(57)【要約】本発明は抗菌活性を有する化合物の産生のためのミクロバクテリウム属の細菌の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌活性を有する化合物の産生のためのミクロバクテリウム属の細菌の使用。
【請求項２】
前記細菌は、ミクロバクテリウム属の一種（Microbacteriumsp.）、ミクロバクテリウム・アルボレッセンス（Microbacterium arborescens）、ミクロバクテリウム・リクファシエンス（Microbacterium liquefaciens）、ミクロバクテリウム・マリティピカム（Microbacterium maritypicum）およびミクロバクテリウム・オキシダンス（Microbacterium oxydans）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記細菌はミクロバクテリウム・アルボレッセンスであり、より好ましくはミクロバクテリウム・アルボレッセンスＣＩＰ５５．８１Ｔである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記化合物は前記細菌を培養した後に抽出される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記細菌は、炭素源、窒素源、および酵母抽出物を含む栄養培地で培養される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記細菌は約２０℃〜約４０℃の温度範囲で培養される、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記細菌は約６〜約８のｐＨで培養される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記細菌は約１０時間〜約１４４時間培養される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
抗菌活性を有する前記化合物は、極性溶媒もしくは無極性溶媒またはそれらの混合物と接触させて、液液抽出によって、または固液抽出によって抽出される、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌剤製造のためのミクロバクテリウム株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌耐性は、微生物に起因する感染症を治癒するために使用される薬剤の作用を回避しようとするそうした微生物の能力に関しており、耐性細菌が増加傾向であるだけでなく、新規の抗生物質が欠如しているために、現在のところの公衆衛生の課題として残る。
【０００３】
このように、耐性の問題だけでなく、個体群の平均余命が延びているため、抗生物質の需要が高まっている。
【０００４】
例えば、多剤耐性グラム陽性細菌（multi-drugresistant Gram-positive、 MDRGP）は科学分野に引き続き課題を提示しており、これは、その最初のペニシリン耐性株が５０年前以前に現れた黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に関与している。また、多剤耐性グラム陰性細菌（multiple-drug resistant Gram-negative、MDRGN）、特に大腸菌耐性株が関心のある問題になっている。
【０００５】
ミクロバクテリウム属に属する株が抗菌性化合物を産生可能であることは文献では証明されたことがない。
【０００６】
Ｌｅａｒｎ−Ｈａｎ  Ｌｅｅ等は、抗微生物性二次代謝物を産生することができるものを同定することを目的として、ミクロバクテリウム属に属する菌種およびストレプトマイセス属に属する菌種を含む放線菌門単離菌をスクリーニングした（Learn-Han Lee等、The Scientific World Journal、Vol.6、No.1、2014年1月1日、pp.12-14）。試験された病原性細菌に対して、ストレプトマイセス属種単離菌のみが活性を示した。試験されたミクロバクテリウム属に属する菌種単離菌は、実施された単離および発酵条件では抗菌活性を示さない。
【０００７】
特許文献１及び特許文献２は、活性二次代謝物を産生する新規細菌株を単離するために細胞破壊ＤＮＡ損傷処理を用いることを記載している。単離株のなかで、ミクロバクテリウム株ＭＡ３−７Ｇは抗真菌活性を示したが、病原細菌に対する活性は認められなかった。さらに、使用されたミクロバクテリウム株ＭＡ３−７Ｇは対応する天然株の照射後に得られ、他のコメントはないことが言及される。
【０００８】
したがって、抗菌特性を有し、その構造が従来の抗生物質に見られるものとは異なる新規の化学物質の探求は、これらの耐性を示す感染を抑制する新しい方法を開発するために差し迫って必要であると考えられる。本出願人は、ミクロバクテリウムが、抗菌活性を有する新規化合物を産生可能であり、その産生に特に有用であることを見い出した。これまでに文献に記載されたすべてのミクロバクテリウム株は、環境源から単離されたものである。初めに、これらの黄またはオレンジ色素性の発酵グラム陽性桿菌（GPR）がＣＤＣコリネ型Ａ−４およびＡ−５細菌であると同定されたが、さらなる研究により、それらがミクロバクテリウム属に属することが明らかにされた（Primary Identification of Microbacterium spp. encountered inClinical Specimens as CDC Coryneform Group A-4 and A-5 Bacteria、Guido FUNKE、JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY、1995年1月、p.188-192）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０８１８９９号
