(57)【要約】本発明は、ヒト血清における組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）に対する中和抗体の存在をインビトロで検出するための方法を提供する。また、組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）中和抗体の存在をインビトロで検出する方法のためのキットも提供する。
2018532115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清サンプルを分析することにより組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）中和抗体の存在を検出するためのインビトロの方法であって、以下のステップ：
（ａ）血清サンプルを前処理すること；
（ｂ）以下のステップ：
ｉ．ｒＨＩの受容体を有する細胞を播種すること；
ｉｉ．細胞を飢餓させること；
ｉｉｉ．ｒＨＩおよび前処理された血清サンプルと細胞の集団を接触させること；
ｉｖ．細胞を溶解し、および透明な溶解物を調製すること；および
ｖ．インシュリン受容体のリン酸化について溶解物の評価すること
を含む、細胞ベースのアッセイ；および
（ｃ）リン酸化の量を浮遊切断点と相関させること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が、以下のステップ；
ｉ．酸解離および炭処理
ｉｉ．中和およびＰＥＧ処理、および
ｉｉｉ．ペレット再懸濁
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸解離が、血清サンプルを酢酸およびデキストラン炭溶液で処理することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、室温で約３０分間、約１８０ｒｐｍで振とうすることで培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
中和およびＰＥＧ処理が、以下のステップ：
ｉ．約４℃で約１０，０００ｒｐｍで約１０分間スピンさせること；
ｉｉ．上清を移し、１Ｍトリス緩衝液および４０％ＰＥＧ溶液を添加すること；および
ｉｉｉ．約１８０ｒｐｍでオービタルシェイクしながら室温で約３０分間培養すること、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ペレット再懸濁が、以下のステップ：
ｉ．約４℃で約６，０００ｒｐｍで約２０分間スピンさせること；
ｉｉ．上清を捨てること；
ｉｉｉ．ＰＢＳを添加すること；および
ｉｖ．約１０分間超音波処理すること、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、ｒＨＩの少なくとも１つの受容体を含む任意の細胞株から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞株が、ＭＣＦ  １０ＡおよびＭＣＦ−７、より好ましくはＭＣＦ−７ヒト乳腺腺癌細胞株から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、ウェル当たり０．０５×１０６個〜０．５×１０６個、好ましくはウェル当たり約０．２×１０６個の範囲の密度を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、ＤＭＥＭ：Ｆ１２増殖培地に播種され、約５％のＣＯ２を含む加湿空気中で約３７℃で１２〜１６時間の間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞を飢餓させることが、グルコースを含まない増殖培地中において約１８時間〜約２６時間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
接触させるステップが、加湿ＣＯ２培養器中でグルコースを含まないＤＭＥＭ中、室温で約５分〜約３０分間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｒＨＩの濃度が、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
溶解が、溶解緩衝液において室温で約１０分間実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
インシュリン受容体のリン酸化が、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのアッセイを使用して検出され、および評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
相関させるステップにおいて、リン酸化の量が浮遊切断点より少ないかまたは等しいときにサンプルが陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
浮遊切断点の決定が、以下のステップ：
ｉ．ＲＨＩの存在下および非存在下において、細胞集団を正常ヒト個体血清サンプルと接触させること；
ｉｉ．各サンプルについて反応の大きさを決定すること；および
ｉｉｉ．反応の大きさの平均に正規化係数を乗ずること、
を含む、請求項１または１６に記載の方法。
【請求項１８】
血清サンプルを分析することにより組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）中和抗体の存在をインビトロで検出する方法のためのキットであって、前記方法が、以下のステップ：
（ａ）血清サンプルを前処理すること；
（ｂ）以下のステップ：
ｉ．ｒＨＩの受容体を有する細胞を播種すること；
