(57)【要約】本発明は、ナノ細孔装置における検出を容易にするように修飾された標的分子に関する。本発明は更に、ナノ細孔装置を用いてこのような修飾された標的分子を検出する方法に関する。また、医薬的、化学的もしくは生物学的産物の追跡及び検証のために、このような修飾された標的分子を使用する方法、及び前記修飾された標的分子を含むサンプルの種々の状態を測定するための方法を開示する。2018537673.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ細孔検出のために設計された複合体であって、
第１の付着部位を含む標的分子と、
第１の付着部位を含むドライバ分子を含み、
前記ドライバ分子の第１の付着部位が、前記標的分子の第１の付着部位への共有結合を形成する、前記複合体。
【請求項２】
ナノ細孔検出のために設計された複合体であって、
第１の付着部位を含む標的分子と、
第１の付着部位及び第２の付着部位を含むリンカー分子を含み、
前記リンカー分子の第１の付着部位が、前記標的分子の第１の付着部位への共有結合を形成し、
前記リンカー分子の第２の付着部位が、ドライバ分子のための結合部位である、前記複合体。
【請求項３】
ドライバ分子を更に含み、前記ドライバ分子が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または別の非共有静電相互作用を介して、前記リンカー分子の第２の付着部位に結合されている、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記リンカー分子が、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、合成ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２または３に記載の複合体。
【請求項５】
前記リンカー分子が、ペプチド、バリン−シトルリンリンカー、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカー、［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）リンカー、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ＰＥＧベースのリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカー、またはカーボネートリンカー、または任意の他のホモ二官能性もしくはヘテロ二官能性分子を含む、請求項２〜４の何れか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記標的分子が生物学的治療薬を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記生物学的治療薬が、モノクローナル抗体、タンパク質、プロテアーゼ、ペプチド、糖、核酸、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記標的分子が小分子を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記小分子が、小分子治療薬または小分子診断薬である、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記小分子が、酵素の阻害剤もしくは活性化剤、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、及び細胞プロセスもしくは経路の小分子修飾物質からなる群から選択される小分子治療薬である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記小分子治療薬がリシノプリルである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記標的分子が、肥料、建設もしくは建築材料、及び食物組成物からなる群から選択される化学的もしくは生物学的産物の成分を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記成分がニトロゲナーゼである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記成分がボロン酸である、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１５】
前記標的分子が、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬からなる群から選択される指示薬である、請求項１〜５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ドライバ分子が、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１〜１５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ドライバ分子が、２０を超えるヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
前記ドライバ分子が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記リンカー分子に結合する、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１９】
前記標的分子が第２の付着部位を更に含み、前記第２の付着部位が第１のペイロード分子に結合されている、請求項１〜１８の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
前記第１のペイロード分子が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記標的分子に結合されている、請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記ドライバ分子が第２の付着部位を更に含み、前記第２の付着部位が第２のペイロード分子に結合されている、請求項１〜１９の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
前記第２のペイロード分子が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記ドライバ分子に結合されている、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記第１または第２のペイロード分子が、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、またはそれらの任意の組み合わせである請求項１９〜２２の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２４】
前記標的分子が複数のペイロード分子に結合されている、請求項１９〜２３の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２５】
前記ドライバ分子が複数のペイロード分子に結合されている、請求項１９〜２４の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２６】
前記標的分子の第１の付着部位が、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンまたは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基を含む、請求項１〜２５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２７】
前記ドライバ分子の第１の付着部位が、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンまたは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基を含む、請求項１〜２５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項２８】
標的分子を検出する方法であって、
ａ．請求項１〜２７の何れか一項に記載の複合体を含むことが疑われるサンプルを、少なくとも１つのナノ細孔を含むナノ細孔装置内にロードするステップと、
ｂ．前記少なくとも１つのナノ細孔を横切って電圧を印加するステップと、
ｃ.前記サンプル中の複合体の存在または不存在と相関する前記細孔を通る電気信号を測定するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記サンプルが医薬組成物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、患者からの血液、尿、唾液、または組織サンプルを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが、水、土壌、空気、スラッジ、石油、または化学的もしくは生物学的産物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記複合体が１以上のペイロード分子に結合され、前記電気信号が、前記１以上のペイロード分子の結合と更に相関する、請求項２８〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記電気信号に基づいて前記サンプル中の前記複合体の存在または不存在を決定するステップを更に含む、請求項２８〜３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記電気信号が、前記サンプル中の前記標的分子の存在または不存在と更に相関する、請求項２８〜３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記電気信号に基づいて前記サンプル中の前記標的分子の存在または不存在を決定するステップを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプル中の前記複合体または前記標的分子の濃度を決定するステップを更に含む、請求項２８〜３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ナノ細孔検出のために設計された修飾された標的分子であって、
ドライバ分子またはリンカー分子のための第１の付着部位を含み、
前記付着部位が、前記標的分子の第１の修飾によって生成される、前記標的分子。
【請求項３８】
前記第１の修飾が、ビオチン化、アセチル化、メチル化、スモレーション（ｓｕｍｍｏｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、リン酸化または酸化を含む、請求項３７に記載の修飾された標的分子。
【請求項３９】
前記第１の修飾が、化学的または生物学的合成を含む、請求項３７に記載の修飾された標的分子。
【請求項４０】
前記第１の修飾が、前記標的の遺伝子操作を含む、請求項３７に記載の修飾された標的分子。
【請求項４１】
前記第１の付着部位が、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リン、もしくは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基を含む、請求項３７〜４０の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項４２】
前記第１の付着部位が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記ドライバ分子に結合できる、請求項３７〜４１の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項４３】
前記第１の付着部位が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記リンカー分子に結合できる、請求項３７〜４２の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項４４】
前記標的分子が生物学的治療薬を含む、請求項３７〜４３の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項４５】
前記生物学的治療薬が、モノクローナル抗体、タンパク質、プロテアーゼ、ペプチド、糖、核酸、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４４に記載の修飾された標的分子。
【請求項４６】
前記標的分子が小分子を含む、請求項３７〜４３の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項４７】
前記小分子が小分子治療薬または小分子診断薬である、請求項４６に記載の修飾された標的分子。
【請求項４８】
前記小分子が、酵素の阻害剤もしくは活性化剤、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、及び細胞プロセスもしくは経路の小分子修飾物質からなる群から選択される小分子治療薬である、請求項４７に記載の修飾された標的分子。
【請求項４９】
前記小分子治療薬がリシノプリルである、請求項４８に記載の修飾された標的分子。
【請求項５０】
前記標的分子が、肥料、建設もしくは建築材料、及び食品組成物からなる群から選択される化学的もしくは生物学的産物の成分である、請求項３７〜４３の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項５１】
前記成分がニトロゲナーゼである、請求項５０に記載の修飾された標的分子。
【請求項５２】
前記成分がボロン酸である、請求項５０に記載の修飾された標的分子。
【請求項５３】
前記標的分子が、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学物質指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬からなる群から選択される、請求項３７〜４３の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項５４】
前記修飾された標的分子が、前記標的分子の少なくとも１つの機能を維持する、請求項３７〜５３の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの機能が、治療的、診断的、生物学的、化学的または栄養的な活性である、請求項５４に記載の修飾された標的分子。
【請求項５６】
