(57)【要約】  本発明は、ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）とビスホスホネートの複合体の制御可能な局所送達を提供して骨形成を促進させるための組成物及び方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、骨吸収に特徴付けられる疾患及び障害を有する対象の治療に用いられる。【選択図】図１
2018537526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、
【化１】
2018537526.tif 000066
（Ｉ）、
式（Ｉ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｒ３は、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ４は、水素、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキル及びアルキルＺ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０からなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ２は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ３は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ３は、Ｎ、ＣＲ１２及びフェニルからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｚ５は、アリール、アルキル、ＯＲ１８及び
【化２】
2018537526.tif 000067
からなる群から選択され、式中、前記アリールまたはアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ５はそれぞれ独立して、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＣＲ１５及びＮからなる群から選択され、
Ｘ２は、ＣＲ１６及びＮからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｒ１７はそれぞれ、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１８は、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜２の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。
【請求項２】
式（Ｉ）の前記化合物は、式（ＩＩ）の化合物、
【化３】
2018537526.tif 000068
（ＩＩ）、
式（ＩＩ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
ｍは１、２または３であり、
ｐは１、２または３であり、
ｎは、０〜１０の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、式（Ｉ）の前記化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物、
【化４】
2018537526.tif 000069
（ＩＩＩ）、
式（ＩＩＩ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
ｍは、１〜５の整数であり、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｐは、１〜５の整数であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、前記化合物。
【請求項４】
式中、Ｙは−ＰＯ３（Ｒ１）２である、請求項１から請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
式中、Ｌ１は、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択される、請求項１、請求項２及び請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式中、Ｌ１は−ＣＨ２ＣＨＲ１９−であり、式中、Ｒ１９は、
【化５】
2018537526.tif 000070
及び
【化６】
2018537526.tif 000071
からなる群から選択される、請求項１、請求項２及び請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
式中、Ｌ２は、フェニル、及びＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖からなる群から選択され、式中、前記アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基、カルボニル基またはシクロアルキル基で任意選択的に置換される、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式中、Ｌ３は、フェニル、及びＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖からなる群から選択され、式中、前記アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基、カルボニル基またはシクロアルキル基で任意選択的に置換される、請求項１及び請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
式中、Ａは、Ｃ（＝Ｎ）またはＣ（＝Ｏ）である、請求項１から請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
式中、Ｚ２はＯである、請求項１から請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｚ５は
【化７】
2018537526.tif 000072
である、請求項１、請求項５、及び請求項７から請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
式中、Ｚ５は
【化８】
2018537526.tif 000073
である、請求項１、請求項５、及び請求項７から請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物であって、前記化合物は、
【化９】
2018537526.tif 000074
【化１０】
2018537526.tif 000075
【化１１】
2018537526.tif 000076
【化１２】
2018537526.tif 000077
【化１３】
2018537526.tif 000078
【化１４】
2018537526.tif 000079
【化１５】
2018537526.tif 000080
【化１６】
2018537526.tif 000081
【化１７】
2018537526.tif 000082
【化１８】
2018537526.tif 000083
【化１９】
2018537526.tif 000084
【化２０】
2018537526.tif 000085
及び
【化２１】
2018537526.tif 000086
、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物からなる群から選択される、前記化合物。
【請求項１４】
前記化合物は、
【化２２】
2018537526.tif 000087
、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含むかまたはその治療薬からなる、少なくとも１種の化合物を含む、治療薬を制御状態で骨に局所送達するための組成物であって、前記治療薬はボルテゾミブまたはそのアナログである、前記組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、前記少なくとも１種の化合物は、式（Ｉ）の化合物、
【化２３】
2018537526.tif 000088
（Ｉ）、
式（Ｉ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｒ３は、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ４は、水素、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキル及びアルキルＺ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０からなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ２は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ３は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ３は、Ｎ、ＣＲ１２及びフェニルからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｚ５は、アリール、アルキル、ＯＲ１８及び
【化２４】
2018537526.tif 000089
からなる群から選択され、式中、前記アリールまたはアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ５はそれぞれ独立して、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＣＲ１５及びＮからなる群から選択され、
