(57)【要約】ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異に関連するスプライスバリアントが本明細書に記載されている。本出願は、記載のスプライスバリアントを検出する方法、及び、がんを診断するため、ＳＦ３Ｂ１の調節因子を評価するための使用、及び、ＳＦ３Ｂ１の変異に関連するがんを治療する方法にも関する。【選択図】  図３
2018525994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントを検出する方法であって、
ａ）１種又は複数種のスプライスバリアントを含有する疑いがある生体試料を用意するステップと、
ｂ）前記生体試料を、前記１種又は複数種のスプライスバリアントと特異的にハイブリダイズすることができる１種又は複数種の核酸プローブと接触させるステップと、
ｃ）前記１種又は複数種のプローブの前記１種又は複数種のスプライスバリアントへの結合を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記１種又は複数種の核酸プローブのそれぞれが標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料を、それぞれが分子バーコードで標識された１種又は複数種の追加的な核酸プローブと接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的細胞におけるネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質の活性を調節する方法であって、ＳＦ３Ｂ１調節化合物を標的細胞に適用するステップであり、標的細胞が、表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを、前記ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有さない細胞におけるレベルと比較して上昇又は低下したレベルで発現することが決定されたものである、ステップを含む方法。
【請求項５】
化合物の、標的細胞におけるネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質の活性を調節する能力を評価するための方法であって、
ａ）変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する標的細胞を用意するステップと、
ｂ）前記化合物を前記標的細胞に適用するステップと、
ｃ）表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップと
を含む方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前に、表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質が、Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ、又はＤ７８１Ｎから選択される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップが、核酸バーコーディング、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、核酸シークエンシング、ナノ粒子プローブ、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションから選択される核酸数量化アッセイを使用することを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップが、標的細胞における１種又は複数種のスプライスバリアントＲＮＡのコピー数を測定することを含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、小分子、抗体、アンチセンス分子、アプタマー、ＲＮＡ分子、及びペプチドから選択される、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、プラジエノライド又はプラジエノライド類似体から選択される小分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラジエノライド類似体が、プラジエノライドＢ、プラジエノライドＤ、Ｅ７１０７、式１：
【化１】
2018525994.tif 000056
の化合物、式２：
【化２】
2018525994.tif 000057
の化合物、式３：
【化３】
2018525994.tif 000058
の化合物、又は式４：
【化４】
2018525994.tif 000059
の化合物から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞が、骨髄異形成症候群、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、又は急性骨髄性白血病を有する疑いがある患者から得たものである、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞が、血液若しくは血液画分から選択される試料から得たものである、又は血液若しくは血液画分から選択される試料から得た細胞に由来する培養細胞である、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標的細胞がリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的細胞が、固形腫瘍から得たものである、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的細胞が、乳房組織細胞、膵臓細胞、肺細胞、又は皮膚細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
新生物疾患を有する患者を治療するための方法であって、治療有効量のＳＦ３Ｂ１調節化合物を前記患者に投与するステップであり、前記患者由来の細胞が、
ａ）ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を含有すること、及び
ｂ）表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを、前記ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有さない細胞におけるレベルと比較して上昇又は低下したレベルで発現すること
が決定されたものである、ステップを含む方法。
【請求項１９】
前記スプライスバリアントのうちの１つ又は複数が、表１の１、７、９、１０、１３、１５、１６、１８、２１、２４、２７、２８、３０、３１、３３、３４、４８、５１、６２、６５、６６、７１、７２、８１、８４、８９、９１、１０５、１０７、１２１、１３５、１３６、１５２、１７８、２３５、２４０、２４７、２６５、２６７、２７２、２７６、２７９、２８２、２８３、２８６、２９２、２９５、２９６、２９８、３０２、３０６、３２９、３３０、３３１、３４３、３５０、３５５、３５６、３６０、３６４、３７２、３７８、３９０、３９１、４２３、４２４、４２５、４２６、４３１、４３３、４３８、４３９、４４３、４４５、４４７、４４８、４５１、４５２、４５８、４５９、４６０、４６２、４６８、４６９、４７２、５００、５０８、５１７、５１９、５２１、５２４、５２５、５２７、５２８、５３０、５３３、５３６、５４０、５４３、５４８、５４５、５５４、５５６、５５９、５７１、５７３、５８０、５８２、５８３、５９７、６０１、６１５、６１７、６１８、６３９、６４０、６５４、６５７、６６６、６７０、６８０、７２７、７３０、７５０、７５８、７６７、又は７７４行目から選択される異常バリアントである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記スプライスバリアントのうちの１つ又は複数が、表１の２１、３１、５１、８１、１１８、２７９、３７２、４０１、４２６、４４３、５２８、５４３、５４５、５４８又は５６６行目から選択される異常バリアントである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[003]スプライソソームによって編成される、高度に制御された分子事象であるＲＮＡスプライシングの結果、ｍＲＮＡ前駆体からイントロン配列が除去されて成熟ｍＲＮＡが生成される。ＲＮＡスプライシングの制御不全は、いくつかの疾患の原因となる欠陥であると同定されている。さらに、制御不全スプライシングは、腫瘍形成及び療法に対する抵抗性に重要な役割を果たすことが提唱されている；しかし、がんにおける制御不全スプライシングの原因分子は依然として捕らえられていない。
【０００２】
[004]ＳＦ３Ｂ１は、ＲＮＡスプライシングに関与するタンパク質である。ＳＦ３Ｂ１は、ｍＲＮＡ前駆体に、枝分かれ部位を含有する領域において結合し、３’スプライス部位（３’ｓｓ）におけるスプライソソームの初期の認識及び安定化に関与するＵ２  ｓｎＲＮＰ複合体の一部を形成する。ＳＦ３Ｂ１変異の影響の詳細な及び系統的な分析は、細胞におけるＲＮＡスプライシングに対するＳＦ３Ｂ１変異の影響を定義するために必要であり、またＳＦ３Ｂ１変異体がんに対する新規の治療的手法を導く可能性がある。
【発明の概要】
【０００３】
[005]本明細書において提供される説明は、ある特定のＳＦ３Ｂ１変異により、公知の及び新規のスプライシングの変化の生成を伴うネオモルフィック活性がもたらされることを実証するものである。さらに、系列特異的スプライシング異常が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、黒色腫、及び乳がんにおいて同定された。さらに、ＳＦ３Ｂ１変異体がん細胞株、異種移植片、及びＣＬＬ患者試料をＳＦ３Ｂ１の調節因子で処理することにより、異常スプライシングが低減し、腫瘍退縮が誘導された。
【０００４】
[006]本明細書に記載の方法は、ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を含有する細胞における１種又は複数種のスプライスバリアントの発現を検出又は数量化することを伴う。本発明の種々の実施形態は、スプライスバリアントを検出又は数量化して、患者が１つ又は複数のネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異を伴うがんを有するかどうかを決定することを含む。さらなる実施形態は、スプライスバリアントの量を測定して、変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質に対する化合物の影響を評価することを含む。別の実施形態は、ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有するがん細胞を有する患者を治療する方法を含む。
【０００５】
[007]種々の実施形態は、生体試料中の表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントを検出する方法であって、
ａ）１種又は複数種のスプライスバリアントを含有する疑いがある生体試料を用意するステップと、
ｂ）生体試料を、１種又は複数種のスプライスバリアントと特異的にハイブリダイズすることができる１種又は複数種の核酸プローブと接触させるステップと、
ｃ）１種又は複数種のプローブの１種又は複数種のスプライスバリアントへの結合を検出するステップと、を含む方法を包含する。
【０００６】
[008]一部の実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントと特異的にハイブリダイズすることができる１種又は複数種の核酸プローブは、それぞれが標識を含む。一部の実施形態では、生体試料中の表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントを検出する方法は、生体試料を、それぞれが分子バーコードで標識された１種又は複数種の追加的な核酸プローブと接触させるステップをさらに含む。
【０００７】
[009]実施形態は、標的細胞におけるネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質の活性を調節する方法であって、ＳＦ３Ｂ１調節化合物を標的細胞に適用するステップであり、標的細胞が、表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを、ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有さない細胞におけるレベルと比較して上昇又は低下したレベルで発現することが決定されたものである、ステップを含む方法をさらに包含する。
【０００８】
[010]実施形態は、化合物の、標的細胞におけるネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質の活性を調節する能力を評価するための方法であって、
ａ）変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する標的細胞を用意するステップと、
ｂ）化合物を標的細胞に適用するステップと、
ｃ）表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップと
を含む方法も包含する。
【０００９】
[011]一部の実施形態では、化合物の、標的細胞におけるネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質の活性を調節する能力を評価するための方法は、ステップ（ｂ）の前に、表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップをさらに含む。
【００１０】
[012]一部の実施形態では、ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質は、Ｋ７００Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｒ６２５Ｃ、Ｇ７４２Ｄ、Ｒ６２５Ｈ、Ｅ６２２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｒ、Ｇ７４０Ｅ、Ｙ６２３Ｃ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ７４１Ｎ、Ｎ６２６Ｙ、Ｔ６６３Ｐ、Ｈ６６２Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｄ７８１Ｅ、又はＲ６２５Ｌから選択される。一部の実施形態では、ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質は、Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ、又はＤ７８１Ｎから選択される。
【００１１】
[013]一部の実施形態では、核酸バーコーディング（例えば、ナノストリング（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）（登録商標））、ＲＴ  ＰＣＲ、マイクロアレイ、核酸シークエンシング、ナノ粒子プローブ（例えば、スマートフレア（ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ）（商標））、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＲＮＡスコープ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）（登録商標））から選択される、核酸を数量化するためのアッセイを使用して１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップを含む。
【００１２】
[014]一部の実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントの発現レベルを測定するステップは、標的細胞における１種又は複数種のスプライスバリアントＲＮＡのコピー数を測定することを含む。
【００１３】
[015]さらなる実施形態では、化合物は、小分子、抗体、アンチセンス分子、アプタマー、ＲＮＡ分子、及びペプチドから選択される。さらなる実施形態では、小分子は、プラジエノライド及びプラジエノライド類似体から選択される。追加的な実施形態では、プラジエノライド類似体は、プラジエノライドＢ、プラジエノライドＤ、Ｅ７１０７、式１：
【化１】
2018525994.tif 000003
の化合物、式２：
【化２】
2018525994.tif 000004
の化合物、式３：
【化３】
2018525994.tif 000005
の化合物、又は式４：
【化４】
2018525994.tif 000006
の化合物から選択される。
【００１４】
[016]一部の実施形態では、標的細胞は、骨髄異形成症候群、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、又は急性骨髄性白血病を有する疑いがある患者から得たものである。一部の実施形態では、標的細胞は、血液若しくは血液画分から選択される試料から得たものである又は血液若しくは血液画分から選択される試料から得た細胞に由来する培養細胞である。一部の実施形態では、標的細胞は、リンパ球である。
【００１５】
[017]さらなる実施形態では、標的細胞は、固形腫瘍から得たものである。一部の実施形態では、標的細胞は、乳房組織細胞、膵臓細胞、肺細胞、又は皮膚細胞である。
【００１６】
[018]一部の実施形態では、異常バリアントのうちの１つ又は複数は、表１の１、７、９、１０、１３、１５、１６、１８、２１、２４、２７、２８、３０、３１、３３、３４、４８、５１、６２、６５、６６、７１、７２、８１、８４、８９、９１、１０５、１０７、１２１、１３５、１３６、１５２、１７８、２３５、２４０、２４７、２６５、２６７、２７２、２７６、２７９、２８２、２８３、２８６、２９２、２９５、２９６、２９８、３０２、３０６、３２９、３３０、３３１、３４３、３５０、３５５、３５６、３６０、３６４、３７２、３７８、３９０、３９１、４２３、４２４、４２５、４２６、４３１、４３３、４３８、４３９、４４３、４４５、４４７、４４８、４５１、４５２、４５８、４５９、４６０、４６２、４６８、４６９、４７２、５００、５０８、５１７、５１９、５２１、５２４、５２５、５２７、５２８、５３０、５３３、５３６、５４０、５４３、５４８、５４５、５５４、５５６、５５９、５７１、５７３、５８０、５８２、５８３、５９７、６０１、６１５、６１７、６１８、６３９、６４０、６５４、６５７、６６６、６７０、６８０、７２７、７３０、７５０、７５８、７６７、又は７７４行目から選択される。
【００１７】
[019]一部の実施形態では、異常バリアントのうちの１つ又は複数は、表１の２１、３１、５１、８１、１１８、２７９、３７２、４０１、４２６、４４３、５２８、５４３、５４５、５４８又は５６６行目から選択される。
【００１８】
[020]実施形態は、新生物疾患を有する患者を治療するための方法であって、治療有効量のＳＦ３Ｂ１調節化合物を患者に投与するステップであり、患者由来の細胞が、
ａ）ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を含有すること、及び
ｂ）表１の１〜７９０行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを、ネオモルフィック変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有さない細胞におけるレベルと比較して上昇又は低下したレベルで発現することが決定されたものである、ステップを含む方法をさらに包含する。
【００１９】
[021]さらなる実施形態は、続く説明に記載されている。
【００２０】
[022]前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はどちらも単に例示的及び説明的なものであり、特許請求された本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】代替スプライシングの様式を示す概略図である。
【図２】患者試料における、種々のがんにわたって正常にスプライシングされない遺伝子についての遺伝子発現のレベルを示すグラフである。
【図３】ＳＦ３Ｂ１タンパク質及び対応するＳＦ３Ｂ１遺伝子のコード領域におけるある特定のネオモルフィック変異の位置を示す概略図である。