【特許文献２】米国特許出願第２０１４／０１７７２４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、抗菌活性を有する化合物の産生のための、ミクロバクテリウム属の細菌の使用に関する。
【００１１】
ミクロバクテリウムのゲノムは、生物学的に活性である二次代謝物を産生する酵素経路をコードすることが示されている。
【００１２】
本発明の主要な目的は、抗菌活性を有する化合物の産生のための、ミクロバクテリウム属の細菌の使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態において、細菌は、ミクロバクテリウム属の一種（Microbacterium sp.）、ミクロバクテリウム・アルボレッセンス（Microbacteriumarborescens）、ミクロバクテリウム・リクファシエンス（Microbacteriumliquefaciens）、ミクロバクテリウム・マリティピカム（Microbacteriummaritypicum）、およびミクロバクテリウム・オキシダンス（Microbacterium oxydans）からなる群より選択される。
【００１４】
特に、細菌はミクロバクテリウム・アルボレッセンスであり、より詳細には、ミクロバクテリウム・アルボレッセンスＣＩＰ５５．８１Ｔである。
【００１５】
本発明において、抗菌活性を有する化合物は、該細菌の培養後に抽出される。
【００１６】
一実施形態において、細菌は、炭素源、窒素源及び酵母抽出物を含む栄養培地で培養される。
【００１７】
好ましくは、細菌は約２０℃〜約４０℃の温度範囲で培養される。
【００１８】
好ましくは、細菌は約６〜約８のｐＨで培養される。
【００１９】
好ましくは、細菌は約１０時間〜約１４４時間培養される。
【００２０】
一実施形態において、抗菌活性を有する化合物は、極性溶媒もしくは無極性溶媒またはそれらの混合物と接触させて、液液抽出によって、または固液抽出によって抽出される。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、抗菌活性を有する化合物としての、ミクロバクテリウム属によって産生される二次代謝物の使用である。
【００２２】
本発明は、ミクロバクテリウム属の微生物が、抗菌活性を有する化合物を産生可能であることを示しており、ゆえに、本発明のさらなる目的は、上述の技術的ステップを含む、抗菌活性を有するそうした化合物を効率的かつ効果的に産生する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の教示において、抗菌活性を有する化合物の産生に有用なミクロバクテリウム属の細菌株が本明細書に開示されるように同定および利用される。
【００２４】
さらに本発明の教示において、抗菌活性を有する化合物を産生する方法が本明細書に開示されている。この方法はミクロバクテリウム属株を培養することを含み、それにより抗菌活性を有する化合物が産生される。
【００２５】
好ましくは、本発明の方法は、ミクロバクテリウム属の一種、ミクロバクテリウム・アルボレッセンス、ミクロバクテリウム・リクファシエンス、ミクロバクテリウム・マリティピカムおよびミクロバクテリウム・オキシダンスであるミクロバクテリウム属株のうちの１つを培養することを含む。
【００２６】
好ましくは、本発明の方法は、ミクロバクテリウム・アルボレッセンス株を培養すること、より詳細には、ミクロバクテリウム・アルボレッセンス株ＣＩＰ５５．８１Ｔを培養することを含む。
【００２７】
本発明の別の関連する態様において、ミクロバクテリウム属株によって産生される抗菌活性を有する化合物の産生方法が本明細書に開示される。この方法はミクロバクテリウム属株を培養するステップを含み、それによって抗菌活性を有する化合物が産生され、回収される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の実施形態は、抗菌活性を有する化合物の産生プロセスを提供することに基づき、該プロセスは、ミクロバクテリウム属の細菌株を栄養培地で培養して、抗菌活性を有する化合物を栄養培地および細菌に蓄積させることを含む。
【００２９】
ミクロバクテリウム属の微生物は、当業者には容易に理解されるように、抗菌活性を有する化合物の同時生産を伴い、その成長を可能にする任意の方法で、培養されることができる。これについて、そうした培養は、炭素源（グルコース、デンプン、グリセロール、スクロースおよび糖蜜など）、窒素源（ペプトンや、カゼイン、肉またはダイズの加水分解誘導体、硝酸アンモニウムまたは硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムまたはリン酸アンモニウム、コーンスティープリカー、麦芽抽出物など）、および所望される場合に無機塩類も含有する培地において行われるということが本明細書で考慮される。水性培地のｐＨは、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、リン酸塩もしくはＴＲＩＳ緩衝液などの緩衝液によって、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウムもしくは水酸化アンモニウム、または塩酸または硫酸など無機酸の連続的かつ制御的添加によって、制御される。ｐＨは約５〜約１０、好ましくは約７〜約９に維持される。
