(57)【要約】  ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害する方法であって、該方法は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞を有効量含有する組成物を、それを必要とするレシピエント被験体に投与することを含み、該小さな体性幹細胞には、ＣＤ３４９＋体性幹細胞とＬｇｒ５＋体性幹細胞とが含まれている、方法。【選択図】図１
2018524360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害する方法であって、該方法は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞を有効量含有する組成物を、それを必要とするレシピエント被験体に投与することを含み、該小さな体性幹細胞は、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞とＬｇｒ５（＋）体性幹細胞を含む、方法。
【請求項２】
前記投与工程の前に前記レシピエント被験体におけるヒストンデアセチラーゼ活性を測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与工程の後に前記レシピエント被験体におけるヒストンデアセチラーゼ活性を測定することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与工程の前後に前記レシピエント被験体におけるヒストンデアセチラーゼ活性を測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記測定工程を、前記レシピエント被験体から得られた末梢血サンプル中の有核細胞におけるヒストンデアセチラーゼ活性を測定することにより行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、静脈投与される注射溶液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、１０００万個〜５億個の前記小さな体性幹細胞を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、二価カチオンキレート剤を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記注射溶液が、
血液サンプルと二価カチオンキレート剤とを含有する混合物を準備することと、
２℃〜１２℃の温度にて３時間〜７２時間、前記混合物を保存することにより、前記小さな体性幹細胞を含有する上層と下層とに該混合物を分離することと、
前記上層を回収することにより、前記注射溶液を調製することと、
を含む手順によって調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液サンプルを前記レシピエント被験体又はドナー被験体から得る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液サンプルを得る前に、前記レシピエント被験体又はドナー被験体に対して幹細胞数を増やす行動を実行する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記行動が、フコイダン又は顆粒球−コロニー刺激因子の投与である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記血液サンプル１ミリメートル当たり１．５ｍｇ〜２．０ｍｇの二価カチオンキレート剤を該血液サンプルに投与して、前記混合物を得る、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記二価カチオンキレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記注射溶液を調製する手順が、前記上層を回収した後に、回収した上層に薬学的に許容可能な賦形剤を添加することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬学的に許容可能な賦形剤が食塩溶液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記小さな体性幹細胞には、ＣＤ１３３（＋）細胞と、ＣＤ３４（＋）細胞と、ＣＤ６６ｅ（＋）細胞とが含まれている、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記レシピエント被験体が、自己免疫障害、糖尿病、癌、神経変性障害、又はウイルス感染症を患っている、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記レシピエント被験体が、認知症、パーキンソン病、関節炎、強直性脊椎炎、又は糖尿病を患っている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験体においてヒストンデアセチラーゼ活性を低減するのに使用される注射用組成物であって、該組成物は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞を有効量含有し、該小さな体性幹細胞には、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞とＬｇｒ５（＋）体性幹細胞とが含まれている、注射用組成物。
【請求項２１】
前記被験体が、自己免疫障害、糖尿病、癌、神経変性障害、又はウイルス感染症を患っている、請求項２０に記載の注射用組成物。
【請求項２２】
前記被験体が、認知症、パーキンソン病、関節炎、強直性脊椎炎、又は糖尿病を患っている、請求項２１に記載の注射用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、いずれも２０１５年７月２８日に出願の米国仮出願第６２／１９７，７４２号、米国仮出願第６２／１９７，７４５号、米国仮出願第６２／１９７，７５３号、米国仮出願第６２／１９７，７５７号、米国仮出願第６２／１９７，７６０号、米国仮出願第６２／１９７，７７０号及び米国仮出願第６２／１９７，７８２号の優先権を主張する。これら全ての先の出願の内容全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、より多くの幹細胞を生成させる自己複製能と、さらに他の種類の細胞への分化能とを兼ね備えている。そのため、幹細胞を多様な疾患の処置に用いることができる。
【０００３】
ヒストンデアセチラーゼは、癌、免疫障害、及び神経変性障害を含む障害の薬物標的であることが分かっている。ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害することができる組成物には、このような障害の処置に対する大きな可能性がある。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害する方法が本明細書に記載される。該方法は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞を有効量含有する組成物を、それを必要とするレシピエント被験体に投与することを含み、該小さな体性幹細胞には、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞とＬｇｒ５（＋）体性幹細胞とが含まれている。上記方法は、投与工程の前又は後（又はその両方）でレシピエント被験体においてヒストンデアセチラーゼ活性を判定する工程を更に含み得る。
【０００５】
レシピエント被験体は、自己免疫障害、糖尿病、癌、神経変性障害、又はウイルス感染症を患い得る。例えば、レシピエント被験体は、認知症、パーキンソン病、関節炎、強直性脊椎炎、又は糖尿病を患い得る。
【０００６】