ｉｉ．細胞を飢餓させること；
ｉｉｉ．ｒＨＩおよび前処理された血清サンプルと細胞の集団を接触させること；
ｉｖ．細胞を溶解させ、および透明な溶解物を調製すること；および
ｖ．インシュリン受容体のリン酸化について溶解物を評価すること；
を含む、細胞ベースのアッセイ；および、
（ｃ）リン酸化の量を浮遊切断点と相関させること、
ここで、前記キットは、ＰＢＳ中で作られたＰＥＧ６０００（４０％）；ＰＢＳ中で作られたデキストラン炭（３％）；抗インシュリンポリクローナル抗体（ＰＡｂ）；６００ｍＭ氷酢酸（ｐＨ２．５）；１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．５）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；および組み換えヒトインシュリンを含む、
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組み換え薬物中和抗体、とりわけ血清サンプル中の組み換えヒトインシュリンに対する中和抗体の存在をインビトロで検出するための方法に関する。また、本発明は、血清サンプル中の組み換えヒトインシュリンに対して中和する抗体の存在を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明および先行技術の背景
糖尿病、特にＩ型およびＩＩ型は、すい臓から分泌されるホルモンであるインシュリンの欠乏、または不十分な生成に関する障害である。それは世界中の多数の人々に影響を与える。Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を制御するための管理アプローチは、血糖値を正常化して短期および長期の合併症を防止することを目的とし、これは主に経口薬の投与またはインシュリンまたはインシュリン類似体の注射によってなされる。
【０００３】
インシュリンは、炭水化物、タンパク質、および脂質代謝の調節を含む、多くの同化作用効果を有する。インシュリンの多面的効果は、細胞表面のインシュリン受容体へのその結合に際し媒介される。インシュリン受容体は、２αサブユニットおよび２βサブユニットからなるヘテロ四量体のチロシンキナーゼである。細胞外のαサブユニットへのインシュリンの結合は、受容体の二量体化、βサブユニットの内因性チロシンキナーゼ活性の活性化、およびいくつかのチロシン残基（Ｙ１１４６、Ｙ１１５０、Ｙ１１５１、Ｙ１３１６、およびＹ１３２２）上の受容体のトランスリン酸化を開始させる。活性化されたインシュリン受容体キナーゼは、続いてインシュリン受容体基質（ＩＲＳ）−１、ＩＲＳ−２、およびＳｈｃを含む多数の細胞内基質をリン酸化する。特定のホスホチロシン残基は、いくつかのアダプタータンパク質の結合部位を提供し、こうしてＰ１３Ｋ、Ｃａｐ−ＣｂｌおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路につながるインシュリンシグナルの伝達の段階を設定する。インシュリン受容体の活性化は、直接および間接的な方法によってインシュリン受容体リン酸化の程度を定量化することによって測定され得る。
【０００４】
ＤＮＡ技術の進歩によって、組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩまたはＲＨＩ）を含む多くの組み換え生物学的製剤を生成することが可能になった。さまざまなかかるｒＨＩ処方物が、糖尿病の処置のために利用可能である。しかしながら、かかる技術の進歩にはしばしば欠点を伴う。言い換えれば、生物学的製剤は、宿主において望ましくない免疫反応を生成する傾向がある。この免疫原性の結果は、任意の影響の非存在から一時的な影響、治療用タンパク質の安全性、有効性および薬物動態に重大なまたは有害な影響に及ぶ。
【０００５】
免疫原性は、特に、本質的に中和している患者の体内で抗薬物抗体（すなわちＡＤＡ）が生成される場合、極めて頻繁にかかる治療用タンパク質の有効性に悪影響を有する。名前が示唆するように、中和抗体（すなわちＮＡｂ）は治療用タンパク質および内因性対応物の活性を中和することができ、したがって、生物学的製剤がその機能を果たすことを妨げる。
【０００６】
ＷＯ／２００９／０２２００１は、ＡＤＡ検出を可能にし、血清中の薬物の存在における薬物妨害作用を克服する酸解離ステップを使用する表面プラズモン共鳴法に基づく方法を開示している。
【０００７】
ＷＯ／２０１５／１２３３１５は、潜在的なＡＤＡを含有する生物学的サンプルを過剰の薬物と組み合わせて複合体を形成し、次いでＰＥＧにより沈殿させた後に塩基または酸の処理によって薬物−Ａｂ複合体を解離し、その後、これをカーボン担体上にコーティングして、該複合体から抗薬物抗体を固定化し、分離することによりＡＤＡを検出するＰおよびＡ（ＰＥＧおよび酸）アッセイを開示している。総ＡＤＡレベルの特定の検出が、標識化薬物を使用して実行されている。
【０００８】
ＷＯ／２０１４／０１１４１６は、細胞集団を、ｉ）タンパク質治療剤中和抗体を含有し得る血清サンプルおよびｉｉ）タンパク質治療剤と接触させること、ここで、当該細胞はタンパク質治療剤の受容体を含む；およびタンパク質治療剤と受容体との結合を示すバイオマーカーを検出することを含む、血清サンプル中のタンパク質治療剤中和抗体の存在を検出する方法を開示している。より詳細には、細胞集団を、ｉ）血清サンプルおよびｉｉ）増殖因子と接触させること、ここで、当該細胞は、増殖因子受容体を含む；および細胞集団中のバイオマーカーの量を検出すること、ここで、バイオマーカーは増殖因子受容体への増殖因子の結合を示す、および、バイオマーカーの量を増殖因子中和抗体の存在と相関させることを含む、血清サンプル中の増殖因子中和抗体の存在を検出する方法を提供する。
