(57)【要約】  本発明は、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、及び特にＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを対象とする。本発明はまた、このような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物も対象とする。本発明は更に、癌並びに他の疾患及び状態の治療における、このようなダイアボディの使用方法を対象とする。【選択図】図１６Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を有し；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項２】
請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項３】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５９のアミノ酸配列を有し；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を有し；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項８】
請求項７に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項９】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項７に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を有し；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を有し；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項１４】
請求項１５に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項１３に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖は、共有結合複合体を形成し：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を有し；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を有し；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又は請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
前記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は状態は、癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第６２／２０６，０５１号（２０１５年８月１７日出願；係属中）及び米国特許出願第６２／２８０，３１８号（２０１６年１月１９日出願）に対する優先権を主張するものであり、これらの特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１２３ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１６年８月１０日作成、サイズ：７０，４８１バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を有する、二重特異性１価ダイアボディ（即ち「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。より好ましくは、このようなＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖で構成され、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を有し、更に免疫グロブリンＦｃドメインを含む（即ち「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）。本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、このような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、癌並びに他の疾患及び状態の治療におけるこのようなダイアボディの使用方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
Ｉ．Ｂ７スーパーファミリー及びＢ７‐Ｈ３
腫瘍の成長及び転移は、これらが宿主の免疫監視機構を回避して宿主の防御を克服する能力に大きく左右される。ほとんどの腫瘍は、宿主の免疫系によって程度が可変であると認識できる抗原を発現するが、多くの場合、エフェクタＴ細胞の無効な活性化により、不十分な免疫応答が誘発される（非特許文献１）。
【０００５】
Ｂ７‐Ｈ３は、免疫グロブリン分子のＢ７スーパーファミリーのメンバーである。Ｂ７スーパーファミリーのメンバーは、免疫グロブリン‐Ｖ様ドメイン及び免疫グロブリン‐Ｃ様ドメイン（例えばそれぞれＩｇＶ及びＩｇＣ）を有する（非特許文献２）。Ｂ７‐スーパーファミリーメンバーのＩｇＶ及びＩｇＣドメインはそれぞれ単一のエクソンによってコードされ、追加のエクソンがリーダ配列、膜貫通及び細胞質ドメインをコードする。細胞質ドメインは短く、アミノ酸残基１９〜６２個の長さであり、複数のエクソンによってコードできる（非特許文献３）。Ｂ７スーパーファミリーのメンバーは、細胞表面において連続した非共有結合ホモ二量体を形成すると予測され、このような二量体はＢ７‐１（ＣＤ８０）及びＢ７‐２（ＣＤ８６）に関して発見されている。Ｂ７‐１（ＣＤ８０）及びＢ７‐２（ＣＤ８６）は、刺激性ＣＤ２８受容体及び阻害性ＣＴＬＡ‐４（ＣＤ１５２）受容体に対する二重特異性を呈する（非特許文献８）。
【０００６】
Ｂ７‐Ｈ３（ＣＤ２７６）は、主要なヒト型が２つの細胞外タンデムＩｇＶ‐ＩｇＣドメイン（即ちＩｇＶ-ＩｇＣ-ＩｇＶ-ＩｇＣ）を含有する点において独特である（非特許文献３）。４免疫グロブリン細胞外ドメイン変異体（「４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３」）は、最初はＩｇドメイン（ＩｇＶ-ＩｇＣ）を２つだけ含むと考えられていた（非特許文献４、５）が、上記タンパク質のより一般的なヒト型であることが発見された（非特許文献２）しかしながら、天然のマウス型は２Ｉｇであり、これとヒト４Ｉｇ型とは同様の機能を呈する（非特許文献６）。４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３分子は、癌細胞のナチュラルキラー細胞媒介性溶解を阻害する（非特許文献７）。ヒトＢ７‐Ｈ３の２Ｉｇ型は、活性化されるＴ細胞上の推定受容体に結合することにより、Ｔ細胞の活性化及びＩＦＮ‐γ産生を促進することが分かっている（非特許文献４、８）。Ｂ７‐Ｈ４及びＢ７‐Ｈ３の両方は、腫瘍細胞上に発現した場合、免疫機能の潜在的阻害因子となる（非特許文献９）。
【０００７】
Ｂ７‐Ｈ３の作用の態様は複雑である。というのは、このタンパク質はＴ細胞共刺激及び共阻害の両方を仲介するためである（非特許文献６、１０、１１）。Ｂ７‐Ｈ３はＴＲＥＭ様転写体２（ＴＬＴ‐２）に結合して、Ｔ細胞活性化を共刺激するが、まだ識別されていない１つ又は複数の受容体に結合して、Ｔ細胞の共阻害を媒介する。更にＢ７‐Ｈ３は、１つ又は複数の未知の受容体との相互作用により、ナチュラルキラー細胞及び骨芽細胞の阻害因子となる（非特許文献６）。上記阻害は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が遺伝子転写を制御するための主要な信号伝達経路のメンバー（例えばＮＦＴＡ、ＮＦ‐κＢ、又はＡＰ‐１因子）との相互作用によって作用し得る。
【０００８】
Ｂ７‐Ｈ３はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を共刺激する。Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＩＦＮ‐γ産生及びＣＤ８＋溶解活性を刺激する（非特許文献４、２）。しかしながらこのタンパク質はまた、ＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ：活性化されたＴ細胞のための核内因子）、ＮＦ‐κＢ（核内因子カッパＢ）、ＡＰ‐１（アクティベータタンパク質‐１）因子によって、Ｔ細胞活性化を阻害するよう作用する場合がある（非特許文献１２）。Ｂ７‐Ｈ３はまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２、又はＴｈ１７をインビボで阻害するとも考えられている（非特許文献１３、１４、１２）。いくつかの独立した研究は、ヒト悪性腫瘍細胞がＢ７‐Ｈ３タンパク質の発現の著しい上昇を呈すること、この著しい発現が、疾患の重篤度の上昇に関連すること（非特許文献１５）を示しており、これはＢ７‐Ｈ３が腫瘍により、免疫回避経路として悪用されていることを示唆している（非特許文献６）。
【０００９】
Ｂ７分子がＴ細胞受容体（例えばＣＤ２８）に結合する能力をブロックする分子は、免疫系を阻害し、自己免疫疾患の治療法として提案されている（非特許文献１６）。抗４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３抗体で治療される、４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３を発現する神経芽腫細胞は、ＮＫ細胞に対して感受性がより高かった。しかしながら、この活性が、４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３型に対する抗体のみによるものとすることができるかどうかは不明である。というのは、４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３に対して産生された、報告された抗体は全て、Ｂ７‐Ｈ３の上記２つのＩｇ様形態にも結合したためである（非特許文献１７、７）。
【００１０】
Ｂ７‐Ｈ３は静置されたＢ若しくはＴ細胞、単球又は樹状細胞上では発現しないが、ＩＦＮ‐γによって樹状細胞上に、またＧＭ‐ＣＳＦによって単球上に誘発される（非特許文献２）。Ｂ７‐Ｈ３と結合する１つ又は複数の受容体は、完全には特性決定されていない。以前の研究は、１つのこのような受容体が、活性化後にＴ細胞上で迅速かつ過渡的に上方制御される必要があることを示唆していた（非特許文献１８）。最近、骨髄性細胞上で発現するＴＲＥＭ様転写体２（ＴＬＴ‐２、又はＴＲＥＭＬ２）受容体（非特許文献１９、２０、１２）は、Ｂ７‐Ｈ３と結合でき、またこれによって特にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を共刺激できることが分かっている（非特許文献２１、２２、６）。
【００１１】
ヒトＢ７‐Ｈ３は、神経芽腫細胞上での発現に加えて、多様な他の癌細胞（例えば胃、卵巣及び非小細胞肺癌）上で発現することも知られている。Ｂ７‐Ｈ３タンパク質発現は腫瘍細胞株において免疫組織学的に検出されている（非特許文献４、２３、７、５）。ｍＲＮＡ発現は、心臓、腎臓、精巣、肺、肝臓、膵臓、前立腺、大腸、骨芽細胞で発見されている（非特許文献１０）。タンパク質レベルにおいて、Ｂ７‐Ｈ３はヒト肝臓、肺、膀胱、精巣、前立腺、乳房、胎盤、リンパ器官に見られる（非特許文献１８）。
【００１２】
ＩＩ．ＣＤ３
ＣＤ３は、４つの異なる鎖で構成されるＴ細胞共受容体である（非特許文献２４、２５、２６）。
【００１３】
哺乳類では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と会合して、Ｔリンパ球における活性化シグナルを生成する（非特許文献２７）。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、崩壊する（非特許文献２８）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他のどの細胞タイプにも結合しないことが分かっている（非特許文献２９、３０、３１を参照）。
【００１４】
Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の、不変ＣＤ３εシグナリング成分は、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間の免疫学的シナプスの形成を強制的に行うための標的として使用されてきた。ＣＤ３と腫瘍抗原との間の共役はＴ細胞を活性化し、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の溶解をトリガする（非特許文献３２）。このアプローチにより、二重特異性抗体を、腫瘍細胞に対する高い特異性を有するＴ細胞区画と全体的に相互作用させることができ、またこのアプローチは、幅広い細胞表面腫瘍抗原に広く適用可能である。
【００１５】
ＩＩＩ．抗体及び他の結合分子
「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、当該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ結合部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の分子の標的領域（「エピトープ」）に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、この用語は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性のエピトープ結合部位を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性のエピトープ結合部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。
【００１６】
完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリンの「軽（ｌｉｇｈｔ）」及び「重（ｈｅａｖｙ）」ポリペプチド鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬ及びＶＨドメイン、これらをまとめて「可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ）」と呼ぶ）の存在に左右される。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、３つの相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）ドメインと、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４で配列されたＦＲドメインとで構成される。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ある抗体がある特定のエピトープに結合できるかどうかを決定する。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特に、それぞれ別個のポリペプチド上に存在するこれらのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。対照的に、ｓｃＦｖ構成は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含み、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さのリンカー（例えば約１２個未満のアミノ酸残基のリンカー）のリンカーによって不可能となる場合、２つのｓｃＦｖ分子が互いに相互作用して２価「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」を形成でき、この分子において一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと連結する（非特許文献３３において概説されている）。
【００１７】
天然抗体は、１つのエピトープ種のみに結合できる（即ち単一特異性である）が、当該種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば特許文献１〜７参照）、その殆どは、更なる結合度め員（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数の抗原結合部分（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を互いに融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（特許文献８〜１１）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば特許文献１２〜１４は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（特許文献１５、１６）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献１７、１８は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。特許文献１９〜２１は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。特許文献２２、２３は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。特許文献２４は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献２５〜３５は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００１８】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えば非特許文献３４、特許文献３６、３７、、非特許文献３５、３６、特許文献３８、非特許文献３７〜４１を参照）。
【００１９】
特に、安定した共有結合ヘテロ二量体非単一特異性ダイアボディについて記載されている（例えば非特許文献４２〜４５、特許文献３９〜９２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００８／００３１１６号
【特許文献２】国際公開第２００９／１３２８７６号
【特許文献３】国際公開第２００８／００３１０３号
【特許文献４】国際公開第２００７／１４６９６８号
【特許文献５】国際公開第２００９／０１８３８６号
【特許文献６】国際公開第２０１２／００９５４４号
【特許文献７】国際公開第２０１３／０７０５６５号
【特許文献８】国際公開第２００５／０７０９６６号
【特許文献９】国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号
【特許文献１０】国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号
【特許文献１１】国際公開第２００７／０４６８９３号
【特許文献１２】国際公開第２０１３／１７４８７３号
【特許文献１３】国際公開第２０１１／１３３８８６号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／１３６１７２号
【特許文献１５】国際公開第２００８／０２７２３６号
【特許文献１６】国際公開第２０１０／１０８１２７号
【特許文献１７】国際公開第２０１３／１６３４２７号
【特許文献１８】国際公開第２０１３／１１９９０３号
【特許文献１９】国際公開第２０１０／０２８７９７号
【特許文献２０】国際公開第２０１０／０２８７９６号
【特許文献２１】国際公開第２０１０／０２８７９５号
【特許文献２２】国際公開第２００３／０２５０１８号
【特許文献２３】国際公開第２００３／０１２０６９号
【特許文献２４】国際公開第２０１３／００６５４４号
【特許文献２５】国際公開第２０１４／０２２５４０号
【特許文献２６】国際公開第２０１３／００３６５２号
【特許文献２７】国際公開第２０１２／１６２５８３号
【特許文献２８】国際公開第２０１２／１５６４３０号
【特許文献２９】国際公開第２０１１／０８６０９１号
【特許文献３０】国際公開第２００８／０２４１８８号
【特許文献３１】国際公開第２００７／０２４７１５号
【特許文献３２】国際公開第２００７／０７５２７０号
【特許文献３３】国際公開第１９９８／００２４６３号
【特許文献３４】国際公開第１９９２／０２２５８３号
【特許文献３５】国際公開第１９９１／００３４９３号
【特許文献３６】米国特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.）
【特許文献３７】米国特許第２００４／０２２０３８８号（Mertens et al.）
【特許文献３８】国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）
【特許文献３９】米国特許第８，０４４，１８０号
【特許文献４０】米国特許第８，１３３，９８２号
【特許文献４１】米国特許第８，１８７，５９３号
【特許文献４２】米国特許第８，１９３，３１８号
【特許文献４３】米国特許第８，５３０，６２７号
【特許文献４４】米国特許第８，６６９，３４９号
【特許文献４５】米国特許第８，７７８，３３９号
【特許文献４６】米国特許第８，７８４，８０８号
【特許文献４７】米国特許第８，７９５，６６７号
【特許文献４８】米国特許第８，８０２，０９１号
【特許文献４９】米国特許第８，８０２，０９３号
【特許文献５０】米国特許第８，９４６，３８７号
【特許文献５１】米国特許第８，９６８，７３０号
【特許文献５２】米国特許第８，９９３，７３０号
【特許文献５３】米国公開特許第２００９／００６０９１０号
【特許文献５４】米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号
【特許文献５５】米国公開特許第２０１１／００８１３４７号
【特許文献５６】米国公開特許第２０１１／００９７３２３号
【特許文献５７】米国公開特許第２０１１／０１１７０８９号
【特許文献５８】米国公開特許第２０１２／０００９１８６号
【特許文献５９】米国公開特許第２０１２／００３４２２１号
【特許文献６０】米国公開特許第２０１２／０１４１４７６号
【特許文献６１】米国公開特許第２０１２／０２９４７９６号
【特許文献６２】米国公開特許第２０１３／０１４９２３６号
【特許文献６３】米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号
【特許文献６４】米国公開特許第２０１４／００１７２３７号
【特許文献６５】米国公開特許第２０１４／００９９３１８号
【特許文献６６】欧州特許第１８６８６５０号
【特許文献６７】欧州特許第２１５８２２１号
【特許文献６８】欧州特許第２２４７３０４号
【特許文献６９】欧州特許第２２５２６３１号
【特許文献７０】欧州特許第２２８２７７０号
【特許文献７１】欧州特許第２３２８９３４号
【特許文献７２】欧州特許第２３７６１０９号
【特許文献７３】欧州特許第２５４２２５６号
【特許文献７４】欧州特許第２６０１２１６号
【特許文献７５】欧州特許第２７１４０７９号
【特許文献７６】欧州特許第２７１４７３３号
【特許文献７７】欧州特許第２７８６７６２号
【特許文献７８】欧州特許第２８３９８４２号
【特許文献７９】欧州特許第２８４００９１号
【特許文献８０】国際公開第２００６／１１３６６５号
【特許文献８１】国際公開第２００８／１５７３７９号
【特許文献８２】国際公開第２０１０／０２７７９７号
【特許文献８３】国際公開第２０１０／０３３２７９号
【特許文献８４】国際公開第２０１０／０８０５３８号
【特許文献８５】国際公開第２０１１／１０９４００号
【特許文献８６】国際公開第２０１２／０１８６８７号
【特許文献８７】国際公開第２０１２／１６２０６７号
【特許文献８８】国際公開第２０１２／１６２０６８号
【特許文献８９】国際公開第２０１４／１５９９４０号
【特許文献９０】国際公開第２０１５／０２１０８９号
【特許文献９１】国際公開第２０１５／０２６８９２号
【特許文献９２】国際公開第２０１５／０２６８９４号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Khawli, L.A. et al. (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors,” Exper. Pharmacol. 181:291-328
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【非特許文献４２】Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82
【非特許文献４３】Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449
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【非特許文献４５】Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
このような成功にもかかわらず、治療用途に最適化された、安定した官能性ヘテロ二量体非単一特異性ダイアボディを、ポリペプチド鎖内に採用されるドメインの入念な考察及び配置によって、更に改善できる。従って本発明は、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に結合できる、安定した、治療に有用なヘテロ二量体ダイアボディ及びヘテロ二量体Ｆｃダイアボディを、共有結合によって形成するように特に設計された、特異的なポリペプチドの提供を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を有する、二重特異性１価ダイアボディ（即ち「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。より好ましくは、このようなＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖で構成され、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を有し、更に免疫グロブリンＦｃドメインを含む（即ち「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）。本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、このような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、癌並びに他の疾患及び状態の治療におけるこのようなダイアボディの使用方法を対象とする。
【００２４】
本発明は特に、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを対象とする。本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ヘテロ二量体として互いに会合して、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する、ポリペプチド鎖を含む。従って本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープの１つの複製のみ、及びＣＤ３のエピトープの１つの複製のみに結合できるという点で１価であるが、単一のダイアボディがＢ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに同時に結合できるという点で二重特異性である。
【００２５】
本発明の好ましいＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖（「第１の（ｆｉｒｓｔ）」、「第２の（ｓｅｃｏｎｄ）」及び「第３の（ｔｈｉｒｄ）」ポリペプチド鎖）を含み、上記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、上記第１の及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合する。