【図４】ナノストリング（登録商標）アッセイを使用した、膵臓がん同質遺伝子細胞株、肺がん同質遺伝子細胞株、及びＮａｌｍ−６同質遺伝子細胞株から単離されたＲＮＡにおいて検出された異常スプライスバリアントのレベルを示すグラフである。データは３連反復実験の平均として示されている。
【図５】２９３ＦＴ細胞におけるＳＦ３Ｂ１タンパク質の過剰発現を確認するウエスタンブロット画像のセットである。
【図６】ナノストリング（登録商標）アッセイで測定された、野生型ＳＦ３Ｂ１（ＳＦ３Ｂ１ＷＴ）又は変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を発現する２９３ＦＴ細胞から単離されたＲＮＡにおける異常スプライスバリアントのレベルを示すグラフである。データは３連反復実験の平均として示されている。
【図７】２９３ＦＴ細胞におけるＳＦ３Ｂ１タンパク質の過剰発現を確認するウエスタンブロット画像のセットである。
【図８】ナノストリング（登録商標）アッセイで測定された、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ又は変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を発現する２９３ＦＴ細胞から単離されたＲＮＡにおける異常スプライスバリアントのレベルを示すグラフである。
【図９Ａ】Ｐａｎｃ  ０５．０４細胞における、ｓｈＲＮＡによるノックダウンの前後のＳＦ３Ｂ１対立遺伝子の発現を示すウエスタンブロット画像のセットである。
【図９Ｂ】全てのＳＦ３Ｂ１対立遺伝子（ＳＦ３Ｂ１ＰＡＮ）又はＳＦ３Ｂ１ＷＴ又は変異体ＳＦ３Ｂ１（ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ）対立遺伝子のｓｈＲＮＡによるノックダウンの前後の、Ｐａｎｃ  ０５．０４細胞におけるｑＰＣＲによって検出されたＳＦ３Ｂ１  ＲＮＡのレベルを示すグラフである。ｑＰＣＲデータは、ドキシサイクリンで処理していないｐＬＫＯに対する倍率変化として表されている（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。黒い実線の棒、輪郭が描かれた棒、及び灰色の棒は、それぞれＳＦ３Ｂ１ＰＡＮ対立遺伝子特異的ｑＰＣＲデータ、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ対立遺伝子特異的ｑＰＣＲデータ、及びＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ対立遺伝子特異的ｑＰＣＲデータを示す。
【図１０Ａ】Ｐａｎｃ  １０．０５細胞における、ｓｈＲＮＡによるノックダウンの前後のＳＦ３Ｂ１対立遺伝子の発現を示すウエスタンブロット画像のセットである。
【図１０Ｂ】ＳＦ３Ｂ１対立遺伝子のｓｈＲＮＡによるノックダウンの前後の、Ｐａｎｃ  １０．０５細胞におけるｑＰＣＲによって検出されたＳＦ３Ｂ１  ＲＮＡのレベルを示すグラフである。ｑＰＣＲデータは、ドキシサイクリンで処理していないｐＬＫＯに対する倍率変化として表されている（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。黒い実線の棒、輪郭が描かれた棒、及び灰色の棒は、それぞれＳＦ３Ｂ１ＰＡＮ対立遺伝子特異的ｑＰＣＲデータ、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ対立遺伝子特異的ｑＰＣＲデータ、及びＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ対立遺伝子特異的ｑＰＣＲデータを示す。
【図１１】ＳＦ３Ｂ１対立遺伝子のｓｈＲＮＡによるノックダウンの前後の、ナノストリング（登録商標）アッセイで測定されたＰａｎｃ  ０５．０４細胞（図１１Ａ）及びＰａｎｃ  １０．０５細胞（図１１Ｂ）におけるスプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである。データは、３つの生物学的反復実験の平均として示されている。
【図１２】ＳＦ３Ｂ１対立遺伝子のｓｈＲＮＡによるノックダウンの前（丸）及び後（四角）のＰａｎｃ  ０５．０４細胞の成長曲線を示すグラフのセットである。
【図１３】ＳＦ３Ｂ１対立遺伝子のｓｈＲＮＡによるノックダウンの前（丸）及び後（四角）のＰａｎｃ  １０．０５細胞の成長曲線を示すグラフのセットである。
【図１４】ＳＦ３Ｂ１対立遺伝子のｓｈＲＮＡによるノックダウンの前後のＰａｎｃ  ０５．０４細胞（図１４Ａ）及びＰａｎｃ  １０．０５細胞（図１４Ｂ）のコロニー形成を示す培養プレートの画像のセットである。
【図１５】種々の濃度のＥ７１０１で処理した、（図１５Ａ）ＦｌａｇタグＳＦ３Ｂ１ＷＴ又はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅを発現する２９３Ｆ細胞由来の核抽出物におけるｍＲＮＡ前駆体Ａｄ２基質のスプライシングのレベルを示すグラフのセット（それぞれ左側のパネル及び右側のパネル［丸及び三角形］）及び（図１５Ｂ）Ｎａｌｍ−６（ＳＦ３Ｂ１ＷＴ）細胞及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞由来の核抽出物におけるｍＲＮＡ前駆体Ａｄ２基質のスプライシングのレベルを示すグラフのセット（それぞれ左側のパネル及び右側のパネル［丸及び三角形］）である。データは、平均±ＳＤとして示されている、ｎ＝２。
【図１６Ａ】放射標識されたＥ７１０７類似体の、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ（丸、左側のパネル）又はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ（三角形、右側のパネル）のいずれかへの、当該タンパク質を種々の濃度のＥ７１０７と一緒にインキュベートした後の結合を示すグラフの対である。
【図１６Ｂ】上のパネルは、ｑＰＣＲによって測定された、種々の濃度のＥ７１０７で処理したＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞（左側のパネル）及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞（右側のパネル）におけるＥＩＦ４Ａ１  ｍＲＮＡ前駆体（四角）及びＳＬＣ２５Ａ１９成熟ＲＮＡ（逆三角形）のレベルを示すグラフの対である。下のパネルは、ｑＰＣＲによって測定された、種々の濃度のＥ７１０７で処理したＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞（左側のパネル）及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞（右側のパネル）における正常にスプライシングされなかった遺伝子ＣＯＡＳＹ（三角形）及びＺＤＨＨＣ１６（ひし形）の正常にスプライシングされなかったアイソフォームのレベルを示すグラフの対である。（図１６Ｂ）におけるｑＰＣＲデータは、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝３）。
【図１７】ナノストリング（登録商標）アッセイで測定された、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞における、細胞をＥ７１０７を用いて２時間又は６時間にわたって処理した後のスプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである。データは、ＤＭＳＯのみでの処理からの倍率変化として表されている。
【図１８】ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析によって測定された、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞における、細胞をＥ７１０７を用いて６時間にわたって処理した後の、スプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである。
【図１９】ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析によって測定された、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞における、細胞を、グラフの上に示されている番号が付された化合物で処理した後のスプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである。
【図２０】ＲＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞における、細胞をＥ７１０７で処理した後の種々の時間におけるスプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである。データは、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝３）。図２０の上のパネルは、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞（左側のパネル）及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞（右側のパネル）における、Ｅ７１０７で処理した後のある特定の時間において検出されたＥＩＦ４Ａ１  ｍＲＮＡ前駆体（四角）及びＳＬＣ２５Ａ１９成熟ＲＮＡ（逆三角形）のレベルを示す。図２０の下のパネルは、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ細胞（左側のパネル）及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞（右側のパネル）における、Ｅ７１０７で処理した後のある特定の時間において検出された正常にスプライシングされなかった遺伝子ＣＯＡＳＹ（三角形）及びＺＤＨＨＣ１６（ひし形）の正常にスプライシングされなかったアイソフォームのレベルを示す。白抜きの丸は、腫瘍試料の質量分析によって決定されたＥ７１０７の濃度を示す（μｇ／ｍｌ、［右側の垂直方向の軸］）。
【図２１】ナノストリング（登録商標）アッセイで測定された、異種移植マウスをＥ７１０７で処置した後のある特定の時点における、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ異種移植腫瘍及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ異種移植腫瘍における標準スプライスバリアント及び異常スプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである（それぞれ左側及び右側のパネルのセット）。データは、３連反復実験の平均として示されている。
【図２２】ナノストリング（登録商標）アッセイで測定された、異種移植マウスを種々の濃度のＥ７１０７で処置した後のある特定の時点における、Ｐａｎｃ  ０５．０４異種移植腫瘍における標準スプライスバリアント及び異常スプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである（各群ｎ＝４のマウス）。
【図２３】Ｅ７１０７で処置した後のＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ異種移植マウスにおける腫瘍体積（平均±ＳＥＭとして示されている）を示すグラフである。ビヒクルで処置した対照マウスが白抜きの丸で示されている（各群ｎ＝１０の動物）。Ｅ７１０７で処置した動物について、逆三角形＝１．２５ｍｇ／ｋｇ、三角形＝２．５ｍｇ／ｋｇ、及び四角＝５ｍｇ／ｋｇ。
【図２４】Ｅ７１０７で処置した後のＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ異種移植マウスの動物１０匹のコホートにおける生存率を示すグラフである。無処置のコホートが黒い実線によって示されている。Ｅ７１０７で処置した動物について、破線＝１．２５ｍｇ／ｋｇ、灰色の線＝２．５ｍｇ／ｋｇ、及び点線＝５ｍｇ／ｋｇ。
【図２５】分析によって測定された、１０ｎＭのＥ７１０７で６時間にわたって処置した後のＳＦ３Ｂ１ＷＴＣＬＬ細胞試料及びネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体ＣＬＬ細胞試料におけるスプライスバリアントのレベルを示すグラフのセットである。データは、平均値として示されている（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[048]ある特定の態様では、本発明の方法は、細胞におけるスプライスバリアントの量を測定し、それにより、患者がネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異を有するがんを有するかどうかを決定するためのアッセイを提供する。一部の実施形態では、測定されるスプライスバリアントの少なくとも１つは、ＳＦ３Ｂ１タンパク質におけるネオモルフィック変異に関連する異常スプライスバリアントである。追加的な態様では、細胞における変異体ネオモルフＳＦ３Ｂ１タンパク質を調整する化合物の能力を評価するために、細胞におけるスプライスバリアントの測定を使用することができる。
【００２３】
[049]本発明の理解の助けとなるように、最初に特定の用語を定義する。追加的な定義が本出願全体を通して提供される。
【００２４】
[050]本明細書で使用される場合、「変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質」という用語は、配列番号１２００に記載されているヒト野生型ＳＦ３Ｂ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６５６５、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＰ＿０３６５６５．２）（Ｓ．Ｂｏｎｎａｌ、Ｌ．Ｖｉｇｅｖａｎｉ、及びＪ．Ｖａｌｃａｒｃｅｌ、「Ｔｈｅ  ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ｄｒｕｇｓ」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１１：８４７−５９  ［２０１２］）とアミノ酸配列が異なるＳＦ３Ｂ１タンパク質を包含する。ある特定の変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質は、「ネオモルフィック」変異体であり、これは、異常スプライスバリアントの差次的な発現に関連する変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体は、Ｋ７００Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｒ６２５Ｃ、Ｇ７４２Ｄ、Ｒ６２５Ｈ、Ｅ６２２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｒ、Ｇ７４０Ｅ、Ｙ６２３Ｃ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ７４１Ｎ、Ｎ６２６Ｙ、Ｔ６６３Ｐ、Ｈ６６２Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｄ７８１Ｅ、又はＲ６２５Ｌを含む。他の実施形態では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体は、Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ、又はＤ７８１Ｎを含む。ある特定のＳＦ３Ｂ１変異は、Ｋ７００Ｒを含め、異常スプライスバリアントの発現に関連しない。
【００２５】
[051]「スプライスバリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子内の２つのエクソン配列の間又はイントロン−エクソン境界のいずれかのジャンクションにまたがる核酸配列を含み、ジャンクションは、選択的にスプライシングされ得る。代替スプライシングとしては、代替３’スプライスサイトセレクション（「３’ｓｓ」）、代替５’スプライスサイトセレクション（「５’ｓｓ」）、ディファレンシャルエクソン包含（exon inclusion、エクソンインクルージョン）、エクソン読み飛ばし（exonskipping、エクソンスキッピング）、及びイントロン保持（intron retention、イントロンリテンション）が挙げられる（図１）。所与の遺伝子位置に関連するある特定のスプライスバリアントを野生型、又は「標準」バリアントと称することができる。これらのスプライスバリアントは、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異タンパク質を含有しない細胞において最も豊富に発現する。標準スプライスバリアントとは異なり、細胞におけるネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異タンパク質の存在に主に関連する追加的なスプライスバリアントを「異常」スプライスバリアントと称することができる。異常スプライスバリアントは、或いは、「正常でない」又は「非標準」スプライスバリアントと称することができる。ある特定の状況では、野生型又は非ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する細胞は、少量又は検出されない量の異常スプライスバリアントを有し、一方、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する細胞の異常スプライスバリアントのレベルは、野生型ＳＦ３Ｂ１細胞における低レベル又は検出されないレベルと比較して上昇している。一部の場合では、異常スプライスバリアントは、野生型ＳＦ３Ｂ１細胞にも存在するが、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体を有する細胞において差次的に発現するスプライスバリアントであり、それにより、後者の細胞の異常スプライスバリアントのレベルは、野生型ＳＦ３Ｂ１細胞におけるレベルと比較して上昇している又は低下している。異なる型の、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体を含有する細胞、例えば、異なる型のがん細胞などは、ある特定の異常スプライスバリアントの発現のレベルが異なり得る。さらに、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体を含有する１つの細胞型に存在するある特定の異常スプライスバリアントは、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体を含有する他の細胞型には存在しない場合がある。一部の場合では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異タンパク質を有する患者は、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１対立遺伝子の対立遺伝子頻度が低いことに起因して、異常スプライスバリアントを発現しない可能性がある、又は異常スプライスバリアントをより低いレベルで発現する可能性がある。ある特定のがん細胞などの種々の型のネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体を含有する細胞に関連する異常スプライスバリアントの同一性及び相対的発現レベルは、本明細書において提示される説明及び実施例から明らかになるであろう。
【００２６】
[052]「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」という用語は、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異に関連する疾患を治療する化合物の能力を決定することを包含する。一部の実施例では、「評価すること」とは、化合物によりネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質に関連する異常スプライシング事象が調節されるかどうか、又は調節の程度を決定することを含む。ＳＦ３Ｂ１タンパク質の活性の調節は、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質に関連する異常スプライスバリアント発現の上方制御又は下方制御を包含し得る。さらに、「評価すること」とは、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質に関連するスプライスバリアントの発現を調節する化合物を用いて首尾よく治療することができる患者を区別することを含む。
