(57)【要約】本発明は、対象における融合タンパク質の治療効果を高めるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドを含む組成物及び組成物の使用を提供する。融合タンパク質は、第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドは第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドは第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体はＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドは異なり、第１と第２の受容体は異なる。本発明は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質及びＴＷＥＡＫを含む組成物、並びに高レベルのＴＷＥＡＫに関連する疾患又は症状を処置するためのその使用も提供する。本発明は、更に、高レベルのＴＷＥＡＫに関連する疾患又は症状を処置するためのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の使用も対象とする。【選択図】図１Ａ
2018510214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における疾患を処置する方法であって、前記疾患が、患部組織若しくは器官において、又は環境において、又は前記対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において測定して、健常者と比較した第１のＴＮＦファミリーリガンドの存在又は高レベルに関連し、前記方法が、前記疾患を処置するために融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含み、前記融合タンパク質が第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記融合タンパク質が第２のＴＮＦファミリーリガンドを更に含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、前記第１のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、それによって前記対象における前記疾患を処置する、方法。
【請求項２】
対象における疾患を処置する方法であって、前記疾患を処置するために融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含み、前記融合タンパク質が第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記融合タンパク質が第２のＴＮＦファミリーリガンドを更に含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、前記疾患が、前記第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である、方法。
【請求項３】
対象における疾患を処置する方法であって、前記対象において第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能である第１のＴＮＦファミリーリガンドの存在又はレベルを決定するステップ、前記第１のリガンドの前記レベルがベースラインレベルを超える場合、前記疾患を処置するために融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含み、前記融合タンパク質が前記第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記融合タンパク質が第２のＴＮＦファミリーリガンドを更に含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、前記疾患が、前記第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である、方法。
【請求項４】
更に、前記対象において前記第２のＴＮＦファミリーリガンドが結合可能である第２のＴＮＦファミリー受容体のレベルを検出するステップ、及び前記対象において前記第２のＴＮＦファミリー受容体の前記レベルを検出するステップの後に、前記融合タンパク質を投与するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び第２の受容体並びに前記第１及び第２のリガンドが以下のように選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法：
前記第１の受容体が４−１ＢＢである場合、前記第１のリガンドは４−１ＢＢＬであり、又は前記第２の受容体が４−１ＢＢである場合、前記第２のリガンドは４−１ＢＢＬであり、
前記第１の受容体がＢＣＭＡである場合、前記第１のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、又は前記第２の受容体がＢＣＭＡである場合、前記第２のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、
前記第１の受容体がＣＤ２７である場合、前記第１のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ２７である場合、前記第２のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、
前記第１の受容体がＣＤ３０である場合、前記第１のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ３０である場合、前記第２のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、
前記第１の受容体がＣＤ４０である場合、前記第１のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ４０である場合、前記第２のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、
前記第１の受容体がＥＤＡＲである場合、前記第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、又は前記第２の受容体がＥＤＡＲである場合、前記第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、
前記第１の受容体がＸＥＤＡＲである場合、前記第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、又は前記第２の受容体がＸＥＤＡＲである場合、前記第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、
前記第１のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、前記第１の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、前記第２の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、
前記第１のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、前記第１の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、前記第２の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、
前記第１の受容体がＴＲＯＹである場合、前記第１のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、又は前記第２の受容体がＴＲＯＹである場合、前記第２のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、
前記第１の受容体がＦａｓである場合、前記第１のリガンドはＦａｓＬであり、又は前記第２の受容体がＦａｓである場合、前記第２のリガンドはＦａｓＬであり、又は
前記第１の受容体がＧＩＴＲである場合、前記第１のリガンドはＧＩＴＬであり、又は前記第２の受容体がＧＩＴＲである場合、前記第２のリガンドはＧＩＴＬであり、
前記第１のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、前記第１の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、前記第２の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、
前記第１の受容体がＤＲ３である場合、前記第１のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、又は前記第２の受容体がＤＲ３である場合、前記第２のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、
前記第１の受容体がＦｎ１４である場合、前記第１のリガンドはＴＷＥＡＫであり、又は前記第２の受容体がＦｎ１４である場合、前記第２のリガンドはＴＷＥＡＫであり、
前記第１の受容体がＴＮＦＲ１である場合、前記第１のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、前記第２の受容体がＴＮＦＲ１である場合、前記第２のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、
前記第１の受容体がＴＮＦＲ２である場合、前記第１のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、又は前記第２の受容体がＴＮＦＲ２である場合、前記第２のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、
前記第１の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、前記第１のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、又は前記第２の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、前記第２のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、
前記第１の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、前記第１のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、前記第２のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、
前記第１の受容体がＮＧＦＲである場合、前記第１のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、又は前記第２の受容体がＮＧＦＲである場合、前記第２のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、
前記第１の受容体がＤＲ６である場合、前記第１のリガンドはＡＰＰであり、又は前記第２の受容体がＤＲ６である場合、前記第２のリガンドはＡＰＰであり、
前記第１の受容体がＲＥＬＴである場合、前記第１のリガンドはＲＥＬＴリガンドであり、又は前記第２の受容体がＲＥＬＴである場合、前記第２のリガンドはＲＥＬＴリガンドである。
【請求項６】
癌の処置に適合された、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の受容体がＦｎ１４であり、前記第１のリガンドがＴＷＥＡＫであり、前記第２のリガンドがＴＲＡＩＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、脂漏性角化、潰瘍性大腸炎及びクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症、又は高血圧、放射線、鎌状赤血球症などの任意の他の症状に起因する網膜症、又は急性虚血性脳卒中から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患が、精巣癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、角化細胞癌又は骨肉腫から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
対象における融合タンパク質の治療効果を高めるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドとを含む安定化組成物であって、前記融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、前記第１のリガンドが前記第１の受容体に結合可能であり、前記第１及び第２のリガンド並びに前記第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、前記第１と第２のリガンドが異なり、前記第１と第２の受容体が異なる、安定化組成物。
【請求項１１】
天然ＰＡＧＥゲルにおける融合タンパク質の移動時間を増加させるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドとを含む安定化組成物であって、前記融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、前記第１のリガンドが前記第１の受容体に結合可能であり、前記第１及び第２のリガンド並びに前記第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、前記第１と第２のリガンドが異なり、前記第１と第２の受容体が異なる、安定化組成物。
【請求項１２】
アポトーシスを誘導する薬学的に有効な量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質及びＴＷＥＡＫを含む組成物。
【請求項１３】
融合タンパク質及び第１のリガンドを含む複合体であって、前記融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、前記第１のリガンドが前記第１の受容体に結合可能であり、前記第１及び第２のリガンド並びに前記第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、前記第１と第２のリガンドが異なり、前記第１と第２の受容体が異なる、複合体。
【請求項１４】
前記第１の受容体がＦｎ１４であり、前記第１のリガンドがＴＷＥＡＫであり、前記第２のリガンドがＴＲＡＩＬである、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記第１及び第２の受容体並びに前記第１及び第２のリガンドが以下のように選択される、請求項１０若しくは１１のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１３若しくは１４に記載の複合体：
前記第１の受容体が４−１ＢＢである場合、前記第１のリガンドは４−１ＢＢＬであり、又は前記第２の受容体が４−１ＢＢである場合、前記第２のリガンドは４−１ＢＢＬであり、
前記第１の受容体がＢＣＭＡである場合、前記第１のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、又は前記第２の受容体がＢＣＭＡである場合、前記第２のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、
前記第１の受容体がＣＤ２７である場合、前記第１のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ２７である場合、前記第２のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、
前記第１の受容体がＣＤ３０である場合、前記第１のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ３０である場合、前記第２のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、
前記第１の受容体がＣＤ４０である場合、前記第１のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ４０である場合、前記第２のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、
前記第１の受容体がＥＤＡＲである場合、前記第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、又は前記第２の受容体がＥＤＡＲである場合、前記第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、
前記第１の受容体がＸＥＤＡＲである場合、前記第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、又は前記第２の受容体がＸＥＤＡＲである場合、前記第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、
前記第１のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、前記第１の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、前記第２の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、
前記第１のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、前記第１の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、前記第２の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、
前記第１の受容体がＴＲＯＹである場合、前記第１のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、又は前記第２の受容体がＴＲＯＹである場合、前記第２のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、
前記第１の受容体がＦａｓである場合、前記第１のリガンドはＦａｓＬであり、又は前記第２の受容体がＦａｓである場合、前記第２のリガンドはＦａｓＬであり、又は
前記第１の受容体がＧＩＴＲである場合、前記第１のリガンドはＧＩＴＬであり、又は前記第２の受容体がＧＩＴＲである場合、前記第２のリガンドはＧＩＴＬであり、
前記第１のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、前記第１の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、前記第２の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、
前記第１の受容体がＤＲ３である場合、前記第１のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、又は前記第２の受容体がＤＲ３である場合、前記第２のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、
前記第１の受容体がＦｎ１４である場合、前記第１のリガンドはＴＷＥＡＫであり、又は前記第２の受容体がＦｎ１４である場合、前記第２のリガンドはＴＷＥＡＫであり、
前記第１の受容体がＴＮＦＲ１である場合、前記第１のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、前記第２の受容体がＴＮＦＲ１である場合、前記第２のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、
前記第１の受容体がＴＮＦＲ２である場合、前記第１のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、又は前記第２の受容体がＴＮＦＲ２である場合、前記第２のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、
前記第１の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、前記第１のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、又は前記第２の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、前記第２のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、
前記第１の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、前記第１のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、前記第２のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、
前記第１の受容体がＮＧＦＲである場合、前記第１のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、又は前記第２の受容体がＮＧＦＲである場合、前記第２のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、
前記第１の受容体がＤＲ６である場合、前記第１のリガンドはＡＰＰであり、又は前記第２の受容体がＤＲ６である場合、前記第２のリガンドはＡＰＰであり、
前記第１の受容体がＲＥＬＴである場合、前記第１のリガンドはＲＥＬＴリガンドであり、又は前記第２の受容体がＲＥＬＴである場合、前記第２のリガンドはＲＥＬＴリガンドである。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
当該技術分野で公知であるシグナル変換タンパク質（ＳＣＰ：Ｓｉｇｎａｌ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）としても知られる二重シグナル伝達タンパク質（ＤＳＰ：Ｄｕａｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、Ｉ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外アミノ末端）をＩＩ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外カルボキシル末端）に連結して、２個の活性サイドを有する融合タンパク質を形成する、二官能性融合タンパク質である（例えば、その両方を本明細書に全体が記載されたかの如く参照により本明細書に援用する特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００２】
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬは、こうしたＤＳＰの非限定的一例である。ＴＲＡＩＬは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）リガンドスーパーファミリーの一員であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの幾つかの異なる同種受容体に結合し、一部は細胞内シグナル伝達経路を作動させ、一部は単におとり受容体として作用する。ヒトにおけるトリガー受容体はＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２であり、マウスにおいては唯一のトリガー受容体がＤＲ５である。免疫系の実質的に全細胞（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、単球、顆粒球）は、インターフェロン及び他の活性化シグナルに反応して、表面ＴＲＡＩＬを上方制御し、及び／又は分泌小胞に貯蔵された可溶性ＴＲＡＩＬを放出する。ＴＲＡＩＬは、幾つかの動物モデルにおいて自己免疫を阻害する。実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、ＭＳのネズミモデルを阻害するＴＲＡＩＬの能力の証拠は、ＴＲＡＩＬ−／−ノックアウトマウス、可溶性ＴＲＡＩＬ受容体（ｓＤＲ５）又はＴＲＡＩＬ機能を阻害することができる中和抗ＴＲＡＩＬｍＡｂ、及びＴＲＡＩＬと病原性ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド（ＭＯＧ：ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を同時発現する胚性幹細胞由来樹状細胞を発動する実験から得られた。興味深いことに、ＭＳ患者においては、可溶性ＴＲＡＩＬは、ＩＦＮベータ療法の反応マーカーとして出現し、処置に反応する可能性が高い患者は、療法後に早期の持続性可溶性ＴＲＡＩＬ誘導を示す。しかし、ＭＳ／ＥＡＥに対するＴＲＡＩＬの影響はより複雑かもしれず、例えば、ＴＲＡＩＬが脳細胞アポトーシスを促進する可能性が示唆される。ＴＲＡＩＬとＦａｓＬのどちらもＴ細胞の負の調節に関係している。
【０００３】
ＴＲＡＩＬは、癌細胞のアポトーシスを誘導し得ることが知られているが、そのようなものとしてそれを使用する試みにもかかわらず、有効な抗癌治療であることが示されていない（非特許文献１）。
【０００４】
線維芽細胞成長因子誘導性１４（Ｆｎ１４、ＴＮＦ様の弱いアポトーシス誘導物質受容体［ＴＷＥＡＫ−Ｒ］又はＴＮＦＲＳＦ１２Ａとしても知られる）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である。Ｆｎ１４の発現は、組織傷害、再生及び炎症に反応してインビトロ及びインビボで成長因子によって上方制御される。Ｆｎ１４の名称の１つが示唆するように、このタンパク質は、ＴＷＥＡＫと命名されたタンパク質の受容体である。Ｆｎ１４へのＴＷＥＡＫの結合、又は恒常的なＦｎ１４過剰発現は、免疫及び炎症過程、発癌並びに癌治療耐性に重要な役割を果たすことが知られているＮＦＫＢシグナル伝達経路を活性化する。この相互作用は、増殖、移動、分化、アポトーシス、血管新生及び炎症を含めて、多数の細胞活性も制御する。ＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４は、組織修復及び免疫機能調節及び腫瘍増殖及び転移にも関与する。したがって、Ｆｎ１４によって媒介されるシグナル伝達は、ヒトの疾患において重要な役割を果たす経路に関与する。Ｆｎ１４によって媒介されるシグナル伝達は、癌、転移、免疫障害（自己免疫疾患、移植片拒絶及び移植片対宿主病、並びに［発作を含めた］慢性及び急性神経症状を含む）を含めて、多数の疾患においてある役割を果たすことが示唆された。
【０００５】
Ｆｎ１４は、多数の非リンパ球様細胞型（上皮細胞、間葉細胞、内皮細胞及びニューロン）によって、間葉系のすべての前駆細胞を含めた多数の組織前駆細胞によって、発現される。このタンパク質は、例えば、組織傷害及び／又は組織修復の部位においてインビボで遭遇する血清中の、成長因子によって高度に誘導される。その結果、Ｆｎ１４の発現は、大部分の健常な組織では比較的低いが、傷害及び／又は患部組織では増加する。
【０００６】
ＴＷＥＡＫタンパク質は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーに属するサイトカインである。ＴＷＥＡＫは、主に、（主に癌で見られる）成長因子として、また、ＴＮＦとシグナル伝達機能が重なる免疫誘導物質として機能するが、特定のシナリオにおいては、複数の細胞死経路を介して細胞型特異的にアポトーシスを誘導することもでき、又は内皮細胞の増殖及び移動を促進し、したがって血管新生の制御因子として作用する。
【０００７】
ＴＷＥＡＫは、一部の細胞型（星状細胞、内皮細胞、及びある種のヒト腫瘍細胞系）の増殖を促進し、一部（赤芽球、腎細胞、メサンギウム細胞、神経細胞、ＮＫ細胞、単球）を抑制する。ＴＷＥＡＫは、種々の炎症性サイトカイン、ケモカイン及び接着分子の産生を刺激する。さらに、ＴＷＥＡＫは、神経血管ユニットの透過性を高め、その内在性発現は、ヒト疾患の多発性硬化症（ＭＳ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の確立されたモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）中のＣＮＳにおいて、及び急性脳虚血において、増加する。さらに、ＴＷＥＡＫは、血管新生促進作用を有し、これは、癌と自己免疫病因の両方と血管新生の関連性から興味深い。ＴＷＥＡＫは、動物モデルにおけるＥＡＥ重症度及び付随する神経変性を増加させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，５６９，６６３号
【特許文献２】米国特許第８，０３９，４３７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｅｍｋｅら、「Ｇｅｔｔｉｎｇ  ＴＲＡＩＬ  ｂａｃｋ  ｏｎ  ｔｒａｃｋ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１４）２１、１３５０〜１３６４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
例えば、特許文献２及び特許文献１に記載のように、融合タンパク質としてのＴＮＦファミリーリガンドとＴＮＦファミリー受容体のある種の組合せを提供することは、当該技術分野で公知である。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、第１のＴＮＦファミリーリガンド、第２のＴＮＦファミリー受容体の存在に応じて、炎症性疾患、免疫関連疾患又は癌疾患の対象に有利に投与することができる第１のＴＮＦファミリー受容体及び第２のＴＮＦファミリーリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）を含む特定の融合タンパク質を見いだした。一部の実施形態においては、第２のリガンドは第２の受容体に結合可能であり、第１の受容体は第１のリガンドに結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体又はそれらのＥＣＤはＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドは異なり、第１と第２の受容体は異なる。単一の仮説によって限定されるものではないが、融合タンパク質の活性は、場合によっては、第１のＴＮＦファミリーリガンド、第２のＴＮＦファミリー受容体又はそれらのＥＣＤによって増強することができる。こうした別の第１のＴＮＦファミリーリガンド又は第２のＴＮＦファミリー受容体も、場合によっては、安定化組成物の一部として、融合タンパク質と一緒に投与することができる。
【００１２】
「ＤＳＰ」と「融合タンパク質」という用語を本明細書では区別なく使用する。
【００１３】
本発明者らは、本明細書に記載の融合タンパク質プラス追加のＴＮＦファミリーリガンドのこの組合せを、場合によっては、以下のように選択できることを見いだした。それぞれＡ／Ｂ及びＣ／Ｄと標識された２つのＴＮＦファミリーリガンド／受容体対を考える。Ａ及びＣはリガンド又はそれらのＥＣＤであり、Ｂ及びＤは受容体又はそれらのＥＣＤである。「リガンド」及び「受容体」という用語は、これらの異なる組合せを記述するためにのみ使用され、少なくともＴＮＦファミリーに関しては、受容体を可溶性とすることができ、リガンドは細胞膜に結合できることが知られていることに留意されたい。したがって、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの各々は、場合によっては、個々に膜結合性又は可溶性とすることができる。融合タンパク質は、一部の実施形態においては、ＴＮＦファミリーリガンド及びＴＮＦファミリー受容体の各々のＥＣＤを含む。
