の方法の１つまたは複数の態様を実施するための例示的マイクロ流体デバイスを図示する。特に、図７は、開示される方法で使用するための単分散液滴を提供するために利用することができるマイクロ流体液滴メーカーを図示する。
【０１１６】
前述のように、本発明の実施形態はマイクロ流体デバイスを用いる。本発明のマイクロ流体デバイスは、様々な様式で実施することができる。ある種の実施形態では、例えば、マイクロ流体デバイスは少なくとも１つの「マイクロ」チャネルを有する。そのようなチャネルは、およそ１ミリメートル以下（例えば、約１ミリメートル以下）の少なくとも１つの断面の寸法を有し得る。ある種の用途では、この寸法を調整することができ、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの断面の寸法は約５００マイクロメートル以下である。いくつかの実施形態では、さらに、適用上可能である限り、断面の寸法は約１００マイクロメートル以下（またはさらに約１０マイクロメートル以下−さらに約１マイクロメートル以下のこともある）。断面の寸法は、一般に中心線の流動の方向に垂直であるものであるが、流動の方向を変える傾向があるＬ字形の屈曲または他の機構を通る流動に遭遇する場合は、作動中の断面の寸法は流動に厳密に垂直である必要はないことを理解されたい。いくつかの実施形態では、マイクロ−チャネルは、矩形断面の高さ及び幅または楕円形断面の長軸及び短軸のような２つ以上の断面の寸法を有し得ることも理解されたい。これらの寸法のいずれかをここに提示されるサイズと比較することができる。本開示に関連して用いられるマイクロ−チャネルは、著しく不均衡な２つの寸法を有し得ることに留意されたい（例えば、約１００〜２００マイクロメートルの高さ及びおよそ１センチメートル以上の幅を有する矩形断面）。ある種のデバイスは、２つ以上の軸が、サイズが非常に類似しているまたはさらにサイズが同一であるチャネルを用いることができる（例えば、正方形または円形の断面を有するチャネル）。
【０１１７】
上記を考慮して、本明細書に記載の原理及び設計の特徴のいくつかは、ミリメートルまたはさらにはセンチメートルスケールのチャネル断面に達するチャネルを用いるデバイス及びシステムを含めて、より大きなデバイス及びシステムにスケール変更することができることを理解されたい。したがって一部のデバイス及びシステムを「マイクロ流体」と記載する場合は、ある種の実施形態では、この記載は、一部のより大きなスケールのデバイスに等しく適用されることが意図される。
【０１１８】
マイクロ流体「デバイス」に言及する場合は、１つまたは複数のチャネル、リザーバー、ステーションなどが連続的な基材を共有する単一の実体（一体化されていても、されていなくてもよい）を示すことが一般に意図される。マイクロ流体「システム」は、１つまたは複数のマイクロ流体デバイス及び関連する流体コネクション、電気コネクション、制御／ロジック機構などを含むことができる。マイクロ流体デバイスの態様は、本明細書で論じられる寸法を有する１つまたは複数の流体流路、例えばチャネルの存在を含む。
【０１１９】
ある種の実施形態では、本発明のマイクロ流体デバイスは、流体媒体の連続的な流動を提供する。マイクロ流体デバイス中のチャネルを通って流動する流体は、多くの興味深い特性を示す。一般的には、無次元レイノルズ数が極端に低く、その結果、常に層状のままである流動がもたらされる。さらに、このレジームでは、一緒になる２つの流体は容易に混ざらず、拡散だけが２つの化合物の混合をもたらすことができる。
【０１２０】
本開示の例示的な非限定的態様
実施形態を含めて、上記の本主題の態様は、単独で、または１つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて、有益であり得る。前述の説明を制限することなく、１〜６８の番号が付けられた本開示のある種の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読む際に当業者に明らかなように、個々に番号付けされた態様のそれぞれは、先行または後続する個々に番号付けされた態様のいずれかとともに使用することができ、またはいずれかと組み合わせることができる。これは、態様のすべてのそのような組み合わせを支持することが意図され、以下に明確に提供される態様の組み合わせに限定されない。
【０１２１】
１．生物試料から得られた核酸鋳型分子を微小液滴中に封入すること、
多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを前記微小液滴に導入すること、及び
ＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で前記微小液滴をインキュベートすることであって、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、前記インキュベートすること、
を含む、核酸鋳型分子の非特異的増幅方法。
【０１２２】
２．前記微小液滴が、前記導入ステップ及びインキュベートステップより前に、１つより多い核酸鋳型分子を含まない、１に記載の方法。
【０１２３】
３．前記ＭＤＡ試薬がΦ２９ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、１または２に記載の方法。
【０１２４】
４．前記微小液滴が約０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの内容積を有する、１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
５．前記封入することが１つまたは複数の生物試料から得られた複数の核酸鋳型分子を複数の微小液滴中に封入することを含み、前記導入することがＭＤＡ試薬及び複数のＭＤＡプライマーを前記複数の微小液滴のそれぞれに導入することを含み、前記インキュベートすることがＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で前記複数の微小液滴をインキュベートすることであって、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、前記インキュベートすること、を含む、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
６．前記複数の微小液滴のそれぞれが０個または１個及び１個より多くない核酸鋳型分子を含む、５に記載の方法。
【０１２７】
７．前記微小液滴を形成するために、前記核酸鋳型分子、ＭＤＡ試薬及びＭＤＡプライマーが液滴ディスペンサーに装填される、１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
８．１つまたは複数のステップがマイクロ流体制御下で実施される、１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
９．前記微小液滴が振盪エマルジョンを介して生成される、１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
