(57)【要約】  組換え融合タンパク質は、スパイダーシルクフラグメント及びα５β１インテグリンなどのインテグリンに対する選択性を有する環状RGD細胞結合モチーフを含む。前記融合タンパク質は、細胞足場材料として、及びその細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用である。
2018527404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スピドロイン（ｓｐｉｄｒｏｉｎ）フラグメントと、インテグリンに対する選択性を有する細胞結合モチーフとを含む組換え融合タンパク質であって、前記細胞結合モチーフが、アミノ酸配列
Ｃ１Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｃ２
を含み、
ここで
Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ又はＶであり；
Ｘ３は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ又はＰであり；そして
Ｘ５は、Ｇ、Ａ又はＶであり；そして
Ｃ１及びＣ２は、ジスルフィド結合を介して接続されており；
ここで、前記スピドロインフラグメントは、タンパク質部分ＲＥＰ及びＣＴを含み、
ここで、ＲＥＰは、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ及びＬ（ＧＡ）ｎＧＬからなる群から選択される７０〜３００アミノ酸残基の反復フラグメントであり、
ここで、ｎは２〜１０の整数であり；
各個々のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、０〜３個のアミノ酸残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここでアミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；そして
各個々のＬセグメントは、０〜３０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；そして、
ＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基のフラグメントであり、配列番号３に対して少なくとも７０％の同一性を有する、
組換え融合タンパク質。
【請求項２】
Ｘ２が、Ｇ又はＡである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
Ｘ２が、Ｇである、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
Ｘ３が、Ｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
Ｘ４が、Ｇ又はＰである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
Ｘ４が、Ｐである、請求項５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
Ｘ５が、Ｇ又はＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
Ｘ５が、Ａである、請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
前記細胞結合モチーフが、アミノ酸配列ＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（配列番号１０）を含む、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
前記細胞結合モチーフが、α５β１インテグリンに対する選択性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１】
反復単位として、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質を含むタンパク質ポリマーを含む細胞足場材料。
【請求項１２】
前記タンパク質ポリマーが、フィルム、コーティング、発泡体、繊維及び繊維メッシュからなる群から選択される物理的形態である、請求項１１に記載の細胞足場材料。
【請求項１３】
前記タンパク質ポリマーが、自立型マトリックス（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）の物理的形態である、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の細胞足場材料。
【請求項１４】
細胞の培養方法であって、以下：
−細胞のサンプルを提供する工程；
−前記サンプルを、細胞足場材料に適用する工程；及び
−適用された前記細胞を有する前記細胞足場材料を、細胞培養に適した条件下で維持する工程；
を含み、
ここで
前記細胞足場材料は、タンパク質ポリマーを含み、それは反復構造単位として、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質を含む、
前記方法。
【請求項１５】
前記細胞が、その細胞表面上にα５β１インテグリンを提示しているものであって；ここで、前記組換え融合タンパク質の前記細胞結合モチーフは、α５β１インテグリンに対する選択性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択される、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸配列
Ｃ１Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｃ２
を含む、固定化組換え融合タンパク質の使用であって、
ここで、
Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ又はＶであり；
Ｘ３は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ又はＰであり；そして
Ｘ５は、Ｇ、Ａ又はＶであり；そして
Ｃ１及びＣ２は、ジスルフィド結合を介して接続されており、
それらの細胞表面上にインテグリンを提示する細胞の培養のための、前記使用。
【請求項１８】
細胞表面上にインテグリンを提示する細胞の培養のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質、又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細胞足場材料の使用。
【請求項１９】
前記細胞足場材料又は前記組換えタンパク質の前記細胞結合モチーフが、α５β１インテグリンに対する選択性を有し、ここで前記細胞が、その細胞表面上にα５β１インテグリンを提示している、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記細胞が、骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真核細胞の培養及び組織工学の分野に関する。本発明は新規のタンパク質、タンパク質を含む細胞足場材料、及び細胞新規タンパク質ポリマーを細胞足場材料として用いた細胞培養の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の表現型は、インテグリンの提示により大きく影響を受ける。細胞表面でいくつかの型のインテグリンを発現させることにより、細胞は多くの種類のリガンドと結合することができ、それによって周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からの並列シグナルを解釈する。インビトロで培養された細胞は、しばしば対応するインビボの細胞とは異なる種類のインテグリンパターンを発現する。細胞の元の表現型を保持するため、あるいは、特定の細胞応答（例えば、分化、増殖）を行うためには、インビトロ培養中でもインテグリン結合を可能にすることが重要である。このことは通常、細胞培養プラスチックをラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン又はビトロネクチン、あるいはそれらの模倣体のようなＥＣＭタンパク質でコートして行われる。ＥＣＭコーティングは種々のインテグリンに対するリガンドを提供し、結果として異なる細胞経路を活性化する。しかしながら、いくつかの細胞培養領域では、動物由来の基質なしに、規定のマトリックスで、これを実施する方法を見つけることが望ましい。
【０００３】
ＷＯ２０１１／１２９７５６は、真核細胞培養のための小規模のスパイダーシルク（クモの糸）タンパク質をもとにした方法及び細胞足場材料を開示している。タンパク質は種々の短い（３〜５アミノ酸残基）細胞結合ペプチドを含んでいる。
【０００４】
ＷＯ２０１２／０５５８５４は、小規模のスパイダーシルクタンパク質、及び別の分子への親和性をもたらす３０アミノ酸残基以上の大きな非スピドロインタンパク質フラグメントを含む融合タンパク質からなるポリマーを開示している。融合タンパク質はさらに種々の細胞結合ペプチドを含んでもよい。
【０００５】
ＷＯ２０１５／０３６６１９は小規模のスパイダーシルクタンパク質及びアミノ酸残基ＲＧＤを含む細胞結合ペプチドを含む融合タンパク質からなるポリマーを開示している。融合タンパク質はヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）の培養に有用である。
【０００６】
特定のインテグリンに対する高い親和性及び選択性をもったリガンドを実現するのに、いくつかの方法が試みられてきた。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドを発現するファージライブラリーが選別実験で用いられてきた。しかしながら、そのような実験の結果はファージライブラリーの配列範囲に左右される。さらに溶液中のペプチドによってコートされたインテグリンへの結合の阻害に基づいた選別方法を用いると、細胞接着を促進するエピトープ（抗原決定基）を見逃す可能性がある。細胞と周囲のＥＣＭの間の相互作用はクロストークで、そこでは最初の結合が、リガンドへの親和性に影響するインテグリン活性化及び立体構造変化をもたらす細胞内シグナル伝達を引き起こす。従って、コートされたインテグリンをもった無細胞系は、活性化された形のインテグリンのへの最も高い親和性を有するペプチドを見逃すかもしれない。Ivanov, B. et al., Bioconjugate Chem. 6: 269-277 (1995) and Koivunen E. et al., Biotechnology 13(3): 265-270 (1995) は、種々のＲＧＤ含有ペプチドを開示している。
【０００７】
いくつかのペプチド模倣体及び非ペプチド性小分子が強力で選択性のあるインテグリンリガンドを発見する目的で設計され、合成されてきた。特定のインテグリンに対する合理的な設計は構造が決定されていないために阻害されている。
【０００８】
ほとんどの先行研究では、最終目標は、例えば腫瘍細胞浸潤や不必要な血管新生を妨げる目的で、特定のインテグリン結合の強力な阻害剤を得ることである。これらの場合には、機能性のインテグリン結合は不必要で、むしろ目標は、強力なインテグリンアンタゴニスト（拮抗剤）である可溶性分子である。ＷＯ２０１３／１８５０２７は、インテグリンアンタゴニスト活性（すなわち細胞接着のようなインテグリンの活性を遮断又は低減する活性）を有するヒトフィブロネクチンの可溶性の変異体を開示している。
【０００９】
この分野でのこれらの利点にもかかわらず、特に、種々の細胞の型は異なる足場を好むので、又、創傷治癒のための効率的細胞足場が必要とされるので、いまだにこの分野では新たな細胞足場が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の要約
本発明の目的は、細胞、特に初代細胞の増殖、分化及び細胞の遊走を促進するタンパク質及び細胞足場を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、特に、ケラチノサイトの増殖、分化及び遊走を支援するタンパク質及び細胞足場を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、細胞足場への細胞接着効率を高めることである。
【００１３】
本発明の目的は、特に、接着細胞の早期の付着をもたらすタンパク質及び細胞足場を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明の目的は、インビトロでの接着細胞の効率的な増殖に有用なタンパク質及び細胞足場を提供することである。
【００１５】
さらに、本発明の目的は、インビボで細胞を細胞シートとして、例えば、創傷領域に移植するのに有用なタンパク質及び細胞足場を提供することである。
【００１６】
本発明の目的は、例えば創傷の端（通常、創傷治癒の間にそこから皮膚ケラチノサイトが回復する）から創傷領域内への遊走のために、固有の細胞を効率的に引き込むことができるタンパク質及び細胞足場を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
以下の開示から明らかになるこれらの目的及び他の目的に対して、本発明はアミノ酸配列
Ｃ１Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｃ２
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５はそれぞれシステイン以外の天然アミノ酸残基から独立に選択され、かつ
Ｃ１及びＣ２はジスルフィド結合を介して接続されている］、を含む環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを提供する。この細胞結合モチーフはα５β１インテグリンなどのインテグリンに対して選択性を有する。
【００１８】
意外にも、この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する組換えタンパク質は、その細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用であることが見いだされた。
【００１９】
好ましい細胞は骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択されるが、これらに限定されない。
【００２０】
特定の理論に縛られることを望まないが、本明細書に提示される細胞結合モチーフは、ＲＧＤ配列に隣接してシステインを配置することにより、フィブロネクチンのα５β１特異的なＲＧＤループモチーフを模倣し、分子鎖を折り返しループと類似の型に拘束するジスルフィド架橋を形成すると考えられる。この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、組換えで生産されたスパイダーシルクタンパク質などの細胞結合モチーフを含むタンパク質で作られたマトリックスへの細胞接着効率を高める。