一実施の形態では、組成物中の全ての細胞の９５％超（例えば、９９％超又は９９．９９％超）が小細胞であり得る。小細胞には、血小板、Ｌｇｒ５（＋）細胞、ＣＤ３４９（＋）細胞、ＣＤ１３３（＋）細胞、ＣＤ３４（＋）細胞、及びＣＤ６６ｅ（＋）細胞のいずれかを含む１種以上の細胞が含まれ得る。血小板は、組成物中の小細胞の７５％〜８５％を占め得る。全ての小細胞の４％超（例えば、５％超又は４．５％〜１０％）がＬｇｒ５＋体性幹細胞であり得る。ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞は、組成物中の全ての小細胞の４％超（例えば、５％超又は４．５％〜１０％）を占め得る。小細胞の２％未満（例えば、１％未満又は０．５％未満）がＣＤ１３３（＋）細胞とＣＤ３４（＋）細胞とを合わせたものであり得る。小細胞の６％未満（例えば、５％未満又は４．５％未満）がＣＤ６６ｅ（＋）細胞であり得る。
【０００７】
さらに、組成物には、サイズが６マイクロメートルを超える大細胞は実質的に除かれ得る。例えば、大細胞は、組成物中の総細胞数の５％未満（例えば、１％未満、０．５％未満、又は０．０１％未満）を占め得る。
【０００８】
一実施の形態では、組成物は、静脈投与される注射溶液である。組成物には、二価カチオンキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）も含有され得る。注射溶液は、血液サンプルと二価カチオンキレート剤とを含有する混合物を準備することと、２℃〜１２℃の温度にて３時間〜７２時間、混合物を保存することにより、小さな体性幹細胞を含有する上層と下層とに該混合物を分離することと、上層を回収することにより注射溶液を調製することとを含む手順によって調製することができる。この手順に使用する血液サンプルをレシピエント被験体又はドナー被験体から得ることができる。
【０００９】
任意に、注射溶液を調製するための血液サンプルを得る前に、レシピエント被験体又はドナー被験体に対して幹細胞数を増やす行動を実行することができる。例えば、この行動は、フコイダン又は顆粒球−コロニー刺激因子の投与であり得る。
【００１０】
別の態様では、被験体においてヒストンデアセチラーゼ活性を低減するのに使用される注射用組成物が本明細書に記載される。該組成物は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞を有効量含有し、該小さな体性幹細胞には、ＣＤ３４９＋体性幹細胞とＬｇｒ５＋体性幹細胞とが含まれている。
【００１１】
１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面及び下記明細書に記載する。本実施形態の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示の実施形態による幹細胞混合物を調製する方法を説明するフローチャート図である。
【図２】褐藻類フコイダンサプリメントの成分情報（１錠当たり）を示す表である。
【図３】本開示の実施形態による幹細胞の活性化、精製及び濃縮方法を説明するフローチャート図である。
【図４】褐藻類フコイダンサプリメントの経口摂取の前後で得られた６名のヒト被験体の幹細胞データを示すグラフである。
【図５Ａ】一連の顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦ）注射の前に得られたフローサイトメトリーデータを示すグラフである。
【図５Ｂ】一連の顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦ）注射の後に得られたフローサイトメトリーデータを示すグラフである。
【図６Ａ】前方散乱係数（ＦＳＣ）対側方散乱係数（ＳＳＣ）を示すフローサイトメトリーのドットプロット図である。
【図６Ｂ】フローサイトメトリー分析による蛍光ヒストグラムである。
【図６Ｃ】ＦＳＣ対ＳＳＣのフローサイトメトリーのドットプロット図である。
【図７Ａ】ＦＳＣ対ＳＳＣのフローサイトメトリーのドットプロット図である。
【図７Ｂ】フローサイトメトリー分析によるＣＤ６１の蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｃ】フローサイトメトリー分析によるＣＤ１３３の蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｄ】フローサイトメトリー分析によるＣＤ３４の蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｅ】フローサイトメトリー分析によるＣＤ６６ｅの蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｆ】フローサイトメトリー分析によるＣＤ３４９の蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｇ】フローサイトメトリー分析によるＬｇｒ５の蛍光ヒストグラムである。
【図８】表２に示されるデータの散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
或る特定の小さな体性幹細胞（例えば、Ｌｇｒ５（＋）細胞及びＣＤ３４９（＋）細胞）を含有する組成物がｉｎ  ｖｉｖｏにてヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性を阻害したことは予期せぬ発見であった。それに応じて、ヒストンデアセチラーゼを阻害する方法及び組成物を本明細書に記載する。
【００１４】
体性幹細胞
体性幹細胞には、全能性幹細胞、万能性幹細胞、多能性幹細胞、及び前駆幹細胞（単能性幹細胞とも呼ばれる）を含む様々な種類がある。卵割球様幹細胞（ＢＬＳＣ）は、全能性又は万能性の体性幹細胞である。極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、万能性の体性幹細胞である。ＳＢ細胞は、万能性又は多能性の体性幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び造血系幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性の体性幹細胞である。
【００１５】
細胞、例えば幹細胞のサイズ（Ｚ）は、本明細書で使用される場合、（１）細胞生物学分野又は幹細胞分野における細胞のサイズ若しくは代表長さの従来定義、（２）特に細胞が実質的に球体である場合、細胞の直径、（３）特に細胞が実質的に楕円体である場合、細胞の主軸の長さ、（４）細胞の形状が略正方形である場合、細胞の幅、（５）細胞の形状が略長方形である場合、細胞の長さ、又は（６）細胞の最大断面寸法若しくは横断寸法を指し得る。直径、長さ、幅、又は最大断面寸法若しくは横断寸法のいずれかであるサイズ（Ｚ）は、例えば、光学顕微鏡若しくは電子顕微鏡（例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ））により得られた細胞の画像を用いて、又はフローサイトメーターにより得られた細胞のデータ（例えば、二次元のドットプロット、コンタープロット、又は密度プロット）を用いて決定又は測定することができる。光学顕微鏡又は電子顕微鏡により得られた細胞の画像は、細胞の二次元（２Ｄ）断面又は三次元（３Ｄ）構造であり得る。例としては、細胞のサイズ（Ｚ）は、光学顕微鏡又は電子顕微鏡（例えば、ＳＥＭ）により得られた２Ｄ断面画像において細胞の最大断面寸法又は横断寸法を測定することにより得ることができる。
【００１６】
「小細胞」（例えば、小さな体性幹細胞）という用語は、サイズが６マイクロメートル未満（例えば、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル）の細胞を指す。「大細胞」という用語は、サイズが６マイクロメートルを超える細胞を指す。
【００１７】
ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞は、万能性又は多能性の体性幹細胞である。ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞は、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）、及びＮａｎｏｇ（＋）、並びにＣＤ１３３（−）、ＣＤ９０（−）、ＣＤ３４（−）、及びＳｏｘ２（−）であってもよい。ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞のそれぞれのサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルである。サイズは、２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であるのが好ましい。
【００１８】
Ｌｇｒ５（＋）ＳＢ細胞は、万能性又は多能性の体性幹細胞である。これらの細胞は、Ｏｃｔ４（＋）及びＮａｎｏｇ（＋）、並びにＣＤ１３３（−）、ＣＤ６６ｅ（−）、ＣＤ４（−）、ＣＤ８（−）、ＣＤ９（−）、ＣＤ１０（−）、ＣＤ１１（−）、ＣＤ１６（−）、ＣＤ１７（−）、ＣＤ１８（−）、ＣＤ１９（−）、ＣＤ２０（−）、ＣＤ２１（−）、ＣＤ３１（−）、ＣＤ４２（−）、ＣＤ６３（−）、ＣＤ３４（−）、Ｌｉｎ（−）、ＣＤ３８（−）、ＣＤ９０（−）、ＣＤ４５（−）、ＣＤ３４９（−）、及びＳｏｘ２（−）であってもよい。Ｌｇｒ５（＋）ＳＢ細胞のサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルであり得る。Ｌｇｒ５（＋）ＳＢ細胞は、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であるのが好ましい。
【００１９】
卵割球様幹細胞（ＢＬＳＣ）は、ＣＤ６６ｅ（＋）の全能性又は万能性の体性幹細胞である。これらの細胞のサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルであり得る。例えば、ＢＬＳＣのサイズは、２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であり得る。
【００２０】
極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、万能性の体性幹細胞であり、ＣＤ１３３（＋）又はＣＤ３４（＋）であってもよい。ＶＳＥＬは、ＣＤ４５（−）及びＬｉｎ（−）であってもよい。例えば、ＶＳＥＬは、ＣＤ１３３（＋）、ＣＤ４５（−）、及びＬｉｎ（−）、又はＣＤ３４（＋）、ＣＤ４５（−）、及びＬｉｎ（−）であってもよい。ＶＳＥＬのサイズは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、２．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルであり得る。ＶＳＥＬのサイズは、２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満であり得る。
【００２１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多能性の体性幹細胞である。ＭＳＣは、細胞表面マーカーＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の１つ以上を発現することができる。ＭＳＣは、極めて不均一な集団を構成する。幾つかのタイプのＭＳＣは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルのサイズであり得る。他のタイプのＭＳＣのサイズは、６マイクロメートル、７マイクロメートル、又は１０マイクロメートルを超えていてもよい。
【００２２】
造血系幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性の体性幹細胞である。これらの細胞は、ＣＤ３４（＋）、ｃＫｉｔ（−）、ＣＤ３８（−）、Ｌｉｎ（−）の細胞、又はＣＤ１５０（＋）、ＣＤ２４４（−）、及びＣＤ４８（−）の細胞であってもよい。ＨＳＣは、４マイクロメートル以下、５マイクロメートル以下、又は６マイクロメートル以下、例えば０．１マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜６．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、１．０マイクロメートル〜５．０マイクロメートル、０．１マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、０．５マイクロメートル〜４．０マイクロメートル、又は１．０マイクロメートル〜４．０マイクロメートルのサイズであり得る。
【００２３】
幹細胞を増やす行動
行動（Ｘ）は、本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、ヒト被験体又は非ヒト被験体にて１種以上の幹細胞数を増やすのに有効であり得る行動である。行動（Ｘ）には、下記のものが含まれ得る。
１．合成薬物又は天然由来の化合物等の薬物の服用、
２．薬草又は漢方薬、例えばコルディセプス・シネンシス（Cordyceps sinensis：冬虫夏草）、チョウセンニンジン（ginseng）、リシウム・チャイニーズミル（Lycium Chinense Mill：枸杞子）、ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum）（霊芝（lingzhi））、タイワノフンガス・カムホラツス（Taiwanofungus camphoratus：牛樟芝）、及び／又はブラジルキノコ（Brazil mushroom：アガリスク）の服用、
３．下記の材料又は成分：ビタミン（ビタミンＡ、Ｂ、Ｂコンプレックス、Ｂ１２、Ｄ、Ｄ３、Ｅ等）、多量及び／又は微量ミネラル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素、ケイ素、セレン、ベリリウム、リチウム、コバルト、バナジウム、及び／又はニッケル）、多糖類、高分子量フコース含有糖タンパク質、海藻（緑藻類、藍藻類、褐藻類等を含む）、フコース、フコイダン（褐藻類の主成分）、オリゴフコイダン、藻類、フコイダンを含有する褐藻類（例えば、日本の沖縄に生育し、産生される褐藻類）、日本モズク（Japanese Mozuku）、緑藻類、藍藻類（又はラン藻類）、褐藻類（モズク、昆布、ワカメ属のもの（undaria）、サルガッスム・フシホルメ（sargassum fusiforme：ヒジキ）、ワカメ（pinnatifida）等を含む）、植物性化学物質（例えば、イソフラボン又はフィトエストロゲン）、リコペン、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、緑茶エキス、糖栄養素（例えば、キシロース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、又はＮ−アセチルノイラミン酸）、魚油、香椿（China toona）（トーナ・シネンシス（toona sinensis））、及び／又は植物、葉、果物、野菜、魚、海藻、若しくは藻類から抽出された栄養素を含む栄養剤又は粉末等の栄養素又は栄養補助食品の摂取、
４．菜食の実施、
５．健康食品又は有機食品の摂取又は摂食、
６．代替（非伝統）薬の服用、
７．ゲルソン療法又はブレウス癌治療等の代替療法又は処置の実施、
８．鍼治療の実施、
９．足のマッサージ等のマッサージの実施、
１０．ウォーキング、ジョギング、ダンス、体操、ヨガ、エアロビクス運動、及び／又は太極拳（中国のシャドーエクササイズ（shadow exercise））等の運動、
１１．睡眠（睡眠の質を測定する目的）、
１２．瞑想、
１３．個人、医療従事者、又は医師により設計された健康改善プログラム又は疾患治療プログラムの実行、
１４．身体内の或る特定器官の健康改善のための或る特定の栄養素の摂取、例えば前立腺の健康改善のためのリコペンの摂取、
１５．損傷治癒、又は外科的処置により生じた傷の治癒、又は疾患の治療のためのリハビリテーションプログラムの実行、
