(57)【要約】  生物学的異型の個体群の定量的生化学解析及び生物理学解析のためのマイクロキャビティアレイ及び方法を開示する。例として、細胞のハイスループット解析が挙げられ、蛋白質生成物は、結合親和性測定及び時間分解酵素アッセイを含む、様々な蛍光アッセイを使用する。マイクロキャビティ内容物のレーザベース抽出。一態様において、本開示は、開放第１端部及び開放第２端部を備える複数の個別キャビティを備えたアレイと、キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料と、電磁放射線吸収材料に電磁放射線を伝播するように構成されたパルス化ダイオードレーザとを備えるシステムを対象とする。システムの種々の実施形態において、キャビティは、溶融キャピラリであってもよい。【選択図】  図１０Ａ
2018510624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システムであって、
開放第１端部及び開放第２端部を備えた複数の個別キャビティを備えたアレイと、
キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料と、
電磁放射線を前記電磁放射線吸収材料に伝播するように構成されたパルス化ダイオードレーザとを備えるシステム。
【請求項２】
前記キャビティは、溶融キャピラリを備える請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記電磁放射線吸収材料は、前記キャビティ内の粒子を備える請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記アレイは、前記キャビティ間の電磁放射線の伝達を阻害するように取り扱われる請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記電磁放射線吸収材料は、前記キャビティ間の電磁放射線の伝達を阻害する請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記アレイは、水素雰囲気中で還元された鉛ガラスを備える不透明材料で構築される請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記電磁放射線吸収材料は、ケイ酸塩層である請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記パルス化ダイオードレーザは、キャビティの表面に関連付けられた材料に前記電磁放射線を伝播するように構成される請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記表面は、前記キャビティ内の液体のメニスカスに配置される請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記パルス化ダイオードレーザは、１０〜１００ミリ秒のパルス分離で１〜１０ミリ秒のパルス長を有する２〜２０パルスでアレイに電磁放射線を伝播するように構成される請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記粒子は、磁性を有し、
前記システムは、前記アレイのキャビティの液体内容物の表面に粒子を蓄積するための磁石を備える請求項３に記載のシステム。
【請求項１２】
前記アレイのキャビティから抽出した内容物を捕捉するために加熱可能捕捉面をさらに備える請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
マイクロキャビティアレイのキャビティの内容物を抽出する方法であって、
前記キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料にて、パルス化ダイオードレーザから電磁放射線を集束することを備える方法。
【請求項１４】
前記電磁放射線吸収材料は、前記キャビティ内に微小粒子を備える請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレイは、水素雰囲気中で還元された鉛ガラスを備える不透明材料で構築される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記レーザは、前記キャビティ内の液体と接触する前記材料の表面にて集束される請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記レーザは、前記液体のメニスカスに配置された前記材料にて、前記電磁放射線の前記集束を方向付ける請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記材料にて前記電磁放射線を集束させることは、前記材料と接触していない液体を加熱することを回避するために、前記放射線吸収材に前記電磁放射線を付与することを備える請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記パルス化ダイオードレーザは、１０〜１００ミリ秒のパルス分離で１〜１０ミリ秒のパルス長を有する２〜２０パルスで前記アレイに電磁放射線を伝播する請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の個別キャビティは、開放第１端部と開放第２端部とを備え、
基本的にすべての前記複数のキャビティの前記開放第１端部は、集合的に、多孔質平面状親水性表面を備え、基本的にすべての前記複数のキャビティの前記開放第２端部は、多孔質平面状疎水性表面を備える請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
アレイであって、
（ａ）開放第１端部と開放第２端部とを備え、その基本的にすべての前記開放第１端部が、集合的に、第１多孔質平面状表面を備え、その基本的にすべての前記開放第２端部が、第２多孔質平面状表面を備える複数の個別キャビティと、
（ｂ）液体、栄養、及び試薬のうちの少なくとも１つを備える前記第１表面をカバーする吸収材マトリクスとを備えるアレイ。
【請求項２２】
前記カバーは、液体、栄養、及び試薬のうちの少なくとも１つを前記アレイの前記キャビティの内容物と交換するように構成される請求項２１に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記カバーは、アガロースマトリクスである請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２４】
マイクロキャビティアレイであって、
少なくとも１つの開放端部を備える複数の個別キャビティと、
前記アレイから抽出された内容物を収集する加熱可能捕捉面とを備えるマイクロキャビティアレイ。
【請求項２５】
マイクロキャビティアレイの内容物の捕捉面への物質移動を防ぐ方法であって、
前記捕捉面を加熱することを備える方法。
【請求項２６】
マイクロキャビティから抽出された細胞の生存性を維持する方法であって、
前記アレイの少なくとも１つのキャビティから捕捉面上に、細胞を備えたキャビティの内容物を抽出することと、
前記捕捉面を、前記細胞の生存性を維持する培地を備えた培養マトリクスに接触させることとを備える方法。
【請求項２７】
前記培養マトリクスは、アガロースを備える請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
関心対象の分子を生成するための関心対象の表現型を有する細胞について、複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリをスクリーニングする方法であって、
（ａ）マイクロキャビティアレイに前記細胞ライブラリを投入することと、
（ｂ）前記関心対象の分子の生成を可能にする条件下において、前記アレイをインキュベートすることと、
（ｃ）前記関心対象の表現型を有する細胞を備えたキャビティを特定するために、前記アレイを撮像することと、
（ｄ）前記キャビティに関連付けられた放射線吸収材料におけるパルス化ダイオードレーザからの電磁放射線を方向付けることにより、前記関心対象の表現型を有する細胞を備えた前記キャビティの内容物を抽出することとを備える方法。
【請求項２９】
前記電磁放射線を方向付けることは、前記材料と接触しない前記キャビティ内の試料液体の加熱を回避するために、前記電磁放射線を前記放射線吸収材料に付与することを備える請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞は、前記アレイにおいて増加させられる請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞は、哺乳類細胞、酵母細胞、及び細菌性細胞からなる群より選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記関心対象の分子は、酵母細胞の表面上に表示される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記関心対象の分子は、酵母細胞によって分泌される請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
第２世代細胞ライブラリを生成するために、前記キャビティの前記抽出された内容物を培養することと、
前記第２世代ライブラリでステップ（ａ）〜（ｄ）を反復することとをさらに備える請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
（１）前記関心対象の表現型のための遺伝子を備えた前記細胞からＤＮＡを抽出することと、
（２）前記遺伝子に突然変異を導入する条件下において、前記ＤＮＡを増幅することと、
（３）前記増幅されたＤＮＡを備えた第２世代細胞ライブラリを作成することと、
（４）前記第２世代ライブラリでステップ（ａ）〜（ｄ）を反復することとをさらに備える請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記関心対象の表現型は、結合剤を生成する細胞を備える請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記結合剤は、細胞表面結合剤、抗体、抗体断片、リガンド、小分子、又は受容体である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記関心対象の分子は、関心対象の放射強度と関心対象の放射スペクトルのうちの少なくとも１つを有する蛍光蛋白質を備える請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記走査することは、前記関心対象の放射強度と前記関心対象の放射スペクトルのうちの少なくとも１つを放出するキャビティを特定することを備える請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記関心対象の表現型は、酵素活性を有する蛋白質、酵素活性の阻害が欠如した蛋白質、及び酵素の阻害剤の存在下で活性を有する蛋白質である請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
蛍光蛋白質において関心対象の特性を設計する方法であって、
前記関心対象の特性は、放射スペクトル、放射強度、ストークスシフト、及び吸収スペクトルのうちの少なくとも１つを備え、
前記方法は、
蛍光蛋白質の突然変異体型を生成する細胞ライブラリを作成することと、
前記関心対象の特性を有する前記突然変異体型を生成する細胞のための前記ライブラリをスクリーニングすることとを備え、
前記スクリーニングの方法は、
（ａ）マイクロキャビティアレイに前記細胞ライブラリを投入することと、
（ｂ）前記突然変異体型の生成を可能にする条件下において、前記アレイをインキュベートすることと、
（ｃ）前記突然変異体型を生成する細胞を備えたキャビティを特定するために、前記アレイを撮像することと、
（ｄ）前記突然変異体型を生成する細胞を備えた前記キャビティの内容物を抽出することとを備える方法。
【請求項４２】
蛋白質酵素の突然変異体型を生成するために複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリによって生成された蛋白質酵素ライブラリの構成員について、酵素反応速度を測定する方法であって、
（ａ）マイクロキャビティアレイに前記細胞ライブラリを投入することと、
（ｂ）関心対象の酵素の生成を可能にする条件下において、前記蛋白質酵素の基板の存在下で前記アレイをインキュベートすることと、
（ｃ）選択された間隔で前記アレイを撮像することと、
（ｄ）前記アレイの１つ以上のキャビティについて酵素活性の差異を測定することとを備える方法。
【請求項４３】
前記細胞ライブラリは、酵母細胞のライブラリ又は細菌性細胞のライブラリである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記蛋白質酵素は、前記細胞の表面上に表示される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記蛋白質酵素は、前記細胞によって分泌される請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素の阻害剤を添加することをさらに備える請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記関心対象の表現型を有する細胞を備えたキャビティの内容物を抽出することをさらに備える請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記抽出することは、前記キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料にて電磁放射線を方向付けることを備える請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記電磁放射線の放射源は、パルス化ダイオードレーザである請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１５年２月２２日出願の米国仮出願シリアル番号６２／１１９，２５１号、２０１５年２月２５日出願の米国仮出願シリアル番号６２／１２０，８０３号、２０１５年１１月１１日出願の米国仮出願シリアル番号６２／２５０，４７８号、及び２０１６年１月２１日出願の米国仮出願シリアル番号６２／２８１，５４５号の利益を主張するものであり、その内容全体を参照としてここに組み込む。
【０００２】
[0002]  本開示は、マイクロアレイを使用した関心対象化合物の判定を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ハイスループット測定は、生物学的システムの本質的複雑さと高密度な相互接続性への洞察を提供し始めている。例として、全ゲノム解読では、病態生理学の基礎となる決定的遺伝子及び突然変異に関する豊富な情報を得てきており、ＤＮＡマイクロアレイは、切除対象の種々の癌の転写パターンを可能にし、大規模なプロテオミクス法では、種々の成長因子に応じた細胞内シグナリングネットワークの研究を促進してきた。しかしながら、ハイスループット生物学において、数百万に及ぶ蛋白質異型の配列−構造−活性関係を迅速に問い合わせる能力は、生物理学的測定及び生化学的測定の範囲を広げる機能的読み出しを伴い、依然として適えられていない重大なニーズである。我々は、ここで、このニーズに対処すべく開発したユーザフレンドリ且つコスト効率の高い技術を説明し、３つの個別蛋白質クラス、すなわち、抗体治療法、蛍光蛋白質バイオセンサ、及び酵素における新規発見の適用を通じて、その能力と幅広さを紹介する。
【０００４】
[0004]  蛋白質に関する技術者は、特性を改良するように蛋白質を進化させる選択的圧力を使用した強力な組み合わせスクリーニングに大いに依存している。このアプローチを使用して、関心対象への高親和性結合、安定性、発現、又は酵素活性等、望ましい特性を備えた蛋白質を特定するために、ライブラリのスクリーニングが行われる。遺伝子型−表現型の繋がりを維持することは、いずれの指向性進化の努力においても基本的な要件である。つまり、蛋白質異型は、スクリーニングに続いて特定される、その対応ＤＮＡ配列に関連付けられていなければならない。この要件は、蛋白質結合のパートナのスクリーニングで使用されるアッセイにおいて、最も容易に達成される。例として、微生物細胞表面又はファージ要素への蛋白質異型の遺伝子融合、もしくは翻訳機構により、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又はパニング法を使用した大型蛋白質ライブラリ（１０７〜１０１４の異型）からの対象バインダの迅速な特定を可能にしてきた。
【０００５】
[0005]  マイクロタイタープレートにおける個別の酵素異型の検査等、空間的分離を採用した蛋白質解析方法は、結合相互作用を超える蛋白質設計の適用を拡大してきたものの、典型的スクリーニングにおいては、通常、１０３〜１０５の異型にスループットが限定されてしまう。典型的蛋白質に対してもアミノ酸検索空間が広範に亘る論理的多様性を有するため、これらの比較的小さなライブラリサイズでは限定的である。マイクロタイタープレートにおける蛋白質機能のアッセイを行うためのロボットハンドリングシステムは、作業を容易にしてきたものの、依然としてスループットが比較的低く（例えば、１日に１００，０００回のアッセイ）、桁違いにコストの高くなる量の材料及び試薬を必要とする。最近では、ばら又は微小流体チップとの組み合わせで作成された油−水乳化液滴が、ハイスループット酵素設計の適用例において成功を収めているものの、この技術は、実現に課題があり、実験中にリアルタイムで反応速度パラメータの時間的測定を容易に行うことができない。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]  一態様において、本開示は、システムであって、開放第１端部及び開放第２端部を備えた複数の個別キャビティを備えたアレイと、キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料と、電磁放射線を電磁放射線吸収材料に伝播するように構成されたパルス化ダイオードレーザとを備えるシステムを対象とする。システムの種々の実施形態において、キャビティは、溶融キャピラリであってもよい。アレイは、キャビティ間の電磁放射線の伝達を阻害するように取り扱われてもよい。電磁放射線吸収材料は、キャビティ間の電磁放射線の伝達を阻害してもよい。アレイは、水素雰囲気中で還元された鉛ガラスを備える不透明材料で構築されてもよい。電磁放射線吸収材料は、ケイ酸塩層であってもよい。パルス化ダイオードレーザは、キャビティの表面に関連付けられた材料に電磁放射線を伝播するように構成されてもよい。表面は、キャビティ内の液体のメニスカスに配置されてもよい。パルス化ダイオードレーザは、１０〜１００ミリ秒のパルス分離で１〜１０ミリ秒のパルス長を有する２〜２０パルスでアレイに電磁放射線を伝播するように構成されてもよい。
【０００７】
[0007]  本開示のシステムの他の実施形態において、電磁放射線吸収材料は、キャビティ内に粒子を含んでもよい。粒子は、磁性を有してもよい。システムは、キャビティの液体内容物の表面に粒子を蓄積するための磁石を含んでもよい。
【０００８】
[0008]  本開示のシステムの他の実施形態において、システムは、アレイのキャビティから抽出した内容物を捕捉するために加熱可能捕捉面を含む。
【０００９】
[0009]  本開示の他の態様は、マイクロキャビティアレイのキャビティの内容物を抽出する方法を対象とする。この方法は、キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料にて、パルス化ダイオードレーザから電磁放射線を集束することを含む。電磁放射線吸収材料は、キャビティ内の微小粒子であってもよく、又はアレイは、水素雰囲気中で還元された鉛ガラスを備える不透明材料で構築されてもよい。本開示の方法の種々の実施形態において、レーザは、キャビティ内の液体と接触する材料の表面にて集束されてもよい。例えば、レーザの集束は、液体のメニスカスに配置された材料にて、電磁放射線にて方向付けられてもよい。材料にて電磁放射線を集束させることは、材料と接触していない液体を加熱することを回避するために、放射線吸収材に電磁放射線を付与することを含んでもよい。
【００１０】
[0010]  本発明のシステムの他の態様において、複数の個別キャビティは、開放第１端部と開放第２端部とを備え、基本的にすべての複数のキャビティの開放第１端部は、集合的に、多孔質平面状親水性表面を備え、基本的にすべての複数のキャビティの開放第２端部は、多孔質平面状疎水性表面を備える。
【００１１】
[0011]  さらに他の態様において、本開示は、アレイであって、開放第１端部と開放第２端部とを備え、その基本的にすべての開放第１端部が、集合的に、第１多孔質平面状表面を備え、その基本的にすべての開放第２端部が、第２多孔質平面状表面を備える複数の個別キャビティを含むアレイを対象とする。吸収材マトリクスが、第１表面をカバーしてもよい。マトリクスは、液体、栄養、及び試薬のうちの１つ以上を含んでもよい。カバーは、液体、栄養、及び試薬のうちの少なくとも１つをアレイのキャビティの内容物と交換するように構成されてもよい。カバーは、アガロースマトリクスであってもよい。
【００１２】
[0012]  さらに、本開示は、マイクロキャビティアレイであって、少なくとも１つの開放端部を備える複数の個別キャビティと、アレイから抽出された内容物を収集する加熱可能捕捉面とを備えるマイクロキャビティアレイを対象とする。本開示は、また、マイクロキャビティアレイの内容物の捕捉面への物質移動を防ぐ方法であって、捕捉面を加熱することを備える方法も含む。
【００１３】
[0013]  さらに他の態様において、本開示は、マイクロキャビティから抽出された細胞の生存性を維持する方法を対象とする。この方法は、アレイの少なくとも１つのキャビティから捕捉面上に、細胞を備えたキャビティの内容物を抽出することと、捕捉面を、細胞の生存性を維持する培地を備えた培養マトリクスに接触させることとを含む。培養マトリクスは、アガロースを備えてもよい。
【００１４】
[0014]  一態様において、本開示は、関心対象の分子を生成するための関心対象の表現型を有する細胞について、複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリをスクリーニングする方法を対象とする。この方法は、マイクロキャビティアレイに細胞ライブラリを投入することと、関心対象の分子の生成を可能にする条件下において、アレイをインキュベートすることと、関心対象の表現型を有する細胞を備えたキャビティを特定するために、アレイを撮像することと、キャビティに関連付けられた放射線吸収材料におけるパルス化ダイオードレーザからの電磁放射線を方向付けることにより、関心対象の表現型を有する細胞を備えたキャビティの内容物を抽出することとを含む。
【００１５】
[0015]  本開示の方法の種々の実施形態において、電磁放射線を方向付けることは、材料と接触しないキャビティ内の試料液体の加熱を回避するために、電磁放射線を放射線吸収材料に付与することを含む。細胞は、アレイにおいて増殖させてもよく、哺乳類細胞、酵母細胞、及び細菌性細胞から選択されてもよい。
【００１６】
[0016]  本開示の方法は、また、第２世代細胞ライブラリを生成するために、キャビティの抽出された内容物を培養することを含んでもよい。抽出された内容物は、アレイ上に投入されて増殖させてもよい。この方法は、（１）関心対象の表現型のための遺伝子を備えた細胞からＤＮＡを抽出することと、（２）遺伝子に突然変異を導入する条件下において、ＤＮＡを増幅することと、（３）増幅されたＤＮＡを備えた第２世代細胞ライブラリを作成することと、（４）投入、培養、及びアレイからの細胞の抽出という方法ステップを反復することとを含んでもよい。
【００１７】
[0017]  本開示の方法の種々の態様において、関心対象の表現型は、抗体、抗体断片、リガンド、小分子、又は受容体等の結合剤を生成する細胞であってもよい。関心対象の分子は、関心対象の放射強度と関心対象の放射スペクトルのうちの少なくとも１つを有する蛍光蛋白質であってもよく、走査することは、関心対象の放射強度と関心対象の放射スペクトルのうちの少なくとも１つを放出するキャビティを特定することを含んでもよい。関心対象の表現型は、酵素活性を有する蛋白質、酵素活性の阻害が欠如した蛋白質、及び酵素の阻害剤の存在下で活性を有する蛋白質を生成する細胞であってもよい。
【００１８】
[0018]  他の態様において、本開示は、蛍光蛋白質において関心対象の特性を設計する方法を対象とする。関心対象の特性は、放射スペクトル、放射強度、ストークスシフト、及び吸収スペクトルのうちの１つ以上であってもよい。この方法は、蛍光蛋白質の突然変異体型を生成する細胞ライブラリを作成することと、関心対象の特性を有する突然変異体型を生成する細胞のためのライブラリをスクリーニングすることとを含む。スクリーニングの方法は、マイクロキャビティアレイに細胞ライブラリを投入することと、突然変異体型の生成を可能にする条件下において、アレイをインキュベートすることと、突然変異体型を生成する細胞を備えたキャビティを特定するために、アレイを撮像することと、突然変異体型を生成する細胞を備えたキャビティの内容物を抽出することとを含む。
【００１９】
[0019]  さらに、本開示は、蛋白質酵素の突然変異体型を生成するために複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリによって生成された蛋白質酵素ライブラリの構成員について、酵素反応速度を測定する方法を対象とする。この方法は、マイクロキャビティアレイに細胞ライブラリを投入することと、関心対象の酵素の生成を可能にする条件下において、蛋白質酵素の基板の存在下でアレイをインキュベートすることと、選択された間隔でアレイを撮像することと、アレイの１つ以上のキャビティについて酵素活性の差異を測定することとを含む。種々の実施形態において、細胞ライブラリは、酵母細胞のライブラリ又は細菌性細胞のライブラリであってもよい。蛋白質酵素は、細胞の表面上に表示されてもよく、蛋白質酵素は、細胞によって分泌されてもよい。この方法は、酵素の阻害剤を添加することをさらに含んでもよい。
【００２０】
[0020]  本開示の方法の追加実施形態において、この方法は、関心対象の表現型を有する細胞を備えたキャビティの内容物を抽出することを含む。この方法は、キャビティに関連付けられた電磁放射線吸収材料にて電磁放射線を方向付けることを含んでもよい。電磁放射線の放射源は、パルス化ダイオードレーザであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】[0021]  ポアソン統計に従った本開示のマイクロキャビティを投入する例としての実施形態の結果を示す。
【図２】[0022]  本開示の例としての方法に係る、Ｏｔｓｕ法を使用した、蛋白質発現及び結合の生画像のバイナリマスクへの変換の一例を示す。
【図３Ａ】[0023]  導電性コーティングを備えた透明ガラス転写プレートと関連付けられたマイクロキャピラリアレイの一例としての実施形態を示す。
【図３Ｂ】[0023]  導電性コーティングを備えた透明ガラス転写プレートと関連付けられたマイクロキャピラリアレイの一例としての実施形態を示す。
【図４】[0024]  試料とマイクロキャビティの壁部との間の界面に収束されるレーザを使用し、この界面に電磁放射線を伝播することにより、マイクロキャビティアレイのキャビティから内容物を抽出する一例としてのプロセスを示す。
【図５】[0024]  試料とマイクロキャビティの壁部との間の界面に収束されるレーザを使用し、この界面に電磁放射線を伝播することにより、マイクロキャビティアレイのキャビティから内容物を抽出する一例としてのプロセスを示す。
【図６Ａ】[0025]  本開示の一例としての実施形態及び方法の概略を示す。
【図６Ｂ】[0025]  本開示の一例としての実施形態及び方法の概略を示す。
【図６Ｃ】[0025]  本開示の一例としての実施形態及び方法の概略を示す。
【図６Ｄ】[0025]  本開示の一例としての実施形態及び方法の概略を示す。
【図７】[0026]  本開示の一例としてのシステムを使用した、異なるレーザパワー及びビーズ濃度における抽出効率を示すための実験の結果を示す。
