(57)【要約】   本発明は、発現系の全身投与により実現される、個体の血中で一定レベルのＬ−ＤＯＰＡを得ること、又は維持することを目的とする、酵素置換療法のための発現系に関する。したがって発明は、パーキンソン病を含むドパミン欠乏障害などのカテコールアミン欠乏障害の処置において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現の際に、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第一のポリヌクレオチド（Ｎ１）であって、前記ポリヌクレオチドは、第一のプロモーターに動作可能に結合され、前記生物活性がＧＣＨ１の酵素活性である、第一のポリヌクレオチド（Ｎ１）と、
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第二のポリヌクレオチド（Ｎ２）であって、前記ポリヌクレオチドは、第二のプロモーターに動作可能に結合され、前記生物活性がＴＨの酵素活性である、第二のポリヌクレオチド（Ｎ２）と、
発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第三のポリヌクレオチド（Ｎ３）であって、前記ポリヌクレオチドは、第三のプロモーターに動作可能に結合され、前記生物活性がＰＴＰＳの酵素活性である、第三のポリヌクレオチド（Ｎ３）と、
を含む発現系。
【請求項２】
前記発現系が、
少なくとも１つの第一のプロモーターに動作可能に結合されるポリヌクレオチドであって、発現の際に第一のポリペプチド（Ｐ１）及び第二の異なるポリペプチド（Ｐ２）をコードする、ポリヌクレオチド（Ｎ’）と、
少なくとも１つの第二のプロモーターに動作可能に結合される第二のポリヌクレオチドであって、発現の際に第三のポリペプチド（Ｐ３）をコードする、第二のポリヌクレオチド（Ｎ’’）と、
を含み、
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３が、異なっており、
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３が、独立して、ＧＣＨ１、ＴＨ及びＰＴＰＳポリペプチド、又はそれらの生物活性断片若しくは変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第一のプロモーターが、２つのプロモーターである、請求項２に記載の発現系。
【請求項４】
前記２つのプロモーターが、同一である、請求項３に記載の発現系。
【請求項５】
前記２つのプロモーターが、異なっている、請求項３に記載の発現系。
【請求項６】
Ｐ１をコードするポリヌクレオチド配列と、Ｐ２をコードするポリヌクレオチド配列の間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項２に記載の発現系。
【請求項７】
前記発現系が、第一のプロモーターに動作可能に結合された第一のポリヌクレオチドを含み、
前記第一のポリヌクレオチドが発現の際に、
第一、
第二、及び
第三のポリペプチド
をコードし、
前記第一、第二及び第三のポリペプチドが、独立して、ＧＣＨ１ポリペプチド、ＴＨポリペプチド及びＰＴＰＳポリペプチド、又はそれらの生物活性断片若しくは変異体からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８】
前記ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）ポリペプチドが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７５％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８５％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９５％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９６％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９７％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９８％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９９％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと１００％同一である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項９】
前記チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ポリペプチドが、配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７５％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８５％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９５％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９６％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９７％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９８％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９９％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと１００％同一である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１０】
前記６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）が、配列番号：４１と少なくとも７０％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも７５％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも８５％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９５％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９６％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９７％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９８％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９９％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と１００％同一である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１１】
前記ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１２】
前記チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体が、配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１３】
前記６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体が、配列番号：４１と少なくとも７０％同一である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１４】
前記断片又は前記変異体の生物活性が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７及び配列番号：４１からなる群から選択される前記対応する全長酵素の前記酵素活性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１５】
前記生物活性断片が、チロシンヒドロキシラーゼの触媒ドメイン（配列番号：１２）及び／又は（配列番号：４０）である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１６】
前記生物活性変異体が、突然変異したチロシンヒドロキシラーゼポリペプチドであり、配列番号：７の残基Ｓ１９、Ｓ３１、Ｓ４０又はＳ４０４のうちの１つ又は複数が、別のアミノ酸残基に改変されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１７】
ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）ポリペプチド、又はそれらの生物活性断片若しくは変異体をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号：２０の配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１８】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ポリペプチド、又はそれらの生物活性断片若しくは変異体をコードする前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号：２３、２４、２５、２６及び２７からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１９】
前記第一及び前記第二及び前記第三のプロモーターが、異なるプロモーター配列である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２０】
前記第一及び前記第二及び前記第三のプロモーターが、同一のプロモーター配列である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２１】
前記プロモーターが、哺乳動物細胞に選択性のあるプロモーターである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２２】
前記哺乳動物細胞が、肝細胞、筋細胞及び筋芽細胞に選択性のあるプロモーターである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２３】
前記プロモーターが、構成プロモーターである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２４】
前記プロモーターが、例えばｐ−ＭＣＫ１３５０などのＭＣＫ、複数のコピーのヒト・スロートロポニンＩ（slow troponin I）遺伝子エンハンサー、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、ｐＧＫ、Ｈ１及び／又はＵ３からなる群から選択される構成的に活性のプロモーターである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２５】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２６】
前記プロモーターが、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１、プロゲステロン、ＲＵ４８６及び／又はラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される誘導性プロモーターである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２７】
前記プロモーターが、ＬＰ１、ｈＡＰＯ−ＨＣＲ及び／又はｈＡＡＴである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２８】
前記プロモーターが、筋肉細胞に特異性がある、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２９】
前記プロモーターが、
ａ．前記ＣＭＶプロモーター及びＳＰｃ５−１２のエレメントを用いた筋肉特異性組み合わせ又は二重プロモーターと、
ｂ．ＳＰｃ５−１２合成筋肉特異性プロモーターと、
ｃ．ｄＭＣＫ又はｔＭＣＫ又はｐ−ＭＣＫ１３５０又は複数のコピーのヒト・スロートロポニンＩ遺伝子エンハンサーなどの筋肉特異性クレアチンキナーゼプロモーター又はそれらの簡略型と、
ｄ．ＣＭＶプロモーターと、
ｅ．筋肉ＣＡＴプロモーターと、
ｆ．骨格αアクチン４４８プロモーターと、
ｇ．ａ〜ｆのいずれか１つの任意の活性類似体又は断片と、
からなる群から選択される筋肉特異性プロモーターである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３０】
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする前記ポリヌクレオチドが、肝特異性プロモーターに動作可能に結合されている、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３１】
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする前記ポリヌクレオチドが、肝特異性プロモーターに動作可能に結合されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３２】
前記プロモーターが、肝臓プロモーター／エンハンサー１（ＬＰ１）又はその生物活性断片若しくは変異体、及び／或いはハイブリッド肝特異性プロモーター（ＨＬＰ）又はその生物活性断片若しくは変異体からなる群から選択される肝特異性プロモーターである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３３】
前記プロモーターが、配列番号：３８（ＨＬＰ）及び／又は配列番号：３９（ＬＰ１）からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９６％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９７％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９８％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９９％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと１００％同一である、肝特異性プロモーターである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３４】
前記プロモーターの発現パターンが、全身投与可能な薬剤によって調節される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３５】
前記発現系が、プラスミドである、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３６】
前記発現系が、裸のプラスミドＤＮＡである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３７】
前記発現系が、ベクター内にパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３８】
前記発現系が、ベクターである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項３９】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４０】
前記発現系が、合成ベクターである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４１】
前記発現系が、コスミドベクターである、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４２】
前記発現系が、人工染色体である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４３】
前記発現系が、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４４】
前記発現系が、例えば１〜３０ｋｂ、１〜２０ｋｂなど、例えば１〜１５ｋｂ、１〜１０ｋｂなど、例えば１〜８ｋｂ、２〜７ｋｂなど、例えば３〜６ｋｂ、４〜５ｋｂなど、１〜４０ｋｂのパッケージング能力を有する、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４５】
前記発現系が、４．５〜４．８ｋｂのパッケージング能力を有する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターが、組み込み型及び非組み込み型ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４９】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５０】
前記ＡＡＶベクターが、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５１】
チロシンヒドロキシラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、自己相補性配列である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５２】
前記アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）が、セロタイプＡＡＶ５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６及びＡＡＶ２ベクターからなる群から選択される、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５３】
前記アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）が、セロタイプＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９及びＡＡＶ７ベクターからなる群から選択される、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５４】
前記ＡＡＶ８ベクターのゲノムが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ８カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５５】
前記ＡＡＶ７ベクターのゲノムが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ７カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５６】
前記ＡＡＶ６ベクターのゲノムが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ６カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５７】
前記ＡＡＶ５ベクターのゲノムが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ５カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５８】
前記ＡＡＶ２ベクターのゲノムが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ５又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ２カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５９】
前記ＡＡＶ１ベクターのゲノムが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ５カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ１カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６０】
前記発現系が、哺乳動物細胞を感染、トランスフェクト、又は形質導入することが可能なベクターである、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６１】
前記哺乳動物細胞が、肝細胞などの肝臓細胞である、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６２】
前記哺乳動物細胞が、筋細胞などの筋肉細胞又は筋芽細胞などの筋肉細胞前駆体である、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６３】
前記生物活性断片が、少なくとも１００の連続するアミノ酸を含み、前記選択された配列内で指定された任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に改変されているが、但し、前記配列内の１０以下のアミノ酸がそのように改変されていることを条件とする、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６４】
前記断片の酵素活性が、前記全長酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも２０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも３０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも４０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも５０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも６０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも７０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも８０％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性の少なくとも９５％、好ましくは前記全長酵素の酵素活性と実質的に同一である、請求項６０に記載の発現系。
【請求項６５】
前記発現系が、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６及び配列番号：３７を含む群から選択されるベクターである、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６６】
１つ又は複数のポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６７】
前記１つ又は複数のポリアデニル化配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化配列である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６８】
前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列の１つ又は複数が、配列番号：２１及び２２からなる群から選択される配列を有する、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６９】
前記ポリアデニル化配列が、前記ＴＨ及び／又はＧＣＨ−１をコードする核酸配列の３’末端に動作可能に結合されている、請求項１〜６８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７０】
転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７１】
前記転写後調節エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７２】
前記ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントが、配列番号：２８又は２９の配列を含む、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７３】
イントロンをさらに含む、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７４】
イントロンをさらに含み、前記イントロンが、前記ＴＨ及び／又はＧＣＨ−１転写産物の５’末端に動作可能に結合されている、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７５】
請求項１〜７４のいずれかに記載の発現系でトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中の前記発現されたＴＨ及びＧＣＨ１の活性を測定することにより、前記比が決定される、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７６】
前記ＴＨ：ＧＣＨ１比が、請求項１〜７５のいずれかに記載の発現系でトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中のテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の量を測定することにより決定される、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７７】
前記ＴＨ：ＧＣＨ１比が、請求項１〜７６のいずれかに記載の発現系でトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中で転写されたｍＲＮＡの量により決定される、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７８】
前記ＴＨ：ＧＣＨ１比が、請求項１〜７７のいずれかに記載の発現系でトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中で発現されたタンパク質の量により決定される、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７９】
前記発現系は、最小限に組み込む発現系である、請求項１〜７８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８０】
前記発現系は、例えば筋細胞などの筋肉細胞又は筋芽細胞などの筋肉細胞前駆体など、哺乳動物細胞を感染、トランスフェクト又は形質導入することが可能なベクターである、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８１】
第四のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８２】
前記第四のポリヌクレオチドが発現の際、ＴＨ、ＧＣＨ１又はＰＴＰＳをコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの発現を報告することが可能なレポーターをコードする、請求項１〜８１のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８３】
前記レポーターが、ＧＦＰ又はｅＧＦＰなどの蛍光タンパク質である、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８４】
前記第四のポリヌクレオチドが発現の際、小胞モノアミントランスポーター（ＶＭＡＴ）などの輸送タンパク質をコードする、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８５】
前記第四のポリヌクレオチドが発現の際、ＶＭＡＴ阻害剤をコードする、請求項１〜８４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８６】
請求項１〜８５のいずれか１つに記載の発現系により形質導入又はトランスフェクトされる単離された宿主細胞。
【請求項８７】
前記細胞が真核細胞である、請求項１〜８６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜８７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
前記細胞が霊長類細胞である、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９０】
前期細胞がヒト細胞である、請求項１〜８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９１】
肝細胞、筋細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、請求項１〜９０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項９２】
請求項１〜９１のいずれか１項に記載の発現系又は宿主細胞を含む医薬組成物。
【請求項９３】
医療使用のための、請求項１〜９２のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項９４】
カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置方法における使用のための、前記発現系が末梢投与される、請求項１〜９３のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項９５】
前記使用が、血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を得ること及び／又は維持することを含む、請求項１〜９４のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項９６】
血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法における使用のための、それを必要とするヒトへの前記発現系の末梢投与を含む、請求項１〜９５のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項９７】
前記発現系又は前記宿主細胞の投与を、Ｌ−ＤＯＰＡの治療有効量の全身投与で補充することをさらに含む、請求項１〜９６のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項９８】
テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）又はその類似体の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項１〜９７のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項９９】
テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）類似体の治療有効量を投与することをさらに含み、前記類似体がサプロプテリンである、請求項１〜９８のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１００】
末梢デカルボキシラーゼ阻害剤の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項１〜９９のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０１】
ベンセラジン（benserazine）及びカルビドパからなる群から選択される末梢デカルボキシラーゼ阻害剤の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０２】
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０３】
