(57)【要約】本発明者らは、サイトカイン受容体エンドドメインと細胞内Ｔ細胞シグナル伝達構成要素の両方を含む組み合わせエンドドメインに、例えば抗体の、結合特異性を移植した、新しいタイプのキメラ受容体（ＣＲ）を開発した。受容体のライゲーションは、サイトカイン型とＴ細胞受容体型の両方の活性化シグナルおよび増殖シグナルを細胞に提供して、従来のＣＡＲよりも大きな活性化および増殖を引き起こす。本発明は、リガンド結合エキソドメイン；ならびに（ｉ）サイトカイン受容体エンドドメイン；および（ｉｉ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ受容体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド結合エキソドメイン；ならびに
（ｉ）サイトカイン受容体エンドドメイン；および
（ｉｉ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含むエンドドメイン
を含む、キメラ受容体。
【請求項２】
前記リガンド結合エキソドメインが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および／または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項３】
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖を含むか、またはＩ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖からなる、前述のいずれかの請求項に記載のキメラ受容体。
【請求項４】
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、
（ｉ）ＩＬ−２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体α鎖エンドドメイン；もしくは
（ｉｉｉ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含むか、または
（ｉ）ＩＬ−２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体α鎖エンドドメイン；もしくは
（ｉｉｉ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
からなる、請求項３に記載のキメラ受容体。
【請求項５】
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、以下：ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ４０エンドドメインのうちの１つまたはそれより多くを含む、前述のいずれかの請求項に記載のキメラ受容体。
【請求項６】
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（複数可）および前記サイトカイン受容体エンドドメインの配置は、前記受容体が、細胞の表面に発現されるとき、前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（複数可）が、膜の遠位に位置し、前記サイトカイン受容体エンドドメインが、細胞内の細胞表面上の膜の近位に位置するような配置である、前述のいずれかの請求項に記載のキメラ受容体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の第１および第２のキメラ受容体を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記第１のキメラ受容体は、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記第２のキメラ受容体は、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
前記第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第２のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
【請求項８】
前記第１のキメラ受容体および前記第２のキメラ受容体が、同じ抗原の異なるエピトープに結合する、請求項７に記載のキメラ受容体システム。
【請求項９】
前記第１のキメラ受容体および前記第２のキメラ受容体が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、請求項７に記載のキメラ受容体システム。
【請求項１０】
前記第１のキメラ受容体のリガンド結合ドメインおよび前記第２のキメラ受容体のリガンド結合ドメインが、一体となってリガンド結合ができるように、それらが、相補的なリガンド結合ドメインを有する、請求項７に記載のキメラ受容体システム。
【請求項１１】
前記第１および第２のサイトカインエンドドメインが会合して、細胞シグナル伝達をもたらす、請求項７〜１０のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
【請求項１２】
前記第１のキメラ受容体および前記第２のキメラ受容体が、前記抗原に結合したとき、１型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖／β鎖およびγ鎖を介したサイトカインシグナル伝達が生じるように、前記第１のサイトカイン受容体エンドドメインが、１型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖であり、前記第２のサイトカイン受容体エンドドメインが、１型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖である、請求項１１に記載のキメラ受容体システム。
【請求項１３】
前記第１のキメラ受容体が、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み、前記第２のキメラ受容体が、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインおよび４−１ＢＢエンドドメインから選択される１つまたはそれより多い共刺激ドメインを含む、請求項７〜１２のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
【請求項１４】
前記第１のキメラ受容体と前記第２のキメラ受容体の両方が、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含む、請求項７〜１２のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれかに記載のキメラ受容体および細胞内融合タンパク質を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記キメラ受容体は、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記細胞内融合タンパク質は、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
前記第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第２のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
【請求項１６】
前記キメラ受容体が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み、前記細胞内融合タンパク質が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含む、請求項１５に記載のキメラ受容体システム。
【請求項１７】
前記キメラ受容体が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み、前記細胞内融合タンパク質が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含む、請求項１５に記載のキメラ受容体システム。
【請求項１８】
前記キメラ受容体が、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み、前記細胞内融合タンパク質が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く、請求項１５または１６に記載のキメラ受容体システム。
【請求項１９】
前記細胞内融合タンパク質が、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含む、請求項１５〜１８のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれかに記載のキメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記キメラ受容体は、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記膜貫通タンパク質は、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
ここで、前記第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第２のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
【請求項２１】
前記キメラ受容体が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み、前記膜貫通タンパク質が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含む、請求項２０に記載のキメラ受容体システム。
【請求項２２】
前記キメラ受容体が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み、前記膜貫通タンパク質が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含む、請求項２０に記載のキメラ受容体システム。
【請求項２３】
前記キメラ受容体が、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み、前記膜貫通タンパク質が、細胞内シグナル伝達ドメインおよびリガンド結合エキソドメインを欠く、請求項２０または２１に記載のキメラ受容体システム。
【請求項２４】
請求項１〜６のいずれかに記載のキメラ受容体または請求項７〜２３のいずれかに記載のキメラ受容体システムを含む、細胞。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれかに記載のキメラ受容体をコードする、核酸配列。
【請求項２６】
請求項７〜２３のいずれかに記載のキメラ受容体システムをコードする、核酸構築物。
【請求項２７】
第１のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列および第２のキメラ受容体をコードする第２の核酸配列を含む、請求項２６に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、前記第１のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、前記第２のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、前記第２のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、核酸構築物。
【請求項２８】
エンド１が、サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖をコードする核酸配列および第１の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み；エンド２が、サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖をコードする核酸配列および第２の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、請求項２７に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、請求項２７または２８に記載の核酸構築物。
【請求項３０】
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域において使用される、請求項２７〜２９のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項３１】
キメラ受容体をコードする第１の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む、請求項２６に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ドメイン２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、前記キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、前記キメラ受容体と前記細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり；
ドメイン２は、前記細胞内融合タンパク質に対する第２のドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、前記細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、核酸構築物。
【請求項３２】
ドメイン２が、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインをコードする核酸配列である、請求項３１に記載の核酸構築物。
【請求項３３】
キメラ受容体をコードする第１の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む、請求項２６に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、前記キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、前記キメラ受容体と前記膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＴＭ２は、前記膜貫通ドメインの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンド２は、前記膜貫通タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、核酸構築物。