【図８】[0027]  本開示の一例としてのシステム及び方法における蛍光測定に対する磁気ビーズの作用を示しており、図８のパネルａ）は、磁気ビーズの有無におけるマイクロキャビティの蛍光強度のヒストグラムを示し、図８のパネルｂ）は、２つの条件における蛍光及び明視野像を示す。
【図９】[0028]  本開示の一例としてのシステムを示す。
【図１０Ａ】[0029]  本開示の一例としてのシステム及び方法を使用した、結合性蛋白質の高スループットスクリーニングの結果を示す。
【図１０Ｂ】[0029]  本開示の一例としてのシステム及び方法を使用した、結合性蛋白質の高スループットスクリーニングの結果を示す。
【図１０Ｃ】[0029]  本開示の一例としてのシステム及び方法を使用した、結合性蛋白質の高スループットスクリーニングの結果を示す。
【図１０Ｄ】[0029]  本開示の一例としてのシステム及び方法を使用した、結合性蛋白質の高スループットスクリーニングの結果を示す。
【図１１】[0030]  本開示の一例としてのシステム及び方法を使用した、モックライブラリスクリーニングからの散布図を示す。
【図１２】[0031]  Ｇａｓ６−結合ｓｃＦｖに対するナイーブライブラリスクリーニング全体を通じたフローサイトメトリ散布図を示す。
【図１３】[0032]  本開示の一例としてのシステム及び一例としての方法による、オレンジ色相の蛍光蛋白質の設計に使用されるアレイの画像を示す。
【図１４】[0033]  本開示の方法に係る、ＧＦＰを発現する空間的に分断された大腸菌培養液の成長を示す実験の結果を示す。
【図１５Ａ】[0034]  ｄｄＦＰ技術を示す。ｄｄＦＰ−Ａ及びｄｄＦＰ−Ｂで指定される、弱蛍光蛋白質モノマー又は非蛍光蛋白モノマーは、可逆的に結合して、特徴的色相の明蛍光ヘテロダイマーを形成する。発色団は、スターバーストで示されている。
【図１５Ｂ】[0034]  ｄｄＲＦＰテンプレートからｄｄＯＦＰを生成するために使用される設計ストラテジを示す。
【図１６Ａ】[0035]  本開示の方法に係る、大腸菌ライブラリのスクリーニングの定量化を示す。
【図１６Ｂ】[0035]  本開示の方法に係る、反復的指向性進化の一例を示す。
【図１７】[0036]  ｄｄＯＦＰ［配列識別番号：１］とその親ｄｄＲＦＰ［配列識別番号：２］のＡコピーの配列アラインメントを示す。オリジナルＭ６６Ｔ突然変異が囲まれている。３ラウンドの指向性進化で取得された突然変異は、グレーでハイライトされている。
【図１８】[0037]  ｄｄＯＦＰの正規化吸光度（左側）及び放射（右側）スペクトルを示す。
【図１９】[0038]  ｄｄＹＦＰとｄｄＲＦＰの間のスペクトルギャップを埋めるｄｄＯＦＰを示す。
【図２０】[0039]  ｄｄＯＦＰとｄｄＯＦＰ−ＡのｐＨ依存放射プロファイルを示す。
【図２１】[0040]  アルカリホスファターゼ（ＡＰ）変異のハイスループットスクリーニングにおいて使用される蛍光ＤＤＡＯ生成物のｐＫａの判定を示す。
【図２２Ａ】[0041]  本開示の方法に係る、酵素反応速度を定量化するための生成物検量線を示す。
【図２２Ｂ】[0041]  本開示の方法に係る、酵素反応速度を定量化するための生成物検量線を示す。
【図２３】[0042]  可変濃度の生成物規格を単一マイクロキャビティアレイ上の分離スポット上に投入した後、アレイ上の各キャビティの蛍光強度を測定することにより、本開示に係るプラットフォームで検量線が生成された様子を示す。
【図２４】[0043]  大腸菌からの蛍光標識リン酸結合性蛋白質を使用したＡＰ反応における無機リン酸汚染のレベルを定量化するための検量線を示す。
【図２５】[0044]  酵母表示ＷＴ  ＡＰのリン酸阻害プロファイルと、大腸菌から採取された精製酵素のリン酸阻止プロファイルとの比較を示す。
【図２６】[0045]  大腸菌から採取された精製酵素と比較した、酵母の表面に表示されたＷＴ  ＡＰの反応速度を示す。
【図２７】[0046]  本開示の方法に係る、時間分解酵素アッセイからの各スナップショットを示す。
【図２８】[0047]  図２７のスナップショットに対応するマイクロキャビティの定量化を示す。
【図２９】[0048]  本開示の方法に係る、測定触媒効率の低下した酵母表示ＷＴアルカリホスファターゼとＲ１６６Ｓ点突然変異体の単一細胞反応速度プロファイルを示す。
【図３０】[0049]  アルカリホスファターゼ変異性ＰＣＲライブラリにおける推定突然変異頻度を示す。
【図３１】[0050]  本開示の方法に係る、ランダム変異ＡＰライブラリのスクリーニングの定量化を示す。
【図３２】[0051]  図３１に示されたライブラリスクリーニングから分離されるＷＴ酵素と３つの最も活性な異型の相対的比率を示す。
【図３３】[0052]  酵母表示ＷＴ  ＡＰ及び人工進化Ｎ１９７Ｓ−Ｔ１４８Ｐ−Ｓ  １７５Ｒ三重突然変異体の単一細胞反応速度プロファイルを示す。
【図３４】[0053]  本開示の方法に係る、スクリーニングから分離されるＷＴ酵素と３つの改良異型のリン酸阻害曲線を示す。
【図３５】[0054]  人工進化Ｄ１０１Ｇ突然変異体におけるリン酸阻害を低減した構造的基礎を示す。
【図３６】[0055]  ＤＤＡＯＰ濃度の関数としてμＳＣＡＬＥから分離された酵母表示ＷＴ  ＡＰと３つの異型の反応速度を示す。
【図３７】[0056]  酵母の表面に表示されるＡＰ突然変異体の発現プロファイルを示す。
【図３８】[0057]  本開示の方法に係る、時間分解酵素アッセイからの代表的画像と画像の定量化とを示す。
【図３９】[0058]  本開示の一例としての方法に係る、マイクロキャピラリの写真と、ＮＰＰを発現する酵母細胞を内在させるマイクロキャビティの反応速度とを示す。
【図４０】[0059]  本開示の方法に係る、細胞生存性実験の結果を示す。
【図４１】[0060]  本開示の一例としてのシステム及び方法に係る、蛍光強度によって測定されたマイクロキャビティ内のＧＦＰ発現大腸菌の成長を示す。
【図４２Ａ】[0061]  本開示の一例としての方法に係る、Ｇａｓ６競合に酵母表示Ａｘｌ異型の平衡結合滴定を示す。
【図４２Ｂ】[0061]  本開示の一例としての方法に係る、余剰競合とのインキュベート時間の関数としての酵母表示ＡｘｌからのＧａｓ６の反応速度解離を示す。
【図４３】[0062]  本開示の方法に係る、Ｇａｓ６バインダのための酵母表面表示変異性Ａｘｌ  Ｉｇｌライブラリのスクリーニングを示す。
【図４４】[0063]  蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリ解析において観察されたものと比較した、本開示に係る一例としての方法による蛍光測定におけるキャピラリ間変動性の査定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[0064]  種々の実施形態において、本開示は、生物学的要素のサブ個体群又は単一要素の有無について、生物学的要素の大きな個体群をスクリーニングすることを対象とする。本開示の実施形態は、数百万又は数十億の生物学的要素の異種個体群から特定相互作用を発見、特性化、及び選択するために使用することができる。
【００２３】
[0065]  例として、本開示は、空間的に分離された単一のクローン又はその生成物の高密度アレイの解析が可能である、本明細書中μＳＣＡＬＥ（マイクロキャビティ単一細胞解析及びレーザ抽出）と称する多目的技術プラットフォームを対象とする。対象細胞は、精密であるものの軽度のレーザをベースとした抽出技術を使用する事後解析で分離される。このマイクロキャビティベースのプラットフォームは、静的蛍光シグナル及び動的蛍光シグナルの双方を撮像することができ、数分の時間フレーム内で数百万に及ぶ細胞生成蛋白質異型の機能解析を可能にする。
【００２４】
[0066]  本開示の方法は、蛋白質、炭水化物、酵素、ペプチド、ホルモン、受容体を発現又は生成する細胞ライン、抗体を生成する他の細胞ライン、遺伝子操作された細胞、及び活性化細胞を含むが、これに限定されない生物学的細胞の特定及び分離を行うことを含む。さらに、本開示は、関心対象のペプチドを表示するウィルスの宿主となる生物学的細胞を特定する方法を含む。
【００２５】
[0067]  さらに、本開示は、表面受容体蛋白質の発現、酵素生成、及びペプチド生成を含むが、これに限定されない種々の生物学的活性のスクリーニングに使用されてもよい。さらに、本開示は、所望の生物学的活性に対する検査薬の効果を判定するための種々の検査薬のスクリーニングに使用されてもよい。当業者は、分離及びスクリーニングしたい他の種別の細胞、検出したい他の種別の生物学的活性、及びスクリーニング対象の特定検査薬について、容易に理解するであろう。本開示の実施形態は、単一の細胞及び細胞培養のハイスループット解析に有用である。いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、細胞間相互作用、単一細胞の成長及びシグナリング動力学、遺伝子発現の差異、及び組替型宿主発現レベルを精査する方法及び装置を提供する。
【００２６】
[0068]  定義
[0069]  規定のない限り、本明細書において使用する技術的用語及び科学的用語は、当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。いくつかの用語の拡大と明確化について、本明細書中に提供する。本明細書において言及するすべての公開物、特許出願、特許、及びその他の参照文献については、指摘のない限り、参照として明確にここに組み込む。
【００２７】
[0070]  本明細書において使用される単数形の不定冠詞及び定冠詞は、文脈において明確な指示のない限り、複数の指示対象も含む。
【００２８】
[0071]  本明細書において使用される「結合パートナ」、「リガンド」、又は「受容体」という用語は、多数の異なる分子、又は凝集体のいずれかであってもよく、これらの用語は、相互交換可能に使用される。種々の実施形態において、結合パートナは、検出されている検体に関連付けられてもよく、又はこれに結合してもよい。蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体、単糖類、多糖類、脂質、受容体、検査化合物（特に、組み合わせ化学で精製されたもの）が、各々、結合パートナであってもよい。
【００２９】
[0072]  「生物学的細胞」又は「細胞」という用語は、昆虫、微生物、菌類（例えば、酵母）、又は動物（例えば、哺乳類）の細胞を含むが、これらに限定されない、有機体からの任意の細胞をいうものである。生物学的細胞は、関心対象のウィルス又は関心対象の遺伝子型を有するウィルスの宿主ともなり、任意で、これを表示してもよい。
【００３０】
[0073]  本明細書において使用される「生物学的要素」という用語は、任意の生物学的細胞又は生体反応分子をいうものである。生体反応分子の非限定的な例には、蛋白質、核酸、ペプチド、抗体、抗体断片、酵素、ホルモン、及び小分子が含まれる。
【００３１】
[0074]  「検体」は、通常、例えば、生物学的試料における関心対象の生物学的要素等、試料における関心対象の要素をいう。
【００３２】
[0075]  本明細書において使用される「結合」又は「付着」という用語は、任意の物理的付着又は近接会合を含み、これらは、永続的であっても一時的であってもよい。これらの会合の非限定的な例として、水素結合、疎水性力、ファンデルワールス力、共有結合、及び／又はイオン結合が挙げられる。これらの相互作用は、関心対象の分子と測定されている検体の間の物理的付着を促進することができる。「結合」という相互作用は、例えば、結合要素が酵素であり、検体が酵素の基板である時等に、結合が化学反応を生じさせる状況としてまとめられてもよい。
【００３３】
[0076]  結合剤と検体の間の接触を生じる特定の結合反応も、この定義の範囲内である。このような反応は、例えば、抗体と蛋白質又はペプチドの相互作用の結果であり、相互作用が蛋白質上の特定構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存する。特定の結合相互作用は、例えば、蛋白質−蛋白質の相互作用、蛋白質−小分子の相互作用、抗体−小分子の相互作用、及び蛋白質−炭水化物の相互作用等、他の分子間で発生し得る。このような相互作用は、各々、細胞の表面で発生し得る。
【００３４】
[0077]  本明細書において使用される「試料」という用語は、広義な意味で使用されており、環境的試料及び生物学的試料が含まれる。環境的試料には、土壌及び水等、環境からの材料が含まれる。生物学的試料には、ヒトを含む動物、流体（例えば、液体、プラズマ、血清、尿、唾液）、固体（例えば、糞便）、組織、組織、液体食品（例えば、ミルク）、及び固形食品（例えば、野菜）であってもよい。例えば、肺疾患試料は、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって収集されてもよく、これは、肺組織由来の流体及び細胞を備える。生物学的試料の他の例として、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等から分離された細胞、組織抽出物、体液、染色体要素、又は染色体外要素を備えてもよい。
【００３５】
[0078]  以降、本開示の種々の態様を参照すると、本開示のアレイには、超高密度多孔質アレイに含まれる反応キャビティが含まれる。一例として、ここにおいて考慮されるマイクロアレイは、シリカキャピラリの形態等、数百万又は数十億のキャビティ又は小孔を束ね、熱プロセスを通じてこれらをともに融合させることにより、製造することができる。このような融合プロセスは、ｉ）引張下でシングルクラッドファイバに引っ張られたキャピラリシングル引張ガラスを加熱することと、ｉｉ）結束、加熱、及び引張によってシングル引張ガラスからキャピラリマルチ引張シングルキャピラリを作成することと、ｉｉｉ）追加の結束、加熱、及び引張によってマルチ引張シングルキャピラリからキャピラリマルチ−マルチ引張マルチキャピラリを作成することと、ｉｖ）押圧ブロックに積層することにより、マルチ−マルチ引張マルチキャピラリから引張ガラスのブロックアセンブリを作成することと、ｖ）熱及び圧力で処理することにより、ブロックアセンブリからブロック押圧ブロックを作成することと、ｖｉ）精密な長さ（例えば、１ｍｍ）でブロック押圧ブロックを切断することにより、ブロック形成ブロックを作成することを含むが、これに限定されないステップを備えてもよい。
【００３６】
[0079]  一実施形態において、キャピラリは、約１ミリメートルの高さに切断されることにより、約１．０マイクロメートル〜５００マイクロメートルの内径を有する複数の細孔を形成する。一実施形態において、細孔は、約１０マイクロメートル〜１ミリメートルの長さの範囲である。一実施形態において、細孔は、約１０マイクロメートル〜１センチメートルの長さの範囲である。一実施形態において、細孔は、約１０マクロメートル〜１００ミリメートルの長さの範囲である。一実施形態において、細孔は、約０．５ミリメートル〜１センチメートルの長さの範囲である。
【００３７】
[0080]  非常に高密度の細孔アレイが、本開示の種々の態様において使用されてもよい。例としての実施形態において、各細孔は、５μｍの直径を有し、約６６％の開放空間（すなわち、各マイクロキャビティの内腔を表す）を有することができる。いくつかのアレイにおいて、開放したアレイの比率は、約５０％〜約９０％範囲、例えば、約６０〜７５％、より具体的には約６７％である。一例において、５μｍ直径のマイクロキャビティと約６６％の開放空間を有する１０×１０ｃｍアレイは、約３億３０００万個の細孔を有する。マイクロキャビティの内径は、約１．０マイクロメートル〜５００マイクロメートルの範囲であってもよい。いくつかのアレイにおいて、各細孔は、約１．０マイクロメートル〜３００マイクロメートルの範囲、任意で約１．０マイクロメートル〜１００マイクロメートル、さらに任意で約１．０マイクロメートル〜７５マイクロメートル、さらに任意で約１．０マイクロメートル〜５０マイクロメートル、さらに任意で約５．０マイクロメートル〜５０マイクロメートルの範囲の内径を有することができる。
【００３８】
[0081]  いくつかの例において、アレイの開放面積は、開放面積（ＯＡ）の９０％迄を占め、キャビティサイズが１０μｍ〜５００μｍの間で変動する時、アレイ１ｃｍ毎の細孔の数が４５８個〜１，１４６，５００個の間で変動するようにする。いくつかのアレイにおいて、アレイの開放面積は、開放面積の約６７％を占め、キャビティサイズが１０μｍ〜５００μｍの間で変動する時、アレイ１ｃｍ毎の細孔の数が３４１個から８５３，５０３個の間で変動するようにする。一例として、キャビティサイズが１μｍであり、開放面積が９０％迄であれば、アレイ１平方ｃｍに約１１，４６６，０００個迄の細孔を収容するであろう。
【００３９】
[0082]  １つの特定の実施形態において、マイクロキャビティアレイは、数十億のシリカキャピラリを結合した後、熱プロセスを通じてそれらをともに融合させることにより、製造することができる。そのあと、シリカ（０．５ｍｍ以上）を切断し、非常にアスペクト比の高いガラス細孔アレイプレートを形成する。この内容を参照として個々に組み込む、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６２０１５（ＷＯ２０１２／００７５３７）を参照のこと。Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｋ．Ｋ．（日本）、Ｉｎｃｏｍ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州）、Ｐｈｏｔｏｎｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓ．Ａ．Ｓ．Ｉｎｃ．（フランス）等より、多数の有用なアレイが市販されている。いくつかの実施形態において、アレイのマイクロキャビティは、一端において、アレイに付着された固形基板で閉鎖される。
【００４０】
[0083]  特定の実施形態において、アレイのキャビティの側壁は、電磁放射線を透過させないか、又はキャビティは、アレイのキャビティ間の電磁放射線の伝達を防ぐ材料でコートされている。好適なコーティングは、キャビティ内の結合反応又はキャビティへの力の付与に干渉してはならない。例としてのコーティングには、金、銀、及び白金のスパッタナノメートル層が含まれる。他の例において、アレイのキャビティ壁部は、多数の層を備え、壁部の１つ以上の層は、アレイのキャビティ間の電磁放射線の伝達を防ぐか、又は実質的に減少させる低屈折率材料からなる。多層を備えるアレイの一例としての実施形態は、Ｉｎｃｏｍ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州チャールトン）から入手される。
【００４１】
[0084]  特定の実施形態において、アレイは、アレイを通じて電磁放射線の伝達を阻害又は遮断するために、湿式又は乾式のいずれかの水素雰囲気下で調製されるか、又はこのいずれかに晒される。例えば、アルカリドープケイ酸塩ガラスのアレイは、キャビティの壁部を含む、アレイの表面のすべてを不透明にするか、暗くするか、又は黒くして、電磁放射線がアレイのキャビティ間で透過されることを阻害又は防ぐように、水素雰囲気中で還元することができる。このプロセスでは、数百オングストロームの厚さであってもよい、単なるコーティングでないケイ酸塩層を作成することができる。一例において、このアレイは、Ｐｈｏｔｏｎｉｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州スターブリッジ）から入手される抵抗ガラス製品から構築される。
【００４２】
[0085]  アレイのさらなる例としての実施形態には、表２に示されるものが含まれる。
【００４３】
【表１】
2018510624.tif 000003
【００４４】
[0086]  本開示の一態様において、アレイのキャビティは、溶液のキャビティへの自然発生的摂取を促進する親水性表面を有する。他の態様において、アレイの表面は、疎水性を与えるように処理されてもよい。これらの態様を組み合わせると、アレイの一面は疎水性であり、他面が親水性であってもよい。例えば、アレイの上面及び下面は、上面に疎水特性を課し、下面に疎水性特性を与えるように、異なって処理される。アレイは、最初に疎水性を与える薬剤で処理し、次いで親水性を与える薬剤で反対側を処理するように、連続して処理されてもよい。
【００４５】
[0087]  従って、本開示は、開放第１端部と開放第２端部とを備える複数の個別キャビティを含むアレイを対象とし、基本的にすべての複数のキャビティの開放第１端部は、集合的に、多孔質平面状親水性表面を備え、基本的にすべての複数のキャビティの開放第２端部は、多孔質平面状疎水性表面を備える。これらの表面には、キャビティの開放端部と、キャビティ間の間質空間とが含まれる。
【００４６】
[0088]  親水特性は、従来既知の技術に従って、コロナ処理を使用して付与されてもよい。例えば、手持ち式Ｔｅｓｌａコイル（例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃ社の製品であるＢＤ−２０ＡＣ）では、好適な親水特性を与えるのに、アレイ面上方の数ミリメートルをガラスアレイ面に亘ってゆっくり数回通過させる（合計１０〜３０秒の露出）ので十分である。
【００４７】
[0089]  また、アレイは、ポリシロキサン又はポリシロキサンを備える組成等、疎水性薬剤で処理されてもよい。一例として、疎水性薬剤は、ヒドロキシ末端ポリジメチルシロキサンである。特定の実施形態において、疎水性薬剤は、ＲＡＩＮ−Ｘ（登録商標）撥水剤である。
【００４８】
[0090]  対向する親水性表面と疎水性表面とを有するアレイを提供するために、親水特性を付与するように、一面又はアレイ全体を処理することができる。その後、親水性表面は、例えば、シーラントの付与によって保護され、対向面が疎水性薬剤で処理される。ある実施形態において、このシーラントは、例えば、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）の高性能Ｓｕｒｅ  Ｓｔａｒｔ（登録商標）包装用テープ（分類番号Ａ８１４２−６）等、この目的のために有用な市販のテープから選択される。疎水性薬剤の付与後、シーラントテープは、除去され、アレイに対抗する親水性表面及び疎水性表面を提供する。特定の実施形態において、親水性表面は、アレイの頂上部に対応し、これには試料が投入されてもよく、疎水性表面は、アレイの底部に対応する。
【００４９】
[0091]  種々の態様において、本開示は、蛋白質を生成する細胞又は関心対象の表現型を有する他の分子等、関心対象の表現型を有する細胞について、複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリをスクリーニングする方法を対象とする。一般的に、この方法は、例えば、哺乳類、菌類、細菌類、及び昆虫等、アレイ内で生き延び、及び／又は、増加することのできるすべての細胞種別をスクリーニングするのに利用可能である。関心対象の表現型には、プリペプチド及び核酸の生成、分泌、及び／又は表示を含むが、これに限定されない検出可能な結果を生じさせる任意の生物学的プロセスを含むことができる。検出可能な表現型に関連付けられた複数の遺伝子型を有するライブラリは、変異性ＰＣＲ、遺伝子発現のランダム活性化、ファージ表示、突出ベースＤＮＡブロックシャフリング、ランダム突然変異生成、インビトロＤＮＡシャフリング、部位特定組み換え、及び当業者に通常既知のその他の方法を含む方法によって生成することができる。
【００５０】
[0092]  アレイは、一部又は全部のキャビティが、検体のスクリーニングを行うための単一の生物学的要素を含むように設計されてもよい。従って、細胞の異種混合物の濃度は、アレイの設計と特定対象の所望の検体とに応じて、計算される。蛋白質生成細胞がスクリーニングされる実施形態において、この方法は、クローン間競合をなくし、より多様な細胞のスクリーニングを可能にする。
【００５１】
[0093]  アレイは、細胞の異種個体群等、複数の細胞を含む溶液をアレイに接触させることにより、投入されてもよい。一実施形態において、例えば、大腸菌又は酵母等の細胞を均一にマイクロキャビティのすべてに表示又は分泌する抗体の混合物を投入することには、アレイの上側に５００液滴を配置することと、すべての細孔にそれを広げることとを含む。一例として、５００μＬの液滴中、約１０９個の細胞の初期濃度は、結果として、マイクロキャビティ毎に約３個の細胞（又は、サブ個体群）を生じる。一実施形態において、各細孔は、（２５０μｍ〜１ｍｍのガラスキャピラリプレートの厚さに応じて）約２０〜８０ｐＬの概算容量を有する。マイクロキャビティが一旦投入され、一晩インキュベートされると、各マイクロキャビティは、マイクロキャビティ毎に約２，０００〜３，０００個の細胞を含有するはずである。一実施形態において、細胞は、増殖収率を最大化するために、生存性を損なうことなく、４８時間以上まで培養されてもよい。複数の細胞は、動物細胞、植物細胞、及び／又は細菌細胞又は酵母細胞等の微生物細胞であってもよい。細胞は、少なくとも１つの関心対象の化合物を分泌又は表示してもよく、このような関心対象の組替型化合物は、結合パートナとの親和性を有する。
【００５２】
[0094]  種々の例において、約５，０００μＬの溶液中に約１０９個の細胞が存在する場合、キャビティ容量が５０ピコリットルであると仮定すると、約３〜４×１０６個の細孔を有するアレイでは、平均して、細孔毎に約１０個の細胞が存在するはずである。正確な数は、アレイ中のキャビティの容量と、溶液中の細胞の濃度とに応じて決まるであろう。一例として、各細孔は、約２０〜８０ピコリットルの範囲の容量を有してもよい
【００５３】
[0095]  個体群及び／又は細胞ライブラリを含む試料は、アレイへの分布に先立って、調製ステップを必要としてもよい。いくつかの実施形態において、これらの調製ステップには、インキュベート時間が含まれる。インキュベート時間は、スクリーニングの設計と、スクリーニングされている細胞とに応じて決まるであろう。例としての時間には、５分、１時間、３時間、６時間、１２時間、１日、２日、及び３日以上が含まれる。細胞の異種個体群は、アレイへの添加及び／又は投入に先立って、培地で増殖させてもよい。ある適用例については、培地を含む細胞が、指数関数的な成長フェーズの間、アレイ内に投入されてもよい。
【００５４】
[0095]  各キャビティは、細胞を複製させる容量の培地を有してもよい。例えば、２０ピコリットルでは、キャビティ内の多くの単一細胞が複数回複製されるのに十分な培地を提供することができる。アレイは、任意で、細胞が対象蛋白質又はその他の関心対象の生物学的要素を増殖及び生成するのに、任意の温度、湿度、及び時間でインキュベートすることができる。インキュベートの条件は、当分野のルーチンと同様、実験的設計に基づいて判定することができる。
【００５５】
[0096]  一実施形態において、本開示の方法では、細胞の異種個体群の懸濁液の濃度とアレイの寸法とが、１〜１，０００個の生物学的要素、任意で１〜５００個の生物学的要素、さらに任意で１〜１００個の生物学的要素、さらに任意で１〜１０個の生物学的要素、さらに任意で１〜５個の生物学的要素がアレイのマイクロキャビティのうちの少なくとも１つに分布するようにアレンジされることを予期するものである。
【００５６】
[0097]  アレイに投入された細胞含有容量の容量は、例えば、所望の適用例、異種混合物の濃度、及び／又は生物学的要素の所望の希釈を含む、いくつかの変数に応じて決まるであろう。１つの特定の実施形態において、アレイ表面上の所望の容量は、平方ミリメートル毎に約１マイクロリットルである。濃度条件は、生物学的要素が、任意且つ所望のパターン又は希釈で分布される。特定の実施形態において、濃度条件は、アレイのほとんどのキャビティにおいて、単一要素のみが存在するように設定される。これにより、単一要素の最も精密なスクリーニングが可能となる。
【００５７】
[0098]  これらの濃度条件は、容易に計算することができる。例として、細胞スクリーニングにおいて、蛋白質生成細胞対キャビティの比率が約１対３である場合、１０９個のキャビティを備えたアレイには、６ｍＬの容量（６ｍＬ＝２０ピコリットル／小孔×３×１０８個のキャビティ）に３×１０８の異なる蛋白質生成砂防を投入することができ。キャビティの圧倒的多数は、最大でも単一のクローンを含むであろう。他の特定の実施形態において、各小孔に単一細胞は、望ましくない。これらの実施形態について、異種個体群の濃度は、２つ以上の細胞が各小孔に見出されるように設定される。
【００５８】
