(57)【要約】本明細書では、インフルエンザワクチン組成物、関連する調製物および中間体、製剤、作製方法、免疫化方法、ならびにヒト対象における改善された免疫防御を達成するためのこれらの使用が開示される。より具体的には、改善された抗原マッチを提供する、卵ベースでないインフルエンザワクチンについて記載する。近年、驚くべき数の流感シーズンにおいて、無効な流感ワクチンが観察されている。本発明は、抗原マッチが良好な、改良型インフルエンザワクチンであって、例えば、本明細書でより詳細に記載される、レスキューワクチンおよびハイブリッドワクチンの形態の改良型インフルエンザワクチンに対する、既存の満たされていない必要への解決策を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内で調製される抗原を含むレスキューインフルエンザワクチンであって、前記抗原が、蔓延インフルエンザウイルスの抗原に対して、同じインフルエンザシーズンのより早期に利用可能な、季節性インフルエンザワクチンより大きな抗原マッチを有し、前記季節性インフルエンザワクチンが、前記蔓延インフルエンザウイルスに対して、≦５０％のワクチン有効性を有する、レスキューインフルエンザワクチン。
【請求項２】
インフルエンザ株の抗原を含む組成物であって、卵ベースでない調製物中で調製され、前記株が、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい、組成物。
【請求項３】
卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンを既に投与されているヒトを免疫化するための方法であって、同じヒトへと、卵内で継代培養されていない、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを投与するステップを含み、前記第２のインフルエンザワクチン中の前記抗原が、前記第１のインフルエンザワクチン中の前記抗原より、蔓延株に、抗原的に緊密にマッチしている、方法。
【請求項４】
ヒトを免疫化するための方法であって、（ａ）前記ヒトへと、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンを投与するステップと；その後、（ｂ）同じヒトへと、細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを投与するステップとを含み、前記第２のインフルエンザワクチン中の前記抗原が、前記第１のインフルエンザワクチン中の前記抗原より、蔓延株に、抗原的に緊密にマッチしている、方法。
【請求項５】
前記第２のインフルエンザウイルスを、細胞培養物中で増殖させた、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のインフルエンザワクチンに由来する前記抗原が、組換えタンパク質抗原である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のインフルエンザワクチンおよび前記第２のインフルエンザワクチンが、１つのインフルエンザシーズンに由来する、請求項３または５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のインフルエンザワクチンを、前記第２のインフルエンザワクチンの前に利用可能とする、請求項３または５から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項３から８のいずれかに記載の方法によるヒトの免疫化における使用のための、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチン、および細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチン。
【請求項１０】
細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを施されるヒトを、あらかじめ免疫化するための、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンであって、前記第２のインフルエンザワクチン中の前記抗原が、前記第１のインフルエンザワクチン中の前記抗原より、蔓延株に、緊密にマッチしている、第１のインフルエンザワクチン。
【請求項１１】
前記第１のワクチン中の前記インフルエンザ抗原が、卵内で増殖させたインフルエンザウイルスに由来する、請求項３から１０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１２】
前記第１のインフルエンザワクチンが、三価インフルエンザワクチンまたは四価インフルエンザワクチンである、請求項３から１１のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記第２のインフルエンザワクチンが、一価インフルエンザワクチンである、請求項３から１２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記第１のインフルエンザワクチンおよび前記第２のインフルエンザワクチンを、同じインフルエンザシーズン中に投与する、請求項３から１３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１５】
前記第２のインフルエンザワクチンを、前記第１のインフルエンザワクチンの後、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、または５カ月以内に投与する、請求項１０から１４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１６】
前記第２のインフルエンザワクチンが、オボアルブミンおよびオボムコイドを含まない、請求項３から１５のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１７】
（ｉ）前記第１のインフルエンザワクチンが、不活化ウイルスワクチンであるか、（ｉｉ）前記第２のインフルエンザワクチンが、不活化ウイルスワクチンであるか、または（ｉｉｉ）前記第１のインフルエンザワクチンおよび前記第２のインフルエンザワクチンが、不活化ウイルスワクチンである、請求項３から１６のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１８】
前記第２のインフルエンザワクチン中の前記抗原を、卵内で継代培養していないインフルエンザウイルスから調製した、請求項３から１７のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記第１のインフルエンザワクチンおよび／または前記第２のインフルエンザワクチンをアジュバント処理した、請求項３から１８のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２０】
前記アジュバントが、水中油エマルジョンアジュバントである、請求項１９に記載の方法または使用。
【請求項２１】
（ｉ）卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチン；および（ｉｉ）細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを含み、前記第２のインフルエンザワクチン中の前記抗原が、前記第１のインフルエンザワクチン中の前記抗原より、蔓延株に、抗原的に緊密にマッチしているキット。
【請求項２２】
（ｉ）卵ベースの調製物に由来するウイルス抗原；（ｉｉ）細胞培養物ベースの調製物に由来するウイルス抗原；（ｉｉｉ）組換えタンパク質調製物に由来するウイルス抗原；および（ｉｖ）ウイルス抗原をコードするＲＮＡレプリコンからなる群から選択される、２つまたはこれを超える成分を含むハイブリッドワクチン。
【請求項２３】
三価または四価のインフルエンザワクチンである、請求項２２に記載のハイブリッドワクチン。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含む、請求項２２または２３に記載のハイブリッドワクチン。
【請求項２５】
前記細胞培養物ベースの調製物が、哺乳動細胞ベースの調製物または鳥類細胞ベースの調製物である、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のハイブリッドワクチン。
【請求項２６】
前記第２のインフルエンザワクチンに由来する前記抗原を、合成種ウイルスから製造する、請求項３から５または７から２０のいずれか一項に記載の方法、使用のためのワクチン、またはキット。
【請求項２７】
前記第２のインフルエンザワクチンに由来する前記抗原を、合成種ウイルスから製造する、請求項１または２に記載のレスキューワクチンまたは組成物。
【請求項２８】
細胞培養物ベースの調製物に由来する前記抗原を、合成種ウイルスから製造する、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のハイブリッドワクチン。
【請求項２９】
請求項１または２に記載のレスキューワクチンもしくは組成物を製造するための、または請求項２２から２５のいずれか一項に記載のハイブリッドワクチン中の、細胞培養物ベースの調製物に由来するウイルス抗原を製造するための合成種ウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願番号第６２／１８５，５３２号（２０１５年６月２６日出願）および米国仮出願番号第６２／３１３，１８４号（２０１６年３月２５日出願）の利益を主張しており、これら仮出願の全体の内容はすべての目的のために参考として本明細書によって本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、ワクチン、より具体的には、改良型インフルエンザワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インフルエンザは、重度の疾病をもたらす場合があり、死亡をもたらす場合もある。疾患に対して防御する最良の方途は、予防的措置として、ワクチン接種を受けることである。しかし、インフルエンザワクチン製造にとっての主要な難題は、インフルエンザウイルスが恒常的に変化しつつあり、したがって、インフルエンザワクチンが、蔓延株に適応することを、毎年要請することである。この目的で、世界保健機構（ＷＨＯ）は、インフルエンザを、グローバルにモニタリングし、来るべきインフルエンザシーズン中に、インフルエンザワクチン中に組み入れるべきインフルエンザ株を、毎年提起している。
【０００４】
ＷＨＯにより選び出されるインフルエンザ株は一般に、蔓延インフルエンザ株に良好にマッチすることが実証されているが、蔓延株が、ワクチン中に見出されたインフルエンザ株にもはや良好にはマッチせず、したがって、インフルエンザワクチンの効能が低下した場合もあった。例えば、２０１４／２０１５年のシーズンには、ワクチンのために選択されたＨ３Ｎ２株と、蔓延Ｈ３Ｎ２株とのミスマッチが存在した結果として、この株に対する防御が不良なワクチンがもたらされた。
【０００５】
ワクチン調製物中で観察される抗原ミスマッチは、いわゆる馴化、例えば、卵馴化に帰せられている。これは、卵による継代培養が、抗原性に影響を及ぼすグリコシル化の、卵馴化性喪失を結果としてもたらすことを示した研究において例示されている。例えば、Ｋｉｓｈｉｄａら（参考文献１１９）は、Ｂ−Ｖｉｃｔｏｒｉａウイルスにおけるグリコシル化の、卵馴化性喪失であって、抗原性の変化を結果としてもたらす喪失について報告した。
【０００６】
１９８６／８７年のシーズンには、シーズンの後半における、新たなＨ１Ｎ１インフルエンザ株の出現の結果として、２つのインフルエンザワクチンが製造された。この場合、規制機関は、新たなＨ１Ｎ１株に対して、卵内で増殖させたインフルエンザウイルスから調製される、一価インフルエンザワクチンを製造し、シーズン中の早期に利用可能とされた、三価の季節性インフルエンザワクチンに加えて、高危険性者へと投与することを推奨した。
【０００７】
インフルエンザワクチン中の抗原ミスマッチにより引き起こされる、免疫防御の効能／有効性の限定は、依然として難題である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、少なくとも部分的に、ある特定のインフルエンザシーズンにおける、季節性インフルエンザワクチンは、ワクチン株と蔓延ウイルスとの抗原ミスマッチに起因して、望ましいワクチン効能（臨床状況における）またはワクチン有効性（病因的状況における）を欠くという認識に基づく。近年、驚くべき数の流感シーズンにおいて、無効な流感ワクチンが観察されている。本発明は、抗原マッチが良好な、改良型インフルエンザワクチンであって、例えば、本明細書でより詳細に記載される、レスキューワクチンおよびハイブリッドワクチンの形態の改良型インフルエンザワクチンに対する、既存の満たされていない必要への解決策を提供する。
【０００９】
レスキューワクチンとハイブリッドワクチンとは、いずれもが、卵非含有工程で作製された抗原を含み、いずれもが、蔓延ウイルスとの抗原マッチであって、従来型の卵ベースのワクチンが達成しえない抗原マッチをもたらす抗原を含むことを想定する点で共通する。
【００１０】
推奨株は、現在のところ、従来の卵ベースのワクチン製造に対応するために、卵内で増殖し、標準的なアッセイによりたやすく検出および測定されうる株（卵馴化バージョン）に限定されていることに注目されたい。しかし、状況によっては、ある特定のクレード（ｃｌａｄｅ）のインフルエンザウイルスは、卵内で良好に増殖できず、この場合、異なるが近縁のクレードであって、卵内で増殖する良好な能力を伴うクレードを、デフォルトとして選択する場合がある。マッチしていないクレードに由来する株の使用は、結果として得られるワクチン内で抗原ミスマッチをもたらす場合があり、これは、今日でも依然として問題である。
【００１１】
レスキューワクチンは、典型的には、抗原ミスマッチに起因して、十分な免疫防御をもたらすのに無効であることが見出された常用季節性流感ワクチンの後、オフサイクルで作製される。したがって、レスキューワクチンは、同じ流感シーズン中の早期に、既に市販されているか、または既に製造されている、常用季節性ワクチンを補完する「事後」ワクチンとして使用することができる。レスキューワクチンは、典型的には、一価の、細胞培養物ベースのワクチンでありうる。このようなワクチンは、常用季節性ワクチンが利用可能とされた数週間後、例えば、４週間、または、例えば、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間後に利用可能とすることができる。したがって、レスキューワクチンは、卵馴化から生じる抗原ミスマッチに対する解決策をもたらしうる。本明細書で記載されるレスキューワクチンはまた、蔓延ウイルスの抗原ドリフトまたは抗原シフト（例えば、ワクチン作製のための株の選択と、実際の疾患ピークとの間の）から生じる抗原ミスマッチに対する解決策ももたらすことができ、代替的にそうすることもできる。
【００１２】
本明細書で記載される第１のインフルエンザワクチンは、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含むワクチンでありうる。第１のインフルエンザワクチンは、第２のインフルエンザワクチンの前に利用可能とすることができる。本明細書で記載されるレスキューワクチンは、本明細書で記載されるような第２のインフルエンザワクチンのレスキューワクチンでありうる。第２の（レスキュー）ワクチンは、卵内で継代培養されていない、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含むことが可能であり、この場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている。第２のインフルエンザワクチンは、第１のインフルエンザワクチンの後、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、または５カ月以内に投与することができる。好ましくは、第２のインフルエンザワクチンは、第１のインフルエンザワクチンの後３カ月以内に投与する。
【００１３】
一部の実施形態では、レスキューインフルエンザワクチンは、宿主細胞内で調製される抗原であって、この抗原は、蔓延インフルエンザウイルスの抗原（例えば、蔓延株の抗原）に対して、同じインフルエンザシーズンのより早期に利用可能な季節性インフルエンザワクチン（例えば、第１のインフルエンザワクチン）であって、蔓延インフルエンザウイルスに対するワクチン有効性が≦５０％である季節性インフルエンザワクチンより大きな（すなわち、緊密な）抗原マッチを有する抗原を含む。当業者に明らかとなる通り、本明細書で言及される「宿主細胞」とは、卵ではない。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、「細胞培養物」で代用することができる。好ましくは、宿主細胞内で調製される抗原（細胞培養物）は、卵内で継代培養していない抗原である。
【００１４】
したがって、本明細書で規定される、第１のインフルエンザワクチンは、蔓延インフルエンザウイルスに対するワクチン有効性が≦５０％でありうる。
【００１５】
本発明はさらに、ハイブリッドワクチンおよびその中間組成物（例えば、最終ワクチン製品の前に、ハイブリッドワクチンの製造時に調製される中間組成物）を提供する。本質において、ハイブリッドワクチンは、卵ベースでない調製物中で作製される、少なくとも１つの抗原と、卵ベースの調製物中で作製される、少なくとも１つの抗原とを含みうる。従来型の卵ベースの作製は、卵馴化またはクレードミスマッチを受けやすくない株の抗原を製造するのに採用することができる。並行して、しかし、別個に、卵特異的感作を受けやすい株の、１または複数の抗原を、卵非含有システムにより作製する。ハイブリッドワクチンは、卵依存的抗原ミスマッチを回避するように、このような成分を、好ましくは、単一の製剤へと組み合わせうる。
【００１６】
一部の実施形態では、ハイブリッドワクチンは、（ｉ）卵ベースの調製物に由来するウイルス抗原；（ｉｉ）細胞培養物ベースの調製物に由来するウイルス抗原；（ｉｉｉ）組換えタンパク質調製物に由来するウイルス抗原；および（ｉｖ）ウイルス抗原をコードするＲＮＡレプリコンからなる群から選択される、２つまたはこれを超える成分を含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、抗原的にマッチさせたワクチンをもたらすための、改良型種ウイルスおよび関連する方法を提供する。これは、少なくとも部分的に、当初の分離株における混合種（例えば、擬似種）の存在が、その後の抗原ドリフティングへの寄与因子となる可能性が高いという認識に基づく。これは、いわゆる「細胞馴化」の帰結と広く考えられてきたことに反する。したがって、本発明は、規定された遺伝子配列により制作される合成ウイルスを使用することにより、問題の根源に対抗する解決策を提供する。したがって、本発明は、野生型分離株より抗原ドリフティングを受けにくい、改良型種ウイルス、候補ワクチンウイルス（ＣＶＶ）、または基準株を提供する。
【００１８】
本発明に従い、本明細書で記載される種ウイルス調製物は、遺伝子的に均質なウイルス集団であって、ウイルス集団の抗原を、遺伝子的に規定された配列から、合成により導出したウイルス集団を含む。本発明はまた、本明細書で記載される種ウイルス調製物の、組成物の製造における使用も包含する。種ウイルス調製物を使用して、本明細書で規定される、組成物、インフルエンザワクチン、レスキューワクチンまたはハイブリッドワクチンを調製または製造することができる。関連する実施形態では、本発明は、遺伝子的に均質なウイルス集団を含む種ウイルス調製物であって、ウイルス集団の抗原を、遺伝子的に規定された配列から、合成により導出したことによって特徴付けられる種ウイルス調製物を制作するステップを含む工程により制作されるワクチンを提供する。
【００１９】
本発明の目的は、蔓延インフルエンザ株に対する防御をさらに改善する、さらなる改良型投与レジメを提供することである。
【００２０】
本発明はまた、改良型インフルエンザワクチンならびに関連する使用およびこのための製造工程も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、近年で最悪の流感シーズンが、ウイルスが進化したシーズン（すなわち、ウイルスが、最大の変化を受けたシーズン）であることを例示する折れ線グラフを提示する図である。流感様疾病と関連する病院への来院の経時変化を、６つの流感シーズンの各々について、時間経過にわたりプロットする。
【００２２】
【図２】図２は、ワクチン効能と、インフルエンザ関連の入院率との関係を、異なる年齢群について示すグラフを提示する図である（出典：Nichol  Kら、Vaccine、２００３年、２１巻：１７６９〜１７７５頁；Goodwin  Kら、Vaccine、２００６年、２４巻：１１５９〜１１６９頁；Grubeck-Loebenstein  Bら、Nat  Med、１９９８年、４巻：８７０頁；およびGlezen  WPら、Am  Rev  Respir  Dis、１９８７年、１３６巻：５５０〜５５５頁）。
【００２３】
【図３】図３は、４つの異なるシステムにおける、Ｈ３Ｎ２ウイルスの分離率を描示する棒グラフを提示する図である。
【００２４】
【図４】図４は、ＭＤＣＫ細胞内で連続継代培養された、３Ｃ．２ＡウイルスのＨＡ力価（オセルタミビルの存在下における）を示すグラフを提示する図である。
【００２５】
【図５】図５は、抗原の特徴付けのために作出された合成ウイルスのパネルを提示する図である。抗原供給源の下の「卵」または「細胞」とは、合成のためのＨＡ配列およびＮＡ配列を提供したウイルスの、継代培養履歴を指す。混合型の継代培養履歴の場合、卵内の任意の継代培養は、「卵」表示を促すのに十分である。全ての合成被験ウイルスは、使用されるＨＡ配列およびＮＡ配列に関わらず、これらの研究のために、もっぱら、哺乳動物細胞内で継代培養した。
【００２６】
【図６】図６は、卵馴化候補ワクチンウイルスに由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を伴う、卵により繁殖させた非合成ウイルスと、ＭＤＣＫ細胞により繁殖させた合成ウイルスとについての、ＨＩの比較を提示する図である。
【００２７】
【図７】図７は、卵により繁殖させた野生型ウイルスまたは哺乳動物により繁殖させた野生型ウイルスに由来する、ＨＡ配列およびＮＡ配列を伴う合成ウイルスについての、ＨＩの特徴付けを提示する図である。
【００２８】
【図８】図８は、卵由来のＨ３Ｎ２抗原を伴うウイルスと、哺乳動物細胞由来のＨ３Ｎ２抗原を伴うウイルスとの抗原ミスマッチを示す、ＨＩ力価：（Ａ）Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９（Ｈ３Ｎ２）；および（Ｂ）Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）を提示する図である。
【００２９】
【図９】図９は、卵由来のＢ抗原を伴うウイルスと、哺乳動物細胞由来のＢ抗原を伴うウイルスとの抗原ミスマッチを示す、ＨＩ力価を提示する図である。
【００３０】
【図１０】図１０は、Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３についての二元ＨＩ試験を提示する図である。
【００３１】
【図１１Ａ】図１１は、アジュバントを伴うかまたは伴わずに、３つの主要なクレード（３Ｃ．１、３Ｃ．２ａ、３Ｃ．３ａ）に由来する卵由来のＨ３Ｎ２モノバルクおよび細胞由来のＨ３Ｎ２モノバルクに対して惹起され、（Ａ）卵由来のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４被験ウイルス；および（Ｂ）細胞由来のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４被験ウイルスに対して調べられたマウス抗血清についての、マイクロ中和アッセイの結果を提示する図である。
【図１１Ｂ】図１１は、アジュバントを伴うかまたは伴わずに、３つの主要なクレード（３Ｃ．１、３Ｃ．２ａ、３Ｃ．３ａ）に由来する卵由来のＨ３Ｎ２モノバルクおよび細胞由来のＨ３Ｎ２モノバルクに対して惹起され、（Ａ）卵由来のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４被験ウイルス；および（Ｂ）細胞由来のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４被験ウイルスに対して調べられたマウス抗血清についての、マイクロ中和アッセイの結果を提示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、ある特定のインフルエンザシーズンにおける、季節性インフルエンザワクチンは、ワクチン抗原と蔓延株との抗原ミスマッチに起因して、望ましい効能を欠くという認識に基づく。
【００３３】
抗原近縁性
本明細書で使用される「マッチ」および「ミスマッチ」という用語は、そうでないことが指定されない限りにおいて、それぞれ、ワクチン株（例えば、「候補ワクチンウイルス」または「ＣＶＶ」）の対応する抗原と、蔓延株の対応する抗原との、抗原マッチおよび抗原ミスマッチを指す。抗原ミスマッチは、ワクチン接種された個体のための防御をもたらすことにおける、ワクチンの低有効性を結果としてもたらしうる。ある特定のシーズンでは、例えば、効能は、抗原ミスマッチに起因して、５０％またはこれ未満、例えば、０〜５０％の間でありうる（下記の実施例における詳細を参照されたい）。低有効性は、蔓延インフルエンザウイルスに対する≦５０％のワクチン有効性（または≦３０％のワクチン有効性）として規定することができる。
【００３４】
本開示はまた、「抗原マッチ」の程度を指すように互換的に使用される、「抗原近縁性」または「抗原類似性」にも言及する。
【００３５】
抗原ミスマッチには、複数の潜在的な源泉が存在する。第一に、ワクチン作製のタイミングに基づき、実際の疾患ピークの数カ月前に選択を行う必要があるが、この間に、蔓延ウイルスの抗原ドリフティングまたは抗原シフティングが生じる場合がある。第二に、ワクチン株の推奨が、蔓延ウイルスについての正確な情報を反映しない場合があるように、監視は不完全でありうる。第三に、グローバルなインフルエンザシステムは、多くの機関および工程が関与する、極めて大規模なものであり、情報処理の遅延を引き起こす場合がある。そして、第四に、卵への馴化は、ＨＡ内の突然変異により、抗原ミスマッチを結果としてもたらす可能性があるが、これは、最近の数年間で、実際に観察されている。
【００３６】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスの主要抗原である。特に、ＨＡタンパク質のヘッド領域は、優勢抗原領域であり、鍵となるエピトープのほか、宿主細胞への侵入に要請される受容体結合性部位も含有する。
【００３７】
当技術分野では、抗原マッチ／ミスマッチの決定が、良好に確立されている。業界標準法は、血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイであり、これは、ＨＡの抗原性を決定するための選択の基盤として使用されており、ＷＨＯの標準アッセイとなっている。標準プロトコールは、ウイルスを感染させたナイーブフェレットによる抗血清の作出を伴う。本質において、ＨＩは、免疫血清が、赤血球表面抗原に対する受容体を伴う多価ウイルスによる細胞の架橋により引き起こされる、赤血球の凝集を遮断する能力を測定する。高いＨＩ遮断抗体力価は、大きな中和応答と相関する。「一元」ＨＩでは、Ａ型ウイルス感染に由来する血清を、Ａ型ウイルスおよびＢ型ウイルスに対するＨＩで使用するのに対し、「二元」ＨＩでは、Ａ型ウイルス感染に由来する血清を、Ａ型ウイルスおよびＢ型ウイルスに対するＨＩで使用し、Ｂ型ウイルス感染に由来する血清を、Ａ型ウイルスおよびＢ型ウイルスに対するＨＩで使用する。
【００３８】
抗原近縁性の概念をさらに例示するために、下記の表１は、以下のウイルス：ＷＩ／０５（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５）；ＮＹ／０４（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４）；ＷＹ／０３（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３）；およびＰＭ／９９（Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９）の近縁性を示す、完全な「二元」表を示す。
