(57)【要約】遺伝子操作細菌、その医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する障害をモジュレートおよび治療する方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結しており、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、遺伝子操作細菌。
【請求項２】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項２に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項１または請求項２に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物の小腸に見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項２から４のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項６】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、低酸素または嫌気的条件下で誘導される、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項７】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項８】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーターである、請求項１から７のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項９】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、低酸素または嫌気的条件下で誘導される、請求項２から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１０】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターからなる群から選択される、請求項２から９のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１１】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、ＦＮＲ応答性プロモーターである、請求項２から１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１２】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、肝損傷を示す１つもしくは複数の分子または代謝物により誘導される、請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１３】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、肝損傷を示す１つもしくは複数の分子または代謝物により誘導される、請求項２から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１４】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、活性窒素種の存在により誘導される、請求項２から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１５】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、活性酸素種の存在により誘導される、請求項２から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１６】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物消化管に天然で存在しない環境因子により誘導される、請求項２から４および６から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１７】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、細菌における染色体上に存在する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１８】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、細菌におけるプラスミド上に存在する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項１９】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、細菌における染色体上に存在する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２０】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、細菌におけるプラスミド上に存在する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２１】
対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが、１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により、独立に欠失したまたは不活性にされている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２２】
対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが、欠失している、請求項２１に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２３】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、酪酸をコードする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２４】
前記消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットが、プロピオン酸をコードする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２５】
ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２６】
ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質がＧａｂＰである、請求項２５に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２７】
１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２８】
前記ＧＡＢＡ異化酵素が、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＣＯＴから選択される、請求項２７に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項２９】
マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３０】
アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結しており、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項３１】
前記ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項３０に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３２】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項３１に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３３】
前記ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子が、前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項３１または請求項３２に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３４】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物の小腸に見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３５】
ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質がＧａｂＰである、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３６】
１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３７】
前記ＧＡＢＡ異化酵素が、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＣＯＴから選択される、請求項３６に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３８】
マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項３９】
消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、請求項３０から３８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４０】
前記消化管バリア機能増強分子が酪酸である、請求項３９に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４１】
前記消化管バリア機能増強分子がプロピオン酸である、請求項３９に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４２】
アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結しており、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項４３】
前記１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項４２に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４４】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項４３に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４５】
前記１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子が、前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項４３または請求項４４に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４６】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物の小腸に見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４７】
前記ＧＡＢＡ異化酵素が、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＣＯＴから選択される、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４８】
ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項４９】
マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項４２から４８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５０】
消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５１】
前記消化管バリア機能増強分子が酪酸である、請求項５０に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５２】
前記消化管バリア機能増強分子がプロピオン酸である、請求項５０に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５３】
アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌であって、前記細菌が、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結しており、前記細菌が、機能性ＡｒｇＲを欠くように遺伝子操作されており、マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作細菌。
【請求項５４】
前記マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子が、外因性環境条件により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項５３に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５５】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、同じプロモーターの別個のコピーである、請求項５４に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５６】
前記マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子が、前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと異なるプロモーターに作動可能に連結している、請求項５４または請求項５５に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５７】
前記低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターと、前記マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターが、哺乳動物の小腸に見いだされる外因性環境条件により誘導される、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５８】
ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項５９】
１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項５３から５８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項６０】
消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子または遺伝子カセットを含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項６１】
前記消化管バリア機能増強分子が酪酸である、請求項６０に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項６２】
前記消化管バリア機能増強分子がプロピオン酸である、請求項６０に記載の遺伝子操作細菌。
【請求項６３】
非病原性細菌である、請求項１から６２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６４】
プロバイオティク細菌である、請求項６３に記載の細菌。
【請求項６５】
バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、大腸菌、乳酸桿菌属および乳酸球菌属からなる群から選択される、請求項６４に記載の細菌。
【請求項６６】
大腸菌ニッスルである、請求項６５に記載の細菌。
【請求項６７】
細菌が、哺乳動物消化管内に存在する場合、補足される遺伝子における栄養要求体である、請求項１から６６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６８】
哺乳動物消化管がヒト消化管である、請求項６７に記載の細菌。
【請求項６９】
ジアミノピメリン酸またはチミン生合成経路における酵素における栄養要求体である、請求項６７または６８に記載の細菌。
【請求項７０】
細菌に対して有毒な物質をコードする追加の遺伝子を有するようにさらに操作され、前記追加の遺伝子が、哺乳動物消化管に天然で存在しない環境因子により直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項１から６９のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項７１】
請求項１から７０のいずれか一項に記載の細菌および薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物。
【請求項７２】
経口投与用に製剤化された、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
高アンモニア血症を低減するまたは高アンモニア血症に関連する疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項７１または請求項７２に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項７４】
高アンモニア血症が尿素回路異常症である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
尿素回路異常症が、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
高アンモニア血症に関連する障害が、肝臓障害；有機酸障害；イソ吉草酸尿症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸尿症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損；カルニチン回路欠損症；カルニチン欠損症；β−酸化欠損症；リシン尿性タンパク不耐症；ピロリン−５−カルボン酸シンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠損症；高インスリン症−高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア障害；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法；完全腸管外栄養；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体静脈短絡；尿路感染症；尿管拡張；多発性骨髄腫；化学療法；感染；神経因性膀胱；または腸内細菌過剰増殖である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
肝臓障害が、肝性脳症、急性肝不全または慢性肝不全である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
高アンモニア血症に関連する障害の症状が、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力障害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシスおよび低体温症からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１２月４日に出願した米国特許出願第１４／９６０，３３３号の一部継続出願、２０１６年３月２に出願したＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２０５３０号の一部継続出願であり、開示の継続性を可能にするために参照によってそれらの全体として本明細書に組み込まれる、２０１５年６月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／１７３，７１０号、２０１５年６月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／１７３，７０６号、２０１５年６月２４日に出願した米国特許仮出願第６２／１８３，９３５号、２０１５年６月２５日に出願した米国特許仮出願第６２／１８４，８１１号、２０１５年６月２５日に出願した米国特許仮出願第６２／１８４，７７０号、２０１５年１０月３０日に出願した米国特許仮出願第６２／２４８，８０５号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０４１号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０３９号、２０１５年１１月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／２５６，０４８号、２０１５年１２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／２６３，３２９号、２０１６年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／２９１，４６８号および２０１６年２月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／２９３，７４９号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンモニアは、非常に有毒であり、すべての臓器において代謝時に発生する（Ｗａｌｋｅｒ、２０１２年）。哺乳動物では、健常な肝臓は、アンモニアを非毒性分子、例えば、尿素またはグルタミンに変換し、過剰な量のアンモニアが全身循環に入ることを妨げることによって身体を保護する。高アンモニア血症は、アンモニアの解毒作用の低下および／または産生の増加を特徴とする。哺乳動物では、尿素回路がアンモニアを尿素に酵素によって変換し、次いで尿素が尿中に除去されることによってアンモニアを解毒する。アンモニアの解毒作用の低下は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの、尿素回路酵素が欠損している尿素回路異常症（ＵＣＤ）により引き起こされる可能性がある（Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１２年）。国立尿素回路異常症財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｒｅａ  Ｃｙｃｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、ＵＣＤの罹患率が出生８，５００人当たり１人であると推定している。さらに、肝性脳症、門脈体静脈短絡および有機酸代謝異常症などの、いくつかの非ＵＣＤ障害も高アンモニア血症を引き起こし得る。高アンモニア血症は、神経症状、例えば、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力障害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、低体温症または死亡をもたらし得る（Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１２年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。
【０００３】
アンモニアは、様々な生合成経路により合成される、アミノ酸の窒素源でもある。例えば、アルギニン生合成は、１個の窒素原子を含むグルタミン酸を、４個の窒素原子を含むアルギニンに変換する。シトルリンなどの、アルギニン生合成経路において形成される中間代謝物も窒素を組み込む。したがって、高アンモニア血症に関連する状態をモジュレートまたは治療するためにアルギニン生合成の増強を用いて、体内の過剰な窒素を非毒性分子に組み込むことができる。同様に、ヒスチジン生合成、メチオニン生合成、リシン生合成、アスパラギン生合成、グルタミン生合成およびトリプトファン生合成も過剰の窒素を組み込むことができ、それらの経路の増強を用いて、高アンモニア血症に関連する状態をモジュレートまたは治療することができる。
【０００４】
高アンモニア血症およびＵＣＤの現行の療法は、アンモニアの過剰を低減することを目的としているが、最適とはいえないと広く考えられている（Ｎａｇａｍａｎｉら、２０１２年）；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２０１３年；Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａら、２０１４年）。大部分のＵＣＤ患者は、タンパク質制限からなる実質的に改善された食事を必要とする。しかし、低タンパク食は、注意深くモニターしなければならず、タンパク質摂取が過度に制限される場合、身体は筋肉を分解し、その結果としてアンモニアを産生する。さらに、多くの患者は、フェニル酪酸ナトリウム、安息香酸ナトリウムおよびフェニル酪酸グリセロールなどのアンモニア捕捉薬の補給を必要とし、これらの薬物のうちの１つまたは複数を１日３〜４回投与しなければならない（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年；Ｄｉａｚら、２０１３年）。これらの薬物の副作用は、悪心、嘔吐、被刺激性、食欲不振および女性における月経障害を含む（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年）。小児では、食物および薬物の送達には、胃に外科的に植え込まれた医瘻管または鼻を経て胃に手作業により挿入された経鼻胃管を必要とし得る。これらの治療選択肢が奏功しない場合、肝臓移植が必要となり得る（国立尿素回路異常症財団）。したがって、尿素回路異常症を含む、高アンモニア血症に関連する障害の有効で、信頼でき、かつ／または長期の治療の重大な、満たされていない必要性がある。
【０００５】
肝臓は、アミノ酸代謝ならびにタンパク質合成および分解に、ならびにいくつかの解毒過程、特に、アンモニアのような腸代謝の最終産物の解毒過程に中心的な役割を果たしている。高アンモニア血症をもたらす、肝機能障害は、肝機能障害を有する患者に認められる多種多様な潜在的に可逆性の精神神経異常（無関係の神経および／または代謝異常の除外の後）を含む、肝性脳症（ＨＥ）を引き起こし得る。ＨＥにおいて、重度の肝不全（例えば、肝硬変）および／または肝臓の周囲の血液の門脈体静脈短絡が、アンモニアの動脈レベルの上昇をもたらして、血液脳関門を通過させ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００６年）、脳機能の変化をもたらす。
【０００６】
脳内のアンモニアの蓄積は、認知および運動障害、脳潅流の減少、ならびにアンモニアを代謝することができる脳細胞である、星状細胞の酸化ストレス媒介損傷をもたらす。脳内の過剰なアンモニアが、主要な抑制性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のレベルを変化させることによって神経伝達を乱すことを示唆する証拠が存在する（ＡｈｂｏｕｃｈａおよびＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、２００４）。脳マンガン濃度の上昇およびマンガンの沈着も肝硬変患者の大脳基底核において報告され、ＨＥの臨床症状に寄与すると推測されている（Ｃａｓｈら、２０１０年；Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。高アンモニア血症の一般的な神経症状は、発作、運動失調、脳卒中様病変、パーキンソン病様症状（振戦など）、昏睡、精神病、視力障害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、低体温症または死亡を含む（Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１２年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。
【０００７】
アンモニア代謝異常だけでＨＥを有する患者に認められるすべての神経学的変化を説明し得ない。敗血症は、ＨＥの周知の増悪因子である。全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は、炎症性サイトカインおよびメディエーターの放出および循環に起因する。肝硬変を有する患者では、ＳＩＲＳは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン６（ＩＬ６）によって媒介され得る過程における軽微および顕性ＨＥを有する患者の両方におけるＨＥの症状を悪化させる可能性がある。特に、活性窒素種（ＲＮＳ）および活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の増大が、アンモニア、炎症サイトカイン、低ナトリウム血またはベンゾジアゼピンに曝露されている培養星状細胞において起こる。
【０００８】
高アンモニア血症は、脳内の核内／細胞質凝集体および細胞死を特徴とする常染色体優性疾患である、ハンチントン病の顕著な特徴でもある（Ｃｈｅｎら、２０１５年；Ｃｈｉａｎｇら、２００７年）。実際、高アンモニア血症は、本明細書に記載の通り、すべてがアンモニアレベルを低下させることによって治療することができる、いくつかの他の障害の特徴である。
【０００９】
肝性脳症、ハンチントン病ならびに過剰なアンモニアレベルに関連する他の疾患および障害に対する現行の療法は、不十分である（Ｃａｓｈら、２０１０年；ＣｏｒｄｏｂａおよびＭｉｎｇｕｅｚ、２００８年；ＳｈａｎｎｏｎおよびＦｒａｉｎｔ、２０１５）。ハンチントン病において、抗精神病薬（例えば、ハロペリドール、リスペリドン、クエチアピン）および不随意運動を抑制するために投与される薬物（例えば、テトラベナジン、アマンタジン、レベチラセタム、クロナゼパム）の副作用は、患者における筋硬直および認知低下を悪化させ得る（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）。ウレアーゼ産生細菌に対する抗体は、とりわけ長期にわたり投与した場合、腎毒性などの、高度な二次的影響を及ぼすことが示された（Ｂｌａｎｃら、１９９２年；  ＢｅｒｋおよびＣｈａｌｍｅｒｓ、１９７０年）。タンパク質制限は、タンパク質の分解および不良な栄養状態を促し得るものであり、死亡率の増大に関連付けられた（ＫｏｎｄｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒ、１９９７年；Ｖａｑｅｒｏら、２００３年）ことから、これももはや中心的な療法でない。タンパク質制限は、ＨＥを有する肝硬変患者の３分の１に対してのみ適切である（ＮｇｕｙｅｎおよびＭｏｒｇａｎ、２０１４年）。したがって、肝性脳症およびハンチントン病の有効で、信頼でき、かつ／または長期の治療の重大な、満たされていない必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗａｌｋｅｒ、Ｓｅｖｅｒｅ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎａｅｍｉａ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｎｏｔ  ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０１２年５月；４９（Ｐｔ３）：２１４〜２８頁
【非特許文献２】Ｈａｂｅｒｌｅら、Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ、２０１２年５月２９日、７巻：３２頁
【非特許文献３】Ｈａｂｅｒｌｅ  Ｊ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、２０１３年８月１５日；５３６巻（２号）：１０１〜８頁
【非特許文献４】Ｎａｇａｍａｎｉら、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ、２０１２年９月；１０７巻（１〜２号）：１０〜４頁
【非特許文献５】Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ、Ｈａｎｄｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、２０１３年；１１３巻：１７５５〜７３頁
【非特許文献６】Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａら、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０１４年１０月２３日；２２巻（１号）：５８〜６４頁
【非特許文献７】Ｌｅｏｎａｒｄ（２００６年）、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．    Ｉｎｂｏｒｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第４版（２６３〜２７２頁）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｍｅｄｉｚｉｎ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【非特許文献８】Ｄｉａｚら、Ａｍｍｏｎｉａ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｍｏｎｇ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１３年６月；５７巻（６号）：２１７１〜９頁
【非特許文献９】Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００６年
【非特許文献１０】ＡｈｂｏｕｃｈａおよびＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｍ、２００４年
【非特許文献１１】Ｃａｓｈら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、ＱＪＭ、．２０１０年１月；１０３巻（１号）：９〜１６頁
【非特許文献１２】Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎ、２０１５年
【非特許文献１４】Ｃｈｉａｎｇら、Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ  ｂｙ  ｍｕｔａｎｔ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２００７年３月１日；１６巻（５号）：４８３〜４９８頁
【非特許文献１５】ＣｏｒｄｏｂａおよびＭｉｎｇｕｅｚ、Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．、２００８年；２８巻（１号）：７０〜８０頁
【非特許文献１６】ＳｈａｎｎｏｎおよびＦｒａｉｎｔ、２０１５年
【非特許文献１７】Ｂｌａｎｃら、Ｌａｃｔｉｔｏｌ  ｏｒ  ｌａｃｔｕｌｏｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９２年２月；１５巻（２号）：２２２〜２２８頁
【非特許文献１８】ＢｅｒｋおよびＣｈａｌｍｅｒｓ、Ｄｅａｆｎｅｓｓ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．、１９７０年９月；７３巻（３号）：３９３〜３９６頁
【非特許文献１９】ＫｏｎｄｒｕｐおよびＭｕｌｌｅｒ、１９９７年
【非特許文献２０】Ｖａｑｅｒｏら、２００３年
【非特許文献２１】ＮｇｕｙｅｎおよびＭｏｒｇａｎ、２０１４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本開示は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を別の副産物に変換することができる遺伝子操作細菌を提供する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を別の副産物に変換する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、非病原性であり、有毒なアンモニアを減少させるために消化管に導入することができる。高アンモニア血症患者において７０％もの過剰なアンモニアが胃腸管に蓄積する。本発明の他の態様は、アンモニアおよび／または窒素の消費、あるいは非毒性副産物、例えば、アルギニンまたはシトルリンの産生のレベルの増加に基づいて遺伝子操作細菌を選択または標的にする方法を提供する。本発明はまた、遺伝子操作細菌を含む医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する障害、例えば、尿素回路異常症および肝性脳症をモジュレートおよび治療する方法を提供する。
【００１２】
本開示はまた、過剰なアンモニアおよび他の有害な分子、例えば、ＧＡＢＡ、マンガンを減少させることができる遺伝子操作細菌を提供する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰なアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を別の副産物に変換する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、非病原性であり、有毒なアンモニアを減少させるために消化管に導入することができる。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰なアンモニアおよび他の有害な分子、例えば、ＧＡＢＡ、マンガンを減少させることができ、１つまたは複数の消化管バリア増強分子、例えば、酪酸などの、１つまたは複数の短鎖脂肪酸を産生することもできる。本開示の他の態様は、アンモニアおよび／または窒素の消費、あるいは非毒性副産物、例えば、アルギニンまたはシトルリンの産生のレベルの増加に基づいて遺伝子操作細菌を選択または標的にする方法を提供する。本発明はまた、遺伝子操作細菌を含む医薬組成物、ならびに例えば、肝性脳症およびハンチントン病を含む、過剰なアンモニアに関連する障害をモジュレートおよび治療する方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の作用機構を媒介する、１つまたは複数の天然または非天然構成要素を含む、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットまたは回路を含む。さらに、細菌染色体内の１つまたは複数の内因性遺伝子または調節領域は、突然変異または欠失させることができる。遺伝子操作細菌は、これらの遺伝子または遺伝子カセットまたは回路をプラスミド上に収容するか、あるいは、遺伝子／遺伝子カセットは、それらが本質的な遺伝子発現を妨げない、染色体の特定の領域に挿入された。
【００１４】
これらの遺伝子（複数可）／遺伝子カセット（複数可）は、構成的または誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。本明細書に記載の例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）に誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）ならびに消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。
【００１５】
さらに、操作細菌は、（１）当技術分野で公知であり、本明細書で示す栄養要求性のいずれか、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの、１つまたは複数の栄養要求性、（２）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知のキルスイッチのいずれかなどの、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の輸送体のいずれかのような、生体分子または物質を移入する１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の分泌回路のいずかなどの、１つまたは複数の分泌回路、および（６）そのようなさらなる回路のうちの１つまたは複数の組合せうちの１つまたは複数をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、非誘導条件下での本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を示す図である。アルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）は、ＡｒｇＡ（くねった線ξ）と相互作用してＡｒｇＡ活性を阻害し（「Ｘ」印で示す）、一方、酸素（Ｏ２）は、ＦＮＲ（点線の囲み線付きのＦＮＲ）が二量体化し、ＦＮＲプロモーター（灰色の四角囲みのＦＮＲ）およびその制御下のａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）ため好気的条件下で比較的に低いアルギニンの産生を示す。図１Ｂは、誘導条件下での本発明のＡｒｇＲ欠失細菌の一実施形態におけるアルギニンレギュロンの状態を示す図である。ＦＮＲが二量体化し（点線の囲み線付きの２つのＦＮＲ）、アルギニンによる阻害に抵抗性である、ＡｒｇＡｆｂｒ（ａｒｇＡｆｂｒ上のくねった線ξ）のＦＮＲプロモーター（灰色の四角囲みのＦＮＲ）媒介発現を誘導するため嫌気的条件下でのアルギニンの産生の上方制御を示す。これは、ＡｒｇＡ（ａｒｇＡを示す四角の上のくねった線ξ）と相互作用するアルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）により引き起こされる野生型ＡｒｇＡの阻害を克服する（曲がった矢印）。アルギニンレギュロンにおける各遺伝子を遺伝子の名称を含む長方形によって示す。長方形の１つまたは集合に隣接する各矢印は、そのような遺伝子（複数可）の矢印の方向の転写を駆動することに関与するプロモーターを示す。１つまたは一連の長方形に隣接するより太い直線は、この細菌においてＡｒｇＲが欠失しているので利用されないＡｒｇＲ結合部位を示す。各長方形の上の矢印は、各遺伝子の発現産物を示す。
【図２】図２Ａは、本発明の代替の例示的実施形態を示す図である。好気的条件下での実施形態を示し、酸素の存在下では、ＦＮＲタンパク質（四角囲みのＦＮＲ）は、単量体として留まり、アルギニンフィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の発現を駆動するＦＮＲプロモーター（「ＦＮＲ」）に結合し、活性化することができない。野生型ＡｒｇＡタンパク質は、機能性であるが、アルギニンに結合することにより負のフィーバック抑制を受けやすく、それによりアルギニンレベルを正常以下に維持する。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のプロモーター領域におけるアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）結合部位のすべてが突然変異して（黒色の線；黒色の「Ｘ」印）、ＡｒｇＲへの結合を減少または消失させた。図２Ｂは、本発明の代替の例示的実施形態を示す図である。嫌気的条件下での図２Ａと同様の実施形態を示し、酸素の非存在下では、ＦＮＲタンパク質（四角囲みのＦＮＲ）は、二量体化し、ＦＮＲプロモーター（「ＦＮＲ」）に結合し、活性化する。これは、アルギニン（楕円内の「Ａｒｇ」）によるフィーバック抑制に抵抗性である、アルギニンフィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の発現を駆動する（黒色のくねった線（ξ）＝ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子発現産物）。各アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＡ、ａｒｇＥ、ａｒｇＣ、ａｒｇＢ、ａｒｇＨ、ａｒｇＤ、ａｒｇＩ、ａｒｇＧ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のプロモーター領域におけるアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）結合部位のすべてが突然変異して（黒色の線）、ＡｒｇＲへの結合を減少または消失させ（黒色の「Ｘ」印）、ひいてはアルギニン−ＡｒｇＲ複合体による阻害を妨げた。これにより、アルギニンの高レベルの産生が可能となる。
【図３】本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（黒色の線）を含む構築物は、遺伝子Ｘの発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲとＸとの間の黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲが発現し、遺伝子Ｘの発現を阻害する。高アルギニン濃度では、ＡｒｇＲがアルギニンと会合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＴｅｔＲによる阻害が排除され、遺伝子Ｘの発現（黒色のくねった線（ξ））が可能になる。
【図４】本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（黒色の線）を含む構築物は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）の発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＲ楕円に結合した黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲが発現し、ＧＦＰの発現を阻害する。高アルギニン濃度では、ＡｒｇＲがアルギニンと会合し、ＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＴｅｔＲによる阻害が排除され、ＧＦＰの発現が可能になる。この構築物を含む宿主を突然変異させることによって、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）を用いてＧＦＰの発現に基づいて高アルギニン産生体を選択することができる。
【図５】本発明の他の実施形態を示す図である。この実施形態では、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔリプレッサーの発現（示さず）を駆動するプロモーターにおけるＡｒｇＲ結合部位（ＡｒｇＲ−Ａｒｇ複合体により結合された黒色の線）を含む構築物は、宿主の生存に必要な栄養要求性タンパク質（「ＡＵＣ」）の発現を駆動するＴｅｔＲ結合部位（黒色の線）を含む第２のプロモーターに連結している。高アルギニン濃度下では、ＡｒｇＲ−アルギニン複合体がＡｒｇＲ結合部位に結合し、それにより、ｔｅｔＲ遺伝子からのＴｅｔＲの発現を阻害する。これにより、ひいてはＡＵＸの発現が可能となり、宿主が生存することが可能になる。低アルギニン濃度下では、ＴｅｔＲがｔｅｔＲ遺伝子から発現し、ＡＵＸの発現を阻害し、ひいては宿主を殺滅する。図５における構築物は、ＡＵＸ発現のその制御により宿主細胞の生存のためにそれを必要にすることによって高アルギニン（「Ａｒｇ」）産生を増強する。
【図６】強いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｆｎｒＳ）の制御下のａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の概略図である。
【図７】強いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の他の概略図である。他の調節エレメントも存在し得る。
【図８】弱いリボソーム結合部位に融合した例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢ）の制御下のａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の概略図である。
【図９】図９Ａは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ反応性プロモーターの例示的実施形態を示す図である。ＦＮＲ−ＣＲＰプロモーター領域のマップを示し、制限部位は太字で示す。図９Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ反応性プロモーターの例示的実施形態を示す図である。ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的ＦＮＲプロモーター（ｎｉｒＢプロモーター）の制御下のａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の概略図を示す。他の調節エレメントも存在し得る。
【図１０】図１０Ａは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモーターの代替の例示的実施形態を示す図である。制限部位を太字で示したＦＮＲ−ＣＲＰプロモーター領域のマップを示す。図１０Ｂは、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲ応答性プロモーターの代替の例示的実施形態を示す図である。ＣＲＰ結合部位およびリボソーム結合部位の両方に融合した、例示的ＦＮＲプロモーター（ｆｎｒＳプロモーター）の制御下のａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の概略図を示す。
【図１１】大腸菌ニッスル（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）における構成的に発現したａｒｇＧ構築物の例示的実施形態を示す図である。構成的プロモーターは、灰色の囲み線付きのＢＢａ＿Ｊ２３１００である。クローニングに用いる制限部位は太字である。
【図１２】大腸菌ニッスルの野生型ａｒｇＧオペロンおよびその構成的に発現する突然変異体のマップを示す図である。四角囲みのＡＲＧは、野生型オペロンに存在するが、突然変異体には存在しない。ＡｒｇＧは、ＢＢａ＿Ｊ２３１００プロモーターの制御下で構成的に発現する。
【図１３】例示的ＢＡＤプロモーター駆動ａｒｇＡｆｂｒ構築物の概略図である。この実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子がａｒａＣ遺伝子とａｒａＤ遺伝子との間に挿入されている。ＡｒｇＡｆｂｒに、リボソーム結合部位、ＦＲＴ部位および１つまたは複数の転写終結配列が隣接している。
【図１４】ａｒｇＲ遺伝子が欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびアルギニンの産生に有用である。
【図１５】ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子が欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびシトルリンの産生に有用である。
【図１６】ＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびアルギニンの産生に有用である。
【図１７】ａｒｇＧを除くアルギニン生合成オペロンのすべてにおけるＡｒｇＲ結合部位を欠き、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する操作細菌菌株の例示的実施形態を示す図である。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この菌株は、アンモニアの消費およびシトルリンの産生に有用である。
【図１８】大腸菌１９１７ニッスル染色体内の例示的組込み部位のマップを示す図である。これらの部位は、本質的な遺伝子発現を妨げることなく、回路成分を染色体に挿入することができる領域を示す。バックスラッシュ（／）を用いて、挿入が発散的または収束的に発現する遺伝子間に起こることを示す。ｔｈｙＡなどの生合成遺伝子内の挿入は、栄養要求性を作るのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、個々の回路成分を複数の示された部位に挿入する。ｍａｌＥ／Ｋ部位を丸で囲む。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒをｍａｌＥＫ遺伝子座に挿入する。
【図１９】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を構成的に発現する３つの細菌菌株を示す図である。菌株１〜３において、ｒｆｐ遺伝子が細菌染色体内の異なる部位に挿入され、蛍光灯下で様々な程度の輝度をもたらす。非改変大腸菌ニッスル（菌株４）は、非蛍光性である。
【図２０】本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０２を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたΔＡｒｇＲ、ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡおよびクロラムフェニコール耐性を含む。
【図２１】本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０６、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０７およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０９を含む。例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む。
【図２２】本開示の例示的構築物の遺伝子構成を示す図である。そのような構築物を含む菌株の非限定的な例は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０８およびＳＹＮ−ＵＣＤ３１０を含む。例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない。
【図２３】誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）条件下でストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３により産生されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１は、ΔＡｒｇＲを含み、ａｒｇＡｆｂｒを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２は、ΔＡｒｇＲおよび高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む。
【図２４】誘導条件下でストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０５により産生されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアルギニンおよびシトルリンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＧ、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンのそれぞれの四角囲みのＡＲＧにおける突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、構成的に発現したａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモーター）、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンのそれぞれの四角囲みのＡＲＧにおける突然変異を含む。
【図２５】酸素の存在（＋Ｏ２）または非存在（−Ｏ２）下で、誘導（＋ＡＴＣ）および非誘導（−ＡＴＣ）条件下でストレプトマイシン耐性ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４により産生されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照ニッスル構築物である。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡｆｂｒを含む。
【図２６】ベースライン、２時間および４時間におけるＳＹＮ−ＵＣＤ１０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２およびブランク対照からの培養培地中のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２の両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができる。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１は、野生型ＡｒｇＲおよび野生型ＴｈｙＡを含み、ＡｒｇＡＦｂｒを含まず、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２は、野生型ＡｒｇＲ、低コピープラミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む。
【図２７】ベースライン、２時間および４時間におけるＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３およびブランク対照からの培養培地中のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアンモニアレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３の両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができる。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３の両方がΔＡｒｇＲ、それぞれ高コピープラスミドまたは低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、Ａｍｐ耐性および野生型ＴｈｙＡを含む。
【図２８】図２８Ａは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。非改変対照ニッスルまたはＡｒｇリプレッサー遺伝子が欠失し、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子が高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子操作菌株であるＳＹＮ−ＵＣＤ２０２を投与した高アンモニア血症マウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフを示す。合計９６匹のマウスを試験した。エラーバーは、標準誤差を表す。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２を投与したマウスにおける血中アンモニア（ＢＡ）レベルは、４日目および５日目において非改変対照ニッスルを投与したマウスにおけるアンモニアレベルより低い（ニッスル、ＢＡ＝２２０ｍＭ；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＢＡ＝１０５ｍＭ；ＢＡＮｉｓｓｌｅ−ＢＡＳＹＮ−ＵＣＤ２０２＝１１５ｍＭ；平均血液容積＝１．５ｍＬ）。図２８Ｂは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。ストレプトマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）および媒体のみの対照と比較して、ＴＡＡマウスモデルにおけるＳＹＮ−ＵＣＤ２０４のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性（アンモニア消費）を示す棒グラフを示す。図２８Ｃは、高アンモニア血症ＴＡＡマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。ＴＡＡ処理後２４〜４８時間目の血中アンモニア濃度の変化の百分率の棒グラフを示す。
【図２９】高アンモニア血症ｓｐｆａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。５６匹のｓｐｆａｓｈマウスを４群に分けた。群１に通常の飼料を与え、群２〜４に初期の採血の後に７０％タンパク質飼料を与えた。各群にストレプトマイシン耐性ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）またはＳＹＮ−ＵＣＤ２０４を水とともに１日２回強制経口投与し、最初の強制経口投与の４時間後に血液を採取した。ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現したａｒｇＡｆｂｒを含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、血中アンモニアを高アンモニア血症閾値を下回るレベルに有意に低下させた。
【図３０】高タンパク食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフである。マウスにＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含む）または水を投与し、次いで、２日後に高タンパク食に切り替えた。図３０に見られるように、高タンパク食への切り替えの４８時間後にアンモニアレベルがＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の両方において同様の程度に低下し、ＴｈｙＡ栄養要求性が有効性に有意な影響を及ぼさないことがわかる。
【図３１】図３１Ａは、嫌気性誘導後の様々な時点における培地中のアルギニンレベルの棒グラフである。０、３０、６０および１２０分目に測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生のレベルの棒グラフを示す。図３１Ｂは、嫌気性誘導後の様々な時点における培地中のアルギニンレベルの棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲ、低コピープラスミド上のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよび野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（これらの３つすべてが組み込まれたＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ構築物を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１は、ΔＡｒｇＲおよびｗｔＴｈｙＡを含み、ＳＹＮ３０３は、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含む）のアルギニン産生のレベルの棒グラフを示す。結果から、ＦＮＲ  ＡｒｇＡ  ｆｂｒの染色体組込みが、同じ構築物を発現する低コピープラスミド菌株で認められたのと同様のレベルのアルギニン産生をもたらすことがわかる。
【図３２】図３２Ａは、通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆａｓｈマウスのアンモニアレベルおよび生存曲線の棒グラフである。ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有し、１つ（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）はＴｈｙＡ欠失を有し、１つ（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１）は有さない２つの菌株を比較した。通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆａｓｈマウスにおけるアンモニアレベルの棒グラフを示す。高タンパク食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニアレベルは、Ｈ２Ｏ高タンパク食対照群と比較してＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３群において低下した。アンモニアレベルの観測された低下は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の両方において同様であり、ＴｈｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の有効性に有意な影響を及ぼさないことがわかる。図３２Ｂは、通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆａｓｈマウスの生存曲線を示す図であり、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３が対照と比較して生存期間の延長を示したことを表す。
【図３３】通常（ＮＣ）または高タンパク（ＨＰ）食を給餌した高アンモニア血症ｓｐｆａｓｈマウスにおける血中アンモニアレベルのグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について、１×１０７、１×１０８、１×１０９および１×１０１０細胞の用量を１２日間にわたり毎日投与した。血中アンモニアレベルを５日目に測定した。１×１０８および１×１０９の両用量は、このモデルにおける血中アンモニアレベルの有意な低下をもたらすのに十分であった。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む。
【図３４】ニッスルのｉｎ  ｖｉｖｏでの滞在を示すグラフである。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべてのマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。
【図３５】図３５Ａは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイシン耐性ニッスル）の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。図３５Ｂは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含み、ＡｒｇＡｆｂｒを含まないＳＹＮ−ＵＣＤ１０６の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。図３５Ｃは、強制投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目の腸管の様々なコンパートメントにおける細菌の滞在の棒グラフである。マウスに約１０９ＣＦＵを投与し、各時点に動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。腸溶出液を収集し、連続希釈平板培養により、各コンパートメントにおけるＣＦＵｓを決定した。ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含むＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の滞在の時間的推移の棒グラフを示す。
【図３６】図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃは、生存細菌細胞およびアルギニン産生の棒グラフである。細胞を７０％イソプロパノールまたは対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とともに振盪しながら１時間インキュベートした。処理後、細胞を、０．５％グルコースおよび３ｍＭチミジンを添加したＭ９培地中で特定の比率で混合し、振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。図３６Ａおよび３６Ｂに見られるように、培養中のイソプロパノール処理細胞と非処理細胞とのより大きい比率は、平板培養により決定されるより少ないＣＦＵｓおよびより低いレベルのアルギニンの産生をもたらす。存在する細菌の量に対するアルギニンの産生は、種々の培養にわたり一定のままであった（図３６Ｃ）。これらの結果から、生存細菌のみがアルギニンの産生に寄与していることがわかる。
【図３７】非ヒト霊長類毒性試験において採取した糞便試料中の定量された細菌の数を示すグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７（カナマイシン耐性ニッスル）およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびカナマイシン耐性を含む）の投与により得られた薬物動態および薬力学を５０日にわたり比較した。結果から、これらの投与条件下では、糞便中に対照カナマイシン耐性ニッスルと同様の量の細菌が栄養要求体ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について回収されたことがわかる。同様の結果がマウスにおいて観測された。
【図３８】肝性脳症および高アンモニア血症を特徴とする他の障害を治療するための例示的合成遺伝子回路を示す図である。アンモニア変換回路において、アンモニアが細菌（例えば、大腸菌ニッスル）によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。
【図３９】本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための４つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質（ＧａｂＰ）がｇａｂＰ遺伝子により発現され、細胞内へのＧＡＢＡの輸送を促進する。第３の回路において、細菌マンガン輸送タンパク質（ＭｎｔＨ）がｍｎｔＨ遺伝子により発現され、細胞内へのマンガンの輸送を促進する。第４の回路において、酪酸遺伝子カセットの発現が酪酸の産生、およびこの消化管バリア増強分子の細胞外への放出をもたらす。いくつかの実施形態では、４つの回路すべてがそれぞれ同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、４つの回路が異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。
【図４０】本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、ＧＡＢＡ膜輸送タンパク質（ＧａｂＰ）がｇａｂＰ遺伝子により発現され、細胞内へのＧＡＢＡの輸送を促進する。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧＡＢＡのレベルを低下させるための追加の回路、例えば、ＧＡＢＡを代謝する（異化する）ための回路をさらに含み得る。
【図４１】図４１Ａは、合成遺伝子回路を含む遺伝子操作細菌への取込みの後のＧＡＢＡの異化を示す図である。細胞への侵入により、ＧＡＢＡがＧＡＢＡ  α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ（ＧＳＳＴ）によりスクシニルセミアルデヒドに変換される。次にコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）が、ＧＡＢＡ異化における第２および唯一の他の特定のステップである、スクシニルセミアルデヒドのコハク酸への酸化を触媒する。最終的に、コハク酸がクエン酸（ＴＣＡ）回路の基質になる。ＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）は、アルファ−ケトグルタル酸をグルタミン酸に変換する。特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよびＧＯＴのうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されないＧＡＢＡ消費回路を含む。図４１Ｂは、大腸菌ニッスルにおけるＧＡＢＡ利用経路の概略図である。
【図４２】本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、細菌マンガン輸送タンパク質（ＭｎｔＨ）がｍｎｔＨ遺伝子により発現され、細胞内へのマンガンの輸送を促進する。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。
【図４３】本発明の一実施形態を示す図である。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、肝性脳症の治療のための２つの例示的回路を含む。１つの回路において、アンモニアが細菌によって取り込まれ、グルタミン酸に変換され、グルタミン酸がその後アルギニンに代謝される。アルギニンは、最終的に細菌細胞から出ていく。第２の回路において、酪酸遺伝子カセットの発現が酪酸の産生、およびこの消化管バリア増強分子の細胞外への放出をもたらす。いくつかの実施形態では、両回路が同じ誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、２つの回路がそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、および消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースにより誘導されるプロモーターを含む。本明細書に記載の酪酸カセットのうちの１つまたは複数は、アルギニン（および／またはシトルリン）産生回路を含む遺伝子操作細菌により発現させることができる。
【図４４】複数の作用機構（ＭｏＡｓ）を含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。
【図４５】複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、酪酸産生回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路、ならびにマンガン輸送回路が４つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。
【図４６】図４６Ａは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、酪酸産生回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が３つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。図４６Ｂは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路、ならびにマンガン輸送回路が３つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。
【図４７】図４７Ａは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路およびマンガン輸送回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。図４７Ｂは、複数のＭｏＡｓを含む大腸菌１９１７ニッスル染色体の例示的概略図である。アンモニア変換回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が２つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている。
【図４８】図４８Ａは、酪酸の産生のための代謝経路を示す。図４８Ｂおよび図４８Ｃは、両方がテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、２種の酪酸産生回路（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３およびＳＹＮ−ＵＣＤ５０４に見いだされる）の概略図を示す。図４８Ｄは、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下の第３の酪酸遺伝子カセット（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０５に見いだされる）の概略図を示す。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｂｄｃ２酪酸カセットを含む。「ｂｄｃ２カセット」または「ｂｄｃ２酪酸カセット」は、少なくとも次の遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット（ｔｅｒ遺伝子がｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３遺伝子を置換する）を含む。「ｔｅｒカセット」または「ｔｅｒ酪酸カセット」は、少なくとも次の遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する：ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０５は、プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｓＢ酪酸カセット（ｔｅｒ遺伝子が存在し、ｔｅｓＢ遺伝子がｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子を置換する）を含む。「ｔｅｓもしくはｔｅｓＢカセット」または「ｔｅｓもしくはｔｅｓＢ酪酸カセット」は、少なくともｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む酪酸産生カセットを意味する。本開示の代替酪酸カセットは、少なくともｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｔｅｓまたはｔｅｓＢカセットは、テトラサイクリン以外の誘導性プロモーターの制御下にある。ｔｅｓＢカセットの発現を制御し得る例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ，  ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。
【図４９】本開示の例示的な操作細菌の遺伝子構成および酪酸の産生のための嫌気性または炎症条件下でのそれらの誘導を示す図である。図４９Ａおよび４９Ｂに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図４９Ａに酸素（Ｏ２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低い酪酸の産生を示す。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、および酪酸の産生をもたらす、酪酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下での酪酸の産生の増大を示す。図４９Ｃおよび４９Ｄに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および酸化窒素（ＮＯ）の存在下でのその抑制解除を示す。図４９Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＮｓｒＲ」）が対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９Ｄにおいて、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子がＮＯと相互作用し、もはや調節領域に結合もせず、抑制もしない。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。図４９ＥおよびＦに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２の存在下でのその誘導を示す。図４９Ｅにおいて、Ｈ２Ｏ２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＯｘｙＲ」）がｏｘｙＳプロモーターに結合するが、それを誘導しない。したがって、酪酸生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図４９Ｆにおいて、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子がＨ２Ｏ２と相互作用し、次にｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。
【図５０】本開示の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および酪酸の産生のための嫌気性または炎症条件下でのそれらの誘導を示す図である。図５０Ａおよび５０Ｂに本発明の例示的組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図５０Ａに酸素（Ｏ２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低い酪酸の産生を示す。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、および酪酸の産生をもたらす、酪酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下での酪酸の産生の増大を示す。図５０Ｃおよび５０Ｄに本発明の他の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯの存在下でのその抑制解除を示す。図５０Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＮｓｒＲ」）が対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０Ｄにおいて、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子がＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合もせず、抑制もしない。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。図５０Ｅおよび５０Ｆに本発明の他の例示的組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２の存在下でのその誘導を示す。図５０Ｅにおいて、Ｈ２Ｏ２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（灰色の丸囲み、「ＯｘｙＲ」）がｏｘｙＳプロモーターに結合するが、それを誘導しない。したがって、酪酸生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５０Ｆにおいて、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子がＨ２Ｏ２と相互作用し、次にｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これは、酪酸生合成酵素の発現（灰色の矢印および黒色のくねった線で示す）および最終的に酪酸の産生をもたらす。
【図５１】図４８に示した回路（ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ−５０５）を用いた酪酸産生のグラフである。細胞を０．２％グルコースを含むＭ９最少培地中で増殖させ、初期対数期にＡＴＣにより誘導した。図５１Ａに見られるように、好気性対嫌気的条件下で各構築物について同様の量の酪酸が産生された。ｔｅｒ菌株は、全般的により多くの酪酸を産生する。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３は、ｐＬｏｇｉｃ０３１（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｂｄｃ２酪酸カセット）を含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４は、ｐＬｏｇｉｃ０４６（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット）を含む。図５１ＢにＳＹＮ−ＵＣＤ５０４（ｐＬｏｇｉｃ０４６（プラスミド上のｔｅｔプロモーターの制御下のｔｅｒ酪酸カセット））ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ５０５（プラスミドｐＬＯＧＩＣ０４６−デルタｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋、ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子の欠失およびｔｅｓＢ遺伝子によるそれらの置換を含む酪酸構築物を含むＡＴＣ誘導性ｔｅｒを含むニッスル株）の酪酸の産生を示す。ｔｅｓＢ構築物は、より大きい酪酸の産生をもたらす。
【図５２】ｎｕｏＢ遺伝子の欠失を含む異なる酪酸産生回路を用いた酪酸の産生のグラフである。示した菌株は、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ５１０（ＳＹＮ−ＵＣＤ５１０は、それがｎｕｏＢ欠失をさらに含むことを除いてＳＹＮ−ＵＣＤ５０３と同じである）およびＳＹＮ−ＵＣＤ５１１（ＳＹＮ−ＵＣＤ５１１は、それがｎｕｏＢ欠失をさらに含むことを除いてＳＹＮ−ＵＣＤ５０４と同じである）である。ＮｕｏＢ遺伝子の欠失は、酪酸産生菌株における野生型親対照と比較してより大きいレベルの酪酸産生をもたらす。ＮｕｏＢは、呼吸成長時のＮＡＤＨの酸化に関与する主要なタンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨ酸化と電子伝達との共役を妨げることにより、酪酸の産生を維持するために用いられるＮＡＤＨの量が増加する。
【図５３】図５３Ａは、ＦＮＲプロモーターの制御下の酪酸産生回路の概略図である。図５３Ｂは、酪酸産生の嫌気性誘導の棒グラフである。ＦＮＲ応答性プロモーターをｂｃｄまたはｔｅｒ回路を含む酪酸カセットに融合させた。形質転換細胞をＬＢにおいて初期対数期まで増殖させ、嫌気性チャンバー内に４時間入れて、酪酸遺伝子の発現を誘導した。細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含む最少培地に再懸濁し、微好気的にインキュベートして、酪酸の産生を経時的にモニターした。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、嫌気的条件下で有意な酪酸産生をもたらした。図５３Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグルコースおよび酸素の存在下および非存在下でのＳＹＮ−ＵＣＤ５０１についての棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミドを含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５００は、ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄ酪酸プラスミドを含み、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０６は、ｐＳＣ１０１  ｎｉｒＢ−ｂｃｄ酪酸プラスミドを含む。図５３Ｄは、ＨＥのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける糞便試料を用いてＥＬＩＳＡにより定量したマウスリポカリン２およびカルプロテクチンのレベルを示すグラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１は、対照ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３と比較して炎症を低減し、かつ／または消化管バリア機能を保護する。
【図５４】（１）酪酸産生菌株、（２）アルギニン産生菌株（アンモニア消費菌株）ならびに（３）酪酸を産生し、アンモニアも消費する菌株についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアルギニン（図５４Ａ）および酪酸（図５４Ｂ）産生を示す棒グラフである。ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む酪酸産生菌株）、ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒおよびΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まないアルギニン産生／アンモニア消費菌株）、ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０１（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む酪酸産生およびアルギニン産生／アンモニア消費菌株）。データから、ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＹＮ−ＵＣＤ３０５と同様のレベルのアルギニンを、またＳＹＮ−ＵＣＤ５０１と同様のレベルの酪酸を産生することができることがわかる。