１６．例えば、１種の漢方薬又は複数種の漢方薬を酒又はワインに、一定期間浸すことにより作製される医薬酒（medicinal liquor）（又は医薬ワイン（medicinal wine）、薬用酒（medicated liquor）、又は薬用ワイン（medicated wine）とも呼ばれる）、例えばチョウセンニンジンを高アルコール濃度の日本酒に１ヶ月間浸すことで作製されるチョウセンニンジンワインの摂取、
１７．特定疾患（例えば、或る種の癌、皮膚疾患、腎疾患等）の治療のための米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  ＦＤＡ）等の政府機関又は当局に認可された１種以上の薬物の服用、
１８．特定疾患（例えば、或る種の癌、皮膚疾患、又は腎疾患）の治療のための政府機関に認可された処置又は治療法の実施、
１９．平和のために祈りを捧げる又は神を崇拝する等の宗教活動の実践、
２０．日光又は太陽光（sunshine or sunlight）への直接又は間接的な曝露（例えば、日の出の１０分前から日の出の５０分後までの午前中（多大な量の赤外（ＩＲ）光が含有されている）、又は例えば、午前１１：３０から午後１２：３０までの正午前後（多大な量の紫外（ＵＶ）光が含有されている）、又は例えば、日没の５０分前から日没の１０分後までの午後中（多大な量の赤外（ＩＲ）光が含有されている））、
２１．全スペクトルの可視光、ＩＲ光、赤色光、緑色光、青色光、若しくはＵＶ光、又は上記の光の２種以上の組合せを含み得る、灯光又は発光ダイオード（ＬＥＤ）光への曝露、
２２．運動、又は身体の自然治癒を改善するためのプログラム、治療法、方法、装置及び／又はシステム、例えば自然治癒を改善するために損傷又は外科的処置後に行う方法又は治療法（例えば、高圧酸素療法）の実施、
２３．ブラックコーヒー等のコーヒーを飲むこと、
２４．緑茶、紅茶、又はジャスミン茶等の茶を飲むこと、
２５．赤ワインを飲むこと、
２６．メラトニンの摂取、
２７．モーツァルト又はベートーヴェンの交響曲等の音楽を聴くこと、
２８．フコイダン又はオリゴフコイダンを含有する物質（例えば、栄養素又はサプリメント）の注射、
２９．ホルモンサプリメントの摂取又はホルモン注射の実施、
３０．糖タンパク質である顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はＧＣＳＦ）の注射、
３１．一連のＧＣＳＦ注射の実施、並びに、
３２．（１）各種アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、バリン、プロリン、グリシン、セレノシステイン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、又はトリプトファン）、（２）バランスの取れたアミノ酸類（balanced amino acids）、又は（３）人体に必須の９種のアミノ酸（すなわち、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリン）を含有する、栄養素、栄養品、栄養流体（nutrient fluid）、栄養ドリンク、栄養液（nutrient liquid）、又は栄養食品、例えば、（ａ）小豆、サヤインゲン、黒豆の発酵により産生又は抽出される製品、（ｂ）果物又は果物の組合せ、例えばテンサイ、リンゴ、グァバ、キウイ、ブドウ、パイナップル、レッドピタヤ（red pitaya）（ドラゴンフルーツ）、グリーンパパイヤ、トマト、及び／又はアボガド等の発酵により産生される液体、流体、又は飲料、（ｃ）例えば、１種の漢方薬又は複数種の漢方薬を酒又はワインに、一定期間浸すことにより作製される医薬酒（又は医薬ワイン、薬用酒、若しくは薬用ワインとも呼ばれる）、例えばチョウセンニンジンを高アルコール濃度の日本酒に１ヶ月間浸すことで作製されるチョウセンニンジンワインの摂取。
【００２４】
幹細胞含有組成物
幹細胞含有組成物（例えば、幹細胞含有溶液）は、図１に示されるフローチャート図で説明される例示的な方法を用いて調製することができる。
【００２５】
図１を参照すると、工程１０では、被験体は、上述の行動（Ｘ）の１つであり得る行動（Ｘ）を取る、又は実施する。被験体は、例えば、ヒト（例えば、小児、未成年（teenager）、成人、又は高齢者）、又は非ヒト動物である。非ヒト動物の例としては、霊長類（例えば、サル又はゴリラ）、イヌ、齧歯類（例えば、マウス又はモルモット）、ネコ、ウマ、雌ウシ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、鳥類、及びゾウが挙げられる。
【００２６】
例えば、工程１０では、被験体は、フコイダン含有化合物等の幹細胞動員剤を摂取することができる。フコイダン含有化合物は、褐藻類サプリメントとすることができる。図２は、褐藻類サプリメントの成分を示している。褐藻類サプリメント剤には、８０％のモズク粉末と、１５％の結晶性セルロースと、３％のスクロース脂肪酸エステルと、２％の微小又は微細なシリカ（二酸化ケイ素を含有する）とが含有されている。モズク粉末は、日本の沖縄近海に生育する褐藻類であるモズク（海藻の一種）から抽出することができる。次いで、モズク粉末を、結晶性セルロース、スクロース脂肪酸エステル、及び微小又は微細なシリカ（二酸化ケイ素を含有する）と混合して、０．１グラムのフコイダンを含有する褐藻類サプリメント剤を形成する。工程１０では、被験体は、２０錠以上（例えば、少なくとも３０錠）の褐藻類サプリメント又は２グラム以上（例えば、少なくとも３グラム）のフコイダンを摂取することができる。別の例では、工程１０では、被験体に、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、すなわち動員剤を注射しても、又は一連のＧＣＳＦ注射を実施してもよい。
【００２７】
工程１０を行った後、工程１１では、被験体は、一定期間（例えば、所定の期間）、例えば１５分〜６０分、２０分〜１００分、３０分〜４時間、６０分〜９０分、０．５時間〜３時間、１時間〜６時間、１時間〜１２時間、１２時間〜３６時間、又は３６時間〜５０時間、待機する。工程１０及び工程１１によって、１つ以上の特定種の体性幹細胞、例えばＳＢ細胞（すなわち、ＣＤ３４９（＋）及びＬｇｒ５（＋）ＳＢ細胞）を、例えば、被験体の骨髄から被験体の末梢血へと動員させることができる。このようにして、被験体の末梢血が、１つ以上の特定種の体性幹細胞で富化されることになる。１つ以上の特定種の体性幹細胞は、例えば、１種以上の上記の体性幹細胞であっても、又はそれらを含んでいてもよい。例えば、１つ以上の特定種の体性幹細胞は、サイズが６マイクロメートル未満であり、より好ましくはサイズが２マイクロメートルを超える体性幹細胞、例えばＣＤ３４９（＋）体性幹細胞及び／又はＬｇｒ５（＋）体性幹細胞であっても、又はそれらを含んでいてもよい。
【００２８】
工程１０及び工程１１は、任意である。換言すると、幹細胞含有組成物を作製するために、初めに被験体に対して行動（Ｘ）を一切実行せずに、被験体から血液サンプルを得ることができる。
【００２９】