[0099]  例えば、アレイが適正に投入される時、細胞は、ポアソン分布に従ってアレイ内にランダムに分布されなければならない。本分布によると、λがバルク濃度である（マイクロキャピラリの容量における細胞の平均数）場合、マイクロキャピラリにおけるｋ個の細胞を投入する可能性Ｐは、以下の式で計算される。
【００５９】
[00100]
【数１】
2018510624.tif 000004
【００６０】
[00101]  マイクロキャピラリ毎の単一細胞について（ｋ＝１）について、この式は、以下の通りとなる。
【００６１】
[00102]
【数２】
2018510624.tif 000005
【００６２】
[00103]  そして、マイクロキャピラリ毎の１つの細胞の分画を最大化するためには、式２の極大は、０でなければならない。式２を派生させると、以下の通りである。
【００６３】
[00104]
【数３】
2018510624.tif 000006
【００６４】
[00105]  本例において、λ＝１である時、投入された試料の濃度は、マイクロキャピラリの容量毎に１つの細胞と等しくなければならない。表３は、異なるマイクロキャピラリアレイについて、λ＝１に対して投入された試料の濃度をまとめたものである。
【００６５】
【表２】
2018510624.tif 000007
【００６６】
[00106]  投入した混合物の濃度は、以下の式により、マイクロキャピラリ毎の細胞の平均数、λ、及びマイクロキャピラリの容量（Ｖｃａｐｉｌｌａｒｙ）に関連する。
【００６７】
[00107]
【数４】
2018510624.tif 000008
【００６８】
[00108]  図１は、マイクロキャピラリ毎に３個、１個、及び１／３個の粒子（λ＝３、１、１／３）の平均に対応する３つの濃度にて、アレイに投入された蛍光ビーズを示している。２０，０００個のマイクロキャピラリの内容物を計数し、各条件に対する累積分布関数（ＣＤＦ）を赤線としてプロットした。細胞は、ポアソン分布に従ってアレイ内にランダムに分布され、観察される平均値及び予期される平均値は、いくつかの粒子が撮像面内に進行しなくてもよいように、恐らくはマイクロキャピラリのアスペクト比が高いために、２倍〜３倍異なる。従って、観察される平均値と予期される平均値との間の差異を克服するために、計算された試料濃度よりも高い濃度を使用することができる。
【００６９】
[00109]  他の実施形態において、異種個体群及び／又は細胞ライブラリを含む試料は、アレイへの添加後、例えば、インキュベート等の調製ステップを必要としてもよい。他の実施形態において、各キャビティ内の各細胞は、インキュベート期間中、増殖する（細胞成長、ファージ増殖、蛋白質表現及び遊出等）。このインキュベート期間により、細胞に関心対象の表現型を表現又は表示させることができ、又はウィルスを複製させることができる。
【００７０】
[00110]  細胞がアレイに投入された後、細胞を分布させることなく、追加の分子又は粒子をアレイに対して追加又は除去することができる。例えば、細胞の検出に有用な任意の生物学的反応分子又は粒子を添加することができる。これらの追加分子又は粒子は、例えば、細胞の添加との関連で本明細書中に説明する通り、液滴添加によって、これらの分子又は粒子を備えた液体試薬をアレイの頂上部に導入することにより、アレイに添加することができる。生物学的要素を備えたアレイから特定の分子を除去するために、除去対象の選択された分子を含まないものの、キャビティアレイ内にある残りすべての分子を所望の濃度で含む溶液を調製することができる。液滴は、前述の通り、アレイに添加する。キャビティアレイの添加物がこの溶液の液滴と平衡した後、アレイ中の選択された分子の濃度は低下するであろう。この低下量は、添加された液滴の容量と、アレイ中に含まれる合計容量とによって決まる。選択された分子の濃度をさらに低減するために、このステップは、アレイの頂上部から最初の液滴が除去されてから、液体の第２の液滴が添加された後に、反復されてもよい。液体は、例えば、ペーパタオル又はピペットでアレイを拭き取ることにより、アレイの頂上部から除去することができる。
【００７１】
[00111]  他の例として、アレイに対して水分、栄養、又はその他の生物学的分子を添加、維持、又は交換するために、流体保持性且つ浸透性を備えたカバーをアレイ上に配置することができる。流体保持性且つ浸透性を備えたカバーについて、さらに本明細書中に説明する。
【００７２】
[00112]  特定の実施形態において、粒子は、１つ以上の生物学的要素とともに含まれてもよい。この粒子は、アレイのマイクロキャビティへの組み合わせの導入に先立って、１つ以上の生物学的要素と組み合わせられてもよく、又は、この粒子は、１つ以上の生物学的要素を含む前後に、マイクロキャビティに提供されてもよい。
【００７３】
[00113]  ある実施形態において、粒子には、１つ以上の生物学的要素に対して十分な容量を残しつつ、マイクロキャビティキャビティの底部に蓄積するのに好適な濃度で、１つ以上の生物学的要素が提供される。溶液中の粒子の濃度は、特定の粒子によって決まる。例えば、１つ以上の生物学的要素を組み合わせた後、粒子の調製により、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度を提供してもよい。ある実施形態において、溶液中の粒子は、２．５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を提供する。
【００７４】
[00114]  関心対象の１つ又は複数のキャビティが一旦特定されると、キャビティの内容物は、本明細書に記載の装置及び方法で抽出することができる。キャビティの内容物は、さらに、解析又は増殖させることができる。１つ又は複数のキャビティからの増殖細胞個体群は、本明細書に記載の方法により、アレイで再スクリーニングすることができる。例えば、個体群中の生物学的要素の数がアレイ内のキャビティの数を超過した場合、個体群は、各小孔内の２つ以上の要素でスクリーニングすることができる。サブ個体群を提供するため、正のシグナルを提供するキャビティの内容物を抽出することができる。サブ個体群は、増殖させることができる。スクリーニングプロセスは、アレイの各キャビティが単一要素を含むまで反復することができる。スクリーニングは、所望の検体が中に入っていることを示すキャビティの検出及び／又は抽出にも適用することができる。キャビティの選抜に続いて、関心対象の個別検体を分離するために、より高レベルの蛋白質生成を提供する技術等、従来の他の技術が使用されてもよい。
【００７５】
[00115]  ある実施形態において、アレイの頂上部は、キャビティからの培地の蒸発を低減するために、キャビティへの試料の添加に続いて、膜でシールされる。キャビティへの試料の添加に続いてアレイの表面をシールするために、１つ以上の実質的に気体及び／又は液体を透過しない膜を使用することができる。例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等、典型的な食品サービス種別のプラスチックラップが好適である。他の実施形態において、この膜は、水蒸気を小孔中の液体の頂上部液体層と平衡させることにより、蒸発防止に役立つことができる。例えば、マイクロキャビティアレイの頂上面に接触して、フィルムの頂上部に水が配置されるように配置されたフィルムは、個別の小孔内のキャビティの内容物を捕捉するものの、水又は培地はキャビティ内に流入させるであろう。有用な膜の例として、ニトロセルロース及びＮＡＦＩＯＮ（登録商標）膜がある。キャビティ内の任意の細胞を捕捉するものの、水、培地、及びその他の試薬はキャビティ内に通過させる非常に小さな穴（例えば、１０〜１００ｎｍ）を有するポリテトラフルオロエチレン膜（例えば、ＧＯＲＥ−ＴＥＸ（登録商標）布）の多孔質形態で、同様のアレンジを得ることができる。
【００７６】
[00116]  特定の実施形態において、アレイの頂上部は、キャビティ内容物の蒸発も防ぎつつ、液体及び試薬をアレイのキャビティに供給する半透過性組成でカバーされる。同様に、このカバーは、液体及び試薬をキャビティ内容物で交換することができるようにする。一態様において、半透過性組成は、上述の通り、１つ以上の試料をアレイ内に導入した後、マイクロキャビティアレイの頂上面上に積層される。
【００７７】
[00117]  いくつかの実施形態において、半透過性組成は、流体保持性及び浸透性を有し、弧の組成により、流体、栄養、及び生物学的反応分子をアレイの内容物に付与及び／又はこれと交換させるのに十分な容量の液体を蓄えることができる。従って、この組成は、流体を保持及び付与することができ、態様によっては、アレイのキャビティ内の流体と組成内の流体との間で生物学的活性分子の濃度を平衡に維持することができる。
【００７８】
[00118]  一態様において、この組成は、マイクロキャビティアレイの表面に接触するポリマーゲルであるか、又はこれを含む。ある実施形態において、ポリマーゲルは、ポリアクリルアミド、寒天、又はアガロースから選択される。当業者は、本開示の実施形態において有用な他の好適なポリマーを認識するであろう。また、ポリマーゲル中のポリマーの濃度は、異なる実施形態及び異なる適用例に応じて変動してもよい。例えば、アガロースのポリマー濃度として、０．２体積重量％〜１０体積重量％含まれてもよい。一態様において、アガロースとして、アガロースの０．２体積重量％、０．５体積重量％、０．８体積重量％、１体積重量％、２体積重量％、３体積重量％、４体積重量％、５体積重量％、６体積重量％、７体積重量％、８体積重量％、９体積重量％、又は１０体積重量％含まれてもよい。
【００７９】
[00119]  種々の実施形態において、ポリマーゲル層は、０．１〜１０ｍｍの厚さである。特定の態様において、ポリマーゲル層は、０．１ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．７５ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、又は１０ｍｍの厚さである。種々の態様において、流体保持性且つ浸透性を備えたカバーは、所望の期間、アレイのキャビティの内容物の蒸発を回避するのに十分な厚さである。
【００８０】
[00120]  流体保持性及び浸透性を備えたカバーの液体フェーズには、生物学的プロセスに含まれる溶液が含まれてもよい。例えば、この液体フェーズには、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、又は非緩衝水性フェーズ等、好適な緩衝水溶液が含まれてもよい。種々の実施形態において、液体フェーズには、数時間又は数日の経過でキャビティ内の細胞に栄養又は生物学的反応分子を提供する細胞培養培地が含まれてもよい。一態様において、液体フェーズには、溶解緩衝剤が含まれてもよい。
【００８１】
[00121]  一態様において、カバーは、カバーとキャビティの間の自由な拡散を可能にする。従って、ある実施形態においては、半透過性ゲルは、すべてのマイクロキャビティ内に均一に所望の分子を供給するために使用される。ある態様において、このゲルは、既にマイクロキャビティ内にある望ましくない分子を希釈又は「洗浄」するために使用される。ある実施形態において、細胞−培養培地ベースのゲルは、マイクロキャビティ間の接触ブリッジを提供するために使用され、成長因子が細胞自体でなく、細胞間で転写されるようにする。ある態様において、細胞−培養ベースのゲルは、細胞間のパラクリンの研究に使用される。他の実施形態において、関心対象の分子の勾配は、ゲル中に含侵させることができ、これにより、アレイの異なる箇所でマイクロキャビティに異なる刺激を与えるであろう。
【００８２】
[00122]  栄養の方法なゲルの使用により、例えば、アレイ内の細菌性細胞、酵母細胞、及び哺乳類細胞等、アレイのキャビティ内の細胞の成長を可能にする。各細胞種別について、特定種のための標準培地が、修正を伴って、又は修正を伴うことなく、使用されてもよい。特定の実施形態において、ある誘導培地において、リン酸緩衝剤の代わりにＨＥＰＥ（例えば、２５ｍＭ）又はリン酸緩衝剤の代わりにＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（例えば、２５ｍＭ）を使用し、より高い蛋白質発現を導いてもよい。ＨＥＰＥ又はＴｒｉｓ−ＨＣｌで置換した誘導培地は、リン酸緩衝剤の濃度がより高い誘導培地もしくは２ｇ／Ｌのデキストロース又は２０ｇ／Ｌのラフィノース五水和物を補った誘導培地に比べて、酵母における蛋白質発現レベルが高くなる。
【００８３】
[00123]  従って、一態様において、本開示は、開放第１端部及び開放第２端部を備えた複数の個別キャビティを含むアレイを対象とし、基本的にすべての複数のキャビティの開放第１端部は、集合的に、第１多孔質平面状表面を備え、基本的にすべての複数のキャビティの開放第２端部は、第２多孔質平面状表面を備え、第１表面のカバーは、キャビティの内容物に、水分、栄養、又は生物学的反応分子のうちの少なくとも１つを与える。
【００８４】
[00124]  アレイのための溶融流体及び浸透性カバーにおける培地の特定の例は、以下の通りである。
【００８５】
[00125]  １）細胞のためのマイクロキャビティ内の内容物／浸透圧を維持するための、水を伴う１％アガロースゲル及びリン酸緩衝生理食塩水を伴う１％アガロースゲル。このゲルは、細胞をアレイの底部に確保するために使用されてもよい。
【００８６】
[00126]  ２）４８時間に亘る酵母の成長のための、酵母成長培地を伴う１％アガロースゲル。
【００８７】
[00127]  ３）酵素反応の適正な緩衝を確実に維持するための、酵素反応緩衝剤を伴う１％アガロースゲル。
【００８８】
[00128]  ４）キャビティへの均一な反応基板の供給のための、酵素反応緩衝剤及び反応基板を伴う１％アガロースゲル。
【００８９】
[00129]  ５）哺乳類細胞に栄養を供給するための、哺乳類細胞培地を伴う１％アガロースゲル。
【００９０】
[00130]  ６）キャビティをブリッジし、キャビティの内容物を離間したキャビティの細胞に影響させる哺乳類細胞培地を伴う１％アガロースゲル。
【００９１】
[00131]  本明細書に記載の種々の実施形態において、１％アガロースと水の１．５ｍｍ層は、アレイの頂上部に配置することができる。アガロース等の透明ゲルは、アレイ上に配置された光源を遮断することがないため、明視野撮像に適している。
【００９２】
[00132]  さらに、流体保持性且つ浸透性を有するカバーは、細胞のインキュベート及び／又はアレイにおける増殖期間中に、交換することができる。本実施形態において、栄養又はその他の試薬は、頂上部のカバーを試薬又はその他の化合物を含む新しいカバーに交換することにより、添加又は洗浄される。例えば、酵素反応のための基板は、成長培地を含むカバーから基板を含むゲルに切り替えることにより、正確な時間に（例えば、細胞成長後）、カバーに組み込むことができ、反応に対して添加することができる。
【００９３】
[00133]  インキュベート、要素の添加、及び／又はその他の調製ステップに続いて、アレイは、関心対象の表現型を有する細胞を含むキャビティを特定するために走査され、これには、関心対象の表現型を表示するウィルスの宿主となる細胞が含まれてもよい。例えば、定量的格子や顕微鏡のために策定されたガイドラインに従い、アレイから検出された蛍光シグナル中のキャピラリ間の変動が測定されてもよい。プロセスを満たすマイクロキャピラリの受動的性質が、結果として、アレイ全体に亘って均一なメニスカスレベルを生じる。この均一性は、投入された細胞の重量沈降と結び付けられ、オートフォーカスの必要性を伴うことなく、撮像フォーカス面の確立を簡易化する。むしろ、フォーカスは、例えば、隅部等、アレイ上の３つの遠く離間した地点に設定されてもよい。これら３つの地点から、マイクロキャピラリアレイの平面が計算されてもよい。
【００９４】
[00134]  図２に示される通り、生の入力階調画像が最小明度及び閾値レベルに対する任意のユーザ入力で、閾値化（Ｏｔｓｕ法）を介してバイナリ画像に変換されてもよい。発現及び結合の生の入力画像をパネルａ）に示す。パネルｂ）は、Ｏｔｓｕｋａ法による閾値化を示している。特徴は、サイズ（最小及び最大）及び粗度（偏心度）によるフィルタがかけられてもよい。ユーザ規定パラメータを通過する特徴は、ハイライト表示されている。パネルｃ）は、フィルタのかけられたバイナリマスクが生画像に適用されてもよいこと、蛍光値が定量化及びプロットされてもよいことを示している。追加の演算速度を犠牲にして、定量化を改善するため、背景差分を実施することができる。特徴フィルタリングは、蛍光片のバルクをなくしてもよく、空間的分離及び直接撮像により、個々の単一細胞の問い合わせに十分な時間を提供することができる。この能力により、研究者は、蛍光片と細胞の区別ができるようにし、偽陽性率を低下させる。
【００９５】
[00135]  定量的広視野顕微鏡の最適化は、結果として、光学的ケラレを生じることもあり、これは、恐らくカメラセンササイズを拡大したために、画像の縁部の明るさを低減するものである。これは、与えられた領域をカバーするより多くの画像を要求することにより、撮像速度を低減してもよい。また、絶対的定量化が必要な場合、フラットフィールド補正が使用されてもよい。Ｗｏｌｆらによって確立されたプロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＣｅＬＬ  Ｂｉｏｌ．（２０１３年）、１１４：３３７−６７）に従い、４つの画像が撮られてもよい。つまり、均質蛍光参照（Ｈｆｌａｔ）、蛍光のない領域での暗画像（Ｈｄａｒｋ）、試料において蛍光がない領域での暗画像（Ｓｄａｒｋ）、及び試料画像（Ｓｉｍａｇｅ）である。フラットフィールド補正画像は、以下の式によって見出すことができる。
【００９６】
[00136]
【数５】
2018510624.tif 000009
【００９７】
[00137]  マイクロキャビティ内容物の抽出
[00138]  キャビティのアレイに関連付けられた検出器から受信された光学情報に基づき、所望の特性を備えた対象キャビティが特定され、さらなる特性化及び増殖のために、それらの内容物が抽出される。本開示の方法は、キャビティ内の生物学的要素の保全を維持する。従って、本明細書に開示の方法は、数十億個の対象生物学的要素までの個体群から生物学的要素の対象個体群を表示し、独立的に回復するものである。これは、細胞がスクリーニングされる実施形態にとって特に好都合である。
【００９８】
[00139]  例えば、関心対象の結合イベントを配置するために、各キャビティからのシグナルが走査される。これにより、関心対象のキャビティを特定する。所望のクローンを含む個別のキャビティは、種々の方法を使用して抽出することができる。すべての抽出技術にとって、抽出された細胞又は材料は、培養又は増殖反応を通じて増殖され、蛋白質、核酸、又はその他の生物学的要素の回復のために特定できる。上述の通り、複数ラウンドのスクリーニングも考慮される。各スクリーニングに続いて、関心対象の１つ以上のキャビティは、本明細書に記載の通り、抽出することができる。その後、各キャビティの内容物は、所望の選択性が達成されるまで、スクリーニングすることができる。ある実施形態において、所望の選択性は、小孔毎の単一の生物学的要素であろう。これらの実施形態において、キャビティが単一要素のみを含む前に、各ランドのスクリーニングに従ってもよい。
【００９９】
[00140]  一実施形態において、この方法は、圧力放出によって、マイクロキャビティに配置された細胞を分離することを含む。例えば、離間したマイクロキャビティアレイは、プラスチックフィルムでカバーされる。一実施形態において、この方法は、さらに、プラスチックフィルムを貫通する孔を作れるレーザを提供することにより、空間的に位置指定された細孔を露出する。次いで、圧力源（例えば、空気圧）への露出により、空間的に位置指定されたマイクロキャビティからの内容物を押し出す。ＷＯ２０１２／００７５３７号を参照のこと。
【０１００】
[00141]  他の実施形態は、マイクロキャビティアレイの単一のマイクロキャビティから生物学的要素を含む溶液を抽出する方法を対象とする。本実施形態において、マイクロキャビティは、材料がキャビティ内に収まるか、又はマイクロキャビティをコーティング又はカバーするように、電磁放射線吸収剤材料と関連付けられる。抽出は、試料、材料、又はその双方の増殖か、もしくはマイクロキャビティから試料の少なくとも一部を押し出す蒸発とを生じるために、マイクロキャビティに電磁放射線を集束することによって生じる。電磁放射線源は、蛍光ラベルを励起する発生源と同一であってもよく、又はこれと異なってもよい。発生源は、材料及びラベルの異なる吸収スペクトルに対応するために、複数の波長の電磁放射線を放出することができてもよい。
【０１０１】
[00142]  いくつかの実施形態において、集束された電磁放射線に選択されたマイクロキャビティを晒すことにより、電磁放射線吸収剤材料の増殖を生じることができ、これにより、押し出された内容物の収集を行う基板上に試料内容物を押し出す。
【０１０２】
[00143]  いくつかの実施形態において、レーザは、小径の直径と略同一であるか、又はこれより小さい直径を備えたスポットサイズに収束できるように、十分なビーム量を有していなければならない。例えば、アレイ材料が電磁放射線を吸収することができる時、例えば、アレイが電磁放射線吸収材料で製造されるか、又はこれでコーティングされる時、レーザスポットの直径は、レーザが材料−試料の界面に収束されるように、キャピラリの直径より小さくてもよい。いくつかの実施形態において、アレイ自体の材料は、暗化キャピラリアレイ又は黒化キャピラリアレイ等、コーティングを伴うことなく、電磁放射線吸収剤材料として機能することができる。例えば、本明細書においてさらに説明を行う通り、アレイは、水素雰囲気中で還元された鉛ガラスで構築されてもよい。種々の実施形態において、レーザの焦点は、キャビティの直径の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、４％、３％、２％、又は１％であってもよい。
【０１０３】
[00144]  一態様において、電磁放射線は、電磁放射線吸収材料に集束され、レーザエネルギーの線形吸収と、材料／液体の界面における液体試料の培養とを生じる。電磁放射線は、アレイの電磁放射線吸収材料の集中的且つ局所的な加熱を生じ、キャビティの内容物の残りの部分を加熱することなく、材料と接触した流体の薄膜層の爆発的蒸発及び膨張を生じる。ほとんどの適用例において、電磁放射線を材料に方向付けることは、マイクロキャビティの液体内容物の加熱及び細胞内の生物学的材料に影響を与えることを回避するため、放射の集束部分にて、材料と接触しない液体の加熱を回避すべきである。従って、電磁放射線の集束部分に近接した液体の非常に薄膜の層が加熱され、液体の爆発的蒸発と膨張とを生じ、メニスカスを破壊するのに必要なエネルギーの量が、液体内容物全体の温度を著しく上昇させるのに十分でなくなる。一態様において、レーザは、メニスカス自体に隣接したアレイのキャビティの材料に集束され、レーザ集束部分に隣接したメニスカスの一部における少量の液体の蒸発に関連付けられた加熱以外に、キャビティの液体内容物を加熱することなく、メニスカスの破壊を生じる。
【０１０４】
[00145]  ある実施形態において、アレイのキャビティからの抽出は、マイクロキャビティ内の１つ以上の粒子の励起によって達成されるが、この場合、励起エネルギーは粒子に集束される。従って、いくつかの実施形態では、キャビティ内のエネルギー吸収粒子と、アレイの各キャビティ内の粒子に電磁放射線を個別伝搬することができる電磁放射線とを採用する。ある実施形態において、エネルギーは、マイクロキャビティ内の溶液の温度を最低限に抑えるか、又は全く上昇させず、粒子に移される。ある態様において、パルスシーケンスは、メニスカスを破壊するために、キャビティ内の磁気ビーズを反復的に扇動し、押し出された内容物を収集するための基板上に試料内容物を押し出す。
【０１０５】
[00146]  電磁放射線源からの電磁放射線放射スペクトルは、キャビティと関連付けられた電磁放射線吸収剤材料の吸収スペクトルに少なくとも部分的重複が存在するようにしなければならない。ある実施形態において、マイクロキャビティアレイからの個別のキャビティは、単一の大きなパルスでなく、短いレーザパルスのシーケンスによって抽出される。例えば、レーザは、約３００〜６５０、より具体的には、約３４９ｎｍ、４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、又は６３５ｎｍの波長でパルス化される。レーザのピークパワーは、例えば、約５０ｍＷ〜１００ｍＷであってもよい。また、レーザのパルス長は、約１ｍｓｅｃ〜約１００ｍｓｅｃであってもよい。ある実施形態において、レーザの総パルスエネルギーは、約１０μＪ〜約１０ｍＪであり、例えば、１０μＪ、２５μＪ、５０μＪ、１００μＪ、５００μＪ、１０００μＪ、２５００μＪ、５０００μＪ、７５００μＪ、又は１０，０００μＪである。ある実施形態において、レーザビームウェストの集束スポットの直径は、約１μｍ〜約２０μｍであり、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、又は２０μｍである。特定の例としての実施形態において、レーザは、７５ｍＷピークパワー、１ｍｓｅｃパルス長、１０ｍｓｅｃパルス分離、２μｍ直径ビーム、抽出毎に計１０パルスでパルス化される。
【０１０６】
[00147]  いくつかの実施形態において、関心対象のキャビティは、選択された後、２０〜３０％の強度パワーで３４９ｎｍ固体状態ＵＶレーザを集束させることにより、抽出される。一例において、発生源は、約５０ナノ秒パルスで約１μジュール〜約１ミリジュールの発光を行う三周波数パルス化固体状態Ｎｄ：ＹＡＧ又はＮｄ：ＹＶＯ４レーザ源である。他の例において、発生源は、ダイオード励起Ｑ切替Ｎｄ：ＹＬＦ  Ｔｒｉｔｏｎ  ＵＶ３４９ｎｍレーザ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）である。例えば、レーザは、約１５〜２５ｍｓの合計操作時間で、約２〜３ｋＨｚで３５〜５５パルスのトレインを伝播し、約８〜１８ｎｓｅｃのパルス幅、約４〜６μｍのビーム直径、８０〜１２０μＪの合計パワー出力を有してもよい。１つの特定の例において、レーザは、約１５〜２０ｍｓの合計操作時間で、約２．５ｋＨｚにて約４１〜５３のトレインを伝播し、約１０〜１５ｎｓｅｃのパルス幅、約５μｍのビーム直径、１００μＪの合計パワー出力を有してもよい。本開示によると、シャッタを備えた連続波レーザとパルス化レーザ源との双方を使用することができる。
【０１０７】
[00148]  いくつかの実施形態において、ダイオードレーザは、電磁放射線源として使用されてもよい。ある実施形態において、ダイオードレーザの集束は、約１μｍ〜約１０μｍ、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、又は１０μｍ、のビームウェスト直径を有する。ダイオードレーザは、約２０ｍＷ〜約２００ｍＷのピークパワー、例えば、約２０ｍＷ、４０ｍＷ、６０ｍＷ、８０ｍＷ、１００ｍＷ、１１０ｍＷ、１２０ｍＷ、１３０ｍＷ、１４０ｍＷ、１５０ｍＷ、１６０ｍＷ、１７０ｍＷ、１８０ｍＷ、１９０ｍＷ、又は２００ｍＷのピークパワーを有してもよい。ダイオードレーザは、約３００〜約２０００ｎｍ、例えば、約４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、又は６３５ｎｍの波長で使用することができる。他の実施形態において、赤外線ダイオードレーザが、約８００ｎｍ、９８０ｎｍ、１３００ｎｍ、１５５０ｎｍ、又は２０００ｎｍの波長で使用される。任意の与えられた試料に対する光毒性を低減するには、より長い波長が期待される。
【０１０８】
[00149]  ある実施形態において、ダイオードレーザは、約２〜２０パルス、例えば２パルス、４パルス、６パルス、８パルス、１０パルス、１２パルス、１４パルス、１６パルス、１８パルス、及び２０パルスでパルス化され、約１〜１０ｍｓｅｃのパルス長、例えば、１ｍｓｅｃ、２ｍｓｅｃ、３ｍｓｅｃ、４ｍｓｅｃ、５ｍｓｅｃ、６ｍｓｅｃ、７ｍｓｅｃ、８ｍｓｅｃ、９ｍｓｅｃ、及び１０ｍｓｅｃのパルス長であり、約１０ｍｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃのパルス分離、例えば、１０ｍｓｅｃ、２０ｍｓｅｃ、３０ｍｓｅｃ、４０ｍｓｅｃ、５０ｍｓｅｃ、６０ｍｓｅｃ、７０ｍｓｅｃ、８０ｍｓｅｃ、９０ｍｓｅｃ、及び１００ｍｓｅｃのパルス長を有する。例としての実施形態において、ダイオードレーザは、６３５ｎｍの波長で動作するピークパワー１７０ｍＷのＯｃｌａｒｏ  ＨＬ６３１３３ＤＧレーザである。他の例としての実施形態において、ダイオードレーザは、４５０ｎｍで動作するＯｓｒａｍ  ＰＬ４５０Ｂレーザである。