【請求項３４】
請求項２５に記載の核酸配列または請求項２６〜３３のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【請求項３６】
ｉ）請求項１〜６のいずれかにおいて定義されたような第１のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）請求項１〜６のいずれかにおいて定義されたような第２のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【請求項３７】
ｉ）請求項１〜６のいずれかにおいて定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）請求項１５〜１９のいずれかにおいて定義されたような細胞内融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【請求項３８】
ｉ）請求項１〜６のいずれかにおいて定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）請求項２０〜２３のいずれかにおいて定義されたような膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【請求項３９】
請求項２４に記載の細胞を作製するための方法であって、前記方法は、請求項２５に記載の核酸配列；請求項２６〜３３のいずれかに記載の核酸構築物；請求項３４もしくは３５に記載のベクター；または請求項３６〜３８のいずれかに記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記細胞が、被験体から単離された試料由来である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２４に記載の複数の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
【請求項４３】
以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）請求項２５に記載の核酸配列；請求項２６〜３３のいずれかに記載の核酸構築物；請求項３４もしくは３５に記載のベクター；または請求項３６〜３８のいずれかに記載のベクターのキットでの前記細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）前記被験体に（ｉｉ）からの前記細胞を投与すること
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が、Ｔ細胞含有試料である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が、がんである、請求項４２〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
疾患の処置および／または予防において使用するための、請求項４１に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における請求項２４に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラ受容体（ＣＲ）およびかかるキメラ受容体を発現する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、がん処置での使用について記載されている。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。上記分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。
【０００５】
白血病およびリンパ腫などの液性腫瘍の処置においてＣＡＲ  Ｔ細胞を適用することについて、現在までにいくらか成功している。しかしながら、Ｔ細胞に適さない免疫抑制性の微小環境が原因で、固形腫瘍を処置するためにＣＡＲ  Ｔ細胞を使用することは、よりいっそう難易度が高い。
【０００６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続および活性は、サイトカインの投与によって、またはサイトカインを恒常的に産生するＣＡＲ  Ｔ細胞によって、高めることができる。しかしながら、これらのアプローチにも限界がある：サイトカインの全身投与は、毒性であり得る；サイトカインの恒常的な産生は、制御されない増殖および癌化に至るおそれがある（Ｎａｇａｒｋａｔｔｉら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：７６３８−７６４２；Ｈａｓｓｕｎｅｈら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：６１０−６２０）。
ゆえに、上で述べた欠点を伴わない、Ｔ細胞の生着および拡大を促進する代替的なＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｇａｒｋａｔｔｉら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：７６３８−７６４２
【非特許文献２】Ｈａｓｓｕｎｅｈら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：６１０−６２０
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】様々なサイトカイン受容体の構造、それらのサイトカインを産生する細胞型、およびそれらのサイトカイン受容体を発現する細胞型を要約している模式図。
【０００９】
【図２】本発明の二重キメラ受容体システムの模式図。第１のＣＲは、サイトカイン受容体エンドドメイン（共通ガンマ鎖）および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ゼータ）を含むエンドドメインを有する。第２のＣＲは、サイトカイン受容体エンドドメイン（ＩＬ２受容体ベータ鎖）および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８共刺激ドメインとＯＸ４０共刺激ドメインの両方を含む）を含むエンドドメインを有する。それらの２つのキメラ受容体の抗原結合エキソドメイン（ｅｘｏｄｏｍａｉｎｓ）は、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する。これらのＣＲが、リガンドに結合すると、各分子上のサイトカインエンドドメインは、接近して、それらは会合し得、サイトカイン様の細胞活性化をもたらし得る。細胞活性化は、シグナル１およびシグナル２を細胞に提供するＴ細胞活性化エンドドメインを介しても生じる。注意：１本の鎖だけが示されているが、このシステムにおけるＣＲは、ホモ二量体である。
【００１０】
【図３】本発明の代替的二重ＣＲシステムの模式図。このシステムでは、第１および第２のＣＲは、エンドドメインなどに関して図２に示されているものと類似の構造を有する。相違点は、２つのキメラ受容体の抗原結合エキソドメインが、リガンド上の同じエピトープに結合する点である。それらは、同一の抗原結合部分を含み得る。密接なシナプスが存在する場合、２つのキメラ受容体による独立した抗原結合は、エンドドメインを、サイトカインエンドドメインが会合するのに十分近くにして、活性化をもたらし得る。注意：１本の鎖だけが示されているが、このシステムにおけるＣＲは、ホモ二量体である。
【００１１】
【図４】本発明のＣＲ：ＺＡＰ７０システムの模式図。このシステムでは、単一のＣＲが、同族抗原を認識し、そのエンドドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメイン（少なくともＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る）だけでなく、サイトカイン受容体エンドドメイン（例えば、共通ガンマ鎖またはＩＬ２受容体ベータ鎖のいずれかに由来）も含む。この受容体は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインと、相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）サイトカイン受容体エンドドメインとの融合物と共発現される（例えば、ＣＲが、共通ガンマ鎖を含む場合、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインは、ＩＬ２受容体ベータ鎖に融合され得る）。抗原の認識の際、ＣＲ  ＣＤ３−ゼータエンドドメインＩＴＡＭは、リン酸化され、ＺＡＰ７０融合タンパク質をリクルートする。ここで、そのサイトカイン受容体の２つのエンドドメインは、近くなり、サイトカインシグナルが伝達される。
【００１２】
【図５】個々の構成要素を示している図２に図示されているような二重ＣＲシステムに対するアミノ酸配列。この構築物では、両ＣＡＲが、ＣＤ２２を認識する。第１のＣＲは、ＬＴ２２に基づくバインダー、およびＩＬ２受容体ベータ鎖を含むエンドドメインを含み；第２のＣＲは、ＲＦＢ４に基づくバインダー、ならびにＩＬ２受容体ガンマ鎖およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含むエンドドメインを含む。
【００１３】
【図６】実施例３に記載されている増殖／生存アッセイにおいて試験されたキメラ受容体システムを図示している模式図。一方のキメラ受容体は、Ｒ１１  ｓｃＦｖを含むのに対して、他方は、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含む。Ｒ１１およびＲ１２は、同じ抗原：ＲＯＲ１上の別個のエピトープに結合する。
【００１４】
【図７】リガンドでコーティングされたビーズと共培養されたときの、形質導入された細胞の増加倍率を示しているグラフ。Ｒ１１−ｉｌ２ｂ−ｚ−２Ａ−Ｒ１２−ｉｌ２ｇ−ｚは、サイトカイン受容体エンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインの両方を含む、図６に図示されている第４世代ＣＡＲシステムをコードする構築物であり；Ｒ１１−ｚ−２Ａ−Ｒ１２−ｚは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムをコードする構築物である。
【００１５】
【図８】ＲＯＲ１でコーティングされたビーズと共培養した後の３および６日後の、形質導入された細胞の数を示しているグラフ。
【００１６】
【図９】実施例４に記載されている死滅アッセイにおいて試験されたキメラ受容体システムを図示している模式図。一方のキメラ受容体は、Ｒ１１  ｓｃＦｖを含むのに対して、他方は、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含む。Ｒ１１およびＲ１２は、同じ抗原：ＲＯＲ１上の別個のエピトープに結合する。
【００１７】
【図１０】１０：１のＥ：Ｔ比で４８時間インキュベーションした後の標的細胞の細胞死滅を示しているグラフ。Ｒ１１−ＩＬ２Ｂ−Ｚ−２Ａ−Ｒ１２−ＩＬ２Ｇ−ｚは、サイトカイン受容体エンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインの両方を含む、図９に図示されている第４世代ＣＡＲシステムをコードする構築物であり；Ｒ１１−ＩＬ２Ｂ−２Ａ−Ｒ１２−ＩＬ２Ｇは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムをコードする構築物である。
【００１８】
【図１１】１０：１のＥ：Ｔ比で４８時間インキュベーションした後の細胞のＩＦＮγ分泌を示しているグラフ。Ｒ１１−ＩＬ２ＲＢ−Ｚ＋Ｒ１２−ＩＬ２ＲＧ−ｚは、サイトカイン受容体エンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインの両方を含む、図９に図示されている第４世代ＣＡＲシステムを発現する細胞を表し；Ｒ１１−ＩＬ２ＲＢ＋Ｒ１２−ＩＬ２ＲＧは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現する細胞を表す。
【００１９】
【図１２】実施例６に記載されている増殖／生存アッセイにおいて試験されたキメラ受容体システムを図示している模式図。両方のキメラ受容体が、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含むので、それらは、同じ抗原：ＲＯＲ１上の同じエピトープに結合する。相同組換えを防ぐために、第１のＲ１２  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列をゆらぎにした（ｗｏｂｂｌｅｄ）。
【００２０】
【図１３】リガンドでコーティングされたビーズと共培養されたときの、形質導入された細胞の増加倍率を示しているグラフ。Ｒ１２ｗ−ｉｌ２ｂ−ｚ−２Ａ−Ｒ１２−ｉｌ２ｇ−ｚは、サイトカイン受容体エンドドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインの両方を含む、図１２に図示されている第４世代ＣＡＲシステムをコードする構築物であり；Ｒ１２ｗ−ｚ−２Ａ−Ｒ１２−ｚは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムをコードする構築物である。
【００２１】
【図１４】ＲＯＲ１でコーティングされたビーズと共培養された後の３および６日後の、形質導入された細胞の数を示しているグラフ。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の態様の要旨
本発明者らは、サイトカイン受容体エンドドメインと細胞内Ｔ細胞シグナル伝達構成要素の両方を含む組み合わせエンドドメインに、例えば抗体の、結合特異性を移植した、新しいタイプのキメラ受容体（ＣＲ）を開発した。受容体のライゲーションは、サイトカイン型とＴ細胞受容体型の両方の活性化シグナルおよび増殖シグナルを細胞に提供して、従来のＣＡＲよりも大きな活性化および増殖を引き起こす。
【００２３】
生着、増殖および生存の増強は、ＣＲ発現細胞が、不適な腫瘍微小環境に生着してそこで拡大することを可能にするので、それは、固形腫瘍の処置において特に有用である。