Ｘ２は、ＣＲ１６及びＮからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｒ１７はそれぞれ、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１８は、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜２の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その立体異性体もしくはその立体異性体の混合物である、前記組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物であって、前記化合物は、
【化２５】
2018537526.tif 000090
【化２６】
2018537526.tif 000091
【化２７】
2018537526.tif 000092
【化２８】
2018537526.tif 000093
【化２９】
2018537526.tif 000094
【化３０】
2018537526.tif 000095
【化３１】
2018537526.tif 000096
【化３２】
2018537526.tif 000097
【化３３】
2018537526.tif 000098
【化３４】
2018537526.tif 000099
【化３５】
2018537526.tif 000100
【化３６】
2018537526.tif 000101
及び
【化３７】
2018537526.tif 000102
、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項１８】
前記化合物は、
【化３８】
2018537526.tif 000103
またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１５から請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記治療薬は、骨形成を必要とする部位において、前記化合物から制御可能に放出される、請求項１５から請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
対象内の骨形成を必要とする部位において骨形成を促進させるための方法、もしくは、より少ない骨吸収を必要とする対象内の骨吸収を抑制するための方法、またはその両方の方法であって、前記方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、前記治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである、前記方法。
【請求項２２】
それを必要とする対象における多発性骨髄腫及び骨がんからなる群から選択される疾患を治療するための方法であって、前記方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、前記治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである、前記方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の化合物は、式（Ｉ）の化合物、
【化３９】
2018537526.tif 000104
（Ｉ）、
式（Ｉ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｒ３は、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ４は、水素、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキル及びアルキルＺ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０からなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ２は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ３は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ３は、Ｎ、ＣＲ１２及びフェニルからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｚ５は、アリール、アルキル、ＯＲ１８及び
【化４０】
2018537526.tif 000105
からなる群から選択され、式中、前記アリールまたはアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ５はそれぞれ独立して、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＣＲ１５及びＮからなる群から選択され、
Ｘ２は、ＣＲ１６及びＮからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｒ１７はそれぞれ、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１８は、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜２の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１から請求項２３のいずれか１項に記載の方法であって、前記化合物は、
【化４１】
2018537526.tif 000106
【化４２】
2018537526.tif 000107
【化４３】
2018537526.tif 000108
【化４４】
2018537526.tif 000109
【化４５】
2018537526.tif 000110
【化４６】
2018537526.tif 000111
【化４７】
2018537526.tif 000112
【化４８】
2018537526.tif 000113
【化４９】
2018537526.tif 000114
【化５０】
2018537526.tif 000115
【化５１】
2018537526.tif 000116
【化５２】
2018537526.tif 000117
及び
【化５３】
2018537526.tif 000118
、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物からなる群から選択される、前記方法。
【請求項２５】
前記化合物は、
【化５４】
2018537526.tif 000119
、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を更に含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
疾患の症候を予防または治療するための請求項２１または請求項２２に記載の方法であって、前記対象は、多発性骨髄腫、骨粗鬆症、骨壊死、変形性関節症、関節リウマチ、パジェット病、骨折治癒、プロテーゼの緩み、骨がん、骨髄増殖性疾患、放射線療法誘発性骨粗鬆症、白血病、及び骨に転移したがんからなる群から選択される疾患または障害を有する、前記方法。
【請求項２８】
前記治療薬は、骨形成を必要とする前記部位において、前記化合物から制御可能に放出される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
対象内の骨、骨髄及び骨周囲組織のがん細胞を殺傷するための方法であって、前記方法は、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物、
【化５５】
2018537526.tif 000120
（Ｉ）、
式（Ｉ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｒ３は、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ４は、水素、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキル及びアルキルＺ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０からなる群から選択され、式中、前記アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ２は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ３は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、前記アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ３は、Ｎ、ＣＲ１２及びフェニルからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｚ５は、アリール、アルキル、ＯＲ１８及び
【化５６】
2018537526.tif 000121
からなる群から選択され、式中、前記アリールまたはアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ５はそれぞれ独立して、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＣＲ１５及びＮからなる群から選択され、