【表１】
2018524323.tif 000002
【００３９】
業界標準法により、ＨＩにおける差違が≦４倍のウイルスは、「類似する」（すなわち、抗原的に類似する）（例えば、ＷＹ／０３およびＰＭ／９９）と考えられる。ＨＩアッセイは本質的に、ＨＡが抗原性に寄与するエピトープの、（ｉ）存在、（ｉｉ）接近可能性、および（ｉｉｉ）免疫優勢を測定する。したがって、ＨＩとは、抗原が、免疫応答を惹起する可能性が高いのかどうかを決定する機能的アッセイであり、抗原近縁性（例えば、マッチまたはミスマッチ）についての情報をもたらす。上記の表１を使用してさらに例示すると、ＷＩ／０５が、ＰＭ／９９と共有され、これにより接近可能な免疫優性エピトープに対する応答を惹起しうる（ＨＩ＝１，２８０）のに対し、ＰＭ／９９は、ＷＩ／０５と共有され、これにより接近可能な免疫優性エピトープに対する応答を惹起しない（ＨＩ≦２０）．
【００４０】
より近年になって、インフルエンザウイルスの、ある特定の株またはクレードのＨＡは、赤血球に良好に結合しないことが明らかとなっている。信頼できるＨＩアッセイは、ウイルスのＨＡが、赤血球に結合する能力（血球凝集）を要請するため、このようなウイルスは、標準的なＨＩアッセイで調べることができない。
【００４１】
マイクロ中和（「ＭＮ」）アッセイは、ウイルスの抗原性を特徴付けるための代替的手段である。ＨＩアッセイは、ウイルスのＨＡが、赤血球を凝集させることが可能な場合に限り有用であるので、特に、赤血球に十分に結合する能力を伴うＨＡを有さない、ある特定のウイルスについては、ＭＮアッセイを、ＨＩアッセイの代わりに使用することができる。例えば、３Ｃ．２Ａウイルスなど、ある特定のＨ３Ｎ２ウイルスは、それらのＨＡにより赤血球に結合することがない。したがって、一部の好ましい実施形態では、このようなウイルスに由来する抗原の抗原マッチを、ＭＮアッセイにより決定する。
【００４２】
ＭＮアッセイは、ヒト血清中または動物血清中のインフルエンザウイルスに対するウイルス特異的中和抗体を検出するための、高感度かつ高特異度のアッセイである（参考文献：WHO  Global  Influenza  Surveillance  Network:  Manual  for  the  laboratory  diagnosis  and  virological  surveillance  of  influenza、２０１１年、ISBN  978  92  4  154809  0；http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/44518/1/9789241548090_eng.pdfにおいて閲覧可能である）。ＭＮアッセイは、インフルエンザウイルスＨＡに対する血清中和抗体は、ＭＤＣＫ細胞への、ウイルスの感染を阻害するという仮定に基づく。ＭＤＣＫ細胞を添加する前に、系列希釈された血清を、標準化量のウイルスと共にプレインキュベートする。一晩にわたるインキュベーションの後、細胞を固定し、ウイルス感染細胞の存在を、抗インフルエンザヌクレオタンパク質ＥＬＩＳＡまたはプラーク低減法により検出する。感染性の非存在は、陽性の中和反応を構成し、ウイルスに結合しうる、血清試料中の特異的抗体の存在を指し示す。中和力価は、ウイルス感染が遮断されるときの、血清の最高希釈率の逆数として表される。被験血清が、２つのウイルスに対して、同様の中和力価をもたらす場合、これは、被験血清中の抗体が、いずれのウイルスとも効果的に交差反応することを意味することから、２つのウイルスは、抗原近縁であることが示唆される。
【００４３】
したがって、下記で説明される通り、当業者は、標準的なアッセイを使用して、１つのインフルエンザ抗原またはワクチンが、別の抗原またはワクチンより、基準株（例えば、蔓延株）に、緊密に抗原的にマッチするのかどうかを評価することができる。抗原マッチは、ＨＩアッセイを使用して決定することができる。代替的に、または加えて、抗原マッチは、ＭＮアッセイを使用して決定することができる。アッセイにおいて、同一な条件下で、第２のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体と比較して、高度な交差反応を示す場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に、緊密に抗原的にマッチする。
【００４４】
場合によって、抗原ミスマッチは、来るべきシーズンにおいて、どのウイルスが、疾病を引き起こす可能性が最も高いのかについての不正確な予測からも生じうる。季節性流感ワクチン中のウイルスは毎年、ウイルスについての監視ベースの予報に基づき選択され、ＷＨＯも、インフルエンザワクチンへの組入れのための、特異的なワクチンウイルスを推奨するが、ここで、各個別の国は、その国内で認可されたインフルエンザワクチン中に、どの株を組み入れるべきかについて、その独自の決定を下す。それに基づき、ワクチン製造元により、常用季節性インフルエンザワクチンが作製される、「推奨」株（または「基準」株）は、流感シーズン中に蔓延する優勢株と異なる場合がある。しかし、場合によって、ＷＨＯからの適正な推奨に従い製造されたインフルエンザワクチンがやはり、低効能ワクチンを結果としてもたらす場合もある。これは部分的に、卵馴化と称する現象に起因する。卵馴化は、ウイルスを卵内で繁殖または増殖させる場合に、卵特異的な遺伝子選択に起因して生じうる。ここで、ウイルスは、宿主の細胞内環境および遺伝子的バックグラウンドに適応しなければならず、この結果として、卵ベースのシステム内で調製されたウイルス抗原と、蔓延ウイルスまたは推奨ウイルスの対応する抗原との抗原ミスマッチがもたらされる。
【００４５】
加えてまたは代替的に、一部の状況では、推奨株は、卵ベースのシステムでは、良好に増殖することができない場合がある。実際、インフルエンザウイルスの、ある特定のクレードは、卵内で増殖不良であることが公知である。これらの状況では、卵ベースのワクチンの作製に順応するために、異なるが近縁のウイルス、例えば、異なるが近縁のクレードに由来するウイルスが、流感ワクチンを製造するために選択および推奨される場合がある。これは、抗原ミスマッチを引き起こしうる、クレードミスマッチを結果としてもたらす。
【００４６】
これらの問題に対応するために、本開示は、卵ベースのワクチンが提供できない免疫防御を達成するように改善された抗原マッチを可能とする、卵ベースでないワクチンを提供する。
【００４７】
卵非含有種ウイルス
上記で既に言及した通り、インフルエンザワクチンシステムは、インフルエンザウイルスの天然の進化に応答するように開発されているが、ある特定の年には、抗原ミスマッチの問題が、難題であり続けている。ある年には、ミスマッチは、ワクチン株の選択が既になされた後で、蔓延ウイルスの抗原ドリフトに起因して自然発生する。他の年には、ミスマッチは、候補ワクチンウイルスのための出発材料としての卵馴化分離株の使用に依拠する、現行のシステムの一部として導入される。既存の問題の源泉を認識し、ワクチンウイルスを制作するための現行の工程を転換することは、公衆衛生の改善に向けて、大きな価値を有しうる。
【００４８】
ワクチン製造における、いわゆる合成種ウイルス技術の使用については、（例えば、ＷＯ２０１４／１１５１０４；ＷＯ２０１３／０８７９４５；ＷＯ２０１４／０８６７３２；ＷＯ２０１４／１４１１２５；およびＷＯ２０１４／１９５９２０を参照されたい）において既に記載されている。例えば、ワクチン用に承認されたＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系において、ウイルスレスキュー効率および抗原収率を増大させる、新規の高増殖骨格を使用して、インフルエンザウイルスを迅速に作出するために、合成手法を援用することができる（参考文献１２４）。
【００４９】
本発明の発明者らは、この技術はまた、遺伝子合成のために使用される、ヘマグルチニン（ＨＡ）配列およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）配列に応じて、意図される基準ウイルス（例えば、蔓延株にマッチするウイルス）への抗原マッチを維持するウイルスを作製するのにも使用されうるという考えについても調べた。
【００５０】
本明細書で開示される作業結果（実施例を参照されたい）は、この手法の一般的有用性を裏付ける。略述すると、最近の分離株に由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して、合成ウイルスのパネルを作出する。血球凝集阻害試験により査定される通り、合成ウイルスは、従来型の、卵により繁殖させた基準株または細胞により繁殖させた基準株と、抗原的に類似することが示される。重要なことは、新規の骨格の、抗原性に対する影響がないことから、この合成手法が一般に、卵ベースのワクチン製造プラットフォームおよび細胞ベースのワクチン製造プラットフォームのいずれのためにも効率的に、良好にマッチしたウイルス候補物質をもたらすのに適すると示唆されることである。抗原作製のための細胞培養技術と組み合わせる場合、非卵馴化原型に由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して作出される合成ウイルスは、現行の季節性インフルエンザワクチンを難化させる、抗原ミスマッチ問題を低減する一助となりうる。本明細書で記載される合成種ウイルス手法は特に、馴化を受けやすく、よって、抗原ドリフティングを受けやすい、ある特定のクレード／株に適する。
【００５１】
本明細書でさらに詳述される通り、例えば、細胞培養物中で維持された野生型３Ｃ．２Ａウイルスは、宿主細胞または赤血球（ＲＢＣ）における、受容体結合特性を変化させうる、ＨＡ突然変異および／またはＮＡ突然変異を示す。このような突然変異は、現在のところ、細胞馴化と考えられている（例えば、Chambersら（２０１４年）、J  Virol.、８８巻（１８号）：１０９８６〜９頁；Leeら（２０１３年）、PLoS  One、８巻（１１号）：ｅ７９２５２頁；およびMohrら（２０１５年）、Virol  J.、１２巻：６７頁を参照されたい）。
【００５２】
しかし、予期に反して、本明細書で提示されるデータは、顕著に異なる問題の源泉を指摘し、代わりに、元の分離株内の混合種の存在が、その後の抗原ドリフティングへの、重要な寄与因子である可能性が高いことを指し示す。本発明者らは、規定された配列により制作される合成ウイルスの使用が、かつて、宿主細胞環境への馴化（例えば、細胞馴化）として考えられた、同様の変化を回避しうることを見出した。さらに、本明細書で提示されるデータは、ある特定の合成骨格を、高ＨＡ力価を達成するのに、信頼できる形で援用しうることも裏打ちする。したがって、本発明は、野生型分離株より抗原ドリフティングを受けにくい、改良型種ウイルス、候補ワクチンウイルス（ＣＶＶ）、または基準株を提供する。
【００５３】
したがって、一態様では、本発明は、改良型候補ワクチンウイルス、および合成種ウイルスを使用して、候補ワクチンウイルスをもたらす関連する方法を包含する。
【００５４】
合成種ウイルス技術を使用して、ワクチン（例えば、本明細書で規定されるワクチン）を作製するのに使用されうる種ウイルスの、遺伝子的に均質な調製物を得ることができる。したがって、本発明はまた、細胞培養物など、卵ベースでない宿主系内で継代培養された改良型種ウイルスも含む。適切な細胞培養物は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞などの真核細胞を含む（本明細書でさらに論じられる）。このような合成種ウイルスは、それらが、遺伝子的に安定であり、典型的に、卵内で継代培養されたウイルスより高力価まで増殖することによって特徴付けられる。本明細書で使用される遺伝子安定性とは、細胞培養物中の、数ラウンドにわたる継代培養、例えば、２、３、４、５、または６代にわたる継代培養の後における、突然変異／馴化への耐性を指す。このような種ウイルスはさらに、各調製物が、遺伝子的に均質なウイルス集団（従来型の種ウイルス調製物における場合でありうる、混合型（すなわち、不均質）亜集団と対比される）からなることによっても特徴付けられる。本明細書で使用される合成種ウイルス調製物は、ＤＮＡサンガーシーケンシング（であり、必ずしも、次世代ディープシーケンシングではない）に基づき、遺伝子的に均質であると決定することができる。遺伝子的に均質な合成種ウイルス調製物は、遺伝子的に１００％「純粋」ではない場合がある。実際、細胞内の単一ラウンドの継代培養も、少量の配列多様性をもたらしうる。したがって、遺伝子的に均質な合成種ウイルス調製物は、低比率（例えば、１０％未満、より好ましくは５％、３％または１％未満）の、集団内の優勢合成ウイルスと遺伝子的に同一ではない合成ウイルスを含有しうる。
【００５５】
したがって、本発明は、ワクチン（これは、本発明に従う使用のためのインフルエンザワクチンでありうる）を製造するための方法であって、合成種ウイルスを卵内で継代培養しない卵非含有工程内で、合成種ウイルスを調製するステップを含む方法を含む。好ましい実施形態では、合成種ウイルス（これは、本明細書で規定される、第２のインフルエンザワクチンの抗原でありうる）から調製される抗原は、卵ベースの対応物（例えば、本明細書で規定される、第１のインフルエンザワクチン）に由来する抗原と比較して、より、基準株（例えば、蔓延株）に、緊密に抗原的にマッチする。特に有用な実施形態では、合成種ウイルスを、（ｉ）卵馴化を受けやすい株；および／または（ｉｉ）赤血球に良好に結合しないＨＡを有する株から分離する。「赤血球に良好に結合しない」という表現は、この特定のウイルス株／クレードのＨＡが、標準的なＨＩアッセイを信頼できないものとするように、赤血球に対して、小さなアフィニティーを有することを意味する。
【００５６】
一部の実施形態では、ワクチンは、Ｈ３Ｎ２株および／またはＢ株に由来する抗原を含む。一部の実施形態では、抗原は、ＨＡ、ＮＡ、またはこれらの組合せである。
【００５７】
したがって、本発明は、遺伝子的に均質なウイルス集団を含む種ウイルス調製物であって、遺伝子的に均質なウイルス集団のＨＡを、遺伝子的に規定された配列から合成により調製したことによって特徴付けられる種ウイルス調製物を提供する。本発明はまた、種ウイルス調製物の、組成物の製造における使用も包含する。関連する実施形態では、本発明は、遺伝子的に均質なウイルス集団を含む種ウイルス調製物であって、遺伝子的に均質なウイルス集団の抗原を、遺伝子的に規定された配列から、合成により調製したことによって特徴付けられる種ウイルス調製物を制作するステップを含む工程により制作されるワクチンを提供する。好ましい実施形態では、抗原は、ＨＡ、ＮＡ、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、ワクチン製造工程の全体を通して、ウイルスが卵内で継代培養されないように、ワクチンを、卵非含有工程内で製造する。遺伝子的に規定された配列は、例えば、本明細書で記載される通りに分離されうる、細胞ベースの分離株のＨＡ配列でありうる。
【００５８】
したがって、上記で記載した合成種ウイルスを、本明細書で規定される、組成物、第２のインフルエンザウイルスワクチン、レスキューワクチン、またはハイブリッドワクチンを製造するために使用することができる。本発明における使用のための合成種ウイルスは、卵非含有工程内で製造することができ、卵内で継代培養していない場合もある。好ましくは、合成種ウイルスは、細胞培養物中で増殖させる。
【００５９】
合成種ウイルスは、基準インフルエンザウイルス株（例えば、蔓延ウイルス株）の分離株に由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して作出することができる。好ましい実施形態では、分離株を、卵馴化させない。さらに、分離株は、好ましくは細胞培養物中で（例えば、ワクチンの作製に適格な哺乳動物細胞系内で）分離する。分離株は、卵ベースの高増殖遺伝子再集合体ではない場合もある。
【００６０】
分離株は、好ましくは蔓延株の分離株である。例えば、分離株は、所与のインフルエンザシーズンに優勢な蔓延インフルエンザ株のリスト（例えば、ＷＨＯおよび／またはＦＤＡにより公表されるリスト）に含まれうる。分離株は、１または複数の世界保健機構（ＷＨＯ）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃｅｎｔｅｒｓにより、臨床試料から分離されうる。
【００６１】
分離株は、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすいクレードまたは株の分離株でありうる。
【００６２】
合成種ウイルスは、典型的には本明細書で記載される逆遺伝学技法を使用して調製する。例えば、ウイルスは、インフルエンザウイルスタンパク質（ＨＡおよびＮＡ以外の）をコードするウイルスゲノムセグメントのセットを含むウイルス骨格を使用して調製することができる。合成種ウイルスが、Ａ型株のウイルス（例えば、Ｈ３Ｎ２ウイルス）である場合、合成種ウイルスは、ＰＲ８、ＰＲ８ｘ、＃１９、および＃２１から選択される骨格を使用して調製することができる。一部の好ましい実施形態では、株は、Ｈ３Ｎ２株であり、骨格は、ＰＲ８ｘである。合成種ウイルスが、Ｂ型株のウイルス（例えば、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統に由来する株）である場合、合成種ウイルスは、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に由来する６つの骨格セグメント全てを含む骨格を使用して調製することができる。
【００６３】
レスキューワクチン
別の態様では、本発明は、本明細書で、レスキューワクチンとして言及されるようなワクチンを提供する。レスキューワクチンは、所望の有効性を欠くことが示されている常用季節性ワクチンを補完する是正措置として、例えば、同じ流感シーズン中に製造することができる。したがって、常用季節性ワクチンは、従来通り、ＷＨＯ推奨に従い作製することができ、ワクチン接種のために市販される。その後、このような常用ワクチンが、抗原ミスマッチに起因して、ほとんど効果的でない、例えば、５０％またはこれ未満のＶＥ（ワクチン有効性）を有することが観察されたまたは決定される場合、レスキューワクチンを、同じ流感シーズン中に、蔓延ウイルスへの良好な抗原マッチをもたらす、卵ベースでない調製物による事後措置として作製することができる。したがって、レスキューワクチンは、卵を伴わずに、調製するかまたは繁殖させることが想定される。
【００６４】
一部の実施形態では、レスキューワクチンは、（ａ）鳥類細胞培養物および哺乳動物細胞培養物など、細胞培養物ベースの調製物中で作製される抗原；（ｂ）組換えタンパク質ベースの抗原；（ｃ）抗原をコードするＲＮＡレプリコン（例えば、自己増幅ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、レスキューワクチンは、その任意の組合せを含む。レスキューワクチンは、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの、１つ、１つを超える、または全てを含みうる。組換えタンパク質ベースの抗原は、組換えにより発現させた抗原でありうる。本発明に従い、抗原は、インフルエンザ抗原である。
【００６５】
上記で指し示した通り、本発明は、宿主細胞内で調製される抗原を含むレスキューインフルエンザワクチンであって、抗原が、蔓延インフルエンザウイルスの抗原（例えば、蔓延株の抗原）に対して、同じインフルエンザシーズンの早期に利用可能な、季節性インフルエンザワクチンであり、蔓延インフルエンザウイルスに対するワクチン有効性が≦５０％である、季節性インフルエンザワクチンより大きな（すなわち、緊密な）抗原マッチを有する、レスキューインフルエンザワクチンを提供する。抗原は、本明細書で記載される、卵内で継代培養されていない抗原でありうる。季節性インフルエンザワクチンは、本明細書で記載される第１のインフルエンザワクチンでありうる。
【００６６】
上記で論じた通り、合成種ウイルスを使用して、本発明のレスキューワクチンを作製することができる。合成種ウイルスは、本明細書で提供される合成種ウイルスでありうる。合成種の調製は、迅速であることが可能であり、一時的な調整も可能とする。さらに、合成種ウイルス技術の使用は、遺伝子安定性に寄与しうる、種ウイルスの遺伝子的に均質な調製を可能とする。これに対して、従来型の種ウイルス調製物は、時間経過にわたり（例えば、継代培養を介して）より優勢な、ある特定の亜集団へとシフトする、ウイルス配列の遺伝子的に不均質な（例えば、混合された）集団を含有しうる。このようなイベントにおいて、結果として得られる、種ウイルス調製物中で優勢な亜集団は、基準株内で優勢な元の亜集団と異なる。
【００６７】
本発明のレスキューワクチンは、一価インフルエンザワクチンでありうる。一部の実施形態では、常用季節性ワクチン（典型的に、三価または四価）は、このような製品に含まれる株のうちの１つの抗原が、抗原的にミスマッチしていることを示しうる。その後、マッチ抗原を提供する一価レスキューワクチンを作製し、同じ流感シーズン内に免疫防御を提供するように、利用可能とすることができる。万一、常用季節性ワクチン（典型的に、三価または四価）が、このような製品に含まれる、１つを超える株の抗原は、蔓延ウイルスに対して抗原的にミスマッチしていることを示す場合、これに応じて、１つを超えるマッチ抗原を含むように、レスキューワクチンを作製することができる。したがって、レスキューワクチンは、例えば、二価レスキューワクチンでありうる。同様に、万一、常用季節性ワクチン（典型的に、三価または四価）が、このような製品に含まれる、１つの（または複数の）株の抗原は、蔓延ウイルスに対して抗原的にミスマッチしていることを示す場合、これに応じて、１つの（または複数の）マッチ抗原を含むように、レスキューワクチンを作製することができる。したがって、レスキューワクチンは、一価レスキューワクチンでありうる。
【００６８】
本発明のレスキューワクチンは、アジュバント処理されていない場合もあり、アジュバント処理されている場合もある。アジュバント処理されたレスキューワクチンについての一部の実施形態では、レスキューワクチンは、低用量抗原を要請しうる。この文脈における「低用量」とは、対象において、統計学的に許容可能な免疫応答を誘発するのに要請される投与１回当たりの抗原の量が、標準量未満であることを意味する。典型的には、標準的な季節性インフルエンザワクチンは、各剤形中、株１つ当たり約１５μｇのＨＡを含有する。したがって、「低用量」ワクチンは、株１つ当たり約１５μｇ未満、例えば、約１２μｇ、約９μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．７５μｇのＨＡを含有しうる。一部の実施形態では、アジュバント処理されたレスキューワクチンは、対象において、それ以外では同じ成分を含有する、アジュバント処理されていないレスキューワクチンと比較して、迅速な免疫応答をもたらしうる。レスキューワクチンが、ある程度の抗原ミスマッチ（卵ベースのワクチンより低度ではあるが）をなおも含有しうる状況下では、このようなレスキューワクチンは、完全未満の抗原マッチではあるが、患者において、広範な免疫防御（例えば、交差防御）を可能とするように、アジュバント処理することができる。総じて、アジュバントは、より頑健な応答を作出することができ、優勢エピトープおよび亜優勢エピトープに対する全体的な力価を増大させうる。
【００６９】
したがって、アジュバント処理されたレスキューワクチンは、対象において、それ以外では同じ成分を含有する、アジュバント処理されていないレスキューワクチンと比較して、迅速な免疫応答をもたらすことが可能であり、加えて、抗原節約効果ももたらしうる。一部の好ましい実施形態では、レスキューワクチン（または本明細書で規定される、第２のインフルエンザワクチン）は、特に、それが、蔓延株と比較して、ある程度の抗原ミスマッチを伴う抗原を含有する場合、アジュバント処理される。ミスマッチの程度は、例えば、蔓延株に対するＨＩ力価の、相同ウイルス力価と比較して、４倍、３倍、２倍、または１倍の差違により指し示すこともでき、蔓延株に対するＭＮ力価の、相同ウイルス力価と比較して、２倍または１倍の差違により指し示すこともできる。
【００７０】
本発明のレスキューワクチンは、流感シーズンの早期に常用季節性流感ワクチンを既に投与されたヒト対象の免疫化に適する。本発明のレスキューワクチンは、流感シーズンのより早期に、常用季節性流感ワクチンを投与されていないヒト対象の免疫化に適する。レスキューワクチンを使用して、健常対象、危険性がある対象、および／または免疫障害対象を免疫化することができる。レスキューワクチンを使用して、老齢集団および小児集団を含む、多様な年齢群の対象を免疫化することができる。適切な年齢群については、本明細書でさらに記載する。
【００７１】
ハイブリッドワクチン
別の態様では、本発明は、ハイブリッドワクチンと、これを作製するのに活用されうる、任意の中間組成物とを提供する。本明細書で使用される「ハイブリッドワクチン」とは、作製手段（例えば、供給源またはシステム）の異なる、２つまたはこれを超える抗原を含有するワクチン組成物を指す。例えば、「ハイブリッドワクチン」は、異なる作製プラットフォームから作製される、２つまたはこれを超える抗原を含有しうる。したがって、ハイブリッドワクチンは、１または複数の卵ベースの抗原、１または複数の細胞培養物ベースの抗原、１または複数の組換えタンパク質抗原、１または複数のＲＮＡレプリコンなどの任意の組合せを含有しうる。好ましくは、このような抗原を、ヒト対象における投与に適する単一の製剤として提供する。しかし、ある特定の実施形態では、所望される抗原の完全パネルを、複数の製剤として投与することもできる。例えば、複数の製剤のうちの少なくとも１つは、レスキューワクチン（上記を参照されたい）でありうる。本発明に従い、抗原は、インフルエンザ抗原である。
【００７２】
本発明に従い、ハイブリッドワクチンは、卵非含有工程において調製される抗原を含むように作製することができる。卵非含有工程は、細胞培養、組換え発現系、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡレプリコンの転写などでありうる。これは、特に、蔓延する疾病原因ウイルスであることが予測されるウイルス株のうちの１または複数が、卵馴化を受けやすいことが公知のウイルス株である場合、および／またはある特定のクレードが、卵内で増殖不良であることが公知である場合に適しうる。これはまた、ある特定のクレードまたは株に由来するＨＡが、赤血球に結合せず、かつ／または赤血球を凝集させることが可能でない（例えば、ＨＩアッセイにおいて）場合にも、特に適しうる。一部の実施形態では、このようなウイルス株は、Ｈ３Ｎ２であるかまたはこれを含む。代替的にまたは加えて、このようなウイルスクレードは、クレード３Ｃ．３Ａまたはクレード３Ｃ．２Ａであるかまたはこれを含む。このような株またはクレードのさらなる例については、本明細書で記載する。
【００７３】
一部の実施形態では、クレードの卵馴化バージョンが、抗原ミスマッチを結果としてもたらすのに対し、細胞バージョンは、より大きな抗原マッチを結果としてもたらす。一部の実施形態では、卵馴化が、グリコシル化の喪失など、ＨＡのヘッド領域におけるグリコシル化パターンの変化を介して、抗原ミスマッチを結果としてもたらすのに対し、細胞バージョンにおいて抗原性に関与性のグリコシル化パターンは保存され、したがって、抗原マッチを維持する。関与性のグリコシル化部位とは、抗原の抗原性に寄与する部位、例えば、エピトープの存在、接近可能性、および／または免疫優勢に影響を及ぼす部位である。例えば、クレード３Ｃ．２Ａは、卵馴化時に、鍵となるＨＡ糖を喪失するが、これは、抗原ミスマッチに随伴しうる。ある特定のＢ株は、卵馴化時に、鍵となるＨＡ糖を喪失し、可能な抗原ミスマッチをもたらすことが報告されている（例えば、参考文献１１９を参照されたい）。抗原ミスマッチおよびより大きな抗原マッチは、本明細書で記載される通り、ＨＩまたはＭＮにより（例えば、それぞれ、相同ウイルス力価と比較して、蔓延株に対するＨＩ力価の＞４倍の差違により、および蔓延株に対するＨＩ力価の≦４倍の差違により）決定することができる。
【００７４】
本発明は、来るべきシーズン中に疾患原因となることが予測される１または複数の株が、抗原マッチを達成する卵ベースの作製のために、不良の候補物質であると考えられる場合、結果として得られるワクチン中で、抗原マッチを達成しうるように、このような株を、卵非含有システムにより作製することを想定する。一部の実施形態では、したがって、卵非含有工程で作製される、１または複数の抗原を、任意選択で、卵内で作製される、１または複数の抗原と組み合わせることができる。したがって、本発明は、作製方法の２つまたはこれを超える供給源に由来する、２つまたはこれを超える抗原（例えば、卵ベースの抗原；細胞培養物ベースの抗原、組換え抗原、ＲＮＡレプリコンなど）を含む製剤（例えば、ハイブリッドワクチン）を作製するように、さらなる抗原と組み合わされる中間体成分でありうる、卵を伴わずに作製される抗原を含む組成物を提供する。
