(57)【要約】  開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、一般形態ｍ７Ｇｐｐｐ［Ｎ２’Ｏｍｅ］ｎ［Ｎ］ｍ（式中、ｍ７Ｇは、Ｎ７−メチル化グアノシンまたは任意のグアノシン類似体であり、Ｎは、任意の天然、修飾または非天然ヌクレオシドであり、「ｎ」は、０〜４の任意の整数であり得、「ｍ」は、１〜９の任意の整数であり得る）を有する、５’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物が本明細書において提供される。
2018527015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を含む開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー：
【化１】
2018527015.tif 000008
［式中、
Ｂ１からＢ１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９の各々は独立に、０または１であり、
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ２およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ−アルキル、ハロゲン、リンカーまたは検出可能なマーカーであり、
Ｘ１からＸ１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ１からＹ１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ３、アリール、アルキル、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールであり、
Ｚ１からＺ２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、Ｃ（ハロゲン）２またはＣＨ（ハロゲン）であり、
Ｒ４からＲ１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅまたは検出可能なマーカーである］。
【請求項２】
ｑ１＝１であり
ｑ２〜ｑ９の各々＝０または１である、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
Ｂ１が、転写鋳型位置＋１で核酸鋳型上のヌクレオシド塩基と完全に相補的であり、
Ｂ２からＢ９が、存在する場合には、位置＋２以降の転写開始部位で核酸鋳型上のそれぞれのヌクレオシド塩基と完全に相補的であり、
Ｂ１０、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの最後のヌクレオシド塩基が、最後のハイブリダイズされる転写鋳型ヌクレオチドと完全に相補的である、請求項１または２に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
ｑ２〜ｑ９＝０、かつ
Ｂ１０が、鋳型ヌクレオチド２とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
ｑ１〜ｑ２＝１、
ｑ３〜９＝０、かつ
Ｂ２およびＢ１０が、それぞれ鋳型ヌクレオチド２および３とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
ｑ１〜ｑ３＝１、
ｑ４〜９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３および４とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
ｑ１〜ｑ４＝１、
ｑ５〜９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４および５とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
ｑ１〜ｑ５＝１、
ｑ６〜９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４、５および６とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
ｑ１〜ｑ６＝１、
ｑ７〜９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４、５、６および７とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１０】
ｑ１〜ｑ７＝１、
ｑ８〜９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４、５、６、７および８とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１１】
ｑ１〜ｑ８＝１、
ｑ９＝０、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８およびＢ１０が、それぞれ鋳型ヌクレオチド２、３、４、５、６、７、８および９とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１２】
ｑ１〜ｑ９＝１、かつ
Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２、３、４、５、６、７、８、９および１０とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１３】
ｑ１〜ｑ２＝１、
ｑ３〜９＝０、かつ
Ｂ２およびＢ１０が、それぞれ、鋳型ヌクレオチド２および３とハイブリダイズする、請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１４】
請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子を含有する細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡから翻訳されたタンパク質またはペプチドを含有する細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
十分に鋳型となるＲＮＡ分子を合成するための方法であって、以下の構造を有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを、ポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促す条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中に入れるステップと、
【化２】
2018527015.tif 000009
［式中、
Ｂ１からＢ１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ２およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ−アルキル、ハロゲン、リンカーまたは検出可能なマーカーであり、
Ｘ１からＸ１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ１からＹ１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ３、アリール、アルキル、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールであり、
Ｚ１からＺ２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、Ｃ（ハロゲン）２またはＣＨ（ハロゲン）であり、
Ｒ４からＲ１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅまたは検出可能なマーカーである］
前記混合物を、前記鋳型の転写を可能にするのに十分な時間インキュベートするステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月２１日に出願された米国特許仮出願番号第６２／２２１，２４８号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１６年１１月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９５１０９−０００５００ＰＣ−１０２２５４３＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、７８５バイトの大きさである。
【０００２】
本発明は、５’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物に関する。特定の態様では、本発明は、天然の、または修飾された５’−キャップ０、キャップ１、キャップ２またはトリメチルグアノシン−キャップ（ＴＭＧ−キャップ）構造を有する新規キャップ含有開始オリゴヌクレオチドプライマーに関する。さらなる態様では、本発明は、５’キャップ付ＲＮＡを効率的に作製し、それを使用するための方法に関し、５’キャップ付ＲＮＡを調製するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
読者の理解を補助するために以下の説明を提供する。提供される情報または引用される参考文献のうち、本発明において先行技術であると認められるものはない。
【０００４】
治療的適用にとって生理学的に重要なタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、遺伝物質を送達するためのＤＮＡベースのプラスミドおよびウイルスベクターを上回る相当な利点を示している。これらの利点のうち最も重要なものとして以下がある：
（ｉ）高レベルの安全性（ウイルスまたはプラスミド組込みからのゲノム損傷の可能性を低減する）、
（ｉｉ）ｍＲＮＡ送達は、即時のタンパク質発現をもたらす（プラスミドを用いる場合に一般に起こる遅延応答とは異なる）、
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡは、タンパク質の発現に対する頑強な用量依存性制御を可能にする、および
（ｉｖ）プラスミドおよびウイルスベクターの製造と比較した、ｍＲＮＡの大規模合成の単純性。
【０００５】
メッセンジャーＲＮＡは、実質的に任意の公知のタンパク質をコードすることができ、当業者に公知の種々の方法によって特定の組織および臓器に送達することができる。これらのｍＲＮＡは、ひとたび送達されると、標的とされる組織内でリボソームタンパク質発現を指示し、ｍＲＮＡ分子１つあたり数百のタンパク質の生成をもたらす。
【０００６】
コードされるタンパク質を効率的に翻訳するために、活性なｍＲＮＡ分子各々中に存在するいくつかの構造エレメントが利用される。これらのエレメントのうち１種が、ｍＲＮＡの５’末端上のキャップ構造であり、これは、すべての真核生物（およびいくつかのウイルス）中に存在する。天然に存在するキャップ構造は、グアニン塩基のＮ７位置でメチル化されるリボ−グアノシン残基を含む。この７−メチルグアノシン（７ｍＧ）は、ｍＲＮＡ分子の５’末端での５’−対５’−三リン酸鎖を介して連結される。本出願を通じて、７ｍおよびｍ７は、同義的に使用され、同等の意味を有する。５’末端上の７ｍＧｐｐｐ断片の存在は、ｍＲＮＡ成熟にとって必須であり、
ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、
核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、
翻訳開始複合体の組み立てにおいて重要な役割を果たす（Ｃｅｌｌ第９巻：６４５〜６５３頁、（１９７６年）；Ｎａｔｕｒｅ第２６６巻：２３５頁（１９７７年）；Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｌｅｔｔｅｒ第９６巻：１〜１１頁（１９７８年）；Ｃｅｌｌ第４０巻：２２３〜２４頁、（１９８５年）；Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．第３５巻：１７３〜２０７頁、（１９８８年）；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６８巻：９１３〜９６３頁、（１９９９年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻：３０３３７〜３０４０頁（１９９９年））。
【０００７】
キャップ依存性翻訳においては、キャップ構造を保持するｍＲＮＡのみが活性である；ｍＲＮＡの「キャップ除去」は、タンパク質合成のためのその鋳型活性のほとんど完全な喪失をもたらす（Ｎａｔｕｒｅ、第２５５巻：３３〜３７頁、（１９７５年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５３巻：５２２８〜５２３１頁、（１９７８年）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７２巻：１１８９〜１１９３頁、（１９７５年））。
【０００８】
真核細胞のｍＲＮＡの別のエレメントは、転写物位置１（キャップ１）での、いくつかの場合には、転写物位置１および２（キャップ２）での２’−Ｏ−メチルヌクレオシド残基の存在である。ｍＲＮＡの２’−Ｏ−メチル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ翻訳のより高い有効性にとって必要であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻：３９５２〜３９５６頁（１９８０年））、５’キャップ付ｍＲＮＡのヌクレアーゼ安定性をさらに改善する。キャップ１（およびキャップ２）を有するｍＲＮＡは、細胞が真正のｍＲＮＡ  ５’末端を認識するのを可能にし、いくつかの例では、感染性遺伝要素から生じる転写物を識別する特有の印である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４３巻：４８２〜４９２頁（２０１５年））。
【０００９】
一次ｍＲＮＡ転写物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＴＰ（通常、ＧＴＰ）で出発するＲＮＡ合成の開始に起因する５’−三リン酸基（５’−ｐｐｐｍＲＮＡ）を保持する。ｍＲＮＡ転写物の５’−三リン酸化末端のキャップ構造（キャップ０）への変換は、いくつかの酵素ステップによって起こる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５０巻：９３２２頁（１９７５年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６頁（１９９６年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻：１６４３０頁、（１９９２年））。これらの酵素反応ステップとして以下がある：
ステップ１：ＲＮＡ三リン酸分解酵素が、ｍＲＮＡの５’−三リン酸を５’−二リン酸に変換する、ｐｐｐＮ１（ｐＮ）ｘ→ｐｐＮ１（ｐＮ）ｘ＋無機リン酸、
ステップ２：ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼが、ＧＴＰを使用して、ＧＭＰ残基をｍＲＮＡの５’−二リン酸に移す、ｐｐＮ１（ｐＮ）ｘ＋ＧＴＰ→Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ＋無機ピロリン酸、および
ステップ３：グアニン−７−メチルトランスフェラーゼが、補因子としてＳ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を使用し、ＡｄｏＭｅｔからグアニン塩基の７−窒素にメチル基を移す、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ＋ＡｄｏＭｅｔ→７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ＋ＡｄｏＨｙｃ）。
これらの酵素活性から得られたＲＮＡは、「５’キャップ付ＲＮＡ」または「キャップ付ＲＮＡ」と呼ばれ、「キャップ付ＲＮＡ」の形成をもたらすこのプロセスに関与する酵素の組合せは、「キャップ形成（capping）酵素」と呼ばれる。このような酵素のクローニングされた形態を含むキャップ形成酵素は、同定されており、多数の供給源から精製されており、当技術分野で周知である（Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第６６巻：１〜４０頁、（２００１年）；Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第５０巻：１０１〜１２９頁、（１９９５年）；およびＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第４４巻：１７５頁、（１９８０年））。キャップ形成酵素による一次ＲＮＡの５’末端へのキャップヌクレオチドの付加から得られるキャップ付ＲＮＡは、「キャップ０構造」を有するキャップ付ＲＮＡと呼ばれている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４９７４〜１４９８１頁、（１９９４年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６〜１１９４４頁（１９９６年））。キャップ形成酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでキャップ０構造を有するキャップ付ＲＮＡを合成するために使用されてきた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５５巻：１１５８８頁、（１９８０年）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９４巻：９５７３頁、（１９９７年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻：１６４３０頁、（１９９２年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４９７４頁、（１９９４年）；およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６頁、（１９９６年））。
【００１０】
５’−キャップ０構造を有するキャップ付ＲＮＡは、（ヌクレオシド−２’−Ｏ−）メチルトランスフェラーゼの作用によって「キャップ１」構造にｉｎ  ｖｉｖｏでさらに変換され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４９７４〜１４９８１頁、（１９９４年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１１９３６〜１１９４４頁、（１９９６年）；およびＥＭＢＯ第２１巻：２７５７〜２７６８頁、（２００２年））。例えば、ワクシニアｍＲＮＡ（ヌクレオシド−２’−Ｏ）メチルトランスフェラーゼは、以下の反応によって、キャップ０構造を有する５’キャップ付ＲＮＡの５’の最後から２番目のヌクレオチドの２’−ヒドロキシル基のメチル化を触媒できる：
７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｐＮ２（ｐＮ）ｘ＋ＡｄｏＭｅｔ→７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１２’−ＯＭｅｐＮ２（ｐＮ）ｘ＋ＡｄｏＨｙｃ。
【００１１】
キャップ１構造を有するジメチル化キャップ付ＲＮＡは、キャップ０構造を有するキャップ付ＲＮＡよりも効率的に翻訳されると報告されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２６巻：３２０８頁、（１９９８年））。真核細胞は、別の（ヌクレオシド−２’−Ｏ）メチルトランスフェラーゼ（例えば、ヒト細胞ではｈＭＴＲ２（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第３９巻：４７５６頁（２０１１年））を利用して、以下の反応によって、５’キャップ付ＲＮＡの第２の転写されるヌクレオチドの２’−ヒドロキシル基のメチル化を触媒して、キャップ１構造をキャップ２構造に変換する：
７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１２’−ＯＭｅｐＮ２（ｐＮ）ｘ＋ＡｄｏＭｅｔ→７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１２’−ＯＭｅｐＮ２２’−ＯＭｅ（ｐＮ）ｘ＋ＡｄｏＨｙｃ。
真核細胞ｍＲＮＡのおよそ５０％が、キャップ２構造を有する。
【００１２】
種々の生物学的研究のために長い機能的ＲＮＡを生成するために、１９８０年代中盤に、一次ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的合成の方法が開発された（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１８０巻：５１〜６２頁、（１９８９年）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１０巻：６３５３〜６３６２頁、（１９８２年）；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１８０巻：４２〜５０頁（１９８９年）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１２巻：７０３５〜７０５６頁、（１９８４年）およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第１５巻：８７８３〜８７９８頁、（１９８７年））。
【００１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後、５’−三リン酸基を保持する一次ｍＲＮＡ転写物を、キャップ形成酵素を用いてさらにキャップすることができる。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的５’−キャップ形成は、高価であり、労力を要するものであり、効率的でなく、制御することが困難である。
【００１４】
これらの不利点を考慮して、化学的に合成されたジヌクレオチド７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰとも呼ばれる）を使用して転写を開始する、キャップ付ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のための別の方法が開発された（ＲＮＡ第１巻：９５７〜９６７頁、（１９９５年））。ｍＣＡＰジヌクレオチドは、成熟ｍＲＮＡの５’−キャップ０構造を含有するが、キャップ１およびキャップ２構造に特徴的な２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有さない。
【００１５】
しかし、合成ｍＣＡＰジヌクレオチドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の開始に起因する２つの主な不利点がある。第１は、ｍＲＮＡ合成の開始のためのｍＣＡＰおよびｐｐｐＧの強力な競合である。ｐｐｐＧを用いてｍＲＮＡが開始される場合には、得られたｐｐｐ−ｍＲＮＡは、５’−三リン酸の存在のために翻訳および免疫原性において不活性である。対応して、ｍＲＮＡがｍＣＡＰを用いて開始される場合には、得られた５’キャップ付ｍＲＮＡは、翻訳において活性であり、免疫原性としては活性ではない。
