(57)【要約】肺癌または肺疾患の診断用多分析物組成物は、哺乳類血液試料由来のｍＲＮＡ遺伝子転写物と特異的に、複合体化する、ハイブリダイズする、またはこれを同定することができる、核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される、リガンド；及び哺乳類血液試料由来の遺伝子のｍｉＲＮＡと特異的に、複合体化する、ハイブリダイズする、またはこれを同定することができる、核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される、追加リガンドを含む。各リガンド及び追加リガンドは、異なる遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡと結合し、かつ同定された遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、肺癌または肺疾患の段階の特徴的なプロファイルを形成する。診断及び評価のためのこの組成物の使用方法、ならびにそのような組成物の開発方法も記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌の診断用の多分析物組成物であって、以下
（ａ）哺乳類生体試料由来のｍＲＮＡ遺伝子転写物と特異的に、複合体化する、ハイブリダイズする、またはこれを同定することができる、核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される、リガンド；及び
（ｂ）哺乳類生体試料由来のｍｉＲＮＡと特異的に、複合体化する、ハイブリダイズする、またはこれを同定することができる、核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される、追加リガンド；
を含み、
各リガンド及び追加リガンドは、異なる遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡと結合し、かつ同定された該遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡの発現レベルの組み合わせは、肺癌の、または肺癌の段階の特徴的なプロファイルを形成する、前記組成物。
【請求項２】
前記遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１または２または３から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１の順位１〜１１９位から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リガンドはそれぞれ、前記遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡの核酸配列を増幅及び検出する増幅核酸プライマーまたはプライマー対、前記遺伝子のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ、あるいは抗体または抗体断片であり、各リガンドは、表１または２または３の少なくとも１つのｍＲＮＡまたは１つのｍｉＲＮＡに特異的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記リガンドが固定されている基材、マイクロアレイ、マイクロ流体カード、チップ、チャンバまたは複数のプローブからなる複合体あるいは複数のプローブ配列を含むキット、少なくとも１つの該プローブ配列は表１、表２、または表３の前記ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的のうち１つのｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、かつ少なくとも１つのプローブは表１、表２、または表３の前記ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的のうち１つのｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができる；あるいは前記同一ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができる追加リガンドをさらに含むキット；あるいは前記リガンドを複数含むキット、それぞれは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマープローブセットを含み、かつ該キットはプライマー及びプローブ両方を含み、各プライマープローブセットは異なる遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡを増幅する、をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、検出可能な標識を伴う、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、同一の選択された遺伝子及びｍｉＲＮＡの発現、発現レベル、または活性について、対象の全血中のものの、参照または対照のものからの変化を検出することができ、該変化は、肺癌の初期診断、肺癌の段階、肺癌の型または分類、肺癌の再発、肺癌の退縮、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的治療に対する肺癌の反応と相関する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、同一の選択された遺伝子の発現について、対象の血液中のものの、参照または対照のものからの変化を検出することができ、該変化は、肺癌の診断または評価と相関する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記リガンドは、ＲＮＡプライマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも２つのリガンドを含むキットまたはマイクロアレイであり、少なくとも１つのリガンドは、前記対象が肺癌を有する場合に発現に修飾を生じる選択された遺伝子のｍＲＮＡ転写物を同定し、かつ少なくとも２つ目のリガンドは前記対象が肺癌を有する場合に発現レベルに変化を生じるｍｉＲＮＡを同定する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
哺乳類対象でのアッセイの感度及び特異性の向上方法であって、哺乳類対象の生体液中、少なくとも１つのｍＲＮＡ標的と少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的の組み合わせの発現の、参照または対照由来の同一生体試料におけるｍＲＮＡ標的及びｍｉＲＮＡ標的の同一組み合わせでの発現レベルからの変化を同定することを含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の多分析物組成物を使用することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記診断または評価は、肺癌の診断、良性肺小結節、肺癌の段階の診断、肺癌の型または分類の診断、肺癌の再発の診断または検出、肺癌の退縮の診断または検出、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的治療に対する肺癌の反応の評価、または初期肺癌の診断、またはステージＩもしくはＩＩの非小細胞肺癌である肺癌の診断のうち１つまたは複数を含み；あるいは、前記選択されたｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡは、肺疾患なしで喫煙歴なし、肺疾患なしで喫煙歴あり、肺癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、良性肺小結節、腫瘍切除前の肺癌、及び腫瘍切除後の肺癌から選択される２つ以上の条件下で異なって発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記変化は、前記参照または対照との比較での１つまたは複数の選択された遺伝子転写物の上向き調節または下向き調節と、及び前記参照または対照との比較での１つまたは複数の選択されたｍｉＲＮＡの上向き調節または下向き調節との組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１または表２または表３に列挙されるものの中から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象は、固形腫瘍切除の手術または化学療法を受けた後であり；かつ前記参照または対照は、手術前または治療前の同一対象由来の同一の選択された遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡを含み；かつ前記選択された遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡの発現の変化は、癌の再発または退縮と相関する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記参照または対照は、少なくとも１つの参照対象を含み、該参照対象は、以下からなる群より選択され：（ａ）悪性疾患のある喫煙者、（ｂ）非悪性疾患のある喫煙者、（ｃ）非悪性疾患のある元喫煙者、（ｄ）疾患のない健康な非喫煙者、（ｅ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、（ｆ）ＣＯＰＤのある元喫煙者、（ｇ）固形肺腫瘍があり、その除去のための手術前である対象；（ｈ）固形肺腫瘍があり、該腫瘍の外科的除去後の対象；（ｉ）固形肺腫瘍があり、その治療前である対象；及び（ｊ）固形肺腫瘍があり、その治療中または治療後の対象；前記参照または対照の対象（ａ）〜（ｊ）は、時間的により早い時点での同一試験対象である；または、前記参照ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標準は、参照対象または参照集団に由来する、算術平均、広義の平均、数値平均、または数値平均の範囲、数値パターン、図式パターン、または組み合わせた、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルである、請求項１１に記載の方法
【請求項１８】
さらに、前記対象由来の前記生体試料を、前記試料中の前記選択されたｍＲＮＡと複合
体化し、その発現レベルを測定する診断試薬と接触させること、及び前記対象由来の前記生体試料を、前記試料中の前記選択されたｍｉＲＮＡと複合体化し、その発現レベルを測定する診断試薬と接触させること、を含み、前記発現レベルの前記変化の組み合わせは、癌またはその段階の診断となる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
診断試薬を作製する方法であって、哺乳類対象の生体液の試料中の、疾患の選択されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列特性の発現における変化の組み合わせを検出することを含む、該疾患の分類プロファイルの形成を含む、前記方法。
【請求項２０】
肺癌のある対象と良性小結節のある対象とを識別するためのアッセイの感度及び特異性の向上方法であって、以下：
対象から生体液または組織試料を得ること；
哺乳類生体試料由来の表１、２、または３の１つまたは複数のｍＲＮＡ遺伝子転写物標的と特異的に、複合体化する、ハイブリダイズする、またはこれを同定することができる核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のリガンドと、該試料を接触させることにより、表１、２、または３の１つまたは複数のｍＲＮＡ標的が該試料に存在するかどうか検出すること；及び
哺乳類生体試料由来の表１、２、または３の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的と特異的に、複合体化する、ハイブリダイズする、またはこれを同定することができる核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のリガンドと、該試料を接触させることにより、表１、２、または３の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的が該試料に存在するかどうか検出すること、
を含み、各リガンドは、異なるｍＲＮＡ標的またはｍｉＲＮＡ標的と結合する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形式で提出されたデータの参照による援用
本出願人は、本明細書とともに電子形式で出願された配列表データを、本明細書により参照することにより援用する。このファイルは名前が「ＷＳＴ１５５ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、２０１６年５月１９日に作製されたもので、４３ＫＢである。
【０００２】
政府の権利についての声明
本発明は、国立衛生研究所により支給される助成金番号第Ｐ３０  ＣＡ０１０８１５号の下、政府支援でなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
肺癌は、全世界で最大の癌死亡原因であり、毎年新たに約２２０，０００の症例が診断されるが、これは全ての癌診断の約１３％を占める。全ての癌死のうち２７％超は、肺癌によるものであり、毎年約１５０，０００人が亡くなっている。現在の診断率は、後期のものである、すなわち、診断の＞７０％超は、ステージＩＩＩ以上であり、診断された肺癌のうち、１５％のみが、初期の治療可能な段階、すなわちステージＩまたはＩＩＡで診断される。肺癌全体の生存率は、約１８％の５年生存率であるが、これは、この疾患の初期に診断された場合の５年生存率が＞５０％であるのとは対照的である。
【０００４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、致死性の高い疾患であり、早期検出に続く手術によってのみ治癒可能である。残念ながら、診断時に限局性疾患であるのは、肺癌患者の１５％のみである。肺上皮がタバコ煙曝露後に変異してしまう領域癌化により、喫煙者と初期肺癌の喫煙者とを区別する遺伝子変化を同定することは困難である。肺癌生存率を改善する上で最も重要な長期目的の１つは、患者、主に、全肺癌症例の大部分を占める喫煙者及び元喫煙者の悪性腫瘍を、初期段階で、それらが依然として外科切除可能なうちに、検出することの達成である。現在、良性小結節と悪性小結節を区別する唯一の方法は、侵襲的バイオプシー、手術、または繰り返しスキャニングでの長期観察である。初期診断へのアプローチには、ＣＴスキャン、経気管支擦過、ならびに疾患の生体マーカーとして痰、血漿、及び血液の分析などのプロセスが関与する。
【０００５】
遺伝子診断の目的を達成する１つの確立された有効な方法は、腫瘍組織からのマイクロアレイシグネチャーの使用であった。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）プロファイルは、癌を含む全身性疾患の診断及び分類に、ならびに治療反応のモニタリングに使用することができる。癌患者でＰＢＭＣ遺伝子発現プロファイルを使用することの有効性は、マイクロアレイの使用による後期腎細胞癌の患者と正常対照でのＰＢＭＣの比較で、既に報告されている。末梢血試料から初期乳癌を検出するための３７の遺伝子による分類指標が、８２％精度で開発されている。別の研究では、結腸直腸癌患者のＰＢＭＣの遺伝子発現プロファイルが同定されたが、これは、治療に対する反応と相関する可能性がある。本発明者らは、患者ＰＢＭＣの疾患に関する２９の遺伝子による分類指標も明らかにした（例えば、米国特許第８，４７６，４２０号を参照、本明細書中参照として援用される）。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、非翻訳リボ核酸配列の大きな１グループであり、昆虫、微生物、ヒト、動物、及び植物から単離及び同定されており、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｉＲＮＡ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）を始め複数のデータベースに報告されている。こうしたｍｉＲＮＡは、長さが約２２ヌクレオチドであり、それより長い前駆体から生じ、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体は、自己相補的領域
で自分自身に対して折り返して構造を形成する。ｍｉＲＮＡの機能的役割についてはあまり知られておらず、それらの標的についてはさらに不明である。ｍｉＲＮＡ分子は、それらの標的と正確または不正確に塩基対形成することを通じて、遺伝子翻訳を中断または抑制すると思われる（米国特許出願公開第２００４／０１７５７３２号）。生物情報学解析から、どのようなｍｉＲＮＡであっても、最大で数百の異なる遺伝子と結合しその発現を改変する可能性があること；及び１つの遺伝子が複数のｍｉＲＮＡにより制御される可能性があることが示唆される。ｍｉＲＮＡと標的遺伝子間の複雑な相互作用調節ネットワークは、実際のところ、どの遺伝子が、与えられたｍｉＲＮＡに反応して不適切に調節されることになるかを正確に予測することを困難にしていると、指摘されている。ある特定のｍｉＲＮＡの発現レベルは、様々な癌と関連しているとされてきた（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ，  ２００６  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ６（４）：２５９−２６９；  ＭｃＭａｎｕｓ  ２００３  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １３：２５３−２５８；  Ｋａｒｕｂｅ  Ｙ  ｅｔ
ａｌ  ２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，  ９６（２）：１１１−５；  Ｙａｎａｉｈａｒａ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ  ２００６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，  ９（３）：１８９−９８）。
【０００７】