１０．前記微小液滴がマイクロ流体エマルジョンを介して生成される、１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
１１．前記核酸鋳型分子を提供するために前記生物試料の１つまたは複数の核酸が断片化される、１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
１２．前記断片化が酵素的断片化、加熱及び超音波処理のうちの１つを介する、１１に記載の方法。
【０１３３】
１３．前記核酸鋳型分子を提供するために前記生物試料の１つまたは複数の細胞が溶解される、１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１３４】
１４．次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を介して前記ＭＤＡ増幅産物の配列を決定することをさらに含む、１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
１５．前記ＭＤＡ増幅産物が単一のＭＤＡ増幅産物を含む、１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
１６．前記ＭＤＡ増幅産物が複数の異なるＭＤＡ増幅産物を含む、１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
１７．前記生物試料が１つまたは複数の細胞を含む、１〜１２及び１４〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１３８】
１８．前記１つまたは複数の細胞が１つまたは複数の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む、１７に記載の方法。
【０１３９】
１９．検出成分を各微小液滴に導入するステップであって、前記検出成分の検出がもう１つのＭＤＡ増幅産物の存在を示す前記ステップをさらに含む、１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４０】
２０．前記検出成分が蛍光の変化に基づいて検出される、１９に記載の方法。
【０１４１】
２１．各微小液滴の内容積がほぼ等容積である、５に記載の方法。
【０１４２】
２２．各微小液滴の内容積が有意に異なる容積である、５に記載の方法。
【０１４３】
２３．微小液滴の数が核酸鋳型分子の数に対応する、５に記載の方法。
【０１４４】
２４．増幅される核酸鋳型分子の数が生成される微小液滴の数を制御することによって変えられる、５に記載の方法。
【０１４５】
２５．各微小液滴に含まれる前記核酸鋳型分子に由来する所定量のＭＤＡ増幅産物を得るために、各微小液滴のサイズが変えられる、５に記載の方法。
【０１４６】
２６．１０ｆｇ以下の前記核酸鋳型分子が前記微小液滴に封入される、１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
２７．５ｆｇ以下の前記核酸鋳型分子が前記微小液滴に封入される、２６に記載の方法。
【０１４８】
２８．前記封入すること及び導入することが単一ステップで生じる、１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０１４９】
２９．生物試料から単離した核酸集団に対するコピー数多型（ＣＮＶ）解析の実施方法であって、
前記核酸集団を断片化すること、
前記断片化した核酸集団を複数の微小液滴に封入すること、
多置換増幅（ＭＤＡ）試薬及び複数のＭＤＡプライマーを前記複数の微小液滴のそれぞれに導入すること、
ＭＤＡ増幅産物の生成に効果的な条件下で前記微小液滴をインキュベートすることであって、前記核酸鋳型分子からＭＤＡ増幅産物を生成するのに効果的である、前記インキュベートすること、
前記ＭＤＡ増幅産物をシークエンシングして、前記核酸集団中の１つまたは複数の核酸配列のコピー数を決定すること
含む、前記実施方法。
【０１５０】
３０．前記核酸集団がゲノムＤＮＡを含む、２９に記載の方法。
【０１５１】
３１．前記ゲノムＤＮＡが単一細胞から単離される、２９に記載の方法。
【０１５２】
３２．前記単一細胞が癌細胞である、３１に記載の方法。
【０１５３】
３３．前記癌細胞が循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）である、３２に記載の方法。
【０１５４】
３４．前記微小液滴のそれぞれが、前記導入ステップ及びインキュベートステップより前に、１つより多い核酸鋳型分子を含まない、２９〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
３５．前記ＭＤＡ試薬がΦ２９ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、２９〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
３６．前記微小液滴が約０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの内容積を有する、２９〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
３７．前記複数の微小液滴のそれぞれが０個または１個及び１個より多くない核酸鋳型分子を含む、２９〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
３８．前記微小液滴を形成するために、前記核酸鋳型分子、ＭＤＡ試薬及びＭＤＡプライマーが液滴ディスペンサーに装填される、２９〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
３９．１つまたは複数のステップがマイクロ流体制御下で実施される、２９〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
４０．前記微小液滴が振盪エマルジョンを介して生成される、２９〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
４１．前記微小液滴がマイクロ流体エマルジョンを介して生成される、２９〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
４２．前記断片化が酵素的断片化、加熱及び超音波処理のうちの１つを介する、２９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
４３．前記核酸鋳型分子を提供するために前記生物試料の１つまたは複数の細胞が溶解される、２９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
４４．各微小液滴に関する前記ＭＤＡ増幅産物が単一のＭＤＡ増幅産物を含む、２９〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
