(57)【要約】  本発明は、精製され、組換え産生された、細菌リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）酵素、およびＬｓｐ触媒活性をモニターするためのインビトロアッセイを提供する。また、本発明では、新規な抗生剤を同定するためのスクリーニング方法、および細菌感染症を治療するためのそれらの治療適用も提供される。さらに、本発明では、細菌感染症に起因する疾患を治療する際に殺菌剤として使用することのできる特異的Ｌｓｐ阻害化合物が提供される。【選択図】図1
2018532384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）の触媒活性を測定するためのアッセイ系であって、（ａ）組換え発現され、可溶性の、精製されたＬｓｐ酵素および（ｂ）Ｌｓｐ基質を含む、アッセイ系。
【請求項２】
前記Ｌｓｐが、細菌Ｌｓｐである、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項３】
前記Ｌｓｐが、大腸菌Ｌｓｐである、請求項２に記載のアッセイ系。
【請求項４】
前記Ｌｓｐが、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質として発現する、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項５】
前記Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がＮ末端Ｈｉｓ６タグを含む、請求項４に記載のアッセイ系。
【請求項６】
前記Ｌｓｐが、界面活性剤によって可溶化されている、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項７】
前記界面活性剤が、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）である、請求項６に記載のアッセイ系。
【請求項８】
前記基質が、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項９】
前記基質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナー−アクセプター対で標識されている、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１０】
リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）を阻害する作用剤を同定する方法であって、（ａ）組換え産生され、精製されたＬｓｐとＬｓｐ基質とを被験化合物の存在下で接触させる工程、および（ｂ）１以上の前記被験化合物によって、前記基質のＬｓｐ切断の阻害を検出する工程；それにより、前記リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）を阻害する作用剤を同定する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記Ｌｓｐが、細菌Ｌｓｐである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｌｓｐが、大腸菌Ｌｓｐである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｌｓｐが、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がＮ末端Ｈｉｓ６タグを含む、請求項１４に記載の方法
【請求項１５】
前記Ｌｓｐが、界面活性剤によって可溶化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤が、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質が、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記基質が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナー−アクセプター対で標識されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
Ｌｓｐ触媒活性が蛍光共鳴エネルギー移動によって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ハイスループット形式で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験化合物が小さい有機化合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記同定された作用剤を殺菌活性について調べることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記同定された作用剤を、細菌リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ（Ｌｇｔ）を阻害する能力について調べることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
細菌細胞においてＬｓｐ触媒活性を阻害するための方法であって、前記細胞に存在するＬｓｐを化合物に阻害させる条件下で、前記細菌細胞をＬｓｐ阻害化合物と接触させる工程を含み、前記Ｌｓｐ阻害化合物が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１００００２７０７２８−１、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８またはＣｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、またはそれらの機能性変異体である、方法。
【請求項２５】
前記細菌細胞が、被験体の内部に存在している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体が、前記細菌細胞による感染症に罹患している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、治療上有効な量の前記Ｌｓｐ阻害化合物を投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
被験体において細菌の増殖を阻害し、細菌感染症を治療するための方法であって、細菌感染症に罹患した前記被験体に、治療上有効な量のＬｓｐ阻害化合物を含む医薬組成物を投与し、それにより前記被験体において細菌の増殖を阻害し、細菌感染症を治療する工程を含み；前記Ｌｓｐ阻害化合物が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１００００２７０７２８−１、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８またはＣｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、またはそれらの機能性変異体である、方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アッセイ系の触媒活性を測定することの可能な、活性界面活性剤で可溶化された膜貫通酵素を生成する方法であって、（ａ）前記活性膜貫通酵素を発現することの可能な発現ベクターを構築する工程；（ｂ）前記活性膜貫通酵素を前記ベクターから発現させる工程；および（ｃ）界面活性剤に基づく系において前記活性膜貫通酵素を可溶化し精製する工程；それにより、アッセイ系の特異的触媒活性を測定することの可能な、活性膜貫通界面活性剤で可溶化された酵素を生成する工程を含む、方法。
【請求項３１】
前記膜貫通酵素がＬｓｐである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素の触媒活性を測定するためのアッセイにおいて請求項３０に従って生成された前記膜貫通酵素の使用。
【請求項３３】
前記膜貫通酵素の特異的阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングにおける、請求項３０に従って生成された前記膜貫通酵素の使用。
【請求項３４】
前記膜貫通酵素がＬｓｐである、請求項３３に従って生成された前記膜貫通酵素の使用。
【請求項３５】
改良された特性を備えるＬｓｐ阻害化合物を同定するための方法であって、（ａ）リードＬｓｐ阻害化合物の１以上の構造類似体を合成する工程；（ｂ）機能アッセイを前記類似体に実施して、前記リード化合物のものと比較して改良された生物学的または薬学的特性を有する類似体を同定する工程；それにより、改良された特性を備えるＬｓｐ阻害化合物を同定する工程を含む、方法。
【請求項３６】
前記リードＬｓｐ阻害化合物が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１００００２７０７２８−１、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、またはそれらの機能性変異体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記改良された生物学的または薬学的特性が、Ｌｓｐ触媒活性の阻害の向上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記機能アッセイが、精製され、界面活性剤で可溶化されたＬｓｐ酵素を用いる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記改良された生物学的または薬学的特性が、安定性または血清半減期の増加である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、米国特許仮出願第６２／２１４，６９５号（２０１５年９月４日出願）に対する優先権の利益を主張する。優先権出願の全開示は、参照によりあらゆる目的においてその全文が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
全ての細菌は、栄養素の取り込み、シグナル伝達、細胞壁安定性、接着、および毒性をはじめとする多数の多様な重要な役割をリポタンパク質に依存している。共有結合脂質の修飾は、全てのリポタンパク質を細菌細胞膜に係留し、脂質付着のプロセスは、膜内在性リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）に完全に左右される。Ｌｓｐは、細菌界（グラム陰性細菌門と陽性細菌門）で高度に保存され、ヒト相同体が存在しないので、広範かつ新規な抗菌薬の開発の注目される標的となっている。ヒト相同体が存在しないという基準は、宿主に投与された際に分子の乱交雑およびオフターゲット作用を除去するために非常に重要である。この種類の分子特異性の最もよい例は、細菌界に限定される特有の機能である酵素ＤＤ−トランスペプチダーゼを標的にする、β−ラクタム抗生物質のペニシリンである。タンパク質を魅力的な創薬標的にするＬｓｐの多数の特質にもかかわらず、小分子阻害剤はこれまでに報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細菌感染症の治療のための、さらなるより良い薬物が当技術分野で強く必要とされている。本発明は、当技術分野のこれらの実現されていない必要性に向けられる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本発明は、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）の触媒活性を測定するためのアッセイ系のための方法を提供する。この系は、（ａ）組換え発現され、可溶性の、精製されたＬｓｐ酵素と（ｂ）Ｌｓｐ基質を含む。一部の系では、Ｌｓｐは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌｓｐなどの細菌Ｌｓｐである。一部の実施形態では、Ｌｓｐは、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質として発現する。一部の実施形態では、Ｌｓｐは、界面活性剤、例えば、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）によって可溶化される。一部の実施形態では、基質は、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である。一部の実施形態では、基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナー−アクセプター対で標識されている。
【０００５】
別の態様では、本発明は、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）を阻害する作用剤を同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）組換え産生され、精製されたＬｓｐとＬｓｐ基質を被験化合物の存在下で接触させること、および（ｂ）１以上の被験化合物によって、前記基質のＬｓｐ切断の阻害を検出することを伴う。一部の実施形態では、Ｌｓｐは、大腸菌Ｌｓｐなどの細菌Ｌｓｐである。一部の実施形態では、Ｌｓｐは、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質として発現する。一部の実施形態では、Ｌｓｐは、界面活性剤、例えば、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）によって可溶化される。一部の実施形態では、基質は、ペプチド、ペプチド模倣物、または、脂質修飾システイン残基を含有するタンパク質である。一部の実施形態では、基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナー−アクセプター対で標識されている。一部の実施形態では、Ｌｓｐ触媒活性は蛍光共鳴エネルギー移動によって検出される。一部の実施形態では、スクリーニングはハイスループット形式で実施される。一部の実施形態では、被験化合物は、小さい有機化合物である。本発明の一部の方法は、同定された作用剤を殺菌活性について調べることをさらに含む。