【００２１】
本発明は、ある態様によれば、インテグリン、例えばα５β１インテグリンに対する選択性をもった前記細胞結合モチーフを含む組換えタンパク質を提供する。この組換えタンパク質は、意外にもその細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用である。
【００２２】
本発明は、ある態様によれば、スピドロインフラグメント、及びインテグリン、例えばα５β１インテグリンに対する選択性をもった前記細胞結合モチーフを含む組換え融合タンパク質を提供する。この組換え融合タンパク質は、意外にもその細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用である。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、それぞれのＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｐ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から独立に選択される。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施態様では、それぞれのＸ１及びＸ３は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から独立に選択され；そして、それぞれのＸ２、Ｘ４及びＸ５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から独立に選択される。
【００２５】
本発明の特定の好ましい実施態様では、Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から選択され；Ｘ３はＳ、Ｔ及びＱからなるアミノ酸残基の群から選択され；かつ、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５はそれぞれＧ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｐ及びＮからなるアミノ酸残基の群から独立に選択される。
【００２６】
本発明のいくつかの好ましい実施態様では、Ｘ１はＳ又はＴであり；Ｘ２はＧ、Ａ又はＶであり；好ましくはＧ又はＡであり；より好ましくはＧであり；Ｘ３はＳ又はＴであり；好ましくはＳであり；Ｘ４はＧ、Ａ、Ｖ又はＰであり；好ましくはＧ又はＰであり；より好ましくはＰであり；かつ、Ｘ５はＧ、Ａ又はＶであり；好ましくはＧ又はＡあり；より好ましくはＡである。
【００２７】
本発明の特定の好ましい実施態様では、細胞結合モチーフは、アミノ酸配列ＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（配列番号１０）を含む。
【００２８】
本発明によるさらに好ましい環状ＲＧＤ 細胞結合モチーフは、１位及び１０位が常にＣであり；４位は常にＲであり；５位は常にＧであり；６位は常にＤであり、かつ２〜３位及び７〜９位は決してシステインではないという条件で、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％のＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（配列番号１０）との同一性を提示する。当然のことだが、２〜３位及び７〜９位の中の同一でない位置は上に示したように、自由に選択することができる。
【００２９】
本発明によるいくつかの好ましい融合タンパク質では、細胞結合モチーフは、スピドロインフラグメントにＮ−末端で配置される。
【００３０】
本発明による特定の好ましい融合タンパク質では、スピドロインフラグメントはタンパク質部分ＲＥＰ及びＣＴを含み、ここで、
ＲＥＰは、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ及びＬ（ＧＡ）ｎＧＬからなる群から選択される７０〜３００アミノ酸残基の反復フラグメントであり、
ｎは２〜１０の整数であり；
各個別のＡセグメントは８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０〜３アミノ酸残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり；
各個別のＧセグメントは１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここでアミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；
各個別のＬセグメントは０〜３０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；かつ
ＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基のフラグメントであり、配列番号３に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００３１】
本発明によるいくつかの好ましい融合タンパク質では、スピドロインフラグメントは、配列番号２、又は配列番号１３のアミノ酸残基１８−２７７に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００３２】
更なる態様によれば、本発明は、反復単位として本発明による組換え融合タンパク質を含むタンパク質ポリマーを含む細胞足場材料を提供する。
【００３３】
本発明による細胞足場材料の好ましい実施態様では、タンパク質ポリマーは、フィルム、コーティング、発泡体、繊維及び繊維メッシュからなる群から選択される物理的形態である。
【００３４】
本発明による細胞足場材料の一つの好ましい実施態様では、タンパク質ポリマーは、自立型マトリックス（free-standing matrix）の物理的形態である。
【００３５】
関連する態様によれば、本発明は、
−細胞のサンプルを提供する工程；
−サンプルを、細胞足場材料に適用する工程；及び
−適用された細胞を有する細胞足場材料を、細胞培養に適した条件下で維持する工程を含み、ここで
前記細胞足場材料は、反復構造単位として、本発明による組換え融合タンパク質などの、組換えタンパク質を含むタンパク質ポリマーを含む、細胞の培養方法を提供する。
【００３６】
意外にも、この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含む組換えタンパク質は、その細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用であることが見いだされた。以下に限定されるものではないが、好ましい細胞は、骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択される。
【００３７】
更なる態様によれば、本発明は、本発明による組換え融合タンパク質、本発明による細胞足場材料、又はその細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養のための本発明による組換えタンパク質の使用を提供する。
【００３８】
意外にも、この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含む組換え融合タンパク質などの組換えタンパク質は、その細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用であることが見いだされた。固定化した（すなわち溶液中でない）細胞結合モチーフは、インテグリンの活性化及び細胞結合を促進する。
【００３９】
好ましい細胞は、骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明による方法又は使用の好ましい実施態様では、細胞はその細胞表面にα５β１インテグリンを提示し；かつ、組換え融合タンパク質の細胞結合モチーフはα５β１インテグリンに対して選択性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、フィブロネクチンから誘導した細胞結合モチーフをもつシルクの構築物を示す。
【００４２】
【図２】図２は、ＦＮＣＣシルク（配列番号１３）マトリックスの顕微鏡写真及びＦＴＩＲスペクトルを示す。
【００４３】
【図３−１】図３は、ＷＴシルク（配列番号２）又は、ＲＧＤ（配列番号１６）あるいはＦＮＣＣ（配列番号１３）で機能化されたシルクのフィルムに1時間接着後の内皮細胞（ＥＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びケラチノサイト（ＫＣ）の顕微鏡写真及び被覆密度を示す。
【図３−２】図３は、ＷＴシルク（配列番号２）又は、ＲＧＤ（配列番号１６）あるいはＦＮＣＣ（配列番号１３）で機能化されたシルクのフィルムに1時間接着後の内皮細胞（ＥＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びケラチノサイト（ＫＣ）の顕微鏡写真及び被覆密度を示す。
【００４４】
【図４】図４は、ＦＮＣＣ（配列番号１３），ウシフィブロネクチンで被覆された表面（ＢＦＮ）又は組織培養処理された（ＴＣＴ）細胞プラスチックのいずれかで機能化されたシルクに１時間接着後のケラチノサイト（ＫＣ）の顕微鏡写真及び細胞被覆面積を示す。
【００４５】
【図５】図５は、ＷＴシルク（配列番号２）又はＦＮＣＣ（配列番号１３）、ＦＮＶＳ（配列番号１５）、ＦＮＳＳ（配列番号１４）又はＲＧＤ（配列番号１６）で機能化されたシルクに１時間接着後のケラチノサイト（ＫＣ）の顕微鏡写真及び細胞被覆面積を示す。
【００４６】
【図６】図６は、ＷＴシルク（配列番号２）又はＦＮＣＣ（配列番号１３）、ＦＮＶＳ（配列番号１５）、ＦＮＳＳ（配列番号１４）又はＲＧＤ（配列番号１６）で機能化されたシルクに３時間接着後のケラチノサイト（ＫＣ）の細胞被覆面積及び張線維等級を示す。
【００４７】
【図７】図７は、ＷＴシルク（配列番号２）又はＦＮＣＣ（配列番号１３）、ＦＮＶＳ（配列番号１５）、ＦＮＳＳ（配列番号１４）又はＲＧＤ（配列番号１６）で機能化されたシルクに３時間接着後のケラチノサイト中の接着斑の形成のグラフを示す。
【００４８】
【図８】図８はＷＴシルク（配列番号２）又はＦＮＣＣシルク（配列番号１３）のフィルムに播種されたケラチノサイトのアラマーブルー生死判別試験のグラフを示す。
【００４９】
【図９−１】図９は、スピドロインＣ−末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図９−２】図９は、スピドロインＣ−末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【化１−１】
2018527404.tif 000003
【化１−２】
2018527404.tif 000004
【発明を実施するための形態】
【００５０】
〔発明の詳細な説明〕
組換えで生産されたスパイダーシルク及び多くの他の材料は哺乳類細胞の培養のマトリックスとして有用である。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から誘導された細胞接着モチーフをそれらの材料に組み入れると、細胞表面でのインテグリンとの相互作用により、細胞付着及び増殖を増強する。インテグリンは細胞と周囲の間の物理的結合だけでなく、例えば細胞成長、極性、増殖及び生存を制御するシグナルを調節する。さらに、インテグリンは細胞の「足」として作用するので細胞遊走に対して不可欠である。
【００５１】
最も広く解析されている細胞接着モチーフはフィブロネクチン中に最初に発見されたＲＧＤペプチドである。ＲＧＤモチーフは、又、多くの他の天然のＥＣＭ分子中に、例えばビトロネクチン、フィブリノーゲン中に、さらに、コラーゲンＩ及びいくつかのラミニンα鎖中の両方の隠れた場所で発見されている。α３β１、α５β１、α８β１、αｖβ１、αＩＩｂβ３、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６ａ及びαｖβ８を含む既知のインテグリンの約半分は、ＲＧＤ依存の方法でＥＣＭを結合することが示されている。しかしながら、一般的な細胞接着モチーフとしてのＲＧＤが最初に証明された後、インテグリンは、一般に、短いＲＧＤペプチドよりもタンパク質を含有する大きいＲＧＤに高い親和性で結合することがすぐに明らかになった。結合の好ましい条件は異なるインテグリン間でも変わるようである。
【００５２】
本発明は設計された細胞結合モチーフに基づいている。特定の理論に縛られることを望まないが、本明細書に示される細胞結合モチーフモチーフは、ＲＧＤ配列に隣接するシステインを精確な位置に配置することで、フィブロネクチンのα５β１特異的なＲＧＤループモチーフを模倣し、分子鎖を折り返しループと類似の型に拘束するジスルフィド架橋を形成すると考えられる。この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、組換えで生産されたスパイダーシルクタンパク質又は合成ペプチドなどの細胞結合モチーフを含むタンパク質で作られたマトリックスへの細胞接着効率を高くする。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「環状」は、二つのアミノ酸残基がそれらの側鎖を介して、さらに具体的には二つのシステイン残基間のジスルフィド結合を通じて、共有結合しているペプチドを指す。
【００５４】
本明細書では、環状ＲＧＤ細胞結合モチーフをシステイン結合したループに導入すると、直鎖状ＲＧＤペプチドを加えた時に比べ、材料の細胞接着性能が著しく増強されることが示される。さらに、本明細書に提示される環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは初代細胞の増殖及び初代細胞による遊走の両方を促進する。環状ＲＧＤ細胞結合モチーフ細胞を含有する細胞足場材料で培養されたヒト初代細胞では、直鎖状ＲＧＤペプチドを含有する同じ材料に比べ、付着、拡散、張線維の形成及び接着斑が増加した。
【００５５】
本明細書に提示された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、細胞が単層培養物を容易に形成できる自立型マトリックス、特に、スパイダーシルクを含有するマトリックスにも適している。そのような自立型マトリックスは、細胞シートの移植に有用である。従って、本明細書に提示された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する材料（例えばスパイダーシルク材料）は、接着細胞が効率的に拡張する必要があるインビトロ状況に対しても、細胞が細胞シートとして創傷領域などに移植される必要のあるインビボの状況でも有用である。この結果は、本明細書に提示された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する材料（例えばスパイダーシルク材料）が、創傷の端（通常、創傷治癒の間にそこから皮膚ケラチノサイトがリクルートされる場所）などから創傷領域内への遊走のために、固有の細胞を効率的に引き込むことができることを支持している。本明細書に提示される環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する細胞足場へ細胞結合は、α５β１インテグリンを含み、かつケラチノサイトの増殖及び遊走を支援することが示される。