４５．各微小液滴に関する前記ＭＤＡ増幅産物が複数の異なるＭＤＡ増幅産物を含む、２９〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
４６．前記生物試料が１つまたは複数の細胞を含む、２９〜４２及び４４〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
４７．前記１つまたは複数の細胞が１つまたは複数の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む、４６に記載の方法。
【０１６８】
４８．各微小液滴の内容積がほぼ等容積である、２９〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
４９．各微小液滴の内容積が有意に異なる容積である、２９〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
５０．微小液滴の数が核酸鋳型分子の数に対応する、２９〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
５１．増幅される核酸鋳型分子の数が生成される微小液滴の数を制御することによって変えられる、２９〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７２】
５２．各微小液滴に含まれる前記核酸鋳型分子に由来する所定量のＭＤＡ増幅産物を得るために、各微小液滴のサイズが変えられる、２９〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７３】
５３．前記封入すること及び導入することが単一ステップで生じる、２９〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７４】
５４．微小液滴を含む組成物であって、
ａ．核酸鋳型分子、ならびに
ｂ．ｉ．前記核酸鋳型分子を非特異的に増幅することができるポリメラーゼ酵素を含む複数のＭＤＡ試薬、及び
ｉｉ．複数のＭＤＡプライマー
を含むＭＤＡ混合物
を含む、前記組成物。
【０１７５】
５５．前記微小液滴が単一核酸鋳型分子より多くを含まない、５４に記載の組成物。
【０１７６】
５６．前記微小液滴が検出成分をさらに含む、５４または５５に記載の組成物。
【０１７７】
５７．前記微小液滴が前記核酸鋳型分子から生成された１つまたは複数のＭＤＡ増幅産物をさらに含む、５４〜５６のいずれか１つに記載の組成物。
【０１７８】
５８．前記微小液滴が約０．００１ピコリットル〜約１０００ピコリットルの内容積を有する、５４〜５７のいずれか１つに記載の組成物。
【０１７９】
５９．前記ポリメラーゼ酵素がΦ２９ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼである、５４〜５８のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８０】
６０．前記ＭＤＡ試薬がマグネシウム試薬を含む、５４〜５９のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８１】
６１．前記微小液滴中の前記核酸鋳型分子の初期量が約０．００１ｐｇ〜約１０ｐｇである、５４〜６０のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８２】
６２．前記微小液滴中の前記核酸鋳型分子の初期量が約０．０１ｐｇ〜約１ｐｇである、６１に記載の組成物。
【０１８３】
６３．前記微小液滴中の前記核酸鋳型分子の初期量が約０．１ｐｇ〜約１ｐｇである、６２に記載の組成物。
【０１８４】
６４．前記組成物が複数の単分散微小液滴を含む、５４〜６３のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８５】
６５．前記組成物が複数の多分散微小液滴を含む、５４〜６３のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８６】
６６．前記微小液滴が複数の核酸鋳型分子を含む、５４及び５６〜６５のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８７】
６７．前記微小液滴が１０ｆｇより多い前記核酸鋳型分子を含まない、５４〜６０及び６４〜６６のいずれか１つに記載の組成物。
【０１８８】
６８．前記微小液滴が５ｆｇより多い前記核酸鋳型分子を含まない、６７に記載の組成物。
【実施例】
【０１８９】
上記で提供する本開示から理解できるように、本開示は多種多様の用途を有する。したがって、以下の実施例は、本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載され、本発明者らが自身の発明であると見なすものの範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験がすべての、または唯一の実施した実験であることも意図しない。本質的に類似した結果を得るように変更または改変することができる様々な重要でないパラメーターを当業者なら容易に認識するであろう。したがって、以下の実施例は、本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載され、本発明者らが自身の発明であると見なすものの範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験がすべての、または唯一の実施した実験であることも意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するために努力したが、いくつかの実験的誤差及び偏差が考慮されるべきである。
【０１９０】
実施例１：振盪エマルジョン液滴の調製
振盪エマルジョンは、３０μＬのＨＦＥ−７５００フッ素化油（３Ｍ、カタログ番号９８−０２１２−２９２８−５）及び２％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤（ＲＡＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号００８−ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ−１Ｇ）を３０μＬのＭＤＡ反応混合物に添加することによって生成した。あるいは、２％ＰｉｃｏＳｕｒｆｌ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油を使用することができる。ＶＷＲボルテクサーを使用して、組み合わせた混合物を３０００ｒｐｍで１０秒間ボルテックスし、直径が１５μｍ〜２５０μｍに及ぶ液滴を作出した（図８）。インキュベーションの終わりに、１０μＬのパーフルオロ−１−オクタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、この混合物をボルテックスして、液滴を合体させ、ピペットで水性層を取り出した。振盪エマルジョン形成についての詳細なプロトコールは、以下の実施例７に見出すことができる。
