(57)【要約】  本発明は、結合されたリガンドを有する一本鎖核酸分子がハイブリダイズされた、固定化された一本鎖核酸分子を使用することにより、２つの分子の間、特に、２つのタンパク質の間、最も特に、抗原と抗体との間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドとその結合パートナーとの間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）（ｉ）固体基質上に固定化され、反復配列を含んでいない一本鎖核酸分子と、
（ｉｉ）第１のリガンドが第１の一本鎖核酸分子に結合され、第２のリガンドが第２の一本鎖核酸分子に結合されている、前記固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成する少なくとも前記第１および前記第２の一本鎖核酸分子、または
前記固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成し、第１および第２のリガンドが異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子と
を含む核酸構造を提供することと、
ｂ）前記核酸構造を、分析される前記結合パートナーの試料と接触させることと、
ｃ）前記リガンドと前記結合パートナーとの間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法。
【請求項２】
リガンドとその結合パートナーとの間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）第１のリガンドが第１の一本鎖核酸分子に結合され、第２のリガンドが第２の一本鎖核酸分子に結合されている、固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成することができる少なくとも前記第１および前記第２の一本鎖核酸分子、または
固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成することができ、第１および第２のリガンドが異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子を、
分析される前記結合パートナーの試料と接触させ、それによって第１の混合物を提供することと、
ｂ）前記第１の混合物を、固体基質上に固定化され、反復配列を含んでいない一本鎖核酸分子と接触させ、前記少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子または前記少なくとも１つの一本鎖核酸分子が、前記固定化された一本鎖核酸分子の一部と二本鎖を形成するのを可能にすることと、
ｃ）前記リガンドと前記結合パートナーとの間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法。
【請求項３】
前記第１および前記第２のリガンドが同じである、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のリガンドが前記第２のリガンドと異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および前記第２のリガンドが抗原であり、前記結合パートナーが前記抗原に特異的な抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の一本鎖核酸分子に結合される前記抗原が、前記第２の一本鎖核酸分子に結合される前記抗原と異なり、前記抗体が二重特異性抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および／または前記第２のリガンドが、タンパク質もしくはその一部または小分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記固定化された一本鎖核酸分子が、蛍光色素で標識される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記固体基質が少なくとも１つの電極を有し、前記固定化された一本鎖核酸分子が蛍光色素で標識され、前記相互作用が、
ｄ）前記電極に外部電場をかけて前記組合せ産物の運動を引き起こすステップ、
ｅ）前記二本鎖の前記運動の間の前記標識のシグナルを観察するステップ、ならびに
ｆ）前記観察されたシグナルを使用して、前記第１および第２のリガンドと前記結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記固体基質が、そこから光が反射される表面を有し、前記相互作用が、
ｄ）前記表面に光を当てるステップ、
ｅ）前記反射光の強度、角度、またはスペクトルを測定するステップ、ならびに
ｆ）前記反射光の強度、角度、またはスペクトルにおけるシグナル変化を観察することにより、前記第１および前記第２のリガンドと前記結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗体とその同族の抗原との間の相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）（ｉ）固体基質上に固定化された一本鎖核酸分子と、
（ｉｉ）第１の抗原が第１の一本鎖核酸分子に結合され、第２の抗原が第２の一本鎖核酸分子に結合されている、前記固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成する少なくとも前記第１および前記第２の一本鎖核酸分子、または
前記固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成し、第１および第２の抗原が異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子と
を含む核酸構造を提供することと、
ｂ）前記核酸構造を、分析される前記抗体の試料と接触させることと、
ｃ）前記抗原と前記抗体との間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法。
【請求項１２】
前記固体基質が少なくとも１つの電極を有し、前記固定化された一本鎖核酸分子が蛍光色素で標識され、前記相互作用が、
ｄ）前記電極に外部電場をかけて前記組合せ産物の運動を引き起こすステップ、
ｅ）前記二本鎖の前記運動の間の前記標識のシグナルを観察するステップ、および
ｆ）前記観察されたシグナルを使用して、少なくとも１つのリガンドと前記結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体基質が、そこから光が反射される表面を有し、前記相互作用が、
ｄ）前記表面に光を当てるステップ、
ｅ）前記反射光の強度、角度、またはスペクトルを測定するステップ、ならびに
ｆ）前記反射光の強度、角度、またはスペクトルにおけるシグナル変化を観察することにより、前記第１および前記第２のリガンドと前記結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の抗原が前記第２の抗原と異なり、前記抗体が二重特異性抗体である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リガンドが、タンパク質もしくはその一部または小分子である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合されたリガンドを有する一本鎖核酸分子がハイブリダイズされた、固定化された一本鎖核酸分子を使用することにより、２つの分子の間、特に、２つのタンパク質の間、最も特に、抗原と抗体との間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんおよび自己免疫疾患などの疾患の治療のための治療用抗体の使用がますます重要になってきている。それらの抗体の開発では、それらの結合特性、およびそれらの結合標的とそれらの相互作用を徹底的に分析することが必要である。
【０００３】
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発には、抗原／抗体複合体の動態学的結合特性の測定が必要とされる。速度定数ｋon、ｋoff、ならびに解離定数Ｋdの決定のための正確かつ詳細な動態学的測定により、抗体特性についての情報が提供される。Ｋdは、ｍＡｂの効力に影響を及ぼしうる、薬物動態および投与戦略に影響しうる、かつ／または、ｍＡｂ結合が強固であればあるほど通常は用量を低くすることができる（Drake et al. (2012) Anal. Biochem. 429: 58-69）とすれば、最終的な薬物コストに影響しうる。