トルカポン、エンタカポン及びニテカポンからなる群から選択されるカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０４】
ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又はＣＯＭＴ阻害剤、並びにそれらの類似体の前記投与が、全身投与による、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０５】
ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又はＣＯＭＴ阻害剤、並びにそれらの類似体の前記投与が、腸内又は非経口投与による、請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０６】
ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又はＣＯＭＴ阻害剤、並びにそれらの類似体の前記投与が、経口、静脈内又は筋肉内投与による、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０７】
前記発現系の末梢投与が、ＣＮＳの外部への非経口投与である、請求項１〜１０６のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０８】
ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又はＣＯＭＴ阻害剤、並びにそれらの類似体の前記投与が、分離式肢灌流による、請求項１〜１０７のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１０９】
前記発現系の末梢投与が、筋肉内投与である、請求項１〜１０８のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１０】
前記発現系の末梢投与が、静脈内投与である、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１１】
前記発現系の静脈内投与が、門脈で行われる、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１２】
前記発現系の末梢投与が、肝臓内投与である、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１３】
前記発現系の末梢投与が、皮下投与である、請求項１〜１１２のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１４】
前記カテコールアミン機能障害が、カテコールアミン欠乏である、請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１５】
前記カテコールアミン欠乏が、ドパミン欠乏である、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１６】
前記カテコールアミン機能障害に関連する前記疾患が、中枢及び／又は末梢神経系の疾患、障害又は損傷である、請求項１〜１１５のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１７】
前記中枢及び／又は末梢神経系の前記疾患、障害又は損傷が、神経変性障害である、請求項１〜１１６のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１８】
前記カテコールアミン機能障害に関連する前記疾患が、基底核の疾患である、請求項１〜１１７のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１１９】
パーキンソン病（ＰＤ）、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）などのジスキネジア、ＤＯＰＡ反応性ジストニア、ＡＤＨＤ、統合失調症、うつ病、血管性パーキンソン症候群、本態性振戦、慢性ストレス、遺伝子性ドパミン受容体異常、慢性オピオイド、コカイン、アルコール又はマリファナ使用、副腎不全、高血圧、低血圧、ノルアドレナリン欠乏、心的外傷後ストレス障害、病的ギャンブル障害、認知症、レビー小体型認知症及び遺伝性チロシンヒドロキシラーゼ欠乏からなる群から選択される疾患の処置方法における使用のための、請求項１〜１１８のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１２０】
パーキンソン病、例えば多系統萎縮症などの状態を含む異型性パーキンソン病、進行性核上性麻痺、血管性若しくは動脈硬化性パーキンソン病、薬物誘導性パーキンソン症候群及びＧＴＰシクロヒドロラーゼ１欠乏並びに／又はドパミン欠乏による任意のジストニア性疾病などの疾病の処置方法における使用のための、請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１２１】
前記神経変性障害が、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物。
【請求項１２２】
患者の血中でＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法であって、前記方法は、請求項１〜１２１のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物を前記患者へ投与することを含む、方法。
【請求項１２３】
Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）の発生を低減、遅延及び／又は予防する方法であって、前記方法は、請求項１〜１２２のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物を、必要とする患者へ末梢投与することを含む、方法。
【請求項１２４】
血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を得る、そして／又は維持する方法であって、前記方法は、前記発現系、宿主細胞、又は医薬組成物を末梢投与することを含む、方法。
【請求項１２５】
血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を得る、そして／又は維持する方法であって、前記方法は、発現の際に、少なくとも１種の治療性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを末梢投与することを含み、前記少なくとも１種の治療性ポリペプチドがチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体である、方法。
【請求項１２６】
パーキンソン病又はＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアなどのカテコールアミン機能障害の処置又は防護の方法であって、前記方法は、請求項１〜１２５のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞、又は医薬組成物発現系を末梢投与することを含む、方法。
【請求項１２７】
前記発現系が、分離式肢灌流により投与される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記分離式肢灌流が、筋肉内又は静脈内に前記発現系を注射する少なくとも１つのステップを含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記発現系、前記宿主細胞又は前記医薬組成物が、筋肉内へ少なくとも２回注射される、請求項１２５〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記発現系、前記宿主細胞又は前記医薬組成物が、静脈へ少なくとも１回注射される、請求項１２５〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
請求項１〜１３０のいずれか１項に記載の発現系、宿主細胞及び／又は医薬組成物を含むキット、及び使用説明書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願で引用された全ての特許及び非特許参考資料は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、標的細胞中で差示的に発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現系であって、カテコールアミン機能障害に関連する医療状態、特にパーキンソン病及びＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアをはじめとする関連の障害などのドパミン欠乏に関連する疾患を処置するために必要とする患者へ末梢投与される、発現系に関する。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、臨床的には安静時振戦、強剛、随意運動の緩慢、及び姿勢不安定を特徴とする一般的な神経変性疾患である。黒質緻密部（ＳＮｐｃ）内のドパミン作動性ニューロン、ニューロン内細胞質封入体又は「レビー小体」の喪失、グリオーシス、及び線条体ドパミン欠損が、主な神経病理学的所見である。症例の１０％を占める特異的遺伝子欠損に関係する遺伝性の症例を除き、ＰＤは、原因不明の散発性疾病である。
【０００４】
ドパミンは、血液脳関門を通過しない。線条体ドパミン欠損は、ドパミンの末梢投与によって解決することができない。ドパミン（ＤＡ）前駆体Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）での治療が、パーキンソン病への最も有効な処置である。しかし処置の応答は、最初は優れているが、数年経過すると、ほとんどの患者がＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアなどの治療関連の有害作用を発症する（Obeso, Olanow, & Nutt, 2000）、（Ahlskog & Muenter, 2001）。これらの合併症は、線条体ニューロン上の過感受性ＤＡ受容体の間欠的かつパルス状の刺激により生じると考えられている（Chase, 1998）、（Nutt, Obeso, & Stocchi, 2000）。
【０００５】
黒質ドパミンニューロンは、およそ４サイクル／秒の一定速度で持続性に発火する。このバックグランド発火は、食物などの予期されない、又は有益な刺激の提供の際に相動性バーストにより一時的に中断される。神経伝達物質の放出量は一般に、ニューロン発火の速度を反映するため、線条体ドパミン濃度はかなり狭い範囲内になり、黒質線条体シナプスでのドパミン受容体はかなり安定した濃度の同族の神経伝達物質に暴露される。黒質線条体ドパミン作動性ニューロンの除神経が増加すると、外因性ＤＯＰＡから形成される線条体ドパミンへの暴露がますます短時間になり、ドパミン濃度の相対的上昇及び降下が、生理学的に生じる振幅よりも大きな振幅を生じる。早期疾患の場合、経口投与の際に結果として生じるＤＯＰＡの送達における必然的な可変性は、大部分が気づかなくなり、ほとんどの患者が、持続的な効果を感じる。この安定した反応は、残りのドパミン作動性ニューロンの能力を反映して、外因性ＤＯＰＡを長期間の運動反応に変換する。これらの観察は、初期パーキンソン病における黒質ドパミン作動性ニューロンの適切な残存補体の存在が線条体を脳ＤＯＰＡの変遷から防護する、という概念と一致する。
【０００６】
処置が続くにつれ、Ｌ−ＤＯＰＡの薬物動態特性で、より大きな臨床関連性が推測され始め、９０分の半減期から予測されたより短期の運動反応が、明白になる。
【０００７】
Ｌ−ＤＯＰＡの十二指腸（Syed, Murphy, Zimmerman, Mark, & Sage, 1998）、（Nyholm et al., 2003）若しくは静脈内（Mouradian, Heuser, Baronti, & Chase, 1990）輸液、又はＤＡ受容体アゴニストアポモルフィンの皮下輸液（Poewe & Wenning, 2000）を利用した継続的なＤＡ受容体刺激が、パーキンソン病患者における異常な不随意運動の頻度及び重症度を著しく低減することが示された。
【０００８】
経皮管及び携帯ポンプを介した十二指腸へのレボドパ／カルビドパのゲル配合剤の連続送達が、経口薬物療法よりも一定した血漿濃度をもたらす。治療薬（Duodopa）が、ＵＳＡで、そして希少疾病用医薬品免除の下、ＥＵで認可され、現在およそ８００名の患者で用いられている。この治療薬のエビデンスベースは、依然として進展しつつある。Nyholmは、無作為化クロスオーバー試験を実施して、重度のジスキネジアのオフ期間（off periods）及びオンタイム（on time）の低減における経口多剤療法を越える十二指腸レボドパ輸液の優越性を立証した（Nyholm et al., 2005）。この兆候の効果は、非盲検試験において確認された（Nilsson, Nyholm, & Aquilonius, 2001）、（Nyholm et al., 2008）。より近年になり、（Antonini, Chaudhuri, Martinez-Martin, & Odin, 2010）で、進行したパーキンソン病の患者９名における健康関連の生活の質に及ぼす該治療の長期影響が前向きに評価された。該治療は、オフ期間及びジスキネジアの日常的な持続時間を有意に短縮させた。これにより、ＰＤＱ−３９の４つのドメイン（運動性、ＡＤＬ、恥辱及び身体的不快感）における有意な改善が得られた（Wolters, Lees, Volkmann, van Laar, & Hovestadt, 2008）。
【０００９】
ＰＤのためのDuodopaの薬物動態・薬力学的試験から、１．５５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−Ｄｏｐａの５０％の効果の濃度が示された（Westin et al., 2011）。レボドパメチルエステルの腸内輸液を利用した類似の試験で、血漿レベル３０００〜４０００ｎｇ／ｍｌのレボドパによるＰＤ及びジスキネジアのコントロール改善が実現された。
【００１０】
パーキンソン病の脳へのウイルスベクターの直接注射が、脳の特異的標的部位、即ちＤＡが欠如した線条体を中心とするＬ−ＤＯＰＡの連続的かつ局所的産生をもたらす。ＤＡ合成酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の線条体内遺伝子導入を利用したインビボ遺伝子療法による局所Ｌ−ＤＯＰＡ送達が、パーキンソン病の潜在的な治療的介入として探究された（Horellou et al., 1994） （Kaplitt et al., 1994）。ＴＨの発現がＴＨの補因子であるテトラヒドロビオプテリンの外因性投与、又は律速合成酵素であるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の共発現と組み合わせない限り、ＤＯＰＡ産生レベルが非常に低くなることが示された（Mandel, Spratt, Snyder, & Leff, 1997）、（Bencsics et al., 1996）、（Corti et al., 1999）。これまでで最も有望な長期結果は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを用いて得られた（Mandel et al., 1998）、（Kirik, Rosenblad, & Bjorklund, 1998）、（Szczypka et al., 1999）。線条体ＤＯＰＡ産生のレベルが、臨界閾値を超えていることを条件に、ＴＨ及びＧＣＨ１のための遺伝子をコードする高力価ｒＡＡＶベクターの線条体内注射が、６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）の注射によりパーキンソン病様にされたラットにおいて顕著な行動回復を提供する可能性が示された（Kirik et al., 2002）。さらなる試験で、線条体におけるＤＯＰＡ合成酵素、ＴＨ及びＧＣＨ１のｒＡＡＶ介在性発現が、ラットパーキンソン病モデルにおいてＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアを排除し得ることが示された。ｒＡＡＶ−ＴＨ及びｒＡＡＶ−ＧＣＨ１ベクターによるインビボ遺伝子療法は、二重の作用：（ｉ）全身の間欠的Ｌ−ＤＯＰＡ処置により誘発されるジスキネジアの軽減；及び（ｉｉ）自発的な運動行動における病変誘発性欠損のほぼ完全な回復、を有する。これらの変化は、線条体オピオイド遺伝子発現の正常化、及び異常なＤＦｏｓＢ発現の回復に関連し、両者ともＬ−ＤＯＰＡ処置により誘発された不適応な可塑性のマーカーと見なされている（Carlsson et al., 2005）。
【００１１】
パーキンソン病のための改善された処置が、介入的脳手術、長期の静脈輸液を必要としない経路、又は経皮内視鏡胃瘻造設チューブの外科的移植を必要とする経路により、Ｌ−ＤＯＰＡの長期の一定した投与を可能にするが、各投与経路に関連するリスク及び合併症を伴う。
【００１２】
意図される使用部位での直接の生成は、複数の利点（用量の要件が最少であること及び末梢作用を含まないこと）を有するが、投与経路は、神経外科術を必要とする。線条体注射の必要性により、臨床適用が介入により利益を受けると予測される患者の一部へ限定され得る。現在は、全ての適格な患者がそのような方法により確実に処置され得るには不十分な神経外科施設及び神経外科医が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
治療レベル又は治療以下のレベルのＬ−ＤＯＰＡを直接連続で末梢循環へ分泌すれば、摂取された食物による消化管内での望ましくないデカルボキシル化及び不調和な吸収、ヘリコバクターピロリ感染、消化管の運動性及び胃の酸性度の変動、食物中の中性アミノ酸から胃壁を通した吸収での競合、並びに消化管フローラにより形成されたＤＯＰＡ代謝産物など、腸内投与に関連する問題が回避されよう。
【００１４】
治療レベルのＬ−ＤＯＰＡを血管系へ直接連続分泌するのが最適であり得るが、治療以下のレベルの連続分泌でさえも有意義であり得、したがって線条体ドパミンの十分な一定したバックグランドレベルが促されて、ジスキネジアの発症が予防又は遅延されて、有効性に必要な経口Ｌ−ＤＯＰＡ補助物質の用量が最小限に抑えられる。
【００１５】
消化管を介した、又は非経口でのＬ−ＤＯＰＡの連続輸液よりむしろ、肝臓又は筋肉などの１つ又は複数の組織によりＬ−ＤＯＰＡを末梢循環へ連続分泌させることが提案される。これは、Ｌ−ＤＯＰＡを可能にする遺伝子を標的組織へ導入することにより実現される。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）は、Ｌ−ＤＯＰＡへのチロシンのヒドロキシル化を触媒し、補因子としてのテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を必要とする。ＢＨ４の生合成は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）を必要とする場合がある。
【００１６】
末梢循環へＬ−ＤＯＰＡレベルを分泌すれば、パーキンソン病などのドパミン欠乏による病気では経口Ｌ−ＤＯＰＡ又はドパミンアゴニストなどの他の形態のドパミン作動性療法の必要性が低減する。最適レベルのＬ−ＤＯＰＡ分泌は、追加的なドパミンアゴニストの必要性を排除するであろう。Ｌ−ＤＯＰＡ分泌が最適レベル未満であっても、追加的なアゴニストの用量を低減するであろう。これにより、経口若しくは非経口のＬ−ＤＯＰＡ若しくは非経口のＬ−ＤＯＰＡ若しくはドパミンアゴニスト、又はドパミン欠乏のための他の処置の利用に関連する有害事象が低減し得る。
【００１７】
Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア及びオン／オフ症候群などの経口及び非経口Ｌ−ＤＯＰＡ療法及びドパミン作動性アゴニストの厄介な合併症は、経口又は非経口投与後のこれらの薬剤の薬物動態ピーク及びトラフ値の高下によるものと考えられている。治療レベル又は治療以下レベルでの末梢循環へのＬ−ＤＯＰＡの一定分泌を実現すれば、血漿Ｌ−ＤＯＰＡのベースラインレベルの上昇が確定され、追加的なドパミン作動薬の用量低減が促され、これによりピーク−トラフ変動が低減されるであろう。
【００１８】
本発明の目的は、現在の処置戦略が不十分である、又は現在の処置が重度の副作用に関連する、及び／若しくは処置された個体が前記処置への抵抗性を発症するような障害の処置のための新しい分子ツールを開発することであった。より具体的には本発明は、カテコールアミン生合成に関与する酵素レベルを調節し、これにより必要とする対象における正常なカテコールアミンバランスに向けて回復する方法において有用となる、新規な発現構築物に関する。
【００１９】
詳細には本発明は、患者の大部分が長期処置の間に処置応答の減少及び有害事象増加を経験する神経障害、好ましくは非治癒性変性神経障害の処置方法における前記発現構築物の使用に関する。
【００２０】
本発明は第一に、現在の処置戦略にＬ−ＤＯＰＡ又は他のドパミン受容体刺激剤の投与が含まれる、パーキンソン病及びＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）の処置に関する。現行の処置レジメンは、主に疾患の初期段階で効率的であるが、長期処置の間に、ほとんどの患者がＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアを発症する。ジスキネジアの発症は、Ｌ−ＤＯＰＡ又は他のドパミン受容体刺激剤の非連続送達に関連すると考えられる。したがって本発明の主な目的は、必要に応じて局所的に、そして任意の有害作用を減少させる連続速度で、特にパーキンソン病の処置に必要となる該化合物を供給することにより、現在の処置を洗練することである。
【００２１】
本発明は、Ｌ−ＤＯＰＡの全身レベルを調節するために末梢組織へ投与される発現系を含む発現系に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
一態様において、本発明は、
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び／或いは
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、
を含む発現系に関する。
【００２３】
一態様において、本発明は、
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第一のプロモーターに動作可能に結合された第一のポリヌクレオチド（Ｎ１）であって、該生物活性がＧＣＨ１の酵素活性である、第一のポリヌクレオチド（Ｎ１）、及び
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第二のプロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチド（Ｎ２）であって、該生物活性がＴＨの酵素活性である、第二のポリヌクレオチド（Ｎ２）、及び
発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第三のプロモーターに動作可能に結合された第三のポリヌクレオチド（Ｎ３）であって、該生物活性がＰＴＰＳの酵素活性である、第三のポリヌクレオチド（Ｎ３）、
を含む発現系に関する。
【００２４】
一態様において、本発明は、本明細書の先に定義された発現系により形質導入又はトランスフェクトされる、単離された宿主細胞に関係する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、本明細書の先に定義された発現系と、場合により医薬的に許容し得る塩、担体又はアジュバントと、を含む医薬組成物に関係する。
【００２６】
一態様において、本発明は、医療使用のための本明細書の先に定義された発現系に関する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置方法における使用のために、末梢へ投与される、即ちＣＮＳの外部へ投与される、本明細書の先に定義された発現系に関係する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、発現の際に、
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び／或いは
ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
からなる群から選択される１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む発現系であって、
カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置の方法における使用のために末梢に投与される、発現系に関係する。
【００２９】
本発明は、本明細書の先に定義された発現系の、必要なヒトへの末梢投与（即ち、ＣＮＳの外部への投与）を含む、血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法に関係する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、本明細書の先に定義された発現系の治療有効量を、必要とするヒトへ、必要とする患者へ末梢投与することを含む、カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置及び／又は予防の方法に関係する。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、患者の血中でＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法であって、本明細書の先に定義された発現系を、前記患者へ投与することを含む、方法に関係する。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書の先に定義された発現系を、必要とする患者へ末梢投与することを含む、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）の発生を低減、遅延及び／又は予防する方法に関係する。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、発現の際に、少なくとも１種の治療性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現系を末梢投与することを含む、血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を得る、そして／又は維持する方法であって、該少なくとも１種の治療性ポリペプチドがチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体である、方法に関係する。
【００３４】
一態様において、本発明は、先に定義された医薬組成物及び使用説明書を含むキットに関係する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｌ−ＤＯＰＡ生合成の概要
【図２】肝臓における連続Ｌ−ＤＯＰＡ合成のためのＡＡＶベクター。Ａ）バイシストロン性ベクター：ＩＴＲ＝逆位末端反復配列、ＬＰ１＝肝臓プロモーター／エンハンサー１、ＨＬＰ＝ハイブリッド肝特異性プロモーター（McIntosh J et. al Blood 2013 121(17) 3335-3344参照）、ｔＴＨ＝トランケート型チロシンヒドロキシラーゼ（配列番号：２４）、ＧＣＨ１＝ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（配列番号：２０）、ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（配列番号：２８又は２９）、Ｂ〜Ｅ）モノシストロン性ベクター。ＨＬＰ：ＬＰ１と等しい強さの短い肝特異性プロモーター（McIntosh J et al, Blood. 2013 Apr 25;121(17):3335-44）。
【図３】動物試験。Ａ）マウスを６匹からなる群３つに無作為に割り付けた。１日目に動物は、表Ａ）に詳述された通り、それぞれ非処置（ナイーブ）又はウイルスベクターのいずれかを受けた。Ｂ）マウスを、２匹からなる群２つに無作為に割り付けた。１日目に動物は、表Ｂ）に詳述された通り、ウイルスベクターを受けた。Ａ）及びＢ）：２８日目にマウスは、Ｌ−ＤＯＰＡのデカルボキシル化を遮断するための１０ｍｇ／ｋｇベンセラジドと、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによるＬ−ＤＯＰＡの代謝を遮断するためのＣＯＭＴ阻害剤と、を受け、その１時間後に殺処分されて、Ｌ−ＤＯＰＡアッセイ用の血漿及び免疫組織化学検査用の肝臓を採取された。ＣＯＭＴ阻害剤の意図する用量は、Ｌ−ＤＯＰＡアッセイのための殺処分及び血漿採取の４時間及び１時間前に２回投与されたトルカポン３０ｍｇ／ｇであった。Ｃ）実験構成の図：２８日目の殺処分及び臓器回収の１時間前の、尾静脈注射と、それに続く低用量のベンセラジド及びエンタカポン。
【図４】ＧＣＨ１染色。Ａ）図３Ａに関連して記載された通り、ナイーブマウス、又は７．０２×１０１０ｖｇ／マウスの総用量の発現ベクターｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１及び／又はｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＴＨで処置されたマウスからの肝臓切片。切片から、１％未満の形質導入が実証される。Ｂ）図３Ｂに関連して記載された通り、ナイーブマウス、又は３．６×１０１２ｖｇ／マウスの総用量の発現ベクターｓｃＡＡＶ−ＨＰＬ−ＧＣＨ１及びｓｃＡＡＶ−ＨＰＬ−ｔＴＨで処置されたマウスからの肝臓切片。切片から、約２５％の形質導入が実証される。
【図５】動物試験−マウス血漿Ｌ−ＤＯＰＡ濃度。マウスにおける血漿Ｌ−ＤＯＰＡレベル。Ａ）は、平均Ｌ−ＤＯＰＡレベルを示す表であるが、Ｂ）は、試験された全てのマウスのＬ−ＤＯＰＡレベルを表示したプロットを示す。群を以下の通り処置した：Ａ：ベクターなし（対照）Ｂ：ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＴＨ（３．５×１０１０）＋ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１（３．５×１０１０）Ｃ：ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＴＨ（７．０×１０１０）Ｄ：ｓｃＡＡＶ  ＨＬＰ−ｔＴＨ（１．８×１０１２）＋ｓｃＡＡＶ  ＨＬＰ−ＧＣＨ１（１．８×１０１２）Ｅ：ｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ｔＴＨ（３．６×１０１２）ベクターは、静脈内注射により投与した。投与の２８日後、ベンセラジド（１０ｍｇ／ｋｇ）及びエンタカポンでの処置の１時間後に、血漿を採取した。
【図６】動物試験−Ｈ＆Ｅ染色。図３Ｂに関連して記載された通り、ナイーブマウス、又は３．６×１０１２ｖｇ／マウスの総用量の発現ベクターｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ＧＣＨ１及び／又はｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ｔＴＨで処置されたマウスからの肝臓切片を、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。染色から、組織損傷又は白血球浸潤の兆候は示されない。
【図７】バイシストロン性構築物の相同組換え。バイシストロン性ＩＴＲ−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ−ＷＰＲＥ−ＩＴＲベクターの生成の際に、共通するＬＰ１部位での相同組換えはまた、モノシストロン性ＩＴＲ−ＬＰ１−ｔＴＨ−ＷＰＲＥ−ＩＴＲの生成をもたらす。
【図８】トリシストロン性発現系。図は、本発明の発現系の例を示している。この系は、トリシストロン性である。ＴＨ遺伝子は、構成プロモーターＥＦ−１αの制御下にあり、ＩＲＥＳ及び６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）をコードする配列を含む。ＩＴＲ：逆位末端反復配列。ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
