(57)【要約】遺伝学的に操作した細菌、その薬剤組成物、および自己免疫障害を処置または防止し、消化管における炎症メカニズムを抑制し、および／または消化管粘膜バリア機能を強化する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非天然な消化管バリア機能エンハンサー分子または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生する１つ以上の生合成経路をコードする少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットを含む細菌であって、
前記１つ以上の消化管バリア機能エンハンサー分子の少なくとも１つは、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）アゴニスト、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）アゴニスト、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＧＰＲ４１活性化因子、ＧＰＲ４３活性化因子、およびＧＰＲ１０９Ａから選ばれ、
前記少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットは、天然では当該遺伝子または遺伝子カセットと関連していない直接的または間接的に誘導可能なプロモーターであって、哺乳類の消化管において見出される外因性環境条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される、細菌。
【請求項２】
１つ以上の非天然な抗炎症分子をコードする、少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットをさらに含む、請求項１の細菌。
【請求項３】
前記プロモーターは低酸素または嫌気条件下で誘導される、請求項１または２の細菌。
【請求項４】
前記プロモーターはＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーター、またはＤＮＲ応答性プロモーターである、請求項３の細菌。
【請求項５】
前記プロモーターはＦＮＲ応答性プロモーターである、請求項４の細菌。
【請求項６】
前記プロモーターは反応性窒素種の存在によって誘導される、請求項１または２の細菌。
【請求項７】
前記プロモーターはＮｓｒＲ応答性プロモーター、ＮｏｒＲ応答性プロモーター、またはＤＮＲ応答性プロモーターである、請求項６の細菌。
【請求項８】
前記プロモーターは反応性酸素種の存在によって誘導される、請求項１または２の細菌。
【請求項９】
前記プロモーターはＯｘｙＲ応答性プロモーター、ＰｅｒＲ応答性プロモーター、ＯｈｒＲ応答性プロモーター、ＳｏｘＲ応答性プロモーター、またはＲｏｓＲ応答性プロモーターである、請求項８の細菌。
【請求項１０】
前記遺伝子および／または遺伝子カセットは細菌の染色体上に位置する、請求項１−９のいずれか一項の細菌。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの遺伝子および／または遺伝子カセットは細菌のプラスミド上に位置する、請求項１−９のいずれか一項の細菌。
【請求項１２】
前記アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）アゴニストは、インドール、インドール−３アルデヒド、インドール−３プロピオン酸、インドール−３アセタート、キヌレニン、６−フォルミルインドールカルバゾール（６−ｆｏｒｍｙｌｉｎｄｏｌｃａｒｂａｚｏｌｅ）、およびキヌレン酸から選ばれる、請求項１−１１のいずれか一項の細菌。
【請求項１３】
前記プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）アゴニストはインドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）である、請求項１−１１のいずれか一項の細菌。
【請求項１４】
前記ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤はブチラートである、請求項１−１１のいずれか一項の細菌。
【請求項１５】
前記ＧＰＲ４１活性化因子はブチラート、プロピオナート、およびアセタートから選ばれる、請求項１−１１のいずれか一項の細菌。
【請求項１６】
前記ＧＰＲ４３活性化因子はブチラート、プロピオナート、およびアセタートから選ばれる、請求項１−１１のいずれか一項の細菌。
【請求項１７】
前記ＧＰＲ１０９Ａ活性化因子はブチラート、キヌレン酸、およびナイアシンから選ばれる、請求項１−１１のいずれか一項の細菌。
【請求項１８】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、短鎖脂肪酸、プロピオナート、ブチラート、アセタート、ＩＬ−１０（ヒト）、ＩＬ−１０（ウイルス）、ＩＬ−２、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４，ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＧＬＰ−２、エラフィン、トレフォイル因子、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２アナログ、ＧＬＰ−１、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、メラトニン、トリプトファン、トリプトファン代謝産物、ＰＧＤ2，キヌレン酸、インドール、およびインドール代謝産物から選ばれる、請求項１−１７のいずれか一項の細菌。
【請求項１９】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は短鎖脂肪酸である、請求項１８の細菌。
【請求項２０】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、プロピオナート、ブチラート、およびアセタートから選ばれる、請求項１９の細菌。
【請求項２１】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、およびＧＬＰ−２から選ばれる、請求項１８の細菌。
【請求項２２】
ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、およびＧＬＰ−２から選ばれる抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子をさらに含む、請求項１９の細菌。
【請求項２３】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＣＸＣＬ−８、およびＣＣＬ２から選ばれる炎症促進性分子に対して向けられるｓｃＦｖ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから選ばれる、請求項１−１７のいずれか一項の細菌。
【請求項２４】
ブチラート、プロピオナート、アセタート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、およびＧＬＰ−２から選ばれる１つ以上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子をさらに含む、請求項２３の細菌。
【請求項２５】
変異または欠失がある１つ以上のネイティブ遺伝子を有し、前記ネイティブ遺伝子はｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡ、ｎｌｐ１、ｄｅｇＰ、およびｏｍｐＴから選択される、請求項１−２４のいずれか一項の細菌。
【請求項２６】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はＮ末端に分泌タグを有する、請求項１−２５のいずれか一項の細菌。
【請求項２７】
Ｎ末端の前記分泌タグは、前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子のｓｅｃ依存性分泌を促進する、請求項２６の細菌。
【請求項２８】
Ｎ末端の前記分泌タグは、前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子のｔａｔ依存性分泌を促進する、請求項２６の細菌。
【請求項２９】
Ｎ末端の前記分泌タグは、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡ、およびＣｖａＣから選ばれる、請求項２７の細菌。
【請求項３０】
Ｎ末端の前記分泌タグはＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、および  ＤｍｓＡから選ばれる、請求項２８の細菌。
【請求項３１】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子をコードする前記少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットは、ネイティブＦｌｉＣ遺伝子由来の５’−ＵＴＲ配列を含む、請求項１−２４のいずれか一項の細菌。
【請求項３２】
前記抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子をコードする前記少なくとも１つの遺伝子または遺伝子カセットは、ＦｌｉＣの少なくとも最初の２０アミノ酸をコードする遺伝子配列をさらに含む、請求項３１の細菌。
【請求項３３】
プロバイオティク細菌である、請求項１−３２のいずれか一項の細菌。
【請求項３４】
バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびラクトコッカス属からなる群より選ばれる、請求項３３の細菌。
【請求項３５】
エシェリキア・コリ株ニッスルである、請求項３４の細菌。
【請求項３６】
哺乳動物の消化管内に存在するとき補完される遺伝子において栄養要求体である、請求項１−３５のいずれか一項の細菌。
【請求項３７】
ジアミノピメリン酸、またはチミン生合成経路における酵素において栄養要求体である、請求項３６の細菌。
【請求項３８】
請求項１−３７のいずれか一項の細菌；および薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的に許容可能な組成物。
【請求項３９】
経口または直腸投与用に調剤される、請求項３８の組成物。
【請求項４０】
自己免疫障害を処置または防止する方法であって、
その必要がある患者に、請求項３８または３９のいずれか一項の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４１】
消化管炎症および／または低下した消化管バリア機能に関連する疾患または状態を処置する方法であって、
その必要がある患者に請求項３８または３９のいずれか一項の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４２】
自己免疫障害は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患、本態性混合性クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、パリンドロームリウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症からなる群より選ばれる、請求項４０の方法。
【請求項４３】
自己免疫障害は、１型糖尿病、ループス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、若年性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、セリアック病、および強直性脊椎炎からなる群より選ばれる、請求項４２の方法。
【請求項４４】
疾患または状態は、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、および下痢性疾患から選ばれる、請求項４１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１６年３月２日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２０５３０の一部継続出願であり、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８，８１４号の利益を主張する。２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８，８２５号、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８，８０５号、２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６，０４２号、２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６，０４４号、２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６，０４８号、２０１６年２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２９１，４６１号、２０１６年２月４日に出願された米国仮出願第６２／２９１，４７０号、２０１６年２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２９１，４６８号、および２０１５年１２月２２日に出願された米国特許出願第１４／９９８，３７６号；それらは、開示の連続性を提供するためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列リスト
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されたシーケンスリストを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年１月５日に作成され、１２６７１＿０００８−０１３０４＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは８１５，３８０バイトである。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、消化管において炎症性メカニズムを抑制し、消化管粘膜バリア機能を回復および強化し、および/または自己免疫障害を処置および防止するための組成物および治療上の方法に関する。一定の態様において、本開示は、消化管において炎症を低減し、および/または消化管バリア（腸障壁とも言う）機能を高めることが可能な遺伝学的に操作された細菌に関する。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、消化管炎症を低減し、および／または消化管バリア機能を高めることが可能であり、それによって自己免疫障害が改善または防止される。いくらかの態様では、ここに開示される組成物および方法は、自己免疫障害、ならびに消化管炎症および/または低下した消化管バリア機能に関連する疾患および状態、例は、下痢性疾患、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、および関連疾患を処置または防止するために使用されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤｓ）は、Ｔ細胞および活性化マクロファージにより典型的に駆動される胃腸管において顕著な局所炎症によって、および宿主循環系からの消化管の内腔内容物を分離する上皮バリアの機能低下によって特徴付けられる疾患のグループである〔Ｇｈｉｓｈａｎ（ギースハン）ら、２０１４〕。ＩＢＤの病因は、遺伝学的要因および環境的要因の双方に関連しており、および消化管細菌と腸免疫系との間の変動した相互作用によって引き起こされる可能性がある。ＩＢＤを処置するための現在のアプローチは免疫系を調節し、および炎症を抑止する治療学に焦点が当てられる。これらの治療には、ステロイド、たとえば、プレドニゾンなどのようなもの、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビター、たとえば、Ｈｕｍｉｒａ（ヒュミラ）(R)（商標）などのようなものが含まれる〔Ｃｏｈｅｎ（コーエン）ら、２０１４〕。このアプローチの欠点は、全身免疫抑制に関連し、それには、感染性疾患およびガンに対する罹患率がより一層高いことが含まれる。
【０００５】
他のアプローチは、短鎖脂肪酸ブチラートを、注腸を介して供給することによってバリア機能低下の処置に焦点があてられた。近年、いくつかのグループは、消化管での免疫系の調節において共生細菌による短鎖脂肪酸産生の重要性を実証しており〔Ｓｍｉｔｈ（スミス）ら、２０１３〕、ブチラートが調節性Ｔ細胞の分化を誘導し、およびＩＢＤにおける炎症に関連する免疫応答を抑制することにおいて直接役割を果たすことが示された〔Ａｔａｒａｓｈｉ（アタラシ）ら、２０１１；Ｆｕｒｕｓａｗａ（フルサワ）ら、２０１３〕。ブチラートは通常、食物繊維の微生物発酵によって生成され、結腸上皮細胞恒常性およびバリア機能を維持する中心的な役割を果たす〔Ｈａｍｅｒ（ハマー）ら、２００８〕。ブチラート注腸剤を用いた研究は、ペイシェント（主として患者を意味する）にいくらかの利益をもたらすが、この処置は長期療法には実用的ではない。より最近では、ＩＢＤを有する患者は健康な患者から糞便移送により処置され、いくらか成功している〔Ｉａｎｉｒｏ（イアニロ）ら、２０１４〕。この成功は、消化管微生物が疾患の病理学において果たす中心的役割を例示し、一定の微生物機能がＩＢＤ疾患プロセスの改善に関連することを示唆する。しかしながら、このアプローチは、感染性疾患をドナーからレシピエントに伝達することに対する安全性の懸念を提起する。さらに、この処置の性質はネガティブスティグマ（否定的とも言う）であり、そして従って広く受け入れられる可能性は低い。
【０００６】
低下した消化管バリア機能はまた、自己免疫疾患の病因において中心的な役割を果たす〔Ｌｅｒｎｅｒ（ラーナー）ら、２０１５ａ；Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ｂ；Ｆａｓａｎｏ（ファザーノ）ら、２００５；Ｆａｓａｎｏ、２０１２〕。上皮細胞の単一の層は、体において免疫細胞から消化管内腔を分離する。上皮は細胞間タイトジャンクションによって調節され、および耐性と非自己抗原に対する免疫との間の平衡を制御する（Ｆａｓａｎｏら、２００５）。上皮層を破壊することにより、高度に免疫反応性の上皮下組織の病理学的暴露が内腔において膨大な数の外来抗原に対して導かれることがあり（Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ａ）、結果として増加した罹患率がもたらされ、および腸内および腸管外の自己免疫障害の双方が起こりうる″（Ｆａｓａｎｏら、２００５）。いくらかの外来抗原は、自己抗原に似ていると考えられ、および既存の自己免疫疾患の進行を促進し、または自己免疫疾患を惹起するエピトープ特異的交差反応を誘発することができる（Ｆａｓａｎｏ、２０１２）。関節リウマチおよびセリアック病は、たとえば、腸の透過性の増加を伴うと考えられる自己免疫障害である（Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ｂ）。遺伝学的に自己免疫疾患に罹患し易い個体では、細胞間タイトジャンクションの調節不全が疾患発症を引き起こす可能性がある（Ｆａｓａｎｏ、２０１２）。実際、自己免疫が発達するためには、環境と相互作用する粘膜バリアの防御機能の喪失が必要である（Ｌｅｒｎｅｒら、２０１５ａ）。
【０００７】
消化管微生物における変化は宿主の免疫応答を変動させる可能性がある〔Ｐａｕｎ（ポーン）ら、２０１５；Ｓａｎｚ（サンス）ら、２０１４；Ｓａｎｚら、２０１５；Ｗｅｎ（ウェン）ら、２００８〕。たとえば、１型糖尿病について遺伝学的リスクが高い小児では、疾患について自己免疫を発達させる子供と健康を維持する者との間に消化管内微生物に著しい差異がある〔Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（リチャードソン）ら、２０１５〕。他は、消化管細菌が喘息の防止における潜在的な治療上の標的であり、および肺の炎症における強力な免疫調節能力を見せることが示された〔Ａｒｒｉｅｔａ（アーリエータ）ら、２０１５〕。したがって、胃腸管におけるバリア機能の増強および炎症の減少は、自己免疫疾患の処置または防止のための潜在的な治療メカニズムである。
【０００８】
最近では、抗炎症性分子、たとえば、ＩＬ−１０などのようなものを生成する微生物を作製し、および治療用物質を消化管において炎症の部位に直接送るためにそれらを患者に経口施与する努力がなされている。このアプローチの利点は、免疫抑制剤の全身投与が避けられ、および治療用物質が胃腸管に直接送られることである。しかしながら、これらの操作された微生物はいくらかの前臨床モデルにおいて有効性を示しているが、患者における有効性は観察されていない。患者の処置における成功の欠如の一つの理由は、多量の非天然タンパク質、たとえば、ヒトインターロイキンの構成上の生産に起因して、微生物の生存能力および安定性が損なわれることである。したがって、消化管炎症を減少させ、消化管バリア機能を増強し、および／または自己免疫疾患を処置し、およびそれらが望ましくない副作用を回避するものであるためにさらなる治療に対する大きな必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ここに開示される遺伝学的に操作された細菌は、治療上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を生成することが可能である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、それらが誘発性の環境、例は、哺乳動物の消化管に達するまで、機能的にサイレントであり、そこで治療上の分子の発現が誘導される。一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は自然に非病原性であり、および消化管炎症を減少させ、および/または消化管バリア機能を増強するために消化管に導入することができ、およびそれによって自己免疫障害をさらに改善または防止しうる。一定の実施態様において、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、遺伝学的に操作された細菌によって安定的に生成され、および／または遺伝学的に操作された細菌は、インビボおよび／またはインビトロで安定に維持される。本発明はまた、遺伝学的に操作された細菌を含む製薬上組成物、および消化管炎症の減少および/または消化管粘膜バリア機能の強化、例は、炎症性腸疾患または自己免疫障害からの利益を享受する疾患を処置する方法も提供する。
【００１０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、環境条件、例は、哺乳類の消化管で見出される環境条件、たとえば、炎症状態または低酸素状態によって誘導される一またはそれよりも多く（一以上とも言う）のプロモーターの制御下に一以上の治療上の分子（群、複数でもありうる）を生成する。したがって、いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、酸素レベル依存性プロモーター、反応性酸素種（ＲＯＳ、活性酸素種とも言う）依存性プロモーター、または反応性窒素種（ＲＮＳ、活性窒素種とも言う）依存性プロモーター、および対応する転写因子の制御下で一以上の治療上の分子（群）を生成する。いくらかの実施態様では、治療上の分子はブチラート（酪酸塩、酪酸、ブチレートとも言う）であり；誘導性環境において、酪酸塩生合成遺伝子カセットが活性化され、および酪酸塩が生成される。酪酸塩の局所生産は、消化管において調節性（制御性とも言う）Ｔ細胞の分化を誘導し、および／または結腸上皮細胞のバリア機能を促進する。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、誘導性環境、たとえば、消化管などのようなものにおいてだけそれらの治療上の効果を生じ、それによって全身暴露に関連する安全性の問題が低減される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、および図１Ｆは、ＦＮＲ応答性プロモーター制御下で、プロピオナート生合成カセット（図１Ａ）、ブチラート生合成カセット（図１Ｂ）、アセタート生合成カセット（図１Ｃ）、ＧＬＰ−２発現カセット（図１Ｄ）、ヒトＩＬ−１０発現カセット（図１Ｅ）を発現するように遺伝学的に操作された大腸菌の概略を示す。図１Ｄ、図１Ｅ、および図１Ｆに示す遺伝学的に操作された大腸菌は、発現したポリペプチドを細胞外に分泌させるための分泌系をさらに含み得る。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄは、ブチラート生成経路の模式図および様々なブチラート生成回路の模式図である。図２Ａは、ブチラート生成のための代謝経路を示す。図２Ｂおよび図２Ｃは、ともにテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、2つの異なる例示的なブチラート生成回路の概略を示す。図２Ｂは、プラスミド上でｔｅｔプロモーターの制御下にあるｂｄｃ２ブチラートカセットを示す。「ｂｄｃ２カセット」または「ｂｄｃ２ブチラートカセット」は、少なくとも以下の遺伝子を含むブチラート生成カセットのことをいう：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ遺伝子。図２Ｃは、プラスミド上でｔｅｔプロモーターの制御下にあるブチラートカセット（ｔｅｒ遺伝子がｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３遺伝子を置換する）を示す。「ｔｅｒカセット」または「ｔｅｒブチラートカセット」は、少なくとも以下の遺伝子を含むブチラート生成カセットのことをいう：ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ。図２Ｄは、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある第３の例示的なブチラート遺伝子カセット、具体的には、プラスミド上でｔｅｔプロモーーター制御下にあるｔｅｓＢブチラートカセット（ｔｅｒ遺伝子が存在し、ｔｅｓＢ遺伝子がｐｂｔ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子を置換する）の模式図を示す。「ｔｅｓまたはｔｅｓＢカセット」または「ｔｅｓまたはｔｅｓＢブチラートカセット」とは、少なくともｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含むブチラート生成カセットをいう。本発明における代替のブチラートカセットは、少なくともｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢ遺伝子を含む。いくつかの実施態様においては、ｔｅｓまたはｔｅｓＢカセットは、テトラサイクリン以外の誘導性プロモーターの制御下にある。ｔｅｓＢカセットの発現を制御する例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例は、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症応答（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）によって誘導されるプロモーター、および消化管内に自然に存在してもよいしまたは存在しなくてもよい（例えば、外因的に付加され得る）代謝産物、例えばアラビノースおよびテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターが含まれる。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、および図３Ｆは、本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の模式図を描く。図３Ａおよび図３Ｂは、本発明の例示的な操作された細菌の遺伝子構成および低酸素条件下におけるブチラート生成の誘導を示す。図３Ａは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、ブチラート生成が比較的低くなることを示す。したがって、ブチラート生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ；白いボックス）はいずれも発現しない。図３Ｂは、低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現誘導によりブチラート生成がもたらされ、ブチラート生成が増加することを示す。図３Ｃおよび図３Ｄは、本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成と、一酸化窒素（ＮＯ）の存在下での抑制解除を示す。図３Ｃに示すように、ＮＯが存在しない場合、ＮｓｒＲ転写因子（丸、「ＮｓｒＲ」）は、対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。図３Ｄに示すように、ＮＯ存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合または抑制しない。これにより、ブチラート生合成酵素（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）の発現および最終的にはブチラートの生成がもたらされる。図３Ｅおよび図３Ｆは、本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２の存在下でのその誘導を示す。図３Ｅに示すように、Ｈ２Ｏ２が存在しない場合、ＯｘｙＲ転写因子（丸、「ＯｘｙＲ」）はｏｘｙＳプロモーターに結合するが、誘導はしない。したがって、ブチラート生合成酵素（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。図３Ｆに示すように、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子はＨ２Ｏ２と相互作用し、次いでｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これにより、ブチラート生合成酵素（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）の発現および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、および図４Ｆは、本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略を示す。図４Ａおよび図４Ｂは、本発明の別の例示的な操作された細菌の遺伝子構成と、図３に示すものとは異なるブチラート回路を用いた低酸素条件下でのブチラート生成の誘導を示す。図４Ａは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、ブチラート生成が比較的低くなることを示す。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ；白いボックス）はいずれも発現しない。図４Ｂは、低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現誘導によりブチラート生成がもたらされ、ブチラート生成が増加することを示す。図４Ｃおよび図４Ｄは、本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯの存在下での抑制解除を示す。図４Ｃに示すように、ＮＯが存在しない場合、ＮｓｒＲ転写因子（丸、「ＮｓｒＲ」）は、対応する調節領域に結合し、抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。図４Ｄに示すように、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合または抑制しない。これにより、ブチラート生合成酵素（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）の発現および最終的にはブチラート生成がもたらされる。図４Ｅおよび図４Ｆは、本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２の存在下でのその誘導を示す。図４Ｅに示すように、Ｈ２Ｏ２が存在しない場合、ＯｘｙＲ転写因子（丸、「ＯｘｙＲ」）はｏｘｙＳプロモーターに結合するが、誘導はしない。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、ｂｕｋ）はいずれも発現しない。図４Ｆに示すように、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子はＨ２Ｏ２と相互作用し、次いでｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これにより、ブチラート生合成酵素（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）の発現および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略を示す。図５Ａおよび図５Ｂは、本発明の例示的な組換え細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのその誘導を示す。図５Ａは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、ブチラート生成が比較的低くなることを示す。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、およびｔｅｓＢ）はいずれも発現しない。図５Ｂは、低酸素条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびブチラート生合成酵素の発現誘導によりブチラート生成がもたらされ、ブチラート生成が増加することを示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＮＯ存在下での抑制解除を示す。図５Ｃにおいて、ＮＯの非存在下では、ＮｓｒＲ転写因子（「ＮｓｒＲ」）は、対応する調節領域に結合し、これを抑制する。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｔｅｓＢ）はいずれも発現しない。図５Ｄに示すように、ＮＯの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＮＯと相互作用し、もはや調節配列に結合または抑制しない。これにより、ブチラート生合成酵素（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）の発現および最終的にはブチラート生成がもたらされる。図５Ｅおよび図５Ｆは、本発明の別の例示的な組換え細菌の遺伝子構成およびＨ２Ｏ２存在下でのその誘導を示す。図５Ｅに示すように、Ｈ２Ｏ２の非存在下では、ＯｘｙＲ転写因子（丸、「ＯｘｙＲ」）はｏｘｙＳプロモーターに結合するが、誘導はしない。したがって、ブチラート生合成酵素（ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｔｅｓＢ）はいずれも発現しない。また、図６Ｆに示すように、Ｈ２Ｏ２の存在下では、ＯｘｙＲ転写因子はＨ２Ｏ２と相互作用し、次いでｏｘｙＳプロモーターを誘導することができる。これにより、ブチラート生合成酵素（黒色の矢印および黒色の短い不規則な曲線で示される）の発現および最終的にはブチラート生成がもたらされる。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略を示す。図６Ａは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、ａｃｒＣ）はいずれも発現しない。図６Ｂは、低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。他の実施態様では、前記の図３Ｃ−３Ｆ、図４Ｃ−４Ｆ、図５Ｃ−５Ｆのブチラートカセット（群）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図７】図７は、例示的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示す。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃは、誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略を示す。図８Ａは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ）はいずれも発現しない。図８Ｂは、低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。図８Ｃは、例示的なプロピオナート生合成遺伝子カセットを示す。他の実施態様では、前記の図３Ｃ−３Ｆ、図４Ｃ−図４Ｆ、図５Ｃ−５Ｆのブチラートカセット（群）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは誘導性プロピオナート生成のための本開示の例示的な細菌の遺伝子構成の概略を示す。図９Ａは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオナート生合成酵素（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、ｔｅｓＢ）のいずれも発現しない。図９Ｂは、低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。他の実施態様では、前記の図３Ｃ−３Ｆ、図４Ｃ−図４Ｆ、図５Ｃ−５Ｆのブチラートカセット（群）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、本開示の例示的な細菌のスリーピングビューティー経路および遺伝子構成の概略を示す。図１０Ａは、プロピオナート生産のための大腸菌の遺伝学的に操作されたスリーピングビューティー代謝経路の概略図を示す。ＳＢＭ経路は循環的であり、スクシニル−ＣｏＡの出発分子を再生しながら、発酵産物としてプロピオナートを形成する一連の生化学的変換からなる。図１０Ｂおよび図１０Ｃは、本発明の別の例示的な操作された細菌の遺伝子構成および低酸素条件下でのプロピオナート生成の誘導を示す図である。図１０Ｂは、好気性条件下では、酸素（Ｏ２）がＦＮＲ（枠付き「ＦＮＲ」）の二量体化およびＦＮＲ応答性プロモーター（「ＦＮＲプロモーター」）の活性化を防止し（「Ｘ」で示す）、プロピオナート生成が比較的低くなることを示す。したがって、プロピオンナート生合成酵素（ｓｂｍ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ）はいずれも発現しない。図１０Ｃは、低酸素または嫌気条件下において、ＦＮＲ二量体化（２つの枠付き「ＦＮＲ」）、ＦＮＲ応答性プロモーターへの結合、およびプロピオナート生合成酵素の発現誘導によりプロピオナート生成がもたらされ、プロピオナート生成が増加することを示す。他の実施態様では、前記の図３Ｃ−３Ｆ、図４Ｃ−図４Ｆ、図５Ｃ−５Ｆのブチラートカセット（群）について図示および記載されているように、プロピオナート生成はＮＯまたはＨ２Ｏ２によって誘導される。
【図１１】図１１は、本開示のブチラート生産株のブチラート生成を示す棒グラフを描いたものである。図１１は、酸素の存在下および非存在下でのｐＬＯＧＩＣ０３１株およびｐＬＯＧＩＣ０４６株におけるブチラート生産を示しており、ブチラート生産に有意差はない。ブチラート産生の増強は、最終２遺伝子（ｐｔｂ−ｂｕｋ）の欠失およびそれらの内因性大腸菌ｔｅｓＢ遺伝子（ブチリルＣｏＡからブチラート部分を切断するチオエステラーゼ）による置換を含む、ｐＬＯＧＩＣ０４６を発現すする低コピープラスミドのＮｉｓｓｌｅにおいて示された。一晩培養した細胞をＬｂで１：１００に希釈し、初期対数期に達するまで１．５時間増殖させ、その時点で無水ｔｅｔを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加してプラスミド発現を誘導した。誘導２時間後、細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含むＭ９最小培地にＯＤ６００＝０．５で再懸濁した。指示された時間にサンプルを取り出し、細胞をスピンダウンした。ＬＣ−ＭＳを用いて、上清をブチラート生産について試験した。
【図１２】図１２は、本開示のブチラート生産菌株のブチラート生産を示す棒グラフを示す。図１２は、ｔｅｒ置換（ｐＬＯＧＩＣ０４６）またはｔｅｓＢ置換（ｐｔｂ−ｂｕｋ欠失）を有するｔｅｔ−ブチラートカセットを含む株におけるブチラート産生を示し、ｔｅｓＢ置換株がより大きなブチラート産生を有することを実証する。
【図１３】図１３は、ｎｕｏＢ遺伝子欠失を含む種々のブチラート生産体回路を用いたブチラート生産のグラフを示す。ＮｕｏＢ欠失を有するかまたは含まないｂｃｄ−ブチラートカセットを含むＢＷ２５１１３およびブチラートカセットを含むＢＷ２５１１３  ｎｕｏＢ欠失の有無にかかわらず、欠失を有する株は、ｎｕｏＢで標識される。ＮｕｏＢ遺伝子の欠失は、ブチラート産生株における野生型親対照と比較して、ブチラート産生レベルの上昇をもたらす。ＮｕｏＢは、呼吸器の成長中にＮＡＤＨの酸化に関与する主要なタンパク質複合体である。いくつかの実施態様では、ＮＡＤＨ酸化の電子輸送への結合の防止は、ブチラート生成を支持するために使用されるＮＡＤＨの量を増加させる。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、および図１４Ｄは、ＦＮＲプロモーターの制御下にあるブチラート生成回路のブチラートまたはバイオマーカー生成を示す模式図およびグラフを描く。図１４Ａは、ＦＮＲプロモーターの制御下のブチラート生成回路を示す模式図である。図１４Ｂは、ブチラート生産の嫌気的誘導の棒グラフを示す。ＦＮＲ応答性プロモーターを、ｂｃｄまたはｔｅｒ回路のいずれかを含むブチラートカセットに融合させた。形質転換した細胞をＬＢ中で初期対数期まで増殖させ、嫌気性チャンバーに４時間置いて、ブチラート遺伝子の発現を誘導した。細胞を洗浄し、０．５％（ｗ／）グルコースを含む最小培地に再懸濁し、経時的にブチラート産生をモニターするために微好気的にインキュベートした。ＳＹＮ−５０１は、嫌気性条件下で有意なブチラート生産をもたらした。図１４Ｃは、インビトロでのグルコースおよび酸素の存在下および非存在下におけるＳＹＮ−５０１を示す。ＳＹＮ−５０１は、ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒブチラートプラスミドを含む；ＳＹＮ−５００は、ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄブチラートプラスミドを含む；ＳＹＮ−５０６は、ｐＳＣ１０１  ｎｉｒＢ−ｂｃｄブチラートプラスミドを含む。図１４Ｄは、インビボモデルにおける糞便試料を用いたＥＬＩＳＡによって定量されたマウスリポカリン２（左）およびカルプロテクチン（右）のレベルを示す。ＳＹＮ−５０１は、野生型ニッスルコントロールと比較して、炎症を低減し、および／または消化管バリア機能を保護する。
【図１５】図１５は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発によるＩＢＤのマウスモデルにおける消化管バリア機能を測定するグラフを示す。異なる濃度のＤＳＳを投与したマウスの血漿中に見出されたＦＩＴＣデキストラン量を、消化管バリア機能の指標として測定した。
【図１６】図１６は、分光光度法によって分析したＦＩＴＣ-デキストランの血清レベルを示す。ＦＩＴＣ−デキストランは、ＤＳＳ誘発によるＩＢＳのマウスモデルにおける消化管バリア機能の読み出し情報である。
【図１７】図１７は、Ｈ２Ｏ、Ｈ２０中の１００ｍＭブチラート、ストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅコントロールまたはＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミドを含むＳＹＮ５０１のいずれかを投与したマウスの糞便中のブチラート濃度の散布図を描く。Ｎｉｓｓｌｅコントロールを投与したマウスまたは水のみを与えたマウスと比較して、ＳＹＮ５０１を投与されたマウスの糞便において、有意により高いレベルのブチラートが検出された。レベルは２ｍＭに近く、Ｈ２０（+）２００ｍＭブチラートを与えたマウスで見られるレベルよりも高い。
【図１８】図１８は、クロストリジウム・ブチリカムＭＩＹＡＲＩＳＡＮ（日本人のプロバイオティクス株）、クロストリジウム・チロブチリカムＶＰＩ  ５３９２（タイプ・ストレイン）、およびクロストリジウム・ブチリカムＮＣＴＣ  ７４２３（タイプ・ストレイン）と比較した、ブチラートカセットプラスミド株ＳＹＮ５０１によるインビトロでのブチラート濃度の比較を示す棒グラフである。好気性および嫌気性条件を示した。ブチラートカセットを含むＮｉｓｓｌｅ株は、ＲＣＭ培地中でクロストリジウム属に匹敵する酪酸濃度を産生する。
【図１９】図１９は、プラスミドコピーと比較して、染色体に完全に組み込まれたブチラートコピーを含む株によってインビトロで生成されたブチラート濃度を示す棒グラフを示す。組み込まれたブチラート株、すなわちＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２（両方ともａｇａＩ／ｒｓｍｌ遺伝子座で組み込まれている）は、プラスミド株ＳＹＮ５０１に匹敵するブチラート生産を与えた。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、例示的なプラスミドの構築および遺伝子構成を示す。図２０Ａは、ＮｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢからの調節配列、およびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物）を含む例示的なプラスミドの構築および遺伝子構成を示す。図２０Ｂは、ＮｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢからの調節配列、およびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む別の例示的プラスミドの構築および遺伝子構成を示す。
【図２１】図２１は、ＳＹＮ００１＋ｔｅｔ（プラスミドを含まない野生型Ｎｉｓｓｌｅコントロール）、ＳＹＮ０６７＋ｔｅｔ（ｐＬＯＧＩＣ０３１  ＡＴＣ誘導性ブチラートプラスミドを含むＮｉｓｓｌｅ）、およびＳＹＮ０８０＋ｔｅｔ（ｐＬＯＧＩＣ０４６  ＡＴＣ誘導性ブチラートプラスミドを含むＮｉｓｓｌｅ）を使用したブチラート産生を示す。
【図２２】図２２は、野生型Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ００１）と比較してより多くのブチラートを産生するｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物（ＳＹＮ１３３）またはｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物（ＳＹＮ１４５）を含む、遺伝学的に操作されたＮｉｓｓｌｅによるブチラート生産を示す。
【図２３】図２３は、ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｏｘｙＳ−ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む例示的なプラスミドの構築および遺伝子構成を示す。
【図２４】図２４は、ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｏｘｙＳ−ブチロジーニック遺伝子カセット）を含む別の例示的なプラスミドの構築および遺伝子構成を示す。
【図２５】図２５は、操作された細菌におけるブチラートおよびアセタート生成を増加させるための戦略を示す概略図である。クエン酸回路（ＴＣＡ回路）（交差させた）による好気的代謝は、結腸の嫌気的環境において不活性である。大腸菌は発酵の最終産物として高レベルのアセタートを生成する。高レベルのブチラート産生を依然として維持しながら、アセタート産生を改善するために、標的化された欠失を導入して、不要な代謝発酵副産物の生成を防止することができる（それによって同時にブチラートおよびアセタート産生を増加させる）。競合経路（丸いボックスで示されている）の非限定的な例は、ｆｒｄＡ（ホスホエノールピルビン酸をスクシナートに変換する）、ｌｄｈＡ（ピルビン酸をラクタートに変換する）およびａｄｈＥ（アセチル−ＣｏＡをエタノールに変換する）である。したがって、関心のある欠失には、ａｄｈＥ、ｌｄｈ、およびｆｒｄの欠失が含まれる。よって、特定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ｆｒｄＡ、ｌｄｈＡ、およびａｄｈＥの１つ以上に変異および/または欠失をさらに含む。
【図２６】図２６Ａおよび図２６Ｂは、０．５％グルコース＋ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）中におけるアセタート/ブチラート生成（図２６Ａ）、および０．５％グルクロン酸＋ＭＯＰＳ（ｐＨ６．３）におけるアセタート/ブチラート生成（図２６Ｂ）を示す棒グラフを描いたものである。内因性ａｄｈＥ（アルデヒド−アルコール脱水素酵素）およびｌｄｈ（ラクタートデヒドロゲナーゼ）の欠失の欠失 は、ＦＮＲＳ  ｔｅｒ−ｔｅｓＢまたはＦＮＲＳ−ｔｅｒ−ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートカセットのいずれかを組み込んだＮｉｓｓｌｅ株に導入した。
【図２７】図２７は、例示的なプロピオナート生合成遺伝子カセットの概略図を示す。
【図２８】図２８は、異種ＦｎｒＳプロモーターの制御下にある大腸菌由来のスリーピングビューティームターゼオペロンを含む構築物の模式図を示す。
【図２９】図２９は、野生型大腸菌ＢＷ２５１１３株、および図２８に図式的に示すようにＦｎｒＳプロモーターの制御下の内在性ＳＢＭオペロンを含むＢＷ２５１１３株によって、インビトロで産生されたプロプリオナート濃度の棒グラフを示す。
【図３０】図３０Ａ、図３０Ｂ、および図３０Ｃは、鞭毛ＩＩＩ型分泌系の成分を用いて分泌される治療用ポリペプチドの発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の概略を示す。目的の治療用ポリペプチド、例えばＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、およびＩＬ−２２は、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲの後ろに組み立てられ、天然のｆｌｉＣおよび／またはｆｌｉＤプロモーターによって駆動される（図３０Ａおよび図３０Ｂ）またはｔｅｔ誘導性プロモーター（図３０Ｃ）である。別の実施態様では、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＩＢＤ特異的分子または炎症または炎症応答（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）によって誘導されるプロモーターによって誘導されるプロモーターなどの誘導性プロモーターおよび腸内に天然に存在していてもいなくてもよい（例えば、外因的に付加されていてもよい）代謝産物、例えばアラビノースを使用することができる。目的の治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、中程度のコピープラスミド）から発現されるか、またはｆｌｉＣ遺伝子座に組み込まれる（それによってｆｌｉＣおよび／またはｆｌｉＤの全部または一部が欠失される）。必要に応じて、図３０Ｂおよび図３０Ｄに示すように、ＦｌｉＣのＮ末端部分が構築物に含まれる。
【図３１】図３１Ａおよび図３１Ｂは、拡散性外膜（ＤＯＭ）系を介して分泌される治療用ポリペプチドの発現のための本開示の例示的回路の遺伝子構成の模式図を描く。目的の治療用ポリペプチドは、ペリプラズム空間への分泌の際に切断されるプロトタイプのＮ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルまたはＴａｔ依存性分泌シグナルに融合される。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡ、および／またはｎｌｐＩのうちの１つ以上の欠損を含む。ペリプラズムプロテアーゼも、ペリプラズム中のポリペプチドの安定性を高めるために、例えば、限定されるものではないが、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴを含めて、削除される。発現は、ｔｅｔプロモーター（図３１Ａ）または酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導プロモーター、図３１Ｂ）のような誘導性プロモーターによって駆動され、ＦＲＴ−ＫａｎＲ−ＦＲＴカセットは下流の組み込みに使用される。炎症または炎症反応（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）によって誘導されるＩＢＤ特異的分子またはプロモーターによって誘導されるプロモーター、および腸内に天然に存在してもしなくてもよい（例えば、外因的に付加され得る）代謝産物によって誘導されるプロモーター、アラビノース。
【図３２】図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃ、図３２Ｄ、および図３２Ｅは、細菌分泌のためのＧＬＰ２の発現のための構築物の非限定的な例の模式図を描写する。図３２Ａは、天然のＦｌｉＣプロモーターの制御下で、ＦｌｉＣ遺伝子座に挿入されたヒトＧＬＰ２構築物の模式図を示す。図３２Ｂは、天然のＦｌｉＣプロモーターの制御下でＦｌｉＣ遺伝子座に挿入された、ＦｌｉＣのＮ末端２０アミノ酸を含むヒトＧＬＰ２構築物の概略図を示す。図３２Ｃは、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下でＦｌｉＣ遺伝子座に挿入された、ＦｌｉＣのＮ末端２０アミノ酸を含むヒトＧＬＰ２構築物の概略図を示す。図３２Ｄは、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下にＮ末端ＯｍｐＦ分泌タグ（ｓｅｃ依存性分泌系）を有するヒトＧＬＰ２構築物の模式図を示す。図３２Ｅは、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下にあるＮ末端ＴｏｒＡ分泌タグ（ｔａｔ分泌系）を有するヒトＧＬＰ２構築物の概略図を示す。
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂは、ＥＬＩＳＡ結果の折れ線グラフを示す。図３３Ａは、ＰＡＬ欠失を含む操作された細菌からの上清およびｐｈｏＡ分泌タグを有するｈＩＬ−２２をコードする組み込み構築物で処理した血清飢餓Ｃｏｌｏ２０５細胞からの抽出物に対して行ったｐｈｏｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ＥＬＩＳＡを示す折れ線グラフを描く。データは、操作された細菌から分泌されたｈＩＬ−２２が機能的に活性であることを実証している。図３３Ｂは、抗体完成アッセイを示すｐｈｏｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ＥＬＩＳＡを示す折れ線グラフを示す。Ｃｏｌｏ２０５細胞からの抽出物を、増加する濃度の中和抗ＩＬ−２２抗体でプレインキュベートしたＩＬ−２２過剰発現株由来の細菌上清で処理した。データは、分泌されたｈＩＬ−２２によって誘導されたリン酸化Ｓｔａｔ３シグナルが、ｈＩＬ−２２抗体ＭＡＢ７８２１によって競合されていることを実証した。
【図３４】図３４はヒトのキヌレニンおよびセロトニン腕に沿ったトリプトファン代謝の模式図を描いている。酵素の略号は以下の通りである：３−ＨＡＯ：３−ヒドロキシル−アントラニル酸３，４−ジオキシダーゼ；  ＡＡＡＤ：芳香族−アミノ酸脱炭酸酵素；  ＡＣＭＳＤ、α−アミノ−β−カルボキシムコネート−ε−セミアルデヒドデカルボキシラーゼ；  ＨＩＯＭＴ、ヒドロキシル−Ｏ−メチル基転移酵素；  ＩＤＯ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ；  ＫＡＴ、キヌレニンアミノトランスフェラーゼＩ−ＩＩＩ；  ＫＭＯ：キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ；  ＫＹＮＵ、キヌレニナーゼ；  ＮＡＴ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ；  ＴＤＯ、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ；  ＴＰＨ、トリプトファンヒドロキシラーゼ；  ＱＰＲＴ、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ。
【図３５】図３５は、Ｖｕｊｋｏｖｉｃ−Ｃｖｉｊｉｎらに記載されているように、ＩＤＯ１酵素活性と遺伝的および機能的に相同である細菌トリプトファン異化機構の概略図を描写しており、腸内微生物叢のＤｙｓｂｉｏｓｉｓはＨＩＶ疾患進行およびトリプトファン異化作用に関連する。Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３年７月１０日  ５（１９３）：１９３ｒａ９１に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示の特定の実施態様において、遺伝子操作された細菌は、図３５に示される細菌トリプトファン代謝酵素の１つ以上を含む遺伝子カセットを含む。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、図３５に示される１つまたは複数の代謝産物を産生する１つまたは複数の遺伝子カセットを含む、（キヌレニン、インドール−３−アルデヒド、インドール−３−酢酸、および／またはインドール−３アセトアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【図３６】図３６Ａおよび図３６Ｂは、インドール代謝産物作用様式（図３６Ａ）およびインドール生合成（図３６Ｂ）の図式を示す。図３６Ａは、宿主の生理および疾患に対するインドールおよびその代謝産物の作用の分子メカニズムの模式図を示す。腸内腔にインドールおよび他のインドール代謝産物、例えばインドール−３−プロピオナート（ＩＰＡ）およびインドール−３−アルデヒド（Ｉ３Ａ）を産生する細菌によって異化されたトリプトファン。ＩＰＡは、粘膜恒常性およびバリア機能を維持するために、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）を介して腸細胞に作用する。Ｉ３Ａは、腸の免疫細胞に見出されるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）に作用し、ＩＬ−２２産生を促進する。ＡｈＲの活性化は、上皮バリア機能を維持し、病原性感染を防御しながら微生物の共生を促進する免疫寛容を促進するなど、腸内免疫に重要な役割を果たす。インドールは、グルカゴン様タンパク質１（ＧＬＰ−１）を産生する腸管Ｌ細胞へのシグナル伝達分子またはＡｈＲに対するリガンド（Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．２０１６年；８：４６）のような多くの役割を有する。図３６Ｂは、トリパファン異化経路／インドール生合成経路の概略を示す。（例えば、Ｌａｍａｓら、トリプトファンの腸内微生物代謝をアリール炭化水素受容体リガンドに変化させることによりＣＡＲＤ９が大腸炎に影響を及ぼす；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２、５９８−６０５（非特許文献２）を参照されたい）、ＡｈＲアゴニスト活性を有する宿主および微生物代謝産物は、本開示の特定の実施態様において、遺伝子操作された細菌は、図３６Ａおよび３６Ｂに示される反応を触媒する細菌トリプトファン代謝酵素の１つまたは複数を含む遺伝子カセットを含む。インドール−３−酢酸、および／またはインドール−３−アセトアルデヒドを含むが、これらに限定されない、図３６Ａおよび３６Ｂに示される１つまたは複数の代謝物を産生する、より多くの遺伝子カセットを含む。
【図３７】図３７Ａおよび図３７Ｂは細菌のトリプトファン代謝経路の図を示す。例えば、酵素に以下のように番号が付けられているように、細菌のトリプトファン代謝の概略図を示す図である。Ｔｒｐ  ２，３ジオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１３．１１．１１）；  ２）キヌレニンホルミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４９）；  ３）キヌレニナーゼ（ＥＣ  ３．７．１．３）；  ４）トリプトファナーゼ（ＥＣ  ４．１．９９．１）；  ５）Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２７）；  ６）インドール乳酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）；  ７）Ｔｒｐデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．２８）；  ８）トリプタミンオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．４）；  ９）Ｔｒｐ側鎖オキシダーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４３）；  １０）インドールアセタールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）；  １１）インドール酢酸オキシダーゼ；  １３）Ｔｒｐ  ２−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１３．１２．３）；  １４）インドールアセトアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．０）。点線（−−−−−）は自発的反応を示している。  ３７Ｂトリプトファン由来経路の模式図を描写する。既知のＡＨＲアゴニストにはアスタリスクが付いています。略語は次のとおりです。  Ｔｒｐ：トリプトファン；  ＴｒＡ：トリプタミン；  ＩＡＡｌｄ：インドール−３−アセトアルデヒド；  ＩＡＡ：インドール−３−酢酸；  ＦＩＣＺ：６−ホルミルインドロ（３，２−ｂ）カルバゾール；  ＩＰｙＡ：インドール−３−ピルビン酸；  ＩＡＭ：インドール−３−アセトアミド；  ＩＡＯｘ：インドール−３−アセタールドキシム；  ＩＡＮ：インドール−３−アセトニトリル；  Ｎ−ホルミルＫｙｎ：Ｎ−ホルミルキヌレニン；キン：キヌレニン；  ＫｙｎＡ：キヌレン酸；  Ｉ３Ｃ：インドール−３−カルビノール；  ＩＡｌｄ：インドール−３−アルデヒド；  ＤＩＭ：３，３’−ジインドリルメタン。ＩＣＺ：Ｉｎｄｏｌｏ（３，２−ｂ）カルバゾール。酵素は、以下のように番号が付けられている：１．ＥＣ  １．１３．１１．１１（Ｔｄｏ２、Ｂｎａ２）、ＥＣ１．１３．１１．１１（Ｉｄｏ１）。２．ＥＣ  ４．１．１．２８（Ｔｄｃ）；  ３．  ＥＣ  １．４．３．２２、ＥＣ  １．４．３．４（ＴｙｎＡ）；  ＥＣ  １．２．１．３（ｌａｄ１）、ＥＣ  １．２．３．７（Ａａｏ１）；  ＥＣ  ３．５．１．９（Ａｆｍｉｄ  Ｂｎａ３）；  ５。  ＥＣ  ２．６．１．７（Ｃｃｌｂ１、Ｃｃｌｂ２、Ａａｄａｔ、Ｇｏｔ２）；  ＥＣ  １．４．９９．１（ＴｎａＡ）；  ＥＣ  １．１４．１３．１２５（ＣＹＰ７９Ｂ２、ＣＹＰ７９Ｂ３）。  ＥＣ  １．４．３．２（ＳｔａＯ）、ＥＣ２．６．１．２７（Ａｒｏ９、ａｓｐＣ）、ＥＣ２．６．１．９９（Ｔａａ１）、ＥＣ１．４．１．１９（ＴｒｐＤＨ）。  １０．ＥＣ．１．３．１２．３（ｌａａＭ）。  １１．  ＥＣ  ４．１．１．７４（ＩｐｄＣ）；  １２．  ＥＣ  １．１４．１３．１６８（Ｙｕｃ２）；  １３．Ｅｃ  ３．５．１．４（ＩａａＨ）；  ＥＣ  ３．５．５．１。  （Ｎｉｔ１）；  ＥＣ  ４．２．１．８４（Ｎｉｔ１）；  １６．ＥＣ  ４．９９．１．６（ＣＹＰ７１Ａ１３）；  １７．  ＥＣ  ３．２．１．１４７（Ｐｅｎ２）。本開示の特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、図１および２に示される細菌トリプトファン代謝酵素の１つ以上を含む遺伝子カセットを含む。図３７Ａおよび３７Ｂを参照されたい。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、図１〜４に示される１つ以上の代謝産物を産生する１つ以上の遺伝子カセットを含む。図３７Ａおよび３７Ｂを参照されたい。特定の実施態様では、１つ以上のカセットはプラスミド上にある。他の実施態様では、カセットはゲノムに組み込まれる。特定の実施態様では、１つまたは複数のカセットは、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下で、低酸素条件下、特定の分子または代謝産物の存在下で誘導される誘導性プロモーターの制御下にあるアラビノースのような腸内に存在していても存在していなくてもよい他の代謝産物の存在。
【図３８】図３８は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において、トリプトファンは芳香族アミノ酸トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの主要な共通前駆体であるコリスミ酸、ならびに必須化合物であるテトラヒドロ葉酸、ユビキノン−８、およびトリコデルマリンから生合成される。メナキノン−８およびエンテロトキシン（エンテロセリン）が、コリスミ酸代謝のスーパーパスに示されている。５つの遺伝子は、コリスミ酸からトリプトファン生合成を触媒する５つの酵素をコードする。ｔｒｐＥ  ｔｒｐＤ  ｔｒｐＣ  ｔｒｐＢ  ｔｒｐＡの５つの遺伝子は、単一の転写単位ｔｒｐオペロンを形成する。低レベルの構成的レベルのｍＲＮＡを提供するｔｒｐＤ構造遺伝子内には、弱い内部プロモーターも存在する。
【図３９】図３９は、例示的なトリプトファン回路を示す概略図を示す。トリプトファンは、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ（ｔｒｐＤとも呼ばれる）、ｔｒｐＣ−Ｆ（ｔｒｐＣとも呼ばれる）、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子の発現を介して、コリスミ酸前駆体から産生される。トリプトファンリプレッサー、すなわちｔｒｐＲの任意のノックアウトもまた描かれている。ａｒｏＧ／Ｆ／ＨおよびａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびａｒｏＣ遺伝子の発現によるコリスミ酸前駆体の任意産生も示されている。これらの遺伝子の全ては誘導性プロモーター、例えばＦＮＲ誘導性プロモーターから、任意に発現される。細菌はまた、栄養要求性、例えばｔｈｙＡの欠損（ΔｔｈｙＡ；チミジン依存性）を含み得る。細菌はまたＹｄｄＧを発現させるｙｄｄＧの遺伝子配列を含み、トリプトファンの輸送を介助することができる。細菌株の非限定的な例が列挙される。
【図４０】図４０は、テトラサイクリン誘導系の制御下にある構築物から、大腸菌ＴＲＰ合成酵素が発現される開示の一実施態様を示す。
【図４１】図４１Ａ、図４１Ｂ、図４１Ｃ、図４１Ｄ、図４１Ｅ、図４１Ｆ、図４１Ｇ、および図４１Ｈは、本開示の実施態様の非限定的な例の模式図を描く。すべての実施態様において、輸出者をコードする任意に遺伝子も含まれ得る。図４１Ａは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンからトリプタミンを産生する、本開示の一実施態様を示す。トリプトファン生産のための任意の回路は、図１に描かれ説明されている通りである。この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。代替的に、場合により、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを例えば誘導性プロモーター、ＦＮＲプロモーターの制御下でトリプトファンをトリプタミンに変換する、例えばＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ由来のトリプトファンデカルボキシラーゼのための回路を含む。図４１Ｂは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを産生する、本開示の一実施態様を示す。トリプトファン生産のための任意の回路は、図１に描かれ説明されている通りである。この歪みは、任意選択的に、図３９に示されかつ／または図解されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、例えばＳ．セレビシエ由来）またはａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来、またはｔａａ１（Ｌ−トリプトファン  −  ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８からのトリプトファンデヒドロゲナーゼ）およびｉｐｄＣ（インドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、例えば、ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）またはｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ、例えばストレプトマイセスエスピー例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で、トリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを共に産生するトランスジェニック植物（例えば、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ））を提供する。トリプトファン産生のための任意の回路は、図３９に示され説明される通りである。この株は、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに示されおよび／または図解されるように、場合により付加的な回路を含む。必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンをインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺに変換するｔｄｃ（例えば、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ由来のトリプトファンデカルボキシラーゼ）およびｔｙｎＡ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のモノアミンオキシダーゼ）を含む回路を含む。誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターの制御下に置く。図４１Ｄは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する、本開示の一実施態様を示す。トリプトファン生産のための任意の回路は、図１に描かれ説明されている通りである。この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子組み換え細菌は、一緒にトリプトファンをインドール−３−アセトニトリルに変換するｃｙｐ７９Ｂ２（シロイヌナズナ由来のトリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）またはｃｙｐ７９Ｂ３（シロイヌナズナ由来のトリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）の回路を含む例えば誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターの制御下に置くことができる。図４１Ｅは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンからキヌレニンを産生する、本開示の一実施態様を示す。トリプトファン生産のための任意の回路は、図１に描かれ説明されている通りである。この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作されたバクテリアは、ホモサピエンスまたはＴＤＯ２（例えばホモサピエンス由来のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）またはＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）由来のＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）、例えば誘導性の制御下でトリプトファンをキヌレニンに一緒に変換するＢＮＡ３（キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）およびＡｆｍｉｄ：Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅホルムアミダーゼ）プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターを含む。図４１Ｆは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンからキヌレニン酸を産生する、本開示の一実施態様を示す。トリプトファン生産のための任意の回路は、図１に描かれ説明されている通りである。この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作されたバクテリアは、ホモサピエンスまたはＴＤＯ２（例えばホモサピエンス由来のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）またはＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）由来のＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の）およびＡｆｍｉｄ：Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅホルムアミダーゼ、例えば、マウス由来の）またはＢＮＡ３（キネレニン−オキソグルタレートトランスアミナーゼ、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ由来）およびＧＯＴ２（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えばホモサピエンスまたはＡＡＤＡＴ（例えばホモサピエンス由来のキヌレニン／α−アミノアジペートアミノトランスフェラーゼ、ミトコンドリア）、またはＣＣＬＢ１（ホモサピエンス由来のキヌレニ���−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ１）またはＣＣＬＢ２（例えばホモサピエンス由来のキヌレニン−オキソグルタレートトランスアミナーゼ３）誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターの制御下で、トリプトファンからキヌレニン酸を一緒に産生する。図４１Ｇは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンからインドールを産生する、本開示の一実施態様を示す。トリプトファン生産は、図１に示され、記載されている通りである。この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、例えば誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御下で、トリプトファンをインドールに変換するｔｎａＡ（トリプトファナーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来）回路を含む。図４１Ｈは、遺伝子改変細菌がインドール−３−カルビノール、インドール−３−アルデヒド、３，３’ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、インドール（３，２−ｂ）カルバゾール（ＩＣＺ）をインドールから生成する開示の一実施態様を示すグルコシノラートは食事を通して取り込まれる。遺伝子操作された細菌は、ｐｎｅ２（シロイヌナズナ由来のミロシナーゼ）を誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター。図４１Ａ、図４１Ｂのいずれかに示される改変細菌。図４１Ａ、図４１Ｂ、図４１Ｃ、図４１Ｄ、図４１Ｅ、図４１Ｆ、図４１Ｇおよび図４１Ｈのいずれかに示される操作された細菌は栄養要求性を有していてもよく、例えば、一例では、ｔｈｙＡ遺伝子は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムにおいて突然変異されていてもよく、その場合、増殖を支援するためにチミジンを培地に供給しなければならない。
【図４２】図４２Ａ、図４２Ｂ、図４２Ｃ、図４２Ｄ、および図４２Ｅは、遺伝子操作された細菌がトリプトファンをインドール−３−酢酸に変換する、本開示の例示的な実施態様の略図を示す。図４２Ａに示すように、トリプトファン生産のための任意の回路は、この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、例えばＳ．セレビシエ由来）またはａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来、またはｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来のトリプトファンデヒドロゲナーゼ）およびｉｐｄＣ（インドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、例えば、シロイヌズナ由来）またはｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ、例えばストレプトマイセスエスピートリプトファンからインドール−３−酢酸を一緒に産生する、例えばＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ由来のＩｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）またはＡＡＯ１（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＩｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）の制御を含む。図４２Ｂにおいて、トリプトファン生産のための任意の回路は、図３９に示され、記載されている通りである。図４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、ｔｄｃ（例えば、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ由来）ｔｔＡ（モノアミンオキシダーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来）および／またはｉａｄ１（Ｉｎｄｏｌｅ−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）またはＡＡＯ１（例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のインドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ）、例えば誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターの制御下に置くことができる。図１図４２Ｃにおいて、トリプトファン生産のための任意の回路は、図１８に図示および記載されている。この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。  ４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、例えばＳ．セレビシエ由来）またはａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来、またはｔａａ１（Ｌ−トリプトファン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、  （例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８からのトリプトファンデヒドロゲナーゼ）およびｙｕｃ２（例えばインドール−３−ピルビン酸モ���オキシゲナーゼからのｔｒｐＤＨ（シロイヌナズナ由来）またはｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ、例えばストレプトミセス種ＴＰ−Ａ０２７４由来）図４２Ｄにおいて、トリプトファン産生のための任意の回路は、図３９に示され説明されている通りである。この株は、必要に応じて、図示および／または記載されるような追加の回路を含む（例えば、ＦＮＲプロモーター）。さらに、遺伝子改変された細菌は、ＩａａＭ（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ）からのトリプトファン２−モノオキシゲナーゼ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ２−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ由来のインドールアセトアミド加水分解酵素）、例えば、誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターの制御下にある。図４２Ｅに示すように、トリプトファン生産のための任意の回路は、この株は、必要に応じて、図３９に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ。あるいは、必要に応じて、トランスポーターを介してトリプトファンを輸入することができる。さらに、遺伝子操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（例えばシロイヌナズナ由来のトリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）またはｃｙｐ７９Ｂ３（例えばアラビドプシス・タリアナ由来のトリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼおよびｃｙｐ７１ａ１３（例えばシロイヌナズナ由来のインドールアセタルドオキシム脱水酵素））および（例えば、シロイヌナズナ由来のニトリラーゼ）およびｉａａＨ（インドールアセトアミド加水分解酵素、例えば、シュードモナス・サバスタノイ由来）を、例えば誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターの制御下で発現させることができる。図４２Ｂ、図４２Ｃ、図４２Ｄおよび図４２Ｅはまた、栄養要求性を有することができ、例えば、一例では、ｔｈｙＡ遺伝子を大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムにおいて突然変異させることができるので、チミジンを培養物中に供給しなければならない成長を支える媒体。
【図４３】図４３Ａおよび図４３Ｂは、インドール代謝産物を産生するための方法の概略図を示す。図４３Ａは、インドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）合成回路の概略図を示す。腸内微生物によって産生されるＩＰＡは、バリアの完全性に有意な正の効果を有する。  ＩＰＡはＡｈＲを介してシグナルを伝達するのではなく、異なる受容体（ＰＸＲ）を介してシグナル伝達する（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら、共生細菌代謝産物は生体異物センサーＰＸＲおよびＴｏｌｌ様受容体４を介して胃腸障壁機能を調節する；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１、２９６−３１０、２０１４年８月２１日）。いくつかの実施態様において、ＩＰＡは、トリプトファンアンモニアリアーゼおよびインドール−３−アクリラートレダクターゼ（例えば、トリプトファンアンモニアリアーゼ（ＷＡＬ）（例えば、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃｕｓ由来））およびインドール−３−アクリラートレダクターゼトリプトファンアンモニアリアーゼはトリプトファンをインドール−３−アクリル酸に変換し、インドール−３−アクリル酸レダクターゼはインドール−３−アクリル酸をＩＰＡに変換する。理論に拘束されることは望まないが、酸素は存在しない（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ由来）この反応のために必要であり、例えば、哺乳動物の腸に見られるような低酸素状態または無酸素条件下で進行させることが可能である。菌株は、図３９および／または図４５Ａおよび／または図４５Ｂに図示し説明したように、トリプトファン生産のための任意の回路をさらに含む。図４３Ｂは、別のインドール−３−プロピオン酸（ＩＰＡ）合成回路の概略図を示す。酵素は以下の通りである：１。ＴｒｐＤＨ：例えばＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来のトリプトファンデヒドロゲナーゼ；２。ＦｌｄＨ１／ＦｌｄＨ２：例えば、クロストリジウム・スポロゲネスからのインドール−３−乳酸デヒドロゲナーゼ；  ＦｌｄＡ：インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、例えばクロストリジウム・スポロゲネス由来；ＦｌｄＢＣ：例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のインドール−３−乳酸デヒドラターゼ；  ＦｌｄＤ：例えば、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）由来のインドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ；  ＡｃｕＩ：例えば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のアクリロイル−ＣｏＡレダクターゼ。トリプトファン脱水素酵素（ＥＣ  １．４．１．１９）は、Ｌ−トリプトファン、ＮＡＤ（Ｐ）および水を（インドール−３−イル）ピルビン酸、ＮＨ  ３、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＨ  ＋に変換する可逆的化学反応を触媒する酵素である。インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸−ＣｏＡ：（ＦｌｄＡ）は、インドール−３−乳酸塩およびインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−乳酸−ｃｏＡに変換する。インドール−３−アクリリック−ＣｏＡレダクターゼ（ＦｌｄＤ）は、インドール−３−乳酸デヒドラターゼ（ＦｌｄＢＣ）は、インドール−３−ラクテート−ＣｏＡをインドール−３−アクリロイル−ＣｏＡに変換し、そしてアクリリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＡｃｕＩ）は、インドール−３−アクリロイル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡに変換する。トリプトファン産生のための任意の回路をさらに含む株は、図３９および／または図４５Ａおよび／または図４５Ｂに図示および記載されている。
【図４４】図４４Ａおよび図４４Ｂおよび図４４Ｃは、種々の操作された細菌株によるトリプトファン産生を示す棒グラフを描く。図４４Ａは、種々のトリプトファン産生株によるトリプトファン産生を示す棒グラフを示す。トリプトファン産生を得るためには、ＡｒｏＧ（ＡｒｏＧｆｂｒ）のフィードバック耐性形態を示すデータが必要である。さらに、フィードバック抵抗性ｔｒｐＥ（ｔｒｐＥ  ｆｂｒ）を用いることは、トリプトファン産生に正の効果を有する。図４４Ｂは、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ構築物を含む株からのトリプトファン生産を示し、グルコースおよびグルクロン酸を酸素の存在下および非存在下で炭素源として比較する。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２分子のホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ、ＰＥＰ）を取り込んでトリプトファン１分子を生成する。グルコースが炭素源として使用される場合、利用可能な全ＰＥＰの５０％がＰＴＳ系（ホスホトランスフェラーゼ系）を介して細胞内にグルコースを導入するために使用される。トリプトファンの生産は、非ＰＴＳ糖（グルクロン酸）を好気的に使用することによって改善される。このデータはまた、ｔｎａＡを欠失させる（好気的に初期の時点でのみ）正の効果を示す。図４４Ｃは、セリンの添加によるΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒを含む改変株による改良されたトリプトファン産生を示す棒グラフを示す。
【図４５】図４５Ａ、図４５Ｂ、図４５Ｃ、図４５Ｄ、および図４５Ｅは本発明の例示的な実施態様の概略図であって、遺伝子操作された細菌が、トリプトファン、トリプタミン、インドール酢酸およびインドールプロピオン酸の製造のための回路を含む。遺伝子、遺伝子配列および／または遺伝子回路またはカセットのいずれかは、場合により、誘導性プロモーターから発現される。遺伝子、遺伝子配列および／または遺伝子回路またはカセットの発現を制御し得る例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、誘導されたプロモーター（例えば、外因的に添加され得る）代謝産物（例えば、アラビノースおよびテトラサイクリン）によって誘導されるプロモーターを含むが、これらに限定されない。細菌はまた、栄養要求性、例えばｔｈｙＡの欠損（ΔｔｈｙＡ；チミジン依存性）を含み得る。図４５Ａは、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子の発現によりトリプトファンがコリスミ酸前駆体から産生されるトリプトファン産生株を示す。ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、トリプトファン産生を改善するためのフィードバック耐性型に置き換えられている。必要に応じて、細菌は、図１に示すトランスポーターおよび／または追加のトリプトファン回路のいずれかを含むことができる。図３９の説明に記載されている。および／または４５Ｂ。場合により、Ｔｒｐリプレッサーおよび／またはＴｒｐＡをコードするｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換する）を欠失させて、産生されるトリプトファンのレベルをさらに増加させる。細菌はまた、ＹｄｄＧを発現させるためのｙｄｄＧの遺伝子配列を含み、トリプトファンの輸出を助けることができる。図４５Ｂは、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子の発現によりトリプトファンがコリスミ酸前駆体から産生されるトリプトファン産生株を示す。ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、トリプトファン産生を改善するためのフィードバック耐性型に置き換えられている。該株は、野生型またはフィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子のいずれかをさらに含む。エシェリヒア・コリｓｅｒＡでコードされた３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）デヒドロゲナーゼは、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）生合成の主要リン酸化経路の第１段階を触媒する。この段階は、３ＰＧの３−ホスホヒドロキシピルビン酸（３ＰＨＰ）への酸化であり、ＮＡＤ１  ＮＡＤＨに大腸菌は、産生された各トリプトファンに対して１つのセリンを使用する。その結果、ｓｅｒＡを発現させることにより、トリプトファン産生が改善される。必要に応じて、細菌は、図１に示すトランスポーターおよび／または追加のトリプトファン回路のいずれかを含むことができる。図３９の説明に記載されている。場合により、Ｔｒｐリプレッサーおよび／またはＴｒｐＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）を欠失させて、産生されるトリプトファンのレベルをさらに増加させる。バクテリアはまた、ｙｄｄＧがＹｄｄＧを発現してトリプトファンの輸出を助けるための遺伝子配列を含んでいてもよい。図４５Ｃは、トリプタミン産生株の非限定的な例を示す。トリ��トファンは、必要に応じて、コリスミ酸前駆体から生成され、この株は、任意に、図１に示すおよび／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ及び／さらに、この株は、トリプトファンをトリプタミンに変換するｔｄｃ（トリプトファンデカルボキシラーゼ、例えばＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ由来）を含む。図４５Ｄは、インドール−３−酢酸生成株の非限定的な例を示す。トリプトファンは、所望により、コリスミ酸前駆体から生成され、この株は、任意に、図１に示されかつ／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ及び／さらに、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを一緒に産生するｔｒｐＤＨ（例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来のトリプトファンデヒドロゲナーゼ）およびｉｐｄＣ（エンテロバクター・クロアカエ由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）インドール−３−アセトアルデヒドをインドール−３−アセテートに変換するｉａｄ１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ由来）を含む。  ４５Ｅは、インドール−３−プロピオナート産生株の非限定的な例を描く。トリプトファンは、必要に応じて、コリスミ酸前駆体から生成され、この株は、任意に、図１に示すおよび／または記載されるような追加の回路を含む。図４５Ａおよび／または図４５Ａを参照する。４５Ｂ及び／３９。さらに、この株は、図２に記載の回路を含む。（例えば、トリプトファンから（インドール−３−イル）ピルビン酸を産生するＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来の）トリプトファンデヒドロゲナーゼ、ｆｌｄＡ（インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば、インドール−３−乳酸塩およびインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−乳酸−ｃｏＡに変換するクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣ（インドール−３−乳酸脱水酵素、例えばクロストリジウム  インドール−３−ラクテート−ＣｏＡをインドール−３−アクリリル−ＣｏＡに変換するｆｏｒＤおよび／またはＡｃｕＩ：（インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ、例えばクロストリジウム・スポロゲネスおよび／またはアクリリル−ＣｏＡレダクターゼから、インドール−３−アクリロイル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡに変換するＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のもの）である。この回路はさらに、（インドール−３−イル）ピルビン酸をインドール−３−乳酸塩に変換するｆｌｄＨ１および／またはｆｌｄＨ２（インドール−３−乳酸デヒドロゲナーゼ１および／または２、例えばクロストリジウムスポロゲネス由来）を含む。
【図４６】図４６Ａ、図４６Ｂ、図４６Ｃ、図４６Ｄ、図４６Ｅは、本明細書に記載の１つまたは複数の遺伝子配列および／または遺伝子カセットを含む、本開示の遺伝子操作された細菌の非限定的な例を示す。
【図４７】図４７は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ染色体内の組込み部位の地図を描く。これらの部位は、必須の遺伝子発現を妨げることなく、回路構成要素が染色体に挿入され得る領域を示す。バックスラッシュ（／）は、発散的または収束的に発現した遺伝子の間に挿入が起こることを示すために使用される。ｔｈｙＡのような生合成遺伝子内への挿入は、栄養要求性を作成するのに有用であり得る。いくつかの実施態様では、個々の回路構成要素が、示されたサイトの２つ以上に挿入される。
【図４８】図４８は、複数の作用機序（ＭｏＡｓ）を含むＥ．ｃｏｌｉ  １９１７  Ｎｉｓｓｌｅ染色体の例示的な模式図を示す。
【図４９】図４９Ａおよび図４９Ｂは、細菌染色体、例えば大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７染色体の模式図を示す。例えば、図４９Ａは、ブチラート生成のための回路、プロピオナート生成のための回路、およびＩＢＤに関連する１つ以上のインターロイキンの生成のための回路を含む操作された細菌の概略図を示す。図４９Ｂは、３つの回路、ブチラート生成のための回路、ＧＬＰ−２発現のための回路、およびＩＢＤに関連する１つまたは複数のインターロイキンの産生回路を含む操作された細菌の概略図を示す。
【図５０】図５０は鞭毛ＩＩＩ型分泌に基づく分泌系の模式図であり、この鞭毛ＩＩＩ型分泌は、ペプチドを天然の鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルに組換え的に融合することにより、目的の治療用ペプチド（星）を分泌するために使用される細胞内で発現されたキメラペプチドを内膜および外膜を介して周囲の宿主環境に動員できることを示している。
【図５１】図５１は、治療用ペプチド（スター）が自己輸送体のＮ末端分泌シグナル、リンカーおよびベータドメインに融合され得る組換えタンパク質の細胞外産生のためのＶ型分泌系の模式図を示す。このシステムでは、Ｎ末端シグナル配列はタンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に導き、タンパク質を内膜を通ってペリプラズムに移動させ、続いてシグナル配列を切断する。βドメインは、βドメインが折り畳まれ、外膜にβバレル構造として挿入されるＢａｍ複合体に補充される。次いで、治療用ペプチドは、リンカー配列の前にベータ−バレル構造の中空細孔を貫通している。治療用ペプチドは、自己触媒的切断によって、または膜結合ペプチダーゼ（はさみ）をリンカー中の相補的プロテアーゼ切断部位に標的化することによって、リンカー系から解放される。
【図５２】図５２はＨｌｙＢ（ＡＴＰ結合カセットトランスポーター）を用いて、パッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外空間に直接転座させるＩ型分泌系の模式図を描く。ＨｌｙＤ（膜融合タンパク質）；およびＴｏｌＣ（外膜タンパク質）を含み、内膜および外膜の両方を介してチャネルを形成する。ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分は、このペプチドの分泌を媒介するために、治療用ペプチド（スター）のＣ末端部分に融合される。
【図５３】図５３は、グラム陰性細菌の外膜および内膜、および漏出性または不安定化した外膜を生成するためのいくつかの欠損標的の模式図を示し、それにより、治療用ポリペプチドの細胞外空間への転位、例えば、ジスルフィド結合。外膜をペプチドグリカン骨格、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌおよび／またはペリプラズムプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子に連結するタンパク質をコードする１以上の遺伝子の変異を失活させる、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌは漏出表現型を生成する。突然変異の組み合わせは、漏出性表現型を相乗的に増強し得る。
【図５４】図５４は、バクテリアが腸管腔に分泌された治療用タンパク質を注入することを可能にするために改変されたタイプ３分泌システム（Ｔ３ＳＳ）を呈する。誘導性プロモーター（小さな矢印、上部）、例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーターは、細胞からタグ化ペプチドを分泌する装置を産生するＴ３分泌系遺伝子カセット（３つの大きな矢印、上部）の発現を駆動する。誘導性プロモーター（小さな矢印、下部）、例えば、ＦＮＲＳ誘導性プロモーターは、調節因子、例えばアデノウイルスの発現を駆動する。Ｔ７ポリメラーゼは、次いで、標識された治療用ペプチド（六角形）の発現を活性化する。
【図５５】図５５Ａ−５５Ｃは、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の他の非限定的な実施態様を記載する。アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制するコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、ＡｒａＣ転写因子は、それがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導するＰａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）に結合して活性化することを可能にする構造変化を受ける。ＴｅｔＲは毒素（これはＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げるが、抗毒素は組換え細菌細胞中に蓄積する。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方は発現されない。ＴｅｔＲは毒素の発現を抑制するために存在しないので、毒素が発現され、細胞を殺す。組換えバクテリアに見出されない必須遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の別の非限定的な実施態様を示す。アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下で必須遺伝子の転写を抑制するコンホメーションを採用し、細菌細胞は生き残ることができない。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターに結合してこれを活性化させ、必須遺伝子の発現を誘導し、細菌細胞の生存能力を維持するコンフォメーション変化を受ける。抗毒素が構成的プロモーターから発現され、異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の非限定的な実施態様を描く。アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制するコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、ＡｒａＣ転写因子は、それがＴｅｔＲの発現を誘導するａｒａＢＡＤプロモーターに結合してこれを活性化し、それにより毒素の発現を防止する構造変化を受ける。しかし、アラビノースが存在しない場合、ＴｅｔＲは発現されず、毒素が発現し、最終的に抗毒素を克服し、細胞を死滅させる。抗毒素の発現を調節する構成的プロモーターは、毒素の発現を促進するプロモーターよりも弱いプロモーターであるべきである。この回路では、ａｒａＣ遺伝子は構成的プロモーターの制御下にある。異種遺伝子の発現が外因性環境シグナルによって活性化される、本開示の別の非限定的な実施態様を描く。アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣ転写因子は、転写を抑制するコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、ＡｒａＣ転写因子は、それがＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および抗毒素の発現を誘導するａｒａＢＡＤプロモーターに結合してこれを活性化することを可能にする構造変化を受ける。ＴｅｔＲは毒素（これはＴｅｔＲ結合部位を有するプロモーターの制御下にある）の発現を妨げるが、抗毒素は組換え細菌細胞中に蓄積する。しかし、アラビノースが存在しない場合、抗毒素およびＴｅｔＲの両方は発現されない。ＴｅｔＲは毒素の発現を抑制するために存在しないので、毒素が発現され、細胞を殺す。ａｒａＣ遺伝子は、この回路中の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＡｒａＣプロモーター）の制御下にある。
【図５６】図５６は、外因性環境条件または１つまたは複数の環境シグナルが、誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーター由来の異種遺伝子および少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施態様を決定する。次いで、リコンビナーゼは、毒素遺伝子を活性化コンフォメーションにフリップし、リコンビナーゼの天然動力学は、毒素の発現における時間遅延を生じ、異種遺伝子が完全に発現されることを可能にする。毒素が発現されると、細胞を殺す。
【図５７】図５７は、外因性環境条件または１つまたは複数の環境シグナルが、異種遺伝子、抗毒素、および誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーター由来の少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の別の非限定的な実施態様を描く。次いで、リコンビナーゼは、毒素遺伝子を活性化コンフォメーションにフリップするが、蓄積された抗毒素の存在は、毒素の活性を抑制する。外因性の環境条件または合図がもはや存在しなくなると、抗毒素の発現は停止される。毒素は構成的に発現され、蓄積し続け、細菌細胞を死滅させる。
【図５８】図５８は、外因性環境条件または１つまたは複数の環境シグナルが、異種遺伝子および誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーター由来の少なくとも１つのリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の別の非限定的な実施態様を描く。次いで、リコンビナーゼは、少なくとも１つの切除酵素を活性化コンフォメーションに反転させる。次いで、少なくとも１つの切除酵素は、１つ以上の必須遺伝子を切除し、老化および最終的な細胞死をもたらす。リコンビナーゼおよび切除遺伝子の自然な動力学は、時間遅延を引き起こし、その動力学は、切除される必須遺伝子の数および選択に応じて変更および最適化され得、細胞死が数時間または数日以内に起こることを可能にする。複数のネステッドリコンビナーゼの存在を用いて、細胞死のタイミングをさらに制御することができる。
【図５９】図５９は、外因性環境条件または１つまたは複数の環境シグナルが、誘導性プロモーターまたは誘導性プロモーターからの異種遺伝子および第１のリコンビナーゼの発現を活性化する、本開示の１つの非限定的な実施態様を示す。次いで、リコンビナーゼは、第２のリコンビナーゼを反転配向から活性コンフォメーションに反転させる。活性化された第２のリコンビナーゼは毒素遺伝子を活性化コンフォメーションにフリップし、リコンビナーゼの天然動力学は毒素の発現における時間遅延を生じ、異種遺伝子を完全に発現させる。毒素が発現されると、細胞を殺す。
【図６０】図６０は、遺伝子操作された安全要素としてのＧｅｎｅＧｕａｒｄの使用について示すものである。全ての操作されたＤＮＡは、条件的に破壊され得るプラスミド上に存在する。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：バイオセーフティのために設計されたモジュラープラスミドシステム」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４：３０７−３１６を参照されたい。
【図６１】図６１は、表２５（Ｐｆｎｒ１−５）に示される例示的ＦＮＲプロモーターから選択されるＦＮＲ応答性プロモーター由来のｌａｃＺを発現する低コピープラスミドを有する細菌を含む試料中のβ−ガラクトシダーゼレベルを呈する。異なるＦＮＲ応答性プロモーターを用いて、様々な発現レベルおよびダイナミックレンジを有する嫌気性誘導性レポーターのライブラリーを作製した。これらのプロモーターは強力なリボソーム結合部位を含んでいた。細菌培養物は、好気性（+Ｏ２）または嫌気性条件（−Ｏ２）のいずれかで増殖させた。サンプルを４時間で除去し、β−ガラクトシダーゼレベルに基づくプロモーター活性を、標準的なβ−ガラクトシダーゼ比色アッセイを実施することによって分析した。
【図６２】図６２Ａ−６２Ｃは、例示的なＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）制御下にあるｌａｃＺ遺伝子の模式図および対応するグラフデータを描く。図６２Ａは、例示的なＦＮＲプロモーター（ＰｆｎｒＳ）の制御下にあるｌａｃＺ遺伝子の模式図を示す。ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードし、細菌中の一般的なレポーター遺伝子である。図６２Ｂは、ＳＹＮ３４０におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の関数としてのＦＮＲプロモーター活性を示す。低コピーｆｎｒＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子を保有する改変細菌株であるＳＹＮ３４０を、酸素の存在下または非存在下で増殖させた。標準β−ガラクトシダーゼ比色定量アッセイの値は、ミラー単位（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）で表される。これらのデータは、ｆｎｒＳプロモーターが嫌気性条件下で１時間以内に高レベルの遺伝子発現を開始し始めることを示唆している。図６２Ｃは、酸素の存在下および非存在下の両方でｌａｃＺを経時的に発現する細菌細胞培養物の増殖を示す。
【図６３】図６３Ａ−６３Ｄはそれぞれ、レポーター構築物の構造または活性を示す棒グラフ、模式図、およびドットブロットを描いている。図６３Ａおよび図６３Ｂは、レポーター構築物の活性の棒グラフを示す。図６９Ａは、ＡＴＣ−誘導性レポーター構築物発現のグラフを示し、図６３Ｂは、一酸化窒素誘導性レポーター構築物発現のグラフを示す。これらの構築物は、同族の誘導因子によって誘導されると、ＧＦＰの発現を導く。コントロール、ＡＴＣ−誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを有するプラスミドを有するニッスル細胞は、ある範囲の濃度にわたって誘導された。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表される。図６３Ｃは、構築物の模式図を示す。図６３Ｄは、構成的プロモーターの制御下でＮｓｒＲを発現するプラスミドを有する細菌と、ＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を有する細菌のドットブロットを示す。ＤＳＳで処置したマウスは、ＨＥの典型的なモデルとして役立つ。ＨＥ被験者の場合と同様に、２−３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で飲料水を補充することにより、マウスの腸が損傷する。化学発光は、ＤＳＳ処理マウスにおいて誘導されたＮｓｒＲ調節プロモーターについて示される。
【図６４】図６４は、インビボでＮｉｓｓｌｅの存在のグラフを描く。ストレプトマイシン耐性ニッスルを、抗生物質の前処理なしで経口強制飼養によりマウスに投与した。６匹の全マウスからの糞便ペレットを投与後にモニターして、依然としてマウス胃腸管内に存在するＮｉｓｓｌｅ投与量を決定した。棒グラフは、マウスに投与された細菌の数を表す。線は、１０日間連続して毎日糞便サンプルから回収されたニッスルの数を表す。
【図６５】図６５は胃管栄養法の１、４、８、１２、２４および３０時間後の腸管の様々な区画におけるストレプトマイシン耐性ニッスルについての経時的な滞留の棒グラフを示す図である。マウスを約１０９  ＣＦＵで処置し、各時点で動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を取り出した。小腸は３つの切片に切断され、大腸および大腸はそれぞれ２つの切片に切断された。集められた腸溶出液および各区画のＣＦＵは、連続希釈播種によって決定した。
【図６６】図６６Ａおよび図６６Ｂは、野生型ｃｌｂＡ構築物（図６６Ａ）の概略図およびｃｌｂＡノックアウト構築物（図６６Ｂ）の概略図を示す。
【図６７】図６７は、設計−構築−試験サイクルの概略図を示す。ステップは次のとおりである。１：疾患経路を定義する。２：標的代謝物を同定する。３：遺伝的回路を設計する。４：合成バイオティックを構築する。５：インビボで回路を活性化する。６：回路活性化動態を特徴付ける。７：インビトロの生産性を疾病閾値に最適化する。８：動物 疾患モデルにおいて最適化回路を試験する。９：微生物に同化する。１０：インビボＰＫおよび投薬レジメンの理解を発展させる。図６７は、出現順にそれぞれ配列番号２９２−２９３を開示する。
【図６８】図６８は、本開示の遺伝子操作されたバクテリアの上流および下流産生のための非限定的な製造プロセスの概略図を描く。ステップ１は、スターター培養１（ＳＣ１）のパラメータを示す：ループフル―グリセロールストック、一晩、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振盪する。ステップ２は、スターター培養２（ＳＣ２）のパラメータを示す：ＳＣ１から１／１００希釈、１．５時間、温度３７℃、２５０ｒｐｍで振とう。ステップ３は、生産バイオリアクターのパラメータを示す：接種原−ＳＣ２、温度３７℃、ｐＨ設定点７．００、ｐＨ不感帯０．０５、溶存酸素設定点５０％、溶存酸素カスケード攪拌／ガスＦＬＯ、撹拌限界３００−１２００ｒｐｍ、ガスＦＬＯは０．５−２０リットル／分、２４時間継続する。ステップ４は収穫のためのパラメータを示す：４０００ｒｐｍの速度および３０分間の遠心分離、１Ｘ１０％グリセロール／ＰＢＳ洗浄、遠心分離、１０％グリセロール／ＰＢＳに再懸濁。ステップ５は、バイアル充填／保存のためのパラメータを示す：１−２ｍＬのアリコート、−８０℃。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下は実施態様の説明である。
本開示は、遺伝学的に操作された細菌、その製薬上組成物、ならびに消化管炎症を減少させ、消化管バリア機能を増強し、および／または自己免疫障害を処置または防止する方法を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的操作細菌には、ノンネイティブな（非自然なとも言う）抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成するための少なくとも一の非自然遺伝子および/または遺伝子カセットが含まれる。いくらかの実施態様では、少なくとも一の遺伝子および/または遺伝子カセットは、誘発性条件、例は、低酸素環境、ＲＯＳの存在、またはＲＮＳの存在を感知することが可能な転写因子によって制御される調節領域にさらに作動可能に連結される。遺伝学的に操作細菌は、誘導性環境、例は、消化管内で抗炎症および/または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を生成することが可能である。したがって、遺伝学的に操作された細菌およびそれらの細菌を含む製薬上組成物は、自己免疫障害および/または消化管炎症および/またはＩＢＤを含む消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態を処置または防止するために使用されうる。
【００１３】
本開示がより一層容易に理解されうるように、一定の用語を最初に規定する。これらの規定は、開示の残りの部分に照らして、またこの技術において熟練した技量の者（当業者とも言う）に理解されるように読まれるべきである。他に規定されない限り、ここで使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって不通に理解されるのと同じ意味を有する。追加の規定は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
【００１４】
ここに使用されるように、「消化管炎症および/または消化管バリア機能低下に関連する疾患および状態」には、制限されないが、炎症性腸疾患、下痢性疾患、および関連疾患が含まれる。「炎症性腸疾患」および「ＩＢＤ」は、ここにおいて互換的に使用され、消化管炎症に関連する疾患の群に言及し、これには、制限されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎（コラーゲン蓄積性大腸炎とも言う）、リンパ球性大腸炎、転換大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、および不確定な大腸炎（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）が含まれる。ここに使用されるように、「下痢性疾患」には、制限されないが、急性水様性下痢、例は、コレラ；急性血性下痢、例は、赤痢；持続性下痢が含まれる。ここに使用されるように、関連疾患には、制限されないが、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側結腸炎（左腸大腸炎とも言う）、全結腸炎（全大腸炎）、および劇症性大腸炎が含まれる。
【００１５】
上記の疾患および状態に関連する症状には、制限されないが、下痢、血便、口内炎（ｍｏｕｔｈ  ｓｏｒｅｓ、口のびらんとも言う）、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲の喪失（食欲不振とも言う）、重量減少、無食欲、増殖遅延（発育遅延とも言う）、思春期発達の遅れ（ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｕｂｅｒｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、皮膚の炎症、目の炎症、関節の炎症、肝臓の炎症、および胆管の炎症の一以上が含まれる。
【００１６】