【０１０９】
[00150]  他の例としての実施形態において、ダイオードレーザ又はＴｒｉｔｏｎレーザは、１〜１０ミクロンの直径に集束される。レーザは、１０ｍｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃの期間、１０〜５０パルスのトレインを放出する。各個別のパルスは、１ｍｓｅｃ（ダイオードレーザ）又は１０ｎｓｅｃ（Ｔｒｉｔｏｎレーザ）の持続時間を有する。合計パルストレインエネルギーは、約１００マイクロジュールである。レーザエネルギーは、レーザビームウェストの直径と略等しい直径とレーザビームの吸収長によって判定される高さとを備えた略円筒形であるマイクロキャピラリの容量内に吸収される。磁気ビーズがキャピラリ内にある場合、レーザパルスエネルギーは、これらのビーズに吸収され、レーザに直接晒されたビーズの表面を主に加熱する。この表面にすぐ近接した液体は、爆発的に蒸発し、キャピラリ内のビーズを推し進める。ビーズの爆発的な動きは、付近の液体の蒸発とともに、メニスカスを破壊し、キャピラリ内を空にする。アレイ自体の材料が光を吸収する場合、レーザエネルギーは、レーザが入射するキャピラリ壁部の一部に主として蓄積される。この吸収容量で十分に短い時間で十分なレーザエネルギーが吸収される場合、周囲の液体に熱が拡散される時間はないであろう。吸収容量内の液体は、レーザパルスによって爆発的に蒸発され、試料の一部の急速な増殖を生じ、メニスカスを破壊してマイクロキャピラリの内容物を空にし、吸収容量の外側の周辺液体への熱拡散が最小化されるであろう。
【０１１０】
[00151]  特定の例において、個々のレーザパルスは、約１ｍｓｅｃの持続時間を有し、ビーム廃棄直径は、約１０ミクロンである。本例において、単一レーザパルスは、レーザビームの吸収領域内の液体容量を加熱し、パルス中、この熱は、吸収領域の外側わずか数ミクロンに拡散するであろう。レーザパルス中に蓄積されたエネルギーは、吸収領域内の液体温度を蒸発温度の数倍まで急激に上昇させる。液体は、この吸収領域内で爆発的に蒸発されるが、周囲領域は、基本的に、その当初の温度のままである。吸収領域内の液体の爆発的蒸発により、メニスカスを破壊し、液体は、吸収材料から周辺培地へのごくわずかな熱拡散を伴ってマイクロキャピラリから押し出され、結果として、マイクロキャピラリの全液体内容物をごくわずかに加熱するか、又は全く加熱しない。
【０１１１】
[00152]  短時間スケールにおける基板内の熱伝搬距離を記述する式は、以下の通りである。
【０１１２】
[00153]
【数６】
2018510624.tif 000010
【０１１３】
[00154]  ｄが特徴的熱拡散距離である場合、αは、熱拡散係数であり、τは、エネルギー蓄積時間又はレーザパルス長である。水については、α＝０．１４３ｍｍ２／ｓｅｃであり、τ＝１ｍｓｅｃであれば、この式は、結果として、予測拡散長が約１０ミクロンとなる。ウェスト直径１０ミクロンで高さ１０ミクロン（〜１０ｅ−１２ｃｍ３）のビームで判定される略円筒形吸収容量に蓄積される合計１００マイクロジュールのパルスエネルギーは、この容量の液体の温度を、液体の蒸発温度より何倍も高く上昇させ、結果として、この容量内の液体の爆発的膨張を生じる。
【０１１４】
[00155]  Ｖｅｒｉｔａｓレーザは、約４０のトレイン、５ｎｓｅｃのパルスを供給し、各パルスは、約５００マイクロ秒で分離される。各パルスは、吸収容量内の液体の爆発的膨張を生じ、ビーズ（があれば、これら）を推進し、メニスカスを破壊する。ダイオードレーザは、同様に、数ミリ秒で分離された１０分の１ｍｓｅｃのトレインで伝搬し、同様にキャピラリ内の液体と相互作用する。双方の場合において、パルストレイン内の複数のパルスを使用することにより、単一の高エネルギーパルスを使用するのに比べて、抽出効率が向上する。
【０１１５】
[00156]  微小球の使用時、直径ｄの均一球に対する熱緩和時間（ｔｒ）の式は、以下の通りである。
【０１１６】
【数７】
2018510624.tif 000011
【０１１７】
[00157]  レーザパルスが＜−３００ｎｓ（これは、ビーズの直径によって決まる）である限り、吸収剤材料の熱閉じ込めと急速且つ局所的な加熱が生じるであろう。
【０１１８】
[00158]  さらなる例としての実施形態において、以下のパラメータが使用されてもよい。
１）レーザパラメータ
ａ．ベリタスレーザ
ｉ．Ｔｒｉｔｏｎ  ＵＶ３４９ｎｍレーザ（ダイオード励起Ｑ切替Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）
ｉｉ．合計操作時間：１８±２ｍｓ（ｎ＝５回測定）、２．５ｋＨｚにて４６．６±５．９パルスのトレインを伝播
ｉｉｉ．パルス幅：１０−１５ｎｓｅｃ
ｉｖ．ビーム直径：５μｍ
ｖ．総出力：１００μＪ
２）吸収材料
ａ．超常磁性酸化鉄ドープマイクロビーズ
ｉ．直径〜１μｍ（１００ｎｍ〜１０μｍまでの範囲可）
【０１１９】
【数８】
2018510624.tif 000012
【０１２０】
[00158]  ｂ．黒色キャピラリ壁部（例えば、アルカリドープシリケートガラスを水素雰囲気で還元することによって得られたケイ酸鉛層）
【０１２１】
[00159]  キャビティ内の材料は、例えば、上述の通り、結合アッセイにおいて使用される粒子とすることができる。従って、粒子は、表面に蓄積するために、粒子が力に応じるようにする特性を有してもよく、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）粒子等の電磁放射線吸収剤材料も含んでよい。種々の実施形態において、エネルギーが粒子に印加され、これらは（連続的又は複製的な力で）表面のシグナルが検出された後に表面に蓄積されるか、又は粒子が試料粒子に戻るように取り除かれる。あるいは、キャビティは、結合反応に関与しないものの、本明細書に記載の通り、内容物の抽出をもたらす粒子又はその他の材料を含む。これらの粒子は、アッセイの結合反応によらず、マイクロキャビティの壁部に結合するように、機能を持たせられてもよい。マイクロキャビティのコーティング又はカバーを行うために、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）等、特に高膨張性材料等の同様の材料を使用することができる。他の実施形態において、各キャビティが膨張層に接合されるように、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）材料をアレイの一方側に接合される接着層の形態で供給することができる。
【０１２２】
[00160]  マイクロキャビティに電磁放射線を集束させることにより、電磁放射線吸収材料を膨張せることができ、キャビティの液体容量の少なくとも一部を押し出す。材料が加熱され、キャビティ内容物の急速膨張を生じる時、内容物の一部が、例えば、１６００倍まで膨張されてもよく、これにより、内容物の残りの一部をキャビティから押し出す。
【０１２３】
[00161]  材料又はキャビティ内容物の急速な膨張を伴うことなく、加熱により、内容物の蒸発を生じることができ、基板上に内容物を凝集することにより、これを収集することができる。例えば、基板は、キャビティの開口又はその付近に配置された疎水性マイクロピラーとすることができる。内容物の排除は、メニスカスの外側でのキャピラリの壁部で試料が蒸発及び凝集する際にも発生することがあり、メニスカスに、キャピラリの内容物を破壊及び解放させる。
【０１２４】
[00162]  マイクロキャビティは、両端において開放されるものとすることができ、内容物が静水圧で定位置に保持される。抽出プロセス中、キャビティの両端のうちの一方は、キャビティの誤った方の端部から内容物が追い出されることを防ぐために、カバーすることができる。キャビティは、例えば、上述のプラスチックフィルム又はポリマーゲル等と同一の方法でカバーすることができる。また、膨張材料が、層として、アレイの一方側に接合されてもよい。
【０１２５】
[00163]  いくつかの実施形態において、捕捉面は、キャビティの内容物が押し出される吸湿性層を備える。吸湿性層は、水を引き付け、光学面が変形するのを防いで、キャビティの内容物が明確に撮像されるようにする。ある実施形態において、層は、マンサク、グリセロールを含む溶液、ウシ血清アルブミンと、例えば、０．１％重量／体積ＢＳＡの濃度のソルビトールと、１Ｍソルビトールとを伴うリン酸緩衝生理食塩水の溶液等の吸湿性組成である。この層は、広げること、ぬぐうこと、又は噴射することによって付与することができ、表面上に均一に分散させなければならない。通常、この層は、層を通過するＥＭ放射をゆがめることなく、上方のアレイに接触することがない限り、約１０〜１００μｍの厚さである。
【０１２６】
[00164]  他の実施形態において、１つ以上のキャビティの細胞内容物が一旦捕捉面上に抽出されると、この表面が、キャビティの内容物をマトリクスに移行するように、培養マトリクスに接触されてもよい。内容物がマトリクスに一旦移行されると、細胞は、マトリクス上を伝播してもよい。マトリクスは、細胞の成長及び複製を可能にする任意の固体、半固体、又はゲルタイプの培地（例えば、アガロース）であってもよい。マトリクスは、必要に応じてインキュベートされてもよい。捕捉面は、マトリクス内の細胞培養の生存性を確保するのに適切となるように、接触直後、又は数分、数時間、数日、又は数週間のうちに取り除くことができる。あるいは、マトリクスが、本明細書に記載の通り、アレイにエネルギーを移行するのに十分な集束をせず、抽出レーザにマトリクスを貫通させる十分な透明度を有すると仮定すると、細胞は、成長マトリクス上に直接抽出されてもよい。
【０１２７】
[00165]  いくつかの実施形態において、本開示に係る検体の検出は、試料、特に、マイクロアレイ等のキャビティのアレイへ電磁放射線を付与することができる装置の使用を要求する。この装置は、試料、特に、試料キャビティから放出される電磁放射線を検出することもできなければならない。
【０１２８】
[00166]  一実施形態において、装置の電磁放射線源は、試料の少なくとも１つのラベルの波長に合致する波長を有する広域スペクトル光又は単色光の光源である。さらなる実施形態において、電磁放射線源は、連続波レーザ等のレーザである。さらなる実施形態において、電磁波源は、固体ＵＶレーザである。その他の好適な電磁放射線源の非限定的なリストには、アルゴンレーザ、クリプトン、ヘリウムネオン、ヘリウムカドミウムタイプ、及びダイオードレーザが含まれる。いくつかの実施形態において、電磁波源は、１つ以上の連続波レーザ、アークランプ、又はＬＥＤである。
【０１２９】
[00167]  いくつかの実施形態において、この装置は、複数（１つ以上）の電磁波源を備える。他の実施形態において、複数の電磁波（ＥＭ）放射源は、同一波長で電磁放射線を放出する。他の実施形態において、複数の電磁波源は、試料にあってもよい種々のラベルの異なる吸収スペクトルに対処するために、異なる波長を放出する。
【０１３０】
[00168]  いくつかの実施形態において、複数の電磁放射線源は、３４９ｎｍの波長、５μｍの集束ビーム直径、及び２０ｎｓのパルス持続時間で動作するＴｒｉｔｏｎ  ＵＶレーザ（ダイオード励起Ｑ切替Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を備える。さらなる実施形態において、複数の電磁放射線源は、ＸＦ４１０ＱＭＡＸ  ＦＩＴＣとＸＦ４０６  ＱＭＡＸ赤色フィルタセット（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）を備えたＸ−ｃｉｔｅ１２０照明システム（ＥＸＦＯ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）を備える。一例としての実施形態において、ダイオードレーザは、６３５ｎｍの波長で動作する１７０ｍＷのピークパワーを備えたＯｃｌａｒｏ  ＨＬ６３１３３ＤＧレーザである。他の例としての実施形態において、ダイオードレーザは、４５０ｎｍで動作するＯｓｒａｍ  ＰＬ４５０Ｂレーザである。
【０１３１】
[00169]  この装置は、試料、アレイのラベルからの電磁（ＥＭ）放射を受信する検出器も含む。検出器は、１つ以上のラベルから電磁放射線を放出する少なくとも１つのキャビティ（例えば、マイクロキャビティ）を特定することができる。
【０１３２】
[00170]  一実施形態において、電磁放射線への露出後に蛍光ラベルによって発光された光（例えば、紫外線領域、可視領域、又は赤外線領域の光）が検出される。１つ又は複数の検出器は、蛍光部分からの光子バーストの振幅及び持続時間を取得し、さらに、光子バーストの振幅及び持続時間を電気信号に変換することができる。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の検出器が反転される。
【０１３３】
[00171]  一旦粒子又は要素が検出可能となった旨がラベル付けされると、あるいは、粒子が検出可能となる本質的特性を持っている場合、例えば、ＣＣＤカメラ、ビデオ入力モジュールカメラ、ストリークカメラ、ボロメータ、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェフォトダイオード、連続シグナルを生成する光電子増倍管、及びこれらの組み合わせ等、本開示の範囲を逸脱することなく、従来既知の任意の好適な検出機構を使用してもよい。放射波長、放射強度、バーストサイズ、バースト持続時間、蛍光偏光、及びこれらの組み合わせを含む、電磁放射線の異なる特性が検出されてもよい。一例として、本開示に対応した検出器は、２０×Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒｉｔｅ対物（開口数：０．４５、ＣＦＩ、ＷＤ：７．４、Ｎｉｋｏｎ）とＯＲＣＡ−ＥＲ冷却ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を備えた倒立蛍光顕微鏡である。
【０１３４】
[00172]  検出プロセスは、自動化も可能であり、この場合、装置は、レーザ走査顕微鏡等の自動化検出器を備える。
【０１３５】
[00173]  いくつかの実施形態において、本開示の装置は、少なくとも１つの検出器を備えることができる。他の実施形態において、装置は、少なくとも２つの検出器を備えることができ、各検出器は、ラベルによって放出された特定波長範囲で光エネルギーを検出するように選択及び構成することができる。例えば、異なるラベルでタグ付けされ、電磁波源で励起されると、異なるスペクトルのエネルギーで光子を放出する粒子を検出するために、２つの別の検出器を使用することができる。
【０１３６】
[00174]  マイクロキャビティアレイのキャビティからの蒸発は、キャビティ内のメニスカスの高さを変更することで、マイクロキャビティの内容物の測定を複雑化する。特に、キャビティと付近の任意の表面の間で、その表面の温度がより低い場合、キャビティ内の液体の蒸発のために物質移動が生じる。この蒸発は、キャビティ内のメニスカスの高さを変更し、キャビティ内の細胞の位置を上昇させ、レーザ抽出をより困難にしたり、顕微鏡の焦点面からシグナル生成要素を（例えば、細胞、ビーズ）を上昇させ得る。
【０１３７】
[00175]  アレイからの液体の物質移動に対処するために、マイクロキャビティアレイは、各ガラスプレートの一面が透明導電性コーティングでコーティングされた状態で、１つ又は２つの透明ガラスプレートに隣接して、又はこれらの間に配置されてもよい。例えば、図３Ａは、アレイの下方の単一ガラスプレート３０を備えたホルダ２０におけるマイクロキャピラリアレイ１０の上面図を示している。明確さのために、アレイ上方の第２プレートは図示していないが、存在してもよい。温度を制御するために、ガラスプレートを均一に加熱すべく、プレート上に透明コーティング（図示せず）を使用することができる。このコーティングは、例えば、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）であってもよく、これは、可視領域のスペクトルで透明である。コーティングが透明であることにより、上方（例えば、明視野）又は下方（例えば、倒立顕微鏡の溶射蛍光）から伝搬された光を励起する。コーティングされたガラスプレートにより、本明細書において説明した捕捉面（図示せず）を、アレイのキャピラリから抽出された内容物の収集を行うプレート間に挿入させる。捕捉面の近傍にあるプレートは、表面上のキャビティの内容物の凝集を防ぐため、捕捉面を加熱する。
【０１３８】
[00176]  図３Ｂは、ホルダ２０及びプレート３０の底面図を示している。ガラスプレートの２つの対向縁部４０上のコーティングには、導電性ストリップを付与することができる。これらの導電性ストリップは、例えば、導電性接着剤を備えた銅テープ、導電エポキシのライン、又は蒸着導電層（例えば、金、銀、チタン等）とすることができる。ストリップに印加された電圧は、結果として、コーティングを通過する電流を生じる。コーティングが有限の抵抗性を有するため、電流は、結果として、ガラスプレートの表面のオーム加熱を生じる。プレートを通過する電流が均一であれば、プレートに亘る加熱は、均一でなければならない。ガラスプレートの表面の温度は、熱電対、サーミスタ、又はその他の温度プローブで測定することができ、温度を安定化するために、フィードバック回路を使用することができる。底部又は頂上部のガラスプレート上での凝集と、凝集をなくすための温度上昇とを観察することにより、加熱の適正量を判定することができる。あるいは、メニスカスの高さは、キャビティ内の細胞又は磁気ビーズと、メニスカスをウェルの底部に下げるための温度昇降とに注目することにより、測定することができる。
【０１３９】
[00177]  種々の態様において、本開示は、関心対象の検体又は細胞プロセスの検出、特定、及び／又は特性化のためのキットを対象とする。いくつかの実施形態において、このキットは、検出試薬及び緩衝剤に加え、関心対象の蛋白質等、検体に特定の抗体を含む。他の実施形態において、このキットは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー）の検出に特定の試薬を含む。種々の実施形態において、このキットは、アッセイ実施のためのすべての制御及び指導を含む、検出アッセイの実施に必要なすべての要素を含み、キットに設けられるＭ個の磁気粒子の解析及び表現に必要な任意のソフトウェアが、検体のための結合パートナで機能化される。ラベルは、検体又はその他の試料要素のための結合パートナに結合させてもよい。このキットは、試料内の第２検体、第３検体、第４検体等を結合するために、又は、アレイのマイクロキャビティ間の試料要素の正規化をもたらすために、機能化される第２セット粒子、第３セット粒子、第４セット粒子等も含んでよい。光又はその他の悪条件による試薬の劣化を防ぐための安定剤（例えば、酸化防止剤）も、このキットの一部であってよい。
【０１４０】
[00178]  指導用資料には、通常、書面又は印刷物が含まれるが、これに限定されるものでない。このような指導を記憶することができ、エンドユーザにこれらを通信することのできる任意の媒体が、本開示によって考慮される。このような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）等が含まれるが、これに限定されるものでない。このような媒体には、このような指導用資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれてもよい。
【０１４１】
[00179]  一実施形態において、本開示は、新規の治療薬を特定することを備える方法を対象とする。例えば、病状に関与する既知の薬剤結合パートナ（すなわち、例えば、抗体、生物学的受容体、及び／又は酵素）は、結合パートナに対する親和性を有すると疑われる種々の化合物を分泌するか、又は表面表示する複数の細胞に対してスクリーニングすることができる。最高の結合親和性を有する化合物を表示又は分泌する細胞を含むマイクロキャビティが、適切なレポータシステムで特定できる。特定されたマイクロキャビティのニア要物は、未来の開発のために抽出及び使用することができる。他の実施形態において、治療用化合物等の化合物の存在下において、細胞生存性又は相互作用がスクリーニングされてもよい。このような化合物の存在下において生存性を有する細胞、又はその存在下における関心対象の活性が、さらに解析されてもよい。
【０１４２】
[00180]  一実施形態において、本開示は、各細胞が、抗体を生成し、マイクロキャビティ内にその抗体を分泌するように、抗原−抗体結合を判定する方法を対象とする。抗体は、組換型抗体及び／又はモノクロナール抗体であってもよい。１つ又は複数の細胞は、２つ以上の種類の抗体か、又は同抗体の複数のコピーを生成してもよい。一実施形態において、本開示は、診療用抗体を特定することを備える方法を考慮するものである。例えば、結合パートナに対する親和性を有する疑いのある種々の交替を分泌する複数の細胞は、病状に関与する既知の結合パートナ（すなわち、例えば、抗原及び／又はエピトープ）についてスクリーニングできる。最高の結合親和性を有する化合物を表示又は分泌する細胞を含むマイクロキャビティは、適切なレポータシステムで特定することができる。
【０１４３】
[00181]  一実施形態において、本開示は、蛋白質−蛋白質の相互作用を特定することを備える方法を対象とする。病状に関与する既知の結合パートナ（すなわち、例えば、蛋白質及び／又はペプチド）に対する親和性を有する疑いのある種々の蛋白質及び／又はペプチドを分泌又は表面表示する複数の細胞は、結合パートナに対してスクリーニングできる。最高の結合親和性を有する化合物を表示又は分泌する細胞を含むマイクロキャビティは、適切なレポータシステムで特定することができる。
【０１４４】
[00182]  一例として、本開示は、Ａｘｌ受容体チロシンキナーゼ及び介在線免疫機能、血液凝固、並びに腫瘍細胞浸潤及び転移に結合する臨床対象Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｒｅｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ６（Ｇａｓ６）に対する蛋白質バインダを特定する方法を対象とする。本方法によると、高い親和性を備えたＧａｓ６に結合する異型を特定するために、酵母表示単鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）のナイーブライブラリをスクリーニングすることができる。
【０１４５】
[00183]  一実施形態において、本開示は、蛋白質−核酸相互作用を特定することを備える方法を対象とする。病状に関与する既知の結合パートナである核酸（例えば、デオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸及び／又はＳＯＭＡｍｅｒ及び／又はアプタマー）は、結合パートナに対する親和性を有する疑いのある種々の蛋白質及び／又はペプチドを分泌又は表面表示する複数の細胞に対して、スクリーニングできる。最高の結合親和性を有する化合物を表示又は分泌する細胞を含むマイクロキャビティは、適切なレポータシステムで特定することができる。
【０１４６】
[00184]  一実施形態において、本開示は、蛋白質−炭水化物の相互作用を特定することを備える方法を考慮するものである。病状に関与する既知の結合パートナである炭水化物（すなわち、例えば、オリゴ単糖類、及びリポ単糖類、又はプロテオ単糖類）は、結合パートナに対する親和性を有する疑いのある種々のレクチン、蛋白質、及び／又はペプチドを分泌又は表面表示する複数の細胞に対してスクリーニングできる。最高の結合親和性を有する化合物を表示又は分泌する細胞を含むマイクロキャビティは、適切なレポータシステムで特定することができる。
【０１４７】
[00185]  一実施形態において、所望の特性（例えば、蛍光）を有する蛋白質検体又は蛋白質を検出するために、開示の方法を使用する。特定の検体蛋白質の検出は、アレイのキャビティにおいて直接実施することができる。生化学センシングは、サンドイッチ免疫測定又は同様の結合反応又は交配反応を含む標準検出技術を使用して行うことができる。例えば、本開示は、蛍光蛋白質における関心対象特性の設計方法を対象とする。関心対象特性は、放射スペクトル又は放射強度、ストークスシフト、及び吸収スペクトル又は吸収強度のうちの少なくとも１つであってもよい。特定の一例において、特定の蛍光吸光度スペクトル、放射スペクトル、及び／又は消光率を有する蛋白質を発現する細胞ライブラリをスクリーニングするために、本開示の方法を使用することができる。特定の一実施形態において、蛋白質は、図１７に特定した突然変異のうちの少なくとも１つを有する二量化依存性オレンジ蛍光蛋白質（ｄｄＯＦＰ）である。
【０１４８】
[00186]  ある実施形態において、本開示は、酵素活性のハイスループット解析を実施するのに有用な方法及び装置を提供する。一態様において、これらの実施形態は、マイクロキャビティに添加される酵素の反応速度を判定する方法を提供する。例えば、複数の酵素異型を符号化する遺伝子が、マイクロキャビティアレイに添加された細胞に導入され、ここに発現される。酵素のための基板も提供し、この場合、マイクロキャビティにおける酵素の活性は、生成物の形成又は各小孔からの基板の枯渇のいずれかを（連結アッセイを直接又は間接に介して）経時的にモニタリングすることができる。いくつかの実施形態において、特定の反応速度特性を備えた酵素異型が、マイクロキャビティアレイから選択、抽出され、続く解析ステップ、拡張ステップ、そして任意でさらに選択ステップのために分離される。酵素活性のモジュレータは、特定酵素活性のために選択的圧力を付与するために、マイクロキャビティ内でのインキュベート前又はインキュベート中に、添加されてもよい。従って、本開示の実施形態は、モジュレータへの抵抗性又はモジュレータによる刺激を示す酵素異型を特定するのに有用である。
【０１４９】
[00187]  一例において、本開示は、蛋白質酵素の突然変異体型を生成する複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリによって生成された蛋白質酵素ライブラリの構成員について、酵素反応速度を測定する方法を対象とする。この方法は、マイクロキャビティアレイに細胞ライブラリを投入することと、関心対象の酵素を生成させる条件下で、蛋白質酵素のための基板の存在下においてアレイをインキュベートすることとを備える。このアレイは、酵素活性の時間分解解析を提供するように選択された間隔で撮像されてもよい。この期間は、解析されている酵素及び基板システムに照らし合わせて選択されてもよい。例えば、期間は、数秒、数分、又は数時間であってもよく、アレイの１つ以上のキャビティからのシグナルは、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、４０回、６０回、８０回、又は１００回等、任意の数の間隔で測定されてもよい。
【０１５０】
[00188]  特定の例において、酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）であり、モジュレータは、無機リン酸であって、ＡＰの活性を阻害する。本開示の方法によると、ＡＰ異型を発現する細胞ライブラリは、細胞をアレイに投入し、無機リン酸の存在下でＡＰ活性についてマイクロキャビティをスクリーニングすることによって、スクリーニングすることができる。
【０１５１】
[00189]  本開示の方法によって特定されたＡＰ異型は、以下の突然変異、すなわち、Ｄ１０１Ｇ、Ｉ１６Ｖ、Ｎ１４５Ｉ、Ｄ２９４Ｇ、Ｎ１９７Ｓ、Ｔ１４８Ｐ、及びＳ１７５Ｒのうちの少なくとも１つを有する。特に、異型は、Ｄ１０１Ｇであってもよく、Ｉ１６Ｖ−Ｎ１４５Ｉ−Ｄ２９４Ｇ及びＮ１９７Ｓ−Ｔ１４８Ｐ−Ｓ１７５Ｒの一方であってもよい。また、ＡＰ異型の残りは、野生型ＡＰと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であってもよい。Ｄ１０１の位置は、ＡＰ活性部位内のリン酸イオンを調整するＲ１６６残渣を配置するのに重要であることが知られている。このように、本開示の方法でカバーされていないＤ１０１Ｇ突然変異は、無機リン酸に対する酵素の親和性を低下させるＲ１６６の配置を変更してしまうようである。
