(57)【要約】  コンパニオン診断に関連するエピジェネティックな染色体相互作用を判定する方法。
2018527016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブグループ間を識別するコンパニオン診断に関連するエピジェネティックな染色体相互作用を判定する方法であって、サブグループ由来の第一の核酸のセットと、染色体相互作用の指標集団に相当する第二の核酸のセットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含み、該第一および第二の核酸のセットにおける核酸が、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物に相当し、かつ該第一および第二の核酸のセットの間でのハイブリダイゼーションのパターンが、エピジェネティックな染色体相互作用が集団内のサブグループに特異的であるという判定を可能にし、該サブグループが、コンパニオン診断に関連した特徴の点で異なる方法。
【請求項２】
−サブグループが、ヒト集団内のサブグループであり、および／または
−第一の核酸のセットが、少なくとも８個の個体由来であり、および／または
−第一の核酸のセットが、第一のサブグループ由来の少なくとも４個の個体、および該第一のサブグループと好ましくは重複しない第二のサブグループ由来の少なくとも４個の個体由来であり、および／または
−第二の核酸のセットが、染色体相互作用の非選択群に相当し、および／または
−第二の核酸のセットが、規定の位置でアレイに結合しており、および／または
−第二の核酸のセットが、少なくとも１００個の異なる遺伝子または遺伝子座における染色体相互作用に相当し、および／または
−第二の核酸のセットが、少なくとも１０００種の異なるエピジェネティックな染色体相互作用に相当する少なくとも１０００種の異なる核酸を含み、および／または
−第一の核酸のセットおよび第二の核酸のセットが、１０〜１００ヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含む
請求項１記載の方法。
【請求項３】
どの遺伝子座または遺伝子が、コンパニオン診断に関連した前記特徴に関連するかを判定する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
サブグループが、
（i）特異的な治療および／または予防に（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防に）応答すること、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患の存在
の点において異なる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第一の核酸のセットが、
（i）染色体相互作用において一体となっている染色体領域をインビトロ架橋する工程；
（ii）架橋したＤＮＡを酵素による制限消化切断に供する工程；および
（iii）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、（特に、ライゲーションしたＤＮＡを含む）第一の核酸のセットを形成する工程
を含む方法において生成される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
治療および／または予防（特に、薬学的な治療および／または予防）に関連した特徴を有するサブグループを選択するコンパニオン診断アッセイ法であって、
（ａ）上記の方法によって同定されている遺伝子座を、サブグループに特徴的なエピジェネティックな相互作用を有するものとして型付けする工程、ならびに／あるいは
（ｂ）（i）特異的な治療および／または予防（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防）に応答すること、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患の存在
によって特徴的である、好ましくは少なくとも５個の異なる遺伝子座における、少なくとも５種のエピジェネティックな染色体相互作用の有無を検出する工程
を含む方法。
【請求項７】
請求項６に規定される工程（ａ）を含み、
（１）遺伝子座が遺伝子であり、および／または
（２）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が型付けされ、および／または
（３）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が遺伝子座から発現され、および／または
（４）ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が遺伝子座から発現され、および／または
（５）遺伝子座が、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基をコードする核酸配列を発現し、および／または
（６）遺伝子座は調節エレメントを発現し、および／または
（７）型付けする工程は、シーケンシングする工程もしくは遺伝子座からの発現のレベルを判定する工程を含む
請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項６に規定される工程（ｂ）を含み、
好ましくは少なくとも５個の異なる遺伝子座における、５〜５００種、好ましくは２０〜３００種、より好ましくは５０〜１００種のエピジェネティックな染色体相互作用が型付けされる
請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記特徴が、
抗体を含む治療、および／または
免疫系またはがんに関する病状
に関するコンパニオン診断に関連する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記コンパニオン診断に関連する特徴が、
−関節リウマチ患者におけるメトトレキサート（または別の関節リウマチ薬）への応答性、および／または
−急性骨髄性白血病に対する療法への応答性、および／または
−メラノーマにおける再発の可能性、および／または
−メラノーマ患者における抗−ＰＤ−１療法への応答性、および／または
−好ましくは、メラノーマ、乳がん、前立腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、膵臓がん、甲状腺がん、鼻腔がん、肝臓がんまたは肺がんの治療における、抗−ＰＤ−１、抗−ＰＤ−Ｌ１療法、または抗−ＰＤ１−１／抗−ＰＤ−Ｌ１併用療法への応答性
である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記コンパニオン診断に関連する特徴が、次の系：代謝系、免疫系、内分泌系、消化器系、外皮系、骨格系、筋肉系、リンパ系、呼吸器系、神経系または生殖器系のいずれかに関し；かつ前記特徴が、好ましくは
−多発性硬化症患者におけるＩＦＮ−Ｂ（ＩＦＮ−β）治療への応答性、および／または
−再発寛解型多発性硬化症になりやすい傾向、および／または
−一次性進行型多発性硬化症の可能性、および／または
−筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−急速進行性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−侵攻性２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−前２型糖尿病の状態になりやすい傾向、および／または
−１型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−潰瘍性結腸炎の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−潰瘍性結腸炎患者に対する結腸直腸癌の再発の可能性、および／または
−神経線維腫症患者に対する悪性末梢神経鞘腫瘍の可能性、および／または
−前立腺癌および／または侵攻性前立腺癌を発症する可能性、および／または
−神経変性の疾患もしくは病状、好ましくはアルツハイマー病、軽度認知障害、血管性認知症、レビー小体を有する認知症、前頭側頭型認知症などの認知症、もしくはより好ましくはアルツハイマー病、最も好ましくはβ−アミロイド凝集体誘導性アルツハイマー病を発症するおよび／またはそれらになりやすい傾向を有する可能性、および／または
−特に記憶および／または認知に関して、認知症患者（好ましくはアルツハイマー病患者、より好ましくはβ−アミロイド凝集体を有するアルツハイマー病患者）とアルツハイマー病を有しない認知障害患者との比較
である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
個体における病状の治療および／または予防における使用のための治療剤であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により、該個体が該治療剤を必要とするものであることが同定されている治療剤。
【請求項１３】
個体の疾患状態を第一の状態から第二の状態に変化させることのできる薬剤の同定方法であって、候補薬剤が、染色体相互作用を第一の状態に当たるものから第二の状態に当たる染色体相互作用に変化させ得るかどうかを判定する工程を含み、好ましくは該第一および第二の状態が、
（i）特異的な治療および／または予防（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防）への応答性、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患
の有無に相当し、および／または好ましくは疾患状態が請求項１〜１１のいずれか１項に規定されるコンパニオン診断に関連する特徴に相当する方法。
【請求項１４】
薬物によって引き起こされるエピジェネティックな染色体相互作用の変化を検出する工程を含む、薬物を効果を判定する方法であって、該効果が、好ましくは薬物の作用機序または薬物の薬力学的特性であり、かつ染色体相互作用が、好ましくは、
（i）特異的な治療および／または予防（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防）への応答性、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患
に特異的であり、および／または好ましくは疾患状態が請求項１〜１１のいずれか１項に規定されるコンパニオン診断に関連する特徴に相当する方法。
【請求項１５】
ゲノムの第一の遺伝子座における配列への遺伝子改変が、該ゲノムの他の遺伝子座に影響を及ぼすかどうかを判定する方法であって、遺伝子改変の後に１つまたは複数の他の遺伝子座における染色体相互作用の有無を検出する工程を含み、好ましくは該遺伝子改変が系の特徴を変化させ、該系が、好ましくは代謝系、免疫系、内分泌系、消化器系、外皮系、骨格系、筋肉系、リンパ系、呼吸器系、神経系または生殖器系であり；
−染色体シグネチャーを検出する工程が、任意で、好ましくは請求項７に規定される、好ましくは５個以上（例えば、５個）の異なる遺伝子座における、５種以上（例えば、５種）の異なる染色体相互作用の有無を検出する工程を含む、および／または
−好ましくは、該染色体のシグネチャーまたは相互作用は、請求項１〜５のいずれかに規定されている方法により同定される、および／または
−改変された遺伝子座および／または染色体相互作用の有無が検出される染色体の１個以上の遺伝子座がＣＴＣＦ結合部位を含む、および／または
−検出された染色体相互作用が請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンパニオン診断に関連する特徴に相当する
方法。
【請求項１６】
前記遺伝子改変が、細胞内に、（ａ）２種以上種類のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、または２種以上のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｂ）２種以上のガイドＲＮＡ、または２種以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する工程を含み、各ガイドＲＮＡが、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼの１つを、染色体配列における標的部位にガイドし、かつＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが、標的部位における染色体配列の少なくとも１本の鎖を切断する方法により達成される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝的改変は、標的配列を有しかつ遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有しかつ発現する真核細胞内に、操作された天然には生じない、クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムを導入する工程を含み、少なくとも１種の遺伝子産物の発現を変更し、
ａ）標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結された、真核細胞において作動可能な第一の調節エレメント、および
ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、真核細胞において作動可能な第二の調節エレメント
を含む１種以上のベクターを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）は、該システムの同じかまたは異なるベクター上に位置し、それによってガイドＲＮＡは標的配列を標的にし、かつＣａｓ９タンパク質はＤＮＡ分子を切断し、それによって少なくとも１種の遺伝子産物の発現は変更され；そして、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは天然には一緒に生じず、好ましくは各ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来しかつ少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み、そして任意で、２種のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼのそれぞれのヌクレアーゼドメインの一方は、各ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが二本鎖配列の一方の鎖を切断するように改変され、そして２種のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、染色体配列に二本鎖断裂を一緒に導入し、それは、染色体配列が改変されるようなＤＮＡ修復過程によって修復される
請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝的改変が、少なくとも５、２０、５０、１００、または１０００塩基、好ましくは１０，０００または１０００，０００塩基までの、欠失、挿入または置換を含む請求項１５〜１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体相互作用を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
医療費は高騰しており、そのため既存の薬物をより効果的に用いて人々を治療する必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、コンパニオン診断の基礎としてまたはそれと合わせた使用のための、ならびに特に、療法（例えば、薬学的療法）への応答性、疾患／病状になりやすい傾向、および／または残存疾患をモニターすることを判定するためのエピジェネティック状態の検出における、エピジェネティックな染色体相互作用の使用を検討した。本発明者らの仕事は、多様なセットの病状におけるエピジェネティックな相互作用によって果たされる役割を示し、かつ関連する染色体相互作用を同定するための方法を提供する。本発明は、個体のサブグループに存在する染色体相互作用に注目することに基づく、関連する染色体相互作用を同定する方法を含む。本発明は、コンパニオン診断検査のための基礎として、同定された染色体相互作用を用いることも含む。
【０００４】
したがって、本発明の第一の局面は、サブグループ由来の第一の核酸のセットと、染色体相互作用の指標集団に相当する第二の核酸のセットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含む、サブグループ間を識別するコンパニオン診断に関連するエピジェネティックな染色体相互作用を判定する方法を提供し、該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物に相当し、かつ該第一および第二の核酸のセットの間でのハイブリダイゼーションのパターンは、エピジェネティックな染色体相互作用が集団内のサブグループに特異的であるという判定を可能にし、該サブグループは、コンパニオン診断に関連した特徴の点で異なる。
【０００５】
好ましくは、本発明の第一の局面（および／または他の任意の局面）において、
−サブグループは、動物（例えば、哺乳類または線虫）集団内のサブグループ、最も好ましくはヒト集団内のサブグループであり；および／または
−第一の核酸のセットは、少なくとも８個の個体由来であり、および／または
−第一の核酸のセットは、第一のサブグループ由来の少なくとも４個の個体、および該第一のサブグループと好ましくは重複しない第二のサブグループ由来の少なくとも４個の個体由来であり、および／または
−第二の核酸のセットは、染色体相互作用の非選択群に相当し；および／または
−第二の核酸のセットは、規定の位置でアレイに結合しており；および／または
−第二の核酸のセットは、少なくとも（least）１００個の異なる遺伝子または遺伝子座における染色体相互作用に相当し；および／または
−第二の核酸のセットは、少なくとも１０００種の異なるエピジェネティックな染色体相互作用に相当する少なくとも１０００種の異なる核酸を含み；および／または
−第一の核酸のセットおよび第二の核酸のセットは、１０〜１００ヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含み；および／または
−方法を行って、どの遺伝子座または遺伝子が、コンパニオン診断に関連した特徴に関連するかを判定し；および／または
−サブグループは、
（i）特異的な治療および／または予防に（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防に）応答すること、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患の存在
の点において異なり；および／または
−第一の核酸のセットは、
（i）染色体相互作用において一体となっている染色体領域をインビトロ架橋する工程；
（ii）架橋したＤＮＡを酵素による制限消化切断に供する工程；および
（iii）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、（特に、ライゲーションしたＤＮＡを含む）第一の核酸のセットを形成する工程
を含む方法において生成され；および／または
−コンパニオン診断に関連した特徴は、
（i）関節リウマチ患者におけるメトトレキサートへの（または別の関節リウマチ薬への）応答性、および／または
（ii）急性骨髄性白血病に対する療法への応答性；および／または
（iii）メラノーマにおける再発の可能性
である。
【０００６】
好ましくは、本発明の第一および／または他の局面において、「該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物に相当する」という特質は、「該第一および第二の核酸のセットにおける核酸は、エピジェネティックな染色体相互作用において一体となっている染色体領域の両方由来の配列を含むライゲーションした産物（好ましくはライゲーションした核酸、より好ましくはライゲーションしたＤＮＡ）の形態にある」を含み得るまたはそれであり得る。
【０００７】
本発明の第二の局面は、治療および／または予防（特に、薬学的な治療および／または予防）に関連した特徴を有するサブグループを選択するコンパニオン診断アッセイ法を提供し、該方法は、
（ａ）上記の方法によって同定されている遺伝子座を、サブグループに特徴的なエピジェネティックな相互作用を有するものとして型付けする工程、ならびに／あるいは
（ｂ）i．特異的な治療および／または予防（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防）に応答すること、および／または
ii．特異的な病状になりやすい傾向、および／または
iii．再発につながり得る残存疾患の存在
によって特徴的である、好ましくは少なくとも５個の異なる遺伝子座における、少なくとも５種のエピジェネティックな染色体相互作用の有無を検出する工程
を含む。
【０００８】
好ましくは、本発明の第二の局面（および／または他の任意の局面）において、
−方法は、本発明の第二の局面において規定される工程（ａ）を含み、
（１）遺伝子座は遺伝子であり、および／または
（２）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が型付けされ、および／または
（３）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は遺伝子座から発現され、および／または
（４）ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は遺伝子座から発現され、および／または
（５）遺伝子座は、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基をコードする核酸配列を発現し、および／または
（６）遺伝子座は調節エレメントを発現し、および／または
（７）型付けする工程は、シーケンシングする工程もしくは遺伝子座からの発現のレベルを判定する工程を含み；および／または
−方法は、本発明の第二の局面において規定される工程（ｂ）を含み、
−好ましくは少なくとも５個の異なる遺伝子座における、５〜５００種、好ましくは２０〜３００種、より好ましくは５０〜１００種のエピジェネティックな染色体相互作用が型付けされ；および／または
−好ましくは少なくとも５個の異なる遺伝子座における、５〜５００種、好ましくは２０〜３００種、より好ましくは５０〜１００種のエピジェネティックな染色体相互作用の有無が検出される。
【０００９】
本発明の第二の局面（および／または他の任意の局面）のまたはそれにおける他の好ましいまたは特定の特質には、以下のものが含まれる。
【００１０】
本発明の第二の局面のコンパニオン診断アッセイ法を特に用いて、本明細書において言及される特異的な病状または特徴のいずれかの存在を検出し得る。
【００１１】
好ましくは、本発明の第二の局面のコンパニオン診断法を用いて、すべての場合において、好ましくはヒトにおいて、
−関節リウマチ患者におけるメトトレキサート（または別の関節リウマチ薬）への応答性、
−急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に対する療法への応答性、
−メラノーマにおける再発の可能性、
−前立腺癌および／または侵攻性前立腺癌を発症する可能性、および／または
−神経変性の疾患もしくは病状、好ましくはアルツハイマー病、軽度認知障害、血管性認知症、レビー小体を有する認知症、前頭側頭型認知症などの認知症、もしくはより好ましくはアルツハイマー病、最も好ましくはβ−アミロイド凝集体誘導性アルツハイマー病を発症するおよび／またはそれらになりやすい傾向を有する可能性、および／または
−特に記憶および／または認知に関して、認知症患者（好ましくはアルツハイマー病患者、より好ましくはβ−アミロイド凝集体を有するアルツハイマー病患者）とアルツハイマー病を有しない認知障害患者との比較
を検出する。
【００１２】
好ましくは、本発明の第二の局面においておよびすべての他の局面において、（特に、ヒトにおける）疾患または病状は、
−特にヒトにおける、炎症性疾患、好ましくは関節リウマチ；
−特にヒトにおける、血液癌、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；
−特にヒトにおける、固形癌／固形腫瘍、好ましくはメラノーマ、前立腺癌、および／または侵攻性前立腺癌；および／または
−特にヒトにおける、神経変性の疾患もしくは病状、好ましくはアルツハイマー病、軽度認知障害、血管性認知症、レビー小体を有する認知症、前頭側頭型認知症などの認知症、もしくはより好ましくはβ−アミロイド凝集体誘導性アルツハイマー病などのアルツハイマー病、および／または
−抗体療法、好ましくは抗ＰＤ１療法などの免疫療法への応答性
を含む。
【００１３】
一態様において、療法、好ましくは抗ＰＤ１療法への応答性は、好ましくは、示されているおよび／または好ましくはウイルス感染などの他の表示された特徴を有するステージまたはクラスの、以下の癌のいずれかにおいて検出される。
−ＤＬＢＣＬ＿ＡＢＣ：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫亜型活性化Ｂ細胞
−ＤＬＢＣＬ＿ＧＢＣ：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫亜型胚中心Ｂ細胞
−ＨＣＣ：肝細胞癌腫
−ＨＣＣ＿ＨＥＰＢ：Ｂ型肝炎ウイルスを有する肝細胞癌腫
−ＨＣＣ＿ＨＥＰＣ：Ｃ型肝炎ウイルスを有する肝細胞癌腫
−ＨＥＰＢ＋Ｒ：寛解期にあるＢ型肝炎
−Ｐｃａ＿クラス３：前立腺癌ステージ３
−Ｐｃａ＿クラス２：前立腺癌ステージ２
−Ｐｃａ＿クラス１：前立腺癌ステージ１
−ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ４：乳癌ステージ４
−ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ３Ｂ：乳癌ステージ３Ｂ
−ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ２Ａ：乳癌ステージ２Ａ
−ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ２Ｂ：乳癌ステージ２Ｂ
−ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ１Ａ：乳癌ステージ１Ａ
−ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ１：乳癌ステージ１
【００１４】
病状または特徴は、
−多発性硬化症患者におけるＩＦＮ−Ｂ（ＩＦＮ−β）治療への応答性、および／または
−再発寛解型多発性硬化症になりやすい傾向、および／または
−一次性進行型多発性硬化症の可能性、および／または