【００５６】
本発明者は、ＲＧＤモチーフが折り返しループに存在しているフィブロネクチンの細胞結合モチーフを改変するためにＤＮＡ技術を用いた。このことは、ＲＧＤがフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインに塩基として配置されたアミノ酸配列で達成された（図１ｂ）。最初に、フィブロネクチンの折り返しループと同じであるデカペプチド（ＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ；配列番号９）をタンパク質にＮ−末端で導入し、ＦＮＶＳで示される構築物を得た（図１ａ）。特定の理論に縛られることを望まないが、細胞結合モチーフは、バリン及びセリン残基を、空間的に互いに非常に近い、それぞれＲＧＤモチーフの３位前、４位後ろに配置することによってより効果的になると仮定される。本発明者は、それゆえ、これら二つの残基をシステインに変更し（図１ａ、ｃ）、ＲＧＤを含有するモチーフのそれぞれの側に一つのシステインを配置した。システインは空間的に２Å未満しか離れておらず、したがってペプチド鎖をジスルフィド架橋ループ（ＦＮＣＣで示される；配列番号１０）に結合する。対照として、二つのシステインをセリンに変更した変異体（ＦＮＳＳで示される；配列番号１１）も構築した。本発明の発明者は、タンパク質マトリックスに導入されたときの、ヒト由来の初代接着細胞での初期の付着（拡散、張線維形成、接着斑及びインテグリン結合を含む）に関する種々のメカニズムにおける、これらのＦＮモチーフの効果を調べた。環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有するＦＮＣＣ変異体は、参照のＦＮＶＳ及びＦＮＳＳに比べて、細胞結合モチーフを含有するタンパク質で作られたマトリックスへの細胞接着効率を増すことが見いだされた。
【００５７】
Leahy DJ et al., Cell 84(1): 155-164 (1996)によって決定されたフィブロネクチンの９番目及び１０番目のドメインの結晶構造から、空間的に互いに非常に近い、ＲＧＤモチーフのそれぞれ３位前、４位後ろに位置するバリン及びセリン残基は、互いに空間的に極めて近い位置であることが分かる（図１ｃ）。再び、特定の理論に縛られることを望まないが、それゆえ、本明細書に提示される細胞結合モチーフは、ＲＧＤ配列に隣接してシステインを配置することにより、フィブロネクチンのα５β１特異的なＲＧＤループモチーフを模倣し、分子鎖を折り返しループと類似の型に拘束するジスルフィド架橋を形成すると考えられる。結果として、本明細書に提示される細胞結合モチーフはα５β１インテグリンに特に選択的であると結論づけられる。
【００５８】
このように、フィブロネクチンから誘導された細胞結合モチーを持つ関連シルクの構築物を図１に示す。図１ａに、Ｎ−末端に遺伝的に導入された異なるＲＧＤモチーフを持つシルクタンパク質４ＲｅｐＣＴを図示する。図１ａの「ＲＧＤ」は、Widhe M et al., Biomaterials 34(33): 8223-8234 (2013)が用いたペプチドを含有するＲＧＤを指す（配列番号１２）。「ＦＮＶＳ」は、フィブロネクチン由来のデカペプチドを含有するＲＧＤを指す（配列番号９）。「ＦＮＣＣ」は、Ｖ及びＳをＣに交換した同じペプチドを指す（配列番号１０）。「ＦＮＳＳ」は、Ｖ及びＳをＳに交換した同じペプチドを指す（配列番号１１）。図１ｂに、ＲＧＤモチーフを含有する折り返しループを提示するフィブロネクチンの９番目及び１０番目のドメイン（配列番号６０）の構造を示す。図１ｃに、残基Ｖ及びＳをＣに変更したフィブロネクチンから採ったＲＧＤループの構造モデルを示す（出典１ＦＮＦ．ｐｄｂ）
【００５９】
本明細書に提示される細胞結合モチーフは、細胞表面に存在するインテグリン、好ましくは例えば、α５β１インテグリンへの結合に対して選択的である。本発明の文脈において、細胞結合モチーフのその標的インテグリンとの「特異的」又は「選択的」相互作用とは、相互作用が特異的と非特異的相互作用との間、又は選択的と非選択的相互作用との間の差異が有意であるようなものであることを意味する。二つのタンパク質の間の相互作用は解離定数で測定されることがある。解離定数は、二つの分子の間の結合（又は親和性）の強さを表す。典型的には、抗体とその抗原の間の解離定数は１０−７〜１０−１１Ｍである。しかしながら、高選択性は高親和性を必ずしも必要としない。対応する分子に対して低親和性（モル範囲で）の分子は、より高い親和性の分子と同様に特異的である。本発明の場合、特異的又は選択的相互作用とは、一定条件の下で、他のタンパク質又は細胞の存在下で、天然起源の又は処理された生物学的又は生化学的の液体の試料中で標的インテグリン又はそのフラグメントを提示する、特異タンパク質又は細胞型に優先的に結合する特定の方法までを指す。言い換えると、特異性すなわち選択性とは関係タンパク質及び細胞型の間を区別する能力である。特異的及び選択的は本明細書では区別しないで使われることがある。
【００６０】
環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは以下のアミノ酸配列を含むか、以下のアミノ酸配列からなる：Ｃ１Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｃ２
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５はそれぞれシステイン以外の天然アミノ酸残基から独立に選択され、かつ
Ｃ１及びＣ２はジスルフィド結合を介して接続されている］。
【００６１】
好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５はそれぞれ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、Ｐ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から独立に選択される。
【００６２】
より好ましくは、Ｘ１及びＸ３はそれぞれ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から独立に選択され；及び、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５はそれぞれＧ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から独立に選択される。得られた細胞結合モチーフは、細胞結合効率にとって不利になるいかなる帯電した残基あるいはかさ高い残基も含まない。
【００６３】
特に好ましくは：
−Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から選択され；
−Ｘ３はＳ、Ｔ及びＱからなるアミノ酸残基の群から選択され；かつ
−Ｘ２、Ｘ４及びＸ５はそれぞれＧ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｐ及びＮからなるアミノ酸残基の群から独立に選択される。
【００６４】
さらに好ましくは
−Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；
−Ｘ２は、Ｇ、Ａ又はＶ、好ましくはＧ又はＡ、より好ましくはＧであり；
−Ｘ３は、Ｓ又はＴ、好ましくはＳであり；
−Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ又はＰ、好ましくはＧ又はＰ、より好ましくはＰであり；かつ
−Ｘ５は、Ｇ、Ａ又はＶ、好ましくはＧ又はＡ、より好ましくはＡである。
【００６５】
特に好ましい環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、以下のアミノ酸配列を含むか、以下のアミノ酸配列からなる：ＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（ＦＮＣＣ；配列番号１０）。
【００６６】
本発明によるさらに好ましい環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、１位及び１０位が常にＣであり、４位は常にＲであり、５位は常にＧであり、６位は常にＤであり、かつ２〜３位及び７〜９位は決してシステインではないという条件で、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％のＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（ＦＮＣＣ；配列番号１０）との同一性を示す。当然のことだが、２〜３位及び７〜９位の中の同一でない位置は上に示したように、自由に選択することができる。
【００６７】
このようにして同定された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフはいかなる組換え又は合成タンパク質又はペプチドにも有用であり、インテグリン、特にα５β１インテグリンへの特異的結合をもたらす。このようにして、α５β１インテグリンなどのインテグリンに対する選択性をもつ細胞結合モチーフを含む組換えタンパク質が提供される。組換えタンパク質は、インテグリン、特にα５β１インテグリンをその細胞表面に提示する細胞、例えば、哺乳類細胞の培養に有用である。
【００６８】
好ましい細胞は骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択されるが、これらに限定されない。
【００６９】
フィブロネクチンは、インテグリンファミリーの少なくとも１０個の細胞表面受容体によって認識される。それらのうちの５個（α３β１、α４β１、α５β１、α８β１、αｖβ１）はβ１サブユニットを含む。α５サブユニットは、β１サブユニットとの組み合わせのみが見いだされており、α５β１インテグリンはフィブロネクチンの結合のみに特化されているのでユニークであり、それゆえに最初にフィブロネクチン受容体と表された。α５β１とフィブロネクチンの間の特異的相互作用は、α５β１又はフィブロネクチンのいずれかが欠如すると早期に胚性致死をもたらすので脊椎動物の成長に基本的なものであるように思われる。フィブロネクチン及びα５β１は、又、気道上皮の創傷の修復過程にとって重要であることが示されている。ここで、両者は創傷領域内で遊走細胞によってもっぱら発現し、インビトロでの内皮細胞の遊走及びインビボでの血管新生において重要な役割を演じていることが観察されている。
【００７０】
インテグリン、例えば、α５β１インテグリンに対して選択性を有する細胞結合モチーフを含む組換え又は合成のタンパク質又はペプチドを提供する。ここで、細胞結合モチーフは上に示した通りである。
【００７１】
好ましい組換えタンパク質は、インテグリン、例えばα５β１インテグリンに対して選択性を有する細胞結合モチーフを含む。ここで、細胞結合モチーフはアミノ酸配列
Ｃ１Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｃ２
［式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ及びＱからなるアミノ酸残基の群から選択され；
Ｘ３はＳ、Ｔ及びＱからなるアミノ酸残基の群から選択され；かつ
Ｘ２、Ｘ４及びＸ５はそれぞれＧ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｐ及びＮからなるアミノ酸残基の群から独立に選択され、かつ
Ｃ１及びＣ２はジスルフィド結合を介して接続されている］、を含む。
【００７２】
細胞結合モチーフの好ましい実施態様を本明細書に提示する。特に好ましくは：
Ｘ１は、Ｓ又はＴ、好ましくはＴであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ又はＶ、好ましくはＧ又はＡ、好ましくはＧであり；
Ｘ３は、Ｓ又はＴ、好ましくはＳであり；
Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ又はＰ、好ましくはＧ又はＰ、より好ましくはＰであり；
Ｘ５は、Ｇ、Ａ又はＶ、好ましくはＧ又はＡ、より好ましくはＡである。
【００７３】
好ましい特定の細胞結合モチーフは、アミノ酸配列ＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（ＦＮＣＣ；配列番号１０）を含む。
【００７４】
組換えタンパク質は細胞足場材料で有用である。それは、細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養、特にその細胞表面にα５β１インテグリンを提示している細胞の培養に有用である。
【００７５】
好ましい細胞は骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択されるが、これらに限定されない。
【００７６】
組換え又は合成タンパク質は、例えば１０〜５０個、又は１０〜３０アミノ酸残基を含有する細胞結合モチーフを含む、又はそれらからなる短いペプチドによって構成されてもよい。これらのペプチドは、当業者に知られているように、表面に化学的に結合又は固定化される。有利に、ペプチドは、細胞結合モチーフにより接近しやすくするスペーサーを含むか、又はスペーサーに結合している。このように固定化した（すなわち溶液中でない）組換えタンパク質は、意外にも、インテグリンをその細胞表面に提示する細胞、特に、細胞がその細胞表面にα５β１インテグリンを提示している細胞の培養に有用である。
【００７７】
細胞結合モチーフは、融合タンパク質の一部として、スパイダーシルクタンパク質、特に、小規模のスパイダーシルクタンパク質と共に存在しているのが好都合である。用語ス「スピドロイン（spidroins）」及び「スパイダーシルクタンパク質」は本記述を通して互換的に用いられ、典型的には「ＭａＳｐ」、又はニワオニグモ（Araneus diadematus）の場合は「ＡＤＦ」と略される、大瓶状腺（major ampullate）スパイダーシルクタンパク質を含む全ての既知のスパイダーシルクタンパク質を含む。これらの大瓶状腺スパイダーシルクタンパク質は一般に１と２の二つの型がある。これらの用語は、さらに、既知のスパイダーシルクタンパク質と高度に同一性及び／又は類似性をもつ非天然タンパク質を含む。
【００７８】