Ｘ２は、ＣＲ１６及びＮからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、前記アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｒ１７はそれぞれ、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１８は、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜２の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
前記化合物は、
【化５７】
2018537526.tif 000122
、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象は多発性骨髄腫を有する、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月２日に出願された米国仮出願番号第６２／２４９，３８２号の優先権を主張するものである（本明細書中に、その全体が参照として組み込まれる）。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所による認可番号１Ｓ１０ＲＲ０２７３４０、ＡＲ０６９７８９及びＡＲ０６３６５０のもとで、政府による支援を受けて成立した。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
年間５百万人超のアメリカ人が骨折に苦しんでいる。高齢者においては骨折治癒が遅れる場合が多く、生活の質の低下及び健康管理コストの増加をまねいている。骨折修復を促進させるための新規治療手法の開発が重要な臨床ニーズとなっている。有望な結果を示す骨折の動物モデル及びヒトにおける間葉系幹／前駆細胞（ＭＰＣ）の試験が行われている（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：４９１−５１４）。骨折治癒に能動的に関与する３つの細胞プロセスは、ＭＰＣの骨折部位へのホーミング、増殖、及び骨原性細胞への分化である（Ｕｎｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２９：１８０４−１８１１；Ｓａｔｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１６：７−２３）。これら３つのプロセスの全てを調節する因子が理想的な薬物候補または薬物標的となるであろう。Ｅ３リガーゼのＮｅｄｄ４サブクラスにおけるいくつかのメンバーを欠損したマウス由来のＭＰＣが、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）を介してＲｕｎｘ２、ＪｕｎＢ及びＣＸＣＲ４タンパク質の安定性を向上させることにより、遊走、増殖及びＯＢ分化を促進していることが見出された（Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０：５５４−５６３）。高齢マウス由来のＭＰＣは、ＵＰＳ介在性のＲｕｎｘ２及びＪｕｎＢ分解を促進している（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８  １９２５−１９３５）。
【０００４】
ＵＰＳはタンパク質の翻訳後修飾における重要な複合細胞機構（とりわけ基質へとユビキチンを付加するまたは基質からユビキチンを除去する）であり、プロテアソームまたはリソソームによるユビキチン化（Ｕｂ）基質の分解をもたらす。基質のユビキチン化は、ユビキチンを標的分子へと結合させることにより基質特異性を付与する連続的な酵素反応（ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２及びユビキチンリガーゼＥ３が関与する）を介して行われる。多数の骨芽細胞（ＯＢ）陽性調節因子、例えば、ＢＭＰシグナル伝達タンパク質（Ｓａｐｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２５：４４１−４５４）及びＴＧＦβシグナル伝達タンパク質（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｎｃｅｒ  １２１：８０−８７）、Ｒｕｎｘ２（Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０：５５４−５６３）、ＪｕｎＢ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１：７０−７８）、ならびにＣＸＣＲ４（Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：９０１−９１９；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｓａｋｉ，２００３，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４２：１３１９−１３３０）は、Ｅ３リガーゼのＮｅｄｄ４サブクラス（Ｎｅｄｄ４−１、Ｎｅｄｄ４−２、Ｉｔｃｈ、ＷＷＰ１＆２、及びＳｍａｄユビキチン化制御因子（Ｓｍｕｒｆ）１＆２を含む７つのメンバーで構成される）によりＵＰＳを介して調節される。
【０００５】
骨におけるＥ３リガーゼのＳｍｕｒｆ１、ＷＷＰ１及びＩｔｃｈの役割が、Ｓｍｕｒｆ１−／−、ＷＷＰ１−／−及びＩｔｃｈ−／−マウスを用いて研究されている。それら全ては、ＪｕｎＢ及びＲｕｎｘ２のユビキチン化及び分解の結果として、骨体積、骨形成及びＯＢ分化を促進させている（Ｗｅａｔｈｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｌａｍｐａｌｌｉ，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：６−１２；Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：１１４３−１１４８；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０：１３５５−１３５９；Ａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：２１３１−２１４０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．；Ｂａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ  ７：８７−９７；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６２：１８８１−１８８９）。骨折修復は、炎症、血管新生及び骨形成を含む一連の現象（複数の機構により制御される）で構成されることが発見されている。しかしながら、骨折治癒におけるＵＰＳによるタンパク質代謝回転の役割については研究されていなかった。
【０００６】
加えて、臨床上の主な課題として、加齢に伴うＭＰＣ−ＯＢ分化減退に一部起因して高齢者が難治性骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）に苦しむ場合が多いということが挙げられる（Ｌｉｅｂｅｒｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２１：１６３１−１６３８）。高齢マウス由来のＭＰＣがＲｕｎｘ２及びＪｕｎＢタンパク質のＵＰＳ介在性プロテアソーム分解を促進していることが以前より報告されている（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．２８：１９２５−１９３５）。
【０００７】
ボルテゾミブ（Ｂｔｚ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓがベルケイド（元の名称はＰＳ−３４１）として市販している）は、多発性骨髄腫患者用のＦＤＡ承認済みプロテアソーム阻害薬である。ボルテゾミブは、２０Ｓプロテアソームの活性タンパク質分解部位が可逆的に占有することでプロテアソームを阻害することにより作用する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１：７０−７８）。骨髄腫細胞に対するボルテゾミブの主な細胞傷害効果は、過剰タンパク質蓄積後のアポトーシス誘導によるものである（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１０：２０３４−２０４２）。ボルテゾミブは、インビトロにおいてマウス及びヒトのＭＰＣからのＯＢ分化を促進し（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：４９１−５０４；Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９０：２６３−２７２）、ＯＢ陽性調節因子の代謝回転を阻害することでＭＰＣ−ＯＢ分化を促進し、また、ＮＦ−κＢ／ＴＲＡＦ６シグナル経路を阻害することで破骨細胞（ＯＣ）形成を阻害する（Ｈｏｎｇｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｊｉａｎ，２００９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．３３：１１５−１２２；Ｋｈｅｄｇｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．４：ｅ７７８）。ボルテゾミブのＯＢに対するプラスの作用及びＯＣに対するマイナスの作用により、Ｂｔｚ及びその他プロテアソーム阻害薬は、骨同化薬開発における非常に魅力的な候補とみなされている。いくつかのマウス研究では、Ｂｔｚが、正常マウス及びＯＶＸマウスにおける骨体積を増加させること（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：８０−８７）、及び、骨折治癒を促進すること（Ｋｈｅｄｇｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．４：ｅ７７８；Ｍａｓｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１５：６００−６１２）（その全ては若年マウスまたは成体マウスを用いて実施された）を報告している。しかしながら、臨床でのＢｔｚの利用については、その毒性、例えば、末梢神経障害及び血小板減少症などによる制限がある（Ｗｅａｔｈｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｌａｍｐａｌｌｉ，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：６−１２）。全身分布により生じる毒性副作用を改善及び／または予防するため、とりわけ骨組織に向けてＢｔｚを選択的に送達させるための、また治療効果を向上させるため、用量漸増を可能とするための新規手法が差し迫って求められている。