−（特にヒトにおける）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−急速進行性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−侵攻性２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−前２型糖尿病の状態になりやすい傾向、および／または
−１型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−潰瘍性結腸炎の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−潰瘍性結腸炎患者に対する結腸直腸癌の再発の可能性、および／または
−神経線維腫症患者に対する悪性末梢神経鞘腫瘍の可能性、および／または
−前立腺癌および／または侵攻性前立腺癌を発症する可能性
であり得る。
【００１５】
本発明の第三の局面は、個体における（特に、ヒト個体における）病状の治療および／または予防における使用のための治療剤（特に、薬学的治療剤）を提供し、該個体は、本発明の第二の局面の方法によって該治療剤を必要としていると同定されている。本発明の第三の局面は、個体における（特に、ヒト個体における）病状の治療および／または予防における使用のための医薬（特に、治療剤を含む薬学的組成物）の製造における治療剤（例えば、薬学的治療剤）の使用も提供し、該個体は、本発明の第二の局面の方法によって該治療剤を必要としていると同定されている。本発明の第三の局面は、治療剤（例えば、薬学的治療剤および／または効果的な量の治療剤）を個体に投与する工程を含む、個体における（特に、ヒト個体および／またはそれを必要としている個体における）病状の治療および／または予防の方法も提供し、該個体は、本発明の第二の局面の方法によって該治療剤を必要としていると同定されている。
【００１６】
好ましくは、本発明の第三の局面（および／または他の局面）において、治療剤（特に、薬学的治療剤）は、
−特にヒトにおける、炎症性疾患の治療および／または予防における使用に適した薬学的活性薬剤（例えば、化合物、またはタンパク質もしくは抗体などの生物的／生物学的な薬剤）；
−特にヒトにおける、好ましくは、関節リウマチ（ＲＡ）の治療および／または予防における使用に適した薬学的活性薬剤（例えば、化合物、またはタンパク質もしくは抗体などの生物的／生物学的な薬剤）であって、好ましくは該薬学的活性薬剤は、メトトレキサート；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）阻害剤、特にインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ・ペゴル、もしくはゴリムマブなどのモノクローナル抗体ＴＮＦ−α阻害剤、またはエタネルセプトなどの循環受容体融合タンパク質ＴＮＦ−α阻害剤；または、アバタセプトなどのＴ細胞共刺激阻害剤；または、アナキンラなどのインターロイキン１（ＩＬ−１）阻害剤；または、リツキシマブもしくはトシリズマブなど、Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体を含む、薬学的活性薬剤；あるいは
−特にヒトにおける、血液癌、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療および／または予防における使用に適した薬学的活性薬剤（例えば、化合物、またはタンパク質もしくは抗体などの生物的／生物学的な薬剤）；あるいは
−特にヒトにおける、固形癌／固形腫瘍、好ましくはメラノーマ、前立腺癌、および／または侵攻性前立腺癌の治療および／または予防における使用に適した薬学的活性薬剤（例えば、化合物、またはタンパク質もしくは抗体などの生物的／生物学的な薬剤）；あるいは
−特にヒトにおける、神経変性の疾患もしくは病状、好ましくはアルツハイマー病、軽度認知障害、血管性認知症、レビー小体を有する認知症、前頭側頭型認知症などの認知症、もしくはより好ましくはβ−アミロイド凝集体誘導性アルツハイマー病などのアルツハイマー病の治療および／または予防における使用に適した薬学的活性薬剤（例えば、化合物、またはタンパク質もしくは抗体などの生物的／生物学的な薬剤）
を含む。
【００１７】
本発明の第四の局面は、候補薬剤が、染色体相互作用を第一の状態に当たるものから第二の状態に当たる染色体相互作用に変化させ得るかどうかを判定する工程を含む、個体の疾患状態を第一の状態から第二の状態に変化させ得る薬剤を同定する方法を提供し、好ましくは該第一および第二の状態は、
（i）特異的な治療および／または予防（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防）への応答性、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患
の有無に当たる。
【００１８】
本発明の第五の局面は、薬物によって引き起こされるエピジェネティックな染色体相互作用の変化を検出する工程を含む、薬物を効果を判定する方法を提供し、該効果は、好ましくは薬物の作用のメカニズムまたは薬物の薬力学的特性であり、かつ該染色体相互作用は、好ましくは、
（i）特異的な治療および／または予防（特に、特異的な薬学的な治療および／または予防）への応答性、および／または
（ii）特異的な病状になりやすい傾向、および／または
（iii）再発につながり得る残存疾患
に特異的である。
【００１９】
付加的にまたは代替的に、本発明のすべての局面の好ましい態様に従って、本発明は、５種以上（特に、７種以上、または１０種以上、または１５種以上、または２０種以上）の染色体相互作用の有無を検出する工程を含む、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類）における関節リウマチに対する特異的療法（特に、特異的薬学的療法）への応答性を判定する方法であって、該染色体相互作用は、特に５個以上（例えば、５個）の異なる遺伝子座にあり；および／または該検出する工程は、特に、相互作用の一部である染色体の領域が一つにまとまっているか否かを各相互作用について判定する工程を含む、方法には関しない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関するパイ図表である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。パイ図表は、ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者の両方に関するＣＤＡＩスコアの臨床的解釈を示している。
【図１Ｂ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関するグラフである。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者のＣＤＡＩスコア。
【図１Ｃ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。ＲおよびＮＲ、ならびに健常対照（ＨＣ）から診断時に採取された末梢血単核細胞のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ解析は、９２２種の統計的に有意な層別化マーカー候補を同定した。さらなる解析により、４２０種はＮＲに、２１０種はＲに、そして１５９種はＨＣに特異的であることが明らかになった。パイ図表は、スクリーニングされた１３，３２２種の条件付き染色体コンフォメーションに関する割合を示している。すべてのマーカーは、調整されたｐ＜０．２を示した。
【図１Ｄ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、ＭＴＸ応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）とを弁別することに関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の発見コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism））応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。完全連結凝集によるマンハッタン距離測定を用いた階層的クラスタリングが、ヒートマップによって示されている。３つの群（Ｒ、ＮＲ、およびＨＣ）にわたる二元パターン形成（pattering）を用いたマーカー選択により、初めに９２２種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーは６５種に、次いで上位３０種のマーカーに縮小された。
【図２Ａ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関するパイ図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。パイ図表は、ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者の両方に関するＣＤＡＩスコアの臨床的解釈を示している。
【図２Ｂ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関するグラフである。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。ベースラインおよび６ヶ月の時点におけるＲおよびＮＲ患者のＣＤＡＩスコア。****Ｐ＜０．０００１、ダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較事後検定とのクラスカル・ウォリス検定による。
【図２Ｃ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。５種の分類化ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの相関プロット。赤色のボックスは、ＮＲを規定するマーカーを示し、一方でオレンジ色のボックスは、Ｒを規定するマーカーを示した。
【図２Ｄ】染色体コンフォメーションシグネチャーＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの洗練および検証に関する図である。応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者の検証コホートは、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）応答基準（方法を参照されたい）に基づいて選択された。５種の分類化ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関するそれらの二元スコアに基づく、６０人の患者コホートに対する主成分分析（ＰＣＡ）。
【図３Ａ】メトトレキサート（ＭＴＸ）治療への応答に関する予後層別化およびモデル検証に関するグラフである。５種のＣＣＳマーカーロジスティック回帰分類子を用いたデータの１５０回の無作為化からの、５種の選択された受信者動作特徴（ＲＯＣ）曲線の代表的な例。
【図３Ｂ】メトトレキサート（ＭＴＸ）治療への応答に関する予後層別化およびモデル検証に関するグラフである。ＭＴＸ応答者とＭＴＸ非応答者とを判別するために選択されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーを用いた、応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）ＲＡ患者対健常対照（ＨＣ）に関する因子分析。
【図４】３Ｃ抽出過程の概略図である。３Ｃとは、クロマチン立体構造キャプチャーまたは染色体コンフォメーションキャプチャーを意味する。
【図５】ＭＴＸ治療の６ヶ月以内に応答者（Ｎ）または非応答者（ＮＲ）として確認された、ＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者に関するエピジェネティックな層別化バイオマーカーシグネチャーの発見および検証のための設計を図解したスキームである。エピジェネティックな層別化は、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイおよびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プラットフォームによってスクリーニングされかつモニターされた条件付き染色体コンフォメーションに基づいた。同定されたバイオマーカーの疾患特異的なエピジェネティックな性質は、健常対照（ＨＣ）に対する層別化によって確認された。検証は、６０人のＲＡ患者（３０人の応答者および３０人の非応答者）および３０人のＨＣに対して実施された。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、いくつかの異なる局面：
−特にサブグループ間を識別する、コンパニオン診断に関連した染色体相互作用（特に、エピジェネティックな）を同定する方法；
−コンパニオン診断法；
−個体の治療および／または予防（例えば、個体、例えばヒト個体における、病状の治療および／または予防）における使用のための治療剤であって、該個体は、特に本発明のコンパニオン診断法によって治療剤を必要としていると同定されている、治療剤；
−候補薬剤が、染色体相互作用、特に疾患状態に関連したまたはそれと関連がある染色体相互作用を変化させ得るかどうかを判定する工程を含む、個体におけるまたは個体の疾患状態を変化させ得る薬剤、特に治療剤をスクリーニングする（同定する）方法；
−薬物によって引き起こされるエピジェネティックな染色体相互作用の変化を検出する工程を含む、薬物の効果を判定する方法
を有する。
【００２２】
エピジェネティックな相互作用
本明細書において使用するとき、「エピジェネティックな」相互作用という用語は、典型的に、染色体上の遺伝子座の遠位領域間での相互作用を指し、該相互作用は、染色体の領域の状態に応じて動的であり、かつ変容し、形成され、または壊れる。
【００２３】
本発明の特定の方法において、染色体相互作用は、染色体相互作用の一部である染色体の両領域由来の配列を含むライゲーションした核酸をまず生成することによって検出される。そのような方法において、領域は、任意の適切な手段によって架橋され得る。好ましい態様において、相互作用は、ホルムアルデヒドを用いて架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルもしくはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによっても架橋され得る。パラホルムアルデヒドは、４オングストローム離れているＤＮＡ鎖を架橋し得る。
【００２４】
染色体相互作用は、染色体の領域の状態、例えばそれが生理学的条件の変化に応答して転写されているまたは抑制されているかどうかを反映し得る。本明細書において規定されるサブグループに特異的である染色体相互作用は、安定であることが見出されており、ゆえに２つのサブグループ間での差を測定する確実な手段を提供する。
【００２５】
加えて、疾患状況に特異的な染色体相互作用は、通常、例えばメチル化またはヒストンタンパク質の結合への変化などの他のエピジェネティックマーカーと比較して、疾患過程における早期に生じると考えられる。ゆえに、本発明のコンパニオン診断法は、疾患状態の早期ステージを検出することができる。このことは、結果としてより効果的であり得る早期治療を可能にする。本発明の別の利点は、関連する染色体相互作用の同定にどの遺伝子座が関連するかについての事前知識を必要としないことである。さらに、同じサブグループ内の個体間で、関連する染色体相互作用にほとんど変動がない。染色体相互作用を検出することは、１遺伝子あたり最大５０種の考え得る異なる相互作用を有して非常に有益であり、そのため本発明の方法は、５００，０００種の異なる相互作用を詮索し得る。
【００２６】
エピジェネティックな相互作用の位置および原因
エピジェネティックな染色体相互作用は、関連するまたは記載されていない遺伝子をコードすることが示された染色体の領域と重複し得かつ含み得るが、同様に遺伝子間領域にあり得る。さらに留意すべきは、本発明者らは、すべての領域におけるエピジェネティックな相互作用が、染色体座の状態を判定することにおいて同様に重要であることを発見したことである。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域にあるわけではなく、遺伝子間領域にあり得る。
【００２７】
本発明において検出される染色体相互作用は、基礎となるＤＮＡ配列への変化によって、環境因子、ＤＮＡメチル化、ノンコーディングアンチセンスＲＮＡ転写産物、非変異原性発癌物質、ヒストン修飾、クロマチン再構成、および特異的な局所ＤＮＡ相互作用によって引き起こされ得る。染色体相互作用につながる変化は、それ自体は遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響を及ぼさない、基礎となる核酸配列への変化によって引き起こされ得る。そのような変化は、例えば遺伝子の内部および／または外側のＳＮＰ、遺伝子融合、および／または遺伝子間ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびノンコーディングＲＮＡの欠失であり得る。例えば、大体２０％のＳＮＰがノンコーディング領域にあることが知られており、それゆえ記載される方法は、ノンコーディング場面においても有益である。一態様において、一体となって相互作用を形成する染色体の領域は、５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対、または２００塩基対未満離れている。
【００２８】
コンパニオン診断法において検出される染色体相互作用は、好ましくは本明細書において表中で言及される遺伝子のいずれかの内部にあるものである。しかしながら、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子からまたはコード配列から最大５０，０００、３０，０００、２０，０００、１０，０００、または５０００塩基上流または下流にもあり得る。
【００２９】
検出される染色体相互作用は、遺伝子（コード配列を含む）と、プロモーターなどのその調節領域との間で生じるものであってもなくてもよい。型付けされる染色体相互作用は、遺伝性であるもの、例えば遺伝子領域の遺伝性の刷り込まれた特徴であってもなくてもよい。
【００３０】
臨床場面のタイプ
ＲＡ（関節リウマチ）の具体的症例は、一般原理を解説する。現在、患者が最初に薬物を与えられた際に患者がメトトレキサート（ＭＴＸ）に応答するかどうかを臨床医が判定するために先験的に用い得る検査はない。相当数（約３０％）の患者はＭＴＸに応答しないため、患者が応答者または非応答者であるかどうかを予測し得ることは、ＲＡの治療に成功する、ならびに時間および金銭を節約する機会を増加させるであろう。
【００３１】
これは、本発明者らが、用いられる対象となる本発明をどのように可視化するかについての一例である。より大まかに言えば、本発明の目的は、疾患の検出およびモニタリングを可能にすることである。より詳細には、この技術は、医学的病状に関係する特異的表現型に対するバイオマーカーに基づき、すなわち特定の染色体コンフォメーションシグネチャーおよび／またはその特定のシグネチャーの変化を認識することによって、層別化を可能にする。
【００３２】
本発明の方法は、好ましくは、治療および／または予防への応答性、最も効果的な療法／薬物の同定、疾患の経過のモニタリング、疾患になりやすい傾向の同定、および／または残存疾患の存在および／または再発の可能性の同定など、疾患に関係する特異的な特徴の背景において用いられる。それゆえ、方法は、特異的な病状の存在の診断に用いられても用いられなくてもよい。本発明の方法を用いて、疾患のメカニズムが不明である、不明確である、または複雑である遺伝子座を型付けし得る。染色体相互作用の検出は、その一部が複雑である、種々のレベルの調節における変化に従う効率的なやり方を提供する。例えば、ある場合には、３７，０００個前後のノンコーディングＲＮＡは、単一の誘発因子によって活性化され得る。
【００３３】
サブグループおよび個別化治療
本明細書において使用するとき、「サブグループ」とは、好ましくは、集団サブグループ（集団内のサブグループ）、より好ましくは特定の哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスもしくはラット）または特定の線虫（例えば、シー・エレガンス（C. elegans））などの特定の動物の集団内のサブグループを指す。最も好ましくは、「サブグループ」とは、ヒト集団内のサブグループを指す。
【００３４】
関心対象の特定の集団、例えばヒト集団には、ヒト集団全体、特異的な病状／疾患（特に、炎症性疾患、例えばＲＡ、血液癌、例えばＡＭＬ、固形癌、例えばメラノーマもしくは前立腺癌（ＰＣ）、または神経変性の疾患／病状、例えばアルツハイマー病（ＡＤ））に罹患しているヒト集団、ヒト健常集団（健常対照）、関心対象のもしくは調査対象の特異的な病状／疾患（例えば、ＲＡ、ＡＭＬ、メラノーマ、ＰＣ、またはＡＤ）に罹患していないという意味で健常であるヒト集団、特定の薬物／療法に応答者であるヒト集団（例えば、健常な、および／または特異的な病状／疾患、例えばＲＡ、ＡＭＬ、メラノーマ、ＰＣ、もしくはＡＤを有する）、または特定の薬物／療法に非応答者であるヒト集団（例えば、健常な、および／または特異的な病状／疾患、例えばＲＡ、ＡＭＬ、メラノーマ、ＰＣ、もしくはＡＤを有する）が含まれる。
【００３５】
本発明は、集団における、好ましくはヒト集団における特定のサブグループを検出することおよび治療することに関する。そのようなサブグループの中には、本明細書において論じられる特徴（治療および／または予防への応答性；特に１つもしくは複数の病状もしくは疾患の特異的な治療および／または予防への応答性、および／または特に１つもしくは複数の病状もしくは疾患の治療および／または予防における、特異的医療もしくは治療的活性物質／治療剤への応答性など）が存在するまたは存在しないと考えられる。染色体上のエピジェネティックな相互作用の差は、一般的に言えば、ゲノムレベルで存在する構造差である。本発明者らは、これらが、所与の集団における部分集合（例えば２つの、または２つ以上の部分集合）の間で異なることを発見した。これらの差を同定することにより、医師は、方法において記載される集団の１つの部分集合の一部として彼らの患者を類別することが可能となる。それゆえ、本発明は、患者に対する医療を彼らのエピジェネティックな染色体相互作用に基づいて個別化する方法を医師に提供し、かつ代替的なより効果的な治療および／または予防レジームを提供する。
【００３６】
別の態様において、どの程度対象が集団の一方のサブグループに属しかつ他方のサブグループに属しないものとして規定されるかを判定するための閾値レベルが適用される。サブグループが特定の疾患の治療および／または予防のための療法の応答者対非応答者を含む１つの好ましい態様において、閾値は、特に関節リウマチに対して、ＤＡＳ２８（２８関節の疾患活動性スコア）スコアの変化によって測定され得る。一態様において、１．２単位を上回るスコアは、対象が応答者サブグループに入ることを示し、一方で１．２単位を下回るスコアは、対象が非応答者として規定されることを示す。
【００３７】
典型的に、サブグループは、一般集団の少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％である。
【００３８】
ライゲーションした核酸を生成する
本発明のある特定の態様は、ライゲーションした核酸、特にライゲーションしたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用において一体となる領域の両方由来の配列を含み、それゆえ、相互作用についての情報を提供する。本明細書において記載されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、そのようなライゲーションした核酸の生成を用いて、染色体相互作用を検出する。
【００３９】
１つのそのような方法、特に、染色体相互作用を検出する１つの特定の方法、および／またはエピジェネティックな染色体相互作用を判定する１つの特定の方法、および／またはライゲーションした核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成する１つの特定の方法は、
（i）染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用をインビトロ架橋する工程；
（ii）任意で、架橋したＤＮＡを染色体座から単離する工程；
（iii）架橋したＤＮＡを、少なくとも１回それを切る酵素（特に、該染色体座内で少なくとも１回切る酵素）による制限消化に供する工程；
（iv）（特に、ＤＮＡループを形成するために、）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションする工程；ならびに
（v）特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの技法を用いて、ライゲーションしたＤＮＡおよび／またはＤＮＡループの存在を同定して、特異的な染色体相互作用の存在を同定する工程
を含む。
【００４０】
架橋、制限消化、ライゲーション、および同定についてのとりわけ上記の工程を伴う、染色体相互作用および／またはエピジェネティックな変化を検出する、判定する、および／またはモニターする１つの特に好ましい方法が、国際公開第２００９／１４７３８６号（オックスフォード  バイオダイナミックス社）に開示されており、その全開示（特に、その請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１）は、あたかも完全に明記されているかのように参照により本明細書に組み入れられる。ライゲーションした産物および／またはライゲーションした核酸を伴う本発明のそうした方法において用いられ得る国際公開第２００９／１４７３８６号の請求項１は、少なくとも１つの染色体座における条件付きの長距離染色体相互作用の変化をモニターする工程を含む、エピジェネティックな変化をモニターする方法であって、長距離相互作用のスペクトルは特異的な生理学的条件と関連がある方法を開示し、該方法は、
（i）少なくとも１つの染色体座に存在する長距離染色体相互作用をインビトロ架橋する工程；
（ii）架橋したＤＮＡを染色体座から単離する工程；
（iii）架橋したＤＮＡを、少なくとも１つの染色体座内で少なくとも１回切る酵素による制限消化に供する工程；
（iv）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ＤＮＡループを形成する工程；および
（v）ＤＮＡループの存在を同定する工程
を含み、ＤＮＡループの存在は特異的な長距離染色体相互作用の存在を示す。