【００２７】
[053]「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」又は「その（ｔｈｅ）」という単語の使用は、特許請求の範囲又は本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される場合、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ又は複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」、及び「１つ又は２つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味とも一致する。「又は（ｏｒ）」とは、代替物が相互排他的である場合など、代替物のみを指すことが明示されていなければ、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するものと包括的に読み取られるべきである。
【００２８】
スプライスバリアント
[054]本発明のスプライスバリアントは表１に列挙されている。表１には、各標準（「ＷＴ」）及び異常（「Ａｂ．」）スプライスジャンクションの遺伝子位置並びに配列が提示されている。表に列挙されている各配列は、スプライスジャンクションの３’側及び５’側のそれぞれから２０ヌクレオチドを含有する（すなわち、スプライスジャンクションが列挙されているヌクレオチド配列の中点になる）。「Ａｖｇ  ＷＴ％」及び「Ａｖｇ  Ａｂ．％」の列には、それぞれ、共有されるスプライス部位を利用する全てのスプライスバリアントの総計数に対して表される標準（ＷＴ）スプライスバリアント又は異常スプライスバリアントの平均百分率計数が提示されており、この計数は、実施例１に記載されている通り決定したものである。「Ｌｏｇ２倍率変化」の列には、標準コホートの百分率計数と異常コホートの百分率計数の間で観察された倍率変化のｌｏｇ２が提示されている（実施例１を参照されたい）。「ＦＤＲ  Ｑ値」の列には、統計的有意性の評価基準として、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ’ｓ  ｌｉｍｍａパッケージにおいて定義されているモデレートｔ検定（ｍｏｄｅｒａｔｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇにおいて入手可能である）を使用して決定されたｐ値からＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用して算出されたｑ値が提示されている（実施例１を参照されたい）。「事象」の列には、異常スプライスバリアントの性質が示されており、「３’ｓｓ」は、代替３’スプライスサイトセレクションを示し、「５’ｓｓ」は、代替５’スプライスサイトセレクションを示し、「ｅｘｏｎ  ｉｎｃｌ．」は、ディファレンシャルエクソンインクルージョンを示し、「ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐ」は、エクソンスキッピングを示す。「型」の列は、異常スプライスバリアントを同定した試料のがんの型を指し、「Ｂｒ．」は乳がんを示し、「ＣＬＬ」は慢性リンパ球性白血病を示し、「Ｍｅｌ．」は黒色腫を示す。
【００２９】
【表１】
2018525994.tif 000007
2018525994.tif 000008
2018525994.tif 000009
2018525994.tif 000010
2018525994.tif 000011
2018525994.tif 000012
2018525994.tif 000013
2018525994.tif 000014
2018525994.tif 000015
2018525994.tif 000016
2018525994.tif 000017
2018525994.tif 000018
2018525994.tif 000019
2018525994.tif 000020
2018525994.tif 000021
2018525994.tif 000022
2018525994.tif 000023
2018525994.tif 000024
2018525994.tif 000025
2018525994.tif 000026
2018525994.tif 000027
2018525994.tif 000028
2018525994.tif 000029
2018525994.tif 000030
2018525994.tif 000031
2018525994.tif 000032
2018525994.tif 000033
2018525994.tif 000034
2018525994.tif 000035
2018525994.tif 000036
2018525994.tif 000037
2018525994.tif 000038
2018525994.tif 000039
2018525994.tif 000040
2018525994.tif 000041
2018525994.tif 000042
2018525994.tif 000043
2018525994.tif 000044
2018525994.tif 000045
2018525994.tif 000046
2018525994.tif 000047
2018525994.tif 000048
2018525994.tif 000049
2018525994.tif 000050
2018525994.tif 000051
2018525994.tif 000052
2018525994.tif 000053
[055]ある特定のスプライスバリアントは、２つ以上の疾患に関連し、したがって、表１中に２回以上現れる。特定の例では、２つ以上のがんの型に関連するスプライスバリアントは、各疾患において異なる発現レベルを有し得、したがって、所与のスプライスバリアントに関する発現データの２つ以上のセットが存在し得る。試験したがんの型全てにわたって差次的に発現するバリアントを使用して、追加的ながんの型においてＳＦ３Ｂ１ネオモルフィック変異を有する細胞を評価することができる。そのようなバリアントは以下の表１の行に示されている（３つ組は、異なるがんの型において測定された同じスプライスジャンクションを表す）：［１３、２７２、５２５］、［２７、２８６、５２７］、［３３、５３６、３３０］、［１０７、４４５、６５７］、［２８、３５０、５７３］、［２２９、７６２、４６７］、［２４０、５０８、７６７］、［７、３５６、５２４］、［７６、３７４、５９６］、［３５、５４７、２８０］、［８４、３６４、５７１］、［８５、５６４、２９７］、［２４、５９７、２９６］、［２１、３７２、５４５］、［３６、５７６、４０７］、［１０５、４２３、６３９］、［６２、５８０、４４７］、［３１、２７９、５２８］、［２３５、７５８、４３９］、［３０６、８９、６６６］、［３４、２９５、５３３］、［３９０、７２、６４０］、［４８、３４３、５５４］、［３６０、６５、５４０］、［１７８、３２９、７５０］、［７１、２６５、５５６］、［１５、２８３、５３０］、［１８、２６７、５８３］、［１２９、４１８、６２２］、［３３３、２５、５４１］、［２４７、５００、７７４］、［２５９、５、５４２］、［１５２、４３８、６１５］、［２９２、１、５１７］、［８１、５４３、４４３］、［３４７、７０、５９２］、［９１、４３１、６１７］、［３０、２９８、５８２］、［１７、３３４、６０２］、［１６、２７６、５５９］、［５１、４２６、５４８］、［１１８、４０１、５６６］、［８３、４３５、５７４］、及び［２６９、４５、５４６］。ある特定の実施形態では、特定のがんの型に対して非特異的なバリアントは、以下の表１の行から選択することができる：［１３、２７２、５２５］、［２７、２８６、５２７］、［３３、５３６、３３０］、［１０７、４４５、６５７］、［２８、３５０、５７３］、［２４０、５０８、７６７］、［７、３５６、５２４］、［８４、３６４、５７１］、［２４、５９７、２９６］、［２１、３７２、５４５］、［１０５、４２３、６３９］、［６２、５８０、４４７］、［３１、２７９、５２８］、［２３５、７５８、４３９］、［３０６、８９、６６６］、［３４、２９５、５３３］、［３９０、７２、６４０］、［３６０、６５、５４０］、［１７８、３２９、７５０］、［７１、２６５、５５６］、［１５、２８３、５３０］、［１８、２６７、５８３］、［２４７、５００、７７４］、［１５２、４３８、６１５］、［２９２、１、５１７］、［８１、５４３、４４３］、［９１、４３１、６１７］、［３０、２９８、５８２］、［１６、２７６、５５９］、又は［５１、４２６、５４８］。
【００３０】
[056]本発明のある特定の実施形態は、がんのマーカーとしてのスプライスバリアントを提供する。ある特定の状況では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質を有するがん細胞は、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質を有さない細胞と比較してある特定のスプライスバリアントの差次的な発現を示す。したがって、１種又は複数種のスプライスバリアントの差次的な発現を使用して、患者がネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異を有するがんを有するかどうかを決定することができる。ある特定の実施形態では、患者が変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有するがん細胞を有することも決定される。これらの方法では、表１に列挙されているスプライスバリアントのうちの１つ又は複数を測定して、患者がネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異を有するがんを有するかどうかを決定することができる。ある特定の実施形態では、表１からの１種又は複数種の異常スプライスバリアントを測定する。他の実施形態では、１つ又は複数の標準スプライスバリアントを測定する。時には、異常バリアントと標準バリアントの両方を測定する。
【００３１】
[057]一部の実施形態では、ＣＬＬを有する疑いがある患者において、表１の２６０、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２７２、２７３、２７５、２７６、２７７、２７９、２８１、２８２、２８６、２８７、２８８、２９０、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０８、３１０、３１２、３１３、３１５、３１６、３１８、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３５、３３７、３３９、３４２、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３６２、３６３、３６５、３６６、３６８、３６９、３７０、３７２、３７５、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９７、３９８、４００、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４１３、４１５、４１６、４１７、４１９、４２０、４２１、４２４、４２５、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５４、４５５、４５６、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４６５、４６８、４６９、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４８０、４８１、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４９０、４９１、４９４、４９６、４９７、４９８、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１３、５１４、５１５、又は５１６行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを測定することができる。追加的な実施形態では、ＣＬＬを有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：２５９、２６９、２７０、２７１、２７４、２７８、２８０、２８２、２９２、２９６、２９７、３０２、３０６、３３０、３３１、３３３、３４３、３４７、３５５、３６０、３６１、３７１、３７３、３７６、３７８、３９０、３９１、４０７、４０８、４２３、４２４、４２５、４３３、４３４、４３９、４４３、４４７、４４８、４５１、４５２、４５３、４５８、４５９、４６０、４６２、４６３、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７２、４７９、４８２、又は４８９行目。追加的な実施形態では、ＣＬＬを有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：２８２、２９２、２９６、３０２、３０６、３３０、３３１、３４３、３５５、３６０、３７３、３７８、３９０、３９１、４２３、４２４、４２５、４３３、４３４、４３９、４４３、４４７、４４８、４５１、４５２、４５８、４５９、４６０、４６２、４６３、４６６、４６８、４６９、４７０、４７２、４７９、４８２、又は４８９行目。さらに別の実施形態では、ＣＬＬを有する疑いがある患者を、表���に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：２８２、２９６、３０２、３０６、３３０、３３１、３５５、３７８、３９０、３９１、４２４、４２５、４３３、４３９、４４３、４４７、４４８、４５１、４５２、４５８、４５９、４６０、４６２、４６８、４６９、又は４７２行目。
【００３２】
[058]他の実施形態では、乳がんを有する疑いがある患者において、表１の２、３、４、７、９、１０、１１、１３、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、７１、７２、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５９、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４７、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、又は２５７行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを測定することができる。追加的な実施形態では、乳がんを有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：７、８、９、１０、２６、４８、６６、１０５、１２１、１３５、１３６、又は１６６行目。追加的な実施形態では、乳がんを有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：７、８、９、１０、２６、４８、６６、１０５、１２１、１３５、又は１３６行目。さらに別の実施形態では、乳がんを有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：７、９、１０、６６、１２１、１３５、又は１３６行目。
【００３３】
[059]さらなる実施形態では、黒色腫を有する疑いがある患者において、表１の５１８、５１９、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３１、５３３、５３４、５３６、５３７、５３８、５３９、５４３、５４４、５４５、５４９、５５１、５５２、５５３、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６５、５６７、５６８、５６９、５７０、５７２、５７３、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８８、５８９、５９０、５９１、５９３、５９５、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２３、６２５、６２７、６２８、６２９、６３０、６３２、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６４０、６４１、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５４、６５７、６５８、６５９、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６８０、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９２、６９４、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、又は７９０行目から選択される１種又は複数種の異常スプライスバリアントを測定することができる。追加的な実施形態では、黒色腫を有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：５１９、５２１、５２２、５３５、５５４、５８７、５９４、６０１、６１８、６３９、６５４、６５５、６７０、６７９、６８０、７２７、７２９、又は７３０行目。追加的な実施形態では、黒色腫を有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる：５１９、５２１、５２２、５３５、５５４、５８７、６０１、６１８、６３９、６５４、６７０、６８０、７２７、又は７３０行目。さらに別の実施形態では、黒色腫を有する疑いがある患者を、表１に列挙されている以下の異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定���ることによって同定することができる：５１９、５２１、６０１、６１８、６５４、６７０、６８０、７２７、又は７３０行目。
【００３４】
[060]一部の実施形態では、異常バリアントのうちの１つ又は複数は、表１の２１、３１、５１、８１、１１８、２７９、３７２、４０１、４２６、４４３、５２８、５４３、５４５、５４８又は５６６行目から選択される。ある特定の実施形態では、がんを有する疑いがある患者を、２１、３１、５１、８１、１１８、２７９、３７２、４０１、４２６、４４３、５２８、５４３、５４５、５４８又は５６６行目から選択される異常バリアントのうちの１つ又は複数の量を測定することによって同定することができる。種々の実施形態では、がんは、例えば、ＣＬＬ、乳がん、又は黒色腫であり得る。
【００３５】
[061]追加的な方法は、がんに対する治療の有効性を、治療前又は治療中に患者から得た試料における１種又は複数種の異常スプライスバリアントのレベルを測定することによって予測又はモニタリングするステップを含む。例えば、治療の経過にわたって１種又は複数種の異常スプライスバリアントのレベルが低下することにより、治療が有効であることが示される。他の場合では、治療の経過にわたって１種又は複数種の異常スプライスバリアントのレベルが低下しないこと又は上昇により、治療が有効ではなく、調整する、補足する、又は終結させるべきであることが示され得る。一部の実施形態では、スプライスバリアントを使用して、個々の患者の治療効果を追跡し、調整する。
【００３６】
[062]本発明の実施形態は、がん患者を、患者試料における１つ又は複数の特定のスプライスバリアントの存在若しくは非存在、又は、１つ又は複数の特定のスプライスバリアントの、正常細胞試料におけるものと比較して上昇若しくは低下したレベルでの検出に基づいて異なるカテゴリーに層別化する方法も包含する。カテゴリーは、異なる予後カテゴリー、種々の再発率を有する患者のカテゴリー、治療に応答する患者及び治療に応答しない患者のカテゴリー、並びに特定の負の副作用を有する患者のカテゴリーなどであり得る。次いで、個々の患者が入るカテゴリーに応じて、それらの患者に対して最適な治療を選択することができる、又は特定の患者を臨床試験のために選択することができる。
【００３７】
[063]実施形態は、本明細書に開示されているスプライスバリアントをマーカーとして使用することにより、ＳＦ３Ｂ１ネオモルフィック変異を有するがん性細胞を正常細胞と区別する方法も包含する。そのような方法は、例えば、がん性細胞の成長又は消失を評価するため、及び治療又は除去するがん性細胞を同定するために使用することができる。一部の実施形態では、がんの進行に対する治療の効果をモニタリングする目的で、抗がん治療の前後に、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異を有する細胞を有するがん性組織におけるスプライスバリアントを測定する。