本発明者らは、２００９年１１月６日出願の国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５４２３３号において、複数のｍｉＲＮＡと、及び特に１つのｍｉＲＮＡと特異的に複合体形成、これとハイブリダイズ、またはこれらのプロファイルを同定することができるリガンドを含む診断試薬またはキットをすでに開示しており、これらのプロファイルには、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４２の様々な組み合わせが含まれる。これらの試薬及びキットは、対象の全血または末梢血単核球中のこれらｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現レベルまたはプロファイルを同定することにより、哺乳類対象の肺癌を診断または検出する方法で有用である。当該分野では、様々な肺癌及び他の肺疾患の初期診断を促進する新規かつ有効な道具が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
１つの態様において、肺癌または肺疾患があることが疑われる哺乳類対象の診断または評価のための多分析物組成物が提供される。この組成物は、試薬またはキットであり、哺乳類生体試料中のある特定のｍＲＮＡ（遺伝子転写物）及び非翻訳ｍｉＲＮＡの発現における変化の同定を可能にするリガンドを含む。これらの選択された翻訳及び非翻訳配列における変化の組み合わせは、肺癌または肺疾患の存在、段階、または進行に反応して変化する配列のプロファイルまたは分類を同定することを可能にする。
【０００９】
１つの実施形態において、リガンドは、以下の表１に提示するある特定のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡと結合するプローブである。
【００１０】
別の態様において、多分析物組成物を用いて肺癌または肺疾患の存在、段階、または進行を診断する方法が提供される。
【００１１】
なおさらなる態様において、肺癌、肺疾患の診断、またはそれらの段階もしくはサブタイプの診断を可能にする特徴的な肺癌分類またはｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡプロファイルの組み合わせを開発する方法が提供される。
【００１２】
別の態様において、肺癌のある対象と良性小結節のある対象とを識別するためのアッセイの感度及び特異性を上昇させる方法が提供される。
【００１３】
別の態様において、肺癌または肺疾患があることが疑われる哺乳類対象の診断または評価のための多分析物組成物が提供され、本組成物は、試薬またはキットであり、哺乳類生体試料中のある特定のｍＲＮＡ標的（遺伝子転写物）の発現における変化の同定を可能にするリガンドを含む。ｍＲＮＡ標的は、本明細書中の表１、表２、及び表３から選択される複数標的である。
【００１４】
これらの組成物及び方法の他の態様及び利点を、それらの好適な実施形態についての以下の詳細な説明でさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】訓練集合の大きさを拡大していった場合の誤り率の推定を示すグラフである。全データから訓練集合を様々な大きさで選択することにより、検出力関数曲線の当てはめを行った。ＭＡＤ：５０の再サンプリングにまたがる中央絶対偏差。本方法で記載される試料の本発明者らの予備試験で、検出力関数曲線を作成した。全データから訓練集合を様々な大きさで選択し、大きさを、そのデータの分類について該当する誤り率に対してプロットすることにより、検出力関数の当てはめを行った。訓練に使用した試料数と誤り率の間の関連性は、訓練集合の大きさを拡大することにより、ＮＳＣＬＣ対小結節あり及びなしの対照の分類により高い精度を得ることが可能であることを示す。約５５０の試料を含む訓練集合を使用することにより、９０％分類精度を達成することができる。実施例で訓練に使用した２４２の試料での結果は、曲線上に緑色で示す；この分析の誤り率は、０．１７であり、本発明者らの以前の予測とまさに一致する。ＭＡＤ：５０の再サンプリングにまたがる中央絶対偏差。
【図２】実施例３の分類指標の組み合わせについてＲＯＣのＡＵＣを示すグラフである。このデータは、２４２の訓練試料及び１０３の試験試料、例えば、癌対対照を使用して得られたものである。精度の比較は、ｍＲＮＡのみでは７９％、ｍｉＲＮＡのみでは７１％であるが、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの組み合わせでは８３％であることを示した。アッセイ感度は７６％であった。アッセイの特異性は、８８％であり、ＲＯＣのＡＵＣは０．８８であった。癌対象（ｎ＝５４）；対照（ｎ＝４９）。
【図３】独立した訓練集合からの各試料に対して分類指標により割り当てられた個別のスコアを示す、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）プロットである。各試料には、ＳＶＭ分類指標により割り当てられたスコアが与えられた。正のスコアは、癌という分類であり、負のスコアは対照という分類を示す。各カラムは、患者を表し、カラムの高さは、分類の強度すなわち信頼度の尺度と解釈することができる。示される分類は、分類について古典的０点切捨を使用する。感度は、９２．６％で最大であり、この時の特異性は７３．５％である。ＳＶＭ分析は、各試料にスコアを割り当て、これは、それぞれどれくらい良好に分類されているかの尺度である。
【図４】肺疾患を診断するためのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的からなる分類指標を開発するのに使用された生体試料の数及び評価を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、分類のためのアルゴリズムを開発したが、それは前向き特徴選択を用いたＳＶＭであった。ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを別々に分析して、独立した分類指標を開発し、診断を下すのにｍＲＮＡのみまたはｍｉＲＮＡのみを使用する場合の精度を超える相乗的レベルの精度を実証した。翻訳及び非翻訳特徴を組み合わせることにより、組み合わせ分類指標を開発したが、これは、改善された精度での診断を可能にする。
【００１７】
ｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ発現の組み合わせ（組み合わせ分類指標）は、ｍｉＲＮＡ結果のみを使用する予備ＰＢＭＣと比較して、より正確である。多分析物分類指標は、よりロバストである。分類のためにより多くの特徴が必要とされ；これらの特徴の個数
は、訓練集合が大きくなるほど減少させることができるが、しかし個数は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）及びＰＣＲアレイなど可能性のある開発プラットホームと適合するものである。
【００１８】
本明細書中記載される方法及び組成物は、選択された遺伝子転写物（ｍＲＮＡ）の検出及び選択されたｍｉＲＮＡ（非翻訳）の検出を組み合わせた技法を、肺疾患などの症状の検出、診断、及びその治療に対する反応のモニタリングのために、生体液のスクリーニングに応用する。ある特定の実施形態において、肺疾患は、ＮＳＣＬＣまたはＣＯＰＤである。他の実施形態において、疾患は、良性結節の存在である。本明細書中記載される組成物を用いて、さらに他の肺疾患が診断される。本明細書中記載される組成物及び方法は、生体試料に由来する特徴的遺伝子転写物（ｍＲＮＡ）及び特徴的ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ発現プロファイル（非翻訳）の組み合わせにおける変化を求めることにより、概して症状または疾患またはその段階を、特には肺癌及びＣＯＰＤを、診断または検出することを可能にする。試料として、様々な実施形態において、哺乳類、好ましくはヒト対象の全血、血清、または血漿が挙げられる。ｍＲＮＡ標的及びｍｉＲＮＡ標的両方の発現における変化の組み合わせは、同一クラス（例えば、ある特定の型及び段階の肺癌またはＣＯＰＤである、あるいは混合した型及び段階である、患者）の多数の対象のプロファイルを、あるクラスの複数の対象のプロファイルと比較することにより、確立されるが、比較されるクラスに由来する個々の対象は、有用な診断を提供する目的で、必ず識別できなければならない。
【００１９】
肺疾患スクリーニングのこれらの方法は、前立腺特異的抗原を使用して診断を補助し前立腺癌の進行を追跡するのとほぼ同じやり方で、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイリングを組み合わせて用いて、簡潔で費用効果が高く非侵襲的な血液検査を行うのに適した組成物を使用し、スクリーニングの結果、患者及び医師に胸部Ｘ線写真またはＣＴスキャンなどさらなる検査を行うように注意喚起することができる。本明細書中記載されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現のレベル及びプロファイルは、この診断問題と関連した様々な分類の基礎を提供する。これらの比較レベル及びプロファイルの応用は、疾患が悪性か非悪性の初期検査から始まる、肺疾患の型の重複及び確認診断を提供する。
【００２０】
組成物及び方法の構成要素
「患者」または「対象」は、本明細書中使用される場合、哺乳動物を意味し、そのような動物として、ヒト、獣医学的または農業家畜、家庭家畜またはペット、及び臨床研究に通常用いられる動物が挙げられる。より詳細には、これらの方法及び組成物の対象は、ヒトである。
【００２１】
「リガンド」は、本明細書中使用される場合、標的ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの検出及び定量を可能にするように、標的ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとハイブリダイズ、結合、またはなんにせよ会合することができる、標識化または未標識の、任意のヌクレオチド配列、アミノ酸配列、抗体、プローブ、プライマー、それらの断片、あるいは任意の実体（小分子または化学もしくは遺伝子組換え分子）を示す。
【００２２】
「参照」レベル、標準、またはプロファイルは、本明細書中使用される場合、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの提供源を示す。１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する参照ヒト対象または集団から選択された生体試料から得られる。例えば、１つの実施形態において、利用される参照標準は、扁平上皮癌の参照ヒト対象またはヒト対象の集団あるいは扁平上皮癌の複数対象の平均の生体試料に由来する標準またはプロファイルである。ある特定の実施形態において、利用される参照標準は、初期扁平上皮癌の参照ヒト対象、または複数対象の平均に由来する標準
またはプロファイルである。別の実施形態において、参照標準は、腺癌の参照ヒト対象、または複数対象の平均の生体試料に由来する標準またはプロファイルである。別の実施形態において、参照標準は、初期腺癌の参照ヒト対象、または複数対象の平均の生体試料に由来する標準またはプロファイルである。
【００２３】
別の実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、ＣＯＰＤまたは他のある肺疾患を有する参照ヒト対象または集団から選択された生体試料から得られる。例えば、参照標準は、ＣＯＰＤの参照ヒト対象、または複数対象の平均の生体試料に由来する標準またはプロファイルである。１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、健康で喫煙したことがない参照ヒト対象または集団から選択された生体試料から得られる。例えば、参照標準は、健康で喫煙したことがない参照ヒト対象、または複数対象の平均の生体試料に由来する標準またはプロファイルである。１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、元喫煙者または現在喫煙者であるが疾患はない参照ヒト対象または集団から選択された生体試料から得られる。例えば、参照標準は、元喫煙者または現在喫煙者であるが疾患はない参照ヒト対象、または複数対象の平均に由来する標準またはプロファイルである。
【００２４】
１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、良性肺小結節を有する参照ヒト対象または集団から選択された生体試料から得られる。例えば、参照標準は、良性肺小結節を有する参照ヒト対象、または複数対象の平均の生体試料に由来する標準またはプロファイルである。１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、ＮＳＣＬＣ腫瘍の外科的除去後の参照ヒト対象、または集団から選択された生体試料から得られる。１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、ＮＳＣＬＣ腫瘍の外科的除去前の参照ヒト対象または集団から選択された生体試料から得られる。１つの実施形態において、参照ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標準は、時間的により早く生体試料を提供した同一対象から選択された生体試料から得られる。別の実施形態において、参照標準は、２つ以上の上記参照標準の組み合わせである。
【００２５】
参照標準は、様々な実施形態において、参照対象または参照集団に由来する、算術平均、広義の平均、数値平均、または数値平均の範囲、数値パターン、図式パターン、またはｍｉＲＮＡもしくはｍＲＮＡもしくは遺伝子発現プロファイルである。特定クラスの参照標準、参照集団、ｍＲＮＡレベルもしくはプロファイル、またはｍｉＲＮＡレベルもしくはプロファイルの選択は、医師が設定する診断／モニタリング方法及び組成物の使い方に依存する。
【００２６】
「試料」または「生体試料」は、本明細書中使用される場合、免疫細胞及び／または癌細胞を含有する任意の生体液または組織を意味する。１つの実施形態において、適切な試料は、全血である。別の実施形態において、試料は、静脈血の場合がある。別の実施形態において、試料は、動脈血の場合がある。別の実施形態において、本明細書中記載される方法で使用するのに適した試料として、末梢血が挙げられ、より具体的には末梢血単核球が挙げられる。他の有用な生体試料として、制限なく、全血、血漿、または血清が挙げられる。なお他の実施形態において、試料は、肺疾患を有することが疑われる対象から得られる、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、子宮頸管粘液、鼻分泌物、痰、精液、羊水、気管支肺胞洗浄液、及び他の細胞滲出液である。そのような試料は、生理食塩水、緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤で、さらに希釈される場合がある。あるいは、そのような試料は、従来手段で濃縮される。当然のことながら、本明細書全体を通じて、いずれか１つの生体試料を使用するまたはそれについて記述するのは、例示にすぎない。例えば、本明細書中、試料が全血であると示される場合、当然のことながら、他の試料、例えば、血清、血漿なども、同様にして採用することができる。
【００２７】
１つの実施形態において、生体試料は、全血であり、本方法は、ＰａｘＧｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｋｆｌｏｗシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を採用する。このシステムには、血液収集（例えば、１回血液吸引）及びＲＮＡ安定化、続いて輸送及び貯蔵、続いて全ＲＮＡの精製及び分子ＲＮＡ検査が関与する。このシステムは、即時ＲＮＡ安定化及び一定した血液吸引体積を提供する。血液は、医師の診療室または診療所で吸引することができ、同一試験管で検体を輸送及び貯蔵することができる。短期ＲＮＡ安定性は、１８〜２５℃で３日間、または２〜８℃で５日間である。長期ＲＮＡ安定性は、−２０〜−７０℃で４年間である。この試料収集システムは、利用者が、全血での遺伝子発現及びｍｉＲＮＡ発現のデータを信頼して得ることを可能にする。１つの実施形態において、生体試料は、全血である。ＰＡＸｇｅｎｅシステムは生体試料源としてＰＢＭＣを使用するもよりも高い雑音を有するものの、ＰＡＸｇｅｎｅ試料収集の有益性は、この問題を上回る。雑音は、生物情報工学により差し引くことが可能である。
【００２８】
「免疫細胞」は、本明細書中使用される場合、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、肥満細胞、単球、及び樹状細胞を意味する。
【００２９】
本明細書中使用される場合、「症状」という用語は、疾患の不在（健康な状態）または存在を示し、そのような疾患として、肺疾患、肺癌、肺での良性小結節もしくは良性腫瘍増殖の存在、慢性肺疾患（関連癌を伴うまたは伴わない）、手術前の癌性肺腫瘍の存在、癌性肺腫瘍除去後の術後症状が挙げられる。指定される場合、そのような症状のどれであっても、喫煙または非喫煙と関連する可能性がある。
【００３０】
本明細書中使用される場合、「肺疾患」という用語は、肺癌または慢性閉塞性肺疾患、あるいは喫煙もしくは他の肺組織での有害事象による肺小結節または肺病変の存在を示す。
【００３１】
本明細書中使用される場合、「癌」という用語は、制御不能な細胞増殖を典型的な特徴とする、哺乳類の生理学的状態を示す、または説明する。より詳細には、本明細書中使用される場合、「癌」という用語は、任意の肺癌を示す。１つの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。より具体的な実施形態において、肺癌の型は、肺腺癌（ＡＣ）である。別の実施形態において、肺癌の型は、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。別の実施形態において、肺癌は、「初期」（ＩまたはＩＩ）ＮＳＣＬＣである。なお別の実施形態において、肺癌は、「後期」（ＩＩＩまたはＩＶ）ＮＳＣＬＣである。なお別の実施形態において、肺癌は、初期及び後期、ならびに複数の型のＮＳＣＬＣの混合物である。
【００３２】
「腫瘍」という用語は、本明細書中使用される場合、悪性か良性かに関わらず、全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を示す。
【００３３】
「診断」または「評価」により、肺癌の診断、肺癌の段階の診断、肺癌の型または分類の診断、肺癌の再発の診断または検出、肺癌の退縮の診断または検出、肺癌の予後、外科的または非外科的治療に対する肺癌の反応の評価、あるいは良性肺小結節の診断を示す。
【００３４】
「発現の変化」により、参照または対象との比較での、１つまたは複数の選択された遺伝子転写物（ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡの上向き調節；参照または対象との比較での、１つまたは複数の選択された遺伝子またはｍｉＲＮＡの下向き調節；あるいはある特定の上向き調節された遺伝子もしくはｍｉＲＮＡと下向き調節遺伝子もしくはｍｉＲＮＡとの組み合わせを意味する。