【０００６】
別の態様では、本発明は、微生物細胞（例えば、細菌）においてＬｓｐ触媒活性を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞に存在するＬｓｐを化合物に阻害させる条件下で、微生物細胞をＬｓｐ阻害化合物と接触させることを伴う。この際、Ｌｓｐ阻害化合物は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、または図１２に示される化合物のいずれか、例えばＣｏｍｐｏｕｎｄ  ０１０００２７０７２８−１など、あるいはそれらの機能性変異体である。一部の実施形態では、微生物細胞は、被験体の内部に存在している。一部のこれらの実施形態では、被験体は、微生物細胞による感染に罹患している。
【０００７】
関連する態様では、本発明は、被験体において微生物（例えば、細菌）の増殖を阻害するための方法、および微生物感染症（例えば、細菌感染症）を治療するための方法を提供する。これらの方法は、微生物感染に罹患した被験体に、治療上有効な量のＬｓｐ阻害化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。これらの方法では、Ｌｓｐ阻害化合物は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、または図１２に示される化合物のいずれか、例えばＣｏｍｐｏｕｎｄ  ０１０００２７０７２８−１など、あるいはそれらの機能性変異体である。一部の好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０００８】
別の態様では、本発明は、アッセイ系の触媒活性を測定することの可能な、活性界面活性剤で可溶化された膜貫通酵素を生成するための方法を提供する。この方法は、（ａ）活性膜貫通酵素を発現することの可能な発現ベクターを構築すること；（ｂ）活性膜貫通酵素を発現から発現させること；および（ｃ）界面活性剤に基づく系において活性膜貫通酵素を可溶化し精製することを伴う。一部のこれらの方法では、用いる膜貫通酵素はＬｓｐである。一部の関連する実施形態では、本発明は、これらの方法に従って生成した膜貫通酵素を、酵素の触媒活性を測定するアッセイで使用することを提供する。この使用の一部は、細菌の膜貫通酵素、例えばＬｓｐの特異的阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングに関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、改良された特性を備えるＬｓｐ阻害化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）リードＬｓｐ阻害化合物の１以上の構造類似体を合成すること；（ｂ）機能アッセイを前記類似体に実施して、前記リード化合物のものと比較して改良された生物学的または薬学的特性を有する類似体を同定すること；それにより、改良された特性を備えるＬｓｐ阻害化合物を同定することを伴う。一部の実施形態では、リードＬｓｐ阻害化合物は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、または図１２に示される化合物のいずれか、例えばＣｏｍｐｏｕｎｄ  ０１０００２７０７２８−１など、あるいはそれらの機能性変異体である。一部のこれらの方法では、改良された生物学的または薬学的特性は、Ｌｓｐ触媒活性の阻害の向上である。一部の方法では、機能アッセイは、精製され、界面活性剤で可溶化されたＬｓｐ酵素を用いる。
【００１０】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｌｓｐ  ＦＲＥＴペプチド基質の概略図を示す図である。
【図２】１０−プレート  Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ（商標）アッセイの散布図を示す図である。
【図３】４０−プレート  Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ（商標）アッセイの散布図を示す図である。
【図４】Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ（商標）スクリーニングのヒット化合物およびＬｓｐ活性の阻害％を示す図である。
【図５】三つ組で測定した、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ化合物ライブラリーの阻害を示す図である。
【図６】ヒット化合物ＢＢＳ−８および−２０の構造を示す図である。
【図７】ＢＢＳ−２０によるＬｓｐの用量依存性の阻害を示す図である。
【図８】ＢＢＳ−２０が非競合的機構によってＬｓｐを阻害することを示す図である。
【図９】機能性変異体を生成するための、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０へのいくつかの修飾を示す図である。
【図１０】Ｌｓｐ阻害剤を探索する超高スループットスクリーニングで使用される濃度および体積の概略図を示す図である。
【図１１】ＬＳＰ一次およびカウンタースクリーニング滴定アッセイ結果に関するデータを示す図である。図のパネルＡ、ＢおよびＣは、ＬＳＰ一次スクリーニング滴定アッセイ、カウンタースクリーニング滴定アッセイ、および両アッセイでの対照化合物のＣＲＣの総合的な統計概要を示す。パネルＤは、滴定アッセイで試験した３４４種の化合物のクラスター順位であり、最大応答％をクラスターＩＤと比較して用いてプロットされたものである。３４４種の化合物の中に５５のクラスターがあることに留意されたい。上位１７のヒットは赤色の点で示される。代表的な上位ヒットの構造が、各々のクラスターの赤色の点の近くに示される。
【図１２−１】Ｌｓｐを用量依存的な様式で阻害する、カウンタースクリーニング滴定アッセイで同定された化合物の例を示す図である。
【図１２−２】Ｌｓｐを用量依存的な様式で阻害する、カウンタースクリーニング滴定アッセイで同定された化合物の例を示す図である。
【図１２−３】Ｌｓｐを用量依存的な様式で阻害する、カウンタースクリーニング滴定アッセイで同定された化合物の例を示す図である。
【図１２−４】Ｌｓｐを用量依存的な様式で阻害する、カウンタースクリーニング滴定アッセイで同定された化合物の例を示す図である。
【図１２−５】Ｌｓｐを用量依存的な様式で阻害する、カウンタースクリーニング滴定アッセイで同定された化合物の例を示す図である。
【図１３】Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１０００２７０７２８−１の合成および用量依存性のアッセイによるインビトロでの検証を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．概要
当技術分野で長年必要とされてきたにもかかわらず、現在、Ｌｓｐに特異的な阻害剤はない。これは、活性膜貫通酵素の精製およびアッセイ開発に関連する途方もない困難によるものであると思われる。本発明は、本発明者らによる膜内在性プロテアーゼの最初のインビトロハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の開発に一部分基づいている。本明細書において詳述されるように、本発明者らは、大腸菌リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）を発現させ、精製し、可溶化することに成功した。本発明者らはさらに、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいてＬｓｐ切断活性をモニターするインビトロアッセイを開発した。このアッセイは、フルオロフォアおよび蛍光消光剤で標識したリポタンパク質模倣ペプチド基質を用いた。本発明者らは、全ての可能性のある阻害様式（すなわち、競合的および非競合的）を同定することの可能な酵素、基質、およびライブラリー化合物濃度を選択することによってＨＴＳを最適化した。さらに、本発明者らは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒコレクションから１５，０００の化合物の暫定的なパイロットスクリーニングを実施した。内部ライブラリー（「Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ化合物ライブラリー」）のさらなる選別の結果、リード化合物が同定され、それはインビトロ機能アッセイでＬｓｐ阻害剤と確認された。十分なシグナル対バックグラウンドと統計学的に有意な値０．５をはるかに上回るＺ−ｐｒｉｍｅに強調されるように、これらの結果は、Ｌｓｐが創薬の実行可能な標的であること、およびアッセイが再現性があり頑強であることを実証した。本明細書に記載される精製されたＬｓｐ酵素およびインビトロスクリーニング系の実用性をさらに検証するものとして、本発明者らは、超ハイスループットスクリーニングおよびＬｓｐ阻害剤の検証アッセイをさらに実施した。この選別は１，５３６のウェル形式を用い、６４６，２７５の候補化合物のライブライリーを選別した。本明細書において詳述されるように、合計２，２７１の活性化合物が一次アッセイから得られた。二次アッセイによって、約３４４の化合物が選択的活性を示すことが見出された。例示的な化合物の特性を、さらなる合成および検証アッセイで確認した。
【００１３】
これらの研究に従って、本発明は、Ｌｓｐ酵素活性をモニターし、数量化するための新規なアッセイ系を提供する。また、本発明では、Ｌｓｐ酵素活性を阻害し、細菌の増殖を阻害する新規な作用剤を同定するための方法が提供される。そのような作用剤は、細菌感染症を治療するために広く用いることのできる新規な抗生物質をもたらす。本発明はさらに、グラム陰性生物およびグラム陽性生物に対する殺菌剤として使用することのできる特異的Ｌｓｐ阻害化合物を提供する。さらに、本発明では、同定したＬｓｐ阻害分子をリード化合物として使用して、改良された生物学的および／または薬学的特性をもつさらなる抗生剤を同定する方法が提供される。以下の項は、本発明の組成物を作製し、使用するための、そして本発明の方法を実行するためのさらなるガイダンスを提供する。
【００１４】
ＩＩ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味をもつ。次の参考文献は、本発明で使用する多くの用語の一般的定義を当業者に与える：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。加えて、以下の定義が本発明の実践において読者を助けるために記載される。
【００１５】
用語「作用剤」または「被験剤」には、任意の物質、分子、元素、化合物、実体、またはそれらの組合せが含まれる。それには、限定されるものではないが、例えば、タンパク質、ポリペプチド、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチド、および同類のものが含まれる。それは、天然物、合成化合物、または化学物質、あるいは２以上の物質の組合せであり得る。別に指定されない限り、用語「作用剤」、「物質」、および「化合物」は同義的に使用され得る。
【００１６】
用語「類似体」は、本明細書において、参照分子に構造的に似ているが、参照分子の特定の置換基を代わりの置換基で置換することにより、標的化され制御された方法で修飾された分子をさすために使用される。参照分子と比較して、類似体が同じ、同程度、または改良された有用性を示すことを当業者は予想する。改良された形質（例えば標的分子に対するより高い結合親和性など）を有する既知化合物の変異体を同定する、類似体の合成およびスクリーニングは、製薬化学で周知の手法である。
【００１７】
用語「接触させる」はその通常の意味を有し、２以上の作用剤（例えば、ポリペプチドまたは小分子化合物）を組み合わせること、または作用剤と細胞（例えば、小分子および細胞）を組み合わせることをさす。接触は、インビトロで行うことができる（例えば、試験管またはその他の容器中で２以上の作用剤を組み合わせるか、または被験剤と細胞もしくは細胞溶解液を組み合わせる）。接触は、細胞でまたはインサイチュでも行うことができる（例えば、２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの細胞中での同時発現によって細胞中で、あるいは細胞溶解液中で、細胞内の２つのポリペプチドを接触させる）。
【００１８】
ＥＤＡＮＳ、５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸は、ＦＲＥＴに基づく核酸プローブおよびプロテアーゼ基質を開発するための最も一般的なドナーの１つである。ＥＤＡＮＳは、ＦＲＥＴに基づくプローブ中でＤＡＢＣＹＬまたはＤＡＢＳＹＬと対になる場合が多い。その蛍光は環境に感受性である。Ｄａｂｓｙｌ（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）は、緑色のスペクトルを吸収し、フルオレセインとともに使用される場合が多い。それは、励起エネルギーをフルオロフォアから吸収し、エネルギーを熱として放散する物質であるダーククエンチャーである。一方、典型的な（蛍光）クエンチャーは、このエネルギーの多くを光として再放出する。ダーククエンチャーは、分子生物学においてフルオロフォアと併せて使用される。これら２つが接近している場合（例えば分子またはタンパク質の状態で）、フルオロフォアの放出は抑制される。この作用を使用して、分子幾何学および分子運動を研究することができる。
【００１９】
グロボマイシンは、グラム陰性細菌、例えば大腸菌の増殖を阻害する環状ペプチド抗生物質である。例えば、Ｉｎｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３１：４１０−４２０，１９７８を参照されたい。グロボマイシンは、Ｌｓｐを阻害し、ジアシルグリセリルプロリポタンパク質を内膜に蓄積させる。従って、グラム陰性生物は、リポタンパク質に対するムレイン・プロリポタンパク質プロセシングの阻害のためにグロボマイシンに感受性がある。