【００３８】
[064]追加的な実施形態では、がん細胞などの細胞にＳＦ３Ｂ１調節因子を投与することにより、スプライスバリアントの差次的な発現を変化させることができる。したがって、１種又は複数種のスプライスバリアントの発現の変化を使用して、ＳＦ３Ｂ１タンパク質に対するＳＦ３Ｂ１調節因子の効果を評価することができる。一実施形態では、ＣＬＬ細胞に対するＳＦ３Ｂ１調節因子の効果を、そのような細胞にＳＦ３Ｂ１調節因子を適用し、次いで、表１のスプライスバリアントのうちの１つ又は複数を検出又は数量化することによって評価する。追加的な実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の２５８〜５１６行目から選択される。さらなる実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の２６０、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２７２、２７３、２７５、２７６、２７７、２７９、２８１、２８２、２８６、２８７、２８８、２９０、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０８、３１０、３１２、３１３、３１５、３１６、３１８、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３５、３３７、３３９、３４２、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３６２、３６３、３６５、３６６、３６８、３６９、３７０、３７２、３７５、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９７、３９８、４００、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４１３、４１５、４１６、４１７、４１９、４２０、４２１、４２４、４２５、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５４、４５５、４５６、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４６５、４６８、４６９、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４８０、４８１、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４９０、４９１、４９４、４９６、４９７、４９８、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１３、５１４、５１５、又は５１６行目から選択される。さらなる実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、２５９、２６９、２７０、２７１、２７４、２７８、２８０、２８２、２９２、２９６、２９７、３０２、３０６、３３０、３３１、３３３、３４３、３４７、３５５、３６０、３６１、３７１、３７３、３７６、３７８、３９０、３９１、４０７、４０８、４２３、４２４、４２５、４３３、４３４、４３９、４４３、４４７、４４８、４５１、４５２、４５３、４５８、４５９、４６０、４６２、４６３、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７２、４７９、４８２、又は４８９行目から選択される。追加的な実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の２８２、２９２、２９６、３０２、３���６、３３０、３３１、３４３、３５５、３６０、３７３、３７８、３９０、３９１、４２３、４２４、４２５、４３３、４３４、４３９、４４３、４４７、４４８、４５１、４５２、４５８、４５９、４６０、４６２、４６３、４６６、４６８、４６９、４７０、４７２、４７９、４８２、又は４８９行目から選択される。さらに別の実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の２８２、２９６、３０２、３０６、３３０、３３１、３５５、３７８、３９０、３９１、４２４、４２５、４３３、４３９、４４３、４４７、４４８、４５１、４５２、４５８、４５９、４６０、４６２、４６８、４６９、又は４７２行目から選択される。
【００３９】
[065]ある特定の実施形態では、乳がん細胞に対するＳＦ３Ｂ１調節因子の効果を、そのような細胞にＳＦ３Ｂ１調節因子を適用し、次いで、表１のスプライスバリアントのうちの１つ又は複数を検出又は数量化することによって評価する。追加的な実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の１〜２５７行目から選択される。さらなる実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の２、３、４、７、９、１０、１１、１３、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５４、５６、５７、５８、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、７１、７２、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５９、１６３、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４７、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、又は２５７行目から選択される。追加的な実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の７、８、９、１０、２６、４８、６６、１０５、１２１、１３５、１３６、又は１６６行目から選択される。さらなる実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の７、８、９、１０、２６、４８、６６、１０５、１２１、１３５、又は１３６行目から選択される。さらに別の実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の７、９、１０、６６、１２１、１３５、又は１３６行目から選択される。
【００４０】
[066]さらなる実施形態では、メラノーマ細胞に対するＳＦ３Ｂ１調節因子の効果を、そのような細胞にＳＦ３Ｂ１調節因子を適用し、次いで、表１のスプライスバリアントのうちの１つ又は複数を検出又は数量化することによって評価する。追加的な実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の５１７〜７９０行目から選択される。さらなる実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の５１８、５１９、５２０、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３１、５３３、５３４、５３６、５３７、５３８、５３９、５４３、５４４、５４５、５４９、５５１、５５２、５５３、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６５、５６７、５６８、５６９、５７０、５７２、５７３、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８８、５８９、５９０、５９１、５９３、５９５、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２３、６２５、６２７、６２８、６２９、６３０、６３２、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６４０、６４１、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５４、６５７、６５８、６５９、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６８０、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９２、６９４、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、又は７９０行目から選択される。さらに別の実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の５１９、５２１、５２２、５３５、５５４、５８７、５９４、６０１、６１８、６３９、６５４、６５５、６７０、６７９、６８０、７２７、７２９、又は７３０行目から選択される。追加的な実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアントは、表１の５１９、５２１、５２２、５３５、５５４、５８７、６０１、６１８、６３９、６５４、６７０、６８０、７２７、又は７３０行目から選択される。さらに別の実施形態では、１種又は複数種のスプライスバリアント���、表１の５１９、５２１、６０１、６１８、６５４、６７０、６８０、７２７、又は７３０行目から選択される。
【００４１】
[067]一部の実施形態では、がん細胞に対するＳＦ３Ｂ１調節因子の効果を、そのような細胞にＳＦ３Ｂ１調節因子を適用し、次いで、表１の２１、３１、５１、８１、１１８、２７９、３７２、４０１、４２６、４４３、５２８、５４３、５４５、５４８又は５６６行目から選択される異常バリアントのうちの１つ又は複数を検出又は数量化することによって評価する。種々の実施形態では、がん細胞例えば、ＣＬＬ細胞、乳がん細胞、又はメラノーマ細胞であり得る。
【００４２】
[068]１つの型のがん細胞に対するＳＦ３Ｂ１調節因子の効果を実証するために有用な特定のスプライスバリアントは、別の型のがん細胞に対する調節因子の効果を実証するためには有用でない場合がある。特定のがん細胞におけるそのような影響を明らかにするために適した異常スプライスバリアントは、本明細書において提示される説明及び実施例から明らかになるであろう。
【００４３】
[069]一部の実施形態では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する細胞において上昇したレベルで存在する異常スプライスバリアントをマーカーとして使用する。他の実施形態では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する細胞においてレベルが低下しているスプライスバリアントをマーカーとして使用する。一部の実施形態では、２種以上のスプライスバリアントを測定する。２種以上のスプライスバリアントを使用する場合、全てがレベルの上昇を有するものであってもよく、全てがレベルの低下を有するものであってもよく、レベルが上昇したスプライスバリアントとレベルが低下したスプライスバリアントの混合物を使用してもよい。本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、２種以上の異常スプライスバリアントを測定する。他の実施形態では、少なくとも１種の異常スプライスバリアント及び少なくとも１種の標準スプライスバリアントを測定する。一部の場合では、特定の遺伝子位置に関連する異常スプライスバリアントと標準スプライスバリアントの両方を測定する。別の状況では、測定される標準スプライスバリアントは、測定された異常スプライスバリアント（複数可）とは異なる遺伝子位置にある。
【００４４】
[070]細胞におけるスプライスバリアントについてのアッセイを実施する前に、細胞が変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有するかどうかを決定することができる。ある特定の実施形態では、細胞がネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異タンパク質を有することが決定された場合に、スプライスバリアントについてのアッセイを実施する。
【００４５】
試料
[071]細胞試料は、種々の生物学的供給源から入手することができる。例示的な細胞試料としては、これだけに限定されないが、細胞培養物、細胞株、組織、口腔組織、胃腸組織、器官、細胞小器官、生体液、血液試料、尿試料、皮膚試料などが挙げられる。血液試料は、全血、部分的に精製された血液、又は、全血若しくは部分的に精製された血液の画分、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などであり得る。細胞試料の供給源は、組織生検などの固形組織試料であり得る。組織生検試料は、乳房組織、皮膚、肺、又はリンパ節からの生検材料であり得る。試料は、骨髄穿刺液及び骨髄生検材料を含めた骨髄の試料であり得る。
【００４６】
[072]ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、がん細胞、例えば、血液がん細胞又は固形腫瘍細胞であり得る。血液がんとしては、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、腺癌などの癌腫が挙げられ、乳がん、肺がん、肝臓がん、前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸部がん、又は腎がんから選択することができる。細胞試料は、患者から直接得ることもでき、例えば生体液又は組織試料に由来する培養細胞など、患者から得た細胞に由来するものであってもよい。試料は、対象から直接得た細胞又は患者から得た細胞に由来する細胞の凍結保存試料などの保管試料であり得る。
【００４７】
[073]ある特定の実施形態では、細胞を、がんを有する疑いがある患者から得る。患者は、リンパ節腫大、肝腫大、又は脾腫、正常を上回る白血球数、再発性感染症、食欲の喪失又は早期満腹、正常でない挫傷、疲労、及び寝汗を含めた、ＣＬＬの１つ又は複数の一般的症状などのがんの徴候及び症状を示し得る。追加的な実施形態では、細胞は、変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有する。
【００４８】
[074]本明細書に記載されている細胞試料は、本開示の方法のいずれにも使用することができる。
【００４９】
スプライスバリアントの検出
[075]本明細書に記載の方法のある特定の実施形態は、スプライスバリアントの検出又は数量化を伴う。核酸を検出及び数量化するための種々の方法が存在し、そのそれぞれを、記載されている実施形態におけるスプライスバリアントの検出に適応させることができる。典型的な方法としては、核酸バーコーディング、ナノ粒子プローブ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、核酸シークエンシング、及びリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めたＰＣＲに基づく方法、などの、核酸を数量化するためのアッセイが挙げられる。
【００５０】
[076]ナノストリング（登録商標）アッセイ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのバーコーディング技術を利用する核酸アッセイを、例えば、米国特許第８，５１９，１１５号；米国特許第７，９１９，２３７号；及びＫｕｌｋａｒｎｉ，Ｍ．Ｍ．、２０１１、「Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ．」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９４：２５Ｂ．１０．１−２５Ｂ．１０．１７に記載の通り実施することができる。例示的なアッセイでは、プローブの対を使用して、目的の特定のスプライスバリアントなどの目的の特定のヌクレオチド配列を検出する。プローブ対は、捕捉プローブ及びレポータープローブからなり、それぞれが、標的配列に対して特異的な約３５〜５０塩基の長さの配列を含む。捕捉プローブは、３’末端に、デジタル検出のために標的ｍＲＮＡを表面付着させるための分子ハンドルをもたらすビオチンなどの親和性標識を含み、レポータープローブは、５’末端に、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ標的配列の分子バーコーディングをもたらす独特の色コードを含む。捕捉プローブ及びレポータープローブ対を溶液中で標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、過剰なプローブを除去した後、標的ｍＲＮＡ−プローブ複合体をエヌカウンター（ｎＣｏｕｎｔｅｒ）（商標）カートリッジ中に固定化する。デジタル分析機器によりカートリッジの表面の直接画像を取得して、特定のｍＲＮＡスプライスバリアント配列に対応する色コードを検出する。特定のスプライスバリアントについての色分けされたバーコードが検出される回数が、ｍＲＮＡライブラリーにおける特定のスプライスバリアントのレベルを反映する。スプライスバリアントを検出するために、捕捉プローブ又はレポータープローブのいずれかが所与のスプライスバリアントのエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションにまたがり得る。他の実施形態では、捕捉プローブ及びレポータープローブの一方又は両方の標的配列は、エクソン−エクソンジャンクションの２つのエクソンの末端配列又はイントロン−エクソンジャンクションのイントロン及びエクソンの末端配列に対応し、したがって、一方のプローブはエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションまで伸長するが、ジャンクションにまたがらず、他方のプローブは、ジャンクションの逆側から始まる配列に結合し、それぞれのエクソン又はイントロンまで伸長する。
【００５１】
[077]例示的なＰＣＲに基づく方法では、特定のスプライスバリアントを、スプライスバリアントを含有する配列を特異的に増幅させることによって検出することができる。例えば、当該方法では、スプライスバリアントの第１の部分とハイブリダイズするように特別に設計された第１のプライマーを使用することができ、ここで、スプライスバリアントは、代替スプライシングが起こるエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションにまたがる配列である。当該方法では、上流又は下流の位置にある配列などの遺伝子の別の配列に対応する第１のプライマーのＰＣＲ伸長産物のセグメントとハイブリダイズする第２の対立プライマー（opposing primer）をさらに使用することができる。ＰＣＲ検出法は、定量的（又はリアルタイム）ＰＣＲであり得る。定量的ＰＣＲの一部の実施形態では、増幅されたＰＣＲ産物を、核酸プローブを使用して検出し、ここで、プローブは、１つ又は複数の検出可能な標識を含有し得る。ある特定の定量的ＰＣＲ法では、目的のスプライスバリアントの量を、スプライスバリアントのレベルを検出し、適切な内部標準と比較することによって決定する。
【００５２】
[078]ＲＮＡスコープ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用してスプライスバリアントを検出するための典型的な方法としては、Ｗａｎｇ，Ｆら、「ＲＮＡｓｃｏｐｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ、ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２０１２  Ｊａｎ；１４（１）：２２−９に記載されているものが挙げられる。所与のスプライスバリアントを標的とし、固定し透過処理した細胞において標的ＲＮＡとハイブリダイズするプローブの対を設計することにより、ＲＮＡスコープ（登録商標）アッセイを使用してスプライスバリアントを検出することができる。標的プローブを、標的配列とハイブリダイズするとプレアンプリファイア核酸（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に対する結合性部位が創出される対としてハイブリダイズするように設計する。次に、プレアンプリファイア核酸は、アンプリファイア核酸（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に対する多数の結合性部位を有し、次に、アンプリファイア核酸は、発色分子又は蛍光分子を有する標識プローブに対する多数の結合性部位を含有する。一部の実施形態では、ＲＮＡスコープ（登録商標）標的プローブのうちの１つは、所与のスプライスバリアントのエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションにまたがる。他の実施形態では、標的プローブの標的配列は、エクソン−エクソンジャンクションの２つのエクソンの末端配列又はイントロン−エクソンジャンクションのイントロン及びエクソンの末端配列に対応し、したがって、標的プローブ対の一方のプローブはエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションまで伸長するが、ジャンクションにはまたがらず、他方のプローブは、ジャンクションの逆側から始まる配列に結合し、それぞれのエクソン又はイントロンまで伸長する。