【００４１】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ライゲーションした核酸を検出するまたは同定するために用いられ得、例えば産生されたＰＣＲ産物のサイズは、存在する特異的染色体相互作用を示し得、それゆえ遺伝子座の状態を同定するために用いられ得る。当業者であれば、関心対象の染色体座内でＤＮＡを切るために用いられ得る無数の制限酵素を承知しているであろう。用いられる特定の酵素が、調査される遺伝子座およびそこに位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明において記載されるＤＮＡを切るために用いられ得る制限酵素の非限定的な例は、ＴａｑＩポリメラーゼである。
【００４２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術などの態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャーの検出における、マイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関係する。本発明者らは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームが、健常対照に対して特定の不利な表現型サブグループに特異的な潜在的バイオマーカーの染色体シグネチャープールの発見にどのように用いられているかを本明細書において記載する。本発明者らは、アレイで検査されたコホート由来のサブグループの間での特異的ないくつかのマーカーの例を用いて、マイクロアレイからの染色体コンフォメーションシグネチャーの有効な使用およびＰＣＲプラットフォームへの転換の例も提供する。
【００４３】
（関連する染色体相互作用を同定するための、およびコンパニオン診断法における）本明細書において記載される様式で、ライゲーションした核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの態様は、いくつかの利点を有する。例えば本発明の第一の核酸のセット由来の核酸配列は、第二の核酸のセットとハイブリダイズするまたはハイブリダイズしないため、それらは低レベルの確率的ノイズを有する。これは、エピジェネティックなレベルにおける複雑なメカニズムを測定する比較的簡潔なやり方を可能にする二元結果を提供する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、迅速な処理時間および低コストも有する。一態様において、処理時間は３時間〜６時間である。
【００４４】
サンプルおよびサンプル処置
サンプルは、個体由来のＤＮＡを含有すると考えられる。それは、通常細胞を含有すると考えられる。一態様において、サンプルは、最小限に侵襲的な手段によって獲得され、例えば血液であり得る。ＤＮＡは抽出され得、かつ標準的な制限酵素で細かく切られ得る。これは、どの染色体コンフォメーションが保持されかつＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかをあらかじめ判定し得る。サンプルが患者から以前に獲得された血液サンプルである一態様において、記載される方法は、手順が最小限に侵襲的であるため有利である。水平移動を含めた、組織と血液との間での染色体相互作用の同時性により、血液サンプルを用いて、疾患に関連した組織などの組織における染色体相互作用を検出し得る。癌などのある特定の病状に関しては、変異による遺伝子ノイズが、関連組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼし得、それゆえ血液を用いることが有利である。
【００４５】
本発明の核酸の特性
本明細書における開示は、第一および第二の核酸に言及する。加えて、該核酸をコンパニオン診断法においておよび他の態様において用いて、染色体相互作用の有無を検出する（例えば、サンプルから生成されたライゲーションした核酸に結合させることによって）。本発明の核酸は、典型的に、染色体相互作用において一体となる染色体の２つの領域の一方由来の配列をそれぞれが含む２つの部分を含む。典型的に、それぞれの部分は、長さが少なくとも８、１０、１５、２０、３０、または４０ヌクレオチドである。好ましい核酸は、特に核酸がその表に関連した病状に関連した態様において用いられる場合、表中で言及される遺伝子のいずれか由来の配列を含む。好ましい核酸は、特異的な病状、またはそのような配列のフラグメントもしくはホモログに対して、表中で言及される特異的プローブ配列を含む。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の態様において必要に応じて相補体を用い得ると理解される。
【００４６】
第二の核酸のセット−「指標」配列
第二の核酸配列のセットは、指標であるという機能を有し、かつ本質的に、サブグループ特異的配列を同定するのに適している核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用に相当し得、かつ何らかのやり方で選択され得るまたは選択され得ない。それらは、一般に、すべての考え得る染色体相互作用の部分集合である。
【００４７】
第二の核酸のセットは、任意の適切な方法によって導き出され得る。それらは、コンピューターにより導き出され得る、またはそれらは、個体における染色体相互作用に基づき得る。それらは、典型的に、第一の核酸のセットよりも大きな集団群に相当する。一つの特定の実施態様において、第二の核酸のセットは、遺伝子の特異的セットにおけるすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用に相当する。別の特定の実施態様において、第二の核酸のセットは、本明細書において記載される集団に存在するすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用の大部分に相当する。一つの特定の実施態様において、第二の核酸のセットは、少なくとも２０、５０、１００、または５００種の遺伝子におけるエピジェネティックな染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％に相当する。
【００４８】
第二の核酸のセットは、典型的に、集団における疾患状態／表現型を改変する、調節する、または何らかのやり方で仲介する少なくとも１００種の考え得るエピジェネティックな染色体相互作用に相当する。第二の核酸のセットは、例えば任意の疾患状態、疾患または疾患表現型になりやすい傾向と関連があるサイトカイン、キナーゼ、または調節因子をコードする核酸配列を含む、種における疾患状態に影響を及ぼす染色体相互作用に相当し得る。第二の核酸のセットは、コンパニオン診断法に関連したおよび関連しないエピジェネティックな相互作用に相当する配列を含む。
【００４９】
一つの特定の態様において、第二の核酸のセットは、集団における天然に生じる配列に少なくとも部分的に由来し、かつ典型的にインシリコ法によって獲得される。該核酸は、天然に生じる核酸に存在する核酸の対応する部分と比較して、単一または複数の変異をさらに含み得る。変異には、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の欠失、置換、および／または付加が含まれる。一つの特定の態様において、第二の核酸のセットは、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルソログに相当する配列を含み得る。別の特定の態様において、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００５０】
第二の核酸のセットの特性
一つの特定の態様において、第二の核酸のセットには、少なくとも１００種の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００、または５０００種の異なる核酸配列、最大で１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００種の異なる核酸配列が存在する。典型的な数は、１，０００〜１００，０００種の異なる核酸配列など、１００〜１，０００，０００種であると考えられる。これらのすべてまたは少なくとも９０％もしくは少なくとも５０％は、異なる染色体相互作用に当たると考えられる。
【００５１】
一つの特定の態様において、第二の核酸のセットは、１００〜１０，０００種の異なる遺伝子座または遺伝子など、少なくとも２０種の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、好ましくは少なくとも４０種の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、およびより好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００種の異なる遺伝子座もしくは遺伝子における染色体相互作用に相当する。
【００５２】
第二の核酸のセットの長さは、それらが、ワトソン・クリック塩基対合に従って第一の核酸のセットに特異的にハイブリダイズして、サブグループに特異的な染色体相互作用の同定を可能にするのに適している。典型的に、第二の核酸のセットは、染色体相互作用において一体となる２つの染色体領域に配列が対応する２つの部分を含むと考えられる。第二の核酸のセットは、典型的に、長さが少なくとも１０、好ましくは２０、およびさらに好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）である核酸配列を含む。別の態様において、核酸配列は、長さが多くても５００、好ましくは多くても１００、およびさらに好ましくは多くても５０塩基対であり得る。好ましい態様において、第二の核酸のセットは、１７〜２５塩基対の核酸配列を含む。一態様において、第二の核酸配列のセットの少なくとも１００、８０％、または５０％は、上記で記載される長さを有する。好ましくは、異なる核酸は、いかなる重複する配列も有せず、例えば該核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％、または５０％は、少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって同じ配列を有しない。
【００５３】
第二の核酸のセットが「指標」として作用することを考慮すると、第二の核酸の同じセットは、種々の特徴に対するサブグループに相当する第一の核酸の種々のセットとともに用いられ得る、すなわち第二の核酸のセットは、種々の疾患特徴に関連する染色体相互作用を同定するために用いられ得る核酸の「普遍的な」コレクションに相当し得る。
【００５４】
第一の核酸のセット
第一の核酸のセットは、通常、本明細書において言及される任意のそのような特徴など、コンパニオン診断に関連した特徴の有無によって規定される２つまたはそれを上回る数の個別のサブグループにあることが知られる個体由来である。第一の核酸は、本明細書において言及される第二の核酸のセットの特徴および特性のいずれかを有し得る。第一の核酸のセットは、通常、本明細書において記載される処置および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けている個体由来のサンプルに由来する。典型的に、第一の核酸のセットは、個体から採取されたサンプルに存在する染色体相互作用のすべてまたは少なくとも８０％もしくは５０％に相当する。
【００５５】
典型的に、第一の核酸のセットは、第二の核酸のセットによって表される染色体相互作用と比較して、第二の核酸のセットによって表される遺伝子座または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さな集団に相当する、すなわち第二の核酸のセットは、遺伝子座または遺伝子の規定のセットにおける相互作用のバックグラウンドまたは指標セットに相当している。
【００５６】
核酸のライブラリー
本明細書に記載される核酸は、第二の核酸のセット由来の少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００種の異なる核酸を含むライブラリーの形であり得る。本発明は、典型的に少なくとも２００種の異なる核酸を含む、核酸の特定のライブラリーを提供する。核酸のライブラリーは、本明細書において言及される第二の核酸のセットの特徴または特性のいずれかを有し得る。ライブラリーは、アレイに結合している核酸の形態であり得る。
【００５７】
ハイブリダイゼーション
本発明は、第一の核酸のセットおよび第二の核酸のセット由来の全体的にまたは部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズするのを可能にするための手段を要する。一態様において、第一の核酸のセットのすべてと第二の核酸のセットのすべてとを単一アッセイで、すなわち単一ハイブリダイゼーション工程で接触させる。しかしながら、任意の適切なアッセイが用いられ得る。
【００５８】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書において言及される核酸は、好ましくは成功するハイブリダイゼーションの検出を支援するフルオロフォア（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を用いて標識され得る。ある特定の標識は、ＵＶ光の下で検出され得る。
【００５９】
例えば本明細書において記載されるアレイ上での、ハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループ間でのエピジェネティックな染色体相互作用の差に相当し、ゆえにエピジェネティックな染色体相互作用を比較する方法、およびエピジェネティックな染色体相互作用が本発明の集団内のサブグループに特異的であるという判定を提供する。
【００６０】
「ハイブリダイゼーションのパターン」という用語は、第一および第二の核酸のセットの間でのハイブリダイゼーションの有無、すなわち第一のセット由来のどの特異的核酸が、第二のセット由来のどの特異的核酸にハイブリダイズするかを広く網羅し、そのためそれは、いかなる特定のアッセイもしくは技法にも、またはそこで「パターン」が検出され得る表面もしくはアレイを有する必要性に限定されない。
【００６１】
コンパニオン診断法
本発明は、染色体相互作用によって提供される情報に基づくコンパニオン診断法を提供する。個体が、コンパニオン診断に関連した特定の特徴を有するかどうかを同定する、２つの個別のコンパニオン診断法が提供される。一方の方法は、任意の適切なやり方で遺伝子座を型付けすることに基づき、そして他方は、染色体相互作用の有無を検出することに基づく。特徴は、病状に関係する本明細書において言及される特徴のいずれか１つであり得る。コンパニオン診断法は、１つを上回る数の時点において行われ得、例えば個体のモニタリングが要される。
【００６２】
遺伝子座を型付けすることに基づくコンパニオン診断法
サブグループに特異的である染色体相互作用を同定した本発明の方法は、コンパニオン診断検査の基礎として型付けされ得る遺伝子であり得る遺伝子座を同定するために使用することができる。多くの異なる遺伝子関連効果は、生じている同じ染色体相互作用につながり得る。この態様において、遺伝子座におけるまたは発現した核酸もしくはタンパク質における多型の存在、遺伝子座からの発現のレベル、遺伝子座の物理的構造、あるいは遺伝子座に存在する染色体相互作用など、遺伝子座の任意の特徴が型付けされ得る。１つの特定の態様において、遺伝子座は、本明細書において表中で、特に表１、３、５、６ｃ、６Ｅ、１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、１８ｆ、２２、２３、２４または２５（特に、表１、３、および／または５）で言及される遺伝子のいずれか、または関連する病状に結び付くことが見出された染色体相互作用の近くにある遺伝子座の任意の特性であり得る。
【００６３】
染色体相互作用を検出することに基づくコンパニオン診断法
本発明は、染色体相互作用、典型的には５〜２０または５〜５００種のそのような相互作用、好ましくは２０〜３００または５０〜１００種の相互作用の有無を検出して、個体における特徴の有無を判定する工程を含むコンパニオン診断法を提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。１つの特定の態様において、例えば方法が、それらの表において規定される特徴の有無を判定する目的のためのものである場合、型付けされる染色体相互作用は、本明細書において表中で、特に表６ｂ、６Ｄ、１８ｂ、１８ｅ、１８ｆ、２２、２３、２４または２５で開示される核酸によって表されるものである。
【００６４】
特異的な病状
コンパニオン診断法を用いて、本明細書において言及される特異的な病状または特徴のいずれかの存在を検出し得る。コンパニオン診断法を用いて、関節リウマチ患者におけるメトトレキサート（または別の関節リウマチ薬）への応答性、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に対する療法への応答性、メラノーマにおける再発の可能性、前立腺癌および／または侵攻性前立腺癌を発症する可能性、および／またはβ-アミロイド凝集体誘導性アルツハイマー病を発症する可能性を検出し得る。
【００６５】
一態様において、本発明の方法は、抗体療法などの免疫療法への応答性を検出する。好ましくは、癌の抗体療法への応答性が、例えば抗ＰＤ−１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１、または組み合わせ抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１療法を用いた免疫療法において検出される。好ましくは、癌は、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、膵臓癌、甲状腺癌、鼻腔癌、肝臓癌、または肺癌である。そのような態様において、実施例に記載されるものなど、ＳＴＡＴ５Ｂおよび／またはＩＬ１５における染色体相互作用の検出が好ましい。実施例における仕事は、免疫療法への応答が、癌独自性よりもむしろ免疫系エピジェネティック機構の特質であるという事実と一致している。［「抗ＰＤ−１」は、ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）に特異的に結合する抗体または抗体の誘導体もしくはフラグメントである。「抗ＰＤ−Ｌ１」は、ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的に結合する抗体または抗体の誘導体もしくはフラグメントである］。
【００６６】
本発明の方法および／またはコンパニオン診断法は、
−（特にヒトにおける）多発性硬化症患者におけるＩＦＮ−Ｂ（ＩＦＮ−β）治療への応答性、および／または
−（特にヒトにおける）再発寛解型多発性硬化症になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）一次性進行型多発性硬化症の可能性、および／または
−（特にヒトにおける）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）急速進行性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）侵攻性２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）前２型糖尿病の状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）１型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）潰瘍性結腸炎の疾患状態になりやすい傾向、および／または
−（特にヒトにおける）潰瘍性結腸炎患者に対する結腸直腸癌の再発の可能性、および／または
−（特にヒトにおける）神経線維腫症患者に対する悪性末梢神経鞘腫瘍の可能性、および／または
−（特にヒトにおける）前立腺癌および／または侵攻性前立腺癌を発症する可能性、および／または
−特にヒトにおける、神経変性の疾患もしくは病状、好ましくはアルツハイマー病、軽度認知障害、血管性認知症、レビー小体を有する認知症、前頭側頭型認知症などの認知症、もしくはより好ましくはアルツハイマー病、最も好ましくはβ−アミロイド凝集体誘導性アルツハイマー病を発症する可能性および／またはそれらになりやすい傾向、および／または
−特にヒトにおける、特に記憶および／または認知に関して、認知症患者（好ましくはアルツハイマー病患者、より好ましくはβ−アミロイド凝集体を有するアルツハイマー病患者）とアルツハイマー病を有しない認知障害患者との比較
に用いられ得る。
【００６７】
好ましくは、表中で言及される関連遺伝子のいずれかの内部にある染色体相互作用のいずれかの有無が検出される。例えば、表のいずれか１つで言及される遺伝子の少なくとも１、３、１０、２０、５０種において。好ましくは、表中のプローブ配列によって表される染色体相互作用の有無が、方法において判定される。例えば、表のいずれか１つからの関連する染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、１０、２０、５０、または１００種。遺伝子または染色体相互作用についてのこれらの数は、本明細書において言及される種々の態様のいずれにおいても用いられ得る。
【００６８】
コンパニオン診断法を用いて検査された個体
検査される対象となる個体は、本明細書において言及される任意の疾患の病状または特徴の任意の症状を有しても有しなくてもよい。個体は、任意のそのような病状または特徴の危険性があり得る。個体は、病状または特徴から回復している可能性があるまたは回復する過程にあり得る。個体は、好ましくは非ヒト霊長類、ヒト、または齧歯類などの哺乳類である。個体は、雄または雌であり得る。個体は、３０歳またはそれよりも高齢であり得る。個体は、２９歳またはそれよりも若齢であり得る。
【００６９】
スクリーニング法
本発明は、候補薬剤が、染色体相互作用を第一の状態に当たるものから第二の状態に当たる染色体相互作用に変化させ得るかどうかを判定する工程を含む、個体の疾患状態を第一の状態から第二の状態に変化させ得る薬剤を同定する方法を提供し、好ましくは該第一および第二の状態は、
−特異的な治療および／または予防への応答性、および／または
−特異的な病状になりやすい傾向、および／または
−再発につながり得る残存疾患
の有無に当たる。
【００７０】
一態様において、方法は、候補薬剤が、本明細書において言及される任意の染色体相互作用を変化させ得るかどうかを判定する。
【００７１】
方法は、インビトロで（細胞の内側または外側で）またはインビボで（非ヒト生命体で）行われ得る。一態様において、方法は、関連する染色体相互作用を含むものなど、細胞、細胞培養物、細胞抽出物、組織、器官、または生命体で行われる。細胞は、方法は、典型的に、候補薬剤と遺伝子、細胞、細胞培養物、細胞抽出物、組織、器官、または生命体とを接触させる（または投与する）ことによって行われる。
【００７２】
上記のスクリーニング法で検査される適切な候補物質には、抗体薬剤（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲ移植された抗体）が含まれる。さらに、ディスプレイライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）など、組み合わせライブラリー、規定の化学的同一性、ペプチドおよびペプチド模倣体、オリゴヌクレオチド、ならびに天然薬剤ライブラリーも検査され得る。候補物質は、本明細書において言及される薬剤の特性のいずれかを有し得る小分子を中心とした合成に典型的に由来する化学的化合物であり得る。
【００７３】
好ましい遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用
本発明のすべての局面に関して、好ましい遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が表中で言及される。本発明のすべての局面に関して、好ましい遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が表中で提供される。典型的に、方法の染色体相互作用は、表中で挙げられる関連遺伝子のうちの少なくとも１、３、１０、２０、３０、または５０種から検出される。好ましくは、任意の１つの表におけるプローブ配列によって表される関連する特異的染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、１０、２０、３０、または５０種の有無が検出される。
【００７４】
遺伝子座は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００７５】
各病状に対する一態様において、表４８に示されるｐ値または調整されたｐ値の上位域によって表される関連する特異的染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、５、１０、２０種の有無が検出される。各病状に対する別の態様において、表４８に示されるｐ値または調整されたｐ値の中間域によって表される関連する特異的染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、５、１０、２０、３０、または５０種の有無が検出される。各病状に対するさらに別の態様において、表４８に示されるｐ値または調整されたｐ値の下位域によって表される関連する特異的染色体相互作用のうちの少なくとも１、３、５、１０、２０、３０、または５０種の有無が検出される。各病状に対する別の態様において、表４８に示されるｐ値または調整されたｐ値の上位域、中間域、および下位域のそれぞれからの関連する特異的染色体相互作用のうちの少なくとも１、２、３、５、または１０種、すなわち合計で少なくとも３、６、９、１８、または３０種の有無が検出される。
【００７６】
本明細書における表中で開示される相互作用のすべてまたは表からの選択物に典型的に相当する、染色体相互作用の特定の組み合わせが検出され得る（すなわち、その有無を判定する）。本明細書において言及されるように、特定の数の相互作用が個々の表から選択され得る。一態様において、任意の表で開示される、または任意の病状に関係して開示される相互作用の少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、または９０％が検出される。
【００７７】
検出される相互作用は、本明細書における任意の表におけるものなど、例えば本明細書において規定される、特定の特徴の有無に当たり得る。相互作用の組み合わせが検出される場合には、それらはすべて特徴の存在に当たり得る、またはそれらはすべて特徴の非存在に当たり得る。一態様において、検出される相互作用の組み合わせは、特徴の存在に関係する少なくとも２、５、または１０種の相互作用、および特徴の非存在に関係する少なくとも２、５、または１０種の他の相互作用に当たる。
【００７８】
表４９に示されるプローブは、特に癌に関係する病状、および抗ＰＤ１療法などの療法への応答性に関して、本明細書において言及される選択物のいずれかの一部であり得るまたはそれらと組み合わせられ得る。
【００７９】
遺伝子改変に関する態様