前記ドライバ分子が、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項３７〜５５の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項５７】
前記ドライバ分子が２０を超えるヌクレオチドを含む、請求項５６に記載の複合体。
【請求項５８】
ペイロード分子に結合するための第２の付着部位を更に含む、請求項３６〜５７の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項５９】
前記第２の付着部位が、前記標的分子または前記修飾された標的分子の第２の修飾によって生成される、請求項５８に記載の修飾された標的分子。
【請求項６０】
前記第２の修飾が、ビオチン化、アセチル化、メチル化、スモレーション、グリコシル化、リン酸化または酸化を含む、請求項５９に記載の修飾された標的分子。
【請求項６１】
前記第２の修飾が、化学的または生物学的合成を含む、請求項５９に記載の修飾された標的分子。
【請求項６２】
前記第２の修飾が、前記標的の遺伝子操作を含む、請求項５９に記載の修飾された標的分子。
【請求項６３】
前記第２の付着部位が、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンまたは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基を含む、請求項５８〜６２の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項６４】
前記第２の付着部位が、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記ペイロード分子に結合できる、請求項５８〜６３の何れか一項に記載の修飾された標的分子。
【請求項６５】
前記修飾された標的分子を検出する方法であって、
ａ．請求項３７〜６４の何れか一項に記載の修飾された標的分子を含むことが疑われるサンプルを得るステップと、
ｂ．前記ドライバ分子を前記サンプルに添加して、反応生成物を生じさせるステップと、
ｃ．少なくとも１つのナノ細孔を含むナノ細孔装置に前記反応生成物を適用するステップと、
ｄ．前記少なくとも１つのナノ細孔に電圧を印加するステップと、
ｅ．前記サンプル中の前記修飾された標的分子の存在または不存在と相関する、前記細孔を通る電気信号を測定するステップとを含む、前記方法。
【請求項６６】
前記サンプルが医薬組成物を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプルが、患者からの血液、尿、唾液、または組織サンプルを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記サンプルが、水、土壌、空気、スラッジ、石油、または化学的もしくは生物学的産物を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記修飾された標的分子が１以上のペイロード分子に結合され、前記電気信号が、前記１以上のペイロード分子の結合と更に相関する、請求項６５〜６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記電気信号に基づいて、前記サンプル中の前記修飾された標的分子の存在または不存在を決定するステップを更に含む、請求項６５〜６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記サンプル中における前記修飾された標的分子の濃度を決定するステップを更に含む、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月２３日に出願された米国仮特許出願番号６２／２５９，０１２の優先権を主張するものであり、この仮出願を本明細書の一部として援用する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
生物学的分子のようなナノスケール及びマイクロスケールの分子、例えば生物学的治療薬、小分子薬物、化学的もしくは生物学的産物の成分、または化学的もしくは生物学的指示薬の検出は大きな価値がある。
【０００３】
例えば、そのような検出は、医薬品、化学的もしくは生物学的産物を、それらの生産点からそれらの販売者を介して消費者まで追跡及び検証することを可能にする。そのような追跡及び検証は、非常に困難であり且つ時間を要している。そのような産物を追跡し、所定の時点において特定の製品の構成要素を特定する複数の方法が存在するが、標準的な方法はサンプルをラボに送ることであり、これは実行可能であってもしばしば時間がかかるプロセスである。
【０００４】
ナノスケール及びマイクロスケールの分子の検出はまた、サンプルの種々の物理的または生理学的状態の測定をも可能にする。例えば、ｐＨ、毒性組成物、化学組成物、温度等のような種々の条件に応じて、それらのコンホメーション、構造、または安定性を変化させることが知られた、ナノスケール及びマイクロスケールの分子が数多く存在する。しかしながら、そのような分子の物理的状態を検出し、関連情報を得ることは困難で且つ時間を要している。
【０００５】
近年、ナノ細孔装置を用いたナノスケール及びマイクロスケールの分子の検出が可能になった。ナノ細孔検出は、ナノスケール及びマイクロスケールの分子を検出及び分析するための、迅速、携行可能、安価かつ正確な手段である。しかしながら、ナノ細孔検出は、分子が捕捉され、ナノ細孔を通過し、且つナノ細孔センサでの検出を可能にする特定の物理的特性（例えば、サイズ、電荷など）を有する標的分子を必要とするため、ナノ細孔検出の適用は少数の標的分子に限られていた。従って、本来的にはそのような特性を有していない様々な標的分子に対してナノ細孔技術を適用する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
３．概要
本明細書で開示される種々の態様は、上記で述べた必要性の１以上を満たすことができる。本明細書に記載のシステム及び方法は、それぞれ幾つかの側面を有し、そのうちの１つだけが単独でその望ましい属性に貢献するものではない。後述の特許請求の範囲により表される本開示の範囲を限定することなく、より顕著な特徴を、ここで簡単に説明する。この議論を検討した後、特に「詳細な説明」と題するセクションを読んだ後には、本明細書に記載されたサンプル的特徴が、如何にして改善されたシステム及び方法を提供するかを理解するであろう。
【０００７】
幾つかの実施形態において、本開示は、ナノ細孔装置における検出を容易にするように修飾された標的分子を提供する。幾つかの実施形態において、前記標的分子は第１の付着部位を含み、前記付着部位はドライバ分子に結合される。幾つかの実施形態において、前記標的分子は第２の付着部位を更に含み、前記第２の付着部位は第１のペイロード分子に結合される。
【０００８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ナノ細孔検出のために設計された複合体であって、第１の付着部位を含む標的分子と、第1の付着部位を含むドライバ分子を含み、前記ドライバ分子の第１の付着部位は、前記標的分子の第１の付着部位への共有結合を形成する複合体を提供する。
【０００９】
幾つかの実施形態において、本発明は、ナノ細孔検出のために設計された複合体であって、第１の付着部位を含む標的分子と、第1の付着部位及び第2の付着部位を含むリンカー分子を含み、前記リンカー分子の第１の付着部位は前記標的分子の第１の付着部位に共有結合を形成し、前記リンカー分子の第２の付着部位は前記ドライバ分子のための結合部位である複合体を提供する。幾つかの実施形態において、前記複合体はドライバ分子を更に含み、前記ドライバ分子は共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または別の非共有静電相互作用を介して、前記リンカー分子の第２の付着部位に結合される。
【００１０】
幾つかの実施形態において、前記リンカー分子には、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、合成ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。幾つかの実施形態において、前記リンカー分子には、ペプチド、バリン−シトルリンリンカー、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカー、［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）リンカー、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ＰＥＧベースのリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカー、またはカーボネートリンカー、または任意の他のホモ二官能性もしくはヘテロ二官能性分子が含まれる。
【００１１】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は生物学的治療薬を含む。幾つかの実施形態において、前記生物学的治療薬は、モノクローナル抗体、タンパク質、プロテアーゼ、ペプチド、糖、核酸、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１２】
幾つかの実施形態において、前記標的分子には小分子が含まれる。幾つかの実施形態において、前記小分子は小分子治療薬または小分子診断薬である。幾つかの実施形態において、前記小分子は、酵素の阻害剤もしくは活性化剤、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、及び細胞プロセスもしくは経路の小分子修飾剤からなる群から選択される小分子治療薬である。幾つかの実施形態において、前記小分子治療薬はリシノプリルである。
【００１３】
幾つかの実施形態において、前記標的分子には、肥料、建設もしくは建築材料、及び食品組成物からなる群から選択される化学的産物もしくは生物学的産物の成分が含まれる。幾つかの実施形態において、前記成分はニトロゲナーゼである。幾つかの実施形態において、前記成分はボロン酸である。
【００１４】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学物質指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬からなる群から選択される指示薬である。
【００１５】
幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は２０を超えるヌクレオチドを含む。
【００１６】
幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して前記リンカーに結合する。
【００１７】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は第２の付着部位を更に含み、前記第２の付着部位は第１のペイロード分子に結合される。幾つかの実施形態において、前記第１のペイロード分子は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して前記標的分子に結合される。
【００１８】
幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は第２の付着部位を更に含み、前記第２の付着部位は第２のペイロード分子に結合される。幾つかの実施形態において、前記第２のペイロード分子は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して前記ドライバ分子に結合される。
【００１９】
幾つかの実施形態において、前記第１または第２のペイロード分子は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２０】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は、複数のペイロード分子に結合される。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は複数のペイロード分子に結合される。
【００２１】
幾つかの実施形態において、前記標的分子の第１の付着部位には、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンまたは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基が含まれる。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子の第１の付着部位には、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンまたは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基が含まれる。
【００２２】
本発明は更に、標的分子を検出する方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、（ａ）標的分子を含む複合体を含むことが疑われるサンプルを、少なくとも１つのナノ細孔を含むナノ細孔装置内にロードするステップと、（ｂ）前記少なくとも１つのナノ細孔を横切って電圧を印加するステップと、（ｃ）前記サンプル中の複合体の存在または不存在と相関する前記細孔を通る電気信号を測定するステップを含んでいる。
【００２３】
幾つかの実施形態において、前記サンプルには医薬組成物が含まれる。幾つかの実施形態において、前記サンプルには、患者からの血液、尿、唾液、または組織サンプルが含まれる。幾つかの実施形態において、前記サンプルには、水、土壌、空気、スラッジ、石油、または化学的もしくは生物学的産物が含まれる。
【００２４】
幾つかの実施形態において、前記複合体は１以上のペイロード分子に結合し、前記電気信号は、前記１以上のペイロード分子の結合と更に相関する。
【００２５】
幾つかの実施形態において、前記方法は、前記電気信号に基づいて、前記サンプル中の前記複合体の存在または不存在を決定するステップを更に含む。幾つかの実施形態において、前記電気信号は、前記サンプル中の前記標的分子の存在または不存在と更に相関する。
【００２６】
幾つかの実施形態において、前記方法は、前記電気信号に基づいて、前記サンプル中の前記標的分子の存在または不存在を決定するステップを更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、前記サンプル中の前記複合体または前記標的分子の濃度を決定するステップを更に含む。
【００２７】