【０００９】
上で述べた多くの他のヒトタンパク質治療剤と同様に、ＮＡｂはｒＨＩを受け取る患者の体内で生成され、ｒＨＩが受容体に結合するのを防止し、致命的な影響を及ぼし得る糖尿病の管理の失敗をもたらす。さらに、ｒＨＩは慢性的にしばしば生涯投与され、他のほとんどの薬物よりも全身曝露が高く、したがってＡＤＡ生成の発生率も非常に高い。それゆえ、かかるＮＡｂを検出する方法が、薬物の不作為の原因を正確に判定するために利用可能であることは極めて重要である。
したがって、ｒＨＩを受け取る糖尿病患者の血清サンプルを分析することにより、かかるＮＡｂの存在を検出するための高度に選択的かつ特異的な方法の必要性がある。
【発明の概要】
【００１０】
発明の目的
本発明の目的は、血清サンプル中の組み換えヒトインシュリンに対する中和抗体の存在を検出するための、高度に選択的かつ特異的なインビトロの方法を提供することである。
本発明の別の目的は、中和抗体の存在を検出するためのキットを提供することである。
【００１１】
発明の概要
一つの側面において、本発明は、血清サンプルにおいてｒＨＩ中和抗体の存在をインビトロで検出する方法に関し、以下のステップ：
（ａ）血清サンプルを前処理すること；および
（ｂ）細胞ベースのアッセイであって、以下のステップ：
ｉ．ｒＨＩの受容体を有する細胞を播種すること；
ｉｉ．細胞を飢餓させること；
ｉｉｉ．細胞の集団をｒＨＩおよび前処理血清サンプルで刺激すること；
ｉｖ．細胞を溶解させ、透明の溶解物を調製すること；および
ｖ．インシュリン受容体のリン酸化について溶解物を評価すること；を含み、ならびに
（ｃ）リン酸化の量を浮遊切断点（floating cut point）と相関させること、
を含む。
【００１２】
別の側面において、本発明は、血清サンプルを分析することにより組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）中和抗体の存在を検出するインビトロの方法のためのキットであって、以下のステップ：
（ａ）血清サンプルを前処理すること；および
（ｂ）細胞ベースのアッセイであって、以下のステップ：
ｉ．ｒＨＩの受容体を有する細胞を播種すること；
ｉｉ．前記細胞を飢餓させること；
ｉｉｉ．細胞の集団をｒＨＩおよび前記前処理血清サンプルと接触させること；
ｉｖ．前記細胞を溶解させ、透明の溶解物を調製すること；および
ｖ．インシュリン受容体のリン酸化について溶解物を評価することを含み、ならびに
（ｃ）リン酸化の量を浮遊切断点と相関させること、
を含み、ここで、キットは、ＰＢＳ中で作られたＰＥＧ６０００（４０％）；ＰＢＳ中で作られたデキストラン炭（３％）；抗インシュリンポリクローナル抗体（ＰＡｂ）；６００ｍＭ氷酢酸（ｐＨ２．５）；１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．５）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；および組み換えヒトインシュリンを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
添付図面の簡潔な説明
上のおよびその他の側面、特徴、および本発明の特定の例示的態様の利点は、添付する図面と一体となって理解されるべき以下の記載からより明らかになるであろう。
【図１】図１は、ｒＨＩに対する細胞の投与量依存的な反応を表し、終点は、ＥＣＬをプラットフォームとして使用したｒＨＩ濃度の増加に伴う受容体リン酸化の増加として捕捉される。
【図２】図２は、ｙ軸上の平均ＭｏＲおよびｘ軸上の濃度をプロットすることによって、各感度実験に対する４ＰＬ曲線を表す。
【図３】図３は、炭処理後のＲＨＩの消耗を表す。
【図４】図４は、ＲＨＩの存在下および非存在下におけるｎＡｂの回収を表す。
【図５】図５は、ＪＭＰソフトウェアによる切断点データの異常値分析と分布分析を表す。
【図６】図６は、血清サンプルの前処理ステップを表す。
【図７】図７は、細胞ベースのアッセイのステップを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の詳細な説明
添付図面を参照した以下の記載は、本発明の例示的な態様の包括的な理解を助けるために提供される。当該記載は、理解を助けるためのさまざまな具体的な詳細が含まれるが、これらは単に例示的なものとみなされるべきである。
【００１５】
したがって、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の態様のさまざまな変更および修正を行うことができることを認識するであろう。さらに、周知の機能および構成の記載は、明瞭かつ簡潔にするために省略されている。
【００１６】
以下の記載および特許請求の範囲で使用される用語および単語は、書誌的な意味に限定されず、発明者が本発明の明確かつ一貫しての理解を可能にするために単に使用される。したがって、当業者には、本発明の例示的な態様の以下の記載は、例示の目的でのみ提供され、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって定義される本発明を限定する目的ではないことが明らかである。
【００１７】
単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈から明らかに他を指示しない限り、複数形をも包含する旨、理解されるべきである。
「実質的に」という用語は、列挙された特性、パラメータ、または値が正確に達成される必要はないが、例えば許容誤差、測定誤差、測定精度限界、および当業者に知られている他の因子を含む偏差または変動が、特性が提供しようとしている効果を排除しない量で生じ得る。