【００１４】
受容体又はそれらのＥＣＤは互いに異なり、リガンド又はそれらのＥＣＤも互いに異なる。さらに、リガンドＡは受容体Ｄに結合せず、リガンドＣは受容体Ｂに結合しない。融合タンパク質は、場合によっては、受容体Ｂ及びリガンドＣのＥＣＤ（細胞外ドメイン）から構築することができる。少なくとも一部の実施形態によれば、この融合タンパク質を対象に有利に投与できるかどうかを判定する診断法は、したがって、例えば、それらに限定されないが、全体的に（例えば、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ：Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において）、又は局所的に、例えば、特定の患部組織若しくは器官又は患部組織若しくは器官の領域の環境を試験することによって、対象におけるリガンドＡのレベルを検出するステップを含む。
【００１５】
少なくとも一部の実施形態によれば、安定化組成物は、場合によっては、受容体Ｂ及びリガンドＣのＥＣＤ、プラス安定化量のリガンドＡ、又は受容体Ｄを含む、上記融合タンパク質を含むことができる。
【００１６】
ＴＮＦファミリーリガンド／受容体対のこうしたグループの非限定的一例は、ＴＷＥＡＫ（リガンドＡ）／Ｆｎ１４（受容体ＢのＥＣＤ）及びＴＲＡＩＬ（リガンドＣのＥＣＤ）／ＴＲＡＩＬ受容体（受容体Ｄ）である。下表１は、ＴＮＦファミリーリガンドとそれらの受容体の対を示し、それらから、第２のリガンド及び第１の受容体又はそれらのＥＣＤを融合タンパク質用に選択することができ、第１のリガンド若しくは第２の受容体又はそれらのＥＣＤは、融合タンパク質を含む組成物に添加するために、又は疾患若しくは症状の処置に使用される融合タンパク質を選択するための疾患若しくは症状におけるその存在を判定するために、選択することができ、ただし、第２のリガンドは第２の受容体に結合可能であり、第１の受容体は第１のリガンドに結合可能であり、第１と第２のリガンドは異なり、第１と第２の受容体又はそれらのＥＣＤは異なる。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
単一の仮説によって限定されるものではないが、こうした有利な処置方法及び／又は安定化組成物を以下の理由で達成し得ることが可能である。受容体Ｂ及びリガンドＣを含む融合タンパク質（例えば、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）は、リガンドＣ（ＴＲＡＩＬ）の三量体形成のために、三量体形成すると予想される。投与後、及び／又は安定化組成物の一部として、及び／又は対象の患部組織若しくは器官中に既に存在して、又は患部器官若しくは組織の環境において、リガンドＡ（ＴＷＥＡＫ）も三量体形成し、３種の三量体形成融合タンパク質の受容体Ｂ（Ｆｎ１４のＥＣＤ）に結合する。図１６Ａ〜１６Ｃは、こうした三量体形成の説明のための非限定的一例を示し、オリゴマー化も示す。これらの「三量体の三量体」はクラスターを形成する。また、単一の仮説によって限定されるものではないが、こうしたクラスターは、リガンドＡ（ＴＷＥＡＫ）の活性を阻害し、リガンドＣ（ＴＲＡＩＬ）の三量体のクラスターを形成し、それによってＴＲＡＩＬ活性を増強すると予想される。これは図１６Ｃに例示されており、（Ａ）が患部組織若しくは器官又はそれらの環境において正常器官又は組織よりも多量に存在する場合、（Ａ）＋（ＢＣ）のクラスターは、（Ａ）濃度が高い場所、例えば、体内で形成される可能性があり、クラスターは、（Ａ）の活性を阻害し、（Ｃ）リガンドのクラスター形成を介して、又は（Ｄ）受容体とのそれらの結合を強化するように（Ｃ）リガンドを位置決めすることによって、細胞膜上の（Ｄ）受容体の活性を誘導する。
【００１９】
したがって、一部の実施形態においては、融合タンパク質及び第１のリガンドを含む複合体を提供する。融合タンパク質は第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドは第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドは第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体はＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドは異なり、第１と第２の受容体は異なる。場合によっては、少なくとも一部の実施形態によれば、それに加えて、又はその代わりに、受容体「Ｂ」及びリガンド「Ｃ」のＥＣＤを備える上記融合タンパク質を対象に投与するかどうかを決定するために、リガンド「Ａ」及び／又は受容体「Ｄ」の存在を検出する診断法を提供することができる。
【００２０】
本発明の一部の実施形態においては、本発明の実施形態に係る受容体「Ｂ」及びリガンド「Ｃ」のＥＣＤを含む融合タンパク質は、患部器官、組織において、又はそれらの環境において、又はこうした疾患若しくは症状を有する対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において測定して、検出可能な又は高レベルのリガンド「Ａ」及び／又は受容体「Ｄ」に関連する疾患又は症状を有する対象に投与される。「検出可能な」という用語は、同じ組織、器官において、又はそれらの環境において、又は血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿において、又は任意の他の体液若しくは排出物において、リガンド「Ａ」及び／又は受容体「Ｄ」の存在を検出できない健常者と比較されるものである。「高レベル」という用語も、リガンド「Ａ」及び／又は受容体「Ｄ」のレベルが、同じ組織、器官において、又はそれらの環境において、又は血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿において、又は任意の他の体液若しくは排出物において検出されるレベルよりも少なくとも２０％低い健常者と比較されるものである。
【００２１】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における融合タンパク質の治療効果を高めるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドを含む安定化組成物を提供する。融合タンパク質は第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドは第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドは第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体はＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドは異なり、第１と第２の受容体は異なる。
【００２２】
この例においては、融合タンパク質は、受容体「Ｂ」（第１の受容体）及び第２のリガンド（リガンド「Ｃ」）のＥＣＤを含み、組成物は、更に第１のリガンド（リガンド「Ａ」）を含む。
【００２３】
場合によっては、治療効果の向上は、非限定的一例として、対象における融合タンパク質の半減期の増加を含む。
【００２４】
少なくとも一部の実施形態によれば、（融合タンパク質を含み第１のリガンドのない組成物の移動時間に比べて）天然ＰＡＧＥゲルにおける融合タンパク質の移動時間を増加させるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドを含む安定化組成物を提供する。融合タンパク質は第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドは第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドは第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体はＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドは異なり、第１と第２の受容体は異なる。
【００２５】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における疾患を処置する方法であって、患部器官、組織において、又はそれらの環境において、又は対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において、第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能である第１のリガンドのレベル又は存在を決定するステップ、及び／又は対象の患部器官、組織において、又はそれらの環境において、又は血液若しくは尿において、第２のＴＮＦファミリーリガンドに結合可能である第２の受容体のレベル又は存在を決定するステップ、第１のリガンドのレベルがベースラインレベルを超える場合、又は第１のリガンド若しくは第２の受容体が、健常者の同じ組織、器官に、又はそれらの環境に、血液若しくは尿に、存在しない場合、疾患を処置するために融合タンパク質を対象に投与するステップを含む方法を提供する。融合タンパク質は第１の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、融合タンパク質は更に第２のＴＮＦファミリーリガンドのＥＣＤを含み、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第１の受容体に結合できないが、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、疾患は第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である。
【００２６】
「ベースラインレベル」とは、場合によっては最小レベルを意味し、それは、場合によっては、ゼロを超える任意のレベルであり得る。
【００２７】
場合によっては、本明細書に記載のいずれの組成物も上記処置方法の１つによって投与することができる。
【００２８】
場合によっては、方法は、更に、対象において第２のＴＮＦファミリーリガンドが結合可能である第２のＴＮＦファミリー受容体の存在を検出するステップ、及び存在する場合、融合タンパク質を投与するステップを含む。
【００２９】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における疾患を処置する方法であって、患部器官、組織において、又はそれらの環境において、又はこうした疾患若しくは症状を有する対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において測定して、検出可能な又は高レベルのリガンド「Ａ」及び／又は受容体「Ｄ」に関連する疾患を有する対象に融合タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。融合タンパク質は第１の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、融合タンパク質は更に第２のＴＮＦファミリーリガンドを含み、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第１の受容体に結合できないが、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、疾患は第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である。
【００３０】
例えば、疾患が、高レベルに関連する場合、又は患部組織、器官において、若しくはそれらの環境において、ＴＷＥＡＫの存在を特徴とする場合、（Ｆｎ１４として）ＴＷＥＡＫの受容体又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質を使用する。非限定的一例においては、融合タンパク質はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬである。
【００３１】
「Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質」とは、共有結合した本明細書に記載のＦｎ１４ドメインとＴＲＡＩＬドメインを備える２成分タンパク質を意味する。この融合タンパク質を本明細書では「Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ」とも称する。場合によっては、好ましくは、２成分タンパク質は、Ｆｎ１４の細胞外ドメイン及びＴＲＡＩＬの細胞外ドメインを含む。場合によっては、２成分タンパク質は、Ｆｎ１４の細胞外ドメインであるＮ末端側、及びＴＲＡＩＬの細胞外ドメインで構成されるＣ末端側を有する。
【００３２】
ＴＷＥＡＫが健常者と比較して存在し、又は高く、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置可能である疾患の非限定的例は、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ：ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸腺癌、肝細胞癌、腎癌、胃癌、乳癌、扁平上皮癌、食道癌、膵癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、神経膠腫、頭頚部癌、肝癌、黒色腫、前立腺癌、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、転移性神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、星細胞腫若しくは星状細胞脳腫瘍、肺癌、膵臓腺癌、卵巣嚢胞腺癌、頚部扁平上皮癌、前立腺腺癌、扁平上皮癌、角化細胞癌、転移性悪性黒色腫、骨肉腫、又は転移性絨毛癌である。
【００３３】
本発明の一部の実施形態においては、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置される疾患は、脂漏性角化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、ループス腎炎、関節リウマチ（ＲＡ：Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎及びクローン病としての炎症性腸疾患（ＩＢＤ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、蕁麻疹様血管炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症、又は急性虚血性脳卒中である。
【００３４】
本発明の一部の実施形態においては、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置される疾患は、脂漏性角化、潰瘍性大腸炎及びクローン病としての炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症、若しくは任意の他の状態（例えば、高血圧、放射線、鎌状赤血球症など）に起因する網膜症、又は急性虚血性脳卒中である。
【００３５】
本発明の一部の実施形態においては、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置される疾患は、精巣癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、角化細胞癌又は骨肉腫である。
【００３６】
上述したように、表１にリガンド−受容体対のリストを示した。こうしたリガンド−受容体は、場合によっては、第１のリガンド／受容体対（すなわち、リガンドＡと受容体Ｂ）又は（リガンドＣと受容体Ｄである）第２のリガンド／受容体対とすることができる。ただし、リガンドＡとリガンドＣは異なり、受容体Ｂと受容体Ｄは異なる。
【００３７】
場合によっては、第１の受容体が４−１ＢＢである場合、第１のリガンドは４−１ＢＢＬであり、又は第２の受容体が４−１ＢＢである場合、第２のリガンドは４−１ＢＢＬである。
【００３８】
場合によっては、第１の受容体がＢＣＭＡである場合、第１のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、又は第２の受容体がＢＣＭＡである場合、第２のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦである。
【００３９】
場合によっては、第１の受容体がＣＤ２７である場合、第１のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、又は第２の受容体がＣＤ２７である場合、第２のリガンドはＣＤ２７Ｌである。
【００４０】
場合によっては、第１の受容体がＣＤ３０である場合、第１のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、又は第２の受容体がＣＤ３０である場合、第２のリガンドはＣＤ３０Ｌである。
【００４１】
場合によっては、第１の受容体がＣＤ４０である場合、第１のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、又は第２の受容体がＣＤ４０である場合、第２のリガンドはＣＤ４０Ｌである。
【００４２】
場合によっては、第１の受容体がＥＤＡＲである場合、第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、又は第２の受容体がＥＤＡＲである場合、第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ１である。
【００４３】
場合によっては、第１の受容体がＸＥＤＡＲである場合、第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、又は第２の受容体がＸＥＤＡＲである場合、第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ２である。
【００４４】
場合によっては、第１のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、第１の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、又は第２のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、第２の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択される。
【００４５】
場合によっては、第１のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、第１の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、又は第２のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、第２の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択される。
【００４６】
場合によっては、第１の受容体がＴＲＯＹである場合、第１のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、又は第２の受容体がＴＲＯＹである場合、第２のリガンドはＴＲＯＹリガンドである。
【００４７】
場合によっては、第１の受容体がＦａｓである場合、第１のリガンドはＦａｓＬであり、又は第２の受容体がＦａｓである場合、第２のリガンドはＦａｓＬである。
【００４８】
場合によっては、第１の受容体がＧＩＴＲである場合、第１のリガンドはＧＩＴＬであり、又は第２の受容体がＧＩＴＲである場合、第２のリガンドはＧＩＴＬである。
【００４９】
場合によっては、第１のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、第１の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、又は第２のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、第２の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択される。
【００５０】
場合によっては、第１の受容体がＤＲ３である場合、第１のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、又は第２の受容体がＤＲ３である場合、第２のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩである。
【００５１】
場合によっては、第１の受容体がＦｎ１４である場合、第１のリガンドはＴＷＥＡＫであり、又は第２の受容体がＦｎ１４である場合、第２のリガンドはＴＷＥＡＫである。
【００５２】
場合によっては、第１の受容体がＴＮＦＲ１である場合、第１のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、第２の受容体がＴＮＦＲ１である場合、第２のリガンドはＴＮＦ−アルファである。
【００５３】
場合によっては、第１の受容体がＴＮＦＲ２である場合、第１のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、又は第２の受容体がＴＮＦＲ２である場合、第２のリガンドはＴＮＦ−ベータである。
【００５４】
場合によっては、第１の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、第１のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、又は第２の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、第２のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択される。
【００５５】
場合によっては、第１の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、第１のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、又は第２の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、第２のリガンドはＯＸ４０Ｌである。
【００５６】
場合によっては、第１の受容体がＮＧＦＲである場合、第１のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、又は第２の受容体がＮＧＦＲである場合、第２のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択される。
【００５７】
場合によっては、第１の受容体がＤＲ６である場合、第１のリガンドはＡＰＰであり、又は第２の受容体がＤＲ６である場合、第２のリガンドはＡＰＰである。
【００５８】
場合によっては、第１の受容体がＲＥＬＴである場合、第１のリガンドはＲＥＬＴリガンドであり、又は第２の受容体がＲＥＬＴである場合、第２のリガンドはＲＥＬＴリガンドである。
【００５９】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における融合タンパク質の治療効果を高めるのに十分な比の融合タンパク質とリガンドＡを含む安定化組成物を提供する。融合タンパク質は、受容体Ｂの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びリガンドＣのＥＣＤを含み、リガンドＣは受容体Ｄに結合可能であり、リガンドＡは受容体Ｂに結合可能であり、リガンドＡ及びＣ並びに受容体Ｂ及びＤはＴＮＦファミリーメンバーであり、リガンドＡとＣは異なり、受容体ＢとＤは異なる。
【００６０】
場合によっては、治療効果の向上は、対象における融合タンパク質の半減期の増加を含む。
【００６１】
少なくとも一部の実施形態によれば、天然ＰＡＧＥゲルにおける融合タンパク質の移動時間を増加させるのに十分な比の融合タンパク質とリガンドＡを含む安定化組成物を提供する。融合タンパク質は、受容体Ｂ及びリガンドＣの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、リガンドＣは受容体Ｄに結合可能であり、リガンドＡは受容体Ｂに結合可能であり、リガンドＡ及びＣ並びに受容体Ｂ及びＤはＴＮＦファミリーメンバーであり、リガンドＡとＣは異なり、受容体ＢとＤは異なる。
【００６２】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における疾患を処置する方法であって、対象においてＴＮＦファミリー受容体Ｂに結合可能であるリガンドＡのレベルを決定するステップ、リガンドＡのレベルがベースラインレベルを超える場合、疾患を処置するために融合タンパク質を対象に投与するステップを含む方法を提供する。融合タンパク質は受容体Ｂの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、融合タンパク質は更にＴＮＦファミリーリガンドＣを含み、リガンドＣは受容体Ｂに結合できないが、リガンドＣはＴＮＦファミリー受容体Ｄに結合可能であり、疾患は、受容体Ｄを活性化することによって処置可能である。
【００６３】
場合によっては、方法は、更に、請求項３２から３４のいずれかの組成物を投与するステップを含む。
【００６４】
場合によっては、方法は、更に、対象においてリガンドＣが結合可能であるＴＮＦファミリー受容体Ｄのレベルを検出するステップ、及び対象において受容体Ｄのレベルを検出した後にのみ融合タンパク質を投与するステップを含む。
【００６５】
場合によっては、受容体Ｂが４−１ＢＢである場合、リガンドＡは４−１ＢＢＬであり、又は受容体Ｄが４−１ＢＢである場合、リガンドＣは４−１ＢＢＬである。
【００６６】
場合によっては、受容体ＢがＢＣＭＡである場合、リガンドＡはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、又は受容体ＤがＢＣＭＡである場合、リガンドＣはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦである。
【００６７】
場合によっては、受容体ＢがＣＤ２７である場合、リガンドＡはＣＤ２７Ｌであり、又は受容体ＤがＣＤ２７である場合、リガンドＣはＣＤ２７Ｌである。
【００６８】
場合によっては、受容体ＢがＣＤ３０である場合、リガンドＡはＣＤ３０Ｌであり、又は受容体ＤがＣＤ３０である場合、リガンドＣはＣＤ３０Ｌである。
【００６９】
場合によっては、受容体ＢがＣＤ４０である場合、リガンドＡはＣＤ４０Ｌであり、又は受容体ＤがＣＤ４０である場合、リガンドＣはＣＤ４０Ｌである。
【００７０】
場合によっては、受容体ＢがＥＤＡＲである場合、リガンドＡはＥＤＡ−Ａ１であり、又は受容体ＤがＥＤＡＲである場合、リガンドＣはＥＤＡ−Ａ１である。
【００７１】
場合によっては、受容体ＢがＸＥＤＡＲである場合、リガンドＡはＥＤＡ−Ａ２であり、又は受容体ＤがＸＥＤＡＲである場合、リガンドＣはＥＤＡ−Ａ２である。
【００７２】
場合によっては、リガンドＡがＴＲＡＩＬである場合、受容体Ｂは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、又はリガンドＣがＴＲＡＩＬである場合、受容体Ｄは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択される。
【００７３】
場合によっては、リガンドＡがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、受容体Ｂは、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、又はリガンドＣがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、受容体Ｄは、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択される。
【００７４】
場合によっては、受容体ＢがＴＲＯＹである場合、リガンドＡはＴＲＯＹリガンドであり、又は受容体ＤがＴＲＯＹである場合、リガンドＣはＴＲＯＹリガンドである。
【００７５】
場合によっては、受容体ＢがＦａｓである場合、リガンドＡはＦａｓＬであり、又は受容体ＤがＦａｓである場合、リガンドＣはＦａｓＬである。
【００７６】
場合によっては、受容体ＢがＧＩＴＲである場合、リガンドＡはＧＩＴＬであり、又は受容体ＤがＧＩＴＲである場合、リガンドＣはＧＩＴＬである。
【００７７】
場合によっては、リガンドＡがＬＩＧＨＴである場合、受容体Ｂは、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、又はリガンドＣがＬＩＧＨＴである場合、受容体Ｄは、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択される。
【００７８】
場合によっては、受容体ＢがＤＲ３である場合、リガンドＡはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、又は受容体ＤがＤＲ３である場合、リガンドＣはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩである。
【００７９】
場合によっては、受容体ＢがＦｎ１４である場合、リガンドＡはＴＷＥＡＫであり、又は受容体ＤがＦｎ１４である場合、リガンドＣはＴＷＥＡＫである。
【００８０】
場合によっては、受容体ＢがＴＮＦＲ１である場合、リガンドＡはＴＮＦ−アルファであり、受容体ＤがＴＮＦＲ１である場合、リガンドＣはＴＮＦ−アルファである。
【００８１】
場合によっては、受容体ＢがＴＮＦＲ２である場合、リガンドＡはＴＮＦ−ベータであり、又は受容体ＤがＴＮＦＲ２である場合、リガンドＣはＴＮＦ−ベータである。
【００８２】
場合によっては、第１の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、第１のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、又は第２の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、第２のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択される。
【００８３】
場合によっては、受容体ＢがＯＸ４０Ｒである場合、リガンドＡはＯＸ４０Ｌであり、又は受容体ＤがＯＸ４０Ｒである場合、リガンドＣはＯＸ４０Ｌである。
【００８４】
場合によっては、受容体ＢがＮＧＦＲである場合、リガンドＡは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、又は受容体ＤがＮＧＦＲである場合、リガンドＣは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択される。
【００８５】
場合によっては、受容体ＢがＤＲ６である場合、リガンドＡはＡＰＰであり、又は受容体ＤがＤＲ６である場合、リガンドＣはＡＰＰである。
【００８６】
場合によっては、受容体ＢがＲＥＬＴである場合、リガンドＡはＲＥＬＴリガンドであり、又は受容体ＤがＲＥＬＴである場合、リガンドＣはＲＥＬＴリガンドである。
【００８７】
場合によっては、受容体Ｄ及びリガンドＣは、受容体Ｄが受容体Ｂとは異なり、リガンドＣがリガンドＡとは異なるように、ＴＮＦファミリーメンバーから選択される。
【００８８】
場合によっては、上記組成物又は方法のいずれかを癌の処置に適合させることができ、癌は、乳癌、結腸直腸癌、血液癌、膵癌、軟部組織肉腫、頚部癌、脳癌、脳脊髄癌、膀胱癌、肝癌、皮膚癌及び肺癌からなる群から選択される。
【００８９】