バイシストロン性：本明細書で用いられる用語「バイシストロン性」は、発現系、ベクター又はプラスミドを指し得る。バイシストロン性プラスミド又はベクターは、１つのプラスミド又はベクターの中に２つの遺伝子を含む。バイシストロン性発現系は、少なくとも１つのバイシストロン性プラスミド又は少なくとも１つのバイシストロン性ベクターを含む発現系を指す。
【００３７】
生物活性：本発明の発現系構築物によりコードされる酵素に関連して本明細書で用いられる場合の用語「生物活性」は、前記酵素の酵素活性を指し、特定の酵素反応を触媒する能力を意味する。詳細には生物活性は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ（ＧＣＨ−１）若しくは６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）の酵素活性、又は本開示の発現系によりコードされ、治療効果の実現を支援し得る任意の他の酵素を指し得る。
【００３８】
生物活性断片：本明細書で用いられる用語「生物活性断片」は、全長ポリペプチドの生物活性を共有する酵素をはじめとするポリペプチドの一部を指す。該断片の生物活性は、ネイティブ全長ポリペプチドの酵素活性よりも小さく、大きく、又はそれと等しくなり得る。ポリペプチドの生物活性断片は、配列番号：１、２、３、４、５、６、４０、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８の任意の１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する断片を包含する。所与のポリペプチドの生物活性断片はまた、前記ポリペプチドのアミノ酸残基の３０％以下が欠失された、前記ポリペプチドのアミノ酸残基の２９％以下など、例えば２８％以下、２７％以下など、例えば２６％以下、２５％以下など、例えば２４％以下、２３％以下など、例えば２２％以下、２１％以下など、例えば２０％以下、１９％以下など、例えば１８％以下、１７％以下など、例えば１６％以下、１５％以下など、例えば１４％以下、１３％以下など、例えば１２％以下、１１％以下など、例えば１０％以下、９％以下など、例えば８％以下、７％以下など、例えば６％以下、５％以下など、例えば４％以下、３％以下など、例えば２％以下、１％以下などが欠失された断片を包含する。
【００３９】
生物活性変異体：本明細書で用いられる用語「生物活性変異体」は、ネイティブ全長タンパク質と同じ生物活性を有する、酵素などのタンパク質のポリペプチド部分を指す。該断片の生物活性は、ネイティブ全長ポリペプチドの酵素活性よりも小さく、大きく、又はそれと等しくなり得る。
【００４０】
カテコールアミン機能障害：本明細書で用いられる用語カテコールアミン機能障害は、健常個体の同じパラメータと比較した、カテコールアミンの合成、調節、貯蔵、放出、取込み又は代謝の異常を指す。特に、該カテコールアミン機能障害は、ドパミン欠乏などのドパミン機能障害である。当業者は、カテコールアミン機能障害を診断することが可能である。
【００４１】
認知障害：本明細書で用いられる用語「認知障害」は、錯乱、忘却及び集中困難に関連する精神機能の低下を伴う状態を指す。
【００４２】
発現：用語ポリペプチドをコードする核酸配列の「発現」は、タンパク質の産生をもたらす、ｍＲＮＡとしての核酸配列の転写、並びに／又はその核酸配列の転写及び翻訳を意味する。
【００４３】
発現カセット：本明細書で用いられる用語「発現カセット」は、インビボでタンパク質の合成をもたらすのに必要な全てのエレメントを提供するゲノム配列を指す。これには、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を誘導する配列、即ちプロモーター配列、該当するタンパク質のためのゲノム配列を含むオープンリーディングフレーム、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする３’非翻訳領域を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４４】
発現系：本明細書で用いられる用語「発現系」は、遺伝子産物、詳細にはポリペプチドの産生のために特異的に設計された系を指す。発現系は、発現の際にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。発現系は、ウイルスベクターなどのベクター、例えばＡＡＶベクター構築物であり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
哺乳動物細胞中で機能的：本明細書で用いられる用語「哺乳動物細胞中で機能的」は、哺乳動物細胞へ導入されると、生物活性ポリペプチド内への翻訳をもたらす配列、例えば発現系などのヌクレオチド配列を意味する。
【００４６】
ＨＬＰ：本明細書で用いられる用語「ハイブリッド肝特異性プロモーター」又は「ＨＬＰ」は、McIntosh J et. al Blood 2013 121(17) 3335に記載されたプロモーターを指す。本発明のＨＬＰは、ヒト肝特異性エンハンサー、ヒト肝特異性プロモーター、及び修飾されたイントロンを含む。一実施形態において、該ＬＰ１は、配列番号：４５のポリヌクレオチド配列、又はその生物活性断片若しくは変異体を有する。
【００４７】
相同性：本出願の目的では、本明細書で用いられる用語、配列「相同性」及び「相同的な」配列は、配列「同一性」及び「同一の」配列と等しいと理解されなければならない。
【００４８】
ＬＰ１：本明細書で用いられる用語「肝臓プロモーター／エンハンサー１」又は「ＬＰ１」は、Nathwani AC et al. Blood. 2006;107(7):2653-2661、及びMiao HZ et al. Blood. 2004;103(9):3412-3419に記載されるプロモーターを指す。本発明者のＬＰ１は、トランケート型肝特異性エンハンサー及びトランケート型肝特異性プロモーターを含む。一実施形態において、該ＬＰ１は、配列番号：３９のポリヌクレオチド配列、又はその生物活性断片若しくは変異体を有する。
【００４９】
動作可能に結合された：本明細書で用いられる用語「動作可能に結合された」は、該当する１つ又は複数のポリペプチドをコードする核酸配列及び転写調節配列が、細胞に導入された時に該核酸配列の発現を可能にするような方法で連結されていることを示す。
【００５０】
末梢投与：本明細書で用いられる用語「末梢投与」は、中枢神経系（ＣＮＳ）に関係する末梢を指す。詳細には末梢投与は、骨格筋及び肝臓組織への投与を指す。当業者は、医薬組成物及びその原材料を前記組織へ投与する手段を熟知している。
【００５１】
医薬組成物：又は薬物、薬品若しくは薬剤は、患者へ適当に投与された時に、所望の治療効果を誘発することが可能な任意の化学的又は生物学的材料、化合物、又は組成物を指す。一部の薬物は、不活性形態の固体であり、インビボで医薬活性を有する代謝産物へ変換される。本発明の目的では、用語「医薬組成物」及び「薬品」は、不活性薬物及び活性代謝産物の両方を包含する。
【００５２】
プラスミド：用語「プラスミド」は、本明細書ではベクター内で裸になり得る、又は包まれ得るポリヌクレオチドを指す。本開示において、プラスミドは、好ましくは転移された細胞の染色体ＤＮＡから物理的に分離されており、独立して複製し得る。幾つかの実施形態において、本開示の発現系は、当該技術分野で公知の通り裸である、即ちベクターに包まれていないか、又は包まれている、１つ又は複数のプラスミドを含む。
【００５３】
ポリペプチド：本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸を含む分子を指す。該アミノ酸は、天然又は合成であり得る。「オリゴペプチド」は、本明細書では１００アミノ酸長以下のポリペプチドであると定義される。用語「ポリペプチド」は、タンパク質、即ち少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子を含むものとし、少なくとも２種のポリペプチドを含む場合、これらは複合体を形成し得るか、共有結合でつながり得るか、又は非共有結合でつながり得る。タンパク質内の該ポリペプチドは、グリコシル化され得、そして／又は脂質付加され得、そして／又は補欠分子族を含み得る。
【００５４】
ポリヌクレオチド：本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、鎖の中で共有結合されたヌクレオチドモノマーで構成された有機ポリマー分子である分子を指す。本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つの核酸を含む分子を指す。該核酸は、天然由来又は修飾されたもの、例えば架橋型人工核酸（ＬＮＡ）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）などであり得る。本明細書で用いられるポリヌクレオチドは一般に、
ｉ）所定のコード配列を含むポリヌクレオチド、又は
ｉｉ）所定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は
ｉｉｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）若しくは（ｉｉ）によりコードされたポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記断片が本明細書で指定された少なくとも１種の所定の活性を有する、ポリヌクレオチド、並びに
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のうちの任意の１つに定義されたポリヌクレオチドとハイブリダイズし、本明細書で指定された少なくとも１種の所定の活性を有するポリペプチド又はその断片をコードする、相補鎖のポリヌクレオチド、並びに
ｖ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のヌクレオチド配列に変性するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
或いはそのようなポリヌクレオチドの相補鎖、
に属する。
【００５５】
プロモーター：本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域を指す。したがってプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの初期結合部位として作用するオペロンの領域である。プロモーターは、典型的には同じ鎖及び上流でそれらが調節する遺伝子の付近に位置する。本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、古典的なプロモーターの構造に限定されず、上記の機能を有するヌクレオチド配列の領域として理解されなければならない。
【００５６】
トリシストロン性：本明細書で用いられる用語「トリシストロン性」は、発現系、ベクター又はプラスミドを指し得る。トリシストロン性プラスミド又はベクターは、１つのプラスミド又はベクター内に３つの遺伝子を含む。トリシストロン性発現系は、少なくとも１つのトリシストロン性プラスミド又は少なくとも１つのトリシストロン性ベクターを含む発現系を指す。
【００５７】
ベクター：本発明によるベクターは、外来遺伝子材料を別の細胞に転移するビヒクルとして用いられるＤＮＡ分子である。ベクターの４つの主な型が、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体である。
【００５８】
ウイルスベクター：ウイルスベクターは、カプシド及びゲノムを含むウイルス粒子と理解されるべきである。ゲノムは、典型的にはカプシドに封入されている。
【００５９】
発現系
一定した基礎的Ｌ−ＤＯＰＡの末梢産生及び循環内への分泌は、ＰＤを処置するために現在用いられている治療方式である経皮胃瘻造設術を介して小腸内に一定の輸液と類似の治療効果を実現し得る。
【００６０】
本発明を支持する論拠は、パーキンソン病、又はＬ−ＤＯＰＡの内因性末梢分泌の増加が示され得る任意の他の病気、例えば遺伝性チロシンヒドロキシラーゼ欠乏（Wevers et al., 1999）及び下肢静止不能症候群などの患者の全身循環へのＬ−ＤＯＰＡの連続日中又は連続２４時間分泌を提供することである。
【００６１】
本発明は、パーキンソン病、又はチロシンヒドロキシラーゼ欠乏若しくは下肢静止不能症候群をはじめとする別の病気の処置において治療的に有用になるのに十分な循環Ｌ−Ｄｏｐａの基礎レベルを産生する末梢組織の形質導入又はトランスフェクションである。
【００６２】
末梢組織の形質導入は、チロシンをＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）に変換することが可能な酵素を標的末梢組織に産生させる遺伝子材料を転移する発現系からなる遺伝子療法系の投与により実現される。発現系は、本明細書の以下に詳述される通り、１つ又は複数のベクターとして提供され得る。好ましくは該発現系は、少なくとも３つのポリペプチド、即ちＴＨ、ＧＣＨ１及びＰＴＰＳの、そして場合により第四のポリペプチドの発現を可能にする。幾つかの実施形態において、該発現系は、２つのバイシストロン性ベクター又はプラスミドとして提供される。他の実施形態において、該発現系は、場合によりモノシストロン性ベクター又はプラスミドを有する、トリシストロン性ベクター又はプラスミドとして提供される。他の実施形態において、該発現系は、３つ又は４つのモノシストロン性ベクター又はプラスミドとして提供される。
【００６３】
本発明の発現系により標的とされる細胞は、好ましくは少なくとも成体対象において、低い細胞ターンオーバーを有する細胞であり得る。理論に束縛されるものではないが、これは、本開示のベクター又はプラスミドが標的細胞の染色体ＤＮＡに取り込まれないため、該ベクター又はプラスミドが細胞分化ごとに希釈されると考えられるためである。したがって、細胞が再生するにつれ、治療効果が次第に薄れると予測される。本発明の発現系を用いた遺伝子療法にとって特に有利な標的になり得る細胞は、筋肉細胞、特に横紋筋細胞及び肝臓細胞である。
【００６４】
例えば本発明は、少なくとも１つの、例えば２つのアデノ随伴ウイルスベクターセロタイプ８（肝臓の形質導入を標的とする）を含み、ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（例えば、ｈＴＨ２）をコードする遺伝子配列を送達する発現系に基づく遺伝子療法の形態をとり得る。該ゲノムをトランスフェクトすることで、ＴＨ遺伝子配列の上流に肝特異性プロモーターを含み得、ＴＨ遺伝子配列の下流に最大発現のためのウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み得る。処置は、好ましくは経口補助物質の、又はＧＰＴ−シクロヒドロラーゼ−１（ＧＣＨ１）遺伝子のコトランスフェクションにより内因的に産生されるテトラヒドロビオプテリンの供給を必要とする。コトランスフェクションにより、経口補充の必要性が除外されるが、経口補充への依存は、トランスフェクション部位での「ターンオフ」Ｌ−ＤＯＰＡ産生の能力を提起するが、これは、毒性を管理すること、又は夜間のＬ−ＤＯＰＡ産生を減少させる期間を提供することが望ましくなければならない。ＧＣＨ１が必要とされる程度は、標的組織の型に応じて変動し得る（例えば肝臓組織は、横紋筋組織に比較してより高い内因性レベルのＧＣＨ１を有する）。好ましい実施形態において、処置はまた、７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸塩から６−ピルボイルテトラヒドロプテリン及び三リン酸塩への変換を触媒する６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）の供給を必要とする。好ましくはＰＴＰＳは、本明細書に記載されたＰＴＰＳ遺伝子のコトランスフェクションにより内因的に産生される。
【００６５】
別の実施形態において、該発現系は、少なくとも１つ、例えば２つのアデノ随伴ウイルスベクターセロタイプ１（横紋筋を標的とする）を含み得る。そのような実施形態において、発現系内に含まれるポリヌクレオチドに結合されたプロモーターのいずれも、筋肉特異性であり得る。筋細胞、特に成熟した横紋筋細胞のターンオーバーは非常に低いため、筋細胞、特に成熟した横紋筋細胞の標的化は、特に有利であると考えられる。
【００６６】
該発現系は、バイシストロン性であり得、即ち少なくとも１つのバイシストロン性ベクター又はプラスミドを含み得る。該バイシストロン性の系は、モノシストロン性ベクター又はプラスミドをさらに含み得る。或いは該発現系は、トリシストロン性であり得、即ち少なくとも１つのトリシストロン性ベクター又はプラスミドを含み得る。該トリシストロン性の系は、モノシストロン性ベクター又はプラスミドをさらに含み得る。
【００６７】
現行の経口Ｌ−ＤＯＰＡ薬物治療と同様に、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、ベンセラジン（benserazine）又はカルビドパ）は、好ましくはドパミンへのＬ−ＤＯＰＡの末梢変換を遮断し、これにより耐容性及び線条体への生物学的利用性を改善するために投与される。
【００６８】
一態様において、本発明は、
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び／或いは
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、
を含む発現系に関する。
【００６９】
一態様において、本発明は、
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第一のプロモーターに動作可能に結合された第一のポリヌクレオチド（Ｎ１）であって、該生物活性がＧＣＨ１の酵素活性である、第一のポリヌクレオチド（Ｎ１）、及び
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第二のプロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチド（Ｎ２）であって、該生物活性がＴＨの酵素活性である、第二のポリヌクレオチド（Ｎ２）、及び
発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第三のプロモーターに動作可能に結合された第三のポリヌクレオチド（Ｎ３）であって、該生物活性がＰＴＰＳの酵素活性である、第三のポリヌクレオチド（Ｎ３）、
を含む発現系に関する。
【００７０】
一態様において、本発明は、
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び／或いは
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、
を含む発現系に関する。
【００７１】
一実施形態において、本発明の発現系は、
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第一プロモーターに動作可能に結合された第一のポリヌクレオチド、及び
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第二のプロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチド、
を含む。
【００７２】
一実施形態において、本発明の発現系は、
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第一のプロモーターに動作可能に結合された第一のポリヌクレオチド、及び
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第二のプロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチド、及び
発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、第三のプロモーターに動作可能に結合された第三のポリヌクレオチド、
を含む。
【００７３】
一態様において、本発明は、発現の際に、
−  チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び
−  ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするヌクレオチド配列を含むバイシストロン性発現系に関する。
【００７４】
本開示全体を通して、用語「第一」、「第二、「第三」及び「第四」が特定の序列を指すのではなく、代わりに明瞭にするために用いられていることは、理解されよう。したがって、幾つかの実施形態の第三のポリヌクレオチドは、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドの間に位置し得る。
【００７５】
本発明のバイシストロン性発現系は、疾患及び障害の処置のために、ヒトなどの個体に投与するのに適する。
【００７６】
したがって一態様において、本発明は、医療使用のための本明細書の先に定義された発現系に関する。
【００７７】
本発明の発現系は、カテコールアミンレベルの不均衡に関連する、そして／又はそれから生じる、そして／又はそれをもたらす疾患及び障害を処置するのに特に有用である。したがって一態様において、本発明は、カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置方法において使用され、末梢投与される、即ちＣＮＳの外部へ投与される、本明細書の先に定義された発現系に関係する。
【００７８】
即ち、前記態様における本発明は、発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体と、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体と、をコードするヌクレオチド配列を含むバイシストロン性発現系であって、カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置方法において使用され、末梢投与される、即ちＣＮＳの外部へ投与される、バイシストロン性発現系に関係する。
【００７９】
別の態様において、本発明は、発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び／又はＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体からなる群から選択される１つ又は複数のポリペプチドをコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む発現系であって、カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置方法において使用され、末梢投与される、発現系に関係する。
【００８０】
一実施形態において、前記使用のための発現系は、本明細書の先に定義されたバイシストロン性発現系を含む。
【００８１】
該発現系はまた、３つのモノシストロン性発現系、又は１つのモノシストロン性発現系と１つのバイシストロン性発現系、のいずれかの組み合わせであり得る。該発現系が発現の際に４つのポリヌクレオチドをコードする実施形態において、該系は、１つのモノシストロン性発現系と１つのトリシストロン性発現系との組み合わせ、又は２つのモノシストロン性発現系と１つのバイシストロン性発現系の組み合わせ、又は４つのモノシストロン性発現系の組み合わせであり得る。
【００８２】
したがって一実施形態において、本発明の発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び
ｉｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするバイシストロン性発現系、
を含む。
【００８３】
別の実施形態において、本発明の発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と；
ｂ）発現の際に、
ｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００８４】
さらに別の実施形態において、本発明の発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と；
ｂ）発現の際に、
ｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００８５】
一実施形態において、本発明の発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と；
ｂ）発現の際に、
ｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００８６】
したがって一実施形態において、本発明の発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体と、
ｉｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体と、
ｉｉｉ）６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体と、
をコードするトリシストロン性発現系、
を含む。
【００８７】
別の実施形態において、該発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び
ｉｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするバイシストロン性発現系と、
ｂ）発現の際に、
ｉｉｉ）６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００８８】
別の実施形態において、該発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び
ｉｉ）６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするバイシストロン性発現系と、
ｂ）発現の際に、
ｉｉｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００８９】
別の実施形態において、該発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、及び
ｉｉ）６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするバイシストロン性発現系と、
ｂ）発現の際に、
ｉｉｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００９０】
別の実施形態において、本発明の発現系は、
ａ）発現の際に、
ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
ｂ）発現の際に、
ｉｉ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
ｃ）発現の際に、
ｉｉｉ）６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体、
をコードするモノシストロン性発現系と、
を含む。
【００９１】
該発現系は追加として、発現の際に、本明細書の以下に詳述される第四のポリペプチドをコードし得る。
【００９２】
本発明の発現系の使用目的は、本発明の発現系で処置される個体の血液におけるＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を得ること、及び／又は維持することである。
【００９３】
本発明において適用されるＬ−ＤＯＰＡのインビボ生合成に必要とされる酵素置換療法は、３種の酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）及び／又はＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）及び／又は６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）のうちの１つ又は複数を頼りにする。
【００９４】
前記酵素は、全長ポリペプチドとして、又は全長酵素の生物活性断片若しくは変異体として発現され得る。生物活性とは、野生型全長酵素の触媒活性の少なくとも一部を実施する能力が、該断片又は変異体によって保持されているはずであることを意味する。
【００９５】
したがって一実施形態において、本発明による発現系は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一であるＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体を発現することが可能である。
【００９６】
一実施形態において、本発明による発現系は、配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体を発現することが可能である。
【００９７】
一実施形態において、本発明による発現系は、配列番号：４１と少なくとも７０％同一である６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体を発現することが可能である。
【００９８】
該発現系は、基本的に任意の適切な形態又は構造を有し得るが、但し、前記形態又は構造が、本明細書の先に定義された酵素又はその断片若しくは変異体の任意の１つと同一の、又は本質的に同一の、又は少なくとも本明細書に定義された同一性の度合いを有する遺伝子産物をもたらすことを条件とする。
【００９９】
ウイルスベクター
広範には遺伝子療法は、新しい遺伝子材料を患者の細胞に転移して患者への治療効果を得ることを探求する。そのような効果としては、広範囲の疾患、障害及び他の状態の処置又は防護が挙げられる。
【０１００】
エクスビボ遺伝子療法のアプローチは、単離された細胞（幹細胞、神経及びグリア前駆細胞、並びに胎児幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない）を修飾し、その後、患者へ輸注、グラフト、又は他の方法で移植することを含む。例えば、米国特許第４，８６８，１１６号、同第５，３９９，３４６号及び同第５，４６０，９５９号を参照されたい。インビボ遺伝子療法は、宿主となる患者組織をインビボで直接標的とすることを探求する。
【０１０１】
遺伝子転移ベクターとして有用なウイルスとしては、パポバウイルス、アデノウイルス、ワクチンウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスが挙げられる。適切なレトロウイルとしては、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＭｏＭＬＶからなる群が挙げられる。適切なレトロウイルスのさらなる群としては、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＡＩＶ、ＣＩＶからなる群が挙げられる。好ましいウイルスベクターの別の群としては、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピローマウイルス、ＭｏＭＬＶ、好ましくはアデノ随伴ウイルスからなる群が挙げられる。
【０１０２】
肝細胞又は横紋筋細胞の形質導入に好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス及びレンチウイルスである。
【０１０３】
ＡＡＶの調製方法は、当該技術分野、例えば米国特許第５，６７７，１５８号に記載される。
【０１０４】
レンチウイルスベクターは、複製欠損レンチウイスル粒子である。そのようなレンチウイルス粒子は、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドシグナルに動作可能に結合されたプロモーター、第二の鎖のＤＮＡ合成の起点、及び３’レンチウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスベクターから生成され得る。
【０１０５】
発現ベクター
本発明で使用するためのＴＨ及び／又はＧＣＨ１及び／又はＰＴＰＳポリペプチドの組換え発現のためのベクターの構築は、当業者への詳細な説明を必要としない従来の技術を利用して完遂され得る。しかし再調査のために、当業者は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, （NY 1982）においてManiatisらに助言を求めることができる。発現ベクターは、医療使用でのＴＨ及び／又はＧＣＨ１及び／又はＰＴＰＳポリペプチドの組換え産生のために、そして裸の、又はカプセル化療法でＴＨ及び／又はＧＣＨ１及び／又はＰＴＰＳポリペプチドを分泌する治療細胞を作製するために用いられ得る。