【００２６】
詳細には、本発明はＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを提供し、上記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合でき、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、ここで上記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含み、上記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、上記第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し：
Ｉ．上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＡであって：
（１）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを含む、サブドメイン（ＩＡ１）；及び
（２）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを含む、サブドメイン（ＩＡ２）
を含み、
上記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２は、１２アミノ酸残基以下のポリペプチドリンカーによって互いから隔てられ、また：
（ａ）上記サブドメインＩＡ１が、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＡ２は、ＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択され；又は
（ｂ）上記サブドメインＩＡ１が、ＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＡ２は、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択される
ように、協調的に選択される、ドメインＩＡ；並びに
Ｂ．ヘテロ二量体促進ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含む、任意に存在するドメインＩＢ；
Ｃ．抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含む、ドメインＩＣ
を含み；
ＩＩ．上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＩＡであって：
（１）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを含む、サブドメイン（ＩＩＡ１）；及び
（２）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを含む、サブドメイン（ＩＩＡ２）
を含み、
上記サブドメインＩＩＡ１及びＩＩＡ２は、１２アミノ酸残基以下のポリペプチドリンカーによって互いから隔てられ、また：
（ａ）上記サブドメインＩＡ１が、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＩＡ１は、ＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できる上記ＶＬドメインを含むよう選択され、上記サブドメインＩＩＡ２は、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択され；及び
（ｂ）上記サブドメインＩＡ１が、ＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＩＡ１は、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）に結合できる上記ＶＬドメインを含むよう選択され、上記サブドメインＩＩＡ２は、ＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択される
ように、協調的に選択される、ドメインＩＩＡ；並びに
Ｂ．ヘテロ二量体促進ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含む、任意に存在するドメインＩＩＢ
を含み；
ＩＩＩ．上記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含むドメインＩＩＩＣを含み；
ここで：
（Ａ）（１）上記任意に存在するドメインＩＢ及び上記任意に存在するドメインＩＩＢのうちの少なくとも一方が存在し、存在する上記ドメインＩＢ若しくはＩＩＢは、正若しくは負の電荷を有し；又は
（２）上記任意に存在するドメインＩＢ及び上記任意に存在するドメインＩＩＢの両方が存在し：
（ｉ）上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちの一方は、正の電荷を有するヘテロ二量体促進ドメインを有し、上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちのもう一方は、負の電荷を有するヘテロ二量体促進ドメインを有し；又は
（ｉｉ）上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちの一方は、アミノ酸配列GVEPKSC（配列番号６）若しくはVEPKSC（配列番号７）を含むヘテロ二量体促進ドメインを有し、上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちのもう一方は、アミノ酸配列GFNRGEC（配列番号８）若しくはFNRGEC（配列番号９）を含むヘテロ二量体促進ドメインを有し；
（Ｂ）上記ＶＬB7-H3及び上記ＶＨB7-H3は相互作用して、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成し、上記ＶＬCD3及び上記ＶＨCD3は、ＣＤ３のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成し；並びに
（Ｃ）上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ受容体に結合できるＦｃドメインを形成する。
【００２７】
本発明は更に、ヒト及び霊長類両方のＢ７‐Ｈ３及びＣＤ３と交差反応できる、上述のようなＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態に関する。
【００２８】
本発明は特に：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｂ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５９のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列をするか；又は
（Ｃ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｄ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、上述のようなＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態に関する。
【００２９】
好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ａ４９８（腎臓癌）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（乳癌）、Ａ３７５（黒色腫）；２２Ｒｖ１（前立腺癌）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（咽頭癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）；ＢｘＰＣ３（膵臓癌）、ＳＫＭＥＳ‐１（肺癌）及びＵ８７（神経膠芽細胞腫）からなる群から選択された標的ヒト腫瘍細胞を採用し、またエフェクタ細胞として精製ヒト一次Ｔ細胞を、１：１、５：１又は１０：１のエフェクタ細胞：Ｔ細胞比で用いるアッセイにおいて、ヒトＴ細胞を用いて、標的腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる。このようなアッセイでは、標的腫瘍細胞の殺滅は、細胞死の際に細胞から放出されたＬＤＨの酵素活性を定量的に測定する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いて、又はルシフェラーゼ相対光単位（ＲＬＵ）が、標的細胞（これは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼレポータ遺伝子の両方を発現するように操作されている）の相対生存率を示す読み取り値となる、ルシフェラーゼアッセイによって、測定される。このような標的転換殺滅の、観察されたＥＣ50は、約１．５μｇ／ｍＬ以下、約１．０μｇ／ｍＬ以下、約５００ｎｇ／ｍＬ以下、約３００ｎｇ／ｍＬ以下、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１００ｎｇ／ｍＬ以下、約５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００３０】
好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、共混合異種移植片中でのヒト腫瘍の成長の阻害を仲介でき、この共混合異種移植片では、上記分子を、２２Ｒｖ１（ヒト前立腺癌）又はＡ４９８（ヒト腎臓癌）腫瘍細胞及び活性化ヒトＴ細胞（５：１の比）と共に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに導入する。更に、又はあるいは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは：
（Ａ）‐１日目に腹腔内（ＩＰ）注射によってヒトＰＢＭＣ（１×１０7）を、及び０日目に皮内（ＩＤ）にＤｅｔｒｏｉｔ（ヒト咽頭癌腫瘍細胞（５×１０6））を埋入され、２０、２２、２３、２６、２８、３０、３３、３５及び３７日目にダイアボディを投与される；又は
（Ｂ）０日目に皮内（ＩＤ）にＡ４９８（ヒト腎臓癌腫瘍細胞（５×１０6））を、及び１３日目に腹腔内（ＩＰ）注射によってヒトＰＢＭＣ（１×１０7）を埋入され、３３、３５、３６、３９、４１、４３、４６、４８及び５０日目にダイアボディを投与される、
メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおいて、ヒト腫瘍成長の阻害の仲介、及び／又は異種移植片モデルにおける抗腫瘍活性の呈示が可能である。
【００３１】
好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、約１．０ｍｇ／ｋｇ超の濃度、約１ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．５ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．２５ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．１ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．０５ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．０２ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．０１ｍｇ／ｋｇの濃度、若しくは約０．００５ｍｇ／ｋｇの濃度、又は約０．００５ｍｇ／ｋｇ未満の濃度で提供した場合に、上述の異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を阻害できる。
【００３２】
本発明は更に、上述のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれを、医薬品としての使用のために提供する。
【００３３】
本発明は更に、上述のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれを、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する若しくはＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療における、又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療方法における使用のために提供し、詳細には、上記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする上記疾患又は状態は、癌であり、更に詳細には、上記癌は、以下からなる群から選択される：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、２つのポリペプチド鎖で構成され、Ｆｃ領域を含まない、共有結合二重特異性１価ダイアボディの構造を示す。上記ポリペプチド鎖は、システイン（「Ｃ」）残基間に形成されるジスルフィド結合によって互いに共有結合される。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の３鎖二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖の２つのバージョンの構造を示す（バージョン１、図２Ａ；バージョン２、図２Ｂ）。上記ポリペプチド鎖は、システイン（「Ｃ」）残基間に形成されるジスルフィド結合によって互いに共有結合される。
【図３Ａ−３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊは、Ａ４９８（腎臓癌）（図３Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（乳癌）（図３Ｂ）、Ａ３７５（黒色腫）（図３Ｃ）、２２Ｒｖ１（前立腺癌）（図１Ｄ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（咽頭癌）（図１Ｅ）、ＤＵ１４５（前立腺癌）（図３Ｆ）、ＢｘＰＣ‐３（膵臓癌）（図３Ｇ）、ＳＫＭＥＳ‐１（肺癌）（図３Ｈ）、Ｕ８７（神経膠芽細胞腫）（図３Ｉ）、及びＲａｊｉ（Ｂリンパ腫）（図３Ｊ）細胞株のＦＡＣＳヒストグラムを示す。破線は、アイソタイプ対照ＰＥ標識抗体で染色された細胞を表し、実線は、抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体で染色された細胞を表す。
【図４Ａ−４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、Ｂ７‐Ｈ３発現標的癌細胞株（図４Ａ〜４Ｄ）又はヒト一次Ｔ細胞（図４Ｅ）における抗ＥＫコイル抗体の蛍光のＦＡＣＳヒストグラムを示す。濃度１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａを、Ｂ７‐Ｈ３発現癌細胞株（Ａ４９８（図４Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図４Ｂ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（図４Ｃ）若しくは２２Ｒｖ１（図４Ｄ））又はヒト一次Ｔ細胞（図４Ｅ）に添加し、３０分間インキュベートした。ＡＰＣストレプトアビジンと混合したビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル抗体を用いた更なるインキュベーションの後、細胞を、ＤＡＲＴ‐Ａ細胞表面結合に関して、ＦＡＣＳによって分析した。実線は、細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ結合プロファイルを表す。ビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル抗体からの細胞の非特異的な染色は、破線で示されている。
【図５Ａ−５Ｌ】図５Ａ〜５Ｌは、Ｂ７‐Ｈ３発現細胞株（Ａ４９８（図５Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図５Ｂ‐５Ｃ）、Ａ３７５（図５Ｄ）、Ｕ８７（図５Ｅ）、ＤＵ１４５（図５Ｆ）、ＢｘＰＣ‐３（図５Ｇ）、ＳＫＭＥＳ‐１（図５Ｈ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（図５Ｉ）及び２２Ｒｖ１（図５Ｊ））、並びにＢ７‐Ｈ３陰性細胞株（ＣＨＯ（図５Ｋ）及びＲａｊｉ（図５Ｌ））に対するＤＡＲＴ‐Ａ仲介細胞毒性に関する、用量応答曲線を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴを、様々な腫瘍細胞株及び一次ヒトＴ細胞を、５：１のエフェクタ細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で用いて、約２４時間インキュベートした。％細胞毒性を、全ての細胞株に関してＬＤＨ放出アッセイを用いて評価した（図５Ａ〜５Ｂ及び５Ｄ〜５Ｌ）。更に、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ細胞株（図５Ｃ）に関して、ＬＵＭアッセイを用いて細胞毒性を測定した。複数のドナーからのＴ細胞を用いた複数の実験からの代表的なデータを示す。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、Ｅ：Ｔ比１０：１（図６Ａ及び６Ｂ）、５：１（図６Ｃ及び６Ｄ）並びに１：１（図６Ｅ及び６Ｆ）における、Ａ４９８細胞（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅ）並びにＡ３７５細胞（図６Ｂ、６Ｄ及び６Ｆ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介標的転換殺滅を示す。細胞毒性は、ＬＤＨアッセイによって決定した。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図７Ａ−７Ｅ】図７Ａ〜７Ｅは、エフェクタ細胞としての精製Ｔ細胞と、Ａ４９８標的細胞とを、Ｅ：Ｔ細胞比１０：１で用いた、２４時間のインキュベーション後の、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介標的転換標的細胞殺滅（図７Ａ）、並びにＣＤ４＋（図７Ｂ及び７Ｄ）並びにＣＤ８＋（図７Ｃ及び７Ｅ）Ｔ細胞に対するＴ細胞活性化マーカＣＤ２５（図７Ｂ及び７Ｃ）並びにＣＤ６９（図７Ｄ及び７Ｅ）の導入の、用量応答曲線を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■；Ｔ細胞＋Ａ４９８細胞：黒の▽；Ｔ細胞単独：黒の△である。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、Ｂ７‐Ｈ３陽性標的細胞の存在下での、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介Ｔ細胞増殖を示す。ヒト一次Ｔ細胞の増殖は、１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａ（太線）又は対照ＤＡＲＴ（塗りつぶされた細線）の存在下での、ＣＦＳＥ標識ヒト一次Ｔ細胞とＡ４９８標的細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）との７２時間（図８Ａ）又は９６時間（図８Ｂ）に亘る共培養後に、ＦＡＣＳ分析によって評価した。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ａが、（図９Ａ）及びカニクイザル（図９Ｂ）Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞に効率的に結合し、エフェクタ細胞としての精製ヒト一次Ｔ細胞と、Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ標的細胞とを、Ｅ：Ｔ細胞比５：１で用いた２４時間のインキュベーションの後、ヒト（図９Ｃ）及びカニクイザル（図９Ｄ）Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞の標的転換殺滅を仲介することを示す。細胞毒性は、ＬＤＨアッセイを用いて測定した。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａが、カニクイザル及びヒト一次Ｔ細胞に結合できることを示す。１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａをカニクイザル（図１０Ａ）又はヒト（図１０Ｂ）ＰＢＭＣに添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＡＰＣストレプトアビジンと混合したビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル抗体を用いた第２のインキュベーションを行った。細胞を、ゲートされ完全に組み合わされたＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ  Ｔ細胞表面結合（太線）に関して、ＦＡＣＳで分析した。ビオチンコンジュゲート抗ＥＫコイル二次抗体からの細胞に対する非特異的な染色は、細線／影付きの細線で示されている。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、カニクイザルＰＢＭＣをＥ：Ｔ比３０：１で用いた、Ｂ７‐Ｈ３陽性標的細胞株ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図１１Ａ及び１１Ｂ）並びにＡ４９８（図１１Ｃ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介標的転換殺滅を示す。細胞毒性は、ＬＵＭアッセイ（図１１Ａ）又はＬＤＨアッセイ（図１１Ｂ及び１１Ｃ）を用いて測定した。ＤＡＲＴ‐Ａ：●；対照ＤＡＲＴ：■である。
【図１２】図１２は、活性化ヒトＴ細胞の存在下で２２Ｒｖ１腫瘍細胞を埋入されたマウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａによる腫瘍成長の阻害を示す。０日目に、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／群）に、活性化ヒトＴ細胞（１×１０6）と共混合した２２Ｒｖ１腫瘍細胞（５×１０6）をＳＣ埋入し、続いて、合計４用量をＩＶ投与するために０日目、１日目、２日目及び３日目に、ビヒクル対照（●）、対照ＤＡＲＴ（○）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ（■）、０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．００４ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置を行った。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１３】図１３は、活性化ヒトＴ細胞の存在下でＡ４９８腫瘍細胞を埋入されたマウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａによる腫瘍成長の阻害を示す。０日目に、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／群）に、活性化ヒトＴ細胞（１×１０6）と共混合したＡ４９８腫瘍細胞（５×１０6）をＳＣ埋入し、続いて、合計４用量をＩＶ投与するために、０日目、１日目、２日目及び３日目に、ビヒクル対照（●）、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ（○）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ（■）、０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．００４ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置を行った。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１４】図１４は、Ａ４９８腫瘍細胞を埋入され、ヒトエフェクタ細胞で再構成されたＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を示す。０日目に、メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝７／群）にＡ４９８腫瘍細胞（５×１０6細胞）をＩＤ埋入し、続いて１３日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7）をＩＰ埋入した。その後、この群を、３３、３５、３６、３９、４１、４３、４６、４８及び５０日目に、ビヒクル対照（●）、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ（○）、又は１ｍｇ／ｋｇ（■）、０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．０１ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．００１ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置した。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１５】図１５は、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞を埋入され、ヒトエフェクタ細胞で再構成されたＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を示す。０日目に、メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝８／群）にＤｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞（５×１０6）細胞をＩＤ埋入し、一方、‐１日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7）をＩＰ埋入した。続いて合計９用量をＩＶ投与するために、２０、２２、２３、２６、２８、３０、３３、３５及び３７日目に、これらの群を、ビヒクル対照（●）、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ（○）、又は１ｍｇ／ｋｇ（■）、０．５ｍｇ／ｋｇ（黒の△）、０．２５ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）若しくは０．１ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａで処置した。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞を埋入され、ヒトエフェクタ細胞で再構成されたＮＳＧ  ＭＨＣｌ１‐／‐マウスにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を示す。０日目に、ＭＨＣｌ１  ‐／‐マウス（ｎ＝７／ビヒクル対照；７／群Ｉ；及び５／群ＩＩ）に、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞（５×１０6細胞）をＩＤ埋入し、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7細胞）をＩＰ埋入した。続いてこれらの群を、ビヒクル対照（●）又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ（黒の△）で処置した。群Ｉ（図１６Ａ）は、１５、２２、２９、３６及び４３日目にＩＶ投与された５用量を受けた。群ＩＩ（図１６Ｂ）は、１５、２９及び４３日目にＩＶ投与された３用量を受けた。腫瘍体積は、群平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１７】図１７は、カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａ及びＤＡＲＴ‐Ｂの薬物動態プロファイルを示す。カニクイザルの複数の群（ｎ＝２／群；１Ｍ／１Ｆ）に、ＤＡＲＴ‐Ａ又はＤＡＲＴ‐Ｂを１用量０．５ｍｇ／ｋｇを投与した後、週１回１用量１．０ｍｇ／ｋｇを３週間投与し、合計４用量をＩＶ投与した。研究の経過全体に亘って、４体の試験動物それぞれに関する、ＤＡＲＴ‐Ａ（実線）及びＤＡＲＴ‐Ｂ（破線）の血清濃度をプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を有する、二重特異性１価ダイアボディ（即ち「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。より好ましくは、このようなＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖で構成され、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を有し、更に免疫グロブリンＦｃドメインを含む（即ち「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）。本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、このような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、癌並びに他の疾患及び状態の治療におけるこのようなダイアボディの使用方法を対象とする。