【０１９１】
実施例２：単分散マイクロ流体エマルジョン液滴の調製
【０１９２】
シリコンウエハ上のフォトリソグラフィによりパターニングされたフォトレジスト（ＳＵ−８  ３０２５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）の層上に未硬化ＰＤＭＳ（１０．５：１のポリマー対架橋剤比）に注ぐことによって、単分散エマルジョンを生成するのに使用するポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）マイクロ流体デバイスを製造した（１９）。このデバイスを８０℃のオーブンで１時間硬化し、小刀で取り出し、０．７５ｍｍの生検コア（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号５０４５２９）を使用して入口ポートを加えた。Ｏ２プラズマ処理によってこのデバイスをガラススライドに結合させ、チャネルをＡｑｕａｐｅｌ（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で処理して疎水性にした。最後に、このデバイスを８０℃で１０分間ベーキングした。市販のマイクロ流体液滴メーカー及びポンプを使用して、本明細書に記載の方法、例えばｄｄＭＤＡのための単分散エマルジョンを生成することもできる。
【０１９３】
ＭＤＡ反応混合物及び２％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油を別々の１ｍＬのシリンジに装填し、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトで制御されるシリンジポンプ（Ｎｅｗ  Ｅｒａ、カタログ番号ＮＥ−５０１）を使用して、それぞれ３００及び５００μＬ／時で流動集束液滴メーカーに注入した。あるいは、２％ＰｉｃｏＳｕｒｆｌ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油も使用可能であり得、これは購入可能である。液滴メーカーによって直径が約２６μｍの単分散液滴を生成し（図８、パネルＡ〜Ｃを参照されたい）、これをＰＣＲチューブに収集した。このサイズ範囲の液滴はｄｄＭＤＡ反応の間安定である。インキュベーションの終わりに、１０μＬのパーフルオロ−１−オクタノールを添加し、エマルジョンをボルテックスして、液滴を合体させ、ピペットで水性層を取り出した。マイクロ流体デバイスの製造及び乳化に関する詳細なプロトコールは、以下の実施例８に見出すことができる。本明細書に記載の方法を実施するのに使用することができる液滴メーカーの例を図９に図示する。
【０１９４】
実施例３：ゲノムＤＮＡの抽出、断片化及び増幅
精製したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ＤＨ１０Ｂ）細胞をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（カタログ番号Ｃ３０１９Ｈ）から得て、ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡミニキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｋ１８２０−００）を使用して、溶解し、精製した。１０キロベースの断片をゲル抽出し、続いて、８００ｎｇのＤＮＡをＮＥＢＮｅｘｔ  ｄｓＤＮＡ断片化酵素（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３４８Ｓ）で１０分間消化し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ＲＥＰＬＩ−ｇ単一細胞キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１５０３４３）を使用して、ＭＤＡ反応を実施した。精製したＤＮＡ（０．０５ｐｇ、０．５ｐｇ及び５ｐｇ）を３μＬの緩衝液Ｄ２及び３μＬのＨ２Ｏとともに１０分間６５℃でインキュベートした。３μＬの停止液を添加して停止した後、反応物を２つに分け、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ、ＲＥＰＬＩ−ｇ反応緩衝液及びＲＥＰＬＩ−ｇ  ＤＮＡポリメラーゼを含むマスターミックスを各分割部分に添加した。ＭＤＡ反応は、バルクでまたはエマルジョンとして、３０℃で１６時間インキュベートした。
【０１９５】
実施例４：単一Ｅ．ＣＯＬＩ細胞のソーティング及び全ゲノム増幅
【０１９６】
ＯｎｅＳｈｏｔ  ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｃ４０４０−１０）をＬＢ培地中で１２時間培養し、水に希釈し、０．２５×サイバーグリーンＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−７５６３）で染色した。細胞染色に続いて、細胞溶液をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩに移入した。単一の陽性事象を９６ウェルプレートの１０個の別々のウェルにソートした。３μＬの緩衝液Ｄ２及び３μＬのＨ２Ｏを各ウェルに添加し、その後、このプレートを９８℃で４分間加熱した。この熱ステップは、細胞を溶解し、ｄｄＭＤＡにとって十分な長さ（例えば、５〜１５キロベース）にゲノムＤＮＡを断片化する。加熱後、３μＬの停止液を各ウェルに添加して反応を止めた。次に、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ、ＲＥＰＬＩ−ｇ反応緩衝液及びＲＥＰＬＩ−ｇ  ＤＮＡポリメラーゼを含むマスターミックスを各ウェルに添加した。ＭＤＡ反応は、バルクでまたはエマルジョンとして、３０℃で１６時間インキュベートした。
【０１９７】
実施例５：デジタル液滴ＰＣＲ及びＭＤＡ
鋳型としてファージラムダゲノムＤＮＡ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｎ３０１１Ｓ）を用いて、デジタルＰＣＲ及びＭＤＡ実験を実施した。デジタルＰＣＲについては、１００μＬの全体積中に、プライマー（ＩＤＴ）、ＴａｑＭａｎプローブ（ＩＤＴ）及び２×ＰｌａｔｉｎｕｍマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４６４２６８）と鋳型をバルクで混合した。プライマー及びプローブの配列は、ラムダフォワード：５’−ＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＴＡＡＴ−３’（配列番号１）、ラムダリバース：５’ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣＡＴＡＡ−３’（配列番号２）、ラムダプローブ：５’／６−ＦＡＭ／ＡＴＡＣＴＧＡＧＣ／ＺＥＮ／ＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号３）であった。