【００２０】
本明細書において使用する場合、ＩＣ５０とは、酵素活性の最大半量の阻害に達する化合物の濃度をさす。
【００２１】
用語「同一の」または「配列同一性」とは、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、明示された比較ウィンドウにわたる最大一致を求めて整列させた場合に同じである２つの配列中の残基をさす。比較のための配列アライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のアライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索の方法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって（限定されるものではないが、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ；およびＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＴＦＡＳＴＡを含む）実行してよい。アラインメントは、検査および手動アラインメントによって実施される場合も多い。
【００２２】
用語「実質的に同一の」核酸またはアミノ酸配列とは、核酸またはアミノ酸配列が、標準的なパラメータを使用して上記のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して参照配列と比較して、少なくとも９０％以上の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって存在し、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００２３】
細菌リポタンパク質は、それを脂質膜に固定するその脂肪アシル化アミノ末端を特徴とする。細菌リポタンパク質は、細菌において幅広い種類の生物学的機能を有し、例えば、細胞エンベロープ構造の維持（ＬｐｐおよびＰａｌ）、外膜タンパク質の挿入および安定化（ＢａｍＢ）、栄養分および金属の取り込み（ＯｐｐＡおよびＳｉｔＣ）、タンパク質折り畳み（ＰｒｓＡ）、バクテリオシン放出（ＢＲＰ）、ならびに接着および侵入（ＯｓｐＣおよびＬｍｂ）を行う。細菌のプロテオームの２〜３％を構成するリポタンパク質は、細胞質でプロリポタンパク質として合成され、リポタンパク質修飾機構による認識を可能にするリポボックスと呼ばれる保存されたリポタンパク質シグネチャーモチーフを含む。インバリアントシステイン＋１は修飾語の成熟タンパク質の第１のアミノ酸となる；残基−４〜−１は、シグナルペプチドの一部として切断除去される。
【００２４】
リポタンパク質は、３つの膜結合酵素の連続作用によって膜に挿入され、膜で修飾される。最初のステップは、リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ（Ｌｇｔ）に触媒され、これは、保存されたシステイン残基と、膜ホスファチジルグリセロールに由来するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）部分との間のチオエーテル結合の形成を触媒する。これにより、チオエーテル結合ジアシルグリセリル−プロリポタンパク質および副生成物としてグリセロールリン酸塩が形成される。脂質に付着した後、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）は、ジアシル化システイン残基のアミノ末端でジアシルグリセリル−プロリポタンパク質を切断することによってシグナルペプチドを除去し、ＤＡＧ修飾システインを新しく形成されたアポリポタンパク質の新しいＮ末端として残す。第３の酵素、リポタンパク質Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（Ｌｎｔ）は、さらなるアシル基を膜リン脂質から脂質修飾システインの新しく生成されたα−アミノ基に転移させ、完全に成熟したトリアシル化リポタンパク質を生成する。酵素ＬｇｔおよびＬｓｐは、全てのクラスの細菌で保存されているが、Ｌｎｔはグラム陰性細菌と一部のグラム陽性種だけに存在する。３種類の酵素は全て大腸菌およびその他のグラム陰性細菌の生存において重要な役割を果たすことが示されている。対照的に、グラム陽性細菌では、ＬｇｔおよびＬｓｐは、少なくとも一部の試験した放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）［高グアニン＋シトシン（ＧＣ）含量種］において必須であるが、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（低ＧＣ含量種）ではそうではないと思われる。
【００２５】
リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）は、「プロリポタンパク質シグナルペプチダーゼ」、「シグナルペプチダーゼＩＩ」、「プレムレイン−リーダーペプチダーゼ」および「リーダーペプチダーゼＩＩ」とも呼ばれ、プロリポタンパク質の脂質化システイン残基の前に位置するシグナルペプチドを切断する。実例として、大腸菌Ｌｓｐは、４つの膜貫通セグメントをもつ内在性膜タンパク質である。そのＮ末端とＣ末端の両方は、細胞質に面する。大腸菌を含む１９の細菌種のＩＩ型シグナルペプチダーゼで保存された２つのアスパラギン酸残基（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬｓｐのＤ１０２およびＤ１２９）は、枯草菌とＳ．セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の両方のＬｓｐ活性に重要である。これらの２つのアスパラギン酸は、ペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼの触媒二分子として作用する可能性がある。大腸菌Ｌｓｐは、脂質修飾システイン残基のＮ末端のペプチド結合を忠実に切断するが、一部のグラム陽性細菌由来のＬｓｐは、基質に対して特異性が低いか、または異なる認識様式を有することがある。Ｌｓｐの酵素活性は、環状デプシペプチド抗生物質グロボマイシンによって非競合的に阻害することができる。
【００２６】
用語「調節」または「調節すること」とは、別の分子（例えば、Ｌｓｐ酵素）の生物活性、または別の分子（例えば、Ｌｓｐ酵素）に媒介される機能的応答に変化を起こす際の化合物またはその他の作用剤の活性をさす。用語「調節する」とは、標的分子の生物学的または細胞活性（例えば、酵素活性またはシグナル伝達活性）の変化をさす。調節は、上方制御（すなわち活性化または刺激）または下方制御（すなわち、阻害または抑制）であり得る。例えば、調節は、標的酵素（例えば、Ｌｓｐ）の触媒活性の低下、または、標的分子の任意のその他の生物学的活性もしくは機能、または標的分子（例えば、基質との酵素の結合）に媒介される細胞活性もしくは免疫活性に変化を引き起こすことがある。作用様式は、直接的、例えば、標的分子との結合によるものであってよい。変化は間接的、例えば、そうでなければ標的分子を調節する別の分子との結合および／または別の分子の（例えば、酵素的）修飾によるものであってもよい。
【００２７】
「精製された」とは、材料（例えば、Ｌｓｐタンパク質またはそのフラグメント）が、それが作製された環境から取り出されていることを意味する。材料は、部分的にまたは実質的に精製されてよく、完全に（１００％）純粋である必要はない。例えば、本発明のＬｓｐタンパク質は、それが組換えによって合成された後に、一部または全ての未反応化学物質、副生成物、細胞残屑およびその他の成分を除去することによって精製されてよい。本明細書において使用する場合、「実質的に精製された」または「実質的に純粋」とは、材料が、その他の物質または成分を少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％含まないことを意味する。
【００２８】
用語「被験体」とは、哺乳動物、特にヒトをさす。それはその他の非ヒト動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ネズミ、ラット、ウサギ、モルモット、サルを包含する。
【００２９】
分子の「変異体」とは、構造および生物活性が分子全体かまたはその断片と実質的に同様の分子をさす。従って、２つの分子が類似した活性を有するならば、たとえ分子の１つの組成または二次、三次、または四次構造が、他方の分子に見出されるそれと同一でないか、またはアミノ酸残基の配列が同一でないとしても、その用語が本明細書において使用されるように、それらは変異体と考えられる。本明細書において使用する場合、機能性変異体または機能性誘導体とは、参照分子のものに類似する生物学的機能（例えば、触媒機能）を共有する参照分子（例えば、Ｌｓｐ酵素）の変異体をさす。
【００３０】
ＩＩＩ．組換えによって産生され、可溶化され、精製されたＬｓｐタンパク質
本発明は、本明細書に記載されるように組換え産生され、精製され、可溶化されたＬｓｐタンパク質を提供する。本明細書において例証されるように、一部の精製されたＬｓｐタンパク質は、界面活性剤で可溶化される。また、本発明では、Ｌｓｐ触媒活性をモニターするためのアッセイ系におけるこれらの機能性Ｌｓｐ酵素の使用が提供される。Ｌｓｐは、様々な細菌、マイコプラズマおよび古細菌種で発現する。これらの種のいずれかに由来するＬｓｐは、本明細書に記載される方法に従って発現させ、精製することができる。一部の好ましい実施形態では、本発明の実践で使用されるＬｓｐは、グラム陽性とグラム陰性の両細菌種を含む細菌に由来する。Ｌｓｐは、多くの細菌種においてよく保存されている。これらには、例えば、大腸菌および、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア属、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種が含まれる。いくつかの細菌種由来のＬｓｐの配列および構造は、当技術分野で全て公知であり特徴づけられている。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３７０８−３７１２，１９８４；Ｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：４６９−４７２，１９９０；Ｒｅｇｌｉｅｒ−Ｐｏｕｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：６３２−６３５，２００３；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１５４３−１５５２，２００４；Ｗｉｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２６：２３３−２３９，１９９５；Ｄｅ  Ｇｒｅｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：１３９９−４０７，２００３；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１７３：８０−８４，１９９２を参照されたい。様々なＬｓｐ酵素の構造情報のさらなる説明は、当技術分野でも入手可能である。これらとしては、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）（Ｒｔ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６１４２）、発疹チフスリケッチア（Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）（Ｒｐ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２３５２７１）、Ｒ．ベリイ（Ｒ．ｂｅｌｌｉｉ）（Ｒｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＲＣ０１０００００１）、Ｒ．カナデンシス（Ｒ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）（Ｒｃａｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＦＦ０１０００００１）、痘瘡リケッチア（Ｒ．ａｋａｒｉ）（Ｒａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＦＥ０１０００００１）、Ｒ．コノリイ（Ｒ．ｃｏｎｏｒｉｉ）（Ｒｃ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３１０３）、Ｒ．シビリカ（Ｒ．ｓｉｂｉｒｉｃａ）（Ｒｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢＷ０１０００００１）、Ｒ．リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）（Ｒｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＤＪ０１０００００１）、Ｒ．フェリス（Ｒ．ｆｅｌｉｓ）（Ｒｆ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００７１０９）、および大腸菌（Ｅｃ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００７７６）由来のＬｓｐの配列が挙げられる。これらのＬｓｐ配列またはその実質的に同一の配列のどれでも、本発明において組換えＬｓｐまたは変異体を産生する際に用いることができる。
【００３１】