【００１６】
５’キャップを有するまたは５’キャップのない（または５’−三リン酸化；ｐｐｐｍＲＮＡ）ｍＲＮＡの割合を改善するために、５’−キャップ構造ｍＲＮＡ転写物（最大８０〜９０％）の生成に好都合であるために、ｐｐｐＧを上回る過剰の７ｍＧｐｐｐＧ（４：１〜１０：１）を使用しなくてはならない。このアプローチのマイナス面は、転写の際のＧＴＰ供給の迅速な枯渇および多量の高価であり得る合成ｍＣＡＰ二量体が必要であることによるｍＲＮＡの全体的な収率の大幅な低減である。転写後、５’キャップ付ｍＲＮＡおよび５’ｐｐｐｍＲＮＡの両方を含有する粗混合物の、アルカリホスファターゼでのさらなる処理が、合成されたｍＲＮＡの免疫原性を低減するためにｐｐｐｍＲＮＡからキャップのない５’−三リン酸基を除去するために必要である。ホスファターゼ処理後に得られたｍＲＮＡのキャップのない５’−ＯＨ型は、不活性であり、翻訳プロセスに関与しない。
【００１７】
非対称ｍＣＡＰジヌクレオチドを使用する場合には、別の不利点、二方向性の開始が起こり得る。７ｍＧｐｐｐＧのＧまたは７ｍＧ部分のいずれかの３’−ヒドロキシル基の、およそ同程度の確率で転写伸長の開始点として役立つ傾向がある。通常、転写反応の条件に応じて、およそ同等の割合での、形態７ｍＧ（５’）ｐｐｐＧ（ｐＮ）ｎおよびＧ（５’）ｐｐｐ７ｍＧ（ｐＮ）ｎの２種の異性体ＲＮＡの合成につながる（ＲＮＡ第１巻：９５７〜９６７頁、（１９９５年））。
【００１８】
ｍＣＡＰジヌクレオチドを用いた場合のｍＲＮＡ合成の二方向性開始を排除するために、７ｍＧ残基の３’−ＯＨ基が、ＯＣＨ３で置換された新規修飾ｍＣＡＰ類似体（「ＯＭｅ」）：７ｍＧ（３’−Ｏ−Ｍｅ）ｐｐｐＧ（アンチリバースキャップ類似体（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）としても知られる）が開発された。ＡＲＣＡは、正しいフォワード配向でのみｍＲＮＡ合成を開始する（ＲＮＡ第７巻：１４８６〜１４９５頁（２００１年））。いくつかの種類のＡＲＣＡ類似体が当技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，０７４，５９６号を参照のこと）。しかし、ほとんどのｍＲＮＡ転写物分子が５’−キャップ構造を有することを確実にするには、ｐｐｐＧを上回る大モル過剰のＡＲＣＡが依然として必要である。さらなる不利点は、キャップ１構造を有するｍＲＮＡは、７ｍＧｐｐｐＧ２’−ＯＭｅキャップ二量体（ＲＮＡ第１巻：９５７頁、（１９９５年））またはそのＡＲＣＡ類似体を使用して合成できないということである。
【００１９】
現在、キャップ１構造を含有する活性な長いｍＲＮＡの生成のための公知の経路は、酵素的キャップ形成および５’−三リン酸化ｍＲＮＡ転写物の酵素的２’Ｏ−メチル化またはｍＣＡＰキャップもしくはＡＲＣＡキャップ付ｍＲＮＡ前駆体の酵素的２’−Ｏ−メチル化（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、第２５巻：３３７〜３４０頁、（２００６年）およびＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ第２５巻（３号）：３０７〜１４頁、（２００６年））からなる。両アプローチは、かなり労力を要するものであり、制御することが困難であり、実質的な最適化を行っても、どちらのアプローチも、キャップを有し、メチル化されたｍＲＮＡ前駆体の高収率を保証できない（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第９１巻：１１２〜１２１頁、（２０１０年））。さらに、キャップ２構造を有するｍＲＮＡを調製するための方法は、一層より困難であり、結果は、予測可能性が低い。キャップ１からキャップ２に変換するための酵素は、現在市販されていない。
【００２０】
特に大規模製造におけるｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の別の重要な複雑性は、不活性であり、いくつかの場合には、免疫原性であるすべてのキャップのないｍＲＮＡ形態から、キャップを保持する活性ｍＲＮＡ分子を単離および精製することが必要であることである。残念ながら、これらの方法は、些細なものではなく、キャップ付ＲＮＡ転写物の、より容易な単離および精製を可能にする親和性タグ部分がコンジュゲートされた修飾されたｍＣＡＰ類似体の合成が必要であることが多い。リポーター／親和性部分として親和性タグを有するｍＣＡＰ類似体を合成する方法および転写反応混合物からのキャップ付ＲＮＡの単離のための新規プロトコールは、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第８，３４４，１１８号を参照のこと）。これらのアプローチは効率的であるが、それらはより多くの高価なｍＣＡＰ類似体の使用を必要とし、キャップ０構造のみを含有するｍＲＮＡの調製および単離を可能にする。
【００２１】
天然および修飾ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成は、リボザイム、アンチセンス、生物物理学的および生化学的研究を含む種々の適用において使用される。さらに、キャップ付ｍＲＮＡ転写物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現実験（マイクロインジェクション、トランスフェクションおよび感染を使用する）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験およびアッセイならびに治療薬、診断薬、ワクチン開発、標識および検出における種々の適用abo-thibタンパク質合成を必要とする適用のために使用される。
【００２２】
結果として、（ａ）従来の方法よりも労力を要するものではない、（ｂ）転写の際に二方向性開始を排除または低減する、（ｄ）現在の方法と比較して低減した費用で（ｃ）ｍＲＮＡのより高い収率をもたらす、（ｅ）異なる５’配列を有する不均一生成物の生成を低減する、（ｆ）合成されたｍＲＮＡにキャップ１およびキャップ２構造を組み込むためにさらなる酵素反応を必要としない、ｍＲＮＡの大規模合成を可能にする組成物および方法が、当業界で必要である。また、分子の５’末端にまたはその付近に、特定の修飾および／または蛍光色素、放射性同位元素、質量タグなどの親和性タグおよび／またはビオチンなどの分子結合対の一方のパートナーを保持する、修飾されたおよび／または非天然ヌクレオシドを含有する種々のｍＲＮＡの合成も必要である。
【発明の概要】
【００２３】
本明細書において、５’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物が提供される。本発明の一態様では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、式Ｉ：
【化１】
2018527015.tif 000003
［式中、
Ｂ１からＢ１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
ｑ１は、１であり、
ｑ２からｑ９の各々は独立に、０または１であり、
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ２およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ−アルキル、ハロゲン、アミン、アジド、リンカーまたは検出可能なマーカーであり、
Ｘ１からＸ１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ１からＹ１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ３、アリール、アルキル、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールであり、
Ｚ１からＺ２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、Ｃ（ハロゲン）２またはＣＨ（ハロゲン）であり、
Ｒ４からＲ１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、リンカーまたは検出可能なマーカーである］
で示される一般構造を含む。
【００２４】
本発明の別の態様では、式Ｉのキャップ含有開始オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子、このようなＲＮＡを含む医薬組成物、このようなＲＮＡを含有する細胞およびこのようなＲＮＡから翻訳されたタンパク質またはペプチドを含有する細胞が提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、ポリヌクレオチド鋳型のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促す条件下で、式Ｉのキャップ含有開始オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子を、ポリヌクレオチド鋳型およびＲＮＡポリメラーゼを含む混合物に合成し、その後、得られた混合物を、前記鋳型の転写を可能にするのに十分な時間インキュベートする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】グアノシン５’−二リン酸から７−メチルグアノシン５−二リン酸（ｐｐ７ｍＧ）を調製する例示的方法を示す図である。
【図２】ｐｐ７ｍＧから７−メチルグアノシン５’−二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ）を調製する例示的方法を示す図である。
【図３】３’−Ｏ−メチルグアノシンから３’−Ｏ−メチルグアノシン５’−リン酸（ｐＧ３’Ｏｍｅ）を調製する例示的方法を示す図である。
【図４】ｐＧ３’Ｏｍｅから３’−Ｏ−メチルグアノシン５’−ホスホルイミダゾリド（Ｉｍ−ｐＧ３’Ｏｍｅ）を調製する例示的方法を示す図である。
【図５】Ｉｍ−ｐＧ３’Ｏｍｅから３’−Ｏ−メチルグアノシン５’−二リン酸（ｐｐＧ３’Ｏｍｅ）を調製する例示的方法を示す図である。
【図６】ｐｐＧ３’Ｏｍｅから７−メチル−３’−Ｏ−メチルグアノシン５−二リン酸（ｐｐ７ｍＧ３’Ｏｍｅ）を調製するための例示的方法を示す図である。
【図７】ｐｐ７ｍＧ３’Ｏｍｅから７−メチル−３’−Ｏ−メチルグアノシン５−二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ３’Ｏｍｅ）を調製するための例示的方法を示す図である。
【図８】ｐＮ２’−ＯＲ１ｐＮオリゴヌクレオチド（Ｒ１＝ＨまたはＭｅ）の調製のための一般手順を示す図である。
【図９】キャップ０、キャップ１またはキャップ２構造を有する開始オリゴヌクレオチドの合成のための一般手順を示す図である。
【図１０Ａ】式Ｉ［式中、Ｂ１はグアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｏ−メチルであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｂ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、グアニンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｈであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｃ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、グアニンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｏ−メチルであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｄ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、アデニンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｈであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｅ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、アデニンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｏ−メチルであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｆ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、シトシンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｈであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｇ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、シトシンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｏ−メチルであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１０Ｈ】式Ｉ［式中、Ｂ１は、アデニンであり、Ｂ２は、グアニンであり、Ｂ１０は、グアニンであり、Ｍは、０であり、Ｌは、１であり、ｑ１は、１であり、ｑ２は、１であり、ｑ３からｑ９は、０であり、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ２は、Ｈであり、Ｒ３は、Ｏ−メチルであり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ４は、Ｏであり、Ｘ５は、Ｏであり、Ｘ１３は、Ｏであり、Ｙ１は、ＯＨであり、Ｙ２は、ＯＨであり、Ｙ４は、ＯＨであり、Ｙ５は、ＯＨであり、Ｙ１３は、ＯＨであり、Ｚ０は、Ｏであり、Ｚ１は、Ｏであり、Ｚ２は、Ｏであり、Ｚ４は、Ｏであり、Ｚ５は、Ｏであり、Ｚ６は、Ｏであり、Ｚ２２は、Ｏであり、Ｒ４は、Ｏ−メチルであり、Ｒ５は、Ｏ−メチルである］に従う実施例において使用される、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す図である。
【図１１】ｍＲＮＡ同時転写によってキャップ形成されたｍＲＮＡのルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図１２Ａ−１２Ｈ】１２Ａ）ＡＲＣＡを用いて、１２Ｂ）ｍ７ＧｐｐｐＧ２’ＯｍｅｐＧを用いて、１２Ｃ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’ＯｍｅｐＧを用いて、１２Ｄ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧを用いて、１２Ｅ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’−ＯＭｅｐＧを用いて、１２Ｆ）ｍ７ＧｐｐｐＣ２’ＯｍｅｐＧを用いて、１２Ｇ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’ＯｍｅｐＧを用いて、１２Ｈ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ２’ＯｍｅｐＧを用いて同時転写によってキャップが付けられたｍＲＮＡのキャップ形成効率を合わせて示す図である。図１１Ｂ〜１１Ｇにおけるキャップ形成効率は、図１１Ａにおいて観察されたものと同等であるか、またはそれを大幅に超える。
【図１３Ａ−１３Ｄ】転写鋳型上のｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧを用いる同時転写によりキャップ形成されるｍＲＮＡの開始のキャップ形成効率および忠実度をまとめて示す図であり、図１３Ａはプライマー／ＮＴＰ処方２を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基の使用を例示し、図１３Ｂは、プライマー／ＮＴＰ処方３を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基の使用を例示し、図１３Ｃは、プライマー／ＮＴＰ処方２を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’−デオキシシチジン残基の使用を例示し、図１３Ｄは、プライマー／ＮＴＰ処方３を使用する、鋳型位置＋１および＋２での２’−デオキシシチジン残基の使用を例示する。
【図１４Ａ−１４Ｂ】鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を有する転写鋳型対鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型での、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドを用いて作製されたｍＲＮＡの、分化したＴＨＰ−１細胞における翻訳の比較をまとめて示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本開示を通じて言及されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書において用語について複数の定義がある事象では、この節にあるものが優先する。
【００２８】
本明細書において、数値に関連して、用語「およそ」または「約」は、記載された値を含む定義される範囲内のすべての値を含む示される値のプラスまたはマイナス３０％を意味する。
【００２９】
本明細書において、用語「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその任意の断片、任意のリボまたはデオキシリボ誘導体ならびに天然および／もしくは修飾ヌクレオチド残基およびヌクレオチド間連結を含有する天然に存在する分子または合成分子を指す。これらの語句はまた、一本鎖、二本鎖、三本鎖もしくは四本鎖であり得、センスもしくはアンチセンス鎖を表し得る、天然起源（例えば、ゲノム）または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、または任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様材料を指す。ＤＮＡ配列に関して「ＲＮＡ等価物」は、窒素塩基チミンのすべてまたはほとんどの出現が、ウラシルと置換され、糖骨格が、２’−デオキシリボースの代わりにリボースから構成される点を除いて、参照ＤＮＡ配列と同一のヌクレオチドの直線配列から構成される。本明細書において提供される方法および組成物に適したさらなる代替核酸骨格として、それだけには限らないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、アルキルホスホトリエステル、アリールホスホトリエステル、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、ホスホボロネート、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、リボ−もしくはデオキシリボ−またはキメラリボ／デオキシリボ−オリゴヌクレオチドを指し、一本鎖は、天然に存在するものであっても、合成であってもよく、通常、約２から約１０ヌクレオチド、約３から約８ヌクレオチドまたは約３から約５の間のヌクレオチドの配列を含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、１つまたは複数の修飾基を含有し得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはその他の修飾ヌクレオシドを含み得る。当業者は、ＤＮＡ鋳型配列の転写にとって適当であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計および調製可能である。
【００３１】
本明細書において、用語「開始キャップ付オリゴヌクレオチド類似体」または「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」とは、プライマーの５’末端にキャップ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ−キャップ構造を含有する、開始オリゴヌクレオチドプライマーを指す。キャップ付プライマーは、非修飾または開放３’−ＯＨ基を有し、プライマーの３’末端でのＮＴＰの組込みによってＲＮＡポリメラーゼによって延長され得る。必要な成分：ＤＮＡ鋳型（例えば、ＤＮＡプラスミド）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド５’−三リン酸および適当なバッファーを含有する転写系においてプロモーターの制御下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始することができる。また、本明細書において同様に使用される「開始プライマー」または「開始オリゴヌクレオチドプライマー」とは、ＲＮＡポリメラーゼの妥当な基質である末端３’−ＯＨ基を保持するオリゴヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、開始オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼの基質であり、プライマーの３’末端でのＮＴＰの組込みによって伸長され得る。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、開始部位でＤＮＡ鋳型と相補的である。
【００３２】
本明細書において、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＮＴＰとの関連で、用語「非置換」または「非修飾」とは、修飾されていない、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＮＴＰを指す。
【００３３】
本明細書において、用語「修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」とは、１つまたは複数のさらなる修飾基を含有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを指す。
【００３４】
本明細書において、用語「修飾基」とは、それだけには限らないが、糖、ヌクレオシド塩基、三リン酸架橋および／またはヌクレオチド間リン酸を含む位置で開始プライマーと結合され得る任意の化学部分を指す（例えば、米国特許出願第２００７０２８１３０８号）。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの修飾基は、転写のプロセスと適合する任意の性質の基であり得る。
【００３５】
本明細書において、用語「ヌクレオチド間連結」とは、オリゴヌクレオチドプライマーまたは核酸の２つのヌクレオシドをつなげる結合（単数または複数）を指し、天然ホスホジエステル連結または修飾された連結であり得る。
【００３６】
本明細書において、用語「標識」または「検出可能な標識」とは、分子が標識を検出することによって直接的または間接的に検出され得るように、分子に結合され得る、またはそうでなければ分子と会合され得る化合物または化合物の組合せを指す。検出可能な標識は、放射性同位元素（例えば、炭素、リン、ヨウ素、インジウム、硫黄、トリチウムなど）、質量同位体（例えば、Ｈ２、Ｃ１３またはＮ１５）、色素またはフルオロフォア（例えば、シアニン、フルオレセインまたはクマリン）、ハプテン（例えば、ビオチン）または直接的もしくは間接的に検出され得る任意のその他の薬剤であり得る。