【００２４】
したがって、第１の態様において、本発明は、
リガンド結合エキソドメイン；ならびに
（ｉ）サイトカイン受容体エンドドメイン；および
（ｉｉ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含むエンドドメイン
を含むキメラ受容体を提供する。
【００２５】
リガンド結合エキソドメインは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および／または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み得る。
【００２６】
サイトカイン受容体エンドドメインは、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖を含み得るか、またはＩ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖からなり得る。例えば、サイトカイン受容体エンドドメインは、
（ｉ）ＩＬ−２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体α鎖エンドドメイン；もしくは
（ｉｉｉ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得るか、または
（ｉ）ＩＬ−２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体α鎖エンドドメイン；もしくは
（ｉｉｉ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
からなり得る。
【００２７】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、以下のうちの１つまたはそれより多くを含み得る：ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ４０エンドドメイン。
【００２８】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（複数可）およびサイトカイン受容体エンドドメインの配置（複数可）は、その受容体が、細胞の表面に発現されたとき、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（複数可）が、膜の遠位に位置し、サイトカイン受容体エンドドメイン（複数可）が、細胞内の細胞表面上の膜の近位に位置するような配置であり得る。
【００２９】
第２の態様において、本発明は、キメラ受容体システムを提供する。
【００３０】
本発明の第２の態様の第１の実施形態において、キメラ受容体システムは、本発明の第１の態様に記載の少なくとも２つのキメラ受容体を含む。
【００３１】
この第１の実施形態において、キメラ受容体システムは、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含む第１のキメラ受容体および第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含む第２のキメラ受容体を含む。第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、第２のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である。
【００３２】
第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体は、同じ抗原の異なるエピトープに結合し得る。
【００３３】
あるいは、第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体は、同じ抗原の同じエピトープに結合し得る。
【００３４】
あるいは、第１のキメラ受容体のリガンド結合ドメインおよび第２のキメラ受容体のリガンド結合ドメインが、一体となってリガンド結合ができるように、それらは、相補的なリガンド結合ドメインを有し得る。
【００３５】
用語「相補的」は、第１および第２のサイトカインエンドドメインが会合して、細胞シグナル伝達をもたらすことを示す。
【００３６】
第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体が、抗原に結合したとき、α／β鎖およびγ鎖を介してサイトカインシグナル伝達が生じるように、第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、１型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖もしくはβ鎖であり得るかまたは１型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖もしくはβ鎖を含み得、第２のサイトカイン受容体エンドドメインは、１型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖であり得るかまたはそれを含み得る。
【００３７】
第１のキメラ受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、第２のキメラ受容体は、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインおよび４−１ＢＢエンドドメインから選択される１つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得る。
【００３８】
あるいは、第１のキメラ受容体と第２のキメラ受容体の両方が、ＣＤ３ゼータエンドドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【００３９】
本発明の第２の態様の第２の実施形態において、キメラ受容体システムは、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体および細胞内融合タンパク質を含む。
【００４０】
この第２の実施形態において、キメラ受容体は、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、細胞内融合タンパク質は、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含む。
【００４１】
第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、第２のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である。
【００４２】
上記キメラ受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み得、細胞内融合タンパク質は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み得るか、またはその逆である。
【００４３】
上記キメラ受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、上記細胞内融合タンパク質は、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインおよび４−１ＢＢエンドドメインから選択される１つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得るか、またはその逆である。
【００４４】
上記キメラ受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、上記細胞内融合タンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き得る。
【００４５】
上記細胞内融合タンパク質は、リン酸化されたＣＤ３ゼータエンドドメインに結合するドメイン、例えば、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。キメラ受容体が標的抗原に結合すると、これにより、ＣＤ３ゼータエンドドメインがリン酸化する。そのリン酸化されたＣＤ３ゼータエンドドメインに細胞内融合タンパク質のＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインが結合して、第１および第２のサイトカイン受容体エンドドメインが一体となる。
【００４６】
本発明の第２の態様の第３の実施形態において、キメラ受容体システムは、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む。
【００４７】
上記キメラ受容体は、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、上記膜貫通タンパク質は、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含む。第１のサイトカイン受容体エンドドメインは、第２のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である。
【００４８】
上記膜貫通タンパク質は、リガンド結合エキソドメインを欠き得る。上記膜貫通タンパク質は、例えば、膜貫通ドメインまたはミリストイル化基を介して、細胞膜に繋がれ得る。
【００４９】
上記キメラ受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み得、上記膜貫通タンパク質は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み得るか、またはその逆である。
【００５０】
上記キメラ受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、上記膜貫通タンパク質は、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメインおよび４−１ＢＢエンドドメインから選択される１つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得る。
【００５１】
上記キメラ受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、上記膜貫通タンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを欠き得る。
【００５２】
上記膜貫通タンパク質は、リン酸化されたＣＤ３ゼータエンドドメインに結合するドメイン、例えば、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。上記キメラ受容体が、標的抗原に結合すると、これにより、ＣＤ３ゼータエンドドメインがリン酸化される。そのリン酸化されたＣＤ３ゼータエンドドメインに膜貫通タンパク質のＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインが結合して、第１および第２のサイトカイン受容体エンドドメインが一体となる。
【００５３】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体または本発明の第２の態様に記載のキメラ受容体システムを含む細胞を提供する。
【００５４】
本発明の第３の態様の第１の実施形態において、細胞は、第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含む細胞受容体システムを含む。
【００５５】
上記細胞は、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含み得る。
【００５６】
あるいは、上記細胞は、同じ抗原上の同じエピトープに結合する第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含み得る。
【００５７】
あるいは、第１のキメラ受容体のリガンド結合ドメインと第２のキメラ受容体のリガンド結合ドメインとが一体となって、リガンド結合ができるように、上記細胞は、相補的なリガンド結合ドメインを有する第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含む。
【００５８】
第１のキメラ受容体は、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得、第２のキメラ受容体は、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得、その第１および第２のサイトカイン受容体エンドドメインは、会合して、細胞シグナル伝達をもたらすことができる。
【００５９】
例えば、第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体が、抗原に結合したとき、α／β鎖およびγ鎖を介して、組み合わさったシグナル伝達が生じるように、第１のキメラ受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み得、第２のキメラ受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み得る。
【００６０】
第１のキメラ受容体は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得；第２のキメラ受容体は、例えば、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメインおよびＣＤ４０エンドドメインから選択される１つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得る。
【００６１】
本発明の第２の態様に記載の細胞は、
リガンド結合エキソドメイン；および
キメラ受容体のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的なサイトカイン受容体エンドドメインを含むエンドドメイン
を含む第２の受容体も含み得、その第２の受容体は、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを欠く。
【００６２】
本発明の第３の態様の第２の実施形態において、細胞は、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体および上で定義されたような細胞内融合タンパク質を含む。
【００６３】
上記細胞内融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。