【００３６】
Ｉ．抗体及び他の結合分子
Ａ．抗体
本明細書中で使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、エピトープに免疫特異的に結合できる免疫グロブリン可変ドメイン（「エピトープ結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」）を有するいずれの分子を包含する。従ってこの用語は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、このようなエピトープ結合部位を含む融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。本出願全体を通して、抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域のアミノ酸残基の番号付与は、Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health Publication No. 91‐3242におけるようなＥＵインデックスに従う。本明細書中で使用される場合、「抗体のエピトープ結合断片（ｅｐｉｔｏｐｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる抗体の一部分を指すことを意図している。本明細書中で使用される場合、この用語は、ダイアボディの断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2Ｆｖ）及び単鎖（ｓｃＦｖ）、並びにエピトープ結合ドメインを包含する。
【００３７】
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる均質な抗体集団を指す。用語「モノクローナル抗体」は、上記抗体のソース、又は上記抗体が作製される方法（例えばハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子組み換え動物における産生等）に関する限定を意図したものではない。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495‐497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の二重特異性分子及びキメラ抗体、ヒト化抗体若しくはイヌ化抗体を生成するため、又は抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び／又は予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用される抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術を適用するステップ；並びに（４）���ト化抗体のトランスフェクション及び発現ステップ（例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照）。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、抗体又はそのエピトープ結合断片は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性若しくは結合活性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」結合する、と言い表される。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体又はそのエピトープ結合断片は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。
【００３９】
Ｂ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ、及びＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
非単一特異性「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」の提供は、異なるエピトープを発現する細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その２価性、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。特に重要なのは、異なる細胞の共結紮、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T-Cells,” Nature 314:628-631、及びHolliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305）によって、Ｔ細胞を腫瘍細胞の部位に共存させることである。
【００４０】
このようなダイアボディを、Ｔ細胞に結合するよう標的化する代わりに、ダイアボディエピトープ結合ドメインを、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０及びＣＤ７４といったＢ細胞の表面決定因子に対して配向させてよい（Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768）。多くの研究において、エフェクタ細胞決定因子、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するダイアボディは、エフェクタ細胞を活性化させることも分かった（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、Ｆｃドメイン‐ＦｃγＲ相互作用によるエフェクタ細胞への抗原結合抗体の結合によってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメインを含むかどうかとは無関係に、（例えば当該技術分野において公知の、又は本明細書に例示されているいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）においてアッセイされるように）Ｉｇ様官能性を示し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋させることによって、ダイアボディは腫瘍細胞近傍にエフェクタ細胞を移動させるだけではなく、効果的な腫瘍殺滅をもたらす（例えばCao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics, "Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197を参照）。
【００４１】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合に対処できる（即ちこれらのホモ二量体化を最小化できる）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。
【００４２】
従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked 抗CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非官能性単一ポリペプチド鎖モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００４３】
しかしながら、この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）（Ｄｕａｌ‐Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ‐Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した。例えばChichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551；米国特許第８，０４４，１８０号；米国特許第８，１３３，９８２号；米国特許第８，１８７，５９３号；米国特許第８，１９３，３１８号；米国特許第８，５３０，６２７号；米国特許第８，６６９，３４９号；米国特許第８，７７８，３３９号；米国特許第８，７８４，８０８号；米国特許第８，７９５，６６７号；米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第８，８０２，０９３号；米国特許第８，９４６，３８７号；米国特許第８，９６８，７３０号；及び米国特許第８，９９３，７３０号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２０１１／００８１３４７号；米国公開特許第２０１１／００９７３２３号；米国公開特許第２０１１／０１１７０８９号；米国公開特許第２０１２／０００９１８６号；米国公開特許第２０１２／００３４２２１号；米国公開特許第２０１２／０１４１４７６号；米国公開特許第２０１２／０２９４７９６号；米国公開特許第２０１３／０１４９２３６号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１４／００１７２３７号；及び米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；欧州特許第１８６８６５０号；欧州特許第２１５８２２１号；欧州特許第２２４７３０４号；欧州特許第２２５２６３１号；欧州特許第２２８２７７０号；欧州特許第２３２８９３４号；欧州特許第２３７６１０９号；欧州特許第２５４２２５６号；欧州特許第２６０１２１６号；欧州特許第２７１４０７９号；欧州特許第２７１４７３３号；欧州特許第２７８６７６２号；欧州特許第２８３９８４２号；欧州特許第２８４００９１号；並びにＰＣＴ公開番号第２００６／１１３６６５号；ＰＣＴ公開番号第２００８／１５７３７９号；ＰＣＴ公開番号第２０１０／０２７７９７号；ＰＣＴ公開番号第２０１０／０３３２７９号；ＰＣＴ公開番号第２０１０／０８０５３８号；ＰＣＴ公開番号第２０１１／１０９４００号；ＰＣＴ公開番号第２０１２／０１８６８７号；ＰＣＴ公開番号第２０１２／１６２０６７号；ＰＣＴ公開番号第２０１２／１６２０６８号；ＰＣＴ公開番号第２０１４／１５９９４０号；ＰＣＴ公開番号第２０１５／０２１０８９号；ＰＣＴ公開番号第２０１５／０２６８９２号；及びＰＣＴ公開番号第２０１５／０２６８９４号を参照。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【００４４】
最も単純なＤＡＲＴ（登録商標）は、２つのポリペプチド鎖を含み、これらははそれぞれ３つのドメインを含む（図１）。第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含むドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチド鎖に対する第１のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ‐Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）を含む。第２のポリペプチド鎖は：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン」）を含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。これらは、標的抗原を発現する細胞の、Ｔ細胞仲介殺滅を促進できる。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチド鎖の第３のドメインはそれぞれ、システイン（「Ｃ」）残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチド鎖のうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される）。このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば米国特許公開第２０１３‐０２９５１２１号；米国特許公開第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国特許公開第２００９‐００６０９１０号；欧州特許公開第２７１４０７９号；欧州特許公開第２６０１２１６号；欧州特許公開第２３７６１０９号；欧州特許公開第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。
【００４５】
本発明の好ましいＦｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含み、図２Ａ〜２Ｂに図示されている。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ダイアボディの第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、ドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン」）；及び（ｉＶ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン」）を含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）の第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従って、このようなＤＡＲＴ（登録商標）の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として複合体化して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。本発明の好ましいＦｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、ＣＤ３又はＢ７‐Ｈ３であってよい「第１のエピトープ」と、第１のエピトープがＣＤ３である場合にはＢ７‐Ｈ３であり、第１のエピトープがＢ７‐Ｈ３である場合にはＣＤ３である「第２のエピトープ」とに結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディである。第１及び第２のポリペプチドは、それぞれのリンカー及び／又は第３のドメイン内のシステイン残基が関与する１つ又は複数のジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このようなダイアボディは、増強された強度を有する。本発明の好ましいＦｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、２つの配向（表１）のうちのいずれを有してよい：
【００４６】
【表１】
2018523686.tif 000003
【００４７】
ＩＩ．本発明の好ましいＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ
本発明は特に、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に結合できる、従ってＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディである、上述のようなＦｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療におけるこのような分子の使用を対象とする。コドン最適化による遺伝子発現において得られる改善と同様、最適化されていないＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは完全な官能性を有する（例えばGrosjean, H. et al. (1982) "Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes" Gene 18(3):199-209を参照）が、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの配列を修飾又は洗練することにより、その安定性及び／又は機能を更に増強できる。
【００４８】
好ましくは、図２Ａに示すように、上記３つのポリペプチド鎖のうち第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；「第１の」抗原のエピトープ（ＣＤ３又はＢ７‐Ｈ３）に結合できる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＬ１）；「第２の」抗原のエピトープ（第１の抗原がＣＤ３である場合にはＢ７‐Ｈ３；第１の抗原がＢ７‐Ｈ３である場合にはＣＤ３）に結合できる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ２）；ヘテロ二量体促進ドメイン：及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）から隔てる。好ましくは、重鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体促進ドメインに連結される。ある好ましいＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのＣ末端は、介在リンカーペプチド（リンカー３）によって、又は介在スペーサリンカーペプチド（スペーサリンカー３）によって、Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結される。従って最も好ましくは、上記３つのポリペプチド鎖のうち第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＶＬ１‐リンカー１‐ＶＨ２‐リンカー２‐ヘテロ二量体促進ドメイン‐スペーサリンカー３‐Ｆｃドメインを含有する。
【００４９】
あるいは図２Ｂに示すように、上記３つのポリペプチド鎖のうち第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；リンカー３；Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」）；例えばアミノ酸配列：APSSS（配列番号５１）又はアミノ酸配列APSSSPME（配列番号５２）を有する、介在スペーサペプチド（リンカー４）；「第１の」抗原のエピトープ（ＣＤ３又はＢ７‐Ｈ３）に結合できる（ＶＬ１）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；「第２の」抗原のエピトープ（第１の抗原がＣＤ３である場合にはＢ７‐Ｈ３；第１の抗原がＢ７‐Ｈ３である場合にはＣＤ３）に結合できる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）から隔てる。好ましくは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体促進促進ドメインに連結される。従って最も好ましくは、このような代替的な配向において、上記３つのポリペプチド鎖のうち第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：リンカー３‐Ｆｃドメイン‐リンカー４‐ＶＬ１‐リンカー１‐ＶＨ２‐リンカー２‐ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。
【００５０】
好ましくは、上記２つの好ましい配向に関して、上記３つのポリペプチド鎖のうち第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；「第２の」抗原のエピトープに結合できる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＬ２）；「第１の」抗原のエピトープに結合できる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ１）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）から隔てる。好ましくは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）は、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体促進に連結される。従って最も好ましくは、上記３つのポリペプチド鎖のうち第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＶＬ１‐リンカー１‐ＶＨ２‐リンカー２‐ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。
【００５１】
好ましくは、上記２つの好ましい配向のいずれに関して、上記３つのポリペプチド鎖のうち第３のものは、リンカーペプチド（リンカー３）、及びＦｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」）を含有する。第３のポリペプチド鎖はＶＬドメイン又はＶＨドメインを含んでいないため、第３のポリペプチド鎖は、２つ以上の本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの間で同一となり得る。
【００５２】
第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）は、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と相互作用することによって、第１の抗原のエピトープ（即ちＢ７‐Ｈ３又はＣＤ３）に免疫特異的に結合できる官能性エピトープ結合部位を形成できるよう、協調的に選択される。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と相互作用することによって、第２の抗原のエピトープ（即ちＢ７‐Ｈ３又はＣＤ３）に免疫特異的に結合できる官能性エピトープ結合部位を形成できるよう、協調的に選択される。従って、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの選択は、これら２つのポリペプチド鎖が合わせて、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に結合できるエピトープ結合部位を含むよう、協調される。
【００５３】
Ａ．好ましいリンカー
より好ましくは、ポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインと上記ＶＨドメインとを隔てるリンカー１の長さは、上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択される（例えば１２アミノ酸残基以下の長さ）。従って、第１のポリペプチド鎖のＶＬ１及びＶＨ２ドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は完全に不可能であり、第１又は第２の抗原に実質的に結合できるエピトープ結合部位を形成しない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ２及びＶＨ１ドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は完全に不可能であり、第１又は第２の抗原に実質的に結合できるエピトープ結合部位を形成しない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１）：GGGSGGGGを有する。
【００５４】
リンカー２の目的は、ポリペプチド鎖のＶＨドメインを、当該ポリペプチド鎖の、任意に存在するヘテロ二量体促進ドメインから隔てることである。様々なリンカーのうちのいずれを、リンカー２の目的のために使用できる。このようなリンカー２の好ましい配列は、ジスルフィド結合によって第１及び第２のポリペプチド鎖を互いに対して共有結合させるために使用できるアミノ酸配列：GGCGGG（配列番号２）、又はＩｇＧ  ＣＨ１ドメインに由来するASTKG（配列番号３）を有する。リンカー２：ASTKG（配列番号３）は、上述のようなシステインを有しないため、このようなリンカー２の使用は好ましくは、配列番号１２のＥコイル又は配列番号１３のＫコイル等の、システイン含有ヘテロ二量体促進ドメインと関連する（以下を参照）。
【００５５】
リンカー３の目的は、ポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインを、当該ポリペプチド鎖のＦｃドメインから隔てることである。様々なリンカーのうちのいずれを、リンカー３の目的のために使用できる。このようなリンカー３の好ましい配列は、アミノ酸配列：DKTHTCPPCP（配列番号４）を有する。スペーサリンカー３に関する好ましい配列は、アミノ酸配列：GGGDKTHTCPPCP（配列番号５）を有する。
【００５６】
Ｂ．好ましいヘテロ二量体促進ドメイン
第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、「ヘテロ二量体促進ドメイン」を含めることによって推進できる。このようなドメインは、一方のポリペプチド鎖にＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号６）又はVEPKSC（配列番号７）を、そしてもう一方のポリペプチド鎖にGFNRGEC（配列番号８）又はFNRGEC（配列番号９）を含む（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【００５７】
しかしながらより好ましくは、本発明のヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの荷電アミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成される（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,” Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′--d--d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5): 2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355-367）。
【００５８】