【００３７】
本明細書において、用語「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」とは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、転写反応の際に適当にストリンジェントな条件下でＤＮＡ鋳型とアニールするプロセスを指す。ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、特定の実施形態では、５’−５’逆位キャップ構造を含む３〜１０ヌクレオチドの長さである開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．（１９９４））。
【００３８】
本明細書において、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ鋳型の複合体との関連で、用語「相補体」、「相補的な」または「相補性」とは、標準ワトソン／クリック塩基対形成ルールを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’」と相補的である。特定の非天然または合成ヌクレオチドは、本明細書において記載される核酸中に含まれてもよく、これらとして、それだけには限らないが、イノシン、７−デアザグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、プソイドウリジン、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、塩基および糖修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸が挙げられる。相補性は、完全であることを必要とせず、二本鎖は、ミスマッチした塩基対、変性または非対応ヌクレオチドを含有し得る。当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、ミスマッチした塩基対の出現率、イオン強度、ハイブリダイゼーションバッファーの成分および反応条件を含むいくつかの変数を考慮して二本鎖安定性を経験的に決定できる。
【００３９】
相補性は、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のすべてが、認識されている塩基対形成ルールに従って対応している「完全」または「全面的（total）」であっても、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ標的のヌクレオチド塩基の一部のみが、認識されている塩基対形成ルールに従って対応している「部分的」であってもよく、または２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のうち、認識されている塩基対形成ルールに従って対応するものがない「存在しない」場合もある。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ鋳型の間の相補性の程度は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドとＤＮＡ鋳型の間のハイブリダイゼーション力に対して、それに応じて、反応の効率に対して相当な効果を有し得る。用語相補性はまた、個々のヌクレオチドに関しても使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの残部とＤＮＡ鎖の間の相補性と対照的な、またはそれと比較した、別の鎖内のヌクレオチドに対するその相補性について、またはそれがないことについて述べられることもある。
【００４０】
本明細書において、用語「完全な」、「全面的な」または「完璧な（perfectly）」相補性とは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド塩基の各々と、ＤＮＡ標的が、認識されている塩基対形成ルールに従って正確に対応することを意味する。
【００４１】
本明細書において、用語「実質的に相補的な」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を指す。当業者ならば、実質的に相補的な配列は、その全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、標的配列とハイブリダイズしない塩基の連続配列を含むこともあり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズする塩基の連続配列の３’または５’に位置し得る。
【００４２】
本明細書において、用語「特異的な」とは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー配列およびＤＮＡ鋳型とハイブリダイズするその能力に関して使用される場合、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡ鎖がアラインされる場合、ＤＮＡ鋳型の部分と少なくとも５０％の配列同一性を有する配列である。好ましいものであり得るより高いレベルの配列同一性として、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％および最も好ましくは、１００％の配列同一性が挙げられる。
【００４３】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、天然に見られるヌクレオシド塩基およびフラノシドのすべての形態を含む、すべての天然に存在するヌクレオシドを含む。天然に存在するヌクレオシド中に最もよく見られる塩基環は、プリンおよびピリミジン環である。天然に存在するプリン環として、例えば、アデニン、グアニンおよびＮ６−メチルアデニンが挙げられる。天然に存在するピリミジン環として、例えば、シトシン、チミン、５−メチルシトシン、プソイドウラシルが挙げられる。天然に存在するヌクレオシドとして、例えば、それだけには限らないが、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、イノシン、７−メチルグアノシンまたはプソイドウリジンのリボ、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシリボ誘導体が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、用語「ヌクレオシド類似体」、「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド誘導体」として、本明細書において記載されるような合成ヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシド誘導体はまた、保護基とともに、または伴わずに、修飾塩基または／および糖部分を有するヌクレオシドを含み、例えば、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン、５−フルオロウリジンなどが挙げられる。本明細書において提供される化合物および方法として、このような塩基環およびその合成類似体ならびに非天然複素環置換塩基糖および非環式置換塩基糖が挙げられる。本発明とともに利用できるその他のヌクレオシド誘導体として、例えば、ＬＮＡヌクレオシド、ハロゲン置換プリン（例えば、６−フルオロプリン）、ハロゲン置換ピリミジン、Ｎ６−エチルアデニン、Ｎ４−（アルキル）−シトシン、５−エチルシトシンなど（米国特許第６，７６２，２９８号）が挙げられる。
【００４５】
本明細書において、用語「ユニバーサル塩基」、「縮重塩基」、「ユニバーサル塩基類似体」および「縮重塩基類似体」として、例えば、特定の実施形態では、天然ＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ）またはその他の特定のＮＴＰのうちの１種の代理としてＲＮＡポリメラーゼによって認識されることが可能である人工塩基を有するヌクレオシド類似体が挙げられる。ユニバーサル塩基または縮重塩基は、Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２９巻：２４３７〜２４４７頁（２００１年）；Ｃｒｅｙ−Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３３巻：１５３２〜１５４３頁（２００５年）；Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３３巻：２６２０〜２６２８頁（２００５年）；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ、Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７５３〜７６５頁（２００４年）；およびＨｉｌｌ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻：４２５８〜４２６３頁（１９９８年））に開示されている。
【００４６】
本明細書において、用語「修飾されたＮＴＰ」とは、糖、塩基、三リン酸鎖を含む任意の位置またはこれら３つの位置の何らかの組合せに結合された、化学部分の基を有するヌクレオシド５’−三リン酸を指す。このようなＮＴＰの例は、例えば、「Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｖａｇｈｅｆｉ，Ｍ．ら、Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（２００５年）に見出すことができる。
【００４７】
本明細書において、用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド間連結を含有する、または修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド間連結の何らかの組合せを有するオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドヌクレオチド間連結修飾の例として、ホスホロチオエート、ホスホトリエステルおよびメチルホスホネート誘導体が挙げられる（Ｓｔｅｃ、Ｗ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、第３３巻：７０９〜７２２頁（１９９４年）；Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ｖ．ら、Ｅ．，Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｓ．、第４巻：１７〜４０頁（１９９６年）；およびＺｏｎら、米国特許出願第２００７０２８１３０８号）。ヌクレオチド間連結修飾のその他の例は、Ｗａｌｄｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ第６巻：２３６３〜２３６６頁（１９９６年）に見出すことができる。
【００４８】
用語「プロモーター」とは、本明細書において、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）の転写の開始を指示および制御するｄｓＤＮＡ鋳型の領域を指す。プロモーターは、同一鎖上およびＤＮＡの上流に位置する（センス鎖の５’領域に向けて）。プロモーターは、通常、転写されるＤＮＡ配列のすぐ隣である（または部分的に重複している）。プロモーター中のヌクレオチド位置は、ＤＮＡの転写が始まる転写開始部位（位置＋１）に対して指定される。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、プロモーター配列の開始部位（特定の実施形態では、位置＋１および＋２にあり、開始四量体の場合には、位置＋１、＋２および＋３にある）に対して相補的である。
【００４９】
本明細書において、用語「転写」または「転写反応」とは、ＤＮＡ鋳型と相補的であるＲＮＡを酵素的に作製し、それによって、ＤＮＡ配列のいくつかのＲＮＡコピーを生成するための当技術分野で公知の方法を指す。転写反応において合成されたＲＮＡ分子は、「ＲＮＡ転写物」、「一次転写物」または「転写物」と呼ばれる。本明細書において提供される組成物および方法が関与する転写反応は、「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」を使用する。ＤＮＡ鋳型の転写は、指数関数的、非線形または線形であり得る。ＤＮＡ鋳型は、二本鎖直鎖状ＤＮＡ、部分的に二本鎖の直鎖状ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ＰＣＲアンプリコン、ＲＮＡポリメラーゼと適合する修飾核酸鋳型であり得る。
【００５０】
本明細書において、用語「アシル」とは、基−Ｃ（Ｏ）Ｒａ（式中、Ｒａは、水素、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールなどである）を示す。
【００５１】
本明細書において、用語「置換アシル」とは、基−Ｃ（Ｏ）Ｒａ’（式中、Ｒａ’は、置換低級アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アリール、置換ヘテロアリールなどである）を示す。
【００５２】
本明細書において、用語「アシルオキシ」とは、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂ（式中、Ｒｂは、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールなどである）を示す。
【００５３】
本明細書において、用語「アルキル」とは、いくつかの実施形態では、１〜２０個の炭素原子の範囲の、いくつかの実施形態では、１〜８個の炭素原子の範囲の炭化水素の単結合鎖を指し、例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ドデカニルなどが挙げられる。
【００５４】
本明細書において、用語「低級アルキル」とは、いくつかの実施形態では、１〜６個の炭素原子の範囲の、いくつかの実施形態では、２〜５個の炭素原子の範囲の炭化水素の直鎖または分枝鎖を指す。例として、エチル、プロピル、イソプロピルなどが挙げられる。
【００５５】
本明細書において、用語「アルケニル」とは、１つまたは複数の二重結合を有し、特に断りのない限り、約２〜約２０個の、いくつかの実施形態では、約２〜約１０個の炭素原子の範囲の、いくつかの実施形態では、約２〜約８個の炭素原子の、いくつかの実施形態では、約２〜約６個の炭素原子の範囲の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルケニルラジカルの例として、ビニル、アリル、１，４−ブタジエニル、イソプロペニルなどが挙げられる。
【００５６】
本明細書において、用語「アルケニルアリール」とは、アルケニル置換アリール基を指し、「置換アルケニルアリール」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアルケニルアリール基を指す。
【００５７】
本明細書において、用語「アルケニレン」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、通常、２〜２０個の炭素原子、いくつかの実施形態では、２〜１２個の範囲の炭素原子、いくつかの実施形態では、２〜８個の範囲の炭素原子を含有する、二価直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルケニレン」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアルケニレン基を指す。
【００５８】
本明細書において、用語「アルキレン」とは、１〜２０個の炭素原子、いくつかの実施形態では、１〜１５個の範囲の炭素原子の、２個の水素原子が同一炭素原子から、または異なる炭素原子からとられる直鎖または分岐鎖を含有する二価ヒドロカルビル基を指す。アルキレンの例として、それだけには限らないが、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）などが挙げられる。
【００５９】
本明細書において、用語「アルキニル」とは、１つまたは複数の三重結合を有し、約２〜２０個の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２〜１０個の範囲の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２〜８個の範囲の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２〜６個の範囲の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルキニルラジカルの例として、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、ブチニルなどが挙げられる。
【００６０】
本明細書において、用語「アルキニルアリール」とは、アルキニル置換アリール基を指し、「置換アルキニルアリール」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアルキニルアリール基を指す。
【００６１】
本明細書において、用語「アルコキシ」は、基−ＯＲｃ（式中、Ｒｃは、定義されるような、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキルまたは置換シクロヘテロアルキルである）を示す。
【００６２】
本明細書において、用語「低級アルコキシ」とは、基−ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、低級アルキルである）を示す。
【００６３】
本明細書において、用語「アルキルアリール」とは、アルキル置換アリール基を指し、「置換アルキルアリール」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアルキルアリール基を指す。
【００６４】
本明細書において、用語「アルキルチオ」とは、基−Ｓ−Ｒｈ（式中、Ｒｈは、アルキルである）を指す。
【００６５】
本明細書において、用語「置換アルキルチオ」とは、基−Ｓ−Ｒｉ（式中、Ｒｉは、置換アルキルである）を指す。
【００６６】
本明細書において、用語「アルキニレン」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、通常、約２〜１２個の範囲の炭素原子、いくつかの実施形態では、約２〜８個の範囲の炭素原子を有する二価直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルキニレン」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアルキニレン基を指す。
【００６７】
本明細書において、用語「アミド」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲｊＲｊ’（式中、ＲｊおよびＲｊ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり得る）を示す。
【００６８】
本明細書において、用語「置換アミド」とは、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲｋＲｋ’（式中、ＲｋおよびＲｋ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、ただし、ＲｋおよびＲｋ’のうち少なくとも一方は、水素ではない）を示す。窒素と組み合わせたＲｋＲｋ’は、任意選択で、置換複素環式環またはヘテロアリール環を形成し得る。
【００６９】
本明細書において、用語「アミノ」または「アミン」とは、基−ＮＲｎＲｎ’（式中、ＲｎおよびＲｎ’は独立に、本明細書において定義されるような、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり得る）を示す。「二価アミン」は、基−ＮＨ−を示す。「置換二価アミン」とは、基−ＮＲ−（式中、Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである）を示す。
【００７０】
本明細書において、用語「置換アミノ」または「置換アミン」とは、基−ＮＲｐＲｐ’（式中、ＲｐおよびＲｐ’は独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールであり、ただし、ＲｐおよびＲｐ’のうち少なくとも一方は、水素ではない）を示す。窒素と組み合わせたＲｐＲｐ’は、任意選択で、置換複素環式環またはヘテロアリール環を形成し得る。
【００７１】
本明細書において、用語「アロイル」とは、ベンゾイルなどのアリール−カルボニル種を指し、「置換アロイル」とは、本明細書において示されるような１つまたは複数の置換基をさらに保持するアロイル基を指す。
【００７２】
本明細書において、用語「アリール」は、単独または組み合わせて、フェニル、ナフチルまたは任意選択で、５〜１０の環員の、いくつかの実施形態では、５〜６の環員のシクロアルキルを有する、および／または任意選択で、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で一置換もしくは二置換されていてもよいアミノ、アミジノ、任意選択で、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で置換されていてもよい尿素、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基でＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノなどの１〜３の基もしくは置換基で置換されていてもよい、縮合芳香族複素環を指す。
【００７３】
本明細書において、用語「アリールオキシ」とは、基−ＯＡｒ（式中、Ａｒは、アリールまたは置換アリール基である）を示す。
【００７４】
本明細書において、用語「炭素環」とは、連結された炭素原子から構成される単環または複数の縮合環を有する飽和、不飽和または芳香族基を指す。環（単数または複数）は、任意選択で、非置換であっても、または例えば、ハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン（−Ｃ＝ＣＨ）、アミノ、アミド、アジド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、チオール（−ＳＨ）、スルファミド（−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２などで置換されていてもよい。
【００７５】
本明細書において、用語「グアニジニル」とは、基−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２を示し、「置換グアニジニル」とは、基−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ２）２（式中、各Ｒは独立に、本明細書において示されるようなＨ、アルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである）を示す。
【００７６】
本明細書において、用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、すべてのハロゲン、すなわち、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）およびヨード（Ｉ）を指す。