【０００４】
抗体とその標的の相互作用を特徴付けするために一般的に採用される１つの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、そこでは、相互作用対の一方の相互作用物が、プリズム上に載置された金コーティング付きのガラススライド上に固定化されており、もう一方の相互作用物が、水性緩衝溶液中でこの表面をわたって流れるように誘導される。光が、いわゆる「表面プラズモン共鳴」条件に近い角度および波長で、プリズムを通って金表面上へ通過するとき、金表面に生体分子が結合されると金の光反射率が変化する。この反射率変化をモニタリングすることによって、金表面上の相互作用物と水性緩衝溶液中のその結合パートナーとの間の相互作用の程度を検出および定量化することができる（Vancott (1999) Methods Mol. Med. 17: 273-282; Hearty et al. (2012) Methods Mol. Biol. 907: 411-442）。
【０００５】
抗体とその標的の相互作用を特徴付けするためのさらなるプロセスは、バイオ層インターフェロメトリーであり、これは、２つの表面、すなわち、バイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層および内部基準層によって反射される白色光の干渉パターンを分析するものである。バイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質にリガンドが結合すると、検出可能な波長シフトが生じる。
【０００６】
最近開発されたもう１つの技術は、「ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ」技術であり、これは、微小電極上で相互作用物が高頻度で結合される核酸二本鎖の電気的な操作に基づいている。次いで、時間分解単一光子計測によって核酸二本鎖の方向がモニタリングされる。核酸二本鎖に結合された相互作用物に被分析物が結合する場合、二本鎖のスイッチング動態は、特徴的な検出可能な方法で減速される（Rant et al., Nano Letters, 2009, Vol. 9, 1290 - 1295; Knezevic et al. (2012) J. Am. Chem. Soc. 134(37): 15225-15228; Langer et al. (2013) Nature Communications 4: 2099）。
【０００７】
表面バイオセンサーを使用する上記の方法では、バイオセンサー表面上に固定化される相互作用物は、典型的には無作為に分布され、表面上での相互作用物の局所密度における差異をもたらす。これらの差異により、分析される抗体に結合する抗原などの相互作用物の表面上の空間配置を調節することができない。結果として、二価または二重特異性の抗体を分析するとき、結合部位において結合可能な第２の抗原がない場合には、ある百分率の抗体が１つのＦａｂアームのみを介して抗原と結合するのに対して、２つの抗原がバイオセンサー表面上で互いの近くに位置して抗体がそれらの両方に結合することができる場合には、別の百分率の抗体が両方のＦａｂアームを介して抗原と結合する。１つのＦａｂアームを介しておよび２つのＦａｂアームを介して結合した抗体のこの異種起源の混合物は、分析が困難な複合体シグナルをもたらす。
【０００８】
国際公開第２０１５／１５０４８２号パンフレットには、少なくとも１つのリガンドが結合され、その後、分析される結合パートナーの試料と接触される少なくとも１つの一本鎖核酸分子とステムループ構造がハイブリダイズする分子相互作用を検出および／または分析するための方法が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それにもかかわらず、抗原間の距離の正確な調節、ならびに、したがって、二価および二重特異性の抗体などの複合体分子の結合挙動の正確な分析を可能にする簡単なシステムの必要性が依然としてある。
【００１０】
本発明の目的は、独立請求項の主題によって解決される。本発明のさらなる実施形態および利点は、従属請求項に組み込まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、リガンドとその結合パートナーとの間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）（ｉ）固体基質上に固定化された一本鎖核酸分子と、
（ｉｉ）第１のリガンドが第１の一本鎖核酸分子に結合され、第２のリガンドが第２の一本鎖核酸分子に結合されている、固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成する少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子、または
固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成し、第１および第２のリガンドが異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子と
を含む核酸構造を提供することと、
ｂ）核酸構造を、分析される結合パートナーの試料と接触させることと、
ｃ）リガンドと結合パートナーとの間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法において使用することができる例示的な核酸構造は、図１に例示されている。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、リガンドとその結合パートナーとの間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）（ｉ）固体基質上に固定化され、反復配列を含んでいない一本鎖核酸分子と、
（ｉｉ）第１のリガンドが第１の一本鎖核酸分子に結合され、第２のリガンドが第２の一本鎖核酸分子に結合されている、固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成する少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子、または
固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成し、第１および第２のリガンドが異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子と
を含む核酸構造を提供することと、
ｂ）リガンドと結合パートナーとが相互作用することができるように、核酸構造を、分析される結合パートナーの試料と接触させることと、
ｃ）リガンドと結合パートナーとの間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法を提供する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、リガンドとその結合パートナーとの間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）第１のリガンドが第１および第２の一本鎖核酸分子に結合され、第２のリガンドが第２の一本鎖核酸分子に結合されている、固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成する少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子、または
固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成し、第１および第２のリガンドが異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子を、
分析される結合パートナーの試料と接触させ、それによって第１の混合物を提供することと、
ｂ）第１の混合物を、固体基質上に固定化された一本鎖核酸分子と接触させ、少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子または少なくとも１つの一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子の一部と二本鎖を形成するのを可能にすることと、