【図５５】本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５５Ａに酸素（Ｏ２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、ａｃｒＣ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５５ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。
【図５６】例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す図である。
【図５７】図５７Ａ、５７Ｂおよび５７Ｃは、例示的な操作された細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５７Ａに酸素（Ｏ２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５７ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。図５７Ｃに例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す。
【図５８】本発明の例示的な操作細菌の遺伝子構成およびプロピオン酸の産生のための低酸素条件下でのその誘導を示す図である。図５８Ａに酸素（Ｏ２）が、ＦＮＲ（灰色の四角囲みの「ＦＮＲ」）が二量体化し、ＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）を活性化することを妨げる（「Ｘ」印で示す）好気的条件下での比較的に低いプロピオン酸の産生を示す。したがって、プロピオン酸生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、ｔｅｓＢ；黒色の四角囲み）のいずれも発現しない。図５８ＢにＦＮＲ二量体化（灰色の四角囲みの２つの「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターに結合すること、およびプロピオン酸の産生をもたらす、プロピオン酸生合成酵素の発現を誘導することによる低酸素条件下でのプロピオン酸の産生の増大を示す。
【図５９】例示的プロピオン酸生合成遺伝子カセットを示す図である。
【図６０】図６０Ａおよび６０Ｂは、正のフィードバック栄養要求体を作製し、高アルギニン産生のために選択するために用いることができる例示的構築物を示す図である。図６０ＡにｔｈｙＡの発現を駆動するａｓｔＣプロモーターのマップを示す。図６０ＢにａｓｔＣプロモーターの制御下のｔｈｙＡ遺伝子の概略図を示す。調節領域は、ＣＲＰ、ＡｒｇＲおよびＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の結合部位を含み、追加の調節エレメントも含み得る。
【図６１】アンモニアをシトルリンまたはアルギニンなどの所望の産物への変換により、尿素回路異常症（ＵＣＤ）を標的にするための操作細菌菌株の他の例示的実施形態を示す図である。該菌株は、ａｒｇＲが欠失し、フィードバック抵抗性ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、この菌株は、染色体上の１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。尿素回路異常症（ＵＣＤ）を標的にするように操作された合成生物も図６５に記載するキルスイッチ実施形態を有する。この例では、ＩｎｔリコンビナーゼおよびＫｉｄ−Ｋｉｓ毒素抗毒素システムをＵＣＤを治療するための組換え細菌細胞に用いる。組換え細菌細胞は、過剰のアンモニアを消費して、患者予後を改善するための有益な副産物を産生するように操作されている。組換え細菌細胞は、安全性を保証するための高度に制御可能なキルスイッチも含む。低酸素環境（例えば、消化管内に見いだされるような）に反応して、ＦＮＲプロモーターは、Ｉｎｔリコンビナーゼの発現を誘導し、Ｋｉｓ抗毒素の発現も誘導する。Ｉｎｔリコンビナーゼは、Ｋｉｄ毒素遺伝子を活性化立体配座に転換させるが、蓄積されたＫｉｓ抗毒素の存在が発現Ｋｉｄ毒素の活性を抑制する。酸素の存在下（例えば、消化管外）では、抗毒素の発現は停止する。毒素は、構成的に発現するので、蓄積し続け、細菌細胞を殺滅する。高アンモニア血症は、他の病変にも寄与し得る。
【図６２】図６２
【図６３】図６３
【図６４】図６４
【図６５】図６５
【図６６】図６６Ａは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。図６６Ａに組換え細菌に見いだされない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態も示す。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の必須遺伝子の転写を抑制する立体配座をとり、細菌細胞は生存することができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これが必須遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能力を維持する。図６６Ｂは、抗毒素が構成的プロモーターから発現し、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔＲの発現を誘導し、ひいては毒素の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場会、ＴｅｔＲは、発現せず、毒素が発現し、最終的に抗毒素に打ち勝ち、細胞を殺滅する。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を駆動するプロモーターより弱いプロモーターであるべきである。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターの制御下にある。図６６Ｃは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルにより活性化される、本開示の他の非限定的な実施形態を示す図である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、これをＰａｒａＢＡＤプロモーターに結合させ、それを活性化させる立体配座の変化を受け、これがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導する。抗毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し、一方、ＴｅｔＲは、毒素（ＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げる。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方が発現しない。毒素の発現を抑制するＴｅｔＲが存在しないので、毒素は、発現し、細胞を殺滅する。ａｒａＣ遺伝子は、この回路における構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）の制御下にある。
【図６７】操作された安全構成要素としてのＧｅｎｅＧｕａｒｄｓの使用を示す図である。すべての操作されたＤＮＡは、条件付きで破壊することができるプラスミド上に存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４巻、３０７〜３１６頁を参照されたい。
【図６８】短寿命抗毒素および長寿命毒素の両方を産生するプラスミドを含むプラスミド安定システムを含む、本開示の１つの非限定的な実施形態を示す図である。細胞がプラスミドを失った場合、抗毒素がもはや産生されず、毒素が細胞を殺滅する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、等量のＨｏｋ毒素および短寿命Ｓｏｋ抗毒素を産生する。上のパネルにおいて、細胞は、等量の毒素および抗毒素を産生し、安定である。中間のパネルにおいて、細胞は、プラスミドを失い、抗毒素が崩壊し始める。下のパネルにおいて、抗毒素が完全に崩壊し、細胞が死ぬ。
【図６９】細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境に移動させることができるようにペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることによって、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチド（星）を分泌する鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づく分泌システムの概略図である。
【図７０】治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータ−ドメインに融合させることができる、組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌システムの概略図である。このシステムにおいて、Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータ−ドメインは、Ｂａｍ複合体に動員され、そこでベータ−ドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。次いで治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。治療用ペプチドは、自触媒切断によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（ハサミ）の標的化によってリンカーシステムから解放される。
【図７１】内および外膜の両方を通るチャンネルを形成するＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）、ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を用いてパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接転位させる、Ｉ型分泌システムの概略図である。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。
【図７２】漏出性または不安定化外膜を作製し、それにより、細胞外腔への治療用ポリペプチド、例えば、ジスルフィド結合を含む真核生物由来の治療用ポリペプチドの転位を促進するためのグラム陰性細菌の外および内膜、ならびにいくつかの欠失標的の概略図である。外膜をペプチドグリカン骨格につなぎ留めるタンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはペリプラズムプロテアーゼをコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌの不活性化突然変異は、漏出性表現型を発生させる。突然変異の組合せは、漏出性表現型を相乗的に増強させ得る。
【図７３】細菌が消化管内腔に分泌治療用タンパク質を注入することを可能にする改変された３型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）を示す図である。誘導性プロモーター（小矢印、上）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、タグ付きペプチドを細胞外に分泌する装置を作るＴ３分泌システム遺伝子カセット（３つの大矢印、上）の発現を誘導する。誘導性プロモーター（小矢印、下）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、次にタグ付き治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する、調節因子、例えば、Ｔ７ポリメラーゼの発現を駆動する。
【図７４】例示的なＬ−ホモセリンおよびＬ−メチオニン生合成経路を示す図である。円形は、ＭｅｔＪにより抑制される遺伝子を表し、ｍｅｔＪの欠失は、これらの遺伝子の構成的発現および経路の活性化をもたらす。
【図７５】例示的なヒスチジン生合成経路を示す図である。
【図７６】例示的なリシン生合成経路を示す図である。
【図７７】例示的なアスパラギン生合成経路を示す図である。
【図７８】例示的なグルタミン生合成経路を示す図である。
【図７９】例示的なトリプトファン生合成経路を示す図である。
【図８０】本開示の遺伝子操作細菌を設計し、作製する非限定的な方法の概略を示す図である。「定義する」ステップは、１．微生物生理学および疾患生物学に基づく多様な候補アプローチの特定、２．候補代謝経路を決定するためのバイオインフォマティクスの使用、最適化操作された合成生物の要求される性能目標を決定するための予測ツールの使用を含む。「設計する」ステップは、１．経路構成のコンビナトリアル試験を可能にするための最先端のＤＮＡアセンブリ、２．経路の効率を予測するための数学モデル、３．操作された回路の制御および調節を可能にする専用のスイッチおよび部品の内部安定の使用を含む。「構築する」ステップは、１．コア構造「シャーシー」を構築すること、２．操作された回路を、効率的発現のための最適な染色体位置に安定に組み込むこと、３．固有の機能アッセイを用いて、遺伝子回路の忠実性および活性を評価することを含む。「組み込む」ステップは、１．動物モデルにおける合成生物の局在および通過時間のモニタリングを可能にする、染色体マーカーの使用、２．特定の疾患状態がＧＩ微生物叢および当環境における合成生物の挙動にどのように影響を及ぼすかの理解を拡大するための専門のマイクロバイオームネットワークおよびバイオインフォマティクスを利用すること、３．開発候補の前臨床への速やかで、途切れのない移行を可能にする、発見段階における組織内での方法の開発研究および最適化を活発にすること、候補合成生物の用意周到で、高品質の試験を支援する、特殊疾患動物モデルの改良の広範な経験を利用することを含む。
【図８１】図８１Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、本開示の遺伝子操作細菌の上流および下流生産のための非限定的な製造方法の略図である。図８１Ａは、種培養１（ＳＣ１）のパラメーター：白金耳量−グリセロール保存液、継続時間一夜、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図８１Ｂは、種培養２（ＳＣ２）のパラメーター：ＳＣ１からの１／１００希釈、継続時間１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪を示す。図８１Ｃは、生産バイオリアクターのパラメーター：接種物−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定点７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶存酸素設定点５０％、溶存酸素カスケード撹拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００〜１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯ限界１分当たり０．５〜２０標準リットル、継続時間２４時間を示す。図８１Ｄは、収集のパラメーター：４０００ｒｐｍの速度および３０分の継続時間での遠心分離、洗浄１×１０％グリセロール／ＰＢＳ、遠心分離、再懸濁１０％グリセロール／ＰＢＳを示す。図８１Ｅは、バイアル充填／貯蔵のパラメーター：１〜２ｍＬの小分け、−８０℃を示す。
【図８２】ＡＴＣ（図８２Ａ）または酸化窒素誘導性（図８２Ｂ）リポーター構築物を示す図である。これらの構築物は、それらの同種誘導物質により誘導された場合、ＧＦＰの発現をもたらす。対照、ＡＴＣ誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰリポーター構築物または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰリポーター構築物を含むプラスミドを含むニッスル細胞は、一連の濃度にわたり誘導した。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表す。図８２Ｃは、構築物の概略図を示す図である。
【図８３】構成的プロモーターの制御下のＮｓｒＲを発現するプラスミドおよびＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下のリポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を含む細菌のドットブロットを示す図である。ＤＳＳ投与マウスをＨＥの例示的モデルとする。ＨＥ対象と同様に、マウスの消化管は、飲料水に２〜３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を添加することによって損傷する。化学発光は、ＤＳＳ投与マウスにおいて誘導されたＮｓｒＲ調節プロモーターで示されている。
【図８４】野生型ニッスルと比較してより多くの酪酸を産生する、ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸構築物（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０７）またはｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸構築物（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０８）を含む遺伝子操作ニッスルによる酪酸の産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、遺伝子操作細菌、その医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する障害、例えば、尿素回路異常症、肝性脳症および過剰のアンモニアもしくはアンモニアレベルの上昇に関連する他の障害をモジュレートまたは治療する方法を含む。遺伝子操作細菌は、とりわけ、哺乳動物消化管内におけるような、特定の環境条件下で、過剰のアンモニアを減少させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、体内の過剰の窒素を非毒性分子、例えば、アルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンに組み込むことによって過剰のアンモニアを減少させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、１つもしくは複数の他の有毒物質、例えば、ＧＡＢＡおよび／またはマンガンも減少させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、例えば、ＧＡＢＡを移入することによって、かつ／またはＧＡＢＡを代謝することによって、ＧＡＢＡレベルも低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、例えば、マンガンを移入することによって、マンガンレベルも減少させる。遺伝子操作細菌は、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害（例えば、ＵＣＤ、ＨＥ等）の症状を軽減する１つまたは複数の分子をさらに産生し得る。したがって、述べた実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作細菌は、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つまたは複数の分子も産生し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、短鎖脂肪酸、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸を産生する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つまたは複数の分子を産生する、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、１つもしくは複数の他の有毒物質、例えば、ＧＡＢＡおよび／またはマンガンを減少させ、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つもしくは複数の分子を産生する、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、例えば、ＧＡＢＡを移入することによって、かつ／またはＧＡＢＡを代謝することによって、ＧＡＢＡレベルを低下させ、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つもしくは複数の分子を産生する、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、例えば、マンガンを移入することによって、マンガンレベルを低下させ、消化管のバリア機能を改善するあるいはアンモニアの上昇に関連する障害の症状を軽減する１つもしくは複数の分子を産生する、例えば、酪酸、プロピオン酸および／または酢酸などの、短鎖脂肪酸を産生する。
【００１８】
述べた実施形態のいずれかにおいて、操作細菌は、（１）当技術分野で公知であり、本明細書で示す栄養要求性のいずれか、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの、１つまたは複数の栄養要求性、（２）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知のキルスイッチのいずれかなどの、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の輸送体のいずれかのような、生体分子または物質を移入する１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の分泌回路のいずれかなどの、１つまたは複数の分泌回路、および（６）そのようなさらなる回路の１つまたは複数の組合せのうちの１つまたは複数をさらに含み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、構成的プロモーターにより調節することができる。いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、組織特異的プロモーターにより調節することができる。いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、誘導性プロモーターにより調節することができる。いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、環境条件、因子もしくはキュー、例えば、哺乳動物消化管に見いだされる環境条件、因子もしくはキューに反応する誘導性プロモーターにより調節することができる。例示的誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＨＥ特異的分子または肝損傷を示す代謝物（例えば、ビリルビン）により誘導されるプロモーター、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、ならびに消化管における天然に存在する可能性があるまたは可能性がない（例えば、外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、１つもしくは複数の低コピーまたは高コピープラスミド上に存在し得る。いくつかの実施形態では、ペイロードもしくは治療回路（例えば、アンモニア消費、ＧＡＢＡ減少、マンガン減少、短鎖脂肪酸産生回路）のうちのいずれか１つもしくは複数および／または追加の回路（例えば、栄養要求性、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、輸送体および分泌回路）のうちのいずれか１つもしくは複数のものは、細菌の染色体に組み込むことができる。本開示をより容易に理解することができるために、特定の用語を最初に定義する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして、また当業者により理解されているように読むべきである。別途定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、この詳細な説明を通して示す。
【００２１】
「高アンモニア血症」、「高アンモニア血」または「過剰アンモニア」は、体内のアンモニアの濃度の増加を指すために用いる。高アンモニア血症は、アンモニアの解毒の低下および／または産生の増加によって引き起こされる。解毒の低下は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの、尿素回路異常症（ＵＣＤ）に、あるいは肝臓のバイパス、例えば、開放肝管、および／またはグルタミンシンテターゼの欠損に起因し得る（Ｈｏｆｆｍａｎら、２０１３年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。解毒の低下は、肝性脳症、急性肝不全または慢性肝不全などの肝臓障害およびハンチントン病などの神経変性疾患にも起因し得る（Ｃｈｅｎら、２０１５年；Ｃｈｉａｎｇら、２００７年）。アンモニアの産生の増加は、感染、薬物、神経因性膀胱および消化管細菌過増殖に起因し得る（Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。高アンモニア血症に関連する他の障害および状態は、肝性脳症、急性肝不全または慢性肝不全などの肝臓障害；有機酸障害；イソ吉草酸尿症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸尿症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損；カルニチン回路欠損症；カルニチン欠損症；β−酸化欠損症；リシン尿性タンパク不耐症；ピロリン−５−カルボン酸シンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水酵素欠損症；高インスリン症−高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア障害；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法；完全腸管外栄養；グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体静脈短絡；尿路感染症；尿管拡張；多発性骨髄腫；および化学療法を含むが、これらに限定されない（Ｈｏｆｆｍａｎら、２０１３年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年；Ｐｈａｍら、２０１３年；Ｌａｚｉｅｒら、２０１４年）。健常者では、血漿アンモニア濃度は、一般的に約５０μｍｏｌ／Ｌ未満である（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年）。いくつかの実施形態では、高アンモニア血症の診断シグナルは、少なくとも約５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約８０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１８０μｍｏｌ／Ｌ、または少なくとも約２００μｍｏｌ／Ｌの血漿アンモニア濃度である（Ｌｅｏｎａｒｄ、２００６年；Ｈｏｆｆｍａｎら、２０１３年；Ｈａｂｅｒｌｅら、２０１３年）。
【００２２】
「アンモニア」は、気体アンモニア（ＮＨ３）、イオン性アンモニア（ＮＨ４＋）またはそれらの混合物を指すために用いられる。体液中では、気体アンモニアとイオン性アンモニアが以下のように平衡状態にある。
ＮＨ３  ＋  Ｈ＋  ←→  ＮＨ４＋
【００２３】
いくつかの臨床検査で総アンモニア（ＮＨ３＋ＮＨ４＋）を分析する（Ｗａｌｋｅｒ、２０１２年）。本発明のいずれかの実施形態では、特に示さない限り、「アンモニア」は、気体アンモニア、イオン性アンモニアおよび／または総アンモニアを意味し得る。
【００２４】
アンモニアの「解毒」は、有毒なアンモニアが除去され、かつ／またはアルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、トリプトファンまたは尿素を含むが、これらに限定されない１つもしくは複数の非毒性分子に変換される、天然または合成の１つまたは複数の過程を指すために用いられる。例えば、尿素回路は、身体から尿中への除去のためにアンモニアを尿素に酵素的に変換する。アンモニアは、多くの生化学的経路を経て合成される、多くのアミノ酸の窒素源であるので、それらのアミノ酸生合成経路のうちの１つまたは複数の増強を用いて、過剰の窒素を非毒性分子に組み込むことができる。例えば、アルギニン生合成は、１個の窒素原子を含むグルタミン酸を４個の窒素原子を含むアルギニンに変換し、それにより、過剰の窒素を非毒性分子に組み込む。ヒトでは、アルギニンは、大腸から再吸収されず、結果として、大腸における過剰のアルギニンは、有害であるとみなされない。同様に、シトルリンは、大腸から再吸収されず、結果として、大腸における過剰のシトルリンは、有害であるとみなされない。アルギニン生合成は、シトルリンを最終産物として産生するように修正することもできる。シトルリンは、３個の窒素原子を含み、したがって、修正経路も過剰の窒素を非毒性分子に組み込むことができる。
【００２５】
「アルギニンレギュロン」、「アルギニン生合成レギュロン」および「アルグレギュロン」は、同義で用いられ、アルギニン生合成経路において、グルタミン酸をアルギニンおよび／または中間代謝物、例えば、シトルリンに変換することに関与する酵素をコードする遺伝子を含む所定の細菌種におけるオペロンの集合を意味する。アルギニンレギュロンは、それらのオペロンに関連するオペレーター、プロモーター、ＡＲＧボックスおよび／または調節領域も含む。アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成酵素であるＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロン、そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックスおよび／またはその調節領域を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／またはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えてあるいはその代わりにオルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするオペロンならびに関連するオペレーター、プロモーター、ＡＲＧボックスおよび／または調節領域も含む。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンの１つもしくは複数のオペロンまたは遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在し得る。いくつかの実施形態では、細菌は、アルギニンレギュロンにおける任意の遺伝子またはオペロンの複数のコピーを含んでいてよく、１つもしくは複数のコピーは、本明細書に記載の通り突然変異させるか、あるいは変更することができる。
【００２６】
１つの遺伝子は、１つの酵素、例えば、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡ）をコードし得る。２つまたはそれ以上の遺伝子は、１つの酵素の異なるサブユニット、例えば、カルバモイルリン酸シンターゼのサブユニットＡおよびサブユニットＢ（ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）をコードし得る。いくつかの細菌では、２つまたはそれ以上の遺伝子は、同じ酵素、例えば、オルニチントランスカルバミラーゼをそれぞれ独立にコードし得る（ａｒｇＦおよびａｒｇＩ）。いくつかの細菌では、アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする、ａｒｇＡ；Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードする、ａｒｇＢ；Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードする、ａｒｇＣ；アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードする、ａｒｇＤ；Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードする、ａｒｇＥ；アルギニノコハク酸シンターゼをコードする、ａｒｇＧ；アルギニノコハク酸リアーゼをコードする、ａｒｇＨ；それぞれがオルニチントランスカルバミラーゼを独立にコードする、ａｒｇＦおよびａｒｇＩの１つまたは両方；カルバモイルリン酸シンターゼの小サブユニットをコードする、ｃａｒＡ；カルバモイルリン酸シンターゼの大サブユニットをコードする、ｃａｒＢ；そのオペロン；そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックスおよび／またはその調節領域を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンは、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／またはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えてあるいはその代わりに）をコードする、ａｒｇＪ、そのオペロン、そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックスおよび／またはその調節領域を含む。
【００２７】
「アルギニンオペロン」、「アルギニン生合成オペロン」および「ａｒｇオペロン」は、同義で用いられ、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む共有された調節領域の制御下のアルギニン生合成酵素をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数のクラスターを意味する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、共転写され、かつ／または共翻訳される。アルギニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の任意の組合せを自然にまたは合成によりオペロンに組織化することができる。例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよびオルニチントランスカルバミラーゼをコードする遺伝子をプロモーターおよびＡＲＧボックスを含む共有調節領域の制御下の単一オペロンａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦ（例えば、表２参照）に組織化する。大腸菌Ｋ１２およびニッスルにおいて、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼをコードする遺伝子を２つの２極性オペロンａｒｇＥＣＢＨに組織化する。アルギニン生合成に関与する酵素をコードするオペロンを染色体にわたる異なる遺伝子座に分配することができる。非改変細菌において、各オペロンは、ＡｒｇＲを介してアルギニンにより抑制することができる。いくつかの実施形態では、アルギニンおよび／または中間副産物の産生は、本発明の遺伝子操作細菌において、本明細書で示したアルギニン生合成オペロンによりコードされる酵素の発現を変化させることによって変化させることができる。各アルギニンオペロンは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し得る。さらに、任意のアルギニンオペロン、またはアルギニンオペロン内の遺伝子もしくは調節領域の複数のコピーは、細菌に存在し得るものであって、オペロンまたは遺伝子もしくは調節領域の１つもしくは複数のコピーは、本明細書に記載の通り突然変異させるか、あるいは変更することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、コピー数を増加させるために同じ産物（例えば、オペロンまたは遺伝子もしくは調節領域）の複数のコピーを含むようにまたは複数の異なる機能を果たすオペロンの複数の異なる構成要素を含むように操作されている。
【００２８】
「ＡＲＧボックス共通配列」は、ＡＲＧボックス核酸配列を意味し、その核酸は、ａｒｇＲ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよび／またはｃａｒＢの調節領域のうちの１つまたは複数に高頻度で存在することが公知である。上述のように、各ａｒｇオペロンは、プロモーターと重複し、レプレッサータンパク質が結合しているＡＲＧボックスと呼ばれる少なくとも１つの１８ヌクレオチド不完全回文構造配列を含む調節領域を含む（Ｔｉａｎら、１９９２年）。ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列は、各オペロンごとに異なり得るものであり、共通ＡＲＧボックス配列は、Ａ／Ｔ  ｎＴＧＡＡＴ  Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ Ｔ／Ａ Ｔ／Ａ  ＡＴＴＣＡｎ  Ｔ／Ａである（Ｍａａｓ、１９９４年）。アルギニンリプレッサーは、１つまたは複数のＡＲＧボックスに結合して、当１つまたは複数のＡＲＧボックスに作動可能に連結したアルギニン生合成酵素（複数可）の転写を能動的に阻害する。
【００２９】
「突然変異アルギニンレギュロン」または「突然変異型アルギニンレギュロン」は、突然変異アルギニンレギュロンが、同じ条件下で同じ細菌亜型に由来する非改変レギュロンより多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生するように、アルギニン生合成経路における、グルタミン酸をアルギニンおよび／または中間副産物、例えば、シトルリンに変換することに関与する酵素をコードするオペロンのそれぞれのアルギニン媒介抑制を低減または消失させる１つまたは複数の核酸の突然変異を含むアルギニンレギュロンを指すために用いられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒならびにアルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、それにより、レギュロンを活性化し、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成を増強する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下もしくは不活性化し、または遺伝子操作細菌がアルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失し）、レギュロンの抑制解除ならびにアルギニンおよび／または中間副産物の生合成の増強がもたらされるように、１つもしくは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒ、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つもしくは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンおよび／または突然変異もしくは欠失アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒおよびアルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれに対する少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒおよびアルギニンリプレッサーの突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンおよび前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンおよび突然変異または欠失アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／またはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えてあるいはその代わりに）をコードするオペロンならびに前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。
【００３０】
ＡＲＧボックスは、各アルギニン生合成オペロンの調節領域におけるプロモーターと重複する。突然変異アルギニンレギュロンにおいては、１つまたは複数のアルギニン生合成オペロンの調節領域は、回文構造ＡＲＧボックス配列を破壊し、ＡｒｇＲ結合を低減するのに十分に突然変異しているが、天然オペロン特異的プロモーターとして認識されるのに、非突然変異調節領域のプロモーターとの十分に高い相同性を依然として含む。オペロンは、ＡＲＧボックスおよびオペロンの調節領域へのＡｒｇＲ結合が低減または消失するように少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける少なくとも１つの核酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化から保護される塩基およびＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカル攻撃から保護される塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である（例えば、表３参照）。突然変異調節領域のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが、作動可能に連結したアルギニン生合成酵素（複数可）の転写を促進するのに十分な親和性でそれに結合するように非突然変異調節領域のプロモーターとの十分に高い相同性を保持している。いくつかの実施形態では、突然変異体のプロモーターのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比は、野生型プロモーターのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比と１０％以下異なっている。
【００３１】
いくつかの実施形態では、複数のＡＲＧボックスが単一オペロンに存在し得る。これらの実施形態の一態様では、オペロンにおけるＡＲＧボックスのうちの少なくとも１つは、オペロンの調節領域へのＡｒｇＲ結合の必要な低減をもたらすように変更される。これらの実施形態の別の態様では、オペロンにおけるＡＲＧボックスのそれぞれは、オペロンの調節領域へのＡｒｇＲ結合の必要な低減をもたらすように変更される。
【００３２】
ＡｒｇＲ結合の「低減」は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボックスおよび調節領域へのリプレッサー結合と比較して、オペロンにおけるＡＲＧボックスへのリプレッサー結合の低減または前記オペロンの調節領域への全リプレッサー結合の低減を指すために用いる。いくつかの実施形態では、オペロンの突然変異ＡＲＧボックスおよび調節領域へのＡｒｇＲ結合は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボックスおよび調節領域へのＡｒｇＲ結合より少なくとも約５０％低い、少なくとも約６０％低い、少なくとも約７０％低い、少なくとも約８０％低い、少なくとも約９０％低い、または少なくとも約９５％低い。いくつかの実施形態では、突然変異ＡＲＧボックスおよび調節領域へのＡｒｇＲ結合の低減は、オペロンにおける１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍の増加をもたらす。
【００３３】
「ＡｒｇＲ」または「アルギニンリプレッサー」は、アルギニンレギュロンにおけるアルギニン生合成遺伝子の転写を調節することによりアルギニン生合成を抑制することができるタンパク質を指すために用いられる。アルギニンリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（「ａｒｇＲ」）の発現が野生型細菌において増加する場合、アルギニン生合成が減少する。ａｒｇＲの発現が野生型細菌において減少する場合、またはａｒｇＲが欠失しているかもしくはアルギニンリプレッサー機能を不活性化するように突然変異している場合、アルギニン生合成が増加する。
【００３４】
「機能し得るＡｒｇＲを欠く」細菌および「ＡｒｇＲ欠失細菌」は、各アルギニンリプレッサーが、同じ条件下の同じ亜型の細菌の非改変アルギニンリプレッサーと比較して活性を著しく低下または消失した細菌を指すために用いられる。アルギニンリプレッサー活性の低下または消失は、例えば、アルギニン生合成遺伝子の転写の増加ならびに／またはアルギニンおよび／もしくは中間副産物、例えば、シトルリンの濃度の増加をもたらし得る。アルギニンリプレッサー活性が低下または消失している細菌は、細菌ａｒｇＲ遺伝子を改変することによりまたはａｒｇＲ遺伝子の転写を改変することにより作製することができる。例えば、染色体ａｒｇＲ遺伝子を欠失させることができ、突然変異させることができ、またはａｒｇＲ遺伝子を野生型リプレッサー活性を示さないａｒｇＲ遺伝子で置換することができる。
【００３５】
「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現が例えば、シスで作動することを可能にする形で調節領域配列に連結している核酸配列、例えば、フィードバック抵抗性ＡｒｇＡをコードする遺伝子に当てはまる。調節領域は、目的の遺伝子の転写を導くことができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列ならびにイントロンを含むことができる。「誘導性プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結している調節領域を意味し、遺伝子の発現が前記調節領域のインデューサーの存在下で増加する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、低酸素、微好気性または嫌気的条件により誘導される酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、分子もしくは代謝物、例えば、組織特異的分子もしくは代謝物または肝損傷を示す分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、代謝物は、腸特異的であり得る。いくつかの実施形態では、代謝物は、肝性脳症に関連付けることができ、例えば、ビリルビンであり得る。分子もしくは代謝物の非限定的な例は、それらの血液および腸における例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンを含む。これらの分子またはそれらの代謝物のうちの１つに応答するプロモーターを本明細書で示した遺伝子操作細菌に用いることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。
【００３６】
「外因性環境条件（複数可）」は、本明細書に記載のプロモーターが誘導される状況（複数可）または環境（複数可）を意味する。「外因性環境条件」という語句は、操作された微生物にとっては外部であるが、宿主対象の環境にとっては内因性または天然の環境条件を意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、同義で用いて、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、完全な微生物細胞に対しては外部または外因性である環境条件を意味することができる。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の上部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の下部胃腸管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の小腸に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、健常または疾患状態（例えば、ＨＥ）の哺乳動物の消化管に固有である分子もしくは代謝物の存在を意味する。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境のような、低酸素、微好気的または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有である分子もしくは代謝物、例えば、プロピオネートである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織に固有または疾患に固有の代謝物もしくは分子（複数可）である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルにより誘発され、異なる速度論で発生し得る。
【００３７】
「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流遺伝子発現を活性化する。
【００３８】
酸素レベル依存性転写因子の例は、ＦＮＲ、ＡＮＲおよびＤＮＲを含むが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターは、当技術分野で公知であり（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００３年参照）、非限定的な例を表１に示す。
【００３９】
非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、低または無環境酸素の条件下で高度に発現することが公知である大腸菌ニッスルフマル酸・硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来していた（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、ニッスルに天然で見いだされるグローバルな転写調節因子ＦＮＲにより嫌気的条件下で活性化される。嫌気的条件下では、ＦＮＲは、二量体を形成し、その制御下の特定の遺伝子のプロモーターにおける特定の配列に結合し、それにより、それらの発現を活性化する。しかし、好気的条件下では、酸素がＦＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形に変換する。このようにして、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本願書においてＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびＰｆｎｒＳプロモーターを示すための他のそのような関連する記号表示と同義で用いる。
【００４０】
【表１】
2018523978.tif 000003
【００４１】
「消化管バリア機能増強分子」は、短鎖脂肪酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、エラフィン（ペプチダーゼ阻害剤３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ２、キヌレン酸およびキヌレニンを含むが、これらに限定されない。消化管バリア機能増強分子は、単一遺伝子によりコードされ得る。例えば、エラフィンは、ＰＩ３遺伝子によりコードされる。あるいは、例えば、酪酸などの、消化管バリア機能増強分子は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路により合成することができる。これらの分子は、治療用分子と呼ぶこともできる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、生合成経路をコードする「遺伝子カセット」または「オペロン」は、消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸、プロピオン酸を産生するために必要な２つまたはそれ以上の遺伝子を意味する。前記分子を産生することができる一組の遺伝子をコードすることに加えて、遺伝子カセットまたはオペロンは、さらなる転写および翻訳エレメント、例えば、リボソーム結合部位も含み得る。
【００４３】
「酪酸生成遺伝子カセット」、「酪酸生合成遺伝子カセット」および「酪酸オペロン」は、同義で用いて、酪酸を生合成経路で生成することができる一組の遺伝子を意味する。内因性酪酸生合成経路を介して酪酸を産生することができる非改変細菌は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペプトクロストリジウム属（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ユウバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）を含むが、これらに限定されず、これらの内因性酪酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酪酸生合成遺伝子、あるいは細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来する酪酸生合成遺伝子の組合せを含み得る。酪酸生成遺伝子カセットは、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル（Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）とも呼ばれる）に由来する酪酸産生経路の８つの遺伝子：それぞれブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼサブユニット、電子伝達フラビンタンパク質サブユニットベータ、電子伝達フラビンタンパク質サブユニットアルファ、アセチルＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼおよび酪酸キナーゼをコードするｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含み得る（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３年）。酪酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換または改変することができる。ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０菌株および１２９６菌株は、両方が酪酸を産生することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。酪酸生成遺伝子カセットは、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０菌株に由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３およびｔｈｉＡ１ならびにペプトクロストリジウム・ディフィシル１２９６菌株に由来するｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含み得る。あるいは、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）に由来する単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノイルＣｏＡレダクターゼをコードする）は、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３遺伝子の３つすべてを機能的に置換することができる。したがって、酪酸生成遺伝子カセットは、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋならびにトレポネーマ・デンティコラに由来するｔｅｒを含み得る。酪酸生成遺伝子カセットは、酪酸の好気的生合成の遺伝子および／または酪酸の嫌気的もしくは微好気的生合成の遺伝子を含み得る。
【００４４】
同様に、「プロピオン酸遺伝子カセット」または「プロピオン酸オペロン」は、プロピオン酸を生合成経路で生成することができる一組の遺伝子を意味する。内因性プロピオン酸生合成経路を介してプロピオン酸を産生することができる非改変細菌は、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、メガスフェラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）およびプレボテラ・ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）を含むが、これらに限定されず、これらの内因性プロピオン酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するプロピオン酸生合成遺伝子、あるいは細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来するプロピオン酸生合成遺伝子の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、プロピオン酸遺伝子カセットは、アクリル酸経路プロピオン酸生合成遺伝子、例えば、それぞれプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼＡ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼＢ、ラクトイルＣｏＡデヒドラターゼＣ、電子伝達フラビンタンパク質サブユニットＡ、アクリロイルＣｏＡレダクターゼＢおよびアクリロイルＣｏＡレダクターゼＣをコードするｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣを含む（Ｈｅｔｚｅｌら、２００３年、Ｓｅｌｍｅｒら、２００２年）。代替実施形態では、プロピオン酸遺伝子カセットは、ピルビン酸経路プロピオン酸生合成遺伝子（例えば、ＴｓｅｎｇおよびＰｒａｔｈｅｒ、２０１２年参照）、例えば、それぞれホモセリンデヒドロゲナーゼ１、ホモセリンキナーゼ、Ｌ−トレオニンシンターゼ、Ｌ−トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼおよびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードするｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを含む。いくつかの実施形態では、プロピオン酸遺伝子カセットは、アシルＣｏＡチオエステラーゼをコードするｔｅｓＢをさらに含む。プロピオン酸遺伝子カセットは、プロピオン酸の好気的生合成の遺伝子および／またはプロピオン酸の嫌気的もしくは微好気的生合成の遺伝子を含み得る。プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換または改変する、例えば、コドンを最適化することができる。
【００４５】
「酢酸遺伝子カセット」または「酢酸オペロン」は、酢酸を生合成経路で生成することができる一組の遺伝子を意味する。細菌は、セルロース、リグニンおよび無機気体などの様々な基質を含む、「多くの炭素およびエネルギー源から酢酸を合成し」、当技術分野で公知である、種々の生合成機序および遺伝子を利用する（Ｒａｇｓｄａｌｅら、２００８年）。内因性酢酸生合成経路を介して酢酸を産生することができる非改変細菌は、本発明の遺伝子操作細菌の酢酸生合成遺伝子の起源であり得る。本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子、あるいは細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子の組合せを含み得る。大腸菌は、好気的増殖中にグルコースおよび酸素を消費して、酢酸および二酸化炭素を産生することができる（Ｋｌｅｍａｎら、１９９４年）。アセチトマクラム属（Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、アセトアナエロビウム属（Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）、アセトハロビウム属（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ）、アセトネマ属（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ）、バルチア属（Ｂａｌｕｔｉａ）、ブチリバクテリウム属（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属、ムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オキソバクター属（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ）、スポロムサ属（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ）およびサーモアセトゲニウム属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ）などの、いくつかの細菌は、例えば、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を用いて、ＣＯまたはＣＯ２＋Ｈ２を酢酸に変換することができる酢酸生成嫌気性菌である（Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、２０１２年）。様々な細菌種のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路における遺伝子は、当技術分野で公知である。酢酸遺伝子カセットは、酢酸の好気的生合成の遺伝子および／または酢酸の嫌気的もしくは微好気的生合成の遺伝子を含み得る。酢酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換または改変することができる。
【００４６】
「ＧＡＢＡ」および「γ−アミノ酪酸」は、哺乳動物中枢神経系における主要な抑制性神経伝達物質（Ｃ４Ｈ９ＮＯ２）を指すために用いられる。ヒトにおいては、ＧＡＢＡは、筋緊張の調節にも直接的に関与する。ＧＡＢＡは、リガンド開口型イオンチャンネル複合体の一部である、ＧＡＢＡＡ受容体、ならびにＧＡＢＡＢ代謝調節型Ｇタンパク質共役受容体を活性化することができる。ＧＡＢＡを産生するニューロンは、「ＧＡＢＡ作動性」ニューロンとして公知であり、ＧＡＢＡ受容体の活性化は、ＧＡＢＡ作動性トーンと表現される（すなわち、ＧＡＢＡ受容体の活性化の増大は、ＧＡＢＡ作動性トーンの増大を意味する）。
【００４７】
「ＧＡＢＡ輸送体」および「ＧａｂＰ」は、ＧＡＢＡを細菌細胞内に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために用いられる（例えば、Ｌｉら、２００１年参照）。大腸菌では、ｇａｂＰ遺伝子は、ＧＡＢＡの輸送に関与する高親和性ＧＡＢＡパーミアーゼをコードする（Ｌｉら、２００１年）。いくつかの実施形態では、ＧＡＢＡ輸送体は、枯草菌および大腸菌を含むが、これらに限定されない、細菌種に由来するｇａｂＰ遺伝子によりコードされる。これらの内因性ＧＡＢＡ輸送体遺伝子は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。ＧＡＢＡ輸送体をコードする任意の適切な遺伝子（複数可）を用いることができる。
【００４８】
「マンガン」は、記号「Ｍｎ」および原子番号２５を有する化学元素を意味する。生体系においては、マンガンは、必須微量金属であり、酵素媒介性触媒作用に重要な役割を果たすが、有害な作用も有し得る。細胞は、毒性を避けるためにマンガンを厳格な恒常性制御下に維持する。高アンモニア血症に関連するいくつかの障害は、マンガンのレベルの上昇を特徴とすることもあり得るものであり、マンガンは、疾患病因（例えば、肝性脳症）に寄与し得るものである（Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。
【００４９】
「マンガン輸送体」および「ＭｎｔＨ」は、マンガンを細菌細胞内に輸送することができる膜輸送タンパク質を指す（例えば、ＪｅｎｓｅｎおよびＪｅｎｓｅｎ、２０１４年参照）。大腸菌では、ｍｎｔＨ遺伝子は、マンガンの輸送に関与するプロトン刺激性２価金属陽イオン取込み系をコードする（Ｐｏｒｃｈｅｒｏｎら、２０１３年）。いくつかの実施形態では、マンガン輸送体は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）および大腸菌を含むが、これらに限定されない、細菌種に由来するｍｎｔＨ遺伝子によりコードされる。これらの内因性マンガン輸送体遺伝子は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。マンガン輸送体をコードする任意の適切な遺伝子（複数可）を用いることができる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「非天然」核酸配列は、通常細菌に存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の余剰のコピー、あるいは細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する配列などの異種配列、あるいは同じ亜型の細菌に由来する非改変配列と比較して改変され、かつ／または突然変異した配列を意味する。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は、合成非天然型配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年参照）。非天然核酸配列は、遺伝子カセットにおける調節領域、プロモーター、遺伝子および／または１つもしくは複数の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」は、天然で互いに同じ関係性が見いだされない２つまたはそれ以上の核酸配列を意味する。非天然核酸配列、例えば、遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、天然において前記遺伝子カセットと関連していない誘導性プロモーター、例えば、酪酸生成遺伝子カセットまたはアルギニン産生カセットに作動可能に連結したＦＮＲ応答性プロモーターに直接的または間接的に作動可能に連結している遺伝子カセットを含む。さらに、遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の複数のコピーが細菌に存在し、１つもしくは複数のコピーは、本明細書に記載の通り突然変異させるか、あるいは変更することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、コピー数を増大させるまたは複数の異なる機能を果たす遺伝子カセットの複数の異なる構成要素を構成するために、同じ非天然核酸配列、例えば、遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の複数のコピーを含むように操作されている。
【００５１】
「構成的プロモーター」は、その制御下の、かつ／またはそれが作動可能に連結したコード配列もしくは遺伝子の連続的転写を駆動することができるプロモーターを意味する。構成的プロモーターおよび変異体は、当技術分野で周知であり、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｓ  Ｎａｍｅ  ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；  ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧ熱ショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；  ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０）、構成的枯草菌σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３）、構成的枯草菌σＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サルモネラ属に由来するＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ属に由来するＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、バクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））およびそれらの機能的断片を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用する場合、アルギニンまたは中間副産物、例えば、シトルリンを「過剰産生する」遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含む細菌を指す。例えば、操作細菌は、ＡｒｇＡのフィードバック抵抗形を含み得るものであり、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡが発現する場合、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生することができる。遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを代わるべきものとしてまたはさらに含み得る。遺伝子操作細菌は、突然変異もしくは欠失アルギニンリプレッサーを代わるべきものとしてまたはさらに含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のアルギニンを産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のシトルリンまたは他の中間副産物を産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌におけるアルギニン生合成遺伝子のうちの１つまたは複数のｍＲＮＡ転写物レベルは、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌におけるｍＲＮＡ転写物レベルの少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍である。特定の実施形態では、非改変細菌は、検出可能なレベルのアルギニン、中間副産物、および／またはそのようなオペロンにおける遺伝子（複数可）の転写を有さない。しかし、タンパク質ならびに／またはアルギニンおよび／もしくは中間副産物の転写レベルは、突然変異アルギニンレギュロンを有する対応する遺伝子操作細菌において検出可能である。転写レベルは、遺伝子のｍＲＮＡレベルを直接測定することによって検出することができる。アルギニンおよび／または中間副産物レベル、ならびにアルギニン生合成遺伝子から発現する転写物のレベルを測定する方法は、当技術分野で公知である。アルギニンおよびシトルリンは、例えば、質量分析により測定することができる。
【００５３】
「消化管」は、食物の輸送および消化、栄養素の吸収、ならびに廃物の排泄に関与する器官、腺、路および系を意味する。ヒトにおいては、消化管は、口から始まり、肛門で終わり、食道、胃、小腸および大腸をさらに含む、胃腸管を含む。消化管は、脾臓、肝臓、胆嚢および膵臓などの、付属器官および腺も含む。上部胃腸管は、食道、胃および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、ならびに大腸のすべて、すなわち、盲腸、結腸、直腸および肛門管を含む。細菌は、消化管を通して、例えば、胃腸管、とりわけ腸に見いだすことができる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば、核酸配列を意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子配列（ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子配列（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝子配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列または他の非タンパク質コード配列を含むことも意味する。
【００５５】
「微生物」は、一般的に単細胞からなる顕微鏡的、超顕微鏡的または極超微鏡的サイズの生物または微小生物を意味する。微生物の例は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類および原虫を含む。いくつかの態様では、微生物は、１つまたは複数の治療用分子を生産するように操作される（「操作微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境、例えば、消化管からの特定の有毒な代謝物、基質または他の化合物を移入し、かつ／または異化するように操作される。特定の態様では、微生物は、有益な代謝物、分子または他の化合物（合成もしくは天然）を合成し、それらをその環境中に放出するように操作される。特定の実施形態では、操作微生物は、操作細菌である。特定の実施形態では、操作微生物は、操作ウイルスである。
【００５６】
「非病原性細菌」は、宿主における疾患または有害な反応を引き起こす能力がない細菌を意味する。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、共生細菌である。非病原性細菌の例は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、大腸菌、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ズブチリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。天然で病原性の細菌を遺伝子操作して、病原性の低下または消失をもたらすことができる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「ペイロード」は、細菌またはウイルスなどの、遺伝子操作微生物により産生される目的の１つもしくは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、遺伝子もしくは複数の遺伝子またはオペロンによりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードを含む１つもしくは複数の遺伝子および／またはオペロンは、微生物に対して内因性である。いくつかの実施形態では、ペイロードの１つもしくは複数のエレメントは、異なる微生物および／または生物に由来する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の生合成のための遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の代謝、異化または分解のための遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の移入のための遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の輸出のための遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節分子（複数可）、例えば、ＦＮＲのような転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーのような、調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ペイロードは、ＦＮＲＳのような、誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、キルスイッチのような、リプレッサーエレメントを含む。代替実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により生成されるものであって、生合成または生化学的経路は、任意選択で微生物に対して内因性であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作微生物は、２つまたはそれ以上のペイロードを含む。ペイロード（複数可）の非限定的な例は、（１）ＡｒｇＡｆｂｒ、（２）突然変異Ａｒｇボックス、（３）突然変異ＡｒｇＲ、（４）突然変異ＡｒｇＧ、（５）酪酸生合成カセット、（６）プロピオン酸生合成カセット、（７）酢酸生合成カセット、（８）ＧＡＢＡ代謝カセット、（９）ＧＡＢＡ輸送体、（１０）Ｍｎ輸送体のうちの１つまたは複数を含む。他の例示的ペイロードは、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、エラフィン（ペプチダーゼ阻害剤３またはＳＫＡＬＰとしても公知）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ２、キヌレン酸およびキヌレニンを含む。他の例示的ペイロードは、栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性をもたらす突然変異配列（複数可）、キルスイッチ回路、抗生物質耐性回路、生体分子または基質を移入するための輸送体配列、分泌回路を含む。
【００５８】
「プロバイオティク」は、適切な量の微生物を含む宿主生物に健康上の恩恵をもたらし得る、生存している非病原性微生物、例えば、細菌を指すために用いられる。いくつかの実施形態では、宿主生物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、ヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、菌株および／または亜型は、現在プロバイオティク細菌と認識されている。プロバイオティク細菌の例は、ビフィドバクテリウム属、大腸菌、乳酸桿菌属およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エンテロコッカス・ファシウム、大腸菌ニッスル、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プランタルムおよびサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクは、細菌の変異または突然変異菌株であり得る（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原性細菌を遺伝子操作して、所望の生物学的特性、例えば、生存性を増強または改善することができる。非病原性細菌を遺伝子操作して、プロバイオティク特性を与えることができる。プロバイオティク細菌を遺伝子操作して、プロバイオティク特性を増強または改善することができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、
非天然遺伝物質が保持され、発現し、伝播するように、宿主ゲノムに組み込まれるまたは自己複製染色体外プラミド上に伝播する非天然遺伝物質、例えば、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子、突然変異アルギニンリプレッサーおよび／または他の突然変異アルギニンレギュロンを有する細菌宿主細胞を指すために用いられる。安定な細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、例えば、培地中での、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの、例えば、消化管中での生存および／または増殖の能力がある。例えば、安定な細菌は、ａｒｇＡｆｂｒを細菌において発現させることができ、細菌がｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生存し、かつ／または増殖することができるように、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を有するプラスミドまたは染色体が細菌において安定に維持されている、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を含む遺伝子操作細菌であり得る。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「モジュレートする」および「治療する」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害および／または状態、あるいはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、患者によって必ずしも認識できない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、疾患、障害および／または状態の進行を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、抑制することを意味する。他の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」は、疾患、障害および／または状態の進行を遅くすることまたは進行を逆転することを意味する。本明細書で使用する場合、「妨げる」およびその同語源語は、所定の疾患、障害および／または状態あるいはそのような疾患、障害および／または状態に関連する症状の発生を遅延させることまたはかかるリスクを低下させることを意味する。
【００６１】
治療を必要とする人は、特定の医学的障害を既に有する人、障害を有するリスクがある、または最終的に障害にかかる可能性がある人を含み得る。治療の必要性は、例えば、障害の発生に関連する１つもしくは複数のリスクファクターの存在、障害の進行もしくは存在、または障害を有する対象の治療に対する生じ得る受容によって評価される。原発性高アンモニア血症は、公知の治療法が存在しない常染色体劣性またはＸ連鎖先天性代謝異常である、ＵＣＤによって引き起こされる。高アンモニア血症は、尿素回路の他の破壊、例えば、有毒代謝物、感染および／または基質欠損に二次的でもあり得る。高アンモニア血症は、他の病的状態にも寄与し得る。例えば、ハンチントン病は、公知の治療法が存在しない常染色体優性障害である。高アンモニア血症、高血中シトルリンおよび尿素回路酵素の抑制を特徴とする尿素回路異常は、公知の治療法が存在しない常染色体優性障害である、ハンチントン病の病状に寄与し得る。高アンモニア血症の治療は、過剰のアンモニアおよび／または随伴症状を低減または除去することを含み得るものであり、潜在する高アンモニア血症に関連する障害の除去を必ずしも含まない。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、本発明の遺伝子操作細菌と生理学的に適切な担体および／または賦形剤のような他の成分との製剤を意味する。
【００６３】
同義で用いることができる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対する著しい刺激を引き起こさず、投与された細菌化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を意味する。アジュバントは、これらの語句のもとに含まれる。
【００６４】
「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を意味する。例は、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコールならびに例えば、ポリソルベート２０を含む、界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発生の予防、遅延、または状態、例えば、高アンモニア血症の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために用いられる。治療有効量は、例えば、アンモニア濃度の上昇に関連する障害の１つもしくは複数の症状を治療する、防止する、重症度を低下させる、発症を遅延させる、かつ／または発生のリスクを低下させるのに十分であり得る。治療有効量、ならびに治療有効投与頻度は、当技術分野で公知であり、下文で述べる方法により決定することができる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」ならびに「（複数の）ポリペプチド」を含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）により直線状に連結したアミノ酸単量体から構成される分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つもしくはそれ以上のアミノ酸の１つもしくは複数の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはそれらと同義で用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断または非天然アミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得ることができ、または組換え技術により生成することができる。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作細菌またはウイルスにより産生される。本発明のポリペプチドは、約３もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、１０もしくはそれ以上、２０もしくはそれ以上、２５もしくはそれ以上、５０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以上、２００もしくはそれ以上、５００もしくはそれ以上、１０００もしくはそれ以上、または２０００もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有さないが、定義された３次元構造を有し得る。定義された３次元構造を有するポリペプチドは、折りたたみと呼ばれ、定義された３次元構造を有さずに、多数の異なる立体配座をとり得るポリペプチドは、変性と呼ばれる。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を意味し、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列および他のペプチド配列から選択される配列と一致するアミノ酸配列を意味し得る。
【００６７】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は、要求されない。細菌または哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない宿主細胞において発現した組換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと見なされる。
組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物により形質転換した、細胞、微生物または哺乳動物から産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。大部分の細菌培養において発現するタンパク質またはペプチドは、一般的にグリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変異体、およびそれらのいずれかの組合せもポリペプチドとして含まれる。「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」という用語は、最初のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する最初のポリペプチドの少なくとも１つまたは複数の特性を保持している、任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解性断片ならびに欠失断片を含む。断片は、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異抗体または生物活性断片もしくは免疫学的に活性な断片も含む。変異体は、天然型または非天然型であり得る。非天然型変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発法を用いて生成することができる。変異型ポリペプチドは、同類もしくは非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００６８】
ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、最初のペプチドのまたは最初のペプチドと十分に類似した配列を含む、融合タンパク質を含む。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、２つまたはそれ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を意味する。一般的に、融合タンパク質は、周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術により得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の成分である個別の最初のタンパク質と類似の構造的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または類似の調節機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または類似の生化学的機能（ただし必ずしも同じ程度でない）および／または免疫学的活性（ただし必ずしも同じ程度でない）を有し得る。「誘導体」は、２０種の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含む、ペプチドを含むが、これに限定されない。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。それが同一または同類アミノ酸置換である場合、１つのペプチドのアミノ酸は、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。同類置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ  Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９７８年）およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものを含む。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保守的変化または置換を示す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「十分に類似している」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように第２のアミノ酸配列と比べて十分なまたは最小限の数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書で十分に類似していると定義される。好ましくは、変異体は、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。そのような変異体は、一般的に本発明のペプチドの機能活性を保持している。変異体は、１つもしくは複数のアミノ酸欠失、付加および／または置換により、それぞれ天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列が異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体ならびに人工的に設計されたものであり得る。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を結合または連結する、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは非天然型アミノ酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を意味する。例示的リンカーは、本明細書に記載されている。さらなる例示的リンカーは、その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に記載されている。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「コドン最適化配列」という用語は、例えば、コード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するために、またはコード配列の転写を改善するために、既存のコード配列から改変された、または設計された配列を意味する。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン選択に適合するコード配列のコドンを選択することを含む過程を含むが、これに限定されない。
【００７２】
多くの生物は、成長しつつあるポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用についてバイアスまたは選択を示す。コドン選択またはコドンバイアスは、生物間のコドン使用の差であり、遺伝コードの縮重によって可能になるものであり、多くの生物で十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率としばしば相関しており、これがひいては、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選択されるｔＲＮＡｓが優位であることは、一般的にペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映するものである。したがって、コドン最適化に基づいて所定の生物における最適の遺伝子発現を得るために遺伝子を調整することができる。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「分泌システム」または「分泌タンパク質」という用語は、微生物、例えば、細菌細胞質から目的のタンパク質または治療用タンパク質を分泌または輸出することができる天然または非天然分泌機構を意味する。分泌システムは、単一タンパク質を含み、または複合体、例えば、ＨｌｙＢＤに集合する２つまたはそれ以上のタンパク質を含み得る。グラム陰性細菌の分泌システムの非限定的な例は、改変ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、ヘモリシン分泌システム）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌システム、レジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌システムを含む。グラム陽性細菌の分泌システムの非限定的な例は、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌システムを含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）は、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を特定の分泌システムに導くためのＲＮＡまたはペプチド起源の「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌システムは、操作細菌から目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌する前にこのタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃシステムにより「パッセンジャー」ペプチドの細胞質からペリプラズムコンパートメント内への転位時に除去される。さらに、自己分泌体が外膜を越えて転位したならば、Ｃ末端分泌タグを自己触媒またはプロテアーゼ触媒、例えば、ＯｍｐＴ切断によって除去し、それにより、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を細胞外環境中に放出することができる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「輸送体」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、毒素、代謝物、基質等を細胞外環境から微生物に移入するための機構、例えば、１つまたは複数のタンパク質を意味する。
【００７５】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で使用する場合、それに反することが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解すべきである。
【００７６】
「および／または」という語句は、リストにおける要素の間に用いられる場合、（１）１つの列挙された要素のみが存在すること、または（２）リストの複数の要素が存在することを意味するものとする。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、選択がＡのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、ＢおよびＣであり得ることを示している。「および／または」という語句は、リストにおける要素「のうちの少なくとも１つ」または「のうちの１つもしくは複数」と同義で用いることができる。
【００７７】
細菌
本明細書で開示する遺伝子操作細菌は、過剰のアンモニアを減少させ、アンモニアおよび／または窒素を代替副産物に変換することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、天然で非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロバイオティク細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、病原性を低下または消失させるように改変または突然変異させた天然で病原性の細菌である。例示的細菌は、バシラス属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、クロストリジウム属、腸球菌属、大腸菌、乳酸桿菌属、乳酸球菌属、サッカロミセス属およびスタフィロコッカス属、例えば、バシラス・コアグランス、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・ファシウム、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・ブルガリクス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティスおよびサッカロミセス・ブラウディを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ズブチリス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌ニッスル、ラクトバシラス・アシドフィラス、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・ロイテリおよびラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、最も十分に特徴付けられたプロビオティクの１つに進化した腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のグラム陰性細菌である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）、大腸菌ニッスル１９１７株である。該菌株は、その完全な無害（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）を特徴とし、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認識された（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ））状態（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、強調は著者による）を有する。ゲノム配列決定により、大腸菌ニッスルが顕著な毒性因子（例えば、大腸菌α−ヘモリシン、Ｐ線毛アドヘシン）を欠いていることが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ，  ２００８）。さらに、大腸菌ニッスルが病原性接着因子を有さず、腸毒素または細胞毒素を産生せず、侵襲性でなく、尿路病原性でないことが示された（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。１９１７年という早期に、大腸菌ニッスルが治療用のＭｕｔａｆｌｏｒと呼ばれた医薬カプセルに包装された。大腸菌ニッスルは、それ以来、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトにおける潰瘍性大腸炎を治療するために（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎら、１９９９年）、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトにおける炎症性腸疾患、クローン病および回腸嚢炎を治療するために（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで腸管侵襲性サルモネラ属、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）を抑制するために（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒら、２００４年）用いられている。大腸菌ニッスルの治療有効性および安全性が説得力をもって立証された（Ｕｋｅｎａら、２００７年）ことは、一般的に受け入れられている。
【００７９】
当業者は、本明細書で開示した遺伝子改変は、修正し、細菌の他の種、菌株および亜型に適応することができることを十分に理解するであろう。例えば、アルギニン媒介調節は、非常に多様な細菌、すなわち、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サーモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）およびモンテラ・プロファンダ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｐｒｏｆｕｎｄａ）などのグラム陰性菌ならびに枯草菌、ゲオバシラス・ステアサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびストレプトミセズ・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）などのグラム陽性菌ならびに他の細菌において著しく十分に保存されていることが公知である（Ｎｉｃｏｌｏｆｆ、２００４年）。さらに、アルギニンリプレッサーは、細菌ゲノムにおいて普遍的に保存されており、弱い回文構造である、その認識シグナル（ＡＲＧボックス）もゲノム間に保存されている（Ｍａｋａｒｏｖａら、２００１年）。
【００８０】
非改変大腸菌ニッスルおよび本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、消化管または血清中の防御因子により破壊することができる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌の滞留時間は、本明細書に記載の方法を用いて決定することができる。いくつかの実施形態では、滞留時間をヒト対象について計算する。野生型ＡｒｇＲおよび野生型アルギニン調節を含むストレプトマイシン耐性大腸菌ニッスルを用いる非限定的な例を本明細書で示す。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間を本発明の遺伝子操作細菌について計算する。
【００８１】
過剰なアンモニアの低減
アルギニン生合成経路
大腸菌などの細菌において、アルギニン生合成経路は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸リン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、およびアルギニノコハク酸リアーゼを含む８ステップ酵素過程においてグルタミンをアルギニンに変換することができる（Ｃｕｎｉｎら、１９８６年）。最初の５ステップは、オルニチン前駆体を得るためのＮ−アセチル化を含む。第６のステップにおいて、オルニチントランスカルバミラーゼ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼとしても公知である）がシトルリンの形成を触媒する。最後の２ステップは、シトルリンからアルギニンを得るためのカルバモイルリン酸の利用を含む。
【００８２】
いくつかの細菌、例えば、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）において、アルギニン生合成における第１および第５ステップは、二機能性酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼにより触媒され得る。オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）が大腸菌におけるＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡ）およびＮ−アセチルオルニチナーゼ（ａｒｇＥ）栄養要求性遺伝子突然変異の両方を補完することが示された場合、この二機能性が最初に特定された（Ｍｏｕｎｔａｉｎら、１９８４年；Ｃｒａｂｅｅｌら、１９９７年）。
【００８３】
ａｒｇＡは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードし、ａｒｇＢは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードし、ａｒｇＣは、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードし、ａｒｇＤは、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードし、ａｒｇＥは、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードし、ａｒｇＦは、オルニチントランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＩもオルニチントランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＧは、アルギノコハク酸シンターゼをコードし、ａｒｇＨは、アルギノコハク酸リアーゼをコードし、ａｒｇＪは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする。ｃａｒＡは、グルタミナーゼ活性を有するカルバモイルリン酸シンターゼの小Ａサブユニットをコードし、ｃａｒＢは、アンモニアからのカルバモイルリン酸の合成を触媒するカルバモイルリン酸シンターゼの大Ｂサブユニットをコードする。これらのアルギニン生合成遺伝子（すなわち、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢ）のうちの１つまたは複数の異なる組合せを天然でまたは合成により、１つまたは複数のオペロンに組織化することができ、そのような組織化は、細菌の種、菌株および亜型間で異なり得る（例えば、表２参照）。各オペロンの調節領域は、少なくとも１つのＡＲＧボックスを含み、調節領域当たりのＡＲＧボックスの数は、オペロンおよび細菌間で異なり得る。
【００８４】
これらの酵素をコードする遺伝子のすべてをＡｒｇＲとのその相互作用を介してアルギニンによる抑制にかけて、各遺伝子の調節領域に結合し、転写を抑制する複合体を形成する。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼもアルギニンのみによるタンパク質レベルでのアロステリックフィードバック阻害にかける（Ｔｕｃｈｍａｎら、１９９７年；Ｃａｌｄａｒａら、２００６年；  Ｃａｌｄａｒａら、２００８年；Ｃａｌｄｏｖｉｃら、２０１０年）。
【００８５】
細菌におけるアルギニン生合成を調節する遺伝子は、染色体にわたって散在しており、単一リプレッサーにより制御される複数のオペロンに組織化され、これは、ＭａａｓおよびＣｌａｒｋ（１９６４年）により「レギュロン」と名付けられた。各オペロンは、プロモーターと重複し、リプレッサータンパク質が結合しているＡＲＧボックスと呼ばれる、少なくとも１つの１８ヌクレオチドの不完全回文構造配列を含む調節領域により調節される（Ｔｉａｎら、１９９２年；Ｔｉａｎら、１９９４年）。ａｒｇＲ遺伝子は、１つまたは複数のＡＲＧボックスに結合している、リプレッサータンパク質をコードする（Ｌｉｍら、１９８７年）。アルギニンは、アルギニンリプレッサーを活性化する共リプレッサーとして機能する。各オペロンを調節するＡＲＧボックスは、同一でないことがあり、共通ＡＲＧボックス配列は、Ａ／ＴｎＴＧＡＡＴＡ／ＴＡ／ＴＴ／ＡＴ／ＡＡＴＴＣＡｎＴ／Ａである（Ｍａａｓ、１９９４年）。さらに、ａｒｇＲの調節領域は、２つのプロモーターを含み、そのうちの１つは、２つのＡＲＧボックスと重複し、自己制御性である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含み、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物、例えば、シトロリンを産生する。突然変異アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成経路におけるグルタミン酸をアルギニンに変換することに関与する酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数の、ＡＲＧボックスへのＡｒｇＲの結合および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのアルギニンの結合を介した、アルギニン媒介抑制を低減または妨げ、それによりアルギニンおよび／または中間副産物の生合成を増大させる１つまたは複数の核酸突然変異を含む。
【００８７】
代替実施形態では、細菌を、他の代謝経路、例えば、ヒスチジン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グルタミン生合成経路およびトリプトファン生合成経路を介して過剰のアンモニアを消費するように遺伝子操作を施す。本明細書で使用する場合、「アンモニア変換回路」は、過剰のアンモニアを消費し、かつ／または減少させることができる代謝経路を意味する。
【００８８】
ヒスチジン生合成経路
ヒスチジン生合成は、例えば、大腸菌における単一オペロン内にある８つの遺伝子により行われる。該オペロンの８つの遺伝子のうちの３つ（ｈｉｓＤ、ｈｉｓＢおよびｈｉｓＩ）は、二機能性酵素をコードし、２つ（ｈｉｓＨおよびｈｉｓＦ）は、一緒に１つの酵素を形成して、合計１０酵素反応の１つのステップを触媒するポリペプチド鎖をコードする（Ａｌｉｆａｎｏら、１９９６年）。ｈｉｓＧ遺伝子の産物であるＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼは、ヒスチジンによりタンパク質レベルで阻害される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗性ｈｉｓＧを含む。細菌は、当技術分野で公知の技術を用いて突然変異を起こさせ、かつ／またはフィードバック抵抗性ｈｉｓＧ突然変異体についてスクリーニングすることができる。フィードバック抵抗性ｈｉｓＧを含むように操作された細菌は、ヒスチジンの産生のレベルの上昇を示し、ひいてはアンモニアの消費を増加させ、高アンモニア血を低下させることとなる。あるいは、ヒスチジン生合成に必要な１つまたは複数の遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、誘導性プロモーターの制御下におき、律速酵素の産生の増大を可能にし得る。ヒスチジン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。
【００８９】
メチオニン生合成経路
細菌のメチオニンレギュロンは、ホモセリンからのメチオニンの３ステップ合成（すなわち、アシル化、スルフリル化およびメチル化）を制御する。ｍｅｔＪ遺伝子は、メチオニンまたはその誘導体と結合した場合、メチオニンレギュロン内の遺伝子の転写レベルでの抑制をもたらす調節タンパク質をコードする（Ｓａｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓら、１９８４年；Ｓｈｏｅｍａｎら、１９８５年）。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ｍｅｔＪ遺伝子の欠失、破壊または突然変異を含む。ｍｅｔＪ遺伝子を欠失する、破壊または突然変異させるように操作された細菌は、メチオニンの産生のレベルの上昇を有し、ひいてはアンモニア消費を増加し、高アンモニア血を低下させる。メチオニン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。
【００９０】
リシン生合成経路
微生物は、２つの経路の１つによりリシンを合成する。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）経路を用いて、アスパラギン酸およびピルビン酸からリシンを合成し（Ｄｏｇｏｖｓｋｉら、２０１２年）、アミノアジピン酸経路を用いて、アルファ−ケトグルタル酸およびアセチル補酵素Ａからリシンを合成する。ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）は、ＤＡＰ経路の第１のステップを触媒し、リシンによるフィードバック阻害を受ける（Ｌｉｕら、２０１０年；Ｒｅｂｏｕｌら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗性ＤＨＤＰＳを含む。フィードバック抵抗性ＤＨＤＰＳを含むように操作された細菌は、ヒスチジン産生のレベルの上昇を示し、ひいてはアンモニア消費を増加し、高アンモニア血を低下させる。あるいは、リシン生合成に必要な１つまたは複数の遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、誘導性プロモーターの制御下におくことによって、リシンの産生を最適化することができる可能性がある。リシン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。
【００９１】
アスパラギン生合成経路
アスパラギンは、それぞれオキサロ酢酸トランスアミナーゼおよびアスパラギンシンテターゼ酵素によりオキサロ酢酸およびアスパラギン酸から直接合成する。この経路の第２のステップにおいて、Ｌ−グルタミンまたはアンモニアがアミノ基ドナーとしての役割を果たす。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較してアスパラギンを過剰産生し、それにより過剰のアンモニアを消費し、高アンモニア血を低下させる。あるいは、これらの遺伝子の１つまたは両方をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、誘導性プロモーターの制御下におくことによって、アスパラギン合成を最適化することができる。アスパラギン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。
【００９２】
グルタミン生合成経路
アンモニアおよびオキソグルタル酸からのグルタミンおよびグルタミン酸の合成は、３つの酵素により強固に調節される。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、オキソグルタル酸の還元的アミノ化を触媒して、単一ステップでグルタミン酸を生成させる。グルタミンシンテターゼは、グルタミン酸およびアンモニアのＡＴＰ依存性縮合を触媒して、グルタミンを形成させる（Ｌｏｄｅｉｒｏら、２００８年）。グルタミンシンテターゼはまた、サイクル反応においてグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸シンターゼとしても公知）とともに作用して、グルタミンおよびオキソグルタル酸からグルタミン酸を生成させる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較してグルタミンシンテターゼを高いレベルで発現する。グルタミンシンテターゼの発現の増大を示すように操作された細菌は、高いレベルのグルタミン産生を有し、ひいてはアンモニア消費を増加し、高アンモニア血を低下させる。あるいは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはグルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼの発現を改変して、アンモニア消費を促進することができる。グルタミンシンテターゼの産生が窒素により転写レベルで調節される（Ｆｅｎｇら、１９９２年；ｖａｎ  Ｈｅｅｓｗｉｊｋら、２０１３年）ので、グルタミンシンテターゼ遺伝子をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、異なる誘導性プロモーターの制御下において用いて、グルタミンの産生を改善することもできる。グルタミンおよびグルタミン酸生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。
【００９３】
トリプトファン生合成経路
大部分の細菌において、コリスミ酸前駆体からのトリプトファンの合成に必要な遺伝子は、単一転写単位、ｔｒｐオペロンとして組織化されている。ｔｒｐオペロンは、高レベルのトリプトファンが存在する場合に、トリプトファンリプレッサー（ＴｒｐＲ）により阻害される単一プロモーターの制御下にある。ｔｒｐオペロンの転写は、高レベルの荷電トリプトファンｔＲＮＡの存在下でも終結され得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ｔｒｐＲ遺伝子の欠失、破壊または突然変異を含む。ｔｒｐＲ遺伝子の欠失、破壊または突然変異、および結果として生じるＴｒｐＲ機能の不活性化は、トリプトファンの産生およびアンモニアの消費の両方のレベルの上昇をもたらし得る。あるいは、トリプトファン生合成に必要な１つまたは複数の酵素をＦＮＲ誘導性プロモーターなどの、誘導性プロモーターの制御下におくことができる可能性がある。トリプトファン生合成経路の任意の他の適切な改変（複数可）を用いて、アンモニアの消費を増加させることができる。
【００９４】
突然変異アルギニンレギュロンを含む操作細菌
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路を含み、過剰のアンモニアを減少させることができる。より具体的な態様では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素（複数可）をコードする１つまたは複数のオペロンが活性化されて、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンまたは中間副産物、例えば、シトルリンを産生する突然変異アルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンを過剰産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、シトルリンを過剰産生し、これは、さらに有益であり得る。その理由は、シトルリンが現在、特定の尿素回路異常症の治療薬として使用されているからである（国立尿素回路異常症財団）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、本明細書に記載の中間体のいずれかのような、アルギニン生合成経路における別の中間副産物を過剰産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのアルギニン、シトルリンおよび／または他の中間副産物を産生することによって過剰のアンモニアを消費する。尿素回路異常症および肝性脳症を含む、高アンモニア血症に関連する状態を治療するために、アルギニンおよび／または中間副産物生合成の増強を用いて、体内の過剰の窒素を非毒性分子に組み込むことができる。
【００９５】
当業者は、オペロン内のアルギニン生合成遺伝子の構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）が、細菌の種、菌株および亜型、例えば、大腸菌Ｋ１２株における二極ａｒｇＥＣＢＨ、枯草菌におけるａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦおよびＬ．プランタルム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における二極ｃａｒＡＢ−ａｒｇＣＪＢＤＦにわたって異なることを理解するであろう。種々の細菌のオペロン構成の非限定的な例を表２に示す（いくつかの例では、遺伝子は、推測であり、かつ／または大腸菌における公知の配列との配列相同性により同定されている；いくつかの例では、アルギニンレギュロンにおける遺伝子のすべてが公知かつ／または下に示されているとは限らない）。特定の例において、アルギニン生合成酵素は、細菌の種、菌株および亜型にわたって異なる。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
各オペロンは、前記オペロンにおけるアルギニン生合成遺伝子の抑制および発現を制御する、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む調節領域により調節される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路におけるグルタミン酸をアルギニンおよび／または中間副産物に変換することに関与する酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数のアルギニン媒介抑制を低減または消失させる１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。アルギニン媒介抑制を低減または消失させることは、ＡｒｇＲリプレッサー結合（例えば、アルギニンリプレッサーを突然変異させるもしくは欠失させることにより、またはアルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれに対する少なくとも１つのＡＲＧボックスを突然変異させることにより）、および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのアルギニンの結合（例えば、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを産生するためにＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを突然変異させることにより）を低減または消失させることによって達成することができる。
【００９９】
ＡＲＧボックス
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、それにより、レギュロンを活性化し、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成を増強する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下もしくは不活性化し、または遺伝子操作細菌がアルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失し）、レギュロンの抑制解除ならびにアルギニンおよび／または中間副産物の生合成の増強がもたらされるように、１つもしくは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒをさらに含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒ、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つもしくは複数の核酸突然変異を含む、突然変異アルギニンレギュロンおよび／または突然変異もしくは欠失アルギニンリプレッサーを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｇＲ結合が低減もしくは消失し、それにより、レギュロンを活性化し、アルギニンおよび／または中間副産物生合成を増強するように、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードし、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオペロンのＡＲＧボックスは、ＡｒｇＲに結合する能力を維持し、それにより、シトルリン生合成を駆動する。例えば、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオペロンの調節領域は、構成的であり、それにより、アルギニン生合成を駆動し得る。代替実施形態では、１つまたは複数の代替オペロンの調節領域は、構成的であり得る。しかし、特定の細菌において、複数の酵素をコードする遺伝子は、二極オペロンにまたは共有調節領域の制御のもとに組織化することができ、これらの場合、活性調節領域を構成的に操作するために調節領域をデコンボリュートする（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）必要があり得る。例えば、大腸菌Ｋ１２およびニッスルにおいて、ａｒｇＥおよび／またはａｒｇＣＢＨの構成的な型を得るために、ａｒｇＥおよびａｒｇＣＢＨを２つの二極オペロンに組織化し、ａｒｇＥＣＢＨおよびそれらの調節領域をデコンボリュートすることができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンにおけるすべてのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンにおけるすべてのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。いくつかの実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む各オペロンにおけるすべてのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする各オペロンにおけるすべてのＡＲＧボックスを突然変異させて、ＡｒｇＲ結合を低減または消失させる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｇＲ結合が低減もしくは消失し、それにより、レギュロンを活性化し、シトルリン生合成を増強するように、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、ＡｒｇＲ抑制性調節領域により駆動されるアルギニノコハク酸シンターゼをコードし、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび任意選択で、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンのそれぞれの各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。いくつかの実施形態では、シトルリンを産生することができる遺伝子操作細菌は、とりわけ好都合である。その理由は、シトルリンは、特定の尿素回路異常症の治療用の治療上有効な栄養補助食品としてさらに役割を果たすからである（国立尿素回路異常症財団）。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｇＲ結合が低減もしくは消失し、それにより、レギュロンを活性化し、アルギニン生合成を増強するように、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、構成的プロモーターにより駆動されるアルギニノコハク酸シンターゼをコードし、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび任意選択で、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンのそれぞれの各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンおよびフィードバック抵抗性ＡｒｇＡを含み、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡが発現する場合、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、突然変異アルギニンレギュロンおよび／またはフィードバック抵抗性ＡｒｇＡは、細菌染色体の１つもしくは複数の組込み部位に組み込むことができるかまたは１つもしくは複数のプラスミド上に存在していてもよい。
【０１０６】
アルギニンリプレッサー結合部位（ＡＲＧボックス）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンレギュロンが活性化され、アルギニンおよび／または中間副産物、例えば、シトルリンの生合成が増強されるように、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンをさらに含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするオペロンおよび前記オペロンの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。１つまたは複数の核酸突然変異は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボックスおよび調節領域へのＡｒｇＲの結合と比較して、当ＡＲＧボックスへのおよびオペロンの調節領域へのＡｒｇＲの結合が低減または消失するように、回文構造ＡＲＧボックス配列の破壊をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化およびヒドロキシルラジカル攻撃から保護される核酸は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、上述のアルギニン生合成酵素をコードするオペロンのそれぞれの１つまたは複数のＡＲＧボックスにおける少なくとも３つの核酸突然変異を含む。ＡＲＧボックスは、プロモーターと重複し、突然変異アルギニンレギュロンにおいて、突然変異プロモーター領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比は、野性型プロモーター領域のＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比と１０％以下異なる（表３）。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を駆動するのに十分な親和性で結合するように非突然変異プロモーターとの十分に高い相同性を保持している。
【０１０８】
大腸菌ニッスルにおける各アルギニン生合成オペロンのＡＲＧボックスを含む野生型ゲノム配列およびその突然変異体を表３に示す。例示的野生型配列については、ＡＲＧボックスを斜体で示し、各遺伝子の開始コドンは囲み線付きである。ＲＮＡポリメラーゼ結合部位は、下線付きである（Ｃｕｎｉｎ、１９８３年；Ｍａａｓ、１９９４年）。いくつかの実施形態では、下線付きの配列は、変化していない。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化から保護される塩基は網掛け付きであり、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカル攻撃から保護される塩基は太字である（Ｃｈａｒｌｉｅｒら、１９９２年）。網掛け付きの塩基および太字の塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である。
【０１０９】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０１１０】
いくつかの実施形態では、複数のＡＲＧボックスが単一オペロンに存在し得る。これらの実施形態の一態様では、オペロンの調節領域へのＡｒｇＲの結合の必要な低減をもたらすためにオペロンにおけるＡＲＧボックスのうちの少なくとも１つを突然変異させる。これらの実施形態の代替態様では、オペロンの調節領域へのＡｒｇＲの結合の必要な低減をもたらすためにオペロンにおけるＡＲＧボックスのそれぞれを突然変異させる。当業者は、調節領域当たりのＡＲＧボックスの数が各細菌で異なり、ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列が各オペロンごとに異なり得ることを理解するであろう。例えば、大腸菌ニッスルにおけるｃａｒＡＢオペロンは、２つのＡＲＧボックスを含み、１つまたは両方のＡＲＧボックス配列を突然変異させることができる。大腸菌ニッスルにおけるａｒｇＧオペロンは、３つのＡＲＧボックスを含み、１つ、２つまたは３つのＡＲＧボックス配列を突然変異させる、破壊する、または欠失させることができる。いくつかの実施形態では、３つすべてのＡＲＧボックス配列を突然変異させ、破壊し、または欠失させ、構成的プロモーター、例えば、ＢＢａ＿Ｊ２３１００をａｒｇＧオペロンの調節領域に挿入する。当業者は、調節領域当たりのＡＲＧボックスの数が各細菌で異なり、ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列が各オペロンごとに異なり得ることを理解するであろう。
【０１１１】
大腸菌ニッスルにおける構成的に発現するａｒｇＧ構築物の例示的実施形態を表４に示す。表４に大腸菌ニッスルにおけるａｒｇＧ遺伝子の調節領域および５’部分の野生型ゲノム配列ならびにその構成的突然変異体を示す。各配列のプロモーター領域は下線付きであり、ａｒｇＧ遺伝子の５’部分は囲み線付きである。野生型配列では、ＡｒｇＲ結合部位は大文字の下線付きである。突然変異配列では、５’非翻訳領域は大文字の下線付きである。構成的プロモーターの制御下でａｒｇＧを発現する細菌は、アルギニンを産生することができる。野生型ＡｒｇＲ抑制性プロモーターの制御下でａｒｇＧを発現する細菌は、シトルリンを産生することができる。大腸菌ニッスルの野生型ａｒｇＧオペロンおよびその構成的に発現する突然変異体のマップを図１２に示す。
【０１１２】
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１１３】
いくつかの実施形態では、オペロンの突然変異ＡＲＧボックスまたは調節領域に対するＡｒｇＲの結合親和性は、同じ条件下の同じ亜型の細菌における非改変ＡＲＧボックスおよび調節領域に対するＡｒｇＲの結合親和性より少なくとも約５０％低い、少なくとも約６０％低い、少なくとも約７０％低い、少なくとも約８０％低い、少なくとも約９０％低い、または少なくとも約９５％低い。いくつかの実施形態では、突然変異ＡＲＧボックスおよび調節領域へのＡｒｇＲの結合の低減は、関連オペロンにおける遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現を少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１５００倍増加させる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。アルギニン生合成遺伝子、例えば、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢに特異的プライマーを当技術分野で公知の方法（Ｆｒａｇａら、２００８年）に従って設計し、試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ａｒｇ  ｍＲＮＡを含む可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１つのＣＴ結果を発生させ、ＣＴ結果（複数可）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒをさらに含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡ、ならびにアルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡ、ＡｒｇＲ抑制性調節領域により駆動されるアルギノコハク酸シンターゼ、ならびにアルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのそれぞれの各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。これらの実施形態では、細菌は、シトルリンを産生することができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡ、構成的プロモーターから発現するアルギノコハク酸シンターゼ、ならびにアルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンのそれぞれの各ＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。これらの実施形態では、細菌は、アルギニンを産生することができる。
【０１１９】
表３に１つまたは複数の核酸突然変異がアルギニンオペロンのそれぞれのアルギニン媒介性抑制を低減または消失させる突然変異構築物の例を示す。突然変異構築物は、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターにより駆動されるフィードバック抵抗型のＡｒｇＡを含む。各突然変異アルギニンレギュロンは、ＡｒｇＲ結合が低減または消失し、それにより、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成が増強されるように、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよび野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む。突然変異アルギニンレギュロン構築物の非限定的な例を表５に示す。
【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
突然変異は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンは、単一リプレッサータンパク質により調節される。細菌の特定の種、菌株および／または亜型において、アルギニンレギュロンが２つの推定上のリプレッサーにより調節され得ることが提案された（Ｎｉｃｏｌｏｆｆら、２００４年）。したがって、特定の実施形態では、本発明のアルギニンレギュロンは、複数のリプレッサータンパク質により調節される。
【０１２２】
特定の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、遺伝子操作細菌の１つの種、菌株または亜型において発現する。代替実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、遺伝子操作細菌の２つまたはそれ以上の種、菌株または亜型において発現する。
【０１２３】
アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）
本発明の遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路におけるグルタミン酸をアルギニンおよび／または中間副産物に変換することに関与する酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数のアルギニン媒介抑制を低減または消失させる１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、アルギニン媒介抑制を低減または消失は、ＡｒｇＲレプレッサー結合を低減もしくは消失させることにより、例えば、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数の少なくとも１つのＡＲＧボックスを突然変異させることにより（上で述べたように）またはアルギニンリプレッサーを突然変異もしくは欠失させることにより（ここで述べるように）かつ／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのアルギニンの結合を低減もしくは消失させることにより（例えば、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを生じるようにＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを突然変異させることにより）達成することができる。
【０１２４】
したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、機能し得るＡｒｇＲリプレッサーを欠いており、したがって、アルギニン生合成オペロンのそれぞれのＡｒｇＲリプレッサー媒介転写抑制が低減または消失している。いくつかの実施形態では、操作細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下するまたは不活性であるように１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失した）、レギュロンの活性化ならびにアルギニンおよび／または中間副産物の生合成の増強がもたらされる。いくつかの実施形態では、対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーは、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって独立に欠失するかまたは不活性にされる。いくつかの実施形態では、対応する野生型細菌に通常存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが欠失している。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、アルギニンレギュロンは、単一リプレッサータンパク質により調節される。細菌の特定の種、菌株および／または亜型において、アルギニンレギュロンが２つの異なる推定上のリプレッサーにより調節され得ることが提案された（Ｎｉｃｏｌｏｆｆら、２００４年）。したがって、特定の実施形態では、それぞれが異なるアミノ酸配列を含む２つの異なるＡｒｇＲタンパク質は、遺伝子操作細菌において突然変異または欠失している。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーを含む遺伝子改変細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡを含み、機能性アルギニンリプレッサーを欠き、アルギニンを産生することができる。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、機能性ＡｒｇＧをさらに欠き、シトルリンを産生することができる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子を遺伝子操作細菌において欠失させる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子を突然変異させて、ＡｒｇＲ機能を不活性化する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＧ遺伝子を遺伝子操作細菌において欠失させる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＧ遺伝子を突然変異させて、ＡｒｇＲ機能を不活性化する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡｒｇＲを欠失した。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡｒｇＲを欠失し、ａｒｇＧを欠失した。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧが細菌ゲノムから欠失し、ａｒｇＡｆｂｒがプラスミドに存在する。いくつかの実施形態では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧが細菌ゲノムから欠失し、ａｒｇＡｆｂｒが染色体に組み込まれる。１つの特定の実施形態では、遺伝子改変細菌は、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含み、ゲノムＡｒｇＲを欠失し、ゲノムａｒｇＧを欠失した。他の特定の実施形態では、遺伝子改変細菌は、プラスミド上に存在するａｒｇＡｆｂｒを含み、ゲノムＡｒｇＲを欠失し、ゲノムａｒｇＧを欠失した。ａｒｇＧが欠失している実施形態のいずれかにおいて、アルギニンではなく、シトルリンが産生される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗型のＡｒｇＡが発現する条件下で、本発明の遺伝子操作細菌は、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のアルギニン、シトルリン、他の中間副産物および／またはオペロンにおける遺伝子（複数可）の転写物を産生する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。アルギニン生合成遺伝子、例えば、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢに特異的プライマーを当技術分野で公知の方法（Ｆｒａｇａら、２００８年）に従って設計し、試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ａｒｇ  ｍＲＮＡを含む可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１つのＣＴ結果を発生させ、ＣＴ結果（複数可）を用いて、アルギニン生合成遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。
【０１２９】
ＡｒｇＲが突然変異しているこれらの実施形態のいずれかにおいて、突然変異ＡｒｇＲおよび／またはフィードバック抵抗性ＡｒｇＡは、１つもしくは複数の組込み部位において細菌染色体に組み込まれるかまたは１つもしくは複数のプラスミド上に存在し得る。
【０１３０】
フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡを含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、アルギニンフィードバック抵抗性ＡｒｇＡが発現する場合、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生することができる。アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼタンパク質（ａｒｇＡｆｂｒ）は、フィードバック感受性親系統の酵素よりＬ−アルギニンに対して著しく感受性が低い（例えば、Ｅｃｋｈａｒｄｔら、１９７５年；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、１９９８年参照）。フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。いくつかの実施形態では、プラスミドからの発現は、ａｒｇＡｆｂｒ発現を増大させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、染色体からの発現は、ａｒｇＡｆｂｒ発現の安定性を向上させるのに有用であり得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、アルギニン生合成経路に関与する述べた突然変異配列（例えば、ＡｒｇＲ、ａｒｇＡｆｂｒ、Ａｒｇボックス配列）のいずれかを細菌染色体の１つまたは複数の組込み部位に組み込む。例えば、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする配列の１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれたアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼの複数のコピーを有することは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼのより多くの産生が可能になり、発現のレベルの微調整も可能になる。或いは、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼに加えて、輸送体またはキルスイッチ回路のいずれかのような、本明細書に記載の異なる回路を、複数の異なる機能を果たす１つまたは複数の異なる組込み部位において細菌染色体に組み込むことができよう。複数の異なるフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼタンパク質は、当技術分野で公知であり、遺伝子操作細菌において組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下に発現させる。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、外因性環境条件により誘導されるプロモーターの制御下に発現させる。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管に固有のものである。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、健常または疾患状態の哺乳動物の消化管に固有である分子または代謝物、例えば、プロピオン酸である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物消化管の環境のような、低酸素または嫌気的条件である。
【０１３２】
細菌は、酸素レベルを検知することができる転写因子を発達させた。異なるシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルにより誘発され、異なる速度論で発生し得る。酸素レベル依存性プロモーターは、１つまたは複数の酸素レベル検知転写因子が結合することができる核酸配列であり、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する。一実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、酸素レベル依存性プロモーターの制御下にある。より具体的な態様では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、哺乳動物消化管の環境のような、低酸素または嫌気的環境下で活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下にある。
【０１３３】
特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む。大腸菌では、ＦＮＲは、好気的代謝から嫌気的代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気的状態では、ＦＮＲは、嫌気性増殖への適応に関与する数百もの遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気的状態では、ＦＮＲは、酸素によって二量体化を妨げられ、不活性である。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーターの制御下、例えば、アルギニンデイミニアーゼおよび硝酸還元ＡＮＲプロモーター（Ｒａｙら、１９９７年）、異化型硝酸呼吸調節因子ＤＮＲプロモーター（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）の嫌気的調節下で発現するａｒｇＡｆｂｒを含む。これらの実施形態では、アルギニン生合成経路は、消化管内のような、低酸素または嫌気的環境下で特に活性化される。
【０１３４】
緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）では、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元（ＡＮＲ）転写調節因子の嫌気的制御は、「酸素制限または嫌気的条件下で誘導性である生理学的機能の発現のために必要である」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年；Ｓａｗｅｒｓ、１９９１年）。緑膿菌ＡＮＲは、大腸菌ＦＮＲと相同であり、「共通ＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）は、ＡＮＲおよびＦＮＲにより効率的に認識された」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気的状態では、ＡＮＲは、嫌気性増殖への適応に関与する多くの遺伝子を活性化する。好気的状態では、ＡＮＲは、不活性である。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）はすべて、ＡＮＲの機能性類似体を有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９１年）。ＡＮＲにより制御されるプロモーターは、当技術分野で公知であり、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモーターなどがある（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年参照）。
【０１３５】
ＦＮＲファミリーは、「緑膿菌の嫌気性硝酸呼吸」のためにＡＮＲとの結合に必要である転写調節因子である（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）、異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）も含む（Ａｒａｉら、１９９５年）。特定の遺伝子について、ＦＮＲ結合モチーフは、「おそらくＤＮＲのみによって認識される」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）。外因性環境条件および対応する調節領域によって制御される任意の適切な転写調節因子を用いることができる。非限定的な例は、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／Ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／ＣおよびＡｉｒＳＲならびに当技術分野で公知のその他を含む。
【０１３６】
ＦＮＲプロモーター配列は、当技術分野で公知であり、任意の適切なＦＮＲプロモーター配列（複数可）を本発明の遺伝子操作細菌に用いることができる。任意の適切なＦＮＲプロモーター（複数可）を任意の適切なａｒｇＡｆｂｒと組み合わせることができる（例えば、例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列を表７に示す）。非限定的なＦＮＲプロモーター配列を表６に示す。表６にＦＮＲ応答性プロモーター配列を含む例示的調節領域配列の核酸配列を示す。下線付きの配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに用いられる制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、配列番号１８、配列番号１９、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号２０）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号２１）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号２２）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号２３）、強リボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２４）、強リボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号２５）、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子であるｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号２６またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号２７）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２８）およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号２９）のうちの１つまたは複数を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のＤＮＡ配列またはそれらの機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１３８】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１３９】
他の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒは、転写活性化因子、例えば、ＣＲＰの結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現する。ＣＲＰ（環状ＡＭＰ受容体タンパク質または異化代謝産物活性化タンパク質もしくはＣＡＰ）は、グルコースのような迅速代謝性炭水化物が存在する場合にさほど有益でない炭素源の取込み、代謝および同化に関与する遺伝子を抑制することによって細菌における調節における主要な役割を果たす（Ｗｕら、２０１５年）。このグルコースに対する選択は、グルコース抑制ならびに炭素異化代謝産物抑制と呼ばれた（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８年；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８年）。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒの発現は、ＣＲＰ結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒの発現は、ＣＲＰ結合部位に融合したＦＮＲプロモーターにより制御される。これらの実施形態では、グルコースが環境中に存在しない場合、環状ＡＭＰがＣＲＰに結合する。この結合が、ＣＲＰにおける立体配座の変化を引き起こし、ＣＲＰがその結合部位に強固に結合することを可能にする。ＣＲＰの結合が次に、直接的なタンパク質間相互作用によるＲＮＡポリメラーゼのＦＮＲプロモーターへの動員をもたらすことによってａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の転写を活性化する。グルコースの存在下では、環状ＡＭＰは、ＣＲＰに結合せず、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子の転写が抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子の結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）を用いて、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にグルコースを加えることにより、十分な量のグルコースが存在する場合にａｒｇＡｆｂｒが嫌気的条件下で発現しないことを保証する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒは、環境中、例えば、哺乳動物消化管内の特定の分子または代謝物に応答性である誘導性プロモーターの制御下で発現する。例えば、短鎖脂肪酸プロピオネートは、消化管に局在する主要な微生物発酵代謝物である（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら、２０１１年）。一実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子発現は、プロピオン酸誘導性プロモーターの制御下にある。より具体的な実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子発現は、哺乳動物消化管内のプロピオン酸の存在によって活性化されるプロピオン酸誘導性プロモーターの制御下にある。健常および／または疾患状態の、哺乳動物消化管内に見いだされる任意の分子または代謝物を用いて、ａｒｇＡｆｂｒ発現を誘導することができる。非限定的な例は、プロピオネート、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファ−フェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンを含む。代替実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子発現は、アラビノース糖の存在下で活性化される、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある（例えば、図１３参照）。
【０１４１】
肝性脳症（ＨＥ）および他の肝臓疾患または障害を有する対象は、それらの血液および腸における高いアンモニアレベルをもたらす慢性肝損傷を有する。アンモニアに加えて、これらの患者は、それらの血液および腸におけるビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファ−フェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンのレベルの上昇も有する。これらのＨＥに関連する分子またはそれらの代謝物のうちの１つに応答するプロモーターは、消化管内のａｒｇＡｆｂｒの発現を誘導するために遺伝子操作細菌に用いることができる。これらのプロモーターは、非ＨＥ患者において誘導されるとは予期されないものであろう。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、炎症または炎症反応への曝露により誘導されるプロモーター（例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーター）の制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、アラビノースのような代謝物への曝露により誘導されるプロモーター（例えば、ＡｒａＢＡＤプロモーター）の制御下で発現する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を向上させることによって、当技術分野で公知の方法により遺伝子発現をさらに最適化する。例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列の核酸配列を表７に示す。例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列のポリペプチド配列を表８に示す。
【０１４４】
【表７】
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【０１４５】
【表８】
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【０１４６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３０の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３０と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３０のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３０と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３１のポリペプチド配列またはその機能性断片をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３１またはその機能性断片に対する１つもしくは複数の同類アミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３１またはその機能性断片のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチド配列をコードする。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼのアルギニンフィードバック阻害は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼが活性である場合、同じ条件下の同じ亜型の細菌の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒを宿主細胞中で発現させることができ、宿主細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、培地中で、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、消化管内で、生存し、かつ／または増殖することができるように、遺伝子操作細菌は、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子を低コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を向上させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導性条件下での漏出性発現を低下させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子を高コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、ａｒｇＡｆｂｒ発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子を染色体上で発現させる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路または複数の異なる機能を果たす回路を含むように細菌に遺伝子操作を施す。挿入部位の例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａおよび図１８に示すその他を含むが、これらに限定されない。例えば、遺伝子操作細菌は、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡｆｂｒの４つのコピーを含み得る。あるいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／ＩおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡｆｂｒの３つのコピーならびに３つの異なる挿入部位ｄａｐＡ、ｃｅａおよびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入された、３つの突然変異アルギニンレギュロン、例えば、シトルリンを産生する２つおよびアルギニンを産生する１つを含み得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、プラスミドまたは染色体は、野生型ＡｒｇＲ結合部位、例えば、ＡＲＧボックスも含む。いくつかの例では、機能性ＡｒｇＲの存在および／または集積は、遺伝子発現のオフターゲット変化をもたらし得る、ＡＲＧボックス以外の部位におけるオフターゲット結合をもたらし得る。機能性ＡＲＧボックスをさらに含むプラスミドまたは染色体を用いて、すなわち、ＡｒｇＲシンクとして作用することによって、オフターゲットＡｒｇＲ結合を低減または消失させることができる。いくつかの実施形態では、プラスミドまたは染色体は、機能性ＡｒｇＲ結合部位を含まず、例えば、プラスミドまたは染色体は、改変ＡＲＧボックスを含むかまたはＡＲＧボックスを含まない。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、染色体に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミド上に存在し、哺乳動物消化管に特異的である分子または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、染色体上に存在し、哺乳動物消化管に特異的である分子または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、フィードバック抵抗性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、対応する酸素レベル依存性プロモーターに加えて、変異もしくは突然変異酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを含む。変異もしくは突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、低酸素または嫌気性環境中の作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を保持している。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させて、野生型活性を低減または消失させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を増強するアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６年参照）。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、低酸素または嫌気性環境中でアンモニアを減少させ、かつ／または消費する異なる細菌種に由来する酸素レベル依存性転写調節因子を含む。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、淋菌に由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年参照）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、完全なままであり、野生型活性を保持する。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させて、野生型活性を低減または消失させる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現するａｒｇＡｆｂｒ、ならびに上で述べた１つまたは複数のＡＲＧボックス突然変異を含む突然変異調節領域の制御下で発現する野生型ａｒｇＡを含む。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現するａｒｇＡｆｂｒを含み、野生型ａｒｇＡを含まない。他の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンは、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現するａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡＲＧボックス突然変異を含まない野生型ａｒｇＡをさらに含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プラスミドおよび／または染色体からａｒｇＡｆｂｒを発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現する。一実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、低酸素または嫌気性環境中で活性化される酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現する。例示的ＦＮＲプロモーター駆動ａｒｇＡｆｂｒ配列の核酸配列を表９に示す。ＦＮＲプロモーター配列は太字であり、ａｒｇＡｆｂｒ配列は囲み線付きである。ＦＮＲプロモーター駆動ａｒｇＡｆｂｒプラスミドの核酸配列を表１０に示し、ＦＮＲプロモーター配列は太字であり、ａｒｇＡｆｂｒ配列は囲み線付きである。表１１に例示的ｐＳＣ１０１プラスミドの核酸配列を示す。任意の適切なＦＮＲプロモーター（複数可）を任意の適切なフィードバック抵抗性ＡｒｇＡと組み合わせることができる。非限定的なＦＮＲプロモーター配列を表６に示す。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、配列番号１６、配列番号１７、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号１８）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１９）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号２０）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号２１）、強リポソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２２）、強リポソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号２３）、嫌気的に誘導された小ＲＮＡ遺伝子ｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号２４またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号２５）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２６）およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号２７）のうちの１つまたは複数を含む。表１２に例示的ｆｎｒＳプロモーター駆動ａｒｇＡｆｂｒ配列の核酸配列を示す。ＦＮＲプロモーター配列は太字であり、リボソーム結合部位は網掛け付きであり、ａｒｇＡｆｂｒ配列は囲み線付きである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３２の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３２と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３２のＤＮＡ配列、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３２と同じポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３３の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３３と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３３のＤＮＡ配列、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３３と同じポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３５の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３５と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３５のＤＮＡ配列、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３５と同じポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１６０】
【表９】
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【０１６１】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０１６２】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【０１６３】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
2018523978.tif 000024
【０１６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、組み込まれたｆｂｒＡｒｇＡは、ｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性カセットも同じ部位に存在する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性カセットは、存在しない。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性は、クロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性は、カナマイシンである。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含む遺伝子操作細菌は、ｔｈｙＡ栄養要求体である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異も含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有する。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異を含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有し、ｔｈｙＡ栄養要求性を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異を含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有し、ｔｈｙＡ栄養要求性を含み、抗生物質耐性カセットを含む。他の特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒを含み、ＡｒｇＲ突然変異を含むかまたはＡｒｇＲの欠失を有し、ｔｈｙＡ栄養要求性を含み、カナマイシン耐性カセットを含む。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５である。他の特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＳＹＮ＿ＵＣＤ３０３である。