場合によっては、少なくとも一部の実施形態によれば、癌は、乳癌、子宮頚癌、卵巣癌、子宮体癌、膀胱癌、肺癌、膵癌、結腸癌、前立腺癌、白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、甲状腺濾胞癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ：ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、線維肉腫及び横紋筋肉腫、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、グリア芽細胞腫、皮膚の良性腫瘍、角化きょく細胞腫、腎癌、未分化大細胞型リンパ腫、食道扁平上皮癌、濾胞樹状細胞腫、腸癌、筋層浸潤癌、精嚢腫瘍、表皮癌、脾臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、胃癌、肝癌、骨癌、脳腫瘍、網膜の癌、胆道癌、唾液腺癌、子宮の癌、精巣の癌、結合組織の癌、前立腺肥大症、骨髄異形成症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、鼻咽腔癌、神経内分泌癌、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃癌、ファロピウス管癌、腹膜癌、乳頭状漿液性ミュラー管癌、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ：ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｔｕｍｏｒ）、リ・フラウメニ症候群及びフォンヒッペル・リンダウ症候群（ＶＨＬ：Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）からなる群から選択され、癌は非転移性、浸潤性又は転移性である。
【００９０】
場合によっては、白血病は、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病又は骨髄性白血病であり、及び／又は肝癌は肝細胞癌であり、及び／又は腸癌は小腸癌である。
【００９１】
場合によっては、骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ：ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）又は慢性骨髄性白血病である。
【００９２】
場合によっては、上記組成物又は方法のいずれかを炎症又は免疫に関連する症状の処置、例えば、自己免疫疾患の処置に適合させることができる。
【００９３】
場合によっては、自己免疫疾患は、関節リウマチ、血液学的自己免疫疾患、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＮＣＡは、抗好中球細胞質抗体（ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を意味する）及び自己免疫性甲状腺炎からなる群から選択される。
【００９４】
少なくとも一部の実施形態によれば、場合によっては、自己免疫疾患は、再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症及び二次性進行型多発性硬化症を含めた多発性硬化症；関節リウマチ；乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、（ＳＬＥ）；ループス腎炎；潰瘍性大腸炎；クローン病；良性リンパ球性血管炎、血小板減少性紫斑病、特発性血小板減少症、特発性自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患、結合組織病、炎症性リウマチ、変形性リウマチ、関節外リウマチ、若年性関節リウマチ、尿酸塩関節炎、筋肉リウマチ、慢性多発性関節炎、クリオグロブリン血症性血管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、抗リン脂質抗体症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、ギラン・バレー症候群、慢性免疫多発性神経障害、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病、アジソン病、膜性糸球体腎症、限局性分節性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、線維性（Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ）、イムノタクトイド糸球体腎炎、抗ＧＢＭ（グッドパスチャー病を含めて、ただしそれらに限定されない）、自己免疫性胃炎、自己免疫性萎縮性胃炎、悪性貧血、天疱瘡、尋常性天疱瘡、硬変、原発性胆汁性肝硬変、皮膚筋炎、多発性筋炎、線維筋炎、筋硬症、セリアック病、免疫グロブリンＡ腎症、Ｃ３腎症、免疫複合体糸球体腎炎、へノッホ・シェーンライン紫斑病、エバンス症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、グレーブス病、グレーブス眼症、強皮症、全身性強皮症、進行性全身性強皮症、喘息、アレルギー、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、肝炎、慢性作用肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、膠原病、強直性脊椎炎、上腕肩甲関節周囲炎、汎動脈炎（ｐａｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｎｏｄｏｓａ）、軟骨石灰化、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発性血管炎、慢性蕁麻疹、水疱性皮膚障害、類天疱瘡、アトピー性湿疹、デビック病、小児期自己免疫性溶血性貧血、難治性又は慢性自己免疫性血球減少症、後天性血友病Ａにおける自己免疫性抗第ＶＩＩＩ因子抗体の発生防止、寒冷凝集素症、視神経脊髄炎、全身硬直症候群、歯肉炎、歯根膜炎、膵炎、心筋炎、血管炎、胃炎、痛風性関節炎、並びに乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、酒さ、蕁麻疹及びざ瘡からなる群から選択される炎症性皮膚障害、正補体血症性蕁麻疹様血管炎、心膜炎、筋炎、抗合成酵素抗体症候群、強膜炎、マクロファージ活性化症候群、ベーチェット症候群、ＰＡＰＡ症候群、ブラウ症候群、痛風、成人及び若年性スティル病、クリオピリン関連周期性症候群（ｃｒｙｒｏｐｙｒｉｎｏｐａｔｈｙ）、マックル・ウェルズ症候群、家族性低温誘導性自己炎症性症候群、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、家族性地中海熱、慢性乳児性神経性、皮膚性及び関節症候群、全身型若年性特発性関節炎、高ＩｇＤ症候群、シュニッツラー症候群、自己免疫性網膜症、加齢黄斑変性症、アテローム性動脈硬化症、慢性前立腺炎、並びにＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ：ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）からなる群から選択される。
【００９５】
他の疾患は、脂漏性角化、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、蕁麻疹様血管炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症又は急性虚血性脳卒中である。
【００９６】
下表の表２は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンド／受容体と種々の疾患の幾つかの例示的な非限定的関係に関する。
【００９７】
【表２−１】
2018510214.tif 000004
【００９８】
【表２−２】
2018510214.tif 000005
【００９９】
【表２−３】
2018510214.tif 000006
【０１００】
【表２−４】
2018510214.tif 000007
【０１０１】
【表２−５】
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【０１０２】
【表２−６】
2018510214.tif 000009
【０１０３】
【表２−７】
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【０１０４】
【表２−８】
2018510214.tif 000011
【０１０５】
【表２−９】
2018510214.tif 000012
【０１０６】
少なくとも一部の実施形態によれば、アポトーシスを誘導する薬学的に有効な量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質及びＴＷＥＡＫを含む組成物を提供する。
【０１０７】
場合によっては、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の量は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質を投与する対象の体重１ｋｇ当たりＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質０．００１ｍｇ〜２０ｍｇである。
【０１０８】
場合によっては、量は、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜５ｍｇである。
【０１０９】
場合によっては、ＴＷＥＡＫタンパク質の量は、ＴＷＥＡＫタンパク質を投与する対象の体重１ｋｇ当たりＴＷＥＡＫタンパク質０．００１ｍｇ〜２０ｍｇである。
【０１１０】
場合によっては、量は０．１ｍｇ〜５ｍｇである。
【０１１１】
場合によっては、ＴＷＥＡＫタンパク質は、更に半減期延長部分を含む。ただし、半減期延長部分が、ＴＷＥＡＫタンパク質を含む三量体の形成に影響しないことを条件とする。
【０１１２】
場合によっては、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、ＸＴＥＮ分子、ｒＰＥＧ分子、アドネクチン、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、アシル基又は異種ペプチドを含む。
【０１１３】
場合によっては、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、更に半減期延長部分を含む。
【０１１４】
場合によっては、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又はＸＴＥＮ分子を含む。
【０１１５】
場合によっては、半減期延長部分の付加は、融合タンパク質及び／又はＴＷＥＡＫの生体内半減期を、こうした半減期延長部分のない同一分子に比べて少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又はそれ以上増加させる。
【０１１６】
場合によっては、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質とＴＷＥＡＫタンパク質の比は５０：１〜１：５０である。
【０１１７】
場合によっては、比は２０：１〜１：２０である。
【０１１８】
場合によっては、比は１０：１〜１：１０である。
【０１１９】
場合によっては、比は５：１〜１：５である。
【０１２０】
場合によっては、比は２：１〜１：２である。
【０１２１】
少なくとも一部の実施形態によれば、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質とＴＷＥＡＫタンパク質を５０：１〜１：５０の比で含む組成物を提供する。
【０１２２】
場合によっては、比は２０：１〜１：２０である。
【０１２３】
場合によっては、比は１０：１〜１：１０である。
【０１２４】
場合によっては、比は５：１〜１：５である。
【０１２５】
場合によっては、比は２：１〜１：２である。
【０１２６】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象におけるＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の半減期を増加させるのに十分な比のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質とＴＷＥＡＫタンパク質を含む安定化組成物を提供する。
【０１２７】
場合によっては、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質とＴＷＥＡＫタンパク質の比は５０：１〜１：５０である。
【０１２８】
場合によっては、比は２０：１〜１：２０である。
【０１２９】
場合によっては、比は１０：１〜１：１０である。
【０１３０】
場合によっては、比は５：１〜１：５である。
【０１３１】
場合によっては、比は２：１〜１：２である。
【０１３２】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における癌を処置する方法であって、本発明の実施形態に係るＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。癌は、ＴＲＡＩＬ経路を活性化することによって処置することができる任意の癌からなる群から選択され、ＴＷＥＡＫは、患部器官、組織において、又はそれらの環境において、又は癌を有する対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において、健常者と比較して検出することができ、又はそのレベルが高い。
【０１３３】
一部の実施形態によれば、癌は、精巣癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、角化細胞癌又は骨肉腫である。
【０１３４】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象における自己免疫疾患を処置する方法であって、上記請求項のいずれかの組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。自己免疫疾患は、ＴＲＡＩＬ経路を活性化することによって処置することができる任意の自己免疫疾患からなる群から選択される。
【０１３５】
少なくとも一部の実施形態によれば、対象におけるＴＲＡＩＬ受容体を活性化することによって処置可能な疾患を処置する方法であって、疾患に関連した細胞をＴＷＥＡＫの存在について試験し、ＴＷＥＡＫを検出した場合に、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１３６】
場合によっては、ＴＷＥＡＫは、局所的疾患部位で検出される。
【０１３７】
場合によっては、ＴＷＥＡＫは、局所的疾患部位において十分高いレベルで存在する。
【０１３８】
本発明の少なくとも一部の実施形態によれば、成分１タンパク質はＩ型膜タンパク質であり、成分２タンパク質はＩＩ型膜タンパク質である。場合によっては、好ましくは、こうした実施形態では、２成分タンパク質は、Ｉ型膜タンパク質の細胞外ドメイン及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含む。場合によっては、より好ましくは、２成分タンパク質は、Ｉ型膜タンパク質の細胞外ドメインであるＮ末端側、及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインで構成されるＣ末端側を有する。場合によっては、より好ましくは、Ｉ型膜タンパク質はＴＮＦスーパーファミリー受容体であり、ＩＩ型膜タンパク質はＴＮＦスーパーファミリーリガンドである。場合によっては、より好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリー受容体は、上記実施形態においては「Ｂ」と命名され、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、上記実施形態においては「Ｃ」と命名される。
【０１３９】
「ＴＷＥＡＫに関係する症状」又は「ＴＷＥＡＫに関連する疾患」又は「ＴＷＥＡＫに関連する症状」は、異常なＴＷＥＡＫ機能又は調節に起因する任意の症状を区別なく指す。この用語は、異常なＴＷＥＡＫ機能又は調節に直接起因しないが、ＴＷＥＡＫ活性の混乱、増加又は変化が症状に対して検出可能な結果をもたらすある別の機序から生じる任意の症状も指し得る。ＴＷＥＡＫに関係する症状は、本質的に炎症性でも非炎症性でもよく、癌及び自己免疫疾患並びに本明細書に記載の他の疾患を含めて、ただしそれらに限定されない、本明細書に具体的に開示した症状及び疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４０】
本明細書では「融合タンパク質」という用語は、２種以上のタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。一般に、融合タンパク質は、当該技術分野で周知であるインビトロリコンビナトリー技術に由来する。
【０１４１】
本明細書では「生物学的に活性又は免疫学的に活性」とは、本発明の融合タンパク質の構成要素である個々の野生型タンパク質と類似の構造機能（ただし、必ずしも同じ程度ではない）、及び／又は類似の調節機能（ただし、必ずしも同じ程度ではない）、及び／又は類似の生化学的機能（ただし、必ずしも同じ程度ではない）、及び／又は免疫学的活性（ただし、必ずしも同じ程度ではない）を有する本発明に係る融合タンパク質を指す。
【０１４２】
本明細書では「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が野生型タンパク質と比較して欠けているアミノ酸配列の変化と定義される。
【０１４３】
本明細書では「挿入」又は「付加」は、野生型タンパク質と比較して１個以上のアミノ酸残基の付加をもたらすアミノ酸配列の変化である。
【０１４４】
本明細書では「置換」は、野生型タンパク質と比較して、それぞれ、異なるアミノ酸による１個以上のアミノ酸の交換によって生じる。
【０１４５】
本明細書では「変異体」という用語は、野生型タンパク質と比較して、対立遺伝子変異を含めた配列（又はこれらの任意の組合せ）からの、又は該配列への、１個（以上）のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する任意のポリペプチドを意味する。ただし、得られる変異体融合タンパク質は、本発明に使用される野生型タンパク質と比較して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の生物学的又は免疫学的活性を保持する。一般に、本発明に包含されるＦｎ１４／ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の変異体は、配列番号１と少なくとも８０％以上の配列同一性又は相同性を有し、より好ましくは配列番号１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、更には９９％の配列同一性を有する。配列同一性又は相同性という用語は、当該技術分野において理解される通りである。
【０１４６】
配列同一性又は相同性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４）によって記述されたＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、又はＢＬＡＳＴＸプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０）などの当該技術分野で公知の標準技術を用いて求めることができる。アラインメントは、整列させる配列におけるギャップの導入を含むことができる。さらに、本明細書に開示したタンパク質よりも多い又は少ないアミノ酸を含む配列の場合、相同性の割合は、アミノ酸の総数に対する相同アミノ酸の数に基づいて求められると理解される。
【０１４７】
さらに、一般に、変異体は、所与の分子への高い結合能力を示すことが望ましいが、一部の実施形態においては、例えば、意図的に活性を弱めて、例えば、神経毒性を減少させたい場合に、本発明の他の融合タンパク質よりもわずかに低い活性で変異体を設計することもできる。さらに、ＴＲＡＩＬ受容体変異体（ヒトには５種のＴＲＡＩＬ受容体があり、２種は活性化受容体、３種はおとり受容体である）の１つにより選択的に結合する変異体又は誘導体を生成することができる。さらに、多量体化特性が変化した変異体又は誘導体を生成することもできる。変異体を操作するときには、ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン全体に対して、又は融合タンパク質内にそれ自体が取り込まれた細胞外ドメインの成分に対して、それを行うことができる。
【０１４８】
好ましくは、本発明の融合タンパク質の変異体又は誘導体は、アミノ酸配列の疎水性／親水性を維持する。保存的アミノ酸置換は、修飾された配列が本発明に係る融合タンパク質として作用する能力を保持するという条件で、例えば、１、２又は３から１０、２０又は３０個を置換することができる。アミノ酸置換は、例えば、血漿中半減期を延長するために、非天然の類似体の使用を含むことができる。
【０１４９】
本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、疾患が、患部組織若しくは器官において、又は環境において、又は対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において測定して、健常者と比較した第１のＴＮＦファミリーリガンドの存在又は高レベルに関連し、方法が、疾患を処置するため融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、融合タンパク質が第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、融合タンパク質が更に第２のＴＮＦファミリーリガンドを含み、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第１の受容体に結合できないが、第１のＴＮＦファミリーリガンドは第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、それによって対象における疾患を処置する、方法に関する。
【０１５０】
本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、疾患を処置するための融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、融合タンパク質が第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、融合タンパク質が更に第２のＴＮＦファミリーリガンドを含み、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第１の受容体に結合できないが、第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、疾患が、第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である、方法に関する。
【０１５１】
本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、対象において第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能である第１のＴＮＦファミリーリガンドの存在又はレベルを決定するステップ、前記第１のリガンドの前記レベルがベースラインレベルを超える場合、疾患を処置するための融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、融合タンパク質が前記第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記融合タンパク質が更に第２のＴＮＦファミリーリガンドを含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、前記疾患が、前記第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である、方法に関する。
【０１５２】
本発明は、対象における融合タンパク質の治療効果を高めるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドを含む安定化組成物であって、融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドが第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドが異なり、第１と第２の受容体が異なる、安定化組成物に関する。
【０１５３】
本発明は、天然ＰＡＧＥゲルにおける融合タンパク質の移動時間を増加させるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドを含む安定化組成物であって、融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドが第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドが異なり、第１と第２の受容体が異なる、安定化組成物に関する。
【０１５４】
本発明は、アポトーシスを誘導する薬学的に有効な量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質及びＴＷＥＡＫを含む組成物に関する。
【０１５５】
本発明は、融合タンパク質及び第１のリガンドを含む複合体であって、融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、第１のリガンドが第１の受容体に結合可能であり、第１及び第２のリガンド並びに第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、第１と第２のリガンドが異なり、第１と第２の受容体が異なる、複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１Ａ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）によるアポトーシスに対する白血病細胞の感受性は、ＴＷＥＡＫの存在下で増加する。４種のリンパ芽球系（Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ、Ｄａｕｄｙ及びＲａｊｉ）の細胞（０．５＊１０６／ｍＬ）を２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（「ＦＴ」）融合タンパク質と一緒に２４時間インビトロで培養し、未処理対象に対するアポトーシス細胞の割合をフローサイトメトリーによって試験した。
【図１Ｂ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）によるアポトーシスに対する白血病細胞の感受性は、ＴＷＥＡＫの存在下で増加する。４種のリンパ芽球系（Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ、Ｄａｕｄｙ及びＲａｊｉ）の細胞（０．５＊１０６／ｍＬ）を２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬと一緒に２４時間インビトロで培養し、未処理対象に対するアポトーシス細胞の割合をフローサイトメトリーによって試験した。
【図１Ｃ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）によるアポトーシスに対する白血病細胞の感受性は、ＴＷＥＡＫの存在下で増加する。未処理対象に対するアポトーシス細胞の割合を試験する前に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を２５０ｎｇ／ｍＬのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４、ＴＲＡＩＬ、又はＦｎ１４とＴＲＡＩＬの組合せと一緒に２４時間インビトロで培養した。
【図１Ｄ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）によるアポトーシスに対する白血病細胞の感受性は、ＴＷＥＡＫの存在下で増加する。１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫ、又は１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫと２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ若しくは５００ｎｇ／ｍＬ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬの組合せを含む培地中で２４時間インビトロでインキュベートされた４種のリンパ芽球様細胞系において、未処理対象に対するアポトーシス細胞の割合をフローサイトメトリーによって検出した。バーは、３つ組実験の平均±ＳＥである（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ）。
【図１Ｅ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）によるアポトーシスに対する白血病細胞の感受性は、ＴＷＥＡＫの存在下で増加する。Ｊｕｒｋａｔ細胞において２５０ｎｇ／ｍＬ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ  ＴＲＡＩＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬと１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫの組合せ、又は２５０ｎｇ／ｍＬ  ＴＲＡＩＬと１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫの組合せと一緒に２４時間インキュベーションによって誘導されたアポトーシスの代表的な密度プロット分析の図である。
