(57)【要約】  本開示は、半翅目害虫の標的コード配列及び転写非コード配列のRNA干渉介在性阻害を介した、半翅目害虫の制御のための核酸分子、及びその使用方法に関する。本開示はまた、半翅目害虫の制御に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作製する方法、ならびに当該方法により得られる植物細胞及び植物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有する単離核酸であって、前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１、配列番号１の相補配列、配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、配列番号1を含有する半翅目生物体の天然コード配列、配列番号1を含有する半翅目生物体の天然コード配列の相補配列、配列番号1を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、からなる群から選択される、単離核酸。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、配列番号１１、及び前述のいずれかの相補配列からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
【請求項４】
前記生物体が、Euschistus heros (Fabr.) （新熱帯茶色カメムシ（Neotropical Brown Stink Bug））、Nezara viridula (L.) （ミナミアオカメムシ（Southern Green Stink Bug））、Piezodorus guildinii (Westwood) （アカオビカメムシ（Red-banded Stink Bug））、Halyomorpha halys (Stal) （クサギカメムシ（Brown Marmorated Stink Bug））、Chinavia hilare (Say) （アオカメムシ（Green Stink Bug））、Euschistus servus (Say) （茶色カメムシ（Brown Stink Bug））、Dichelops melacanthus (Dallas)（ディケロプス・メラカンツス（ダラス））、Dichelops furcatus (F.)（ディケロプス・フルカツス（Ｆ．））、 Edessa meditabunda (F.)（エデッサ・メディタブンダ（Ｆ．））、Thyanta perditor (F.)（新熱帯カタアカカメムシ（Neotropical Red Shouldered Stink Bug））、Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois)（チナビア・マルギナツム（パリソ  ド  ボーヴォワ））、Horcias nobilellus (Berg) （ワタムシ（Cotton Bug））、Taedia stigmosa (Berg)（タエディア・スティグモサ（バーグ））、Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)（ディスデルクス・ペルビアヌス（ゲーリン‐メネヴィル））、Neomegalotomus parvus (Westwood)（ネオメガロトムス・パルブス（ウェストウッド））、Leptoglossus zonatus (Dallas)（レプトグロッサス・ゾナツス（ダラス））、Niesthrea sidae (F.)（ニエストレア・シデ（Ｆ．））、Lygus hesperus (Knight)（サビイロカスミカメムシ（Western Tarnished Plant Bug））、及びLygus lineolaris (Palisot de Beauvois)（リグス・リネオラリス（パリソ  ド  ボーヴォワ））からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドから転写されたリボ核酸（RNA）分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現から産生された二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド配列と、半翅目害虫との接触が、前記ポリヌクレオチドに特異的に相補的な内因性核酸配列の発現を阻害する、請求項６に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
前記リボ核酸分子と、半翅目害虫との接触が、前記害虫を殺す、又は前記害虫の成長、及び／もしくは摂食を阻害する、請求項７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
第一、第二、及び第三のRNAセグメントを含有する二本鎖RNAであって、前記第一のRNAセグメントが前記ポリヌクレオチドを含有し、前記第三のRNAセグメントが、第二のポリヌクレオチド配列により前記第一のRNAセグメントに連結され、及び前記第三のRNAセグメントが、前記第一のRNAセグメントの実質的に逆相補配列であり、それによって、リボ核酸に転写されたときに前記第一及び第三のRNAセグメントがハイブリダイズし、前記二本鎖RNAを形成する、請求項６に記載の二本鎖RNA。
【請求項１０】
約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドの長さの、二本鎖リボ核酸分子及び一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項５に記載のRNA。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、植物細胞内で機能する、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された細胞。
【請求項１３】
前記細胞が原核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が真核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が植物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物。
【請求項１７】
種子が、前記ポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の植物の種子。
【請求項１８】
商品生産物が、検出可能な量の前記ポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の植物から製造された商品生産物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、二本鎖リボ核酸分子として前記植物において発現される、請求項１６に記載の植物。
【請求項２０】
前記細胞がトウモロコシ、ダイズ、又は綿花の細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
前記植物が、トウモロコシ、ダイズ、又は綿花である、請求項１６に記載の植物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸分子として前記植物中で発現され、及び前記リボ核酸分子は、半翅目害虫が前記植物の一部を摂取したときに、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的に相補的な内因性ポリヌクレオチドの発現を阻害する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２３】
内因性の害虫遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする追加のポリヌクレオチドを少なくとも１つ、さらに含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記追加のポリヌクレオチドが、植物細胞内で機能する異種プロモーターに各々操作可能に連結されている、請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
【請求項２５】
半翅目害虫群を制御する方法であって、前記方法が、
半翅目害虫の宿主植物において、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する形質転換植物細胞を提供することであって、前記ポリヌクレオチドが発現され、前記群に属する半翅目害虫との接触で機能するリボ核酸分子を生成し、前記半翅目害虫内の標的配列の発現を阻害し、その結果、前記ポリヌクレオチドを含有しない同一宿主植物種の植物上の同一害虫種と比較し、前記半翅目害虫又は害虫群の成長及び／もしくは生存の低下がもたらされること、を含む方法。
【請求項２６】
前記リボ核酸分子が、二本鎖リボ核酸分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記半翅目害虫群が、前記形質転換植物細胞が無い同一宿主植物種の宿主植物に寄生する同一害虫種の群と比較して減少している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記リボ核酸分子が、二本鎖リボ核酸分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記半翅目害虫群が、前記形質転換植物細胞が無い同一種の宿主植物に寄生する半翅目害虫群と比較して減少している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
トウモロコシ作物の生産量を改善する方法であって、前記方法が、
請求項１に記載の前記核酸を、トウモロコシ植物内に導入し、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製すること、及び
前記トウモロコシ植物を栽培し、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、半翅目害虫の発達又は成長を阻害する、及び半翅目害虫寄生による生産量の減少を阻害すること、を含む方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記トウモロコシ植物の一部に接触した半翅目害虫において少なくとも第一の標的遺伝子を抑制するRNA分子を生成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
植物細胞を、請求項１に記載の核酸を含有するベクターを用いて形質転換すること、
前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の進展を可能とさせるために充分な条件下で培養すること、
少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に組み込んだ形質転換植物細胞を選択すること、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされたリボ核酸（RNA）分子の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすること、及び 
前記RNAを発現する植物細胞を選択すること、を含む方法。
【請求項３３】
前記RNA分子が、二本鎖RNA分子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
半翅目害虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製する方法であって、前記方法が、
請求項３２に記載の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供すること、及び 
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸分子の発現が、前記形質転換された植物に接触する半翅目害虫の標的遺伝子の前記発現を調節するために充分であること、を含む方法。
【請求項３５】
トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
半翅目害虫抵抗性を植物に提供するための手段を含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換すること、
前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の進展を可能とさせるために充分な条件下で培養すること、
半翅目害虫抵抗性を植物に提供するための前記手段がそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること、
半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすること、及び 
半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段の発現する植物細胞を選択すること、を含む方法
【請求項３６】
半翅目害虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製する方法であって、前記方法が、
請求項４４に記載の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供すること、及び 
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段の発現が、前記形質転換された植物に接触する半翅目害虫の標的遺伝子の発現を調節するために充分であること、を含む方法。
【請求項３７】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、及び／又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３８】
B.チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３、Cry３４、及びCry３５を含有する群から選択される、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記細胞が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、及び／又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項４０】
B.チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３、Cry３４、及びCry３５を含有する群から選択される、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記植物が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、及び／又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の植物。
【請求項４２】
B.チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３、Cry３４、及びCry３５を含有する群から選択される、請求項４１に記載の植物。
【請求項４３】
前記形質転換植物細胞が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、及び／又はPIP-1ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
B.チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Cry３、Cry３４、及びCry３５を含有する群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
作物の生産量を改善する方法であって、前記方法が、
トウモロコシ植物に核酸を導入し、トランスジェニック植物を作製することであって、前記核酸が、
thread遺伝子を標的とするsiRNAを少なくとも１つコードするポリヌクレオチドと、
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来する殺虫性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、のうちの少なくとも２つ以上を含む、作製すること、及び
前記植物を栽培し、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、半翅目害虫の発達又は成長を阻害する、及び半翅目害虫寄生による生産量の減少を阻害すること、とを含む、方法。
【請求項４６】
前記植物が、トウモロコシ、ダイズ、又は綿花である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
第一、第二、及び第三のRNAセグメントを含有する請求項６に記載の二本鎖RNAであって、前記第一のRNAセグメントが前記ポリヌクレオチドを含有し、前記第三のRNAセグメントが、前記第二のポリヌクレオチド配列により前記第一のRNAセグメントに連結され、及び前記第三のRNAセグメントが、前記第一のRNAセグメントの実質的に逆相補配列であり、それによって、リボ核酸に転写されたときに前記第一及び第三のRNAセグメントがハイブリダイズし、前記二本鎖RNAを形成する、前記二本鎖RNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、2015年5月27日に出願された米国仮特許出願第62/166,985号明細書の優先権及び利益を主張するものである。ここで、この出願の全内容が、本出願に参照により援用される。
【０００２】
電子的に提出された配列表に対する参照
配列表の正式な複製が、ASCII形式の配列表としてEFS-WEBを介して電子的に提出されている。ファイル名は、“75883-WO-PCT_20160523_Priority_Sequence_Listing_as_filed_20150527”。作成日は2016年5月13日であり、サイズは28キロバイト。本明細書と同時に出願されている。このASCII形式の書面に含有されている配列表は、本明細書の一部であり、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、概して、半翅目害虫を起因とする植物被害を遺伝的に制御することに関する。特定の実施形態において、本発明は、標的コード配列及び非コード配列の特定に関するものであり、及び半翅目害虫の細胞において標的コード配列及び非コード配列の発現を転写後に抑制又は阻害し、植物防御作用をもたらすことを目的とした組み換えDNA技術の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
カメムシと他の半翅目：異翅目の昆虫は、重大な農業病害虫複合系を構成している。世界中で、５０を超えるカメムシの近縁種が作物被害を引き起こすことが知られている。McPherson & McPherson, R.M. (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico CRC Press. これらの昆虫は、トウモロコシ、ダイズ、綿花、果物、野菜、及び穀物をはじめとする多くの重要な作物中に存在している。新熱帯茶色カメムシ（Neotropical Brown Stink Bug）、Euschistus heros、アカオビカメムシ（Red-banded Stink Bug）、Piezodorus guildinii、クサギカメムシ（Brown Marmorated Stink Bug）、Halyomorpha halys、及びミナミアオカメムシ（Southern Green Stink Bug）、Nezara viridulaが特に懸念されている。これら害虫は、米国単独で、毎年数百万ドルの農作物被害を引き起こしている。
【０００５】
カメムシは複数の若虫期を経て、その後に成虫期に到達する。卵から成虫にまで発達する期間は、約３０〜４０日である。温暖な気候では複数世代が発生し、多大な昆虫の圧力が生じる。
【０００６】
若虫と成虫の両方が軟組織から樹液を吸い、またその中に消化酵素を注入し、余剰な口腔組織消化とネクローシスを引き起こしている。次いで、消化された植物物質と栄養素が摂取される。植物の維管束系から水と栄養素が枯渇すると、植物組織の損傷が生じる。発育中の穀物と種子への損傷が、収率として最も重要であり、発芽は著しく低下する。
【０００７】
半翅目害虫の現時点の管理法は、個々の農地を基準とした殺虫剤処置に依っている。それゆえ、現在進行中の作物損害を最小化する別の管理戦略が緊急に必要とされている。
【０００８】
RNA干渉（RNAi）は、内因性の細胞経路を利用するプロセスであり、これによって標的遺伝子のすべて、または適切なサイズの任意の位置に特異的な干渉RNA（iRNA）分子（例えばdsRNA分子など）が、そこにコードされたmRNAの分解を生じさせる。近年、RNAiを使用し、多くの種及び実験系、例えば、カエノラブディティス・エレガンスCaenorhabditis elegans、植物、昆虫胚、及び組織培養の細胞で遺伝子を「ノックダウン」させることが行われている。例えば、Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747.を参照のこと。
【０００９】
RNAiは、DICERタンパク質複合体を含む内因性経路を介してmRNAの分解を行う。DICERは長いdsRNA分子を、低分子干渉RNA（siRNA）と名付けられている、およそ２０ヌクレオチドの短い断片へと分解する。このsiRNAが、２つの一本鎖RNAの、パッセンジャーストランドとガイドストランドへとほどかれる。パッセンジャーストランドは分解され、ガイドストランドはRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）へと組み込まれる。マイクロ阻害性リボ核酸（miRNA：Micro inhibitory ribonucleic acid）分子も同様に、RISCへと組み込まれることができる。ガイドストランドがmRNA分子の相補配列に特異的に結合したとき、転写後遺伝子サイレンシングが発生し、RISC複合体の触媒構成要素であるアルゴノート（Argonaute）による開裂が誘導される。このプロセスは、例えば植物、線形動物、及び一部の昆虫などの一部の真核生物において、siRNA及び／又はmiRNAの初期濃度がわずかであっても、生物体全体で全身に広がることが知られている。
【００１０】
siRNA及び／又はmiRNAに相補的な転写物のみが開裂、及び分解されるため、mRNA発現のノックダウンは配列特異的である。植物においては、数種のDICER遺伝子の機能群が存在する。RNAiの遺伝子サイレンシング効果は数日間持続する。実験条件下では、多数の標的転写物の９０％以上の低下が生じ、結果として対応するタンパク質値も低下させられる。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書において、例えば、Euschistus heros (Fabr.)（新熱帯茶色カメムシ、BSB）、Nezara viridula (L.) （ミナミアオカメムシ）、Piezodorus guildinii (Westwood) （アカオビカメムシ）、Halyomorpha halys (Stal) （クサギカメムシ）、Chinavia hilare (Say) （アオカメムシ）、Euschistus servus (Say) （茶色カメムシ）、Dichelops melacanthus (Dallas)（ディケロプス・メラカンツス（ダラス））、Dichelops furcatus (F.)（ディケロプス・フルカツス（Ｆ．））、 Edessa meditabunda (F.)（エデッサ・メディタブンダ（Ｆ．））、Thyanta perditor (F.)（新熱帯カタアカカメムシ）、Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois)（チナビア・マルギナツム（パリソ  ド  ボーヴォワ））、Horcias nobilellus (Berg) （ワタムシ）、Taedia stigmosa (Berg)（タエディア・スティグモサ（バーグ））、Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)（ディスデルクス・ペルビアヌス（ゲーリン‐メネヴィル））、Neomegalotomus parvus (Westwood)（ネオメガロトムス・パルブス（ウェストウッド））、Leptoglossus zonatus (Dallas)（レプトグロッサス・ゾナツス（ダラス））、Niesthrea sidae (F.)（ニエストレア・シデ（Ｆ．））、Lygus hesperus (Knight)（サビイロカスミカメムシ）、及びLygus lineolaris (Palisot de Beauvois)（リグス・リネオラリス（パリソ  ド  ボーヴォワ））をはじめとする半翅目害虫を制御するための核酸分子（例えば、標的遺伝子、DNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）、及びその使用方法が開示される。特定の例において、半翅目害虫の１つ以上の天然核酸配列の少なくとも一部に対し相同であり得る、例示的な核酸分子が開示される。
【００１２】
これら、及びさらなる例において、天然核酸配列が標的遺伝子であってもよく、その産物は例えば限定されないが、代謝プロセスに関与してもよく、繁殖プロセスに関与してもよく、又は若虫の発達に関与してもよい。一部の例において、標的遺伝子発現の、それに相同な配列を含有する核酸分子による転写後阻害は、半翅目害虫において致命的であってもよく、又は成長及び／もしくは繁殖の低下をもたらすものであってもよい。特定の例において、アポトーシス阻害因子（IAP：inhibitor of apoptosis）ファミリーのタンパク質（本明細書において、threadとも呼称される）からなる遺伝子が、転写後サイレンシングの標的遺伝子として選択されてもよい。特定の例において、転写後阻害に有用な標的遺伝子は、本明細書において、threadと呼称される新規遺伝子である。従って、thread （配列番号１）、thread （配列番号１）の相補配列、及び前述のいずれかの断片のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子が本明細書に開示される。
【００１３】
また、標的遺伝子産物（例えば、THREADと呼称される遺伝子の産物）内のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子が開示される。例えば、核酸分子は、配列番号２（THREADタンパク質のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有していてもよい。特定の例において、核酸分子は、THREAD）の産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有していてもよい。さらに、標的遺伝子産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の逆相補であるヌクレオチド配列を含有する核酸分子が開示される。
【００１４】
また、例えばthreadなどの半翅目害虫の標的遺伝子のすべて、又は一部に相補的なiRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及びhpRNA）分子の製造に使用することができるcDNA配列が開示される。特定の実施形態において、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及び／又はhpRNAは、in vitroで、又は例えば植物もしくｊは細菌などの遺伝子改変生物体により、in vivoで製造されてもよい。特定の例において、thread（配列番号１）のすべて、又は一部に対し相補的なiRNA分子を製造するために使用することができるcDNA分子が開示される。
【００１５】
さらに、半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段、及び植物に対して半翅目害虫抵抗性を提供するための手段が開示される。半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段は、配列番号３（Euschistus heros thread 領域１、本明細書において場合によってBSB_thread-1とも呼称される）、又は配列番号４（Euschistus heros thread 領域２、本明細書において場合によってBSB_thread-2とも呼称される）、又はそれらの相補配列のうちの少なくとも１つからなる一本鎖RNA分子又は二本鎖RNA分子である。半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の機能的均等物としては、配列番号１を含有するBSB遺伝子のすべて、又は一部に対し実質的に相同な一本鎖RNA分子又は二本鎖RNA分子が挙げられる。半翅目害虫抵抗性を植物に提供するための手段は、プロモーターに操作可能に連結された半翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段をコードする核酸配列を含有するDNA分子であり、当該DNA分子は、トウモロコシ植物のゲノムに組み込まれることができる。
【００１６】
半翅目害虫群を制御するための方法が開示され、当該方法は、半翅目害虫により取り込まれることで、半翅目害虫内の生物学的機能を阻害するよう機能する、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及びhpRNA）分子を半翅目害虫に提供することを含み、当該iRNA分子は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列のすべて又は一部を含有する：配列番号１、配列番号３、及び配列番号４；配列番号１、配列番号３、及び配列番号４の相補配列；配列番号１、配列番号３、及び配列番号４のいずれかのすべて又は一部を含有する半翅目生物体（例えば、BSB）の天然コード配列；配列番号１、配列番号３、及び配列番号４のいずれかのすべて又は一部を含有する半翅目生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１、配列番号３、及び配列番号４のいずれかのすべて又は一部を含有する天然RNA分子に転写される半翅目生物体の天然非コード配列；ならびに配列番号１、配列番号３、及び配列番号４のいずれかのすべて又は一部を含有する天然RNA分子に転写される半翅目生物体の天然非コード配列の相補配列。
【００１７】
また、本明細書において、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAが、食物をベースとしたアッセイにおいて半翅目害虫に提供され得る、又はdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／もしくはhpRNAを発現する遺伝子改変植物細胞において半翅目害虫に提供され得る方法が開示される。これらの例、及びさらなる例において、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAは、半翅目害虫の若虫に摂取されることができる。本発明のdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAの摂取により、その後、若虫においてRNAiが発生することができ、次いで半翅目害虫の活性に必須な遺伝子のサイレンシングが発生することができ、最終的には若虫の死がもたらされ得る。したがって、半翅目害虫の制御に有用な例示的な核酸配列を含有する核酸分子が半翅目害虫に提供される方法が開示される。特定の例において、本発明の核酸分子を使用することにより制御される半翅目害虫は、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、アオカメムシ（Chinavia hilare）、茶色カメムシ（Euschistus servus）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）、エデッサ・メディタブンダ（Edessa meditabunda）、新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）、ワタムシ（Horcias nobilellus）、タエディア・スティグモサ（Taedia stigmosa）、ディスデルクス・ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）、レプトグロッサス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）、ニエストレア・シデ（Niesthrea sidae）、、及びリグス・リネオラリス（Lygus lineolaris）であってもよい。前記及び他の特徴は、幾つかの実施形態に関する以下の詳述からより明らかとなり、添付の図１及び図２を参照することで発展するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、１つの転写鋳型からのdsRNAの生成に関する戦略の図の説明である。
【図２】図２は、２つの転写鋳型からのdsRNAの生成に関する戦略の図の説明である。配列表  添付の配列表に列記される核酸配列は、37 C.F.R. §1.822に規定されるヌクレオチド塩基に対する標準的な略号を使用して示されている。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、提示されている鎖を任意に参照することにより、相補鎖及び逆相補鎖も含まれることが理解される。添付の配列表において：
【００１９】
配列番号１は、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）からのBSBthread転写物の例示的なDNA配列である。
【００２０】
配列番号２は、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）のthreadタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号３は、in vitroでのdsRNA合成に使用された、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）由来のBSB_thread-1のDNA配列を示す（５’末端及び３’末端のT7プロモーター配列は示していない）。
【００２２】
配列番号４は、in vitroでのdsRNA合成に使用された、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）由来のBSB_thread-2のDNA配列を示す（５’末端及び３’末端のT7プロモーター配列は示していない）。