【００５３】
[079]スマートフレア（ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ）（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）などのナノ粒子プローブを使用してスプライスバリアントを検出するための典型的な方法としては、Ｓｅｆｅｒｏｓら、「Ｎａｎｏ−ｆｌａｒｅｓ：Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（５０）：１５４７７−１５４７９（２００７）及びＰｒｉｇｏｄｉｃｈ，ＡＥ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｎａｎｏｆｌａｒｅｓ：ｍＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４（４）：２０６２−２０６６（２０１２）に記載されているものが挙げられる。（１）それぞれが検出される特定のスプライスバリアントに相補的である及び（２）それぞれが相補的なフルオロフォア標識レポーター核酸とハイブリダイズするヌクレオチド認識配列を含む１種又は複数種の核酸を用いて改変した金ナノ粒子を生成することにより、スマートフレア（商標）検出プローブを使用してスプライスバリアントを検出することができる。プローブが細胞に取り込まれると、標的スプライスバリアント配列が１つ又は複数のヌクレオチド認識配列とハイブリダイズし、フルオロフォア標識レポーター核酸と置き換わり得る。次いで、フルオロフォアが金ナノ粒子表面の近傍にあることに起因してクエンチされたフルオロフォア標識レポーター核酸が金ナノ粒子から遊離し、次いで、ナノ粒子のクエンチ効果がなくなったら、フルオロフォアが検出され得る。一部の実施形態では、プローブのヌクレオチド認識配列は、所与のスプライスバリアントのエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションにまたがる配列を認識する。一部の実施形態では、プローブのヌクレオチド認識配列は、ジャンクションで終結する配列及びジャンクションから１つ又は複数のヌクレオチ離れて終結する配列を含めた、スプライスバリアントのエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションの一方の側にのみある配列を認識する。
【００５４】
[080]核酸シークエンシングを使用してスプライスバリアントを検出するための典型的な方法としては、Ｒｅｎ，Ｓら、「ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ、ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇｓ．」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２２、８０６−８２１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１２．３０（２０１２）；及びｖａｎ  Ｄｉｊｋら、「Ｔｅｎ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ３０（９）：４１８−２６（２０１４）に記載されているＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）が挙げられる。一部の実施形態では、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術などのハイスループットなシークエンシングを使用してスプライスバリアントを検出することができる。例えば、当該方法では、ＲＮＡ−Ｓｅｑに利用可能な市販のシークエンシングプラットフォーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳＯＬＩＤ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＲｏｃｈｅ  ４５４などを使用することができる。一部の実施形態では、シークエンシング方法は、パイロシークエンシングを含み得る。例えば、試料をシークエンシング用酵素及びプライマーと混合し、一度に１つの標識されていないヌクレオチドの流れに曝露させ、それにより、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にすることができる。ヌクレオチドが組み込まれると、ピロリン酸が放出され、それにより、光の放出が導かれ、それをリアルタイムでモニタリングする。一部の実施形態では、シークエンシング方法は、半導体シークエンシングを含み得る。例えば、ヌクレオチドの取り込み中にピロリン酸の代わりにプロトンを放出させ、イオンセンサーによってリアルタイムで検出することができる。一部の実施形態では、当該方法は、可逆的ターミネーターを用いたシークエンシングを含み得る。例えば、合成試薬は、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び４つの異なるように標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドが組み入れられた後、それを色によって同定し、塩基上の３’ターミネーター及びフルオロフォアを除去し、サイクルを繰り返す。一部の実施形態では、当該方法は、ライゲーションによるシークエンシングを含み得る。例えば、シークエンシングプライマーをアダプターとハイブリダイズさせることができ、プライマーの５’末端は、隣接する配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとのライゲーションに利用可能である。塩基４及び５が４色の標識のうちの１つによりコードされる八量体の混合物がプライマーとのライゲーションについて競合し得る。色の検出後、ライゲーションした八量体を５位と６位の間で切断して標識を除去することができ、サイクルを繰り返すことができる。それにより、第１のラウンドにおいて、当該プロセスにより、４位、５位、９位、１０位、１４位、１５位などにおける可能性のある塩基の同一性を決定することができる��プロセスを、シークエンシングプライマーの第１の塩基に達するまで、３位、４位、８位、９位、１３位、１４位などを決定するために、より短いシークエンシングプライマーを使用して繰り返し、１塩基ずつオフセットすることができる。
【００５５】
[081]同じく遺伝子内の所与のエクソン−エクソンジャンクション又はイントロン−エクソンジャンクションのスプライスバリアントをジャンクションの両側のヌクレオチド配列を同定することによって区別する他の核酸検出及び分析方法を利用して、本明細書に開示されているスプライスバリアントを検出又は数量化することができる。例えば、エクソン−エクソンジャンクションのスプライスバリアントは、１つのエクソンに結合するプライマーが、その隣接するエクソンの配列に従って他方の側のジャンクションのエクソンまで伸長する、プライマー伸長法によって検出することができる。例えば、ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，ＲＭ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５  Ｊｕｎ  ２０；３３（１１）：ｅ９９；及びＭｉｌａｎｉ，Ｌら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２：２０２−２１１（２００６）を参照されたい。大規模なバリアントの検出は、例えばＪｏｈｎｓｏｎ，ＪＭ．ら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｅｘｏｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：２１４１−２１４４（２００３）；及びＭｏｄｒｅｋ，Ｂら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：２８５０−２８５９（２００１）に記載されている、エクソン−エクソンジャンクションプローブ又はイントロン−エクソンジャンクションプローブを有する発現マイクロアレイを使用して実施することができる。
【００５６】
[082]種々の実施形態は、本発明のスプライスバリアントを検出するための試薬を含む。一実施例では、試薬は、表１に列挙されている異常スプライスバリアントのうちの１つ又は複数の量を測定するために設計されたナノストリング（登録商標）プローブを含む。バーコーディング（例えば、ナノストリング（登録商標））、ナノ粒子プローブ（例えば、スマートフレア（商標））、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＲＮＡスコープ（登録商標））、マイクロアレイ、核酸シークエンシング、及びＰＣＲに基づくアッセイなどの核酸数量化アッセイ用のプローブを上記の通り設計することができる。
【００５７】
[083]核酸検出のためのこれらの典型的な方法又は他の方法では、異常スプライスバリアントを、異常スプライスバリアントには存在するが標準スプライスバリアントには存在しない核酸配列を特異的に認識するプローブ、プライマー、又は他の試薬を使用して同定することができる。他の実施形態では、異常スプライスバリアントを、それが存在するジャンクションの状況で異常スプライスバリアントに特異的である配列を検出することによって同定する、すなわち、独特の配列が、標準スプライスバリアントのスプライスジャンクションのいずれかの側に存在する配列に挟まれている。そのような場合では、その標的配列を特異的に認識するプローブ、プライマー、又は他の検出試薬の一部は、異常配列の長さ又は異常配列の一部に対応する長さを有し得る。他の実施形態では、その標的配列を特異的に認識するプローブ、プライマー、又は他の検出試薬の一部は、異常配列の長さと、スプライスジャンクションにおいて異常配列を挟む配列の一方又は両方に由来する選択された数のヌクレオチドの長さとを足したものに対応する長さを有し得る。一般に、プローブ又はプライマーは、非特異的な結合を低減するために十分な長さに設計すべきである。異常スプライスバリアント又は標準スプライスバリアントを検出するプローブ、プライマー、及び他の試薬は、核酸を検出するための種々の方法の技術的特徴及び形式に従って設計することができる。
【００５８】
ＳＦ３Ｂ１調節因子
[084]種々のＳＦ３Ｂ１調節化合物が当技術分野で公知であり、本明細書に記載の方法に従って使用することができる。一部の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１調節化合物は、プラジエノライド又はプラジエノライド類似体である。「プラジエノライド類似体」とは、プラジエノライドとして公知の天然物のファミリーのメンバーと構造的に関連する化合物を指す。プラジエノライドは、細菌ストレプトマイセス・プラテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）において最初に同定された（Ｓａｋａｉ，Ｔａｋａｓｈｉ；Ｓａｍｅｓｈｉｍａ，Ｔｏｍｏｈｉｒｏ；Ｍａｔｓｕｆｕｊｉ，Ｍｏｔｏｋｏ；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｎａｏｔｏ；Ｄｏｂａｓｈｉ，Ｋａｚｕｙｕｋｉ；Ｍｉｚｕｉ，Ｙｏｓｈｉｈａｒｕ．、「Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅｓ、Ｎｅｗ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒ−１１１０７．Ｉ．Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．２００４、Ｖｏｌ．５７、Ｎｏ．３）。これらの化合物のうちの１つであるプラジエノライドＢは、ＳＦ３Ｂスプライソソームを標的として、スプライシングを阻害し、遺伝子発現のパターンを変化させる（Ｋｏｔａｋｅら、「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ＳＦ３ｂ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５７０−５７５［２００７］）。ある特定のプラジエノライドＢ類似体は、ＷＯ２００２／０６０８９０；ＷＯ２００４／０１１４５９；ＷＯ２００４／０１１６６１；ＷＯ２００４／０５０８９０；ＷＯ２００５／０５２１５２；ＷＯ２００６／００９２７６；及びＷＯ２００８／１２６９１８に記載されている。
【００５９】
[085]どちらも「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ  Ｄ」という表題の米国特許第７，８８４，１２８号及び同第７，８１６，４０１号には、プラジエノライドＢ及びＤを合成するための方法が記載されている。プラジエノライドＢ及びＤの合成は、Ｋａｎａｄａら、「Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ  Ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６：４３５０−４３５５（２００７）に記載されている方法を使用して実施することもできる。「Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ」という表題の、Ｋａｎａｄａら、米国特許第７，５５０，５０３号、及び国際公開第ＷＯ２００３／０９９８１３（ＷＯ’８１３）号には、プラジエノライドＤ（ＷＯ’８１３の１１１０７Ｄ）からＥ７１０７（ＷＯ’８１３の化合物４５）を合成するための方法が記載されている。一部の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１調節因子は、プラジエノライドＢである。他の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１調節因子は、プラジエノライドＤである。さらなる実施形態では、ＳＦ３Ｂ１調節因子は、Ｅ７１０７である。
【００６０】
[086]一部の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１調節因子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年５月１３日出願の米国特許出願第１４／７１０，６８７号に記載されている化合物である。一部の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１調節化合物は、表２に記載されている式１〜４のうちの１つを有する化合物である。
【００６１】
【表２】
2018525994.tif 000054
[087]本明細書に記載の方法は、既知のＳＦ３Ｂ１調節化合物及び新規のＳＦ３Ｂ１調節化合物を評価するために使用することができる。
【００６２】
治療方法
[088]本発明の種々の実施形態は、がんと診断された患者を、ＳＦ３Ｂ１調節因子を使用して治療することを含む。特定の例では、患者由来のがん細胞は、変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有することが決定されたものである。特定のＳＦ３Ｂ１変異体として、Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ、又はＤ７８１Ｎが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１変異体は、Ｋ７００Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｒ６２５Ｃ、Ｇ７４２Ｄ、Ｒ６２５Ｈ、Ｅ６２２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｒ、Ｇ７４０Ｅ、Ｙ６２３Ｃ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ７４１Ｎ、Ｎ６２６Ｙ、Ｔ６６３Ｐ、Ｈ６６２Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｄ７８１Ｅ、又はＲ６２５Ｌから選択される。追加的な実施形態では、がん細胞は、表１から選択される１種又は複数種のスプライスバリアントの量を測定するために試験されたものである。ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異に関連する特定のスプライスバリアントが表１に示されており、又、上のスプライスバリアントの節に記載されている。
【００６３】
[089]ある特定の実施形態では、変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を有することが決定されたがん患者を、２０１５年５月１３日出願の米国特許出願第１４／７１０，６８７号に記載されている通りＳＦ３Ｂ１調節因子を用いて治療する。
【実施例】
【００６４】
実施例１：ＳＦ３Ｂ１変異により、正常でないスプライシングが系列特異的に誘導される
[090]多数の腫瘍型にわたるＳＦ３Ｂ１変異（「ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ」）に関連するスプライシングの変化を調査するために、ＲＮＡ−Ｓｅｑ数量化及びディファレンシャルスプライシングパイプラインを開発し、それを使用して以下の試料からＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを解析した：
Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ；１６種のがんの型の全部で８１名の患者に由来する）における全てのＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ試料、並びに、ＴＣＧＡにおける乳がんコホート（２０）及び黒色腫コホート（２０）のそれぞれに由来する、４０例の野生型ＳＦ３Ｂ１（ＳＦ３Ｂ１ＷＴ）試料、
Ｌｙｍｐｈｏｍａ／Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した７例のＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ  ＣＬＬ患者試料及び７例のＳＦ３Ｂ１ＷＴ  ＣＬＬ患者試料。
【００６５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ定量化方法
[091]アノテートされていないスプライスバリアントの発見を容易にするために、スプライスジャンクションをアラインメント（ＢＡＭファイル）から直接数量化した。内部で生成されたＲＮＡ−Ｓｅｑデータに関して、読み取りをヒト参照ゲノムｈｇ１９（ＧＲＣｈ３７）に対してＭａｐＳｐｌｉｃｅによってアラインメントし、ＴＣＧＡ「ＲＮＡＳｅｑＶ２」パイプライン（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｈｕｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｄｏｃｓ／ｔｃｇａ／ＵＮＣ＿ｍＲＮＡｓｅｑ＿ｓｕｍｍａｒｙ．ｐｄｆ参照）をエミュレートするＴＣＧＡ  ＧＡＦ  ２．１アイソフォーム及び遺伝子定義に対するＲＳＥＭによって数量化した。ＭａｐＳｐｌｉｃｅによって生成されたスプライスジャンクション計数を下流の処理に使用した。ＴＣＧＡ  ＲＮＡ−Ｓｅｑデータに関しては、ＭａｐＳｐｌｉｃｅによって生成された包括的なスプライスジャンクション計数は利用不可能であり、その代わりに、ＴＣＧＡ「レベル３」スプライスジャンクションデータにより、参照トランスクリプトームに由来する所定のスプライスジャンクションセットのマッピングされた読み取り計数が報告される。内部で生成されたＲＮＡ−Ｓｅｑ試料と同等のゲノムワイドなスプライスジャンクション計数を再構築するために、未加工のＲＮＡ−Ｓｅｑアラインメント（ＢＡＭファイル）をＣＧＨｕｂ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｈｕｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）から入手し、潜在的なスプライスジャンクションにまたがる任意の読み取りを直接計数した。ＲＳＥＭにより推定された遺伝子発現読み取り計数をＴＣＧＡ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｖ２レベル３データマトリックスから直接集約した。