【００６４】
本発明の第３の態様の第３の実施形態において、細胞は、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体および上で定義されたような膜貫通タンパク質を含む。
【００６５】
第４の態様において、本願は、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体をコードすることができる核酸配列を提供する。
【００６６】
第５の態様において、本発明の第２の態様に記載のキメラ受容体システムをコードする核酸構築物が提供される。
【００６７】
本発明の第５の態様の第１の実施形態において、核酸構築物は、第１のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列および第２のキメラ受容体をコードする第２の核酸配列を含む。
【００６８】
核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【００６９】
本発明の第５の態様の核酸構築物において、エンド１は、サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖をコードする核酸配列および第１の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み得；エンド２は、サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖をコードする核酸配列および第２の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み得る。
【００７０】
「ｃｏｅｘｐｒ」は、自己切断性ペプチドを含む配列をコードし得る。
【００７１】
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用され得る。
【００７２】
本発明の第５の態様の第２の実施形態において、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【００７３】
その核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ドメイン２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、キメラ受容体と細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ドメイン２は、細胞内融合タンパク質の第２のドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【００７４】
第２のドメインである「ドメイン２」は、リン酸化されたＣＤ３ゼータドメインに結合することができる配列をコードし得る。この点において、「ドメイン２」は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインをコードする核酸配列である「ＺＡＰ７０」であり得る。
【００７５】
本発明の第５の態様の第３の実施形態において、キメラ受容体をコードする第１の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【００７６】
その核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、キメラ受容体と膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＴＭ２は、膜貫通ドメインの膜貫通局在化配列をコードする核酸配列であり、
エンド２は、膜貫通タンパク質（ｔｒａｎｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【００７７】
第６の態様において、本発明は、本発明の第４の態様に記載の核酸配列または本発明の第５の態様に記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００７８】
そのベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
【００７９】
第７の態様において、
ｉ）本発明の第１の態様において定義されたような第１のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）本発明の第１の態様において定義されたような第２のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットが提供される。
【００８０】
ｉ）本発明の第１の態様において定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）第２の受容体または上で定義されたような細胞内融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットも提供される。
【００８１】
ｉ）本発明の第１の態様において定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）上で定義されたような膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットも提供される。
【００８２】
第８の態様において、本発明の第３の態様に記載の細胞を作製するための方法が提供され、その方法は、本発明の第４の態様に記載の核酸配列；本発明の第５の態様に記載の核酸構築物；本発明の第６の態様に記載のベクター；または本発明の第７の態様に記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む。
【００８３】
その細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
【００８４】
第９の態様において、本発明の第３の態様に記載の複数の細胞を含む薬学的組成物が提供される。
【００８５】
第１０の態様において、疾患を処置および／または予防するための方法が提供され、その方法は、本発明の第９の態様に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００８６】
その方法は、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）本発明の第４の態様に記載の核酸配列；本発明の第５の態様に記載の核酸構築物；本発明の第６の態様に記載のベクター；または本発明の第７の態様に記載のベクターのキットでのその細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与すること
を含み得る。
【００８７】
上記試料は、Ｔ細胞含有試料であり得る。
【００８８】
上記疾患は、がんであり得る。
【００８９】
疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明の第９の態様に記載の薬学的組成物も提供される。
【００９０】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第３の態様に記載の細胞の使用も提供される。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
詳細な説明
キメラ受容体（ＣＲ）
キメラ受容体（ＣＲ）は、サイトカイン受容体エンドドメインおよび異種リガンド結合エキソドメインを含む分子である。キメラ受容体のエンドドメインは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインも含み得る。
【００９２】
ゆえに、キメラ受容体は、
（ｉ）リガンド結合エキソドメイン；
（ｉｉ）任意選択のスペーサー；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；
（ｉｖ）サイトカイン受容体エンドドメイン；および
（ｖ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含み得る。
サイトカイン受容体およびシグナル伝達
【００９３】
多くの細胞の機能は、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーによって制御されている。これらの受容体によるシグナル伝達は、それらとＪａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）との会合に依存し、このＪａｎｕｓキナーゼは、リガンドの結合を、受容体複合体にリクルートされたシグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化と結び付ける。これらには、シグナル伝達物質、およびサイトカイン応答の多様性に寄与する転写因子のファミリーである転写活性化因子（ＳＴＡＴ）が含まれる。
【００９４】
本発明のキメラ受容体が、そのリガンドに結合すると、以下の細胞内シグナル伝達経路のうちの１つまたはそれより多くが、惹起され得る：
（ｉ）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路
（ｉｉ）ＭＡＰキナーゼ経路；および
（ｉｉｉ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路。
【００９５】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系は、３つの主要な構成要素：（１）受容体（２）Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）および（３）シグナル伝達物質および転写の活性化因子（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＳＴＡＴ）からなる。
【００９６】
ＪＡＫは、チロシンキナーゼ活性を有し、細胞表面のサイトカイン受容体に結合する。このリガンドと受容体との結合によって、ＪＡＫの活性化が引き起こされる。キナーゼ活性が高まると、それらは、受容体上のチロシン残基をリン酸化し、ホスホチロシンに結合するＳＨ２ドメインを含むタンパク質と相互作用するための部位を形成する。これらのホスホチロシン残基に結合することができるＳＨ２ドメインを有するＳＴＡＴは、その受容体にリクルートされ、それ自体が、ＪＡＫによってチロシンがリン酸化される。次いで、これらのホスホチロシンは、他のＳＴＡＴのＳＨ２ドメインに対する結合部位として働き、それらの二量体化を媒介する。種々のＳＴＡＴが、ヘテロ二量体またはホモ二量体を形成する。活性化されたＳＴＡＴ二量体は、細胞核の中に蓄積し、それらの標的遺伝子の転写を活性化する。
サイトカイン受容体エンドドメイン
【００９７】
本発明のキメラ受容体は、エキソドメインがそのリガンドに結合したとき、「サイトカイン型」細胞シグナル伝達を引き起こす（単独で、または別のキメラ受容体の存在下において）エンドドメインを含む。
【００９８】
サイトカイン受容体エンドドメインは、Ｉ型サイトカイン受容体に由来し得る。Ｉ型サイトカイン受容体は、細胞膜に隣接した細胞外の部分に、共通アミノ酸モチーフ（ＷＳＸＷＳ）を共有する。
【００９９】
サイトカイン受容体エンドドメインは、ＩＩ型サイトカイン受容体に由来し得る。ＩＩ型サイトカイン受容体には、Ｉ型およびＩＩ型のインターフェロンに結合するもの、ならびにインターロイキン−１０ファミリーのメンバー（インターロイキン−１０、インターロイキン−２０およびインターロイキン−２２）に結合するものが含まれる。
【０１００】
Ｉ型サイトカイン受容体は、
（ｉ）インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３およびＩＬ−２７に対する受容体）；
（ｉｉ）コロニー刺激因子受容体（例えば、エリトロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦに対する受容体）；ならびに
（ｉｉｉ）ホルモン受容体／神経ペプチド受容体（例えば、ホルモン受容体およびプロラクチン受容体）
を含む。
【０１０１】
Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、異なる鎖を含み、それらのうちのいくつかが、リガンド／サイトカイン相互作用に関わり、他のものが、シグナル伝達に関わる。例えば、ＩＬ−２受容体は、α鎖、β鎖およびγ鎖を含む。
【０１０２】
ＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２としても知られる）は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５受容体の間で共有されている。
ＩＬ−２
【０１０３】
ＩＬ−２は、３つの形態を有するＩＬ−２受容体に結合し、その受容体は、α、βおよびγ「鎖」と称されることが多い３つの異なるタンパク質の異なる組み合わせによって生成される；これらのサブユニットは、他のサイトカインに対する受容体の一部でもある。ＩＬ−２Ｒのβ鎖およびγ鎖は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【０１０４】
それらの３つの受容体鎖は、様々な細胞型上で別々にかつ異なって発現され、異なる組み合わせおよび順序で組み立てられて、低親和性、中親和性および高親和性のＩＬ−２受容体が生成され得る。
【０１０５】
α鎖は、ＩＬ−２に低親和性で結合し、βとγとの組み合わせは一体となって、主にメモリーＴ細胞上およびＮＫ細胞上のＩＬ−２に中親和性で結合する複合体を形成し；３つすべての受容体鎖は、活性化Ｔ細胞上および制御性Ｔ細胞上のＩＬ−２に高親和性（Ｋｄ約１０−１１Ｍ）で結合する複合体を形成する。
【０１０６】
これらの３つのＩＬ−２受容体鎖は、細胞膜にまたがり、細胞内に伸びることによって、生化学的シグナルを細胞内部に伝える。アルファ鎖は、シグナル伝達に参加しないが、ベータ鎖が、チロシンホスファターゼＪＡＫ１と複合体を形成する。同様に、ガンマ鎖も、ＪＡＫ３と呼ばれる別のチロシンキナーゼと複合体を形成する。これらの酵素は、ＩＬ−２Ｒの外部ドメインにＩＬ−２が結合することによって活性化される。
【０１０７】
初期のＴ細胞が、抗原によって刺激されたときも、ＩＬ−２シグナル伝達は、Ｔ細胞からエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞への分化を促進する。ＩＬ−２受容体鎖は、抗原によって選択されたＴ細胞クローンの数および機能の拡大に依存するＴ細胞の免疫学的記憶の発生におけるその役割を通じて、長期間の細胞性免疫においても重要な役割を果たす。
【０１０８】