【００７７】
本明細書において、用語「ヘテロアリール」とは、群Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される、１個もしくは複数の、いくつかの実施形態では、１〜４個の、いくつかの実施形態では、１〜３個の、いくつかの実施形態では、１〜２個のヘテロ原子を含有する、任意選択で、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で一置換もしくは二置換されていてもよいアミノ、アミジノ、任意選択で、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で置換されていてもよい尿素、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基でＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノなどの１〜３の基もしくは置換基で置換された、５もしくは６個の環原子を含有する単環式芳香環構造または８〜１０個の原子を有する二環式芳香族基を指す。ヘテロアリールはまた、スルフィニル、スルホニルおよび第三級環窒素のＮ−オキシドなどの酸化ＳまたはＮを含むものとする。炭素または窒素原子は、安定な芳香環が保持されるようなヘテロアリール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例として、フタルイミド、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キナゾリニル、プリニル、インドリル、キノリニル、ピリミジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソキサゾリル、オキサチアジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフリル、インドリルなどがある。置換ヘテロアリールは、安定な化合物を生成するために利用可能な炭素または窒素で結合された置換基を含有する。
【００７８】
本明細書において、用語「置換ヘテロアリール」とは、任意選択で、１つまたは複数の官能基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどで一置換または多置換された複素環を指す。
【００７９】
本明細書において、用語「複素環」とは、任意選択で、非置換であってもよく、または、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミドなどで置換されていてもよい、単環（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）または多環縮合環（例えば、ナフトピリジル、キノキサリル、キノリニル、インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）を有し、環内に炭素原子およびＮ、ＯまたはＳなどの少なくとも１個のヘテロ原子を有する、飽和、不飽和または芳香族基を指す。
【００８０】
本明細書において、用語「置換複素環」とは、安定な化合物を生成するように任意の利用可能な点で結合された、任意選択で置換されていてもよいアルキル、任意選択で置換されていてもよいアルケニル、任意選択で置換されていてもよいアルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アミノ、アミド、アミジノ、任意選択で、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で置換されていてもよい尿素、任意選択で、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基でＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アシル、カルボキシル、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルホンアミドおよびオキソからなる群から選択される１つまたは複数の、例えば、１、２または３つの置換基で置換された複素環を指す。
【００８１】
本明細書において、用語「ヒドロカルビル」とは、その骨格が、炭素および水素のみを含む任意の有機ラジカルを指す。したがって、ヒドロカルビルは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アルケニルアリール、アリールアルキニル、アルキニルアリールなどを包含する。
【００８２】
本明細書において、用語「置換ヒドロカルビル」とは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（式中、Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ’）−、−Ｃ（＝ＣＲ’２）−（式中、Ｒ’は、アルキルまたは置換アルキルである）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ２−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｒ２−または−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）Ｒ２−（式中、各Ｒは独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルである）などのようなリンカー／スペーサー部分によってヒドロカルビル部分と結合された、ヒドロキシ、ヒドロカルビルオキシ、置換ヒドロカルビルオキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、カルボキシ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２（式中、各Ｒは独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、ニトロ、シアノ、ハロ、−ＳＯ３Ｍまたは−ＯＳＯ３Ｍ（式中、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｃａまたはメグルミンである）、グアニジニル、置換グアニジニル、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、置換ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、置換ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ、アシル、アシルオキシ、複素環、置換複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、カルバメート基、ジチオカルバメート基、アロイル、置換アロイル、有機スルホニル、置換有機スルホニル、有機スルフィニル、置換アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、置換アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、置換アリールスルホニルアミノ、スルホンアミド基、スルフリルなどから選択される１つまたは複数の置換基をさらに保持する上記で言及されたヒドロカルビル基のいずれかを指す。
【００８３】
本明細書において、用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」とは、基−ＯＨを指す。
【００８４】
本明細書において、用語「オキソ」とは、結合している炭素に二重結合された酸素置換基を指す。
【００８５】
本明細書において、用語「スルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）−を示す。
【００８６】
本明細書において、用語「置換スルフィニル」とは、基−Ｓ（Ｏ）Ｒｔ（式中、Ｒｔは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリル（hetereocyclyl）アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、へテロアラルキル、置換へテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである）を示す。
【００８７】
本明細書において、用語「スルホニル」とは、基−Ｓ（Ｏ）２−を示す。
【００８８】
本明細書において、用語「置換スルホニル」とは、基−Ｓ（Ｏ）２Ｒｔ（式中、Ｒｔは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリル（hetereocyclyl）アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、へテロアラルキル、置換へテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである）を示す。
【００８９】
本明細書において、用語「スルフリル」とは、基−Ｓ（Ｏ）２−を示す。
【００９０】
本発明は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、一般形態ｍ７Ｇｐｐｐ［Ｎ２’Ｏｍｅ］ｎ［Ｎ］ｍ（式中、ｍ７Ｇは、Ｎ７−メチル化グアノシンまたは任意のグアノシン類似体であり、Ｎは、任意の天然、修飾または非天然ヌクレオシドであり、「ｎ」は、１〜４の任意の整数であり得、「ｍ」は、１〜９の整数であり得る）を有する、５’キャップ付ＲＮＡを合成するための方法および組成物を提供する。本発明の一態様では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、式Ｉ：
【化２】
2018527015.tif 000004
［式中、
Ｂ１からＢ１０の各々は独立に、天然、修飾または非天然ヌクレオシド塩基であり、
Ｍは、０または１であり、
Ｌは、０または１であり、
ｑ１は、１であり、
ｑ２からｑ９の各々は独立に、０または１であり、
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ２およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、Ｏ−アルキル、アミン、アジド、ハロゲン、リンカーまたは検出可能なマーカーであり、
Ｘ１からＸ１３の各々は独立に、ＯまたはＳであり、
Ｙ１からＹ１３の各々は独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＢＨ３、アリール、アルキル、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールであり、
Ｚ１からＺ２２の各々は独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、Ｃ（ハロゲン）２またはＣＨ（ハロゲン）であり、
Ｒ４からＲ１２の各々は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、または検出可能なマーカーである］
で示される構造を有する。
【００９１】
特定の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、三量体（ｑ２−ｑ９＝０）、四量体（ｑ３−ｑ９＝０）、五量体（ｑ４−ｑ９＝０）、六量体（ｑ５−ｑ９＝０）、七量体（ｑ６−ｑ９＝０）、八量体（ｑ７−ｑ９＝０）、九量体（ｑ８−ｑ９＝０）、十量体（ｑ９＝０）または十一量体である。開始キャップ付オリゴヌクレオチド三量体プライマーのいくつかの例を、以下の表Ｉに提示する：
【００９２】
【表１】
2018527015.tif 000005
2018527015.tif 000006
【００９３】
本発明によって包含されるその他の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、既知または新規塩基類似体を有するプライマーを含む。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを合成するための方法を以下の実施例において例示する。
【００９４】
転写
真核生物では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって行われる。これは、複雑な調節を有する複雑な多サブユニット酵素である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大規模転写を実施するために、研究者らは、一般に、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、Ｋ１−５、Ｋ１Ｅ、Ｋ１ＦまたはＫ１１バクテリオファージに由来する単一サブユニットファージポリメラーゼを使用する。このファミリーのポリメラーゼは、アクセサリータンパク質を必要とせず、開始ヌクレオチド配列の最小の制約を有する約１７ヌクレオチドの簡単な最小プロモーター配列を有する。本出願は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）に焦点を当てているが、当業者ならば、本発明は、その他のＲＮＡポリメラーゼを用いても実施できるということは理解するであろう。
【００９５】
Ｔ７  ＲＮＡＰは、少なくとも２つのタンパク質状態で存在する。第１のものは、「アボーティブ（abortive）複合体」と呼ばれ、転写開始と関連している。第２のものは、「伸長複合体」と呼ばれる極めて前進性のコンホメーションである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、６つのステップに分けることができる：１）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列との結合、２）転写の開始、３）アボーティブ転写と呼ばれ、その間に、ポリメラーゼがＤＮＡ鋳型および短いアボーティブ転写物を頻繁に放出する非前進性伸長、４）開放複合体の閉鎖複合体への変換、５）前進性伸長および６）転写終結。転写の際に生成された相当な量のＲＮＡは、約２〜８ヌクレオチド長の短いアボーティブ断片からなる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第１９巻：３２４５〜３２５３頁（１９８０年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第９巻：３１〜４５頁（１９８１年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１５巻：８７８３〜８７９８頁（１９８７年）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２７巻：３９６６〜３９７４頁（１９８８年））。約１０〜１４塩基の合成後、ＲＮＡポリメラーゼは、アボーティブサイクリングから逃れ、同時にプロモーターＤＮＡとの配列特異的接触を失い、前進性伸長複合体を形成し、これでは、ＲＮＡ鎖が配列非依存的に延長される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８３巻：１６５〜１７７頁（１９８５年）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８３巻：３６１４〜３６１８頁（１９８６年）；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第７巻：３３７１〜３３７９頁（１９８７年））。
【００９６】
最も活性なクラスＩＩＩ  Ｔ７プロモーターのコンセンサス配列は、転写開始部位の上流の１７ｂｐの配列および下流の６ｂｐを包含する（Ｃｅｌｌ第１６環：８１５〜２５頁（１９７９年））。最初に転写されるヌクレオチドの位置は、一般に、ＲＮＡの＋１転写物ヌクレオチドと呼ばれ、２番目に転写されるヌクレオチドは、＋２転写物ヌクレオチドなどと呼ばれる（表２）。転写の際、２つの鎖が融解し、転写バブルを形成し、二本鎖のボトム鎖（表２において３’から５’で示されている）は、転写の鋳型である。転写物ヌクレオチド＋３およびそれを超えるものについては、鋳型鎖は、主にワトソン−クリック塩基対形成相互作用によって転写されるヌクレオチドの同一性を規定する。ここで、第１のＲＮＡ転写物ヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、鋳型の＋１ヌクレオチドと定義される。表２に示される例では、＋１転写物ヌクレオチドは、Ｇであり、＋１鋳型ヌクレオチドは、Ｃである。同様に、＋４転写物ヌクレオチドは、Ａであり、＋４鋳型ヌクレオチドは、Ｔである。
【００９７】
【表２】
2018527015.tif 000007
【００９８】
ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、Ｔ７  ＲＮＡＰは、プライマーの不在下でＲＮＡ合成を開始する。開始における第１のステップは、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＲＮＡ合成と呼ばれ、これでは、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型上の特異的配列を認識し、位置＋１および＋２の鋳型残基と相補的であるヌクレオチド三リン酸の第１の対を選択し、ジヌクレオチドを形成するリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。開始ヌクレオチドは、ポリメラーゼに対して伸長の際に使用されるものよりも低い親和性を有する。Ｋｄ値は、第１の開始ＮＴＰについて２ｍＭであり、第２については、８０μＭであるのに対し、Ｋｄは、伸長の際のＮＴＰについてはおよそ５μＭである（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７年）第３７０巻、２５６〜２６８頁）。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成が、転写の際の律速ステップであるということがわかっている。Ｔ７  ＲＮＡＰは、開始ヌクレオチドとしてＧＴＰに対して強いバイアスを示す（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２４８巻：２２３５〜２２４４頁（１９７３年））。ゲノム中の１７のＴ７プロモーター中、１５がＧＴＰで（また、１３がｐｐｐＧｐＧで）開始するのに対し、転写伸長の際には明らかなＮＴＰ優先はない（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３７０巻：２５６〜２６８頁（２００７年））。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、位置＋１にＡをコードするプロモーターでは不十分にしか開始せず、代わりに、転写は、主に位置＋２のコードされるＧで開始する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７８巻：２８１９〜２８２３頁（２００３年））。
【００９９】
ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＲＮＡ合成の際には、開始ヌクレオチドの結合は、塩基スタッキング、ポリメラーゼ残基、開始ヌクレオチドのグアニン部分の間の特異的相互作用および塩基相補性相互作用によって生じた自由エネルギーによって主に達成される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３７０巻：２５６〜２６８頁（２００７年））。
【０１００】
Ｔ７  ＲＮＡＰはまた、短いオリゴヌクレオチドプライマーを用いても開始できることがわかっている。例えば、Ｔ７ゲノム中の１３のプロモーターは、ｐｐｐＧｐＧを用いて開始することがわかっている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３７０巻：２５６〜２６８頁（２００７年））。いくつかのグループが、Ｔ７  ＲＮＡＰが、ジヌクレオチドプライマーから開始できることを示した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４巻：５７１６〜５７２３頁（１９８５年））。Ａｘｅｌｒｏｄらは、キャップのないＧｐＡジヌクレオチドは、それぞれ、２’−デオキシシチジンおよび２’−デオキシチミジンである＋１および＋２鋳型ヌクレオチド（「ＣＴ」鋳型）から開始できることを示した。彼らの反応条件は、２００マイクロモル（μＭ）の二量体ならびに１００μＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰであった。彼らの反応混合物はまた、１００μＭの３’  ｄＡＴＰ、３’  ｄＣＴＰ  ３’  ｄＵＴＰまたは５０μＭの３’  ｄＧＴＰを含有していた。彼らは、ＧｐＡ開始されたＲＮＡのみを観察し、ＧｐＡの混合物で開始したＲＮＡおよびＧＴＰ開始からの５’三リン酸ＲＮＡを観察しなかった。これは、使用された反応条件によるものである可能性がある。１００μＭ  ＧＴＰは、第１の開始グアノシンに対するＴ７ポリメラーゼの２ｍＭ  Ｋｄよりもかなり低い（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７年）第３７０巻、２５６〜２６８頁）。ＧＴＰは、開始オリゴヌクレオチドを用いる開始について競合するので、低ＧＴＰ濃度を使用することは、ＧｐＡ開始に好都合であるが、低い転写収率をもたらす（＜１５０μｇ／反応物１ｍＬであると推定される、最大の算出された収率）。ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＵｐＧまたはＧｐＧを用いる「ＣＴ」鋳型での転写を開始する場合には、彼らは、ＲＮＡ転写物の形成およびさらなる鋳型にならない（untemplated）５’ヌクレオチド（それぞれ、Ａ、Ｃ、ＵまたはＧ）を観察した。
【０１０１】
Ａｘｅｌｒｏｄらはまた、キャップのないＧｐＧジヌクレオチドを使用して、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２は、２’−デオキシシチジンである（「ＣＣ」鋳型）プロモーターでＲＮＡ合成を開始した。彼らは、開始の低忠実度を観察し、３種の異なる転写産物を観察した。彼らは、「オートラジオグラフの試験は、各トリプレットのあるメンバーは、正常な（＋１）位置のＧｐＧでの開始に起因し、各トリプレットの第２のメンバーは、異常な（−１）位置のＧｐＧでの開始に起因し、各トリプレットの第３のメンバーは、正常位置のグアノシン三リン酸での開始に起因することを示す。したがって、ＧｐＧは、φ１０プロモーター（「ＣＣ」鋳型）ならびにφ１．１Ａプロモーター（「ＣＴ」鋳型）を用いた場合、相対的に弱いイニシエーターであり、使用された濃度のグアノシン三リン酸を用いる正常な開始を防ぐことはできない。」と述べている。彼らは、φ１０プロモーター（「ＣＣ」鋳型）を用いるＧｐＡジヌクレオチドを用いる開始を観察しなかった。ＣｐＡ、ＡｐＣおよびＡｐＡは、上記の「ＴＣ」および「ＣＣ」鋳型のいずれかでイニシエーターとして働かなかったが、これは、おそらくは、これらが、位置＋１および＋２の鋳型ヌクレオチドとハイブリダイズできないためである。Ａｘｅｌｒｏｄらに記載される方法は、シーケンシングのための極めて少量の放射活性転写物の生成のために設計されたものであり、有用な製薬量のＲＮＡの大規模生成には適していない。より高い濃度（約５ｍＭ）の開始二量体およびＧＴＰを含むＮＴＰを使用して、ＲＮＡの収率を増大する場合には、予測される結果は、ＧＴＰが、Ｋｄ（２ｍＭ）に近いＮＴＰ濃度で＋１ヌクレオチドからの開始について二量体と効率的に競合するので、開始二量体を用いて出発する低い割合のＲＮＡであり、ｐｐｐＧを用いて出発する大きな割合のＲＮＡが生成する。