【００３５】
「治療用試薬」または「レジメン」により、固形腫瘍の有無にかかわらず癌の治療に採
用される任意の種類の治療を意味し、そのような治療として、制限なく、化学療法薬、生体反応修飾剤、放射線、食事、ビタミン療法、ホルモン療法、遺伝子治療、外科切除などが挙げられる。
【００３６】
本明細書中使用される場合、「選択されたまたは指定された」ｍＲＮＡまたは「選択されたまたは指定された」ｍｉＲＮＡにより、それらｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列について、それらの発現の組み合わせが、肺疾患または肺癌などの症状の存在下、特徴的に変化する（上向き調節または下向き調節いずれかの様式で）ことを意味する。１つの実施形態において、選択されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、表１〜３に記載されるものである。統計上有意な個数のそのような情報価値のあるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、本方法及び組成物で使用するのに適したｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルの組み合わせを形成する。統計上有意な個数は、そのような個数での組み合わせが持つ、試験された２つ以上の参照集団を識別することができる能力に基づいて決定される。
【００３７】
「統計上有意な個数のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ」という用語は、本発明の文脈において、観察されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせでの変化の度合いに応じて異なる。ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現での変化の度合いは、条件、例えば、肺疾患または癌の型、及び癌または固形腫瘍の大きさまたは拡散などで変わる。変化の度合いは、個体の免疫応答でも変化し、個々の個体による多様性に左右される。指定されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現での変化の度合いは、診断される疾患の型、例えば、ＣＯＰＤまたはＮＳＣＬＣ、及び癌または固形腫瘍の大きさまたは拡散などで変わる。変化の度合いは、個体の免疫応答でも変化し、個々の個体による多様性に左右される。例えば、本発明の１つの実施形態において、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡまたは２つより多いそのようなｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの組み合わせ、さらには３〜約１１９もしくは１４５もしくは２００以上の特徴的なｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの組み合わせの発現における１．２倍以上の増加または減少による変化は、統計上有意である。別の実施形態において、より大きな変化、例えば、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡまたは２つより多いそのようなｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの組み合わせ、さらには３〜約１１９以上の特徴的なｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの組み合わせの発現における１．５倍以上、１．７倍以上、または２．０倍以上の増加または減少による変化は、統計上有意である。これは、固形腫瘍のない癌に特に当てはまる。さらにまた別で、１つのｍＲＮＡと１つのｍｉＲＮＡの単独の組み合わせが、そのｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを通常は発現しない細胞で上向き調節されるまたは顕著に発現されるとプロファイリングされる場合、単独のｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのそのような上向き調節が、単独で、統計上有意となり得る。反対に、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの単独の組み合わせが、そのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの組み合わせを通常は発現する細胞で、下向き調節されるまたは顕著に発現されないとプロファイリングされる場合、単独の組み合わせのそのような下向き調節が、単独で、統計上有意となり得る。
【００３８】
すなわち、本明細書中記載される方法及び組成物は、単独のプロファイルにおいて、組み合わせたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち１〜約２００個の発現レベルまたはプロファイルを試験することを企図する（表１及び表２を参照）。別の実施形態において、本明細書中記載される方法及び組成物は、単独のプロファイルにおいて、組み合わせたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち１〜約１１９個（表１の順位による）の発現レベルまたはプロファイルを試験することを企図する。別の実施形態において、本明細書中記載される方法及び組成物は、単独のプロファイルにおいて、組み合わせたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち１〜約１４５個（表１の順位による）の発現レベルまたはプロファイルを試験することを企図する。別の実施形態において、本明細書中記載される方法及び組成物は、単独のプロファイルにおいて、組み合わせたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち１〜約１４７個（表２の順位による）の発現レベルまたはプロファイルを試験することを企図する。別の実施形態において、本明細書中記載される方法及び組成物は、表３に同定されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮ
Ａを有する単独のプロファイルにおいて、組み合わせたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち１〜約２００個の発現レベルまたはプロファイルを試験することを企図する。なお別の実施形態において、表１〜３の複数のｍＲＮＡのみまたは表１〜３の複数のｍｉＲＮＡのみの組み合わせが、肺癌または肺の患者を診断するのに使用されるプロファイルとして有用である。
【００３９】
１つの実施形態において、ｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡの同定された組み合わせのうち１つの発現レベルにおける顕著な変化は、症状、例えば、肺疾患の診断となり得る。別の実施形態において、同定された複数のｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのうち２つの発現レベルにおける顕著な変化は、症状、例えば、肺疾患を示すものとなり得る。別の実施形態において、同定された複数のｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのうち３つの組み合わせの発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断または別の症状を示すものとなり得る。ｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡの組み合わせは、発現プロファイルにおいて数が等しい必要はない。例えば、表１の上位１１９位までの構成要素の組においてそうであるとおり、ｍＲＮＡは、組み合わせ中でｍｉＲＮＡの数を上回る可能性がある。別の実施形態において、同定された複数のｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのうち４つ以上の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断または別の症状を示すものとなり得る。別の実施形態において、表１の同定された組み合わせのｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのうち少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも約１１９、または少なくとも約１４５（またはこれらの端点のいずれかの間にある任意の整数）の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断となる、または別の症状を示す。
【００４０】
別の実施形態において、同定されたｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのうち４つ以上の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断または別の症状を示すものとなり得る。別の実施形態において、表２の同定された組み合わせのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも約１２０、または少なくとも約１４７（またはこれらの端点のいずれかの間にある任意の整数）の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断となる、または別の症状を示す。
【００４１】
別の実施形態において、表３の同定された組み合わせのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０（またはこれらの端点のいずれかの間にある任意の整数）の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断となる、または別の症状を示す。
【００４２】
別の実施形態において、選択された組み合わせのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち約１５の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断または別の症状を示すものとなり得る。別の実施形態において、選択された組み合わせのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち約２０〜４０の発現レベルにおける顕著な変化は、肺疾患の診断または別の症状を示すものとなり得る。さらに他の個数のｍＲＮＡとｍｉＲＮＡを組み合わせた変化が、本明細書中教示されるとおり、肺疾患の診断に使用され得るまたは別の肺症状を示す。なおさらなる実施形態において、肺疾患または別の症状の診断となるｍＲＮＡのプロファイルは、以下の表１に２、５、７、１０、１２、１５、１７、２４、２６、２７、３１、３６、４０、４１、４６、５１、５７、５８、６３、６９、７８、８０、８５、９４、１０１、１０５、１０７、１１７、１１８、１２５、１２７、１２８、１３４、及び１３９位として順位付けされたｍＲＮＡのうち５つ以上を含む。ｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡのさらに他の群も、表１、表２、または表３の中から選ぶことができる。
【００４３】
「マイクロアレイ」という用語は、ハイブリダイズ可能なアレイ要素の順序だった配列を示す。１つの実施形態において、マイクロアレイは、基材上に、指定された組み合わせのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを含む。別の
実施形態において、マイクロアレイは、複数のプライマーまたは抗体を含み、それらは任意選択で基材に固定されている。
【００４４】
本明細書中記載される方法による診断または検出に必要な、ｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡの組み合わせの発現における変化は、参照対象または参照標準でのｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現と比べて、症状があるまたは疾患を罹患している、具体的には肺癌またはＮＳＣＬＣである対象で、その発現が活性化されて、より高いまたはより低いレベルになることを示す。ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、同一疾患または症状の異なる段階で、より高いまたはより低いレベルで発現される場合もある。ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの特定の組み合わせの発現は、喫煙したことがないまたは現在もしくは元喫煙者である正常な対象と、疾患、具体的にはＣＯＰＤ、良性肺小結節、または癌を罹患している対象との間で、あるいは同一疾患の異なる段階間で、異なる。特定ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現は、肺癌の患者で手術前後で異なる。ｍｉＲＮＡ発現におけるそのような差異には、例えば、正常細胞と疾患細胞の間での、または異なる疾患事象または疾患段階にある細胞間での、発現パターンの時間的または細胞的な、定量的、ならびに定性的差異の両方が含まれる。本発明の目的に関して、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせにおける顕著な変化は、参照標準と比較した場合に、対象と参照標準またはプロファイルとの間に、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせに統計上有意な（ｐ＜０．０５）差が存在する場合に、存在するとみなされる。
【００４５】
すなわち、１つの実施形態において、肺癌のある対象と良性小結節のある対象とを識別するためのアッセイの感度及び特異性を上昇させる方法が提供される。本方法は、対象から生体液または組織試料を得ること；哺乳類生体試料由来の表１、２、または３の１つまたは複数のｍＲＮＡ遺伝子転写物標的と特異的に複合体化、これとハイブリダイズ、またはこれを同定することができる核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のリガンドと試料を接触させることにより、試料中に１つまたは複数のｍＲＮＡ標的（例えば、以下の表１、２、または３のｍＲＮＡ標的）が存在するかどうか検出すること、を含む。この方法の別の工程は、同一哺乳類生体試料由来の表１、２、または３の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的と特異的に複合体化、これとハイブリダイズ、またはこれを同定することができる核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１種のリガンドと試料を接触させることにより、試料中に１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的（例えば、以下の表１、２、または３のｍｉＲＮＡ）が試料中に存在するかどうか検出することが関与する。本方法で使用される各リガンドは、異なるｍＲＮＡ標的またはｍｉＲＮＡ標的と結合する。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ標的とｍｉＲＮＡ標的の両方の検出の組み合わせは、診断の感度または特異性あるいはその両方を向上させることを可能にする。１つの実施形態において、本方法は、対象が肺癌を有するのか良性小結節を有するのか同定する精度の上昇を可能にする。別の実施形態において、本方法は、肺癌のある対象と喫煙者であるが小結節のない対象と識別する精度を上昇させる。喫煙者は、非癌疾患の他の症状特徴を有する可能性がある。以下の実施例を参照。
【００４６】
表１は、肺癌または肺疾患の患者を、参照標準から、特に、肺疾患のある対象を含む健康なまたは健康ではない対象から診断するのに使用するｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡプロファイルの組み合わせを形成するのに有用な１４５のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの一覧を特定する。１４５の混合された配列からなるこの集合は、以下の実施例において表５で参照される、肺癌と、小結節（ＮＯＤ）の患者及び小結節のない（ＳＣ）喫煙者との比較で参照される。表１は、癌と対象を比較するＳＶＭ分類指標訓練で、ＦＦＳ手順により選択された、順位付けされた特徴（ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ）の一覧である。ｍｉＲＮＡは、アスタリスクを付けて示す。ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ受入番号で特定される；ｍｉＲＮＡは、ＡＢＩ  ＯｐｅｎＡｒｒａｙ識別番号（ＯＡ＃）で特定される。これらの配列は、公
的に入手可能である。標的配列の配列番号は、順位数に該当し、それぞれ配列番号１〜１４５である。表１の欄１（順位及び配列番号）に示すとおり、順位及び配列番号は、同一数字である。当然ながら、ｍＲＮＡの他の標的配列も同様に使用される。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【００４７】
表２は、肺癌または肺疾患の患者を、参照標準から、特に、肺疾患のある対象を含む健康なまたは健康ではない対象から診断するのに使用するｍＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡプロファイルの組み合わせを形成するのに有用な約１４７のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの一覧を特定する。１４７の混合された配列からなるこの集合は、以下の実施例において表５で参照される、肺癌と、小結節（ＮＯＤ）のある患者との比較で参照される。表２は、癌と対象を比較するＳＶＭ分類指標訓練で、ＦＦＳ手順により選択された、順位付けされた特徴（ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ）の一覧である。ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ受入番号で特定される；ｍｉＲＮＡは、ＡＢＩ  ＯｐｅｎＡｒｒａｙ識別番号（ＯＡ＃）で特定される。以下の実施例で使用される標的配列を、以下の表に提示する。しかしながら、受入番号で同定される配列の他の部分も同様にして使用可能である。これらの配列は、公的に入手可能である。表２の標的配列１〜１４７の配列番号は、それぞれ配列番号１４６〜２９２であり、順位／配列番号の欄で特定される。これらの配列は、公的に入手可能である。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【００４８】