本発明のキメラ受容体は、ＩＬ−２受容体β鎖および／またはＩＬ−２受容体（すなわち、共通）γ鎖を含み得る。
【０１０９】
ＩＬ−２β鎖および共通γ鎖のエンドドメインに対するアミノ酸配列を配列番号１および２として示す。
配列番号１：ヒト共通ガンマ鎖由来のエンドドメイン：
【化１】
2018532407.tif 000002
配列番号２：ヒトＩＬ−２Ｒβ由来のエンドドメイン：
【化２】
2018532407.tif 000003
【０１１０】
用語「〜由来の」は、本発明のキメラ受容体のエンドドメインが、内在性分子の野生型配列、またはＪＡＫ−１もしくはＪＡＫ−３と複合体を形成する能力および上で述べたシグナル伝達経路のうちの１つを活性化する能力を保持するその変異型と同じ配列を有することを意味する。
【０１１１】
「変異型」配列は、野生型配列（例えば、配列番号１または２）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するが、但し、その変異型配列は、野生型配列の機能、すなわち、ＪＡＫ−１またはＪＡＫ−３と複合体を形成し、例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を保持する。
【０１１２】
２つのポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に測定され得る。
ＩＬ−７
【０１１３】
インターロイキン−７受容体は、２本の鎖：インターロイキン−７受容体−α鎖（ＣＤ１２７）および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）から構成される。共通γ鎖受容体は、インターロイキン−２、−４、−９および−１５をはじめとした様々なサイトカインと共有される。インターロイキン−７受容体は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞をはじめとした様々な細胞型上に発現される。
【０１１４】
インターロイキン−７受容体は、リンパ球の発達、特に、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにおいて重要な役割を果たす。ＩＬ−７Ｒは、ＳＴＡＴ５による、Ｔ細胞受容体ガンマ遺伝子を含むゲノムの領域の接近可能性およびヒストンアセチル化も制御する。マウスでのノックアウト研究から、アポトーシスの阻止が、Ｔリンパ球の分化および活性化における、このタンパク質の必須の機能であることが示唆されている。
【０１１５】
本発明のキメラ受容体は、ＩＬ−７受容体α鎖および／もしくはＩＬ−７受容体（すなわち、共通）γ鎖またはその変異型を含み得る。
【０１１６】
ＩＬ−７α鎖のエンドドメインに対するアミノ酸配列を配列番号３として示す。
配列番号３−ヒトＩＬ−７Ｒα由来のエンドドメイン：
【化３】
2018532407.tif 000004
単量体キメラ受容体システム
【０１１７】
キメラ抗原受容体は、通常、同一の２本の鎖のホモ二量体である。
【０１１８】
本発明のキメラ受容体は、ホモ二量体、またはリガンドの存在下において別のキメラ受容体単量体と会合される単量体であり得る。
【０１１９】
特に、本キメラ受容体は、
（ｉ）エキソドメイン；
（ｉｉ）膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）サイトカイン受容体エンドドメイン；および
（ｖ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む単量体であり得る。
【０１２０】
エキソドメインは、ｓｃＦｖなどのリガンド結合ドメインを含み得る。ある細胞は、第１のＣＲのリガンド結合ドメインおよび第２のＣＲのリガンド結合ドメインが、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する、２つの単量体ＣＲを含み得る。
【０１２１】
あるいは、エキソドメインは、別のキメラ受容体のエキソドメインと一体となったとき、機能的なリガンド結合ドメインを生成するドメインを含み得る。例えば、一方の単量体キメラ受容体が、ＶＨを含み得、第２のキメラ受容体が、抗体のＶＬを含む。
【０１２２】
単量体サイトカイン受容体は、１つまたはそれより多い細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインも含み得る。例えば、その受容体は、以下のうちの１つまたはそれより多くを含み得る：ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ４０エンドドメイン。
二重キメラ受容体システム
【０１２３】
細胞が、２つのホモ二量体キメラ受容体または単量体キメラ受容体を含む場合、それらは、「相補的な」サイトカイン受容体エンドドメインを有し得る。相補的なサイトカイン受容体エンドドメインは、互いと会合して、サイトカイン型のシグナル伝達を誘導することができる。
【０１２４】
相補的なサイトカイン受容体エンドドメインの例を下記の表に示す。本発明の二重ＣＲシステムにおいて、一方のＣＲが、第１のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得、他方のＣＲが、第２のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得る。
【表Ａ】
2018532407.tif 000005
【０１２５】
本発明の二重キメラ受容体システムは、１つまたはそれより多い細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。その細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、２つのホモ二量体キメラ受容体または単量体キメラ受容体の間で共有され得るか、または一方の受容体が、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含み得、他方は、含まない。可能性のあるいくつかの組み合わせを以下の表に要約する：
【表Ｂ】
2018532407.tif 000006
【０１２６】
例えば、一方の受容体が、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、他方の受容体が、１つまたはそれより多い共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメインおよび／またはＣＤ４０エンドドメイン）を含み得る。
ＺＡＰ７０キメラ受容体システム
【０１２７】
本発明の１つの実施形態において、キメラ受容体は、細胞内融合タンパク質とともに細胞の中で発現される。その細胞内融合タンパク質は、サイトカイン受容体エンドドメインを含む。その細胞内融合タンパク質は、リン酸化されたＣＤ３ゼータエンドドメインに結合するドメイン、例えば、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。この実施形態は、図４に模式的に図示されている。
【０１２８】
ＺＡＰ７０は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の表面膜の近くに通常発現されるタンパク質である。ＺＡＰ７０は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部であり、Ｔ細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす。その分子量は、７０ｋＤａであり、２つのＮ末端ＳＨ２ドメインおよび１つのＣ末端キナーゼドメインから構成される。ＺＡＰ７０は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。
【０１２９】
Ｔ細胞の活性化における最も早い工程は、ＴＣＲによる標的細胞上のペプチドＭＨＣ−複合体の認識である。この最初の事象は、ＴＣＲ複合体におけるＣＤ３−ゼータの細胞質テイルとＬｃｋキナーゼとの近接会合を引き起こす。次いで、Ｌｃｋは、ＣＤ３−ゼータの細胞質テイルにおけるチロシン残基をリン酸化し、それにより、ＺＡＰ７０のリクルートが可能になる。ＺＡＰ７０は、ＴＣＲの会合の後のＴ細胞の活性化において中心的役割を果たすＳＨ２含有キナーゼである。ＺＡＰ７０におけるタンデムなＳＨ２ドメインは、リン酸化されたＣＤ３に結合することにより、ＺＡＰ７０がリン酸化され、Ｌｃｋによってまたはトランスで他のＺＡＰ７０分子によって活性化される。次いで、活性なＺＡＰ７０は、下流の膜タンパク質をリン酸化することができる。それらの膜タンパク質の中でも重要なのは、活性化Ｔ細胞のリンカー（ＬＡＴ）タンパク質である。ＬＡＴは、足場タンパク質であり、複数の残基上でそれがリン酸化されると、それは、他のいくつかのＳＨ２ドメイン含有タンパク質と相互作用することが可能になる。それらのＳＨ２ドメイン含有タンパク質には、ＬＡＴの中のリン酸化されたペプチドを認識して、Ｔ細胞の活性化シグナルを下流に伝達し、最終的に、一連のＴ細胞応答をもたらすＧｒｂ２、ＰＬＣ−ｇおよびＧｒａｐが含まれる。
【０１３０】
ＺＡＰ７０タンパク質の一例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４３４０３を有するヒトＺＡＰ７０タンパク質である。この例証の配列は、６１９アミノ酸長であり、配列番号２２として示される。
ＺＡＰ７０アミノ酸配列（配列番号２２）
【化４】
2018532407.tif 000007
【０１３１】
配列番号２２として示されるＺＡＰ７０配列は、タンデムなＳＨ２ドメインを含む。ＳＨ２  １は、アミノ酸番号１０〜１０２を含み、ＳＨ２  ２は、この配列のアミノ酸番号１６３〜２５４を含む。ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインは、ＳＨ２  １、ＳＨ２  ２または両方のＳＨ２ドメインを含み得る。
【０１３２】
上記融合タンパク質は、タンデムなＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインを含み得る。例えば、融合タンパク質は、配列番号２３として示される配列を含み得る。
ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメイン（配列番号２３）
【化５】
2018532407.tif 000008
【０１３３】
上記融合タンパク質は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号２３の変異型を含み得るが、但し、その変異型の配列は、必要とされる特性を有するＳＨ２ドメイン配列である。換言すれば、変異型の配列は、ＺＡＰ７０のリクルートを可能にする、ＣＤ３−ゼータの細胞質テイルにおけるリン酸化されたチロシン残基に結合することができなければならない。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、上記融合タンパク質は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインおよびＺＡＰ７０キナーゼドメインを含み得る。例えば、上記融合タンパク質は、配列番号２２として示される配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【０１３５】
上記融合タンパク質は、サイトカイン受容体エンドドメインも含む。上記融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインは、上で定義されたようなキメラ受容体のサイトカイン受容体エンドドメインに「相補的」であり得る。相補的なサイトカイン受容体エンドドメインは、互いと会合して、サイトカイン型のシグナル伝達を誘導することができる。
膜貫通タンパク質
【０１３６】
本発明の別の実施形態において、キメラ受容体は、膜貫通タンパク質とともに細胞の中で発現される。そのキメラ受容体および膜貫通タンパク質は、相補的なサイトカイン受容体エンドドメインを含む。
【０１３７】
膜貫通タンパク質は、細胞膜に繋がれ得るかまたは細胞膜と会合し得る。例えば、膜貫通タンパク質は、細胞の膜に当該タンパク質を繋ぎ留める膜貫通ドメインを含み得る。あるいは、膜貫通タンパク質は、ミリストイル基を含み得る。
【０１３８】
ミリストイル化は、ミリスチン酸に由来するミリストイル基が、Ｎ末端のグリシン残基のアルファ−アミノ基にアミド結合によって共有結合的に付着される、脂質化修飾である。
【０１３９】
膜貫通タンパク質は、１つまたはそれより多い共刺激ドメインも含み得る。
【０１４０】
膜貫通タンパク質は、リガンド結合エキソドメインを欠き得る。
スペーサー
【０１４１】
本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインと空間的に分離する、スペーサーを含み得る。フレキシブルスペーサーは、抗原結合ドメインが、抗原結合を可能にする種々の方向に向くことを可能にする。
【０１４２】
本発明の細胞が、２つまたはそれを超えるキメラ受容体を含む場合、スペーサーは、同じであっても異なってもよい。
【０１４３】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含み得る。リンカーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を二者択一的に含み得る。
【０１４４】
ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更され得る。
【０１４５】
これらのスペーサーに対するアミノ酸配列の例を下記に示す：
配列番号４（ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３）
【化６】
2018532407.tif 000009
【化７】
2018532407.tif 000010
配列番号５（ヒトＣＤ８ストーク）：
【化８】
2018532407.tif 000011
配列番号６（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）：
【化９】
2018532407.tif 000012
【０１４６】
スペーサーは、単量体であり得る。単量体のスペーサーは、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基（複数可）の変異によって作製され得る（Ｂｒｉｄｇｅｍａｎら（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：６９３８−６９４９）。
膜貫通ドメイン
【０１４７】