消化管炎症および／または消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態は、自己免疫障害でありうる。消化管炎症および/または消化管バリア機能低下に関連する疾患または状態は、自己免疫障害と併発する（ｃｏ−ｍｏｒｂｉｄ  ｗｉｔｈ）可能性がある。ここに使用されるように、「自己免疫障害」には、制限されないが、急性散在性（急性播種性とも言う）脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎（ａｃｕｔｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、無ガンマグロブリン（アガンマグロブリンまたはアマガングロブリンとも言う）血症、円形脱毛症、アミロイドーシス（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全（症）、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー（ａｘｏｎａｌ  ＆  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、バロー病（Ｂａｌｏ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ、心筋症）、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｏｓｔｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、慢性再発性多巣性耳状骨症）（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（チャーグ病、Ｃｈｕｒｇｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患（ＣＲＥＳＴ病）、本態性混合性クリオグロブリン血症（必須混合性クリオグロブリン血症とも言う）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状（疱疹性とも言う）皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（デヴィス病とも言う）（視神経脊髄炎）（神経鞘炎とも言う）、円板状ループス（円板状狼瘡とも言う）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性（白血球梗塞性）血管炎、扁平苔癬、硬化性���癬（苔状硬化症）、木質性結膜炎（羊膜結膜炎）、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（狼瘡）（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、視神経炎、パリンドロームリウマチ（回帰性リウマチ）、ＰＡＮＤＡＳ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症（傍腫瘍性小脳変性症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群（ｐｏｓｔｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（むずむず脚症候群）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症が含まれる。
【００１７】
ここに使用されるように「抗炎症分子」および/または「消化管バリア機能エンハンサー分子」は、制限されないが、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオナート、アセタート（酢酸塩、アセテートとも言う）、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２およびアナログ、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、エラフィン（またペプチダーゼインヒビター３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、トリプトファン、ＰＧＤ２、およびキヌレン酸、インドール代謝物、および他のトリプトファン代謝物、ならびにここに開示される他の分子が含まれる。そのような分子はまた、炎症促進分子を抑制する化合物、例は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、および／またはケモカイン、例は、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２を中和する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含むこともできる。このような分子はまた、本明細書に記載のＡＨＲアゴニスト（例えば、ＩＬ−２２産生を生じる、例えばインドール酢酸、インドール-3-アルデヒド、およびインドール）およびＰＸＲアゴニスト（例えば、ＩＰＡ）を含む。このような分子はまた、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、酪酸塩）、ＧＰＲ４１および/またはＧＰＲ４３の活性化剤（例えば、ブチラートおよび/またはプロピオナートおよび／またはアセタート）、ＧＰＲ１０９Ａの活性化剤（例えば、酪酸）、ＮＦ−κＢシグナル伝達、酪酸）、およびＰＰＡＲガンマのモジュレーター（例えば、酪酸）、ＡＭＰＫシグナル伝達のアクチベーター（例えば、アセテート）、およびＧＬＰ−１分泌のモジュレーターが挙げられる。そのような分子はまた、ヒドロキシルラジカル捕捉剤および抗酸化剤（例えば、ＩＰＡ）を含む。ある分子は、主として抗炎症剤、例は、ＩＬ−１０、または主に消化管バリア機能増強性、例は、ＧＬＰ−２でありうる。ある分子は抗炎症性および消化管バリア機能増強性の双方であることができる。抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子は、単一遺伝子によってコードされてもよく、例は、エラフィンはＰＩ３遺伝子によってコードされる。あるいはまた、消炎および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路、例は、ブチラートによって合成されてよい。これらの分子はまた、治療上の分子と称されうる。場合によっては、「抗炎症分子」および/または「消化管バリア機能エンハンサー分子」は、本明細書において「エフェクター分子」または「治療分子」または「治療用ポリペプチド」と呼ばれる。
【００１８】
本明細書で使用される「組換え微生物」という用語は、天然の状態から遺伝子改変された微生物、例えば細菌、酵母、またはウイルス細胞、または細菌、酵母またはウイルスを指す。したがって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」は、それらの天然状態から遺伝的に改変された細菌細胞または細菌をいう。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入されたヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再配列、およびヌクレオチド修飾を有し得る。これらの遺伝子改変は、細菌または細菌細胞の染色体または細菌または細菌細胞中のプラスミドに存在し得る。本明細書に開示される組換え細菌細胞は、プラスミド上の外因性ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、組換え細菌細胞は、その染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【００１９】
「プログラムされたまたは操作された微生物」とは、特定の機能を実行するためにその天然の状態から遺伝的に改変された微生物、例えば細菌またはウイルス細胞、または細菌またはウイルスをいう。したがって、「プログラムされたまたは操作された細菌細胞」または「プログラムされたまたは操作された細菌」とは、特定の機能を実行するためにその天然の状態から遺伝的に改変された細菌細胞または細菌をいう。特定の実施態様では、プログラムまたは操作された細菌細胞は、１つまたは複数のタンパク質、例えば、治療活性を有するか、または治療目的に役立つ１つまたは複数のタンパク質を発現するように改変されている。プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、一旦目的のタンパク質が発現されると、増殖を停止するか、またはそれ自体を破壊する能力をさらに有することができる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、（５’非コード配列）に先行し、（３’非コード配列）に続く調節配列を場合により含むタンパク質またはその断片をコードする核酸断片を指す。コード配列。一実施態様では、「遺伝子」はコード配列の前後の調節配列を含まない。「天然の遺伝子」とは、自然界に見出されるような遺伝子であって、必要に応じてコード配列の前後にそれ自身の調節配列を有するものを指す。「キメラ遺伝子」とは、コード配列の前後にある調節配列を任意に含む天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指し、コード配列および／または調節配列は、全体または一部が天然で一緒には見出されない。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なるように配置された調節およびコード配列を含み得る。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子配列」は、遺伝子配列、例えば核酸配列を指すことを意味する。遺伝子配列または遺伝子配列は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子配列または遺伝子配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝子配列、例えば調節配列、リーダー配列、シグナル配列、タンパク質コード配列。
【００２２】
いくつかの実施態様では、用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、ここに説明される抗炎症および消化管バリア機能増強性分子、例は、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、キヌレニン、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）、エラフィンおよびトレフォイル因子、ならびにその他のいずれかをコードする核酸配列に言及することを意味する。核酸配列には、遺伝子配列の全体または機能的分子をコードする部分的な遺伝子配列が含まれうる。核酸配列は、自然配列または合成配列であってもよい。核酸配列には、自然型または野生型配列が含まれてよく、または一以上の挿入、欠失、置換、または他の修飾を有する修飾配列が含まれてよく、たとえば、核酸配列はコドン最適化されうる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「異種」遺伝子または「異種配列」とは、自然界において所与の細胞において通常は見いだされないヌクレオチド配列をいう。本明細書で使用される場合、異種配列は、所与の細胞に外因的に導入された天然配列（天然に見出されるか、または細胞で発現される）または非天然配列（天然には見出されないか、天然または野生型配列または変異体、非天然または合成配列であり得る。「異種遺伝子」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態で宿主細胞に導入された天然遺伝子またはその断片を含む。例えば、異種遺伝子は、宿主細胞に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード配列を含み得る。異種遺伝子はまた、非天然宿主細胞に導入された天然遺伝子またはその断片を含み得る。したがって、異種遺伝子は、レシピエント細胞に対して外来性または原性であり得る;所与の細胞において天然に見出されるが、それがコードする核酸および/またはポリペプチドの非天然の量を発現する核酸配列；および／または天然にお互いに同じ関係にない２つ以上の核酸配列を含む。本明細書中で使用される場合、用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおける天然の位置にある天然の遺伝子を指す。本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、宿主生物、例えば宿主細菌細胞、ゲノムに導入された遺伝子を指す。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「非天然」核酸配列は、微生物中に通常は存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の余分なコピー、または異種配列、例えば異なるまたは同じサブタイプの細菌またはウイルスからの未修飾配列と比較して改変および/または突然変異した配列である、請求項１に記載の方法。いくつかの実施態様では、非天然核酸配列は、合成非天然配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３参照）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセット中の１つ以上の遺伝子であり得る。いくつかの実施態様では、「非天然」とは、本質的にお互いに同じ関係では見出されない２つ以上の核酸配列をいう。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子操作された微生物は、本質的に前記遺伝子に関連しないプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む。例えば、いくつかの実施態様では、本明細書中に開示される遺伝子操作された細菌は、本質的に前記遺伝子に関連しない直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲ応答性プロモーター（または本明細書に開示される他のプロモーター）抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子に作動可能に連結されている。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子操作されたウイルスは、本質的に前記遺伝子に関連しない直接的または間接的誘導性プロモーター、例えば抗炎症性または腸をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含むバリアエンハンサー分子。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「コード領域」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。「調節配列」という用語は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡ安定性に影響を与えるヌクレオチド配列を指す、または関連するコード配列の翻訳を含む。  調節配列の例には、プロモーター、翻訳リーダー配列、エフェクター結合部位、シグナル配列、およびステムループ構造が含まれるが、これらに限定されない。一実施態様では、調節配列は、プロモーター（例えば、本明細書に開示されるＦＮＲ応答性プロモーターまたは他のプロモーター）を含む。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、生合成経路をコードする「遺伝子カセット」または「オペロン」は、抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために必要とされる2つ以上の遺伝子をいう。前記分子を生成可能な遺伝子のセットをコードすることに加え、遺伝子カセットまたはオペロンにはまた、追加的な転写および翻訳要素、例は、リボソーム結合部位も含まれうる。
【００２７】
「ブチロジーニック遺伝子カセット」、「ブチラート生合成遺伝子カセット」および「ブチラートオペロン」は、生合成経路においてブチラートを産生することができる一組の遺伝子を指すために交換可能に使用される。内因性ブチラート生合成経路を介してブチラートを産生することができる未修飾細菌には、クロストリジウム、ペプトクロスジウム、フソバクテリウム、ブチリビブリオ、ユーバクテリウムおよびトレポネマが含まれるが、これらに限定されない。本発明の遺伝学的に操作された細菌には、細菌の異なる種、菌株、または亜株（ｓｕｂｓｔｒａｉｎ、亜系とも言う）由来のブチラート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のブチラート生合成遺伝子の組合せが含まれてよい。ブチロジーニック遺伝子カセットには、たとえば、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）〔Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）とも称される〕由来のブチラート生成経路の八つの遺伝子：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを含むことができ、それらはブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼサブユニット、電子伝達フラボタンパク質サブユニットベータ、電子伝達フラボタンパク質サブユニットアルファ、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ-アセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ、およびブチラートキナーゼをそれぞれコードする〔Ａｂｏｕｌｎａｇａ（アブルナガ）ら、２０１３〕。ブチラート生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されてもよく、例は、コドン最適化される。Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）菌株６３０および菌株１２９６はいずれもブチラートを生成することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。ブチロジーニック遺伝子カセットには、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、およびｔｈｉＡ１を、およびＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１２９６由来のｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを含むことができる。あるいはまた、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来の単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３の遺伝子の三つすべてを機能的に置換することができる。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のｔｅｒを含むことができる。ブチラート遺伝子カセットは、酪酸の好気性生合成のための遺伝子および/または酪酸の嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含み得る。ブチラート遺伝子カセットの別の��では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢ（例えば、大腸菌由来）で置換される。したがって、ブチラート遺伝子カセットは、ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢを含み得る。
【００２８】
同様に、「プロピオナート遺伝子カセット」または「プロピオナートオペロン」は、生合成経路においてプロピオナートを生成することができる遺伝子のセットを指す。内因性プロピオナート生合成経路を介してプロピオナートを生成することができる未修飾細菌としては、限定されないが、クロストリジウム・プロピオニカム、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａが挙げられる。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子の組合せを含みうる。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、アクリラート経路のプロピオナート生合成遺伝子、例は、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣを含み、それらは、プロピオナートＣｏＡ−トランスフェラーゼ、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼＡ、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼＢ、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼＣ、電子伝達フラボタンパク質サブユニットＡ、アクリロイル−ＣｏＡレダクターゼＢ、およびアクリロイル−ＣｏＡレダクターゼＣをそれぞれコードする（それぞれ、Ｈｅｔｚｅｌら、２００３、Ｓｅｌｍｅｒら、２００２、およびＫａｎｄａｓａｍｙ、 ２０１２  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ａｃｒｙｌａｔｅ  プロピオン酸合成のための経路遺伝子およびそのインパクト・ミックス酸発酵）。このオペロンは乳酸塩からプロピオン酸塩への還元を触媒する。（Ｒ）−ラクトイル−ＣｏＡの脱水は、ラクトイル−ＣｏＡ脱水酵素（ＬｃｄＡＢＣ）による中間アクリロイル−ＣｏＡの生成をもたらす。Ａｃｒｏｌｙｌ−ＣｏＡは、Ａｃｒｏｌｙｌ−ＣｏＡ還元酵素（ＥｔｆＡ、ＡｃｒＢＣ）によってプロピオニル−ＣｏＡに変換される。いくつかの実施態様において、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣによってコードされる酵素によって触媒される律速段階は、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のａｃｕＩ遺伝子によって置換される。この遺伝子産物は、ＮＡＤＰＨ依存性のアクリロイル−ＣｏＡ還元を触媒してプロピオニル‐ＣｏＡ（Ａｃｒｙｌｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓによる３−ヒドロキシプロピオン酸の同化に関与する酵素；  Ａｓａｏ、 ２０１３）を生成する。したがって、プロピオナートカセットは、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣおよびａｃｕＩを含む。別の実施態様では、大腸菌ＹｈｄＨ中のＡｃｕＩのホモログが使用される（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＹｈｄＨの構造、推定キノンオキシドレダクターゼＳｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ  ２００４参照）。このプロピオナートカセットは、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣおよびｙｈｄＨを含む。代わりの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、ピルバート経路プロピオナート生合成遺伝子〔例は、Ｔｓｅｎｇ（ツェン）ら、２０１２参照〕、例は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含み、それ���は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ１、ホモセリンキナーゼ、Ｌ−スレオニンシンターゼ、Ｌ−スレオニンデヒドラターゼ、ピルバートデヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ、およびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをそれぞれコードする。いくらかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードするｔｅｓＢをさらに含む。
【００２９】
プロピオン遺伝子カセットの別の例では大腸菌から、例えば、スリーピングビューティームターゼオペロンの遺伝子を含む（ＳＢＭ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ）。最近、この経路はＡｋａｗｉら（グリセロールからのプロピオン酸の高収率工業生産のために考慮され、利用されたプロピオン酸の高レベル産生のために、エンジニアリング大腸菌；  ＪインディアナＭｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１５）４２：１０５７から１０７２、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。加えて、本明細書に記載されているように、この経路は、グルコースからのプロプリオネートの生成にも適していることが見出されている。本開示の遺伝子操作されたバクテリアによって達成される。ＳＢＭ経路は循環的であり、スクシニル−ＣｏＡの出発分子を再生しながら、発酵産物としてプロピオナートを形成する一連の生化学的変換からなる。ＳＢＭ（メチルマロニルＣｏＡムターゼ）がＬ−メチルマロニルＣｏＡへのスクシニルＣｏＡを変換し、ＹｇｆＤはＧＴＰアーゼ活性を有するＳＢＭ相互作用タンパク質キナーゼである、ｙｇｆＧ（メチルマロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ）は、プロピオニルＣｏＡにＬ−メチルマロニルＣｏＡに変換し、ｙｇｆＨ（プロピオニルＣｏＡ／スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ）に変換しますスクシニルＣｏＡへプロピオン酸コハク酸へプロピオニルＣｏＡ（スリーピングビューティームターゼ（ＳＢＭ）を発現し、大腸菌におけるｙｇｆｄと相互作用するが、Ｆｒｏｅｓｅ  ２００９）。この経路は、プロピオン酸菌の酸化的プロピオン酸塩経路に非常に類似しており、これはまた、コハク酸塩をプロピオン酸塩に変換する。スクシニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｍｕｔＡＢ）によってＲ-メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。これは、次に、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＧＩ：１８０４２１３４）を介してＳ-メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。メチルマロニルＣｏＡは、プロピオニルＣｏＡに変換するメチルマロニルＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＭＭＤＡ、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８７０、ＢＣＣＰ）をコードする三つの遺伝子がある。
【００３０】
プロピオナート遺伝子カセットは、プロピオナートの好気性生合成のための遺伝子および/またはプロピオナートの嫌気性または微好気性生合成のための遺伝子を含みうる。   プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、機能的に置換または修飾されていてもよく、たとえば、コドン最適化である。
【００３１】
「アセタート遺伝子カセット」または「アセタートオペロン」とは、生合成経路においてアセタートを産生することができる遺伝子のセットをいう。細菌は、セルロース、リグニン、および無機ガスなどの様々な基質を含む「多数の炭素およびエネルギー源からアセタートを合成し、当技術分野で知られている異なる生合成メカニズムおよび遺伝子を利用する（Ｒａｇｓｄａｌｅら、２００８）。本発明の遺伝学的に操作された細菌には、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のアセタート生合成遺伝子、または細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のアセタート生合成遺伝子の組合せが含まれてよい。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）は、好気的増殖の間にグルコースおよび酸素を消費してアセタートおよび二酸化炭素を生成することができる〔Ｋｌｅｍａｎ（クレマン）ら、１９９４〕。いくつかの細菌、たとえば、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ（アセチトマクラム属）、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ（アセトアナエロビウム属）、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ（アセトハロビウム属）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ（アセトネマ属）、Ｂａｌｕｔｉａ（ブラウティア属）、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ブチリバクテリウム属）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム属）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ（モーレラ属）、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ（オキソバクター属）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ（スポロミュサ属）、およびＴｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ（サーモアセトゲニウム属）などのようなものは、例は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ  ｐａｔｈｗａｙ（ウッド-ユングダール経路）を使用して、ＣＯまたはＣＯ２＋Ｈ２をアセタートに変換することができるアセトジーニック嫌気性菌である〔Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ（シーレ-ベンゲルスドルフ）ら、２０１２〕。種々の細菌種のためのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ  ｐａｔｈｗａｙの遺伝子が当技術で知られる。アセタート遺伝子カセットはアセタートの好気性生合成のための遺伝子および／またはアセタートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含んでよい。アセタート生合成遺伝子の一以上は機能的に置換または修飾されてよく、たとえば、コドン最適化される。
【００３２】
各遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在し得る。さらに、任意の遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の複数のコピーが細菌に存在してもよく、そこでは遺伝子、遺伝子カセットまたは調節領域の一以上のコピーは、ここに記載されるように変異または他の方法で変動してもよい。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、コピー数を増強するために、同じ遺伝子、遺伝子カセット、または調節領域の複数のコピーを含むように操作される。
【００３３】
各遺伝子または遺伝子カセットは、低酸素条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結され得る。「作動可能に連結された」とは、核酸配列、例えば核酸配列の発現を可能にする様式で調節領域配列に連結された、抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットをいう。シスで行動する。「作動可能に連結された」調節領域は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。調節エレメントは、調節エレメントとコード配列との間の距離にかかわらず、遺伝子コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コード配列と作動可能に連結される。より具体的には、作動可能に連結されるとは、核酸配列、例えば核酸配列の発現を可能にする様式で調節配列に結合された抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子、例えば、コードする遺伝子抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子である。言い換えれば、調節配列はシスで作用する。一実施態様では、遺伝子は、遺伝子の発現を可能にする様式で調節配列に「直接的に」連結され得る。別の実施態様では、遺伝子は、遺伝子の発現を可能にするように調節配列に「間接的に」連結され得る。１つの実施態様において、２つ以上の遺伝子は、２つ以上の遺伝子の発現を可能にするように制御配列に直接的または間接的に連結され得る。調節領域または配列は、目的の遺伝子の転写を指令することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導可能エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で使用する「プロモーター」は、コード配列または遺伝子の発現を制御することができるヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、一般に、それらが調節する配列の５’に位置する。プロモーターは、天然の遺伝子から完全に誘導され得るか、または天然に見出されるプロモーターに由来する異なる要素から構成され得、および／または合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。当業者は、異なるプロモーターが、異なる環境条件または生理学的条件に応答して、例えば細胞特異的または組織特異的様式で、または特定の刺激に応答してコード配列または遺伝子の発現を調節し得ることを容易に確認するであろう。特定の化合物への応答。原核生物のプロモーターは、典型的には、２つのクラス：誘導性および構成性に分類される。「構成的プロモーター」は、その制御下でコード配列または遺伝子の継続的な転写を可能にするプロモーターをいう。
【００３５】
「構成的プロモーター」は、その制御下でコード配列または遺伝子の連続的転写を促進することができ、および／または作動可能に連結されているプロモーターを指す。構成的プロモーターおよび変異体は、当技術分野で周知であり、Ｐｔａｃプロモーター、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（ｉＧＥＭ）登録標準生物学的部品名（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感受性オペロンプロモーター（例えば、ＥｃｏＲＩ）Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）構成的枯草菌σAプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ））、遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０）（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ由来のＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ由来のＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、およびバクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））が挙げられる。
【００３６】
「誘導性プロモーター」とは、遺伝子の発現が前記調節領域の誘導物質の存在下で増加する、１つ以上の遺伝子に作動可能に連結された調節領域をいう。「誘導性プロモーター」は、刺激または外因性環境条件に応答してその制御下でコード配列または遺伝子の転写レベルの上昇を開始させるプロモーターを指す。「直接誘導性プロモーター」とは、調節領域を指し、調節領域は、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されており、前記調節領域の誘導物質の存在下でタンパク質またはポリペプチドが発現される。「間接的に誘導性のプロモーター」とは、２つ以上の調節領域、例えば、第１のタンパク質、ポリペプチドまたは因子をコードする第１の遺伝子、例えば転写調節因子に作動可能に連結された第１の調節領域を含む調節システムを指し、第２の遺伝子に作動可能に連結された第２の調節領域を調節することができ、第２の調節領域を活性化または抑制して、第２の遺伝子の発現を活性化または抑制することができる。直接誘導性プロモーターおよび間接的に誘導性プロモーターの両方が「誘導性プロモーター」に包含される。本明細書に記載の例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えばＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症応答（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、および腸内に天然に存在してもしなくてもよい（例えば、外因的に付加され得る）代謝産物、例えばアラビノースおよびテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターを含む。誘導性プロモーターの例としては、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、およびＰＴｅｔＲプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の誘導性プロモーターの例を以下に示す。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「安定に維持される」または「安定な」細菌は、非天然の遺伝物質を有する細菌宿主細胞、例えば、１つ以上の抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子非天然の遺伝物質が保持され、発現され、そして増殖されるように、宿主ゲノムに組み込まれるか、または自己複製染色体外プラスミド上に増殖される。安定な細菌は、インビトロで、例えば、中および／またはインビボで、例えば腸内で生存および／または増殖することができる。例えば、安定な細菌は、ペイロード、例えば、１つ以上の抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子を含む遺伝子操作された細菌であってもよく、その遺伝子を有するプラスミドまたは染色体は、ペイロードが細菌内で発現され、細菌がインビトロおよび/またはインビボで生存および/または増殖することができるように、細菌内で安定に維持される。いくつかの実施態様において、コピー数は、非天然の遺伝物質の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施態様において、コピー数は、非天然遺伝物質の発現レベルに影響する。
【００３８】
本明細書で使用する「発現」という用語は、核酸に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積、および/またはｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す。
【００３９】
本明細書で使用する「プラスミド」または「ベクター」という用語は、細菌細胞のゲノムに組み込まれていない染色体外核酸、例えばＤＮＡ構築物を指す。プラスミドは通常環状であり、自律複製が可能である。プラスミドは、当技術分野で周知のように、低コピー、中コピー、または高コピーであり得る。プラスミドは、プラスミドを含有する細菌細胞の選択を助け、プラスミドが細菌細胞内に保持されることを確実にする選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子を任意に含み得る。本明細書中に開示されるプラスミドは、異種遺伝子をコードする核酸配列、例えば、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子を含み得る。
【００４０】
本明細書で使用される「形質転換」または「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、核酸断片の宿主細菌細胞への移入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主細菌細胞は、「組換え」または「トランスジェニック」または「形質転換」された生物と呼ばれる。
【００４１】
本明細書で使用する「遺伝子改変」という用語は、任意の遺伝的変化を指す。例示的な遺伝子改変には、例えば、天然の染色体または染色体外の遺伝物質の改変を含む、遺伝子の発現を増加、減少、または消滅させるものが含まれる。例示的な遺伝子改変には、染色体または染色体外の遺伝子配列、遺伝子過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子の少なくとも１つのプラスミド、改変、突然変異、塩基欠失、塩基付加、塩基置換および／またはコドン改変の導入も含まれる変化が表現型の変化を生じるか否かにかかわらず、宿主細胞の遺伝子エレメントに対する抑制、プロモーターの修飾または置換、遺伝子付加（単一または複数コピーのいずれか）、アンチセンスの発現または抑制、または他の任意の変化を含む。遺伝子改変は、プラスミド、例えばプロモーターに作動可能に連結された抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子を含むプラスミドの細菌細胞への導入を含むことができる。遺伝的改変はまた、例えば、天然の遺伝子プロモーターを誘導性プロモーター、調節されたプロモーター、強力なプロモーター、または構成的プロモーターで置換するために、染色体における標的置換を伴い得る。遺伝子改変はまた、遺伝子増幅、例えば、細胞の染色体への天然遺伝子の少なくとも１つのさらなるコピーの導入を含み得る。あるいは、染色体遺伝子改変は、遺伝子突然変異を伴い得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子変異」は、その天然または野生型配列と比較してヌクレオチド配列を変化させる遺伝子または関連調節領域のヌクレオチド配列の変化または変化をいう。突然変異は、例えば、野生型配列内の全部または一部における置換、付加および欠失を含む。そのような置換、付加または欠失は、単一ヌクレオチドの変化（例えば、１つまたは複数の点の突然変異）であり得るか、または配列に実質的な変化をもたらし得る２つ以上のヌクレオチドの変化であり得る。突然変異は、遺伝子のコード領域内ならびに遺伝子の非コードおよび調節配列内で起こり得る。「遺伝子突然変異」という用語は、コード領域内のサイレントおよび保存的突然変異ならびに遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更する変化を含むことを意図する。遺伝子コード配列中の遺伝子突然変異は、例えば、遺伝子のポリペプチド産物の活性（例えば、酵素活性）を増加させるか、低下させるか、さもなければ変化させることができる。調節配列中の遺伝子突然変異は、変更された調節配列に作動可能に連結された配列の発現を増加させるか、減少させるか、さもなければ変化させることができる。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスポーター」は、分子、例えばアミノ酸、ペプチド（ジペプチド、トリペプチドなど）を導入するためのメカニズム、例えばタンパク質、タンパク質またはタンパク質複合体を意味することを意味する。ポリペプチドなど）、毒素、代謝産物、基質、および他の生体分子を、細胞外環境から微生物に導入することができる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「外因性環境条件」または「外因性環境シグナル」という句は、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される設定、状況、刺激または生体分子をいう。「外因性環境条件」という語句は、操作された微生物の外部の環境条件であるが、宿主の対象環境に内因性または本来の環境条件を指すことを意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、環境条件が哺乳類の体内にあるが、インタクトな微生物細胞に外的または外因性である環境条件を指すために交換可能に使用され得る。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の上部胃腸管に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の下部胃腸管に特異的である。いくらかの実施態様では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施態様では、外因性環境条件は、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、例えば哺乳動物の腸の環境である。いくつかの実施態様では、外因性環境条件は、哺乳類の腸に特異的な分子または代謝物、例えばプロピオナートである。いくつかの実施態様では、外因性環境条件は、組織特異的または疾患特異的代謝産物または分子である。いくつかの実施態様では、外因性環境状態は炎症性疾患に特異的である。いくつかの実施態様では、外因性環境条件は低ｐＨ環境である。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施態様では、微生物学の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの局面において、細菌は、酸素レベルを感知することができる進化した転写因子を有する。様々なシグナル伝達経路は、異なる酸素レベルによって誘発され、異なる動態で起こる可能性がある。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つ以上の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列を指し、対応する転写の結合および／または活性化下流の遺伝子発現を活性化する。
【００４５】
酸素レベル依存性転写因子の例には、ＦＮＲ（フマル酸および硝酸レダクターゼ）、ＡＮＲおよびＤＮＲが含まれるが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気性硝酸塩呼吸）応答性プロモーター、およびＤＮＲ（解毒性硝酸塩呼吸調節剤）応答性プロモーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９；  Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９；  Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１；  Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８；  Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３；  Ｓａｌｍｏｎら、２００３）、非限定的な例を表１に示す。
【００４６】
非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、環境酸素が低いかまたは全くない条件下で高度に発現することが知られている大腸菌Ｎｉｓｓｌｅフマレートおよび硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来する（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０；  Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、Ｎｉｓｓｌｅに自然に見出される包括的転写制御因子ＦＮＲによって嫌気条件下で活性化される。嫌気的条件下では、ＦＮＲは二量体を形成し、その制御下で特定の遺伝子のプロモーター中の特定の配列に結合し、それによりそれらの発現を活性化する。しかしながら、好気性条件下では、酸素はＦＮＲ二量体中の鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形態に変換する。このようにして、タンパク質またはＲＮＡの発現を調節するために、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターが採用される。ＰｆｎｒＳは、本出願では、ＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびプロモーターＰｆｎｒＳを示す他のそのような関連した指定として互換的に使用される。
[表１]
【００４７】
ここに使用されるように、「チューナブル（調整可能）調節領域」は転写因子の直接的または間接的コントロール下にある核酸配列に言及し、およびそれはインデューサーのレベルと比較して遺伝子発現を活性化、抑制、抑制解除、またはさもなければ制御することができる。いくらかの実施態様において、調整可能調節領域はプロモーター配列を含む。インデューサー（誘導物質とも言う）は、ＲＮＳまたはここに記載の他の誘導物質であってもよく、および調整可能調節領域はＲＮＳ応答性調節領域またはここに記載の他の応答性調節領域であってもよい。調整可能な調節領域は、１つまたは複数のペイロード、例えば、ブチロジーニックまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列の生成のために、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結され得る。たとえば、一の特定の実施態様では、調整可能調節領域はＲＮＳ抑制解除性調節領域であり、ＲＮＳが存在するとき、ＲＮＳ感知性転写因子はもはや調節領域に結合せず、および／または調節領域を抑制せず、それによって作動可能に連結される遺伝子または遺伝子カセットの発現が可能である。この場合、調整可能調節領域は、ＲＮＳレベルと比較して遺伝子または遺伝子カセット発現を抑制解除する。各遺伝子または遺伝子カセットは、少なくとも一のＲＮＳを感知することができる転写因子によって直接または間接にコントロールされる調整可能調節領域に作動可能に連結されうる。
【００４８】
いくつかの実施態様において、外因性環境条件は、活性酸素種（ＲＯＳ）の存在または非存在である。他の実施態様では、外因性環境条件は、反応性窒素種（ＲＮＳ）の存在または非存在である。いくつかの実施態様では、外因性環境条件は、炎症反応に関与する生体分子、例えば、腸の炎症性障害に存在する分子である。いくつかの実施態様では、外因性環境条件またはシグナルは、組換え細菌細胞が存在する環境に自然に存在するか、または自然に存在しない。いくつかの実施態様では、外因性環境条件またはシグナルは、例えば、生物学的状態の生成または除去、および／または生物学的分子の投与または除去によって、人工的に作製される。
【００４９】
いくつかの実施態様において、外因性環境条件および/またはシグナルは、誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施態様では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件および／またはシグナルは、哺乳類の腸内に自然に存在しない。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、本開示の医薬組成物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するように作用する任意の生体分子と組み合わせて投与される分子または代謝産物によって刺激される。いくつかの実施態様において、外因性環境条件および／またはシグナルは、本開示の組換え細菌細胞を含む培地に添加される。いくつかの実施態様では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件は、哺乳類の腸内に自然に存在する（例えば、低酸素または嫌気性条件、または炎症反応に関与する生体分子）。いくつかの実施態様では、外因性環境条件がプロモーターを誘導するために存在しないため（例えば、インビボでの外因性環境条件への曝露の喪失は、誘導性プロモーターの活性を阻害する（例えば、腸外の好気性環境）。「消化管（腸を含む）」は、食物の移動および消化、栄養素の吸収、および廃棄物の排出を担う器官、腺、管、およびシステムに言及する。ヒトでは、消化管は胃腸（ＧＩ）管を含み、それは口から始まり、および肛門で終わり、さらに加えて食道、胃、小腸、および大腸を含む。消化管はまた、副器官および腺、たとえば、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などのようなものを含む。上部胃腸管には、食道、胃および小腸の十二指腸が含まれる。下部胃腸管には、小腸の残りの部分、すなわち、空腸および回腸、および大腸のすべて、すなわち、盲腸、結腸、直腸、および肛門管が含まれる。細菌は、消化管、例は、胃腸管において、および特に腸において、その全体にわたって見出すことができる。
【００５０】
「微生物」は、典型的には単一の細胞からなる微視的、潜顕微鏡的、または超顕微鏡的サイズの生物または微生物を指す。微生物の例には、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、酵母、例えばサッカロミセスおよび原生動物が含まれる。いくつかの局面では、微生物は、１つ以上の黄体形成分子、例えば、抗炎症性またはバリアエンハンサー分子を産生するように操作される（「操作された微生物」）。特定の実施態様では、操作された微生物は、操作された細菌である。特定の実施態様では、操作された微生物は、操作されたウイルスである。
【００５１】
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことが可能でない細菌に言及する。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくらかの実施体態様では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくらかの実施態様では、非病原性細菌はリポ多糖類（ＬＰＳ）を含有しない。いくらかの実施態様では、非病原性細菌は共生細菌である。非病原性細菌の例には、制限されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス属）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス属）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ビフィドバクテリウム属）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ（ブレビバクテリウム属）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム属）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（エンテロコッカス属）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス属）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（ラクトコッカス属）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス属）、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィロコッカス属）で、例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス・コアグランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サブティリス）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（バクテロイデス・フラジリス）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バクテロイデス・サブティリス）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（バクテロイデス・テタイオタオミクロン）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ（ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・インファンティス）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（ビフィドバクテリウム・ロングム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（クロストリジウム・ブチリカム）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（エンテロコッカス・フェシウム）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ（エシェリキア・コリ・ニッスル）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ラクトバチルス・アシドフィラス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・ブルガリカス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ラクトバチルス・ジョンソニイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・パラカゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタルム）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（ラクトバチルス・ロイテリー）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノーサス）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ（サッカロミセス・ブラウディ）が含まれる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９；  ��ｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４；  米国特許第６，８３５，３７６号；  米国特許第６，２０３，７９７号；  米国特許第５，５８９，１６８号；７，７３１，９７６）。非病原性細菌にはまた、腸の原生微生物叢に存在する共生細菌も含まれる。一実施態様では、本開示は、サッカロマイセス・ブルジュルイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）などの非病原性サッカロマイセスをさらに含む。自然に病原性の細菌は、病原性を低減または排除するために遺伝学的に操作することができる。
【００５２】
「プロバイオティク」は、生きた、非病原性の微生物、例は、細菌に言及するために使用され、それは微生物の適量を含む宿主有機体に健康上の利益を与えることができる。いくらかの実施態様では、宿主有機体は哺乳動物である。いくらかの実施態様では、宿主有機体はヒトである。いくつかの実施態様では、プロバイオティクス細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施態様では、プロバイオティック細菌は、グラム陽性細菌である。非病原性細菌のいくつかの種、株および／またはサブタイプは現在、プロバイオティック細菌として認識されている。プロバイオティクス細菌の例には、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属するいくつかの菌株、例えばＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４；  米国特許第５，５８９，１６８号；  米国特許第６，２０３，７９７号；  米国特許第６，８３５，３７６号）を含むが、これらに限定されない。プロバイオティックは、細菌の変形体または変異体株であってもよい（Ａｒｔｈｕｒ（アーサー）ら、２０１２；  Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓ（クエバス-ラモス）ら、２０１０；  Ｏｌｉｅｒ（オリエ）ら、２０１２；  Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ（ヌーガイリーデ）ら、２００６）。非病原性細菌は、望ましい生物学的特性、例は、生存性を増強または改善するために遺伝学的に操作されうる。非病原性細菌は、プロバイオティク特性を提供するように遺伝学的に操作されうる。プロバイオティク細菌は、プロバイオティク特性を増強または改善するために遺伝学的に操作されうる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「調節する」およびそのコグネイトは、分子、生理学的な読出し、結果またはプロセスを正または負に変更、調節または調整して、前記読出し、結果またはプロセスの変化を野生型、またはベースラインの測定値と比較して、正常であることを示す。したがって、例えば、「調節する」または「調節する」には、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションが含まれる。読取り、結果またはプロセスを調節する非限定的な例は、生体分子（例えば、タンパク質、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモンなど）の正常またはベースラインの機能、活性、発現または分泌の変化または変化をもたらす。代謝産物、短鎖脂肪酸、または他の化合物）を含む。読み出し、結果、またはプロセスを調節する別の非限定的な例は、対象の生体分子の量またはレベルの変化をもたらす。血清および／または腸管腔内に存在する。別の非限定的な例において、読出し、結果、またはプロセスを調節することは、表現型の変化または１つまたは複数の疾患症状の変化に関する。したがって、「調節する」は、正常な機能、活性、または読み出し、結果またはプロセスのレベル（例えば、目的の生体分子および／または分子または生理学的な分子）の増加、減少、マスキング、変更、プロセス、および／または１つまたは複数の疾患症状における表現型の変化）を含む。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「栄養要求株」または「栄養要求性」は、その成長を支援するために、特定の因子、例えばアミノ酸、糖または他の栄養素を必要とする生物をいう。「栄養要求性改変（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、前記栄養素を産生することができないため、生存または成長に不可欠な外因的に添加された栄養素がない場合に生物を死滅させる遺伝子改変である。本明細書中で使用される場合、用語「必須遺伝子」は、細胞増殖および／または生存のために必要な遺伝子を指す。必須遺伝子は、以下により詳細に記載され、ＤＮＡ合成遺伝子（ｔｈｙＡなど）、細胞壁合成遺伝子（ｄａｐＡなど）、およびアミノ酸遺伝子（ｓｅｒＡおよびｍｅｔＡなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、疾患およびそれらの同族体を「調節する」および「治療する」という用語は、疾患、障害および/または状態、またはその少なくとも１つの識別可能な症状の改善を指す。別の実施態様において、「調節する」および「治療する」とは、必ずしも患者によって識別可能ではない少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施態様において、「調節する」および「治療する」とは、物理的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、物理的パラメータの安定化）のいずれかの疾患、障害および／または両方。別の実施態様において、「調節する」および「治療する」とは、疾患、障害および／または状態の進行を遅くすることまたは進行を逆転させることをいう。本明細書中で使用される場合、「予防する」およびその同属語は、所与の疾患、障害および/または状態、またはそのような疾患、障害、および/または状態に関連する症状の発症の遅延またはリスクの軽減を意味する。
【００５６】
処置を必要とするものには、既に特定の医学的障害を有する個体、ならびにその疾患を有する危険性のあるもの、または最終的にはその障害を獲得する可能性のあるものが含まれうる。処置の必要性は、たとえば、障害の発症、障害の存在または進行、または障害を有する対象の処置への受容性に関連する一以上の危険因子の存在によって評価される。自己免疫疾患および/または消化管炎症および／または消化管バリア機能の低下に関連する疾患および状態を治療することは、過剰な炎症および／または関連する症状の軽減または排除を包含し、必ずしも根底にある疾患の排除を包含するとは限らない。
【００５７】
本明細書に記載の疾患を治療することは、ブチラートのレベルを増加させること、アセタートのレベルを増加させること、ブチラートのレベルを上昇させることおよびＧＬＰ−２、ＩＬ−２２および／またはｒＩＬ−１０を増加させること、および／またはトリプトファンおよび／および／または任意の他の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を提供すること、および根底にある疾患の排除を必ずしも包含しないことを意味する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および／または賦形剤のような他の成分との、本開示の遺伝子改変微生物、例えば遺伝子操作された細菌またはウイルスの調製物を指す。
【００５９】
交換可能に使用されうる語句「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」は、有機体に著しい刺激を引き起こさず、および施与される細菌性またはウイルス性化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤に言及する。アジュバントはこれらの語句の下に含まれる。
【００６０】
用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウムリン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
用語「治療上有効な用量」および「治療上有効な量」は、症状の発症の予防、遅延、または状態の症状、例は、炎症、下痢、自己免疫障害の改善を生じる化合物の量に言及するために使用される。治療的に有効な量は、たとえば、重症度を処置、防止、低減し、発症を遅延し、および／または自己免疫障害および/または消化管炎症および／または消化管バリア機能の低下に関連する疾患または状態の一以上の症状の発生のリスクを軽減するために十分でありうる。治療上有効な量、ならびに治療上有効な施与の頻度は、当該技術で知られ、および以下に議論される方法によって定めることができる。
【００６２】
本明細書で使用される「静菌性」または「細胞増殖抑制性」という用語は、本開示の組換え細菌細胞の増殖、分裂、増殖または複製を阻止、遅延または阻害することができる分子またはタンパク質を指す。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「殺菌性」は、本開示の組換え細菌細胞を死滅させることができる分子またはタンパク質をいう。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「毒素」は、そのタンパク質、酵素、またはそのポリペプチド断片、または組換え細菌細胞の増殖、分裂、増殖または複製を阻止、遅延または阻害することができる他の分子または本開示の組換え細菌細胞を死滅させることが可能なものである。用語「毒素」は、静菌性タンパク質および殺菌性タンパク質を含むことが意図される。用語「毒素」は、溶解タンパク質、バクテリオシン（例えば、マイクロシンおよびコリシン）、ジャイレース阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、転写阻害剤、翻訳阻害剤、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含むことを意図する。本明細書で使用する「抗毒素」または「抗毒素」という用語は、毒素の活性を阻害することができるタンパク質または酵素を指す。抗毒素という用語は、免疫モジュレーター、および毒素発現の阻害剤を含むが、これらに限定されないことを意図する。毒素および抗毒素の例は、当技術分野で公知であり、以下により詳細に記載される。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「ペイロード」は、バクテリアまたはウイルスなどの遺伝子操作された微生物によって産生される１つまたは複数の目的の分子を指す。いくつかの実施態様では、ペイロードは治療用ペイロードである。抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子、例えば、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、他のインターロイキン、および/またはトリプトファンおよび/またはその代謝産物の1つ以上を含む。いくつかの実施態様では、ペイロードは調節分子、例えばＦＮＲなどの転写調節因子である。いくつかの実施態様では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーのような調節エレメントを含む。いくつかの実施態様では、ペイロードは、ＦＮＲＳなどの誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施態様では、ペイロードは、キルスイッチなどのリプレッサー要素を含む。いくつかの実施態様では、ペイロードは抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、ペイロードは、遺伝子、複数の遺伝子、遺伝子カセット、またはオペロンによってコードされる。別の実施態様では、ペイロードは、生合成または生化学経路によって生成され、生合成経路または生化学経路は、場合により微生物に対して内在性であり得る。別の実施態様では、ペイロードは、生合成経路または生化学経路が微生物に対して内因性でない生合成経路または生化学経路によって生成される。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された微生物は、２つ以上のペイロードを含む。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「従来の治療」または「従来の療法」は、現在受け入れられている現行のケア標準と見なされる、および／または大部分の医療従事者が、ＢＣＡＡ。代替療法または補完療法とは異なり、広く用いられていない。
【００６７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」および「ポリペプチド」を含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）によって線状に連結されたアミノ酸モノマーからなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義およびこれらの用語のいずれかと互換的に使用することができる。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物を指すものとする。ポリペプチドは、天然の生物源に由来してもよく、組換え技術によって産生されてもよい。他の実施態様では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子改変細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、より多く、１，０００またはそれ以上、または２，０００またはそれ以上のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有するとは限らないが、定義された三次元構造を有していてもよい。定義された三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれたと呼ばれ、規定された三次元構造を有さず、多数の異なるコンフォメーションを採用することができるポリペプチドは折り畳まれていないと呼ばれる。用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、タンパク質またはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指してもよく、または非タンパク質配列に対応するアミノ酸配列、例えば、制御ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列を含む。
【００６８】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体または誘導体は、その天然の環境にないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは必要とされない。細菌細胞または哺乳動物細胞を含むがこれに限定されない宿主細胞中で発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的のために単離されたと考えられ、天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、技術。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドをコードする外来組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された組換えＤＮＡ技術、すなわち細胞、微生物または哺乳動物から産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をいう。ほとんどの細菌培養で発現されるタンパク質またはペプチドは、典型的にはグリカンを含まない。前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体または変異体、およびそれらの任意の組み合わせも、ポリペプチドとして含まれる。「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」という用語は、元のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ポリペプチドの少なくとも１つ以上の特性を保持する対応する元のポリペプチド。本発明のポリペプチドのフラグメントには、タンパク質分解フラグメントおよび欠失フラグメントが含まれる。断片はまた、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的に活性な断片を含む。変異体は天然に存在してもよいし、非天然に存在してもよい。天然に存在しない変異体は、当該分野で公知の突然変異誘発法を用いて生成され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００６９】
ポリペプチドには、融合タンパク質も含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「変異体」は、元のペプチドの配列または元のペプチドと十分に類似した配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的には、融合タンパク質は、周知のインビトロ組換え技術から生じる。融合タンパク質は、類似の構造機能（必ずしも同じ程度ではない）および／または同様の調節機能（必ずしも同じ程度ではない）および／または類似の生化学機能（必ずしも同じ程度ではない）および/または融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と免疫学的活性（しかし、必ずしも同じではない）を含むことが意図されている。２０標準アミノ酸である。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、それが同一であるかまたは保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸に類似している。保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤ．Ｃ．（１９７８）およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９）、７７９−７８５に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００７０】
抗体は、一般に、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、または対応する抗原に非共有的に、可逆的に、および特異的に結合することができる免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを指す。例示的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ジスルフィド結合を介して連結された１つの「軽」（約２５ｋＤ）鎖および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する２つの同一の対のポリペプチド鎖からなる。認識された免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子と同様に、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類されます。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を指す。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「抗体」は、１つまたは複数の特定の結合特異性を有する抗体およびその断片のすべての変形物を包含することを意味する。したがって、「抗体」または「抗体」という用語は、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらのフラグメントの多量体型（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ、ＶＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ、ダイアボディー、およびミニボディーが含まれる。抗体は、２つ以上の結合特異性、例えば二重特異性を有することができる。用語「抗体」はまた、いわゆる抗体模倣体を含むことを意味する。抗体模倣物は、抗原に特異的に結合することができるが、抗体関連構造を有さない単一のアミノ酸鎖分子であり得る小分子、例えば３〜３０ｋＤａをいう。抗体模倣物には、アフィボディ分子（プロテインＡのＺドメイン）、アフィリン（ガンマＢ結晶）、ユビキチン、アフィマー（シスタチン）、Ａｆｆｉｔｉｎｓ（Ｓａｃｏｌｄから得られるＳａｃ７ｄ、Ａｌｐｈａｂｏｄｙ（三重らせんコイル様々なプロテアーゼインヒビターのクニッツドメインペプチド）、Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（Ｋａｌｂｉｔｏｒ）、およびＭｏｎｏｂｏｄｉｅｓ（ＦｙｎのＦ３ドメイン）、ＥｐｈＡ。特定の態様では、用語「抗体」または「抗体」は、一本鎖抗体（単数）、単一ドメイン抗体（複数可）およびラクダ抗体（複数可）を意味する。癌およびさらなる抗癌抗体の治療における抗体の有用性は、例えばＳｃｏｔｔら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ（癌のための抗体治療）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２年４月第１２巻（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【００７２】
「一本鎖抗体」または「一本鎖抗体」は、典型的には、免疫グロブリンの重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、および必要に応じてジスルフィド結合などのリンカーまたは結合を含むペプチドを指す。一本鎖抗体は、従来の抗体に見られる一定のＦｃ領域を欠いている。いくつかの実施態様では、一本鎖抗体は天然に存在する一本鎖抗体、例えばラクダ抗体である。いくつかの実施態様では、一本鎖抗体は、合成、改変、または修飾された一本鎖抗体である。いくつかの実施態様では、一本鎖抗体は、リンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。いくつかの局面では、一本鎖抗体は、（任意の定常領域を有さない）免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を意味する「ｓｃＦｖ抗体」であってもよく、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているように、１０〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｆｖフラグメントは、抗体の結合部位を保持する最小のフラグメントであり、この結合部位は、いくつかの態様において、元の抗体の特異性を維持することができる。一本鎖抗体の製造技術は、米国特許第4,946,778号に記載されている。ｓｃＦｖのＶｈおよびＶＬ配列は、ＶＬのＣ末端に連結するＶＨのＮ末端またはＶＬのＮ末端に連結するＶＨのＣ末端を介して連結することができる。ＳｃＦｖフラグメントは、いずれかの末端で他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインに不明瞭に融合することができる独立したフォールディングエンティティである。様々な長さのリンカーを用いてＶｈおよびＶＬ配列を連結することができ、リンカーはグリシンリッチ（柔軟性を提供する）およびセリンまたはスレオニンリッチ（溶解度を増加させる）であり得る。短いリンカーは、２つのドメインの会合を妨げ、多量体（ダイアボディ、トライボディなど）をもたらすことがある。長いリンカーは、タンパク質分解または弱いドメイン結合を生じ得る（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１１に記載されている）。１５〜２０アミノ酸または１８〜２０アミノ酸の長さのリンカーが最も頻繁に使用される。他の柔軟なリンカーを含むリンカーのさらなる非限定的な例は、Ｃｈｅｎら、２０１３年（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７−１３６９、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ（融合タンパク質リンカー：性質、設計および機能性））に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。フレキシブルリンカーはまた、グリシンおよびセリンのような小型または極性アミノ酸が豊富であるが、溶解性を改善するためにリシンおよびグルタミン酸塩のような極性アミノ酸だけでなく、柔軟性を維持するためにトレオニンおよびアラニンのようなさらなるアミノ酸を含むことができる。例示的なリンカーには、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２８４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２８５）およびＥＧＫＳＳＧＳＧ���ＥＳＫＳＴ（配列番号２８６）、（Ｇｌｙ）８（配列番号２８７）、およびＧｌｙおよびＳｅｒリッチなフレキシブルリンカーＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号２８８）を含む。本明細書で使用される「一本鎖抗体」は、ラクダ抗体および他の重鎖抗体、ヒト抗体、マウスまたは他の種に由来するナノボディおよび単一ドメインＶＨまたはＶＬドメインを含む軽鎖抗体を含む単一ドメイン抗体も含む。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体には、ラクダ、ラマまたはアルパカ由来のラクダ足場を有するドメイン抗原結合単位が含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖がない機能性抗体を産生する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面は、古典的抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して３つのＣＤＲのみを含む。ラクダ科動物抗体は、従来の抗体と同等の結合親和性を達成することができる。ラクダ科の足場に基づく抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。軟骨魚はまた、ＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有する。あるいは、ヒトまたはマウスからのＩｇＧ由来の二量体可変ドメインを単量体に分割することができる。ナノボディは、軽鎖由来の一本鎖抗体である。「一本鎖抗体」という用語はまた、抗体模倣体を指す。
【００７３】
いくつかの実施態様では、操作された微生物によって発現される抗体は二重特異性である。特定の実施態様では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープおよびｓｃＦｖまたはそのフラグメントに対する結合特異性を有するｓｃＦｖまたはその断片を含み、第2のエピトープに対する結合特異性を有する。抗原結合断片または抗体部分は、抗体分子が2つの異なるエピトープ、単一結合ドメイン（ｄＡｂ）およびミニボディを認識する二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、二重特異性ｓｃＦｖ抗体を含む。単量体一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、細菌および哺乳動物細胞内で容易に組み立てられ、生理学的条件下で改善された安定性を示す（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２００１およびその参考文献；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（２００１）１４（１０）：８１５−８２３（単量体および二量体の二重特異性一本鎖ダイアボディの発現のための最適化されたリンカー配列について記載）。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「十分に類似している」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列と比較して、第２のアミノ酸配列と比較して十分または最小限の数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。共通の構造ドメインおよび/または共通の機能的活性を有する。例えば、アミノ酸配列の少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７０％少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の同一性が十分に類似していると定義される。好ましくは、変異体は、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているであろう。そのような変異体は、一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。変異体は、１つ以上のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を介して、天然のペプチドおよびｗｔペプチドとアミノ酸配列がそれぞれ異なるペプチドを含む。これらは天然に存在する変異体および人工的に設計された変異体であってもよい。
【００７５】
本明細書で使用される「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を連結または連結する合成または非天然または非天然のアミノ酸配列を指す。２つのポリペプチドドメインを連結している。本明細書中で使用される場合、用語「合成」は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。代表的なリンカーが本明細書に記載される。さらなる例示的なリンカーが、米国特許第２０１４００７９７０１号に提供されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「コドン最適化」は、核酸分子によってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するために、。このような最適化には、宿主生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンと少なくとも１つまたは１つ以上のコドンまたは有意な数のコドンを置換することが含まれる。「コドン最適化配列」とは、既存のコード配列から改変された、またはコード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞または生物における翻訳を改善するように設計された配列を意味する。コード配列の転写を改善する。コドンの最適化には、発現宿主生物のコドン選好に適合するように、コード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれるが、これに限定されない。多くの生物は、成長中のポリペプチド鎖中の特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用のためのバイアスまたは選好を示す。コドン優先度またはコドンバイアス、生物間のコドン使用の差異は、遺伝暗号の縮重によって許容され、多くの生物の間で十分に実証されている。コドンバイアスは、しばしば、とりわけ翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する。細胞における選択されたｔＲＮＡの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物において最適な遺伝子発現のために調整することができる。
【００７７】
本明細書で使用する「分泌系」または「分泌タンパク質」という用語は、微生物、例えばバクテリアの細胞質からポリペプチドなどの生体分子を分泌または輸出することができる天然または非天然の分泌機構を指す。分泌系は、単一のタンパク質を含むことができ、または複合体、例えばＨｌｙＢＤ中に組み立てられた２つ以上のタンパク質を含むことができる。グラム陰性細菌の分泌系の非限定的な例としては、改変ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌系、（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌システムを含む。グラム陽性細菌の分泌系の非限定的な例には、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系が含まれる。いくつかの実施態様では、分泌されるポリペプチドには、ポリペプチドを特異的分泌系に向けるＲＮＡまたはペプチド起源の「分泌タグ」が含まれる。いくつかの実施態様において、分泌システムは、操作された細菌からポリペチドを分泌する前に、このタグを除去することができる。例えば、タイプＶの自己分泌媒介性分泌において、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然のＳｅｃ系によって細胞質からペリプラズム区画への「パッセンジャー」ペプチドの転位の際に除去される。さらに、自己分泌因子が外膜を横切って移動すると、Ｃ末端分泌タグは自己触媒またはプロテアーゼによって触媒されるＯｍｐＴ切断のいずれかによって除去され、それによって抗炎症またはバリアエンハンサー分子が細胞外環境に放出される。いくつかの実施態様では、分泌系は、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣを含む硬質ペプチドグリカン骨格に外膜をつなぎとめる役割を果たす遺伝子を欠失または突然変異させることによって達成され得る「漏出性」または非安定化外膜の生成を含む、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、およびｎｌｐｌ。Ｌｐｐは、ペプチドグリカンに対する細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出表現型を生成する他の欠失標的である。さらに、漏出表現型は、ペリプラズムプロテアーゼ、例えばｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩが不活性化された場合に観察されている。したがって、いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される、１つ以上の欠失または変異膜遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つ以上の欠失または変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つ以上の欠失または変異遺伝子を有する。
【００７８】
ここに使用されるように、冠詞「ａ（ある一つの）」および「ａｎ（母音の前の不定冠詞）」は、反対のことが明確に示されていない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解すべきである。
【００７９】
語句「および／または」は、リスト内の要素間で使用されるとき、次のいずれかを意味することを意図し、（１）単一のリストされた要素だけが存在すること、または（２）リストの一よりも多くの要素が存在することである。たとえば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、その選定は、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣでありうることを示す。語句「および/または」は、リストの要素の「少なくとも一つ」または「一またはそれよりも多く（一以上とも言う）」と交換可能に使用されてもよい。
【００８０】
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値の略語であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０であることができる。
細菌
【００８１】
本発明の遺伝子操作された微生物またはプログラムされた微生物、例えば本開示の遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の非天然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、偏性嫌気性細菌である。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は通性嫌気性細菌である。特定の実施態様では、遺伝子改変細菌は好気性細菌である。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性細菌であり、ＬＰＳを欠く。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性細菌および偏性嫌気性細菌である。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、グラム陽性および通性嫌気性細菌である。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は非病原性細菌である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は共生細菌である。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はプロバイオティク細菌である。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は病原性を低減または排除するために修飾または変異された自然な病原性細菌である。例示的な細菌には、バチルス、バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、カビロバクター、クロストリジウム、腸球菌、ラクトコッカス、ラクトコッカス、リステリア、マイコバクテリウム、サッカロミセス、サルモネラ、ブドウ球菌、ストレプトコッカス、ビブリオ、バチルス・コアグランス、バチルス・ズブチリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ズブチリス、バクテロイデス・シータイオタオーミクロン、ビフィドバクテリウム・ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウムブレーベＵＣＣ２００３、ビフィドバクテリウムインファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、クロストリジウム・アセトブチリカム、酪酸菌、クロストリジウム・ブチリカムＭ−５５、クロストリジウムｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、クロストリジウムｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、クロストリジウムヒストリチカム、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｐｅｒｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｒｔａｔａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａからなる群から選択される。ある種の実施態様において、遺伝子操作された細��は、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョーンソイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトコッカス・ラクティスおよびサッカロミセス・ブルジュルディ、（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍの種を含む）クラスＩＶおよびＸＩＶａ、ローズバリア、糞便バクテリウム、エンテロバクター、フォスファリバクテリウム・プラウスニッツイ、クロストリジウム・ディフィシレ、サブドロガラス、クロストリジウム・スポロゲネス、カンピロバクタージェジュニ、クロストリジウム・サッカロリチクム、クレブシエラ、シトロバクター、プソイドビトリビブリオおよびルミノコッカスのクラスターＩＶおよびＸＩＶａ。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・シータイロトロン、バクテロイデス・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ラクチス、クロストリジウム・ブチリカム、エシェリヒア・コリ、エシェリヒア・コリ・ニシェル、ラクトバシルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリラクトコッカス・ラクティス
【００８２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、自然に高レベルのブチラートを生成することができるグラム陽性菌、例は、クロストリジウム属である。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ブチリカム）ＺＪＵＣＢ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  Ｓ２１、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（サーモブチリカム）ＡＴＣＣ  ４９８７５、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（ベイジェリンキイ）、Ｃ．ｐｏｐｕｌｅｔｉ（ポプレティ）ＡＴＣＣ  ３５２９５、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（チロブチリカム）ＪＭ１、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＣＩＰ  １−７７６、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５７５５、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＣＮＲＺ  ５９６、およびＣ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＺＩＵ  ８２３５からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＣＢＭ５８８、タンパク質分泌に非常に敏感なプロバイオティク細菌であり、およびＩＢＤの処置において立証された有効性を有する（Ｋａｎａｉ（カナイ）ら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子的に非常に扱いやすく、および工業的タンパク質生産のための一般的なシャーシ（胴体とも言う）であったＳａｃｉｌｌｕｓ（バチルス属）、プロバイティク細菌である。いくらかの実施態様では、細菌は高度に活性な分泌および/または毒性副生成物を有さない（Ｃｕｔｔｉｎｇ（カッティング）、２０１１）。
【００８３】
一実施態様では、細菌細胞はバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はバクテロイデス・シータイオタオーミクロン細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はバクテロイデス・サブチリス細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はビフィドバクテリウム・ビフィダム細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はビフィドバクテリウム・インファンティス細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はビフィドバクテリウム・ラクティス細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はクロストリジウム・ブチリカム細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞は、乳酸菌菌体である。１つの実施態様において、細菌細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞は、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）細菌細胞である。一実施態様では、細菌細胞はラクトコッカス・ラクチス細菌細胞である。
【００８４】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、最も特徴付けられたプロバイオティクの一つに進化したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）、腸内細菌科ファミリーのグラム陰性菌である（Ｕｋｅｎａ（ウケナ）ら、２００７）。その菌株は完全無害で特徴付けられ（Ｓｃｈｕｌｔｚ（シュルツ）、２００８）、およびＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ、一般に安全と認められている）状態を有する（Ｒｅｉｓｔｅｒ（レイスター）ら、２０１４、強調が加えられる）。ゲノムシーケンシングにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは顕著なビルレンス（病原性とも言う）因子（例は、Ｅ．ｃｏｌｉα−溶血素、Ｐ−線毛アドヘシン（付着因子とも言う））を欠くことが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは病原性接着因子を保有せず、エンテロトキシン（腸毒素とも言う）または細胞毒を生成せず、侵襲性でなく、および泌尿器病原性でもないことが示されている。（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９）。１９１７年の早くにも、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは、治療用途のために、薬用カプセルにパッケージングされ、Ｍｕｔａｆｌｏｒ（ムータフロル）と呼ばれた。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅは、以来、インビボでヒトの潰瘍性大腸炎を処置するために（Ｒｅｍｂａｃｋｅｎ（レムバッケン）ら、１９９９）、インビボでヒトの炎症性腸疾患、クローン病、および嚢炎（回腸嚢炎とも言う）を処置するために（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８）、腸管組織侵入性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（レジオネラ属）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア属）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ（シゲラ属）をインビボで抑制するために使用された（Ａｌｔｅｎｈｏｅｆｅｒ（アルテンホーファー）ら、２００４）。Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅの治療上の効果および安全性が納得がいくように証明されていることは一般に認められている（Ｕｋｅｎａら、２００７）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅであり、自然にタイトジャンクション（密着結合とも言う）および消化管バリア機能を促進することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＥ．ｃｏｌｉであり、および組換えタンパク質技術に非常に適している。
【００８５】
当業者は、ここに開示される遺伝学的修飾が細菌の他の種、菌株、およびサブタイプに適合しうることを理解するであろう。たとえば、クロストリジウムのブチロジーニック経路遺伝子が、ゲノム配列のクロストリジウムおよび関連する種に広く存在することは知られている（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３）。さらに、一以上の異なる種の細菌由来の遺伝子を互いに導入することができ、例は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロストリジウム・ディフィシル）由来のブチロジーニック遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現された（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３）。
【００８６】
一実施態様では、組換え細菌細胞は、障害を有する対象に定着しない。非修飾Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝学的に操作された細菌は、例は、消化管または血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９）、またはキルスイッチの活性化によって、施与後数時間または数日で破壊されうる。そのようにして、遺伝学的に操作された細菌は、継続的な施与を必要とすることがある。インビボでの滞留時間は、遺伝学的に操作された細菌について算出されうる。いくらかの実施態様において、滞留時間はヒト対象について算出される。いくつかの実施態様において、インビボでの滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌、例えば、本明細書に記載の通りである。
【００８７】
いくつかの実施態様において、細菌細胞は、遺伝子操作された細菌細胞である。別の実施態様では、細菌細胞は組換え細菌細胞である。いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に開示される細菌細胞のコロニーを含む。
【００８８】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示された細菌細胞を含む組換え細菌培養物を提供する。
【００８９】
いくつかの実施態様では、抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子を含む遺伝子操作された細菌は、本明細書に提供されるキルスイッチ回路のいずれかなどのキルスイッチ回路をさらに含む。例えば、いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下にある１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子および逆毒素配列をさらに含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌はさらに、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、誘導プロモーターおよび１つまたは複数の逆方向切除遺伝子の制御下にある１つまたは複数のリコンビナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含み、切除遺伝子は、遺伝子。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌はさらに、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ＴｅｔＲリプレッサー結合部位を有するプロモーターおよびアラビノースによって誘導される誘導性プロモーターの制御下にあるＴｅｔＲをコードする遺伝子の制御下にある毒素をコードする１つ以上の遺伝子、例えばＰａｒａＢＡＤ。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌はさらに、抗毒素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。
【００９０】
いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子配列を含む栄養要求体であり、本明細書に記載のキルスイッチ回路のいずれかなどのキルスイッチ回路をさらに含む。
【００９１】
上記の遺伝子操作された細菌のいくつかの実施態様において、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子は、細菌のプラスミド上に存在する。いくつかの実施態様では、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子配列は、細菌染色体に存在する。いくつかの実施態様では、生体分子を分泌するための、分泌タンパク質またはタンパク質複合体（例えば、本明細書に開示される分泌系のいずれか）をコードする遺伝子配列（例えば、抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子）が、。いくつかの実施態様において、生体分子を分泌するための分泌タンパク質またはタンパク質複合体をコードする遺伝子配列（例えば、本明細書に開示される分泌系のいずれか）は、細菌染色体に存在する。いくつかの実施態様では、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列は、細菌のプラスミド上に存在する。いくつかの実施態様において、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子配列は、細菌染色体中に存在する。
抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子
【００９２】
遺伝学的に操作された細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための一以上の遺伝子配列（群）および／または遺伝子カセット（群）を含む。いくらかの実施態様では、遺伝子的に操作された細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するために一以上の遺伝子配列（群）を含む。たとえば、遺伝子的に操作された細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための二以上の遺伝子配列（群）を含みうる。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は、同じ遺伝子の複数のコピーである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は異なる遺伝子をコードする配列である。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子配列は一以上の異なる遺伝子の複数のコピーをコードする配列である。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、非自然抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための一以上の遺伝子カセット（群）を含む。たとえば、遺伝学的操作細菌は、非自然抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を生成するための二以上の遺伝子カセットを含むことができる。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは同じ遺伝子カセットの複数のコピーである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは同じか、または異なる抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）のいずれかをも生成するための異なる遺伝子カセットである。いくらかの実施態様では、二以上の遺伝子カセットは、一以上の異なる抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）の複数のコピーを生成するための遺伝子カセットである。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオナート、アセタート、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０（ヒトまたはウイルス性）、  ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥｓ）、エラフィン（ペプチダーゼインヒビター３またはＳＫＡＬＰとしても知られる）、トレフォイル因子、メラトニン、ＰＧＤ２、キヌレン酸、キヌレニン、チプトポン代謝物、インドール、インドール代謝産物、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬを中和する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２、ＡＨＲアゴニスト（例えば、インドール酢酸、インドール−３−アルデヒドおよびインドール）、ＰＸＲアゴニスト（例えば、ＩＰＡ）などのケモカイン、ＧＰＲ１０９Ａアクチベーター（例えば、酪酸）、ＮＦ−κＢシグナル伝達（例えば、酪酸）の阻害剤、モジュレーター（例えば、酪酸）、ＧＰＲ４１および／またはＧＰＲ４３アクチベーター（例えば、ブチラートおよび／またはプロピオナートおよび／またはアセタート）ＰＰＡＲガンマの（例えば、しかしＧＬＰ−１分泌のモジュレーター、およびヒドロキシルラジカルスカベンジャーおよび酸化防止剤（例えば、ＩＰＡ）を含むが、これらに限定されるものではな���。分子は、主として抗炎症剤、例は、ＩＬ−１０、または主として消化管バリア機能増強剤、例は、ＧＬＰ−２でありうる。あるいは、分子は、抗炎症性および消化管バリア機能を増強することができる。
【００９３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、単一の遺伝子によってコードされる一以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を発現し、例は、分子がエラフィンであり、およびＰＩ３遺伝子であるか、または分子はインターロイキン−１０であり、ＩＬ１０遺伝子によってコードされる。代わりの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、複数の遺伝子を必要とする生合成経路によって合成される、一以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）、例は、ブチラートをコードする。
【００９４】
１つ以上の遺伝子配列および／または遺伝子カセットは、高コピープラスミド、低コピープラスミド、または染色体上に発現され得る。いくつかの実施態様において、プラスミドからの発現は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子の発現を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施態様では、染色体からの発現は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子の発現の安定性を高めるために有用であり得る。いくつかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（単数または複数）を産生するための遺伝子配列または遺伝子カセットは、遺伝子操作された細菌の１つまたは複数の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれる。例えば、酪酸生合成遺伝子カセットの１つまたは複数のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。いくつかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子配列または遺伝子カセットは、遺伝子操作された細菌中のプラスミドから発現される。いくつかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子配列または遺伝子カセットは、Ｅ中の以下の挿入部位の１つまたは複数で細菌ゲノムに挿入される大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ：ｍａｌＥ／Ｋ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ。任意の適切な挿入部位を使用することができる（例は、模範的挿入部位について図５１を参照）。挿入部位は、例は、生存および／または生存に必要な遺伝子、たとえば、ｔｈｙＡのようなものにおいて（栄養要求体を作り出すために）；ゲノムの活性領域、たとえば、ゲノム複製の部位の近くなどにおいて；および／または意図しない転写のリスクを低減するために、ダイバージェント（分岐や発散などとも言う）プロモーターの間、たとえば、アラビノースオペロンのＡｒａＢおよびＡｒａＣの間などのようなものにおいて、ゲノム中のどこにあってもよい。
短鎖脂肪酸およびトリプトファン代謝産物
【００９５】
炎症性腸疾患の治療、予防および／または管理における１つの戦略は、消化管バリア機能の維持および／または再確立を助けるためのアプローチを含み得る。増大した透過性の根底にある炎症事象の予防、治療および／または管理を通じて、例えば、抗炎症性エフェクターの投与を介して。
【００９６】
例えば、腸管保護的役割を果たす主要な代謝産物は、短鎖脂肪酸である。アセタート、ブチラートおよびプロピオナート、ならびにトリプトファン代謝に由来するものが挙げられる。これらの代謝産物は、炎症性疾患の予防において主要な役割を果たすことが示されている。したがって、腸障壁の健康の治療、予防、および／または管理における１つのアプローチは、そのような代謝産物の１つ以上を含む治療を提供することであり得る。
【００９７】