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、一方のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、負荷電アミノ酸残基の配列を含んでよく、もう一方のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、負荷電アミノ酸残基の配列を含んでよい。特定の実施形態では、コイルドメインは、８つの負荷電アミノ酸残基又は８つの正荷電アミノ酸残基を含んでよい。反対の電荷のコイルを他方のポリペプチド鎖に使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどのコイルが設けられるかは重要ではない。しかしながら、好ましい本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、負荷電コイルを有する第１のポリペプチド鎖を有する。正荷電コイルドメインの正荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、好ましくはリシンである。負荷電コイルの負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよく、好ましくはグルタミン酸である。
【００５９】
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、ヘテロ二量体促進ドメインを１つだけ有してよい（即ち第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖のうちの両方ではなくいずれかが、ヘテロ二量体促進ドメインを含有する）。このような単一のヘテロ二量体促進ドメインの存在により、ホモ二量体であるダイアボディ（いずれのヘテロ二量体促進ドメインを有しない、又は２つの反発する（同様に荷電された）ヘテロ二量体促進ドメインを有する分子）の形成を阻止することによって、ヘテロ二量体化が促進される。しかしながら、本発明の第１及び第２のポリペプチド鎖の両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
【００６０】
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの１つは、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号１０：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）を含み、そのグルタミン酸残基は、ｐＨ７において負の電荷を形成し、またその一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号１１：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含み、そのリジン残基は、ｐＨ７において正の電荷を形成する。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体化が促進される。別の好ましい実施形態では、配列番号１０の上記４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１２）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインが利用される。同様に、別の好ましい実施形態では、配列番号１１の上記４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１３）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインが利用される。
【００６１】
Ｃ．ポリペプチド鎖の共有結合
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、その第１及び第２のポリペプチド鎖が、その長さに沿って位置決めされた１つ又は複数のシステイン残基によって、互いに対して共有結合するよう、操作される。このようなシステイン残基は、上記ポリペプチドのＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる介在リンカーに導入できる。あるいは、リンカー２がシステイン残基を含有してよい。更に、又はあるいは、配列番号４又は配列番号５のように、リンカー３がシステイン残基を含有してよい。最も好ましくは、ヘテロ二量体促進ドメインの１つ又は複数のコイルドメインを、配列番号１２又は配列番号１３のようにシステイン残基を含有するよう、置換する。
【００６２】
Ｄ．好ましいＦｃドメイン
本発明の本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全なＦｃ領域（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃ領域）であっても、又は完全なＦｃ領域の断片のみであってもよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下するよう修飾されているか、又は１つ若しくは複数のこのような受容体に結合する上記Ｆｃドメインの能力を実質的に排除するよう修飾されている。従って、本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【００６３】
ある好ましい実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、複合体化して免疫グロブリン（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ１のある例示的なＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：
231    240        250        260        270        280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290        300        310        320        330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340        350        360        370        380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390        400        410        420        430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440     447
ALHNHYTQKS LSLSPGK 
である。
【００６４】
ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（これは参照により本出願に明示的に援用される）におけるようなＥＵインデックスの番号付与である。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ａｓ  ｉｎ  Ｋａｂａｔ）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付与を指す。抗体定常領域の多数の異なる位置（例えば２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において多形性が観察されており、従って、従来技術において提示されている配列間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多形体は、十分に特性決定されている。現時点で、１８のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）又はＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）又はＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ３、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Lefranc, et al., “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G.  et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。具体的には、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込んでよく、本明細書において提供されている配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、いくつかの発現系では、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字部分）は、翻訳後に除去できる。従って、ＣＨ３ドメインのＣ末端は、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディにおいて任意のアミノ酸残基である。配列番号１４のＣ末端残基を含む例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを、以下に提供する。また本発明には、配列番号１４のＣ末端リシン残基を有しない構造も包含される。
【００６５】
第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、いずれも配列番号１４又はその変異型で構成され得る。
【００６６】
特に、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関して、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が（野生型Ｆｃ領域（配列番号１４）が示す結合よりも）低減される（又は略結合しない）ことが好ましい。このような変化した結合を仲介できるＦｃ変異型及び突然変異形態は、当該技術分野において公知であり、２３４位及び２３５位のアミノ酸置換、２６５位の置換、又は２９７位の置換を含み、これらの番号付与は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付与である（例えば、参照により本出願に援用される米国特許第５，６２４，８２１号を参照）。ある好ましい実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換、及びアラニンによる２３５位の置換を含み、これらの番号付与は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付与である。
【００６７】
第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」対合させることができる。このような一連の突然変異は、上記二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、更に上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらの文書はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、ノブは第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、ホールは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従ってノブは、第１のポリペプチド鎖の２つの分子がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、これは、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する能力を有することになる（しかしながらこのような二量体化は、エピトープ結合部位を有する分子を形成しない）。好ましいノブは、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Fcダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。
【００６８】
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ノブ担持（ｋｎｏｂ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」配列（配列番号１５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGK
を有する。
【００６９】
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ホール担持（ｈｏｌｅ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」配列（配列番号１６）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。
【００７０】
上述のように、配列番号１５及び配列番号１６のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１４）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。更に、本発明は具体的には、配列番号１４、配列番号１５及び／又は配列番号１６のＣ末端リシン残基を有しない、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ構造を包含する。
【００７１】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号１５のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号１６）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号１５）は、第３のポリペプチド鎖中に採用される。
【００７２】
Ｅ．好ましいＢ７‐Ｈ３可変ドメイン
いずれの抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の抗体結合ドメインを、本発明に従って使用してよい。ヒトＢ７‐Ｈ７に対して免疫特異的である例示的な抗体（「Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａ」、「Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂ」及び「Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃ」と呼ばれる）を、以下に提供する。
【００７３】
１．Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＶＬドメインのアミノ酸置換（配列番号１７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS 
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIK 
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲL１：（配列番号１８）KASQNVDTNVA
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲL２：（配列番号１９）SASYRYS
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲL３：（配列番号２０）QQYNNYPFT
【００７４】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY 
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR 
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲH１：（配列番号２２）SFGMH
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲH２：（配列番号２３）YISSDSSAIYYADTVKG
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲH３：（配列番号２４）GRENIYYGSRLDY
【００７５】
２．Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIK
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＣＤＲL１（配列番号２６）RASQDISNYLN
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＣＤＲL２（配列番号２７）YTSRLHS
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＣＤＲL３（配列番号２８）QQGNTLPPT
【００７６】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT 
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG 
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＣＤＲH１：（配列番号３０）SYWMQ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＣＤＲH２：（配列番号３１）TIYPGDGDTRYTQKFKG
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＢのＣＤＲH３：（配列番号３２）RGIPRLWYFDV
【００７７】
３．Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIK
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＣＤＲL１：（配列番号３４）ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＣＤＲL２：（配列番号３５）ＹＴＳＲＬＱＳ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＣＤＲL３：（配列番号３６）ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ
【００７８】
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT 
IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG 
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＣＤＲH１：（配列番号３８）SYWMQ
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＣＤＲH２：（配列番号３９）TIYPGGGDTRYTQKFQG
Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  ＣのＣＤＲH３：（配列番号４０）RGIPRLWYFDV
【００７９】
Ｆ．好ましいＣＤ３可変ドメイン
いずれの抗ＣＤ３抗体の抗原結合ドメインを、本発明に従って使用してよい。ヒトＣＤ３に対して免疫特異的である例示的な抗体（「ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ」と呼ばれる）を、以下に提供する。
【００８０】
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲL１：（配列番号４２）RSSTGAVTTSNYAN
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲL２：（配列番号４３）GTNKRAP
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲL３：（配列番号４４）ALWYSNLWV
【００８１】
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲH１：（配列番号４６）TYAMN
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲH２：（配列番号４７）RIRSKYNNYATYYADSVKD
ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＣＤＲH３：（配列番号４８）HGNFGNSYVSWFAY
【００８２】
特定の実施形態では、ＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置６５におけるアスパラギン酸からグリシンへの置換（Ｄ６５Ｇ置換、配列番号４５の残基６８に対応）を含み、従ってＣＤＲH２のアミノ酸配列は：RIRSKYNNYATYYADSVKG（配列番号４９）となる。Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３  ｍＡｂ  ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）を以下に示す（置換された残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS 
【００８３】
ＩＩＩ．例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ
本発明は、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に同時に特異的に結合できる、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを提供する。上述のように、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含む。Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に結合できる４つの例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（「ＤＡＲＴ‐Ａ」、「ＤＡＲＴ‐Ｂ」、「ＤＡＲＴ‐Ｃ」及び「ＤＡＲＴ‐Ｄ」）のポリペプチド鎖を、以下に提供する。
【００８４】
Ａ．ＤＡＲＴ‐Ａ
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号１７）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号４５）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１０））；介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））；「ノブ担持」Ｆｃドメイン（配列番号１５）；及びＣ末端を含む。
【００８５】
よってＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は：配列番号１７‐配列番号１‐配列番号４５‐配列番号２‐配列番号１０‐配列番号５‐配列番号１５で構成される。
【００８６】
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号５３）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS 
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN 
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM 
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA 
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF 
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL 
SPGK
である。
【００８７】
このようなポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドは、（配列番号５４）：
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga 
cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg 
cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc 
gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc 
tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg 
ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag 
ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt 
gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga 
gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat 
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag 
gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaaggata 
gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg 
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg 
taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga 
cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca 
ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa 
ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc 
caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc 
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac 
atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact 
ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 
ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa 
gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 
tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct 
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 
tctccgggta aa
である。
【００８８】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号４１）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号２１）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１１）；及びＣ末端を含む。
【００８９】
よってＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は：配列番号４１‐配列番号１‐配列番号２１‐配列番号２‐配列番号１１で構成される。
【００９０】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号５５）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF 
GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ 
MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA 
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
である。
【００９１】
このようなポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列（配列番号５６）：
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac 
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact 
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc 
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag 
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg 
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg 
aggcgaggtg cagctggtcg agtctggcgg aggactggtg cagcctggcg 
gctccctgag actgtcttgc gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc 
ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc aagggactgg aatgggtggc 
ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac accgtgaagg 
gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag 
atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg 
ccgggagaat atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca 
ccaccgtgac cgtgtcctcc ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca 
ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag aaggtcgccg cacttaagga 
aaaggtcgca gccctgaaag ag
を有する。
【００９２】
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））；「ホール担持」Ｆｃドメイン（配列番号１６）；及びＣ末端を含む。
【００９３】
よってＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチドは：配列番号４‐配列番号１６で構成される。
【００９４】
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号５７）：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
【００９５】
このようなポリペプチドをコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列（配列番号５８）：
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg 
accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 
cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc 
caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca 
gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 
caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 
cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa 
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 
ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 
tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac 
gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a
を有する。
【００９６】
Ｂ．ＤＡＲＴ‐Ｂ
ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂ）（配列番号２５）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号４５）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１０））；介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））；「ノブ担持」Ｆｃドメイン（配列番号１５）；及びＣ末端を含む。
【００９７】
よってＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖は：配列番号２５‐配列番号１‐配列番号４５‐配列番号２‐配列番号１０‐配列番号５‐配列番号１５で構成される。
【００９８】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号５９）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN 
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM 
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA 
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF 
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK
である。
【００９９】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号４１）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂ）（配列番号２９）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１１）；及びＣ末端を含む。
【０１００】
よってＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチドは：配列番号４１‐配列番号１‐配列番号２９‐配列番号２‐配列番号１１で構成される。
【０１０１】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号６０）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY 
WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME 
LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK 
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
【０１０２】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））；「ホール担持」Ｆｃドメイン（配列番号１６）；及びＣ末端を含む。
【０１０３】
よってＤＡＲＴ‐Ｂの第３のポリペプチドは：配列番号４‐配列番号１６で構成され、上述のＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖（配列番号５７）と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
Ｃ．ＤＡＲＴ‐Ｃ
ＤＡＲＴ‐Ｃの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃ）（配列番号３３）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（Ｄ６５Ｇ置換を有するＶＨCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号５０）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１０））；介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））；「ノブ担持」Ｆｃドメイン（配列番号１５）；及びＣ末端を含む。
【０１０５】
よってＤＡＲＴ‐Ｃの第１のポリペプチド鎖は：配列番号３３‐配列番号１‐配列番号５０‐配列番号２‐配列番号１０‐配列番号５‐配列番号１５で構成される。
【０１０６】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第１のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号６１）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN 
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM 
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA 
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF 
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL 
SPGK
である。
【０１０７】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ｃ）（配列番号４１）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂ）（配列番号３７）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１１）；及びＣ末端を含む。
【０１０８】
よってＤＡＲＴ‐Ｃの第２のポリペプチドは：配列番号４１‐配列番号１‐配列番号３７‐配列番号２‐配列番号１１で構成される。
【０１０９】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６２）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY 
WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGGGDTRYTQ KFQGRVTITA DKSTSTAYME 
LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK 
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
【０１１０】
ＤＡＲＴ‐Ｃの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））；「ホール担持」Ｆｃドメイン（配列番号１６）；及びＣ末端を含む。
【０１１１】
よってＤＡＲＴ‐Ｃの第３のポリペプチドは：配列番号４‐配列番号１６で構成され、上で提供されたＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド（配列番号５７）と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
Ｄ．ＤＡＲＴ‐Ｄ
例示的なＤＡＲＴ‐Ｄの第１及び第２のポリペプチド鎖の一般構造は、ＤＡＲＴ‐Ｄがシステイン残基を含まない代替的なリンカー２を含み、またシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインを含む点を除いて、ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ｂ及びＤＡＲＴ‐Ｃと同一である。ＤＡＲＴ‐Ｄの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃ）（配列番号３３）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（Ｄ６５Ｇ置換を有するＶＨCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号５０）；介在リンカーペプチド（リンカー２；ASTKG（配列番号３））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１２））；介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））；「ノブ担持」Ｆｃドメイン（配列番号１５）；及びＣ末端を含む。
【０１１３】
よってＤＡＲＴ‐Ｄの第１のポリペプチド鎖は：配列番号３３‐配列番号１‐配列番号５０‐配列番号３‐配列番号１２‐配列番号５‐配列番号１５で構成される。
【０１１４】
ＤＡＲＴ‐Ｄの第１のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号６３）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN 
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM 
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS  
PGK
である。
【０１１５】
ＤＡＲＴ‐Ｄの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ｃ）（配列番号４１）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨB7-H3  Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂ）（配列番号３７）；介在リンカーペプチド（リンカー２；ASTKG（配列番号３））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１３）；及びＣ末端を含む。
【０１１６】
よってＤＡＲＴ‐Ｄの第２のポリペプチドは：配列番号４１‐配列番号１‐配列番号３７‐配列番号３‐配列番号１３で構成される。
【０１１７】
ＤＡＲＴ‐Ｄの第２のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号６４）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY 
WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGGGDTRYTQ KFQGRVTITA DKSTSTAYME 
LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSAS TKGKVAACKE 
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
【０１１８】
第１及び第２のポリペプチド鎖は、異なるリンカー及びヘテロ二量体促進ドメインを組み込んでいるが、ＤＡＲＴ‐Ｄの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））；「ホール担持」Ｆｃドメイン（配列番号１６）；及びＣ末端を含む。
【０１１９】
よってＤＡＲＴ‐Ｄの第３のポリペプチドは：配列番号４‐配列番号１６で構成され、上述のＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド（配列番号５７）と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１２０】
ＩＶ．対照ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの特性をより意義深く実証するために、フルオレセイン及びＣＤ３に結合できる対照二重特異性１価Ｆｃダイアボディを構成した（「対照ＤＡＲＴ」と呼ばれる）。
【０１２１】
対照ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを形成するために使用される抗フルオレセイン抗体は、抗体４‐４‐２０であった（Gruber, M. et al. (1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli," J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569）。抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖及び可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１２２】
抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IK
【０１２３】
抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ 
IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG 
SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
【０１２４】
対照ＤＡＲＴの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；フルオレセインに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬFluor  ４‐４‐２０）（配列番号６５）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（Ｄ６５Ｇ置換を有するＶＨCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号５０）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１０））；介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））；「ノブ担持」Ｆｃドメイン（配列番号１５）；及びＣ末端を含む。
【０１２５】
よって対照ＤＡＲＴの第１のポリペプチド鎖は：配列番号６５‐配列番号１‐配列番号５０‐配列番号２‐配列番号１０‐配列番号５‐配列番号１５で構成される。
【０１２６】
対照ＤＡＲＴの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６７）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 
TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS 
LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG 
GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP 
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK 
TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK 
AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE 
NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 
KSLSLSPGK
である。
【０１２７】
対照ＤＡＲＴの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3  ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａ）（配列番号３７）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））；フルオレセインに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨfluor  ４‐４‐２０）（配列番号６５）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号２））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１１）；及びＣ末端を含む。
【０１２８】
よって対照ＤＡＲＴの第２のポリペプチド鎖は：配列番号３７‐配列番号１‐配列番号６５‐配列番号２‐配列番号１１で構成される。
【０１２９】
対照ＤＡＲＴの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６８）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VASGFTFSDY 
WMNWVRQSPE KGLEWVAQIR NKPYNYETYY SDSVKGRFTI SRDDSKSSVY 
LQMNNLRVED MGIYYCTGSY YGMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK 
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
である。
【０１３０】
対照ＤＡＲＴの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））；「ホール担持」Ｆｃドメイン（配列番号１６）；及びＣ末端を含む。
【０１３１】
よって対照ＤＡＲＴの第３のポリペプチド鎖は：配列番号４‐配列番号１６で構成され、上述のＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖（配列番号５７）と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
Ｖ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
【０１３３】
本発明はまた、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディと；免疫応答の刺激に有効な１つ若しくは複数の分子（例えば免疫チェックポイント阻害因子）、及び／又は少なくとも１つの特定の癌抗原に対して特異的である、癌抗原に特異的に結合する１つ若しくは複数の追加の分子と組み合わせられた、１つ又は複数の追加の分子（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体若しくはダイアボディ）と；薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物も包含する。本明細書中で使用される場合、用語「癌抗原（cancer antigen）」は、腫瘍細胞の表面上に特徴的に発現する抗原を指す。癌抗原の例としては：Ａ３３（結腸直腸癌抗原；Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998）；Ｂ１（Egloff, A.M. et al. 2006,Cancer Res. 66(1):6-9）；ＢＡＧＥ（Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；βカテニン（Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9）；ＣＡ１２５（Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81）；ＣＤ５（Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73）；ＣＤ１９（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48）；ＣＤ２０（Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36）；ＣＤ２２（Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51）；ＣＤ２３（Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107）；ＣＤ２５（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48）；ＣＤ２７（Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40）；ＣＤ２８（Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40）；ＣＤ３６（Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7）；ＣＤ４０／ＣＤ１５４（Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60）；ＣＤ４５（Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46）；ＣＤ５６(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40）；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106）；ＣＤ１０３（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；ＣＤＫ４（Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4）；ＣＥＡ（癌胎児性抗原；Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9）；ＣＴＬＡ４（Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13）；ＥＧＦ-Ｒ（表皮成長因子受容体；Adenis, A. et al. 2003 BullCancer. 90 Spec No:S228-32）；Ｅｒｂ（ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25）；ｇｐ１００（Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27）；ＨＥＲ-２／ｎｅｕ（Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91）；ヒトパピローマウイルス-Ｅ６／ヒトパピローマウイルス-Ｅ７（DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59）；ＫＳＡ（１７-１Ａ）(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80）；ＭＡＧＥ（MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84)；ＭＡＲＴ（Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82）；ＭＵＣ-１（Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46）；ＭＵＭ-１（Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31）；Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34）；ｐ１５（Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77）；ＰＳＡ（前立腺特異性抗原；Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11）；ＰＳＭＡ（Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80）；ｓＴｎ（Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91）；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ-α受容体, ＴＮＦ-β受容体；又はＴＮＦ-γ受容体；van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64）；ＶＥＧＦ受容体（O’Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8）；ＡＤＡＭ-９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８４０７５号）；ＡＬＣＡＭ（ＰＣＴ公開番号第０３／０９３４４３号）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国公開特許第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ４６（米国特許第７，１４８，０３８号；ＰＣＴ公開番号第０３／０３２８１４号）；サイトケラチン８（ＰＣＴ公開番号第０３／０２４１９１号）；エフリン受容体（及び特にＥｐｈＡ２）（米国特許第７，５６９，６７２号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８４２２６号）；インテグリンα-V-β-６（ＰＣＴ公開番号第０３／０８７３４０号）；ＪＡＭ-３（ＰＣＴ公開番号第０６／０８４０７８号）；ＫＩＤ３（ＰＣＴ公開番号第０５／０２８４９８号）；ＫＩＤ３１（ＰＣＴ公開番号第０６／０７６５８４号）；ＬＵＣＡ-２（米国公開特許第２００６／０１７２３４９号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８３８５２号）；オンコスタチンＭ（オンコスタチン受容体β）（米国特許第７，５７２，８９６号；ＰＣＴ公開番号第０６／０８４０９２号）；ＰＩＰＡ（米国特許第７，４０５，０６１号；ＰＣＴ公開番号第０４／０４３２３９号）；ＲＯＲ１（米国特許第５，８４３，７４９号）；並びにトランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９５号；ＰＣＴ公開番号第０５／１２１１７９号）が挙げられる。