【０００８】
骨髄腫治療の臨床情報は、Ｂｔｚ、及びカルフィルゾミブ（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓがカイプロリスとして市販している）を含むその他プロテアソーム阻害薬が、末梢神経障害及び血小板減少症などの重大な毒性を有している（それにより阻害薬の利用が制限される）ことを示している。マウスにおいて、Ｂｔｚは、その投与後早ければ３日で胸腺内のＴ細胞数を有意に減少させる（Ｍａｓｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１５：６００−６１２）。これら副作用は、薬物の全身分布によるものであると考えられている。最近では、Ｂｔｚを活性ビスホスホネート（ＢＰ）に結合させることによる骨標的（ＢＴ）Ｂｔｚの合成が試みられている（Ａｇｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２３：６４５５−６４５８）。これらＢｔｚ−ＢＰ複合体がインビトロで骨髄腫細胞の増殖を阻害するという研究結果にも関わらず、それらのインビボでの効果が有効であるとは報告されていなかった。更に、これらＢｔｚ−ＢＰ複合体は、インビボで開裂が生じる見込みがないように、またたとえ開裂が生じたとしてもＢｔｚが放出基質とならないように、化学的または生化学的に安定な結合を用いてＢｔｚをＢＰに結合している。更に、生理活性（抗吸収性）ＢＰ（アレンドロネート）もまたこの複合体調製に利用され、それにより、活性源を同定することが困難となった（Ａｇｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２３：６４５５−６４５８）。
【０００９】
近赤外（ＮＩＲ）蛍光性ＢＰ誘導体（ＮＩＲ蛍光体ＩＲＤｙｅ７８は、コンジュゲートのための１つの第一級アミンを含むＢＰパミドロネートにコンジュゲートしている）が開発され、細胞内または生きたマウス内で用いられている（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．６６：６５７−６６６；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２８：１９２５−１９３５）。ＮＩＲイメージングはまた、マウスにおけるリンパ液排出能の調査に使用されている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２５：１２４６−１２５６；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２９：１６０１−１６１０）。
【００１０】
全身分布により生じる毒性副作用を改善及び／または予防するため、とりわけ骨組織に向けてＢｔｚなどの化合物を選択的に送達させるための、また治療効果を向上させるため、用量漸増を可能とするための新規化合物及び方法が当該技術分野において求められている。そして本発明はこのニーズを満たしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、式（Ｉ）の化合物、
【化１】
2018537526.tif 000003
（Ｉ）、
式（Ｉ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｒ３は、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ４は、水素、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択され、式中、アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキル及びアルキルＺ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０からなる群から選択され、式中、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ２は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ３は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ３は、Ｎ、ＣＲ１２及びフェニルからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｚ５は、アリール、アルキル、ＯＲ１８及び
【化２】
2018537526.tif 000004
からなる群から選択され、式中、アリールまたはアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ５はそれぞれ独立して、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＣＲ１５及びＮからなる群から選択され、
Ｘ２は、ＣＲ１６及びＮからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｒ１７はそれぞれ、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１８は、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜２の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物を含む。
【００１２】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物、
【化３】
2018537526.tif 000005
（ＩＩ）、
式（ＩＩ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
ｍは１、２または３であり、
ｐは１、２または３であり、
ｎは、０〜１０の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。
【００１３】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物、
【化４】
2018537526.tif 000006
（ＩＩＩ）、
式（ＩＩＩ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
ｍは、１〜５の整数であり、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｐは、１〜５の整数であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。
【００１４】
一実施形態では、Ｙは−ＰＯ３（Ｒ１）２である。別の実施形態では、Ｌ１は、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｌ１は−ＣＨ２ＣＨＲ１９−であり、式中、Ｒ１９は、
【化５】
2018537526.tif 000007
及び
【化６】
2018537526.tif 000008
からなる群から選択される。
【００１５】
別の実施形態では、Ｌ２は、フェニル、及びＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖からなる群から選択され、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基、カルボニル基またはシクロアルキル基で任意選択的に置換される。別の実施形態では、Ｌ３は、フェニル、及びＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖からなる群から選択され、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基、カルボニル基またはシクロアルキル基で任意選択的に置換される。別の実施形態では、ＡはＣ（＝Ｎ）またはＣ（＝Ｏ）である。別の実施形態では、Ｚ２はＯである。別の実施形態では、Ｚ５は
【化７】
2018537526.tif 000009
である。別の実施形態では、Ｚ５は
【化８】
2018537526.tif 000010
である。別の実施形態では、化合物は、
【化９】
2018537526.tif 000011
【化１０】
2018537526.tif 000012
【化１１】
2018537526.tif 000013
【化１２】
2018537526.tif 000014
【化１３】
2018537526.tif 000015
【化１４】
2018537526.tif 000016
【化１５】