【００６６】
[092]ＭａｐＳｐｌｉｃｅではエクソン−エクソンジャンクション計数のみがもたらされるので、イントロン−リテンションスプライスバリアントを同定するためには各イントロン−エクソンジャンクションにまたがる読み取り計数の推定値が必要であった。各ＢＡＭファイルにおけるあらゆるスプライスジャンクションについて、３’及び５’イントロン−エクソンジャンクションのそれぞれにわたって少なくとも３ｂｐのオーバーハングを有する読み取りを計数した。
【００６７】
[093]ＢＡＭファイル内のスプライスされた読み取りの操作の全てについて、ｓａｍｔｏｏｌｓの「ｐｙｓａｍ」伸長（Ｌｉ，Ｈら、「Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ．」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年８月１５日；２５（１６）：２０７８−９）を使用する、カスタムＰｙｔｈｏｎモジュール「ｓｐｌｉｃｅｄｂａｍ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈ３ｂｉｏｍｅｄ／ｓｐｌｉｃｅｄｂａｍで入手可能）を使用した。
【００６８】
[094]一部の実施例では、スプライスジャンクションは、時々、シークエンシング及びアラインメントの誤差に起因して非常に低い計数を有した。したがって、ＳＦ３Ｂ１ＷＴコホート又はＳＦ３Ｂ１ＭＵＴコホートのいずれかに由来する、平均で少なくとも合計１０計数を有するスプライスジャンクションのみを下流の解析に含めた。
【００６９】
ディファレンシャルスプライシング検出方法
[095]一方のコホートにおいてもう一方のコホートと比較してディファレンシャルスプライスバリアントの使用を検出するために、遺伝子発現の変化及び所定の代替スプライシングモデルとは独立して、スプライスジャンクション計数を多数の可能性のあるジャンクションを有するスプライス部位におけるジャンクション使用の百分率に変換する、コンピュータによるディファレンシャルスプライシングパイプラインを開発した。ジャンクション使用の百分率は、１つのスプライスバリアントの、同じスプライス部位を共有する他の全てのスプライスバリアントと比較した出現の測定値である。例えば、代替３’スプライス部位を有するスプライスバリアントは、５’スプライス部位を別のスプライスバリアントと共有しなければならない。したがって、共有されるスプライス部位のそれぞれについて、各スプライスバリアントの未加工の計数を、共有されるスプライス部位を利用する全てのスプライスバリアントの総計数で割って比を導き出した。次いで、この比に１００を掛けて百分率に変換した。各試料について、同じスプライス部位を共有するスプライスバリアントの百分率の全ての合計は１００と等しくなる。各スプライスバリアントの未加工の計数を、スプライス部位を共有する全てのスプライスバリアントに対する百分率に変換することは、それ自体が遺伝子発現の変化の影響を低減するための正規化である。標準ジャンクション及び異常ジャンクションについての百分率は表１にそれぞれ「Ａｖｇ  ＷＴ％」及び「Ａｖｇ  Ａｂ．％」として列挙されている。これらの百分率の差異を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ’ｓ  ｌｉｍｍａパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇで入手可能）において定義されているモデレートｔ検定を使用することによって統計的有意性について評価した。統計学的ｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用して補正してｑ値にし、表１に「ＦＤＲ  Ｑ値」として列挙した。０．０５以下のｑ値を満たすあらゆるスプライスバリアントを統計的に有意であるとした。
【００７０】
[096]未加工のジャンクション計数を百分率ジャンクション使用に変換することにより、一部の実施例、すなわち、スプライスバリアントが生じる遺伝子が一方のコホートでは発現するが、もう一方のコホートでは発現が非常に低い又は全く発現しない場合では、ノイズが導入される可能性がある。これに取り組むために、追加的なフィルタリングステップを導入した。上記のｑ値の閾値を満たす、ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ試料において上方制御されたスプライスバリアントのそれぞれについて、その対応する標準スプライスバリアントは、ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ試料では下方制御されるはずであり、また、異常スプライスバリアントであるとされる上方制御されたスプライスバリアントについてのｑ値の閾値を満たすはずである。
【００７１】
ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ患者試料における異常スプライスバリアントの同定
[097]最初に、この枠組みを、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ；ルミナルＡ型原発性乳がん：７例のＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ及び２０例のＳＦ３Ｂ１ＷＴ；転移性黒色腫：４例のＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ；及び２０例のＳＦ３Ｂ１ＷＴ）並びに内部で生成された７例のＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ及び７例のＳＦ３Ｂ１ＷＴＣＬＬ患者試料からの既知のＳＦ３Ｂ１ＭＵＴがん又は野生型対応物のサブセットに適用した。この解析により、６２６種の異常スプライスジャンクションがＳＦ３Ｂ１ＭＵＴにおいてＳＦ３Ｂ１ＷＴと比較して有意に上方制御されることが明らかになった。異常スプライシング事象の大部分で代替３’ｓｓが使用される（表１参照、「事象」の列）。
【００７２】
[098]異常スプライシング事象のコンピュータによるスクリーニングにより、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ試料において乳がん、黒色腫及びＣＬＬにおける腫瘍特異的スプライシング事象のパターンが明らかになった（表１）。さらに、腫瘍非特異的事象（すなわち、少なくとも２つの腫瘍型において見いだされるスプライシング事象）のセットが観察された。腫瘍特異的スプライシング事象を伴う遺伝子の一部のスプライスバリアントが、ｍＲＮＡ発現がより高い遺伝子において生じ、これにより、観察された腫瘍特異的スプライシングの一部が遺伝子発現の差異に起因することが示される（図２）。
【００７３】
[099]がんの型にわたる全てのＳＦ３Ｂ１バリアントにおける異常スプライシングの影響を特徴付けるために、ＴＣＧＡにおける１４種のがんの型からの残りの７０名のＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ患者についてのＲＮＡ−Ｓｅｑデータを数量化し、全部で１３６例の試料を使用して教師なしクラスタリング解析を行った。このクラスタリングにより、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体に関連するスプライシング事象と野生型ＳＦ３Ｂ１又は非ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体に関連するスプライシング事象が分離された。例えば、乳がん（ＳＦ３Ｂ１Ｋ６６６Ｅ、ＳＦ３Ｂ１Ｎ６２６Ｄ）、肺腺癌（ＳＦ３Ｂ１Ｋ７４１Ｎ、ＳＦ３Ｂ１Ｇ７４０Ｖ）、及び膀胱がん（ＳＦ３Ｂ１Ｒ６２５Ｃ）患者試料におけるスプライシング事象はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅネオモルフィック試料におけるスプライシング事象と一緒にクラスタリングされ、一方、他のＳＦ３Ｂ１変異体試料についてのスプライシングプロファイルは同じ腫瘍型のＳＦ３Ｂ１ＷＴ試料のスプライシングプロファイルと同様であったので、乳がん（ＳＦ３Ｂ１Ｋ６６６Ｅ、ＳＦ３Ｂ１Ｎ６２６Ｄ）、肺腺癌（ＳＦ３Ｂ１Ｋ７４１Ｎ、ＳＦ３Ｂ１Ｇ７４０Ｖ）、及び膀胱がん（ＳＦ３Ｂ１Ｒ６２５Ｃ）患者試料では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体に関連するスプライシングパターンが観察された。スプライシングプロファイルがネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体のスプライシングプロファイルと一緒にクラスタリングされたＳＦ３Ｂ１変異体の一覧表が表３、１列目に提示されている。ネオモルフィックであることが予測される追加的なＳＦ３Ｂ１変異が表３、２列目に列挙されている。表３に提示されている全ての変異の位置を示す概略図が図３に示されている。
【００７４】
【表３】
2018525994.tif 000055
実施例２：細胞株における異常スプライスバリアントの検証
[0100]細胞株モデルにおける異常スプライシングを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］又はＲＩＫＥＮ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手し、指示通り培養した内在性ＳＦ３Ｂ１ネオモルフィック変異（膵臓腺癌Ｐａｎｃ  ０５．０４：ＳＦ３Ｂ１Ｑ６９９Ｈ／Ｋ７００Ｅ二重変異体；転移性黒色腫Ｃｏｌｏ８２９：ＳＦ３Ｂ１Ｐ７１８Ｌ；及び肺がんＮＣＩ−Ｈ３５８：ＳＦ３Ｂ１Ａ７４５Ｖを有する細胞株のパネルについての、並びに、同じ腫瘍型（膵臓腺癌Ｐａｎｃ  １０．０５、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＭＩＡＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ０４．０３、ＰＫ−５９、肺がんＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ１７９２、ＮＣＩ  Ｈ１６５０、ＮＣＩ  Ｈ１９７５、ＮＣＩ  Ｈ１８３８）又は同じ患者の正常対照細胞（エプスタイン・バーウイルス［ＥＢＶ］により形質転換したＢリンパ芽球ｃｏｌｏ８２９ＢＬ）のいずれかに由来するいくつかのＳＦ３Ｂ１ＷＴ細胞株からのＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを収集することによって解析した。ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ（Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ）又は同義の変異（Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋ）を発現するようにＡＡＶ媒介性相同性によって操作した同質遺伝子型プレＢ細胞株（Ｎａｌｍ−６）からもＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを収集した。Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙにおいて生成された同質遺伝子細胞株Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋを、選択のためにジェネテシン（０．７ｍｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で培養した。ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析は全て、実施例１において患者試料について記載されているものと同じパイプラインを使用して実施した。患者において同定された異常スプライスジャンクションを使用した細胞株の教師なしクラスタリングにより、Ｐａｎｃ  ０５．０４及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅと野生型及び他のＳＦ３Ｂ１変異体細胞の明白な分離がもたらされた。
【００７５】
[0101]異常スプライスバリアント及び標準スプライスバリアントを数量化するために、ナノストリング（登録商標）アッセイを展開し、同じ細胞パネルを使用して検証した。ナノストリング（登録商標）アッセイのために、ナノストリング（登録商標）プローブのカスタムパネルを使用したエヌカウンター（ｎＣｏｕｎｔｅｒ）（登録商標）（ナノストリングテクノロジーズ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（登録商標））発現アッセイのための鋳型として、精製された全ＲＮＡ７５０ｎｇを使用した。６５℃で終夜のハイブリダイゼーションのために試料の調製を推奨の通りセットアップした（ナノストリング（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓプロトコール番号Ｃ−０００３−０２）。翌日、試料を、高感度プロトコール（ナノストリング（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓプロトコール番号ＭＡＮ−Ｃ００２９−０５）を使用して自動エヌカウンター（登録商標）アナリシスシステムプレップステーション（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎ）によって処理し、その後、検出のために１１５０ＦＯＶを使用してエヌカウンター（商標）（登録商標）アナリシスシステムデジタルアナライザー（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（プロトコール番号ＭＡＮ−Ｃ００２１−０１）によって処理した。データをダウンロードし、品質管理測定基準及び正規化のために、エヌソルバー（ｎＳｏｌｖｅｒ）（商標）アナリシス  ソフトウェア（ｎＳｏｌｖｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ナノストリングテクノロジーズ（登録商標））を使用して解析した。データを、まず、製造者によって提供された陽性アッセイ対照（ナノストリング（登録商標）陽性対照Ａ〜Ｆ［ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ転写物を１２８ｆＭ、３２ｆＭ、８ｆＭ、２ｆＭ、０．５ｆＭ、及び０．１２５ｆＭの濃度で含有し、それぞれナノストリング（登録商標）レポーターコードセットプローブ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＣｏｄｅＳｅｔ  ｐｒｏｂｅｓ）と予備混合されたもの］））を使用して、レーン毎の変動について正規化した。正規化因子が＜０．３及び＞３の試料はいずれもさらなる解析には考慮しなかった。この後、ＧＡＰＤＨ、ＥＥＦ１Ａ１及びＲＰＬＰ０の幾何平均を使用した含有量正規化を行った。全ての試料が推奨される０．１〜１０の正規化因子の範囲内であった。次いで、正規化された値のそれぞれを確認して、そのレーンについて記録されたバックグラウンドシグナルの平均よりも少なくとも２標準偏差高いことを確実にした。これを下回る値はいずれも検出限界を下回るものとした。これらの正規化された値はさらなるバイオインフォマティクス及び統計解析のために取得した。
【００７６】
[0102]ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析において観察された通り、Ｐａｎｃ  ０５．０４及び同質遺伝子型Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞株のみで異常スプライシングの明白な存在が示された（図４）。
【００７７】
ＳＦ３Ｂ１変異体ＳＦ３Ｂ１Ｑ６９９Ｈの分析
[0103]Ｐａｎｃ  ０５．０４細胞株は、ネオモルフィック変異ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ及び６９９位における追加的な変異（ＳＦ３Ｂ１Ｑ６９９Ｈ）を有する。この第２の変異の機能的関連性を評価するために、ナノストリング（登録商標）によるＲＮＡの分析のためにＳＦ３Ｂ１Ｑ６９９Ｈ変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質及びＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ変異体ＳＦ３Ｂ１タンパク質を単独で又は組み合わせて２９３ＦＴ細胞において発現させた（図５）。変異体を２９３ＦＴ細胞において発現させるために、ゲートウェイ技術（Ｇａｔｅｗａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して哺乳動物発現プラスミドを生成した。まず、ＨＡタグｍｘＳＦ３Ｂ１野生型（Ｙｏｋｏｉ，Ａら、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ＳＦ３ｂ  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ．」、ＦＥＢＳ  Ｊ．２７８：４８７０−４８８０  ［２０１１］）をＰＣＲによってｐＤＯＮＲ２２１にクローニングし、次いで、部位特異的変異誘発キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して変異を導入した。ＬＲ反応を実施して、ＨＡタグｍｘＳＦ３Ｂ１野生型及び変異体の全てをｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。製造者の指示に従って培養した２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を６ウェル／プレートに播種し、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、生成したプラスミドでトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  ＨＡ−ｍｘＳＦ３Ｂ１構築物当たり１μｇのＤＮＡを３連反復実験で生成した各一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集して、それぞれウエスタンブロット及びナノストリング（登録商標）分析のためにタンパク質及びＲＮＡを単離した。ＲＩＰＡ（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて細胞を溶解させることによってタンパク質抽出物を調製した。タンパク質２３μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、ＳＦ３Ｂ１抗体（ａ−ＳＡＰ  １５５、ＭＢＬ）及び抗ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ）を使用して同定した。Ｌｉ−Ｃｏｒロバ抗マウス８００ＣＷ及びＬｉ−Ｃｏｒ  ロバ抗ウサギ８００ＣＷを二次抗体として使用し、オデッセイイメージャー（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｅｒ）（Ｌｉ−Ｃｏｒ）によって検出した。ＲＮＡを細胞から単離し、ＭａｇＭａｘ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ製造者のマニュアルに従って使用して逆転写し、次いで、ナノストリング（登録商標）アッセイを用いて分析した。
【００７８】
[0104]ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ及びＳＦ３Ｂ１Ｑ６９９Ｈ／Ｋ７００Ｅの発現により、異常スプライシングが誘導されたが、ＳＦ３Ｂ１Ｑ６９９Ｈ単独で又はＳＦ３Ｂ１Ａ７４５Ｖ又はＳＦ３Ｂ１Ｒ１０７４Ｈ（スプライソソーム阻害剤プラジエノライドＢに対する抵抗性を付与する置換）では異常スプライシングは誘導されず（図６）、これにより、ＳＦ３Ｂ１Ｑ９９９Ｈが非機能的置換であることが示される。
【００７９】