【００２３】
配列番号５は、T7ファージプロモーターのDNA配列を示している。
【００２４】
配列番号６〜９は、 BSB_ thread-1、及びBSB_ thread-2を含有する、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）のthread配列部分を増幅するために使用されたプライマーを示す。
【００２５】
配列番号１０は、pDAB119611に存在するときの、BSB threadヘアピンv1-RNA形成配列を示す。大文字の塩基は、threadセンス鎖であり、下線が引かれた小文字の塩基は、ST-LS1イントロンを含有し、下線が引かれていない小文字の塩基は、threadアンチセンス鎖である。
ggagacctggagatgatccaatgaatgaccatgttcgttggtctggtggatgtccatttgtaaataaagaacccgttggcaacattcctctagaaaatgatgatgatgaccactcttctgatagagactctggttttgatacttgtgggccttttagtctacaaatccagagttgtggagataagacggctcttgcagaagatcccaaaatattggaaagccctaattttttgaaggactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatgagctcacttcaaaaaattagggctttccaatattttgggatcttctgcaagagccgtcttatctccacaactctggatttgtagactaaaaggcccacaagtatcaaaaccagagtctctatcagaagagtggtcatcatcatcattttctagaggaatgttgccaacgggttctttatttacaaatggacatccaccagaccaacgaacatggtcattcattggatcatctccaggtctcc
【００２６】
配列番号１１は、pDAB119612に存在するときの、BSB threadヘアピンv4-RNA形成配列を示す。大文字の塩基は、threadセンス鎖であり、下線が引かれた小文字の塩基は、ST-LS1イントロンを含有し、下線が引かれていない小文字の塩基は、threadアンチセンス鎖である。
ttcgtctcctgagaaccagttgagaaatattcaatctctagtcaaaagagagttaacacaagaaagtgtgcacgagaaaaacatccttaaaggctacaggatctatggctggattatttctatacctttattattttaagaatataatttccaatgccgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatgagctcaggcattggaaattatattcttaaaataataaaggtatagaaataatccagccatagatcctgtagcctttaaggatgtttttctcgtgcacactttcttgtgttaactctcttttgactagagattgaatatttctcaactggttctcaggagacgaa
【００２７】
配列番号１２は、YFP標的化dsRNAのセンス鎖である。YFPv2
【００２８】
配列番号１３〜１４は、YFP標的化dsRNA部分を増幅するために使用されたプライマーを示す：YFPv2
【００２９】
配列番号１５は、YFPヘアピン配列（YFP v2-1）を示す。大文字の塩基は、YFPのセンス鎖であり、下線が引かれた小文字の塩基は、RTM1イントロンを含有し、下線が引かれていない小文字の塩基は、YFPのアンチセンス鎖である。
Atgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaagtccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttctccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataacttaatatgtgatttggacccagcagatagagctcattactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat
【００３０】
配列番号１６は、ST-LS1イントロンを含有する配列を示す。
【００３１】
配列番号１７〜２０は、dsRNA合成を目的として、YFPの遺伝子領域を増幅するために使用されたプライマーを示している。
【００３２】
配列番号２１は、TIP41様タンパク質をコードするトウモロコシDNA配列を示す。
【００３３】
配列番号２２は、オリゴヌクレオチドT20NVのDNA配列を示す。
【００３４】
配列番号２３〜２７は、トウモロコシの転写レベルを測定するために使用されたプライマーとプローブの配列を示す。
【００３５】
配列番号２８は、バイナリーベクター主鎖検出に使用されたSpecRコード領域の一部のDNA配列を示す。
【００３６】
配列番号２９は、ゲノムコピー数解析に使用されたAAD1コード領域の一部のDNA配列を示す。
【００３７】
配列番号３０は、トウモロコシのインベルターゼ遺伝子のDNA配列を示す。
【００３８】
配列番号３１〜３９は、遺伝子コピー数解析に使用されたプライマーとプローブの配列を示す。
【００３９】
配列番号４０〜４２は、トウモロコシ発現解析に使用されたプライマーとプローブの配列を示す。
【００４０】
配列番号４３は、pDAB101992に存在するときのYFPタンパク質のコード配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本明細書において、半翅目害虫の寄生を遺伝的に制御するための方法及び組成物が開示される。半翅目害虫群のRNAi介在性制御を目的とした標的遺伝子としての使用のための、半翅目害虫のライフサイクルに必須な１つ以上の遺伝子を特定する方法もまた提供される。成長、生存、発達、及び／又は繁殖に必須な１つ以上の標的遺伝子を抑制するように、１つ以上のdsRNA分子をコードするDNAプラスミドベクターを設計してもよい。一部の実施形態において、半翅目害虫の標的遺伝子のコード配列又は非コード配列に対し相補的な核酸分子を介して、標的遺伝子の発現の転写後抑制、又は標的遺伝子の阻害の転写後抑制のための方法が提供される。これら、及びさらなる実施形態において、半翅目害虫に、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列に相補的な核酸分子のすべて又は一部から転写されたdsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、及び／又はhpRNA分子を１つ以上摂取させ、それにより植物防御作用をもたらすことができる。
【００４２】
したがって、一部の実施形態は、標的遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列に相補的なdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAを使用し、標的遺伝子産物の発現を配列特異的に阻害し、半翅目害虫の少なくとも部分的な制御を達成することを含む。例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、及びそれらの断片のいずれかに明記されているヌクレオチド配列を含有する単離及び精製された核酸分子のセットが開示される。一部の実施形態において、標的遺伝子の転写後サイレンシング又は阻害を目的として、この配列、その断片、又はこれらの配列のうちの１つを含む遺伝子から、安定化されたdsRNA分子が発現されてもよい。ある実施形態において、単離及び精製された核酸分子は、配列番号１のすべて又は一部を含有する。他の実施形態において、単離及び精製された核酸分子は、配列番号３のすべて又は一部を含有する。さらなる実施形態において、単離及び精製された核酸分子は、配列番号４のすべて又は一部を含有する。
【００４３】
一部の実施形態は、少なくとも１つのiRNA（例えばdsRNA）分子をコードする組み換えDNA配列を少なくとも１つ、そのゲノム中に有する組み換え宿主細胞（例えば植物細胞）を含む。特定の実施形態において、半翅目害虫により摂取されたときに、当該半翅目害虫の標的遺伝子の発現を転写後にサイレンシングする、又は阻害する、dsRNA分子が提供されてもよい。組み換えDNA配列は、例えば配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれか；配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれかの断片；又は配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号４のうちの１つ以上を含有する遺伝子の部分配列；又はそれらの相補配列のうちの１つ以上を含有してもよい。
【００４４】
特定の実施形態は、配列番号１のすべて又は一部を含有するiRNA（例えば、dsRNA）分子を少なくとも１つコードする組み換えDNA配列をそのゲノム中に有する組み換え宿主細胞を含む。半翅目害虫に摂取されたときに、当該iRNA分子は、当該半翅目害虫において、配列番号１を含有する標的遺伝子の発現をサイレンシング又は阻害することができ、それによって、当該半翅目害虫の成長、発達、繁殖、及び／又は摂食の停止がもたらされる。
【００４５】
一部の実施形態において、dsRNA分子を少なくとも１つコードする組み換えDNA配列を少なくとも１つ、そのゲノム中に有する組み換え宿主細胞は、形質転換された植物細胞であってもよい。一部の実施形態は、かかる形質転換植物細胞を含有するトランスジェニック植物を含む。かかるトランスジェニック植物に加え、いずれかのトランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子、及びトランスジェニック植物の産物がすべて提供され、それら各々が組み換えDNA配列を含有している。特定の実施形態において、本発明のdsRNA分子は、トランスジェニック植物細胞において発現されることができる。したがって、これら及び他の実施形態において、本発明のdsRNA分子は、トランスジェニック植物細胞から単離されることができる。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ（Zea mays)、ダイズ (Glycine max)、綿花(Gossypium種)、及びイネ（Poaceae）科の植物を含有する群から選択される植物である。
【００４６】
一部の実施形態は、半翅目害虫の細胞において、標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これら、及び他の実施形態において、核酸分子が提供されてもよく、この場合において、当該核酸分子は、dsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含有している。特定の実施形態において、dsRNA分子をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能に連結されてもよく、及び転写終結配列に操作可能に連結されていてもよい。特定の実施形態において、半翅目害虫細胞において標的遺伝子の発現を調節する方法は、以下を含む場合がある：（a）dsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを用いて、植物細胞を形質転換すること；（ｂ）当該形質転換植物細胞を、複数の形質転換植物細胞を含有する植物細胞培養の進行が可能となるために充分な条件下で培養すること；（ｃ）当該ベクターがそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること；及び（ｄ）選択された形質転換植物細胞が、当該ベクターのヌクレオチド配列によりコードされているdsRNA分子を含有することを決定すること。ベクターがそのゲノム中に組み込まれており、及び当該ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるdsRNA分子を含有する植物細胞から、植物を再生させてもよい。
【００４７】
したがって、そのゲノム中に組み込まれたdsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含有するトランスジェニック植物もまた開示され、この場合において当該トランスジェニック植物は、当該ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるdsRNA分子を含有している。特定の実施形態において、dsRNA分子の植物における発現は、当該形質転換植物又は当該形質転換植物細胞に、例えば当該形質転換植物、当該植物の一部（例えば、根）又は植物細胞を餌とすることにより接触している半翅目害虫の細胞における標的遺伝子の発現を調節するのに充分である。本明細書に開示されるトランスジェニック植物は、半翅目害虫の寄生に対する抵抗性を示すことができ、及び／又は耐性の増強を示すことができる。特定のトランスジェニック植物は、以下からなる群から選択される半翅目害虫の１つ以上に対する抵抗性、及び／又は耐性の増強を示すことができる：新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、アオカメムシ（Chinavia hilare）、茶色カメムシ（Euschistus servus）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）、エデッサ・メディタブンダ（Edessa meditabunda）、新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）、ワタムシ（Horcias nobilellus）、タエディア・スティグモサ（Taedia stigmosa）、ディスデルクス・ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）、レプトグロッサス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）、ニエストレア・シデ（Niesthrea sidae）、サビイロカスミカメムシ（Lygus hesperus）、及びリグス・リネオラリス（Lygus lineolaris）。
【００４８】
また本明細書において、例えばiRNA分子などの制御剤を、半翅目害虫へと送達する方法が開示される。かかる制御剤は、半翅目害虫の摂食、成長、又はさもなければ宿主において損害を生じさせる能力に機能的障害を直接又は間接的に生じさせることができる。一部の実施形態において、安定化されたdsRNA分子を半翅目害虫に送達させ、当該半翅目害虫において少なくとも１つの標的遺伝子を抑制し、それによって、半翅目害虫による植物被害を減少させる、又は取り除くことを含む方法が提供される。一部の実施形態において、半翅目害虫において標的遺伝子の発現を阻害する方法は、当該半翅目害虫の成長、発達、繁殖、及び／又は摂食の停止を生じさせることができる。一部の実施形態において、当該方法は最終的に、半翅目害虫の死をもたらす場合がある。
【００４９】
一部の実施形態において、植物、動物、及び／又は植物もしくは動物の周囲環境における使用のための本発明のiRNA分子（例えば、dsRNA）を含有し、半翅目害虫寄生の撲滅又は減少を実現する組成物（例えば、局所用組成物）が提供される。特定の実施形態において、組成物は、半翅目害虫に食べられる栄養組成物又は食物源であってもよい。一部の実施形態は、半翅目害虫が利用可能な栄養組成物又は食物源を作製することを含む。iRNA分子を含有する組成物の摂取は、半翅目害虫の１つ以上の細胞による分子の取り込みを発生させることができ、それによって次いで、当該半翅目害虫の細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害を発生させることができる。半翅目害虫による植物又は植物細胞の摂取、又は損害は、当該半翅目害虫の宿主に、本発明のiRNA分子を含有する組成物を１つ以上提供することによって、当該半翅目害虫が存在している任意の宿主組織もしくは環境の中又は上で限定され、又は除外されることができる 
【００５０】
本明細書に開示される組成物及び方法は、半翅目害虫による損害を制御するための他の方法及び組成物と一緒に組み合わせて使用されてもよい。例えば、半翅目害虫から植物を防御するための本明細書に記載されるiRNA分子は、半翅目害虫に対し有効な化学物質、半翅目害虫に対して有効な農薬、輪作、又はRNAi介在法及び本発明RNAi組成物の特性とは異なる特性を示す組み換え遺伝子法（例えば、植物における、半翅目害虫に対して有害なタンパク質（例えば、Bt毒素又はPIP-1ポリペプチド）の組み換え産生）の１つ以上の追加使用を含む方法において使用されてもよい。
【００５１】
ＩＩ．略語
dsRNA  二本鎖リボ核酸
GI  成長阻害
NCBI  全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）
gDNA  ゲノムDNA
iRNA  阻害性リボ核酸（inhibitory ribonucleic acid）
ORF  オープンリーディングフレーム
RNAi  リボ核酸干渉
miRNA  マイクロ阻害的リボ核酸
shRNA  低分子ヘアピンリボ核酸
siRNA  低分子阻害的リボ核酸
hpRNA  ヘアピンリボ核酸
UTR  非翻訳領域
PCR  ポリメラーゼ鎖反応
RISC  RNA誘導サイレンシング複合体
BSB  新熱帯茶色カメムシ(Euschistus heros Fabricius)
【００５２】
ＩＩＩ．用語
以下の記載及び表において、多くの用語が使用されている。所与のかかる用語の範囲を含む、明細書及び請求項の明白で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
【００５３】
半翅目害虫：本明細書において使用される場合、「半翅目害虫」という用語は、半翅目：異翅目の昆虫を指し、限定されないが、カメムシ科（Pentatomidae）、カスミカメムシ科（Miridae）、ホシカメムシ科（Pyrrhocoridae）、ヘリカメムシ科（Coreidae）、ホソヘリカメムシ科（Alydidae）、及びヒメヘリカメムシ科（Rhopalidae）が含まれ、それらは広範な宿主植物を餌とし、貫通口部分及び吸汁口部分を有している。特定の例において、半翅目害虫は、Euschistus heros (Fabr.) （新熱帯茶色カメムシ（Neotropical Brown Stink Bug））、Nezara viridula (L.) （ミナミアオカメムシ（Southern Green Stink Bug））、Piezodorus guildinii (Westwood) （アカオビカメムシ（Red-banded Stink Bug））、Halyomorpha halys (Stal) （クサギカメムシ（Brown Marmorated Stink Bug））、Chinavia hilare (Say) （アオカメムシ（Green Stink Bug））、Euschistus servus (Say) （茶色カメムシ（Brown Stink Bug））、Dichelops melacanthus (Dallas)（ディケロプス・メラカンツス（ダラス））、Dichelops furcatus (F.)（ディケロプス・フルカツス（Ｆ．））、 Edessa meditabunda (F.)（エデッサ・メディタブンダ（Ｆ．））、Thyanta perditor (F.)（新熱帯カタアカカメムシ（Neotropical Red Shouldered Stink Bug））、Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois)（チナビア・マルギナツム（パリソ  ド  ボーヴォワ））、Horcias nobilellus (Berg) （ワタムシ（Cotton Bug））、Taedia stigmosa (Berg)（タエディア・スティグモサ（バーグ））、Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)（ディスデルクス・ペルビアヌス（ゲーリン‐メネヴィル））、Neomegalotomus parvus (Westwood)（ネオメガロトムス・パルブス（ウェストウッド））、Leptoglossus zonatus (Dallas)（レプトグロッサス・ゾナツス（ダラス））、Niesthrea sidae (F.)（ニエストレア・シデ（Ｆ．））、Lygus hesperus (Knight)（サビイロカスミカメムシ（Western Tarnished Plant Bug））、及びLygus lineolaris (Palisot de Beauvois)（リグス・リネオラリス（パリソ  ド  ボーヴォワ））を含むリストから選択される。
【００５４】
（生物体との）接触：本明細書において使用される場合、生物体（例えば、半翅目害虫）「との接触」又は「による取り込み」という用語は、核酸分子に関しては、当該生物体への核酸分子の内面化を含み、例えば限定されないが：当該生物体による（例えば、摂食による）分子の摂取；当該生物体と、核酸分子を含む組成物との接触；及び核酸分子を含有する溶液に生物体が浸ることを含む。
【００５５】
コンティグ：本明細書において使用される場合、「コンティグ」（contig）という用語は、単一の遺伝源に由来する重複DNAセグメントのセットから再構築されたDNA配列を指す。
【００５６】
トウモロコシ植物：本明細書において使用される場合、「トウモロコシ植物」という用語は、Zea mays（トウモロコシ）の種の植物を指す。
【００５７】
dsRNAをコードする：本明細書において使用される場合、「dsRNAをコードする」という用語は、そのRNA転写産物が、分子内dsRNA構造（例えばヘアピン）又は分子間dsRNA構造（例えば、標的RNA分子にハイブリダイズすることによる）を形成することができる遺伝子を含む。
【００５８】
発現：本明細書において使用される場合、コード配列（例えば、遺伝子又は導入遺伝子）の「発現」とは、核酸転写ユニット（例えば、ゲノムDNA又はcDNAを含む）のコード化情報が、細胞の使用可能な部分、使用不可能な部分、又は構造部分へと転換されるプロセスを指し、多くの場合、タンパク質の合成を含んでいる。遺伝子発現は、遺伝子発現を増加又は低下させる剤への、例えば細胞、組織、又は生物体の曝露などの外部シグナルにより影響され得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、蛋白質への経路のいずれかで制御され得る。遺伝子発現の制御は、例えば転写、翻訳、ＲＮＡの輸送及びプロセッシング、例えばｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対する作用を制御することにより発生するか、又はそれらが生成された後の特定の蛋白質分子の活性化、不活化、区画化、又は分解を介して発生するか、又はそれらの組み合わせにより発生する。遺伝子発現は、当分野に公知の任意の方法によりRNAレベルで、又はタンパク質レベルで測定することができ、ノーザン（RNA）ブロット、RT-PCR、ウェスタン（免疫）ブロット、又はin vitro、in situ、もしくはin vivoのタンパク質活性のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
遺伝物質：本明細書において使用される場合、「遺伝物質」という用語は、全ての遺伝子、ならびに例えばDNA及びRNAなどの核酸分子を含む。
【００６０】
阻害：本明細書において使用される場合、「阻害」という用語は、コード配列（例えば、遺伝子）に対する作用を記載するために使用される場合、当該コード配列から転写されたmRNAの細胞レベルにおける測定可能な低下を指し、及び／又はコード配列のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質産物の細胞レベルにおける測定可能な低下を指す。一部の例において、発現がほぼ消失するまで、コード配列の発現が阻害される場合がある。「特異的阻害」とは、特異的阻害が達成される細胞において、他のコード配列（例えば遺伝子）の発現に結果として影響を与えることなく、標的コード配列を阻害することを指す。
【００６１】
単離した：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸又はタンパク質）は、当該構成要素が天然に存在している、生物体の細胞中の他の生物学的構成要素（すなわち、他の染色体及び余剰染色体のＤＮＡならびにＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離され、から離れて生成され、又はから精製されている。「単離されている」核酸分子及びタンパク質としては、標準的な精製法により精製された核酸分子及びタンパク質が挙げられる。またこの用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸及びタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、及びペプチドを包含する。
【００６２】
核酸分子：本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、多量体型のヌクレオチドを指す場合があり、RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み、ならびにそれらの合成型及び混合型ポリマーを含む場合がある。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を指す場合がある。本明細書で使用されるとき、「核酸分子」は、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。別段の言及がない限り、核酸分子は通常、少なくとも１０塩基の長さである。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、その分子の５’末端から３’末端へと読まれる。ヌクレオチド配列の「相補配列」とは、当該ヌクレオチド配列の核酸塩基と塩基対を形成する核酸塩基（すなわち、A-T/U、及びG-C）の、５’から３’方向の配列を指す。核酸配列の「逆相補配列」とは、当該ヌクレオチド配列の核酸塩基と塩基対を形成する核酸塩基の、３’から５’方向の配列を指す。
【００６３】
「核酸分子」には、一本鎖型及び二本鎖型のDNA、一本鎖型のRNA、ならびに二本鎖型のRNA（dsRNA）が含まれる。「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖又は二本鎖のいずれかとしての核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を指す。「リボ核酸（RNA）」という用語は、iRNA（阻害的RNA）、dsRNA（二本鎖RNA）、siRNA（低分子干渉RNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、shRNA（低分子ヘアピンRNA）、miRNA（マイクロRNA）、hpRNA（ヘアピンRNA）、tRNA（トランスファーRNA、対応するアシル化アミノ酸での荷電、又は非荷電いずれも）、及びcRNA（相補的RNA）を含む。「デオキシリボ核酸」（DNA）という用語は、cDNA、ゲノムDNA、及びDNA-RNAハイブリッドを含む。「核酸セグメント」及び「ヌクレオチド配列セグメント」という用語、より大まかには「セグメント」という用語は、ゲノム配列、リボソームRNA配列、トランスファーRNA配列、メッセンジャーRNA配列、オペロン配列、及びペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする、又はコードするよう適合され得る、低分子改変ヌクレオチド配列を含む、機能的な用語として当分野の当業者により理解されている。
【００６４】
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの開裂により形成されてもよく、又は個々のヌクレオチド前駆体の重合により形成されてもよい。自動合成により、最大で数百塩基の長さのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるため、ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。DNA（オリゴデオキシリボヌクレオチド）から構成されるオリゴヌクレオチドを、DNA配列及びRNA配列（cDNAへと逆転写される）の増幅のための技術であるPCRにおいて使用してもよい。PCRにおいて、オリゴヌクレオチドは一般的に、DNAポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを延長して相補鎖を複製することを可能にする「プライマー」と称される。
【００６５】
核酸分子は、天然型、及び／又は非天然型のヌクレオチド結合によって、共に連結された天然型ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドのいずれか、又は両方を含んでもよい。核酸分子は化学的に、又は生化学的に修飾されてもよく、又は非天然型ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよいことが、当分野の当業者には容易に認識されるであろう。かかる修飾としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然型ヌクレオチドとアナログの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えばホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバマートなど；荷電結合：例えばチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステルなど；ペンデント部分（pendent moieties）：例えば、ペプチド；挿入剤：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレーター；アルキレーター；及び修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。また「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン化、環状、及び南京錠構造をはじめとするトポロジー構造の全てを含む。
【００６６】
本明細書においてDNAに関して使用される場合、「コード配列」、「構造的ヌクレオチド配列」、又は「構造的核酸分子」という用語は、適切な調整配列の制御下に置かれたときに、転写及びmRNAを介してポリペプチドへと最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。RNAに関しては、「コード配列」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質へと翻訳されるヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列としては、限定されないが、ゲノムDNA、cDNA、EST、及び組み換えヌクレオチド配列が含まれる。
【００６７】
ゲノム：本明細書において使用される場合、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に存在する染色体DNAを指し、また細胞の細胞内成分内に存在する細胞小器官DNAも指す。本発明の一部の実施形態において、DNA分子が植物細胞のゲノムへと組み込まれるように、DNA分子は植物細胞に導入されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、DNA分子は、植物細胞の核DNAに組み込まれてもよく、又は植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのDNAへと組み込まれてもよい。「ゲノム」という用語は、細菌に適用される場合、細菌細胞内の染色体及びプラスミドの両方を指す。本発明の一部の実施形態において、DNA分子が細菌のゲノムへと組み込まれるように、DNA分子は細菌に導入されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、DNA分子は、染色体に組み込まれていてもよく、又は安定プラスミドとして存在してもよく、又は安定プラスミド内に存在してもよい。
【００６８】
配列の同一性：２つの核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、規定の比較ウィンドウ上で最大一致で並べられたとき、２つの配列中の同一である残基を指す。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「配列同一性の割合」という用語は、最適に並べられた２つの配列（例えば核酸配列又はポリペプチド配列）を、比較ウィンドウ上で比較することにより決定される値を指す場合があり、この場合において比較ウィンドウの配列部分は、２配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加又は欠失を含んでいない）と比較し、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含有する場合がある。割合は、比較ウィンドウにおいて、同一のヌクレオチド残基又はアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定し、合致した位置の数を出し、合致した位置の数を位置の総数で割り、１００を掛けて配列同一性の割合を出すことにより算出される。参照配列に対する比較において、各位置で同一である配列は、当該参照配列に対し１００％同一であるとされ、逆もまた同じとなる。
【００７０】
比較のための配列アライメントの方法は当分野において公知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが記載されており、例えば以下がある：Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Ｂｉｏｌ．   48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Ｎａｔｌ．   Ａｃａｄ．   Ｓｃｉ．   U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Ａｐｐｌ．   Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Ｂｉｏｌ．  24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. 配列アライメント法及び相同性算出に関する詳細な検討については、例えば、下記に見出される：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．(1990) J. Mol. Ｂｉｏｌ．   215:403-410. 