【図２Ａ】抗ＤＲ５及び抗ＴＲＡＩＬ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せの両方によるアポトーシス誘導を妨害するが、抗Ｆｎ１４及び抗ＴＷＥＡＫ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ誘導性アポトーシスのみを阻止する。ＴＲＡＩＬに対する中和ｍＡｂ又は関連するアイソタイプ対照２０μｇ／ｍＬと一緒にＪｕｒｋａｔ細胞を３０分間インキュベートした。次いで、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）とＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）単体を細胞に添加した。すべてのグループにおけるアネキシンＶ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって２４時間後に調べた。２つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図２Ｂ】抗ＤＲ５及び抗ＴＲＡＩＬ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せの両方によるアポトーシス誘導を妨害するが、抗Ｆｎ１４及び抗ＴＷＥＡＫ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ誘導性アポトーシスのみを阻止する。ＤＲ５に対する中和ｍＡｂ又は関連するアイソタイプ対照２０μｇ／ｍＬと一緒にＪｕｒｋａｔ細胞を３０分間インキュベートした。次いで、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）とＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）単体を細胞に添加した。すべてのグループにおけるアネキシンＶ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって２４時間後に調べた。２つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図２Ｃ】抗ＤＲ５及び抗ＴＲＡＩＬ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せの両方によるアポトーシス誘導を妨害するが、抗Ｆｎ１４及び抗ＴＷＥＡＫ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ誘導性アポトーシスのみを阻止する。ＴＷＥＡＫに対する中和ｍＡｂ又は関連するアイソタイプ対照２０μｇ／ｍＬと一緒にＪｕｒｋａｔ細胞を３０分間インキュベートした。次いで、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）とＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）単体を細胞に添加した。すべてのグループにおけるアネキシンＶ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって２４時間後に調べた。２つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図２Ｄ】抗ＤＲ５及び抗ＴＲＡＩＬ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せの両方によるアポトーシス誘導を妨害するが、抗Ｆｎ１４及び抗ＴＷＥＡＫ中和抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ誘導性アポトーシスのみを阻止する。Ｆｎ１４に対する中和ｍＡｂ又は関連するアイソタイプ対照２０μｇ／ｍＬと一緒にＪｕｒｋａｔ細胞を３０分間インキュベートした。次いで、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）とＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）単体を細胞に添加した。すべてのグループにおけるアネキシンＶ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって２４時間後に調べた。２つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図３Ａ】ＴＷＥＡＫによって修飾されたＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５を介してＪｕｒｋａｔ細胞に結合する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を未処理で放置し、又はＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、若しくはＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せ（ＴＷＥＡＫ１００ｎｇ／ｍＬ、残りのタンパク質２５０ｎｇ／ｍＬ）と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、結合していないタンパク質を洗浄によって除去し、細胞を抗ＤＲ５蛍光色素標識抗体で染色し、関連マーカーの発現をフローサイトメトリーによって調べた。結果を４つの実験の平均割合±Ｓとして表す。＊＊未処理に対してＰ＜０．００１。
【図３Ｂ】ＴＷＥＡＫによって修飾されたＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５を介してＪｕｒｋａｔ細胞に結合する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を未処理で放置し、又はＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、若しくはＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せ（ＴＷＥＡＫ１００ｎｇ／ｍＬ、残りのタンパク質２５０ｎｇ／ｍＬ）と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、結合していないタンパク質を洗浄によって除去し、細胞を抗ＤＲ５（図３Ａ）又は抗Ｆｎ１４（図３Ｂ）蛍光色素標識抗体で染色し、関連マーカーの発現をフローサイトメトリーによって調べた。抗ＤＲ５阻止抗体の存在下で同じ実験を行った。結果を４つの実験の平均割合±Ｓとして表す。＊＊未処理に対してＰ＜０．００１。
【図４Ａ】Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せで処理すると、ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体の各々で処理するよりもアポトーシス誘導を早めた。ただし、全３種類のリガンドは、カスパーゼ−８とカスパーゼ−９の両方のアポトーシス経路を活性化した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬによるＪｕｒｋａｔ細胞アポトーシス誘導の動力学を、インキュベーションの最初の４時間で評価した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬを細胞培養物に濃度２５０ｎｇ／ｍｌで添加し、ＴＷＥＡＫを濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した。インキュベート細胞の各３０分試料をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ  Ｋｉｔで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を未処理試料における初期（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）又は全アポトーシス細胞の割合に対する初期及び全アポトーシス細胞の平均割合±ＳＥとして表す。３つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図４Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せで処理すると、ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体の各々で処理するよりもアポトーシス誘導を早めた。ただし、全３種類のリガンドは、カスパーゼ−８とカスパーゼ−９の両方のアポトーシス経路を活性化した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せによるＪｕｒｋａｔ細胞アポトーシス誘導の動力学を、インキュベーションの最初の４時間で評価した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬを細胞培養物に濃度２５０ｎｇ／ｍｌで添加し、ＴＷＥＡＫを濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した。インキュベート細胞の各３０分試料をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ  Ｋｉｔで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を未処理試料における初期（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）又は全アポトーシス細胞の割合に対する初期及び全アポトーシス細胞の平均割合±ＳＥとして表す。３つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図４Ｃ】Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せで処理すると、ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体の各々で処理するよりもアポトーシス誘導を早めた。ただし、全３種類のリガンドは、カスパーゼ−８とカスパーゼ−９の両方のアポトーシス経路を活性化した。ＴＲＡＩＬによるＪｕｒｋａｔ細胞アポトーシス誘導の動力学を、インキュベーションの最初の４時間で評価した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬを細胞培養物に濃度２５０ｎｇ／ｍｌで添加し、ＴＷＥＡＫを濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した。インキュベート細胞の各３０分試料をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ  Ｋｉｔで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を未処理試料における初期（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）又は全アポトーシス細胞の割合に対する初期及び全アポトーシス細胞の平均割合±ＳＥとして表す。３つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図４Ｄ】Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せで処理すると、ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体の各々で処理するよりもアポトーシス誘導を早めた。ただし、全３種類のリガンドは、カスパーゼ−８とカスパーゼ−９の両方のアポトーシス経路を活性化した。ＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せに起因する細胞死に対するカスパーゼ−８及びカスパーゼ−９阻害剤の効果を示す図である。上記濃度のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫと一緒に２４時間インキュベートする前に、４０μＭ汎用カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、カスパーゼ−８阻害剤Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、カスパーゼ−９阻害剤Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、又は等量のＤＭＳＯと一緒にＪｕｒｋａｔ細胞を１時間インキュベートした。
【図４Ｅ】Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せで処理すると、ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体の各々で処理するよりもアポトーシス誘導を早めた。ただし、全３種類のリガンドは、カスパーゼ−８とカスパーゼ−９の両方のアポトーシス経路を活性化した。ＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せに起因する細胞死に対するカスパーゼ−８及びカスパーゼ−９阻害剤の効果を示す図である。上記濃度のＴＲＡＩＬ（図４Ｅ）と一緒に２４時間インキュベートする前に、４０μＭ汎用カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、カスパーゼ−８阻害剤Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、カスパーゼ−９阻害剤Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、又は等量のＤＭＳＯと一緒にＪｕｒｋａｔ細胞を１時間インキュベートした。インキュベート細胞をアポトーシスについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。３つの独立した実験のアポトーシス細胞の平均割合±ＳＥとして結果を表す。
【図５】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬへの可溶性ＴＷＥＡＫ（ｓＴＷＥＡＫ）付加がより大きい複合体の形成をもたらすことを示す図である。可溶性ＴＷＥＡＫ（５０ｎｇ／レーン）、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（７０ｎｇ／レーン）、及びそれらの混合物を天然ゲル電気泳動によって分離し、抗ＴＲＡＩＬ（Ａｂｅａｍ）又は抗ＴＷＥＡＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体を用いて免疫ブロットした。１：ＴＷＥＡＫ、２：Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ；３：ＴＷＥＡＫ＋Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ
【図６】Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ、又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫを用いた処理によって活性化されたアポトーシス関連タンパク質のウエスタンブロット検出を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０６／ｍＬ）を未処理で放置し、又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＲＡＩＬ（２５０ｎｇ／ｍＬ）、若しくはＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５０ｎｇ／ｍｌ）及びＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で培養した。細胞溶解物を指定時間に調製し、ウエスタンブロット法によって指定タンパク質の発現を試験した。各タンパク質の３〜４つの独立した実験の代表的な免疫ブロットを示す。
【図７Ａ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｂ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｃ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｄ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｅ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｆ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｇ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｈ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。
【図７Ｉ】ウエスタンブロットデータ解析が、ＴＲＡＩＬの存在下で測定されたものと比較したＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬによる、細胞内アポトーシス促進性分子経路のより早くより強い活性化、及び抗アポトーシス性分子経路の阻害を実証していることを示す図である。  ＧＡＰＤＨに対して規準化されたウエスタンブロットデータを、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ、又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫと一緒にインキュベートした細胞の溶解物において検出されたアポトーシス促進性タンパク質発現の動力学の解析に使用した（図６参照）。大部分の図は、溶解物において指定抗体によって検出された総タンパクの切断（活性化）タンパク質画分の平均±ＳＥとしてデータを示す。すなわち、ｐ１８／全カスパーゼ−８画分をｐ１８／（ｐ１８＋ｐ４１−４３＋ｐ５５）として計算し、ｐ３４−３５／全カスパーゼ−９画分をｐ３４−３５／（ｐ３４−３５＋ｐ４５）として計算した。そうでなく、タンパク質発現の変化がタンパク質切断を伴わなかったときには、結果をＧＡＰＤＨと未処理対象の両方に対して規準化した。３つ又は４つの独立したウエスタンブロットを各タンパク質について分析した。
【図８】Ｊｕｒｋａｔ細胞移入を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ細胞移入効率を、ＴＷＥＡＫ発現プラスミドとＧＦＰ産生プラスミドの同時移入によって評価した。
【図９】細胞生存に対するＴＷＥＡＫ発現の効果を示す図である。未処理Ｊｕｒｋａｔ、及びヒトＦｕｌｌ  ＴＷＥＡＫをコードするＤＮＡを移入したＪｕｒｋａｔ細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（ＦＴ）の存在下で異なる濃度（０．１、０．３、１、３、３０及び３００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートし、細胞生存をＭＴＳアッセイによって評価した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬと組換え可溶性ＴＷＥＡＫ（各３０ｎｇ／ｍｌ）の組合せを正の対照として使用した。Ｊｕｒｋａｔ未処理細胞；ｐＤＥＳＴ−ＥＦ１及びｐＣＲ３．１とは、ＴＷＥＡＫ移入Ｊｕｒｋａｔ細胞を指す。
【図１０】細胞生存に対する可溶性ＴＷＥＡＫの効果を示す図である。ＴＷＥＡＫ移入又は未処理Ｊｕｒｋａｔ細胞培養物から収集された培養上清を添加して、３ｎｇ／ｍｌ又は３０ｎｇ／ｍｌのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒にＪｕｒｋａｔ未処理細胞を２４時間インキュベートした。細胞生存をＭＴＳによって評価した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬと組換え可溶性ＴＷＥＡＫ（各３０ｎｇ／ｍｌ）の組合せ、３０ｎｇ／ｍｌのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体、又は３０ｎｇ／ｍｌ組換え可溶性ＴＷＥＡＫを対照として使用した。Ｊｕｒｋａｔとは、未処理細胞を指し、ｐＤＥＳＴ−ＥＦ１又はｐＣＲ３．１とは、培養未処理Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加されたＴＷＥＡＫ移入Ｊｕｒｋａｔ細胞培養上清を指す。
【図１１】ＴＷＥＡＫが腎細胞癌細胞に対するＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ阻害効果を増強することを示す図である。Ａ４９８（ＲＣＣ細胞系）細胞を漸増濃度の可溶性ＴＷＥＡＫの存在下で漸増濃度のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの存在下で２４時間インキュベートした。細胞生存をＭＴＳアッセイによって試験した。
【図１２】ＴＷＥＡＫがＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合を改善することを示す図である。ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合を評価するためにＢｉａ−ｃｏｒｅを行った。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体、ＴＷＥＡＫ単体又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬを漸増量のＴＷＥＡＫと一緒に試験した。
【図１３Ａ】標的細胞におけるＴＷＥＡＫ発現がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの死滅作用を増強していることを示す図である。ＴＷＥＡＫ  ＫＯをＷＴ  Ａ４９８ＲＣＣ細胞系から調製した。
【図１３Ｂ】標的細胞におけるＴＷＥＡＫ発現がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの死滅作用を増強していることを示す図である。ＷＴ及びＴＷＥＡＫノックアウトＡ４９８細胞（選別後）溶解物を抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂを用いて免疫ブロットした。
【図１３Ｃ】標的細胞におけるＴＷＥＡＫ発現がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの死滅作用を増強していることを示す図である。ＷＴ及び細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒に２４時間インキュベートした。
【図１３Ｄ】標的細胞におけるＴＷＥＡＫ発現がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの死滅作用を増強していることを示す図である。ＴＷＥＡＫノックアウトＡ４９８及び細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒に２４時間インキュベートした。
【図１３Ｅ】標的細胞におけるＴＷＥＡＫ発現がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの死滅作用を増強していることを示す図である。ＴＷＥＡＫノックアウトＡ４９８細胞を、可溶性ＴＷＥＡＫを添加したＦｎ１４−ＴＲＡＩＬとも一緒に２４時間インキュベートした。  細胞生存率をＭＴＳによって測定した。
【図１４Ａ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの組合せによるアポトーシスに対する、また、抗ＦＡＳモノクローナル抗体に対する、正常ヒトＴ細胞芽球の感受性を示す図である。健康なドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）によってインビトロで活性化した。３日目にＴ細胞芽球（１＊１０６細胞／ｍＬ）をアポトーシス誘導のためにＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５０ｎｇ／ｍｌ）及びＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍＬ）又は細胞毒性抗ＦＡＳ抗体ＣＨ１１（１００ｎｇ／ｍＬ）と一緒に２４時間培養した。
【図１４Ｂ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの組合せによるアポトーシスに対する、また、抗ＦＡＳモノクローナル抗体に対する、正常ヒトＴ細胞芽球の感受性を示す図である。健康なドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）によってインビトロで活性化した。３日目にＴ細胞芽球（１＊１０６細胞／ｍＬ）をＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）と一緒に更に１０日間培養放置した。
【図１４Ｃ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの組合せによるアポトーシスに対する、また、抗ＦＡＳモノクローナル抗体に対する、正常ヒトＴ細胞芽球の感受性を示す図である。健康なドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）によってインビトロで活性化した。３日目にＴ細胞芽球（１＊１０６細胞／ｍＬ）をＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）と一緒に更に１６日間培養放置した。
【図１４Ｄ】Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの組合せによるアポトーシスに対する、また、抗ＦＡＳモノクローナル抗体に対する、正常ヒトＴ細胞芽球の感受性を示す図である。健康なドナー由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）によってインビトロで活性化した。同じ量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ又は抗ＦＡＳ抗体と一緒に２４時間インキュベーション後に検出されたアポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞の割合を示す図である。  図１４Ａに示したように、培養の最後に、Ｔ細胞芽球をＴＷＥＡＫ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫ、又は抗ＦＡＳ抗体にさらした。処理細胞をアポトーシス評価のために染色し、フローサイトメトリーによって分析した。培地及びＩＬ−２のみで最後に２４時間インキュベートした対照に対するアポトーシス細胞の割合として結果を示す。２つの独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図１５Ａ】Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ由来のリンパ芽球上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５並びにＴＷＥＡＫ受容体Ｆｎ１４の細胞表面発現の比較を示す図である。
【図１５Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ由来のリンパ芽球上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５並びにＴＷＥＡＫ受容体Ｆｎ１４の細胞表面発現の比較を示す図である。
【図１５Ｃ】Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ由来のリンパ芽球上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５並びにＴＷＥＡＫ受容体Ｆｎ１４の細胞表面発現の比較を示す図である。  培養細胞系由来のリンパ芽球をＰＥ複合化抗Ｆｎ１４、抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を特異的マーカー陽性細胞の割合±ＳＥとして表す。Ｙ軸上のバーは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫによるアポトーシスに対する感受性の減少する順に配列され、Ｊｕｒｋａｔ細胞がアポトーシスに対して最も感受性が高い。
【図１６Ａ】示唆されるクラスター形成モデル、及び関与分子の活性に対するその潜在的効果の非限定的略図である。Ａ）ＴＮＦファミリー受容体（Ｂ）とＴＮＦファミリーリガンド（Ｃ）の細胞外部分を連結するＤＳＰ融合タンパク質は、三量体形成するＴＮＦファミリーリガンド固有の能力のために、ホモ三量体を形成することができる。（ＢＣ）ＤＳＰ三量体は、異なるＴＮＦファミリーリガンド三量体（Ａ）［（Ｂ）のリガンド］に結合することができる。
【図１６Ｂ】示唆されるクラスター形成モデル、及び関与分子の活性に対するその潜在的効果の非限定的略図である。Ｂ）（ＢＣ）ＤＳＰ三量体と（Ａ）三量体の相互作用によって、（Ａ）＋（ＢＣ）のクラスターを形成することができる。
【図１６Ｃ】示唆されるクラスター形成モデル、及び関与分子の活性に対するその潜在的効果の非限定的略図である。Ｃ）（Ａ）が患部組織若しくは器官又はそれらの環境において正常器官又は組織よりも多量に存在する場合、（Ａ）＋（ＢＣ）のクラスターは、（Ａ）濃度が高い場所、例えば、体内で形成される可能性があり、（Ａ）の活性を阻害し、細胞膜上の（Ｄ）受容体のクラスター形成を介して、又は（Ｄ）とのそれらの結合を強化するように（Ｃ）リガンドを位置決めすることによって、（Ｃ）の活性を誘導する。
【発明を実施するための形態】
【０１５７】
驚くべきことに、本発明者らは、別のＴＮＦファミリーリガンド及び／又はＴＮＦ受容体の存在に応じて、炎症性疾患、免疫関連疾患又は癌疾患の対象に特定の融合タンパク質を有利に投与できることを見いだした。こうした別のＴＮＦファミリーリガンドも、場合によっては、安定化組成物の一部として、融合タンパク質と一緒に投与することができる。
【０１５８】
「ＤＳＰ」と「融合タンパク質」という用語を本明細書では区別なく使用する。
【０１５９】
本発明者らは、本明細書に記載の融合タンパク質プラス追加のＴＮＦファミリーリガンドのこの組合せを、場合によっては、以下のように選択できることを見いだした。それぞれＡ／Ｂ及びＣ／Ｄと標識された２つのＴＮＦファミリーリガンド／受容体対を考える。Ａ及びＣはリガンドであり、Ｂ及びＤは受容体である。受容体は互いに異なり、リガンドも互いに異なる。さらに、リガンドＡは受容体Ｄに結合せず、リガンドＣは受容体Ｂに結合しない。融合タンパク質は、場合によっては、受容体Ｂ及びリガンドＣのＥＣＤ（細胞外ドメイン）から構築することができる。少なくとも一部の実施形態によれば、この融合タンパク質を対象に有利に投与できるかどうかを判定する診断法は、したがって、例えば、それらに限定されないが、全体的に（例えば、対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において、又は局所的に、例えば、特定の患部組織を試験することによって、対象におけるリガンドＡのレベルを検出するステップを含む。
【０１６０】
少なくとも一部の実施形態によれば、安定化組成物は、場合によっては、受容体Ｂ及びリガンドＣのＥＣＤ、プラス安定化量のリガンドＡを含む、上記融合タンパク質を含むことができる。
【０１６１】
ＴＮＦファミリーリガンド／受容体対のこうしたグループの非限定的一例は、ＴＷＥＡＫ（リガンドＡ）／Ｆｎ１４（受容体Ｂ）及びＴＲＡＩＬ（リガンドＣ）／ＴＲＡＩＬ受容体（受容体Ｄ）である。可能なリガンド／受容体対の別の例を表１に示す。
【０１６２】
ＴＷＥＡＫ／ＴＲＡＩＬシグナル伝達軸及び融合タンパク質
本発明は、一態様においては、ＴＷＥＡＫ及びＴＲＡＩＬシグナル伝達軸に作用する融合タンパク質、例えば、ＴＷＥＡＫリガンドに結合するポリペプチドを含む第１のドメイン、及びＴＲＡＩＬ受容体に結合するポリペプチドを含む第２のドメインを有する融合タンパク質を上記ＤＳＰの非限定的一例として提供する。
【０１６３】
特に、第１のドメインは、そのＦｎ１４受容体を介したＴＷＥＡＫの誘発能力を妨害する能力を有するポリペプチドであり、第２のドメインは、Ｔ細胞上の同種受容体、又はＴＲＡＩＬ受容体を有する別の細胞を介してシグナルを導くことができるポリペプチドである。
【０１６４】
ＴＷＥＡＫ及びＴＲＡＩＬシグナル伝達軸に関連した適切な第１のドメインとしては、例えば、Ｆｎ１４タンパク質、野生型Ｆｎ１４タンパク質の変異体若しくは誘導体、又はＴＷＥＡＫに結合する抗体、ＴＷＥＡＫに結合する抗体の一部、ＴＷＥＡＫに結合するように操作されたリポカリン誘導体など、ＴＷＥＡＫに結合し、このリガンドがそのＦｎ１４受容体を介してシグナル伝達するのを防止するように特に調整された別のポリペプチド若しくはタンパク質が挙げられる。好ましくは、この実施形態の融合タンパク質の第１のドメインは、Ｆｎ１４タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部であり、特に、ＴＷＥＡＫリガンドに結合し、その膜結合Ｆｎ１４受容体に結合し、作動させる能力を妨害するのに必要である細胞外ドメインの部分である。ＴＷＥＡＫ結合を担う細胞外ドメイン又は細胞外ドメインの部分の野生型の変異体も、変異体が野生型タンパク質と同様のレベルの生物活性を与える限り、本発明に含まれる。
【０１６５】
したがって、本明細書では「ＴＷＥＡＫリガンドに結合するポリペプチド」という用語は、Ｆｎ１４タンパク質；Ｆｎ１４タンパク質の細胞外ドメイン；Ｆｎ１４タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部であるポリペプチド、該部分はＴＷＥＡＫリガンドへの結合を担う；ＴＷＥＡＫに対する抗体又は抗体の一部；リポカリン誘導体；並びにこれらのいずれかの変異体及び／又は誘導体を含む。「Ｆｎ１４」という用語は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメイン、並びに細胞外ドメイン、細胞外ドメインの一部などのタンパク質のより小さい部分に対応するポリペプチドを含めて、Ｆｎ１４タンパク質の完全なアミノ酸配列に対応するポリペプチドを包含すると理解される。一実施形態においては、Ｆｎ１４／ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の第１のドメインは、ヒトＦｎ１４タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部である。