【００３０】
そうした培養の温度は、培養される所定の株に基づいて、約１０〜約１４４時間、より好ましく約７２〜９６時間の間、約２０℃〜約４０℃、好ましくは約３０℃〜約３５℃の温度範囲であるとよい。培地のｐＨは、約ｐＨ５〜約ｐＨ１０、好ましくは約７〜約９のｐＨであるとよい。
【００３１】
ミクロバクテリウム属の微生物は、その後、培養の終わりに回収されることができる。そうした回収は、当業者に周知の任意の適切な手段によって行われることができる。本明細書に開示されるように、そうした回収は、培養ブロスを遠心分離して細胞を含有するペレットを形成し、続いて上清をデカントするか、そうでなければ細胞を回収することによって行われる。微生物は、遊離形態の細菌細胞で使用され得るが、細菌細胞を固定化することが可能である。このような場合、細菌細胞は、全発酵（からその除去前）の間、固定化されていてもよい。そうした固定化の後、発酵ブロスは、単純なデカントによるなどの当業者に周知の任意の方法によって容易に除去されることができる。
【００３２】
細菌細胞の固定化は、本発明の方法による使用を可能にするのに適した、当業者に周知の任意の従来の方法によって行われることができる。そうした方法には、アルギネートもしくはカラギーナンゲルまたは高分子フィルムに固定化されることを含む。
【００３３】
培養が終了すると、上清とペレットとが分離される。ミクロバクテリウム属株によって産生された抗菌活性を有する化合物の抽出は、極性溶媒もしくは無極性溶媒、またはそれらの混合物によって、ペレットまたは上清またはその両方においておこなわれ、その後任意的に、極性溶媒または無極性溶媒から抗菌活性を有する化合物を濃縮する精製プロセスが続く。
【００３４】
本発明のこの態様の一実施形態では、抽出または精製のための極性溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール）、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、またはそれらの混合物を独立的に含むが（単独または混合物）、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のこの態様の一実施形態では、抽出または精製のための無極性溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、エチルエーテル、酢酸エチル、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、またはそれらの混合物を独立的に含むが（単独または混合物）、これらに限定されない。極性溶媒と無極性溶媒の混合物、例えばジクロロメタン／メタノール（DCM）などの塩素系溶媒とアルコールとの混合物も使用されることができる。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、抗菌活性を有する化合物の産生方法を提供することに基づき、該方法は、ミクロバクテリウム属株を栄養培地で培養して、抗菌活性を有する化合物を栄養培地および細菌に蓄積させることを含む。
【００３７】
ミクロバクテリウム、好ましくはミクロバクテリウム・アルボレッセンスは、本発明において最も有効に用いることができる例である。この株の生理的特徴は以下の通りである。
【００３８】
［種々の生理的特性］
最適な成長条件：この株の最も適切な成長条件は、ｐＨ５〜９、温度２０℃〜３５℃である。
【００３９】
ミクロバクテリウム・アルボレッセンス株は、抗菌活性を有する化合物の産生のために、最初に適切な栄養培地内またはその上で培養される。こうした本発明の株の培養において、一般的な培養方法が概して適用される。培地としては、微生物が資化できる炭素源、微生物が消化できる窒素源、さらには必要であれば無機塩類を含む栄養培地が適宜用いられる。
【００４０】
上述の資化可能な炭素源として、グルコース、スクロース、サトウキビ、糖蜜、デンプン、デキストリン、セルロース、グリセリン、有機酸、ペプトンを単独または組み合わせて用いることができる。消化可能な窒素源として、ペプトン、肉抽出物、酵母抽出物、乾燥酵母、大豆粕、コーンスティープリカー、綿実粕、カゼイン、大豆たんぱく加水分解物、アミノ酸、および尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物を単独または組み合わせて用いることができる。
【００４１】
さらに、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびホスフェート、重金属塩などの無機塩を必要であれば添加してもよい。さらに、本発明の微生物の成長、および／または抗菌活性物質を付加した化合物の産生を促進する微量栄養素、成長促進剤および前駆体を、必要であれば培地に適宜添加してもよい。
【００４２】
通常、振とう培養やエアレーションかく拌培養などの好気条件下で培養することが好ましい。産業的には、浸漬エアレーション培養が好ましい。培地のｐＨは、好ましくは中性付近である。培養温度は２０℃〜４０℃の範囲でよいが、温度は２４℃〜３０℃の範囲、好ましくは約３０℃に通常は保たれる。培養時間については、抗菌活性を有する化合物は３〜６日間培養すると通常産生および蓄積されるため、抗菌活性を有する蓄積化合物が最大レベルに達したときに培養を好ましくは終了するとよい。
【００４３】