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＲの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来し得、良好な受容体安定性をもたらす。
【０１４８】
あるいは、膜貫通ドメインは、サイトカイン受容体、例えば、エンドドメインが由来する同じサイトカインに由来し得る。
【０１４９】
膜貫通ドメインは、例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７ＲまたはＩＬ−１５Ｒに由来し得る。
配列番号７−ヒト共通ガンマ鎖に由来する膜貫通：
【化１０】
2018532407.tif 000013
配列番号８−ヒトＩＬ−２Ｒβに由来する膜貫通：
【化１１】
2018532407.tif 000014
配列番号９−ヒトＩＬ−７Ｒαに由来する膜貫通：
【化１２】
2018532407.tif 000015
配列番号１０−ヒトＩＬ−１５Ｒαに由来する膜貫通：
【化１３】
2018532407.tif 000016
リガンド結合エキソドメイン
【０１５０】
用語「リガンド結合ドメイン」とは、リガンド結合に関わるＣＲの細胞外の部分のことを指す。単一のキメラ受容体のリガンド結合ドメインは、それ自体がリガンドに結合することができ得る（例えば、それがｓｃＦｖに基づく場合）。あるいは、リガンド結合ドメインは、別のキメラ受容体と会合しているとき（例えば、一方のＣＲがＶＨを含み、もう一方のＣＲが抗体のＶＬを含む場合）、リガンド結合が可能であり得る。
【０１５１】
用語「リガンド」は、ＣＲの抗原結合ドメインまたは相補的なＣＲリガンド結合ドメインの組み合わせによって特異的に認識および結合される実体を意味する「抗原」の同意語として使用される。
【０１５２】
数多くの抗原結合ドメインが、当該分野で公知であり、それらとしては、抗体、抗体模倣物およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものが挙げられる。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原に対しての天然受容体由来の結合ドメイン；標的リガンドに対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメインバインダー（例えば、ラクダ科動物のもの）；人工単一バインダー（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｂｉｎｄｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ）（例えば、Ｄａｒｐｉｎ）；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【０１５３】
図５に示されているアミノ酸配列は、各々がＣＤ２２に結合するリガンド結合ドメインを有する２つのＣＡＲを含む。一方は、ｓｃＦｖ  ＬＴ２２に基づき、もう一方は、ｓｃＦｖ  ＲＦＢ４に基づく。
リガンド
【０１５４】
本発明のＣＲまたはＣＲシステムは、リガンドに結合する。
【０１５５】
リガンドは、腫瘍分泌因子またはケモカインなどの可溶性リガンドであり得る。
【０１５６】
あるいは、リガンドは、細胞表面抗原などの膜結合型リガンドであり得る。
【０１５７】
用語「可溶性リガンド」は、細胞の一部ではないかまたは細胞に付着しておらず、細胞外空間で、例えば、目的の組織の体液中で自由に動く、リガンドまたは抗原を表すために使用される。可溶性リガンドは、個体の血清、血漿または他の体液中において無細胞の状態で存在し得る。
【０１５８】
可溶性リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。
【０１５９】
可溶性リガンドは、がんセクレトーム（ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）、すなわち腫瘍によって分泌される因子のコレクションの一部であり得、がん幹細胞、非幹細胞または周囲のストローマ由来であり得る。可溶性リガンドは、腫瘍細胞によって分泌され得るか、または腫瘍により脱落させられ得る。
【０１６０】
可溶性リガンドは、疾患または罹患組織に特徴的であり得る。可溶性リガンドは、疾患を有する被験体にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において；もしくは健康な組織と比べて罹患組織においてより高いレベルで見られ得る。可溶性リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において；または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで発現され得る。
【０１６１】
用語「細胞表面抗原」および「細胞表面リガンド」は、細胞の表面に付着されたまたは細胞の表面上に発現されたリガンドを意味する「膜結合型抗原」および「膜結合型リガンド」の同意語として使用される。細胞表面リガンドは、例えば、膜貫通タンパク質であり得る。
【０１６２】
細胞表面リガンドが見られる細胞は、がん細胞などの標的細胞であり得る。
【０１６３】
細胞表面リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。あるいは、細胞表面リガンドは、必ずしも病的状態に関連せずに、標的細胞（例えば、Ｂ細胞）の細胞型に特徴的であり得る。
【０１６４】
細胞表面リガンドは、疾患または罹患組織に特徴的である場合、その疾患を有する被験体の関連する細胞上にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べてその疾患を有する被験体の関連する細胞上において；もしくは健康な組織と比べて罹患組織においてより高いレベルで見られ得る。細胞表面リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体の細胞上において；または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで発現され得る。
腫瘍分泌因子
【０１６５】
上記ＣＲによって認識されるリガンドは、腫瘍によって分泌されるまたは腫瘍から脱落した可溶性リガンドであり得る。
【０１６６】
この「腫瘍分泌因子」は、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、血管（ｖａｓｃｙｌａｒ）内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはがん抗原−１２５（ＣＡ−１２５）であり得る。
細胞表面抗原
【０１６７】
上記ＣＲまたはＣＲシステムは、細胞表面抗原、すなわち、腫瘍細胞などの標的細胞の表面上に発現される膜貫通タンパク質などの実体を認識し得る。
【０１６８】
上記ＣＲまたはＣＲシステムは、腫瘍関連細胞表面抗原に特異的に結合し得る。
【０１６９】
様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が知られており、それらのうちのいくつかを表１に示す。本発明において使用される抗原結合ドメインは、その中に示されているようなＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。
【表１】
2018532407.tif 000017
【０１７０】
前立腺がん関連抗原
【０１７１】
上記ＣＲは、前立腺がんに関連する細胞表面抗原（例えば、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ））に特異的に結合し得る。
【０１７２】
ＰＳＣＡは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型の細胞膜糖タンパク質である。ＰＳＣＡは、前立腺がんの大部分においてアップレギュレートされ、膀胱および膵臓のがんにおいても検出される。
【０１７３】
７Ｆ５（Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈら（Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２００７）６７：１１２１−１１３１）；１Ｇ８（Ｈｉｌｌｅｒｄａｌら（２０１４）ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：３０）；およびＨａ１−４．１１７（Ａｂａｔｅ−Ｄａｇａら（２０１４）２５：１００３−１０１２）などの様々な抗ＰＳＣＡ抗体が知られている。
【０１７４】
本発明のＣＲ発現細胞は、これらの抗体のうちの１つに基づく抗原結合ドメインを含み得る。
【０１７５】
ＰＳＭＡは、膜に存在する亜鉛金属酵素である。ＰＳＭＡは、ヒト前立腺において強く発現され、他のほとんどの組織での発現よりも１００倍高い。がんにおいて、ＰＳＭＡは、発現がアップレギュレートされ、前立腺がんにおいて２番目に多くアップレギュレートされる遺伝子と呼ばれており、その増加は、非がん性前立腺よりも８〜１２倍高い。ヒト前立腺および前立腺がんにおける発現に加えて、ＰＳＭＡは、腫瘍の血管新生においても高度に発現されると見出されているが、腎臓、乳房、結腸などのようなすべてのタイプの固形腫瘍の正常な脈管構造では高度に発現されないと見出されている。
【０１７６】
７Ｅ１１、Ｊ５９１、Ｊ４１５ならびにＨｙｂｒｉｔｅｃｈ  ＰＥＱ２２６．５およびＰＭ２Ｊ００４．５などの様々な抗ＰＳＭＡ抗体が知られており、それらの各々が、ＰＳＭＡの異なるエピトープに結合する（Ｃｈａｎｇら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：３１９２−８）。
【０１７７】
本発明のＣＲは、これらの抗体のうちの１つに基づく抗原結合ドメインを含み得る。
【０１７８】
例えば、本ＣＲは、配列番号１１として示されている配列を有する、Ｊ５９１に基づくｓｃＦｖを含み得る。
配列番号１１（Ｊ５９１  ｓｃＦｖ）
【化１４】
2018532407.tif 000018
シグナルペプチド
【０１７９】
本明細書中に記載されるＣＲまたは膜貫通タンパク質は、それがＴ細胞などの細胞において発現されるとき、新生タンパク質が小胞体に向けられ、続いて細胞表面（このＣＲまたは膜貫通タンパク質は細胞表面で発現される）に向けられるようにシグナルペプチドを含み得る。
【０１８０】
シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
【０１８１】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。本発明におけるＣＲとともに使用するのに適した数多くのシグナルペプチドが当該分野で公知である。
ＣＲエンドドメイン
【０１８２】
エンドドメインは、膜の細胞内の側に位置する、キメラ受容体または膜貫通タンパク質の一部である。
【０１８３】
エンドドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原結合ドメインによる抗原認識の後、個々のＣＡＲ分子クラスター、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。同じ原理が、本発明のキメラ受容体にも当てはまる。動力学的隔離によるキメラ受容体のクラスター化は、細胞シグナル伝達が細胞内（ｉｎｔｒｃｅｌｌｕｌａｒ）Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを介して生じることを可能にする。
【０１８４】
最も一般的に使用されるシグナル伝達成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータエンドドメインのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。
【０１８５】
ＣＲは、ＣＤ３−ゼータエンドドメインのみを含み得るか、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０のエンドドメインとともにＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得るか、またはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【０１８６】
上記細胞が、２つまたはそれを超えるキメラ受容体を含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、それらのＣＲ分子の間で「共有」され得る。例えば、一方のＣＲが、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、もう一方のＣＲが、１つまたはそれより多い共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４−１ＢＢに由来するものを含み得る。
【０１８７】
上記細胞が、キメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、そのＣＲと膜貫通タンパク質との間で「共有」され得る。例えば、そのＣＲは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、膜貫通タンパク質は、１つまたはそれより多い共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４−１ＢＢに由来するものを含み得る。
【０１８８】
上記ＣＲまたは膜貫通タンパク質エンドドメインは、以下のうちの１つまたはそれより多くを含み得る：ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＢＴＬＡエンドドメイン、ＣＤ３０エンドドメイン、ＧＩＴＲエンドドメインおよびＨＶＥＭエンドドメイン。
【０１８９】
上記エンドドメイン（ｅｎｄｏｍａｉｎ）は、配列番号１２〜２０として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらの変異型のうちの１つまたはそれより多くを含み得る。
配列番号１２−ＣＤ３  Ｚエンドドメイン
【化１５】
2018532407.tif 000019
配列番号１３−ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータエンドドメイン
【化１６】
2018532407.tif 000020
配列番号１４−ＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメイン
【化１７】
2018532407.tif 000021
配列番号１５−ＩＣＯＳエンドドメイン