[0105]これらのデータにより、Ｐａｎｃ  ０５．０４及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ同質遺伝子細胞が、ＳＦ３Ｂ１ネオモルフィック変異の機能活性及びスプライシング阻害剤の活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて試験するための代表的なモデルであることが確認される。
【００８０】
実施例３：ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異により、正常でないｍＲＮＡスプライシングが誘導される
[0106]ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴがんにおいて見いだされるネオモルフィック変異の機能活性を、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体、又はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｒ（ＳＦ３Ｂ１ＷＴ患者と一緒にクラスタリングされる腎明細胞癌患者において観察される変異）を２９３ＦＴ細胞において発現させ、ナノストリング（登録商標）によってスプライシング異常を決定することにより分析した。全ての構築物の発現をウエスタンブロットによって確認した（図７）。試験した全てのＳＦ３Ｂ１ネオモルフィック変異で患者試料において観察される代替スプライス部位の同じ使用が示されたが（図８の「ＭＵＴアイソフォーム」）、ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｒ及びＳＦ３Ｂ１ＷＴでは異常スプライシングは示されなかった（図８）。さらに、ＳＦ３Ｂ１構築物のいずれの発現によっても、全体的な遺伝子発現（図８の「全遺伝子」）も標準スプライシングアイソフォーム（図８の「ＷＴアイソフォーム」）も変化しなかった。これにより、患者試料のＲＮＡ−Ｓｅｑ解析によって示されたのと同じく、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異の存在と代替スプライシングの相関、並びに異なるネオモルフィック変異の類似した機能活性が示される。
【００８１】
[0107]ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅネオモルフィック変異と異常スプライシングの相関を、Ｐａｎｃ  ０５．０４細胞株及びＰａｎｃ  １０．０５細胞株（それぞれネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ細胞株及びＳＦ３Ｂ１ＷＴ細胞株；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］又はＲＩＫＥＮ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手し、指示通り培養したもの）においてネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異体又はＳＦ３Ｂ１ＷＴ対立遺伝子を選択的にノックダウンさせるテトラサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡを使用して分析した。
【００８２】
[0108]ノックダウン実験のために、ｓｈＲＮＡをコードするウイルスを、製造者の指示に従って培養したＬｅｎｔｉＸ−２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において調製した。誘導性ｓｈＲＮＡをｐＬＫＯ−ｉＫＤ−Ｈ１  ｐｕｒｏベクターのＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩにクローニングした。ヘアピンの配列は、
ｓｈＲＮＡ  ＃１３  ＳＦ３Ｂ１ＰＡＮＧＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＧ（配列番号１１８０）、
ｓｈＲＮＡ  ＃８  ＳＦ３Ｂ１ＷＴＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴ（配列番号１１８１）、及び
ｓｈＲＮＡ  ＃９６  ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧ（配列番号１１８２）
であった。
【００８３】
[0109]細胞に、標的ｐＬＫＯ−ｓｈＲＮＡプラスミド２．４μｇと、それに加えてｐ  Δ８．９１（パッケージング）２．４μｇ、及びＶＳＶＧ（エンベロープ）０．６μｇを、ＴｒａｎｓＩＴ試薬（Ｍｉｒｕｓ）を使用してトランスフェクトした。ウイルスを使用して、Ｐａｎｃ  ０５．０４及びＰａｎｃ  １０．０５に、ポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したスピンインフェクションによって感染させた。感染の翌日、細胞を選択培地（１．２５μｇ／ｍｌのピューロマイシン［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］）で７日間培養して、ｓｈＲＮＡ発現細胞を選択した。選択された細胞をドキシサイクリン塩酸塩（１００ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）の存在下又は不在下で培養して、ｓｈＲＮＡを誘導した。誘導後４日目に、タンパク質及びＲＮＡのために細胞を回収した。さらに、細胞を、コロニー形成アッセイ及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のために播種した。９日目に、細胞を、ホルムアルデヒドを用いて固定し、クリスタルバイオレットを用いて染色した。
【００８４】
[0110]ウエスタンブロットを使用してＳＦ３Ｂ１ノックダウンを確認するために、ＲＩＰＡ（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて細胞を溶解させることによってタンパク質抽出物を調製した。各試料に由来するタンパク質２０〜２５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレン（ｉｂｌｏｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に転写した。メンブレンをまずオデッセイブロッキングバッファー（Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いてブロッキングし、次いで、ＳＦ３Ｂ１抗体（ａ−ＳＡＰ  １５５、ＭＢＬ）及び抗ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ）と一緒にインキュベートした。Ｌｉ−Ｃｏｒロバ抗マウス８００ＣＷ及びＬｉ−Ｃｏｒロバ抗ウサギ８００ＣＷを二次抗体として使用し、オデッセイイメージャー（Ｌｉ−Ｃｏｒ）によって検出した。
【００８５】
[0111]対立遺伝子特異的ｑＰＣＲによってＳＦ３Ｂ１ノックダウンを確認するために、ＲＮＡを細胞から単離し、ＭａｇＭａｘ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ製造者のマニュアルに従って使用して逆転写した。ＶｉｉＡ７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｑＰＣＲを実施した。反応にはｃＤＮＡ２０〜５０ｎｇ、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びプライマー３００ｎＭを含めた。以下のプライマーを使用した：
ＳＦ３Ｂ１ＷＴ：ＦＷ  ５’−ＧＡＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣ（配列番号１１８３）及びＲＷ  ５’−ＡＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣ（配列番号１１８４）、
ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ：ＦＷ  ５’−ＧＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号１１８５）及びＲＷ  ５’−ＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＣＣＧＡＡＣＴＴＣＡ（配列番号１１８６）、
ＳＦ３Ｂ１ＰＡＮ：ＦＷ  ５’−ＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧ（配列番号１１８７）及びＲＷ  ５’−ＡＡＣＣＡＧＴＣＡＴＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧ（配列番号１１８８）、
β−アクチン（内部標準）：ＦＷ  ５’−ＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号１１８９）及びＲＷ  ５’−ＡＣＴＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣ（配列番号１１９０）。
【００８６】
生物学的３連反復実験及び技術的３連反復実験を実施した。
【００８７】
[0112]ウエスタンブロッティング及び対立遺伝子特異的ＰＣＲのどちらによってもＳＦ３Ｂ１対立遺伝子のノックダウンが確認された（図９及び１０）。
【００８８】
[0113]ＳＦ３Ｂ１変異の発現と異常スプライシングの関連を決定するために、ドキシサイクリン誘導性ノックダウン後に細胞から単離したＲＮＡをナノストリング（登録商標）によって分析した。Ｐａｎｃ  ０５．０４では、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ対立遺伝子のノックダウン後に、異常スプライスバリアントが下方制御され、標準スプライスバリアントが上方制御されたが、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ対立遺伝子の選択的枯渇では逆のことが観察され（図１１Ａ）、これにより、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴタンパク質が野生型スプライシング活性を有さないことが示される。Ｐａｎｃ  １０．０５細胞では、全ｓｈＲＮＡの発現により、全てのスプライスバリアントの制御、並びにＳＦ３Ｂ１ＷＴの枯渇が誘導された（図１１Ｂ）。Ｐａｎｃ０５．０４細胞では、ＳＦ３Ｂ１ＰＡＮノックダウンによりどちらの細胞株の成長及びコロニー形成も損なわれたが、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴの選択的枯渇では、最小の影響が観察された（図１２及び１３）。Ｐａｎｃ  ０５．０４細胞においてＳＦ３Ｂ１ＷＴ対立遺伝子をノックダウンした場合には生存能力への部分的な影響が観察されたが、ＳＦ３Ｂ１ＰＡＮノックダウンではコロニー形成及び細胞増殖が妨げられ（図１２及び１４）、これにより、ＳＦ３Ｂ１の全阻害により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性が導かれることが示される。
【００８９】
実施例４：ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴスプライシングの調節
スプライシングに対するＥ７１０７の全体的な影響
[0114]Ｅ７１０７は、Ｕ２  ｓｎＲＮＰ関連複合体ＳＦ３Ｂを標的とすることによってスプライシングを阻害する小分子化合物である（Ｋｏｔａｋｅ，Ｙら、「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ＳＦ３ｂ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ．」、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３、５７０−５７５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．２００７．１６［２００７］）。以下の通り、基質Ａｄ２（Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉ，Ｌ、Ｋａｔａｏｋａ，Ｎ、Ｃｈａｒｒｏｕｘ，Ｂ＆Ｄｒｅｙｆｕｓｓ，Ｇ、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＳＭＮ、ｔｈｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ、ｉｎ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．」、Ｃｅｌｌ  ９５、６１５−６２４［１９９８］）及びＦｌａｇタグＳＦ３Ｂ１ＷＴ又はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅを発現するＮａｌｍ−６同質遺伝子細胞株又は２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；製造者の指示に従って培養したもの）からの核抽出物を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイ（ＩＶＳ）において、スプライシングを阻害するＥ７１０７の能力が観察された。
【００９０】
[0115]ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２−ＳＦ３Ｂ１プラスミドをトランスフェクトした２９３Ｆ細胞から、又は同質遺伝子型Ｎａｌｍ−６細胞（ＳＢＨ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から、核抽出物を調製した。ｍｘＳＦ３Ｂ１遺伝子をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（Ｓｉｇｍａ）にＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＫｐｎＩ部位にクローニングすることによってプラスミドを生成し、変異ｍｘＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ、ｍｘＳＦ３Ｂ１Ｒ１０７４Ｈ及びｍｘＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ−Ｒ１０７４Ｈを、同じ部位特異的変異誘発キットを使用して導入した。細胞ペレットを低張性緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、及び０．５ｍＭのＤＴＴ；Ｎａｌｍ−６細胞については、４０ｍＭのＫＣｌを使用した）に再懸濁させた。懸濁液を合計５圧縮細胞量（ＰＣＶ）まで育てた。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞を、低張性緩衝液を用いて３ＰＣＶまで育て、氷上で１０分インキュベートした。細胞を、ダウンス型ホモジナイザーを使用して溶解させ、次いで、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１／２圧縮核量（ＰＮＶ）の低塩濃度緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５％グリセロール、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、０．５ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させ、その後、１／２ＰＮＶの高塩濃度緩衝液（１．４ＭのＫＣｌを使用した以外は低塩緩衝液と同じ）に再懸濁させた。核を３０分にわたって穏やかに混合した後、遠心分離した。次いで、上清（核抽出物）を貯蔵緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１００ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、０．５ｍＭのＤＴＴ）中に透析した。タンパク質濃度を、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）８０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。
【００９１】
[0116]ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシング（ＩＶＳ）反応のために、Ａｄ２由来の配列（Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉ，Ｌ、Ｋａｔａｏｋａ，Ｎ、Ｃｈａｒｒｏｕｘ，Ｂ＆Ｄｒｅｙｆｕｓｓ，Ｇ、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＳＭＮ，ｔｈｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ，ｉｎ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．」、Ｃｅｌｌ  ９５、６１５−６２４［１９９８］）をｐＧＥＭ−３Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にＥｃｏＲＩ制限部位及びＸｂａＩ制限部位を使用してクローニングした。得られたｐＧＥＭ−３Ｚ−Ａｄ２プラスミドを、ＸｂａＩを使用して直線化し、精製し、ＴＥ緩衝液に再懸濁し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応においてＤＮＡ鋳型として使用した。Ａｄ２  ｍＲＮＡ前駆体を、それぞれメガスクリプト（ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ）Ｔ７及びメガクリア（ＭｅｇａＣｌｅａｒ）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成し、精製した。核抽出物８０μｇ、２０ＵのＲＮＡｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ａｄ２  ｍＲＮＡ前駆体１０ｎｇ、及び種々の濃度のＥ７１０７を使用してスプライシング反応液２０μＬを調製した。１５分間のプレインキュベーション後、活性化緩衝液（０．５ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのクレアチンリン酸、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２）を添加してスプライシングを開始させ、反応液を９０分間インキュベートした。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）からの改変プロトコールを使用して抽出した。スプライシング反応をＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）３５０μＬ中でクエンチし、１．５体積のエタノールを添加した。混合物をＲＮｅａｓｙ  ９６プレートに移し、試料をキットプロトコールに記載されている通り処理した。ＲＮＡをｄＨ２Ｏで１／１０に希釈した。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応液１０μＬを、ＴａｑＭａｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １−ｓｔｅｐ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＮＡ８．５μＬ、及びＡｄ２  ｍＲＮＡプライマー／プローブセット（ＦＷ  ５’ＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＧＣＴＧＴ（配列番号１１９１）、ＲＷ  ５’ＣＣＧＡＣＧＧＧＴＴＴＣＣＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号１１９２）及びプローブ  ５’ＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧ（配列番号１１９３））１μＬを使用して調製した。
【００９２】