【０１６６】
ＴＷＥＡＫ及びＴＲＡＩＬシグナル伝達軸に関連した適切な第２のドメインとしては、例えば、ＴＲＡＩＬタンパク質自体、ＴＲＡＩＬタンパク質の変異体若しくは誘導体、又はＴ細胞若しくは別の細胞の活性化を阻害するように、及び／又はＴＲＡＩＬ受容体を介してアポトーシスを誘導するように、又はアゴニスト抗ＴＲＡＩＬ  Ａｂなどの任意の他のＴＲＡＩＬ活性を誘導若しくは阻害するように特に設計された別のポリペプチド若しくはタンパク質、並びにこれらのいずれかの変異体及び／又は誘導体が挙げられる。
【０１６７】
好ましくは、この実施形態における融合タンパク質の第２のドメインは、ＴＲＡＩＬタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部、特にＴＲＡＩＬ受容体に結合するのに必要である部分である。ＴＲＡＩＬ受容体結合を担うＴＲＡＩＬタンパク質の細胞外ドメイン又は細胞外ドメインの部分の野生型の変異体も、変異体が野生型タンパク質と同様のレベルの生物活性を与え、一部の実施形態においては三量体を形成することができる限り、本発明に含まれる。
【０１６８】
したがって、本明細書では「ＴＲＡＩＬ受容体に結合するポリペプチド」という用語は、ＴＲＡＩＬタンパク質；ＴＲＡＩＬタンパク質の細胞外ドメイン；ＴＲＡＩＬタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部であるポリペプチド、該部分はＴＲＡＩＬ受容体への結合を担う；ＴＲＡＩＬ受容体に対する抗体（及び抗体の一部）；並びにこれらのいずれかの変異体及び／又は誘導体を含む。「ＴＲＡＩＬ」という用語は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメイン、並びに細胞外ドメイン、細胞外ドメインの一部などのタンパク質のより小さい部分に対応するポリペプチドを含めて、ＴＲＡＩＬタンパク質の完全なアミノ酸配列に対応するポリペプチドを包含すると理解される。一実施形態においては、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の第２のドメインは、ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部である。
【０１６９】
一実施形態においては、本発明は、Ｆｎ１４／ＴＲＡＩＬ融合タンパク質を含む。別の一実施形態においては、「Ｆｎ１４／ＴＲＡＩＬ融合タンパク質」という用語は、配列番号１で識別される特定の融合タンパク質を指す：
【０１７０】
【表３】
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【０１７１】
１．ヒトウロキナーゼタンパク質のシグナルペプチド、すなわちＭＲＡＬＬＡＲＬＬＬＣＶＬＶＶＳＤＳＫＧ（配列番号２）には下線が引かれている。
２．ヒトＦｎ１４の細胞外ドメインは太字、すなわちＥＱＡＰＧＴＡＰＣＳＲＧＳＳＷＳＡＤＬＤＫＣＭＤＣＡＳＣＲＡＲＰＨＳＤＦＣＬＧＣＡＡＡＰＰＡＰＦＲＬＬＷ（配列番号３）である。
３．ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインは通常の書体、すなわちＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧ（配列番号４）である。
【０１７２】
更なる実施形態においては、Ｆｎ１４／ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の変異体及び／又は誘導体である。幾つかのこうした変異体は、例えば、本明細書に全体が記載されたかの如く参照により本明細書に援用する特許文献２のように、当該技術分野で公知である。
【０１７３】
本発明の更なる実施形態においては、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかのＴＲＡＩＬ成分は、別の抑制タンパク質、すなわち、Ｔ細胞において、又はＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ：ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞、ＮＫＴ細胞、リンパ球前駆細胞、樹状細胞、単球／マクロファージ、抗原提示能力を有する組織ベースのマクロファージ系列細胞、幾つかの非専門の抗原提示細胞のいずれか一つ、例えば、内皮細胞などの別の細胞型において、免疫応答の活性化を防止する、及び／又はアポトーシスを誘導するタンパク質で置換することができる。抑制タンパク質の例は、本明細書に記載されている。
【０１７４】
一実施形態においては、本発明の融合タンパク質は、ミエリン特異的Ｔ細胞の増殖及び分化を防止又は抑制することによって、免疫系の活性化を阻害する。一部の実施形態においては、本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１などの炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの産生を阻害し、又はＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータなどの別のサイトカイン／ケモカインの増強を阻害し、又はＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９などのマトリックスメタロプロテイナーゼの誘導を阻害し、又は線維芽細胞及び滑膜細胞からのプロスタグランジンＥ２分泌を阻害する。本発明は、ＴＷＥＡＫリガンドによって促進される、又はＴＲＡＩＬリガンドによって下方制御される、任意のすべてのサイトカインの阻害／下方制御を包含する。
【０１７５】
別の実施形態においては、本発明の融合タンパク質は、自己反応性Ｔ細胞増殖、自己反応性抗体産生及び炎症反応を抑制する。
【０１７６】
更なる実施形態においては、本発明の融合タンパク質は、自己免疫疾患モデル、例えば、ＥＡＥ及びコラーゲン誘発関節炎、炎症誘発剤を動物に局所的又は全身的に導入する遅延型過敏モデル及び別のモデルなどの炎症のインビボモデル系において、炎症誘発性サイトカイン及びケモカイン産生の阻害、及び／又は抗炎症性サイトカイン産生の増加を測定するインビトロ及びインビボアッセイで測定して、炎症を抑制する。これらのインビボモデルにおいては、炎症は、炎症組織の組織学的検査、患部組織からの炎症細胞の単離、及び罹患動物における発症の測定によって評価される。本発明の融合タンパク質は、別の実施形態においては、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの病原性Ｔ細胞、及びＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、リンパ球前駆細胞、樹状細胞、単球／マクロファージなどの別の病原性免疫細胞の増殖、分化及び／又はエフェクター機能を阻害し、病原性免疫細胞においてアポトーシスを誘導し、調節性を有する免疫細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、Ｔｒ１細胞、ＣＤ８＋、ＮＫ  ＮＫＴ、及び免疫阻害活性を有する樹状細胞など）の産生を促進し、血液脳関門の透過性を減少させ、それによってＣＮＳへの炎症細胞の到達を制限し、他の疾患部位への炎症細胞の到達を減少させ、炎症に付随する血管新生を減少させる。
【０１７７】
Ｆｎ１４
Ｆｎ１４は、原形質膜に固定されたタンパク質であり、１２９アミノ酸長のＴＮＦＲ（ＴＮＦ受容体）スーパーファミリーメンバーである（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＣＲ７５（マウス）及びＱ９ＮＰ８４（ヒト）。Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．アイソフォーム番号Ｑ９ＮＰ８４．１及びＱ９ＮＰ８４．２（ＮＣＢＩ受託番号は、それぞれＮＰ．ｓｕｂ．−−０５７７２３及びＢＡＢ１７８５０である）で識別されるＦｎ１４の２種の変異体が知られている。Ｆｎ１４配列は、アフリカツメガエル（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＲ２１２２５）及びラット（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−８５１６００）を含めて、多数の他の種においても決定されている。
【０１７８】
大部分のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、１〜６個のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）の存在を構造的特徴とする細胞外ドメインを含む。典型的なＣＲＤは、約４０アミノ酸長であり、３個の鎖内ジスルフィド架橋を形成する６個の保存されたシステイン残基を含む。ＣＲＤ自体は、一般に、２個の異なる構造モジュールで構成される。
【０１７９】
Ｆｎ１４は、５３アミノ酸細胞外ドメイン、アミノ酸２８〜８０を含み、１個のＣＲＤを有するＩ型膜貫通タンパク質である。このＣＲＤ内のある種の荷電アミノ酸残基は、有効なＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用に特に重要であることが示された。参照により本明細書に援用する、Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ａ．ら、「Ｔｗｅａｋ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｎ１４  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｓｈａｒｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  Ａ１  ａｎｄ  Ｄ２  ｍｏｄｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９７：２９７〜３０４（２００６）。
【０１８０】
Ｂｒｏｗｎらの論文で提供された情報に基づくと、例えば、当業者は、Ｆｎ１４タンパク質のどの変異体がＴＷＥＡＫ結合活性を保持し、どれが保持しないかを決定することができる。例えば、進化的に保存されなかった位置における部位特異的変異によって調製された幾つかの特異的変異体は、ＴＷＥＡＫ結合活性を有することが判明した。それに対して、ＣＲＤ領域の少なくとも３個のアミノ酸は、ＴＷＥＡＫ結合に重要であった。多様な種におけるＦｎ１４タンパク質のアミノ酸配列を比較することによって、どのアミノ酸位置が高度に保存されず、置換／付加／欠失の良好な候補であるかを決定することができる。高度に保存された領域、特にＴＮＦＲ相同性領域における置換／欠失／付加は、本発明に係る変異体の有望な調製候補とは考えられない。
【０１８１】
ＴＲＡＩＬ
ＴＲＡＩＬは、２９１個のアミノ酸を有するＩＩ型膜タンパク質であり、マウス：Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ５０５９２、ヒト：Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．受託番号Ｐ５０５９１、ドブネズミ：ＮＣＢＩ受託ＮＰ．ｓｕｂ．−６６３７１４、Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ  Ｃｈｕａｔｓｉ（ケツギョ）：ＮＣＢＩ受託ＡＡＸ７７４０４、Ｇａｌｌｕｓ  Ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）：ＮＣＢＩ受託ＢＡＣ７９２６７、Ｓｕｓ  Ｓｃｒｏｆａ（ブタ）：ＮＣＢＩ受託ＮＰ．ｓｕｂ．−００１０１９８６７、Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ  Ｉｄｅｌｌａ（ソウギョ）：ＮＣＢＩ受託ＡＡＷ２２５９３、及びＢｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（ウシ）：ＮＣＢＩ受託ＸＰ．ｓｕｂ．−００１２５０２４９を含めて、ただしそれらに限定されない幾つかの種において配列が決定されている。
【０１８２】
ＴＲＡＩＬの細胞外ドメインは、アミノ酸３９〜２８１を含み、受容体結合を担うＴＮＦドメインは、ＴＮＦ相同性モデルに基づいて、アミノ酸１２１〜２８０である。活性の付与に特に重要であるタンパク質の部分が特定されている。例えば、参照により本明細書に援用する、「Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ｉｎ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  Ｓ  Ｇら、Ａｍ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９９年１０月；４（４）：５６３〜７１）を参照されたい。これは、その受容体へのＴＲＡＩＬ結合及び活性に最も重要なアミノ酸がアミノ酸（１９１〜２０１〜２０５〜２０７〜２３６〜２３７）及びアミノ酸（１５０〜２１６）などの亜鉛領域周囲のアミノ酸であることを報告している。１）アポトーシス活性のない２種のヒトＴＲＡＩＬ変異体ＴＲＡＩＬ−ガンマ及びＴＲＡＩＬベータを記述した、Ｋｒｉｅｇ  Ａら、２００３  Ｂｒ．Ｊ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８８：９１８〜９２７、２）「Ｅｎｆｏｒｃｅｄ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｌｉｇａｎｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ＴＲＡＩＬ  ａｎｄ  ＣＤ９５Ｌ」、Ｄ  Ｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００７）１４、２０２１〜２０３４、及び３）「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｒａｍｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｓ．Ｃｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１１７１〜３１１７７（２０００）。これらすべてを参照により本明細書に援用する。
【０１８３】
ＴＲＡＩＬは、２つのタイプの受容体、すなわち、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを誘発する細胞死受容体とこの経路を阻害するかもしれないおとり受容体を連結することが知られている。ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３及びＴＲＡＩＬＲ４を含むＴＲＡＩＬの４種のヒト受容体が特定されている。ＴＲＡＩＬは、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）に結合することもできる。これらの受容体の各々への結合は、十分特徴付けられている。例えば、「Ｔｈｅ  ＴＲＡＩＬ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｎｓｅｔ，ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ８巻（２００８）７８２〜７９８を参照されたい。
【０１８４】
ＴＷＥＡＫに関係する症状又は疾患
少なくとも一部の実施形態によれば、ＴＷＥＡＫに関係する症状としては、以下に示す種々の癌、すなわち、急性心外傷、慢性心不全、（非炎症性拡張型心筋症を含めて、ただしそれだけに限定されない）心筋症、うっ血性心不全、肝上皮細胞過形成、肝細胞死、肝細胞空胞化、他の肝障害、胆管過形成を含めた胆管疾患、肝炎症性疾患、多発性炎症などの炎症性腎臓疾患、尿細管性腎症などの非炎症性腎臓疾患、尿細管過形成、糸球体嚢胞、糸球体腎症、糸球体腎炎、アルポート症候群、腎尿細管空胞化、腎硝子円柱、（肝線維症、腎線維症及び／又は肺線維症を含めて、ただしそれらに限定されない）種々の線維性疾患及び炎症性肺疾患、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸腺癌、肝細胞癌、腎癌、胃癌、乳癌、扁平上皮癌、食道癌、膵癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、神経膠腫、頭頚部癌、肝癌、黒色腫、前立腺癌、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、転移性神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、星細胞腫及び星状細胞脳腫瘍、肺癌、膵臓腺癌、卵巣嚢胞腺癌、頚部扁平上皮癌、前立腺腺癌、扁平上皮癌、角化細胞癌、転移性悪性黒色腫、骨肉腫、又は転移性絨毛癌が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８５】
本発明の一部の実施形態においては、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置される疾患は、脂漏性角化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、潰瘍性大腸炎及びクローン病としての炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、蕁麻疹様血管炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症、又は急性虚血性脳卒中である。
【０１８６】
本発明の一部の実施形態においては、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置される疾患は、脂漏性角化、潰瘍性大腸炎及びクローン病としての炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症、若しくは任意の他の状態（例えば、高血圧、放射線、鎌状赤血球症など）に起因する網膜症、又は急性虚血性脳卒中である。
【０１８７】
本発明の一部の実施形態においては、例えばＦｎ１４−ＴＲＡＩＬなどのＦｎ１４又はそのＥＣＤを含む融合タンパク質によって処置される疾患は、精巣癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、角化細胞癌又は骨肉腫である。
【０１８８】
タンパク質化学修飾
本発明においては、本発明のタンパク質の任意の部分を場合によっては化学修飾することができ、すなわち、官能基の付加によって変化させることができる。例えば、天然配列に見られる側鎖アミノ酸残基を場合によっては修飾することができるが、以下に示すように、あるいは、側鎖アミノ酸残基に加えて又はその代わりに、タンパク質の別の部分を場合によっては修飾することができる。化学合成プロセスの後に、例えば、化学修飾アミノ酸の付加が続く場合、修飾を、場合によっては、分子の合成中に行うことができる。しかし、アミノ酸が既に分子中に存在するときにはアミノ酸の化学修飾（「ｉｎ  ｓｉｔｕ」修飾）も可能である。
【０１８９】
分子の配列領域のいずれかのアミノ酸を、場合によっては、（ペプチドにおいて概念的に「化学修飾」とみなされる）以下の例示的なタイプの修飾のいずれか一つに従って修飾することができる。非限定的例示的なタイプの修飾としては、カルボキシメチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化又は脂肪酸アシル化が挙げられる。場合によっては、エーテル結合を利用して、セリン又はスレオニンヒドロキシルを糖のヒドロキシルに連結することができる。場合によっては、アミド結合を利用して、グルタミン酸又はアスパラギン酸カルボキシル基を糖のアミノ基に連結することができる（Ｇａｒｇ  ａｎｄ  Ｊｅａｎｌｏｚ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）；Ｋｕｎｚ，Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ２６：２９４〜３０８（１９８７））。アセタール及びケタール結合も、場合によっては、アミノ酸と炭水化物の間で形成することができる。脂肪酸アシル誘導体を、場合によっては、例えば、遊離アミノ基（例えば、リジン）のアシル化によって製造することができる（Ｔｏｔｈら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｉｖｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌ編、ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｅｉｄｅｎ，１０７８〜１０７９（１９９０））。
【０１９０】
本明細書では「化学修飾」という用語は、本発明に係るタンパク質又はペプチドに言及するときには、そのアミノ酸残基の少なくとも１個がプロセシング、別の翻訳後修飾などの天然プロセスによって、又は当該技術分野で周知である化学修飾技術によって、修飾されたタンパク質又はペプチドを指す。多数の公知の修飾の例としては、一般に、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰリボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、脂質又は脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ＰＥＧ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、又は任意の類似のプロセスが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９１】
別のタイプの修飾としては、場合によっては、本明細書に全体が記載されたかの如く参照により本明細書に援用する国際公開第２００６／０５０２６２号に記載のように、タンパク質などの生体分子へのシクロアルカン部分の付加が挙げられる。これらの部分は、生体分子と一緒に使用するように設計され、場合によっては、タンパク質に種々の性質を付与するように使用することができる。
【０１９２】
さらに、場合によっては、タンパク質の任意のポイントを修飾することができる。例えば、タンパク質のグリコシル化部分のＰＥＧ化を、場合によっては、本明細書に全体が記載されたかの如く参照により本明細書に援用する国際公開第２００６／０５０２４７号に記載のように行うことができる。１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を、場合によっては、Ｏ結合型及び／又はＮ結合型グリコシル化に追加することができる。ＰＥＧ基は、場合によっては、分枝状又は線状とすることができる。場合によっては、任意のタイプの水溶性ポリマーをタンパク質のグリコシル化部位にグリコシルリンカーを介して結合することができる。
【０１９３】
「ＰＥＧ化タンパク質」とは、生物活性を有する、タンパク質のアミノ酸残基に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有する、タンパク質又はその断片を意味する。
【０１９４】
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」とは、カップリング剤、又はカップリング若しくは活性化成分を用いた（例えば、チオール、トリフラート、トレシラート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジリジン、オキシランを用いた、又は好ましくはマレイミド成分を用いた）誘導体化を用いても用いなくても、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。マレイミドモノメトキシＰＥＧなどの化合物は、本発明の例示的又は活性化ＰＥＧ化合物である。ポリプロピレングリコールなどの別のポリアルキレングリコール化合物を本発明に使用することができる。別の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、以下のタイプの荷電又は中性ポリマー、すなわち、デキストラン、コロミン酸又は別の炭水化物ポリマー、アミノ酸のポリマー、及びビオチン誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９５】
改変グリコシル化タンパク質修飾
本発明のタンパク質を修飾して、改変グリコシル化パターンを持たせることができる（すなわち、本来又は天然のグリコシル化パターンからの改変）。本明細書では「改変」とは、除去された１個以上の炭水化物部分を有すること、及び／又は最初のタンパク質に付加した少なくとも１個のグリコシル化部位を有することを意味する。
【０１９６】
タンパク質のグリコシル化は、一般に、Ｎ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付加のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のどちらかがポリペプチド中に存在すると、潜在的グリコシル化部位が生成する。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１種の付加を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを使用することもできる。
【０１９７】
本発明のタンパク質へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上記トリペプチド配列の１つ以上を含むようにタンパク質のアミノ酸配列を改変することによってなされる（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。改変は、元のタンパク質の配列における１個以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。タンパク質のアミノ酸配列は、変化をＤＮＡレベルで導入することによっても改変することができる。
【０１９８】
タンパク質の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質のアミノ酸残基へのグリコシドの化学又は酵素カップリングによるものである。使用するカップリング法に応じて、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に糖を付加することができる。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９〜３０６（１９８１）に記載されている。
【０１９９】
本発明のタンパク質上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に、又は変化をＤＮＡレベルで導入することによって、行うことができる。化学脱グリコシル化は、タンパク質をトリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物にさらす必要がある。この処理によって、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分又はすべての糖が切断されて、アミノ酸配列がそのまま残る。
【０２００】
化学脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）、及びＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記述されている。タンパク質の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）によって記述された種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。
【０２０１】
医薬組成物
本発明は、一部の実施形態においては、治療有効量の本発明に係る治療薬を含む医薬組成物を特徴とする。本発明によれば、治療薬は、本明細書に記載のポリペプチドとすることができる。本発明に係る医薬組成物は、更に、本明細書に記載の癌又は免疫関連障害の処置に使用される。本発明の治療薬は、対象に単独で、又はそれが薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物の一部として、提供することができる。
【０２０２】
本明細書では「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、（例えば、注射又は注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、本明細書に記載のポリペプチドは、１種以上の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物作用を与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９参照）。こうした塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒の無機酸から、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から、並びにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒の有機アミンから誘導されるものが挙げられる。
【０２０３】
本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含むこともできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が挙げられる。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物は、洗浄剤及び可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート−８０））、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、バルキング物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含むこともできる。
【０２０４】
本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物において採用することができる適切な水系及び非水系担体の例としては、水、種々の緩衝剤内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。
【０２０５】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０２０６】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などのアジュバントを含むこともできる。微生物の存在の防止は、上記滅菌処置と種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方によって確保することができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用剤形の吸収は、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンなどの吸収を遅らせる剤を含むことによって延長することができる。
【０２０７】
薬学的に許容される担体としては、無菌水溶液又は分散物、及び無菌注射液又は分散物を即座に調製するための無菌粉体が挙げられる。薬学的活性物質のためのこうした媒体及び剤の使用は、当該技術分野で公知である。従来の媒体又は剤が活性化合物に不適合な場合を除いて、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物におけるその使用が企図される。補充の活性化合物を組成物に混ぜ込むこともできる。
【０２０８】