【０１６５】
表１３に染色体に組み込まれているＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡ構築物の非限定的な例を示す。
【０１６６】
配列番号３６は、例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２に含まれているような、ＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡおよびクロラムフェニコール耐性を含む。配列番号３７は、例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０６、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０７およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０９に含まれているような、ＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡおよびカナマイシン耐性を含む。配列番号３８は、例えば、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０８、ＳＹＮＵＣＤ３１０に含まれているような、ＦＮＲＳ−ｆｂｒＡｒｇＡを含み、抗生物質耐性を含まない。
【０１６７】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【０１６８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３６の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３６のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３７と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３７の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３７と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３７のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３７と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３８の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３８のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０１７１】
アルギニン異化
本発明を実施するうえでの重要な考慮すべき事柄は、アンモニアがアルギニンおよび／またはシトルリン異化の副産物として過剰産生されないことを保証することである。尿素回路の最終酵素ステップにおいて、アルギナーゼは、アルギニンのオルニチンおよび尿素への加水分解開裂を触媒する（Ｃｕｎｉｎら、１９８６年）。腸内細菌により産生され得る、ウレアーゼは、尿素の二酸化炭素およびアンモニアへの開裂を触媒する（Ｓｕｍｍｅｒｓｋｉｌｌ、１９６６年；Ａｏｙａｇｉら、１９６６年；Ｃｕｎｉｎら、１９８６年）。したがって、ウレアーゼ活性は、ヒト組織に対して有毒であり得るアンモニアを発生し得る（Ｋｏｎｉｅｃｚｎａら、２０１２年）。大腸菌ニッスルを含む、いくつかの細菌において、ａｒｃＤ遺伝子は、アンモニアも放出し得る、アルギニン／オルニチン対向輸送体をコードする（Ｖａｎｄｅｒ  Ｗａｕｖｅｎら、１９８４年；Ｇａｍｐｅｒら、１９９１年；Ｍｅｎｇら、１９９２年）。
【０１７２】
ＡｓｔＡは、アンモニアを放出する、コハク酸へのアルギニンの変換に関与する酵素である。ＳｐｅＡは、さらに異化されてアンモニアを生成し得る、アグマチンへのアルギニンの変換に関与する酵素である。したがって、いくつかの例において、アルギニンの分解を防ぐことは、有益であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌は、アルギニン異化を低減または消失させ、それにより、さらなるアンモニアの産生を低減または消失させる突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｒｃＤ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、ＡｒｃＤが欠失している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＡｓｔＡ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、ＡｓｔＡが欠失している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＳｐｅＡ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、ＳｐｅＡが欠失している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギナーゼ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、アルギナーゼが欠失している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ウレアーゼ活性を低減または消失させる突然変異も含む。特定の実施形態では、ウレアーゼが欠失している。いくつかの実施形態では、アルギニン異化に関与する１つまたは複数の他の遺伝子が突然変異または欠失している。
【０１７３】
他の高アンモニア血障害
肝性脳症（ＨＥ）は、患者における神経認知変化を特徴とし、生化学的撹乱が病因に関連付けられた。具体的には、アンモニアレベルの上昇が疾患の病態生理に部分的に寄与していると推測されている。高アンモニア血症に加えて、脳ＧＡＢＡのレベルおよびマンガンレベルの上昇が認められ、臨床症状に寄与すると推測された。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作微生物、例えば、細菌およびウイルス、その医薬組成物、ならびに高アンモニア血症に関連する疾患もしくは障害、例えば、肝性脳症およびハンチントン病をモジュレートまたは治療する方法を提供する。遺伝子操作細菌は、哺乳動物における過剰のアンモニアを減少させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、体内の過剰の窒素を非毒性分子、例えば、アルギニン、シトルリン、メチオニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンに組み込むことによって過剰のアンモニアを減少させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、他の有毒または有害分子（複数可）、例えば、ＧＡＢＡ、マンガンのレベルを低下させるための１つまたは複数の回路（遺伝子配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管バリア増強分子、例えば、酪酸、プロピオン酸および酢酸のような短鎖脂肪酸を産生する１つまたは複数の回路をさらに含む。本開示はまた、過剰のアンモニアならびに他の有害な分子、例えば、ＧＡＢＡおよびマンガンを減少させるための組成物および治療方法を提供する。特定の態様では、本開示は、過剰のアンモニアおよび他の有害な分子を減少させることができる遺伝子操作細菌を提供する。特定の実施形態では、本開示は、過剰のアンモニアおよび他の有害な分子を減少させ、消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸などの、１つまたは複数の治療用分子をさらに産生することができる遺伝子操作細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、回路が誘導性プロモーター制御下にある過剰のアンモニアを減少させるための１つまたは複数の回路を含む遺伝子操作細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、回路のうちの１つまたは複数が誘導性プロモーター制御下にある過剰のアンモニアを減少させるための１つまたは複数の回路および他の有害な分子を減少させるための１つまたは複数の回路を含む遺伝子操作細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、回路のうちの１つまたは複数および／または治療用分子が誘導性プロモーター制御下にある過剰のアンモニアを減少させるための１つまたは複数の回路および他の有害な分子を減少させるための１つまたは複数の回路を含み、消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸などの、１つまたは複数の治療用分子をさらに産生する遺伝子操作細菌を提供する。特定の態様では、本明細書で開示する組成物および方法は、過剰のアンモニアに関連する疾患もしくは障害、例えば、肝性脳症もしくはハンチントン病、および／または肝性脳症もしくはハンチントン病などの、過剰のアンモニアに関連する疾患もしくは障害に随伴する１つもしくは複数の症状を治療するために用いることができる。
【０１７５】
ＧＡＢＡの輸送および代謝
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、哺乳動物中枢神経系における主要な抑制性神経伝達物質である。ヒトにおいて、ＧＡＢＡは、リガンド開口型塩化物特異的イオンチャンネル複合体の一部である、シナプス後ＧＡＢＡＡ受容体を活性化する。シナプス後ニューロン上のこの複合体の活性化により、塩化物イオンがニューロンに入り、抑制作用を及ぼすことが可能となる。そのようなＧＡＢＡ作動性神経伝達の変化は、てんかん（Ｊｏｎｅｓ−ＤａｖｉｓおよびＭａｃＤｏｎａｌｄ、２００３年）、ハンチントン病（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ、１９９２年）および肝性脳症（ＪｏｎｅｓおよびＢａｓｉｌｅ、１９９７年）を含む、いくつかの神経障害の病態生理に関連付けられた。
【０１７６】
ＧＡＢＡによりモジュレートされる脳内のニューロンは、抑制性ＧＡＢＡ作動性トーンのもとにあると言われる。この抑制性トーンは、十分に強力な興奮性刺激が受容されるまで、または抑制性トーンが別の方法で開放されるまで、ニューロン発火を妨げる。肝性脳症におけるＧＡＢＡ作動性トーンの増大は、ガラクトサミン誘発性肝不全を有するウサギおよびＧＡＢＡＡ受容体のアロステリックモジュレーター（例えば、ペントバルビタール、ジアゼパム）を投与したウサギにおける同様な視覚的応答パターン基づいて、１９８０年代初頭に最初に記載された（ＪｏｎｅｓおよびＢａｓｉｌｅ、１９９７年）。ＧＡＢＡＡ受容体における高度に選択的なベンゾジアゼピンアンタゴニストであるフルマゼニルにより治療したＨＥ患者における臨床的改善は、これらの所見をさらに確認するものであった（Ｂａｎｋｓｙら、１９８５年；Ｓｃｏｌｌｏ−ＬａｖｉｚｚａｒｉおよびＳｔｅｉｎｍａｎｎ、１９８５年）。ＨＥにおけるＧＡＢＡ作動性トーンの増大は、それ以来、（１）脳内のＧＡＢＡ濃度の上昇、（２）ＧＡＢＡＡ受容体の完全性の変化、および／または（３）ＧＡＢＡＡ受容体の内因性モジュレーターの濃度の上昇（ＡｈｂｏｕｃｈａおよびＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、２００４年）のうちの１つまたは複数の結果であると提案された。
【０１７７】
大腸菌におけるＧＡＢＡの取込みは、膜電位により駆動され、膜輸送タンパク質ＧａｂＰにより促進される（Ｌｉら、２００１年）。ＧａｂＰは、二次性能動輸送体の２つの最大のファミリーの１つである、アミノ酸／ポリアミン／有機陽イオン（ＡＰＣ）輸送体スーパーファミリーのメンバーである（Ｊａｃｋら、２０００年）。ｇａｂＰ遺伝子によりコードされる、ＧａｂＰタンパク質は、４６６アミノ酸および１２膜貫通アルファらせんからなり、ＮおよびＣ末端の両方が細胞質ゾルに面している（ＨｕおよびＫｉｎｇ、１９９８ａ）。ＧａｂＰ残基配列は、細菌から哺乳動物までのＡＰＣファミリーのメンバー間で保存されている、共通両親媒性領域（ＣＡＲ）も含む（ＨｕおよびＫｉｎｇ、１９９８ｂ）。細胞への侵入により、ＧＡＢＡがＧＡＢＡ  α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ（ＧＳＳＴ）によりスクシニルセミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換される。コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）がＧＡＢＡ異化における第２の唯一の他の特異的ステップである、スクシニルセミアルデヒドのコハク酸への酸化を触媒する（ＤｏｖｅｒおよびＨａｌｐｅｒｎ、１９７２年）。最終的に、コハク酸がクエン酸（ＴＣＡ）回路の基質になる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、細菌は、本明細書に記載の代謝経路、例えば、アルギニン生合成経路、ヒスチジン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グルタミン生合成経路またはトリプトファン生合成経路（「アンモニア変換回路」）により過剰のアンモニアを消費するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成経路を含み、過剰のアンモニアを減少させることができる。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路は、誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路は、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路は、肝性脳症に関連する分子または代謝物、例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、トランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファ−フェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアまたマンガンにより誘導されるプロモーターの制御下にある。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＧＡＢＡ膜輸送タンパク質、例えば、ＧａｂＰを産生するための１つまたは複数の回路をさらに含み、ＧＡＢＡを細胞内に輸送することができる（「ＧＡＢＡ輸送回路」）（図４１）。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素、例えば、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよび／またはＣＯＴを産生するための１つまたは複数の回路（「ＧＡＢＡ代謝回路」）をさらに含む（図４９）。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、１つまたは複数のＧＡＢＡ膜輸送タンパク質、例えば、ＧａｂＰを産生するための１つまたは複数の回路および１つまたは複数のＧＡＢＡ異化酵素、例えば、ＧＳＳＴ、ＳＳＤＨおよび／またはＣＯＴを産生するための１つまたは複数の回路（「ＧＡＢＡ代謝回路」）をさらに含む（図４１）。
【０１８１】
より具体的な態様では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路を含む。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路は、同じプロモーターの制御下にある。代替実施形態では、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路は、異なるプロモーターの制御下にある。例示的プロモーターは、本明細書で開示するプロモーターのいずれかを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、低酸素、微好気性または嫌気的条件により誘導される酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、分子もしくは代謝物、例えば、組織特異的分子もしくは代謝物または肝損傷を示す分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターを含む。分子もしくは代謝物の非限定的な例は、それらの血液および腸における例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。
【０１８２】
例示的ＧａｂＰ輸送体のアミノ酸配列を表４２に示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０５のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０５と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０５のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０５と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０１８３】
ポリヌクレオチド配列の非限定的な例を表４３（配列番号１０６）に示す。
【０１８４】
マンガンの輸送
マンガンは、生物学的に重要な微量金属であり、大部分の生存生物の生存に必要である。哺乳動物において、マンガンは、胆汁中に排泄されるが、その除去は、肝不全を伴う肝臓から十二指腸への胆汁の流れの障害（すなわち、胆汁うっ滞）の影響を受ける。アンモニアと同様に、マンガンの濃度の上昇は、肝性脳症の発現に一定の役割を果たす（Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。グルタミンシンテターゼによって触媒される反応におけるアンモニアを解毒する脳内の星状細胞は、マンガンを補助因子として必要とし、したがって、この金属を蓄積する傾向を有する（Ａｓｃｈｎｅｒら、１９９９年）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で、マンガンがグルタミン酸の輸送の抑制（ＨａｚｅｌｌおよびＮｏｒｅｎｂｅｒｇ、１９９６年）、星状細胞の形態の異常（Ｈａｚｅｌｌら、２００６年）および細胞容積の増加（Ｒａｍａ  Ｒａｏら、２００７年）をもたらし得るが示された。
マンガンおよびアンモニアは、肝脳症の病因において相乗的に作用することも示された（Ｊａｙａｋｕｍａｒら、２００４年）。
【０１８５】
内部区画を欠く原核細胞における金属イオンの恒常性は、細胞膜を横切る金属イオンフラックスの厳格な調節により維持されている（ＪｅｎｓｅｎおよびＪｅｎｓｅｎ、２０１４年）。細菌におけるマンガンの取込みは、プロトン依存性Ｎｒａｍｐ関連輸送体および／またはＡＴＰ依存性ＡＢＣ輸送体の２つの主要な種類の輸送体が主として関与している。Ｎｒａｍｐ（天然抵抗性関連マクロファージタンパク質（Ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ））輸送体ファミリーは、植物、動物および酵母において最初に記載された（Ｃｅｌｌｉｅｒら、１９９６年）が、ＭｎｔＨは、それ以来、いくつかの細菌種において特徴付けがなされた（Ｐｏｒｃｈｅｒｏｎら、２０１３年）。マンガンに対するＮｒａｍｐ１輸送体の選択性が金属蓄積試験において示され、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ｍｎｔＨの過剰発現が細胞結合マンガンのレベルの増加をもたらしたが、カルシウム、銅、鉄、マグネシウムまたは亜鉛の蓄積をもたらさなかった（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、２００２年）。さらに、ｍｎｔＨ遺伝子の突然変異を含む枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株は、マンガンの添加により救出された金属不含有培地中の増殖の障害を示した（ＱｕｅおよびＨｅｌｍａｎｎ、２０００年）。例示的ＭｎｔＨ輸送体のアミノ酸配列を表４４に示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０７のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号３６と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０７のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０７と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。ポリヌクレオチド配列の非限定的な例を表４５（配列番号１０８）に示す。
【０１８６】
マンガンの高親和性取込みは、ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ））輸送体によっても媒介され得る。この輸送体スーパーファミリーのメンバーは、ＡＴＰの加水分解を利用して、イオンから巨大分子までの多様な基質の移入または輸出を増大させ、原核および真核細胞の両方の多剤耐性におけるそれらの役割について十分に特徴付けられている。マンガンの移入に関与する細菌ＡＢＣ輸送体の非限定的な例は、ＭｎｔＡＢＣＤ（枯草菌、黄色ブドウ球菌）、ＳｉｔＡＢＣＤ（ネズミチフス菌、フレキスナー赤痢菌）、ＰｓａＡＢＣＤ（肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））およびＹｆｅＡＢＣＤ（ペスト菌）を含む（ＢｅａｒｄｅｎおよびＰｅｒｒｙ、１９９９年；Ｋｅｈｒｅｓら、２００２年；ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら、２００４年；Ｚｈｏｕら、１９９９年）。ＭｎｔＡＢＣＤ輸送体複合体は、３つのサブユニットからなり、ＭｎｔＣおよびＭｎｔＤは、パーミアーゼサブユニットを含む内在性膜タンパク質であり、陽イオン輸送を媒介し、ＭｎｔＢは、ＡＴＰアーゼであり、ＭｎｔＡは、マンガンに結合し、パーミアーゼサブユニットに送達する。ｓｉｔＡＢＣＤ、ｐｓａＡＢＣＤおよびｙｆｅＡＢＣＤなどの、他のＡＢＣ輸送体オペロンは、同様のサブユニット構成および機能を示す（Ｈｉｇｇｉｎｓ、１９９２年；Ｒｅｅｓら、２００９年）。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、マンガン膜輸送タンパク質、例えば、ＭｎｔＨを産生するための１つまたは複数の回路をさらに含み、マンガンイオンを細胞内に輸送することができる（「マンガン輸送回路」）（図４２）。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路およびＧＡＢＡ輸送回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ輸送回路およびＧＡＢＡ代謝回路を含む。いくつかの実施形態では、各回路は、同じプロモーターの制御下にある。代替実施形態では、各回路は、異なるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、低酸素、微好気性または嫌気的条件により誘導される酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、分子もしくは代謝物、例えば、組織特異的分子もしくは代謝物または肝損傷を示す分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターを含む。分子もしくは代謝物の非限定的な例は、それらの血液および腸における例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、炎症または炎症反応により誘導されるプロモーター、例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管内に自然に存在し得るまたはし得ない（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えば、アラビノースおよびテトラサイクリンにより誘導されるプロモーターを含む。
【０１８９】
酪酸および他の消化管バリア機能増強分子の産生
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、消化管バリア機能増強分子をコードする遺伝子、または消化管バリア機能増強分子を産生することができる生合成経路をコードする遺伝子カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、該分子は、短鎖脂肪酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、エラフィン（ペプチダーゼ阻害剤３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ２、キヌレン酸およびキヌレニンからなる群から選択される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、単一遺伝子によりコードされる消化管バリア機能増強分子を発現するものであり、例えば、該分子は、エラフィンであり、ＰＩ３遺伝子によりコードされる。代替実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路により合成される消化管バリア機能増強分子、例えば、酪酸またはプロピオン酸をコードする。
【０１９１】
遺伝子または遺伝子カセットは、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上で発現させることができる。いくつかの実施形態では、プラスミドからの発現は、消化管バリア機能増強分子の発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、染色体からの発現は、消化管バリア機能増強分子の発現の安定性を向上させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、消化管バリア機能増強分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを遺伝子操作細菌における１つまたは複数の組込み部位において細菌染色体に組み込む。例えば、酪酸生合成遺伝子カセットの１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、消化管バリア機能増強分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを遺伝子操作細菌におけるプラスミドから発現させる。いくつかの実施形態では、消化管バリア機能増強分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入する。任意の適切な挿入部位を用いることができる（例えば、図１８参照）。挿入部位は、ゲノムにおけるどこでもよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を創製するための）のような、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部位の近くのような、ゲノムの活性領域；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間のような、意図しない転写のリスクを低下させるために多様なプロモーターの間であってよい。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、酪酸生成遺伝子カセットを含み、酪酸を産生することができる。遺伝子操作細菌は、適切な組の酪酸生成遺伝子を含み得る（例えば、表１４参照）。酪酸生合成遺伝子を含む非改変細菌は、公知であり、ペプトクロストリジウム属、クロストリジウム属、フゾバクテリウム属、ブチリビブリオ属、ユウバクテリウム属およびトレポネーマ属を含むが、これらに限定されず、これらの内因性酪酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酪酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペプトクロストリジウム・ディフィシル、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０株に由来する酪酸生合成経路の８つの遺伝子：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含み（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３年）、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのようなある種の他の代謝物に存在下で、低酸素条件で酪酸を産生することができる。ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０菌株および１２９６菌株は、両方が酪酸を産生することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来する酪酸生成遺伝子の組合せを含み、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で酪酸を産生することができる。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０菌株に由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３およびｔｈｉＡ１ならびにペプトクロストリジウム・ディフィシル１２９６菌株に由来するｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で酪酸生合成カセットを発現し、酪酸を産生することができる。遺伝子をコドン最適化することができ、翻訳および転写エレメントを加えることができる。表１４に酪酸生合成遺伝子カセットにおける例示的遺伝子の核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８のＤＮＡ配列、その機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８の核酸配列、またはその機能性断片を含む。
【０１９３】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【０１９４】
クロストリジウム・ディフィシルにおけるｂｃｄ２、ｅｔｆＡ３およびｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、酸素依存性共酸化剤として機能し得る、クロトニルＣｏＡをブチリルＣｏＡに変換する複合体を形成する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、微好気的または酸素制限環境、例えば、哺乳動物消化管内で酪酸を産生するように設計されているので、酸素依存性は、消化管内での酪酸の産生に負の影響を及ぼす可能性がある。トレポネーマ・デンティコラに由来する単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノイルＣｏＡレダクターゼをコードする）が、この３遺伝子複合体を酸素非依存的に機能的に置換し得ることが示された。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３遺伝子の３つすべてを機能的に置換することができる、例えば、トレポネーマ・デンティコラに由来するｔｅｒ遺伝子を含む。この実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ、ならびに例えば、トレポネーマ・デンティコラに由来するｔｅｒを含み、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得る、もしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で酪酸を産生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、好気的酪酸生合成の遺伝子および／または嫌気的もしくは微好気的酪酸生合成の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ、例えば、トレポネーマ・デンティコラに由来するｔｅｒ、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３およびｅｔｆＡ３のうちの１つまたは複数を含み、低酸素条件で、またはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で酪酸を産生する。いくつかの実施形態では、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物、または肝損傷に関連する分子もしくは代謝物の存在下、または炎症もしくは炎症反応のような他の条件（複数可）で、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で安定性を増大させ、かつ／または酪酸の産生を増加させるために、酪酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換し、改変し、かつ／または突然変異させる。いくつかの実施形態では、酪酸の局所産生は、消化管内の調節Ｔ細胞の分化を誘導し、かつ／または結腸上皮細胞のバリア機能を増進させる。
【０１９５】
ｐｂｔおよびｂｕｋの遺伝子産物は、ブチリルＣｏＡを酪酸に変換する。いくつかの実施形態では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子は、ｔｅｓＢ遺伝子により置換することができる。ｔｅｓＢは、ブチリルＣｏＡからＣｏＡを切り離すために用いることができる。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄおよびｃｒｔ２、ならびに大腸菌に由来するｔｅｓＢを含み、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で酪酸を産生する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、トレポネーマ・デンティコラに由来するｔｅｒ遺伝子（トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）、例えば、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来するｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ、ならびに大腸菌に由来するｔｅｓＢを含み、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で酪酸を産生する。いくつかの実施形態では、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物、または肝損傷に関連する分子もしくは代謝物の存在下、または炎症もしくは炎症反応のような他の条件（複数可）で、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で安定性を増大させ、かつ／または酪酸の産生を増加させるために、酪酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換し、改変し、かつ／または突然変異させる。いくつかの実施形態では、酪酸の局所産生は、消化管内の調節Ｔ細胞の分化を誘導し、かつ／または結腸上皮細胞のバリア機能を増進させる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、プロピオン酸遺伝子カセットを含み、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下でプロピオン酸を産生することができる。遺伝子操作細菌は、任意の適切な組のプロピオン酸生合成遺伝子を発現し得る（例えば、表１５参照）。内因性プロピオン酸生合成経路を介してプロピオン酸を産生することができる非改変細菌は、クロストリジウム・プロピオニクム、メガスフェラ・エルスデニイおよびプレボテラ・ルミニコラを含むが、これらに限定されず、これらの内因性プロピオン酸生合成経路は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するプロピオン酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、クロストリジウム・プロピオニクムに由来する遺伝子ｐｃｔ、ｌｃｄおよびａｃｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのアクリル酸経路遺伝子、例えば、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣを含む。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、例えば、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを含み、ｔｅｓＢを任意選択でさらに含む。遺伝子は、コドンを最適化することができ、翻訳および転写エレメントを加えることができる。表１５にプロピオン酸生合成遺伝子カセットにおける例示的遺伝子の核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１もしくは６２のＤＮＡ配列、その機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１もしくは６２の核酸配列、またはその機能性断片を含む。
【０１９７】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【０１９８】
いくつかの実施形態では、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、合成プロピオン酸生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、大腸菌プロピオン酸生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）プロピオン酸生合成遺伝子である。いくつかの実施形態では、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、Ｃ．プロピオニクムプロピオン酸生合成遺伝子である。プロピオン酸遺伝子カセットは、プロピオン酸の好気的生合成のための遺伝子および／またはプロピオン酸の嫌気的もしくは微好気的生合成のための遺伝子を含み得る。プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数は、機能的に置換または改変、例えば、コドンを最適化することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来するプロピオン酸生合成遺伝子の組合せを含み、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件でプロピオン酸を産生することができる。いくつかの実施形態では、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で安定性を向上させ、かつ／またはプロピオン酸の産生を増加させるために、プロピオン酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換、改変、および／または突然変異させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件でプロピオン酸生合成カセットを発現し、プロピオン酸を産生することができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、酢酸遺伝子カセットを含み、酢酸を産生する。遺伝子操作細菌は、適切な組の酢酸生合成遺伝子を含み得る。内因性酢酸生合成遺伝子を含む非改変細菌は、当技術分野で公知であり、好気的および／または嫌気的条件下で様々な基質を消費して、酢酸を産生することができる（例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅら、２００８年参照）。これらの内因性酢酸生合成遺伝子は、本発明の遺伝子操作細菌の遺伝子の起源であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌における天然酢酸生合成遺伝子は、増強されている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、大腸菌に由来する好気性酢酸生合成遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、アセチトマクラム属、アセトアナエロビウム属、アセトハロビウム属、アセトネマ属、バルチア属、ブチリバクテリウム属、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、スポロムサ属および／またはサーモアセトゲニウム属に由来する嫌気性酢酸生合成遺伝子を含む。遺伝子操作細菌は、好気的酢酸生合成の遺伝子または嫌気的もしくは微好気的酢酸生合成の遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、好気性および嫌気性または微好気性酢酸生合成遺伝子の両方を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜菌株に由来する酢酸生合成遺伝子の組合せを含み、酢酸を産生することができる。いくつかの実施形態では、安定性および／または酢酸の産生を増大させるために、酢酸生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を機能的に置換、改変、および／または突然変異させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、低酸素条件でまたはＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で酢酸生合成カセットを発現し、酢酸を産生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替短鎖脂肪酸を産生することができる。
【０２００】
当業者は、消化管バリア機能増強分子を産生することができるさらなる遺伝子および遺伝子カセットが当技術分野で公知であり、本発明の遺伝子操作細菌により発現させることができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、さらなる転写および翻訳エレメント、例えば、治療用分子の発現を増大させるための、リボソーム結合部位も含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２種またはそれ以上の消化管バリア機能増強分子を産生する。特定の実施形態では、２種またはそれ以上の消化管バリア機能増強分子は、相乗的に挙動して、消化管バリア機能を増強する。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、酪酸およびプロピオン酸を発現する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路を含む遺伝子操作細菌は、消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路をさらに含む（図４３）。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ輸送回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アンモニア変換回路、マンガン輸送回路、ＧＡＢＡ輸送回路、ＧＡＢＡ代謝回路および消化管バリア増強分子、例えば、酪酸を産生するための１つまたは複数の回路を含む。いくつかの実施形態では、各回路は、同じプロモーターの制御下にある。代替実施形態では、各回路は、異なるプロモーターの制御下にある。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥ特異的分子もしくは代謝物の存在下で、肝損傷、炎症もしくは炎症反応に関連する分子もしくは代謝物の存在下、またはアラビノースのような、消化管中に存在し得るもしくは存在し得ないある種の他の代謝物の存在下で、低酸素条件で、記載した回路のうちの１つまたは複数を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載した回路のうちの１つまたは複数が１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピーもしくは低コピー）上に存在するかまたは細菌染色体における１つもしくは複数の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、記載した回路のうちの１つまたは複数をさらに発現することができ、（１）当技術分野で公知であり、本明細書で示す栄養要求性のいずれか、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの、１つまたは複数の栄養要求性、（２）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知のキルスイッチのいずれかなどの、１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の輸送体のいずれかのような、生体分子または物質を移入する１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載の、あるいは当技術分野で公知の分泌回路のいずれかなどの、１つまたは複数の分泌回路、および（６）そのようなさらなる回路のうちの１つまたは複数の組合せのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【０２０５】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作細菌は、リファキシミンに対する耐性をさらに含み得る。リファキシミンに対する耐性は、ｒｐｏＢ遺伝子における突然変異によって主としてもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ｒｐｏＢ遺伝子における公知のリファキシミン耐性を含む。他の実施形態では、リファキシミン耐性をもたらす有用な突然変異を同定するために、遺伝子操作細菌を漸増量のリファキシミンに曝露する、スクリーニングを用いることができる。
【０２０６】
誘導性プロモーター
いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）を宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、培地中で、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、消化管内で、生存し、かつ／または増殖することができるように、細菌細胞は、ペイロード（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２種またはそれ以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、２種またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、３種またはそれ以上の異なる輸送体またはオペロン、例えば、３種またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、同じペイロード遺伝子（複数可）の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、誘導性プロモーターに直接的または間接的に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、誘導性プロモーターに直接的または間接的に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンまたはアラビノースへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝に作動可能に連結されたプロモーターは、外因性環境条件により直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝に作動可能に連結されたプロモーターは、外因性環境条件により間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に固有の外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に固有の外因性環境条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境のような低酸素または嫌気的条件により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特有である分子または代謝物により直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により直接的または間接的に誘導される。
【０２０９】
特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターの制御下に発現するペイロードをコードする遺伝子を含む。大腸菌において、ＦＮＲは、好気的代謝から嫌気的代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気的状態では、ＦＮＲは、嫌気的増殖への適応に関与する数百種の遺伝子を活性化する活性なＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気的状態では、ＦＮＲは、酸素により二量体化することが妨げられ、不活性である。ＦＮＲ応答性プロモーターは、下文の図表に示すＦＮＲ応答性プロモーターを含むが、これらに限定されない。下線付き配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに用いられる制限部位である。
【０２１０】
ＦＮＲプロモーター配列は、当技術分野で公知であり、任意の適切なＦＮＲプロモーター配列（複数可）を本発明の遺伝子操作細菌に用いることができる。任意の適切なＦＮＲプロモーター（複数可）を適切なペイロードと組み合わせることができる（例えば、例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列を表７に示す）。非限定的なＦＮＲプロモーター配列を表６に示す。表６にＦＮＲ応答性プロモーター配列を含む例示的調節領域配列の核酸配列を示す。下線付きの配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに用いられる制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、配列番号１８、配列番号１９、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号２０）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号２１）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号２２）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号２３）、強リボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２４）、強リボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号２５）、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子であるｆｎｒＳ（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号２６またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号２７）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号２８）およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号２９）のうちの１つまたは複数を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のＤＮＡ配列またはそれらの機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０２１２】
一実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号２を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号３を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号４を含む。他の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が遺伝子操作細菌に挿入されている。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年）の制御下に発現するペイロードをコードする遺伝子を含む。これらの実施形態では、ペイロード遺伝子の発現は、消化管内のような、低酸素または嫌気的環境において特に活性化される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、当技術分野で公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を向上させることにより、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物消化管は、ヒト哺乳動物消化管である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および異なる細菌種に由来する対応するプロモーターを含む。異種酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、同じ条件下の細菌における天然遺伝子（複数可）およびプロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境における、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、ペイロードをコードする遺伝子の転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素レベル依存性転写調節因子は、淋菌に由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年参照）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、完全なままであり、野生型活性を保持している。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を低減または消失するように欠失または突然変異させる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および同じ亜型の細菌に由来する野生型プロモーターと比べて突然変異している対応するプロモーターを含む。突然変異プロモーターは、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して、低酸素または嫌気的環境における、野生型転写調節因子への結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、ペイロードをコードする遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲプロモーター、および同じ亜型の細菌に由来する野生型転写調節因子と比べて突然変異している対応する転写調節因子を含む。突然変異転写調節因子は、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気的環境における、野生型プロモーターへの結合を増強させ、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えば、ペイロードをコードする遺伝子の転写を増加させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を増加させるアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６年参照）。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子、例えば、ＦＮＲ遺伝子をコードする内因性遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子は、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子は、同じ異染色体上に存在する。いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードの発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびペイロードは、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０２１７】
ＲＮＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現するペイロードをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、炎症状態により活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、炎症性環境において活性化される炎症依存性プロモーター、例えば、活性窒素種またはＲＮＳプロモーターの制御下に発現する。
【０２１８】
本明細書で使用する場合、「活性窒素種」および「ＲＮＳ」は、同義で用い、分子状窒素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＮＳは、ニトロソ化ストレスのような有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＮＳは、酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）、二酸化窒素（・ＮＯ２）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）およびニトロペルオキシカーボネート（ＯＮＯＯＣＯ２−）を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＮＳシグナル伝達経路は、異なるＲＮＳレベルにより誘発され、異なる速度論で発生する。
【０２１９】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域に結合し、かつ／またはそれを活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＮＳ誘導性調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、ペイロード遺伝子配列（複数可）、例えば、本明細書に記載のペイロードのいずれかに作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。
【０２２０】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制解除調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合せず、抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＮＳ抑制解除調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、ペイロード遺伝子配列（複数可）に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、調節領域にもはや結合し、かつ／または抑制することをせず、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを活性化する。このように、ＲＮＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を活性化する。
【０２２１】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ抑制性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合し、抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＮＳ抑制性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結することができる。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。このように、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。
【０２２２】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＳ応答性調節領域」は、ＲＮＳ誘導性調節領域、ＲＮＳ抑制性調節領域および／またはＲＮＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＮＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＮＳを感知する転写因子ならびにそれらの対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の例は、表Ａに示すものを含むが、これらに限定されない。
【０２２３】
【表Ａ】
2018523978.tif 000045
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの活性窒素種を感知することができる転写因子により直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調節可能な調節領域は、ペイロードの発現を直接的または間接的に駆動することができる１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結し、ひいてはＲＮＳレベルに対してペイロードの発現を制御する。例えば、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ペイロードは、本明細書で示すペイロードのいずれかのような、ペイロードであり、例えば、炎症組織においてＲＮＳが存在する場会、ＲＮＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、かつ／または活性化し、１つまたは複数のペイロード遺伝子の発現を駆動する。その後、炎症が改善し、ＲＮＡレベルが低下した場合、ペイロードの産生は、減少または消失する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子をＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域に結合させ、転写因子がＲＮＳを感知するとき、それは、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を誘導する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ＮＯを亜酸化窒素に還元する、フラボルブレドキシンおよび関連フラビタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発現を調節するＮＯ応答性転写活性化因子である」（Ｓｐｉｒｏ、２００６年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＮｏｒＲによって活性化される遺伝子の任意の適切なＲＮＡ応答性調節領域を含み得る。ＮｏｒＲによって活性化することができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ、２００６年；Ｖｉｎｅら、２０１１年；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０１２年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列に作動可能に連結したｎｏｒＶＷに由来するＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＲの存在下で、ＮｏｒＲ転写因子は、ＲＮＲを感知し、ｎｏｒＶＷ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子（複数可）の発現を駆動し、ペイロードを産生する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＤＮＲである。ＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）は、酸化窒素の存在下で「ｎｉｒ、ｎｏｒおよびｎｏｓ遺伝子の発現を促進する」（Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＤＮＲによって活性化される遺伝子の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＤＮＲによって活性化することができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｇｉａｒｄｉｎａら、２００８年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、酪酸生成遺伝子カセットに作動可能に連結したｎｏｒＣＢのＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＲの存在下で、ＤＮＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＣＢ調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子の発現を駆動し、１つまたは複数のペイロードを産生する。いくつかの実施形態では、ＤＮＲは、緑膿菌ＤＮＲである。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットを活性化する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ＮＯを感知し、ＮＯの代謝に関与する遺伝子の発現を制御することができるＲｒｆ２型の転写リプレッサー」である（Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＮｓｒＲによって抑制される遺伝子の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＮｓｒＲは、淋菌ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年；Ｄｕｎｎら、２０１０年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のペイロード遺伝子に作動可能に連結したｎｏｒＢのＲＮＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｓｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＢ調節領域にもはや結合せず、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結したペイロード遺伝子を活性化し、ペイロードをコードするもの（ｔｈｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐａｙｌｏａｄ（ｓ））を生成する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌が、細菌におけるかなりの数の天然遺伝子の発現を調節しないＲＮＳ感知転写因子を発現することは、有利である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、転写因子が本発明の遺伝子操作細菌における調節配列に結合しない、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子を発現する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、大腸菌であり、ＲＮＳ感知転写因子は、例えば、淋菌に由来するＮｓｒＲであり、ここで、大腸菌は、前記ＮｓｒＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作細菌における内因性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小限にまたは排除する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制性調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０２３２】
これらの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロードを発現させるために用いる、２つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＮＳ感知リプレッサーおよび例えば、ペイロードをコードする遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結した、第２のリプレッサーを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＮＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。これらの実施形態において有用な第２のリプレッサーの例は、ＴｅｔＲ、Ｃ１およびＬｅｘＡを含むが、これらに限定されない。第１のリプレッサーによる結合の非存在（ＲＮＳの非存在下で起こる）下では、第２のリプレッサーが転写され、これが１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する。第１のリプレッサーによる結合の存在（ＲＮＳの存在下で起こる）下では、第２のリプレッサーの発現が抑制され、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つまたは複数のペイロード遺伝子が発現する。
【０２３３】
ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝子操作細菌において用いられる調節領域の配列によって遺伝子発現を誘導、活性化、または抑制し得る。１つまたは複数の種類のＲＮＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が遺伝子操作細菌に存在し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲ、および例えば、ｎｏｒＢに由来する１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲ、ならびに例えば、ｎｏｒＢおよびａｎｉＡに由来する、２つまたはそれ以上の異なる対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲおよびＮｏｒＲ、ならびに例えば、それぞれｎｏｒＢおよびｎｏｒＲに由来する、２つまたはそれ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＮＳ応答性調節領域が複数の転写因子に結合できることがあり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＮＳ感知転写因子および１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかのＲＮＳにより調節される調節領域の核酸配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｐｉｒｏ、２００６年；Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９年；Ｄｕｎｎら、２０１０年；Ｖｉｎｅら、２０１１年；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０１２年）。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、その天然プロモーターにより制御されるｎｓｒＲ遺伝子、誘導性プロモーター、天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターを含む。いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下のＲＮＳ感知転写因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子および治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ応答性調節領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＮＳ感知転写因子および対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知転写因子および調節領域は、同じ条件下の同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子および調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させ得る。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子ＮｓｒＲおよび淋菌に由来する対応する調節領域ｎｓｒＲを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、完全なままであり、野生型活性を保持している。代替実施形態では、天然ＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異させる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ｎｓｒＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えば、ＮｓｒＲ遺伝子、同じ亜型の細菌の野生型調節領域と比べて突然変異している、対応する調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域を含む。突然変異調節領域は、同じ条件下の野生型調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢ調節領域、および同じ亜型の細菌の野生型転写因子と比べて突然変異している、対応する転写因子、例えば、ＮｓｒＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下の野生型転写因子と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＳの存在下でのペイロードの発現を増加させるために、ＲＮＳ感知転写因子および対応する調節領域の両方を同じ亜型の細菌の野生型配列と比べて突然変異させる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、抗炎症および／または消化管バリア機能増強分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＮＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を増大させることによって、発現がさらに最適化される。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子（複数可）のいずれかを１つまたは複数の組込み部位において細菌染色体に組み込むことができる。例えば、ペイロード遺伝子（複数可）をコードする１つまたは複数の１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれた１つまたは複数の遺伝子の複数のコピーを有することにより、ペイロード（複数可）のより多くの産生が可能となり、発現のレベルの微調整も可能となる。あるいは、複数の異なる機能を果たすために治療用遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（複数可）に加えて、分泌または輸出回路のいずれかのような、本明細書に記載の異なる回路を細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことが可能である。
【０２４１】
ＲＯＳ依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現するペイロードを産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、細胞損傷の状態により活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、細胞もしくは組織損傷が存在する環境において活性化される細胞損傷依存性プロモーター、例えば、活性酸素種またはＲＯＳプロモーターの制御下で発現する。
【０２４２】
本明細書で使用する場合、「活性酸素種」および「ＲＯＳ」は、同義で用いられ、分子状酸素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを意味する。ＲＯＳは、好気的呼吸または金属触媒酸化の副産物として産生され、酸化的損傷などの有害な細胞効果をもたらし得る。ＲＯＳは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシドまたはスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、炭酸ラジカル、過酸化物またはペルオキシルラジカル（・Ｏ２−２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、酸化窒素（ＮＯ・）およびペルオキシ亜硝酸またはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）を含むが、これらに限定されない（不対電子を・により示す）。細菌は、ＲＯＳレベルを感知することができる転写因子を発達させた。異なるＲＯＳシグナル伝達経路は、異なるＲＯＳレベルによって誘発され、異なる速度論で発生する（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。
【０２４３】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、調節領域に結合し、かつ／またはそれを活性化する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＯＳ誘導性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子配列、例えば、１つもしくは複数のペイロードをコードする１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を駆動する。このように、ＲＯＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を誘導する。
【０２４４】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制解除調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合せず、抑制しない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＯＳ抑制解除調節領域は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、１つもしくは複数のペイロード（複数可）をコードする１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｈｒＲは、ＲＯＳを感知し、もはや調節領域に結合し、かつ／または抑制することをせず、それにより、作動可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットを活性化する。このように、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を活性化する。
【０２４５】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ抑制性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができ、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、核酸配列を意味し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域に結合し、抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。ＲＯＳ抑制性調節領域は、１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結することができる。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えば、ＰｅｒＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、１つまたは複数の作動可能に連結した遺伝子配列の発現を阻止する。このように、ＲＯＳは、１つまたは複数の遺伝子の発現を抑制する。
【０２４６】
本明細書で使用する場合、「ＲＯＳ応答性調節領域」は、ＲＯＳ誘導性調節領域、ＲＯＳ抑制性調節領域および／またはＲＯＳ抑制解除調節領域を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＯＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＯＳを感知する転写因子ならびにそれらの対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域の例は、表Ｂに示すものを含むが、それらに限定されない。
【０２４７】
【表Ｂ】
2018523978.tif 000046
【０２４８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの活性酸素種を感知することができる転写因子に直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。調節可能な調節領域は、ペイロードの発現を直接的または間接的に駆動することができる遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結し、ひいてはＲＯＳレベルに対してペイロードの発現を制御する。例えば、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、分子は、ペイロードであり、例えば、炎症組織にＲＯＳが存在する場合、ＲＯＳ感知転写因子は、調節領域に結合し、かつ／または活性化し、ペイロードの遺伝子配列の発現を駆動し、それにより、ペイロードを生成する。その後、炎症が改善された場合、ＲＯＳレベルが低下し、ペイロードの産生が減少または消失する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それにより、下流の遺伝子発現を活性化する。代替実施形態では、転写因子をＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域に結合させ、転写因子がＲＯＳを感知するとき、それは、立体配座の変化を受け、それにより、下流の遺伝子発現を誘導する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「過酸化物ストレス反応のグローバルな調節因子として主として機能し」、多くの遺伝子、例えば、「Ｈ２Ｏ２の解毒（ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成（ｈｅｍＨ）、還元剤供給（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔｒｘＣ）、チオール−ジスルフィド異性化（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ−Ｓ中心修復（ｓｕｆＡ−Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合（ｙａａＡ）、鉄移入システムの抑制（ｆｕｒ）に関与する遺伝子」および「小調節ＲＮＡであるＯｘｙＳ」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）を調節することができる。遺伝子操作細菌は、ＯｘｙＲによって活性化される遺伝子の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｘｙＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｚｈｅｎｇら、２００１年；Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子、例えば、ペイロード遺伝子に作動可能に連結するｏｘｙＳのＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、Ｈ２Ｏ２の存在下で、ＯｘｙＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｘｙＳ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子の発現を駆動し、ペイロードを生成する。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、大腸菌ｏｘｙＲ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ｏｘｙＳ調節領域は、大腸菌ｏｘｙＳ調節領域である。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓおよびａｈｐＣの調節領域から選択される。
【０２５１】
代替実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＳｏｘＲである。ＳｏｘＲが「その［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターの酸化によって活性化される場合、それがＳｏｘＳの合成を増加させ、これがその標的遺伝子発現を活性化する」（Ｋｏｏら、２００３年）。「ＳｏｘＲは、スーパーオキシドおよび酸化窒素に主として応答することが公知であり」（Ｋｏｏら、２００３年）、Ｈ２Ｏ２に応答することもできる。本発明の遺伝子操作細菌は、ＳｏｘＲにより活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＳｏｘＲによる活性化を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｋｏｏら、２００３年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子、例えば、ペイロードに作動可能に連結しているｓｏｘＳのＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳの存在下で、ＳｏｘＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子の発現を駆動し、ペイロードを生成する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットを活性化する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは、「ｏｈｒＡプロモーター部位と重複する逆方向反復ＤＮＡ配列の対に結合し、それにより、転写イベントを抑制する」が、酸化ＯｈｒＲは、「そのＤＮＡ標的に結合することが不可能である」（Ｄｕａｒｔｅら、２０１０年）。ＯｈｒＲは、「有機過酸化物およびＮａＯＣｌの両方を感知する転写リプレッサーであり」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、「Ｈ２Ｏ２により弱く活性化されるが、有機ヒドロペルオキシドに対するはるかにより高い反応性を示す」（Ｄｕａｒｔｅら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｈｒＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｈｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロード遺伝子に作動可能に連結されているｏｈｒＡのＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、ＮａＯＣｌの存在下で、ＯｈｒＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｈｒＡ調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子を活性化し、ペイロードを生成する。