工程１１直後（工程１０及び工程１１を行う場合）の工程１２では、被験体の末梢血から血液サンプルを抽出、採血、採取、取得、回収、又は誘導し、二価カチオンキレート剤の入った１つ以上の容器（例えば、バッグ、１つ以上のシリンジ、又は１つ以上のチューブ）に入れる。血液サンプルを容器内にて二価カチオンキレート剤と混合して、混合物を形成する。二価カチオンキレート剤、例えば抗凝血剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、例えばＫ２  ＥＤＴＡ抗凝血剤又はＫ３  ＥＤＴＡ抗凝血剤とすることができ、その重量は、例えば７０ｍｇを超える、例えば９０ｍｇ〜９００ｍｇ、１２０ｍｇ〜４５０ｍｇ、又は１５０ｍｇ〜４００ｍｇである。代替的には、二価カチオンキレート剤は、クエン酸塩とすることができ、その重量は、例えば７０ｍｇを超える、例えば９０ｍｇ〜９００ｍｇ、１２０ｍｇ〜４５０ｍｇ、又は１５０ｍｇ〜４００ｍｇである。血液サンプルには、サイズが６マイクロメートル未満の小細胞と、サイズが６マイクロメートルを超える大細胞とを含む複数種の細胞が含有されている。小細胞は、例えば、血小板と、サイズが６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞とを含有する。例えば、小さな体性幹細胞は、１つ以上の特定種の体性幹細胞（すなわち、例えばＳＢ細胞）と、ＢＬＳＣ（すなわち、ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）と、ＶＳＥＬ（例えば、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞及びＣＤ３４（＋）体性幹細胞）とを含有する。大細胞は、例えば、サイズが６マイクロメートルを超える大きな体性幹細胞と、赤血球及び白血球等の系統細胞とを含有する。血液サンプル量は、４５ミリリットル以上、例えば６０ミリリットル〜５００ミリリットル、８０ミリリットル〜２５０ミリリットル、又は１００ミリリットル〜２００ミリリットルとすることができる。一例では、血液サンプルを、血液サンプル１ミリリットル当たり１．５ｍｇ以上、例えば１．６ｍｇ〜２．０ｍｇの二価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡ、又はクエン酸塩）と混合して、容器内にて混合物を形成することができる。
【００３０】
次に、工程１３では、混合物を処理して、幹細胞含有溶液を形成する。この処理には、図３で説明される工程２１及び工程２２のような幹細胞の活性化工程及び精製／単離工程が含まれ得る。「精製」又は「単離」という用語は、本明細書で使用される場合、大細胞（例えば、サイズが６マイクロメートルを超える細胞）からの小細胞（例えば、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の細胞）の実質的な分離、例えば、混合物又は血液サンプルにおいて大細胞を除去することにより混合物又は血液サンプル中の小細胞を得る行為を意味する。
【００３１】
図３を参照すると、工程２１では、工程１２にて形成された混合物を、好適な設備（例えば、冷蔵庫又は低温に維持するのに用いられる装置）にて摂氏２度（℃）〜１２℃、より好ましくは２℃〜７℃、又は４℃の温度で所定の期間、保存する。所定の期間は、３時間〜７２時間、より好ましくは３時間〜６時間、６時間〜７２時間、６時間〜４８時間、１６時間〜７２時間、１６時間〜４８時間、３６時間〜６０時間、４８時間〜７２時間、又はおよそ４８時間とすることができる。混合物を所定の期間、保存した後、混合物中の１つ以上の特定種の体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を、二価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡ、又はクエン酸塩）によって活性化する、すなわち、１つ以上の特定種の体性幹細胞の細胞周期をＧ０からＧ１へと活性化させる。活性化は、二価カチオンキレート剤が（おそらくは、Ｚｎ２＋をキレート化することにより）ｐ５３の機能を抑えることで、１つ以上の特定種の体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を細胞周期のＧ０静止期からＧ１期にする能力と関連している。ｐ５３タンパク質は、正確に折り畳まれ、機能性タンパク質を形成するには、Ｚｎ２＋を必要とすることから、二価カチオンキレート剤によるＺｎ２＋のキレート化は、１つ以上の特定種の体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を活性化するのに重要な工程となる。二価カチオンキレート剤は、他の二価イオン（例えば、Ｃａ２＋）をキレート化することができ、それにより１つ以上の特定種の体性幹細胞を活性化し、これらの体性幹細胞を増殖及び拡大させることが可能である。
【００３２】
工程２１では、混合物が、重力により上層及び下層を含む複数の別々の層へと分離する。上層、又は上清の量は、２０ミリリットル〜２５０ミリリットル、４０ミリリットル〜１２５ミリリットル、又は５０ミリリットル〜１００ミリリットルとすることができる。上層には、血小板と、血清と、１つ以上の特定種の小さな体性幹細胞（すなわち、例えばＳＢ細胞）と、ＢＬＳＣ（すなわち、ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）と、ＶＳＥＬ（例えば、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞及びＣＤ３４（＋）体性幹細胞）とが含有されている。血液サンプルの系統細胞及び大きな体性幹細胞を含有する大細胞のほとんど、例えば血液サンプルの大細胞の９５％超、９８％超、又は９９％超が下層にある。上清量と血液サンプル量との比は、例えば、３分の１から２分の１の範囲とすることができる。
【００３３】
次に、工程２２では、実質的に上層を全て、液体容器、例えば、バッグ、シリンジ、又はガラス瓶に回収し、又は移し、幹細胞含有溶液又は幹細胞混合物を作製することができる。上層、例えば、幹細胞含有溶液には、血小板と小さな体性幹細胞とを含む小細胞が含有されている。幹細胞含有溶液中の小さな体性幹細胞数は、１０００万以上（例えば、３０００万以上、５０００万以上、１０００万〜５億、２５００万〜３億、又は３０００万〜５億）とすることができる。幹細胞含有溶液には、二価カチオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）及び／又は成長因子が含有されていてもよい。
【００３４】
加えて、幹細胞含有溶液には、大細胞（例えば、大きな体性幹細胞及び系統細胞）がほとんど含まれていないか、又は実質的に排除されている。例えば、大細胞は、幹細胞含有溶液中の総細胞数の５％未満（例えば、１％未満、０．５％未満、又は０．０１％未満）を占め得る。例えば、幹細胞含有溶液（例えば、回収した上層）中の赤血球の数は、１ミリリットル当たり１０５未満又は１０４未満であり得る。幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの赤血球の数は、１０３未満であるのが好ましい。幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの白血球の数は、１０４未満（例えば、１０３未満）であり得る。幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの白血球の数は、１０２未満であるのが好ましい。
【００３５】
幹細胞含有溶液中の全ての細胞の９５％超（例えば、９９％又は９９．９９％）が小細胞であり得る。小細胞には、血小板、Ｌｇｒ５（＋）細胞、ＣＤ３４９（＋）細胞、ＣＤ１３３（＋）細胞、ＣＤ３４（＋）細胞、及びＣＤ６６ｅ（＋）細胞が含まれ得る。血小板は、幹細胞含有溶液中の小細胞の７５％〜８５％を占め得る。全ての小細胞の４％超（例えば、５％超又は４．５％〜１０％）がＬｇｒ５＋体性幹細胞であり得る。ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞は、幹細胞含有溶液中の全ての小細胞の４％超（例えば、５％超又は４．５％〜１０％）を占め得る。小細胞の２％未満（例えば、１％未満又は０．５％未満）がＣＤ１３３（＋）細胞とＣＤ３４（＋）細胞とを合わせたものであり得る。小細胞の６％未満（例えば、５％未満又は４．５％未満）がＣＤ６６ｅ（＋）細胞であり得る。
【００３６】
任意の特定の小細胞を、フローサイトメトリー又は他の従来技法（例えば、抗体結合ビーズ等の抗体ベースの技法）を用いて、回収した上層から更に単離することもできる。
【００３７】