当技術分野で周知の分子生物学および生化学の一般的技術（例えば、ＰＣＲおよびアフィニティークロマトグラフィー）を、本発明のＬｓｐタンパク質のクローニング、発現および精製で利用することができる。そのような常套的に行われる方法および技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００１）；およびＢｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３）に記載されている。しかし、機能性可溶性のＬｓｐ酵素を発現および精製するためのいくつかの特定のプロトコールが、本発明者によって開発され、本明細書中の実施例において詳細に記載されている。一例として、大腸菌Ｌｓｐを使用し、コロニーＰＣＲによってそのコード配列を最初にクローニングすることによって、全長タンパク質を生成することができる。大腸菌Ｌｓｐコード配列は、本明細書において配列番号３に示される。その後の精製を容易にするために、適切なタグを有する融合タンパク質としてＬｓｐを過剰発現させることができる。大腸菌Ｌｓｐに関して本発明者らが見出したように、Ｎ末端のＨｉｓタグはＬｓｐの発現および精製を大いに促進した。これは、適した発現ベクターおよび宿主細胞株、例えば、ｐＥＴ１９ｂベクターおよび大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）細胞によって容易に実現することができる。本明細書において例証されるＮ末端のＨｉｓタグ以外に、本発明の組換え発現および精製戦略は、タンパク質切断によって同様に切断されることのできるＣ末端のＨｉｓタグも利用することができる。過剰発現の後、細胞を溶解し、適切な作用剤を使用して膜タンパク質を可溶化することができる。一部の特定の界面活性剤、例えばｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）は、精製およびその構造完全性の維持を確実にするために最適なタンパク質の可溶化を可能にすることが見出された。本明細書において例証されるように、Ｎ末端のＨｉｓタグおよび可溶化界面活性剤の使用を含む、本明細書に記載されるタンパク質発現および精製スキームは、アフィニティーカラムおよびゲル濾過クロマトグラフィーによってタンパク質の効率的な精製を可能にする。これは、その酵素活性を保持する、精製され無傷の可溶性膜タンパク質Ｌｓｐも導く。
【００３２】
Ｌｓｐはグラム陽性とグラム陰性の両細菌種で高度に保存されているので、同じ組換え発現および精製スキームを、多様なその他の細菌種由来の可溶性で機能性の組換えＬｓｐタンパク質を得るために容易に適用させることができる。従って、大腸菌Ｌｓｐ酵素に加えて、任意のその他の種由来のＬｓｐタンパク質をｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ１９ｂ）に同様にクローニングし、大腸菌Ｌｓｐについて本明細書に記載されるように精製することができる。実際に、本発明者らは、いくつかのその他の種由来のＬｓｐ酵素もクローニングし、発現させた。例えば、本明細書において実証されるように、大腸菌Ｌｓｐのために開発された同じプロトコールを上手く用いて化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＬｓｐをクローニングし、発現させ、精製した。具体的に言うと、Ｃ末端のＨｉｓ６タグ付き融合物として、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩクローニング部位を介してコード配列（配列番号４）をベクターｐＥＴ２３ｂにクローニングすることによって、化膿連鎖球菌株Ｍ１ＧＡＳのＬｓｐタンパク質を発現させ、精製した。同様に、Ｎ末端のＨｉｓ６タグ付きタンパク質として、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を介してコード配列（配列番号５）をベクターｐＥＴ１９ｂにクローニングすることによって、サーモトガ・マリチマ株ＭＳＢ８由来のＬｓｐを発現させ、精製した。
【００３３】
ＩＶ．可溶化された膜タンパク質のためのアッセイ系およびスクリーニング方法
本発明は、Ｌｓｐについて本明細書中で例証されるように、活性界面活性剤で可溶化された酵素を利用するアッセイ系を提供する。アッセイ系および関連するスクリーニング方法は、多くのその他の膜タンパク質の触媒活性を測定するために、そしてその修飾物質をスクリーニングするために用いることができる。本明細書に記載される細菌リポタンパク質新生に関連する酵素（Ｌｓｐを含む）に加えて、当技術分野で公知の多くのその他の膜酵素も本発明のアッセイ系およびスクリーニング方法に適していることがある。例としては、ヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ（例えば、ホスホリパーゼＡおよびＣ）、コレステロールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、カロテノイドオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、グリコール酸オキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。当技術分野で周知の適切な基質をこれらの酵素に対して使用して、本明細書において例証したＬｓｐのものに類似するアッセイ系およびスクリーニング方法でこれらの酵素の各々を調べることができる。
【００３４】
アッセイ系を得るために、またはスクリーニング方法を実施するために、一般に、Ｌｓｐについて本明細書中で例証されるような活性膜貫通酵素を発現することの可能な発現構築物を最初に生成する。この後に、活性膜貫通酵素を発現構築物から発現させる。発現した膜貫通酵素は、次に、界面活性剤に基づく系で可溶化され、精製される。この系は、活性膜貫通界面活性剤で可溶化された酵素の形成を可能にする。この機能性界面活性剤可溶化酵素は、次に本発明のアッセイ系またはスクリーニング方法で特異的触媒活性を測定するために用いることができる。Ｌｓｐについて本明細書中で実証されるように、アッセイ系は、界面活性剤で可溶化された酵素の触媒活性を測定するために使用することができる。一部の実施形態では、界面活性剤で可溶化された酵素は、酵素の特異的阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングで使用される。本明細書に記載されるように、そのような阻害剤は、様々な候補化合物、例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチドまたはそれらのキメラ型から同定されることができる。本発明の一部の実施形態は、本明細書中で例証されるような界面活性剤で可溶化されたＬｓｐは、抗菌活性を有するＬｓｐの特異的阻害剤についてスクリーニングするために使用される。
【００３５】
実例として、本発明は、Ｌｓｐ触媒活性をモニターするための、本明細書に記載される界面活性剤で可溶化された活性Ｌｓｐ酵素を用いるアッセイ系を提供する。組換え産生され、精製されたＬｓｐタンパク質に加えて、このアッセイ系は、一般に、Ｌｓｐ基質も含み、その基質上の酵素の触媒イベントを検出することのできる手段も含んでよい。基質は、Ｌｓｐの酵素の機能によって認識され、特異的に切断されることのできるあらゆるペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。基質は一般にＬｓｐ切断部位、すなわち脂質化システイン残基を含有する。一部の実施形態では、基質は、切断イベントの検出を可能にする標識部分と結合している。標識部分は、基質からの切断によって変化する蛍光特性を有する分子、または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）化合物の一致したドナー−アクセプター対であり得る。一部の実施形態では、基質切断のモニタリングが蛍光共鳴エネルギー移動を検出することによって実施されるように、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分対はＬｓｐ切断部位の反対側で基質ペプチドと結合している。モニタリングには、蛍光アクセプター部分の励起および／または発光最大値のシフトを検出することが含まれ得、そのシフトは、Ｌｓｐペプチダーゼ活性による基質からの蛍光アクセプター部分の放出に由来する。
【００３６】
一部の実施形態では、Ｌｓｐ触媒活性は、標識された基質ペプチドの切断に由来する蛍光シグナルをモニタリングすることによる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイによって検出され、定量化される。ＦＲＥＴは、ドナーとアクセプターが適した配向および距離（例えば、１０〜１００Åの範囲内）をもつ重なり合った発光／吸収スペクトルを有する場合に、ドナーからのエネルギーがアクセプターに移動する、非放射性プロセスである。当技術分野で公知のどんな蛍光共鳴移動エネルギー対（フルオロフォアと蛍光消光剤）も、Ｌｓｐペプチド基質を標識するために使用することができる。一部の好ましい実施形態では、アッセイ系は、本明細書中で例証されるようなＥＤＡＮＳおよびＤａｂｓｙｌのＦＲＥＴドナー−アクセプター対で標識される基質ペプチド模倣物を利用することができる。この例証される標識に加えて、当技術分野で公知のその他のＦＲＥＴドナー−アクセプター対も本発明の実践で使用されてよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、融合タンパク質の優れたレポーターモジュールとして一般に採用されている自発的蛍光タンパク質である。ＧＦＰの最も重要な特徴は、ＧＦＰの変異体が、ＦＲＥＴのドナーおよびアクセプターとして使用され得る顕著なスペクトル特性を示したことである。蛍光タンパク質の最初の対は、比較的低い量子収率、容易な漂白、および高い自己蛍光バックグラウンドをもつ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）ドナーとＧＦＰアクセプターであった（Ｈｅｉｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３０２：４０８−４２３，１９９９）。改良版として、より長い波長をもつＧＦＰ変異株の対、すなわちシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）と黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が、より良好なＦＲＥＴ効率を有することが示された（例えば、Ｍｉｙａｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：８８２−８８７，１９９７を参照）。その上、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質もクローニングされ、ＹＦＰと対にされて、赤色シフトした励起および発光ピークを作り出した（例えば、Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：２５０２−２５１０，２００１を参照）。本発明の実践で使用されてよいＦＲＥＴドナー−アクセプター対のさらなる例としては、アミノ安息香酸とニトロ−チロシン；７−メトキシ−３−カルバモイル−４−メチルクマリンとジニトロフェノール；または７−ジメチルアミノ−３−カルバモイル−４−メチルクマリンとダブシルが挙げられる。
【００３７】
関連する態様では、本発明は、Ｌｓｐ酵素活性を阻害することの可能な作用剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明によれば、細菌Ｌｓｐの新規な阻害剤は、一般にハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）形式でインビトロで同定される。スクリーニング方法は、上記のアッセイ系を利用する。それは大腸菌Ｌｓｐ（または機能性変異体または断片）などの精製されたＬｓｐ酵素および脂質化タンパク質またはペプチド基質を含み、被験剤または候補化合物の存在下でＬｓｐ触媒活性をモニターする。酵素活性の検出を可能にするために、基質をフルオロフォアおよび蛍光消光剤で標識することができる。Ｌｓｐ切断活性は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいて定量化される。本明細書において例証されるように、Ｌｓｐ酵素は、界面活性剤で可溶化されて、基質タンパク質またはペプチド模倣物での触媒反応を促進する。下に詳述されるスクリーニング方法を実行するための特定のプロトコールに加えて、当技術分野で周知の様々な一般的な生化学および分子生物学の技法またはアッセイを本発明のスクリーニング方法で用いることができる。そのような技法は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｓｅｅｔｈａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１ｓｔ  ｅｄ．，２００１）；Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９０），Ｊａｎｚｅｎ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，２００２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（２００２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００１）；およびＢｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３）に記載されている。
【００３８】