【００７１】
The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAS（商標）; Altschul et al. (1990))は、いくつかの配列解析プログラムと関連した用途に対し、National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD)、及びインターネットをはじめとするいくつかの源から利用可能である。このプログラムを使用し、どのように配列同一性を決定するかについての説明は、インターネットのBLAST（商標）の「ヘルプ」の項で入手可能である。核酸配列の比較に関しては、BLAST「商標」（Blastn）の「Blast 2 sequences」機能を、デフォルトのパラメーターに設定されたデフォルトBLOSUM62マトリクスを使用して、用いることができる。この方法で評価する場合、参照配列に対して高い配列類似性を有する核酸配列は、高い割合の同一性を示す。
【００７２】
特異的ハイブリダイズの可能性／特異的相補性：本明細書において使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「特異的相補性」という用語は、核酸分子と標的核酸分子の間に安定で特異的な結合が発生するのに充分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子の間のハイブリダイゼーションは、当該２つの核酸分子の核酸配列の間の逆平行のアライメントの形成を含む。その後この２つの分子は逆鎖上の対応する塩基と水素結合を形成し、そしてもしこれが充分に安定であった場合には、当分野に公知の方法を使用して検出することが可能な二重鎖分子を形成することができる。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列に対して１００％相補的であることは必ずしも必要ではない。しかしながら、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない配列相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【００７３】
特定の程度のストリンジェンシーを生じさせるハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法の性質、及びハイブリダイズする核酸配列の組成と長さに応じて変化する。概して、ハイブリダイゼーションの温度、及びハイブリダイゼーションのイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋の濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。洗浄緩衝液のイオン強度及び洗浄温度もまた、ストリンジェンシーに影響を与える。特定のストリンジェンシーの程度を得るために必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する算定は当分野の当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11, and updates; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985.において検討されている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらに詳細な説明及びガイダンスは、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；及びAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995、及び改訂版に見出され得る。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション分子の配列と、標的核酸分子内の相同配列の間に、８０％を超える配列マッチがある場合にのみハイブリダイゼーションが発生する条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって本明細書において使用される場合、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、８０％を超える配列マッチを有する分子（すなわち、２０％未満のミスマッチを有する配列）がハイブリダイズする条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件は、９０％を超えるミスマッチを有する配列（すなわち、１０％未満のミスマッチを有する配列）がハイブリダイズする条件であり、及び「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、９５％を超えるマッチを有する配列（すなわち、５％未満のミスマッチを有する配列）がハイブリダイズする条件である。
【００７５】
以下は代表的な非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
【００７６】
高いストリンジェンシー条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：５ｘＳＳＣ緩衝液、６５℃、１６時間のハイブリダイゼーション；２ｘＳＳＣ緩衝液、室温で各々１５分間の洗浄を２回；及び０．５ｘＳＳＣ緩衝液、６５℃で各々２０分の洗浄を２回。
【００７７】
中程度のストリンジェンシー条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：５ｘ〜６ｘＳＳＣ緩衝液、６５℃〜７０℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘＳＳＣ緩衝液、室温で各々５〜２０分間の洗浄を２回；及び１ｘＳＳＣ緩衝液、５５℃〜７０℃で各々３０分の洗浄を２回。
【００７８】
非ストリンジェントな対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする）：６ｘＳＳＣ緩衝液、室温〜５５℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ〜３ｘＳＳＣ緩衝液、室温〜５５℃で各々２０〜３０分間の洗浄を少なくとも２回。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「実質的に相同」又は「実質的な相同性」という用語は、連続した核酸配列に関する場合、ストリンジェントな条件下で、参照核酸配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子により担持される連続したヌクレオチド配列を指す。例えば、配列番号１の参照核酸配列に対して実質的に相同である配列を有する核酸分子は、ストリンジェントな条件（例えば、上記に明記される中程度のストリンジェントな条件）下で、配列番号１の参照核酸配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子である。実質的に相同な配列は、少なくとも８０％の配列同一性を有していてもよい。例えば、実質的に相同な配列は、約８０％〜１００％の配列同一性を有していてもよく、例えば約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、及び約１００％の配列同一性を有していてもよい。実質的な相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関係している。例えば、特異的結合が望ましい条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性がある場合、核酸分子は特異的にはハイブリダイズ可能である。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「オルソログ」という用語は、共通の先祖ヌクレオチド配列から進化した、２個以上の種の遺伝子を指し、当該２個以上の種において同じ機能を保持している場合がある。
【００８１】
本明細書において使用される場合、５’から３’の方向で読まれた配列の各ヌクレオチドが、３’から５’の方向で読まれたときに、他の配列の各ヌクレオチドに対し相補的である場合、２つの核酸配列分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補配列に対し、配列同一性を示す。これらの用語及び記載は当分野においてよく定義されており、当分野の当業者には容易に理解される。
【００８２】
操作可能に連結された：第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能的関係性にあるとき、第一のヌクレオチド配列は第二の核酸配列と操作可能に連結されている。組み換えで作製された場合、操作可能に連結された核酸配列は多くの場合連続的であり、及び必要な場合には、２つのタンパク質のコード領域を同一のリーディングフレーム内で繋いでもよい（例えば、翻訳的に融合されたORF。）  しかしながら、核酸は、操作可能に連結されるために必ずしも連続ではない。
【００８３】
調節性配列及びコード配列に関し使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、当該調節性配列が、連結されたコード配列の発現に作用することを意味する。「調節性配列」又は「制御性エレメント」とは、関連するコード配列の転写、RNAのプロセッシングもしくは安定性、又は翻訳のタイミング、及びレベル／量に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節性配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終結配列ド、ポリアデニル化認識配列などが挙げられる。特定の調節性配列は、自身に操作可能に連結されたコード配列の上流及び／又は下流に位置している場合がある。また、コード配列に操作可能に連結された特定の調節性配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置する場合もある。
【００８４】
プロモーター：本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、転写の開始部分から上流にある場合があるDNAの領域、ならびにRNAポリメラーゼ及び転写を開始させる他のタンパク質の認識及び結合に関与する場合があるDNAの領域を指す。プロモーターは、細胞における発現のためにコード配列に操作可能に連結されてもよく、又はプロモーターは、細胞における発現のためにコード配列に操作可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されてもよい。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターであってもよい。発生制御下のプロモーターの例としては、例えば葉、根、種、繊維、導管、仮道管、又は厚膜組織などの特定の組織において転写を優先的に開始させるプロモーターが挙げられる。かかるプロモーターは、「組織優先的」と呼称される。特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターは、「組織特異的」と呼称される。「細胞型特異的」プロモーターは主に、例えば根又は葉の管細胞などの１つ以上の器官の特定の細胞型における発現を誘導する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである場合がある。誘導性プロモーターによる転写を開始させることができる環境条件の例としては、嫌気的条件、及び光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、及び誘導性のプロモーターは、「非構造性」プロモーターに分類を構成する。「構造性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であり得、又はほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
【００８５】
任意の誘導性プロモーターを本発明の一部の実施形態に使用することができる。誘導性プロモーターに関しては、Ward et al. (1993) Plant Mol. Ｂｉｏｌ．   22:361-366.を参照のこと。転写率は、誘導剤に応じて増加する。例示的な誘導性プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：銅に反応するACEI系由来のプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に反応する、トウモロコシ由来のIn2遺伝子；Tn10由来のTetリプレッサー；及びステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーター。その転写活性は、グルココルチコステロイドホルモンによる誘導され得る（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425）。
【００８６】
例示的な構造性プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV:Cauliflower Mosaic Virus)由来の35Sプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター；イネのアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；pEMU；MAS；トウモロコシH3ヒストンプロモーター；及びALSプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ALS3構造遺伝子に対して５’のXba1/NcoI断片(又は前記Xba1/NcoI断片に類似のヌクレオチド配列)（米国特許5,659,026号)。
【００８７】
さらに、任意の組織特異的プロモーター、又は組織優先的プロモーターを、本発明の一部の実施形態に使用することができる。組織特異的プロモーターに操作可能に連結されたコード配列を含有する核酸分子で形質転換された植物は、特定の組織において限局的に、又は優先的にコード配列の産物を産生することができる。例示的な組織特異的プロモーター又は組織優先的プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えばファセオリン（phaseolin）遺伝子由来のプロモーターなどの種子優先的プロモーター；例えばcab又はrubisco由来のプロモーターなどの、葉特異的プロモーター及び光誘導性プロモーター；例えばLAT52由来のプロモーターなどの葯特異的プロモーター；例えばZm13由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター；及び例えばapg由来のプロモーターなどの小胞子優先的プロモーター。
【００８８】
ダイズ植物：本明細書において使用される場合、「ダイズ植物」という用語は、ダイズ（Glycine max）を含むGlycine sp.の植物を指す。
【００８９】
綿花植物  本明細書において使用される場合、「綿花植物」という用語は、Gossypium種の植物を指す。
【００９０】
形質転換：本明細書において使用される場合、「形質転換（transformation）」又は「形質導入(transduction)」という用語は、１つ以上の核酸分子を細胞内へと移送させることを指す。細胞ゲノムへの核酸分子の組み込み、又はエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞により安定的に複製されるようになったとき、細胞内に導入された核酸分子により細胞は「形質転換」されている。本明細書において使用される場合、「形質転換」という用語は、かかる細胞内に核酸分子を導入することができる全ての技術を包含している。例としては限定されないが、以下が挙げられる：ウイルスベクターを用いたトランスフェクション法；エレクトロポレーション法(Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793)；リポフェクション法(Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417)；マイクロインジェクション法(Mueller et al. (1978) Cell 15:579-585)；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入(Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807)；直接的なDNA取り込み；及び微粒子銃 (Klein et al. (1987) Nature 327:70)。
【００９１】
導入遺伝子：外因性核酸配列。一部の例において、導入遺伝子は、半翅目害虫に存在する核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含有するdsRNAの一方の鎖又は両方の鎖をコードする配列であってもよい。さらなる例において、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列であってもよく、この場合において当該アンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。よりさらなる例では、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、産業的又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、又は望ましい農学的形質をコードする遺伝子であってもよい。これら、及び他の例において、導入遺伝子は、当該導入遺伝子のコード配列に操作可能に連結されている制御配列を含有してもよい（例えば、プロモーター）。
【００９２】
ベクター：核酸分子が細胞に導入されると、例えば形質転換細胞が生成される。ベクターは、例えば複製起源などの、宿主細胞で自身を複製することができるようになる核酸配列を含有してもよい。ベクターの例としては、細胞内に外因性DNAを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。またベクターはRNA分子であってもよい。またベクターは、１つ以上の遺伝子、アンチセンス配列、及び／又は選択マーカー遺伝子、ならびに当分野に公知の他の遺伝エレメントを含有してもよい。ベクターが、細胞に形質導入し、形質転換し、又は感染することにより、当該細胞が、ベクターにコードされた核酸分子及び／又は蛋白質を発現してもよい。ベクターは任意で、細胞内への核酸の侵入の実現を補助するための物質を含む（例えば、リポソーム、タンパク質、コーティングなど）。
【００９３】
収率：同条件下、同じ増殖場所で同じ時間で増殖した基準型の収率と比較した、約１００％以上の安定した収率。特定の実施形態において、「改善された収率」又は「収率を改善する」とは、同条件下、同じ時間で生育した作物に対して有害である半翅目害虫の有意な密度を含有する、同じ生育場所での基準型の収率に対し、１０５％〜１１５％以上の安定した収率を有する栽培品種を意味する。
【００９４】
具体的に指示、又は暗示されたことを除き、「a」、「an」、及び「the」は、本明細書において使用される場合、「少なくとも１つ」を示す。
【００９５】
具体的に別段の説明がなされない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者により普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学の普遍的な用語の定義については、例えば、以下に見出される：Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及びMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology:  Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）．全ての割合は重量によるものであり、すべての溶媒混合物の比率は、別段の記載がない限り体積によるものである。全ての温度はセ氏である。
【００９６】
IV. 半翅目害虫の配列を含有する核酸分子
A. 概要
本明細書において、半翅目害虫の制御に有用な核酸分子が記載される。記載される核酸分子は、標的配列（例えば、天然遺伝子、及び非コード配列）、dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、及びmiRNAを含む。例えば、一部の実施形態において、半翅目害虫の１つ以上の天然核酸配列のすべて、又は一部に対し特異的に相補的であり得るdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNA分子が記載される。これら、及びさらなる例において、天然核酸配列は、１つ以上の標的遺伝子であってもよく、その産物は例えば限定されないが、代謝プロセスに関与してもよく、繁殖プロセスに関与してもよく、又は若虫の発達に関与してもよい。本明細書に記載される核酸分子は、当該核酸分子が特異的に相補的である天然核酸配列を少なくとも１つ含有する細胞へと導入される場合、当該細胞においてRNAiを開始させ、その結果として当該天然核酸配列の発現を低下又は消失させることができる。一部の例において、特異的に相補的な配列を含有する核酸分子による標的遺伝子の発現低下又は発現消失は、半翅目害虫において致死性であってもよく、又は成長、及び／もしくは繁殖の低下を生じさせ得る。
【００９７】
一部の実施形態において、半翅目害虫において少なくとも１つの標的遺伝子が選択されてもよく、この場合において当該標的遺伝子は、thread（配列番号１）を含有するヌクレオチド配列を含有する。特定の実施形態において、半翅目害虫において標的遺伝子が選択され、この場合において当該標的遺伝子は、thread（配列番号１）を含有する新規ヌクレオチド配列を含有する。
【００９８】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、thread（配列番号１）のタンパク質産物のアミノ酸配列に対し、少なくとも約８５％同一（例えば、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又は１００％同一）である連続したアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子であってもよい。標的遺伝子は、半翅目害虫の任意の核酸配列であってもよく、その転写後阻害は、半翅目害虫に対し有害な影響を与え、又は植物に対し半翅目害虫に対する防御的利益を与える。特定の例において、標的遺伝子は、新規ヌクレオチド配列、配列番号１のタンパク質産物のアミノ酸配列に対し、少なくとも約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約１００％同一、又は１００％同一である連続したアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子である。
【００９９】
本発明により核酸配列が提供され、その発現は、半翅目害虫のコード配列によりコードされる天然RNA分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列を含有するRNA分子を生じさせる。一部の実施形態において、半翅目害虫による発現RNA分子の摂取後、当該半翅目害虫の細胞内において、コード配列の下方制御を得ることができる。特定の実施形態において、半翅目害虫の細胞におけるコード配列の下方制御により、当該半翅目害虫の成長、活性、増殖、及び／又は繁殖に対し有害な作用が生じ得る。
【０１００】
一部の実施形態において、標的配列としては、例えば５’UTR、３’UTR、スプライスリーダー配列、イントロン配列、アウトロン配列（例えば、トランススプライシングにおいてその後に改変される５’UTR  RNA）、ドナトロン（donatrons）配列（例えば、トランススプライシングにドナー配列を提供するために必要とされる非コードRNA）、及び標的半翅目害虫遺伝子の他の非コード転写RNAなどの転写非コードRNA配列が挙げられる。かかる配列は、モノシストロニックな遺伝子、及びポリシストロニックな遺伝子の両方から誘導することができる。
【０１０１】
したがって、本明細書において、一部の実施形態に関連し、半翅目害虫の標的配列のすべて又は一部に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列を少なくとも１つ含有するiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）が記載される。一部の実施形態において、iRNA分子は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の標的配列などの複数の標的配列のすべて又は一部に相補的なヌクレオチド配列を含有してもよい。特定の実施形態において、iRNA分子は、例えば植物又は細菌などの遺伝子改変生物体により、in vitro又はin vivoで生成されてもよい。半翅目害虫の標的核酸のすべて又は一部に特異的に相補的な、dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及び／又はhpRNA分子の生成に有用であり得るcDNA配列が開示される。さらに、特定の宿主標的の安定な形質転換の実現における使用のための組み換えDNA構築物が開示される。形質転換された宿主標的は、組み換えDNA構築物から、有効レベルのdsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、及び／又はhpRNA分子を発現することができる。したがって、植物細胞において機能する異種プロモーターに操作可能に連結されているヌクレオチド配列を少なくとも１つ含有する植物形質転換ベクターが記載され、この場合において当該ヌクレオチド配列の発現により、半翅目害虫の標的配列のすべて又は一部に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列を含有するRNA分子が生じる。
【０１０２】
一部の実施形態において、半翅目害虫の制御に有用な核酸分子としては、以下が挙げられる：thread (配列番号１)を含有するユースキスツス（Euschistus heros）から単離された天然核酸配列のすべて又は一部；発現されたときに、thread（配列番号１）によりコードされる天然RNA分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列を含有するRNA分子を生じさせるヌクレオチド配列；thread（配列番号１）のすべて又は一部に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列を少なくとも1つ含有するiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）；thread（配列番号１）のすべて又は一部に対し特異的に相補的なdsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、及び／又はhpRNA分子の生成に使用され得るcDNA配列；及び特定の宿主標的の安定的な形質転換の実現における使用のための組み換えDNA構築物であって、形質転換された宿主標的が前述の核酸分子のうちの１つ以上を含有する組み換えDNA構築物。
【０１０３】
threadは、生物体のアポトーシスを阻害するアポトーシス阻害因子（IAP：inhibitor of apoptosis）タンパク質ファミリーに属している。IAPは、アポトーシスカスケードの主要な中断要因であり、従って、細胞死の主要な分子スイッチである。IPAによるアポトーシスの阻害は、プログラム化細胞死の執行物質であるカスパーゼへの直接結合により発生する。細胞のアポトーシス性分解はカスパーゼにより行われる。カスパーゼは、アスパラギン酸残基で基質を開裂するシステインプロテアーゼファミリーである。健常な細胞では、カスパーゼの活性は、IAPの直接的結合又は間接的活性のいずれかにより抑制状態となっている。哺乳類には、８種のIAPが存在する：NAIP、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、サバイビン、Apollon/Bruce、ML-IAP/livin、及びILP-2である これらのタンパク質の中で、c-IAP1、c-IAP2、ML-IAP、及びXIAPはアポトーシスの制御に直接かかわっている。このファミリーの他のメンバーは、例えば細胞サイクルや炎症反応などのプロセスを制御している。サバイビンは、癌治療の重要な標的となるIAPである。ショウジョウバエ（Drosophila）にはたった４つのIAPしか存在しない：DAIP1/thread、DAIP2、dBRUCE、及びDeterinである。threadは、細胞及び生物体の活性に関し、群を抜いて最も重要なIAPである。ショウジョウバエのthread変異体は、極めて多量のアポトーシスにより、胚形成の早期段階で死亡する(Wang et al. (1999) Cell 98 (4):453-63 ; Lisi et al.(2000) Genetics 154 (2):669-78 ; Goyalet al. (2000) EMBO J 19 (4):589-97)。さらに、細胞培養での二本鎖RNA（dsRNA）のスクリーニングにより、threadが、ミバエ（fruit fly)のゲノム中の最も致死性のRNAi遺伝子標的の１つであることが明らかになった(Boutros et al.(2004) Science 303 (5659):832-5 ; Chewet al. (2009) Nature 460 (7251):123-7)。半翅目害虫のサビイロカスミカメムシ（Lygus lineolaris）において、threadを標的とするdsRNAを注入することにより、死がもたらされた(Walker Iii and Allen (2011) Entomologia Experimentalis et Applicata 138 (2):83-92)が、threadの経口摂食では、この害虫には有効ではなかった(Allen and Walker (2012) J Insect Physiol 58 (3):391-6)。threadは、アポトーシス細胞死カスパーゼの抑制に関与するE3ユビキチンリガーゼである。IAPタンパク質は、１〜３個のバキュロウイルスIAPリピート（BIR）ドメインの存在により特徴づけられる。ショウジョウバエ（Drosophila）のIAP1は、２つのBIRドメインと、１つのE3ユビキチンリガーゼRING（Really Interesting New Gene）フィンガードメインを含有している。IAPは、BIRドメインを介してカスパーゼに直接結合することができ、それによりカスパーゼの機能を阻害する。またIAPは、自身のRINGドメインを使用したユビキチン化を介して、タンパク質を分解の標的とすることができる。IAPのBIRドメインもまた、アポトーシス促進性のタンパク質を相互作用する（例えば、hid、reaper、及びgrim）。
【０１０４】
B.核酸分子
本発明は、特に、半翅目害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害するiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）を提供するものであり、及び半翅目害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害する、細胞又は微生物においてiRNA分子として発現されることができるDNA分子を提供するものである。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又はそれ以上）含有する単離された核酸分子を提供するものである：配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。特定の実施形態において、半翅目害虫による、単離核酸配列との接触、又は取り込みは、当該半翅目害虫の成長、発達、繁殖及び／又は摂食を阻害する。