【０１５２】
[00190]  一実施形態において、検体は、核酸である。例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの発現は、任意の好適な方法で測定されてもよい。例えば、ＲＮＡ発現は、特定の構造の酵素開裂によって検出される（ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイ、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、第６，０９０，５４３号、第６，００１，５６７号、第５，９８５，５５７号、及び第５，９９４，０６９号を参照のこと。各々、参照としてここに組み込む）。ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）アッセイは、オリゴヌクレオチドプローブを重複させる交配によって形成された錯体を開裂するために構造特定酵素を使用することにより、特定核酸（例えば、ＲＮＡ）配列を検出する。他の実施形態において、ＲＮＡ（又は、対応するｃＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドプローブへの交配によって検出される。交配及び検出のための種々の技術を使用した種々の交配アッセイが利用可能である（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ。例えば、米国特許第５，９６２，２３３号及び第５，５３８，８４８号を参照のこと。各々、参照としてここに組み込む）。また、ＲＮＡの発現を検出するために、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、競合テンプレート法の規格化混合物による定量的逆転写酵素ＰＣＲは、米国特許第５，６３９，６０６号、第５，６４３，７６５号、及び第５，８７６，９７８号（各々、参照としてここに組み込む）に記載されている。
【０１５３】
[00191]  蛋白質、炭水化物、酵素、ペプチド、ホルモン、受容体を発現又は生成する細胞ライン、抗体を生成する他の細胞ライン、遺伝子操作細胞、及び／又は活性化細胞を含むが、これらに限定されない任意の種別の生物学的細胞を分離するために、本開示の検出を使用してもよい。さらに、表面受容体蛋白質、酵素生成、及びペプチド生成を含むが、これに限定されない種々の生物学的活性のスクリーニングを行うために、本開示を使用してもよい。さらに、所望の生物学的活性に対する検査薬の効果を判定する種々の検査薬をスクリーニングするために、本開示を使用してもよい。分離及びスクリーニングしたい他の種別の細胞、検出したい他の種別の生物学的活性、及びスクリーニングする特定検査薬は、当業者によって容易に認識されるであろう。生物学的細胞は、形質転換生物学的細胞である。細胞の形質転換は、任意の周知の方法により、例えば、プラスミド又はウィルス等、任意の周知のベクターを使用して発生し得る。生物学的細胞は、微生物、菌類、哺乳類、昆虫、又は動物の細胞であってもよい。微生物細胞は、大腸菌細胞等、細菌性細胞であってもよい。一実施形態において、動物細胞には、希少生化学化合物が含まれる。一実施形態において、希少生化学化合物は、蛋白質、ペプチド、ホルモン、核酸、炭水化物の群より選択される。他の実施形態において、生物学的細胞は、蛍光蛋白質を生成及び／又は発現する。さらに他の実施形態において、生物学的細胞は、蛍光蛋白質に融合される蛋白質を生成する（例えば、ＧＦＰ）。
【０１５４】
[00192]  従って、本開示の実施形態は、関心対象の分子を生成するための関心対象の表現型を有する細胞に対する複数の遺伝子型を有する細胞ライブラリをスクリーニングする方法を対象とする。この方法には、マイクロキャビティアレイに細胞ライブラリを投入することと、関心対象の分子の生成を可能にする条件下で、アレイをインキュベートすることとを含む。アレイは、関心対象の表現型を有する細胞を含む１つ以上のキャビティを特定するために、アレイを撮像することができる。キャビティの内容物は、キャビティに関連付けられた放射線吸収材料にパルス化ダイオードレーザから電磁放射線を方向付けることによって、抽出されてもよい。
【０１５５】
[00193]  いくつかの実施形態において、試料液体における細胞の数は、結果として、各キャビティにおける多様な細胞の個体群を生じる。特定キャビティの内容物の抽出及び増殖後、結果として得られた個体群は、関心対象の特定細胞を特定するための次のステップでスクリーニングすることができる。図４及び図５は、アレイのキャビティの抽出前後における、例としてのアレイの係合及び明視野像の前後を示している。白色矢印は、同一のキャビティの抽出前及び抽出後を示している。
【０１５６】
[00194]  図５に示される通り、キャビティの抽出物は、結果として、単一キャビティからの２つの関心対象細胞を生じた。他の実施形態において、試料液体における細胞の数は、アレイのキャビティの数未満であり、結果として、各キャビティに１つ以下の細胞のみを投入することとなる。従って、キャビティ毎に２つ以上の細胞を備える、初期スクリーニングで抽出されたキャビティの内容物から、キャビティの内容物の増殖に続くキャビティ内容物の次のスクリーニングと、アレイ上への低濃度投入とにより、多様な細胞の個体群から関心対象の表現型を有する単一の細胞を特定することができる。
【０１５７】
[00195]  また、ライブラリは、（１）関心対象の表現型に対する遺伝子を備えた細胞からのＤＮＡ抽出、（２）遺伝子にランダム突然変異を導入する条件下におけるＤＮＡの増加、（３）増加されたＤＮＡを備える第２世代細胞ライブラリの生成、及び（４）第２世代細胞ライブラリ上で特定されたステップの反復で強化されてもよい。ライブラリの初期スクリーニング中、又は強化プロセス中、複数の細胞が、任意の特定のキャピラリに添加されてもよい。細胞内容物は、抽出され、本開示の方法によってさらに解析又は強化されてもよい。最終的に、キャビティ毎に１つの細胞を有することにより、特定遺伝子型の特定を可能にする。抽出することは、関心対象の表現型を有する蛋白質を生成する細胞を有するキャビティに、電磁放射線を個別に方向付けることであってもよく、この場合、キャビティに電磁放射線を方向付けることにより、抽出に先立って液体を加熱することはない。
【０１５８】
[00196]  本発明の種々の態様において、関心対象の表現型は、細胞表面結合剤である。他の態様において、関心対象の表現型は、関心対象の吸収又は放射の強度と、関心対象の吸収又は放射のスペクトルと、関心対象のストークスシフトとのうちの少なくとも１つを有する蛍光蛋白質である。さらに、関心対象の表現型は、酵素活性を有する蛋白質、酵素活性の阻害が欠如した蛋白質、及び酵素に対する阻害剤の存在下で活性を有する蛋白質を生成したものであってもよい。
【０１５９】
[00197]  本開示のある実施形態は、１つ以上の生物学的要素を成長させる方法及び装置を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、成長に好適な培養培地におけるアレイのマイクロキャビティに導入される。そして、アレイは、例えば、好適な温度、湿度、及び周辺気体組成にて、細胞の成長をサポートする条件下でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、マイクロキャビティアレイの表面は、アレイに添加される細胞の成長をサポートするように取り扱われる。
【０１６０】
[00198]  粒子
[00199]  種々の実施形態において、アレイのキャビティには、キャビティ内容物の抽出を促進する結合反応をサポートする固形面及び／又はエネルギー吸収材料として、粒子を投入する。本明細書に開示の方法によると、好適な粒子は、容易に市販のものを入手可能であり、広範に亘る粒子を使用することができる。種々の実施形態は、粒子は、部分的又は完全に不透明である。ある実施形態において、粒子は、電磁放射線を吸収し、例えば、粒子は、少なくとも１０％、例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の吸光効率を有する。
【０１６１】
[00200]  種々の実施形態において、粒子のサイズは、ナノスケールから、キャビティの断面の約３分の１のサイズまでの範囲である。例えば、マイクロキャビティの直径が約２０ミクロンである時、粒子の直径は、約０．０１〜７ミクロンとすることができる。他の実施形態において、粒子直径は、使用キャビティのサイズに応じて、約０．０１ミクロン〜約５０ミクロンの範囲である。種々の実施形態において、粒子は、約０．１〜１５ミクロン、約０．５〜１０ミクロン、及び約１〜約５ミクロンのサイズの範囲である。特定の実施形態において、粒子は、金属又は炭素を備える。好適な金属の非限定的な例として、金、銀、及び同が含まれる。当業者に周知の通り、結合アッセイ及び検出アッセイにおける使用に他の金属材料が好適である。
【０１６２】
[00201]  一実施形態において、粒子は、例えば、参照としてここに組み込む米国特許出願第２０１４／０１１６９０号に記載のマイクロキャビティのメニスカス等、各反応キャビティの表面に粒子を蓄積するために磁力を使用することができるように、磁性を有する。  
【０１６３】
[00202]  本開示のいくつかの態様において、粒子の表面化学は、当業者に周知の通り、試料要素への結合をもたらすように機能化されてもよい。例えば、粒子は、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴ（ｄＴ）、蛋白質Ａ＆Ｇ、タグ付蛋白質、及び／又はその他任意のリンカポリペプチドと結合される。膨大な数の適用例において、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用の非常に高い結合親和性が利用される。ストレプトアビジンでコーティングした粒子は、ビオチン化拡散、抗体、又はその他のビオチン化リガンド及び対象を結合させるであろう。ビオチン化抗原は、検体に対するスクリーニングを行うために粒子に付着可能な試薬の有用な例でもある。特定の実施形態において、粒子は、ＤＹＡＮＡＢＥＡＤ（登録商標）粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）である。例えば、オリゴ（ｄＴ）、蛋白質Ａ＆Ｇ、タグ付蛋白質（Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ）、二次抗体、及び／又はストレプトアビジンである（製品番号１１２−０５Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）。
【０１６４】
[00203]  いくつかの実施形態において、粒子に作用する磁力を独立に制御するために、異なる磁気誘電率を有する粒子を使用することができる。他の実施形態において、各キャビティにおいて行われるアッセイの増加能力を拡張するために、粒子の他の特性を使用することができる。試料への添加時、粒子は、所望の対象（細胞、病原性微生物、核酸、ペプチド、蛋白質、又は蛋白質錯体等）に結合する。この相互作用は、粒子の表面へのリガンドの特性の親和性に依存する。あるいは、酵素のための基板に結合された粒子を試料に添加することができ、この場合、試料における酵素／検体は、蛍光に対する基板の能力を低減するか、又は蛍光される基板を活性化する（例えば、基板の酵素媒介開裂）。
【０１６５】
[00204]  他の実施形態では、異なる形状、密度、サイズ、電荷、磁気誘電率、又は光学コーティングを有する磁気粒子を使用する。これにより、異なるプローブ（すなわち、結合パートナ）を異なる粒子上に置き、これらの粒子は、磁界又はその他の力をいつ、いかにして付与するかを調整することによって、別々に精査される。サイズ、形状、及び密度によって粒子を分離し、各キャビティにおいて実行されるアッセイの増加能力を拡大するために、沈降率も使用することができる。一例としての実施形態において、粒子は、約１μｍ、例えば、約１００ｎｍ〜約１０μｍの平均直径を備えた超常磁性酸化鉄ドープマイクロビーズを備える。
【０１６６】
[00205]  ある実施形態において、キャビティの内容物を混合するために、粒子を使用する。例えば、磁気粒子を、インキュベートステップ中、間欠的磁界に晒すか、又はこれと交互に発生させる。粒子の移動及び沈降は、結果として、反応キャビティの内容物の混合を生じる。
【０１６７】
[00206]  検出される、例えば、マーカ等の分子の形態に関する必要選択性を備えた任意の好適な結合パートナを使用することができる。例えば、マーカ等の分子がいくつかの異なる形態を有する場合、結合パートナの種々の特異性が可能となる。好適な結合パートナは、当分野で既知であり、抗体、アプタマー、レクチン、及び受容体を含む。有用且つ多目的な種別の結合パートナは、抗体である。
【０１６８】
[00207]  本開示の試料において検体を検出する方法は、小孔毎に２つ以上の異なる抗原の同時検査を行うことを可能にする。従って、いくつかの実施形態において、同一の小孔内で、同時にポジティブスクリーニング及びネガティブスクリーニングを発生させることができる。このスクリーニング設計は、初期ヒットの選択制を改善する。特定の実施形態において、試験される第２の抗原を、コントロール抗原とすることができる。コントロール抗原の使用は、アレイにおける種々のキャビティに亘る生物学的要素濃度を正規化するのに有用である。非限定的な例としては、関心対象の検体に特定の第１の抗原と、Ｎ−又はＣ−末端エピトープタグ等、すべての蛋白質に対して非特定的な第２の抗原とを使用することであろう。従って、関心対象のキャビティの結果は、シグナルを合計蛋白質濃度に比較することにより、定量化することができる。
【０１６９】
[00208]  いくつかの実施形態において、第２の抗原が、第１の粒子とは異なる第２の粒子に関連付けられる。粒子は、以下の特性、すなわち、形状、サイズ、密度、磁気誘電率、電荷、及び光学コーティングの少なくとも１つにより、変動し得る。従って、第２のラベルは、試料における第２の検体の有無の結果として、第２の粒子に関連付けられることができ、後述の通り、原動力を使用して処理される。
【０１７０】
[00209]  他の実施形態において、粒子は、非特定的に試料要素を結合させる。例えば、粒子は、試料におけるすべての蛋白質を非特定的に結合させるように機能化することができ、これにより、アレイ内の試料間の蛋白質内容物の正規化を可能とする。
【０１７１】
[00210]  抗体
[00211]  本明細書において使用される「抗体」という用語は、広義の用語であり、その通常の意味で使用され、天然発生抗体と、例えば、単鎖抗体、キメラ、二官能性、及びヒト化抗体を含む非天然発生抗体、並びにそれらの抗原−結合断片を含むものをいうが、これに限定されるものでない。抗体が上げられるエピトープ又は分子の領域の選択により、存在する場合には分子の種々の形態について、又はそのすべてについて（例えば、分子の全部、又は略全部）の選択性を判定することが理解されるであろう。
【０１７２】
[00212]  抗体を生成する方法は、十分に確立されている。当業者は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ―に記載の通り、抗体の生成には、多くの手続きが利用可能であることを認識するであろう。当業者は、抗体を模倣する結合断片又はＦａｂ断片が種々の手続きによって遺伝情報から調製可能であることを理解するであろう（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．，ｅｄ．）、１９９５年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９、３９１４〜３９２０（１９９２年））。例えば、蛋白質等の分子へのモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体とマーカも、市販のものが入手可能である（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス；ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．、フィンランド共和国トゥルク；Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州ウェストチェスター；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州コンコード；ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，カリフォルニア州エメリービル）。
【０１７３】
[00213]  いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクロナール抗体である。他の実施形態において、抗体は、モノクロナール抗体である。
【０１７４】
[00214]  本開示の実施形態において、例えば、捕捉抗体と検出抗体の対等、捕捉結合パートナと検出結合パートナの対を使用することができる。そこで、いくつかの実施形態においては、累積アッセイプロトコルが使用され、この場合は通常、例えば、２つの抗体等、２つの結合パートナが使用される。１つの結合パートナは捕捉パートナであり、大抵粒子状で固定化され、他方の結合パートナは検出結合パートナであり、通常検出可能なラベルを付着される。このような抗体の対は、カリフォルニア州エメリービルのＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ等、いくつかの市販のソースから入手可能である。抗体の対は、当分野で周知の方法によっても設計及び調製可能である。特定の実施形態において、抗体は、ビオチン化されるか、又はビオチンラベル化される。
【０１７５】
[00215]  一実施形態において、関心対象の検体のすべての構成員を非特定的に結合させる第２の撮像要素がある。従って、キャビティから小孔への蛍光の量を正規化するために、このシグナルを読むことができる。一例として、Ｎ−又はＣ−末端エピトープタグにてすべての蛋白質を結合する抗体がある。
【０１７６】
[00216]  ラベル
[00217]  粒子の混合物中での検出又は区別を可能にするために結合パートナにラベル付けを行うためにいくつかのストラテジを使用することができる。ラベルは、非特定的又は特定の相互作用を利用する方法を含む、任意の既知の手段によって付着されてもよい。また、ラベル付けは、結合パートナに対して直接的に、又はこれを通じて、達成することができる。
【０１７７】
[00218]  部分からの放射、例えば、蛍光は、本明細書に記載の通り、検出器を使用した検出を行うのに十分でなければならない。通常、本開示の組成及び方法は、部分の励起波長で電磁放射線源によって刺激された時、電磁放射線を放出することができる部分等、蛍光部分を高度に利用する。いくつかの部分が、本開示の組成及び方法に好適である。
【０１７８】
[00219]  本開示において、電磁放射線以外のエネルギーによって活性化可能なラベルも有用である。このようなラベルは、例えば、電気、熱、又は化学反応（例えば、化学発光ラベル）によって活性化することができる。また、多数の酵素活性ラベルは、当業者に周知である。
【０１７９】
[00220]  通常、部分の蛍光は、検出の所望の限度、精度、及びアッセイの正確さに必要な整合性とともに、その部分が本開示の検出器における背景レベルを超えて検出可能となるのに十分な量子効率と光退色の不足との組み合わせを含む。
【０１８０】
[00221]  さらに、この部分は、選択したアッセイにおける使用と整合性のある特性を有する。いくつかの実施形態において、アッセイは、免疫測定であり、この場合、蛍光部分が抗体に付着される。またこの部分は、他の抗体又は蛋白質と凝集することのないような特性を有さなければならず、あるいは、要求されるアッセイの精度と正確さへの整合性と同程度の凝集を経験する。いくつかの実施形態において、蛍光部分染料分子は、本開示の解析器及びシステム（例えば、関心対象の蛋白質の析出、又はこの部分が付着された蛋白質の析出を生じない）を使用して解析されてもよいように、１）高吸収係数、２）高量子収率、３）高光安定性（低光退色性）、及び４）関心対象の分子（例えば、蛋白質）のラベル付けとの適合性の組み合わせを有する。
【０１８１】
[00222]  蛍光部分は、単一の実体（例えば、量子ドット又は蛍光分子）を備えるか、又は複数の実体（例えば、複数の蛍光分子）を備えてもよい。「部分」という用語が本明細書において使用される時、例えば、複数の蛍光染料分子等の蛍光実体の群をいい、個々の実体は、別々に結合パートナに付着されてもよく、又は、それらの実体が群として検出される蛍光を十分に提供する限り、ともに付着されてもよい。
【０１８２】
[00223]  いくつかの実施形態において、蛍光染料分子は、インドリウム環の３つの炭素の置換基が科学的反応基又は結合基板を含む、少なくとも１つの置換インドリウム環系を備える。例として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ分子が含まれる。
【０１８３】
[00224]  いくつかの実施形態において、ラベルは、２つの異なるＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等、第１種別のラベルと、第２種別のラベルとを備え、この場合、第１種別の染料分子と第２種別の染料分子とは、異なる放射スペクトルを有する。
【０１８４】
[00225]  蛍光部分に使用するのに有用な蛍光実体の非包括的な例として、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｂ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３、Ａｔｔｏ５９０、及びＱＤｏｔ６０５が含まれる。
【０１８５】
[00226]  ラベルは、吸収、共有結合、ビオチン／ストレプトアビジン、又はその他の結合対を含む、当分野で既知の任意の方法で、粒子又は結合パートナに付着されてもよい。また、ラベルは、リンカを通じて付着されてもよい。いくつかの実施形態において、ラベルは、検体によって開裂されることにより、ラベルを粒子から解放する。あるいは、検体は、リンカの開裂を防いでもよい。
【０１８６】
実施例
[00227]  実施例１：マイクロアレイ単一細胞解析及びレーザ抽出
[00228]  本開示の一態様のマイクロアレイ（本明細書中、「μＳＣＡＬＥ」と称する）に関する全体的概念及びワークフローを、図６Ａ〜図６Ｄにおいて説明する。図６Ａは、プラットフォームワークフローを示している。
１）バクテリア又は酵母細胞に発現した蛋白質異型のライブラリを、不透明磁気ビーズと混合する。
２）混合物を、マイクロキャビティ内に平均単一細胞占有率を生じるような濃度で、アレイ内にピペット注入する。読み出された蛍光を使用して、細胞成長を伴うか、又は伴うことなく、種々の生化学アッセイを実施する。
３）蛍光顕微鏡を介してアレイを撮像する。
４）各マイクロキャビティの蛍光強度を定量化し、レーザベースの抽出法により、単一細胞又はバルクプールとして、所望のクローンをアレイから分離する。
５）抽出した細胞を液体中又は固形培地上で培養する。
６）細胞を溶解し、追加の進化ラウンドのための新たなライブラリの特性化及び／又は生成のために、プラスミドを回復させる。図６Ｂは、レーザベースの抽出法を表示したものである。関心対象のマイクロキャビティを抽出するために、レーザを配置及びパルス化し、マイクロキャビティの表面張力を破壊し、その内容物をアレイ下の捕捉面上に出す。図６Ｃは、蛍光粒子を投入した２つの近隣マイクロキャビティの抽出を示している。左側のパネルでは、抽出される第１のマイクロキャビティ及び第２のマイクロキャビティの輪郭が、各々、濃い円と薄い円とで示されている。第２のパネルは、近隣のマイクロキャビティを妨げることなく、第１のマイクロキャビティの抽出に成功した様子を実証している（濃い矢印で示されている）。第３のパネルは、アレイ下の捕捉面上に分離した粒子を示している。最後のパネルは、第２のマイクロキャビティの抽出に成功した様子を実証している（薄い矢印で示されている）。図６Ｄは、μＳＣＡＬＥプラットフォームにおいて実施される３つの多様なアッセイの表示したものである。左側は、蛍光抗体で事前染料された酵母表面表示ｓｃＦｖライブラリの結合相互作用を示している。中央は、マイクロキャビティ内で培養した大腸菌クローンに発現される蛍光蛋白質異型を示している。右側は、基板を蛍光生成物に転換する酵母表面表示酵素異型のライブラリにおけるリアルタイム反応速度測定を示している。高アスペクト比（１ｍｍの厚さ、１０μｍ又は２０μｍの直径）の数百万の空間的に分断して作成されたマイクロキャビティの高密度ガラス基板アレイに、磁気粒子を混合した細胞懸濁液を投入する。この懸濁液は、アレイの頂上部に付与され、キャピラリ作用を通じてマイクロキャビティに充填される。マイクロキャビティアレイは、底部ではシールされない。液体試料は、表面張力によって定位置で保持される。充填プロセスの受動的性質は、結果として、アレイ全体に亘る均一なメニスカスレベルを生じる。他の効果の中でも、この均一性は、投入細胞の重量沈降とともに、オートフォーカスの必要性なく、撮像焦点面の確立を簡易化する。
【０１８７】
[00229]  各マイクロキャビティには、図１に示される通り、ポアソン分布に従って単一細胞又は粒子の投入が可能である。蛍光ビーズは、キャビティ毎に３個、１個、及び１／３個（λ＝３、１、１／３）の粒子の平均に対応する３つの濃度でアレイ内に投入した。約２５，０００個のキャビティの内容物を計数し、各条件に対する累積分布関数（ＣＤＦ）を赤線でプロットしている。λ＝０．７９、０．４３、及び０．１５でのポアソン分布に合う最大尤度は黒線でデータ上に重ね合わせている。分布は、ポアソン統計に密に従っており、観察及び予期される平均は、２〜３倍異なる。この差は、マイクロキャビティのアスペクト比が高いために生じるようである。いくつかの粒子は、撮像面内に完全に進行しなくてもよい。
【０１８８】
[00230]  パルス化ＵＶレーザは、最も近隣にあるものに対して影響を与えることなく、単一のマイクロキャビティ内の表面張力を破壊するために、磁気粒子と相互作用する（図６Ｂ及び図６Ｃ）。レーザ抽出は、マイクロキャビティの内容物をアレイ下方の捕捉面上に出し、これが、抽出を確認し、追加の形態学研究を実施するために、撮像可能である。抽出技術を改良するために、レーザ強度を変動し、図７に示される通り、完全な抽出効率を達成した条件範囲を確立するために、磁気ビーズ濃度を滴定する。各抽出に対して、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）顕微鏡のＴｒｉｔｏｎ切断レーザは、レーザメーカによって設定された最大電流の５％〜２０％の範囲の異なるレーザパワーの範囲で、１０ｍｓｅｃ、パルス化した。各条件について３０回の抽出を実施した。エラーバーは、各条件についての２項サンプリング誤差を表す。
【０１８９】
[00231]  続く実験で抽出された細胞の生存性を表４に示す。
【０１９０】
【表３】
2018510624.tif 000013
【０１９１】
[00232]  アレイのキャビティ内で種々の生化学アッセイを実施するために、方法が開発されてもよい。例えば、関心対象の蛋白質を発現する細胞をマイクロキャビティアレイに投入し、数日間、時間分解実験測定又は細胞増殖を許容する湿潤環境内にこれを維持してもよい。
【０１９２】
[00233]  定量的広視野顕微鏡について確立されたガイドラインに従い、アレイから検出された蛍光シグナルにおけるキャピラリ間変動性を測定し、他のハイスループット方法に匹敵するものであることを見出した。μＳＣＡＬＥとＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリの双方で、蛍光ビーズ（Ｓｐｈｅｒｏ、ＦＰ−４０５２−２、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を解析した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ｎ＝１０，０００）。μＳＣＡＬＥ測定のためには、磁気粒子を伴うことなく、蛍光ビーズを２０μｍのマイクロキャビティアレイに投入した。双方の個体群を、各分布の平均で正規化した。フローサイトメトリ及びμＳＣＡＬＥで解析したビーズ蛍光の変動係数は、各々、０．１５及び０．１４であった。マイクロキャビティ全体をカバーするため、アレイは、毎秒約１０，０００個のマイクロキャビティの速度で、複数位置及び複数波長で撮像する。標準画像処理機能を使用して、結果として得られた画像を解析する。細胞は高解像度で撮像されるため、見込みのある候補が、定量化測定基準（サイズ、円形度、及び蛍光強度）又は目視検査により、細胞破片及び他の疑似蛍光シグナルから区別可能である。