例えば、酪酸塩および他のＳＣＦＡ、例えば微生物叢に由来するものは、腸の完全性の維持を促進することが知られている（例えば、Ｔｈｏｒｂｕｒｎら、Ｄｉｅｔ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  “Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ”  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第４０巻、第６号、２０１４年６月１９日、ページ８３３−８４２）。（Ａ）おそらく代謝産物感知ＧＰＣＲを介したシグナル伝達を介して、消化管上皮細胞によるＳＣＦＡ誘発性の粘液の促進；（Ｂ）Ｂ細胞によるＩｇＡのＳＣＦＡ誘発分泌；（Ｃ）組織修復および創傷治癒のＳＣＦＡ誘発促進；（Ｄ）免疫学的寛容をおそらく容易にするプロセスにおいて、腸におけるＴｒｅｇ細胞発生のＳＣＦＡ誘発促進；（Ｅ）インフラマーム活性化（例えば、ＮＡＬＰ３を介した）およびＩＬ−１８産生に依存するプロセスにおけるＳＣＦＡ媒介性の上皮完全性の増強；（Ｆ）抗炎症効果、炎症性サイトカイン産生（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−６、およびＩＦＮ−ガンマ）の阻害、およびＮＦ−κＢの阻害。腸内ホメオスタシスにおけるＳＣＦＡのこれらの作用の多くは、結腸上皮、炎症性白血球（例えば、好中球およびマルコファージ）およびＴｒｅｇ細胞によって発現されるＧＰＲ４３およびＧＰＲ１０９Ａに帰することができる。これらの受容体は、ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲならびにＮＦκＢ阻害をもたらす別個のアレスチン経路に結合したＧタンパク質を介してシグナル伝達する。他の効果は、ＳＣＦＡ媒介性のＨＤＡＣ阻害に起因する可能性がある。酪酸はマクロファージ機能を調節し、ＴＲｅｇ細胞を促進する。
【００９８】
さらに、キヌレニンおよびキヌレン酸を含む多くのトリプトファン代謝物ならびにインドール−３アルデヒド、インドール−３−プロピオン酸およびいくつかの他のインドール代謝産物（ミクロバイオタータまたは  ダイエット）は、腸ホメオスタシスに必須であり、腸壁の健康を促進することが示されている。これらの代謝産物はアリール炭化水素受容体（Ａｈｒ）に結合する。アゴニスト結合後、ＡｈＲは核に移動し、ＡｈＲ核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）とのヘテロ二量体を形成する。ＡｈＲ依存性遺伝子発現には、腸特異的ホメオスタシスにとって重要なメディエーターの産生に関与する遺伝子が含まれる；  これらのメディエータには、ＩＬ−２２、抗菌剤、Ｔｈ１７細胞活性の増加、および上皮内リンパ球およびＲＯＲγｔ＋先天性リンパ系細胞の維持が含まれる。
【００９９】
トリプトファンはまた、アンギオテンシンＩ変換酵素２（Ａｃｅ２）を含む輸送機構によって上皮を横切って輸送され得る。トリプトファンは、Ｔ細胞応答の抑制、Ｔｒｅｇ細胞の促進、および免疫寛容に関連する免疫調節酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によってキヌレニン（別のＡｈＲアゴニスト）に分解される。さらに、キヌレン酸およびナイアシンを含むいくつかのトリプトファン代謝産物は、ＧＰＲ３５およびＧＰＲ１０９Ａなどの代謝産物感知ＧＰＣＲに作用し、したがってトリプトファン異化の複数の要素が腸ホメオスタシスを促進する。
【０１００】
さらに、インドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）などのいくつかのインドール代謝産物は、腸の必須レギュレーターとしての重要な役割を果たすと考えられているプレグネンＸ受容体（ＰＸＲ）のリガンドの作用を発揮し得る（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら、２０１４Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ細菌代謝物は、生体異物センサーＰＸＲおよびＴｏｌｌ様受容体４を介した胃腸障壁機能を調節する；  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１、２９６−３１０、２０１４年８月２１日）。結果として、インドールレベルは、恒常性および腸障壁の健康を促進するために、ＰＸＲの活性化を介してＴＬＲ４発現のレベルを調節および平衡させることができる。
【０１０１】
したがって、いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子操作された細菌は、１つ以上の短鎖脂肪酸および／または１つ以上のトリプファン代謝産物を産生する。
ブチラート
【０１０２】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ブチロジーニック遺伝子カセットを含み、特定の外因性環境条件下でブチラートを産生することができる。遺伝子操作された細菌は、任意の適切な組のブチロジーニック遺伝子を含み得る（例えば、表２および表３参照）。ブチラート生合成遺伝子を含む非改変細菌は公知であり、ペプトクロスジウム、クロストリジウム、フソバクテリウム、ブチリビブリオ、ユーバクテリウム、およびトレポネマが含まれるが、これらに限定されない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のブチラート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ペプトクロスジウム・ディフィシル）、例は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０由来の８つの酪酸生合成経路遺伝子：ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ（Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３）を含み、およびブチラートを生産することができる。Ｐｈｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０および株１２９６は、いずれもブチラートを産生することができるが、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋについて異なる核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、および／または亜株由来のブチロジーニック遺伝子の組合せを含み、およびブチラートを産生することができる。たとえば、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、およびｔｈｉＡ１、およびＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１２９６由来のｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋを含む。あるいは、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａトランス−２−エノニル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３遺伝子の３つ全てを機能的に置換することができる。したがって、ブチロージニック遺伝子カセットは、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のｔｅｒを含み得る。酪酸遺伝子カセットの別の例では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子はｔｅｓＢ（例えば、大腸菌由来）で置換される。したがって、ブチロジーニック遺伝子カセットは、ｔｅｒ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２およびｔｅｓＢを含むことができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、特定の分子の存在下で、低酸素条件下で酪酸生合成カセットを発現し、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下で、またはアラビノースのような腸内に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物の存在下で行うことができる。ブチラート生合成遺伝子の１つまたは複数は、機能的に置換または改変された、例えば、コドン最適化された。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、ブチラート生成のレベルをさらに増加させるために、追加の遺伝子を変異させるかまたはノックアウトすることができる。嫌気性条件下での生産は、内因性ＮＡＤＨプールに依存する。したがって、ＮＡＤＨ利用のための競合する経路を排除することにより、ブチラート経路を通る流束を高めることができる。そのような競合経路の非限定的な例は、ｆｒｄＡ（ホスホエノールピルビン酸をコハク酸に変換する）、ｌｄｈＡ（ピルビン酸を乳酸に変換する）およびａｄｈＥ（アセチル−ＣｏＡをエタノールに変換する）である。したがって、特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｆｒｄＡ、ｌｄｈＡ、およびａｄｈＥの１つ以上の変異および／または欠失をさらに含む。
【０１０４】
表２は、例示的なブチラート生合成遺伝子カセットにおける例示的遺伝子の核酸配列を示す。
[表２−１]
[表２−２]
[表２−３]
[表２−４]
[表２−５]
【０１０５】
遺伝子操作された細菌によるブチラートの産生のための例示的なポリペプチド配列を表３に示す。
[表３−１]
[表３−２]
[表３−３]
【０１０６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにおいてｂｃｄ２、ｅｔｆＡ３、およびｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、それらは酸素依存性共酸化剤として機能し得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、微好気性または酸素制限環境、例は、哺乳類の消化管においてブチラートを産生するように設計され、酸素依存性は消化管においてブチラート生成に悪影響を及ぼし得る。Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａの単一遺伝子（ｔｅｒ、トランス−２−エノイル（ｅｎｏｙｎｌ）−ＣｏＡレダクターゼをコードする）は酸素非依存マナーでこの３遺伝子複合体を機能的に置き換えることができることが示された。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、ｔｅｒ遺伝子、例は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のものを含み、それはｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３遺伝子の三つすべて、例は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のものを機能的に置換することができる。この実施態様では、遺伝子改変細菌は、例えばＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のｔｅｒを含み、特定の分子の存在下で低酸素条件下で酪酸を産生する炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下で、または腸内に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物、例えばアラビノースの存在下で投与することができる。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子改変細菌は、例えばＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含む。例えばＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のもの；例えばＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、およびｅｔｆＡ３の１つ以上；炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下で、または特定の分子または代謝産物の存在下で、低酸素状態で、牛乳中に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物の存在下で腸、例えばアラビノース。いくつかの実施態様では、酪酸塩生合成遺伝子の１つまたは複数は、特定の分子または代謝産物の存在下、低酸素条件下での安定性を高め、および／または酪酸生成を増加させるために機能的に置換、修飾、および／炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在、またはアラビノースのような腸内に存在していても存在しなくてもよい他の代謝産物の存在下で起こる。
【０１０８】
ｐｂｔおよびｂｕｋの遺伝子産物は、ブチリルＣｏＡをブチラートに変換する。いくつかの実施態様では、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子をｔｅｓＢ遺伝子に置き換えることができる。テトＢを使用して、ブチリル−ｃｏＡからＣｏＡを切断することができる。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えばＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄおよびｃｒｔ２を含み、大腸菌由来のｔｅｓＢは、低酸素条件下で、分子または代謝産物の存在下で、炎症反応または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下で、または腸内に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物、例えばアラビノースの存在下で投与され得る。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えばＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋ由来の、例えばＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｔｅｒｇｅｎｅ（トランス−２−エノニル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）およびＥ．ｃｏｌｉ由来のｔｅｓＢ炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下で、または存在しても存在しなくてもよいいくつかの他の代謝産物の存在下で、特定の分子または代謝産物の存在下で低酸素状態で酪酸を生成するアラビノースのような腸。いくつかの実施態様では、低酸素条件下または特定の分子もしくは代謝産物または分子の存在下で、酪酸塩生合成遺伝子の１つまたは複数が機能的に置換、修飾および／または変異されて安定性を増強し、および／または炎症または炎症応答のような状態に関連する代謝産物、またはアラビノースのような消化管に存在してもいなくてもよい他の代謝産物の存在下で投与することができる。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、酪酸塩の局所産生は、消化管における制御性Ｔ細胞の分化を誘導し、および／または結腸上皮細胞のバリア機能を促進する。  いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性ブチラート生合成の遺伝子および／または嫌気性または微好気性ブチラート生合成の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、局所酪酸塩生成は、腸炎症、ＩＢＤおよび他の腸関連障害の症状を軽減する。
【０１１０】
一実施態様では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約８５％の同一性を有する。ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施態様では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約９０％  、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｂｃｄ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６  配列番号１と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％  別の実施態様では、ｂｃｄ２遺伝子は配列番号１の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｂｃｄ２遺伝子は配列番号１の配列からなる。
【０１１１】
一実施態様では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２と少なくとも約８５％の同一性を有する。ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２と少なくとも約９０％  、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｅｔｆＢ３遺伝子は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６  配列番号２と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％  別の実施態様において、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｅｔｆＢ３遺伝子は、配列番号２の配列からなる。
【０１１２】
一実施態様では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｅｔｆＡ３遺伝子は、配列番号３の配列からなる。
【０１１３】
一実施態様では、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号4と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｈｉＡ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｔｈｉＡ１遺伝子は配列番号４の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｔｈｉＡ１遺伝子は配列番号４の配列からなる。
【０１１４】
一実施態様では、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５と少なくとも約８５％の同一性を有する。ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５と少なくとも約９０％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｈｂｄ遺伝子は、配列番号５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％配列番号５と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様では、ｈｂｄ遺伝子は配列番号５の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｈｂｄ遺伝子は配列番号５の配列からなる。
【０１１５】
一実施態様では、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６と少なくとも約８０％の動一性を有する。別の実施態様において、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６と少なくとも約９０％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。従って、一実施態様において、ｃｒｔ２遺伝子は、配列番号６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％配列番号６と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様では、ｃｒｔ２遺伝子は配列番号６の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｃｒｔ２遺伝子は配列番号６の配列からなる。
【０１１６】
一実施態様では、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７と少なくとも約９０％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％  配列番号７と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様において、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｐｂｔ遺伝子は、配列番号７の配列からなる。
【０１１７】
一実施態様では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８と少なくとも約９０％  、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｂｕｋ遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６配列番号８と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様では、ｂｕｋ遺伝子は配列番号８の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｂｕｋ遺伝子は配列番号８の配列からなる。
【０１１８】
一実施態様では、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９と少なくとも約９０％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｅｒ遺伝子は、配列番号９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％配列番号９と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様において、ｔｅｒ遺伝子は配列番号９の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｅｒ遺伝子は配列番号９の配列からなる。
【０１１９】
一実施態様では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９０％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％  配列番号１０と少なくとも９５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０の配列からなる。
【０１２０】
一実施態様では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１から配列番号２０の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。ブチラート回路によりコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ブチラート回路によってコードされ、遺伝学的に操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、遺伝的に改変された細菌によって、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ブチラート回路によってコードされ、少なくとも１つの実施態様では、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。酪酸回路は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％配列番号１１〜配列番号２０のうちの１つ以上と少なくとも９５％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。酪酸回路によってコードされ、酪酸回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号２０の１つ以上の配列を含む。別の実施態様では、ブチラート回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号１１の１つまたは複数の塩基配列配列番号２０。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、ブチラート生合成遺伝子の１つまたは複数は合成ブチラート生合成遺伝子である。いくつかの実施態様において、ブチラート生合成遺伝子の１つまたは複数は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａのブチラート生合成遺伝子である。いくつかの実施態様では、ブチラート生合成遺伝子の１つまたは複数は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのブチラート生合成遺伝子である。いくつかの実施態様では、ブチラート生合成遺伝子の１つまたは複数は、ペプトクロストリジウム・ディフィシレのブチラート生合成遺伝子である。ブチラート遺伝子カセットは、ブチラートの好気性生合成のための遺伝子および／またはブチラートの嫌気性または微好気性の生合成のための遺伝子を含み得る。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株および／または副系からのブチラート生合成遺伝子の組み合わせを含み、ブチラートを産生することができる。いくつかの実施態様では、ブチラート生合成遺伝子の１つまたは複数は、安定性を増強し、および／またはブチラート産生を増加させるために、機能的に置換、修飾、および／または突然変異される。いくつかの実施態様において、ブチラートの局所的な産生は、食物摂取を減少させ、寛解は、消化管バリア機能を改善し、炎症を軽減する。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、特定の分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下、またはアラビノースのような腸内に存在していても存在していなくてもよい他の代謝産物の存在下でブチラート生合成カセットを発現し、ブチラートを産生することができる。
【０１２３】
一実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、第１プロモーターに直接作動可能ニ連結される。別の実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、間接的に作動可能に第１プロモーターに連結される。一実施態様では、プロモーターは、実際にブチラート遺伝子カセットと機能的に連結されていない。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施態様において、ブチラート遺伝子カセットは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。  一実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、低酸素または嫌気性条件によって直接または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、ブチラート遺伝子カセットの発現は、哺乳類の消化管の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。誘導可能なプロモーターは、以下により詳細に記載される。
【０１２５】
ブチラート遺伝子カセットは、細菌細胞中のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、細菌細胞中のプラスミド上に位置する。別の実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、細菌細胞の染色体に位置する。さらに別の実施態様では、ブチラート遺伝子カセットの天然のコピーが細菌細胞の染色体に位置し、異なる種の細菌由来のブチラート遺伝子カセットが細菌細胞中のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、ブチラート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来のブチラート遺伝子カセットが細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、ブチラート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体に位置し、異なる種の細菌由来のブチラート遺伝子カセットが細菌細胞の染色体に位置する。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは低コピープラスミド上に発現される。いくつかの実施態様において、ブチラート遺伝子カセットは、高コピープラスミド上に発現される。いくつかの実施態様において、高コピープラスミドは、ブチラート発現を増加させるために有用であり得る。
プロピオナート
【０１２７】
代替の実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、複数の遺伝子および/または酵素を必要とする生合成経路によって合成される抗炎症または消化管バリアエンハンサー分子、例えばプロピオナートを産生することができる。
【０１２８】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、プロピオナート遺伝子カセットを含み、特定の外因性環境条件下でプロピオナートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切なセットのプロピオナート生合成遺伝子を発現することができる（例は、表４、表５、表６、表７参照）。内在性プロピオナート生合成経路を介してプロピオナートを生成することができる未修飾細菌には、制限されないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａが含まれる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来の遺伝子ｐｃｔ、ｌｃｄ、およびａｃｒを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、例は、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣを含む。いくつかの実施態様では、Ａｃｒ酵素によって触媒される律速段階は、プロピオニル−ＣｏＡを生成するためのＮＡＤＰＨ依存性アクリロイル−ＣｏＡ還元を触媒するＲ．スフェロイデス由来のＡｃｕＩによって置換される。したがって、プロピオナートカセットは、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、およびａｃｕＩを含む。別の実施態様では、大腸菌におけるＡｃｕＩのホモログ、ｙｈｄＨが使用される。代わりの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのピルバート経路遺伝子、例は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含み、および随意にｔｅｓＢをさらに含む。別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、例えば、大腸菌（ｓｂｍ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ）由来のスリーピングビューティームターゼ（Ｓｌｅｅｐｔｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  Ｍｕｔａｓｅ）オペロンの遺伝子を含む。ＳＢＭ経路は循環的であり、スクシニル−ＣｏＡの出発分子を再生しながら、発酵産物としてプロピオナートを形成する一連の生化学的変換からなる。ＳｂｍはスクシニルＣｏＡをＬ−メチルマロニルＣｏＡに変換し、ｙｇｆＧはＬ−メチルマロニルＣｏＡをプロピオニルＣｏＡに変換し、ｙｇｆＨはプロピオニルＣｏＡをプロピオナートに変換し、スクシネートをスクシニルＣｏＡに変換する。
【０１２９】
この経路は、コハク酸をプロピオン酸に変換するプロピオン酸菌の酸化的プロピオン酸経路に非常に類似している。スクシニル−ＣｏＡは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｍｕｔＡＢ）によってＲ−メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。これは、次に、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＧＩ：１８０４２１３４）を介してＳ−メチルマロニル−ＣｏＡに変換される。メチルマロニル−ＣｏＡをプロピオニル−ＣｏＡに変換するメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシトランスフェラーゼ（ｍｍｄＡ、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８７０、ｂｃｃｐ）をコードする３つの遺伝子が存在する。
【０１３０】
遺伝子は、コドン最適化されていてもよく、翻訳および転写要素が加えられてもよい。  表４−６は、プロピオナート生合成遺伝子カセット中の例示的遺伝子の核酸配列を列挙する。表７は、例示的なプロピオナート生合成遺伝子によって発現されるポリペプチド配列を列挙する。
[表４−１]
[表４−２]
[表４−３]
[表４−４]
[表４−５]
[表４−６]
[表４−７]
[表４−８]
[表４−９]
[表４−１０]
[表４−１１]
[表４−１２]
【０１３１】
[表５−１]
[表５−２]
[表５−３]
[表５−４]
[表６−１]
[表６−２]
[表６−３]
[表６−４]
[表６−５]
【０１３２】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表４（配列番号２１〜配列番号３５および配列番号１０）の１つまたは複数の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの重複のために、しかし表４の１つ以上の核酸配列と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む（配列番号２１−配列番号配列番号：３５、および配列番号：１０）またはその機能的断片。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表４の１つまたは複数の核酸配列（配列番号２１−配列番号３５および配列番号１０）またはその機能的断片、または遺伝コードは、表４（配列番号２１−配列番号３５および配列番号１０）の１つ以上の核酸配列またはその機能的フラグメントと同一のポリペプチドをコードする。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表５（配列番号３６−配列番号３９）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの重複のために、しかし表５の１つ以上の核酸配列と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む（配列番号３６−配列番号３９）またはその機能的断片。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表５（配列番号３６−配列番号３９）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片、または遺伝コードの重複性のために、それらをコードする核酸配列表５（配列番号３６−配列番号３９）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片としてのポリペプチドを含む。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表６（配列番号４０−配列番号４５）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、遺伝コードの重複のために、しかし表６の１つ以上の核酸配列と同じポリペプチドをコードする核酸配列を含む（配列番号４０−配列番号４５）またはその機能的断片。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表６（配列番号４０−配列番号４５）の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片、または遺伝コードの重複性のために、それらをコードする核酸配列表６（配列番号４０−配列番号４５）の１つ以上の核酸配列またはその機能的フラグメントとしてのポリペプチドを含む。
【０１３５】
表７は、遺伝的に操作された細菌のプロピオン酸産生遺伝子またはカセット（１つまたは複数）によってコードされ得る例示的なポリペプチド配列を列挙する。
【０１３６】
［表７−１］
［表７−２］
［表７−３］
［表７−４］
［表７−５］
［表７−６］
【０１３７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表７（配列番号４６−配列番号７０および配列番号２０）の１つまたは複数のポリペプチド配列またはその機能的断片または変異体をコードする。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つのポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチド配列を含む  またはそれ以上の表７（配列番号４６−配列番号７０、および配列番号２０）のポリペプチド配列またはその機能的断片を含む。
【０１３８】
一実施態様では、細菌細胞は、非天然または異種プロピオナート遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、本開示は、第１のプロモーターに作動可能に連結された非ネイティブ異種プロピオナート遺伝子カセットを含む細菌細胞を提供する。一実施態様では、第１のプロモーターは誘導性プロモーターである。一実施態様では、細菌細胞は、異なる生物、例えば、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットを含む。別の実施態様では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする天然遺伝子の２つ以上のコピーを含む。さらに別の実施態様では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする少なくとも１つの天然遺伝子、ならびに異なる生物、例えば異なる細菌種由来のプロピオナート遺伝子カセットの少なくとも１つのコピーを含む。一実施態様では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする遺伝子の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのコピーを含む。一実施態様では、細菌細胞は、プロピオナート遺伝子カセットをコードする複数の遺伝子のコピーを含む。
【０１３９】
複数の異なるプロピオナート遺伝子カセットが当該分野で公知である。いくつかの実施態様において、プロピオナート遺伝子カセットは、細菌種に由来する遺伝子カセットによってコードされる。いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、非細菌種に由来する遺伝子カセットによってコードされる。いくつかの実施態様において、プロピオナート遺伝子カセットは、真核生物種、例えば、真菌に由来する遺伝子によってコードされる。一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットをコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉまたはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａを含む属または種の生物に由来するが、これらに限定されない。
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ（メガスファエラ・エルスデニイ）、またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（プレボテーラ・ルミニコーラ）
【０１４０】
一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、操作された細菌細胞における使用のためにコドン最適化されている。一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での使用のためにコドン最適化されている。別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、ラクトコッカスにおける使用のためにコドン最適化されている。プロピオナート遺伝子カセットが操作された細菌細胞において発現される場合、細菌細胞は、同じ条件（例えば、培養または環境条件）下で、同じ細菌サブタイプの非修飾細菌よりも多くのプロピオナートを産生する。したがって、異種性プロピオナート遺伝子カセットを含む遺伝子操作された細菌は、自己免疫疾患、例えばＩＢＤを治療するためのプロピオナートを生成するために使用され得る。
【０１４１】
本開示は、プロピオナート生合成酵素の機能的断片またはプロピオナート生合成酵素の機能的変異体をコードする遺伝子をさらに含む。本明細書中で使用される場合、用語「その機能的断片」または「その機能的変異体」は、その断片または変異体が由来する野生型酵素と共通の定性的生物学的活性を有する要素に関する。例えば、突然変異したプロピオナート生合成酵素の機能的断片または機能的変異体は、機能的断片または機能的変異体が由来するプロピオナート生合成酵素と同じようにプロピオナートを合成する能力を本質的に保持するものである。例えば、プロピオナート生合成酵素活性を有するポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端で切断されてもよく、プロピオナート生合成酵素活性の保持は、本明細書で提供される例示的アッセイを含む当業者に公知のアッセイを用いて評価される。一実施態様では、操作された細菌細胞は、プロピオナート生合成酵素機能的変異体をコードする異種遺伝子を含む。別の実施態様では、操作された細菌細胞は、プロピオナート生合成酵素機能性フラグメントをコードする異種遺伝子を含む。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、用語「相同性」を含む「パーセント（％）配列同一性」または「パーセント（％）同一性」は、同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ配列同一性の一部としての保存的置換を考慮しないで、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成し。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動でのほかに、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｓ  Ａｐｐ。数学。  Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ。  Ｂｉｏｌ。  ４８，４４３に記載されているように、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ。  Ｎａｔｌ。  Ａｃａｄ。  Ｓｃｉ。  （Ｇａｐ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ。）を使用して、。
【０１４３】
本開示は、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じ配列中に、アミノ酸を含むプロピオナート生合成酵素を包含する。本明細書に記載の配列と実質的に同じアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、ならびにアミノ酸の欠失および／または挿入を含む配列を含む。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸を、第１のアミノ酸と類似の化学的および／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸で置換することをいう。保存的置換には、以下の群の中の１つのアミノ酸の別のものによる置換が含まれる：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ，ＳおよびＴ。同様に、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間の置換）、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること（例えば、ＡｓｐおよびＧｌｕ間の置換）、  中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置換すること（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ間の置換）も同様に考えられる。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、プロピオナート生合成酵素に突然変異が導入される。増加した活性を示す突然変異体が選択される；プロピオナート生合成酵素をコードする突然変異導入遺伝子を単離し、本開示の細菌細胞に挿入する。本明細書に記載の改変を含む遺伝子は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０１４５】
一実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子カセットは、クロストリジウム属菌由来である。一実施態様では、クロストリジウム属菌は、クロストリジウム・プロピオニカムである。別の実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子カセットはメガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属菌由来である。一実施態様では、メガスファエラ属菌は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉである。別の実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子カセットはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌由来である。一実施態様では、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａである。他のプロピオナート生合成遺伝子カセットは、当業者に周知である。
【０１４６】
いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、クロストリジウム・プロピオニカム由来のｐｃｔ、ｌｃｄおよびａｃｒ遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、例えばｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣを含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、例えばｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄのようなプロピオナート生合成のためのピルビン酸経路遺伝子を含み、任意でｔｅｓＢをさらに含む。遺伝子は、コドン最適化されていてもよく、翻訳および転写要素が加えられてもよい。
【０１４７】
一実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｐｃｔ遺伝子は、配列番号２１と少なくとも約８０％、８２１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９２１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は配列番号２１の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｐｃｔ遺伝子は配列番号２１の配列からなる。
【０１４８】
一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２２と少なくとも約８０％、８１％、８２２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は配列番号２２の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は配列番号２２の配列からなる。
【０１４９】
一実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｃｄＢ遺伝子は、配列番号２３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８２３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は配列番号２３の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｌｃｄＢ遺伝子は配列番号２３の配列からなる。
【０１５０】
一実施態様において、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｃｄＡ遺伝子は、配列番号２４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８２４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９２４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は配列番号２４の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｌｃｄＣ遺伝子は配列番号２４の配列からなる。
【０１５１】
一実施態様では、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８２５％の同一性を有する。一実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９２５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｅｔｆＡ遺伝子は、配列番号２５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８２５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９２５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は配列番号２５の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｅｔｆＡ遺伝子は配列番号２５の配列からなる。
【０１５２】
一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６と少なくとも約９２６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ａｃｒＢ遺伝子は、配列番号２６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８２６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９２６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６の配列を含む。さらに別の実施態様において、ａｃｒＢ遺伝子は配列番号２６の配列からなる。
【０１５３】
一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約９２６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ａｃｒＣ遺伝子は、配列番号２７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８２６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９２６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ａｃｒＣ遺伝子は配列番号２７の配列を含む。さらに別の実施態様では、ａｃｒＣ遺伝子は配列番号２７の配列からなる。
【０１５４】
一実施態様では、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約２８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約２８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約９６％、９７％、９２８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８と少なくとも約２８０％、２８１％、２８２％、２８３％、２８４％、２８５％、２８６％、２８７％、２８２８％、２８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９２８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は配列番号２８の配列を含む。さらに別の実施態様においてｔｈｒＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号２８の配列からなる。
【０１５５】
一実施態様では、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約２９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約２９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約２９６％、２９７％、２９８％、または２９２９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｔｈｒＢ遺伝子は、配列番号２９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８２９％、２９０％、２９１％、２９２％、２９３％、２９４％、２９５％、２９６％、２９７％、２９８％、または２９２９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は配列番号２９の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｈｒＢ遺伝子は配列番号２９の配列からなる。
【０１５６】
一実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は配列番号３０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｈｒＣ遺伝子は配列番号３０の配列からなる。
【０１５７】
一実施態様では、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は、配列番号３１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は配列番号３１の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｉｌｖＡｆｂｒ遺伝子は配列番号３１の配列からなる。
【０１５８】
一実施態様では、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は、配列番号３２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は配列番号３２の配列を含む。さらに別の実施態様において、ａｃｅＥ遺伝子は配列番号３２の配列からなる。
【０１５９】
一実施態様では、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ａｃｅＦ遺伝子は、配列番号３３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は配列番号３３の配列を含む。さらに別の実施態様において、ａｃｅＦ遺伝子は配列番号３３の配列からなる。
【０１６０】
一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は、配列番号３４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は配列番号３４の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｌｐｄ遺伝子は配列番号３４の配列からなる。
【０１６１】
一実施態様では、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｔｅｓＢ遺伝子は、配列番号１０の配列からなる。
【０１６２】
一実施態様では、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ａｃｕＩ遺伝子は、配列番号３５に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。他の実施態様では、ａｃｕＩ遺伝子は配列番号３５の配列を含む。さらに別の実施態様では、ａｃｕＩ遺伝子は配列番号３５の配列からなる。
【０１６３】
一実施態様では、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｓｂｍ遺伝子は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。他の実施態様では、ｓｂｍ遺伝子は配列番号３６の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｓｂｍ遺伝子は配列番号３６の配列からなる。
【０１６４】
一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｙｇｆＤ遺伝子は、配列番号３７と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＤ遺伝子は配列番号３７の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｙｇｆＤ遺伝子は配列番号３７の配列からなる。
【０１６５】
一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は、配列番号３８と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は配列番号３８の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｙｇｆＧ遺伝子は配列番号３８の配列からなる。
【０１６６】
一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は配列番号３９の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｙｇｆＨ遺伝子は配列番号３９の配列からなる。
【０１６７】
一実施態様では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ｍｕｔＡ遺伝子は、配列番号４０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は配列番号４０の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｍｕｔＡ遺伝子は配列番号４０の配列からなる。
【０１６８】
一実施態様では、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は、配列番号４１と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は配列番号４１の配列を含む。さらに別の実施態様において、ｍｕｔＢ遺伝子は配列番号４１の配列からなる。
【０１６９】
一実施態様では、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は配列番号４２と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は、配列番号４２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は配列番号４２の配列を含む。さらに別の実施態様において、ＧＩ  １８０４２１３４遺伝子は配列番号４２の配列からなる。
【０１７０】
一実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約８５％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約９０％の同一性を有する。１つの実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。  したがって、一実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は、配列番号４３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は配列番号４３の配列を含む。さらに別の実施態様では、ｍｍｄＡ遺伝子は配列番号４３の配列からなる。
【０１７１】
一実施態様では、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。  したがって、一実施態様では、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は、配列番号４４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は配列番号４４の配列を含む。さらに別の実施態様において、ＰＦＲＥＵＤ＿１８８８７０遺伝子は配列番号４４の配列からなる。
【０１７２】
一実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、ＢＣＣＰ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様において、ＢＣＣＰ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は、配列番号４５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は配列番号４５の配列を含む。さらに別の実施態様では、ＢＣＣＰ遺伝子は配列番号４５の配列からなる。
【０１７３】
一実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６から配列番号７０の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。プロピオナート回路によりコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つ以上のポリペプチドは、配列番号４６から配列番号７０の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、コードされる１つ以上のポリペプチドプロピオナート回路によりコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現されるタンパク質は、配列番号４６−配列番号７０の１つ以上と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌による、配列番号４６−配列番号７０の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、１つまたは複数の配列番号４６−配列番号７０と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。従って、一実施態様では、１つまたは複数のコードされたポリペプチドプロピオナート回路によって、遺伝子操作された細菌によって発現され、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％  、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。プロピオナート回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現され、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号４６−配列番号７０の１つまたは複数の配列を含む。さらに別の実施態様では、プロピオナート回路によってコードされ、遺伝子操作された細菌によって発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号４６−配列番号７０。
【０１７４】
いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、合成プロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、Ｅ．ｃｏｌｉプロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（グルタニカム）プロピオナート生合成遺伝子である。いくらかの実施態様において、プロピオナート生合成遺伝子の一以上はＣ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍプロピオナート生合成遺伝子である。いくつかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の１つ以上がａＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓプロピオナート生合成遺伝子である。プロピオナート遺伝子カセットは、プロピオナートの好気性生合成のための遺伝子および／またはプロピオナートの嫌気性または微好気性生合成のための遺伝子を含み得る。
【０１７５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株および／または亜株由来のプロピオナート生合成遺伝子の組合せを含み、およびプロピオナートを生成することができる。いくらかの実施態様では、プロピオナート生合成遺伝子の一以上は、安定性を増強し、および／またはプロピオナート生成を増加させるために、機能的に置換、修飾、および／または変異される。いくつかの実施態様では、プロピオナートの局所産生は、食物摂取を減少させ、消化管バリア機能を改善し、炎症を軽減する。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、プロピオナート生合成カセットを発現し、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下で、または腸内に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物、例えばアラビノースの存在下で投与することができる。
【０１７６】
一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、第１のプロモーターに直接作動可能に連結される。別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、間接的に作動可能に第１プロモーターに連結される。一実施態様では、プロモーターは、天然ではプロピオナート遺伝子カセットと作動可能に連結されていない。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、プロピオナート遺伝子カセットは、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施態様において、プロピオナート遺伝子カセットは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、低酸素または嫌気性条件によって直接または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、プロピオナート遺伝子カセットの発現は、哺乳類の消化管の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。誘導可能なプロモーターは、以下においてより詳細に記載される。
【０１７８】
プロピオナート遺伝子カセットは、細菌細胞中のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、細菌細胞の染色体に位置する。さらに別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体に位置し、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットが細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットの天然コピーは細菌細胞内のプラスミド上に位置し、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットは細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットの天然コピーが細菌細胞の染色体に位置し、異なる種の細菌由来のプロピオナート遺伝子カセットが細菌細胞の染色体に位置する。
【０１７９】
いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、低コピープラスミドで発現される。いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセットは、高コピープラスミドで発現される。いくつかの実施態様において、高コピープラスミドは、プロピオナートの発現を増加させるために有用であり得る。
アセタート
【０１８０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、アセタート遺伝子カセットを含み、およびアセタートを生成することができる。遺伝学的に操作された細菌は、アセタート生合成遺伝子の任意の適切なセットを含み得る。アセタート生合成遺伝子を含む非修飾細菌は当該技術において知られ、および好気性および／または嫌気性条件下で種々の基質を消費してアセタートを生成することができ（例はＲａｇｓｄａｌｅ、２００８参照）、およびこれらの内因性アセタート生合成経路は、本発明の遺伝学的に操作された細菌についての遺伝子の供給源でありうる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株または亜株由来のアセタート生合成遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌中の自然アセタート生合成遺伝子が増強される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、好気性アセタート生合成遺伝子、例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、嫌気性アセタート生合成遺伝子、例は、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ、Ｂａｌｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、および／またはＴｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ由来のものを含む。遺伝学的に操作された細菌は、好気性アセタート生合成のための遺伝子、または嫌気性もしくは微好気性アセタート生合成のための遺伝子を含み得る。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、好気性および嫌気性または微好気性アセタート生合成遺伝子の両方を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、および／または亜株に由来するアセタート生合成遺伝子の組合せを含み、およびアセタートを生成することができる。いくらかの実施態様において、アセタート生合成遺伝子の一以上は、安定性および／またはアセタート産生を増強するために、機能的に置換、修飾、および／または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でアセタート生合成カセットを発現し、およびアセタートを生成することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、代わりの短鎖脂肪酸を産生することができる。
トリプトファンおよびトリプトファンの代謝
キヌレニン
【０１８１】
いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンを産生することができる。キヌレニンは、トリプトファン異化作用の最初の律速段階で生成される代謝物である。このステップは、トリプトファンのキヌレニンへの変換を含み、遍在的に発現される酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）、または肝臓に主に局在する酵素であるトリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）によって触媒され得る（Ａｌｖａｒａｄｏら、２０１５）。ＩＢＤを有するヒト患者からの生検は、健康な個体、特に潰瘍部位付近の生検と比較して、ＩＤＯ−１発現のレベルの上昇を示す（Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｅら、２００８；  Ｗｏｌｆら、２００４）。ＩＤＯ−１酵素発現は、同様に、トリニトロベンゼンスルホン酸およびデキストラン硫酸ナトリウム誘導性のＩＢＤマウスモデルにおいてアップレギュレートされる。ＩＤＯ−１の阻害は、各誘導因子によって引き起こされる炎症反応を有意に増大させる（Ｃｉｏｒｂａら、２０１０；  Ｇｕｒｔｎｅｒら、２００３；  Ｍａｔｔｅｏｌｉら、２０１０）。キヌレニンは、好中球におけるアポトーシスを直接誘導することも示されている（Ｅｌ−Ｚａａｔａｒｉら、２０１４）。これらの所見から、ＩＤＯ−１およびキヌレニンが炎症を制限する役割を果たすことが示唆される。遺伝子操作された細菌は、キヌレニンを産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン輸送体、ＩＤＯ−１を産生する遺伝子または遺伝子カセット、およびＴＤＯを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレニンを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン産生を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されている（例えば、トランスポーターまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む）。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレニンを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でキヌレニンを産生することができる。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、キヌレン酸を産生することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼによって触媒される反応におけるキヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。キヌレン酸は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして作用する（Ｔｕｒｓｋｉら、２０１３）。グルタミン酸塩は中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質であることが知られているが、末梢神経系におけるグルタミン酸塩のさらなる役割を示唆する証拠が存在する。例えば、胃腸管（すなわち、筋叢）への主要な神経供給におけるＮＭＤＡグルタミン酸受容体の活性化は腸運動の増加を導くが（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）、キヌレン酸で処置したラットは腸の減少を示す（Ｖａｒｇａら、２０１０）。したがって、ＩＢＤ患者で報告されたキヌレン酸の上昇したレベルは、腸内ニューロンの活性化の増加に対する代償的応答であり得る（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）。遺伝子操作された細菌は、キヌレン酸を産生するための任意の適切な遺伝子、遺伝子、または遺伝子カセットを含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレン酸を産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン酸産生を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレン酸を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でキヌレン酸を産生することができる。
トリプトファン、トリプトファン代謝、およびトリプトファン代謝産物
トリプトファンおよびキヌレニン経路
【０１８３】
トリプトファン（ＴＲＰ）は、消費後、新しいタンパク質合成によってタンパク質に組み込まれるか、または健康および疾患において多数の異なる役割を有する多数の生物学的に活性な代謝産物を変換する必須アミノ酸である（Ｐｅｒｅｚ−Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚら、２００７  Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ：概要；  ＣＮＳおよび神経学的障害−Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２００７、６，３９８−４１０）。トリプトファン異化の一腕に沿って、トリプトファンはトリプトファンヒドロキシラーゼによって神経伝達物質セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）に変換される。セロトニンはさらにメラトニンホルモンに変換することができます。しかし、トリプトファンの大部分は、キヌレニン経路（ＫＰ）と呼ばれる第２の腕に沿って、キヌレニンと総称される多数の生物活性代謝物に代謝される。異化の第一段階では、ＴＲＰは、いくつかのタイプの免疫細胞において十分に証明された免疫抑制機能を有するキヌレニン（ＫＹＮ）に変換され、アリールカルボニル受容体の活性化リガンドであることが最近示されているダイオキシン受容体として知られている）。ＫＹＮは、免疫および腫瘍細胞における内在性ＡＨＲリガンドとして、自己分泌および傍分泌様式の両方で作用し、腫瘍細胞の生存を促進することで、癌の設定において最初に示された。腸内では、キヌレニン経路の代謝は、キヌレニン経路の代謝に対するトリプトファンの利用可能性を調節し得る腸内微生物叢によって調節される。
【０１８４】
より最近では、例えば、インドール−３アルデヒド、インドール−３アセテート、インドール−３−プロピオン酸、インドール、インドール−３アセトアルデヒド、インドール−３−アセトニトリル、ＦＩＣＺを含む、本明細書では総称して「インドール」と呼ばれる追加のトリプトファン代謝産物。これらは、ヒト宿主によって一部、食餌に由来し、ＡｈＲアゴニストとしても機能することができる（表８および図９参照）。３７および本明細書の他の箇所に記載されており、Ｌａｍａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１６年６月；２２（６）：５９８−６０５；ＣＡＲＤ９は、トリプトファンの腸内微生物代謝をアリール炭化水素受容体リガンドに変化させることによって大腸炎に影響を及ぼす。
【０１８５】
多環式芳香族炭化水素のような生体異物の受容体として最もよく知られているＡｈｒは、リガンド結合後に細胞核に転位することができるリガンド依存性細胞質転写因子である。最近、キヌレニン、トリプトファン代謝産物Ｌ−キヌレニン、６−ホルミルインドールカルバゾール（ＦＩＣＺ、ＴＲＰの光産物）、およびＫＹＮＡが、免疫抑制機能を媒介する内因性ＡｈＲリガンドとして同定されている。核内にＡｈＲ標的遺伝子の転写を誘導するために、ＡｈＲは、ＡｈＲ核トランスロケーター（ＡＲＮＴ）またはＮＦ−κＢサブユニットＲｅｌＢのようなタンパク質と協同する。ヒト癌細胞に関する研究により、ＫＹＮはＳＴＡＴ３を介してＩＤＯ１の自己分泌活性化を誘導するＩＬ−６のＡｈＲ−ＡＲＮＴ関連転写を活性化することが示されている。このＡｈｒ−ＩＬ−６−ＳＴＡＴ３ループは、ＩＤＯ／キヌレニン媒介免疫抑制が腫瘍細胞の免疫逃避を可能にするという考えを支持する、肺癌における不良な予後と関連する。
【０１８６】
腸内では、トリプトファンは、アンジオテンシンＩ変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む輸送機構によって上皮を横切って輸送され、Ｔ細胞応答の抑制およびＴｒｅｇ細胞の促進において機能するキヌレニンに変換され得る。
【０１８７】
ＴＲＰのＫＹＮへの律速変換は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）の２つの形態のいずれかによって媒介され得る。ＴＲＰ代謝の１つの特徴は、ＴＲＰからＫＹＮへの触媒の律速段階が、肝酵素トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）およびユビキタス発現酵素ＩＤＯ１の両方によって生じることである。ＴＤＯは、生物におけるＴＲＰ濃度のホメオスタシスに必須であり、ＩＤＯ１よりもＴＲＰに対する親和性が低い。その発現は、主に血漿ＴＲＰ濃度の増加によって活性化されるが、グルココルチコイドおよびグルカゴンによっても活性化され得る。トリプトファンキヌレニン経路は、多くの微生物叢においても発現され、腸内細菌科において最も顕著であり、キヌレニンおよび代謝産物は、図１４およびＳｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３年７月１０日；５（１９３）：１９３頁、９１頁）。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、腸内細菌科由来の１つ以上の異種細菌由来遺伝子を含む。その遺伝子産物はＴＲＰ：ＫＹＮの変換を触媒する。１つの経路に沿って、ＫＹＮは、グルタミン酸受容体に拮抗し得る他の生物活性代謝産物、キヌレニン酸（ＫＹＮＡ）にさらに代謝され得、ＡＨＲおよびＧＰＣＲ、例えばＧＰＲ３５、グルタミン酸受容体、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）ＫＰの第３の経路に沿って、ＫＹＮは、グルタミン酸受容体アゴニストであり、神経毒性の役割を有するアントラニル酸（ＡＡ）およびさらに下流のキノリン酸（ＱＵＩＮ）に変換することができる。
【０１８８】
したがって、ＫＰを介してフラックスのレベルをアップレギュレートおよび／またはダウンレギュレートする手段の発見、ならびにトリプトファンおよびその種々の生物活性代謝物の相対的な量および／または比の再設定は、予防、治療および／または管理において有用であり得る。本明細書に記載の多くの疾患が含まれる。本開示は、トリプトファンおよび／またはトリプトファンの合成、細菌摂取および異化を可能にする回路を含む遺伝子操作された細菌を介して、例えば血清または胃腸系においてトリポファンおよびトリプトファン代謝産物レベルを調節、調節および微調整するための組成物を記載する。  代謝産物。多数の異なる疾患の治療、管理および／または予防においてこれらの組成物を使用するための方法を提供する。
他のインドールトリプトファン代謝物
【０１８９】
キヌレニンおよびＫＹＮＡに加えて、内因性ＡＨＲリガンドとして多数の化合物が提案されており、その多くはトリプトファンおよびインドールの代謝に関与する経路を介して生成される（Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒら、２００３；  ＣｈｕｎｇおよびＧａｄｕｐｕｄｉ、２０１１）。トリプトファンインドール経路を介して生成された多数の代謝産物が腸内の微生物によって生成される。例えば、バクテリアは、インドール酢酸（ＩＡＡ）およびトリプタミンなどの一置換インドール化合物、およびＡＨＲを活性化することが判明している他の化合物に変換することができるトリプトファンを取り込む（Ｈｕｂｂａｒｄら、２０１５、微生物起源のインドールを感知するためのヒトアリール炭化水素受容体の適応；  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｏｐｏｒｔｓ  ５：１２６８９）。
【０１９０】
胃腸管では、食餌由来および細菌性のＡｈＲリガンドは、３型ＩＬＣと呼ばれる先天性リンパ系細胞によるＳｐ−２２産生を促進する（Ｓｐｉｔｓら、２０１３、Ｚｅｌａｎｔｅら、微生物叢のトリプトファン代謝産物は、インターロイキン−２２を介してアリール炭化水素レセプターおよびバランス粘膜反応性に関与する；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９，３７２−３８５、８月２２日、２０１３年）による受容体およびバランス粘膜反応性。
【０１９１】
ＩＬ−２２発現は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の開始により、抗菌化合物の発現および細胞増殖に関連する経路の範囲を引き起こすことができ、その両方が組織修復機序を増強する。ＩＬ−２２は、腸の障壁の忠実度および治癒を促進し、炎症状態を調節する上で重要である。マウスモデルは、ＩＬ−２２の投与後の改善された腸炎症状態を実証している。さらに、ＩＬ−２２は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化して粘液産生を促進し、バリア機能を保持する。
【０１９２】
表８は、ＡｈＲに結合することが示され、本開示の遺伝子操作された細菌によって産生され得る例示的なトリプトファン代謝産物を列挙する。
[表８]
【０１９３】
さらに、いくつかのインドール代謝産物は、腸のバリア機能の必須調節因子として重要な役割を果たすと考えられるプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）を介して、その効果を発揮し得る。ＰＸＲ欠損（Ｎｒ１ｉ２−／−）マウスは、ＬＰＳを認識し、先天性免疫系を活性化することが知られている受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）のアップレギュレーションと共役する明確に「漏出（ｌｅａｋｙ）」する腸生理を示した（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら、２０１４、共生細菌代謝物は、生体異物センサーＰＸＲおよびＴｏｌｌ様受容体４による消化管バリア機能を調節する；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１、２９６−３１０、８月２１日、２０１４年）。特に、腸内の微生物によって産生されるインドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）は、インビボでＰＸＲのリガンドであることが示されている。
【０１９４】
ＰＸＲアゴニズムの結果として、例えば、共生細菌によって、または遺伝学的に操作された細菌によって産生されるインドールレベルは、ＰＸＲの活性化を介してＴＬＲ４の発現レベルを調節し、恒常性および腸障壁の健康を促進することができる。すなわち、ＩＰＡおよび／またはＰＸＲの低レベルおよびＴＬＲ４の過剰は、腸内障壁機能不全につながり得るが、ＩＰＡレベルの増加は、ＰＸＲ活性化およびＴＬＲ４ダウンレギュレーションを促進し、腸壁障壁の改善を促進し得る。
【０１９５】
トリプトファンのインドール−３−プロピオナートへの微生物分解は、数多くの微生物において示されているが（例えば、Ｅｌｓｄｅｎら、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａによる芳香族アミノ酸の代謝の最終生成物、Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７６年４月１日；  １０７（３）：２８３−８）、トリプトファンからＩＰＡまでの細菌性生合成経路は未知である。クロストリジウムスポロゲネスにおいて、トリプトファンは、インドール−３−ピルビン酸、インドール−３−乳酸およびインドール−３を介して異化される（Ｏ’ＮｅｉｌｌおよびＤｅＭｏｓｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のＴｒｉｍｐｏｐｈａｎトランスアミナーゼ、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９６８年９月２０日；１２７（１）：３６１−９）。Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓから精製された２つの酵素は、トリプトファントランスアミナーゼおよびインドール−３−乳酸脱水素酵素である（ＪｅａｎおよびＤｅＭｏｓｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓのＩｎｄｏｌｅｌａｃｔａｔｅ脱水素酵素、Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９６８年４月；１４（４）：４２９−３５）。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓは、アミノトランスフェラーゼによってトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に分解する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓトリプトファンはまた、連続的なアミノ基転移および脱水素化を介してインドール−３−ラクテートに異化される（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｅｓｅ  ｆｌａｖｏｒ  ａｄｊｕｎｃｔｓ  Ｇｕｍｍａｌｌａ、Ｓ．、Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ、ＪＲＪ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ８２：２０７０−２０７７およびその中の参考文献）。
【０１９６】
Ｌ−トリプトファントランスアミナーゼ（例えば、ＥＣ２．６．１．２７、例えばクロストリジウムスポロゲネスまたはラクトバチルスカゼイ）は、Ｌ−トリプトファンおよび２−オキソグルタル酸を（インドール−３−イル）ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸に変換する。インドール−３−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１１０、例えばクロストリジウムスポロゲネスまたはラクトバチルスカゼイ）は（インドール−３−イル）ピルビン酸およびＮＡＤＨおよびＨ＋をインドール−３−乳酸およびＮＡＤ＋に変換する。
【０１９７】
いくつかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファントランスアミナーゼ（例えば、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来）および／またはインドール−３−乳酸デヒドロゲナーゼ（例えば、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来）、および／またはインドール−３−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来）から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子配列（群）を含む。他の実施態様では、細菌によってコードされるそのような酵素は、ラクトバチルスカゼイおよび／またはラクトバチルスヘルベティカス由来である。
【０１９８】
他の実施態様では、ＩＰＡ生成回路は、図４４および本明細書の他の箇所に示され、記載される酵素を含む。
【０１９９】
いくつかの実施態様では、細菌は、１つ以上のトリプトファン代謝産物、例えば「インドール」を産生するための遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、細菌は、インドール−３アルデヒド、インドール−３アセタート、インドール−３−プロピオン酸、インドール、インドール−３アセトアルデヒド、インドール−３−アセトニトリル、ＦＩＣＺから選択されるインドールおよび生産のための遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、細菌は、ＡｈＲアゴニストとして機能するインドールを産生するための遺伝子配列を含む（例えば、表８および図３７を参照）。
【０２００】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＰＡの生成のための回路を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンアンモニアリアーゼおよびインドール−３−アクリラートレダクターゼ、例えば、トリプトファンアンモニアリアーゼ（ＷＡＬ）（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃｕｓ）およびインドール−３−アクリラートレダクターゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）をコードする一以上の遺伝子配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝子配列の発現は誘導性プロモーターの制御下にある。ＩＰＡ生合成カセットの発現を制御し得る例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症反応によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＮＯプロモーター）、および消化管に天然に存在してもよいし存在しなくてもよい代謝物（例えば、外因的に添加され得る）、例はアラビノースおよびテトラサイクリン、によって誘導されるプロモーターを含む。
【０２０１】
いくつかの実施態様では、細菌は、図３９、４１Ａ−Ｈ、４２Ａ−Ｅ、４３Ａ、４３Ｂ、４５Ａ−Ｅに記載および図示される任意の１つ以上の回路を含む。
メトキシインドール経路、セロトニンおよびメラトニン
【０２０２】
メトキシインドール経路は、セロトニン（５−ＨＴ）およびメラトニンの形成をもたらす。  第１に、２つのトリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子（Ｔｐｈ１またはＴｐｈ２）のうちの１つによってコードされる酵素は、トリプトファンの５−ＨＴへの律速変換を触媒し、この酵素はセロトニンの生理活性を脳（Ｔｐｈ２）または末梢（Ｔｐｈ１）のいずれかに割り当てる。次に、５−ＨＴＰを脱カルボキシル化してセロトニンとする。腸内セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）は、エンテロクロマフィン細胞およびニューロンによって放出され、セロトニン再取り込みトランスポーター（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅ−ｕｐｔａｋｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＳＥＲＴ）を介して調節される。ＳＥＲＴは、腸の上皮細胞およびニューロン上に存在する。特定の実施態様では、本明細書に記載の遺伝子操作された細菌は、腸内のセロトニンレベルを調節して、例えばセロトニンレベルを低下させることができる。
【０２０３】
５−ＨＴはまた、メラトニン生合成の基質として機能する。メラトニン生合成の律速段階は、Ｎ−アセチル−セロトニン（ＮＡＳ）の形成をもたらす５−ＨＴ−Ｎ−アセチル化であり、続いて５−メトキシ−Ｎ−アセチルトリプタミン（メラトニン）へのメチル化を伴う。５−ＨＴ、ＮＡＳ、およびメラトニンの不足した生産は、気分の落ち込み、睡眠障害および概日リズムの障害に寄与する。メラトニンは、神経ホルモンとして作用し、概日リズムおよび睡眠−覚醒サイクルの発達に関連する。
【０２０４】
特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、５−ＨＴ合成、放出および／または分解に影響を及ぼす。腸内微生物叢は、セロトニンシグナル伝達および宿主セロトニン産生を介してセロトニンレベルを増加させることができるケアと相互に連結されている（Ｊａｎｏら、Ｃｅｌｌ．２０１５  Ａｐｒ  ９；１６１（２）：２６４−７６、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０２．０４７、腸内微生物叢由来の常在菌は、宿主セロトニン生合成を調節する）。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、腸内のセロトニンレベルを調節して、炎症の症状を改善することができる。いくつかの態様において、遺伝子操作された細菌は、セロトニンを環境、例えば腸から取り込む。非限定的な例において、セロトニンは、例えば、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）、ヒドロキシル−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＩＯＭＴ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、芳香族−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＡＤ）によってメラトニンに変換することができる。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された影響は、宿主によって産生されるセロトニンレベルに影響を及ぼす。
【０２０５】
細菌において、メラトニンは、シキミ酸経路の中間生成物としてトリプトファンを用いて間接的に合成される。これらの細胞において、合成はｄ−エリスロース−４−リン酸およびホスホエノールピルビン酸から開始する。いくつかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、メラトニンの産生のための内因性または外因性のカセットを含む。非限定的な例として、１つの経路またはカセットが、Ｂｏｃｈｋｏｖ、Ｄｅｎｉｓ  Ｖ．；Ｓｙｓｏｌｙａｔｉｎ、Ｓｅｒｇｅｙ  Ｖ．；  Ｋａｌａｓｈｎｉｋｏｖ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｉ．；  Ｓｕｒｍａｃｈｅｖａ、Ｉｒｉｎａ  Ａ．（２０１１）「シキミ酸：植物および微生物源からの分析、単離および精製技術のレビュー」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１）：５−１７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２１５４−０１１−００６４−８、に記載されている。
例示的なトリプトファンおよびトリプトファン代謝産物回路  
外因性トリプトファンの減少
【０２０６】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンのレベルおよび／またはトリプトファン代謝産物のレベルを低下させることができる。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、１つまたは複数の芳香族アミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子配列を含む。一実施態様では、アミノ酸トランスポーターはトリプトファントランスポーターである。トリプトファン輸送体は、細胞内へのトリプトファン輸送を増強するために、本明細書に記載の組換え細菌中で発現または改変され得る。具体的には、本明細書に記載の組換え細菌細胞においてトリプトファントランスポーターが発現される場合、トランスポーターが発現された場合、同じ条件下で同じ細菌サブタイプの非改変細菌より多くのトリプトファンが細胞に導入される。したがって、遺伝子操作された細菌は、細菌にトリプトファンを取り込むために使用することができるトリプトファントランスポーターをコードする異種遺伝子を含む。
【０２０７】
トリプトファンの細菌細胞への取り込みは、当業者に周知のタンパク質によって媒介される。例えば、トリプトファンに対するそれらの親和性に基づいて識別可能な３つの異なるトリプトファントランスポーターが、大腸菌で同定されている（例えば、Ｙａｎｏｆｓｋｙら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６００９−１７参照）。細菌遺伝子ｍｔｒ、ａｒｏＰ、およびｔｎａＢは、細菌におけるトリプトファンの取り込みの原因となるトリプトファンパーミアーゼをコードする。高親和性パーミアーゼＭｔｒは、ｔｒｐリプレッサーによって負に調節され、ＴｙＲ産物によって正に調節される（例えば、Ｙａｎｏｆｓｋｙら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６００９−１７およびＨｅａｔｗｏｌｅら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：３６０１−０４）。  ＡｒｏＰはｔｙＲ産物によって負に調節される（Ｃｈｙｅら（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３８６−９３）。
【０２０８】
一実施態様では、トリプトファントランスポーターをコードする少なくとも１つの遺伝子は、ｍｔｒ、ａｒｏＰおよびｔｎａＢからなる群より選択される遺伝子である。一実施態様では、本明細書に記載の細菌細胞は、ｍｔｒ、ａｒｏＰおよびｔｎａＢからなる群から選択される少なくとも１つの異種遺伝子を含むように遺伝学的に操作されている。一実施態様では、トリプトファントランスポーターをコードする少なくとも１つの遺伝子は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｍｔｒ遺伝子である。一実施態様では、トリプトファントランスポーターをコードする少なくとも１つの遺伝子は大腸菌ａｒｏＰ遺伝子である。一実施態様では、トリプトファントランスポーターをコードする少なくとも１つの遺伝子は、大腸菌ｔｎａＢ遺伝子である。
【０２０９】
いくつかの実施態様において、トリプトファントランスポーターは、細菌属または種（限定されないが、エシェリキア、コリネバクテリウム、エシェリキア・コリ、サッカロマイセスセレビシエまたはコリネバクテリウムグルタミカムを含む）由来のトリプトファントランスポーター遺伝子によってコードされる。いくつかの実施態様では、細菌種は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施態様では、細菌種は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株である。
【０２１０】
トリプトファントランスポーター、トリプトファントランスポーターの機能的変異体、またはトリプトファントランスポーターの機能的フラグメントの活性を試験するためのアッセイは、当業者に周知である。例えば、トリプトファンの取り込みは、Ｓｈａｎｇら、（２０１３）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９５：５３３４−４２に記載の方法によって決定することができ、これらの各々の全内容は、本明細書中に参考として明示的に援用される。
【０２１１】
一実施態様では、トリプトファントランスポーターが本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、同じ条件下で同じ細菌サブタイプの非修飾細菌よりもトランスポーターが発現された場合、細菌細胞にトリプトファンを１０％。別の実施態様では、トリプトファントランスポーターが本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、トリプトファンを２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％同じ条件下で同じ細菌サブタイプの非改変細菌よりもトランスポーターが発現された場合には、細菌細胞に導入される。さらに別の実施態様では、本明細書に記載の組換え細菌細胞においてトリプトファントランスポーターが発現される場合、トランスポーターが同じ条件下で同じ細菌サブタイプの非修飾細菌よりも発現される場合、細菌細胞は２倍以上のトリプトファンを細胞に輸入する。さらに別の実施態様では、トリプトファントランスポーターが本明細書に記載の組換え細菌細胞で発現される場合、細菌細胞は、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍同じ条件下で同じ細菌サブタイプの非改変細菌よりもトランスポーターが発現された場合に、より多くのトリプトファンを細胞に導入することを意味する。
【０２１２】
いくつかの実施態様では、トリプトファン取込みトランスポーターに加えて、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書に記載のように、トリプトファン代謝物の生成回路、例えばキヌレニン、キヌレニン代謝物、または表８に示すインドールトリプトファン代謝物の生成回路をさらに含む。
【０２１３】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンのレベルを低下させることができる。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファンをキヌレニンに変換するための１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）および酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．５２；トリプトファンからＮ−ホルミルキヌレニンを産生する）およびｎ−ホルミルキヌレニンからキヌレニンを産生するキヌレニンホルムアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．９）をコードする遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、、例えば、Ｖｕｊｋｏｖｉ−Ｃｖｉｊｉｎら、２０１３に記載のように、前記の酵素は細菌由来である。
【０２１４】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、本明細書に記載の遺伝子（群）および遺伝子カセット（群）の発現を介して、例えばインドール代謝産物の生成と組み合わせてトリプトファンのレベルを低下させることができる。
キヌレニンの増加
【０２１５】
いくつかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを産生することができる。
【０２１６】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンのレベルを低下させることができる。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファンをキヌレニンに変換するための１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ−１）および酵素トリプトファンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードする遺伝子配列を１以上含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．５２；トリプトファンからＮ−ホルミルキヌレニンを産生する）およびｎ−ホルミルキヌレニンからキヌレニンを産生するキヌレニンホルムアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．９）をコードする遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、例えば、Ｖｕｊｋｏｖｉ−Ｃｖｉｊｉｎら、２０１３に記載のように、前記の酵素は細菌由来である。
【０２１７】
遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレニンを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン産生を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアはまたトリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されており、例えば、トランスポータまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレニンを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、ある種の分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、または他のアラビノースのような腸内に存在していてもいなくてもよい他のいくつかの代謝物の存在下で、キヌレニンを産生することができる。
【０２１８】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を産生することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼによって触媒される反応におけるキヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレン酸を産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン酸産生を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、例えば、炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレン酸を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、ある種の分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下、またはアラビノースのような腸内に存在しても存在しなくてもよい他のいくつかの代謝産物の存在下で、キヌレニン酸を産生することができる。
【０２１９】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌由来のトリプトファンの消費およびキヌレニンの産生のための１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、ＴＲＰからＫＹＮへの変換のための酵素は、シュードモナス、キサントモナス、バークホルデリア、ステノトロホモナス、シュワネラ、およびバチルスの１つ以上から、および／またはロドバクタス科、ミクロコッカス科、Ｖｕｊｋｏｖｉｃ−Ｃｖｉｊｉｎらの表Ｓ７に列挙された種に由来する。（腸内微生物叢のジビオシスは、ＨＩＶ疾患の進行およびトリプトファン異化と関連している（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１３年７月１０日；  ５（１９３）：１９３頁９１頁）。
【０２２０】
いくつかの実施態様において、キヌレニンを産生するための１つ以上の遺伝子は、例えば、安定性を増強し、キヌレニン産生を増加させ、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されている（例えば、トランスポーターまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む）。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレニンを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下、ある種の分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下、またはアラビノースのような腸内に存在していてもいなくてもよい他のいくつかの代謝物の存在下で、キヌレニンを産生することができる。いくつかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を産生することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼによって触媒される反応におけるキヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。
【０２２１】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニン後ＫＰ代謝物、例えば、神経毒性代謝産物または糖尿病誘発性代謝産物の蓄積を防止する。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のキヌレニナーゼをコードする。
【０２２２】
いくつかの実施態様では、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌は、例えば循環中に、ＴＲＰ：ＫＹＮ比を変えることができる。いくつかの実施態様では、ＴＲＰ：ＫＹＮ比が増加する。いくつかの実施態様では、ＴＲＰ：ＫＹＮ比は減少する。いくつかの実施態様では、１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌は、ＫＹＮＡ：ＱＵＩＮ比を変えることができる。
【０２２３】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下で、低酸素状態で記載された回路のいずれか１つまたは複数を、または腸に存在してもいなくてもよいいくつかの他の代謝産物、例えばアラビノースの存在下で投与され得る。いくつかの実施態様では、記載された回路のうちの任意の１つ以上が、１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、記載された回路の任意の１つまたは複数をさらに発現することができ、さらに以下の１つ以上を含む：（１）１つまたは複数の栄養要求性、（２）１つまたは複数のキイスイッチ回路、例えば、本明細書中に記載されるか、または当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）生物学的分子または基質をインポートするための１つ以上のトランスポーター、例えば、本明細書に記載されるか、または当該分野で知られているトランスポーター、（５）本明細書に記載され、当技術分野で公知の任意の分泌回路のような１つまたは複数の分泌回路、および（６）そのような追加回路の１つ以上の組合せ。
増加するトリプトファン
【０２２４】
いくつかの実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された微生物は、トリプトファンを産生することができる。トリプトファンの製造のための例示的な回路を図３９、図４５Ａおよび図４５Ｂに示す。
【０２２５】
いくつかの実施態様において、トリプトファンを産生する遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンオペロンを含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトリプトファンオペロンを含む。（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、ＲＮＡ（２００７）、１３：１１４１−１１５４）。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのトリプトファンオペロンを含む。（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、ＲＮＡ（２００７）、１３：１１４１−１１５４）。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列（群）を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。
【０２２６】
また、これらの実施態様のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスミ酸を産生する遺伝子配列を任意に含む。したがって、いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を任意に含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、トリプトファン生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列、およびコリスミ酸生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、大腸菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列（群）ならびにａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列（群）を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、枯草菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列（群）ならびにａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列（群）を含む。
【０２２７】
[0291]
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型またはフィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子（表１０）をコードする配列を含む。大腸菌ｓｅｒＡでコードされた３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）デヒドロゲナーゼは、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）生合成の主要なリン酸化経路の第１段階を触媒する。この工程は、３ＰＧから３−ホスホヒドロキシピルビン酸（３ＰＨＰ）への酸化であり、それに付随してＮＡＤ＋がＮＡＤＨに還元される。トリプトファン生合成の一環として、大腸菌は産生された各トリプトファンに対して１つのセリンを使用する。その結果、ｓｅｒＡを発現させることにより、トリプトファン産生が改善される（例えば、図３８参照）。
【０２２８】
これらの実施態様のいずれにおいても、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、トリプトファン産生を改善するために、必要に応じてフィードバック耐性のバージョンで置き換えられる（表１０）。
【０２２９】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、そのリプレッサー機能を低下または消失させるように、任意に欠失、突然変異、または改変され得る。
【０２３０】
これらの実施態様のいずれかにおいて、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）は、この経路に沿ったトリプトファン異化を防ぎ、産生されるトリプトファンのレベルをさらに増加させるために必要に応じて選択することができる（表１０）。
【０２３１】