【００１８】
１つの態様に関して記載および／または例示される特徴は、１つまたは複数の他の態様において同じ方法または同様の方法で、および／または他の態様の特徴と組み合わせて、またはその代わりに使用され得る。
本明細書中で使用される場合、「含む（comprises）／含む（comprising）」という用語は、記載された特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を特定するために用いられるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはその群の存在を排除しない。
【００１９】
「細胞単独／（ＣＡ）」は、細胞の対照として使用された。それは、薬物で刺激されない細胞のＩＲ受容体の基本的なリン酸化を表す。
「細胞＋薬物」（Ｃ＋ＲＨＩ）は、薬物の対照として使用された。それは、ＲＨＩの存在下におけるＩＲ受容体のリン酸化を表す。
【００２０】
「浮遊切断点」は、このアッセイの切断点である（直接中和アッセイ）であり、サンプルが陽性であるか、それ以下と定義された反応レベルであり、それを超えると、薬物製品に対する中和活性が陰性であると定義される。細胞ベースのアッセイの可変性のため、浮遊切断点がこのアッセイのためには好ましい。
【００２１】
「反応の大きさ（ＭｏＲ）」は、Ｃ＋ＲＨＩ／ＣＡの比である。それは、固定濃度のＲＨＩの存在下におけるＩＲ受容体のリン酸化を表す。
「ＭｏＲ  Ｎａｂ」は、ＮａＢ＋Ｃ＋ＲＨＩ／ＣＡの比である。それは、ＮＡｂ存在下において達成されたリン酸化の抑制を表す。
「％中和」は、ＲＨＩに誘発されたＩＲ受容体のリン酸化の中和を示す。％中和は、（Ｃ＋ＲＨＩのシグナル−ＮＡｂのシグナル）／（Ｃ＋ＲＨＩのシグナル−ＣＡのシグナル）×１００として決定される。
【００２２】
「ＰＣサンプル」−モルモット抗ＲＨＩ抗体は、アッセイにおいてサロゲート陽性対照として使用された。ＮＡｂは、正常プールされたヒト血清中またはアッセイ培地中でスパイクされ、陽性対照サンプル（ＰＣ）を生成した。
「精度」は、正常の操作条件下の方法の再現性の程度を測定する。
【００２３】
「感度」は、陽性対照の最低濃度であり、陽性アッセイ反応または切断点と一貫して等しい読み取りを生じさせる。
「特異性」は、陽性対照だけが中和反応を示し、他のいずれの非特異的抗体もこの反応を示さないことを確立するために決定された。
「選択性」は、分析方法がサンプル中に存在する他の成分（干渉物質）の存在下で分析物を識別し検出する能力である。選択性は、サンプルの異質性および多形性のために試験サンプル間で変化し得る。
【００２４】
本発明は、組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）に対する抗体を中和する測定のための特異的および選択的アッセイの開発に基づく。
本発明の背景技術において述べたように、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病に罹患している患者、特にＩ型に罹患している患者には、インシュリンまたはインシュリン類似体が投与される。多くの場合、患者の免疫系は、主に患者がｒＨＩを投与された場合に、インシュリンまたはインシュリン類似体が機能しないように妨げる抗体を生成する。かかる抗体は、薬物ｒＨＩがインシュリン受容体に結合することを妨げ、炭水化物、タンパク質および脂質代謝を含むその同化機能を行うことができないように失敗させる。これは糖尿病の非効率的な管理につながり、さらに致命的な影響を及ぼし得る。
【００２５】
抗薬物抗体としても知られているこれらの中和抗体（ＮＡｂ）は、ｒＨＩがインシュリン受容体に結合するのを妨げ、それによって薬物またはｒＨＩの効果を中和する。
細胞の前述のインシュリン受容体部位は、ｒＨＩに結合する際にリン酸化を受ける。したがって、リン酸化されたインシュリン受容体は、ｒＨＩの受容体への結合を示すバイオマーカーとして作用する。いずれの特定の理論にも縛られていないが、細胞中のリン酸化されたインシュリン受容体の量はｒＨＩへの暴露の増加とともに増加すると考えられるが、血清サンプル中の中和抗体の存在は、リン酸化インシュリン受容体の量の減少を導くであろう。インシュリンシグナル伝達の他の下流効果を測定することとは対照的に、リン酸化されたインシュリン受容体の測定は、非常に特異的で正確な評価につながることが、本発明者らによって見出された。
【００２６】
本発明は、血清サンプルを分析することによって、組み換えヒトインシュリン（ｒＨＩ）中和抗体の存在をインビトロで検出する方法を提供し、以下のステップ：
（ａ）血清サンプルを前処理すること；および
（ｂ）細胞ベースのアッセイであって、以下のステップ：
ｉ．ｒＨＩの受容体を有する細胞を播種すること；
ｉｉ．細胞を飢餓させること；
ｉｉｉ．細胞の集団をｒＨＩおよび前処理血清サンプルで刺激すること；
ｉｖ．細胞を溶解させ、透明の溶解物を調製すること；および
ｖ．インシュリン受容体のリン酸化について溶解物を評価することを含み、ならびに
（ｃ）リン酸化の量を浮遊切断点と相関させること、
を含む。
【００２７】
用語が示すように、前処理は、患者から得られた血清のアッセイされる前の処理に関与する。血清サンプルにおいて、ＮＡｂは、循環するインシュリンを有する免疫複合体の形態で存在し得る。血清サンプルの前処理のステップは、サンプル中に存在する中和抗体の完全な環境（milieu）がインシュリンの妨害なく検出できるように、ＮＡｂ−インシュリン複合体を解離するために必要である。インシュリンは、痕跡でさえも細胞ベースのアッセイ手順を妨害し、不正確かつ誤った評価をもたらし得るから、残存するインシュリンの消耗も重要である。
【００２８】