【０２５４】
ＯｈｒＲは、ＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「ＭａｒＲファミリーの大部分のメンバーは、転写リプレッサーであり、プロモーターにおける−１０または−３５領域にしばしば結合し、ＲＮＡポリメラーゼの結合の立体阻害をもたらす」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。このファンリーの他のメンバーは、当技術分野で公知であり、ＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲおよびＳａｒＺを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺであり、本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺにより抑制される遺伝子の１つまたは複数の対応する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「共通配列ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡを有する１８ｂｐ逆方向反復配列」に結合する「ＭａｒＲ型転写調節因子」であり、「酸化剤Ｈ２Ｏ２により可逆的に阻害される」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。ＲｏｓＲは、「推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１３２２、ｒｏｓＲの上流で、異なる遺伝子）、感覚ヒスチジンキナーゼ（ｃｇｔＳ９）、Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリーの推定転写調節因子（ｃｇ３２９１）、グルタチオンＳ−トランフェラーゼファミリーのタンパク質（ｃｇ１４２６）、２つの推定ＦＭＮレダクターゼ（ｃｇ１１５０およびｃｇ１８５０）ならびに４つの推定モノオキシゲナーゼ（ｃｇ０８２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９およびｃｇ３０８４）」を含むが、これらに限定されない、多くの遺伝子および推定遺伝子を抑制することができる（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＲｏｓＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＲｏｓＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０年参照）。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードに作動可能に連結されているｃｇｔＳ９のＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＯＳ、例えば、Ｈ２Ｏ２の存在下で、ＲｏｓＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｃｇｔＳ９調節領域にもはや結合せず、それにより、作動可能に連結したペイロード遺伝子を活性化し、ペイロードを生成する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌が、細菌におけるかなりの数の天然遺伝子の発現を調節しないＲＯＳ感知転写因子を発現することは、有利である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、転写因子が本発明の遺伝子操作細菌における調節配列に結合しない、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子を発現する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、大腸菌であり、ＲＯＳ感知転写因子は、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムに由来するＲｏｓＲであり、大腸菌は、前記ＲｏｓＲに対する結合部位を含まない。いくつかの実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作細菌における内因性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小限にまたは排除する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制性調節領域であり、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制するものであり、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＰｅｒＲである。枯草菌では、ＰｅｒＲは、「ＤＮＡに結合した場合、酸化ストレス応答（ｋａｔＡ、ａｈｐＣおよびｍｒｇＡ）、金属恒常性（ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒおよびｚｏａＡ）ならびにそれ自体の合成（ｐｅｒＲ）に関与するタンパク質をコードする遺伝子を抑制する」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「主としてＨ２Ｏ２に応答するグローバルな調節因子であり」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、「ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内および近くに存在する特定の回文構造共通配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）である、ｐｅｒボックスにおけるＤＮＡと相互作用する」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「プロモーターの一部と重複するかまたはそのすぐ下流にある」調節領域に結合することができる（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＰｅｒＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＰｅｒＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕｂｂｓら、２０１２年参照）。
【０２５９】
これらの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロードを発現するために用いられる、２つのリプレッサー活性化調節回路を含み得る。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＯＳ感知リプレッサー、例えば、ＰｅｒＲ、および第２のリプレッサー、例えば、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードに作動可能に連結されている、ＴｅｔＲを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。これらの実施形態において有用な第２のリプレッサーの例は、ＴｅｔＲ、Ｃ１およびＬｅｘＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、ＰｅｒＲである。いくつかの実施形態では、第２のリプレッサーは、ＴｅｔＲである。この実施形態では、ＰｅｒＲ抑制性調節領域は、ＴｅｔＲの発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑制性調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードの発現を駆動する。ＰｅｒＲ結合の非存在（ＲＯＳの非存在下で起こる）下では、ｔｅｔＲが転写され、ＴｅｔＲが遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードの発現を抑制する。ＰｅｒＲ結合の存在（ＲＯＳの存在下で起こる）下では、ｔｅｔＲの発現が抑制され、遺伝子または遺伝子カセット、例えば、ペイロードが発現する。
【０２６０】
ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝子操作細菌において用いられる調節領域配列によって遺伝子発現を誘導、活性化または抑制し得る。例えば、「ＯｘｙＲは、酸化条件下では主として転写活性化因子として考えられているが、ＯｘｙＲは、酸化および還元の両条件下でリプレッサーまたは活性化因子として機能することができ」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）、ＯｘｙＲは、「それ自体のリプレッサーならびにｆｈｕＦ（第二鉄イオンレダクターゼをコードする）およびｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のそれであることが示された」（Ｚｈｅｎｇら、２００１年）。本発明の遺伝子操作細菌は、ＯｘｙＲにより抑制される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＯｘｙＲは、上述のように、２つのリプレッサー活性化調節回路に用いられる。ＯｘｙＲによる抑制を受けることができる遺伝子は、当技術分野で公知である（例えば、Ｚｈｅｎｇら、２００１年参照）。または、例えば、ＲｏｓＲは、多くの遺伝子を抑制することができるが、それは、特定の遺伝子、例えば、ｎａｒＫＧＨＪＩオペロンを活性化することもできる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲｏｓＲにより活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。さらに、「ＰｅｒＲ媒介性の正の調節も認められ、遠隔上流部位へのＰｅｒＲの結合に関係すると思われる」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＰｅｒＲにより活性化される遺伝子の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。
【０２６１】
１つまたは複数の種類のＲＯＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が遺伝子操作細菌に存在し得る。例えば、「ＯｈｒＲは、グラム陽性およびグラム陰性細菌に認められ、ＯｘｙＲもしくはＰｅｒＲまたは両方と共存し得る」Ｄｕｂｂｓら、２０１２年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲ、および例えば、ｏｘｙＳに由来する１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲ、ならびに例えば、ｏｘｙＳおよびｋａｔＧに由来する２つまたはそれ以上の異なる対応する調節領域配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲおよびＰｅｒＲ、ならびに例えば、ｏｘｙＳおよびｋａｔＡに由来する２つまたはそれ以上の対応する調節領域配列を含む。１つのＲＯＳ応答性調節領域は、複数の転写因子に結合し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、２またはそれ以上の種類のＲＯＳ感知転写因子、および１つの対応する調節領域配列を含む。
【０２６２】
いくつかの例示的なＯｘｙＲにより調節される調節領域の核酸配列を表Ｃに示す。ＯｘｙＲ結合部位は、下線付きの太字である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号６３、６４、６５もしくは６６のＤＮＡ配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０２６３】
【表Ｃ】
2018523978.tif 000047
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、その天然プロモーターにより制御されるｏｘｙＲ遺伝子、誘導性プロモーター、天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターを含む。いくつかの例では、発現安定性を向上させるために誘導性プロモーターの制御下のＲＯＳ感知転写因子を発現させることは、有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写調節因子および治療用分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ応答性調節領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜菌株に由来するＲＯＳ感知転写因子および対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知転写因子および調節領域は、同じ条件下の同じ亜型の細菌に由来する天然転写因子および調節領域と比較して、ＲＯＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させ得る。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子ＯｘｙＲ、および大腸菌に由来する対応する調節領域ｏｘｙＳを含む。いくつかの実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、完全なままであり、野生型活性を保持している。代替実施形態では、天然ＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異させる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする内因性遺伝子、例えば、ｏｘｙＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えば、ｓｏｘＲ遺伝子、同じ亜型の細菌の野生型調節領域と比べて突然変異している、対応する調節領域、例えば、ｓｏｘＳ調節領域を含む。突然変異調節領域は、同じ条件下の野生型調節領域と比較して、ＲＯＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳ調節領域、および同じ亜型の細菌の野生型転写因子と比べて突然変異している、対応する転写因子、例えば、ＯｘｙＲを含む。突然変異転写因子は、同じ条件下の野生型転写因子と比較して、ＲＯＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＲＯＳの存在下でのペイロードの発現を増加させるために、ＲＯＳ感知転写因子および対応する調節領域の両方を同じ亜型の細菌の野生型配列と比べて突然変異させる。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化し、転写調節因子を操作し、かつ／またはｍＲＮＡの安定性を増大させることにより、発現をさらに最適化する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロード（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）を産生することができる遺伝子（複数可）は、プラスミド上に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生することができる遺伝子（複数可）は、染色体上に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に作動可能に連結している。
【０２７１】
このように、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌または遺伝子操作ウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、活性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーターまたは活性窒素種（ＲＮＳ）依存性プロモーターおよび対応する転写因子の制御下で１つまたは複数のペイロードを産生する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ペイロードを宿主細胞中で発現させることができ、宿主細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、培地中で、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏで生存し、かつ／または増殖することができるように、ペイロードを産生するための遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、ペイロードをコードする遺伝子の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子を低コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を増大させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導性条件下で漏出性発現を減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子を高コピープラスミド上で発現させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、ペイロードの発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子を染色体上で発現させる。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、細菌に、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増加させるため）または複数の異なる機能を果たす回路を含むように遺伝子操作を施す。例えば、遺伝子操作細菌は、４つの異なる挿入部位に挿入された特定のペイロードをコードする遺伝子の４つのコピーを含み得る。あるいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位に挿入された特定のペイロードをコードする遺伝子の３つのコピーおよび３つの異なる挿入部位に挿入された異なるペイロードをコードする遺伝子の３つのコピーを含み得る。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ペイロードが発現する条件下で、本開示の遺伝子操作細菌は、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１５００倍のペイロード、および／またはオペロンにおける遺伝子（複数可）の転写物を産生する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ペイロード遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。ペイロード遺伝子（複数可）に固有のプライマーは、当技術分野で公知の方法により設計し、試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ペイロードｍＲＮＡを含む可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１つのＣＴ結果を発生させ、ＣＴ結果（複数可）を用いて、ペイロード遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ペイロード遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを増幅し、検出し、かつ／または定量する。ペイロード遺伝子（複数可）に固有のプライマーは、当技術分野で公知の方法により設計し、試料中のｍＲＮＡを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ペイロードｍＲＮＡを含む可能性がある試料反応混合物に発蛍光団を加え、サーマルサイクラーを用いて、試料反応混合物に特定の波長の光を照射し、その後の発蛍光団による発光を検出する。反応混合物を所定の温度に所定の時間にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を９０〜１００℃、６０〜７０℃および３０〜５０℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を９３〜９７℃、５５〜６５℃および３５〜４５℃に所定のサイクル回数にわたり加熱し、冷却する。いくつかの実施形態では、蓄積しつつあるアンプリコンをｑＰＣＲの各サイクルの後に定量する。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（ＣＴ）である。各試料について少なくとも１つのＣＴ結果を発生させ、ＣＴ結果（複数可）を用いて、ペイロード遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。
【０２７７】
複数の作用機構
いくつかの実施形態では、細菌に、複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路または複数の異なる機能を果たす回路を含むように遺伝子操作を施す。挿入部位の例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａおよび図１８に示すその他を含むが、これらに限定されない。例えば、遺伝子操作細菌は、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡｆｂｒの４つのコピーを含み得る。あるいは、遺伝子操作細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／ＩおよびｌａｃＺに挿入されたａｒｇＡｆｂｒの３つのコピーならびに３つの異なる挿入部位ｄａｐＡ、ｃｅａおよびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入された、３つの突然変異アルギニンレギュロン、例えば、シトルリンを産生する２つおよびアルギニンを産生する１つを含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の異なる挿入部位に挿入された１つまたは複数のアンモニア変換回路および１つまたは複数の他の挿入部位に挿入された１つまたは複数の追加の回路を含み得る。例えば、遺伝子操作細菌は、１つもしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたａｒｇＡｆｂｒの１つもしくは複数のコピー（および／または他のアンモニア変換回路（複数可））、ならびに他の挿入部位における１つもしくは複数の消化管バリア増強回路、例えば、１つもしくは複数の酪酸産生回路（または他の消化管バリア増強回路（複数可）を含み得る。他の例示的実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つもしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたａｒｇＡｆｂｒの１つもしくは複数のコピー（および／または他のアンモニア変換回路（複数可））、ならびに他の挿入部位に挿入された、１つもしくは複数のＧＡＢＡ低減回路、例えば、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路（複数可）を含み得る。他の例示的実施形態では、遺伝子操作細菌は、１つもしくは複数の異なる挿入部位に挿入されたａｒｇＡｆｂｒの１つもしくは複数のコピー（および／または他のアンモニア変換回路（複数可））、ならびに他の挿入部位に挿入された１つもしくは複数のマンガン輸送回路（図４７Ａ）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つもしくは複数のアンモニア変換回路（例えば、ａｒｇＡｆｂｒおよび／または他のアンモニア変換回路（複数可））、１つもしくは複数の消化管バリア増強回路（例えば、酪酸、プロピオン酸、酢酸生合成回路（複数可））、１つもしくは複数のＧＡＢＡ低減回路（例えば、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路）、ならびに１つもしくは複数のマンガン輸送回路が４つまたはそれ以上の異なる染色体挿入部位に挿入されている（例えば、図４５）。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、消化管バリア増強回路、ＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が３つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。いくつかの実施形態では、アンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送／ＧＡＢＡ代謝回路およびマンガン輸送回路が３つの異なる染色体挿入部位に挿入されている（図４６Ｂ）。他の実施形態では、アンモニア変換回路およびマンガン輸送回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている（図４７Ａ）。他の実施形態では、アンモニア変換回路、ならびにＧＡＢＡ輸送および／またはＧＡＢＡ代謝回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。さらに他の実施形態では、アンモニア変換回路および消化管バリア増強回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。さらに他の実施形態では、アンモニア変換回路およびマンガン低減回路が２つの異なる染色体挿入部位に挿入されている。
【０２７８】
表１４に本開示の実施形態の非限定的な例を示す。
【０２７９】
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【表１６−１０】
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【表１６−１１】
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【表１６−１２】
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【０２８０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌による酪酸の産生は、さらなる改変によってさらに向上させることができる。嫌気的条件下の酪酸の産生は、内因性ＮＡＤＨプールに依存する。いくつかの実施形態では、酪酸経路を経るフラックスは、ＮＡＤＨの利用の競合経路を除去することによって増加させることができる。非限定的な例は、ＮＡＤＨを利用して、ホスホエノールピルビン酸のコハク酸への変換を触媒する、ｆｒｄＡの突然変異／欠失である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは、ＮＡＤＨの利用の競合経路を除去する、突然変異、例えば、ｆｒｄＡの突然変異／欠失をさらに含む。
【０２８１】
分泌
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌細胞質から、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌することができる天然分泌機構（例えば、グラム陽性細菌）または非天然分泌機構（例えば、グラム陰性細菌）をさらに含む。多くの細菌が細菌細胞外被を越えて基質を輸送する高機能の分泌システムを発達させた。小分子、タンパク質およびＤＮＡのような、基質は、細胞外腔もしくはペリプラズム（消化管内腔もしくは他の腔など）中に放出し、標的細胞中に注入し、または細菌膜に結合させることができる。
【０２８２】
グラム陰性細菌では、分泌機構は、内および外膜の１つまたは両方にわたり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然二重膜スパンニング分泌システムをさらに含む。二重膜スパンニング分泌システムは、Ｉ型分泌システム（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌システム（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌システム（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌システム（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌システム（Ｔ６ＳＳ）およびレジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ＲＮＤ）多剤排出ポンプのファミリーを含むが、これらに限定されない（Ｐｕｇｓｌｅｙ、１９９３年；Ｇｅｒｌａｃｈら、２００７年；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎら、２０１５年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年；Ｒｅｅｖｅｓら、２０１５年；国際公開第２０１４１３８３２４号Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような分泌システムの例を図６９〜７３に示す。グラム陰性様細胞外被を有する、マイコバクテリアもＶＩＩ型分泌システム（Ｔ７ＳＳ）をコードし得る（Ｓｔａｎｌｅｙら、２００３年）。Ｔ２ＳＳを除いて二重膜スパンニング分泌は、一般的に基質を細菌細胞質から細胞外腔または標的細胞内に直接的に輸送する。対照的に、Ｔ２ＳＳおよび外膜のみに及ぶ分泌システムは、２ステップ機構を使用し得るものであり、基質は、最初に内膜スパンニング輸送体によってペリプラズムに転位させられ、次に外膜に運ばれるかまたは細胞外腔に分泌される。外膜スパンニング分泌システムは、Ｖ型分泌または自己輸送システム（Ｔ５ＳＳ）、カーリー（ｃｕｒｌｉ）分泌システムおよび線毛アセンブリのシャペロン−アッシャー経路を含むが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ、２００６年；Ｃｏｓｔａら、２０１５年）。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、赤痢菌属、サルモネラ属、大腸菌属、ビブリオ属（Ｂｉｖｒｉｏ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来するＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌システム（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、ニードル複合体を介して細菌細胞質から宿主細胞質にタンパク質を輸送することができる。Ｔ３ＳＳは、細菌細胞質から分子を分泌するが、宿主細胞質に分子を注入しないように、改変することができる。したがって、分子は、消化管内腔または他の細胞外腔に分泌される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、前記改変Ｔ３ＳＳを含み、細菌細胞質から目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌することができる。いくつかの実施形態では、異種タンパク質もしくはペプチド、例えば、目的のタンパク質または治療用タンパク質などの、分泌分子は、目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）が細菌から分泌されることを可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路を用いて、目的の分子を分泌する。いくつかの実施形態では、ペプチドを天然鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換えにより融合させることにより、不完全鞭毛を用いて、目的の治療用ペプチドを分泌する。この方法で、細胞内で発現したキメラペプチドを内および外膜を越えて周囲宿主環境中に移動させることができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、Ｖ型自己輸送体分泌システム（Ｔｙｐｅ  Ｖ  Ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、治療用ペプチドを分泌する。このマシナリーの単純さおよび比較的に大きなタンパク質フラックスを扱う能力のため、Ｖ型分泌システムは、組換えタンパク質の細胞外産生に魅力的である。図７０に示すように、治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータドメインに融合させることができる。Ｎ末端シグナル配列は、タンパク質を内膜を越えてペリプラズム内に移動させるＳｅｃＡ−ＹＥＧマシナリーにタンパク質を導き、その後、シグナル配列の切断が起こる。ベータドメインは、Ｂａｍ複合体（「ベータ−バレルアセンブリマシナリー」）に動員され、そこでベータドメインが折りたたまれ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。細胞外環境に曝露したならば、治療用ペプチドは、自触媒切断（Ｂａｍ複合体の左側）によってまたはリンカーにおける相補的プロテアーゼ切断部位への膜結合ペプチド（黒いハサミ；Ｂａｍ複合体の右側）の標的化によってリンカーシステムから解放される。このように、いくつかの実施形態では、異種タンパク質もしくはペプチド、例えば、目的のタンパク質または治療用タンパク質などの、分泌分子は、分子が細菌から分泌されるようにＮ末端分泌シグナル、リンカーおよび自己輸送体のベータドメインを含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、ヘモリシンに基づく分泌システムを用いて、目的の分子を分泌する。Ｉ型分泌システムは、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外腔に直接に移動させ、他の分泌の種類の２ステップ工程が不要となるという利点がある。図７１に尿路病原性大腸菌のアルファ−ヘモリシン（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＡＴＰ結合カセット輸送体である、ＨｌｙＢ；膜融合タンパク質である、ＨｌｙＤ；および外膜タンパク質である、ＴｏｌＣを用いる。これらの３つのタンパク質の集合により、内および外膜の両方を通るチャンネルが形成される。天然では、このチャンネルは、ＨｌｙＡを分泌するために用いられるが、本開示の治療用ペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分を治療用ペプチド（星）のＣ末端部分に融合させて、このペプチドの分泌を媒介する。
【０２８７】
代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、非天然単一膜スパンニング分泌システムをさらに含む。単一膜スパンニング輸出体は、分泌システムの構成要素としての役割を果たすか、または基質を独立して輸出し得る。そのような輸出体は、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／ビルレンス関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、一般的分泌システム（例えば、大腸菌におけるＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリアおよびいくつかの種類のグラム陽性細菌（例えば、バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ、コリネバクテリウム・グルタミクム、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、黄色ブドウ球菌における付属分泌システム、およびツイン−アルギニン転位（ＴＡＴ）システムを含むが、これらに限定されない（Ｓａｉｅｒ、２００６年；ＲｉｇｅｌおよびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ、２００８年；Ａｌｂｉｎｉａｋら、２０１３年）。一般的分泌およびＴＡＴシステムは、両方が切断可能なＮ末端シグナルペプチドを用いて基質をペリプラズム内に輸出し得ることが公知であり、生物医薬の製造に関連して探究された。しかし、ＴＡＴシステムは、とりわけ折りたたまれた基質を輸送することができ、それにより早発または不正折りたたみの可能性が解消される点で優位である。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様システムを含み、細菌細胞質から目的のタンパク質（複数可）または治療用タンパク質（複数可）を分泌することができる。当業者は、本明細書で開示した分泌システムは、細菌の種々の種、菌株および亜型において機能を発揮するように改変し、かつ／または種々のペイロードを送出するように構成することができることを理解するであろう。
【０２８８】
タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外腔に移動させるために、ポリペプチドは、最初に細胞内で移動させ、内膜を越えて移動させ、最後に外膜を越えて移動させなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−とりわけ真核生物由来のもの−は、３次および４次構造を安定化するためにジスルフィド結合を含む。これらの結合は、酸化ペリプラズムコンパートメント内でペリプラズムシャペロンの助けにより正しく形成することができるが、ポリペプチドを外膜を越えて移動させるために、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を再び広げなければならない。
【０２８９】
グラム陰性細菌−とりわけジスルフィド結合を必要とするもの−における適切に折りたたまれたタンパク質を分泌する１つの方法は、不安定な外膜を有する細菌におけるペリプラズムを標的にすることである。この方法により、タンパク質を酸化環境中に移動させ、適切に折りたたませる。調和のとれた細胞外分泌システムと対照的に、タンパク質は、膜の漏れによって正しく折りたたまれた形態でペリプラズム腔を脱出することができる。したがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異体は、生物活性の、適切にジスルフィド結合したポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、「漏出性」または不安定な外膜を有する。漏れをもたらすために細菌の外膜を不安定にすることは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌを含む、外膜を強固なペプチドグリカン骨格につなぎ留めることに関与する遺伝子を欠失または突然変異を起こさせることによって達成することができる。Ｌｐｐは、細胞当たり約５００，０００コピーで存在する細菌細胞中の最も豊富なポリペプチドであり、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する（Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．  Ｊ．、Ｋａｈｎｅ  Ｄ．およびＷａｌｋｅｒ  Ｓ．Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２、  ａ０００４１４  （２０１０年））。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を得るための他の欠失標的である。さらに、漏出性表現型は、ペリプラズムプロテアーゼが不活性化した場合に認められた。ペリプラズムは、タンパク質とともに非常に密に充填されており、したがって、いくつかのペリプラズムタンパク質をコードして、タンパク質のターンオーバーを促進する。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩのようなペリプラズムプロテアーゼを除去することにより、ペリプラズムタンパク質の過剰な蓄積が促進されて、漏出性表現型がもたらされ得る。プロテアーゼの突然変異によっても、これらのプロテアーゼによる標的化分解が妨げられることによりエフェクターポリペプチドを保存することができる。さらに、これらの突然変異の組合せにより、細胞の生存の重大な犠牲を伴わずに細胞の漏出性表現型が相乗的に高められる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つもしくは複数の欠失または突然変異膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、欠失または突然変異ｌｐｐ膜遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ遺伝子から選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子（複数可）を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つもしくは複数の欠失または突然変異遺伝子を有する。
【０２９０】
細胞の生存への擾乱を最小限にするために、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つもしくは複数の膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を誘導性プロモーターの制御下におくことによって漏出性表現型を誘導性にすることができる。例えば、治療用ポリペプチドを送出（分泌）させる必要がある状態においてｌｐｐまたは他の細胞壁安定タンパク質またはペリプラズムプロテアーゼの発現を抑制することができる。例えば、誘導性条件下で、標的膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を低減する転写リプレッサータンパク質または設計アンチセンスＲＮＡを発現させることができる。逆に、特定のペプチドの過剰発現、例えば、コリシンまたはＴｏｌＡの第３のトポロジードメインの過剰発現は、表現型の不安定化をもたらし得るものであり、治療用ポリペプチドを送出（分泌）させる必要がある状態においてペプチドの過剰発現を誘導することができる。これらの戦略の選別は、脆弱、漏出性表現型をバイオマス産生から切り離すものである。したがって、いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つもしくは複数の膜および／またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。
【０２９１】
表１５および表１６にグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の分泌システムを示す。これらは、操作細菌から目的のポリペプチド、タンパク質または治療用タンパク質（複数可）を分泌させるために用いることができ、これらは、その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈ．  Ｓａｉｅｒ、Ｊｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｅ／１巻、１号、２００６年、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｍａｎｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈａｔ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ」に総説されている。
【０２９２】
【表１７】
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【０２９３】
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【０２９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、治療用酵素の分泌のための本明細書に記載の天然または非天然分泌システムを含む。いくつかの実施形態では、分泌システムは、改変ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、ヘモリシン分泌システム）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌システム、レジスタンス−ノジュレーション−ディビジョン（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、単一膜分泌システム、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌システムから選択される。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌により分泌される治療用タンパク質は、プロテアーゼ、例えば、腸プロテアーゼに対する抵抗性を増大させるように改変する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、分泌のための１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、本明細書に記載の通り、誘導性プロモーターの制御下にある。一例では、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、ＦＮＲプロモーターの制御下にあり、嫌気的条件下で産生され、分泌される。いくつかの実施形態では、分泌のための１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、構成的プロモーターの制御下にある。
【０２９７】
１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質が微生物から分泌または輸出される、いくつかの実施形態では、操作微生物は、分泌タグを含む遺伝子配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質を特定の分泌システムに導くためのＲＮＡまたはペプチド由来の「分泌タグ」を含む。例えば、Ｉ型ヘモリシン分泌システムの分泌タグは、アルファヘモリシンタンパク質（ＨｌｙＡ）のＣ末端５３アミノ酸、ＨｌｙＡ分泌シグナルにコードされる。
【０２９８】
ＨｌｙＢが内膜に挿入して、孔を形成し、ＨｌｙＤがＨｌｙＢをＴｏｌＣ（外膜孔）と一直線に並べ、それにより内および外膜を通るチャンネルを形成する。Ｃ末端分泌タグを自触媒またはプロテアーゼ触媒、例えば、ＯｍｐＴ切断により除去し、それにより、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質を細胞外環境中に放出することができる。
【０２９９】
Ｖ型自己分泌システムは、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性ペプチドタグ（内膜）およびＣ末端タグ（外膜）を利用する。これは、Ｓｅｃシステムを用いて、細胞質からペリプラズムに移動する。Ｃ末端タグは、外膜に挿入して、「パッセンジャー」タンパク質が通る孔を形成する。外膜を越えたならば、パッセンジャー（抗癌分子）は、自触媒、インテイン様機構によりまたは膜結合プロテアーゼ（すなわち、ＯｍｐＴ）により膜埋込みＣ末端タグから放出される。Ｎ末端タグは、Ｓｅｃシステムにより除去される。したがって、いくつかの実施形態では、分泌システムは、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質を操作細菌から分泌する前にこのタグを除去することができる。Ｖ型自己分泌媒介分泌では、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃシステムによる細胞質からペリプラズムコンパートメントへの「パッセンジャーペプチド」の転位時に除去される。さらに、自己分泌型が外膜を越えて転位したならば、Ｃ末端分泌タグは、自触媒またはプロテアーゼ触媒、例えば、ＯｍｐＴ切断により除去し、それにより抗癌分子（複数可）を細胞外環境中に放出させることができる。
【０３００】
鞭毛改変ＩＩＩ型分泌では、タグは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域にコードされ、したがって、切断／除去すべきペプチドタグが存在しない。この改変システムは、「シリンジ」部分を含まず、その代わりに両膜を越え、形成鞭毛から出るための孔として鞭毛構造の基底小体を使用する。ｆｌｉＣ／ｆｌｉＤ遺伝子（鞭毛「尾」／むちをコードする）が破壊される場合、鞭毛が十分に形成し得ず、これが全体的な分泌を促進する。いくつかの実施形態では、尾部を完全に除去することができる。ＩＩＩ型の伝統的なシステムでは、基底小体は、鞭毛に極めて類似しているが、「尾」／むちの代わりに伝統的なＴ３ＳＳは、パッセンジャータンパク質を宿主細胞に注射するためのシリンジを有する。分泌タグは、Ｎ末端ペプチドによりコードされる（長さが変化し、いくつかの異なるタグが存在する、ＰＣＴ／ＵＳ１４／０２０９７２参照）。Ｎ末端タグは、この分泌システムにおけるポリペプチドから除去されない。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の目的のタンパク質または治療用タンパク質は、大腸菌ＣＦＴ０７３のアルファ−ヘモリシン（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３アミノ酸を含む融合タンパク質として発現する（タグ）を含む（Ｃ末端分泌タグ）。
【０３０２】
必須遺伝子および栄養要求体
本明細書で使用する場合、「必須遺伝子」という語は、細胞の増殖および／または生存に必要な遺伝子を意味する。細菌必須遺伝子は、当業者に周知であり、遺伝子の特異的欠失および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定することができる（例えば、それぞれの全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｚｈａｎｇおよび  Ｌｉｎ、２００９年、ＤＥＧ  ５．０、ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３７巻：Ｄ４５５〜Ｄ４５８頁ならびにＧｅｒｄｅｓら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻（５号）：４４８〜４５６頁参照）。
【０３０３】
「必須遺伝子」は、生物が生存する状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、修飾または除去は、本開示の組換え細菌が栄養要求体になることをもたらし得る。栄養要求性の改変は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させることを意図するものである。
【０３０４】
栄養要求性菌株を作製するために破壊または除去することができる例示的細菌遺伝子を以下に示す。これらは、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に必要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０３０５】
栄養要求性の改変は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させることを意図するものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは、細胞の生存および／または増殖に必要な遺伝子における欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子は、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡである。他の実施形態では、必須遺伝子は、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡである。他の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含むが、これらに限定されない、細胞の生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子を標的にすることができる。表１７に栄養要求性菌株を作製するために破壊または除去することができる例示的な細菌遺伝子を示す。これらは、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に必要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０３０６】
【表１９】
2018523978.tif 000063
【０３０７】
表１８に強制経口投与後２４時間および４８時間目に検出されたマウス消化管内の種々のアミノ酸栄養要求体の生存を示す。これらの栄養要求体は、大腸菌の非ニッスル株であるＢＷ２５１１３を用いて作製した。
【０３０８】
【表２０】
2018523978.tif 000064
【０３０９】
例えば、チミンは、細菌細胞の増殖に必要な核酸であり、その非存在下では、細菌は、細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによる、チミン合成における第１のステップを触媒する酵素であるチミジル酸シンテターゼをコードする（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｔｈｙＡ栄養要求体である。ｔｈｙＡ栄養要求体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを加えることによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでヒト消化管内で天然で認められる高いチミンレベルの存在下で十分の量のチミンが存在する場合にのみ増殖することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物消化管内に存在する場合、補足される遺伝子における栄養要求体である。十分な量のチミンが存在しない場合、ｔｈｙＡ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。
【０３１０】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌細胞壁の増殖に必要である（Ｍｅａｄｏｗら、１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作細菌のいずれかは、ｄａｐＤが欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｄａｐＤ栄養要求体である。ｄａｐＤ栄養要求体は、例えば、ＤＡＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることによって、十分の量のＤＡＰが存在する場合にのみ増殖することができる。十分の量のＤＡＰが存在しない場合、ｄａｐＤ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。
【０３１１】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、ｕｒａＡが欠失し、かつ／または無関係の遺伝子で置換されているｕｒａＡ栄養要求体である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取込みおよびその後の代謝を促進する膜結合輸送体であるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９５年）。ｕｒａＡ栄養要求体は、例えば、ウラシルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖培地に加えることによって十分の量のウラシルが存在する場合にのみ増殖することができる。十分の量のウラシルが存在しない場合、ｕｒａＡ栄養要求体は、死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変を用いて、細菌が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことが確認される。
【０３１２】
複雑なコミュニティーにおいて、細菌がＤＮＡを共有することは可能である。非常にまれな状況では、栄養要求性細菌菌株は、ゲノム欠失を修復し、栄養要求体を永久的に救出する非栄養要求性菌株からＤＮＡを受け取り得る。したがって、複数の栄養要求体を含む細菌菌株を操作することにより、ＤＮＡ転移が栄養要求体を救出するのに十分な時間起こる可能性が著しく低くなり得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な２つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または突然変異を含む。
【０３１３】
必須遺伝子の他の例は、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡを含むが、これらに限定されない。他の必須遺伝子は、当業者に公知である。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する１つまたは複数の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求体である（その全体の内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｌｏｐｅｚおよび  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１  ＤＥ３  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５参照）。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧおよびａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃのうちの１つまたは複数を含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌのうちの１つまたは複数を含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇのうちの１つまたは複数を含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃのうちの１つまたは複数を含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇのうちの１つまたは複数を含むａｄｋである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、リガンドにより補足されている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸またはＬ−ヒスチジンメチルエステルにより補足される。ｄｎａＮ（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補足される。ｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補足される。ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールにより補足される。ａｄｋ（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）における突然変異を有する細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールにより補足される。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、リガンドに対して栄養要求性にする複数の突然変異遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）ならびにｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）における突然変異を含む。他の実施形態では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）ならびにｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ）における突然変異を含む。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、その必須遺伝子（複数可）が例えば、図６６に示すアラビノース系を用いて置換されている条件付き栄養要求体である。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ成分およびシステムのいずれかのような、キルスイッチ回路も含む。例えば、組換え細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な必須遺伝子における、例えば、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡおよび／またはアミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡもしくはＭｅｔＡにおける欠失もしくは突然変異を含み、環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）（述べたアラビノース系のような）に応答して発現する１つもしくは複数の転写活性化因子により調節されるあるいは外因性環境条件（複数可）および／またはシグナル（複数可）を感知することにより発現する１つもしくは複数のリコンビナーゼ（本明細書および図６２〜６５に記載するリコンビナーゼシステムのような）により調節される毒素遺伝子も含み得る。他の実施形態は、その全内容が参照により明確に本明細書に組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５年）４巻：３０７〜３１６頁に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ成分およびシステムのいずれかのような、キルスイッチ回路、ならびに条件複製起点のような、他のバイオセキュリティシステム（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）も含む。
【０３２０】
他の実施形態では、栄養要求性の改変は、過剰のアンモニアを消費する突然変異細菌をスクリーニングするためにも用いることができる。より具体的な態様では、栄養要求性の改変は、アルギニンを過剰産生することによって過剰のアンモニアを消費する然変異細菌をスクリーニングするために用いることができる。本明細書に記載の通り、アルギニン代謝に関与する多くの遺伝子は、ＡｒｇＲとのその相互作用によるアルギニンによる抑制を受ける。ａｓｔＣ遺伝子プロモーターは、アルギニン−ＡｒｇＲ複合体が、転写リプレッサーとは対照的に、転写活性化因子として作用する点で独特である。ａｓｔＣは、アンモニア産生アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）経路の第３の酵素および大腸菌におけるａｓｔＣＡＤＢＥオペロンの第１の酵素である、スクシニルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードする（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８年）。特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ある遺伝子について栄養要求性であり、ａｓｔＣプロモーターの制御下で栄養要求性遺伝子産物を発現する。これらの実施形態では、栄養要求性は、正のフィードバック機構の支配下にあり、アルギニンを過剰産生することにより過剰のアンモニアを消費する突然変異細菌を選択するために用いる。正のフィードバック栄養要求体の非限定的な例を図６０Ａおよび６０Ｂに示す。
【０３２１】
遺伝子調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するための重層的遺伝子調節回路を含む（例えば、その全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／１８４，８１１号参照）。
【０３２２】
特定の実施形態では、本発明は、アルギニンを過剰産生する遺伝子操作細菌を選択する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、代替代謝経路、例えば、ヒスチジン生合成経路、メチオニン生合成経路、リシン生合成経路、アスパラギン生合成経路、グルタミン生合成経路およびトリプトファン生合成経路により過剰のアンモニアを消費する遺伝子操作細菌を選択する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、突然変異アルギニンレギュロンおよびＡｒｇＲ調節２リプレッサー活性化遺伝子調節回路を含む遺伝子操作細菌を提供する。２リプレッサー活性化遺伝子調節回路は、アンモニアを減少させるまたは栄養要求体を救出する突然変異細菌についてスクリーニングするために有用である。いくつかの構築物において、高レベルのアルギニンおよびアルギニンによるＡｒｇＲの結果として生じる活性化は、細胞の生存に必要な検出可能なレベルまたは必須遺伝子の発現をもたらし得る。
【０３２３】
２リプレッサー活性化調節回路は、第１のＡｒｇＲおよび第２のリプレッサー、例えば、Ｔｅｔリプレッサーを含む。これらの実施形態の一態様では、ＡｒｇＲは、目的の特定の遺伝子の転写、例えば、過剰なアンモニアを消費する突然変異体、および／または細胞の生存に必要な必須遺伝子についてスクリーニングするために用いることができる、検出可能な産物を抑制する、第２のリプレッサーの転写を抑制する。ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびＧＦＰのような蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない、任意の検出可能な産物を用いることができる。いくつかの実施形態では、第２のリプレッサーは、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）である。この実施形態では、野生型ＡＲＧボックスを含むＡｒｇＲ抑制性プロモーターは、ＴｅｔＲの発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑制性プロモーターは、目的の少なくとも１つの遺伝子、例えば、ＧＦＰの発現を駆動する。ＡｒｇＲ結合の非存在（低アルギニン濃度で起こる）下では、ｔｅｔＲが転写され、ＴｅｔＲがＧＦＰの発現を抑制する。ＡｒｇＲ結合の存在（高アルギニン濃度で起こる）下では、ｔｅｔＲの発現が抑制され、ＧＦＰが発生する。これらの実施形態に有用な他の第２のリプレッサーの例は、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲおよびＰｔｘＳ（米国特許出願公開第２００３０１６６１９１号）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、スイッチを含む突然変異アルギニンレギュロンを突然変異誘発にかけ、アルギニンを過剰産生することによってアンモニアを減少させる突然変異体を、例えば、フローサイトメトリー、検出可能な産物が蛍光を発する場合には蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、検出可能な産物のレベルに基づいて選択する。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、細菌の生存および／または増殖に必要な遺伝子である。ＡｒｇＲの制御下を除いて遺伝子産物を産生しないようにするために対応する野生型遺伝子が除去または突然変異を起こさせた限り、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含むが、これらに限定されない、任意のそのような遺伝子を用いることができる。いくつかの実施形態では、野生型ＡＲＧボックスを含むＡｒｇＲ抑制性プロモーターは、ＴｅｔＲタンパク質の発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑制性プロモーターは、細菌の生存および／または増殖に必要な少なくとも１つの遺伝子、例えば、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡの発現を駆動する（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌が哺乳動物消化管内に存在する場合、補足されない遺伝子において栄養要求性であり、前記遺伝子は、細菌に存在する第２の誘導性遺伝子により補足され、第２の遺伝子の転写は、ＡｒｇＲ抑制性であり、十分に高い濃度のアルギニンの存在下で誘導される（ひいては栄養要求性遺伝子を補足する）。いくつかの実施形態では、２リプレッサー活性化回路を含む突然変異アルギニンレギュロン突然変異誘発にかけ、過剰のアンモニアを減少させる突然変異体を、生存および／または増殖に必要な遺伝子産物の非存在下での増殖により選択する。いくつかの実施形態では、２リプレッサー活性化回路を含む突然変異アルギニンレギュロンを用いて、細菌が高レベルのアルギニンの非存在下（例えば、消化管外）で生存しないことを確認する。
【０３２５】
宿主−プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、宿主−プラスミド相互依存性をもたらすように改変されたプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、ＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）必須の複製イニシエータータンパク質がトランスで配置されている、条件複製起点、（ｉｉ）ゲノム転位により宿主によって救出され、リッチ培地中の使用にも適合する栄養要求性の改変、および／または（ｉｉｉ）広域スペクトルの毒素をコードする核酸配列を含む。毒素遺伝子は、抗毒素を発現しない菌株（例えば、野生型細菌）に対してそれ自体不利であるプラスミドＤＮＡを作製することによりプラスミドスプレッド（ｓｐｒｅａｄ）を対照として選択するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗体分泌なしで少なくとも１００世代にわたり安定である。いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、宿主の増殖を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、本発明の遺伝子操作細菌における意図的でないプラスミドの増殖を著しく減少させるために用いられる。
【０３２６】
相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、単独で、または本明細書に記載のもの（例えば、キルスイッチ、栄養要求体）などの、他のバイオセフティ機能と組み合わせて用いることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数のキルスイッチを含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１つもしくは複数の栄養要求体を含む。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１つもしくは複数のキルスイッチおよび／または１つもしくは複数の栄養要求体を含む。
【０３２７】
プラスミド上の合成遺伝子回路発現は、短期では十分に機能し得るが、長期では能力および／または機能を失う（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、長期間にわたって目的の遺伝子を発現するための安定な回路を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管増強分子を産生することができ、毒素（ｈｏｋ）および短寿命抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素システムをさらに含み、プラスミドの喪失は、細胞が長寿命毒素により殺滅されることをもたらす（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年；図６８）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、枯草菌プラスミドｐＬ２０に由来するａｌｐ７をさらに含み、細胞分裂中の等しい分離を保証するために細胞の極にプラスミドを押すことができるフィラメントを産生する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５年）。
【０３２８】
キルスイッチ
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、キルスイッチも含む（例えば、それぞれが参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／１８３，９３５号、第６２／２６３，３２９号および第６２／２７７，６５４号参照）。キルスイッチは、外部刺激に反応して操作された微小生物を能動的に殺滅することを意図する。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために死ぬという栄養要求性突然変異と対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微小生物内の有毒分子の産生を誘導する環境中の特定の因子によって誘発される。
【０３２９】
キルスイッチにより操作された細菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究目的のために、例えば、実験室環境の外部へのバイオ燃料産生微生物の広がりを制限するために操作された。疾患または障害を治療するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために操作された細菌は、１つまたは複数の異種遺伝子、例えば、治療用遺伝子（複数可）の発現および送達の後または対象が治療効果を経験した後の特定に時点に死ぬようにプログラムを組むこともできる。例えば、いくつかの実施形態では、キルスイッチは、ａｒｇＡｆｂｒの酸素レベル依存性発現後の一定の期間の後に細菌を殺滅するように作動させる。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、ａｒｇＡｆｂｒの酸素レベル依存性発現後に例えば、アルギニンまたはシトルリンの産生の後に遅れて作動させる。あるいは、細菌は、細菌が疾患部位の外側に広がった後に死ぬように操作することができる。とりわけ、微生物による対象への長期住みつき、対象内の目的の範囲外への微生物の広がり（例えば、消化管の外側）、または対象の外側の微生物の環境中への広がり（例えば、対象の大便を介する環境への広がりを防ぐことは、有用であり得る。キルスイッチに用いることができるそのような毒素の例は、バクテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞ＤＮＡを分解すること、または他の機構により細胞死を引き起こす他の分子を含むが、これらに限定されない。そのような毒素は、個別にまたは組み合わせて用いることができる。それらの産生を制御するスイッチは、例えば、転写活性化（トグルスイッチ；例えば、Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００年参照）、翻訳（リボレギュレーター）またはＤＮＡ組換え（リコンビナーゼベースのスイッチ）に基づくものであってよく、嫌気状態または活性酸素種のような環境刺激を検知することができる。これらのスイッチは、単一環境因子により作動させることができるか、または細胞死をもたらすためにＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤおよびＮＯＲ論理構成のいくつかの活性化因子を必要とし得る。例えば、ＡＮＤリボレギュレータースイッチは、細胞膜を透過性にし、細胞を殺滅するリシンの発現を誘導するためのテトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）およびアラビノースにより活性化される。ＩＰＴＧは、エンドリシンおよびホリンｍＲＮＡの発現を誘導し、これらが次に、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって活性化される。細胞死をもたらすために３つの誘導物質のすべてが存在しなければならない。キルスイッチの例は、当技術分野で公知である（Ｃａｌｌｕｒａら、２０１０年）。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、ａｒｇＡｆｂｒの酸素レベル依存性発現の後の期間後に細菌を殺滅するために作動させる。いくつかの実施形態では、キルスイッチは、ａｒｇＡｆｂｒの酸素レベル依存性発現の後に遅らせて作動させる。
【０３３０】
キルスイッチは、毒素が環境条件もしくは外部シグナルに反応して産生される（例えば、細菌が外部キューに反応して殺滅される）ように設計する、または代わるべきものとして環境条件がもはや存在しなくなるもしくは外部シグナルが停止したならば、毒素が産生されるように設計することができる。
【０３３１】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、例えば、低酸素環境において外因性環境シグナルを感知した後に死ぬようにさらにプログラムされる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌、例えば、ａｒｇＡｆｂｒおよびリプッレサーＡｒｇＲを発現する細菌は、１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、その発現は、環境条件またはシグナルに反応した誘導され、細胞を殺滅する毒素の発現を最終的にもたらす１つまたは複数の組換え事象を引き起こす。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のレコンビナーゼによってフリップされた後に構成的に発現する細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素の構成的発現は、遺伝子操作細菌を殺滅する。これらの種類のキルスイッチシステムでは、操作細菌が外因性環境条件を感知し、目的の異種遺伝子を発現したならば、組換え細菌細胞は、もはや生存しない。
【０３３２】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌、例えば、ａｒｇＡｆｂｒおよびリプッレサーＡｒｇＲを発現する細菌が少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに反応して１つまたは複数のリコンビナーゼを発現し、遺伝子操作細菌は、外因性環境条件またはシグナルに反応して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、抗毒素は、毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作細菌の死を遅らせる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現しない場合、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。
【０３３３】
他の実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第２のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップした後に構成的に発現する。一実施形態では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第２のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、外因性環境条件に反応して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施形態では、抗毒素は、外因性環境条件が存在する場合に毒素の活性を阻害し、それにより遺伝子操作細菌の死を遅らせる。一実施形態では、外因性環境条件がもはや存在しない場合に抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現しない場合、遺伝子操作細菌は、細菌毒素により殺滅される。
【０３３４】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第２のリコンビナーゼによる第３のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングとそれに続く第３のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。
【０３３５】
一実施形態では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子のフリッピングである。一実施形態では、第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第１のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第１の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、第１の切除酵素は、第１の必須遺伝子を切除する。一実施形態では、プログラムされた組換え細菌細胞は、第１の必須遺伝子が切除された後に生存しない。
【０３３６】
一実施形態では、第１のリコンビナーゼは、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子をさらにフリップする。一実施形態では、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２のフォワードリコンビナーゼ認識配列と第２のリバースリコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施形態では、第２の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによりフリップされた後に構成的に発現する。一実施形態では、第１の必須遺伝子および第２必須遺伝子の両方が切除される場合、遺伝子操作細菌は、死ぬかまたはもはや生存できない。一実施形態では、第１のリコンビナーゼにより第１の必須遺伝子が切除されるかまたは第２の必須遺伝子が切除される場合、遺伝子操作細菌は、死ぬかまたはもはや生存できない。
【０３３７】
一実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起こった後に死ぬ。他の実施形態では、遺伝子操作細菌は、少なくとも１つの組換え事象が起こった後にもはや生存できない。
【０３３８】
これらの実施形態のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４からなる群またはその生物学的活性な断片から選択されるリコンビナーゼであり得る。
【０３３９】
上述のキルスイッチ回路において、毒素は、環境因子またはシグナルの存在下で産生される。キルスイッチ回路の他の態様では、毒素は、環境因子の存在下で抑制され（産生されず）、環境条件または外部シグナルがもはや存在しなくなれば、産生され得る。毒素が環境因子またはシグナルの存在下で抑制され（かつ外部シグナルが除去されたならば活性化される）例示的キルスイッチを図６６〜６８に示す。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を感知することにより１つまたは複数の異種遺伝子を発現する組換え細菌細胞を提供する。この態様では、組換え細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコードする、ａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の１つまたは複数の遺伝子を含む。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の遺伝子の転写を抑制する立体配座をとる。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、所望の遺伝子、例えば、毒素遺伝子の発現を抑制するｔｅｔＲの発現を誘導する、ａｒａＢＡＤプロモーターに結合し、活性化することを可能にする立体配座の変化を受ける。この実施形態では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境においては、ｔｅｔＲ遺伝子が活性化されず、毒素が発現し、それにより細菌を殺滅する。必須遺伝子がアラビノースまたは他の糖の存在下でのみ発現し、アラビノースまたは他の糖が環境に存在しない場合には発現しないという、アラビノース系を用いて、必須遺伝子を発現させることもできる。
【０３４０】
したがって、外因性環境中のアラビノースを感知することにより１つまたは複数の異種遺伝子が発現するいくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種遺伝子は、直接的または間接的にａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、発現異種遺伝子は、異種治療用遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、リプレッサータンパク質もしくはポリペプチド、例えば、ＴｅｔＲリプレッサーをコードする異種遺伝子、細菌細胞に見いだされない必須タンパク質をコードする異種遺伝子および／または調節タンパク質もしくはポリペプチドをコードする異種遺伝子のうちの１つまたは複数から選択される。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、直接的または間接的にａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。図１３に例示的なＢＡＤプロモーター駆動ａｒｇＡｆｂｒ構築物の概略図を示す。この実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、ａｒａＣ遺伝子とａｒａＤ遺伝子との間に挿入されている。ａｒｇＡｆｂｒは、リボソーム結合部位、ＦＲＴ部位および１つまたは複数の転写終結配列により隣接されている。例示的なＢＡＤプロモーター駆動ａｒｇＡｆｂｒ構築物の核酸配列を表１９に示す。すべての太字の配列はニッスルゲノムＤＮＡである。ａｒａＣ遺伝子の一部は太字の下線付きであり、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は囲み線付きであり、間の太字の配列は、アラビノースの存在下で活性化されるプロモーターである。リボソーム結合部位は斜体であり、終結配列は網掛け付きであり、ＦＲＴ部位は囲み線付きである。ａｒａＤ遺伝子の一部は点線の囲み線付きである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号６７のＢＡＤプロモーター配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号６７のＢＡＤプロモーター配列またはその機能性断片を含む。
【０３４２】
【表２１−１】
2018523978.tif 000065
【表２１−２】
2018523978.tif 000066
【表２１−３】
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【０３４３】
アラビノース誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＣおよびＰａｒａＢＡＤを含む。一実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、大腸菌に由来する。いくつかの実施形態では、ＰａｒａＣプロモーターおよびＰａｒａＢＡＤプロモーターは、二方向性プロモーターとして作動し、ＰａｒａＢＡＤプロモーターは、１つの方向の異種遺伝子（複数可）の発現を制御し、ＰａｒａＣ（ＰａｒａＢＡＤプロモーターに近接し、それと反対側の鎖上の）は、他の方向の異種遺伝子（複数可）の発現を制御する。アラビノースの存在下では、両プロモーターからの両異種遺伝子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの非存在下では、両プロモーターからの両異種遺伝子の転写は誘導されない。
【０３４４】