治療用組成物は、一般に、製造及び貯蔵条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適切な他の秩序構造（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に入れることによって延長することができる。無菌注射液は、必要に応じて、必要量の活性化合物を適切な溶媒中で上記成分の１種類又は組合せと混合し、続いて滅菌精密濾過して調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒と上記のものからの必要な他の成分とを含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混ぜ込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉体の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望成分の粉末を、あらかじめ無菌濾過したその溶液から生成する、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０２０９】
無菌注射液は、必要に応じて、必要量の活性化合物を適切な溶媒中で上記成分の１種類又は組合せと混合し、続いて滅菌精密濾過して調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒と上記のものからの必要な他の成分とを含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混ぜ込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉体の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望成分の粉末を、あらかじめ無菌濾過したその溶液から生成する、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０２１０】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置対象及び特定の投与方法に応じて変わる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、活性成分約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは活性成分約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０２１１】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療反応）が得られるように調節される。例えば、単一ボーラスを投与することができ、幾つかの分割用量をある期間にわたって投与することができ、又は投与量を治療状況の緊急性に比例して増減することができる。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を単位用量形態で処方することが特に有利である。本明細書では単位用量形態とは、処置対象に対する単位投与量として適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と一緒に、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る単位用量形態の仕様は、（ａ）活性化合物特有の特性、及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）個体における感受性に対処してこうした活性化合物を配合する当該技術分野における固有の制約に従い、かつ直接左右される。
【０２１２】
本発明の組成物は、１つ以上の投与経路を介して、当該技術分野で公知の種々の方法の１つ以上を用いて、投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路及び／又は方法は所望の結果に応じて変わる。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療薬の好ましい投与経路としては、血管内送達（例えば、注射又は注入）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、経口、経腸、直腸、肺（例えば、吸入）、経鼻、局所（経皮、頬及び舌下を含む）、膀胱内、硝子体内、腹腔内、膣、脳送達（例えば、脳室内、脳内及び対流強化拡散（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ））、ＣＮＳ送達（例えば、髄腔内、脊髄周囲及び脊髄内）又は非経口（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）及び皮内を含む）、経皮（受動的に、又はイオントフォレーシス若しくは電気穿孔法によって）、経粘膜（例えば、舌下投与、経鼻、膣、直腸又は舌下）、投与若しくは移植物を介した投与、又は例えば注射若しくは注入による別の非経口投与経路、又は当該技術分野で公知の別の送達経路及び／又は投与形態が挙げられる。本明細書では「非経口投与」という句は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入、又は生侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）挿入物の使用を含むが、それらに限定されず、各投与経路に適切な剤形で処方することができる。特定の一実施形態においては、本発明の少なくとも一部の実施形態に係るタンパク質、治療薬又は医薬組成物を腹腔内又は静脈内に投与することができる。
【０２１３】
本発明の組成物は、吸入中に肺に送達することができ、空気力学的直径約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子として送達すると、肺上皮層を横切って、血流に入る。そのすべてが当業者によく知られた、噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器を含めて、ただしそれらに限定されない、治療用製品の肺送達用に設計された広範囲の機械装置を使用することができる。市販装置の幾つかの具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州）、ＡｃｏｒｎＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、イングルウッド、コロラド州）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ノースカロライナ州）、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、マサチューセッツ州）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ及びＭａｎｎｋｉｎｄすべてが、認可された又は臨床試験中の吸入可能なインスリン粉末調製物を有し、その技術を本明細書に記載の処方に応用することができる。
【０２１４】
一部のインビボ手法においては、本明細書に開示した組成物を治療有効量で対象に投与する。本明細書では「有効量」又は「治療有効量」という用語は、処置する障害の１つ以上の症候を処置、阻害若しくは軽減するのに、又は所望の薬理的及び／又は生理的効果をもたらすのに、十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存した変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、実施する処置などの種々の要因に応じて変わる。本明細書に開示したポリペプチド組成物及びそれをコードする核酸の場合、更に研究を進めると、様々な患者において種々の症状の処置に適切な投与量レベルに関する情報が明らかになり、通常の技能を有する者は、レシピエントの治療状況、年齢及び全般的健康状態を考慮して、適切な投薬を確認することができるであろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、及び所望の処置期間に応じて決まる。ポリペプチド組成物の場合、一般に、毎日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルを哺乳動物に投与する。例えば、投与量を０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲にすることができる。例示的な処置計画では、週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回、又は３〜６か月ごとに１回投与する必要がある。一般に、静脈内注射又は注入の場合、投与量を少なくすることができる。投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療反応）が得られるように調節される。例えば、単一ボーラスを投与することができ、幾つかの分割用量をある期間にわたって投与することができ、又は投与量を治療状況の緊急性に比例して増減することができる。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を単位用量形態で処方することが特に有利である。本明細書では単位用量形態とは、処置対象に対する単位投与量として適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と一緒に、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る単位用量形態の仕様は、（ａ）活性化合物特有の特性、及び達成すべき特定の治療効果、並びに（ｂ）個体における感受性に対処してこうした活性化合物を配合する当該技術分野における固有の制約に従い、かつ直接左右される。
【０２１５】
場合によっては、ポリペプチド製剤を、任意の適切なタイミングの投薬計画に従って、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日、好ましくは０．００１〜２０．０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与することができる。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る少なくとも一部の実施形態に係る治療用組成物は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、毎週３回、毎週２回又は毎週１回、２週間又は３、４、５、６、７若しくは８週間ごとに１回投与することができる。さらに、組成物を、短期間又は長期間投与することができる（例えば、１週間、１か月、１年、５年）。
【０２１６】
あるいは、治療薬を徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない回数の投与が必要である。投与量及び頻度は、患者における治療薬の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。融合タンパク質の半減期は大きく変動し得る。投与量及び投与頻度は、処置が予防か治療かに応じて変わり得る。予防的適用例においては、比較的少ない投与量を比較的まばらな間隔で長期間投与する。一部の患者は、その余生の間、処置を受け続ける。治療的適用例においては、疾患の進行が遅くなる、又は停止するまで、好ましくは患者が疾患の症候の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時折必要になる。その後、患者は、予防的投薬計画で投与することができる。
【０２１７】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒でなく、特定の患者、組成物及び投与方法に対して所望の治療反応を得るのに有効である活性成分量が得られるように変えることができる。選択される投与量レベルは、使用する本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、処置期間、使用する特定の組成物と併用される別の薬物、化合物及び／又は材料、処置する患者の年齢、性別、体重、症状、全般的健康状態及び病歴、並びに医薬技術分野において周知の類似要因を含めて、種々の薬物動態学的要因に依存する。
【０２１８】
「治療有効投与量」の本明細書に開示したポリペプチドは、好ましくは、症候の重症度の減少、無症候期間の頻度及び持続時間の増加、寿命の延長、疾患寛解、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害の防止若しくは減少をもたらす。
【０２１９】
当業者は、対象の大きさ、対象の症候の重症度、選択された特定の組成物又は投与経路などの要因に基づく治療有効量を決定することができるであろう。
【０２２０】
ある実施形態においては、ポリペプチド組成物を局所的に、例えば、注射によって処置部位に直接投与する。一般に、注射は、ポリペプチド組成物の局所濃度を増加させ、それは全身投与で得ることができる局所濃度よりも高い。例えば、多発性硬化症のような神経疾患の場合、タンパク質をＣＮＳ近くの部位に局所投与することができる。別の一例においては、関節リウマチのような関節炎障害の場合と同様に、タンパク質を患部関節の滑膜に局所投与することができる。ポリペプチド組成物は、上述したようにマトリックスと組み合わせて、処置部位からポリペプチドが受動拡散するのを抑制することによって、ポリペプチド組成物の局所濃度を増加しやすくすることができる。
【０２２１】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で公知の医療機器を用いて投与することができる。例えば、任意選択の実施形態においては、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物を、米国特許第５，３９９，１６３号、同５，３８３，８５１号、同５，３１２，３３５号、同５，０６４，４１３号、同４，９４１，８８０号、同４，７９０，８２４号又は同４，５９６，５５６号に開示された装置などの針皮下注射装置を用いて投与することができる。本発明において有用である周知の移植物及びモジュールの例としては、薬物を制御された速度で分注する移植可能な微小輸液ポンプを開示した米国特許第４，４８７，６０３号、医薬品を皮膚から投与する治療用装置を開示した米国特許第４，４８６，１９４号、薬物を正確な注入速度で送達する薬物注入ポンプを開示した米国特許第４，４４７，２３３号、連続薬物送達のための移植可能な可変流注入装置を開示した米国特許第４，４４７，２２４号、多室型区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示した米国特許第４，４３９，１９６号、及び浸透圧薬物送達システムを開示した米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許を参照により本明細書に援用する。多数の他のこうした移植物、送達システム及びモジュールが当業者に知られている。
【０２２２】
活性化合物は、移植物、皮膚貼付剤及びマイクロカプセル送達系を含めて、制御放出製剤などの急速放出に対して化合物を保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。こうした製剤を調製する多数の方法が特許化され、又は当業者に一般に知られている。例えば、「徐放及び制御放出薬物送達システム（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９７８年を参照されたい。
【０２２３】
治療用組成物は、当該技術分野で公知の医療機器を用いて投与することができる。例えば、任意選択の実施形態においては、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療用組成物を、米国特許第５，３９９，１６３号、同５，３８３，８５１号、同５，３１２，３３５号、同５，０６４，４１３号、同４，９４１，８８０号、同４，７９０，８２４号又は同４，５９６，５５６号に開示された装置などの針皮下注射装置を用いて投与することができる。本発明において有用である周知の移植物及びモジュールの例としては、薬物を制御された速度で分注する移植可能な微小輸液ポンプを開示した米国特許第４，４８７，６０３号、医薬品を皮膚から投与する治療用装置を開示した米国特許第４，４８６，１９４号、薬物を正確な注入速度で送達する薬物注入ポンプを開示した米国特許第４，４４７，２３３号、連続薬物送達のための移植可能な可変流注入装置を開示した米国特許第４，４４７，２２４号、多室型区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示した米国特許第４，４３９，１９６号、及び浸透圧薬物送達システムを開示した米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許を参照により本明細書に援用する。多数の他のこうした移植物、送達システム及びモジュールが当業者に知られている。
【０２２４】
ある実施形態においては、本発明の少なくとも一部の実施形態に係るＣ１ＯＲＦ３２可溶性タンパク質、Ｃ１ＯＲＦ３２外部ドメイン、Ｃ１ＯＲＦ３２融合タンパク質、別のタンパク質又は別の治療薬を、インビボで適切に分布するように処方することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ：ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療用化合物が（必要に応じて）ＢＢＢを確実に通過するように、それらを、例えば、リポソーム中に処方することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同５，３７４，５４８号及び同５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に輸送され、したがって標的薬物送達を向上させる１種以上の成分を含むことができる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。例示的なターゲティング成分としては、葉酸塩又はビオチン（例えば、Ｌｏｗら、米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）；Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３も参照されたい。
【０２２５】
非経口投与製剤
更なる一実施形態においては、ペプチド及びポリペプチドを含むものを含めて、本明細書に開示した組成物を水溶液で非経口注射によって投与する。製剤は、懸濁剤又は乳濁剤の形とすることもできる。一般に、医薬組成物は、有効量のペプチド又はポリペプチドを含んで提供され、場合によっては、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を含む。こうした組成物は、場合によっては、以下の１種以上を含む：希釈剤、滅菌水、種々の緩衝剤内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝食塩水、洗浄剤及び可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート−８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；及びクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）及びバルキング物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤。非水系溶媒又はビヒクルの例は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、トウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）又は減圧乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁させることができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルタ濾過によって、殺菌剤を組成物に混ぜ込むことによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって、滅菌することができる。
【０２２６】
局所投与製剤
本明細書に開示した種々のポリペプチドを局所的に適用することができる。局所投与は、大部分のペプチド製剤では十分機能しないが、特に、肺、経鼻、経口（舌下、頬）、膣又は直腸粘膜に適用すると有効であり得る。
【０２２７】
組成物は、吸入中に肺に送達することができ、空気力学的直径約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子として送達すると、肺上皮層を横切って、血流に入る。
【０２２８】
そのすべてが当業者によく知られた、噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器を含めて、ただしそれらに限定されない、治療用製品の肺送達用に設計された広範囲の機械装置を使用することができる。市販装置の幾つかの具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州）、ＡｃｏｒｎＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、イングルウッド、コロラド州）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ノースカロライナ州）、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、マサチューセッツ州）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ及びＭａｎｎｋｉｎｄすべてが、認可された又は臨床試験中の吸入可能なインスリン粉末調製物を有し、その技術を本明細書に記載の処方に応用することができる。
【０２２９】
粘膜投与製剤は、一般に、噴霧乾燥薬物粒子であり、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、懸濁剤又は乳濁剤に混ぜ込むことができる。標準医薬品賦形剤は、任意の処方者から入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲル片、錠剤又はロゼンジの形とすることができる。
【０２３０】
経皮製剤を調製することもできる。これらは、一般に、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤又は貼付剤であり、そのすべてを標準技術によって調製することができる。経皮製剤は、浸透促進剤を含める必要がある。
【０２３１】
制御送達ポリマーマトリックス
本明細書に開示した種々のポリペプチドを制御放出製剤として投与することもできる。ポリマー装置（棒、円柱、膜、円盤）の移植又は注射（微粒子）に続いて全身的に長期放出するための制御放出ポリマー装置を作製することができる。マトリックスは、ミクロスフェアなどの微粒子の形とすることができ、ペプチドは、固体ポリマーマトリックス又はマイクロカプセル内に分散され、コアはポリマーシェルとは異なる材料でできており、ペプチドはコアに分散又は懸濁され、コアは本質的に液体又は固体とすることができる。特に本明細書で定義しない限り、微粒子、ミクロスフェア及びマイクロカプセルは区別なく使用される。あるいは、ポリマーをナノメートルから４センチメートルの薄板又は膜、粉砕又は別の標準技術によって製造される粉末、更にはヒドロゲルなどのゲルとしてキャストすることができる。
【０２３２】
非生分解性又は生分解性マトリックスをポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸の送達に使用することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは、天然又は合成ポリマーとすることができるが、分解及び放出プロファイルの特性分析がより良好な合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。ある場合には線状放出が最も有用であり得るが、別の場合にはパルス放出又は「バルク放出」がより有効な結果をもたらし得る。ポリマーは、ヒドロゲルの形とすることができ（一般に、最高約９０重量％の水を吸収する）、場合によっては多価イオン又はポリマーで架橋することができる。
【０２３３】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、及び当業者に既知の別の方法によって形成することができる。生侵食性ミクロスフェアは、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５：１３〜２２（１９８７）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，６：２７５〜２８３（１９８７）；及びＭａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＳｃＬ，３５：７５５〜７７４（１９８８）によって記述されたように、薬物送達用ミクロスフェアを製造するために開発された方法のいずれかによって調製することができる。
【０２３４】
装置は、一般に全身処置のための投与量よりはるかに少ない投与量を送達する、移植又は注射の領域を処置する局所放出用に、又は全身送達用に、組み立てることができる。これらは、皮下、筋肉、脂肪に移植若しくは注射することができ、又は嚥下することができる。
【実施例】
【０２３５】
ＤＳＰ融合タンパク質とリガンドの組合せの非限定的例としてのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫ
本明細書に記載の通り、多種多様な成分１（受容体「Ｂ」のＥＣＤなど）及び成分２（リガンド「Ｃ」など）タンパク質、並びにそれらの機能的部分は、場合によっては、融合タンパク質（「Ｂ−Ｃ」）を形成することができ、融合タンパク質は、場合によっては、融合タンパク質の受容体（「Ｂ」）に対するリガンド（「Ａ」）の存在下で、及び／又は融合タンパク質のリガンド（「Ｃ」）に対する受容体（「Ｄ」）の存在下で、安定化及び／又は投与することができる。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、こうした融合タンパク質の非限定的例であり、その詳細な実験法及び結果については後述する。しかし、別の成分１及び成分２タンパク質（及びそれらの機能的部分）も少なくとも類似の挙動を示すＤＳＰ融合タンパク質を形成すると考えられる。適切な成分１及び成分２タンパク質を表１に列挙する。
【０２３６】
血液悪性腫瘍におけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの有効性の向上を実証する研究が、機能的ＴＲＡＩＬ分子をＴＮＦ様の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）の受容体である線維芽細胞成長因子誘導性１４分子（Ｆｎ１４）と組み合わせる融合タンパク質Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬを用いて行われた。ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）は、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、リンパ球、及び大部分の形質転換血液学的系統の細胞を含めて、広範囲の造血細胞型上で膜貫通ＩＩ型タンパク質として一般に発現されるＴＮＦリガンドスーパーファミリーの別のメンバーである。ＴＷＥＡＫは、当初、ある種の腫瘍細胞系のアポトーシス促進性因子として記述されたが、その後の研究によって、細胞増殖、生存及び分化を含めた多数の他の細胞応答を刺激し得ることが明らかになった。血液悪性腫瘍は、一般に、Ｆｎ１４受容体を欠き、したがって、大部分はＴＷＥＡＫによるシグナル伝達に対して耐性がある。
【０２３７】
ＴＲＡＩＬは、その細胞死受容体とＴＷＥＡＫの両方に融合タンパク質のＦｎ１４成分を介して固定されると、悪性腫瘍においてより強力なアポトーシス促進性シグナル伝達を導くと仮定された。研究の結果は、悪性細胞上のＴＲＡＩＬ受容体へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの優先的な結合、及びその低いアポトーシス促進能力を示している。しかし、組換えＴＷＥＡＫは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質分子の最も効率的な修飾を引き起こし、試験したすべての血液学的悪性系統及び腎細胞癌において強力なアポトーシスを誘発可能なスーパーＴＲＡＩＬにそれを変換させた。
【０２３８】
実験手順
試薬
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ）は、Ｃｏｂｒａ  Ｂｉｏ−ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（キール、英国）によって、ＣＭＶプロモータの下流のキメラヒトＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ配列をコードするＤＮＡ構築物を安定に移入されたチャイニーズハムスター卵巣細胞から製造され、９５％純度に精製された。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸５３〜２１７）に直接連結されたヒトＦｎ１４の細胞外ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸１〜５２）を含む。
【０２３９】
可溶性組換えヒトＴＷＥＡＫ、Ｆｎ１４及びＴＲＡＩＬ
Ｆｎ１４及びＴＲＡＩＬをＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ロッキーヒル、ニュージャージー州、米国）から購入した。カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ及びＺ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を製造者の指示に従って機能的研究に使用した。
【０２４０】
細胞系
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病、２種のバーキットリンパ腫Ｂ細胞系、Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ及びＡ４９８腎細胞癌細胞系をＡＴＣＣ（ベセズダ、メリーランド州、米国）から得た。ＪＹ  Ｂ−リンパ芽球系は、Ｍａｒｋ  Ｌ．Ｔｙｋｏｃｉｎｓｋｉ教授、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、米国）の好意によって提供された。すべての系を市販ＰＣＲキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を用いてマイコプラズマについて定期的に試験した。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ培地中で細胞を培養した。培地成分はすべてＲｈｅｎｉｕｍ（Ｍｏｄｉ’ｉｎ、イスラエル）によって供給された。
【０２４１】
フローサイトメトリー
膜結合ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＤＲ４、ＤＲ５又はＦｎ１４の検出のための免疫染色を、最適な濃度のフィコエリトリン（ＰＥ）複合化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて実施した。すべてのＰＥ複合化特異的ｍＡｂ及び関連するアイソタイプ対照をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から得た。フローサイトメトリーをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州、米国）によって行った。合計２０＊１０３事象を各試料でカウントした。データをＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ４ソフトウェア（ｗｗｗ．ｄｅｎｏｖｏｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ）によって解析した。