【０１０２】
Ｐｉｔｕｌｌｅらは、Ｔ７  ＲＮＡＰを用いる転写は、キャップのないオリゴヌクレオチド（２マー〜６マー）を用いて開始され得ることを示した（Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１０１〜１０５頁（１９９２年））。これらのオリゴヌクレオチドは、５’−ＯＨまたは５’一リン酸のいずれかを有していた。それらはまた、構造ビオチン−ＡｐＧのオリゴヌクレオチドを用いて転写を開始した。この研究に使用されたオリゴヌクレオチドのすべては、３’末端Ｇを含有していた。Ｐｉｔｕｌｌｅらはまた、ＲＮＡの５’末端にまたは５’末端付近に２’−Ｏ−メチル化または２’−デオキシ残基を有するＲＮＡ転写物を生成するために、プライマー配列内に２’−Ｏ−メチル残基およびデオキシ残基を含めることができることを示した。この刊行物において、任意の開始オリゴヌクレオチドの３’末端グアノシン残基が、＋１鋳型ヌクレオチドと対形成したことは明確である。これは、転写されたＲＮＡの５’末端に付加された鋳型にならないヌクレオチドをもたらす。具体的には、著者は、「Ｙ末端Ｇは別として、鋳型ＤＮＡとの塩基対合は必要ではないので、このセグメントにおける配列変動も容易にあり得る」と述べている。したがって、開始オリゴヌクレオチドプライマーのうち、位置＋１の鋳型ヌクレオチド「Ｃ」に対してのみ完全に相補的であり、以降の位置（＋２、＋３など）の任意のヌクレオチドに対して相補的ではないものはない。これは、このグループによるその後の方法の論文において確認される（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．第７４巻：９９〜１１０頁（１９９７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２５２巻：９〜１７頁、（２００４年））。それらの方法は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーのすべてのヌクレオチドが、位置＋１および以降の位置の鋳型ヌクレオチドと完全に相補的である本明細書において記載される方法とは異なる。Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍらは、２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチル糖で修飾された二量体または三量体を用いる開始によって５’修飾ｔＲＮＡ転写物を作出した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２１巻：１０９７〜１１０１頁（１９９３年）。やはり、著者らは、プライマーの３’−末端グアノシンは、＋１鋳型ヌクレオチド「Ｃ」で開始することを述べている。
【０１０３】
Ｉｓｈｉｋａｗａらによる別の研究は、構造ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ６ＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧまたはｍ７Ｇｐｐｐｍ６Ａ２’ＯｍｅｐＧのキャップ形成開始オリゴヌクレオチド三量体は、鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシシチジン残基を有する鋳型で（「ＣＣ」鋳型；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９年））転写を開始できることを示した。著者らは、「ｍ７Ｇ５’ｐｐｐＧを使用するケースから得られた異なる結果は、−１位置での、ｍ７Ｇ５’ｐｐｐＮ１ｐＧ中のさらなるアデノシン（Ｎ１）と、Ｔ７プロモーター中の２’−デオキシチミジンの間の塩基対形成から引き起こされ得る」と述べている。この方法は、開始キャップ付オリゴヌクレオチド三量体の＋１および＋２ヌクレオチドが、鋳型ヌクレオチドの＋１および＋２と対形成する本発明において記載される方法とは明確に異なる。Ｉｓｈｉｋａｗａらは、６ｍＭの開始オリゴヌクレオチド三量体、０．９ｍＭ  ＧＴＰおよび７．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの各々を使用した。著者らは、転写反応を、ｐｐｐＲＮＡを上回ってキャップ形成ＲＮＡに向けて指示するために、競合ＧＴＰを上回る、６倍超過剰のキャップ付開始オリゴヌクレオチドプライマーを使用した、これは転写反応の最も高価なヌクレオチド成分であり、これが、合成されたＲＮＡの総費用を増大させる。他方、低濃度のＧＴＰ（０．９ｍＭ）は、転写反応におけるＲＮＡの総収量を制限する（理論的には、１．４ｍｇ／ｍＬ未満に）。それに反して、本明細書において記載される方法は、効率的なＲＮＡキャップ形成およびＲＮＡのより高い収量（２〜６ｍｇ／ｍＬ）の両方を達成し、ひいては、商業的に有用な費用での高品質ｍＲＮＡの生成を可能にするために、任意のＮＴＰの濃度を制限することを必要としない。
【０１０４】
上記で論じられた刊行物のうち、ＲＮＡキャップ形成効率を直接的に測定したものはなく、そのため、それらの研究におけるキャップ形成の程度は、未知である。
【０１０５】
重要なことに、上記で記載されたすべての研究において、＋１鋳型ヌクレオチドは、２’−デオキシシチジンである（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４巻：５７１６〜５７２３頁（１９８５年）、Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１０１〜１０５頁（１９９２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第７４巻：９９〜１１０頁（１９９７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２５２巻：９〜１７頁、（２００４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２１巻：１０９７〜１１０１頁（１９９３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９年））。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いる転写開始研究の公開から２０年超において、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９）における短い報告の公開まで、５’−対５’逆位キャップ構造を含有する開始オリゴヌクレオチドプライマーを用いる転写開始の公開された例はなかった。
【０１０７】
５’キャップ付ＲＮＡを調製するための本明細書において提供される方法および組成物として、それだけには限らないが、ｍＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）が挙げられる。これらの方法は、ＤＮＡを鋳型とし、プロモーターによって制御されるＲＮＡの合成のための、キャップ含有オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオシド５’−三リン酸（ＮＴＰ）およびＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。特定の態様では、方法は、ＲＮＡ合成、特に、キャップ付ＲＮＡの合成において有用性を提供する開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、天然ＲＮＡ分子のキャップ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ−キャップに似ている構造を有し、ＴＭＧ−キャップはＲＮＡの５’位置に、キャップ１はその２番目に、キャップ２はその２番目の隣に２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドユニットを含む。天然のキャップ０構造は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドユニットを有さない。
【０１０８】
ＲＮＡを調製するための方法および組成物は、それだけには限らないが、分子の５’末端に、または５’末端の付近に修飾を保持する、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびトランスファー−メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）を含む。これらの方法は、ＤＮＡを鋳型とし、プロモーターによって制御されるＲＮＡの合成のための、キャップを有する、または有さない開始オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオシド５’−三リン酸（ＮＴＰ）およびＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。特定の態様では、方法は、ＲＮＡ合成において、特に、５’修飾されたＲＮＡの合成において有用性を提供する、構造的修飾を保持する修飾された開始オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。
【０１０９】
開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、プライマーの３’末端にヌクレオチドユニットを付加することによって、ＤＮＡ鋳型でのＲＮＡのＲＮＡポリメラーゼ媒介性合成の開始を可能にする開放３’−ＯＨ基を有する。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、転写開始部位（すなわち、開始部位は、プロモーター配列の３’末端に近接して位置し、プロモーター配列と重複し得る）で鋳型ＤＮＡ配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマーの３’末端から出発して主に一方向で（「フォワード」）ＲＮＡの合成を指示する。特定の態様および実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡ合成の開始についてあらゆるヌクレオシド５’−三リン酸を打ち負かし、それによって、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーで出発するＲＮＡの生成を最大にし、５’−三リン酸−ヌクレオシド（通常、ＧＴＰ）で出発するＲＮＡの生成を最小にする。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるｍＲＮＡの製造は、高度に活性なファージＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびその他）を利用する。ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ヌクレオチド配列の前にＤＮＡプラスミド構築物に組み込まれている特定のプロモーターの制御下で働く。転写プロセスは、通常、プリンヌクレオシド５’−三リン酸（通常、ＧＴＰ）で出発し、ＲＮＡポリメラーゼが終結配列と遭遇するか、またはＤＮＡ鋳型を完了するまで継続する。
【０１１１】
上記で論じたように、ｍＣＡＰジヌクレオチド類似体、キャップ０を含有する７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写における開始のために使用されている（例えば、ＲＮＡ第１巻：９５７〜９６７頁（１９９５年））。これらのジヌクレオチド類似体を使用して生成されるキャップ付ＲＮＡ分子は、キャップ０を含有する。しかし、合成されたキャップ付ＲＮＡ分子の約５０％のみ、キャップ０の正しい「フォワード」方向を有する。キャップ０を有するＲＮＡを、キャップ１を有するＲＮＡに変換するために、（ヌクレオシド−２’−Ｏ）メチルトランスフェラーゼを使用するさらなる酵素反応を実施しなくてはならない。しかし、この変換は、定量的でない場合もあり、制御することは容易ではなく、残存するキャップ０ＲＮＡを、キャップ１ＲＮＡから分離することは困難である。さらに、転写を開始するためのＮＴＰ（具体的には、ＧＴＰ）からの競合は、生成される活性キャップ形成ＲＮＡ分子の量をさらに低減する。
【０１１２】
さらに、リボース上のブロックされた３’および／または２’位置を有する修飾７ｍＧ残基を保持する、７ｍＧ３’Ｏｍｅ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎおよびその他の関連ＡＲＣＡ類似体などの修飾ジヌクレオチド類似体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の開始のために使用されている（例えば、ＲＮＡ第７巻：１４８６〜１４９５頁（２００１年））。これらのＡＲＣＡキャップ類似体は、「フォワード」方向においてのみＲＮＡ合成を指示し、したがって、５’末端（７ｍＧ残基の２’および／または３’修飾を有する）に（天然）キャップ０を有するＲＮＡ分子を生成する。このようなＲＮＡは、標準ジヌクレオチド類似体、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎを使用して調製されたＲＮＡと比較して、翻訳系においてより活性である。ＡＲＣＡキャップ０を有するＲＮＡを、ＡＲＣＡキャップ１を有するＲＮＡに変換するために、これまでに論じられたジヌクレオチド類似体に必要なものと同様の（ヌクレオシド−２’−Ｏ）メチルトランスフェラーゼを用いるさらなる酵素反応を実施しなくてはならない。この方法は、ｍＣＡＰジヌクレオチド類似体について詳細に述べられたものと同一の不利点を有し、キャップ０を有するＲＮＡの、ＡＲＣＡキャップ１を有するＲＮＡへの変換は、定量的でない場合もあり、反応は、制御することが容易ではなく、残存するキャップ０ＲＮＡを、キャップ１ＲＮＡから分離することは困難であり、転写の開始のためのＮＴＰ（具体的には、ＧＴＰ）からの競合は、生成される活性キャップ形成ＲＮＡ分子の量をさらに低減する。
【０１１３】
３’末端グアノシン残基を有する短いオリゴヌクレオチドプライマー（２〜６マー）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の開始のために使用されている（Ｐｉｔｕｌｌｅ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１０１〜１０５頁（１９９２年））。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、修飾および非修飾リボヌクレオシド残基を含有していた（例えば、修飾リボヌクレオシド残基は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド残基および２’−デオキシリボヌクレオシド残基を含んでいた）。より短いオリゴヌクレオチドプライマー（二量体〜四量体）は、転写の開始についてＧＴＰを実質的に打ち負かし、より長いプライマー（五量体〜六量体）は、ＧＴＰと比較して、転写の開始においてかなり効率的ではない。それは、これらのより長いプライマー（それらが設計されるような）が、開始部位でＤＮＡ鋳型との低いパーセントの相補性を有するためであり得る。対照的に、二量体、ＡＧ（設計されるような）は、開始部位でＤＮＡ鋳型と相補的であった。この節において論じられた、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成されたＲＮＡ分子は、内部２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドを有するが、５’−キャップ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ−キャップを含有しなかった。キャップ構造を有さないＲＮＡを、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ−キャップ構造を有するＲＮＡに変換するために、キャップ形成酵素を使用するさらなる酵素反応を実施しなくてはならない。しかし、このような変換は、上記で記載されたものと同一の不利点を有する。
【０１１４】
キャップ構造および内部２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド残基を含有するその他の短いＲＮＡオリゴヌクレオチドは、化学的に調製されている（Ｏｈｋｕｂｏら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｅｒｓ第１５巻：４３８６〜４３８９頁（２０１３年））。これらの短いキャップ形成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび相補的ＤＮＡスプリンターオリゴヌクレオチドを使用して長いＲＮＡの「キャップ除去された」（５’−キャップ構造を有さない）断片とライゲートした。この化学的−酵素的方法を使用して合成された最終ＲＮＡは、内部２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド残基および５’−ＴＭＧ−キャップ構造の両方を有していた。しかし、このライゲーションアプローチを使用すると、短いキャップ形成ＲＮＡ（＜２００マー）のみが調製された。さらに、収率は低かった（１５〜３０％）。Ｔ４  ＤＮＡライゲーション反応を制御し、最適化することは容易ではなく、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する労力を要する分離プロセスおよび残存するキャップのないＲＮＡからのキャップ形成ＲＮＡの単離を必要とする。ＰＡＧＥ法による、残存するキャップのないｍＲＮＡからの、長い（５００〜１００００塩基）キャップ形成ｍＲＮＡの分離は、実現可能ではない。
【０１１５】
最後に、ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を開始するために、５’修飾ヌクレオシドまたは５’修飾モノヌクレオチドまたは５’修飾ジヌクレオチド、通常、グアノシンの誘導体が使用されている（Ｇｅｎｅ、第１１２巻：１０１〜１０５頁（１９９２年）およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１０３７１〜３７８頁（１９９９年））。これらのイニシエーターヌクレオシドおよびヌクレオチドは、標識または親和性基（例えば、ビオチン）を保持することができ、ＲＮＡの５’末端に組み込まれる場合には、合成されたＲＮＡの容易な検出、単離および精製を可能にするであろう。この５’標識された、またはタグが付けられたＲＮＡは、一部の適用にとって必要であり得る。しかし、この戦略は、キャップ０、キャップ１、キャップ２またはＴＭＧ−キャップ構造を有するｍＲＮＡの調製には使用されなかった。
【０１１６】
本発明の特定の態様では、式Ｉの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの組成物が提供される。関連する態様では、ＲＮＡが、式Ｉの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを使用して合成される方法である。
【０１１７】
開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー
本発明の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、開始部位でＤＮＡ鋳型上の配列と相補的であり得るハイブリダイゼーション配列を有する。本明細書において提供される方法および組成物において使用するためのプライマーのハイブリダイゼーション配列の長さは、鋳型ヌクレオチド配列の同一性およびこのプライマーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の際にＤＮＡ鋳型とハイブリダイズされ、使用される温度を含むいくつかの因子に応じて変わる。転写において使用するための開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの特異的ヌクレオチド配列の所望の長さの決定は、当業者によって、または通例の実験によって容易に決定できる。例えば、核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは、所望のハイブリダイゼーション特異性または選択性に基づいて決定できる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（逆位５’−５’キャップヌクレオチドを含む）のヌクレオチド長は、３〜約９の間であり、いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（キャップを含む）のヌクレオチド長は、３〜約７の間であり、いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（キャップを含む）のヌクレオチド長は、３〜約５の間であり、いくつかの実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー（キャップを含む）のヌクレオチド長は、約３である。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー内のハイブリダイゼーション配列の長さは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの全長以下であり得る。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション配列の存在が、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーに、所望の方向（すなわち、「フォワード」方向）のみで開始部位でＤＮＡ鋳型の相補的配列と主にアラインさせる。フォワード方向では、ＲＮＡ転写物は、逆位グアノシン残基（すなわち、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ）で始まる。不正確な「逆」方向を超える、ＤＮＡ鋳型でのプライマーアラインメントのフォワード方向の優位（図１）は、ハイブリダイゼーション複合体の熱力学によって維持される。後者は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション配列の長さおよびＤＮＡ鋳型とのハイブリダイゼーションに関与する塩基の同一性によって決定される。所望のフォワード方向のハイブリダイゼーションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の際に、ＤＮＡ鋳型および開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされ、または使用される温度および反応条件に応じても変わり得る。
【０１２０】