表３は、表１及び表２のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ集合の間で重複する１８の遺伝子及び５つのｍｉＲＮＡを同定する。
【表３】
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【００４９】
表１〜３で特定される遺伝子及びｍｉＲＮＡは、公的に入手可能である。当業者なら、
それらとハイブリダイズするこれらの組成物またはプローブ及びプライマー配列を、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの配列を使用することにより、容易に再現することができるだろう。そのような配列は全て、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＡＢＩ  ＯｐｅｎＡｒｒａｙ、ＧｅｎＢａｎｋ、またはＮＣＢＩデータベースなどの従来よりある提供源から公的に入手可能である。ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇとして特定されるウェブサイトも、そのような配列の別の公的提供源である。
【００５０】
本明細書中記載される組成物及び方法の文脈において、どのような特定の組み合わせ集合であってもその中に列挙されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの組み合わせについての「少なくとも２」、「少なくとも５」などの記述は、同定されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのありとあらゆる組み合わせを意味する。疾患プロファイルに特異的なｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、表１及び表２にあるとおりの順位付け順である必要はなく、本明細書中、及び／または表３に特定されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの任意の組み合わせが可能である。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形または複数形で使用される場合、概して、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを示し、これらは、未改変ＲＮＡまたはＤＮＡの場合も、改変ＲＮＡまたはＤＮＡの場合もある。すなわち、例えば、本明細書中定義されるとおりのポリヌクレオチドとして、制限なく、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子、この分子中のＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖の場合もあるし、より典型的には、二本鎖の場合もあるし、一本鎖及び二本鎖領域を含む場合もある、を挙げることができる。また、「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中使用される場合、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も示す。そのような領域中の鎖は、同一分子に由来する場合も異なる分子に由来する場合もある。そのような領域は、１つまたは複数の分子の全てを含む場合があるが、より典型的には、分子のあるもののある領域のみを含む。三重螺旋領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には、ｃＤＮＡを含む。この用語は、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡを含む。すなわち、安定性または他の理由から修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中意図するとおりの「ポリヌクレオチド」である。その上、イノシンなどの普通ではない塩基、またはトリチウム標識した塩基などの修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書中定義されるとおりの「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾のポリヌクレオチドが化学的、酵素的、及び／または代謝的に修飾された全ての形、ならびに単純細胞及び複雑細胞をはじめとするウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡ特徴の化学的形を包含する。
【００５２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドを示し、オリゴヌクレオチドとして、制限なく、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡが挙げられる。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどは、化学的方法により、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、合成されることが多い。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、様々な他の方法によっても作製することができ、そのような方法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ介在技法、ならびに細胞及び生命体でのＤＮＡ発現が挙げられる。
【００５３】
本明細書中使用される場合、「抗体」という用語は、二本の軽鎖及び二本の重鎖を有するインタクト免疫グロブリン、またはそれらの任意の断片を示す。すなわち、単独の孤立した抗体または断片は、ポリクローナル抗体、高親和性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体の場合があ
る。「抗体断片」という用語は、インタクト抗体構造未満のものを示し、抗体断片として、制限なく、孤立した単独抗体鎖、一本鎖Ｆｖ構築物、Ｆａｂ構築物、軽鎖可変もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列などを挙げることができる。
【００５４】
「差次的に発現される遺伝子転写物またはｍＲＮＡ」または「差次的に発現されるｍｉＲＮＡ」、「差次的発現」という用語及びそれらの同義語は、互換使用されるが、これらは、疾患、具体的には肺癌などの癌に罹患している対象では発現が活性化して、対照となる対象における発現よりも高いまたはより低いレベルになる遺伝子またはｍｉＲＮＡ配列を示す。これらの用語は、同一疾患の異なる段階で発現が活性化されてより高いまたはより低いレベルになる遺伝子またはｍｉＲＮＡも含む。同じく当然のことながら、差次的に発現される遺伝子またはｍｉＲＮＡは、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化または阻害いずれかを受ける場合もあるし、代替スプライシングの対象となって異なるポリペプチド産物をもたらす場合もある。そのような差異は、例えば、ｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、またはポリペプチドの他の分配での変化により明らかになる場合がある。差次的遺伝子発現は、２種以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物間の発現の比較、あるいは２種以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物間の発現の比の比較、あるいはさらに同一遺伝子の２種の異なるプロセシング産物の比較を含む場合があり、これらは、正常な対象、健康ではない対照、及び疾患、具体的には癌に罹患している対象の間で、または同一疾患の様々な段階間で異なる。差次的発現は、例えば、正常細胞と患部細胞間、または異なる疾患事象もしくは疾患段階にある細胞間での遺伝子もしくはその発現産物の時間的または細胞的発現パターンでの、定量的ならびに定性的差異の両方を含む。本発明の目的に関して、「差次的遺伝子発現」は、対象試料と対照試料の間で遺伝子発現に統計上有意差（ｐ＜０．０５）がある場合、存在するとみなされる。
【００５５】
ＲＮＡ転写物に関して「過剰発現」という用語は、参照ｍＲＮＡのレベルに対して正規化することにより求められる転写物のレベルを示すのに使用され、過剰発現のレベルは、検体またはｍＲＮＡの特定参照集団中の全ての測定された転写物の場合がある。
【００５６】
「増幅」という用語は、遺伝子または遺伝子断片またはｍｉＲＮＡの複数のコピーが、特定細胞または細胞株中に形成されるプロセスを示す。複製された領域（一続きの増幅ＤＮＡ）は、「アンプリコン」と称することが多い。通常、産生されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現レベルによって、発現する特定遺伝子から作製されるコピーの数の割合も増加する。
【００５７】
「予後」という用語は、本明細書中、癌が寄与する死亡または進行の可能性の予測を示すために使用され、この用語には、腫瘍性疾患、例えば肺癌などの再発、転移性伝播、及び薬物耐性が含まれる。「予測」という用語は、本明細書中、薬物または薬物集合に対して有利または不利のいずれかで反応すること、同じくそれらの反応の度合い、あるいは患者が、原発性腫瘍の外科的除去及び／または化学療法後、ある特定の長さの時間、癌の再発なしに生存することの可能性を示すために使用される。本発明の予測方法は、どのような患者についても最も適切な治療様式を選択することで治療の決定を下すのに臨床上使用することができる。本明細書中記載される予測方法は、患者が、外科治療介入、所定の薬物または合剤を用いた化学療法、及び／または放射線療法などの治療レジメンに対して有利に反応しそうであるかどうか、あるいは手術及び／または化学療法もしくは他の治療様式の終了後、患者の長期生存が望めるかどうかを予測するのに役立つ道具である。
【００５８】
「長期」生存という用語は、本明細書中、手術または他の治療後少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも３年間、特に好ましくは少なくとも７年間の生存を示すために使用される。
【００５９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定することができ、概して、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的見積もりである。一般に、プローブが長いほど、適切にアニーリングするためにより高い温度が必要となり、一方プローブが短いほど低温が必要となる。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖が、それらの溶融温度より低い環境中に存在する場合の変性ＤＮＡの再アニーリング能力に依存する。ハイブリダイズする配列とプローブとの間の所望の相同性の度合いが高いほど、使用される相対温度は高くなる。結果として、当然ながら、より高い相対温度が、よりストリンジェントな反応条件を作り、温度が低いほどそうではなくなる傾向にある。様々な文献が、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについて追加の詳細及び説明を提供している。
【００６０】
本明細書中記載される組成物及び方法の文脈において、どのような遺伝子集団でもその中に列挙されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ（例えば、表１、２、または３）のうち「３つ以上」、「少なくとも５つ」などの記述は、列挙されるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの任意の１つまたはありとあらゆる組み合わせを意味する。例えば、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルの適切な組み合わせとして、少なくとも３から１４５までの間の任意の個数のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを表１、２及び／または３から選んで含有するプロファイルが挙げられる。１つの実施形態において、表から選択された、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡにより形成される発現プロファイルは、好ましくは、順位付けされた順序で使用され、例えば、表の最上位にある遺伝子は、試験で、より顕著に識別される結果を実証したので、したがって、それより下位の遺伝子よりもプロファイルにおいてより意義深い可能性がある。しかしながら、他の実施形態において、有用な遺伝子プロファイルを形成する遺伝子は、必ずしも順位付けの順序にある必要はなく、それぞれの表から選ばれた任意の遺伝子の場合がある。
【００６１】
当然のことながら、本明細書中の様々な実施形態は、様々な状況下で「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という言葉を使用して表現されているものの、関連実施形態は、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）」という言葉を使用しても記載される。なお、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つまたは複数であることを示し、例えば、「ａｎ  ｍｉＲＮＡ」は、当然ながら、１つまたは複数のｍｉＲＮＡを表す。そのため、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の」、及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書中、同義で使用される。
【００６２】
本明細書中特に記載がない限り、本明細書中使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるもの、及び本出願で使用される用語の多くについて全般的な案内を当業者に提供する文献を参照することにより一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００６３】
本明細書中で、ならびに表１、２、及び／または３の遺伝子コレクションの使用を通じて特定される、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの肺癌及び肺疾患シグネチャー、または遺伝子及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、さらに最適化して遺伝子及びｍｉＲＮＡの個数を減少または増加させることができ、それにより診断の精度を上昇させることができる。
【００６４】
遺伝子（ｍＲＮＡ）発現プロファイリング方法
本明細書中記載される組成物及び方法に有用なプロファイルを作製するのに、または本明細書中記載される組成物を使用して診断工程を行うのに使用された遺伝子（ｍＲＮＡ）発現プロファイリングの方法は、既知であり、米国特許第７，０８１，３４０号に、及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５４２３３号に充分にまとめられている。これらの特許文献は、本明細書中参照として援用される。遺伝子発現プロファイリングのそのよう
な方法として、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、及びプロテオミクスに基づく方法が挙げられる。試料中のｍＲＮＡ発現を定量するための当該分野で既知の最も一般的に使用される方法として、ノーザンブロット法及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法；ＲＮＡアーゼ保護アッセイ；及びＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲに基づく方法が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖をはじめとする特定二重鎖を認識することが可能な抗体が使用される場合がある。配列決定に基づく遺伝子発現分析の代表的な方法として、遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）、及び大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。
【００６５】
簡単に述べると、最も高感度かつ最も柔軟な定量方法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、この方法を用いて、異なる試料集団中、正常及び腫瘍組織中、薬物治療ありまたはなしでの、ｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特性決定し、密接に関連したｍＲＮＡ同士を識別し、及びＲＮＡ構造を分析することができる。第一工程は、標的試料からのｍＲＮＡの単離である（例えば、この場合、典型的には全ＲＮＡをヒトＰＢＭＣから単離する）。ｍＲＮＡは、例えば、凍結または保管されたパラフィン包埋した固定（例えばホルマリン固定した）組織試料から抽出することができる。ＲＮＡ単離は、企業から購入した精製キット、緩衝剤セット、及びプロテアーゼを用いて、取扱説明書に従って行うことができる。市販品の例として、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラム、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ完全ＤＮＡ及びＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、パラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）、及びＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）が挙げられる。塩化セシウム密度勾配遠心分離などの従来技法も使用できる。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第一工程は、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡへの逆転写、続いてＰＣＲ反応でのその指数関数的増幅である。逆転写工程は、典型的には、状況及び発現プロファイリングの目的に応じて、特定のプライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを用いて刺激する。例えば、ＧＥＮＥＡＭＰ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）製品に付属する取扱説明書を参照。次いで、これに由来するｃＤＮＡを、その後のＲＴ−ＰＣＲ反応でテンプレートとして使用することができる。