【０１９３】
[00234]  落射照明構成のバンドパスフィルタ高強度アークランプを使用して照明された高開口数顕微鏡対物を使用し、マイクロキャビティを撮像する。蛍光放射は、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用したハイパスフィルタを通じて検出される。複数の波長で、毎秒約１０，０００マイクロキャビティの割合で、蛍光放射を撮像及び解析するために、アルゴリズムを開発した。そして、本明細書に記載の通り、レーザ抽出（単一細胞抽出と称する）により、関心対象の単一細胞を回収することができ、又は、抽出される細胞個体群を指定するユーザ選択指標を使用する、バルク選択法（プール抽出と称する）を採用することができる。
【０１９４】
[00235]  蛍光強度に対する微小粒子の影響。磁気微小粒子は、不透明であってもよく、細胞懸濁液に茶色っぽい色を与えるものであってもよい。蛍光強度及び明視野撮像への磁気ビーズの影響を判定するために、抽出に使用される磁気粒子の存在下、又はこの存在を伴うことなく、μＳＣＡＬＥに対して蛍光ビーズ（Ｓｐｈｅｒｏ、ＦＰ−４０５２−２、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を解析した（ｎ＝１０，０００）。図８に示される通り、パネルａでは、正規化された「ビーズ有」個体群の平均は、０．８３であり、磁気ビーズが部分的にマイクロキャビティの蛍光強度を遮蔽することを実証している。磁気粒子を伴う場合と伴わない場合の、蛍光ビーズ分布の変動係数は、各々、０．２と０．１４であり、抽出のための磁気ビーズの使用が、μＳＣＡＬＥにおける蛍光測定の変動性を著しく増加させないことを実証している。図８のパネルｂは、磁気ビーズの存在が蛍光強度を低減し、明視野像を暗くすることを示している。これらの微小粒子の添加は、限定的な程度、蛍光シグナルを均一に遮蔽し、マイクロキャビティの内容物の明視野撮像を防ぐ。
【０１９５】
[00236]  図９は、自動化倒立蛍光顕微鏡と、ＵＶレーザ又はダイオードレーザ等の電磁放射線源の周囲に組み込まれた一例としてのプラットフォームを示している。一例としての機器は、明視野撮像能力と蛍光撮像能力の双方を有する。３軸ステージにより、所望のマイクロキャビティによるレーザの迅速なアラインメントを可能にする。適切な蛍光照明システムとレーザ源とを備えた広範に亘る自動化倒立顕微鏡で、同様の構成を再度作成することができる。試料（黒色矢印で示されるビーズによって付与された茶色）が、マイクロキャビティアレイに投入され、ホルダ内に載置された後、機器を使用して解析される。試料回収のためのホルダの下方に、抽出カバースリップを載置する。
【０１９６】
[00237]  マイクロアレイの実験は、マイクロキャビティスクリーニング適用を可能にするハードウェア及びソフトウェアの修正で適合化されたレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）顕微鏡で実施してもよい。一実施形態において、このシステムは、モータ化したステージとＴｒｉｔｏｎ  ＵＶレーザ（ダイオード励起Ｑ切替Ｎｄ：ＹＬＦレーザ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）とを備えた倒立蛍光顕微鏡を含む。レーザシステムは、３４９ｎｍの波長、５μｍの集束ビーム直径、及び２０ｎｓのパルス持続時間を使用する。蛍光撮像には、ＸＦ４１０ＱＭＡＸ  ＦＩＴＣとＸＦ４０６ＱＭＡＸ赤色フィルタセット（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）とともに、Ｘ−ＣＩＴＥ（登録商標）１２０照明システム（ＥＸＦＯ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）が使用される。すべての画像は、ＯＲＣＡ−Ｒ２冷却ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）によって２０×Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒｉｔｅ対物（開口数：０．４５、ＣＦＩ、ＷＤ：７．４、Ｎｉｋｏｎ）で取得した。
【０１９７】
[00238]  ＬＣＭ顕微鏡とレーザを制御する、マイクロキャビティの自動化画像定量化のためのソフトウェアを開発した。このソフトウェアスーツは、アレイ上を自動走査し、すべてのマイクロキャビティのマルチカラー蛍光画像及び明視野画像を取得する。各マイクロキャビティを定量化するために、選択されたカラー画像を閾値化し、バイナリマスクを精製するＯｔｓｕ法を使用して、画像分割を実施する。各関心対象領域における蛍光強度を定量化するために、バイナリマスクを使用した。所望のマイクロキャビティを一旦特定すると、ソフトウェアは、ユーザに、２つの異なる様式、すなわち、単一細胞選別とプール選別とで細胞を検索させる。単一細胞選別では、ソフトウェアは、選択されたマイクロキャビティに戻り、ユーザに、さらなる実験を実施させ、滅菌捕捉面上へ所望の細胞を抽出させ、結果として、隔離クローナル個体群を生じる。プール選別では、選別ゲートを確立し、ソフトウェアは、単一捕捉面上に任意の特定マイクロキャビティの内容物を自動抽出し、濃縮細胞の個体群を生成する。
【０１９８】
[00239]  マイクロキャビティアレイの調製、投入、及び抽出。ＩＮＣＯＭ，Ｉｎｃ．から利用可能なマイクロキャビティアレイ（１０μｍ及び２０μｍのキャビティ直径、１ｍｍ厚さ）をエタノールで滅菌して乾燥した。アレイの投入側を、親水性面を生成するために、１分間、テスラコイル（ＢＤ−２０ＡＣ、Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）でコロナ処理したが、これは、投入を促進するものである。投入側には、一片の透明パッケージテープをキャビティの開口の頂上部に付与し、平坦化した。アレイを反転し、ＲＡＩＮ−Ｘ（登録商標）撥水剤を、ウェットティッシュに少量の撥水剤を付与し、１分間空気乾燥を施すことにより、使い捨てウェットティッシュに付与した。その後、アレイの表面上のキャビティの開口を研磨するために、そのウェットティッシュを使用した。接着テープを除去し、アレイの投入側にテスラ処理を再度施した。
【０１９９】
[00240]  単一細胞を含むウェルの最小分画を達成するために、ポアソン統計（２０μｍアレイに〜３，２００個／μＬの細胞と、１０μｍアレイに〜１２，８００個／μＬの細胞）による投入に先立って、細胞懸濁液を希釈した。各蛋白質設計の適用例に対する特定の投入条件を、次の実施例において説明する。簡単に述べると、懸濁液を磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３７００２Ｄ）と混合して、最終ビーズ濃度を１０ｍｇ／ｍｌにし、アレイにピペット注入した。蒸発を防ぐために、１％重量／体積アガロースの〜２ｍｍスラブをアレイに重複させた。所望のキャビティの内容物を抽出するために、ＬＣＭシステムのＴｒｉｔｏｎ  ＵＶレーザを使用した。図７に示される通り、単一パルスの抽出効率が１００％となるように、レーザパワーを調整した。ここに述べる一例としての実施形態において、抽出パラメータは、以下を備える。すなわち、レーザが１８±２ｍｓ（ｎ＝５回の測定）、動作して、約１００μＪの合計エネルギーにより、２．５ｋＨｚでパルスのトレインを伝播する。キャビティ内容物をガラスカバースリップ上に抽出した後、抽出細胞を繁殖させるために、酵母又は細菌性の成長培地（液体培地又は寒天プレート）に載置した。各実験後、強い流れの蒸留水で内容物を除去することにより、アレイを洗浄した後、１ＭのＮａＯＨで簡単に超音波処理し、１００％エタノール中で保管した。
【０２００】
[00241]  実施例２：蛋白質結合相互作用の高スループットスクリーニング
[00242]  Ａｘｌ  Ｉｇｌモックライブラリスクリーニング。ＤＮＡ符号化ヒトＡｘｌ  Ｉｇｌ（アミノ酸Ａｌａｉ９−Ｐｒｏｉ３ｉ）及び非結合Ａｌｘ異型（Ｅ５９Ｒ、Ｔ７７Ｒ）を、Ｎｈｅｌ制限部位とＢａｍＨｉ制限部位の間でｐＣＴ酵母表示プラスミドｉにクローン化した（Ｋａｒｉｏｌｉｓ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１〜１０（２０１４年））。プラスミドＤＮＡは、酵母表面表示研究のためのエレクトロポレーションにより、サッカロマイセス・セレビシエ菌株ＥＢＹ１００に形質転換した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞に可溶Ｇａｓ６を組み換え発現し、前述の通り、生成した（Ｋａｒｉｏｌｉｓ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１〜１０（２０１４年））。酵母表面表示ナイーブｓｃＦｖライブラリ（〜７×１０８個の異型）を前述した（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｖａｎ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．１１３１、１５１〜１８１（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０１４年）。前述の通り、ｐＣＴ表示プラスミドを内在したすべての酵母細胞を、選択的培地で成長させ、誘導した。（Ｃｈａｏ，Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１、７５５〜６８（２００６年））。
【０２０１】
[00243]  Ａｘｌ  Ｉｇｌモックライブラリについては、野生型非結合Ａｘｌ異型を表示する誘導酵母細胞を、野生型：非結合が１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、及び１：１００，０００という規定の細胞比率で混合した。約（３−６×１０６）個の酵母細胞（モックライブラリによる）を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中、１ｎＭの精製成長停止特異６（Ｇａｓ６）で、６時間、室温にてインキュベートした。Ｇａｓ６によるインキュベート後、酵母を洗浄し、ニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（２５０；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２８１）の１：２５０希釈液を含むＰＢＳＡ中、４℃で４５分間、再懸濁した。Ｇａｓ６結合を検出するために、酵母を洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ  ＩｇＧ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ５５５（Ａｎａｓｐｅｃ、６１２５０−Ｈ５５５）の１：１００希釈液を含むＰＢＳＡ中、４℃で４５分間、再懸濁した。結合シグナルを強化するために、酵母を洗浄し、ＰＢＳＡ中で再懸濁を行い、次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ５５５（Ａｎａｓｐｅｃ、ＡＳ−２８１７５−０５−Ｈ５５５）の１：１００希釈液を、４℃で３０分間、添加した。最後に、ｃ−Ｍｙｃ発現を検出するために、酵母を洗浄し、ヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｌ  １０３９）の１：１００希釈液を含むＰＢＳＡ中、４℃で３０分間、再懸濁した。ラベル付酵母を〜１２，８００個／μＬまで希釈し、１０μｍアレイ上に投入し、４７５／４０ｎｍ励起／５１０ｎｍロングパス放射フィルタでＧａｓ６結合について解析を行い、５２５／４５ｎｍ励起／５６５ｎｍロングパス放射フィルタでｃ−Ｍｙｃ細胞表面発現について解析を行った。単一細胞選別により、野生型酵母又は非結合異型を抽出し、ＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート上で培養した。抽出された細胞を特定するために、Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを回収し、ＰＣＲで増殖させ、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ）で配列決定した。
【０２０２】
[00244]  表５は、野生型（ＷＴ）と非結合Ａｘｌクローンからなるモックライブラリからの濃縮比を示している。選別効率を定量化するために、一連のモックライブラリ抽出を実施した。濃縮比は、下記のように規定される。
【０２０３】
【数９】
2018510624.tif 000014
【０２０４】
[00244]  式中、ηは濃縮比であり、Ｎ＋，０は、野生型細胞の初期数であり、Ｎ＋，１は、選別後の野生型細胞の数であり、Ｎ−，０及びＮ−，１は、各々、非結合細胞の相当値である。
【０２０５】
【表４】
2018510624.tif 000015
【０２０６】
[00245]  μＳＣＡＬＥは、その表面上に野生型又は非結合Ａｘｌ受容体ドメインのいずれかを表示する酵母を区別した（Ｋａｒｉｏｌｉｓ，Ｍ．Ｓ．らのＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０、９７７〜８３（２０１４年））。図１０Ａは、２つのパラメータの散布図（左側）であり、各ドットは、マイクロキャビティと、野生型Ａｘｌ個体群（Ｒ）と非結合Ａｘｌ異型個体群（Ｂ）の顕微鏡画像（右側）を表している。野生型：非結合クローンが１：１０〜１：１００，０００に及ぶ範囲の酵母表示Ａｘｌ異型のモックライブラリを作成し、スクリーニングした。Ａｘｌ発現（Ｃ末端ｃ−Ｍｙｃエピトープタグに対する抗体によって測定）とＧａｓ６結合（Ｇａｓ６上のヘキサヒスチジンに対する抗体を使用して測定）とに対する２色蛍光解析により、酵母を解析した。各モックライブラリについて、野生型Ａｘｌ又は非結合Ａｘｌ異型を発現する細胞に対して予測された蛍光強度を示すいくつかの個々の酵母細胞をアレイから抽出し、培養して、ＤＮＡ回収及び配列決定により、査定した。図１０Ｂは、代表的モックライブラリスクリーニング（野生型：非結合異型＝１：１０，０００）からの散布図を示している。野生型Ａｘｌ（灰色輪郭のドット）及び非結合Ａｘｌ異型（黒色ドット）として、抽出したキャビティを特定した。図１１は、野生型：非結合が１：１（ａ）、１：１０（ｂ）、１：１００（ｃ）、１：１，０００（ｄ）、１：１０，０００（ｅ）、及び１：１００，０００（ｆ）で表されるＡｘｌの比率を示している。抽出されたキャビティは、赤色ドット（野生型として特定）と青色ドット（非結合突然変異体として特定）とで特定した。受容体−結合（野生型）抽出物は、プロットのゲート領域の内側に収まっており、１つを除いてすべての非結合突然変異体は、ゲート領域の外側に収まっている（単一ゲート非バインダは、左下パネルにおいて矢印で示されている（野生型：非結合の割合が１：１０００）。
【０２０７】
[00246]  ６個のモックライブラリに亘って、３９個中３７個の抽出物が、野生型Ａｘｌとして正確に特定され、ほとんどの厳しい条件下（表４）で１００，００１の濃縮比であり、乳化ベーススクリーニング法に好適に匹敵する値を達成している（例えば、Ｚｉｎｃｈｅｎｋｏ，Ａ．らによるＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８６、２５２６〜３３（２０１４年）；Ｆｉｓｃｈｌｅｃｈｎｅｒ，Ｍ．らによるＮａｔ．Ｃｈｅｍ．６、７９１〜７９６（２０１４年）を参照のこと）。
【０２０８】
[00247]  さらに、非バインダとして選択された１９個すべての抽出物を非結合Ａｘｌ異型として特定した。そこで、これらのモックライブラリスクリーニングは、特に、非機能的クローンの大きな個体群における希少な機能的クローンにおいて、リガンド−結合性蛋白質異型を発現する細胞を差別化するμＳＣＡＬＥの能力を査定する。
【０２０９】
[00248]  ｓｃＦｖナイーブライブラリスクリーニング。高い親和性でＧａｓ６に結合する異型を特定するために、酵母表示単鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）のナイーブライブラリのスクリーニングに、μＳＣＡＬＥプラットフォームを適用した。上述の通り、発現のため、酵母表示ｓｃＦｖライブラリを成長及び誘導させた（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｖａｎ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ、Ｋ．Ｄ．、Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．１１３１、１５１〜１８１（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０１４年）。μＳＣＡＬＥスクリーニングに先立って論理的多様性を低減するために、ライブラリに２ラウンドの磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を施した。すなわち、Ｈｉｓタグ分離ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、１０１０３Ｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合しない細胞のためのネガティブ選択と、Ｇａｓ６コーティング磁気ビーズに結合する細胞のためのポジティブ選択とである。メーカーの指示（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ＆Ｐｕｌｌｄｏｗｎプロトコル）により、双方の選別を実施し、前述の選別後、モデル化した（Ｃｈａｏ，Ｇ．らによるＮａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１、７５５〜６８（２００６年））。回転子上で飽和量のＨｉｓタグＧａｓ６により、４℃で２時間、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）をインキュベートすることにより、Ｇａｓ６コーティング磁気ビーズ（４ｍｇ）を調製した。未結合Ｇａｓ６を除去するために、結合／洗浄緩衝剤（水に５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を入れたもの）を含む磁気ホルダ（ＭＰＣ−Ｓ、Ｄｙｎａｌ）を使用して、これらのビーズを洗浄した。選別１については、プルダウン緩衝剤（水に３．２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、７０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を入れたもの）で、８×１０９個の酵母細胞を洗浄し、プルダウン緩衝剤内の非コーティングＨｉｓタグＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で、４℃にて２時間、インキュベートを行った。インキュベート後、細胞及びビーズを磁気ホルダ内に載置し、未結合細胞を収集した。これらの非結合酵母を新たなチューブに移行し、調製したＧａｓ６コーティングビーズで、４℃にて２時間のインキュベートを行った。磁気ホルダを使用して、結合／洗浄緩衝剤により、酵母及びビーズを数回洗浄した。Ｈｉｓ溶出緩衝剤（水に１５０ｍＭのイミダゾール、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａｃｌ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０を入れたもの）で、Ｇａｓ６結合酵母細胞を磁気ビーズから溶出し、ＳＤ−ＣＡＡ中で成長させた。このプロトコルを使用することにより、ＭＡＣＳは、〜２×１０６個の異型までライブラリを低減したが、これは、当初のライブラリサイズの０．４％に対応する。
【０２１０】
[00249]  ＭＡＣＳ低減ｓｃＦｖライブラリの２つの連続スクリーニングラウンドのために、μＳＣＡＬＥを使用した。酵母を、３３ｎＭのＧａｓ６（選別１）又は１０ｎＭのＧａｓ６（選別２）を含有するＰＢＳ  Ａ中で２時間、室温にてインキュベートした。Ｇａｓ６によるインキュベートに続いて、ニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ａ２１２８１）の１：２５０希釈液を含有するＰＢＳＡ中、４℃にて３０分間、細胞を染色した。また、マウス抗ＨｉＳタグＩｇＧ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ａｎａｓｐｅｃ、６１２５０−Ｈ４８８）の１：１００希釈液を含有するＰＢＳＡ中、４℃にて３０分間、細胞を染色した。最後に、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｌ１００１）と、ヤギ抗−ニワトリＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１４３７）との双方の１：１００希釈液を含むＰＢＳＡ中、４℃にて３０分間、二次ラベリングを実施した。ラベル付酵母を〜１２，８００個／μＬの細胞に希釈し、１０μｍアレイ上に投入し、上述の励起／放射パラメータを使用してＧａｓ６結合について解析した。μＳＣＡＬＥのラウンド１については、Ｇａｓ６結合／ｃ−Ｍｙｃ発現比が最高となる１４３個のキャビティを単一プール内で自動抽出し、Ｇａｓ６に対する結合親和性を濃縮した個体を生成した。μＳＣＡＬＥのラウンド２では、単一細胞選別を介して、上位１５個のキャビティを抽出した。ラウンド２の後、Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを回収し、ＰＣＲで増殖させ、配列決定した（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ）。
【０２１１】
[00250]  ＰＢＳＡ２００（ＰＢＳ中に０．１％ＢＳＡ＋２００ｍＭのＮａＣｌを入れたもの）中に、可溶Ｇａｓ６の濃度を変化させて、室温で２時間、誘導した１０５個の酵母細胞をインキュベートすることにより、結果として得られたｓｃＦｖクローンのＧａｓ６結合親和性を測定した。ニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２８１）の１：２５０希釈液を含有するＰＢＳＡ２００において、４℃で１５分間、細胞を染色した。マウス抗ＨｉｓタグＩｇＧ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ａｎａｓｐｅｃ、６１２５０−Ｈ４８８）とヤギ抗ニワトリＩｇＹ  ＰＥ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−３７３０）の１：１００希釈液を含有するＰＢＳＡ２００において、４℃で３０分間、二次抗体ラベリングを実施した。フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ラベル付細胞の結合及び発現シグナルを測定した。レポートされたＫＤに対する誤差は、推定された結合親和性の１−σ（６８％）信頼区間に対応し、各合致点に対する３回の独立した実験からのデータを使用したパラメータブートストラップ法で計算した。
【０２１２】
[00251]  各選別ステップの進捗をモニタリングするために、この手順で、フローサイトメトリを使用した。開始ｓｃＦｖライブラリ（７×１０８個の形質転換態）は、Ｇａｓ６に対していずれの区別可能な結合も示さなかった。図１２は、Ｇａｓ６結合ｓｃＦｖに対するナイーブライブラリスクリーニング全体を通じたフローサイトメトリ散布図を示している。非特定的結合ｓｃＦｖのライブラリをクリアするために、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）をまず使用し、次いで、論理的ライブラリサイズを２．８×１０６個のクローンまで低減するＧａｓ６コーティング磁気ビーズを使用して、ＭＡＣＳのラウンドを行った。図１２のパネルａ）は、０ｎＭのＧａｓ６で染色された当初のｓｃＦｖナイーブライブラリ（ライブラリサイズ：７×１０８）を示している。パネルｂ）は、３３ｎＭのＧａｓ６で染色した当初のｓｃＦｖナイーブライブラリを示している。パネルｃ）は、ＭＡＣＳ後のｓｃＦｖライブラリ（ライブラリサイズ：２．８×１０６）を示している。μＳＣＡＬＥプラットフォームへの２ラウンドのスクリーニングを使用して、結果として得られたｓｃＦｖ異型のプールをＧａｓ６に対するバインダについて濃縮した。
【０２１３】
[00252]  図１０Ｃは、Ｇａｓ６バインダのための酵母表面表示ナイーブｓｃＦｖライブラリのμＳＣＡＬＥスクリーニングのラウンドの散布図を示している。選別１：ユーザ引込ゲートによる自動化プール抽出（左側）であり、選別２：手動単一細胞抽出（右側）である。灰色ドットは、抽出クローンである。また輪郭灰色ドットは、Ｇａｓ６に対する結合が最高であるクローンである。第１ラウンドにおいて、比較的低濃度のＧａｓ６（３３ｎＭ）をライブラリに添加し、平衡を達成させる。ｓｃＦｖ発現量に正規化された、Ｇａｓ６結合レベルが最高である酵母を含有した約１５０個のマイクロキャビティを、プール抽出を介して選択した（図１０Ｃ、左側）。この抽出した酵母プールを培養し、ｓｃＦｖ発現のために再誘導し、プール抽出を介して選択した（図１０Ｃ、左側）。この抽出した酵母プールを培養し、ｓｃＦｖ発現のために再誘導し、フローサイトメトリで解析したが、酵母の個体群が、Ｇａｓ６に特定の結合を有するものの、抗体ベース検出試薬とは特定の結合を有さないことが明らかであった。図１２のパネルｄ）は、自動抽出を介して第１μＳＣＡＬＥ選別後に分離されたｓｃＦｖライブラリを示している（ライブラリサイズ：１４３）。
【０２１４】
[00253]  より厳しい選択圧力（１０ｎＭのＧａｓ６）下で、第２μＳＣＡＬＥスクリーニングを実施した。このスクリーニングでは、単一細胞抽出を介して、１５個のマイクロキャビティを分離し、配列決定した。（図１０Ｃ、右側）。図１２のパネルｅ）は、単一細胞抽出を介した第２μＳＣＡＬＥ選別後に分離されたＡ  Ｇａｓ６−結合ｓｃＦｖクローンを示している。
【０２１５】
[00254]  スクリーニングの回顧的検討により、最高のＧａｓ６結合レベル（ｓｃＦｖ発現に対して正規化）が観察された５つのマイクロキャビティは同一のクローンであるであることを明らかにした（図１０Ｃ、右側）。図１０Ｄは、μＳＣＡＬＥで特定された酵母表示ｓｃＦｖのＧａｓ６結合曲線が、結合Ｇａｓ６の分画対追加濃度として表されており、結果として得られるｓｃＦｖ異型は、ナイーブｓｃＦｖライブラリから採れた他のバインダに匹敵する１３０±３０ｎＭのＫＤを伴ってＧａｓ６に結合される。エラーバーは、３回の独立した測定の標準偏差に対応する。
【０２１６】
[00255]  実施例３：受容体の親和性成熟：変異性ライブラリ選別
[00256]  腫瘍転移の効果的な阻害剤として機能する高親和性Ａｘｌ異型を分離するためのモデルシステムとして、Ｇａｓ６／Ａｘｌを使用した。蛋白質設計ストラテジは、反復的な２ラウンドのライブラリ生成及びスクリーニングを含むものであり、ランダムに生成されたＡｘｌ突然変異の初期ライブラリと、第１ライブラリから回収された異型に由来する組み換えＡｘｌ突然変異の第２ライブラリとである。
【０２１７】
[00257]  Ｇａｓ６コーティング磁気ビーズを使用した１ラウンドのＭＡＣＳは、論理的ライブラリサイズを３．５×１０６個のクローンに低減するものであり、マイクロキャピラリ毎に平均４個の細胞を生じる濃度でアレイを投入した。
【０２１８】
[00258]  結果として得られたＡｘｌ異型のプールを培養し、誘導し、平衡結合を生じるため、１００ｐＭのＧａｓ６で１５時間インキュベートした。２０μｍ直径のキャピラリ毎に平均４個の細胞を産出する濃度である、１２，６００個／μＬの細胞となるように、ライブラリを希釈し、２色のエピ蛍光で撮像した。我々は、Ｇａｓ６バインダのために濃縮を行うべく、Ａｘｌ発現レベルに対して最高レベルのＧａｓ６結合で酵母を含有する３０個のマイクロキャピラリを個別に抽出し、各マイクロキャピラリの内容物を、別々に繁殖させた（図３４）。３０個中２２個の抽出物に、少なくとも１つの細胞を成長し、合計３０個のクローンを産出した。これらの酵母クローンからのプラスミドＤＮＡの配列決定時、いくつかの突然変異の一致が観察されたが、注目すべきは、Ｄ８７Ｇ突然変異及びＶ９２Ａ突然変異であった。