【０１０６】
手短に述べると、組換え発現ベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いる。構築されたベクターにおける正しい配列を確認するための分析では、例えばMessingらの方法（Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981）、Maxamらの方法（Methods in Enzymology, 65: 499, 1980）、又は当業者に公知の他の適切な方法を用いて、遺伝子を配列決定する。
【０１０７】
切断された断片のサイズ分離は、例えばManiatisら（Molecular Cloning, pp. 133-134,1982）により記載された通り従来のゲル電気泳動を利用して実施される。
【０１０８】
効率的な発現ベクターの作製では、これらは、コードされた遺伝子の発現に必要な調節配列を正しいリーディングフレーム内に含まなければならない。遺伝子の発現は、転写、翻訳、又は翻訳後レベルで制御される。転写開始は、遺伝子発現における早期で、かつ重大なイベントである。これは、プロモーター及びエンハンサー配列に依存し、これらの配列と相互作用する特異的細胞因子によって影響を受ける。多くの遺伝子の転写単位は、プロモーターと、幾つかの例ではエンハンサー又は調節エレメントと、からなる（Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980);及びBreathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)）。本発明の強力なプロモーター及び他の調節エレメントを、本明細書の以下にさらに詳細に記載する。
【０１０９】
一実施形態において、該発現系は、ウイルスベクターなどのベクター、例えばウイルスベクター発現系である。
【０１１０】
別の実施形態において、該発現系は、プラスミドベクター発現系である。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、該発現系は、合成ベクターを基にしている。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、該発現系は、コスミドベクター又は人工染色体である。
【０１１３】
特定の実施形態において、ベクター内へのＡＡＤＣの封入は、複数の理由のいずれかのために不利になり得る。第一にそれは、調整せずにチロシンをドパミンへ変換し得る新しい系を生成する。形質導入された細胞は、ドパミンを小胞へ封鎖するメカニズムが欠如するため、ドパミンが、細胞質内へ急速に蓄積し得る。ＴＨ酵素が、Ｎ−末端調節ドメインと共に残されると、生成されたドパミンが、処置の有効性を大きく限定し得るネガティブフィードバックによってＤＯＰＡ合成を直接阻害し得る。その一方で、ＴＨ酵素が切断されると（例えば、配列番号：４０）、切断された細胞もまたドパミンを放出するメカニズムが欠如するため、細胞質ドパミンレベルが急速に上昇し得る。
【０１１４】
本発明の一実施形態において、先に定義された発現系は、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない。
【０１１５】
一実施形態において、本発明による発現系は、１〜４０ｋｂ、例えば１〜３０ｋｂ、１〜２０ｋｂなど、例えば１〜１５ｋｂ、１〜１０ｋｂなど、例えば１〜８ｋｂ、２〜７ｋｂなど、例えば３〜６ｋｂ、４〜５ｋｂなどのパッケージング能力を有する。
【０１１６】
一実施形態において、本発明による発現系は、４．５〜４．８ｋｂのパッケージング能力を有するウイルスベクターである。
【０１１７】
一実施形態において、本発明による発現系は、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである。
【０１１８】
一実施形態において、該ベクターは、組み込み型ベクターである。別の実施形態において、該ベクターは、非組み込み型ベクターである。
【０１１９】
一実施形態において、本発明のベクターは、最小限に組み込むベクターである。
【０１２０】
好ましい実施形態において、本発明による発現系は、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。
【０１２１】
ＡＡＶベクターの調製方法は、当業者に公知である。例えば中枢神経系へのＡＡＶ送達の例を記載した米国特許第５，６７７，１５８号、同第６，３０９，６３４号、及び同第６，４５１，３０６号を参照されたい。
【０１２２】
一実施形態において、本発明によるＡＡＶベクターは、セロタイプＡＡＶ５、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９及びＡＡＶ２ベクターからなる群から選択される。これらは好ましくは、筋細胞又は筋芽細胞などの筋肉細胞を標的とするために用いられる。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明によるＡＡＶベクターは、セロタイプＡＡＶ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９及びＡＡＶ７ベクターからなる群から選択される。これらは好ましくは、肝臓の細胞、好ましくは肝細胞を標的とするために用いられる。
【０１２４】
研究により、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）遺伝子送達ベクターの有効性が実証され（McCarty (2008) Mol Ther.16(10):1648-56）、近年の臨床試験で、見込みのある結果が示された。しかし、形質導入に必要となるゲノム含有粒子の数に関するこれらのベクターの効率は、発現前に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換する必要性によって妨害される。このステップは、複数のベクターゲノム間のＤＮＡ合成又は塩基対合を必要とせずに、ｄｓＤＮＡへフォールディングすることが可能な逆位反復ゲノムをパッケージングする自己相補性ベクターの使用により全体として回避され得る。この効率のための重要なトレードオフは、小さなタンパク質コード遺伝子（最大５５ｋｄ）によるベクターのコード能力の半分を喪失することであり、任意の現在利用可能なＲＮＡに基づく治療では、適応され得る。自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターで増進された効率の上昇は、組織、細胞型、及び投与経路に応じて、控えめ〜驚くほどの量の範囲内であった。自己相補性ベクターの構築及び物理的性質と同様に、肝臓、筋肉及び中枢神経系（ＣＮＳ）をはじめとする複数の組織での種々の応答の基本原理は、McCarthyによる論評に概説されている。
【０１２５】
したがって一実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。
【０１２６】
一実施形態において、ＡＡＶ８ベクターのゲノムは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ８カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。
【０１２７】
別の実施形態において、ＡＡＶ７ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ７カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。
【０１２８】
さらに別の実施形態において、ＡＡＶ６ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ６カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。
【０１２９】
さらに別の実施形態において、ＡＡＶ５ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ５カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。
【０１３０】
別の実施形態において、ＡＡＶ２ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ５又はＡＡＶ１カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ２カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。
【０１３１】
別の実施形態において、ＡＡＶ１ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ２又はＡＡＶ５カプシド内にパッケージングされるなど、ＡＡＶ１カプシド以外のＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。
【０１３２】
別の好ましい実施形態において、該発現系は、１つ又は複数プラスミドであり、それは先に列挙されたベクターのいずれかにパッケージングされ得る、又は裸、即ち非パッケージングであり得る。好ましい実施形態において、プラスミドは裸である。
【０１３３】
一実施形態において、本発明によるベクターは、哺乳動物細胞を感染又は形質導入させることができる。
【０１３４】
実施形態において、本発明によるベクターは、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：５２及び配列番号：５３を含む群から選択されるベクターである。
【０１３５】
プロモーター
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始するヌクレオチド配列である。プロモーターは、該ヌクレオチド配列上の同じ鎖上及び上流で（テンプレート鎖及び非コード鎖とも呼ばれるアンチセンス鎖の３’領域に向かって）、それらが転写する遺伝子付近に位置する。プロモーターは、典型的には約１００〜１０００塩基対からなる。
【０１３６】
一実施形態において、本発明の発現系は、本明細書に記載された第一及び第二のプロモーターを含む。一実施形態において、前記第一及び第二のプロモーター配列は、異なるプロモーター配列である。別の実施形態において、前記第一及び第二のプロモーター配列は、同一のプロモーター配列である。
【０１３７】
一実施形態において、該発現系は、ＩＲＥＳと共に、３つのポリペプチドＴＨ、ＧＣＨ１及びＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドのうちの２つの間に位置する１つのプロモーターを含む。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明の発現系は、発現の際に、本明細書の先に記載されたチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、肝特異性プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチドを含む。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明による発現系は、発現の際に、本明細書の先に記載されたＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、肝特異性プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチドを含む。
【０１４０】
別の実施形態において、本発明による発現系は、発現の際に、本明細書の先に記載された６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ；ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、肝特異性プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチドを含む。
【０１４１】
さらなる実施形態において、本発明による発現系は、本明細書の先に記載されたプロモーターを含み、該プロモーターは、肝臓プロモーター／エンハンサー１（ＬＰ１）又はその生物活性断片若しくは変異体、及び／或いはハイブリッド肝特異性プロモーター（ＨＬＰ）又はその生物活性断片若しくは変異体からなる群から選択される肝特異性プロモーターである。
【０１４２】
別の実施形態において、本発明による発現系は、本明細書の先に記載されたプロモーターを含み、該プロモーターは、配列番号：３８（ＨＬＰ）及び／又は配列番号：３９（ＬＰ１）からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９６％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９７％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９８％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９９％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと１００％同一である、肝特異性プロモーターである。
【０１４３】
別の実施形態において、本発明の発現系は、発現の際に、本明細書の先に記載されたチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、筋肉特異性プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチドを含む。
【０１４４】
別の実施形態において、本発明による発現系は、発現の際に、本明細書の先に記載されたＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、筋肉特異性プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチドを含む。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明による発現系は、発現の際に、本明細書の先に記載された６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ；ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、筋肉特異性プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチドを含む。
【０１４６】
さらなる実施形態において、本発明による発現系は、本明細書の先に記載されたプロモーターを含み、該プロモーターは、ｐＭＣＫ−１３５０、ｄＭＣＫ、ｔＭＣＫ及びヒト・スロートロポニンＩ（slow troponin I）遺伝子エンハンサーの複数のコピーであるプロモーター、又はその生物活性断片若しくは変異体からなる群から選択される筋肉特異性プロモーターである。
【０１４７】
別の実施形態において、本発明による発現系は、本明細書の先に記載されたプロモーターを含み、該プロモーターは、配列番号：３８（ＨＬＰ）及び／又は配列番号：３９（ＬＰ１）からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９６％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９７％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９８％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９９％同一である、より好ましくは配列番号：３８及び／又は配列番号：３９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと１００％同一である、肝特異性プロモーターである。
【０１４８】
一実施形態において、本発明による発現系は、哺乳動物細胞、例えば非限定的に肝臓及び骨格筋又は平滑筋の哺乳動物細胞に選択性のあるプロモーターを含む。一実施形態において、本発明のプロモーターは、幹細胞、筋細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞に特異性がある。
【０１４９】
該プロモーターは、天然由来プロモーター又は合成プロモーターであり得る。
【０１５０】
一実施形態において、本発明による発現系は、非限定的にｐ−ＭＣＫ（筋肉クレアチンキナーゼ用のプロモーター）、例えばｐ−ＭＣＫ１３５０、複数のコピーのヒト・スロートロポニンＩ遺伝子エンハンサー、ＬＢ１、ＨＬＰ、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、ｐＧＫ、Ｈ１及び／又はＵ３であるプロモーターからなる群から選択される１つ又は複数のプロモーターなどの構成プロモーターを含む。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、該発現系は、ＥＦ−１αプロモーターを含む。ＥＦ−１αプロモーターは、ＴＨ又はＧＣＨ１の上流に位置し得る。
【０１５２】
一実施形態において、本発明による発現系は、非限定的にＴｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１、プロゲステロン、ＲＵ４８６及び／又はラパマイシン誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターを含む。
【０１５３】
一実施形態において、本発明による発現系は、肝臓細胞、例えば肝細胞に特異性のあるプロモーターを含む。そのようなプロモーターとしては、ＬＰ１、ｈＡＰＯ−ＨＣＲ及び／又はｈＡＡＴが挙げられる。任意の肝特異性プロモーター、例えばhttp://rulai.cshl.edu/LSPD/で見出され得る“The Liver Specific Gene Promoter Database”など、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/で見出され得るGenbankなどのゲノムデータベースで見出されるプロモーターなどが、本発明において有用になり得る。
【０１５４】
別の実施形態において、本発明による発現系は、非限定的に、
ａ．肝臓プロモーター／エンハンサー１（ＬＰ１）、
ｂ．ハイブリッド肝特異性プロモーター（ＨＬＰ）（McIntosh J et. al Blood 2013 121(17) 3335-3344参照）、
ｃ．ＣＭＶプロモーター及びＳＰｃ５−１２のエレメントを用いた筋肉特異性組み合わせ又は二重プロモーター、
ｄ．ＳＰｃ５−１２合成筋肉特異性プロモーター、
ｅ．ｄＭＣＫ若しくはｔＭＣＫ、ｐＭＣＫ−１３５０、又は複数のコピーのヒト・スロートロポニンＩ遺伝子エンハンサーであるプロモーターなどの筋肉特異性クレアチンキナーゼプロモーター、又はそれらの簡略型、
ｆ．ＣＭＶプロモーター、
ｇ．筋肉ＣＡＴプロモーター、
ｈ．骨格αアクチン４４８プロモーター、
ｉ．ａ〜ｆのいずれかの任意の活性類似体又は断片、
からなる群から選択されるプロモーターなどの筋肉細胞に特異性のある１つ又は複数のプロモーターを含む。
【０１５５】
一実施形態において、該プロモーターの発現パターンは、全身投与可能な物質、例えばテトラサイクリン・オン遺伝子又はテトラサイクリン・オフ遺伝子発現系によって調節され得る。
【０１５６】
好ましい実施形態において、本発明による発現系は、ＬＢ１及びＨＬＰを含む群から選択される１つ又は複数のプロモーターを含む。より好ましい実施形態において、本発明による発現系は、配列番号：３８及び配列番号：３９を含む群から選択される１つ又は複数のプロモーターを含む。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、該発現系は、発現の際にＴＨをコードするポリヌクレオチドと、発現の際にＧＣＨ１をコードし、さらに２つのプロモーターを含むポリヌクレオチドと、を含み、該第一のプロモーターは、ＴＨに動作可能に結合され、第二のプロモーターは、ＧＣＨ１に動作可能に結合されている。
【０１５８】
２つのプロモーターの一方又は両方は、ＬＢ１、ＨＬＰ、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、ｐＧＫ、Ｈ１及び／又はＵ３からなる群から選択される構成プロモーターであり得る。一実施形態において、両方のプロモーターが、ＥＦ−１αである。
【０１５９】
２つのプロモーターの一方は、ＬＢ１、ＨＬＰ、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、ｐＧＫ、Ｈ１及び／又はＵ３からなる群から選択される構成プロモーターであり得、２つのプロモーターの他方は、非限定的に、
ａ．肝臓プロモーター／エンハンサー１（ＬＰ１）、
ｂ．ハイブリッド肝特異性プロモーター（ＨＬＰ）（McIntosh J et. al Blood 2013 121(17) 3335-3344参照）、
ｃ．ＣＭＶプロモーター及びＳＰｃ５−１２のエレメントを用いた筋肉特異性組み合わせ又は二重プロモーター、
ｄ．ＳＰｃ５−１２合成筋肉特異性プロモーター、
ｅ．ｄＭＣＫ若しくはｔＭＣＫ、ｐ−ＭＣＫ１３５０、又は複数のコピーのヒト・スロートロポニンＩ遺伝子エンハンサーであるプロモーターなどの筋肉特異性クレアチンキナーゼプロモーター、又はそれらの簡略型、
ｆ．ＣＭＶプロモーター、
ｇ．筋肉ＣＡＴプロモーター、
ｈ．骨格αアクチン４４８プロモーター、
ａ〜ｆのいずれかの任意の活性類似体又は断片、
からなる群から選択されるプロモーターなどの筋肉細胞に特異性のあるプロモーターであり得る。
【０１６０】
２つのプロモーターの一方は、ＬＢ１、ＨＬＰ、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、ｐＧＫ、Ｈ１及び／又はＵ３からなる群から選択される構成プロモーターであり得、２つのプロモーターの他方は、非限定的に、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１、プロゲステロン、ＲＵ４８６及び／又はラパマイシン誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターであり得る。
【０１６１】
２つのプロモーターの一方は、ＬＢ１、ＨＬＰ、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、ｐＧＫ、Ｈ１及び／又はＵ３からなる群から選択される構成プロモーターであり得、２つのプロモーターの他方は、本明細書の先に詳述された肝臓細胞、例えば肝細胞に特異性のあるプロモーターであり得る。
【０１６２】
調節エレメント
本発明による発現系はまた、先に議論されたプロモーターに加えて、含まれれば、ＴＨ及び／又はＧＣＨ１をコードする遺伝子の１つ又は複数の転写の調整をもたらす他の調節エレメントを含み得る。
【０１６３】
一実施形態において、本発明による発現系は、ＳＶ４０ポリアデニル化配列などのポリアデニル化配列を含む。
【０１６４】
該ポリアデニル化配列は典型的には、ＴＨ及び／又はＧＣＨ１をコードする核酸配列の３’末端に動作可能に結合されている。
【０１６５】
一実施形態において、本発明による発現系はさらに、転写後調節エレメント、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。
【０１６６】
様々な実施形態において、前記ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、配列番号：２８又は２９の配列を含む。好ましい実施形態において、前記ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、配列番号：２９の配列を含む。
【０１６７】
一実施形態において、該発現系はさらに、典型的にはＴＨ及び／又はＧＣＨ１転写産物の５’末端に動作可能に結合されたイントロンを含む。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、該発現系は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。そのようなＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの内部で開始されるヌクレオチド配列の翻訳を可能にする。したがって幾つかの実施形態において、該発現系は、発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び
少なくとも１つの内部リボソーム進入部位、
を含む。そのような実施形態において、該発現系はさらに、発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド及び６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）からなる群から選択される第三のポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、ＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドは、ＴＨをコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、ＩＲＥＳは、ＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドの下流及びＴＨをコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。別の実施形態において、ＴＨをコードするポリヌクレオチドは、ＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、ＩＲＥＳは、ＴＨをコードするポリヌクレオチドの下流及びＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
【０１７０】
したがって幾つかの実施形態において、該発現系は、ＴＨ及びＧＣＨ１の独立した翻訳開始事象を可能にする。したがってＴＨとＧＣＨ１のタンパク質合成レベルは、異なり得る。
【０１７１】
一実施形態において、ＴＨ：ＧＣＨ１の比などの発現される酵素間の比を調節することに、特に関心を持たれている。
【０１７２】
一実施形態において、ＴＨ：ＧＣＨ１比は、７：１である。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、該発現系は、
発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び
発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び
少なくとも１つの内部リボソーム進入部位、
を含む。
【０１７４】
そのような実施形態において、該発現系はさらに、発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１７５】
幾つかの実施形態において、ＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドは、ＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、ＩＲＥＳは、ＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドの下流及びＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。別の実施形態において、ＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドは、ＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、ＩＲＥＳは、ＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドの下流及びＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
【０１７６】
したがって幾つかの実施形態において、該発現系は、ＰＴＰＳ及びＧＣＨ１の独立した翻訳開始事象を可能にする。したがってＰＴＰＳとＧＣＨ１のタンパク質合成レベルは、異なり得る。
【０１７７】
一実施形態において、ＰＴＰＳ：ＧＣＨ１の比などの発現される酵素間の比を調節することに、特に関心が持たれる。
【０１７８】
一実施形態において、本発明の発現系のプロモーター及び／又は他の調節エレメントは、ＰＴＰＳ及びＧＣＨ１の両方の発現を誘導することができ、発現されたＰＴＰＳ：ＧＣＨ１の比は、少なくとも３：１、少なくとも４：１など、例えば少なくとも５：１、少なくとも６：１など、例えば少なくとも７：１、少なくとも１０：１など、例えば１５：１、２０：１など、例えば２５：１、３０：１など、例えば３５：１、４０：１など、例えば４５：１、５０：１などである。
【０１７９】
一実施形態において、ＰＴＰＳ：ＧＣＨ１比は、７：１である。
【０１８０】
幾つかの実施形態において、該発現系は、
発現の際に、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び
発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合されたポリヌクレオチド、及び
少なくとも１つの内部リボソーム進入部位、
を含む。
【０１８１】
そのような実施形態において、該発現系はさらに、発現の際に、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１；ＥＣ３．５．４．１６）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体をコードする、プロモーターに動作可能に結合された第二のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１８２】
幾つかの実施形態において、ＴＨをコードするポリヌクレオチドは、ＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、ＩＲＥＳは、ＴＨをコードするポリヌクレオチドの下流及びＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。別の実施形態において、ＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドは、ＴＨをコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、ＩＲＥＳは、ＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドの下流及びＴＨをコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
【０１８３】
したがって幾つかの実施形態において、該発現系は、ＰＴＰＳ及びＴＨの独立した翻訳開始事象を可能にする。したがってＰＴＰＳとＴＨのタンパク質合成レベルは、異なり得る。
【０１８４】
一実施形態において、ＴＨ：ＧＣＨ１の比などの発現される酵素間の比を調節することに、特に関心が持たれる。
【０１８５】
一実施形態において、本発明の発現系のプロモーター及び／又は他の調節エレメントは、ＰＴＰＳ及びＴＨの両方の発現を誘導することができ、発現されたＰＴＰＳ：ＴＨの比は、少なくとも３：１、少なくとも４：１など、例えば少なくとも５：１、少なくとも６：１など、例えば少なくとも７：１、少なくとも１０：１など、例えば１５：１、２０：１など、例えば２５：１、３０：１など、例えば３５：１、４０：１など、例えば４５：１、５０：１などである。
【０１８６】
一実施形態において、ＰＴＰＳ：ＴＨ比は、７：１である。
【０１８７】
ＴＨ：ＧＣＨ１、ＰＴＰＳ：ＴＨ又はＰＴＰＳ：ＧＣＨ１の比は、本明細書の先に定義されたベクターでトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中の発現されたＴＨ及びＧＣＨ１の活性を測定することにより、決定され得る。
【０１８８】
或いはその比は、本明細書の先に定義されたベクターでトランスフェクト又は形質導入された試料宿主からの試料中のテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の量を測定することにより、決定される。