ｃ）リガンドと結合パートナーとの間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法を提供する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、リガンドとその結合パートナーとの間の分子相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）第１のリガンドが第１および第２の一本鎖核酸分子に結合され、第２のリガンドが第２の一本鎖核酸分子に結合されている、固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成することができる少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子、または
固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成することができ、第１および第２のリガンドが異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子を、
分析される結合パートナーの試料と接触させ、それによって第１の混合物を提供することと、
ｂ）第１の混合物を、固体基質上に固定化され、反復配列を含んでいない一本鎖核酸分子と接触させ、少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子または少なくとも１つの一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子の一部と二本鎖を形成するのを可能にすることと、
ｃ）リガンドと結合パートナーとの間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法を提供する。
【００１６】
一実施形態では、第１および第２のリガンドは同じである。
【００１７】
代替の実施形態では、第１のリガンドは第２のリガンドと異なる。
【００１８】
好ましくは、第１および第２のリガンドは抗原であり、結合パートナーは前記抗原に特異的な抗体であり、より好ましくは、第１の一本鎖核酸分子に結合される抗原は、第２の一本鎖核酸分子に結合される抗原と異なり、抗体は二重特異性抗体である。
【００１９】
一実施形態では、第１および／または第２のリガンドは、タンパク質もしくはその一部または小分子である。
【００２０】
一実施形態では、固定化された一本鎖核酸分子は、蛍光色素で標識されている。
【００２１】
一実施形態では、固体基質は、少なくとも１つの電極を有し、固定化された一本鎖核酸分子は、蛍光色素で標識され、相互作用は、
ｄ）電極に外部電場をかけて前記組合せ産物の運動を引き起こすステップ、
ｅ）二本鎖の前記運動の間の標識のシグナルを観察するステップ、ならびに
ｆ）観察されたシグナルを使用して、少なくとも１つのリガンドと結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる。
【００２２】
別の実施形態では、固体基質は、そこから光が反射される表面を有し、相互作用は、
ｄ）表面に光を当てるステップ、
ｅ）反射光の強度、角度、またはスペクトルを測定するステップ、ならびに
ｆ）反射光の強度、角度、またはスペクトルにおけるシグナル変化を観察することにより、第１および第２のリガンドと結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる。
【００２３】
本発明は、抗体とその同族の抗原との間の相互作用を検出および／または特徴付けするための方法であって、
ａ）（ｉ）固体基質上に固定化された一本鎖核酸分子と、
（ｉｉ）第１の抗原が第１の一本鎖核酸分子に結合され、第２の抗原が第２の一本鎖核酸分子に結合されている、固定化された一本鎖核酸分子の一部とそれぞれ二本鎖を形成する少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子、または
固定化された一本鎖核酸分子の少なくとも一部と二本鎖を形成し、第１および第２の抗原が異なる位置で結合される少なくとも１つの一本鎖核酸分子と
を含む核酸構造を提供することと、
ｂ）核酸構造を、分析される抗体の試料と接触させることと、
ｃ）抗原と抗体との間の相互作用を検出および／または特徴付けすることと
を含む方法にも関する。
【００２４】
固体基質上に固定化された一本鎖核酸分子は、反復配列を含んでいなくてもよい。
【００２５】
一実施形態では、固体基質は、少なくとも１つの電極を有し、固定化された一本鎖核酸分子は、蛍光色素で標識され、相互作用は、
ｄ）電極に外部電場をかけて前記組合せ産物の運動を引き起こすステップ、
ｅ）二本鎖の前記運動の間の標識のシグナルを観察するステップ、および
ｆ）観察されたシグナルを使用して、少なくとも１つのリガンドと結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる。
【００２６】
別の実施形態では、固体基質は、そこから光が反射される表面を有し、相互作用が、
ｄ）表面に光を当てるステップ、
ｅ）反射光の強度、角度、またはスペクトルを測定するステップ、ならびに
ｆ）反射光の強度、角度、またはスペクトルにおけるシグナル変化を観察することにより、第１および第２のリガンドと結合パートナーの相互作用を検出するステップ
によって検出および／または特徴付けされる。
【００２７】
好ましくは、第１の抗原は第２の抗原と異なり、抗体は二重特異性抗体である。
【００２８】
一実施形態では、リガンドは、タンパク質またはその一部である。
【００２９】
一実施形態では、固定化された一本鎖核酸分子は、蛍光色素で標識される。
【００３０】
換言すれば、振動分子を有する少なくとも１つのリガンドと結合パートナーの相互作用を検出するための方法が提供される。これに関して、振動分子は、固定化された一本鎖核酸分子ならびにそれにハイブリダイズされた第１および第２の一本鎖核酸分子を含む核酸構造として理解されるべきである。したがって、振動分子は、動かされた核酸構造の分子である。前記核酸構造は、外部電場によって横になっている状態から立っている状態へと切り換えることができ、その逆もまた同様である。この測定原理は、例えば、科学論文"Detection and Size Analysis of Proteins with Switchable DNA Layers", Nano Letters, 2009, Vol. 9, 1290 - 1295から集めることができる。横になっているポジションから立っているポジションへと核酸構造の運動を引き起こすことによって、結合相互作用を検出するための動力学的方法が提供される。この方法は、核酸構造のリガンドへの結合パートナーの結合による、核酸構造の動力学的挙動の変化に基づいた検出を促進する。本発明のこれらの態様は、核酸構造が荷電され、したがって極性を有するという事実を利用する。換言すれば、この実施形態では、本明細書中に示されている方法は、以前に記載されているような「ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ（商標）」技術を利用する。この方法のさらなる実施形態では、検出は、切り換えられる分子の流体力学的抵抗の観察される変化に基づいている。このさらなる詳細は、以下で実施例および図面の文脈において説明される。
【００３１】
本発明のもう１つの例示的な実施形態によれば、標識のシグナルのクエンチングが使用され、ここで、使用されるクエンチング機序は、クエンチング媒質と標識との間の距離に依存している。したがって、使用されるクエンチングは、距離依存的である（Kaiser and Rant (2010) J. Am. Chem. Soc. 132: 7935）。
【００３２】
例えば、バイオチップ上で、電極としても使用される、クエンチング層は、標識からの電磁放射線放出のクエンチングを促進するために提供されてもよい。適用されたバイアスは、電極を分極化させ、Ｇｏｕｙ−Ｃｈａｐｍａｎ−Ｓｔｅｒｎスクリーニング層の形成をもたらす。クエンチング層における標識から表面プラズモンへの無放射エネルギー移動は、標識が表面に接近するときに、放出されたシグナル強度をクエンチしうる。したがって、高いシグナル強度は、負に適用された電極バイアス時の核酸構造の立っている立体構造およびより少ないクエンチングを示す。低いシグナル強度は、正に適用された電極バイアス時の核酸構造の横になっている立体構造を示す。後者は、クエンチング層が基質に近い場合である。しかし、前記クエンチング層は、電極の反対側、例えば、対電極上に配置されてもよい。
【００３３】