【００７５】
したがって、本発明のハイブリッドワクチンは、（ｉ）卵ベースの調製物に由来するウイルス抗原；（ｉｉ）細胞培養物ベースの調製物に由来するウイルス抗原；（ｉｉｉ）組換えタンパク質調製物に由来するウイルス抗原；および（ｉｖ）ウイルス抗原をコードするＲＮＡレプリコンからなる群から選択される、２つまたはこれを超える成分を含みうる。ウイルス抗原は、インフルエンザ抗原でありうる。ハイブリッドワクチンは、三価または四価でありうる。ハイブリッドワクチンはさらに、アジュバントも含みうる。細胞培養物ベースの調製物は、哺乳動細胞ベースの調製物または鳥類細胞ベースの調製物でありうる。「細胞培養物ベースの調製物」とは、細胞培養物中で増殖させた抗原を指す。
【００７６】
卵ベースの調製物に由来するウイルス抗原（ｉ）は、卵内で継代培養したウイルス抗原でありうる。卵非含有工程内で調製されるウイルス抗原は、細胞培養物ベースの調製物に由来する抗原、組換えタンパク質調製物に由来するウイルス抗原、および／またはＲＮＡレプリコンによりコードされる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ウイルス抗原でありうる。典型的には、卵ベースの調製物に由来するウイルス抗原（ｉ）は、本明細書で記載される通り、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすくない株またはクレードに由来する。好ましい実施形態では、卵非含有工程内で調製されるウイルス抗原（（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および／または（ｉｖ））は、本明細書で記載される通り、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい株またはクレードに由来する抗原である。代替的にまたは加えて、卵非含有工程内で調製されるウイルス抗原は、本明細書で記載される通り、赤血球に結合せず、かつ／または赤血球を凝集させることが可能でない（例えば、ＨＩアッセイにおいて）株またはクレードに由来する抗原である。本明細書で記載されるハイブリッドワクチンでは、卵非含有工程内で調製されるウイルス抗原は、インフルエンザ抗原（例えば、第２のインフルエンザワクチン中またはレスキューワクチン中の）であることが可能であり、好ましくは基準ワクチン中の対応する抗原より、蔓延インフルエンザ株に、緊密に抗原的にマッチする。基準ワクチンは、本明細書で規定される、第１のインフルエンザワクチンであることが可能であり、かつ／または卵内で継代培養されている可能性がある。基準ワクチンは、例えば、所与のインフルエンザシーズン中のより早期に利用可能とされるワクチンでありうる。抗原マッチの相対的程度は、本明細書で記載される通りに（例えば、ＨＩアッセイおよび／またはＭＮアッセイにより）決定することができる。代替的に、または加えて、本明細書で記載されるワクチン中で使用される、卵ベースの調製物（例えば、卵馴化クレードまたは卵馴化株）に由来する抗原は、蔓延株に対して、≦５０％のワクチン有効性を呈示しうるが、細胞培養物中で増殖させた抗原（任意選択で、卵内で継代培養されていない）は、＞５０％のワクチン有効性を呈示しうる。
【００７７】
免疫化方法
本発明は、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンによるワクチン接種に続いて、細胞培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンによるワクチン接種を施すワクチン接種レジメを提供することにより、既存の抗原ミスマッチ問題を克服することを目的とする。ヒト蔓延インフルエンザ株に、より緊密に抗原的にマッチさせた第２のワクチンを使用することにより、本発明の方法は、とりわけ、ミスマッチインフルエンザ株の組入れに起因して、常用季節性ワクチンの効能が、最適未満である状況におけるインフルエンザに対する良好な防御を提供する。
【００７８】
したがって、本発明は、ヒトを免疫化するための方法であって、（ａ）ヒトへと、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンを投与するステップと；その後、（ｂ）同じヒトへと、細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを投与するステップとを含み、第２のインフルエンザワクチン中の抗原が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延インフルエンザ株に抗原的に緊密にマッチしている、方法を提供する。
【００７９】
また、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンを既に投与されているヒトを免疫化するための方法であって、同じヒトへと、細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを投与するステップを含み、第２のインフルエンザワクチン中の抗原が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている、方法も提供される。代替的に、または加えて、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を、卵内で継代培養していない場合もある。
【００８０】
本発明はまた、いずれかの先行する請求項の方法によるヒトの免疫化における使用のための、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチン、および細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンも提供する。
【００８１】
さらに、細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンを施されるヒトを、あらかじめ免疫化するための、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンであって、第２のインフルエンザワクチン中の抗原が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている、第１のインフルエンザワクチンも提供される。
【００８２】
また、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザワクチンを既に施されているヒトの免疫化における使用のための、卵内で継代培養されていない、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチン（例えば、細胞培養物中で増殖させた）であって、第２のインフルエンザワクチン中の抗原が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている、第２のインフルエンザワクチンも提供される。
【００８３】
２つのインフルエンザワクチンを、同じインフルエンザシーズン中に投与する。第２のインフルエンザワクチンは、第１のインフルエンザワクチンの、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、または５カ月後に投与することができる。好ましくは、第２のインフルエンザワクチンを、第１のインフルエンザワクチンの３カ月後以内に投与する。
【００８４】
本発明はまた、（ｉ）卵内で継代培養した、第１のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第１のインフルエンザワクチンと；（ｉｉ）細胞培養物中で増殖させた、第２のインフルエンザウイルスに由来する抗原を含む、第２のインフルエンザワクチンとを含み、第２のインフルエンザワクチン中の抗原が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしているキットも提供する。キットは、本発明の方法における、キットの使用のための指示書を含みうる。
【００８５】
インフルエンザ株
ヒトインフルエンザウイルス感染に対する季節性ワクチンを調製するための現行の工程は、以下のステップ：（ａ）蔓延ウイルス株の分離；（ｂ）分離されたウイルスについての、抗原解析および遺伝子解析；（ｃ）来るべきシーズン中の使用のためのウイルス株の選択；（ｄ）遺伝子再集合または逆遺伝学の使用による（または、例えば、下記で言及する通り、遺伝子再集合を要請しない、Ｂ型ウイルスの原型株では、卵内または細胞培養物中の継代培養による）、高増殖種株（すなわち、ＣＶＶ）の調製；（ｅ）ワクチン製造元への種株（ＣＶＶ）の出荷；（ｆ）製造元による、工業生産への株の適性についての査定；および（ｇ）次いで、そこからワクチンが製造される、ウイルス（すなわち、種ウイルスストック）を作製するための、種株の増殖（すなわち、ＣＶＶの継代培養および拡大）を伴う（参考文献１および２）。
【００８６】
この工程のステップ（ａ）〜（ｅ）は、ＦＤＡおよび政府が承認した、国際的なインフルエンザ施設により、典型的には、世界保健機構（ＷＨＯ）の後援下で実施されており、ステップ（ｆ）および（ｇ）は、製造元自身により実施されている。
【００８７】
ステップ（ｄ）および（ｇ）は、ウイルスを、天然でヒトへの感染に適応したウイルスから、工業的増殖条件下で、高力価まで増殖するウイルスへと移行させる。Ａ型インフルエンザウイルスでは、典型的にはステップ（ｄ）は、（ｃ）で選択された株に由来する、ＨＡおよびＮＡをコードするゲノムセグメントと、鶏卵内で効率的に増殖する株に由来する、残りの６つのゲノムセグメントとを含む、６：２の遺伝子再集合体株を創出するステップを伴い、この株は通例、Ａ／ＰＲ／８／３４である。次いで、遺伝子再集合手順に続き、孵化させた卵内で、株の継代培養を反復して、卵馴化および増殖の増強を可能とする。Ｂ型インフルエンザウイルスでは、増殖特徴が良好な原型株は通例、遺伝子再集合体を作出しようと試みることなく、孵化させた卵内の、直接的かつ反復的な継代培養により得られる。場合によって、代わりに、ステップ（ｄ）は、６：２以外の遺伝子再集合体、例えば、５：３または４：４の遺伝子再集合体を創出するステップを伴う場合もある。
【００８８】
したがって、ワクチン製造元への出荷の前に実施されるステップは、卵を介する、インフルエンザウイルスの継代培養を伴う。製造元が、ステップ（ｇ）において、ウイルスを、卵上ではなく、細胞基質上で増殖させる場合であってもなお、ウイルスは、ステップ（ａ）における分離と、ステップ（ｅ）における、製造元による受領との間の一部の段階ではやはり、卵を介して継代培養されているであろう。
【００８９】
抗原が、細胞培養物中または卵内で増殖させたインフルエンザウイルスに由来する場合、これは一般に、ステップ（ｇ）における増殖を指す。したがって、卵内または細胞培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスに由来する抗原は、それぞれ、卵または細胞培養物から採取されたインフルエンザウイルスから調製された抗原を指す。例えば、抗原が、卵内で増殖させたインフルエンザウイルスに由来する場合、インフルエンザウイルスは、卵内で増殖させており、インフルエンザウイルスは、卵から採取されており、抗原は、採取されたインフルエンザウイルスから調製されているであろう。これに対し、ウイルスが、卵内で継代培養されている場合、インフルエンザウイルスは、作製工程中のいかなる段階であっても卵内で増殖させることができる。典型的には、卵の継代培養の後においてであるが、さらなる培養ステップがあり、これらのさらなる培養ステップは、卵内で実行することもでき、細胞培養物中で実行することもできる。
【００９０】
卵内の継代培養ステップは、関連当局により、特に重要であるとみなされている。例えば、北半球における、２００３／０４年のインフルエンザシーズンでは、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様変異体が優勢であったが、使用されたワクチン株は、過去の年に由来するＨ３Ｎ２（Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９）株を含有した。この株は、Ｆｕｊｉａｎ株への抗原マッチが不良であることから、ワクチン有効性の低減をもたらした。Ｆｕｊｉａｎ株は、卵内で継代培養されておらず（参考文献２および３）、抗原的に類似する、卵により分離された株が利用可能でなかったために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により却下された。
【００９１】
効果的なインフルエンザワクチンをもたらすためには、ワクチン中で見出されるインフルエンザ株は、蔓延インフルエンザ株に、可能な限り緊密にマッチする必要がある。ＷＨＯおよびＦＤＡなどの当局は、優勢な蔓延インフルエンザ株のリストを毎年公表し、インフルエンザワクチン中に組み入れるための推奨インフルエンザ株、またはインフルエンザワクチン中に組み入れるための株の選択の指針となる基準株もさらに公表している。
【００９２】
本発明の第１のインフルエンザワクチン中および第２のインフルエンザワクチン中で使用されるインフルエンザ抗原は、蔓延株にマッチする。これは、それらが、前記インフルエンザ株に対する免疫応答を誘発することを可能とするのに必要である。第２のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原は一般に、第１のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原より緊密な、蔓延インフルエンザ株への抗原マッチをもたらすであろう。
【００９３】
抗原的にマッチするインフルエンザ抗原は一般に、同じインフルエンザ亜型（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１）に属するインフルエンザ株に由来し、抗原的に類似する。２つのインフルエンザ抗原が、抗原的にマッチするのかどうかは、例えば、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）アッセイを使用して、容易に決定することができる。特に、２つのインフルエンザ抗原は、それらが、ＨＩアッセイにおいて、高度な交差反応（例えば、４倍未満の力価）を示す場合、抗原的にマッチすると考えられる。
【００９４】
第２のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原は、第１のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原より、蔓延株に、緊密にマッチする。これもまた、当業者が、ＨＩアッセイなどの標準的アッセイにより、容易に決定することができる。代替的に、または加えて、ＭＮアッセイも使用することができる。
【００９５】
例えば、第２のインフルエンザ抗原が、蔓延株に抗原的により緊密にマッチするのかどうかについて評価するために、非ヒト動物（フェレットまたはマウスなど）に、生ウイルスを感染させるか、または第１のインフルエンザ抗原もしくは第２のインフルエンザ抗原を注射する。インフルエンザ抗原に対する抗体を発生させるのに十分な時間の後、血液を、非ヒト動物から抽出し、血清を調製し、系列希釈（例えば、１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、１：３２０、１：６４０、１：１２８０、１：２５６０、１：５１２０、１：１０２４０、および１：２０４８０の系列）にかける。次いで、等容量の各希釈点を、赤血球および蔓延インフルエンザ株と組み合わせるが、この場合、赤血球の最終濃度と、蔓延インフルエンザ株の最終濃度とは、各希釈液について同じとなる。次いで、反応物を、血球凝集について、注意深くモニタリングする。抗体が血球凝集をやはり阻害する希釈率が大きいほど、抗原は、蔓延株に良好にマッチしうると考えられる。したがって、第１のインフルエンザ抗原に対する抗体が、やはり血球凝集を阻害する最高希釈率と、第２のインフルエンザ抗原に対する抗体が、やはり血球凝集を阻害する最高希釈率とを比較することにより、いずれの抗原が、蔓延株により緊密にマッチするのかを決定することができる。
【００９６】
抗原マッチは、非ヒト動物に、目的の抗原（例えば、第１のインフルエンザ抗原または第２のインフルエンザ抗原）を含有する生ウイルス（第１のウイルスまたは第２のウイルス）を感染させることにより評価することができる。例えば、生ウイルスは、そこから、第１のインフルエンザワクチンまたは第２のインフルエンザワクチンを製造しうる、種ウイルス株でありうる。
【００９７】
ＨＩアッセイにおいて、同一な条件下で、第２のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体と比較して、高度な交差反応を示す場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている。特に、ＨＩアッセイを使用して、同一な条件下で、第２のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体が血球凝集を阻害しうる最高希釈率が、第１の抗原に対して惹起される抗体が血球凝集を阻害しうる最高希釈率と比較して高値である場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている。例えば、第２のインフルエンザ抗原に対して惹起される抗体が、１：２５６０の希釈率まで血球凝集を阻害しうるのに対し、第１のインフルエンザ抗原に対する抗体が血球凝集を阻害しうるのが、１：１２８０の希釈率までに過ぎない場合、第２のインフルエンザ抗原は、より緊密に抗原的にマッチすると考えられるであろう。この文脈における「同一な」とは、この抗体は、個別の抗原に対して惹起されることになるので、アッセイにおいて使用される抗体を除き、全ての条件が同一であることを意味することが理解される。
【００９８】
好ましい例では、同一な条件下で、第２のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体が蔓延株による血球凝集を阻害しうる最高希釈率が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体が蔓延株による血球凝集を阻害しうる最高希釈率より、蔓延株に対して惹起される抗体が蔓延株による血球凝集を阻害しうる最高希釈率に近い（すなわち、相同ウイルス力価に近い）場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている。
【００９９】
第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、例えば、蔓延株に対するＨＩ力価の、相同ウイルス力価と比較して≦４倍の差違を示しうる。一部の好ましい実施形態では、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、蔓延株に対するＨＩ力価の、相同ウイルス力価と比較して４倍未満の差違（例えば、≦３倍、≦２倍、１倍の差違）を示すであろう。さらに好ましい実施形態では、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、蔓延株に対するＨＩ力価の、相同ウイルス力価と比較して≦２倍の差違を示すであろう。
【０１００】
第１のインフルエンザワクチン中の抗原は、例えば、蔓延株に対するＨＩ力価の、相同ウイルス力価と比較して＞４倍の差違を示しうる。
【０１０１】
代替的に、または加えて、同一な条件下で、第２のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体についての、蔓延株に対するＭＮ中和力価が、第１のインフルエンザワクチン中の抗原に対して惹起される抗体についての、蔓延株に対するＭＮ中和力価より、相同ＭＮ力価に近い場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より、蔓延株に抗原的に緊密にマッチしている。
【０１０２】
第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、例えば、蔓延株に対するＭＮ力価の、相同ＭＮ力価と比較して≦２倍の差違を示しうる。
【０１０３】
第１のインフルエンザワクチン中の抗原は、蔓延株に対するＭＮ力価の、相同ＭＮ力価と比較して＞２倍の差違を示しうる。
【０１０４】
したがって、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、ＨＩアッセイ（例えば、二元ＨＩ試験）および／またはＭＮアッセイにおいて、蔓延株と比較した場合、前記アッセイにおいて、蔓延株と比較した場合の、第１のインフルエンザワクチン中の抗原より高度な交差反応を示しうる。
【０１０５】
第２のインフルエンザワクチンは、本明細書で記載される、レスキューワクチン、ハイブリッドワクチン、または組成物でありうる。第１のインフルエンザワクチンは、季節性インフルエンザワクチンでありうる。
【０１０６】
第１のインフルエンザワクチンおよび第２のインフルエンザワクチンは、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい株に由来する抗原を含みうる。
【０１０７】
卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい、ウイルス株またはウイルスクレードは、本明細書で言及される通り、Ｈ３Ｎ２株でありうる。クレードは、クレード３Ｃ．２Ａ（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４様またはＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４様）、クレード３Ｃ．３Ａ（例えば、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３様）、または３Ｃ．１（例えば、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２様ウイルス分離株）でありうる。代替的に、または加えて、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい、ウイルス株またはウイルスクレードは、Ｂ株、例えば、Ｂ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統に由来する株（例えば、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様）でありうる。当業者は、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい株またはクレードをたやすく同定しうる。例えば、このような株の分離株を、卵内で継代培養することは、元の分離株および／または蔓延株と比較して、それほど緊密に抗原的にマッチしないウイルスを結果としてもたらしうる。これに対し、分離株を、哺乳動物細胞内で継代培養する場合、結果として得られるウイルス内のこのようなミスマッチは観察されない（または同じ程度には観察されない）。
【０１０８】
蔓延株は、季節性蔓延株でありうる。季節性ワクチンにおける使用のためのインフルエンザウイルス株は、シーズンごとに変化する。上記で論じた通り、関連当局は、蔓延インフルエンザ株のリストを、毎年公表しているので、当業者は、これらについて認識している。
【０１０９】
蔓延株はまた、Ｈ２亜型株、Ｈ５亜型株、Ｈ７亜型株、またはＨ９亜型株（特に、Ａ型インフルエンザウイルスの）など、汎発性インフルエンザ株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般のヒト集団が、免疫的にナイーブである株）でもありうる。
【０１１０】
第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザワクチン中の抗原と同じインフルエンザ亜型に由来する。例えば、第１のインフルエンザワクチンが、Ｈ１株、Ｈ３株、およびＢ型インフルエンザ株に由来する抗原を含み、３つの株全てが、卵内で継代培養されている場合、第２のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原は、Ｈ１株、Ｈ３株、またはＢ型インフルエンザ株に由来しうる。同様に、第１のインフルエンザワクチンが、一価Ｈ１インフルエンザワクチンである場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原もまた、Ｈ１亜型となるであろう。
【０１１１】
第１のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原のうちの一部だけが、卵内で継代培養されたインフルエンザウイルスから調製されている場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原も、これらの株と同じ亜型となるであろう。例えば、三価インフルエンザワクチン中のＨ１株およびＨ３株だけが、卵内で継代培養された場合、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、Ｈ１株および／またはＨ３株に由来するインフルエンザ抗原のうちの一方または両方を含有しうる。
【０１１２】
蔓延株へのそれらの抗原マッチについて評価される、第１のインフルエンザワクチン中の抗原および第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、同じインフルエンザ亜型の抗原であることが理解されるであろう。
【０１１３】
ワクチン
多様な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能であり、ワクチンは一般に、生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオンに基づく場合もあり、スプリットビリオンに基づく場合もあり、精製サブユニット（例えば、精製表面）抗原に基づく場合もある。インフルエンザ抗原はまた、ウィロソームの形態で提示することもできる。本発明は、これらのワクチン型のうちのいずれと共に使用することもできるが、典型的には不活化ワクチンと共に使用するであろう。
【０１１４】
抗原は、生ウイルスの形態を取る場合もあり、不活化ウイルスの形態を取る場合もある。ウイルスを不活化させるための化学的手段は、有効量の、以下の薬剤：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、βプロピオラクトン、またはＵＶ光のうちの１または複数による処理を含む。不活化のための、さらなる化学的手段は、メチレンブルー、ソラーレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、またはこれらのうちの任意の組合せによる処理を含む。当技術分野では、例えば、二元エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはガンマ線照射など、他のウイルス性不活化方法も公知である。ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）剤は、全ビリオン不活化ワクチンである。
【０１１５】
不活化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製表面抗原（ヘマグルチニンを含み、通例、ノイラミニダーゼもまた含む）を含みうる。
【０１１６】
ビリオンは、ウイルスを含有する流体から、多様な方法で採取することができる。例えば、精製工程は、ビリオンを破壊するように洗浄剤を含む、直線スクロース勾配溶液を使用する、ゾーン遠心分離を伴いうる。次いで、任意選択の希釈の後、抗原を、透析濾過により精製することができる。
【０１１７】