本発明者らは、前処理がＮＡｂ−インシュリン複合体の解離を確実にし、酢酸およびグリシンＨＣｌから選択されたサンプルの酸処理により実行されることを見出した。好ましい酸は酢酸である。酸性化後、サンプルは炭処理を受け、インシュリンを吸着し、細胞ベースのアッセイにおいて検出するためにＮＡｂを自由に残す。インシュリンは細胞ベースのアッセイ手順を痕跡でさえも妨害することができるため、残存するインシュリンの消耗も重要である。遊離ＮａｂをＰＥＧ溶液中に沈殿させ、その後超音波処理バス中で約１０分間のボルテックスまたは超音波処理により再懸濁する。
【００２９】
本発明の細胞ベースのアッセイのステップは、受容体リン酸化に関してリガンド誘導性受容体チロシンキナーゼ活性化の測定に基づくキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）原理において働く。
【００３０】
リン酸化されたインシュリン受容体は、例えばＥＣＬアッセイなど、当技術分野で公知の任意の技術によって検出され得る。電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのアッセイは、ｒＨＩ中和抗体の存在を検出するより定量的な方法を提供する。その受容体に治療薬が結合されるかかるアッセイにおいて、発光が溶液中の電気化学反応中に生成され、該発光は、測定され、定量化される。
【００３１】
細胞株は、分析されるｒＨＩの少なくとも１つの受容体を含む任意の細胞であり得る。好ましい細胞株は、それらの表面上に多数の受容体を有する細胞を含む。特定の態様において、細胞株は、ＭＣＦ  １０ＡおよびＭＣＦ−７から選択される。ＭＣＦ−７、ヒト乳腺腺癌細胞株が好ましい細胞株である。
【００３２】
いくつかの態様において、細胞密度は、９６ウェルのウェル当たり０．０５×１０６〜約０．５×１０６個、好ましくは９６ウェルのウェル当たり約０．２×１０６個の範囲内である。
該方法は、細胞をＤＭＥＭ：Ｆ１２増殖培地に播種し、約５％のＣＯ２を含む加湿空気中で３７℃にて１２時間〜１６時間培養し、続いて細胞を飢餓状態にすることを含む。細胞を約１８時間〜約２６時間、好ましくは約１８時間〜約２２時間の範囲の期間飢餓状態にする。飢餓は、完全増殖培地をグルコースを含まない培地で約２４時間置換することによって引き起こされる。飢餓のために使用される培地は、グルコースを含まないＤＭＥＭ培地である。
【００３３】
次いで、細胞は、血清サンプルおよびｒＨＩの存在下で、適切な培地中、室温で約５分〜約３０分間、好ましくは約１０分間の範囲の時間刺激される。同時に、ＰＣもｒＨＩとともに、加湿ＣＯ２培養器中、室温で約３０分〜約９０分間、好ましくは約６０分間、続いて３７℃で１０分間培養される。
【００３４】
インシュリン受容体に結合し、それによりリン酸化を誘導するのに有効なｒＨＩの濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬの範囲である。図１は、ＲＨＩが、処理された正常ヒト血清中で０．３〜１０００ｎｇ／ｍｌでスパイクされた投与量反応曲線を示す。
【００３５】
刺激後、細胞を溶解する。細胞は、依然として培養プレートに付着したまま溶解され得る。溶解は、一般に知られている溶解緩衝液の存在下で、好ましくは溶解緩衝液を用いて行われ、その間、室温で約５分〜３０分、好ましくは１０分の時間、培養される。
【００３６】
遠心分離後に得られた細胞溶解物が、ＥＣＬベースのアッセイによってリン酸化されたインシュリン受容体について評価される。リン酸化の評価のためのアッセイは、MesoScale Discovery（MSD（登録商標））プラットフォームで開発される。MSD（登録商標）ベースのInsulin Signaling Panel（Phospho Protein）Whole Cell Lysate Kitが使用された。試薬は、キットに提供されているように使用し、製造業者の指示書に従って調製された。MSD（登録商標）ベースのアッセイは、市販Insulin Signaling Panel（Phospho Protein）Whole Cell Lysate Kitを使用して実施された。Insulin Signaling Panel（Phospho Protein）はサンドイッチ免疫アッセイである。MSD（登録商標）プレートは、全ＩＧＦ−１Ｒ、全ＩＲ、および空間的に異なるスポット上の全ＩＲＳ−１に対して、捕捉抗体で予備被覆される。リン酸化キナーゼ受容体を含む細胞溶解物を、検出抗体−電気化学発光化合物であるSulfoTag標識（MSD（登録商標））と結合した抗ホスホチロシンによって検出されるウェルに添加する。
【００３７】
図１に表されているように、投与量反応曲線およびｒＨＩ誘導インシュリン受容体のリン酸化反応の中和は、アッセイがインシュリン存在下で受容体リン酸化の形態で使用する頑強な終点、および、任意の中和抗体の存在を検出する際のアッセイプラットフォームの敏感な反応をも表す。
【００３８】
血清サンプル中のリン酸化されたインシュリン受容体の検出された量は、ｒＨＩ中和抗体の存在を確認するための浮遊切断点と比較して評価することができる。浮遊切断点は負のベースプールに基づいて決定され、浮遊切断点はｒＨＩ中和抗体の存在と相関する。例えば、サンプル中のリン酸化インシュリン受容体の検出量が浮遊切断点よりも大きい場合、血清サンプルはかなりの量のｒＨＩ中和抗体を含有せず、サンプル中のリン酸化インシュリン受容体の検出量が浮遊切断点よりも低い場合、血清サンプルはかなりの量のｒＨＩ中和抗体を含有する。
【００３９】
特定の態様において、本方法は、インシュリン中和抗体を含む陽性対照を含む。したがって、本方法は、インシュリン中和抗体の存在を評価するためのサンプルの比較分析を包含し得る。
【００４０】