【化１８】
2018532407.tif 000022
配列番号１６−ＣＤ２７エンドドメイン
【化１９】
2018532407.tif 000023
配列番号１７−ＢＴＬＡエンドドメイン
【化２０】
2018532407.tif 000024
【化２１】
2018532407.tif 000025
配列番号１９−ＧＩＴＲエンドドメイン
【化２２】
2018532407.tif 000026
配列番号２０−ＨＶＥＭエンドドメイン
【化２３】
2018532407.tif 000027
【０１９０】
変異型の配列は、配列番号１２〜２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、但し、その配列は、効果的な細胞内シグナル伝達ドメインを提供する。
核酸
【０１９１】
本発明は、本発明のＣＲをコードする核酸も提供する。
【０１９２】
その核酸は、以下の構造：
ＡｇＢ−スペーサー−ＴＭ−エンド
（ここで、
ＡｇＢ１は、ＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、ＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、ＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、ＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
核酸構築物
【０１９３】
本発明はさらに、本発明のキメラ受容体システムをコードする核酸構築物を提供する。
【０１９４】
その核酸構築物は、本発明の第１の態様に関連して定義されたような第１のＣＲをコードする第１の核酸配列；および本発明の第１の態様に関連して定義されたような第２のＣＲをコードする第２の核酸配列を含み得る。
【０１９５】
その核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０１９６】
核酸構築物が、Ｔ細胞などの細胞において発現されるとき、それは、第１および第２のＣＲが細胞表面で共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする。  
【０１９７】
第１および第２のＣＲは、同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る。あるいは、第１および第２のＣＲは、一体となって抗原結合が可能である相補的なリガンド結合ドメインを含み得る。
【０１９８】
第１および第２のＣＲは、相補的なサイトカイン受容体エンドドメイン、例えば、サイトカイン受容体のαまたはβ鎖に由来するものおよび同じサイトカイン受容体のγ鎖に由来するものを有し得る。
【０１９９】
あるいは、上記核酸構築物は、本発明の第１の態様に記載のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第２の核酸配列を含み得る。
【０２００】
その核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ドメイン２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、キメラ受容体と細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ドメイン２は、細胞内融合タンパク質の第２のドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０２０１】
第２のドメインである「ドメイン２」は、ＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインをコードする核酸配列である「ＺＡＰ７０」であり得る。
【０２０２】
あるいは、上記核酸構築物は、キメラ受容体をコードする第１の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第２の核酸配列を含み得る。
【０２０３】
その核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、キメラ受容体と膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＴＭ２は、膜貫通ドメインの膜局在化ドメインをコードする核酸配列であり、
エンド２は、膜貫通タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０２０４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いと同義であると意図されている。
【０２０５】
遺伝暗号の縮重の結果として、数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードできることは、当業者によって理解される。さらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、当業者は、日常的な手法を用いて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチドの置換を行うことがあることが理解されるべきである。
【０２０６】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当該分野で公知である。これらには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載されるような使用の目的において、それらのポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性を高めるためまたは寿命を延長するために行われ得る。
【０２０７】
ヌクレオチド配列に関する用語「変異型」、「ホモログ」または「誘導体」は、その配列からのまたはその配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変更、修飾、置換、欠失または付加を含む。
【０２０８】
上記の構造において、「ｃｏｅｘｐｒ」は、第１のＣＲと第２のＣＲの両方の共発現を可能にする核酸配列である。それは、切断部位をコードする配列であり得、その結果、核酸構築物は、切断部位によって連結された２つまたはそれを超えるＣＲを生成し含む。切断部位は、自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが生成されると、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに個々のペプチドに切断される。
【０２０９】
切断部位は、第１および第２のＣＲが分断されるようになるのを可能にする任意の配列であってよい。
【０２１０】
用語「切断」は、便宜上、本明細書中で使用されるが、切断部位は、上記ペプチドを古典的な切断以外の機構によって個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断性ペプチド（下記を参照のこと）の場合、「切断」活性を説明する様々なモデルが提案されている：宿主細胞のプロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク分解または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、それらのタンパク質を別個の実体として発現させる限り、そのような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要でない。
【０２１１】
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。
【０２１２】
フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な生成物にプロセシングするプロタンパク質コンバターゼである。フューリンは、前駆体タンパク質をそれらの対になった塩基性アミノ酸プロセシング部位で効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンの基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ−ベータ−セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブラント因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ装置において濃縮される。
【０２１３】
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の切断部位であり得る。
【０２１４】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であるので、インビトロとインビボの両方において、融合タンパク質の制御された切断のために使用されることが多い。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓである（ここで、「＼」は、切断されるペプチド結合を表す）。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外来性ＴＥＶプロテアーゼは、哺乳動物細胞においても発現されなければならない。
【０２１５】
切断部位は、自己切断性ペプチドをコードし得る。
【０２１６】
「自己切断性ペプチド」とは、そのポリペプチドが当該タンパク質を構成し、かつ自己切断性ペプチドが生成されると、そのポリペプチドは、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに「切断」されるか、または異なる不連続の第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドのことを指す。
【０２１７】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断性ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの最初の２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端で「切断」する２Ａによって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルス）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸という短いセクションであり、それは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）とともに、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントになる（上記のようなＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０２１８】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｓｐｐの中の反復配列および細菌の配列（上記のようなＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））において見られる。切断部位は、これらの２Ａ様配列のうちの１つ、例えば：
【０２１９】
配列番号２１：ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
を含み得る。
【０２２０】
本発明は、本発明の第１の態様に記載の第１および第２のＣＲをコードする１つまたはそれより多い核酸配列を含むキットも提供する。
ベクター
【０２２１】
本発明は、本発明の第１の態様に記載の１つまたはそれより多いＣＲをコードする１つまたはそれより多い核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。そのようなベクターは、そのベクターが本発明の第１の態様に記載のＣＲを発現するように、その核酸配列（複数可）を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【０２２２】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２２３】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトすることまたは形質転換することができ得る。
細胞
【０２２４】
本発明は、本発明の１つまたはそれより多いＣＲを含む細胞を提供する。その細胞は、上で定義されたようなＣＲシステムを含み得る。
【０２２５】
その細胞は、本発明の１つまたはそれより多い核酸またはベクターを含み得る。
【０２２６】
上記細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性の免疫細胞であり得る。
【０２２７】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０２２８】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０２２９】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０２３０】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２３１】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２３２】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０２３３】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０２３４】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０２３５】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０２３６】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０２３７】
本発明のＣＲ細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０２３８】
本発明の第１の態様に記載のＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。
【０２３９】