【０１３４】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、生理食塩水、水性デキストロース及びグリセロール溶液といった水性キャリアが好ましい。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【０１３５】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０１３６】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本発明はまた、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを単独で、又は他の作用剤、特に薬学的に許容可能なキャリアと共に内包する１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０１３８】
キットは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【０１３９】
ＶＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の分子又は本発明の分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、癌又は他の疾患若しくは障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０１４０】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の分子及び組成物の投与に使用できる。
【０１４１】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【０１４２】
本発明はまた、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０１４３】
凍結乾燥された本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの液体形態を、気密性コンテナ内に入れて供給する。
【０１４４】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；疾患の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。
【０１４６】
上述のような有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な、ウイルスの存在（又はその影響）の増殖の低減、並びに疾患（例えば癌）の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０１４７】
本発明に包含されるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。投与される投薬量は典型的には、被験者の体重の少なくとも０．０１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ、少なくとも約２μｇ／ｋｇ、少なくとも約３μｇ／ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、少なくとも約３０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上である。
【０１４８】
治療的又は予防的有効量の本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを用いた被験者の治療は、単回治療、又は好ましくは、同一の若しくは異なる投薬量を伴い得る複数回の一連の治療を含むことができる。例えば被験者は、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを用いて、約２〜約１２０週間、又は１２０週間超に亘って、週１回又は２週間に１回の治療を受けることができる。治療に使用されるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの有効投薬量は、特定の治療の経過に亘って増減し得ることが理解されるだろう。
【０１４９】
好ましくは、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを、１つ又は複数の投薬（これは変化させないままであってよく、又は治療に対する被験者の応答に応じて増減させてよい）を含む連続治療レジメンを用いて投与し、この治療レジメンは、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間又は８週間超に亘って投与される。典型的には、１、２、３、４、５又は６コース以上の治療を行う。各治療コースは、それ以前のいずれのレジメンと同一であっても異なっていてもよい。
【０１５０】
特定の実施形態、投薬レジメンは、第１の６週間サイクルを含み、ここではＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを２週間に１回（即ち１週間おきに）投与し、これに、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを２週間に１回投与する１つ又は複数の８週間サイクルが続く。特定の実施形態では、第１の６週間サイクルに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５回以上の８週間サイクルが続く。
【０１５１】
特定の実施形態では、被験者に投与されるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの投薬量は、被験者の体重の少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１．３μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇである。算出された用量は、ベースラインにおける患者の体重に基づいて投与される。しかしながら、ベースライン又は確立された安定体重からの体重の有意な（≧１０％の）変化は、投与される用量の再計算を喚起するものとする。
【０１５２】
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によってＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
【０１５３】
患者に投与される本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは他の治療用組成物と併用され、従って患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０１５４】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０１５５】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０１５６】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240;Buchwald et al.(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574-579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science228:190-192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（２‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunn et al.に従って使用できる（米国特許第5,945,155号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０１５７】
放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372-397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照（これらの文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１５８】
本発明の組成物が、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディをエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードするＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１５９】
治療的又は予防的有効量の本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜５２週間に亘って、週１回、２週間に１回（即ち１週間おきに）、又は３週間に１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【０１６０】
ＶＩＩ．本発明の組成物の使用
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｔ細胞をＢ７‐Ｈ３発現細胞と共存させる能力を有し、従って、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する、又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする、いずれの疾患又は状態の治療に使用できる。よってこのような分子を含む医薬組成物は、限定するものではないが、以下を含むがこれらに限定されない癌細胞の存在を特徴とする癌の診断又は治療に採用できる：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌の細胞。
【０１６１】
特に、本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、それぞれＢ７‐Ｈ３を高発現する、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、並びに神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む小児期のメルケル細胞癌の治療に有用である。
【０１６２】
本発明のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは更に、上述の状態の治療のための医薬品の製造に使用できる。
【０１６３】
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施形態を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施形態は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。
【０１６４】
本発明の実施形態
これより、本発明の特定の実施形態の非限定的な例を提供する。
【０１６５】
実施形態１：
Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、上記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合でき、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを備え、ここで上記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含み、上記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、上記第１の及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し：
Ｉ．上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＡであって：
（１）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを含む、サブドメイン（ＩＡ１）；及び
（２）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを含む、サブドメイン（ＩＡ２）
を含み、
上記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２は、１２アミノ酸残基以下のポリペプチドリンカーによって互いから隔てられ、また：
（ａ）上記サブドメインＩＡ１が、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＡ２が、ＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択され；又は
（ｂ）上記サブドメインＩＡ１が、ＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＡ２が、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択される
ように、協調的に選択される、ドメインＩＡ；並びに
Ｂ．ヘテロ二量体促進ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含む、任意に存在するドメインＩＢ；
Ｃ．抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含む、ドメインＩＣ
を含み；
ＩＩ．上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＩＡであって：
（１）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを含む、サブドメイン（ＩＩＡ１）；及び
（２）Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを含む、サブドメイン（ＩＩＡ２）
を含み、
上記サブドメインＩＩＡ１及びＩＩＡ２は、１２アミノ酸残基以下のポリペプチドリンカーによって互いから隔てられ、また：
（ａ）上記サブドメインＩＡ１が、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＩＡ１は、ＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できる上記ＶＬドメインを含むよう選択され、上記サブドメインＩＩＡ２は、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＨB7-H3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択され；及び
（ｂ）上記サブドメインＩＡ１が、ＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できる上記ＶＬドメインを含む場合、上記サブドメインＩＩＡ１は、Ｂ７‐Ｈ３（ＶＬB7-H3）に結合できる上記ＶＬドメインを含むよう選択され、上記サブドメインＩＩＡ２は、ＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できる上記ＶＨドメインを含むよう選択される
ように、協調的に選択される、ドメインＩＩＡ；並びに
Ｂ．ヘテロ二量体促進ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含む、任意に存在するドメインＩＩＢ
を含み；
ＩＩＩ．上記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結されたポリペプチドリンカーを含むドメインＩＩＩＣを含み；
ここで：
（Ａ）（１）上記任意に存在するドメインＩＢ及び上記任意に存在するドメインＩＩＢのうちの少なくとも一方が存在し、存在する上記ドメインＩＢ若しくはＩＩＢは、正若しくは負の電荷を有し；又は
（２）上記任意に存在するドメインＩＢ及び上記任意に存在するドメインＩＩＢの両方が存在し：
（ｉ）上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちの一方は、正の電荷を有するヘテロ二量体促進ドメインを有し、上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちのもう一方は、負の電荷を有するヘテロ二量体促進ドメインを有し；又は
（ｉｉ）上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちの一方は、アミノ酸配列GVEPKSC（配列番号６）若しくはVEPKSC（配列番号７）を含むヘテロ二量体促進ドメインを有し、上記ドメイン１Ｂ及び上記ドメインＩＩＢのうちのもう一方は、アミノ酸配列GFNRGEC（配列番号８）若しくはFNRGEC（配列番号９）を含むヘテロ二量体促進ドメインを有し；
（Ｂ）上記ＶＬB7-H3及び上記ＶＨB7-H3は相互作用して、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成し、上記ＶＬCD3及び上記ＶＨCD3は、ＣＤ３のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成し；並びに
（Ｃ）上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ受容体に結合できるＦｃドメインを形成する、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１６６】
実施形態２：
ヒト及び霊長類両方のＢ７‐Ｈ３及びＣＤ３と交差反応できる、実施形態１に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態に関する。
【０１６７】
実施形態３：
（Ａ）（１）上記ドメインＩＢ及び上記ドメインＩＩＢはそれぞれ、ジスルフィド結合によって上記第１のポリペプチド鎖を上記第２のポリペプチド鎖と共有結合させるシステイン残基を含み；かつ
（２）上記ドメインＩＣ及び上記ドメインＩＩＩＣはそれぞれ、ジスルフィド結合によって上記第１のポリペプチド鎖を上記第３のポリペプチド鎖と共有結合させるシステイン残基を含むか；又は
（Ｂ）（１）上記ドメインＩＡ２と上記ドメインＩＢとを隔てる上記ポリペプチドリンカー、及び上記ドメインＩＩＡ２と上記ドメインＩＩＢとを隔てる上記ポリペプチドリンカーはそれぞれ、ジスルフィド結合によって上記第１のポリペプチド鎖を上記第２のポリペプチド鎖と共有結合させるシステイン残基を含み；かつ
（２）上記ドメインＩＣ及び上記ドメインＩＩＩＣはそれぞれ、ジスルフィド結合によって上記第１のポリペプチド鎖を上記第３のポリペプチド鎖と共有結合させるシステイン残基を含む、実施形態１又は２に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１６８】
実施形態４：
（Ａ）上記ＶＬB7-H3は、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨB7-H3は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｂ）上記ＶＬB7-H3は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨB7-H3は、配列番号２９のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｃ）上記ＶＬB7-H3は、配列番号３３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨB7-H3は、配列番号３７のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１６９】
実施形態５：
上記ＶＬCD3は、配列番号４１のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨCD3は、配列番号４５又は５０のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７０】
実施形態６：
（Ａ）上記ドメインＩＣの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＩＣの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｂ）上記ドメインＩＣの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＩＣの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７１】
実施形態７：
（Ａ）上記サブドメインＩＡ１と上記サブドメインＩＡ２とを隔てる上記ポリペプチドリンカーは、配列番号１のアミノ酸配列を有し；及び／又は
（Ｂ）上記サブドメインＩＩＡ１と上記サブドメインＩＩＡ２とを隔てる上記ポリペプチドリンカーは、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７２】
実施形態８：
（Ａ）上記ドメインＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｂ）上記ドメインＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｃ）上記ドメインＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｄ）上記ドメインＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＢの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７３】
実施形態９：
（Ａ）上記ドメインＩＢと上記ドメインＩＡとを隔てる上記ポリペプチドリンカーは、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列を有し；及び／又は
（Ｂ）上記サブドメインＩＩＢと上記サブドメインＩＩＡとを隔てる上記ポリペプチドリンカーは、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７４】
実施形態１０：
上記ドメインＩＣは更に、上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを上記ドメインＩＢから隔てるポリペプチドリンカーを含み、
上記ドメインＩＩＩＣは更に、上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに対するＮ末端であるポリペプチドリンカーを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７５】
実施形態１１：
上記ドメインＩＣと上記ドメインＩＩＣとの間の上記ポリペプチドリンカーは、配列番号４又は５のアミノ酸配列を有する、実施形態１０に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７６】
実施形態１２：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｂ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号５９のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列をするか；又は
（Ｃ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するか；又は
（Ｄ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を有し、上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７７】
実施形態１３
Ａ４９８（腎臓癌）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（乳癌）、Ａ３７５（黒色腫）；２２Ｒｖ１（前立腺癌）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（咽頭癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）；ＢｘＰＣ３（膵臓癌）、ＳＫＭＥＳ‐１（肺癌）及びＵ８７（神経膠芽細胞腫）からなる群から選択された標的ヒト腫瘍細胞を採用し、またエフェクタ細胞として精製ヒト一次Ｔ細胞を、１：１、５：１又は１０：１のエフェクタ細胞：Ｔ細胞比で用いるアッセイにおいて、ヒトＴ細胞を用いて、標的腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介でき、
ここで、上記標的転換殺滅の、観察されたＥＣ５０は、約１．５μｇ／ｍＬ以下、約１．０μｇ／ｍＬ以下、約５００ｎｇ／ｍＬ以下、約３００ｎｇ／ｍＬ以下、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１００ｎｇ／ｍＬ以下、約５０ｎｇ／ｍＬ以下である、実施形態１〜１２に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７８】
実施形態１４