本発明はまた、ナノ細孔検出のために設計された修飾された標的分子に関する。幾つかの実施形態において、前記修飾された標的分子は、前記ドライバ分子または前記リンカー分子の第１の付着部位を含み、この付着部位は前記標的分子の第１の修飾によって生成される。
【００２８】
幾つかの実施形態において、前記第１の修飾には、ビオチン化、アセチル化、メチル化、スモレーション（ｓｕｍｍｏｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、リン酸化または酸化が含まれる。幾つかの実施形態において、前記第１の修飾には、化学的または生物学的合成が含まれる。幾つかの実施形態において、前記第１の修飾には、前記標的の遺伝子操作が含まれる。
【００２９】
幾つかの実施形態において、前記第１の付着部位には、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンもしくは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコールが含まれる。幾つかの実施形態において、前記第１の付着部位は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記ドライバ分子またはリンカー分子に結合できる。
【００３０】
幾つかの実施形態において、前記標的分子には生物学的治療薬が含まれる。幾つかの実施形態において、前記生物学的治療薬は、モノクローナル抗体、タンパク質、プロテアーゼ、ペプチド、糖、核酸、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００３１】
幾つかの実施形態において、前記標的分子には小分子が含まれる。幾つかの実施形態において、前記小分子は小分子治療薬または小分子診断薬である。幾つかの実施形態において、前記小分子は、酵素の阻害剤もしくは活性化剤、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、及び細胞プロセスもしくは経路の小分子修飾物質からなる群から選択される小分子治療薬である。幾つかの実施形態において、前記小分子治療薬はリシノプリルである。
【００３２】
幾つかの実施形態において、前記標的分子には、肥料、建設もしくは建築材料、及び食品組成物からなる群から選択される化学的もしくは生物学的産物の成分が含まれる。幾つかの実施形態において、前記成分はニトロゲナーゼである。幾つかの実施形態において、前記成分はボロン酸である。
【００３３】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学物質指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬からなる群から選択される指示薬である。
【００３４】
幾つかの実施形態において、前記修飾された標的分子は、前記標的分子の少なくとも１つの機能を維持する。幾つかの実施形態において、前記少なくとも１つの機能は、治療的、診断的、生物学的、化学的または栄養的な活性である。
【００３５】
幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子には２０を超えるヌクレオチドが含まれる。
【００３６】
幾つかの実施形態において、前記修飾された標的分子は、前記ペイロード分子に結合するための第２の付着部位を更に含む。幾つかの実施形態において、前記第２の付着部位は、前記標的分子または前記修飾された標的分子の第２の修飾によって生成される。幾つかの実施形態において、前記第２の修飾には、ビオチン化、アセチル化、メチル化、スモレーション、グリコシル化、リン酸化または酸化が含まれる。幾つかの実施形態において、前記第２の修飾には化学的または生物学的合成が含まれる。幾つかの実施形態において、前記第２の修飾には、標的の遺伝子操作が含まれる。
【００３７】
幾つかの実施形態において、前記第２の付着部位には、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンもしくは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基が含まれる。幾つかの実施形態において、前記第２の付着部位は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、前記ペイロード分子に結合できる。
【００３８】
本発明は更に、前記修飾された標的分子を検出する方法に関する。幾つかの実施形態において、前記方法は、（ａ）修飾された標的分子を含むことが疑われるサンプルを得るステップと、（ｂ）ドライバ分子を前記サンプルに添加して、反応生成物を生じさせるステップと、（ｃ）少なくとも１つのナノ細孔を含むナノ細孔装置に前記反応生成物を適用するステップと、（ｄ）前記少なくとも１つのナノ細孔に電圧を印加するステップと、（ｅ）前記サンプル中の修飾された標的分子の存在または不存在と相関する前記細孔を通る電気信号を測定するステップを含む。
【００３９】
幾つかの実施形態において、前記サンプルには医薬組成物が含まれる。幾つかの実施形態において、前記サンプルには、患者からの血液、尿、唾液、または組織サンプルが含まれる。幾つかの実施形態において、前記サンプルには、水、土壌、空気、スラッジ、石油、または化学的もしくは生物学的産物が含まれる。
【００４０】
幾つかの実施形態において、前記修飾された標的分子は、１以上のペイロード分子に結合され、前記電気信号は、前記１以上のペイロード分子の結合と更に相関する。
【００４１】
幾つかの実施形態において、前記方法は、前記電気信号に基づいて、前記サンプル中の修飾された標的分子の存在または不存在を決定するステップを更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、前記サンプル中における修飾された標的分子の濃度を決定するステップを更に含む。
【００４２】
本明細書ではまた、サンプル中の標的分子の存在または不存在を検出するためにデータを分析する方法であって、本明細書に記載される修飾された標的分子を含有することが疑われるサンプルを含有するナノ細孔装置からの電気信号を得ることと、前記電気信号を分析して、前記ナノ細孔を通る前記標的分子の移動と相関する識別特性の存在または不存在を検出することを含み、前記識別特性の存在が前記サンプル中における前記標的分子の存在を示し、また前記識別特性の不存在は、前記サンプルからの前記標的分子の不存在を示す前記方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
４．図面の簡単な説明
本開示の実施形態として提供される図面は、限定ではなく、例示のみにより特徴を示す図である。
【図１】ナノ細孔（１０６）を通しての複合体の移動を容易にするために、リンカー分子（１０４）を介してドライバ分子（１０２）に結合された標的分子（１０１）を提示する。この図はまた、バックグラウンド分子（１０５）を提示する。
【図２】ドライバ分子（１０２）に結合していない標的分子（１０１）を示す。ナノ細孔装置（１０６）は、前記ドライバ分子が前記標的分子に結合しているか否かと相関する電気信号を検知する。
【図３】Ａ〜Ｃは、ナノ細孔を通って移動するサンプルに固有の電気信号（ｘ軸に時間及びｙ軸に電流）を示す。前記サンプルは、リンカー分子（１０４）を介してドライバ分子（１０２）に結合された標的分子（１０１）（Ａ）、ドライバ分子（１０２）のみ（Ｂ）；標的分子（１０１）のみ（Ｃ）を含む。
【図４】修飾されたリシノプリルの化学構造を示し、ここでのリシノプリル分子はＳＭＣＣリンカーを介してドライバ分子（即ち、ｄｓＤＮＡ）に共有結合している。
【図５】ＳＭＣＣリンカーで標識されたリシノプリルの質量分析からのデータを提供する。このデータは、リシノプリルがリンカー分子に化学的に結合していることを実証する。測定された６２５．２の質量は、予測された６２５−６２７の質量と一致する。
【図６】ドライバ分子（即ち、５３２ｂｐのｄｓＤＮＡ）に結合した標的分子（即ち、リシノプリル）からの電気信号をプロットするグラフを提供する。
【図７】ナノ細孔を通過するＤＮＡ−破傷風抗体複合体（ドット）、または抗体なしのＤＮＡ−ＰＮＡ複合体（四角）から収集された電気信号をプロットするグラフである。
【図８】リンカー分子（１０４ａ）を介してドライバ分子（１０２）に結合した標的分子（１０１）を提示する。この標的分子はまた、別のリンカー分子（１０４ｂ）を介してペイロード分子（１０３）に結合される。
【図９】Ａ〜Ｂは、ナノ細孔を通って移動するサンプルに特有の電気信号を提供する。サンプルは、リンカー分子を介してドライバ分子（１０２）及びペイロード分離（１０３）に結合した標的分子（１０１）を含み（Ａ）、またリンカー分子を介してドライバ分子（１０２）に結合した標的分子（１０１）を含んでいる（Ｂ）。
【図１０】ＤＮＡ−標的−ペイロード複合体（ドット）またはペイロードを含まないＤＮＡ−標的複合体（四角）から収集された電気信号をプロットしたグラフを提供する。前記標的はペプチドであり、前記ペイロードは抗体である。
【図１１】ペイロードを伴わないドライバ分子（ｄｓＤＮＡ）及び標的分子（ビオチン）を含む複合体から収集した電気信号をプロットしたグラフ（四角形）、並びにドライバ分子（ｄｓＤＮＡ）、標的（ビオチン）及びペイロード（抗ビオチン抗体）を含む複合体から収集した電気信号をプロットしたグラフ（逆三角形）である。
【図１２】リンカー（１０４ａ及び１０４ｂ）を介して、ドライバ分子（１０２）及びペイロード分子（１０３ａ）に結合された標的分子（１０１）を示す。前記ドライバ分子は、ナノ細孔内の検出を向上させるために、追加のペイロード分子（１０３ｂ、波形ボックス）に更に結合される。
【図１３】図１２の複合体のナノ細孔を介した移動を示す。
【図１４】Ａ〜Ｃは、ナノ細孔を通って移動するサンプルに固有の電気信号を示す。サンプルは、ペイロード分子及びドライバ分子に結合した標的分子を含んでおり、ここでのドライバ分子は別のペイロード分子に結合され（Ａ）、標的分子はドライバ分子及びペイロード分子に結合され（Ｂ）、また標的分子はドライバ分子のみに結合される（Ｃ）。
【図１５】一方はＰＮＡ−ＰＥＧのため、他方はＰＮＡ−ペプチドのための２つの結合部位を含むドライバ分子（即ち、５６３１ｂｐのＤＮＡ）を示す。
【図１６】Ａ〜Ｂは、ナノ細孔を通過する異なる複合体からの電気信号をプロットするグラフを提供する。ドットは、ドライバ分子単独（ＤＮＡ）からの信号を表す。正方形及び菱形は、ＤＮＡ及びＰＮＡ−ＰＥＧ（ＰＰ）複合体からの信号を表す。逆三角は、Ｖ３ループ（ＰＶ３Ｂ）複合体を有するＤＮＡ及びＰＮＡ−ＰＥＧ（ＰＰ）からの信号を表す。星印は、ＤＮＡ、Ｖ３ループを伴うＰＮＡ−ＰＥＧ（ＰＰ）（ＰＶ３Ｂ）及びＨＩＶ抗体複合体からの信号を表す。  上記図面の一部または全部は、例示のための概略図である。従って、それらは必ずしも示された要素の実際の相対的な大きさまたは位置を示すものではない。上記図面は、それらが後述の請求項の範囲または意味を限定するためには使用されないとの明確な理解の下に、１以上の実施形態を例示する目的で提示される。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
５．詳細な説明
ａ．用語の解釈
本出願の全体を通して、このテキストは、本発明の装置、組成物、システム、及び方法の様々な実施形態を参照する。記載された種々の実施形態は、様々な例示的実施例を提供することを意図しており、代替的な種の記載として解釈されるべきではない。むしろ、提供される種々の実施形態の説明は、範囲が重複している可能性があることに留意されたい。本明細書で論じられる実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
また、本開示の全体を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書が、識別的引用によって参照される。これら刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、その全体を本開示の一部として援用する。
【００４６】
明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈上で別途明確に指示されない限り、複数形の参照が含まれる。例えば、「電極」の用語には複数の電極が含まれ、それらの混合も含まれる。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「含む」の用語は、システム、装置、及び方法が列挙された構成要素または工程を含むが、他の構成要素またはステップを排除しないことを意味するものである。「実質的にからなる」とは、システム、装置及び方法を定義するために使用するときは、当該組合せに対して何らかの実質的な重要性を持った他の構成要素または工程を排除することを意味するものである。「からなる」とは、他の構成要素またはステップを排除することを意味するものである。これら移行部の用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にあるものである。
【００４８】
範囲を含む全ての数値指定、例えば距離、サイズ、温度、時間、電圧及び濃度は、０．１の増分で変化する（＋）または（−）近似である。必ずしも明記されるわけではないが、すべての数値表示の前に「約」の用語が付いていることが理解されるべきである。また、必ずしも明示されるわけではないが、本明細書に記載された構成要素は単なる例示であり、その均等物が当該技術分野で知られていることもまた理解されるべきである。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「標的分子」の用語は、ナノ細孔による検出のために修飾され得る興味の対象である分子を指す。標的分子は、ドライバ分子に結合すると、ナノ細孔を通過し得る物理的寸法を有する。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「リンカー分子」の用語は、標的分子とドライバ分子との間、標的分子とペイロード分子との間、またはドライバ分子とペイロード分子との間を連結し得る分子を言う。リンカー分子は、標的分子及び／またはドライバ分子に結合したときにナノ細孔を通過できる物理的大きさを有する。
【００５１】
本明細書中で使用するとき、「ドライバ分子」の用語は、印加された電圧下の溶液中において、ナノ細孔中に捕捉され得るように十分に荷電した分子を言う。標的分子に結合すると、ドライバ分子は標的分子をナノ細孔の中へと駆動させることができる。ドライバ分子は、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００５２】