プライマー及びプローブはそれぞれ１μＭ及び２５０ｎＭの濃度で使用し、ラムダファージゲノム中の１１０塩基対領域を標的にする。反応混合物及び２％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油を別々の１ｍＬのシリンジに装填し、それぞれ３００及び６００μＬ／時で流動集束デバイスに注入した。ＰＣＲチューブにエマルジョンを収集した後、エマルジョンの下の油をピペットを使用して除去し、５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤を含むＦＣ−４０フッ素化油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号５１１４２−４９−５）と置き換えた。この油／界面活性剤の組み合わせは、加熱ｄｄＭＤＡ反応中に、ＨＦＥ油の組み合わせよりも高い安定性をもたらす。エマルジョンをＴ１００サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）に移し、以下のプログラムでサイクルをまわした：９５℃２分間、続いて９５℃３０秒、６０℃９０秒及び７２℃２０秒を３５サイクル、続いて１２℃での最終的な保持。
【０１９８】
デジタルＭＤＡについては、以前に記載されているようにＲＥＰＬＩ−ｇ単一細胞キットの試薬と鋳型を混合し、ＤＮＡ色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ、Ｂｉｏｔｉｕｍ）と混合した。反応混合物及び２％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−ＰＦＰＥ両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油を含むシリンジに接続した流動集束デバイスを介して、この反応混合物を乳化した。収集したエマルジョンを３０℃で１６時間インキュベートした。熱サイクリングを必要としないので、ＦＣ−４０の置き換えはデジタルＭＤＡに必要でない。
【０１９９】
実施例６：ライブラリー調製及びシークエンシングパラメーター
Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、各試料由来の１ｎｇのゲノムＤＮＡから細菌ライブラリーを調製した。高感度バイオアナライザーチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｑｕｂｉｔアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｑＰＣＲ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、得られたライブラリーを定量化した。細菌ライブラリーは、断片サイズが８００〜１０００ｂｐで変化していた。すべてのライブラリーを等モルの比率でプールし、１５０ｂｐのペアエンドリードでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを使用し、後に１００ｂｐのペアエンドリードでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑを使用して、シークエンスした。
【０２００】
ＢａｓｅＳｐａｃｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）から利用可能なＢＷＡ全ゲノムシークエンシングプログラムを使用して、シークエンシングデータをＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＨ１０Ｂ参照ゲノムにマッピングした。マッピングしたデータをＳＡＭファイルに変換し、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用してｐｉｌｅｕｐファイルを生成した。ｐｉｌｅｕｐファイルからの整列したリードの数を構文解析し、各リード数を平均リード数で割り、正規化データを１０，０００ｂｐのビンに統合することによって、ゲノム位置の関数としてのゲノムカバレッジを決定した。
【０２０１】
実施例７：振盪エマルジョン液滴におけるＭＤＡ
実施例７は、本明細書に記載の方法の実施及び組成物の提供で使用するための振盪エマルジョン液滴を生成する方法の一例を提供する。
【０２０２】
ステップ１：５０μｌのＲＥＰＬＩ−ｇ単一細胞反応混合物（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１５０３４３）をＰＣＲチューブ中に調製した直後に、２％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−パーフルオロポリエーテル両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号００８−ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ−１Ｇ）を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油（３Ｍ、カタログ番号９８−０２１２−２９２８−５）を５０μｌ添加する。
【０２０３】
ステップ２：１００μｌの組み合わせた混合物を含むＰＣＲチューブをＶＷＲボルテクサー２（ＶＷＲ、カタログ番号５８８１６−１２３）上に水平に保つ。３０００ｒｐｍで１０秒間ボルテックスする。
【０２０４】
ステップ３：ボルテックスした後、ＰＣＲチューブを垂直に保つ。白色の半透明エマルジョンが上清に現れるはずである。
【０２０５】
ステップ４：ＰＣＲチューブを３０℃で１６時間インキュベートする。
【０２０６】
ステップ５：１６時間のインキュベーション後、ＰＣＲチューブを７０℃で２０分間加熱して、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼを失活させる。
【０２０７】
ステップ６：１０μｌのパーフルオロ−１−オクタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号３７０５３３−５Ｇ）を上清に添加する。ピペットで激しく上下させ、短く遠心分離する。これは、界面活性剤を不安定化させ、液滴を合体させる働きがある。
【０２０８】
ステップ７：ＰＣＲチューブから上清を取り出す。いかなる油相も取り出さない。
【０２０９】
ステップ８：ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００４）を使用してＤＮＡを浄化する。１０μｌのＨ２Ｏに溶出する。
【０２１０】
実施例８：単分散マイクロ流体エマルジョン液滴製造ＰＤＭＳデバイスにおけるｄｄＭＤＡ
実施例８は、本明細書に記載の方法及び組成物に関連してマイクロ流体エマルジョンを実施するのに使用するためのＰＤＭＳデバイスを製造する方法の一例を提供する。
【０２１１】
ステップ１：シリコンウエハ上への２０μｍ厚のフォトレジスト（ＳＵ−８  ３０２５、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）層のスピンコーティング、それに続く、パターニングされたＵＶ曝露及びレジスト現像によって、デバイスマスターを作出する（１）。