本発明者らは該アッセイを認定し、とりわけ高い特異性および選択性を有することを見出した。堅牢性と精度を含むアッセイの認定について、さまざまなパラメータを評価した。投与された薬物に対する中和抗体を検出するためのかかる堅牢性、感度および精度のために、本発明の方法は、臨床試験中の薬物の安全性を予測する非常に効率的な手段を提供し、したがって全ての規制見直し、および競合他社に対する戦略的な優位性に耐えることを助ける。ｒＨＩの潜在的な使用としてのコンパニオン診断を開発するための基礎を形成することができ、それは、臨床医が投与量および処置経過の決定を助けることができ、一方で処置のための薬物を指示する、インシュリンに対する既存の抗体が存在するかどうかを確立する助けとなり得る。
【００４１】
本発明の方法を実施するためのキットも、本発明の範囲内であると考えられる。一態様において、キットは、ＰＢＳ中で作られたＰＥＧ６０００（４０％）；ＰＢＳ中で作られたデキストラン炭（３％）；抗インシュリンポリクローナル抗体（ＰＡｂ）；６００ｍＭ氷酢酸（ｐＨ２．５）；１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．５）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；および組み換えヒトインシュリンを含む。キットの他の成分は、任意に、免疫アッセイを実施するための試薬および／または指示書を含み得る。
キットが実行され、分析され得る手段は、本明細書でなされた開示を考慮すると容易に理解することができる。
【００４２】
例
例１
サンプルの前処理
血清サンプルを６００ｍＭの酢酸で処理した。循環インシュリンの消耗は、３％デキストラン炭溶液により起こり、室温にて約３０分間培養し、および１８０ｒｐｍにてオービタルシェイクする。その後、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間スピンさせ、その後、上清を移す。１５０μｌの１Ｍトリス緩衝液、３７５μｌの４０％ＰＥＧ６０００溶液を５５０μｌの上清に添加する。これを１８０ｒｐｍでオービタルシェイクしながら室温で約３０分間培養した。ＰＥＧ沈殿させたサンプルの上清を、ＮＡｂの存在について評価したが、これはＰＥＧ沈殿中に損失がないことを示した。ペレットの再懸濁を１８０μｌのＰＢＳ溶液中、４℃で６０００ｒｐｍにて約２０分間、超音波処理バス中で１０分間の超音波処理によって実施した。
サンプル処理後のＮＡｂの回収率は一定であり、５０〜７０％の範囲であった。
図６は、本方法の前処理ステップの概略図である。
【００４３】
例２
サンプルの細胞ベースのアッセイ
ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに完全増殖培地において播種し、１４±２時間表面に接着させた。２日目に、完全増殖培地をグルコースを含まないＤＭＥＭ培地（ＦＢＳおよびＲＨＩを含まない）と２０±２時間交換することによって、接着した細胞を飢餓状態に保った。３日目に、グルコースを含まない培地を除去し、実験の設計ごとにサンプルをプレートに添加する。１０分間の短時間の刺激後、細胞を溶解し、ＭＳＤベースのリン酸化タンパク質シグナリングパネルキット（図２）によってリン酸化されたインシュリン受容体について細胞溶解物を評価する。
【００４４】
例３
０．１μｇ／ｍｌのＲＨＩ濃度での市販の抗体によるＩＲ受容体のリン酸化の中和の評価
細胞をウェル当たり０．５×１０６個の播種密度で播種した。ｒＨＩの２つの濃度（１および０．１μｇ／ｍｌであった）を細胞の刺激に使用した。３つの利用可能な抗ＲＨＩ抗体をＩＲリン酸化の中和について評価した。２つの抗体は商業的供給源、すなわち、それぞれPeninsulaおよびInvitrogenから得られ、３番目は社内で生成された抗体であった。すべての抗体を、２、１および０．５μｇ／ｍｌの濃度で評価した。
【００４５】
【表１】
2018532115.tif 000003
観察されたとおり、ＲＨＩ誘導リン酸化が起こる。
【００４６】
例４
発明者らは、正常なプールされた血清中において、抗ＲＨＩ抗体の中和活性を評価した。
抗ＲＨＩ抗体は、血清中でスパイクされ、例１に従って前処理された。処理ＮＡｂサンプルは、表２に記載されるようにアッセイにおいて評価された。
【００４７】
【表２】
2018532115.tif 000004
中和反応は、１０および２０ｎｇ／ｍｌのＲＨＩ濃度にて評価された。アッセイ培地でスパイクされたＮＡｂをアッセイの対照として使用した。
結果：アッセイ培地でスパイクされたＮＡｂによるＩＲリン酸化反応の中和−
【００４８】
【表３】
2018532115.tif 000005
血清中スパイクされたＮＡｂによるＩＲリン酸化反応の中和−
【００４９】
【表４】
2018532115.tif 000006
矛盾のない結果が観察された。ＲＨＩによる細胞の刺激は、２０ｎｇ／ｍｌレベルにて選択された。
【００５０】
例５
処理された血清マトリクス中の細胞に対するＲＨＩの投与量依存的な反応を評価し、抗ＲＨＩ抗体の中和反応を決定するためのＲＨＩの濃度を選択すること
正常なプールされたヒト血清を、例１に記載のサンプル前処理手順に従って処理した。ＲＨＩの範囲は、０．３〜１０００ｎｇ／ｍｌで調製し、飢餓状態の細胞（０．２×１０６個／ウェル）に添加した。細胞溶解物をＭＳＤアッセイで分析した。平均ＭＳＤデータは、以下の表５および図１に報告される。
【００５１】
【表５】
2018532115.tif 000007
【００５２】
細胞単独では前の例で観察されたものよりも小さいことが観察された。ＲＨＩの投与量依存的な反応は、図１に示すように培養細胞で観察された。ＥＣ５０は１９．８ｎｇ／ｍｌであり、前の実験で選択されたＲＨＩ濃度２０ｎｇ／ｍｌと同様であった。