2018537526.tif 000017
【化１６】
2018537526.tif 000018
【化１７】
2018537526.tif 000019
【化１８】
2018537526.tif 000020
【化１９】
2018537526.tif 000021
【化２０】
2018537526.tif 000022
及び
【化２１】
2018537526.tif 000023
、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物からなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態では、化合物は、
は
【化２２】
2018537526.tif 000024
、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。
【００１７】
本発明はまた、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含むかまたはその治療薬からなる、少なくとも１種の化合物を含む、治療薬を制御状態で骨に局所送達するための組成物を含み、治療薬はボルテゾミブまたはそのアナログである。一実施形態では、少なくとも１種の化合物は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。別の実施形態では、組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を更に含む。別の実施形態では、治療薬は、骨形成を必要とする部位において、化合物から制御可能に放出される。
【００１８】
本発明はまた、対象内の骨形成を必要とする部位において骨形成を促進させるための方法、もしくは、より少ない骨吸収を必要とする対象内の骨吸収を抑制するための方法、またはその両方の方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。
【００１９】
本発明はまた、それを必要とする対象における多発性骨髄腫及び骨がんからなる群から選択される疾患を治療するための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。別の実施形態では、少なくとも１種の化合物は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。別の実施形態では、組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を更に含む。
【００２０】
一実施形態では、対象は、多発性骨髄腫、骨粗鬆症、骨壊死、変形性関節症、関節リウマチ、パジェット病、骨折治癒、プロテーゼの緩み、骨がん、骨髄増殖性疾患、放射線療法誘発性骨粗鬆症、白血病、及び骨に転移したがんからなる群から選択される疾患または障害を有する。別の実施形態では、治療薬は、骨形成を必要とする部位において、化合物から制御可能に放出される。
【００２１】
本発明はまた、対象内の骨、骨髄及び骨周囲組織のがん細胞を殺傷するための方法を含む。方法は、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、対象は多発性骨髄腫を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明を説明する目的で、本発明の特定の実施形態について図中に示す。しかしながら、本発明は、図中に示す実施形態の正確な構成及び手段に限定されない。
【図１】図１Ａ〜図１Ｂを含み、骨折カルス内におけるＥ３レベル及びＵｂタンパク質レベルの上昇を示す実験データについて記載している。骨折後の別々の時点で、Ｃ５７／Ｂ６  ＷＴマウスを殺した。図１Ａは、ｑＰＣＲを用いて測定した骨折カルス内におけるＥ３リガーゼの発現レベルを示す実験データのグラフである。倍率変化は、別々の時点における数値を０時間における数値（１とする）で割ることで求めた。図１Ｂは、イムノブロット法における一連の画像である。殺す２４時間前にＭＧ１３２をマウスに投与した。全細胞溶解物を抗ユビキチンＡｂでブロッティングすることで、全Ｕｂタンパク質の発現を測定した。ＵｂアッセイでＵｂ−ＪｕｎＢタンパク質を検出した。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｆを含み、ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）がカルス形成、骨強度、ＭＳＣ数、及び骨芽細胞陽性調節因子の発現を促進することを示す実験データについて記載している。開放性脛骨骨折させたＷＴマウスを、骨折後１、３、５、７日目にＢｔｚ（０．６ｍｇ／ｋｇ（体重）、ｉｐ）または溶媒で治療して、骨折後別々の日に殺した。図２Ａは、ボルテゾミブの化学構造の画像である。図２Ｂは、骨折後１０日におけるカルスサイズのμＣＴデータ解析を示すグラフである。Ｎ＋４匹のマウス／群。図２Ｃは、軟骨形成（ブルー）及び骨形成（ピンク）を示すアルシアンブルーヘマトキシリン／オレンジＧエオシンで染色した骨折脛骨における代表的な組織構造の一連の画像である。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエアシステムで組織形態計測を行った。Ｎ＝３匹のマウス／群。図２Ｄは、骨折後２８日における脛骨の生体力学試験データを示す一連のグラフである。Ｎ＝５匹のマウス／群。図２Ｅは、骨折後７日におけるカルス細胞の免疫表現型データを示す一連のスペクトル画像である。図２Ｆは、骨折後１０日における全Ｕｂタンパク質のタンパク質発現レベル、ならびにカルス内におけるＪｕｎＢ及びＲｕｎｘ２レベルを示すイムノブロット法における一連の画像である。＊溶媒群に対して、ｐ＜０．０５。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｆを含み、ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）がカルス形成、骨強度、ＭＳＣ数、及び骨芽細胞陽性調節因子の発現を促進することを示す実験データについて記載している。開放性脛骨骨折させたＷＴマウスを、骨折後１、３、５、７日目にＢｔｚ（０．６ｍｇ／ｋｇ（体重）、ｉｐ）または溶媒で治療して、骨折後別々の日に殺した。図２Ａは、ボルテゾミブの化学構造の画像である。図２Ｂは、骨折後１０日におけるカルスサイズのμＣＴデータ解析を示すグラフである。Ｎ＋４匹のマウス／群。図２Ｃは、軟骨形成（ブルー）及び骨形成（ピンク）を示すアルシアンブルーヘマトキシリン／オレンジＧエオシンで染色した骨折脛骨における代表的な組織構造の一連の画像である。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエアシステムで組織形態計測を行った。Ｎ＝３匹のマウス／群。図２Ｄは、骨折後２８日における脛骨の生体力学試験データを示す一連のグラフである。Ｎ＝５匹のマウス／群。図２Ｅは、骨折後７日におけるカルス細胞の免疫表現型データを示す一連のスペクトル画像である。図２Ｆは、骨折後１０日における全Ｕｂタンパク質のタンパク質発現レベル、ならびにカルス内におけるＪｕｎＢ及びＲｕｎｘ２レベルを示すイムノブロット法における一連の画像である。＊溶媒群に対して、ｐ＜０．０５。
【図３】ＢＰ−Ｂｔｚ１の例示的な合成スキームである。一実施形態では、Ｂｔｚは、カルバメートリンカーの開裂及び／またはボロン酸エステルの加水分解により放出され得る。試薬及び条件：１：トリホスゲン（０．５当量）、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２、２：トリエタノールアミン、トルエン、４：Ｂｔｚ（３）、トルエン−ＤＭＳＯ、加熱（−Ｈ２Ｏ）、その後、トリメチルシリルブロミドに続いてＨ２Ｏ。
【図４】アミン安定化ボロン酸エステル複合体を介して放出され得るＢＰ−Ｂｔｚ１１の例示的な合成スキームである。試薬及び条件：５：ジエタノールアミン、エチルブロモアセテートコリジン、ＣＨ２Ｃｌ２、室温、６：塩化ｔ−ブチルジメチルシリル、イミダゾール（触媒）、ＣＨ２Ｃｌ２、室温、それから、水酸化カリウム、メタノール、８：塩化オキサリル、エーテル、０℃、それから、アミノＢＰ、７；９：フッ化テトラブチルアンモニウム、テトラヒドロフラン、室温、それから、Ｂｔｚ（３）、トルエンＤＭＳＯ、加熱（−Ｈ２Ｏ）、それから、トリメチルシリルブロミド、ＣＨ２Ｃｌ２、室温、続いて、ＮａＯＨ、水、凍結乾燥。アミノ酸アナログ６の鎖長を長くすることで、ＢＰ−Ｂｔｚ２を同様に調製してもよい。
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｄを含み、骨基質に結合した骨標的ボルテゾミブ（ＢＰ−Ｂｔｚ）が破骨細胞を阻害して骨芽細胞を促進している（プロテアソーム阻害に関連）ことを示す実験データについて記載している。図５Ａは、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ１の例示的な合成スキームである。図５Ｂは、１μＭのＢＰ−Ｂｔｚ１、Ｂｔｚまたはビスホスホネート（ＢＰ）で一晩プレインキュベートした骨スライスの一連の画像である。薬液を除去してから、骨スライスをＰＢＳで広範囲にわたって洗浄した。ＵＢＧ７６Ｖ−ＧＦＰマウス由来の骨基質（ＢＭ）細胞を、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下、骨スライス上で９日間培養した。上段画像（ａ）：蛍光顕微鏡でＧＦＰ＋細胞を観察して、ＧＦＰシグナル強度を定量した。中段画像（ｂ）：骨スライスを固定して、破骨細胞（ＯＣ）のＴＲＡＰ染色を行った。ＯＣ数／スライスをカウントした。下段画像（ｃ）：スライスから細胞を除去した。トルイジンブルー染色を行い、窩領域／スライスをカウントした。図５Ｃは、培養及びＡＬＰ染色したマウスＢＭ細胞の一連の画像である。図５Ｄは、培養及びＡＬＰ染色したヒトＭＳＣの一連の画像である。マウスＢＭ細胞及びヒトＭＳＣを、異なる濃度のＢＰ−Ｂｔｚ１またはＢｔｚを添加したＯＢ誘導培地中でそれぞれ４日間または６日間培養した。細胞をＡＬＰ染色した。ＡＬＰ＋領域をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて測定した。＊Ｂｔｚ治療細胞に対して、Ｐ＜０．０５。