ｙｄｄＧ遺伝子によってコードされる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の内膜タンパク質ＹｄｄＧは、既知のアミノ酸輸出体ＲｈｔＡおよびＹｄｅＤの相同体である。研究により、ＹｄｄＧはトリプトファンを含む芳香族アミノ酸を輸出することができることが示されている。したがって、ＹｄｄＧは、トリプトファン排出輸送体またはトリプトファン分泌装置（またはトリプトファン分泌タンパク質）として機能し得る。他の芳香族アミノ酸排出輸送体は、Ｄｏｒｏｓｈｅｎｋｏら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｅｔｔ．、２７５：３１２−３１８（２００７）に記載されている。したがって、いくつかの実施態様では、操作された細菌は、必要に応じて、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌はＹｄｄＧを過剰発現することができる。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアは、ｙｄｄＧ遺伝子の１つ以上のコピーを任意に含む。
【０２３２】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニンを代謝または分解する機構を含み、いくつかの実施態様ではトリプトファンの産生も増加する。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、酵素キヌレニナーゼをコードする配列を含む。キヌレニナーゼは、キヌレニンを細胞内のアントラニル酸に代謝するために産生される。Ｓｃｈｗａｒｃｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１３、４６５−４７７；２０１２；  Ｃｈｅｎ＆Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、２００９；２；１−１９；Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒｅｓ．。例示的なキヌレニナーゼ配列は、本明細書の以下の表１１に提供される。いくつかの実施態様では、操作された微生物は、キヌレニンを局所環境から細胞に輸入（輸送）する機構を有する。したがって、いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレニナーゼ分泌体をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つ以上のコピーを含む。
【０２３３】
いくつかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の酵素およびキヌレニナーゼをコードする配列をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、トリプトファンオペロン、例えば大腸菌のトリプトファンオペロンを含む。または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ならびにキヌレニナーゼをコードする配列。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えばＥ．ｃｏｌｉおよびキヌレニナーゼをコードする配列からの、ｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびキヌレニナーゼをコードする配列からのｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、そのリプレッサー機能を低下または消失させるために、必要に応じて欠失、突然変異、または改変され得る。また、これらの実施態様のいずれかにおいて、遺伝子操作されたバクテリアは、トリプトファン前駆体、コリスミテートを産生するための配列（群）、例えばａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびａｒｏＣをコードする配列（群）を任意に含む。したがって、いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、大腸菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＧ−Ｄ、ｔｒｙｐＣ−Ｆ、ｔｒｙｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤをコードする配列（群）、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子、およびキヌレニナーゼをコードする配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、枯草菌由来のｔｒｙｐＥ、ｔｒｙｐＤ、ｔｒｙｐＣ、ｔｒｙｐＦ、ｔｒｙｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫをコードする配列（群）、およびＡｒｏＣ遺伝子、およびにキヌレニナーゼをコードする配列を含む。
【０２３４】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、内因性ｔｒｐＥに欠失または変異を任意選択で有し、ｔｒｐＥを非機能的にすることができる。したがって、一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＡ、およびｔｒｐＤおよびキヌレニナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含み得る（例えば、図１８参照）。この欠失は、内因性コリスミ酸経路を介したトリプトファン産生を妨げ、キヌレニンからキヌレニナーゼを介したトリプトファンの産生を増加させる可能性がある。
【０２３５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、野生型またはフィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子のいずれかをコードする配列を含む（表１０）。
【０２３６】
これらの実施態様のいずれかにおいて、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、トリプトファン産生を改善するために、必要に応じてフィードバック耐性のバージョンで置き換えられる（表１０）。
【０２３７】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、そのリプレッサー機能を低下または消失させるように、任意に欠失、変異、または修飾されていてもよい。
【０２３８】
これらの実施態様のいずれにおいても、Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードするｔｎａＡ遺伝子は、この経路に沿ったトリプトファン異化を防ぎ、産生されるトリプトファンのレベルをさらに増加させるために、必要に応じて欠失させることができる（表１０）。
【０２３９】
これらの実施態様のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞からトリプトファンを輸出または分泌するための遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。したがって、いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、芳香族アミノ酸輸出者であるＹｄｄＧを過剰発現することができる。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアは、ｙｄｄＧ遺伝子の１つ以上のコピーを任意に含む。これらの実施態様のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンを細胞に輸入または輸送するための遺伝子配列をさらに含み得る。したがって、いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼセクレーターをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つ以上のコピーを含む。
【０２４０】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作された微生物は、低酸素条件下で活性化されるプロモーターの制御下で、炎症状態（例えば、任意のもの）によってトリプトファンおよび／またはキヌレニナーゼを産生するための１つまたは複数の遺伝子を含む。前記条件下で活性化され、かつ本明細書に記載されるプロモーター。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、癌特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または本明細書に記載のプロモーターのいずれかなどの構成的プロモーターの制御下で、トリプトファンおよび/またはキヌレニナーゼを産生するための１つまたは複数の遺伝子を発現する。表９は、本開示の遺伝子操作された細菌によってコードされる例示的なトリプトファン合成カセットを列挙する。
[表９]
【０２４１】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表９の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、遺伝暗号の重複のために、表９の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表９の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片、または遺伝コードの重複のためであるが、表９の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列。
【０２４２】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドは、配列番号７１から配列番号８３の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する.１つの実施態様において、１つまたは複数のポリペプチドおよび/または遺伝学的に操作された細菌によりコードされ発現されるポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、コードされて発現される１つ以上のポリペプチドおよび／遺伝的に操作された細菌によってコードされ発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。バクテリアは、配列番号７１〜配列番号８３の１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、１つまたは複数のポリペプチドおよび/または遺伝学的に操作された細菌によって発現されるポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％配列番号７１〜配列番号８３の１つまたは複数との９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、遺伝的に操作されたバクテリアによってコードされ発現される１つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドは、配列番号７１〜配列番号８３の１つまたは複数の配列を含む。配列番号7１〜配列番号８３の１つまたは複数の配列の少なくとも１つを含む。
【０２４３】
表１０は、例示的なポリペプチド配列帰還抵抗性ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥを示す。表１０はまた、例示的なＴｎａＡ（大腸菌由来のトリプトファナーゼ）配列を示す。いくつかの実施態様では、配列は、トリプトファン異化のための回路でインドールにコードされている。他の態様では、配列はトリプトファンのレベルを増加させるために大腸菌染色体から欠失される。
[表１０]
【０２４４】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４から配列番号８７の１つ以上と少なくとも約80％の同一性を有する。遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上と少なくとも約85％の同一性を有する。１つの実施態様において、１つ以上のポリペプチドおよびまたは遺伝学的に操作された細菌によってコードされ発現されるポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、コードされ発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／遺伝的に操作された細菌によってコードされ発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。バクテリアは、配列番号８４〜配列番号８７の１つ以上と少なくともやく９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、１つ以上のポリペプチドおよび/または遺伝子操作された細菌によって発現されるポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％別の実施態様では、１つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドは、配列番号８４〜配列番号８７の１つまたは複数と９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様では、遺伝的に操作されたバクテリアによってコードされ発現される１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号８４−配列番号８７の１つまたは複数の配列を含む。配列番号８４−配列番号８７のうちの１つ以上の配列のアミノ酸配列を含む。
【０２４５】
表１１は、特定の実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌によりコードされるキヌレニナーゼをコードする例示的な遺伝子を列挙する。
[表１１-１]
[表１１-２]
【０２４６】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９から配列番号９１の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９−配列番号９１の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、１つまたは複数のポリペプチドおよびまたは遺伝学的に操作された細菌によってコードされ発現されるポリヌクレオチドは、配列番号８９から配列番号９１の１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、コードされ発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９−配列番号９１の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌によってコードされ発現される一つ以上のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９から配列番号９１の１つ以上と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、１つ以上のポリペプチドおよび／または遺伝学的に操作された細菌によって発現されるポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％別の実施態様では、１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号８９−配列番号９１の１つまたは複数と９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様では、遺伝的に操作されたバクテリアによってコードされ発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号８９−配列番号９１の１つまたは複数の配列を含む。配列番号８９−配列番号９１の１つまたは複数の配列の少なくとも１つを含む。
【０２４７】
表１２は、例示的なコドン最適化キヌレニナーゼカセット配列を列挙する。
[表１２-１]
[表１２-２]
[表１２-３]
ｐｔｅｔ−プロモーターを太字で、設計されたリボゾーム結合部位を下線付きで、コドン最適化したタンパク質のコード配列をプレーンテキストで、ターミネーターをイタリックで示している。
【０２４８】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、表１２の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、遺伝暗号の重複のために、表１２の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。  表１２の１つまたは複数の核酸配列またはその機能的断片、または遺伝コードの重複のためであるが、表１２の１つまたは複数の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列。
【０２４９】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号９２から配列番号９４の１つ以上と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施態様では、遺伝的に操作されたバクテリアによりコードされ発現されるポリヌクレオチドは、配列番号９２から配列番号９４の１つ以上と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアによってコードされ発現される１つ以上のポリヌクレオチドは、一実施態様では、遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号９２−配列番号９４の１つ以上と少なくとも約９５％の同一性を有する。１つの実施態様では、遺伝子操作された細菌によってコードされ発現される１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号９２−配列番号９４の１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％配列番号９２のより多くしたがって、一実施態様では、遺伝子改変細菌によって発現される１つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％  、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施態様では、遺伝子操作された細菌によってコードされ、発現される１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号９２から配列番号９４の１つ以上の配列を含む。別の実施態様では、コードされる１つ以上のポリヌクレオチド遺伝子操作された細菌によって発現されるものは、配列番号９２−配列番号９４の１以上の配列からなる。
【０２５０】
遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼを産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレニナーゼを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を高めるために、キヌレニナーゼ産生を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアはまた、トリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されており、例えば、トランスポータまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレニナーゼを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下で、またはある種の分子または代謝産物の存在下で、または他のいくつかの存在下で低酸素状態でキヌレニナーゼを産生することができるアラビノースのような腸内に存在していてもいなくてもよい代謝物。
【０２５１】
遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼを産生するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレニナーゼを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を高めるために、キヌレニナーゼ産生を増加させるために、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアはまた、トリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されており、例えば、トランスポータまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレニナーゼを産生することができる。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でキヌレニナーゼを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下で、または他の代謝産物の存在下または非存在下で、特定の分子または代謝産物の存在下でキヌレニナーゼを産生することができるアラビノースのような腸内に存在する。
キヌレン酸の産生
【０２５２】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、キヌレン酸を産生することができる。キヌレニン酸は、酵素キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼによって触媒される反応におけるキヌレニンの不可逆的アミノ基転移から生成される。キヌレン酸は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体のアンタゴニストとして作用する（Ｔｕｒｓｋｉら、２０１３）。グルタミン酸塩は中枢神経系の主要な興奮性神経伝達物質であることが知られているが、末梢神経系におけるグルタミン酸塩のさらなる役割を示唆する証拠が存在する。例えば、胃腸管（すなわち、筋叢）への主要な神経供給におけるＮＭＤＡグルタミン酸受容体の活性化は腸運動の増加を導くが（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）、キヌレン酸で処置したラットは腸の減少を示す（Ｖａｒｇａら、２０１０）。したがって、ＩＢＤ患者で報告されたキヌレン酸の上昇したレベルは、腸内ニューロンの活性化の増加に対する代償的応答であり得る（Ｆｏｒｒｅｓｔら、２００３）。遺伝子操作された細菌は、キヌレン酸を産生するための任意の適切な遺伝子を含むことができる。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、１つまたは複数のキヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩなど）とも呼ばれる）をコードする遺伝子配列を含む。
【０２５３】
いくつかの実施態様において、キヌレン酸を産生するための遺伝子または遺伝子は、例えば、安定性を増強するために、条件を誘導してキヌレン酸の産生を増加させるように改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、例えば、炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレン酸を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下で、またはある種の分子または代謝産物の存在下で、低酸素状態で、アラビノースのような腸内に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物。
【０２５４】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌由来のトリプトファンの消費およびキヌレン酸の産生のための１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、キヌレン酸を産生するための酵素は、シュードモナス、キサントモナス、バークホルデリア、ステノトロホモナス、シュワネラ、およびバチルスの１以上から、および／またはロドバクテラセア、ミクロコッカス、およびハロモナス科のメンバーから誘導される。Ｖｕｊｋｏｖｉｃ−Ｃｖｉｊｉｎらの表Ｓ７に列挙された種に由来する。（腸内微生物叢のジビオシスは、ＨＩＶ疾患の進行およびトリプトファン異化と関連している（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１３年７月１０日；  ５（１９３）：１９３頁９１頁）。
【０２５５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のトリプトファントランスポーターをコードする遺伝子配列およびキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。  いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、１つ以上のトリプトファン輸送体をコードする遺伝子配列および１つ以上のキヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（キヌレニンアミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、１つ以上のトリプトファン輸送体をコードする遺伝子配列、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列、および１つ以上のキヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ（キヌレニンアミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列および１つまたは複数のキヌレニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列を含む。
【０２５６】
いくつかの実施態様において、キヌレン酸を産生するための１つ以上の遺伝子は、例えば、安定性を増強するために、誘導条件下でキヌレン酸産生を増加させるように、改変および／または突然変異される。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、トリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されている（例えば、トランスポーターまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む）。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えば炎症に関連する状態の下で、誘導条件下でキヌレン酸を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、炎症または炎症応答に関連する分子または代謝産物の存在下で、またはある種の分子または代謝産物の存在下で、低酸素状態で、アラビノースのような腸内に存在しても存在しなくてもよい他の代謝産物。
【０２５７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下で、低酸素状態で記載された回路のいずれか１つまたは複数を、アラビノースのような腸内に存在していても存在していなくてもよい他の代謝産物の存在下で、炎症反応、炎症反応または免疫抑制作用を有する。いくつかの実施態様では、記載された回路のうちの任意の１つ以上が、１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、記載された回路の任意の１つまたは複数をさらに発現することができ、さらに以下の１つ以上を含む：（１）１つまたは複数の栄養要求性、（２）１つまたは複数のキイスイッチ回路、例えば、本明細書中に記載されるか、または当技術分野で公知のキルスイッチのいずれか、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）  （５）本明細書に記載され、当技術分野で公知の任意の分泌回路のような１つまたは複数の分泌回路、および（１）本明細書中に記載されているかまたは他の方法で知られているトランスポーターのような、  ６）そのような追加回路の１つ以上の組合せ。
インドールトリプトファン代謝物およびトリプタミンの産生
トリプタミン
【０２５８】
いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含み、トリプトファンからトリプタミンを産生する。モノアミンアルカロイド、トリプタミンは、トリプトファンの直接脱カルボキシル化に由来する。インドール−３−アセトアミド（ＩＡＭ）経路を構成するトリプトファンモノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）およびインドール−３−アセトアミド加水分解酵素（ＩａａＨ）を介してトリプトファンをインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）に変換する。例えば、図３６Ｂ、図３７Ａおよび図３７Ｂを参照。
【０２５９】
このような歪みの非限定的な例を図１８に示す。一実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上のトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）から入手可能である。  一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）から入手可能である。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えばＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇｎａｖｕｓ由来の１つ以上のトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。歪みの別の非限定的な例を図５に示す。４５Ｃ。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓからのｔｄｃをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２６０】
いくつかの実施態様では、トリプトファンからトリプタミンを産生する遺伝的に操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つ以上の酵素を含む１つまたは複数の遺伝子配列、および図１に示され説明される遺伝子欠失／図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。トリプトファンからトリプタミンを産生する遺伝的に改変された細菌はまた、トリプトファンを輸入することができる本明細書に記載の１つ以上のトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に含んでいてもよい。必要に応じて、いくつかの実施態様では、トリプトファンからトリプタミンを産生する遺伝的に改変された細菌は、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列も任意に含む。
インドール−３−アセトアルデヒド  （Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）  およびＦＩＣＺ
【０２６１】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを産生する１つまたは複数のトリプトファン異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。トリプトファンからのインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺの生産のための例示的な遺伝子カセットを図４１Ｂに示す。
【０２６２】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。  １つの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、エンコードＣ（エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼはＳ．セレビシエ由来である。一実施態様では、遺伝学的にバクテリアは、ａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に改変バクテリアは、一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ａｓｐＣおよびｉｐｄＣをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１（Ｌ−トリプトファンピルビン酸アミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含み、一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、１つ以上の遺伝子配列シロイヌナズナ由来のｔａａ１をコードするｃｅ（ｓ）。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔａａ１およびｉｐｄＣをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ。）由来のｓｔａＯをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。ＴＰ−Ａ０２７４。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ｓｔａＯおよびｉｐｄＣをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８からのＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｉｐｄＣをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａ０またはｔｒｐＤＨの１つ以上をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａ０またはｔｒｐＤＨおよびｉｐｄＣの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２６３】
トリプトファンからインドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを産生するためのさらなる例示的な遺伝子カセットを図４１Ｃに示す。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、エンコードされた（トリプトファンデカルボキシラーゼ）１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓからのｔｄｃをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、エンコードＤ（モノアミンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、大腸菌からのｔｙｎＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｄｃおよびｔｙｎＡをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２６４】
これらの実施態様のいずれかにおいて、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを産生する遺伝子操作された細菌はまた、任意に、トリプトファン産生のための１つまたは複数の酵素および遺伝子の欠失／または突然変異を含む１つまたは複数の遺伝子配列を含む  に示す。図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。いくつかの実施態様では、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを産生する遺伝子操作された細菌は、場合により、本明細書に記載の１つまたは複数のトランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含み、これを介してトリプトファン  インポートすることができます。場合によっては、いくつかの実施態様では、インドール−３−アセトアルデヒドおよびＦＩＣＺを産生する遺伝子操作された細菌は、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列も任意に含む。
インドール−３−アセトニトリル  （Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）
【０２６５】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。遺伝的に操作されたバクテリアがトリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成することを可能にするそのような遺伝子配列の非限定的な例を図４１Ｄに示す。
【０２６６】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｃｙｐ７９Ｂ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｅｎｃｏｄｅｃｙｐ７１ａ１３（インドールアセタルドオキシムデヒドラターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、シロイヌナズナ由来の１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２６７】
一の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、一の実施態様ではｃｙｐ７９Ｂ３（トリプトファン、Ｎ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つのまたは複数の遺伝子配列（単数または複数）を含む、遺伝子操作された細菌は、シロイヌナズナからｃｙｐ７９Ｂ３をコードする１つのまたは複数の遺伝子配列（単数または複数）を含みます。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、コード７９Ｂ３およびコード７１Ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２６８】
これらの実施態様のいずれかにおいて、トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを産生する遺伝子操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つ以上の酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および。図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを産生する遺伝子操作された細菌はまた、本明細書に記載の１つまたは複数のトランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含み、これを介してトリプトファン（単数または複数）  インポートすることができます。場合によっては、いくつかの実施態様では、トリプトファンからインドール−３−アセトニトリルを生成する遺伝的に操作された細菌もまた、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含む。
キヌレニン
【０２６９】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンからキヌレニンを産生する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。そのような遺伝子配列の非限定的な例を図１に示す。本明細書の他の箇所に記載されている。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ホモサピエンスからのＩＤＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＤＯ２（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ホモサピエンス由来のＤＯ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、プラスミド：キヌレニンホルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、マウス由来のＫｙｎｕｒｅｎｉｎｅホルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｄｍｉｄおよび／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｄｍ１と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ＢＮＡ２と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む．１つの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ＢＮＡ３（キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ一実施態様では、遺伝的に改変されたバクテリアは、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＢＮＡ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に改変されたバクテリアは、１つまたは複数の遺伝子を含み、この遺伝子改変バクテリアは、１つまたは複数の遺伝子配列を含み、一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｂｎａ２と組合わせてＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列（単数または複数）を含む。一実施態様では、遺伝子改変バクテリアは、１以上のｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２をコードする１以上の遺伝子配列を含む。一実施態様において、遺伝子操作されたバクテリアは、１以上の遺伝子配列（群）であり、これはａｆｍｉｄおよび／ｏｒｂｎａ３の１つ以上をコードする。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のｉｄ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２を、１つまたは複数のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３と組み合わせてコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２７０】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンからキヌレニンを産生する遺伝子操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つ以上の酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および図１に図示および記載される遺伝子欠失／図３９  図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。トリプトファンからキヌレニンを産生する遺伝子操作された細菌はまた、トリプトファンを輸入することができる本明細書に記載の１つまたは複数のトランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含んでいてもよい。  場合によっては、いくつかの実施態様では、トリプトファンからキヌレニンを産生する遺伝的に操作された細菌もまた、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含む。
キヌレン酸  （Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）
【０２７１】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンからキヌレニン酸を産生する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。そのような遺伝子配列の非限定的な例を図１に示す。本明細書の他の箇所に記載されている。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ホモサピエンスからのＩＤＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＤＯ２（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ホモサピエンス由来のＤＯ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＢＮＡ２（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＢＮＡ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、プラスミド：キヌレニンホルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、マウス由来のＫｙｎｕｒｅｎｉｎｅホルムアミダーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｄｍｉｄおよび／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つ以上と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｄｍ１と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｂｎａ２と組み合わせてＡｆｍｉｄをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ｃｃｌｂ１および／またはｃｃｃ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列および／またはａａａｄａｔおよび／または２をさらに含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＢＮＡ３一実施態様では、遺伝的に改変されたバクテリアは、Ｓ．セレビシエ由来のＢＮＡ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。ＢＮＡ２を、ｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２の１つまたは複数と組み合わせて含む一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｄｏ１と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。細菌は、ｔｄｏ２と組み合わせてＢＮＡ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＢＮＡ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含むｂｎａ２との交配。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、ｃｃｌｂ１および／またはｃｃｌｂ２および／またはａａｄａｄおよび／またはａｃｋ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列をさらに含む。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、１以上のｉｄｏ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２を含む。
【０２７２】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＧＯＴ２（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ミトコンドリア）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ホモサピエンス由来のＧＯＴ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＡＡＤＡＴ（キヌレニン／α−アミノアジペートアミノトランスフェラーゼ、ミトコンドリア）。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ホモサピエンス由来のＡＡＤＡＴをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ＣＣＬＢ１（キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ホモサピエンス由来のＣＣＬＢ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む）。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ＣＣＬＢ２（キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ３）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ホモからＣＣＬＢ２をコードする１つの実施態様において、遺伝子改変バクテリアは、ｃｃｌｂ１および／またはｃｃｌｂ２および／またはａａａｄａｔおよび／または２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様において、遺伝子操作されたバクテリアは、１以上のｉｄ１および／またはｔｄｏ２および／またはｂｎａ２を、１以上のａｆｍｉｄおよび／またはｂｎａ３と組み合わせて、そして１以上のｃｃｌｂ１および／またはｃｃｃ２および／またはａａａｄａｔおよび／または２と組み合わせてコードする。
【０２７３】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンからキヌレン酸を産生する遺伝子操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つ以上の酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および図１に示され、記載される遺伝子欠失／  図３９  図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。  トリプトファンからキヌレン酸を産生する遺伝的に改変された細菌は、トリプトファンを輸入することができる本明細書に記載の１つ以上のトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に含み、  。  場合によっては、いくつかの実施態様では、トリプトファンからキヌレン酸を産生する遺伝的に改変された細菌もまた、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含む。
インドール
【０２７４】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンからインドールを産生する１つまたは複数のトリプトファン異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。そのような遺伝子配列の非限定的な例を図１に示す。本明細書の他所に記載されている。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｎａＡ（トリプトファナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、大腸菌からのｔｎａＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０２７５】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンからインドールを産生する遺伝子操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つまたは複数の酵素、および図１に示され説明された遺伝子欠失／または突然変異を含む１つ以上の遺伝子配列を任意に含む。  図３９  図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。トリプトファンからインドールを産生する遺伝的に改変された細菌はまた、本明細書に記載の１つ以上のトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子配列を任意に含み、トリプトファンをそれを通して輸入することができる。場合によっては、いくつかの実施態様では、トリプトファンからインドールを産生する遺伝子操作された細菌もまた、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含む。
他のインドール代謝産物
【０２７６】
一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、インドール−３−カルビノール、インドール−３−アルデヒド、３，３’ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、インドロ（２）、インドール−３−アルデヒドを産生する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。  ３，２−ｂ）カルバゾール（ＩＣＺ）（インドールグルコシノレートからのもの）。そのような遺伝子配列の非限定的な例を図１に示す。本明細書の他所に記載されている。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｐｎｅ２（ミロシナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｐｎｅ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０２７７】
これらの実施態様のいずれにおいても、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つまたは複数の酵素、および図１に示され記載された遺伝子欠失／または突然変異を含む１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含む。図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂを参照する。いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、トリプトファンを輸入することができる、本明細書に記載の１つまたは複数のトランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子配列も任意に含む。場合によっては、いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌はまた、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる、本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を任意に含む。
インドール酢酸  （Ｉｎｄｏｌｅ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
【０２７８】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、インドール−３−酢酸を産生する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。
【０２７９】
そのような遺伝子配列の非限定的な例を図４２Ａ、図４２Ｂ、図４２Ｃ、図４２Ｄ、および図４２Ｅに示す。
【０２８０】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のａｒｏ９をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからａｓｐＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変バクテリアは、ｔａａ１（Ｌ−トリプトファンピルベートアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、シロイヌナズナからのｔａａ１をコードするｔｈａｌｉａｎａ）。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ。）由来のｓｔａＯをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。ＴＰ−Ａ０２７４）。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８からのｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓからのｉａｄ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＡＡＯ１（インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ）。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＡＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｐｄＣ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ａｒｏ９および／またはａｓｐＣから選択される酵素をコードする１つまたは複数の配列と組み合わせて、ｉｐｄＣ（エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列および／またはｔａａ１および／またはｓｔａＯおよび／またはｔｒｐＤＨを含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉａｄ１および／またはａａａ１から選択される酵素をコードする１つまたは複数の配列と組み合わせて、ｉｐｄＣ（エンテロバクター・クロアカエ由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ａｒｏ９および／またはａｓｐＣから選択される酵素を���ードする１つまたは複数の配列と組み合わせて、ｉｐｄＣ（エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列および／またはｔａａ１および／またはｓｔａＯから選択され、そしてｉａｄ１および／またはａａａ１から選択される酵素をコードする１以上の配列と組み合わせて使用され得る（例えば、図４２Ａ参照）。
【０２８１】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４２Ｂに示す。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、エンコードされた（トリプトファンデカルボキシラーゼ）１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓからのｔｄｃをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｙｎＡ（モノアミンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ｉａｄ１（Ｉｎｄｏｌｅ−３（配列番号２））をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓからのｉａｄ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＡＡＯ１（インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＡＯ１をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｅｎｃｏｄｅｔｄｃおよびｔｙｎＡの１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｅｎｃａｄｅｔｄｃおよびｉａｄ１および／またはａａａ１から選択される１つまたは複数の配列（群）を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｅｎｃｏｄｅｔｙｎＡおよびｉａｄ１および／またはａａａ１から選択される１つまたは複数の配列（単数または複数）を含む１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｅｎｃｏｄｅｔｄｃおよびｔｙｎＡの１つまたは複数の遺伝子配列と、ｉａｄ１および／またはａａａ１から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【０２８２】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４５Ｄに示す。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８からのＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｉｐｄＣ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ由来のインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１（インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓからのｉａｄ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｔｒｐＤＨの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の遺伝子配列、またはｉｐｄＣおよび／またはｉａｄ１。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｉｐｄＣおよびｉａｄ１の１つまたは複数をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２８３】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４２Ｃに示す。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、エンコード２（インドール−３−ピルビン酸モノオキシゲナーゼ）の１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）由来のエンコード２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏ９（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する）一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、エンコード９およびｙｕｃ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変バクテリアは、大腸菌からａｓｐＣをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、１つ以上の遺伝子（例えば、一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔａａ１（Ｌ−トリプトファンピルビン酸アミノトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔａａ１およびｙｕｃ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。遺伝的に操作された細菌は、ｓｔａＯ（Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ。）由来のｓｔａＯをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。  ＴＰ−Ａ０２７４。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｓｔａＯおよびｙｕｃ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８からのＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変バクテリアは、ｔｒｐＤＨおよびｙｕｃ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、ａｒｏ９またはａｓｐＣの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。  ｔａａ１またはｓｔａＯ  ｏｒｔｒｐＤＨ。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏ９またはａｓｐＣまたはｔａａ１またはｓｔａ０またはｔｒｐＤＨおよびｙｕｃ２のうちの１つ以上をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２８４】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４２Ｄ  に示す。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩａａＭ（トリプトファン２−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、シュードモナス・サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）からの１ａａをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｈ（インドールアセトアミド加水分解酵素）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、シュードモナス・サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）からのｉａａＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩａａＭおよびＩａａＨをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２８５】
酢酸生成のための遺伝子配列の別の非限定的な例を図４２Ｅに示す。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｃｙｐ７１ａ１３（インドールアセタルドキシムデヒドラターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、シロイヌナズナ由来の１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｎｉｔ１（ニトリラーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、シロイヌナズナからエンコードした１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｈ（インドールアセトアミド加水分解酵素）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含み、  。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｃｙｐ７９Ｂ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｃｙｐ７９Ｂ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｎｉｔ１および／またはｉａａＨをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｃｙｐ７９Ｂ３（トリプトファンＮ−モノオキシゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変バクテリアは、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、コード７９Ｂ３およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、コード７９Ｂ３およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列、ならびにｎｉｔ１および／またはｉａａＨを含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作された細菌は、７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３、ならびにｎｉｔ１および／またはｉａａＨをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子改変バクテリアは、シロイヌナズナ由来のｃｙｐ７９Ｂ３をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。一実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、７９Ｂ３およびｃｙｐ７１ａ１３をコードする１つ以上の遺伝子配列およびｎｉｔ１およびｉａａＨを含む。一実施態様では、遺伝子改変細菌は、７９Ｂ３、ｃｙｐ７９Ｂ２およびｃｙｐ７１ａ１３およびｎｉｔ１およびｉａａＨをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２８６】
これらの実施態様のいずれかにおいて、インドール酢酸を産生する遺伝的に改変された細菌はまた、トリプトファン産生のための１つ以上の酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂ示され説明される遺伝子欠失／を参照する。いくつかの実施態様では、インドール酢酸を産生する遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを輸入することができる、本明細書に記載の１つまたは複数のトランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子配列も任意に含む。場合によっては、いくつかの実施態様では、インドール酢酸を産生する遺伝的に改変された細菌は、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列も任意に含む。
インドール−３−プロピオン酸  （Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （ＩＰＡ））
【０２８７】
一実施態様では、遺伝子改変細菌は、トリプトファンからインドール−３−プロピオン酸を生成する１つ以上のトリプトファン異化酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。図４３Ａおよび図４３Ｂは、インドール−３−プロピオン酸の製造のための例示的な回路を示す。
【０２８８】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンアンモニアリアーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｒｒｉｖｉｖａｘ  ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃｕｓ由来のトリプトファンアンモニアリアーゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、インドール−３−アクリラートレダクターゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ボツリヌス菌由来のインドール−３−アクリラートレダクターゼをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。  いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンアンモニアリアーゼおよびインドール−３−アクリラートレダクターゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２８９】
図４５Ｅは、インドール−３−プロピオナート産生株の別の非限定的な例を示す。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来のｔｒｐＤＨをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ｆｌｄＡ（インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：３−乳酸ＣｏＡトランスフェラーゼ）。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｌｄＡをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣ（インドール−３−乳酸デヒドラターゼ）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｆｌｄＤ（インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のｆｌｄＤをコードする１以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ＡｃｕＩ（アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする１以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ロドバクター・スフェロイデス由来のＡｃｕＩをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｆｌｄＨ１（３−乳酸脱水素酵素１）をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子組み換え細菌は、ｆｌｄＨ２（インドール−３−乳酸デヒドロゲナーゼ２）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のｆｌｄＨ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。遺伝子操作された細菌は、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）からのｆｌｄＨ２をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む）。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはｆｌＤおよび／またはｆｌｄＨ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはｆｌＤおよび／またはｆｌｄＨ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはａｃｕｌおよび／またはｆｌｄＨ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｒｐＤＨおよび／またはｆｌｄＡおよび／またはｆｌｄＢおよび／またはａｃｕｌおよび／またはｆｌｄＨ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢおよびｆｌＤおよびｆｌｄＨ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡならびにｆｌｄＢおよびｆｌＤおよびｆｌｄＨ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢならびにａｃｕｌおよびｆｌｄＨ１をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨおよびｆｌｄＡおよびｆｌｄＢならびにａｃｕｌおよびｆｌｄＨ２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０２９０】
これらの実施態様のいずれかにおいて、インドール−３−プロピオン酸を産生する遺伝的に操作された細菌は、トリプトファン産生のための１つ以上の酵素を含む１つ以上の遺伝子配列、および図３９、図４５Ａおよび／または図４５Ｂに示されそして記載される遺伝子欠失を参照する。いくつかの実施態様では、インドール−３−プロピオン酸を産生する遺伝的に改変された細菌はまた、場合により、本明細書に記載の１つ以上のトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子配列を含み、それを通してトリプトファンが  輸入される。場合により、いくつかの実施態様では、インドール−３−プロピオン酸を産生する遺伝的に改変された細菌は、トリプトファンまたはその代謝産物のいずれかを輸出することができる本明細書に記載の輸出者をコードする１つまたは複数の遺伝子配列も任意に含む。
【０２９１】
特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン代謝産物の産生のための１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。  いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の異なるトリプトファン代謝産物をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。  特定の実施態様では、細菌は、トリプトファンおよび／またはインドール−３アセトアルデヒド、インドール−３−アセトニトリル、キヌレニン、キヌレニン酸、インドール、インドール酢酸（インドール−３−アセトニトリル）から選択されるトリプトファン代謝産物の生成のための１つまたは複数の酵素をコードする１つ以上の遺伝子配列  ＦＩＣＺ、インドール−３−プロピオン酸。
【０２９２】
これらの実施態様のいずれかにおいて、トリプトアミンおよび／またはインドール−３アセトアルデヒド、インドール−３−アセトニトリル、キヌレニン、キヌレン酸を含むがこれらに限定されないインドールおよび他のトリプトファン代謝産物の生成のための遺伝子配列の発現、インドール、インドール酢酸ＦＩＣＺ、インドール−３−プロピオン酸は、誘導性プロモーターの制御下にある。生合成カセットの発現を制御する例示的な誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症応答（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）によって誘導されるプロモーター、および  またはアラビノースおよびテトラサイクリンなどの腸内に天然には存在しない（例えば、外因的に付加され得る）。
【０２９３】
[0326]
インドール代謝産物／誘導体の製造のための例示的な回路を図４１Ａから図４１Ｈ、図４２Ａから図４２Ｅ、図４３Ａから図４３Ｂ、および図４５Ａから４５Ｅに示す。
【０２９４】
[表１３-１]
[表１３-２]
【０２９５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表１３の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、遺伝暗号の重複のために、表１３の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片と同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表１３の１つまたは複数の核酸配列またはその機能的フラグメント、または遺伝コードの重複のためであるが、表１３の１つまたは複数の核酸配列またはその機能的フラグメントと同一のポリペプチドをコードする核酸配列。
【０２９６】
一実施態様では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、全体と少なくとも約９０％一実施態様では、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様では、配列番号９５または配列番号９６の配列全体と少なくとも約９５％トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様において、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％配列番号９５または配列番号９６の全配列と９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施態様において、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の配列を含む。さらに別の業者トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号９５または配列番号９６の配列からなる。
【０２９７】
いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、トリプトファンをインドール−３−アルデヒドおよびインドール酢酸に、例えばトリプトファンアミノトランスフェラーゼカセットを介して変換する１つまたは複数の遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、遺伝的に改変された細菌は、内因性または外因性トランスポーターを介してトリプトファンを取り込み、さらに、インドール−３−アルデヒドおよびインドール酢酸を産生する  トリプトファンからの酸。いくつかの実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアは、場合によりトリプトファンおよび／またはインドール代謝産物エクスポーターを含む。
[表１４-１]
[表１４-２]
【０２９８】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、表１４の１つ以上の核酸配列またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝的に改変された細菌は、遺伝コードの重複のために、表１４の１つ以上の核酸配列またはその機能的フラグメントと同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、以下のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表１４の１つまたは複数の核酸配列またはその機能的断片、または遺伝コードの重複のためであるが、表１４の１つまたは複数の核酸配列と同じポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸配列。
【０２９９】
一実施態様において、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼは、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の配列と少なくとも約８５％一実施態様では、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施態様では、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約９０％  Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の態様において、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％配列番号９７または配列番号９８の全配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％または９９％配列全体と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％配列番号９７または配列番号９８のアミノ酸配列を含む。その実施態様において、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の配列を含む。さらに別の実施態様において、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号９７または配列番号９８の配列からなる。
【０３００】
遺伝子操作された細菌は、インドール−３−アルデヒドおよび／またはインドール酢酸および／またはトリプタミンを製造するための任意の適切な遺伝子を含み得る。いくつかの実施態様において、キヌレニンを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強し、インドール−３−アルデヒドおよび／またはインドール酢酸および／またはトリプタミン産生を増加させるために、および／または誘導条件下で抗炎症効力を増加させる。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアはまた、トリプトファンの取り込みまたは取り込みが増強されており、例えば、トランスポータまたはトリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させるための他の機構を含む。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアはまた、インドールトリプトファン代謝産物の高められた輸出を有し、例えば、先に詳述したように、トリプトファンの細菌細胞への取り込みを増加させる輸出者または他の機構を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、例えば炎症に関連する条件下で誘導条件下でインドール−３−アルデヒドおよび／またはインドール酢酸および／またはトリプタミンを生成することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、炎症または炎症反応に関連する分子または代謝産物の存在下で、またはある種の分子または代謝産物の存在下で、または他のいくつかの存在下で低酸素状態でキヌレニンを産生することができるアラビノースのような腸内に存在していてもいなくてもよい代謝物。
【０３０１】
表１５は、本開示の遺伝子操作された細菌によりコードされるそのような酵素のポリペプチド配列を含む。
［表１５-１]
［表１５-２]
［表１５-３]
［表１５-４]
［表１５-５]
［表１５-６]
［表１５-７]
［表１５-８]
【０３０２】
一実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９から配列番号１２６の１つ以上の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、トリプトファン経路異化酵素は、１以上の配列番号９９−配列番号１２６の配列全体と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様において、トリプトファン経路異化酵素は、１以上の配列全体と少なくとも約９０％１つの実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号９９−配列番号１２６の１つ以上の配列全体と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様においては、配列番号９９−トリプトファン経路異化酵素は、１つ以上の配列番号９９−配列番号１２６の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％配列全体と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％別の実施態様において、トリプトファン経路異化酵素は、１つ以上の配列番号９９から配列番号１２６の配列を含む。さらに別の実施態様において、トリプトファンは、配列番号９９−配列番号１２６の１つ以上の配列番号９９−経路異化酵素は、１つ以上の配列番号９９から配列番号１２６の配列からなる。
【０３０３】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン由来のトリプタミンの生産のための遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、本明細書中の上記のように、内因性または外因性のトランスポーターを介してトリプトファンを取り込む。一実施態様では、細菌はトリプトファンからトリプタミンをさらに産生する。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、必要に応じて、トリプタミン輸出者を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、生産されたインドール代謝産物の輸出を増加させるために、１つ以上のインドール代謝産物の輸出者を含む。
【０３０４】
インドール３−プロピオン酸（ＩＰＡ）
【０３０５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、インドール−３−プロピオナート（ＩＰＡ）の産物のための少なくとも１つの遺伝的回路を含む。いくつかの実施態様では、インドール−３−プロピオナート産生株は、場合によりコリスミ酸前駆体からトリプトファンを産生し、この株は、本明細書に記載のトリプトファン産生および／またはトリプトファン取り込み／輸送のための追加回路を任意に含む。さらに、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤＨ（トリプトファンから（インドール−３−イル）ピルビン酸を産生するＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来のトリプトファンデヒドロゲナーゼ）、ｆｌｄＡ（インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−プロピオン酸をインドール−３−プロピオン酸およびインドール−３−乳酸−ｃｏＡに変換する変換剤であるクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）由来の乳酸塩ＣｏＡトランスフェラーゼ、ｆｌｄＢおよびｆｌｄＣ（インドール−３インドール−３−ラクテート−ＣｏＡをインドール−３−アクリリル−ＣｏＡに変換するクロストリジウム・スポロゲネス由来のｆｌｄＤおよび／またはＡｃｕＩ：（インドール−３−アクリリル−ＣｏＡレダクターゼ、例えばクロストリジウム・スポロゲネスおよび／またはインドール−３−アクリロイル−ＣｏＡをインドール−３−プロピオニル−ＣｏＡに変換するロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のアクリロイル−ＣｏＡレダクターゼ）である。この回路はさらに、（インドール−３−イル）ピルビン酸をインドール−３−乳酸塩に変換するｆｌｄＨ１および／またはｆｌｄＨ２（インドール−３−乳酸デヒドロゲナーゼ１および／または２、例えばクロストリジウムスポロゲネス由来）を含む（例えば、図４４）。
【０３０６】
表１６は、インドール−３−プロピオナート産生細菌によってコードされる企図されたポリペプチド配列の非限定的な例を示す。
[表１６-１]
[表１６-２]
【０３０７】
一実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、配列番号１２７から配列番号１３３の１つ以上の全配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施態様において、トリプトファン経路異化酵素は、１以上の配列番号１２７−配列番号１３３の全配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、１以上の配列全体と少なくとも約９０％  １つの実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、１つ以上の配列番号１２７−配列番号１３３の全配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施態様においては、配列番号１２７−トリプトファン経路異化酵素は、１つまたは複数の配列番号１２７−配列番号１３３の全配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％  ８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％別の実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、１つ以上の配列番号１２７から配列番号１３３の配列を含む。さらに別の実施態様では、配列番号１２７から配列番号１３３の配列全体は、一実施態様では、トリプトファン経路異化酵素は、１つ以上の配列番号１２７から配列番号１３３の配列からなる。
【０３０８】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンまたはトリプトファン代謝産物から本明細書に記載の１つまたは複数のインドール経路代謝産物を生成するための遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、本明細書中の上記のように、内因性または外因性のトランスポーターを介してトリプトファンを取り込む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載された経路のいずれか、例えば図３９、図４５Ａ、４５Ｂによって、トリプトファンおよび／またはコリスミ酸をさらに産生する。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、生産されたインドール代謝産物の輸出を増加させるために、１つ以上のインドール代謝産物の輸出者を含む。
【０３０９】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下で、低酸素状態で記載された任意の１つまたは複数の回路を、関連する分子または代謝産物の存在下で発現することができるアラビノースまたはテトラサイクリンのような腸内に存在していても存在していなくてもよい他の代謝産物の存在下で、炎症反応または炎症反応または免疫抑制作用を有する。いくつかの実施態様では、記載された回路のうちの任意の１つ以上が、１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体の１つ以上の部位に組み込まれる。いくつかの実施態様において、トリプトファン合成および／またはトリプトファン異化カセット（単数または複数）は、誘導性プロモーターの制御下にある。アルテスト１配列の発現を制御し得る例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症応答（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）によって誘導されるプロモーター、および誘導されるプロモーターアラビノースおよびテトラサイクリンなどの腸内に天然に存在していてもいなくてもよい（例えば、外因的に付加されていてもよい）代謝産物である。
【０３１０】
また、いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、記載された回路の任意の１つまたは複数をさらに発現することができ、さらに以下の１つ以上を含む：（１）１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書中に記載されているかまたは当技術分野で公知のキルスイッチのいずれかなどの１つまたは複数のキルスイッチ回路、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載かまたは当業者に既知の輸送体のような、生物学的分子または基質を輸送するための１つまたは複数の輸送体、（５）本明細書に記載かまたは当業者に既知の排出輸送体のような、生物学的分子または基質を排出するための１つまたは複数の排出輸送体、（６）本明細書に記載され、当技術分野で知られている分泌回路のいずれかなどの１つ以上の分泌回路、および（７）そのような１つまたは複数の追加回路の組み合わせ。
トリプトファンリプレッサー（ＴｒｐＲ）
【０３１１】
これらの実施態様のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、そのリプレッサー機能を低下または消失させるように、任意に欠失、変異、または修飾されていてもよい。また、これらの実施態様のいずれかにおいて、遺伝子操作されたバクテリアは、トリプトファン前駆体であるコリスミアを産生するための配列（群）、例えばａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣをコードする配列（群）を任意に含む。
トリプトファンおよびトリプトファン代謝物の輸送
【０３１２】
代謝産物輸送体は、トリプトファンまたは細胞へのＫＰ代謝産物輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌においてさらに発現または改変され得る。
【０３１３】
ｙｄｄＧ遺伝子によってコードされる大腸菌の膜内タンパク質ＹｄｄＧは、公知のアミノ酸輸出業者ＲｈｔＡおよびＹｄｅＤの相同体である。研究により、ＹｄｄＧはトリプトファンを含む芳香族アミノ酸を輸出することができることが示されている。したがって、ＹｄｄＧは、トリプトファン輸出者またはトリプトファン分泌系（またはトリプトファン分泌タンパク質）として機能し得る。  他の芳香族アミノ酸の輸出業者は、Ｄｏｒｏｓｈｅｎｋｏら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、２７５：３１２−３１８（２００７）。したがって、いくつかの実施態様では、操作された細菌は、必要に応じて、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施態様では、操作された細菌はＹｄｄＧを過剰発現することができる。いくつかの実施態様では、操作されたバクテリアは、ｙｄｄＧ遺伝子の１つ以上のコピーを任意に含む。
【０３１４】
いくつかの実施態様では、操作された微生物は、キヌレニンを局所環境から細胞に輸入（輸送）する機構を有する。したがって、いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼセクレーターをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つ以上のコピーを含む。
【０３１５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンの細胞への取り込みを促進するためのトランスポーターを含む。３つの透過酵素、Ｍｔｒ、ＴｎａＢおよびＡｒｏＰは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるＬ−トリプトファンの取り込みに関与する。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＭｔｒ、ＴｎａＢ、およびＡｒｏＰの１つ以上のコピーを含む。
【０３１６】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、トランスポーター遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、異なる細菌種由来のトランスポート遺伝子も含む。いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、異なる細菌種に由来するトランスポーター遺伝子の複数のコピーを含む。  いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作されたバクテリア中の天然トランスポータ遺伝子は改変されていない。いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、天然プロモーター、誘導性プロモーター、または天然プロモーターよりも強力なプロモーター、例えばＧｌｎＲＳプロモーター、Ｐ（Ｂｌａ）プロモーター、  または構成的プロモーターである。
【０３１７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌の天然運搬体は改変されず、天然運搬体の１つ以上の追加コピーがペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーターの制御下でゲノムに挿入される。ＦＮＲプロモーター、またはペイロードまたは構成的プロモーターの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーターを含む。別の実施態様では、天然トランスポータ遺伝子は修飾されておらず、ペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲの制御下で、異なる細菌種由来の非天然輸送体遺伝子のコピーがゲノムに挿入されるプロモーター、またはペイロードの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターである。
【０３１８】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作されたバクテリア中の天然のトランスポーター遺伝子は改変されておらず、天然のトランスポータ遺伝子の１つ以上のさらなるコピーがプラスミド上のバクテリア中に存在し、発現を制御する同じ誘導性プロモーター例えば、ＦＮＲプロモーター、またはペイロードまたは構成的プロモーターの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーターを含むことができる。別の実施態様では、天然輸送体遺伝子は修飾されておらず、異なる細菌種由来の非天然運搬体遺伝子のコピーがプラスミド上の細菌中に存在し、ペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーターの制御下にある  例えば、ＦＮＲプロモーター、またはペイロードまたは構成的プロモーターの発現を制御するプロモーターとは異なる誘導性プロモーターであり得る。
【０３１９】
いくつかの実施態様では、天然輸送体遺伝子を変異誘発し、増加したアンモニア輸送を示す突然変異体を選択し、突然変異誘発輸送体を単離し、遺伝子操作された細菌に挿入する。いくつかの実施態様では、天然輸送体遺伝子が突然変異誘発され、増加したアンモニア輸送を示す突然変異体が選択され、それらの突然変異体が本発明の細菌を生産するために使用される。本明細書に記載のトランスポーター改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
【０３２０】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然輸送体は修飾されていない。１つまたは複数の追加のコピー、天然の大腸菌ニッスルトランスポーター遺伝子は、ペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターまたはそれとは異なる誘導性プロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅゲノムに挿入される。ペイロードまたは構成的プロモーターの発現を制御する。代替的な実施態様では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然輸送体遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然輸送体遺伝子、例えばラクトバチルス・プランタラムのコピーが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムの対照下に挿入される例えば、ＦＮＲプロモーター、またはペイロードまたは構成的プロモーターの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーターのような、ペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーターを含む。
【０３２１】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然輸送体遺伝子は改変されていない。１つまたは複数の追加のコピー、天然の大腸菌ニッスルトランスポーター遺伝子は、プラスミド上の細菌に存在し、ペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーターまたは異なる誘導性プロモーターペイロードの発現を制御するもの、または構成的プロモーターである。代替的な実施態様では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然輸送体遺伝子は改変されず、異なる細菌、例えばラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の非天然輸送体遺伝子のコピーが、細菌上にプラスミド上および対照下に存在するペイロードの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーター、またはペイロードの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターを含む。
分泌ポリペプチド
ＩＬ−１０
【０３２２】
いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０を産生することができる。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、クラス２サイトカインで、サイトカイン、インターフェロン、およびインターフェロン様分子、たとえば、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、およびリミチン（ｌｉｍｉｔｉｎ）などのようなものを含むカテゴリーにある。ＩＬ−１０は、二の受容体、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２を通してシグナル伝達する抗炎症性サイトカインである。ヒトＩＬ−１０の抗炎症特性には、炎症誘発性サイトカインのダウンレギュレーション、樹状細胞上の抗原提示の阻害または主要組織適合性複合体発現の抑制が含まれる。ＩＬ−１０および／またはその受容体の欠損は、ＩＢＤおよび腸の感受性と関連する（Ｎｉｅｌｓｅｎ（ニールセン）、２０１４）。ＩＬ−１０またはプロテアーゼインヒビターを発現する細菌は、たとえば、クローン病および潰瘍性結腸炎などのような状態を改善し得る（Ｓｉｍｐｓｏｎ（シンプソン）ら、２０１４）。遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０をコードする任意の適切な遺伝子、例は、ヒトＩＬ−１０を含み得る。いくらかの実施態様において、ＩＬ−１０をコードする遺伝子は、誘導条件下で安定性を増強し、ＩＬ−１０産生を増加させ、および／または抗炎症効力を増加させるために、修飾および／または変異される。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でＩＬ−１０を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−１０を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−１０をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号１３４またはその機能的フラグメントを含む核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号４９またはその機能的フラグメントの核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[表１７]
【０３２３】
野生型ＩＬ−１０（ｗｔＩＬ−１０）は、２つのペプチド鎖の二量化に構造依存性が依存するドメインスワップダイマーである。ＩＬ−１０は、６アミノ酸をループに挿入することによって単量体異性体に変換され、（例えば、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、Ｋ．ら、設計されたヒトインターロイキン−１０モノマーの設計および分析、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１３５５２−１３５５７（２０００）、およびＹｏｏｎ、ＳＩら、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＩＬ−１０は、変化したシグナル伝達特性に至る２段階の機構によってＩＬ−１０Ｒ１を関与させる（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７、２６５８６−２６５９５（２０１２））。モモモ化ＩＬ−１０は、このリンカーは、ＩＬ１０を二量体ではなく単量体として活性化させる（例えば、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、Ｋ．ら、設計されたヒトインターロイキン−１０モノマーの設計および分析、Ｊ．  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０Ｒ１を２工程メック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によってエンゲージする（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１３５５２−１３５５７（２０００）およびＹｏｏｎ、ハニズムシグネチャの変更されたプロパティにつながります。  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７、２６５８６−２６５９５（２０１２））。
【０３２４】
単量体タンパク質の分泌は、ペリプラズム空間における二量体化の余分な工程を回避して、利点を有し得る。さらに、適切な分泌系の選択においてより柔軟性がある。例えば、ｔａｔ依存性分泌系は、折り畳まれた様式でポリペプチドを分泌する。二量体はジスルフィド結合の形成なしには正確に折り畳まれない。しかしながら、ジスルフィド結合は、還元細胞内環境において形成することができず、ペリプラズムの酸化環境を形成することを必要とする。したがって、ｔａｔ依存性系は、二量体化が適切に機能することを必要とするタンパク質の分泌に適切ではない可能性がある。
【０３２５】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、単量体化ヒトＩＬ−１０を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、誘導条件下で、例えば炎症に関連する状態の下で、モノマー化ＩＬ−１０を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でモノマー化されたＩＬ−１０を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、単量体化ＩＬ−１０をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１９８またはその機能的断片を含む核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む配列番号１９８またはその機能的断片を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１９８によってコードされるポリペプチドをコードする配列またはその断片または機能変異体を含む。いくつかの実施態様において、細菌によって発現されるモノマー化ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−シグナル伝達を開始する。シグナリングはＳｔａｔシグナリングを含む。Ｔｙｒ７０５および／またはＳｅｒ７２７のリン酸化を介して行われる。
【０３２６】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ウイルスＩＬ−１０を産生することができる。細菌によってコードされる例示的なウイルスＩＬ−１０ホモログには、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ＩＬ−１０が含まれる。その抗炎症効果とは別に、ヒトＩＬ−１０は炎症誘発活性、例えばＢ細胞の成熟およびナチュラルキラー細胞の増殖の刺激も有する（Ｆｏｅｒｓｔｅｒら、生物学的に活性なヒトヘルペスウイルスインターロイキン−１０の分泌発現ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；１３：８２およびその中の参考文献を参照のこと）を介して、大腸菌内の類似体を同定することができる。対照的に、ウイルスＩＬ−１０相同体は、ｈＩＬ−１０の多くの生物学的活性を共有するが、ウイルスの進化中の選択圧および宿主免疫系を逃れる必要があるため、安定性の増加および免疫賦活機能の欠如を含むユニークな形質を示す（Ｆｏｅｒｓｔｅｒら、およびその中の参考文献）。このように、ウイルスの対応物は、抗炎症性および／または免疫抑制効果に関して、ｈＩＬ−１０よりも有用であり、場合によってはより有効であり得る。
【０３２７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、誘導条件下で、例えば炎症に関連する条件下でウイルスＩＬ−１０を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でウイルスＩＬ−１０を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ウイルスＩＬ−１０をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１９３および／または配列番号１９４またはその機能的断片を含む核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む配列番号１９３および／または配列番号１９４を含むか、またはその機能的断片である。いくつかの実施態様では、細菌によって発現されるウイルスｄ  ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２を刺激し、シグナル伝達を開始する。シグナリングはＳｔａｔシグナリングを含む。Ｔｙｒ７０５および／またはＳｅｒ７２７のリン酸化を介して行われる。
ＩＬ−２
【０３２８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−２を産生することができる。インターロイキン２（ＩＬ−２）は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のヘルス（健全性）を維持することによって自己免疫を媒介する。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３を発現するものを含み、典型的には、自己抗原に対して活性であるエフェクターＴ細胞を抑制し、およびその際、自己免疫活性を低下させる可能性がある。ＩＬ−２はＴｒｅｇ細胞の分化および活性を増強するためのサイトカインとして機能するが、一方で減少したＩＬ−２活性は自己免疫事象を促進することができる。ＩＬ−２は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって、および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびＮＫ  Ｔ細胞を含む他の免疫メディエーターによって生じる。ＩＬ−２は、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、およびＣＤ１３２が含まれる三つの鎖から構成されるＩＬ−２Ｒに結合する。ＩＬ−２は、胸腺におけるＴｒｅｇ細胞の増殖を促進する一方、全身循環におけるそれらの機能および活性を維持する。Ｔｒｅｇ細胞活性はＩＢＤ設定において複雑な役割を果たすと共に、マウスの研究は疾病病因（疾病病理発生とも言う）における保護的役割を示唆する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３５またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３５またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下でＩＬ−２を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−２を産生することができる。
[表１８]
ＩＬ−２２
【０３２９】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−２２を産生することができる。インターロイキン２２（ＩＬ−２２）サイトカインは、樹状細胞、リンパ系組織インデューサー様細胞、ナチュラルキラー細胞によって産生され、および適応リンパ球上に発現されることができる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の開始を通して、ＩＬ−２２発現は、抗微生物化合物の発現ならびに細胞増殖関連経路のある範囲を誘発することができ、双方とも組織修復機構を増強する。ＩＬ−２２は、腸バリアのフィデリティー（忠実度とも言う）および治癒を促進しながら、炎症状態を調節する上で重要である。マウスモデルはＩＬ−２２の施与後に改善された腸炎症状態を実証した。また、ＩＬ−２２はＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化して高められた粘液産生を促進し、バリア機能を保持する。ＩＢＤ感受性遺伝子とのＩＬ−２２の関連は、同様に疾患の表現型発現を調節し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３６またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３６またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、ＩＬ−２２を産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−２２を産生することができる。
[表１９]
【０３３０】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−２７を産生することができる。インターロイキン２７（ＩＬ−２７）サイトカインは、活性化抗原提示細胞によって主に発現される一方、ＩＬ−２７受容体は、中でもＴ細胞、ＮＫ細胞などを含め、ある細胞の範囲に見出される。特に、ＩＬ−２７は、炎症促進性Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞の発生を抑制し、これはＩＢＤ病因において重要な役割を果たす。さらに、ＩＬ−２７はＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の分化を促進し、およびＩＬ−１０産生量を高めることができ、それらの双方は抗炎症効果を有する。ＩＬ−２７は腸上皮細胞内のＭＡＰＫおよびＳＴＡＴシグナル伝達の活性化を介して、上皮バリア機能に対する保護効果を有する。さらに、ＩＬ−２７は、細菌増殖を抑える抗菌タンパク質の産生を増強する。バリア機能での改善および細菌増殖の減少はＩＢＤ病因におけるＩＬ−２７についての好ましい役割を示唆する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３７またはその機能的フラグメント（機能的断片とも言う）をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３７またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、ＩＬ−２７を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でＩＬ−２７を産生することができる。
[表２０]