【００６７】
ＰＣＲ工程は、一般に、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性は欠けているＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲなどの熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。選択されたポリメラーゼは、その標的アンプリコンと結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解し、２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、アンプリコンを生成させる。第三のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、好ましくは標識されており、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販されている装置を用いて行うことができる。
【００６８】
リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競争相手が正規化のために使用される定量的競合ＰＣＲ、及び試料中に含有される正規化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用ハウスキーピング遺伝子を利用する定性的競合ＰＣＲの両方に匹敵する。別のＰＣＲ方法は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹに基づく遺伝子発現プロファイリング方法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）である。当該分野で既知であり遺伝子発現プロファイリングに使用可能な、ＰＣＲに基づく技法のさらに他の実施形態として、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法、増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）、及び遺伝子発現の迅速アッセ
イに市販されているＬｕｍｉｎｅｘ  １００  ＬａｂＭＡＰシステム及び多色符号化微粒子（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）を使用するＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）技法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）；ならびに広範囲適用発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析が挙げられる。
【００６９】
ＲＮＡ発現プロファイルは、対象の血液から、ＣＰＴ管を用いた遠心、フィコール勾配、または等価な密度分離により、赤血球及び顆粒球を除去し、続いてＴＲＩＺＯＬトリ試薬、ＲＮＡＬＡＴＥＲ試薬、または同様な試薬を用いてＲＮＡを抽出して、完全性の高いＲＮＡを得ることにより、得られる。個々のメッセンジャーＲＮＡ種の量は、マイクロアレイ及び／または定量的ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて求めた。
【００７０】
プロファイルのためＲＮＡ発現レベルを得るのに使用される他の手順の中に、機械学習アルゴリズム、例えば、再帰的特徴消去を伴うＳＶＭ（ＳＶＭ−ＲＦＥ）、または他の分類アルゴリズム、例えばペナルティ付き判別分析（ＰＤＡ）などを解析に使用して（国際特許出願公開第ＷＯ２００４／１０５５７３号、２００４年１２月９日公開、を参照）数学的関数を得るＲＴ−ＰＣＲがあり、この関数の係数は、入力されるＲＮＡ遺伝子発現値に従って作用して「スコア」を出力し、「スコア」の値は、個々のクラス及び予測の確実性を決定する。その後識別される予定のメンバーのクラスに属することが既知である対象を多数解析することによりこの関数を決定したら、それを用いて、対象をその疾患状態に関して分類する。
【００７１】
差次的遺伝子発現も、マイクロアレイ技法を用いて同定または確認することが可能であり、これも国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５４２３３号に詳細に記載されている。すなわち、肺癌／肺疾患関連遺伝子の発現プロファイルは、マイクロアレイ技法を用いて、新鮮なまたはパラフィン包埋組織いずれかで測定することができる。この方法では、関心対象のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップまたはガラス基板に撒くまたは整列させる。次いで、整列させた配列を、関心対象の細胞または組織由来の特定ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。マイクロチップに固定されたマイクロアレイ化遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。チップに適用される標識化ｃＤＮＡプローブは、アレイのＤＮＡの各点と特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄により非特異的に結合したプローブを除去した後、チップを、共焦点レーザー顕微鏡法によりまたはＣＣＤカメラなど別の検出法によりスキャニングする。各整列させたエレメントのハイブリダイゼーションの定量は、対応するｍＲＮＡ存在量の査定を可能にする。マイクロアレイ分析は、市販されている装置で、製造者のプロトコルに従って行うことができる。
【００７２】
米国特許第７，０８１，３４０号（本明細書注参照として援用される）にまとめられている他の有用な方法として、遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）、及び大規模並列シグネチャー配列決定法（ＭＰＳＳ）が挙げられる。
【００７３】
免疫組織化学的方法及びプロテオミクス的方法も、本明細書中の方法及び組成物への使用について記載される遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルを検出するのに適しており、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する有用な補助であり、単独でまたは他の方法と併用して、本明細書中記載される遺伝子及びｍｉＲＮＡプロファイルの組み合わせの遺伝子発現産物を検出するのに使用することができる。抗体または抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、特に好ましくはモノクローナル抗体、または各マーカーに対して特異的な他のタンパク質結合リガンドを使用して、発現を検出することができる。抗体は、抗体自身を、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素で、直接標識化することにより、検出することができる。あるいは、未標識一次抗体を、一次抗体に特異的な
抗血清、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を含む標識化二次抗体と併用する。免疫組織化学的分析用プロトコル及びキットは、当該分野で周知であり、市販されている。
【００７４】
本発明のアッセイ及び方法を行う上で、これらの同一技法を用いて、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡプロファイルの組み合わせについてｍＲＮＡ発現レベル要素を得ることができ、患者のプロファイルを、適切な参照プロファイルと比較することができ、この情報に基づいて、推奨される診断または治療を選択することができる。
【００７５】
ｍｉＲＮＡの検出／定量方法
ｍｉＲＮＡ発現を得る、検出する、及び定量するのに使用可能な方法は、既知であり、本発明の診断目標を達成するために使用することができる。例えば、以下の実施例に記載される技法、ならびに、例えば、特に国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０７３９２３号；米国特許出願公開第２００６／０１３４６３９号、米国特許第６，０４０，１３８号、及び同第８，４７６，４２０号に記載される技法を参照。
【００７６】
例えば、生体試料は、専売のＰａｘＧｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステム（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、ａ  Ｑｉａｇｅｎ、ＢＤ  ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて収集することができる。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステムは、２つの統合された構成要素を含む：ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ管及びＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキットである。血液試料は、標準的な静脈切開技法を介して、直接ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ管に吸引採取される。これらの管は、細胞内ＲＮＡを直ちに安定させる専売試薬を含有しており、ｅｘ−ｖｉｖｏ分解またはＲＮＡ転写物の上向き調節を最小限に抑える。バッチ試料凍結を排除すること及び収集後の試料処理の緊急性が最小限に抑えられることが可能になることで、大幅に検査効率が向上し費用が削減される。
【００７７】
その後、様々なアッセイを用いて、ｍｉＲＮＡを、検出及び／または測定する。最も高感度かつ最も柔軟な定量方法は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、この方法を用いて、異なる試料集団中、正常及び腫瘍組織中、薬物治療ありまたはなしでの、ｍｉＲＮＡレベルを比較して、ｍｉＲＮＡ発現のパターンを特性決定し、密接に関連したｍｉＲＮＡ同士を識別し、及びＲＮＡ構造を分析することができる。この方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）など、従来のＲＴ−ＰＣＲアッセイキットを、取扱説明書に従って使用することにより、採用することができる。
【００７８】
第一工程は、標的試料からのＲＮＡの単離である（例えば、この場合、典型的には全ＲＮＡをヒト全血から単離する）。ｍＲＮＡ抽出の一般的方法は、当該分野で、例えば、分子生物学の標準的教科書において、周知である。ＲＮＡ単離は、企業から購入した精製キット、緩衝剤セット、及びプロテアーゼを用いて、取扱説明書に従って行うことができる。市販品の例として、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ、Ｓｉｅｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラム、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ完全ＤＮＡ及びＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などが挙げられる。塩化セシウム密度勾配遠心分離などの従来技法も使用できる。
【００７９】
逆転写工程では、ｃＤＮＡは、検出しようとするｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いて、ｍＲＮＡ試料から逆転写される。逆転写の方法は、当該分野で、例えば、分子生物学の標準的教科書において、周知である。簡単に述べると、ＲＮＡを、最初に、プライマーとともに７０℃でインキュベートしてＲＮＡ二次構造を変性させ、次いで、氷上で急速に冷却して、プライマーでＲＮＡをアニールさせる。ｄＮＴＰ、ＲＮＡアーゼ阻害剤、逆転写酵素、及び逆転写緩衝剤を含む他の構成要素を反応物に加える。逆転写反応は、４２
℃で１時間行う。次いで、反応物を７０℃に加熱して、酵素を不活性化させる。
【００８０】
ＲＴ−ＰＣＲ工程では、ｃＤＮＡ試料からＰＣＲ産物を増幅させる。ＰＣＲ産物の蓄積は、二重標識化蛍光発生プローブ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）により測定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競争相手が正規化のために使用される定量的競合ＰＣＲ、及び試料中に含有される正規化ｍｉＲＮＡ、またはＲＴ−ＰＣＲ用ハウスキーピングｍｉＲＮＡを使用する定性的競合ＰＣＲの両方に適合する。さらなる詳細については、例えばＨｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６  ９９４（１９９６）を参照。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販されている装置を使用して行うことができる。誤差及び試料間の多様性の影響を最小限に抑えるため、ＲＴ−ＰＣＲは、通常、内部標準を用いて行われる。理想的な内部標準とは、異なる組織間で一定レベルで発現し、実験処理により影響されないものである。ｍｉＲＮＡ発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピングｍｉＲＮＡであるグリセルアルデヒド−３リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００８１】
ＲＮＡ源として固定されたパラフィン包埋組織を使用する、ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングの代表的プロトコルの工程には、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー延長、及び増幅が含まれるが、これらの工程は、当業者に既知である。簡単に述べると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋腫瘍組織試料から、約１０μｍ厚さの切片を切り出すことから始まる。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、ＲＮＡ修復及び／または増幅工程が、必要であれば、これを含めることができ、そしてＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ特異的プロモーターを用いて逆転写し、続いてＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００８２】
以下の実施例で同定される具体的な技法は、当該分野の状況を示す。しかしながら、ｍｉＲＮＡ単離、検出、及び定量の他の従来方法を、これらの方法で採用することもできる。ｍｉＲＮＡを検出する及び／または測定するさらに他の方法を、抗体またはその断片を使用して、採用することができる。ｍｉＲＮＡと結合する配列を有する組換え分子も、これらの方法で使用することができる。当然ながら、本明細書中定義されるとおりの指定されたｍｉＲＮＡと結合する任意の抗体、抗体断片、またはそれらの混合物は、その抗体または抗体混合物がどのようにして生成したかに関わらず、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡプロファイルの組み合わせのためｍｉＲＮＡ発現レベルを得る方法に採用することができる。
【００８３】
同様に、ｍｉＲＮＡ配列を同定するためにゲノムまたは他のハイブリダイゼーションプローブを使用する方法は、本明細書中有用である。別の実施形態において、適切なアッセイ検出アッセイは、免疫組織化学的アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、カウンター免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、放射性免疫沈降アッセイ、ドットブロットアッセイ、競合阻害アッセイ、またはサンドイッチアッセイである。
【００８４】
上記または本明細書中のその他どこかで記載される方法は、どれでも、状態または２つの状態の間の差異を診断または検出するのに有用な数値データまたはグラフデータを作製するコンピュータープロセッサまたはコンピューターでプログラミングされた装置により行うことができる。
【００８５】
組成物
遺伝子（ｍＲＮＡ）及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルの定義された組み合わせを利用して肺癌及び肺疾患を診断する方法は、肺癌、例えば、ＮＳＣＬＣなどを診断する、あるいは肺癌の具体的な段階（初期、ステージＩ、ステージＩＩ、または後期）を診断する、肺癌の具体的な型（例えば、ＡＣ対ＬＳＣＣ）を診断する、肺疾患の種類、例えば、ＣＯＰ
Ｄまたは良性肺小結節などを診断する、または癌もしくは疾患のさらなる治療を決めるまたは再発の可能性を評価するための治療的または外科的介入の効果をモニタリングするための簡潔な診断道具の開発を可能にする。
【００８６】
すなわち、本明細書中記載されるとおりの哺乳類対象でのそのような診断または評価のための組成物は、キットまたは試薬が可能である。例えば、組成物の１つの実施形態は、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを検出及び定量するのに使用されるリガンドが固定されている基材を含む。試薬は、１つの実施形態において、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの核酸配列を増幅及び検出する増幅核酸プライマー（ＲＮＡプライマーなど）またはプライマー対である。別の実施形態において、試薬は、標的配列とハイブリダイズずるポリヌクレオチドプローブである。別の実施形態において、試薬は、抗体または抗体断片である。試薬は、上記のプライマー、プローブ、または抗体を複数含むことが可能であり、それぞれが、表１、２、または３の少なくとも１つのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに特異的である。任意選択で、試薬は、従来の検出可能な標識と併用することができる。本明細書中使用される場合、「標識」または「レポーター分子」は、核酸（単独ヌクレオチドを含む）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質リガンド、例えば、アミノ酸もしくは抗体などを標識するのに有用な化学または生化学部分である。「標識」及び「レポーター分子」として、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子、及び他の当該分野で既知の部分が挙げられる。「標識」または「レポーター分子」は、測定可能な信号を生成することができ、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）またはリガンドと共有結合または非共有結合で結合できる。