本開示の１つの例示的実施形態では、本開示の操作細菌は、少なくとも以下の配列：テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＣプロモーター、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＰＴｅｔＲ）により抑制されるプロモーターに作動可能に連結した細菌毒素をコードする異種遺伝子を有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、これがＴｅｔＲタンパク質の転写を活性化し、これが次に毒素の転写を抑制する。しかし、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣがＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、ＴｅｔＲタンパク質は発現しない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、毒素が発現する。毒素は、組換え細菌細胞中に蓄積し、組換え細菌細胞は殺滅される。一実施形態では、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、したがって、構成的に発現する。
【０３４５】
本開示の一実施形態では、組換え細菌細胞は、構成的プロモーターの制御下の抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲタンパク質による抑制のため、毒素が発現せず、抗毒素タンパク質が細胞中に蓄積する。しかし、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し始める。毒素タンパク質が細胞中の抗毒素タンパク質の量と等しいかまたはそれより多量に存在したならば、組換え細菌細胞がもはや生存できず、組換え細菌細胞は、毒素により殺滅される。
【０３４６】
本開示の他の実施形態では、組換え細菌細胞は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下の抗毒素をさらに含む。この状況において、アラビノースの存在下では、ＴｅｔＲおよび抗毒素が発現し、抗毒素が細胞中に蓄積し、ＴｅｔＲタンパク質による抑制により、毒素は、発現しない。しかし、アラビノースの非存在下では、ＴｅｔＲタンパク質および抗毒素の両方が発現せず、毒素の発現が誘導される。毒素は、組換え細菌細胞内に蓄積し始める。毒素タンパク質が発現したならば、組換え細菌細胞がもはや生存できず、組換え細菌細胞は、毒素により殺滅される。
【０３４７】
本開示の他の例示的実施形態では、本開示の操作細菌は、少なくとも以下の配列を有するキルスイッチを含む：組換え細菌細胞中に見いだされない（かつ生存に必要な）必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーターおよびＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＣプロモーター。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子がＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌細胞が生存することが可能になる。しかし、アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣがＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質が発現しない。この場合、組換え細菌細胞は、アラビノースの非存在下で死ぬ。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞に見いだされない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、直前に述べたＴｅｔＲ／毒素キルスイッチシステムとともに細菌細胞中に存在し得る。いくつかの実施形態では、組換え細菌細胞に見いだされない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結したＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、直前に述べたＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチシステムとともに細菌細胞中に存在し得る。
【０３４８】
他の実施形態では、細菌は、短寿命抗毒素および長寿命毒素の両方を産生するプラスミドを含むプラスミド安定システムを含み得る。このシステムでは、細菌細胞は、毒素を中和するために等量の毒素および抗毒素を産生する。しかし、細胞がプラスミドを失うならば／場合、短寿命抗毒素は、減衰し始める。抗毒素が完全に減衰した場合、長寿命毒素が細胞を殺滅した結果として、細胞は死ぬ。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、本開示の操作細菌、例えば、ａｒｇＡｆｂｒおよびリプレッサーＡｒｇＲを発現する細菌は、上述のキルスイッチ回路のいずれかの構成要素をコードする遺伝子（複数可）をさらに含む。
【０３５０】
上述の実施形態のいずれかにおいて、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、ミクロシンＢ、ミクロシンＢ１７、ミクロシンＣ、ミクロシンＣ７−Ｃ５１、ミクロシンＪ２５、ミクロシンＣｏｌＶ、ミクロシン２４、ミクロシンＬ、ミクロシンＤ９３、ミクロシンＬ、ミクロシンＥ４９２、ミクロシンＨ４７、ミクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシンＩｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６；コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭおよびクロアシンＤＦ１３、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される。
【０３５１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、抗毒素は、抗リシン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ｙａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤおよびＣｍｉ、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される。
【０３５２】
一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子操作細菌に対して殺菌性である。一実施形態では、細菌毒素は、遺伝子操作細菌に対して静菌性である。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に示す操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンが同じ条件下の同じ細菌亜型の非改変レギュロンより多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生するように、アルギニン生合成経路における、グルタミン酸をアルギニンおよび／または中間副産物、例えば、シトルリンに変換することに関与する酵素をコードするオペロンのそれぞれのアルギニン媒介抑制を低減または消失させる１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼアルギニノコハク酸リアーゼおよびカルバモイルリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、それにより、レギュロンを活性化し、アルギニンおよび／または中間副産物の生合成を増強する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、酸素レベル依存性プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーター、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元（ＡＮＲ）プロモーターおよび異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）プロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、ａｒｇＡｆｂｒである。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異アルギニンレギュロンを含み、細菌は、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較してアルギニンフィードバック阻害を減少させるように突然変異させた機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、突然変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子の発現は、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにより制御され、突然変異アルギニンレギュロンは、アルギニン合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼをコードする遺伝子を含む１つまたは複数のオペロンを含み、各オペロンは、ＡｒｇＲリプレッサーの結合によりオペロンのアルギニン媒介抑制を低減させる１つまたは複数の核酸突然変異を特徴とする１つまたは複数の突然変異ＡＲＧボックスを含み、オペロンにおける遺伝子の転写を促進するのに十分な親和性を有するＲＮＡポリメラーゼ結合を保持している。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む栄養要求体である。一実施形態では、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求体から選択される栄養要求体である。いくつかの実施形態では、操作細菌は、複数の栄養要求性を有する。例えば、それらは、ΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求体であり得る。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌は、本明細書で示すキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および逆方向毒素配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の逆方向切除遺伝子をさらに含み、切除遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下の毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子およびＰａｒａＢＡＤのような、アラビノースにより誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をコードするオペロンのそれぞれの少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンレギュロンを含み、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む栄養要求体である。
【０３５８】
上述の遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で作動可能に連結されている。他の実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌染色体に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに染色体において作動可能に連結されている。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンリプッレサー機能が低下もしくは不活性である、あるいは遺伝子操作細菌がアルギニンリプッレサーを有さず（例えば、アルギニンリプッレサー遺伝子が欠失した）、レギュロンの抑制解除ならびにアルギニンおよび／または中間副産物の生合成の増大をもたらすような１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異アルギニンリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、酸素レベル依存性プロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにより制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーター、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元（ＡＮＲ）プロモーターおよび異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）プロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体は、ａｒｇＡｆｂｒである。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、アルギニンレギュロンを含み、細菌は、同じ条件下の同じ細菌亜型の野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して低いアルギニンフィードバック阻害を有する機能性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を含み、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子の発現は、外因性環境条件により誘導されるプロモーターにより制御され、細菌は、機能性ＡｒｇＲリプレッサーを欠くように遺伝子操作された。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操作細菌は、栄養要求体である。一実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操作細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求体から選択される栄養要求体である。いくつかの実施形態では、操作細菌は、複数の栄養要求性を有する。例えば、それらは、ΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求体であり得る。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む遺伝子操作細菌は、本明細書で示したキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および逆方向毒素配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の逆方向切除遺伝子をさらに含み、切除遺伝子（複数可）は、必須遺伝子を欠失させる酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターの制御下の毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子およびＰａｒａＢＡＤのような、アラビノースにより誘導される誘導性プロモーターの制御下のＴｅｔＲをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、抗毒素をコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、突然変異または欠失アルギニンリプレッサーおよびアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体を含む栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかのような、キルスイッチ回路をさらに含む。
【０３６４】
上述の遺伝子操作細菌のいくつかの実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌におけるプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターにプラスミド上で作動可能に連結されている。他の実施形態では、アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子は、細菌染色体に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに染色体において作動可能に連結されている。
【０３６５】
アンモニア輸送体
細胞内へのアンモニアの輸送を増大させるために本発明の遺伝子操作細菌におけるアンモニア輸送体をさらに発現させるまたは改変することができる。ＡｍｔＢは、アンモニアを細菌細胞内に輸送する膜輸送タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、天然ａｍｔＢ遺伝子の複数のコピーも含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、異なる細菌種に由来するａｍｔＢ遺伝子も含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、異なる細菌種に由来するａｍｔＢ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、その天然プロモーター、誘導性プロモーター、または天然プロモーターより強いプロモーター、例えば、ＧｌｎＲＳプロモーター、Ｐ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターにより制御されるａｍｔＢ遺伝子を含む。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、天然ａｍｔＢ遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーが、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にゲノムに挿入されている。代替実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、異なる細菌種に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にゲノムに挿入されている。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌における天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、天然ａｍｔＢ遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーが、細菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。代替実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、異なる細菌種に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、細菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子に突然変異を起こさせ、アンモニア輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異体したａｍｔＢ遺伝子を単離し、遺伝子操作細菌に挿入する。いくつかの実施形態では、天然ａｍｔＢ遺伝子に突然変異を起こさせ、アンモニア輸送の増加を示す突然変異体を選択し、それらの突然変異体を用いて、本発明の細菌を作製する。本明細書に記載のアンモニア輸送体の改変は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、大腸菌ニッスルであり、大腸菌ニッスルにおける天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、天然大腸菌ニッスルａｍｔＢ遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーが、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下に大腸菌ニッスルゲノムに挿入されている。代替実施形態では、大腸菌ニッスルにおける天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、異なる細菌、例えば、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下に大腸菌ニッスルゲノムに挿入されている。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、大腸菌ニッスルであり、大腸菌ニッスルにおける天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、天然大腸菌ニッスルａｍｔＢ遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーが、細菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。代替実施形態では、大腸菌ニッスルにおける天然ａｍｔＢ遺伝子は、改変されておらず、異なる細菌、例えば、ラクトバシラス・プランタルムに由来する非天然ａｍｔＢ遺伝子のコピーが、細菌におけるプラスミド上に存在し、ａｒｇＡｆｂｒの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒｇＡｆｂｒの発現を制御するものと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
【０３７１】
医薬組成物および製剤
本明細書に記載の遺伝子操作細菌を含む医薬組成物は、高アンモニア血症に関連する障害または高アンモニア血症に随伴する症状（複数可）を治療する、管理する、改善する、かつ／または予防するために用いることができる。１つまたは複数の遺伝子操作細菌を、単独でまたは予防薬、治療薬および／または薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【０３７２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように操作された細菌の１つの種、菌株または亜型を含む。代替実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように操作された細菌の２つまたはそれ以上の種、菌株および／または亜型を含む。
【０３７３】
本明細書に記載の医薬組成物は、有効成分を医薬用組成物に加工することを促進する、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を用いて通常の方法で製剤化することができる。医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野で公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ参照）。いくつかの実施形態では、医薬組成物を打錠、凍結乾燥、直接圧縮、常法による混合、溶解、造粒、研和、乳化、カプセル封入、封入または噴霧乾燥にかけて、腸溶コーティングを施しても非被覆であってもよい、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット剤または散剤を形成する。適切な製剤は、投与経路に依存する。
【０３７４】
本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液剤、カプセル剤、サシェ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、腸溶性錠剤、懸濁散剤、顆粒剤または経口投与用のマトリックス持続放出製剤）の、および任意の適切な種類の投与（例えば、経口、局所、注射、即時放出、拍動性放出、遅延放出または持続放出）用の医薬組成物に製剤化することができる。遺伝子操作細菌の適切な投与量は、約１０５〜１０１２細菌、例えば、約１０５細菌、約１０６細菌、約１０７細菌、約１０８細菌、約１０９細菌、約１０１０細菌、約１０１１細菌または約１０１１細菌の範囲であり得る。組成物は、１日、週または月１回もしくは複数回投与することができる。組成物は、食事の前、食事中または後に投与することができる。一実施形態では、対象が食事をとる前に医薬組成物を投与する。一実施形態では、医薬組成物を食事と同時に投与する。一実施形態では、対象が食事をとった後に医薬組成物を投与する。
【０３７５】
組成物は、日、週または月１回もしくは複数回投与することができる。遺伝子操作細菌は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝液、緩衝剤、界面活性剤、中性もしくは陽イオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または物質を含む医薬組成物に製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコールならびに例えば、ポリソルベート２０を含む表面活性剤の添加を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、重炭酸ナトリウムの溶液、例えば、重炭酸ナトリウムの１モル溶液（例えば、胃などの、酸性細胞環境を緩衝するために）に製剤化することができる。遺伝子操作細菌は、中性または塩の形態として投与すること、かつ製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの陰イオンとで形成されるものならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの陽イオンとで形成されるものを含む。
【０３７６】
本明細書で開示した遺伝子操作細菌は、軟膏剤、クリーム剤、経皮貼付剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー、噴霧剤、エアゾール剤、液剤、乳剤の形態でまたは当業者に周知の他の形態で局所投与すること、かつ製剤化することができる。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照されたい。一実施形態では、非噴霧用局所剤形については、局所適用に適合性であり、水より大きい動粘度を有する担体または１つもしくは複数の賦形剤を含む粘稠から半固体または固体剤形が用いられる。適切な製剤は、滅菌することができるまたは様々な特性、例えば、浸透圧に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合することができる、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、塗布剤、軟膏剤等を含むが、これらに限定されない。他の適切な局所剤形は、有効成分が固体または液体不活性担体と一緒に加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状噴射剤）との混合物でまたはスクィーズボトルに包装されている噴霧用エアゾール製剤を含む。保湿剤または湿潤剤も医薬組成物および製剤に加えることができる。そのような付加的な成分の例は、当技術分野で周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生用品として製剤化することができる。例えば、衛生用品は、抗菌製剤または発酵ブロスなどの発酵製品であり得る。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、パスタ、ローションおよびリップクリームであり得る。
【０３７７】
本明細書で開示した遺伝子操作細菌は、経口投与することができ、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として製剤化することができる。経口用医薬組成物は、固体賦形剤を用い、得られた混合物を場合によって粉砕し、所望の場合、適切な補助剤を加えた後に、顆粒剤の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを製造することができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖などの増量剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーを含むが、これらに限定されない。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤も加えることもできる。
【０３７８】
錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ゴム、カオリンおよびトラガント）；増量剤（例えば、ラクトース、結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて通常の手段により調製することができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法により被覆することができる。コーティングシェルが存在していてもよく、一般的な膜は、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギネート−ポリリシン−アルギネート（ＡＰＡ）、アルギネート−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギネート（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルアクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メチルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、珪質カプセル化物、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸ナトリウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ゲラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−−ｃｏグリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸および腸溶コーティングポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、消化管または消化管の特定の領域、例えば、大腸内への放出のために腸溶コーティングを施す。胃から結腸までの一般的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）および５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルを修正することができる。いくつかの実施形態では、コーティングは、放出部位を規定するために特定のｐＨ環境において分解する。いくつかの実施形態では、少なくとも２種のコーティングを用いる。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングが異なるｐＨレベルで分解する。
【０３８０】
経口投与用の液体製剤は、液剤、シロップ剤、懸濁剤または使用前に水もしくは他の適切な媒体で構成するための乾燥製剤の形態をとり得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される物質を用いて通常の手段により調製することができる。製剤は、適宜、緩衝塩類、着香料、着色剤および甘味料も含み得る。経口投与用の製剤は、本明細書に記載の遺伝子操作細菌の徐放、制御放出または持続放出用に適切に製剤化することができる。
【０３８１】
一実施形態では、本開示の遺伝子操作細菌は、小児対象への投与に適する組成物に製剤化することができる。当技術分野で周知のように、小児は、胃排出速度、ｐＨ、消化管透過性等を含む多くの面で成人と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら、２０１４年）。さらに、投与経路および味覚特性などの、小児用製剤の受容性および好みは、容認できる小児のコンプライアンスを達成するために重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、飲み込み易い若しくは溶ける剤形、または添加着香料、甘味料もしくは味覚ブロッカーを含む組成物などの、より味の良い組成物を含み得る。一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、成人への投与に適するものでもあり得る。
【０３８２】
一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤もしくは液剤として再構成するための散剤、分散／発泡錠、咀嚼錠剤、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ剤、チューインガム、経口薄型ストリップ、口内崩壊錠剤、サシェ剤、軟ゼラチンカプセル剤、振りかけ経口散剤、または顆粒剤を含み得る。一実施形態では、組成物は、キャンディーに弾性、所望の噛みごたえのある堅さおよびより長い貯蔵寿命を与える、ゼラチン基剤から製造されるグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーは、甘味料または着香料も含み得る。
【０３８３】
一実施形態では、小児対象への投与に適する組成物は、着香料を含み得る。本明細書で使用する場合、「着香料」は、製剤に明白な風味および芳香をもたらす物質（液体または固体）である。着香料は、製剤の食味を改善する助けともなる。着香料は、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、風船ガムおよびチェリーを含むが、これらに限定されない。
【０３８４】
特定の実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、不活性希釈剤または同化可食性担体とともに経口投与することができる。この化合物は、硬もしくは軟シェルゼラチンカプセルに封入、錠剤に圧縮、または対象の食事に直接混入することもできる。経口治療投与のために、化合物は、賦形剤とともに組込み、摂食できる錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハースなどの形態で用いることができる。非経口投与以外により化合物を投与するためには、その不活性化を防ぐための材料で化合物を被覆すること、またはそれ共に化合物を同時投与することが必要であり得る。
【０３８５】
他の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、摂食可能な製剤、例えば、食品であり得る。一実施形態では、食品は、乳、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酸乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉乳、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜果実ジュース、果実ジュース、スポーツ飲料、菓子類、砂糖菓子、乳児食（乳児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品などの、発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品は、ヨーグルトである。他の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、乳、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキまたはケフィアである。他の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することを意図する他の生菌細胞を含む製剤に組み込む。他の実施形態では、食品は、飲料である。一実施形態では、飲料は、果実ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブエキスを含む飲料である。他の実施形態では、食品は、ゼリーまたはプリンである。本発明の組換え細菌の投与に適する他の食品は、当技術分野で周知である。例えば、それぞれの内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および米国特許出願公開第２０１５／０２３８５４５号を参照されたい。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルトまたはチーズなどの、食品に注入、噴霧、または振りかける。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングを施したまたは非被覆の、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセルまたは微小錠剤による、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃シャント投与または結腸内投与用に製剤化する。医薬組成物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を用いた、坐剤または停留かん腸剤などの直腸組成物に製剤化することもできる。組成物は、油性または水性媒体中懸濁剤、液剤または乳剤であってよく、懸濁化、安定化および／または分散剤を含み得る。
【０３８７】
本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、エアゾールの形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の形態に製剤化して鼻腔内に投与し、また適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を用いることにより、加圧パックまたはネブライザーからエアゾール噴霧剤の形態で好都合に送達することができる。加圧エアゾールの投与単位は、定量を送出するために弁を備えることによって決定することができる。吸入器または吹送器に用いるカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンの）は、ラクトースまたはデンプンなどの化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤を含むものを製剤化することができる。
【０３８８】
遺伝子操作細菌は、デポ製剤として投与し、製剤化することができる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込みにより、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射を含む注射、もしくは注入により投与することができる。組成物は、例えば、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはわずかに溶ける誘導体として（例えば、わずかに溶ける塩として）製剤化することができる。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、単一剤形の、薬学的に許容される組成物を本明細書で開示する。単一剤形は、液体または固形であり得る。単一剤形は、変更なしに患者に直接投与することができ、または投与前に希釈もしくは再構成することができる。特定の実施形態では、単一剤形は、ボーラス型で、例えば、単回注射で、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤等を含む経口投与を含む、単回経口投与で投与することができる。代替実施形態では、単一剤形は、例えば、注入により、一定の時間にわたって投与することができる。
【０３９０】
医薬組成物の単一剤形は、医薬組成物を、より小さい分割量、一回量容器、一回量液体製剤、または腸溶コーティングを施しても非被覆であってもよい、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット剤もしくは散剤などの、一回量固形製剤に分割することによって用意することができる。固形製剤の一回量は、患者への投与前に液体、一般的に滅菌水または生理食塩水を加えることにより再構成することができる。
【０３９１】
他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いて、本開示の治療薬の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号参照）。持続放出製剤に用いられるポリマーの例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリメタクルリル酸、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステルを含むが、これらに限定されない。持続放出製剤に用いられるポリマーは、不活性で、浸出性不純物を含まず、保存で安定で、滅菌で、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出システムは、予防および治療標的の近くに配置することができ、したがって、全身投与量の一部を必要とするにすぎない。当業者に公知の任意の適切な技術を用いることができる。
【０３９２】
投与計画は、治療反応をもたらすように調節することができる。投与は、疾患の重症度および反応性、投与経路、治療の時間経過（数日から数カ月、さらには数年）ならびに疾患の改善までの時間などのいくつかの因子に依存し得る。例えば、単回ボーラスは、１回で投与することができ、いくつかの分割量を所定の期間にわたって投与することができ、あるいは治療状況によって示される通りに減量または増量することができる。用量の明細は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果によって決定づけられる。投与量は、緩和されるべき状態の種類および重症度によって異なり得る。個別の対象について、個々の必要および担当臨床医の専門的判断に従って具体的な投与計画を長期にわたって調節することができる。本明細書で示す化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬学的方法により判断することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０およびＩＣ５０を決定することができ、毒性および治療効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として計算することができる。毒性副作用を示す組成物は、副作用を低減するために起こり得る被害を最小限にする注意深い修正を加えて用いることができる。投与は、最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイならびに動物試験から得られるデータは、ヒトに用いる一連の用量を策定するのに用いることができる。
【０３９３】
成分は、例えば、活性薬剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器に入れた乾燥凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として、単位剤形で別個にまたは一緒に混合して供給される。投与方法が注射による場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを用意することができる。
【０３９４】
医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器に包装することができる。一実施形態では、医薬組成物のうちの１つまたは複数を密閉容器に入れた乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として供給し、対象への投与に適切な濃度に再構成することができる（例えば、水または生理食塩水で）。一実施形態では、予防もしくは治療薬または医薬組成物のうちの１つまたは複数を２℃〜８℃で保存された密閉容器に入れた乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給し、再構成した後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内または１週間以内に投与する。凍結乾燥剤形について主として０〜１０％スクロース（最適には０．５〜１．０％）などの凍結防止剤を含めることができる。他の適切な凍結防止剤は、トレハロースおよびラクトースを含む。他の適切な充填剤は、いずれかを０〜０．０５％の濃度で含めることができる、グリシンおよびアルギニン、ならびにポリソルベート８０（０．００５〜０．０１％の濃度で任意選択で含める）を含む。さらなる界面活性剤は、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤を含むが、これらに限定されない。医薬組成物は、注射用容器として調製することができ、吸収または分散を高めるために用いられるもの、例えば、ヒアルロニダーゼなどの佐剤として有用な物質をさらに含み得る。
【０３９５】
治療の方法
本発明の他の態様は、高アンモニア血症に関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、これらの疾患または障害に随伴する１つもしくは複数の症状を低減、改善または消失させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの尿素回路異常症である。代替実施形態では、障害は、肝性脳症、急性肝不全もしくは慢性肝不全などの肝臓障害；有機酸障害；イソ吉草酸尿症；３−メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸尿症；脂肪酸酸化欠損症；カルニチン回路欠損症；カルニチン欠乏症；β−酸化欠損症；リジン尿性タンパク不耐症；ピロリン−５−カルボキシレートシンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；炭酸脱水素酵素欠損症；インスリン過剰症高アンモニア血症症候群；ミトコンドリア障害；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法；完全腸管外栄養；グリシン含有溶液を用いる膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後；門脈体静脈短絡；尿路感染症；尿管拡張症；多発性骨髄腫；化学療法；感染症；神経因性膀胱；または腸内細菌異常増殖である。いくつかの実施形態では、それに随伴する症状（複数可）は、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力障害、急性脳症、脳浮腫ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシスおよび低体温症を含むが、これらに限定されない。
【０３９６】
方法は、本明細書に記載の細菌の少なくとも１つの遺伝子操作種、菌株または亜型を含む医薬組成物を調製し、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、液体懸濁剤で経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、ゲルキャップ中で凍結乾燥し、経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、胃管または胃シャントにより投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、直腸に、例えば、かん腸剤により投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、局所、腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および／または結腸内投与する。
【０３９７】
特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与により、対象におけるアンモニア濃度が低下する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象におけるアンモニア濃度を無処置または対照対象におけるレベルと比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低下させ得る。いくつかの実施形態では、低下は、医薬組成物の投与の前および後の対象におけるアンモニア濃度を比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、高アンモニア血症を治療または改善する方法は、状態または障害の１つもしくは複数の症状が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上改善することを可能にする。
【０３９８】
医薬組成物の投与前、投与中および後に、対象におけるアンモニア濃度は、血液、血清、血漿、尿、糞便物質、腹水、腸粘膜剥離物などの生物学的試料、組織から採取した試料、および／または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肛門管のうちの１つもしくは複数の内容物から採取した試料について測定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、対象におけるアンモニア濃度を、検出できないレベルに、または治療前の対象のアンモニア濃度の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％もしくは８０％より低いレベルに低下させるための本発明の組成物の投与を含み得る。
【０３９９】
特定の実施形態では、突然変異アルギニンレギュロンを含む遺伝子操作細菌は、大腸菌ニッスルである。遺伝子操作細菌は、例えば、消化管内もしくは血清中の防御因子（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）により、または投与の数時間もしくは数日後にキルスイッチの活性化により、殺滅することができる。したがって、突然変異アルギニンレギュロンを含む医薬組成物は、治療有効量および頻度で再投与することができる。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのニッスルの滞留期間を図３４および３５に示す。代替実施形態では、遺伝子操作細菌は、投与後数時間または数日以内に殺滅されず、増殖し、消化管にコロニー形成し得る。
【０４００】
医薬組成物は、単独で、またはフェニル酪酸ナトリウム、安息香酸ナトリウムおよびフェニル酪酸グリセロールを含むが、これらに限定されない、１つもしくは複数の追加の治療薬と併用して投与することができる。１つもしくは複数の追加の治療薬の選択に際して考慮すべき重要な事柄は、薬剤（複数可）が本発明の遺伝子操作細菌に適合すべきであること、例えば、薬剤（複数可）が細菌を殺滅してはならないことである。
【０４０１】
一実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥの予防、治療または管理のために投与する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、ＨＥの再発を防ぐための他の治療アプローチと併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、分枝鎖アミノ酸補足と併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、アセチル−１−カルニチンおよび／または安息香酸ナトリウムおよび／または亜鉛および／またはアカルボースおよび／またはオルニチンアスパラギン酸と併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、患者におけるＨＥを治療し、かつ予防するために一般的に適用される、非吸収性二糖類と併用して投与する。一実施形態では、遺伝子操作細菌は、ラクトースおよび／またはラクチトールと併用して投与する。
【０４０２】
一実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ＨＥの治療用の１つまたは複数の抗生物質と併用して投与する。そのような抗生物質の例は、アミノグリコシド、例えば、ネオマイシンおよび／またはパラモマイシンなどの、非吸収性抗生物質を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、抗生物質は、リファマイシンである。一実施形態では、抗生物質は、リファマイシン誘導体、例えば、リファキシミンを含むが、これに限定されない、合成誘導体である。
【０４０３】
リファキシミンは、６カ月間にわたって、プラセボと比較して、肝性脳症のエピソードのリスクを著しく低下させることが示された（Ｂａｓｓら、Ｒｉｆａｘｉｍｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０；３６２巻：１０７１〜１０８１頁）。リファキシミンは、リファンピンの半合成誘導体であり、細菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニットに結合することにより作用し、それによって転写を阻止する。結果として、細菌のタンパク質合成および増殖が抑制される。
【０４０４】
リファキシミンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび臨床試験の両方において大腸菌に対して活性であることが示された。したがって、リファキシミンとの併用療法が有効であるために、遺伝子操作細菌がリファキシミン耐性をさらに含まなければならないことが理解される。
【０４０５】
リファキシミンに対する耐性は、ｒｐｏＢ遺伝子の突然変異によって主としてもたらされる。これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ上の結合部位を変化させ、リファキシミン結合親和性を低下させ、それにより、有効性を低下させる。一実施形態では、リファキシミン耐性は、ｒｐｏＢ遺伝子における突然変異である。そのような突然変異の非限定的な例は、例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｅｒｄｕｇｏ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｒｅｓｓ、ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２０１３年２月２２日、１３巻：５０頁に記載されている。注目すべきことに、ｒｐｏＢ共通配列の同じ３コドンにおける突然変異が数種の細菌種の無関係のリファキシミン耐性臨床分離株において反復して起こる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ：総説においてレビューされている；その内容がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（２０１４年）、１〜６頁）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、例えば、ｒｐｏＢ遺伝子における公知のリファキシミン耐性突然変異を含む。他の実施形態では、リファキシミン耐性をもたらす有用な突然変異を同定するために、遺伝子操作細菌を漸増量のリファキシミンに曝露する、スクリーニングを用いることができる。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物を食物とともに投与する。代替実施形態では、食物を摂食する前または後に医薬組成物を投与する。医薬組成物を、１つまたは複数の食事改善、例えば、低タンパク質食およびアミノ酸補給と併用して投与することができる。医薬組成物の用量および投与頻度は、症状の重症度および障害の進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効量および／または投与頻度は、担当臨床医が選択することができる。
【０４０７】
表２０に高アンモニア血症患者（ＵＣＤ＜ＨＥ）におけるフェニルアラニンの平均レベルに基づく、標的分解速度の非限定的な例を示す。
【０４０８】
【表２２】
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【０４０９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療
本発明の遺伝子操作細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。高アンモニア血症に関連する疾患または状態の任意の適切な動物モデル（例えば、Ｄｅｉｇｎａｎら、２００８年；Ｎｉｃａｉｓｅら、２００８年参照）、例えば、急性肝不全および高アンモニア血症のマウスモデルを用いることができる。この急性肝不全および高アンモニア血症は、チオールアセトアミド（ＴＡＡ）による処理により誘発することができる（Ｂａｓｉｌｅら、１９９０年；Ｎｉｃａｉｓｅら、２００８年）。あるいは、肝損傷は、物理的胆管結紮を用いてモデル化することができる（Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。高アンモニア血症は、酢酸アンモニウムおよび／または塩化マグネシウムの経口補給によっても誘発することができる（Ａｚｏｒｉｎら、１９８９年；Ｒｉｖｅｒａ−Ｍａｎｃｉａら、２０１２年）。
【０４１０】
さらに、ＣＣｌ４は、動物における肝線維症および肝硬変を誘発するためにしばしば用いられる（Ｎｈｕｎｇら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ；  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４年、１巻（２号）：４３〜４９頁）。
【０４１１】
本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、強制経口投与により動物に投与し、例えば、血液試料中のアンモニアおよび／または糞便試料中のアルギニン、シトルリンもしくは他の副産物を測定することによって治療有効性を判定することができる。
【０４１２】
本明細書を通して引用した参考文献の完全な典拠は、以下の通りである。
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２．Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４  Ａｐｒ  ９；４０（３）：２２３−２２９．ＰＭＩＤ：１５０３９０９８．
３．Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｒａｃｉｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒａＡ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５  Ａｐｒ；１７７（８）：２００８−２０１３．ＰＭＩＤ：７７２１６９３．
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１７．Ｃａｌｌｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ，ｔｕｎｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ｓｅｐ  ７；１０７（３６）：１５８９８−１５９０３．ＰＭＩＤ：２０７１３７０８．
１８．Ｃａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．ＱＪＭ．２０１０  Ｊａｎ；１０３（１）：９−１６．ＰＭＩＤ：１９９０３７２５．
１９．Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＤＮＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｈａｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９  Ｓｅｐ；１５５（Ｐｔ  ９）：２８３８−２８４４．ＰＭＩＤ：１９４７７９０２．
２０．Ｃｅｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｒａｍｐ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６  Ｊｕｎ；１２（６）：２０１−２０４．ＰＭＩＤ：８９２８２２１．
２１．Ｃｈａｒｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２．Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｊｕｌ  ２０；２２６（２）：３６７−３８６．ＰＭＩＤ：１６４０４５６．
２２．Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ  ｂｙ  ｍｕｔａｎｔ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００７  Ｍａｒ  １；１６（５）：４８３−４９８．ＰＭＩＤ：１７２１３２３３．
２３．Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ：ｈｏｗ  ａｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｈｉｐｐｅｄ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ？  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２０１５；  ３７０：２０１５００２５．ＰＭＩＤ：２６３７０９３７．
２４．Ｃｏｒｄｏｂａ  Ｊ，Ｍｉｎｇｕｅｚ  Ｂ．Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２００８；  ２８（１）：７０−８０．ＰＭＩＤ：１８２９３２７８．
２５．Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５；１３（６）：３４３−３５９．ＰＭＩＤ：２５９７８７０６．
２６．Ｃｒａｂｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＲＧ７  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｌｓｏ  ｅｎｄｏｗｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７  Ｄｅｃ  １；２５０（２）：２３２−２４１．ＰＭＩＤ：９４２８６６９．
２７．Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  Ｊｕｎ  ２２；１０７（２５）：１１５３７−４２．ＰＭＩＤ：２０５３４５２２．
２８．Ｃｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８３  Ａｕｇ  １１；１１（１５）：５００７−５０１９．ＰＭＩＤ：６３４８７０３．
２９．Ｃｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９８６  Ｓｅｐ；５０（３）：３１４−５２．Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９８７  Ｍａｒ；５１（１）：１７８．ＰＭＩＤ：３５３４５３８．
３０．Ｄａｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｍａｙ  ２７；７（２８９）：２８９ｒａ８４．ＰＭＩＤ：２６０１９２２０．
３１．Ｄｅｉｇｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２００８  Ｊａｎ；９３（１）：７−１４．ＰＭＩＤ：１７９３３５７４．
３２．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ．Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８  Ａｐｒ；１１（２）：８７−９３．ＰＭＩＤ：１８３５９２６９．
３３．Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｍｏｎｉａ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｍｏｎｇ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１３  Ｊｕｎ；５７（６）：２１７１−９．ＰＭＩＤ：２２９６１７２７．
３４．Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ  ＣＮＣＭ  Ｉ−７４５  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｎｏｖ；１４（１１）：１５９３−６０９．ＰＭＩＤ：２４９９５６７５．
３５．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ．Ａ  ｎｅｗ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐａｒｓｅ  ｆｕｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｊ  Ｈｅｒｅｄ．１９７４  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；６５（３）：１９４−５．ＰＭＩＤ：４６０３２５９．
３６．Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ  １２．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９７５  Ｊｕｎ  １９；１３８（３）：２２５−３２．ＰＭＩＤ：１１０２９３１．
３７．Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８９  Ｊｕｌ；３（７）：８６９−７８．ＰＭＩＤ：２６７７６０２．
３８．Ｆｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１０．３．１−１０．３．３３）．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
３９．Ｇａｌｉｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＦＮＲ−ｌｉｋｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１  Ｍａｒ；１７３（５）：１５９８−６０６．ＰＭＩＤ：１９００２７７．
４０．Ｇａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｃＤＡＢＣ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１  Ａｕｇ；１７３（１５）：４７４２−５０．ＰＭＩＤ：１９０６８７１．
４１．Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｇｇｌｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０３：３３９−４２．ＰＭＩＤ：１０６５９８５７．
４２．Ｇｏｒｋｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８  Ａｕｇ；６（８）：６１３−２４．ＰＭＩＤ：１８６２８７６９．
４３．Ｈａｂｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．２０１２  Ｍａｙ  ２９；７：３２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２６４２８８０．
４４．Ｈａｂｅｒｌｅ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１３  Ａｕｇ  １５；５３６（２）：１０１−８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３６２８３４３．
４５．Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＦＮＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ＤＮＲ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｉｔｒｉｔｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９８  Ｓｅｐ  １５；１６６（２）：２１３−７．ＰＭＩＤ：９７７０２７６．
４６．Ｈｏｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｐｆａｓｈ  ｍｏｕｓｅ：ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｌｓｏ  ｃａｕｓｅｓ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８９  Ｊｕｎ；８６（１１）：４１４２−６．ＰＭＩＤ：２４７１１９７．
４７．Ｈｏｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｎｉｔｒｏｕｓ−ｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  Ｎｏｖ  １５；２１８（１）：４９−５７．ＰＭＩＤ：８２４３４７６．
４８．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ．Ｈａｎｄｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３；１１３：１７５５−７３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３６２２３９９．
４９．Ｈｏｓｓｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ  ａｓ  ａ  ｈｅａｌｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ．Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ．２０１１  Ｍａｙ；６９（５）：２４５−５８．ＰＭＩＤ：２１５２１２２７．
５０．Ｉｓａｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｔｉｍｕｌｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１  Ｊａｎ  ２０；１２：５１．ＰＭＩＤ：２１２５１２５５．
５１．Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｕｒｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２０１２  Ｄｅｃ；１３（８）：７８９−８０６．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３３０５３６５．
５２．Ｌａｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ａｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｇｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ；２１（５）：ｅ７３６−９．ＰＭＩＤ：２５３０２０４６．
５３．Ｌｅｏｎａｒｄ（２００６）．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｅａ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｉｎｂｏｒｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４ｔｈ  ｅｄ（ｐｐ．２６３−２７２）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｍｅｄｉｚｉｎ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
５４．Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｇＲ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ，ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８７  Ｏｃｔ；８４（１９）：６６９７−７０１．ＰＭＩＤ：３１１６５４２．
５５．Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｉｎ  ａｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００１；２（４）．ＰＭＩＤ：１１３０５９４１．
５６．Ｍａａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｄｉｐｌｏｉｄｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６４  Ｍａｒ；８：３６５−７０．ＰＭＩＤ：１４１６８６９０．
５７．Ｍａａｓ．Ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９９４  Ｄｅｃ；５８（４）：６３１−４０．ＰＭＩＤ：７８５４２５０．
５８．Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃａｄ  ｏｐｅｒｏｎ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２  Ａｐｒ；１７４（８）：２６５９−６９．ＰＭＩＤ：１５５６０８５．
５９．Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＮＲ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｎｏｖ  ３；２８１（４４）：３３２６８−７５．ＰＭＩＤ：１６９５９７６４．
６０．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｅｉｇｈｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９８４；１９７（１）：８２−９．ＰＭＩＤ：６０９６６７５．
６１．Ｎａｇａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．２０１２  Ｓｅｐ；１０７（１−２）：１０−４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２８４１５１６．
６２．Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ，ｃｈｒｏｎｉｃ，ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ  ｂｙ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００８  Ｏｃｔ；４８（４）：１１８４−９２．ＰＭＩＤ：１８６９７２１１．
６３．Ｎｉｃｏｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｗｏ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００４  Ｓｅｐ；１８６（１８）：６０５９−６９．ＰＭＩＤ：１５３４２５７５．
６４．Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ａｕｇ  １１；３１３（５７８８）：８４８−５１．ＰＭＩＤ：１６９０２１４２．
６５．Ｏｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｔｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．２０１２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５０１−９．ＰＭＩＤ：２２８９５０８５．
６６．Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ａｎ  ｅｎｔｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｉｎ−ｐａｔｉｅｎｔ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ；３７（１０）：１２２９−３２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２３９３２５４９．
６７．Ｒａｊａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ａｒｇＡ）  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８  Ｍａｙ；６４（５）：１８０５−１１．ＰＭＩＤ：９５７２９５４．
６８．Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｒ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９７  Ｎｏｖ  １５；１５６（２）：２２７−３２．ＰＭＩＤ：９５１３２７０．
６９．Ｒｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ  １０；１８７：１０６−７．ＰＭＩＤ：２５０９３９３６．
７０．Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９９  Ａｕｇ  ２１；３５４（９１７９）：６３５−９．ＰＭＩＤ：１０４６６６６５．
７１．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．
７２．Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ＦＮＲ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ａｕｇ  ８；２７８（３２）：２９８３７−５５．ＰＭＩＤ：１２７５４２２０．
７３．Ｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍａｚＥＦ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｍｏｄｕｌｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ  ｄｅａｔｈ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３  Ｍａｒ；１８５（６）：１８０３−７．ＰＭＩＤ：１２６１８４４３．
７４．Ｓａｗｅｒｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＦＮＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１  Ｊｕｎ；５（６）：１４６９−８１．ＰＭＩＤ：１７８７７９７．
７５．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８  Ａｕｇ；  １８０（１６）：４２７８−８６．ＰＭＩＤ：９６９６７７９．
７６．Ｓｃｈｕｌｔｚ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．２００８  Ｊｕｌ；１４（７）：１０１２−８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：１８２４０２７８．
７７．Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  −  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．２００９；２１：１２２−５８．
７８．Ｓｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｔｎｅｓｓ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ａ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｏｃｔ  ２８；１００（２２）：１２７８２−６．ＰＭＩＤ：１４５５５７６６．
７９．Ｓｕｍｍｅｒｓｋｉｌｌ．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｍｍｏｎｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．１９６６  Ｎｏｖ；４５（６）：４９１−６．ＰＭＩＤ：５９２５９００．
８０．Ｓｚｗａｊｋａｊｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｏｃｔ  ５；３１２（５）：９４９−６２．ＰＭＩＤ：１１５８０２４１．
８１．Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ｔｏ  ｉｔｓ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｓｉｔｅｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｊｕｌ  ２０；２２６（２）：３８７−９７．ＰＭＩＤ：１６４０４５７．
８２．Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅｉｒ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｊａｎ  ７；２３５（１）：２２１−３０．ＰＭＩＤ：８２８９２４３．
８３．Ｔｏｒｒｅｓ−Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｏｃｔ  ２３；２２（１）：５８−６４．ＰＭＩＤ：２５３３８９２１．
８４．Ｔｒｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｒ  ａｎｄ  Ｄｎｒ  ｒｅｇｕｌｏｎｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０  Ｊｕｎ；１２（６）：１７１９−３３．ＰＭＩＤ：２０５５３５５２．
８５．Ｔｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｕｒｅａ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７  Ｊａｎ；６３（１）：３３−８．ＰＭＩＤ：８９７９３３６．
８６．Ｕｋｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｅａｋｙ  ｇｕｔ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００７  Ｄｅｃ  １２；２（１２）：ｅ１３０８．ＰＭＩＤ：１８０７４０３１．
８７．Ｕｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７  Ｊｕｌ  ４；１３２０（３）：２１７−３４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：９２３０９１９．
８８．Ｖａｎｄｅｒ  Ｗａｕｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｆｏｕｒ−ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４  Ｄｅｃ；１６０（３）：９２８−３４．ＰＭＩＤ：６４３８０６４．
８９．Ｗａｌｋｅｒ．Ｓｅｖｅｒｅ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎａｅｍｉａ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｎｏｔ  ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２  Ｍａｙ；４９（Ｐｔ  ３）：２１４−２８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ：２２３４９５５４．
９０．Ｗｉｎｔｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ＡＮＲ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｎｄ  ＦＮＲ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈａｖｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｂｕｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｎａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｍａｒ；１４２（  Ｐｔ  ３）：６８５−９３．ＰＭＩＤ：８８６８４４４．
９１．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｆｏＸ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）  ａｎｄ  ｃＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｏｃｔ  ７；５：１４９２１．ＰＭＩＤ：２６４４２５９８．
９２．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ａｎｒ，ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｆｎｒ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１  Ｊｕｎ；５（６）：１４８３−９０．ＰＭＩＤ：１７８７７９８．
９３．Ｗｒｉｇｈｔ  Ｏ，Ｄｅｌｍａｎｓ  Ｍ，Ｓｔａｎ  ＧＢ，Ｅｌｌｉｓ  Ｔ．ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓａｆｅｔｙ．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｍａｒ  ２０；４（３）：３０７−１６．ＰＭＩＤ：２４８４７６７３．
９４．Ｌｉｕ  Ｙ，Ｗｈｉｔｅ  ＲＨ，Ｗｈｉｔｍａｎ  ＷＢ．Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉ  ｕｓｅ  ｔｈｅ  ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＤａｐＬ）  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｌｙｓｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１０  Ｊｕｌ；１９２（１３）：３３０４−１０．ＰＭＩＤ：２０４１８３９２．
９５．Ｄｏｇｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｒｏｆ．Ｄｅｎｉｚ  Ｅｋｉｎｃｉ（Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１−００７６−８，ＩｎＴｅｃｈ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ：
９６．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ−ｏｆ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．
９７．Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ；１７４（１９）：６０６１−７０．ＰＭＩＤ：１３５６９６４．
９８．Ｌｏｄｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．２００８  Ａｐｒ；３４（１−２）：９１−１０６．ＰＭＩＤ：１９６６９４９５．
９９．Ｒｅｂｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１２；８（６）：ｅ１００２５３７．ＰＭＩＤ：２２６８５３９０．
１００．Ｓａｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔＪ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８４  Ｎｏｖ  ２５；２５９（２２）：１４２８２−５．ＰＭＩＤ：６０９４５４９．
１０１．Ｓｈｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔＪ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ａｎｄ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔＦ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８５  Ｊｕｎ；８２（１１）：３６０１−５．ＰＭＩＤ：１６５９３５６４．