電極が金属である場合、標識が金属と相互作用する限り、例えば、金属の近くに位置するとき、吸収可能な波長の光を照射されたときであっても、弱い光ルミネセンスを放出するが、標識が金属と相互作用しない場合、例えば、金属から離れて位置するとき、吸収可能な波長の光に曝露されたときに、光エネルギーに応答して光ルミネセンスを放出する能力のある光ルミネセンス（ＰＬ）標識は、本明細書中に記載の放出／クエンチング機序の使用に特に好適である。標識は、以下の態様によって選択されてもよい。クエンチング媒質の吸収スペクトルは、標識の放出スペクトルとある程度一致し、それによって、無放射エネルギー移動が可能となる。例えば、標識は、ＰＬ放出体であってもよく、有機色素分子またはさらにナノ粒子であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の方法において使用される２つの代表的な核酸構造の概略図である。ａ）固定化された一本鎖核酸分子（黒色のヘリックスとして示されている）は、蛍光色素（灰色の円形）で標識され、第１の一本鎖核酸分子（白色で塗りつぶされたヘリックスとして示されている）および第２の一本鎖核酸分子（破線のヘリックスとして示されている）と二本鎖を形成する。第１の一本鎖核酸分子に結合したリガンドは四角形として示されており、第２の一本鎖核酸分子に結合したリガンドは五角形として示されている。ｂ）固定化された一本鎖核酸分子（黒色のヘリックスとして示されている）は、蛍光色素（灰色の円形）で標識され、第１の一本鎖核酸分子（より短い黒色のヘリックスとして示されている）、第２の一本鎖核酸分子（白色で塗りつぶされたヘリックスとして示されている）および第３の一本鎖核酸分子（破線のヘリックスとして示されている）と二本鎖を形成する。第１の一本鎖核酸分子に結合したリガンドは四角形として示されており、第２の一本鎖核酸分子に結合したリガンドは五角形として示されている。
【図２】上（ａ）または下（ｂ）のいずれかのＤＮＡ一本鎖にカップリングされたジゴキシゲニンと表示の量の抗Ｄｉｇ  ＩｇＧ１κ抗体の相互作用の分析を示した図である。
【図３−１】ジゴキシゲニン（ａ）、Ｇタンパク質（ｂ）と表示の量の抗Ｄｉｇ  ＩｇＧ１κ抗体の相互作用の分析を示した図である。
【図３−２】ジゴキシゲニンおよびＧタンパク質の両方（ｃ）と表示の量の抗Ｄｉｇ  ＩｇＧ１κ抗体の相互作用の分析を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、以下に例示的に記載されているように、本明細書中に特に開示されていないいかなる要素、制限の非存在下でも好適に実施されうる。
【００３６】
特定の実施形態に関して、特定の図面を参照しながら本発明を記載するが、本発明は、それに限定されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００３７】
「含む」という用語が本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために、「からなる」という用語は、「含む」という用語の好ましい一実施形態であると考えられる。以下で群が少なくともある数の実施形態を含むと定義される場合、これは、それらの実施形態のみからなることが好ましい群を開示しているとも理解される。
【００３８】
単数名詞、例えば、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」に言及するときに不定冠詞または定冠詞が使用される場合、これは、何か他のものが特記されていない限り、その名詞の複数形を含む。本発明の文脈中の「約」または「およそ」という用語は、当業者であれば問題となっている特徴の技術的効果をさらに確実にすると理解するであろう精度の区間を表す。この用語は、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％の表示の数値からの偏差を典型的には示す。
【００３９】
さらに、本明細書および特許請求の範囲において、「第１」、「第２」、「第３」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」などという用語は、同様の要素を区別するために使用され、連続的または経時的な順序を記載するのに必然的ではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で互換性であること、および本明細書中に記載の本発明の実施形態は、本明細書中に記載または例示されている以外の配列で操作できることは理解されるべきである。
【００４０】
「第１」、「第２」、「第３」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」などという用語が、方法または使用またはアッセイのステップに関する場合には、他に示されていない限り、ステップ間に時間または時間間隔の干渉性がない、すなわち、ステップは、本明細書中に上記または下記のような本出願において他に示されていない限り、同時に行われてもよく、またはこうしたステップ間に秒、分、時間、日、週、月またはさらに年の時間間隔があってもよい。
【００４１】
技術用語は、それらの一般的な意味によって使用される。特定の意味がある用語に伝達される場合、用語の定義は、以下においてそれらの用語が使用される文脈中で与えられる。
【００４２】
本発明の意味の範囲内で、「核酸構造」は、固定化された一本鎖核酸分子と第１および第２の一本鎖核酸分子との間の相互作用によって形成される二次構造である。例示的な核酸構造は、図１に示されている。
【００４３】
「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＰＮＡまたはＬＮＡなどのあらゆる種類の核酸分子を指し、ＤＮＡが好ましい核酸である。
【００４４】
固定化された一本鎖核酸分子は、ハイブリダイゼーションとして知られているプロセスにおいて一本鎖内の相補的塩基の相互作用によって第１および第２の一本鎖核酸分子と二本鎖を形成する。
【００４５】
当業者は、それらが二本鎖を形成するように配列を選択する方法を知っている。特に、ヌクレオチド二本鎖は、相補的塩基間、すなわち、アデニンおよびチミン間またはシトシンおよびグアニン間で水素結合を形成することによって形成することがよく知られている。
【００４６】
したがって、固定化された一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子の配列に相補的な第１の配列および第２の一本鎖核酸分子の配列に相補的な第２の配列を含んでいなければならない。クロスハイブリダイゼーション、すなわち、固定化された一本鎖核酸分子の第１の配列との第２の一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションおよび／または固定化された一本鎖核酸分子の第２の配列との第１の一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションを避けるために、第１および第２の配列が互いに十分に異なっていなければならないことは明らかである。したがって、第１および第２の一本鎖核酸分子は、固定化された核酸分子の別々のオーバーラップしていない部分に結合する。
【００４７】
第１および第２の一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたって一緒に結合してもよい。代替的に、第１および第２の一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたって一緒に結合しなくてもよく、第３の一本鎖核酸分子は、第１および第２の一本鎖核酸分子のいずれによっても結合されていない配列において、固定化された一本鎖核酸分子に結合してもよい。第３の一本鎖核酸分子は、第１および第２の一本鎖核酸分子が互いに隣接して結合していない場合、第１と第２の一本鎖核酸分子の間に結合してもよく、または固定化の部位と第１の一本鎖核酸分子の間に結合してもよい。
【００４８】
好ましくは、固定化された一本鎖核酸分子は、反復配列を含まない。「反復配列」という用語は、１つの一本鎖核酸分子内の２つ以上の同一または実質的に同一の配列を表し、ここで、一本鎖核酸分子内の各反復配列は、その反復配列と相補的または実質的に相補的な特定の配列を有する１つの一本鎖核酸分子と二本鎖を形成する。したがって、同じ配列の少なくとも２つの一本鎖核酸分子は、少なくとも２つの反復配列を含む一本鎖核酸分子にハイブリダイズする。反復配列を含む一本鎖核酸分子の一部と、相補配列を有する一本鎖核酸分子との間で二本鎖を形成することができるように、反復配列がある長さを有していなければならないことを当業者は知っている。反復配列の最小の長さは、したがって４ヌクレオチドである。したがって、固定化された一本鎖核酸分子は、少なくとも４ヌクレオチドの長さを有する反復配列を含まない。
【００４９】