【００８７】
別の実施形態において、組成物は、関連する複数のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブもしくはリガンド、それらに対する任意選択の検出可能な標識、固定用基材、酵素標識に対する任意選択の基質、ならびに他の検査用具を含有するキットである。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、検出可能な標識を伴う。ある特定の実施形態において、試薬は、基材に固定されている。基材の例として、マイクロアレイ、チップ、マイクロ流体カード、またはチャンバが挙げられる。
【００８８】
そのような組成物は、１つの実施形態において、複数のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含有し、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、哺乳類生体試料、例えば、血液、血清、または血漿由来の異なる遺伝子または異なるｍｉＲＮＡとハイブリダイズする。ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、１つの実施形態において、表１、２、及び／または３に列挙されるものから選択される。表１は、肺癌の存在を示すプロファイルまたはシグネチャーの代表として本発明者らが同定した上位約１４５の遺伝子及びｍｉＲＮＡの１つの実施形態を含む。遺伝子及びｍｉＲＮＡのこのコレクションは、参照対照の生体試料中の同一ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現と比較して、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現が変更される（すなわち、増加または減少する）遺伝子及びｍｉＲＮＡのものである。表２は、肺癌の存在を示す別のプロファイルまたはシグネチャーの代表として本発明者らが同定した上位約１４７の遺伝子及びｍｉＲＮＡの１つの実施形態を含む。遺伝子及びｍｉＲＮＡのこのコレクションは、参照対照の生体試料中の同一ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現と比較して、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現が変更される（すなわち、増加または減少する）遺伝子及びｍｉＲＮＡのものである。表３は、表１と表２の間で重複するｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含有する。
【００８９】
１つの実施形態において、標的となるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、表１で１位から１１９位に順位付けされたものから選択される。別の実施形態において、表１の順位に入ったこれらの標的の他に、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対するリガンドを、本発明の組成物に含
める。１つの実施形態において、組成物は、表１の単独のｍＲＮＡを標的とするリガンド、及び表１の単独のｍｉＲＮＡを標的とするリガンドを含有する。別の実施形態において、組成物は、同一ｍＲＮＡまたは同一ｍｉＲＮＡを標的とする複数のリガンドを含有する。
【００９０】
１つの実施形態において、標的となるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、表１で特定される標的全部から選択される。別の実施形態において、標的となるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、表２で特定される標的の一部または全部から選択される。別の実施形態において、表１及び表２の順位に入ったこれらの標的の他に、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対するリガンドを、本発明の組成物に含める。１つの実施形態において、組成物は、表１または２の単独のｍＲＮＡを標的とするリガンド、及び表１または２の単独のｍｉＲＮＡを標的とするリガンドを含有する。別の実施形態において、組成物は、同一ｍＲＮＡまたは同一ｍｉＲＮＡを標的とする複数のリガンド、すなわち、これらの表のものの少なくとも５、１０、２０、５０、７５、１００、１３０、１４０、またはそれ以上の組み合わせを標的とする複数のリガンドを含有する。
【００９１】
別の実施形態において、哺乳類対象で肺癌を診断する組成物は、３セット以上のＰＣＲプライマープローブセットを含む。各プライマープローブセットは、対象の生体試料で見つかる２つ以上のｍＲＮＡとは異なるポリヌクレオチド配列を増幅し、プライマーまたはプローブまたはセットは、対象の生体試料で見つかる１つまたは複数のｍｉＲＮＡとは異なるポリヌクレオチド配列を増幅する。別の実施形態において、哺乳類対象で肺癌を診断する組成物は、３セット以上のＰＣＲプライマープローブセットを含む。各プライマープローブセットは、対象の生体試料で見つかる２つ以上のｍＲＮＡの異なるポリヌクレオチド配列を増幅し、プライマーまたはプローブまたはセットは、対象の生体試料で見つかる１つまたは複数のｍｉＲＮＡの異なるポリヌクレオチド配列を増幅する。
【００９２】
さらに他の実施形態は、１〜１１９位の順位にあるｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの全て、すなわち表１の全てのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的、表２の１１９のまたは全てのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的、及び／または表３の全てのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的を増幅するのに十分な、プライマー、プローブ、またはセットを含む。すなわち、別の実施形態において、リガンドは、組成物で使用するために表１、２、または３の少なくとも１つのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対して作製される。さらに別の実施形態において、ＰＣＲプライマー及びプローブは、組成物で使用するために表１、２、及び／または３の少なくとも２５のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対して作製される。さらに別の実施形態において、ＰＣＲプライマー及びプローブは、組成物で使用するために表１、２、及び／または３の少なくとも５０のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対して作製される。さらに別の実施形態において、ＰＣＲプライマー及びプローブは、組成物で使用するために表１、２、及び／または３の少なくとも７５のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対して作製される。さらに別の実施形態において、ＰＣＲプライマー及びプローブは、組成物で使用するために表１または表２の少なくとも１００のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対して作製される。さらに別の実施形態において、ＰＣＲプライマー及びプローブは、組成物で使用するために表１または２の少なくとも１２５のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに対して作製される。当業者なら、上記に指定される数字の間に存在する全ての整数が、たとえ本明細書中具体的に記述されなかったとしても、この開示に含まれることがわかるだろう。表１、２、または３から選択された遺伝子及びｍｉＲＮＡは、順位付けされた順序にある必要はなく；そうではなくて、参照対照対病気と診断された患者で発現の差を明らかに示す任意の組み合わせが、そのような組成物で有用である。
【００９３】
さらに他の実施形態は、表１の順位付けされたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的のより小さなサブセットを増幅するのに十分なＰＣＲプライマー、プローブ、またはセットを含む。
さらに他の実施形態は、表１の順位付けされたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的のより小さなサブセットを増幅するのに十分なＰＣＲプライマー、プローブ、またはセットを、肺疾患または癌で特徴的に変化することが見つかった他のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的を増幅するのに十分なＰＣＲプライマー、プローブ、またはセットとともに含む。
【００９４】
これらの選択された遺伝子及びｍｉＲＮＡは、遺伝子／ｍｉＲＮＡ発現の組み合わせプロファイルまたはシグネチャーを形成し、このプロファイルまたはシグネチャーは、肺癌または別の肺疾患を有する対象と選択された参照対照との間で識別可能である。１つの実施形態において、患者の生体試料、例えば、血液中のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせにおける参照のものからの顕著な変化は、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断と相関する。１つの実施形態において、患者の生体試料、例えば、血液中のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせにおける参照のものからの顕著な変化は、そのような癌の段階の診断と相関する。１つの実施形態において、患者の生体試料、例えば、血液中のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせにおける参照のものからの顕著な変化は、肺癌の型の診断と相関する。１つの実施形態において、患者の生体試料、例えば、血液中のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせにおける参照のものからの顕著な変化は、非癌性症状、例えば、ＣＯＰＤ、良性肺病変、または小結節などの診断と相関する。１つの実施形態において、患者の生体試料、例えば、血液中のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現の組み合わせにおける参照のものからの顕著な変化は、別の疾患の診断と相関する。さらにこれらの組成物は、原因不明の肺小結節を有する対象で、追加診断または最初の診断を下すのに有用である。
【００９５】
上記の組成物の１つの実施形態において、参照対照は、非健康対照（ＮＨＣ）である。他の実施形態において、参照対照は、上記に記載されるとおりの対照のどのクラスのものでもよい。選択された組み合わせの遺伝子及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルのメンバーとハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含有する組成物は、診断用だけでなく、切除／化学療法の陽性効果が、最初の治療後長期に渡り維持されるかどうかを判断する外科的または非外科的治療処置の効果のモニタリング用にも望ましい。これらのプロファイルは、結果が手術前／化学療法前のプロファイルに戻ることを示すかどうかで、肺癌、例えば、ＮＳＣＬＣなどの再発または再発の可能性を判断することも可能にする。これらの組成物が、肺癌の非外科的治療の有効性のモニタリング用に採用される可能性も非常に高い。
【００９６】
表１、２、及び／または３から選択された遺伝子及びｍｉＲＮＡに、任意選択で検出可能な標識を付随させたものに基づく組成物は、上記のＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＱＰＣＲ技法で使用するのに適合させたマイクロ流体カード、チップもしくはチャンバ、またはキットの形式で存在させることができる。１つの態様において、そのような形式は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量的ＰＣＲ低密度アレイを使用する診断アッセイである。予備結果は、必要とされる遺伝子及びｍｉＲＮＡの数が、これらのプラットホームと適合性があることを示唆する。選択された対象由来の生体試料を組成物中のプライマー及びプローブと接触させた場合、対象由来の発現プロファイルにおける情報価値のある標的遺伝子及びｍｉＲＮＡのＰＣＲ増幅は、遺伝子及びｍｉＲＮＡの発現における、参照遺伝子発現プロファイルからの変化を検出することを可能にする。患者の試料中の選択されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現組み合わせにおける、参照プロファイルのものからの顕著な変化は、肺癌の診断と相関するものとなり得る。同様に、手術後開在性対象由来の生体試料を組成物中のプライマー及びプローブと接触させた場合、プロファイル中の、表１、２、及び／または３のものから選択された情報価値のある標的遺伝子及びｍｉＲＮＡのＰＣＲ増幅は、手術前の患者（または同様な患者）のものと比較することができる。患者の試料中の選択されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現における、参照発現プロファイルのものからの顕著な変化は、手術の陽性効果、及び／または陽性効果の維持と相関する。
【００９７】
プライマー及びプローブ配列の設計は、いったん、特定のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的が選択されれば、当業者の技能内にある。プライマー及びプローブ設計のために選択される特定の方法ならびに特定のプライマー及びプローブ配列は、これらの組成物の制限特徴ではない。当業者が利用可能なプライマー及びプローブ設計技法の良い説明が、公的に入手可能な道具、例えば、ＤＮＡ  ＢＬＡＳＴソフトウェア、Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラム（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｐｒｉｍｅｒ
Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎ  Ｊ．  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ  （２０００）ＷＷＷ上の一般利用者用及び生物学プログラマー用のＰｒｉｍｅｒ３に関して、米国特許第７，０８１，３４０号に、及び他の出版物にまとめられている。一般に、本明細書中記載される組成物に使用される最適なＰＣＲプライマー及びプローブは、概して、長さが１２〜３０、例えば、１７〜２２塩基であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含有する。５０〜８０℃、例えば約５０〜７０℃の融点が、典型的には好ましい。
【００９８】
マイクロ流体カード、マイクロアレイ、チップもしくはチャンバの形式で存在させることが可能な組成物は、本明細書中記載されるポリヌクレオチドハイブリダイゼーション技法を採用する。選択された開在性対象由来の生体試料を組成物中のハイブリダイゼーションプローブと接触させた場合、患者由来の発現プロファイルにおける情報価値のある標的遺伝子及びｍｉＲＮＡのＰＣＲ増幅は、発現プロファイル中の遺伝子及びｍｉＲＮＡの発現における、参照組み合わせ発現プロファイル、例えば、健康な対照、または肺疾患があるが癌はない対照などのものからの変化の検出及び定量を可能にする。
【００９９】
これらの組成物は、肺癌、例えば、ステージＩまたはステージＩＩのＮＳＣＬＣなどを診断するのに使用することができる。さらに、これらの組成物は、原因不明の肺小結節を有する対象で、追加診断または最初の診断を下すのに有用である。表１、２、及び／または３から選択された標的またはそのサブセットにより形成されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルの組み合わせは、炎症性遺伝子発現プロファイルと識別可能である。
【０１００】
参照対象のクラスとして、悪性疾患のある喫煙者、非悪性疾患のある喫煙者、非悪性疾患のある元喫煙者、疾患のない健康な非喫煙者、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、ＣＯＰＤのある元喫煙者、固形肺腫瘍がありその除去のための手術前である対象；固形肺腫瘍があり、その腫瘍の外科的除去後の対象；固形肺腫瘍があり、その治療前である対象；及び固形肺腫瘍があり、その治療中または治療後の対象を挙げることができる。適切なクラスの選択は、組成物の用途、すなわち、初期診断用か、治療もしくは手術後の予後用か、または疾患の型、例えば、ＡＣ対ＬＳＣＣの詳細診断用かに依存する。
【０１０１】
診断方法
上記の組成物は全て、対象の疾患状態の、血液に基づく非侵襲性評価を可能にする様々な診断道具を提供する。診断検査におけるこれらの組成物の使用は、他のスクリーニング検査、例えば胸部Ｘ線またはＣＴスキャンなどとカップリングさせることが可能であるが、これらの使用は診断精度を高め、及び／または直接の追加試験を増加させる。他の態様において、本明細書中記載される診断用組成物及び道具は、疾患の予後、特定治療に対する反応のモニタリング、及び再発のリスクの定期評価を可能にする。本明細書中記載される方法及び組成物使用は、治療前、手術前、及び／または治療中の様々な時点、ならびに治療後の試料で、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡレベルまたはプロファイルの診断用組み合わせにおける変化の評価も可能にし、再発の可能性を査定するのに使用可能な発現プロファイルまたはシグネチャーの組み合わせを同定する。
【０１０２】