本発明の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、標準ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰでの開始の有効性と比較して、転写の開始の有効性を増強する。いくつかの実施形態では、転写の開始は、ＲＮＡの合成が、転写混合物中の任意のＮＴＰからではなく、主に、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーから出発する場合に増強されると考えられる。増強された転写の開始の効率は、ＲＮＡ転写物のより高い収率をもたらす。増強された転写の開始の効率は、開始キャップ付プライマーを用いない従来法を用いるＲＮＡの合成を約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％または約５００％上回って増大され得る。特定の実施形態では、「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」は、転写の開始について任意のＮＴＰ（ＧＴＰを含む）を打ち負かす。当業者ならば、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの基質活性および有効性のレベルを容易に決定できる。基質有効性を決定する方法の一例は、実施例１３）に例示される。特定の実施形態では、開始は、ＮＴＰではなくキャップ付オリゴヌクレオチドプライマーから起こり、これは、より高いレベルの転写されたｍＲＮＡのキャップ形成をもたらす。
【０１２１】
一部の態様では、ＲＮＡが、置換または修飾を有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを利用して合成される方法が提供される。一部の態様では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの置換および修飾は、ＲＮＡの合成を実質的に損なわない。通例の試験合成を実施して、修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いて望ましい合成結果を得ることができるか否かを調べることができる。当業者は、このような通例の実験を実施して、望ましい結果を得ることができるか否かを調べることができる。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの置換または修飾は、例えば、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド塩基、１つまたは複数の修飾された糖、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチド間連結および／または１つまたは複数の修飾された三リン酸橋を含む。
【０１２２】
本明細書において提供される方法および組成物の１つまたは複数の修飾基を含み得る、修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、ＮＴＰの開放３’−ＯＨ基への組込みによって、ＤＮＡ鋳型上でＲＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、天然ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオシド、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み得る。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、天然ヌクレオチド間ホスホジエステル連結またはその修飾またはそれらの組合せを含有し得る。
【０１２３】
一実施形態では、修飾基は、酵素反応媒体の温度が上がるにつれ、増大する速度で、修飾された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーから解離する、熱的に不安定な基であり得る。オリゴヌクレオチドおよびＮＴＰの熱的に不安定な基の例は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３６巻：ｅ１３１（２００８年）、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、第１０巻：２５９〜２６３頁（２００８年）およびＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８１巻：４９５５〜４９６２頁（２００９年）に記載されている。
【０１２４】
一部の態様では、本明細書において開示されるような修飾を有し得る、少なくとも１種のまたはより多くのＮＴＰが、転写反応に付加される場合にＲＮＡが合成される方法が提供される。一部の態様では、少なくとも１種のＮＴＰの修飾は、ＲＮＡポリメラーゼ媒介性のＲＮＡの合成を実質的に損なわない。ＮＴＰの修飾は、例えば、１種または複数の修飾されたヌクレオシド塩基、１種または複数の修飾された糖、１種または複数の修飾された５’−三リン酸を含み得る。修飾されたＮＴＰは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に組み込まれ得、転写を遮断せず、プライマーのさらなる伸長を支持する。
【０１２５】
別の実施形態では、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの修飾基は、検出可能な標識または検出可能なマーカーであり得る。したがって、転写後、検出可能な標識またはマーカーを含有する標的ＲＮＡを、大きさ、質量、色および／または親和性捕獲によって同定できる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識またはマーカーは、蛍光色素であり、親和性捕獲標識は、ビオチンである。特定の実施形態では、転写反応の１つまたは複数の成分（開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはＮＴＰ）を、検出可能な標識またはマーカーを用いて標識できる。したがって、転写後、ＲＮＡ分子を、例えば、大きさ、質量、親和性捕獲または色によって同定できる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光色素であり、親和性捕獲標識は、ビオチンである。
【０１２６】
本発明の「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」を合成するために標準化学的および酵素的合成方法を利用でき、実施例の節において本明細書において開示される。
【０１２７】
キット
転写を実施するための「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」を含むキットも考慮される。例えば、キットは、一般的なＲＮＡ（例えば、ＦＬｕｃ  ｍＲＮＡ）の合成のためのすべての転写試薬を含有し得る。より詳しくは、キットは、「開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー」、転写のための印がつけられた容器、ＲＮＡ合成を実施するための使用説明書および１種もしくは複数の修飾されたもしくは非修飾開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー、１種もしくは複数の非修飾ＮＴＰ、１種もしくは複数の修飾されたＮＴＰ（例えば、プソイドウリジン５’−三リン酸）、ＲＮＡポリメラーゼ、その他の酵素、反応バッファー、マグネシウムおよびＤＮＡ鋳型からなる群から選択される１種または複数の試薬を含有し得る。
【０１２８】
本発明の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、種々の開始ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの使用またはｍＣＡＰおよびＡＲＣＡなどのキャップ０構造を含有するポリホスフェートジヌクレオチド誘導体の使用を含む、現在の方法および組成物を上回る相当な利点を有する。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーは、既存の転写系および試薬と適合可能であり、さらなる酵素または試薬は必要ではない。さらに、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの使用は、いくつかの非酵素的および酵素的ステップ（キャップ形成および２’−Ｏ−メチル化など）を不要なものにし、ひいては、ＲＮＡ合成のプロセスの複雑性および費用を低減する。
【０１２９】
本明細書において記載される例示的方法は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写反応に関し、転写反応における使用のための当技術分野で公知のいくつかのその他のＲＮＡポリメラーゼを、本発明の組成物および方法を用いて利用できる。利用することができる天然または突然変異した変異体を含むその他の酵素として、例えば、ＳＰ６およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼおよび熱安定性ＲＮＡポリメラーゼを含むその他の供給源由来のＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０１３０】
一部の核酸複製および増幅方法は、プロセスの一部として転写を含み得る。これらの方法の中に、当技術分野で公知の転写媒介性増幅（ＴＭＡ）ならびに核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ＤＮＡおよびＲＮＡシーケンシングならびにその他の核酸延長反応がある。当業者ならば、将来開発される転写反応の変法を含むその他の方法を転写方法の代わりに、転写方法と一緒に使用してもよいということは理解するであろう。
【０１３１】
治療的使用
本発明はまた、医薬組成物中の治療薬として使用するための、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡを細胞中に導入して、細胞の医学的状態を治療するための、または開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡを、それらのＲＮＡを利用する細胞中に導入して、宿主細胞に対して治療的影響を有し得るタンパク質を生成するための、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するｍＲＮＡの生成を考慮する。
【０１３２】
開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡを利用する状態を治療するための１つの方法は、式Ｉの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡまたはこのようなＲＮＡを含む組成物を、その症状／総体症状が重症度において低減され得る、または排除され得る状態を有する、または有すると疑われる対象に投与するステップを含む。
【０１３３】
式Ｉの「化合物」の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを含有するＲＮＡは、４ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される塩に製剤化される場合に、薬学的に許容される担体単独を用いた治療されない個体よりも、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上に症状および／または総体症状の低減をもたらすのに有効である。
【０１３４】
特定の状態を治療するために、注射または当業者に公知のその他の適当な経路による投与のために、医薬組成物が製剤化され得る。非経口投与用の注射用物質組成物は、通常、滅菌生理食塩水などの適した溶液および／または薬剤担体中に活性化合物を含有する。組成物はまた、脂質またはリン脂質中の、リポソーム懸濁液中の、または水性エマルジョン中の懸濁液として、製剤化され得る。
【０１３５】
種々の組成物および／または製剤を調製するための方法は、当業者に公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５年）を参照のこと。投与されるべき組成物は、標的細胞または組織中の所望のタンパク質の発現を増大するために、製薬上安全な、有効な量で一定量の選択された化合物を含有する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の化合物を含有する、上記のように、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、０．１％超を含有する、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大約１０％を含有する、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大約５％を含有する、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大約１％（ｗ／ｖ）の化合物を含有する。適した濃度の選択は、所望の用量、頻度および活性薬剤の送達の方法などの因子に応じて変わる。
【０１３７】
哺乳動物またはヒトなどの対象の治療のために、対象の体重および全体的な健康、治療される状態、症状の重症度などといった因子に基づいて投与量が決定される。投与量および濃度は、あらゆる望ましくない副作用を避けながら、所望の利益をもたらすように決定される。対象化合物の通常の投与量は、ヒト患者のために約０．０００５〜５００ｍｇ／日の範囲、いくつかの実施形態では、約１〜１００ｍｇ／日の間の範囲である。例えば、より高い用法は、例えば、５０〜１００、７５〜１００または５０〜７５ｍｇ／日を含み、より低い用法は、例えば、１〜５０、２５〜５０または１〜２５ｍｇ／日を含む。
【０１３８】
本発明の種々の態様を、以下の限定されない例によって例示する。実施例は、例示目的であって、本発明のいかなる実施に対しても制限ではない。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変法および改変を行うことができるということは理解されよう。当業者ならば、本明細書において記載される試薬および成分を合成する、または商業的に入手する方法を容易に承知する。
【実施例１】
【０１３９】
グアノシン５’−二リン酸からの７−メチルグアノシン５−二リン酸（ｐｐ７ｍＧ）の調製（図１）
４０．０ｍＬの水中のグアノシン５’−二リン酸（２．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、酢酸を添加して、溶液のｐＨを４．０に調整する。この混合物に、硫酸ジメチル（４．０ｍＬ）を、３０分間にわたって滴加し、反応混合物を、０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を使用して反応混合物のｐＨを約４．０で維持しながら、室温で４時間撹拌する。４時間後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）を用いて抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去する。水層を、水を用いて５００ｍＬに希釈し、１Ｍ  ＴＥＡＢを用いてｐＨ６．５に調整し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（３×５０ｃｍ）にロードする。０〜１Ｍ  ＴＥＡＢ、ｐＨ７．５の直線勾配（３Ｌ）を使用して生成物を溶出する。純粋なｐｐ７ｍＧ（トリエチルアンモニウム塩）を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥すると、微細な白色粉末が得られる（収率：８０％）。同様の手順は、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ第１７巻：５２９５〜５２９９頁（２００７年）に開示されている。
【実施例２】
【０１４０】
ｐｐ７ｍＧからの７−メチルグアノシン５’−二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ）の調製
（図２）
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中で、ｐｐ７ｍＧのトリエチルアンモニウム塩（０．４ｍｍｏｌ）を、イミダゾール（４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２ｍｍｏｌ）および２、２’−ジピリジルジスルフィド（２ｍｍｏｌ）と８時間反応させる。反応混合物を、２５０ｍＬの０．２Ｍ過塩素酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れることによって、粗Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧが沈殿する。混合物を−２０℃に冷却し、得られた沈殿を遠心分離によって回収し、アセトン（３×５０ｍＬ）を用いて洗浄し、高真空下で乾燥させる。Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧの単離収率は、およそ１００％である。同様の手順は、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ第２４巻：１１３１〜１１３４頁（２００５年）およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第６４巻：５８３６〜５８４０頁（１９９９年）に開示されている。
【実施例３】
【０１４１】
３’−Ｏ−メチルグアノシンからの３’−Ｏ−メチルグアノシン５’−リン酸（ｐＧ（３’Ｏｍｅ））の調製
（図３）
３’−Ｏ−メチルグアノシン（１０ｍｍｏｌ）を、６０〜７０℃のリン酸トリエチル（４０ｍＬ）中に溶解する。混合物を氷−水浴中で０℃に冷却し、オキシ塩化リン（３０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を、アルゴン下、室温で３時間撹拌する。１Ｍ  ＴＥＡＢ（１００ｍＬ；ｐＨ８．５）を撹拌しながらゆっくりと添加することによって、反応をクエンチする。混合物を８時間撹拌し、１Ｌの水で希釈する。得られた溶液を、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（３×４０ｃｍ）にロードし、ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）の直線勾配０．０５〜１．０Ｍ（３Ｌ）を用いて生成物を溶出する。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させて固体残渣とし、メタノール（４×５０ｍＬ）と共蒸発させると、ｐＧ（３’Ｏｍｅ）（トリエチルアンモニウム塩）が、白色固体として得られる（収率６０％）。同様の手順は、米国特許出願番号第２０１２／０１５６７５１号に開示されている。
【実施例４】
【０１４２】
ｐＧ（３’Ｏｍｅ）からの３’−Ｏ−メチルグアノシン５’−ホスホルイミダゾリド（Ｉｍ−ｐＧ（３’Ｏｍｅ））の調製
（図４）
無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中で、ｐＧ（３’Ｏｍｅ）のトリエチルアンモニウム塩（０．５ｍｍｏｌ）を、イミダゾール（５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２．５ｍｍｏｌ）および２，２’−ジピリジルジスルフィド（２．５ｍｍｏｌ）と５時間反応させる。反応混合物を、４００ｍＬの、アセトン溶液中の０．２Ｍ過塩素酸ナトリウム中に注ぎ入れることによって、粗Ｉｍ−ｐＧ（３’Ｏｍｅ）が沈殿する。混合物を−２０℃に冷却し、得られた沈殿を遠心分離によって回収し、アセトン（３×６０ｍＬ）を用いて洗浄し、高真空下で乾燥させる（収率：１００％）。同様の手順は、米国特許出願番号第２０１２／０１５６７５１号に開示されている。
【実施例５】
【０１４３】
Ｉｍ−ｐＧ（３’Ｏｍｅ）からの３’−Ｏ−メチルグアノシン５’−二リン酸（ｐｐＧ（３’Ｏｍｅ））の調製
（図５）
無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のＩｍ−ｐＧ（３’Ｏｍｅ）（７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、固体塩化亜鉛（１４．０ｍｍｏｌ）を少量で添加する。混合物を、固体が溶解するまでアルゴン下で１５分間撹拌する。ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の１Ｍリン酸トリブチルアンモニウムの溶液を添加し、混合物を室温で撹拌する。５時間後、混合物を、２００ｍＬの水で希釈し、ジクロロメタン（２×２００ｍＬ）を用いて抽出する。水層を水（１Ｌ）で希釈し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（５×４０ｃｍ）にロードし、０．０５〜１．０Ｍの直線勾配（６Ｌ）ＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）を用いて溶出する。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、メタノール（４×５０ｍＬ）と共蒸発させると、ｐｐＧ（３’Ｏｍｅ）（トリエチルアンモニウム塩）が白色固体として得られる（収率：６０％）。同様の手順は、米国特許出願番号第２０１２／０１５６７５１号に開示されている。
【実施例６】
【０１４４】
ｐｐＧ（３’Ｏｍｅ）からの７−メチル−３’−Ｏ−メチルグアノシン５−二リン酸（ｐｐ７ｍＧ（３’Ｏｍｅ））の調製
（図６）
５０ｍＬの水中のｐｐＧ（３’Ｏｍｅ）（トリエチルアンモニウム塩；３．０ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、氷酢酸を添加して、溶液のｐＨを４．０に調整する。この混合物に硫酸ジメチル（１０．０ｍＬ）を３０分間にわたって滴加し、０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を使用して４．０±０．５のｐＨを維持しながら、反応混合物を室温で４時間撹拌する。４時間後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×１５０ｍＬ）を用いて抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去する。水層をｐＨ５．５に調整し、水（５００ｍＬ）で希釈し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（３×５０ｃｍ）にロードする。生成物を０〜１．０Ｍ  ＴＥＡＢ、ｐＨ７．５の直線勾配（３Ｌ）を使用して溶出する。純粋なｐｐ７ｍＧ３’Ｏｍｅ（トリエチルアンモニウム塩）を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥すると、微細な白色粉末が得られる（収率：８０％）。同様の手順は、ＲＮＡ第９巻：１１０８〜１１２２頁（２００３年）；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ第２５巻：３３７〜３４０頁（２００６年）；および米国特許出願番号第２０１２／０１５６７５１号に開示されている。
【実施例７】
【０１４５】
ｐｐ７ｍＧ（３’Ｏｍｅ）からの７−メチル−３’−Ｏ−メチルグアノシン５−二リン酸イミダゾリド（Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ（３’Ｏｍｅ））の調製
（図７）
Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ（３’Ｏｍｅ）の調製のために、実施例１に記載されるプロトコールを利用する。同様の手順は、ＲＮＡ第１４巻：１１１９〜１１３１頁（２００８年）に開示されている。
【実施例８】
【０１４６】
ｐＮ（２’−ＯＲ１）ｐＮジヌクレオチド（Ｒ１＝ＨまたはＭｅ）の調製のための一般的な手順
（図８）