【０３３１】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はＳＯＤを産生することができる。増加したＲＯＳレベルは炎症性腸疾患の病態生理に寄与する。増加したＲＯＳレベルは、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の高められた発現を導くことがあり、それは、炎症性メディエーターの疾病患部組織への転換を促すことができ、およびより一層大きな程度の炎症負荷をもたらす。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を含む抗酸化システムは、全体のＲＯＳ負荷を軽減するように機能することができる。しかし、研究は、ＩＢＤの設定におけるＳＯＤの発現が損なわれ、例えば、ＩＢＤにおいてより一層低いレベルで産生され、それにより疾患病状が進行されることを示す。さらなる研究は、大腸炎モデル内でラットにＳＯＤを補給することは、結腸脂質過酸化および内皮ＶＣＡＭ−１発現の減少ならびに炎症環境の全体的な改善に関連することを示した。したがって、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号１３８またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３８またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例えば、炎症に関連する状態（群）の下で、ＳＯＤを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でＳＯＤを産生することができる。
[表２１]
【０３３２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＧＬＰ−２またはプログルカゴンを産生することができる。グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）は、腸内分泌細胞によって産生され、腸の成長を刺激し、および消化管バリア機能を増強する。  ＧＬＰ−２施与は、ＩＢＤ、短腸症候群、および小腸腸炎の処置において治療上の可能性を有する（Ｙａｚｂｅｃｋ（ヤズベック）ら、２００９）。遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２またはプログルカゴンをコードする任意の適切な遺伝子、例は、ヒトＧＬＰ−２またはプログルカゴンを含み得る。いくらかの実施態様において、プロテアーゼインヒビター（抑制剤、阻害剤とも言う）、例は、ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤もＧＬＰ−２分解を減少させるために施与される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、分解耐性ＧＬＰ−２類似体、例は、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ（テデュグルチド）（Ｙａｚｂｅｃｋら、２００９）を発現する。いくらかの実施態様では、ＧＬＰ−２またはプログルカゴンをコードする遺伝子は、例は、安定性を増強し、ＧＬＰ−２産生を増加させ、および／または誘導条件下で消化管バリア増強効力を増加させるために、改変および／変異される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下でＧＬＰ−２またはプログルカゴンを産生することができる。ネズミモデルのＩＢＤにおけるＧＬＰ−２施与は、たとえば、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどのような炎症性メディエーターでの減少だけでなく、粘膜損傷および炎症の減少に関連する。さらに、ＧＬＰ−２補充はまた、大腸炎／回腸炎モデルにおいて粘膜ミエロペルオキシダーゼの減少をもたらし得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は配列番号１３９またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１３９またはその機能的断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導条件下で、例は、炎症に関連する状態（群）の下で、ＧＬＰ−２を産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下でＧＬＰ−２を産生することができる。
[表２２]
【０３３３】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、Ｇａｔｔｅｘおよびｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅを含むがこれらに限定されないＧＬＰ−２類似体を産生することができる。Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅは、ＧＬＰ−２のプロテアーゼ耐性類似体である。これは３３アミノ酸から構成され、１アミノ酸（アラニンはグリシンで置換されている）によってＧＬＰ−２とは異なる。この置換の重要性は、ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅがジペプチジルペプチダーゼ−４からのタンパク質分解に対してより耐性であるため、内因性ＧＬＰ−２よりも長い作用を示すことである。
[表２３]
【０３３４】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１４０またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む  配列番号１４０またはその機能的断片をコードする。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、誘発条件下で、例えば炎症に関連する状態の下で、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でＴｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅを産生することができる。
IL-19、IL-20、および/またはIL-24
【０３３５】
いくつかの実施態様では、遺伝的に操作された細菌は、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、および／またはＩＬ−２４を産生することができる。および／またはＩＬ−２４を誘導する条件下で、例えば炎症に関連する状態の下で投与することを含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下でＩＬ−１９、ＩＬ−２０および／またはＩＬ−２４を産生することができる。
炎症誘発性分子の阻害
【０３３６】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、炎症誘発性分子を抑制することが可能な分子を産生することができる。遺伝学的に操作された細菌は、任意の適切な抑制分子、例は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを発現してよく、それは、一以上の炎症誘発性分子、例は、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２６、ＩＬ−３２、アラキドン酸、プロスタグランジン（例は、ＰＧＥ２）セロトニン、トロンボキサン（例は、ＴＸＡ２）、ロイコトリエン（例は、ＬＴＢ４）、ヘポキシリン（ｈｅｐｏｘｉｌｌｉｎ）Ａ３、またはケモカインを中和することができる（Ｋｅａｔｅｓ（キートス）ら、２００８；Ａｈｍａｄ（アフマド）ら、２０１２）。遺伝学的に操作された細菌は、一以上の炎症促進性分子、例は、ＴＮＦ、ＩＬ−１７を抑制し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、表２４に示される一以上の分子を調節することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は一以上の炎症分子を抑制、除去、分解、および／または代謝することができる。
[表２４-１]
[表２４-２］
【０３３７】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生し、およびさらに炎症分子を阻害することができる分子を産生することができる。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生し、さらに炎症分子を分解することができる酵素を産生することができる。たとえば、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ブチラートを産生するための遺伝子カセット、ならびに炎症分子、例は、ＰＧＥ２を阻害、除去、分解、および／または代謝するための分子または生合成経路を発現することができる。
ＲＮＡｉ、ｓｃＦＶ、他の機構
【０３３８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、植物および動物における転写後遺伝子サイレンシング機構である。ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）がショート干渉（低分子干渉とも言う）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖にプロセシングされるとき活性化される（Ｋｅａｔｅｓ（キーツ）ら、２００８）。ＲＮＡｉは、標的細胞、たとえば、哺乳類細胞のようなものに対するｓｈＲＮＡの製造および配送のために設計される非病原性細菌によってインビトロおよびインビボで活性化されうる（Ｋｅａｔｅｓら、２００８）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子のＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを誘導する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、低酸素条件下でＴＮＦを標的とするｓｉＲＮＡを産生する。
【０３３９】
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、「ｗｉｄｅｌｙ  ｕｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ…  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（原核生物において産生される広く用いられる抗体断片）」である（Ｆｒｅｎｚｅｌ（フレンゼル）ら、２０１３）。ｓｃＦｖは、伝統的な抗体の定常ドメインを欠き、および単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現する。細菌、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどのようなものは、炎症促進性サイトカイン、たとえば、ＴＮＦを標的とするｓｃＦｖを産生することができる（Ｈｒｉｓｔｏｄｏｒｏｖ（フリストドロフ）ら、２０１４）。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子を中和するための結合タンパク質を発現する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は低酸素条件下でＴＮＦを標的とするｓｃＦｖを産生する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は低酸素条件下で一以上の炎症促進性分子を標的とするｓｃＦｖおよびｓｉＲＮＡの両方を産生する（例は、Ｘｉａｏ（シャオ）ら、２０１４参照）。
【０３４０】
当業者は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる追加の遺伝子および遺伝子カセットが当該技術で知られ、および本発明の遺伝学的に操作された細菌によって発現され得ることを理解するであろう。いくらかの実施態様において、治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、治療上分子の発現を増強するために、さらなる転写および翻訳エレメント、たとえば、リボソーム結合部位をも含む。
【０３４１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、二以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生する。一定の実施態様において、二以上の分子は、消化管炎症を減少させるために、および／または消化管バリア機能を強化するために、相乗的に挙動する。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、少なくとも一の抗炎症分子および少なくとも一の消化管バリア機能エンハンサー分子を発現する。一定の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０およびＧＬＰ−２を発現する。別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はＩＬ−１０およびブチラートを発現する。
【０３４２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、プロピオナート、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびブチラートを産生することができる。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ブチラート、およびプロピオナートを産生することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧＬＰ−２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＳＯＤ、ブチラート、およびプロピオナートが可能である。治療上分子の任意の適切な組合せは遺伝学的に操作された細菌によって産生され得る。
アミノ酸輸送能の向上した細菌株の作製
【０３４３】
培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さなゲノムのために、微生物は短縮された時間スケールで独特の表現型に進化することができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型の株を進化させるために選択的圧力下で微生物を継代するプロセスである。最も一般的には、これは、炭素／エネルギー源の利用を増加させるため、または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）にストレインを適応させるために適用され、炭素基質またはストレス下でより成長しやすい突然変異株は、人口は最終的に人口を支配するようになります。
【０３４４】
この同じプロセスは、栄養要求株を作製することによって、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求株は、必須代謝産物を合成することができない株であり、従って、増殖するために培地中に代謝産物を供給しなければならない。このシナリオでは、栄養要求株を作って代謝産物の量を減らすことによってそれを継代することにより、得られた優性株は、この必須代謝産物をより入手し、組み込むことができるはずである。
【０３４５】
例えば、アミノ酸を生成するための生合成経路が破壊された場合、前記アミノ酸の高親和性捕捉能を有する菌株は、ＡＬＥを介して進化させることができる。最初に、増殖を支持するための最小濃度が確立されるまで、栄養要求性アミノ酸の様々な濃度で株を増殖させる。次いで、その菌株をその濃度で継代し、一定の間隔でアミノ酸の濃度を下げて希釈する。時間が経つと、アミノ酸に最も競争力のある細胞（成長を制限する濃度で）が集団を支配するようになります。これらの菌株は、アミノ酸輸送体に変異を有する可能性が高く、その結果、必須および制限アミノ酸を輸入する能力が高まる。
【０３４６】
同様に、アミノ酸を形成するために上流の代謝産物を使用することができない栄養要求株を使用することによって、上流の代謝産物をより効率的に輸入することができるだけでなく、代謝産物を必須の下流の代謝産物に変換することができる。これらの株はまた、上流代謝産物の輸入を増加させるために突然変異を進化させるが、下流の酵素の発現または反応動力学を増加させる突然変異、または競合的基質利用経路を減少させる突然変異も含み得る。
【０３４７】
微生物に固有の代謝産物は、内在性代謝産物の増殖制限補充を適用した突然変異栄養要求および選択によって必須とすることができる。しかしながら、非天然化合物を消費することができる表現型は、それらの消費を必須化合物の生産に結びつけることによって進化させることができる。例えば、本質的な化合物または必須の化合物の前駆体を産生することができる異なる生物由来の遺伝子が単離された場合、この遺伝子は異種宿主において組換えにより導入および発現され得る。この新しい宿主株は、以前は非代謝性の基質から必須の栄養素を合成する能力を持つようになりました。
【０３４８】
これにより、直ぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求株を作製し、生育を制限する量の非天然化合物を組換え酵素の同時発現で選択することにより、同様のＡＬＥプロセスを適用することができる。これにより、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性、および下流の天然酵素の発現および活性に変異が生じる。このプロセスにおける重要な要件は、非天然代謝産物の消費を成長に不可欠な代謝産物の産生につなげる能力であることが強調されるべきである。
【０３４９】
選択メカニズムの基礎が確立され、補充の最低レベルが確立されたら、実際のＡＬＥ実験を続けることができる。このプロセスを通じて、いくつかのパラメータを注意深く監視する必要があります。培養物が指数増殖期に維持され、飽和／定常期に達することができないことが重要である。これは、各継代中に増殖率をチェックし、それに応じてその後の希釈率を調整しなければならないことを意味する。希釈率が大きくなる程度に成長率が向上すれば、栄養補給の濃度を低下させて、増殖速度を遅くし、選択圧を高め、継代中に部分集団を大きく偏らせるほどの希釈はしないようにすべきである。さらに、定期的に細胞を希釈し、固体培地で増殖させ、個々のクローンを試験して、ＡＬＥ培養物で観察される増殖速度の表現型を確認する必要がある。
【０３５０】
停止をいつ停止するか予測すると、ＡＬＥ実験はまた警戒を必要とする。進化を導く成功が実験を通して「スクリーニング」された突然変異の数に直接結びついており、突然変異は一般にＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂（ＣＣＤ）はスクリーニングされた全突然変異体の代理として作用する。これまでの研究では、異なる炭素源で増殖するための有益な表現型が約１０１１．２  ＣＣＤ１で分離できることが示されている。この速度は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン  （ＮＴＧ）  のような培養物への化学的突然変異誘発剤の添加によって加速され、ＤＮＡ複製エラーを増加させる。しかし、継続的な継代が成長率の限界に至るか、または成長率の改善をもたらさない場合、集団はある適応度の最大値に収束し、ＡＬＥ実験は停止することができる。
【０３５１】
ＡＬＥ実験の終了時に、細胞を希釈し、固体培地上で単離し、培養フラスコの成長表現型と一致する成長表現型についてアッセイする必要がある。選択されたものから最良のパフォーマーがゲノムＤＮＡのために準備され、全ゲノム配列決定のために送られる。改善された表現型を提供することができるゲノムの周りに現れる明らかな突然変異を伴う配列決定は、サイレント突然変異（有益ではないが所望の表現型を損なわないもの）も含む。  ＮＴＧまたは他の化学的突然変異誘発物質の存在下で進化した培養物では、より多くのサイレントなバックグラウンド突然変異が存在するであろう。現在の状態で最良の性能を示す歪みに満足すれば、ユーザーはその歪みを伴う適用に進むことができる。さもなければ、関与する突然変異は、ゲノム工学技術によって突然変異を親株に再導入することによって、進化した株からデコンボリューションされ得る。  Ｌｅｅ、Ｄ．Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ、Ａ．Ｍ．、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃ．Ｌ．＆Ｐａｌｓｓｏｎ、Ｂ．Ｏ．エシェリヒア・コリの適応実験室進化のための意味的タイムスケールとしての細胞分裂の累積数ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２６１７２（２０１１）。
【０３５２】
トリプトファンを消費または輸入するＥ．Ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ変異体を作製するために、同様の方法を使用することができる。
誘導性調節領域
ＦＮＲ依存性調節
【０３５３】
いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターを含む。特定の実施態様では、細菌細胞は、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、例えば、ラクタート、プロピオナート、アセタート、ＩＬ１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４、ＩＬ−１９、ＳＯＤ、ＧＬＰ２、および／またはトリプトファンおよび／またはその代謝産物を含むが、これらに限定されない１つ以上の抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子（群）を指す。いくつかの実施態様において、ペイロードは、フマル酸および硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）プロモーターの制御下で発現される。特定の実施態様では、細菌細胞は、フマル酸塩および硝酸塩の制御下で発現されるペイロード（例えば、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子）を産生するための１つまたは複数の遺伝子配列を含むレダクターゼレギュレーター（ＦＮＲ）プロモーターである。特定の実施態様では、細菌細胞は、治療分子が低酸素、微好気性または嫌気性で発現されるように、酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結されたペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。条件。例えば、低酸素状態では、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写調節因子によって活性化され、それによって治療分子（群）の産生を促進する。一定の実施態様では、遺伝学的操作細菌は、フマラートおよびナイトラート（硝酸）レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答プロモーター、アルギニンデイミナーゼおよびナイトラート還元（ＡＮＲ）応答性プロモーターの嫌気的調節、または異化性ナイトラート呼吸調節因子（ＤＮＲ）応答性プロモーターの制御下で発現され、それらは転写因子ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲによってそれぞれ調節され得る抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための一以上の遺伝子配列（群）を含む。大腸菌では、ＦＮＲは、好気性から嫌気性代謝への転換を制御する主な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７）。嫌気性状態では、ＦＮＲは、嫌気的増殖に適応する何百もの遺伝子を活性化する活性ＤＮＡ結合タンパク質に二量体化する。好気性状態では、ＦＮＲは酸素によって二量化することが防止され、不活性である。
【０３５４】
ＦＮＲ応答性プロモーターには、以下の表に列挙するＦＮＲ応答性プロモーターが含まれるが、これに限定されない。下線を付した配列は予想されるリボソーム結合部位であり、太字の配列はクローニングに使用される制限部位である。
［表２５］
【０３５５】
１つの実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４１を含む。別の実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４２を含む。別の実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１４３を含む。別の実施態様において、ＦＮＲ応答性プロモーターは配列番号１４４を含む。さらに別の実施態様では、ＦＮＲ応答性プロモーターは配列番号１４５を含む。さらなるＦＮＲ応答性プロモーターを以下に示す。
[表２６-１]
[表２６-２]
[表２６-３]
【０３５６】
いくつかの実施態様では、遺伝子発現は、例えばリボソーム結合部位の最適化および／またはｍＲＮＡ安定性の増加など、当該分野で公知の方法によってさらに最適化される。ＦＮＲプロモーター配列は当該技術で知られ、および任意の適切なＦＮＲプロモーター配列（群）を本発明の遺伝学的に操作された細菌に使用することができる。任意の適切なＦＮＲプロモーターを、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための任意の適切な遺伝子または遺伝子カセットと組み合わせてもよい。非制限的なＦＮＲプロモーター配列は表２６に提供される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、以下の一以上を含む：配列番号１４６、配列番号１４７、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号１４８）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１４９）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号１５０）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号１５１）、強いリボソーム結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５２）、強力なリボソーム結合部位に融合したｙｄｆＺプロモーター（配列番号１５３）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導された低分子ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号１５４またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号１５５）、ｃｒｐ結合部位に融合したｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５６）、およびｃｒｐ結合部位に融合したｆｎｒＳ（配列番号１５７）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、または１５７、またはそれらの機能的断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０３５７】
いくつかの実施態様では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が、遺伝子操作された細菌に挿入される。別の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、代替の酸素レベル依存性プロモーター、例えばＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７）の制御下で発現されるペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列を含む。これらの実施態様では、ペイロードの発現は、腸のような低酸素または嫌気性環境で特に活性化される。一実施態様では、哺乳動物の腸はヒト哺乳動物の腸である。
【０３５８】
他の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための一以上の遺伝子配列は、転写アクチベーター（転写活性化因子）、例は、ＣＲＰの結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。グルコースのような迅速に代謝可能な炭水化物が存在する場合、ＣＲＰ（サイクリックＡＭＰ受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質またはＣＡＰ）は、取り込み、代謝、および好ましくない炭素源の同化に関与する遺伝子を抑制することによって、細菌において主要な調節的役割を果たす（Ｗｕら、２０１５）。このグルコースの選択は、グルコース抑制、および炭素代謝産物抑制（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８）と呼ばれている。いくつかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、ＣＲＰ結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための一以上の遺伝子配列は、ＣＲＰ結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。これらの実施態様では、環状ＡＭＰは、グルコースが環境中に存在しない場合にＣＲＰに結合する。この結合は、ＣＲＰの立体配座変化を引き起こし、ＣＲＰがその結合部位に強く結合することを可能にする。次いで、ＣＲＰ結合は、直接のタンパク質  −  タンパク質相互作用を介してＦＮＲプロモーターにＲＮＡポリメラーゼを動員することにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下では、サイクリックＡＭＰはＣＲＰに結合せず、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写が抑制される。いくつかの実施態様では、転写活性化因子の結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）を用いて、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生する遺伝子または遺伝子カセット十分な量のグルコースが存在する場合、例えばインビトロで成長培地にグルコースを添加することによって、嫌気性条件下で発現されない。
【０３５９】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株またはサブ系由来の酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株またはサブ系由来の酸素レベル感知転写因子、例えばＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株またはサブ系由来の酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種の酸素レベル依存性転写調節因子および／またはプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子、例えば、低酸素または嫌気性環境でペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列の転写を、同じ条件下で細菌中の天然の遺伝子およびプロモーターに結合する。特定の実施態様では、非天然酸素レベル依存性転写調節因子は、淋菌由来のＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年参照）。いくつかの実施態様では、対応する野生型転写調節因子は無傷のままであり、野生型活性を保持する。別の実施態様では、対応する野生型転写調節因子を欠損または突然変異させて野生型活性を減少または排除する。
【０３６０】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存転写調節因子、例えばＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲ、および野生型プロモーターに対して同じサブタイプの細菌から突然変異した対応するプロモーターを含む。変異プロモーターは、野生型転写調節因子への結合を増強し、同じ条件下で野生型プロモーターと比較して、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させる。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えばＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲプロモーター、および野生型転写調節因子に対して同じサブタイプの細菌から変異した対応する転写調節因子を含む。突然変異型転写制御因子は、野生型プロモーターへの結合を増強し、同じ条件下で野生型転写調節因子と比較して低酸素または嫌気性環境で前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させる。特定の実施態様では、変異型酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を増強するアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２００６参照）。いくらかの実施態様では、酸素レベル感知転写調節因子および対応するプロモーターの両方が、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子の発現を低酸素条件下に増加させるために同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０３６１】
いくつかの実施態様では、本明細書に開示される細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内在性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施態様では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子がプラスミド上に存在する。いくつかの実施態様では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施態様において、酸素レベルを感知する転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施態様において、酸素レベルを感知する転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、同じプラスミド上に存在する。
【０３６２】
いくつかの実施態様では、酸素レベル感知転写制御因子をコードする遺伝子が染色体上に存在する。いくつかの実施態様において、酸素レベルを感知する転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施態様において、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、同じ染色体上に存在する。
【０３６３】
場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることが有利であり得る。いくつかの実施態様では、転写調節因子の発現は、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施態様では、転写調節因子の発現は、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施態様において、転写調節因子およびペイロードは、プロモーター領域から発散的に転写される。
【０３６４】
いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、および低酸素条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様において、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体において存在し、および低酸素条件によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様において、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、発現は、例えば、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることなど、当技術分野で公知の方法によってさらに最適化される。
【０３６５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子または遺伝子カセットを有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、宿主細胞において発現され得、そして宿主細胞は、インビトロで、例えば、培地中で、および／またはインビボで（例えば、腸内で）、生存および／または増殖することができる。いくらかの実施態様において、細菌は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットは低コピープラスミドにて発現される。いくらかの実施態様において、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、低コピープラスミドは非誘導条件下で漏出性発現（ｌｅａｋｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を減少させるために有用であり得る。いくらかの実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットは高コピープラスミドで発現される。いくらかの実施態様において、高コピープラスミドは遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるために有用であり得る。いくらかの実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に発現される。
【０３６６】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）の複数のコピーを含み得る。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）はプラスミド上に存在し、および酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生することができる遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）は染色体において存在し、および酸素レベル依存性プロモーターに作動可能に連結される。
【０３６７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、低酸素条件下で少なくとも一の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下同じサブタイプの未修飾細菌と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍だけ減少させる。炎症は、当技術で知られる方法、例は、内視鏡検査を用いて病変の病巣を計数すること；末梢血におけるＴ制御細胞の分化を、例は、蛍光活性化選別によって検出すること；Ｔ調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症性バイオマーカーを、例は、ｑＰＣＲによってアッセイすること；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキットによって測定し得る（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）（メソスケール、ケイマン・ケミカル、キアゲン）。
【０３６８】
いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍以上のペイロード、例えば、同じ条件下での同じサブタイプの未修飾細菌よりも低酸素状態の１つ以上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を含む。特定の非改変細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を有さないであろう。これらの細菌の遺伝的に改変された形態を使用する実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は、低酸素条件下で検出可能である。
【０３６９】
特定の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子は酪酸塩である。質量分析法、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのブチラートレベルの測定方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３参照）。いくつかの実施態様において、酪酸塩は、酪酸塩レベル／細菌の光学密度（ＯＤ）として測定される。いくつかの実施態様では、ブチロジーニクウ遺伝子カセット中の１つ以上の遺伝子産物の活性および／または発現の測定は、ブチラート産生の代理測定として役立つ。いくつかの実施態様では、本発明の細菌細胞を採取し、溶解させて酪酸生産を測定する。別の実施態様では、細菌細胞培地中で酪酸生産を測定する。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約５００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１μＭ／ＯＤ、少なくとも約１０μＭ／ＯＤ、少なくとも約１００μＭ／ＯＤ、少なくとも約５００μＭ／ＯＤ、少なくとも約１ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約少なくとも約１０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３０ｍＭ／ＯＤ、または少なくとも約５０ｍＭ／ＯＤの酪酸塩を低酸素状態で使用する。
【０３７０】
特定の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はプロピオナートである。質量分析法、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによるプロピオナートのレベルの測定方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈｉｌｌｍａｎ、１９７８；  Ｌｕｋｏｖａｃら、２０１４参照）。いくつかの実施態様では、プロピオナート遺伝子カセット中の１つ以上の遺伝子産物の活性および／または発現を測定することは、プロピオナート産生のプロキシ測定として役立つ。いくつかの実施態様では、本発明の細菌細胞を採取し、プロピオナート産生を測定するために溶解させる。別の実施態様では、プロピオナート産生を細菌細胞培地中で測定する。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ  、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、または少なくとも約５０ｍＭの低酸素状態のプロピオナート。
ＲＮＳ依存性調節
【０３７１】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現される１つまたは複数のペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列を発現する遺伝子操作された細菌は、炎症状態によって活性化されるプロモーターの制御下にある。一実施態様では、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、炎症環境、例えば反応性窒素種またはＲＮＳプロモーターで活性化される炎症依存性プロモーターの制御下で発現される。
【０３７２】
本明細書中で使用される場合、「反応性窒素種」および「ＲＮＳ」は、分子窒素に由来する高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを指すために交換可能に使用される。ＲＮＳはニトロソ性ストレスのような細胞の有害作用を引き起こす可能性があります。ＲＮは、一酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシナイトライトまたはペルオキシナイトライトアニオン（ＯＮＯＯ−）、二酸化窒素（ＮＯ２）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）、ペルオキシニトロセルロース酸（ＯＮＯＯＨ）およびニトロペルオキシカルボナート（ＯＮＯＯＣＯ２−）  （・で示される不対電子）。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することができる転写因子を進化させてきた。異なるＲＮＳシグナル伝達経路は、異なるＲＮＳレベルによって誘発され、異なる動態で起こる。
【０３７３】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」は、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流遺伝子を活性化する、１つまたは複数のＲＮＳ感受性転写因子が結合することができる核酸配列を指す発現；ＲＮＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、および／または調節領域を活性化する。いくつかの実施態様では、ＲＮＳ誘導調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施態様では、転写因子はＲＮＳを感知し、続いてＲＮＳ誘導性制御領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現を活性化する。別の実施態様では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下ではＲＮＳ誘導調節領域に結合している。ＲＮＳの存在下で、転写因子はコンホメーション変化を受け、それにより下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＮＳ誘導性調節領域は、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結されていてもよい。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子はＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ誘導性制御領域を活性化し、それにより、作動可能に連結された遺伝子配列の発現を促進する。したがって、ＲＮＳは遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。
【０３７４】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＳ抑制解除調節領域」は、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、１つ以上のＲＮＳセンス転写因子が結合することができる核酸配列を指す。ＲＮＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合せず、調節領域を抑制しない。いくつかの実施態様において、ＲＮＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＮＳ抑制解除調節領域は、ペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結され得る。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子はＲＮＳを感知し、もはや調節領域に結合および／または抑制せず、それにより、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子カセットを抑制解除する。したがって、ＲＮＳは遺伝子の発現を抑制する。
【０３７５】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ抑制可能調節領域」とは、１つ以上のＲＮＳ感受性転写因子が結合することができる核酸配列を指し、対応する転写因子の結合は下流遺伝子発現を抑制する。ＲＮＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、調節領域を抑制する。いくつかの実施態様では、ＲＮＳ抑制可能な調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施態様では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。別の実施態様では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流の調節領域に結合することができる。ＲＮＳ抑制性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子カセットに作動可能に連結され得る。例えば、ＲＮＳの存在下では、転写因子はＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それにより、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子配列の発現を遮断する。したがって、ＲＮＳは遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。
【０３７６】
本明細書で使用される「ＲＮＳ応答調節領域」は、ＲＮＳ誘導調節領域、ＲＮＳ抑制可能調節領域、および/またはＲＮＳ抑制解除調節領域をいう。いくつかの実施態様では、ＲＮＳ応答調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＮＳ感受性転写因子に結合することができる。ＲＮＳおよびそれらの対応するＲＮＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域を感知する転写因子の例としては、表２７に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。
[表２７]
【０３７７】
いくつかの実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの反応性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、ペイロードを生成するために１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結され、したがってＲＮＳレベルに対するペイロードの発現を制御する。例えば、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり、ペイロードは本明細書に記載されたペイロードのいずれかである。ＲＮＳが例えば炎症を起こした組織に存在する場合、ＲＮＳ感知転写因子は調節領域に結合および／または活性化してペイロードの発現を駆動する。その後、炎症が緩和されると、ＲＮＳレベルが低下し、ペイロードの産生が減少または排除される。
【０３７８】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり；ＲＮＳの存在下で、転写因子がＲＮＳを感知し、およびＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子群の発現が促進される。いくらかの実施態様では、転写因子はＲＮＳを感知し、および続いてＲＮＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導調節領域に結合し；転写因子がＲＮＳを感知するとき、それはコンフォメーション変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
【０３７９】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり、およびＲＮＳを感知する転写因子はＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ｉｓ  ａｎ  ＮＯ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｒＶＷ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｌａｖｏｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｄｕｃｅ  ＮＯ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｕｓ  ｏｘｉｄｅ（フレーバーブレドキシンおよび関連するフラビンタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発現を調節するＮＯ応答性転写活性化因子であり、それはＮＯを亜酸化窒素に還元する」（Ｓｐｉｒｏ（スピロ）２００６）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＮｏｒＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＮｏｒＲによって活性化され得る遺伝子は当該技術で知られる（例は、Ｓｐｉｒｏ、２００６；Ｖｉｎｅ（バイン）ら、２０１１；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙ（カーリンシー）ら、２０１２；表１参照）。特定の実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列に作動可能に連結されたｎｏｒＶＷ由来のＲＮＳ誘導性制御領域を含む。ＲＮＳの存在下では、ＮｏｒＲ転写因子はＲＮＳを感知し、ｎｏｒＶＷ調節領域に活性化し、それにより、作動可能に連結された遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットの発現を駆動し、ペイロードを産生する。
【０３８０】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ誘導性調節領域であり、およびＲＮＳを感知する転写因子はＤＮＲである。ＤＮＲ（異化性ナイトラート呼吸調節因子）は、酸化窒素の存在下で「ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｒ，  ｔｈｅ  ｎｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｓ  ｇｅｎｅｓ（ｎｉｒ、ｎｏｒおよびｎｏｓ遺伝子の発現を促進する）」（Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＤＮＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。ＤＮＲによって活性化され得る遺伝子は当技術において知られる（例は、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９；Ｇｉａｒｄｉｎａ（ジャルディナ）ら、２００８；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例は、ブチロジーニック遺伝子カセットに作動可能に連結されるｎｏｒＣＢ由来のＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＤＮＲ転写因子はＲＮＳを感知し、ｎｏｒＣＢ調節領域に活性化し、それにより、作動可能に連結された遺伝子の発現を駆動し、１つ以上のペイロードを生成する。いくつかの実施態様では、ＤＮＲは緑膿菌ＤＮＲである。
【０３８１】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ抑制解除調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑える。ＲＮＳの存在下、転写因子はもはや調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットが抑制解除される。
【０３８２】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ抑制解除調節領域であり、およびＲＮＳを感知する転写因子はＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ａｎ  Ｒｒｆ２−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ［ｔｈａｔ］  ｃａｎ  ｓｅｎｓｅ  ＮＯ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ＮＯ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（Ｒｒｆ２型転写抑制因子で、［それは］ＮＯを感知し、およびＮＯ代謝を担う遺伝子の発現を制御することができる）」（Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＮｓｒＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含み得る。いくらかの実施態様では、ＮｓｒＲはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ナイセリア・ゴノレエ）ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲによって抑制され得る遺伝子は当該技術で知られる（例は、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９；Ｄｕｎｎ（ダン）ら、２０１０；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子群に作動可能に連結されたｎｏｒＢ由来のＲＮＳ抑制解除調節領域を含む。ＲＮＳの存在下では、ＮｓｒＲ転写因子はＲＮＳを感知し、もはやｎｏｒＢ調節領域に結合せず、それによってペイロードを生成し、ペイロードを生成するために作動可能に連結された遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットを脱抑制する）。
【０３８３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌において著しい数の自然な遺伝子の発現を調節しないＲＮＳ感知性転写因子を発現することが有利である。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ感知性転写因子を発現し、そこでは、転写因子は本発明の遺伝学的操作細菌において調節配列に結合しない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、およびＲＮＳ感知性転写因子はＮｓｒＲで、例は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来であり、そこでは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは前記ＮｓｒＲについての結合部位を含まない。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【０３８４】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＮＳ抑制性調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑制し；ＲＮＳの存在下、転写因子はＲＮＳを感知し、およびＲＮＳ抑制性調節領域に結合し、それによって作動可能に連結される遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子は、プロモーター配列の上流または下流の調節領域に結合することができる。
【０３８５】
これらの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のペイロードを発現するために使用される２つのリプレッサー活性化調節回路を含むことができる。２つのリプレッサー活性化制御回路は、第１のＲＮＳ感知リプレッサーと、ペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結された第２のリプレッサーとを含む。これらの実施態様の１つの態様において、ＲＮＳ感知性抑制因子は遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する第２の抑制因子の転写を抑制する。これらの実施態様において有用な第２の抑制因子の例には、制限されないが、ＴｅｔＲ、Ｃ１、およびＬｅｘＡが含まれる。第１の抑制因子による結合がない場合（ＲＮＳの不存在下で生じる）、第２の抑制因子が転写され、それは遺伝子または遺伝子群の発現を抑制する。第１の抑制因子による結合の存在下で（ＲＮＳの存在下で起こり）、第２の抑制因子の発現は抑制され、ペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列が発現される。
【０３８６】
ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝学的に操作された細菌において使用される調節領域配列に応じて、遺伝子発現を誘導、抑制解除、または抑制することができる。１つ以上のタイプのＲＮＳ感知性転写因子および対応する調節領域配列は、遺伝学的に操作された細菌において存在し得る。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、１つのタイプのＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲ、および対応する１つの調節領域配列、例は、ｎｏｒＢからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、１つのタイプのＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲ、および２つ以上の異なる対応する調節領域配列、例は、ｎｏｒＢおよびａｎｉＡからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、２つ以上のタイプのＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲおよびＮｏｒＲ、および２つ以上の対応する調節領域配列、例は、ｎｏｒＢおよびｎｏｒＲからのものそれぞれを含む。１つのＲＮＳ応答調節領域は、１よりも多くの転写因子に結合することができてよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、２つ以上のタイプのＲＮＳ感知性転写因子および１つの対応する調節領域配列を含む。いくつかのＲＮＳ調節された調節領域の核酸配列は当該技術で知られる（例は、Ｓｐｉｒｏ、２００６；Ｉｓａｂｅｌｌａら、２００９；Ｄｕｎｎら、２０１０；Ｖｉｎｅら、２０１１；Ｋａｒｌｉｎｓｅｙら、２０１２参照）。
【０３８７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子、例は、ｎｓｒＲ遺伝子を含み、それはその自然なプロモーター、誘導性プロモーター、自然なプロモーターよりも強力なプロモーター、例は、ＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御される。場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下でＲＮＳ感知性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子および治療上の分子は、プロモーター領域から発散的に転写される。
【０３８８】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ感知性転写因子のための遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ応答性調節領域を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＮＳ感知性転写因子および対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知性転写因子および調節領域は、同じ条件下で同じサブタイプの細菌からの自然な転写因子および調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させることができる。
【０３８９】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感知性転写因子、ＮｓｒＲ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の対応する調節領域、ｎｓｒＲを含む。いくらかの実施態様では、自然なＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲは無傷のままであり、および野生型活性を保持する。代替的な実施態様では、野生型活性を減少または排除するために、自然なＲＮＳ感知性転写因子、例は、ＮｓｒＲを欠失または変異させる。
【０３９０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする内在性遺伝子、例は、ｎｓｒＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＮＳ感知性転写因子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＮＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０３９１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳ感受性転写因子、例は、ＮｓｒＲ遺伝子をコードする野生型遺伝子、および対応する調節領域、例は、ｎｏｒＢ調節領域を含み、それは、同じサブタイプの細菌由来の野生型調節領域に対して変異される。変異した調節領域は、同じ条件下で野生型調節領域と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢ調節領域、および同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異される対応する転写因子、例は、ＮｓｒＲを含む。変異型転写因子は、同じ条件下で野生型転写因子と比較して、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させる。いくつかの実施態様では、ＲＮＳ感受性転写因子および対応する調節領域の両方が、ＲＮＳの存在下でペイロードの発現を増加させるために、同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０３９２】
いくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリア機能エンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、およびＲＮＳによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくらかの実施態様では、発現は、当技術で知られる方法によって、例は、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることによってさらに最適化される。
【０３９３】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝子（群）のいずれかを、一以上の組込み部位で細菌染色体に組み込むことができる。たとえば、ペイロードの一以上のコピーを細菌染色体に組み込むことができる。染色体に組み込まれた遺伝子または遺伝子（群）の複数のコピーを有することにより、ペイロードのより一層多くの産生が可能になり、および発現レベルの微調整も可能になる。あるいはまた、治療上の遺伝子（群）または遺伝子カセット（群）に加えて、ここに記載の異なる回路、たとえば、任意の分泌回路または輸出回路などのようなものを、一以上の異なる組込み部位で細菌染色体に組み込んで、複数の異なる機能を実行することができた。
【０３９４】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、ＲＮＳの存在下で少なくとも１つの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下、同じサブタイプの未修飾細菌に比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍減少させる。炎症は、当技術で知られる方法、例は、内視鏡検査を用いて疾患病変を計数すること；末梢血におけるＴ制御細胞の分化を、例は、蛍光活性化選別によって検出すること；Ｔ調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症バイオマーカーを、例は、ｑＰＣＲによってアッセイすること；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキットによって測定することができる（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）。
【０３９５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子についてＲＮＳの存在下で、同じ条件下で同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍多く生成する。一定の非修飾細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を有さないであろう。これらの細菌の遺伝子修飾形態を使用する実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はＲＮＳの存在下で検出可能であろう。
【０３９６】
一定の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルを測定する方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってのものは、当該技術において知られる（例は、Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル／細菌光学密度（ＯＤ）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセットにおいて一以上の遺伝子産物の活性および／または発現の測定は、ブチラート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地においてブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＮＳの存在下でブチラートの少なくとも約１ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約５００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１μＭ／ＯＤ、少なくとも約１０μＭ／ＯＤ、少なくとも約１００μＭ／ＯＤ、少なくとも約５００μＭ／ＯＤ、少なくとも約１ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約５ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３０ｍＭ／ＯＤ、または少なくとも約５０ｍＭ／ＯＤを生成する。
ROS依存性調節
【０３９７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくつかの実施態様では、細胞損傷の状態によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌である。一実施態様では、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、細胞または組織の損傷が存在する環境で活性化される細胞損傷依存性プロモーターの制御下で発現される（例えば、反応性  酸素種またはＲＯＳプロモーターである。
【０３９８】
本明細書中で使用される場合、「活性酸素種」および「ＲＯＳ」は、分子酸素から誘導される高度に活性な分子、イオンおよび／またはラジカルを指すために交換可能に使用される。  ＲＯＳは、好気性呼吸または金属触媒酸化の副産物として生成することができ、酸化的損傷などの有害な細胞作用を引き起こす可能性がある。  ＲＯＳは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ）、スーパーオキシドまたはスーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）  （Ｏ２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、一酸化窒素（ＮＯ２）、過酸化亜硝酸塩または過酸化亜硝酸塩アニオン（ＯＮＯＯ−）（不対電子は・で示す）。細菌は、ＲＯＳレベルを感知することができる転写因子を進化させてきた。異なるＲＯＳシグナル伝達経路は、異なるＲＯＳレベルによって誘発され、異なる動態で起こる（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４）。
【０３９９】
本明細書中で使用される場合、「ＲＯＳ誘導調節領域」は、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流遺伝子を活性化する、１つまたは複数のＲＯＳ感受性転写因子が結合することができる核酸配列を指す発現；ＲＯＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、および／または調節領域を活性化する。いくつかの実施態様では、ＲＯＳ誘導調節領域はプロモーター配列を含む。いくつかの実施態様では、転写因子はＲＯＳを感知し、続いてＲＯＳ誘導調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現を活性化する。別の実施態様では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下ではＲＯＳ誘導調節領域に結合している。ＲＯＳの存在下で、転写因子はコンフォメーション変化を受け、それにより下流の遺伝子発現を活性化する。ＲＯＳ誘導調節領域は、ペイロードを生成するための１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結されていてもよい。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えばＯｘｙＲがＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ誘導調節領域を活性化し、それにより、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子配列の発現を推進する。したがって、ＲＯＳは遺伝子または遺伝子の発現を誘導する。
【０４００】
本明細書中で使用される場合、「ＲＯＳ脱抑制調節領域」は、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、１つ以上のＲＯＳ感受性転写因子が結合することができる核酸配列を指す。ＲＯＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合せず、抑制もしない。いくつかの実施態様において、ＲＯＳ抑制解除調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＯＳ抑制解除調節領域は、ペイロードを生成するために１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結されてもよい。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えばＯｈｒＲはＲＯＳを感知し、もはや調節領域に結合および／または抑制せず、それにより、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子カセットを抑制解除する。したがって、ＲＯＳは遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制する。
【０４０１】
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ抑制性調節領域」は、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑制する、１つ以上のＲＯＳ感受性転写因子が結合することができる核酸配列を指す。ＲＯＳの存在下では、転写因子は調節領域に結合し、調節領域を抑制する。いくつかの実施態様において、ＲＯＳ抑制性調節領域は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施態様において、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。別の実施態様では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流の調節領域に結合することができる。ＲＯＳ抑制性調節領域は、遺伝子配列または遺伝子配列に作動可能に連結され得る。例えば、ＲＯＳの存在下では、転写因子、例えばＰｅｒＲはＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑制性制御領域に結合し、それにより、作動可能に連結された遺伝子配列または遺伝子配列の発現を遮断する。したがって、ＲＯＳは遺伝子または遺伝子配列の発現を抑制する。
【０４０２】
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ応答調節領域」は、ＲＯＳ誘導調節領域、ＲＯＳ抑制性調節領域、および／またはＲＯＳ抑制解除調節領域をいう。いくつかの実施態様において、ＲＯＳ応答調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＯＳ感受性転写因子に結合することができる。ＲＯＳおよびそれらの対応するＲＯＳ応答性遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域を感知する転写因子の例としては、表２８に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。
[表２８-１]
[表２８-２]
【０４０３】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも一の活性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調整可能な調節領域を含む。調整可能調節領域は、１つ以上のペイロードの発現を直接または間接的に駆動し、そうしてＲＯＳレベルに対してペイロード（群）の発現を制御することができる遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結される。  たとえば、調整可能な調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり、および分子はブチラートであり；ＲＯＳが存在するとき、例は炎症組織において、ＲＯＳ感受性転写因子は調節領域を結合および／または活性化し、ペイロード（群）の遺伝子配列の発現を駆動し、それによってペイロード（群）が産生される。その後、炎症が緩和されるとき、ＲＯＳレベルが低下し、およびペイロード（群）の産生が減少または排除される。
【０４０４】
いくらかの実施態様では、チューナブル（調整可能な）調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり；ＲＯＳの存在下で、転写因子はＲＯＳを感知し、およびＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が促進される。いくらかの実施態様では、転写因子はＲＯＳを感知し、および続いてＲＯＳ誘導性調節領域に結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代わりの実施態様では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下で、ＲＯＳ誘導性調節領域に結合する。転写因子がＲＯＳを感知するとき、それはコンフォメーションの変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
【０４０５】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり、およびＲＯＳを感知する転写因子はＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ａｓ  ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ（主に過酸化水素ストレス応答の全体的調節因子として機能し」、および多数の遺伝子、例は、「ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ２  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ｋａｔＥ，  ａｈｐＣＦ），  ｈｅｍｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ｈｅｍＨ），  ｒｅｄｕｃｔａｎｔ  ｓｕｐｐｌｙ  （ｇｒｘＡ，  ｇｏｒ，  ｔｒｘＣ），  ｔｈｉｏｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  （ｄｓｂＧ），  Ｆｅ−Ｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ｒｅｐａｉｒ  （ｓｕｆＡ−Ｅ，  ｓｕｆＳ），  ｉｒｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  （ｙａａＡ），  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｍｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  （ｆｕｒ）（Ｈ２Ｏ２解毒（ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成（ｈｅｍＨ）、還元剤供給（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔｒｘＣ）、チオール−ジスルフィド異性化（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ−Ｓ中心修復（ｓｕｆＡ−Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合（ｙａａＡ）、鉄の取り込みシステムの抑制（ｆｕｒ）」および「ＯｘｙＳ，  ａ  ｓｍａｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＲＮＡ（ＯｘｙＳ、低分子調節性ＲＮＡ）」（Ｄｕｂｂｓ（ダブス）ら、２０１２）において関与する遺伝子を調節可能である。遺伝学的に操作された細菌は、ＯｘｙＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｘｙＲによって活性化され得る遺伝子はこの技術において知られる（例は、Ｚｈｅｎｇ（ツェン）ら、２００１；Ｄｕｂｂｓら、２０１２；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ペイロードを産生するために１つ以上の遺伝子配列に作動可能に連結されたｏｘｙＳ由来のＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例は、Ｈ２Ｏ２の存在下、ＯｘｙＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびｏｘｙＳ調節領域に対して活性化し、それによって作動可能に連結されたペイロード（群）の発現を駆動し、およびペイロード（群）を産生する。いくらかの実施態様において、ＯｘｙＲはＥ．  ｃｏｌｉのｏｘｙＲ遺伝子によってコードされる。いくらかの実施態様において、ｏｘｙＳ調節領域はＥ．ｃｏｌｉのｏｘｙＳ調節領域である。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓ、およびａｈｐＣの調節領域から選定される。
【０４０６】
代わりの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ誘導性調節領域であり、およびＲＯＳを感知する対応する転写因子はＳｏｘＲである。ＳｏｘＲが「ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ［２Ｆｅ−２Ｓ］  ｃｌｕｓｔｅｒ，  ｉｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＳｏｘＳ，  ｗｈｉｃｈ  ｔｈｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（その［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターの酸化によって活性化されるとき、それはＳｏｘＳの合成を増加させ、次いで、その標的遺伝子発現を活性化する）」（Ｋｏｏ（クー）ら、２００３）。「ＳｏｘＲ  ｉｓ  ｋｎｏｗｎ  ｔｏ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｔｏ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ（ＳｏｘＲは主にスーパーオキシドおよび一酸化窒素に反応することが知られ）（Ｋｏｏら、２００３）、Ｈ２Ｏ２にも応答することが可能である。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＳｏｘＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＳｏｘＲによって活性化され得る遺伝子は、当該技術で知られる（例は、Ｋｏｏら、２００３；表１参照）。特定の実施態様では、本発明の遺伝子操作された細菌は、一の遺伝子に作動可能に連結されたｓｏｘＳ由来のＲＯＳ誘導調節領域を含む。ＲＯＳの存在下、ＳｏｘＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それによってペイロード（群）を生成しペイロード（群）を生成する ために作動可能に連結された遺伝子、遺伝子（群）、または遺伝子カセットの発現を駆動する。
【０４０７】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制解除調節領域であり、および対応する転写因子の結合は下流の遺伝子発現を抑制し；ＲＯＳの存在下、転写因子はもはや調節領域に結合せず、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットが脱抑制される。
【０４０８】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制解除調節領域であり、およびＲＯＳを感知する転写因子はＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは、「ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｈｒＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｅｂｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ（ｏｈｒＡプロモーター部位と重複する一対の逆方向反復ＤＮＡ配列に結合し、およびそれによって転写事象を抑制する）」が、酸化型ＯｈｒＲは「ｕｎａｂｌｅ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ｉｔｓ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔ（そのＤＮＡ標的に結合できない）」（Ｄｕａｒｔｅ（デュアルテ）ら、２０１０）。ＯｈｒＲは、「ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ［ｔｈａｔ］…  ｓｅｎｓｅｓ  ｂｏｔｈ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ＮａＯＣｌ（有機過酸化物およびＮａＯＣｌの両方を感知する［ところの］転写抑制因子）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）であり、「ｗｅａｋｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ２Ｏ２  ｂｕｔ  ｉｔ  ｓｈｏｗｓ  ｍｕｃｈ  ｈｉｇｈｅｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ（Ｈ２Ｏ２によって弱く活性化されるが、それは有機ヒドロペルオキシドに対してはるかに高い反応性を示す）」（Ｄｕａｒｔｅら、２０１０）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＯｈｒＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＯｈｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術において知られる（例は、Ｄｕｂｂｓら、２０１２；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結されるｏｈｒＡからのＲＯＳ抑制解除調節領域を含む。  ＲＯＳ、例は、ＮａＯＣｌの存在下、ＯｈｒＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびもはやｏｈｒＡ調節領域に結合せず、それによってペイロード（群）を産生しペイロード（群）を生成するために 、作動可能に連結された遺伝子、遺伝子（群）、または遺伝子カセットを脱抑制する。
【０４０９】
ＯｈｒＲはＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「Ｍｏｓｔ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭａｒＲ  ｆａｍｉｌｙ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｆｔｅｎ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  −１０  ｏｒ  −３５  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔｅｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ（ＭａｒＲファミリーのほとんどのメンバーは転写抑制因子であり、およびしばしばＲＮＡポリメラーゼ結合の立体的抑制を引き起こすプロモーターにおいて−１０または−３５領域に結合する）」（Ｂｕｓｓｍａｎｎ（バスマン）ら、２０１０）。このファミリーの他のメンバーは、当技術で既知であり、および制限されないが、ＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲ、およびＳａｒＺが含まれる。いくらかの実施態様では、ＲＯＳを感知する転写因子はＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、および／またはＳａｒＺであり、および本発明の遺伝学的に操作された細菌はＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、および／またはＳａｒＺによって抑制される遺伝子由来の１つ以上の対応する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲ、および／またはＳａｒＺによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Ｄｕｂｂｓら、２０１２参照）。
【０４１０】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制解除調節領域であり、およびＲＯＳを感知する対応する転写因子はＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「１８−ｂｐ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８９）（コンセンサス配列ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡ（配列番号２８９）で１８ｂｐの逆方向反復）」に結合し、および「ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｎｔ  Ｈ２Ｏ２（酸化剤Ｈ２Ｏ２によって可逆的に抑制される）」（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０）、「ａ  ＭａｒＲ−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＭａｒＲタイプ転写調節因子）」である。ＲｏｓＲは、制限されないが、「ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｃｇ１３２２，  ｇｅｎｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｒｏｓＲ），  ａ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ｃｇｔＳ９），  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｐ／ＦＮＲ  ｆａｍｉｌｙ  （ｃｇ３２９１），  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  （ｃｇ１４２６），  ｔｗｏ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＦＭＮ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ  （ｃｇ１１５０  ａｎｄ  ｃｇ１８５０），  ａｎｄ  ｆｏｕｒ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  （ｃｇ０８２３，  ｃｇ１８４８，  ｃｇ２３２９，  ａｎｄ  ｃｇ３０８４）（推定ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１３２２、ｒｏｓＲの上流およびそれから発散する遺伝子）、知覚性ヒスチジン（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）キナーゼ（ｃｇｔＳ９）、Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリーの推定転写調節因子、グルタチオンＳトランスフェラーゼファミリー（ｃｇ０８２３）、二つの推定ＦＭＮレダクターゼ（ｃｇ１１５０およびｃｇ１８５０）、および四つの推定モノオキシゲナーゼ（ｃｇ１８２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９、およびｃｇ３０８４））」を含む多くの遺伝子および推定遺伝子を抑制することができる（Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲｏｓＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＲｏｓＲによって抑制され得る遺伝子は当技術で既知である（例は、Ｂｕｓｓｍａｎｎら、２０１０；表１参照）。一定の実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセットに作動可能に連結されるｃｇｔＳ９由来のＲＯＳ抑制解除性調節領域を含む。ＲＯＳ、例は、Ｈ２Ｏ２の存在下、ＲｏｓＲ転写因子はＲＯＳを感知し、およびもはやｃｇｔＳ９調節領域に結合せず、それによってペイロードを生成しペイロードを生成するために、作動可能に結合した遺伝子、遺伝子（群）、または遺伝子カセットを脱抑制する。
【０４１１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌において著しい数の自然遺伝子の発現を調節しないＲＯＳ感受性転写因子を発現することが有利である。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ感知性転写因子を発現し、そこでは転写因子は本発明の遺伝学的操作細菌において調節配列に結合しない。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり、およびＲＯＳ感知性転写因子はＲｏｓＲ、例は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（コリネバクテリウム・グルタニカム）由来であり、そこではＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは前記ＲｏｓＲのための結合部位を含まない。いくらかの実施態様では、異種転写因子は、内因性調節領域および遺伝学的に操作された細菌における遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または排除する。
【０４１２】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制性制御領域であり、および対応する転写因子の結合は下流遺伝子発現を抑制し；ＲＯＳの存在下、転写因子はＲＯＳを感知し、およびＲＯＳ抑制性制御領域に結合し、それによって作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現が抑制される。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子はプロモーター配列の一部と重複する調節領域に結合することができる。代わりの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子はプロモーター配列の上流または下流である調節領域に結合することができる。
【０４１３】
いくらかの実施態様では、調整可能な調節領域はＲＯＳ抑制性調節領域であり、およびＲＯＳを感知する転写因子はＰｅｒＲである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌とも言う）では、ＰｅｒＲは「ｗｈｅｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＤＮＡ，  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  （ｋａｔＡ，  ａｈｐＣ，  ａｎｄ  ｍｒｇＡ），  ｍｅｔａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  （ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ，  ｆｕｒ，  ａｎｄ  ｚｏａＡ）  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ｐｅｒＲ）（ＤＮＡに結合するとき、酸化ストレス応答（ｋａｔＡ、ａｈｐＣ、およびｍｒｇＡ）、金属恒常性（ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒ、およびｚｏａＡ）およびそれ自身の合成（ｐｅｒＲ）に関与するタンパク質をコードする遺伝子を抑制する）」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４）。ＰｅｒＲは、「ｇｌｏｂａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｔｏ  Ｈ２Ｏ２（主としてＨ２Ｏ２に応答するグローバルレギュレーター（包括調節因子とも言う））」であり（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）、および「ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｅｒ  ｂｏｘ，  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  （ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）  ｒｅｓｉｄｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｎｅａｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＰｅｒＲ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｇｅｎｅｓ（ｐｅｒボックス、ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内およびその近くに存在する特定のパリンドロームコンセンサス配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）（配列番号２９０）にてＤＮＡと相互作用する）」（Ｍａｒｉｎｈｏら、２０１４）。ＰｅｒＲは、「ｏｖｅｒｌａｐｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｒ  ｉｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｆｒｏｍ  ｉｔ（プロモーターの一部と重複するか、またはプロモーターからのすぐ下流にある）」調節領域に結合することができる（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＰｅｒＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。ＰｅｒＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Ｄｕｂｂｓら、２０１２；表１参照）。
【０４１４】
これらの実施態様では、遺伝子改変細菌は、アミノ酸異化酵素を発現するために使用される２つのリプレッサー活性化調節回路を含むことができる。  ２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＯＳ感知リプレッサー、例えばＰｅｒＲ、および遺伝子または遺伝子カセット、例えばそれ以上のペイロードに作動可能に連結された第２のリプレッサー、例えばＴｅｔＲを含む。これらの実施態様の１つの態様において、ＲＯＳ感知性抑制因子は、遺伝子または遺伝子カセットの転写を抑制する第２の抑制因子の転写を抑制する。これらの実施態様において有用な第２の抑制因子の例としては、ＴｅｔＲ、Ｃ１、およびＬｅｘＡが挙げられるが、これらに制限されない。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性抑制因子はＰｅｒＲである。いくらかの実施態様では、第２の抑制因子はＴｅｔＲである。この実施態様において、ＰｅｒＲ抑制性制御領域はＴｅｔＲの発現を駆動し、およびＴｅｔＲ抑制性調節領域は遺伝子または遺伝子カセット、例は、アミノ酸異化酵素の発現を駆動する。
ＰｅｒＲ結合がない場合（ＲＯＳの不存在下で生じる）、ｔｅｔＲが転写され、およびＴｅｔＲは遺伝子または遺伝子カセット、例は、１以上の抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子（群）の発現を抑制する。ＰｅｒＲ結合の存在下では（ＲＯＳの存在下で起こる）、ｔｅｔＲ発現が抑制され、および遺伝子または遺伝子カセットが発現される。
【０４１５】
ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝学的に操作された細菌において使用される調節領域配列に依存して、遺伝子発現を誘発、抑制解除、または抑制することができる。たとえば、「ＯｘｙＲ  ｉｓ  ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｔｈｏｕｇｈｔ  ｏｆ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｕｎｄｅｒ  ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ…  ＯｘｙＲ  ｃａｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｅｉｔｈｅｒ  ａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｕｎｄｅｒ  ｂｏｔｈ  ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ＯｘｙＲは主に酸化条件下で転写活性化因子と考えられている・・・が、ＯｘｙＲは酸化状態および還元状態の両方で抑制因子またはアクチベーターとして機能することができ）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）、およびＯｘｙＲは「ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｓｈｏｗｎ  ｔｏ  ｂｅ  ａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｆｈｕＦ  （ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｆｅｒｒｉｃ  ｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）  ａｎｄ  ｆｌｕ  （ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４３  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（それ自体の発現の抑制因子であること、ならびにｆｈｕＦ（鉄イオンレダクターゼをコードする）およびｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のものであることが示された）」（Ｚｈｅｎｇら、２００１）。本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＯｘｙＲによって抑制される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含み得る。いくらかの実施態様において、ＯｘｙＲは上記のように、２つの抑制因子活性化調節回路において用いられる。ＯｘｙＲによって抑制され得る遺伝子は、当技術で既知である（例は、Ｚｈｅｎｇら、２００１；表１参照）。または、たとえば、ＲｏｓＲは多数の遺伝子を抑制することができるが、一定の遺伝子、例は、ｎａｒＫＧＨＪＩオペロンを活性化することもできる。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、ＲｏｓＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。さらに、「ＰｅｒＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｈａｓ  ａｌｓｏ  ｂｅｅｎ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ…ａｎｄ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｉｎｖｏｌｖｅ  ＰｅｒＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｓｉｔｅｓ（ＰｅｒＲ媒介陽性調節も観察されており、そして．遠隔上流部位へのＰｅｒＲ結合を含むようである）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＰｅｒＲによって活性化される遺伝子由来の任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。
【０４１６】
１つ以上のタイプのＲＯＳ感知性転写因子および対応する調節領域配列が、遺伝学的に操作された細菌において存在し得る。たとえば、「ＯｈｒＲ  ｉｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｃｏｒｅｓｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｅｉｔｈｅｒ  ＯｘｙＲ  ｏｒ  ＰｅｒＲ  ｏｒ  ｂｏｔｈ（ＯｈｒＲは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に見出され、およびＯｘｙＲまたはＰｅｒＲまたは両方とも共存することができる）」（Ｄｕｂｂｓら、２０１２）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、１つのタイプのＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲ、および１つの対応する調節領域配列、例は、ｏｘｙＳからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、１つのタイプのＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲ、および２つ以上の異なる対応する調節領域配列、例は、ｏｘｙＳおよびｋａｔＧからのものを含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、２以上のタイプのＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲおよびＰｅｒＲ、および２以上の対応する調節領域配列、例は、それぞれｏｘｙＳおよびｋａｔＡからのものを含む。１つのＲＯＳ応答性調節領域は、１よりも多くの転写因子に結合することができる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、２以上のタイプのＲＯＳ感知性転写因子および１つの対応する調節領域配列を含む。
【０４１７】
いくつかの例示的なＯｘｙＲ調節された調節領域の核酸配列を表２９に示す。ＯｘｙＲ結合部位に下線を付し、および太字で示す。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１５８、１５９、１６０、または１６１、またはその機能的断片のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[表２９]
【０４１８】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、その自然プロモーター、誘導性プロモーター、誘導性プロモーター、自然プロモーターよりも強いプロモーター、例は、ＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子、例は、ｏｘｙＲ遺伝子を含む。いくらかの場合、発現安定性を高めるために誘導性プロモーターの制御下でＲＯＳ感知性転写因子を発現させることが有利であり得る。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子の発現は、治療上の分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子の発現は、治療上分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくらかの実施態様において、ＲＯＳ感知性転写因子および治療上分子はプロモーター領域から発散的に転写される。
【０４１９】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ感知性転写因子の遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ応答性調節領域を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細菌の異なる種、菌株、または亜株由来のＲＯＳ感知受性転写因子および対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知性転写因子および調節領域は、ＲＯＳの存在下で前記調節領域に作動可能に連結された遺伝子の転写を、同じ条件下で同じサブタイプの細菌からの自然転写因子および調節領域と比較して、増加させることができる。
【０４２０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳ感知性転写因子、ＯｘｙＲ、および対応する調節領域、ｏｘｙＳ、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のものを含む。いくらかの実施態様では、自然なＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲは無傷のままであり、および野生型活性を保持する。代替的な実施態様では、野生型活性を減少または排除するために、自然なＲＯＳ感知性転写因子、例は、ＯｘｙＲが欠損または変異される。
【０４２１】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする内因性遺伝子、例は、ｏｘｙＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じものの上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。いくらかの実施態様において、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする遺伝子および治療上の分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
【０４２２】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳ感知性転写因子をコードする野生型遺伝子、例は、ｓｏｘＲ遺伝子、および対応する調節領域、例は、ｓｏｘＳ調節領域を含み、それは、同じサブタイプの細菌由来の野生型調節領域に対して変異される。変異した調節領域は、ＲＯＳの存在下でペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の発現を、同じ条件下で野生型調節領域と比較して増加させる。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳ調節領域、および対応する転写因子、例は、ＯｘｙＲを含み、それは同じサブタイプの細菌由来の野生型転写因子に対して変異される。変異型転写因子は、ＲＯＳの存在下でペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の発現を、同じ条件下で野生型転写因子と比較して増加させる。いくらかの実施態様では、ＲＯＳ感知性転写因子および対応する調節領域の両方が、ペイロードの発現をＲＯＳの存在下で増加させるために、同じサブタイプの細菌由来の野生型配列に対して変異される。
【０４２３】
いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列がプラスミド上に存在し、ＲＯＳによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体に存在し、ＲＯＳによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施態様では、発現は、例えば、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることなど、当技術分野で公知の方法によってさらに最適化される。
【０４２４】
いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施態様において、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、ＲＯＳ応答調節領域に作動可能に連結される。いくつかの実施態様において、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体に存在し、ＲＯＳ応答調節領域に作動可能に連結される。
【０４２５】
したがって、いくつかの実施態様では、遺伝子操作されたバクテリアまたは遺伝子操作されたウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、反応性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーターまたは反応性の制御下の１つ以上のアミノ酸異化酵素を産生する窒素種（ＲＮＳ）依存性プロモーター、および対応する転写因子を含む。
【０４２６】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列を保持するように、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む宿主細胞で発現させることができ、宿主細胞は、例えば、培地および／またはインビボで、インビトロで生存および／または増殖することができる。いくつかの実施態様において、細菌は、ペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列の複数のコピーを含み得る。いくつかの実施態様において、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、低コピープラスミドで発現される。いくつかの実施態様において、低コピープラスミドは、発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施態様では、低コピープラスミドは、非誘導条件下での漏出発現を減少させるために有用であり得る。いくつかの実施態様では、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、高コピープラスミドで発現される。いくつかの実施態様において、高コピープラスミドは、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列の発現を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施態様において、ペイロードを生成するための１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体上に発現される。
【０４２７】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的操作細菌は、ＲＯＳの存在下で少なくとも１つの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生して、局所消化管炎症を、同じ条件下、同じサブタイプの未修飾細菌に比べ、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍だけ減少させる。炎症は、当技術において既知の方法、例は、内視鏡検査を用いて病変の病巣を計数すること；末梢血におけるＴ制御細胞の分化を検出すること、例は、蛍光活性化選別によるもの；Ｔ調節細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の領域を測定すること；炎症バイオマーカーをアッセイすること、例は、ｑＰＣＲによるもの；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）によって測定することができる。