１０２．ｖａｎ  Ｈｅｅｓｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｐｕｔｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｔａ  ｉｎｔｏ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｄｅｃ；７７（４）：６２８−９５．ＰＭＩＤ：２４２９６５７５．
[実施例]
【０４１３】
以下の実施例は、本開示の例示的実施形態を示す。当業者は、本開示の精神または範囲を変更することなく実施することができる多くの変更形態および変形形態を認識する。そのような変更形態および変形形態は、本開示の範囲内に含まれる。実施例は、本開示を多少なりとも限定するものではない。
アルギニンリプレッサー結合部位（ＡＲＧボックス）
[実施例１]
【０４１４】
ＡＲＧボックス突然変異
大腸菌ニッスルにおける各アルギニン生合成オペロンのＡｒｇＲ結合部位を含む野生型ゲノム配列を表３に示す。それらの配列の改変は、以下のパラグラフに従って設計される。各野生型配列については、ＡＲＧボックスを斜体で示す。アルギニンレギュロンのＡＲＧボックスは、各オペロンのプロモーター領域と重複する。下線付きの配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を表し、それらの配列は、変更しなかった。ＡｒｇＲ結合時にＤＮＡメチル化から保護される塩基は網掛け付きであり、ＡｒｇＲ結合時にヒドロキシルラジカル攻撃から保護される塩基は太字である。網掛け付きの塩基および太字の塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主要な標的である。
[実施例２]
【０４１５】
ラムダレッド組換え
ラムダレッド組換えを用いて、染色体改変、例えば、ＡＲＧボックス突然変異を施した。ラムダレッドは、バクテリオファージラムダに由来する組換え酵素を用いて、カスタムＤＮＡの断片を大腸菌の染色体に挿入する手法である。ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌ニッスル宿主株に導入する。大腸菌ニッスル細胞をＬＢ培地中で一夜増殖させる。一夜培養を５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌細胞を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に加え、ピペッティングし、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングすることによって混合する。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３０℃で１時間インキュベートする。細胞を選択培地プレート上に広げ、３０℃で一夜インキュベートする。
【０４１６】
表３に示す所望のＡＲＧボックス配列を含むＤＮＡ配列を遺伝子合成会社に発注した。ａｒｇＡオペロンについては、突然変異調節領域は、以下の核酸配列（配列番号２）を含む：ｇｃａａａａａａａｃａＣＴＴｔａａａａａＣＴＴａａｔａａｔｔｔｃＣＴＴｔａａｔｃａＣＴＴａａａｇａｇｇｔｇｔａｃｃｇｔｇ。
ラムダ酵素を用いて、この構築物を相同的組換えにより大腸菌ニッスルのゲノムに挿入する。構築物は、そのＤＮＡ配列に基づいて大腸菌ニッスルのゲノムにおける特定の部位に挿入される。構築物を特定の部位に挿入するために、構築物に隣接する相同ＤＮＡ配列を識別する。ＤＮＡの相同配列は、突然変異配列の両側の約５０塩基を含む。相同配列は、合成遺伝子の一部として注文する。あるいは、相同配列は、ＰＣＲにより加えることができる。構築物を用いて、大腸菌ニッスルにおけるａｒｇＡの上流の天然配列を置換する。構築物は、組換えによって除去することができる抗生物質耐性マーカーを含む。得られる突然変異ａｒｇＡ構築物は、ａｒｇＡの上流の相同性の約５０塩基、組換えによって除去することができるカナマイシン耐性マーカー、
ｇｃａａａａａａａｃａＣＴＴｔａａａａａＣＴＴａａｔａａｔｔｔｃＣＴＴｔａａｔｃａＣＴＴａａａｇａｇｇｔｇｔａｃｃｇｔｇ、および
ａｒｇＡと相同性の約５０塩基を含む。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、ＡＲＧボックスは、上述のようにａｒｇＧ調節領域において突然変異させ、ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモーターをラムダレッド組換えを用いて調節領域に挿入した（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５）。これらの細菌は、アルギニンを産生することができた。代替実施形態では、ａｒｇＧ調節領域（配列番号１６）は、ＡｒｇＲ抑制性のままであり（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４）、細菌は、シトルリンを産生することができた。
[実施例３]
【０４１８】
大腸菌ニッスルの形質転換
突然変異ＡＲＧボックス構築物をｐＫＤ４６を含む大腸菌ニッスルに導入する。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。一夜培養をアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．１のＯＤ６００に達するまで増殖させる。０．０５ｍＬの１００Ｘ  Ｌ−アラビノース保存溶液を加えて、ｐＫＤ４６ラムダレッド発現を誘導する。培養を０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。大腸菌細胞を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。０．５μｇの突然変異ＡＲＧボックス構築物を細胞に加え、ピペッティングにより混合し、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングする。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞をカナマイシンを含むＬＢプレート上に広げ、一夜インキュベートする。
[実施例４]
【０４１９】
突然変異体の確認
突然変異体の存在をコロニーＰＣＲにより確認する。コロニーをピペットチップにより採取し、上下にピペッティングすることによって２０μｌの冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。３μｌの懸濁液を、後の使用のために適切な抗生物質を含むインデックスプレート上にピペットで移す。インデックスプレートを３７℃で一夜増殖させる。５μＬの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液、０．６μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．４μＬの５０ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４、６．０μＬの１０Ｘエンハンサーおよび３．０μＬのｄｄＨ２Ｏを用いてＰＣＲマスターミックスを調製する（ＰＣＲ反応当たり１５μＬのマスターミックス）。ａｒｇＡ突然変異構築物に特有の２μＬのプライマー（１００μＭ保存液）を１６μＬのｄｄＨ２Ｏに混合することによって１０μＭプライマーミックスを調製する。各２０μＬ反応について、１５μＬのＰＣＲマスターミックス、２．０μＬのコロニー懸濁液（鋳型）、２．０μＬのプライマーミックスおよび１．０μＬのＰｆｘ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＤＮＡ  ＰｏｌをＰＣＲ管中で混合する。ＰＣＲサーモサイクラーを次のようにプログラムし、ステップ２〜４を３４回反復する：１）  ５：００分に９４℃、２）０：１５分に９４℃、３）０：３０分に５５℃、４）２：００分に６８℃、５）７：００分にｍ６８℃および次に４℃に冷却する。１０μＬの各アンプリコンおよび２．５μＬの５Ｘ染料を用いてＰＣＲ産物をゲル電気泳動により解析する。突然変異がゲノムに挿入された場合のみ、ＰＣＲ産物が形成する。
[実施例５]
【０４２０】
選択マーカーの除去
抗生物質耐性遺伝子をｐＣＰ２０で除去する。突然変異ＡＲＧボックスを有する各菌株を０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで抗生物質を含むＬＢ培地中で３７℃で増殖させる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。細胞を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを細胞に加え、ピペッティングにより混合し、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングする。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３０℃で１〜３時間インキュベートする。細胞をカナマイシンを含むＬＢプレート上に広げ、一夜インキュベートする。一夜で十分なＯＤ６００に増殖しないコロニーは、さらに２４時間インキュベートする。２００μＬの細胞をアンピシリンプレート上に広げ、２００μＬの細胞をカナマイシンプレート上に広げ、両方を３７℃で一夜増殖させる。アンピシリンプレートは、ｐＣＰ２０を有する細胞を含む。カナマイシンプレートは、いくつの細胞がエレクトロポレーションで生き残るかの兆候を示す。アンピシリンプレートからの形質転換細胞を４３℃で非選択的に精製し、一夜増殖させる。
[実施例６]
【０４２１】
形質転換細胞の確認
精製形質転換細胞をアンピシリンおよびカナマイシンに対する感受性について試験する。４３℃で増殖したプレートからのコロニーを採取し、１０μＬのＬＢ培地に再懸濁する。３μＬの細胞懸濁液を次の３つのプレートのそれぞれにピペッティングする。１）宿主菌株のゲノムにおけるｋａｎＲ遺伝子の存否について試験する、カナマイシンを３７℃でインキュベートしたＬＢプレート；２）ｐＣＰ２０プラスミドからのａｍｐＲ遺伝子の存否について試験する、アンピシリンを３７℃でインキュベートしたＬＢプレート；および３）３７℃でインキュベートした抗生物質を含まないＬＢプレート。個別のコロニーについてカナマイシンまたはアンピシリンプレート上に増殖が認められない場合、ｋａｎＲ遺伝子およびｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われたこととなり、さらなる解析のためにコロニーを残しておく。残しておいたコロニーをＬＢプレート上に再び画線して、単一コロニーを得て、３７℃で一夜増殖させる。突然変異ゲノムＡＲＧボックスの存在は、ゲノムのａｒｇＡ領域の配列決定により確認する。
【０４２２】
ラムダレッド組換えの方法、大腸菌ニッスルの形質転換、突然変異の確認、選択マーカーの除去、および形質転換細胞の確認／配列決定を表３に示すＡＲＧボックス突然変異およびオペロンのそれぞれについて反復する。得られる細菌は、ＡＲＧボックスへのＡｒｇＲの結合が減少し、オペロンの調節領域への全ＡｒｇＲ結合が減少するような、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む。
[実施例７]
【０４２３】
アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡｆｂｒ）
上述のＡＲＧボックスの突然変異に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、次のプロモーター：テトラサイクリン誘導性プロモーター、配列番号１８〜２９から選択されるＦＮＲプロモーターのそれぞれの制御下に発現するアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡｆｂｒ、配列番号３０）遺伝子をさらに含む。本明細書に記載の通り、他のプロモーターを用いることができる。
【０４２４】
ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上に発現する。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１は、プラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒならびに各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む。プラスミドは、機能性ＡｒｇＲ結合部位、すなわち、ＡＲＧボックスを含まない。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１を用いて、プラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒならびに各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０２を作製した。該プラスミドは、機能性ＡｒｇＲ結合部位、すなわち、ＡＲＧボックスをさらに含む。場合によっては、機能性ＡｒｇＲの存在および／または蓄積がＡＲＧボックス以外の部位におけるオフターゲット結合をもたらし得る。このプラスミドに機能性ＡＲＧボックスを導入することは、オフターゲットＡｒｇＲ結合を低減または消失させるのに、すなわち、ＡｒｇＲシンクとしての役割を果たすことによって、有用なものであり得る。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０４は、低コピープラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＧ、およびａｒｇＧを除く各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０５は、低コピープラスミド上の野生型ＡｒｇＲ、野生型ＡｒｇＡ、テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒ、構成的に発現するａｒｇＧ（ＢＢａ＿Ｊ２３１００構成的プロモーターを含む配列番号１７）および各アルギニン生合成オペロンの各ＡＲＧボックスにおける突然変異を含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照ニッスル構築物である。
【０４２５】
ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を、大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数における細菌ゲノムに挿入する。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参照されたい。挿入部位は、ゲノムにおけるどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を作製するため）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間であってもよい。挿入の部位において、挿入部位と、およびａｒｇＡｆｂｒ構築物と相同であるＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含む線状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを上述のように実施する。
【０４２６】
得られる大腸菌ニッスル細菌は、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンのうちの１つまたは複数の、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼへのＡｒｇＲ結合およびアルギニン結合を介した、アルギニン媒介抑制を減少させる核酸突然変異を含むように遺伝子操作されており、それによってアルギニンおよび／またはシトルリンの生合成が強化される。
【０４２７】
アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）配列  大腸菌ニッスルにおける野生型ａｒｇＲヌクレオチド配列およびａｒｇＲ欠失後のヌクレオチド配列を以下の表２１および表２２に示す。
【０４２８】
【表２３】
2018523978.tif 000069
【０４２９】
【表２４】
2018523978.tif 000070
[実施例９]
【０４３０】
ＡｒｇＲの欠失
ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌ニッスル宿主株に導入する。大腸菌ニッスル細胞をＬＢ培地中で一夜増殖させる。一夜培養を５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌細胞を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に加え、ピペッティングし、滅菌済み冷却キュベット中にピペッティングすることによって混合する。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３０℃で１時間インキュベートする。細胞を選択培地プレート上に広げ、３０℃で一夜インキュベートする。
【０４３１】
ＡｒｇＲ遺伝子の上流および下流の相同性の約５０塩基をＰＣＲによりｐＫＤ４プラスミドにおけるカナマイシン耐性遺伝子に加えて、次のＫａｎＲ構築物：（ＡｒｇＲの上流の約５０塩基）（ターミネーター）（ｐＫＤ４のＦＲＴ部位により隣接されたｋａｎＲ遺伝子）（ａｒｇＲの下流のＤＮＡ）を作製する。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、ａｒｇＲおよびａｒｇＧ遺伝子の両方を上述のラムダレッド組換えを用いて欠失させることにより、細菌は、シトルリンを産生することができる。
[実施例１０]
【０４３３】
アルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡｆｂｒ）およびＡｒｇＲ欠失を有する細菌菌株
上述のＡｒｇＲ欠失に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、以下のプロモーターのそれぞれの制御下に発現するアルギニンフィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ａｒｇＡｆｂｒ、配列番号３０）遺伝子をさらに含む：テトラサイクリン誘導性プロモーター、配列番１８〜２９から選択されるＦＮＲプロモーター。上述のように、他のプロモーターを用いることができる。
【０４３４】
ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上に発現する。ＡｒｇＲは、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０３のそれぞれにおいて欠失している（ΔＡｒｇＲ）。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０１は、野生型ａｒｇＡをさらに含むが、誘導性ａｒｇＡｆｂｒを欠いている。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２は、ΔＡｒｇＲおよび高コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０３は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーター（ｆｎｒＳ２）の制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む。
【０４３５】
ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子を、大腸菌ニッスルにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数における細菌ゲノムに挿入する。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参照されたい。挿入部位は、ゲノムにおけるどこであってよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求体を作製するため）などの、生存および／または増殖に必要な遺伝子；ゲノム複製の部位の近傍などの、ゲノムの活性部分；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣ間などの、意図しない転写のリスクを低減するために多様なプロモーター間であってもよい。挿入の部位において、挿入部位と、およびａｒｇＡｆｂｒ構築物と相同であるＤＮＡプライマーを設計する。標的部位との相同性を有する構築物を含む線状ＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製し、ラムダレッド組換えを上述のように実施する。得られる大腸菌ニッスル細菌は、欠失ＡｒｇＲおよび挿入フィードバック抵抗性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを有し、それにより、アルギニンまたはシトルリン生合成を増加させる。
[実施例１１]
【０４３６】
ΔＴｈｙＡの発生
栄養要求性突然変異は、細菌が必須栄養素を産生するために必要な遺伝子（複数可）を欠いているため、生存または増殖に必須である、外部から加えられる栄養素の非存在下では細菌を死滅させる。栄養要求性の改変を有する遺伝子操作細菌を作製するために、オリゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子であるｔｈｙＡを欠失させた。大腸菌ニッスルにおけるｔｈｙＡの欠失は、チミジンが補給されない限り、ＬＢプレート上でコロニーを形成することができない菌株を生じさせる。
【０４３７】
ｔｈｙＡ：：ｃａｍ  ＰＣＲ断片を以下のように３ラウンドのＰＣＲを用いて増幅した。１００μｍの濃度で用いたプライマーの配列は、表２３に見いだされ
る。
【０４３８】
【表２５】
2018523978.tif 000071
【０４３９】
第１のＰＣＲラウンドについては、鋳型としての１ｎｇ  ｐＫＤ３、２５μｌ２ｘｐｈｕｓｉｏｎ、０．２μｌプライマーＳＲ３６およびＳＲ３８、ならびに０、０．２、０．４または６μｌ  ＤＭＳＯを含む４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応物をヌクレアーゼ不含有水を用いて５０μｌとし、以下のサイクル条件下で増幅した。
ステップ１：３０秒間９８ｃ
ステップ２：１０秒間９８ｃ
ステップ３：１５秒間５５ｃ
ステップ４：２０秒間７２ｃ
反復ステップ２〜４：３０サイクル
ステップ５：５分間７２ｃ
【０４４０】
その後、５μｌのＰＣＲ反応をアガロースゲル上で行って、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認した。ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを用いて製造業者の指示に従って、残りのＰＣＲ反応からＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのヌクレアーゼ不含有水で溶出した。
【０４４１】
第２のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド１からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を除き、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、第１のＰＣＲ反応について上述したのと同じであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにかけて、増幅を確認し、精製し、上述のように３０μｌで溶出した。
【０４４２】
第３のラウンドのＰＣＲについては、ラウンド２からの１μｌの精製ＰＣＲ産物を、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を除いて、上で述べた４ｘ５０μｌ  ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。サイクル条件は、ラウンド１および２について述べたのと同じであった。上述のように増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、溶出した。濃度および純度は、分光光度計を用いて測定した。ｔｈｙＡの上流に相同の９２ｂｐ、ｆｒｔ部位により隣接されたクロラムフェニコールカセットおよびｔｈｙＡ遺伝子の下流に相同の９８ｂｐを含む、得られた線状ＤＮＡ断片を組換えのために増殖させたｐＫＤ４６を含む大腸菌ニッスル１９１７株に形質転換させた。エレクトロポレーションの後、３ｍＭチミジンを含む１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、細胞を振盪しながら３７℃で２時間回復させた。次いで細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。細胞を３７℃で一夜インキュベートした。ＬＢプレート上に出現したコロニーを再び画線した。＋ｃａｍ  ２０μｇ／ｍｌ＋または−ｔｈｙ  ３ｍＭ（ｔｈｙＡ栄養要求体のみがｔｈｙ  ３ｍＭを添加した培地中で増殖する）
【０４４３】
次に、ｐＣＰ２０形質転換によって抗生物質耐性を除去した。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐ組換え遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子および温度感受性複製を有する。細胞を選択抗生物質を含むＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．４〜０．６となるまで３７℃で増殖させた。１ｍＬの細胞を次のように洗浄した。細胞を１６，０００ｘｇで１分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬ氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。この洗浄ステップを３回反復した。最終ペレットを７０μｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。次に、細胞を１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡとともにエレクトロポレートし、３ｍＭチミジンを添加した１ｍＬのＳＯＣを直ちにキュベットに加えた。細胞を再懸濁し、培養管に移し、３０℃で１時間増殖させた。次に、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭ  ｔｈｙおよび１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃で１６〜２４時間増殖させた。次に、形質転換細胞を４２℃で非選択的（無抗生物質）にコロニー精製した。
【０４４４】
コロニー精製形質転換細胞を試験するために、コロニーを４２℃プレートからピペットチップで採取し、１０μｌのＬＢに再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を次の一組の３つのプレート上にピペッティングした：Ｃａｍ（３７℃；宿主菌株のゲノムにおけるＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在について試験する）、Ａｍｐ（３０℃；ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在について試験する）および３７℃のＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを失った所望の細胞）。ＣａｍまたはＡｍｐプレートのいずれにおいても増殖が存在しない場合、コロニーは治癒したとみなし、採取し、ＬＢプレート上に再画線して、単一コロニーを得て、３７℃で一夜増殖させた。
[実施例１２]
【０４４５】
アンモニアの定量
上述の遺伝子操作細菌を５ｍＬのＬＢ中で一夜増殖させた。翌日、細胞をペレット化し、Ｍ９＋グルコースで洗浄し、ペレット化し、３ｍＬのＭ９＋グルコースに再懸濁した。細胞培養を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４時間インキュベートし、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）中で３７℃で好気的または嫌気的にインキュベートした。各細胞の相対存在量を決定するために、ベースライン時（ｔ＝０）、２時間目および４時間目に各細胞培養のＯＤ６００を測定した。
【０４４６】
培地中のアンモニアの濃度を決定するために、ｔ＝０、２時間および４時間目に各細胞培養の１ｍＬアリコートをＮｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３００で分析した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０２の両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアンモニアを消費することができた（図２６）。図２５、２６および２７にＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３およびブランク対照を用いたアンモニア濃度の棒グラフを示す。
[実施例１３]
【０４４７】
アルギニンおよびシトルリンの定量
いくつかの実施形態では、上述の遺伝子操作細菌をＬＢ中で振盪しながら３７℃で一夜増殖させる。細菌を５ｍＬのＬＢで１：１００に希釈し、振盪しながら３７℃で１．５時間増殖させる。細菌培養を以下のように誘導する。（１）ＦＮＲ誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を３７℃のＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２および２０ｍＭ硝酸塩を供給）中で嫌気的条件でＬＢ中で３７℃で最長４時間誘導する。（２）テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌をアンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）により誘導する。（３）アラビノース誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌をグルコース欠損培地中で１％アラビノースにより誘導する。誘導後、細菌細胞をインキュベーターから除去し、最大速度で５分間遠沈する。細菌を１ｍＬのＭ９グルコースに再懸濁し、ＯＤ６００を測定する。細胞をＯＤ６００が０．６〜０．８となるまで希釈する。Ｍ９グルコース培地中の再懸濁細胞を振盪しながら３７℃で好気的に増殖させる。１００μＬの細胞再懸濁液を除去し、０時間目にＯＤ６００を測定する。質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために１００μＬアリコートを丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結する。その後の各時点に、１００μＬの細胞懸濁液を除去し、ＯＤ６００を測定し、質量分析のために１００μＬアリコートを丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結する。試料は、アルギニンおよび／またはシトルリン濃度について分析する。各時点に、質量分析対ＯＤ６００により測定された標準化濃度を用いて、単位時間当たり細胞当たりのアルギニンおよび／またはシトルリンの産生の速度を決定する。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、上述の遺伝子操作細菌を寒天上の単一コロニーのグリセロール保存液から画線する。コロニーを採取し、３ｍＬのＬＢ中で４時間または一夜増殖させ、次いで２５００ｒｃｆで５分間遠心分離する。培養を０．５％グルコースを含むＭ９培地で洗浄する。培養を０．５％グルコースを含む３ｍＬのＭ９培地に再懸濁し、ＯＤ６００を測定する。すべてのＯＤ６００が０．４〜０．５となるように、培養を０．５％グルコースを含み、ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含みまたは含まず、２０ｍＭグルタミンを含むまたは含まないＭ９培地で希釈する。各試料の０．５ｍＬアリコートを除去し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、残しておく。上清を−８０℃で凍結し、細胞ペレットを−８０℃で凍結する（ｔ＝０）。残りの細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）中で３７℃で好気的または嫌気的にインキュベートする。１つの０．５ｍＬアリコートを各試料から２時間ごとに除去し、ＯＤ６００を測定する。アリコートを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去する。上清を−８０℃で凍結し、細胞ペレットを−８０℃で凍結する（ｔ＝２、４および６時間）。試料を氷上におき、質量分析を用いてアルギニンおよびシトルリンレベルを測定する。
【０４４９】
細菌培養上清について、水中５００、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬアルギニンおよびシトルリン標準の試料を調製する。丸底９６ウエルプレートにおいて、２０μＬの試料（細菌上清または標準）を、最終２μｇ／ｍＬ濃度のＬ−アルギニン−１３Ｃ６，１５Ｎ４（Ｓｉｇｍａ）およびＬ−シトルリン−２，３，３，４，４，５，５−ｄ７（ＣＤＮ同位体）内部標準を含む８０μＬの水に加える。プレートをＰｉｅｒｃｅＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、十分に混合する。Ｖ型底９６ウエルポリプロピレンプレートにおいて、５μＬの希釈試料を９５μＬの誘導体化ミックス（８５μＬの１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．７および１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ塩化ダンシル（アセトニトリルで希釈））に加える。プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌフォイルを用いて熱融着させ、十分に混合する。試料を誘導化のために６０℃で４５分間インキュベートし、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。丸底９６ウエルプレートにおいて、２０μＬの誘導体化試料を０．１％ギ酸を含む１８０μＬの水に加える。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートを用いて熱融着させ、十分に混合する。
【０４５０】
アルギニンおよびシトルリンは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いたタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定する。以下の表２４にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要を示す。
【０４５１】
【表２６】
2018523978.tif 000072
【０４５２】
ＡＴＣもしくは嫌気性誘導物質の存在下または非存在下における遺伝子操作細菌における細胞内アルギニンおよび分泌（上清）アルギニン産生を測定し、同じ条件下の同じ菌株の対照細菌と比較する。
【０４５３】
ＡＴＣもしくは嫌気性誘導物質の存在下または非存在下における遺伝子操作細菌における６時間にわたる総アルギニン産生を測定し、同じ条件下の同じ菌株の対照細菌と比較する。
[実施例１４]
【０４５４】
高アンモニア血症および急性肝不全のマウスモデルにおける遺伝子操作細菌の有効性
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに急性肝不全および高アンモニア血症を引き起こす、チオールアセトアミド（ＴＡＡ）を投与する（Ｎｉｃａｉｓｅら、２００８年）。ＴＡＡマウスモデルは、業界で受け入れられているＨＥのｉｎ  ｖｉｖｏモデルである。マウスに非改変対照ニッスル細菌または上述の高レベルのアルギニンもしくはシトルリンを産生するように操作されたニッスル細菌を投与する。
【０４５５】
１日目に、５０ｍＬの細菌培養を一夜増殖させ、ペレット化する。ペレットを５ｍＬのＰＢＳに約１０１１ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度で再懸濁する。マウスにおける血中アンモニアレベルは、下顎採血により測定し、ＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）によりアンモニアレベルを決定する。マウスに１００μＬの細菌（約１０１０ＣＦＵ）を強制経口投与する。マウスの飲料水を０．１ｍｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）および味を良くするための５％スクロースを含むように交換した。
【０４５６】
２日目に、細菌強制経口投与溶液を上述のように調製し、マウスに１００μＬの細菌を強制経口投与する。マウスに０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含む飲料水を与え続ける。
【０４５７】
３日目に、細菌強制経口投与溶液を上述のように調製し、マウスに１００μＬの細菌を強制経口投与する。マウスに０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含む飲料水を与え続ける。マウスは、１００μＬのＴＡＡ（０．５％ＮａＣｌ中２５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内（ＩＰ）注射を受ける。
【０４５８】
４日目に、細菌強制経口投与溶液を上述のように調製し、マウスに１００μＬの細菌を強制経口投与する。マウスに０．１ｍｇ／ｍＬのＡＴＣおよび５％スクロースを含む飲料水を与え続ける。マウスは、１００μＬのＴＡＡ（０．５％ＮａＣｌ中２５０ｍｇ／ｋｇ体重）のもう１回のＩＰ注射を受ける。マウスにおける血中アンモニアレベルを下顎採血により測定し、ＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）によりアンモニアレベルを決定する。
【０４５９】
５日目に、マウスにおける血中アンモニアレベルを下顎採血により測定し、ＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｒｋｒａｙ）によりアンモニアレベルを決定する。糞便ペレットをマウスから採取して、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によりアルギニン含量を測定する。遺伝子操作ニッスルおよび非改変対照ニッスルを投与したマウスにおけるアンモニアレベルを比較する。
[実施例１５]
【０４６０】
高アンモニア血症およびＵＣＤのマウスモデルにおける遺伝子操作細菌の有効性
オルニチントランスカルバミラーゼは、尿素回路酵素であり、ｓｐｆ−ａｓｈ突然変異を含むマウスは、部分的オルニチントランスカルバミラーゼ欠損を示し、これがヒトＵＣＤのモデルとしての役割を果たす。マウスに非改変対照ニッスル細菌または上述の高レベルのアルギニンもしくはシトルリンを産生するように操作されたニッスル細菌を投与する。
【０４６１】
６０匹のｓｐｆ−ａｓｈマウスに本発明の遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４）またはＨ２Ｏ対照を１００μｌ  ＰＯ  ＱＤで投与した：Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１５）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１５）；ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、高タンパク質食（ｎ＝１５）；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４、高タンパク質食（ｎ＝１５）。１日目に、マウスの体重を測定し、各群に選別して、ケージ当たりのマウスの体重の変動を最小限にした。マウスに強制経口投与し、２０ｍｇ／Ｌ  ＡＴＣを含む水をケージに加えた。２日目に、マウスに午前および午後に強制経口投与した。３日目に、マウスに朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、ベースラインアンモニアレベルを得た。マウスに午後に強制経口投与し、飼料を７０％タンパク質飼料に変更した。４日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。５日目に、マウスに朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得た。６および７日目に、マウスに朝に強制経口投与した。８日目に、マウスに朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得た。９日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。１０日目に、マウスに朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得た。１２日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。１３日目に、マウスに朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得た。血中アンモニアレベル、体重および生存率を解析する（図２９）。
[実施例１６]
【０４６２】
高タンパク質食で飼育した高アンモニア血症およびＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）のマウスモデルにおける遺伝子操作細菌の有効性
実施例１４で述べた高アンモニア血症／ＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）モデルを用いて、高タンパク質食の投与時のアンモニアレベルに対する低コピープラスミド上のｆｎｒプロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒをコードする遺伝子操作細菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価した。
【０４６３】
低コピープラスミド上のｆｎｒプロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒをコードする２つの菌株ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡならびに低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーター（ｆｎｒＳ２）の制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ２０５（ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーター（ｆｎｒＳ２）の制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）を比較して、チミジン栄養要求性が血液からのアンモニア除去の有効性に影響を及ぼし得るかどうかを判断した。
【０４６４】
Ｓｐｆ−ａｓｈマウスを遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６）またはＨ２Ｏ対照の経口投与により治療した。通常または高タンパク質食を次のように与えた：ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６、高タンパク質食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１０）。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６については、細菌を１回投与した１、５、６および７日目を除いて、＞１×１０１０細胞／ｍｌの１００μｌの用量を１２日間にわたり１日２回投与した。１日目に、マウスの体重を測定し、無作為化した。Ｔ＝０  ＮＨ４レベルをＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｒｋｒａｙ）を用いて下顎採血により測定し、その後、マウスに強制経口投与した。２日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。３日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与し、飼料を通常飼料から７０％タンパク質飼料に変更した。４日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。５日目に、マウスに朝に強制経口投与し、体重を測定し、投与後４時間目に血液を採取して、アンモニアレベルを得た。８〜１２日目に、マウスに朝および午後に強制経口投与した。
【０４６５】
図３０に見られるように、高タンパク質食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニアレベルは、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６群における高タンパク質食への切り替え後４８時間目にＨ２Ｏ高タンパク質食対照群と比較して低下し、ＦＮＲ誘導性プロモーターがＡｒｇＡｆｂｒの発現を駆動し、操作細菌を投与したマウスの血液中のアンモニアレベルの低下をもたらしたことがわかる。アンモニアレベルの観測された低下は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の両方において同様であり、ＴｈｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ２０６の有効性に有意な影響を有さないことが示唆される。
[実施例１７]
【０４６６】
染色体挿入を用いた細菌菌株の操作
ＡｒｇＡｆｂｒがＭＡＬＥＫ部位においてＦＮＲ応答性プロモーターの制御下に大腸菌ニッスルのゲノムに直接組み込まれている細菌菌株を構築した。
【０４６７】
ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒをニッスルＭａｌＥおよびＭａｌＫ遺伝子座において染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ニッスルＭＡＬＥ／Ｋ遺伝子座と相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列をノックインノックアウト（ＫＩＫＯ）プラスミド上のフリッパーゼ組換え標的（ＦＲＴ）部位フランククロラムフェニコール耐性（ｃｍＲ）カセットの両側に加えた。次いでＧｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ部位に隣接する、これらの相同性アーム間のＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ  ＤＮＡ配列をクローニングした。断片の挿入の成功は、配列決定によってバリデートした。ＰＣＲを用いて、全ＭａｌＥＫ：：ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ：：ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ：：ＭａｌＫ領域を増幅する。このノックインＰＣＲ断片を用いて、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含むエレクトロコンピテントニッスル菌株を形質転換した。形質転換の後、細胞を３７℃で２時間増殖させた。３７℃での増殖により、温度感受性プラスミドが治癒する。該断片の染色体組込みの成功を有する形質転換細胞を２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにより選択した。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼベースのスイッチを用いて、ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒの発現を活性化することができる。リコンビナーゼベースのスイッチがＡｒｇＡｆｂｒの発現を調節することを可能にする菌株を構築するために、ＰｆｎｒＳ駆動Ｉｎｔ５遺伝子およびｒｒｎＢＵＰ駆動のリコンビナーゼ部位フランクＡｒｇＡｆｂｒａｒｅをＧｅｎｅｗｉｚ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）により合成した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢＵＰ−ＡｒｇＡｆｂｒ配列の両側のニッスルｍａｌＥおよびｍａｌＫ遺伝子座と相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列を加え、相同性アーム間のこの配列をクローニングした。ＫＩＫＯプラスミドへの断片の挿入の成功は、配列決定によってバリデートする。ＰＣＲを用いて、全ＰｆｎｒＳ−Ｉｎｔ５、ｒｒｎＢＵＰ−ＡｒｇＡｆｂｒ領域を増幅する。このノックインＰＣＲ断片を用いて、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を発現するエレクトロコンピテントニッスル菌株を形質転換する。形質転換後、細胞を３７℃で２時間増殖させる。ｍａｌＥＫ遺伝子間領域におけるＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒの組込みの成功を有する形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンにより選択する。この戦略は、ＡｒｇＡｆｂｒ発現のためにＴ７ポリメラーゼ活性を必要とするリコンビナーゼベースの菌株を構築するためにも用いることができる。
[実施例１８]
【０４６９】
染色体挿入およびプラスミド保有操作細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の比較
ｍａｌＥＫ遺伝子座におけるｆｎｒ誘導性プロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有する遺伝子操作細菌菌株とｆｎｒ誘導性プロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒを含む低コピープラスミドを含む菌株との間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性を比較するために、嫌気的誘導後の様々な時点に培地中のアルギニンレベルを測定した。さらに、チミジンに対する栄養要求性がアルギニン産生効率に対して影響を有し得るかどうかを評価するために、低コピープラスミド上にまたは染色体に組み込まれたｆｎｒ−ＡｒｇＡｆｂｒを含む、ＴｈｙＡ欠失を含むもしくは含まない操作細菌菌株のアルギニン産生を比較した。
【０４７０】
一夜培養をＬＢで１：１００に希釈し、振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で増殖させた。１．５時間の増殖の後に、細菌培養を以下のように誘導した。（１）ＦＮＲ誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を３７℃のＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２および２０ｍＭ硝酸塩を供給）中で嫌気的条件でＬＢ中３７℃で４時間誘導した；（２）テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌をアンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）により誘導した。誘導後、細菌をインキュベーターから除去し、最大速度で５分間遠沈した。細胞を１ｍＬのＭ９グルコースに再懸濁し、ＯＤ６００を測定した。細胞をＯＤ６００が０．６〜０．８となるまで希釈した。Ｍ９グルコース培地中再懸濁細胞を振盪しながら３７℃で好気的に増殖させた。１００μＬの細胞再懸濁液を除去し、時間＝０におけるＯＤ６００を測定した。１００μＬのアリコートを質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結した。その後の各時点（例えば、３０、６０および１２０分）に、１００μＬの細胞懸濁液を除去し、ＯＤ６００を測定し、１００μＬのアリコートを質量分析のために丸底９６ウエルプレートで−２０℃で凍結した。試料をアルギニン濃度について分析した。各時点に、質量分析対ＯＤ６００により測定された標準化濃度を用いて、単位時間当たり細胞当たりのアルギニン産生の速度を決定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要は、上に示されている。
【０４７１】
誘導後３０、６０および１２０分目におけるアルギニンの産生を、（１）Ｓｙｎ−ＵＣＤ３０１（ＳＹＮ８２５；ΔＡｒｇＲおよびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）、（２）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５（ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）ならびに（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡならびに低コピープラスミド上のＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３を対照ニッスル構築物として用い、結果を図３１Ａに示す。
【０４７２】
図３１Ａに０、３０、６０および１２０分目に測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６およびＳｙｎ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生のレベルを示す。アルギニンの産生は、３菌株すべてで同等であり、最大のアルギニンの産生は、１２０分目にＳｙｎ−ＵＣＤ３０１で認められ、ＦＮＲ  ＡｒｇＡ  ｆｂｒの染色体組込みが、同じ構築物を発現する低コピープラスミド菌株で認められたのと同様のレベルのアルギニン産生をもたらし、アルギニンの産生の速度をわずかに増加させ得ることがわかる。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳｙｎ−ＵＣＤ３０１と比較してアルギニン産生の低下（６０分目により低いアルギニンレベル）を示したが、１２０分目に同等のアルギニン産生レベルに達したことから、ΔＴｈｙＡがアルギニン産生に対するわずかな減弱化作用を有し得ることがわかる。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３対照については、アルギニン産生が検出されなかった。
【０４７３】
次に、試料を上述のように調製し、誘導後１２０分目におけるアルギニンの産生を、（１）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（ΔＡｒｇＲおよび低コピープラスミド上のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（２）Ｓｙｎ−ＵＣＤ３０１（ΔＡｒｇＲ、ＣｍＲおよびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）、（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２（ΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＣｍＲ（クロラムフェニコール耐性）およびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）および（４）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＫａｎＲ（カナマイシン耐性）およびｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下に発現するａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。
【０４７４】
ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含む、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０６を対照ニッスル構築物として用いた。結果を図３１Ｂに示す。図３１Ｂに見られるように、アルギニンの産生は、０．７〜０．９μｍｏｌ／１×１０９細胞に上昇し、アルギニンの産生が、プラスミド上にＡｒｇＡｆｂｒを有する菌株とＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有する菌株で同様同じレベルであることがわかる。
[実施例１９]
【０４７５】
高タンパク質食で飼育した高アンモニア血症およびＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）のマウスモデルにおける遺伝子操作細菌の有効性
実施例１４で述べた高アンモニア血症／ＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）モデルを用いて、高タンパク質食の投与時のアンモニアレベルに対する細菌染色体に組み込まれたｆｎｒプロモーターにより駆動されるＡｒｇＡｆｂｒをコードする遺伝子操作細菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価した。マウスを非改変対照ニッスル細菌または上述のように高レベルのアルギニンもしくはシトルリンを産生するように操作されたニッスル細菌により治療した。
【０４７６】
１つはＴｈｙＡ欠失を含み（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）、１つはＴｈｙＡ欠失を含まない（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１）、２つの菌株を有効性について試験し、ΔＴｈｙＡが、染色体ｆｎｒ−ＡｒｇＡｆｂｒを有するこれらの菌株による血液からのアンモニア除去の有効性に影響を及ぼし得るかどうかを判断するために比較した。
【０４７７】
Ｓｐｆ−ａｓｈマウスを遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）またはＨ２Ｏ対照の経口投与により治療した。通常または高タンパク質食を次のように与えた：ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、高タンパク質食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１０）。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０６については、細菌を１回投与した１、５、６および７日目を除いて、＞１×１０１０細胞／ｍｌの１００μｌの用量を１２日間にわたり１日２回投与した。実施例１６で述べたのと本質的に同じプロトコールに従い、アンモニアレベルを得るために血液を５日目に採取した（図３２Ａ）。１０日目に、生存率を解析し、生存の時間的経過を図３２Ｂに示す。
【０４７８】
図３２Ａに示すように、高タンパク質食におけるｓｐｆ−ａｓｈマウスのアンモニアレベルは、Ｈ２Ｏ高タンパク質食対照群と比較してＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３群において低下したことから、構築物が染色体に組み込まれた場合、ＦＮＲ誘導性プロモーターがＡｒｇＡｆｂｒ発現を駆動し、操作細菌により治療したマウスの血液中のアンモニアレベルの低下をもたらし得ることがわかる。アンモニアレベルの観測された低下は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の両方において同様であり、ＴｈｙＡ栄養要求性がＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の有効性に有意な影響を有さないことがわかる。図３２Ｂに見られるように、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、対照と比較して長期の生存を示した。実験を２回連続して行ったところ、同様の結果が得られた。
[実施例２０]
【０４７９】
様々な用量における有効性の比較
実施例１４で述べた高アンモニア血症／ＵＣＤ（ｓｐｆ−ａｓｈ）モデルにおける最適アルギニン産生を達成しながら、用いることができる最低用量を決定するために、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の３用量を投与した。
Ｓｐｆ−ａｓｈマウスを遺伝子操作細菌（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）またはＨ２Ｏ対照の強制経口投与により治療した。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３については、１×１０７、１×１０８、１×１０９および１×１０１０  ＣＦＵｓの用量を、細菌を１回投与した１、５、６および７日目を除いて、１２日間にわたって１日２回１００μｌの容量で投与した。通常食または高タンパク質食を次のように与えた：ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１×１０７ＣＦＵ）、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１×１０８ＣＦＵ）、高タンパク質食（ｎ＝１０）；ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１×１０９ＣＦＵ）、高タンパク質食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、通常食（ｎ＝１０）；Ｈ２Ｏ対照、高タンパク質食（ｎ＝１０）。実施例１６で述べたのと本質的に同じプロトコールに従い、アンモニアレベルを得るために血液を５日目に採取した。５日目に血中アンモニアレベルを各用量について解析した。結果を図３３に示す。１×１０８および１×１０９の両用量は、このモデルにおける血中アンモニアレベルの有意な低下をもたらすのに十分であった。
[実施例２１]
【０４８０】
ニッスルの滞留時間
非改変大腸菌ニッスルおよび本発明の遺伝子操作細菌は、例えば、消化管または血清中の防御因子により殺滅され得る。細菌のｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間を計算することができる。大腸菌ニッスルのストレプトマイシン耐性菌株を用いる非限定的な例を以下に述べる。代替実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌の滞留時間を計算する。
【０４８１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを動物施設において１週間馴化させた。１週間の馴化後（すなわち、０日目）に、ストレプトマイシン耐性ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）を１〜３日目に強制経口投与によりマウスに投与した。マウスに抗生物質を前投与しなかった。投与された細菌、すなわち、接種物の量を表２５に示す。接種物のＣＦＵを決定するために、接種物を連続希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上で平板培養した。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、コロニーを計数した。
【０４８２】
【表２７】
2018523978.tif 000073
【０４８３】
２〜１０日目に、最大で６匹のマウス（ＩＤ番号１〜６；表１４）から糞便ペレットを採取した。ペレットをＰＢＳを含む管に量り入れ、ホモジナイズした。糞便ペレット中のニッスルのＣＦＵを決定するために、ホモジナイズした糞便ペレットを連続希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上で平板培養した。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、コロニーを計数した。
【０４８４】
１日目の糞便ペレットも採取し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上で平板培養して、ストレプトマイシン耐性であったマウス胃腸管に固有の菌株が存在していたかどうかを判断した。マウス胃腸管内に依然として滞留していた投与ニッスルの時間経過および量を表２６に示す。
図３４にｉｎ  ｖｉｖｏでのニッスルの滞留のグラフを示す。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質を前投与せずに強制経口投与によりマウスに投与した。６匹すべてのマウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、マウスの胃腸管内に滞在している投与ニッスルの量を測定した。バーは、マウスに投与した細菌の数を表す。線は、１０日間連日にわたる各日の糞便試料から回収されたニッスルの数を表す。
【０４８５】
【表２８】
2018523978.tif 000074
[実施例２２]
【０４８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌菌株の腸内滞留および生存
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（組込みｆｎｒＳ誘導性プロモーター駆動ＡｒｇＡｆｂｒ、カナマイシン耐性、ΔＴｈｙＡ、図３５Ｃ）の局在および腸内滞留時間をＳＹＮ−ＵＣＤ１０６（ΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡおよびクロラムフェニコール耐性、図３５Ｂ）およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイシン耐性ニッスル、図３５Ａ）と比較した。マウスに強制経口投与し、様々な時点に屠殺し、流出物を小腸、盲腸および結腸の様々な部分から採取した。
【０４８７】
細菌培養を一夜増殖させ、ペレット化した。ペレットを約１０１０ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度でＰＢＳに再懸濁した。マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、１０〜１２週齢）に１００μＬの細菌（約１０９ＣＦＵ）を強制経口投与した。マウスの飲料水を０．１ｍｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）および味を良くするための５％スクロースを含むように交換した。各時点（強制経口投与後１、４、８、１２、２４および３０時間目）に、動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を除去した。小腸を３つの部分に切断し、大腸および結腸をそれぞれ２つの部分に切断した。各部分を０．５ｍｌの冷ＰＢＳでフラッシュし、別個の１．５ｍｌ管に収集した。盲腸を採取し、内容物をしぼり出し、０．５ｍｌの冷ＰＢＳでフラッシュし、１．５ｍｌ管に収集した。腸流出物を連続希釈平板培養のために氷上においた。
【０４８８】
各流出物中の細菌のＣＦＵを決定するために、流出物を連続希釈し、カナマイシンを含むＬＢプレート上で平板培養した。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、コロニーを計数した。各コンパートメントに認められた細菌の量ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ１０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０６およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の滞留時間を図３５に示す。図３５に見られるように、３つの菌株すべてが同様に挙動する。図３５Ａを図３５Ｂと比較すると、ΔＴｈｙＡ栄養要求性およびΔＡｒｇＲは、滞留および通過時間に対する実質的な影響を有さないと思われる。
[実施例２３]
【０４８９】
腸滞留時間に対する栄養要求性の影響
栄養要求性が局在および滞留時間に対して影響を有し得るかどうかを判断するために、上述のマウスモデルを用いて、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ΔＴｈｙＡ）の滞留をＳＹＮ−ＵＣＤ３０４（野生型ＴｈｙＡ）と比較した。ＡｒｇＲ欠失およびａｒｇＡｆｂｒが滞留に対する影響を有するかどうかを判断するために、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（ストレプトマイシン耐性対照ニッスル）を並行して投与する。
【０４９０】
実施例２２で述べたように細菌を用意し、マウスに強制経口投与し、安楽死させ、様々な時点に腸流出物を採取する。各流出物中の細菌のＣＦＵを決定するために、実施例２０で述べたように流出物を連続希釈し、平板培養する。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３についてはストレプトマイシン含有プレートを、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１についてはクロラムフェニコール含有プレートを用いる。
[実施例２４]
【０４９１】
高アンモニア血症のＴＡＡモデル
マウスのＴＡＡ処理は、ＵＣＤ、急性もしくは慢性肝臓疾患ならびにＨＥに随伴する血中アンモニアレベルの増加を模擬するために以前に文献において用いられた（Ｗａｌｌａｃｅ  ＭＣら、Ｌａｂ  Ａｎｉｍ．、２０１５年４月；４９巻（増補１）：２１〜９頁、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔｓ）。いくつかの実施形態では、高アンモニア血症のＴＡＡ誘発性マウスモデルを用いて、血中アンモニアレベルを低下させる遺伝子操作細菌の能力を検討する。ＴＡＡは、ｓｐｆ−ａｓｈモデルの代替としての役割を果たす。ｓｐｆ−ａｓｈモデルは、遺伝モデルであるため、マウスの数が限られており、したがって、野生型マウスにおける誘導性モデルを開発することは、目的の可能性がある菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を著しく促進することとなる。
【０４９２】
血中アンモニアの長期の上昇に対する操作細菌の影響を検討するために、３００ｍｐｋの用量のチオアセトアミド（ＴＡＡ）も投与するＣ５７ＢＬ６マウスに細菌を投与する。
【０４９３】
Ｃ５７ＢＬ６（１０週齢）にＳＹＮ−ＵＣＤ１０３もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌの＞１×１０１０細胞／ｍｌ）または媒体対照を１日１回投与する。あるいは、マウスに２一日量の細菌（１００μｌの＞１×１０１０細胞／ｍｌ）（各治療群につきｎ＝５）を午前に１回、午後に１回投与する。細菌の前投与の３日後に、マウスに３００ｍｐｋのチオアセトアミド（ＴＡＡ）または対照としてのＨ２Ｏを腹腔内投与する。あるいは、マウスに２５０ｍｐｋを１日２回、午前に１回、午後に１回投与する。試験の期間は、５日である。アンモニアレベルを測定し、全般的な健康状態、生存、体重変化をモニターする。
【０４９４】
手短に述べると、動物を７日間馴化する。時間経過の１日目に、動物の体重を測定し、採血して、ベースラインアンモニアを測定し、糞便ペレットを採取し（ケージごとに）、初期血中アンモニアレベルに基づいて無作為化する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与により投与する。水をＨ２Ｏ（＋）２０ｍｇ／ｍｌ  ＡＴＣに交換する。２日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与により投与する。３日目に、動物の体重を測定し、Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与により投与する。さらに、動物に３００ｍｐｋ  ＴＡＡ（または生理食塩水対照）を腹腔内投与する。あるいは、動物に２５０ｍｐｋ  ＴＡＡ（または生理食塩水対照）を午前に１回、午後に１回投与する。４日目に、動物の体重を測定し、採血し、血中アンモニアを測定する。糞便ペレットをケージごと採取する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与により投与する。動物に２５０ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）も投与してもよい。５日目に、動物の体重を測定し、採血し、血中アンモニアを測定する。糞便ペレットを採取する（ケージごと）。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）強制経口投与により投与する。アンモニアレベル、糞便ペレットにおける細菌負荷ならびに全般的な健康状態、生存および体重変化をモニターする。
[実施例２５]
【０４９５】
アルギナーゼ阻害剤を用いた高アンモニア血症のモデル
遺伝的ｓｐｆ−ａｓｈモデルの代替として、アルギナーゼ阻害剤＋／−高タンパク質食を高アンモニア血症の誘導性モデルとして用いる。アルギナーゼ阻害剤は、少なくとも２つのクラスに分類される（Ｓｔｅｐｐａｎら、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３年；４巻：２７８頁、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｒｇｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎに記載されている）。アルギナーゼ阻害剤の第１の群は、ｌ−アルギニン（２）Ｓ−アミノ−６−ヘキサン酸（ＡＢＨ）のボロン酸類似体およびＳ−２−ＢＥＣからなり、その両方がアルギナーゼの触媒活性を阻害する。Ｎ−ヒドロキシ−ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）およびＮ−ヒドロキシ−ノル−ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）によって主として代表される、アルギナーゼ阻害剤の他のカテゴリーは、Ｎ−ヒドロキシ−グアニジニウム側鎖を特徴とし、アルギナーゼの金属架橋水酸化物イオンをそれらのＮ−ヒドロキシ基で置換することによってアルギナーゼを阻害する。モデル開発試験で、各群のアルギナーゼ阻害剤、ＢＥＣおよびノル−ＮＯＨＡ＋／−高タンパク質食（７０％タンパク質）を用いる。
【０４９６】
操作細菌が血液中のアンモニアレベルを変化させることができるかどうかを判断するために、野生型マウスにおいて各群のアルギナーゼ阻害剤、ＢＥＣおよびノル−ＮＯＨＡ、＋／−高タンパク質食（７０％タンパク質）を用いた誘導性モデルを用いる。Ｃ５７ＢＬ６（雌、８週）を遺伝子操作細菌（１００μｌの＞１×１０１０細胞／ｍｌ）または媒体対照の強制経口投与およびＢＥＣまたはノルＮＯＨＡの腹腔内投与により治療し、通常食（治療群当たりｎ＝５）または高タンパク質食（治療群当たりｎ＝５）を与えて飼育する。投与群は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３および媒体対照治療動物について次の通りである：通常食（ｎ＝５）；高タンパク質食（７０％タンパク質食；ｎ＝５）；高タンパク質食（＋）ＢＥＣ（ｎ＝５）；高タンパク質食（＋）ノルＮＯＨＡ（ｎ＝５）。
【０４９７】
時間経過の１日目に、動物の体重を測定し、採血して、ベースラインアンモニアを測定し、初期血中アンモニアレベルに基づいて無作為化する。糞便ペレットを採取する（ケージごと）。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の強制経口投与により投与する。水をＨ２Ｏ（＋）２０ｍｇ／ｍｌ  ＡＴＣに交換する。２日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。３日目に、動物の体重を測定し、Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。さらに、動物にＢＥＣ（２５ｍｐｋ）またはノルＮＯＨＡ（１００ｍｐｋ）または生理食塩水対照を腹腔内投与する。高タンパク質食群について、飼料を通常食から７０％タンパク質食に変更する。４日目に、動物の体重を測定し、採血し、血中アンモニアを測定する。糞便ペレットをケージごとに採取する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物にＢＥＣ（２５ｍｐｋ）またはノルＮＯＨＡ（１００ｍｐｋ）を腹腔内投与する。４日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物の体重を測定し、投与後１時間目に採血し、血中アンモニアを測定する。糞便ペレットをケージごとに採取する。動物にＢＥＣ（２５ｍｐｋ）またはノルＮＯＨＡ（１００ｍｐｋ）の腹腔内投与も行う。５日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０３（１００μｌ／用量／動物）の１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物の体重を測定し、投与後１時間目に採血し、アンモニアレベルを測定する。
【０４９８】
ＳＹＮ−ＵＣＤ２０２、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４およびＳＹＮ−ＵＣＤ１０３菌株を用いた同様の試験を行った。結果を図２８に示す。
[実施例２６]
【０４９９】
アルギニン産生に対する増殖能および代謝活性の影響
遺伝子操作細菌によるアルギニン産生のための細胞分裂および／または活性代謝の必要条件をＳＹＮＵＣＤ−３０３菌株において検討した。
【０５００】
ＳＹＮＵＣＤ−３０３を７０％イソプロパノールまたは対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とともに振盪しながら１時間インキュベートした。７０％イソプロパノールは、細胞膜を破壊し、細胞分裂を妨げたが、細胞代謝を可能にする。ＰＢＳインキュベーションは、細胞に対して何の影響も有さなかった（示さず）。処理後、細胞を、０．５％グルコースおよび３ｍＭチミジンを添加したＭ９培地中で特定の比で混合した。細胞を振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。細胞は、Ｍ９培地に含まれていた塩化アンモニウムを用いてアルギニンを形成することができる。ゼロ時間目および２時間のインキュベーションの後に再度アルギニン濃度を培地中で測定し、１０億個の細胞当たり１時間当たり産生されるアルギニンの量を計算した。図３６Ａおよび３６Ｂに見られるように、培養中のイソプロパノール処理細胞と非処理細胞との比率がより大きい場合に、平板培養により決定されるより少数のＣＦＵｓおよびより低いレベルのアルギニン産生がもたらされる。存在する細菌の量に対するアルギニンの産生量は、様々な培養にわたり一定のままであった（図３６Ｃ）。これらの結果は、生存細菌のみがアルギニン産生に寄与することを示すものである。
[実施例２７]
【０５０１】
カニクイザルにおける２８日間にわたり毎日経鼻胃管投与した後のＳＹＮ−ＵＣＤ−３０３の反復投与薬物動態および薬力学試験（非ＧＬＰ）
遺伝子操作細菌または大腸菌ニッスル単独の投与により生じる可能性がある毒性を評価するために、雌カニクイザルへの２８日間にわたる毎日の経鼻胃管（ＮＧ）投与の後のＳＹＮ−ＵＣＤ−３０３およびカナマイシン耐性を有する大腸菌ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７）の薬物動態および薬力学を試験した。カニクイザルを選択した理由は、この種が系統発生学的にかつ生理学的にヒトと密接に関連しており、非臨床的毒性評価に一般的に用いられる種であるためである。遺伝子操作細菌は、ヒトにおける提案された投与経路と一致する、経鼻胃管により投与した。動物の全般的健康状態（臨床的観察）、体重、臨床病理（血清化学、血液学および凝固）を追跡した。糞便試料を細菌負荷について検査した。血漿をアンモニアレベルについて分析した。
【０５０２】
Ａ．  材料、動物および投与計画：
本試験は、非臨床実験室試験に関する、米国食品医薬品局により公布された安全性試験の実施に関する基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（Ｔｉｔｌｅ  ２１  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｔ  ５８；１９７９年６月２０日発効）およびＯＥＣＤ  ＧＬＰ原則（ＯＥＣＤ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｎ  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（Ｃ［９７］１８６／最終；１９９７年発効）に従って実施された。動物は、実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ２０１１）に記載の勧告に基づいて個別収容した。
【０５０３】
本試験に用いた動物は、３〜６ｋｇ（最初の身体検査）で、年齢３〜８年（最初の身体検査）の雌パーパスブレッド非ナイーブカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ＳＮＢＬ  ＵＳＡストック、原産：Ｃａｍｂｏｄｉａ）であった。
【０５０４】
バイアスの制御のために、動物を、同様の群別体重分布が得られるように体重で層別して群に無作為化した。無作為化に選択された動物数ならびにそれらの体重および年齢を表２７に含める。
【０５０５】
【表２９】
2018523978.tif 000075
【０５０６】
１７匹の動物を投与開始前の７日間馴化させ、１５匹の動物を治療群に割り付けた。予備の動物を１日目に試験から除去した。
【０５０７】
試験期間中、動物にＰＭＩ  ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）Ｆｉｂｅｒ−Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｍｏｎｋｅｙ  Ｄｉｅｔ  ５０４９ビスケットを毎日２回与えた。投与前の少なくとも２時間動物を絶食させ、投与後１時間以内に給餌した。動物はまた、特定の処置（例えば、血清化学検査のための採血、糞便採取の前）による必要に応じて絶食させた。飼料を汚染物質について定期的に分析しており、製造業者の規格の範囲内であることが認められた。試験の結果に支障を来たすようなレベルの汚染物質は存在するとは予期されない。
【０５０８】
新鮮な飲料水をすべての動物に供給し、自由に摂取させた。水を汚染物質について定期的に分析した。試験の結果に支障を来たすようなレベルの汚染物質は存在しなかった。動物に試験中果実、野菜、他の補助食品およびケージエンリッチメントデバイスを与えた。
【０５０９】
事前に検疫した動物を投与の開始（１日目）の前の７日間試験室に馴化させた。最終投与は、２８日目に行った。体重を組み込んだ層化無作為化スキームを用いて、動物を試験群に割り付けた。動物を群に割り付け、表２８に示すように処置した。
【０５１０】
【表３０】
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【０５１１】
ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３保存液は、２．２％グルコースおよび３ｍＭチミジンを含む１ＸＰＢＳ中１５％グリセロール中１×１０９ｃｆｕ／ｍＬおよび１×１０１１ｃｆｕ／ｍＬで調製し、８６〜−６０℃で保持した（表２８参照）。重炭酸ナトリウムを含む２０％グリセロールで調製したＰＢＳを対照媒体として用いた。重炭酸濃度は、０．３６Ｍであり、重炭酸ナトリウムについては０．１２Ｍであった（表２８参照）。投与当日に、細菌および媒体対照を冷凍庫から取り出し、氷上において解凍し、投与するまで氷上においた。
【０５１２】
動物に０、１×１０９または１×１０１２ｃｆｕ／動物で投与した。すべての動物に２８日間にわたり１日１回、経鼻胃管（ＮＧ）により投与した後、対照／媒体でフラッシュした。重炭酸塩の濃度および各群の容量を表２８に明記する。バイアルは、注射器に投与液を吸引する前に少なくとも３回反転した。投与部位および投与時間（フラッシュ時間の終了）を記録した。６日目に、群４（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、１×１０９／動物）における動物１９、２１および２３は、１４ｍＬの代わりに５ｍＬの重炭酸塩フラッシュを、その後に被験物質投与を受けた。
【０５１３】
Ｂ．  解析
全般的状態および重量
全般的状態：  臨床的観察は、−６日目に開始して、４４日目まで、１日２回実施した。第１の観察は、午前であった。第２の観察は、午前の観察の後４時間より早くない時点であった。投与期間中は、第２の観察は、投与後４時間（±１０分）目に実施した。必要に応じて、追加の臨床的観察を実施した。
被験物質に関連した臨床的観察所見は、本試験では確認されなかった。
【０５１４】
同様に収容される動物に一般的に認められ、個体間で散発的に発生した偶発的かつ／または処置上の所見は、対照動物に認められ、馴化期間にも存在し、投与群間で重症度および発生率が増加しなかった。これらは、皮膚に関連する所見（痂皮／結痂、創傷、擦過傷、異常な皮膚変色、紫斑）、脱毛、曲尾、凹眼、食欲不振、嘔吐および泌尿生殖器分泌物を含む。
【０５１５】
重量：  体重は、−６、１、８、１１、１５、２２、２９、３６および４３日目、適宜、最初の給餌および投与前に測定した。
【０５１６】
体重に対する被験物質に関連する影響は、本試験では確認されなかった。ベースライン（１日目）と比べて、３６日目までに５〜１０％の体重の減少が、対照を含むすべての群にわたり明らかであり、試験処置に関連すると判断された。値はベースラインに完全には戻っていなかったが、３６日目と比較して、上向き傾向が４３日目の入手可能な体重データで認められた。
【０５１７】
臨床病理
血液採取：  動物は、毎日の投与前に一夜ならびに血清化学および血漿生物分析用の試料を含む各一連の採取の少なくとも４時間前に絶食させた。これらの場合、関連する臨床病理評価は、絶食動物についてのものであった。血液は、拘束した覚醒動物の末梢静脈の静脈穿刺によって１回の採血（可能な場合）で採取し、分析用の適切な管に次のように分割した：血液学：約１．３ｍＬ、Ｋ２ＥＤＴＡ管；凝固：約１．８ｍＬ、３．２％クエン酸ナトリウム管；血清化学：約１．０ｍＬ、血清分離管（ＳＳＴ）；血漿試料：約１．０ｍＬ、ヘパリンリチウム；臨床病理評価用の血液は、ＳＮＢＬ  ＵＳＡ  ＳＯＰｓに従って、血清もしくは血漿に処理するか、またはそのままで用いた。
【０５１８】
可能な場合には、血液は、１回の採血により採取し、次に適切に分割する。試料採取頻度を表２９に要約する。
【０５１９】
【表３１】
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【０５２０】
表３０に臨床病理評価情報を要約する。
【０５２１】
【表３２】
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【０５２２】
血液学、凝固および血清化学パラメーターにおける被験物質に関連した影響は、本試験では確認されなかった。
【０５２３】
血漿試料：  動物は、試料の除去の前の４時間絶食させた。約１Ｌｍの血液を、−１および３０日目に、ならびに２、７、１４および２８日目の投与前に大腿静脈から採取し、２ｍＬヘパリンリチウム管に移した。管内への標的容積の血液の採取後に、約０．０５（−１および２日目）または０．１ｍＬ（７、１４、２８および３０日目）の鉱油を加えて、管内の血液の表面を覆った。管は、反転せずに、湿潤氷上においた。
【０５２４】
試料を採取してから１５分以内に２〜８℃で遠心分離して、血漿を得て、血漿は−６０〜−８０℃での保存の前にドライアイス上に保持した。
【０５２５】
試料の分析は、血中アンモニア分析機器を用いて行った。
【０５２６】
糞便試料の採取：  動物当たり２つの糞便試料を表２９に示す標的時点に採取した。試料採取日時を記録した。約５ｍＬのＰＢＳを含む５０ｍＬファルコン管を容器として用いた（糞便が液体である場合、ＰＢＳを加えない）。糞便試料の重量を得るために、容器の試料採取前後の重量を測定した。試料は、各動物のケージの底から採取した。新鮮で、非汚染試料を得るために、採取前に残存食物を除去し、ケージパンを掃除し、ゴムぞうきんをかけて、デブリおよび／または水を除去した。−５、２、４、７および１４日目に、最初の給餌および／または投与の後に食物除去およびパン掃除を実施した。１８、２０、２４、２８、３０、３５、４０、４６および５０日目に、食物除去およびパン掃除を各採取の前の夜に実施した。視覚的に新鮮な糞便試料も臨床的観察を除く、処置を行う前の朝に採取した。
【０５２７】
糞便スワブ採取：  糞便試料が予定日の終了までに採取されなかった場合、処置用ケージに拘束した動物の直腸から綿チップアプリケーターを用いて糞便スワブ試料を採取した。
試料は、採取直後に湿潤氷上においた。試料を分析時まで−２０〜−１５℃で保存した。試料の分析は、実施例３１で述べたＰＣＲ分析法を用いて行った。
【０５２８】