上に述べたように、スピドロインフラグメント及びインテグリン、例えばα５β１インテグリンに対して選択性を持つ細胞結合モチーフを含む組換え融合タンパク質を提供する。スピドロインフラグメントは、好ましくは、タンパク質部分ＲＥＰ及びＣＴを含むか、ＲＥＰ及びＣＴからなり、ここで、
ＲＥＰは、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ及びＬ（ＧＡ）ｎＧＬからなる群から選択される７０〜３００アミノ酸残基の反復フラグメントであり、
ｎは２〜１０の整数であり；
各個別のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、０〜３アミノ酸残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基はＡｌａであり；
各個別のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の少なくとも４０％がＧｌｙであり；かつ
各個別のＬセグメントは、０〜３０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；かつ
ＣＴは、７０〜１２０アミノ酸残基のフラグメントであり、配列番号３に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００７９】
本発明による融合タンパク質は、細胞結合モチーフ中の所望の選択的細胞結合活性、及び、スピドロインフラグメント中の内部固体担持活性の両方を持つ。融合タンパク質の結合活性は、それが構造的に再配置され高分子固体構造を形成したときに保持される。これらのタンパク質構造、又はタンパク質ポリマーは、インテグリン、例えばα５β１インテグリンに対する選択的相互作用活性をもった細胞結合モチーフの高くかつ予測可能な密度をもたらす。このように固定化した細胞結合モチーフはインテグリンの活性化及び細胞結合を促進する。ＲＧＤで機能化されたバイオ材料が異なる細胞応答を刺激する方法は、用いられたＲＧＤモチーフの型だけでなく、結果として得られたリガンドの表面濃度にも影響を受ける。本研究で用いられるある程度小さいシルクタンパク質は、それぞれの分子がＲＧＤモチーフを運ぶ多層（multilayer）へと自己組織化するので、高密度表面の発現が予想される。しかしながら、よりまばらな表面濃度を求める場合は、シルクタンパク質を本明細書に開示された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフと異なる比率で混合するか、混合しないかで、目的とする細胞応答を目指すことにより、任意の表面密度を容易に達成できる。
【００８０】
ＲＧＤを含むように設計されたほとんどのタンパク質では、モチーフはＮ−又はＣ−末端のいずれにも直鎖状の伸長として導入される。したがって、タンパク質の残りの部分は分子鎖の拘束は最小限に抑えられ露出と柔軟性の可能性が高くなる。タンパク質の折り畳みの中に置かれたＲＧＤモチーフを有するいくつかの構築物は、ＲＧＤモチーフの柔軟性を低減するように作製されたが、同時に、露出も低減した。本明細書に開示された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、有利に、Ｎ−又はＣ−末端のいずれにも直鎖状の伸長として存在し、したがって露出可能性が高くなる。同時に、その環状の特性は、柔軟性を制限し、高度に有用な細胞結合特性に寄与すると考えられる。さらに、折り畳まれたタンパク質分子鎖へのペプチドの共有結合性の組み込みは外見上効率的な、α５β１を含むインテグリン媒介の細胞結合に寄与する。
【００８１】
用語「融合タンパク質」は、ここでは、組換え核酸、すなわち、通常は同時には生じない２つ以上の核酸配列を結合して人工的に創られたＤＮＡ又はＲＮＡが発現して作られたタンパク質を指す（遺伝子工学）。本発明による融合タンパク質は、組換えタンパク質であり、それゆえ、それらは天然起源のタンパク質と同一ではない。特に、野生型スピドロインは、上記のような組換え核酸が発現したものではないので、本発明による融合タンパク質ではない。結合した核酸配列は、特定の機能特性を持った、異なるタンパク質、部分的なタンパク質又はポリペプチドをコードする。結果として得られた融合タンパク質、すなわち組換え融合タンパク質は、元のタンパク質、部分的タンパク質又はポリペプチドのそれぞれから誘導される機能特性を持った単一タンパク質である。さらに、本発明による融合タンパク質及び対応する遺伝子はキメラである。すなわち、タンパク質／遺伝子断片は少なくとも２つの異なる種から誘導される。
【００８２】
融合タンパク質は、典型的には１７０〜２０００アミノ酸残基、例えば１７０〜１０００アミノ酸残基、例えば１７０〜６００アミノ酸残基、好ましくは１７０〜５００アミノ酸残基、例えば１７０〜４００アミノ酸残基からなる。スパイダーシルクタンパク質を含有する長いタンパク質フラグメントは、溶解及び高分子化のために強い溶媒を必要とする無定形の凝集体を形成するので、サイズの小さいものが有利である。
【００８３】
融合タンパク質は１つ以上のリンカーペプチド、すなわちＬセグメントを含んでもよい。リンカーペプチド（単数又は複数）は、融合タンパク質の任意の断片の間、例えば、ＲＥＰ及びＣＴ部分の間に、融合タンパク質の両末端、又は、スピドロインフラグメントと細胞結合モチーフの間に配置されてもよい。リンカー（単数又は複数）は、融合タンパク質の機能単位の間にスペーサーを提供してもよいが、しかし、融合タンパク質の同定及び精製のための、例えばＨｉｓ及び／又はＴｒｘタグなどの手がかりを構成してもよい。融合タンパク質が、融合タンパク質の同定及び精製のために２つ以上のリンカー ペプチドを含む場合は、例えば、Ｈｉｓ６−スペーサー−Ｈｉｓ６−のように、区切られていることが望ましい。リンカーは又、シグナルペプチド、例えば、シグナル認識粒子を構成してもよく、それらは融合タンパク質を膜に導き、及び／又は宿主細胞から周囲の培地への融合タンパク質の分泌を引き起こす。融合タンパク質は、そのアミノ酸配列に、リンカー（単数又は複数）及び／又は他の関連部分の開裂及び除去を可能にする開裂部位を含んでもよい。種々の開裂部位、例えば、Ｍｅｔ残基の後のＣＮＢｒ及びＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間のヒドロキシルアミンなどの化学試薬に対する開裂部位、トロンビン又はプロテアーゼ３Ｃなどのプロテアーゼ、及び、インテイン自己スプライシングなどの自己スプライシング配列に対する開裂部位が、当業者に知られている。
【００８４】
スピドロインフラグメント及び細胞結合モチーフは直接又は間接的に互いに結びついている。直接の結合は、リンカーなどの介在する配列なしに部分（moieties）間の直接の共有結合を意味する。間接的結合では、部分が、共有結合によって結びついているが、リンカー及び／又は１つ以上の更なる部分（例えば１−２ＮＴ部分）などの介在する配列が存在することになる。
【００８５】
細胞結合モチーフは融合タンパク質の内部に配置されても、いずれかの末端、すなわち、Ｃ−末端配置又はＮ−末端配置で、配置されてもよい。好ましくは、細胞結合モチーフは融合タンパク質のＮ−末端に配置される。融合ンパク質が、融合タンパク質の同定及び精製のための一つ以上のリンカーペプチド（単数又は複数）、例えばＨｉｓ及び／又はＴｒｘタグ（単数又は複数）を含む場合は、融合タンパク質のＮ−末端に配置されるのが好ましい。
【００８６】
好ましい融合タンパク質は、０〜３０アミノ酸残基、例えば、０〜１０アミノ酸残基のリンカー ペプチドでＲＥＰ部分に結合されて、Ｎ−末端に配置された細胞結合モチーフの形態を有する。任意に、融合タンパク質はＮ−末端又はＣ−末端リンカー ペプチドを有し、それらはＨｉｓタグなどの精製タグ、及び開裂部位を含んでもよい。
【００８７】
この組換えタンパク質は細胞足場材料に有用である。それは、その細胞表面にインテグリンを提示する細胞、特にその細胞表面にα５β１インテグリンを提示する細胞の培養にも有用である。
【００８８】
好ましい細胞は骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択されるがこれらに限定されない。
【００８９】
特定の理論に縛られることを望まないが、細胞結合モチーフは、結果として得られる細胞足場材料の表面に機能的に提示されると考えられる。この細胞足場材料は、本明細書において、意外にも、哺乳類細胞に関して、結合能力で有利であった。実施態様６〜９を参照。
【００９０】
本明細書に提示される環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する細胞足場材料の突出した有効性は、初代細胞の初期付着（０．５〜３時間以内）ですでに明白である。細胞の材料上への強くかつ速い付着は、種々の臨床的応用ではかなり重要であると思われる。臨床的応用では、細胞の現実の環境は最適なものからはかけ離れており、細胞の生存には速い構築が必要である。一つの例は、しばしば細菌の高負荷や壊死を伴う慢性創傷のストレスの多い環境である。ここで、遊走するケラチノサイトは、スパイダーシルク融合タンパク質などの環状ＲＧＤ細胞結合モチーフからなる又はこのモチーフを含む適切に設計されたバイオ材料の支持体から恩恵を受けるかもしれない。また、近接した環境が必然的に、通過する体液、例えば心臓のステント又は移植血管を通過する血液の粘度のような物理的なストレスを伴う臨床的状況においては、内皮細胞が、迅速にかつ確実に、移植組織に付着するのを容易にする材料が、結果が成功するためには、重要であり、したがって、決定的ですらある。
【００９１】
再生医療を対象とした足場は、明らかに、細胞培養の状況よりも厳しい取扱い及び環境にさらされる。それが、環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有するスパイダーシルク材料で観察された安定性の改良に価値がある理由である。野生型のシルクに比較したこの安定性の向上は移植可能な足場、例えば、本明細書に示される自立型フィルムの調製を可能にする。
【００９２】
タンパク質部分ＲＥＰは、アラニンリッチストレッチとグリシンリッチストレッチの間を交互に繰り返す反復特性をもったフラグメントである。ＲＥＰフラグメントは一般に７０を超える、例えば１４０を超え、かつ３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００未満のアミノ酸残基を含み、かつ、下記により詳細に述べるように、それ自身をいくつかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント及びＧ（グリシンリッチ）セグメントに分割できる。典型的には、前記リンカーセグメントは任意であり、ＲＥＰフラグメントの末端に位置し、一方、残りのセグメントは順にアラニンリッチ及びグリシンリッチである。従って、ＲＥＰフラグメントは一般に以下の構造のいずれかを有することができ、ここでｎは整数である：
Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ａ６Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｌ；又は
Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ、例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｇ６Ｌ。
【００９３】
従ってアラニンリッチセグメント又はグリシンリッチセグメントがＮ−末端又はＣ−末端のリンカーセグメントに隣接しているかどうかは重要ではないということになる。ｎは２〜１０の整数であることが好ましく、好ましくは２〜８、好ましくは４〜８、より好ましくは４〜６、すなわち、ｎ＝４、ｎ＝５又はｎ＝６である。
【００９４】
いくつかの実施態様では、ＲＥＰフラグメントのアラニン含有量は２０％より大きく、好ましくは２５％より大きく、より好ましくは３０％より大きく、かつ５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満である。アラニン含有量が高いほど、より硬い、及び／又はより強い、及び／又はより少ない伸長可能な繊維になると考えられる。
【００９５】
特定の実施態様では、ＲＥＰフラグメントはプロリン残基を欠いている、すなわち、ＲＥＰフラグメントにはＰｒｏ残基がない。
【００９６】
次にＲＥＰフラグメントを構成するセグメントを見てみると、それぞれのセグメントは個別であること、すなわち、特定のＲＥＰフラグメントの任意の２つのＡセグメント、任意の２つのＧセグメント又は任意の２つのＬセグメント同一であってもよいし、同一でなくてもよいことを強調しておく。従って、それぞれのセグメントの型が特定のＲＥＰフラグメント内で同一であるということはスピドロインの一般的な特徴ではない。むしろ、以下の開示では、個別のセグメントをどのように設計し、それらを細胞足場材料に有用な機能性スパイダーシルクタンパク質の一部であるＲＥＰフラグメントにまとめるかの指針を当業者に提供するものである。
【００９７】
各個別のＡセグメントは、８〜１８アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。好ましくは、各個別のＡセグメントは１３〜１５アミノ酸残基を含む。Ａセグメントの大部分又は３つ以上は、１３〜１５のアミノ酸残基を含み、かつＡセグメントの少数部分、例えば１つ又は２つは８〜１８、例えば、８〜１２又は１６〜１８アミノ酸残基を含むことも可能である。これらのアミノ酸残基の圧倒的多数はアラニン残基である。より具体的には、アミノ酸残基の０〜３個がアラニン残基ではなく、残りのアミノ酸残基はアラニン残基である。従って、各個別のＡセグメントの全てのアミノ酸残基は、除外することなく、又は、１個、２個又は３個のアミノ酸残基が任意のアミノ酸であってもよい例外を除き、アラニン残基である。好ましくは、アラニンを置換するアミノ酸は天然アミノ酸、好ましくはセリン、グルタミン酸、システイン及びグリシンからなる群から個別に選択され、より好ましくはセリンである。もちろん、１つ以上のＡセグメントがすべてアラニンセグメントであり、一方、残りのＡセグメントが１〜３個の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン又はグリシンを含むことは可能である。
【００９８】
一実施態様では、各Ａセグメントは、１０〜１５のアラニン残基及び０〜３の上記の非アラニン残基を含む１３〜１５のアミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様では、各Ａセグメントは１２〜１５のアラニン残基及び０〜１つの上記の非アラニン残基を含む１３〜１５のアミノ酸残基を含む。
【００９９】