回収した上層を幹細胞含有溶液としてそのまま使用する（例えば、被験体に投与する、又は保存する）か、又は更に処理することができる。例えば、上層を更に精製する（例えば、濾過する）か、又は１つ以上の更なる成分と混合することができる。例えば、４００ミリリットルを超える、例えば５００ミリリットル〜９００ミリリットル量の好適なＣａ２＋不含細胞媒体又は溶液を回収した上層に添加し、幹細胞含有溶液を作製することができる。ＮａＣｌ含有溶液等の好適なＣａ２＋不含媒体又は溶液は、Ｍｇ２＋を含む任意の二価イオンを更に含んでいなくてもよい。ＮａＣｌ含有溶液は、例えば、生理食塩水（例えば、０．９０％（ｗ／ｖ）、約３００ｍＯｓｍ／Ｌ、又は９．０グラム／リットルのＮａＣｌ溶液）とすることができる。
【００３８】
幹細胞含有溶液を、凍結保存温度、例えば、−７０℃以下又は−８０℃以下（例えば、−７５℃〜−８５℃）で長期間（例えば、１週間超、１ヶ月超、又は１年超）保存することができる。使用の準備が整ったら、凍結した幹細胞含有溶液を速やかに解凍し、任意に上述の好適なＣａ２＋不含媒体又は溶液（例えば、０．９％のＮａＣｌ）と混合することができる。
【００３９】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性の阻害
上記の手順によって作製された幹細胞含有溶液又は組成物は、ＨＤＡＣ活性の阻害に使用することができる。
【００４０】
例えば、幹細胞含有組成物を被験体に投与（例えば、静注）して、被験体におけるＨＤＡＣ活性を阻害又は低減することができる。この処置により、例えば、被験体においてＨＤＡＣ活性を、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又はそれ以上、低減することができる。自己又は同種の体性幹細胞を被験体に投与することができる。
【００４１】
ＨＤＡＣは、多くの生物学的過程及び疾患に関わるエピジェネティック調節において重要な作用因子である。エピジェネティック修飾は可逆的であるが、或る特定疾患において、不均衡又は異常となることがある。ＨＤＡＣは、癌、神経変性障害、免疫障害、糖尿病、及び心血管障害を含む、多くの疾患についての有望な薬物標的であることが分かっている。例えば、Arguelles et al., Drug Discovery Today, 21(3):499-509 (2015)、Abel and Zukin, Curr. Opin. Pharmacol., 8(1):57-64 (2008)、Irwin et al., Drug Development Research, 77:109-123 (2016)、及びHuang, Journal of Cellular Physiology, 209:611-616 (2006)を参照されたい。幹細胞含有溶液は、ＨＤＡＣ阻害剤であることから、これらの過程の調整及びこれらの疾患の処置に使用することができる。
【００４２】
例えば、系統リプログラミング（分化転換としても知られる）は、或る成熟した体細胞が、中間の万能性状態又は前駆細胞型を経ることなく別の成熟した体細胞へと転換する過程である。この過程は、異なるエピジェネティック状態間での移行を伴うものである。したがって、エピジェネティック調節因子は、系統リプログラミングに重要な役割を果たす。このため、本明細書に記載の幹細胞含有溶液を被験体に投与して、被験体において系統リプログラミングを調整することができる。例えば、幹細胞含有溶液によって、第１のタイプの最終分化細胞を、（ｉ）第１のタイプの最終分化細胞の上流にある体細胞、又は（ｉｉ）異なるタイプの最終分化細胞へと戻す又は転換させることができる。
【００４３】
したがって、本明細書に記載の幹細胞含有組成物を、例えば、免疫障害（例えば、自己免疫障害又は炎症性障害）、神経変性若しくは神経障害、ウイルス感染症、癌、又は糖尿病を処置するためのＨＤＡＣ阻害剤として使用することができる。
【００４４】
自己免疫障害又は炎症性障害としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、血小板減少性紫斑病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、グロヴァー病、多発性硬化症、炎症性皮膚疾患、及び炎症性腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
神経変性障害としては、例えば、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。
【００４６】
処置対象の癌は、例えば、リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌又は気管支癌）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌（例えば、肝細胞癌又は肝内胆管癌）、腎臓癌、胃癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、甲状腺癌、食道癌、脳癌、膵癌、口腔癌、咽喉癌（例えば、咽頭癌又は喉頭癌）、子宮頸癌、骨癌、膀胱癌、白血病、又は上皮内癌とすることができる。
【００４７】
ウイルス感染症（又はウイルス感染によって引き起こされる疾患）は、ＨＩＶ感染症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヘルペスウイルス感染症（例えば、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ、又はＥＢＶ感染症）、又はＨＢＶ感染症とすることができる。
【００４８】
幹細胞含有組成物は、１型糖尿病（又は１型真性糖尿病と呼ばれる）又は２型糖尿病（又は２型真性糖尿病と呼ばれる）の処置に使用することができる。
【００４９】
上述の疾患又は障害の１つを処置する被験体は、この特定疾患又は障害に標準的な診断法によって特定することができる。「処置」は、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、疾患若しくは障害に続発する疾患状態、又は疾患若しくは障害の素因の治療、軽減、緩和、改善、発症遅延、予防、又は回復を目的として、この疾患若しくは障害を患っている又は発症するリスクのあるヒト被験体に、組成物、作用物質、又は物質（例えば、幹細胞含有溶液）を投与することを指す。「有効量」は、処置される被験体において（医学的に）望ましい転帰をもたらすことが可能である、組成物、作用物質、又は物質の量を指す。処置法は、単独で、又は他の薬物若しくは治療法に併せて行うことができる。
【００５０】
幹細胞含有組成物を被験体に投与する前又は投与した後のいずれか（又はその両方で）、被験体から得られたサンプル（例えば、末梢血サンプル又は治療対象の疾患に侵された組織のサンプル）中のＨＤＡＣ活性を評価することができる。例えば、サンプルから調製された核抽出物又はＨＤＡＣタンパク質におけるＨＤＡＣ活性を分析評価することができる。投与後のＨＤＡＣ活性の低減（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又はそれ以上）は、幹細胞含有溶液が被験体においてＨＤＡＣ活性を阻害するのに有効であることを示している。ＨＤＡＣ活性の低減は、この処置が上述の障害の１つの処置に有効であることも示し得る。幹細胞含有組成物の投与後の、又は一連の投与の間の被験体におけるＨＤＡＣ活性レベルは、処置決定、例えば、処置の継続若しくは中断、又は処置頻度の決定にも使用することができる。ＨＤＡＣ活性を分析評価するための技法及び試薬は、当該技術分野において既知である。さらに、ＨＤＡＣ活性アッセイキットが市販されている。
【００５１】
以下の特定の実施例は単なる例示と解釈され、それ以外の開示を何ら限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。本明細書に引用した全ての刊行物の全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００５２】
実施例１：幹細胞動員剤の効果
幹細胞含有溶液を、上記の手法を用いて６名のヒト被験体から得られた末梢血サンプルから調製した。図１及び図３も参照されたい。
【００５３】