スプリットビリオンは、ビリオン内調製物を作製するように、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリッティング工程を含む、ビリオンの、洗浄剤または溶媒（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミドなど）による処理により得られる。当技術分野では、インフルエンザウイルスをスプリッティングする方法が周知である（例えば、参考文献４〜９などを参照されたい）。ウイルスのスプリッティングは、典型的には、感染性であれ、非感染性であれ、全ウイルスを破壊濃度のスプリッティング剤で破壊または断片化することにより実行される。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化、ウイルスの完全性の変更を結果としてもたらす。好ましいスプリッティング剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン（betain）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン（ethlene）エステルなどである。１つの有用なスプリッティング手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続効果を使用し、スプリッティングは、初期ビリオン精製（例えば、スクロース密度勾配溶液中の）時に生じうる。スプリットビリオンは、ナトリウムリン酸緩衝等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁させると有用でありうる。ＡＦＬＵＲＩＡ（商標）剤、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）剤、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）剤、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）剤、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）剤は、スプリットワクチンである。
【０１１８】
精製表面抗原（または精製サブユニット）ワクチンは、インフルエンザ表面抗原であるヘマグルチニンを含み、また、ノイラミニダーゼも含みうる。当技術分野では、これらのタンパク質を、精製形態で調製するための工程が周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）剤、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）剤、ＦＬＵＣＥＬＶＡＸ（商標）剤、ＦＬＵＡＤ（商標）剤、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）剤は、サブユニットワクチンである。
【０１１９】
組成物中に有用に組入れられうる他の株は、耐性汎発性株（参考文献１１）を含む、抗ウイルス治療に対して耐性（例えば、オセルタミビル（参考文献１０）および／またはザナミビルに対して耐性）の株である。
【０１２０】
インフルエンザウイルスは、弱毒化させることができる。インフルエンザウイルスは、温度感受性でありうる。インフルエンザウイルスは、低温適応させることができる。これらの３つの可能性は特に、生ウイルスに当てはまる。
【０１２１】
第１のインフルエンザワクチンは、三価インフルエンザワクチンでありうる。第１のインフルエンザワクチンはまた、四価インフルエンザワクチンでもありうる。このような四価インフルエンザワクチンは高頻度で、２つのＡ型インフルエンザ株と、２つのＢ型インフルエンザ株とを含有し、それらが、Ｂ型インフルエンザウイルスの２つの異なる系統を含みうるという利点を有する。したがって、このようなワクチンは、蔓延インフルエンザウイルスに対する広範な防御をもたらしうる。第１のインフルエンザワクチンはまた、Ａ型インフルエンザウイルスおよび／またはＢ型インフルエンザウイルスを含む、１つ、２つ、５つ、６つ、またはこれを超えるインフルエンザ株に由来する抗原も含みうる。ワクチンが、１つを超えるインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、典型的には別個に増殖させ、ウイルスを採取し、抗原を調製した後で、混合する。
【０１２２】
第１のワクチン中のインフルエンザ抗原のうちの少なくとも１つは、卵内で継代培養されたインフルエンザウイルスから調製されているであろう。ヒトインフルエンザウイルスは、末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖（α２，６においてガラクトースへと連結されたシアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵は、そうではなく、末端Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ二糖を伴う受容体オリゴ糖を有する。したがって、ヒトインフルエンザウイルスの、卵内の増殖は、ヘマグルチニンに対して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌへの結合から離れ、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌへの結合へと向かう選択圧をもたらす。したがって、卵内で継代培養されたインフルエンザウイルスを、それらが、末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖と比較して、末端Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖に対する結合優先性を有することにより同定することができる。
【０１２３】
ウイルスが、末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖と比較して、末端Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖に対する結合優先性を有するのかどうかを決定するために、多様なアッセイを使用することができる。例えば、参考文献１２は、アフィニティー定数の高感度かつ定量的な測定をもたらす、インフルエンザウイルス受容体結合活性についての固相酵素免疫測定アッセイについて記載している。参考文献１３は、２つの異なるシアリル糖タンパク質（Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定基を伴うオボムコイド；およびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定基を伴うブタα２マクログロブリン）に対するウイルスの結合性を評価した固相アッセイを使用し、また、２つの受容体類似体：遊離シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に対するウイルスの結合性を評価したアッセイについても記載している。参考文献１４は、α２，３連結に対する受容体の優先性またはα２，６連結に対する受容体の優先性を明確に鑑別することが可能なグリカンアレイを使用するアッセイについて報告している。参考文献１５は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌを含有するように、酵素的に修飾されたヒト赤血球の凝集に基づくアッセイについて報告している。アッセイの種類に応じて、アッセイは、ウイルス自体により直接実施することもでき、ウイルスから精製されたヘマグルチニンにより間接的に実施することもできる。
【０１２４】
第１のインフルエンザワクチンが、多価インフルエンザワクチンである場合、ワクチン中のインフルエンザ抗原の全ては通例、卵内で継代培養されたインフルエンザウイルスから調製されているであろう。しかし、本発明はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超えるインフルエンザ抗原が、卵内で継代培養されたインフルエンザウイルスから調製された、第１のインフルエンザワクチンによっても実施することができる。
【０１２５】
第１のインフルエンザワクチンはまた、卵内で増殖されたインフルエンザウイルスから調製されているインフルエンザウイルスに由来する抗原も含みうる。これは、ワクチン中の抗原をそこから調製するインフルエンザウイルスを、卵内で増殖させたことを意味する。
【０１２６】
これに対し、ウイルスが、卵内で継代培養されただけである場合、ウイルスを、元は、卵内で増殖させ、次いで、インフルエンザ抗原をそこから最終的に調製するインフルエンザウイルスを、細胞培養物中で増殖させるように、細胞培養物へと移した可能性がある。このようなウイルスは、末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖と比較して、末端Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖に対する、それらの結合優先性を保持するので、本発明の方法は、このようなワクチンの効能にもやはり有益であろう。
【０１２７】
一部の好ましい実施形態では、第２のインフルエンザワクチン中の抗原を、細胞培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスから調製する。インフルエンザウイルスを、細胞培養物中で増殖させることにより、インフルエンザウイルスを卵内で増殖させる場合に見出される、ヘマグルチニンに対する、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌへの結合から離れ、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌへの結合へと向かう選択圧を回避することができる。さらに、細胞培養物中の増殖は、これもまた蔓延株とより酷似するインフルエンザウイルスの作製を優先する、卵内の高増殖へと適応していないインフルエンザウイルスの使用を可能とする。したがって、これらのインフルエンザウイルスは、蔓延ヒトインフルエンザウイルスに対する、はるかに良好なマッチであり、したがって、良好な防御をもたらすことが期待されうる。
【０１２８】
代替的に、第２のインフルエンザワクチンに由来する抗原は、組換えタンパク質抗原でありうる。
【０１２９】
好ましくは、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、卵内で継代培養されていない。
【０１３０】
第２のインフルエンザワクチンは、一価インフルエンザワクチンでありうる。第２のインフルエンザワクチンはまた、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を、細胞培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスから調製したことを条件として、１つを超えるインフルエンザ抗原、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超えるインフルエンザ抗原も含有しうる。上記で論じた通り、細胞培養物中で増殖させた、少なくとも１つのインフルエンザ抗原は、卵内で継代培養した、第１のインフルエンザワクチン中のインフルエンザ抗原と同じ亜型であることが理解される。
【０１３１】
好ましくは、細胞培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスから調製された、第２のインフルエンザワクチン中の抗原は、卵内で継代培養されていない。上記で論じた通り、このような抗原は、末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖と比較して、末端Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ二糖に対する、それらの結合優先性により、卵内で継代培養されたインフルエンザウイルスから調製されたインフルエンザ抗原と識別することができる。
【０１３２】
細胞培養物を使用する場合、ウイルス増殖基質は、典型的には哺乳動物由来の細胞系であろう。適切な哺乳動物細胞は、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長動物（ヒトおよびサルを含む）細胞、およびイヌ細胞を含むがこれらに限定されない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など、多様な細胞型を使用することができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系のような、腎臓細胞などのアフリカングリーンモンキー細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系のような腎臓細胞である。したがって、適切な細胞系は、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ  ５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などを含むがこれらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるのに好ましい哺乳動物細胞系は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞（参考文献１６〜１９）；アフリカングリーンモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞（参考文献２０〜２２）；またはヒト胎児性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞（参考文献２３）を含む。これらの細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション（参考文献２４）、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（参考文献２５）、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、型番ＣＣＬ  ８１、ＣＣＬ  ８１．２、ＣＲＬ  １５８６、およびＣＲＬ−１５８７下で、異なる多様なＶｅｒｏ細胞を供給しており、型番ＣＣＬ  ３４下で、ＭＤＣＫ細胞を供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、受託番号９６０２２９４０下で、ＥＣＡＣＣから入手可能である。
【０１３３】
インフルエンザウイルスはまた、鳥類胚性幹細胞（参考文献２６および２９）およびアヒル（例えば、アヒル網膜）または雌ニワトリに由来する細胞系を含む鳥類細胞系（例えば、参考文献２６〜２８）上で増殖させることもできる。適切な鳥類胚性幹細胞は、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系である、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４を含む（参考文献３０）。また、ニワトリ胎仔線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用することができる。最も好ましい鳥類細胞系は、アヒル胚性幹細胞に由来する、ＥＢ６６細胞系である。この細胞系は、インフルエンザ抗原を作製するために良好に働くことが報告されている（参考文献３１）。
【０１３４】
好ましくは、本発明の細胞培養物は、哺乳動物である。哺乳動物細胞の使用は、本明細書で記載されるワクチン中の株が、卵馴化を受けやすい株である場合に、特に好ましい。例えば、第１のインフルエンザワクチンの抗原ミスマッチが、卵馴化性突然変異と関連する場合、第２のインフルエンザワクチン（例えば、レスキューワクチン）は、哺乳動物細胞ベースのプラットフォームなど、卵非含有工程内で製造すべきである。
【０１３５】
細胞培養物を使用する場合、細胞は、ヘマグルチニンに対する、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌへの結合から離れる選択圧を回避することができる。実際、ある特定の非哺乳動物細胞（例えば、鳥類細胞）を、受容体末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖を有するように適応させることができる。例えば、非哺乳動物細胞は、１または複数の哺乳動物酵素を発現させるように、遺伝子操作することができる。したがって、このような細胞内で増殖させたウイルスに由来する抗原は、末端Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖と比較して、末端Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ二糖を伴うオリゴ糖に対する結合優先性を有する。
【０１３６】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞系は、ＭＤＣＫ細胞である。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＣＣＬ  ３４として、ＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞系の派生細胞もまた、使用することができる。例えば、参考文献１６は、浮遊培養物中の増殖に適応したＭＤＣＫ細胞系（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として受託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）について開示している。同様に、参考文献３２は、無血清培養物中の浮遊状態で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞系（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として受託された「Ｂ−７０２」）について開示している。参考文献３３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞について開示している。参考文献３４は、「ＭＤＣＫ.５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２０４２）を含む、感染への感受性が高いＭＤＣＫ細胞系について開示している。これらのＭＤＣＫ細胞系のうちのいずれも使用することができる。
【０１３７】
ウイルスを細胞系上で増殖させている場合、組成物は、有利には卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、これにより、アレルゲン性を低減するであろう。
【０１３８】
ウイルスを細胞系上で増殖させている場合、増殖のための培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、シルコウイルス（特に、ブタシルコウイルス）、および／またはパルボウイルスを含まず、また、培養を開始するのに使用されるウイルス接種物も、好ましくはこれらを含まない（すなわち、これらの夾雑について調べ、これについて陰性の結果が与えられている）であろう（参考文献３５）。単純ヘルペスウイルスの非存在は、特に、好ましい。
【０１３９】
ウイルスを細胞系上で増殖させている場合、組成物は、好ましくは投与１回当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満であり、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡ（典型的に、小児で０．２５ｍＬであるか、または成人で０．５ｍＬ）を含有するが、微量の宿主細胞ＤＮＡは存在しうる。一般に、本発明の組成物から除外することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐより長いＤＮＡ、例えば、１５０ｂｐより長いＤＮＡ断片、２００ｂｐより長いＤＮＡ断片などである。
【０１４０】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は今や、生物学的薬剤についての、規定の規制要件であり、当業者の通常の能力の範囲内にある。ＤＮＡを測定するのに使用されるアッセイは、典型的には妥当性の確認されたアッセイであろう（参考文献３６および３７）。妥当性の確認されたアッセイの性能特徴は、数学的および定量的に記載することができ、その誤差の可能な源泉は、同定されているであろう。アッセイは一般に、確度、精度、特異度などの特徴について調べられているであろう。アッセイを較正（例えば、宿主細胞ＤＮＡの公知の標準的な数量に対して）し、調べたら、定量的ＤＮＡ測定を、規定通りに実施することができる。ＤＮＡ定量化のための、３つの主要な技法：サザンブロットまたはスロットブロット（参考文献３８）などのハイブリダイゼーション方法；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システム（参考文献３９）などのイムノアッセイ方法；および定量的ＰＣＲ（参考文献４０）を使用することができる。当業者は、これらの方法全てに精通しているが、各方法の正確な特徴、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選出し、増殖のためのプライマーおよび／またはプローブの選出しなどは、当該宿主細胞に依存しうる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの総ＤＮＡのための定量的アッセイであり、生物学的製剤中の夾雑ＤＮＡレベルをモニタリングするために使用されている（参考文献３８）。典型的アッセイは、ビオチニル化ｓｓＤＮＡ結合性タンパク質と、ウレアーゼコンジュゲート抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の、反応複合物の非配列特異的形成を伴う。全てのアッセイ構成要素は、製造元から入手可能な、Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ一式中に組み入れられている。多様な市販品製造元、例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどが、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの夾雑を測定するための、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと、全ＤＮＡ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムとの比較については、参考文献４１において見出すことができる。
【０１４１】
夾雑ＤＮＡは、例えば、クロマトグラフィーなど、標準的な精製手順を使用して、ワクチン調製時に除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮアーゼを使用することによりヌクレアーゼ処理により増強することができる。宿主細胞ＤＮＡの夾雑を低減するための簡便な方法は、参考文献４２および４３において開示されており、まず、ウイルスの増殖時に使用しうるＤＮアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）を使用し、次いで、ビリオンの破壊時に使用しうるカチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２ステップの処理を伴う。また、β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤による処理も、宿主細胞ＤＮＡを除去するのに使用することができ、また、有利にはビリオンを不活化させるのに使用することもできる（参考文献４４）。アルキル化剤、またはＤＮアーゼと、アルキル化剤との組合せによる、２ステップの処理を使用する方法についてもまた、記載されている（参考文献４５）。
【０１４２】
ヘマグルチニン１５μｇ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンは、容量０．２５ｍｌ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンと同様に好ましい。ヘマグルチニン５０μｇ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンは、容量０．５ｍｌ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンと同様により好ましい。
【０１４３】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均長は、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【０１４４】
ＭＤＣＫ細胞などの細胞系上で増殖させるために、ウイルスは、浮遊培養物中の細胞上で増殖させることができ（参考文献１６、４６および４７）、または接着培養物中の細胞上で増殖させることもできる。浮遊培養に適する１つのＭＤＣＫ細胞系は、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として受託されている）である。代替法として、マイクロキャリア培養を使用することもできる。
【０１４５】
本開示に従い、細胞培養物を使用して、ウイルスを、野生型試料（例えば、臨床試料）から分離し、増殖させることができ、このウイルスを使用して、本発明に従う使用のためのワクチンまたは組成物を作製することができる。分離株は、好ましくは蔓延株の分離株（試料から得られた）である。分離株は、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすいクレードまたは株の分離株でありうる。細胞培養物中の分離および増殖は、卵内で分離し、増殖させたウイルスと比較した場合、組成物および作製工程に、さらなる利点をもたらしうる。細胞培養物中の分離は、卵を使用して分離されるウイルスと比較して、臨床試料からの分離率を著明に改善しうる。細胞培養物中の分離および増殖は、卵ベースの工程内で分離し、増殖させたウイルスと比較して、高増殖率および／またはウイルス収率の増大を誘発しうる。さらに、細胞培養物中の分離および増殖は、遺伝子安定性の改善（上記で記載した）、すなわち、抗原ミスマッチを引き起こす宿主適応突然変異を導入せずに、元の臨床試料の遺伝子配列を保持する能力をもたらしうる。これらの効果は、クレードまたは株が、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい場合（例えば、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統に由来する株）、および／または特定の蔓延株への、第１のインフルエンザワクチンより緊密な抗原マッチを有するレスキューワクチン（例えば、第２のインフルエンザワクチン）を提供しようとする場合（特に、これを、第１のインフルエンザワクチンと同じシーズン内の投与のために提供しようとする場合）に、特に有利でありうる。これらの効果はまた、ワクチンが、１つまたは２つのＢ株を含有する実施形態においても、特に有利でありうる。Ｂ株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統および／またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統に由来しうる。一部の好ましい実施形態では、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ株が存在し、卵馴化および／またはクレードミスマッチを受けやすい株またはクレードである。ワクチンは、例えば、２つのＡ株と、２つのＢ株とを含む四価ワクチン（ＡＡＢＢ）、または２つのＡ株と、１つのＢ株とを含む三価ワクチン（ＡＡＢ）でありうる。好ましくは、ワクチンは、少なくとも２つのＢ株、例えば、四価ＡＡＢＢワクチンを含む。細胞培養物ベースの分離および増殖は、本明細書で記載されるレスキューワクチンおよび組成物の作製における使用のための複数のＢ株を、臨床試料から作製するために、特に有利でありうる。細胞培養物中で作製されるＢ株は、卵内で作製されるＢ株より優れた、分離率、増殖率、収率、および／または遺伝子安定性を呈示しうる。細胞培養物は、好ましくは本明細書で記載されるＭＤＣＫ細胞培養物（これは、ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞培養物でありうる）である。
【０１４６】