本明細書の実施例３および４に例証されるように、本発明者らが開発したハイスループットスクリーニング形式は、被験剤のライブラリーの各メンバーの存在下で同時にＬｓｐ触媒アッセイを実施することによって、Ｌｓｐ調節剤の同定を可能にする。被験剤の存在下で下方制御されたＬｓｐ触媒活性を検出することにより、有望な、すなわち候補Ｌｓｐ阻害剤を次にこれらの被験剤から得ることができる。候補Ｌｓｐ阻害剤であるとみなされるためには、下方制御されたＬｓｐ活性が、一般に被験化合物のいずれかの不在下で実施したアッセイから得られるベースラインＬｓｐ活性から有意な逸脱を示さなければならない。ベースラインレベルまたは活性からの逸脱は、化合物と実験誤差との間の固有の変動のために、Ｌｓｐ酵素機能に影響を及ぼさないことが公知の対照化合物で一般に観察される範囲から所定のレベルが外れる場合に、有意であるとみなされる。例えば、一部の方法では、逸脱は、所定のレベルが対照化合物のレベルの平均値＋１標準偏差の範囲に含まれない場合に有意であるとみなされ得る。一般に、有意な逸脱は、測定されたレベルとベースラインレベルとの間の差が少なくとも２０％、３０％、または４０％である場合に起こる。好ましくは、この差は少なくとも５０％または６０％である。より好ましくは、この差は少なくとも７０％または８０％よりも大きい。最も好ましくは、この差は少なくとも９０％である。所定の値と、対照化合物の標準的なまたはベースラインの値との間の逸脱の程度も、同定されたヒット化合物の可能性の高い信頼性または阻害機能の指標をもたらす。一部の実施形態では、スクリーニング方法は、スクリーニングアッセイで陽性対照として公知のＬｓｐ阻害剤（例えば、グロボマイシン）をさらに用いて、同定されたヒット化合物の可能性の高い活性を評価することができる。
【００３９】
ヒット化合物が最初のスクリーニングで同定されれば、それらは一般にさらなるスクリーニングまたは機能検証を受けることができる。従って、Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ＢＢＳ−８およびＢＢＳ−２０（図６）およびＣｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１０００２７０７２８−１（図１４および１５）について本明細書中で例証されるように、一部の実施形態では、ヒット化合物は、インビトロでＬｓｐ酵素活性を阻害するその能力を試験されることができる。一部の実施形態では、そのようなインビトロ検証を通過するヒット化合物は、殺菌活性について調べられることができる。これは、化合物との接触が原因で死滅した細胞を検出するのに十分な感受性のあるハイスループットアッセイで実施することができる。一部の実施形態では、候補Ｌｓｐ阻害剤は、グラム陽性とグラム陰性の両細菌種のパネルを使用する周知の殺菌曲線アッセイによって殺菌活性について調べることができる。例えば、Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１８：２９７−３０３，１９７３を参照されたい。一部の実施形態では、細菌の死滅は、適した手段によって１以上の生存力指標を調べることによって検出することができる。生存力指標は、生細胞と死細胞を区別するために、または損傷しているが生きている細胞と損傷を受けておらず生きている細胞を区別するために使用することのできるどんなシグナルでもあり得る。一部の実施形態では、生存力指標は、細胞生存力指標と相関する光信号をモニターすることによって調べられる。例えば、蛍光に基づくアッセイは、細菌の生存力を評価するために使用され得る。これらのアッセイの一部は、生細胞と死細胞を区別するために核酸染色を使用する。アッセイおよび使用された染色の多くは、商業的に入手することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）製ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＢａｃＬｉｇｈｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ＫｉｔおよびＰｒｏｍｅｇａ製ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ）。本発明のＬｓｐ阻害化合物の殺菌活性を調べるためのさらなるアッセイは、当技術分野で、例えば、Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：２４２１−２４３１，１９９７に記載されている。
【００４０】
一部の実施形態では、同定された候補阻害剤は、細菌リポタンパク質新生を触媒するその他の酵素を阻害する能力についてさらにスクリーニングされ得る。例えば、同定された候補Ｌｓｐ阻害剤を、リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ（Ｌｇｔ）の酵素の機能を阻害する能力について試験することができる。あるいは、被験化合物を、Ｌｓｐ阻害機能について調べる前に、最初にＬｇｔ阻害剤についてスクリーニングしてもよい。一部の実施形態では、被験化合物を、ＬｇｔとＬｓｐの両方の阻害活性について同時にスクリーニングしてよい。そのような二重の阻害活性をもつ候補化合物は、殺菌機能についてさらに分析されることができる。一部のその他の実施形態では、最初のスクリーニングで同定された候補Ｌｓｐ阻害化合物を例えば合理的設計によって修飾して、改良されたかまたは望ましい生理化学的または薬学的特性を有する類似体または誘導体化合物を生成することができる。そのような類似体または誘導体化合物は、それから、本明細書に記載される後のスクリーニングまたはさらなる機能試験を受けることがある。
【００４１】
無傷のＬｓｐ分子または無傷のＬｓｐ分子をコードする核酸に加えて、Ｌｓｐ機能性断片（例えば、基質結合ドメインおよび触媒ドメインを有する断片）、類似体、誘導体、または実質的に同一の配列をもつ変異体タンパク質も、本発明のスクリーニング方法で使用することができる。これらのアッセイで用いることのできるＬｓｐ断片は、通常、Ｌｓｐ分子の生物活性（例えば、そのペプチダーゼ活性）の１以上を保持する。上記のように、異なる種由来のＬｓｐは既に配列決定され、酵素の活性部位の描写をはじめとしてよく特徴づけられている。例えば、Ｊｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８１９１−２８１９７，１９９９を参照されたい。そのため、本発明に適したそれらの断片、類似体、誘導体、または融合タンパク質は、当技術分野で周知の方法を用いて容易に得ることができる。例えば、Ｌｓｐの機能性誘導体は、本明細書に記載される組換え産生されたＬｓｐタンパク質から、当業者に公知の従来のタンパク質切断とそれに続く精製手順によって調製することができる。あるいは、機能性誘導体は、その基質結合および酵素活性を保持するＬｓｐの断片だけを発現させることによる、組換えＤＮＡ技術によって産生させることができる。
【００４２】
Ｖ．被験化合物
本発明の方法でスクリーニングされることのできる被験化合物または候補作用剤としては、小分子有機化合物、ポリペプチド、βターンミメティクス、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、オリゴカルバメート、ポリペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せが挙げられる。一部の被験剤は合成分子であるが、その他の被験剤は天然分子である。
【００４３】
被験剤は、合成または天然化合物のライブラリーをはじめとする幅広い種類の供給源から得ることができる。コンビナトリアルライブラリーは、段階的な方法で合成することのできる、多種類の化合物について作製することができる。多くの有機小分子のライブラリーは、薬物スクリーニングのために公的にまたは商業的に利用可能であるか、あるいはアクセス可能である。例としては、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ  ライブラリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＩＨ）、およびＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（マサチューセッツ州ボストン）のいくつかの小分子化合物ライブラリーが挙げられる。そのようなライブラリーは、例えば、当技術分野においてＣａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．２：１７１−１８３，１９９５に記載されるように合成することもできる。小分子化合物の大型のコンビナトリアルライブラリーは、「ＤＮＡにコードされた化学物質ライブラリー」（ＤＥＬ）または「コードされた合成ライブラリー」（ＥＳＬ）法によって構築することもできる。これは、前例のない大きさの小分子化合物のコレクションを合成およびスクリーニングするための技術である。ＤＥＬは、コンビナトリアルケミストリーと分子生物学の分野に橋を架けるために医薬品化学で使用されている。ＤＥＬライブラリーを構築するための詳細な手順は、国際公開第９５／１２６０８号、国際公開第９３／０６１２１号、国際公開第９４／０８０５１号、国際公開第９５／３５５０３号および国際公開第９５／３０６４２号に記載されている。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ方法によっても生成することができる（例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、国際公開第９１／１８９８０号参照）。細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、商業的に入手可能な供給源から得るかまたは当分野で収集することができる。公知の薬理学的作用剤は、定方向もしくはランダム化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などに付して構造類似体を生成することができる。
【００４４】
小分子、ペプチドまたはその他の化合物のコンビナトリアルライブラリーは、完全に無作為化されることができ、どんな位置にも好ましい化合物の基または配列が優先的にまたは定常的に存在しない。あるいは、ライブラリーにバイアスをかける、すなわち一部の有機化合物の基またはペプチド配列内の位置を一定に保持することができる。例えば、一部の例では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、定義されたクラスの中で、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスをかけた（小さいかまたは大きい）残基の中で、架橋のためのシステインの作製、ＳＨ−３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン、あるいはプリンが生じるよう無作為化される。
【００４５】
被験剤は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片であり得る。そのような被験剤は天然源、例えば、細胞または組織溶解液から得ることができる。ポリペプチド作用剤のライブラリーはまた、例えば、商業的に入手可能であるかまたは日常的な方法で生成したｃＤＮＡライブラリーからも作製することができる。被験剤は、ペプチド、例えば、約５〜約３０アミノ酸のペプチドであってもよく、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５が特に好ましい。ペプチドは、天然に存在するタンパク質、ランダムペプチド、または「バイアスをかけた」ランダムペプチドの消化物であり得る。一部の方法では、被験剤はポリペプチドまたはタンパク質である。被験剤は核酸でもあり得る。核酸被験剤は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「バイアスをかけた」ランダム核酸であり得る。例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質について上に記載されるのと同様に使用されることができる。
【００４６】
一部の好ましい方法では、被験剤は、小分子、例えば、分子量がせいぜい約５００または１，０００の分子である。好ましくは、ハイスループットアッセイをそのような小分子をスクリーニングするために適合させて使用する。一部の方法では、上記のような小分子被験剤のコンビナトリアルライブラリーは、本明細書に記載されるアッセイ系によって、Ｌｓｐの小分子修飾物質をスクリーニングするために容易に用いることができる。小分子化合物のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするためのいくらかの一般的なガイダンスは当技術分野でも提供される。例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ  ８：２４０９−２４１４，１９９８；Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：６１−７０，１９９７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５９７−６０３，１９９８；およびＳｉｔｔａｍｐａｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：３８４−９１，１９９７を参照されたい。本発明のハイスループットスクリーニング方法に適した小分子化合物の例となるライブラリーは、下の実施例４に記載される。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明のスクリーニング方法で用いられる被験剤は、既知化合物から生成される類似体または誘導体化合物である。例えば、被験剤は、グロボマイシンの誘導体または類似体であり得る。グロボマイシンはＬｓｐ阻害剤である。グロボマイシンは、数種類のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種から作製され、Ｌｓｐの阻害を通してグラム陰性細菌を阻害するペプチド抗生物質である。グロボマイシン誘導体も、グラム陽性細菌に対して強力な活性を有することが示されている。一部のその他の実施形態では、被験剤は、本明細書において同定される特異的Ｌｓｐ阻害化合物、例えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、またはＣｏｍｐｏｕｎｄ  ０１０００２７０７２８−１などの図１２に示される化合物のいずれかから誘導された類似体であり得る。これらのベース化合物に基づく類似体または誘導体化合物は、下に記載される本開示に従って調製することができる。既知化合物の類似体または誘導体化合物は、一般に、既知化合物と比較して改良された生物学的または薬学的特性をもつ作用剤を同定するためにスクリーニングされる。