【０１８９】
或いはその比は、本明細書の先に定義されたベクターでトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中の転写されたｍＲＮＡの量により、決定される。
【０１９０】
或いはその比は、本明細書の先に定義されたベクターでトランスフェクト又は形質導入された宿主試料からの試料中の発現されたタンパク質の量により、決定される。
【０１９１】
チロシンヒドロキシラーゼ
ＴＨと略されるチロシンヒドロキシラーゼは、チロシンから、ドパミンの前駆体である３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）への変換を触媒するモノオキシゲナーゼである。ＴＨ活性は、環境の変化、並びに神経及びホルモンの刺激に応答した転写及び翻訳後メカニズムにより調整される。ＴＨ活性の最も急性期の調節は、リン酸化によるタンパク質の翻訳後修飾を通して起こり得る。
【０１９２】
上述の通り、チロシンヒドロキシラーゼの主な機能は、チロシンからドパミンへの変換である。ＴＨは主として、ドパミン作動性ニューロンにおいて見出されるが、これらに制限されない。ＴＨノックアウト遺伝子型は、マウスの胎生期１４日以内は致命的であるため、ＴＨ遺伝子は、胎児発生に必須であるが、ＴＨ突然変異に関してヘテロ接合性のマウスは、カテコールアミンレベルがわずかに減少するだけで正常に発達する。
【０１９３】
ＴＨ酵素は、高特異性でありインドール誘導体を受け入れず、カテコールアミンの産生に関与する多くの他の酵素に比べ異質である。カテコールアミンの合成における律速段階酵素として、ＴＨは、アドレナリン作動性ニューロンの生理学的作用において重要な役割を有する。ドパミンなどのカテコールアミンは、前記アドレナリン作動性ニューロンのシグナル伝達における重要な担い手である。アドレナリン作動性ニューロンの機能不全は、一般には末梢神経症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、虚血発作、急性脳損傷、急性脊髄損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、末梢神経傷害若しくは損傷、神経毒への暴露、糖尿病若しくは腎機能障害などの代謝疾患、及び感染性物質により誘発された損傷、又はうつ病などの気分障害などの複数の神経変性障害を起こす。
【０１９４】
本発明の構築物及び方法を用いて投与されるＴＨは、パーキンソン病を処置する際に用いられ得る。図１で実証される通り、Ｌ−ＤＯＰＡは、酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）によりアミノ酸Ｌ−チロシンから生合成される。
【０１９５】
Ｌ−チロシンは、酵素フェニルアラニンヒドロラーゼ（ＰＡＨ）によりアミノ酸フェニルアラニンから生合成される。
【０１９６】
フェニルアラニンは、肝細胞及び横紋筋細胞をはじめとする細胞の形質膜を通して運搬される（Thony, 2010）。
【０１９７】
チロシンヒドロキシラーゼは、カテコールアミンの合成における律速段階である。
【０１９８】
プレｍＲＮＡのスプライシングは、ｍｅｔ３０に続いて追加のアミノ酸をもたらすため、ヒトは、Ｒドメインが異なるＴＨの４つのアイソザイムを有する。
【０１９９】
その酵素の複雑な調節が起こることは公知で、それらは２つの広範なカテゴリー：酵素活性の短期の直接的調節（チロシンによる基質阻害（Reed, Lieb, & Nijhout, 2010）、フィードバック阻害（Kumer & Vrana, 1996）、アロステリック調節、及び酵素リン酸化）と、遺伝子発現の中期〜長期調節（転写調節、選択的ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、翻訳調節、及び酵素安定性）に分けられる。
【０２００】
ＴＨが合成されたら、該酵素は、カテコールアミンと結合しない限りはリン酸化せずに活性であり、カテコールアミンと結合すれば、その後、活性化されるのにリン酸化が必要になる（Bobrovskaya et al., 2007）。
【０２０１】
ＴＨは、芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（ＡＡＡＨ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰｈｅＨ）及びトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴｒｐＨ）も含む酵素ファミリーのメンバーである。３つの酵素は全て、アミノ酸の芳香族環のヒドロキシル化を実施する。それらは全て、結合された鉄イオン原子との反応において、二原子酸素及び還元されたビオプテリンを利用しする。鉄原子は、２つのヒスチジン残基及びグルタミン酸残基により開裂された活性部位に代わって保持され、それは触媒作用を実施するのに第一鉄の状態でなければならない。活性部位におけるこれらの類似性に加えて、該ファミリーは、三次元構造の他の特色を共有する。ＴＨは、１６０のアミノ酸残基のアミノ末端調節ドメイン（Ｒ）と、その後の触媒ドメイン（Ｃ）及びカルボキシル末端のかなり短いコイルドコイルドメインを備えたマルチドメイン構造を有する。該酵素は、テトラマーを形成する。
【０２０２】
Ｒドメインは、８位、１９位、３１位及び４０位にセリンを含有する。それらは全て、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）によりリン酸化される（Fitzpatrick, 1999）。ＴＨは、ＰＫＡによりリン酸化されると、それは、カテコールアミンによるフィードバック阻害を受けにくくなる（Daubner, Lauriano, Haycock, & Fitzpatrick, 1992）。結晶構造からはそれが立証されないが、リン酸化により、Ｒドメインが活性部位の最初の部分から移動し、それがホスファターゼで脱リン酸化されることにより、妨害される位置へ戻る、と推定するのが論理的である（Daubner, Le, & Wang, 2011）
【０２０３】
ＴＨは、調節ドメイン内の３つのセリン残基のいずれかのリン酸化後に活性化される。ｓｅｒ４０は、主にＰＫＡによりリン酸化され、カテコールアミンへの親和性を低下させる。ｓｅｒ３１は、複数のキナーゼによりリン酸化されて、テトラヒドロビオプテリンに関するＫＭ値を低下させる。ｓｅｒ１９は、ｓｅｒ１９のみ、又はｓｅｒ１９とｓｅｒ４０の両方を修飾する酵素によりリン酸化されるが、他の因子の非存在下では活性化されない。ＣａＭＫＩＩによるｓｅｒ１９のリン酸化は、同じキナーゼによるｓｅｒ４０のリン酸化を促進する。多点リン酸化の他の結果はいずれもまだ確定されていないが、安定化及びシャペロンタンパク質へのより堅い結合が可能である。ドパミン、ノルエピネフリン、及びエピネフリンは全て、ＴＨのフィードバック阻害剤であり、ｓｅｒ４０リン酸化の際のＴＨ活性の最も大きな改変が、カテコールアミンに関するＫｄ値の変動である。ＴＨのＤＡ親和性は、この酵素がリン酸化されると、３００倍低下する（Ramsey & Fitzpatrick, 1998）。
【０２０４】
最初の３２（ＴＨΔ３２）、最初の６８の（ＴＨΔ６８）、最初の７６の、又は最初の１２０のアミノ酸が欠如しているｒＴＨの欠失変異体のドパミン阻害は、研究されている（Daubner & Piper, 1995）。欠失変異体を、理論量のドパミンとのプレインキュベートにより阻害について試験したところ、ＴｙｒＨＤ３２は、ドパミンにより９０％阻害されたが、ＴｙｒＨＤ６８及び他のトランケート型は、阻害されなかった。さらに、ドパミン結合及び放出速度を検討すると、ドパミンはＴＨΔ３２から放出されず、ＴＨΔ６８から急速に放出された（Ramsey & Fitzpatrick, 1998）。ドパミンは、ＤＯＰＡよりも１０００倍堅く結合し、ジヒドロキシフェニル酢酸塩は、ＤＯＰＡよりも１００倍緩く結合する（Ramsey & Fitzpatrick, 2000）。
【０２０５】
ＴＨはまた、第二の低親和性（Ｋ（Ｄ）＝９０ｎＭ）ドパミン結合部位を含有し、それは、該酵素の非リン酸化形態及びｓｅｒ４０リン酸化形態の両方に存在する。高親和性部位へのドパミンの結合は、補因子であるテトラヒドロビオプテリンに関してＶ（ｍａｘ）を低下させ、ＫＭを上昇させるが、低親和性部位へのドパミンの結合は、テトラヒドロビオプテリンに関するＫＭを上昇させることによりＴＨ活性を調節する。反応速度分析から、両方の部位が４つのヒトＴＨアイソフォームのそれぞれに存在することが示される。低親和性部位からのドパミンの解離は、ＴＨ活性を、非リン酸化された酵素では１２倍、そしてｓｅｒ４０リン酸化された酵素では９倍上昇させる。低親和性ドパミン結合部位は、ほとんどの条件下でカテコールアミン合成の調節を担う主要なメカニズムである可能性を有する（Gordon, Quinsey, Dunkley, & Dickson, 2008）。
【０２０６】
Ｎ末端調節ドメインの最初の１６０のアミノ酸がほぼ欠如したトランケート型ＴＨは、チロシンからＤＯＰＡ（例えば、配列番号：４０）への変換を触媒することにおいて依然として活性である。ＴＨの他のトランケート型は、最初の１５５のアミノ酸を除去する。８位、１９位、３１位、４０位のセリンは、フィードバック制御又はＴＨの調節におけるリン酸化／脱リン酸化で特に重要な部位と見なされる。したがって他のトランケート型もまた、本発明において有用であり得る。一実施形態において、本発明のＴＨは、最初の１０〜３００のアミノ酸が欠如しており、最初の１００〜２５０のアミノ酸が欠如するなど、最初の１３０〜２１０のアミノ酸が欠如するなど、好ましくは１４０〜１７０のアミノ酸が欠如するなど、より好ましくは最初の１５０〜１６０のアミノ酸が欠如するなどである。
【０２０７】
３つの芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼＴＨ、フェニルアラニンヒドロラーゼ（ＰＡＨ）及びトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＲＰＨ）の全てが、Ｃ末端のおよそ３３０のアミノ酸の高相同性触媒ドメインを共有することを条件とし、基質特異性が一部としてそれぞれの調節ドメインによることが提案された。各酵素のＲドメインが他の酵素のＣドメインに結合している、ＴＨ及びＰＡＨのキメラ突然変異体が構築された（Daubner, Hillas, & Fitzpatrick, 1997）。これらのキメラ突然変異体に加え、それらのＮ末端Ｒドメインが欠如したトランケート型突然変異体及び野生型酵素を用いて、Daubnerらが、これらの酵素のアミノ酸基質特異性を定義する上でのアミノ末端ドメインの役割を実証した。トランケート型タンパク質は、いずれかのアミノ酸とも低い結合特異性を示した。いずれかの調節ドメインの結合が、特異性を大幅に上昇させたが、その特異性は、キメラタンパク質中の触媒ドメインによって決定された、
【０２０８】
本発明のＴＨをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６及び配列番号：２７に示される。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６及び配列番号：２７と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６及び配列番号：２７と７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性などを含むＴＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０２０９】
本発明の発現系構築物中に含まれる、ＴＨをコードするポリヌクレオチドはまた、ＴＨポリペプチドの生物活性断片又は変異体をコードし得る。
【０２１０】
好ましい実施形態において、ＴＨポリヌクレオチドのそのような断片又は変異体は、少なくとも５０の連続するアミノ酸、７５の連続するアミノ酸など、例えば１００の連続するアミノ酸、１５０の連続するアミノ酸など、例えば２００の連続するアミノ酸、２５０の連続するアミノ酸など、例えば３００の連続するアミノ酸、３５０の連続するアミノ酸など、例えば４００の連続するアミノ酸、４５０の連続するアミノ酸などを含むＴＨポリペプチドをコードする。
【０２１１】
一実施形態において、該生物活性断片は、チロシンヒドロキシラーゼの触媒ドメイン（配列番号：１３）又は（配列番号：４０）である。
【０２１２】
特定の実施形態において、本発明のコードされたＴＨポリペプチドの配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７の突然変異及び／又は置換された変異体である指定されたチロシンヒドロキシラーゼもまた、含まれる。一実施形態において、アミノ酸配列内の置換は、保存的であり、該アミノ酸が、類似の化学的及び／又は物理的特性を有する別のアミノ酸で置換されている。突然変異は、配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７中の１つ若しくは複数の部位で、並びに／又はコードされたＴＨポリペプチドで起こり得る。好ましい実施形態において、本発明は、例えば中立突然変異又はサイレント突然変異など、ＴＨを生物活性にする任意の突然変異に関する。より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：７の任意の１つのセリン残基Ｓ８、Ｓ１９、Ｓ３１、Ｓ４０若しくはＳ４０４のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号：４０、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７のうちの任意の１つの等しいアミノ酸残基が改変されている突然変異に関する。
【０２１３】
一実施形態において、該生物活性変異体は、配列番号：７のＳ１９、Ｓ３１、Ｓ４０又はＳ４０４のうちの１つ又は複数が、別のアミノ酸残基に改変されている、突然変異したチロシンヒドロキシラーゼポリペプチドである。
【０２１４】
一実施形態において、本発明による発現系構築物によって発現されたチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ポリペプチドは、配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７５％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８５％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９５％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９６％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９７％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９８％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９９％同一であり、より好ましくは配列番号：４０、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７からなる群から選択されるポリペプチドと１００％同一である。
【０２１５】
ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１
ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）は、酵素のＧＴＰシクロヒドロラーゼファミリーのメンバーである。ＧＣＨ１は、葉酸及びビオプテリン生合成経路の一部である。ＧＣＨ１Ｄは、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）生合成の最初及び律速段階の酵素であり、ＧＴＰから７，８−ＤＨＮＰ−３’−ＴＰへの変換を触媒する。ＢＨ４は、モノアミン神経伝達物質であるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ））、メラトニン、ドパミン、ノルアドレナリン、及びアドレナリンの生合成において芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（ＡＡＡＨ）によって要求される必須の補因子である。この遺伝子内の突然変異は、悪性フェニルケトン尿症及び高フェニルアラニン血症に加え、Ｌ−ＤＯＰＡ反応性ジストニアに関連する。しかし、異なるアイソフォームをコードする複数の選択スプライシング転写産物の変異体が記載されており、それらの変異体の全てが、機能的酵素を生じるとは限らない。
【０２１６】
ＧＣＨ１は、幾つか障害を含む複数の臨床的関わりを有する。ＧＣＨ１の欠陥は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１欠乏症（ＧＣＨ１Ｄ）の原因であり、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１欠乏症による異型重度フェニルケトン尿症としても知られる。ＧＣＨ１は、テトラヒドロビオプテリン欠乏による悪性高フェニルアラニン血症の原因の１つである。それはまた、神経伝達物質ドパミン及びセロトニンの枯渇による神経伝達物質の欠如を担い、パーキンソン病などの疾患を生じる。主要な症状としては、精神運動遅滞、緊張障害、痙攣、眠気、過敏性、異常運動、体温上昇、唾液分泌過多、及び嚥下困難が挙げられる。一部の患者は、重度の高フェニルアラニン血症と軽度ジストニア５型（日内変動を伴うジストニア・パーキンソン症候群）の間の中間的な重症度の表現型を呈する場合がある。この中間的表現型では、著しい運動遅延があるが、精神遅滞はなく、高フェニルアラニン血症があったとしても、非常に低い。ＧＣＨ１の欠如は、ジストニア５型（ＤＹＴ５）の原因であり、日内変動を伴う進行性ジストニア、常染色体優性瀬川症候群又は日内変動を伴うジストニア・パーキンソン症候群としても知られる。ＤＹＴ５は、ＤＯＰＡ反応性ジストニアである。ジストニアは、持続的な不随意性筋肉収縮の存在により定義され、多くの場合、姿勢の異常を生じる。ＤＹＴ５は、典型的には小児に存在し、下肢のジストニアによる歩行問題及び夜間に向かって増悪するジストニアを有する。それは、著しい日内変動を示す姿勢及び運動障害を特徴とする。胴体のねじれが、異常である。症状は、睡眠後に軽減し、疲労及び運動により悪化する。Ｌ−ＤＯＰＡへは好適に応答し、副作用を起こさない。
【０２１７】
本発明の構築物及び方法を用いて投与されるＧＣＨ１は、パーキンソン病を処置するのに用いられ得る。
【０２１８】
本発明におけるＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号：３０に示される。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３０、及び配列番号：３０と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性などを含むＧＣＨ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列変異体に関する。
【０２１９】
本発明の発現系構築物に含まれるＧＣＨ１をコードするポリヌクレオチドはまた、ＧＣＨ１ポリペプチドの生物活性断片又は変異体をコードし得る。
【０２２０】
好ましい実施形態において、本発明によりコードされるＧＣＨ１ポリヌクレオチドのそのような断片又は変異体は、少なくとも５０の連続するアミノ酸、７５の連続するアミノ酸など、例えば１００の連続するアミノ酸、１５０の連続するアミノ酸など、例えば２００の連続するアミノ酸、２５０の連続するアミノ酸などを含み、該当する配列内で指定された任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に改変されているが、但し、前記断片又は変異体内の１５以下のアミノ酸がそのように改変されていることを条件とする。
【０２２１】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６、並びに本発明のコードされたＧＣＨ１ポリペプチドの突然変異及び置換形態もまた、含まれる。一実施形態において、アミノ酸配列内の置換は、保存的であり、該アミノ酸が、類似の化学的及び／又は物理的特性を有する別のアミノ酸で置換されている。突然変異は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６の１つ若しくは複数の部位で、並びに／又はコードされたＧＣＨ１ポリペプチド内で起こり得る。好ましい実施形態において、本発明は、例えば中立突然変異又はサイレント突然変異など、ＧＣＨ１を生物活性にする任意の突然変異に関する。
【０２２２】
一実施形態において、本発明による発現系構築物により発現された生物活性断片は、少なくとも５０の連続するアミノ酸を含み、選択された配列内で指定された任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に改変されているが、但し、該配列内の１５以下のアミノ酸残基が、そのように改変されていることを条件とする。
【０２２３】
一実施形態において、本発明による発現系構築物によって発現されたＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）ポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７５％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８５％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９５％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９６％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９７％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９８％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９９％同一であり、より好ましくは配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択されるポリペプチドと１００％同一である。
【０２２４】
６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）
６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）は、７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸塩から６−ピルボイルテトラヒドロプテリン及び三リン酸塩への変換を触媒する酵素である。この反応は、可逆性がある。６−ピルボイルテトラヒドロプテリンは、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の生合成における中間体である。特にＰＴＰＳは、ＧＣＨ１の産生及び活性を促進するようである。ＢＨ４は、フェニルアラニンヒドロラーゼの安定性及び活性において、そしてそれによりＬ−ＤＯＰＡの生合成において役割を担うことが報告されている。ＰＴＰＳは、肝臓において発現される。理論に束縛されるのを望むものではないが、肝臓内のＰＴＰＳのナイーブな内因性発現レベルが、Ｌ−ＤＯＰＡの生合成を可能にするのに十分であると推定される。したがって、以下に詳述される宿主細胞内でトランスフェクトされる本発明の発現系は、発現の際に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ，ＥＣ４．２．３．１２）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。これは、宿主細胞が肝臓細胞でない、例えば宿主細胞が筋細胞などの筋肉細胞又は筋芽細胞などの筋肉細胞前駆体である実施形態において、特に関連する。
【０２２５】
本発明の構築物及び方法を用いて投与されるＰＴＰＳは、パーキンソン病を処置する際に用いられ得る。
【０２２６】
本発明におけるＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号：４１に示される。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：４１、及び配列番号：４１と少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは配列番号：４１と７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性などを含むＰＴＰＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列変異体に関する。
【０２２７】
本発明の発現系構築物に含まれるＰＴＰＳをコードするポリヌクレオチドはまた、ＰＴＰＳポリペプチドの生物活性断片又は変異体をコードし得る。
【０２２８】
好ましい実施形態において、本発明によりコードされるＰＴＰＳポリヌクレオチドのそのような断片又は変異体は、少なくとも５０の連続するアミノ酸、７５の連続するアミノ酸など、例えば１００の連続するアミノ酸、１５０の連続するアミノ酸など、例えば２００の連続するアミノ酸、２５０の連続するアミノ酸などを含み、該当する配列内で指定された任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に改変されているが、但し、前記断片又は変異体内の１５以下のアミノ酸が、そのように改変されていることを条件とする。
【０２２９】
配列番号：４１、及び本発明のコードされたＰＴＰＳポリペプチドの突然変異及び置換形態もまた、含まれる。一実施形態において、アミノ酸配列内の置換は、保存的であり、該アミノ酸が、類似の化学的及び／又は物理的特性を有する別のアミノ酸で置換されている。突然変異は、配列番号：４１内の１つもしく複数の部位で、及び／又はコードされたＰＴＰＳポリペプチドで起こり得る。好ましい実施形態において、本発明は、例えば中立突然変異又はサイレント突然変異など、ＰＴＰＳを生物活性にする任意の突然変異に関する。
【０２３０】
一実施形態において、本発明による発現系構築物により発現された生物活性断片は、少なくとも５０の連続するアミノ酸を含み、選択された配列内で指定された任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に改変されているが、但し、該配列内の１５以下のアミノ酸残基が、そのように改変されていることを条件とする。
【０２３１】
一実施形態において、本発明による発現系構築物によって発現されたＰＴＰＳポリペプチドは、配列番号：４１と少なくとも７０％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも７５％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも８５％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９５％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９６％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９７％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９８％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と少なくとも９９％同一であり、より好ましくは配列番号：４１と１００％同一である。
【０２３２】
細胞株
一態様において、本発明は、本発明によるベクター／発現系を用いて遺伝子修飾されている、単離された宿主細胞に関する。
【０２３３】
本発明はまた、ＴＨ及び／又はＧＣＨ−１を過剰発現するように遺伝子修飾されていて、該当する末梢組織内で生物活性ＴＨ及び／又はＧＣＨ−１ポリペプチドを局所送達するために患者へ移植され得る、裸の細胞を介したＴＨ及び／又はＧＣＨ−１の生体送達に適した細胞に関する。そのような細胞は、広範囲で治療細胞と称される場合がある。
【０２３４】
エクスビボ遺伝子療法では、好ましい細胞群としては、本明細書の先に定義された発現系により形質導入又はトランスフェクトされている、単離された宿主細胞が挙げられる。該宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞からなる群から選択される。
【０２３５】
一実施形態において、該宿主細胞は、エクスビボでトランスフェクトされ、次に哺乳動物へ投与、例えば移植される。
【０２３６】
一実施形態において、該宿主細胞は、肝細胞、筋細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される。
【０２３７】
一実施形態において、該宿主細胞は、肝細胞などの肝臓細胞である。
【０２３８】
別の実施形態において、該哺乳動物細胞は、筋細胞などの筋肉細胞又は筋芽細胞などの筋肉細胞前駆体である。そのような実施形態において、該発現系は、好ましくはプロモーターに動作可能に結合された６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２３９】
発現系の医療使用
本明細書で先に示された通り、本発明による発現系は、医療使用を意図するものである。
【０２４０】
非常に好ましい態様において、本発明による発現系は、カテコールアミン機能障害に関連する疾患又は障害の処置のための末梢投与での使用のためのものである。
【０２４１】
したがって一実施形態において、本発明による発現系は、必要とするヒトへの前記発現系の末梢投与を含む、血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法での使用に特に十分適する。
【０２４２】
血漿Ｌ−ＤＯＰＡのための治療有効量、又は言い換えれば治療範囲は通常、０．２〜１．５ｍｇ／Ｌの範囲内であるが、任意に時点での血漿レベルと治療状態との相関は、１日の間に変動する。この変動は、血漿への到達と血液脳関門の通過の間のラグ、並びに血液脳関門を通る能動輸送に関する他のアミノ酸との競合などの要因に関係する。
【０２４３】
全身遺伝子療法は、妨害なく基礎レベルのＬ−ＤＯＰＡを誘発し、Ｌ−ＤＯＰＡの循環レベルで予防するが、そうでなく従来の経口Ｌ−ＤＯＰＡが与えられればトラフが生じる。したがって本発明は、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）を処置及び／又は予防するのに有用である。
【０２４４】
したがって該発現系は、パーキンソン病及びＬ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアなどのカテコールアミン機能障害に関連する状態又は疾患の処置を目的とした末梢投与のために設計及び配合される。
【０２４５】
本発明は、必要とするヒトへの本明細書の先に定義された発現系の末梢投与（即ち、ＣＮＳの外部への投与）を含む、血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効量を維持する方法に関係する。
【０２４６】
別の態様において、本発明は、本明細書の先に定義された発現系の治療有効量を、必要とする患者へ末梢投与することを含む、カテコールアミン機能障害に関連する疾患の処置及び／又は予防の方法に関係する。
【０２４７】
さらに別の態様において、本発明は、患者の血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法であって、本明細書の先に定義された発現系を、前記患者へ投与することを含む、方法に関係する。
【０２４８】
さらに別の態様において、本発明は、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）の発生を低減、遅延及び／又は予防する方法であって、本明細書に定義された発現系を必要とする患者へ末梢投与することを含む、方法に関係する。
【０２４９】