第１および第２の一本鎖核酸分子は、互いに隣接して結合してもよい。代替的に、固定化された一本鎖核酸分子の一部は、二本鎖を形成するための一本鎖核酸分子のいずれによっても結合されなくてもよいが、一本鎖のままであってもよい。好ましくは、二本鎖を形成していないこの部分の長さは、３ヌクレオチド以下であり、より好ましくは、それは２ヌクレオチド以下であり、さらにより好ましくは、それは１ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは、第１および第２の一本鎖核酸分子が互いに隣接して結合する。
【００５０】
固定化された一本鎖核酸分子と二本鎖を形成するために、２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子が１つだけ使用される場合には、固定化された一本鎖核酸分子は、この一本鎖核酸分子の配列に相補的な配列を含んでいなければならない。２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子は、１つのリガンドが固体基質の近くに位置するように、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたって結合してもよい。代替的に、２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたって結合しなくてもよい。この場合には、リガンドが結合されないさらなる一本鎖核酸分子は、２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子によって結合されていない配列において、固定化された一本鎖核酸分子に結合してもよい。
【００５１】
固定化された一本鎖核酸分子と、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子との間の二本鎖は、配列が、好適な条件下、すなわち、２を超えるｐＨ、２０ｍＭを超えるＮａＣｌに相当する塩濃度、および二本鎖の長さに依存する二本鎖の融解温度よりも低い温度で接触される場合に、形成する。二本鎖を形成するのに好適な条件は、当業者にも知られており、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液の２５℃の温度での使用を含む。
【００５２】
二本鎖を形成している配列は、互いに１００％相補的である必要はない、すなわち、二本鎖内で１つまたは複数の塩基は、それらの相補的塩基と対になっていなくてもよい。当業者は、より長い二本鎖分子が、二本鎖の安定性に有意に影響することなく、より短い二本鎖分子よりも多数の非対形成塩基を許容することを知っている。一般に、二本鎖を形成している配列内の少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％の塩基は、互いに相補的でなければならない。
【００５３】
本発明の方法では、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子の好ましくはすべてのヌクレオチドは、固定化された一本鎖核酸分子との二本鎖の形成に参加する、すなわち、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子と二本鎖の部分を形成しないいかなるヌクレオチドも含まない。特に、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子と二本鎖を形成する核酸分子の部分と、リガンドが結合される核酸分子の部分との間に、いかなるリンカーも含まない。
【００５４】
一本鎖核酸分子の配列は、それが自己相補配列を含まないように、すなわち、一本鎖核酸分子内の配列間で、実質的に二本鎖が形成されないように、例えば、４塩基対を超える長さを有する二本鎖が形成されないように、選択されなければならない。さらに、第１および第２の一本鎖核酸分子の配列は、第１と第２の核酸分子の間で、実質的に二本鎖、すなわち、４塩基対を超える長さを有する二本鎖が形成されないように選択されなければならない。
【００５５】
固定化される一本鎖核酸分子を基質に固定化するために、前記核酸分子は、表面への結合を促進するリンカーに結合されてもよい。好適なリンカー分子は、当業者に知られており、核酸構造が結合される表面に依存する。基質が金表面である場合、リンカーは、（ＣＨ2）6−ＳＨまたはジチオールホスホラミダイトなどのチオールリンカーであることが好ましい。ガラスまたはケイ素表面には、シランリンカーが使用されてもよい。表面がアビジンで修飾される場合、リンカーは、ビオチンであってもよい。さらなるリンカーの概要は、会社Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のウェブサイト上に提供されている。リンカーを核酸分子に結合するための方法は、よく知られており、チオール化されたヌクレオチドの使用を含む（Hegner et al. (1993) FEBS 336(3): 452-456を参照されたい）。結合されたリンカーを有する核酸分子は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓまたはａｔｄｂｉｏなどの会社から商業的に得ることができる。
【００５６】
本発明の範囲内では、第１および第２の核酸分子と、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子と二本鎖を形成している一本鎖核酸分子は、基質に直接に固定化される必要があるわけではなく、１つまたは複数のヘルパー核酸分子を介して固定化されてもよく、ヘルパー分子は、その一端でそれ自体が基質に固定化されるのに対して、ヘルパー核酸分子のもう一端は、第１および第２の一本鎖核酸分子との二本鎖の形成に参加しないその一本鎖核酸分子の一部にわたって固定化される一本鎖核酸分子とハイブリダイズする。ヘルパー核酸分子とハイブリダイズする一本鎖核酸分子の部分が、第１および第２の核酸分子と、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子と、二本鎖を形成する部分と同じではありえないことは明らかである。
【００５７】
本出願において使用される用語の中で、第１の一本鎖核酸分子は、第２の一本鎖核酸分子がハイブリダイズする配列よりも固定化の部位の近くに位置する固定化された一本鎖核酸分子の配列にハイブリダイズする核酸分子である。典型的には、しかし、必然的にではなく、リガンドは、もう一端よりも固定化の部位からより遠い第１の一本鎖核酸分子の端で第１の一本鎖核酸分子に結合される。
【００５８】
本発明の意味の範囲内での第２の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子がハイブリダイズする配列よりも固定化の部位からより遠い、固定化された一本鎖核酸分子の配列にハイブリダイズする核酸分子である。典型的には、しかし、必然的にではなく、リガンドは、もう一端よりも第１の一本鎖核酸分子からより遠い第２の一本鎖核酸分子の端で第２の一本鎖核酸分子に結合される。
【００５９】
第１および第２の一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子に一緒にハイブリダイズさせることができ、したがって、ハイブリダイゼーション反応物は、第１および第２の一本鎖核酸分子ならびに固定化された一本鎖核酸分子を含む。代替的に、第１および第２の一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子に連続してハイブリダイズさせることができる、すなわち、第１のステップにおいて第１または第２の一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子にハイブリダイズされ、その後、第２のステップにおいてそれぞれ第２または第１の一本鎖核酸分子が、別々のハイブリダイゼーション反応物において添加またはハイブリダイズされる。
【００６０】
第１および第２の一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子にハイブリダイズされる核酸構造は、図１ａに例示されている。
【００６１】
一実施形態では、第１および第２の一本鎖核酸分子は、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたってハイブリダイズしなくてもよい。代わりに、少なくとも第３の一本鎖核酸分子も、第１および第２の一本鎖核酸分子がハイブリダイズしない固定化された一本鎖核酸分子の一部に、好ましくは、固定化の部位に最も近い固定化された一本鎖核酸分子の領域において、ハイブリダイズしてもよい。こうした核酸構造は、図１ｂに例示されている。
【００６２】
第１および第２の一本鎖核酸分子は、同じまたは異なる長さを有していてもよい。それらが異なる長さを有する場合、それらは、同じ条件下で、固定化された一本鎖核酸分子と安定な二本鎖を形成することができるはずである。