【０２１９】
[00259]  バクテリア突然変異を組み合わせ、中性又は有害の突然変異を取り除くために、付着伸長プロセス（ＳｔＥＰ）を介して第２ライブラリを生成するテンプレートとして、ライブラリクローンから分離したＤＮＡを使用した。我々は、延長期間後、Ｇａｓ６リガンドに結合したままのＡｘｌ突然変異体を分離するために、反応速度オフレートアッセイを使用して、この第２ライブラリをスクリーニングし、より解離速度の遅い異型の選択を行った。飽和レベルのＧａｓ６で、酵母表示Ａｘｌライブラリをインキュベートし、未結合リガンドを除去するために洗浄し、抗体染色に先立って、過剰な野生型Ａｘｌ  Ｉｇｌ  Ｆｃの存在下で２４時間、解離を生じさせた。
【０２２０】
[00260]  解離の２４時間後であっても、このライブラリのサブセットは、高い結合レベルを保ったが、これはμＳＣＡＬＥ上で明確に観察された。我々は、Ａｘｌ発現レベルに対して最高のＧａｓ６結合を示す４０個の個別マイクロキャピラリを抽出し、各マイクロキャピラリの内容物を別々に繁殖させた。我々は、３０個の抽出物から少なくとも１つの細胞を回収し、合計４２個のクローンを産出した。
【０２２１】
[00261]  図４３は、Ｇａｓ６バインダに対する酵母表面表示変異性Ａｘｌ  Ｉｇｌライブラリのスクリーニングを示している。平衡結合を生じるために、１００ｐＭのＧａｓ６で１５時間、このライブラリをインキュベートした。３０個のマイクロキャピラリを別々に抽出した。２２／３０個の抽出物が成長し、結果として３０個のクローンが生じた。（ｂ）ＳｔＥＰ後、我々は、抗体染色に先立って、反応速度オフレート選別を２４時間実施した。このライブラリから、３０個のマイクロキャピラリを別々に抽出した。２３／３０個の抽出物が成長し、結果として４５個のクローンが生じた。
【０２２２】
[00262]  抽出された酵母クローンからのプラスミドＤＮＡの配列決定後、我々は、強い合致突然変異、特に、Ａ７２Ｖ、Ｄ８７Ｇ、Ｖ９２Ａ、及びＶ１２６Ｉの突然変異を観察した。Ｄ８７Ｇ及びＶ９２Ａの突然変異は、以前に特性化したＡｘｌ  Ｉｇｌ異型における親和性のキーとなる原動力である。我々の以前の作業においてＦＡＣＳでスクリーニングした時、Ｄ８７Ｇ及びＶ９２Ａに加え、点突然変異Ａ７２Ｖも、当初の変位性ＰＣＲライブラリから特定され、単独の場合並びにＤ８７Ｇ及びＶ９２Ａの組み合わせの場合の双方において、ＧａＳ６結合の強い貢献因子となることが分かった。
【０２２３】
[00263]  最終的なクローンを査定するために、我々は、μＳＣＡＬＥスクリーニングで最も頻繁に出現した酵母表示異型で結合アッセイを実施した。酵母表面表示ＷＴ  Ａｘｌ  Ｉｇｌは、５００±３００ｐＭのＫｄ及び４６７０±１９０ｓ−１（ｎ＝３の技術的再現）の結合オフレート（ｋｏｆｆ）で、Ｇａｓ６に結合した。開発したＡｘｌ  Ｉｇｌ異型のすべてが、ＷＴ  Ａｘよりも約３倍タイトな親和性を備え、５０倍まで低速の反応速度解離速度で、Ｇａｓ６への結合が改善したことを実証した。表６並びに図４２Ａ及び図４２Ｂを参照こと（エラーバーは、３つの技術的再現のｓ．ｄ．を示している）。
【０２２４】
【表５】
2018510624.tif 000016
【０２２５】
[00264]  測定された結合親和性間の類似度は、真の蛋白質結合相互作用でなく、酵母上結合アッセイにおける限定を反映することができる。解離係数（ＩＱ）、その結合パートナの半分を占有するのに必要なリガンド濃度に等しい平衡定数を使用して、結合親和性を説明する。解離定数は、会合率と解離率の比率は下記である。
【０２２６】
【数１０】
2018510624.tif 000017
【０２２７】
[00264]  研究者は、細胞会合結合親和性の測定時の２つの共通争点、すなわち、リガンド枯渇と平衡時間とを意識しなければならない。
【０２２８】
[00265]  結合アッセイ実施時の共通前提は、リガンドの可溶濃度が一定に保たれるということである。換言すると、遊離リガンドの小さな分画のみがその結合パートナに結合するということが前提とされる。リガンドの１０分の１未満を溶液から確実に除去することが実践として良好である。しかしながら、高親和性蛋白質を得るには、リガンドの実質的分画がその結合パートナに結合して、遊離リガンド濃度を枯渇させてしまうリスクがある。例えば、５×１０５個の酵母細胞は、各々、高親和性（ＩＱ＝１０ｐＭ）のバインダの５×１０５個のコピーを発現するが、１０ｐＭのリガンド溶液から約１．２５×１０９個のリガンドに結合するであろう。このシナリオでのリガンドの枯渇を防ぐために、少なくとも２．１ｍＬの反応体積を使用することで、必要とされる蛋白質の総量を増加させなければならない。２．５ｍｌを超える反応体積については、大型（１５ｍｌ又は５０ｍｌ）のチューブを使用しなければならない。これらのチューブにおける試料を回転して静かに注入することは、非常に多くの手間を要し、誤りを生じやすい。我々は、さらに適正な反応条件を確保するには、５０ｍＬまでの反応体積を使用して、リガンド枯渇を防ぐために、必要な体積を最適化しなければならない。
【０２２９】
[00266]  平衡に近づけるため、蛋白質相互作用に必要な時間を推定するのに、リガンド濃度と組み合わせた会合率及び解離率を使用することができる。可溶蛋白質濃度が酵母表示蛋白質のモル過剰である場合（リガンド枯渇を防ぐため）、平衡に近づくための時間定数（τ）は、下記である。
【０２３０】
【数１１】
2018510624.tif 000018
【０２３１】
[00266]  式中、［Ｌ］０は、リガンドの初期濃度である。我々のＡｘｌ異型とＧａｓ６の間の結合相互作用をさらに特性化するために、我々は、それらの酵母上反応速度オフレートを測定した。我々は、ＷＴ  Ａｘｌと我々の開発した異型との間の劇的な差異を観察した。酵母結合Ｇａｓ６レベルは、ＷＴ  Ａｘｌについては、６時間以内に背景レベルに対して急速に解離したが、我々のＡｘｌ異型は、４８時間後も、初期のＧａｓ６結合レベルの１０％超に保たれた。注目すべきは、Ａ７２Ｖ／Ｖ９２Ａ異型（ｋｏｆｆ＝７．１×１０−６ｓ−１）は。他の２つの異型（ｋｏｆｆ＝１．４×１０−５ｓ−１）より２倍低いオフレートを有する。以前に特性化したＡｘｌ  Ｉｇｌ異型は、すべて、２×１０７Ｍ−１ｓ−１付近の反応速度オンレート値を有し、親和性の向上がより低速なオフレートの結果であったことを提示している。興味深いことに、これらのオンレート値は、通常の抗体分画５８より１００倍高い。我々は、これらの高速なオンレート値により、最低のリガンド濃度（［Ｌ］０＝１０ｐＭ）については、異型とＧａＳ６の間の反応が６時間以下で９９％の平衡結合（４．６τ）に達することを見出すことができる。論理［Ｌ］０＝１ｐＭの条件であっても、すべての反応が、４８時間で９９％の平衡結合に達し、これが、実験に使用した平衡時間であった。
【０２３２】
[00267]  確実に正確な結合親和性測定を行うためにこれらの対策を採るにも関わらず、酵母表示Ａｘｌ異型の結合親和性は、酵母表示結合の本質的な限定が故に、低く見積もられるようである。例えば、反応速度除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）による以前の作業では、３３±０．６ｐＭと１２．０±０．２ｐＭの親和性で可溶野生型Ａｘｌ又はＶ９２Ａの突然変異体に結合するＧａｓ６が、各々１０であることを示した。
【０２３３】
[00268]  我々がアッセイ条件を慎重に考慮したのにも関わらず、酵母表示Ａｘｌ異型の親和性は、酵母表示実験の本来の制限により、低く見積もられるようである。例えば、反応速度除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）による以前の作業では、Ｇａｓ６が、３３±０．６ｐＭ及び１２．０±０．２ｐＭの親和性で可溶野生型Ａｘｌ又はＶ９２Ａ突然変異体に結合されたことを示した。
【０２３４】
[00269]  Ａｘｌ  Ｉｇｌ平衡選別
[00270]  ＭＡＣＳから分離した酵母を、ＳＤ−ＣＡＡ最小酵母培地（２０ｇのデキストロース、６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素塩基、５ｇのＢａｃｔｏカサミノ酸、５．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、８．５６ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏであり、１ｌの体積に対して脱イオン化Ｈ２Ｏ中に溶解した）内で成長させ、ＳＧ−ＣＡＡ培地）デキストロースを置換する２０ｇのガラクトースを使用した以外、ＳＤ−ＣＡＡのように調製した）内で培養することにより、それらの表面上にＡｘｌを発現させるように誘発した。Ａｘｌ異型を表示する酵母を、１００ｐＭのＧａｓ６を含むＰＢＳＡ（リン酸緩衝生理食塩水＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中、室温で１５分間、インキュベートした。Ｇａｓ６によるインキュベートに続き、ニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２１２８１）の１：２００希釈液を含有するＰＢＳＡ中、４℃で４５分間、細胞を染色した。その後、マウス抗ＨｉＳタグＩｇＧ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ５５５（Ａｎａｓｐｅｃ、６１２５０−Ｈ５５５）の１：１００希釈液を含有するＰＢＳＡ中、４℃で４５分間、細胞をインキュベートした。その後、ウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ５５５（Ａｎａｓｐｅｃ、２８１６４−Ｈ５５５）の１：１００希釈液を含むＰＢＳＩ中、４℃で４５分間、Ｇａｓ６に対する追加の二次ラベリングを実施した後、ヤギ抗ニワトリＩｇＹ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１１０３９）の１：１００希釈液を含むＰＢＳＡ中、４℃で４５分間、ｃ−Ｍｙｃの二次ラベリングを行った。ラベル付酵母を〜１２，６００個／μｌの細胞まで希釈し、２０μｍマイクロキャピラリアレイに投入し、上述の励起／放射パラメータを使用して、Ｇａｓ６結合及びｃ−Ｍｙｃ発現について解析した。最高のＧａｓ６結合／ｃ−Ｍｙｃ発現比を有する３０個のキャピラリを個別に抽出した。注した酵母をＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート上で成長させ、コロニーＰＣＲにより、それらに含まれるプラスミドを解析し、後述の通り、配列決定した。
【０２３５】
[00271]  Ａｘｌ  Ｉｇｌ反応速度オフレート選別
[00272]  ＤＮＡシャッフルライブラリで形質転換した酵母細胞をＳＤ−ＣＡＡ最小酵母培地中で成長させ、ＳＧ−ＣＡＡ培地内で培養することにより、それらの表面上にＡｘｌを発現させるように誘発した。２ｎＭのＧａｓ６を含有するＰＢＳＡ中、室温で３時間、酵母表示ライブラリをインキュベートし、未結合Ｇａｓ６を除去するためにＰＢＳＡで２度洗浄した後、余剰量（１００ｎＭ）の野生型Ａｘｌ  Ｆｃ競合により、室温で２４時間、インキュベートする。上述のμＳＣＡＬＥ平衡選別と同様に、蛍光抗体ラベル化及びマイクロキャピラリアレイ投入を実施した。μＳＣＡＬＥ反応速度オフレート選別について、最高のＧａｓ６結合／ｃ−Ｍｙｃ発現比を備えた４０個のキャピラリを個別に抽出した。抽出した酵母をＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート上で成長させ、それらに含まれるプラスミドをコロニーＰＣＲによって解析し、
【０２３６】
[00273]  実施例４：蛍光蛋白質の細胞成長及び高スループットスクリーニング
[00274]  方法
[00275]  マイクロキャビティアレイにおける細胞成長。結果としてマイクロキャビティ毎に平均１個のバクテリアとなるような大腸菌濃度で、２０μｍ直径のマイクロキャビティアレイを投入し、０．２％アラビノースを含有するＬＢ培地中、３７℃でインキュベートを行い、順次撮像した。４０００個のマイクロキャビティ培養の緑色蛍光を、時間の関数として定量化し、結果として、図４１に示される観察成長曲線を作成した。合致された指数関数的曲線に基づくと、観察されたダブル化時間は、５２．８±．５分（４０００回の合致時間経過の再サンプル化によって推定した不確実性）であり、５６±５分（ニコール５の生物学的再現）のバルク培養におけるダブル化時間に近く、合致する。レーザ時点におけるマイクロキャビティ間の蛍光強度の高い変動程度は、成長動態における細胞間不均質を反映している。
【０２３７】
[00276]  蛍光蛋白質ライブラリの構築及びスクリーニング。ｄｄＦＰ技術には、蛍光ヘテロダイマーを形成するための２つの暗いＦＰモノマーの可逆的会合が含まれる。成分ＦＰモノマーを命名する慣習として、ｄｄＦＰ−Ａ及びｄｄＦＰ−Ｂである。ｄｄＦＰ−Ａモノマーは、急冷発色団を所持し、ｄｄＦＰ−Ｂモノマーには発色団が不足する。我々は、非共有結合錯体をｄｄＦＰ−ＡＢ（例えば、ｄｄＯＦＰ−ＡＢ）として指定し、略溶融タンデムダイマーをｔｄＦＰ−ＡＢとして指定した。ｔｄＲＦＰ−ＡＢをＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩの制限部位（ここでは、ｄｄＲＦＰ−Ｂがタンデム遺伝子溶融内の５’パートナである）の間のｐＢＡＤ発現プラスミド内にクローン化し、ｄｄＯＦＰ−ＡＢの設計のためのテンプレートとして使用した。まず、Ｍ６６Ｔを部位指定突然変異生成により、ｄｄＲＦＰ−Ａ内に導入した。以下の変位性ＰＣＲ反応条件、すなわち、０．１５ｍＭ又は０．０７５ｍＭのＭｎＣｌ２、１０ｎｇのテンプレート、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２を使用して、ｄｄＲＦＰ−Ａ（Ｍ６６Ｔ）をランダムに変異誘発することにより、変異性ライブラリを作成した。６８℃の伸長温度を備えたＴａｑポリメラーゼを使用して、各反応について、４０サイクルのＰＣＲ増殖を実施した。突然変異体遺伝子ライブラリをｄｄＲＦＰ−Ｂにクローン化３’した、タンデムＦＰ異型のライブラリを作り、μＳＣＡＬＥプラットフォーム内での成長及びスクリーニングのため、ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント大腸菌に形質変換した。
【０２３８】
[00277]  高度蛍光ｄｄＯＦＰを作成するために、各ラウンドのスクリーニング間に分離したＤＮＡ上に変異性ＰＣＲを実施し、３つの連続的大腸菌ライブラリをスクリーニングすべく、μＳＣＡＬＥを使用した。各ライブラリサイクルでは、大腸菌を回収するために、形質変換後、振動させつつ、３７℃のＬＢ培地内で一晩、細胞を成長させた。その後、培養液を発現培地（アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びアラビノース（０．１％）を補ったＬＢ）中、〜３，２００個／μＬの細胞となるまで希釈し、２０μｍアレイに投入し、湿らせたキムワイプでペトリ皿内に一晩、３７℃でインキュベートした。一晩の成長後、５２５／４５ｎｍ励起／５６５ｎｍロングパス放射フィルタの蛍光強度について、アレイを解析した。μＳＣＡＬＥラウンド１については、１０個のキャビティをバルク個体群として自動抽出し、これを、上述の通り、変異性ＰＣＲを介して次のライブラリの作製に使用した。μＳＣＡＬＥラウンド２については、単一細胞選別を介して１２個のキャビティを抽出した。蒸気と同一の条件で第３世代変異性ライブラリを作成するために、最高蛍光シグナルを備えた４個のクローンを使用した。第３及び最終μＳＣＡＬＥラウンドについては、単一細胞選別を介して上位１０個のキャビティを抽出した。各ライブラリスクリーニング後の蛋白質特性を評価するために、抽出した細胞を発現培地内で振動させつつ、３７℃にて一晩培養した。Ｂ−Ｐｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して蛍光蛋白質を抽出し、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４プレートリーダを使用してスペクトルを収集した。
【０２３９】
[00278]  ｄｄＯＦＰスペクトル特性。スペクトル解析に先立ち、金属キレートＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィを使用してすべての蛋白質を精製し、ＰＢＳ内に表示した。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４プレートリーダにより、放射スペクトルを記録した。１ｃｍ水晶製微小細胞キュベットを使用して、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０  ＵＶ／Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒに吸光度測定を行った。ε値を判定するために、アルカリ発色団変性法を使用した。ｄｄＯＦＰのための量子収率判定の参照として、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（φ＝０．７６）を使用した。所望のｐＨの緩衝剤において精製蛋白質をインキュベートし、９６ウェルのＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４プレートリーダで放射スペクトルを取得することにより、ｐＨ測定を実施した。ＰＢＳ中に１μＭの蛍光蛋白質溶液を調製し、所望のｐＨの広域緩衝剤で１：１０に希釈した。この広域緩衝液は、銅体積の０．０４ＭのＨ３ＢＯ３、０．０４ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ、及び０．０４ＭのＨ３ＰＯ４を混合して調製した。調整して貯蔵した溶液に１ＭのＮａＯＨを添加することにより、ｐＨを所望の値に調整した。実験データを下記に合致させることにより、ｐＫａを判定した。
【０２４０】
【数１２】
2018510624.tif 000019
【０２４１】
[00278]  式中、Ｆは、蛍光であり、Ａ及びＢは、ベースラインを規定する変数であり、ｎＨは、Ｈｉｌｌ係数である。平均統合放射ピーク強度は、ｐＨの関数として正規化及びプロットした。
【０２４２】
[00279]  μＳＣＡＬＥを新たな蛍光蛋白質異型を開発するために使用し、利用可能なバイおセンサのカラーパレットを拡大し、大腸菌ライブラリでプラットフォームの適合性を実証した。従来、蛍光蛋白質は、所望の色相及び／又は明度（Ａｉ、Ｈ．−Ｗ．らによるＮａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．９、９１０〜２８（２０１４年））を特定するために、寒天皿上の個別の大腸菌コロニー成長をスクリーニングすることにより、開発する。単純明快ながら、この低スループット法は、基礎的光学とコロニー選出の手間に依存しており、時間を消費し、主体的であり、最も望ましい異型の回収を妨げる。我々は、まず、マイクロキャビティアレイ内の個々の大腸菌細胞から空間的に分断された培養の能力を確立した。小孔毎に単一細胞を得るような濃度で蛋白質発現大腸菌懸濁液をアレイに投入し、３７℃でインキュベートし、種々の間隔で撮像した。結果として得られた経時変化は、ロバストなクローン増殖と蛍光蛋白質精製を示している。大腸菌成長をキャビティ内に制限することにより、隔離培養の高密度アレイを作成した。
【０２４３】
[00280]  図１３は、ＧＦＰを発現する空間的に分断された大腸菌培養液の成長を示している。画像は、２０μｍアレイの小さな一部を示しており、ここには、マイクロキャビティ毎に単一のバクテリア細胞が投入され、指示された時間、３７℃で培養され、順次撮像される。図１４は、成長が小孔毎の合計ＧＦＰ放射を統合することによってモニタリングされたことを反映している。エラーバーは、測定したキャビティ（ｎ＝１７７）の±標準偏差を示している。
【０２４４】
[00281]  明色相移行、二量化依存蛍光蛋白質（ｄｄＦＰ）の新色異型を精製するために、μＳＣＡＬＥを使用した（図１５Ａ）。二量化依存蛋白質（ｄｄＲＦＰと称する）をテンプレートとして使用することにより、青色移行突然変異（Ｍ６６Ｔ）を導入したが、これは、初期段階では蛍光をなくすものであった（Ｓｈａｎｅｒ，Ｎ．Ｃ．らによるＮａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、１５６７〜７２（２００４年）；Ａｌｆｏｒｄ，Ｓ．Ｃ，らによるＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１、５６９〜７５（２０１２年））。図１５Ｂは、ｄｄＲＦＰテンプレートからｄｄＯＦＰを精製するために使用される設計ストラテジを示している。Ｍ６６Ｔ突然変異をｄｄＲＦＰ（スターバースト）のＡコピーに導入し、大いに非蛍光である色相移行異型を生成した。３ラウンドの突然変異生成及び大腸菌に発現された蛋白質ライブラリのμＳＣＡＬＥスクリーニングにより、結果として、ｄｄＯＦＰを生じたが、これは、Ｍ６６Ｔに加えて５個の突然変異を有するものである。
【０２４５】
[00282]  蛍光を取り返して強化するために、我々は、変異性ＰＣＲ突然変異生成によって生成され、大腸菌に発現されたライブラリのμＳＣＡＬＥスクリーニングを通じて、別々の３ランドの指向性進化を実施した。指向性進化ラウンド１及び２については、弱い蛍光を実証する約十数個のクローンを分離し、次の突然変異生成ランドのための遺伝子テンプレート混合物を生成するために使用した。ラウンド３により、ライブラリの分画は、ライブラリ平均より実質的に高い蛍光レベルを示した。図１６Ａは、蛍光の最も明るい１０個のキャビティを反映しており、これらを抽出、培養、及び特性化した。最も明るい蛍光蛋白質異型を更なる解析のために選択した。観察されたライブラリ異型の蛍光強度の分布を線トレースで示す。この分布の上尾に最も明るい１０個の細胞を示している（シェード付き）
【０２４６】
[00283]  このラウンド３の異型は、二量化依存オレンジ蛍光蛋白質（ｄｄＯＦＰ）を指定し、ラウンド２からの最高の突然変異体と「親」Ｍ６６Ｔクローンとに対して蛍光強度の劇的な増加を与える当初のＭ６６Ｔ突然変異に加え、５個の突然変異を取得した。図１６Ｂに示される通り、反復的指向性進化は、蛍光強度の増加を示している。プロットは、Ｍ６６Ｔ、ラウンド２異型、及びｄｄＯＦＰ（ラウンド３から）を発現する大腸菌粗溶解物の蛍光放射スペクトルを描いている。挿入は、上述のＦＰ異型を発現する大腸菌の細胞ペレットの色相の増加を描いている。
【０２４７】
[00284]  図１７は、ｄｄＯＦＰ［配列識別番号：１］とその親であるｄｄＲＦＰ［配列識別番号：２］のＡコピーの配列アラインメントを示している。当初のＭ６６Ｔ突然変異は丸で囲んである。３ラウンドの指向性進化で取得した突然変異を灰色でハイライト表示し、下線を付した。
【０２４８】
[00285]  図１８は、ｄｄＯＦＰが、各々、５３５ｎｍ及び５６５ｎｍにおいて吸収及び放射の最大値を有することを示しており、ｄｄＲＦＰとｄｄＹＦＰの異型間のスペクトルギャップを埋めている。図１９は、ｄｄＧＦＰ、ｄｄＹＦＰ、ｄｄＯＦＰ（ダッシュ線）、及びｄｄＲＦＰに対する正規化放射スペクトルを示している。ｄｄＧＦＰ、ｄｄＹＦＰ、及びｄｄＲＦＰに対する参照スペクトルは、Ａｌｆｏｒｄ，Ｓ．ＣらによるＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１、５６９〜７５（２０１２年）及びＡｌｆｏｒｄ，Ｓ．ＣらによるＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９、３５３〜６０（２０１２年）から得た。また、ｄｄＯＦＰは、他のｄｄＦＰに匹敵する明度とコントラストを示し（表７）、それをｄｄＦＰベースのバイオセンシング適用の好適なモジュールとする。
【０２４９】
【表６】
2018510624.tif 000020
【０２５０】
[00286]  図２０は、ｄｄＯｆｐ及びｄｄＯＦＰ−Ａに対するｐＨ依存放射プロファイルを示している。平均統合放射ピーク強度をｐＨの関数として正規化し、プロットした。ｄｄＯＦＰ−ＡとｔｄＯＦＰに対するｐＫａの値を、各々、７．９及び６．９であると判定した。エラーバーは、３回の独立した実験に対する±標準偏差を示している。
【０２５１】
[00287]  実施例５：改良酵素触媒に対するハイスループット反応速度測定及びスクリーニング
[00288]  アルカリホスファターゼ蛋白質構築物の調製。大腸菌野生型アルカリホスファターゼ（ＷＴ  ＡＰ）遺伝子と反応速度比較に使用したＲ１６６Ｓ異型とを、Ｎｈｅｌ及びＢａｍＨＩ制限部位間のｐＣＴ酵母表示プラスミド内にクローン化した。酵母表面表示研究のためのエレクトロポレーションにより、プラスミドＤＮＡをサッカロマイセス・セレビシエＥＢＹ１００に形質転換した。ＷＴ  ＡＰとＲ１６６Ｓ突然変異体の可溶バージョンも発現させ、上述の通り、大腸菌ＳＭ５４７  ＤＥ３細胞から精製した（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｌ．Ｄ．らによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３、６８１１〜９（２０１４年））。ｐＣＴ表示プラスミドで形質転換した酵母細胞を選択的培地で成長させ、上述の通り、誘発させた。酵母誘発培地には、５００μＭのＺｎＣｌ２と５００μＭのＭｇＣとを補い、触媒のために必要とされる金属イオンを提供した。酵母表面表示酵素のレベルを定量化するために、各酵素に溶融したＣ末端ｃ−Ｍｙｃタグの抗体ラベル化を実施した。約８×１０４個の酵母細胞を洗浄し、ニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２８１）の１：２５０希釈液を含有するＰＢＳＡ中、ロータ上で室温にて４５分間、再懸濁した。インキュベート後、酵母を洗浄し、ヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１０３９）の１：１００希釈液を含有するＰＢＳＡ中、ロータ上で室温にて３０分間、再懸濁した。その後、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でｃ−Ｍｙｃ発現レベルを検出した。
【０２５２】
[00289]  ＤＤＡＯ生成物ｐＫａの測定。生成物蛍光のｐＨ依存性を判定するため、７−ヒドロキシ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン（ＤＤＡＯ）にｐＨ測定を実施した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中、１μＭのＤＤＡＯ貯蔵溶液を調製し、溶液のｐＨを調整するために１ＭのＨＣｌと１ＭのＮａＯＨとで滴定した。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４プレートリーダを使用して、各滴定ステップからのアリコートに５９０／６６０ｎｍの励起／放射における蛍光測定を実施した。Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈの式にデータを合致させることにより、ＤＤＡＯ生成物について５のｐＫａを生じた。そこで、ＤＤＡＯ窒素のプロトン化から生じる蛍光消光をなくすため、次の酵素アッセイをｐＨ８（生成物ｐＫａを上回る３ユニット）で実施した。図２１は、滴定の結果を示している。エラーバーは、合致したｐＫａ値に対する１−σ（６８％）の信頼区間に対応し、データのケース再サンプリングを使用したブートストラップによって判定した。
【０２５３】