本明細書で使用するとき、「ペイロード分子」の用語は、ナノ細孔の中に捕捉されたときに、固有の電気信号の生成を促進する物理的寸法を備えた分子を指す。ペイロード分子は、標的分子またはドライバ分子のための結合部位を有する。幾つかの実施形態において、ペイロード分子は、ナノ細孔を通過するのを容易にするように荷電されることができる。
【００５３】
本明細書で使用するとき、「内部空間を分離するナノ細孔を含む装置」は、構造内の開口を含む細孔を有する装置を指すものであり、前記構造は内部空間を２以上の容積またはチャンバに分離する。
【００５４】
本明細書で使用する「電気信号」の用語は、電子回路の構成に応じて、電流、インピーダンス／抵抗、または経時的な電圧について収集された一連のデータを包含する。従来、電流は「電圧クランプ」構成において測定され、電圧は「電流クランプ」構成において測定され、また抵抗測定は、何れの構成においてもオームの法則Ｖ＝ＩＲを使用して導き出すことができる。インピーダンスはまた、ナノ細孔装置から収集された電流または電圧データからの測定によって生成することができる。本明細書で言及される電気信号のタイプには、電流識別特性及び電流インピーダンス識別特性が含まれるが、ナノ細孔内の粒子を検出するためには様々な他の電気的識別特性を使用することができる。
【００５５】
本明細書中で使用するとき、「ナノ細孔」の用語は、特定のサイズの分子の通過を可能にするために十分な大きさの開口部（孔またはチャネル）を指す。ナノ細孔を通して荷電分子を駆動するために電圧が印加される。
【００５６】
本明細書で使用するとき、「センサ」の用語は、ナノ細孔装置からの信号を収集する装置を言う。多くの実施形態において、このセンサは、分子または他の物質、特に標的分子が細孔を通って移動するとき、細孔を横切るイオン電流を測定するために、細孔の２つの側面に配置された１対の電極を含んでいる。電極に加えて、追加のセンサ、例えば光センサを用いて、ナノ細孔装置内の光信号を検出することができる。電流遮断、電子トンネル電流、電荷誘導電界効果、ナノ細孔通過時間、光信号、光散乱、及びプラズモン共鳴のような特性を検出するために、他のセンサを使用することができる。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「電流測定」の用語は、或る印加電圧でのナノ細孔を通る経時的な一連の電流測定を言う。電流はｘ、ｙの値として表され、ここでのｘはある時点を表し、ｙは前記チャネル内において妨害される電流の量を表す。電流測定は、オームの法則による電流インピーダンス／抵抗及び電圧（他の電気信号）に関する電気信号である。
【００５８】
本明細書で使用するとき、「開放チャネル」の用語は、電流が分析ソフトウェアにより規定される値の閾値から逸脱しない、ノイズ範囲内での、ナノ細孔チャネルを通る電流のベースラインレベルを意味する。
【００５９】
本明細書で使用するとき、「事象」の用語は、電流測定のｙ値が所定の閾値だけ開放チャネル値から逸脱したときに始まり、ｙ値が開放チャネル値の閾値内に戻るときに終了する１組の電流インピーダンス測定値を意味する。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「電流インピーダンス識別特性」の用語は、電流測定値の集合を指し、最初のこのような測定値は、ｙの値がソフトウェアにより規定された所定の閾値を超えるときに始まり、ｙの値が過去の同じ閾値に戻るときに終了する。この閾値は、事象内の複数の識別特性を同定するために使用できる（即ち、標的分子は１以上の付着した分子を有する可能性があるため、１事象に１以上の固有の識別事象が含まれる可能性がある）。
【００６１】
本明細書で使用する「識別特性曲線」の用語は、単一の識別特性内において全てのｘ、ｙ点に適用される数式の積を言う。この式は、全ての点の単純平均（ｙにおいて１本の直線を生成する）、またはＮ個の点毎の移動平均（単純な曲線を生成する）、または他の数式のような単純なものとすることができる。ステップフィッティングアルゴリズムは、各識別特性に適用する式の別の例である。ステップの数またはそれらのプロパティを使用して、識別特性曲線または曲線についてのプロパティを推論することができる（例えば、本明細書の一部として援用するＣ  Ｒａｉｌｌｏｎ，  Ｐ  Ｇｒａｎｊｏｎ，  Ｍ  Ｇｒａｆ，  Ｌ  Ｊ  Ｓｔｅｉｎｂｏｃｋ，  ａｎｄ  Ａ  Ｒａｄｅｎｏｖｉｃ．  Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｌｅｖｅｌ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，  ４（１６）：４９１６，  ２０１２を参照されたい）。ナノ細孔は本質的に非決定性なので、電気信号は、同じタイプの分子が通過する毎にかなり変化し得る。従って、測定値を分析するソフトウェアは、同じ分子が読み取られる毎に一貫した識別特性曲線を保証するように、十分な柔軟性を用いることができる。
【００６２】
本明細書で使用するとき、「光学的センサ」の用語は、ナノ細孔に存在しまたはナノ細孔に隣接して存在し得る固定視野内において、光を捕捉する装置を意味する。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「光学的事象」の用語は、単一の標的分子からセンサにより捕捉された一組の光学的測定値を言う。光学的測定値は、電流のインピーダンス測定値と相関させて、標的分子がナノ細孔に侵入した時点を決定することができる。
【００６４】
本明細書で使用するとき、「光学的測定値」の用語は、前記光学的センサにより一定期間内に得られる値を指す。この測定値には、色、ルミネッセンス、強度などの個々の値の１以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「記号」の用語は、単一の抽象概念を含むように、ある事象内の１以上の光学的識別特性の集合を意味する。例えば、「赤、緑、赤、緑」は文字「Ａ」と等価であってよい。
【００６６】
ｂ．標的分子
本発明は、ペイロード分子及び／またはドライバ分子を、医薬化合物のような標的分子に加えるための装置及び方法を提供する。一定の実施形態において、前記標的分子は、ドライバ分子が結合され得る付着部位を含む。一定の実施形態において、前記標的分子は、ペイロード分子が結合され得る付着部位を含む。幾つかの実施形態において、前記付着部位は前記標的分子の化学構造の一部であり、アミノ酸、二本鎖デオキシリボース核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンもしくは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシル、またはアルコール上の反応性基が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は生物学的治療薬であり、これにはモノクローナル抗体、タンパク質、プロテアーゼ、ペプチド、糖、核酸、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００６８】
幾つかの実施形態において、前記標的分子には小分子が含まれる。幾つかの実施形態において、前記小分子は小分子治療薬であり、これには酵素の阻害剤もしくは活性化剤、受容体のアンタゴニストもしくはアゴニスト、または細胞プロセスもしくは経路の他の小分子修飾剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、前記小分子はリシノプリルである。幾つかの実施形態において、前記小分子は小分子診断薬である。
【００６９】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は合成分子である。幾つかの実施形態において、前記標的分子には、肥料、建設もしくは建築材料、及び食物組成物からなる群から選択される化学的もしくは生物学的産物の成分が含まれる。幾つかの実施形態において、前記成分は、特定の機能を有する化学的もしくは生物学的産物の必須成分である。幾つかの実施形態において、前記成分は酵素である。幾つかの実施形態において、前記酵素はニトロゲナーゼである。幾つかの実施形態において、前記成分はボロン酸である。
【００７０】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は、物理的状態に応じてその立体コンホメーション、構造または安定性を変化させる指示薬である。幾つかの実施形態において、前記指示薬は、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学物質指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬である。
【００７１】
ｃ．リンカー分子
幾つかの実施形態において、前記標的分子及びドライバ分子は、前記付着部位を通して、リンカー分子を介して共有結合される。
【００７２】
幾つかの実施形態において、前記リンカー分子には、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、合成ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００７３】
幾つかの実施形態において、前記リンカー分子は、ペプチド、バリン−シトルリンリンカー、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカー、［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）リンカー、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ＰＥＧベースのリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカー、もしくはカーボネートリンカー、または任意の他のホモ二官能性もしくはヘテロ二官能性分子である。
【００７４】
幾つかの実施形態において、前記リンカー分子は、ナノ細孔内の標的分子の捕捉を促進できる荷電分子である。
【００７５】
ｄ．ペイロード分子
幾つかの実施形態において、前記標的分子は、サンプル内に存在する他の標的分子／ペイロード分子またはバックグラウンド分子からの識別を可能にするために、ナノ細孔内へ、またはナノ細孔を通って移動する際に固有の電気信号を提供する１以上のペイロード分子により修飾される。ペイロード分子は、ナノ細孔内の標的分子の検出を可能にするように構成される。これらのペイロード分子は、前記ナノ細孔を通過するときに電流インピーダンスにより相互に区別される。この電流インピーダンスは、前記ペイロード分子の幅、長さ、サイズ及び／または電荷の影響を受ける。前記ペイロード分子は、サイズ、形状または電荷によって相互に異なることができる。従って、各ペイロード分子は、ナノ細孔を通過する際に固有の電気信号を提供し、ナノ細孔内において、前記ペイロード分子に結合した標的分子の同定を可能にする。
【００７６】
前記ペイロード分子は、幅、長さ、サイズ、及び／または電荷等のパラメータで修飾できるので、本明細書に記載の組成物及び方法は、小さいナノ細孔装置よりも製造が容易で且つ安価な、より大きな細孔を含む様々なサイズの細孔を用いて実施できる。より大きなサイズの検出可能なマーカーは、標識されていない化合物と比較して、前記細孔を通る電流または電流インピーダンスのより大きな変化をもたらす。
【００７７】
幾つかの実施形態において、前記ペイロード分子には、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。幾つかの実施形態において、前記ペイロード分子は、共有結合、中間リンカー、または非共有結合性静電相互作用を介して前記標的分子に連結される。
【００７８】
幾つかの実施形態において、標的分子、ドライバ分子またはリンカー分子は、ペイロード分子に対する結合部位を有する。幾つかの実施形態において、標的分子、ドライバ分子またはリンカー分子は、追加の信号識別ペイロード分子を連結できる追加の付着部位を含み、サンプル中の標的分子の更なる識別または増強された同定を可能にする。幾つかの実施形態においては、前記標的分子、ドライバ分子、及びペイロード分子の１以上が、追加のペイロード分子で更に修飾される。幾つかの実施形態において、前記追加のペイロード分子は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水結合、πスタッキング、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用によって、前記付着部位に直接連結される。
【００７９】
ｅ．ドライバ分子
前記ドライバ分子は、ナノ細孔内での前記標的分子の捕捉を容易にするように構成される。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、電圧によって前記ナノ細孔の中に捕捉され得る。幾つかの実施形態において、前記標的分子及びドライバ分子は、共有結合によって、前記付着部位を通して直接連結される。幾つかの実施形態において、前記標的分子及びドライバ分子は、共有結合によっては連結されず、代わりに静電相互作用、水素結合、塩橋、ファンデルワールス相互作用、カチオン−π相互作用または疎水性相互作用を含む非共有結合によって連結される。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子には、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質、炭水化物、またはそれらの組み合わせが含まれる。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、１以上の合成分子、例えば、デンドリマー、ナノ／マイクロ粒子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または他の合成ポリマーである。幾つかの実施形態において、前記標的分子は同じ製剤中にあるが、前記ドライバ分子の付着部位と会合していない。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、前記ナノ細孔の中へ、または前記ナノ細孔を通って移動するときに電流インピーダンスを提供し、それによって前記標的分子の存在または不存在を推測することを可能にする。
【００８０】