【０２１２】
ステップ２：４グラムのＳｙｌｇａｒｄ１８４シリコーンエラストマー硬化剤を４２グラムのＳｙｌｇａｒｄ１８４シリコーンエラストマーベース（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）とプラスチックカップ中で混合する。
【０２１３】
ステップ３：電動ミキサーを使用して、混合物が白色になり泡立つまで硬化剤及びベースを混合する。
【０２１４】
ステップ４：真空チャンバー中に２０分間置いて、混合物を脱気する。
【０２１５】
ステップ５：以前に作製したシリコンウエハ上のフォトリソグラフィによりパターニングされたフォトレジスト層上に３０グラムの新しく形成されたＰＤＭＳを注ぐ。
【０２１６】
ステップ６：８０℃のオーブン中に３時間置いて、ＰＤＭＳを硬化させる。
【０２１７】
ステップ７：小刀を使用して、フォトレジストによってパターニングされた硬化ＰＤＭ領域を切り取る。
【０２１８】
ステップ８：０．７５ｍｍの生検コア（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号５０４５２９）を使用して、デバイスの入口及び出口ポートに穴を開ける（図７（左）に示す）。
【０２１９】
ステップ９：イソプロパノールでデバイスを洗浄し、空気乾燥する。
【０２２０】
ステップ１０：デバイスを、３００Ｗプラズマクリーナー中での１ｍｂａｒのＯ２プラズマの３０秒の処理に続いて、ガラススライドに結合させる。デバイスをテープに結合させることもできる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｂａｔｅ（２０１３）“Ａｄｈｅｓｉｖｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ＰＤＭＳ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ．”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，１３，６３２−５）。
【０２２１】
ステップ１１：結合させたデバイスを８０℃のオーブン中に３０分間置く。
【０２２２】
ステップ１２：Ａｑｕａｐｅｌ（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を前もって装填し、ポリエチレンマイクロチュービング（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ、カタログ番号ＢＢ３１６９５−ＰＥ／２）に接続したシリンジを使用して、デバイスの全チャネルをフラッシュして、それらを疎水性にする。
【０２２３】
ステップ１３：フラッシュしたデバイスを８０℃のオーブン中にさらに１０分間置く。
【０２２４】
ステップ１４：結合していないまたは閉塞したチャネルの存在について、顕微鏡を使用してデバイスを注意深く検査する。
【０２２５】
実施例９：単分散液滴の生成
実施例９は、本明細書に記載の方法の実施及び組成物の提供で使用するための単分散液滴を生成するための方法の一例を記載する。
【０２２６】
ステップ１：以下のものを３０分間ＵＶ処理する：ポリエチレンマイクロチュービング、２つの１ｍＬシリンジ、以前に調製したマイクロ流体デバイス（実施例８に記載されている）、一本のＰＣＲチューブ。
【０２２７】
ステップ２：少なくとも２００μＬの、２％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ−パーフルオロポリエーテル両親媒性ブロックコポリマー界面活性剤を含むＨＦＥ−７５００フッ素化油を１つのＵＶ処理したシリンジに前もって装填する。
【０２２８】
ステップ３：少なくとも２００μＬのＨＦＥ−７５００フッ素化油で再充填した第２のＵＶ処理したシリンジに５０μＬのＲＥＰＬＩ−ｇ単一細胞反応混合物を前もって装填して、シリンジのボトムアウトを防止する。
【０２２９】
ステップ４：８インチのポリエチレンマイクロチュービングをシリンジ針に取り付ける。
【０２３０】
ステップ５：カスタムポンプ制御プログラムで制御されるコンピューターに接続された２つのシリンジポンプ（Ｎｅｗ  Ｅｒａ、カタログ番号ＮＥ−５０１）にシリンジを設置する。
【０２３１】
ステップ６：ポンプ制御プログラムのプライム機能を使用して、両方のシリンジをプライムする。
【０２３２】
ステップ７：油シリンジに接続したポリエチレンマイクロチュービングを図７（左）に示す「油入口部」に取り付ける。
【０２３３】
ステップ８：ＲＥＰＬＩ−ｇ単一細胞反応混合物を有するシリンジに接続したポリエチレンマイクロチュービングを図７（左）に示す「水入口部」に取り付ける。
【０２３４】
ステップ９：４インチ片のチュービングを１つ図７に示すデバイスの出口部に取り付ける。ＵＶ処理したＰＣＲチューブに移してチュービングを空にする。
【０２３５】
ステップ１０：ＲＥＰＬＩ−ｇ単一細胞反応混合物を有するシリンジの流速を３００μＬ／時間に設定し、油シリンジの流速を５００μＬ／時間に設定する。
【０２３６】
ステップ１１：流動プログラムを開始する。顕微鏡を使用して、油チャネルと水性チャネルの間の界面におけるドロップの形成を注視する（図７の右側の画像を参照されたい）。
【０２３７】
ステップ１２：ポリエチレンマイクロチュービングを介する出口部への及びＰＣＲチューブへの液滴の流動を観察する。いったん５０μＬの反応混合物の全体が液滴に変換されれば、ポンプ制御プログラムを停止する。
【０２３８】
ステップ１３：ＰＣＲチューブを３０℃で１６時間インキュベートする。
【０２３９】
ステップ１４：１６時間のインキュベーション後に、ＰＣＲチューブを７０℃で２０分間加熱して、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼを失活させる。
【０２４０】
ステップ１５：１０μＬのパーフルオロ−１−オクタノールを上清に加える。ピペットで激しく上下させ、短く遠心分離する。これは、界面活性剤を不安定化させ、液滴を合体させる働きがある。
【０２４１】
ステップ１６：ＰＣＲチューブから上清を取り出し、油相の取り出しはない。
【０２４２】
ステップ１７：ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５を使用してＤＮＡを浄化する。１０μＬのＨ２Ｏに溶出する。
【０２４３】
デジタル液滴ＭＤＡのワークフロー
図１を参照すると、パネルＡ〜Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉ核酸鋳型分子（複数可）を増幅し、次いで、次世代シーケンシングを実施して核酸鋳型分子（複数可）の配列を決定する様々な方法を図示する。
【０２４４】