インフルエンザウイルスの複製を支援する細胞系は、好ましくは無血清培養培地中および／または無タンパク質培地中で増殖させる。本発明の文脈では、ヒト由来または動物由来の血清に由来する添加剤が存在しない培地を、血清非含有培地と称する。タンパク質非含有とは、細胞の増多が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加剤、および非血清タンパク質を除外して生じる培養物を意味すると理解されるが、任意選択で、ウイルスの増殖に必要でありうる、トリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を含みうる。このような培養物中で増殖する細胞自体は、天然で、タンパク質を含有する。
【０１４７】
インフルエンザウイルスの複製を支援する細胞系は、好ましくは、例えば、ウイルス複製時に、３７℃よりも下で（参考文献４８）（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃で）増殖させる。
【０１４８】
ウイルスを、培養細胞内で繁殖させる方法は一般に、培養細胞に、培養される株を接種するステップと、感染させた細胞を、例えば、ウイルス力価または抗原の発現により決定される時間（例えば、接種の２４〜１６８時間後の間）などの、ウイルスの繁殖に所望される時間にわたり培養するステップと、繁殖させたウイルスを回収するステップとを含む。培養細胞を、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０により測定される）対細胞比で接種する。ウイルスを、細胞の懸濁液へと添加するか、または細胞の単層へと適用し、ウイルスを、細胞上で、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で、少なくとも６０分間であるが、通例３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間の間にわたり吸収させる。感染させた細胞培養物（例えば、単層）は、採取された培養物上清のウイルス含量を増大させるように、凍結−融解または酵素作用により除去することができる。次いで、採取された流体を、不活化または凍結保存する。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染の３０〜６０時間後に採取することができる。好ましくは、細胞は、感染の３４〜４８時間後に採取する。さらにより好ましくは、細胞は、感染の３８〜４０時間後に採取する。しかしながら、最適な採取時間の決定は、当業者の通常の能力の範囲内にある。一般に、ウイルスの放出を可能とするように、細胞培養時に、プロテアーゼ（典型的には、トリプシン）を添加するが、プロテアーゼは、培養時の、任意の適する段階において、添加することができる。
【０１４９】
インフルエンザウイルスは、遺伝子再集合体株であることが可能であり、逆遺伝学技法により得られている。逆遺伝学技法（例えば、参考文献４９〜５３）は、プラスミドを使用して、所望のゲノムセグメントを伴うインフルエンザウイルスを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調製することを可能とする。典型的には、逆遺伝学技法は、細胞中の両方の種類のＤＮＡの発現が、完全無欠の感染性ビリオンのアセンブリーをもたらすように、（ａ）所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を、例えば、ｐｏｌＩプロモーターから発現させるステップと、（ｂ）ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターから発現させるステップとを伴う。ＤＮＡは、好ましくはウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てをもたらすが、また、ヘルパーウイルスを使用して、一部のＲＮＡおよびタンパク質をもたらすことも可能である。各ウイルスＲＮＡを作製するために、別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が好ましく（参考文献５４〜５６）、これらの方法はまた、ウイルスタンパク質の全部または一部（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質、およびＮＰタンパク質だけ）を発現させるのにも、プラスミドの使用を伴い、一部の方法では、１２のプラスミドを使用する。また、直鎖状発現構築物の使用も可能である（参考文献５７）
【０１５０】
必要とされるプラスミドの数を低減するため、近年の手法（参考文献５８）は、同じプラスミド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのＡ型インフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）上における、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡの合成のための）と、別のプラスミド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのＡ型インフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）上における、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを伴う、複数のタンパク質コード領域とを組み合わせる。参考文献５５の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上の、ＰＢ１  ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２  ｍＲＮＡコード領域、およびＰＡ  ｍＲＮＡコード領域と；（ｂ）単一のプラスミド上の、８つ全てのｖＲＮＡコードセグメントとを伴う。ＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを、１つのプラスミド上に組み入れ、他の６つのセグメントを、別のプラスミド上に組み入れることによってもまた、事態を容易とすることができる。
【０１５１】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするために、ｐｏｌＩプロモーターを使用することの代替として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することも可能である（参考文献５９）。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、またはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターは、簡便に使用することができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）で、より簡便でありうるが、細胞にはまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドもトランスフェクトしなければならない。
【０１５２】
他の技法では、ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩ二重プロモーターを使用して、ウイルスＲＮＡと、単一の鋳型発現可能なｍＲＮＡとを同時にコードすることも可能である（参考文献６０および６１）。
【０１５３】
したがって、特に、ウイルスを卵内で増殖させる場合、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する、１または複数のＲＮＡセグメント（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する６つのセグメントであり、ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２の遺伝子再集合体）を含みうる。Ａ型インフルエンザウイルスはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス、またはワクチン調製物のための遺伝子再集合体ウイルスを作出するのに有用な、他の任意のウイルス株に由来する、１または複数のＲＮＡセグメントも含みうる。参考文献６２および６３はまた、Ａ型インフルエンザ株と、Ｂ型インフルエンザ株とを再集合させるのに適切な骨格についても論じている。
【０１５４】
典型的には、本発明は、ヒト対ヒトの伝染が可能な株に対して防御し、株のゲノムは通例、哺乳動物の（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来した、少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含むであろう。株のゲノムは、鳥類インフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含みうる。
【０１５５】
ヘマグルチニン（ＨＡ）とは、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的には一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイにより測定されるように、ＨＡレベルを参照することにより標準化される。ワクチンは、典型的には株１つ当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば、小児のために、または汎発性状況では、低用量もまた使用される。１／２用量（すなわち、株１つ当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４用量、および１／８用量などの部分用量も、高用量（例えば、３倍用量または９倍用量（参考文献６６および６７））と同様に使用されている（参考文献６４および６５）。したがって、ワクチンは、インフルエンザ株１つ当たり０．１〜１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇの間、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含みうる。特定の用量は、例えば、株１つ当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５μｇなどを含む。これらの低用量は、アジュバントがワクチン中に存在する場合に最も有用である。本発明のワクチンの成分、キット、および工程（例えば、それらの容量および濃度）は、最終生成物中に、これらの抗原用量をもたらすように選択することができる。
【０１５６】
生ワクチンでは、投与量は、ＨＡ含量ではなく、中央値組織培養物感染性用量（ＴＣＩＤ５０）により測定し、株１つ当たり１０６〜１０８の間のＴＣＩＤ５０（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）が典型的である。
【０１５７】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルス中に見出される天然ＨＡの場合もあり、修飾されている場合もある。例えば、鳥類種においてウイルスを高病原性とする決定基（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の切断部位近傍の高塩基性領域）は、除去しなければ、ウイルスが卵内で増殖することを妨げうるので、これらの決定基を除去するように、ＨＡを修飾することが公知である。
【０１５８】
組成物は、洗浄剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステルによる界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、または、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのための、デオキシコール酸ナトリウムを含みうる。洗浄剤は、微量だけで存在しうる。したがって、ワクチンは、オクトキシノール１０、α−トコフェリル水素スクシネート、およびポリソルベート８０の各々１ｍｇ／ｍｌ未満ずつを含みうる。微量中の他の残りの成分は、抗生剤（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）でありうる。
【０１５９】
不活化の、しかし非全細胞のワクチン（例えば、スプリットウイルスワクチンまたは精製表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置する、さらなるＴ細胞エピトープから利益を得るために、マトリックスタンパク質を含みうる。したがって、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含む、非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は加えて、Ｍ１マトリックスタンパク質および／またはＭ２マトリックスタンパク質を含みうる。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ１マトリックスタンパク質の組入れが好ましい。ヌクレオタンパク質もまた、存在しうる。
【０１６０】
第１のインフルエンザワクチン中の抗原は、典型的にはインフルエンザビリオンから調製されるが、代替として、ヘマグルチニンなどの抗原は、組換え宿主内（例えば、プラスミド発現系を使用する酵母内、またはバキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞系内）で発現させ、精製形態で使用することができる（参考文献６８および６９）。しかし、一般に、抗原は、ビリオンに由来するであろう。
【０１６１】
医薬組成物
本発明で使用されるワクチンは、薬学的に許容される。それらは、抗原およびアジュバントに加えて、成分も含みうる、例えば、それらは典型的に、１または複数の医薬担体および／または賦形剤を含むであろう。このような成分についての完全な議論は、参考文献７０において閲覧可能である。粘膜ワクチン中で使用される担体／賦形剤は、非経口ワクチン中で使用される担体／賦形剤と、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【０１６２】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含みうる。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満である）、例えば、チオメルサール非含有であることが好ましい（参考文献８および７１）。水銀を含有しないワクチンが、より好ましい。
【０１６３】
等張性を制御するために、特に、注射用ワクチンでは、ナトリウム塩など、生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在しうる。存在しうる他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【０１６４】
注射用の組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に収まるであろう。浸透圧は、ワクチン接種により引き起こされる疼痛に対して、影響を及ぼさないことが既に報告されている（参考文献７２）が、それに関わらず、浸透圧をこの範囲内に保つことが好ましい。
【０１６５】
組成物は、１または複数の緩衝液を含みうる。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１６６】
組成物のｐＨは一般に、５．０〜８．１の間であり、より典型的には６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間であろう。したがって、本発明の工程は、パッケージングの前に、バルクワクチンのｐＨを調整するステップを含みうる。
【０１６７】
組成物は、好ましくは滅菌である。組成物は、好ましくは非発熱物質性である、例えば、投与１回当たり＜１ＥＵ（標準尺度である内毒素単位）を含有し、好ましくは投与１回当たり＜０．１ＥＵである。組成物は、好ましくはグルテン非含有である。
【０１６８】
組成物は、単回の免疫化のための材料を含む場合もあり、複数回の免疫化のための材料を含む場合もある（すなわち、「複数回投与」キット）。複数回投与の設定では、保存剤の組入れが好ましい。複数回投与用組成物中に保存剤を組み入れることに対する代替として（またはこれに加えて）、組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器内に含有される場合もある。
【０１６９】
インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投与容量で投与するが、小児には、半容量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を投与することもできる。鼻腔内投与では、この総投与容量を、鼻孔間で分割する、例えば、各鼻孔内に１／２ずつに分割することができる。
【０１７０】
組成物およびキットは、好ましくは２℃〜８℃の間で保存する。典型的には、組成物およびキットは、凍結させるべきではない。組成物およびキットは、理想的には、直接的な光の外で保存するべきである。
【０１７１】
組成物またはキット構成要素のパッケージング
本発明の組成物（またはキット構成要素）に適する容器は、バイアル、シリンジ（例えば、ディスポーザブルのシリンジ）、鼻腔内スプレーなどを含む。これらの容器は、滅菌であるべきである。
【０１７２】
組成物／構成要素を、バイアル内に配置する場合、バイアルは、好ましくはガラス材料製またはプラスチック材料製である。バイアルは、好ましくは組成物を添加する前に滅菌化する。ラテックス感受性患者に関する問題を回避するため、バイアルは、好ましくはラテックス非含有止栓でシーリングし、全てのパッケージング材料中のラテックスの非存在が好ましい。バイアルは、単回投与用量のワクチンを含む場合もあり、１回を超える投与の用量（「複数回投与」バイアル）、例えば、投与１０回の用量を含む場合もある。好ましいバイアルは、無色ガラス製である。
【０１７３】
バイアルは、あらかじめ充填したシリンジを、キャップへと挿入し、シリンジの内容物を、バイアル内へ駆出し（例えば、その中の凍結乾燥材料を再構成するように）、バイアルの内容物を、シリンジへと取り戻しうるように適応したキャップ（例えば、ルアーロック）を有する場合がある。シリンジをバイアルから取り外した後で、次いで、注射針を取り付け、組成物を、患者へと投与することができる。キャップは、好ましくは、キャップにアクセスしうる前に、シールまたはカバーを取り外さなければならないように、シールまたはカバーの内側に配置する。バイアルは、特に、複数回投与用バイアルでは、その内容物の無菌的な取出しを可能とするキャップを有しうる。
【０１７４】
組成物／構成要素を、シリンジ内にパッケージングする場合、シリンジは通常、注射針が取り付けられていないが、アセンブリーおよび使用のために、別個の注射針を、シリンジと共に供給することができる。安全な注射針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの注射針が典型的である。シリンジは、記録管理を容易とするように、その上に、ロット数、インフルエンザシーズン、および内容物の有効期限を印字した、剥離式ラベルと共に供給することができる。シリンジ内のプランジャーは、好ましくは、プランジャーが吸引時に事故で外れることを防止するように、ストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有する場合もある。ディスポーザブルのシリンジは、単回投与用量のワクチンを含有する。シリンジは一般に、注射針を取り付ける前の先端部をシーリングするように、先端部キャップを有し、先端部キャップは、好ましくはブチルゴム製である。シリンジと、注射針とを、別個にパッケージングする場合、注射針は、好ましくはブチルゴム製のシールドにはまる。好ましいシリンジは、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）の商標名で市販されているシリンジである。
【０１７５】
容器は、半用量の容量を示して、例えば、小児への送達を容易とするように、マーキングすることができる。例えば、０．５ｍｌの用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌの容量を示すマークを有しうる。
【０１７６】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダライムガラス製の容器ではなく、ボロシリケートガラス製の容器を使用することが好ましい。
【０１７７】
キットまたは組成物は、ワクチンについての詳細、例えば、投与のための指示書、ワクチン中の抗原についての詳細などを含む小冊子と共にパッケージングする（例えば、同じ箱内に）ことができる。指示書はまた、例えば、アドレナリン溶液を、ワクチン接種後におけるアナフィラキシー反応の場合にたやすく利用可能な状態に保つための警告なども含有しうる。
【０１７８】
処置方法およびワクチンの投与方法
本発明の方法および使用により惹起される免疫応答は一般に、抗体応答、好ましくは防御的抗体応答を含むであろう。当技術分野では、インフルエンザウイルスワクチン接種後における、抗体応答、中和能、および防御について評価するための方法が周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関することを示している（血清試料による、約３０〜４０の血球凝集阻害力価は、相同なウイルスによる感染からの、およそ５０％の防御をもたらす）（参考文献７３）。抗体応答は、典型的には、血球凝集阻害、マイクロ中和、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血（ＳＲＨ）により測定する。当技術分野では、これらのアッセイ技法が周知である。
【０１７９】
ワクチンの粘膜投与の場合、使用されうる経路は、直腸内、経口（例えば、錠剤、スプレー）、咽頭、口腔内、膣内、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻腔内、眼内、肺内などを含むがこれらに限定されない。上記で言及した通り、好ましい粘膜投与経路は、鼻腔内注入を介する経路である。経鼻投与は、例えば、スプレー、液滴、エアゾールなどでありうる。
【０１８０】
ワクチンの非経口投与の場合、使用されうる経路は、筋内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射（利用可能な場合）、皮内注射など、および他の全身経路を含むがこれらに限定されない。上記で言及した通り、好ましい非経口投与経路は、筋内注射（例えば、腕部または脚部への）を介する経路である。
【０１８１】
本発明に従う投与レジメを使用して、小児および成人の両方を処置することができる。インフルエンザワクチンは現在のところ、生後６カ月からの、小児および成人の免疫化における使用のために推奨されている。したがって、患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でありうる。ワクチンを施されるのに好ましい患者は、老齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）者、若齢（例えば、≦５歳）者、入院患者、医療作業者、軍務従事者および兵士、妊婦、慢性疾病者、免疫不全患者、ワクチンを施される７日前以内に、抗ウイルス性化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を使用されたい）を服用している患者、卵アレルギーを有する者、および海外旅行者である。ワクチンは、これらの群だけに適するものではなく、集団内でより一般に使用することもできる。汎発性株については、全ての年齢群への投与が好ましい。
【０１８２】
ミスマッチ抗原を含有する、従来型のワクチンは、特に、「危険性が高い」と考えられる個体に、限定的な防御を提供するに過ぎない場合がある（例えば、http://www.cdc.gov/flu/about/disease/high_risk.htmを参照されたい）。高危険性の個体は、典型的には、高重症度の感染を受けやすい個体、二次感染を受けやすい個体、入院の発生数が多く、かつ、期間が長くなりやすい個体、および／または死亡しやすい個体であることが典型的である。高危険性個体はまた、ウイルスへとたやすく曝露される個体も含む。例えば、高危険性患者は、≧６５歳、≦５歳（より好ましくは≦２歳）の患者、入院患者、医療作業者、軍務従事者および兵士、妊婦、慢性疾病者、免疫不全患者、およびワクチンを施される７日前以内に、抗ウイルス性化合物を服用している患者から選択することができる。本明細書で提供されるワクチンおよび方法は、このような高危険性患者において免疫防御をもたらすのに有用である。したがって、本発明は、患者を免疫化するための方法であって、患者へと、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれか１つによる組成物を投与するステップを含み、患者が、高危険性患者である方法を含む。
【０１８３】
本発明の好ましい組成物は、効能についてのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ（ＣＨＭＰ；かつては、ＣＰＭＰとして公知であった）基準のうちの１つ、２つ、または３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は、（１）≧７０％の血清防御；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増大である。老齢（＞６０歳）では、これらの基準は、（１）≧６０％の血清防御；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増大である。これらの基準は、少なくとも５０例の患者についての、オープンラベルの研究に基づく。ＣＨＭＰ基準に従い、抗ＨＡ抗体応答についてのセロコンバージョン率は、各群内の、ワクチン接種後の防御的力価≧１：４０を有する対象の比率として規定されている。セロコンバージョン率とは、ワクチン接種の前に、＜１：１０のＨＩ力価を有し、かつ、ワクチン接種後に、≧１：４０のＨＩ力価を有する対象の％である。しかし、初期力価が≧１：１０である場合、ワクチン接種後において、抗体量の、少なくとも４倍の増大が必要である。
【０１８４】
代替的に、または加えて、本発明の好ましい組成物は、インフルエンザワクチンについて、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）により確立された免疫学的基準のうちの１つまたは２つを満たす。成人（１８〜６４歳）では、これらの基準は、（１）≧１：４０のＨＩ抗体力価を達成する対象の％は、≧７０％であるべきである；（２）≧４０％のセロコンバージョンである。老齢（＞６４歳）では、これらの基準は、（１）≧１：４０のＨＩ抗体力価を達成する対象の％は、≧６０％であるべきである；（２）≧３０％のセロコンバージョンである。ＣＢＥＲ基準に従い、セロコンバージョン率とは、ａ）ベースラインの力価が≧４０％のセロコンバージョン１：１０である対象では、４倍またはこれを超える上昇；またはｂ）ベースラインの力価が＜１：１０である対象では、≧１：４０への上昇として規定されている。真の値についての９５％のＣＩの下限において、これらの基準を満たさなければならない。
【０１８５】
評価項目は、ワクチン接種の３週間後（例えば、２２日目）に測定することができる（２回投与のスケジュールでは、これは、典型的には２回目の投与後から計算する）。
【０１８６】
小児患者群（例えば、＜１８歳）についても、同じ（例えば、成人）基準に依拠することができる。
【０１８７】
所与の組成物により、上記で言及した「統計学的に許容可能な」免疫応答がもたらされるのかどうかについて評価することは、当業者の通常の能力の範囲内にある。統計学的に許容可能な応答は、例えば、上記の基準のうちの少なくとも１つが、真の値についての９５％のＣＩの下限において満たされるように、ＣＨＭＰ基準またはＣＢＥＲ基準に従い裏付けられる免疫原性でありうる。
【０１８８】
本発明に従い投与されるワクチンは、同じインフルエンザシーズン中に投与される。北半球では、典型的には、インフルエンザシーズンは１０月から５月まで続き、インフルエンザの活動ピークは、１２月〜２月の間である。南半球では、インフルエンザシーズンは、５月に始まり、７月にピークに達し、１０月に終わる。第２のインフルエンザワクチンは、第１のインフルエンザワクチンの後、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、または５カ月以内に投与することができる。好ましくは、第２のインフルエンザワクチンは、第１のインフルエンザワクチンの後３カ月以内に投与する。