ヒト被験体Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、及びＹにそれぞれ、図２に記載の褐藻類サプリメントを２０錠、経口摂取させた。換言すると、被験体Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、及びＹにそれぞれ、少なくとも２グラムのフコイダンを経口摂取させた。ヒト被験体Ｐは、対照とし、褐藻類サプリメントを摂取させなかった。被験体が丸薬を摂取する前及び摂取した後にサンプルを採取した。
【００５４】
図４に示されるように、ＳＢ細胞（すなわち、ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞及びＬｇｒ５（＋）ＳＢ細胞）の数の大幅な増加が、４名の被験体において褐藻類サプリメント摂取の１．５時間後に見られた。対照被験体では増加は見られなかった。このデータから、フコイダン、例えば、褐藻類サプリメントの摂取が、ＳＢ細胞（例えば、ＣＤ３４９（＋）ＳＢ細胞及びＬｇｒ５（＋）ＳＢ細胞）を末梢血（又は血流）へと動員させ、末梢血をＳＢ細胞で富化することができることが明らかとなる。図４では、０時間は、ヒト被験体Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、及びＹについては「フコイダン摂取前」を表し、またヒト被験体Ｐについては「対照試験の開始時」を表し、１．５時間は、ヒト被験体Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、及びＹについては「フコイダン摂取の１．５時間後」を表し、またヒト被験体Ｐについては「対照試験の開始の１．５時間後」を表し、２４時間は、ヒト被験体Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、及びＹについては「フコイダン摂取の２４時間後」を表し、またヒト被験体Ｐについては「対照試験の開始の２４時間後」を表す。
【００５５】
ＳＢ細胞の動員に対するＧＣＳＦの効果も評価した。ヒト被験体に、５日連続して単回用量の５マイクログラム／ｋｇ／日のＧＣＳＦを注射した。第１の末梢血サンプルは、１回目の注射の前に被験体から得て、第２の末梢血サンプルは、最後の注射の３．５時間後に被験体から得た。第１のサンプルと比較したＬｇｒ５＋  ＳＢ細胞数の大幅な増加が第２のサンプルにおいて見られた。
【００５６】
２つのサンプルのフローサイトメトリーデータを図５Ａ及び図５Ｂに示す。両図における領域Ｑ５−ＬＲの黒点は、Ｌｇｒ５（＋）細胞を表す。図５Ａに示されるように第１の末梢血サンプルについて、領域Ｑ５−ＬＲにおけるＬｇｒ５（＋）細胞数は、領域Ｑ５−ＵＬ、Ｑ５−ＵＲ、Ｑ５−ＬＬ、及びＱ５−ＬＲにおける総細胞数の１．６％である。図５Ｂに示されるように第２の末梢血サンプルについて、領域Ｑ５−ＬＲにおけるＬｇｒ５（＋）細胞数は、領域Ｑ５−ＵＬ、Ｑ５−ＵＲ、Ｑ５−ＬＬ、及びＱ５−ＬＲにおける総細胞数の８％である。したがって、ＧＣＳＦが、ＳＢ細胞（特に、Ｌｇｒ５（＋）細胞）を末梢血（又は血流）へと動員させ、末梢血をＳＢ細胞で富化することができた。
【００５７】
上記のデータから、褐藻類サプリメントの摂取又は一連のＧＣＳＦ注射の実施が、ＳＢ細胞を被験体の末梢血へと動員させることができることが明らかとなった。
【００５８】
実施例２：幹細胞含有溶液における細胞
幹細胞含有溶液を、上記の、また図１及び図３に示される方法に従って、被験体から得られた末梢血サンプルから調製した。幹細胞含有溶液の細胞含量を分析した。
【００５９】
幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの赤血球数を、図６Ａ及び図６Ｂに示されるデータに基づいて算出した。図６Ａは、フローサイトメーターを用いて１０マイクロリットル（μｌ）の幹細胞含有溶液を分析することにより得た。赤血球（すなわち、ＣＤ２３５ａ（＋）細胞）が図６Ａの領域Ｒ３に示され、図６Ａの領域Ｒ３における総細胞数は、２５０００である。図６Ｂは、図６Ａの領域Ｒ３における全ての細胞でのＣＤ２３５ａ蛍光強度の分布を示している。図６Ｂでは、蛍光ヒストグラムは、垂線２ａ（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ３−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ３−Ｒとに分離されている。図６Ｂの領域Ｖ３−Ｒは、ＣＤ２３５ａについて陽性染色した細胞、すなわち、赤血球を表し、図６Ｂの領域Ｖ３−Ｌは、ＣＤ２３５ａについて陰性染色した細胞を表す。図６Ｂの結果から、図６Ａの領域Ｒ３における全細胞数に対する図６Ａの領域Ｒ３における赤血球数の割合が０．１％であることが示される。領域Ｒ３における全細胞数、すなわち、２５０００と、図６Ａの領域Ｒ３における全細胞数に対する図６Ａの領域Ｒ３における赤血球数の割合、すなわち、０．１％とを乗算することにより、１０マイクロリットルの幹細胞含有溶液中の赤血球数が２５であることが見出された。１０マイクロリットルの幹細胞含有溶液中の赤血球数から幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの赤血球数を算出したところ、２５００に等しいことが見出された。
【００６０】
幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの白血球数は、図６Ｃのフローサイトメトリーデータに基づき算出した。図６Ｃのフローサイトメトリーデータは、５０マイクロリットル（μｌ）の幹細胞含有溶液を分析することにより得た。図６Ｃでは、領域Ｒ１は、白血球（ＷＢＣ）ゲーティングである。図６Ｃのフローサイトメトリーデータに基づき、５０マイクロリットルの幹細胞含有溶液中の白血球数を算出したところ、３０に等しいことが見出された。したがって、５０マイクロリットルの幹細胞含有溶液中の白血球数から幹細胞含有溶液１ミリリットル当たりの白血球数を算出したところ、６００に等しいことが見出された。
【００６１】
図７Ａは、前方散乱係数（ＦＳＣ）対側方散乱係数（ＳＳＣ）のフローサイトメトリードットプロット図を示しており、これはフローサイトメーターを用いて５．６マイクロリットル（μｌ）の幹細胞含有溶液を分析することにより得た。図７Ａでは、領域Ｒ５は、サイズが６マイクロメートル未満であり、かつ２マイクロメートルを超える細胞を表す。換言すると、領域Ｒ５における全ての細胞のサイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満である。図７Ｂは、図７Ａの領域Ｒ５における全ての細胞でのＣＤ６１蛍光強度の分布を示している。図７Ｂでは、蛍光ヒストグラムは、垂線（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ１−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ１−Ｒとに分離されている。図７Ｂの領域Ｖ１−Ｒは、ＣＤ６１について陽性染色した細胞、すなわち、血小板を表し、図７Ｂの領域Ｖ１−Ｌは、ＣＤ６１について陰性染色した細胞を表す。図７Ｂの結果から、領域Ｒ５における血小板数が領域Ｒ５における全ての細胞の８０．５％であることが示される。
【００６２】
図７Ｃは、図７Ａの領域Ｒ５における全ての細胞でのＣＤ１３３蛍光強度の分布を示している。図７Ｃでは、蛍光ヒストグラムは、垂線（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ３−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ３−Ｒとに分離されている。図７Ｃの領域Ｖ３−Ｒは、ＣＤ１３３について陽性染色した細胞、すなわち、ＶＳＥＬを表し、図７Ｃの領域Ｖ３−Ｌは、ＣＤ１３３について陰性染色した細胞を表す。図７Ｃの結果から、領域Ｒ５におけるＣＤ１３３（＋）細胞数の割合が領域Ｒ５における全細胞数の０．３％であることが示される。図７Ｄは、図７Ａの領域Ｒ５における全ての細胞でのＣＤ３４蛍光強度の分布を示している。図７Ｄでは、蛍光ヒストグラムは、垂線（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ１−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ１−Ｒとに分離されている。図７Ｄの領域Ｖ１−Ｒは、ＣＤ３４について陽性染色した細胞、すなわち、ＶＳＥＬを表し、図７Ｄの領域Ｖ１−Ｌは、ＣＤ３４について陰性染色した細胞を表す。図７Ｄの結果から、領域Ｒ５におけるＣＤ３４（＋）細胞数が領域における全細胞数の０．４％であることが示される。