各個々のＡセグメントは、配列番号５のアミノ酸残基７−１９、４３−５６、７１−８３、１０７−１２０、１３５−１４７、１７１−１８３、１９８−２１１、２３５−２４８、２６６−２７９、２９４−３０６、３３０−３４２、３５７−３７０、３９４−４０６、４２１−４３４、４５８−４７０、４８９−５０２、５１７−５２９、５５３−５６６、５８１−５９４、６１８−６３０、６４８−６６１、６７６−６８８、７１２−７２５、７４０−７５２、７７６−７８９、８０４−８１６、８４０−８５３、８６８−８８０、９０４−９１７、９３２−９４５、９６９−９８１、９９９−１０１３、１０２８−１０４２及び１０６０−１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有することが望ましい。この群の各配列は、ユープロステノプスオーストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質の天然起源の配列のセグメントに対応し、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される（WO2007/078239参照）。代わりに、各個別のＡセグメントは配列番号２のアミノ酸残基２５−３６、５５−６９、８４−９８、１１６−１２９及び１４９−１５８の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列はタンパク質が適切な条件下でシルク繊維を形成する可能性を有する発現した非天然のスパイダーシルクタンパク質のセグメントに対応する。従って、スピドロインの特定の実施態様では、各個別のＡセグメントは、上記アミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列と同一である。特定の理論に縛られることを望まないが、本発明によるＡセグメントはらせん構造又はベータシートを形成すると予想される。
【０１００】
さらに、各個別のＧセグメントは、１２〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であることが、実験データから結論付けられている。各個別のＧセグメントは１４〜２３アミノ酸残基からなることが好ましい。各Ｇセグメントのアミノ酸残基の少なくとも４０％はグリシン残基である。典型的には、各個別のＧセグメントのグリシン含有量は４０〜６０％の範囲である。
【０１０１】
各個別のＧセグメントは、配列番号５のアミノ酸残基２０−４２、５７−７０、８４−１０６、１２１−１３４、１４８−１７０、１８４−１９７、２１２−２３４、２４９−２６５、２８０−２９３、３０７−３２９、３４３−３５６、３７１−３９３、４０７−４２０、４３５−４５７、４７１−４８８、５０３−５１６、５３０−５５２、５６７−５８０、５９５−６１７、６３１−６４７、６６２−６７５、６８９−７１１、７２６−７３９、７５３−７７５、７９０−８０３、８１７−８３９、８５４−８６７、８８１−９０３、９１８−９３１、９４６−９６８、９８２−９９８、１０１４−１０２７、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有することが好ましい。この群の各配列は、ユープロステノプスオーストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質の天然起源の配列のセグメントに対応し、対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される（WO2007/078239参照）。代わりに、各個別のＧセグメントは配列番号２のアミノ酸残基１−２４、３７−５４、７０−８３、９９−１１５及び１３０−１４８の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列はタンパク質が適切な条件下でシルク繊維を形成する可能性を有する発現した非天然のスパイダーシルクタンパク質のセグメントに対応する。従って、細胞足場材料中のスピドロインの特定の実施態様では、各個別のＧセグメントは、上記のアミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列と同一である。
特定の実施態様では、各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【０１０２】
Ｇセグメントには３つのサブタイプがある。この分類は、ユープロステノプスオーストラリス（Euprosthenops australis）ＭａＳｐ１タンパク質配列の注意深い解析に基づいており（WO2007/078239参照）、その情報は新規の非天然スパイダーシルクタンパク質の構築において用いられかつ検証されている。
【０１０３】
Ｇセグメントの第一のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列第一のＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡＧＳＳ（配列番号６）により表される。この第一の、そして一般的に最長のＧセグメントサブタイプは、典型的には、２３アミノ酸残基を含むが、わずか１７アミノ酸残基しか含まない場合もあり、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。従って、この第一のＧセグメントサブタイプは、典型的には１７〜２３アミノ酸残基を含むことが好ましいがが、わずか１２個の、又は３０個もの多くのアミノ酸残基を含み得ることが考えられる。特定の理論に縛られることを望まないが、本発明によるＧセグメントはコイル構造又は３１−らせん構造を形成すると予想される。この第一のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列５のアミノ酸残基２０−４２、８４−１０６、１４８−１７０、２１２−２３４、３０７−３２９、３７１−３９３、４３５−４５７、５３０−５５２、５９５−６１７、６８９−７１１、７５３−７７５、８１７−８３９、８８１−９０３、９４６−９６８、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２である。特定の実施態様では、本発明によるこの第一のサブタイプの各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【０１０４】
Ｇセグメントの第ニのサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号７）により表わされる。この第二の、一般には中規模の、Ｇセグメントサブタイプは、典型的には１７アミノ酸残基を含み、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。この第二のＧセグメントサブタイプは、典型的には１４〜２０アミノ酸残基を含むことが好ましいが、わずか１２個又は３０個もの多くのアミノ酸残基を含み得ることが考えられる。特定の理論に縛られることを望まないが、このサブタイプはコイル構造を形成すると予想される。この第二のサブタイプの代表的なＧセグメントは、配列番号５のアミノ酸残基２４９−２６５、４７１−４８８、６３１−６４７及び９８２−９９８である。
【０１０５】
Ｇセグメントの第三のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号８）により表わされる。この第三のＧセグメントサブタイプは、典型的には１４アミノ酸残基を含み、一般的にはＧセグメントサブタイプの中で最も短い。この第三のＧセグメントサブタイプは、典型的には１２〜１７アミノ酸残基を含むことが好ましいが、２３個もの多くのアミノ酸残基を含み得ることが考えられる。特定の理論に縛られることを望まないが、本発明によるＧセグメントはターン構造を形成すると予想される。この第三のサブタイプの代表的なＧセグメントは、配列番号５のアミノ酸残基５７−７０、１２１−１３４、１８４−１９７、２８０−２９３、３４３−３５６、４０７−４２０、５０３−５１６、５６７−５８０、６６２−６７５、７２６−７３９、７９０−８０３、８５４−８６７、９１８−９３１、１０１４−１０２７である。
【０１０６】
従って、細胞足場材料中のスピドロインの好ましい実施態様において、各個別のＧセグメントは、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有する。
【０１０７】
ＲＥＰフラグメントのＡセグメントとＧセグメントの交互配列の一実施態様では、全ての第二のＧセグメントは、第一のサブタイプのものであり、一方、残りのＧセグメントは、第三のサブタイプ、例えば．．．Ａ１ＧｓｈｏｒｔＡ２ＧｌｏｎｇＡ３ＧｓｈｏｒｔＡ４ＧｌｏｎｇＡ５Ｇｓｈｏｒｔ．．．である。ＲＥＰフラグメントの別の実施態様では、第二のサブタイプの一つのＧセグメントが、挿入部、例えば．．．Ａ１ＧｓｈｏｒｔＡ２ＧｌｏｎｇＡ３ＧｍｉｄＡ４ＧｓｈｏｒｔＡ５Ｇｌｏｎｇ．．．を介して、規則的にＧセグメントに割り込む。
【０１０８】
各個別のＬセグメントは任意のリンカーアミノ酸配列を表し、０〜３０個のアミノ酸残基、例えば、０〜２０個のアミノ酸残基を含む。このセグメントは任意であり、かつ、スパイダーシルクタンパク質の機能にとって本質的ではないものの、その存在はなお、繊維、フィルム、発泡体及び他の構造体を形成するスパイダーシルクタンパク質及びそのポリマーにとって十分に機能をもつ。また、ユープロステノプスオーストラリス（Euprosthenops australis）由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号５）に存在するリンカーアミノ酸配列もある。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されたＡセグメント又はＧセグメントの何れかに似ている可能性があるが、通常は、本明細書で定義されるような基準を満たすには十分でない。
【０１０９】
WO2007/078239に示されるように、ＲＥＰフラグメントのＣ−末端部分に配置されたリンカーセグメントは、アラニンの多いアミノ酸一文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳ（配列番号２２）及びＡＳＡＡＳＡＡＡ（配列番号２３）によって表される。事実、第一の配列がこの定義によるＡセグメントに対し高度な同一性を有するのに対して、第二の配列は、本明細書の定義によるＡセグメントであると考えられる。リンカーセグメントの別の例は、アミノ酸一文字コンセンサス配列ＧＳＡＭＧＱＧＳ（配列番号２４）を有し、この配列は、グリシンリッチで、本明細書の定義によるＧセグメントに対し高度な同一性を有する。リンカーセグメントの別の例はＳＡＳＡＧ（配列番号２５）である。
【０１１０】
代表的なＬセグメントは、配列番号５のアミノ酸残基１−６及び１０９３−１１１０；及び配列番号２のアミノ酸残基１５９−１６５であるが、当業者は、これらのセグメントについて多くの適切な代替アミノ酸配列があることを容易に認識するであろう。ＲＥＰフラグメントの一実施態様において、Ｌセグメントの一つは０個のアミノ酸を含む、即ち、Ｌセグメントの一つが欠けている。ＲＥＰフラグメントの別の実施態様では、両方のＬセグメントが０個のア ミノ酸を含む、即ち、両方のＬセグメントが欠けている。従って、本発明によるＲＥＰフラグメントのこれらの 実施態様は、以下のように模式的に表わすことができる；（ＡＧ）ｎＬ、（ＡＧ）ｎＡＬ、（ＧＡ）ｎＬ、（ＧＡ）ｎＧＬ；Ｌ（ＡＧ）ｎ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡ、Ｌ（ＧＡ）ｎ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧ；及び（ＡＧ）ｎ、（ＡＧ）ｎＡ、（ＧＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎＧ。任意のこれらのＲＥＰフラグメントは、以下に定義するＣＴフラグメントに適している。
【０１１１】
細胞足場材料中のスピドロインのＣＴフラグメントは、スパイダーシルクタンパク質のＣ−末端アミノ酸配列に高度の同一性を有している。WO2007/078239に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む様々な種及びスパイダーシルクタンパク質によく保存されている。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のＣ−末端領域のコンセンサス配列は配列番号４として提供される。図９に、以下のＭａＳｐタンパク質を列挙し、あてはまるGenBankの登録エントリーを表示する：
【表１−１】
2018527404.tif 000005
【表１−２】
2018527404.tif 000006
【０１１２】
特定のＣＴフラグメントが細胞足場材料中のスパイダーシルクタンパク質に存在することは重要ではない。従って、ＣＴフラグメントは、図９及び表１に示される任意のアミノ酸配列又は高度の同一性を持つ配列から選択される。多様なＣ−末端配列をスパイダーシルクタンパク質に用いることができる。
【０１１３】
ＣＴフラグメントの配列は、図９のアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列（配列番号４）に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％の同一性、又はさらに少なくとも７０％の同一性を有する。
【０１１４】
代表的ＣＴフラグメントは、ユープロステノプスオーストラリス（Euprosthenops australis）配列（配列番号３）、又は配列番号１３のアミノ酸残基１８０−２７７である。従って、一実施態様では、ＣＴフラグメントは配列番号３、配列番号１３のアミノ酸残基１８０−２７７、又は図９及び表１の任意の個別のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。例えば、ＣＴフラグメントは、配列番号３、配列番号１３のアミノ酸残基１８０−２７７、又は図９及び表１の任意の個別のアミノ酸配列と同一であってもよい。
【０１１５】
ＣＴフラグメントは、典型的には７０〜１２０アミノ酸残基からなる。好ましくは、ＣＴフラグメントは、少なくとも７０、又は８０より多い、好ましくは９０より多いアミノ酸残基を含む。また、好ましくは、ＣＴフラグメントは、多くとも１２０、又は１１０未満のアミノ酸残基を含む。典型的なＣＴフラグメントは約１００アミノ酸残基を含む。
【０１１６】
本発明で用いられる用語「％同一性」は、以下のように計算される。クエリ配列をCLUSTAL Wアルゴリズム(Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994))を使用して、標的配列に対して列挙する。列挙した配列の最短のものに対応するウィンドウに対して比較を行う。各位置のアミノ酸配列を比較し、標的配列において同一の対応を有するクエリ配列における位置の割合を、％同一性として報告する。
【０１１７】