ある特定の態様において、本発明の方法を行って、遺伝子改変に関連したまたはそれによって影響される染色体相互作用を検出し得る、すなわち部分群は、遺伝子改変の点において異なり得る。明らかに、改変は、（非ヒト）生命体全体または細胞などの生命体の一部のものであり得る。どの染色体相互作用が生体系状態に関連するかを判定する方法において、第一の核酸のセットは、その一つは規定の遺伝子改変を有し、かつ一つは遺伝子改変を有しない少なくとも２つの部分群由来であり得、そして該方法は、どの染色体相互作用が遺伝子改変に関連しおよび／またはそれによって影響を受けるかを判定し得る。改変は、ＣＲＩＳＰＲ技術を含めた任意の適切な手段によって達成され得る。
【００８０】
本発明は、遺伝子改変の後に１つまたは複数の他の遺伝子座における染色体シグネチャーを検出する工程を含む、ゲノムの第一の遺伝子座における配列への遺伝子改変が、該ゲノムの他の遺伝子座に影響を及ぼすかどうかを判定する方法を含み、好ましくは該遺伝子改変は系の特徴を変化させ、該系は、好ましくは代謝系、免疫系、内分泌系、消化器系、外皮系、骨格系、筋肉系、リンパ系、呼吸器系、神経系、または生殖器系である。染色体シグネチャーを検出する工程は、任意で、好ましくは表のいずれかにおいて規定される、好ましくは５個またはそれを上回る数（例えば、５個）の異なる遺伝子座における、５種またはそれを上回る種類（例えば、５種）の異なる染色体相互作用の有無を検出する工程を含む。好ましくは、染色体のシグネチャーまたは相互作用は、本明細書において言及される任意の適切な方法によって同定される。
【００８１】
一態様において、遺伝子改変は、細胞内に、（ａ）２種以上のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、または２種以上のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｂ）２種以上のガイドＲＮＡ、または２種以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入する工程を含む方法によって達成され、各ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼの１つを、染色体配列における標的部位にガイドし、かつＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、標的部位における染色体配列の少なくとも１本の鎖を切断する。
【００８２】
別の態様において、改変は、標的配列を有しかつ遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有しかつ発現する真核細胞内に、操作された天然には生じない、クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート（Clustered Regularly interspaced Short Palindromic Repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）を導入する工程を含む、少なくとも１種の遺伝子産物の発現を変更する方法によって達成され、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムは、
ａ）標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結された、真核細胞において作動可能な第一の調節エレメント、および
ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、真核細胞において作動可能な第二の調節エレメント
を含む１種または複数種のベクターを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）は、該システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによってガイドＲＮＡは標的配列を標的にし、かつＣａｓ９タンパク質はＤＮＡ分子を切断し、それによって少なくとも１種の遺伝子産物の発現は変更され；そして、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは天然には一緒に生じず、好ましくは各ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来しかつ少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み、そして任意で、２種のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼのそれぞれのヌクレアーゼドメインの一方は、各ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが二本鎖配列の一方の鎖を切断するように改変され、そして２種のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、染色体配列に二本鎖断裂を一緒に導入し、それは、染色体配列が改変されるようなＤＮＡ修復過程によって修復される。
【００８３】
典型的に、改変は、少なくとも５、２０、５０、１００、または１０００個の塩基、好ましくは最大１０，０００または１０００，０００個の塩基の欠失、挿入、または置換を含んだ。
【００８４】
改変は、本明細書において言及される遺伝子座のいずれかに、例えば表のいずれかにおいて言及される領域または遺伝子のいずれかにあり得る。他の（改変されていない）遺伝子座で検出される染色体相互作用も、本明細書において言及される遺伝子座のいずれかに、例えば表のいずれかにおいて言及される領域または遺伝子のいずれかにあり得る。
【００８５】
遺伝子改変に関係する態様は、真核生物、脊索動物、哺乳類、植物、農業用の動物および植物、ならびに非ヒト生命体を含めた、任意の生命体で実施され得る（many）。
【００８６】
本発明の方法および使用
本発明の方法は、種々のやり方で記載され得る。それは、（i）染色体相互作用において一体となっている染色体領域をインビトロ架橋する工程；（ii）架橋したＤＮＡを切り取りまたは制限消化切断に供する工程；および（iii）架橋した切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ライゲーションした核酸を形成する工程、を含むライゲーションした核酸を作製する方法であって、該ライゲーションした核酸の検出を用いて、遺伝子座における染色体状態を判定し得、そして好ましくは、
−遺伝子座は、本明細書において言及される遺伝子座、領域、もしくは遺伝子のいずれかであり得、
−および／または、染色体相互作用は、本明細書において言及されるもしくは表中で開示されるプローブのいずれかに当たる染色体相互作用のいずれかであり得、および／または
−ライゲーションした産物は、（i）本明細書において開示されるプローブ配列のいずれかと同じであるもしくは相同である配列；または（ii）（ii）と相補的である配列を有し得るまたは含み得る
方法として記載され得る。
【００８７】
本発明の方法は、染色体相互作用が、ゲノムの規定の領域内に存在するまたは存在しないかどうかを判定する工程を含む、集団内の種々の部分群に相当する染色体状態を検出するための方法であって、好ましくは、
−部分群は、本明細書において言及される特徴の有無によって規定され、および／または
−染色体状態は、本明細書において言及される任意の遺伝子座、領域、もしくは遺伝子にあり得；および／または
−染色体相互作用は、本明細書において言及されるもの、または本明細書において開示されるプローブもしくはプライマーペアのいずれかに当たるもののいずれかであり得る
方法として記載され得る。
【００８８】
本発明は、本明細書において言及される任意の遺伝子座、遺伝子、または領域における染色体相互作用を検出する工程を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための、本明細書において言及される核酸およびプローブ（またはプライマー）の使用、例えば少なくとも１０、２０、１００、または５００個の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための、少なくとも１０、５０、１００、または５００種のそのような核酸またはプローブの使用を含む。
【００８９】
本明細書において提供される表
本明細書における表は、病状（第一の言及される群）に存在しかつ対照群、典型的にしかしながら必ずではなく健常個体（第二の言及される群）に存在しない染色体相互作用に相当する、プローブ（Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データまたは遺伝子データを示している。プローブ配列は、染色体相互作用において一体となっている遺伝子領域の両方の部位から生成されるライゲーションした産物を検出するために用いられ得る配列を示している、すなわちプローブは、ライゲーションした産物における配列と相補的である配列を含むと考えられる。第一の２組の開始−終結箇所はプローブ箇所を示しており、そして第二の２組の開始−終結箇所は関連する４ｋｂ領域を示している。以下の情報は、プローブデータ表において提供される。
−ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ：超幾何学的濃縮のパラメーターに基づく、遺伝子座における有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのその数を見出す確率に対するｐ値
−プローブカウント合計：遺伝子座における検査されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの合計数
−プローブカウントＳｉｇ：遺伝子座における統計的に有意であると見出されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの数
−ＦＤＲ  ＨｙｐｅｒＧ：多重検定（偽発見率）補正された超幾何学的ｐ値
−パーセントＳｉｇ：遺伝子座における検査されたマーカーの数に対する、有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのパーセンテージ
−ｌｏｇＦＣ：エピジェネティック比（ＦＣ）の２を底とする対数
−ＡｖｅＥｘｐｒ：すべてのアレイおよびチャネルにわたるプローブに対する平均ｌｏｇ２表現
−Ｔ：加減されたｔ統計量
−ｐ値：生のｐ値
−ａｄｊ．ｐ値：調整されたｐ値またはｑ値
−Ｂ−Ｂ統計（ロッドまたはＢ）は、その遺伝子が差異的に発現するという対数オッズである。
−ＦＣ−非対数倍変化
−ＦＣ＿１−ゼロを中心とする非対数倍変化
−ＬＳ−二元値、これはＦＣ＿１値に関係する。−１．１を下回るＦＣ＿１値、それは−１に設定され、かつＦＣ＿１値が１．１を上回る場合、それは１に設定される。それらの値の間で、値は０である。
【００９０】
遺伝子表データは、関連する染色体相互作用が生じることが見出されている遺伝子を示している。遺伝子座表におけるｐ値は、ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ（超幾何学的濃縮のパラメーターに基づく、遺伝子座における有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのその数を見出す確率に対するｐ値）と同じである。
【００９１】
プローブは、Ｔａｑ１部位から３０ｂｐ離れているように設計される。ＰＣＲの場合、ＰＣＲプライマーも、ライゲーションした産物を検出するように設計されるが、Ｔａｑ１部位からのそれらの位置は変動する。
【００９２】
プローブ位置：
開始１−フラグメント１上のＴａｑＩ部位の３０塩基上流
終結１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
開始２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
終結２−フラグメント２上のＴａｑＩ部位の３０塩基下流
４ｋｂ配列位置：
開始１−フラグメント１上のＴａｑＩ部位の４０００塩基上流
終結１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
開始２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
終結２−フラグメント２上のＴａｑＩ部位の４０００塩基下流
【００９３】
以下の情報は、表においても提供される。
−ＧＬＭＮＥＴ−ｌａｓｓｏ全体またはｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ正則化をフィッティングするための手順。０．５に設定されたλ（ｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ）
−ＧＬＭＮＥＴ＿１−１に設定されたλ（ｌａｓｓｏ）
−フィッシャーのＰ値−フィッシャーの正確検定Ｐ値
−Ｃｏｅｆ−ロジスティック回帰係数、ｅ（ｅ＾Ｘ）を係数の力まで高めた場合、変数に対するオッズ比が得られる
−Ｓ．Ｅ．−標準誤差
−Ｗａｌｄ−Ｗａｌｄ方程式統計。Ｗａｌｄ統計は、モデル係数の最大尤度概算は０に等しいというＷａｌｄ検定の一部である。該検定は、最大尤度概算と０との間の差は、漸近的に通常分布すると想定する。
−Ｐｒ（＞｜Ｚ｜）−ロジスティックモデル内のマーカーに対するＰ値。＜０．０５を下回る値は統計的に有意であり、かつロジスティックモデルにおいて用いられるべきである。
【００９４】
サンプル調製および染色体相互作用検出のための好ましい態様
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法が、本明細書において記載される。例えばこの節で記載されるように、これらの方法の最適化された（非従来的な）バージョンが用いられ得る。
【００９５】
典型的に、サンプルは、少なくとも２×１０5個の細胞を含有すると考えられる。サンプルは、最大５×１０5個の細胞を含有し得る。一態様において、サンプルは、２×１０5〜５．５×１０5個の細胞を含有すると考えられる。
【００９６】
染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用の架橋が、本明細書において記載される。これは、細胞溶解が起きる前に実施され得る。細胞溶解は、４〜６または約５分間など、３〜７分間実施され得る。一部の態様において、細胞溶解は、少なくとも５分間かつ１０分間未満実施される。
【００９７】
制限酵素でＤＮＡを消化することが、本明細書において記載される。典型的に、ＤＮＡ制限は、約６５℃などの約５５℃〜約７０℃で、約２０分間などの約１０〜３０分間の期間実施される。
【００９８】
好ましくは、最大４０００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす高頻度カッター制限酵素が用いられる。任意で、制限酵素は、約２５６塩基対などの約２００〜３００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす。一態様において、典型的なフラグメントサイズは、４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対など、２００塩基対〜４，０００塩基対である。
【００９９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ法の一態様において、ＤＮＡ沈殿工程は、ＤＮＡ制限消化工程とＤＮＡライゲーション工程との間では実施されない。
【０１００】
ＤＮＡライゲーションが本明細書において記載される。典型的に、ＤＮＡライゲーションは、約１０分間など、５〜３０分間実施される。
【０１０１】
サンプル中のタンパク質は、例えばプロテイナーゼ、任意でプロテイナーゼＫを用いて酵素的に消化され得る。タンパク質は、約３０分間〜１時間の期間、例えば約４５分間酵素的に消化され得る。一態様において、タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化の後に、架橋反転またはフェノールＤＮＡ抽出の工程はない。
【０１０２】
一態様において、ＰＣＲ検出は、好ましくはライゲーションした核酸の存在／非存在に対する二元読み出しを有して、ライゲーションした核酸の単一コピーを検出し得る。
【０１０３】
ホモログ
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログが、本明細書において触れられる。そのようなホモログは、典型的に、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性に基づいて算出され得る（時には、「厳密な相同性（hard homology）」と称される）。
【０１０４】
それゆえ、特定の態様において、ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログは、本明細書において配列同一性％を参照して触れられる。典型的に、そのようなホモログは、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１０５】
例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性および／または配列同一性％を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、そのデフォルト設定で用いられる）を提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性および／または配列同一性％を算出し得、および／または配列を整列させ得る（（典型的にそれらのデフォルト設定で）同等のまたは対応する配列を同定するなど）。
【０１０６】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードでアライメントした場合に合致する、またはある正の値を有する閾値スコアＴを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定する工程を伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al、上記）。これらの初回の近隣ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出す検索を始めるための種として作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。それぞれの方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大限に達した値から分量Ｘだけ下落する；負のスコアを取る１つもしくは複数の残基アライメントの累積により、累積スコアがゼロもしくはそれより下に行く；または、いずれかの配列の末端に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターのＷ５  ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【０１０７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間での類似性についての統計解析を実施する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性についての１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのポリヌクレオチド配列間の合致が偶然に生じるであろう確率の表示を提供する。例えば、第一の配列を第二の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列はもう一方の配列と類似していると見なされる。
【０１０８】
相同な配列は、典型的に、１０、１５、または２０塩基未満など、１、２、３、４個、またはそれを上回る数の塩基だけ異なる（それはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る）。これらの変化は、相同性および／または配列同一性％を算出する工程に関して上記で言及された領域のいずれかにわたり測定され得る。
【０１０９】
アレイ
第二の核酸のセットがアレイに結合され得、そして一態様において、好ましくは少なくとも３００、９００、２０００、または５０００個の遺伝子座に相当する、アレイに結合している少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００、または２５０，０００種の異なる第二の核酸が存在する。一態様において、第二の核酸の種々の集団のうちの１つ、または複数、またはすべては、アレイの１つを上回る数の個別の領域に結合され、事実上アレイで反復され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づく。アレイへの第一の核酸の結合の検出は、二色システムによって実施され得る。
【０１１０】
治療剤
治療剤が本明細書において言及される。本発明は、関連する病状を阻止するまたは治療することにおける使用のためのそのような薬剤を提供する。これは、必要としている個体に治療上効果的な量の薬剤を投与する工程を含み得る。本発明は、疾患を阻止するまたは治療するための医薬の製造における薬剤の使用を提供する。本発明の方法を用いて、治療に対する個体を選択し得る。本発明の方法、特にコンパニオン診断アッセイ法は、該方法によって同定された人に、次いで、関連する病状を阻止するまたは治療する薬剤を投与し得る治療工程を含み得る。
【０１１１】
薬剤の製剤化は、該薬剤の性質に依存すると考えられる。薬剤は、該薬剤および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含有する薬学的組成物の形態で提供される。適切なキャリアおよび希釈剤には、等張生理食塩溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。典型的な経口投薬組成物には、錠剤、カプセル、液体溶液、および液体懸濁液が含まれる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または経口の投与のために製剤化され得る。
【０１１２】
薬剤の用量は、様々なパラメーターに従って、とりわけ用いられる物質；治療される対象となる個体の年齢、重量、および病状；投与の経路；ならびに要求されるレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の薬剤に対する投与の要求経路、および投薬量を決定することができる。しかしながら、適切な用量は、例えば１日に１〜３回摂取されるべき、１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重などの０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０１１３】
本明細書において言及される物質の形態
本明細書において言及される核酸または治療剤などの物質のいずれも、精製したまたは単離した形態であり得る。それらは（The）、天然に見出されるものとは異なる形態にあり得、例えばそれらは、それらが天然ではともに生じない他の物質と組み合わせて存在し得る。核酸（本明細書において規定される配列の一部分を含む）は、天然に見出されるものと異なる配列を有し得、例えば、相同性に関する節で記載される配列において、少なくとも１、２、３、４個、またはそれを上回る数のヌクレオチド変化を有する。核酸は、５’または３’末端に異種配列を有し得る。核酸は、天然に見出されるものとは化学的に異なり得、例えばそれらは何らかのやり方で修飾され得るが、好ましくはなおもワトソン・クリック塩基対合が可能である。適当な場合には、核酸は、二重鎖または一本鎖の形態で提供される。本発明は、本明細書において言及される特異的核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖の形態で提供し、ゆえに開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
【０１１４】
本発明は、特定のサブグループと関連がある染色体相互作用の検出を含む、本発明の任意の方法を行うためのキットも提供する。そのようなキットは、本発明の方法によって生成されるライゲーションした核酸を検出し得る薬剤など、関連する染色体相互作用を検出し得る特異的な結合薬剤を含み得る。キットに存在する好ましい薬剤には、ライゲーションした核酸、または例えば本明細書において記載されるように、ライゲーションした核酸をＰＣＲ反応において増幅し得るプライマーペアにハイブリダイズし得るプローブが含まれる。
【０１１５】
本発明は、関連する染色体相互作用を検出し得るデバイスも提供する。デバイスは、好ましくは、本明細書において記載される任意のそのような薬剤、プローブ、またはプライマーペアなど、染色体相互作用を検出し得る任意の特異的な結合薬剤、プローブ、またはプライマーペアを含む。
【０１１６】
特異的な明記される病状に対する本発明における使用のための好ましい治療剤
Ａ．再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）になりやすい傾向
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇疾患修飾性療法（ＤＭＴ）：
●注射可能な医薬
・アボネックス（Avonex）（インターフェロンβ−１ａ）
・ベタセロン（Betaseron）（インターフェロンβ−１ｂ）
・コパキソン（Copaxone）（グラチラマー酢酸塩）
・エクスタビア（Extavia）（インターフェロンβ−１ｂ）
・グラトパ（Glatopa）（グラチラマー酢酸塩）
・プレグリディ（Plegridy）（ペグインターフェロンβ−１ａ）
・レビフ（Rebif）（インターフェロンβ−１ａ）
●経口医薬
・オーバジオ（Aubagio）（テリフルノミド）
・ジレニア（Gilenya）（フィンゴリモド）
・テクフィデラ（Tecfidera）（フマル酸ジメチル）
●点滴医薬
・レムトラダ（Lemtrada）（アレムツズマブ）
・ノバントロン（Novantrone）（ミトキサントロン）
・タイサブリ（Tysabri）（ナタリズマブ）
〇再発管理：
●高用量静脈内ソルメドロール（Solu-Medrol）（登録商標）（メチルプレドニゾロン）
●高用量経口デルタゾン（Deltasone）（登録商標）（プレドニゾン）
●H.P.アクサーゲル（H.P. Acthar Gel）（ＡＣＴＨ）
〇ステロイド
●メチルプレドニゾロン
【０１１７】
Ｂ．一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）の可能性
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇ステロイド
〇全身リンパ節放射線療法、シクロスポリン、メトトレキサート、２−クロロデオキシアデノシン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、アザチオプリン、インターフェロン、ステロイド、および免疫グロブリンなどの免疫抑制療法
〇コパキソン
〇オクレリズマブ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）