１０ｍＬの、２．５モル当量のアクチベーター（テトラゾール）を含有するアセトニトリル中で、ホスホルアミダイトモノマー（ｉ）（１．０ｍｍｏｌ）および２’，３’，Ｎ−保護ヌクレオシド（ｉｉ）（１．０ｍｍｏｌ）を反応させる。室温で６０分撹拌した後、中間生成物を、ヨウ素を用いてＰ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）状態に酸化し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）を用いて抽出する。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、蒸発させて固体泡沫（中間体（ｉｉｉ））とする。
【０１４７】
ＤＭＴ−保護基を除去するために、１０ｍＬの８０％酢酸に中間体（ｉｉｉ）を溶解し、反応が完了した後（約１〜２時間）、混合物を蒸発させ、メタノール（５×３０ｍＬ）と共蒸発させて、酢酸を除去する。溶出剤としてジクロロメタン中の５％メタノールを使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗５’−ＯＨ二量体（ｉｖ）を単離し、精製する。
【０１４８】
５’−ＯＨ二量体（ｉｖ）（１．０ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのアセトニトリル中の２当量のビス−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイトおよび２当量のアクチベーター（テトラゾール）を用いて亜リン酸化（phosphitylated）する。室温で３０分撹拌した後、５’−亜リン酸化二量体を、ヨウ素を用いてＰ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）状態に酸化し、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）およびブライン（１５０ｍＬ）を用いて抽出する。有機層を蒸発させて油性残渣とし、メタノール（２×３０ｍＬ）を用いて共蒸発させ、１２ｍＬのメタノール中に溶解し、濃アンモニア（１２ｍＬ）を添加した。混合物を、ｐＮ２’ＯＲ１ｐＮ二量体（ｖ）の脱保護が完了するまで４８時間にわたって室温で維持する。混合物を蒸発させ、メタノール（２×３０ｍＬ）と共蒸発させる。
【０１４９】
Ｒ＝メチルである場合には、粗二量体（ｖ）を、陰イオン交換および逆相クロマトグラフィーによって直接精製する（ステップ５）。画分を蒸発させると、最終ｐＮ２’ＯＲ１ｐＮ二量体（ｖ）（ｖ；Ｒ１＝メチル；トリエチルアンモニウム塩）が白色固体として得られる（３５％の全体の収率）。
【０１５０】
Ｒ＝ＴＢＤＭＳである場合には、粗二量体（ｖ）をＨＦ−３ＴＥＡ混合物を用いて処理して（ステップ４Ｂ）、２’−ＯＴＢＤＭＳ保護基を除去する（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．第３巻：３８５１〜３８６８頁（２００５年）およびＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２巻：２４３０〜２４３１頁（１９９４年））。反応が完了した時点で、混合物を、０．０５Ｍ  ＴＥＡＢで希釈し、陰イオン交換および逆相クロマトグラフィーによって精製する（ステップ５）。画分を蒸発させると、最終ｐＮ２’ＯＲ１ｐＮ二量体（ｖ）（Ｒ１＝Ｈ；トリエチルアンモニウム塩）が白色固体として得られる（３０％の全体の収率）。
【実施例９】
【０１５１】
キャップ０、キャップ１またはキャップ２構造を有する開始オリゴヌクレオチドの合成のための一般手順（実施例では、５’−リン酸化ジヌクレオチドを使用する）
（図９）
Ａ．アプローチ１：
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の、Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ（３’Ｏｍｅ）またはＩｍ−ｐｐ７ｍＧ（２ｍｍｏｌ；ナトリウム塩の形態）および５’−リン酸化ジヌクレオチド（１ｍｍｏｌ；トリエチルアンモニウム塩）の懸濁液に、３５℃で混合物を撹拌しながら、無水ＺｎＣｌ２（１ｇ）をゆっくりと添加する。２４時間後、水中のＥＤＴＡの２５ｍＭ溶液（５００ｍＬ）の添加によって反応を停止し、重炭酸ナトリウムの１Ｍ溶液によって中和する。混合物を水で１Ｌに希釈し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（３×５０ｃｍ）にロードする。０〜１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．２の直線勾配（２Ｌ）を使用して生成物を溶出する。純粋な生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、微細な白色粉末が得られる（収率：６０％）。同様のアプローチは、米国特許出願番号第２０１２／０１５６７５１号；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第１７巻：５２９５〜５２９９頁（２００７年）およびＲＮＡ第１４巻：１１１９〜１１３１頁（２００８年）に開示されている。
【０１５２】
Ｂ．アプローチ２：
Ｉｍ−ｐｐ７ｍＧ（３’Ｏｍｅ）またはＩｍ−ｐｐ７ｍＧ（２ｍｍｏｌ）を、ＭｎＣｌ２（２ｍｍｏｌ）を含有するＮ−メチルモルホリンバッファー（０．２Ｍ、ｐＨ７．０、１０ｍＬ）中に溶解し、固体５’−リン酸化ジヌクレオチド（１ｍｍｏｌ；トリエチルアンモニウム塩）に添加する。反応物を室温で撹拌する。２４〜４０時間後、反応を、１０ｍＬのＥＤＴＡの０．２５Ｍ溶液を用いて停止する。混合物を、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（３×５０ｃｍ）にロードする。生成物を０〜１．０Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．２の直線勾配（２Ｌ）を使用して溶出する。純粋な生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、微細な白色粉末が得られる（収率５０％）。同様のアプローチは、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２１巻：７９２１〜７９２８頁（２０１３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第３７巻：１９２５〜１９３５頁（２００９年）；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第６４巻：５８３６〜５８４０頁（１９９９年）に開示されている。（注記：１．実施例９において例示されるような５’−リン酸化ジヌクレオチドの代わりに、５’−リン酸化三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体オリゴヌクレオチドを使用できる。２．キャップ０を有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドを調製するために、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドは、第１の５’−ヌクレオシド残基上に２’−Ｏ−メチル基を有さない、例えば、ｐＡｐＧ。３．キャップ１を有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドを調製するために、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドは、第１の５’−ヌクレオシド残基上に１つの２’−Ｏ−メチル基を保持する、例えば、ｐＡ（２’Ｏｍｅ）ｐＧ。４．キャップ２を有する開始キャップ付オリゴヌクレオチドを調製するために、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドは、第１および第２の５’−ヌクレオシド残基上に２つの２’−Ｏ−メチル基を保持する、例えば、ｐＡ（２’Ｏｍｅ）ｐＧ（２’Ｏｍｅ）ｐＧ）。
【実施例１０】
【０１５３】
式Ｉに従う、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造
図１０は、構造Ｉに従う実施例において使用される開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの構造を示す。Ａ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ、Ｂ）ｍ７ＧｐｐｐＧ２’ＯｍｅｐＧ、Ｃ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’ＯｍｅｐＧ、Ｄ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、Ｅ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ、Ｆ）ｍ７ＧｐｐｐＣ２’ＯｍｅｐＧ、Ｇ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’ＯｍｅｐＧ、Ｈ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ２’ＯｍｅｐＧ。
【実施例１１】
【０１５４】
ＡＲＣＡプライマーを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
ポリメラーゼ連鎖反応によってホタルルシフェラーゼをコードする二本鎖ＤＮＡ転写鋳型を作製した。＋１鋳型ヌクレオチドは、２’−デオキシシチジンであった。転写反応物は、２５μｇ／ｍＬの転写鋳型、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０００ユニット／ｍＬマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３１４）、２ユニット／ｍＬ無機ピロホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２４０３）、４０００ユニット／ｍＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２５１）、６ｍＭ  ＡＲＣＡ（ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧＧ）、１．５ｍＭ  ＧＴＰ、７．５ｍＭ  ＡＴＰ、７．５ｍＭ  ＣＴＰおよび７．５ｍＭ  ＵＴＰを用いて組み立てた。転写を３７℃で２時間インキュベートした。反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ユニット／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３０３）を補給し、３７℃で１時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出し、溶液を５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパンＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２５０ユニット／ｍｇアンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２８９）に調整することによって脱リン酸化した。反応物を３７℃で１時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出した。
【実施例１２】
【０１５５】
三量体開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
転写において利用される一部の開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを、表１に示す。ポリメラーゼ連鎖反応によって、各三量体に特異的な二本鎖ホタルルシフェラーゼＤＮＡ転写鋳型を作製する。これらの鋳型は、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２が異なっていた。所与の三量体については、鋳型ヌクレオチド＋１は、Ｂ１（転写物ヌクレオチド＋１になるように運命づけられたヌクレオチド）と相補的であった。同様に、鋳型ヌクレオチド＋２は、Ｂ１０（転写物ヌクレオチド＋２になるように運命づけられたヌクレオチド；実施例１０を参照のこと））と相補的であった。転写反応物は、２５μｇ／ｍＬ転写鋳型、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０００ユニット／ｍＬマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３１４）、２ユニット／ｍＬ無機ピロホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２４０３）、４０００ユニット／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２５１）および６ｍＭの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー、１．５ｍＭ  ＧＴＰおよび７．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの各々を用いて組み立てる。その後の実施例では、このプライマー／ＮＴＰ処方は、プライマー／ＮＴＰ処方１と呼ばれる。当業者には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのその他のポリメラーゼを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの代わりに使用して、そのそれぞれのプロモーターを使用することによる同一機能を実施できるということは明らかである。転写反応混合物を、３７℃で２時間インキュベートする。反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ユニット／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３０３）を補給し、３７℃で１時間インキュベートする。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製する。ｍＲＮＡを水で溶出し、溶液を５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパンＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２５０ユニット／ｍｇアンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２８９）に調整することによって脱リン酸化する。反応物を３７℃で１時間インキュベートする。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製する。ｍＲＮＡを水で溶出する。
【実施例１３】
【０１５６】
四量体開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー７ｍＧ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ２’ＯｍｅｐＧを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
転写において、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー７ｍＧ３’ＯＭｅｐｐｐＡ２’ＯＭｅｐＧ２’ＯＭｅｐＧを使用した。転写を、実施例１１におけるように、以下の改変を用いて実施した。ポリメラーゼ連鎖反応によって、四量体に特異的な二本鎖ＤＮＡ転写鋳型を作製した。鋳型ヌクレオチド＋１（２’−デオキシチミジン）は、アデノシン（転写物ヌクレオチド＋１になるように運命づけられたプライマーの第１のヌクレオチド）と相補的であった。同様に、鋳型ヌクレオチド＋２（２’−デオキシシチジン）は、グアノシン（転写物ヌクレオチド＋２になるように運命づけられたプライマーの第２のヌクレオチド）と相補的であった。同様に、鋳型ヌクレオチド＋３（２’−デオキシシチジン）は、グアノシン（転写物ヌクレオチド＋３になるように運命づけられたプライマーの第３のヌクレオチド）と相補的であった。転写反応物は、２５μｇ／ｍＬ転写鋳型、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０００ユニット／ｍＬマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３１４）、２ユニット／ｍＬ無機ピロホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２４０３）、４０００ユニット／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２５１）、６ｍＭの開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー７ｍＧ３’ＯＭｅｐｐｐＡ２’ＯＭｅｐＧ２’ＯＭｅｐＧ、１．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＡＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰおよび７．５ｍＭのＣＴＰを用いて組み立てた。当業者には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのその他のポリメラーゼを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの代わりに使用して、そのそれぞれのプロモーターを使用することによる同一機能を実施できるということは明らかである。転写反応混合物を、３７℃で２時間インキュベートした。反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ユニット／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３０３）を補給し、３７℃で１時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出し、溶液を５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパンＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２５０ユニット／ｍｇアンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２８９）に調整することによって脱リン酸化した。反応物を３７℃で１時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出した。
【実施例１４】
【０１５７】
それぞれ、鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を有する転写鋳型での、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
それぞれ、鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を有する二本鎖ホタルルシフェラーゼＤＮＡ転写鋳型を使用した。２種の転写反応物を、２５μｇ／ｍＬ転写鋳型、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２７ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０００ユニット／ｍＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３１４）、２ユニット／ｍＬ無機ピロホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２４０３）、４０００ユニット／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２５１）を用いて組み立てた。２種の転写は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドの量、ＮＴＰの量およびＮＴＰの同一性が異なっていた。第１の転写は、Ｉｓｈｉｃａｗａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９年））の転写条件を模倣するように設計した。この転写反応は、６ｍＭのｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー、０．９ｍＭ  ＧＴＰおよび７．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含有していた。その後の実施例では、このプライマー／ＮＴＰ処方は、プライマー／ＮＴＰ処方２と呼ばれる。この処方では、開始オリゴヌクレオチドプライマーは、ＧＴＰを上回って６倍超過剰であった。第２の転写は、５ｍＭのｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマー、５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびプソイドウリジン三リン酸（ΨＴＰ）を使用した。その後の実施例では、このプライマー／ＮＴＰ処方は、プライマー／ＮＴＰ処方３と呼ばれる。プライマー／ＮＴＰ処方３では、商業的に有用な量のＲＮＡを生成するためにＧＴＰ濃度を増大した。当業者には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのその他のポリメラーゼを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの代わりに使用して、そのそれぞれのプロモーターを使用することによる同一機能を実施できるということは明らかである。転写反応混合物を３７℃で２時間インキュベートする。反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ユニット／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３０３）を補給し、３７℃で１時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出し、溶液を５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパンＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２５０ユニット／ｍｇアンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２８９）に調整することによって脱リン酸化した。反応物を３７℃でプライマー／ＮＴＰ処方２について１時間、プライマー／ＮＴＰ処方３について３時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑ��ａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出した。プライマー／ＮＴＰ処方１および２を用いて精製された転写収率は、それぞれ、０．７ミリグラム／１ミリリットル転写反応（ｍｇ／ｍＬ）および３．９ｇ／１ｍＬ転写反応であった。プライマー／ＮＴＰ処方２を用いた収率は、プライマー／ＮＴＰ処方１を用いて得られたものよりも大幅に優れていた。
【実施例１５】
【０１５８】
鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型での、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
＋１および＋２鋳型ヌクレオチドがシチジンであり、したがって、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーと完全に相補的ではない二本鎖ホタルルシフェラーゼＤＮＡ転写鋳型を使用した。２種の転写反応物を、２５μｇ／ｍＬ転写鋳型、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２７ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０００ユニット／ｍＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３１４）、２ユニット／ｍＬ無機ピロホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２４０３）、４０００ユニット／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２５１）を用いて組み立てた。２種の転写は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドおよびＮＴＰの量が異なっていた。第１の転写は、Ｉｓｈｉｃａｗａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第５３号：１２９（２００９年））の転写条件を模倣するように設計した。この転写反応は、プライマー／ＮＴＰ処方２を含有していた。第２の転写は、プライマー／ＮＴＰ処方３を使用した。当業者には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどのその他のポリメラーゼを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの代わりに使用して、そのそれぞれのプロモーターを使用することによる同一機能を実施できるということは明らかである。転写反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ユニット／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０３０３）を補給し、３７℃で１時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して、または逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製した。ｍＲＮＡを、溶液を５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−プロパンＨＣｌ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２および２５０ユニット／ｍｇアンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２８９）に調整することによって脱リン酸化した。反応物を３７℃でプライマー／ＮＴＰ処方２について１時間、プライマー／ＮＴＰ処方３について３時間インキュベートした。得られたｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７５１６２）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ｍＲＮＡを水で溶出した。プライマー／ＮＴＰ処方１および２を用いて精製された転写収率は、それぞれ、０．６ミリグラム／１ミリリットル転写反応（ｍｇ／ｍＬ）および３．９ｇ／１ｍＬ転写反応であった。プライマー／ＮＴＰ処方２を用いた収率は、プライマー／ＮＴＰ処方１を用いて得られたものよりも大幅に優れていた。
【実施例１６】
【０１５９】
Ｈｕｈ−７細胞におけるｍＲＮＡの翻訳
（図１１）
開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いて作製したルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳活性を、培養肝細胞において３連で評価した。Ｈｕｈ−７細胞を、１０％  ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸およびペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭで、３７℃、５％  ＣＯ２の雰囲気下で培養した。細胞を、４００ｎｇのｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした。比較のために、細胞をまた、ＡＲＣＡを用いる開始によって作製したキャップ０ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした。２０時間で、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を、ＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ６１２０）を製造業者の推奨に従って使用して測定した。発光を、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ＋検出システム機器を製造業者の推奨に従って使用して測定した。試験したすべてのｍＲＮＡについてルシフェラーゼ活性を検出した（図１１）。開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーまたは３’−Ｏ−メチル開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いて作製したｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップ形成ＲＮＡと同様の効率で翻訳するという事実は、それらが、同時転写的に効率的にキャップ形成されることを示す。
【実施例１７】
【０１６０】
プライマー／ＮＴＰ処方１を使用してＡＲＣＡまたは開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーを用いて同時転写キャップ形成によって作製されたｍＲＮＡのキャップ形成効率を調べるアッセイ（図１２Ａ〜１２Ｈ）
試験された開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーの各々について、液体クロマトグラフィー質量分光法（ＬＣ−ＭＳ）によって検出されるべき十分な量のｍＲＮＡを、キャップ形成アッセイに付した。このアッセイでは、小さい断片が、全長ｍＲＮＡの５’末端から切断され、ＬＣ−ＭＳによって解析された。ｍＲＮＡの切断に先立って、解析を容易にするために、アンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号  Ｍ０２８９）を用いて処理して、キャップのない一リン酸、二リン酸および三リン酸を、５’ＯＨに変換した。ホスファターゼ処理したｍＲＮＡを、次いで、切断し、精製した。精製したＲＮＡをＬＣ−ＭＳ解析に付した。図１２は、ＬＣトレースを示す。キャップのない（ホスファターゼ処理後５’ＯＨ）およびキャップ１に対応するＬＣピークが、実測質量とともに示されている。挿入模式図は、転写鋳型上での開始オリゴヌクレオチドプライマーのアラインメントを示す。「｜」は、模式図において、キャップ形成開始ヌクレオチドの鋳型ヌクレオチドとの塩基対を示すということは留意されたい。下付文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル基を示し、上付文字「ｍ７」は、塩基メチル化を示す。比較のために、ＡＲＣＡで同時転写的にキャップ形成されたｍＲＮＡを、キャップ形成アッセイに付した。キャップ形成効率の推定は、以下の式（キャップ形成されたピークの強度）／［（キャップ形成されたピークの強度）＋（５’ＯＨピークの強度）］を使用して行った。図１２中の実測キャップ形成％は、Ａ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ＝７９％、Ｂ）ｍ７ＧｐｐｐＧ２’ＯｍｅｐＧ＝８９％、Ｃ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ２’ＯｍｅｐＧ＝８７％、Ｄ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ＝９９％、Ｅ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ＝９９％、Ｆ）ｍ７ＧｐｐｐＣ２’ＯｍｅｐＧ＝９８％、Ｇ）ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＣ２’ＯｍｅｐＧ＝９７％、Ｈ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ２’ＯｍｅｐＧ＝５０％であった。各場合において、開始三量体キャップ形成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて同時転写的にキャップ形成された転写物のキャップ形成効率は、ｍ７Ｇ３’ＯｍｅｐｐｐＧ（ＡＲＣＡ）を用いた場合に観察されたものよりも高かった。
【実施例１８】
【０１６１】
鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を有する転写鋳型対鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型での、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドを用いるキャップ形成の比較
（図１３Ａ〜１３Ｄ）
実施例１４および１５において作製されたｍＲＮＡを、キャップ形成アッセイに付して、鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を有する転写物対鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型のキャップ形成の相対効率および特異性を調べた。液体クロマトグラフィー質量分光法（ＬＣ−ＭＳ）によって検出されるべき十分な量のｍＲＮＡを、キャップ形成アッセイに付した。このアッセイでは、小さい断片が全長ｍＲＮＡの５’末端から切断され、ＬＣ−ＭＳによって解析された。ｍＲＮＡの切断に先立って、解析を容易にするために、アンタークティックホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２８９）を用いて処理して、キャップのない一リン酸、二リン酸および三リン酸を、５’ＯＨに変換した。ホスファターゼ処理したｍＲＮＡを、次いで、切断し、精製した。精製したＲＮＡをＬＣ−ＭＳ解析に付した。図１３は、ＬＣトレースを示す。キャップのないおよびキャップ１に対応するＬＣピークが実測質量とともに示されている。挿入模式図は、転写鋳型上での開始オリゴヌクレオチドプライマーのアラインメントを示す。下付文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル基を示し、上付文字「ｍ７」は、塩基メチル化を示す。図１３Ａおよび１３Ｂ転写物は、それぞれ、プライマー／ＮＴＰ処方２および３を使用して、それぞれ、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジンを有する鋳型から転写された。図１３Ｃおよび１３Ｄは、それぞれ、プライマー／ＮＴＰ処方２および３を使用して、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２に２’−デオキシシチジンを有する鋳型から転写された転写物であった。ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始オリゴヌクレオチドが、＋１および＋２ヌクレオチドと完全に相補的である場合には、観察された主要生成物は、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧで開始された所望の鋳型が使用されたキャップ１転写物であった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。図１３Ａおよび１３Ｂについては、キャップ形成効率の推定は、以下の式（キャップ形成されたピークの強度）／［（キャップ形成されたピークの強度）＋（５’ＯＨピークの強度）］を使用して行い、プライマー／ＮＴＰ処方２およびプライマー／ＮＴＰ処方３を用いるキャップ形成効率は、それぞれ９９％および９６％であった。わずかな異常開始生成物のみ検出された。対照的に、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２がシチジンである場合には、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始オリゴヌクレオチドとこれらの鋳型ヌクレオチドの間に完全な相補性はない。図１２Ｃおよび１２Ｄは、開始キャップ付オリゴヌクレオチドが２種のレジスターにおいて開始したことを示す。第１のレジスターでは、３’グアノシン開始キャップ付オリゴヌクレオチド残基は、＋１鋳型シチジンと対形成して、さらなる鋳型にならない５’アデノシン（キャップ１＋Ａ）を有する転写物を生成した。「｜」は、模式図において、キャップ付開始ヌクレオチドの鋳型ヌクレオチドとの塩基対を示すということは留意されたい。指定された鋳型ヌクレオチド位置が示されている。第２のレジスターでは、３’グアノシン開始キャップ付オ��ゴヌクレオチド残基は、＋２鋳型シチジンと対形成し、＋１開始キャップ付オリゴヌクレオチドアデノシンは、＋１鋳型ヌクレオチドと完全なハイブリッドを形成しない。これは、鋳型となる５’グアノシンが鋳型にならないアデノシンと置換されている（キャップ１ＧからＡ）転写物を生成する。キャップ形成効率の推定は、以下の式（キャップ形成されたピークの強度「キャップ１＋Ａ」＋「キャップ１ＧからＡ」）／［（キャップ形成されたピークの強度「キャップ１＋Ａ」＋「キャップ１ＧからＡ」）＋（５’ＯＨピークの強度）］を使用して行った。図１３Ｃおよび１３Ｄにおける算出されたキャップ形成効率は、９７および７７％であった。本発明者らは、キャップ形成効率および鋳型とされた転写開始忠実度は、開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、対応する鋳型＋１および＋２ヌクレオチドと完全に相補的であった場合にかなり高いという驚くべき発見を記す。さらに、本発明者らの方法を用いれば、キャップ形成を駆動するＮＴＰの濃度を低減することなく効率的なキャップ形成を達成でき、はるかに高い転写収率を可能にする。したがって、本発明者らが記載するキャップ形成方法は、Ｉｓｈｉｋａｗａらのものとは異なっており、それよりも優れている。
【実施例１９】
【０１６２】
（図１４Ａ〜１４Ｂ）
鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を有する転写鋳型対鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型でｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドを用いて作製されたｍＲＮＡの分化したＴＨＰ−１細胞における翻訳の比較
実施例１４および１５において作製されたルシフェラーゼｍＲＮＡの発現を評価するために、ｍＲＮＡを、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＴＩＢ−２０２）中にトランスフェクトし、６回反復した。ＴＨＰ−１細胞を、１０％  ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＡＴＣＣ製剤化ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００１）中、３７℃、５％  ＣＯ２の雰囲気下で培養した。細胞を、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４１７４）の存在下、２４ウェルプレート形式でウェル１つあたり２Ｅ＋０５個細胞で播種して、分化を誘導した。播種の７２時間後に、細胞をウェル１つあたり１００ｎｇのｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした。比較のために、細胞をまた、ＡＲＣＡでの開始によって作製されたキャップ０ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を、ＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ６１２０）を製造業者の推奨に従って使用して測定した。発光を、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ＋検出システム機器を製造業者の推奨に従って使用して測定した。データを、６回の反復の平均＋／−平均からの標準偏差としてグラフ化した。独立ｔ検定を使用してデータを解析して、重要性の尺度としてｐ値を作成した。対間のｐ値が示されている。ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドおよび鋳型位置＋１および＋２に２’−デオキシチミジンおよび２’−デオキシシチジン残基を含む鋳型（「ＴＣ」鋳型）対鋳型位置＋１および＋２にシチジン残基を有する転写鋳型（「ＣＣ」鋳型）を用いて作製した転写物について、ＴＨＰ−１細胞において翻訳を比較した。Ａ）転写はプライマー／ＮＴＰ処方２を用いて、またはＢ）プライマー／ＮＴＰ処方３を用いて実施した。両処方を用いる場合、培養ＴＨＰ−１細胞における翻訳は、本発明に記載されるように、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２と完全に相補的であるである場合（「ＴＣ」鋳型）に有意に優れていた。図１４Ｂでは、本発明者らはまた、「ＴＣ」鋳型を用いて作製され、ＡＲＣＡを用いてキャップ形成された（キャップ０）ｍＲＮＡの活性を評価した。これは、同時転写的にキャップ形成されたｍＲＮＡを作製するための現在の業界の標準である。ＡＲＣＡキャップ形成されたＲＮＡは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２’ＯｍｅｐＧ開始キャップ付オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型ヌクレオチド＋１および＋２と完全に相補的である場合（「ＴＣ」鋳型）に作製された転写物よりも有意に低い活性を有していた。
【０１６３】
要するに、本明細書において示される実施例は、本明細書において記載される方法は、これまでに公開された方法に対して、１）高い収率、２）高いキャップ形成度、３）鋳型転写の高い忠実度および４）細胞における優れた活性の組合せを伴ってＲＮＡを作製することを実証する。
【０１６４】
本明細書において例示的に記載された本発明は、本明細書において具体的に開示されない任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の不在下で適宜実施されてよい。したがって、例えば、用語「１つの（a）」および「１つの（an）」および「その（the）」および同様の参照対象は、本発明を説明することとの関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、本明細書において特に断りのない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を対象とすると解釈されるべきである。用語「含んでいる（comprising）」、「有している（having）」、「含んでいる（including）」、「含有している（containing）」などは、制限なく広く読みとられなければならない（例えば、「それだけには限らないが、含んでいる」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、本明細書において特に断りのない限り、範囲内に入る各別個の値を個別に言及することの簡潔表現法として働くものとし、別個の値は各々、本明細書において個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書において記載されるすべての方法は、本明細書において特に断りのない限り、そうでなければ、文脈によって明確に矛盾しない限り、任意の適した順序で実施できる。本明細書において提供されるありとあらゆる例または例示的言葉（例えば、「など」）の使用は、単に、本発明をより良好に理解を容易にするものであり、別に主張されない限り、本発明の範囲に対して制限を課さない。本明細書中の言葉のうち、主張されない任意の要素を、本発明の実施に対して必須として示すと解釈されなくてはならないものはない。さらに、本明細書において使用される用語および表現は、説明の用語として使用されており制限の用語ではなく、このような用語および表現の使用において、示され記載される特徴の任意の等価物またはその一部を排除するという意図はないが、主張される本発明の範囲内で種々の改変が可能であるということは認識される。したがって、本発明を、特定の実施形態および任意選択の特徴を参照して具体的に開示してきたが、開示される本明細書においてそこで具体化される本発明の改変および変法は、当業者によってなされ得るということおよびこのような改変および変法は、本発明の範囲内にあると考慮されるということは理解されなければならない。したがって、本発明を、特定の実施形態および任意選択の特徴を参照して具体的に開示してきたが、開示される本明細書においてそこで具体化される本発明の改変、改善および変法は、当業者によってなされ得るということおよびこのような改変、改善および変法は、本発明の範囲内にあると考慮されるということは理解されなければならない。本明細書において提供される材料、方法および例は、特定の実施形態の代表的なものであり、例示的なものであり、本発明の範囲に対する制限と意図されない。
【０１６５】
本明細書において、本発明は、広く一般的に記載されている。属の開示内に入るより狭い種および亜属集団の各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、削除される材料が本明細書に具体的に列挙されるか否かに関わらず、属から任意の対象を除去する条件または負の制限付きで、本発明の属の記載を含む。
【０１６６】
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群の観点で記載される場合には、当業者は、本発明はまた、それによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群の観点で記載されると認識するであろう。
【０１６７】
本明細書において言及されたすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、各々が個別に参照により組み込まれる場合と同程度に、参照によりその全体が明確に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。
【０１６８】
本出願人は、任意のこのような論文、特許、特許出願またはその他の物理的および電子的文書から得られる、ありとあらゆる材料および情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
【０１６９】
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2018527015.tif 000042