【０２４２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞系におけるＴＷＥＡＫ過剰発現
Ｊｕｒｋａｔ細胞系（ＡＴＣＣ）細胞を、加湿された３７℃及び５％ＣＯ２恒温器中のＬ−グルタミン及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で懸濁状態で増殖させた。
【０２４３】
１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞に、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたヒト完全長ＴＷＥＡＫタンパク質をコードする２種の発現ベクターのうち一つのＪｕｒｋａｔマイクロポレーション最適化電気穿孔パラメータプロトコル（Ｎｅｏｎ（商標）移入システム細胞プロトコル）を用いて、Ｒ緩衝剤中の超高純度プラスミドＤＮＡ５マイクロｇと、移入効率評価用ＧＦＰ発現プラスミドを同時移入した。２種の発現ベクターは、恒常的なタンパク質発現をどちらも促進する哺乳動物プロモータ：ｐＣＲ３．１＆ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１が異なる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。次いで、同時移入細胞を上記培地及び条件で培養した。４８時間目に、ｐＣＲ３．１（１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８）及びｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１（５マイクログラム／ｍｌブラスチシジン）の特異的抗生物質選択を含む標準補足培地で細胞を培養した。淘汰圧下で３週間後、１ｘ１０６個の細胞を上清培地採取のために補足通常培地中で４日間培養して、可溶形態のＴＷＥＡＫの存在について試験した。細胞の残りを、膜完全長ＴＷＥＡＫタンパク質の検出のために抗生物質選択下に残した。移入細胞における膜ＴＷＥＡＫの存在をＦＡＣＳによって抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を用いて確認した。
【０２４４】
アポトーシス誘導及び検出
指定の細胞（５＊１０５）を指定濃度の目的タンパク質を含むＲＰＭＩ培地中で指定時間培養した。アポトーシス誘導処理後、細胞を製造者の推奨に従ってアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アポトーシス検出キット（ＭＢＬ、デスプレーンズ、イリノイ州、米国）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。合計２０＊１０３事象を各試料でカウントした。結果をすべてのアポトーシス細胞（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−及びＦＩＴＣ＋ＰＩ＋）の平均割合±ＳＥとして示した。場合によっては、アポトーシス動態研究において、初期アポトーシス段階の細胞（ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）の割合も示した。
【０２４５】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合したＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ修飾Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬの分析
標的細胞へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ修飾Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合モードを、指定タンパク質と一緒にインキュベートした前後のＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ受容体の発現に従って、ＴＲＡＩＬ結合と比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（３＊１０６）を２５０ｎｇ／ｍＬ  ＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫの存在下で４℃で３０分間インキュベートした。結合していないタンパク質を洗浄除去し、各細胞バッチ及び未処理細胞を関連ＰＥ標識抗体で免疫染色して細分し、ＦＡＣＳによって分析した。ＤＲ５中和ｍＡｂ８０μｇ／ｍｌと一緒にプレインキュベートした細胞を用いて同じ実験を繰り返した。
【０２４６】
アポトーシスシグナル伝達に関与する分子の機能解析のために、ＴＲＡＩＬ２５ｎｇ／ｍｌ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ２５ｎｇ／ｍｌ、ＴＷＥＡＫ１００ｎｇ／ｍｌと組み合わせたＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ２５ｎｇ／ｍｌ、又はＴＷＥＡＫ単体の添加３０分前に、Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＤＲ５又はＴＲＡＩＬ（２０μｇ／ｍｌ）に対する中和抗体をＪｕｒｋａｔ細胞（０．５＊１０６／ｍｌ）に添加した。アポトーシスを２４時間目に測定した。ＴＷＥＡＫ（クローンＣａｒｌ−１）に対する中和抗体をＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から購入し、ＴＲＡＩＬ（ＲＩＫ−２）、ＤＲ５（ＨＳ２０１）及びＦｎ１４（ＩＴＥＭ−２）に対する中和抗体、適切なアイソタイプ対照をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から購入した。
【０２４７】
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫによるアポトーシス誘導に対する活性化Ｔ芽細胞感受性の評価のための正常末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のインビトロでの活性化
製造者の指示に従ってＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ、オスロ、ノルウェー）密度勾配遠心法によってＰＢＬをヒトボランティアの血液から単離した。ＰＢＬ（１０６細胞／ｍＬ）をＲＰＭＩ培地中で０．１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）と一緒に３７℃及び５％ＣＯ２で３日間培養した。更なる培養（最高１６日間）のために細胞を１０ＥＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ培地（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、バーゼル、スイス）中に再懸濁させた。指定の時点で（培養３、１０及び１６日）、１００ｎｇ／ｍＬ抗ＦＡＳｍＡｂ（ＣＨ−１１、ＭＢＬ、デスプレーンズ、イリノイ州、米国）、２５０ｎｇ／ｍＬ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、又は１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫと組み合わせた２５０ｎｇ／ｍＬ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬを培養物に添加した。アポトーシスを２４時間目に測定した。
【０２４８】
全細胞溶解物及びウエスタンブロット法
タンパク質発現を確認するために、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤ＰｈｏｓＳＴＯＰカクテル（Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイス）を補充した１２５μｌ溶解緩衝剤（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５％ノニデットＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に２＊１０７細胞を溶解して、全細胞溶解物を調製した。分析のために、溶解物を１２％又は１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、マサチューセッツ州、米国）に移した。免疫ブロットを以下の抗体を用いて行った：抗カスパーゼ−８（９７４６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗カスパーゼ−９（ＬＡＰ６、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗カスパーゼ−３（９６６２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＦＬＩＰ（ＮＦ−６、Ｅｎｚｏ）、抗Ｂｉｄ（２００２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｒｉｐ（Ｄ９４Ｃ１２ＸＰ（商標）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＮＦκＢ  ｐ６５（Ｃ−２０：ｓｃ−３７２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＩｋＢα（４１７２０８、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（６Ｃ５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。西洋ワサビペルオキシダーゼと対になった第２の種特異的抗体をＢｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）から購入した。化学発光検出キットＥＺ−ＥＣＬ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｃ、イスラエル）を免疫特異的バンドの検出に使用した。
【０２４９】
ウエスタンブロット分析
免疫ブロットデータをＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いてＧＡＰＤＨに対して規準化した。図は、溶解物において特異的Ａｂによって検出された総タンパクの切断（活性化）タンパク質画分の平均±ＳＥとしてＧＡＰＤＨ規準化データを示す。すなわち、ｐ１８／全カスパーゼ−８画分を同じウェルにおいてｐ１８／（ｐ１８＋ｐ４１−４３＋ｐ５５）として計算し、ｐ３４−３５／全カスパーゼ−９画分を同じウェルにおいてｐ３４−３５／（ｐ３４−３５＋ｐ４５）として計算した。そうでなく、タンパク質発現の変化がタンパク質切断を伴わなかったときには、結果をＧＡＰＤＨと未処理対象の両方に対して規準化した。３〜５個の独立したウエスタンブロットを各タンパク質について分析した。
【０２５０】
非変性天然ゲル電気泳動
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ４〜１６％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌｓ及び試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、電気泳動及びウエスタンブロット法を製造者の手順に従って実施した。手短に述べると、複合体形成のために、等モル量の組換えヒトｓＴＷＥＡＫ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝剤、ｐＨ７．２、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ中５０ｎｇ／μｌ）とＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（同じ緩衝剤中７０ｎｇ／μｌ）を混合し、天然ゲル電気泳動前に氷上で１０分間インキュベートした。Ｔｗｅａｋ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ又はそれらの組合せ（２μｌ）を１μｌ  ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥカソード添加剤（ｘ２０）、２．５μｌ  ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ試料緩衝剤（ｘ４）及び脱イオン水と混合して、総体積１０μｌ／レーンにした。電気泳動を２時間１５０ｖで室温で行った。ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｔａｎｄａｒｄをＴＷＥＡＫ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びそれらの複合体の分子サイズ推定に使用した。ゲル電気泳動後、タンパク質を抗ＴＲＡＩＬ抗体（Ａｂｅａｍ）又は抗ＴＷＥＡＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた免疫ブロット用にＰＶＤＦ膜に移した。
【０２５１】
統計解析
結果を３つ又は４つの独立した実験の平均割合及びそれらの標準誤差として表した。データを分散分析によって分析して、異なる実験群を比較した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０２５２】
実施例１
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、白血病細胞系において弱いアポトーシス誘導物質である。
【０２５３】
上記例は、ヒト白血病及びリンパ腫細胞系に対するＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの効果を考察したものである（図１Ａ）。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬ）と一緒に２４時間インキュベートするとＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病及びＪＹリンパ芽球様Ｂ細胞系においてはアポトーシスを誘導したが（最大死亡率は約３０％であった）、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ（バーキットリンパ腫患者由来の２つの系）は、最高Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ投与量でインキュベートしたときでも、アポトーシスに対して抵抗性のままであることが判明した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒のインキュベーション時間を４８時間に延長してもインビトロでの細胞死は実質的に増加しなかった（データ示さず）。
【０２５４】
融合タンパク質の成分の一つであるＴＲＡＩＬは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ感受性リンパ芽球様細胞系においてＦｎ１４−ＴＲＡＩＬよりも強力なアポトーシスを誘導することが判明した（図１Ｂ）。しかし、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬに抵抗性の細胞系は、ＴＲＡＩＬにも抵抗性であった。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ感受性Ｊｕｒｋａｔ細胞系を用いて、インビトロでのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（２５０ｎｇ／ｍｌ）の細胞死誘導能力を、同量の第２のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ成分可溶性Ｆｎ１４（ｓＦｎ１４）、又はＴＲＡＩＬと組み合わせたｓＦｎ１４によって引き起こされる細胞死と比較した。図１Ｃに示したように、ｓＦｎ１４は、細胞単体と一緒にインキュベートしたときにインビトロで実質的なアポトーシスを誘導することができず、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに何も付け加えない。
【０２５５】
実施例２
ＴＷＥＡＫは、悪性リンパ芽球のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを有意に増強する。
【０２５６】
ＴＷＥＡＫは、その受容体Ｆｎ１４に効率的に結合することができる。したがって、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ誘導性抗癌毒性の変更においてＴＷＥＡＫ結合が果たし得る役割を評価する実験を行った。ＴＷＥＡＫ用量（１００ｎｇ／ｍＬ）を機能的研究に最も有効な用量として選択した。図１Ｄに示した結果によれば、ＴＷＥＡＫと一緒の細胞インキュベーションは、インビトロでリンパ芽球様細胞のアポトーシスをもたらさない。しかし、同じＴＷＥＡＫ用量をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬに添加すると、試験したすべてのリンパ芽球様細胞系においてアポトーシス誘導を増幅した（図１Ａと１Ｄを比較）。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せに起因するアポトーシスは、すべての評価細胞系、すなわちＲａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、ＪＹ及びＪｕｒｋａｔにおいてＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスよりも顕著であった（図１Ｂと１Ｄを比較）。ＴＷＥＡＫをＴＲＡＩＬに付加しても、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを増加できなかった（図１Ｅ）。これらの結果が示唆するところによれば、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬに結合したＴＷＥＡＫは、癌細胞においてアポトーシスを誘導する融合タンパク質の能力を特異的に増強する。
【０２５７】
実施例３
健常者由来の活性化末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せによるアポトーシスに対して比較的抵抗性である。
【０２５８】
積み重なる証拠は、免疫応答の調節におけるＴＲＡＩＬの生理学的役割を実証している。ＴＲＡＩＬは、インビトロで活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローン及びＰＢＬのアポトーシスを起こすことが示された。したがって、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫによる組合せ処置が活性化正常ＰＢＬにおいてアポトーシスを誘導するかどうか実験で調べた。０．１μｇ／ｍＬアゴニスト抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）と一緒にインビトロで３日間インキュベートしたヒトＰＢＬを、アポトーシス誘導のために２５０ｎｇ／ｍＬ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＴＷＥＡＫと一緒に２４時間培養した。そうでなければ、ＯＫＴ３活性化ＰＢＬを１０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した培地中で、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫと一緒にインキュベートする前に、更に１０又は１６日間放置した。１００ｎｇ／ｍＬ  抗ＦＡＳｍＡｂによるアポトーシス誘導に対する同様に処理したＰＢＬの感受性を活性化の正の対照とした。図１４Ａ〜Ｄに示した結果によれば、ＯＫＴ３ｍＡｂと一緒に３日間インキュベートしたＰＢＬは、抗ＦＡＳとＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫの両方によるアポトーシス誘導に対して非感受性のままであった。ＩＬ−２濃縮培地中で更に１０日間培養すると、ＰＢＬは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ（対照に対して３１．９％±０．０３％死細胞）並びに抗ＦＡＳｍＡｂ（対照に対して５０．６％±４．８％死細胞）によるアポトーシスに対して中程度の感受性になった。しかし、悪性Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫ並びに抗ＦＡＳに対してはるかに強い感受性を示した（対照に対して８６．１％±５％及び８０．９％±１．６％死細胞）。ＰＢＬは、ＩＬ−２濃縮培地中で１６日間の培養後にＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫによるアポトーシスに対する感受性を失ったが、抗ＦＡＳによるアポトーシスに対する感受性は高いままであった（５９．４％±５．６％）。こうして、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫは、１０日目に統計的に有意な中等度のアポトーシスの効果を示し、その後弱まった。
【０２５９】
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬとＴＷＥＡＫの組合せによって誘導されるアポトーシスに対する悪性リンパ芽球の感受性は、高レベルのＤＲ５と相関する。
【０２６０】
結合分子プロファイルがＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫによるアポトーシスに対する感受性を予測できるかどうか評価するために、白血病のリンパ芽球又はリンパ腫細胞系上の膜結合Ｆｎ１４並びにＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５の発現についてＦＡＣＳ分析を行った。図１５Ａ〜Ｃは、Ｆｎ１４が試験系のいずれでも発現されなかったことを示している。膜結合ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４に陽性な細胞の割合は、系ごとに異なり、アポトーシスに対する感受性と相関しなかった。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及びＴＷＥＡＫによるアポトーシスに最も感受性の高いＪｕｒｋａｔ芽細胞は、ＤＲ４を全く発現しなかった。それに対して、アポトーシス感受性のＪｕｒｋａｔ及びＪＹリンパ芽球上のＤＲ５発現は、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞などのアポトーシス耐性細胞上のＤＲ５発現よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【０２６１】
実施例４
ＴＷＥＡＫの存在下のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬは、ＤＲ５受容体を介して白血病細胞に結合する。
【０２６２】
次に、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、及びＴＷＥＡＫの存在下のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫ）がＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５を介してＪｕｒｋａｔ細胞に結合するかどうか実験で評価した。したがって、Ｊｕｒｋａｔ細胞をアポトーシス誘導のためにＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫで処理する前にＴＷＥＡＫ、ｓＦｎ１４、ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５に対する中和ｍＡｂと一緒にインキュベートした。図２に示した結果によれば、ＴＷＥＡＫ又はＦｎ１４を阻止する抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫによって誘導される細胞死を有意に減少させることができたが、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体の投与前に添加すると無効であった。一方、ＤＲ５及びＴＲＡＩＬを阻止する抗体は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫによって誘導されるアポトーシスをかなり減少させることができた。これらの結果は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質がＤＲ５受容体を介してＪｕｒｋａｔ細胞に結合し、ＴＷＥＡＫがこの結合を修飾することを示唆している。
【０２６３】
次に、ＴＲＡＩＬ、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫと一緒のインキュベーション前後の細胞上のＤＲ５受容体の検出を、結合タンパク質のキャッピングを防止する条件（４℃）において、フローサイトメトリーによって試験した。ＴＲＡＩＬ又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒のＪｕｒｋａｔ細胞インキュベーション後に、ＤＲ５＋細胞の割合の有意な減少が認められ（図３Ａ）、ＤＲ５受容体へのこれらのタンパク質の結合が示唆された。重要なことには、細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫと一緒にインキュベートしたときに、ＤＲ５がほとんど検出されず、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫがＴＲＡＩＬ受容体へのより強力な結合を発揮することが示唆された。
【０２６４】
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬがそのＴＲＡＩＬ側を介して細胞に結合するという仮定の別の裏づけは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒のインキュベーション後のＦｎ１４＋Ｊｕｒｋａｔ細胞の割合が有意に増加することからきている（図３Ｂ）。Ｆｎ１４＋細胞の割合のこの増加は、ＤＲ５中和抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞の前処理によって妨げられた。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫと一緒のインキュベーションは、Ｆｎ１４＋細胞の割合の実質的な増加を起こさなかった。これは、恐らく、融合タンパク質のＦｎ１４部分に結合したＴＷＥＡＫが蛍光色素標識抗体によるＦｎ１４検出を妨げたためである。
【０２６５】
実施例５
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの結合は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬよりも早く強力な悪性リンパ芽球のアポトーシス死を生じる。
【０２６６】
アポトーシス誘導の動力学は、薬物の抗癌効力に影響する重要な薬理学的要因である。したがって、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ及びＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫによるアポトーシス誘導の動力学を比較した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの強い初期のアポトーシス効果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、インキュベーション開始後３０分で早くも見られ、１時間でピークに達した（図４Ｂ）。それに対して、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ単体又はＴＲＡＩＬ単体の両方は、はるかに弱いアポトーシスを誘導した。処理の明確な効果は、１〜２時間のインキュベーション後に検出され、次の２時間以内にアポトーシス細胞の割合が少し増加した（図４Ａ及び４Ｃ）。
【０２６７】
実施例６
細胞をＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫと共培養することによって誘導される細胞死がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫによるアポトーシスに起因したという仮定の追加の証拠を探索すること（図４Ｄ）。さらに、カスパーゼ−８阻害剤Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ及びカスパーゼ−９阻害剤Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫの添加は、アポトーシスを部分的に阻止し、細胞死の媒介における両方のカスパーゼ経路（内因性と外因性）の寄与を示している（図４Ｄ）。
【０２６８】
実施例７
ＴＷＥＡＫをＦｎ１４−ＴＲＡＩＬに付加すると、大きい複合体の形成を誘発する。
【０２６９】
次に、本発明者らは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬのＦｎ１４成分へのＴＷＥＡＫの結合がＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体形成をもたらすかどうか調べた（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によれば、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬモノマーの近似分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）は２５〜２７．５ｋＤａである。ＢＮ−ＰＡＧＥ及び抗ＴＲＡＩＬ特異的モノクローナル抗体を用いた免疫ブロット後に、融合タンパク質を約６６ｋＤａのバンドとして検出し（三量体の推定ＭＷは７４ｋＤａである）、別のバンドは約２０ｋＤａに見られ、モノマーサイズに最も近い（モノマーの推定ＭＷは２５ｋＤａである）。ＰｅｐｒｏＴｅｃｈによって製造される可溶性ＴＷＥＡＫのモノマーはＭＷ１７ｋＤａである。ＢＮ−ＰＡＧＥ及びＴＷＥＡＫ特異的モノクローナル抗体を用いた免疫ブロット後、それは約６０ｋＤａの単一バンドとして検出された。抗ＴＷＥＡＫ抗体と抗ＴＲＡＩＬ抗体は交差反応しない。それでも、等モル量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの混合物が両方の抗体によって約２４２ｋＤａの同じバンドとして検出され（Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ＋ＴＷＥＡＫの六量体の推定ＭＷは２５０ｋＤａである）、約４８０ｋＤａに関連のある別のバンドも別のより大きいバンドと一緒に見られた。この結果は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫが安定な複合体をインビトロで形成することを示唆する。
【０２７０】
実施例８
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの組合せは、細胞内アポトーシス促進性シグナル伝達の活性化を促進し、抗アポトーシスシグナル伝達を阻害する。
【０２７１】