[0117]ｐＳＦ３Ｂ１を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシング反応液を上記の通り調製した。反応をクエンチするために、６×レムリバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に供した。分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写し、次いで、ブロッキング緩衝液（５０％オデッセイブロッキングバッファー（Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び５０％ＴＢＳＴ）を用いてブロッキングした。ブロットを抗ＳＦ３Ｂ１抗体と一緒に終夜インキュベートし、ＴＢＳＴで何回か洗浄した後、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＬＴロバ−α−マウス−ＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートし、オデッセイＣＬｘイメージングシステム（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して可視化した。
【００９３】
[0118]Ｅ７１０７は、ＦｌａｇタグＳＦ３Ｂ１ＷＴ又はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅを発現するＮａｌｍ−６細胞又は２９３Ｆ細胞のどちらに由来する核抽出物においてもスプライシングを阻害することができた（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
【００９４】
Ｅ７１０７は、ＳＦ３Ｂ１ＷＴタンパク質及びＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅタンパク質の両方に結合する
[0119]ＳＦ３Ｂ１ＷＴタンパク質及びＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅタンパク質の両方に結合するＥ７１０７の能力を、一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞に由来する、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降するＦｌａｇタグＳＦ３Ｂ１タンパク質を使用した競合結合アッセイにおいて評価した。抗体のビーズへのバッチ固定化を、抗ＳＦ３Ｂ１抗体（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）８０μｇと抗マウスＰＶＴ  ＳＰＡシンチレーションビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）２４ｍｇを３０分インキュベートすることによって調製した。遠心分離後、抗体−ビーズ混合物を、ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）及び完全なＵＬＴＲＡプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＰＢＳに再懸濁させた。核抽出物を、４０ｍｇを総体積１６ｍＬのＰＢＳ中にホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤と一緒に希釈し、混合物を遠心分離することによって調製した。上清をきれいなチューブに移し、抗体−ビーズ混合物を添加し、２時間インキュベートした。ビーズを遠心分離し、ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で２回洗浄し、ＰＢＳ４．８ｍＬを用いて再懸濁させた。スラリー及び種々の濃度のＥ７１０７を使用して結合反応液１００μＬを調製した。室温で１５分間のプレインキュベーション後、３Ｈ−プローブ分子（Ｋｏｔａｋｅ，Ｙら、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ＳＦ３ｂ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３、５７０−５７５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．２００７．１６［２００７］に記載されている）１ｎＭを添加した。混合物を室温で１５分インキュベートし、マイクロベータ２プレートカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２  Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光シグナルを読み取った。
【００９５】
[0120]図１６Ａに示されている通り、Ｅ７１０７は、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ（ＩＣ５０：１３ｎＭ）又はＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ（ＩＣ５０：１１ｎＭ）のいずれに対する３Ｈプローブ分子の結合も同様に競合的に阻害することができた。
【００９６】
正常スプライシング及び異常スプライシングに対するＥ７１０７及び他の化合物の効果
[0121]Ｅ７１０７を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮａｌｍ−６同質遺伝子細胞株においても、ＳＦ３Ｂ１ＷＴタンパク質及びＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅタンパク質によって誘導される正常スプライシング及び異常スプライシングを調節する能力について試験した。Ｎａｌｍ−６同質遺伝子細胞を漸増濃度のＥ７１０７で６時間処理し、ＲＮＡをｑＰＣＲによって分析した。図１６Ｂに示されている通り、標準スプライシングが観察され、ＥＩＦ４Ａ１のｍＲＮＡ前駆体の蓄積及び成熟ｍＲＮＡ  ＳＬＣ２５Ａ１９の下方制御がどちらの細胞株においても観察された。さらに、ＣＯＡＳＹ及びＺＤＨＨＣ１６の２つの正常にスプライシングされなかったアイソフォームの成熟ｍＲＮＡの下方制御がＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅにおいて観察された（図１６Ｂ）。
【００９７】
[0122]正常スプライシング及び異常スプライシングに対するＥ７１０７のより広範な活性を調査するために、１５ｎＭで２時間及び６時間処理したＮａｌｍ−６同質遺伝子細胞由来のＲＮＡをナノストリング（登録商標）によって分析した。どちらの同質遺伝子細胞株においても２時間の時点ではスプライシングの部分的な阻害のみが観察され、遺伝子のレベルでは、ＷＴ関連アイソフォーム、及びＭＵＴ関連アイソフォーム発現が観察された。６時間の処理後、数量化した全てのアイソフォームについて明白な阻害が検出された（図１７）。１５ｎＭのＥ７１０７で６時間処理した同質遺伝子細胞株のＲＮＡ−Ｓｅｑ解析により、同様の結果が得られた（図１８）。式１又は２を有する追加的な化合物の１つで処理した後の同質遺伝子細胞株における正常スプライシング及び異常スプライシングもＲＮＡ−Ｓｅｑによって分析した。Ｅ７１０７と同様に、これらの追加的な化合物のそれぞれにより、ＷＴ関連ＲＮＡアイソフォーム及びＭＵＴ関連ＲＮＡアイソフォームの発現が阻害された（図１９；化合物は、垂直方向のグラフの対のそれぞれの上の式番号によって示される）。ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析のために、細胞を、Ｅ７１０７又は他の試験化合物で処理した後にＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、製造者のマニュアルに報告されている通り単離した。ｃＤＮＡライブラリー調製、シークエンシング及び未加工の読み取りのフィルタリングをＲｅｎ，Ｓら、「ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ、ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇｓ．」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２２、８０６−８２１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１２．３０（２０１２）に記載されている通り実施した。
【００９８】
[0123]さらに、スプライシングを調節するＥ７１０７の能力を、ヒト腫瘍異種移植片を有するマウスにおいて試験した。Ｎａｌｍ−６同質遺伝子型異種移植マウスを、１０×１０６個のＮａｌｍ−６同質遺伝子細胞をＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの側腹部の皮下に埋め込むことによって生成し、これらのマウスから、Ｅ７１０７（５ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内（ＩＶ）投薬した後の異なる時点で腫瘍を採取し、分析して化合物濃度及びスプライシング制御を決定した。ＲＮＡを、リボピュア（ＲｉｂｏＰｕｒｅ）（商標）ＲＮＡ精製キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）（登録商標））を使用して腫瘍から単離し、ナノストリング（登録商標）アッセイ又はｑＰＣＲのために使用した。ＲＮＡをスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標））の指示に従って逆転写し、ｃＤＮＡ０．０４μｌをｑＰＣＲに使用した。ｍＲＮＡ前駆体ＥＩＦ４Ａ１及び成熟ｍＲＮＡ  ＳＬＣ２４Ａ１９についてのｑＰＣＲ並びに薬物動態評価をＥｓｋｅｎｓ，Ｆ  Ａ．ら、「Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ及びｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｃｌａｓｓ  ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｅ７１０７  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．」、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９、６２９６−６３０４、ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１３−０４８５（２０１３）に記載されている通り実施した。ＺＤＨＨＣ１６に対して使用したプライマー及びプローブは以下のものである：ＦＷ  ５’−ＴＣＴＴＧＴＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号１１９４）、ＲＷ  ５’ＣＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＣ（配列番号１１９５）及びプローブ  ５’ＦＡＭ  ＣＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧ（配列番号１１９６）。ＣＯＡＳＹに対して使用したプライマー及びプローブは以下のものである：ＦＷ  ５’−ＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＡ（配列番号１１９７）、ＲＷ  ５’−ＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＴＣＴ（配列番号１１９８）及びプローブ  ５’−ＦＡＭ−ＣＴＴＧＡＧＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣ（配列番号１１９９）。Ｅ７１０７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された通り、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｋモデル及びＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅモデルのどちらにおいても、同様の薬物濃度に達し、標準スプライシングを調節し（ＥＩＦ４Ａ１のｍＲＮＡ前駆体の蓄積及び成熟ｍＲＮＡ  ＳＬＣ２５Ａ１９の下方制御）、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞ではＣＯＡＳＹ及びＺＤＨＨＣ１６の正常でないスプライシングを下方制御した（図２０）。標準スプライシング及び異常スプライシングｍＲＮＡアイソフォームは、Ｅ７１０７により、早ければ化合物投与の１時間後に下方制御され、発現は処理の直後に正常化し（図２１）、これは、Ｅ７１０７薬物動態プロファイルと一致した。Ｐａｎｃ  ０５．０４ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１異種移植モデルにおいても同様の結果が観察された（図２２）。これら��全てのデータから、Ｅ７１０７が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＳＦ３Ｂ１ＷＴタンパク質及びＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅタンパク質に結合し、阻害することが可能な全スプライシング調節因子であることが示される。
【００９９】
実施例５：Ｅ７１０７はＳＦ３Ｂ１調節による抗腫瘍活性を有する
[0124]ＳＦ３Ｂ１調節因子Ｅ７１０７を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性について、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅの皮下モデルにおけるＥ７１０７の影響を決定することによって試験した。１０×１０６個のＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００ＥをＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの側腹部の皮下に埋め込み、マウスに、Ｅ７１０７を３つの忍容性が良好である用量レベル（１．２５、２．５及び５ｍｇ／ｋｇ）で１日１回、５日連続して（ＱＤｘ５）で静脈内投与した。この投薬後、動物を、以下のエンドポイントのいずれかに達するまでモニタリングした：１）過剰な腫瘍体積が１週間に３回測定される（楕円式：（長さ×幅２）／２を使用することによって算出される腫瘍体積）、又は２）麻痺又は過剰な体重減少などの任意の健康問題が発生する。部分退縮（ＰＲ）及び完全退縮（ＣＲ）は、３回連続した腫瘍測定値が出発体積のそれぞれ＜５０％及び＜３０％であると定義される。
【０１００】
[0125]１．２５ｍｇ／ｋｇ群では、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ異種移植群の全ての動物（ｎ＝１０）が完全退縮（ＣＲ）に達した。２．５ｍｇ／ｋｇ群では、Ｎａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ群において９日目までに１０／１０のＣＲが観察された。５ｍｇ／ｋｇ群では、全てのＮａｌｍ−６  ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ異種移植動物が早ければ処置の９日後にＣＲに達し、平均生存時間は２５０日を超えた（図２３及び２４）。これらのデータから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ異種移植片でのＳＦ３Ｂ１調節因子の抗腫瘍活性が実証される。
【０１０１】
[0126]ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＬＬ患者試料におけるスプライシングを阻害するＥ７１０７の能力を、Ｅ７１０７を１０ｎＭで用いて６時間にわたって処理した、Ｅ７１０７で処理した患者細胞の試料からＲＮＡを単離し、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析を実施することによって決定した。そうするために、細胞を、Ｅ７１０７で処理後にＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造者のマニュアルに報告されている通り使用して単離した。ｃＤＮＡライブラリー調製、シークエンシング及び未加工の読み取りのフィルタリングをＲｅｎ，Ｓら、「ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ、ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｏｎｇ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ及びａｂｅｒｒａｎｔ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇｓ．」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２２、８０６−８２１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１２．３０（２０１２）に記載されている通り実施した。図２５に示されている通り、Ｅ７１０７により、ＳＦ３Ｂ１ＷＴ患者試料及びネオモルフィックＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ患者試料における標準スプライシングアイソフォームの発現が阻害された。Ｅ７１０７により、ネオモルフィックＳＦ３Ｂ１変異を有する全てのＣＬＬ患者試料における異常スプライシングを阻害することができた。
【０１０２】
[0127]本明細書を考察し、本明細書に開示されている本発明を実行することにより、本発明の他の実施形態が当業者に明らかになるであろう。本明細書及び実施例は単に例示的なものと考え、本発明の真の範囲及び主旨は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。
【０１０３】
[001]本出願は、その内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年９月１日出願の米国仮特許出願第６２／２１２，８７６号に関する優先権の利益を主張するものである。
【０１０４】
[002]本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１４年５月１６日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、名称１２６３６．６−３０４＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズ１８３キロバイトである。
【図１】
2018525994.tif 000060
【図２】
2018525994.tif 000061
【図３】
2018525994.tif 000062
【図４】
2018525994.tif 000063
【図５】
2018525994.tif 000064
【図６】
2018525994.tif 000065
【図７】
2018525994.tif 000066
【図８】
2018525994.tif 000067
【図９Ａ】
2018525994.tif 000068
【図９Ｂ】
2018525994.tif 000069
【図１０Ａ】
2018525994.tif 000070
【図１０Ｂ】
2018525994.tif 000071
【図１１】
2018525994.tif 000072
【図１２】
2018525994.tif 000073
【図１３】
2018525994.tif 000074
【図１４Ａ】
2018525994.tif 000075
【図１４Ｂ】
2018525994.tif 000076
【図１５】
2018525994.tif 000077
【図１６Ａ】
2018525994.tif 000078
【図１６Ｂ】
2018525994.tif 000079
【図１７】
2018525994.tif 000080
【図１８】
2018525994.tif 000081
【図１９】
2018525994.tif 000082
【図２０】
2018525994.tif 000083
【図２１】
2018525994.tif 000084
【図２２】
2018525994.tif 000085
【図２３】
2018525994.tif 000086
【図２４】
2018525994.tif 000087
【図２５】
2018525994.tif 000088
【配列表】
2018525994000001.app
【国際調査報告】
2018525994.tif 000089
2018525994.tif 000090
2018525994.tif 000091
2018525994.tif 000092
2018525994.tif 000093
2018525994.tif 000094
2018525994.tif 000095