【０１１８】
Ｃ．急速進行性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の疾患状態になりやすい傾向
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇リルゾール
〇バクロフェン
【０１１９】
Ｄ．２型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇メトホルミン
〇スルホニルウレア、例えば：
・グリベンクラミド（glibenclamide）
・グリクラジド（gliclazide）
・グリメピリド（glimepiride）
・グリピジド（glipizide）
・グリキドン（gliquidone）
〇グリタゾン（チアゾリジンジオン、ＴＺＤ）
〇グリプチン（ＤＰＰ−４阻害剤）、例えば：
・リナグリプチン（Linagliptin）
・サキサグリプチン（Saxagliptin）
・シタグリプチン（Sitagliptin）
・ビルダグリプチン（Vildagliptin）
〇ＧＬＰ−１アゴニスト、例えば：
・エキセナチド（Exenatide）
・リラグルチド（Liraglutide）
〇アカルボース
〇ナテグリニドおよびレパグリニド
〇インスリン治療
【０１２０】
Ｅ．１型糖尿病の疾患状態になりやすい傾向
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇ランタス（Lantus）皮下
〇ランタスソロスター（Solostar）皮下
〇レベミル（Levemir）皮下
〇ノボログフレックスペン（Novolog Flexpen）皮下
〇ノボログ皮下
〇ヒューマログ（Humalog）皮下
〇ノボログミックス７０−３０フレックスペン皮下
〇シムリンペン（SymlinPen）６０皮下
〇ヒューマログクイックペン（KwikPen）皮下
〇シムリンペン１２０皮下
〇ノボリン（Novolin）Ｒ注射
〇Ｔｏｕｊｅｏソロスター皮下
〇アピドラ（Apidra）皮下
〇ヒューマログミックス７５−２５皮下
〇ヒューマリン（Humulin）７０／３０皮下
〇ヒューマログミックス７５−２５クイックペン皮下
〇ノボリンＮ皮下
〇ヒューマリンＲ注射
〇ノボリン７０／３０皮下
〇インスリンデテミル（detemir）皮下
〇レベミルフレックスタッチ（FlexTouch）皮下
〇ヒューマリンＮ皮下
〇インスリングラルギン（glargine）皮下
〇アピドラソロスター皮下
〇インスリンリスプロ（lispro）皮下
〇インスリンレギュラーヒト注射
〇インスリンレギュラーヒト吸入
〇ヒューマログミックス５０−５０クイックペン皮下
○インスリンアスパルト（aspart）皮下
〇ノボログミックス７０−３０皮下
〇ヒューマログミックス５０−５０皮下
〇アフレッツァ（Afrezza）吸入
〇インスリンＮＰＨヒト組換え（recomb）皮下
〇インスリンＮＰＨおよびレギュラーヒト皮下
〇インスリンアスパルトプロタミン-インスリンアスパルト皮下
〇ヒューマリン７０／３０クイックペン皮下
〇ヒューマリンＮクイックペン皮下
〇トレシーバ（Tresiba）フレックスタッチＵ−１００皮下
〇トレシーバフレックスタッチＵ−２００皮下
〇インスリンリスプロプロタミンおよびリスプロ皮下
〇プラムリンタイド（pramlintide）皮下
〇インスリングルリジン（glulisine）皮下
〇ノボログペンフィル（PenFill）皮下
〇インスリンデグルデク（degludec）皮下
【０１２１】
Ｆ．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の疾患状態になりやすい傾向
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）：イブプロフェン、ナプロキセン、およびジクロフェナク
〇ヒドロキシクロロキン
〇コルチコステロイド（Corticosteriod）
〇免疫抑制剤：アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、およびシクロホスファミド
〇リツキシマブ
〇ベリムマブ
〇コルチコステロイド：プレドニゾン、コルチゾン、およびヒドロコルチゾン
〇ＮＳＡＩＤｓ：インドメタシン（インドシン（Indocin））、ナブメトン（レラフェン（Relafen））、およびセレコキシブ（セレブレックス（Celebrex））
〇抗炎症剤：アスピリンおよびアセトアミノフェン（タイレノール（Tylenol））
〇疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）：ヒドロキシクロロキン（プラケニル（Plaqenil））、シクロスポリン（ゲングラフ（Gengraf）、ネオーラル（Neoral）、サンディミュン（Sandimmune））、およびアザチオプリン（アザサン（Azasan）、イムラン（Imuran））
○抗マラリア剤：クロロキン（アラレン（Aralen））およびヒドロキシクロロキン（プラケニル）
〇ＢＬｙＳ特異的阻害剤またはモノクローナル抗体（ＭＡｂＳ）：ベリムマブ（ベンリスタ（Benlysta））
〇免疫抑制性薬剤／免疫変調剤：アザチオプリン（イムラン）、メトトレキサート（リウマトレックス（Rheumatrex））、およびシクロホスファミド（シトキサン（Cytoxan））
〇抗凝固剤：低用量アスピリン、ヘパリン（カルシパリン（Calciparine）、リクエミン（Liquaemin）、およびワルファリン（クマジン（Coumadin））
【０１２２】
Ｇ．潰瘍性結腸炎の疾患状態になりやすい傾向
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇抗炎症薬：アミノサリチレート−スルファサラジン（アザルフィジン（Azulfidine））、ならびにメサラミン（アサコール（Asacol）、リアルダ（Lialda）、ロワサ（Rowasa）、カナサ（Canasa）、他）、バルサラジド（コラザール（Colazal））、およびオルサラジン（ジペンタム（Dipentum））を含めたある特定の５−アミノサリチレート、ならびにコルチコステロイド−プレドニゾンおよびヒドロコルチゾン
〇免疫系抑制因子(supressor)：アザチオプリン（アザサン、イムラン）、メルカプトプリン（プリントール（Purinethol）、プリキサム（Purixam））、シクロスポリン（ゲングラフ、ネオーラル、サンディミュン）、インフリキシマブ（レミケード（Remicade））、アダリムマブ（ヒュミラ（Humira））、ゴリムマブ（シンポニ（Simponi））、およびベドリズマブ（エンティビオ（Entyvio））
〇潰瘍性結腸炎の特異的症状を管理するための他の医薬
・抗生物質
・抗下痢医薬
・鎮痛剤
・鉄補給剤
【０１２３】
Ｈ．潰瘍性結腸炎患者に対する結腸直腸癌の再発の可能性
■病状を治療するために用いられる薬物：
アミノサリチレート
ＵＣステロイド
アザチオプリン
【０１２４】
Ｉ．神経線維腫症患者に対する悪性末梢神経鞘腫瘍の可能性
■治療
ＭＰＮＳＴに対する治療には、外科手術、放射線療法、および化学療法が含まれる。
【０１２５】
Ｊ．前立腺癌および／または侵攻性前立腺癌を発症する可能性
■病状を治療するために用いられる薬物：
・黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト
・抗アンドロゲン治療
・組み合わせＬＨＲＨおよび抗アンドロゲン治療
〇ステロイド
〇他の医学的治療：
・アビラテロン（Abiraterone）
・エンザルタミド（Enzalutamide）
・ドセタキセル（タキソテール（Taxotere）（登録商標））
・カルボプラチンまたはシスプラチン化学療法
【０１２６】
Ｋ．アルツハイマー病
■病状を治療するために用いられる薬物：
〇ドネペジル（Donepezil）
〇リバスチグミン（Rivastigmine）
〇ガランタミン（Galantamine）
●メマンチン（Memantine）
【０１２７】
刊行物
本明細書において言及されるすべての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み入れられ、そして本発明に関連する特質をさらに規定するために用いられ得る。
【０１２８】
具体的な態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常および異常な病状の間での調節的変化についてのエピジェネティックな調節的シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られるヒト染色体の調節的高次構造と関連がある遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定しかつモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子脱調節のカスケードにおける個別の一次工程である。それらは、ＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングなど、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現のバイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、固有の一連の利点を有する高次バイオマーカーである。
【０１２９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションという４つの密度があり、それぞれのキメラフラグメントはアレイで４回反復され、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万という効果的な密度を作製する。
【０１３０】
カスタム設計されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見技術で詮索された３００個前後の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングし得る。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに構築され；この技術は、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万個という４つの密度のプローブを付与する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブは四つ組として提示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋに減り、ゆえに再現性についての統計的評価を可能にする。遺伝子座あたりの詮索される潜在的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり；そのため、検討され得る遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【０１３１】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、１組のサンプルを有する二色システムであり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリー生成の後、Ｃｙ５で標識され、かつ比較／解析される対象となるサンプル（対照）の他方はＣｙ３で標識される。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎスキャナーを用いてスキャンされ、かつ結果として生じた特質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて抽出される。次いで、データは、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを用いて処理される。アレイは、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準的な二色パッケージ：Ｌｉｍｍａ*を用いて処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ*におけるアレイ内正規化機能を用いてなされ、かつこれは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対してなされる。データはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルターにかけられ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは除去され、かつ技術的複製プローブは平均化されて、それらはＬｉｍｍａ*を用いて解析される。プローブは、比較されておりかつ次いで偽発見率（False Discovery Rate）を用いることによって補正されている２つのシナリオ間でのそれらの差に基づいてモデル化される。＜１または＞１でありかつｐ＝０．０１のＦＤＲ  ｐ値を通過する、＜３０％の変動係数（ＣＶ）を有するプローブが、さらなるスクリーニングに用いられる。プローブセットを縮小するために、さらなる多因子分析が、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを用いて実施される。
【０１３２】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を査定するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１３３】
プローブのプールは、最終選抜のために、調整されたｐ値、ＦＣ、および＜３０％のＣＶ（任意のカットオフポイント）のパラメーターに基づいて初めに選択される。さらなる解析および最終リストは、最初の２つのパラメーター（調整された（ａｄｊ）ｐ値；ＦＣ）のみに基づいて引き出される。
【実施例】
【０１３４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例証される。
【０１３５】
統計的パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイを、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージを用いて処理して、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームへの転換のための高い値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択する。
【０１３６】
工程１
プローブを、改変した線形回帰モデルの産物であるそれらの補正ｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値≦０．１より下のプローブが選択され、次いでそれらのエピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに縮小され、さらなる解析に選択されるためにプローブＥＲは≦−１．１または≧１．１でなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは≦０．３より下でなければならない。
【０１３７】
工程２
統計リストからの上位４０種のマーカーが、ＰＣＲ転換に対するマーカーとしての選択のためにそれらのＥＲに基づいて選択される。最も高いの負のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカー、および最も高い正のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカーがリストを形成する。
【０１３８】
工程３
工程１からの結果として生じたマーカーである統計的に有意なプローブが、超幾何学的濃縮（ＨＥ）を用いたエンリッチメント解析の基盤を形成する。この解析は、有意なプローブリストからのマーカー縮小を可能にし、かつ工程２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに転換されるプローブのリストを形成する。
【０１３９】
統計的プローブをＨＥによって処理して、どの遺伝的位置が統計的に有意なプローブの濃縮を有するかを判定し、どの遺伝的位置がエピジェネティックな差の中心地であるかが示される。
【０１４０】
補正されたｐ値に基づく最も有意な濃縮された遺伝子座が、プローブリスト作成に選択される。０．３または０．２のｐ値より下の遺伝的位置が選択される。工程２からのマーカーとともに、これらの遺伝的位置にマッピングする統計的プローブが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ転換のための高い値のマーカーを形成する。
【０１４１】
アレイの設計および処理
アレイの設計
１．遺伝子座をＳＩＩソフトウェア（現在、ｖ３．２）を用いて処理して、
ａ．これらの特異的遺伝子座におけるゲノムの配列（５０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流を有する遺伝子配列）を取り出す。
ｂ．この領域内の配列がＣＣ’ｓに関与している確率を規定する。
ｃ．特異的ＲＥを用いて配列を切る。
ｄ．制限フラグメントが、ある特定の配向で相互作用する可能性があるかを判定する。
ｅ．一緒に相互作用する種々のＣＣ’ｓの可能性をランク付けする。
２．アレイサイズ、それゆえ利用可能なプローブ箇所の数（ｘ）を判定する。
３．ｘ／４個の相互作用を取り出す。
４．各相互作用に対して、パート１からの制限部位まで３０ｂｐかつパート２の制限部位まで３０ｂｐの配列を規定する。それらの領域が反復でないことをチェックし、そうであれば除外し、かつリストの下にある次の相互作用を選ぶ。両方の３０ｂｐをつなぎ合わせてプローブを規定する。
５．ｘ／４個のプローブ、それに加えて規定の対照プローブのリストを創出し、かつ４回複製して、アレイ上に創出される対象となるリストを創出する。
６．カスタムＣＧＨアレイに対するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎウェブサイトにプローブのリストをアップロードする。
７．プローブ群を用いて、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
【０１４２】
アレイの処理
１．鋳型産生のために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＳＯＰを用いてサンプルを処理する。
２．アレイ処理研究室によって、エタノール沈殿で浄化する。
３．Agilent SureTag complete DNA labelling kitのAgilent Oligonucleotide Array-based CGH for Genomic DNA Analysis Enzymatic labelling for Blood, Ceils or Tissuesのとおりサンプルを処理する。
４．Agilent feature extractionソフトウェアを用いたAgilent C Scannerを用いてスキャンする。
【０１４３】
実施例１：関節リウマチの治療のためのメトトレキサートの非応答者と応答者とを識別するコンパニオン診断に関連する染色体相互作用を判定する方法
【０１４４】
供給源：グラスゴーのスコットランド教育研究協会（ＳＥＲＡ）コホート
【０１４５】
実施例１の序論および簡単な概要
個々の患者の安定したエピジェネティックプロファイルは、シグナル伝達経路の感度を変調し、遺伝子発現を調節し、疾患発症の道筋に影響し、かつ薬物の効果的な作用および治療への応答に関わる調節制御を無効の状態にし得る。ここで、本発明者らは、関節リウマチ（ＲＡ）患者のエピジェネティックプロファイルを解析して、メトトレキサート（ＭＴＸ）治療への非応答者を規定することにおけるその役割を評価した。
【０１４６】
第一線の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、通常メトトレキサート（ＭＴＸ））への応答についての確実な臨床的予測は、現在可能でない。現在、第一線のＤＭＡＲＤ（特に、メトトレキサート（ＭＴＸ））への応答を判定し得る能力は、療法後の経験的臨床測定に依存している。
【０１４７】
早期関節リウマチ（ＥＲＡ）において、第一線のＤＭＡＲＤ（特に、メトトレキサート（ＭＴＸ））への応答を予測することは可能になっておらず、そのため治療決定は、主に臨床的アルゴリズムに頼る。薬物ナイーブ患者を第一線のＤＭＡＲＤに応答しないであろうものに分類する能力は、患者層別化のための貴重なツールであろう。ここで、本発明者らは、早期ＲＡ患者の血中白血球における染色体コンフォメーションシグネチャー（ＲＡにおいて以前に記載されていない、非常に有益でかつ安定したエピジェネティックな修飾）は、ＭＴＸ治療への非応答性を予測し得ることを報告する。
【０１４８】
方法：
スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートに採用されたＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を獲得した。この調査への包含は、中程度から高い疾患活動性（ＤＡＳ２８≧３．２）を有するＲＡの診断（２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準を満たす）、およびメトトレキサート（ＭＴＸ）による後続の単一療法に基づいた。ＤＡＳ２８＝２８関節の疾患活動性スコア。ＥＵＬＡＲ＝欧州リウマチ学会。ＡＣＲ＝米国リウマチ学会（American College of Rheumatology）。ＭＴＸ応答性を、以下の基準：応答者−ＤＡＳ２８寛解（ＤＡＳ２８＜２．６）または良好な応答（＞１．２のＤＡＳ２８改善、およびＤＡＳ２８≦３．２）、非応答者−ＤＡＳ２８の改善なし（≦０．６）を用いて、６ヶ月の時点で規定した。４人のＭＴＸ応答者、４人のＭＴＸ非応答者、および４人の健常対照における染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）についての初回解析に、３０９個のＲＡ関連遺伝子座を網羅する１３，３２２種の一意的なプローブを含有するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイを用いて着手した。差別化ＣＣＳを、ＬＩＭＭＡ*線形モデリング、後続の二元フィルタリング、およびクラスター分析によって規定した。３０人のＭＴＸ応答者および３０人の非応答者の検証コホートを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームを用いて差別化ＣＣＳについてスクリーニングした。差別化シグネチャーを、二元スコアおよびロジスティック回帰モデリング、ならびにＲＯＣ分析**によって判定されるモデルの精度および堅牢性を用いてさらに洗練させた。
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を査定するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
**注記：ＲＯＣは、受信者動作特徴を意味しかつＲＯＣ曲線を指す。ＲＯＣ曲線は、その弁別閾値が変動するため、二元分類子システムの性能を図解する図式的プロットである。曲線は、様々な閾値設定で偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることによって創出される。
【０１４９】
ＣＣＳのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ解析は、応答者および非応答者のＥＲＡ患者を差別化する３０種マーカー層別化プロファイルを同定した。本発明者らの検証コホートにおけるこのシグネチャーについての後続の評価は、これを、応答者と非応答者とを弁別し得る５種マーカーＣＣＳシグネチャーに洗練させた。予測モデリングは、０．００９８〜０．９９に及ぶ、応答者および非応答者に対する確率スコアを提供した（０＝応答者、１＝非応答者）。応答者に関して９２％の真陽性率（９５％の信頼区間［９５％  ＣＩ］７５〜９９％）、および非応答者に関して９３％の真陰性率（９５％  ＣＩ  ７６〜９９％）があった。重要なことには、この層別化モデルを検証するＲＯＣ分析は、シグネチャーが、ＭＴＸへのＮＲに対して９２％の感度の予測力を有することを実証した。
【０１５０】
本発明者らは、診断の時点で患者を層別化する力を有する、ＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者の末梢血における非常に有益な全身的エピジェネティック状態を同定した。血液に基づく臨床検査を用いて患者を非応答者に先験的に差別化する能力は、貴重な臨床ツールであると考えられ；層別化された医療への道を開き、かつＥＲＡ臨床におけるより積極的な治療レジームを正当化する。
【０１５１】
実施例１の詳細なバージョン
患者を応答者（Ｒ）および非応答者（ＮＲ）に先験的に差別化する能力は、効果的な治療のより早期の導入につながる患者層別化のための貴重なツールであろう。本発明者らは、疾患状態およびＭＴＸ応答性を示す、血液由来の白血球における染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）を同定するために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームを用いた。それによって、本発明者らは、治療ナイーブの早期ＲＡ（ＥＲＡ）患者のＭＴＸ  ＲおよびＮＲへの層別化を可能にする第一の予後分子シグネチャーを提供する、ＣＸＣＬ１３、ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２１Ｒ、およびＩＬ−２３遺伝子座に含有されるエピジェネティックなシグネチャーを同定した。重要なことには、この層別化モデルは、ＭＴＸへのＮＲに対して９２％の感度の予測力を有した。このエピジェネティックなＲＡバイオマーカーシグネチャーは、ＥＲＡと健常対照（ＨＣ）との間で識別され得る。この組み合わせの予測的末梢血シグネチャーは、臨床におけるより積極的な療法のより早期の導入を支持し得、ＲＡにおける個別化医療への道を開く。
【０１５２】
ＲＡは、世界人口の最大１％に影響を及ぼす慢性自己免疫疾患である。病因は多因性であり、そして環境因子、特に喫煙および他の肺刺激と相互作用する主たる免疫宿主遺伝子座によって特徴付けされる。遺伝的に感受性がある個体のそのような環境因子への曝露は、疾患の発生および進行に関するエピジェネティックな背景を示唆する。クロマチンマーカー（例えば、ゲノムのメチル化状態）についての最近の調査は、ＲＡと関連があるエピジェネティックな差の最初の証拠を提供する。しかしながら、今日まで、遺伝的関連性もエピジェネティックな変化も、所与の療法への応答に対する有効な予測的マーカーを提供していない。さらには、臨床提示は、従来的ＤＭＡＲＤの効力および毒性をわずかに予測するのみである。ＥＵＬＡＲ（欧州リウマチ学会）およびＡＣＲ（米国リウマチ学会）管理指針によって推奨される最も一般的な第一選択医薬であるＭＴＸ8は、治療の６ヶ月後に５０〜６５％に及ぶ臨床的に意義のある応答率をもたらす。そのような応答、およびとりわけ、高いハードルの応答を呈する幾分より小さな割合は、個々の患者において現在予測され得ない。このことが、治療用レジメン選定（単一または組み合わせの治療法）への「試行錯誤」に基づく手法を生む。第一線治療への応答が長期転帰の最も重要な予測因子であることを考慮すると、個々の患者における薬物応答性を予測し得る能力は、貴重な臨床ツールであろう。