前記ドライバ分子は、標的分子に結合したときに、適切な拡散係数及び電気的移動度を提供するように構成される。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子の電気移動度は、当技術分野で既知の技術によって測定される。幾つかの実施形態において、前記電気移動度はゲル電気泳動によって決定され、ここでは固有の電荷が特定の静的条件の下で測定され、これは特定のイオン強度緩衝液、ｐＨ及び駆動力（例えば、ＴＥＡ緩衝液、ｐＨ７．５及び５０Ｖ駆動力）を含むことができる。幾つかの実施形態において、前記電気移動度は等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって決定されるが、これは可変の「ゾーン化された」緩衝系において、その電荷に基づいて分析物の移動度を測定する。この方法の下において、異なる荷電変異体は、分析物の等電点に一致するｐＨ領域に入ると移動を停止する。異なるように移動した「ゲル上のバンド」を分析することにより、前記分子の異なる荷電状態を推測することができる。幾つかの実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、分析物の電荷に基づいて、固体支持体から離れる移動度を測定する。ここで、前記標的分子はカラムに結合され、ｐＨ勾配を用いて溶出される。ｐＨが分子の等電点と一致したときには、分析物はもはやカラムに結合せず、溶出され、続いて検出される。幾つかの実施形態において、電気移動度は、質量対電荷比により決定されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間）に基づいて決定される。電荷が大きくまた質量が小さいほど、検出器への移動がより速くなる。逆に、電荷が小さく質量が大きくなるほど、「飛行時間」は長くなる。分子は、それらの固有の「飛行時間」を用いて同定される。
【００８１】
前記ドライバ分子は、ナノ細孔を通過する上で十分小さい物理的寸法を有するように構成される。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、少なくとも２０ｂｐｓのポリヌクレオチドを含んでいる。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子は、それが標的分子、１以上のペイロード分子に結合するときに、ナノ細孔を通過するのに十分小さい物理的寸法を有するように構成される。
【００８２】
ｆ．標的分子の修飾
本開示は、標的分子の修飾及び検出のための方法及びシステムを提供する。一定の実施形態において、サンプル中の標的分子の存在または不存在を検出及び／または定量する目的で、標的分子を修飾する方法が本明細書で提供される。一定の実施形態において、修飾された標的分子はナノ細孔装置において検出され得る。
【００８３】
幾つかの実施形態において、前記標的分子は、標的分子のための付着部位を含むように修飾される。幾つかの実施形態において、前記標的分子は更に、ペイロード分子のための付着部位を含むように修飾される。幾つかの実施形態において、前記付着部位は、前記標的分子の生物学的または化学的修飾によって生成される。幾つかの実施形態において、前記化学修飾はビオチン化、アセチル化、メチル化、スモレーション、グリコシル化、リン酸化または酸化である。幾つかの実施形態において、前記付着部位は、分子的、生物学的または生化学的方法によって導入される。幾つかの実施形態において、前記付着部位は酵素反応によって導入される。幾つかの実施形態において、前記付着部位は遺伝子操作によって導入される。
【００８４】
幾つかの実施形態において、前記付着部位には、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンまたは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシルまたはアルコール上の反応性基が含まれる。幾つかの実施形態において、前記付着部位は、共有結合、中間リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性結合、πスタッキング、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、ドライバ分子またはペイロード分子に結合できる。
【００８５】
幾つかの実施形態において、付着部位を含む標的分子は、生物学的または化学的に合成される。幾つかの実施形態において、前記合成には、ビオチニル化、アセチル化、メチル化、スモレーション、グリコシル化、リン酸化、酸化、または他の酵素反応が含まれる。幾つかの実施形態において、前記付着部位には、アミノ酸、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アミン基、チオール、アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、硫黄、リンもしくは他の反応性原子、ケトン、カルボン酸、エーテル、アミド、ハロゲン化アルキル、エステル、アルキン、ヒドロキシル、またはアルコール上の反応性基が含まれる。幾つかの実施形態において、前記付着部位は、共有結合、中間体リンカー、ファンデルワールス結合、静電結合、疎水性結合、πスタッキング、イオン結合、または他の非共有結合性静電相互作用を介して、ドライバ分子またはペイロード分子に結合できる。
【００８６】
幾つかの実施形態において、前記修飾された標的分子は、前記標的分子の少なくとも１つの機能を維持する。幾つかの実施形態において、前記標的分子の修飾は、生物学的治療薬、小分子薬剤、及び化学的もしくは生物学的産物の成分としての前記標的分子の活性を変化させない。
【００８７】
ｇ．標的−ドライバ複合体：
幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子は共有結合される。幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子を含む複合体は、前記標的分子と前記ドライバ分子との間に共有結合を形成する化学反応によって生成される。幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバを含む複合体は、化学的、生物学的、分子的及び遺伝的反応によって合成される。
【００８８】
幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子を含む複合体は、治療目的または診断目的のための医薬組成物として使用される。幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子を含む前記複合体は、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学物質指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬などの指示薬として使用される。幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子を含む前記複合体は、肥料、建設もしくは建築材料、及び食物組成物のような化学的もしくは生物学的産物の成分として使用される。
【００８９】
ｈ．標的−リンカー複合体
幾つかの実施形態において、前記標的分子及びドライバ分子は、リンカー分子に共有結合される。幾つかの実施形態において、標的分子とリンカー分子とを含む複合体は、前記標的分子と前記リンカー分子との間に共有結合を形成する化学反応によって生成される。幾つかの実施形態において、標的分子及びリンカー分子を含む複合体は、化学的、生物学的、分子的及び遺伝的反応によって合成される。
【００９０】
幾つかの実施形態において、前記リンカーには、ペプチド、タンパク質、炭水化物、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ナノ粒子、ペプチド核酸酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デンドリマー、合成ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。幾つかの実施形態において、前記リンカーには、ペプチド、バリン−シトルリンリンカー、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカー、［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）リンカー、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ＰＥＧベースのリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカー、もしくはカーボネートリンカー、または任意の他のホモ二官能性またはヘテロ二官能性分子の少なくとも一つが含まれる。
【００９１】
幾つかの実施形態において、標的分子及びリンカー分子を含む前記複合体は、治療目的または診断目的のための医薬組成物として使用される。幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子を含む複合体は、ｐＨ指示薬、毒素指示薬、化学指示薬、汚染物質指示薬、または温度指示薬などの指示薬として使用される。幾つかの実施形態において、標的分子及びドライバ分子を含む前記複合体は、肥料、建設及び建築材料、並びに食物組成物のような化学的もしくは生物学的産物の成分として使用される。
【００９２】
ｉ．検出の方法
幾つかの実施形態において、本技術は、サンプル中の標的分子を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）標的分子を含むことが疑われるサンプルを、２つの容積を分離して連結する細孔を有する装置の中に、標的分子（例えば、検出可能なペイロード分子に結合した医薬品）が前記細孔を通して一方の容積から他方の容積へと移動することを可能にする条件下に装填することと、（ｂ）前記ナノ細孔を通る標的分子の通過に相関する電気信号を収集することを必要とする。前記電気信号を使用することにより、前記ナノ細孔を通って移動する検出可能な分子と相関する事象を収集し、分析して、前記ペイロード分子に結合した標的分子と相関する電気信号を同定することができる。
【００９３】
幾つかの実施形態において、前記方法は、（ａ）修飾された標的分子を含むことが疑われるサンプルを得ることと、（ｂ）前記サンプルに前記ドライバ分子を加えて反応生成物を生じさせることと、（ｃ）前記反応生成物をナノ細孔装置に適用することと、（ｄ）各細孔を横切って電圧を印加することと、（ｅ）前記細孔を通して、前記サンプル中の前記修飾された標的分子の存在または不存在と相関する電気信号を測定することを必要とする。
【００９４】
幾つかの実施形態において、前記方法は更に、電気信号に基づいて、サンプル中の標的分子または標的分子を含む複合体の存在または不存在を決定することを必要とする。幾つかの実施形態において、前記方法は更に、電気信号に基づいて、前記サンプル中の標的分子または標的分子を含む複合体の濃度を決定することを必要とする。
【００９５】
「電気信号」は、一度に、標的分子に結合された１、或いは２以上のペイロード分子の前記細孔を通る移動に由来した電流識別特性を生じる電流測定を含むことができる。
【００９６】
幾つかの実施形態においては、複数の特有のペイロード分子を用いて複数の標的分子を検出することができ、ここでの特有のペイロード分子に結合した各標的分子は、それぞれ別個の標的分子の同定に使用される特有の電気信号を生成する。例えば、ペイロード分子Ａは１つの特有の電気信号を提供し、ペイロード分子Ｂは異なる特有の電気信号を形成することができる。
【００９７】
これら上記シナリオの各々において、前記ナノ細孔装置は、それぞれの標的分子に結合された各特有のペイロード分子が生成した特有の電気信号を識別するように、適切に構成することができる。
【００９８】
幾つかの実施形態において、前記サンプルは医薬組成物である。幾つかの実施形態において、前記サンプルは混合サンプル、例えば患者から得られた血液または尿サンプルである。幾つかの実施形態において、前記サンプルは、患者からの血液、尿、唾液、または組織サンプルである。幾つかの実施形態において、前記サンプルは、標的を投与された被験体から得られる。幾つかの実施形態において、前記サンプルはヒト患者から得られる。
【００９９】
幾つかの実施形態において、前記サンプルは、水、土壌、空気、スラッジ、石油、または化学的もしくは生物学的産物である。分析物検出のための方法及び組成物は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１４／１８２６３４に開示されており、その全体を本明細書の一部として援用する。
【０１００】
ナノ細孔実験においては、電流インピーダンス事象の集団が生成される。数学的モデリングを使用して、ある程度の信頼性の範囲内でバックグラウンドから標的分子が選択される。しかしながら、混合サンプル、例えば、処理されていない血液はバックグラウンド分子の大きな集団を有し、これが標的の信号と重複する電気信号を生成する。これらの分子によって高いエラー率が導入され、標的分子を検出するためナノ細孔の信頼性に影響を及ぼす可能性がある。本明細書に開示するように、信頼性を向上させる１つの機構は、ナノ細孔を通って移動するペイロード分子に結合した標的分子の存在及び／または同一性を同定するために使用できる特有の電気信号を提供するために、前記標的分子に1または複数のペイロード分子を結合させることである。従って、バルクサンプルにおいて、ナノ細孔を用いて１以上のペイロード分子に付着した修飾された標的分子を検出するための、改善された方法及び組成物が提供される。
【０１０１】
標的分子並びに１以上のドライバ分子及び／またはペイロード分子を含む形成された複合体は、ナノ細孔（または単に細孔）を含む装置及びセンサを用いて検出することができる。前記細孔は、２つの容積を分離する構造におけるナノスケールまたはミクロスケールの開口部である。前記センサは、前記細孔を通過する対象を識別するように構成される。例えば、幾つかの実施形態において、前記センサは、測定可能なパラメータの変化を検出することによって前記細孔を通過する対象を識別し、ここでの変化は前記細孔を通過する対象を示す。この装置は、全体を通して「ナノ細孔装置」と称される。幾つかの実施形態において、前記ナノ細孔装置は、標的分子をある容積から別の容積へと前記細孔を横切って移動させるために、電源に接続された電極を含んでいる。前記標的分子は、荷電されることができ、または電荷を含むドライバ分子に結合され得るからである。前記細孔を横切る電位または電圧を発生させることにより、前記標的分子、または前記ドライバ分子に結合された前記標的分子の移動が促進され、制御される。一定の実施形態において、前記センサは一対の電極を含み、これは電流を読み取ることにより前記ナノ細孔を通る対象の通過を検出するため、及び前記細孔を横切る電圧を提供するための両方の目的でのセンサとして構成されている。一定の実施形態においては、電圧クランプまたはパッチクランプを使用して、前記細孔を横切って電圧を供給すると同時に前記細孔を通る電流を測定する。
【０１０２】