【０１８９】
ワクチンは、患者へと、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ診察時、または医療従事者もしくはワクチン接種施設への同じ来院時に）、例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅコンジュゲートワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン（四価Ａ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチンなどと実質的に同時に投与することができる。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、老齢患者において有用である。
【０１９０】
同様に、ワクチンは、患者へと、抗ウイルス化合物と実質的に同時に（例えば、同じ診察時、または医療従事者への同じ来院時に）投与することができ、特に、インフルエンザウイルスに対して活性の抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に投与することができる。これらの抗ウイルス剤は、それらのエステル（例えば、エチルエステル）およびそれらの塩（例えば、リン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼ阻害剤を含む。好ましい抗ウイルス剤は、オセルタミビルリン酸塩（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としてもまた公知の、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）である。
【０１９１】
「ワクチン有効性」（または「ＶＥ」）という用語は、流感ワクチンによりもたらされる、危険性の低減を表す。例えば、米国では、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）によるワクチン有効性研究は一般に、医師への来院転帰または救急医療のための来院転帰を結果としてもたらす、検査室で確認された流感性疾病について測定する。この転帰について、５０％のＶＥ推定値は、人が、医師の診察室または救急医療施設への来院を結果としてもたらす流感性疾病を発症する危険性を、流感ワクチンが５０％低減することを意味する。ＶＥの決定は、当業者の通常の能力の範囲内にある。ＶＥは、米国ＣＤＣなどの規制機関により決定される通りでありうる。例えば、ＶＥは、先行技術（参考文献１１１）において記載されている方法であって、ＶＥ（％）を、［１−補正ＯＲ］×１００［式中、ＯＲは、診察を受け、検査室により、ワクチン接種されていない対象と対比して、ワクチン接種された対象において確認されたインフルエンザについての推定オッズ比である］（参考文献１１１）として計算する方法を使用して決定することができる。推定補正ＯＲは、臨床的に関与性の交絡因子についての調整を伴うロジスティック回帰により決定することができる。過去のＶＥ解析によれば、共変量は、年齢、並存疾患、地方、検体回収週、およびインフルエンザ様疾病（ＩＬＩ）の発病と、検体回収との間の間隔を含む。
【０１９２】
アジュバント
第１のインフルエンザワクチンおよび／または第２のインフルエンザワクチンは、アジュバント処理されていない場合もあり、アジュバントと共に投与する場合もある。アジュバントは、組成物を施される患者において誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能しうる。一部のアジュバントは、非経口投与には効果的であるが、粘膜投与には効果的でなく（例えば、アルミニウム塩）、この逆も成り立つが、一部のアジュバントは、両方の経路に効果的である。アジュバントを使用する場合、アジュバントは、適材適所に選び出される。
【０１９３】
水中油エマルジョンアジュバント
水中油エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンのアジュバント処理における使用に、特に適することが見出されている。このような多様なエマルジョンは、公知であり、典型的には少なくとも１つの油と、油を伴う少なくとも１つの界面活性剤と、生体分解性（代謝性）かつ生体適合性の界面活性剤とを含む。エマルジョン中の油滴は一般に、直径が５μｍ未満であり、１ミクロン未満の直径を有する場合もあり、これらの小さなサイズは、安定的なエマルジョンをもたらすように、マイクロフルイダイザーにより達成される。サイズを２２０ｎｍ未満とする液滴が、濾過無菌にかけうるので好ましい。
【０１９４】
好ましい実施形態では、エマルジョンは、均一である。均一なエマルジョンは、その中に分散させた液滴（粒子）の大部分が、指定されたサイズ範囲（例えば、直径範囲）内にあることにより特徴付けられる。適切な指定の粒子サイズ範囲は、例えば、５０〜２２０ｎｍの間、５０〜１８０ｎｍの間、８０〜１８０ｎｍの間、１００〜１７５ｎｍの間、１２０〜１８５ｎｍの間、１３０〜１９０ｎｍの間、１３５〜１７５ｎｍの間、１５０〜１７５ｎｍの間でありうる。一部の実施形態では、均一エマルジョンは、指定の直径範囲外にある液滴（粒子）のうちの、≦１０％の数の液滴（粒子）を含有する。一部の実施形態では、水中油エマルジョン調製物中の油滴の、平均値粒子サイズは、動的光散乱により測定される通り、１３５〜１７５ｎｍの間、例えば、１５５ｎｍ±２０ｎｍであり、このような調製物は、光学粒子センシングにより測定される通り、調製物１ｍＬ当たり１×１０７を越えない大型粒子を含有する。本明細書で使用される「大型粒子」とは、直径を＞１．２μｍ、典型的に１．２〜４００μｍの間とする粒子を意味する。好ましい実施形態では、均一エマルジョンは、好ましいサイズ範囲外にある液滴のうちの１０％未満、５％未満、または３％未満を含有する。一部の実施形態では、水中油エマルジョン調製物中の粒子の平均値液滴サイズは、１２５〜１８５ｎｍの間、例えば、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、または約１８０ｎｍであり、水中油エマルジョンは、１２５〜１８５ｎｍの範囲外にある調製物中の液滴の数は、５％未満であるという意味で均一である。
【０１９５】
本発明は、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来する油などの油と共に使用することができる。植物油のための供給源は、堅果、種、および穀物を含む。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油は、最も一般に利用可能であり、堅果油を例示する。例えば、ホホバ豆から得られたホホバ油を使用することができる。種油は、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油などを含む。穀物群では、トウモロコシ油が、最もたやすく入手可能であるが、コムギ、オオムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなど、他の穀類の油もまた、使用することができる。種油中で自然発生するわけではないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの、６〜１０炭素の脂肪性酸エステルも、堅果油および種油から出発する適切な材料の、加水分解、分離、およびエステル化により調製することができる。哺乳動物のミルクに由来する脂肪および油は、代謝性であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。当技術分野では、分離、精製、サポニン化のための手順、および純粋な油を、動物供給源から得るために必要な他の手段が周知である。大半の魚類は、たやすく回収されうる、代謝性の油を含有する。例えば、肝油、サメ肝油、およびマッコウクジラなどの鯨油は、本明細書で使用されうる魚油のうちのいくつかを例示する。多数の分枝鎖油が、５−炭素イソプレン単位内で、生化学的に合成されており、一般に、テルペノイドと称する。サメ肝油は、本明細書で特に好ましい、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンである、スクアレンとして公知である、分枝状の不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンの飽和類似体であるスクアランもまた、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販品供給源からたやすく入手可能であるか、または当技術分野で公知の方法により得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロール（下記を参照されたい）である。油の混合物を使用することができる。
【０１９６】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）により分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステルによる界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎと称する）、とりわけ、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に目的である、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数を変動させうるオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来する、ポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知である）を含むがこれらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に組み入れるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１９７】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールとの組合せもまた適する。別の有用な組合せは、ｌａｕｒｅｔｈ  ９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１９８】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ  ８０など）０．０１〜１％、特に、約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中の他の洗浄剤など）０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％であり、特に、０．１〜１％または約０．５％である。
【０１９９】
最も好ましい水中油エマルジョンは、水中スクアレンエマルジョン、好ましくは、１ミクロン未満の水中スクアレンエマルジョンである。
【０２００】
本発明で有用な、具体的な水中油エマルジョンアジュバントは、以下を含むがこれらに限定されない。
【０２０１】
１ミクロン未満のスクアレンエマルジョン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエート：エマルジョン容量組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のソルビタントリオレエートでありうる。重量による場合、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のソルビタントリオレエートとなる。エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含みうる。クエン酸イオンは、水性相中にありうる。より特定すると、エマルジョン容量組成は、約４．６％のスクアレン、約０．４５％のポリソルベート８０、および約０．５％のソルビタントリオレエートでありうる。「ＭＦ５９」として公知のアジュバント（参考文献７４〜７６および１３３）は、参考文献１３３の第１０章および参考文献７７の第１２章においてより詳細に記載されている。スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートは、９７５０：１１７５：１１７５の重量比で存在しうる。一部の実施形態では、エマルジョンは、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定される、３６〜４２ｍｇ／ｍｌのスクアレン；ＲＰ−ＬＣにより測定される、４．１〜５．３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０；およびＲＰ−ＬＣにより測定される、４．１〜５．３ｍｇ／ｍｌのソルビタントリオレエートを含有しうる。約３９ｍｇ／ｍＬのスクアレン、約４．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約４．７ｍｇ／ｍＬのソルビタントリオレエートの濃度が典型的である。一部の実施形態では、動的光散乱により測定される、１５５±２０ｎｍの平均値粒子サイズが好ましい。Ｚ平均による１５５〜１８５ｎｍの間の、多分散性を＜０．２とする液滴サイズが好ましい。好ましくは、スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートを含む１ミクロン未満のエマルジョンは、均一である（上記を参照されたい）。
【０２０２】
スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０によるエマルジョン：エマルジョンは、リン酸緩衝液生理食塩液を含みうる。エマルジョンはまた、Ｓｐａｎ  ８５（例えば、１％の）および／またはレシチンも含みうる。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ  ８０を有することが可能であり、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定的なエマルジョンをもたらすので、好ましくは＜１である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ  ８０は、約５：２の容量比で存在しうる。このようなエマルジョンの１つは、Ｔｗｅｅｎ  ８０を、ＰＢＳ中で溶解させて、２％の溶液をもたらし、次いで、この溶液９０ｍｌを、混合物（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）と混合し、次いで、混合物をマイクロフルイダイズすることにより制作することができる。結果として得られるエマルジョンは、例えば、平均直径を、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１５０〜１８０ｎｍの間、例えば、約１５０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、または約１８０ｎｍとする１ミクロン未満の油滴を有しうる。
【０２０３】
スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤によるエマルジョン：エマルジョンはまた、３ｄ  ＭＰＬも含みうる（下記を参照されたい）。エマルジョンのＴｒｉｔｏｎ洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でありうる。トコフェロールは、α−トコフェロールでありうる。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有しうる。
【０２０４】
ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン：エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌの、α−トコフェロールスクシネート）の質量比で含むことが可能であり、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。エマルジョンは、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびα−トコフェロールスクシネートを含みうる。エマルジョンはまた、スクアレンも含みうる。エマルジョンはまた、３ｄ  ＭＰＬも含みうる（下記を参照されたい）。水性相は、リン酸緩衝液を含有しうる。
【０２０５】
スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン：エマルジョンは、リン酸緩衝液生理食塩液、ｐＨ７．４中で製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中で、トレオニルＭＤＰと共に使用されている（参考文献７８）（０．０５〜１％のＴｈｒ  ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバント中の場合のように、Ｔｈｒ  ＭＤＰを伴わずに使用することもできる（参考文献７９）（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０２０６】
０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン：参考文献８０に記載される通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。１ミクロン未満の液滴サイズが、有利である。
【０２０７】
非代謝性油（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、またはＳｐａｎ  ８０など）による、１ミクロン未満の水中油エマルジョン：ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物質コンジュゲート（参考文献８１において記載されている、脂肪族アミンを、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、デスアシルサポニンへと添加することにより作製されたＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyidioctadecylammonium  bromide）、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤も組み入れることができる。
【０２０８】
サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）と、ステロール（例えば、コレステロール）とが、ヘリカルミセルとして会合するエマルジョン：サポニンは、ＱｕｉｌＡの場合もあり、かつ／またはＱＳ２１の場合もあり、ステロールは、コレステロールでありうる（参考文献８２）。
【０２０９】
ミネラル油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤を含むエマルジョン：エマルジョンは、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含みうる（参考文献８３）。
【０２１０】
ミネラル油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤を含むエマルジョン：エマルジョンは、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含みうる（参考文献８３）。
【０２１１】
本発明に従い、エマルジョンは、送達時に、即席で、抗原と混合することができる。したがって、アジュバントと抗原とは、使用時における最終的な製剤の準備ができた状態で、パッケージングされたワクチン内または販売されるワクチン内で別個に保たれている。２つの液体を混合することにより、ワクチンを最終的に調製するように、抗原は一般に、水性形態であろう。混合のための２つの液体の容量比は、変動しうる（例えば、５：１〜１：５の間で）が、一般に約１：１である。
【０２１２】
抗原とアジュバントとを混合した後で、ヘマグルチニン抗原は一般に、なおも水溶液中にあるが、油／水界面の近傍に分布しうる。一般に、エマルジョンの油相に入るヘマグルチニンは、存在するとしても少量である。
【０２１３】
組成物が、トコフェロールを含む場合、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、εトコフェロール、またはξトコフェロールのうちのいずれも使用しうるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、異なる塩および／またはアイソマーを取りうる。塩は、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などの有機塩を含む。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールのいずれも使用することができる。トコフェロールは、ビタミンＥは、この患者群内で、免疫応答に対して、肯定的な効果を及ぼすことが報告されているため、老齢患者（例えば、６０歳またはそれ超、６１歳またはそれ超、６５歳またはそれ超など）における使用のためのワクチン中に含まれると有利である（参考文献８４）。トコフェロールはまた、エマルジョンを安定化させる一助となる、抗酸化特性も有する（参考文献８５）。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＴＮＦ関連のリガンドと協同作用することが見出されている。さらに、α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物の代替物としても有用な保存剤であることが公知である（参考文献８）。保存剤非含有ワクチンが特に好ましい。
【０２１４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチド
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含むことが可能であり、二本鎖の場合もあり、または（ＲＮＡを除き）一本鎖の場合もある。参考文献８６、８７および８８は、類似体による可能な置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換について開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果については、参考文献８９〜９４においてさらに論じられている。モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどのＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９を指向しうる（参考文献９５）。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）など、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的な場合もあり、またはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど、Ｂ細胞応答を誘導するのにより特異的な場合もある。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮについては、参考文献９６〜９８において論じられている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が、受容体の認識にアクセス可能となるように構築する。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端において付着させて、「イムノマー」を形成することができる。例えば、参考文献９５および９９〜１０１を参照されたい。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ）としてもまた公知のＣｐＧ７９０９である。
【０２１５】
ＣｐＧ配列の使用に対する代替物として、またはこれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することもできる（参考文献１０２）。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフ非含有でありうる。
【０２１６】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチでありうる。例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つを超える連続チミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１０２において開示されているＴＴＴＴ）を含む場合もあり、かつ／または＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を伴うヌクレオチド組成を有する場合もある。例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つを超える連続シトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１０２において開示されているＣＣＣＣ）を含む場合もあり、かつ／または＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を伴うヌクレオチド組成を有する場合もある。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフ非含有でありうる。
【０２１７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも２０ヌクレオチドを含むであろう。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１００より少数のヌクレオチドを含む場合もある。
【０２１８】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ
３ｄＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしてもまた公知である）は、モノホスホリルリピドＡ内の還元末端であるグルコサミンの３位を、脱アシル化させたアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損突然変異体から調製されており、リピドＡと化学的に類似するが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠く。３ｄＭＰＬは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化させ、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦを含む、いくつかのサイトカインの放出を刺激する（参考文献１０３もまた参照されたい）。３ｄＭＰＬの調製については、元は、参考文献１０４において記載された。
【０２１９】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化により変化する（例えば、長さが異なりうる、３つ、４つ、５つ、または６つのアシル鎖を有する）、類縁分子の混合物の形態を取りうる。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしてもまた公知である）単糖は、それらの２位炭素（すなわち、２位および２’位において）、Ｎ−アシル化されており、また、３’位において、Ｏ−アシル化されてもいる。炭素２に付着した基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に付着した基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に付着した基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は、
【化１】
2018524323.tif 000003
である。
【０２２０】
基Ｒ１、基Ｒ２、および基Ｒ３は各々、独立に、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは８〜１６の間、より好ましくは９〜１２の間であり、最も好ましくは１０である。
【０２２１】