【０１５３】
本明細書において、本発明者らは、スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートからのＤＭＡＲＤナイーブのＥＲＡ患者のエピジェネティックプロファイリングに焦点を合わせて、ＭＴＸ治療へのＮＲを示しゆえに代替療法へのそのような患者の先験的な同定および層別化を可能にする、安定した血液に基づくエピジェネティックプロファイルが存在するかどうかを確かめた。供給源のエピジェネティックな変調は、細胞活性化および転写プロファイルに強く影響し得る。考えられる限りでは、薬物に対する作用の様式は、エピジェネティックに修飾された遺伝子座によって影響を受け得る。本発明者らは、長距離クロマチン相互作用としても知られるＣＣＳに焦点を合わせた、というのもそれらは、転写調節に対する重要な意味合いを有する非常に有益でかつ安定した高次のエピジェネティック状態を反映するためである。それらは、重要な利点15および表現型の差への早期の機能的結び付き16も付与し、かつ腫瘍学および他の疾患エリアにおける有益なバイオマーカー候補として報告されている。
【０１５４】
本発明者らは、スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートによって提供される早期ＲＡ（ＥＲＡ）患者を用いた。人口統計学的な、臨床的な、および免疫学的な因子を、診断時および６ヶ月の時点で獲得した。この調査への包含は、中程度から高い疾患活動性（ＤＡＳ２８≧３．２）を有するＲＡの診断（２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準を満たす）、およびＭＴＸによる後続の単一療法に基づいた。応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８寛解（ＤＡＳ２８＜２．６）または良好な応答（＞１．２のＤＡＳ２８改善、およびＤＡＳ２８≦３．２）に達する患者として規定された。非応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８の改善を有しない（≦０．６）患者として規定された。エピジェネティック解析のための血液サンプルを診断時に回収した。（ＤＡＳ２８＝２８関節の疾患活動性スコア）。
【０１５５】
本発明者らは、ＲＡに機能的に結び付いた３０９個の遺伝子座にわたり、１３，３２２種の染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）（１３，３２２種の一意的なプローブ）にわたって解析することによる、二元エピジェネティックバイオマーカープロファイリングを用いた。非常に有益なクラスのエピジェネティックバイオマーカー（１）としてのＣＣＳを、早期黒色腫（２）を有するメイヨークリニックコホートの血液に基づく層別化においてすでに利用に成功しており、かつＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１による免疫療法への応答の予測的層別化に現在用いられるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで読み取り、モニターし、かつ評価した。
【０１５６】
ナイーブＲＡ患者についての同定されたエピジェネティックプロファイルを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＷＥＫＡ、およびＲ統計的言語に供した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームおよび９０個の臨床サンプルの拡張コホートを用いることによって、本発明者らは、応答者、非応答者、ＲＡ患者、および健常対照に対して統計的に有意な、９２２種のエピジェネティックなリードバイオマーカーのプールを同定した。
【０１５７】
ＥＲＡ患者における治療前の循環ＣＣＳ状態を同定するために、ＲＡ病因と関連がある１２３個の遺伝子座（表１）を選択し、かつＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）インシリコ予測パッケージを用いて予測された染色体コンフォメーション相互作用で注釈を付した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）インシリコ予測により、１３，３２２種の高信頼度ＣＣＳマーカー候補（表１）が作成された。これらの候補を用いて、特注の発見ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ（図５）を作り出して、すべてが６ヶ月の療法の後に臨床的に規定された４人のＭＴＸ応答者（Ｒ）および４人のＭＴＸ  ＮＲ（図１Ａ、Ｂ、および表２）、ならびに４人の健常対照（ＨＣ）から診断の時点（ＤＭＡＲＤナイーブ）で単離された末梢血単核細胞をスクリーニングした。Ｒ、ＮＲ、およびＨＣを差別化したＣＣＳを同定するために、正規化されたエピジェネティック負荷のＬＩＭＭＡ*線形モデルを採用した。合計９２２種の統計的に有意な層別化マーカー（調整されたｐ値およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）比に基づいて査定された有意性）を同定した。９２２種のリードマーカーのうち、４２０種はＮＲと、２１０種はＲと、そして１５９種はＨＣと関連付けされた（図１Ｃ）。二元フィルタリングおよびクラスター分析をＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに適用して、同定されたＣＣＳの有意性を査定した。段階的な階層的クラスター手法（完全連結凝集によるマンハッタン距離測定を用い、かつＲ対ＮＲ、ＨＣ対Ｒ、およびＨＣ対ＮＲを考慮に入れる）は、有意なマーカーの数を９２２種から６５種に縮小し、かつ最終的に３０種マーカー層別化プロファイルをもたらした（図１Ｄおよび表３）。
【０１５８】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を査定するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１５９】
ＣＣＳシグネチャーを洗練させかつ検証するために、３０種の同定されたマーカーを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームを用いて（図５）、段階的な手法でＲおよびＮＲの第二のＥＲＡ患者コホートにおいて（図２Ａ、Ｂ、および表４）スクリーニングした。第一の例において、３０種のＣＣＳマーカー全体を、１２人のＥＲＡ患者（６人のＲおよび６人のＮＲ）においてランした。二元スコアに対して、イェーツの連続補正による独立性に関するカイ二乗検定を適用することによって、最良の差別化ＣＣＳマーカーを同定し、１２種マーカーのＣＣＳプロファイルが明らかになった（表５）。これら１２種のＣＣＳマーカーを付加的な１２人のＥＲＡ患者（６人のＲおよび６人のＮＲ）に対してランし、かつデータを以前の１２人のＥＲＡと組み合わせた。２４人の患者サンプル（１２人のＲおよび１２人のＮＲ）を組み合わせて、ＷＥＫＡ分類プラットフォーム（各マーカーの判別力を採点する５分割交差検証を用いる）におけるロジスティック回帰モデルを構築し、かつ初回のデータセットの無作為データ再サンプリングによって１０回ランして、モデル作成のための１０個の異なる出発点を作成した。最も高い平均スコアを有するマーカーを選択し、ゆえにプロファイルを１０種の最良の判別ＣＣＳマーカーまで縮小した（表５）。１０種のＣＣＳマーカーを用いて、さらなる３６人のＥＲＡサンプル（１８人のＲおよび１８人のＮＲ）をプローブした。すべてのデータ（３０人のＲおよび３０人のＮＲ）を組み合わせ、かつ同じロジスティック回帰およびスコア算出解析を用いて、ＭＴＸ  ＲとＮＲとを識別する５種のＣＣＳマーカーシグネチャー（ＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７Ａ、およびＣＸＣＬ１３）が明らかになった（図２Ｃ、表５）。ＣＸＣＬ１３およびＩＬ−１７Ａ遺伝子座におけるＣＣＳは非応答者と関連付けされ、一方でＩＦＮＡＲ１、ＩＬ−２３、およびＩＬ−２１Ｒ遺伝子座におけるＣＣＳは応答者と関連付けされた。ヒト自己免疫におけるＩＬ−１７軸に対して仮定される中心的役割を考慮すると、これは興味深いプロファイルであった。
【０１６０】
重要なことには、層別化シグネチャーの構成は、ＭＴＸ応答を判定するのに最も重要である遺伝的位置を潜在的に制御する染色体コンフォメーションの位置を同定する。５種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーを分類するための二元スコアについての主成分分析（ＰＣＡ）は、それらのＭＴＸ応答に基づくＥＲＡ患者の明確な分離を提供した（図２Ｄ）。モデルは、０．００９８〜０．９９に及ぶ、応答者および非応答者に対する予測確率スコアを提供した（０＝応答者、１＝非応答者）。カットオフ値は、応答者に対して≦０．３０および非応答者に対して≧０．７０に設定された。≦０．３０のスコアは９２％の真陽性率（９５％の信頼区間［９５％  ＣＩ］７５〜９９％）を有し、一方で≧０．７０のスコアは９３％の真陰性応答率（９５％  ＣＩ  ７６〜９９％）を有した。応答カテゴリー（ＭＴＸへのＲまたはＮＲ）あたりの観察されたおよび予測された患者の数が、表６に示されている。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーモデルを用いて、５３人の患者（８８％）は、応答者または非応答者のいずれかとして分類された。
【０１６１】
【表１】
2018527016.tif 000003
【０１６２】
５種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＳＳマーカーを決定したロジスティック分類モデルの「精度」および「性能の堅牢性」を検査するために、ＲおよびＮＲデータの無作為データ再サンプリングによって、１５０個のＲＯＣ**曲線（一意的な出発点を有する）を作成した（図３Ａ）。これは、訓練群（６６％、６０００個の既知のクラスのサンプルに等しい）および検査群（３４％、３０００個の不明なクラスのサンプルに等しい）に分裂されるデータをもたらし；重要なことには、同じ分裂は、交差検証に対するデータには決して見られない。モデルの平均弁別能（ＡＵＣ）は８９．９％（９５％  ＣＩ  ８７〜１００％）であり、９２％というＮＲに対する平均感度（応答普及率に対して調整される）および８４％というＲに対する平均特異性を有した。モデルの予測能力を判定するために、平均モデル精度統計を、ベイズ有病率定理を用いてＭＴＸに対する集団Ｒ／ＮＲに対して調整した21。５５％のＭＴＸ応答率を用いると、陽性の予測値（ＰＰＶ）は９０．３％であり、一方で陰性の予測値（ＮＰＶ）は８６．５％であった。応答率を６０％に調整した場合、これはＰＰＶを８７％に減少させ、一方でＮＰＶを８９％に増加させた。
【０１６３】
**注記：ＲＯＣは、受信者動作特徴を意味しかつＲＯＣ曲線を指す。ＲＯＣ曲線は、その弁別閾値が変動するため、二元分類子システムの性能を図解する図式的プロットである。曲線は、様々な閾値設定で偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることによって創出される。
【０１６４】
選択された５種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳマーカーの判別力についての独立した評価として、３０人のＨＣを組み入れた混合データの因子分析（ＦＡＭＤ）を実施した。これは、シグネチャーが、ＭＴＸ  ＲとＮＲとを差別化する力を有するだけではなく、健常個体とＲＡ患者とを差別化する十分な疾患特異的特質も保持することを例証した（図３Ｂ）。
【０１６５】
実施例１−表６Ｄおよび６Ｅ−ＲＡ−ＭＴＸ応答者と非応答者との間の層別化
下記で実施例１Ａの表６ｂ＋６ｃの後に提示される表６Ｄおよび続きの表６Ｅは、とりわけ約５４種のＤＮＡプローブ（６０マー）およびそれらのＤＮＡ配列のリストを示している。これらのプローブは、実施例１で用いられるプローブの一部に相当する。拘束されることなく、表６Ｄ＋６Ｅにおいて例証されるプローブのほとんどは、ＲＡ−ＭＴＸ応答者とＲＡ−ＭＴＸ非応答者との間を層別化するのに重要である／有用である可能性が高いと思われる。示されたプローブを、ＰＣＲによってさらに検討した。Ｐ値＝確率値；ａｄｊ．＝調整された。
【０１６６】
実施例１−結論
結論として、Ｒ／ＮＲについての有望な臨床査定に基づく、ＤＭＡＲＤナイーブＥＲＡ患者のエピジェネティックプロファイル分類についての本発明者らの調査は、ＭＴＸ応答につながるおよびつながらないエピジェネティック状態を弁別する一貫したエピジェネティックなシグネチャーを同定した。これは、本発明者らの知る限りでは、（健常対照に対して）疾患関連であるように見えかつ第一線ＭＴＸ療法への非応答性を予測し得る、早期ＲＡ患者における安定したかつ選択的に差別化する血液に基づくエピジェネティックバイオマーカーの最初の例である。このモデルは、臨床業務内で近い将来日常的に利用可能である可能性を有する、５種の条件付きＣＣＳおよび産業用ＩＳＯ−１３４８５のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームによるそれらの検出に基づく有効な分類子を有して、直接的かつ実際的な利益を付与する。重要なことには、この予測的シグネチャーを取り入れることによって、ＭＴＸナイーブＥＲＡ患者をＲおよびＮＲコホートに層別化することが可能であるはずである。これは、効果的な療法のより早期の使用を探求するＥＲＡに対する現在認可されている治療ストラテジーを通じた患者の進行を加速する可能性を付与し、それゆえ「個別化された」治療レジームにつながる。さらに、臨床においてファストトラックの生物学的治療レジームを正当化するために用いられ得る代替的ＣＣＳシグネチャーが、ＲＡ患者（および他の自己免疫疾患を有する患者）に存在すると考えられる。これは、遠大な社会経済的な意味合いを有すると考えられ、よりコスト効果がよくかつ堅牢な治療的手法を提供する。
【０１６７】
実施例１−材料および方法
実施例１−ＲＡ患者集団
この調査におけるＥＲＡ患者は、スコットランド早期関節リウマチ（ＳＥＲＡ）開始コホートの一部である。人口統計学的な、臨床的な、および免疫学的な因子を、診断時および６ヶ月の時点で獲得した（表２）。開始コホートへの包含は、スコットランドにおける二次ケアリウマチ科での差別化されない多発性関節炎またはＲＡの臨床診断（≧１の関節腫脹）に基づいた。除外基準は、以前もしくは現在のＤＭＡＲＤ／生物学的療法、および／または確立された代替診断（すなわち、乾癬性関節炎、反応性関節炎）であった。この調査への包含は、中程度から高い疾患活動性（ＤＡＳ２８≧３．２）を有するＲＡの診断（ＲＡに対する２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準を満たす）、およびＭＴＸによる後続の単一療法に基づいた。［ＤＡＳ２８＝２８関節の疾患活動性スコア。ＥＵＬＡＲ＝欧州リウマチ学会。ＡＣＲ＝米国リウマチ学会］。応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８寛解（ＤＡＳ２８＜２．６）または良好な応答（＞１．２のＤＡＳ２８改善、およびＤＡＳ２８≦３．２）に達する患者として規定された。非応答者は、ＭＴＸを受けると、６ヶ月の時点でＤＡＳ２８の改善を有しない（≦０．６）患者として規定された。血液サンプルを診断時（ベースライン）にＥＤＴＡチューブ内に回収し、かつ遠心分離してＰＢＭＣを含有するバフィー層を生成し、それを収集しかつ−８０℃で保存した。地域倫理委員会は調査プロトコールを認可し、かつすべての患者は、調査への登録前にインフォームドコンセントを与えた。
【０１６８】
実施例１−ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）処理、アレイ、およびＰＣＲ検出。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイのためのプローブの設計および位置
パターン認識方法論を用いて、ヒトゲノムにおける転写単位に関係するヒトゲノムデータを解析した。独自のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）パターン認識ソフトウェア18,20は、領域がクロマチン相互作用に関与する確率的スコアを提供する。１２３個の遺伝子座からの配列をダウンロードしかつ処理して、１３，３２２種の最も起こりそうな染色体相互作用のリストを作成した。６０マーのプローブを設計して、これらの潜在的相互作用を詮索し、かつＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎウェブサイトにカスタムアレイとしてアップロードした。ネステッドＰＣＲにより潜在的マーカーをスクリーニングするための選定された部位で、Ｐｒｉｍｅｒ３23を用いて配列特異的オリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチド特異的ＢＬＡＳＴを用いて、オリゴヌクレオチドを特異性について検査した。
【０１６９】
実施例１−患者ＰＢＭＣからのクロマチンコンフォメーションシグネチャー解析
鋳型調製：５０μｌの各ＰＢＭＣサンプルからのクロマチンを、メーカーの指示（Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌｔｄ）に従って、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイを用いて抽出した。簡潔には、高次構造をホルムアルデヒドで固定し、クロマチンを抽出し、ＴａｑＩで消化し、分子内ライゲーションを最大限に高める条件での希釈およびライゲーション、ならびに後続のプロテイナーゼＫ処置。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイ：ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイハイブリダイゼーションを、メーカーの指示（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って、Ａｇｉｌｅｎｔシステムを用いたカスタムＡｇｉｌｅｎｔ  ８×６０ｋアレイを用いて実施した。各アレイは、四つ組になった、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）パターン認識ソフトウェアによって予測された１３，３２２種の潜在的な染色体相互作用、それに加えてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）およびＡｇｉｌｅｎｔの対照に相当する、５５０８８個のプローブスポットを含有する。簡潔には、１μｇのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）鋳型を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇ標識キットを用いて標識した。標識されたＤＮＡの処理を実施した。アレイ解析を、洗浄の直後に、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーおよびソフトウェアを用いて実施した。すべての実験を比較するために、データをバックグラウンド補正しかつ正規化した。アレイにおける各スポットは四つ組で存在するため、アレイにおける各プローブの４つのスポットの中央値を算出し、かつそのｌｏｇ２変換された値をさらなる解析に用いた。変動係数およびｐ値を、各プローブ複製物に対して算出した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ検出：オリゴヌクレオチドを鋳型に対して検査して、各プライマーセットが正しく働いていることを確認した。技術的なおよび複製の変動に適応するために、各サンプルを４回処理した。これら４つの複製物からのすべての抽出物をプールし、かつ最終的なネステッドＰＣＲを各サンプルに対して実施した。この手順は、限定されたコピー数の鋳型の検出をより高い精度で可能にした。ＰＣＲ増幅されたすべてのサンプルを、ＬａｂＣｈｉｐ  ＤＮＡ  １Ｋ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製のＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸにおける電気泳動によって可視化し、かつ内部ＤＮＡマーカーを、蛍光色素を用い、メーカーのプロトコールに従って、ＤＮＡチップにのせた。蛍光をレーザーによって検出し、かつエレクトロフェログラムの読み出しを、機器ソフトウェアを用いて、ゲル写真上のシミュレートされたバンドに転換した。陽性であると見なされる対象となるバンドに対して本発明者らが設定した閾値は、３０蛍光単位およびそれより上であった。
【０１７０】
実施例１−統計の方法およびパッケージ
ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍおよびＳＰＳＳを、臨床データのすべての統計解析に用いた。カイ二乗検定およびフィッシャーの正確検定（カテゴリー変数に関して）、独立したサンプルに対するｔ検定（連続的な通常分布変数に関して）、ならびにマン・ホイットニーＵ検定（通常分布ではない連続変数に関して）を用いて、差を同定した。統計的有意性のレベルを０．０５に設定し、かつすべての検定は両側であった。Ｒ（および適当なパッケージ）を、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）データの評価に用いた。これには、カイ二乗検定およびＧＬＭ（ロジット）に対するＳｔａｔｓパッケージ、ＷＥＫＡ見込み率からのＲＯＣ曲線に対するＲＯＣＲパッケージ、ヒートマップに対するＲにおけるｇｐｌｏｔおよびｓｔａｔｓパッケージが含まれた。ＦａｃｔｏｒＭｉｎｅｒパッケージを、ＰＣＡおよび因子プロットに用いた。Ｗｅｋａを、属性縮小、データの無作為化および再サンプリング、ロジスティックモデル分類子、ＡＵＣ算出、ならびにモデル精度算出に用いた。
【０１７１】
【表２】
2018527016.tif 000004
2018527016.tif 000005
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【０１７２】
【表３】
2018527016.tif 000010
【０１７３】
【表４】
2018527016.tif 000011
2018527016.tif 000012
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【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
【表６】
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【０１７６】
【表７】
2018527016.tif 000016
【０１７７】
実施例１Ａ−ＲＡ解析：ＭＴＸ応答者対非応答者：実施例１の後の作業
実施例１の後に続いて、実施例１Ａにおいて、本明細書における実施例の節の始まりにある「統計的パイプライン」の方法を用いて、生物統計学的超幾何学的解析を行って、ＭＴＸ単一療法でのＲＡ患者に対して、ＭＴＸ応答者対ＭＴＸ非応答者の間を層別化するさらに洗練されたＤＮＡプローブを生成した。
【０１７８】
実施例１Ａ結果：下記の表６ｂ（および続きの表６ｃ）は、ＲＡ−ＭＴＸに対するプローブおよび遺伝子座のデータ−応答者（Ｒ）と非応答者（ＮＲ）との間を層別化するＤＮＡプローブを開示する。Ｂ＝その遺伝子が差異的に発現するという対数オッズである、Ｂ統計（ロッドまたはＢ）。ＦＣは、非対数倍変化である。ＦＣ＿１は、ゼロを中心とする非対数倍変化である。表６ｂ＋６ｃは、超幾何学的解析からの、ＭＴＸ応答者（ＭＴＸ−Ｒ）を同定するための２５種の洗練された好ましいＤＮＡプローブ（６０マー）、およびＭＴＸ非応答者（ＭＴＸ−ＮＲ）を同定するための２４種（または２５種）の洗練された好ましいＤＮＡプローブ（６０マー）の配列を含むと見られる。
【０１７９】
【表８】
2018527016.tif 000017
2018527016.tif 000018
【０１８０】
【表９】
2018527016.tif 000019
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【０１８１】
【表１０】
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【０１８２】
【表１１】
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【０１８３】
【表１２】
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【０１８４】
実施例２：ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）の治療におけるＬＳＤ１の阻害の間の薬力学的バイオマーカーとしての、コンパニオン診断に関連した染色体相互作用を判定する方法
【０１８５】
供給源：英国癌研究所（Institute of Cancer Research UK）
【０１８６】
薬力学的バイオマーカー
薬力学的（ＰＤ）バイオマーカーとは、生命体内の標的に対する薬物効果の分子指示物である。ＰＤバイオマーカーを用いて、薬物レジメン、標的効果、および生物学的腫瘍応答の間の結び付きを調べ得る。新たな薬物開発と、焦点を合わせたＰＤバイオマーカー測定とをつなげることにより、情報に基づく早期の決行／中止の決定をするための、標的薬剤の合理的組み合わせを選択するための、および組み合わせ薬物レジメンのスケジュールを最適化するための重大なデータが提供される。ＰＤ評価項目の使用は、ファースト・イン・ヒューマン試験の前臨床モデルにおけるリード化合物の選択から薬物開発までの合理性および仮説検定力も増強する（国立がん研究所）。
【０１８７】
本発明者らは、染色体シグネチャーが、観察される表現型変化と一致した時点におけるいくつかの薬物への応答をモニターする薬力学的バイオマーカーとして用いられ得ることを発見した。
【０１８８】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー−理想的な薬力学的バイオマーカー