パネルＡは、バルク多置換増幅（バルクＭＤＡ）を介する核酸鋳型分子（複数可）の増幅を図示する。バルクＭＤＡは反応の指数関数的性質を束縛しない。代わりに、バルクＭＤＡは配列特異的な（すなわち、偏りのある）増幅を示し、この場合、他の配列と比べて、核酸鋳型分子（複数可）の特異的な配列が不均衡に増幅される。その結果、偏った増幅配列が高カバレッジで増幅されるが、他の配列は低カバレッジで増幅される。不均等なカバレッジはシークエンシングの大きな課題をもたらし、これには、シークエンシングリードの非効率的な使用、低カバー領域を使用してゲノムを確信的にアセンブルすることの困難さ、及びゲノム中の未シークエンスギャップ（図１Ａ、右）が含まれる。
【０２４５】
パネルＢは、振盪エマルジョンＭＤＡを介する核酸鋳型分子（複数可）の増幅を図示する。分離したリアクターは物理的に互いに接続していないので、反応は、独立且つ並列に起こり、これによって、各区画が飽和まで増幅することが可能になる。したがって、増幅産物中の各鋳型は、はるかに均一に表される。それにもかかわらず、「振盪」エマルジョンは、液滴容積が何千回も変化し得る多分散液滴からなる。飽和の際の生成分子の数はリアクターの容積と釣り合いが採れているので、リアクターの多分散性は偏りをもたらし得る。
【０２４６】
パネルＣは、等容積の液滴におけるｄｄＭＤＡを介する核酸鋳型分子（複数可）の増幅を図示する。パネルＣは、ＭＤＡ増幅産物を生成するために、単一核酸鋳型分子がリソース（例えば、プライマー、試薬）のために他の核酸と競合しないように各核酸鋳型分子が単一の微小液滴内で区画化されていることを図示する。代わりに、各単一核酸鋳型分子が同じリソースが割り当てられるので、各核酸鋳型分子は均一に増幅される。
【０２４７】
単一分子が増幅されることを確実にするために、鋳型濃度は、ポアソン統計に従ってごくわずかのパーセンテージの液滴（一般的には＜１０％）が分子を含むように、十分に低くすべきである。これは、生成される生成分子の数を減少させるが、より良い均一性を提供する（図１、パネルＣ、右）。さらに、ＭＤＡは単位容積あたり大量のＤＮＡをもたらす極端に効率的な反応であるので、少数の生産的な液滴が十分過ぎるほどのシークエンシング用材料を提供する。
【０２４８】
ｄｄＭＤＡによるＤＮＡの非特異的定量化
デジタル液滴ＭＤＡは、分離した液滴リアクターにおいて単一鋳型分子を区画化及び増幅することによって、ＤＮＡの均一な増幅を可能にする。所与の液滴が増幅を受け、それにより鋳型分子を含むときを示す蛍光レポーターが含まれる場合、これは、蛍光性液滴及び薄暗い液滴の割合を数えることによって、溶液中で核酸を定量化するのにも使用することができる。この方法は、ｄｄＰＣＲが既知の鋳型を数えるのに対して、ｄｄＭＤＡが、未知配列の鋳型を含めた、この反応によって増幅可能な任意の鋳型を定量化することを除いては、ＤＮＡ濃度を測定するためのｑＰＣＲのより正確な代替法であるデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）と類似している。これを例示するために、ｄｄＭＤＡを適用して溶液中でラムダファージゲノム断片の濃度を定量化し、ｄｄＰＣＲと結果を比較した（図２）。小さなラムダファージゲノムは、増幅及び混入の定量化に好都合なＤＮＡ源を提供する。ｄｄＰＣＲは特異的なプライマー及びプローブを使用するので、ｄｄＭＤＡと比較して、同じ濃度について観察される蛍光性液滴が少ない（図２、パネルＡ）。さらに、ｄｄＰＣＲに必要とされるＴａｑＭａｎプローブは、ｄｄＭＤＡで使用される非特異的色素よりも高いバックグラウンド蛍光をもたらす（図２、パネルＡ）。さらに、単一分子のポアソン封入に基づく予測がｄｄＰＣＲのデータに近いが（図２、パネルＢ）、デジタルＭＤＡは体系的に濃度を過大評価する（図２、パネルＢ）。これは、ＰＣＲの特異的性質対ＭＤＡの非特異的性質によって、理論的に説明することができる。ｄｄＰＣＲは試料中の各標的ゲノムに対しておよそ１つの蛍光性液滴をもたらすのに対して、ｄｄＭＤＡは、反応によって増幅可能なあらゆるゲノム断片に対してそうする。ＤＮＡ濃度が増大するにしたがって、複数の鋳型分子が液滴に封入される確率も増大し、２つ、３つまたはより多くの分子を有する液滴の割合が大きくなる。それにもかかわらず、この現象はポアソン分布で説明されるので、正確さは低減するが、この方法を依然としてこれらの濃度で使用することができる。したがって、断片化されたまたは高度に汚染されたＤＮＡは、ｄｄＰＣＲと比較して、ｄｄＭＤＡを使用した場合により高い濃度をもたらす。これは、ｄｄＭＤＡの非特異的なＤＮＡ定量化の有効性に、及び配列に関係なく低投入量ＤＮＡを増幅するために重要である。
【０２４９】
ｄｄＭＤＡ増幅ＤＮＡの次世代シークエンシング
シークエンス解析のために低投入量ＤＮＡを増幅することに対するｄｄＭＤＡの有効性を検討するために、様々な方法で調製した試料をシークエンスし、結果を比較した（非増幅Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ（増幅の偏りなし）、バルクＭＤＡを使用して増幅したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ（現在の標準）及び単分散ｄｄＭＤＡを使用して増幅したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ（区画化された反応の最良のシナリオ））。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのより大きなサイズ及び複雑さにより、ラムダファージゲノムの代わりにＥ．ｃｏｌｉゲノムを使用し、このことは、次世代シークエンシング技法により大きな適用性を与える。ＭＤＡ反応に対する出発濃度は０．５ｐｇであり、これは、約１００個のＥ．ｃｏｌｉ細胞のゲノムに相当した。当然のことながら、非増幅試料は、細菌の天然のＤＮＡ複製サイクルを表し得る長い範囲の体系的変動を除いては、極端に均一なカバレッジを示した（図３、パネルＡ、上部の列）。試料をバルクＭＤＡにかけた場合、領域のオーバーカバレッジ及びアンダーカバレッジを引き起こす相当な増幅の偏りが観察された（図３、パネルＡ、中央の列）。これに対して、単分散液滴中にＭＤＡ増幅が閉じ込められた場合、鋳型のサブセットは最終産物で優位を占めず、その結果、ゲノムにわたって均一なカバレッジがもたらされた（図３、パネルＡ、下部の列）。
【０２５０】
これらの調製方法に関するシークエンシングの偏りの違いをさらに定量化するために、３つの試料に対するカバレッジレベルの確率密度をプロットした（図３、パネルＢ）。非増幅Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡは、狭い分布を有しており、カバレッジの変動がほとんどなかった。これに対して、バルクＭＤＡによって増幅したＤＮＡのカバレッジは極端に広く、多くの領域が非常に低いまたは非常に高いカバレッジを示した。この変動はいくつかの課題を引き起こす。カバーが不十分な領域に関する限られたデータは、これらの領域にまたがる長い配列をアセンブルすることを困難にし、これは、低カバレッジの接合部を高い信頼度をもって決定することができないからである。さらに、高カバレッジ領域はシークエンシングを無駄にし、これは、これらの領域が既に十分にカバーされているからである。高カバレッジ領域は大きな割合のシークエンシングデータを含むが、さらなる情報をほとんど提供しない。ｄｄＭＤＡで増幅したＤＮＡは非増幅の最良のシナリオと類似したカバレッジ分布を有するが、偏りがより大きい。したがって、ｄｄＭＤＡは非増幅材料の均一性に近づく増幅ＤＮＡをもたらす。