【０４２８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳの存在下、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を、同じ条件下で同じサブタイプの未修飾細菌よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍より多く生成する。一定の非修飾細菌は、検出可能なレベルの抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を有しないであろう。これらの細菌の遺伝子修飾形態を使用する実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はＲＯＳの存在下で検出可能である。
【０４２９】
一定の実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子はブチラートである。ブチラートレベルの測定方法、例は、質量分析、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものは、当技術において既知である（例は、Ａｂｏｕｌｎａｇａら、２０１３参照）。いくらかの実施態様において、ブチラートはブチラートレベル／細菌光学密度（ＯＤ）として測定される。いくらかの実施態様では、ブチロジーニック遺伝子カセット中の１つ以上の遺伝子産物の活性および／または発現の測定は、ブチラート産生のプロキシ測定として役立つ。いくらかの実施態様では、本発明の細菌細胞を収集し、および溶解させてブチラート生産を測定する。代わりの実施態様では、細菌細胞培地中でブチラート生産を測定する。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＲＯＳの存在下、ブチラートの少なくとも約１ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約５００ｎＭ／ＯＤ、少なくとも約１μＭ／ＯＤ、少なくとも約１０μＭ／ＯＤ、少なくとも約１００μＭ／ＯＤ、少なくとも約５００μＭ／ＯＤ、少なくとも約１ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約５ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約１０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約２０ｍＭ／ＯＤ、少なくとも約３０ｍＭ／ＯＤ、または少なくとも約５０ｍＭ／ＯＤを生成する。
複数の作用メカニズム
【０４３０】
いくらかの実施態様において、細菌は、複数の異なる作用を実行する複数の作用機構（ＭＯＡｓ）、例は、同じ生成物の複数のコピーを生成する（例は、コピー数を高める）回路または複数の異なる機能を行う回路を含むように遺伝学的に操作される。挿入部位の例には、図４７に示されるｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびその他が含まれるが、これらに制限されない。例えば、遺伝学的に操作された細菌は、４つの異なる挿入部位、例はｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺ、に挿入されたＧＬＰ−２の四コピーを含みうる。あるいはまた、遺伝学的に操作された細菌は、３つの異なる挿入部位、例は、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺに挿入された三コピーのＧＬＰ−１、および３つの異なる挿入部位、例は、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびａｒａＣ／ＢＡＤに挿入された三コピーのブチロジーニック遺伝子カセットを含みうる。
【０４３１】
いくつかの実施態様において、細菌は、複数の異なる作用を行う同じ製品（例えば、コピー数を高めるため）の複数のコピーを産生する回路など、複数の作用メカニズム（ＭＯＡ）を含むように遺伝子工学的に操作される。例えば、遺伝子操作された細菌は、４つの異なる挿入部位に挿入されたペイロードを産生するための遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットの４つのコピーを含むことができる。あるいは、遺伝子操作された細菌は、３つの異なる挿入部位に挿入されたペイロードを産生するための３コピーの遺伝子、遺伝子、または遺伝子カセット、ならびに遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットの３コピーを含み得る  ３つの異なる挿入部位に挿入されたペイロードを生成するためのものである。
【０４３２】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、本明細書中に記載されるように、（１）１つ以上の遺伝子またはプロセイネートの生成のための遺伝子カセット、（２）本明細書中に記載されるように、本明細書中に記載されるように、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセット（例えば、本明細書に記載されるようなトリプトファンおよび／またはその代謝産物（キヌレニン、インドール、インドール酢酸、インドール−３アルデヒドおよびＩＰＡを含むがこれらに限定されない）の産生のための遺伝子カセット（５）本明細書に記載のＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２類似体の１つまたは複数の産生のための遺伝子（複数可）または遺伝子カセット（６）ヒトの生産のための１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセット本明細書中に記載されるようなヒトＩＬ−２２の産生のための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットを、本明細書中に記載されるように、本明細書中に記載されるように（単数または複数の）ｐｒの遺伝子カセット本明細書中に記載されるように（ＩＬ−２、および/またはＳＯＤおよび／またはＩＬ−２７および他のインターロイキン）、（９）１つまたは複数のトランスポーターの産生のための１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセット、例えばＧＬＰ−２およびその類似体、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−２２、ＳＣＦＡおよび／またはトリプトファン合成（これらに限定されない）分泌のための１つ以上のポリペプチドを本明細書に記載のトリプトファンおよび／または代謝産物（１１）デルタＴｈｙＡ（１３）のような１つまたは複数の栄養要求性タンパク質（１つまたは複数）を本明細書に記載のように（１２）分泌機構の１つまたは複数の成分（１４）１つ以上の遺伝子または遺伝子カセットによってコードされる代謝経路を通るフラックスを増加させるための１つまたは複数の突然変異／欠失、例えば遺伝子における突然変異/欠失（例えば、ＮＡＤＨ消費経路において、本明細書に記載のように（１５）内因性代謝の１つ以上の遺伝子における１つ以上の突然変異／欠失（１５）遺伝子または遺伝子カセット遺伝子によってコードされる代謝経路のフィードバック阻害に関与する遺伝子経路、例えば、トリプトファンシンヘイズ経路。
【０４３３】
（１）ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１を中和する、以下のエフェクター機能の１つ以上を促進する：いくつかの実施態様では、ＧＰＲ４１および/またはＧＰＲ４３を活性化する（例えば、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２（２）活性化は、ＩＬ−２２産生を生じるなどのＡＨＲを含み、そして（３）ＰＸＲを活性化する、（４）ＨＤＡＣを阻害する（６）ＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害する、（７）ＰＰＡＲガンマのモジュレーター、（８）ＡＭＰＫシグナル伝達の活性化、（９）ＧＬＰ−１分泌および/または（１０）を調節する。ヒドロキシルラジカルを捕捉し、抗酸化剤として機能する。
【０４３４】
いくつかの実施態様では、ペイロードを産生するための遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットが発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍  少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、  少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍以上のペイロード（単数または複数）を含み得る。
【０４３５】
いくつかの実施態様において、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ペイロードを生成するための遺伝子、遺伝子または遺伝子カセットのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および/または定量化するために使用される。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計され、使用され得る。いくつかの実施態様では、ペルロードＲＮＡを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーモサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定の波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の放出を検出する。反応混合物を加熱し、所定の時間、所定の温度に冷却する。特定の実施態様では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施態様では、反応混合物を加熱し、９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に所定のサイクル数にわたって冷却する。特定の実施態様では、反応混合物を加熱し、所定のサイクル数の間、９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に冷却する。いくつかの実施態様において、蓄積アンプリコンは、ｑＰＣＲの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについての少なくとも１つのＣＴ結果が生成され、ＣＴ結果がペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。
【０４３６】
いくつかの実施態様において、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および／または定量するために使用される。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計され、使用され得る。いくつかの実施態様では、ペルロードｍＲＮＡを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定の波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の放出を検出する。反応混合物を加熱し、所定の時間、所定の温度に冷却する。特定の実施態様では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施態様では、反応混合物を加熱し、９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に所定のサイクル数にわたって冷却する。特定の実施態様では、反応混合物を加熱し、所定のサイクル数の間、９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に冷却する。いくつかの実施態様において、蓄積アンプリコンは、ｑＰＣＲの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについての少なくとも１つのＣＴ結果が生成され、ＣＴ結果がペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。
【０４３７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の短鎖脂肪酸生産酵素をコードする遺伝的に改変されたバクテリオファージ遺伝子配列および／または本明細書に記載のトリプトファン異化酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列（単数または複数）  本明細書に記載の代謝産物トランスポーターをコードする配列、および／または分泌のための１つまたは複数の治療用ペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
【０４３８】
いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、酪酸遺伝子カセットを含み、酪酸塩を産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、プロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、アセタート遺伝子カセットを含み、酢酸塩を生成することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＳＯＤをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、キュレニンを産生することができる。
【０４３９】
いくつかの実施態様において、遺伝的に操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートであり、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラート塩を産生することができ、ＳＯＤをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、キュレニンを産生することができる。
【０４４０】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤを含む。これらの実施態様のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。これらの実施態様のいずれにおいても、バクテリアはキュウリネを生産することができる。
【０４４１】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを含み、酪酸塩を産生することができ、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤを含む。これらの実施態様のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、酪酸遺伝子カセットを含み、酪酸を産生することができ、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列およびＩＬ−２をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤを含む。これらの実施態様のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。これらの実施態様のいずれかにおいて、細菌はキュウリネンを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は酪酸遺伝子カセットを含み、酪酸を産生することができ、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０、ＧＬＰ−２、およびＳＯＤを含む。これらの実施態様のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。これらの実施態様のいずれかにおいて、細菌はキュウリネウイルスを産生することができる。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は酪酸遺伝子カセットを含み、酪酸を産生することができ、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０、およびＳＯＤを含む。これらの実施態様のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。これらの実施態様のいずれにおいても、バクテリアはキュウリネを生産することができる。
【０４４２】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌はブチラート遺伝子カセットを含み、ブチラートを産生することができ、ＳＯＤをコードする遺伝子配列と、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２、およびＩＬ−１０を含む。これらの実施態様のいずれにおいても、細菌はプロピオナート遺伝子カセットを含み、プロピオナートを生成することができる。これらの実施態様のいずれにおいても、バクテリアはキュウリネを生産することができる。
【０４４３】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１０をコードする遺伝子配列、およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２から選択される１つ以上の分子をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする遺伝子配列、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２およびＳＯＤから選択される１つまたは複数の分子をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、ＩＬ−２２をコードする遺伝子配列、およびＩＬ−２、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０、ＧＬＰ−２およびＳＯＤから選択される１つまたは複数の分子をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２７をコードする遺伝子配列およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０、ＧＬＰ−２およびＳＯＤから選択される1つ以上の分子をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、ＳＯＤをコードする遺伝子配列、およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＧＬＰ−２およびＩＬ−１０から選択される１つ以上の分子をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子配列およびＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０およびＳＯＤから選択される１つまたは複数の分子をコードする遺伝子配列を含む。これらの実施態様のいずれかにおいて、遺伝的に改変されたバクテリアは、酪酸を産生することができる。これらの実施態様のいずれかにおいて、遺伝子操作されたバクテリアは、プロピオナートを産生することができる。これらの実施態様のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は酢酸塩を生成することができる。
【０４４４】
いくつかの実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物トランスポーターをコードする遺伝子配列および／または分泌のための治療用ペプチドは、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物トランスポーターおよび／または治療薬をコードする遺伝子配列は、分泌のためのペプチドは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物トランスポーターおよび／または治療薬をコードする遺伝子配列は、分泌のためのペプチドは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物トランスポーターおよび／または治療薬をコードする遺伝子配列は、分泌のためのペプチドは、低酸素または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、１つまたは複数の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはその断片をコードする遺伝子配列の発現が、トリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または哺乳類腸の環境のような低酸素または嫌気性環境下で活性化される分泌用の治療用ペプチドを含む。（単数または複数の）短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物トランスポータおよび／または治療ペプチドをコードする遺伝子配列（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、炎症または炎症性応答（ＲＮＳ、ＲＯＳ）によって誘導されるプロモーター（例えば、炎症誘発性プロモーター）を含む、本明細書に記載の例示的な誘導性プロモーターは、プロモーター）、および腸内に天然に存在してもしなくてもよい（例えば、外因的に付加され得る）代謝産物、例えばアラビノースおよびテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターを含む。誘導性プロモーターの例としては、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＰａｒａＣプロモーター、ＰａｒａＢＡＤプロモーター、およびＰＴｅｔＲプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターは、以下により詳細に記載される。
【０４４５】
少なくとも１つの短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物トランスポータおよび／または治療ペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に分泌が存在していてもよい。一実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体をコードする遺伝子配列および／または分泌のための治療用ペプチドは、細菌細胞中のプラスミド上に位置する。別の実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体をコードする遺伝子配列および／または分泌のための治療用ペプチドは、細菌細胞の染色体に位置する。さらに別の実施態様では、１つまたは複数の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素をコードする遺伝子配列の天然コピーおよび／または少なくとも１つの短鎖脂肪酸産生酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む細菌細胞の染色体に位置する分泌用代謝産物トランスポータおよび／細菌の異なる種からの分泌のための酵素および／または代謝産物輸送体および／または治療用ペプチドが、細菌細胞中のプラスミド上に配置される。さらに別の実施態様では、１つまたは複数の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素をコードする遺伝子配列の天然コピーおよび／または少なくとも１つの短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子および／または細菌細胞中のプラスミドに位置する分泌のための代謝産物トランスポータおよび／トリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または異なる種の細菌からの分泌用の治療用ペプチドは、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施態様では、１つまたは複数の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素をコードする遺伝子配列の天然コピーおよび／または細菌細胞の染色体に位置する分泌用の代謝産物輸送体および／または治療用ペプチド、および少なくとも１つの短鎖脂肪酸産生酵素および／またはトリプトファン異化酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体および／または異なる種の細菌からの分泌のための治療用ペプチドは、細菌細胞の染色体に位置する。
【０４４６】
いくつかの実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体をコードする遺伝子配列は、および／または低コピープラスミド上に発現される分泌用の治療用ペプチドを含む。いくつかの実施態様では、１つ以上の短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素および／または代謝産物輸送体をコードする遺伝子配列および／または  分泌のための治療用ペプチドは、高コピープラスミド上に発現される。いくつかの実施態様では、高コピープラスミドは、少なくとも１つの短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素の発現を増加させるために有用であり得る、および／または代謝産物輸送体および／または分泌のための治療用ペプチドを含む。
【０４４７】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの短鎖脂肪酸生産酵素および／またはトリプトファン異化酵素および／またはトリプトファン生合成酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む本発明の組換え細菌細胞は、および／または高コピープラスミド上に発現される分泌用の代謝産物トランスポーターおよび／または治療用ペプチドは、異種のインポーターの非存在下で低コピープラスミド上に発現される同じ遺伝子を含む組換え細菌細胞と比較してトリプトファン異化を増加させないトリプトファンおよび／またはその代謝産物ならびにトリプトファンおよび／またはその代謝産物の天然の輸入者の追加コピーを含む。別の実施態様において、トリプトファンおよび／またはその代謝産物のインポーターは、高コピープラスミドとともに使用される。いくつかの実施態様では、上記の遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の内在性遺伝子における１つ以上の改変、突然変異、および／または欠失をさらに含む。
分泌
【０４４８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、細胞外環境において、細菌の細胞質から分子を分泌することができる自然な分泌機構または非自然な分泌機構をさらに含む。多くの細菌は、細菌細胞エンベロープを横切って基質を輸送するために高度化した分泌システムを進化させた。基質、たとえば、小分子、タンパク質、およびＤＮＡなどのようなものは、細胞外空間またはペリプラズム（たとえば、消化管内腔または他の空間など）中に放出され、標的細胞中に注入され、または細菌膜に結合され得る。
【０４４９】
グラム陰性細菌では、分泌機械は、内膜および外膜の一方または両方に広がっていてもよい。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、非自然な二重膜貫通分泌系（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）をさらに含む。膜貫通型分泌系には、制限されないが、Ｉ型分泌系（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、および多剤排出ポンプ（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｕｍｐｓ）の抵抗性結節分割（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）ファミリーが含まれる（Ｐｕｇｓｌｅｙ（パグスレイ）、１９９３；Ｇｅｒｌａｃｈ（ガーラック）ら、２００７；Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ（コリンソン）ら、２０１５；Ｃｏｓｔａ（コスタ）ら、２０１５；Ｒｅｅｖｅｓ（リーブス）ら、２０１５；ＷＯ２０１４１３８３２４Ａ１（国際公開第２０１４／１３８３２４  Ａ１号）、参照によりここに組み込まれる）。そのような分泌システムの例を図５０、図５１、図５２、図５３、および図５４に示す。グラム陰性様細胞エンベロープを有するマイコバクテリアはまた、ＶＩＩ型分泌系（Ｔ７ＳＳ）をコードし得る（Ｓｔａｎｌｅｙ（スタンリー）ら、２００３）。Ｔ２ＳＳを除いて、二重膜貫通分泌物（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）は概して、基質をバクテリア細胞質から直接細胞外空間または標的細胞に輸送する。対照的に、Ｔ２ＳＳおよび分泌系は、外膜だけに広がるもので二つの段階機構を用いるものであってもよく、そこでは内膜貫通型輸送体によって基質がペリプラズムに最初に転位され、および次いで外膜に移されるか、または細胞外空間中に分泌される。外膜貫通分泌系には、制限されないが、Ｖ型分泌または自己輸送体系または自己分泌体系（Ｔ５ＳＳ）、毛様体分泌系（ｃｕｒｌｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、および線毛アセンブリーのためのシャペロン−アッシャー経路（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｕｓｈｅｒ  ｐａｔｈｗａｙ）が含まれる（Ｓａｉｅｒ（サイアー）、２００６；Ｃｏｓｔａ（コスタ）ら、２０１５）。
【０４５０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（シゲラ属、赤痢菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ属）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ビブリオ（Ｂｉｖｒｉｏ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア属）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア属）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（クラミジア属）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス属）由来のＩＩＩ型またはＩＩＩ型様の分泌系（Ｔ３ＳＳ）をさらに含む。Ｔ３ＳＳは、針状複合体を通して細菌の細胞質から宿主の細胞質にタンパク質を輸送することができる。Ｔ３ＳＳは、細菌の細胞質から分子を分泌するが、宿主の細胞質に分子を注入しないように修飾することができる。したがって、分子は、消化管内腔または他の細胞外空間に分泌される。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、前記修飾Ｔ３ＳＳを含み、および細菌細胞質から目的の分子を分泌することができる。いくらかの実施態様では、異種タンパク質またはペプチドなどの分泌分子は、目的の分子が細菌から分泌されることを可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
【０４５１】
いくつかの実施態様において、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路が、関心のある分子を分泌するために使用される。いくつかの実施態様では、不完全な鞭毛を使用して、天然の鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルにペプチドを組換え的に融合させることにより目的の治療用ペプチドを分泌する。このようにして、細胞内で発現されたキメラペプチドを、内膜および外膜を介して周囲の宿主環境に動員することができる。例えば、ｆｌｉＣ（フラジェリンをコードする）の上流の非翻訳ＤＮＡフラグメント、例えばフラジェリンＩＩＩ、１７３−ｂｐ領域は、異種ポリペプチドを分泌するために使用され得る（例えば、Ｍａｊａｎｄｅｒら、目的のポリペプチドをコードする遺伝子に融合される、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年４月；２３（４）：４７５−８１を参照）。場合によっては、ｆｌｉＣ遺伝子座からの非翻訳領域は、鞭毛を介した乗客ペプチドの転座を媒介するのに十分ではないかもしれない。ここで、ＦｌｉＣのアミノ酸コード配列にＮ末端シグナルを、例えばＦｌｉＣの最初の２０アミノ酸とともに１７３ｂｐの非翻訳領域を使用して伸長させることが必要な場合がある（例えば、Ｄｕａｎら、共生細菌によるインスリン分泌性タンパク質の分泌：糖尿病を治療するための消化管の再編成、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８年１２月  ７４巻  ｎｏ．２３  ７４３７−７４３８）。
【０４５２】
いくらかの実施態様において、Ｖ型自己輸送体分泌系を用いて、目的の分子、例えば治療用ペプチドを分泌する。機構の単純さおよび比較的大きなタンパク質フラックスを扱う能力のために、Ｖ型分泌系は組換えタンパク質の細胞外産生にとって魅力的である。図５１に示すように、治療上のペプチド（スター）は、Ｎ末端分泌シグナル、リンカー、および自己輸送体のベータドメインに融合することができる。Ｎ末端のＳｅｃ依存性シグナル配列はタンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に導き、それがタンパク質を内膜通過させてペリプラズムに移動させ、その後シグナル配列の切断が続く。ベータドメインは、ベータドメインが折り畳まれ、およびベータ−バレル構造として外膜に挿入されるＢａｍ複合体（‘ベータ-バレルアセンブリ機構‘）に補充される。治療上のペプチドは、リンカー配列の前にベータ-バレル構造の中空細孔を貫通させられる。一旦細胞外環境に曝露されると、治療上のペプチドは、自己触媒的開裂（Ｂａｍ複合体の左側）によって、またはリンカーにおいてコンプリメンタリープロテアーゼ切断部位（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｕｔ  ｓｉｔｅ）に対する膜結合ペプチダーゼの標的化（黒色のはさみ；Ｂａｍ複合体の右側）によって、リンカーシステムから解放される。したがって、いくらかの実施態様では、分泌される分子、たとえば、異種タンパク質またはペプチドなどのようなものは、分子が細菌から分泌されるように、自己輸送体のＮ末端分泌シグナル、リンカー、およびベータドメインを含む。
【０４５３】
いくらかの実施態様では、目的の分子、例は治療上のペプチドを分泌するために溶血素に基づく分泌系が使用される。Ｉ型分泌系は、それらのパッセンジャーペプチドを細胞質から細胞外空間に直接転位させる利点を提供し、他の分泌型の２段階プロセスを回避する。図５２は、尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのアルファ−溶血素（ＨｌｙＡ）を示す。この経路は、ＨｌｙＢ、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター；ＨｌｙＤ、膜融合タンパク質、およびＴｏｌＣ、外膜タンパク質を使用する。これらの３つのタンパク質の集合体は、内側膜および外側膜の両方を通るチャネルを形成する。自然には、このチャネルはＨｌｙＡを分泌するために使用されるが、しかし、本開示の治療上のペプチドを分泌するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分は、治療上のペプチド（スター）のＣ末端部分に融合して、このペプチドの分泌が媒介される。
【０４５４】
代わりの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、非自然な単一膜貫通分泌系をさらに含む。単一膜貫通輸送体は、分泌系の成分として作用し得るか、または基質を独立して送り出し得る。そのような輸送体（トランスポーターとも言う）には、制限されないが、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／毒性関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、包括的分泌系（例は、Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリアおよび種々のタイプのグラム陽性細菌におけるアクセサリー分泌系（例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（バチルス・アンシラシス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ（ストレプトコッカス・ゴルドニイ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカス・アウレウス））、およびツイン−アルギニン透過（ＴＡＴ）（Ｓａｉｅｒ、２００６；Ｒｉｇｅｌ（リゲル）およびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ（ブラウンスタイン）、２００８；Ａｌｂｉｎｉａｋ（アルビニアク）ら、２０１３）が含まれる。包括的分泌系およびＴＡＴ系は、開裂可能なＮ末端シグナルペプチドを有する基質を共にペリプラズム中に送り出すことができ、および生物製剤生産の関連において探求されたことが知られる。しかしながら、ＴＡＴ系は、折り畳まれた基質を輸送することができ、従って、早すぎるか、または不適切な折り畳みの可能性を排除するという点で、特別な利点を提供し得る。一定の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様の系を含み、細菌細胞質から目的の分子を分泌することができる。当業者は、ここに開示される分泌系が、細菌の異なる種、菌株、およびサブタイプにおいて作用するように修飾され得、および／または異なるペイロードを送るように適合され得ることを理解するであろう。
【０４５５】
タンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）を細胞外空間に転位させるために、ポリペプチドはまず細胞内で翻訳され、内膜を越えて動員され、最後に外膜を介して動員されなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）、特に真核生物起源のもの、は、三次構造および四次構造を安定化するためにジスルフィド結合を含む。  これらの結合はペリプラズムシャペロンの助けを借りて酸化ペリプラズム区画内で正しく形成することができるが、ポリペプチドを外膜を横切って転位させるためにはジスルフィド結合を還元しなければならず、タンパク質は再び折り畳まれなくてはならない。
【０４５６】
グラム陰性バクテリア、特にジスルフィド結合を必要とするものにおいて適切に折り畳まれたタンパク質を分泌する１つの方法は、不安定化する外膜と一緒に還元環境ペリプラミンを標的とすることである。このようにして、タンパク質は酸化環境に動員され、適切に折り畳まれる。組織化された細胞外分泌系とは対照的に、タンパク質は膜漏出によって正確に折りたたまれた形態でペリプラズム間隙を逃れることができる。したがって、これらの「漏出性」グラム陰性突然変異体は、生物活性のある適切なジスルフィド結合ポリペプチドを分泌することができる。いくつかの実施態様において、遺伝子操作された細菌は、「漏出性」または非安定化外膜を有する。漏出を誘発するために細菌の外膜を不安定化することは、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰなどを含む硬質ペプチドグリカン骨格に外膜をテザーする役割を果たす遺伝子を欠失または突然変異させることによって、ｎｌｐｌ。Ｌｐｐは、１細胞あたり約５００，０００コピー存在する細菌細胞中の最も豊富なポリペプチドであり、ペプチドグリカンに対する細菌細胞壁の主要な「ステープル」として機能する。Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．、Ｋａｈｎｅ、Ｄ．＆Ｗａｌｋｅｒ、Ｓ．細菌細胞エンベロープ。Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２、ａ０００４１４（２０１０）。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出表現型を生成する他の欠失標的である。さらに、ペリプラズムプロテアーゼが不活性化されると漏出表現型が観察された。ペリプラズムはタンパク質で非常に密に詰め込まれており、したがってタンパク質の代謝回転を促進するためにいくつかのペリプラズムタンパク質をコードする。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩのようなペリプラズムプロテアーゼの除去は、ペリプラズムタンパク質の過剰な蓄積を促進することによって漏出性表現型を誘導し得る。プロテアーゼの突然変異はまた、これらのプロテアーゼによる標的分解を防止することによってエフェクターポリペプチドを保存することもできる。さらに、これらの突然変異の組合せは、細胞生存率の大きな犠牲なしに、細胞の漏出表現型を相乗的に増強し得る。したがって、いくつかの実施態様では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠損または突然変異した膜遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は欠失または突然変異ｌｐｐ遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ遺伝子から選択される１つまたは複数の欠失または変異遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される１つまたは複数の欠失または変異遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠失または変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つまたは複数の欠失または突然変異ペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。いくつかの実施態様では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ��ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される１つまたは複数の欠失または変異遺伝子を有する。
【０４５７】
細胞生存性に対する妨害を最小限にするために、漏出表現型は、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される１つまたは複数の膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を配置することによって誘導可能にすることができる誘導性プロモーターの制御下に置く。例えば、ｌｐｐまたは他の細胞壁安定性タンパク質またはペリプラズムプロテアーゼの発現は、治療用ポリペプチドを送達（分泌）する必要がある状態で抑制することができる。例えば、誘導条件下で、標的膜またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を減少させる転写リプレッサータンパク質または設計アンチセンスＲＮＡを発現させることができる。逆に、特定のペプチドの過剰発現は、例えばコリシンまたはＴｏｌＡの第３のトポロジードメインの過剰発現などの不安定化表現型をもたらし得、このペプチド過剰発現は、治療用ポリペプチドを送達（分泌）する必要がある状態で誘導することができる。この種の戦略は、壊れやすい漏出表現型をバイオマス生産から切り離すだろう。したがって、いくつかの実施態様では、操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下で、１つ以上の膜および/またはペリプラズムプロテアーゼ遺伝子を有する。
【０４５８】
以下の表３０および表３１は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の分泌系を列挙する。
[表３０-１]
[表３０-２]
[表３１-１]
[表３１-２]
【０４５９】
グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の上記の表は、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈ．  Ｓａｉｅｒ、Ｊｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ／  Ｖｏｌｕｍｅ  １、Ｎｕｍｂｅｒ  ９、第２版で概説されている、操作された細菌由来のポリペプチドおよび他の分子を分泌するために使用することができる分泌系を列挙する。２００６年グラム陰性細菌のタンパク質分泌系グラム陰性菌は明らかに進化した多くのタンパク質分泌膜挿入系を有する
【０４６０】
本明細書中に記載される分泌系のいずれも、本開示によれば、目的のタンパク質を分泌するために使用され得る。目的タンパク質の非限定的な例は、ＧＬＰ−２類似体、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、モノマー化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−  ２４、トリプトファン合成酵素、ＳＣＦＡ生合成酵素、トリプトファン異化酵素を含む（ＩＤＯ、ＴＤＯ、キヌレニナーゼ、他のトリプトファン経路異化酵素を含むが、これに限定されない）本明細書に記載のインドール経路および/またはキヌレニン経路に存在する。これらのポリペプチドは、安定性、プロテアーゼ消化に対する耐性および／または活性を増加させるように突然変異され得る。
[表３２］
【０４６１】
いくつかの実施態様では、目的の治療用ポリペプチドは、鞭毛ＩＩＩ型分泌系の成分を用いて分泌される。非限定的な例では、ＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２類似体、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、単量体化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−  ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲ（例えば、ｆｌｉＣ遺伝子座からの１７３ｂｐの非翻訳領域）の後ろに組み立てられ、天然のプロモーターによって駆動される。他の実施態様では、鞭毛ＩＩＩ型分泌系の成分を使用して分泌される興味のある治療用ペプチドの発現は、ｔｅｔ誘導性プロモーターによって駆動される。別の実施態様では、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＩＢＤ特異的分子または炎症または炎症応答（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）によって誘導されるプロモーターによって誘導されるプロモーターなどの誘導性プロモーターおよび腸内に天然に存在していてもいなくてもよい（例えば、外因的に付加されていてもよい）代謝産物、例えばアラビノースが使用される。いくつかの実施態様において、目的の治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、中程度のコピープラスミド）から発現される。いくつかの実施態様では、目的の治療用ポリペプチドは、ｆｌｉＣ遺伝子座に組み込まれた構築物（それによってｆｌｉＣを欠失させる）から発現され、そこで天然のＦｌｉＣプロモーターによって駆動される。いくつかの実施態様では、分泌効率をさらに高めるために、ＦｌｉＣのＮ末端部分（例えば、ＦｌｉＣの最初の２０アミノ酸）が構築物に含まれる。
【０４６２】
いくらかの実施態様において、目的の治療用ポリペプチド、例えばＧＬＰ−２ペプチド、ＧＬＰ−２アナログ、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、モノマー化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、拡散性外膜（ＤＯＭ）系を介して分泌される。いくつかの実施態様において、目的の治療用ポリペプチドは、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルに融合される。このようなＮ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルの非限定的な例には、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡおよびｃｖａＣが含まれる。代替的な実施態様では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｔａｔ依存性分泌シグナルに融合される。例示的なＴａｔ依存性タグには、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、およびＤｍｓＡが含まれる。いくつかの実施態様では、分泌タグ付き治療タンパク質の発現は、ｔｅｔプロモーターまたは酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）などの誘導性プロモーター、または誘導されたＩＢＤ特異的分子またはプロモーターによって誘導されるプロモーター（例えば、外因的に添加することができる）代謝産物（例えば、アラビノース）によって誘導されるプロモーターを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、目的の分泌タグ付き治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、培地コピープラスミド）から発現される。他の実施態様では、目的の治療用ポリペプチドは、細菌染色体に組み込まれた構築物、例えば図１に示される１つ以上の組み込み部位で発現される。特定の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、外膜および／またはペリプラズムタンパク質の１つ以上の欠失または突然変異を含む。そのようなタンパク質の非限定的な例は、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡ、および／またはｎｌｐＩを含み、そのうちの１つ以上が欠失されまたは変異されてもよい。いくつかの実施態様において、ｌｐｐは欠失または突然変異される。いくつかの実施態様において、ｐａｌは欠失または変異される。いくつかの実施態様では、ｔｏｌＡは欠失または変異される。他の実施態様では、ｎｌｐＩは欠失または変異される。さらに他の実施態様では、例えばペリプラズム中のポリペプチドの安定性を高めるために、特定のペリプラズムプロテアーゼが欠失または変異される。そのようなプロテアーゼの非限定的な例としては、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが挙げられる。いくつかの実施態様において、ｄｅｇＰは欠失または突然変異される。いくつかの実施態様では、ｏｍｐＴは欠失または変異される。いくつかの実施態様では、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴは欠失または変異される。
【０４６３】
ＧＬＰ−２類似体、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、単量体化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−  ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、タイプＶの自動分泌（ｐｉｃタンパク質）分泌を介して分泌される。いくつかの実施態様では、目的の治療用タンパク質は、天然のＮｉｓｓｌｅ自動分泌細胞Ｅ．ｃｏｌｉ＿０１６３５（ここで元のパッセンジャータンパク質は、目的の治療用ポリペプチドで置き換えられる）との融合タンパク質として発現される。
【０４６４】
ＧＬＰ−２類似体、ＩＬ−２２、ｖＩＬ−１０、ｈＩＬ−１０、モノマー化ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４は、Ｉ型溶血素分泌によって分泌される。一実施態様では、目的の治療用ポリペプチドは、大腸菌ＣＦＴ０７３のα−溶血素（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３アミノ酸との融合タンパク質として発現される。
必須遺伝子および栄養要求株
【０４６５】
ここに使用されるように、用語「必須遺伝子」は、細胞増殖および/または生存のために必要な遺伝子に言及する。細菌の必須遺伝子は、当業者によく知られ、および遺伝子の指向的欠失および/またはランダム変異誘発およびスクリーニングによって識別することができる（例は、Ｚｈａｎｇ（チャン）およびＬｉｎ、２００９、ＤＥＧ５．０、原核生物および真核生物の双方における必須遺伝子のデータベース、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ）、３７：Ｄ４５５−Ｄ４５８およびＧｅｒｄｅｓ（ゲルデス）ら、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｐｓ（代謝マップに関する必須遺伝子）」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー）、１７（５）：４４８−４５６、それらのそれぞれの全内容は参照によりここに明示的に組み込まれる）。
【０４６６】
「必須遺伝子」は有機体が存在する状況および環境に依存し得る。たとえば、必須遺伝子の変異、修飾、または切除により、本開示の遺伝学的に操作された細菌が栄養要求株になる可能性がある。栄養要求性改変は、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠如しているため、生存または増殖に必須の外因的に添加される栄養素の不存在下で細菌の死滅が起こることを意図する。
【０４６７】
栄養要求性改変は、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠損しているため、生存または増殖に必須の外因的に添加される栄養素の不存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくらかの実施態様では、ここに記載の遺伝学的に操作された細菌のいずれも、細胞生存および/または増殖に必要な遺伝子の欠失または変異を含む。一実施態様では、必須遺伝子はＤＮＡ合成遺伝子、たとえば、ｔｈｙＡである。別の実施態様では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、たとえば、ｄａｐＡである。さらに別の実施態様において、必須遺伝子はアミノ酸遺伝子、たとえば、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。細胞生存および/または増殖に必要な任意の遺伝子は、標的にすることができ、制限されないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢおよびｔｈｉ１を、対応する野生型遺伝子産物が細菌中で産生されない限り含む。
【０４６８】
表３３のリストは、栄養要求株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を示す。これらには、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要とされる遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
[表３３］
表３４は、胃管栄養法の２４時間後および４８時間後に検出された、マウス腸における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す。これらの栄養要求株は、大腸菌のＮｉｓｓｌｅ株ではないＢＷ２５１１３を用いて作製した。
[表３４］
【０４６９】
たとえば、チミンは、細菌細胞増殖に必要とされる核酸であり；その不存在下では、細菌は細胞死を受ける。ｔｈｙＡ遺伝子は、チミジル酸シンテターゼをコードし、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成における第１段階を触媒する酵素である（Ｓａｔ（サト）ら、２００３）。いくらかの実施態様では、本開示の細菌細胞は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失され、および／または無関係な遺伝子で置換されたｔｈｙＡ栄養要求株である。ｔｈｙＡ栄養要求株は、インビトロで増殖培地にチミンを添加することによって、またはインビボでヒト消化管内で自然に見出される高チミンレベルの存在下で、十分な量のチミンが存在するときにだけ増殖することができる。いくらかの実施態様では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳類の消化管内に存在するときに補完される遺伝子において栄養要求性である。十分な量のチミンがなければ、ｔｈｙＡ栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性改変は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０４７０】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、および細菌細胞壁発達に必要である（Ｍｅａｄｏｗ（メドウ）ら、１９５９；Ｃｌａｒｋｓｏｎ（クラークスン）ら、１９７１）。いくらかの実施態様では、ここに記載される遺伝学的に操作された細菌のいずれかは、ｄａｐＤが欠失し、および／または無関係の遺伝子で置換されたｄａｐＤ栄養要求株である。ｄａｐＤ栄養要求体は、十分な量のＤＡＰが存在するときだけ、例は、インビトロで増殖培地にＤＡＰを添加することによって増殖することができる。十分な量のＤＡＰがなければ、ｄａｐＤ栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性改変は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で生存しないことを確実にするために使用される。
【０４７１】
他の実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、ｕｒａＡが欠失され、および/または無関係の遺伝子で置換されたｕｒａＡ栄養要求体である。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよび引き続く代謝を促進する膜結合輸送体であるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ（アンデルセン）ら、１９９５）。ｕｒａＡ栄養要求体は、十分な量のウラシルが存在するときだけ、例は、インビトロで増殖培地にウラシルを添加することによって増殖することができる。十分な量のウラシルがなければ、ｕｒａＡ栄養要求体は死ぬ。いくらかの実施態様において、栄養要求性遺伝子産物の不存在下（例は、消化管の外側）で細菌が生存しないことを確実にするために、栄養要求性改変が使用される。
【０４７２】
複雑なコミュニティでは、細菌がＤＮＡを共有することが可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は、非栄養要求株からＤＮＡを受け取ることができ、それはゲノム欠失を修復し、および栄養要求株が恒久的に救出される。したがって、一よりも多くの栄養要求性を有する細菌株を操作することにより、栄養要求性を救済するのに十分な時間にＤＮＡ転移が起こる可能性を大きく低下させる可能性がある。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、細胞生存および/または増殖に必要な２つ以上の遺伝子の欠失または変異を含む。
【０４７３】
必須遺伝子の他の例としては、制限されないが、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に既知である。
【０４７４】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でだけ増殖する１つ以上の必須遺伝子に変異を有する合成栄養要求体である（Ｌｏｐｅｚ（ロペズ）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（アンダーソン）、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｒａｉｎ（ＢＬ２１（ＤＥ３）バイオセーフティ株についてリガンド依存性必須遺伝子を有する合成栄養要求体）」、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＡＣＳシンセティック・バイオロジー）（２０１５）ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８５参照、その全体の内容は参照によりここに明示的に組み込まれる）。
【０４７５】
いくらかの実施態様では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は必須遺伝子において変異を含む。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋからなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、次の変異：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃの１つ以上を含むｄｎａＮである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌの１以上を含むｐｈｅＳである。いくらかの実施態様において、必須遺伝子は、変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、以下の変異：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇの１以上を含むｔｙｒＳである。いくらかの実施態様において、必須遺伝子は、変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、次の変異：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃの１以上を含むｍｅｔＧである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、以下の変異：Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇの１以上を含むａｄｋである。いくらかの実施態様では、必須遺伝子は、変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
【０４７６】
いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はリガンドによって補完される。いくらかの実施態様において、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群より選ばれる。たとえば、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはL-ヒスチジンメチルエステルによって補完される。ｄｎａＮ（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ａｄｋ（Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇ）において変異を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって補完される。
【０４７７】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、それをリガンドに対して栄養要求性にする一よりも多い変異必須遺伝子を含む。いくらかの実施態様では、細菌細胞は２つの必須遺伝子において変異を含む。たとえば、いくらかの実施態様では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）およびｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）において変異を含む。他の実施態様では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子において変異を含む。たとえば、いくらかの実施態様では、細菌細胞はｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）、およびｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）において変異を含む。
【０４７８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌はコンディショナルな（条件的なとも言う）栄養要求体であり、その必須遺伝子（群）は、図５６に示されるアラビノース系を用いて置換される。
【０４７９】
いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は栄養要求株であり、およびキルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ構成要素およびシステムのいずれかなどのようなものも含む。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、細胞生存および／または増殖に必要な必須遺伝子において、たとえば、ＤＮＡ合成遺伝子において、たとえば、ｔｈｙＡ、細胞壁合成遺伝子、たとえば、ｄａｐＡおよび／またはアミノ酸遺伝子、例えばｓｅｒＡまたはＭｅｔＡにおいて、欠失または変異を含むことができ、およびまた環境条件（群）および／またはシグナル（群）に応答して（たとえば、記載のアラビノース系などのようなもの）発現する１以上の転写活性化因子によって調節される毒素遺伝子を含むことができ、または外因性環境条件（群）および／またはシグナル（群）（たとえば、ここに記載のリコンビナーゼ系などのようなもの）を感知して発現される1以上のリコンビナーゼによって調節されうる。他の実施態様は、Ｗｒｉｇｈｔ（ライト）ら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ（ジーンガード：バイオセーフティのために設計されたモジュラープラスミドシステム）」ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）４：３０７−１６に記載され、その全体の内容を参照によりここに明示的に組み込む）。いくらかの実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌は栄養要求体であり、およびまた、キルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ成分およびシステムなどのようなもの、ならびに別のバイオセキュリティ（生物学的に安全なとも言う）システム、たとえば、コンディショナルな複製の起点（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）などのようなものを含む（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５）。他の実施態様では、抗炎症性または消化管バリアエンハンサー分子を産生する変異細菌をスクリーニングするために栄養要求性改変を使用することもできる。
遺伝学的調節回路
【０４８０】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ここに記載の構築物を発現させるための多層遺伝学的調節回路（ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ）を含む（例は、米国仮特許出願第６２／１８４，８１１号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４３４参照、それら両方の全体が参照によりここに組み込まれる）。遺伝学的調節回路は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するか、または栄養要求体を救出する変異細菌をスクリーニングするために有用である。特定の実施態様では、本発明は、関心がある１以上の遺伝子を産生する遺伝学的に操作された細菌を選定するための方法を提供する。
【０４８１】
いくらかの実施態様において、本発明は、治療上の分子（例は、ブチラート）およびＴ７ポリメラーゼ調節遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、Ｔ７ポリメラーゼをコードする第一の遺伝子で、そこでは、第一の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；治療上の分子（例は、ブチラート）を産生するための第二の遺伝子または遺伝子カセットで、そこでは、第二の遺伝子または遺伝子カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによって誘導されるＴ７プロモーターに作動可能に連結され；および抑制因子、ｌｙｓＹをコードする第三の遺伝子で、Ｔ７ポリメラーゼを抑制することができるものを含む。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、および治療上の分子（例は、ブチラート）は発現しない。ＬｙｓＹは構成的に発現され（Ｐ−ｌａｃ構成性）、およびさらにＴ７ポリメラーゼを抑制する。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、Ｔ７ポリメラーゼはｌｙｓＹ抑制を克服するのに十分なレベルで発現され、および治療上の分子（例は、ブチラート）が発現される。いくらかの実施態様では、ｌｙｓＹ遺伝子はさらなるＦＮＲ結合部位に作動可能に連結される。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化して上記のようにＴ７ポリメラーゼ発現を活性化し、およびまたｌｙｓＹ発現を抑制する。
【０４８２】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子（例は、ブチラート）およびプロテアーゼ調節された遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；Ｔｅｔ調節領域（ＴｅｔＯ）に作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；およびＴｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）に連結されるｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルをコードする第３の遺伝子で、ＴｅｔＲがＴｅｔ制御領域に結合し、および第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識し、ＴｅｔＲを分解することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、抑制因子は分解されず、および治療上の分子は発現されない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターを二量体化し、およびそれに結合し、それによってｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼの発現が誘導される。ｍｆ−ｌｏｎプロテアーゼは、ｍｆ−ｌｏｎ分解シグナルを認識し、およびＴｅｔＲを分解し、および治療上の分子が発現される。
【０４８３】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子および抑制因子調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、第１の抑制因子をコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子はＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；構成的プロモーターを含む第１調節領域に作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第２遺伝子または遺伝子カセット；および第２の抑制因子をコードする第３の遺伝子で、第２の抑制因子は、第１の調節領域に結合し、および第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。第３の遺伝子は、構成的プロモーターを含む第２の調節領域に作動可能に連結され、そこでは、第１の抑制因子は第２の調節領域に結合し、および第２の抑制因子の発現を抑制することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、第１の抑制因子は発現せず、第２の抑制因子は発現し、および治療上の分子は発現しない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターを二量体化し、およびそれに結合し、第１の抑制因子は発現し、第２の抑制因子は発現せず、および治療上の分子が発現される。
【０４８４】
これらの実施態様において有用な抑制因子の例には、制限されないが、ＡｒｇＲ、ＴｅｔＲ、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＬａｃＩ、ＣｓｃＲ、ＤｅｏＲ、ＤｇｏＲ、ＦｒｕＲ、ＧａｌＲ、ＧａｔＲ、ＣＩ、ＬｅｘＡ、ＲａｆＲ、ＱａｃＲ、およびＰｔｘＳ（ＵＳ２００３０１６６１９１）が含まれる。
【０４８５】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子および調節ＲＮＡで調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、調節ＲＮＡをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子はＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され、および治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターに作動可能に連結され、および治療上の分子の翻訳を抑制するｍＲＮＡヘアピンを産生することができるヌクレオチド配列にさらに連結される。調節ＲＮＡは、ｍＲＮＡヘアピンを除去し、およびリボソーム結合部位を介して翻訳を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、調節ＲＮＡは発現せず、およびｍＲＮＡヘアピンは治療上の分子の翻訳を妨げる。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、調節ＲＮＡが発現され、ｍＲＮＡヘアピンが排除され、および治療上の分子が発現される。
【０４８６】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびＣＲＩＳＰＲ調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、Ｃａｓ９タンパク質；ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセットで、そこでは、第２の遺伝子または遺伝子カセットは、構成的プロモーターを含む調節領域に作動可能に連結され；および構成的プロモーターに作動可能に連結される抑制因子をコードする第３遺伝子で、抑制因子が、調節領域に結合し、および第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制することができるものを含む。第３の遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡに結合することができるＣＲＩＳＰＲ標的配列にさらに連結され、そこでは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡへの前記結合は、Ｃａｓ９タンパク質による開裂を誘導し、および抑制因子の発現を抑制する。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、ガイドＲＮＡは発現されず、抑制因子は発現され、および治療上の分子は発現されない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、ガイドＲＮＡは発現され、抑制因子は発現せず、および治療上の分子が発現される。
【０４８７】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびリコンビナーゼ調節された遺伝子調節回路を生成するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子はＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され、および構成的プロモーターに作動可能に連結される治療上の分子を産生する第２の遺伝子または遺伝子カセットを含む。第２の遺伝子または遺伝子カセットは、方向が逆転し（３’から５’）、およびリコンビナーゼ結合部位に隣接し、およびリコンビナーゼは、リコンビナーゼ結合部位に結合して、その向きを元に戻し（５’から３’）て、第２の遺伝子または遺伝子カセットの発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現されず、遺伝子または遺伝子カセットは３’から５’配向のままであり、および機能的な治療分子は産生されない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターに結合し、リコンビナーゼが発現され、遺伝子または遺伝子カセットは５’から３’方向に戻され、および機能的な治療上の分子が産生される。
【０４８８】
いくらかの実施態様では、本発明は、治療上の分子およびポリメラーゼおよびリコンビナーゼ調節された遺伝子調節回路を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む遺伝学的に操作された細菌を提供する。たとえば、遺伝学的に操作された細菌は、リコンビナーゼをコードする第１の遺伝子で、そこでは、第１の遺伝子は、ＦＮＲ応答性プロモーターに作動可能に連結され；Ｔ７プロモーターに作動可能に連結される治療上の分子を産生するための第２の遺伝子または遺伝子カセット；Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子で、Ｔ７ポリメラーゼがＴ７プロモーターに結合し、および治療上の分子の発現を誘導することができるものを含む。Ｔ７ポリメラーゼをコードする第３の遺伝子は、向きを逆転され（３’から５’）、およびリコンビナーゼ結合部位に隣接し、およびリコンビナーゼは、リコンビナーゼ結合部位に結合し、その向きを戻す（５’から３’）ことによってＴ７ポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導することができる。酸素の存在下では、ＦＮＲはＦＮＲ応答性プロモーターに結合せず、リコンビナーゼは発現せず、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は３’から５’配向のままであり、および治療上の分子は発現しない。酸素が存在しない場合、ＦＮＲは、二量体化し、およびＦＮＲ応答性プロモーターを結合し、リコンビナーゼは発現され、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は５’から３’方向に戻り、および治療上の分子が発現される。
【０４８９】
プラスミド上に発現される合成遺伝子回路は、短期間ではうまく機能することができるが、長期間では能力および／または機能を失うことがある（Ｄａｎｉｎｏ（ダニノ）ら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、興味がある遺伝子を長時間にわたって発現させるための安定した回路を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、治療上の分子を産生することができ、および毒素（ｈｏｋ）および短命の抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素系をさらに含み、プラスミドの損失が長寿命の毒素によって引き起こされる（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）プラスミドｐＬ２０由来のａｌｐ７をさらに含み、および細胞分裂中の均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞の極に押し出すことができるフィラメントを産生する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。
宿主-プラスミド相互依存性
【０４９０】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌はまた、宿主−プラスミド相互依存性を作り出すように修飾されたプラスミドも含む。一定の実施態様において、相互に依存する宿主−プラスミドプラットフォームはＧｅｎｅＧｕａｒｄである（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５）。いくらかの実施態様では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、（ｉ）条件的複製起点で、そこで、必要な複製開始タンパク質がトランスで提供されるもの；（ｉｉ）栄養要求性改変で、ゲノム転座を介して宿主によって救済され、およびリッチメディア（富栄養培地とも言う）での使用にも適合するもの；および／または（ｉｉｉ）核酸配列で、広域スペクトル毒素をコードするものを含む。毒素遺伝子は、抗毒素を発現しない株（例は、野生型細菌）に対してプラスミドＤＮＡ自体を不利にすることにより、プラスミドの広がりに対して選定するために使用され得る。いくらかの実施態様では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、抗生物質の選択なしで少なくとも１００世代にわたって安定である。いくらかの実施態様では、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは宿主の増殖を妨害しない。ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドは、本発明の遺伝学的に操作された細菌で意図しないプラスミド増殖を大幅に減少させるために使用される。
【０４９１】
相互依存性の宿主−プラスミドプラットフォームは、単独で、または他のバイオセーフティ機構、たとえば、ここに記載されているものなどのようなもの（例は、キルスイッチ、栄養要求性）と組み合わせて使用され得る。いくらかの実施態様において、遺伝学的に操作された細菌はＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドを含む。他の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１以上のキルスイッチを含む。他の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミドおよび／または１以上の栄養要求性を含む。さらに他の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＧｅｎｅＧｕａｒｄプラスミド、１以上のキルスイッチ、および／または１以上の栄養要求性を含む。
【０４９２】
プラスミド上に発現する合成遺伝子回路は、短期間ではうまく機能するが、長期間に能力および／または機能を失うことがある（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、興味がある遺伝子を長時間にわたって発現させるための安定した回路を含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗炎症および／または消化管エンハンサー分子を産生することができ、および毒素（ｈｏｋ）および短命の抗毒素（ｓｏｋ）を同時に産生する毒素−抗毒素システムをさらに含み、そこで、プラスミドの損失は、細胞が長命毒素によって殺されるようにする（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５；図６６）。いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓプラスミドｐＬ２０由来のａｌｐ７をさらに含み、および細胞分裂中の均等な分離を確実にするためにプラスミドを細胞の極に押し出すことができるフィラメントを産生する（Ｄａｎｉｎｏら、２０１５）。
キルスイッチ
【０４９３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチも含む（例は、米国仮特許出願第６２／１８３，９３５号、第６２／２６３，３２９号、および第６２／２７７，６５４号参照、それらの各々は参照によりその全体においてここに組み込む）。キルスイッチは外部刺激に応答して遺伝学的に操作された細菌を積極的に殺すことを意図する。細菌が生存のために不可欠な栄養素を欠いているために死滅する栄養要求性変異とは対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘発する環境内の特定の因子によって引き起こされる。
【０４９４】
キルスイッチを含む細菌は、インビトロ研究目的のために、例は、実験室環境の外部のバイオ燃料生産微生物の広がりを制限するために設計されたものである。疾患を処置するためのインビボ施与のために操作された細菌は、異種遺伝子または遺伝子群（例は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子）の発現および送付の後、または対象が治療上の効果を経験した後に、特定の時間に死ぬようにプログラムされてもよい。たとえば、いくらかの実施態様では、キルスイッチは、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子、例は、ＧＬＰ−２の発現後ある期間後に細菌を殺すために活性化される。いくらかの実施態様では、キルスイッチは、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子の発現後に遅延した様式で活性化される。あるいは、細菌が疾患部位の外に広がった後、細菌は死滅するように操作されてもよい。具体的には、微生物による対象の長期コロニー形成、対象の内側の関心がある領域外（たとえば、消化管の外側）での微生物の拡散、または対象の外側の微生物の環境への拡散（たとえば、対象の便を通しての環境への広がり）を防ぐことは有用でありうる。キルスイッチに用いることができるそのような毒素の例には、制限されないが、バクテリオシン、リシン、および細胞膜を溶解すること、細胞ＤＮＡを分解すること、または他の機序によって細胞死を引き起こす他の分子が含まれる。そのような毒素は、個々に、または組み合わせて使用することができる。それらの産生をコントロールするスイッチは、たとえば、転写活性化（トグルスイッチ；例は、Ｇａｒｄｎｅｒ（ガードナー）ら、２０００参照）、翻訳（リボソームレギュレーター）、またはＤＮＡ組換え（リコンビナーゼ系スイッチ）に基づくことができ、および環境刺激、たとえば、嫌気生活または反応性酸素種のようなものを意味することができる。これらのスイッチは、単一の環境要因によって活性化することができ、または細胞死を誘発するために複数の活性化因子をＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤおよびＮＯＲ論理構成において必要とすることがある。たとえば、ＡＮＤリボソームレギュレータースイッチは、リシンの発現を誘導するために、テトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、およびアラビノースによって活性化され、それは、細胞膜を透過性にし、および細胞を殺す。ＩＰＴＧは、エンドリシンおよびホリンｍＲＮＡの発現を誘導し、それらはその後、アラビノースおよびテトラサイクリンの添加によって抑制解除される。細胞死を引き起こすためには、３種すべての誘導物質が存在しなければならない。キルスイッチの例は当技術で既知である（Ｃａｌｌｕｒａ（カルラ）ら、２０１０）。
【０４９５】
キルスイッチは、環境条件または外部信号に応答して毒素が生成されるように設計する（例は、外部キューに応答して細菌が殺され）か、あるいはまた、環境条件がもはや存在せず、または外部信号が停止されると、毒素が生成されるように設計することができる。
【０４９６】
したがって、いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、たとえば、ＲＯＳの存在下で、またはＲＮＳの存在下で、低酸素条件において、外因性環境シグナルを感知した後に死ぬようにさらにプログラムされる。いくらかの実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、１以上のリコンビナーゼ（群）をコードする１以上の遺伝子を含み、それらの発現は環境条件またはシグナルに応答して誘導され、および１以上の組換え事象を引き起こし、それは細胞を死滅させる毒素の発現を最終的に導く。いくらかの実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、それが第１のリコンビナーゼによってフリッピング（反転とも言う）された後に構成的に発現される細菌毒素をコードする逆の異種遺伝子のフリッピングである。一実施態様では、細菌毒素の構成的発現は遺伝学的に操作された細菌を死滅させる。これらのタイプのキルスイッチシステムでは、一旦操作された細菌細胞が外因性環境条件を感知し、および興味がある異種遺伝子を発現すると、組換え細菌細胞はもはや生存可能ではない。
【０４９７】
本開示の遺伝学的操作細菌が、少なくとも１つの組換え事象を引き起こす環境条件またはシグナルに応答して１以上のリコンビナーゼ（群）を発現する別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性の環境条件または信号に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子を発現する。一実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第１のリコンビナーゼによる細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子のフリッピングである。一実施態様では、細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子は、第１の順方向リコンビナーゼ認識配列と第１の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによってフリッピングされた後に構成的に発現される。一実施態様では、抗毒素は毒素の活性を抑制し、それによって遺伝学的に操作された細菌の死が遅延される。一実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されないとき、外因性環境条件がもはや存在しないときに、細菌毒素によって殺される。
【０４９８】
別の実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向の異種遺伝子の第１のリコンビナーゼによるフリッピングであり、次に、細菌毒素をコードする逆方向の異種遺伝子の第２のリコンビナーゼによるフリッピングが続く。一実施態様では、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子は、第１の順方向リコンビナーゼ認識配列と第１の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２の順方向リコンビナーゼ認識配列と第２の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第２のリコンビナーゼをコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、細菌毒素をコードする異種遺伝子は、それが第２のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は細菌毒素によって殺される。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、外因性環境条件に応答して抗毒素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。一実施態様では、抗毒素は、外因性環境条件が存在するとき、毒素の活性を抑制し、それによって遺伝学的に操作された細菌の死を遅延させる。一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、抗毒素をコードする異種遺伝子がもはや発現されないとき、外因性環境条件がもはや存在しないとき、細菌毒素によって死滅する。
【０４９９】
一実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第２のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子の第１のリコンビナーゼによるフリッピングであり、次いで、第３のリコンビナーゼをコードする逆方向異種遺伝子の第２のリコンビナーゼによるフリッピングが続き、次に、細菌毒素をコードする逆方向異種遺伝子の第３のリコンビナーゼによるフリッピングが続く。
【０５００】
一実施態様では、少なくとも１つの組換え事象は、第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子の第１のリコンビナーゼによるフリッピングである。一実施態様では、第１の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第１の順方向リコンビナーゼ認識配列と第１の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第１の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、第１の切除酵素は第１の必須遺伝子を切除する。一実施態様では、プログラムされた組換え細菌細胞は第１の必須遺伝子が切除された後に生存できない。
【０５０１】
一実施態様では、第１のリコンビナーゼは、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子をさらに反転させる。一実施態様では、第２の切除酵素をコードする逆方向異種遺伝子は、第２の順方向リコンビナーゼ認識配列と第２の逆方向リコンビナーゼ認識配列との間に位置する。一実施態様では、第２の切除酵素をコードする異種遺伝子は、それが第１のリコンビナーゼによって反転された後に構成的に発現される。一実施態様では、第１の必須遺伝子および第２の必須遺伝子が両方とも切除されるとき、遺伝学的に操作された細菌は死ぬか、またはもはや生存できない。一実施態様では、第１のリコンビナーゼによって第１の必須遺伝子が切除されるか、または第２の必須遺伝子が切除されるかのいずれかのとき、遺伝学的に操作された細菌は死ぬか、またはもはや生存できない。
【０５０２】
一実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも１つの組換え事象が生じた後に死滅する。別の実施態様では、少なくとも１つの組換え事象が生じた後、遺伝学的に操作された細菌はもはや生存できない。
【０５０３】
これらの実施態様のいずれかにおいて、リコンビナーゼは、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＢｘｂＩ、ＰｈｉＣ３１、ＴＰ９０１、ＨＫ０２２、ＨＰ１、Ｒ４、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３、Ｉｎｔ４、Ｉｎｔ５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ７、Ｉｎｔ８、Ｉｎｔ９、Ｉｎｔ１０、Ｉｎｔ１１、Ｉｎｔ１２、Ｉｎｔ１３、Ｉｎｔ１４、Ｉｎｔ１５、Ｉｎｔ１６、Ｉｎｔ１７、Ｉｎｔ１８、Ｉｎｔ１９、Ｉｎｔ２０、Ｉｎｔ２１、Ｉｎｔ２２、Ｉｎｔ２３、Ｉｎｔ２４、Ｉｎｔ２５、Ｉｎｔ２６、Ｉｎｔ２７、Ｉｎｔ２８、Ｉｎｔ２９、Ｉｎｔ３０、Ｉｎｔ３１、Ｉｎｔ３２、Ｉｎｔ３３、およびＩｎｔ３４、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれるリコンビナーゼであることができる。
【０５０４】
上記のキルスイッチ回路では、毒素は環境因子または信号の存在下で生成される。キルスイッチ回路の別の態様では、毒素は環境因子の存在下で抑制され（生成されず）、および環境条件または外部信号がもはや存在しなくなると生成され得る。そのようなキルスイッチは、抑制ベースのキルスイッチと呼ばれ、および細菌細胞が外部因子またはシグナル、たとえば、アラビノースまたは他の糖などのようなものの存在下だけで生存可能である系を表す。外因性因子またはシグナルの存在下で毒素が抑制される（および外部シグナルが除去された後に活性化される）例示的なキルスイッチ設計は、図５７、６０、６５において示される。本開示は、外因性環境においてアラビノースまたは他の糖を感知すると、１以上の異種遺伝子（群）を発現する組換え細菌細胞を提供する。この局面において、組換え細菌細胞は、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子、ならびにａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある１以上の遺伝子を含む。アラビノースの不存在下では、ＡｒａＣ転写因子は、ａｒａＢＡＤプロモーターの制御下で遺伝子の転写を抑制するコンフォメーションを採用する。アラビノースの存在下で、ＡｒａＣ転写因子は、ＡｒａＢＡＤプロモーターに結合してこれを活性化し、それは毒素遺伝子の発現を抑制する望ましい遺伝子、たとえば、ｔｅｔＲの発現を誘導する構造変化を受ける。この実施態様では、毒素遺伝子は、アラビノースまたは他の糖の存在下で抑制される。アラビノースが存在しない環境では、ｔｅｔＲ遺伝子は活性化されず、おおび毒素が発現され、それによって細菌が死滅する。アラビノース系はまた、必須遺伝子がアラビノースまたは他の糖の存在下だけで発現され、アラビノースまたは他の糖が環境中に存在しない場合に発現されない必須遺伝子を発現するためにも使用され得る。
【０５０５】
したがって、外因性環境においてアラビノースを感知する際に１以上の異種遺伝子（群）が発現されるいくらかの実施態様において、１以上の異種遺伝子は、ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰａｒａＢＡＤ）の制御下に直接的または間接的に存在する。いくらかの実施態様では、発現された異種遺伝子は、次の：異種の治療上の遺伝子、抗毒素をコードする異種遺伝子、抑制因子タンパク質またはポリペプチドをコードする異種遺伝子、たとえば、ＴｅｔＲ抑制因子、細菌細胞に見出されない必須タンパク質をコードする異種遺伝子、および／または調節タンパク質またはポリペプチドをコードする異種タンパク質の一以上から選定される。
【０５０６】
アラビノース誘導性プロモーターは、Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＣ、およびＰａｒａＢＡＤを含め、当技術において既知である。一実施態様では、アラビノース誘導性プロモーターはＥ．  ｃｏｌｉ由来である。いくらかの実施態様において、ＰａｒａＣプロモーターおよびＰａｒａＢＡＤプロモーターは、一方向において異種遺伝子（群）の発現を制御するＰａｒａＢＡＤプロモーターを伴って、双方向性プロモーターとして機能し、およびＰａｒａＣ（ＰａｒａＢＡＤプロモーターに近接近し、およびそれから逆ストランドにあり）、他の方向において異種遺伝子（群）の発現が制御される。アラビノースの存在下では、双方のプロモーターからの双方の異種遺伝子の転写が誘導される。しかし、アラビノースの不存在下では、双方のプロモーターからの双方の異種遺伝子の転写は誘導されない。
【０５０７】
本開示の１つの例示的な実施態様において、本開示の遺伝学的操作細菌は、少なくとも以下の配列：テトラサイクリン抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーター、ＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＣプロモーター、およびテトラサイクリン抑制因子タンパク質（ＰＴｅｔＲ）によって抑制されるプロモーターに作動可能に連結された細菌毒素をコードする異種遺伝子を有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それはＴｅｔＲタンパク質の転写を活性化し、それは次に毒素の転写を抑制する。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣはＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、およびＴｅｔＲタンパク質は発現しない。この場合、異種毒素遺伝子の発現が活性化され、および毒素が発現される。毒素は組換え細菌細胞中に蓄積し、および組換え細菌細胞は死滅する。一実施態様では、ＡｒａＣ転写因子をコードするａｒａＣ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあり、および従って、構成的に発現される。
【０５０８】
本開示の１の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、構成的プロモーターの制御下に抗毒素をさらに含む。この状況では、アラビノースの存在下で、毒素はＴｅｔＲタンパク質による抑制のために発現されず、および抗毒素タンパク質は細胞内に蓄積する。しかし、アラビノースの不存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は発現されず、および毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。組換え細菌細胞は、毒素タンパク質が細胞中の抗毒素タンパク質の量と等しいかそれ以上の量で存在するともはや生存できず、および組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０５０９】
本開示の別の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下に抗毒素をさらに含む。この状況では、アラビノースの存在下で、ＴｅｔＲおよび抗毒素が発現され、細胞内に抗毒素が蓄積し、および毒素はＴｅｔＲタンパク質による抑制のために発現されない。しかしながら、アラビノースの不存在下では、ＴｅｔＲタンパク質および抗毒素の双方が発現されず、および毒素の発現が誘導される。毒素は組換え細菌細胞内に蓄積し始める。毒素タンパク質が発現されると、組換え細菌細胞はもはや生存できず、および組換え細菌細胞は毒素によって死滅する。
【０５１０】
本開示の別の例示的な実施態様において、本開示の遺伝学的に操作された細菌は、少なくとも以下の配列：組換え細菌細胞において見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーター（および生存のために必要とされる）、およびＡｒａＣ転写因子をコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＣプロモーターを有するキルスイッチを含む。アラビノースの存在下では、ＡｒａＣ転写因子はＰａｒａＢＡＤプロモーターを活性化し、それは必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子の転写を活性化し、組換え細菌細胞が生存することを可能にさせる。しかしながら、アラビノースが存在しない場合、ＡｒａＣはＰａｒａＢＡＤプロモーターからの転写を抑制し、生存に必要な必須タンパク質は発現しない。この場合、組換え細菌細胞はアラビノースの不存在下で死ぬ。いくらかの実施態様では、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、ちょうど上記のＴｅｔＲ／毒素キルスイッチシステムと共に細菌細胞中に存在することができる。いくらかの実施態様において、組換え細菌細胞に見出されない必須ポリペプチドをコードする異種遺伝子に作動可能に連結されたＰａｒａＢＡＤプロモーターの配列は、ちょうど上記のＴｅｔＲ／毒素／抗毒素キルスイッチシステムと併せて細菌細胞において存在することができる。
【０５１１】
さらに他の実施態様では、細菌は、短命の抗毒素および長命の毒素の双方を産生するプラスミドを伴うプラスミド安定性システムを含みうる。このシステムでは、細菌細胞は等量の毒素および抗毒素を産生して毒素を中和する。しかし、細胞がプラスミドを失う場合／とき、短命の抗毒素が崩壊し始める。抗毒素が完全に崩壊するとき、より一層長命の毒素が細胞を殺す結果として、その細胞が死ぬ。
【０５１２】
いくらかの実施態様では、本開示の操作された細菌は、上記のキルスイッチ回路のいずれかの成分をコードする遺伝子（群）をさらに含む。
【０５１３】
上記の実施態様のいずれかにおいて、細菌毒素は、リシン、Ｈｏｋ、Ｆｓｔ、ＴｉｓＢ、ＬｄｒＤ、Ｋｉｄ、ＳｙｍＥ、ＭａｚＦ、ＦｌｍＡ、Ｉｂｓ、ＸＣＶ２１６２、ｄｉｎＪ、ＣｃｄＢ、ＭａｚＦ、ＰａｒＥ、ＹａｆＯ、Ｚｅｔａ、ｈｉｃＢ、ｒｅｌＢ、ｙｈａＶ、ｙｏｅＢ、ｃｈｐＢＫ、ｈｉｐＡ、マイクロシンＢ、マイクロシンＢ１７、マイクロシンＣ、マイクロシンＣ７−Ｃ５１、マイクロシンＪ２５、マイクロシンＣｏｌＶ、マイクロシン２４、マイクロシンＬ、マイクロシンＤ９３、マイクロシンＬ、マイクロシンＥ４９２、マイクロシンＨ４７、マイクロシンＩ４７、ミクロシンＭ、コリシンＡ、コリシンＥ１、コリシンＫ、コリシンＮ、コリシンＵ、コリシンＢ、コリシンＩａ、コリシン１ｂ、コリシン５、コリシン１０、コリシンＳ４、コリシンＹ、コリシンＥ２、コリシンＥ７、コリシンＥ８、コリシンＥ９、コリシンＥ３、コリシンＥ４、コリシンＥ６、コリシンＥ５、コリシンＤ、コリシンＭ、およびクロアシンＤＦ１３、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれ得る。
【０５１４】
上記の実施態様のいずれかにおいて、抗毒素は、抗リジン、Ｓｏｋ、ＲＮＡＩＩ、ＩｓｔＲ、ＲｄｌＤ、Ｋｉｓ、ＳｙｍＲ、ＭａｚＥ、ＦｌｍＢ、Ｓｉｂ、ｐｔａＲＮＡ１、ｙａｆＱ、ＣｃｄＡ、ＭａｚＥ、ＰａｒＤ、ＹａｆＮ、Ｅｐｓｉｌｏｎ、ＨｉｃＡ、ｒｅｌＥ、ｐｒｌＦ、ｙｅｆＭ、ｃｈｐＢＩ、ｈｉｐＢ、ＭｃｃＥ、ＭｃｃＥＣＴＤ、ＭｃｃＦ、Ｃａｉ、ＩｍｍＥ１、Ｃｋｉ、Ｃｎｉ、Ｃｕｉ、Ｃｂｉ、Ｉｉａ、Ｉｍｍ、Ｃｆｉ、Ｉｍ１０、Ｃｓｉ、Ｃｙｉ、Ｉｍ２、Ｉｍ７、Ｉｍ８、Ｉｍ９、Ｉｍ３、Ｉｍ４、ＩｍｍＥ６、クロアシン免疫タンパク質（ｃｌｏａｃｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｉｍ）、ＩｍｍＥ５、ＩｍｍＤ、およびＣｍｉ、またはその生物学的に活性な断片からなる群より選ばれ得る。
【０５１５】
一実施態様では、細菌毒素は遺伝学的に操作された細菌に対して殺菌性である。一実施態様では、細菌毒素は遺伝学的に操作された細菌に対して静菌性である。
【０５１６】
いくらかの実施態様では、ここに提供される遺伝学的に操作された細菌は、栄養要求体である。一実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、  ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１栄養要求株である。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、１よりも多くの栄養要求性を有し、たとえば、それらはΔｔｈｙＡおよびΔｄａｐＡ栄養要求性であり得る。
【０５１７】
いくらかの実施態様では、ここに提供される遺伝学的に操作された細菌は、キルスイッチ回路、たとえば、ここに提供されるキルスイッチ回路などのようなものをさらに含む。たとえば、いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、誘導性プロモーターおよび逆毒素配列の制御下に１以上のリコンビナーゼ（群）をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、誘導性プロモーターおよび１以上の逆方向切除遺伝子の制御下に１以上のリコンビナーゼ（群）をコードする１以上の遺伝子をさらに含み、そこで、切除遺伝子（群）は必須遺伝子を削除する酵素をコードする。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。いくらかの実施態様では、操作された細菌は、ＴｅｔＲ抑制因子結合部位を有するプロモーターの制御下に毒素をコードする１以上の遺伝子、およびアラビノースによって誘導される誘導性プロモーターの制御下にＴｅｔＲをコードする遺伝子、たとえば、ＰａｒａＢＡＤなどのようなものをさらに含む。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、抗毒素をコードする１以上の遺伝子をさらに含む。
【０５１８】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、治療上のペイロードを含む栄養要求体であり、およびキルスイッチ回路、たとえば、ここに記載のキルスイッチ回路などのようなものをさらに含む。
【０５１９】
上記の遺伝学的に操作された細菌のいくらかの実施態様では、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌のプラスミド上に存在し、およびプラスミド上で誘導性プロモーターに作動可能に連結される。他の実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、細菌染色体に存在し、および染色体において誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
スクリーニング法
変異誘発
【０５２０】
いくらかの実施態様では、誘導性プロモーターは、検出可能な生成物に、例は、ＧＦＰに、作動可能に連結され、および変異体をスクリーニングするために使用することができる。いくらかの実施態様では、誘導性プロモーターは変異誘発され、および変形物は、検出可能な生成物のレベルに基づいて、例は、フローサイトメトリー、検出可能な生成物が蛍光を発するとき蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選定される。いくらかの実施態様では、１以上の転写因子結合部位は変異誘発されて結合を増加または減少させる。代わりの実施態様では、野生型結合部位は無傷のままであり、および調節領域の残りは変異誘発に供される。いくらかの実施態様では、誘導性条件下で抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子の発現を、同じ条件下で同じサブタイプの変異されていない細菌と比較して増加させるために、変異プロモーターが本発明の遺伝学的に操作された細菌に挿入される。いくらかの実施態様において、誘導性プロモーターおよび/または対応する転写因子は、合成の、非自然配列である。
【０５２１】
いくらかの実施態様において、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子をコードする遺伝子は、誘発条件下で前記分子の発現および/または安定性を、同じ条件下で同じサブタイプの変異されていない細菌と比較して増加させるように変異される。いくらかの実施態様では、抗炎症および/または消化管バリアエンハンサー分子を産生するための遺伝子カセット中の１以上の遺伝子が、誘導性条件下で前記分子の発現を、同じ条件下に同じサブタイプの非変異細菌と比較して増加させるよう変異される。いくつかの実施態様において、目的の代謝産物についての輸入者および輸出者のいずれかの効力または活性は、これらの遺伝子のいずれかの突然変異によって改善され得る。突然変異は、同じ条件下で同じサブタイプの非突然変異細菌と比較して、誘発条件下でのトリプトファンを含むがこれらに限定されない代謝産物の取り込みまたは輸出を増加させる。指向性突然変異およびスクリーニングのための方法は、当該分野で公知である。
目的の代謝産物を輸送する能力を増強した細菌株の作製
【０５２２】
培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さなゲノムのために、微生物は短縮された時間スケールで独特の表現型に進化することができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）  は、好ましい表現型の株を進化させるために選択的圧力下で微生物を継代するプロセスである。最も一般的には、これは、炭素/エネルギー源の利用を増加させるため、または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）にストレインを適応させるために適用され、炭素基質またはストレス下でより成長しやすい突然変異株は、人口は最終的に人口を支配するようになります。
【０５２３】
この同じプロセスは、栄養要求株を作製することによって、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求株は、必須代謝産物を合成することができない株であり、従って、増殖するために培地中に代謝産物を供給しなければならない。このシナリオでは、栄養要求株を作って代謝産物の量を減らすことによってそれを継代することにより、得られた優性株は、この必須代謝産物をより入手し、組み込むことができるはずである。
【０５２４】
例えば、目的の代謝産物を産生するための生合成経路が破壊される場合、目的の代謝産物の高親和性捕捉能を有する菌株は、ＡＬＥを介して進化させることができる。最初に、増殖を支持するための最小濃度が確立されるまで、目的の栄養要求性代謝産物の様々な濃度で株を増殖させる。次いで、その菌株をその濃度で継代し、規則的な間隔で目的の代謝産物の濃度を低下させるために希釈する。時間が経つと、成長制限濃度で、目的の代謝産物に対して最も競合する細胞が集団を支配するようになる。これらの菌株は、目的の代謝産物を輸入する能力が向上するように、目的の輸送体の代謝産物に突然変異を有する可能性が高い。
【０５２５】
同様に、上流代謝産物を使用して目的代謝産物を形成することができない栄養要求株を使用することによって、上流代謝産物をより効率的に輸入することができるだけでなく、代謝産物を重要な下流代謝産物。これらの株はまた、上流代謝産物の輸入を増加させるために突然変異を進化させるが、下流の酵素の発現または反応動力学を増加させる突然変異、または競合的基質利用経路を減少させる突然変異も含み得る。
【０５２６】
微生物に固有の代謝産物は、内在性代謝産物の増殖制限補充を適用した突然変異栄養要求および選択を介して必須とすることができる。しかしながら、非天然化合物を消費することができる表現型は、それらの消費を必須化合物の生産に結びつけることによって進化させることができる。例えば、本質的な化合物または必須の化合物の前駆体を産生することができる異なる生物由来の遺伝子が単離された場合、この遺伝子は異種宿主において組換えにより導入および発現され得る。この新しい宿主株は、以前は非代謝性の基質から必須の栄養素を合成する能力を持つようになりました。
【０５２７】
これにより、直ぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求株を作製し、生育を制限する量の非天然化合物を組換え酵素の同時発現で選択することにより、同様のＡＬＥプロセスを適用することができる。これにより、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性、および下流の天然酵素の発現および活性に変異が生じる。このプロセスにおける重要な要件は、非天然代謝産物の消費を成長に不可欠な代謝産物の産生につなげる能力であることが強調されるべきである。
【０５２８】
選択メカニズムの基礎が確立され、補充の最低レベルが確立されたら、実際のＡＬＥ実験を続けることができる。このプロセスを通じて、いくつかのパラメータを注意深く監視する必要があります。培養物が指数増殖期に維持され、飽和/定常期に達することができないことが重要である。これは、各継代中に増殖率をチェックし、それに応じてその後の希釈率を調整しなければならないことを意味する。希釈率が大きくなる程度に成長率が向上すれば、栄養補給の濃度を低下させて、増殖速度を遅くし、選択圧を高め、継代中に部分集団を大きく偏らせるほどの希釈はしないようにすべきである。さらに、定期的に細胞を希釈し、固体培地で増殖させ、個々のクローンを試験して、ＡＬＥ培養物で観察される増殖速度の表現型を確認する必要がある。
【０５２９】
停止をいつ停止するか予測すると、ＡＬＥ実験はまた警戒を必要とする。進化を導く成功が実験を通して「スクリーニング」された突然変異の数に直接結びついており、突然変異は一般にＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂（ＣＣＤ）はスクリーニングされた全突然変異体の代理として作用する。これまでの研究では、異なる炭素源で増殖するための有益な表現型が約１０１１．２ＣＣＤ１で分離できることが示されている。この速度は、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような培養物への化学的突然変異誘発剤の添加によって加速され、ＤＮＡ複製エラーを増加させる。しかし、継続的な継代が成長率の限界に至るか、または成長率の改善をもたらさない場合、集団はある適応度の最大値に収束し、ＡＬＥ実験は停止することができる。
【０５３０】
ＡＬＥ実験の終了時に、細胞を希釈し、固体培地上で単離し、培養フラスコの成長表現型と一致する成長表現型についてアッセイする必要がある。選択されたものから最良のパフォーマーがゲノムＤＮＡのために準備され、全ゲノム配列決定のために送られる。改善された表現型を提供することができるゲノムの周りに現れる明らかな突然変異を伴う配列決定は、サイレント突然変異（有益ではないが所望の表現型を損なわないもの）も含む。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異誘発物質の存在下で進化した培養物では、より多くのサイレントなバックグラウンド突然変異が存在するであろう。現在の状態で最良の性能を示す歪みに満足すれば、ユーザーはその歪みを伴う適用に進むことができる。さもなければ、関与する突然変異は、ゲノム工学技術によって突然変異を親株に再導入することによって、進化した株からデコンボリューションされ得る。Ｌｅｅ、Ｄ．Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ、Ａ．Ｍ。、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃ．Ｌ．＆Ｐａｌｓｓｏｎ、Ｂ．Ｏ。エシェリヒア・コリの適応実験室進化のための意味的タイムスケールとしての細胞分裂の累積数ＰＬｏＳ  ＯＮＥ６、ｅ２６１７２（２０１１）。
【０５３１】
類似の方法を使用して、代謝産物（トリプトファンを含むがこれに限定されない）を消費または輸入する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ突然変異体を作製することができる。
製薬上組成物および調剤物
【０５３２】
本発明の遺伝学的に操作された微生物を含む製薬上組成物は、消化管において炎症性機構を抑制し、消化管粘膜バリア機能を回復および強化し、および／または自己免疫疾患を処置または予防するために使用され得る。１以上の遺伝学的に操作された細菌および/または１以上の遺伝学的に操作されたウイルスを含む製薬上組成物は、単独で、または予防剤、治療剤、および／または薬学的に許容可能な担体と組み合わせて提供される。
【０５３３】
一定の実施態様では、製薬上組成物は、例は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために、ここに記載の遺伝子修飾を含むように操作される細菌の１つの種、菌株、またはサブタイプを含む。代わりの実施態様において、製薬上組成物は、ここに記載の遺伝子修飾をそれぞれ含むように、例は、抗炎症および／または消化管バリアエンハンサー分子を産生するために操作された細菌の２以上の種、菌株、および／またはサブタイプを含む。