標的腫瘍細胞の殺滅は、細胞死の際に細胞から放出されたＬＤＨの酵素活性を定量的に測定する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いて、又はルシフェラーゼ相対光単位（ＲＬＵ）が、Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞（これは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼレポータ遺伝子の両方を発現するように操作されている）の相対生存率を示す読み取り値となる、ルシフェラーゼアッセイによって、測定される、実施形態１３に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１７９】
実施形態１５
共混合異種移植片中でのヒト腫瘍の成長の阻害を仲介でき、
上記共混合異種移植片では、上記分子を、２２Ｒｖ１（ヒト前立腺癌）又はＡ４９８（ヒト腎臓癌）腫瘍細胞及び活性化ヒトＴ細胞（５：１の比）と共に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに導入する、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１８０】
実施形態１６
（Ａ）‐１日目に腹腔内（ＩＰ）注射によってヒトＰＢＭＣ（１×１０7）を、及び０日目に皮内（ＩＤ）にＤｅｔｒｏｉｔ（ヒト咽頭癌腫瘍細胞（５×１０6)）を埋入され、２０、２２、２３、２６、２８、３０、３３、３５及び３７日目にダイアボディを投与される；又は
（Ｂ）０日目に皮内（ＩＤ）にＡ４９８（ヒト腎臓癌腫瘍細胞（５×１０6））を、及び１３日目に腹腔内（ＩＰ）注射によってヒトＰＢＭＣ（１×１０7）を埋入され、３３、３５、３６、３９、４１、４３、４６、４８及び５０日目にダイアボディを投与される、
メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおいて、ヒト腫瘍成長の阻害の仲介、及び／又は異種移植片モデルにおける抗腫瘍活性の呈示が可能である、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１８１】
実施形態１７
上記Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、約０．５ｍｇ／ｋｇ超の濃度、約０．５ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．２ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．１ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．０５ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．０２ｍｇ／ｋｇの濃度、約０．０１ｍｇ／ｋｇの濃度、若しくは約０．００５ｍｇ／ｋｇの濃度、又は約０．００５ｍｇ／ｋｇ未満の濃度で提供した場合に、上述の異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を阻害する、実施形態１５又は１６に記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１８２】
実施形態１８
医薬品としての使用のための、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【０１８３】
実施形態１９
実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【０１８４】
実施形態２０
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、実施形態１９に記載の医薬組成物の使用。
【０１８５】
実施形態２１
上記Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする上記疾患又は状態は、癌である、実施形態２０に記載の使用。
【０１８６】
実施形態２２
上記癌は：急性骨髄性白血病；副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；胃癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽腫；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、実施形態２１に記載の使用。
【０１８７】
実施形態２３：
上記癌は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）からなる群から選択される、実施形態２２に記載の使用。
【０１８８】
実施形態２４：
上記Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、２週間に１回（即ち１週おきに）被験者に投与される、実施形態２１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【０１８９】
実施形態２５：
上記Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ベースラインの被験者の体重の０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、１．３μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇの投薬量で投与される、実施形態２４に記載の使用。
【０１９０】
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【０１９１】
以下の実施例は、本発明の診断又は治療方法の構成に関する様々な方法を例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を例示することを意図したものであり、限定を意図するものではない。
【０１９２】
実施例１  結合親和性
複数の例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ｂ及びＤＡＲＴ‐Ｃ）の、ヒト又はカニクイザルＢ７‐Ｈ３に対する結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析によって評価した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、解離オフレートｋｄを測定する。抗体とその標的との間の結合親和性（ＫＤ）は、式ＫＤ＝［ｋｄ］／［ｋａ］に従った、会合（オンレート、ｋａ）及び解離（オフレート、ｋｄ）に関する動力学定数の関数である。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、表面プラズモン共鳴を用いて、これらの動力学パラメータを直接測定する。
【０１９３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析された、ヒト及びカニクイザルＢ７‐Ｈ３に対するＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ｂ及びＤＡＲＴ‐Ｃの結合の結果を、表２に示す。
【０１９４】
【表２】
2018523686.tif 000004
【０１９５】
ＤＡＲＴ‐Ａの結合親和性は、ヒト及びカニクイザルＢ７‐Ｈ３に関して同様である（それぞれＫＤ＝２４．６ｎＭ及び３０．２ｎＭ）。ＤＡＲＴ‐Ｂの、Ｂ７‐Ｈ３に関する結合親和性は、カニクイザルＢ７‐Ｈ３に関する親和性の３倍以内である（それぞれＫＤ＝３．２ｎＭ及び８．９ｎＭ）。しかしながらＤＡＲＴ‐Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ａに比べておよそ８倍高い、ヒトＢ７‐Ｈ３に対する親和性を有する（それぞれＫＤ＝３．２ｎＭ及び２４．６ｎＭ）。同様に、ＤＡＲＴ‐Ｃは、ＤＡＲＴ‐Ａに比べておよそ１５倍高い、ヒトＢ７‐Ｈ３に対する親和性を有する。ＤＡＲＴ‐Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ｃと同一のＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含み、Ｂ７‐Ｈ３に関する同一の結合親和性を有すると予想される。他の研究において、ＤＡＲＴ‐Ｃ及びＤＡＲＴ‐ＤのＢ７‐Ｈ３結合ドメインは、カニクイザルＢ７‐Ｈ３に結合することが示された。ヒト及びカニクイザルＣＤ３に関する結合親和性（ＫＤ）は、略同一（〜１４ｎＭ）である。ヒト及びカニクイザルＢ７‐Ｈ３に関する結合親和性が同様であることから、カニクイザルは、毒物学的評価に関して適切な種である。
【０１９６】
実施例２  腫瘍細胞株上でのＢ７‐Ｈ３発現のＦＡＣＳ分析
例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの生物活性を評価するために好適な標的細胞株を同定するために、異なるヒト組織腫瘍タイプに由来する複数の腫瘍細胞株のパネルに亘って、Ｂ７‐Ｈ３発現を評価した。図３は、様々な癌細胞株上で検出された抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体結合のＦＡＣＳヒストグラムを示す。９個の細胞株がＢ７‐Ｈ３発現に関して陽性であると確認され、また抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体結合の蛍光強度に基づく、Ｂ７‐Ｈ３発現レベルの範囲を示す。最高のＢ７‐Ｈ３発現を伴う細胞株は：Ａ４９８（腎臓癌）（図３Ａ）、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（乳癌）（図３Ｂ）及びＡ３７５（黒色腫）（図３Ｃ）であり；中程度のＢ７‐Ｈ３発現は：２２Ｒｖ１（前立腺癌）（図３Ｄ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（咽頭癌）（図３Ｅ）及びＤＵ１４５（前立腺癌）（図３Ｆ）であり；低Ｂ７‐Ｈ３発現は：ＢｘＰＣ３（膵臓癌）（図１Ｇ）、ＳＫＭＥＳ‐１（肺癌）（図３Ｈ）及びＵ８７（神経膠芽細胞腫）（図３Ｉ）であった。Ｂ７‐Ｈ３発現に関して陰性であることが知られているＢリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞は、使用した抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＰＥ抗体によっていずれの蛍光も示さなかった（図３Ｊ）。評価された細胞株のパネルにおけるＢ７‐Ｈ３発現の範囲は、様々なレベルの標的密度を有しかつ異なるヒト組織に由来する複数の腫瘍細胞株に対するＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（例えばＤＡＲＴ‐Ａ）の生物活性を特性決定するための基礎を提供する。
【０１９７】
実施例３  Ｂ７‐Ｈ３陽性癌細胞株及びＣＤ３発現Ｔ細胞に対する結合
例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを、二重特異性結合性能に関して検査した。４つのＢ７‐Ｈ３発現腫瘍細胞株（Ａ９４８、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２及び２２Ｒｖ１）並びにヒト一次Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ分析によって、ＤＡＲＴ‐Ａ細胞表面結合に関して評価した。ＤＡＲＴ‐ＡはＣＤ３と結合するため、Ｔ細胞に関するマーカとしてＣＤ３を使用する代わりに、ＣＤ４及びＣＤ８を、Ｔ細胞マーカとして使用した。従ってこの研究では、一次ヒト白血球を使用した場合、複合ＣＤ４＋プラスＣＤ８＋ゲートイベントは、Ｔ細胞集団を表す。
【０１９８】
ＤＡＲＴ‐Ａの１０μｇ／ｍＬを用いたインキュベーション後、癌細胞株及びＴ細胞上の細胞結合済みＤＡＲＴ‐Ａを、ＤＡＲＴ‐Ａタンパク質のＥコイル／Ｋコイル（ＥＫ）ヘテロ二量体促進ドメインを認識する、抗ＥＫコイル抗体を用いて検出した。ＤＡＲＴ‐Ａは、ヒトＢ７‐Ｈ３発現腫瘍細胞（図４Ａ〜４Ｄ）及びＣＤ３発現Ｔ細胞（図４Ｅ）の両方に対する結合を示した。同様の研究において、ＤＡＲＴ‐Ｂ、ＤＡＲＴ‐Ｃ及びＤＡＲＴ‐Ｄもまた、二重特異性結合能力を有することが分かった。
【０１９９】
実施例４  エフェクタ細胞として精製ヒトＴ細胞を用いた、複数の標的癌細胞株に対するＣＴＬ活性
ＣＤ３発現Ｔ細胞及びＢ７‐Ｈ３発現腫瘍細胞両方に対する結合の確認後（実施例３参照）、Ｂ７‐Ｈ３発現標的細胞の、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介標的転換Ｔ細胞殺滅を、標的細胞としての９個のヒト腫瘍細胞株（Ａ４９８、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ、Ａ３７５、Ｕ８７、ＤＵ１４５、ＢｘＰＣ‐３、ＳＫＭＥＳ‐１、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２及び２２Ｒｖ１）並びにエフェクタ細胞としての正常ヒトＴ細胞を使用して、インビトロで評価した。細胞毒性は、細胞死の際に細胞から放出される安定した細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの酵素活性を定量的に測定するＬＤＨ放出アッセイを用いて決定した。ＬＤＨアッセイは、標的及びエフェクタ細胞両方を内包するウェルからの上清におけるＬＤＨ活性を測定するため、エフェクタ細胞の死による干渉の可能性がある。従って、ＬＤＨ放出アッセイで測定される細胞毒性が、標的細胞のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介標的細胞殺滅に対して特異的であることを確認するために、細胞毒性を、ルミネッセンス（ＬＵＭ）アッセイも用いて評価した。このアッセイフォーマットでは、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するようトランスフェクト及び選択された標的細胞（ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ細胞）のルシフェラーゼ活性を測定し、これを用いて、アッセイの終了時に残っている生存標的細胞を計数する。これらの研究では、ＦＩＴＣ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（「対照ＤＡＲＴ」と呼ばれる）を対照タンパク質として使用した。ＦＩＴＣ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、抗ＣＤ３結合成分がＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ中のものと同一である、抗フルオレセイン（ＦＩＴＣ）×抗ＣＤ３ダイアボディタンパク質であるが、抗ＦＩＴＣ成分は無関係の結合標的を示す。従って、ＦＩＴＣ×ＣＤ３二重特異性１価ＦｃダイアボディはＴ細胞上のＣＤ３に係合するものの、標的細胞との係合は予想されない。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを用いて、３パラメータシグモイド用量‐応答関数に対してデータを曲線フィッティングさせることにより、ＥＣ５０値を決定した。
【０２００】
ＤＡＲＴ‐Ａは、ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として用いて（Ｅ：Ｔ細胞比＝５：１）を用いて、強力かつ特異的な、Ｂ７‐Ｈ３発現標的細胞の標的転換殺滅を仲介した。代表的なドナーのＴ細胞を用いた、標的細胞のＤＡＲＴ‐Ａ用量依存性殺滅を、図５Ａ〜５Ｊに示し、またＥＣ５０値及び最大％細胞毒性（Ｅｍａｘ）を表３に示す。４７〜１２７５ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａ  ＥＣ５０濃度が、評価された９個の標的細胞株に亘って観察され、ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃが最も感受性の高い細胞株であった（ＥＣ５０＝４７ｎｇ／ｍＬ）。生存しているＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ標的細胞を特異的に測定するＬＵＭアッセイを用いて、ほとんど完全な腫瘍細胞殺滅が観察された（図５Ｃを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ活性はＢ７‐Ｈ３発現と概ね相関していた。というのは、より高いＢ７‐Ｈ３発現を伴う標的細胞株に関して、より低いＥＣ５０値が観察されたためである。評価した最高の濃度（１０，０００ｎｇ／ｍＬ）では、対照ＤＡＲＴを用いた場合、活性は最小限しか又は全く観察されなかった。Ｂ７‐Ｈ３陰性ＣＨＯ細胞（図５Ｋ）又はＲａｊｉ細胞（図５Ｌ）では、ＤＡＲＴ‐Ａの存在下において細胞毒性は観察されず、これにより、Ｂ７‐Ｈ３発現標的細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ活性の特異性が確認された。
【０２０１】
【表３】
2018523686.tif 000005
【０２０２】
Ａ４９８及びＪＩＭＴ‐１を含む多数の異なる標的細胞株を用いて、ＤＡＲＴ‐Ｃ及びＤＡＲＴ‐Ｄによって実施された同様の研究は、これら２つの分子が同様の最大溶解レベル（Ｅｍａｘ）を有するものの、標的転換細胞殺滅の仲介においてＤＡＲＴ‐Ａより平均２０倍強力であることを実証した。ＤＡＲＴ‐Ｂもまた、Ａ４９８、ＴＨＰ‐１、及びＤＵ１４５を含む多数の異なる標的細胞株を用いて試験され、ＤＡＲＴ‐Ａより平均６倍強力であった。
【０２０３】
実施例５  異なる複数のエフェクタ細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比におけるＤＡＲＴ‐ＡのＣＴＬ活性
Ｅ：Ｔ細胞比と、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介標的転換殺滅との関係を実証するために、Ａ４９８（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅ）並びにＡ３７５（図６Ｂ、６Ｄ及び６Ｆ）標的細胞、並びにエフェクタ細胞としての精製ヒトＴ細胞を用いたＬＤＨアッセイで、１０：１（図６Ａ及び６Ｂ）、５：１（図６Ｃ及び６Ｄ）、並びに１：１（図６Ｅ及び６Ｆ）のＥ：Ｔ細胞比において、ＤＡＲＴ‐ＡのＣＴＬ活性を更に評価した。ＤＡＲＴ‐Ａは、Ｅ：Ｔ細胞比１０：１（図６Ａ及び６Ｂ）において、最高の強度（ＥＣ５０）及び最大％細胞毒性（Ｅｍａｘ）を示し、この強度及び最大細胞毒性は、Ｅ：Ｔ細胞比の低下と共に低下した（図６Ａ〜６Ｆ及び表４）。しかしながら、評価した最低のＥ：Ｔ細胞比（１：１）においてさえ、より低い程度ではあるものの、特異的活性が観察された（図６Ｅ及び６Ｆ並びに表４）。
【表４】
2018523686.tif 000006
【０２０４】
実施例６  Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介Ｔ細胞活性化は、標的細胞係合に依存する
Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディによって誘発されるＴ細胞活性化のレベルを、ヒトＴ細胞単独で、又はＥ：Ｔ細胞比１０：１でのＢ７‐Ｈ３発現標的細胞（Ａ４９８）の存在下で、評価した。ＤＡＲＴ‐Ａを用いたこれらの研究の結果を図７に示す。フローサイトメトリー分析は、Ｂ７‐Ｈ３発現標的細胞（図７Ｂ〜７Ｄ）の存在下でのＤＡＲＴ‐Ａによる、ＣＤ４＋（図７Ｂ及び７Ｄ）並びにＣＤ８＋（図７Ｃ及び７Ｅ）Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２５（図７Ｂ及び７Ｃ）並びにＣＤ６９（図７Ｄ及び７Ｅ）、Ｔ細胞活性化マーカの用量依存性上方制御が明らかになった。ＤＡＲＴ‐Ａ仲介Ｔ細胞活性化は、標的細胞の細胞毒性に相関していた（図７Ａ）。
【０２０５】
ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴを用いて評価された全ての濃度において、Ｔ細胞の活性化は、Ｂ７‐Ｈ３発現標的細胞の不在下のＴ細胞単独では観察されなかった（図７Ｂ〜７Ｅ）。これらのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ等のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディによって仲介されるＴ細胞活性化が、エフェクタ細胞‐標的細胞の共係合に依存することを示唆している。更に、ＣＴＬアッセイにおいて、Ｔ細胞を単独で、ＤＡＲＴ‐Ａ（図７Ｂ〜７Ｅ）又は対照ＤＡＲＴを用いてインキュベートした場合、細胞毒性は観察されなかった。対照的に、標的細胞の存在下では有意なＤＡＲＴ‐Ａ仲介細胞毒性が観察された（図７Ａ）。ＤＡＲＴ‐Ｂ、ＤＡＲＴ‐Ｃ又はＤＡＲＴ‐Ｄを用いて実施された同様の研究でも、同等の結果が見られた。
【０２０６】
実施例７  標的細胞の共係合時の、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介Ｔ細胞増殖
二重特異性抗体によって誘発されるＣＴＬ活性に関連するＴ細胞の膨張が、過去に報告されている（Klinger M et al. (2012) "Immunopharmacologic Response Of Patients With B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3-Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab," Blood 119(26):6226-6233）。従って、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを用いた治療によって、Ｔ細胞活性化マーカの増大を伴う標的細胞の用量依存性欠失がもたらされるのが観察された後、標的細胞及びＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディと共に培養したＴ細胞の膨張を評価した。これを実施するために、ヒトＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、濃度１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴの存在下で、７２又は９６時間に亘って、Ｅ：Ｔ細胞比１０：１のＡ４９８標的細胞と共に共培養した。細胞分裂のたびに、娘細胞に含有される染料のレベルは半減するため、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を、ＦＡＣＳ分析によってＣＦＳＥのレベルを経時的に測定することにより、監視した。図８Ａ（７２時間）及び図８Ｂ（９６時間）は、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ及び標的細胞の存在下での共培養の開始後のインキュベーションに続く、ＣＦＳＥ染色プロファイルを示す。ＤＡＲＴ‐Ａの存在は、７２時間（図８Ａ）のインキュベーション後に約４５％、９６時間（図８Ｂ）のインキュベーション後に７３％の増殖パーセンテージでの、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖をもたらした。対照的に、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖は、対照ＤＡＲＴの存在下では観察されなかった（図８Ａ及び８Ｂ）。
【０２０７】
実施例８  ヒト及びカニクイザルＢ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞に対する結合及び標的転換殺滅の特性決定
カニクイザルＢ７‐Ｈ３と交差反応するＤＡＲＴ‐Ａの能力を確認するために、ヒトＢ７‐Ｈ３（ｈｕＢ７‐Ｈ３‐ＣＨＯ）（図９Ａ）又はカニクイザルＢ７‐Ｈ３（ｃｙｎｏ‐Ｂ７‐Ｈ３‐ＣＨＯ）（図９Ｂ）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対する、ＤＡＲＴ‐Ａの結合を、フローサイトメトリーで評価した。細胞を、１０μｇ／ｍＬから開始して濃度を５倍低下させたＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴタンパク質で処置し、細胞結合済みのＤＡＲＴ‐Ａを、抗ＥＫコイル抗体を用いて検出した。図９Ａ及び９Ｂはそれぞれ、ヒトＢ７‐Ｈ３発現及びカニクイザルＢ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞両方に対する、ＤＡＲＴ‐Ａの濃度依存性結合を示す。
【０２０８】
ヒトＢ７‐Ｈ３又はカニクイザルＢ７‐Ｈ３を発現するＣＨＯ細胞を用いて、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介標的転換殺滅を評価するために、Ｅ：Ｔ細胞比５：１でのヒトＴ細胞の存在下で、ＤＡＲＴ‐Ａの濃度を変化させながら細胞をインキュベートした。図９Ｃ及び９Ｄに示すように、カニクイザル（図９Ｃ）及びヒト（図９Ｄ）Ｂ７‐Ｈ３発現ＣＨＯ細胞の両方に関して、効率的なＤＡＲＴ‐Ａ仲介殺滅が観察された。
【０２０９】
実施例９  エフェクタ細胞としてカニクイザルＰＢＭＣを用いた、標的細胞のＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ仲介標的転換殺滅
カニクイザルＴ細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａの結合を、フローサイトメトリーで評価した。ここでＤＡＲＴ‐Ａの結合は、ゲートＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団においてプロファイリングした。カニクイザルＴ細胞（図１０Ａ）に対するＤＡＲＴ‐Ａの結合は、ヒトＴ細胞（図１０Ｂ）と同様であった。
【０２１０】
ＤＡＲＴ‐Ａの、カニクイザルＴ細胞との交差反応性を確認した後、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介エクスビボＣＴＬ活性を、カニクイザルＰＢＭＣを用いて評価した。Ｂ７‐Ｈ３発現標的細胞（ＪＩＭＴ‐１／Ｌｕｃ（図１１Ａ及び１１Ｂ）又はＡ４９８（図１１Ｃ））とＥ：Ｔ細胞比３０：１で混合し、２４時間インキュベートしたカニクイザルＰＢＭＣに、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴを添加した。図１１Ａ〜１１Ｃに示すように、ヒトＢ７‐Ｈ３発現標的細胞株に対するエフェクタ細胞としてカニクイザルＰＢＭＣを用いて、用量依存性ＤＡＲＴ‐Ａ‐仲介エクスビボ細胞毒性を観察した。
【０２１１】
実施例１０  ２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌の共混合異種移植片モデル
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カナダ、バンクーバー））で提供されている製造元のプロトコルに従って、ヘパリン化された全血からヒトＴ細胞を単離した。続いて、精製されたＴ細胞を、抗ＣＤ３（ＯＫＴ‐３；１μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（６６μｇ／ｍＬ）抗体又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１の比）に対して４８時間曝露することにより、活性化した。この刺激後、細胞を、ＩＬ２（７．６ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトアビジンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、最大３週間成長させた。
【０２１２】
ヒトＴ細胞（１×１０6）と２２Ｒｖ１腫瘍細胞（５×１０6）とを組み合わせ、２００μＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中に再懸濁させた後、０日目に皮下（ＳＣ）注入した。２２Ｒｖ１腫瘍細胞及びＴ細胞の埋入後、マウスを、ビヒクル対照（●）、対照ＤＡＲＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（○）、又は４つの異なる用量レベル（０．００４（◆）、０．０２（黒の▽）、０．１（黒の△）若しくは０．５（■）ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＴ‐Ａで、腫瘍細胞埋入の日から開始して４日間（０、１、２及び３日目）、１日１回ＩＶ処置した。