[00290]  アルカリリン酸活性の解析。誘発した酵母細胞を〜３２００個／ｓＬの細胞となる最終濃度まで希釈し、ＡＰ反応緩衝剤（１００ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのＺｎＳＯ４、０．２％ＢＳＡ、１ｍＭのマンノース）中で２度、洗浄し（Ａｌｆｏｒｄ，Ｓ．Ｃ，らによるＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１、５６９〜７５（２０１２年）；Ａｌｆｏｒｄ，Ｓ．Ｃ，らによるＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９、３５３〜６０（２０１２年））を参照のこと、解析の直前に、可変濃度のＤＤＡＯＰ及び無機リン酸を含有するＡＰ反応緩衝剤中で再懸濁した。その後、各々、バルク実験及び単一細胞実験のために、反応化合物を９６ウェルマイクロタイタープレート又はμＳＣＡＬＥアレイのいずれかに投入した。Ｂｉｏｔｅｋ  ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）Ｈ４プレートリーダ分光計上で、５９０／６６０ｎｍの励起／放射にて、蛍光経時変化を測定することにより、バルク反応速度アッセイを実施し、これにより、０〜３μＭの範囲のＤＤＡＯ濃度で蛍光シグナルの線形相関を可能にした。図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダ分光計上で生成物濃度の関数として測定したＤＤＡＯの生成物に対する放射スペクトルと、右側には検量線を生じるように定量化されたピーク放射とを示している。蛍光取得パラメータは、以下の通りであった。感度＝１００、帯域幅＝９．０ｎｍ。
【０２５４】
[00291]  μＳＣＡＬＥプラットフォームの反応速度測定について、アレイの各キャビティについて、単一細胞反応の経時変化を精製するために、６００／６０ｎｍの励起／６５５ｎｍのロングパス放射フィルタの設定間隔で、一連の画像を取得した。μＳＣＡＬＥフィルタセットとカメラにより、プレートリーダに匹敵する動的範囲に亘って、蛍光での生成物形成の線形相関を検出した。図２３は、単一のマイクロキャビティアレイ上の分離スポット上に可変濃度の生成物標準を投入した後、アレイ上の各キャビティの蛍光強度を測定することにより、μＳＣＡＬＥプラットフォーム上に精製した、図２２Ａ及び図２２Ｂと同様の検量線を示している。エラーバーは、各スポットのすべてのキャビティに亘る標準偏差を反映しており、加重最小二乗を使用して、検量線に合致させるために使用した。双方の場合において、反応速度を推定するために、各反応速度時系列の線形領域を使用した。反応速度データからの逆算率定数のために、５０ｐＭの効果的酵素濃度（細胞１５、４５毎に表示された〜１０４個の酵素コピーを前提とする）を使用した。
【０２５５】
[00292]  ＡＰ反応における無機リン酸汚染の測定。上述の通り、大腸菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＶ４４０６）からの蛍光ラベル付リン酸結合性蛋白質（ＰＢＰ）を使用して、ＡＰ反応速度アッセイにおいて使用したすべての試薬の無機リン酸内容物を定量化した（Ｂｒｕｎｅ，Ｍ．らによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３、８２６２〜７１（１９９４年））。簡単に述べると、各試料のうちの１００をリン酸センサ検出緩衝剤（２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．６、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の１μｍのＰＢＰのうちの１００と混合し、Ｂｉｏｔｅｋ  ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）Ｈ４プレートリーダ分光計上にて４３０／４５０ｎｍの励起／放射で混合物の蛍光を直ちに読み出した。ＰＢＰ結合熱力学における濃縮ＭＯＰＳ及び食塩水からの干渉を最少化するために、センサでのインキュベートに先立ち、ＡＰ反応緩衝剤中のリン酸内容物の測定時、乾燥剤を水中で１：２０に希釈した。ＰＢＰ貯蔵物を−８０℃にてリン酸センサ保管緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．６、５０ｍＭのＮａＣｌ）中、１０μＭのアリコートとして保管し、使用に先立って個々に解凍した。図２４に示される通り、Ｆ＝Ｆｍｉｎ＋（Ｆｍａｘ−Ｆｍｉｎ）＊（１＋Ｋｄ／［Ｐｉ］）−１の形態の２状態結合等温線に合致した標準曲線を使用して、蛍光測定をリン酸濃度に変換した。エラーバーは、３つの測定に亘る標準偏差を反映している。２状態結合等温線への合致は、実線としてデータ上に重ね合わせられている。結合パラメータは、Ｆｍｉｎ＝１４２００＋／−５００ＲＦＵ、Ｆｍａｘ＝８５０００＋／−１０００ＲＦＵ、及びＫｄ＝０．９４＋／−０．０５μＭであると判定された。
【０２５６】
[00293]  アルカリホスファターゼライブラリの構築及びスクリーニング。以下の反応条件、すなわち、０．１ｍＭのＭｎＣ２、１０ｎｇのＷＴテンプレート、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２を使用して、ＷＴ  ＡＰ遺伝子［ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｍ１３３４５］をランダムに変異させるために、変異性ＰＣＲを使用した。上述の通り、ＰＣＲ増殖を実施した。変異させたＡＰ挿入ＤＮＡ及びＮｈｅｌ／ＢａｍＨＩ消化ｐＣＴプラスミドを、ＥＢＹ１００酵母中に５：１の重量比で電気穿孔し、試験管内の相同組替で会合させた（Ｃｈａｏ，Ｇ．らによるＮａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１、７５５〜６８（２００６年））。ライブラリサイズは、希釈平板により、〜１０７であると推定された。
【０２５７】
[00294]  アッセイ条件下で活性の改善した突然変異体について変異性ＡＰライブラリをスクリーニングするために、μＳＣＡＬＥを使用した。誘発した酵母細胞をＡＰ反応緩衝剤中で２度洗浄し、１μＭのＤＤＡＯＰ及び１５μＭの無機リン酸を含有するＡＰ反応緩衝剤中で〜３，２００個／μＬの細胞となるように再懸濁し、アレイ内に投入した。３０分の反応時間後、ＡＰ反応速度研究において説明した通り、各キャビティの蛍光強度を解析した。最高の蛍光強度を備えた１５個のキャビティを個々に抽出し、ＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート上で成長させた。上述の通り、抽出した細胞からの酵母表示ＡＰ異型の反応速度パラメータを測定した。３つの改良した突然変異体の遺伝子型決定のために、Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、プラスミドＤＮＡを回収し、ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント大腸菌に形質変換し、プラスミドｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分離し、配列決定した。
【０２５８】
[00295]  モデルシステムとして、アルカリホスファターゼを使用した。基板９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸（ＤＤＡＯＰ）を使用して、触媒活性を測定した。酵母表示野生型（ＷＴ）アルカリホスファターゼのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度及びリン酸阻害は、大腸菌から採取した精製酵素で測定した値の２倍以内であった。さらに、ＷＴアルカリホスファターゼと以前に特性化したＲ１６６Ｓ突然変異体の間の反応速度の差異は、ＤＤＡＯＰ基板に対する見かけ上の二次速度定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）における顕著な低下を示しているが、酵母表示構築において保たれた（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．Ｊ．＆Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：５６９１−５６９９（２００１年））。図２５は、大腸菌から採取した精製酵素に匹敵する酵母の表面上に表示されたＷＴ  ＡＰの反応速度を示している。誘発したＳＧＣＡＡ培養からの５０ｐＭの精製酵素又は６．４×１０５の細胞のいずれかで、９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて２００μＬのスケールで反応を進行させた。エラーバーは、３回の独立した測定の標準偏差に対応している。標準Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎモデルへの合致が実線としてデータ上に重ね合わせられている。ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｍ１３３４５のヌクレオチド配列に対応するＷＴ大腸菌蛋白質配列について、新たな配列異型を説明する。図２６は、反応の結果が４００ｎＭのＤＤＡＯＰ濃度で進行される様子を示している（ＷＴ  ＡＰに対する見かけ上のＫｍを１０倍下回る）。エラーバーは、３回の独立した測定の標準偏差に対応する。競合阻害モデルへの合致が実線としてデータ上に重ね合わせられている。
【０２５９】
[00296]  表８は、酵母表示と精製ＡＰ構築物について得られた反応速度パラメータの比較を示している。酵母表示酵素で実施された基板測定については、酵母細胞毎に１０４個の表示蛋白質コピーの平均を仮定することにより、初期比を酵素ターンオーバーに変換した。誤差は、合致パラメータに対する１−σ（６８％）の信頼区間に対応し、各合致点に対する３回の独立した測定からのデータを使用して、パラメータブートストラップ法により、推定した。
【０２６０】
【表７】
2018510624.tif 000021
【０２６１】
[00297]  酵母表示ＷＴアルカリホスファターゼとＲ１６６Ｓ突然変異体に対する単一細胞反応の経時変化を測定するために、μＳＣＡＬＥを使用し、プラットフォームが、時間分解、酵素異型の活性の反応速度情報を提供できることを実証した。酵母表示酵素のロバストな空間的分離と蓄積生成物７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン（ＤＤＡＯ）が、アレイ内の各反応経時変化の長さ全体に亘って維持され、高度に活性の酵母表示酵素を含有するキャビティの簡易且つ定量的反応速度を不活性／活性の低い近隣、又は空のキャビティから区別できるようにした。図２７は、時間分解酵素アッセイからの代表的スナップショットを示している。活性酵素を表示している４個のマイクロキャビティ内在酵母細胞を白字の数字で示しており、近隣の空のキャビティには、比較のため、「ｘ」を記してある。明確さのため、画像コントラストを人為的に強調してある。図２８は、図２７のスナップショットに対応するマイクロキャビティの定量化を示している。ラベル化は図２７に対応しており、活性酵素を表示する４個のマイクロキャビティ内在酵母細胞と比較のための付近の空のキャビティを示している。各マイクロキャビティ内の生成物が一定に蓄積されていることが観察され、これが直線回帰による反応速度計算を可能にする。
【０２６２】
[00298]  アレイＷＴアルカリホスファターゼとＲ１６６Ｓについて、アレイ内で２０分間又は３時間の反応（ＷＴ及びＲ１６６Ｓの各々について）を通じて、約５，０００個の単一細胞トレースを定量化した。経時変化スロープのヒストグラムは、マイクロキャビティアレイの各突然変異体の活性分布を規定するものであり、図２９に示されている。特に、触媒効率の低減した、酵母表示ＷＴアルカリホスファターゼ及びＲ１６６Ｓ点突然変異体の単一細胞反応速度プロファイルを示している。２０μＭアレイにおいて、単一酵母細胞をマイクロキャビティ毎に投入し、１０μＭのＤＤＡＯＰ基板を使用して反応を実施した。単一細胞反応速度は、各クローン個体群内の酵素活性における細胞間変動性（蛋白質発現レベルの不均一によるものと思われる）にも関わらず、際立っており、μＳＣＡＬＥプラットフォームは、反応速度に基づくＷＴ酵素からのＲ１６６Ｓ突然変異体を明確に示している。
【０２６３】
[00299]  次に、改良酸素異型を特定するμＳＣＡＬＥの能力を実証するために、ランダム変異アルカリホスファターゼライブラリをスクリーニングした（〜１０７個の形質転換態で、１μＭのＤＤＡＯＰ（ＷＴアルカリホスファターゼの見かけ上のＫＭより４倍低い）に対して、各反応に対して添加された１５μＭ無機リン酸（ＷＴアルカリホスファターゼの測定ＫＩより４倍高い）の存在下で）。これらの条件は、酸素設計における多数の多様な副次的分野における共通目的である、阻害薬への酵素の耐性を増す配列を強化するために、ライブラリに選択的圧力を課すものである（例えば、Ａｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．らによるＰｌａｎｔ  Ｊ．６９、５７〜６９（２０１２年）；Ｙａｎｇ，Ｊ．−Ｓ．らによるＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．８，ｅｌ００２６１２（２０１２年）；Ｈｕ，Ｘ．，らによるΑｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８７、１７７３〜８２（２０１０年）を参照のこと）。０．２〜６のＯＤ６００からの形質転換と３回の継代後、酵母ｅＰＣＲライブラリのアリコートにＺｙｍｏｐｒｅｐを施し、ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞に形質転換した。２０個のクローンを取り出し、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、図３０に示される突然変異率の分布の産出によって遺伝子型分類した。単一細胞抽出を介して、検査済スクリーニング条件下におけるＷＴアルカリホスファターゼに対して強化活性を備えた１５個の推定ヒットを分離し、上述と同一の条件下、バルクで再度スクリーニングした。図３１は、ランダム変異ＡＰライブラリのμＳＣＡＬＥの定量化を示している。ピークは、スクリーニング中に観察された単一細胞酵素活性の分布を示している。アレイから、この分布の上尾における１５個の最も活性な細胞を抽出し、増殖させ、改良酵素異型を得るべく、さらに濃縮するために再度スクリーニングした。双方のバルク生化学アッセイにおけるＷＴアルカリホスファターゼに対するその顕著な速度加速に基づく配列決定及び詳細な特性化のために、３つの異型を選択した。図３２は、ＷＴ酵素とμＳＣＡＬＥライブラリスクリーニングで分離した３つの最も活性な異型との相対的比率を示している。比率は、スクリーニングで使用されるものと同一の条件下で、バルク生化学アッセイにおける酵母表示構成で測定した。図３３は、酵母表示ＷＴ  ＡＰと人工進化Ｎ１９７Ｓ−Ｔ１４８Ｐ−Ｓ１７５Ｒ三重突然変異体の単一細胞反応速度プロファイルを示している。反応は、無機リン酸を伴うことなく、５μＭのＤＤＡＯＰで実施し、ｅＰＣＲライブラリスクリーニングで採用するのと同一の手順を使用して、μＳＣＡＬＥプラットフォーム上で解析した。
【０２６４】
[00300]  Ｄ１０１位置は、ＡＰ活性部位内のリン酸イオンを調整するＲ１６６残渣を配置するのに重要であることが知られている。このように、我々のスクリーニングではカバーされていないＤ１０１Ｇ突然変異が、無機リン酸に対する酵素の親和性を低下させるＲ１６６の配置を変えるようである。図３４は、μＳＣＡＬＥスクリーニングから分離されたＷＴ酵素と３つの改良異型についてのリン酸阻害曲線を示している。３つの異型のうちの１つは、ＷＴ酵素よりも１０倍高い見かけ上のＫｉで、無機リン酸に対する感度が著しく低減したことを示している。反応は、各突然変異体の見かけ上のＫｍより少なくとも１０倍低い基板濃度で進行させた。競合阻害モデルへの合致が、実線で示される通り、データ上に重ね合わせられている。すべての実験において、エラーバーは、３回の独立した測定の標準偏差に対応している。図３５は、人工進化Ｄ１０１Ｇ突然変異体におけるリン酸阻害の低下の構造的基礎を示している。ＷＴ  ＡＰ（ＰＤＢ  １ＡＬＫ）の活性部位は、無機リン酸（Ｐ）拘束されている。活性部位亜鉛イオンが示されており（ｚ）、Ｄ１０１及びＲ１６６の残渣が棒状で表現され、他のすべての蛋白質残渣がリボン表現で描かれている。
【０２６５】
[00301]  大腸菌からの可溶発現精製に際して、リン酸の存在下のＷＴ酵素に対するこのＤ１０１Ｇ突然変異体の改良性能が保存された（表８）。図３６に示される通り、他の２つの異型が、ＷＴアルカリホスファターゼよりも高い活性の基本的レベルを示したが、これは、部分的に、これらの突然変異体の酵母表面発現が増加したことによって説明することができる。図３６において、標準Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎモデルへの合致が、実線の通り、データ上に重ね合わせられている。図３７は、酵母の表面に表示されたＡＰ突然変異体の発現プロファイルを示している。蛋白質表示レベルは、各酵素へのＣ−末端ｍｙｃタグ溶融の抗体ラベリングを介して測定し、フローサイトメトリを使用して定量化した。
【０２６６】
[00302]  いずれの異型も大腸菌からのアクティブ形態で精製可能であり、これらのクローンによって得られた有益な突然変異が酵母表面環境に特定的であり、溶液中のホモダイマーの適正なフォールディングとは不適合であることを示している。
【０２６７】
[00303]  表９は、大腸菌からの蛍光標識リン酸結合性蛋白質を使用したＡＰ反応における無機リン酸汚染の測定を示している。図２３における検量線を使用して、蛍光測定をリン酸濃度に変換した。誤差は、独立して調製した２つの試料に標準偏差を反映する。アッセイの検出限界は、１０ｎＭＰｉである。
【０２６８】
【表８】
2018510624.tif 000022
【０２６９】
[00304]  表１０は、大腸菌からの蛍光標識リン酸結合性蛋白質を使用してアルカリホスファターゼ反応における無機リン酸レベルの測定を示している。図２３における検量線を使用して（方法を参照のこと）、蛍光測定をリン酸濃度に変換した。誤差は、パラメータブートストラップ法を使用して、検量線の不確実性から伝えられた。アッセイの検出限界は、１０ｎＭＰｉである。
【０２７０】
【表９】
2018510624.tif 000023
【０２７１】
[00305]  表１１は、酵母表示及び生成酵素フォーマットの双方で、μＳＣＡＬＥから分離されたＷＴ  ＡＰと３つの異型との相対的比率を示している。すべての反応は、１５μＭ添加した無機リン酸の存在下で、１μＭのＤＤＡＯＰを使用して実施した。すべての酵母アッセイは、新たに形質転換した細胞を使用して、３２００個／μＬの細胞の細胞密度で実施した。５０ｐＭ酵素を使用して、ＷＴ  ＡＰとＤ１０１Ｇ突然変異体による精製酵素反応を実施し、Ｉ１６Ｖ−Ｎ１４５Ｉ−Ｄ２９４ＧとＮ１９７Ｓ−Ｔ１４８Ｐ−Ｓ  １７５Ｒの三重突然変異体による反応は、５０ｎＭ酵素を使用して（対応して調整されたレートで）実施した。
【０２７２】
【表１０】
2018510624.tif 000024
【０２７３】
[00306]  表１２は、原子放射分光法（ＡＥＳ）で測定される、μＳＣＡＬＥスクリーニングから分離されたＷＴアルカリホスファターゼと２つの三重突然変異体における金属イオンとリン内容物とを示している。アルカリホスファターゼモノマーに対して予期されるＺｎ／Ｍｇ／蛋白質の化学量論は、２：１：１．３である。また、ＷＴアルカリホスファターゼは、１：１の化学量論において活性部位に束縛された無機リン酸を伴って発現している。ＷＴアルカリホスファターゼ試料におけるこれらの値の偏差は、試料調製及び蛋白質濃度の判定における誤差を、推定上、反映する。Ｉ１６Ｖ−Ｎ１４５Ｉ−Ｄ２９４ＧとＮ１９７Ｓ−Ｔ１４８Ｐ−Ｓ  １７５Ｒの三重突然変異体の活性部位における著しい金属占有率の不足は、これらの異型の活性の乏しさの説明を補助するものである。ＡＥＳデータは、ＷＴアルカリホスファターゼ（ＰＤＢ  １ＡＬＫ）の結晶構造とともに、Ｎ１４５及びＴ１４８における突然変異が可溶蛋白質のフォールディング、ひいては効率的触媒に必要とされる金属補因子を結合させる能力を妨害するモデルをサポートする。
【０２７４】
【表１１】
2018510624.tif 000025
【０２７５】
[00307]  発現の酵素活性の正規化
[00308]  ＡＰスーパーファミリにおいて十分に研究された他の酵素として、ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＮＰＰ）があり、リン酸ジエステルの加水分解を触媒する。このスーパーファミリの他の構成員として、ＮＰＰは、２Ｚｎ２＋モチーフを含むバイメタロ酵素である。
【０２７６】
[00309]  ＮＰＰは、普通、真核性細胞表面上の膜貫通蛋白質として見出だされ、この場合、これらは、細胞外リン酸ジエステルに作用する。ＮＰＰは、カンキツかいよう病菌であり、その本来のコンテキストでは、この酵素に対する機能的データは存在しない。この異型は、その過剰発現とそのホスホジエステラーゼ活性のために選択された。このＮＰＰ異型は、モノマーであり、酵母表面表示を容易にする。
【０２７７】
[00310]  ＮＰＰについては、加水分解に際して２蛍光４−メチルウンベリフェロンロン（ＭＵ）を産出する基板ビス（４−メチルウンベリフェリル）ホスフェート（Ｂｉｓ−ＭＵＰ）を使用して、触媒活性を測定した。Ａｐ基板（ＤＤＡＯＰ）とは異なり、Ｂｉｓ−ＭＵＰは、開裂に先立って蛍光でなく、その生産物は、狭い蛍光励起及び放射スペクトルを有する。この特性のため、酵母表面蛋白質発現のレベルの定量化を判定することができる。Ｃ末端ｃ−ｍｙｃに対して蛍光標識二次抗体を備えた酵母細胞を染色することにより、酵素活性は発現で正規化することができ、アッセイのノイズを低減することができる。
【０２７８】
[00311]  本実験において、黒い水素焼成ガラスアレイを使用した。黒ガラスの壁部は、マイクロキャビティ間の蛍光クロストークを防ぎ、透明ガラスアレイに観察された「ハロー」効果をなくした。また、黒アレイは、磁気マイクロビーズを添加することなく、抽出を可能にする。マイクロビーズを伴うことなく、画質及び測定感度を劇的に改善する。
【０２７９】
[00312]  発現用酵母を染色し、酵母表示ＮＰＰについて単一細胞反応の経時変化を測定した。経時的に反応をモニタリングした後、直線回帰及びＮＰＰ発現に対するプロット率により、各マイクロキャピラリの反応速度を計算した。図３８は、パネルａ）にて、ハイライト表示されたデータ（円）の画像を描く写真を示している。活性酵素（白字）を表示する酵母細胞を内在させた３つのマイクロキャビティと、付近の空のキャピラリ（点線円）とを比較のために示している。図３８は、パネルｂ）にて、画像の定量化も示している。図３９は、直線回帰で計算され、ｃ−Ｍｙｃタグ発現に対してプロットされたＮＰＰを発現した酵母細胞を内在させる各マイクロキャビティの反応速度を描いている。写真は、ハイライト表示されたデータ（円）の画像を描いている。
【０２８０】
[00313]  実施例６：培養マトリクス上の細胞の抽出及び成長
[00314]  アレイで培養された酵母細胞を、培養マトリクス又は捕捉面上に直接抽出した。表面に捕捉された細胞を、培養マトリクス又は培養培地に移行した。細胞の生存性の測定を行った。
【０２８１】
[00315]  材料
[00316]  ＳＤ−ＣＡＡ培地
５００ｍｌのＨ２Ｏ中
１０ｇのデキストロース
アミノ酸を伴わない３．３５ｇの窒素塩基
２．５ｇのＣａＳアミノ酸
２．７ｇのＮａ２ＨＰＯ４無水
４．２８ｇのＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ
【０２８２】
[00317]  ＳＤ−ＣＡＡ寒天プレート
５００ｍｌのＨ２Ｏ中
９１ｇのソルビトール
７．５ｇの寒天
アミノ酸を伴わない３．３５ｇの窒素塩基
２．５ｇのＣａｓアミノ酸
２．７ｇのＮａ２ＨＰＯ４無水
４．２８ｇのＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ
【０２８３】
[00318]  ＳＧ−ＣＡＡ培地
５００ｍｌのＨ２Ｏ中
１０ｇのガラクトース
アミノ酸を伴わない３．３５ｇの窒素塩基
２．５ｇのＣａｓアミノ酸
２．７ｇのＮａ２ＨＰＯ４無水
４．２８ｇのＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ
【０２８４】
[00319]  酵母成長及び蛋白質誘導：ＰＣＴ−Ｃｏｎ２プラスミドを備えた出芽酵母をＳＤ−ＣＡＡ培養で培養し、３０度でＯＤ６００＝３−６まで２４時間成長させる。細胞は、最終ＯＤ６００＝１となるように、ＳＧ−ＣＡＡにおいて遠心分離及び再懸濁される。その後、細胞は、最終ＯＤ６００＝７となるように、さらに２４時間成長させられる。ＳＧ−ＣＡＡにおける成長には、酵母細胞表面上に蛋白質を発現するためのＰＣＴ−ＣｏＮ２を含む。
【０２８５】
[00320]  酵母の染色及び投入：視認性を改善するために、誘導された酵母は、ＰＣＴ−Ｃｏｎ２プラスミドを介して酵母表面に表示されたｃ−Ｍｙｃタグを対象とした蛍光抗体で染色する。酵母は、ａｎｔｉ−ｃＭｙｃ抗体で３０分間インキュベートした後、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５染料でタグ付けされたａｎｔｉ−ｃＭｙｃ抗体に対する二次抗体で、さらに３０分間インキュベートする。ラベル付けした後、酵母細胞を、結果としてコア毎に１つの細胞（２０μｍ小孔アレイについては３２００個／ｕＬの細胞）を生じるように、計算された濃度まで希釈し、細孔アレイ上に広げる。
【０２８６】
[00321]  捕捉面の調製及び抽出：捕捉面を調製するために、２０μＬの水和流体（グリセロール）を１８ｍｍ×２４ｍｍのガラスカバースリップ上に均一に広げる。このカバースリップを小孔アレイ下、約１ｍｍに配置する。
【０２８７】
[00322]  レーザ強度が適切であれば、選択された小孔が培養マトリクス又は捕捉面上に直接抽出される。その後、細胞は、２日間、又はコロニーが形成されるまで培養した。
【０２８８】
[00323]  図４０は、検査される異なる種別の単一細胞抽出構成のすべての結果の棒グラフを示している。（１）ＦＡＣＳ〜ＳＤ−ＣＡＡは、９６ウェルプレート（ウェル毎に１つの細胞）内のＳＤ−ＣＡＡ培養培地内に直接ＦＡＣＳを行うことによって選別した細胞の結果を示している。（２）ＳＤ−ＣＡＡ寒天は、アレイから寒天コーティングされた捕捉面上に直接抽出された細胞の結果である。（３）Ｈ流体〜ＳＤ−ＣＡＡ寒天は、水和流体（グリセロール）でコーティングした捕捉面上に抽出され、寒天ＳＤ−ＣＡＡ寒天マトリクス上に反転された細胞の結果である。（４）Ｈ流体〜０．３ｍＬのＳＤ−ＣＡＡは、捕捉面（水和流体を伴う）上に抽出された後、ＳＤ−ＣＡＡ培地へ直接以降された細胞の結果を示す。（５）ガラス〜０．５ｍＬのＹＰＤ〜０．５ｍＬのＳＤ  ＣＡＡは、非コーティングガラス捕捉面上に捕捉され、ＹＰＤ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に移行された後、培地をＳＤ−ＣＡＡ培地に移行した細胞の結果を示している。（６）ガラス〜５ｍＬのＳＤ−ＣＡＡは、５ｍＬのＳＤ−ＣＡＡ培地内に直接以降された非コーティングガラス表面上に捕捉された細胞の結果を示している。（７）ガラス〜０．３ｍＬのＳＤ−ＣＡＡは、０．３ｍＬのＳＤ−ＣＡＡ培地内に直接移行された非コーティングガラス表面上に捕捉された細胞の結果を示している。単一細胞の最高生存性は、被覆された捕捉面上に細胞を抽出することと、直後のＳＤ−ＣＡＡ培地を伴う寒天上に細胞移行を配置することとを組み合わせた時に得られている。
【０２８９】
[00324]  本明細書中、本開示の好適な実施形態について図示及び説明を行ったが、当業者にとって、このような実施形態が単なる例示として提供されることは明らかである。当業者により、本開示から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換が行われるであろう。本開示の実施において、本明細書に記載の開示の実施形態に対する種々の代替が採用可能であることを理解しなければならない。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定することを意図するものであり、本特許請求の範囲の範囲内にある方法及び構造とそれらの同等物がこれによって網羅されることを意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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