【０５３４】
ここに記載の製薬上組成物は、活性成分の製薬上用途のための組成物への加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む１以上の生理学的に許容可能な担体を用いて慣習的な方法で調剤しうる。製薬上組成物を調剤する方法は、当技術において既知である（例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ）」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（マック・パブリッシング社）、Ｅａｓｔｏｎ（イーストン）、ＰＡ（ペンシルベニア州）」参照）。いくらかの実施態様において、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または紛体を形成するために、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、慣習的混合、溶解、造粒、レビゲーティング（水簸とも言う）、乳化、エンカプスレーティング（被包とも言う）、エントラッピング（捕捉とも言う）、または噴霧乾燥に供され、それらは腸溶性にコーティングされるか、またはコーティングされていなくてもよい。適切な製剤は施与経路に依存する。
【０５３５】
遺伝学的に操作された微生物は、任意の適切な剤形（例は、液体、カプセル、サシェ、硬カプセル、軟カプセル、錠剤、腸溶錠、懸濁粉末、顆粒、または経口投与のためのマトリクス持続放出調剤）において、および任意の適切なタイプの施与（例は、経口、局所、注射可能、静脈内、皮下、即時放出、拍動放出、遅延放出、または持続放出）のために製薬上組成物に調剤し得る。遺伝学的に操作された細菌の適切な投薬量は、約１０５から１０１２細菌まで、例は、およそ１０５細菌、およそ１０６細菌、およそ１０７細菌、およそ１０８細菌、およそ１０９細菌、およそ１０１０細菌、およそ１０１１細菌、またはおよそ１０１１細菌に及んでよい。組成物は、毎日、毎週、または毎月１回以上施与することができる。組成物は、食餌の前、間、または後に施与することができる。一実施態様では、製薬上組成物は対象が食餌を取る前に施与される。一実施態様では、製薬上組成物は広く食餌と共に施与される。一実施態様では、製薬上組成物は、対象が食餌を取った後に施与される。
【０５３６】
遺伝学的に操作された細菌または遺伝学的に操作されたウイルスは、１以上の薬学的に許容可能な担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、緩衝化剤、界面活性剤、中性またはカチオン性（陽イオン性とも言う）脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または薬剤を含む製薬上組成物に調剤され得る。たとえば、製薬上組成物は、制限されないが、重炭酸（炭酸水素とも言う）カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および界面活性剤の添加を含む。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、重炭酸ナトリウムの溶液、例は、重炭酸ナトリウムの１モル溶液において（たとえば、胃などのような酸性細胞環境を緩衝するために）調剤し得る。遺伝学的に操作された細菌は、中性または塩形態として施与および製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、アニオン（陰イオンとも言う）、たとえば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののようなもので形成されるもの、およびカチオン（陽イオン）、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、などから導き出されるもののようなものから形成されるものが含まれる。
【０５３７】
遺伝学的に操作された微生物は、静脈内に、例えば、注入または注射によって投与され得る。
【０５３８】
ここに開示される遺伝学的に操作された微生物はくも膜下腔内に投与され得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された微生物を経口投与され得る。ここに開示される遺伝学的に操作された微生物は、局所的に施与され、および軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、または当業者によく知られる他の形態において調剤され得る。例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照。一実施態様では、非噴霧可能な局所剤形のために、担体または局所適用に適合可能な、水よりも大きい動粘度を有する１以上の賦形剤を含む粘性から半固形または固形形態が用いられる。適切な調剤物には、制限されないが、溶液、懸濁物、エマルション、クリーム、軟膏、紛体、リニメント剤、サルブ（膏薬とも言う）、などが含まれ、それらは滅菌することができ、または種々の特性、例は、浸透圧に影響を及ぼすために、助剤（例は、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩類）と混合することができる。他の適切な局所投与形態には、噴霧可能なエアロゾル調剤物が含まれ、そこでは、固形または液状の不活性担体と組み合わせられる活性成分が、加圧揮発性物質（例は、気体状推進物質、たとえば、フレオンなどのようなもの）との混合物において、またはスクイズボトルにおいて包装される。加湿剤または湿潤剤も、製薬上組成物および剤形に添加することができる。そのような追加の成分の例は当技術においてよく知られる。一実施態様では、本発明の組換え細菌を含む製薬上組成物は、衛生用品として調剤してよい。たとえば、衛生用品は、抗菌調剤物、または発酵生成物、たとえば、発酵ブロスなどのようなものであってもよい。衛生用品は、たとえば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであり得る。
【０５３９】
ここに開示される遺伝学的に操作された微生物は、経口的に投与され、および錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液状物、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物、などとして調剤され得る。経口使用のための薬理学的組成物は、錠剤またはドラジェ（糖衣錠）コアを得るために、固形賦形剤を用いること、得られる混合物を随意に、グラインディング（粉砕とも言う）すること、および所望により適切な助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理することで作成することができる。適切な賦形剤には、制限されないが、充填材、たとえば、糖で、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含むもの；セルロース組成物で、たとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのようなもの；および/または生理学的に許容可能なポリマーで、たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのようなものが含まれる。崩壊剤を添加してもよく、たとえば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、たとえば、アルギン酸ナトリウムなどのようなものである。
【０５４０】
錠剤またはカプセルは、薬学的に許容可能な賦形剤、たとえば、結合剤（例は、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）などのようなもの；充填剤（例は、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例は、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例は、デンプン、ジャガイモデンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉体）；または湿潤剤（例は、ラウリル硫酸ナトリウム）により慣習的な手段によって調製することができる。錠剤は、当技術においてよく知られる方法によってコーティングすることができる。コーティングシェルが存在してよく、および共通の膜には、制限されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、他の生分解可能なポリマー、アルギナート（アルギン酸とも言う）−ポリリジン−アルギン酸（ＡＰＡ）、アルギン酸−ポリメチレン−コ−グアニジン−アルギン酸（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリラート−メチル−メタクリラート（ｈｙｄｒｏｙｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＨＥＭＡ−ＨＥＭＡ）、多層状ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリルビニルクロライド（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、シリカ質カプセル（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｓ）、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−コ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガム−ゲルビーズ（ｋ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−ｌｏｃｕｓｔ  ｂｅａｎ  ｇｕｍ  ｇｅｌ  ｂｅａｄｓ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物、ポリメタクリル酸デンプン、ポリアミノ酸、および腸溶性コーティングポリマーが含まれる。
【０５４１】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された微生物は、消化管または消化管の特定の領域、たとえば、大腸への放出のために腸溶性にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１−４（胃）、５．５−６（十二指腸）、７．３−８．０（回腸）、および５．５−６．５（結腸）である。いくつかの疾患では、ｐＨプロファイルは修飾されうる。いくらかの実施態様において、コーティングは、放出部位を特定するために、特定のｐＨ環境で分解される。いくらかの実施態様では、少なくとも２つのコーティングが使用される。いくらかの実施態様では、外側のコーティングおよび内側のコーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
【０５４２】
経口投与のための液状調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁物、または乾燥生成物の形態をとり得る。このような液状調製物は、薬学的に許容される薬剤、たとえば、懸濁剤（例は、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔｓ））；乳化剤（例は、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例は、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および保存剤（例は、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などのようなものによる慣習的な手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝剤塩、着香剤、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。経口投与のための調製物は、ここに記載の遺伝学的に操作された微生物の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に調剤され得る。
【０５４３】
一実施態様では、本開示の遺伝学的に操作された微生物は、小児対象への施与に適する組成物において調剤され得る。当技術においてよく知られるように、胃内容排出、ｐＨ、消化管透過性、などの異なる速度を含め、チルドレンは多くの側面で成体と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａ（イワノフスカ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（ペディアトリックス）、１３４（２）：３６１−３７２、２０１４）。さらに、小児の調剤受容性および嗜好、たとえば、施与経路および味覚属性は、許容可能な小児の服薬遵守を達成するために重要である。したがって、一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は、嚥下しやすいか、または溶解可能な剤形、またはより一層美味な組成物、たとえば、風味、甘味料、または味覚遮断剤を添加した組成物などのようなものを含み得る。１の実施態様において、小児対象への施与に適する組成物はまた、成体への施与に適していてもよい。
【０５４４】
一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁物、エリキシル、懸濁物または溶液として再構成するための粉体、分散性/発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザー・ポップ（ｆｒｅｅｚｅｒ  ｐｏｐ）、トローチ、チューインガム、オーラル・ティン・ストリップ（ｏｒａｌ  ｔｈｉｎ  ｓｔｒｉｐ、口腔薄片とも言う）、口腔内崩壊錠（ｏｒａｌｌｙ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、サシェ（小さな袋とも言われる）、軟質ゼラチンカプセル、スプリンクル・オーラル・パウダー（散剤経口粉末とも言う）、または顆粒が含まれ得る。一実施態様では、組成物は、キャンディー弾力性、望ましい噛む必要がある粘稠度、およびより一層長い貯蔵寿命を与える、ゼラチンベースから作られたグミ（ゴム状とも言う）キャンディーである。いくらかの実施態様では、グミキャンディーは甘味料または香味料を含むこともできる。
【０５４５】
一実施態様では、小児対象への施与に適した組成物は香味料を含むことができる。ここに使用するように、「香味料（フレーバー）」は、調剤物に明確な味および香りを提供する物質（液体または固体）である。香味料はまた、調剤物の嗜好性を改善するのに役立つ。香味料には、制限されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。
【０５４６】
一定の実施態様において、遺伝学的に操作された微生物は、たとえば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与され得る。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されても、錠剤に圧縮されても、または対象の食餌に直接組み込んでもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に取り込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエハー、およびその他同種類のものなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外の方法で化合物を投与するには、化合物をその不活性化を防止する物質でコーティングするか、化合物と一緒に投与することが必要な場合がある。
【０５４７】
別の実施態様では、本発明の組換え細菌を含む製薬上組成物は、食用に適した生成物、たとえば、食料生成物であってもよい。一実施態様では、食料生成物は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、サワーミルク（酸乳）、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、植物果実ジュース、果汁、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児食（たとえば、乳児用ケーキなどのようなもの）、栄養上の食料生成物、動物飼料、または栄養補給剤である。一実施態様では、食料生成物は、発酵食料、たとえば、発酵乳生成物などのようなものである。一実施態様では、発酵乳生成物はヨーグルトである。別の実施態様において、発酵乳生成物は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクシェイク（ミルクセーキとも言う）、またはケフィアである。別の実施態様では、本発明の組換え細菌を、プロバイオティクスとして作用することが意図される他の生菌細胞を含む調製物において組み合わせる。別の実施態様において、食料生成物は飲料である。一実施態様では、飲料は、果汁系飲料または植物またはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施態様において、食料生成物はゼリーまたはプディング（プリンとも言う）である。本発明の組換え細菌の施与に適する他の食料生成物は当技術においてよく知られる。たとえば、米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および第２０１５／０２３８５４５号が参照され、それらの各々の全体の内容は参照によりここに明示的に組み込まれる。さらに別の実施態様では、本発明の製薬上組成物は、食料生成物、たとえば、パン、ヨーグルト、またはチーズなどのようなものに注入、噴霧、または散在される。
【０５４８】
いくらかの実施態様では、組成物は、腸溶性にコーティングされ、またはコーティングされていないナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、またはマイクロタブレットを介して、腸管内（小腸内とも言う）投与、内腔内（空腸内とも言う）投与、十二指腸内投与、腹腔内（回腸内とも言う）投与、胃シャント（ｇａｓｔｒｉｃ  ｓｈｕｎｔ）投与、または腸内（結腸内とも言う）投与のために調剤される。製薬上組成物はまた直腸組成物、たとえば、坐剤または停留浣腸などのようなものにおいて、例は、慣習的な座薬基剤、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドなどのようなものを使用して調剤することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおいて懸濁物、溶液、またはエマルションであってもよく、および懸濁剤、安定化剤および/または分散剤を含んでいてもよい。
【０５４９】
ここに記載される遺伝学的に操作された微生物は、鼻腔内投与され、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で調剤され得、そして好都合には、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で、適切な推進剤（例は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）の使用を伴ってデリバリーされる。加圧エアロゾル投与単位は、計量された量を送るためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例は、ゼラチン製のもの）は、化合物および適切な粉体基剤、たとえば、ラクトースまたはデンプンなどのようなものとの粉体混合物を含め、調剤することができる。
【０５５０】
遺伝学的に操作された微生物は、デポー製剤として投与され、および調剤され得る。そのような長時間作用性調剤物は、静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、または注入を含め、移植によってか、または注射によって施与されうる。たとえば、組成物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例は、許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ）誘導体として（例は、難溶性塩として）調剤され得る。
【０５５１】
いくらかの実施態様では、ここに開示されるものは、単一剤形において薬学的に許容可能な組成物である。単一剤形は、液状または固形形態であり得る。単一剤形は、改変することなくペイシェント（主として患者を意味する）に直接施与してもよく、または施与に先立ち希釈または再構成してもよい。一定の実施態様では、単一剤形をボーラス形態、例は、複数回の錠剤、カプセル、丸剤、などを含む経口投与を含め、単一注射、単一経口用量で施与することができる。代替実施態様では、単一剤形は、ある期間にわたって、例は、注入によって施与することができる。
【０５５２】
製薬上組成物の単一剤形は、製薬上組成物を、より一層小さなアリコート、単一用量容器、単一用量液状形態、または単一用量固形形態、たとえば、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロタブレット、ペレット、または粉末などのようなものに分けることによって調製することができ、それらは腸溶性コーティングまたは非コーティングであり得る。固形形態での単一用量は、ペイシェントに施与するのに先立ち、液体、典型的には滅菌水または生理的塩類溶液を添加することによって再構成することができる。
【０５５３】
他の実施態様では、組成物は制御放出システムまたは持続放出システムにおいて送ることができる。一実施態様では、制御されたか、または持続的な放出を達成するためにポンプを使用することができる。別の実施態様では、ポリマー材料を使用して、本開示の療法での制御または持続的な放出を達成することができる（例は、米国特許第５，９８９，４６３号参照）。持続放出性（徐放性とも言う）製剤に使用されるポリマーの例には、制限されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン-コ-ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。徐放性調剤物に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能不純物フリーで、貯蔵時に安定であり、滅菌され、および生分解性であり得る。いくらかの実施態様では、制御放出または徐放性システムを予防または治療上の標的の近傍に配置することができ、それにより全身的投与量のほんの一部しか必要とされない。当業者に既知の任意の適切な技術を使用することができる。
【０５５４】
投薬量レジメンは、治療上の応答を提供するように調節され得る。投薬は、疾患の重篤度および応答性、投与経路、処置の時間経過（数日から数ヶ月から数年にかけて）、および疾患の改善時間を含め、いくつかの要因に依存し得る。たとえば、単一のボーラスを一度に施与することができ、いくつかの分割用量を所定の期間にわたって投与してもよく、または治療上の状況によって示されるように用量を減少または増加させることができる。投薬量の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果によって規定される。投薬量値は、緩和すべき状態のタイプおよび重症度によって変動し得る。いずれかの特定の対象について、個々の必要性および治療臨床医の専門的判断に従って、特定の投薬量計画を経時的に調整することができる。ここに提供される化合物の毒性および治療上の効力は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬学的手順によって決定することができる。たとえば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、およびＩＣ５０を決定し、および毒性および治療上の効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として算出することができる。有害な副作用を示す組成物を使用して、潜在的な損傷を最小限にして副作用を軽減するために注意深く修飾してもよい。施与は、初期に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定することができる。インビトロおよびインビボアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投薬量の範囲を定式化する際に使用することができる。
【０５５５】
成分は、別個に、または密閉式のシール容器、たとえば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどのようなものにおいて乾燥した凍結乾燥粉体または水分フリー濃縮物のような単位剤形において一緒に混合して供給される。施与のモードが注射によるものである場合、注射のための滅菌水または生理的塩類溶液のアンプルを提供して、その結果成分を施与前に混合することができる。
【０５５６】
製薬上組成物は、密閉式のシールされた容器、たとえば、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどのようなものにおいて包装されてもよい。一実施態様では、製薬上組成物の１以上は、密閉式のシールされた容器内で乾燥した滅菌凍結乾燥粉体または水フリー濃縮物として供給され、および対象への施与のために適切な濃度に再構成（例は、水または生理的塩類溶液により）することができる。ある実施態様では、１以上の予防剤または治療剤または製薬上組成物は、２℃および８℃間で貯蔵された密閉式シール容器内で乾燥滅菌凍結乾燥粉体として供給され、および１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または再構成後１週間以内に施与される。凍結保護物質は、凍結乾燥剤形のために、主に０−１０％のスクロース（最適には０．５−１．０％）で含まれることができる。他の適切な凍結保護物質には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニンが含まれ、そのいずれも０−０．０５％の濃度で、およびポリソルベート−８０（最適には０．００５−０．０１％の濃度で含まれる）が含まれることができる。追加の界面活性剤には、制限されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。製薬上組成物は、注射可能な溶液として調製することができ、およびアジュバントとして有用な薬剤、たとえば、吸収または分散を増加させるために使用されるもの、例は、ヒアルロニダーゼなどのようなものをさらに含むことができる。
処置の方法
【０５５７】
本発明の別の態様は、自己免疫障害、下痢性疾患、ＩＢＤ、関連疾患、および消化管炎の減少および/または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置する方法を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、薬の製造のための、ここに記載の細菌の少なくとも１つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプの使用を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、自己免疫障害、下痢性疾患、ＩＢＤ、関連疾患、および消化管炎の減少および／または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置するために、ここに記載の細菌の少なくとも１種の遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプの使用について提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、自己免疫疾患、下痢性疾患、ＩＢＤ、関連疾患、および消化管炎の減少および／または消化管バリア機能の増強から利益を得る他の疾患の処置に使用するために、ここに記載の細菌の少なくとも１つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプを提供する。
【０５５８】
いくらかの実施態様では、下痢性疾患は、急性水様性下痢、例は、コレラ、急性血性下痢、例は、赤痢、および持続性下痢からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、ＩＢＤまたは関連疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎（コラーゲン蓄積性大腸炎とも言う）、リンパ球性大腸炎、転換大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、中間大腸炎（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側結腸炎（左腸大腸炎とも言う）、全結腸炎（全大腸炎）、および劇症性大腸炎からなる群より選ばれる。いくらかの実施態様では、疾患または状態は、急性散在性（急性播種性とも言う）脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎（ａｃｕｔｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、無ガンマグロブリン（アマガングロブリン）血症、円形脱毛症、アミロイドーシス（類でんぷん症）、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全（症）、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索アンド神経ニューロパシー（ａｘｏｎａｌ  ＆  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、バロー病（Ｂａｌｏ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ、心筋症）、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｏｓｔｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、慢性再発性多巣性耳状骨症）（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（チャーグ病、Ｃｈｕｒｇｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患（ＣＲＥＳＴ病）、本態性混合性クリオグロブリン血症（必須混合性クリオグロブリン血症）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状（疱疹性）皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（デヴィス病）（視神経脊髄炎）（神経鞘炎）、円板状ループス（円板状狼瘡）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト脳炎、ハシモト甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕ��ａｔｏｒｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、カワサキ症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性（白血球梗塞性）血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（苔状硬化症）、木質性結膜炎（羊膜結膜炎）、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（狼瘡）（全身性エリトマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、視神経炎、パリンドロームリウマチ（回帰性リウマチ）、ＰＡＮＤＡＳ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症（傍腫瘍性小脳変性症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソンネージターナー症候群（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、I型、II型およびIII型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群（ｐｏｓｔｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（むずむず脚症候群）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、タカヤス動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、脈管炎、小水疱性外皮疾患、白斑、およびウエゲナー肉芽腫症からなる群より選ばれる自己免疫疾患である。いくらかの実施態様では、本発明は、制限されないが、下痢、血便、口内炎（ｍｏｕｔｈ  ｓｏｒｅｓ、口のびらんとも言う）、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲の喪失（食欲不振とも言う）、重量減少、無食欲、増殖遅延（発育遅延とも言う）、思春期発達の遅れ（ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｕｂｅｒｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、および皮膚、眼、関節、肝臓、および胆管の炎症を含め、それらの疾患に関連する一以上の症状（群）を軽減、改善、または排除するための方法を提供する。いくらかの実施態様では、本発明は、消化管炎症を軽減し、および／または消化管バリア��能を増強するための方法を提供し、それによって全身性自己免疫疾患、例は、喘息（Ａｒｒｉｅｔａら、２０１５）が改善または防止される。
【０５５９】
本方法は、ここに記載の細菌の少なくとも１つの遺伝学的に操作された種、菌株、またはサブタイプを伴う製薬上組成物を調製すること、および治療上有効な量において対象に本製薬上組成物を施与することを包含し得る。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、液状懸濁物において経口投与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌をゲルキャップにおいて凍結乾燥し、および経口投与する。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は栄養管を介して施与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、直腸に、例は、浣腸によって施与される。いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、局所的、小腸内（ｉｎｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｌｙ）、空腸内（ｉｎｔｒａｊｅｊｕｎａｌｌｙ）、十二指腸内、回腸内、および／または結腸内（ｉｎｔｒａｃｏｌｉｃａｌｌｙ）に施与される。
【０５６０】
いくつかの実施態様において、遺伝子操作されたウイルスは、効率的な送達の必要性および宿主抗ウイルス免疫応答を克服するための必要性を考慮に入れて、送達のために調製される。抗ウイルス応答を回避するアプローチには、抗体認識からウイルスをマスクするポリマーコーティングおよび送達ビヒクルとしての細胞の使用など、治療計画（血清型切り替え）、処方のパーツとは異なるウイルス血清型の投与が含まれる。
【０５６１】
別の実施態様では、組成物は制御放出系または持続放出系で送達することができる。一実施態様では、制御されたまたは持続的な放出を達成するためにポンプを使用することができる。別の実施態様では、ポリマー材料を使用して、本開示の治療の制御放出または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。徐放性製剤に使用されるポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリルポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリ（ポリビニルピロリドン）ポリオルトエステル。徐放性製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、貯蔵時に安定であり、滅菌され、生分解性であり得る。いくつかの実施態様では、制御放出または持続放出系を予防または治療標的の近傍に配置することができ、全身投与量のほんの一部しか必要としない。当業者に公知の任意の適切な技術を使用することができる。
【０５６２】
本発明の遺伝子操作された細菌は、中性または塩形態として投与および製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもののような陰イオンと、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどが挙げられる。
【０５６３】
一定の実施態様では、ここに記載の製薬上組成物は、消化管炎症を軽減し、消化管バリア機能を増強し、および／または対象において自己免疫障害を処置または防止するために施与される。いくらかの実施態様では、本開示の方法は、対象において消化管炎症を、未処置またはコントロール対象におけるレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれらより多くだけ減少させることができる。いくらかの実施態様では、本開示の方法は、対象において消化管バリア機能を、未処置またはコントロール対象のレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれらより多くだけ増加させることができる。いくらかの実施態様では、炎症および／または消化管バリア機能の変化は、製薬上組成物の施与前および施与後の対象を比較することによって測定される。いくらかの実施態様では、自己免疫障害および／または消化管炎症および／または消化管バリア機能の低下に関連する疾患または状態を処置または改善する方法は、疾患または状態の１以上の症状が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれらよりも多くだけ改善されることを可能にする。
【０５６４】
いくつかの実施態様では、低下は、医薬組成物の投与前後の被験体の炎症レベルを比較することによって測定される。一実施態様では、被験体の腸内で炎症のレベルが低下する。１つの実施態様において、消化管バリア機能は被験体の腸で増強される。別の実施態様において、炎症のレベルは、対象の血液中で減少する。別の実施態様では、被験体の血漿中の炎症レベルが低下する。別の実施態様において、炎症のレベルは、被験体の脳において減少する。
【０５６５】
一実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、被験体の炎症レベルを正常レベルまで低下させるために投与される。別の実施態様では、本明細書に記載の医薬組成物を投与して、被験体における炎症のレベルを正常よりも低下させる。
【０５６６】
いくつかの実施態様では、自己免疫障害を治療する方法は、状態または障害の１つ以上の症状が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％。いくつかの実施態様では、障害を処置する方法は、状態または障害の1つまたは複数の症状が、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍である。
【０５６７】
製薬上組成物の施与の前、その間およびその後に、消化管炎症および／またはバリア機能は、対象において、生物学的サンプル、たとえば、血液、血清、血漿、尿、糞便物質、腹腔液（腹水とも言う）、腸粘膜のスクレイピング、組織から収集した試料、および/または次のもの：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管などのようなものの１以上の内容物から収集した試料において測定することができる。いくらかの実施態様では、本方法は、消化管バリア機能を増強するため、および／または消化管炎症をベースラインレベル、例は、対象において、健康コントロールのレベルに匹敵するものに低下させるため、本発明の組成物の施与を含み得る。いくらかの実施態様では、本方法は、対象において、消化管炎症を検出不能レベルまで、または処置前の対象のレベルの少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または８０％未満に低下させるために、本発明の組成物の施与を含み得る。いくらかの実施態様では、本方法は、対象において、消化管バリア機能を、処置前の対象のレベルの少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％またはそれらよりも多くだけ高めるために、本発明の組成物の施与を含み得る。
【０５６８】
一定の実施態様では、組換え細菌はＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅである。組換え細菌は、例は、消化管または血清中の防御因子（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９）によって、または施与の数時間後または数日後にキルスイッチの活性化によって破壊され得る。したがって、組換え細菌を含む製薬上組成物は、治療上有効な用量および頻度で再施与され得る。別の実施態様では、組換え細菌は、施与後数時間または数日以内には破壊されず、および消化管で増殖および定着することができる。
【０５６９】
製薬上組成物は、単独で、または１以上の追加の治療剤、例は、コルチコステロイド、アミノサリチラート（アミノサリチル酸とも言う）、抗炎症剤と組み合わせて施与することができる。いくらかの実施態様において、製薬上組成物は、抗炎症薬物（例は、メサラジン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド（ｂｕｔｅｓｏｎｉｄｅ））、免疫抑制薬物（例は、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス）、抗生物質（例は、メトロニダゾール、オルニダゾール、クラリスロマイシン、リファキシミン、シプロフロキサシン、抗ＴＢ）、他のプロバイオティクス、および/または生物学的物質（例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル）（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｌｉｄｉｓ（トリアンタフィリディス）ら、２０１１）と組み合わせて施与される。１以上の追加の治療剤の選定における重要な考慮点は、薬剤が本発明の遺伝学的に操作された細菌と適合性でなければならないことであり、例は、薬剤（群）は本細菌を死滅させてはならない。本明細書中に開示される細胞は、１日１回被験体に投与される。別の実施態様では、本明細書に開示される細菌細胞は、１日２回対象に投与される。別の実施態様では、本明細書に開示される細菌細胞は、食事と組み合わせて対象に投与される。別の実施態様では、本明細書に開示される細菌細胞は、食事の前に被験体に投与される。別の実施態様では、本明細書に開示される細菌細胞は、食事の後に被験体に投与される。製薬上組成物の投薬量および施与頻度は、症状の重篤度および病気の進行に基づいて選定し得る。施与の適切な治療上有効な用量および/または頻度は、治療を行う医師によって選定することができる。
インビボでの処置
【０５７０】
本発明の遺伝学的に操作された細菌は、インビボで、例は、動物モデルにおいて評価することができる。消化管炎症、消化管バリア機能の低下、および/または自己免疫障害に関連する疾患または状態の任意の適切な動物モデルを使用し得る（例は、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ（ミゾグチ）、２０１２参照）。動物モデルはＩＢＤのマウスモデル、例は、ＣＤ４５ＲＢＨｉＴ細胞トランスファーモデルまたはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルであり得る。動物モデルは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のマウスモデルであり得、そしてＴ１Ｄは、ストレプトゾトシンでの処置によって誘導され得る。
【０５７１】
大腸炎は結腸の内層の炎症によって特徴付けられ、そしてＩＢＤの一形態である。マウスでは、モデル化大腸炎はしばしばＴ細胞および／またはサイトカインの異常な発現を伴う。ＩＢＤの１つの例示的なマウスモデルは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞をそのＣＤ４５ＲＢ発現レベルに従って選別し、および正常ドナーマウスからのＣＤ４５ＲＢ発現が高いＣＤ４＋  Ｔ細胞を免疫不全マウスに養子（適合とも言う）移入することによって生じさせることができる。移行のために使用され得る免疫不全マウスの非制限的な例には、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ（モリッシー）ら、１９９３；Ｐｏｗｒｉｅ（パウリー）ら、１９９３）、および組換え活性化遺伝子２（ＲＡＧ２）欠損マウス（Ｃｏｒａｚｚａ（コラザ）ら、１９９９）が含まれる。免疫不全マウスへの、例は、静脈内または腹腔内注射を介して、ＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞を移行することは、結腸内の上皮細胞過形成、組織損傷、および重度の単核細胞浸潤をもたらす（Ｂｙｒｎｅ（バーン）ら、２００５；Ｄｏｈｉ（ドヒ）ら、２００４；Ｗｅｉ（ウェイ）ら、２００５）。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤのＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞移行マウスモデルにおいて評価され得る。
【０５７２】
マウスの飲料水にデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を補充することにより、ＩＢＤの別の例示的な動物モデルを生じさせることができる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ（マルチネス）ら、２００６；Ｏｋａｙａｓｕ（オカヤス）ら、１９９０；Ｗｈｉｔｔｅｍ（ホイットム）ら、２０１０）。ＤＳＳによる処置は、結腸での数日間続く上皮損傷および頑強な炎症を生じる。急性傷害または急性傷害とその後の修復をモデル化するために、単一の処置を用いることができる。急性で処置されたマウスは、血便、直腸出血、下痢、および体重減少を含め、急性大腸炎の兆候を示す（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０）。対照的に、ＤＳＳの反復施与サイクルは慢性炎症性疾患をモデル化するために使用され得る。慢性大腸炎を発症するマウスは、結腸粘膜再生、たとえば、異形成、リンパ濾胞（リンパ球の小胞とも言う）形成、および大腸の短縮などのようなものの徴候を示す（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０）。いくらかの実施態様において、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤのＤＳＳマウスモデルにおいて評価され得る。
【０５７３】
いくらかの実施態様では、本発明の遺伝学的に操作された細菌は、動物に、例は、経口強制飼養によって施与され、処置の有効性は、例は、内視鏡検査、結腸透光性、フィブリン付着、粘膜および血管病理、および／または便の特性によって定められる。いくらかの実施態様では、動物を屠殺し、および組織試料を採取し、そして分析し、例は、結腸切片を固定し、および炎症および潰瘍のスコアを付け、および/またはホモジナイズし、およびミエロペルオキシダーゼ活性およびサイトカインレベル（例は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）について分析する。
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【実施例】
【０５７４】
以下の例は、本開示の例示的な実施態様を提供する。当技術において通常の技量の者（当業者とも言う）は、本開示の精神または範囲を変えることなく実行され得る多くの改変および変形を認識するであろう。そのような改変および変形は、本開示の範囲内に包含される。これらの例は本開示を何ら制限しない。
例１．治療上の分子を生成するためのベクターの構築 
ブチラート
【０５７５】
エシェリキア・コリのニッスルにおいてブチラートの誘導性産生を促進するために、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０由来のブチラート産生経路の８つの遺伝子（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔ、およびｂｕｋ；ＮＣＢＩ；表２および表３６）、ならびに転写および翻訳要素が合成され（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ケンブリッジ）、ＭＡ（マサチューセッツ州））、およびベクターｐＢＲ３２２中にクローニングされることにより、ｐＬｏｇｉｃ０３１（ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット、別名ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３ブチラートカセット、配列番号１６２）が作製される。
【０５７６】
ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、共酸化剤として酸素に依存する可能性がある。本発明の組換え細菌は酸素制限された環境（例えば、哺乳動物の腸）において酪酸塩を生成するように設計されているので、酸素依存性は腸内での酪酸生成の負の効果を有する可能性がある。Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａのトランス−２−エノニル−ＣｏＡレダクターゼ（ｔｅｒ、表２および表３６）からの単一の遺伝子が、酸素非依存的にこの３つの遺伝子複合体を機能的に置き換えることができることが示されている。したがって、第１の酪酸カセットのｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３遺伝子をｔｅｒ遺伝子で置換した第２のブチラート遺伝子カセットを合成する（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。ｔｅｒ遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのオンラインコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：//ｗｗｗ.ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ/ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて、大腸菌コドン使用のためにコドン最適化されている。第2の酪酸遺伝子カセット、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＬｏｇｉｃ０４６（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット、本明細書ではｔｅｒブチラートカセットまたはｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセットとも呼ばれる、配列番号１６３）を作製する。
【０５７７】
第３の酪酸遺伝子カセットでは、ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢ（配列番号１０）で置換されている。ＴｅｓＢは、ブチリル−ｃｏＡからブチラートを切断し、ｐｂｔ−ｂｕｋ（例えば、図２および表２および表３６参照）の必要性を排除するＥ.ｃｏｌｉにおいて見出されるチオエステラーゼである。第３の酪酸遺伝子カセット、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ.ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂ酪酸カセット、本明細書ではｔｅｓＢ酪酸カセット、配列番号１６４とも呼ばれる）。表３６は、３つのカセットの配列の非限定的な例を列挙する。
[表３５-１]
[表３５-２]
[表３５-３]
[表３５-４]
[表３５-５]
[表３５-６]
[表３５-７]
[表３５-８]
【０５７８】
特定の構築物において、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット  ｐＬｏｇｉｃ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ  ＋））を、ＲＮＳ応答調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下に置く。  いくつかの実施態様では、ブチラート遺伝子カセットは、ＲＮＳ応答調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下に置かれる。この細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えばｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表３７および表３８および配列番号１６７参照）。
【０５７９】
表３７は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物；配列番号１６５）を含む例示的なＲＮＳ調節構築物の核酸配列を示す。ＮｓｒＲをコードする配列は下線付きの太字で示され、ＮｓｒＲ結合部位、すなわちｎｏｒＢの調節領域は囲まれている。表３８は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物；配列番号１６６）を含む例示的なＲＮＳ調節構築物の核酸配列を示す。ＮｓｒＲをコードする配列は下線付きの太字で示され、ＮｓｒＲ結合部位、すなわちｎｏｒＢの調節領域は枠で囲まれている。
【０５８０】
表３９（配列番号１６７）は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子、ｎｏｒＢの調節領域、およびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ブチラート構築物）を含む例示的なＲＮＳ調節構築物の核酸配列を示す（配列番号１６７）。
【０５８１】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１６５、１６６、１６７のＤＮＡ配列、またはそれらの機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[表３６-１]
[表３６-２]
[表３６-３]
[表３６-４]
【０５８２】
[表３７-１]
[表３７-２]
[表３７-３]
【０５８３】
[表３８-１]
[表３８-２]
[表３８-３]
【０５８４】
一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）、および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ  ＋））は、ＲＯＳ応答性調節領域、例えばｏｘｙＳの制御下に置かれる。  一定の構築物では、ブチラート遺伝子カセット（例えば、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）、および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋））は、ＲＯＳ応答調節領域、例えばｏｘｙＳの制御下に置かれ、細菌はさらに対応するＲＯＳ応答性転写因子（例えば、表２８および表２９および本明細書の他の箇所を参照）、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子を含む。
【０５８５】
ｏｘｙＳプロモーターを含む例示的なＲＯＳ調節構築物の核酸配列を、表４０および表４１および表４３に示す。ＯｘｙＲをコードする例示的構築物の核酸配列を表４２に示す。表４０は、ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｏｘｙＳ−ブチラート構築物；配列番号１６８）を含む例示的なＲＯＳ調節構築物のアミノ酸配列を示す。表４１は、ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｏｘｙＳ−ブチラート構築物；配列番号１６９）を含む例示的なＲＯＳ調節構築物の核酸配列を示す。表４２は、ＯｘｙＲ（ｐＺＡ２２−ｏｘｙＲ構築物；配列番号１７０）をコードする例示的な構築物の核酸配列を示す。表４３は、ｏｘｙＳプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋−ｏｘｙＳ−ブチラート構築物；配列番号１７１）を含む例示的なＲＯＳ調節構築物の核酸配列を示す。
【０５８６】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１６８、１６９、１７０、または１７１のＤＮＡ配列、またはそれらの機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[表３９-１]
[表３９-２]
[表３９-３]
【０５８７】
[表４０-１]
[表４０-２]
[表４０-３]
【０５８８】
[表４１-１]
[表４１-２]
【０５８９】
[表４２-１]
[表４２-２]
[表４２-３]
【０５９０】
いくつかの実施態様では、ブチラート遺伝子カセット（例は、ｂｃｄ２−ｅｔｆＢ３−ｅｔｆＡ３−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬｏｇｉｃ０３１）および／またはｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ  ＋））を、表２５または２６および配列番号１４１−１５７から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置く。一定の構築物において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、強力なリボソーム結合部位配列にさらに融合される。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロン中の各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。
例２． ｔｅｔ誘導性プロモーターを用いるブチラート過剰発現のためのベクターの構築（ブチラート回路）
【０５９１】
エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅにおいてブチラートの誘導性産生を促進するために、ペプトクロスジウム・ディフィシル６３０（ｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｂｐｔ、およびｂｕｋ；ＮＣＢＩ）由来のブチラート産生経路の８つの遺伝子ならびに  転写および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングしてｐＬｏｇｉｃ０３１を作製した。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロン中の各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーターに由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。
【０５９２】
ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３の遺伝子産物は、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに変換する複合体を形成し、酸素を共酸化剤としてある程度依存する可能性がある。  実施例１に記載の理由により、ｂｃｄ２−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３をトランス−２−エノニル−ＣｏＡレダクターゼ；大腸菌におけるブチラート生成のトレポネーマデンシコ可能なトランスフェラーゼで置き換えた）第２のプラスミドを作製した。インバースＰＣＲを用いてｂｃｄ−ｅｔｆＡ３−ｅｔｆＢ３領域外のｐＬｏｇｉｃ０３１の全体配列ｔｅｒ遺伝子は、合成ＤＮＡ技術（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いた大腸菌コドン使用のためにコドン最適化され、ＰＣＲ断片をＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用してｐＬｏｇｉｃ０４６を作製した。
【０５９３】
ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢ（配列番号１０）で置換された第３のブチラート遺伝子カセットをさらに生成させた。ＴｅｓＢはブチラート−ｃｏＡからブチラートを切断する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に見出されるチオエステラーゼであり、ｐｂｔ−ｂｕｋの必要性を排除する（図２参照）。第３のブチラート遺伝子カセット、ならびに転写および翻訳エレメントを合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングして、ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋（ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｔｅｓｂブチラートカセット、本明細書ではｔｅｓＢブチラートカセットとも呼ばれる）。
【０５９４】
合成されたように、３つのブチラート遺伝子カセットの全てをテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置き、テトラリダクターゼ（ｔｅｔＲ）から誘導されるｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）を構成的に発現させた。
【０５９５】
ｔｅｔプロモーターを含むテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を表４４および表４５および表４６に示す。表４４は、ｔｅｔプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセットを含む例示的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を示すｐＬｏｇｉｃ０３１−ｔｅｔ−ブチラート構築物；配列番号７８）。ＴｅｔＲをコードする配列に下線を引いて、重複するｔｅｔＲ／ｔｅｔＡプロモーターを囲む。表４５は、ｔｅｔプロモーターおよびブチロジーニック遺伝子カセット（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｔｅｔ−ブチラート構築物；配列番号７９）を含む例示的なテトラサイクリン調節構築物の核酸配列を示す。ＴｅｔＲをコードする配列に下線を引いて、重複するｔｅｔＲ／ｔｅｔＡプロモーターを囲む。
【０５９６】
表４６は、ｔｅｔＲリプレッサーの逆相補体（下線）を含むテトラサイクリン調節コンストラクト（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａ  ｐｂｔ．ｂｕｋ／ｔｅｓＢ＋−ｔｅｒｔ−ブチラート構築物）の核酸配列、ダイバージェントプロモーターを含む遺伝子間領域ｔｅｔＲおよびブチラートオペロンならびにそれらのそれぞれのＲＢＳ（太字）およびＲＢＳによって分離されたブチラート遺伝子を制御する。
【０５９７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１７２、１７３、または１７４のＤＮＡ配列、またはそれらの機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[表４３-１]
[表４３-２]
[表４３-３]
[表４３-４]
【０５９８】
[表４４-１]
[表４４-２]
[表４４-３]
【０５９９】
[表４５-１]
[表４５-２]
[表４５-３]
ブチラート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＧＬＰ−２
【０６００】
一定の構築物では、上記のブチラート（酪酸とも言う）産生経路に加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ、大腸菌とも言う）Ｎｉｓｓｌｅは、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＳＯＤ、キヌレニン（ｋｙｕｒｅｎｉｎｅ、キュレニンとも言う）、キヌレン酸（ｋｙｕｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ、キュレイク酸とも言う）、およびＧＬＰ−２を生産するために、上記の方法を用いてさらに操作される。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようなブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−１０をコードする遺伝子（例は、配列番号１３４、配列番号１９３、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９４参照）を含む。いくらかの実施態様において、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−２をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３５参照）。いくらかの実施態様において、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−２２をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３６、配列番号１９５、配列番号１９６参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−２７をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３７参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＳＯＤをコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３８参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含む（例は、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１３６１８９、配列番号１９０、配列番号１９２参照）。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびキュレニンまたはキュウリン酸を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。いくらかの実施態様では、本細菌は、上記のようにブチラートを産生するための遺伝子カセット、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、およびＧＬＰ−２をコードする遺伝子を含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号１４１〜配列番号１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２７および本明細書の他の箇所を参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例は、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書の他の箇所を参照）。一定の構築物では、１以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＩＬ−２７
【０６０１】
ある構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作してプロピオナート、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７から選択される１つ以上の分子を産生する、ＳＯＤ、キヌレニン、キヌレン酸、およびＧＬＰ−２を上記の方法を用いて検出する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、プロピオナート、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２、およびＩＬ−２２から選択される１つ以上の分子を産生するようにさらに操作される。一定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、プロピオナート、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２、およびＩＬ−２７から選択される１つ以上の分子を産生するようにさらに操作される。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢおよびａｃｒＣをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝子操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦおよびｌｐｄを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄおよびｔｅｓＢを含む。
【０６０２】
細菌は、上記のようなブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようなプロピオナートを生産するための遺伝子カセット、ＩＬ−１０をコードする遺伝子（例えば４９参照）、ＩＬ−２７をコードする遺伝子（例えば、配列番号１３７参照）、ＩＬ−２２をコードする遺伝子（例えば、配列番号１３６、配列番号１９５、配列番号１９６参照）、およびＩＬ−２をコードする遺伝子（例えば、配列番号１３５）。一実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、配列番号１４１−１５７（表２５および２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答調節領域、例えば、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例えば、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表２７参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答調節領域、例えば、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例えば、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例えば、表２８および本明細書の他の箇所を参照）。一定の構築物では、１つまたは複数の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、キヌレニン
【０６０３】
一定の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作して、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンから選択される１以上の分子を上記の方法を用いて生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、プロピオン酸塩、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンから選択される１以上の分子を上記の方法を用いて産生するようにさらに操作される。一定の構築物では、上記のブチラート生成経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンを上記の方法を用いて産生するようにさらに操作される。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２およびキヌレニンを上記の方法を用いて産生するようにさらに操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオナート生合成のためのアクリラート経路遺伝子、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオナート生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、およびｔｅｓＢを含む。
【０６０４】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産するための遺伝子カセット、ＩＬ−１０をコードする遺伝子（例は、配列番号１３４参照）、ＩＬ−２２をコードする遺伝子（例は、配列番号１３６、配列番号１９５、配列番号１９６参照）、ＳＯＤをコードする遺伝子（例は、配列番号１３８）、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２アナログまたはＧＬＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９２）、およびキヌレニン生成のための遺伝子または遺伝子カセットを含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号１４１−１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２７および本明細書中のその他の場所を参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例は、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書中のその他の場所を参照）。一定の構築物では、１以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
ブチラート、プロピオナート、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、キヌレニン
【０６０５】
一定の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作して、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、およびキヌレニンから選択される１以上の分子を上記の方法を用いて産生する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅをさらに操作して、プロピオン酸塩、およびＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、およびキヌレニンから選択される１以上の分子を、上記の方法を使用して生成する。ある種の構築物では、上記のブチラート産生経路に加えて、エシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅは、上記の方法を用いてＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−２２、ＳＯＤ、ＧＬＰ−２、およびキヌレニンを産生するようにさらに操作される。いくらかの実施態様では、遺伝学的操作細菌は、プロピオン酸生合成のためのアクリラート経路遺伝子、ｐｃｔ、ｌｃｄＡ、ｌｃｄＢ、ｌｃｄＣ、ｅｔｆＡ、ａｃｒＢ、およびａｃｒＣをさらに含む。代替の実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、プロピオン酸生合成のためのピルビン酸経路遺伝子、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄを含む。別の代替の実施態様において、遺伝学的に操作された細菌は、ｔｈｒＡｆｂｒ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｉｌｖＡｆｂｒ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、およびｔｅｓＢを含む。
【０６０６】
本細菌は、上記のようにブチラートを生産するための遺伝子カセット、上記のようにプロピオン酸を生産するための遺伝子カセット、ＩＬ−１０をコードする遺伝子（例は、配列番号１３４、１９３、１９７、１９８、１９４参照）、ＩＬ−２７をコードする遺伝子（例は、配列番号１３７参照）、ＩＬ−２２をコードする遺伝子（例は、配列番号５１参照）、ＩＬ−２をコードする遺伝子（例は、配列番号５０参照）、ＳＯＤをコードする遺伝子（例は、配列番号５３参照）、ＧＬＰ−２をコードする遺伝子（例は、配列番号５４参照）、およびキヌレニンを生産するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。一実施態様では、各々の遺伝子または遺伝子カセットは、配列番号１４１−１５７（表２５および表２６）から選択されるＦＮＲ調節領域の制御下に置かれる。代替の実施態様では、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＮＳ応答性調節領域、例は、ｎｏｒＢの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＮＳ応答性転写因子、例は、ｎｓｒＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書中のその他の場所を参照）。さらに別の実施態様において、遺伝子または遺伝子カセットのそれぞれは、ＲＯＳ応答性調節領域、例は、ｏｘｙＳの制御下に置かれ、および本細菌は、対応するＲＯＳ応答性転写因子、例は、ｏｘｙＲをコードする遺伝子をさらに含む（例は、表２８および表２９および本明細書中のその他の場所を参照）。一定の構築物では、１以上の遺伝子をテトラサイクリン誘導性または構成的プロモーターの制御下に置く。
【０６０７】
いくらかの実施態様において、細菌遺伝子は栄養要求株を生成するために破壊または欠失され得る。これらには、制限されないが、表３３に示すように、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
例３ ．Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換
【０６０８】
各プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＮｉｓｓｌｅまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ に形質転換する。すべての試験管、溶液、およびキュベットは４℃まで予備チルド冷却する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｉｓｓｌｅまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ の一昼夜培養物を５ｍＬの溶原性ブロス（ＬＢ）において１：１００に希釈し、およびそれが０．４−０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させる。細胞培養培地は、選択マーカー、例は、プラスミドに適するアンピシリンを含む。次いでＥ．ｃｏｌｉ細胞を２，０００ｒｐｍにて５分間４℃で遠心分離し、上清を除去し、および細胞を１ｍＬの４℃の水に再懸濁する。Ｅ．ｃｏｌｉを再び２，０００ｒｐｍにて５分間４℃で遠心分離し、上清を除去し、および細胞を０．５ｍＬの４℃の水に再懸濁する。Ｅ．ｃｏｌｉを再び２，０００ｒｐｍにて５分間４℃で遠心分離し、上清を除去し、および最後に細胞を０．１ｍＬの４℃の水に再懸濁する。エレクトロポレーターは２．５ｋＶに設定される。０．５μｇの上記プラスミドの１つを細胞に添加し、ピペットによって混合し、およびピペットにより、滅菌してあるチルド冷却したキュベットに入れる。乾燥したキュベットをサンプルチャンバーに入れ、および電気パルスを適用する。室温でのＳＯＣ培地１ｍＬを直ちに加え、および混合物を培養管に移し、そして３７℃で１時間インキュベートする。細胞は、アンピシリンを含有するＬＢプレート上に広げ、および一昼夜インキュベートする。
【０６０９】
代わりの実施態様では、ブチラートカセットは相同組換え（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を通してＮｉｓｓｌｅゲノムに挿入することができる。構築物およびヌクレオチド配列の編成はここに提供される。構築物およびヌクレオチド配列の編成は図２に示されている。合成されたブチラートカセット構築物を染色体に組み込むことができるベクターを作製するために、ＮｉｓｓｌｅのｌａｃＺ座に相同なＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６Ｋ起点プラスミドｐＫＤ３に加えるために最初にＧｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ギブソンアセンブリ）を使用した。これは、これらのホモロジーアームの間でクローニングされたＤＮＡを標的にして、ＮｉｓｓｌｅゲノムのｌａｃＺ遺伝子座に組み込まれる。ギブソンアセンブリは、これらのアーム間の断片をクローン化するために使用した。ＰＣＲを使用して、相同性アームの全体の配列、ならびにそれらの間のブチラートカセットを含むこのプラスミドからの領域を増幅した。このＰＣＲ断片を用いて、エレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ−ｐＫＤ４６を形質転換し、その株はラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含んだ。形質転換後、３７℃で２０ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール上に平板培養する前に、細胞を２時間培養した。３７℃での増殖により、ｐＫＤ４６プラスミドもキュアした。カセットを含む形質転換体はクロラムフェニコール耐性およびｌａｃ−マイナス（ｌａｃ−）であった。
例４ ．ｔｅｔ誘導性プロモーターを用いる組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるブチラートの生産
【０６１０】
ブチラートの生成に対する酸素の影響を決定するために、ブチラートの生成を上記のブチラートカセットを含むＥ．ｃｏｌｉのＮｉｓｓｌｅ株で評価した。試験されたｔｅｔ−誘導性カセットには、（１）８つの遺伝子のすべてを含むｔｅｔ−ブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０３１）；（２）ｔｅｒが置換されたｔｅｔ−ブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６）および（３）ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子の代わりにｔｅｓＢが置換されたｔｅｔ−ブチアーテ （ｔｅｔ−ｂｕｔｙａｒｔｅ）カセット。
【０６１１】
全てのインキュベーションを３７℃で行う。ブチラートカセットで形質転換されたエシェリキア・コリＤＨ５ａおよびＮｉｓｓｌｅの培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いで０．５％グルコースを含む４ｍＬのＭ９最少培地に１：２００に希釈する。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４−６時間増殖させ、Ｃｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給する）中で好気的にまたは嫌気的にインキュベートした。１ｍＬの培養アリコートを１．５ｍＬのキャップ付き試験管中で調製し、定置インキュベーターで培養通気を制限するためにインキュベートした。１つのチューブを各時点（０、１、２、４および２０時間）に取り出し、ＬＣ−ＭＳによってブチラート濃度を分析して、これらの組換え株におけるブチラート産生が低酸素環境下で達成できることを確認する。
【０６１２】
図１１は、図２に示す異なるブチラート生成回路を用いたブチラート生成の棒グラフを示す。
【０６１３】
図１１Ａは、酸素の存在下および非存在下でのｐＬＯＧＩＣ０３１株およびｐＬＯＧＩＣ０４６株におけるブチラート生産を示し、ブチラート生産に有意差はない。ブチラート産生の増強は、最終２遺伝子（ｐｔｂ−ｂｕｋ）の欠失および内因性大腸菌ｔｅｓＢ遺伝子（ブチリルＣｏＡからブチラート部分を切断するチオエステラーゼ）を含む低コピープラスミド発現ｐＬＯＧＩＣ０４６のＮｉｓｓｌｅに示された。
例５ ．組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるＴｅｔ駆動およびＲＮＳ駆動によるインビトロでのブチラート生産
【０６１４】
全てのインキュベーションは、３７℃で行った。ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６で形質転換されたエシェリキア・コリＮｉｓｓｌｅの一夜培養物を、０．５％グルコースを含む１０ｍＬのＭ９最少培地に１：１００継代培養し、２時間振とう培養（２００ｒｐｍ）した後、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えて、ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６からのブチラートオペロンの発現を誘導した。誘導から２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に再懸濁した。培養上清をＬＣ−ＭＳによるブチラート産生レベルを評価するために、示された時点（図２１に示すように０〜２４時間）で分析した。図２１に見られるように、ブチラート産生は、ｐＬｏｇｉｃ０３１構築物を含む株よりもｐＬｏｇｉｃ０４６構築物を含む株で高い。
【０６１５】
上記のＲＮＳプロモーター（ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物およびｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物）によって駆動される酪酸カセットを含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株においても、酪酸の産生を評価した酪酸生産における窒素の一晩の細菌培養物を新鮮なＬＢに１：１００に希釈し、１．５時間増殖させて初期対数期に入るようにした。この時点で、長い半減期の一酸化窒素供与体（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−酸化窒素付加物）を最終濃度０．３ｍＭで培養物に添加してプラスミドからの発現を誘導した。誘導から２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に再懸濁した。次いで、培養上清を、示された時点（図２２に示すように０−２４時間）で分析して、酪酸産生レベルを評価した。図２２に示すように、野生型Ｎｉｓｓｌｅと比較して有意に多くの酪酸を産生した（ｐＬｏｇｉｃ０４６−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物）、ｐＬｏｇｉｃ０３１−ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−酪酸オペロン構築物を含む遺伝子操作されたＮｉｓｓｌｅ）。
例６ ．誘導性ｔｅｔプロモーター酪酸回路を用いた組換え大腸菌におけるインビトロ酪酸生産
【０６１６】
ＮｕｏＢは、呼吸性増殖（電子輸送を必要とする増殖の形態）の間にＮＡＤＨの酸化に関与するタンパク質複合体である。ＮＡＤＨ酸化の電子輸送への結合の防止は、ブチラート生成を支持するために使用されるＮＡＤＨの量にて増加を可能にする。ＮＡＤＨ酸化の電子輸送への結合の防止はブチラート生成増加を可能にするのかどうかを検証するため、ＮｕｏＢ欠失を有するＮｕｏＢ変異体が得られた。
【０６１７】
全てのインキュベーションは３７℃で行った。ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６を含有するＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａおよびＮｉｓｓｌｅの一夜培養物を、０．２％グルコースを含む１０ｍＬのＭ９最少培地に継代培養し、２時間にわたって振とう（２００ｒｐｍ）して増殖させたが、その間に無水（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ）テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に加えて、ｐＬｏｇｉｃ０３１またはｐＬｏｇｉｃ０４６からの酪酸オペロンの発現を誘導した。培養物をフラスコ（＋Ｏ２）または嫌気性チャンバー（−Ｏ２）中で振盪してインキュベートし、試料を除去し、酪酸をＬＣ−ＭＳにより２、４および２４時間で定量した。図を参照してください。図１３は、ｎｕｏＢ遺伝子欠失を含む異なるブチラート生成回路を用いたブチラート産生のグラフを示す。図１３は、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＷ２５１１３株を示しており、これは、共通のクローニング株であり、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）突然変異体のＫＥＩＯコレクションのバックグラウンドである。図１３は、野生型Ｎｉｓｓｌｅと比較して、ＮｕｏＢの欠失が酪酸のより大きな産生をもたらすことを示す。
例７ ．組換えＥ．ｃｏｌｉにおけるブチラートの生産
【０６１８】
テトラサイクリンプロモーターの制御下でのブチラートのインビトロ産生を、（１）ブチラート遺伝子カセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ  ｂｕｋブチラート）と（２）ｐｂｔおよびｂｕｋ遺伝子がｔｅｓＢとともに配置されたブチラートカセット（ｐＬＯＧＩＣ０４６−ｄｅｌｔａｐｂｔ−ｂｕｋ／ｔｅｓＢ  ＋−ブチラート；配列番号５６）との間で比較した。
【０６１９】
一晩の細菌培養物を新鮮なＬＢ中に１：１００に希釈し、および１．５時間増殖させて初期対数期に入るようにした。この時点で、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で培養物に添加して、プラスミドからのブチラート遺伝子の発現を誘導した。誘導から２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、および細胞を０．５％グルコース含有Ｍ９最小培地に再懸濁した。次いで、培養上清を指示された時点で分析して、ブチラート産生レベルを評価した。図１１Ｂに示すように、ｐｂｔおよびｂｕｋをｔｅｓＢに置き換えることにより、より一層高いレベルのブチラート塩生成がもたらされる。
例８ ．ブチラート過剰発現のためのベクターの構築（ＦＮＲ駆動）
【０６２０】
実施例１（例えば、表３６、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５を参照）に記載された３つのブチラートカセットを、（配列番号１４１から配列番号１５７）（表２５および表２６）特定の構築物において、ＦＮＲ応答性プロモーターは、強力なリボソーム結合部位配列にさらに融合される。ブチラート遺伝子の効率的な翻訳のために、オペロン中の各合成遺伝子を、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離した。特定の実施態様では、ｙｄｆＺプロモーターを使用した。  他の実施態様では、ＦＮＲＳプロモーターが使用される。
例９ ．組換え大腸菌  （Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＦＮＲおよびＲＮＳ駆動によるインビトロでのブチラート産生
【０６２１】
ブチラート産生に対する酸素の影響を決定するために、ＦＮＲプロモーターによって駆動される、上記のブチラートカセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株でブチラートの産生を評価する。全てのインキュベーションを３７℃で行う。ブチラートカセットで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａおよびＮｉｓｓｌｅの培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いで０．５％グルコースを含む４ｍＬのＭ９最小培地に１：２００に希釈する。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、好気性嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給する）中で好気的にまたは嫌気的にインキュベートする。１ｍＬの培養アリコートを、１．５ｍＬのキャップ付き試験管中で調製し、定置インキュベーター内でインキュベートして培養通気を制限する。１つのチューブを各時点（０、１、２、４および２０時間）に取り出し、ＬＣ−ＭＳによってブチラート濃度を分析して、これらの組換え株におけるブチラート産生が低酸素環境下で達成できることを確認する。
【０６２２】
別の実施態様では、ブチラート産生に対する窒素の影響を決定するために、ＲＮＳプロモーターによって駆動される、上記のブチラートカセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株においてブチラートの産生を評価する。一晩の細菌培養物を新鮮なＬＢに１：１００に希釈し、１．５時間増殖させて初期対数期に入るようにする。この時点で、長い半減期の一酸化窒素供与体（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン-酸化窒素付加物）を培養物に最終濃度０．３ｍＭで添加してプラスミドからの発現を誘導する。誘導の2時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に再懸濁する。次いで、培養上清を指示された時点で分析して、ブチラート産生レベルを評価する。
例１０ ．組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるインビトロでのブチラート産生
【０６２３】
ＦＮＲプロモーター駆動ブチラート生成に対する酸素およびグルコースの影響を、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ５０１（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒブチラートプラスミド、すなわち、（ｔ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子をＳＹＮ−ＵＣＤ５００（ｙｄｆＺプロモーターの制御下でのｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｂｃｄブチラートプラスミド、すなわちｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含む）およびＳＹＮ−ＵＣＤ５０６（ｐＳＣ１０１  ｎｉｒＢプロモーターの制御下で、ｎｉｒＢ−ｂｃｄブチラートプラスミド、すなわちｂｃｄ２、ｅｔｆＢ３、ｅｔｆＡ３、ｔｈｉＡ１、ｈｂｄ、ｃｒｔ２、ｐｂｔおよびｂｕｋを含む。
【０６２４】
全てのインキュベーションを３７℃で行った。ブチラートカセットで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株の培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いで０．５％グルコースを含む４ｍＬのＭ９最少培地に１：２００に希釈した。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４〜６時間増殖させ、４時間にわたってＣｏｙ嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給する）中で嫌気的にインキュベートした。細胞を洗浄し、０．５％グルコースを含む最小培地に再懸濁し、経時的にブチラート産生をモニターするために微好気的にインキュベートした。１つのアリコートを各時点（２、８および２４時間）に取り出し、ＬＣ−ＭＳによるブチラート濃度の分析を行い、これらの組換え株におけるブチラート生産が低酸素環境下で達成できることを確認した。図１４Ｂに示すように、ＳＹＮ−５０１は嫌気的条件下で有意なブチラート生成をもたらした。
【０６２５】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１７５、１７６、１７７、または１７８のＤＮＡ配列、またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
[表４６-１]
[表４６-２]
[表４６-３]
[表４６-４]
[表４６-５]
[表４６-６]
[表４６-７]
[表４６-８]
例１１．組換え大腸菌  （Ｅ．ｃｏｌｉ）  におけるブチラート産生
【０６２６】
ブチラート生成に対する酸素およびグルコースの効果は、ＦＮＲプロモーター（ｙｄｆＺプロモーターの制御下でのｔｅｒ−ｔｈｉＡ１−ｈｂｄ−ｃｒｔ２−ｐｂｔ−ｂｕｋ遺伝子）によって駆動されるブチラートカセットを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株において評価された。
【０６２７】
全てのインキュベーションを３７℃で行った。ブチラートカセットで形質転換された大腸菌ＤＨ５ａおよびニッスル（Ｎｉｓｓｌｅ）の培養物をＬＢ中で一晩増殖させ、次いでグルコースを含有しない４ｍＬのＬＢまたは０．５％グルコースを含むＲＣＭ培地に１：２００に希釈した。細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）しながら４−６時間増殖させ、好気性嫌気性チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２を供給する）中で好気的にまたは嫌気的にインキュベートした。１ｍＬの培養アリコートを１．５ｍＬのキャップ付き試験管中で調製し、定置インキュベーターで培養通気を制限するためにインキュベートした。１つの試験管を各時点（０、１、２、４および２０時間）に取り出し、ＬＣ−ＭＳによりブチラート濃度を分析し、低酸素環境下でこれらの組換え株のブチラート生産を達成できることを確認した。
【０６２８】
図１４Ｃは、グルコースおよび酸素の存在下／不存在下でＦＮＲ−ブチラートカセット（ｔｅｒ置換を有する）を含む株におけるブチラート生産、および細菌がＦＮＲプロモーターからのブチラート産生のためにグルコースおよび嫌気的条件の両方を必要とすることを示す。細胞は、グルコースを含まない培地（ＬＢ）または０．５％グルコースを含む培地（ＲＭＣ）中で好気的にまたは嫌気的に増殖させた。培養サンプルを表示された時間のパイント（ｐｉｎｔｓ）で採取し、および上清画分をＬＣ−ＭＳを用いてブチラート濃度について評価した。これらのデータは、ＳＹＮ５０１がブチラート産生のためにグルコースを必要とし、グルコースの存在下でブチラート産生が嫌気性ＦＮＲ調節ｙｄｆＺプロモーターの制御下に嫌気性条件下で増強され得ることを示す。
例１２ ．損傷したバリア機能の検出のための低用量ＤＳＳ誘発大腸炎モデルの最適化
【０６２９】
種々の濃度のＤＳＳを用いたマウスで試験を行ったので、損傷したバリア機能を調べることができるようにマウスに投与する最適なＤＤＳ濃度を決定する。
【０６３０】
簡潔には、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週、Ｎ＝２５）を０．２５％、０．５％、１％および１．５％ＤＳＳおよびＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤ）で処置した。
【０６３１】
試験の０日目に、動物を秤量し、マウスを以下のように体重に従って、無作為に５つの処置グループ（ｎ＝５／グループ）に分けた：グループ１、Ｈ２Ｏ対照、ｎ＝５；グループ２、０．２５％ＤＳＳ、ｎ＝５；グループ３、０．５％ＤＳＳ、ｎ＝５；グループ４、１％ＤＳＳ、ｎ＝５；グループ５、１．５％ＤＳＳ、ｎ＝５。糞便ペレットを集め、水をＤＳＳ含有水に変えた。動物を再び１日目および３日目に体重測定した。２日目に、ＦＩＴＣの分光光度分析のために血液サンプルを収集した。４日目に、マウスを４時間絶食させ、全てのマウスを０．６ｍｇ／ｇ  ＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤ）で強制飼養した。ＦＩＴＣ−デキストラン投与の３時間後に、動物の体重を測定し、出血させた。糞便ペレットを収集し、結腸サンプルを採取した。血液試料をＦＩＴＣの分光光度分析のために処理し、血清を全血から調製した。
【０６３２】
図２５に示すように、マウスのリポカリン２およびカルプロテクチンのレベルについて、糞便ペレットをＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析する。ＣＲＰレベルもまたＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析される。ＩＬ−１ａ／ｂ、−６、−１３、−１８、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ  ＥｐＣＡＭ、ＭＰＯおよびＧ−ＣＳＦのレベルの増加について、結腸組織をｑＰＣＲにより分析する。ＦＩＴＣ−デキストランレベルについて、血清を分光光度法により分析し、結果を図１５に示す。図１５に示すように、０．５％ＤＳＳは、ＦＩＴＣデキストランの増加が観察された最低用量である。
例１３ ．損傷したバリア機能の検出のための低用量ＤＳＳ濃度と異なるＦＩＴＣ分子量の比較
【０６３３】
損傷したバリア機能を調べることができるように、マウスに投与するのに最適なＤＳＳ濃度（０．７５または１．５％）およびＦＩＴＣ−デキストランの分子量（４または４０ｋＤＡ）を決定するための研究を行った。
【０６３４】
Ｃ５７ＢＬ６（９週、ｎ＝１８）を以下のようにＤＳＳで処理し、大腸炎の分子マーカーへの効果（分光光度法およびＥＬＩＳＡで評価）を評価し、体重および全体の動物の健康状態をモニターした：ＤＳＳ（０．７５および１．５％）；ＦＩＴＣ−デキストラン（４および４０ｋＤ）。
【０６３５】
０日目に、マウスを体重測定し、マウスを以下のように体重に従って、無作為に３つの処置グループ（ｎ＝６／グループ）に分けた：グループ１、Ｈ２Ｏコントロール、ｎ＝６；グループ２、０．７５％ＤＳＳ、ｎ＝６；グループ３、１．５％ＤＳＳ、ｎ＝６。水をＤＳＳ含有水に変えた。
【０６３６】
マウスを１−３日目に再び体重測定した。４日目にマウスを４時間絶食させ、各グループから３匹のマウスに、４ｋＤａまたは４０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストラン０．６ｍｇ／ｇのいずれかを強制飼養した。各グループのマウス１−３および４−６（尾印で示される）をそれぞれ４ｋＤａおよび４０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘ）  投与に用いた。ＦＩＴＣ−ｄｅｘ投与の３時間後に、マウスを体重測定し、出血させ、糞便ペレットを収集した。血液試料をＦＩＴＣの分光光度分析のために処理し、全血から血清を調製した。
【０６３７】
分光光度法によるＦＩＴＣ−デキストランレベルの血清分析を図１５に示す。
例１４ ．ブチラート生成細菌株は低用量ＤＳＳ誘導マウスモデルのＩＢＤにおいて消化管炎症を減少させる
【０６３８】
０日目に、４０匹のＣ５７ＢＬ６マウス（８週齢）を秤量し、および以下の５つの処置群（群当たりｎ＝８）に無作為化した：Ｈ２Ｏコントロール（グループ１）；０．５％ＤＳＳコントロール（グループ２）；０．５％ＤＳＳ＋１００ｍＭブチラート（グループ３）；０．５％ＤＳＳ＋ＳＹＮ９４（グループ４）；および０．５％ＤＳＳ＋ＳＹＮ３６３（グループ５）。無作為化後、グループ３のケージ水をブチラート（１００ｍＭ）を補充した水に変え、およびグループ４および５で、それぞれ１００μＬのＳＹＮ９４およびＳＹＮ３６３を経口強制飼養によって投与した。１日目に、グループ４および５は、朝に細菌で強制飼養され、計量され、そして夕方に再び強制飼養された。グループ４および５も、２日目および３日目に１日１回強制飼養した。
【０６３９】
４日目に、グループ４および５に、細菌を強制経口投与し、および次いですべてのマウスを秤量した。ケージ水をＨ２Ｏ＋０．５％ＤＳＳ（グループ２、４、および５）に、または１００ｍＭブチラート（グループ３）を補充したＨ２Ｏ＋０．５％ＤＳＳのいずれかに変化させた。グループ４および５のマウスを夕方に再び強制飼養した。５−７日目に、グループ４および５には、朝に細菌が強制飼養され、計量され、および夕方に再び強制飼養された。
【０６４０】
８日目に、すべてのマウスを４時間絶食させ、およびグループ４および５を、食物の除去直後に細菌で強制飼養した。次いで、すべてのマウスを秤量し、およびＦＩＴＣ−デキストラントレーサー（４ｋＤａ、０．６ｍｇ／ｇ体重）の単回用量で強制飼養した。糞便ペレットを集めたが；しかし、大腸炎が糞便収集を防ぐのに十分に重度であった場合、安楽死後に糞便を採取した。ＦＩＴＣ−デキストラン投与後、すべてのマウスを正確に３時間で安楽死させた。次いで、動物を心臓採血し、および血液サンプルを処理して血清を取得した。マウスリポカリン２、カルプロテクチン、およびＣＲＰ−１のレベルをＥＬＩＳＡによって定量し、およびＦＩＴＣ−デキストランの血清レベルを分光光度法によって分析した（例８も参照）。
【０６４１】
図１４Ｄは、研究の８日目にＥＬＩＳＡによって示される、すべての処置グループにおけるリポカリン２（ＬＣＮ２）レベルを示す。ＬＣＮ２は炎症疾患活性のバイオマーカーであるので、これらのデータは、低用量のＤＳＳ誘導性のＩＢＤマウスモデルにおいて、ＳＹＮ−５０１がＬＣＮ２濃度、ならびに消化管炎症を有意に低下させるのに十分なブチラートを産生することを示唆する。
例１５ ．染色体挿入およびプラスミド含有改変細菌株のインビトロブチラート生産効率の比較
【０６４２】
ブチラートカセットの染色体挿入を有する改変細菌株のインビトロにおけるブチラート生産効率を、プラスミド上にブチラートカセットを有する株と比較した。ＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２は、ブチラートカセット（それぞれ、ｔｅｒＢまたはｔｅｒβｐｂｔ−ｂｕｋのいずれか）のａｇｎＩ／ｒｓｍＩ遺伝子座の間に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロモーターを駆動する染色体挿入部を有する。これらの菌株を、同じくｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動される低コピープラスミド株ＳＹＮ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミド）と並べて比較した。培地中のブチラート濃度は、嫌気誘発の４時間後および２４時間後に測定した。
【０６４３】
簡単に説明すると、３ｍｌのＬＢに凍結グリセロールストックからの細菌を接種した。細菌を振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。一晩の培養物を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ中で１０ｍｌのＬＢ（抗生物質を含む）に１：１００に希釈して希釈した。培養物を約１．５時間振盪しながら３７℃で好気的に増殖させ、次いで３７℃で４時間嫌気性チャンバーに移した。細菌（２Ｘ１０８ＣＦＵ）を、マイクロ遠心チューブ中の０．５％グルコースを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含む１ｍｌのＭ９培地に添加した。細胞数を決定するために細胞をプレーティングした。アッセイチューブを３７℃の嫌気性チャンバーに入れた。指示された時間（４および２４時間）に、１２０ｕｌの細胞を取り出し、１４，０００ｒｐｍで１分間ペレット化し、１００ｕｌの上清を９６ウェルアッセイプレートに移し、アルミ箔でシールし、ブチラート濃度についてＬＣ−ＭＳによる分析まで−８０Ｃ で保存した（実施例２２に記載）。結果は図２９に示されており、ＳＹＮ１００１およびＳＹＮ１００２がプラスミド株ＳＹＮ５０１と同等のブチラート生産を与えることを示す。
【０６４４】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１７９、１８０、１８１、または１８２のＤＮＡ配列、またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０６４５】
[表４７-１]
[表４７-２]
[表４７-３]
[表４７-４]
[表４７-５]
例１６ ．マウスにおけるＳＹＮ５０１投与に応答した腸内ブチラートレベルの評価
【０６４６】
遺伝学的に操作された細菌によるブチラート産生のインビボでの有効性を決定するために、ＳＹＮ５０１（Ｌｏｇｉｃ１５６（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミド））をＣ５７ＢＬ６マウスに投与したときのブチラートのレベルを最初に糞便中にて評価した。１００ｍＭブチラートを含む水をコントロールとして用いた。
【０６４７】
１日目に、Ｃ５７ＢＬ６マウス（合計２４匹の動物）を体重測定し、無作為化に４グループに分けた；グループ１：Ｈ２Ｏコントロール（ｎ＝６）、グループ２：１００ｍＭブチラート（ｎ＝６）、グループ３：ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ（ｎ＝６）、グループ４：ＳＹＮ５０１（ｎ＝６）。マウスを１００ｕｌのストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ５０１で強制飼養し、またグループ２をＨ２Ｏ（＋）１００ｍＭブチラートに１０ｅ１０細胞／１００μｌの用量で変更した。２−４日目に、マウスを秤量し、グループ３およびグループ４はストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ５０１で午前および午後に強制飼養した。５日目に、マウスを体重測定し、グループ３およびグループ４を、ストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ５０１で午前中に強制飼養し、糞便を採取し、実施例２３に記載したようにブチラート濃度を測定した。図２３に結果が示されている。Ｎｉｓｓｌｅコントロールを飼養したマウスまたは水のみを与えたマウスと比較して、ＳＹＮ５０１を投与されたマウスの糞便中には、有意により高いレベルのブチラートが検出された。レベルは２ｍＭに近く、Ｈ２Ｏ（＋）２００ｍＭブチラートを与えたマウスで見られるレベルよりも高い。
【０６４８】
次に、盲腸、糞便流出液、大腸および大腸排出液中のブチラート濃度に対するＳＹＮ５０１の影響を評価する。これらの区画では、ブチラートのベースライン濃度が高いので、腸内のブチラート生成を担う細菌を除去するために、抗生物質処理を事前に投与する。結果として、ブチラートレベルのより小さい差異をより正確に観察および測定することができる。ブチラート１００ｍＭを含む水をコントロールとして使用する。
【０６４９】
研究の第１週の間に、常在微生物叢のベースラインレベルを低下させるために飲料水中の抗生物質カクテルで動物を処置する。抗生物質カクテルは、ＡＢＸ−アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシンおよびメトロニダゾールからなる。第２週の間に、１００ｕｌのストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅまたは操作株ＳＹＮ５０１を１日２回、５日間（１０ｅ１０細胞／１００ｕｌの用量で）動物に経口投与する。
【０６５０】
１日目に、Ｃ５７ＢＬ６（雌、８週齢）を以下のように４つのグループに分ける。グループ１：Ｈ２Ｏコントロール（ｎ＝１０）、グループ２：１００ｍＭブチラート（ｎ＝１０）、グループ３：ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ（ｎ＝１０）、グループ４：ＳＹＮ５０１（ｎ＝１０）。動物の体重を測定し、動物から糞便を採取する（Ｔ＝０時点）。動物をＨ２Ｏ（＋）抗生物質カクテルに変える。５日目に、動物の体重を測定し、糞便を採取する（Ｔ＝５ｄ時点）。Ｈ２Ｏ（＋）抗生物質カクテルボトルが交換されます。８日目に、マウスの体重を測定し、糞便を採取する。グループ３およびグループ４のマウスは、ストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ５０１を用いて午前および午後に強制経口投与される。すべてのケージの水は抗生物質なしの水に交換される。グループ２には、Ｈ  ２  Ｏ中の１００ｍＭのブチラートが与えられる。９−１１日目に、マウスの体重を測定し、グループ３およびグループ４のマウスをストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ５０１で午前および午後に強制投与する。１２日目に、マウスをストレプトマイシン耐性ＮｉｓｓｌｅまたはＳＹＮ５０１で午前中に強制飼養し、投与の４時間後に血液を採取し、盲腸および大腸内容物、ならびに組織および糞便を採取して分析のために処理する。
例１７．ブチラートカセットと選択されたクロストリジウム菌株をコードする遺伝学的に操作された細菌間のブチラート生産レベルの比較
【０６５１】
ＳＹＮ５０１（ｐＳＣ１０１  ＰｙｄｆＺ−ｔｅｒ−＞ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートプラスミド）におけるブチラート生産の効力を、ＣＢＭ５８８（クロストリジウム・ブチリカム・ミヤリザン、日本のプロバイオティック菌株）、クロストリジウム・チロブチリカムＶＰＩ  ５３９２（タイプ菌株）、およびクロストリジウム・ブチリカム  ＮＣＴＣ  ７４２３（タイプ菌株）と比較した。
【０６５２】
簡潔には、ＳＹＮ５０１の一晩培養物を１：１００に希釈して、３７℃で２時間振とうしながらＲＣＭ（補強クロストリジウム培地、ＬＢと同様であるが０．５％グルコースを含む）中で増殖させ、次いで嫌気性チャンバー  または好気的に振とうさせる。クロストリジウム菌株は嫌気的にしか増殖しなかった。指示された時間（２、８、２４、および４８時間）に、１２０μｌの細胞を取り出し、１４，０００ｒｐｍで１分間ペレット化し、上清１００μｌを９６穴アッセイプレートに移し、アルミニウム箔で密封し、ブチラート濃度についてＬＣ−ＭＳによる分析まで（実施例１８に記載の通り）、−８０℃で保存した。結果を図３に示す。ＳＹＮ５０１がＲＣＭメディア中で、クロストリジウム属に匹敵するブチラート濃度を産生することを示す。  
例１８．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるブチラートの定量
【０６５３】
実施例３７のブチラート測定値を得るために、ブチラート定量のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロトコルを使用した。
サンプル調整
【０６５４】
最初に、新鮮な１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム標準を水中で調製した。次いで、Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに１０μＬのサンプル（細菌上清および標準液）をピペットで入れ、最終濃度４ｕｇ／ｍＬのブチラート−ｄ７（ＣＤＮ同位体）を内部標準として含む６７％ＡＣＮ（各反応につき、６０ｕＬ  ＡＣＮ  ＋３０ｕＬ水）を各試料に添加した。プレートをヒートシールし、よく混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。丸底９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、１０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ４．５，２０ｍＭのＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、および２０ｍＭのＴＦＥＡ（２，２，２−トリフルオロエチルアミン）を含む緩衝液１８０μＬに２０μＬの希釈サンプルを添加した。プレートを再びヒートシールし、よく混合し、サンプルを室温で１時間インキュベートした。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６５５】
ブチラートは、サーモＴＳＱクワンタムマックストリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して、タンデム質量分析に結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。ＨＰＬＣの詳細を表４９および表５０に示す。タンデム質量分析の詳細を表５１に示す。
【０６５６】
[表４８]
【０６５７】
[表４９]
【０６５８】
[表５０]
例１９．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる糞便中のブチラート定量
サンプル調整
【０６５９】
新鮮な１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム標準を水中で調製した。単一の糞便ペレットを１００μＬの水に粉砕し、１５，０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離した。Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに１０μＬのサンプル（糞便上清および標準液）をピペットで入れ、アセトニトリル中に５ｕｇ／ｍＬのブチラート−ｄ７とともに、５０ｍＭの２−ヒドラジノキノリン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（２−ＨＱ）、ジピリジルジスルフィド（ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）およびトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｉｎｅ）を含む誘導体化溶液９０μＬを各サンプルに添加した。プレートをヒートシールし、６０℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、誘導体化サンプル２０μＬを、０．１％ギ酸を含む２２％アセトニトリル１８０μＬと混合した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６６０】
ブチラートは、サーモＴＳＱクワンタムマックストリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して、タンデム質量分析に結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。ＨＰＬＣの詳細を表５２および表５３に示す。タンデム質量分析の詳細を表５４に示す。
【０６６１】
[表５１]
【０６６２】
[表５２]
【０６６３】
[表５３]
例２０．操作されたＮｉｓｓｌｅにおけるインビトロでのブチラートおよびアセタート生成増加