基Ｒ１’、基Ｒ２’、および基Ｒ３’は各々、独立に、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４でありうる［式中、Ｒ４は、−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３［式中、ｍの値は、好ましくは８〜１６の間であり、より好ましくは１０、１２または１４である］である］。２位において、ｍは、好ましくは１４である。２’位において、ｍは、好ましくは１０である。３’位において、ｍは、好ましくは１２である。したがって、基Ｒ１’、基Ｒ２’、および基Ｒ３’は、好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸、またはヘキサデカン酸に由来する−Ｏ−アシル基である。
【０２２２】
Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちの全てが、−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは、３つのアシル鎖だけ（２位、２’位、および３’位の各々に１つずつの）を有する。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちの２つだけが、−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは、４つのアシル鎖を有しうる。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちの１つだけが、−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは、５つのアシル鎖を有しうる。Ｒ１’、Ｒ２’、およびＲ３’のうちの１つも、−Ｈでない場合、３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有しうる。本発明に従い使用される３ｄＭＰＬアジュバントは、３つ〜６つのアシル鎖を伴う、これらの形態の混合物でありうるが、特に、ヘキサアシル鎖形態が、全３ｄＭＰＬのうちの、重量で少なくとも１０％、例えば、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、またはそれ超を構成することを確保するように、混合物中に６つのアシル鎖を伴う３ｄＭＰＬを含むことが好ましい。６つのアシル鎖を伴う３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性の大きな形態であることが見出されている。
【０２２３】
したがって、本発明の組成物中に組み入れるのに最も好ましい３ｄＭＰＬの形態は、
【化２】
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である。
【０２２４】
３ｄＭＰＬを、混合物の形態で使用する場合、本発明の組成物の３ｄＭＰＬの量または濃度に対する言及は、混合物中の３ｄＭＰＬ分子種の組合せを指す。
【０２２５】
水性条件下で、３ｄＭＰＬは、サイズの異なる、例えば、直径を＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍとする、ミセル状凝集物または粒子を形成しうる。本発明では、これらの一方または両方を使用することができ、良好な粒子は、規定のアッセイにより選択することができる。それらの優れた活性のために、小型粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液をもたらすのに十分な程度に小型の）が、本発明に従う使用には好ましい（参考文献１０５）。好ましい粒子は、平均値直径が、２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満であり、平均値直径はなお、１００ｎｍ未満でもありうる。しかし、大半の場合、平均値直径は、５０ｎｍ未満とはならないであろう。これらの粒子は、濾過滅菌に適する程度に十分に小型である。粒子直径は、平均値粒子直径を明らかにする、規定の動的光散乱技法により評価することができる。粒子の直径が、ｘｎｍであるという場合は、一般に、この平均値の近傍に粒子の分布があるが、少なくとも５０％の数（例えば、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、またはそれ超）の粒子は、直径が、ｘ±２５％の範囲内にあるであろう。
【０２２６】
３ｄＭＰＬは、水中油エマルジョンと組み合わせて使用すると有利でありうる。３ｄＭＰＬの実質的に全ては、エマルジョンの水性相中に位置しうる。
【０２２７】
ワクチン中の３ｄＭＰＬの典型的な量は、投与１回当たり１０〜１００μｇ、例えば、約２５μｇまたは約５０μｇである。
【０２２８】
３ｄＭＰＬは、それ自体で使用することもでき、１または複数のさらなる化合物と組み合わせて使用することもできる。例えば、３ｄＭＰＬを、ＱＳ２１サポニン（参考文献１０６）（水中油エマルジョン中を含む（参考文献１０７））、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム（参考文献１０８）、水酸化アルミニウム（参考文献１０９）、またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて使用することが公知である。
【０２２９】
全般
「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のほか、「〜からなること」も包含し、例えば、「Ｘを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）組成物」  は、Ｘからもっぱらなる場合もあり、さらなる何物か、例えば、Ｘ＋Ｙを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）場合もある。
【０２３０】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外せず、例えば、「Ｙを実質的に含まない組成物」とは、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明による定義から省略することができる。
【０２３１】
数値ｘとの関連における「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２３２】
具体的に言明されない限りにおいて、２つまたはこれを超える成分を混合するステップを含む工程は、いかなる具体的な混合順序も要請しない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を、互いと組み合わせ、次いで、この組合せを、第３の成分と組み合わせることができるなどである。
【０２３３】
動物（そして、特に、ウシ）材料を、細胞培養物中で使用する場合、それらは、伝染性海綿状脳症（transmissible  spongiform  encaphalopathies）（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るものとする。総じて、動物由来の材料の完全な非存在下で、細胞を培養することが好ましい。
【０２３４】
細胞基質を、遺伝子再集合手順または逆遺伝学手順のために使用する場合、細胞基質は、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ  ５．２．３における通り、ヒトワクチンの作製における使用について承認された細胞基質であることが好ましい。
【０２３５】
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらは、限定的であるとはみなされるべきではない。
【実施例】
【０２３６】
本発明について、例だけを目的として記載してきたが、本発明の範囲および精神の範囲内にとどまりながら、改変を行いうることが理解されるであろう。
【０２３７】
（実施例１）
Ｈ３Ｎ２内の抗原ミスマッチ
病原体と人類とは、共進化してきた。どのようにして、病原体を中和するように、免疫系は進化し、どのようにして、免疫系を回避するように、病原体は進化するのかということにおいては、相互交渉がなされてきた。
【０２３８】
インフルエンザウイルスは、表面抗原特徴により分類される、多様な範囲にわたる亜型を含む。さらに変異も存在するので、特異的なインフルエンザ分離株は、ウイルス型、最初に分離された地理的位置、分離の通し番号、分離年、ならびにＨＡ亜型およびＮＡ亜型を特定する、標準的な命名法により同定する。表面抗原の高度の抗原変異のために、十分な防御をもたらすように、主要な蔓延（例えば、疾患原因）株にマッチするインフルエンザワクチンを調製することが重要である。
【０２３９】
近年、米国、欧州、およびその他の地域では、ワクチン有効性が驚くほど低下している。例えば、米国では、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）が、検査室で確認された、加療中の急性呼吸器疾患（ＡＲＩ）と関連するＨ３Ｎ２インフルエンザに対するワクチン有効性（ＶＥ）は、２３％であることを報告している。蔓延Ｈ３Ｎ２ウイルスのうちの６８％は、ワクチン株への、著明な抗原ミスマッチを示すことが観察された。同じシーズンには、ミスマッチクレードである、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２様ウイルス（クレード３Ｃ．１）が推奨された。
【０２４０】
さらに、卵馴化Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２様ウイルスは、類縁の蔓延ウイルスへのマッチも弱い。卵馴化性突然変異は、抗原性に影響を及ぼすことが認識されている。２０１３〜１４年のシーズンにおける推奨は、抗原マッチを確実にすることの重要性を強調し、卵ベースでない工程により、良好なマッチを可能とする、新たなシステムが必要とされることを示唆した。
【０２４１】
同様に、カナダでも、検査室で確認された、加療中のＡＲＩと関連するインフルエンザに対するＶＥは、−８％である（Eurosurveillance、２０１５年１月）ことが報告されたが、ここで、９９％は、Ｈ３Ｎ２であることが同定され、シーケンシングされた株のうちの９１％は、３Ｃ．２Ａクレードであることが同定された。英国では、検査室で確認された、プライマリーケアを受診したインフルエンザに対するＶＥの対応する数は、３．４％であり、Ａ（Ｈ３Ｎ２）については、−２．３％ＶＥである（Eurosurveillance、２０１５年２月）。
【０２４２】
流感ワクチンが、人を流感への罹患から防御する可能性の決定には、少なくとも２つの、鍵となる因子：１）ワクチン接種される者の特徴（彼らの年齢および健康状態など）、および２）それに対して防御するように、流感ワクチンがデザインされる流感ウイルスと、コミュニティー内で拡散している流感ウイルスとの類似性または「マッチ」が存在する。この点について、ＣＤＣは、流感ワクチンが、蔓延ウイルスによくマッチしない年には、流感ワクチン接種からの利益を観察しえない可能性もあると論評した（www.cdc.gov/flu/about/qa/vaccineeffect.htmを参照されたい）。
【０２４３】
図１は、流感と関連する疾病（病院への来院率により測定される）と、シーズンの経過との関係を、６つのインフルエンザシーズンの各々について描示する。図が指し示すことは、システムが抗原変化に対処するのは、極めて困難であるということである。さらに、卵馴化は、認識されていないワクチンの抗原変化の駆動因子でありうる。図はまた、運用している現行のシステムでは、Ｈ３Ｎ２に対する効果的なワクチン接種は、成功とはいえないことも強調している。この認識は、Ｈ３Ｎ２が優勢な、将来の流感シーズンでも、利用可能な季節性ワクチンの同様な抗原ミスマッチが生じうる可能性を提起する。すなわち、卵馴化および／または不正確なクレードのために、推奨は、ミスマッチしうる。
【０２４４】
本明細書で例示される通り、ワクチン有効性の低下は、クレードミスマッチおよび卵／細胞馴化ミスマッチが優勢なインフルエンザシーズンと相関する。
【０２４５】
例えば、ある特定のクレードは、抗原ミスマッチを特に引き起こしやすい。
【０２４６】
北半球において来るべきシーズンには、クレード３Ｃ．３Ａ株が選び出されている。卵馴化バージョン（Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３）が、細胞バージョンにミスマッチする（マッチは、ＵＫ  ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒにより報告されている通り、被験ウイルスのうちの１３％である）ことは注目に値する。対照的に、細胞バージョンは、被験蔓延ウイルスの８８％近くとマッチした。
【０２４７】
本出願の起草時現在では、実際にクレード３Ｃ．２Ａが勃興し、優勢である。Flanneryら（CDC  Report、２０１５年６月２４日）に従い、米国内の検査室による監視に基づくと、３Ｃ．２Ａは、蔓延Ｈ３Ｎ２株のうちの８１％強を表した。３Ｃ．２Ａの細胞バージョンが、蔓延ウイルスにマッチするのに対し、卵馴化は、抗原ミスマッチおよびＨＡ抗原のヘッド領域における、同時的なグリコシル化の喪失を結果としてもたらす。
【０２４８】
図２から明らかなとおり、ワクチン効能は、インフルエンザと関連する医療上の必要と反比例する。この関係は、患者のある特定の亜集団、例えば、それらの免疫系が、未成熟であるか、または抑制されている、極めて若齢の小児および老齢者について特に強い。同じことは、疾病または投薬に起因する免疫障害個体についても言われる可能性が高い。
【０２４９】
Ｈ３Ｎ２ウイルスは、ＨＩアッセイにおいて観察される技術的困難により裏付けられる通り、赤血球に結合しないように進化してきた。実際、当初は大きかった３Ｃ．２Ａウイルスのセットが、ＨＩベースの初期スクリーニングに不可欠な、それらが赤血球（ＲＢＣ）に結合する能力の欠如のために、検出されなくなり、３Ｃ．２Ａウイルスの多くは、標準的なＨＩアッセイにより調べることができないため、依然として特徴付けられていない。重要なことは、卵馴化３Ｃ．２Ａウイルスが、ＲＢＣを凝集させる能力を再獲得したが、鍵となるグリコシル化を喪失し、蔓延ウイルスには抗原的にミスマッチしたことである。図４は、ＭＤＣＫ細胞内の連続継代培養にかけられた、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４（３Ｃ．２Ａ）のＨＡ力価を示す。結果は、哺乳動物細胞により産生される合成ウイルスが、継代培養の後で、ＲＢＣを凝集させる能力を獲得（ｇａｉｎ）しなかったのに対し、哺乳動物細胞により産生される野生型ウイルスは、ＲＢＣに結合する能力を獲得した（ａｃｑｕｉｒｅｄ）ことを示したが、これは、継代５代目までの、ＨＡグリコシル化部位の喪失と符合する。全ての卵馴化ウイルスは、ＨＡ力価を有した。
【０２５０】
さらに、図３で例示される通り、卵内では、Ｈ３Ｎ２の分離率が劇的に降下しているのに対し、細胞内では、細胞特異的な馴化を伴わずに、依然として高度である。満たされていない必要を例示する、これらの観察および難題を念頭に、本開示は、ある特定のインフルエンザウイルス、特に、卵ベースの産生と関連する問題を受けやすいインフルエンザウイルスに対する良好な防御のための解決策を提供する。
【０２５１】
（実施例２）
合成ＤＮＡおよび新規の骨格を使用して作製されるインフルエンザウイルスの抗原の特徴付け。
数十年間にわたり、インフルエンザウイルスは、それらのＲＮＡゲノム内の突然変異率が高く、それらの天然のドリフトを容易とし、ワクチン作製を絶えず困難とする特性である複雑な擬似種として存在することが察知されている。ヒトにおいて循環するインフルエンザ株は頻繁に、抗原的に重要な突然変異を獲得して、免疫圧を回避し、優勢となり、季節性再感染を引き起こす、新たな変異体をもたらす。これらの抗原変化は、インフルエンザワクチンを毎年再検討し、ほぼ頻繁に更新することを義務付ける。ワクチン接種は、季節性インフルエンザに対して防御するのに、最も効果的な戦略であるが、ワクチンの性能は年によって変動し、ワクチン抗原と蔓延株の抗原とのミスマッチと関連して、有効性も低下する（参考文献１１０〜１１２）。
【０２５２】
現行のシステム下では、哺乳動物細胞、特に、ＭＤＣＫ細胞系が、感染に対するそれらの高感受性のために、監視活動のためのインフルエンザウイルスの分離に好ましい基質である（参考文献１１３）。しかし、もっぱら孵化鶏卵内で再分離することができ、繁殖させうるインフルエンザウイルスだけが、哺乳動物細胞ベースのワクチン製造プラットフォームおよび卵ベースのワクチン製造プラットフォームのいずれのための候補物質としても推奨されている。この標準的な慣行は、ワクチンミスマッチをもたらす可能性を永続化させる。
【０２５３】
卵内のウイルス分離率の変動性は、特に、近年のＨ３Ｎ２株の場合（参考文献１１４）、利用可能な、適切なワクチン候補物質の数を、年によって制限する場合がある。２００４年には、季節性ワクチンを作製する時期に、卵内で、マッチの良好なＨ３Ｎ２株を分離することができなかった結果として、この亜型に対する実質的なワクチンミスマッチおよび関連するワクチン有効性の低減がもたらされた（参考文献１１１および１１５）。さらに、卵内で繁殖させたヒト由来のインフルエンザウイルスは、選択圧を受け、それらのアフィニティーを、ヒト呼吸器上皮内で優勢なα−２，６結合型シアル酸（参考文献１１６）から、卵尿膜腔内で優勢なα−２，３結合型シアル酸（参考文献１１７および１１８）へと変更しうる、ＨＡ内の突然変異を獲得しうる。近年、推奨されるＨ３Ｎ２およびＢ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のワクチンウイルスは、これらの卵馴化性突然変異に起因して、蔓延株へのマッチの著明な低減を呈示している（参考文献１１０、１１９および１２０）。
【０２５４】
蔓延ウイルスにおける進化ドリフトは、制御することができないが、現行の卵ベースのインフルエンザワクチン作製システムの一部として導入される抗原ミスマッチは、改善することができる。哺乳動物細胞内で繁殖させたインフルエンザウイルスは、臨床素材中に存在するウイルスとの、遺伝子的および抗原的な類似性を、しばしば維持していることが公知である（参考文献１２１〜１２３）。したがって、ワクチン作製に適格な哺乳動物細胞系内で分離されたウイルスの使用は、ワクチン株の、蔓延ウイルスへの抗原マッチを維持する一助となりうる（参考文献１２３）。
【０２５５】
代替的に、本発明者らは、もっぱら、ワクチンに適格なＭＤＣＫ細胞内で、高収率のインフルエンザウイルスを作出するための効率的な合成手法も開発した（参考文献１２４）。これらのウイルスは、逆遺伝学により、報告されているＨＡ配列およびＮＡ配列に基づき、最適化された骨格遺伝子セグメントと組み合わせて、合成により導出された核酸から作製する（参考文献１２４）。これらの高増殖骨格は、ウイルスレスキュー効率を増大させることが可能であり、ウイルスＨＡ収率を増大させうる（参考文献１２４）。これらの骨格の潜在的な有用性は、抗原性に対するそれらの影響に部分的に依存する。この合成手法が、意図される基準株への遺伝子マッチおよび抗原マッチを維持するウイルスをもたらす能力を裏付けるために、本発明者らは、季節性Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株、およびＢ株をカバーする合成ウイルスのパネルの抗原性を、それらのそれぞれの卵により増殖させた基準対応物または哺乳動物細胞により増殖させた基準対応物と比較する研究を実施した。
【０２５６】
材料および方法
細胞およびウイルス
ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞は、既に記載されている通りに維持した（参考文献１２４）。野生型のインフルエンザウイルスは、世界保健機構（ＷＨＯ）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃｅｎｔｅｒｓが、臨床試料から分離した。卵ベースの遺伝子再集合体ウイルスは、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（ＷＨＯ  ＣＣ）で作出された。全てのウイルスは、Ｃｒｉｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｉｌｌ  Ｈｉｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＫに保持されているストックに由来した。
【０２５７】
合成ＤＮＡ
ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントは、既に記載されている（参考文献１２４）通りに、または以下の改変を伴ってアセンブルした。重複オリゴヌクレオチドは、プライマーＢＭＰ＿１３およびＢＭＰ＿１４を使用してアセンブルした（参考文献１２４）。ＰＣＲ産物を、変性および再アニールさせて、ミスマッチ二重鎖ＤＮＡを形成した後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）およびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（ＮＥＢ）を伴うインキュベーションを行った。ネステッドプライマーである、ＢＭＰ＿２７（ＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ）（配列番号１）およびＢＭＰ＿３４（ＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡ）（配列番号２）を使用して、エラーを補正したＤＮＡを増幅し、エタノール沈殿により精製した。最終的な産物は、上流および下流の調節的制御エレメントに挟まれる、直鎖状の遺伝子セグメントであった。
【０２５８】
逆遺伝学
合成ウイルスは、既に記載されている通りに作出した（参考文献１２４）。略述すると、合成ＨＡ遺伝子カセットおよび合成ＮＡ遺伝子カセットならびに６つの骨格遺伝子（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ）を保有するプラスミドと、プラスミドＴＭＰＲＳＳ２（セリンプロテアーゼをコードする（参考文献１２５））とを、ＭＤＣＫ細胞へと共トランスフェクトした。清明化させた培養物培地を、トランスフェクションの少なくとも７２時間後に採取し、フォーカスフォーメーションアッセイにより、ウイルスを検出した（参考文献１２４）。全ての実験は、レスキューされ、ＭＤＣＫ細胞内で最大３回にわたり継代培養されたウイルスにより実施した。
【０２５９】
合成ウイルスを作出するのに使用したＨＡアミノ酸配列を、標準的な一文字フォーマットで、下記に列挙する。
Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ／１６／２０１０（ＮＩＢ７４）（卵）
【化３】
2018524323.tif 000005
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９（Ｘ１８７）（卵）
【化４−１】
2018524323.tif 000006
【化４−２】
2018524323.tif 000007
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９（哺乳動物細胞）
【化５】
2018524323.tif 000008
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（ＩＶＲ１６５）（卵）
【化６】
2018524323.tif 000009
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（哺乳動物細胞）
【化７−１】
2018524323.tif 000010
【化７−２】
2018524323.tif 000011
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（卵）
【化８】
2018524323.tif 000012
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（哺乳動物細胞）
【化９】
2018524323.tif 000013
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｘ１７５Ｃ）（卵）
【化１０−１】
2018524323.tif 000014
【化１０−２】
2018524323.tif 000015
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／２９９／２０１１（ＩＶＲ１６４）（卵）
【化１１】
2018524323.tif 000016
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｂｅｒｌｉｎ／９３／２０１１（卵）
【化１２】
2018524323.tif 000017
Ａ／Ｈ３Ｎ２／ＳｏｕｔｈＡｕｓｔｒａｌｉａ／３／２０１１（哺乳動物細胞）
【化１３−１】
2018524323.tif 000018
【化１３−２】
2018524323.tif 000019
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３（哺乳動物細胞）
【化１４】
2018524323.tif 000020
Ａ／Ｈ３Ｎ２／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３（卵）
【化１５】
2018524323.tif 000021
Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（卵）
【化１６】
2018524323.tif 000022
Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（哺乳動物細胞）
【化１７】
2018524323.tif 000023
【０２６０】
ウイルスシーケンシング
ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ウイルスＲＮＡを抽出し、Ｍｏｎｓｔｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、ｃＤＮＡを作出した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子を増幅し、サンガーＤＮＡシーケンシングにより、配列を解析した。
【０２６１】
血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ
血球凝集アッセイおよびＨＩアッセイは、標準的なＷＨＯ方法に従い、モルモット赤血球の０．１％懸濁液および２０ｎＭのオセルタミビルカルボキシレートを使用することにより実施した。ＨＡ力価は、薬物の存在下で決定した。ＨＩ力価は、血球凝集を阻害する血清の最高希釈率の逆数とした。多様な基準ウイルスに対する、感染後フェレット抗血清を、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａに由来する受容体破壊酵素で処理した。
【０２６２】
フェレットの接種
感染後抗血清は、軽度の鎮静下で、希釈ウイルスを鼻腔内点滴した後のフェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ）において作製し、血清は、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ認可番号ＰＰＬ／８０／２５４１下にある、Ｃｒｉｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｌｌ  Ｈｉｌｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて、神経終末麻酔下で回収するか、またはＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ認可番号ＰＩＬ／８０／２５３０下にある、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＵＫが制作した。他の抗血清は、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｅｓａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ．、Ｓｔ  Ｊｕｄｅ’ｓ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ、およびＰｅｔｅｒ  Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａにおける、ＷＨＯ  ＣＣによる抗血清であった。