【０１０６】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、細胞又は微生物においてiRNA分子として発現されることができるDNA配列を少なくとも１つ（例えば、１、２、３又はそれ以上）含有し、半翅目害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害することができる。かかるDNA配列は、DNA分子を含有する細胞において機能するプロモーター配列に操作可能に連結され、dsRNA分子を形成することができるコード化RNAの転写を開始する、又は増強することができる。１つの実施形態において、少なくとも１つ（例えば、１、２、３又はそれ以上）のDNA配列は、配列番号１を含有するヌクレオチド配列から誘導されてもよい。配列番号１の誘導体は、配列番号１の断片を含有する。一部の実施形態において、かかる断片は例えば、配列番号１、又はその相補配列の少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを含有してもよい。従って、かかる断片は、例えば配列番号１、又はその相補配列の１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含有してもよい。これら、及びさらなる実施形態において、かかる断片は例えば、配列番号１、又はその相補配列の約１５個超の連続したヌクレオチドを含有してもよい。従って、配列番号１の断片は例えば、配列番号１又はその相補配列の１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、約２５個（例えば、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、及び２９個）、約３０個、約４０個、（例えば、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、及び４５個）、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含有してもよい。
【０１０７】
一部の実施形態は、半翅目害虫に部分的又は完全に安定化したdsRNA分子を導入し、当該半翅目害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害することを含む。iRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）として発現され、半翅目害虫により取り込まれる場合、配列番号１の１つ以上の断片を含有する核酸配列は、半翅目害虫の死、成長阻害、性比の変化、一腹子数の減少、感染の停止、及び／又は摂食の停止のうちの１つ以上を生じさせることができる。例えば、一部の実施形態において、半翅目害虫の標的遺伝子配列に対し実質的に相同な約１５個〜約３００個又は約１９個〜約３００個のヌクレオチドを含有するdsRNA分子、及び配列番号１を含有するヌクレオチド配列の１つ以上の断片を含有するdsRNA分子が提供される。かかるdsRNA分子の発現により、例えば、当該dsRNA分子を取り込んだ半翅目害虫の死亡及び／又は成長阻害がもたらされてもよい。
【０１０８】
ある実施形態において、本発明により提供されるdsRNA分子は、配列番号１を含有する標的遺伝子に対し相補的なヌクレオチド配列、及び／又は配列番号１の断片に対し相補的なヌクレオチド配列を含有し、半翅目害虫においてその標的遺伝子を阻害することにより、半翅目害虫の成長、発達、又は他の生物学的機能に必須であるタンパク質又はヌクレオチド配列の低下又は除去が生じる。選択されたヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号１に明記されるヌクレオチド配列の連続した断片、又は前述のいずれかの相補配列に対し、約８０％〜約１００％の配列同一性を示してもよい。例えば、選択されたヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号１に明記されるヌクレオチド配列の連続した断片、又は前述のいずれかの相補配列に対し、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％  約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、又は約１００％の配列同一性を示してもよい。
【０１０９】
一部の実施形態において、細胞又は微生物中でiRNA分子として発現され、標的遺伝子の発現を阻害することができるDNA分子は、１つ以上の標的半翅目害虫種に存在する天然核酸配列のすべて又は一部に対し特異的に相補的な単一のヌクレオチド配列を含有してもよく、又は当該DNA分子は、複数のかかる特異的に相補的な配列からキメラとして構築されることができる。
【０１１０】
一部の実施形態において、核酸分子は、「スペーサー配列」により分離された第一及び第二のヌクレオチド配列を含有してもよい。スペーサー配列は、それが望ましい場合に、第一及び第二のヌクレオチド配列の間の二次構造の形成を促進する任意のヌクレオチド配列を含有する領域であってもよい。１つの実施形態において、スペーサー配列は、mRNAに対するセンス、又はアンチセンスのコード配列の一部である。あるいはスペーサー配列は、核酸分子に共有結合されることができるヌクレオチド又はそのホモログの任意の組み合わせを含有してもよい。
【０１１１】
例えば、一部の実施形態において、DNA分子は、１つ以上の異なるRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含有してもよく、この場合において当該異なるRNA分子の各々は、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列を含有し、この場合において当該第一及び第二のヌクレオチド配列は互いに相補的である。第一及び第二のヌクレオチド配列は、スペーサー配列によりRNA分子内で繋がれていてもよい。スペーサー配列は、第一のヌクレオチド配列、または第二のヌクレオチド配列の一部を構成してもよい。第一及び第二のヌクレオチド配列を含有するRNA分子の発現は、第一と第二のヌクレオチド配列の特異的な塩基対形成により、本発明のdsRNA分子の形成を誘導することができる。第一のヌクレオチド配列、または第二のヌクレオチド配列は、半翅目害虫に固有の核酸配列（例えば標的遺伝子又は転写非コード配列）、その誘導体、又はそれらの相補配列に対して、実質的に同一であってもよい。
【０１１２】
dsRNA核酸分子は、多量体化リボヌクレオチド配列の二本鎖を含有し、及びリン酸−糖の主鎖又はヌクレオシドのいずれかに対し修飾を含んでもよい。RNA構造における修飾を調節し、特異的阻害を可能にしてもよい。１つの実施形態において、dsRNA分子は、siRNA分子が生成されるよう、ユビキタスな酵素プロセスを経て修飾されてもよい。この酵素プロセスは、例えば真核生物のDICERなどのRNaseIII酵素を、in vitro又はin vivoのいずれかで利用してもよい。 Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; and Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952を参照のこと。DICER又は機能的に同等のRNaseIII酵素は、大きなdsRNA鎖及び／又はhpRNA分子を、小さなオリゴヌクレオチド（例えば、siRNA）へと開裂し、小さな各ヌクレオチドは約１９〜２５ヌクレオチドの長さである。これらの酵素により生成されたsiRNA分子は、２〜３個のヌクレオチド３’オーバーハング、ならびに５’リン酸末端、及び３’ヒドロキシル末端を有している。RNaseIII酵素により生成されたsiRNA分子はほどかれ、細胞中で一本鎖RNAへと分離される。次いでsiRNA分子は、標的遺伝子から転写されたRNA配列に特異的にハイブリダイズし、両RNA分子はその後、固有の細胞性RNA分解メカニズムにより分解される。このプロセスによって、標的生物において、標的遺伝子によりコードされたRNA配列の効果的な分解又は除去がもたらされ得る。この結末は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。一部の実施形態において、異種核酸分子から内因性RNaseIII酵素により生成されたsiRNA分子は、半翅目害虫において標的遺伝子の下方制御を効率的に調節することができる。
【０１１３】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、in vivoで、分子間ハイブリダイゼーションを介してdsRNA分子を形成することができる一本鎖RNA分子へと転写されることができる非天然型ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含有してもよい。かかるdsRNAは多くの場合、自己アセンブリし、半翅目害虫の栄養源中で提供され、標的遺伝子の転写後阻害を実現することができる。これら、及びさらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、２つの異なる非天然型ヌクレオチド配列を含有してもよく、それら各々は、半翅目害虫中の異なる標的遺伝子に対し特異的に相補的である。かかる核酸分子がdsRNA分子として半翅目害虫にもたらされる場合、当該dsRNA分子は、半翅目害虫中の少なくとも２つの異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【０１１４】
C.核酸分子の取得
半翅目害虫の様々な天然配列を、例えばiRNA、及びiRNAをコードするDNA分子などの本発明の核酸分子の設計に対する標的配列として使用してもよい。しかしながら天然配列の選択は、容易な道ではない。半翅目害虫の少数の天然配列のみが、有効な標的である。例えば、特定の天然配列が本発明の核酸分子により有効に下方制御され得るか否かを確信をもって予測することはできず、又は特定の天然配列の下方制御が半翅目害虫の成長、活性、増殖、及び／又は繁殖に対し有害な作用を有しているか否かを確信をもって予測することはできない。半翅目害虫の天然配列、例えばそれらから単離されたEST（例えば、米国特許第7,612,194号及び米国特許第7,943,819号）などの大部分が、例えばBSB、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、アオカメムシ（Chinavia hilare）、茶色カメムシ（Euschistus servus）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus,）、エデッサ・メディタブンダ（Edessa meditabunda）、新熱帯カタアカカメムシ（Thyanta perditor）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）、ワタムシ（Horcias nobilellus）、タエディア・スティグモサ（Taedia stigmosa）、ディスデルクス・ペルビアヌス（Dysdercus peruvianus）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）、レプトグロッサス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）、ニエストレア・シデ（Niesthrea sidae）、サビイロカスミカメムシ（Lygus hesperus）、及びリグス・リネオラリス（Lygus lineolaris）などの半翅目害虫の成長、活性、増殖、及び・又は繁殖に対し有害な影響を有していない。
【０１１５】
半翅目害虫に対し有害な作用を有する天然配列であって、宿主植物中でかかる天然配列に対し相補的な核酸分子を発現させるための組み換え技術に使用することができ、当該宿主植物に対し害を及ぼすことなく摂食することで半翅目害虫に対し有害作用をもたらすことを予測できるものはない。
【０１１６】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子（例えば、半翅目害虫の宿主植物にもたらされるdsRNA分子）は、半翅目害虫の生存に必須なタンパク質又はタンパク質部分、例えば代謝又は触媒の生化学的経路、細胞分割、繁殖、エネルギー代謝、消化、宿主植物認識などに関与するアミノ酸配列をコードするcDNA配列を標的とするように選択される。本明細書に記載されるように、１つ以上のdsRNAを含有する組成物を標的生物体が摂取することによって、標的の死又は他の阻害がもたらされ得、その少なくとも１つのセグメントは、当該標的害虫生物体の細胞中で産生されるRNAの少なくとも実質的に同一のセグメントに対し特異的に相補的である。半翅目害虫に由来する、DNA又はRNAいずれかのヌクレオチド配列を使用して、当該半翅目害虫による寄生に対する抵抗性を植物細胞に構築することができる。半翅目害虫の宿主植物（例えば、トウモロコシ（Z. mays）、又はダイズ（G. max））を例えば形質転換し、本明細書に提示される半翅目害虫に由来するヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含有させることができる。宿主へと形質転換されるヌクレオチド配列は、形質転換される宿主内の細胞又は生物学的液体中でdsRNA配列を形成するRNAを１つ以上コードしてもよく、それによって、半翅目害虫がトランスジェニック宿主と栄養学的関係性を形成するとき／形成した場合に、dsRNAを利用可能な状態とすることができる。その結果、半翅目害虫の細胞内で１つ以上の遺伝子の発現の抑制が生じ、最終的には死、又はその成長もしくは発達の阻害がもたらされ得る。
【０１１７】
従って一部の実施形態において、半翅目害虫の成長、発達、及び繁殖に本質的に関与する遺伝子が標的とされる。本発明で使用するための他の標的遺伝子としては、例えば、半翅目害虫の活性、動作、移動、成長、発達、感染性、餌場の確立、及び繁殖に重要な役割を果たす遺伝子が挙げられる。ゆえに標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子又は転写因子であってもよい。さらに、本発明で使用するための半翅目害虫の天然ヌクレオチド配列は、植物、ウイルス、細菌、又は昆虫の遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から誘導されてもよく、その機能は当分野の当業者に公知であり、そのヌクレオチド配列は標的半翅目害虫のゲノム中の標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションによって、既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを特定する方法は、当分野の当業者に公知である。
【０１１８】
一部の実施形態において、本発明は、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）分子を生成するためのヌクレオチド配列を含有する核酸分子を取得する方法を提供するものである。かかる実施形態の１つは以下を含有する：（a）半翅目害虫におけるdsRNA介在性遺伝子抑制に対する、その発現、機能、及び表現型に関し、１つ以上の標的遺伝子を解析すること；（b）dsRNA介在性抑制解析において、成長又は発達の表現型の改変（例えば、低下）を示す、標的半翅目害虫由来のヌクレオチド配列もしくはそのホモログのすべて又は一部を含有するプローブを用いて、cDNA又はgDNAライブラリーをプロービングすること；（c）プローブと特異的にハイブリダイズするDNAクローンを特定すること；（d）工程（b）で特定されたDNAクローンを単離すること；（e）工程（d）で単離されたクローンを含有するcDNA断片又はgDNA断片を配列解析することであって、配列解析された核酸分子がRNA配列又はそのホモログのすべて又は実質的な部分を含有していること；及び（f）遺伝子、又はsiRNA、もしくはmiRNA、もしくはhpRNA、もしくはmRNA、もしくはshRNA、もしくはdsRNAのすべて又は実質的な部分を化学合成すること。
【０１１９】
さらなる実施形態において、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）分子の実質的な部分を生成するためのヌクレオチド配列を含有する核酸断片を取得する方法は以下を含む：（a）標的半翅目害虫由来の天然ヌクレオチド配列の一部に特異的に相補的な第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；及び（b）工程（a）の第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するcDNA挿入又はgDNA挿入を増幅させることであって、増幅された核酸分子は、siRNA、shRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、又はdsRNA分子の実質的な部分を含有していること。
【０１２０】
本発明の核酸は、多くの方法により単離、増幅、又は生成することができる。例えば、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びhpRNA）分子は、gDNAライブラリー又はcDNAライブラリーから誘導された標的核酸配列（例えば、標的遺伝子、又は標的転写非コード配列）、又はその一部のPCR増幅により取得されてもよい。DNA又はRNAは、標的生物体から抽出されてもよく、及び核酸ライブラリーは、当分野の当業者に公知の方法を使用して、DNA又はRNAから調製されてもよい。標的生物体から作製されたgDNA又はcDNAのライブラリーは、標的遺伝子のPCR増幅及び配列解析に使用されてもよい。確認されたPCR産物は、最小プロモーターを用いてセンスRNA及びアンチセンスRNAを生成するためのin vitro転写のための鋳型として使用されてもよい。あるいは、核酸分子は、例えばホスホラミダイト化学などの標準的な化学法を用いた、自動化DNA合成装置（例えばP.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.)のモデル392又は394 DNA/RNA合成装置）の使用をはじめとする多くの技術のうちのいずれかにより合成されてもよい（例えば、Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214；及びAgrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423を参照のこと）。例えば、Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311；米国特許第4,415,732号、第4,458,066号、第4,725,677号、第4,973,679号、及び第4,980,460号を参照のこと。例えばホスホロチオアート、ホスホラミダートなどの非天然主鎖基を生じさせる別の化学法を使用することもできる。
【０１２１】
本発明のRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、又はhpRNA分子は、手動又は自動化された反応を介して、又は当該RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、又はhpRNA分子をコードする配列を含有する核酸分子を含有する細胞においてin vivoで、当分野の当業者により化学的に又は酵素的に作製することができる。RNAはまた、部分的に、又はすべて有機合成により作製することもでき、任意の修飾リボヌクレオチドをin vitro酵素合成法又は有機合成法により導入することができる。RNA分子は、細胞性RNAポリメラーゼ又はバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラーゼ）により合成することができる。ヌクレオチド配列のクローニング及び発現に有用な発現構築物は当分野に公知である。例えば、米国特許第5,593,874号、第5,693,512号、第5,698,425号、第5,712,135号、第5,789,214号、及び第5,804,693号を参照のこと。化学的に合成されたRNA分子、又はin vitro酵素合成により合成されたRNA分子は、精製された後に細胞に導入されてもよい。例えば、RNA分子は溶媒又は樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせにより、混合物から精製されることができる。あるいは、化学的に合成されたRNA分子、又はin vitro酵素合成により合成されたRNA分子は、サンプル処理を原因とするロスを回避するために、精製無しで、又は最低限の精製で使用されてもよい。RNA分子は、保管のために乾燥されてもよく、又は水溶液に溶解されてもよい。溶液は、dsRNA分子の二重鎖のアニーリング、及び／又は安定化を促進させる緩衝液又は塩を含有してもよい。
【０１２２】
複数の実施形態において、dsRNA分子は、単一の自己相補的RNA鎖により形成されてもよく、又は２つの相補的RNA鎖から形成されてもよい。dsRNA分子は、in vivo又はin vitroのいずれかで合成されてもよい。細胞の内因性RNAポリメラーゼは、in vivoで１つ又は２つのRNA鎖の転写を調節することができ、又はクローン化RNAポリメラーゼを使用して、in vivo又はin vitroで転写を調節することができる。半翅目害虫の標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織、又は細胞型における特異的転写により（例えば組織特異的プロモーターにより）；宿主の環境条件の刺激により（例えば、感染、ストレス、温度、及び／又は化学的誘導物質に反応性の誘導性プロモーターを使用することにより）；及び／又は宿主の発達段階又は齢で転写を操作することにより（例えば、発達段階特異的プロモーターを使用することにより）、宿主−標的化されてもよい。dsRNA分子を形成するRNA鎖は、in vitro又はin vivoのいずれで転写されていてもよく、ポリアデニル化されても、されなくてもよく、及び細胞の翻訳機構によりポリペプチドへと翻訳されることができても、できなくてもよい。
【０１２３】
D.組み換えベクター及び宿主細胞の形質転換
一部の実施形態において、本発明はまた、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、又は植物細胞）への導入のためのDNA分子を提供するものであり、当該DNA分子はRNAへと発現され、半翅目害虫により摂取されることで、当該半翅目害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の抑制を実現させるヌクレオチド配列を含有する。したがって、一部の実施形態は、植物細胞においてiRNA（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）分子として発現されることができ、半翅目害虫において標的遺伝子の発現を阻害する核酸配列を含有する組み換え核酸分子を提供するものである。発現を開始させ、又は増強させるために、かかる組み換え核酸分子は、１つ以上の制御配列を含有してもよく、その制御配列はiRNAとして発現されることができる核酸配列に操作可能に連結されていてもよい。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は公知であり、その方法を用いて本発明のヌクレオチド配列を発現させることができる。例えば、国際特許出願公開WO06/073727、及び米国特許出願公開2006/0200878 Alを参照のこと。
【０１２４】
特定の実施形態において、本発明の組み換えDNA分子は、dsRNA分子をコードする核酸配列を含有してもよい。かかる組み換えDNA分子は、摂取することで、半翅目害虫の細胞において内因性標的遺伝子の発現を阻害することができるdsRNA分子をコードしてもよい。多くの実施形態において、転写されたRNAは、安定化した形態、例えば、ヘアピンアンドステムアンドループ構造として提供され得るdsRNA分子を形成してもよい。
【０１２５】
これら、及びさらなる実施形態において、dsRNA分子の１つの鎖は、配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、からなるヌクレオチド配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列からの転写により形成されてもよい。
【０１２６】
特定の実施形態において、dsRNA分子をコードする組み換えDNA分子は、転写される配列内に少なくとも２つのヌクレオチド配列のセグメントを含有してもよく、かかる配列は、転写される配列が、少なくとも１つのプロモーターに対してセンス方向にある第一のヌクレオチド配列セグメントを含有し、及び第二のヌクレオチド配列セグメント（第一のヌクレオチド配列がセグメントの相補配列を含有する）はアンチセンス方向となるように配置され、この場合においてセンスヌクレオチド配列セグメント及びアンチセンスヌクレオチド配列セグメントは、約５（〜５）個〜約１０００（〜１０００）個のヌクレオチドのスペーサー配列セグメントにより連結され、又は繋がれている。スペーサー配列は、センス配列セグメントとアンチセンス配列セグメントの間にループを形成してもよい。センスヌクレオチド配列セグメントとアンチセンスヌクレオチド配列セグメントは、標的遺伝子（例えば、配列番号１を含有する遺伝子）のヌクレオチド配列、又はその断片に対し実質的に相同であってもよい。しかしながら一部の実施形態において、組み換えDNA分子は、スペーサー配列が無いdsRNA分子をコードしてもよい。複数の実施形態において、センスコード配列、及びアンチセンスコード配列は異なる長さであってもよい。
【０１２７】
半翅目害虫に対し有害な作用を有するとして特定された配列、又は半翅目害虫に関し植物防御的効果を有するとして特定された配列は、本発明の組み換え核酸分子中の適切な発現カセットの作製を通して、容易に発現されるdsRNA分子へと組み込まれ得る。例えば、かかる配列は、標的遺伝子配列（例えば、配列番号１、及びその断片）に対応する第一のセグメントを取り込み；この配列を、第一のセグメントに対し相同ではない、又は相補的ではない第二のセグメントのスペーサー領域に連結させ；及び第三のセグメントにこれを連結させることであって、第三のセグメントの少なくとも一部は第一のセグメントに対し実質的に相補的である、ことにより、ステムアンドループ構造を伴うヘアピン構造として発現されることができる。かかる構築物は、第一のセグメントと第三のセグメントの分子内塩基対形成によってステムアンドループ構造を形成し、この場合において当該ループ構造は第二のセグメントを形成し、及び含有する。例えば、米国特許出願公開2002/0048814及び2003/0018993、ならびに国際特許PCT出願公開WO94/01550及びWO98/05770を参照のこと。dsRNA分子は、例えばステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）などの二本鎖構造の形態で生成されてもよく、それによって、半翅目害虫の天然配列に対し標的化されたsiRNAの作製が、例えばsiRNA生成の増強をもたらす、又はdsRNAヘアピンプロモーターの転写後遺伝子サイレンシングを阻むメチル化を低下させる、追加の植物発現用カセット上での当該標的化遺伝子断片の共発現により増強される。
【０１２８】
本発明の特定の実施形態は、半翅目害虫の阻害レベルの１つ以上のiRNA分子の発現を実現させるための、植物への本発明の組み換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組み換えDNA分子は、例えば直線状プラスミド又は閉環状プラスミドなどのベクターであってもよい。ベクターシステムは、単一のベクターもしくはプラスミド、又は宿主ゲノムへと導入される総DNAを共に含有している２以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。さらに、ベクターは、発現ベクターであってもよい。本発明の核酸配列は例えば、１つ以上の宿主において機能する適切なプロモーターの制御下で、ベクターへと適切に挿入され、連結されたコード配列又は他のDNA配列の発現を誘導することができる。この目的に対して多くのベクターが利用可能であり、適切なベクターの選択は主に、ベクターへと挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存している。各ベクターは、その機能（例えば、DNA増幅又はDNA発現）、及び適合性のある特定の宿主細胞に依存して、様々な構成要素を含有している。
【０１２９】
半翅目害虫抵抗性をトランスジェニック植物に付与するために、組み換えDNAは、例えば、組み換え植物の組織又は体液内でiRNA分子（例えば、dsRNA分子を形成するRNA分子）へと転写されてもよい。iRNA分子は、宿主植物種に対し損害を与え得る半翅目害虫内で、対応する転写ヌクレオチド配列に対し実質的に相同であり、及び特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有してもよい。例えばiRNA分子を含有するトランスジェニック宿主植物の細胞又は体液を摂取することにより、半翅目害虫は、トランスジェニック宿主植物の細胞において転写されるiRNA分子と接触することができる。したがって標的遺伝子の発現は、トランスジェニック宿主植物に寄生する半翅目害虫内で、iRNA分子により抑制される。一部の実施形態において、標的の半翅目害虫における標的遺伝子発現の抑制は、当該害虫による攻撃に対し抵抗性の植物を生じさせ得る。
【０１３０】
本発明の組み換え核酸分子で形質転換された植物細胞と栄養学的関係性にある半翅目害虫へのiRNA分子の送達を可能とするためには、植物細胞中でのiRNA分子の発現（すなわち、転写）が必要とされる。したがって、組み換え核酸分子は、例えば細菌細胞及び植物細胞などの宿主細胞中で機能する異種プロモーター配列などの１つ以上の制御配列に操作可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含有してもよく、この場合において、当該細菌細胞は当該核酸分子が増幅される場所であり、当該植物分子は核酸分子が発現される場所である。
【０１３１】