【０６６４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、発酵の最終生成物として高レベルのアセタートを生成する。高レベルのブチラート生産を維持しながらアセタート生産を改善するために、内因性ａｄｈＥ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（アルデヒドアルコール脱水素酵素）およびｌｄｈ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（乳酸デヒドロゲナーゼ）の欠失を生成させて、アセタートまたはブチラートの生成をもたらさない経路による代謝流束を防止または減少させた（例えば、図２５参照）。この研究のために、ＦＮＲＳ  ｔｅｒ−ｔｅｓＢまたはＦＮＲＳ−ｔｅｒ−ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートカセットのいずれかを組み込んだＮｉｓｓｌｅ株を使用した。さらに、この研究では、グルクロン酸が腸内で利用可能な炭素源をよりよく模倣するので０．５％グルコースを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含有する培地Ｍ９培地を、０．５％グルクロン酸を含有する培地と比較した。
【０６６５】
簡潔には、細菌を振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。一晩後の培養物を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ中で１０ｍｌのＬＢ（抗生物質を含む）に１：１００に希釈した。培養物を約１．５時間振とうしながら３７℃で好気的に増殖させ、次いで３７℃で４時間嫌気性チャンバーに移した。細菌（２×１０８ＣＦＵ）を、０．５％グルコースまたは０．５％グルクロン酸とともに５０ｍＭのＭＯＰＳを含むマイクロ遠心チューブ中の１ｍｌのＭ９培地に添加した。細胞数を決定するために細胞をプレーティングした。アッセイチューブを３７℃の嫌気性チャンバーに入れた。１８時間後、細胞を除去し、１４，０００ｒｐｍで１分間ペレット化し、上清１００μｌを９６穴アッセイプレートに移し、アルミニウム箔で密封し、例１８および例２１に記載したように、ＬＣ−ＭＳによるブチラートおよびアセタート濃度の分析まで−８０℃で保存した。
【０６６６】
図２６Ａおよび図２６Ｂに示すように、両方の組込み株は類似した量のアセタートを生成し、ＦＮＲＳ−ｔｅｒ−ｐｂｔ−ｂｕｋブチラートカセットの方がわずかだがより多くのブチラートを産生した。ａｄｈＥおよびｌｄｈＡの欠失は、ブチラートおよびアセタート生産に類似効果を有する。アセタート産生は、０．５％グルクロン酸を含有する培地ではるかに大きかった。
【０６６７】
代わりの実施態様では、ｆｒｄ（フマル酸レダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ））を欠損させて、アセタートおよびブチラート生成に対する欠失の影響を評価する。
例２１．  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる細菌上清中のアセタートおよびブチラートの定量
サンプル調整
【０６６８】
水中で酢酸アンモニウムおよび酪酸ナトリウムストック（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ（１００μＬ）に分注し、−２０℃で保存した。標準物質（１０００、５００、２５０、１００、２０、４、０．８μｇ／ｍＬ）を水中で調製した。サンプルおよびスタンダード（１０μＬ）を氷上でＶ底ポリプロピレン９６ウェルプレートにピペットで添加した。アセトニトリル中に２ｕｇ／ｍＬの酪酸ナトリウム−ｄ７とともに、５０ｍ  の２−ヒドラジノキノリン（２−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（２−ＨＱ）、ジピリジルジスルフィド（ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、およびトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を含有する誘導化溶液（９０μＬ）を最終溶液に加えた。次いで、プレートをＴｈｅｒｍＡＳｅａｌホイルでヒートシールし、よく混合し、サンプルを６０℃で１時間インキュベートして誘導体化し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。誘導体化サンプル（２０μＬ）を丸底９６ウェルプレート内おいて、水／ＡＣＮ（１４０：４０）中の０．１％ギ酸１８０μＬに添加した。次いで、プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートでヒートシールし、よく混合した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６６９】
誘導体化した代謝物の測定は、サーモＴＳＱクワンタムマックストリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して、タンデム質量分析に結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって行われた。表５５および表５６にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の概要を示す。
【０６７０】
[表５４]
【０６７１】
[表５５]
【０６７２】
[表５６]
例２２．遺伝学的に操作された大腸菌ＢＷ２５１１３およびＮｉｓｓｌｅにおけるスリーピングビューティームターゼ経路によるプロピオナート生産
【０６７３】
大腸菌において、４つの遺伝子オペロン、ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ（スリーピングビューティームターゼ経路）は、インビトロでスクシナート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）からプロピオナートを生産する能力を有する推定コバラミン依存性経路をコードすることが示されている。スリーピングビューティームターゼ経路は大腸菌に存在するものの、強力なプロモーターの制御下にはなく、インビボで低活性であることが示されている。
【０６７４】
プロピオナート生産のためのこのオペロンの有用性を評価した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは完全なオペロンを有していないので、最初の実験は大腸菌Ｋ１２（ＢＷ２５１１３）で行った。
【０６７５】
まず、ＢＷ２５１１３株の染色体上のスリーピングビューティームターゼオペロンの天然プロモーターをｆｎｒプロモーター（ＢＷ２５１１３  ｌｄｈＡ：：ｆｒｔ；ＰｆｎｒＳ−ＳＢＭ−ｃａｍ）に置き換えた。この構築物の配列を表５８に示す。乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子（ｌｄｈＡ）の変異は、プロピオナート産生を増加させることが報告されており、したがって一定の実施態様ではこの変異もまた加えられている。
【０６７６】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１８４または１８４ 、またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０６７７】
[表５７-１]
[表５７-２]
[表５７-３]
[表５７-４]
[表５７-５]
[表５７-６]
[表５７-７]
[表５７-８]
[表５７-９]
【０６７８】
次に、この株をプロピオナート産生について試験した。
【０６７９】
簡潔には、野生型大腸菌Ｋ１２またはＦＮＲプロモーターの制御下で染色体スリーピングビューティームターゼオペロンを含む遺伝学に操作された細菌のいずれかを有する凍結グリセロールストックから、３ｍｌのＬＢ（必要に応じて選択的抗生物質（ｃａｍ）を含む）に植菌した。一晩後の培養物を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ中で１０ｍｌのＬＢに１：１００に希釈した。細菌を振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。培養物を３７℃で約１．５時間振とうしながら好気的に増殖させ、次いで３７℃で４時間嫌気性チャンバーに移した。マイクロ遠心管内において、０．５％  グルコースとともに５０ｍＭ  ＭＯＰＳを含む１ｍｌのＭ９培地に、細菌（２×１０８ＣＦＵ）を加えた。細胞をプレーティングして細胞数を測定した。アッセイチューブを３７℃の嫌気性チャンバーに入れた。１時間、２時間、および２４時間の時点で、１２０μｌの細胞を除去し、１４，０００ｒｐｍで１分間ペレット化し、１００μｌの上清を９６穴アッセイプレートに移し、アルミニウム箔でシールし、ＬＣ−ＭＳによるプロピオナート濃度の分析まで−８０℃で保存した。
【０６８０】
結果を図２９に示す。大腸菌Ｋ１２野生型株からプロピオナート産生がほとんどまたは全く産生されなかったのに対し、遺伝学的に操作された株は２４時間後に〜２．５ｍＭを産生することを示している。プロピオナートの測定は、例２５に記載したように行った。
例２３．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるプロピオナート産生のためのスリーピングビューティームターゼ経路の評価
【０６８１】
次に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるプロピオナート生成について、ＳＢＭ経路の評価を行う。Ｎｉｓｓｌｅは４遺伝子スリーピングビューティームターゼ・オペロンを完全には持っていない。第１遺伝子、および第２遺伝子の部分遺伝子のみを有し、第３遺伝子および第４遺伝子は欠損している。したがって、Ｎｉｓｓｌｅにこの経路を導入するためにリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いる。ｆｒｔ−ｃａｍ−ｆｒｔ−ＰｆｎｒＳ−ｓｂｍ、ｙｇｆＤ、ｙｇｆＧ、ｙｇｆＨ構築物は、Ｎｉｓｓｌｅの内因性短縮ＳＢＭの位置に挿入される。次に、構築物を大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換し、実質的に上記の通りに、プロピオナート産生について試験する。
例２４．プロピオナート生産のためのクロストリジウム・プロピオニカム  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）  由来アクリラート経路の評価
【０６８２】
クロストリジウム・プロピオニカム  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のアクリラート経路を、大腸菌におけるプロピオナート産生への適応について評価する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用にコドン最適化された構築物（Ｐｔｅｔ−ｐｃｔ−ｌｃｄＡＢＣ−ａｃｒＡＢＣ）はＧｅｎｅｗｉｚによって合成され、高コピープラスミド（Ｌｏｇｉｃ０５１）中に配置されている。さらに、サイドバイサイド試験のため、ａｃｒＡＢＣ遺伝子（経路の律速段階であり得る）をＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｔｅｔ−ａｃｕＩ−ｐｃｔ−ｌｃｄＡＢＣ）由来のａｃｕＩ遺伝子で置換した別の構築物を作製する。続いて、これらの構築物をＢＷ２５１１３に形質転換し、例２４に上記したＢＷ５１１３株と比較して、プロピオナート産生能について評価する。プロピオナートの測定は例２７に記載のように行った。
【０６８３】
[表５８-１]
[表５８-２]
[表５８-３]
[表５８-４]
[表５８-５]
[表５８-６]
[表５８-７]
[表５８-８]
[表５８-９]
[表５８-１０]
[表５８-１１]
[表５８-１２]
[表５８-１３]
[表５８-１４]
[表５８-１５]
[表５８-１６]
[表５８-１７]
【０６８４】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１８５、１８６、１８７、または１８８のＤＮＡ配列、またはその機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
例２５．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるおプロピオナート定量
サンプル調整
【０６８５】
最初に、新鮮な１０００、５００、２５０、１００、２０、４および０．８μｇ／ｍＬのプロピオン酸ナトリウム標準を水中で調製した。次いで、Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレートに２５μＬのサンプル（細菌上清および標準液）をピペットで入れ、１０ｕｇ／ｍＬのブチラート−ｄ５（ＣＤＮ同位体）を含む６０％ＡＣＮ（４５ｕＬ  ＡＣＮ  ＋３０ｕＬ反応当たり））最終溶液の内部標準を各試料に添加した。プレートをヒートシールし、よく混合し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。丸底９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、希釈サンプル５μＬを、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ４．５，２０ｍＭ  ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、および２０ｍＭのＴＦＥＡを含有する緩衝液９５μＬに添加した２，２，２−トリフルオロエチルアミン）。プレートを再びヒートシールし、よく混合し、サンプルを室温で１時間インキュベートした
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
【０６８６】
プロピオナートは、サーモＴＳＱクワンタムマックストリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｍａｘ  ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して、タンデム質量分析に結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。ＨＰＬＣの詳細を表６０および表６１に示す。タンデム質量分析の詳細を表６２に示す。
【０６８７】
[表５９]
【０６８８】
[表６０]
【０６８９】
[表６１]
例２６．分泌のための治療分子を過剰生産するための構築物の作製
【０６９０】
抗炎症または消化管バリアエンハンサーポリペプチド、例えばＧＬＰ２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０（ウイルスまたはヒト）を分泌することができる株を産生するために、いくつかの構築物が異なる分泌戦略を用いて設計される。例示的な構築物の構成を図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３１Ａ、図３１Ｂ、図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃ、図３２Ｄ、図３２Ｅに示す。様々なＧＬＰ２、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０（ウイルスまたはヒト）構築物を合成し、大腸菌の形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングする。いくらかの実施態様においては、エフェクター分子をコードする構築物は、ゲノム中に組み込まれる。いくらかの実施態様において、エフェクター分子をコードする構築物は、プラスミド、例えば、中コピープラスミド上にある。表６３は、構築物に使用される例示的なポリペプチドコード配列の一覧である。
【０６９１】
[表６２-１]
[表６２-２]
[表６２-３]
[表６２-４]
【０６９２】
いくつかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６のＤＮＡ配列、配列番号１９７、または配列番号１９８またはそれらの機能的断片に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
【０６９３】
表６４は拡散性外膜（ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）法またはｆｌｉＣ法が用いられる時に、末端に付け加えることができる例示的な分泌タグを一覧にしている。
【０６９４】
[表６３-１]
[表６３-２]
[表６３-３]
【０６９５】
いくらかの実施態様では、遺伝学的に操作された細菌は、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、および配列番号２１７のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表６５は、例示的なプロモーター配列および雑多な構築物配列を一覧にしている。
【０６９６】
[表６４-１]
[表６４-１]
[表６４-２]
[表６４-３]
【０６９７】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、および配列番号２２３のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表６６は、例示的な分泌構築物を列挙する。
【０６９８】
[表６５-１]
[表６５-２]
[表６５-３]
[表６５-４]
[表６５-５]
【０６９９】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、および配列番号２３１のＤＮＡ配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。表６６は、例示的な分泌構築物を列挙する。
【０７００】
[表６６-１]
[表６６-２]
[表６６-３]
[表６６-４]
【０７０１】
いくつかの実施態様では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３３４ 、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８および配列番号２３９のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
例２７．  ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０の細菌分泌
【０７０２】
操作された細菌が発現するヒトＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０が分泌されるかどうかを決定するために、様々なｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０構築物／株を含む操作株の細菌上清中のＩＬ−１０濃度の測定を行った（ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０構築物／株のコンポーネントおよび配列については、表６３、表６４、表６５、表６６、表６７を参照）。
【０７０３】
種々のｔｅｔ誘導性構築物または天然ｆｌｉＣプロモーター下の構築物を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ニッスルを、ＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００に希釈し、２時間振とう（２００ｒｐｍ）した。培養物を光学濃度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−１０の発現を誘導した。ｆｌｉＣ構築物を有する培養物にテトラサイクリンを添加しなかった。誘導から１２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を回収した。無細胞培地を生成するために、清澄化された上清をさらに０．２２ミクロンのフィルターで濾過して残っている細菌を除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、細菌を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、元の培養条件と比較して溶解物を１０倍濃縮した。室温で１０分間インキュベートした後、不溶性破片を４℃で１２，０００ｒｃｆで２０分間スピンダウンし、さらに処理するまで氷上に置く。
【０７０４】
無細胞培地および細菌細胞抽出液中のｈＩＬ−１０の濃度を、ｈＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ２１７Ｂ）によって、製造者の指示に従って測定した。  同様に、ｖＩＬ−１０の濃度を決定するために、市販の組換えｖＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、９１５−ＶＬ−０１０）を用いて、超高感度ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ、４５−Ｉ１０ＨＵＵ−Ｅ０１）を用いた。全てのサンプルを３回繰り返し、標準曲線を用いて分泌レベルのＩＬ−１０を算出した。標準曲線は、ヒトおよびウイルスの組換えタンパク質の両方を用いて作製した。野生型ＮｉｓｓｌｅはネガティブコントロールとしてＥＬＩＳＡに含まれ、シグナルは観察されなかった。表６８および表６９は、上清および細胞内表６８ および細胞外表６９ で測定したｈＩＬ１０およびｖＩＬ−１０のレベルをまとめたものである。データは、ｖＩＬ−１０およびｈＩＬ−１０の両方が異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示す。
【０７０５】
[表６７]
【０７０６】
[表６８]
共培養研究
【０７０７】
表６８および表６９に示される遺伝子操作された細菌によって発現されるｈＩＬ−１０およびウイルスＩＬ−１０が生物学的な機能を有するかどうかを決定するために、インビトロ実験を実施する。分泌されたヒトまたはウイルスのＩＬ−１０を含む細菌上清を、Ｒａｊｉ細胞（造血細胞株）およびＪ７７４ａ１細胞（マクロファージ細胞株）の増殖培地に添加する。ＩＬ−１０は、これらの細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導することが知られている。したがって、細菌分泌ＩＬ−１０の機能活性は、ＲａｊｉおよびＪ７７４ａ１細胞におけるＳＴＡＴ３をリン酸化するその能力によって評価される。
【０７０８】
Ｒａｊｉ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充した１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーター中で増殖させる。細菌上清で処理する前に、１０％ＦＢＳ（１ｅ６／２４ウェル）を補充したＲＰＭＩ１６４０を一晩血清飢餓状態にする。ＬＢで希釈した組換えヒトＩＬ−１０または野生型Ｎｉｓｓｌｅまたは操作した細菌からの清澄化した上清のいずれかの滴を細胞に３０分間添加する。細胞を採取し、溶解バッファーに再懸濁し、ホスホ−ＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ  ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を、全てのサンプルについて、製造者の指示に従って３回実施する。ＰＢＳ処理した細胞およびＰＢＳをネガティブコントロールとして加える。線形性を示すために、サンプルの希釈が含まれる。
競合研究
【０７０９】
特異性のためのさらなる対照として、競合アッセイを実施する。抗ＩＬ１０抗体の滴定を、ヒトＩＬ−２２またはウイルスＩＬ−２２を発現する操作された細菌からのｒｈＩＬ２２（データは示さず）または上清のいずれかの一定濃度で１５分間プレインキュベートする。次に、上清／ｒｈＩＬ２溶液を血清欠乏Ｒａｊｉ細胞（１ｅ６／ウェル）に添加し、細胞を上記のようにｐＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡに続いて３０分間インキュベートする。
【０７１０】
他の実施態様では、Ｊ７７４ａ１細胞で同様の研究が行われる。
例２７．ＧＬＰ−２の細菌分泌
【０７１１】
操作された細菌によって発現されたヒトＧＬＰ−２が分泌されるか否かを決定するために、ＧＬＰ−２構築物／株を含む２つの操作された株からの細菌上清中のＧＬＰ−２の濃度を測定した。第１の株は、ＰＡＬに欠失を含み、テトラサイクリン誘導性プロモーターに由来するＯｍｐＦ分泌タグを有するＧＬＰ−２を発現するプラスミドを含み、第２の株は、同じＰＡＬ欠失およびＧＬＰ−２を発現する同じプラスミドを含み、ｄｅｇＰ  （表７０参照）。
【０７１２】
ネイティブｆｌｉＣプロモーターの下で、種々のｔｅｔ誘導性構築物または構築物を含む大腸菌ＮｉｓｓｌｅをＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００に希釈し、２時間振とう（２００ｒｐｍ）した。培養物を吸光度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−１０の発現を誘導した。ｆｌｉＣ構築物を有する培養物にはテトラサイクリンを添加しなかった。誘導から１２時間後に、細胞をスピンダウンし、上清を回収した。無細胞培地を生成するために、清澄化された上清をさらに０．２２ミクロンのフィルターで濾過して残っている細菌を除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、細菌を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、元の培養条件と比較して溶解物を１０倍濃縮した。室温で１０分間インキュベートした後、不溶性破片を４℃で１２，０００ｒｃｆで２０分間スピンダウンし、さらに処理するまで氷上に置く。
【０７１３】
無細胞培地および細菌細胞抽出液中のＧＬＰ−２の濃度を、製造業者の指示に従って、ヒトＧＬＰ２  ＥＬＩＳＡキット（競合ＥＩＡ）（ＬＳＢｉｏ）によって測定した。全ての試料を３回繰り返し、標準曲線を使用してＧＬＰ−２の分泌レベルを算出した。組換えＧＬＰ−２を用いて標準曲線を作成した。野生型ＮｉｓｓｌｅはネガティブコントロールとしてＥＬＩＳＡに含まれ、シグナルは観察されなかった。表７０に見られるように、ｄｅｇＰ、すなわちペリプラズムプロテアーゼの欠失により、３倍を超える分泌レベルの改善がみられた。
[表６９]
共培養研究
【０７１４】
遺伝子操作された細菌によって発現されたｈＧＬＰ−２が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、分泌されたヒトＧＬＰ−２を含有する細菌上清（上記両方の株から）をＣａｃｏ−２細胞およびＣＣＤ−１８Ｃｏ細胞の増殖培地に添加するインビトロ実験を実施する。Ｃａｃｏ−２細胞株は、異種のヒト上皮性結腸直腸腺癌細胞の継代細胞である。例えば、Ｊａｓｌｅｅｎら（Ｊａｓｌｅｅｎら、Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ．２００２年５月；４７（５）：１１３５−４０）に記載されているように、ＧＬＰ−２は、Ｃａｃｏ−２およびＴ８４細胞における増殖および［３Ｈ］チミジンの取り込みを刺激する。さらに、ＧＬＰ−２は、これらの細胞におけるＶＥＧＦＡ分泌を刺激する（例えば、Ｂｕｌｕｔら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００８年１月１４日；  ５７８（２−３）：２７９−８５を参照）。
【０７１５】
したがって、細菌分泌ＧＬＰ−２の機能活性は、増殖およびＶＥＧＦ分泌を誘導するその能力によって評価される。
【０７１６】
Ｃａｃｏ−２を、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーター中、３７℃で１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させる。細菌上清で処理する前に、Ｃａｃｏ−２細胞（１ｅ６／２４ウェル）を一晩血清飢餓状態にする。ＬＢで希釈した組換えヒトＧＬＰ−２（５０および２５０ｎＭ）または野生型Ｎｉｓｓｌｅまたは操作した細菌からの清澄化した上清の滴定を、規定の時間、細胞に添加する。
【０７１７】
細胞増殖アッセイのために、細胞を採取し、溶解緩衝液中に再懸濁する。インキュベーションの１２、２４、４８および７２時間後に細胞をアッセイする。細胞増殖は、細胞増殖アッセイキットを使用して、製造業者の指示に従って測定する（例えば、細胞生存率は、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）−アッセイ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ−ａｓｓａｙ）によって評価した）。
【０７１８】
ＶＥＦＡ分泌の測定のために、細胞を採取し、溶解緩衝液に再懸濁し、ＥＬＩＳＡによって培地中のＧＬＰ−２濃度を決定する。
【０７１９】
ネガティブコントロールとして、ＰＢＳ処理細胞およびＰＢＳを追加する。線形性を示すために、サンプルの希釈が含まれる。
競合研究
【０７２０】
特異性のためのさらなるコントロールとして、競合アッセイを実施する。抗ＧＬＰ−２抗体の滴定を、一定濃度の組換えＧＬＰ−２または操作された細菌由来の上清のいずれかと共に１５分間プレインキュベートする。次に、上清／ｒｈＩＬ２溶液を血清飢餓状態のＣａｃ−２細胞（１ｅ６／ウェル）に添加し、上記のようにＶＥＧＦＡ  ＥＬＩＳＡの後、細胞を３０分間インキュベートする。
例２８．ＩＬ−２２の細菌分泌
【０７２１】
操作された細菌によって発現されたヒトＩＬ−２２が分泌されるか否かを決定するために、ＩＬ−２２構築物／株を含む２つの操作された株由来の細菌上清中のＩＬ−２２濃度を測定した。第１の株は、ＰＡＬ欠失およびテトラサイクリン誘導性プロモーターからＯｍｐＦ分泌タグを有するＩＬ−２２を発現するプラスミドを含み、第２の株は、同じＰＡＬ欠失およびＩＬ−２２を発現する同じプラスミドを含み、さらにｄｅｇＰ欠失を含む（表７１）。
【０７２２】
天然のｆｌｉＣプロモーターの下で種々のｔｅｔ誘導性構築物または構築物を含む大腸菌ＮｉｓｓｌｅをＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００に希釈し、２時間振とう（２００ｒｐｍ）した。培養物を吸光度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−１０の発現を誘導した。ｆｌｉＣ構築物を有する培養物にはテトラサイクリンを添加しなかった。誘導から１２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を回収した。無細胞培地を生成するために、清澄化された上清をさらに０．２２ミクロンのフィルターで濾過して残っている細菌を除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、細菌を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、元の培養条件と比較して溶解物を１０倍濃縮した。室温で１０分間インキュベートした後、不溶性破片を４℃で１２，０００ｒｃｆで２０分間スピンダウンし、さらに処理するまで氷上に置く。
【０７２３】
無細胞培地および細菌細胞抽出液中のＩＬ−２２の濃度を、ｈＩＬ−２２  ＥＬＩＳＡ（ｈＩＬ−２２のＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＤＹ７８２）ＥＬＩＳＡ）によって、製造者の指示に従って測定した。全ての試料を３回繰り返し、標準曲線を用いて分泌レベルのＩＬ−２２を算出した。組換えＩＬ−２２を用いて標準曲線を作成した。野生型ＮｉｓｓｌｅはネガティブコントロールとしてＥＬＩＳＡに含まれ、シグナルは観察されなかった。表７１は、上清中で測定したＩＬ−２２のレベルをまとめたものである。データは、両方のｈＩＬ−２２が異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
[表７０-１]
[表７０-２]
例２９．ＩＬ−２２の細菌分泌および機能アッセイ
細菌上清の生成およびＩＬ−２２濃度の測定
【０７２４】
操作された細菌によって発現されたヒトＩＬ−２２が分泌されるか否かを決定するために、細菌上清中のＩＬ−２２の濃度を測定した。
【０７２５】
ｔｅｔ−誘導性組み込み構築物（ＰｔｅｔからのＰｈｏＡ−ＩＬ２２を発現するｄｅｌｔａ  ｐａｌ：：ＣｍＲ）を含む大腸菌ＮｉｓｓｌｅをＬＢ培地中で一晩増殖させた。培養液をＬＢで１：２００に希釈し、２時間振とう（２００ｒｐｍ）した。培養物を吸光度０．５に希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加して、ｈＩＬ−２２の発現を誘導した。誘導から１２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を回収した。無細胞培地を作製するために、上清を遠心分離し、０．２２ミクロンのフィルターで濾過して、残っている細菌を除去した。
【０７２６】
無細胞培地中のｈＩＬ−２２の濃度を、ｈＩＬ−２２  ＥＬＩＳＡ  （ｈＩＬ−２２のＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＤＹ７８２）  ＥＬＩＳＡ）  によって、製造者の指示に従って測定した。全ての試料を３回繰り返し、標準曲線を用いて分泌レベルのＩＬ−２２を算出した。さらに、サンプルを希釈して、マトリクス効果がないことを確認し、直線性を実証した。野生型ＮｉｓｓｌｅはネガティブコントロールとしてＥＬＩＳＡに含まれ、シグナルは観察されなかった。ＰＡＬ欠失を含む操作された細菌およびｐｈｏＡ分泌タグを有するｈＩＬ−２２をコードする組み込み構築物は、１９９ｎｇ／ｍｌ（上清１ｍｌ中に１９９ｎｇのｈＩＬ−２２）で分泌されると決定された。
共培養研究
【０７２７】
遺伝子操作された細菌によって発現されたｈＩＬ−２２が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、分泌されたヒトＩＬ−２２を含有する細菌上清を哺乳動物結腸上皮細胞の増殖培地に添加するインビトロ実験を行った。ＩＬ−２２は、Ｃｏｌｏ２０５細胞におけるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導することが知られている（例えば、Ｎａｇａｌａｋｓｈｍｉら、ＳＴＡＴ３を活性化し、結腸上皮細胞によってＩＬ−１０を誘導する。Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４年５月；４（５）：６７９−９１）。したがって、細菌で分泌されたＩＬ−２２の機能的活性は、Ｃｏｌｏ２０５細胞においてＳＴＡＴ３をリン酸化するその能力によって評価された。
【０７２８】
Ｃｏｌｏ２０５細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中、３７℃、５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーター中で増殖させた。細菌上清で処理する前に、Ｃｏｌｏ２０５（１ｅ６／２４ウェル）を一晩血清飢餓状態にした。ＬＢで希釈した組換えヒトＩＬ−２２または野生型Ｎｉｓｓｌｅまたは操作した細菌からの清澄化した上清のいずれかの滴を細胞に３０分間添加した。細胞を採取し、溶解緩衝液に再懸濁し、ホスホ−ＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡ  （ＥＬＩＳＡ  ｐＳＴＡＴ３  （Ｔｙｒ７０５）  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））  を、全ての試料について、製造者の指示に従って３回繰り返した。ＰＢＳ処理細胞およびＰＢＳをネガティブコントロールとして加えた。線形性を示すためにサンプルの希釈を含めた。野生型Ｎｉｓｓｌｅについてシグナルは観察されなかった。ＰＡＬ欠失を含む操作された株およびｐｈｏＡ分泌タグを有するｈＩＬ−２２をコードする統合された構築物の結果を図３３Ａに示されており、操作された細菌から分泌されたｈＩＬ−２２が機能的に活性であることが実証されている。
競合研究
【０７２９】
特異性に対する追加のコントロールとして、競合アッセイを行った。抗ＩＬ−２２抗体  （ＭＡＢ７８２１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の滴定を、一定濃度のｒｈＩＬ２２（データは示されていない）または操作されたバクテリア由来の上清と、１５分間プレインキュベートした。次に、上清／ｒｈＩＬ２溶液を血清飢餓Ｃｏｌｏ２０５細胞（１ｅ６／ウェル）に添加し、細胞を上記のようにｐＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡに続いて３０分間インキュベートした。図３３Ｂに示すように、分泌されたｈＩＬ−２２によって誘導されたホスホ−Ｓｔａｔ３シグナルは、ｈＩＬ−２２抗体ＭＡＢ７８２１によって競合される。
例３０．インドールプロピオン酸菌株の生成とインビトロでのインドール生産
【０７３０】
大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいてインドールプロピオン酸（ＩＰＡ）の誘導性産生を促進するために、トリプトファンからのインドールプロピオン酸の産生を可能にする６つの遺伝子ならびに転写および翻訳エレメントを合成し  （Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）  、ｔｅｔ誘導性プロモーター下のベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。他の実施態様では、ＩＰＡ合成カセットは、ＦＮＲ、ＲＮＳまたはＲＯＳプロモーター（例は、本明細書に記載のもの）、または健常な腸または罹患した腸の状態（例は、炎症状態）によって誘導される他のプロモーターの制御下に置かれる。ＩＰＡ合成遺伝子の効率的な翻訳のために、カセット中の各合成遺伝子は、Ｔ７プロモーター／翻訳開始部位に由来する１５塩基対のリボソーム結合部位によって分離される。
【０７３１】
ＩＰＡ合成カセットは、ＴｒｐＤＨ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＮＩＥＳ−２１０８由来のトリプトファン脱水素酵素）、ＦｌｄＨ１／ＦｌｄＨ２（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のインドール−３−乳酸脱水素酵素）、ＦｌｄＡ（インドール−３−プロピオニル−ＣｏＡ：インドール−３−乳酸  （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来のインドール−３−アクリル酸−ｃｏＡ還元酵素）、およびＡｃｕＩ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のアクリリル−ＣｏＡレダクターゼ）を含むが、これらに限定されない。
【０７３２】
上述のｔｅｔ誘導性ＩＰＡ構築物を、本明細書に記載のように大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換し、ＩＰＡの産生を評価する。特定の実施態様では、記載されるＩＰＡ合成カセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株は、トリプトファン合成カセットをさらに含む。特定の実施態様では、株は、より高いＴｒｐ産生を達成するために、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥのフィードバック耐性バージョンを含む。特定の実施態様においては、さらに、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼ）が欠失される。
【０７３３】
全てのインキュベーションは３７℃で行われる。ＩＰＡ生合成構築物単独で、またはトリプトファン生合成系構築物およびフィードバック耐性ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥと組み合わせて形質転換された大腸菌ＮｉｓｓｌｅのＬＢで一晩培養した培養物を、０．５％グルコースを含むＭ９最少培地１０ｍＬに１：１００継代し、ＩＰＡ生合成およびトリプトファン生合成構築物の発現を誘導するために、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加する。誘導の２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に再懸濁する。次いで、培養上清をＬＣ−ＭＳにより所定の時点（例えば、０から２４時間まで）で分析し、ＩＰＡのレベルを評価する。
【０７３４】
ＩＰＡ産生の窒素依存誘導を評価するために、ＲＮＳプロモーター（例えば、ｎｓｒＲ−ｎｏｒＢ−ＩＰＡ生合成構築物）によって駆動されるＩＰＡおよびトリプトファンカセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株においても、ＩＰＡの産生を評価する。一晩の細菌培養物を新鮮なＬＢに１：１００に希釈し、１．５時間増殖させて初期対数期に入るようにする。この時点で、長い半減期の一酸化窒素供与体（ＤＥＴＡ−ＮＯ；ジエチレントリアミン−酸化窒素付加体）を最終濃度０．３ｍＭで培養物に添加してプラスミドからの発現を誘導する。誘導の２時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨て、細胞を０．５％グルコースを含むＭ９最小培地に再懸濁する。次いで、ＩＰＡレベルを評価するために、培養上清を所定の時点（図３３に示すように０から２４時間まで）で分析する。
【０７３５】
別の実施態様では、低酸素誘導性ＦＮＲプロモーター（例えば、ＦＮＲＳ）または反応性酸素制御性ＯｘｙＳプロモーターの両方によって駆動されるＩＰＡおよびトリプトファンカセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株でＩＰＡの産生も評価される。
例３１．ＦＮＲプロモーター活性
【０７３６】
種々のＦＮＲプロモーターのプロモーター活性を測定するために、ｌａｃＺ遺伝子ならびに転写および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。ｌａｃＺ遺伝子は、表２１に開示される例示的なＦＮＲプロモーター配列のいずれかの制御下に置かれた。これらの構築物のヌクレオチド配列は、表７２−表７６（配列番号２４０−２４４）に示されている。ｌａｃＺ遺伝子は、これらのプロモーターの活性を分析するために他の誘導性プロモーターによって駆動されてもよく、プロモーター活性のための読み出しとしてｌａｃＺ遺伝子の代わりに他の遺伝子を用いてもよい。例示的な結果を図３９に示す。
【０７３７】
表７２は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的ＦＮＲプロモーターＰｆｎｒ１（配列番号２４０）を含む例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す。構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｎｉｒＢ１遺伝子とｌａｃＺ遺伝子との翻訳融合物を含み、翻訳融合物がフレーム内でｌａｃＺコード領域の第８コドンに融合される。Ｐｆｎｒ１配列は太字の小文字であり、プロモーター内の推定リボソーム結合部位には下線が引かれている。ｌａｃＺ配列は下線で囲まれた大文字である。ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物を合成するために使用されたクローニング部位は正規の大文字で示されている。
【０７３８】
表７３は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ２（（配列番号２４１）を含む例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す）構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｙｄｆＺ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合を含む。この翻訳融合体は、ｌａｃＺコード領域の８番目のコドンにインフレームで融合されている。Ｐｆｎｒ２配列は太字の小文字であり、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位に下線を付してある。太字の大文字であり、構築物を合成するために使用されるクローニング部位は、大文字の大文字で示されている。
【０７３９】
表７４は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ３（（配列番号２４２）を含む例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す）構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｎｉｒＢ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子の転写融合物を含む。転写融合体は強いリボソーム結合部位に融合されたプロモーター領域のみを使用する。Ｐｆｎｒ３配列は太字の小文字であり、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位に下線を付してある。太字の大文字、およびコンストラクトを合成するために使用されたクローニング部位を、大文字の大文字で示している。
【０７４０】
表７５は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒ４（（配列番号２４３）を含む例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す）構築物は、Ｎｉｓｓｌｅ  ｙｄｆＺ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子の転写融合物を含む。Ｐｆｎｒ４配列は太字の小文字であり、プロモーター内の予想されるリボソーム結合部位に下線を引いてあり、ｌａｃＺ配列は下線で囲まれており、ＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物を合成するために使用されたクローニング部位は、場合。
【０７４１】
表７６は、ｌａｃＺをコードする遺伝子および例示的なＦＮＲプロモーターであるＰｆｎｒＳ（（配列番号２４４）を含む例示的な構築物のヌクレオチド配列を示す）構築物は、嫌気的に誘発された小ＲＮＡ遺伝子ｆｎｒＳ１  ｌａｃＺに融合されたＰｆｎｒｓ配列は太字の小文字であり、プロモーター内の予想されたリボソーム結合部位に下線が引かれており、ｌａｃＺ配列は下線で囲んだ大文字でＡＴＧ部位は太字の大文字であり、構築物を合成するために用いられるクローニング部位は  大文字で表示されます。
[表７１-１]
[表７１-２]
【０７４２】
[表７２-１]
[表７２-２]
【０７４３】
[表７３-１]
[表７３-２]
【０７４４】
[表７４-１]
[表７４−２]
【０７４５】
[表７５−１]
[表７５−２]
例３２．一酸化窒素誘導型レポーター構築物
【０７４６】
ＡＴＣおよび一酸化窒素誘導性レポーター構築物を合成した（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。これらの同族誘導因子によって誘導される場合、これらの構築物はＧＦＰを発現し、これはプレートリーダーで３９５／５０９ｎｍの励起／発光で蛍光をモニターすることによって検出される。コントロール、ＡＴＣ−誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物、または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを有するプラスミドを有するニッスル細胞を、最初に初期対数期（ＯＤ６００約０．４−０．６）まで増殖させ、ＬＢおよび２倍減少インデューサー（ＡＴＣまたは長い半減期のＮＯ供与体、ＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ））を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。ＡＴＣおよびＮＯの両方は、様々な濃度にわたってそれらのそれぞれの構築物においてＧＦＰの発現を誘導することができた（図２８）。プロモーター活性は、相対的な蛍光単位として表される。一酸化窒素誘導性レポーター構築物の例示的な配列が示される。ｂｓｒＲ配列は太字で表示されています。ｇｆｐ配列には下線が引かれている。ＰｎｓｒＲ（ＮＯ制御プロモーターおよびＲＢＳ）はイタリック体である。構成的プロモーターおよびＲＢＳは囲まれている。
【０７４７】
[表７６]
【０７４８】
これらの構築物は、それらの同族の誘導因子によって誘導された場合、ＧＦＰの高レベル発現を導き、これはプレートリーダーで３９５／５０９ｎｍの励起／発光で蛍光をモニターすることによって検出される。ＡＴＣ誘導性Ｐｔｅｔ−ＧＦＰレポーター構築物または酸化窒素誘導性ＰｎｓｒＲ−ＧＦＰレポーター構築物のいずれかを有するプラスミドを有するニッスル細胞を、初めに対数期（ＯＤ６００＝〜０．４−０．６）まで増殖させ、その時点で、それらを９６ウェルプレートに移し、ＬＢを含有し、誘導物質（ＡＴＣまたは長い半減期のＮＯ供与体、ＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ））中に２倍の減少を有するマイクロウェルのマイクロタイタープレートである。ＡＴＣおよびＮＯの両方が、広範囲の濃度にわたってそれらのそれぞれの構築物においてＧＦＰの発現を誘導することができることが観察された。プロモーター活性は、相対蛍光単位として表される。
【０７４９】
図６３Ｄは、ＮＯ−ＧＦＰ構築物（ドットブロット）一酸化窒素誘導性ＮｓｒＲ−ＧＦＰレポーター融合物を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅを、カナマイシンを補充したＬＢ中で一晩増殖させた。次いで、細菌をカナマイシンを含有するＬＢ中に１：１００に希釈し、吸光度０．４−０．５まで増殖させ、次いで遠心分離によりペレット化した。細菌をリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、１００マイクロリットルを経口胃管栄養法によりマウスに投与した。ＩＢＤは、細菌胃管栄養法の前に７日間２−３％デキストラン硫酸ナトリウムで飲料水を補充することによってマウスにおいて誘導される。胃管栄養４時間後に、マウスを殺し、細菌を結腸サンプルから回収した。結腸内容物をＳＤＳ中で沸騰させ、可溶性画分を用いてＧＦＰ検出のためのドットブロットを行った（ＮｓｒＲ調節プロモーターの誘導）。ＧＦＰの検出は、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートした抗ＧＦＰ抗体の結合によって行った。Ｐｉｅｒｃｅ化学発光検出キットを用いて検出を視覚化した。図面では、ＮｓｒＲ調節プロモーターがＤＳＳ処置マウスにおいて誘導されるが、未処置マウスにおいて誘導されることは示されていないことが示される。これは、ＮＯに応答するＮｓｒＲの役割、したがって炎症と一致する。
【０７５０】
構成的プロモーターの制御下でＮｓｒＲを発現するプラスミドを有する細菌およびＮｓｒＲ誘導性プロモーターの制御下でレポーター遺伝子ｇｆｐ（緑色蛍光タンパク質）を、カナマイシンを補充したＬＢ中で一晩増殖させた。次いで、細菌をカナマイシンを含有するＬＢ中に１：１００に希釈し、約０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、次いで遠心分離によってペレット化する。細菌をリン酸緩衝食塩水に再懸濁し、１００マイクロリットルを経口強制飼養によりマウスに投与する。ＩＢＤは、細菌胃管栄養法の前に７日間２−３％デキストラン硫酸ナトリウムで飲料水を補充することによってマウスにおいて誘導される。胃管栄養４時間後に、マウスを殺し、細菌を結腸サンプルから回収した。ＧＦＰ検出のためのドットブロットを行うために可溶性画分を使用した（ＮｓｒＲ調節プロモーターの誘導）ＨＲＰに結合した抗ＧＦＰ抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ）の結合によってＧＦＰの検出を行った。Ｐｉｅｒｃｅ化学発光検出キットを用いて検出を視覚化した。図１５は、ＮｓｒＲ調節プロモーターがＤＳＳ処理マウスで誘導されるが、未処理マウスで誘導されないことを示す。
例３３．ΔＴｈｙＡの作製
【０７５１】
栄養要求性突然変異は、必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子が欠如しているため、生存または成長に必須の外因的に添加された栄養素の不在下で細菌を死滅させる。栄養要求性修飾を有する遺伝子改変細菌を作製するために、オリゴヌクレオチド合成に必須の遺伝子であるｔｈｙＡを欠失させた。大腸菌ＮｉｓｓｌｅにおけるｔｈｙＡ遺伝子の欠失は、チミジンを補充しない限り、ＬＢプレート上にコロニーを形成することができない株を産生する。
【０７５２】
ｔｈｙＡ：：ｃａｍ  ＰＣＲフラグメントを、以下のように３ラウンドのＰＣＲを用いて増幅した。１００ｕｍ濃度で使用したプライマーの配列を表７８に示す。
[表７７]
【０７５３】
最初のＰＣＲラウンドでは、鋳型として１ｎｇのｐＫＤ３、２５μｌの２ｘｐｈｕｓｉｏｎ、０．２μｌのプライマーＳＲ３６およびＳＲ３８、および０、０．２、０．４または０．６μｌのＤＭＳＯを含む４×５０μｌのＰＣＲ反応物を、ヌクレアーゼを含まない水で容量５０μｌに合わせて、以下のサイクル条件下で増幅した：
【０７５４】
ステップ１：９８℃、３０秒間
【０７５５】
ステップ２：９８℃、１０秒間
【０７５６】
ステップ３：５５℃、１５秒間
【０７５７】
ステップ４：７２℃、２０秒間
【０７５８】
ステップ２−４を３０サイクル繰り返す。
【０７５９】
ステップ５：７２℃、５分間
【０７６０】
続いて、５μｌの各ＰＣＲ反応をアガロースゲル上で行い、適切なサイズのＰＣＲ産物を確認した。ＰＣＲ産物は、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して製造者の指示に従って残りのＰＣＲ反応から精製し、３０μｌのヌクレアーゼを含まない水で溶出させた。
【０７６１】
第２ラウンドのＰＣＲでは、０．２μｌのプライマーＳＲ３３およびＳＲ３４を除いて、上記のように４×５０μｌのＰＣＲ反応において、ラウンド１由来の精製ＰＣＲ産物１μｌを鋳型として用いた。サイクル条件は、最初のＰＣＲ反応について上記したものと同じであった。ＰＣＲ産物は、増幅を確認するためにアガロースゲル上を流し、精製し、上記のように３０ｕｌで溶出した。
【０７６２】
３回目のＰＣＲでは、ラウンド２由来の精製ＰＣＲ産物１μｌを、プライマーＳＲ４３およびＳＲ４４を除いて記載したように、４×５０μｌのＰＣＲ反応で鋳型として使用した。サイクル条件はラウンド１およびラウンド２について記載したものと同じであった。増幅を確認し、ＰＣＲ産物を精製し、上記のように溶出させた。濃度および純度は、分光光度計を用いて測定した。ｔｈｙＡの上流に９２ｂｐ、ｆｒｔ部位に隣接し、ｔｈｙＡ遺伝子の下流に９８ｂｐ相同であるクロラムフェニコールカセットを含む得られた線状ＤＮＡ断片を、組換えのために増殖させたｐＫＤ４６を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株に形質転換した。エレクトロポレーションの後、３ｍＭのチミジンを含む１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、細胞を３７℃で２時間振盪しながら回復させた。次いで、細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭチミジンを含む１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭおよび２０ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に広げた。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢプレート上に出現したコロニーが再形成された。＋ｃａｍ  ２０ｕｇ／ｍｌ  ＋または−ｔｈｙ  ３ｍＭ。（ｔｈｙＡ栄養要求株は、３ｍＭのｔｈｙを補充した培地でのみ増殖する）。
【０７６３】
次に、ｐＣＰ２０形質転換により抗生物質耐性を除去した。ｐＣＰ２０は、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子、ＦＬＰ、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子および温度感受性複製を有する。ＯＤ６００＝０．４−０．６になるまで、３７℃で選択抗生物質を含有するＬＢ培地中で細菌を増殖させた。１ｍＬの細胞を以下のように洗浄した：細胞を１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬの氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。この洗浄工程を３回繰り返した。最終ペレットを７０μｌの氷冷した１０％グリセロール中に再懸濁した。次に、細胞を１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡで電気穿孔し、３ｍＭのチミジンを補充した１ｍＬのＳＯＣをキュベットに直ちに加えた。細胞を再懸濁し、培養管に移し、３０℃で１時間増殖させた。細胞を１０，０００ｘｇで１分間ペレット化し、上清を捨て、細胞ペレットを３ｍＭのチミジンを含有する１００μｌのＬＢに再懸濁し、３ｍＭのｔｈｙおよび１００ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃で１６−２４時間増殖させた。次に、形質転換体を４２℃で非選択的に（抗生物質なし）コロニー精製した。
【０７６４】
コロニー精製された形質転換体を試験するために、ピペットチップを用いてコロニーを４２℃のプレートから取り出し、１０μＬのＬＢに再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を３つのプレートのセットにピペットで入れた。：Ｃａｍ（３７℃；宿主株のゲノム中のＣａｍＲ遺伝子の存在／非存在についての試験）、Ａｍｐ（３０℃、ｐＣＰ２０プラスミドからのＡｍｐＲの存在／非存在についての試験）およびＬＢのみ（クロラムフェニコールカセットおよびｐＣＰ２０プラスミドを失った所望の細胞）、３７℃。ＣａｍプレートまたはＡｍｐプレートのいずれにも増殖がない場合にはコロニーは治癒したと考えられ、コロニーを拾い上げ、シングルコロニーを得るためＬＢプレート上に再ストリークして、３７℃で一晩増殖させた。
例３４．  Ｎｉｓｓｌｅの滞留
【０７６５】
改変されていない大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、腸または血清中の防御因子によって破壊され得る。インビボでの細菌の滞留時間を計算することができる。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのストレプトマイシン耐性株を使用する非限定的な例を以下に記載する。別の実施態様において、滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌について計算される。
【０７６６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを動物施設で１週間順化させた。１週間の馴化（すなわち、０日目）の後、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）を、１−３日目に経口強制飼養によりマウスに投与した。マウスは抗生物質で前処理されなかった。接種物のＣＦＵを決定するために、接種物を連続的に希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。
[表７８]
【０７６７】
２−１０日目に、６匹までのマウスから糞便ペレットを採取した（ＩＤ番号１−６；表８０）。ペレットをＰＢＳを含有するチューブ中で秤量し、ホモジナイズした。糞便ペレット中のＮｉｓｓｌｅのＣＦＵを測定するために、均質化した糞便ペレットを連続希釈し、ストレプトマイシン（３００μｇ／  ｍＬ）を含有するＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。
【０７６８】
１日目の糞便ペレットも集め、ストレプトマイシン耐性であるマウス胃腸管に固有の株が存在するかどうかを決定するために、ストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート上に播いた。マウス胃腸管内にまだ存在するＮｉｓｓｌｅ投与時間経過および投与量を表８０に示す。
【０７６９】
図６４は、インビボにおけるＮｉｓｓｌｅ滞留のグラフを示す。ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅを、抗生物質の前処理なしで経口強制飼養によりマウスに投与した。６匹の全マウス由来の糞便ペレットを投与後にモニターして、まだマウス胃腸管内に存在するＮｉｓｓｌｅ投与量を決定した。棒グラフは、マウスに投与された細菌の数を表す。線は、１０日間連続して毎日糞便サンプルから回収されたＮｉｓｓｌｅの数を表す。
[表７９]
例３５．インビボでの腸内滞留と細菌株の生存
【０７７０】
ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅの局在および腸滞留時間（図５６）が決定された。マウスを強制飼養し、様々な時点で犠牲にし、小腸盲腸および結腸の様々な領域から流出液を集めた。
【０７７１】
細菌培養物を一晩増殖させ、ペレット化した。ペレットをＰＢＳ中に約１０１０  ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度で再懸濁した。マウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、１０−１２週齢）を１００μＬの細菌（約１０９ＣＦＵ）で強制飼養した。マウスの飲料水は、嗜好性のために０．１ｍｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）および５％スクロースを含むように変更した。各時点（胃管栄養後１、４、８、１２、２４および３０時間）に、動物（ｎ＝４）を安楽死させ、腸、盲腸および結腸を取り出した。小腸は３つの切片に切断され、大腸および大腸はそれぞれ２つの切片に切断された。各切片を０．５ｍｌの冷ＰＢＳで洗い流し、別々の１．５ｍｌチューブに集めた。盲腸を収穫し、内容物を絞り出し、０．５ｍｌの冷ＰＢＳで洗い流し、１．５ｍｌチューブに集めた。腸溶出液を逐次希釈プレーティングのために氷上に置いた。
【０７７２】
各流出液中の細菌のＣＦＵを決定するために、流出液を段階希釈し、カナマイシンを含有するＬＢプレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。各コンパートメントにおける細菌の量および滞留時間を図５６に示す。
例３６．ＩＢＤのマウスモデルにおけるブチラート発現細菌の有効性
【０７７３】
上記のブチラートカセットを有する細菌を一晩ＬＢ中で増殖させる。次いで、細菌を適切な選択マーカー、例は、アンピシリンを含むＬＢ中に１：１００に希釈し、および０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および次いで遠心分離によりペレット化する。細菌をリン酸塩緩衝化サリン（生理的塩類溶液）に再懸濁し、および１００マイクロリットルを経口強制飼養（経口胃管栄養法とも言う）によりマウスに投与する。細菌強制飼養の前に７日間、３％デキストラン硫酸ナトリウムを伴う飲料水を補充することにより、ＩＢＤをマウスに誘導する。マウスを１週間毎日処置し、および適切な選択マーカー、例あ、アンピシリンを補充した寒天プレート上に糞便ホモジネートをプレーティングすることによって糞便サンプル中の細菌を検出する。細菌処理の５日後、内視鏡検査を用いて生存マウスで大腸炎を採点する。内視鏡的損傷スコアは、結腸透光性、フィブリン付着性、粘膜および血管病理、および／または糞便特徴を評価することによって決定される。マウスを屠殺し、および結腸組織を分離する。遠位結腸切片を固定し、そして炎症および潰瘍形成についてスコアをつける。結腸組織をホモジナイズし、そして酵素アッセイキットを用いてミエロペルオキシダーゼ活性を、およびサイトカインレベル（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）を測定する。
例３７．ＩＢＤのＤＳＳ誘導マウスモデルの作製
【０７７４】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、大腸炎のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導マウスモデルにおいて試験することができる。動物へのＤＳＳの施与は、腸管上皮への化学的損傷をもたらし、炎症誘発性の腸内容物（例は、内腔抗原、腸内細菌、細菌生成物）が伝染して炎症を引き起こすことを可能にする（Ｌｏｗら、２０１３）。ＤＳＳ処置用にマウスを調製するために、耳パンチ、または任意の他の適切な標識方法を用いてマウスを標識する。マウスはＤＳＳ誘導に対する異なる感受性および応答性を示すので、個々のマウスを標識することにより、研究者は各マウスの疾患の進行を追跡することができる。次いで、マウスを秤量し、および必要であれば、平均群重量を平衡化して、群間の有意な体重差を排除する。糞便はまた、ＤＳＳ施与の前に、その後のアッセイのコントロールとして採取される。炎症の糞便マーカー（例は、サイトカインレベルまたはミエロペルオキシダーゼ活性）についての模範的アッセイを以下に記載する。
【０７７５】
ＤＳＳ施与のために、オートクレーブ水においてＤＳＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（ＭＰバイオメディカルズ）、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ（サンタアナ）、ＣＡ（カリフォルニア州）；カタログ番号１６０１１０）の３％溶液を調製する。次いで、ケージの水ボトルに１００ｍＬのＤＳＳ水を満たし、およびコントロールマウスにはＤＳＳ補給なしで同量の水を与える。この量は一般に５匹のマウスで２−３日間用に十分である。ＤＳＳは室温で安定であるが、双方の種類の水は２日ごとに、またはボトルにおいて濁度が観察されるときに交換する。
【０７７６】
ＤＳＳの施与量（通常１−５％）およびＤＳＳ施与の持続時間を改変すること（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４）によって、腸炎症の急性、慢性、および解消（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）モデルが達成される。たとえば、急性および解消大腸炎は一週間以内を超えてＤＳＳに単回の連続曝露後に達成され得るが、慢性大腸炎は、典型的に、回復期間で断続されたＤＳＳの循環投与によって誘発される（例は、ＤＳＳ処置の４サイクルを７日間、続いて７−１０日間の水）。
【０７７７】
図１４Ｄは、ＦＮＲプロモーターの制御下でＤＳＳマウスモデルにおいてインビボで産生されるブチラート塩が腸防御性であり得ることを示す。ＬＣＮ２およびカルプロテクチンは両方とも、消化管バリア破壊の尺度である（このアッセイにおけるＥＬＩＳＡによる測定）。図１４Ｄは、Ｓｙｎ  ５０１（ｔｅｒ置換）が野生型Ｎｉｓｓｌｅと比較して（ｃｏｎｍｐａｒｅ）炎症を低減し、および／または消化管バリアを保護することを示す。
例３８．インビボでの疾患進行のモニタリング
【０７７８】
ＤＳＳの初期の施与後、１５−３０分間空のケージ（寝床材料なし）に単一のマウスを置くことによって、毎日各動物から糞便を採取する。しかし、ＤＳＳ施与が進行し、および炎症がより頑強になるにつれて、収集に要する時間が増加する。糞便サンプルは滅菌鉗子を用いて収集し、および微量遠心管に入れる。単一のペレットを用いて、以下の採点システムに従って潜血を監視する：０、陰性のヘモカルト（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ）を有する正常な糞便粘稠度；１、陽性のヘモカルトを有する軟便；２、血液の痕跡を有する非常な軟便、および３、可視性直腸出血を伴う水様の便である。このスケールは、腸の出血の比較分析に使用される。残りのすべての便は、炎症マーカーの測定のために予定され、および−２０℃で凍結される。
【０７７９】
各動物の体重も毎日測定する。体重は、初期のＤＳＳ施与後最初の３日間はわずかに増加し、およびその後出血の開始時に徐々に減少し始める可能性がある。急性大腸炎のマウスモデルについては、ＤＳＳは典型的には７日間施与される。しかし、この時間の長さは研究者の裁量により変更され得る。
例３９．  ＤＳＳ誘導後の遺伝学的に操作された細菌のインビボ有効性
【０７８０】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＳのＤＳＳ誘発動物モデルにおいて試験することができる。細菌は、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、細菌は選択的抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。次いで、細菌をリン酸塩緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）に再懸濁する。細菌強制飼養の前に７日間３％ＤＳＳで飲料水を補充することにより、ＩＢＤをマウスに誘導する。ＤＳＳ処理の７日目に、１００μＬの細菌（またはビヒクル）を経口強制飼養によってマウスに投与する。細菌処理を１日１回、１週間繰り返し、および糞便サンプル中の細菌を、選択的寒天平板上に糞便のホモジネートをプレーティングすることによって検出する。
【０７８１】
細菌処理の５日後、Ｃｏｌｏｖｉｅｗ  ｓｙｓｔｅｍ（コロビュー・システム）（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ（カール・シュトルツ・ベテリナリー・エンドスコピー）、Ｇｏｌｅｔａ（ゴレタ）、ＣＡ）を用いて、生存マウスにおいて大腸炎を記録する。１．５−２．０％のイソフルラン麻酔下のマウスでは、結腸を空気で膨脹させ、および近位結腸の約３ｃｍを視覚化することができる（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１４）。内視鏡的損傷は、結腸透光性（スコア０−３）、腸壁へのフィブリン付着（スコア０−３）、粘膜細粒度（スコア０−３）、脈管病理（スコア０−３）、糞便特徴（正常ないし下痢；スコア０−３）、および内腔での血液の存在（スコア０−３）、最大スコア１８を生成する。マウスを犠牲にし、および結腸組織を例８および９に記載のプロトコルを用いて分離する。遠位結腸切片を固定し、および炎症および潰瘍形成についてスコアをつける。残りの結腸組織をホモジナイズし、およびミエロペルオキシダーゼ活性と同様にサイトカインレベル（例は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０）を以下に記載の方法を用いて測定する。
例40．IBDのげっ歯類モデルの安楽死手順
【０７８２】
屠殺に先立ち４時間前および２４時間前に、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロゲン）、Ｗａｌｔｈａｍ（ウォルサム）、ＭＡ（マサチューセッツ州）；カタログ番号Ｂ２３１５１）を、供給者の推奨するようにマウスに腹腔内投与することができる。ＢｒｄＵは、標準的な抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ（アブカム）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いた免疫組織化学による腸上皮細胞の増殖および／または移動をモニターするために使用される。
【０７８３】
屠殺の日に、マウスは４時間食物を摂取させ、および次いでＦＩＴＣ−デキストラントレーサー（４ｋＤａ、０．６ｍｇ／ｇ体重）で強制飼養する。糞便ペレットを収集し、およびマウスをＦＩＴＣ−デキストラン投与の３時間後に安楽死させる。次いで、動物を心臓から採血して（ｃａｒｄｉａｃ  ｂｌｅｄ）、溶血のない血清を収集する。腸の透光性は、適切に希釈した血清（励起、４８８ｎｍ；発光、５２０ｎｍ）の蛍光強度と相関し、および分光光度法を用いて測定する。マウス血清中の既知量のＦＩＴＣ−デキストランの連続希釈液を用いて標準曲線を作成する。
【０７８４】
あるいはまた、腸炎症は、血清ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）、リポカリン２、カルプロテクチン、および／またはＣＲＰ−１のレベルに従って定量化する。これらのタンパク質は、炎症疾患活性の信頼できるバイオマーカーであり、およびＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（ヂュオセットＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ（ミネアポリス）、ＭＮ）を使用して製造者の指示に従って測定される。これらのアッセイのために、コントロール血清サンプルをＫＣについては１：２または１：４、およびリポカリン２については１：２００に希釈する。ＤＳＳ処理マウス由来のサンプルは、有意により一層高い希釈度を必要とする。
例４１．結腸組織の分離および保存
【０７８５】
マウスから腸組織を分離するために、腹側正中線切開によって各マウスを切り開く。次いで、脾臓を取り出し、および重さを量る。増加した脾臓重量は、一般に、動物における炎症および／または貧血の程度と相関する。非選択寒天プレート上に播種した脾臓溶解物（ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍＬ）も、散在性腸内細菌の指標である。細菌の蔓延の程度は、ＦＩＴＣ−デキストラン透光性データと一致するべきである。
【０７８６】
次に、腸間膜リンパ節を分離する。これらは、免疫細胞集団の特徴付け、および／または消化管細菌のトランスロケーションのアッセイに使用され得る。リンパ節の拡大も、ＤＳＳ誘発病理の信頼できる指標である。最後に、器官を鉗子で持ち上げて盲腸が見えるまで慎重に引っ張って結腸を取り除く。炎症プロセスにより、結腸組織が薄くなり、短くなり、および腸外組織に付着するので、重度に炎症を起こしたＤＳＳ処置マウスからの結腸切開は特に困難である。
【０７８７】
結腸および盲腸は、回盲接合部での小腸、および直腸の遠位端部の肛門から分離される。この時点で、マウスの腸（盲腸から直腸まで）はグロス分析（ｇｒｏｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ、肉眼的分析とも言う）のために画像化され、および結腸の長さは結腸をまっすぐにして（しかし延伸しないで）測定することができる。次いで、結腸は、回盲接合部での盲腸から分離され、および５または１０ｍＬのシリンジ（給餌針付き）を用いて冷ＰＢＳで短時間フラッシュされる。フラッシングは、任意の糞便および／または血液を除去する。しかし、ムチン層の組織学的染色または細菌の接着／転位が最終的に予想される場合、ＰＢＳで結腸を洗い流すことは避けるべきである。代わりに、結腸は、粘膜構造を維持するためにカルノア液（Ｃａｒｎｏｙ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（６０％エタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、２００８）に浸漬する。ＤＳＳ誘発炎症は一般にこの領域では観察されないので、盲腸は捨てることができる。
【０７８８】
フラッシュ後、結腸重量を測定する。炎症を起こした結腸は、組織の浪費により正常結腸と比較して重量減少を見せ、および結腸重量の減少は急性炎症の重症度と相関する。対照的に、大腸炎の慢性モデルでは、炎症は結腸重量の増加と関連することが多い。重量の増加は、マクロファージ、上皮細胞、および多核巨細胞の病巣集合（ｆｏｃａｌ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）、および／または他の細胞、たとえば、リンパ球、線維芽細胞、形質細胞などのようなものの蓄積に起因する可能性がある（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、１９８３）。
【０７８９】
後のアッセイ用に結腸サンプルを得るため、結腸を適切な数の小片に切断する。アッセイを行うとき、マウスの異なるグループの結腸の同じ領域を比較することが重要である。たとえば、近位結腸を−８０℃で凍結し、およびＭＰＯ分析のために保存し、中結腸（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｏｌｏｎ）をＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（ＲＮＡラター）において保存し、およびＲＮＡ分離のために保存し、直腸領域を組織学のために１０％ホルマリンで固定する。あるいはまた、洗浄した結腸をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で培養してもよい。これらのアッセイの各々についての模範的なプロトコルを以下に記載する。
例４２．ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイ
【０７９０】
げっ歯類の腸における顆粒球浸潤は、炎症と相関し、およびミエロペルオキシダーゼ、好中球顆粒球に豊富に発現されるものの活性レベルによって測定される。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、ｏ−ジアニシジン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ（シグマ社）、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ（セントルイス）、ＭＯ（ミズーリ州）；カタログ番号Ｄ３２５２）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｔ２８８５）のいずれかを基板として用いて定量することができる。
【０７９１】
簡潔には、結腸組織のきれいに洗い流されたサンプル（５０−１００ｍｇ）を−８０℃で貯蔵物から取り出し、および直ちに氷上に置く。次いで、サンプルを５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中の０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｈ６２６９）中でホモジナイズする。次いで、ホモジネートを超音波処理により３０秒間破壊し、ドライアイスで急速冷凍し、および合計３回の凍結融解サイクルの間解凍した後、最終超音波処理を３０秒間行う。
【０７９２】
ｏ−ジアニシジン二塩酸塩でのアッセイのために、サンプルを４℃にて高速（１３，４００ｇ）で６分間遠心分離する。次いで、上清中のＭＰＯを、１ｍｇ／ｍＬのｏ−ジアニシジン二塩酸塩および０．５ｘ１０−４％のＨ２Ｏ２を添加し、光学密度を４５０ｎｍで測定することにより、９６ウェルプレートにおいてアッセイする。褐色がかった黄色は１０−２０分かけてゆっくりと発色するが；しかし、発色があまりにも速すぎる場合、サンプルをさらに希釈した後、アッセイを繰り返す。ヒト好中球ＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｍ６９０８）を標準として、０．５−０．０１５単位／ｍＬの範囲で使用する。１酵素単位は、２５℃で１分間に１．０μｍｏｌの過酸化物を分解するために必要な酵素量として定義される。このアッセイは、げっ歯類結腸サンプル、特にＤＳＳ誘導組織におけるＭＰＯ活性を分析するために使用される。
【０７９３】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いたアッセイのために、サンプルを６０℃で２時間インキュベートし、および次いで、４，０００ｇにて１２分間スピンダウンする。上清中の酵素活性を、６３０ｎｍで測光的に定量する。アッセイ混合物は、ジメチルスルホキシドに溶解した２０ｍＬの上清、１０ｍＬのＴＭＢ（最終濃度、１．６ｍＭ）、および８０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．４において希釈した７０ｍＬのＨ２Ｏ２（最終濃度、３．０ｍＭ）からなる。１酵素単位は、１分当たり１吸光度単位の増加をもたらす酵素の量として定義される。このアッセイは、げっ歯類結腸サンプル、特に、ここに記載のトリニトロベンゼン（ＴＮＢＳ）によって誘導された組織におけるＭＰＯ活性を分析するために使用される。
例４３．ＲＮＡ分離および遺伝子発現分析
【０７９４】
遺伝学的に操作された細菌がインビボで腸炎症をどのように減少させるかについてのさらなる機構的な洞察を得るために、半定量的および／またはリアルタイム逆転写ＰＣＲによって遺伝子発現を評価する。
【０７９５】
半定量的分析のために、ＲＮｅａｓｙ分離キット（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ（ジャーマンタウン）、ＭＤ（メリーランド州）；カタログ番号７４１０６）を用いて腸粘膜サンプルから合計ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ濃度および純度は、２６０および２８０ｎｍでの吸光度測定値に基づいて決定する。１μｇの合計ＲＮＡを逆転写し、および以下の遺伝子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、または、炎症に関連する任意の他の遺伝子についてｃＤＮＡを増幅する。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として使用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応を、９５℃で２分間の融解ステップ、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、および７５℃で１分の２５サイクルを行い、次いで６５℃で５分間の最終的伸長ステップを続ける。逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上でサイズ別に分離し、および臭化エチジウムで染色する。相対的なバンド強度は、標準的な画像分析ソフトウェアを用いて分析する。
【０７９６】
リアルタイムで、定量的な分析のために、ＲＮＡ抽出まで腸サンプル（５０ｍｇ）をＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｒ０９０１）に貯蔵する。サンプルは−２０℃で凍結維持し、長期貯蔵する。ＲＮＡ抽出の日に、サンプルを解凍し、またはＲＮＡｌａｔｅｒから取り出し、Ｔｒｉｚｏｌ（トリゾール）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フィッシャー・サイエンティフィク）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；カタログ番号１５５９６０２６）を用いて合計ＲＮＡを抽出する。任意の適切なＲＮＡ抽出方法を使用することができる。ＤＳＳ誘発サンプルで作業するとき、塩化リチウム法（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら、２０１２）を使用してすべての多糖類（ＤＳＳを含む）を除去する必要がある。結腸組織中の痕跡量のＤＳＳは、その後のステップでＰＣＲ増幅を妨げることが知られる。
【０７９７】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｒ）（プライマー・エクスプレス商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ（フォスターシティ）、ＣＡ）を用いて、免疫応答に関連する種々の遺伝子およびサイトカインのためにプライマーを設計する。合計ＲＮＡの分離後、ランダムプライマー、ｄＮＴＰｓおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）（スーパースクリプト商標）ＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１８０６４０１４）を用いて逆転写を行う。次いで、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター・ミックス）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；４３０９１５５）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００シーケンス・デテクション・システム）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲのために、ｃＤＮＡを使用するが、任意の適切な検出方法を使用できる。ＰＣＲ産物は融解分析によって検証される。
例４４．組織学
【０７９８】
標準的な組織学的染色を使用して、顕微鏡レベルにて腸炎症を評価する。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって、細胞の浸潤、上皮の変化、および粘膜の構造の質および次元の視覚化が可能にされる（Ｅｒｂｅｎら、２０１４）。Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（過ヨウ素酸シッフ）（ＰＡＳ）染色は、炭水化物（糖質とも言う）巨大分子（例は、グリコーゲン、糖タンパク質、ムチン）について染色するために使用される。杯細胞は、たとえば、ムチンの存在のためにＰＡＳ陽性である。
【０７９９】
大抵の組織学的染色にはスイスロールが推奨され、げっ歯類の腸の全長を検査することができる。これは、腸を部分に分け、縦に開き、および次に、粘膜で外側に圧延する単純な技術である（ＭｏｏｌｅｎｂｅｅｋおよびＲｕｉｔｅｎｂｅｒｇ、１９８１）。簡潔には、個々の結腸片を縦に切断し、ＰＢＳで湿らせた爪楊枝のまわりに包み、およびカセットに入れる。１０％ホルマリン中で２４時間固定した後、カセットを染色日まで７０％エタノール中に貯蔵する。ホルマリン固定結腸組織は、抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてＢｒｄＵに対して染色することができる。あるいはまた、Ｋｉ６７を用いて上皮細胞の増殖を視覚化することができる。より一層特異的な標的に対する抗体（例は、免疫組織化学、免疫蛍光）を用いる染色のために、凍結切片を凍結保護包埋媒体、たとえば、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｒ）（ティッシュ−テク商標）ＯＣＴ（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ（ラドナー）、ＰＡ；カタログ番号２５６０８−９３０）などのようなもののにおいて固定する。
【０８００】
Ｈ＆Ｅ染色のために、染色された結腸組織は、上皮損傷、ならびに粘膜、粘膜下組織、および筋肉／漿膜への炎症浸潤の程度に基づいて各セクションに０−３の４つのスコアを割り当てることによって分析する。これらのスコアのそれぞれは、次のように増加する：１、変化が限局性である場合；２、変化がパッチ状である場合；３、変化が拡散する場合である。その後、４つの個々のスコアが各結腸について合計され、その結果、１つの動物につき合計スコア０−３６が得られる。コントロール群および罹患群の平均スコアを集計する。代わりの採点システムはここに詳述される。
例４５．げっ歯類の結腸のエクスビボ培養
【０８０１】
エキソビボで結腸を培養することにより、腸炎症の重篤度に関する情報を提供することができる。縦方向に切断した結腸（約１．０ｃｍ）を、１．０％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー社）；カタログ番号ＢＰ２９５９５０）を伴うＨａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩類溶液）中で３回連続して洗浄する。次に、洗浄した結腸を、１．０％ペニシリン／ストレプトマイシンを伴う１．０ｍＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１１８７５０９３）を各々含む２４ウェルプレートのウェルに入れ、および３７℃にて５．０％ＣＯ２と共に２４時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を集め、および４℃にて１０分間遠心分離する。上清は、炎症促進性サイトカインの分析前に−８０℃にて貯蔵される。
例４６．ＴＮＢＳ誘発後の遺伝学的に操作された細菌のインビボ有効性
【０８０２】
ＤＳＳとは別に、１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの他の化学的に誘導された動物モデルにおいて試験することもできる。非制限的な例には、オキサゾロン（Ｂｏｉｒｉｖａｎｔら、１９９８）、酢酸（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎおよびＰｆｅｉｆｆｅｒ、１９７８）、インドメタシン（Ｓａｂｉｕら、２０１６）、スルフヒドリルインヒビター（Ｓａｔｏｈら、１９９７）、およびトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（Ｇｕｒｔｎｅｒら、２００３；Ｓｅｇｕｉら、２００４）によって誘導されるものが含まれる。大腸炎のＴＮＢＳ誘発マウスモデルにおける遺伝学的に操作された細菌の効力を決定するために、細菌を、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁する。ＩＢＤは、０．２５ｍＬの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール（Ｓｅｇｕｉら、２００４）中の３０ｍｇのＴＮＢＳの結腸内投与によってマウスにおいて誘導される。コントロールマウスに０．２５ｍＬの塩類溶液を施与する。誘発４時間後、１００μＬの細菌（またはビヒクル）を経口強制飼養によりマウスに対して管理する。細菌処理は１日１回、１週間繰り返す。動物の重量を毎日秤量する。
【０８０３】
７日間の細菌処理の後、マウスをチオブタバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によって屠殺する。結腸組織を鈍的切開（ｂｌｕｎｔ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）によって分離し、塩類溶液ですすぎ、および重量を測定する。血液サンプルは、１ｍＬ注射筒を使用して無菌条件下で開放心穿刺（ｏｐｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって収集し、エッペンドルフバイアルに入れ、および４℃にて１，５００ｇで１０分間回転させる。次いで、上清血清をオートクレーブしたエッペンドルフバイアルに分注し、および定量的比色分析市販キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＩＬ−６レベルの後の検定のために−８０℃で凍結する。
【０８０４】
肉眼的損傷は、盲検の観察者によって解剖顕微鏡下で検査される。腸癒着（スコア０−２）、狭窄（スコア０−３）、潰瘍（スコア０−３）、および肉厚（スコア０−２）の存在／重症度を説明するために確立されたスコアリングシステムを使用する（Ｍｏｕｒｅｌｌｅら、１９９６）。その後、２つの結腸サンプル（５０ｍｇ）を切除し、液体窒素中で急速凍結し、およびその後のミエロペルオキシダーゼ活性アッセイのために−８０℃で貯蔵する。必要に応じて、組織標定のために１０％ホルマリン中に追加のサンプルを保存する。次いで、ホルマリン固定した結腸サンプルを、パラフィンに包埋し、および５μｍ切片をＨ＆Ｅで染色する。結腸の顕微鏡的炎症は、以前に規定された基準（ＡｐｐｌｅｙおよびＷａｌｌａｃｅ、１９９５）に従って、０−１１のスケールで評価される。
例４７．ＩＢＤの細胞移入マウスモデルの作製
【０８０５】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの細胞移入動物モデルにおいて試験することができる。１つの典型的な細胞移入モデルは、大腸炎のＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞移入モデルである（Ｂｒａｍｈａｌｌら、２０１５；Ｏｓｔａｎｉｎら、２００９；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２００８）。このモデルは、ＣＤ４５＋  Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＢの発現のそれらのレベルに従って選別し、およびＣＤ４５ＲＢ発現が高いＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＢＨｉＴ細胞と称する）を正常ドナーマウスから免疫不全マウス（例は、ＳＣＩＤまたはＲＡＧ−／−マウス）に養子的に移入することによって生じさせる。具体的なプロトコルは以下の通りである。
ＣＤ４  Ｔ細胞についての豊富化
【０８０６】
いずれかの性のＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ジャクソン・ラボラトリーズ）、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ（バーハーバー）、ＭＥ（メイン州））を安楽死させた後、マウス脾臓を取り出し、１０−１５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝剤（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない４％ウシ胎児血清を補充した１Ｘ  ＰＢＳ）を含む氷上の１００ｍｍペトリ皿中に置く。脾臓は、組織の大きな部分が残らなくなるまで、ＦＡＣＳ緩衝剤でコーティングされた２枚のガラススライドを用いて裂かれる。次いで、細胞懸濁物は、１０ｍＬ注射筒（針なし）を使用して皿から取り出し、および氷上に置かれた５０ｍＬコニカルチューブに注射筒から（２６ゲージ針を使用して）排出する。ペトリ皿を、５０ｍＬコニカルチューブがいっぱいになるまで、同じ針技術を用いてさらに１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝剤いより洗浄する。細胞を４℃にて１０分間４００ｇで遠心分離することによりペレット化する。細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝剤の流れで穏やかに破壊した後、細胞を計数する。計数に使用した細胞を氷上に保持し、および次のセクションで説明する単色染色用に保存する。他のすべての細胞（すなわち、５０ｍＬコニカルチューブに残っているもの）を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移す。各チューブには最大２５×１０７細胞が含まれている必要がある。
【０８０７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞を濃縮するために、Ｄｙｎａｌ（Ｒ）（ダイナル商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（マウスＣＤ４ネガティブ・アイソレーション・キット）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１１４−１５Ｄ）を製造業者の指示に従って使用する。同等の任意のＣＤ４＋  Ｔ細胞濃縮法を用いることができる。陰性選択の後、ＣＤ４＋細胞は上清中に残る。上清を氷上で新しい５０ｍＬコニカルチューブに注意深くピペットで入れ、および細胞を４℃にて１０分間４００ｇで遠心分離してペレットにする。次いで、すべての５０ｍＬチューブからの細胞ペレットを再懸濁し、単一の１５ｍＬチューブにプールし、および遠心分離によりもう一度ペレット化する。最後に、細胞を１ｍＬの新鮮なＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、および抗ＣＤ４−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ抗体で染色する。
ＣＤ４＋  Ｔ細胞の蛍光標識
【０８０８】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞を標識するために、ＦＡＣＳ緩衝剤において予め滴定した抗ＣＤ４−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ抗体の適切な希釈物を含有する抗体カクテル（およそ１ｍＬのカクテル／５×１０７細胞）を、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、および容量をＦＡＣＳ緩衝剤で１ｍＬに調整する。次いで、抗体カクテルを１５ｍＬチューブにおいて細胞と合わせる。チューブに蓋をし、適切に混合されるのを確実にするように穏やかに逆さにし、およびロッキングプラットフォーム上で４℃にて１５分間インキュベートする。
【０８０９】
インキュベーション期間中に、９６ウェル丸底染色プレートは、計数した細胞（前のセクションから保存したもの）の等しいアリコートを、単色コントロール染色に対応するプレートの各ウェル中に移すことによって用意する。次いで、これらのウェルをＦＡＣｓ緩衝液で２００μＬまで満たし、および予め冷却したプレート遠心分離機を用いて細胞を４℃にて３分間３００ｇでペレット化する。遠心分離後、上清を、真空ラインに取り付けた２１ゲージの針を用いて捨て、および非特異的結合を防ぐために各ウェルに１００μＬの抗ＣＤ１６／３２抗体（Ｆｃ受容体ブロッキング）溶液を加える。プレートをロッキングプラットフォーム上で４℃にて１５分間インキュベートする。次いで、細胞を２００μＬＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、および遠心分離によってペレット化する。上清を吸引し、廃棄し、および１００μＬの適切な抗体（すなわち、予め滴定した抗ＣＤ４−ＡＰＣまたは抗ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ）を各単色コントロールに対応するウェルに加える。染色されないコントロールウェル中の細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。プレートをロッキングプラットフォーム上で４℃にて１５分間インキュベートする。２回洗浄した後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１５０−２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を含む１２本の７５ｍｍフローチューブに移し、およびチューブを氷上に置く。
【０８１０】
インキュベーション後、抗体カクテルを含む１５ｍＬチューブ中の細胞を、４℃にて１０分間４００ｇで遠心分離することによってペレット化し、およびＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して２５−５０×１０６細胞／ｍＬの濃度を得る。
ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞の精製
【０８１１】
ＣＤ４５ＲＢＨｉ集団およびＣＤ４５ＲＢＬｏｗ集団の細胞選別は、フローサイトメトリーを用いて行う。簡潔には、非染色細胞のサンプルを用いてベースライン自己蛍光を確立し、リンパ球の前方散乱対側方散乱ゲーティングを行う。単色コントロールは、各蛍光色素に適用する適切なレベルの補正を設定するために使用する。しかし、ＦＩＴＣおよびＡＰＣ蛍光色素では、概して補償は必要とされない。次いで、単一パラメータのヒストグラム（一重項リンパ細胞上にゲートされたもの）を用いてＣＤ４＋（ＡＰＣ＋）一重項細胞をゲートし、および第二の一重項パラメータ（ＣＤ４＋一重項細胞にゲートされたもの）を収集して、ソートゲートを確立する。ＣＤ４５ＲＢＨｉ集団は、最も明るいＣＤ４５ＲＢ染色を示す細胞の４０％として規定され、その一方で、ＣＤ４５ＲＢＬｏｗ集団は、最も暗いＣＤ４５ＲＢ発現を有する細胞の１５％として規定される。これらの集団のそれぞれを個別にソートし、およびＣＤ４５ＲＢＨｉ細胞を養子移入に用いる。
養子移入
【０８１２】
ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢＨｉ細胞の精製集団を、６ないし８週齢のＲＡＧ−／−雄性マウスに養子移入する。選別された細胞を含む収集チューブにＦＡＣＳ緩衝液を満たし、および細胞を遠心分離によってペレット化する。次いで上清を捨て、および細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁する。再懸濁した細胞を、１本のチューブにつき最大５×１０６細胞を用い、注入チューブに移し、および冷ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度にまで希釈する。注射チューブは氷上に保持する。
【０８１３】
注入の前に、レシピエントマウスを秤量し、および注射チューブを穏やかに数回反転させて細胞を混合する。混合細胞（０．５ｍＬ、約０．５×１０６細胞）を、２６Ｇ３／８針を取り付けた１ｍＬシリンジに注意深く引き込む。次いで、細胞をレシピエントマウスに腹腔内注入する。
例４８．ＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞トランスファーモデルにおける遺伝学的に操作された細菌の有効性
【０８１４】
本開示の遺伝学的に操作された細菌がＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞移入マウスにおいて有効であるかどうかを決定するために、養子移入後の疾患の進行について、各マウスを毎週秤量することによってモニターする。典型的には、移送後最初の３週間に控えめな体重増加が観察され、次に４−５週間では遅いが進行性の体重減少が観察される。体重減少は概して、緩い糞便および下痢の出現を伴う。
【０８１５】
レシピエントマウスが疾患の徴候を発症し始めるので、移入後４または５週で、例１に記載された遺伝学的に操作された細菌を、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁し、および１００μＬの細菌（またはビヒクル）をＣＤ４５ＲＢＨｉ  Ｔ細胞トランスファーマウスに経口強制飼養によって投与する。細菌処置は、マウスを安楽死させる前に１日１回１−２週間反復する。ネズミの結腸組織を分離し、および上記の手順を用いて分析する。
例４９．遺伝学的マウスモデルのＩＢＤにおける遺伝学的に操作された細菌の有効性
【０８１６】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの遺伝学的な（コンジェニックおよび遺伝子改変された）動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインであり、ＩＬ−１０をコードする遺伝子はクローン病および潰瘍性大腸炎の両方の感受性遺伝子である（Ｋｈｏｒら、２０１１）。炎症の研究のためのいくつかのマウスモデルを作り出すために、ＩＬ−１０またはその受容体の機能障害が用いられる（Ｂｒａｍｈａｌｌら、２０１５）。正常条件下で飼育されたＩＬ−１０ノックアウト（ＩＬ−１０−／−）マウスは腸内で慢性炎症を発症する（ＩｙｅｒおよびＣｈｅｎｇ、２０１２）。
【０８１７】
本開示の遺伝学的に操作された細菌がＩＬ−１０−／−マウスにおいて有効であるかどうかを定めるために、適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩細菌を増殖させる。次に、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁し、および１００μＬの細菌（またはビヒクル）をＩＬ−１０−／−マウスに経口胃管栄養法によって投与する。細菌処置は、マウスを安楽死させる前に１日１回１−２週間反復する。ネズミの結腸組織を分離し、および上記の手順を用いて分析する。
【０８１８】
遺伝学的に操作された細菌を試験するためのプロトコルは、ＩＢＤの他の遺伝学的動物モデルと同様である。そのようなモデルには、制限されないが、ＳＡＭＰ１／ＹｉｔＦｃ（Ｐｉｚａｒｒｏら、２０１１）、ドミナントネガティブＮ−カドヘリン変異体（ＮＣＡＤデルタ；ＨｅｒｍｉｓｔｏｎおよびＧｏｒｄｏｎ、１９９５）、ＴＮＦΔＡＲＥ（Ｗａｇｎｅｒら、２０１３）、ＩＬ−７（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９８）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＢｉｒ（Ｅｌｓｏｎら、２０００）、およびドミナントネガティブＴＧＦ−βレセプターＩＩ変異体（Ｚｈａｎｇら、２０１０）；およびノックアウトマウスモデル、例は、ＴＣＲα−／−（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９３；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２００８）、ＷＡＳＰ−／−（Ｎｇｕｙｅｎら、２００７）、Ｍｄｒ１ａ−／−（Ｗｉｌｋら、２００５）、ＩＬ−２Ｒα−／−（Ｈｓｕら、２００９）、Ｇαｉ２−／−（Ｏｈｍａｎら、２００２）、およびＴＲＵＣ（Ｔｂｅｔ−／−Ｒａｇ２−／−；Ｇａｒｒｅｔｔら、２００７）が含まれる。
例５０．ＩＢＤのトランスジェニックラットモデルにおける遺伝学的操作細菌の有効性
【０８１９】
例１に記載の遺伝学的に操作された細菌は、ＩＢＤの非ネズミ動物モデルにおいて試験することができる。Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆ３４４）ラットへのヒト白血球抗原Ｂ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）およびヒトβ２−ミクログロブリン遺伝子の導入は、ＧＩ管における自発的な、慢性炎症を誘発する（Ａｌａｖｉら、２０００；Ｈａｍｍｅｒら、１９９０）。本発明の遺伝学的操作細菌がこのモデルにおける消化管炎症を改善することができるかどうかを調べるために、細菌を適切な抗生物質を補充したＬＢ中で一晩増殖させる。次いで、選択性抗生物質を含有する新鮮なＬＢ中で細菌を１：１００に希釈し、０．４−０．５の光学密度まで増殖させ、および遠心分離によってペレット化する。細菌をＰＢＳに再懸濁し、およびトランスジェニックＦ３４４−ＨＬＡ−Ｂ２７ラットに経口胃管栄養法により１００μＬの細菌（またはビヒクル）を投与する。細菌処理を１日１回、２週間繰り返す。
【０８２０】
細菌処理が、２５週齢にてＦ３４４−ＨＬＡ−Ｂ２７ラットに通常存在する肉眼的および組織学的腸病変を軽減するかどうかを定めるために、初期の処置後１４日目にすべての動物を屠殺する。ＧＩ（胃腸）管を次に、腸間膜境界に沿って開き、トライツ（Ｔｒｅｉｔｚ）の靱帯から直腸まで切除し、およびフラットベッドスキャナを用いて画像化する。合計の粘膜損傷は、損傷した合計表面積のパーセントとして報告され、標準画像分析ソフトウェアを用いて定量化する。
【０８２１】
顕微鏡分析のために、サンプル（０．５−１．０ｃｍ）を小腸および大腸の正常領域および疾患領域の両方から切除する。Ｈ＆Ｅ染色のために切片（５μｍ）を処理する前に、サンプルをホルマリンで固定し、およびパラフィンに包埋する。染色された切片を分析し、および以下のように採点する：０、炎症なし；１、軽度の炎症が粘膜下層に広がる；２、中程度の炎症が筋固有層中に広がる；３、重度の炎症。スコアをまとめ、および平均±標準誤差として報告する。
例５１．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの操作株におけるトリプトファン産生
【０８２２】
宿主由来の（トリプタミンまたはキヌレリン（ｋｙｎｕｒｅｒｉｎｅ） のような）または腸内細菌由来の（インドールアセテートまたはインドールのような）多くのトリプトファン代謝産物は、ＩＢＤとの関連で炎症をダウンレギュレートすることが示されている  ＡｈＲ受容体。細菌由来のインドールプロピオナートなどの他のトリプトファン代謝産物は、大腸炎の実験モデルにおいて、腸の障壁の完全性を回復させるのに役立つことが示されている。この実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｎｉｓｓｌｅを操作して、全ての有益な代謝産物の前駆体であるトリプトファンを生成した。
【０８２３】
第１に、転写因子ＴｒｐＲによって媒介されるトリプトファン生合成遺伝子の負の調節を除去するために、大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムからｔｒｐＲ遺伝子を欠失させた。トリプトファンオペロンｔｒｐＥＤＣＢＡをＰＣＲにより大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡから増幅し、ｔｅｔプロモーター遺伝子の下流のｔｅｔプロモーターの制御下で低コピープラスミドｐＳＣ１０１にクローニングした。次いで、このｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡプラスミドをΔｔｒｐＲ突然変異体に形質転換して、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ株を得た。続いて、芳香族アミノ酸生産のための最初のコミットステップを触媒する酵素をコードする大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来のａｒｏＧ遺伝子（ａｒｏＧｆｂｒ）のフィードバック耐性バージョンを合成し、ｔｅｔプロモーターの制御下でｔｅｔＲリプレッサーの下流で、ミディアムコピープラスミドｐ１５Ａにクローニングした。このプラスミドをΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ株に形質転換し、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。最後に、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＢＣＤＡ構築物のフィードバック抵抗性バージョン（ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＢＣＤＡ）をｔｅｔ−ｔｒｐＥＢＣＤＡから生成した。ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒおよびｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＢＣＤＡ構築物の両方をΔｔｒｐＲ突然変異体に形質転換して、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｔｒａｉｎを得た。
【０８２４】
生成した全ての菌株を適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩増殖させ、培養チューブ中の抗生物質を含む３ｍＬのＬＢ中で１／１００継代培養した。２５０ｒｐｍで３７℃で２時間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に添加して構築物の発現を誘導した。誘導の２時間後、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化し、３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁した。細胞を再び４，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、０．５％グルコースを含む３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁し、２５０ｒｐｍで３７℃に置いた。２００μＬを２時間、４時間および１６時間で収集し、トリプトファンを細菌上清中のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。図４４Ａは、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株によってトリプトファンが産生され、分泌されることを示す。トリプトファンの産生は、ｔｒｐＥのフィードバック耐性バージョンを発現することによって有意に増強される。
【０８２５】
例５２．非ＰＴＳ炭素源を使用し、およびトリプトファンをインドールに変換するトリプトファナーゼ酵素をコードするｔｎａＡ遺伝子を欠失させることにより改良されたトリプトファン
【０８２６】
大腸菌中のトリプトファンの前駆体分子の１つは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）である。芳香族酸（トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む）の製造には、通常、利用可能なＰＥＰのわずか３％しか使用されていない。唯一の炭素源としてグルコースを用いて大腸菌を増殖させる場合、ＰＥＰの５０％を用いて、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を用いてグルコースを細胞に導入する。トリプトファン産生を増加させるために、非ＰＴＳ酸化糖であるグルクロン酸を、操作された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒによるトリプトファン分泌の試験に用いた。さらに、トリプトファナーゼ酵素をコードするｔｎａＡ遺伝子は、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株において欠失し、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得るためにトリプトファンのインドールへの変換をブロックした。
【０８２７】
ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒおよびΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を抗生物質を含むＬＢで一晩増殖させ、培養チューブ中の抗生物質を含む３ｍｌのＬＢに１／１００継代した。２５０ｒｐｍ、３７℃で２時間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に添加して構築物の発現を誘導した。誘導の２時間後、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化し、３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁した。細胞を４，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、１％グルコースまたは１％グルクロン酸を含む３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁し、３７℃で２５０ｒｐｍまたは３７℃で嫌気性チャンバーに置いた。３時間および１６時間の時点で２００ｕＬを収集し、細菌上清中のトリプトファンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。図４４Ｂは、非ＰＴＳ酸化糖グルクロン酸塩を使用した場合、好気的条件下でトリプトファン産生が倍増することを示す。さらに、ｔｎａＡの欠失は、好気性および嫌気性条件および１６時間時点の３時間時点でのトリプトファン産生に肯定的な効果を示したが、嫌気性条件でのみ認められた。
例５２．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるセリン生合成速度の増加によるトリプトファン生産の改善
【０８２８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるトリプトファン生合成における最後の工程は、１分子のセリンを消費する。本実施例では、セリンの利用可能性がトリプトファン生産の制限因子であり、トリプトファン生産大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｅｒＡおよびΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｅｒＡｆｂｒ株の構築について記載する。
【０８２９】
ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩増殖させ、培養チューブ中の抗生物質を含む３ｍＬのＬＢ中に１／１００継代した。２５０ｒｐｍ、３７℃で２時間増殖させた後、１００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に添加して構築物の発現を誘導した。誘導の２時間後、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化し、３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁した。細胞を４，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、１％グルクロン酸または１％グルクロン酸および１０ｍＭセリンを含む３ｍＬのＭ９最小培地に再懸濁し、３７℃で嫌気性チャンバーに置いた。３時間および１６時間の時点で２００ｕＬを収集し、細菌上清中のトリプトファンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量した。図４４Ｃは、トリプトファン産生がセリン添加によって３倍に改善されることを示す。
【０８３０】
ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株におけるセリン生合成速度を増加させるために、セリン生合成経路の第１段階を触媒する酵素をコードする大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来のｓｅｒＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）によって、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒプラスミドにクローニングした。次いで、新たに生成したｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ構築物をΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ株に形質転換して、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ株を作製した。ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ構築物をさらに改変して、ｓｅｒＡ（ｓｅｒＡｆｂｒ）のフィードバック耐性バージョンをコードするようにした。新たに生成したｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡｆｂｒ構築物を用いて、セリン生合成速度を改善し、トリプトファン生産を最大化するように最適化されたΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡｆｂｒ株を作製した。
例５３．トリプトファン生合成およびインドール代謝産物合成のための構築物の合成
【０８３１】
種々の構築物を合成し、大腸菌の形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングする。いくつかの実施態様において、エフェクター分子をコードする構築物はゲノムに組み込まれる。
【０８３２】
[表８０−１]
[表８０−２]
[表８０−３]
[表８０−４]
[表８０−５]
[表８０−６]
[表８０−７]
[表８０−８]
[表８０−９]
[表８０−１０]
[表８０−１１]
[表８０−１２]
[表８０−１３]
[表８０−１４]
[表８０−１５]
[表８０−１６]
[表８０−１７]
[表８０−１８]
[表８０−１９]
[表８０−２０]
[表８０−２１]
[表８０−２２]
[表８０−２３]
[表８０−２４]
[表８０−２５]
[表８０−２６]
[表８０−２７]
[表８０−２８]
[表８０−２９]
【図１−１】
2018532412.tif 000002
【図１−２】
2018532412.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
2018532412.tif 000005
【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４１Ｆ】
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【図４１Ｇ】
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【図４１Ｈ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４５Ｅ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６３Ｃ】
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【図６３Ｄ】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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