【００４８】
特許請求される方法によってスクリーニングされる被験剤のライブラリーは、Ｌｓｐ酵素、それらの断片または類似体の構造研究に基づいて生成することもできる。そのような構造研究は、Ｌｓｐポリペプチドと結合する可能性のより高い被験剤の同定を可能にする。Ｌｓｐポリペプチドの三次元構造は、いくつかの方法、例えば、結晶構造および分子モデリングで研究することができる。ｘ線結晶学を用いてタンパク質構造を研究する方法は文献において周知である。Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ，Ｋ．Ｅ．（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  １９７１），２２１−２３９頁、およびＰｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ＆  Ｄ．Ｃ．Ｃｒｏｔｈｅｒｓ（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  １９７９）を参照されたい。Ｌｓｐポリペプチド構造のコンピュータ・モデリングは、Ｌｓｐ阻害剤をスクリーニングするための被験物質を設計するための別の手段をもたらす。分子モデリングの方法は、文献、例えば、米国特許第５，６１２，８９４号、標題「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ」、および米国特許第５，５８３，９７３号、標題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ」に記載されている。その上、タンパク質構造は、中性子回折法および核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によっても決定することができる。例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｗ．Ｊ．（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  １９７２）、およびＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８６）を参照されたい。
【００４９】
ＶＩ．改良された特性をもつ新規なＬｓｐ阻害剤およびその類似体
Ｌｓｐ触媒活性をモニターし、定量化するための本発明のインビトロアッセイ系により、本発明者らが新規なＬｓｐ阻害化合物を同定することが可能になった。パイロットスクリーニングから同定されたそのような新規なＬｓｐ阻害化合物の２つの例が、３−（４−（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ）−３−（（フルオロスルホニル）オキシ）−１７−ヒドロキシ−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプロパン−１−アミニウム（本明細書中では、別称「ＢＢＳ−８」）および２−（４−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−Ｎ−（（（１Ｒ，４ａＳ，１０ａＲ）−７−イソプロピル−１，４ａ−ジメチル−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロフェナントレン−１−イル）メチル）アセトアミド（本明細書中では、別称「ＢＢＳ−２０」）である。実施例で詳述されるように、スクリーニングから同定されたこれらの２つのヒットを、様々な濃度の化合物を使用してＬｓｐ触媒機能へのそれらの阻害効果を評価することによってインビトロでさらに検証した。本明細書中の実施例４に詳述されるように、さらなる超ハイスループットスクリーニング形式によって、多数のさらなるＬｓｐ阻害化合物が得られた。スクリーニングで同定された活性化合物の中で、一部の化合物の選択的Ｌｓｐ阻害活性を二次アッセイによって確認した（図１２）。これらのさらなるＬｓｐ阻害剤の１つである、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１００００２７０７２８−１は、優れた機能プロフィールおよび構造特性を実証した（図１３）。本明細書において同定されるいくつかのその他のＬｓｐ阻害剤のＬｓｐ阻害活性を図４および１４に示す。本明細書に記載されるように、本発明の特異的Ｌｓｐ阻害化合物、それらの類似体、および機能性誘導体または変異体は、全て抗菌薬または治療薬として使用することができる。
【００５０】
リードＬｓｐ阻害化合物の発見ならびに本明細書に記載されるインビトロＬｓｐアッセイ系の有効性によって、本発明は、改良された特性をもつ既知のＬｓｐ阻害化合物の類似体または誘導体を同定するためのスクリーニング方法を提供する。創薬プロセスの重要なステップは、化学類似体プログラムの基になる、適したリード化学鋳型の選択である。所与分子標的のためのリード化学鋳型を同定するプロセスは、一般に、機能アッセイにおいて多数の化合物（多くの場合１００，０００個超）をスクリーニングし、活性を確認するための二次アッセイで試験するためのいくらかの任意の活性閾値に基づくサブセットを選択し、その後、化学的合成（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）の適合性について残りの活性化合物を評価することを伴う。
【００５１】
本明細書に記載されるＬｓｐ阻害化合物、例えば、図４、６および１４に示される化合物、ならびにその他の公知のＬｓｐ阻害剤（例えば、グロボマイシン）は、改良された生物学的または薬学的特性を有する関連する化合物を探すためのリード化合物をもたらす。例えば、これらの化合物の類似体または誘導体は、Ｌｓｐに対する高い親和性を有するか、良好な阻害プロフィールを有するか、あるいはインビトロまたはインビボでの安定性の向上した化合物を同定するためにスクリーニングされることができる。そのような改良された特性をもつ化合物は、様々な薬学的適用に一層適している。その他の実施形態では、そのような類似体または誘導体化合物は、２回目またはそれ以降の本発明のスクリーニング方法で被験剤として使用することができる。
【００５２】
これらの方法は、一般に、既知Ｌｓｐ阻害剤（例えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＳＲ−０１００００２７０７２８−１、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８またはＢＢＳ−２０）の類似体、誘導体または変異体を合成することを伴う。多くの場合、Ｌｓｐ阻害剤の構造類似体のライブラリーは、スクリーニングのために作製される。次に、機能アッセイを実施して、類似体または変異体が誘導されるリード化合物のものと比較して改良された生物学的特性を有する類似体または誘導体の１つを同定する。一部の実施形態では、類似体はＬｓｐ触媒活性を阻害する能力の向上についてスクリーニングされる。一部の実施形態では、それらは、より良好な薬学的特性、例えば、安定性をもつ化合物を同定するためにアッセイされることができる。
【００５３】
既知のまたは現在記載されるＬｓｐ阻害剤の化学骨格に基礎を置く類似体または誘導体を合成するために、当業者に周知の有機化学の日常的に行われる方法だけが必要とされる。一部の実施形態では、既知化合物の類似体は、例えば、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９，２００２；およびＨｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：２１０−２１６，２００５に記載されるように一般的な「クリック」化学に従って化合物を修飾することによって生成することができる。実例として、類似体または誘導体化合物を生成するためにＣｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０に行うことのできるいくつかの修飾を図９に示す。一部の実施形態では、既知化合物の化学類似体のコンビナトリアルライブラリーは、上記の方法を用いて作製することができる。様々な化合物の類似体を合成するための例となる方法は、例えば、Ｏｖｅｒｍａｎによる、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−６２，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）；Ｂｒｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．４５：２７７９−８３，１９８６；Ｂｅｎ−Ｍｅｎａｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５４：２７１−８８，１９９９；Ｓｃｈｒａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６９３−７２０，１９９８；Ｂｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：５７−６６，１９９５；Ｋａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．７：４４−６６，１９８６；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｃｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；（１９９４）；およびＳｃｈｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８０）に記載されている。
【００５４】
その上、日常的に行われるアッセイのいずれか（例えば、結合実験）を用いてＬｓｐ阻害剤の類似体または誘導体において改良された特性（例えば、Ｌｓｐに対する結合親和性または阻害プロフィールの向上）を同定することができる。用いることのできるさらなる生化学的または薬学的アッセイも周知であり、当技術分野で日常的に行われている。例えば、類似体化合物の改良された安定性は、例えば、Ｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．１１：４６９−７６，２００８；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０）に記載される方法などを用いてアッセイすることができる。
【００５５】
ＶＩＩ．治療適用
Ｌｓｐ阻害剤についての本発明のＨＴＳアッセイは、グラム陽性およびグラム陰性の生物に対して強力な殺菌活性をもつ新規な抗生剤の同定を可能にする。実際に、本明細書中で例証されるＣｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０のような非競合的機構によってＬｓｐを阻害することが示された、天然に存在する環状ペプチドグロボマイシンは、殺菌性である。従って、本明細書に記載される特異的Ｌｓｐ阻害化合物（例えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−８、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＢＢＳ−２０、または図１２に示される化合物のいずれか、例えばＣｏｍｐｏｕｎｄ  ０１０００２７０７２８−１など）、ならびにそれらの類似体または機能性変異体（例えば、図９に示される化合物）は、様々な治療適用で使用されることができる。一部の実施形態では、これらの化合物を用いて、微生物細胞（例えば、細菌）中でＬｓｐ触媒活性を阻害するか、または微生物の増殖を阻害することができる。微生物細胞は、インビトロかまたは（被験体の）インビボに存在してよい。一部の実施形態では、本発明は、様々な被験体において細菌感染症を治療するための方法、ならびに微生物感染に起因するかそれに媒介される疾患および状態を治療するための方法を提供する。本発明の一部の実施形態は、細菌感染症に関連するかまたはそれに付随する疾患を治療するための方法に向けられる。
【００５６】
本発明のＬｓｐ調節化合物による治療に従う疾患または状態は、被験体、特にヒト被験体の、Ｌｓｐ酵素を発現する任意の細菌またはその他の微生物（例えば、ブドウ球菌属の種またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種）による感染を含む。細菌感染症に起因するかまたは付随するヒト疾患の具体例としては、例えば、結核（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に起因）、肺炎（連鎖球菌属およびシュードモナス属に起因）、胃炎および潰瘍（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に起因）、食物由来の疾病（大腸菌、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの細菌に起因）、淋病（淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に起因）、髄膜炎（ナイセリア・メニンジチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）に起因）、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒、およびハンセン病が挙げられる。
【００５７】
Ｌｓｐ阻害化合物は、病原性細菌の保菌者である被験体を治療するために有用である。これらの化合物は、活動性細菌感染症と診断されている被験体を治療するために使用することができる。これらの化合物は、そのような被験体における細菌感染症に関連する状態の治療または予防にも有用である。細菌感染症関連疾患（例えば、ループス）に罹っていると診断されていないが、病原性細菌に感染していると思われる被験体、および疾患を発症するリスクがある被験体も、本発明のＬｓｐ阻害化合物による治療を受けることができる。