本発明の核酸分子における使用に適したプロモーターとしては、誘導性、ウイルス性、合成、又は構造性のプロモーターが挙げられ、それらはすべて当分野に公知である。かかるプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第6,437,217号（トウモロコシRS81プロモーター）；米国特許第5,641,876号（イネアクチンプロモーター）；米国特許第6,426,446号（トウモロコシRS324プロモーター）；米国特許第6,429,362号（トウモロコシPR-1プロモーター）；米国特許第6,232,526号（トウモロコシA3プロモーター）；米国特許第6,177,611号（構造性トウモロコシプロモーター）；米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号、及び第5,530,196号（CaMV 35Sプロモーター）；米国特許第6,433,252号（トウモロコシL3オレオシンプロモーター）；米国特許第6,429,357号（イネアクチン2プロモーター、及びイネアクチン2イントロン）；米国特許第6,294,714号（光誘導性プロモーター）；米国特許第6,140,078号（塩誘導性プロモーター）；米国特許第6,252,138号（病原体誘導性プロモーター）；米国特許第6,175,060号（リン欠乏誘導性プロモーター）；米国特許第6,388,170号（二方向性プロモーター）；米国特許第6,635,806号（ガンマ−コイキシン（coixin）プロモーター）；及び米国特許出願公開第2009/757,089号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）が挙げられる。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（NOS）プロモーター(Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-5749)、及びオクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導性プラスミド上に担持されている）；カリモウイルスのプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）19Sプロモーター(Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324)；CaMV 35Sプロモーター(Odell et al. (1985) Nature 313:810-812；ゴマノハモザイクウイルス35Sプロモーター(Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628)；スクロースシンターゼプロモーター(Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148)；R遺伝子複合体プロモーターChandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183)；クロロフィルII a/b結合タンパク質遺伝子プロモーター； CaMV 35S（米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号、及び第5,530,196号）；FMV 35S （米国特許第6,051,753号及び第5,378,619号）；PC1SVプロモーター（米国特許第5,850,019号）SCP1プロモーター（米国特許第6,677,503号）；及びAGRtu.nosプロモーター（GenBank（商標）アクセッション番号V00087；Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187）が挙げられる。
【０１３２】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、例えば根特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターを含有する。根特異的プロモーターは、根組織で限局的又は優先的に、操作可能に連結されたコード配列の発現を誘導する。根特異的プロモーターの例は、当分野に公知である。例えば、米国特許第5,110,732号、第5,459,252号、及び第5,837,848号、ならびにOpperman et al. (1994) Science 263:221-3、及びHirel et al. (1992) Plant Mol. Ｂｉｏｌ．20:207-18を参照のこと。一部の実施形態において、本発明に従う半翅目害虫の制御のためのヌクレオチド配列又は断片は、当該ヌクレオチド配列又は断片に対し反対の転写方向を向いた２つの根特異的プロモーターの間にクローニングされてもよく、及びそれらはトランスジェニック植物細胞において操作可能であり、その中で発現され、トランスジェニック植物細胞中でRNA分子を産生し、その後、それらは上記に記載されるようにdsRNA分子を形成することができる。植物組織中で発現されるiRNA分子は、半翅目害虫に摂取されてもよく、それにより標的遺伝子発現の抑制が実現される。
【０１３３】
対象の核酸分子に操作可能に任意で連結され得る追加の制御配列としては、プロモーター配列とコード配列の間に位置づけられ、翻訳リーダー配列として機能する５’UTRが挙げられる。翻訳リーダー配列は、完全にプロセッシングされたmRNA中に存在し、一次転写物のプロセッシング、及び／又はRNAの安定性に影響を与えうる。翻訳リーダー配列の例としては、トウモロコシ及びペチュニアのヒートショックプロテインリーダー（米国特許第5,362,865号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、及びその他が挙げられる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。5'UTRの非限定的な例としては、GmHsp（米国特許第5,659,122号）、PhDnaK（米国特許第5,362,865号）、AtAnt1、TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7)、及びAGRtunos (GenBank（商標）アクセッション番号V00087、及びBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
【０１３４】
対象の核酸分子に操作可能に任意で連結され得る追加の制御配列としては、３’非翻訳配列、３’転写終結領域、又はポリアデニル化領域も挙げられる。これらはヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝的エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、及び／又は転写もしくはmRNAのプロセッシングに影響を与え得る他の制御シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは植物においいて機能し、mRNA前駆体の３’末端にポリアデニル酸ヌクレオチドの付加をもたらす。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子から誘導することができ、又はT-DNA遺伝子から誘導することができる。３’翻訳終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（nos 3'；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al.、(1989) Plant Cell 1:671-80に提示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウマメ（Pisum sativum）RbcS2遺伝子(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9)及びAGRtu.nos(GenBank（商標）アクセッション番号E01312)からのものが挙げられる。
【０１３５】
一部の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列の１つ以上に操作可能に連結された、上記の制御配列のうちの少なくとも１つを含有する、単離され、及び精製されたDNA分子を含有する植物形質転換ベクターを含む場合がある。発現されたとき、１つ以上のヌクレオチド配列は、半翅目害虫の天然RNA分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列を含有するRNA分子を１つ以上生じさせる。したがって、ヌクレオチド配列は、標的とされた半翅目害虫のRNA転写物内に存在するリボヌクレオチド配列のすべて又は一部をコードするセグメントを含有してもよく、及び標的とされた半翅目害虫の転写物のすべて又は一部の反転リピートを含有してもよい。植物形質転換ベクターは、２つ以上の標的配列に対し特異的に相補的な配列を含有してもよく、それによって、標的半翅目害虫の１つ以上の群れ、又は種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害する２つ以上のdsRNAの産生が可能となる。異なる遺伝子中に存在するヌクレオチド配列に対し特異的に相補的なヌクレオチド配列のセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一混成核酸分子へと組み合わされることができる。かかるセグメントは連続的であってもよく、又はスペーサー配列により分離されていてもよい。
【０１３６】
一部の実施形態において、すでに本発明のヌクレオチド配列を少なくとも１つ含有している本発明のプラスミドは、同じプラスミド中の追加ヌクレオチド配列の連続挿入により改変されていてもよく、この場合において当該追加のヌクレオチド配列は、元の少なくとも１つのヌクレオチド配列と同じ制御エレメントに操作可能に連結されている。一部の実施形態において、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害用に設計されていてもよい。一部の実施形態において、阻害される複数の遺伝子は、同じ半翅目害虫種から取得されてもよく、それらは核酸分子の有効性を増強させるものであってもよい。他の実施形態において、遺伝子は異なる半翅目害虫から誘導されていてもよく、それによって、その剤が有効である半翅目害虫の範囲を広げることができる。複数の遺伝子が、抑制の標的とされた場合、又は発現と抑制の組み合わせの標的とされた場合、ポリシストロニックなDNAエレメントが構築されてもよい。
【０１３７】
本発明の組み換え核酸又はベクターは、例えば植物細胞などの形質転換細胞に選択可能な表現型を寄与する選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーを使用し、本発明の組み換え核酸分子を含有する植物又は植物細胞を選択してもよい。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネティシン（G418）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、など）又は除草剤抵抗性（例えばグリホサートなど）をコードしてもよい。選択マーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない： カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、G418などを使用し選択されることができるneo遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするbar遺伝子；グリホサート耐性をコードする変異EPSPシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノン又はスルホニルウレア抵抗性を付与する変異アセト乳酸シンターゼ（ALS）遺伝子；及びメトトレキサート抵抗性DHFR遺伝子。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、及びテトラサイクリンなどに対する抵抗性を寄与する選択マーカーが複数、利用可能である。かかる選択マーカーの例は、例えば、米国特許第5,550,318号、第5,633,435号、第5,780,708号、及び第6,118,047号に解説されている。
【０１３８】
本発明の組み換え核酸分子又はベクターは、スクリーンマーカーを含有してもよい。スクリーンマーカーを使用し、発現を監視してもよい。例示的なスクリーンマーカーとしては、様々な発色性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ又はuidA遺伝子（GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を制御する産物をコードするR‐locus遺伝子(Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18thStadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82)；β−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41)；様々な発色性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば 、PADAC、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子(Ow et al. (1986) Science 234:856-9)；発色性カテコール類を転換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子(Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55)；アミラーゼ遺伝子(Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2)；チロシンをDOPA及びドーパキノン（次にメラニンへと濃縮される）へと酸化することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14)；及びa-ガラクトシダーゼ、が挙げられる。
【０１３９】
一部の実施形態において、上記に記載される組み換え核酸分子は、トランスジェニック植物の作製方法、及び植物中で異種核酸を発現させ、半翅目害虫に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を作製する方法において使用されてもよい。植物形質転換ベクターは、例えばiRNA分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターへと挿入し、これらを植物へと導入することにより調製することができる。
【０１４０】
宿主細胞の適切な形質転換方法としては、細胞へDNAを導入することができる任意の方法が挙げられるが、例えばプロトプラストの形質転換による方法 (例えば米国特許第5,508,184号を参照のこと)、乾燥／阻害介在性DNA取り込みによる方法（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8を参照のこと)、エレクトロポレーションによる方法（例えば、米国特許第5,384,253号を参照のこと）、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌による方法（例えば、米国特許第5,302,523号及び第5,464,765号を参照のこと）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換による方法（例えば、米国特許第5,563,055号、第5,591,616号、第5,693,512号、第5,824,877号、第5,981,840号、及び第6,384,301号を参照のこと）、及びDNAコート化粒子の加速による方法（例えば、米国特許第5,015,580号、第5,550,318号、第5,538,880号、第6,160,208号、第6,399,861号、及び第6,403,865号を参照のこと）などが挙げられる。トウモロコシの形質転換に特に有用な技術は、例えば米国特許第7,060,876号、第5,591,616号、及び第7,939,3281号に記載されている。例えばこれらの技術を適用することにより、事実上すべての種の細胞を安定的に形質転換することができる。一部の実施形態において、形質転換DNAは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞の種の場合には、トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物体へと再生することができる。これらの技術のいずれかを使用して、例えばトランスジェニック植物のゲノム中に、１つ以上のiRNA分子をコードする核酸配列を１つ以上含有するトランスジェニック植物を作製してもよい。
【０１４１】
植物への発現ベクターの導入に最も広く利用されている方法は、様々なアグロバクテリウム（Agrobacterium）種の固有形質転換系に基づく方法である。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びA.リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のそれぞれTiプラスミドとRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を担持している。Ti（腫瘍誘導性）プラスミドは、T-DNAとして知られる大きなセグメントを含有しており、形質転換植物へと移送される。Tiプラスミドの他のセグメントであるVir領域は、T-DNAの移送に寄与している。T-DNA領域は、末端リピートに隣接している。改変バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導性遺伝子は削除され、Vir領域の機能が利用され、T-DNA境界配列に隣接する外来性DNAが移送される。T-領域はまた、トランスジェニック細胞及び植物の効率的な回収のための選択マーカーを含有してもよく、及び例えばdsRNAコード核酸などの移送のための配列挿入用マルチプルクローニングサイトを含有してもよい。
【０１４２】
従って一部の実施形態において、植物形質転換ベクターは、A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）のTiプラスミドから誘導され（例えば、米国特許第4,536,475号、第4,693,977号、第4,886,937号、及び第5,501,967号、ならびに欧州特許第EP 0 122 791号を参照のこと）、又はA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のRiプラスミドから誘導される。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば限定されないが、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7；Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42、及び欧州特許第EP 0 120 516号に記載されるもの、ならびに前述のいずれかから誘導されるものが挙げられる。例えばシノリゾビウム（Sinorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）、及びメソリゾビウム（Mesorhizobium）などの植物と自然に相互作用する他の細菌を改変し、多くの多様な植物への遺伝子移送を介在してもよい。これらの植物関連共生細菌は、不活性化Tiプラスミド及び適切なバイナリーベクターの両方を獲得することにより、遺伝子移送の能力を有することができる。
【０１４３】
レシピエント細胞に外因性DNAをもたらした後、形質転換細胞は多くの場合、さらなる培養及び植物再生に関して特定される。形質転換細胞を特定する能力を改善するために、形質転換体を作製するために使用された形質転換ベクターと共に、前述の選択マーカー又はスクリーンマーカーを利用することを所望してもよい。選択マーカーが使用された場合、形質転換細胞は、当該細胞を選択剤へと曝露させることにより、形質転換された可能性のある細胞群内で特定される。スクリーンマーカーが使用された場合、細胞は、所望のマーカー遺伝子の形質に対しスクリーニングされてもよい。
【０１４４】
選択剤への曝露を生き残った細胞、又はスクリーニングアッセイにおいて陽性を記録した細胞を、植物再生を支持する培地中で培養してもよい。一部の実施形態において、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、MS及びN6培地）を、例えば成長調節因子などのさらなる物質を含ませることにより改変してもよい。組織は、植物再生の試みを開始するのに充分な組織が利用可能となるまで、成長調節因子を有する基礎培地上で維持されてもよく、又は組織の形態が再生に適するまで（例えば、典型的には約２週間）、手動選択ラウンドを繰り返した後、発芽形成に寄与する培地へ組織を移送してもよい。培養物は、充分な発芽形成が発生するまで、定期的に移送される。発芽が形成されたら、それらを、根形成に寄与する培地へと移送する。充分な根が形成されたら、さらなる成長と成熟のために植物を土壌へと移してもよい。
【０１４５】
対象の核酸分子（例えば、半翅目害虫において標的遺伝子の発現を阻害するiRNA分子を１つ以上コードするDNA配列など）が再生植物中に存在していることを確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。かかるアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、PCRならびに核酸配列解析などの分子生物学的アッセイ；例えばタンパク質産物の存在を検出するための、例えば免疫学的手法（ELISA及び／又はイムノブロット）による、又は酵素機能による生化学的アッセイ；例えば葉又は根のアッセイなどの植物部分のアッセイ；及び再生植物全体の表現型の解析などが挙げられる。
【０１４６】
例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したPCR増幅により、組み込みイベントを解析してもよい。PCR遺伝子型決定は、限定されないが、ゲノム内に組み込まれた対象核酸分子を含有することが予測されている単離宿主植物カルス組織由来のゲノムDNAのポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅を行った後、PCR増幅産物の標準的なクローニングと配列解析を含むものと理解されている。PCR遺伝子型決定法は詳細に記載されており（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53)、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）、又はダイズ（G. max)）由来のゲノムDNA、又は細胞培養物を含む組織型由来のゲノムDNAへと適用することができる。
【０１４７】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は通常、１つの染色体に挿入された単一組み換えDNA配列を含有する。単一組み換えDNA配列は、「トランスジェニックイベント」又は「組み込みイベント」と呼称される。かかるトランスジェニック植物は、挿入された外因性配列に対し、半接合である。一部の実施形態において、導入遺伝子に関してホモ接合体のトランスジェニック植物は、単一外因性遺伝子配列を含有する、独立分離トランスジェニック植物、例えばT0植物を、自身と性的交配（自殖）させ、T1種子を産生させることにより取得することができる。産生されたT1種子のうちの４分の１が、導入遺伝子に関しホモ接合体である。T1種子を発芽させることにより、ヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可能とするSNPアッセイ又はサーマル増幅アッセイを通常は使用して、ヘテロ接合性に関し検証することができる植物が生じる（すなわち、接合性アッセイ）。
【０１４８】
特定の実施形態において、半翅目害虫阻害効果を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の異なるiRNA分子が、植物細胞において産生されている。iRNA分子（例えば、dsRNA分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸配列から発現されてもよく、又は１つの形質転換イベントで導入された１つの核酸配列から発現されてもよい。一部の実施形態において、複数のiRNA分子は、単一のプロモーターの制御下で発現される。他の実施形態において、複数のiRNA分子は、複数のプロモーターの制御下で発現される。１つ以上の半翅目害虫内の異なる遺伝子座（例えば、配列番号１に規定される遺伝子座）に対し各々相同な複数の核酸配列を含有する単一のiRNA分子が、同一種の半翅目害虫の異なる群において、又は別種の半翅目害虫においての両方で発現されてもよい。
【０１４９】
組み換え核酸分子を用いた植物の直接的な形質転換に加え、トランスジェニック植物は、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第一の植物と、かかるイベントを欠く第二の植物を交配させることにより作製することもできる。例えば、iRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含有する組み換え核酸分子を、トランスジェニック植物を産生するための形質転換を受入可能な第一の植物系統へと導入し、そのトランスジェニック植物を第二の植物系統と交配させ、iRNA分子コードするヌクレオチド配列を第二の植物系統に遺伝子移入してもよい。
【０１５０】
本発明はまた、本発明の配列を１つ以上含有する商品生産物を含有する。特定の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列を１つ以上含有する組み換え植物又は種子から作製された商品生産物を含む。本発明の配列を１つ以上含有する商品生産物としては、限定されないが、以下を含むことが意図される：植物種子の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子、又は本発明配列を１つ以上含有する組み換え植物又は種子の任意の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子を含有する任意の食品又は動物用食品。本明細書において予期される農産物又は商品生産物の１つ以上において、本発明配列を１つ以上検出することは、当該農産物又は商品生産物が、dsRNA介在性遺伝子抑制法を使用した半翅目植物害虫制御を目的とした本発明のヌクレオチド配列を１つ以上発現するよう設計されたトランスジェニック植物から作製されたことの事実上の証拠である。
【０１５１】
一部の態様において、形質転換植物細胞に由来するトランスジェニック植物から産生された種子及び商品生産物が含まれ、この場合において当該種子及び商品生産物は、検出可能な量の本発明核酸配列を含有している。一部の実施形態において、かかる商品生産物は、トランスジェニック植物を取得し、それらから食物又は餌を作製することにより製造されてもよい。本発明の核酸配列を１つ以上含有する商品生産物としては、例えば限定されないが、以下が挙げられる：植物の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子、又は植物種子、及び本発明核酸配列を１つ以上含有する組み換え植物又は種子の任意の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子を含有する任意の食品。１つ以上の農産物又は商品生産物中において、本発明配列を１つ以上検出することは、当該農産物又は商品生産物が、半翅目害虫の制御を目的とした本発明iRNA分子を１つ以上発現するよう設計されたトランスジェニック植物から作製されたことの事実上の証拠である。
【０１５２】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子を含有するトランスジェニック植物又は種子はまた、そのゲノム中に、限定されないが以下をはじめとする他のトランスジェニックイベントを少なくとも１つ含有してもよい：配列番号１により規定される遺伝子座以外の半翅目害虫中の遺伝子座、例えば、Caf1-180 (米国特許出願公開2012/0174258)、VatpaseC (米国特許出願公開2012/0174259)、Rho1 (米国特許出願公開2012/0174260)、VatpaseH (米国特許出願公開2012/0198586)、PPI-87B (米国特許出願公開2013/0091600)、RPA70 (米国特許出願公開2013/0091601)、及びRPS6 (米国特許出願公開2013/0097730) からなる群から選択される１つ以上の遺伝子座を標的とするiRNA分子が転写されるトランスジェニックイベント；PIP-1ポリペプチド（米国特許出願公開US2014/0007292A1)が転写されるトランスジェニックイベント；半翅目害虫以外の生物体（例えば、植物寄生性線虫）の遺伝子を標的するiRNA分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の殺虫性タンパク質、例えばCry34Ab1 (米国特許第6,127,180号、第6,340,593号、及び第 6,624,145号)、Cry35Ab1 (米国特許第6,083,499号、第6,340,593号、及び第6,548,291号)、単一のイベント中の“Cry34/35Ab1”の組み合わせ（例えばトウモロコシイベントDAS-59122-7；米国特許第7,323,556号）、Cry3A (例えば、米国特許第7,230,167号)、Cry3B (例えば、米国特許第8,101,826号)、Cry6A (例えば、米国特許第6,831,062号)、及びそれらの組み合わせ(例えば、米国特許出願2013/0167268、2013/0167269、及び2013/0180016)）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサート、グルホシネート、ジカンバ、又は２，４−D（例えば、米国特許第7,838,733号）に対する耐性をもたらす遺伝子）；及びトランスジェニック植物に望ましい表現型、例えば収率の上昇、脂肪酸代謝の変化、又は細胞質雄性不稔の回復などを与える遺伝子。特定の実施形態において、本発明のiRNA分子をコードする配列を、植物における他の昆虫制御又は疾病抵抗性形質と組み合わせ、昆虫による損傷及び植物の疾病の制御を増強する望ましい形質を得てもよい。異なる作用機序を用いる昆虫制御形質を組み合わせることによって、単一の制御形質を有する植物よりも優れた耐久性を有する防御トランスジェニック植物がもたらされ得、例えばその理由は、当該形質に対する抵抗性が野外で発現する可能性が低下するためである。
【０１５３】
V. 半翅目害虫における標的遺伝子の抑制
A. 概要 
本発明の一部の実施形態において、半翅目害虫の制御に有用な少なくとも１つの核酸分子が半翅目害虫にもたらされてもよく、この場合において当該核酸分子は、当該半翅目害虫においてRNAi介在性遺伝子サイレンシングを生じさせる。特定の実施形態において、iRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）が、半翅目害虫にもたらされてもよい。一部の実施形態において、半翅目害虫の制御に有用な核酸分子は、当該核酸分子と半翅目害虫が接触することにより、半翅目害虫へともたらされてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、半翅目害虫の制御に有用な核酸分子は、例えば栄養性組成物などの半翅目害虫の給餌基質中に提供されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、半翅目害虫の制御に有用な核酸分子は、半翅目害虫により摂食される核酸分子を含有する植物性物質の摂取を介して提供されてもよい。ある実施形態において、核酸分子は、例えば組み換え核酸配列を含有するベクターを用いた植物細胞の形質転換、及び当該形質転換された植物細胞からの植物物質及び植物全体の再生による、植物物質へと導入された組み換え核酸配列の発現を介して植物物質中に存在している
【０１５４】
B.RNAi介在性標的遺伝子の抑制