動物当たり２つの糞便試料を−５日目に、ならびに２、４、７および１４日目の投与後に採取し、動物当たり３つの糞便試料を２９、３０、３５、４０、４６および５０日目に、ならびに１８〜２８日目の投与前に採取した。約５ｍＬのＰＢＳを含む５０ｍＬファルコン管を−５〜１４日目の採取に用い、管１については約５ｍＬのＰＢＳ、管２については２０ｍＬの５０％グリセロールおよび１０ｍＭチミジン、管３については２０ｍＬの５０％グリセロール／ＰＢＳを含む５０ｍＬファルコン管を１８〜５０日目の採取に用いた。試料を採取直後に湿潤氷上におき、１８〜５０日目に採取した各管の内容物を滅菌済み舌圧子を用いて破壊し、混合した。
【０５２９】
採取日の終了時までに表２９に示した動物から糞便試料が採取されなかったので、動物当たり２つの糞便スワブ試料を採取した。試料の採取後、スワブの綿部分を１ｍＬのＰＢＳを含む５ｍＬクリオバイアルに移し、直ちに湿潤氷上においた。
【０５３０】
結果を図３７に示すが、糞便試料から定量した細菌の量がカナマイシン耐性対照ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７）およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について類似したパターンに従うことが示されている。糞便試料中の細菌は、３５日目までに糞便１ｍｌ当たり１０００個未満の細菌のレベルに達する。結果から、これらの投与条件下では、糞便中の対照カナマイシン耐性ニッスルと同様の量の細菌が栄養要求体ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３について回収されたことがわかる。同様の結果がマウスで観測された。結論として、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、ニッスル（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７）とほぼ同じ濃度でＮＨＰ糞便中に存在すると思われる。
【０５３１】
全体的結論として、被験物質であるＳＹＮ−ＵＣＤ３０３は、１×１０１２ＣＦＵ／動物までの用量で２８日間毎日のＮＧ投与後に雌カニクイザルによって十分に耐えられた。被験物質に関連した死亡は発生せず、臨床的観察、体重および臨床病理評価について被験物質に関連した影響は確認されなかった。
[実施例２８]
【０５３２】
カニクイザルにおける２８日間にわたり毎日経鼻胃管投与した後のＳＹＮ−ＵＣＤ−３０３の反復投与薬物動態および薬力学試験（非ＧＬＰ）
ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０６の薬物動態および薬力学は、実施例２７で述べたのと本質的に同様に雌カニクイザルへの２８日間にわたる毎日の経鼻胃管（ＮＧ）投与の後に試験する。カニクイザルを選択した理由は、この種が系統発生学的にかつ生理学的にヒトと密接に関連しており、非臨床的毒性評価に一般的に用いられる種であるためである。遺伝子操作細菌は、ヒトにおける提案された投与経路と一致する、経鼻胃管により投与した。動物の全般的健康状態（臨床的観察）、体重、臨床病理（血清化学、血液学および凝固）を追跡する。血漿をアンモニアレベルについて分析し、糞便試料を細菌負荷について検査する。
[実施例２９]
【０５３３】
カニクイザルにおける２週間の回復期間を含む４週間の毒性試験（ＧＬＰ）
遺伝子操作細菌の投与により生じる可能性がある毒性を評価するために、ＧＬＰ条件下での雌カニクイザルへの２８日間にわたる毎日の経鼻胃管（ＮＧ）投与の後のＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の薬物動態および薬力学を試験する。
【０５３４】
他の実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５および／またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０６について試験を行う。
【０５３５】
試験は、本試験は、非臨床実験室試験に関する、米国食品医薬品局により公布された安全性試験の実施に関する基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（Ｔｉｔｌｅ  ２１  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｐａｒｔ  ５８；１９７９年６月２０日発効）およびＯＥＣＤ  ＧＬＰ原則（ＯＥＣＤ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｎ  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（Ｃ［９７］１８６／最終；１９９７年発効）に従って実施される。動物は、実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ２０１１）に記載の勧告に基づいて個別収容する。
【０５３６】
すべての材料がＧＭＰ基準に従って製造されることを除いて、実施例２７で述べたのと本質的に同様に動物にＳＹＮ−ＵＣＤ３０３または対照媒体を投与する。投与を表３１に示す。さらに、動物を１４日間馴化させ、投与期間は、毎日２８日間であり、その後に２８日間の回復期間をおく。さらに、動物を試験の終了時に安楽死させて、組織学的分析を行う。
【０５３７】
【表３３】
2018523978.tif 000079
【０５３８】
試験解析は、表３２に示すように行う。血液学、凝固、血清化学および血漿試料パラメーターは、実施例２７で述べたのと本質的に同様であり、実施例２７で述べた方法を用いて解析する。糞便試料の採取および分析は、実施例２７で述べたのと本質的に同様に行う。
【０５３９】
【表３４−１】
2018523978.tif 000080
【表３４−２】
2018523978.tif 000081
[実施例３０]
【０５４０】
マウスにおける４週間の回復期間を含む４週間の反復投与毒性試験（ＧＬＰ）
遺伝子操作細菌の投与により生じる可能性がある毒性を評価するために、
ＧＬＰ条件下での２週間の回復を後続させる４週間にわたる毎日の経鼻胃管投与の後のＳＹＮ−ＵＣＤ３０３の薬物動態および薬力学を試験する。
【０５４１】
すべての材料をＧＬＰ条件下で製造する。試験開始時に６〜８週齢のＣＤ−１マウスを７日間馴化させる。雄および雌マウスの群を別個に試験する。ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３または媒体対照を表３３に示すように投与する。
【０５４２】
特定の実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０４、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５および／またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０６について試験を行う。
【０５４３】
【表３５】
2018523978.tif 000082
【０５４４】
試験解析は、表３４に示す。血液学、凝固、血清化学および血漿試料パラメーターは、実施例２７で述べたのと本質的に同様であり、実施例２７で述べた方法を用いて解析する。糞便試料の採取および分析は、実施例２７で述べたのと本質的に同様に行う。組織学は、実施例２９と同様に行う。
【０５４５】
【表３６−１】
2018523978.tif 000083
【表３６−２】
2018523978.tif 000084
[実施例３１]
【０５４６】
非ヒト霊長類の糞便試料中のニッスルの存在の決定
ニッスルの存在について非ヒト霊長類（ＮＨＰｓ）の糞便試料を分析するために、ｑＰＣＲを用いた試料中のＤＮＡの量に基づいてＮＨＰ試料における細菌の数を定量した。いくつかの実施形態では、このプロトコールは、マウスおよびヒトを含むが、これらに限定されない、他の哺乳動物の糞便試料の分析に用いられる。
【０５４７】
試料の均質化：  糞便試料（−２０℃で保存）を室温で９０分間解凍した。固体糞便試料については、適切な固体の容積を推定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を容積の２倍まで加えた。液体糞便試料については、追加のＰＢＳを加えなかった。次いで試料を管ごとに３０秒間ボルテックスした。糞便試料をエッペンドルフチューブ中、ＰＢＳ中で使い捨て乳棒（Ｆｉｓｈｅｒ  １２−１４１−３６３）を用いてホモジナイズし、後の処置のために氷上に保持する。
【０５４８】
ＤＮＡの精製：  均質化試料（２５０μＬ）を、最初にグラデーションラインで切断された滅菌済みフィルターチップ（Ｒａｃｋｅｄ  Ｇｉｌｓｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｔｉｐｓ）を用いて除去し、エッペンドルフチューブに移した。ＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従ってＭｏＢｉｏ  ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（１２８５５−１００）を用いて均質化試料（２５０μＬ）から精製した。各試料から回収された精製ＤＮＡの量は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｂａｓｉｃで試料のＯＤ２６０を測定することによって定量した。
【０５４９】
ＰＣＲ反応：  ２つの反応（反応１および反応２）をアセンブルし、３連で行った。第１の反応は、ニッスルの量を定量する役割を、第２の反応は、糞便試料中に存在する細菌の総量を定量する役割を果たす。第１のｑＰＣＲ反応については、精製ＤＮＡ（５ｎｇ）、０．４μＬのプライマー１（１０μＭ）、０．４μＬのプライマー２（１０μＭ）および１０μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：  ４３６８５７７）を水で２０μＬとした。第２のｑＰＣＲ反応については、精製ＤＮＡ（５ｎｇ）、０．４μＬのプライマー３（１０μＭ）、０．４μＬのプライマー４（１０μＭ）および１０μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：  ４３６８５７７）を水で２０μＬとした。
【０５５０】
１０μＭの濃度で反応に用いたプライマーの配列は、表３５に見いだされる。
【０５５１】
【表３７】
2018523978.tif 000085
【０５５２】
増幅された細菌ＤＮＡの量の定量のために、各反応について標準曲線を作成した。標準曲線を得るために、断片＃１（１組の濃度で合成した）（表３６）を以下の量が得られる、１０倍連続希釈で、８ウエルが断片＃１の１０６コピーを有するまで、希釈した：無ＤＮＡ、断片＃１の１コピー、断片＃１の１０コピー、断片＃１の１００コピーなど。次いで標準ＤＮＡｓを反応＃１のｑＰＣＲ反応混合物に加えた。
【０５５３】
【表３８】
2018523978.tif 000086
【０５５４】
標準曲線、ならびに反応１および２のＰＣＲ反応条件を表３７に示す。
【０５５５】
【表３９】
2018523978.tif 000087
【０５５６】
品質管理処置として、試験ｑＰＣＲ反応の融解曲線を各プライマーセットの陽性対照と比較して、陽性対照の融解曲線が試験試料の融解曲線と一致することを保証した。ニッスルおよび総細菌の存在および量は、標準曲線と対照して、ＣＴ値（サイクル閾値）を解析することによって決定した。
[実施例３２]
【０５５７】
酪酸を過剰産生するためのベクターの構築
上述のアンモニア変換回路、ＧＡＢＡ輸送回路、ＧＡＢＡ代謝回路および／またはマンガン輸送回路に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、消化管バリア増強分子を産生するための１つまたは複数の回路をさらに含む。
【０５５８】
大腸菌ニッスルにおける酪酸の誘導性産生を促進するために、ペプトクロストリジウム・ディフィシル６３０に由来する酪酸産生経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｂｐｔおよびｂｕｋ；ＮＣＢＩ）、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。酪酸遺伝子カセットは、配列番号１８〜２９（表６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下におかれる。特定の構築物では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、強いリボソーム結合部位配列にさらに融合されている。酪酸遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロンにおける各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対リボソーム結合部位によって分離させた。
【０５５９】
特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表３８および３９参照）。特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表１４〜１７参照）。特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、テトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下におかれる。
【０５６０】
【表４０−１】
2018523978.tif 000088
【表４０−２】
2018523978.tif 000089
【表４０−３】
2018523978.tif 000090
【表４０−４】
2018523978.tif 000091
【表４０−５】
2018523978.tif 000092
【０５６１】
【表４１−１】
2018523978.tif 000093
【表４１−２】
2018523978.tif 000094
【表４１−３】
2018523978.tif 000095
【表４１−４】
2018523978.tif 000096
【０５６２】
ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に対する依存性を示し得る。本発明の組換え細菌は、酸素制限環境（例えば、哺乳動物消化管）において酪酸を産生するように設計されているため、酸素に対する依存性は、消化管内の酪酸産生の負の影響を有し得る。トレポネーマ・デンティコラ、トランス−２−エノイルＣｏＡレダクターゼに由来する単一遺伝子（ｔｅｒ）がこの３遺伝子複合体を酸素非依存的に機能的に置換することができることが示された。したがって、ｔｅｒ遺伝子が第１の酪酸カセットのｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子を置換した第２の酪酸遺伝子カセットを合成する（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。ｔｅｒ遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて大腸菌コドン使用のためにコドン最適化されている。第２の酪酸遺伝子カセット、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングする。第２の酪酸遺伝子カセットは、上述のＦＮＲ調節領域の制御下におかれる。特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表３８および３９参照）。特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表Ｃおよび表４０参照）。
【０５６３】
【表４２−１】
2018523978.tif 000097
【表４２−２】
2018523978.tif 000098
【表４２−３】
2018523978.tif 000099
【表４２−４】
2018523978.tif 000100
【表４２−５】
2018523978.tif 000101
【表４２−６】
2018523978.tif 000102
【表４２−７】
2018523978.tif 000103
【表４２−８】
2018523978.tif 000104
【表４２−９】
2018523978.tif 000105
【表４２−１０】
2018523978.tif 000106
【表４２−１１】
2018523978.tif 000107
【０５６４】
特定の構築物では、酪酸遺伝子カセットは、テトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下におかれる。第３の酪酸遺伝子カセットでは、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢで置換されている。ｔｅｓＢは、ブチリル−ｃｏＡから酪酸を切り離し、それによりｐｂｔ−ｂｕｋの必要性を除去する大腸菌に見いだされるチオエステラーゼである。
【０５６５】
一実施形態では、ｔｅｓＢは、表６における配列のいずれかから選択されるＦＮＲ調節領域の制御下におかれる。代替実施形態では、ｔｅｓＢは、ＲＮＳ応答性調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、ｔｅｓＢは、ＲＯＳ応答性調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下におかれ、細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む。特定の構築物では、異なる記載されている酪酸遺伝子カセットがそれぞれ、テトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下におかれる。例えば、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子が硝酸応答性調節エレメントの制御下に発現するｔｅｓＢで置換されている酪酸遺伝子カセットを含む遺伝子操作ニッスルを作製する。配列番号８６は、淋菌に由来するｎｓｒＲリプレッサー遺伝子の逆方向相補体（下線付き）、ｎｓｒＲおよび酪酸生成遺伝子カセットならびにそれらのそれぞれのＲＢＳを制御する多様なプロモーターを含む遺伝子間領域（太字）、ならびにＲＢＳによって分離された酪酸遺伝子（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ−ｈｂｄ−ｃｒｔ−ｔｅｓＢ）を含む。
【０５６６】
【表４３−１】
2018523978.tif 000108
【表４３−２】
2018523978.tif 000109
【表４３−３】
2018523978.tif 000110
[実施例３３]
【０５６７】
ｔｅｔ誘導性プロモーター用いる酪酸を過剰産生するためのベクターの構築
大腸菌ニッスルにおける酪酸の誘導性産生を促進するために、ペプトクロストリジウム・ディフィシルに由来する酪酸産生経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ、ｅｔｆＢ、ｅｔｆＡ、ｔｈｉＡ、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｐｔおよびｂｕｋ；ＮＣＢＩ）、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲにクローニングし、ｐＬｏｇｉｃを作製した。合成されたとき、遺伝子を、ｔｅｔ誘導性合成酪酸オペロンから分岐した、構成的に発現するｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）を含む、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下においた。酪酸遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロンにおける各合成遺伝子を、Ｔプロモーターに由来する塩基対リボソーム結合部位によって分離させた。
【０５６８】
ｂｃｄ−ｅｔｆＡ−ｅｔｆＢの遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に対する依存性を示し得る。有効なプロバイオティクは酸素制限環境（例えば、哺乳動物消化管）で機能することができるため、またトレポネーマ・デンティコラの単一遺伝子がこの３遺伝子複合体を酸素非依存的に機能的に置換することができる（トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ；ｔｅｒ）ことが示されたので、我々は、大腸菌において酪酸の産生の能力のある第２のプラスミドを作製した。逆ＰＣＲを用いて、ｂｃｄ−ｅｔｆＡ−ｅｔｆＢ領域の外側のｐＬｏｇｉｃの全配列を増幅した。ｔｅｒ遺伝子をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて大腸菌コドン使用のためにコドン最適化し、合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてこの逆ＰＣＲ断片にクローニングして、ｐＬｏｇｉｃを作製した。
[実施例３４]
【０５６９】
大腸菌の形質転換
各プラスミドを大腸菌ニッスルまたは大腸菌ＤＨ５ａに形質転換する。すべての管、溶液およびキュベットを４℃に予冷する。大腸菌ニッスルまたは大腸菌ＤＨ５ａの一夜培養を５ｍＬの溶原培地（ＬＢ）で１：１００に希釈し、０．４〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。細胞培養培地は、選択マーカー、例えば、プラスミドに適するアンピシリンを含む。次いで大腸菌を４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を再び４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍＬの４℃水に再懸濁する。大腸菌を再び４℃で２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を最後に０．１ｍＬの４℃水に再懸濁する。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定する。０．５μｇの上記のプラスミドの１つを細胞に加え、ピペッティングにより混合し、滅菌済み冷却キュベットにピペッティングする。乾燥キュベットを試料チャンバーに入れ、電気パルスを印加する。１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養管に移し、３７℃で１時間インキュベートする。細胞をアンピシリンを含むＬＢプレート上に広げ、一夜インキュベートする。
【０５７０】
代替実施形態では、酪酸カセットを相同的組換えによりニッスルゲノムに挿入することができる（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。構築物およびヌクレオチド配列の構成を本明細書に示す。合成酪酸カセット構築物を染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、まず、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ニッスルｌａｃＺ遺伝子座に相同のＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６Ｋ起源プラスミドｐＫＤ３に加えた。これは、ニッスルゲノムにおけるｌａｃＺ遺伝子座に組み込まれるこれらの相同性アーム間にクローニングされるＤＮＡを標的とする。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、これらのアーム間の断片をクローニングした。ＰＣＲを用いて、相同性アームの全配列、ならびにそれらの間の酪酸カセットを含むこのプラスミドの領域を増幅する。このＰＣＲ断片を用いて、ラムダレッドレコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含む菌株である、エレクトロコンピテントニッスル−ｐＫＤ４６を形質転換する。形質転換後、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール上で３７℃で平板培養する前に細胞を２時間増殖させた。３７℃での増殖もｐＫＤ４６プラスミドを治癒させる。カセットを含む形質転換細胞は、クロラムフェニコール耐性であり、ｌａｃマイナス（ｌａｃ−）である。
[実施例３５]
【０５７１】
組換え大腸菌における酪酸の産生
酪酸産生に対する酸素の影響を判断するために、上述の酪酸カセットを含む大腸菌ニッスルにおける酪酸の産生を評価する。すべてのインキュベーションを３７℃で実施する。酪酸カセットで形質転換した大腸菌菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養をＬＢ中で一夜増殖させ、４ｍＬの０．５％グルコース含有Ｍ９最少培地で１：２００に希釈する。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。１ｍＬの培養アリコートを１．５ｍＬ栓付き管に入れて用意し、培養の曝気を制限するために静的インキュベーター中でインキュベートする。１本の管を各時点（０、１、２、４および２０時間）に除去し、ＬＣ−ＭＳにより酪酸濃度について分析して、これらの組換え菌株における酪酸産生を低酸素環境で達成することができることを確認する。
[実施例３６]
【０５７２】
組換え大腸菌における酪酸の産生
酪酸産生に対する酸素の影響を判断するために、上述の酪酸カセットを含む大腸菌ニッスルにおける酪酸の産生を評価する。すべてのインキュベーションを３７℃で実施する。酪酸カセットで形質転換した大腸菌菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養をＬＢ中で一夜増殖させ、４ｍＬの０．５％グルコース含有Ｍ９最少培地で１：２００に希釈する。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。１ｍＬの培養アリコートを１．５ｍＬ栓付き管に入れて用意し、培養の曝気を制限するために静的インキュベーター中でインキュベートする。１本の管を各時点（０、１、２、４および２０時間）に除去し、ＬＣ−ＭＳにより酪酸濃度について分析して、これらの組換え菌株における酪酸産生を低酸素環境で達成することができることを確認する。
[実施例３７]
【０５７３】
ｔｅｔ誘導性プロモーターを用いた組換え大腸菌における酪酸の産生
図４８にｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下の上述の酪酸カセットを示す。下文の実施例４０で述べる方法を用いて酪酸の産生を評価する。試験したｔｅｔ誘導性カセットは、（１）８遺伝子すべてを含むｔｅｔ−酪酸カセット（ｐＬＯＧＩＣ０３１）；（２）ｔｅｒが置換されているｔｅｔ−酪酸カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６）ならびに（３）ｔｅｓＢがｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子の代わりに置換されているｔｅｔ−酪酸カセットを含む。図５１Ａに酪酸産生の有意な差がない、酸素の存在下および非存在下でのｐＬＯＧＩＣ０３１およびｐＬＯＧＩＣ０４６菌株における酪酸産生を示す。酪酸産生の増大が、最終２遺伝子（ｐｂｔ−ｂｕｋ）の欠失および内因性大腸菌ｔｅｓＢ遺伝子（ブチリルＣｏＡから酪酸部分を切り離すチオエステラーゼ）によるそれらの置換を含むｐＬＯＧＩＣ０４６を発現する低コピープラスミドにおけるニッスルで示された。
【０５７４】
細胞の一夜培養をＬｂで１：１００に希釈し、初期対数期に達するまで１．５時間増殖させ、その時点に無水ｔｅｔを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えて、プラスミドの発現を誘導した。２時間の誘導後、細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含むＭ９最少培地にＯＤ６００＝０．５で再懸濁した。試料を表示時間に除去し、細胞を遠沈した。上清をＬＣ−ＭＳを用いて酪酸の産生について試験した。図５１Ｂにｔｅｒ置換（ｐＬＯＧＩＣ０４６）またはｔｅｓＢ置換（ｐｔｂ−ｂｕｋ欠失）を有するｔｅｔ−酪酸カセットを含む菌株における酪酸の産生を示すが、ｔｅｓＢ置換菌株がより大きい酪酸産生を有することが実証された。
【０５７５】
図５２に一般的クローニング菌株であり、大腸菌突然変異体のＫＥＩＯ集合のバックグラウンドである、大腸菌のＢＷ２５１１３菌株を示す。ＮｕｏＢ欠失を有するＮｕｏＢ突然変異体が得られた。ＮｕｏＢは、呼吸成長時（電子伝達を必要とする成長の形）のＮＡＤＨの酸化に関与するタンパク質複合体である。ＮＡＤＨ酸化の電子伝達へのカップリングを妨げることにより、酪酸産生を維持するために用いられるＮＡＤＨの量が増加する。図５２に野生型ニッスルと比較して、ＮｕｏＢの欠失が酪酸のより多くの産生をもたらすことを示す。
【０５７６】
【表４４−１】
2018523978.tif 000111
【表４４−２】
2018523978.tif 000112
【表４４−３】
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[実施例３８]
【０５７７】
組換え大腸菌における酪酸の産生
酪酸産生に対する酸素の影響を判断するために、上述の酪酸カセットを含む大腸菌ニッスルにおける酪酸の産生を評価する。すべてのインキュベーションを３７℃で実施する。酪酸カセットで形質転換した大腸菌菌株ＤＨ５ａおよびニッスルの培養をＬＢ中で一夜増殖させ、４ｍＬの０．５％グルコース含有Ｍ９最少培地で１：２００に希釈する。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給）中で好気的または嫌気的にインキュベートする。１ｍＬの培養アリコートを１．５ｍＬ栓付き管に入れて用意し、培養の曝気を制限するために静的インキュベーター中でインキュベートする。１本の管を各時点（０、１、２、４および２０時間）に除去し、ＬＣ−ＭＳにより酪酸濃度について分析して、これらの組換え菌株における酪酸産生を低酸素環境で達成することができることを確認する。
【０５７８】
代替実施形態では、一夜細菌培養を新鮮なＬＢで１：１００に希釈し、１．５時間増殖させて、初期対数期に入ることを可能にした。この時点に、長半減期酸化窒素ドナー（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−酸化窒素付加体）を０．３ｍＭの最終濃度で培養に加えて、プラスミドからの発現を誘導した。２時間の誘導後、細胞を遠沈し、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最少培地に再懸濁した。次いで培養上清を表示時点に分析して、酪酸の産生のレベルを評価した。（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物；ＳＹＮ−ＵＣＤ５０７）または（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物；ＳＹＮ−ＵＣＤ５０８）を含む遺伝子操作ニッスルは、野生型ニッスルと比較して有意に多くの酪酸を産生する。
【０５７９】
ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がテトラサイクリンプロモーターの制御下に発現するｔｅｓＢ（配列番号４８）で置換されている酪酸遺伝子カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｔｅｓＢ−酪酸；配列番号８８）を含む遺伝子操作ニッスルを作製した。配列番号８８は、ｔｅｔＲリプレッサーの逆方向相補体（下線付き）、ｔｅｔＲならびに酪酸オペロンおよびそれらのそれぞれのＲＢＳを制御する多様なプロモーターを含む遺伝子間領域（太字）、ならびにＲＢＳにより分離された酪酸遺伝子（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓＢ）を含む。
【０５８０】
【表４５−１】
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【表４５−２】
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【表４５−３】
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【０５８１】
一夜細菌培養を新鮮なＬＢで１：１００に希釈し、１．５時間増殖させて、初期対数期に入ることを可能にした。この時点に、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で培養に加えて、プラスミドからの酪酸遺伝子の発現を誘導した。２時間の誘導後、細胞を遠沈し、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最少培地に再懸濁した。次いで培養上清を表示時点に分析して、酪酸の産生のレベルを評価した。ｐｂｔおよびｂｕｋのｔｅｓＢによる置換が、より大きいレベルの酪酸産生をもたらす。
【０５８２】
図５３Ｃにグルコースおよび酸素の存在下／非存在下でのＦＮＲ−酪酸カセットｓｙｎ  ３６３（ｔｅｒ置換を有する）を含む菌株における酪酸産生を示す。図５３Ｃは、細菌がＦＮＲプロモーターからの酪酸産生のためにグルコースおよび嫌気的条件の両方を必要とすることを示している。細胞は、グルコース不含有培地（ＬＢ）中または０．５％グルコース含有培地（ＲＭＣ）中で好気的または嫌気的に増殖させた。培養試料を表示時点に採取し、上清の一部をＬＣ−ＭＳを用いて酪酸濃度について評価した。これらのデータから、ＳＹＮ３６３が酪酸の産生のためにグルコースを必要とし、グルコースの存在下では、嫌気性ＦＮＲ調節ｙｄｆＺプロモーターの制御下にある場合、嫌気的条件下で酪酸の産生を増大させることができることがわかる。
[実施例３９]
【０５８３】
アンモニア代謝および酪酸産生回路を含む細菌菌株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
アンモニアの取込みおよびアルギニンへの変換ならびに酪酸の産生を１つの菌株において達成することができるかどうかを判断するために、酪酸産生カセット構築物を含むプラスミド（Ｌｏｇｉｃ１５６）を最初の概念実証実験に用いた。以下の菌株をプラスミドを用いて作製した：ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍ耐性）を含む）；およびＳＹＮ−ＵＣＤ−３０５であり、Ｌｏｇｉｃ１５６をさらに含むＳＹＮ−ＵＣＤ６０１（すなわち、ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１は、ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍ耐性）を含む）。酪酸のみの産生菌ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１、アルギニンのみの産生菌ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５および複合酪酸／アルギニン産生菌ＳＹＮ−ＵＣＤ−６０１の間でアルギニンおよび酪酸の産生を比較した。用いた酪酸カセットの配列を表３８に示す。
【０５８４】
手短に述べると、凍結グリセロールストックからの細菌を含む３ｍｌのＬＢ（選択的抗生物質（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０１についてＡｍｐ）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ３０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０１について３ｍＭチミジンを含む）。細菌を振盪しながら３７℃で一夜増殖させた。一夜培養を１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ中で１０ｍｌのＬＢ（上記のように必要な場合、抗生物質およびチミジンを含む）に１：１００の希釈度で希釈した。培養を振盪しながら３７℃で好気的に約１．５時間増殖させ、次いで３７℃の嫌気的チャンバーに４時間移した。細菌（２×１０８ＣＦＵ）を小遠心管中５０ｍＭ  ＭＯＰＳを０．５％グルコースとともに含む１ｍｌのＭ９培地に加えた。細胞を平板培養して、細胞数を測定した。アッセイ管を３７℃の嫌気性チャンバーに入れた。表示時間（１、２、２４時間）に、１２０μｌの細胞を除去し、１４，０００ｒｐｍで１分間ペレット化し、１００μｌの上清を９６ウエルアッセイプレートに移し、アルミニウムフォイルで密封し、アルギニンおよび酪酸濃度のＬＣ−ＭＳ（実施例１３および実施例４０で述べる）による分析時まで−８０℃で保存した。
【０５８５】
結果を図５３Ａおよび図５３Ｂに示す。ＳＹＮ−ＵＣＤ６０１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＹＮ−ＵＣＤ３０５と同様のレベルのアルギニンを、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１と同様のレベルの酪酸を産生することができることが示されている。
【０５８６】
【表４６−１】
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【表４６−２】
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【表４６−３】
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【表４６−４】
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【表４６−５】
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【表４６−６】
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【表４６−７】
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【０５８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９０の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９０と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９０のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９０と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５８８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９２の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９２と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９２のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９２と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９４の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９４と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９４のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９４と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５９０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９６の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９６のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５９１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９８の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９８のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１００の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１００と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１００のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１００と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５９３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０４の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０４と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０４のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０４と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号４８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号４８のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号４８と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０５９５】
代替実施形態では、ｐｂｔおよびｂｕｋがＴｅｓＢ（配列番号４８）で置換されている。
いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、誘導性プロモーターにより駆動される。例えば、配列番号におけるｙｄｆＺの代わりに他のＦＮＲプロモーターを用いることができる。
【０５９６】
非限定的なＦＮＲプロモーター配列を本明細書に示す。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作細菌は、表６に見いだされるプロモーター配列、例えば、ｎｉｒＢプロモーター、ｙｄｆＺプロモーター、強いリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢ、強いリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター、嫌気的に誘導される小ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳプロモーター）である、ｆｎｒＳ、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳのうちの１つまたは複数の制御下の酪酸カセットを含む。
【０５９７】
いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、消化管内に存在する代謝物により誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、ＨＰ特異的分子または肝損傷を示す代謝物、例えば、ビリルビンにより誘導される。いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、炎症または炎症反応により誘導性である、プロモーター（例えば、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーター）の制御下におかれる。
【０５９８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、それらの血液および腸における分子または代謝物、例えば、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニアならびにマンガンにより誘導されたプロモーターにより駆動される酪酸カセットを含む。これらの分子またはそれらの代謝物の１つに応答するプロモーターは、本明細書で示した遺伝子操作細菌に用いることができる。
【０５９９】
いくつかの実施形態では、酪酸カセットは、アラビノースにより誘導性であり、ＡｒａＢＡＤプロモーターにより駆動される。
[実施例４０]
【０６００】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる酪酸の定量
実施例３７における酪酸の測定値を得るために、酪酸の定量のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロトコールを用いた。
【０６０１】
試料の調製
最初に、新鮮な酪酸ナトリウム保存溶液（１０ｍｇ／ｍ）ならびに１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム標準を水を用いて調製した。次いで、１０μＬの試料（細菌上清および標準）をＶ型底ポリプロピレン９６ウエルプレートにピペッティングし、最終溶液中４μｇ／ｍＬの酪酸−ｄ７（ＣＤＮ同位体）内部標準を含む９０μＬの６７％ＡＣＮ（反応当たり６０μＬ  ＡＣＮ＋３０μＬ水）を各試料に加えた。プレートを熱融着させ、十分に混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。丸底９６ウエルポリプロピレンプレートにおいて、２０μＬの希釈試料を、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．５、２０ｍＭ  ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）および２０ｍＭ  ＴＦＥＡ（２，２，２−トリフルオロエチルアミン）を含む１８０μＬの緩衝液に加えた。プレートを再び熱融着させ、十分に混合し、試料を室温で１時間インキュベートした。
【０６０２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
酪酸は、Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ三連四重極質量分析計を用いたタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ＨＰＬＣの詳細を表４５および表４６に示す。タンデム質量分析の詳細は、表４７に見いだされる。
【０６０３】
【表４７】
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【０６０４】
【表４８】
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【０６０５】
【表４９】
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[実施例４１]
【０６０６】
胆管結紮モデルにおけるアルギニンおよび／または酪酸を産生する遺伝子操作細菌の有効性
げっ歯類における総胆管の結紮は、肝臓胆汁うっ滞および線維症を誘発する多年にわたる研究における実験的処置として用いられている（例えば、Ｔａｇら、Ｂｉｌｅ  Ｄｕｃｔ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ：  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、２０１５年２月；９６；ｅ５２４３８頁、その中の参考文献参照）。
【０６０７】
肝臓炎症および線維症の症状の低減におけるアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株の有効性を判定するために、胆管結紮モデルを用いる。ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）を本試験で比較する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、線維症（門脈、類洞周囲および総）ならびに肝炎が本試験の主要なエンドポイントであり、動物の全般的な健康状態が本試験の副次的エンドポイントである。
【０６０８】
動物（Ｃ５７ＢＬ６、８週）は、Ｈ２Ｏ対照（ｎ＝１２）、またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０７（ｎ＝１２；カナマイシン耐性ニッスル）、またはアルギニン産生ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよび無抗生物質耐性を含む）、または酪酸産生ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２；染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含む）、またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよび染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセット、ならびに無抗生物質耐性を含む）の強制経口投与により治療する。細菌を＞１０ｅ１０細胞／ｍｌの用量で投与する。
【０６０９】
いくつかの実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性を含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０２（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性を含む））をＳＹＮ−ＵＣＤ５０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０５の代わりに用いる。
【０６１０】
０日目に、胆管結紮手術を実施例４０で述べたように実施する。１日目に、マウスの体重を測定し、無作為化する。マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。２日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ７９８およびＳＹＮ９９３を午前および午後に強制経口投与する。３日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。午前の投与の４時間後に、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。４〜６日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。７日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。午前の投与の４時間後に、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。８〜９日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。１０日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。午前の投与の４時間後に、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。１１〜１３日目に、マウスに１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前および午後に強制経口投与する。１４日目に、動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前に強制経口投与する。次いで、投与の４時間後に動物を安楽死させ、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために心臓採血により血液を採取する。組織学的評価による線維症の分析のために肝臓組織を採取する。
[実施例４２]
【０６１１】
胆管結紮処置
胆管結紮
手術前の準備：
完全な実験中に、動物を麻酔システムに永続的に接続された、３７℃の温度の加温プレート上に保持し、手術野を液体浸透性の自己接着性ドレープで全体的に覆う。
【０６１２】
マウスは、麻酔の誘導のための４Ｌ／分の流量の１００％酸素中４容積％イソフルランの吸入により麻酔する。麻酔の深さは、次のバイタル基準に達する場合、十分である：規則的な自発呼吸、指間疼痛刺激の無反射および疼痛への無反応。マウスの腹部の被毛を電気ファーシェーバーで剃毛し、眼および鼻軟膏を用いて眼を乾燥から保護する。マウスを３７℃の加熱ホットプレート上にのせ、マウスの鼻をＦｌｕｏｖａｃ麻酔システムのＦｌｕｏｖａｃマスクに挿入し、動物の脚を絹テープのストライプで固定する。
マウスの麻酔は、１Ｌ／分の流量の１００％酸素中１．５〜３容積％イソフルランの吸入により維持し、ブプレノルフィン溶液（０．９％  ＮａＣｌ溶液に溶解した０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）の腹腔内注射により周術期の鎮痛を誘導する。
【０６１３】
剃毛腹部皮膚を皮膚の術前処置用の調製済みの標準消毒アルコール溶液で湿らせたガーゼスワブ滅菌する。
【０６１４】
外科手術
１１．５ｃｍ外科用鋏で真皮と筋膜を同時に切断することにより約２ｃｍの長さの正中線開腹術により腹部を開く。鋏を延展器として用いることによって腹膜の上部の結合組織を切開した。腹膜を白線に沿って切断して、腹腔を開く。保持縫合糸を胸骨に挿入し、縫合糸のフィラメントを持ち上げることによって腔を拡大し、それをＦｌｕｏｖａｃマスクの上部に固定する。Ｃｏｌｉｂｒｉ牽引器を腹腔に挿入することによって手術野を広げる。その腹側が横隔膜に向かって突き出て、門が明瞭に見えるように、湿らせた（０．９％ＮａＣｌ溶液）綿スワブで肝臓を持ち上げる。腸の尾側移動による胆管を露出させる。小鋸歯状鉗子を用いて胆管を隣接門脈静脈および肝動脈から注意深く分離する。５−０縫合糸を胆管の周囲に設置し、２つの外科結びにより固定する。結び目を作る場合、牽引力を連続的に増加させて、胆管を断ち切ることなく効果的な閉塞を保証する。第２の頭側結紮を間の胆管を切断することなく同様な方法で加える。縫合糸の末端を切断し、胸骨を下げ、牽引器を除去する。腹腔を０．９％ＮａＣｌ溶液ですすぎ、腹部臓器を生理的位置に戻す。両腹部層（腹膜および真皮と筋膜）を６−０  Ｍｅｒｓｉｌｋを用いた別個の連続縫合によって閉鎖する。縫合糸の末端を切断し、手術野を消毒溶液で湿らせたガーゼスワブで滅菌する。
【０６１５】
術後処置およびフォローアップ：
マウスが十分に覚醒し、活動的になるまで、マウスを赤外ランプで加温されたケージ内で回復させる。その後、マウスを通常のケージに移動させ、水および食物を自由に摂取させる。手術後、内部動物管理使用委員会の現地の勧告に従って、動物を定期的にモニターし、適切な鎮痛薬（例えば、ブプレノルフィン溶液）を用いてフォローアップ術後処置を行う。動物に実験の終了まで食物および水を自由に摂取させることを維持した。
[実施例４３]
【０６１６】
肝性脳症のＴＡＡモデル
ＵＣＤ、急性および慢性肝疾患ならびにＨＥに関連する血中アンモニアレベルの増加を模擬するためのマウスのＴＡＡ処理は、文献において以前に用いられた（Ｗａｌｌａｃｅ  ＭＣら、Ｌａｂ  Ａｎｉｍ．、２０１５年４月；４９巻（増補１）：２１〜９頁、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔｓ）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌の活性の持続時間を検討し、肝性脳症の治療へのこのアプローチを支援するための追加データを得るために高アンモニア血症のＴＡＡ誘発マウスモデルを用いる。
【０６１７】
肝臓炎症および線維症の症状を軽減するアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株の有効性を判定するために、ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）をＴＴＡモデル試験において比較する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、線維症（門脈、類洞周囲および総）ならびに肝炎が本試験の主要なエンドポイントである。動物の全般的な健康状態が本試験の副次的エンドポイントである。
【０６１８】
血中アンモニアの長期の上昇に対する操作細菌の影響を検討するために、３００ｍｐｋの用量のチオアセトアミド（ＴＡＡ）も投与するＣ５７ＢＬ６マウスに細菌を投与する。
【０６１９】
Ｃ５７ＢＬ６（１０週齢）にＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、またはＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ｎ＝１２）、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２）、もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２）（１００μｌの＞１×１０１０細胞／ｍｌ）または媒体対照の一日量を投与する。あるいは、マウスに２一日量の細菌（１００μｌの＞１×１０１０細胞／ｍｌ）（各治療群につきｎ＝５）を午前に１回、午後に１回投与する。細菌の前投与の３日後に、マウスに３００ｍｐｋのチオアセトアミド（ＴＡＡ）または対照としてのＨ２Ｏを腹腔内投与する。あるいは、マウスに２５０ｍｐｋを１日２回、午前に１回、午後に１回投与する。試験の期間は、５日である。アンモニアレベルを測定し、全般的な健康状態、生存、体重変化をモニターする。
【０６２０】
手短に述べると、動物を７日間馴化させる。時間経過の１日目に、動物の体重を測定し、ベースラインＡＬＴ／ＡＳＴを測定するために採血し、糞便ペレット（ケージごと）を採取し、ＡＬＴ／ＡＳＴレベルに基づいて無作為化する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。水をＨ２Ｏ（＋）２０ｍｇ／ｍｌ  ＡＴＣに変更する。２日目に、動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。３日目に、動物の体重を測定し、Ｈ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。さらに、動物に３００ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）を腹腔内投与する。あるいは、動物に２５０ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）を午前に１回、午後に１回投与する。４日目に、動物の体重を測定し、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。糞便ペレットをケージごとに採取する。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。動物に２５０ｍｐｋのＴＡＡ（または生理食塩水対照）も投与することができる。５日目に、動物の体重を測定し、ＡＬＴ／ＡＳＴの分析のために血液を採取する。糞便ペレットをに採取する（ケージごと）。動物にＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（１００μｌ／用量／動物）を１回または２回（午前および午後）の強制経口投与により投与する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、糞便ペレット中の細菌負荷ならびに全般的な健康生存期間および体重変化をモニターする。組織学的評価による線維症の分析のために肝臓組織を採取する。
[実施例４４]
【０６２１】
肝性脳症の四塩化炭素（ＣＣｌ４）モデル
ＣＣｌ４は、動物における肝線維症および肝硬変を誘発するためにしばしば用いられる。その理由は、基礎をなす生化学的機構および組織学的特性がヒト肝硬変に認められるものに類似しているからである（Ｎｈｕｎｇら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４年、１巻（２号）：４３〜４９頁）。
【０６２２】
ＣＹＰ２Ｅ１は、細静脈周囲肝細胞において発現し、ＣＣｌ４をＣＣｌ３＋ラジカルに変換する酵素である。ＣＣｌ３＋ラジカルの蓄積は、小葉中心性壊死ならびに肝細胞形質およびミトコンドリア膜の透過性の変化を引き起こす。結果として、炎症および線維形成の増加、ならびに細胞外マトリックスの沈着が認められる。慢性ＣＣｌ４曝露は、創傷治癒過程の産物である、小結節の形成および線維症をもたらす。ＣＣｌ４処理は、２〜４週後に線維症、５〜７週後に著しい架橋線維症、９〜１１週後に硬変および１０〜２０週後に小結節性硬変を引き起こすことが示された（Ｎｈｕｎｇら、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ；  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１４年、１巻（２号）：４３〜４９頁、およびそれにおける参考文献）。
【０６２３】
肝臓炎症および線維症の症状を軽減するアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株の有効性を判定するために、肝硬変のＣＣｌ４マウスモデルを用いる。ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）を本試験において比較する。ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、線維症（門脈、類洞周囲および総）ならびに肝炎が本試験の主要なエンドポイントである。動物の全般的な健康状態が本試験の副次的エンドポイントである。試験期間は８週間である。
【０６２４】
動物（Ｃ５７ＢＬ６、８週齢）をＨ２Ｏ対照（ｎ＝１２）またはＳＹＮ−ＵＣＤ１０７（ｎ＝１２；カナマイシン耐性ニッスル）、もしくはアルギニン産生ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない）もしくは酪酸産生ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２；野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡ、および染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含む）もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡ、染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含み、抗生物質耐性を含まない）の強制経口投与により治療する。細菌は、１００μｌの容量で＞１０ｅ１０細胞／ｍｌの用量で投与する。
【０６２５】
いくつかの実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、 野生型ＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０２（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む）をＳＹＮ−ＵＣＤ５０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０５の代わりに用いる。
【０６２６】
１日目に、マウスの体重を測定し、無作為化する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前に強制経口投与する。さらに、動物にオリーブ油（擬似対照）またはオリーブ油中１ｍｌ／ｋｇ  ＣＣＬ４（他のすべての治療群）を強制経口投与する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午後に強制経口投与する。
【０６２７】
１〜８週目に、動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を１日２回強制経口投与する。さらに、動物にオリーブ油（擬似対照）またはオリーブ油中１ｍｌ／ｋｇ  ＣＣＬ４（他のすべての治療群）を３ｘ／週、強制経口投与する。動物の体重を３ｘ／週測定し、ＡＬＴ／ＡＳＴ分析用の血液を１ｘ／週採取する。
【０６２８】
８週目の終了時に、動物に１００μｌのＨ２Ｏ、ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前に強制経口投与する。投与の４時間後に、動物の体重を測定し、安楽死させ、ＡＬＴ／ＡＳＴ分析のために心臓採血により血液を採取する。組織学的評価による線維症の分析のために肝臓を採取する。
[実施例４５]
【０６２９】
ＤＳＳマウスモデルにおける酪酸発現細菌の有効性
上述の酪酸カセットを含む細菌をＬＢ中で一夜増殖させた。次いで細菌を適切な選択マーカー、例えば、アンピシリンを含むＬＢで１：１００に希釈し、０．４〜０．５の光学濃度まで増殖させ、次いで遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、１００μｌをマウスに強制経口投与する。細菌の強制経口投与前の７日間にわたり３％デキストラン硫酸ナトリウムを含む飲料水を補給することによってマウスにおける消化管の損傷を誘発させる。マウスを１週間にわたり毎日処理し、糞便ホモジネートを適切な選択マーカー、例えば、アンピシリンを添加した寒天プレート上で平板培養することによって糞便試料中の細菌を検出する。５日間の細菌処理の後、内視鏡法を用いて生存マウスにおける消化管の損傷を採点する。内視鏡的損傷スコアは、結腸の透過性、フィブリン付着、粘膜および血管の病変、および／または糞便の特性を評価することにより確定する。マウスを屠殺し、結腸組織を単離する。遠位結腸切片を固定し、炎症および潰瘍形成について採点する。結腸組織をホモジネートし、酵素アッセイキットを用いてミエロペルオキシダーゼ活性ならびにサイトカインレベル（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）について測定を行う。
[実施例４６]
【０６３０】
ＨＥのＤＳＳ誘導マウスモデルの作製
述べた遺伝子操作細菌は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスモデにおいて試験することができる。動物へのＤＳＳの投与は、炎症誘発性腸内容物（例えば、内腔抗原、腸内細菌、細菌産物）に炎症を伝播させ、誘発させる、腸上皮の化学的損傷をもたらす（Ｌｏｗら、２０１３年）。ＤＳＳ処理用のマウスを準備するために、マウスを耳パンチまたは任意の他の適切な標識法を用いて標識する。マウスは、ＤＳＳ誘導に対して異なる感受性および反応性を示すので、個々のマウスを標識することにより、研究者が各マウスにおける疾患の進行を追跡することができる。次いでマウスの体重を測定し、必要な場合、群間の任意の有意な体重差を解消するために平均群体重を均衡させる。後のアッセイの対照として、ＤＳＳの投与の前に糞便も採取する。炎症の糞便マーカー（例えば、サイトカインレベルまたはミエロペルオキシダーゼ活性）の例示的アッセイを以下に述べる。
【０６３１】
ＤＳＳの投与のために、高圧滅菌水中ＤＳＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ；カタログ番号１６０１１０）の３％溶液を調製する。次に、ケージの水ボトルに１００ｍＬのＤＳＳ水を満たし、対照マウスにＤＳＳの補給のない同じ量の水を与える。この量は、一般的に５匹のマウスに対して２〜３日間は十分なものである。ＤＳＳは室温で安定であるが、両方の種類の水を２日ごと、またはボトル内の濁りが認められた場合に交換する。
【０６３２】
腸炎症の急性、慢性および集束性モデルは、ＤＳＳの用量（通常１〜５％）およびＤＳＳ投与の期間を変更することによって達成される（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４年）。例えば、急性および集束性消化管損傷は、１週間以下にわたるＤＳＳへの単一連続曝露後に達成することができるのに対して、慢性消化管損傷は、回復期間により中断されるＤＳＳの周期的投与（例えば、４サイクルの７日間のＤＳＳ処理、と続く７〜１０日の水）によって一般的に誘導される。
【０６３３】
図５３ＤにＦＮＲプロモーターの制御下のＤＳＳマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで産生された酪酸が消化管防護的であり得ることが示されている。ＬＣＮ２およびカルプロテクチンは、両方が消化管バリアの破壊（このアッセイでＥＬＩＳＡにより測定される）の尺度である。図５３ＤにＳｙｎ３６３（ｔｅｒ置換）がＳｙｎ９４（野生型ニッスル）と比較して炎症を低減し、かつ／または消化管バリアを保護することが示されている。
[実施例４７]
【０６３４】
疾患の進行のｉｎ  ｖｉｖｏでのモニタリング
ＤＳＳの初回投与後、単一マウスを空のケージ（床敷き材料を含まない）に１５〜３０分間入れることにより、糞便を各動物から毎日採取する。しかし、ＤＳＳの投与が進み、炎症が強くなるにつれて、採取に必要な時間が長くなる。糞便試料は、滅菌済み鉗子を用いて採取し、遠心管に入れる。単一ペレットを用いて、
以下の採点法に従って潜血をモニターする：０、正常な糞便の堅さと潜血陰性；１、軟便で、潜血陽性；２、非常に軟便で、微量の血液；および３、水様便で、可視直腸出血。この採点基準は、腸出血の比較解析に用いられる。すべての残存糞便は、炎症マーカーの測定のために確保し、−２０℃で凍結する。
【０６３５】
各動物の体重も毎日測定する。体重は、最初のＤＳＳの投与後の最初の３日間にわずかに増加し、次いで出血の開始後徐々に減少し始める。急性大腸炎のマウスモデルについては、ＤＳＳは、一般的に７日間投与する。しかし、この期間は、研究者の裁量で変更することができる。
[実施例４８]
【０６３６】
ＤＳＳ誘導後の遺伝子操作細菌のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
本明細書に記載の遺伝子操作細菌は、ＨＥのＤＳＳ誘導動物モデルにおいて試験することができる。細菌は、適切な抗生物質を添加したＬＢ中で一夜増殖させる。次いで細菌を選択抗生物質を含む新鮮なＬＢで１：１００に希釈し、０．４〜０．５の光学濃度まで増殖させ、遠心分離によりペレット化する。次いで細菌をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁する。細菌の強制経口投与前の７日間にわたり３％ＤＳＳを含む飲料水を補給することによって、マウスにおける消化管損傷を誘発させる。ＤＳＳ処理の７日目に、１００μＬの細菌（または媒体）をマウスに強制経口投与により投与する。細菌処理を１週間にわたり毎日１回反復し、糞便ホモジネートを選択寒天プレート上で平板培養することによって糞便試料中の細菌を検出する。
【０６３７】
細菌処理の５日後に、Ｃｏｌｏｖｉｅｗシステム（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）を用いて生存マウスにおける消化管損傷を採点する。１．５〜２．０％イソフルラン麻酔下のマウスにおいて、結腸を空気で拡張し、近位結腸の約３ｃｍを視覚化することができる（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４年）。内視鏡的損傷は、最大スコアが１８となる、結腸の透過性（スコア０〜３）、腸壁へのフィブリンの付着（スコア０〜３）、粘膜顆粒度（スコア０〜３）、血管病変（スコア０〜３）、糞便の特性（正常〜下痢；スコア０〜３）および内腔における血液の存在（スコア０〜３）を評価することにより採点する。マウスを屠殺し、実施例８および９で述べたプロトコールを用いて結腸組織を単離する。遠位結腸切片を固定し、炎症および潰瘍形成について採点する。残りの結腸組織をホモジナイズし、サイトカインレベル（例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）ならびにミエロペルオキシダーゼ活性を下で述べる方法を用いて測定する。
[実施例４９]
【０６３８】
ＨＥのげっ歯類モデルの安楽死処置法
屠殺の４および２４時間前に、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；カタログ番号Ｂ２３１５１）を供給業者の推奨の通りに、マウスに腹腔内投与することができる。ＢｒｄＵを用いて、標準抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いた免疫組織化学により腸上皮細胞の増殖および／または移動をモニターする。
【０６３９】
屠殺の当日に、マウスに４時間絶食させ、次いでＦＩＴＣ−デキストラントレーサー（４ｋＤａ、０．６ｍｇ／ｇ体重）を強制経口投与する。糞便ペレットを採取し、ＦＩＴＣ−デキストラン投与後３時間目にマウスを安楽死させる。次いで動物の心臓から採血して、無溶血血清を採取する。腸透過性は、適切に希釈された血清の蛍光強度（励起４８８ｎｍ、発光５２０ｎｍ）と相関しており、分光光度法を用いて測定する。マウス血清中の既知量のＦＩＴＣ−デキストランの連続希釈を用いて、標準曲線を作成する。
【０６４０】
あるいは、腸炎症は、血清ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）、リポカリン２、カルプロラクチンおよび／またはＣＲＰ−１のレベルにより定量する。これらのタンパク質は、炎症性疾患の活動性の信頼できるバイオマーカーであり、製造業者の指示に従って、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて測定する。これらのアッセイについては、対照血清試料は、ＫＣについて１：２または１：４に、リポカリン２について１：２００に希釈する。ＤＳＳ処理マウスからの試料は、相当高い希釈を必要とする。
[実施例５０]
【０６４１】
肝性脳症の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）モデル
ＮＯＤマウスは、消化管バリア増強回路、例えば、酪酸生合成カセットを含む細菌の有効性を試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして用いることができる。
その理由は、これらのマウスは、密着結合タンパク質（例えば、オクルジン、ゾニュラオクルジン、ムチン、Ｅ−カドヘリン）のレベルの低下によって明らかである、顕著な「漏出性消化管」表現型を示すからである。
【０６４２】
「漏出性消化管」に関連する症状を軽減するアルギニンおよび酪酸産生回路を含む菌株の有効性を判定するために、ＮＯＤマウスモデルを用いる。ＮＯＤマウスは、膵島β細胞の自己免疫性破壊に起因する。ニッスル対照（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０７、カナマイシン耐性ニッスル）、アルギニン産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５）、酪酸産生菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２）ならびに酪酸およびアルギニンの両方を産生する菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ６０５）を本試験において比較する。消化管上皮の完全性（オクルジンおよび他の密着結合マーカー）ならびに消化管炎症（炎症性バイオマーカー、例えば、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦａ、ＩＬ−２１）が本試験の主要なエンドポイントである。動物の全般的な健康状態が本試験の副次的エンドポイントである。試験の期間は、８週間である。
【０６４３】
動物（Ｃ５７ＢＬ６、８週齢）をＨ２Ｏ対照（ｎ＝１２）または酪酸１００ｍＭ（ｎ＝１２）、もしくはアルギニン産生ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡを含み、抗生物質耐性を含まない）もしくは酪酸産生ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２（ｎ＝１２；野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、野生型ＴｈｙＡ、および染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含む）もしくはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５（ｎ＝１２；ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡ、染色体に組み込まれたＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸カセットを含み、抗生物質耐性を含まない）の強制経口投与により治療する。細菌は、１００μｌの容量で＞１０ｅ１０細胞／ｍｌの用量で投与する。
【０６４４】
いくつかの実施形態では、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０１（野生型ＡｒｇＲ、無ＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ、 野生型ＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む）ならびにＳＹＮ−ＵＣＤ６０２（ΔＡｒｇＲ、ｍａｌＥＫ遺伝子座において染色体に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、ΔＴｈｙＡおよびＬｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ酪酸プラスミド；ａｍｐ耐性）を含む）をＳＹＮ−ＵＣＤ５０２およびＳＹＮ−ＵＣＤ６０５の代わりに用いる。
【０６４５】
１日目に、マウスの体重を測定し、無作為化する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、１００ｍＭ酪酸、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午前に強制経口投与する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、１００ｍＭ酪酸、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を午後に強制経口投与する。動物に１００μｌのＨ２Ｏ、１００ｍＭ酪酸、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ５０２またはＳＹＮ−ＵＣＤ６０５を１日２回強制経口投与する。動物の体重を毎日測定する。
【０６４６】
５日目に、マウスを４時間絶食させ、次いで０．６ｍｇ／ｇ  ＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤ）を強制経口投与する。ＦＩＴＣ−ｄｅｘの投与後３時間目にマウス体重を測定し、心臓採血により血液を採取し、結腸および糞便ペレットを採取する。
【０６４７】
ハプトグロビン／ゾヌリンおよびＬｃｎ２を測定する。ＴＪＰ１、ＯＣＬＮ、ＣＬＤＮ２５およびＥＰＣＡＭのＲＮＡレベルを結腸試料において測定する（これらのマーカーのレベルの増加は治療効果を示す）。炎症バイオマーカーのＲＮＡレベルを血液試料において測定する（これらのマーカーのレベルの低下は治療効果を示す）。
[実施例５１]
【０６４８】
ＧＡＢＡ輸送および代謝回路
上述のアンモニア変換回路に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、１つもしくは複数のＧＡＢＡ輸送および／または１つもしくは複数のＧＡＢＡ代謝回路をさらに含む。少なくとも１つのＧＡＢＡ輸送回路を含む遺伝子操作菌株は、ＧａｂＰ（配列番号１０５、表４８；配列番号１０６、表４９）などの、例示的ＧＡＢＡ輸送タンパク質をコードする遺伝子を含み、上述の方法を用いて構築される。少なくとも１つのＧＡＢＡ代謝回路を含む遺伝子操作菌株は、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨを含むが、これらに限定されない、ＧＡＢＡ代謝に必要な酵素をコードする遺伝子を含み、上述の方法を用いて構築される。
【０６４９】
ＧａｂＰ、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、テトラサイクリン誘導性プロモーター、配列番号１８〜２９から選択されるＦＮＲプロモーターまたはＨＥ関連分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターの制御下に発現する。ＧａｂＰ、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、同じまたは異なるプロモーターの制御下に発現し得る。本明細書に記載の通り、他のプロモーターを用いることができる。ＧａｂＰ、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上に発現する。ＧａｂＰ、ＧＳＳＴおよびＳＳＤＨをコードする遺伝子は、大腸菌ニッスルにおける次の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参照されたい。
【０６５０】
【表５０】
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【表５１−１】
2018523978.tif 000128
【表５１−２】
2018523978.tif 000129
【０６５１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０６の核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０６のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片、または遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０６と同じポリペプチドをコードする核酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[実施例５２]
【０６５２】
マンガン輸送回路
上述の回路に加えて、大腸菌ニッスル細菌は、１つもしくは複数のマンガン輸送回路をさらに含む。少なくとも１つのマンガン輸送回路を含む遺伝子操作菌株は、ＭｎｔＨ（配列番号１０７、表５０；配列番号１０８、表５１）などの、例示的マンガン輸送タンパク質をコードする遺伝子を含み、上述の方法を用いて構築される。
【０６５３】
ＭｎｔＨをコードする遺伝子は、テトラサイクリン誘導性プロモーター、配列番号１８〜２９から選択されるＦＮＲプロモーターまたはＨＥ関連分子もしくは代謝物により誘導されるプロモーターの制御下に発現する。本明細書に記載の通り、他のプロモーターを用いることができる。ＭｎｔＨをコードする遺伝子は、高コピープラスミド、低コピープラスミドまたは染色体上に発現する。ＭｎｔＨをコードする遺伝子は、大腸菌ニッスルにおける次の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔのうちの１つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位を用いることができる。例えば、図１８を参照されたい。
【０６５４】
【表５２】
2018523978.tif 000130
【０６５５】
【表５３】
2018523978.tif 000131
[実施例５３]
【０６５６】
ＴｅｓＢを含む回路
ＴｅｓＢの核酸配列は、以下のように翻訳される。
【０６５７】
【表５４】
2018523978.tif 000132
【０６５８】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０９のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０９のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０９と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０６５９】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９１のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９１のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９１と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０６６０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９３のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９３のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９３と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０６６１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９５のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９５のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９５と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０６６２】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９７のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９７のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９７と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０６６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９９のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号９９のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号９９と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【０６６４】
【表５５−１】
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【表５５−２】
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【表５５−３】
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【０６６５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０１のアミノ酸配列またはその機能性断片を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作細菌は、配列番号１０１のアミノ酸配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列、あるいは、遺伝コードの重複性を別とすれば、配列番号１０１と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４８−３】
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【図４８−４】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図４９−３】
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【図４９−４】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５０−３】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５３−４】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
2018523978.tif 000225
【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６６−３】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
2018523978.tif 000231
【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
2018523978.tif 000234
【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
2018523978.tif 000238
【図７７】
2018523978.tif 000239
【図７８】
2018523978.tif 000240
【図７９】
2018523978.tif 000241
【図８０】
2018523978.tif 000242
【図８１】
2018523978.tif 000243
【図８２−１】
2018523978.tif 000244
【図８２−２】
2018523978.tif 000245
【図８２−３】
2018523978.tif 000246
【図８３】
2018523978.tif 000247
【図８４】
2018523978.tif 000248
【配列表】
2018523978000001.app
【国際調査報告】
2018523978.tif 000249
2018523978.tif 000250
2018523978.tif 000251
2018523978.tif 000252
2018523978.tif 000253
2018523978.tif 000254
2018523978.tif 000255