【００６３】
第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子は、７から３００ヌクレオチドの、好ましくは、１０から２５０の、より好ましくは、２０から２００の、さらにより好ましくは、２０から１５０の、最も好ましくは、２０から１００ヌクレオチドの長さをそれぞれ有していてもよい。第１および／または第２の核酸分子の長さが１０ヌクレオチド未満である場合、核酸分子は、種々のプリンおよびピリミジン塩基がメチレン架橋（−ＣＨ２−）およびカルボニル基（−（Ｃ＝Ｏ）−）によって連結された、ペプチド結合によって連結された反復しているＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位を有する主鎖からなるＰＮＡ（ペプチド核酸）であることが好ましい。特定の一実施形態では、第１の一本鎖核酸分子は、２８ヌクレオチドの長さを有し、第２の一本鎖核酸分子は、２０ヌクレオチドの長さを有する。
【００６４】
第１および第２の一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたってハイブリダイズする場合、固定化された一本鎖核酸分子の長さは、第１および第２の一本鎖核酸分子の長さの合計に相当する。第１および第２の一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたってハイブリダイズしない場合、固定化された一本鎖核酸分子の長さは、第１および第２の一本鎖核酸分子の長さの合計よりも大きい。
【００６５】
第１および第２の一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子の全長にわたってハイブリダイズする場合、第１および第２の一本鎖核酸分子に結合されたリガンド間の距離は、第２の一本鎖核酸分子の長さによって決定される（図１ａも参照されたい）。
【００６６】
少なくとも第３の一本鎖核酸分子が、固定化された一本鎖核酸分子に、固定化の部位に近い配列においてハイブリダイズする場合、リガンドも、固定化の部位により近い第１の一本鎖核酸分子の端に結合されてもよく、したがってこの場合、リガンド間の距離は、第１および第２の一本鎖核酸分子の長さの合計によって決定される（図１ｂも参照されたい）。
【００６７】
第１のリガンドが第１の端に結合され、第２のリガンドが、同じ一本鎖核酸分子の第２の端に結合される場合（そしてこれは「２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子」と呼ばれる）、リガンド間の距離は、一本鎖核酸分子の長さである。
【００６８】
好ましくは、リガンド間の距離は、固定化された一本鎖核酸分子と、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子との間で形成される二本鎖の同じ側にリガンドが位置するように選択される。核酸二重螺旋の１回転が約１０塩基対に相当するので、距離は、好ましくは、１０ヌクレオチドの倍数(integer)、例えば、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチドなどであるべきである。
【００６９】
固定化された一本鎖核酸分子と、少なくとも第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子との間で形成される二本鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡのホモ二本鎖およびそのヘテロ二本鎖、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＬＮＡ、ＲＮＡ／ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＬＮＡなどからなっていてもよい。すでに上述されているように、使用される核酸の種類は、二本鎖の安定性に影響しうるので、安定な二本鎖の形成に必要とされる最小の長さは、二本鎖を形成する核酸の種類に依存する。
【００７０】
当業者は、タンパク質などのリガンドを核酸分子に結合するための方法を知っている。１つの可能性は、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって核酸分子を修飾し、次いで、修飾されたＤＮＡを、コンジュゲーションに好適なアミノ酸残基を有するタンパク質と反応させることである（例えば、Fujiwara et al. (1988). J. Immunol. Methods 112: 77-83; Peeters et al. (1989). J. Immunol. Methods 120: 133-143を参照されたい）。さらに、タンパク質−核酸コンジュゲートを作製するために、例えば、Ｓｏｌｕｌｉｎｋから、キットが入手可能である。異なるコンジュゲーション技術の概要は、Hermanson, Bioconjugate Techniques, Elsevier, third edition 2013およびMark, Bioconjugation Protocols, Humana Press, second edition 2011の中に提供されている。
【００７１】
本発明の方法の範囲内では、「リガンド」は、別の分子に対する特異的な親和性による非共有結合によって別の分子に結合することができる分子である。リガンドは、それが結合される核酸分子のものと異なる化学構造を有する、すなわち、リガンドは、核酸分子ではない。
【００７２】
本発明の意味の範囲内で、「リガンド」という用語は、タンパク質またはその部分、ならびに二本鎖の形成と干渉しない大きさを有していなければならない非タンパク性の化学分子、すなわち、いわゆる小分子を含むがこれらに限定されないことが意図される。
【００７３】
「小分子」という用語は、５００ダルトン未満の分子量およびナノモル範囲の大きさを有する有機分子を含むことが意図される。「小分子」という用語は、メチレンブルーおよび異なるイオンなどの電気化学的に活性な化合物を含むことは意図されない。「電気化学的に活性な化合物」とは、活性部位において電子を受け入れるための適切な還元電位を有するあらゆる物質を意味する。特に、「小分子」という用語は、メチレンブルーを含まない。
【００７４】
好ましくは、リガンドは抗原であり、より好ましくは、リガンドはタンパク質またはその部分である。また好ましくは、リガンドは抗体ではない。タンパク質の部分は、抗体によって認識されるエピトープの最小の長さである少なくとも６アミノ酸の最小の長さを有していてもよい。
【００７５】
抗原は、抗体によって認識されるあらゆる構造的物質であり、ペプチド抗原、脂質抗原および炭水化物抗原を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
一本鎖核酸分子に結合される第１および第２のリガンドは、同じであってもよい、すなわち、それらは、同じ化学構造を有していてもよい。例えば、抗原と二価の単一特異性全長抗体の相互作用を分析する場合、第１および第２のリガンドは、前記抗原であってもよい。
【００７７】
代替の実施形態では、一本鎖核酸分子に結合される第１および第２のリガンドは、異なっていてもよい、すなわち、それらは、異なる化学構造を有していてもよい。タンパク質の場合には、異なるタンパク質または異なるタンパク質の部分が、第１および第２のリガンドとして使用されてもよい。例えば、二重特異性抗体とその標的抗原の相互作用を分析する場合、第１のリガンドは第１の抗原またはその部分であってもよく、第２のリガンドは第２の抗原またはその部分であってもよく、ここで、第１および第２の抗原は二重特異性抗体の標的抗原である。代替的に、同じタンパク質の異なる部分が、第１および第２のリガンドとして使用されてもよく、これは、例えば、抗体の結合エピトープの決定を可能にする。さらなる代替では、第１および第２のリガンドは、同じアミノ酸配列を有していてもよいが、リン酸化、メチル化およびアセチル化などの翻訳後修飾において異なっていてもよい。この実施形態は、抗体のその標的抗原への結合などの結合パートナーの結合に対する翻訳後修飾の影響の分析を可能にする。
【００７８】
第１のリガンドは小分子であってもよく、第２のリガンドはタンパク質もしくはその部分であってもよく、またはその逆もまた同様である。こうした実施形態は、小分子による結合パートナーである酵素のアロステリック阻害を調査するために使用されてもよい。本発明の方法で分析される結合パートナーがシグナル伝達分子である場合、第１のリガンドは、シグナル伝達カスケードにおいて結合パートナーの上流であることが想定されるタンパク質であってもよく、第２のリガンドは、シグナル伝達カスケードにおいて結合パートナーの下流であることが想定されるタンパク質であってもよい。