【００６３】
図７Ｅは、図７Ａの領域Ｒ５における全ての細胞でのＣＤ６６ｅ蛍光強度の分布を示している。図７Ｅでは、蛍光ヒストグラムは、垂線（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ２−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ２−Ｒとに分離されている。図７Ｅの領域Ｖ２−Ｒは、ＣＤ６６ｅについて陽性染色した細胞、すなわち、ＢＬＳＣを表し、図７Ｅの領域Ｖ２−Ｌは、ＣＤ６６ｅについて陰性染色した細胞を表す。図７Ｅの結果から、領域Ｒ５におけるＣＤ６６ｅ（＋）細胞数が領域における全ての細胞の４％であることが示される。
【００６４】
図７Ｆは、図７Ａの領域Ｒ５における全ての細胞でのＣＤ３４９蛍光強度の分布を示している。図７Ｆでは、蛍光ヒストグラムは、垂線（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ３−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ３−Ｒとに分離されている。図７Ｆの領域Ｖ３−Ｒは、ＣＤ３４９について陽性染色した細胞、すなわち、ＳＢ−１細胞を表し、図７Ｆの領域Ｖ３−Ｌは、ＣＤ３４９について陰性染色した細胞を表す。図７Ｆの結果から、領域Ｒ５におけるＣＤ３４９（＋）細胞数が領域における全細胞数の５．６％であることが示される。
【００６５】
図７Ｇは、図７Ａの領域Ｒ５における全ての細胞でのＬｇｒ５蛍光強度の分布を示している。図７Ｇでは、蛍光ヒストグラムは、垂線（すなわち、基準線）によって、蛍光強度が低い領域Ｖ２−Ｌと、蛍光強度が高い領域Ｖ２−Ｒとに分離されている。図７Ｇの領域Ｖ２−Ｒは、Ｌｇｒ５について陽性染色した細胞、すなわち、ＳＢ−２細胞を表し、図７Ｇの領域Ｖ２−Ｌは、Ｌｇｒ５について陰性染色した細胞を表す。図７Ｇの結果から、領域Ｒ５におけるＬｇｒ５（＋）細胞数が領域における全ての細胞の５．４％であることが示される。
【００６６】
実施例３：ＨＤＡＣ活性を阻害するための幹細胞含有溶液
幹細胞含有溶液を、１０名のヒト被験体から得られた末梢血サンプルから調製した。被験体にそれぞれ、図２に記載の褐藻類サプリメントを２０錠、摂取させた。摂取の１．５時間後、被験体からそれぞれ、１５０ミリリットルの末梢血サンプルを採取した。２０ミリリットルの各血液サンプル（以下、「２０ミリリットル血液サンプル」）をフローサイトメーターにより分析し、サンプル中の特定の体性幹細胞数を得た。特定の体性幹細胞は、Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞、ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞、及びＣＤ３４（＋）体性幹細胞を含む、サイズが２マイクロメートルを超え、かつ６マイクロメートル未満の小さな体性幹細胞であった。各末梢血サンプルの残りを、上記の手順に従って処理し、約６５ミリリットルの幹細胞含有溶液を得た。幹細胞含有溶液はそれぞれ、小さな体性幹細胞を含有していた。各幹細胞含有溶液中の体性幹細胞数は、対応する２０ミリリットル血液サンプル中の体性幹細胞数に基づき、算出又は推定した。
【００６７】
幹細胞含有溶液をそれぞれ、５００ミリリットルの食塩水と混合した。１０名のヒト被験体にそれぞれ、自身の幹細胞含有溶液を静注した。表１は、各幹細胞含有溶液中の体性幹細胞数を示している。
【００６８】
【表１】
2018524360.tif 000003
【００６９】
１０名のヒト被験体のそれぞれの末梢血サンプルから得られた精製した有核細胞におけるＨＤＡＣ活性を分析評価した。それぞれの被験体についてのＨＤＡＣ活性の平均を２回の二重反復試験から算出した。下記表２に示されるように、被験体それぞれにおけるＨＤＡＣ活性の大幅な低減（少なくとも２２％）が幹細胞含有溶液の静注の４８時間後に見出された。
【００７０】
図８は、線形回帰直線を含む、表２に示されるＨＤＡＣ活性の平均の散布図である。図８に示されるように、幹細胞含有溶液の静注前のＨＤＡＣ活性の平均と、対応する注射の４８時間後のＨＤＡＣ活性の低減％との間の決定因子（すなわち、Ｒ２）は、０．７３４６と大きく、このことから、２つの変数の間の関係性が極めて強いことが示唆される。このプロットから、注射前のＨＤＡＣ活性が高ければ、注射の４８時間後のＨＤＡＣ活性の低減％も高くなることが分かる。
【００７１】
上記のデータは、幹細胞含有溶液によって、ヒト被験体におけるＨＤＡＣ活性を大幅に低減させることができることを示している。
【００７２】
【表２】
2018524360.tif 000004
【００７３】
実施例４：患者におけるＨＤＡＣ活性を阻害するための幹細胞含有溶液
神経変性障害、自己免疫障害、又は糖尿病を患う患者をそれぞれ、上記の手順を用いて調製した自身の幹細胞含有溶液で処置した。
【００７４】
患者それぞれについて、処置の前後でＨＤＡＣ活性及び臨床評価を得た。これらの結果を下記の表３、表４、及び表５に示す。これらの結果から、幹細胞含有溶液の投与後、ＨＤＡＣ活性が低減し、それに応じて患者の臨床評価が改善したことが明らかとなる。
【００７５】
【表３】
2018524360.tif 000005
【００７６】
【表４】
2018524360.tif 000006
【００７７】
【表５】
2018524360.tif 000007
【００７８】
他の実施形態
本明細書に開示の特徴は全て、任意に組み合わせて併用することができる。本明細書に開示のそれぞれの特徴は、同じ、同等又は同様の目的に役立つ代替の特徴に置き換えることができる。したがって、他に明記されない限り、開示のそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例に過ぎない。
【００７９】
上記の説明から、当業者であれば記載の実施形態の本質的な特徴を容易に解明することができ、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な用途及び条件に合うように実施形態の種々の変化及び変更を適用させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
2018524360.tif 000008
【図２】
2018524360.tif 000009
【図３】
2018524360.tif 000010
【図４】
2018524360.tif 000011
【図５Ａ】
2018524360.tif 000012
【図５Ｂ】
2018524360.tif 000013
【図６Ａ】
2018524360.tif 000014
【図６Ｂ】
2018524360.tif 000015
【図６Ｃ】
2018524360.tif 000016
【図７Ａ】
2018524360.tif 000017
【図７Ｂ】
2018524360.tif 000018
【図７Ｃ】
2018524360.tif 000019
【図７Ｄ】
2018524360.tif 000020
【図７Ｅ】
2018524360.tif 000021
【図７Ｆ】
2018524360.tif 000022
【図７Ｇ】
2018524360.tif 000023
【図８】
2018524360.tif 000024
【国際調査報告】
2018524360.tif 000025
2018524360.tif 000026