【００５８】
本発明のＬｓｐ阻害剤は、無菌条件下で治療する被験体に直接投与することができる。化合物は、単独で投与されてもよいし、医薬組成物の有効成分として投与されてもよい。本発明の治療組成物はまた、細菌感染症を治療するためのその他の治療薬（例えば、その他の公知の抗生物質）と組み合わされてもよいし、その他の治療薬を伴って使用されてもよい。一部の適用では、１種類のＬｓｐ阻害剤を個別に使用した場合に達成できない、より広範な程度まで細菌感染症を阻害するために、第１のＬｓｐ阻害剤は、第２のＬｓｐ阻害剤と組み合わせて使用される。一部のその他の適用では、本発明のＬｓｐ調節化合物は、ペニシリンなどの公知の抗生剤と組み合わせて使用されることがある。
【００５９】
本発明は、本明細書に記載される特異的Ｌｓｐ阻害剤またはそれらの機能性誘導体から導かれる医薬組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、一般に少なくとも１つのＬｓｐ特異的阻害剤を有効成分として含む。この組成物は、その１以上の許容され得る担体または賦形剤も含んでよい。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物の有効成分は、本明細書に記載されるＬｓｐ阻害化合物からなるか、またはそれから本質的になる。薬学的に許容され得る担体は、組成物を向上または安定化させるか、あるいは組成物の調製を促進する。薬学的に許容され得る担体は、一部分、投与される特定の組成物（例えば、核酸、タンパク質、または小分子）によって、ならびに組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。それらは、その他の成分と適合し、被験体に対して傷害性でないという意味において薬学的にも生理学的にも許容され得るべきである。この担体は、投与（例えば、経口、舌下、直腸、鼻腔、静脈、または非経口）に望ましい調製形態に応じて、幅広い種類の形態をとることができる。例えば、Ｌｓｐ阻害化合物は、安定性または薬理学的特性を向上させるために、投与の前にオボアルブミンまたは血清アルブミンなどの担体タンパク質と複合体化することができる。
【００６０】
医薬組成物は、様々な形態、例えば顆粒剤、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル剤、および同類のものに調製することができる。製剤中の治療活性化合物の濃度は、約０．１から１００重量％まで変動することがある。治療用製剤は、薬学分野で周知のあらゆる方法によって調製される。治療用製剤は、治療に使用され得るあらゆる効果的な手段によって送達されることができる。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（１０ｔｈ  ｅｄ．，２００１）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０ｔｈ  ｅｄ．，２００３）；および  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（７ｔｈ  ｅｄ．，１９９９）を参照されたい。
【００６１】
治療用製剤は、便宜に単位剤形で提示され、適した治療用量で投与されることができる。適した治療用量は、最大耐用量を決定するための哺乳類種での臨床研究および安全な投薬量を決定するための正常なヒト被験体での臨床研究などの周知の方法のいずれかによって決定することができる。より高い投薬量が必要とされる可能性のある、ある特定の状況下を除いて、Ｌｓｐ阻害化合物の好ましい投薬量は、一般に１日あたり約０．００１〜約１０００ｍｇの範囲内、さらに一般に約０．０１〜約５００ｍｇである。
【００６２】
Ｌｓｐ阻害剤の好ましい投薬量および投与様式は、治療にあたる医師が個々に検討することのできる要素、例えば治療する１または複数の状態、投与される組成物（特定のＬｓｐ阻害剤を含む）の選択、個々の被験体の年齢、体重、および応答、被験体の症状の重症度、ならびに選択された投与経路などに応じて、異なる被験体に対して変わり得る。一般に、投与されるＬｓｐ阻害剤の量は、被験体の状態を効果的にかつ確実に防ぐかまたは最小に抑える最小投薬量である。そのため、上の投薬量の範囲は、本明細書中の教示についての一般的なガイダンスおよびサポートを提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６３】
［実施例］
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、本発明を制限するために提供されるものではない。
【００６４】
［実施例１］：リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ）の発現および精製
本発明者らは、組換え産生され、可溶化された機能性Ｌｓｐ酵素を得るための戦略を開発した。全長大腸菌Ｌｓｐクローンを、順方向プライマーＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧ（配列番号１）および逆方向プライマーＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号２）を用いる大腸菌Ｋ１２のコロニーＰＣＲを用いて生成し、二本鎖プラスミド配列決定によって検証した。次に、本発明者らは、Ｌｓｐタンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）中でｐＥＴ１９ｂベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ）とのＮ末端Ｈｉｓ９タグ付き融合物として過剰発現させた。具体的に言うと、細胞を、３７℃の１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した２ｘＹＴ培地でＯＤ６００ｎｍが０．６になるまで増殖させた。次にフラスコを１６℃に移行させ、タンパク質発現を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで一晩誘導した。細胞を回収し、氷冷溶解緩衝液（１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加したＰＢＳ、５％  ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）に再懸濁し、微小流動化（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）による２サイクルの溶解に付した。
【００６５】
膜タンパク質を可溶化するために、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を添加して、０．８％  ｗ／ｖの最終濃度を得、溶解液を４℃で２時間撹拌した。溶出緩衝液（ＰＢＳ、５％  グリセロール、０．１％  ＤＤＭ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を添加して最終イミダゾール濃度を２０ｍＭとした。次に、解明されていない溶解液を１ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  ｃｒｕｄｅ  Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥ）に装入した。カラムを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、５％グリセロール、０．１％  ＤＤＭ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で予備平衡化し、２０カラム容量を上回る直線勾配で溶出した。溶出したタンパク質を直ちにＰＢＳ、５％グリセロール、０．１％  ＤＤＭ、ｐＨ７．４でゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ）にかけた。Ｌｓｐを含有する画分にグリセロールを添加して最終濃度を２０％とし、液体窒素で凍らせ、−８０℃で貯蔵した。純粋なＬｓｐ収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価して、約１ｍｇ／Ｌ培養液で純度＞９５％であると本発明者らは判断した。
【００６６】
このタンパク質はグラム陽性とグラム陰性の両方の種で高度に保存されているので、大腸菌Ｌｓｐに加えて、本発明者らは多様な細菌種由来のＬｓｐもクローニングし、発現させた。大腸菌Ｌｓｐのために開発した同じ戦略を用いて、本発明者らは、化膿連鎖球菌およびサーモトガ・マリチマ由来のＬｓｐをクローニングし、発現させ、精製した。結果は、全てのＬｓｐタンパク質が、種に関わらず、ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ１９ｂ）に同様にクローニングされ、大腸菌Ｌｓｐについて記載されるように精製され得ることを示す。
【００６７】
［実施例２］Ｌｓｐ  ＦＲＥＴ基質の合成
Ｌｓｐ  ＦＲＥＴペプチド基質配列Ｄａｂｓｙｌ−ＶＴＧＣ（（Ｒ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）ＡＫＤ（ＥＤＡＮＳ）（図１）は、化膿連鎖球菌（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２６９８７４）由来の推定酸性ホスファターゼのリポボックス領域に基づいた。この配列は、既知リポタンパク質配列または共通のリポボックス残基の並べ替えに基づく、様々な長さのリポタンパク質模倣ペプチドのライブラリーからの組換え精製大腸菌Ｌｓｐを用いるアッセイにおいて最大シグナル対バックグラウンドを得るために選択された。ペプチドは、ＦＲＥＴ蛍光ドナーとアクセプターの対、ＥＤＡＮＳ／Ｄａｂｓｙｌを使用して、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  樹脂（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で標準的なＦｍｏｃ固相合成化学を用いて合成された。具体的に言うと、Ｆｍｏｃ−（Ｒ）−Ｃｙｓ（（Ｒ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−ＯＨを、Ｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）４８，５８９−６０３，１９９５に従って、純粋なジアステレオマーとして調製した。ペプチドカップリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、３当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、３当量のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、および６等量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を室温で１時間使用して実施し、脱保護は、ＤＭＦ中、２０％  ｖ／ｖピロリジンを１５分間使用して実施した。ＥＤＡＮＳは、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−ＯＨによって導入し、Ｄａｂｓｙｌは、３等量のダブシルクロライドおよび６等量のＤＩＰＥＡで一晩の反応によって導入した。
【００６８】
ペプチド合成が終了した後、室温で２時間、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、および水（９５％、２．５％、２．５％  ｖ／ｖ／ｖ）のカクテルによって、基質を樹脂から遊離させた。粗基質は、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ）およびメタノール／ジクロロメタン移動相を１５〜１００％メタノールの直線勾配で使用する、順相ＨＰＬＣによって精製した。Ｄａｂｓｙｌ−ＶＴＧＣ（（Ｒ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）ＡＫＤ（ＥＤＡＮＳ）の最終純度は、９５％（ＨＰＬＣ）を上回り、質量分析によって検証した：予測値  ｍ／ｚ  １７７６．９６、ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １７７７．９７（Ｍ＋Ｈ−）および８８９．９９（Ｍ＋２Ｈ−）。アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、５％グリセロール、０．５％  ＤＤＭ  ｐＨ７．４）中の４００ｎＭの精製されたＬｓｐによるペプチドの加水分解についてのミカエリス−メンテン反応速度測定値は、ＫＭ＝２０±５μＭとなり、１００μＭを超える見かけの基質阻害は明白である。
【００６９】
Ｌｓｐ活性をアッセイするためのＦＲＥＴ基質において、本発明者らは、特定のペプチドを、脂質化（ｌａｐｉｄａｔｅｄ）Ｃｙｓ残基を含むどんなペプチド配列とも置き換えることができる。例えば、本発明者らは、ブラウンのリポタンパク質、ならびに図１の特定のペプチドの例のいくつかの異なる長さおよびアミノ酸置換に基づいてＦＲＥＴ基質を作製した。
【００７０】
［実施例３］Ｌｓｐ阻害剤についてのハイスループットスクリーニング