【００５３】
浮遊切断点に対する正規化係数の決定：
実験の詳細：切断点は、バランスの取れた設計において、３６の正常なヒト個体血清サンプルを用いて決定された。２人の分析者（Ａ１およびＡ２）は、３日の異なる日にサンプルを評価し、各分析者はサンプルを１回分析した。切断点の決定は、以下に参照する設計に従って実行された。したがって、切断点を決定するために合計７２（３６×２）個のデータ点が収集された。
【００５４】
各サンプルを２０ｎｇ／ｍｌのＲＨＩの存在下および非存在下で分析し、切断点を反応の大きさ（薬物ありおよび薬物なしの比）に関して報告した。そのプレートの陰性対照レベルを決定するために、正常なプールされたヒト血清（ＮＳＢ）の２つの複製サンプルを各実験に含めた。
【００５５】
薬物サンプルのあるシグナルを薬物サンプルなしのシグナルで割ることにより、各個々のサンプルについて反応の大きさ（ＭｏＲ）を決定した。ＭｏＲのＬＯＧを決定し、データセットをJMPv 11.2ソフトウェアによる分析にかけた。
ｉ．データをボックスプロット分析によって異常値について評価した。サンプル１９および３５は異常値として同定され、したがって、さらなる分析から除外された（図５）。
ｉｉ．異常値を除外してデータセットの分布を評価し、データセットが正常に分布していることが見出された（図５）。
ｉｉｉ．式：平均−２．３３×ＳＤを用いて、切断点の計算のためのパラメトリックアプローチを適用した。
ｉｖ．切断点の真数が決定された。
ｖ．６回の実験で平均ＮＳＢを決定した。
ｖｉ．乗法正規化係数（ＮＦ）は、切断点／平均ＮＳＢの式を使用して決定された。
切断点データおよびデータ分析は、表６〜８に示される。
【００５６】
【表６−１】
2018532115.tif 000008
【表６−２】
2018532115.tif 000009
【表６−３】
2018532115.tif 000010
【００５７】
【表７】
2018532115.tif 000011
【００５８】
【表８】
2018532115.tif 000012
浮遊切断点は、平均ＮＳＢを正規化係数と乗ずることによって決定された。
【００５９】
アッセイ感度の決定：
アッセイ感度を確立するために、正常なプールされたヒト血清において、陽性対照抗体の６個の希釈が４μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌで調製された。感度は、以下の表９に示された設計によって３日の分離した日における６の独立したアッセイの実験から決定された。
【００６０】
【表９】
2018532115.tif 000013
【００６１】
各感度サンプルについてＭｏＲを計算し、続いて３つのセットの平均を計算することにより、各実験について平均ＭｏＲを決定した。実験に特有の浮遊切断点は、平均ＮＳＢ比×正規化係数として決定された。図２に示すように、ｙ軸上に平均ＭｏＲを、ｘ軸上に濃度をプロットすることにより、各感度実験に対して４ＰＬ曲線が生成された。実験に特有の浮遊切断点の濃度は、それぞれの曲線によって決定した。逆算された濃度の対数を決定し、平均およびＳＤを計算した。
【００６２】
【表１０】
2018532115.tif 000014
【００６３】
感度の決定
平均＝０．１０
ＳＤ＝０．０８
平均＋ｔ０．０５ｄｆ×ＳＤ＝０．１０＋２．０１５×０．０８＝０．２５
真数＝１．８μｇ／ｍｌ
９５％の整合性を有する感度は、式：平均＋ｔ０．０５ｄｆ×ＳＤを使用して決定され、ここで、ｔ０．０５は、５％の偽陽性率に対応するｔ−分布から決定される臨界値であり、「ｄｆ」は自由度（Ｎ−１）である。
【００６４】
低陽性対照（ＬＰＣ）の決定：
ＬＰＣは、式：平均＋ｔ０．０１ｄｆ×ＳＤを使用して感度データセットによって決定された。
平均＝０．１０
ＳＤ＝０．０８
平均＋ｔ０．０１ｄｆ×ＳＤ＝０．１０＋３．３６５×０．０８＝０．３６
真数＝２．３μｇ／ｍｌ
さらなる分析のための陽性対照−
高陽性対照（ＨＰＣ）−４μｇ／ｍｌ
低陽性対照（ＬＰＣ）−２．５μｇ／ｍｌ
【００６５】
アッセイ精度の決定：
感度データセットは、アッセイ制度を確立するために使用された。精度は、次の部分において評価された。
日内精度−３セットのＰＣ調製物間の変動
日間精度−３日の異なる日における３つの調製物の平均間の変動
分析者間精度−２人の分析者による３つの調製物の平均間の変動
総体精度−２人の分析者による３日の各日において走行する全６セットの変動
【００６６】
結果
ＭｏＲの不正確度は、変動係数（ＣＶ）として計算されて報告され、および式：標準偏差／平均×１００を使用して決定された。
精度は、ＨＰＣ（４μｇ／ｍｌ）およびＬＰＣ（２μｇ／ｍｌ）に対して決定された。
精度データは、表１１〜１３に示されている。
【００６７】
【表１１】
2018532115.tif 000015
【００６８】
【表１２】
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【００６９】
【表１３】
2018532115.tif 000017
内精度および間精度の両方が、両ＰＣレベルにて＜２０であったため、アッセイは正確であることが見出された。
【００７０】
アッセイ特異性の決定：
ウサギ抗ペプチド抗体をＨＰＣおよびＬＰＣ（４および２．５μｇ／ｍｌ）レベルでＮＰＨＳにおいてスパイクし、抗ＲＨＩ抗体とともにアッセイにおいて評価した。２つの特異性実験を２つの異なる日に繰り返した。
【００７１】
【表１４】
2018532115.tif 000018
【００７２】
ウサギ抗ペプチド抗体ＰＣサンプルはアッセイにおいて陰性であったが、抗ＲＨＩ抗体ＰＣサンプルは中和活性が陽性であり、したがって抗ＲＨＩ抗体のアッセイの特異性を確立した。
【００７３】