【図５−２】図５Ａ〜図５Ｄを含み、骨基質に結合した骨標的ボルテゾミブ（ＢＰ−Ｂｔｚ）が破骨細胞を阻害して骨芽細胞を促進している（プロテアソーム阻害に関連）ことを示す実験データについて記載している。図５Ａは、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ１の例示的な合成スキームである。図５Ｂは、１μＭのＢＰ−Ｂｔｚ１、Ｂｔｚまたはビスホスホネート（ＢＰ）で一晩プレインキュベートした骨スライスの一連の画像である。薬液を除去してから、骨スライスをＰＢＳで広範囲にわたって洗浄した。ＵＢＧ７６Ｖ−ＧＦＰマウス由来の骨基質（ＢＭ）細胞を、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下、骨スライス上で９日間培養した。上段画像（ａ）：蛍光顕微鏡でＧＦＰ＋細胞を観察して、ＧＦＰシグナル強度を定量した。中段画像（ｂ）：骨スライスを固定して、破骨細胞（ＯＣ）のＴＲＡＰ染色を行った。ＯＣ数／スライスをカウントした。下段画像（ｃ）：スライスから細胞を除去した。トルイジンブルー染色を行い、窩領域／スライスをカウントした。図５Ｃは、培養及びＡＬＰ染色したマウスＢＭ細胞の一連の画像である。図５Ｄは、培養及びＡＬＰ染色したヒトＭＳＣの一連の画像である。マウスＢＭ細胞及びヒトＭＳＣを、異なる濃度のＢＰ−Ｂｔｚ１またはＢｔｚを添加したＯＢ誘導培地中でそれぞれ４日間または６日間培養した。細胞をＡＬＰ染色した。ＡＬＰ＋領域をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて測定した。＊Ｂｔｚ治療細胞に対して、Ｐ＜０．０５。
【図５−３】図５Ａ〜図５Ｄを含み、骨基質に結合した骨標的ボルテゾミブ（ＢＰ−Ｂｔｚ）が破骨細胞を阻害して骨芽細胞を促進している（プロテアソーム阻害に関連）ことを示す実験データについて記載している。図５Ａは、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ１の例示的な合成スキームである。図５Ｂは、１μＭのＢＰ−Ｂｔｚ１、Ｂｔｚまたはビスホスホネート（ＢＰ）で一晩プレインキュベートした骨スライスの一連の画像である。薬液を除去してから、骨スライスをＰＢＳで広範囲にわたって洗浄した。ＵＢＧ７６Ｖ−ＧＦＰマウス由来の骨基質（ＢＭ）細胞を、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下、骨スライス上で９日間培養した。上段画像（ａ）：蛍光顕微鏡でＧＦＰ＋細胞を観察して、ＧＦＰシグナル強度を定量した。中段画像（ｂ）：骨スライスを固定して、破骨細胞（ＯＣ）のＴＲＡＰ染色を行った。ＯＣ数／スライスをカウントした。下段画像（ｃ）：スライスから細胞を除去した。トルイジンブルー染色を行い、窩領域／スライスをカウントした。図５Ｃは、培養及びＡＬＰ染色したマウスＢＭ細胞の一連の画像である。図５Ｄは、培養及びＡＬＰ染色したヒトＭＳＣの一連の画像である。マウスＢＭ細胞及びヒトＭＳＣを、異なる濃度のＢＰ−Ｂｔｚ１またはＢｔｚを添加したＯＢ誘導培地中でそれぞれ４日間または６日間培養した。細胞をＡＬＰ染色した。ＡＬＰ＋領域をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて測定した。＊Ｂｔｚ治療細胞に対して、Ｐ＜０．０５。
【図６】高齢マウスの骨折カルス内におけるＵｂタンパク質増加を示す実験データを示すイムノブロット法の画像である。Ｙ＝若年マウス、Ａ＝高齢マウス。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃを含み、骨折カルスの初期段階におけるＮｅｓｔｉｎ−ＧＦＰ＋細胞増加を示す実験データについて記載している。Ｎｅｓｔｉｎ−ＧＦＰマウスを使用した。図７Ａは、脛骨の染色凍結切片の一連の画像である。骨折後７日の脛骨を凍結切片にした。切片をＤＡＰＩで染色して、ホールスライドイメージングシステムを用いてスキャンした後にデジタル画像に変換した。骨折骨のカルス内で軟骨に隣接し新たに形成された線維性骨において、多数のＧＦＰ＋細胞（グリーン）が観察された。図７Ｂは、骨折後７日の細胞集団における実験データのグラフである。酵素消化により細胞をカルスから単離してから、α−ＣＤ４５、ＣＤ１０５またはＳｃａ−１  Ａｂで染色し、フローサイトメトリーにかけてＮｅｓｔｉｎ−ＧＦＰ＋、ＣＤ４５−ＣＤ１０５＋またはＣＤ４５−Ｓｃａ−１＋細胞の割合を評価した。図７Ｃは、Ｎｅｓｔｉｎ−ＧＦＰ＋細胞とＣＤ４５−ＣＤ１０５＋Ｓｃａ−１＋細胞との間の相関を示すグラフである。
【図８】図８Ａ〜図８Ｄを含み、Ｂｔｚが高齢マウスにおける骨折修復を促進することを示す実験データについて記載している。２０ヶ月齢Ｂ６マウスを脛骨骨折させて、Ｂｔｚ（０．６ｍｇ／ｋｇ（体重）、ｉ．ｐ．）または生理食塩水（対照）を、骨折後１、３及び５日目に３回投与した。図８Ａは、２８日目にμＣＴを実施したマウスのカルス体積を示すグラフである。図８Ｂは、２８日目に生体力学試験を実施したマウスの実験データを示すグラフである。図８Ｃは、２８日目に組織構造解析を実施するために殺したマウスの実験データを示すグラフである。数値は６匹のマウスの平均である。＊生理食塩水で治療したマウスに対して、Ｐ＜０．０５。図８Ｄは、脛骨骨折手術を行い骨折後１４日目に殺した３ヶ月齢（若年）マウス及び２０ヶ月齢（高齢）マウスのデータのグラフである。骨折カルス内におけるＣＤ４５−ＣＤ１０５＋Ｓｃａ−１＋細胞の％を、図７Ｂに示すとおりフローサイトメトリーを用いて測定した。数値は４匹のマウスの平均である。＊生理食塩水で治療した高齢マウスに対して、Ｐ＜０．０５。＃若年マウスに対して、Ｐ＜０．０５。
【図９】化合物ＢＰ−Ｂｔｚ２〜ＢＰ−Ｂｔｚ６の化学構造を示す図である。
【図１０】化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０の化学構造を示す図である。
【図１１】化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７及びＢＰ−Ｂｔｚ８の例示的な合成スキームである。
【図１２】染料ＣＷ８００にコンジュゲートした本発明の化合物の例示的な合成を示す。
【図１３】異なる相対開裂速度を有しボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはその他プロテアソーム阻害薬をインビボで放出する、様々なボロネート結合を有する本発明の化合物を示す図である。
【図１４】酸加水分解条件下、骨標的ボルテゾミブアナログからのＢｔｚ基開裂を示す概略図である。
【図１５】非結合薬物に置換するために表面を洗浄した後であってもＢＰ−Ｂｔｚ１が骨基質に結合して、破骨細胞機能及び骨芽細胞分化を阻害することを示す実験データの一連の画像である。
【図１６】ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨芽細胞分化を刺激することを示す実験データの一連の画像である。
【図１７】ＢＰ−Ｂｔｚ１がＷＴマウスの骨体積及び骨芽細胞分化を促進させることを示す実験データの画像である。
【図１８】ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚよりもより持続するユビキチン化作用を有することを示す実験データの画像である。
【図１９】ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと同じくらい効果的にＯＶＸマウスのＯＶＸ誘導骨吸収を抑制し、骨量及び強度を増加させることを示す実験データの一連の画像である。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｂを含み、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＯＶＸマウスの骨量及び強度を増加させることを示す実験データの一連の表である。図２０Ａは、組織形態計測データを示す。図２０Ｂは、生体力学データを示す。
【図２１】ＢＰ−Ｂｔｚ１がＯＶＸマウス由来細胞からＣＦＵ−Ｆコロニー形成を増加させることを示す実験データについて記載している。
【図２２】ＢＰ−Ｂｔｚ１がＯＶＸマウス由来細胞からＣＦＵ−ＡＬＰコロニー形成を増加させることを示す実験データについて記載している。
【図２３】ＢＰ−Ｂｔｚ１がインビトロで骨髄腫細胞の増殖を阻害することを示す実験データの表について記載している。
【図２４】ＢＰ−Ｂｔｚ１を試験する多発性骨髄腫マウスモデルの例示的なスキームである。
【図２５−１】図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより効果的に全身腫瘍組織量及び骨髄腫誘導骨吸収を抑制することを示す実験データについて記載している。図２５Ａは、実験例に用いる群及び治療を示す。図２５Ｂは、臨床観測結果の表を示す。図２５Ｃは、骨髄腫細胞の分布を示すＧＦＰイメージングの画像を示す。図２５Ｄは、血中ＩｇＧ２ｂ濃度を示す実験データの表である。図２５Ｅは、骨芽細胞分化を示す実験データの表である。