本発明で用いられる用語「％類似性」は、疎水性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓは類似し；塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは類似し；酸性残基ＧｌｕとＡｓｐは類似し；親水性、非荷電残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒは類似していることを例外として、上記の「％同一性」で説明したように計算される。これに関連して、残りの天然アミノ酸Ｇｌｙは他のいずれのアミノ酸にも類似していない。
【０１１８】
この記述を通して、本発明による代替の実施態様では、特定の同一性の割合の代わりに、対応する類似性の割合を用いる。別の代替の実施態様では、各配列に対する同一性の好ましい割合の群から選択された、別のより高い割合の類似性と同様に、特定の同一性の割合を用いる。例えば、配列は別の配列に７０％類似していてもよく；又はそれは別の配列に７０％同一であってもよく；又はそれは別の配列に７０％同一で９０％類似であってもよい。
【０１１９】
本発明による好ましい融合タンパク質では、ＲＥＰ−ＣＴフラグメントは、配列番号２に対して、又は配列番１３のアミノ酸残基１８−２７７に対して、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１２０】
本発明による一つの好ましい融合タンパク質では、タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。特に好ましい実施態様では、本発明による融合タンパク質は配列番号１３である。
【０１２１】
本発明による細胞足場材料は、環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを提示する本発明によるタンパク質又はペプチドを含む。環状ＲＧＤ細胞結合モチーフは、短い合成ペプチド類又は長い合成あるいは組換えタンパク質から露出され、次にマトリックス又は支持体に付着又は結合する。
【０１２２】
細胞足場材料は、好ましくはタンパク質ポリマーを含み、そのタンパク質ポリマーが、次に反復構造単位として、本発明による組換え融合タンパク質を含む。すなわち、タンパク質ポリマーは、本発明による組換え融合タンパク質のポリマーを含むか、このポリマーからなる。このことは、必然的に、タンパク質ポリマーは、正しく並べられた複数の本発明による融合タンパク質、典型的には１００個を優に上回る融合タンパク質単位、例えば、１０００個超の融合タンパク質単位を含むか、それらの融合タンパク質単位からなることになる。好ましい実施態様では、本発明による細胞足場材料はタンパク質ポリマーからなる。
【０１２３】
ポリマー中の融合タンパク質単位の規模は、必然的に、タンパク質ポリマーがかなりの大きさを得ることを意味する。好ましい実施態様では、タンパク質ポリマーは少なくとも二次元で少なくとも０．０１μｍの大きさを有する。従って、本明細書で用いられる用語「タンパク質ポリマー」は、少なくとも０．０１μｍの厚さを有する融合タンパク質ポリマー、好ましくはヒトの肉眼で見える、すなわち少なくとも１μｍの厚さを有する巨視的なポリマーを指す。用語「タンパク質ポリマー」は構造をとらない凝集体又は沈殿物を含まない。融合タンパク質の単量体／二量体が水溶性であるのに対し、当然のことだが、本発明によるタンパク質ポリマーは固体構造である、すなわち水に不溶である。タンパク質ポリマーは本発明による組換え融合タンパク質の単量体を反復構造単位として含んでいる。
【０１２４】
本発明によるタンパク質ポリマーは、典型的には繊維、フィルム、コーティング、発泡体、網、繊維メッシュ、球体及びカプセルからなる群から選択される物理的形態で提供される。一つの実施態様によれば、本発明によるタンパク質ポリマーは、繊維、フィルム又は繊維メッシュであることが好ましい。特定の実施態様によれば、タンパク質ポリマーは発泡体又は繊維メッシュなど三次元形態を有することが好ましい。一つの好ましい実施態様は、タンパク質ポリマーで作られた薄い（典型的には、厚さ０．０１〜０．１μｍ）コーティングを含み、それらはステント及び他の医療用機器のコーティングに有用である。用語「発泡体」は、発泡体の泡が連通したチャネルを持つ多孔質発泡体を含んでおり、時には繊維の三次元の網又はメッシュとみなすことさえもできる範囲まで含んでいる。
【０１２５】
好ましい実施態様では、タンパク質ポリマーは、自立型フィルムなどの自立型マトリックスの物理的形態である。これは高度に有用であり、例えば、細胞シートとして例えば創傷領域に移植されることが必要なインビボの状況で、必要とされる細胞シートの移植を可能にする。
【０１２６】
繊維、フィルム又繊維メッシュは、典型的には少なくとも０．１μｍ、好ましくは少なくとも１μｍの厚さを有する。繊維、フィルム又繊維メッシュは、１〜４００μｍ、好ましくは６０〜１２０μｍの範囲の厚さを有することが望ましい。繊維は、０．５〜３００ｃｍ、好ましくは１〜１００ｃｍの範囲の長さを有することが好ましい。他の好ましい範囲は、０．５〜３０ｃｍ及び１〜２０ｃｍである。繊維は取扱いの間に損傷を受けない状態を保つ性質を有する、すなわち紡糸、織り、撚り、かぎ針編み及び類似の処理に用いることができる。フィルムは、固体構造、例えば、マイクロタイタープレートのプラスチックに、密着し接着する点で有利である。フィルムのこの性質は、洗浄や再生処理を容易にし、分離目的に極めて有用である。
【０１２７】
本発明による融合タンパク質は、環状ＲＧＤ細胞結合モチーフ中の所望の細胞結合活性及びＲＥＰ−ＣＴ断片中の内部固体担持活性の両方を持ち、これらの活性は細胞足場材料に使用される。細胞足場材料は有機標的への選択的相互作用活性の高く予想通りの密度をもたらす。全ての発現されたタンパク質断片は細胞足場材料と結合するので、選択的相互作用活性をもつ有益なタンパク質部分の損失を最小化する。
【０１２８】
本発明による融合タンパク質から形成されるポリマーは固体構造であり、それらの物理的性質に対して有用で、特に高い強度、伸縮性及び軽量性を併せ持つ点で有用である。特に有用な特徴は、融合タンパク質のＲＥＰ−ＣＴ部分が、生化学的に堅固であり、例えば、酸、塩基、又はカオトロピック剤を用いる再生に適しており、又、例えばオートクレーブで１２０℃２０分の加熱殺菌に適していることである。ポリマーは又、細胞接着及び成長を支援する能力でも有用である。
【０１２９】
ＲＥＰ−ＣＴ部分から導かれる特性は、医療用又は産業用の新材料の開発にも魅力的である。特に、本発明による細胞足場材料は、細胞固定、細胞培養、細胞分化、再生医療及び細胞誘導再生のための足場として有用である。それらはまた、クロマトグラフィー、細胞捕獲、選択及び培養、能動フィルタ及び診断などの分取及び分離分析手段に有用である。本発明による細胞足場材料はまた、移植及びステントなどの医療機器として、例えばコーティングとして有用である。
【０１３０】
好ましい実施態様では、細胞足場材料は、反復構造単位としての本発明による組換え融合タンパク質からなるタンパク質ポリマーを含む。また、さらに好ましい実施態様では、細胞足場材料は、反復構造単位としての本発明による組換え融合タンパク質からなるタンパク質ポリマーである。
【０１３１】
更なる態様によれば、本発明は、
細胞のサンプルを提供する工程；
サンプルを、細胞足場材料に適用する工程；及び
適用された細胞を有する細胞足場材料を、細胞培養に適した条件下で維持する工程を含み、
ここで、前記細胞足場材料は、反復構造単位として、本発明による組換え融合タンパク質などの組換えタンパク質を含む、タンパク質ポリマーを含む、細胞の培養方法を提供する。
【０１３２】
好ましい実施態様では、細胞はその細胞表面にα５β１インテグリンを提示し；かつ、組換え融合タンパク質の細胞結合モチーフはα５β１インテグリンに対して選択性を有する。
【０１３３】
好ましい実施態様では、この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する組換えタンパク質は、例えば、固体支持体（すなわち溶液でない）に、例えば、細胞培養機器の表面又は細胞結合及び成長を所望する任意の型の表面に、固定化される。このように固定化された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフが結果として露出すると、意外なことに、インテグリンの活性化及びこの環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する固定化された組換えタンパク質への細胞結合を促進する。
【０１３４】
内部スピドロインフラグメントが、融合タンパク質に要求されたポリマーをもたらし、それにより、固定化された（すなわち溶液でない）細胞結合モチーフへ内部固体支持体を提供するので、この環状ＲＧＤ細胞結合モチーフを含有する組換え融合タンパク質は、特にその細胞表面にインテグリンを提示する細胞の培養に有用であるためである。固定化された環状ＲＧＤ細胞結合モチーフが結果として露出すると、意外なことに、インテグリンの活性化及び組換え融合タンパク質のポリマーへの細胞結合を促進する。
【０１３５】
好ましい細胞は、特にヒト由来の、骨格筋細胞、内皮細胞、幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト及び細胞株から選択されるが、これらに限定されない。
【０１３６】
この方法は、内皮細胞、ヒト間葉系幹細胞及び特にヒト由来のケラチノサイトの培養に有用であるがこれらに限定されない。この方法はケラチノサイトの培養に特に有用である。
【０１３７】
この細胞培養方法は、有利なことにインビトロでもインビボでも実施できる。
【０１３８】
以下に、本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の実施例に限定されない。
【実施例】
【０１３９】
統計データ
一方向ANOVAとそれに続くTukeyの多重比較試験をGraphPad Prism version 6.05 for Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.comを用いて実施した。
【０１４０】
実施例１−フィブロネクチン由来の細胞結合モチーフの組換えスパイダーシルクへの遺伝子組み込み
組換えスパイダーシルクタンパク質４ＲｅｐＣＴ（配列番号２、本明細書ではＷＴと表される）を、フィブロネクチンタイプＩＩＩモジュール１０から、細胞結合モチーフを含有するＲＧＤで、４つのわずかに異なるバージョンに遺伝子学的に機能化した（図１）。１番目（ＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴ；配列番号１３）では、ＲＧＤ配列に配置された二つのアミノ酸をシステインに置換し、モチーフ（ＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ；配列番号１０）のループ形成を可能にした。２番目（ＦＮＳＳ−４ＲｅｐＣＴ；配列番号１４）では、導入されたシステインをセリンに置換し、直鎖状の対照（ＳＴＧＲＧＤＳＰＡＳ；配列番号１１）を創出した。ここで、アミノ酸セリンを選択したが、これはシステインと類似性があるが、ジスルフィド結合を形成する能力がないことによる。３番目（ＦＮＶＳ−４ＲｅｐＣＴ；配列番号１５）では、フィブロネクチンモチーフ（ＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ；配列番号９）の元の配列を直鎖状野生型の対照として用いた。４番目（ＲＧＤ−４ＲｅｐＣＴ；配列番号１６）では、Widhe M et al., Biomaterials 34(33): 8223-8234 (2013)で用いられたＲＧＤ含有ペプチド（配列番号１２）をさらなる直鎖状対照として用いた。
【０１４１】
機能化された変異体（ＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴ、ＤＮＡ−配列番号１７；ＦＮＳＳ−４ＲｅｐＣＴ、ＤＮＡ−配列番号１８；ＦＮＶＳ−４ＲｅｐＣＴ、ＤＮＡ−配列番号１９；及びＲＧＤ−４ＲｅｐＣＴ、ＤＮＡ−配列番号２０）をコード化する遺伝子を、異なるモチーフをベクターコード化４ＲｅｐＣＴ（４ＲｅｐＣＴ、ＤＮＡ−配列番号１）にコード化するオリゴのクローニングにより制限酵素を用いて作製した。新規の配列をＮ−末端で４ＲｅｐＣＴに導入し、塩基配列決定法により確認した。
【０１４２】
実施例２−フィブロネクチン由来細胞結合モチーフを含有する融合タンパク質の発現
実施例１で得られた遺伝子構築物の大腸菌（E. coli）でのタンパク質生産及びそれに続く精製を、基本的にHedhammar M et al., Biochemistry 47(11):3407-3417 (2008)及びHedhammar M et al., Biomacromolecules 11: 953-959 (2010)に記載の通りに実施した。
【０１４３】
簡潔に述べると、標的タンパク質に対する発現ベクターをもつ大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Merck Biosciences）を、カナマイシンを含有するLuria-Bertani培地中３０℃で、ＯＤ６０００．８〜１まで成長させ、次に、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導し、さらに、少なくとも２時間インキュベートした。その後、細胞を採取し、リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼ（DNase）Ｉを添加した２０ｍＭのトリス−HCl（ｐＨ８．０）に再懸濁した。完全に溶解した後、１５，０００ｇで遠心分離した上澄みをＮｉセファロース（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を充填したカラムに投入した。カラムを十分に洗浄した後、結合したタンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出した。標的タンパク質を含有する分画をまとめ、２０ｍＭのトリス−HCl（ｐＨ８．０）に対して透析した。標的タンパク質をタンパク質分解開裂によりタグから外した。外したＨｉｓＴｒｘＨｉｓタグを除去するため、開裂混合物を第２のＮｉセファロースカラムに投入し、流出物を集めた。タンパク質含有量を２８０ｎｍでの吸光度から求めた。
【０１４４】
得られたタンパク質溶液をHedhammar et al., Biomacromolecules 11:953-959 (2010)に記載の通りに、リポ多糖（ｌｐｓ）から精製した。足場（フィルム、発泡体、コーティング又は繊維）の調製に用いる前に、タンパク質溶液を無菌ろ過（０．２２μｍ）した。
【０１４５】
組換えスパイダーシルクタンパク質は、大腸菌（E. coli）中での発現に成功し、元の４ＲｅｐＣＴ（ＷＴ；配列番号２）と同様の収率と純度で精製された。
【０１４６】
実施例３−細胞培養マトリックスの制作
精製後、フィルムを調製する前に、Widhe M et al., Biomaterials 31(36): 9575-9585 (2010)及びWidhe M et al., Biomaterials 34(33): 8223-8234 (2013)に記載の通りに、実施例２で得られたタンパク質溶液を無菌ろ過し（０．２２μｍ）遠心ろ過（Amicon Ultra, Millipore）により濃縮した。