ペイロード分子に結合した標的分子の検出は、様々な方法によって行うことができる。一つの態様において、予め定められた塩（例えば、ＫＣｌ）を含む溶液中において、印加された電圧下での前記細孔を通る前記標的分子の移動は、特有の検出可能な電気信号を生成するであろう。この電気信号は、電流シフト（高さ）の量及び／または電流シフトの持続時間（幅）によって、または電気的識別特性を区別する前記信号の他の任意の特徴によって、相互に区別することができる。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、前記センサは電極を含んでおり、これは電源に接続されて電流を検出することができる。従って、電極の一方または両方が「センサ」として機能する。この実施形態では、電圧クランプまたはパッチクランプを使用して、前記細孔に電圧を供給し、同時に前記細孔を通る電流を測定する。
【０１０４】
幾つかの態様において、検出を助けるためのプローブが前記標的分子に加えられる。このプローブは、前記標的分子に付着されたペイロード分子またはドライバ分子に結合できる。一態様において、前記プローブは、前記ナノ細孔における検出を容易にするために、負または正の何れかの電荷を有する。別の態様において、前記プローブは、前記ナノ細孔における検出を容易にするためにサイズを加算させる。別の態様において、前記プローブは、フルオロフォアのような検出可能な標識を含む。
【０１０５】
ｊ．光学的検出
前記ペイロード分子は、電流インピーダンスを使用する代わりに、当該技術分野で既知の方法により検出できる。幾つかの実施形態において、ペイロード分子は、例えば、蛍光色素（例えば、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタミド蛍光体、テキサスレッド）、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ，１３１Ｉ、電子高密度試薬（例えば金）、ＥＬＩＳＡで共通に使用される酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色標識（例えば金コロイド）、磁気標識（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、ビオチン、ジオキシゲニン、またはハプテン、及びそれに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質が含まれる。他のペイロード分子には、対応する受容体またはオリゴヌクレオチド相補物とそれぞれ複合体を形成できる標識またはオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１０６】
幾つかの態様において、前記ペイロード分子はフルオロフォアである。本明細書で使用するとき、「フルオロフォア」の用語は、特定の波長（励起周波数）で光を吸収し、続いてより長い波長（発光周波数）の光を放出する分子を指す。本明細書で使用するとき、「ドナーフルオロフォア」の用語は、クエンチャー部分に非常に近接しているときに、放出エネルギーをクエンチャーに供与または伝達するフルオロフォアを意味する。クエンチャー部分にエネルギーを供与する結果として、ドナーフルオロフォアは、近接して配置されたクエンチャー部分の不存在下で有する特定の発光周波数において、より少ない光を放出する。
【０１０７】
適切な蛍光部分には、当分野で既知の以下のフルオロフォアが含まれる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸アクリジン及び誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−ｌ−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ（商標））色素（バイオサーチテクノロジー）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ、ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬブリリアントイエロー；クマリン及び誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）；７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（クマリン１５１）、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）；シアノシン４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロールスルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロライド（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．；エオシン及び誘導体：エオシン、エオシン及びソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート、エチジウムフルオレセイン及び誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラロスアニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フ��コエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド、オレゴングリーン（登録商標）、ヨウ化プロピジウム；ピレン及び誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシニミジル１−ピレンブチレート、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミングリーン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体。
【０１０８】
他の蛍光ヌクレオチド類似体を使用することができる。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２７８  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６３−３９０（１９９７）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２２  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４１８−３４２２  （１９９４）を参照されたい。米国特許第５，６５２，０９９号及び第６，２６８，１３２号もまた、蛍光オリゴヌクレオチドを生成するために、酵素合成または化学合成の何れかを介して核酸、例えばＤＮＡ及び／またはＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドに組み込むためのヌクレオシド類似体を記載している。米国特許第５，１３５，７１７号は、蛍光標識として使用するためのフタロシアニン及びテトラベンズトリアザポルフィリン試薬を記載している。
【０１０９】
ｋ．ナノ細孔装置
提供されるようなナノ細孔装置は、該装置の内部空間を２つの容積に分離する構造に開口部を形成する少なくとも１つの細孔と、（例えば、対象を示すパラメータの変化を検出することにより）前記細孔を通過する対象を識別するように構成された少なくとも一つのセンサとを含む。本明細書に記載された方法に使用するためのナノ細孔装置はまた、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１３／０１２８８１に開示されており、その全体を本明細書の一部として援用する。
【０１１０】
前記ナノ細孔装置における細孔は、ナノスケールまたはマイクロスケールのものである。一つの態様において、各細孔は、小さな分子もしくは大きな分子または微生物が通過することを可能にする大きさを有する。一つの態様において、各細孔は直径が少なくとも約１ｎｍのものである。或いは、各細孔は、直径が少なくとも約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍまたは約１００ｎｍのものである。
【０１１１】
一態様において、前記細孔は、直径が約１００ｎｍ以下である。或いは、前記細孔は、直径が約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、約５０ｎｍ、約４５ｎｍ、約４０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、または約１０ｎｍを超えない。
【０１１２】
幾つかの態様において、各細孔は、直径が少なくとも約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約２０００ｎｍ、約３０００ｎｍ、約５０００ｎｍ、約１００００ｎｍ、約２００００ｎｍ、または約３００００ｎｍである。一態様において、前記細孔は直径が約１０００００ｎｍ以下である。或いは、前記細孔は、直径が約５００００ｎｍ、約４００００ｎｍ、約３００００ｎｍ、約２００００ｎｍ、約１００００ｎｍ、約９０００ｎｍ、約８０００ｎｍ、約７０００ｎｍ、約６０００ｎｍ、約５０００ｎｍ、約４０００ｎｍ、約３０００ｎｍ、約２０００ｎｍ、または約１０００ｎｍを超えない。
【０１１３】
一態様において、前記細孔は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約２ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約４ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約３０ｎｍの直径を有する。
【０１１４】
幾つかの態様において、前記ナノ細孔装置内の細孔は、大きな微生物または細胞を検出するための、より大きなスケールのものある。一態様において、各細孔は、大きな細胞または微生物が通過するのを可能にする大きさを有する。一態様において、各細孔は少なくとも約１００ｎｍの直径である。或いは、各細孔は、直径が少なくとも約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１７００ｎｍ、約１８００ｎｍ、約１９００ｎｍ、約２０００ｎｍ、約２５００ｎｍ、約３０００ｎｍ、約３５００ｎｍ、約４０００ｎｍ、約４５００ｎｍ、または約５０００ｎｍである。
【０１１５】
一態様において、前記細孔は直径が約１００，０００ｎｍ以下である。或いは、前記細孔は直径が、約９０，０００ｎｍ、約８０，０００ｎｍ、約７０，０００ｎｍ、約６０，０００ｎｍ、約５０，０００ｎｍ、約４０，０００ｎｍ、約３０，０００ｎｍ、約２０，０００ｎｍ、約１０，０００ｎｍ、約９０００ｎｍ、約８０００ｎｍ、約７０００ｎｍ、約６０００ｎｍ、約５０００ｎｍ、約４０００ｎｍ、約３０００ｎｍ、約２０００ｎｍ、または約１０００ｎｍを超えない。
【０１１６】
一態様において、前記細孔は、約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍ、または約２００ｎｍ〜約９０００ｎｍ、または約３００ｎｍ〜約８０００ｎｍ、または約４００ｎｍ〜約７０００ｎｍ、または約５００ｎｍ〜約６０００ｎｍ、または約１０００ｎｍ〜約５０００ｎｍ、または約１５００ｎｍ〜約３０００ｎｍである直径を有する。
【０１１７】
幾つかの態様において、前記ナノ細孔は膜を通って延びる。例えば、前記細孔は脂質二重層膜に挿入されたタンパク質チャネルであってもよく、または二酸化ケイ素、窒化ケイ素、グラファイト、またはこれらの材料または他の材料の組み合わせで形成された層のような固体状態の基材を貫通して前記細孔を穿孔、エッチング、または他の方法で形成することにより加工されてもよい。幾つかの態様において、前記ナノ細孔の長さまたは深さは、２つの別個の容積を接続するチャネルを形成するように十分に大きい。幾つかのこのような態様において、各細孔の深さは、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍまたは９００ｎｍよりも大きい。幾つかの態様において、各細孔の深さは、２０００ｎｍ以下または１０００ｎｍ以下である。
【０１１８】
一態様において、各細孔は、少なくとも約０．３ｎｍである深さ（即ち、２つの隣接する容積の間に延びる細孔の長さ）を有する。或いは、各細孔は、少なくとも約０．６ｎｍ、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、または約９０ｎｍである深さを有する。
【０１１９】
一態様において、各細孔は約１００ｎｍ以下の深さを有する。或いは、前記深さは約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、約５０ｎｍ、約４５ｎｍ、約４０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、または約１０ｎｍを超えない。
【０１２０】
一態様において、前記細孔は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約２ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３ｎｍ〜約７０ｎｍ、または約４ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約３０ｎｍである深さを有する。
【０１２１】
幾つかの態様において、前記ナノ細孔装置は、前記細孔を横切って標的分子を移動させる手段、及び／または前記細孔を通過する対象を識別する手段を更に含む。以下に、２細孔装置の文脈で記載される更なる詳細を提供する。
【０１２２】
単一細孔のナノ細孔装置と比較して、２細孔装置は、細孔を横切る標的分子の移動の速度及び方向の良好な制御を提供するために、より容易に構成することができる。
【０１２３】
一定の実施形態において、前記ナノ細孔装置は複数のチャンバを含み、各チャンバは、少なくとも１つの細孔を介して隣接するチャンバと連通している。これら細孔のうち２つの細孔、即ち第１の細孔及び第２の細孔は、標的分子の少なくとも一部が第１の細孔から第２の細孔の中へと移動できるように配置される。更に、この装置は、移動中に標的分子を識別できるセンサを含んでいる。一つの態様において、前記識別は、標的分子の個々の成分を同定することを必要とする。別の態様において、前記識別には、前記標的分子に結合した融合分子及び／または標的分析物を同定することを必要とする。単一のセンサが用いられるとき、この単一のセンサは、細孔を横切るイオン電流を測定するために該細孔の両端に配置された二つの電極を含むことができる。別の実施形態において、前記単一のセンサは電極以外の成分を含んでいる。
【０１２４】