１つの実施形態において、哺乳類対象の症状を、診断または検出または査定する方法は、対象の生体試料中、または試料から作製されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルの組み合わせから、表１、２、及び／または３で特定される標的ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ核酸配列の発現レベルを検出すること；ならびに対象試料中のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現レベルまたはプロファイルの組み合わせを、参照標準と比較することを含む。対象試料のプロファイルの発現における、参照標準のものからの変化は、上述の症状の診断または予後を示すが、これは参照標準の選択に依存する。ある特定の実施形態において、症状は、肺癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または良性肺小結節である。これらの方法は、上記の生体試料を用いて採用することができる。ある特定の実施形態において、生体試料は、全血、末梢血単核球、血漿、及び血清である。
【０１０３】
上記で説明したとおり、本方法は、ある特定の実施形態において、対象の試料中の１つまたは複数の指定されたｍＲＮＡ及び１つまたは複数の指定されたｍｉＲＮＡの組み合わせの発現レベルを測定することが関与する。他の実施形態において、本方法の、検出、測定、または比較工程は、複数回繰り返される。例えば、ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡレベルは、対象から異なる時点で採取された一連の試料で検出または測定される。これにより、このｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの組み合わせの発現の、選択した参照標準からの変化のパターンを同定することができる。
【０１０４】
さらに他の実施形態において、検出または測定工程は、対象由来の生体試料を、診断試薬、例えば試料中の標的ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現レベルを同定または測定する上記のもの、と接触させることが関与する。ある特定の実施形態において、接触工程は、上記生体試料中に、上記ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ用診断試薬と試料中のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとの間の直接または間接複合体を形成させることが関与するまたはそれを含む。その後、本方法により、本明細書で記載するような適切なアッセイで複合体のレベルを測定する。
【０１０５】
これらの方法のある特定の実施形態において、組み合わせプロファイルを形成するｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的は、肺疾患なしで喫煙歴なし、肺疾患なしで喫煙歴あり、肺癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、良性肺小結節、腫瘍切除前の肺癌、腫瘍切除後の及び肺癌から選択される２つ以上の条件下で異なって発現する。本方法により査定される症状に応じて、参照標準が、参照対象または参照集団、例えば、（ａ）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する参照ヒト対象または集団；（ｂ）ＣＯＰＤを有する参照ヒト対象または集団、（ｃ）健康でありかつ喫煙したことがない参照ヒト対象または集団、（ｄ）元喫煙者または現在喫煙者であるが、疾患のない参照ヒト対象または集団；（ｅ）良性肺小結節を有する参照ヒト対象または集団；（ｆ）ＮＳＣＬＣ腫瘍の外科的除去後の参照ヒト対象または集団；（ｇ）ＮＳＣＬＣ腫瘍の外科的除去前の参照ヒト対象または集団；及び（ｈ）時間的により早い生体試料を提供した同一対象、などから得られる。
【０１０６】
本明細書中記載される診断組成物及び方法は、現行の診断方法に勝る様々な利点を提供する。そのような利点の中でも以下がある。本明細書中例示されるとおり、肺癌の最も一般的な２種類である肺の腺癌または扁平上皮癌のある対象は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肉芽腫または他の良性腫瘍をはじめとする非悪性肺疾患のある対象と識別される。これらの方法及び組成物は、肺診療科に来た小結節のある患者が悪性疾患を有するかどうかという実務的な診断問題に対する解決策を提供する。中度リスクの小結節のある患者は、その患者を、疾患リスクの可能性が非常に低いカテゴリーまたは非常に高いカテゴリーいずれかに分けると思われる非侵襲性試験の恩恵を明らかに受けるだろう。遺伝子プロファイルに基づいた悪性度の正確な見積もり（すなわち、所定の患者が癌を有する確率が９０％であるという見積もり対患者が癌を有する可能性は５％しかないという見積もり
）は、良性疾患に対する手術を減らし、根治できる段階で除去される初期腫瘍を増やし、経過観察のＣＴスキャンを減らし、小結節について心配する大きな心理的苦痛の削減をもたらすと思われる。肺癌についてＣＴスクリーニングと関連した追加医療の現在の推定費用の削減など、経済的影響も大きいと思われる、すなわち、質調整生存年あたり＄１１６，０００が得られる。十分な感度及び特異性を有する非侵襲性試験は、手術後の悪性腫瘍の可能性を、すなわちその後の臨床診療を大きく変えると思われる。
【０１０７】
既存の方法に勝るこれらの方法の望ましい利点は、それらが、最小限に侵襲的な手順から、すなわち、血液試料の採取により、疾患状態を特性決定することができることである。対照的に、遺伝子発現プロファイルから癌腫瘍を分類する現行の実務は、組織試料、通常は腫瘍由来の試料に依存する。非常に小さな腫瘍の場合、生検は問題があり、腫瘍がわからないまたは見えない場合、その腫瘍から試料を得ることは明らかに不可能である。腫瘍の精製は必要なく、腫瘍の試料を分析する場合も同様である。最近発表された方法は、気管支鏡検査中に肺から上皮細胞をブラシで収集することに依存するが、これも血液試料を採取するよりも明らかに侵襲性である方法であり、しかも肺癌にしか適用できないが、本明細書中記載される方法は、あらゆる癌に一般化できる。血液試料は、さらなる利点を有する。その利点とは、材料の準備及びその後の分析のための安定化が容易であることであり、このことは、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを分析しようとする場合に重要である。
【０１０８】
実施形態
１つの実施形態において、肺癌の診断用多分析物組成物は、（ａ）哺乳類生体試料由来のｍＲＮＡ遺伝子転写物と特異的に、複合体化、ハイブリダイズ、またはこれを同定することができる、核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択されたリガンド；及び（ｂ）哺乳類生体試料由来のｍｉＲＮＡと特異的に、複合体化、ハイブリダイズ、またはこれを同定することができる、核酸配列、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選択された追加リガンドを含む。リガンド及び追加リガンドはそれぞれ、異なる遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡと結合し、同定された遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡの発現レベルの組み合わせは、肺癌または肺癌の段階の特徴的なプロファイルを形成する。
【０１０９】
別の実施形態において、上記組成物の遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１から選択される。別の実施形態において、組成物の遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１の第１〜１１９位から選択される。別の実施形態において、上記組成物の遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１の全ての標的から選択される。別の実施形態において、上記組成物の遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表２の標的の一部または全部から選択される。別の実施形態において、組成物の遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表３の標的の一部または全部から選択される。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、組成物の上記リガンドのそれぞれは、上記遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡの核酸配列を増幅及び検出する増幅核酸プライマーまたはプライマー対である。別の実施形態において、リガンドは、遺伝子のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである。別の実施形態において、組成物は、抗体または抗体断片を含有し、各リガンドは、表１、２、または３の少なくとも１つのｍＲＮＡまたは１つのｍｉＲＮＡに特異的である。
【０１１１】
別の実施形態において、組成物は、さらに、上記リガンドが固定される基材を含む。別の実施形態において、組成物は、マイクロアレイ、マイクロ流体カード、チップ、チャンバ、または複数プローブの複合体を含む。別の実施形態において、組成物は、複数プローブ配列を含むキットを含み、このプローブ配列はそれぞれ、表１の第１〜１１９位、または表１の標的全部、または表２の標的の一部または全部、及び／または表３の標的の一部
または全部に入っているｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのうち１つのｍＲＮＡ及び１つのｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができる。別の実施形態において、キットは、同一のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができる追加リガンドを含む。さらに別の実施形態において、キットは、複数の上記リガンドを含み、リガンドはそれぞれ、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマープローブセットを含む。別の実施形態において、キットは、プライマー及びプローブの両方を含み、上記プライマープローブセットはそれぞれ、異なる遺伝子転写物またはｍｉＲＮＡを増幅する。
【０１１２】
別の実施形態において、組成物は、１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを、検出可能な標識を伴って含有する。
【０１１３】
別の実施形態において、組成物は、同一の選択された遺伝子及びｍｉＲＮＡの発現、発現レベル、または活性について、対象の全血中のものの、参照または対照のものからの変化を検出することができ、この変化は、肺癌の初期診断、肺癌の段階、肺癌の型または分類、肺癌の再発、肺癌の退縮、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的治療に対する肺癌の反応と相関する。別の実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌である。
【０１１４】
別の実施形態において、組成物は、同一の選択された遺伝子の発現について、対象の血液中のものの、参照または対照のものからの変化を検出することができ、この変化は、肺癌の診断または評価と相関する。
【０１１５】
別の実施形態において、診断または評価は、肺癌の診断、肺癌の段階の診断、肺癌の型または分類の診断、肺癌の再発の診断または検出、肺癌の退縮の診断または検出、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的治療に対する肺癌の反応の評価のうち１つまたは複数を含む。組成物の１つの実施形態において、リガンドは、ＲＮＡプライマーである。
【０１１６】
別の実施形態において、組成物は、少なくとも２つのリガンドを含む、キットまたはマイクロアレイであり、リガンドの少なくとも１つは対象が肺癌を有する場合に発現に修飾を生じる選択された遺伝子のｍＲＮＡ転写物を同定し、かつ少なくとも２つ目のリガンドは対象が肺癌を有する場合に発現レベルに変化を生じるｍｉＲＮＡを同定する。
【０１１７】
本発明のさらに別の実施形態は、哺乳類対象での肺癌の存在の診断方法または肺癌の評価方法であり、本方法は、哺乳類対象の生体液中の、表１の第１〜１１９位、表１の標的全部、表２の標的の一部または全部、及び／または表３の標的の一部または全部から選択される遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡの発現の変化を同定すること、ならびにこの対象のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現レベルと、参照または対照由来の同一生体試料中の同じｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのレベルを比較することを含み、対象のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の、参照のものからの変化は、肺疾患または癌の診断または評価と相関する。
【０１１８】
１つの実施形態において、本方法は、本明細書中記載される、多分析物組成物を使用する。別の実施形態において、本方法は、診断または評価が、肺癌の診断、良性肺小結節、肺癌の段階の診断、肺癌の型または分類の診断、肺癌の再発の診断または検出、肺癌の退縮の診断または検出、肺癌の予後、または外科的もしくは非外科的治療に対する肺癌の反応の評価のうち１つまたは複数を含むことを可能にする。
【０１１９】
別の実施形態において、本方法の診断または評価は、肺癌の初期段階の診断を含む。
【０１２０】
別の実施形態において、本方法は、上記参照または対照との比較での１つまたは複数の選択された遺伝子転写物の上向き調節または下向き調節と、及び上記参照または対照との比較での１つまたは複数の選択されたｍｉＲＮＡの上向き調節または下向き調節との組み
合わせを含む変化の検出を可能にする。別の実施形態において、本方法で使用される遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡは、表１、２、及び／または３に列挙されるものの中から選択される。別の実施形態において、肺癌は、ステージＩまたはＩＩの非小細胞肺癌である。
【０１２１】
なおさらなる実施形態において、対象は、固形腫瘍切除の手術または化学療法を受けた後であり；上記参照または対照は、手術前または治療前の同一対象由来の同一の選択された遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡを含み；この選択された遺伝子転写物及びｍｉＲＮＡの発現の変化は、癌の再発または退縮と相関する。さらに他の実施形態において、参照または対照は、少なくとも１つの参照対象を含み、この参照対象は、以下からなる群より選択され：（ａ）悪性疾患のある喫煙者、（ｂ）非悪性疾患のある喫煙者、（ｃ）非悪性疾患のある元喫煙者、（ｄ）疾患のない健康な非喫煙者、（ｅ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、（ｆ）ＣＯＰＤのある元喫煙者、（ｇ）固形肺腫瘍があり、その除去のための手術前である対象；（ｈ）固形肺腫瘍があり、その外科的除去後の対象；（ｉ）固形肺腫瘍があり、その治療前である対象；及び（ｊ）及び固形肺腫瘍があり、その治療中または治療後の対象；上記参照または対照の対象（ａ）−（ｊ）は、時間的により早い時点での同一試験対象である。他の実施形態において、参照ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標準は、参照対象または参照集団に由来する、算術平均、広義の平均、数値平均、または数値平均の範囲、数値パターン、図式パターン、または組み合わせたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現プロファイルである。
【０１２２】
他の実施形態において、本方法で使用される生体試料は、全血、血清、または血漿である。
【０１２３】
なおさらなる実施形態において、本方法は、対象由来の生体試料を、試料中の選択されたｍＲＮＡと複合体化し、その発現レベルを測定する診断試薬と接触させること、及び対象由来の生体試料を、試料中の選択されたｍｉＲＮＡと複合体化し、その発現レベルを測定する診断試薬と接触させること、を含み、発現レベルの変化の組み合わせは、癌またはその段階の診断となる。
【０１２４】
なお別の実施形態において、選択されたｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡは、肺疾患なしで喫煙歴なし、肺疾患なしで喫煙歴あり、肺癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、良性肺小結節、腫瘍切除前の肺癌、及び腫瘍切除後の肺癌から選択される２つ以上の条件下で異なって発現する。
【０１２５】
別の実施形態において、診断試薬を作製する方法は、哺乳類対象の生体液の試料中の、疾患の選択されたｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ配列特性の発現における変化の組み合わせを検出することを含む、疾患分類プロファイルの形成を含む。
【０１２６】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本発明は、いかなる方法でも、これらの実施例に制限されるとして解釈すべきではなく、そうではなくて、本明細書中提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる改変形態を包含すると解釈されるべきである。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：試料規模の計算
この計算は、図１に記載されるＰＡＸｇｅｎｅデータに基づく。本発明者らは、癌患者２３人及び対照２５人の現在のＰＡＸｇｅｎｅデータセットから得られるデータを使用して、試験集団で所望の９０％精度に到達するのに必要と思われる試料規模を推定した。本発明者らは、全試料の５０〜９０％に相当する試料数２４から４４まで様々な規模の訓練集合を無作為に選択した。段階ごとに癌試料１つ及び対照試料１つを加えていけるように
、試料規模を、増加幅２で漸増させていった。所定の試料規模ごとに、５０の再サンプリングを行った。
【０１２８】