【０１４７】
簡潔に述べると、ペトリ皿を室温で濃度０．３ｍｇ／ｍｌの組換えスパイダーシルク溶液で被覆し、フィルムを創り出した。発泡体はシルク溶液の高速ピペット操作で作製し、繊維は１５ｍｌの試験管中でゆっくり振り動かし、その後より小さい片に切断した。
【０１４８】
早期付着及び再増殖を調べるために、タンパク質濃度０．３ｍｇ／ｍｌの溶液を、１％プルロニックでプレコートしてプラスチック表面への細胞接着を制限した９６−及び２４ウエルの細胞培養プレート（Sarstedt, suspension cells）それぞれの中でフィルムにキャストした。対照実験では、還元剤（５ｍＭのジチオスレイトール、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール又は１０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチルホスフィンHClのいずれか）を、フィルムを調製する前に、タンパク質溶液に直接加えた。 
【０１４９】
顕微鏡研究用に、タンパク質をチャンバースライドガラス（LabTekII）中でフィルムにキャストした。全てのウエルの被覆が望ましいアラマーブルー実験用には、液体を除去する前に、細胞培養ウエルを０．３ｍｇ／ｍｌの被覆タンパク質溶液で２時間コートした。フィルム及びコートした表面を無菌条件下、２５℃、３０％ｒｈで一晩乾燥し、次に、無菌２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で２回洗浄し、細胞播種の前に、完全細胞培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で１時間プレインキュベートした。
【０１５０】
自立型フィルムを、タンパク質溶液（３ｍｇ／ｍｌ）の液滴を、９６−ウェルプレートのウエルにつないで吊り下げた金属ワイヤの約３ｍｍ幅の枠上に塗布して調製し、無菌条件下２５℃、３０％ｒｈで一晩乾燥した。
【０１５１】
対照のウシフィブロネクチン（Sigma-Aldrich F1137 ）を推奨濃度（５μｇ／ｃｍ２）で、一晩、３７℃でコートした。
【０１５２】
ジスルフィド−ループ化ＲＧＤモチーフで機能化されたスパイダーシルクタンパク質は、安定したマトリックスの中に自己組織化することが観察された。図２ａの顕微鏡写真に示すように、ＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴ（配列番号１３）タンパク質は繊維（上）、フィルム（中）、及び自立型フィルム（下）の形式でマトリックスとして存在できた。図２ａのスケールバーは５００μｍ（上及び中）及び１０００μｍ（下）を示す。意外にも、ＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴタンパク質は、直鎖状のＲＧＤシルクタンパク質（ＲＧＤ−４ＲｅｐＣＴ、配列番号１６）及びＷＴシルクタンパク質（４ＲｅｐＣＴ、配列番号２）で言及されているよりも高い安定性及び完全性を示す繊維、フィルム及び発泡体を形成できた。ＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴタンパク質では、自立型フィルムの形成さえ可能であった。マトリックス形態の影響を排除するために、滑らかなフィルム形式（キャスト及び自立型）をこの後の細胞接着実験に用いた。
【０１５３】
実施例４−マトリックスの構造分析
実施例３で得られた繊維、キャストフィルム及び自立型フィルムのフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルをＦＴＩＲ分光分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）で測定した。全反射減衰法でＩＲスペクトルを測定するために、フィルムを結晶に取り付けた。各スペクトルは、１００スキャンを平均した。それぞれα−らせん（１６５４ｃｍ−１）及びβ−シート（１６２９ｃｍ−１）構造のピーク高さを比較するために、アミドＩ領域をさらに解析した。
【０１５４】
図２ｂに繊維（上）、フィルム（中）、及び自立型フィルム（下）の形式でのＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴ（配列番号１３）シルクマトリックスのＦＴＩＲスペクトルを示す。α−らせん及びβ−シートそれぞれの典型的なシグナルのピークを線で示す。興味深いことに、図２ｂのＦＴＩＲデータはキャストフィルムとは反対に、自立型フィルムはβ−シート構造に完全に転換していることを示している。
【０１５５】
実施例５−細胞培養
成人ドナーの表皮から単離されたヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＥＣ）（HDMEC, PromoCell GmbH, Germany）をゼラチン（Sigma Aldrich）でコートした培養フラスコ中、５％ウシ胎児血清（PromoCell GmbH, Germany）を含有する完全内皮細胞培地ＭＶで成長させた。
【０１５６】
骨髄のヒト間葉系幹細胞（hＭＳＣ, Gibco）をCELLstart (Gibco)でコートした培養フラスコ中、２５ｎｇ／μｌの繊維芽細胞成長因子β（Gibco）及び２ｍＭのGlutamax（Gibco）を含有する完全StemPro MSC血清フリー培地CTS（Gibco）で成長させた。
【０１５７】
成人皮膚の正常なヒト上皮細胞ケラチノサイト（NHEK-ad）をLonzaから購入した。継代培養、増殖及び遊走実験を、ウシ脳下垂体抽出物を含有するKGM-Gold（Lonza）中で実施し、一方、接着実験を１．２ｍＭのCa2+を与えるようにCaCl2を添加したKGM-CD（既知組成培地）で実施した。
【０１５８】
ケラチノサイト及び間葉系幹細胞培養を、実験と同様に、潜在的に細胞接着の増加を引き起こす可能性のあるマトリックスと血清タンパク質との間の考えられる相互作用を避けるために、血清フリー条件下で実施した。
【０１５９】
培地は２〜３日ごとに変えた。培養密度８０％に達したときに細胞をTrypLE（Life Technologies）で継代培養又は実験用に採取した。全ての実験は、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度で実施した。
実施例６−接着細胞の早期付着に及ぼすマトリックスの影響
Ａ．早期付着試験
【０１６０】
細胞を継代３〜８で採取し、２０，０００／ｃｍ２で播種し、細胞インキュベーター中でフィルム又は対照に１時間接着させた後、あらかじめ温めたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回穏やかに洗浄し、その後、９６％エタノールで１０分間固定した。水で３回洗浄後、細胞を０．１％クリスタルバイオレット水溶液で３０分間染色した。プレートをさらに洗浄後乾燥した。
【０１６１】
実施例３で得られたフィルムに結合した細胞の付着及び形態を、倒立明視野顕微鏡で、２ｘ倍率及び１０ｘ倍率で顕微鏡写真撮影し記録した。色素を４０μＬの２０％酢酸で１０分間溶解し、溶液３５μＬを５９５ｎｍでの光学密度測定（TECAN Infinite M200）用に３８４−ウェルプレートに移した。前洗浄なしで固定した細胞のウエルを陽性対照として用いた。細胞のないウエルを空試験として用いた。実験は各サンプル６ウェル(hexaplicate)で実施し、３回繰り返した。
【０１６２】
顕微鏡写真（２ｘ倍率）の一定領域（９．１２ｍｍ２）の細胞被覆面積の測定をソフトウェアNIS elements BR (Nikon)を用いて行った。
Ｂ．細胞の染色
【０１６３】
細胞を継代３〜８で採取し、３５００／ｃｍ２で播種し、２０分、１時間又は３時間、チャンバースライドでフィルムに接着した。穏やかに洗浄した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００ＰＢＳ溶液で透過処理し、１％ウシ血清アルブミン（BSA, AppliChem）ＰＢＳ溶液でブロッキング処理した。
【０１６４】
一次抗体を以下の１％ＢＳＡ中濃度で用いた：マウス抗ヒトビンキュリン（Sigma V9131）９．５μｇ／ｍｌ、マウス−抗ヒトβ−１インテグリン（活性化構造、クローンＨＵＴＳ−４）３．３μｇ／ｍＬ、又はマウス−抗ヒトα５−インテグリン（リガンド結合構造、クローンＳＮＡＫＡ−５１）２．５μｇ／ｍＬ、いずれもMillipore。
【０１６５】
二次抗体はAlexaFlour488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、クロス吸着型（Invitrogen）を１：５００で用いた。線維状アクチンを検出するために、Phalloidin-AlexaFluor594（Life Technologies）を１：４０で用いた。ＤＡＰＩを核染色に用いた。スライドを蛍光固定媒体（Dako, Copenhagen）に固定した。
【０１６６】
染色した細胞を、倒立顕微鏡（Nikon Eclipse Ti）を用いて４ｘ及び１０ｘ倍率で分析した。赤色蛍光には、５６３／４５ｎｍでの励起及６２５／５０ｎｍでの検出を用い、一方、青色蛍光のモニターには、３８７／１１ｎｍでの励起及び４４７／６０ｎｍでの検出を用いた。
【０１６７】
細胞接着（接着斑及び張線維の形成）の顕微鏡分析には、共焦点顕微鏡（Carl Zeiss LSM 710）を１０ｘ及び６３ｘ倍率で用いた。
【０１６８】
張線維の存在は、強く染色された突起して厚いｆ−アクチンフィラメントで決定し、０〜４（０＝なし、１＝わずか〜いくらか、２＝多い、３＝ほとんど、４＝すべての細胞が張線維を示す）で等級付けした。
【０１６９】
接着斑の存在は、接着斑を示す細胞の割合で評価した。接着斑の品質を、小さく不鮮明な接着斑（＝１ｐ）、小さくはっきりした接着斑（＝２ｐ）、豊富な接着斑（＝３ｐ）及び大きく明るい接着斑（＝４ｐ）の存在で１〜４に等級付し、この特定の接着斑を発現する陽性細胞の比率（０−４、ここで、接着斑陽性細胞が０≒なし、１≒４分の１、２≒２分の１、３≒４分の３、４≒すべて）を乗じた。
Ｃ．ＦＮＣＣ−シルクは接着細胞の早期付着を促進する。
【０１７０】
最初に、実施例３で得られた直鎖状ＲＧＤタンパク質（ＲＧＤ−４ＲｅｐＣＴ、配列番号１６）及びＷＴシルクタンパク質（４ＲｅｐＣＴ、配列番号２）と比較して、ＦＮＣＣ−シルク（ＦＮＣＣ−４ＲｅｐＣＴ、配列番号１３）にウエル接着細胞がどのように付着し拡がるかを検討した。三つの異なる変異体のシルクフィルムを細胞培養プレート中で調製し、ヒト初代内皮細胞（ＥＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はケラチノサイト（ＫＣ）を１時間接着させ、固定して染色した。
【０１７１】
図３ａにＷＴシルク（配列番号２）、又は、ＲＧＤ（配列番号１６）あるいはＦＮＣＣ（配列番号１３）で機能化したシルクのフィルムに１時間接着させ、クリスタルバイオレットで染色したＥＣ、ＭＳＣ及びＫＣの顕微鏡写真（１０ｘ倍率）を示す。スケールバー５０μｍ。
【０１７２】
図３ｂに異なるシルク変異体に接着した細胞（ＥＣ（上パネル）、及びＭＳＣ（中パネル））から溶解したクリスタルバイオレットのＯＤ、及び、一定領域（９．１２ｍｍ２）内のＫＣの細胞被覆面積（下パネル）を示す。ＥＣ及びＭＳＣ：３ウエル又は２ウエル、ＫＣ：４ウェル。すべての細胞タイプでｎ＝３。播種密度２０，０００／ｃｍ２。箱ひげ図：線＝中央値、箱：２５％〜７５％、ひげ＝平均値及び最大値。統計データ：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【０１７３】
図３に示す顕微鏡写真から、ＲＧＤ及びＷＴいずれと比べても、ＦＮＣＣフィルムでは、３つ全ての細胞タイプに対して、付着の明らかな改良が見られた。画像化後、ＥＣ及びＭＳＣそれぞれで捕獲された色素を溶解し、ＯＤを測定して、結合細胞の数の尺度として用いた（図３ｂ、上及び中パネル）。両方の細胞タイプで、ＷＴシルクに比べて、著しく多い細胞が、１時間後ＦＮＣＣ−シルクに結合した（ＥＣではＰ＜０．０１、ＭＳＣではＰ＜０．０５）。ＲＧＤシルクに比べても、著しく多いＥＣがＦＮＣＣ−シルクに結合した（ｐ＜０．０１）。この比色分析法はＫＣには適さない。なぜならば、この細胞タイプでは、かなりの細胞が又フィルム表面の外にも付着し、シルクフィルムに結合していなくても、ＯＤ値に寄与するからである。代わりに、図３ｂ（下パネル）に示すように、フィルムに結合した細胞の面積を２ｘ倍率での画像分析で測定した。ＦＮＣＣに結合したＫＣの面積は、ＷＴ−及びＲＧＤ−シルク両方よりも大きかった（Ｐ＜０．０００１）。
Ｄ．ＦＮＣＣ−シルク及びウシフィブロネクチンへの同様に良好な初代ＫＣ接着
【０１７４】
導入したＦＮＣＣモチーフのこの陽性効果を見て、ＲＧＤが構造で拘束された折り返しループに存在する野生型完全長フィブロネクチンと比べて、ＦＮＣＣ−シルクが、いかに良いかを調べた。従って、ウシ血漿（ＢＦＮ）から得たフィブロネクチンを用いて細胞培養ウエルと、むき出しの細胞培養処理プラスチックをコートした。そこでは、対照と同様にＫＣを培養できる。潜在的に細胞接着の増加を引き起こす可能性のある、マトリックスと血清タンパク質との間の考えられる相互作用を避けるために、血清フリー実験条件を選択した。
【０１７５】
ＦＮＣＣで機能化したシルク、ウシフィブロネクチンでコートした表面（ＢＦＮ）又は組織培養処理（ＴＣＴ）した細胞プラスチックいずれかに対するＫＣの１時間接着後の結果を図４に示す。図４ａにクリスタルバイオレット染色後の１０ｘ倍率の顕微鏡写真を示す。播種密度４０，０００／ｃｍ２。スケールバー５０μｍ。図４ｂに、一定領域（９．１２ｍｍ２）内の細胞被覆面積を示す（４ウェル、ｎ＝３）。播種密度２０，０００／ｃｍ２。箱ひげ図：線＝中央値、箱：２５％〜７５％、ひげ＝平均値及び最大値。統計データ（対ＴＣＴ）：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【０１７６】
細胞被覆面積を比較すると、ＫＣはＢＦＮ及びＦＮＣＣ−シルクに１時間後接着で等しく良好に結合しており、重要なことに、いずれもＴＣＴより著しく良好である（Ｐ＜０．０００１）ことが明らかである（図４）。
【０１７７】
実施例７−ＦＮＣＣ−シルク中のＲＧＤ提示に対するシステインループ構造の効果
これらの結果に勇気づけられ、さらに前進し、細胞が好む表面をＦＮＣＣ−シルク（配列番号１３）が創出するメカニズムを検証した。この目的では、直鎖状ＲＧＤの提示が予測される二つのＦＮ−シルク変異体を用いた（図１ａ）。第１の変異体（ＦＮＶＳ；配列番号１５）は、ＲＧＤ含有モチーフの元の配列を含み、ループ構造の影響なしに、野生型に配置しているアミノ酸の効果を示す。第２の変異体（ＦＮＳＳ；配列番号１４）では、ＦＮＣＣに配置している二つのシステインが、システインに類似しているが、−ＳＨ基がなく、したがってジスルフィド架橋を形成できないセリンで置換された。ＲＧＤ−シルク（配列番号１６）及びＷＴ−シルク（配列番号２）と併せて、異なるＦＮ−シルク変異体を、初代ＫＣで評価した。細胞を早期付着（図５）、拡散及び張線維の形成（図６）、さらに接着斑（図７）について解析した。早期付着試験及び細胞染色は実施例６に詳述の通り実施した。