複数の実施形態において、本発明は、例えば標的配列に対して特異的に相補的なヌクレオチド配列を含有する鎖を少なくとも１つ含有するiRNA分子を設計することにより、半翅目害虫（例えば、BSB、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミドリカメムシ（Acrosternum hilare）、及び茶色カメムシ（Euschistus servus）のトランスクリプトームにおいて必須の天然ヌクレオチド配列（例えば、必須遺伝子）を標的とするよう設計され得るiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）を提供するものである。そのように設計されたiRNA分子の配列は、標的配列と同一であってもよく、又はiRNA分子とその標的標的の間の特異的ハイブリダイゼーションを阻害しないミスマッチを組み込んでもよい。
【０１５５】
本発明のiRNA分子は、半翅目害虫における遺伝子抑制方法に使用されてもよく、それによって、害虫により生じる植物（例えば、iRNA分子を含有する、防御された形質転換植物）への損害のレベル又は発生率を低下させることができる。本明細書において使用される場合、「遺伝子抑制」という用語は、mRNAへの遺伝子転写及び引き続くmRNAの翻訳の結果として生成されるタンパク質のレベルを低下させるための公知の方法のいずれかを指し、転写後発現阻害及び転写抑制をはじめとする遺伝子又はコード配列からのタンパク質の発現低下を含む。転写後阻害は、抑制の標的とされた遺伝子から転写されたmRNAのすべて、又は一部と、抑制に使用される対応するiRNA分子の間の特異的相同性により介在される。さらに、転写後阻害とは、リボソームによる結合に関して細胞内で利用可能なmRNAの量の実質的な低下、及び計測可能な低下を指す。
【０１５６】
iRNA分子がdsRNA分子である実施形態において、dsRNA分子は、酵素のDICERにより短いsiRNA分子（およそ２０ヌクレオチドの長さ）へと開裂されてもよい。dsRNA分子に対するDICERの活性により生成された二本鎖siRNA分子は、２つの一本鎖siRNAの「パッセンジャーストランド」と「ガイドストランド」へと分離され得る。パッセンジャーストランドは分解されてもよく、ガイドストランドはRISCへと組み込まれてもよい。ガイドストランドが特異的に相補的なmRNA分子の配列と特異的にハイブリダイゼーションし、それに引き続き酵素のアルゴノート（RISC複合体の触媒要素）により開裂されることによって、転写後阻害が発生する。
【０１５７】
本発明の複数の実施形態において、任意の形態のiRNA分子を使用してもよい。当分野の当業者であれば、通常、調製の間、及びiRNA分子を細胞に提供する工程の間、一本鎖RNA分子よりも、dsRNAのほうが安定しており、及び多くの場合において、細胞内においてもより安定である。したがって、siRNA分子及びmiRNA分子がたとえば一部の実施形態においては等しく効果的である場合がある一方で、安定性を理由としてdsRNA分子が選択される場合もある。
【０１５８】
ある実施形態において、ヌクレオチド配列を含有する核酸分子が提供され、当該ヌクレオチド配列はin vitroで発現され、半翅目害虫のゲノム内のヌクレオチド配列によりコードされる核酸分子に対して実質的に相同なiRNA分子を生成することができる。ある実施形態において、in vitroで転写されたiRNA分子は、ステムループ構造を有する安定化dsRNA分子であってもよい。半翅目害虫が、in vitro転写されたiRNA分子と接触した後、当該半翅目害虫の標的遺伝子（例えば必須遺伝子）の転写後阻害が発生し得る。
【０１５９】
本発明の一部の実施形態において、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含有する核酸分子の発現が、半翅目害虫の標的遺伝子の転写後阻害のための方法において使用され、この場合において当該ヌクレオチド配列は、以下からなる群から選択される：配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。ある実施形態において、前述のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％及び１００％）である核酸分子の発現が使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、半翅目害虫の少なくとも１つの細胞に存在するRNA分子に対し特異的にハイブリダイズする核酸分子が発現されてもよい。
【０１６０】
本発明の特定の実施形態において、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含有する核酸分子の発現が、半翅目害虫の標的遺伝子の転写後阻害のための方法において使用され、この場合において当該ヌクレオチド配列は、以下からなる群から選択される：配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の相補配列；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含有する半翅目生物体の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号１を含有する天然RNA分子へと転写される半翅目生物体の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。ある実施形態において、前述のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％及び１００％）である核酸分子の発現が使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、半翅目害虫の少なくとも１つの細胞に存在するRNA分子に対し特異的にハイブリダイズする核酸分子が発現されてもよい。特定の例において、かかる核酸分子は、配列番号１を含有するヌクレオチド配列を含有してもよい。
【０１６１】
RNAi転写後阻害系は、遺伝子変異、系統ポリモルフィズム、又は進化的多様性によるものと予測され得る標的遺伝子間の配列変動を許容することができることが、本明細書の一部の実施形態の重要な特性である。導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたmRNAのいずれかに対し、特異的にハイブリダイズ可能である限りは、当該導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたmRNAのいずれかに対し完全に相同性である必要性はない。さらに、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたmRNAのいずれかに対し、完全超である必要はない。
【０１６２】
本発明のiRNA技術を使用した標的遺伝子の阻害は、配列特異的である。すなわち、iRNA分子に対し実質的に相同的なヌクレオチド配列が、遺伝子阻害の標的となる。一部の実施形態において、標的遺伝子配列の一部に対して同一なヌクレオチド配列を含有するRNA分子が、阻害に使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、標的遺伝子配列に対し、１つ以上の挿入、欠失、及び／又は点変異を有するヌクレオチド配列を含有するRNA分子を使用してもよい。特定の実施形態において、iRNA分子と標的遺伝子の一部は、例えば少なくとも約８０％〜、少なくとも約８１％〜、少なくとも約８２％〜、少なくとも約８３％〜、少なくとも約８４％〜、少なくとも約８５％〜、少なくとも約８６％〜、少なくとも約８７％〜、少なくとも約８８％〜、少なくとも約８９％〜、少なくとも約９０％〜、少なくとも約９１％〜、少なくとも約９２％〜、少なくとも約９３％〜、少なくとも約９４％〜、少なくとも約９５％〜、少なくとも約９６％〜、少なくとも約９７％〜、少なくとも約９８％〜、少なくとも約９９％〜、少なくとも約１００％〜、及び１００％の配列同一性を共有してもよい。あるいは、dsRNA分子の二重鎖領域が、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズしてもよい。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、高い相同性を示す全長未満の長さの配列が、より長いが相同性は低い配列を補う。標的遺伝子転写物の一部と同一であるdsRNA分子の二重鎖領域のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又は少なくとも約１０００塩基であってもよい。一部の実施形態において、１５〜１００ヌクレオチドよりも長い配列が使用されてもよい。特定の実施形態において、約２００〜３００ヌクレオチドよりも長い配列が使用されてもよい。特定の実施形態において、標的遺伝子のサイズに応じて、約５００〜１０００ヌクレオチドよりも長い配列が使用されてもよい。
【０１６３】
ある実施形態において、半翅目害虫の標的遺伝子の発現は、重大な阻害が発生するよう、当該半翅目害虫の細胞内で少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、又は少なくとも８０％まで阻害されてもよい。重大な阻害とは、検出可能な表現型（例えば、成長の停止、摂食の停止、発達の停止、死の誘導など）、又は阻害される標的遺伝子に対応するRNA及び／又は遺伝子産物の検出可能な低下を生じさせる閾値を超える阻害を指す。本発明のある実施形態においては、半翅目害虫の実質的に全ての細胞で阻害が発生するが、他の実施形態では、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ阻害が発生する。
【０１６４】
一部の実施形態において、細胞における転写抑制は、プロモーターDNA配列、又はその相補配列に対して実質的な配列同一性を示すdsRNA分子の存在により調節され、「プロモータートランス抑制」と呼ばれる効果をもたらす。遺伝子抑制は、例えばdsRNA分子を含有する植物物質を摂取又は接触することにより、かかるdsRNA分子を摂取又は接触し得る半翅目害虫の標的遺伝子に対して有効であってもよい。プロモータートランス抑制における使用のためのdsRNA分子は、半翅目害虫の細胞における、１つ以上の相同な、又は相補的な配列の発現を阻害又は抑制するよう特異的に設計されてもよい。植物細胞で遺伝子発現を制御する、アンチセンス方向又はセンス方向のRNAによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第5,107,065号、第5,759,829号、第5,283,184号、及び第5,231,020号に開示されている。
【０１６５】
C.半翅目害虫にもたらされたiRNA分子の発現
半翅目害虫におけるRNAi介在性遺伝子阻害のためのiRNA分子の発現は、多くのin vitro又はin vivoの形式のうちのいずれか１つで行うことができる。次いで、例えば害虫とiRNA分子を接触させることにより、又は害虫に摂取させることにより、もしくはさもなければ、害虫にiRNA分子を内在化させることにより、半翅目害虫にiRNA分子がもたらされてもよい。本発明の一部の実施形態は、半翅目害虫の形質転換宿主植物、形質転換植物細胞、及び形質転換植物の子孫を含む。形質転換された植物細胞、及び形質転換された植物を、たとえば異種プロモーターの制御下でiRNA分子のうちの１つ以上を発現するよう操作し、害虫防御効果をもたらしてもよい。したがって、トランスジェニック植物又は植物細胞が、摂食の間に半翅目害虫により摂取された場合、当該害虫は、当該トランスジェニック植物又は細胞中に発現されたiRNA分子を摂取し得る。本発明のヌクレオチド配列はまた、iRNA分子を産生する広範な種類の原核細胞微生物宿主及び真核細胞微生物宿主へと導入されてもよい。「微生物」という用語は、例えば細菌及び真菌などの原核細胞種及び真核細胞種を含む。
【０１６６】
遺伝子発現の調節は、かかる発現の部分抑制又は完全抑制を含み得る。他の実施形態において、半翅目害虫における遺伝子発現の抑制方法は、害虫の宿主の組織に、本明細書に記載されるようにヌクレオチド配列の転写後に形成されたdsRNA分子の少なくとも１つの遺伝子抑制量をもたらすこと、を含み、その少なくとも１つのセグメントは、半翅目害虫の細胞内のmRNAに対して相補的である。本発明に従い半翅目害虫に摂取される、例えばsiRNA、miRNA、shRNA、又はhpRNAなどの改変型を含むdsRNA分子は、配列番号１を含有するヌクレオチド配列を含有する核酸分子から転写されたRNA分子に対し、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又は１００％同一であってもよい。従って限定されないが、本発明のdsRNA分子を提供するための、非天然型ヌクレオチド配列、及び組み換えDNA構築物を含む、単離され、実質的に精製された核酸分子が提供され、当該核酸分子は導入されたとき、半翅目害虫の内因性コード配列又は標的コード配列の発現を抑制又は阻害する。
【０１６７】
特定の実施形態は、半翅目害虫の１つ以上の標的遺伝子の転写後阻害のための、及び半翅目植物害虫群の制御のためのiRNA分子の送達のための送達システムを提供するものである。一部の実施形態において、送達システムは、トランスジェニック宿主植物細胞、又は宿主細胞中で転写されたRNA分子を含有する宿主細胞の内容物の摂取を含む。これら、及びさらなる実施形態において、本発明の安定化dsRNA分子をもたらす組み換えDNA構築物を含有するトランスジェニック植物細胞、又はトランスジェニック植物が作製される。特定のiRNA分子をコードする核酸配列を含有するトランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物は、本発明のiRNA分子（例えば、安定化dsRNA分子）をコードするヌクレオチド配列を含有する植物形質転換ベクターを構築する；植物細胞又は植物を形質転換する；及び転写されたiRNA分子を含有するトランスジェニック植物細胞又はトランスジェニック植物を生成する、組み換えDNA技術（その基礎技術は当分野に公知である）を用いることにより作製されることができる。
【０１６８】
トランスジェニック植物に半翅目害虫抵抗性を与えるため、組み換えDNA分子は例えばdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、又はhpRNA分子などのiRNA分子へと転写されてもよい。一部の実施形態において、組み換えDNA分子から転写されたRNA分子は、組み換え植物の組織又は体液内でdsRNA分子を形成してもよい。かかるdsRNA分子は、宿主植物に寄生し得るタイプの半翅目害虫内でDNA配列から転写された対応するヌクレオチド配列に対し同一なヌクレオチド配列の一部に含まれてもよい。半翅目害虫内での標的遺伝子の発現は、dsRNA分子の摂取により抑制され、及び半翅目害虫の標的遺伝子の発現の抑制によって、例えば半翅目害虫による摂食の停止が生じ、最終的な結果としては、例えばトランスジェニック植物は、半翅目害虫によるさらなる損害から防御される。dsRNA分子の修飾効果は、例えばハウスキーピング遺伝子をはじめとする細胞代謝又は細胞形質転換に寄与する内因性遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；及び細胞代謝又は正常な成長と発達に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、害虫で発現されている様々な遺伝子に適用可能であることが示されている。
【０１６９】
in vivoでの導入遺伝子からの転写、又は発現構築物からの転写のために、一部の実施形態において、RNA鎖を転写するための制御領域（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、及びポリアデニル化シグナル）を使用してもよい。したがって、一部の実施形態において、上記に説明されるように、iRNA分子作製における使用のためのヌクレオチド配列は、植物宿主細胞において機能する１つ以上のプロモーター配列に操作可能に連結されていてもよい。プロモーターは、宿主ゲノム中に通常に内在する内因性プロモーターであってもよい。操作可能に連結されたプロモーター配列の制御下にある本発明のヌクレオチド配列は、その転写、及び／又は得られた転写物の安定性に有益な影響を与える追加の配列にさらに隣接していてもよい。かかるエレメントは、操作可能に連結されたプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置してもよく、及びプロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方にあってもよい。
【０１７０】
一部の実施形態は、植物を餌とする半翅目害虫により引き起こされた宿主植物（例えば、トウモロコシ植物）に対する損害を減少させるための方法を提供するものであり、この場合において当該方法は、宿主植物に、本発明の核酸分子を少なくとも１つ発現する形質転換植物細胞を提供することを含み、この場合において当該核酸分子は、半翅目害虫に取り込まれると機能し、当該半翅目害虫内の標的配列の発現を阻害し、その発現阻害により、半翅目害虫の死、成長の低下、及び／又は繁殖の低下がもたらされ、それによって、半翅目害虫により引き起こされた宿主植物の損害が減少する。一部の実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有する。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有し、そのdsRNA分子は各々、半翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、半翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする１つのヌクレオチド配列からなる。
【０１７１】
他の実施形態において、トウモロコシ作物の収率を増加させる方法が提供され、当該方法は、本発明の核酸分子を少なくとも１つ、トウモロコシ植物に導入すること；当該トウモロコシ植物を栽培し、当該核酸配列を含有するiRNA分子を発現させることを含み、当該核酸配列を含むiRNA分子の発現が、半翅目害虫の損害及び／又は成長を阻害し、それによって、半翅目害虫寄生による生産量の減少が低下し、又は無くなる。一部の実施形態において、iRNA分子は、dsRNA分子である。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有し、そのdsRNA分子は各々、半翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、半翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする１つのヌクレオチド配列からなる。
【０１７２】
一部の実施形態において、半翅目害虫の標的遺伝子の発現を調節する方法が提供され、当該方法は、本発明の核酸分子を少なくとも１つコードする核酸配列を含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換することであって、当該ヌクレオチド配列は、プロモーター及び転写終結配列に操作可能に連結されており；複数の形質転換植物細胞を含有する植物細胞培養の発展が充分に可能な条件下で、形質転換植物細胞を培養すること；そのゲノム内に核酸分子が組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること；組み込まれた核酸分子によりコードされるiRNA分子の発現に関し、形質転換植物細胞をスクリーニングすること；iRNA分子を発現しているトランスジェニック植物細胞を選択すること；及び半翅目害虫に、選択されたトランスジェニック植物細胞を飼料として与えること、を含む。また、組み込まれた核酸分子によりコードされるiRNA分子を発現する形質転換植物細胞から植物が再生されてもよい。一部の実施形態において、iRNA分子は、dsRNA分子である。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有し、そのdsRNA分子は各々、半翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、半翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする１つのヌクレオチド配列からなる。
【０１７３】
本発明のiRNA分子は、植物細胞のゲノム内に組み込まれた組み換え遺伝子からの発現産物として、又は植え付け前に種子に適用されるコーティング処理又は種子処理への組み込みとして、のいずれかで、植物種（例えば、トウモロコシ）の種子内に組み込まれることができる。組み換え遺伝子を含有する植物細胞は、トランスジェニックイベントであるとみなされる。また、本発明の複数の実施形態に、半翅目害虫へiRNA分子を送達するための送達システムが含まれる。例えば、本発明のiRNA分子は、半翅目害虫の細胞内に直接導入されてもよい。導入方法には、iRNAと、半翅目害虫の宿主由来の植物組織を直接混合すること、ならびに本発明のiRNA分子を含有する組成物を宿主植物組織に適用すること、が含まれ得る。例えば、iRNA分子は、植物表面上に噴霧されてもよい。あるいは、iRNA分子は、微生物により発現されてもよく、当該微生物は植物表面上に適用されてもよく、又は例えば注入などの物理的手段により根又は茎に導入されてもよい。上記に検討されているように、トランスジェニック植物を遺伝子操作して、植物に寄生することが知られている半翅目害虫を殺傷するために充分な量のiRNA分子を少なくとも１つ発現させてもよい。化学合成又は酵素合成により作製されたiRNA分子を、一般的な農学的実務に合致する方法で製剤化してもよく、及び半翅目害虫による植物損害を制御するためのスプレー式製品として使用してもよい。製剤は、iRNA分子（例えばdsRNA分子）をUVダメージから守るための効果的な葉の覆い、ならびにUV保護剤に必要とされる適切なステッカー及び湿潤剤を含んでもよい。かかる添加物はバイオ殺虫剤産業において普遍的に使用されており、当分野の当業者に公知である。かかるアプリケーションは、半翅目害虫からの植物防御を増強させるために、他のスプレー式殺虫アプリケーション（生物ベース又はそれ以外）と組み合わされてもよい。
【０１７４】
本明細に引用される、公表文献、特許、及び特許出願を含むすべての参照文献は、本開示の明白な詳細と一致する範囲で参照により本明細書に援用され、各参照文献が個々に、及び具体的に、参照により援用されると示され、本明細書にその全体が明記された場合と同程度に援用される。本明細書において検討された参照文献は、本出願の出願日の前のその開示内容に対してのみ提供される。本明細書はいずれも、先行発明を理由としたかかる開示の先行のために本発明者らが権利付与されないことの同意とはみなされない。
【０１７５】
以下の実施例は、ある特定の特性及び／又は態様の解説のために提供される。これらの実施例によって、記載される特定の特性又は態様に本開示が限定されるとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１７６】
実施例１
新熱帯茶色カメムシ（BSB；Neotropical brown stink bug）(Euschistus heros)コロニー。
BSBを、２７℃、相対湿度６５％のインキュベーターにおいて、１６：８時間の明暗サイクルで、飼育した。２〜３日にわたり採取された卵の１グラムを、底にろ紙ディスクを敷いた５Lの容器中に播種し、この容器を通気のために＃１８メッシュで覆った。各飼育容器から、およそ３００〜４００匹の成虫BSBが得られた。すべての段階で、昆虫は、週に３回、新鮮なサヤマメを与えられ、ひまわりの種、ダイズ、及びピーナッツ（３：１：１の重量比）が日あった種混合物の小袋が週に１回置き換えられた。水は、芯として綿栓を用いたバイアルにて供給された。最初の２週間の後、昆虫は、週に１回、新しい容器へと移された。
【０１７７】
BSBの人工飼料 BSBの人工飼料は、以下のように調製された（調製してから２週間以内に使用された）。凍結乾燥されたサヤマメ(green bean)を、MAGIC BULLET（登録商標）ブレンダー中で微粉末まで混合し、一方で生（有機）のピーナッツは、別のMAGIC BULLET（登録商標）ブレンダー中で混合した。混合された乾燥成分を、大きなMAGIC BULLET（登録商標）ブレンダー中で混ぜ（重量割合：サヤマメ、３５％；ピーナッツ、３５％；スクロース、５％；ビタミン複合体（例えば昆虫用のVanderzant Vitamin Mixture、SIGMA-ALDRICH社、カタログ番号V1007)、０．９％）；ブレンダーの蓋を閉め、よく振とうさせて、成分を混合させた。次いで、混合された乾燥成分を、混合ボウルへと加えた。別の容器において、水、及びベノミル抗真菌剤（５０ｐｐｍ；２５μLの２０，０００ｐｐｍ溶液／５０ｍL飼料溶液）を良く混合し、その後、乾燥成分混合物へと加えた。全ての成分を、溶液が完全に混合されるまで、手でよく混ぜた。飼料を所望の大きさに形作り、アルミニウムホイルで緩く包み、４時間、６０℃で加熱し、その後、冷却して４℃で保存した。
【０１７８】
実施例２
dsRNAを生成するための標的遺伝子の同定及び増幅
BSBトランスクリプトームアセンブリ。BSBの６つの発達段階を、mRNAライブラリー調製に選択した。総RNAは、‐７０℃に凍結させた昆虫から抽出し、FastPrep（登録商標）-24 機器(MP BIOMEDICALS社)上のLysing MATRIX A 2mL管(MP BIOMEDICALS社、Santa Ana, CA)において、１０体積の溶解／結合緩衝液中でホモジナイズした。総mRNAは、メーカーのプロトコールに従い、mirVana（商標）miRNA Isolation Kit (AMBION;INVITROGEN)を使用して抽出した。イルミナ（登録商標）HiSeq（商標）システム (San Diego, CA)を使用したRNA配列解析により、RNAi昆虫制御技術における使用のための候補標的遺伝子配列が提示された。HiSeq（商標）は、６サンプルに対し、全部で約３億７８００万のリードを生成した。TRINITY（商標）アセンブラーソフトウェア(Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652)を使用して、各サンプルに対し個々にリードをアセンブリした。アセンブリされた転写物を組み合わせ、統合トランスクリプトームを生成した。このBSB統合トランスクリプトームは、３７８，４５７個の配列を含有した。
【０１７９】
BSB threadオルソログの同定。BSB統合トランスクリプトームのtBLASTnサーチは、クエリとして、ショウジョウバエ（Drosophila）のthreadであるth-PAタンパク質配列、GENBANKアクセッション番号NP_524101を使用して行われた。BSBのthread (配列番号１)は、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）候補標的遺伝子産物として同定され、予測ペプチド配列は、配列番号２である。
【０１８０】
配列番号１の配列は新規である。BSBのthreadヌクレオチド配列（配列番号１）に最も近いホモログは、GENBANKアクセッション番号 AK417560のホソヘリカメムシ（Riptortus pedestris）のmRNAである（７９％の類似性）。BSBのthreadのアミノ酸配列（配列番号２）に最も近いホモログは、GENBANKアクセッション番号BAN20775.1 を有するホソヘリカメムシ（Riptortus pedestris）のタンパク質である（８０％類似性；相同領域全体で６６％同一性）。
【０１８１】
鋳型調製及びdsRNA合成。cDNAは、TRIzol（登録商標）試薬(LIFE TECHNOLOGIES社)を使用し、１匹の若い成虫（約９０ｍｇ）から抽出された総BSB  RNAから調製された。昆虫は、ペレットペッスル(FISHERBRAND社、カタログ番号12-141-363)及びペッスルモーターミキサー(COLE-PARMER社、Vernon Hills, IL)を使用し、２００μLのTRIzol（登録商標）と共に１．５ｍL微小遠心管中、室温でホモジナイズされた。ホモジナイズ後、追加の８００μLのTRIzol（登録商標）を加え、ホモジネートをボルテックスし、その後、室温で５分間インキュベートした。細胞残渣を遠心分離で取り除き、上清を新しい管に移した。メーカー推奨の1mLのTRIzol（登録商標）用TRIzol（登録商標）抽出プロトコールに従い、RNAペレットを室温で乾燥させ、GFX PCR DNA AND Gel Extraction kit (illustra（商標）  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES社) からの２００μLのTris緩衝液に、溶出緩衝液タイプ４（すなわち、10mM  Tris-HCl、pH8.0）を使用して再懸濁させた。RNAの濃度は、NanoDrop（商標）8000分光光度計(Thermo Scientific社、Wilmington, DE)を使用して測定された。
【０１８２】
cDNA増幅。  cDNAは、メーカー推奨のプロトコールに従い、RT-PCR用のSUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM（商標）(INVITROGEN社)を使用して、５μｇのBSB総RNA鋳型とオリゴｄTプライマーから逆転写された。転写反応の最終量は、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１００μLとした。
【０１８３】
プライマー  BSB_th-dsRNA1_For (配列番号６)、及びBSB_th-dsRNA1_Rev (配列番号７)を使用して、BSB_thread 領域１、又はBSB_thread-1とも呼称される鋳型を増幅した。プライマー  BSB_th-dsRNA2_For (配列番号８)、及びBSB_th-dsRNA2_Rev (配列番号９)を使用して、BSB_thread領域２、又はBSB_thread-2とも呼称される鋳型を増幅した（表１）。DNA鋳型は、タッチダウンPCR（１℃／１サイクルの低下でアニーリング温度を６０℃から５０℃に下げる）により、鋳型として１μLのcDNA（上述）を用いて増幅させた。652bpセグメントのBSB_thread-1(配列番号３)、又は608bpセグメントのBSB_thread-2（配列番号４）を含有する断片が、３５サイクルのPCRの間に生成された。上述の手段を再度使用して、301bpの陰性対照鋳型YFPv2（配列番号１２）を、YFPv2-F（配列番号１３）とYFPv2-R（配列番号１４）のプライマーを使用して増幅させた。BSB_ thread、及びYFPv2のプライマーは、T7ファージプロモーター配列（配列番号５）をその５’末端に含有し、それによって、dsRNA転写のためのYFPv2及びBSB_ threadのDNA断片の使用が可能となった。
【０１８４】
表１  例示的なthread標的遺伝子、及びYFP陰性対照遺伝子のコード領域の一部を増幅するために使用されたプライマー、及びプライマー対。
【表１】
2018523971.tif 000003
【０１８５】
dsRNA合成。  dsRNAは、２μLのPCR産物（上述）を鋳型として使用し、MEGAscript（商標）RNAi キット (AMBION社)をメーカーの説明書に従い使用して合成させた。図１を参照のこと。dsRNAは、NANODROP（商標）8000分光光度計上で定量され、ヌクレアーゼフリーの0.1X TE緩衝液 (1mM Tris HCL、0.1mM EDTA、pH7.4)中、500ng/μLに希釈された。
【０１８６】
実施例１５：
threadRNAi注入後の新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）の死亡率