次いで、各訓練集合でｔ検定を行い、ｐ値で順位付けして上位１００位までの遺伝子を同定した。遺伝子リストを、あらゆるい低発現物（癌群及び非癌群の全試料について平均バックグラウンドの２倍を超えない発現）を除去することにより、さらに縮小した。
【０１２９】
次いで、残った５８の遺伝子を使用して、試験目的に最初持ちこたえたものを含む全試料をクラスター化した。本発明者らは、階層的クラスター化の計量基準として、標準化されたユークリッド距離及び完全連結を使用した。クラスターツリーを水平に横断する１本の切断を入れることにより、クラスターツリーを２つに分割して、２つのクラスター（３６）を同定した。一方は大部分が癌であり、他方は大部分が非癌であった。持ちこたえた試料は、２つのクラスターのうち一方に割り振られ、癌試料の大部分を含有するクラスターを癌クラスターと定義した。
【０１３０】
誤分類された持ちこたえた試験試料の数を用いて、誤り率（ｅ＝誤分類数／合計数）を計算した。次いで、本発明者らは、各特定訓練集合規模で、誤り率の中央値及び中央絶対偏差を５０回の反復で計算した。既に記載したプロセスと同様に、検出力関数曲線を誤り率中央値から得られるデータに当てはめ、本発明者らは、図１に示すとおり、持ちこたえた試験試料で所望の９０％精度を達成するために訓練で必要な症例数を見積もる目的で、直線の方程式を得た。本発明者らの計算では、患者と対照に分かれる約５００の試料を含む訓練集合を使用することにより、新規試験集団での９０％分類精度が達成可能であると示される。
【０１３１】
実施例２−ＲＮＡ精製及び品質の査定
遺伝子のＲＮＡ精製及びｍｉＲＮＡアレイプロセシングを、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅによる通常サービスとして標準化された手順を用いて行う。Ｑｉａｇｅｎ（商標）から市販されている標準キットを使用して、ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡを調製する。このキットは、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの同時精製を可能にする。得られるＲＮＡを、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのプロファイリングに使用する。
【０１３２】
ＲＮＡ品質を、バイオアナライザーを用いて求める。ＲＮＡ完全性数が＞７．５である試料のみを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ承認ＲＮＡ増幅キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いて、一定量（１００ｎｇ）の全ＲＮＡを増幅した（ａＲＮＡ）。この手順は、遺伝子及びｍｉＲＮＡ発現の複数繰り返しに十分な増幅材料を提供する。後日、代替収集系でより少ない試料を入手したとしても、ほんの１０ｎｇの少ないＲＮＡ量で使用することができる。
【０１３３】
実施例３−データの前処理、アレイ品質管理、プローブフィルタリング
ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄ  Ｓｔｕｄｉｏによりアレイデータを処理し、シグナルプローブ及び対照プローブの発現レベルを、分析用にエキスポートする。実験ノイズを減らすため、情報価値のないプローブ（すべての試料の＞９５％で検出されたのではなかったプローブ）及び任意の２つの試料間で少なくとも１．２倍変化することがなかったプローブを除去することにより、データをフィルタリングした。次いで、発現レベルを分位数正規化した。これらの手順により、情報価値のないプローブデータの除去された分位数正規化されたデータを得る。
【０１３４】
各ハイブリダイゼーションバッチ後、本発明者らは、全シグナルプローブ（＞４０，０００）の発現レベルを用いて全てのマイクロアレイにまたがりスピアマン相関中央値として遺伝子観点で包括的相関をコンピューター計算した。そして包括的相関の中央絶対偏差
を計算する。各マイクロアレイについて、スピアマン相関中央値を、全ての他のアレイに対してコンピューター計算し、相関中央値が包括的相関から絶対偏差で８超異なるアレイを、外れ値としてマークし、それ以上の解析に使用しない。外れ値は、典型的にはＰＡＸｇｅｎｅ試料の＜１％である。外れ値のさらなる同定を、全般またはロバスト主成分（ＰＣＡ）プロット及び多次元スケーリングなどの多変量解析を通じて行う。
【０１３５】
ｍｉＲＮＡ発現について、本発明者らは、本研究のためにＡＢＩ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）製のＯｐｅｎＡｒｒａｙプラットホームを選択した。ＯｐｅｎＡｒｒａｙナノ流体ＰＣＲプラットホームは、科学者が、最大３，０７２の独立したＰＣＲ分析を同時に行うことを可能にし、すでに臨床応用されており、変動を排除するロボットステーションを利用する。このプロセス用に検討した追加プラットホームは、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）製のｎＣｏｕｎｔｅｒシステムである。簡単に述べると、このシステムは、デジタルカラーコード化されたバーコード技術を利用する。カラーコード化された分子「バーコード」を、標的遺伝子に対する１つの標的特異的プローブに取り付ける。バーコードは、標的分子と直接ハイブリダイズするので、増幅を必要とせずに個別に計数することができる。そのようなバーコードプローブ及び対照のセットを用いた単独分子の画像化は、１回の反応で多くの独特な転写物の検出及び計数を可能にする。例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが、ウェブサイト、ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｃｏｍに掲載する説明を参照。ｍｉＲＮＡデータ前処理及びＯｐｅｎＡｒｒａｙ品質管理については、全ＲＮＡを、ＡＢＩのプロトコルに従って、ＡＢＩから購入したＯｐｅｎＡｒｒａｙ試薬を使用して、処理する。ＯｐｅｎＡｒｒａｙから得られたデータを、ＭＡＴＬＡＢを使用して、以下のとおり、前処理する：小核ＲＮＡ、ＲＮＵ４４及びＲＮＵ４８のサイクル閾値（Ｃｔ）の平均（ＲＮＵavg）を、内在対照（ハウスキーピング遺伝子）として使用して、試料の発現レベルを正規化し、各ｍｉＲＮＡの相対量（ΔＣｔ）をコンピューター計算する。Ｃｔ値を、製造元（及び本発明者らの施設）が提示する２４に限定することで、最大ΔＣｔ値が、ΔＣｔ24に等しくなる（この場合、ΔＣｔ24＝２４−ＲＮＵavg）。ΔＣｔ24を超えるΔＣｔ値は、信頼できないと見なして、比較解析のため、ΔＣｔ24値にする。次いで、ΔＣｔ値を、２ΔCt24-ΔCtを計算することにより、完全発現レベルに変換することになる。全ての反応は、３つ組で行う。全てのアッセイは、高度に標準化された条件を用いて行う。統計的考察のため、試料を、肺小結節のあるまたはない非癌患者及び肺癌のある患者から収集する。本発明者らの以前のＰＢＭＣ研究の結果に基づき、本発明者は、６００のＰＡＸｇｅｎｅ試料（肺小結節のある患者とない患者を組み合わせる）から、癌を全ての非癌から区別するのにより良好な遺伝子パネルを同定することができると想定している。試料規模及び検出力の推定は、この想定に基づいていた。
【０１３６】
臨床業務では、間違いなく非悪性の小結節のある患者から癌を識別することが、より迅速に重要となる。本発明者らの以前の実験に基づき、癌と非悪性小結節を分類できる可能性がある遺伝子パネルは、癌と全ての非癌を分類するために同定されたものと、ある程度異なると思われる。分類用遺伝子パネルを決定する方法は、複数存在する。１つの従来式のやり方は、本発明者らが予備ＰＡＸｇｅｎｅ試験で使用した手順であり、予備ＰＡＸｇｅｎｅ試験について記載したとおりｔ検定によるもので、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓ  Ｓｏｃ．，  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ，  Ｖｏｌ．  ５７（１）：２８９−３００  （１９９５）を用いて、ｐ値をｐ＜．０５に調整し、かつ最小のｐ値である５０〜１００の遺伝子を階層的クラスタリングのために選択するものであるが、これは、巨大データセットについては有効ではないので、その場合には、本発明者らはＳＶＭ−ＲＦＥを代わりに使用して上手くいった。
【０１３７】
実施例４−遺伝子選出のための教師付き分類
本発明者らは、多くの交絡類似性（喫煙歴、肺疾患、年齢、人種など）を共有する臨床
上定義されたクラス（例えば癌／非癌／良性小結節）を識別する遺伝子発現分類指標を開発するのに、再帰的特徴消去を伴うサポートベクターマシン（ＳＶＭ−ＲＦＥ）（ＷＯ２０１０／０５４２３３を参照）を適用するのが最も成功することを見出した。多くの他の教師付き方法とは異なり、ＳＶＭは、生体マーカーの選択に利点を有する。なぜなら、遺伝子は、クラス分離に対するそれぞれの寄与により順位付けされるので、分離に最も有用な遺伝子を同定することができるからである。寄与遺伝子は、ＲＦＥの反復プロセスにより削減されて、最も正確なクラス識別を提供する最小数の遺伝子が見つかる。また、各試料には、正または負のスコアが与えられ、このスコアは、図１に示すとおり、その試料をどちらかのクラスに振り分けるとともに、その試料がどのくらい良好に特定のクラスで同定されるのかの尺度でもある。本発明者らの研究では、正の場合は、癌と定義し、負の場合は、非癌とする。正のスコアが大きいほど、または負のスコアが小さいほど、各試料が特定のクラスに良好に振り分けられていると定義する。プロセスを、以下により詳細に示す。
【０１３８】
試料の分類を、ＳＶＭ−ＲＦＥを使用して行い、このとき、無作為１０倍再サンプリング及び相互検証を１０回繰り返す（１００位までの遺伝子の順位付けを得る）。各相互検証反復は、ｔ検定で最も有意性の高い１，０００の遺伝子で開始し、遺伝子数を、特徴消去工程１回ごとに１０％削減する。遺伝子の最終順位付けは、Ｂｏｒｄａカウント手順を用いて行う。試験した試料それぞれの分類スコアを、１つの遺伝子になるまで、相互検証及び遺伝子削減工程１回ごとに、記録する。最良の精度をもたらす遺伝子数を求め、最大精度の時点で関連する全ての遺伝子で、最初の識別指標を構成する。次いで、この識別指標を、精度を落とさずに可能な限り縮小していくことで、最終識別指標に到達する。ＳＶＭ−ＲＦＥを用いると、相互検証工程は、過剰適合を回避するために不可欠である。
【０１３９】
検証手順に関して、分類指標の普遍性をさらに確保するため、本発明者らは、全ての患者のうち２５〜３０％を分析に含めず、こうして独立した検定集団を形成する。独立した検定試料を、訓練集合の試料のうち７０〜７５％の分析に由来する候補遺伝子を用いて分類する。各工程で、識別指標検出力計算の感度及び特異性を再評価して、要求されるエンドポイントを定義する。
【０１４０】
本発明者らの分類戦略の大きな強み及び進歩性は、識別力を最適化する目的でｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む複数のデータタイプを組み込み、これらの別箇の遺伝子調節レベル間に相乗効果をもたらすことである。そのような多モードの分析は、癌診断に大きな可能性を提供する。したがって、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、いずれか１種類のデータのみを使用するか、または利用可能な情報全てを合併することで利益を得る最良の識別指標を同定するのに、独立して及び合併したデータセットとしての両方で使用される。各プラットホームから得られたデータを、本発明者らが以前にｍＲＮＡに適用した教師無し分類技法により、別々に定量し、正規化し、分析する。
【０１４１】
これらの技法のそれぞれから得られるデータは、定量的であり、ｔ検定により分析される差次的発現特徴であり、各タイプのデータに顕著な特徴を、別々及び組み合わせたデータセットとしての両方で、ＳＶＭ−ＲＦＥによりさらに分析する。本発明者らは、最も集約された特徴集団は、両タイプのデータのあるものを含有すると予測している。詳細には、１つの情報価値のあるｍｉＲＮＡは、そのｍｉＲＮＡが制御する複数のｍＲＮＡ種と同じぐらいに情報価値があり、したがって、それらと交換できる場合がある。ＳＶＭ−ＲＦＥにより決定された、識別指標に含まれることになる遺伝子またはｍｉＲＮＡの集合は、比較される試料の任意の所定の２群を区別する共通の機能または経路を同定する目的で、さらに分析することができ、かつ新たな治療標的を同定することができる可能性を有している。
【０１４２】
診断アルゴリズムの開発及び実行：
本発明者らが以前に発表した遺伝子シグネチャーに基づき、本発明者らは、＞３０の遺伝子プローブ、及び／または２０未満のｍｉＲＮＡプローブからなるシグネチャーを同定する。ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分類精度を、各データタイプを別々に正規化して処理し、別々に査定する。ＯＰＥＮＡＲＲＡＹシステムにより、本発明者らは、高処理プラットホームで候補遺伝子を試験することができる専用アレイを開発することができる。さらに、ＮＡＮＯＳＴＩＮＧプラットホームは、市販の試験をさらに試験し実行する簡単かつロバストなシステムを提供する。ｍＲＮＡプラットホーム及びｍｉＲＮＡプラットホームは、両方とも、最終的に、その実体が試料中にどれだけ多く存在するかの尺度となる数字をもたらす。これは、分類の最終データを、１つの行列にまとめることができ、単独の分類指標として使用できることを意味する。試料のクラス、分類戦略、ならびに試料及びそれらのサブタイプの個数を、表４にまとめる。
【表４】
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【０１４３】
*（セットＡ）３４５の試料が、一義的に癌（ＬＣ）または対照（ＮＯＤまたはＳＣ）に割り振られ、訓練及び試験に使用された。
【０１４４】
**（セットＢ）不明確な表現型の７０の試料。これら７０の試料には、肺切除後の試料及び後にＬＣを発症した小結節患者由来の試料が含まれており、そのため癌シグネチャーの状態は、本質的に不明であった。ＬＣ対ＮＯＤの比較には、６５のＳＣ試料も含まれていたが、これらの試料は、訓練−試験では使用されなかったものの、分類に利用可能であった。
【０１４５】
分析の合計４１５の試料のうち、３４５の試料は、一義的に、癌（ＬＣ）または対照（ＮＯＤまたはＳＣ）ラベルが割り振られ（セットＡ）、訓練及び試験目的で使用された。残りの７０の試料は、不明確な表現型の試料（セットＢ）であり、肺切除後の試料及び後にＬＣを発症した小結節患者由来の試料が含まれ、３４５の一義的に割り振られた試料（症例または対照として臨床上確認されたが、切除後の試料を含まない）で開発された分類指標によりさらに分類するために使用された。両方のセットから取り出した試料を、無作為に分けて、７０％を訓練集合（セットＡについて２４２の試料）に及び残り３０％を試験集合（セットＡについて１０３の試料）にした。
【０１４６】
訓練集合を使用して、ＳＶＭにＲａｄｉａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＲＢＦ）カーネル及び前向き特徴選択（ＦＦＳ）を使用する１０倍相互検証ルーチンを併用することにより、最良の分類指標を見つけた。ＦＦＳは、各段階で１つの最良の特徴（遺伝子
またはｍｉＲＮＡ）を選出して、この特徴が全体の訓練精度を改善した。あるいは、本発明者らは、過去の８の試料で使用が上手くいった線形カーネル及び再帰的特徴消去（ＲＦＥ）の使用を試みたが、前向き特徴選択とＲＢＦカーネルの併用の方が、予備訓練集合でより良い精度が得られた。次いで、最良の訓練精度をもたらした特徴の個数に合った分類指標を、最終分類指標として選択し、独立集合外の試験集合に適用して、その分類指標の偏りのない精度を見積もった。
【０１４７】
記載した分類指標開発プロセスを使用して、本発明者らは、比較用に、３つのデータセットを用いて、３つの異なる分類指標を作製した：（１）ｍＲＮＡデータのみを使用；（２）ｍｉＲＮＡ発現データのみを使用、及び（３）ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡデータの組み合わせを分析。各データセット／分類分析から、試験集合性能に基づく報告を得たが、それには精度、感度、特異性、及びＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が含まれていた。結果を表５に示す。
【表５】
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【０１４８】
表によれば、最良の精度は、癌全般対全ての対照の分類指標により達成された（８３％精度）が、これは、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡデータ両方を同時に使用し（合計１４５の特徴）、このことは、同一分類において両方のプラットホームを使用することの利点を実証する。組み合わせ分類指標のＲＯＣのＡＵＣを図２に示す。
【０１４９】
独立した試験集合の各試料に対して分類指標により割り振られた個別スコアを、図３のＳＶＭプロットに示すが、各試料には、ＳＶＭ分類指標により割り振られたスコアが与えられていた。正のスコアは、癌に分類されたことを、負のスコアは対照に分類されたことを示す。各カラムは、１人の患者を示し、カラムの高さは、分類の信頼度の強さの尺度と見なすことができる。示される分類は、分類のため古典的な０点切り捨てを使用する。グラフは、カットオフにより感度が９２．６％に最大化され、特異性が７３．５％になるこ
とを示す。
【０１５０】
図４は、この方法論の予備結果を示す：３４５の試料を、ＡＢＩ  ＯｐｅｎＡｒｒａｙ
ＰＣＲプラットホームでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ１２ｖ４  ｍＲＮＡアレイ及びｍｉＲＮＡを用いて、処理及び分析した。完全に独立した試験集合であることを確実にするため、２４２（７０％）を訓練セットとし、１０３（３０％）を試験試料とした。
【０１５１】
本開示全体を通じて記載される、ありとあらゆる、特許、２０１５年５月１９日出願の米国仮特許出願番号第６２／１６３，７６６号をはじめとする特許出願、及びウェブサイトを含む文献は、そのまま全体が、本明細書中参照として明白に援用される。本発明は、具体的な実施形態を参照して開示されてきたものの、本発明の他の実施形態及び変形形態が、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく当業者により考案されることは、明白である。添付の請求項は、そのような実施形態及び等価な変形形態を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018524972.tif 000039
2018524972.tif 000040
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