さらに別の態様において、本発明は、発現の際に、少なくとも１種の治療性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを末梢投与することを含む、血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を得る、そして／又は維持する方法であって、該少なくとも１種の治療性ポリペプチドがチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ＥＣ１．１４．１６．２）ポリペプチド又はその生物活性断片若しくは変異体である、方法に関係する。
【０２５０】
本発明により処置可能な適応症としては、カテコールアミン機能障害、特にドパミン欠乏などのカテコールアミン欠乏に関連する適応症が挙げられる。
【０２５１】
一実施形態において、カテコールアミン機能障害に関連する疾患は、神経変性障害などの中枢及び／又は末梢神経系の疾患、障害又は損傷である。
【０２５２】
一実施形態において、本発明により処置可能な疾患は、基底核の疾患である。
【０２５３】
一実施形態において、本発明による発現系は、パーキンソン病（ＰＤ）、ジスキネジア、ＤＯＰＡ反応性ジストニア、ＡＤＨＤ、統合失調症、うつ病、血管性パーキンソン症候群、本態性振戦、慢性ストレス、遺伝子性ドパミン受容体異常、慢性オピオイド、コカイン、アルコール又はマリファナ使用、副腎不全、高血圧、低血圧、ノルアドレナリン欠乏、心的外傷後ストレス障害、病的ギャンブル障害、認知症、レビー小体型認知症及び遺伝性チロシンヒドロキシラーゼ欠乏からなる群から選択される疾患の処置における使用のために末梢投与される。
【０２５４】
一実施形態において、本発明による発現系及び／又は宿主細胞は、パーキンソン病、異型性パーキンソン病、例えば多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、血管性若しくは動脈硬化性パーキンソン病、薬物誘導性パーキンソン症候群及びＧＴＰシクロヒドロラーゼ１欠乏並びに／又はドパミン欠乏による任意のジストニア性疾病などの疾病の処置方法における使用のためのものである。
特に該発現系は、パーキンソン病（ＰＤ）並びにそれに関連する症状及び状態の処置に有用である。
【０２５５】
一態様において、本発明は、患者の血中のＬ−ＤＯＰＡの治療有効濃度を維持する方法であって、本明細書の先に定義された発現系を、前記患者へ投与することを含む、方法に関係する。
【０２５６】
一態様において、本発明は、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジア（ＬＩＤ）の発生を低減、遅延及び／又は予防する方法であって、本明細書に定義された発現系を必要とする患者へ末梢投与することを含む、方法に関係する。
【０２５７】
発現系の投与
本発明の適当な効果を実現するために、発現系を末梢へ、即ち局所又は全身へ、しかしＣＮＳの外部へ投与することが必要であるが、発現系の一部は、最終的にＣＮＳを透過し得る。
【０２５８】
本発明の発現系は一般に、適切な医薬組成物の形態で投与される。したがって本発明は、本明細書に定義された発現系を含む医薬組成物にも関する。そのような組成物は典型的には、該発現系及び医薬的に許容し得る担体を含有する。本明細書で用いられる言語「医薬的に許容し得る担体」は、医薬投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを包含するものとする。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が該発現系に不適合性である場合を除き、該組成物中でのそれらの使用が、企図される。補足性活性化合物を、該組成物に組み入れることも可能である。
【０２５９】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように配合される。適切な投与経路の例としては、非経口、例えば筋肉内、静脈内、肝臓内、皮内、皮下及び経粘膜投与、又は分離式肢灌流が挙げられる。
【０２６０】
注射可能な使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性であれば）又は分散液、及び滅菌注射性溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体としては、生理学的生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF、Parsippany, N.J.）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての例で、該組成物は、滅菌されていなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防御されなければならない。該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。微生物作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより実現され得る。多くの例で、該組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【０２６１】
先に列挙された１種又は組み合わせでの原材料と共に、適切な溶媒に必要量の発現系を組み入れ、必要に応じて次に濾過滅菌することにより、滅菌注射可能溶液が調製され得る。
【０２６２】
全身投与は、経粘膜又は経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜又は経皮投与では、浸透されるバリアに適したペネトラントが、該配合剤中で用いられる。そのようなペネトラントは一般に、当業者に公知であり、例えば経粘膜投与用では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は坐剤の使用により完遂され得る。経皮投与では、該活性化合物は、当該技術分野で概ね知られる軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームの中に配合される。
【０２６３】
一実施形態において、該薬剤は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムをはじめとする制御放出配合剤など、身体からの該化合物の急速な排出を防御する担体と共に調製される。生分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などが用いられ得る。そのような配合剤の調製方法は、当業者に明白であろう。該材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から市販され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原へのモノクローナル抗体で感染細胞を標的化させるリポソームなど）もまた、医薬的に供し得る担体として用いられ得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載される通り、当業者に公知の方法により調製され得る。
【０２６４】
それは、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために投与剤型に非経口組成物を配合させるのに特に有利である。本明細書で用いられる単位投与剤型は、処置される対象のための単位投薬量として適した物理的に分離した単位であって、各単位が、必要となる医薬担体に関連する所望の治療効果を生成するように計算された活性化合物の所定の量を含有する、単位を指す。本発明の単位投与剤型の仕様は、活性化合物の特有の性質、実行される個々の治療効果、及び個体の処置のために活性化合物などを調合する場合の当該技術分野に生来からある制限によって規定され、それらに直接依存する。
【０２６５】
したがって一態様において、本発明は、本明細書の先に定義された発現系を含む医薬組成物に関係する。
【０２６６】
該医薬組成物は、投与のための使用説明書と共に容器、パック、又はディスペンサー中に含まれ得る。
【０２６７】
したがって一態様において、本発明は、先に定義された医薬組成物及び使用説明書を含むキットに関係する。
【０２６８】
本明細書の先に記載された通り、脳内への注射などの脳手術の利用を回避するために、ＣＮＳに関して末梢へ、即ちＣＮＳの外部へ投与される、遺伝子療法のための発現系を提供することが、本発明の目的である。
【０２６９】
一実施形態において、本発明による発現系は、静脈内投与により、末梢投与される。
【０２７０】
一実施形態において、該投与は、門脈で行われる。そのような投与は、肝臓を標的とする。
【０２７１】
本発明による発現系はまた、肝臓内投与により末梢投与され得る。
【０２７２】
一実施形態において、本発明による発現系は、筋肉内投与により末梢投与される。
【０２７３】
一実施形態において、本発明による発現系は、分離式肢灌流により投与される。この場合、裸のプラスミドＤＮＡが、Hagstrom et al. (2004) Mol. Ther. 10(2): 386-398に記載された通り投与され得る。
【０２７４】
治療効果を有する発現系では、反復投与が必要な場合がある。幾つかの実施形態において、該発現系は、少なくとも１回、例えば１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれを超える回数、投与される。
【０２７５】
投与される投薬量は、処置される個体、発現系及びプロモーターをはじめとする複数の因子に依存し得る。本発明の幾つかの実施形態において、該発現系は、少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｋｇ体重、例えば少なくとも１×１０１２ｖｇ／ｋｇなどの投薬量で投与され得る。本発明の幾つかの実施形態において、該発現系は、少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｋｇ筋肉、例えば少なくとも１×１０１２ｖｇ／ｋｇ筋肉などの投薬量で投与され得る。そのような投薬量は、例えばヒトのために適用可能であり得る。
【０２７６】
併用処置
本明細書の先に定義された発現系による処置レジメンは、他の適切な化合物により補充され得る。１つのそのような実施形態において、本発明は、該発現系の投与を、Ｌ−ＤＯＰＡの治療有効量の全身投与で補充することをさらに含む。
【０２７７】
一実施形態において、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）又はその類似体の治療有効量は、本発明の発現系を通して遺伝子療法を受ける患者に投与される。
【０２７８】
一実施形態において、該ＢＨ４類似体は、サプロプテリンである。
【０２７９】
本発明の一実施形態において、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤の治療有効量が、投与される。該デカルボキシラーゼ阻害剤は、典型的にはベンセラジン及びカルビドパからなる群から選択される。
【０２８０】
更なる実施形態において、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤の治療有効量が、必要とする患者に投与される。
【０２８１】
該カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤は、典型的にはトルカポン、エンタカポン、及びニテカポンからなる群から選択される。
【０２８２】
特定の実施形態において、ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又はカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤は、経口投与される。
【０２８３】
或いは、ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／又はカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤は、静脈内又は筋肉内投与される。
【０２８４】
１つの併用処置において、ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／若しくはＣＯＭＴ阻害剤、並びに／又はそれらの類似体の投与は、全身投与による。
【０２８５】
１つの併用処置において、ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／若しくはＣＯＭＴ阻害剤、並びにそれらの類似体の投与は、直腸又は非経口投与による。
【０２８６】
１つの併用処置において、ＢＨ４、デカルボキシラーゼ阻害剤及び／若しくはＣＯＭＴ阻害剤、並びにそれらの類似体の投与は、経口、静脈内又は筋肉内投与による。
【実施例】
【０２８７】
実施例１：ＡＡＶ生成プラスミドのベクター構築クローニング
モノシストロン性自己相補性ＡＡＶ生成プラスミドの作製
手短に述べると、ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏをＸｂａＩ及びＳｐｅＩで消化して、それを、それぞれｐＬＡ１００（ｓｓＡＡＶ−ＳＹＮ−ＧＣＨ１−ＳＹＮ−ＴＨ−ＷＰＲＥ）及びｐＬＡ１０９（ｓｓＡＡＶ−ＳＹＮ−ＧＣＨ１−ＳＹＮ−ｔＴＨ）から単離されたＧＣＨ１又はｔＴＨ  ＮｈｅＩ／ＮｈｅＩ  ＰＣＲ断片のいずれかとライゲートすることにより、それぞれ二本鎖ｒＡＡＶ２／８−ＬＰ１−ＧＣＨ１及びｒＡＡＶ２／８−ＬＰ１−ｔＴＨを生成するために用いられるＡＡＶ生成プラスミドのｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１（ｐＡＡ００９）及びｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＨ（ｐＡＡ０１０）（配列番号：３４）を構築した。sｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１（ｐＡＡ００９）（配列番号：３５）及びｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＴＨ（ｐＡＡ０１０）（配列番号：３４）ベクターを、以下の通り構築した：適当な緩衝液中のテンプレートＤＮＡ  ２５ｎｇ、２００μＭ  ｄＮＴＰ（NEB）及びGoTaq Polymerase（Promega）と共に、０．７５ｐｍｏｌ／μｌの濃度のプライマーＡＡ１６（ＮｈｅＩ部位を含むフォワードプライマー、５’−ｃｃａａｇｃｔａｇｃＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’、配列番号：４２）及びＡＡ１７（ＮｈｅＩ部位を含むリバースプライマー、５’−ｃｃａａｇｃｔａｇｃＧＧＴＣＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＣ−３’、配列番号：４３）を用いて、ｐＬＡ１００（ｓｓＡＡＶ−ＳＹＮ−ＧＣＨ１−ＳＹＮ−ｔＨ）の９９２ｂｐ  ＧＨＣ１断片を増幅させた。ＰＣＲ増幅の条件は、以下の通りであった：９５℃（２分）、続いて９５℃（３０秒）／６５℃（３０秒）／７２℃（３０秒）を３０サイクル、そして７２℃で５分間の最後の伸長。適当な緩衝液中の２５ｎｇ  ＤＮＡ，  ２００μＭ  ｄＮＴＰ（NEB）及びPhusion Polymerase（Thermo Scientific）と共に、０．４ｐｍｏｌ／μｌの濃度のプライマーＡＡ３３（ＮｈｅＩ部位を含むフォワードプライマー、５’−ＣＣＡＡｇｃｔａｇｃＡＴＧＡＧＣＣＣＣＧＣＧＧＧＧＣＣＣＡＡＧ−３’、配列番号：４４）及びＡＡ３４（ＮｈｅＩ部位を含むリバースプライマー、５’−ＣＣＡＡｇｃｔａｇｃＧＧＧＧＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’、配列番号：４５）を用いて、ｐＬＡ１０９（ｓｓＡＡＶ−ＳＹＮ−ＧＣＨ１−ＳＹＮ−ｔＴＨ）の１８５８ｂｐのｔＴＨ−ＷＰＲＥ断片を増幅させた。ＰＣＲ増幅の条件は、以下の通りであった：９８℃（３０秒）、続いて９８℃（１０秒）／６３℃（３０秒）／７２℃（１分）を３０サイクル、そして７２℃で１０分間の最後の伸長。ｈＦＩＸｃｏ遺伝子を除去するために、ＰＣＲ産物（挿入物）をＮｈｅＩにより３７℃で３時間消化し、プラスミドＡＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏ（ベクター）（配列番号：４３）をＸｂａＩ／ＳｐｅＩにより３７℃で３時間消化した。消化物を、１％アガロースゲルにおいて１００Ｖで１時間移動させた後、ゲル電気泳動により分析し、ＵＶトランスイルミネーターで視覚化した。断片（ＣＨ１挿入物：９９２ｂｐ；ｔＴＨ挿入物：１８５８；ベクター：３５２５ｂｐ）を、メス刃を用いてゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いてゲルから精製した。ベクターをいずれかの挿入物と１６℃で一晩ライゲートして、ＳＵＲＥ細菌内に形質転換した。コ���ニーを選別して、ＸｃｍＩ消化により分析し、ＧＣＨ１又はｔＴＨ  ＰＣＲ断片のいずれかの存在をチェックして、続いて配列決定に送り、各構築物が予測される配列を含むことを確認した。
【０２８８】
最後のトランスジーン構築物は、肝特異性ＬＰ１エンハンサー／プロモーターの制御下、ヒトＧＣＨ１又はトランケート型ヒトＴＨ遺伝子（例えば、配列番号：４０）のいずれかを含むｄｓＡＡＶ生成のための２つのプラスミドであり、全てがＡＡＶ２  ＩＴＲにより隣接されている。
【０２８９】
ｐＡＡ００９及びｐＡＡ０１０中のＨＬＰによるＬＰ１プロモーターの置換
ＡＡＶ生成プラスミドのｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ＧＣＨ１（ｐＡＡ０１１）（配列番号：３１）及びｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ｔＴＨ（ｐＡＡ０１６）（配列番号：３２）を用いて、それぞれ二本鎖ｒＡＡＶ２／８−ＨＬＰ−ＧＣＨ１及びｒＡＡＶ２／８−ＨＬＰ−ｔＴＨを生成した。手短に述べると、ＨＬＰプロモーターをＡＶ−ＨＬＰ−ｃｏｄｏｐ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｖ３（Amit Nathwaniにより贈与された）からプライマーセットＡＡ４３／ＡＡ４４（それぞれ５’ＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＧＣ３’／５’ＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＧ３’、配列番号：４６及び配列番号：４７）を用いて増幅させ、それをＭｓｃＩ及びＥｃｏＲＩで、ＬＰ１プロモーターの代わりにｐＡＡ００９（配列番号：３５）内にクローニングすることにより、ｐＡＡ０１１（配列番号：３５）を構築した。断片ＨＬＰ−ｔＴＨをオーバーラッピングＰＣＲで増幅することにより、ｐＡＡ０１６（配列番号：３２）を作製した。プライマー対ＡＡ５７／ＡＡ６７（それぞれ５’ＣＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＧＣ３’／５’ＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＡＣＧＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴ３’、配列番号：４８及び配列番号：４９）及びＡＡ６８／ＲｍｕｓｃＴＨｅｘｔ２（それぞれ５’ＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣ３’／５’ＡＡＡｇｃｔａｇｃＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＡＣＧＡＴＣＣＡＧ３’、配列番号：５０及び配列番号：５１）を用いて、オーバーラッピング配列を含む、それぞれ断片ＨＬＰ及びｔＴＨを作製した。プライマーＡＡ５７／ＡＡ６７を用いたオーバーラッピングＰＣＲによりＨＬＰをｔＴＨに融合して、ＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングし、それによりｐＡＡ０１５を作製した。最後に、ＮｈｅＩを用いてＨＬＰ−ｔＴＨ断片をｐＡＡ０１５から切り出し、制限部位ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩの間でベクターｐＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏにライゲートし、それによりｐＡＡ０１６（配列番号：３２）を作製した。
【０２９０】
適当な緩衝液中の２０ｎｇテンプレートＤＮＡ、２００μＭ  ｄＮＴＰ（NEB）及びPhision High Fidelity Polymerase（Fischer Scientific）を用いて、２９８ｂｐのＨＬＰ断片を２０μｌ  ＰＣＲ反応物中で増幅させた。ＰＣＲ増幅の条件は、以下の通りであった：９８℃（３０秒）、続いて９８℃（１０秒）／６５℃（１５秒）／７２℃（６０秒）の３０サイクル、７２℃で１０分間の最後の伸長。
【０２９１】
４５ｎｇ  ＨＬＰテンプレートＤＮＡ及び３０６ｎｇ  ｔＴＨテンプレートＤＮＡ（それぞれ予めＰＣＲにより作製）を用いて２０μｌ  ＰＣＲ反応物中で、オーバーラッピングＰＣＲにより作製された２．１ｋｂ  ＨＬＰ−ｔＴＨ断片を増幅させた。２００μＭ  ｄＮＴＰ（NEB）及びPhision High Fidelity Polymerase（Fischer Scientific）を、適当な緩衝液中で用い、ＰＣＲ増幅のサイクル条件は、以下の通りであった：９８℃（３０秒）、続いて９８℃（１０秒）／６５℃（１５秒）／７２℃（６０秒）の３０サイクル、７２℃で１０分間の最後の伸長。
【０２９２】
バイシストロン性一本鎖ＡＡＶ生成プラスミドの作製
ＡＡＶ生成プラスミドｓｓＡＡＶ−ＬＰ１１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ  （ｐＡＡ０１９）（配列番号：３３）を用いて、一本鎖ｒＡＡＶ２／８−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ及びその組換え副産物ｒＡＡＶ２／８−ＬＰ１−ｔＴＨを作製した。手短に述べると、発現カセットＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ−ＷＰＲＥをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）にサブクローニングして、ｐＡＡ０１８を生成した後、ＩＴＲを含有するＡＡＶバックボーンｐＳＵＢ２０１内にクローニングし、それによりｐＡＡ０１９（配列番号：３３）を形成させた。
【０２９３】
１２．５ｎｇ  ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏをテンプレートとして用いて、プロモーターＬＰ１をプライマーＡＡ０１／ＡＡ０２で増幅させ、ＢｌｐＩ及びＳｂｆＩ制限部位を用いてｐＴＲＵＦ１１内にクローニングし、それによりｐＡＡ００１を作製した。次に、２７ｎｇ  ｐＡＡＶ−Ｓｙｎ−ＧＣＨ１−Ｓｙｎ−ＴＨをテンプレートとして用いて、ＧＣＨ１遺伝子をプライマーＡＡ０３／ＡＡ００４で増幅させ、続いてＳｂｆＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ部位を用いてｐＡＡ００１にクローニングし、それによりｐＡＡ００２を形成させた。次に、それぞれＸｂａＩ／ＢｌｐＩ及びＸｂａＩ／ＳｐｈＩ／ＢｓｔＢＩ／Ｔｔｈ１１１Ｉ制限部位を有するオーバーハングを含むプライマー対ＡＡ３７／ＡＡ３８を用いて、ＬＰ１−ＧＣＨ１断片をｐＡＡ００２から増幅させて、モジュラーベクターの構築を可能にした。ＬＰ１−ＧＣＨ１断片をＸｂａＩ制限部位によりＡＡＶバックボーンｐＳｕｂ２０１内にライゲートし、それによりｐＡＡ００３を形成させた。バックボーン内のＩＴＲの存在によるクローニングの難しさを回避するために、ＬＰ１−ＧＣＨ１をＸｂａＩ部位によりクローニングベクターｐＵＣ１８に転移させ、それによりｐＡＡ００４を形成させた。プライマー対ＡＡ００６／ＡＡ０７でｐＡＡ０１０から第二のＬＰ１プロモーターを増幅させ、ＢｓｔＢＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ制限部位を用いてそれをｐＡＡ００４にクローニングし、それによりｐＡＡ００５を形成させることにより、第二のＬＰ１プロモーターを付加した。ｔＴＨ遺伝子を該構築物に付加するために、ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１断片を、ｐＵＣ１８内の余分なＳｐｈＩ部位の存在によりバックボーンｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）内に変換しなければならなかった。これは、ｐＡＡ００５内のＸｂａＩ部位を用いて実施し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）内にライゲートした後、新しい構築物をｐＡＡ００６と命名した。次に、プライマー対ＡＡ５３／ＡＡ６５及び５０ｎｇテンプレートを用いて、ｔＴＨ−ＷＰＲＥ断片をｐＬＡ１０９（ＡＡＶ−Ｓｙｎ−ＧＣＨ１−Ｓｙｎ−ｔＴＨ）から増幅させた。該ｔＴＨ遺伝子を、制限部位ＳｐｈＩ及びＢｓｔＢＩを通してｐＡＡ００６に挿入し、それによりｐＡＡ０１８を形成させた。ｐＡＡ０１８の配列決定後、Ｔｔｈ１１１Ｉ部位の突然変異を見出し、これをＧＣＨ１−ＬＰ１配列の再クローニングにより固定した。ここでの新しいプライマーセットは、Ｔｔｔｈ１１１Ｉ部位の直ぐ下流側にＢｇｌＩＩ制限部位を付加するように、そしてｐＬＡ１００及びｐＬＡ１０９と厳密に同一のＧＣＨ１コザック配列の組み込みを可能にするように、設計された。プライマー対ＡＡ７３／ＡＡ８４及びＡＡ８５／ＡＡＡ０７を用いて、それぞれ新しいＧＣＨ１配列及び第二のＬＰ１プロモーターを増幅させた。プライマー対ＡＡ７３／ＡＡ０７でのオーバーラッピングＰＣＲを実施して、ＧＣＨ１−ＬＰ１を融合し、続いて制限部位ＳｂｆＩ及びＢｓｔＢＩを用いてｐＡＡ０１７内にクローニングし、それによりｐＡＡ０１８を形成させた。最後に、バイシストロン性ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ発現カセット全体を、ＡＡＶバックボーンｐＳｕｂ２０１に戻して、組換えＡＡＶ���成を可能にし、ｐＡＡ０１９（配列番号：３３）と命名した。
【０２９４】
オーバーラッピングＰＣＲによりＨＬＰプロモーターをｔＴＨ遺伝子に融合することにより、モノシストロン性自己相補性ＡＡＶ−ＨＬＰ−ｔＴＨを作製した。ＨＬＰ配列を、ＡＶ−ＨＬＰ−ｃｏｄｏｐ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｖ３（Amit Nathwaniの実験室から提供されたプラスミド）から増幅させた。ｔＴＨの配列は、重要なセリンリン酸化部位を除去するように、Ｎ末端の１６０アミノ酸がトランケートされた（例えば、配列番号：４０）ＴＨの配列であり、さもなければ該セリンリン酸化部位が、ドパミン又はＬ−ＤＯＰＡによるＴＨのフィードバック阻害を可能にすることに関与する。ＨＬＰ及びｔＴＨが増幅されたら、それらをオーバーラッピングＰＣＲにより融合し、ＮｈｅＩ制限部位を用いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングした。品質管理消化（quality control digestions）及び配列決定の後、発現カセットＨＬＰ−ｔＴＨを、Amit Nathwaniにより提供されたＡＡＶ自己相補性バックボーンにクローニングした（図２）。
【０２９５】
該ＧＣＨ１遺伝子をｐＧＰＴ００１（ＳＹＮ−ＧＣＨ１−ＳＹＮ−ＴＨ）から増幅し、それを自己相補性ＡＡＶバックボーンｐＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏ（配列番号：３６）（Amit Nathwaniにより提供された）内にクローニングし、それによりＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１を作製することにより、モノシストロン性自己相補性ＡＡＶ−ＨＬＰ−ＧＣＨを作製した。第二のステップにおいて、ＨＬＰプロモーター配列を、ＡＶ−ＨＬＰ−ｃｏｄｏｐ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｖ３（配列番号：３７）から増幅させて、ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１にライゲートし、それによりＬＰ１をＨＬＰで置換して、ｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ＧＣＨ１を形成させた（図２）。
【０２９６】
ＡＡＶプラスミドｐＳＵＢ２０１をバックボーンとして用いて、バイシストロン性一本鎖ＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨを作製した。各エレメント（遺伝子又はプロモーター）が容易に除去又は置換され得るモジュラーベクターを生成するために、ＩＴＲに隣接する最適な制限部位を同定した。両方のＬＰ１配列を、ＰＣＲによりｐＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏから増幅して、ｐＳＵＢ２０１内にクローニングした。ＧＣＨ１及びｔＴＨを、脳の試験に用いられた既に存在するバイシストロン性ベクター（ＳＹＮ−ＧＣＨ１−ＳＹＮ−ｔＴＨ）から増幅させて、ｐＳＵＢ２０１内にクローニングし、ｓｓＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨを形成させた。クローニングの時系列は、最初にＬＰ１−ＧＣＨ１、二番目にＬＰ１−ｔＴＨとした（図２）。
【０２９７】
他のベクターは、当該技術分野公知の従来法によって構築した。該当する配列を、制限、ライゲーション及びギブソンアッセンブリによりベクターにサブクローニングした。ＡＡＶベクターを、接着ＨＥＫ２９３細胞内でのトリプルトランスフェクションにより調製し、場合によりヨージキサノール勾配遠心分離により濃縮した。
【０２９８】
実施例２：Ｌ−ＤＯＰＡ阻害
該遺伝子をＧＴＰシクロヒドロラーゼ１及び／又はチロシンヒドロキシラーゼ（それぞれＡＡＶ２／８  ＧＣＨ１又はＡＡＶ２／８  ｔＴＨ）と共に運搬して、パーキンソン病（ＰＤ）患者の肝臓においてＬ−ＤＯＰＡの生成を誘導するアデノ随伴ウイルスベクターの能力を評定するために、投薬レジメンを設計した。
【０２９９】
２つの試験を実施した。第一の試験では、１８匹のＣＤ１マウスを、動物６匹からなる群３つに無作為に割り付けた。１日目に、動物を以下の表に示される通り処置した：
【表１】
2018522595.tif 000002
【０３００】
ベクターｓｃＬＰ１−ＧＣＨ１（配列番号：３５）及びｓｃＬＰ１−ｔＴＨ（配列番号：３４）を、実施例１に記載された通り調製した。該ベクターを、ボーラス静脈内注射（尾静脈）により投与した。
【０３０１】
第二の試験では、４匹のＣＤ１マウスを、動物２匹からなる群２つに無作為に割り付けた。１日目に、動物を以下の表に示される通り処置した：
【表２】
2018522595.tif 000003
【０３０２】
ベクターｓｃＨＬＰ−ＧＣＨ１（配列番号：３１）及びｓｃＨＬＰ−ｔＴＨ（配列番号：３２）を、実施例１に記載された通り調製した。
【０３０３】
第一及び第二の試験の両方で、ベクターをボーラス静脈内（尾静脈）注射により投与した（図３）。
【０３０４】
２８日間、さらなる実験を行わずにマウスを観察した。有害事象は、認められなかった。２８日目の殺処分の１時間前に、マウスに腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇベンセラジドを、そして腹腔内注射により低用量のエンタカポンを投与した。エンタカポンの公称注射用量は、３０ｍｇ／ｋｇであった（図３）。
【０３０５】
殺処分の際に、血液試料を心穿刺により得て、その後、動物をＰＢＳと、その後ＰＦＡで灌流して、肝臓を採取した。
【０３０６】
ヘパリンを含有するバイアルに血液を採取して、最後の動物が殺処分されるまで氷上に貯蔵し、その後、４℃でスピンし、次に抗酸化剤の非存在下、血漿を−７０℃で凍結させた。
【０３０７】
Ｌ−ＤＯＰＡを、BioPark, Broadwater Road, Welwyn Garden City, Hertfordshire, AL7 3AX, United Kingdom所在のABS Laboratories Ltdにより、検証された方法を利用してアッセイし、適当な較正標準及び品質管理試料を用い、試料及び重水素内部標準で二重測定として、European Medicines Agencyの生物分析用ガイドラインに従って実施した。
【０３０８】