BSBは、２７℃のインキュベーター中、６５%の相対湿度、１６：８時間の明暗光周期で、サヤマメと種子飼料上でコロニーとして飼育された。二齢若虫（各々１〜１．５ｍｇの重量）を、小さなブラシで穏やかに触れて傷を防ぎ、氷上のペトリディッシュに置き、昆虫を冷却し、静止させた。各昆虫に、500ng/μLのdsRNA溶液を55.2nL（すなわち、27.6ngのdsRNA；投与量は18.4〜27.6μg/g体重)で注入した。Drummond 3.5インチ #3-000-203-G/Xガラスキャピラリーから引き抜かれた注射針を備え付けたNANOJECT（商標） IIインジェクター(DRUMMOND SCIENTIFIC社、Broomhall, PA)を使用し、注入が行われた。針先を破壊し、キャピラリーは、軽油で埋め戻され、次いで、2〜3μLのdsRNAで満たされた。dsRNAは、若虫の腹部に注入され（１試験当たり、１つのdsRNA当たり、１０匹の昆虫に注入）、試験は３つの別々の日に繰り返された。注入された昆虫（５匹／ウェル）を、人工BSB飼料のペレットを含有する３２ウェルトレイ(Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV社、Frenchtown, NJ)へと移し、Pull-N- Peel（商標）タブ(BIO-CV-4; BIO-SERV)で覆った。湿気は、綿栓をした1.5mLの微小遠心管中の1.25mLの水により供給された。トレイを26.5℃、湿度60％、及び16:8の明暗光周期でインキュベートした。活性と重量の計測は、注入後、７日目に行われた。
【０１８７】
注入により、致死性dsRNA標的としてBSBthreadが特定された。YFPコード領域のセグメントを標的とするdsRNAであるYFPv2は、BSB注入実験の陰性対照として使用した。表２に要約されるように、少なくとも１０匹の２齢のBSB若虫（各々1〜1.5mg）に、55.2nLのBSB_thread-1又はBSB_thread-2のdsRNA (500ng/μLの濃度)を用いて体腔内に注入し、およそ18.4〜27.6μg  dsRNA／昆虫gの最終濃度とした。27.6ng、6.9ng、0.69ng、及び0.069ngの濃度のdsRNAの希釈系列を使用し、上述のように各昆虫へ注入した。死亡率は、dsRNA注入後、７日で記録された。BSB_thread-1、及びBSB_thread-2のdsRNAに対し測定された死亡率は、同量のYFPv2  dsRNAを注入された昆虫（陰性対照）で見られた死亡率とは有意に異なっていた。各々、p=0.000196、及び0.000101(スチューデントt検定)。YFP注入処置と、無注入処置の間に有意差は無かった。RNAi反応は、検証されたすべての投与量で濃度に無関係であり、高い死亡率をもたらした（表３）。バイオアッセイを繰り返すことにより、特定のサンプルの注入によって、BSBの幼虫に驚くべき予想外の死亡率がもたらされたことが示された。
【０１８８】
表２  注入の７日後の、２齢の新熱帯茶色カメムシの若虫の体腔へのBSB_thread dsRNA注入の結果。
【表２】
2018523971.tif 000004
【０１８９】
表３ BSB_threaddsRNAの希釈系列。投与量は、27.6ng〜0.069ngの範囲であった。死亡率は、dsRNA注入後、７日で記録された。
【表３】
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【０１９０】
実施例４：
植物形質転換ベクターの構築
thread（配列番号１）のセグメントを含有するヘアピン構造用の標的遺伝子構築物を有するエントリーベクター(pDAB119602、及びpDAB119603)は、化学合成された断片(DNA2.0, Menlo Park, CA)の組み合わせと、標準的な分子クローニング法を使用してアセンブリされた。RNA一次転写物による分子内ヘアピン構造は、標的遺伝子セグメントの２つのコピーを互いに反対方向に（単一転写ユニット内で）配置することにより促進され、この２つのセグメントはST-LS1イントロン配列(配列番号１６：Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)）により分離された。したがって、一次mRNA転写物は、イントロン配列により分離され、互いの大きな反転リピートとして、２つのthread遺伝子セグメント配列を含有している。トウモロコシユビキチン１プロモーター（米国特許第5,510,474号）のコピーを使用して、一次mRNAヘアピン転写物の産生を誘導した。トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子（ZmPer5 3'UTR v2；米国特許第6,699,984号）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を使用して、ヘアピンRNA発現遺伝子の転写を終結させた。
【０１９１】
エントリーベクターのpDAB119602は、thread（配列番号１）のセグメントを含有するthreadヘアピンv1-RNA構築物（配列番号１０）を含有する。
【０１９２】
エントリーベクターのpDAB119603は、pDAB119602にあるものとは異なるthread（配列番号１）のセグメントを含有するthreadヘアピンv4-RNA構築物（配列番号１１）を含有する。
【０１９３】
上記に記載されるエントリーベクターpDAB119602、及びpDAB119603は、典型的なバイナリーデスティネーションベクター(pDAB101836)との標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応に使用され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性トウモロコシ胚形質転換のためのthreadヘアピンRNA発現形質転換ベクターを生成した（それぞれ、pDAB119611及びpDAB119612）。
【０１９４】
YFPヘアピンdsRNAを発現する遺伝子を含有する陰性対照のバイナリーベクターのpDAB110853は、典型的なバイナリーデスティネーションベクター(pDAB109805)とエントリーベクターのpDAB101670を用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築された。エントリーベクターのpDAB101670は、トウモロコシユビキチン1プロモーター（上述）の発現制御下にあるYFPヘアピン配列（配列番号１５）、及びトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子（上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。
【０１９５】
バイナリーデスティネーションベクターのpDAB109805は、サトウキビ桿状型バドナウイルス（SｃBV）プロモーター（Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30)の制御下にある除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；AAD-1 v3)（米国特許第7,838,733(B2)、及びWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5）を含有している。合成５’UTR配列は、トウモロコシストリークウイルス（MSV：Maize Streak Virus）のコートタンパク質遺伝子の５’UTR由来の配列と、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（ADH１：Alcohol Dehydrogenase 1）遺伝子由来のイントロン６遺伝子から構成され、SCBVプロモーターセグメントの３’末端と、AAD-１コード領域の開始コドンの間に位置付けられている。トウモロコシのリパーゼ遺伝子（ZmLip 3'UTR；米国特許第7,179,902号）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を使用し、AAD-1のmRNAの転写を終結させた。
【０１９６】
さらなる陰性対照のバイナリーベクターであるpDAB110556は、YFPタンパク質を発現する遺伝子を含有しており、典型的なバイナリーデスティネーションベクター(pDAB9989)とエントリーベクターのpDAB100287を用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築された。バイナリーデスティネーションベクターのpDAB9989は、トウモロコシユビキチン1プロモーター（上述）の発現制御下にある除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；AAD-1 v3）、及びトウモロコシリパーゼ遺伝子（ZmLip 3'UTR；上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。エントリーベクターのpDAB9379は、トウモロコシユビキチン1プロモーター（上述）の発現制御下にあるYFPコード領域（配列番号４３）、及びトウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子（上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。
【０１９７】
配列番号１０は、pDAB119611に存在するときの、 threadヘアピンv1-RNA形成配列を示す。
【０１９８】
配列番号１１は、pDAB119612に存在するときの、 threadヘアピンv4-RNA形成配列を示す。
【０１９９】
実施例５
殺虫性ヘアピンdsRNAを含有するトランスジェニックトウモロコシ組織の作製
アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換  植物ゲノムへ安定的に組み込まれたキメラ遺伝子の発現を介して、１つ以上の殺虫性dsRNA分子（例えば、thread（配列番号１）を含有する遺伝子を標的とするdsRNA分子を含む、少なくとも１つのdsRNA分子）を産生するトランスジェニックトウモロコシの細胞、組織、及び植物が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換によって作製される。スーパーバイナリー形質転換ベクター、又はバイナリー形質転換ベクターを利用する、トウモロコシの形質転換方法は当分野に公知であり、例えば、その全体で参照より本明細書に援用される米国特許第8,304,604号に記載されている。形質転換された組織は、ハロキシホップ含有培地上での増殖能力により選択され、適切な場合には、dsRNA産生に対しスクリーニングされた。バイオアッセイのために、かかる形質転換組織培養の一部をBSBにもたらしてもよい。
【０２００】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）  培養の開始  上述（実施例２）のバイナリー形質転換ベクターのpDAB114515、pDAB115770、pDAB110853、又はpDAB110556を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株のDAt13192細胞(WO 2012/016222A2）のグリセロールストックを、適切な抗生物質を含有するAB最小培地プレート(Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264)上に画線培養し、３日間、２０℃で増殖させた。次いで、培養物を、同じ抗生物質を含有するYEPプレート(gm/L：酵母抽出物、１０；ペプトン、１０；NaCl、5)上に画線培養し、1日間、２０℃でインキュベートした。
【０２０１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養  実験当日、接種培地のストック溶液、及びアセトシリンゴンを、実験の構築物の数に対して適切な量で調製し、滅菌されたディスポーザブルの２５０ｍLフラスコへとピペッティングで入れる。接種培地(Frame et al.(2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)は、以下を含有した：2.2gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類(Frame et al., 前記) 68.4gm/L スクロース；36gm/L グルコース；115mg/L L-プロリン、及び100mg/L myo-イノシトール；pH 5.4。接種培地を含有するフラスコにアセトシリンゴンを加え、１００％ジメチルスルホキシド中の１Ｍストック溶液から最終濃度２００μＭとし、この溶液を完全に混和した。
【０２０２】
各構築物に対し、YEPプレートからアグロバクテリウム（Agrobacterium）の１つ又は２つの接種ループ−フルを、滅菌ディスポーザブルの５０ｍL遠心管中で１５ｍLの接種培地／アセトシリンゴンのストック溶液に懸濁させ、550nm(OD550)での溶液の光学密度を分光光度計で計測した。その後、懸濁液を、0.3〜0.4のOD550にまで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合液を使用して希釈した。その後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を、７５ｒｐｍ、室温に設定されたプラットフォーム型振とう器上に水平に置き、胚を解体させながら、１〜４時間、振とうさせた。
【０２０３】
穂の不稔化及び胚の単離  トウモロコシの未熟胚を、トウモロコシ（Zea mays）近交系B104(Hallauer et al.(1997) Crop Science 37:1405-1406)の植物から得て、温室で成長させ、自己受粉又は同胞受粉させ、穂を作らせた。受粉後およそ１０〜１２日後に穂を収穫した。実験当日、皮をむいた穂を、市販の漂白剤(Ultra Clorox（登録商標）Germicidal Bleach、6.15%次亜塩素酸ナトリウム；TWEEN20を２滴）の20％溶液の中にひたすことにより表面を滅菌し、２０〜３０分間振とうさせた後、Laminarフローフード内で滅菌脱イオン水で３回リンスした。未成熟な接合胚（1.8〜2.2mmの長さ）を、各穂から無菌で切り出し、適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium ）細胞の、200μMアセトシリンゴンを有する接種培地液の懸濁液2.0mLを含有する微小遠心管に無作為に分配し、そこに2μLの10%BREAK-THRU（登録商標）S233界面活性剤 (Evonik Industries社；Essen, Germany)を加えた。実験の所与の設定に対し、プールされた穂からの胚を各形質転換に使用した。
【０２０４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養  単離後、胚を５分間、ロッカープラットフォーム上に置いた。その後、管の中身を共培養培地のプレート上に流しいれた。当該培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；30gm/L スクロース；700mg/L L-プロリン；3.3mg/L DicambaのKOH(3,6-ジクロロ-o-アニス酸又は3,6-ジクロロ-2-メトキシ安息香酸)溶液；100mg/L myo-イノシトール；100mg/L カゼイン酵素加水分解物；15mg/L AgNO3；200μM アセトシリンゴンのDMSO溶液；及び3gm/L GELZAN（商標）、pH 5.8を含有した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を、滅菌ディスポーザブルの移送ピペットを使用して除去した。次いで、胚を、顕微鏡下で滅菌ハサミを使用し、胚盤を仰向けにさせながら置いた。プレートを閉じ、3M（商標）MICROPORE（商標）医療用テープで密封し、２５℃のインキュベーター内に置き、およそ60μモル m-2s-1で光合成有効放射（PAR)の連続光を当てた。
【０２０５】
カルスの選択、及びトランスジェニックイベントの再生  共培養期間後、胚を休眠培地へと移した。当該培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；30gm/L スクロース；700mg/L L-プロリン；3.3mg/L DicambaのKOH溶液；100mg/L myo-イノシトール；100mg/L カゼイン酵素加水分解物；15mg/L AgNO3；0.5gm/L MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸一水和物；PhytoTechnologies Labr.；Lenexa, KS)；250mg/L カルベニシリン；及び2.3gm/L Gelzan（商標）；pH 5.8から構成された。３６個以下の胚を各プレートへと移動させた。このプレートを透明なプラスチックボックス内に置き、２７℃で７〜１０日間、およそ５０μモル  m-2s-1PARの連続光と共にインキュベートした。次いで、カルス化した胚を選択培地I上に移した（＜１８／プレート）。当該培地は、休眠培地（上述）と、100nM R-ハロキシホップ酸(0.0362mg/L；AAD-1遺伝子を保有するカルスの選択用）から構成された。このプレートを透明な箱に戻し、２７℃で７日間、およそ５０μモル  m-2s-1PARの連続光と共にインキュベートした。次いで、カルス化した胚を選択培地II上に移した（＜１２／プレート）。当該培地は、休眠培地（上述）と、500nM R-ハロキシホップ酸(0.181mg/L）から構成された。このプレートを透明な箱に戻し、２７℃で１４日間、およそ５０μモル  m-2s-1PARの連続光と共にインキュベートした。この選択工程により、トランスジェニックカルスをさらに増殖させ、分化させることが可能となった。
【０２０６】
増殖胚発生カルスを、再生前培地へと移した（＜９／プレート）。再生前培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；45gm/L スクロース；350mg/L L-プロリン；100mg/L myo-イノシトール；50mg/L カゼイン酵素加水分解物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L MES；0.5mg/L ナフタレン酢酸のNaOH溶液；2.5mg/L アブシジン酸のエタノール溶液；1mg/L 6-ベンジルアミノプリン；250mg/L カルベニシリン；2.5gm/L Gelzan（商標）；及び0.181mg/L ハロキシホップ酸；pH 5.8を含有した。このプレートを透明なプラスチックボックス内で保存し、２７℃で７日間、およそ５０μモル  m-2s-1 PARの連続光と共にインキュベートした。その後、再生カルスを、Phytatrays（商標）(sigma-aldrich社)中の再生培地へと移し（＜６／プレート）、２８℃で１日当たり、１６時間の明／８時間の暗（およそ１６０μモル  m-2s-1 PAR）で１４日間、根と茎が発生するまでインキュベートした。再生培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；60gm/L スクロース；100mg/L myo-イノシトール；125mg/L カルベニシリン；3gm/L Gellan（商標）ガム；及び0.181mg/L R-ハロキシホップ酸；pH 5.8を含有した。その後、一次根とともに小さい根を単離し、選択せずに伸長培地へと移した。伸長培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；30gm/L スクロース；及び3.5gm/L Gelrite（商標）、pH 5.8を含有した。
【０２０７】
形質転換された植物の根は、ハロキシホップを含有する培地上で増殖する能力により選択され、Phytatrays（商標）から、増殖培地(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)で満たされた小さなポットへと移植され、カップ又はHUMI-DOMES (ARCO PLASTICS)で覆われ、その後、Conviron 増殖チャンバー（２７℃昼間／２４℃夜間、１６時間の光周期、 50〜70% RH、200μモル m-2s-1 PAR)内で寒冷馴化させた。一部の例において、トウモロコシゲノム内に組み込まれたAAD1除草剤耐性遺伝子を検出するよう設計されたプライマーを使用した定量リアルタイムPCRアッセイにより、導入遺伝子の相対コピー数に関して、推定トランスジェニック小植物を解析した。さらに、RNA qPCRアッセイを使用して、推定形質転換体中で発現されたdsRNA中のST-LS1イントロン配列の存在を検出した。次いで、選択された形質転換小植物を温室内に移動させ、さらに成長させて検証した。
【０２０８】
バイオアッセイ及び種子産生を目的にした、温室内でのT0植物の移送及び確立  植物がV3〜V4段階に達したとき、IE Custom Blend (PROFILE/METRO MIX 160)土壌混合物へと移植し、温室内で成長させて開花させた（光露出型；フォト又は同化；ハイライト限界：1200PAR；１６時間の昼の長さ；２７℃昼間／２４℃夜間）。
【０２０９】
昆虫バイオアッセイに使用される植物は、小さなポットからTinus（商標）350-4 Rootrainers（登録商標） (Spencer-Lemaire Industries、Acheson, Alberta, Canada)へと移植した(１本の植物／イベント／Rootrainer（登録商標）)。Rootrainers（登録商標）へと移植したおよそ４日後、バイオアッセイを行うために植物に寄生させた。
【０２１０】
T1世代の植物は、非トランスジェニック選良近交系B104の植物から採取された花粉、又は他の適切な花粉ドナーから採取された花粉と、T0のトランスジェニック植物の毛を受粉させ、得られた種子を植えることにより取得された。可能な場合には、逆交雑も行われた。
【０２１１】
実施例６：
トランスジェニックトウモロコシ組織の分子学的解析
トウモロコシ組織の分子学的解析（例えば、RNA-qPCR）は、食害が分析される当日に、温室で育った植物から採取された葉及び根からのサンプルに対して行われる。
【０２１２】
Per5 3'UTRに対するRNA qPCRアッセイの結果を使用し、ヘアピン導入遺伝子発現を確認する。（非形質転換トウモロコシ植物においては、低レベルのPer5 3'UTR検出が予測される。その理由は、通常、トウモロコシ組織において内因性Per5遺伝子が発現されているからである）。発現されたRNA中のST-LS1イントロン配列（dsRNAヘアピン分子の形成に必須である）に関するRNA qPCRアッセイの結果を使用して、ヘアピン転写物の存在を確認する。導入遺伝子のRNA発現レベルは、内因性トウモロコシ遺伝子のRNAレベルと比較して測定される。
【０２１３】
ゲノムDNA中のAAD1コード領域の一部を検出するDNA qPCR解析を使用して、導入遺伝子の挿入コピー数を推定する。これらの解析のためのサンプルは、環境チャンバーで成長した植物から採取される。結果を、単一コピーの天然遺伝子の一部を検出するよう設計されたアッセイのDNA qPCRの結果と比較し、シンプルなイベント（thread導入遺伝子を１又は２コピー有する）を、温室内でのさらなる実験へと進める。
【０２１４】
さらに、スペクチノマイシン耐性遺伝子（SpecR；T-DNAの外側のバイナリーベクタープラスミド上に保有されている）の一部を検出するよう設計されたqPCRアッセイを使用して、トランスジェニック植物が、外来性に取込まれたプラスミドの主鎖配列を含有しているか否かを決定する。
【０２１５】
ヘアピンRNA転写物の発現レベル：Per 5 3'UTR qPCR  カルス細胞イベント又はトランスジェニック植物を、Per 5 3'UTR配列のリアルタイム定量PCR（qPCR）により解析し、固有トウモロコシ遺伝子（配列番号２１；GENBANKアクセッション番号BT069734）の転写レベルと比較した、全長ヘアピン転写物の相対発現レベルを決定する。当該配列は、TIP41様タンパク質（すなわち、GENBANKアクセッション番号AT4G34270のトウモロコシホモログであり、74%同一性のtBLASTXスコアを有する）をコードする。RNAは、RNAeasy（商標）96キット (Qiagen社、Valencia, CA)を使用して単離される。溶出後、総RNAを、キット推奨プロトコールに従い、DNase1処置に供する。次いで、RNAを、NanoDrop8000 分光光度計(Thermo Scientific社)上で定量し、濃度を２５ng/μLに標準化する。第一鎖cDNAは、High Capacity cDNA合成キット(INVITROGEN社)を使用し、実質的にメーカー推奨プロトコールに従い、５μLの変性RNAを用いて１０μLの反応量で調製する。プロトコールを若干改変し、10μLの100μM T20VNオリゴヌクレオチド(IDT) (配列番号２２、TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN、式中、VはA、C、又はGであり、及びNはA、C、G、又はT/Uである）を、ランダムプライマーストックミックスの1mL管へと加えるようにして、ランダムプライマーとオリゴdTが混合されたワーキングストックを作製する。
【０２１６】
cDNA合成後、サンプルを、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１：３に希釈し、解析を行うまで-２０℃で保存する。
【０２１７】
Per5 3' UTR及びTIP41様転写物に対し、別々のリアルタイムPCRアッセイを、１０μLの反応量で、LightCycler（商標） 480 (Roche diagnostics社、Indianapolis, IN)上で行う。Per5 3'UTRのアッセイに関しては、プライマーのP5U76S (F) （配列番号２３）と、P5U76A (R) （配列番号２４）、及びRoche Universal Probe（商標）(UPL76；カタログ番号4889960001；FAMで標識）を用いて反応を行う。TIP41様参照遺伝子のアッセイに関しては、プライマーのTIPmxF (配列番号２５)とTIPmxR(配列番号２６)、及びHEX（ヘキサクロロフルオレセイン）で標識されたプローブHXTIP（配列番号２７）を使用する。
【０２１８】
すべてのアッセイに、鋳型無しの陰性対照が含まれる（ミックスのみ）。標準曲線のために、ブランク（ソースウェルに水）も、ソースプレートに含ませ、サンプルのクロスコンタミネーションをチェックする。プライマーとプローブの配列は、表４に記載される。様々な転写物検出のための反応成分のレシピは、表５に開示されており、PCRの反応条件は、表６に要約されている。FAM（6-カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分は465nmで励起し、蛍光は510nmで測定される。HEX（ヘキサクロロフルオレセイン）蛍光部分の対応する値は、533nmと580nmである。
【０２１９】
表４  トランスジェニックトウモロコシ中の転写物レベルの分子学的解析のためのオリゴヌクレオチド配列。
【表４】
2018523971.tif 000006
【０２２０】
表５  転写物検出のためのPCR反応レシピ
【表５】
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【０２２１】
表６  RNA  qPCRのサーモサイクラー条件
【表６】
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【０２２２】
データは、メーカーの推奨に従い、Cq値算出のための二次導関数maxアルゴリズムを使用した相対定量により、LightCycler（商標）ソフトウェア v1.5を使用して解析される。発現解析に関し、発現レベルは、ΔΔCt法（すなわち、2-(Cq TARGET - Cq REF)）を使用して算出される。当該方法は、２つのターゲットの間のCq値の差の比較に依っており、最適化PCR反応に関し、産物はサイクルごとに２倍になるという仮定のもと、基準値２が選択される。
【０２２３】
ヘアピン転写物のサイズと完全性  ノーザンブロットアッセイ  一部の例において、トランスジェニック植物の追加の分子学的特徴解析が、ノーザンブロット（RNAブロット）解析の使用により行われ、threadヘアピンdsRNAを発現するトランスジェニック植物における、threadヘアピンRNAの分子量が決定される。
【０２２４】
すべての材料と装置は、RNAzap(AMBION/INVITROGEN社)を用いて使用前に処置される。組織サンプル（100mg〜500mg）は、2mLのsafelock Eppendorf管で採取され、Klecko（商標）組織粉砕機(Garcia Manufacturing社、Visalia, CA)で、1mLのTRIzol (INVITROGEN社)中、３個のタングステンビーズを用いて５分間破壊され、その後、室温（RT）で１０分間インキュベートされる。任意で、サンプルを１０分間、４℃、１１，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい2mLsafelock Eppendorf管へと移す。ホモジネートに200μLのクロロホルムを加えた後、管を２〜５分間、転倒混和し、RTで１０分間インキュベートして、４℃で１５分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。上層を滅菌1.5mLEppendorf管へと移し、600μLの100%イソプロパノールを加え、その後、１０分間〜２時間、RTでインキュベートし、次いで、４℃〜２５℃で１０分間、１２，０００ｘｇで遠心分離する。上清を捨て、RNAペレットを２回、1mLの70%エタノールで洗浄し、洗浄と洗浄の間に、１０分間、４℃〜２５℃、７，５００ｘｇで遠心分離する。エタノールを捨て、ペレットを３〜５分間、簡単に空気乾燥させ、その後、ヌクレアーゼフリーの水５０μL中に再懸濁する。
【０２２５】
総RNAを、Nanodrop 8000（登録商標）(Thermo-Fisher社)を使用して定量し、サンプルを5μg／10μLに標準化する。次いで、10μLのグリオキサル（AMBION/INVITROGEN社）を各サンプルに加える。5〜14ngのDIG RNA標準マーカーミックス（Roche Applied Science社、 Indianapolis, IN）を調製し、等量のグリオキサルに加える。サンプルとマーカーRNAを４５分間、５０℃で変性させ、NorthernMax 10 X グリオキサル泳動緩衝液(AMBION/INVITROGEN社)中、1.25% SeaKem ゴールドアガロース(Lonza社、Allendale, NJ)ゲルにローディングするまで氷上で保管する。RNAは、65ボルト／30mAで、２時間１５分間、電気泳動により分離される。
【０２２６】
電気泳動後、ゲルを５分間、2xSSC中でリンスし、gel docステーション(BioRad社, Hercules, CA)上で画像化し、その後、RNAを、トランスファー緩衝液として10xSSCを使用して、RTで一晩、ナイロン膜（Millipore社）へ受動的にトランスファーする（20xSSCは、3M 塩化ナトリウムと300mM クエン酸三ナトリウム、pH7.0からなる）。トランスファー後、膜を2xSSCで５分間リンスして、RNAを膜（Agilent/Stratagene社）にUV架橋させ、その膜を室温で最大２日乾燥させる。
【０２２７】
膜を１〜2時間、UltraHyb緩衝液(AMBION/INVITROGEN社)中でプレ−ハイブリダイズさせる。プローブは、Roche Applied Science DIG法によりジゴキシゲニンで標識された、対象配列を含有するPCR増幅産物（例えば、必要に応じて、配列番号１０、又は配列番号１１のアンチセンス配列部分のアンチセンス配列部分）からなる。推奨緩衝液中でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション管中、６０℃の温度で一晩である。ハイブリダイゼーション後、ブロットをDIG洗浄に供し、ラップして、１〜３０分間、フィルムに曝露し、その後、そのフィルムを現像させる。すべてDIGキットのサプライヤーの推奨する方法によるものである。