【０２１３】
図１２に示すように、２２Ｒｖ１腫瘍細胞の成長は、用量レベル０．１（黒の△）又は０．５（■）ｍｇ／ｋｇでの０〜３日目の１日１回のＤＡＲＴ‐ＡによるＩＶ処置の後、遅延及び阻害された。０．０２ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）のＤＡＲＴ‐Ａ用量レベルでは、腫瘍成長の部分的阻害があったが、有意な程度には届かなかった。０．００４ｍｇ／ｋｇ（◆）のＤＡＲＴ‐Ａ用量レベルでは、腫瘍成長の阻害は認められなかった。
【０２１４】
実施例１１  Ａ４９８ヒト前立腺癌の共混合異種移植片モデル
上述のようにして、ヒトＴ細胞を単離及び調製した。ヒトＴ細胞（１×１０6）とＡ４９８腫瘍細胞（５×１０6）とを組み合わせ、２００μＬのＨａｍ’ｓＦ１２培地中に再懸濁させた後、０日目にＳＣ注入した。Ａ４９８腫瘍細胞及びＴ細胞の埋入後、マウスを、ビヒクル対照（●）、対照ＤＡＲＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（○）、又は４つの異なる用量レベル（０．００４（◆）、０．０２（黒の▽）、０．１（黒の△）若しくは０．５（■）ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＴ‐Ａで、腫瘍細胞埋入の日から開始して４日間（０、１、２及び３日目）、１日１回ＩＶ処置した。
【０２１５】
図１３に示すように、０日目に活性化されたヒトＴ細胞の存在下で注入されたＡ４９８腫瘍細胞は、対照動物においてさえも、インビボ環境に対する腫瘍の適合の結果である、ある程度の初期腫瘍収縮を示した。しかしながら、ビヒクル対照（●）及び対照ＤＡＲＴ（○）を受けた動物、並びに０．００４（◆）又は０．０２（黒の▽）ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａで０、１、２及び３日目に１日１回処置した動物においては、後の時点で活発な腫瘍成長が認められ、対照動物と比較して腫瘍成長の阻害はなかった。用量レベル０．１（黒の△）又は０．５（■）ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐ＡでのＩＶ処置後、腫瘍成長は遅延及び阻害された。
【０２１６】
実施例１２  ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける、確立されたＡ４９８ヒト腎臓癌モデル
ＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスにおける確立された腫瘍異種移植片に対するＤＡＲＴ‐Ａの活性を評価するために、ヒトエフェクタ細胞再構成モデルを採用した。このモデルはまた、抗腫瘍活性が、ＤＡＲＴ‐Ａによる、上記確立された腫瘍に対する、移植されるヒトＴ細胞の動員に左右される環境を提供する。
【０２１７】
メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、確立された腫瘍に関する研究に使用した（ｎ＝７〜８／群）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の移植に関連する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生を遅延するため、及び重篤度を最小化するために、ＭＨＣクラスＩの発現が弱いβ‐２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）ノックアウトマウスを採用した。しかしながら、これらのマウスにおけるＢ２ｍ発現の欠如は、ＦｃＲｎの発現の弱さにも関連することに留意されたい（Israel, E.J. et al. (1996) "Increased clearance of IgG in mice that lack beta 2-microglobulin: possible protective role of FcRn," Immunology 89: 573-578）。従って、これらのマウスにおけるＤＡＲＴ‐Ａの半減期は、野生型マウス又は霊長類に比べて短いと予想された。これらの研究における十分な曝露を保証するために、ヒトＦｃ領域を含む分子を有するこのマウスの系統における過去の研究に基づき、２〜４日に１回の投薬頻度を採用した。
【０２１８】
製造元のプロトコルに従って、Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅを用いて、ヘパリン化された全血からヒトＰＢＭＣを単離した。Ａ４９８腫瘍細胞（５×１０6生存細胞）を、１００μＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２中に再懸濁し、０日目に皮内（ＩＤ）注入した後、１３日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7生存細胞）の腹腔内（ＩＰ）注入（２００μＬ、生理食塩水）を行った。腫瘍細胞の埋入に対するＰＢＭＣ接種のタイミングは、腫瘍細胞の成長速度に関連しており、ランダム化及び処置開始時点においておよそ１５０〜３００ｍｍ3の腫瘍サイズの、最適なヒトエフェクタ細胞の再構成が得られるよう、経験的に決定された。処置期間は、ビヒクル対照、対照ＤＡＲＴ（１ｍｇ／ｋｇ）、又は４つの異なる用量レベル（０．００１、０．０１、０．１若しくは１ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＴ‐Ａを含む合計９用量を、３３、３５、３６、３９、４１、４３、４６、４８及び５０日目にＩＶ投与するものであった。
【０２１９】
Ａ４９８腫瘍は、治療開始前の３２日目に、平均体積およそ２５０ｍｍ3に達した（図１４）。１ｍｇ／ｋｇ（■）のＤＡＲＴ‐Ａを受けた群では、腫瘍体積は、３２日目の２４２±１９ｍｍ3から、３９日目の１０６±３５ｍｍ3まで退行した。０．１ｍｇ／ｋｇ（黒の△）のＤＡＲＴ‐Ａを受けた群では、腫瘍体積の減少はより小さかった（２４９±２５から１８１±８７ｍｍ3）が、０．０１ｍｇ／ｋｇ（黒の▽）の群では、同一の間隔（３２日目〜３９日目）の間に細胞分裂停止期間が存在した。１ｍｇ／ｋｇ（■）のＤＡＲＴ‐Ａの群では、腫瘍成長は７体中５体の動物において退行を続けたが、残りの２体の動物では、研究の終了（５３日目）までに再成長した。研究の終了までに、０．１（黒の△）及び０．０１（黒の▽）ｍｇ／ｋｇの群では、腫瘍成長は、それぞれ７体中５体及び７体中４体で退行したままであった。腫瘍成長の進行は、０．００１（◆）ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａで処置した全ての動物に関して明らかであった。ビヒクル対照（●）又は対照ＤＡＲＴ（○）については、腫瘍の成長に対する影響は認められなかった。
【０２２０】
ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおけるＡ４９８ヒト腎臓癌モデルを用いて、０．０２、０．１若しくは０．５ｍｇ／ｋｇで投薬されたＤＡＲＴ‐Ｂ、対照ＤＡＲＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、又はビヒクル対照の活性も評価した。ＤＡＲＴ‐Ｂで処置された動物は、全ての用量において腫瘍成長の有意な阻害を示したが、ビヒクル対照又は対照ＤＡＲＴについては、腫瘍の成長に対する影響は認められなかった。
【０２２１】
実施例１３  ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける確立されたＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌モデル
上述のようにして、ヒトＰＢＭＣを調製した。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞（５×１０6生存細胞）を、１００μＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２中に再懸濁し、０日目にＩＤ注入した。腫瘍細胞埋入の１日前である‐１日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7生存細胞）をＩＰ注入（２００μＬ、生理食塩水）によってＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスに埋入した。処置期間は、ビヒクル対照、対照ＤＡＲＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、又は４つの異なる用量レベル（０．１、０．２５、０．５若しくは１ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＴ‐Ａを含む合計９用量を、２０、２２、２３、２６、２８、３０、３３、３５及び３７日目にＩＶ投与するものであった。
【０２２２】
Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍は、治療開始前の１９日目に、およそ１５０ｍｍ3の腫瘍体積に達した（図１５）。１（■）、０．５（黒の△）及び０．２５（黒の▽）ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＤＡＲＴ‐Ａを受けた群の腫瘍は、処置期間中にサイズが減少し、０．２５（黒の▽）ｍｇ／ｋｇの群については２７日目に最小値（１０６±２１ｍｍ3）に達した（図１５）。１（■）及び０．５（黒の△）ｍｇ／ｋｇの群に関しては、最大の腫瘍減少は研究の最終日である３７日目に観察され、平均腫瘍体積はそれぞれ３２±６及び４７±７ｍｍ3であった（図１５）。０．１（◆）ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａの群では、腫瘍成長の低下が観察され、研究の終了時（３７日目）において、対照ＤＡＲＴ（○）（３４７±３６ｍｍ3）及びビヒクル（３９０±４２ｍｍ3）群のものと比べて減少した最大腫瘍体積（２５８±３７ｍｍ3）を有していた（図１５）。
【０２２３】
実施例１４  ヒトＰＢＭＣ再構成マウス投薬研究における確立されたＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト咽頭癌モデル
ＭＨＣｌ１‐／‐マウスにおける確立された腫瘍異種移植片に対するＤＡＲＴ‐Ａの活性を評価するために、ヒトエフェクタ細胞再構成モデルを採用した。このモデルはまた、抗腫瘍活性が、ＤＡＲＴ‐Ａによる、上記確立された腫瘍に対する、移植されるヒトＴ細胞の動員に左右される環境を提供する。これらの研究では、週１回及び２週間に１回（即ち１週間おき）の投薬レジメンを検査した。
【０２２４】
上述のようにして、ヒトＰＢＭＣを調製した。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞（５×１０6生存細胞）を、５０μＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中に再懸濁し、５０μＬのＭａｔｒｉｇｅｌと組み合わせた後、０日目に皮内（ＩＤ）注入した。０日目に、ヒトＰＢＭＣ（１×１０7生存細胞）をＩＰ注入（２００μＬ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地）によってＭＨＣｌ１‐／‐マウスに埋入した。処置期間は１５日目に開始された。群Ｉのマウスは、週１回（Ｑ１Ｗ）、１５、２２、２９、３６及び４３日目に、ＤＡＲＴ‐Ａ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を合計５用量ＩＶ投与された。群ＩＩのマウスは、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）、１５、２９及び４３日目に、ＤＡＲＴ‐Ａ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を合計３用量ＩＶ投与された。ビヒクル対照動物は、週１回投薬された。
【０２２５】
処置開始前の１４日目には、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍は、２００．４９±１５．５８ｍｍ3〜２８７．５±４８．７９ｍｍ3であった。群Ｉ及びＩＩ（黒の△）両方のＤＡＲＴ‐Ａ処置済みの動物の腫瘍は、ビヒクル処置済みの動物（●）に比べて、処置期間中にサイズが減少した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。群ＩのＤＡＲＴ‐Ａ処置済みの動物では、腫瘍成長の低下が観察され、４５日目において、３１日目におけるビヒクルで処置した動物のもの（８０１．９±１５５．５ｍｍ3）と比べて減少した［最大］腫瘍体積（２４．３±９．５ｍｍ3）を有していた（図１６Ａ）。群ＩＩのＤＡＲＴ‐Ａ処置済みの動物では、腫瘍成長の低下が観察され、３１日目におけるビヒクルで処置した動物のもの（８０１．９±１５５．５ｍｍ3）と比べて減少した［最大］腫瘍体積（４７．６±２８．５ｍｍ3）を有していた（図１６Ｂ）。
【０２２６】
実施例１５  カニクイザルにおける毒物動態学的研究
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ｂ、ＤＡＲＴ‐Ｃ又はＤＡＲＴ‐Ｄの、３つの非ＧＬＰパイロット探査投薬研究を、カニクイザルにおいて実施した。１つの用量増大研究では、２群のカニクイザル（ｎ＝２／群；オス１体／メス１体）に、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ又はＤＡＲＴ‐Ｂを１回投与した後、１．０ｍｇ／ｋｇを週１回、３週間投与した。いずれの群についても有意な知見は得られなかったが、注入後、ＩＬ‐６レベルの一時的な上昇が観察された。サイトカインレベルの上昇に関連する明白な臨床的観察結果は存在しなかった。ＤＡＲＴ‐Ａ及びＤＡＲＴ‐Ｂの血清濃度を、研究の経過中に検査した（図１７）。図１７に示すように、両方の分子は、許容可能な薬物動態プロファイルを示した。ＤＡＲＴ‐Ａの血清レベルは、研究の経過全体を通して、比較的小さい変動しか示さなかった。
【０２２７】
単一用量研究では、２群のカニクイザル（ｎ＝２／群；オス１体／メス１体）に、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｄを１回投与するか、又は０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴを１回投与した後、１．０ｍｇ／ｋｇを週１回、３週間投与した。０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｄで処置された動物はいずれも、異常な臨床的兆候を示した。更なる研究では、４群のカニクイザル（ｎ＝２／群；オス１体／メス１体）に、０．０７５、０．１５若しくは０．３ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｄを週１回、４週間、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｃを週１回、４週間投与した。これらの研究では、全ての用量が耐容性を示した。しかしながら、０．１５及び０．３ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｄ、並びに０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｃにおいて、血小板レベルに対する明白な一時的影響が存在した。
【０２２８】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０２２９】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：リンカー１
配列番号２：リンカー２
配列番号３：代替的なリンカー２
配列番号４：リンカー３
配列番号５：スペーサリンカー３
配列番号６〜９：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１０：「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１１：「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１２：システイン含有「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１３：システイン含有「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１４：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
配列番号１５：「ノブ担持」ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
配列番号１６：「ホール担持」ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
配列番号１７：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖可変ドメイン
配列番号１８：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１９：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２０：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２１：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖可変ドメイン
配列番号２２：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ１
配列番号２３：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ２
配列番号２４：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ３
配列番号２５：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの軽鎖可変ドメイン
配列番号２６：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２７：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２８：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２９：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの重鎖可変ドメイン
配列番号３０：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの重鎖ＣＤＲ１
配列番号３１：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの重鎖ＣＤＲ２
配列番号３２：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｂの重鎖ＣＤＲ３
配列番号３３：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの軽鎖可変ドメイン
配列番号３４：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３５：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３６：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３７：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの重鎖可変ドメイン
配列番号３８：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの重鎖ＣＤＲ１
配列番号３９：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの重鎖ＣＤＲ２
配列番号４０：Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ  Ｃの重鎖ＣＤＲ３
配列番号４１：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖可変ドメイン
配列番号４２：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４３：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖ＣＤＲ２
配列番号４４：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの軽鎖ＣＤＲ３
配列番号４５：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖可変ドメイン
配列番号４６：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ１
配列番号４７：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ２
配列番号４８：ＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ３
配列番号４９：Ｋａｂａｔ位置６５におけるアスパラギン酸からグリシンへの置換を含むＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖ＣＤＲ３
配列番号５０：Ｋａｂａｔ位置６５におけるアスパラギン酸からグリシンへの置換を含むＣＤ３  ｍＡｂ  Ａの重鎖可変ドメイン
配列番号５１：リンカー４
配列番号５２：代替的なリンカー４
配列番号５３：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号５４：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号５５：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号５６：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号５７：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第３のポリペプチド鎖
配列番号５８：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号５９：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ｂダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号６０：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ｂダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号６１：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号６２：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号６３：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ｄダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号６４：Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ｄダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号６５：抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の軽鎖可変ドメイン
配列番号６６：抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の重鎖可変ドメイン
配列番号６７：抗フルオレセイン抗体（対照ＤＡＲＴ）の第１のポリペプチド
配列番号６８：抗フルオレセイン抗体（対照ＤＡＲＴ）の第２のポリペプチド
【図１】
2018523686.tif 000007
【図２Ａ】
2018523686.tif 000008
【図２Ｂ】
2018523686.tif 000009
【図３Ａ】
2018523686.tif 000010
【図３Ｂ】
2018523686.tif 000011
【図３Ｃ】
2018523686.tif 000012
【図３Ｄ】
2018523686.tif 000013
【図３Ｅ】
2018523686.tif 000014
【図３Ｆ】
2018523686.tif 000015
【図３Ｇ】
2018523686.tif 000016
【図３Ｈ】
2018523686.tif 000017
【図３Ｉ】
2018523686.tif 000018
【図３Ｊ】
2018523686.tif 000019
【図４Ａ】
2018523686.tif 000020
【図４Ｂ】
2018523686.tif 000021
【図４Ｃ】
2018523686.tif 000022
【図４Ｄ】
2018523686.tif 000023
【図４Ｅ】
2018523686.tif 000024
【図５Ａ】
2018523686.tif 000025
【図５Ｂ】
2018523686.tif 000026
【図５Ｃ】
2018523686.tif 000027
【図５Ｄ】
2018523686.tif 000028
【図５Ｅ】
2018523686.tif 000029
【図５Ｆ】
2018523686.tif 000030
【図５Ｇ】
2018523686.tif 000031
【図５Ｈ】
2018523686.tif 000032
【図５Ｉ】
2018523686.tif 000033
【図５Ｊ】
2018523686.tif 000034
【図５Ｋ】
2018523686.tif 000035
【図５Ｌ】
2018523686.tif 000036
【図６Ａ】
2018523686.tif 000037
【図６Ｂ】
2018523686.tif 000038
【図６Ｃ】
2018523686.tif 000039
【図６Ｄ】
2018523686.tif 000040
【図６Ｅ】
2018523686.tif 000041
【図６Ｆ】
2018523686.tif 000042
【図７Ａ】
2018523686.tif 000043
【図７Ｂ】
2018523686.tif 000044
【図７Ｃ】
2018523686.tif 000045
【図７Ｄ】
2018523686.tif 000046
【図７Ｅ】
2018523686.tif 000047
【図８Ａ】
2018523686.tif 000048
【図８Ｂ】
2018523686.tif 000049
【図９Ａ】
2018523686.tif 000050
【図９Ｂ】
2018523686.tif 000051
【図９Ｃ】
2018523686.tif 000052
【図９Ｄ】
2018523686.tif 000053
【図１０Ａ】
2018523686.tif 000054
【図１０Ｂ】
2018523686.tif 000055
【図１１Ａ】
2018523686.tif 000056
【図１１Ｂ】
2018523686.tif 000057
【図１１Ｃ】
2018523686.tif 000058
【図１２】
2018523686.tif 000059
【図１３】
2018523686.tif 000060
【図１４】
2018523686.tif 000061
【図１５】
2018523686.tif 000062
【図１６Ａ】
2018523686.tif 000063
【図１６Ｂ】
2018523686.tif 000064
【図１７】
2018523686.tif 000065
【配列表】
2018523686000001.app
【国際調査報告】
2018523686.tif 000066
2018523686.tif 000067
2018523686.tif 000068
2018523686.tif 000069