【０２６３】
結果
合成ウイルスの作出
合成技術および逆遺伝学技術は、公知のウイルス配列に基づき、新たなワクチンウイルスを作出するための、ゲノムの選択を可能とする。低病原性ウイルスに由来する、３つの最適化された骨格（ＰＲ８ｘ、＃１９、および＃２１）（参考文献１２４）を使用して、Ａ亜型ウイルスを制作した。ＰＲ８ｘ骨格は、ＭＤＣＫ馴化Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４株に由来する、６つの内部ゲノムセグメントを含有する。＃１９骨格は、ＭＤＣＫ馴化Ａ／Ｈｅｓｓｅｎ／１０５／２００７株に由来するＰＢ２、ＰＢ１、およびＮＰと、ＰＲ８ｘに由来する残りのセグメントとを含有する。＃２１骨格は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  ＰＢ１と、ＰＲ８ｘに由来する残りのセグメントとを含有する。Ｂ亜型ウイルスは、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に由来する６つの骨格セグメント全てを使用して制作した。レスキューされたウイルスを、もっぱらＭＤＣＫ細胞内で、最大３回にわたり継代培養した。全てのウイルスのＨＡゲノムおよびＮＡゲノムは、合成のために使用したコード配列（上記で示した配列）に対する、１００％の遺伝子同一性を有することが確認された。抗原性試験のために作出されたウイルスは、４つの卵由来のマッチ対と哺乳動物細胞由来のマッチ対を含む季節性インフルエンザ株（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、およびＢ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）をカバーした（図５）。本研究では、ワクチン作製において使用された、Ｈ３Ｎ２候補ワクチンウイルス（ＣＣＶ）が、過去数年間にわたり、蔓延株へのマッチに失敗し、難題を提示し続けていることを踏まえ、Ｈ３Ｎ２亜型を優先した。
【０２６４】
合成ウイルスの抗原の特徴付け
本発明者らはまず、このＭＤＣＫ細胞ベースの合成技術は、合成ウイルスが、卵内で継代培養されていなくてもなお、従来型の卵馴化ＣＶＶと抗原的に類似するウイルスを作出しうることを裏付けた。５つの卵馴化、高増殖、遺伝子再集合体ＣＶＶ（ＮＩＢ−７４、Ｘ−１８７、ＩＶＲ−１６５、Ｘ−１７５、またはＩＶＲ−１６４）由来のＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して、合成ウイルスを制作し、ウイルスの抗原性は、卵馴化ＣＶＶまたは対応する卵馴化野生型分離株に対して惹起されるフェレット抗血清を使用する、一元ＨＩアッセイにより調べた（図６）。５つの被験株全てについて、ＣＶＶに対して惹起される抗血清は、使用された骨格に関わらず、相同ウイルス力価との差違を≦２倍とする力価で、対応する合成ウイルスを認識した。全ての合成ウイルスはまた、卵馴化野生型株に対して惹起されるフェレット抗血清によるＨＩアッセイでも同様に、相同ウイルス力価との差違を≦４倍とする力価で反応した。
【０２６５】
本発明者らは、高増殖骨格上で、直接、新たに分離される任意の野生型株に抗原的にマッチするＣＶＶを作出することを目的とするため、本発明者らは、高増殖遺伝子再集合体ではなく、Ｈ３Ｎ２野生型分離株に由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用するように、その解析を拡張した。合成ウイルスは、哺乳動物細胞により増殖させた、２つの野生型分離株である、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９およびＡ／Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３／２０１１、ならびに２つの卵馴化株である、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２およびＡ／Ｂｅｒｌｉｎ／９３／２０１１に由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して制作した（図７）。ＭＤＣＫ細胞内の１代の継代培養の後で、細胞により繁殖させた野生型株または卵により繁殖させた野生型株に対して惹起されるフェレット抗血清を使用するＨＩ試験により、抗原の特徴付けを実施した。異なる骨格により制作されたウイルスは、所与の抗血清に対して、同様に反応し、全ての被験ウイルスから得られるＨＩ力価は、相同ウイルス力価と≦４倍の差違であった。
【０２６６】
合成ウイルスは、ヒト疾患を引き起こす株へのマッチを改善しうる
合成ウイルスは、卵により増殖させた分離株または哺乳動物細胞により増殖させた分離株に由来する、ＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して制作しうるが、哺乳動物細胞により増殖させたウイルスに遺伝子的にマッチする能力は、ヒト集団内で蔓延する株への抗原マッチを改善することが期待されうる。季節性ワクチンにおいて使用される、最近のＨ３Ｎ２およびＢ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のＣＶＶについて、卵内で選択されるＨＡ遺伝子の変化は、ワクチン有効性の低減と関連することが裏付けられている（参考文献１１０および１１９）。こうして、本発明者らは、合成技術を使用して、最近の３つのＨ３Ｎ２株および１つのＢ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統株について、哺乳動物細胞由来のマッチ抗原と、卵由来のマッチ抗原との抗原性の差違を評価した。北半球では、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９は、２０１０〜１１年および２０１１〜１２年のワクチンのためのＨ３Ｎ２成分であり；Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１様は、２０１２〜１３年および２０１３〜１４年のワクチンのためのＨ３Ｎ２成分であり；Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３は、２０１５〜１６年のワクチンのためのＨ３Ｎ２推奨であった。Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８は、２００９〜１０年、２０１０〜１１年、および２０１１〜１２年の三価ワクチンのためのＢ株成分であり、２０１２〜１３年以来の四価ワクチンのためのＢ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ成分となっている。全ての哺乳動物細胞由来の抗原と、卵由来の抗原との対のＨＡ配列は、１〜３アミノ酸異なっていた（下記の表２を参照されたい）。
【表２】
2018524323.tif 000024
【０２６７】
全ての卵由来のＨ３抗原が、卵内のウイルス増殖を改善するが、ＭＤＣＫ細胞により繁殖させたウイルスに対して抗原性を変更するＧ１８６Ｖ突然変異を含有した（参考文献１２６）ことは注目に値する。卵由来のＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８  ＨＡは、受容体結合性部位近傍の、潜在的なグリコシル化部位を喪失する。卵馴化時における、このグリカンの喪失は、抗原性に影響を及ぼす（参考文献１１９）。
【０２６８】
哺乳動物細胞により増殖させた基準ウイルスおよび卵により増殖させた基準ウイルスに対して惹起される抗血清を使用して、哺乳動物細胞由来のＨＡ配列およびＮＡ配列または卵由来のＨＡ配列およびＮＡ配列から制作した合成ウイルスを、ＨＩアッセイにより、それらのマッチさせた合成対応物および従来型の基準株と比較した。図８および９に示される通り、大半の場合において、本発明者らは、卵により増殖させたウイルスに対して惹起されるフェレット抗血清により解析した場合には、細胞由来の抗原と、卵由来の抗原との反応性の差違を観察したが、哺乳動物細胞により増殖させたウイルスに対して惹起される抗血清により解析した場合には、これを観察しなかった。特に、卵により増殖させたワクチンウイルスに対して惹起されるフェレット抗血清は一般に、卵馴化ＨＡ配列を含有する合成被験ウイルスを、相同力価と２倍以内の力価差で認識したが、ＨＩアッセイにおける、対応する哺乳動物細胞由来の抗原を発現させる全てのウイルスに対する反応は、それほど良好でなかった（＞４倍の減少）。この実験デザインは、卵由来のワクチン抗原に対する免疫応答が、卵馴化を欠く蔓延株に対して防御することを意図される、今日のヒト免疫化状況をモデル化している。しかし、細胞により増殖させた分離株に対して惹起されるフェレット抗血清は、細胞由来の抗原を発現させるウイルスまたは卵由来の抗原を発現させるウイルスを認識した。大半のウイルスは、３２０という低相同力価をもたらすが、卵馴化抗原を発現させるウイルスにはるかに良好に（＞４倍の増大）反応した、細胞により増殖させたＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１ウイルスに対して惹起される抗血清を例外として、所与の哺乳動物細胞により増殖させたウイルスに対して惹起される抗血清に、対応する相同力価と≦４倍の差違で反応した（図８Ｂ）。この驚くべき知見は、ＨＩアッセイの動態に影響を及ぼしうる、卵馴化ウイルスと細胞により増殖させたウイルスとの、受容体アビディティーの差違に帰することができる。最近の、細胞により増殖させたＨ３Ｎ２ウイルスは、シアル酸受容体に対するアビディティーが小さいと考えられるので、ＨＩアッセイで、４ＨＡ単位を得るのに、卵馴化ウイルスと比較して、より多くの細胞により増殖させたＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１ウイルスが使用されており、赤血球への結合を阻害するのに、より多くの抗体を要請している。
【０２６９】
一元ＨＩ試験により、卵により増殖させたＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３基準ウイルスと、哺乳動物細胞により増殖させたＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３基準ウイルスとの間で観察されたミスマッチ（図１０）に促されて、本発明者らは、さらなる二元の抗原の特徴付けのために、この２０１５〜１６年のワクチン株を選択した。哺乳動物細胞由来の抗原または卵由来の抗原を発現させる、２つの合成ウイルスに対して惹起されるフェレット抗血清を、従来型の基準株および異なる骨格上で制作された合成ウイルスで調べた（図１０）。二元ＨＩデータは、合成ウイルスが、それらの対応する基準株と抗原的に類似し、ＨＩ力価差が２倍以内であることを確認した。１つの骨格を伴うウイルスに対して惹起されるフェレット抗血清がまた、異なる骨格上でレスキューされたウイルスも効果的に認識したことから、同じＨＡ配列およびＮＡ配列を伴う代替的骨格の使用は、抗原性を変更しないことが確認される。興味深いことに、細胞由来の合成抗原および野生型抗原は、卵馴化基準ウイルスに対して惹起される抗血清より、卵馴化ＨＡを発現させる合成ウイルス（ＲＧ−ＰＳ−２４０４）に対して惹起される抗血清に良好に反応した（それぞれ、相同力価の４〜８分の１対≧２分の１）。高増殖骨格が、ビリオン表面に組み込まれ、提示されるＨＡの量に影響を及ぼし、これが、赤血球に対するウイルスのアビディティーおよび／またはこのようなウイルスのフェレット感染により誘発される抗体の量に影響を及ぼしえたことは妥当である。これらの因子のいずれも、ＨＩアッセイの動態に影響を与えた可能性があり、探索中である。総じて、本発明者らは、現行の卵馴化ワクチンウイルスと比較して、哺乳動物細胞により増殖させた原型ワクチンウイルスに良好にマッチするウイルスを作出する、合成技術の能力を裏付けた。
【０２７０】
考察
近年における、特に、Ｈ３Ｎ２株についての、推奨されるワクチンウイルスと蔓延ウイルスとの抗原ミスマッチの報告（参考文献１１０〜１１２、１１９および１２０）により、季節性インフルエンザワクチンの有効性をめぐる公衆の危機意識および懸念が高まっている。この懸念により、時代にそぐわない卵ベースの技術に依拠しない、改善されたＣＶＶ作出システムに対する必要が高まっている。抗原ミスマッチは、蔓延ウイルスにおける抗原ドリフトから生じる場合もあり、卵馴化性突然変異から生じる場合もあり、これらの両方から生じる場合もある。２０１０〜１４年の間に、卵馴化Ｈ３Ｎ２ワクチン株内のＨＡ突然変異は、蔓延株との抗原ミスマッチを結果としてもたらし、低ワクチン有効性と関連した（参考文献１１０および１１９）。２０１４〜１５年には、ドリフトＨ３Ｎ２株である、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２ワクチン株は、優勢蔓延株と抗原的に顕著に異なった（参考文献１１２および１２０）。さらに、近年における、卵内のＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス分離率の変動性（参考文献１２７および１２８）は、ミスマッチのさらなる危険性を、現行のシステムに付加しうる。したがって、認定哺乳動物細胞内で分離されるかまたは合成により作出されるＣＶＶを使用すれば、ワクチンウイルスの選択に利用可能なウイルスの数を増大させる一助となり、一部の状況では、ワクチンを製造するために、マッチの良好なウイルスをもたらしうるであろう。
【０２７１】
ＭＤＣＫ細胞は、それらの表面上に、α−２，６結合型シアル酸およびα−２，３結合型シアル酸の両方を有し、これらを、インフルエンザウイルスの変更された変異体の選択に関して、より中性の基質としている（参考文献１１７）。臨床試料中およびそれらの検査室で継代培養された派生物中のインフルエンザウイルスについての配列解析により、ＭＤＣＫ細胞は、鶏卵より、臨床素材中に存在する流行ＨＡ遺伝子型を維持する可能性が高いことが確認されている（参考文献１２２）。ＭＤＣＫ細胞により増殖させたウイルスはまた、感染後におけるト血清中の、中和抗体およびＨＩ抗体による、それらのより強い認識により証拠立てられる通り、それらの卵により増殖させた対応物より、ヒトにおいて複製されるウイルスに、抗原的に類似する（参考文献１２９および１３０）。
【０２７２】
この目的で、本発明者らは、もっぱら、ＭＤＣＫ細胞内で、配列情報からワクチンウイルスを作出するための合成システムを確立した（参考文献１２４）。このシステムは、ヒト疾患を引き起こす株へのマッチングを改善する潜在的可能性を有する。新たなＡ型ウイルスの各々について、高増殖骨格のセットを実験により調べて、哺乳動物細胞内および卵内の、この特定のＨＡおよびＮＡのための、最高収率の骨格を同定することができる。本発明者らがＡ型ウイルスのために確立した骨格は、ＭＤＣＫ細胞内のウイルスレスキュー効率と、ＭＤＣＫ細胞内および卵内の両方におけるＨＡ収率とを増大させうる（参考文献１２４）。標準的なＰＲ８骨格と組み合わせた、この合成技術は、フェーズＩ試験において、良好な安全性プロファイルを有し、防御的であると考えられる抗体力価を誘発した、Ｈ７Ｎ９ワクチン候補物質を作製するのに、既に使用されている（参考文献１３１）。ヒトワクチンのためのＣＶＶを作製するのに、最高収率のキメラ骨格の使用を容易とするために、本発明者らは、代替的骨格の使用が、合成ワクチンウイルスの抗原性を変更しないことを裏付けようと努めてきた。
【０２７３】
本研究では、本発明者らは、合成システムが、新たなワクチンウイルスのゲノム選択および結果として得られる抗原性の制御を可能とすることを示した。合成ウイルスは、遺伝子合成のために選び出されたＨＡ配列およびＮＡ配列に基づき、卵により繁殖させた分離株または哺乳動物細胞により繁殖させた分離株に、抗原的にマッチするように制作することができた。合成ＤＮＡおよび代替的骨格により作出した季節性ウイルスを、ワクチン用に承認されたＭＤＣＫ細胞系内で、最大で３回にわたり継代培養し、対応する従来型の基準株のＨＩ力価と同等なＨＩ力価により、抗原安定性を確立した。特に、本発明者らは、異なる骨格を使用して、同じＨＡ配列およびＮＡ配列を伴うウイルスを作出することが、抗原性を変更しないことを示した。
【０２７４】
ＭＤＣＫ細胞内で継代培養されたウイルスは一般に、ＨＡ内の適応突然変異を獲得しないが、一部のＨ３Ｎ２ウイルス（細胞表面シアル酸に対するアフィニティーが小さなＨＡ分子を有しうる）は、継代培養時に、ＭＤＣＫ細胞への結合を容易とする、ＮＡのシアル酸結合性部位内の突然変異を獲得することが報告されている（参考文献１３２）。選択されたＮＡ突然変異は、突然変異したウイルスの抗原特性および免疫原特性自体には干渉しないが、ＮＡの特性の変更は、ＮＡを媒介する血球凝集と、その結果としてのＨＩ力価への変化とを結果としてもたらす。このＮＡを媒介する血球凝集を遮断するために、本発明者らが報告しつつある研究では、全てのＨ３Ｎ２株についてのＨＩアッセイに、ＮＡ阻害剤であるオセルタミビルを追加した。
【０２７５】
新たなＨＡおよびＮＡを伴う、分離しうる株の数を増大させ、哺乳動物細胞により増殖させた原型ウイルスへの類似性がより大きな株をもたらす合成種技術の能力は、ヒトにおいて蔓延する株へのワクチンマッチを改善しうる。加えて、この技術を使用して、卵ベースの遺伝子再集合と比較して迅速に、これらの候補物質ウイルスを作出する能力（参考文献１２４）は、後になされる株の推奨を潜在的に可能とし、したがって、その間に抗原ドリフトが生じうる、株の選択と、ワクチンの頒布との間の遅延時間を低減しうるであろう。良好なマッチ株により制作されるワクチンの、相対的な臨床有効性は、いまだ決定の必要がある。現行のデータに基づき、本発明者らは、ワクチンウイルスを作出し、抗原を製造するための、哺乳動物細胞など、卵ベースでないプラットフォームの使用により、ワクチンの蔓延株への抗原マッチのレベルを改善しうると結論付けることができる。
【０２７６】
（実施例３）
細胞由来の一価Ｈ３Ｎ２ワクチンおよび卵馴化一価Ｈ３Ｎ２ワクチンを伴うワクチン接種により誘導される、マウス抗血清の血清交差反応性についての精査。
上記で指し示した通り、近年のインフルエンザシーズンでは、Ｈ３Ｎ２ワクチン株と、蔓延株との抗原ミスマッチが、低ワクチン有効性と関連している。２０１２〜２０１３年には、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１様クレード３Ｃ．１ワクチン株が、卵馴化し、対応する蔓延株に、緊密に抗原マッチしなかった。２０１４〜２０１５年には、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２クレード３Ｃ．１ワクチン株が、抗原ドリフトに起因して、優勢蔓延株と、抗原的に顕著に異なった。２０１５〜２０１６年には、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３クレード３Ｃ．３ａワクチン株が、卵馴化および抗原ドリフトの両方に起因して、対応する蔓延株に、緊密に抗原マッチしなかった。
【０２７７】
Ｈ３Ｎ２ワクチン抗原の文脈で、ミスマッチの問題について探索するため、３つの主要なクレード（３Ｃ．１、３Ｃ．２ａ、３Ｃ．３ａ）から導出された、細胞由来の一価Ｈ３Ｎ２ワクチンおよび卵馴化一価Ｈ３Ｎ２ワクチンを伴うワクチン接種により誘導される、マウス抗血清の交差反応性について精査するマウス研究をデザインした。下記の表３において示される各クレードに対応する卵由来の不活化インフルエンザウイルス抗原モノバルクおよび細胞由来の不活化インフルエンザウイルス抗原モノバルクを、細胞培養物（ＰＲ８ｘ骨格に基づく合成ウイルスを使用し、かつ、細胞由来のウイルスまたは卵馴化ウイルスに由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して）中で調製した。したがって、上記で言及した通り、「卵」または「細胞」という表示は、合成のためのＨＡ配列およびＮＡ配列を提供したウイルスの、継代培養履歴を指す。混合型の継代培養履歴の場合、卵内の任意の継代培養は、「卵」表示を促すのに十分である。ＨＡレベルをＳＲＩＤにより定量化し、ＨＡ配列を確認した。ＳＲＩＤ値は、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ９７１５２９３／２０１３試薬に基づく。
【表３】
2018524323.tif 000025
【０２７８】
モノバルクから調製されたワクチンを、表４に示される通り、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群１つ当たりマウス１０匹）へと投与した（ＭＦ５９アジュバントを伴うかまたは伴わずに）。
【表４】
2018524323.tif 000026
【０２７９】
ＨＩアッセイおよびＭＮアッセイを使用して、マウス抗血清と、ウイルス抗原との血清交差反応性について研究した。ＭＮの結果を、図１１Ａおよび１１Ｂに示す。示されるデータは、４１日目の採血（２回目の免疫化の３週間後）を使用して作成した。一般に、抗体力価は、相同なウイルスに対して最大であった。ＭＦ５９は、全体的な抗体力価を増大させる（ＨＩアッセイおよびＭＮアッセイのいずれにおいても）が、特異性は不変である。クレード３Ｃ．２ａ  Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４（Ａ／ＨＫ）ワクチンには、明らかな卵−細胞間の抗原ミスマッチがあったことは注目に値する（例えば、図１１Ａの３列目および４列目を、図１１Ｂの３列目および４列目と比較されたい）。特に、被験ウイルスが、卵馴化ＨＡ配列および卵馴化ＮＡ配列を含有するＡ／ＨＫであった場合、ウイルスは、相同な卵由来のＡ／ＨＫウイルス抗原および細胞由来のＡ／ＨＫウイルス抗原の両方に対する抗血清を含む、全ての被験マウス抗血清により中和された（図１１Ａ）。しかし、被験ウイルスが、細胞由来のＨＡ配列および細胞由来のＮＡ配列を含有するＡ／ＨＫであった場合、ウイルスは、相同な細胞由来のＡ／ＨＫ抗血清により中和されたが、卵由来のＡ／ＨＫウイルス抗原に対する抗血清によっては中和されなかった（図１１Ｂ）。得られたデータは、卵由来のＡ／ＨＫ抗原が、細胞由来のウイルス上には存在しない、免疫優性エピトープを含有するのに対し、細胞由来のＡ／ＨＫ抗原は、卵由来のウイルスと共通のエピトープを共有し、卵由来のウイルスと交差反応しうる抗体を誘発することを示唆する。
【０２８０】
ＭＮアッセイにおける、細胞由来のＡ／ＨＫ抗原および卵由来のＡ／ＨＫ抗原に対するフェレット抗血清を使用して得られた交差反応性データは、マウス抗血清を使用して得られたデータ（図示しない）と同様な傾向を示した。
【０２８１】
（実施例４）
レスキューワクチンとしての、一価不活化インフルエンザＡウイルス（Ｈ３Ｎ２）ワクチンについて探索する動物研究。
本発明者らは、卵由来の三価ワクチン内の対応するワクチン抗原と、蔓延ウイルスとの抗原ミスマッチを克服するように、細胞由来の一価不活化インフルエンザＡウイルス（Ｈ３Ｎ２）ワクチンを、レスキューワクチンとして使用する、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究をデザインし、開始した。
【０２８２】
卵由来の三価（ＴＩＶ）ワクチンおよび細胞由来の一価（ＭＩＶ）ワクチンを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群１つ当たりのマウス１０匹）へと、表５に示される通りに（ＭＦ５９アジュバントを伴うかまたは伴わずに）投与した。ＴＩＶは、卵由来のＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）ウイルス抗原、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス抗原、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／９／２０１４ウイルス抗原を含有する。ＭＩＶは、細胞由来のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５７３８／２０１４（Ｈ３Ｎ２）ウイルス抗原を含有する。ＴＩＶ抗原は、２０１５〜２０１６年の（北半球）季節性ワクチン接種キャンペーン中に、ヒトへと投与された三価インフルエンザワクチンを製造するのに使用された、卵由来のモノバルクと同等の、卵由来のモノバルクに由来した。ＭＩＶ抗原は、細胞由来のＡ／ＨＫウイルス（すなわち、卵内で継代培養されていないウイルス）に由来するＨＡ配列およびＮＡ配列を使用して、合成種ウイルスに由来する細胞培養物中で作製した。
【表５】
2018524323.tif 000027
【０２８３】
本研究は、マウス抗血清（例えば、４１日目および／または６３日目の採血から得られた）と、ウイルス抗原との血清交差反応性について、ＨＩアッセイおよびＭＮアッセイを使用して、実施例３と同様の形で探索する。例えば、各群からの抗血清を使用して、ＭＮ力価およびＨＩ力価を得、細胞由来のＡ／ＨＫウイルス（ここからＭＩＶ抗原を導出する）および卵由来のＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄウイルス（ここからＴＩＶのＨ３Ｎ２成分を導出する）に対して調べる。
【０２８４】
本研究は、良好にマッチさせた細胞由来のＭＩＶの、レスキューワクチンとしての投与が、対応する蔓延株に対する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の中和力価を、ＴＩＶ投与単独と比較して、有利に改善することを確認すると期待される。
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１３２）  Lin  YP,  Gregory  V,  Collins  P,  Kloess  J,  Wharton  S,  Cattle  N,  et  al.  Neuraminidase  receptor  binding  variants  of  human  influenza  A(H3N2)  viruses  resulting  from  substitution  of  aspartic  acid  151  in  the  catalytic  site:  a  role  in  virus  attachment?  Journal  of  virology.  2010;84:6769-81.
１３３）  Vaccine  Design:  The  Subunit  and  Adjuvant  Approach  (eds.  Powell  &  Newman)  Plenum  Press  1995  (ISBN  0-306-44867-X).
【０２８５】
上記の個別の節で言及した、本発明の多様な特色および実施形態は、適切な場合、他の節にも準用して適用される。結果として、１つの節において指定された特色を、適切な場合、他の節で指定された特色と組み合わせることができる。
【０２８６】
当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書で記載される、本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識または確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１】
2018524323.tif 000028
【図２】
2018524323.tif 000029
【図３】
2018524323.tif 000030
【図４】
2018524323.tif 000031
【図５】
2018524323.tif 000032
【図６】
2018524323.tif 000033
【図７】
2018524323.tif 000034
【図８】
2018524323.tif 000035
【図９】
2018524323.tif 000036
【図１０】
2018524323.tif 000037
【図１１Ａ】
2018524323.tif 000038
【図１１Ｂ】
2018524323.tif 000039
【配列表】
2018524323000001.app
【国際調査報告】
2018524323.tif 000040
2018524323.tif 000041
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2018524323.tif 000043
2018524323.tif 000044
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