一態様において、前記装置は、２つの細孔を介して接続された３つのチャンバを含む。３を超えるチャンバを有する装置は、３チャンバ装置の何れかの側に、または３つのチャンバの何れか２つの間に１以上の追加のチャンバを含むように、容易に設計することができる。同様に、チャンバを接続するために３つ以上の細孔を前記装置に含めることができる。
【０１２５】
一態様において、複数の標的分子が１つのチャンバから次のチャンバに同時に移動することを可能にするために、２つの隣接するチャンバの間に２以上の孔があってよい。このようなマルチ細孔設計は、装置における標的分子分析のスループットを向上させることができる。
【０１２６】
例えば、３チャンバ２細孔装置（「２細孔」装置）において、チャンバの各々が電源に接続するための電極を含むことができ、それにより、チャンバ間の細孔の各々を横切って別々の電圧を印加することができる。
【０１２７】
本開示の一実施形態によれば、上部チャンバと、中間チャンバと、下部チャンバとを含む装置が提供され、ここでの上部チャンバは第１の細孔を介して中間チャンバと連通し、中間チャンバは第２の細孔を通して下部チャンバと連通している。このような装置は、以前にその全体を本明細書の一部として援用するＤｕａｌ−  Ｐｏｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅという名称の米国特許出願公開番号２０１３−０２３３７０９に開示された寸法または他の特性の何れかを有することができる。
【０１２８】
幾つかの態様において、前記細孔は実質的に丸い形状を有する。本明細書で使用する「実質的に丸い」とは、少なくとも約８０または９０％がシリンダの形態である形状をいう。幾つかの実施形態において、前記細孔は、正方形、長方形、三角形、楕円形、または六角形の形状である。
【０１２９】
一態様において、２以上の細孔を含む装置では、前記細孔は、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの距離で離間される。幾つかの態様において、前記細孔間の距離は、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、３０００ｎｍ、４０００ｎｍ、５０００ｎｍ、６０００ｎｍ、７０００ｎｍ、８０００ｎｍ、または９０００ｎｍよりも大きい。幾つかの態様において、前記細孔は、３００００ｎｍ、２００００ｎｍ、または１００００ｎｍ以下の間隔をおいて配置される。一態様において、前記距離は少なくとも約１０ｎｍ、或いは少なくとも約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、または約３００ｎｍを超えない。別の態様において、前記距離は約１０００ｎｍ、約９００ｎｍ、約８００ｎｍ、約７００ｎｍ、約６００ｎｍ、約５００ｎｍ、約４００ｎｍ、約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約１５０ｎｍまたは約１００ｎｍを超えない。
【０１３０】
更に別の態様において、前記細孔間の距離は、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約３００ｎｍである。
【０１３１】
前記２つの細孔は、チャンバ間の流体連通を可能にし、且つそれらの間に所定の寸法及び距離を有する限り、任意の位置に配置することができる。１つの態様において、これら細孔は、それらの間に直接的な閉塞がないように配置される。更に、一態様において、これら細孔は実質的に同軸である。
【０１３２】
一態様において、前記ナノ細孔装置は１以上の電源に接続される。幾つかの態様において、前記電源は、各細孔に電圧を供給し且つ各細孔を通る電流を独立して測定できる電圧クランプ、またはパッチクランプを含む。この点において、前記電源及び電極の構成は、前記中間チャンバを両方の電源の共通接地に設定することができる。
【０１３３】
幾つかの態様において、前記電源は、第１の細孔には第１の電圧Ｖ１を印加し、第２の細孔には第２の電圧を印加するように構成される。幾つかの実施形態において、前記２つの細孔は直列である。幾つかの実施形態において、前記第１の細孔は上部チャンバと中間チャンバの間にあり、前記第２の細孔は中間チャンバと下部チャンバの間にある。幾つかの態様において、前記第１の電圧Ｖ１及び前記第２の電圧Ｖ２は独立して調節可能である。一態様において、前記中間チャンバは、前記２つの電圧に対して接地となるように調整される。一態様において、前記中間チャンバは、各々の細孔と中間チャンバ内の電極との間にコンダクタンスを提供するための媒体を含む。一態様において、前記中間チャンバは、各々の細孔と前記中間チャンバ内の電極の各々との間に抵抗を提供するための媒体を含む。このような抵抗をナノ細孔抵抗に比べて十分に小さく保つことは、前記２つの電圧及び電流を前記細孔に亘ってデカップリングするために有用であり、これは前記電圧の独立した調節のために役立つ。
【０１３４】
電圧の調節は、前記チャンバ内での荷電粒子の動きを制御するために使用することができる。例えば、両方の電圧が同じ極性に設定されている場合、適切に荷電された粒子は、上部チャンバから中間チャンバ及び下部チャンバへ、またはその逆の方向に順次移動することができる。幾つかの態様において、前記２つの電圧が反対の極性に設定されるとき、荷電粒子は、上部チャンバまたは下部チャンバの何れかから中間チャンバに移動され、そこで保持されることができる。
【０１３５】
ナノ細孔装置の追加の実施形態、及び検出のための使用メカニズムは、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１３／０１２８８１及びＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１３／０７４５４６号に記載されており、それら各々の全体を本明細書の一部として援用する
【０１３６】
ｌ．センサ
上述したように、種々の態様において、前記ナノ細孔装置は、前記結合モチーフの結合状態の同定を行うために１以上のセンサを更に含む。
【０１３７】
前記装置に使用されるセンサは、標的分子を同定するのに適した任意のセンサであることができる。例えば、センサは、前記標的分子または結合したペイロード分子に関連する電流、電圧、ｐＨ値、光学的特徴、または滞留時間を測定することによって、前記標的分子を同定するように構成することができる。他の態様において、前記センサは、前記標的分子の１以上の個々の成分または前記標的分子に結合された１以上の成分（即ち、前記ペイロード分子）を同定するように構成することができる。前記センサは、測定可能なパラメータにおける変化を検出するように構成された任意の構成要素から形成されてよく、ここでは前記変化が標的分子またはペイロード分子を示す。一態様において、前記センサは、分子または他の実体（特に標的分子）が細孔を通って移動するときの細孔を横切るイオン電流を測定するために、前記細孔の二つの側に配置される一対の電極を含んでいる。一定の態様において、細孔を通過する標的分子セグメントがペイロード分子に結合されると、細孔を横切るイオン電流が測定可能に変化する。このような電流の変化は、例えば、存在し且つ前記標的分子に結合している１以上のペイロード分子の存在、不存在、及び／またはサイズに対応して、予測可能かつ測定可能な方法で変化し得る。
【０１３８】
好ましい実施形態において、前記センサは、電圧を印加して、前記ナノ細孔を横切る電流を測定するために使用される電極を含んでいる。オームの法則Ｖ＝ＩＺ（Ｖは印加される電圧、Ｉは前記ナノ細孔を通る電流、Ｚはインピーダンスである）に従って、ナノ細孔を通る分子の移動は、ナノ細孔を通る電流に影響を与える電気インピーダンス（Ｚ）を提供する。電場において（例えば、印加された電圧の下で）、分子がナノ細孔を通って移動するときの結果は電気信号であり、これは前記電流信号の更なる分析に際して前記ナノ細孔を通過する前記分子と相関し得る。
【０１３９】
前記電気信号からの滞留時間測定値が使用されるとき、前記構成要素のサイズは、前記検出装置を通過するのに要する時間の長さに基づいて、特定の構成要素と相関させることができる。
【０１４０】
一実施形態においては、前記ナノ細孔装置に、前記標的分子、前記標的分子の成分（もしくはユニット）、または前記標的分子に結合した成分（例えば、ペイロード分子もしくはドライバ分子）の光学的特徴を測定するセンサが設けられる。そのような測定の一例には、赤外（または紫外）分光法による特定ユニットに特有の吸収帯の同定が含まれる。
【０１４１】
幾つかの実施形態において、前記センサは電気センサである。幾つかの実施形態において、前記標的分析物または通過する検出可能な標識が独特の蛍光識別特性を有する場合、前記センサは蛍光検出手段を検出する。前記細孔の出口の放射線源を用いて、その識別特性を検出することができる。
【０１４２】
ｍ．ナノ細孔検出からのデータの解析
幾つかの実施形態において、前記標的分子を同定する方法は、１以上のナノ細孔を含む装置上で実施される。前記装置には、サンプルをリザーバチャンバに侵入することを可能にするマイクロ流体チャネルが含まれてよい。次いで、サンプル混合物に電圧を印加し、ドライバ分子に結合した標的分子のような荷電分子を、ナノ細孔に通過させる。分子が細孔を通過するときに事象が生成され、そのデータは、標的分子の存在と相関した既知の識別特性曲線の存在を見分けるために、ソフトウェアによって分析される。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、前記電気信号は、標的分子を含む複合体がナノ細孔を通過する際に生成される。幾つかの実施形態において、前記電気信号は、前記サンプル内の標的分子の存在または不存在と相関する。幾つかの実施形態において、前記電気信号は、前記サンプル内の標的分子の濃度と相関する。
【０１４４】
別の実施形態においては、電流インピーダンス測定の代わりに光信号を使用して、標的分子の存在を識別することができる。前記ナノ細孔を通して荷電分子を駆動するために、電圧が印加される。前記ナノ細孔またはこれに隣接して存在し得る固定視野内での光学測定値を捕捉するために、前記装置において光学センサが使用される。前記光学的測定には、一定時間内に検出された光の測定値が含まれる。この測定には、色、ルミネッセンス、強度のような１以上の個々の値が含まれるが、これらに限定されない。前記方法は、標的分子を検出するために使用することができるが、前記標的分子は、光学センサが検出する光学信号を生成して、特定の光学的測定値を提供するように修飾されている。
【０１４５】
「光学的事象」とは、１以上のペイロード分子を含み得る単一の標的分子の移動からセンサにより捕捉された１組の光学的測定値である。光学的識別特性とは、光学的事象内の光学的測定値の集合であり、ここではソフトウェアが、特有の抽象的値を読み取ったと判断するような方法でそれらを分析する。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、提供される前記電気信号または光信号は、標的分子を電気信号または光信号と相関させるデータベースと比較することができる。この標的分子は、ナノ細孔を通って移動する時の電流インピーダンス、または光学測定のような他の検出方法により検出できるものとして、本明細書で述べた任意の実体であり得る。データベースは、均質な集団によって提供される電気信号を読み取ることにより生成されてよい。ペイロード分子に結合した標的分子（これはドライバ分子に更に結合され得る）の均一な集団の分析は、生成される信号パターンの変化を評価し、そのコードされた分子についての参照信号を決定するために有用である。  
【０１４７】
ｎ．適用
幾つかの実施形態において、本発明は、サンプル中におけるの標的分子の存在または不存在を検出するために適用される。幾つかの実施形態において、本発明は、サンプル中における標的分子の濃度を測定するために適用される。幾つかの実施形態において、本発明は、標的分子を含む複合体の存在または不存在を検出するために適用される。幾つかの実施形態において、本発明は、サンプル中における標的分子を含んだ複合体の濃度を測定するために適用される。幾つかの実施形態において、本発明は、標的分子または標的分子を含む複合体の物理的特性を検出するために適用される。
【０１４８】
幾つかの実施形態において、前記サンプルは薬理学的組成物である。幾つかの実施形態において、前記サンプルは、患者からの血液、尿、唾液、または組織サンプルである。幾つかの実施形態において、前記サンプルは混合サンプル、例えば患者から得られた血液または尿サンプルである。幾つかの実施形態において、前記サンプルは、標的を投与された被験体から得られる。幾つかの実施形態において、前記サンプルはヒト患者から得られる。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、前記サンプルは、水、土壌、空気、スラッジ、石油、または化学的もしくは生物学的産物である。
【０１５０】
幾つかの実施形態において、前記標的分子または該標的分子を含む複合体のナノ細孔検出は、サンプルの組成に関する情報を提供する。幾つかの実施形態において、前記標的分子または該標的分子を含む複合体のナノ細孔検出は、ｐＨ、組成または温度のような前記サンプルの物理的状態に関する情報を提供する。幾つかの実施形態において、前記標的分子または該標的分子を含む複合体のナノ細孔検出は、前記標的分子の安定性に関する情報を提供する。幾つかの実施形態において、前記標的分子または該標的分子を含む複合体のナノ細孔検出は、前記サンプルの起源に関する情報を提供する。
【実施例】
【０１５１】
６．実施例
ａ．実施例１
ｉ．標的−リンカー−ドライバ複合体
図１は、開示された方法及びシステムの実施形態を示す。より具体的には、この図は、リンカー分子１０４を介してドライバ分子１０２に結合された標的分子１０１を開示する。ドライバ分子１０２は、印加電圧下にナノ細孔１０６を通る標的分子１０１の移動を容易にするように荷電される。また、図１には、ナノ細孔における捕捉に際し、検出可能なシグナルを生成し、または生成しないバックグラウンド分子１０５が示されている。
【０１５２】
一定の条件下では、図２に示すように、ドライバ分子１０２を標的分子１０１から分離することができる。これが起きたときには、ドライバ分子１０２は、標的分子を伴わずにナノ細孔を通過する。
【０１５３】
図３に示すように、ドライバ分子単独の移動（図３Ｂ）または標的分子単独の移動（図３Ｃ）で生成される電気信号は、ドライバ−標的複合体の移動（図３Ａ）の際に生成される電気信号とは異なる。この場合、ドライバ分子に結合した標的分子は、持続時間がより長く、及び／または開放チャネル信号からの更に大きな変化を有する電気信号を提供する（図３Ａ〜Ｃ）。
【０１５４】
ｉｉ．標的（リシノプリル）−リンカー（ＳＭＣＣ）−ドライバ（ＤＮＡ）複合体のナノ細孔検出：