あるいは、本発明の第１の態様によるＴまたはＮＫ細胞は、ＴまたはＮＫ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボでの分化から得られ得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化されたＴ細胞株が使用され得る。
【０２４０】
これらのすべての実施形態において、ＣＲ発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによって、各ＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作製される。
【０２４１】
本発明の細胞は、被験体由来のエキソビボのＴまたはＮＫ細胞であり得る。そのＴまたはＮＫ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様に記載のＣＲを提供する分子をコードする核酸を形質導入される前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、活性化および／または拡大され得る。
【０２４２】
本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上に列挙された他の起源からのＴまたはＮＫ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）ＣＲをコードする１つまたはそれより多い核酸配列によるＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって作製され得る。
【０２４３】
次いで、それらのＴまたはＮＫ細胞は、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて精製され得、例えば、選択され得る。
【０２４４】
医薬組成物
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含む医薬組成物に関する。
【０２４５】
医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０２４６】
処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の細胞（例えば、上に記載されたような医薬組成物中の本発明の細胞）を被験体に投与する工程を含む。
【０２４７】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中において、それらの細胞は、既存の疾患に関連する少なくとも１つの症候を和らげるか、減少させるか、もしくは改善するため、および／またはその疾患の進行を減速させるか、減少させるか、もしくは阻止するために、その疾患または症状を有する被験体に投与され得る。
【０２４８】
疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書中において、そのような細胞は、まだ疾患にかかっていないおよび／またはいかなる疾患の症候も示していない被験体に、その疾患を予防するためもしくはその疾患の原因を弱めるため、またはその疾患に関連する少なくとも１つの症候を減少させるためもしくはその発生を予防するために、投与され得る。被験体は、その疾患の素因を有し得るか、またはその疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
【０２４９】
上記方法は、
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）そのような細胞に、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターを形質導入するか、またはそのような細胞を、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターでトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与する工程
を含み得る。
【０２５０】
ＴまたはＮＫ細胞含有試料は、被験体または他の起源、例えば、上に記載されたような起源から単離され得る。ＴまたはＮＫ細胞は、被験体自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植の状況（第二者）、または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）から単離され得る。
【０２５１】
本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明のＣＲ発現またはＣＲシステム発現細胞を提供する。
【０２５２】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明のＣＲ発現またはＣＲシステム発現細胞の使用にも関する。
【０２５３】
本発明の方法によって処置および／または予防される疾患は、がん性疾患（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵がん、前立腺がんおよび甲状腺がん）であり得る。
【０２５４】
上記ＣＲによって認識されるリガンドが、ＰＳＡ、ＰＳＭＡまたはＰＳＣＡである場合、がんは、前立腺がんであり得る。
【０２５５】
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができてもよい。標的細胞は、標的細胞の近くに、腫瘍によって分泌されるリガンドまたはケモカインリガンドが存在することを特徴とし得る。標的細胞は、標的細胞表面における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現とともに、可溶性リガンドが存在することを特徴とし得る。
【０２５６】
本発明の細胞および医薬組成物は、上に記載された疾患の処置および／または予防において使用するためであり得る。
【０２５７】
本発明の細胞および医薬組成物は、上に記載された任意の方法において使用するためであり得る。
【０２５８】
本発明は、実施例によってさらに説明され、この実施例は、本発明を実施する際に当業者を助けるように機能すると意味されており、本発明の範囲を決して限定しないと意図されている。
【実施例】
【０２５９】
実施例１−インビトロ試験
Ｔ細胞に、標準的なＣＡＲまたはサイトカインシグナルを伝達するＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを形質導入する。形質導入されていないおよび形質導入されたＴ細胞を、ＣＲ同族標的を発現している標的細胞でチャレンジする。標的抗原に応答したサイトカイン経路の活性化は、細胞内抗体染色およびフローサイトメトリーを利用して、ＰＩ３キナーゼ、ＭＡＰキナーゼおよびＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路における公知のメディエーターのリン酸化のレベルを計測することによって、直接検出され得る。サイトカインシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、アポトーシスおよび表現型をフローサイトメトリーによって計測することによって、間接的に測定され得る。
実施例２−標的抗原の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する「第４世代」ＣＡＲシステムの作製
【０２６０】
抗原ＲＯＲ１の異なるエピトープに結合するｓｃＦｖを有する第４世代ＣＡＲシステムを設計した（図６）。第１のキメラ受容体は、Ｒ１１  ｓｃＦｖを含む抗原結合ドメイン、ヒトＦｃスペーサー、ＩＬ２受容体βエンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを有し；第２のキメラ受容体は、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含む抗原結合ドメイン、ＣＤ８ストークスペーサー、ＩＬ２受容体γエンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを有した。２つのコントロール受容体システムも設計した：１つは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠き（図６）；もう１つは、ＣＤ３ゼータドメインを欠いた（図９）が、それらは、その他の点では上に記載されたシステムと同一であった。
実施例３−第４世代ＣＡＲシステムは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なＣＡＲシステムよりも高い増殖／生存を示す
【０２６１】
サイトカインエンドドメインを含むキメラ受容体システムの存在が増殖／生存シグナルを提供するかを調べるために、成長のためにＩＬ２を必要とするＣＴＬＬ２マウス細胞傷害性Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−２１４ＴＭ）を使用した。ＣＴＬＬ細胞に、図６に示されている２つのキメラ受容体システムの一方または他方を発現するベクターを形質導入した。ＲＯＲ１でコーティングされたビーズまたはコーティングされていないビーズとともに培養した３および６日後に、細胞増殖を評価した。
【０２６２】
結果を図７および８に示す。図７に示されているように、サイトカイン受容体およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む第４世代ＣＡＲは、リガンドとともに共培養されたとき、３日目と６日目の両方において、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムよりも、形質導入された細胞においてより高い倍率の濃縮を示した。図８に示されているように、リガンドの存在は、第４世代ＣＡＲを発現する細胞に対して、３日目と６日目の両方において細胞生存／増殖を大幅に高めたのに対して、リガンドの存在は、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現する細胞の増殖／生存に対してほとんど影響を及ぼさなかった。
実施例４−第４世代ＣＡＲシステムは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを欠く等価なＣＡＲシステムよりも高い標的細胞の死滅およびＩＦＮｇの放出を示す
【０２６３】
次に、サイトカイン受容体エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む第４世代ＣＡＲが標的細胞を殺すことができるかを調べた。健常なドナーのＰＢＭＣに、図９に示されている２つのキメラ受容体システムの一方または他方を発現するベクターを形質導入した。形質導入された細胞を、ＳｕｐＴ１細胞またはＲＯＲ１を発現するＳｕｐＴ１標的細胞と１０：１のＥ：Ｔ比で４８時間共培養した。次いで、標的細胞の死滅をＦＡＣＳによって解析し、ＥＬＩＳＡを用いて、ＩＦＮγの分泌をアッセイした。
【０２６４】
図１０に示されているように、サイトカイン受容体エンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む第４世代ＣＡＲは、ＲＯＲ１を発現する標的細胞を殺すことができ、ＣＤ３ゼータエンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムよりもいっそう効率的に殺した。
【０２６５】
ＣＤ３ゼータエンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現するＰＢＭＣとは異なり、第４世代ＣＡＲを発現するＰＢＭＣを、ＲＯＲ１を発現する標的細胞と共培養することにより、有意なレベルのＩＦＮγ放出がもたらされる（図１１）。
実施例５−標的抗原の同じエピトープに対する抗原結合ドメインを有する第４世代ＣＡＲシステムの作製
【０２６６】
抗原ＲＯＲ１の同じエピトープに結合するｓｃＦｖを有する第４世代ＣＡＲシステムを設計した（図１２）。第１のキメラ受容体は、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含む抗原結合ドメイン、ヒトＦｃスペーサー、ＩＬ２受容体βエンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを有し；第２のキメラ受容体は、Ｒ１２  ｓｃＦｖを含む抗原結合ドメイン、ＣＤ８ストークスペーサー、ＩＬ２受容体γエンドドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを有した。相同組換えを回避するために、第１のキメラ受容体のＲ１２ＳｃＦｖのＤＮＡ配列をゆらぎにした。サイトカイン受容体エンドドメインを欠くがその他の点では同一であるコントロール受容体システムも設計した（これも図１２に示されている）。
【０２６７】
実施例６−標的抗原の同じエピトープに対する抗原結合ドメインを有する第４世代ＣＡＲシステムは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なＣＡＲシステムよりも高い増殖／生存を示す
【０２６８】
実施例５において開発された構築物に対して実施例３に記載されたものと等価な生存／増殖アッセイを行い、その結果を図１３および１４に示す。図１３に示されているように、サイトカイン受容体およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む第４世代ＣＡＲは、リガンドとともに３日間共培養されたとき、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムよりも、形質導入された細胞においてより高い倍率の濃縮を示した。図８に示されているように、リガンドの存在は、第４世代ＣＡＲを発現する細胞に対して、培養の３日後に細胞生存／増殖を大幅に高めたのに対して、リガンドの存在は、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現する細胞の増殖／生存に対してほとんど影響を及ぼさなかった。
【０２６９】
ゆえに、標的抗原の同じエピトープに結合する２つの抗原結合ドメインを使用する本発明のキメラ受容体システムを用いて、抗原を標的化することが可能である。これは、キメラ受容体システムの設計を潜在的に単純化し、各標的抗原に対して相互排他的なエピトープを見つける必要を無くす。
【０２７０】
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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