【０２５１】
信頼できる全ゲノム増幅法としてのｄｄＭＤＡの有用性をさらに検証するために、ＰＣＲベースのＷＧＡキット（ＰｉｃｏＰＬＥＸ  ＷＧＡ、ＮＥＢ）由来のシークエンスしたＤＮＡをｄｄＭＤＡのものと比較した。ＰｉｃｏＰＬＥＸ  ＷＧＡキットは比較的均一なカバレッジをもたらしたが、それでも大きな割合のカバーが不十分なリードを有する（図４）。これは、最低限の増幅の偏りしかもたらさないというｄｄＭＤＡのユニークな能力を示した。
【０２５２】
様々な調製方法で得た配列の偏りの違いをさらに比較するために、図１に記載されている３つの増幅方法（バルクＭＤＡ、振盪エマルジョンＭＤＡ及びｄｄＭＤＡ）を使用して、３つの異なる投入濃度（５ｐｇ（約１０００ゲノム）、０．５ｐｇ（約１００ゲノム）及び０．０５ｐｇ（約１０ゲノム）で、新たな試料を調製した。これらの試料の次世代シーケンシングは、実際に、バルクＭＤＡはシークエンシングカバレッジの不十分な均一性をもたらすが、ｄｄＭＤＡ及び振盪エマルジョンＭＤＡは、有意に向上した均一性を示すことを明らかにする（図５）。
【０２５３】
未知のゲノムの次世代シーケンシングは、全領域のほぼ完全なカバレッジを必要とする。しかし、増幅は偏ったゲノム表現をもたらし得、これは、シークエンシングの間に少量の領域が十分にカバーされない可能性がある。様々な調製方法及び濃度に対してこの出現の頻度を定量化するために、有意にカバーが不十分なゲノム領域の数を示すドロップアウトメトリックを利用した（図６、パネルＡ）。特に、各試料に対する平均カバレッジの１０％未満でカバーされる塩基の割合を解析した（使用される式は図１０に見出すことができる）。バルクＭＤＡ試料では、かなりの割合のゲノムが低及び中程度の投入濃度について検出されなかった（図６、パネルＡ）。高投入濃度については、アンダーカバレッジの割合は低かったが、それでも有意であった。振盪エマルジョンＭＤＡ試料では、区画化は、３つの濃度すべてについてドロップアウトの顕著な減少をもたらした（図６、パネルＡ）。しかし、相当なドロップアウトが依然として観察された。ｄｄＭＤＡ試料は、ドロップアウト領域の数をさらに減少させ、実にＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの１０ゲノム当量に至るまでの低ドロップアウトを維持した（図６、パネルＡ）。バルクＭＤＡが最も悪いデータをもたらし、ｄｄＭＤＡが最も良いデータをもたらすというこの傾向は、３つの濃度すべてをバルク調製物に対して正規化し、平均する場合に明らかである（図６、パネルＡ、下部のパネル）。
【０２５４】
低投入量ＤＮＡのシークエンシングの別の重要な因子は、シークエンシングの効率であり、特に、シークエンスされたさらなるリードのそれぞれが最大限の新しい情報内容を提供することを確実にすることである。有意なカバレッジスプレッドが存在する場合、小さな高度にカバーされた領域は大きな割合のシークエンスしたリードを含み得、したがって、低カバー領域を観察するためにシークエンシング費の増大を要する。このカバレッジの相違を定量化するために、相対カバレッジの二乗平均平方根として計算される、カバレッジスプレッドを評価するメトリックを使用した（図６、パネルＢ）。使用される式は図１０に見出すことができる。試料間の傾向は、カバーが不十分な領域もドロップアウトする傾向があるので、ドロップアウトメトリックの傾向と類似しており、また、ポイントをバルクの結果に対して正規化し、平均する場合に明らかである（図６、パネルＢ、下部のパネル）。これは、区画化されたＭＤＡはカバレッジの相違を有意に低減し、得られたリードの有用な情報内容を最大にし、その結果、バルクＭＤＡと比較して少ない全体的なシークエンス費で、等しい量の新しい情報が得られるようにすることを示す。
【０２５５】
カバレッジの均一性及び正確なアセンブリーを生成することができることの尤度を推定する別の有用なメトリックは、シグナル、例えば図３、パネルＡから得られるカバレッジシグナルのランダム性を評価するのに使用される尺度である情報エントロピーである。未知のゲノムをシークエンシングする場合、全配列にわたって最大限にランダム化されたカバレッジ分布を示す高エントロピーが理想的である。情報エントロピーはｄｄＭＤＡと振盪エマルジョンＭＤＡについて同様であり、両方ともバルクＭＤＡよりもよく機能する（図６、パネルＣ）。前の場合と同ように、投入濃度に対して正規化及び平均する場合、この傾向が存在する（図６、パネルＣ、右パネル）。情報エントロピーについて使用される式は、図１０に見出すことができる。これらのデータは、区画化されたｄｄＭＤＡは、最低限のシークエンシング費でゲノムを最大限にカバーするのに効果的な手段であることを示す。
【０２５６】
単一細胞からのｄｄＭＤＡ増幅ＤＮＡの次世代シークエンシング
全ゲノム増幅に対するｄｄＭＤＡの有用性をさらに示すために、単一Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にこの方法を適用した。単一細胞の増幅は、単一細胞の解析、特に、培養不可能な単一微生物及び個々の癌細胞の研究に非常に重要である。有用であるが、その手順は、精製したＤＮＡの増幅よりもはるかに複雑である。単一細胞は、一般に、正確に溶解し、ＭＤＡに適合する分子に断片化されなければならない。さらに、混入及びＤＮＡ喪失（これは少量の出発材料に関して特に問題となる）を最小限にするために、ＵＶ曝露及び滅菌手順を含めたいくつかの予防策をとらなければならない。本研究では、単一Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を個々のウェルにＦＡＣＳソーティングし、溶解し、熱により断片化し、前と同一の手順を使用してＭＤＡ反応物を乳化した。特に、ｄｄＭＤＡで増幅した２つの異なる細胞を標準的なバルクＭＤＡで増幅した２つの異なる細胞と比較した。試料をシークエンシングし、以前に記載の同一のバイオインフォマティクス解析を実施した後に、バルクＭＤＡによって増幅した細胞にかなりの量の増幅の偏りが見つかった（図７、パネルＡ、左上のパネル）。特に、バルクＭＤＡ細胞２は莫大な量の不十分な増幅を有しており、これは、いくつかの１０，０００塩基対領域の完全なドロップアウトをもたらした（カバレッジプロット中のギャップによって示される）。これに対して、ｄｄＭＤＡによって増幅した２つの細胞は有意により均一なカバレッジを有していた（図７、パネルＡ、右上パネル）。４試料の確率密度を解析することによって、これらの結果をさらに検証した（図７、パネルＢ）。混入及びＤＮＡ喪失が懸念されるが、バルクＭＤＡとｄｄＭＤＡの間のカバレッジの著しい違いは、単一細菌細胞へのこの技法の適合性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2018525004.tif 000014
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