【０２２８】
導入遺伝子のコピー数決定
おおよそ２葉パンチ分と等しいトウモロコシの葉片を、９６ウェルコレクションプレート（Qiagen社）に集める。組織破壊は、１つのステンレススチールビーズを用いて、Biosprint96 AP1溶解緩衝液（Biosprint96 PLANT KITと共に提供される；Qiagen社)中、Klecko（商標）組織粉砕機(Garcia Manufacturing, Visalia, CA)を使用して行われる。組織を浸軟させた後、ゲノムDNA（gDNA）を、Biosprint96 PLANT KIT 及びBiosprint96抽出ロボットを使用し、ハイスループットフォーマット中で単離する。ゲノムDNAは、qPCR反応をセットアップする前に、２：３のDNA：水に希釈される。
【０２２９】
qPCR解析  加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子の検出は、LightCycler（登録商標）480システムを使用したリアルタイムPCRにより行われる。ST-LS1イントロン配列（配列番号１６）を検出するため、又はSpecR遺伝子（すなわち、バイナリーベクタープラスミド上に担持されているスペクチノマイシン耐性遺伝子；配列番号２８；表７のSPC1オリゴヌクレオチド）を検出するための加水分解プローブアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、LightCycler（登録商標）プローブ設計ソフトウェア 2.0を使用して設計される。さらに、AAD-1除草剤耐性遺伝子（配列番号２９；表７のGAAD1オリゴヌクレオチド）のセグメントを検出するための加水分解プローブアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems社)を使用して設計される。表７は、プライマーとプローブの配列を示す。アッセイは、固有トウモロコシ染色体遺伝子（インベルターゼ（配列番号３０）；GENBANKアクセッション番号U16123；本明細書においてIVR1と呼称される）に対する試薬を用いてマルチプレックス化され、それを各アッセイ中にgDNAが存在していることを確認するための内部標準配列として使用する。増幅のために、LightCycler（登録商標）480 Probes Masterミックス(Roche Applied Science社)を、各プライマーを0.4μM、各プローブを0.2μM含有する、10μL量のマルチプレックス反応液中、１ｘの最終濃度で調製する（表８）。表９に概要されるように、２工程の増幅反応を行う。FAM標識プローブとHEX標識プローブに対する蛍光活性化と発光は上述のとおりであり、CY5結合体は650nmで最大励起し、670nmで最大蛍光発光する。
【０２３０】
Cpスコア（蛍光シグナルがバックグラウンド閾値と交差するポイント）は、適合点アルゴリズム（LightCycler（登録商標）ソフトウェアリリース1.5）と相対Quantモジュール（DDCt法に基づく）を使用したリアルタイムPCRデータから決定される。データは、前述のように（上記；RNA qPCR）扱われる。
【０２３１】
表７  遺伝子コピー数決定とバイナリーベクタープラスミド主鎖検出のためのプライマーとプローブ（蛍光結合付き）の配列。
【表７】
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【０２３２】
表８  遺伝子コピー数解析及びプラスミド主鎖検出のための反応成分
【表８】
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【０２３３】
表９  DNA  qPCRのサーモサイクラー条件
【表９】
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【０２３４】
実施例７
半翅目害虫配列を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
配列番号１、配列番号３、及び／又は配列番号４を含有する核酸に対する発現ベクターを有する、１０〜２０のトランスジェニックT0トウモロコシ（Zea mays）植物を、実施例４に記載されるように作製する。さらに、RNAi構築物用のヘアピンdsRNAを発現する、１０〜２０のT1トウモロコシ（Zea mays）独立系統を、BSBチャレンジのために取得する。ヘアピンdsRNAは、配列番号１０、又は配列番号１１、又はさらに配列番号１を含有する別の配列に明記されるものに由来してもよい。これらは、RT-PCR又は他の分子学的解析法を介して確認される。選択された独立T1系統からの総RNA調製物を、任意で、各RNAi構築物においてヘアピン発現カセットのST-LS1イントロン中に結合するよう設計されたプライマーを用いたRT-PCRに使用する。さらに、RNAi構築物中の各標的遺伝子に対する特異的プライマーを任意で使用して、in plantaでのsiRNAの産生に必要とされるプロセッシング前mRNAを増幅させ、その産生を確認する。各標的遺伝子に対し所望されるバンドの増幅は、各トランスジェニックトウモロコシ（Zea Mays）植物におけるヘアピンRNAの発現を裏付けるものである。引き続き、標的遺伝子のdsRNAヘアピンのsiRNAへのプロセッシングは、任意で、RNAブロットハイブリダイゼーションを使用した独立したトランスジェニック系統において裏付けられる。
【０２３５】
さらに、標的遺伝子に対し８０％を超える配列同一性を伴うミスマッチ配列を有するRNAi分子は、標的遺伝子に対し１００％の配列同一性を有するRNAi分子で見られるものとある程度類似した影響をコーンルートワームに与える。同じRNAi構築物中でヘアピンdsRNAを形成する天然配列とミスマッチ配列の対形成は、摂食している半翅目害虫の成長、発達、及び活性に影響を与えることができる植物−処理化siRNAを送達する。
【０２３６】
標的遺伝子に対応するdsRNA、siRNA、shRNA、又はmiRNAのin planta送達、及びその結果としての摂食を介した半翅目害虫による取込は、RNA介在性遺伝子サイレンシングを介した半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を生じさせる。標的遺伝子の機能が１つ以上の発達段階で重要なものであった場合、半翅目害虫の成長、発達及び繁殖は影響を受け、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、ミドリカメムシ（Acrosternum hilare）、及び茶色カメムシ（Euschistus servus）のうちの少なくとも１つの場合において、半翅目害虫の寄生、摂食、発達、及び／又は繁殖が失敗に導かれ、又は半翅目害虫の死がもたらされる。ひいては、標的遺伝子の選択、及びRNAi適用の成功で、半翅目害虫が制御される。
【０２３７】
トランスジェニックRNAi系統、及び非形質転換トウモロコシ（Zea mays）の表現型比較  ヘアピンdsRNA生成を目的として選択された標的半翅目害虫遺伝子又は配列は、いずれの公知の植物遺伝子配列に対しても類似性を有していない。したがって、これら半翅目害虫遺伝子又は配列を標的とする構築物による（全身性の）RNAiの産生又は活性化は、トランスジェニック植物に対し何らかの有害な影響を与えるとは予測されない。しかしながら、トランスジェニック系統の発達及び形態学的特徴を、非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有していない「空の」ベクターを用いて形質転換されたトランスジェニック系統の植物と比較する  植物の根、芽、葉、及び繁殖の特徴が比較される。トランスジェニック植物と非形質転換植物の根の長さ、及び成長パターンに差異は観察されない。例えば高さ、葉の数、及びサイズなどの植物の芽の特徴、開花時期、花柄のサイズ及び外観は類似している。概して、in vitro及び温室の土壌において栽培された際、トランスジェニック系統と、標的iRNA分子の発現を伴わない系統の間に観察可能な形態学的差異はない。
【０２３８】
実施例８
半翅目害虫配列を含有するトランスジェニックダイズ（Glycine max）
配列番号１、配列番号３、及び／又は配列番号４を含有する核酸に対する発現ベクターを有する、１０〜２０のトランスジェニックT0ダイズ（Glycine max）植物を、以下のように、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換などを含む、当分野に公知のように作製する。成熟ダイズ（Glycine max）の種子を、塩素ガスで一晩、１６時間滅菌する。塩素ガスでの滅菌後、Laminar（商標）フローフード内の蓋の開いた容器に置き、塩素ガスを消散させる。次に、ブラックボックスを用いて１６時間、暗所、２４℃にて滅菌H2Oを滅菌した種に吸収させる。
【０２３９】
分割ダイズ種の調製  胚軸の一部を含有する分割ダイズ種子の手順は、ダイズ種子材料の調製が必要であった。ダイズ種子材料は、外科用メスに装着された#10刃を使用し、種のへそに沿って長軸に切り、種の覆いを分離させて取り除き、種子を２つの子葉部分に分けたものであった。注意深く胚軸を部分的に除去し、胚軸の約１／２〜１／３は子葉の節の末端に付着したままにする。
【０２４０】
接種  胚軸の一部分を含有する分割ダイズ種子を、次いで、配列番号１、配列番号３、及び／又は配列番号４を含有するバイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（例えばEHA101株又はEHA105株）の溶液に約30分間、浸す。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の溶液は、λ＝0.6OD650の最終濃度に希釈され、その後、胚軸を含有する子葉を浸す。
【０２４１】
共培養  接種後、分割ダイズ種子を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）系統と、一片のろ紙で覆われたペトリディッシュ中、共培養培地(Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.) 上で、５日間、共培養させる。
【０２４２】
発芽誘導  共培養の５日後、分割ダイズ種を、B5塩、B5ビタミン類、28mg/L 第一鉄、38mg/L Na2EDTA、30g/L スクロース、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L Timentin（商標）、200mg/L セフォタキシム、及び50mg/L バンコマイシン(pH 5.7)からなる発芽誘導（SI）培地液中で洗浄する。次いで、分割ダイズ種子を、B5塩、B5ビタミン類、7g/L Nobleアガー、28mg/L 第一鉄、38mg/L Na2EDTA、30g/L スクロース、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L Timentin（商標）、200mg/L セフォタキシム、及び50mg/L バンコマイシン(pH 5.7)からなる発芽誘導I（SI  I）培地上で培養し、子葉の平らな面を仰向けにさせ、子葉の節末端を培地中に埋め込む。培養の２週間後、形質転換された分割ダイズ種子からの外植片を、6mg/L グルホシナート(Liberty（登録商標）)を補充されたSI I培地を含有する発芽誘導II（SI  II）培地に移す。
【０２４３】
芽の伸長  SI  II培地上での培養の２週間後、子葉を外植片から取り除き、胚軸を含有する新しい芽の浮葉（pad)を、子葉の底で切断することにより切除する。子葉から単離された芽の浮葉を、芽伸長（SE）培地へと移す。SE培地は、MS塩、28mg/L 第一鉄、38mg/L Na2EDTA、30g/L スクロース、及び0.6g/L MES、50 mg/L アスパラギン、100mg/L L-ピログルタミン酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L ゼアチンリボシド、50mg/L Timentin（商標）、200mg/L セフォタキシム、50mg/L バンコマイシン、6mg/L グルホシナート、及び7g/L Nobleアガー(pH 5.7)からなる。培養物を新鮮なSE培地へと２週間毎に移す。培養物を、Conviron（商標）増殖チャンバー内で、２４℃、80〜90μモル/m2秒の光密度、１８時間の光周期で増殖させる。
【０２４４】
発根  子葉の芽浮葉から発達した伸長根を、子葉の芽浮葉の底で伸長根を切断することにより単離し、発根を促進するために１〜３分間、1mg/L  IBA（3-酪酸インドール）中に伸長根を浸す。次に、伸長した根を、フィタントレイ中、発根培地（MS塩、B5ビタミン、28mg/L 第一鉄、38 mg/L Na2EDTA、20 g/L スクロース及び0.59g/L MES、50 mg/L アスパラギン、100mg/L L-ピログルタミン酸、7g/L Nobleアガー、pH 5.6)に移した。
【０２４５】
栽培  Conviron（商標）増殖チャンバーでの２４℃、１８時間の光周期の１〜２週間の培養後、根が発達した芽を、覆いをしたサンデーカップ中、土壌ミックスへと移し、未発達植物の順応を目的として、長日条件（１６時間の明／８時間の暗）下、120〜150μモル/m2秒の光密度、一定温度（２２℃）と湿度（４０〜５０％）で、Conviron（商標）増殖チャンバー(モデルCMP4030及びCMP3244、Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada)に置く。発根した未発達植物を、数週間、サンデーカップ中で順応させ、その後、さらなる順応と、しっかりしたトランスジェニックダイズ植物の確立のために温室へと移す。
【０２４６】
さらに、RNAi構築物用のヘアピンdsRNAを発現する、１０〜２０のT1ダイズ（Glycine max）独立系統を、BSBチャレンジのために取得する。ヘアピンdsRNAは、配列番号１０、及び／又は配列番号１１、又はさらに配列番号１を含有する別の配列に明記されるものに由来してもよい。これらは、RT-PCR又は他の分子学的解析法を介して確認される。選択された独立T1系統からの総RNA調製物を、任意で、各RNAi構築物においてヘアピン発現カセットのST-LS1イントロン中に結合するよう設計されたプライマーを用いたRT-PCRに使用する。さらに、RNAi構築物中の各標的遺伝子に対する特異的プライマーを任意で使用して、in plantaでのsiRNAの産生に必要とされるプロセッシング前mRNAを増幅させ、その産生を確認する。各標的遺伝子に対し所望されるバンドの増幅は、各トランスジェニックダイズ（Glycine max）植物におけるヘアピンRNAの発現を裏付けるものである。引き続き、標的遺伝子のdsRNAヘアピンのsiRNAへのプロセッシングは、任意で、RNAブロットハイブリダイゼーションを使用した独立したトランスジェニック系統において裏付けられる。
【０２４７】
さらに、標的遺伝子に対し８０％を超える配列同一性を伴うミスマッチ配列を有するRNAi分子は、標的遺伝子に対し１００％の配列同一性を有するRNAi分子で見られるものとある程度類似した影響をコーンルートワームに与える。同じRNAi構築物中でヘアピンdsRNAを形成する天然配列とミスマッチ配列の対形成は、摂食している半翅目害虫の成長、発達、及び活性に影響を与えることができる植物−処理化siRNAを送達する。
【０２４８】
標的遺伝子に対応するdsRNA、siRNA、shRNA、又はmiRNAのin planta送達、及びその結果としての摂食を介した半翅目害虫による取込は、RNA介在性遺伝子サイレンシングを介した半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を生じさせる。標的遺伝子の機能が１つ以上の発達段階で重要なものであった場合、半翅目害虫の成長、発達及び繁殖は影響を受け、新熱帯茶色カメムシ（Euschistus heros）、アカオビカメムシ（Piezodorus guildinii）、クサギカメムシ（Halyomorpha halys）、ミナミアオカメムシ（Nezara viridula）、ミドリカメムシ（Acrosternum hilare）、及び茶色カメムシ（Euschistus servus）のうちの少なくとも１つの場合において、半翅目害虫の寄生、摂食、発達、及び／又は繁殖が失敗に導かれ、又は半翅目害虫の死がもたらされる。ひいては、標的遺伝子の選択、及びRNAi適用の成功で、半翅目害虫が制御される。
【０２４９】
トランスジェニックRNAi系統、及び非形質転換ダイズ（Glycine max）の表現型比較  ヘアピンdsRNA生成を目的として選択された標的半翅目害虫遺伝子又は配列は、いずれの公知の植物遺伝子配列に対しても類似性を有していない。したがって、これら半翅目害虫遺伝子又は配列を標的とする構築物による（全身性の）RNAiの産生又は活性化は、トランスジェニック植物に対し何らかの有害な影響を与えるとは予測されない。しかしながら、トランスジェニック系統の発達及び形態学的特徴を、非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有していない「空の」ベクターを用いて形質転換されたトランスジェニック系統の植物と比較する  植物の根、芽、葉、及び繁殖の特徴が比較される。トランスジェニック植物と非形質転換植物の根の長さ、及び成長パターンに差異は観察されない。例えば高さ、葉の数、及びサイズなどの植物の芽の特徴、開花時期、花柄のサイズ及び外観は類似している。概して、in vitro及び温室の土壌において栽培された際、トランスジェニック系統と、標的iRNA分子の発現を伴わない系統の間に観察可能な形態学的差異はない。
【０２５０】
実施例９
人工飼料に対する新熱帯茶色カメムシ（E. heros）のバイオアッセイ
人工飼料に対するdsRNA摂食アッセイにおいて、注入実験（実施例１）にあるように、32ウェルのトレイを、約18mgの人工飼料のペレットと水でセットアップする。200ng/μLの濃度のdsRNAを飼料ペレットと水サンプルに加える；2つのウェル各々に対し、100μL。５匹の２齢の新熱帯茶色カメムシ（E. heros）若虫を、各ウェルに入れる。水サンプルと、YFP転写物を標的とするdsRNAを陰性対照として使用する。実験は、３回、別の日に繰り返される。処置の８日後に生き残った昆虫の重量を計測し、死亡率を決定する。
【０２５１】
実施例１０：
半翅目害虫配列を含有するトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
thread（配列番号１）のセグメントを含有するヘアピン構造用標的遺伝子構築物を含有するシロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターを、実施例３に類似した標準的な分子学的方法を使用して作製した。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の形質転換は、標準的なアグロバクテリウム（Agrobacterium）を基にした方法を使用して行われた。グルホシナート耐性選択マーカーを有するT1種子が選択された。トランスジェニックT1シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物を作製し、ホモ接合性単一コピーT2トランスジェニック植物を昆虫実験のために作製する。花序を付けた生長中のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物に対しバイオアッセイを行う。５〜１０匹の昆虫を各植物上に置き、１４日以内の生存を監視する。
【０２５２】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターの構築 thread（配列番号１）のセグメントを含有するヘアピン構造用の標的遺伝子構築物を有するエントリーベクターのpDAB119602、及びpDAB119603を基にしたエントリークローンは、化学合成された断片(DNA2.0, Menlo Park, CA)の組み合わせと、標準的な分子クローニング法を使用してアセンブリされた。RNA一次転写物による分子内ヘアピン構造は、標的遺伝子セグメントの２つのコピーを反対方向に（単一転写ユニット内で）配置することにより促進され、この２つのセグメントはST-LS1イントロン配列(配列番号１６）（Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)により分離された。したがって、一次mRNA転写物は、イントロン配列により分離された、互いの大きな反転リピートとして、２つのthread遺伝子セグメント配列を含有した。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター(Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493)のコピーを使用して、一次mRNAヘアピン転写物の産生を誘導し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム２３由来の３’非翻訳領域を含有する断片(AtuORF23 3' UTR v1；米国特許第5,428,147号)を使用して、ヘアピンRNA発現遺伝子の転写を終結させた。
【０２５３】
エントリーベクターのpDAB119602は、thread（配列番号１）のセグメントを含有するthreadヘアピンv1-RNA構築物（配列番号１０）を含有する。
【０２５４】
エントリーベクターのpDAB119603は、pDAB119602にあるものとは異なるthread（配列番号１）のセグメントを含有するthreadヘアピンv4-RNA構築物（配列番号１１）を含有する。
【０２５５】
上記のエントリーベクターのpDAB119602、及びpDAB119603内のヘアピンクローンは、典型的なバイナリーデスティネーションベクターのpDAB101836との標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応に使用され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換のためのヘアピンRNA発現形質転換ベクターが作製された。
【０２５６】
バイナリーデスティネーションベクターのpDAB101836は、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV Promoter v2、米国特許第7,601,885号； Verdaguer et al, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139）の制御下の除草剤耐性遺伝子のDSM-2v2 (米国特許出願2011/0107455)を含有した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム１の３’非翻訳領域を含有する断片(AtuORF1 3' UTR v6；Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172:1814-1822)を使用して、DSM2v2 mRNAの転写を終結させた。
【０２５７】
YFPヘアピンRNAを発現する遺伝子を含有する陰性対照のバイナリー構築物であるpDAB114507は、典型的なバイナリーデスティネーションベクター(pDAB101836) とエントリーベクターのpDAB112644を用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築された。エントリー構築物のpDAB112644は、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ユビキチン１０プロモーター（上述）の発現制御下のYFPヘアピン配列(hpYFP v2-1、配列番号１５）、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（上述）由来のORF23 3'非翻訳領域を含有する断片を含有した。
【０２５８】
配列番号１０は、pDAB119611に存在するときの、 threadヘアピンv1-RNA形成配列を示す。
【０２５９】
配列番号１１は、pDAB119612に存在するときの、 threadヘアピンv4-RNA形成配列を示す。
【０２６０】
殺虫性ヘアピンRNAを含有するトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis ）の産生 アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換。ヘアピン配列を含有するバイナリープラスミドを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）GV3101株(pMP90RK)へとエレクトロポレーションした。組み換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）のクローンは、組み換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーのプラスミド調製物の制限酵素解析によって確認された。Qiagen Plasmid Max Kit (Qiagen社、カタログ番号12162)を使用して、メーカー推奨のプロトコールに従い、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物からプラスミドを抽出した。
【０２６１】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の形質転換、及びT1選択 １２〜１５のシロイヌナズナ属植物（栽培品種Columbia）を、250μモル/m2の光密度、２５℃、及び１８：６時間の明暗条件で、温室内の４インチポット内で成長させた。最初の花の茎を、形質転換の１週間前に切り取った。アグロバクテリウム接種物は、100mlのLBブロス(Sigma社 L3022)+100mg/L スペクチノマイシン+50mg/L  カナマイシン中で、組み換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）グリセロールストック10μlを28℃でインキュベートし、72時間、225rpmで振とうすることにより調製された。アグロバクテリウム細胞を回収し、5%スクロース + 0.04% Silwet-L77 (Lehle Seeds カタログ番号 VIS-02) +10 μg/L ベンズアミノプリン (BA)溶液に、OD600 0.8〜1.0まで懸濁させ、その後、花を浸漬する。植物の地上部分を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液に穏やかに攪拌しながら5〜10分間浸漬する。次いで、正常に成長させるために植物を温室に移し、定期的な水やりと施肥を行いながら、結実させた。
【０２６２】
実施例１１
トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の成長及びバイオアッセイ 
ヘアピンRNAi構築物で形質転換されたT1シロイヌナズナ属（ Arabidopsis）の選択 各形質転換に対し、200mg以下のT1種子を、0.1%アガロース溶液中で階層化させる。#5サンシャインメディア（#5 sunshine media）を有する発芽トレイ(10.5インチ x 21インチ x 1インチ；T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN.)に種を植える。種植え後6日目及び9日目で、280g/haのIgnite（登録商標）(グルホシナート)に対する耐性に関し、形質転換体を選択する。選択されたイベントを、４インチ直径のポットへと移植する。挿入コピー解析を、Roche LightCycler480を使用した加水分解定量的リアルタイムPCR（qPCR）を介して、移植から１週以内に行う。PCRプライマーと加水分解プローブは、LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche社)を使用し、DSM2v2選択マーカーに対して設計される。植物は、２４℃、１６：８時間の明暗光周期で、100〜150mE/m2×sの強度の蛍光及び白熱光の下、維持される。
【０２６３】
新熱帯茶色カメムシ（E. heros）の植物摂食バイオアッセイ. 少なくとも４個の低頻度コピー（１〜２個の挿入）、４個の中頻度コピー（２〜３個の挿入）、及び４個の高頻度コピー（≧４個の挿入）のイベントを、各構築物に対し選択する。植物を、開花期まで成長させる（植物は花と長角果を含有している）。昆虫を簡単に確認するために、土壌表面を、約50mL体積の白砂で覆う。５〜１０匹の２齢の新熱帯茶色カメムシ（E. heros）の若虫を、各植物の上に置く。直径３インチ、高さ１６インチ、壁の厚さは０．０３インチのプラスチック管(製品番号484485, Visipack Fenton MO)で植物を覆う。管をナイロンメッシュで覆い、昆虫から隔離する。植物を、コンビロン（conviron）において、通常の温度、光、及び水やりの条件下で維持する。１４日目に、昆虫を集め、重量を測定し、死亡率ならびに成長阻害（1-重量処置／重量対照）を算出する。YFPヘアピン発現植物を対照として使用する。
【０２６４】
T2シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の種子の産生、及びT2バイオアッセイ T2種子は、各構築物に対し選択された低頻度コピー（１〜２個の挿入）イベントから産生される。植物（ホモ接合体及び／又はヘテロ接合体）を、上述のように新熱帯茶色カメムシ（E. heros）の摂食バイオアッセイに供する。T3種子をホモ接合体から採取し、さらなる解析のために保存する。
【０２６５】
本開示は、様々な改変及び別形態を受容可能であるが、本明細書においては、詳細な例示を目的として特定の実施形態を記載する。しかしながら、本開示は、開示される特定の形態に限定されることを意図していないことを理解されたい。さらに、本開示は、以下に添付される請求項により定義される本開示の範囲内にある全ての改変、均等、及び代替、ならびにそれらの法的均等を含有するものである。
【０２６６】
実施例１２
追加の作物種の形質転換
綿花を、当分野に公知の方法、例えば米国特許第7,838,733号の実施例１４に従前に記載される実質的に同じ技術、又はPCT国際特許出願公開WO 2007/053482の実施例１２に従前に記載される実質的に同じ技術を使用して、threadヘアピンRNAi構築物で形質転換させ、半翅目害虫に対する防御を提供する。
【０２６７】
thread dsRNA導入遺伝子を、他のdsRNA分子と組み合わせて、冗長なRNAi標的化及び相乗的なRNAi効果をもたらすことができる。限定されないが、threadを標的とするdsRNAを発現しているトウモロコシ、ダイズ、及び綿花のイベントをはじめとするトランスジェニック植物は、半翅目昆虫による食害の防御に有用である。threaddsRNA導入遺伝子は、昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドのバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の殺虫性タンパク質技術との組み合わせに対し、新規の作用機序を示し、これら半翅目制御技術のうちのいずれかに対し抵抗性の群の発現を低下させる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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