アッセイ選択性の決定：
選択性は、正常なプールされたヒト血清サンプルと共に、１０個の個々の正常ヒト血清サンプル（５匹の雄＋５匹の雌）を用いて評価した。各サンプルに、抗ＲＨＩ抗体をＬＰＣおよびＨＰＣレベルでスパイクし、ＮＡｂアッセイにて分析した。２つの異なる日に２回の実験が実施された。
結果
ｉ．ＭｏＲを各選択性サンプルについて決定した。
ｉｉ．浮遊切断点を決定した。
ｉｉｉ．反応≦浮遊切断点を示すサンプルが陽性であると決定した。
選択性データは、表１５に示されている。
【００７４】
【表１５−１】
2018532115.tif 000019
【表１５−２】
2018532115.tif 000020
【００７５】
実験１および実験２では、すべてのＨＰＣ選択性サンプルは中和活性が陽性であったが、１０個のＬＰＣサンプルのうち３個は中和反応が陰性を示し、一方、実験２において、ＬＰＣ選択性サンプルはすべて中和反応が陽性であった。したがって、ＨＰＣサンプルの１００％およびＬＰＣサンプルの８５％は、中和反応に対して陽性であった。ＮＰＨＳにおいて調製したＬＰＣおよびＨＰＣサンプルは両方の実験において陽性であった。
【００７６】
疾患マトリクスにおけるアッセイ選択性の決定：
ＨＰＣおよびＬＰＣレベルにて、６つの個々のＴＩ  ＤＭ患者サンプル（男性４人および女性２人）に抗ＲＨＩ抗体をスパイクすることによって、疾患マトリクスにおける選択性を評価した。
【００７７】
【表１６】
2018532115.tif 000021
【００７８】
プールされた疾患マトリクス（１２個体のプール）およびＮＰＨＳの６つの疾患マトリクスにおけるＨＰＣおよびＬＰＣサンプルは、陽性中和反応を示し、これは、アッセイが抗ＲＨＩ検出の検出に選択的であることを示唆している。
【００７９】
薬物許容量の決定：
１型糖尿病患者のＲＨＩ療法におけるＣｍａｘは、約１００ｍＵ／Ｌであり、これは３．５ｎｇ／ｍｌのＲＨＩと同等である。両方のレベルでの抗ＲＨＩ抗体は、５００ｎｇ／ｍｌまでのＲＨＩと複合体化したが、これは予想されたＣｍａｘより約１４０倍高い。ＨＰＣおよびＬＰＣの複合体を５、１０、５０、１００および５００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩで調製した。サンプル処理後のＲＨＩの消耗および抗ＲＨＩ抗体の回収の評価は、ＭＳＤベースのＲＨＩアッセイおよびＥＬＩＳＡベースの抗ＲＨＩアッセイによってそれぞれ実行された。
【００８０】
免疫複合体（サンプル処理後）も中和アッセイで評価した。２つの異なる日に２回実験を実施した。
実験１では、ＨＰＣとＬＰＣを１０、１００、および５００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩと複合体化させたが、実験２では、ＨＰＣとＬＰＣを５、１０、２０、５０および１００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩと複合体化させた。両方の実験において、複合体を含まない抗ＲＨＩ抗体を対照として試験した。
【００８１】
消耗されたＲＨＩの評価：
サンプル処理後のＲＨＩの消耗は、ＭＳＤベースのＲＨＩアッセイによって評価された。このアッセイは、処理された、または未処理のサンプル中のＲＨＩがＭＳＤプレート上にコートされた抗ＲＨＩモノクローナル抗体によって捕捉され、さらにSulfoTag標識抗ＲＨＩモノクローナル抗体によって検出されるサンドイッチアッセイである。サンプル処理後のＲＨＩの消耗データを表１７に示す。
【００８２】
【表１７】
2018532115.tif 000022
炭処理によるＲＨＩの消耗は、図３に表されている。
【００８３】
サンプル処理後のＮＡｂの回収の評価：
サンプル処理後の免疫複合体からのＮＡｂの回収は、抗ＲＨＩ  ＥＬＩＳＡによって決定された。
【表１８】
2018532115.tif 000023
【００８４】
中和アッセイによる薬物許容量の評価：
ｉ．ＭｏＲを各薬物許容量について決定した。
ｉｉ．浮遊切断点を決定した。
ｉｉｉ．ＭｏＲ≦ＦＣＰのサンプルがＲＨＩに抗する中和反応に対して陽性であると決定した。
【００８５】
【表１９】
2018532115.tif 000024
【００８６】
【表２０】
2018532115.tif 000025
【００８７】
９０％以上のＲＨＩの消耗が、サンプル処理後に免疫複合体から観察された。非複合体サンプルからの処理後のＮＡｂの回収率は６０％までであり、ＲＨＩの５〜１００ｎｇ／ｍｌの存在下でＨＰＣの回収率は５３〜６３％の範囲であったが、５００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩの存在下では、回収率はわずか４１％であった。０〜１００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩを有する複合体からのＬＰＣの回収率は４３〜５４％の範囲であったが、５００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩの存在下でのそれはわずか３６％であった。
【００８８】
消耗および回収データは、実験１のＬＰＣにおいて５００ｎｇ／ｍｌのＲＨＩの存在下で陽性中和反応を示さなかった中和アッセイデータと相関していた。ＨＰＣは、５００ｎｇ／ｍｌ（１６．５Ｕ／Ｌｔ）のＲＨＩまで、およびＬＰＣは、１００μｇ／ｍｌ（３．３Ｕ／Ｌｔ）のＲＨＩまで許容することが見出された。
【図１】
2018532115.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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