【００７９】
好ましくは、第１および第２の核酸分子、または第１および第２のリガンドが結合される一本鎖核酸分子は、蛍光色素などの検出可能なレベルで標識されない。
【００８０】
本発明の方法では、（ａ）核酸構造または（ｂ）第１および第２の一本鎖核酸分子または（ｃ）第１および第２のリガンドが結合される一本鎖核酸分子のいずれかが、リガンドおよび結合パートナーが相互作用することができるように、すなわち、リガンドおよび結合パートナーが相互作用するのを可能にする条件下で、分析される結合パートナーの試料と接触される。好適な条件は、好適な緩衝液、例えば、塩化ナトリウムおよび緩衝液を含む緩衝液など、好ましくは、塩化ナトリウムおよびリン酸緩衝液を含む緩衝液、より好ましくは、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４および０．０５％のＴｗｅｅｎを含む緩衝液の使用を必要とする。
【００８１】
核酸構造は、基質に結合される。「基質」という用語は、核酸分子を可逆的または不可逆的にカップリングさせることができる構造としてのその最も広義の意味で理解されるべきであり、例えば、チップまたはビーズなどの平面的なマトリックスを含む。基質は、核酸分子が結合されうる、例えばガラスのような、いかなる物質でできていてもよく、例えば、金または他の金属から、作製されていてもよい。本明細書に記載のようなスイッチング適用には、前記基質の最上部にフィルムを含むバイオチップが使用されてもよい。例えば、５〜３００ｎｍの厚さの金フィルムがガラス基質または有機層上に使用されてもよく、例えば、導電性ポリマーまたは色素増感マトリックスが基質上に使用されてもよい。この層は、該検出法の実施形態において使用されるクエンチング層として機能してもよい。
【００８２】
上述のように、核酸分子を基質に結合するために、核酸構造に結合されて化学反応によって核酸構造を基質に結合することを可能にするチオールなどのリンカー分子が必要とされることもある。本発明のもう１つの例示的な実施形態によれば、化学リンカーは、以下の反応基のうちの１つまたはその組合せを含む群から選択される：アルデヒド、ケトン、チオール、アミン、カルボキシル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、グリカン、アジド、アルキン、アルケン、シリコン、およびこれらの任意の組合せ。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態では、基質は、固定化された一本鎖核酸分子に結合されるチオールリンカーによって核酸構造がカップリングされる金表面である。
【００８４】
本発明の方法では、固定化された一本鎖核酸分子を介して少なくとも１つの核酸構造が結合される基質が使用される。代替的に、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０の異なる核酸構造が基質に結合されてもよい。好ましくは、６つの異なる核酸構造が１つの基質に結合される。また好ましくは、同じ基質に結合される異なる核酸構造は、固定化された一本鎖核酸分子ならびに第１および第２の一本鎖核酸分子の配列において異なる。
【００８５】
さらに、１つまたは複数の特異的なリガンドに結合された一対の第１および第２の一本鎖核酸分子を有する基質上での１つまたは複数の相互作用を分析した後に、結合された固定化された一本鎖核酸分子を有する基質は、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子を、固定化された一本鎖核酸分子から除去した後のさらなる相互作用の分析のために使用することができる。一本鎖核酸分子は、例えば、固定化された一本鎖核酸分子と一本鎖核酸分子との間の二本鎖を変性させるｐＨ１３の溶液などの強塩基性溶液での処理によって除去することができる。第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子を、固定化された一本鎖核酸分子から除去した後に、固定化された一本鎖核酸分子は、他のリガンドが結合されている、第１および第２の一本鎖核酸分子、または２つのリガンドが結合される一本鎖核酸分子とハイブリダイズさせることができる。分析の品質に有意に影響することなく、基質を少なくとも１６回再利用することができることを示すことができた。
【００８６】
本発明の方法が、例えば、「Ｓｗｉｔｃｈｓｅｎｓｅ」技術と共に使用される場合、核酸構造は、蛍光色素で標識されてもよい。好適な蛍光色素は、当業者に知られており、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、シアニン３およびシアニン５を含む。好ましくは、シアニン３および／またはシアニン５が使用される。蛍光色素で標識された核酸分子は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＧｅｎｏｍｉｃｓまたはＧｅｎｓｃｒｉｐｔなどの異なる供給業者から得ることができる。核酸構造内で、蛍光色素は、固定化された一本鎖核酸分子内に位置し、それは、固定化に使用されずしたがって標識付けに利用可能な固定化された一本鎖核酸分子の終端に位置する。
【００８７】
本発明の方法が、序論部分に記載のように、表面プラズモン共鳴またはバイオ層インターフェロメトリーと共に使用される場合、該方法は、
ｄ）表面に光を当てるステップと、
ｅ）反射光の強度、角度、またはスペクトルを測定するステップと、
ｆ）反射光の強度、角度、またはスペクトルにおけるシグナル変化を観察することにより、第１および第２のリガンドと結合パートナーの相互作用を検出するステップと
をさらに含む。
【００８８】
本発明の方法は、分子間の相互作用、特に、抗体と１つまたは複数の抗原の相互作用を検出および／または分析するために使用される。「検出すること」という用語は、それが、そうした相互作用が実際に存在するか否かを決定することができることを意味する。既知の相互作用の特徴付けには、例えば、分子の互いに対する親和性および／または結合活性、結合動態、すなわち、２分子間の結合および解離の動態、分子の大きさ、分子の三次元構造における立体構造的変化、分子の電荷における化学修飾変化、平衡における結合エネルギー（自由エネルギー、エンタルピー、エントロピー）、結合または解離のプロセスに関与するエネルギー障壁などのパラメーターの決定が含まれる。
【００８９】
本発明は、いわゆる「ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ」技術による抗原／抗体相互作用の分析に特に言及して説明される。しかし、本発明が、表面プラズモン共鳴などの他の検出技術によって他の分子の相互作用を検出および／または分析するためにも使用されうることは、本明細書から明らかになる。
【実施例】
【００９０】
１．バイオチップ
バイオチップは、４つのフローチャネル用の入口および出口としての役割を果たす８つの穴（１ｍｍの直径）を有するガラス基質（２７×４０ｍｍ）からなる。Ａｕ作用電極（１２０μｍの直径）およびＰｔ対向電極を、それぞれ６つの電極を有する４つの領域に配置して、標準的な光リソグラフィーおよび金属被覆技術によって作製した。ＤＮＡ固定化の前に、表面を、新たに調製したＰｉｒａｎｈａ溶液（９５％Ｈ2ＳＯ4：３０％Ｈ2Ｏ2＝２：１）中で１５分間洗浄し、その後、脱イオン水での大量のすすぎ、３分間の超音波処理および窒素での乾燥を行った。
【００９１】
２．本発明のＤＮＡ層（「二重特異性ナノレバー」とも呼ばれる）の調製
チオール化された４８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、固定化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ  ＤＮＡ）中でピコリットル分注装置でスポットすることを介して金電極に末端グラフトさせた。Ｃｙ３で標識された固定化用ｓｓＤＮＡの配列は、５’ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＴ−Ｃｙ３  ３’（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）であった。１０分間のインキュベーション後、中間層としてのダイカットフローチャネルおよび上部層としてのカバースライドを有する両面接着性フィルムを使用することによってチップを集結させた。フローチャネルは、６０μｍの高さ、１ｍｍの幅であり、４つの電極領域のうちの１つをそれぞれカバーしていた。ＤＮＡで修飾されたＡｕ電極を不活性化し、非特異的に結合したＤＮＡを、共吸着メルカプトヘキサノール（１ｍＭ  「Ｔ」緩衝液中：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）によって３０分間除去した。