【図２５−２】図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより効果的に全身腫瘍組織量及び骨髄腫誘導骨吸収を抑制することを示す実験データについて記載している。図２５Ａは、実験例に用いる群及び治療を示す。図２５Ｂは、臨床観測結果の表を示す。図２５Ｃは、骨髄腫細胞の分布を示すＧＦＰイメージングの画像を示す。図２５Ｄは、血中ＩｇＧ２ｂ濃度を示す実験データの表である。図２５Ｅは、骨芽細胞分化を示す実験データの表である。
【図２５−３】図２５Ａ〜図２５Ｅを含み、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより効果的に全身腫瘍組織量及び骨髄腫誘導骨吸収を抑制することを示す実験データについて記載している。図２５Ａは、実験例に用いる群及び治療を示す。図２５Ｂは、臨床観測結果の表を示す。図２５Ｃは、骨髄腫細胞の分布を示すＧＦＰイメージングの画像を示す。図２５Ｄは、血中ＩｇＧ２ｂ濃度を示す実験データの表である。図２５Ｅは、骨芽細胞分化を示す実験データの表である。
【図２６】ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより効果的に骨髄腫誘導骨吸収を予防することを示す実験データの一連の画像である。大腿骨体積を試験した。
【図２７】末梢血血小板数及び細胞数に対して、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより少ない有害作用を有することを示す実験データについて記載している。
【図２８】ＢＰ−Ｂｔｚ１で治療した骨髄腫マウス由来の骨髄細胞がより多くの骨芽細胞コロニーを形成することを示す実験データについて記載している。
【図２９−１】図２９Ａ〜図２９Ｅを含み、ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨髄内のＢ細胞数を減少させ、Ｂｔｚと比較してより低い全身性毒性を有することを示す実験データについて記載している。Ｃ５７／Ｂ６マウス、７週、ＢＰまたはＢｔｚ（０．６ｍｇ／ｋｇ）、ＢＰ−Ｂｔｚ（１．２ｍｇ／ｋ）、３週間にわたり毎日。図２９Ａは、実験例に用いる群及び治療を示す。図２９Ｂは、治療前後の体重の実験データの表を示す。図２９Ｃ及び図２９Ｄは、ＢＰ−Ｂｔｚが骨髄内のＢ細胞数を減少させることを示す実験データについて記載している。図２９Ｃは、胸腺の実験データの表を示す。図２９Ｄは、骨髄の実験データを示す。図２９Ｅは、ＢＰ−Ｂｔｚ１が神経細胞への毒性作用を予防することを示す後根神経節ニューロパチーのＥＭ画像について記載している。
【図２９−２】図２９Ａ〜図２９Ｅを含み、ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨髄内のＢ細胞数を減少させ、Ｂｔｚと比較してより低い全身性毒性を有することを示す実験データについて記載している。Ｃ５７／Ｂ６マウス、７週、ＢＰまたはＢｔｚ（０．６ｍｇ／ｋｇ）、ＢＰ−Ｂｔｚ（１．２ｍｇ／ｋ）、３週間にわたり毎日。図２９Ａは、実験例に用いる群及び治療を示す。図２９Ｂは、治療前後の体重の実験データの表を示す。図２９Ｃ及び図２９Ｄは、ＢＰ−Ｂｔｚが骨髄内のＢ細胞数を減少させることを示す実験データについて記載している。図２９Ｃは、胸腺の実験データの表を示す。図２９Ｄは、骨髄の実験データを示す。図２９Ｅは、ＢＰ−Ｂｔｚ１が神経細胞への毒性作用を予防することを示す後根神経節ニューロパチーのＥＭ画像について記載している。
【図３０】（（（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパンアミド）−ブチル）−１，３，７，２−ジオキサザボレカン−７−イル）エトキシ）カルボニル）アミノ）メチレン）ジホスホン酸の例示的な合成スキームである。
【図３１】（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）アセトアミド）メチレン）ジホスホン酸の例示的な合成スキームである。
【図３２】（（４−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパン−アミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）ブタンアミド）メチレン）ジホスホン酸の例示的な合成スキームである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、骨形成に有用な新規ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）複合体の予想外な同定を含む。別の態様では、本発明は、多発性骨髄腫の治療に有用な新規Ｂｔｚ複合体の予想外な同定を含む。これら骨標的化合物は、Ｂｔｚを相対的に生化学的に不活性または活性なビスホスホネート（ＢＰ）にコンジュゲートするように設計された新規化学的リンカー技術を含む。本明細書において実証しているが、本発明の化合物は、破骨細胞形成の低減及び予防、ならびに、骨芽細胞形成の促進の両方において効果的であることが分っている。本発明の化合物はまた、抗腫瘍薬として直接効果的であることが分かっている。本発明の化合物は、骨折修復において、また抗骨髄腫細胞薬としての高い効果を有しており、毒性など全身性の副作用がＢｔｚ（骨標的ではない）の副作用と比較して低い。本発明の化合物は、多発性骨髄腫を有する患者に加えて、その他骨の障害、例えば、骨折、骨粗鬆症、がんの骨転移、放射線療法誘発性骨粗鬆症及び関節炎を有する患者を治療するのに有用である。それゆえ、本発明はまた、骨の障害の治療に有用な組成物及び方法を含む。
【００２４】
部分的に、本発明は、骨標的の目的で特定の薬物をビスホスホネート残基に結合させるための新規化学的手法を提供し、骨の近くにある複合体から薬物を放出することにより、骨区画へのより優れた薬物送達、及び複合体の遊離薬物構成成分を投与する場合よりも複合体のより優れた全身安全性を可能とする。ビスホスホネート構成成分の安全性は通常、その緩慢な生理活性または短期使用及び低用量により高くなる。本発明はまた、今日まで研究されてこなかった高齢者を含む大規模な患者集団における骨折治癒を促進する新規分子経路、ユビキチン−プロテアソーム系を部分的に提供する。
【００２５】
当業者は理解するであろうが、ペイロードの放出速度を調節するために、本発明の化合物に固有の化学結合点及びその他化学変異体に対して変更を行ってもよい。一部の実施形態では、化合物は開裂不可能なリンカーを含み、また化合物は、親Ｂｔｚに固有な薬理活性と少なくとも同等の生理活性を有する。本明細書において実証しているが、Ｂｔｚが若年及び高齢の骨折マウスにおけるカルス形成を促進して骨強度を増加させることが分かっており、それは、Ｎｅｓｔｉｎ＋ＭＰＣ、Ｕｂタンパク質及び血管形成の増加に関係している。
【００２６】
本発明はまた、対象内の骨形成を必要とする部位において、骨形成を促進させるための新規方法を含む。本発明はまた、骨に関連するがんの部位またはその近接部位において、骨形成を促進させるための新規方法を含む。一実施形態では、対象は、多発性骨髄腫、骨粗鬆症、骨壊死、骨髄炎、変形性関節症、関節リウマチ、パジェット病、骨折治癒、プロテーゼの緩み、骨がん、白血病、骨髄増殖性疾患、放射線療法誘発性骨粗鬆症、及び骨に転移したがんからなる群から選択される疾患または障害を有する。
【００２７】
本発明はまた、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む、治療薬を制御状態で骨に局所送達するための組成物を含む。一実施形態では、治療薬はボルテゾミブまたはそのアナログである。本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも１種を含む組成物を含み、組成物は更に、任意選択的に少なくとも１種の別の治療薬を含む。一実施形態では、治療薬は、骨形成を必要とする部位において、化合物から制御可能に放出される。別の実施形態では、治療薬は、がん治療に関係する骨の部位において、化合物から制御可能に放出される。一実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。
【００２８】
定義
別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様または同等の任意の方法及び物質を、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法及び物質について説明する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、本項における用語に関連した意味を有する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的物の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を意味する。例として、「ａｎ  要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素のことを意味する。
【００３１】
量、持続時間などの測定値に言及して本明細書で使用する場合、「約」とは、本開示の方法を実施するのに適切な偏差となるように、記載値から±２０％または±１０％の、より好ましくは±５％の、更により好ましくは±１％の、その上より好ましくは±０．１％の偏差を包含することを意味する。
【００３２】
生物、組織、細胞またはその構成成分の文脈において使用する場合、用語「異常」とは、「正常」な（期待される）対応する特徴を示すそれら生物、組織、細胞またはその構成成分とは少なくとも１つの観察可能または検出可能な特徴（例えば、年齢、治療、時刻など）が異なる、それら生物、組織、細胞またはその構成成分のことを意味する。ある細胞型または組織型における正常または期待される特徴は、別の細胞型または組織型において異常であり得る。
【００３３】