ＭＶ４−１１細胞株に対するBET（ブロモドメインおよび追加末端（extra-terminal））阻害剤に関する仕事は、ＢＥＴ阻害が、主要な癌遺伝子ＢＣＬ２、ＣＤＫ６、およびＣ−ＭＹＣの転写抑制を引き起こすことを示した。ＬＳＤ１阻害剤のようなＢＥＴ阻害剤は、エピジェネティック療法であり、ヒストンのアセチル化およびメチル化の状態を標的にする。遺伝子座における位相的変化はいかなる調節的変化にも先行するため、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）によるＭＹＣ遺伝子座における知見は、ＬＳＤ１阻害による調節的変化の証拠を示している。ＭＶ４−１１細胞株は、ＭＬＬ−ＡＦ４およびＦＬＴ３−ＩＴＤを発現する転座を持し、一方でＴＨＰ−１のみがＭＬＬ−ＡＦ９を発現する。
【０１８９】
ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）に対するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＬＳＤ１阻害バイオマーカー調査
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームによって同定されたエピジェネティックバイオマーカーは、ＬＳＤ１デメチラーゼのエピジェネティックなメカニズムを描出するのに、ならびに細胞株内および細胞株間でのＬＳＤ１阻害剤の種々の特異性の層別化によく適している。この仕事は、染色体立体構造シグネチャーが、ＬＳＤ１阻害におけるメカニズムに結び付いた予測的バイオマーカーとして用いられ得ることを実証する。標準的ＬＳＤ１阻害剤がこの調査において検討される、トラニルシプロミン（ＴＣＰ）。
【０１９０】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＬＳＤ１薬力学的バイオマーカー発見
細胞を１ｕＭのトラニルシプロミン（ＴＣＰ）で処置した。２種のＡＭＬ（急性骨髄性白血病）細胞株ＴＨＰ−１およびＭＶ４−１１を上記の化合物で検査した。ＴＨＰ−１細胞におけるＭＹＤ８８遺伝子の近くで同定された染色体シグネチャーが、表７に示されている。ＭＶ４−１１細胞におけるＭＹＤ８８遺伝子の近くで同定された染色体シグネチャーが、表８に示されている。それぞれの数の組み合わせは、個々の染色体相互作用を指し示す。遺伝子にわたる箇所が、制限部位、および検出の他の特質、およびプライマー効率に基づいて創出されかつ選択されており、次いで相互作用について解析された。表７および８における結果は、シグネチャー検出なしに相当する。シグネチャー検出は、番号１で表される。下記は、細胞株ＴＨＰ−１およびＭＶ４−１１に対する、ＭｙＤ８８遺伝子座に関するＰＣＲ  ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー結果である。ＦＡＣＳ解析を用いて、分化の指示物として、ＣＤ１１ｂ±細胞の発現について選別した。処置の主要な遺伝的ドライバーは７２時間で変化するため、ＭｙＤ８８およびＭＹＣ遺伝子座を、以前に刊行された調査に基づいて選択した。
【０１９１】
ＬＳＤ１阻害剤（ＴＣＰ）実験−発見の知見
未処理の細胞と比べた、より遅い時点（７２時間）で変化する立体構造は、２種の細胞タイプの間で最高の一致を示している。これらは、ＴＨＰ−１データにおいて示される太い二重線より上のマーカーであり、かつＭＶ４−１１データにおける影付きの細胞によって強調されている。
【０１９２】
ＬＳＤ１阻害は、ＭＹＤ８８のＯＲＦに対する５’上流との長距離相互作用を除去し、遺伝子座に対する調節的地形を変化させる。
【０１９３】
ＬＳＤ１阻害解析対遺伝子発現データ−ＭＹＣ遺伝子座立体構造と遺伝子発現（ＧＥＸ）との時間的および構造的な相関
ＭＹＣは、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）病理を駆動する標的遺伝子であるが、７２時間の処置の時点で、倍変化は、マーカーにとって有意であるには小さすぎる。ＧＥＸデータに関する７２時間の時点でのＭＹＣ遺伝子座における表９に見られる変化は、７２時間の時点で同定される立体構造変化と相関する。未処理の細胞と比べたＭＹＣにおける負のＧＥＸ変化は、ＭＹＣ増生効果を混乱させる要件に即している。変化は、無数のシグナルカスケードによってこの遺伝子座上で誘発される厳格な制御にも即して小さい。
【０１９４】
上記のＧＥＸデータとは異なり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーは、細胞分化およびアポトーシスによるそれらの死（表現型変化）と対応した、７２時間の処置の時点における染色体立体構造シグネチャーの変化を明確に検出する。
【０１９５】
ＬＳＤ１阻害解析対遺伝子発現データ−ＭｙＤ８８遺伝子座立体構造と遺伝子発現（ＧＥＸ）との時間的および構造的な相関
ＧＥＸデータに関する７２時間の時点でのＭｙＤ８８で見られる変化は、７２時間の時点で同定される立体構造変化と相関する。ＧＥＸ変化は、未処理の細胞と比べて正であり、それは、ＬＳＤ１阻害剤による処置後のこれらのＡＭＬ（急性骨髄性白血病）細胞において見られる差に即している。
【０１９６】
ＭＹＤ８８遺伝子座においてＴＣＰによる７２時間の処置で観察されたほんの１．５倍の変化は、ＧＥＸおよびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の両方によって同定される。このレベルの変化は、マイクロアレイ遺伝子発現解析におけるノイズによって影響をあまりにも受ける。しかしながら、染色体シグネチャーに対して観察されるエピジェネティックな変化は綺麗であり、０または１という二元形式に従う。データは、変化の個別のパターンを示している。ＭＹＣおよびＭＹＤ８８の両方は、ＧＥＸデータに示されるように、遺伝子発現において強い応答とともに存在し得ないエピジェネティックなドライバーであるが、主要なエピジェネティックな変化は、染色体シグネチャーを通じて目に見えるため、同定され得る。これら２つの遺伝的ドライバーは、治療的処置の成功に要される表現型変化を規定する。７２時間の時点で、細胞は分化しかつアポトーシスを受ける。
【０１９７】
【表１３】
2018527016.tif 000033
【０１９８】
【表１４】
2018527016.tif 000034
【０１９９】
【表１５】
2018527016.tif 000035
【０２００】
【表１６】
2018527016.tif 000036
【０２０１】
【表１７】
2018527016.tif 000037
【０２０２】
【表１８】
2018527016.tif 000038
【０２０３】
実施例３：治療された患者におけるメラノーマ再発の予後に対するコンパニオン診断に関連する染色体相互作用を判定する方法（ＰＣＲデータ）
【０２０４】
供給源：メイヨークリニック転移性メラノーマコホート、米国
【０２０５】
予後バイオマーカーは、疾患の経過または転帰（例えば、終結、安定化、または進行）を予測する。この調査は、外科的治療を受けた再発または回復の兆しについてモニターされたメラノーマ患者における明確なエピジェネティックな染色体立体構造差を同定するための、およびメラノーマの再発をモニターするための予後バイオマーカーである潜在性についてそのようなバイオマーカーを検証するための、再発に対する予後バイオマーカーとして作用し得る染色体シグネチャーを発見しかつ検証する。ここで、本発明者らは、治療の２年以内に再発する可能性がある候補者を同定するための、元の増殖の切除による治療を受けている確認されたメラノーマ患者への適用における染色体立体構造シグネチャーの有効な予後使用についての本発明者らの例を提示したい。
【０２０６】
２２４人のメラノーマ患者を外科手術で治療して、彼らの癌を除去した。次いで彼らを、外科手術後＞１００日の時点での解析のために採られている血液に関して２年間の期間観察した。
【０２０７】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）予後バイオマーカー発見
メラノーマと関連がある４４種の遺伝子の染色体シグネチャー、および次世代シーケンシングＮＧＳによる任意の疾患特異的な長距離相互作用に対するゲノムの残りを検査した。ディープシーケンシングによる、メラノーマと関連がある染色体シグネチャーについての先入観のない査定は、２５００種の候補マーカーをの初回プールを提供した。メラノーマ患者および対照としての非メラノーマ皮膚癌（ＮＭＳＣ）を有する患者からの血液サンプルの拡張セットに対するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームによるさらなる解析は、候補マーカーの初回プールを１５０種に縮小した。表１３に示されるように、サンプル数に対するさらなる拡張を用いると、それは３２種に縮小されている。
【０２０８】
【表１９】
2018527016.tif 000039
【０２０９】
再発の予後
非メラノーマ皮膚癌からメラノーマの層別化のために以前に同定された上位１５種のマーカーは、ＴＢｘ２  ７／１５、ＴＹＲ  １／９、ＴＹＲ  １３／１７、ＴＹＲ  ３／１１、ＴＹＲ  ３／２３、Ｐ１６  １１／１９、Ｐ１６  ７／２３、Ｐ１６  ９／２９、ＭＩＴＦ  ３５／５１、ＭＩＴＦ  ４３／６１、ＭＩＴＦ  ４９／５５、ＢＲＡＦ  ５／１１、ＢＲＡＦ  ２７／３１、ＢＲＡＦ  ２１／３１、ＢＲＡＦ  １３／２１を含み、それは、合計８種の遺伝子：ＴＢｘ２；ＴＹＲ；ＢＲＡＦ；ＭｉＴＦ；ｐ１６；ＢＲＮ２；ｐ２１；ＴＢｘ３から選ばれた。
【０２１０】
メラノーマ患者のエピジェネティックプロファイルについての３Ｃ解析は、予後バイオマーカーである潜在性を有する１５０種の染色体シグネチャーを明らかにし、検査サンプルコホートの拡張セットにおいて３種に縮小した。染色体立体構造シグネチャーにおいて切り替えを示す３種の染色体シグネチャーは、治療および再発に対する２年転帰と高度に一致し、かつこれは最良の潜在的予後メラノーママーカーである：ＢＲＡＦ  ５／１１、ｐ１６−１１／１９、およびＴＹＲ  １３／１７。最終的に、３種の染色体シグネチャーに、予後バイオマーカーとしての検証段階が行われた。
【０２１１】
【表２０】
2018527016.tif 000040
【０２１２】
表１４は、再発が、上記の患者の間で治療後２年以内に観察されていることを示している。染色体シグネチャーについての完全に先入観のない解析により、これらの疾患特異的な３種のマーカーは、治療後に再発した患者の大多数において、治療後に存在したままでありかつ変化しないままであった。
【０２１３】
表１５は、染色体シグネチャーが治療の結果として変化して、より健常なプロファイルを反映するという証拠を提供する。染色体シグネチャーについての完全に先入観のない解析により、同じ疾患特異的な３種のマーカーは、２年間再発の兆しを有しない治療後の患者の大多数において、変化しておりかつ存在しなかった。
【０２１４】
表１６は、同じ３種の予後バイオマーカーが、健常集団に存在しない強い傾向を示している。初回の発見段階において同定されたすべてのメラノーマ特異的バイオマーカーから、これら３種のマーカーのみが、それらは診断マーカーとは異なるという点で、治療後のそれらの変化により予後的価値を持った。
【０２１５】
これらの結果は、３種の同定された染色体シグネチャーが、妥当でかつ堅牢な予後バイオマーカーとして作用する染色体シグネチャーの証拠を例示することを裏付ける。
【０２１６】
【表２１】
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【０２１７】
【表２２】
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【０２１８】
再発の予後（治療されたメラノーマ患者における残存疾患モニタリング）
術後の血液検査からの３種の予後染色体シグネチャーによる層別化に基づく、再発に対する治療後に２年間観察された２２４人のメラノーマ患者に対する交差検証。表１７は、関連する混同表を示している。
【０２１９】
【表２３】
2018527016.tif 000043
【０２２０】
【表２４】
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【０２２１】
薬物応答に対する予測的／薬力学的バイオマーカー：転移性メラノーマ患者における抗ＰＤ−１（アレイデータ）
メラノーマ
悪性メラノーマは極めてまれであるが、最も進行性の形態の皮膚癌である。それは、暗い色素のメラニンの合成に関与する細胞であるメラニン細胞で生じる。悪性メラノーマの大多数は、太陽からの激しいＵＶ曝露によって引き起こされる。新たなメラノーマ症例のほとんどは、太陽光およびサンベッドからＵＶ曝露への行動変化に結び付いていると考えられる。世界的には、２０１２年、メラノーマは２３２，０００人の人々で生じ、そして５５，０００人の死亡をもたらした。発生率の割合は、オーストラリアおよびニュージーランドで最も高い。世界規模の発生率は、他の任意の癌タイプよりも男性の間でより急激に増加しており、過去１０年間にわたって女性の間で２番目に早い発生率増加を有する。生存率は、ステージ１および２のメラノーマを有する個体に関して非常に良好である。しかしながら、癌が遠く離れたリンパ節または身体の他の部分に広がっているメラノーマ患者のうち７〜１９％のみが５年を上回る間生存する。現在、メラノーマを精確に診断する唯一のやり方は、疑わしいホクロに対して切除生検を実施することである。治療は、腫瘍の外科的除去を含む。英国にはメラノーマスクリーニングプログラムはないが、メラノーマの危険性および症状への意識を高めるための教育プログラムが創出されている。メラノーマ発生率が非常に高い国では、例えばオーストラリアでは、スクリーニングプログラムに対する高い需要がある。この仕事は、メラノーマ免疫療法に対する診断、予後、残存疾患モニタリング、およびコンパニオン診断のためのバイオマーカーに関する。
【０２２２】
調査背景
癌の治療において現在検査されるすべての免疫変調因子に関する主な課題は、それらの低い応答率である。後期メラノーマの場合、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体に対して、客観的応答率はほんの３０〜４０％である。そのような療法は、応答者対非応答者を予測するバイオマーカーを強く必要としている。ＰＤ−１遺伝子座は、長距離染色体立体構造シグネチャーの再設定により、エピジェネティックにサイトカインによって調節される。
【０２２３】
ＯＢＤ技術
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、免疫療法の前のおよびそれに応答したＰＤ−１エピジェネティック状態の層別化に理想的に適している。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、メラノーマ患者における抗ＰＤ−１治療への応答の制御および変調に関わる＞３３２個の遺伝子座の解析のために設計されている。
【０２２４】
方法
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ解析を用いたバイオマーカー同定：
１．ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）パターン認識によって判定される３３２個の遺伝子位置に対する染色体立体構造。
２．ＰＤ１スクリーニングアレイ上の１４，０００種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー。
【０２２５】
サンプル
すべての患者は、化学療法および抗ＣＴＬＡ−４療法を用いて以前に治療されている。２つの時点を、治療前（基準サンプル）および治療後（１２週サンプル）と見なした。
【０２２６】
発見コホート
・基準時における４人の応答者対４人の非応答者
・１２週の時点における４人の応答者対４人の非応答者（マッチした）
【０２２７】
超幾何学的解析
アレイデータ解析の最後の工程として、超幾何学的解析を行って、調節的中心地、すなわち層別化のための潜在的な原因となる標的および好ましい遺伝子座であるものとしての最も密に調節された遺伝子を同定した。データを、Ｒ対Ｒ  １２Ｗ（１２Ｗ＿ＦＣ＿１）に関するエピジェネティック比によってランク付けし、ＢＬ二元における１は、応答者対非応答者において、しかしながら基準の応答者を１２週の時点の応答者と比較した場合に、ループが存在することを示す。エピジェネティック比は、ループの存在が、１２週の応答者患者サンプルにおいてより豊富であることを示す。これは、このシグネチャーの拡張が存在していることを示す。
【０２２８】
概要
潜在的な予測的かつ薬力学的なバイオマーカーについての抗ＰＤ１療法のエピジェネティックなスクリーニングは、事前の生物学的証拠と一致した大量の新たな調節的知識を提供する。仕事は、検証解析において使用するための予測的かつ薬力学的／応答ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの豊かなプールを提供する。結果は、抗ＰＤ−１療法に対して寛容な規定のエピジェネティックプロファイルの存在を示している。抗ＰＤ１療法に対して寛容なエピジェネティックプロファイルは、基準時のナイーブ患者に存在しかつ１２週の期間にわたる治療で強化される。
【０２２９】
さらなる情報
この仕事は、一般開業医によるメラノーマ診断の乏しさという課題に対処する、診断検査の基礎としてのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）に関する。本物の臨床設定に相当する８６人の患者サンプルの初回セットから、１５種のリードＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーをスクリーニングしかつ同定した。次いで、バイオマーカーを、２つの独立した患者コホート：オーストラリア由来のもの（３９５人の患者）およびメイヨークリニック由来のもの（１１９人の患者）において訓練しかつ検証した。
・１１９人の独立してかつ遡及的に注釈が付された血液サンプル
・５９人のメラノーマサンプル
・６０人の対照（２０人のＮＭＳＣ、２０人の良性病状、２０人の健常患者）
・米国における２つのクリニック収集物
【表２５】
2018527016.tif 000045
【０２３０】
抗ＰＤ−１療法に対する基準時の予測的バイオマーカーとして、統計処理によって同定された６８種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー。（ＰＤ１−Ｒ対ＮＲ  ＢＬ）。Ｒは応答者であり、そしてＮＲは非応答者である。抗ＰＤ−１療法に対する応答バイオマーカーとして、統計処理によって同定された６３種のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー。（ＰＤ１  Ｒ−ＢＬ対Ｒ−１２Ｗ）。１０種のマーカーは、予測的マーカーおよび応答マーカーに対する両方の優れた候補である。
【０２３１】
フィッシャーの正確検定結果：独立した患者コホートに対するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームで検証された上位８種の予測的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイマーカー（表３７を参照されたい）。基準時の応答者と１２週の時点での応答者との間のＰＣＲ解析のための、フィッシャー正確解析からの判別マーカーに関しては、表３８を参照されたい。１は、立体構造が存在するである。０は、立体構造が存在しないである。アレイ：Ｒ１２＿Ｗは、立体構造が１２週の時点での応答者に存在したことを示す。
【０２３２】
STAT5B_17_40403935_40406459_40464294_40468456_FRプローブを、基準時の応答者対非応答者において測定し、そして立体構造は応答者に存在する。この比較において、マーカーは１２週の時点での応答者にあり、応答者対非応答者における立体構造を検出するために用いられたＤＮＡの凝縮は、基準時の応答者対１２週の時点での応答者においてよりも大きいため、これは事実であり、エピジェネティック負荷が抗ＰＤ−１応答患者において増加していることを示す。マーカーのＳＴＡＴ５ＢおよびＩＬ１５は特に関心対象であり、そして主要な個別化医療、および抗ＰＤ１療法への応答の効率に関わる調節的事象に関与する（表３９〜４０、４３〜４７を参照されたい）。
【０２３３】
以下の表３６ａ〜３６ｆ、３７ａ、３７ｂ、３８ａ、および３８ｂも実施例３に付随し、そして以下のとおりである。
表３６ａ．上位のプローブ−抗ＰＤ１（メラノーマ）−応答者
表３６ｂ．上位のプローブ−抗ＰＤ１（メラノーマ）−応答者−プローブ配列
表３６ｃ．上位のプローブ−抗ＰＤ１（メラノーマ）−応答者−遺伝子座
表３６ｄ．上位のプローブ−抗ＰＤ１（メラノーマ）−非応答者
表３６ｅ．上位のプローブ−抗ＰＤ１（メラノーマ）−非応答者
表３６ｆ．上位のプローブ−抗ＰＤ１（メラノーマ）−非応答者−プローブ配列および遺伝子座
表３７ａ．抗ＰＤ１：薬力学的応答マーカー
表３７ｂ．抗ＰＤ１：薬力学的応答マーカー
表３８ａ．抗ＰＤ１：薬力学的応答マーカー−基準の応答者および基準の非応答者において差はないが、１２週の応答者において有意な変化を示している。
表３８ｂ．プローブ位置−抗ＰＤ１：薬力学的応答マーカー−基準の応答者および基準の非応答者において差はないが、１２週の応答者において有意な変化を示している。
【０２３４】
兆候例
実施例４−筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
運動ニューロン疾患の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）は、中枢神経系における一次運動ニューロンの進行性の死滅によって特徴付けされる致死性神経変性疾患である。症状には、筋肉の弱まりおよび筋肉消耗、嚥下困難および毎日の業務に取り組むことの困難が含まれる。疾患が進行するにつれて、呼吸に関わる筋肉は徐々に落ち、呼吸することの困難、そして最終的に死を引き起こす。ＡＬＳは、１００，０００人あたり２人という平均有病率を有するが、英国および米国ではより高く、最大１００，０００人あたり５人を有する。該病状を有する、米国には５０，０００人を上回る患者、そして英国には５，０００人を上回る患者がいると概算される。ＡＬＳ罹患者に関する死亡率は高く：ＡＬＳを有するという診断からの生存期間中央値（すなわち、患者の５０％が死んでいる時点）は、種々の調査により変動するが、最も確実な（先入観のない）集団調査において、それは１８〜３０ヶ月の範囲を有して約２２ヶ月である。公知の治癒法がなく、ＡＬＳの治療は支持ケアに焦点を合わせる。ＡＬＳ患者に寿命のわずかな増加、しかしながら症状の最低限の改善を提供するリルゾールという、治療に現在認可された唯一の薬物がある。ＡＬＳの生物学的基礎の徹底的な研究にもかかわらず、治療の診断および方法、ならびに疾患進行のモニタリングは、依然として難題のままである。そのような予後検査は、臨床的不均一性の生物学的仲介因子に従った患者の下位層別化を可能にし、急速なおよび緩徐な進行因子を同定することによってより精密な予後およびケア計画を潜在的に可能にすることによって、ＡＬＳ罹患者に大きな利益を与えるであろう。ＯＢＤは、ＡＬＳ対健常対照、および急速進行性ＡＬＳ対緩徐進行性ＡＬＳを層別化するための、ＡＬＳに対する診断的、予後的、および予測的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーを開発しかつ検証するためのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを発見している。
【０２３５】
供給源：北東部筋萎縮性側索硬化症コンソーシアム（ＮＥＡＬＳ）−米国
【０２３６】
ＡＬＳプローブ−ＡＬＳ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、表１、２、１８、および４２、ならびに下記を参照されたい。表２７は、この兆候に対する遺伝子データを示している。
【０２３７】
さらなる仕事を実施して、上位ＡＬＳアレイマーカーを検証し、かつ相互作用を調査し得るプライマーを同定した。アレイマーカーについての統計解析は、ＰＣＲに基づくアッセイ開発のための最終候補リスト選択物の情報を与えた。最良の層別化ＡＬＳアレイプローブのリストから、９９種のマーカーをＰＣＲ段階に選んだ。
【０２３８】
マイクロアレイから同定されたマーカーから、Integrated DNA Technologies（ＩＤＴ）ソフトウェア（および、必要に応じてＰｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．０ソフトウェア）を用いて、プライマーを設計した。プライマー検査を各プライマーセットに対して行った；各セットを、サンプルのプールされた部分集合に対して検査して、適当なプライマーは潜在的相互作用を調査し得ることを確保した。ＰＣＲからの増幅産物の存在は、ライゲーションした産物の存在を示すと受け取られ、特定の染色体相互作用が起こっていることを示した。プライマー検査が成功した場合には、プライマーセットはスクリーニングに通された。
【０２３９】
シグネチャーセットを、単変量統計（ＬＩＭＭＡパッケージ、Ｒ言語）および多変量統計（ＧＬＭＮＥＴパッケージ、Ｒ言語）の組み合わせを用いて単離し、かつＷＥＫＡ（機械学習アルゴリズムパッケージ）内のロジスティックモデリングを用いて検証した。北東部筋萎縮性側索硬化症コンソーシアム（ＮＥＡＬＳ）からのデータを用いて、最良の１０種の層別化ＰＣＲマーカーを、５８人の個体（２９×ＡＬＳ；２９×健常対照−ＨＣ）に対する検証のために選択した。これらは、それらのフィッシャーの正確Ｐ値に基づいて選択された。３つすべての検定からの一貫して優れたマーカーは、ＣＤ３６におけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーであった。表４１に示される最初の９種のＰＣＲマーカーは、９０％ランクの弁別指標でＡＬＳとＨＣとの間を層別化した。
【０２４０】
ＡＬＳマーカーセットを、オックスフォード大学によって提供されたサンプルの小さな独立したコホートに対して解析した。サンプルの小さな部分集合においてさえ、バイオマーカーに基づいて、サンプルの層別化が示された。４種のマーカーは、＜０．３のｐ値を有して、３２人（１６人のＡＬＳ、１６人の健常対照）のサンプルの部分集合を層別化する。これらコアマーカーは、それぞれＥＧＦＲ、ＤＮＭ３、ＣＤ３６、およびＧＬＹＣＡＭ１遺伝子における、ALS.21.23_2、DNM3.5.7_8、ALS.61.63_4、およびNEALS.101.103_32である。フィッシャー正確検定、ＧＬＭＮＥＴ、およびベイズロジスティックモデリングは、ＣＬＩＣ４を該４種のコアマーカーに加えられる貴重なものとして印付けした。
【０２４１】
表４１で与えられるＰＣＲマーカーに対するプライマーの配列は、表４２に提供される。
【０２４２】
実施例５−糖尿病（ＤＭ）ＩＩ型（Ｔ２ＤＭ）