【００９２】
セットアップにおける導入後、ＤＮＡ層を、Ｐ４０緩衝液（４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）中で２種の相補的ＤＮＡであるｃ７−２０−５’リガンド（第２の一本鎖核酸分子）およびｃ７−２８−５’リガンド（第１の一本鎖核酸分子）とハイブリダイズさせ、以前に報告されている電気的な脱離方法を使用して密度を調整した。
【００９３】
ｃ７−２０−５’リガンドのＤＮＡは、以下の配列：ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧを有し、５’端において抗原１−ＨＳ−（ＣＨ2）6−で修飾されている
【００９４】
ｃ７−２８−５’リガンドのＤＮＡは、以下の配列：Ａ  ＣＴＡ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＡを有し、５’端において抗原２−ＨＳ−（ＣＨ2）6−で修飾されている
【００９５】
簡単に説明すると、相対スイッチング振幅ΔＦ／Ｆ（ΔＦは、反発的または誘引的な電位をかけているときの観察可能な蛍光変調振幅であり、Ｆは、反発的な電位における蛍光である）は、表面上でのＤＮＡ鎖の自由な運動性を示すパラメーターとして使用される。立体相互作用により、高密度に詰め込まれたＤＮＡレバーは、表面上で横になることができない、すなわち、スイッチさせることができない（ΔＦ／Ｆ≒０％）のに対して、超低密度層は、１００％に近いΔＦ／Ｆ値を特徴とする。負の電圧パルス（例えば、−０．８Ｖ対Ｐｔ）を数秒間かけることによって、きわめて低密度の層（推定密度＜１０10分子／ｃｍ2）における自由なＤＮＡ運動を示す、ΔＦ／Ｆが最高になるまでＤＮＡを表面から電気的に脱離させた。
【００９６】
必要な場合には、二本鎖ＤＮＡ層を、２５μｌのＮａＯＨ溶液（ｐＨ１２〜１３）を電極上に１０秒間かけてすすぐことによって変性させた。次いで、この層を、新しい相補的ＤＮＡ（２５μｌの緩衝液中に１００ｎＭ）とのハイブリダイゼーションによって再生させることができた。センシング実験中に通常は１００μｌ／分の流速を使用し、これは、反応が限られた動態レジームにおいてセンサーを作動させるのに十分に高かった。ＤＮＡスイッチング挙動に対する、適用された流体力学的な流速の影響は、観察されなかった。
【００９７】
３．測定セットアップ
バイオセンシング測定は、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＧｍｂＨからのＤＲＸ  ２４００  ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ分析機器で行った。Ｃｙ３で標識されたＤＮＡ核酸構造からの蛍光は、ダイクロイックミラーを介して５０×対物レンズ内にカップリングされた（５１７ｎｍ帯域通過フィルター処理された）緑色ＬＥＤによって励起された。放出されたＣｙ３蛍光（５７０ｎｍ）を、同じ対物レンズによって収集し、ダイクロイックミラーおよびロングパスフィルターを通過させて、光電子増倍管（浜松）で検出した。周波数生成器からのＡＣ方形波信号を使用して、ＤＮＡ分子を動かし、同時に、単一光子計測ユニット（ＮａｎｏＨａｒｐ、ＰｉｃｏＱｕａｎｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のイベントタイマーを作動させて、３２ｎｓの分解能で光子到達時間を記録した。試料ホルダー内に組み込まれたＰｅｌｔｉｅｒ素子により、温度を調節した実験が可能であった。
【００９８】
すべての時間分解（ＴＲ）蛍光測定の前に、印加された電圧傾斜に対する静的蛍光応答を記録した。ＴＲ測定のためのスイッチング電位は、蛍光応答の２つの「プラトー領域」（完全に横になっているＤＮＡおよび完全に立っているＤＮＡを示している）の近くになるように選択した。電圧振幅は０．６Ｖと１Ｖとの間であって、「立体構造遷移の電位」、すなわち、測定した電圧応答曲線における変曲点によってＤＣオフセット（≒０．０Ｖ）を調整した（約±０．１Ｖ）。印加した方形波電位の周波数は、１０ｋＨｚであって、これにより、電圧を逆にする前にＤＮＡが完全に立ち上がり完全に横になるのに十分な時間が確実にあったことになる。
【００９９】
上方向の運動および下方向の運動について、それぞれ、以下のように、標準化された蛍光シグナルＦnormから動的応答を算出する。
【０１００】
【数１】
2018537071.tif 000002
【０１０１】
抗体とその抗原（１種または複数）の分析のために、（Ｐ４０緩衝液（４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）中に溶解させた）異なる濃度（０．３３、１、３、９、２７ｎＭ）の４５０μＬの抗体溶液を５０μＬ／分の流速で注入した。リガンド分子との相互作用を時間分解測定において分析した。抗体によってリガンド層を飽和させた後に、数時間にわたる解離を測定した。
【０１０２】
さらなるステップにおいて、動態データセットをｓｗｉｔｃｈＡＮＡＬＹＳＩＳソフトウェア（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＧｍｂＨ、ＤＥ）中にアップロードする。それにより、ｋon、ｋoffおよびＫdの計算のための情報が得られる。所与の時間における、リガンドによって結合されている、標的分子の画分を、動的応答（ＤＲ）または蛍光変調振幅から評価する。結合定数および解離定数の評価のために、生のデータを、以下の指数関数によってフィッティングしなければならない：
ｆ（ｔ）＝Ａ0＋Ａ1  ｅｘｐ（−（ｔ−ｔ0）／τ）
【０１０３】
最終または飽和レベルは、Ａ0として記載されるのに対して、Ａ1は、開始レベルと最終レベルの間の振幅を反映する。時間ｔを、時間オフセットｔ0によって調整しなければならない。指数関数の時定数は、τである。観察可能な結合および解離の時定数τonおよびτoffを使用して、ｋon、ｋoffおよびＫdを算出することができる。
【０１０４】
４．二重特異性抗体結合の分析
その抗原結合部位によってジゴキシゲニン（ｄｉｇ）を認識している抗体の結合およびさらにその定常Ｆｃ領域によって結合しているＧタンパク質を上記のセットアップにおいて分析した。
【０１０５】
最初の実験では、ジゴキシゲニンに対する抗体の結合動態（抗Ｄｉｇ  ＩｇＧ１κ）が、リガンドのカップリングの部位によって、すなわち、リガンドを下方の鎖および上方の鎖にカップリングさせることによって、影響を受けるかどうかを調査した。この目的のために、ジゴキシゲニンを、上方のｃ−２０鎖（本出願の用語の中の第２の一本鎖核酸分子）または下方のｃ−２８鎖（本出願の用語の中の第１の一本鎖核酸分子）のいずれかにカップリングさせた。
【０１０６】
この分析の結果を図２ａおよび２ｂに示しており、この分析から算出したｋon、ｋoffおよびＫd値を以下の表１に示している：
【０１０７】
【表１】
2018537071.tif 000003
【０１０８】
抗体が、下方または上方の一本鎖核酸分子へのリガンドのカップリングとは独立した同様の動態で結合することは明らかである。
【０１０９】
次の１セットの実験では、ジゴキシゲニン、Ｇタンパク質、ならびにジゴキシゲニンおよびＧタンパク質の両方と抗Ｄｉｇ  ＩｇＧ１κ抗体の相互作用を分析した。これらの分析の結果を図３ａからｃに示している。
【０１１０】
予想通り、ジゴキシゲニンと抗Ｄｉｇ  ＩｇＧ１κ抗体の相互作用は速い解離速度を示し、Ｇタンパク質と定常Ｆｃ領域の相互作用も単相性の速い解離という結果になる。最終的に、二重特異性相互作用は、単相性の遅い解離挙動を示す。遅い解離挙動は、抗体が実際に両方のリガンドによって同時に結合されていることを確認するものであり、これは、より強い結合をもたらす。観察された解離動態が単相性である（すなわち、単一の指数曲線によって記載される）という事実により、１種類の相互作用のみ、すなわち、ジゴキシゲニンおよびＧタンパク質を介した抗体の共同（二重特異性）の結合が表面上に存在することが示唆される。これは、両方のリガンドが抗体に、それらが記載の二重特異性核酸構造上に固定化されたときに、到達可能であること、およびそれらが、十分に定められた様式で、すなわち、定められた互いからの距離で存在することを確認するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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