精製し可溶化したＬｓｐ酵素を用いて、本発明者らは、膜内在性プロテアーゼＬｓｐのためのインビトロハイスループット機能性スクリーニングを開発した。最初に、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ  ライブラリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のスクリーニングを、黒色ポリスチレン製３８４ウェル低容量プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＃７８８０７６）でＢｉｏＲＡＰＴＲ試薬ディスペンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行った。精製したＬｓｐを、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、５％グリセロール、０．５％  ＤＤＭ  ｐＨ７．４）中５００ｎＭに希釈し、このストック１０μＬを各ウェルに添加した。次に、ライブラリー化合物の２ｍＭストック１００ｎＬを各ウェルに固定し、プレートを暫く遠心した。室温で３０分間のインキュベーションの後、２５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、７５％アッセイ緩衝液中２５０μＭのＬｓｐ  ＦＲＥＴ基質２．５μＬを各ウェルに添加した。プレートを遠心沈殿し、室温で３０分間インキュベートした。水中５００ｍＭ塩化亜鉛を含有する溶液２．５μＬでアッセイをクエンチし、８３ｍＭの最終濃度を得た。この活性測定法の間のＬｓｐの濃度、ＦＲＥＴ基質、およびライブラリー化合物は、それぞれ４００ｎＭ、５０μＭ、および１６μＭであった。アッセイの最終ＤＭＳＯ濃度は５％であり、最大のＬｓｐ活性は５〜１０％のＤＭＳＯで生じる。
【００７１】
触媒シグナルを、ＤＭＳＯだけで固定した全酵素活性として定義し、Ｌｓｐを含まないアッセイ緩衝液に基質を添加することによってバックグラウンドシグナルを測定した。３，２００の化合物の最初のスクリーニング（図２）により、Ｚ｀＝０．７９、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）＝２．１、平均阻害％（μ）＝−４．３２、阻害％の標準偏差（σ）＝２０．８９を得た。μ＋３σのカットオフに対して、ヒット率は０．１５％であった。それよりも大きい１２，８００化合物のスクリーニング（図３）は、Ｚ｀＝０．７４、Ｓ／Ｂ＝２．０、μ＝−３．６６、σ＝１６．９０をもたらした。μ＋３σのカットオフに対して、ヒット率は０．３％であった。最大阻害％でのヒットは、主に既知の非特異的反応性または汎試験干渉性（ｐａｎ−ａｓｓａｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）をもつ化合物からなった（図４。その上、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ実験室化合物のスクリーニング（図５）を、各々の化合物がスクリーニングプレートに三つ組で存在したことを除いて全く同じように実施し、Ｚ｀＝０．８６およびＳ／Ｂ＝２．２を得た。
【００７２】
Ｓｈａｒｐｌｅｓｓライブラリーから、本発明者らはテルペノイド天然物に基づく２つの阻害剤を同定した：ＢＢＳ−８、フルオロスルホン酸頭部（ｗａｒｈｅａｄ）を導入したＡ環水酸基を含むエストラジオール誘導体、およびＢＢＳ−２０、リールアミン（ｌｅｅｌａｍｉｎｅ）誘導体（図６）。本発明者らは、様々な濃度のＢＢＳ−２０の４００ｎＭ精製Ｌｓｐに対する阻害を検証し、ＩＣ５０を１５±４μＭと計算した（図７）。本発明者らは、数種類の固定濃度のＢＢＳ−２０を様々な濃度のＬｓｐ  ＦＲＥＴ基質に対して試験して、阻害の機構を求めた（図８）。ＢＢＳ−２０の濃度を高めていくと酵素の最大初期速度は低下するが、誤差の範囲内の見かけのＫＭは低下せず、ペプチドＬｓｐ阻害剤グロボマイシンと同様の非競合的な様式の阻害が示される。
【００７３】
ＢＢＳ−２０について示されるように、全てのヒットは、本発明者らのインビトロＦＲＥＴ基質切断アッセイを用いて再検証することができる。その上、二次インビトロ検証アッセイを実施することができる。このアッセイは、ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣによる基質切断の検出を伴う。Ｌｓｐと小分子阻害剤の結合速度は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）ならびに等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）での結合イベントに起因する放出熱によって測定することができる。多様な細菌種由来のＬｓｐの結晶構造も調査することができ、それは全ての阻害剤の発見および進歩を助けることになる。さらに、インビトロ検証アッセイを通過する目的の小分子を、グラム陰性およびグラム陽性の細菌のパネルを用いる殺菌曲線アッセイに付して、殺菌剤として使用する有効性を求めることができる。
【００７４】
［実施例４］超ハイスループットスクリーニングおよびＬｓｐ阻害剤の検証アッセイ
本発明者らは、膜内在性プロテアーゼＬｓｐについての本発明者らのインビトロハイスループット機能性スクリーニングをさらに最適化し、１，５３６ウェル形式に小型化した。６４６，２７５のＳｃｒｉｐｐｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＳＤＤＬ）化合物の一次スクリーニングをＴｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｌｏｒｉｄａ（ＴＳＲＩ  ＦＬ）で行った。精製したＬｓｐを、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ＤＤＭ  ｐＨ７．４）中２００ｎＭに希釈し、このストック４μＬを各ウェルに添加した。次に、５０ｎＬのストックＴＳＲＩ  ＦＬライブラリー化合物を各ウェルに固定して最終濃度８．４μＭとし、プレートを暫く遠心した。室温で３０分間のインキュベーションの後、２５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、７５％アッセイ緩衝液中１μＬのＬｓｐ  ＦＲＥＴ基質を各ウェルに添加して、最終基質濃度を２０μＭとした。プレートを遠心沈殿し、室温で６０分間インキュベートした。水中５００ｍＭ塩化亜鉛を含有する溶液１μＬでアッセイをクエンチし、８３ｍＭの最終濃度を得た。アッセイの最終ＤＭＳＯ濃度は５％であり、最大のＬｓｐ活性は５〜１０％のＤＭＳＯで生じる（図１０）。蛍光をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定した（励起３５５ｎｍ；発光４９５ｎｍ）。
【００７５】
生の蛍光アッセイデータをＴＳＲＩ社のデータベースにインポートし、その後Ｓｙｍｙｘソフトウェアを用いて分析した。各化合物の活性は、次の方程式を用いてプレートごとの原則（ｐｅｒ−ｐｌａｔｅ  ｂａｓｉｓ）に基づいて計算した：
【数１】
2018532384.tif 000003
【００７６】
ここで「高コントロール」は、ＬＳＰなし＋ＤＭＳＯを含有するウェルを表し、「低コントロール」は、ＬＳＰ＋ＤＭＳＯを含有するウェルを表し、「データウェル」は、ＬＳＰ＋被験化合物を含有する。このアッセイのＺ’およびシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は、高コントロールウェルと低コントロールウェルを用いて計算する。６４５，２７５のＳＤＤＬ化合物のスクリーニングにより、Ｚ｀＝０．６９±０．０５、および１．３５±０．０５のＳ／Ｂを得た（ｎ＝５１９プレート）。「区間カットオフ」（＝２７．９２％阻害）を使用して、一次アッセイで２，２７１の活性化合物（「ヒット」）を得た。
【００７７】
確認スクリーニングは、一次スクリーニングアッセイと同じ試薬および検出系を使用したが、２，２７１の化合物の各々を１つの濃度（名目上８．４３μＭ）で三つ組で試験した。クエンチ前（ｐｒｅ−ｑｕｅｎｃｈ）カウンタースクリーニングアッセイは、ＬＳＰ一次アッセイと同様の形式であり、同じ試薬および同じ読み出しを用いたが、酵素反応をクエンチした後の化合物を固定した。このカウンタースクリーニングアッセイの「高コントロール」もＬＳＰなし＋ＤＭＳＯであった。「低コントロール」は、ＬＳＰ＋ＤＭＳＯであった。このアッセイを用いて、蛍光測定に影響を及ぼす種々の「オフターゲット」ヒット、例えば蛍光消光剤などを同定した。
【００７８】
ＬＳＰ確認アッセイの成績は、０．７４±０．０２の平均Ｚ’および１．４１±０．０１のＳ／Ｂで優れていた。２７．９２応答％のアッセイカットオフ（一次カットオフ）を用いて、２７．９２％よりも大きい活性をもつ６９８のヒットを確認した。クエンチ前（ｐｒｅ−ｑｕｅｎｃｈ）カウンタースクリーニングアッセイの成績も、０．７３±０．０３の平均Ｚ’および１．３８±０．０１のＳ／Ｂで優れていた。確認アッセイと同じカットオフを使用して、４５５のヒットを見出した。試験した２，２７１の化合物のうち、６９８の化合物がＬＳＰ一次アッセイで活性を確認し、これらのうち３４４が選択的活性を示した、すなわち、それらはクエンチ前（ｐｒｅ−ｑｕｅｎｃｈ）カウンタースクリーニングアッセイで不活性であった。
【００７９】
これらの３４４の化合物を、三つ組の１０点用量反応滴定（３倍希釈）による用量依存的滴定アッセイに付した。ＬＳＰ一次およびクエンチ前（ｐｒｅ−ｑｕｅｎｃｈ）滴定アッセイは、二次アッセイと同じ試薬、プロトコール、および検出系を用いた。ＬＳＰ一次滴定アッセイの成績は、０．７３±０．０３の平均Ｚ’および１．３２±０．０１のＳ／Ｂで優れていた。ＬＳＰクエンチ前（ｐｒｅ−ｑｕｅｎｃｈ）カウンタースクリーニング滴定アッセイの成績も、０．７０±０．０３の平均Ｚ’および１．２９±０．０２のＳ／Ｂで優れていた（図１１）。グロボマイシンを、対照として両方の滴定アッセイに含めた。各被験化合物について、活性パーセントを化合物濃度に対してプロットした。次に、Ｓ字状用量反応曲線を説明する４パラメータ方程式を、Ａｓｓａｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア（Ｓｙｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、調節可能なベースラインに当てはめた。報告されたＩＣ５０値は、Ｙ切片値の５０％活性レベルでＸ切片値について解くことによって、当てはめた曲線から生成した。三つ組の実験から得た代表的な化合物および用量応答曲線とエラーバーを図１２に示す。
【００８０】
本発明者らは、図１３に示すように、ＳＲ−０１０００２７０７２８−１を出発物質から合成した。インビトロ用量反応アッセイは、大腸菌Ｌｓｐで実施し、２．２μＭのＥＣ５０で阻害することが示された。同様の合成および検証アッセイは、図１２のその他の化合物について容易に実施することができる。
【００８１】
＊＊＊
大腸菌Ｌｓｐコード配列（受託番号ＣＡＱ３０５４７；配列番号３）：
ＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＡＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＴＡＴＧＣＧＣＧＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＴＴＴＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＣＧＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＣＴＴＡＣＧＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＴＧＡＴＣＧＡＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＴＣＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡ．
化膿連鎖球菌Ｌｓｐコード配列（受託番号ＡＡＫ３３７５９；配列番号４）：
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＴＡＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＣＴＴＡＣＧＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＴＡＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ．
Ｔ．マリチマＬｓｐコード配列（受託番号ＮＰ＿２２８２７３；配列番号５）：
ＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＧＣＧＴＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＡＣＡＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＡＡＧＣＧＡＧＡＴＡＣＡＣＧＧＡＡＣＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＧＡＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＣＣＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＧＧＡＴＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＧＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＡＴＴＡＡ．
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本明細書に記載される実施例および実施形態は、説明目的のためだけのものであり、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらが本願の精神および範囲ならびに添付される特許請求の範囲に含まれることは当然理解される。本明細書に記載されるものと同様または等価などんな方法および材料も本発明の実践または試験で使用されることができるが、好ましい方法および材料が記載される。
【００８２】
本明細書において引用される全ての刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は、参照によりその全文が、そしてあらゆる目的において、各々が個別にそのように表示されるように、明示的に本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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