２型糖尿病（Ｔ２ＤＭとしても知られる）は、糖尿病の最もよく見られる形態である。糖尿病は、血中糖レベルを調節する十分なインスリンホルモンを産生しない膵臓、またはインスリン感度の低下によりそれが産生するホルモンを効果的に使用し得ていない身体、のいずれかにより生じ得る。最近まで、Ｔ２ＤＭは成人においてのみ診断されていたが、それは今、子どもおよび若年成人において生じている。世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、糖尿病は、世界的に３４，６００万人の罹患者を有するパンデミックレベルに達し、そしてその発生率は２０３０年までに倍増すると予測される。２００４年だけで、およそ３４０万人の人々が、糖尿病およびその合併症の結果として死亡しており、死亡の大多数は低所得および中所得の国で生じている。Ｔ２ＤＭの発生率は、老齢人口、運動の不足および喫煙などの生活習慣の変化、ならびに食事および肥満が原因で増加している。Ｔ２ＤＭはインスリン依存性ではなく、そして食事、運動などの生活習慣の変化によって制御され得、かつ医薬でさらに補助され得る。インスリンで治療された個体は、重度の低血糖症（低い血中グルコースレベル）を発症するより高い危険性があり、ゆえに彼らの医薬および血中グルコースレベルは、日常的モニタリングを要する。一般的に、確立されたＴ２ＤＭを有するより高齢の個体ほど、心血管疾患（ＣＶＤ）および他の合併症のより高い危険性があり、ゆえに通常、最近認識された疾患を有するより若年の成人よりも多くの治療を要する。英国では７００万人の人々が、Ｔ２ＤＭに進行する危険性を増加させる、前糖尿病の病状による影響を受けていると概算されている。そのような個体は、血中グルコースレベルの上昇によって特徴付けされるが、通常無症状性であり、ゆえに長年見過ごされ得、彼らの健康に徐々に影響を与える。本発明者らは、前糖尿病状態およびＴ２ＤＭに対する予後的層別化を開発する。前糖尿病状態（前Ｔ２ＤＭ）対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー、ならびにＴ２ＤＭ対健常対照を層別化する発見のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー、および侵攻性Ｔ２ＤＭ対緩徐型Ｔ２ＤＭを層別化する予後マーカーが、本明細書において提示される。
【０２４３】
供給源：ノーフォーク・ノリッチ大学病院（Norfolk and Norwich University Hospitals）（ＮＮＵＨ）、ＮＨＳ基金トラスト−英国ノーリッチ
【０２４４】
前２型糖尿病プローブ−前２型糖尿病対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、下記の表１９ａ、１９ｂ、１９ｃ、および１９ｄを参照されたい。表２８は、遺伝子データを示している。
【０２４５】
２型糖尿病プローブ−２型糖尿病対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、下記の表２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄも参照されたい。表２９は、遺伝子データを示している。
【０２４６】
実施例６−糖尿病Ｉ型（Ｔ１ＤＭ）
糖尿病（ＤＭ）１型（Ｔ１ＤＭとしても知られる；かつては、インスリン依存性糖尿病または若年性糖尿病）は、膵臓におけるインスリン産生β細胞の自己免疫破壊により生じる糖尿病の形態である。古典的症状は、多尿症（頻尿）、多飲症（口渇の増加）、多食症（空腹感の増加）、および体重減少である。とはいえ、Ｔ１ＤＭは全糖尿病症例の５％を占め、それは、子どもの間で最もよく見られる内分泌系および代謝系の病状の一つである。その原因は不明であるが、遺伝因子および環境誘因の両方が関与していると思われる。世界的に、Ｔ１ＤＭを有する人々の数は不明であるが、とはいえ、約８０，０００人の子どもが毎年該疾患を発症すると概算される。新たな症例の発症は、国および領域によって変動する。米国および北ヨーロッパは、１年あたり１００，０００件あたり８〜１７件の新たな症例に収まる。糖尿病の治療は、血中グルコース、および血管に損傷を与える他の公知の危険因子のレベルを下げることを伴う。インスリンの投与は、生存に必須である。インスリン療法は永久に続けられなければならず、通常、普通の日常活動を損なわない。治療をしないと、糖尿病は、心臓病、脳卒中、腎不全、足部潰瘍、および目への損傷など、多くの深刻な長期合併症を引き起こし得る。急性合併症には、糖尿病性ケトアシドーシスおよび昏睡が含まれる。ＯＢＤの糖尿病プログラムは、Ｔ１ＤＭの診断的および予後的な層別化のためのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーの開発に焦点を合わせる。
【０２４７】
Ｔ１ＤＭ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、本明細書において提示される。
【０２４８】
供給源：グラスゴーに基盤を置く調達会社ティシュー  ソリューションズ（Tissue Solutions）によって収集されたコーカサス人サンプル（ロシアで収集されたサンプル）；ＮＥＡＬＳコンソーシアム対照（米国）
【０２４９】
１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）プローブ−Ｔ１ＤＭ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、下記の表２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、および２１ｄを参照されたい。表３０は、遺伝子データを示している。
【０２５０】
実施例７−潰瘍性結腸炎（ＵＣ）
胃腸管の慢性炎症性疾患である潰瘍性結腸炎（ＵＣ）は、毎年１００，０００人あたり１０人の発生率および１００，０００人あたり２４３人の有病率を有する、腸の炎症性疾患の最もよく見られるタイプである。とはいえ、ＵＣは、任意の年齢の人々において生じ得、１５〜３０歳の年齢の間および６０歳よりも高齢の人々において発症する可能性がより高い。潰瘍性結腸炎の正確な原因は不明である。しかしながら、過活動の腸管免疫系、家族歴、および環境因子（例えば、情緒的ストレス）が、ＵＣを引き起こすことに役割を果たし得ると思われる。
【０２５１】
それは、他の人種的および民族的な部分群においてよりも、コーカサス人およびアシュケナージ系ユダヤ人起源の人々においてより有病率が高い。この病状の最もよく見られる兆しおよび症状は、血液または膿を有する下痢および腹部不快感である。それは、関節、脊椎、皮膚、目、ならびに肝臓およびその胆管における炎症も引き起こし得る。ＵＣ診断は、家族歴を聴取すること、身体診察、研究室検査、および大腸の内視鏡検査を通じて行われる。この生涯にわたる疾患は、特に制御不良の場合、相当な罹患率、ならびに社会的および精神的な後遺症の潜在性を伴う。潰瘍性結腸炎を有する人々の概算３０〜６０％は、１年あたり少なくとも１回の再発を有すると考えられる。これらのうちの約８０％は軽度〜中程度であり、そして約２０％は重度である。ＵＣを有する人々のおよそ２５％は、彼らの生涯において急性重症結腸炎の１回または複数回の出現を有すると考えられる。これらのうち、２０％は彼らの最初の入院で、そして４０％は彼らの次の入院で、結腸のすべてまたは一部の外科的除去（結腸切除）を必要とすると考えられる。死亡率の割合は過去３０年にわたって着実に改善しているものの、急性重症結腸炎はなおも最大２％の死亡率の割合を有する。死亡率は、医薬療法および結腸切除を含めた、介入のタイミングによって直接影響される。
【０２５２】
潰瘍性結腸炎は、長期にわたるかつ広範な疾患において最大の危険性を有して、結腸直腸癌の発症と十分に立証された関連性を有する。再発の治療は、臨床的重症度、疾患の程度、および患者の選好に依存し得、そしてアミノサリチレート、コルチコステロイド、または免疫変調因子の使用を含み得る。薬剤についての結果として生じた広い選定および投薬レジメンは、英国にわたる管理の幅広い不均一性をもたらしており、そして医療従事者が一貫した高品質のケアを提供するのを助ける包括的指針の重要性を強調する。
【０２５３】
ＵＣに対する疾患特異的シグネチャーの開発のための、ＵＣ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、本明細書において提示される。
【０２５４】
供給源：グラスゴーに基盤を置く調達会社ティシュー  ソリューションズによって収集されたコーカサス人サンプル（ロシアで収集されたサンプル）；ＮＥＡＬＳコンソーシアム対照（米国）
【０２５５】
潰瘍性結腸炎（ＵＣ）プローブ−ＵＣ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、下記の表２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、および２２ｄを参照されたい。表３１は、遺伝子データを示している。
【０２５６】
実施例８−全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
円板状ループスまたは播種性エリテマトーデスとしても知られる全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、皮膚、関節、腎臓、脳、および他の器官に影響を及ぼす自己免疫疾患である。「ループス」にはいくつか異なる疾患が含まれるものの、ＳＬＥはループスの最もよく見られるタイプである。ＳＬＥは、発疹、光過敏症、口腔内潰瘍、関節炎、肺および心臓を取り囲む内壁の炎症、腎臓の問題、発作および精神病、ならびに血液細胞異常を含めた、多岐にわたる臨床所見を有する疾患である。症状は、変動し得かつ経時的に変化し得、かつ疾患特異的ではなく、それが診断を困難にする。それは、１５〜４０歳の年齢でピークの発生を有して、幼児期から高齢までに生じる。集団におけるＳＬＥの報告された有病率は、１００，０００人あたり２０〜１５０件の症例である。女性では、有病率の割合が、１００，０００人あたり１６４人（白人）〜４０６人（アフリカ系アメリカ人）まで変動する。軽度の疾患の検出の改善により、発生率は、２０世紀の過去４０年間でほぼ三倍になった。概算される発生率の割合は、北アメリカ、南アメリカ、ヨーロッパ、およびアジアで１００，０００人あたり１〜２５人である。ＳＬＥの正確な原因は不明であるが、いくつかの因子が該疾患と関連付けされている。ループスを有する人々は、しばしば、他の自己免疫病状を有する家族メンバーを有する。紫外線、ある特定の医薬、ウイルス、身体的または情緒的なストレス、および心的外傷のような環境誘因があり得る。ＳＬＥに対する治癒法はなく、治療は症状を緩和することである。これらは、発現した症状に応じて変動すると考えられ、そして抗炎症医薬、ステロイド、コルチコステロイド、および抗マラリア薬を含み得る。生存は改善してきており、より多くのまたはより軽度の症例が認識されつつあることを示唆する。ＯＢＤは、ＳＬＥに対する予後シグネチャーを開発している。
【０２５７】
ＳＬＥプローブ−ＳＬＥ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、表２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、および２３ｄを参照されたい。表３２は、遺伝子データを示している。
【０２５８】
供給源：グラスゴーに基盤を置く調達会社ティシュー  ソリューションズによって収集されたコーカサス人サンプル（米国で収集されたサンプル）；ＮＥＡＬＳコンソーシアム対照
【０２５９】
実施例９−多発性硬化症（ＭＳ）
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄の両方に影響を及ぼす、中枢神経系（ＣＮＳ）の後天的な慢性免疫介在性炎症病状である。ＭＳの原因は不明である。遺伝的になりやすい傾向がある人々における環境誘因への異常な免疫応答が、免疫介在性の急性、次いで慢性の炎症をもたらすと思われる。炎症の初期位相の後に、神経系における影響を受けた細胞の進行性変性の位相が続く。ＭＳは、ヨーロッパ、米国、カナダ、ニュージーランド、およびオーストラリアの一画における人々の間でより多く見られ、そしてアジアおよび熱帯地方ではあまり見られない。それは、英国においておよそ１００，０００人の人々に影響を及ぼす。米国では、ＭＳを有する人々の数は、毎年診断されるおよそ１０，０００件の新たな症例を有して、約４００，０００人であると概算される。ＭＳを有する人々は、典型的に２０〜４０歳の年齢で症状を発症し、視覚および知覚の乱れ、肢の弱まり、歩行の問題、ならびに膀胱および腸の症状を経験する。彼らは初めに部分的な回復を有し得るが、経時的に進行性の障碍を発症する。とはいえ、治癒法はなく、ＭＳを治療しかつ管理するための多くの選択肢がある。それらには、薬物治療、運動および理学療法、食事療法および代替療法が含まれる。ＭＳは、かなりの個人的、社会的、および経済的な重要性を有する、潜在的に非常に支障を来たす障碍である。ＭＳを有する人々は、彼らの作業能に対するかなりの影響、ならびに彼らの生活の質および彼らの家族のそれに対する有害でかつしばしば非常に衰弱させる効果を有して、診断後に長年生存する。ＯＢＤのＭＳプログラムは、一次性進行型と再発寛解型ＭＳとの間の予後的層別化に注目することを伴う。
【０２６０】
疾患の最もよく見られる（およそ９０％）パターンは、再発寛解型ＭＳ（ＭＳＲＲ）である。このタイプのＭＳを有するほとんどの人々は、彼らの２０代前半に症状を最初に経験する。その後、断続的な攻撃（再発）、それに続く部分的または完全な回復（寛解）がある。影響を受けた神経のパターン、攻撃の重症度、回復の程度、および再発間の時間はすべて、人それぞれに広く変動する。結局、再発寛解型ＭＳを有する人々の３分の２前後は、ＭＳの二次性進行型位相に入る。これは、頻度が少なくなるまたは完全に停止する再発とは無関係な障碍の徐々の蓄積がある場合に生じる。
【０２６１】
ＩＦＮ−Ｂ治療への応答者対非応答者であるＭＳ患者を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）モニタリングマーカー；ＭＳＲＲ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー、およびＭＳＲＲ（再発寛解型タイプのＭＳ）対ＭＳＰＰ（一次性進行型タイプのＭＳ）を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが、本明細書において提示される。
【０２６２】
供給源：グラスゴーに基盤を置く調達会社ティシュー  ソリューションズによって収集されたコーカサス人サンプル（ＭＳ−ＲＲ：ロシア；ＭＳ  ＩＦＮ−Ｂ  Ｒ対ＮＲ：米国で収集されたサンプル）；ＮＥＡＬＳコンソーシアム対照（米国）
【０２６３】
再発寛解型多発性硬化症（ＭＳＲＲ）プローブ−ＭＳＲＲ対健常対照を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、下記の表２４ａ、ｂ、ｃ、およびｄを参照されたい。表３３は、遺伝子データを示している。
【０２６４】
多発性硬化症（ＭＳ）プローブ−ＩＦＮ−Ｂ（ＩＦＮ−β）治療への（Ｂ）応答者対（Ａ）非応答者であるＭＳ患者を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）モニタリングマーカーに関しては、下記の表２５ａ、２５ｂ、２５ｃ、および２５ｄも参照されたい。表３４は、遺伝子データを示している。
【０２６５】
実施例１０−神経線維腫症（ＮＦ）
ＮＦ１変異を有する患者において、悪性状態への形質転換は、それが患者のエピジェネティックな背景によって支配されるため、予測するのが困難である。ＮＦ２変異体において、疾患の予後は、非常に確実でありかつ遺伝学それ自体によって強く規定される。悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）対良性叢状を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが本明細書において提示され、濃縮されたデータにおいて３２９種の上位プローブを示している。
【０２６６】
供給源：ベルギー−ルーヴェン大学
【０２６７】
神経線維腫症（ＮＦ）プローブ−良性叢状対悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーに関しては、下記の表２６ａおよび２６ｂを参照されたい。表３５は、遺伝子データを示している。
【０２６８】
実施例１１−種々の癌における抗ＰＤ１応答性に関連した染色体相互作用
表４７は、特定の癌を有する個体における抗ＰＤ１への応答者（ＮＲ（非応答者）に関して別様に明記されていない限り）に存在する染色体相互作用のパターンを示している。表で用いられる専門用語は、下記で説明される。
【０２６９】
ＤＬＢＣＬ＿ＡＢＣ：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫亜型活性化Ｂ細胞
ＤＬＢＣＬ＿ＧＢＣ：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫亜型胚中心Ｂ細胞
ＨＣＣ：肝細胞癌腫
ＨＣＣ＿ＨＥＰＢ：Ｂ型肝炎ウイルスを有する肝細胞癌腫
ＨＣＣ＿ＨＥＰＣ：Ｃ型肝炎ウイルスを有する肝細胞癌腫
ＨＥＰＢ＋Ｒ：寛解期にあるＢ型肝炎
Ｐｃａ＿クラス３：前立腺癌ステージ３
Ｐｃａ＿クラス２：前立腺癌ステージ２
Ｐｃａ＿クラス１：前立腺癌ステージ１
ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ４：乳癌ステージ４
ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ３Ｂ：乳癌ステージ３Ｂ
ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ２Ａ：乳癌ステージ２Ａ
ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ２Ｂ：乳癌ステージ２Ｂ
ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ１Ａ：乳癌ステージ１Ａ
ＢｒＣａ＿Ｓｔｇ１：乳癌ステージ１
ＰＤ＿１＿Ｒ＿メラノーマ：メラノーマ応答者
ＰＤ＿１＿ＮＲ＿メラノーマ：メラノーマ非応答者
【０２７０】
【表２６】
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【０２７１】
【表２７】
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【０２７２】
【表２８】
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【０２７３】
【表２９】
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【０２７４】
【表３０】
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【０２７５】
【表３１】
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【０２７６】
【表３２】
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【０２７７】
【表３３】
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【０２７８】
【表３４】
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【０２７９】
【表３５】
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【０２８０】
【表３６】
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【０２８１】
【表３７】
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【０２８２】
【表３８】
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【０２８３】
【表３９】
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【０２８４】
【表４０】
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【０２８５】
【表４１】
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【０２８６】
【表４２】
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【０２８７】
【表４３】
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【０２８８】
【表４４】
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【０２８９】
【表４５】
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【０２９０】
【表４６】
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【０２９１】
【表４７】
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【表４８】
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【０２９３】
【表４９】
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【０２９４】
【表５０】
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【０２９５】
【表５１】
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【表５２】
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【０２９７】
【表５３】
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【０２９８】
【表５４】
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【０２９９】
【表５５】
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【０３００】
【表５６】
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【０３０１】
【表５７】
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【表５８】
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【０３０３】
【表５９】
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【０３０４】
【表６０】
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【０３０５】
【表６１】
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【０３０６】
【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【０３１１】
【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【０３１４】
【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【０３１８】
【表７４】
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【表７５】
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【０３２０】
【表７６】
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【０３２１】
【表７７】
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【０３２２】
【表７８】
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【０３２３】
【表７９】
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【０３２４】
【表８０】
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【０３２５】
【表８１】
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【０３２６】
【表８２】
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【０３２７】
【表８３】
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【０３２８】
【表８４】
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【０３２９】
【表８５】
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【０３３０】
【表８６】
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【０３３１】
【表８７】
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【０３３２】
【表８８】
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【０３３３】
【表８９】
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【０３３４】
【表９０】
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【０３３５】
【表９１】
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【０３３６】
【表９２】
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【０３３７】
【表９３】
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【０３３８】
【表９４】
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【０３３９】
【表９５】
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【０３４０】
【表９６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2018527016.tif 000196
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018527016.tif 000198
【図４】
2018527016.tif 000199
【図５】
2018527016.tif 000200
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018527016.tif 000202
2018527016.tif 000203