本発明は、電流インピーダンスに基づいてナノ細孔内で検出可能であるように、ドライバ分子に結合した薬物化合物を提供する。リシノプリル（アンジオテンシン変換酵素阻害剤）は、アストラゼネカ（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）が高血圧症の治療薬として販売している小分子薬である。その小さなサイズ（４０５Ｄａ）を考慮すれば、リシノプリルは小さすぎてナノ細孔では検出されない。しかし、ドライバ分子に接合した場合、リノノプリルは前記ナノ細孔を通って往復することができ、検出を可能にする。図４は、ＳＭＣＣリンカー（これはｄｓＤＮＡドライバ分子に結合する）に共有結合するように修飾された、リシノプリルの化学構造を示す。
【０１５５】
詳細に言えば、本発明者らは、ＮＨＳ−エステル含有分子への結合のための遊離アミンを含むように、リシノプリルを修飾した。この修飾されたリシノプリルが、ＳＭＣＣリンカーを介してチオール化ＤＮＡに連結され、前記ＳＭＣＣリンカーのＮＨＳエステル反応性基はリシノプリル中の遊離アミンと反応する一方、前記リンカー上のマレイミド基はＤＮＡ上の５’チオールと反応する。本発明者らは、リシノプリルのＥＳＩ質量スペクトルを介してＳＭＣＣ標識を確認した。測定質量６２５．２（図５）は、予測質量６２５〜６２７と一致した。次いで、このリシノプリル−ＳＭＣＣ付加物をチオール化ＤＮＡと反応させて、リシノプリル−ＤＮＡ（または標的−ドライバ）複合体を得た。
【０１５６】
前記ＤＮＡドライバ分子は、ナノ細孔装置におけるリジノプリルの並進及び検出を容易にした。ＤＮＡ−リシノプリル複合体は、図６（ドット）にプロットされているように、容易に検出可能な電気信号を生成した。ドライバを伴わないリシノプリルは、細孔を通過するときに信号を生じなかった。１０ｎＭ濃度のＤＮＡ−リシノプリルは１分当たり１４４事象を与え、これは最大コンダクタンスシフトにおいて１〜２ｎＳの範囲に亘り、持続時間において１０−５〜１０−４ｓの範囲に亘る。５３２ｂｐのｄｓＤＮＡドライバ分子に結合しない場合、リシノプリルはナノ細孔では検出されない。
【０１５７】
ｉｉｉ．標的（モノクローナル抗体）−リンカー（ＰＮＡ−ＳＭＣＣ）−ドライバ（ＤＮＡ）複合体のナノ細孔検出：
本発明はまた、ドライバ分子に結合するドメインに標的を共有結合させ、それを電気泳動電流下で細孔を通して先導することにより標的生物学的薬物を検出する方法を提供する。詳細に言えば、破傷風菌中の病原性タンパク質（破傷風毒素）に結合してこれを中和できるモノクローナル抗体薬物が、配列特異的位置でＤＮＡドライバ分子に結合するＳＭＣＣリンカーを介して、ＰＮＡに共有結合される。この複合体（ドライバ−薬物）は、細孔の中で明瞭に検出可能であるが、薬物それ自体及びドライバそれ自体は検出できない。従って、ドライバ−薬物複合体だけが細孔内で検出でき、この特許の図１の概念を実現する。
【０１５８】
図７は、１ＭのＬｉＣｌ中において、２７ｎｍの推定直径及び２９ｎｍの推定膜厚を有する細孔を通過するドライバＤＮＡ及び薬物（抗体）の個々の分子についての、最大コンダクタンスシフト対持続時間の事象プロットを示している。最大コンダクタンスシフトとは、最大電流減衰シフトを印加電圧（この場合は１００ｍＶ）で除したものとして定義される。ドライバと薬物が相互に結合されていない場合、前記ナノ細孔を通る明白は信号が得られないため、最小限に検出される（ドライバＤＮＡ信号の深さは１〜２．５ｎＳ、持続時間は１０−５〜１０−４ｓ、事象率は１分あたり８回未満であり、薬物抗体は全く検出されなかった）。しかしながら、ドライバ−薬物の完全複合体は、１）ドライバ−ＤＮＡの長さ、及び２）薬物抗体の「バルク」により規定される１分間に１７０事象、非常に顕著なシグナル深度（２〜６ｎＳ）及び持続時間（１０−４〜１０−２ｓ）を与えた。これは、前記ユニット（ドライバＤＮＡ−ＰＮＡのみ黒四角、図７）と個別に比較して、容易に検出可能な集団（ドット、図７）を生成するＤＮＡ／薬物複合体をもたらす。これは、ナノ細孔の検出及び定量についての、薬物とドライバ分子の間の結合の重要性を示している。
【０１５９】
ｂ．実施例２
ｉ．標的−リンカー−ドライバ−ペイロード複合体
図４は、標的分子１０１が、リンカー分子１０４ａを介してドライバ分子１０２と、また別のリンカー１０４ｂを介してペイロード分子１０３との両方に結合する、本発明のもう一つの実施形態を提供する。図９Ａ〜図９Ｂに示すように、ペイロード分子の添加は電気信号を増強し、その持続時間及び／または差をオープンチャネル信号から増加させて、ナノ細孔内における標的分子の検出を容易にする。
【０１６０】
ｉｉ．標的（生物学的ペプチド）−リンカー（ＰＮＡ）−ドライバ（ＤＮＡ）−ペイロード（抗体）複合体のナノ細孔検出：
図１０は、ドライバ分子に結合した生物学的ペプチド標的分子及び該ペプチド標的分子に特異的に結合するペイロード分子から収集したデータを提供する。ペイロード分子は、複合体（ドライバ−標的−ペイロード）にバルクを付加し、それによって（図９に記載するように）細孔内における標的分子の検出を容易にする。詳細に言えば、前記生物学的ペプチド標的分子は、その後の遊離チオールを有する化合物への結合のために、マレイミド付着部位を有するように操作された。この操作された生物学的ペプチド標的分子は、１０８ｂｐのｄｓＤＮＡドライバ分子、該ドライバ分子に結合するＰＮＡリンカーに結合された。前記標的分子は更に、ペイロードとして作用する抗体に結合された。
【０１６１】
図１０は、１０８ｂｐのｄｓＤＮＡドライバ分子−標的分子複合体が細孔を通過するときに生成される電気信号の、最大コンダクタンスシフト対持続時間の事象プロットを示す。ペイロード分子をもたない標的−ドライバ複合体は、ＤＮＡの負電荷により細孔を効率的に移動した。しかし、ドライバのサイズが小さく、長さが短いため、検出が容易ではなかった（四角）。事象母集団（四角）は僅かしか検出されない（深さ１ｎＳ及び持続時間１０−４ｓで、１分当たり２事象のみ）。ＤＮＡ／標的がペイロード分子（抗体）に結合して、ＤＮＡ／ペプチド／抗体複合体（別名  ドライバ／標的／ペイロード）を形成する場合、複合体は細孔内で容易に検出可能である（ドット）。この完全な複合体集団は、４〜６ｎＳの事象深度及び０．１〜１０ｍｓの持続時間、並びに1分間当たり５６事象を生じ、前記ペイロードを含まないドライバ−標的複合体に比較して有意性が増大する。
【０１６２】
ｉｉｉ．ターゲット（ビオチン）−ドライバ（ＤＮＡ）−ペイロード（抗体）複合体のナノ細孔検出：
図１１は、標的分子がドライバ及びペイロードに直接結合されるときの、標的分子の検出からのデータを提供する。ここでは、ＤＮＡドライバ分子の５’及び３’末端を小さな（２４４Ｄａ）標的分子、即ち、ビオチン（ビタミンＢ７）に共有結合させ、次いで、これを抗ビオチン抗体ペイロードに結合させて、標的ビオチン分子の検出を可能にした。前記付着について、ビオチンは、その後の炭水化物の５’リン酸への結合の目的のためにアミドを備えるように操作された。前記ドライバ分子は４７０ｂｐのｄｓＤＮＡであり、これはナノ細孔において最小限で検出された（１分当たり約１回の検出、図１１の四角）。標的分子であるビオチンは非常に小さく（２４４Ｄａ）、それ自体ではナノ細孔において検出されない。ドライバ＋ビオチンのナノ細孔信号は、ドライバ単独からの信号と非常によく似ており、従ってビオチンが検出されなくなる。ビオチン−ドライバを抗体と接触させることにより、ドライバ−標的−ペイロード複合体が形成され、この複合体は容易に検出された。図１３の散乱プロットにおける逆三角は、ドライバ−標的−ペイロード複合体からの事象を示し、これは持続時間（１０−４ｓ〜１０−２ｓ）、振幅（１ｎＳ〜７ｎＳ）、及び頻度（1秒当たり１事象）の範囲に及ぶ。ペイロード分子それ自体は、信頼できる検出のための十分な信号を提供しない。加えて、抗ビオチン抗体は、ドライバ−ｄｓＤＮＡ分子に対して非特異的には結合しない。従って、顕著な事象は、標的分子の存在の暗示的な検出のための、完全なドライバ−標的−ペイロード複合体に特有のものである。
【０１６３】
ｃ．実施例３
ｉ．標的−リンカー−ドライバ−２ペイロード複合体： 
図１２は、本発明の別の実施形態を示しており、ここでは追加のペイロード分子１０３ｂ（波形ボックス）がドライバ分子１０２に連結されている。例えば、ＰＮＡ−ＰＥＧペイロード分子１０３ｂは、前記ＤＮＡドライバ分子に結合できる。前記ペイロード分子のこの結合は、ナノ細孔を通る移動の際に電気信号を更に修飾して、ナノ細孔による検出を増強する。幾つかの実施形態において、前記ドライバ分子及び複数のペイロード分子に結合した標的分子は、前記ナノ細孔を通って、１つのチャンバから他のチャンバへと完全に移動するように構成される（図１３）。
【０１６４】
２つのペイロード分子を含む複合体（図１４Ａ）、１つのペイロード分子（図１４Ｂ）を含む複合体、及びペイロード分子をもたない複合体（図１４Ｃ）は、異なる電気信号を生成する。追加のペイロード分子に結合した標的分子により生成された電気信号は、開かれたチャネルからの増大した持続時間または電流の変化を有し得る（図１４Ａ）。追加のペイロード分子からの電気信号はまた、バックグラウンド分子または他の標的分子に対する区別を容易にするために特有の電流識別特性を提供することもできる。
【０１６５】
ｉｉ．標的（ペプチド）−リンカー（ＰＮＡ）−ドライバ（ＤＮＡ）−２ペイロード（第１のペイロードとしての抗体及び第２のペイロードとしてのＰＮＡ−ＰＥＧ）複合体のナノ細孔検出：
図１５は、この実施形態で使用されるドライバ分子を示す。このドライバ分子は、２つの結合部位、即ち、第１のペイロード分子に結合した標的分子のための１つの結合部位、および第２のペイロード分子のための他の結合部位を含む。前記ドライバ分子に付着した二次ペイロードは多重化を可能にする。異なるサイズの、または離間した二次ペイロードを使用することにより、サンプル中の各ドライバ−標的種について特有のインピーダンス識別特性を生じさせることができる。
【０１６６】
具体的に言えば、図１５における５６３１ｂｐのｄｓＤＮＡドライバ分子の２つの結合部位は、２つのＰＮＡ分子に結合できる。１つの結合部位は、特有の同定のための第２のペイロード分子として使用されるＰＮＡ−ＰＥＧについてのものであり、また他の結合部位は標的−ペイロード複合体についてのもので、ここではそれぞれ、前記標的はＰＮＡ−ペプチドであり、また前記ペイロードは抗体である。このモデルでは、先の実施例と同様に、前記標的ペプチド自体が、ナノ細孔検出及び定量のために前記ドライバ（ｄｓＤＮＡ）に結合できる手段として、それにＰＮＡが結合した修飾「薬物」である。ＰＥＧ（第二のペイロード）と共に使用されるＰＮＡ、及びペプチド（標的）と共に使用されるＰＮＡは、この例では同じであるが、実際には特有のＰＮＡ配列が使用され得るであろうし、また足場当たり１つだけの二次ペイロード及び１つの標的−ペイロードを有する可能性を高めるために好ましい場合がある。ＰＮＡ配列は同じであったので、最初の１０×ＰＮＡ−ＰＥＧを使用して、足場の大部分に１つだけのＰＮＡ結合部位を結合させ、続いて１０×ＰＮＡ−ペプチドが足場の大部分の残りのＰＮＡ結合部位を占めることが意図された。試薬は、直径２４．５〜２５．５ｎｍの同じ細孔上で連続的に試験された。
【０１６７】
図１６Ａ〜Ｂは、０．３ｎＭの５６３１ｂｐのＤＮＡ単独（ドライバ単独、丸）、１０×ＰＮＡ−１０ｋＤａのＰＥＧ（ＰＰ）を伴ったＤＮＡ（ドライバ−ペイロード：四角及び菱形）、１０×ＰＰ及び１０×ＰＮＡ−Ｖ３ループペプチド（ＰＶ３Ｂ）を伴ったＤＮＡ（ドライバ−ペイロード−標的複合体：緑の三角）、１０×ＰＰ並びに１０×ＰＶ３Ｂ及び結合部位に対する２×ＨＩＶ・Ａｂを伴ったＤＮＡ（ドライバ−標的−２ペイロード複合体：星印）から収集された事象プロット（図１６Ａ）及び電気信号のヒストグラム（図１６Ｂ）を示している。
【０１６８】
全ての試薬セットの間で、緩衝液のみで事象が存在しない（即ち、１０事象以下）期間を５〜１０分間記録して、試験された各試薬が最小のクロスサンプル汚染で確実に測定されるようにした。０．３ｎＭで５．６ｋｂのＤＮＡ単独では、１０分で４５７事象が生じ、続いて１０×（部位当たり６ｎＭ＝２×３ｎＭ）のＰＮＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）を伴った０．３ｎＭのＤＮＡとでは、８分で２９４事象を生じ、続いて、１０×ＰＮＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）を伴った０．３ｎＭのＤＮＡの繰返しでは、７分で３１６事象が生じた。次に、１０×ＰＰ及び１０×Ｖ３Ｂを伴ったＤＮＡは、１５分で７８７事象を生じ、その後１０×ＰＰ並びに１０×Ｖ３Ｂ及び２×Ａｂを伴ったＤＮＡでは、２５分で８２８事象が生じた。最終的な対照として、２×Ａｂ単独（０．６ｎＭ）が実行され、１０分で７事象のみが生じた。
【０１６９】
ＤＮＡ単独の集団は、他のものから識別可能であり、標準的に折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、折り畳まれない事象プロファイルを生成する。１０×ＰＰ及びＰＶ３Ｂを伴ったＤＮＡ集団は、事象分布においては同等であるが、存在するＡｂとの完全な複合体（ペイロードフリーの場合と同様に）は、より深く且つより長く持続する集団を生成する（図１６Ａ、事象周囲のボックス、左）。標準的な事象プロットを使用したこれらの集合体としての傾向は、二次ペイロード結合を備えた複合体及び標的−ペイロード結合を備えた複合体が、標的の検出及び定量のための独特な電気的識別特性を生成することを示している。
【０１７０】
ドライバ分子を設計する別の方法が、この実施形態において利用可能である。例えば、その全体を本明細書の一部として援用するＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１５／１７６０３は、多重化手段としての特有の識別子、及び標的のための複数の結合部位を含むドライバ分子（即ち、足場）を開示する。そのようなドライバ分子は、ナノ細孔装置を使用して標的分子の検出を可能にするために、標的分子に連結することができる。
【０１７１】
７．参照による援用
本出願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書がそれぞれ個別に示されているかのように、全ての目的のために、その全体を本明細書の一部として援用する。
【０１７２】
８．均等
種々の特定の実施形態を例示し、説明してきたが、上記の明細は限定的ではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行えることが理解されるであろう。本明細書を検討したときには、多くの変形が当業者に明らかになるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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