ＴＷＥＡＫ修飾Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘導の加速に寄与する分子機構を特定するために、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ又はＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体によって処理されたＪｕｒｋａｔ細胞における幾つかの重要なアポトーシス関連タンパク質の発現動力学を評価した。カスパーゼ活性化の動力学のモニタリングによって、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬが、試験した時間間隔（最初の９０分）内にアポトーシスを誘導するのにあまり効果のないことが明らかになった。したがって、調べたタンパク質すべての発現をＴＲＡＩＬ処理とＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体処理で比較した（図６、７）。本発明者らは、ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体が、ＴＲＡＩＬと比較して、カスパーゼ−８及び−９の活性化を有意により早く、より強く誘導し、ＢＩＤからｔＢＩＤへのプロセシングをより早く誘導することを見いだした。ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体は、カスパーゼ−３及びＰＡＲＰの活性化も加速した。ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体処理によるアポトーシス促進性タンパク質活性化の誘導は、抗アポトーシス性ｃＦＬＩＰ  ｓｈｏｒｔの発現減少、ＲＩＰの切断、及びｃ−ＩＡＰ１タンパク質の欠乏に関連した。同様の、しかし統計的に有意でない、Ｃ−ＩＡＰ２発現の減少傾向をＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体による細胞の処理後に検出した（データ示さず）。ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ複合体処理細胞とＴＲＡＩＬ処理細胞の細胞質ゾルにおけるＢＣＬｘ及びＸＩＡＰタンパク質発現レベルは、類似していた（データ示さず）。
【０２７２】
実施例９
ＴＷＥＡＫ及びＧＦＰを同時移入したＪｕｒｋａｔ細胞
Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ）細胞に、方法に記載のようにヒト完全長ＴＷＥＡＫタンパク質ｐＣＲ３．１及びｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１（ｐＤＥＳＴ−ＥＦ１）をコードする２個のプラスミドを移入した。移入効率をＧＦＰプラスミドの同時移入によって評価した（図８）。
【０２７３】
ＴＷＥＡＫを移入したＪｕｒｋａｔ細胞は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬアポトーシス誘導効果に対して高い感受性を示す。
【０２７４】
細胞膜上のＴＷＥＡＫの存在をフローサイトメトリーによって確認した後、可溶及び／又は膜結合型のＴＷＥＡＫの活性を生物学的機能アッセイＭＴＳによって試験した。前のデータ（上記参照）に基づくと、外因性ＴＷＥＡＫの付加は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導能力を増大させる。
【０２７５】
Ｊｕｒｋａｔ未処理細胞の生存を、漸増量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒の２４時間のインキュベーション後にＪｕｒｋａｔ  ＴＷＥＡＫ移入細胞と比較した。
【０２７６】
細胞生存の約３０％の減少が高Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ濃度（３００ｎｇ／ｍｌ）で培養した未処理Ｊｕｒｋａｔ細胞において認められた。重要なことには、より明白な効果が移入細胞で認められた。ＴＷＥＡＫ移入Ｊｕｒｋａｔ細胞では、細胞生存の約７０％の減少が、はるかに低いＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ濃度（例えば、３ｎｇ／ｍｌ）でも認められた（図９）。２つの移入細胞系で見られる相違は、異なる移入構築物のプロモータ能力にあるかもしれない。
【０２７７】
３０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ及び３０ｎｇ／ｍｌ組換え可溶性ＴＷＥＡＫと一緒の移入及び未処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のインキュベーションは、約１００％の細胞死をもたらし、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬアポトーシス誘導に対するＴＷＥＡＫの効果の増大を示している。
【０２７８】
ＴＷＥＡＫ移入細胞由来の培養上清は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ死誘導効果を高める。
【０２７９】
可溶型のＴＷＥＡＫの存在を試験するために、ヒト完全長ＴＷＥＡＫ遺伝子を移入した細胞を濃縮し（抗生物質選択し）、通常の細胞培地で４日間培養した。次いで、上清を収集し、３ｎｇ／ｍｌ及び３０ｎｇ／ｍｌのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの存在下で２４時間インキュベートした未処理Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加した。
【０２８０】
図１０に見られるように、ＴＷＥＡＫ遺伝子移入細胞から収集された培養上清の添加は、未処理細胞から収集された上清のゼロ効果、又はＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ若しくは組換え可溶性ＴＷＥＡＫの効果（約３０〜３５％）に比べて細胞生存のかなり高い（６５〜９５％）減少をもたらした。
【０２８１】
実施例１０
ＴＷＥＡＫは腎細胞癌細胞生存に対するＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ阻害効果を増強する。
【０２８２】
次に、異なる細胞系においてＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ活性を増強するＴＷＥＡＫの能力を試験した。腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系のＡ４９８細胞を、ＴＷＥＡＫの存在又は非存在下で、漸増量のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬと一緒に２４時間インキュベートした。図１１に示すように、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬプラスＴＷＥＡＫの添加は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬの阻害効果を大きく増加させた。
【０２８３】
実施例１１
ＴＷＥＡＫは、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合を改善する。
【０２８４】
細胞生存率の減少、カスパーゼの活性化の増大、及び抗アポトーシスシグナルの阻害によって見られるように、ＴＷＥＡＫがＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ活性を増強することが示された後、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ５へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合に対するＴＷＥＡＫの効果を試験した。そのためにＢｉａ−ｃｏｒｅアッセイを使用した。Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、又は異なる用量のこれら２つの組合せを、ＤＲ５で覆われたＢｉａ  Ｃｏｒｅチープ（ｃｈｅａｐ）上に載せた。図１２に見られるように、ＴＷＥＡＫ自体はＤＲ５に結合しない。予想どおりに、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬはＴＲＡＩＬ受容体に結合する。重要なことには、漸増量のＴＷＥＡＫの付加は、ＤＲ５へのＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合をかなり増大させた。
【０２８５】
実施例１２
Ａ４９８ＲＣＣ細胞は、ＴＷＥＡＫをノックアウトするとＦｎ１４−ＴＲＡＩＬに対して抵抗性になる。
【０２８６】
ＴＷＥＡＫ遺伝子をノックアウトするために、ＴＷＥＡＫ遺伝子を置換するＧＦＰ又はＲＰＦ遺伝子を相同組換えによって野生型Ａ４９８ＲＣＣ細胞に二重移入した（図１３Ａ）。細胞をＦＡＣＳによって選別し、全細胞溶解物を抗ＴＷＥＡＫ  Ａｂを用いて免疫ブロットすることによってＴＷＥＡＫ発現の喪失を試験した（図１３Ｂ）。野生型及びＴＷＥＡＫノックアウト細胞を、漸増濃度のＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの存在下及び非存在下で２４時間インキュベートした。細胞の生存率をＭＴＳアッセイによって推定した。図１３Ｃ〜Ｄに示すように、ＷＴＡ４９８細胞は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬに対してかなりの感受性を示し（図１３Ｃ）、ＴＷＥＡＫ  ＫＯ細胞ははるかに抵抗性であったが図１３Ｄ、ＴＷＥＡＫを培地に添加すると（図１３Ｅ）、細胞は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬの阻害効果に対するその感受性を取り戻した。これらの結果は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬがそのアポトーシス効果をＴＷＥＡＫの存在に依存していることを強調するものである。
【０２８７】
概して、総合すると、データは、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質へのＴＷＥＡＫの結合が、ＴＲＡＩＬ受容体に対するＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの結合及び活性化並びにその機能活性を向上させる、類似の特異的で極めて有効な方法とみなし得ることを示している。
【０２８８】
実施例１３
ループス／免疫複合体腎炎における活性試験に適切なネズミモデルにおけるＦｎ１４−ＴＲＡＩＬ活性の評価
糸球体腎炎の誘発
腎毒性血清腎炎モデルは、免疫複合体糸球体腎炎の確立されたモデルであり（Ｙ．Ｆｕ、Ｙ．Ｄｕ、Ｃ．Ｍｏｈａｎ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉ−ＧＢＭ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２４（２００７）１０９〜１１８）、十分に認められ、ループス腎炎の異なる処置計画の実現性を試験するモデルである。このモデルにおいては、腎損傷は、ウサギ抗マウス糸球体抗体からウサギＩｇＧで前免疫されたマウスへの受身伝達によって誘導される。これは、受身伝達されたウサギ抗マウス糸球体抗体と複合体を形成する抗ウサギ抗体をもたらす。それについては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの糸球体の単離を直径４．５μｍの磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて行った（Ｔａｋｅｍｏｔｏ  Ｍら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６１、Ｎｏ．３、２００２年９月）。糸球体を超音波処理し、タンパク質をＬｅｍｐｉｅｒ  ＬＴＤペンシルベニアによるウサギ免疫処置に送った。次いで、生成した腎毒性ウサギ血清を感作されたマウスに注射した（完全フロイントアジュバント中の２５０ｕｇウサギＩｇＧ（ＳＩＧＭＡイスラエル）を注射後５日）。臨床疾患を臨床徴候、血液、尿及び組織学的試料によって評価する。血清のクレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ：ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を分析する。タンパク尿レベルを尿試験紙及びタンパク質：クレアチニン比によって測定する。腎損傷も盲検の腎臓内科医（Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって組織学によって評価する。糸球体間質増殖、糸球体半月の存在、尿細管間質の変化（細管の炎症性浸潤、萎縮、拡張）を記録し、重症度レベルをスコア化する。さらに、腎臓患部における免疫複合体付着の評価のための腎臓検体の免疫蛍光染色を試験する。
【０２８９】
腎毒性糸球体腎炎に対するＦｎ１４−ＴＲＡＩＬの治療効果を確立する：
実験計画
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬタンパク質をマウスにｓ．ｃ注射によってウサギＩｇＧ注射後２日から８日まで投与する。
【０２９０】
Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬの治療効果を試験するために、各１０匹のマウスの幾つかの対照群を計画する：
Ａ．クエン酸塩緩衝剤（ビヒクル）を注射したマウス
Ｂ．従来の免疫抑制（ステロイド）処理したマウス
Ｃ．３つの処置群、すなわち５０、１００及び２００μｇ／ｄ／マウスが含まれる。
【０２９１】
統計的有意性を検出する能力を高めるためにグループサイズを決定した。
【０２９２】
血液及び尿試料を時間０（完全フロイントアジュバント中のウサギＩｇＧの注射時と定義される）、１日目、５日目（腎毒性ウサギ血清の注射）、７日目、１４日目及び２１日目に収集した。
【０２９３】
様々な時点（未決定の臨床パラメータ、最も可能性が高いのは１４、２１、２８日目）の腎臓を収集し、凍結切片及び免疫蛍光（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｃ３、Ｃ４、アルブミン）用に保存し、光学顕微鏡検査用にパラフィン切片として保存する。腎臓試料は、将来のＲＮＡ及びＤＮＡ試験用にも保存する。
【０２９４】
本発明者らの作業仮説は、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ処理が、糸球体腎炎の臨床及び組織学的パラメータを減衰させるというものである。処置群は、血清クレアチニン及び尿素の上昇がより小さく、（半月体形成、炎症性浸潤、尿細管間質損傷の減少、及び免疫複合体付着の減少に反映されるように）組織学的損傷がより少ないと予想される。処置計画の有効性を評価するために、処置中の異なる時点で血清試料を採取して、Ｆｎ１４−ＴＲＡＩＬ血清中濃度を測定する。
【０２９５】
実施例１４
実施例２及び実施例１０に詳述した実験を、Ｆｎ１４のＥＣＤ、及びＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、４１ＢＢＬ、ＴＮＦ−アルファを有する融合タンパク質を含む以下の組成物を用いて繰り返し、ＴＷＥＡＫを組成物に添加する：
予想される結果は、ＴＷＥＡＫの存在が、融合タンパク質単体の添加に起因するアポトーシスよりも、アポトーシスを促進するというものである。
【０２９６】
実施例１５
本発明の実施形態に係る可能なクラスター形成タンパク質の別の例。
Ａ−ＣＤ４０Ｌ
Ｂ−ＣＤ４０
Ｃ−ＦａｓＬ
Ｄ−Ｆａｓ（ＦａｓＬの受容体、ＣＤ９５）
【０２９７】
ＣＤ４０のＥＣＤのアミノ酸（１〜１９３）をＦａｓＬのＥＣＤ（１２７〜２８１）に融合して、ＣＤ４０−ＦａｓＬを形成した。ＣＤ４０Ｌ（リガンドＡとも称する第１のリガンド）の存在下で、又はＦａｓ（受容体Ｄとも称する第２の受容体）の存在下で試験するために、ＣＤ４０Ｌ又はＦａｓを、融合タンパク質ＣＤ４０−ＦａｓＬを含む培地に２：０．５〜１：５（ＣＤ４０−ＦａｓＬと添加融合タンパク質）の異なる比で添加し、Ｆｎ１４−ｔｒａｉｌプラスｔｗｅａｋの組合せで上述したように、タンパク質を天然ゲル上で分離する。得られたゲルを以下、すなわち、抗ＣＤ４０  Ａｂ、抗ＣＤ４０Ｌ  Ａｂ、抗ＦａｓＬ  Ａｂ及び抗Ｆａｓ  Ａｂのすべてを用いてブロットする。三量体より大きい複合体の存在は、クラスターの形成を支援する。
【０２９８】
ＣＤ４０−ＦａｓＬ活性に対するＣＤ４０Ｌの重要性を試験するために、Ｆａｓに陽性である（かつ、そのために、タンパク質のＦａｓＬドメインのアポトーシス効果に対して感受性である）が、ＣＤ４０Ｌに陰性である細胞を、外因性ＣＤ４０Ｌの存在又は非存在下でＣＤ４０−ＦａｓＬと一緒にインキュベートする。細胞生存をＭＴＳアッセイによって推定し、アポトーシス誘導をアネキシン／ＰＩ染色及びＦＡＣＳ分析によって評価する。それがＣＤ４０−ＦａｓＬタンパク質に結合するのを防止し、そのため、クラスターの形成を防止する、ＣＤ４０Ｌに対する阻止抗体の存在又は非存在下で、ＣＤ４０−ＦａｓＬアポトーシス効果に感受性の高いＦａｓ陽性及びＣＤ４０Ｌ陽性細胞上で別の実験セットを実施する。さらに、ＣＤ４０Ｌに陽性及び陰性である細胞の培地を、ＣＤ４０−ＦａｓＬと一緒にインキュベートし、クラスターの存在を上述したように天然ｐａｇｅゲルを用いて評価する。
【０２９９】
本発明を限られた数の実施形態に関して記述したが、本発明の多数の変更、改変及び別の適用が可能であり、実施形態の様々な組合せ及び下位組合せも可能であり、本願の範囲内に包含されることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2018510214.tif 000017
【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2018510214.tif 000020
【図２Ｃ】
2018510214.tif 000021
【図２Ｄ】
2018510214.tif 000022
【図３Ａ】
2018510214.tif 000023
【図３Ｂ】
2018510214.tif 000024
【図４Ａ】
2018510214.tif 000025
【図４Ｂ】
2018510214.tif 000026
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2018510214.tif 000029
【図５】
2018510214.tif 000030
【図６】
2018510214.tif 000031
【図７Ａ】
2018510214.tif 000032
【図７Ｂ】
2018510214.tif 000033
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2018510214.tif 000035
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2018510214.tif 000038
【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
2018510214.tif 000040
【図８】
2018510214.tif 000041
【図９】
2018510214.tif 000042
【図１０】
2018510214.tif 000043
【図１１】
2018510214.tif 000044
【図１２】
2018510214.tif 000045
【図１３Ａ】
2018510214.tif 000046
【図１３Ｂ】
2018510214.tif 000047
【図１３Ｃ】
2018510214.tif 000048
【図１３Ｄ】
2018510214.tif 000049
【図１３Ｅ】
2018510214.tif 000050
【図１４Ａ】
2018510214.tif 000051
【図１４Ｂ】
2018510214.tif 000052
【図１４Ｃ】
2018510214.tif 000053
【図１４Ｄ】
2018510214.tif 000054
【図１５Ａ】
2018510214.tif 000055
【図１５Ｂ】
2018510214.tif 000056
【図１５Ｃ】
2018510214.tif 000057
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2018510214.tif 000059
【図１６Ｃ】
2018510214.tif 000060
【配列表】
2018510214000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月2日(2017.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における疾患を処置するための、第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が第２のＴＮＦファミリーリガンドを更に含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、第１のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、前記疾患が、患部組織若しくは器官において、又は環境において、又は前記対象の血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、唾液若しくは尿又は任意の他の体液若しくは排出物において測定して、健常者と比較した第１のＴＮＦファミリーリガンドの存在又は高レベルに関連する、融合タンパク質。
【請求項２】
疾患を処置するための、第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が第２のＴＮＦファミリーリガンドを更に含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、前記疾患が、前記第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能である、融合タンパク質。
【請求項３】
疾患を処置するための、第１のＴＮＦファミリー受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が第２のＴＮＦファミリーリガンドを更に含み、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは前記第１の受容体に結合できないが、前記第２のＴＮＦファミリーリガンドは第２のＴＮＦファミリー受容体に結合可能であり、前記疾患が、対象において第１のＴＮＦファミリー受容体に結合可能である第１のＴＮＦファミリーリガンドの存在又はレベルを決定するステップの後に前記第２のＴＮＦファミリー受容体を活性化することによって処置可能であり、前記第１のリガンドの前記レベルがベースラインレベルを超えた場合に、前記疾患を処置するために前記融合タンパク質が前記対象に投与される、融合タンパク質。
【請求項４】
前記決定するステップの後に、前記対象において前記第２のＴＮＦファミリーリガンドが結合可能である第２のＴＮＦファミリー受容体のレベルを検出するステップ、及び前記対象において前記第２のＴＮＦファミリー受容体の前記レベルを検出するステップの後に、前記融合タンパク質を投与するステップがある、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１及び第２の受容体並びに前記第１及び第２のリガンドが以下のように選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質：
前記第１の受容体が４−１ＢＢである場合、前記第１のリガンドは４−１ＢＢＬであり、又は前記第２の受容体が４−１ＢＢである場合、前記第２のリガンドは４−１ＢＢＬであり、
前記第１の受容体がＢＣＭＡである場合、前記第１のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、又は前記第２の受容体がＢＣＭＡである場合、前記第２のリガンドはＡＰＲＩＬ若しくはＢＡＦＦであり、
前記第１の受容体がＣＤ２７である場合、前記第１のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ２７である場合、前記第２のリガンドはＣＤ２７Ｌであり、
前記第１の受容体がＣＤ３０である場合、前記第１のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ３０である場合、前記第２のリガンドはＣＤ３０Ｌであり、
前記第１の受容体がＣＤ４０である場合、前記第１のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＣＤ４０である場合、前記第２のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、
前記第１の受容体がＥＤＡＲである場合、前記第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、又は前記第２の受容体がＥＤＡＲである場合、前記第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ１であり、
前記第１の受容体がＸＥＤＡＲである場合、前記第１のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、又は前記第２の受容体がＸＥＤＡＲである場合、前記第２のリガンドはＥＤＡ−Ａ２であり、
前記第１のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、前記第１の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＴＲＡＩＬである場合、前記第２の受容体は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４からなる群から選択され、
前記第１のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、前記第１の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬである場合、前記第２の受容体は、ＯＰＧ及びＲＡＮＫからなる群から選択され、
前記第１の受容体がＴＲＯＹである場合、前記第１のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、又は前記第２の受容体がＴＲＯＹである場合、前記第２のリガンドはＴＲＯＹリガンドであり、
前記第１の受容体がＦａｓである場合、前記第１のリガンドはＦａｓＬであり、又は前記第２の受容体がＦａｓである場合、前記第２のリガンドはＦａｓＬであり、又は
前記第１の受容体がＧＩＴＲである場合、前記第１のリガンドはＧＩＴＬであり、又は前記第２の受容体がＧＩＴＲである場合、前記第２のリガンドはＧＩＴＬであり、
前記第１のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、前記第１の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、又は前記第２のリガンドがＬＩＧＨＴである場合、前記第２の受容体は、ＤｃＲ３及びＨＶＥＭからなる群から選択され、
前記第１の受容体がＤＲ３である場合、前記第１のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、又は前記第２の受容体がＤＲ３である場合、前記第２のリガンドはＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩであり、
前記第１の受容体がＦｎ１４である場合、前記第１のリガンドはＴＷＥＡＫであり、又は前記第２の受容体がＦｎ１４である場合、前記第２のリガンドはＴＷＥＡＫであり、
前記第１の受容体がＴＮＦＲ１である場合、前記第１のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、前記第２の受容体がＴＮＦＲ１である場合、前記第２のリガンドはＴＮＦ−アルファであり、
前記第１の受容体がＴＮＦＲ２である場合、前記第１のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、又は前記第２の受容体がＴＮＦＲ２である場合、前記第２のリガンドはＴＮＦ−ベータであり、
前記第１の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、前記第１のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、又は前記第２の受容体がリンホトキシンベータＲである場合、前記第２のリガンドは、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）からなる群から選択され、
前記第１の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、前記第１のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、又は前記第２の受容体がＯＸ４０Ｒである場合、前記第２のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、
前記第１の受容体がＮＧＦＲである場合、前記第１のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、又は前記第２の受容体がＮＧＦＲである場合、前記第２のリガンドは、ＮＧＦ及びＮＴＦ４からなる群から選択され、
前記第１の受容体がＤＲ６である場合、前記第１のリガンドはＡＰＰであり、又は前記第２の受容体がＤＲ６である場合、前記第２のリガンドはＡＰＰであり、
前記第１の受容体がＲＥＬＴである場合、前記第１のリガンドはＲＥＬＴリガンドであり、又は前記第２の受容体がＲＥＬＴである場合、前記第２のリガンドはＲＥＬＴリガンドである。
【請求項６】
癌の処置に適合された、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第１の受容体がＦｎ１４であり、前記第１のリガンドがＴＷＥＡＫであり、前記第２のリガンドがＴＲＡＩＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記疾患が、脂漏性角化、潰瘍性大腸炎及びクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、心筋梗塞、増殖糖尿病網膜症、又は高血圧、放射線、鎌状赤血球症などの任意の他の症状に起因する網膜症、又は急性虚血性脳卒中から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記疾患が、精巣癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、扁平上皮癌、角化細胞癌又は骨肉腫から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
対象における融合タンパク質の治療効果を高めるのに十分な比の融合タンパク質と第１のリガンドとを含む安定化組成物であって、前記融合タンパク質が第１の受容体及び第２のリガンドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、前記第２のリガンドが第２の受容体に結合可能であり、前記第１のリガンドが前記第１の受容体に結合可能であり、前記第１及び第２のリガンド並びに前記第１及び第２の受容体がＴＮＦファミリーメンバーであり、前記第１と第２のリガンドが異なり、前記第１と第２の受容体が異なる、安定化組成物。
【請求項１１】
前記疾患が線維性疾患である、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記疾患が肝線維症、腎線維症及び／又は肺線維症である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記疾患が肝線維症であり、前記融合タンパク質がＦｎ１４−ＴＲＡＩＬである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【国際調査報告】
2018510214.tif 000061
2018510214.tif 000062