Ａ．早期付着
【０１７８】
ＷＴ−シルク（配列番号２）、又は、ＦＮＣＣ（配列番号１３）、ＦＮＶＳ（配列番号１５）、ＦＮＳＳ（配列番号１４）あるいはＲＧＤ（配列番号１６）で機能化したシルクのフィルムへの１時間接着後のＫＣの結果を図５に示す。図５ａに、クリスタルバイオレット染色後の１０ｘ倍率での顕微鏡写真を示す。播種密度２０，０００／ｃｍ２。図５ｂに、一定領域（９．１２ｍｍ２）内の細胞被覆面積を示す（各４ウエル、ｎ＝３）。箱ひげ図：線＝中央値、箱：２５％〜７５％、ひげ＝平均値及び最大値。統計データ：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【０１７９】
最初の実験では、ＫＣをＷＴ、ＲＧＤ及びＦＮ−シルク変異体のフィルム上に１時間接着させ、検出及び形態用にクリスタルバイオレットで染色した（図５ａ）。３回の実験（６ウェル）の画像分析のデータをまとめると、ＦＮＣＣ−シルクは、ＦＮＳＳ及びＦＮＶＳの両方と比較して、付着（すなわち細胞によって被覆された面積）の増加を示した（Ｐ＜０．０００１、図５ｂ）。ＦＮＣＣ−シルクはまた、ＲＧＤ−シルクと比較して、ＫＣの接着が著しく高かった（Ｐ＜０．０００１）。すべてのＦＮ−シルク変異体が、ＷＴ−シルクと比較して、接着が著しく増加した（Ｐ＜０．０００１）。
【０１８０】
さらに、クリスタルバイオレットを細胞から溶解し、それらのＯＤをプレートリーダーで測定した８回の実験をまとめると、これらの実験で、細胞は、ある程度はシルク−フィルムの外の細胞プラスチックに接着した（データは示されていない）としても、極めて似た結果を示した（ＦＮＣＣ対ＦＮ−対照、Ｐ＜０．０００１）。
Ｂ．細胞拡散及び張線維の形成
【０１８１】
ＷＴ−シルク （配列番号２）、又はＦＮＣＣ（配列番号１３）、ＦＮＶＳ（配列番号１５）、ＦＮＳＳ（配列番号１４）あるいはＲＧＤ（配列番号１６）で機能化されたシルクのフィルムへの３時間接着後のＫＣの結果を図６に示す。図６ａに細胞被覆面積（２ウェル、ｎ＝４）を示す。箱ひげ図：線＝中央値、箱：２５％〜７５％、ひげ＝平均値及び最大値。図６ｂに張線維等級（平均値及び標準偏差、単ウエル、ｎ＝３）を示す。播種密度３，５００／ｃｍ２。統計データ：＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。
【０１８２】
Ｆ−アクチンを染色することによって、３時間接着後のＫＣにおける細胞拡散及び張線維の形成を検討した（図６）。その結果、４ｘ顕微鏡写真中の全細胞面積を測定したときに、ＦＮＣＣフィルムはＲＧＤ−フィルム（ｐ＜０．０５）及びＷＴ−フィルム（ｐ＜０．００１）と比べて、ＫＣの拡散が著しく増加したが、ＦＮＳＳ又はＦＮＶＳフィルムは増加しなかった（ｎ＝４、２ウエル）、（図６ａ）。ＦＮＣＣ−シルク上でのＫＣの拡散もＦＮＳＳ−シルクと比較して、著しく増加した（ｐ＜０．０５）。ＲＧＤ、ＦＮＳＳ−及びＦＮＶＳ−シルク上のＫＣは、丸みを帯びた外観の細胞の比率が高かったが、一方、ＦＮＣＣ−シルク上では、ほとんどの細胞は明瞭なアクチンフィラメントで広がった形態を有していた。
【０１８３】
また、Ｆ−アクチンを染色したＫＣを、定着した付着の指標として、張線維の存在を解析した（図６ｂ）。張線維の存在を、厚くかつ明るく染色されたアクチンフィラメント（束）として定義し、６３ｘ倍率（ｎ＝３）での検査で分析した。この分析は、面積測定では同様の結果を示したが、統計的には明確な差異はなかった。
Ｃ．接着斑の形成
【０１８４】
細胞内での接着斑の形成を、Ｆ−アクチンと接着斑複合体の主成分の一つであるビンキュリンを組み合わせの染色により３時間後に分析した。従って、Ｆ−アクチン及びビンキュリンの共染色は、インテグリンを含む、下地層の基質への細胞の確実な結合のしるしである。接着斑はＦ−アクチンフィラメントの黄緑色の伸長として現れ、しばしば細胞膜に近接して位置する。
【０１８５】
ＷＴ−シルク（配列番号２）又は、ＦＮＣＣ（配列番号１３）、ＦＮＶＳ（配列番号１５）、ＦＮＳＳ（配列番号１４）あるいはＲＧＤ（配列番号１６）で機能化されたシルクのフィルムに３時間接着後のＫＣ中の接着斑の形成とキャラクタリゼーションの分析結果を図７に示す。スライドを、共焦点顕微鏡共焦点顕微鏡を用いて、全体は１０ｘで（図７ａ）、詳細は６３ｘで走査した（図７ｂ）。細胞中の接着斑を二つの方式で等級付した。
【０１８６】
１番目では、接着斑を示す細胞の比率をそれぞれのウエル中のフィルム全体を外観検査により１０ｘ倍率で評価した。３回の実験をまとめたデータは、ＲＧＤ及びＷＴと比較して、ＦＮＣＣ−シルク上に接着斑を発現している細胞の割合は明らかな増加を示した（ｐ＜０．０５）、（図７ａ）。図７ａは接着斑を示す細胞の割合（平均値及び標準偏差）を示すグラフである。実験は各２ウエル、ｎ＝３で行った。統計データ：＊Ｐ＜０．０５。
【０１８７】
２番目では、接着斑を示す細胞の存在量だけでなく、細胞中に見られる接着斑の特徴も異なるシルク変異体で違いを示したので、さらに調べることにした。従って、各陽性細胞に中の接着斑の外観を等級付けで評価した。簡単に述べると、等級付けは、小さく不鮮明で細胞の中にまばらに現れる（「微妙」）から、大きく明るく、細胞の中に豊富に現れる（「卓越した」）に及んだ。この方法で、これらの構造を示すフィルム上の細胞がいくつあるかとは独立して、接着斑の品質を判断できた。この分析の結果は、他のシルク型に比較して、ＦＮＣＣ−シルクに付着した細胞中に、より卓越した接着斑の傾向を示した。図７ｂに発見された陽性細胞の総数とは独立して接着斑を等級付けしたグラフを示す（平均値及び標準偏差）。等級付は１つのウエルでｎ＝３で行った。
【０１８８】
その結果、接着斑の品質のばらつきは、ＦＮＣＣ−シルク上よりもＲＧＤ、ＦＮＳＳ及びＦＮＶＳ上の細胞の方が大きかった。このことは、ＦＮＳＳ及びＦＮＶＳ上の細胞中には、卓越した接着斑と微妙な接着斑の両方が存在するのに対し、ＦＮＣＣ−シルク上には卓越した接着斑がほとんどであったことを反映している。興味深いことに、このような卓越した接着斑は、ＦＮＣＣ上に播種した２０分後という早期に出現していた。
【０１８９】
各個別の実験で、ＦＮＣＣ−シルクは、例外なく、試験したフィルムの中で最も効率的な接着を示した。対照的に、ＦＮＳＳ−及びＦＮＶＳ−シルク上への付着は、ＲＧＤ−シルクと同程度から、ＦＮＣＣ−シルク上よりもいくらか低いものまでばらつきがあった。
【０１９０】
システイン架橋ループのＲＧＤモチーフの提示に対する役割をさらに解明するために、フィルムをキャストする前に、還元剤をＦＮＣＣ−シルク溶液に直接加える実験を行った。これらのフィルムでのジスルフィドの形成を阻み、直鎖状でループのないモチーフを生成するという考えである。しかしながら、還元していないＦＮＣＣフィルムと比較して、何ら違いは見られなかった。製造工程の間にフィルムが完全に乾燥されることを考えると、緩衝剤がないと、還元剤はもはやジスルフィド結合が起こるのを押さえることができないと仮定することができる。従って、ＦＮＳＳが、達成可能な最も適切なループのない対照と考える。
【０１９１】
実施例８−ＦＮＣＣ−シルクに接着するＫＣ中のインテグリンα５β１の関与
インテグリンα５β１はフィブロネクチンに選択的に結合することが知られているので、このインテグリンがＦＮＣＣ−シルク（配列番号１３）へのＫＣの結合中に含まれるかどうかを検証した。これを行うため、α５インテグリン（SNAKA-51）のリガンド結合構造及び、β１インテグリン（HUTS-4）の活性化された構造をそれぞれ具体的に認識するために開発された二つのモノクローナル抗体を選択し、それらをＫＣの染色と組み合わせてＦＮＣＣ−シルクに３時間接着するのに用いた。染色は実施例６〜７で行ったように、Ｆ−アクチンに対するファロイジンでの染色と組み合わせた。細胞の分析では、弱いが、ビンキュリンで染色したときに見られたパターンに類似したはっきりした染色パターンが現れた。
【０１９２】
実施例９−ＦＮＣＣ−シルクの応用
接着細胞の早期付着に関するＦＮＣＣ−シルクのこのような優れた結合特性の発見に触発されて、種々の細胞培養の利用を支援する能力を把握するためのいくつかの予備研究を行った。はじめに、細胞増殖におけるＦＮＣＣモチーフの効果を評価した。
Ａ．アラマーブルーを用いた細胞生死判別分析
【０１９３】
ＷＴ−シルク（配列番号２）又はＦＮＣＣ−シルク（配列番号１３）のフィルムでコートした９６−ウェルプレートのウエルに最初に低播種密度３，５００細胞／ｃｍ２で播種した初代ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）の細胞成長を培養期間中、３日ごとに、アラマーブルー細胞生死判別試験（Molecular Probes）でモニターした。アラマーブルー（細胞培地で１：１０に希釈）で４時間インキュベートした後、培養液の上澄み９０μＬの蛍光を、励起に５４４ｎｍ、発光に５９５ｎｍを用いて、蛍光プレートリーダー（CLARIOstar, BMG Labtech）で測定した。フィルムを各試料６ウエルで分析する二つの独立した実験を行った。異なる細胞結合モチーフを有するシルクに播種した細胞の成長プロファイルを得るために、各ウエル中の生存細胞の数に関係する蛍光強度を時間に対してプロットした。図８に示した結果は、ＷＴ−シルクと比較して、ＦＮＣＣ−シルク上の生存細胞は高いレベルを示しており（Ｐ＜０．００１、３日目及びＰ＜０．０００１、６日目；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ＦＮＣＣモチーフによって伝えられる細胞増殖を支援する能力が改良されていることを示唆している。
Ｂ．再増殖試験
【０１９４】
開放創領域の再増殖を支援する異なるシルク変異体の能力を評価するため、皮膚ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）をオレゴングリーン細胞追跡剤（Life Technologies）で染色し、２４ウェルプレートでＦＮＣＣ−シルク（配列番号１３）及びＷＴ−シルク（配列番号２）のフィル上に、２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞播種の前に創傷領域挿入物（CytoSelectTM Wound healing assay, Cell Biolabs）をウエルに加え、フィルムを無傷に保ちながら０．９ｍｍ幅の開放創を細胞単層に生成した。１６時間後に、挿入物を除去し、再増殖過程を毎日追跡し、倒立蛍光顕微鏡法で、０日（挿入物除去）２日目及び４日目に記録した。６日目に、試験法プロトコールに従って、細胞を固定し、染色して、倒立明視野顕微鏡法で画像化した。
【０１９５】
このようにして、緑色トレース細胞を、細胞がシルクフィルムの一定の部分「創傷領域」に達するのを防ぐ挿入物と共に、高密度でウエルに播種した。創傷領域の外側に単層が形成された後、挿入物を除去し、隙間の再増殖を培養の６日間記録し、細胞を遊走させ増殖させた。ケラチノサイトは、ＦＮＣＣ−シルク上の創傷領域を効率よく再増殖し、実験の終わりにはほぼ完全に細胞で被覆された。
Ｃ．移動可能な細胞単層
【０１９６】
ＮＨＥＫを採取し、AMCA orange cell tracker（Life Technologies）で追跡し、金属枠に装着したＦＮＣＣ−シルク（配列番号１３）の自立型フィルムに２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。形成された単層を倒立蛍光顕微鏡法で記録した。
【０１９７】
そのような自立型フィルム上に播種された初代ケケラチノサイトは、培養ウエル間で容易に移動できる単層を形成した。
【０１９８】
実施例１０−固定化されたペプチドを有する表面への細胞接着
シリコン（ＳｉＯ）表面を有機シラン（例えば３−アミノプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＴＥＳ）を用いて活性化し、その後、例えばＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いてアミノ反応性ペプチドを（それらのＮ−末端を介して）固定した。
固定に用いたペプチドをグリシンスペーサーで以下の通り設計した：
１．ＧＧＧＧＧＣＴＧＲＧＤＳＰＡＣ（配列番号２１）
２．ＧＧＧＧＧＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号２２）
３．ＧＧＧＧＧＳＴＧＲＧＤＳＰＡＳ（配列番号２３）
４．ＧＧＧＧＧＣＤＷＲＧＤＮＱＦＣ（配列番号２４）
【０１９９】
固定化されたペプチドを有する表面への早期付着を２０，０００／ｃｍ２で播種したヒトケラチノサイト（ＨａＣＡＴ）を用いて分析した。細胞を次に細胞インキュベーターで１時間接着させ、あらかじめ温めたリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに２回洗浄し、続いて９６％エタノールで１０分間固定化した。水で３回洗浄後、細胞を０．１％クリスタルバイオレット水溶液で３０分間染色した。
【０２００】
細胞の付着及び形態を、倒立明視野顕微鏡を用いて２ｘ及び１０ｘ倍率で顕微鏡写真を撮り記録した。次に、クリスタルバイオレット色素を４０μＬの２０％酢酸で１０分間溶解し、溶液３５μＬを３８４−ウェルプレートに移し、５９５ｎｍの光学密度を測定（TECAN Infinite M200）した。あらかじめ洗浄せずに固定した細胞を陽性対照（参照）として用いた。
【０２０１】
実施例１１−ＦＮｃｃシルクマトリックス上での細胞培養
精製後、ＦＮｃｃシルクタンパク質（配列番号１３）の溶液を用いて、細胞培養プレート（Sarstedt、懸濁細胞用疎水性プレート）をコートした。簡単に述べると、タンパク質溶液をトリス緩衝液中０．１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、室温で３０分インキュベートし、除去し洗浄した。
【０２０２】
トリプシン処理（ＴｒｐＬＥ）を用いて細胞を採取し、ＦＮｃｃ−シルクコーティング上に適切な細胞密度（３〜１０，０００細胞／ｃｍ２）で播種した。細胞の成長をアラマーブルー細胞生死判別試験（Molecular Probes）で定期的（２〜３日ごと）にモニターした。７〜１４日後の終点で生／死染色を行った。以下の細胞タイプが、陽性の成長プロファイルを示し、終点において、生存細胞が大部分（＞８０％）であった。
ヒト骨格筋サテライト細胞
ヒト皮膚微小血管内皮細胞
ヒト間葉系幹細胞
マウス間葉系幹細胞
ヒト皮膚線維芽細胞
ＨａＣａＴケラチノサイト
ＭＩＮ６−ｍ９膵臓細胞株
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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