培養組成、培地のｐＨ、培養温度、かく拌速度、およびエアレーション速度などの培養条件は、いうまでもなく、用いる株の種類および/または外部条件に応じて所望の結果が得られるように適宜調整および/または選択されることができる。液体培養で発泡が起こる場合には、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜用いることができる。
【００４４】
抗菌活性を有する化合物を培養物から取り出すために、アセトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ジクロロメタン、メタノール、およびクロロホルムなどの有機溶媒、またはこれらの溶媒の混合物を用いて培養濾液またはペレットを抽出し、抽出物を減圧下で濃縮して、抗菌活性を有する粗化合物を得る。抗菌活性を有する粗化合物には、抗菌活性を有する化合物を分離および精製するためにシリカゲルなどの担体または逆相などを用いたカラムクロマトグラフィーなど精製に通常用いられる既知の方法を行うことができる。
【実施例】
【００４５】
以下において、本発明は一例によって具体的に記載されるが、これらのみに限定されるものではない。
【００４６】
＜Ａ）液相および固相における活性の定性評価＞
ミクロバクテリウム属の様々な株の活性を、固相および液相内で黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ１３７０９に対して定性的に評価した（表１）。株１〜８はミクロバクテリウム・アルボレッセンス属種に属し、株９〜１９はミクロバクテリウム属の様々な種に属するが、その種は同定できなかった。
【表１】
2018524000.tif 000002
【００４７】
ミクロバクテリウム株の培養が行われた相の性質に応じて活性が認められるということが分かった。
【００４８】
＜Ｂ）ミクロバクテリウム・アルボレッセンス株ＣＩＰ５５．８１Ｔによって産生された化合物の抗菌活性の測定＞
＜＜１）．前培養＞＞
１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有する部分酵母−ペプトン−グルコース（ＹＰＧ）培地１００ｍｌを、１２１℃で２０分間オートクレーブした。冷却後、滅菌ＭＯＰＳ溶液（最終濃度150mM）および滅菌グルコース溶液（最終濃度1g/L）により培地を完成させた。ＫＯＨまたはＨＣｌの滅菌溶液を用いてｐＨをｐＨ７．２に調整した。この培地に、パスツール研究所（Institut Pasteur）の生物資源センターにおけるパスツール研究所収集物（Collectionde l'Institut Pasteur、CIP）に寄託された初代ミクロバクテリウム・アルボレッセンス株ＣＩＰ５５．８１Ｔのコロニーを播種し、１６０ｒｐｍでかく拌しながら３０℃で２４時間インキュベートした。ミクロバクテリウム・アルボレッセンス株がその対数増殖期の初期・中期になるまで、６００ｎｍでの光学密度（OD）を分光光度計で測定した(600nmで1<OD<3)。前培養物の純度を、ＹＰＧ寒天上に播種することによってモニターした。プレートを３０℃で４８時間インキュベートした。
【００４９】
＜＜２）．三角フラスコでの培養＞＞
最終量１０００ｍｌの滅菌ＹＰＧ培地を含む５０００ｍｌフラスコに、段落１）に記載の１００ｍｌの前培養物を播種し、１６０ｒｐｍでかく拌しながら３０℃で９６時間インキュベートした。６００ｎｍにおける初期ＯＤは、０．１〜０．３の範囲であった。ＹＰＧ寒天に播種することにより、発酵物の純度を９６時間の終わりにモニターした。プレートを３０℃で４８時間インキュベートした。培養物を２５℃において４５分間、１０，０００ｇで遠心分離した。上清およびペレットを４℃で保存した。
【００５０】
＜＜３）．固相における培養＞＞
１５ｇ／Ｌの寒天を含む最終量３０ｍｌの滅菌ＹＰＧ培地を含むペトリディッシュ（10×10cm）に、段落１）に記載の１０ｍｌ前培養物をあふれさせて播種した。その後余分な前培養物を除去する。次いで、ペトリディッシュを３０℃で９６時間インキュベートする。
【００５１】
＜＜４）．抗菌活性を有する化合物（抗菌剤）の抽出＞＞
抗菌活性を有する化合物の上清からの抽出を、８０：２０の比のジクロロメタン／メタノールで抽出することにより行った。作業を５回行った。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗抽出物を産生した。
【００５２】
抗菌活性を有する化合物の固相からの抽出を、ブタノールまたはアセトンなどの溶媒で寒天片を１６時間覆うことによって行った。溶媒を採取し、減圧下で濃縮乾固して粗抽出物を得た。
【００５３】
＜＜５）．本発明の抗菌化合物の抗菌活性＞＞
臨床検査標準協会（CLSI、旧NCCLS）が推奨するプロトコールに従い、粗抽出物について活性の測定を行った（臨床検査標準協会（CLSI）：好気性細菌の抗微生物剤感受性試験のための希釈方法（DilutionAntimicrobial Susceptibility Methods for Tests for Bacteria That GrowAerobically）、承認標準、第１０版、２０１５年、臨床検査標準協会文献Ｍ０７−Ａ１０）。
【００５４】
ＤＭＳＯにおいて可溶化した粗抽出物の最小発育阻止濃度（minimuminhibitory concentration、MIC)を表２に示す。
【表２】
2018524000.tif 000003
【国際調査報告】
2018524000.tif 000004
2018524000.tif 000005
2018524000.tif 000006