結果を図５に示しているが、群Ａ、Ｂ及びＣは第一の動物試験のもので、Ｄ及びＥは第二の動物試験のものである。
【０３０９】
肝臓をＰＦＡ中に固定し、その後、パラフィンに包埋して、スライドガラスに載せて分析した。肝臓切片を、ＧＣＨ１特異性抗体を使用してＧＣＨ１発現について分析した。有用なＧＣＨ１特異性抗体は、市販されており、Oxford, UK所在のSerotecのマウスIgG MCA3138Zなどがあり、それは１：２０００  ＡｂＤで用いられ得る。
【０３１０】
ＵＫ。第一の動物試験で得られた結果を、図４ａに示す。形質導入は、１％未満であると決定された。第二の動物試験で得られた結果を、図４ｂに示す。形質導入は、約２５％未満であると決定された。
【０３１１】
ＴＨの発現は、Pel Freez及びAbcamにより製造されたものなどの複数の抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて決定され得る。ＩＨＣに有用な希釈：
Pel Freez抗チロシンヒドロキシラーゼ・ウサギポリクローナル抗体  １：７５０
Abcam抗チロシンヒドロキシラーゼ・ウサギモノクローナル［ＥＰ１５３２Ｙ］  １：１０００
【０３１２】
肝臓切片はまた、標準的手順を利用してヘマトキシリン及びエオジンで染色した。ヘマトキシリン及びエオジン染色では、組織損傷又は白血球浸潤の兆候は示されていない（図６参照）。
【０３１３】
結論
第一の動物試験では、低用量のベクター（７．０２×１０１０ｖｇ／マウス）が投与された。肝臓免疫組織化学的検査により示された通り、これにより１％未満の形質導入が得られた（図４ａ参照）。第二の動物試験では、高用量のベクター（３．６×１０１２ｖｇ／マウス）が投与され、形質導入が著しく高くなり、即ち約２５％であった（図４ｂ参照）。Hiroyuki Nakai et al J. Virol. 2005, 79(1):214では、７０％を超える形質導入を実現するためには、ＡＡＶ８ベクターの用量（ｖｇ／マウス）が２Ｅ１２を超える必要があることが示唆されている。これと一致して、高い用量ほど、高い形質導入をもたらした。
【０３１４】
ＨＬＰは、ＬＰ１と等しい強さの短い肝特異性プロモーターである（McIntosh J et al, Blood. 2013 Apr 25;121(17):3335-44）。Ｌ−ＤＯＰＡアッセイでの内部対照から、動物試験１及び２を通して一致した感受性が確認された。
【０３１５】
図５に示される通り、第一の動物試験での群２及び３のマウスにおける全身Ｌ−ＤＯＰＡレベル（それぞれＢ及びＣで表される）は、対照のレベルよりもわずかに高い。しかし、第二の動物試験での群１及び２の両群のマウスにおける全身Ｌ−ＤＯＰＡレベル（それぞれＤ及びＥで表される）は、対照よりも著しく高かった。２つの試験で観察された全身Ｌ−ＤＯＰＡレベルの差は、異なる形質導入効率を生じた用量差が原因であると考えられる。
【０３１６】
さらなる試験では、２又は３用量のベンセラジド及びエンタカポン又はトルカポンを投与し、その８時間後にＬ−ＤＯＰＡアッセイ用に血液を採取して、血漿を抗酸化剤（水中の２５％ｗ／ｖメタ重亜硫酸ナトリウム）の存在下で貯蔵した後、アッセイした。
【０３１７】
実施例３：ベクターの合成
一連のベクターを合成して、末梢組織にトランスフェクト及び形質導入し、Ｌ−ｄｏｐａを一定速度で末梢循環に分泌させ、脳血液関門の通過を可能にし、ドパミン合成のプロドラッグとしての使用を可能にする。
【０３１８】
これらは、以下の構成又はエレメントでのベクターを包含する：
・  該ベクターは、ヒトチロシンヒドロキシラーゼアイソフォームをコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、自己相補性ゲノムとして構成されている。
・  一実施形態において、該核酸配列は、機能的酵素（配列番号：１５）又は（配列番号：４０）の約１６０のＮ末端アミノ酸が欠如したＮ末端トランケート型チロシンヒドロキシラーゼ酵素をコードするようにトランケートされている。該Ｎ末端トランケート型酵素は機能的であるが、該酵素により触媒される反応の生成物によるフィードバック阻害を受けにくい。したがって所望のＬ−ＤＯＰＡ生成物の治療有効レベルまでの生成増加が実現される。
・  一実施形態において、該構築物は、自己相補性ゲノムを使用しない。
・  ベクター構築物は、肝臓及び筋肉を標的とする種々のＡＡＶセロタイプで生成されている。これらは、肝臓ではセロタイプ８、５、２及び７が、筋肉では５、１、６及び２がある。
・  ベクター構築物には、肝臓用のＬＰ１など、種々の組織特異性プロモーターがある。
・  モデルベクター配列は、Nathwaniらによる論文（添付）からの以下の添付により提供される。本発明者らのベクターは、NathwaniらのＦａｃｔｏｒ  ＩＸゲノムと類似の配列を有するが、ＦＩＸコードの代わりに挿入された自己相補性ＴＨコードを含む。
【０３１９】
実施例４：肝臓におけるＧＣＨ及びＴＨの発現
１日目に、マウスはいずれかを受ける：０．１５ｍｌのバイシストロン性ベクター調製物（ｓｓＡＡＶ２／８−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−トランケート型ＴＨ）３．６０Ｅ＋１２ｖｇ／マウスのボーラス静脈内（尾静脈）注射（この調製物は相同組換えにより形成されたモノシストロン性ｓｓＬＰ１−ｔＴＨを一定割合、含む）；０．１５ｍｌビヒクル調製物のボーラス静脈内（尾静脈）注射；又は１０ｍｇ／ｋｇ経口Ｌ−ＤＯＰＡ。
【０３２０】
実施例３に記載された通り、マウスを１０〜１５日間観察した後、殺処分して、血漿を採取する。
【０３２１】
肝臓におけるＧＣＨ１及びＴＨの発現の分析を、ｑＰＣＲにより実施する。
【０３２２】
免疫組織化学的分析を、実施例３に記載された通り実施し、バイシストロン性ベクターを受けたマウスから得られた肝臓切片中にＧＣＨ１の発現が示される。ＧＣＨ１の発現は、ベクタートランスフェクションのマーカーとして用いられ得る。
【０３２３】
ウェスタンブロット分析を実施して、ＧＣＨ１がベクターのボーラス静脈内注射を受けたマウスの肝臓のみで発現されることが示される。
【０３２４】
実施例５：肝臓におけるＬ−ＤＯＰＡの合成
ＥＤＴＡ血漿中のタンパク質を０．４Ｍ過塩素酸で沈殿させることにより、Ｌ−ＤＯＰＡレベルを該血漿中で測定する。遠心分離により沈殿したタンパク質を除去した後、過塩素酸層の一部を９６ウェルプレートに移して、０．１％ギ酸で希釈する。Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｉ）及びその安定した同位体標識内部標準Ｌ−ＤＯＰＡ−ｄ３（ＩＩ）を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。
【化１】
2018522595.tif 000004
【０３２５】
Ｌ−ＤＯＰＡは、血漿中では不安定であるため、Ｌ−ＤＯＰＡを含有する血漿は全て、１％メタ重亜硫酸ナトリウムの添加により安定化させて、公称温度−８０℃で凍結貯蔵する。較正標準を、０（ブランク）、０．０２０、０．０５０、０．１００、０．２５０、１．００、２．５０、５．００及び１０．０μｇ／ｍｌで調製し、品質管理試料（ＱＣ）を、０．０６０、０．８００及び８．００μｇ／ｍｌで調製する。
【０３２６】
この分析は、Agilent 1100シリーズバイナリーポンプ及びCTC Analytics（商標）CTC HTS-xt PALサンプラーを用い、ACE AQ  ５０ｍｍ×３ｍｍ液体クロマトグラフィーカラムでの０．１％ギ酸・アセトニトリル勾配を利用して実施する。質量分析は、TurboIonspray（商標）イオン源を取り付けられたApplied Biosystems（商標）API4000を使用して実施する。Ｌ−ＤＯＰＡ及びＬ−ＤＯＰＡ−ｄ３についてモニタリングする複数の反応イオンは、それぞれｍ／ｚ  １９８．２→１５２．１及び２０１．２→１５５．１であった。検量線を、１／×２で加重された線形回帰を利用して適合させる。
【０３２７】
実施例６：スクリーニング
・  本明細書の先に記載された通り調製された各ベクターを、１つのマウス群（１群あたりおよそ６匹）の尾静脈又は後脚の筋肉塊に注射する。マウスを、投与後２〜６週間観察する。末梢血を採取して、Ｌ−ｄｏｐａについてアッセイする。
・  Ｌ−ｄｏｐａ合成に必要な補因子を提供するために、テトラヒドロビオプテリン（経口又は腹腔内）、又は肝臓若しくは筋肉内でＧＣＨ１及び／若しくはＰＴＰＳ産生を形質導入するＡＡＶベクターの同時投与を受ける。
・  動物は、Ｌ−ＤＯＰＡの異化を制限するために、全身投与される（経口又は腹腔内）デカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、ベンセラジン）及びカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤を受ける。これらを投与し、最短で２４時間後に試料を採取して、末梢Ｌ−ＤＯＰＡレベルを評定する。
・  対照群の動物を、ベクターの注射を行わないこと以外が同じ手法で処置する。この群を、ベクター処置動物からのＬ−ＤＯＰＡレベルを比較する対照群とする。
・  異なる比率のＴＨ、ＧＣＨ１及びＰＴＰＳを発現するモノシストロン性、バイシストロン性又はトリシストロン性ベクター、プラスミド又は発現系を比較して、最適なＬ−ＤＯＰＡ産生を実現することができる。
・  異なる比率のベクター（それぞれ１つ又は複数の遺伝子を発現する）を比較して、最適なＬ−ＤＯＰＡ産生を実現することができる。
【０３２８】
実施例７：前臨床試験
・  最高の末梢Ｌ−ｄｏｐａレベルを生成するベクターを、げっ歯類及び非ヒト霊長類における急性及び慢性試験でテストして、治療関連レベルでのＬ−ｄｏｐａの持続的分泌を実証し、許容し得る耐容性及び安全性を実証する。
・  急性試験では、ベクターをげっ歯類及び非ヒト霊長類の筋肉内又は静脈内へ（末梢静脈又は直接門脈へ）投与する。動物を、注射後２８日間観察する。観察には、体重、摂食、任意の臨床徴候又は症状の観察、全血球計数、尿素及び電解質、肝機能検査、並びにクレアチンホスホキナーゼの測定がある。剖検後に、組織を任意の組織病理学的異常の証拠について検査して、ベクターの生体分布を評定する。
・  慢性試験では、ベクターをげっ歯類及び非ヒト霊長類の筋肉内又は静脈内へ（末梢静脈又は直接門脈へ）投与する。動物を、注射後６〜１２ヶ月観察する。観察には、体重、摂食、任意の臨床徴候又は症状の観察、全血球計数、尿素及び電解質、肝機能検査、並びにクレアチンホスホキナーゼの測定がある。剖検後に、組織を任意の組織病理学的異常の証拠について検査して、ベクターの生体分布を評定する。
・  追加の前臨床試験には、変異原性試験、発癌性試験、及び臨床試験を可能にするのに必要となる他の試験（例えば、心臓ＱＴ間隔に及ぼすベクター又はベクター生成物の影響の評定）が含まれる。
【０３２９】
実施例８：臨床試験
・  上記試験の十分な結果が得られたら、ＩＭ、ＩＶ、門脈への直接の輸液、又は分離式肢灌流のいずれかを利用して、最適な性能のベクターに基づいて臨床試験を設計する。
・  臨床試験には、（経口又は腹腔内の）デカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、ベンセラジン）及びカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤の同時投与を行った処置患者、及び行わなかった処置患者、並びにＢＨ４又は経口Ｌ−ＤＯＰＡの投与を行わなかった処置患者におけるＬ−ＤＯＰＡの薬物動態の詳細な評定が含まれる。
・  臨床試験では、急性Ｌ−ＤＯＰＡ生成（ベクター注射のおよそ４〜８週後）及びベクター注射の３、６、１２、１８及び２４ヶ月後などの時点での慢性Ｌ−ＤＯＰＡ生成を評定する。
・  臨床試験では、パーキンソン病の処置への補助剤としての本発明の急性及び慢性安全性及び有効性の評定が含まれる。
【０３３０】
実施例９：配列の概要
配列番号：１：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ヒト）
配列番号：２：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１アイソフォームＧＣＨ−２（ヒト）  
配列番号：３：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１アイソフォームＧＣＨ−３（ヒト）
配列番号：４：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１アイソフォームＧＣＨ−４（ヒト）
配列番号：５：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ラット）
配列番号：６：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（マウス）
配列番号：７：チロシン３−ヒドロキシラーゼ（ヒト）
配列番号：８：チロシン３−モノオキシゲナーゼ（ヒト）
配列番号：９：チロシンヒドロキシラーゼ（ヒト）
配列番号：１０：チロシンヒドロキシラーゼ（ヒト）
配列番号：１１：チロシン３−モノオキシゲナーゼ（ヒト）
配列番号：１２：トランケート型チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＨ（触媒ドメインに対応；ヒト）
配列番号：１３：ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ
配列番号：１４：配列番号：１４：ｓｅｒ１９＋ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ
配列番号：１５：配列番号：１５：Ｓｅｒ１９＋Ｓｅｒ３１＋Ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ
配列番号：１６：配列番号：１６：チロシン３−ヒドロキシラーゼ（ラット）
配列番号：１７：チロシン３−ヒドロキシラーゼ（マウス）
配列番号：１８：アデノ随伴ウイルス２左末端ヌクレオチド配列
配列番号：１９：アデノ随伴ウイルス２右末端ヌクレオチド配列
配列番号：２０：ホモサピエンスＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）、転写産物変異体１
配列番号：２１：シミアンウイルス４０初期ポリアデニル化ヌクレオチド配列
配列番号：２２：シミアンウイルス４０後期ポリアデニル化ヌクレオチド配列
配列番号：２３：ホモサピエンスチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、転写産物変異体２ヌクレオチド配列
配列番号：２４：トランケート型ＴＨ、触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列
配列番号：２５：ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ、ヌクレオチド配列
配列番号：２６：ｓｅｒ１９及びｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ、ヌクレオチド配列
配列番号：２７：ｓｅｒ１９、ｓｅｒ３１及びｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ、ヌクレオチド配列
配列番号：２８：ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）転写後調節エレメントヌクレオチド配列
配列番号：２９：突然変異したウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）転写後調節エレメントヌクレオチド配列
配列番号：３０：ＧＣＨ−１をコードするヌクレオチド配列
配列番号：３１：ｐＡＡ０１１−ｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ＧＣＨ１
配列番号：３２：ｐＡＡ０１６−ｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ｔＴＨ
配列番号：３３：ｐＡＡｏ１９−ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ
配列番号：３４：ｐＡＡ０１０  ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＴＨ
配列番号：３５：ｐＡＡ００９  ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１
配列番号：３６：ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏ
配列番号：３７：ｐＡＶ  ＨＬＰ  ＦＶＩＩＩ  Ｖ３  ｋａｎ
配列番号：３８：ハイブリッド肝特異性プロモーター（ＨＬＰ）
配列番号：３９：肝臓プロモーター／エンハンサー１（ＬＰ１）
配列番号：４０：ｔＴＨ＝トランケート型チロシンヒドロキシラーゼ
配列番号：４１：ＰＴＰＳ＝６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ
配列番号：４２：プライマーＡＡ１６  
配列番号：４３：プライマーＡＡ１７  
配列番号：４４：プライマーＡＡ３３  
配列番号：４５：プライマーＡＡ３４
配列番号：４６：プライマーＡＡ４３
配列番号：４７：プライマーＡＡ４４
配列番号：４８：プライマーＡＡ５７
配列番号：４９：プライマーＡＡ６７
配列番号：５０：プライマーＡＡ６８
配列番号：５１：プライマーＲｍｉｓｃＴＨｅｘｔ２
配列番号：５２：モノシストロン性送達プラスミドＴＨ
配列番号：５３：バイシストロン性送達プラスミドＧＣＨ１  ＰＴＰＳ
配列番号：１：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ヒト）
＞ｓｐ｜Ｐ３０７９３｜ＧＣＨ１＿ヒトＧＴＰシクロヒドロラーゼ１  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＧＣＨ１  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１
ＥＣ＝３．５．４．１６
別の名称：
ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１
ショートネーム＝ＧＴＰ−ＣＨ−Ｉ又はＧＣＨ−１又はＧＣＨ１又はＧＣＨ１
生物体：ホモサピエンス（ヒト）
http://www.uniprot.org/uniprot/P30793
MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEATHMCMVMRGVQKMNSKTVTSTMLGVFREDPKTREEFLTLIRS
配列番号：２：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１アイソフォームＧＣＨ−２（ヒト）  
＞ｓｐ｜Ｐ３０７９３−２｜ＧＣＨ１＿ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１のヒトアイソフォームＧＣＨ−２  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＧＣＨ１
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配列番号：３：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１アイソフォームＧＣＨ−３（ヒト）
＞ｓｐ｜Ｐ３０７９３−３｜ＧＣＨ１＿ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１のヒトアイソフォームＧＣＨ−３  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＧＣＨ１
MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEAT
配列番号：４：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１アイソフォームＧＣＨ−４（ヒト）
＞ｓｐ｜Ｐ３０７９３−４｜ＧＣＨ１＿ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１のヒトアイソフォームＧＣＨ−４  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＧＣＨ１
MEKGPVRAPAEKPRGARCSNGFPERDPPRPGPSRPAEKPPRPEAKSAQPADGWKGERPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILSSLGENPQRQGLLKTPWRAASAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGKVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALRPAGVGVVVEATKSNKYNKGLSPLLSSCHLFVAILK
配列番号：５：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ラット）
＞ｓｐ｜Ｐ２２２８８｜ＧＣＨ１＿ラットＧＴＰシクロヒドロラーゼ１  ＯＳ＝ドブネズミ  ＧＮ＝Ｇｃｈ１  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１
MEKPRGVRCTNGFPERELPRPGASRPAEKSRPPEAKGAQPADAWKAGRPRSEEDNELNLPNLAAAYSSILRSLGEDPQRQGLLKTPWRAATAMQFFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGRVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALQPAGVGVVIEATHMCMVMRGVQKMNSKTVTSTMLGVFREDPKTREEFLTLIRS
配列番号：６：ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（マウス）
＞ｓｐ｜Ｑ０５９１５｜ＧＣＨ１＿マウスＧＴＰシクロヒドロラーゼ１  ＯＳ＝ハツカネズミ  ＧＮ＝Ｇｃｈ１  ＰＥ＝２  ＳＶ＝１
MEKPRGVRCTNGFSERELPRPGASPPAEKSRPPEAKGAQPADAWKAGRHRSEEENQVNLPKLAAAYSSILLSLGEDPQRQGLLKTPWRAATAMQYFTKGYQETISDVLNDAIFDEDHDEMVIVKDIDMFSMCEHHLVPFVGRVHIGYLPNKQVLGLSKLARIVEIYSRRLQVQERLTKQIAVAITEALQPAGVGVVIEATHMCMVMRGVQKMNSKTVTSTMLGVFREDPKTREEFLTLIRS
配列番号：７：チロシン３−ヒドロキシラーゼ（ヒト）
ＥＣ＝１．１４．１６．２
別の名称：チロシン３−モノオキシゲナーゼ又はチロシン３−ヒドロキシラーゼ又はチロシンヒドロキシラーゼ
ショートネーム＝ＴＨ
生物体：ホモサピエンス（ヒト）
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAI
配列番号：８：チロシン３−モノオキシゲナーゼ（ヒト）
＞ｓｐ｜Ｐ０７１０１｜ＴＹ３Ｈ＿ヒトチロシン３−モノオキシゲナーゼ  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＴＨ  ＰＥ＝１  ＳＶ＝５
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：９：チロシンヒドロキシラーゼ（ヒト）
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｍ３ｂ４｜Ｑ２Ｍ３ｂ４＿ヒトチロシンヒドロキシラーゼ  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＴＨ  ＰＥ＝２  ＳＶ＝１
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAMLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１０：チロシンヒドロキシラーゼ（ヒト）  
＞ｔｒ｜ｂ７ＺＬ７３｜ｂ７ＺＬ７３＿ヒトＴＨタンパク質  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＴＨ  ＰＥ＝２  ＳＶ＝１
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAMLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADHTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１１：チロシン３−モノオキシゲナーゼ（ヒト）
＞ｓｐ｜Ｐ０７１０１｜ＴＹ３Ｈ＿ヒトチロシン３−モノオキシゲナーゼ  ＯＳ＝ホモサピエンス  ＧＮ＝ＴＨ  ＰＥ＝１  ＳＶ＝５
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMVRGQGAPGPSLTGSPWPGTAAPAASYTPTPRSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１２：トランケート型ＴＨ（触媒ドメインに対応）
MPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１３：ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMSPRFIGRRQELIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１４：ｓｅｒ１９＋ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ
MPTPDATTPQAKGFRRAVEELDAKQAEAIMSPRFIGRRQELIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１５：ｓｅｒ１９＋ｓｅｒ３１＋ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ
MPTPDATTPQAKGFRRAVEELDAKQAEAIMEPRFIGRRQELIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：１６：チロシン３−ヒドロキシラーゼ（ラット）
＞ｓｐ｜Ｐ０４１７７｜ＴＹ３Ｈ＿ラットチロシン３−モノオキシゲナーゼ  ＯＳ＝ドブネズミ  ＧＮ＝Ｔｈ  ＰＥ＝１  ＳＶ＝３
MPTPSAPSPQPKGFRRAVSEQDAKQAEAVTSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAAAAAAAAVASSEPGNPLEAVVFEERDGNAVLNLLFSLRGTKPSSLSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPLAGSPHLEYFVRFEVPSGDLAALLSSVRRVSDDVRSAREDKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYKHGEPIPHVEYTAEEIATWKEVYVTLKGLYATHACREHLEGFQLLERYCGYREDSIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTVYWFTVEFGLCKQNGELKAYGAGLLSSYGELLHSLSEEPEVRAFDPDTAAVQPYQDQTYQPVYFVSESFNDAKDKLRNYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPHTIQRSLEGVQDELHTLAHALSAIS
配列番号：１７：チロシン３−ヒドロキシラーゼ（マウス）
＞ｓｐ｜Ｐ２４５２９｜ＴＹ３Ｈ＿マウスチロシン３−モノオキシゲナーゼ  ＯＳ＝ハツカネズミ  ＧＮ＝Ｔｈ  ＰＥ＝１  ＳＶ＝３
MPTPSASSPQPKGFRRAVSEQDTKQAEAVTSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAAAAAAAAVASAEPGNPLEAVVFEERDGNAVLNLLFSLRGTKPSSLSRALKVFETFEAKIHHLETRPAQRPLAGSPHLEYFVRFEVPSGDLAALLSSVRRVSDDVRSAREDKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQAYRQRRKLIAEIAFQYKQGEPIPHVEYTKEEIATWKEVYATLKGLYATHACREHLEAFQLLERYCGYREDSIPQLEDVSHFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTVYWFTVEFGLCKQNGELKAYGAGLLSSYGELLHSLSEEPEVRAFDPDTAAVQPYQDQTYQPVYFVSESFSDAKDKLRNYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPHTIRRSLEGVQDELHTLTQALSAIS
配列番号：１８：アデノ随伴ウイルス２左末端ヌクレオチド配列
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct
配列番号：１９：アデノ随伴ウイルス２右末端ヌクレオチド配列
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
配列番号：２０：ホモサピエンスＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）、転写産物変異体１
ATGGAGAAGGGCCCTGTGCGGGCACCGGCGGAGAAGCCGCGGGGCGCCAGGTGCAGCAATGGGTTCCCCGAGCGGGATCCGCCGCGGCCCGGGCCCAGCAGGCCGGCGGAGAAGCCCCCGCGGCCCGAGGCCAAGAGCGCGCAGCCCGCGGACGGCTGGAAGGGCGAGCGGCCCCGCAGCGAGGAGGATAACGAGCTGAACCTCCCTAACCTGGCAGCCGCCTACTCGTCCATCCTGAGCTCGCTGGGCGAGAACCCCCAGCGGCAAGGGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCTCGGCCATGCAGTTCTTCACCAAGGGCTACCAGGAGACCATCTCAGATGTCCTAAACGATGCTATATTTGATGAAGATCATGATGAGATGGTGATTGTGAAGGACATAGACATGTTTTCCATGTGTGAGCATCACTTGGTTCCATTTGTTGGAAAGGTCCATATTGGTTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGCCTCAGCAAACTTGCGAGGATTGTAGAAATCTATAGTAGAAGACTACAAGTTCAGGAGCGCCTTACAAAACAAATTGCTGTAGCAATCACGGAAGCCTTGCGGCCTGCTGGAGTCGGGGTAGTGGTTGAAGCAACACACATGTGTATGGTAATGCGAGGTGTACAGAAAATGAACAGCAAAACTGTGACCAGCACAATGTTGGGTGTGTTCCGGGAGGATCCAAAGACTCGGGAAGAGTTCCTGACTCTCATTAGGAGCTAA
配列番号：２１：シミアンウイルス４０初期ポリアデニル化ヌクレオチド配列
TTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAA
配列番号：２２：シミアンウイルス４０後期ポリアデニル化ヌクレオチド配列
CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTT
配列番号：２３：ホモサピエンスチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、転写産物変異体２ヌクレオチド配列
ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGTCTGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGAGCCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGG
配列番号：２４：トランケート型ＴＨ（触媒ドメインをコード）、ヌクレオチド配列
ATGAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAA
配列番号：２５：ｓｅｒ４０で突然変異したＴＨ、ヌクレオチド配列
ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGTCTGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGGAGCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGC
配列番号：２６：ｓｅｒ１９及びｓｅｒ４０として突然変異したＴＨ、ヌクレオチド配列
ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGGAGGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGGAGCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGC
配列番号：２７：ｓｅｒ１９、ｓｅｒ３１及びｓｅｒ４０として突然変異したＴＨ、ヌクレオチド配列
ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCCGTGGAGGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGGAGCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGGAGCTCATCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCTGCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAGAAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAGCCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAAATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCCCACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGC
配列番号：２８：ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）転写後調節エレメントヌクレオチド配列
CGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCT
配列番号：２９：突然変異したウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）転写後調節エレメントヌクレオチド配列
CGTCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCT
配列番号：３０  ＧＣＨ１ヌクレオチド配列
ATGGAGAAGGGCCCTGTGCGGGCACCGGCGGAGAAGCCGCGGGGCGCCAGGTGCAGCAATGGGTTCCCCGAGCGGGATCCGCCGCGGCCCGGGCCCAGCAGGCCGGCGGAGAAGCCCCCGCGGCCCGAGGCCAAGAGCGCGCAGCCCGCGGACGGCTGGAAGGGCGAGCGGCCCCGCAGCGAGGAGGATAACGAGCTGAACCTCCCTAACCTGGCAGCCGCCTACTCGTCCATCCTGAGCTCGCTGGGCGAGAACCCCCAGCGGCAAGGGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCTCGGCCATGCAGTTCTTCACCAAGGGCTACCAGGAGACCATCTCAGATGTCCTAAACGATGCTATATTTGATGAAGATCATGATGAGATGGTGATTGTGAAGGACATAGACATGTTTTCCATGTGTGAGCATCACTTGGTTCCATTTGTTGGAAAGGTCCATATTGGTTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGCCTCAGCAAACTTGCGAGGATTGTAGAAATCTATAGTAGAAGACTACAAGTTCAGGAGCGCCTTACAAAACAAATTGCTGTAGCAATCACGGAAGCCTTGCGGCCTGCTGGAGTCGGGGTAGTGGTTGAAGCAACACACATGTGTATGGTAATGCGAGGTGTACAGAAAATGAACAGCAAAACTGTGACCAGCACAATGTTGGGTGTGTTCCGGGAGGATCCAAAGACTCGGGAAGAGTTCCTGACTCTCATTAGGA
配列番号：３１  ｐＡＡ０１１−ｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ＧＣＨ１：
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTCTAGATGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGCCCATTTTAGGGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGCTAGCGAATTCTAGCATGGAGAAGGGCCCTGTGCGGGCACCGGCGGAGAAGCCGCGGGGCGCCAGGTGCAGCAATGGGTTCCCCGAGCGGGATCCGCCGCGGCCCGGGCCCAGCAGGCCGGCGGAGAAGCCCCCGCGGCCCGAGGCCAAGAGCGCGCAGCCCGCGGACGGCTGGAAGGGCGAGCGGCCCCGCAGCGAGGAGGATAACGAGCTGAACCTCCCTAACCTGGCAGCCGCCTACTCGTCCATCCTGAGCTCGCTGGGCGAGAACCCCCAGCGGCAAGGGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCTCGGCCATGCAGTTCTTCACCAAGGGCTACCAGGAGACCATCTCAGATGTCCTAAACGATGCTATATTTGATGAAGATCATGATGAGATGGTGATTGTGAAGGACATAGACATGTTTTCCATGTGTGAGCATCACTTGGTTCCATTTGTTGGAAAGGTCCATATTGGTTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGCCTCAGCAAACTTGCGAGGATTGTAGAAATCTATAGTAGAAGACTACAAGTTCAGGAGCGCCTTACAAAACAAATTGCTGTAGCAATCACGGAAGCCTTGCGGCCTGCTGGAGTCGGGGTAGTGGTTGAAGCAACACACATGTGTATGGTAATGCGAGGTGTACAGAAAATGAACAGCAAAACTGTGACCAGCACAATGTTGGGTGTGTTCCGGGAGGATCCAAAGACTCGGGAAGAGTTCCTGACTCTCATTAGGAGCTAATGCATCCCCATCGATGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAGTCGACCGCTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTCGAGATCTAG
配列番号：３２：ｐＡＡ０１６−ｓｃＡＡＶ−ＨＬＰ−ｔＴＨ：
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCCCTAAAATGGGCAAACATTGCGCTAGCTGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGCCCATTTTAGGGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCATTCAAGCTCGTAGCAAGGATCCACCGGTCACCATGAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAACTAGTGGATCCGTCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACAGCTTATCGATACCGTCGACTTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCCCCCGCTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTCGAGATCTAG
配列番号：３３：ｐＡＡｏ１９−ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１−ＬＰ１−ｔＴＨ：
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配列番号：３４：ｐＡＡ０１０  ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｔＴＨ
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCCGGACTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTCTCTCTTTTAGATTCCAACCTTTGGAACTGAATTCTAGCATGAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAACTAGTGGATCCGTCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACAGCTTATCGATACCGTCGACTTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCCCCCGCTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT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配列番号：３５：ｐＡＡ００９  ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ＧＣＨ１
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配列番号：３６：ｓｃＡＡＶ−ＬＰ１−ｈＦＩＸｃｏ
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCCGGACTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTCTCTCTTTTAGATTCCAACCTTTGGAACTGAATTCTAGACCACCATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGAGCCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCTGCTGAGTGCACTGTGTTCCTGGACCATGAGAATGCCAACAAGATCCTGAACAGGCCCAAGAGATACAACTCTGGCAAGCTGGAGGAGTTTGTGCAGGGCAACCTGGAGAGGGAGTGCATGGAGGAGAAGTGCAGCTTTGAGGAGGCCAGGGAGGTGTTTGAGAACACTGAGAGGACCACTGAGTTCTGGAAGCAGTATGTGGATGGGGACCAGTGTGAGAGCAACCCCTGCCTGAATGGGGGCAGCTGCAAGGATGACATCAACAGCTATGAGTGCTGGTGCCCCTTTGGCTTTGAGGGCAAGAACTGTGAGCTGGATGTGACCTGCAACATCAAGAATGGCAGATGTGAGCAGTTCTGCAAGAACTCTGCTGACAACAAGGTGGTGTGCAGCTGCACTGAGGGCTACAGGCTGGCTGAGAACCAGAAGAGCTGTGAGCCTGCTGTGCCATTCCCATGTGGCAGAGTGTCTGTGAGCCAGACCAGCAAGCTGACCAGGGCTGAGGCTGTGTTCCCTGATGTGGACTATGTGAACAGCACTGAGGCTGAAACCATCCTGGACAACATCACCCAGAGCACCCAGAGCTTCAATGACTTCACCAGGGTGGTGGGGGGGGAGGATGCCAAGCCTGGCCAGTTCCCCTGGCAAGTGGTGCTGAATGGCAAGGTGGATGCCTTCTGTGGGGGCAGCATTGTGAATGAGAAGTGGATTGTGACTGCTGCCCACTGTGTGGAGACTGGGGTGAAGATCACTGTGGTGGCTGGGGAGCACAACATTGAGGAGACTGAGCACACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGGATCATCCCCCACCACAACTACAATGCTGCCATCAACAAGTACAACCATGACATTGCCCTGCTGGAGCTGGATGAGCCCCTGGTGCTGAACAGCTATGTGACCCCCATCTGCATTGCTGACAAGGAGTACACCAACATCTTCCTGAAGTTTGGCTCTGGCTATGTGTCTGGCTGGGGCAGGGTGTTCCACAAGGGCAGGTCTGCCCTGGTGCTGCAGTACCTGAGGGTGCCCCTGGTGGACAGGGCCACCTGCCTGAGGAGCACCAAGTTCACCATCTACAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAGGGGGGCAGGGACAGCTGCCAGGGGGACTCTGGGGGCCCCCATGTGACTGAGGTGGAGGGCACCAGCTTCCTGACTGGCATCATCAGCTGGGGGGAGGAGTGTGCCATGAAGGGCAAGTATGGCATCTACACCAAAGTCTCCAGATATGTGAACTGGATCAAGGAGAAGACCAAGCTGACCTGACTCGATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTCGAGATCTAG
配列番号：３７：ｐＡＶ  ＨＬＰ  ＦＶＩＩＩ  Ｖ３  ｋａｎ
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCCCGGGGGGATCTTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCGGAGGGGTGGAGTCGTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCGTATACTGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGCCCATTTTAGGGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGCGGCCGCCACCATGCAGATTGAGCTGAGCACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGAGGTTCTGCTTCTCTGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAATGCCACTAATGTGTCTAACAACAGCAACACCAGCAATGACAGCAATGTGTCTCCCCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGAGGGAGATCACCAGGACCACCCTGCAGTCTGACCAGGAGGAGATTGACTATGATGACACCATCTCTGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTTGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCACCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGATCGCGAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGATGCAGCCCAAGCTGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCCCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
配列番号：３８：ハイブリッド肝特異性プロモーター（ＨＬＰ）
TGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGCCCATTTTAGGGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATC
配列番号：３９：肝臓プロモーター／エンハンサー１（ＬＰ１）
CCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCCGGACTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTCTCTCTTTTAGATTCCAACCTTTGGAACTGA
配列番号：４０：ｔＴＨ＝トランケート型チロシンヒドロキシラーゼ
MSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
配列番号：４１：ＰＴＰＳ＝６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ
＞ＥＮＡ｜ＢＡＡ０４９５９｜ＢＡＡ０４９５９．１  ホモサピエンス（ヒト）  ６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ
ATGAGCACGGAAGGTGGTGGCCGTCGCTGCCAGGCACAAGTGTCCCGCCGCATCTCCTTCAGCGCGAGCCACCGATTGTACAGTAAATTTCTAAGTGATGAAGAAAACTTGAAACTGTTTGGGAAATGCAACAATCCAAATGGCCATGGGCACAATTATAAAGTTGTGGTGACAGTACATGGAGAGATTGACCCTGCTACGGGAATGGTTATGAATCTGGCTGATCTCAAAAAATATATGGAGGAGGCGATTATGCAGCCCCTTGATCATAAGAATCTGGATATGGATGTGCCATACTTTGCAGATGTGGTGAGCACGACTGAAAATGTAGCTGTTTATATCTGGGACAACCTCCAGAAAGTTCTTCCTGTAGGAGTTCTTTATAAAGTAAAAGTATACGAAACTGACAATAATATTGTGGTTTATAAAGGAGAATAG
配列番号：４２：プライマーＡＡ１６
ccaagctagcATGGAGAAGGGCCCTGTG
配列番号：４３：プライマーＡＡ１７
ccaagctagcGGTCGACTAAAAAACCTCC
配列番号：４４：プライマーＡＡ３３
CCAAgctagcATGAGCCCCGCGGGGCCCAAG
配列番号：４５：プライマーＡＡ３４
CCAAgctagcGGGGGATCTTCGATGCTAGAC
配列番号：４６：プライマーＡＡ４３
CCAATGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTCTAGATGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGC
配列番号：４７：プライマーＡＡ４４
CCAAGAATTCGCTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGTG
配列番号：４８：プライマーＡＡ５７
CCAAGCTAGCTGTTTGCTGCTTGCAATGTTTGC
配列番号：４９：プライマーＡＡ６７
GATCCTTGCTACGAGCTTGAATGATTCACTGTCCCAGGTCAGT
配列番号：５０：プライマーＡＡ６８
ACTGACCTGGGACAGTGAATCATTCAAGCTCGTAGCAAGGATC
配列番号：５１：プライマーＲｍｕｓｃＴＨｅｘｔ２
AAAgctagcTTCGATGCTAGACGATCCAG
配列番号：５２：ＭＬＦ００３ｎｏｅｆｇｐ
GCGATCGCGGCTCCCGACATCTTGGACCATTAGCTCCACAGGTATCTTCTTCCCTCTAGTGGTCATAACAGCAGCTTCAGCTACCTCTCAATTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTATCAATCGTTGCGTTACACACACAAAAAACCAACACACATCCATCTTCGATGGATAGCGATTTTATTATCTAACTGCTGATCGAGTGTAGCCAGATCTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCAGATCTTTGTCGATCCTACCATCCACTCGACACACCCGCCAGCTAGAGATCCCGGGACCATGAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTACTGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAAGACGCCACCTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCCATCTTGACTGACTGAGATACAGCGTACCTTCAGCTCACAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATTGGCCCATCTCTATCGGTATCGTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTGCCCCTCGGGCCGGATTGCTATCTACCGGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAAGGTCGTCAGCTATCCTGCAGGCGATCTCTCGATTTCGATCAAGACATTCCTTTAATGGTCTTTTCTGGACACCACTAGGGGTCAGAAGTAGTTCATCAAACTTTCTTCCCTCCCTAATCTCATTGGTTACCTTGGGCTATCGAAACTTAATTAACCAGTCAAGTCAGCTACTTGGCGAGATCGACTTGTCTGGGTTTCGACTACGCTCAGAATTGCGTCAGTCAAGTTCGATCTGGTCCTTGCTATTGCACCCGTTCTCCGATTACGAGTTTCATTTAAATCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCATTTAAATTTCCGAACTCTCCAAGGCCCTCGTCGGAAAATCTTCAAACCTTTCGTCCGATCCATCTTGCAGGCTACCTCTCGAACGAACTATCGCAAGTCTCTTGGCCGGCCTTGCGCCTTGGCTATTGCTTGGCAGCGCCTATCGCCAGGTATTACTCCAATCCCGAATATCCGAGATCGGGATCACCCGAGAGAAGTTCAACCTACATCCTCAATCCCGATCTATCCGAGATCCGAGGAATATCGAAATCGGGGCGCGCCTGGTGTACCGAGAACGATCCTCTCAGTGCGAGTCTCGACGATCCATATCGTTGCTTGGCAGTCAGCCAGTCGGAATCCAGCTTGGGACCCAGGAAGTCCAATCGTCAGATATTGTACTCAAGCCTGGTCACGGCAGCGTACCGATCTGTTTAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCGCGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGCTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTATTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATTGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACCTTGCGTAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAGTTGATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAAGATCCCGAATCGTTTAAACTCGACTCTGGCTCTATCGAATCTCCGTCGTTTCGAGCTTACGCGAACAGCCGTGGCGCTCATTTGCTCGTCGGGCATCGAATCTCGTCAGCTATCGTCAGCTTACCTTTTTGGCA
配列番号：５３  ＭＤＬ００４
GCGATCGCGGCTCCCGACATCTTGGACCATTAGCTCCACAGGTATCTTCTTCCCTCTAGTGGTCATAACAGCAGCTTCAGCTACCTCTCAATTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTATCAATCGTTGCGTTACACACACAAAAAACCAACACACATCCATCTTCGATGGATAGCGATTTTATTATCTAACTGCTGATCGAGTGTAGCCAGATCTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCAGATCTTTGTCGATCCTACCATCCACTCGACACACCCGCCAGCAATATGGCCACAACCGCGGCCGTAGATCCCGGGACCATGGAGAAGCCGCGGGGAGTCAGGTGCACCAATGGGTTCTCCGAGCGGGAGCTGCCGCGGCCCGGGGCCAGCCCGCCTGCCGAGAAGTCCCGGCCGCCCGAGGCCAAGGGCGCACAGCCGGCCGACGCCTGGAAGGCAGGGCGGCACCGCAGCGAGGAGGAAAACCAGGTGAACCTCCCCAAACTGGCGGCTGCTTACTCGTCCATTCTGCTCTCGCTGGGCGAGGACCCCCAGCGGCAGGGGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCACCGCCATGCAGTACTTCACCAAGGGATACCAGGAGACCATCTCAGATGTCCTGAATGATGCTATATTTGATGAAGATCATGACGAGATGGTGATTGTGAAGGACATAGATATGTTCTCCATGTGTGAGCATCACCTTGTTCCATTTGTAGGAAGGGTCCATATTGGCTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGTCTCAGTAAACTTGCCAGGATTGTAGAAATCTACAGTAGACGACTACAAGTTCAAGAGCGCCTCACCAAACAGATTGCGGTGGCCATCACAGAAGCCTTGCAGCCTGCTGGCGTTGGAGTAGTGATTGAAGCGACACACATGTGCATGGTAATGCGAGGCGTGCAGAAAATGAACAGCAAGACTGTCACTAGCACCATGCTGGGCGTGTTCCGGGAAGACCCCAAGACTCGGGAGGAGTTCCTCACACTAATCAGGAGCTGAGACTATAGGGTGGGTATTATGTGTTCATCAACCATCCTAAAAATACCCGGTAAACAGGTGCAGCCCCAGATCTGGGCAGCAGGAGGGGGCAGTGGGAAGCTTAACGCGCCACGACTATAGGGTGGGTATTATGTGTTCATCAACCATCCTAAAAATACCCGGTAAACAGGTGCAGCCCCAGATCTGGGCAGCAGGAGGGGGCAGTGGGAAGCTTATCTAGTCTCGAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCTCGAGATCTGGATATCGACTATAGGGTGGGTATTATGTGTTCATCAACCATCCTAAAAATACCCGGTAAACAGGTGCAGCCCCAGATCTGGGCAGCAGGAGGGGGCAGTGGGTCTGTTCTATTTTTACCAGCCAGTTGCTGCTGGACACAGTTTTCATAGCCTCCCCTCGGCTCTGCCCCTCACAGTCTGCAGTCTACGGCGAGGCACAGGCCAGCCCAGCTCCACGAGGACTGAACAAGAAGCTTGATATCGAATTGGTACCATCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATATCGCCTTTACTTCTAGGCCACCATGAGCGCGGCGGGTGACCTTCGTCGCCGCGCGCGACTGTCGCGCCTCGTGTCCTTCAGCGCGAGCCACCGGCTGCACAGCCCATCTCTGAGCGATGAAGAGAACTTAAGAGTGTTTGGGAAATGCAACAATCCGAATGGCCACGGGCACAACTATAAAGTTGTGGTGACAGTCCATGGAGAGATTGATCCTGTTACAGGAATGGTTATGAATTTGACCGACCTCAAAGAATACATGGAGGAGGCCATCATGAAGCCTCTTGATCACAAGAACCTGGACCTGGATGTGCCGTACTTTGCGGATGCTGTGAGCACGACAGAAAATGTAGCTGTCTACATCTGGGAAAGCCTCCAGAAACTTCTTCCAGTGGGAGCTCTTTATAAAGTAAAAGTGTTTGAAACCGACAACAACATCGTAGTCTATAAAGGAGAATAGTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCCATCTTGACTGACTGAGATACAGCGTACCTTCAGCTCACAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATTGGCCCATCTCTATCGGTATCGTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTGCCCCTCGGGCCGGATTGCTATCTACCGGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAAGGTCGTCAGCTATCCTGCAGGCGATCTCTCGATTTCGATCAAGACATTCCTTTAATGGTCTTTTCTGGACACCACTAGGGGTCAGAAGTAGTTCATCAAACTTTCTTCCCTCCCTAATCTCATTGGTTACCTTGGGCTATCGAAACTTAATTAACCAGTCAAGTCAGCTACTTGGCGAGATCGACTTGTCTGGGTTTCGACTACGCTCAGAATTGCGTCAGTCAAGTTCGATCTGGTCCTTGCTATTGCACCCGTTCTCCGATTACGAGTTTCATTTAAATCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCATTTAAATTTCCGAACTCTCCAAGGCCCTCGTCGGAAAATCTTCAAACCTTTCGTCCGATCCATCTTGCAGGCTACCTCTCGAACGAACTATCGCAAGTCTCTTGGCCGGCCTTGCGCCTTGGCTATTGCTTGGCAGCGCCTATCGCCAGGTATTACTCCAATCCCGAATATCCGAGATCGGGATCACCCGAGAGAAGTTCAACCTACATCCTCAATCCCGA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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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