「疾患」とは、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善しない場合に動物の健康が悪化し続けるような動物の健康状態のことである。
【００３４】
それに対して「障害」とは、動物が恒常性を維持可能ではあるが、疾患がない状態と比較して動物の健康状態が良好性に欠けるような動物の健康状態のことである。未治療のまま放置したとしても、疾患が必ずしも動物の健康状態の更なる低下をもたらすということではない。
【００３５】
疾患または障害における徴候または症候の重症度、このような徴候または症候を患者が経験する頻度、またはその両方が低減する場合、疾患または障害は「緩和」される。
【００３６】
用語「患者」、「対象」または「個体」は、本明細書では同じ意味で用いられ、インビトロまたはｉｎ  ｓｉｔｕに関わらず、本明細書に記載する方法の対象となる任意の動物またはその細胞のことを意味する。非限定実施形態において、患者、対象または個体はヒトである。
【００３７】
本発明で使用する場合、用語「医薬組成物」とは、本発明において有用な少なくとも１種の化合物と薬学的に許容される担体の混合物のことを意味する。医薬組成物は、患者または対象への化合物の投与を容易にする。当該技術分野に存在する化合物投与のための多数の技術としては、静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、眼投与、経肺投与及び局所投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
「治療用の」治療薬は、病状の徴候を示す対象へとそれら徴候を減少または排除する目的で投与される治療薬である。
【００３９】
本発明で使用する場合、用語「治療」または「治療する」は、治療薬、すなわち本発明の化合物（単剤でまたは別の医薬品と併用して）の患者への適用または投与と定義され、または、本明細書において検討する症状、本明細書において検討する症状の徴候または症候、または本明細書において検討する症状を発症する可能性を有する患者由来の単離組織または細胞株（例えば、診断用途またはエクスビボ用途）へと、本明細書において検討する症状、本明細書において検討する症状の症候、または本明細書において検討する症状を発症する可能性を治療、治癒、緩和、軽減、変化、矯正、改善、好転または影響を及ぼす目的で、治療薬を適用または投与することと定義される。このような治療薬を、薬理ゲノミクス分野から得た知識に基づき具体的に調製または改質してもよい。
【００４０】
本発明で使用する場合、用語「有効量」、「薬学的有効量」及び「治療有効量」とは、所望の生理学的効果をもたらすのに十分な量ではあるが非毒性の薬剤のことを意味する。その効果は、疾患または障害の徴候、症候または原因の低減及び／または緩和であってもよく、または、生物学的機構における任意のその他所望の変化であってもよい。任意の個々のケースにおける適切な治療量については、当業者が日常的に用いる実験法を利用することにより決定してもよい。
【００４１】
本発明で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、化合物の生物学的活性または生物学的特性を阻害せずに比較的無害である担体または賦形剤などの物質のことを意味し、それはすなわち、望ましくない生物学的作用を引き起こさずに、または物質を含む組成物の構成成分のいずれかと有害に相互作用せずに、物質を個体に投与可能であるということである。
【００４２】
本発明で使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される非毒性の酸から調製される投与化合物の塩のことを意味し、無機酸、有機酸、溶媒和物、水和物またはその包接化合物が挙げられる。このような無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、酢酸、ヘキサフルオロリン酸、クエン酸、グルコン酸、安息香酸、プロピオン酸、酪酸、スルホサリチル酸、マレイン酸、ラウリン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、アムソン酸、パモ酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びメシル酸が挙げられる。適切な有機酸は、例えば、有機酸のうち脂肪族酸、芳香族酸、カルボン酸及びスルホン酸の分類から選択されてもよく、その例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、カンファースルホン酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、粘液酸、酒石酸、パラトルエンスルホン酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フロ酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、サリチル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシル酸）、ステアリン酸、スルファニル酸、アルギン酸、ガラクツロン酸などが挙げられる。更に、非限定的実施例として、薬学的に許容される塩としては、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム依存性またはカリウム）及びアンモニウム塩が挙げられる。
【００４３】
本発明で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的に許容される物質、組成物または担体、例えば、液体充填剤もしくは固体充填剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、賦形剤、添加剤、増粘剤、溶媒、または本発明において有用な化合物をその目的の機能を果たすように患者の体内または患者へ送達または輸送することに関わる被包材のことを意味する。通常このような構造体は、ある器官または体の部位から別の器官または体の部位へと送達または輸送される。それぞれの担体は、本発明において有用な化合物を含み患者に有害ではない、製剤中のその他成分と相溶性があるという意味で「許容される」必要がある。薬学的に許容される担体として機能し得る物質の一部の例としては、糖類、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロースなど、デンプン類、例えば、コーンスターチ及びポテトスターチなど、セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなど、粉末状トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、添加剤類、例えば、カカオバター及び座薬用ワックスなど、油類、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油など、グリコール類、例えば、プロピレングリコールなど、ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなど、エステル類、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなど、寒天、緩衝剤類、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなど、界面活性剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、ならびに、医薬品製剤に用いられるその他非毒性の相溶性物質が挙げられる。本発明で使用する場合、「薬学的に許容される担体」としてはまた、本発明において有用な化合物の活性と相性が良く患者にとって生理学的に許容される任意及び全てのコーティング剤、抗菌及び抗カビ剤、ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。補助的な活性化合物をまた組成物内に混合してもよい。「薬学的に許容される担体」は更に、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩を含んでいてもよい。本発明の実施に用いる医薬組成物中に含まれてもよいその他追加成分は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９８５，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４４】
「有効量の」送達媒体とは、化合物を効果的に結合または送達するのに十分な量のことである。
【００４５】
本発明で使用する場合、用語「力価」とは、最大反応の半分（ＥＤ５０）を生じさせるのに必要な用量のことを意味する。
【００４６】
本発明で使用する場合、用語「効果」とは、アッセイにおいて得られる最大作用（Ｅｍａｘ）のことを意味する。
【００４７】
本発明で使用する場合、用語「アルキル」自体または別の置換基の一部としての「アルキル」とは、特に明記しない限り、指定の炭素原子数を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素（すなわち、Ｃ１−６とは、１〜６個の炭素原子のことを意味する）のことを意味し、直鎖、分枝鎖または環状の置換基を含む。その例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル及びシクロプロピルメチルが挙げられる。
【００４８】
本発明で使用する場合、用語「置換アルキル」とは、ハロゲン、−ＯＨ、アルコキシ、−ＮＨ２、アミノ、アジド、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、トリフルオロメチル、−Ｃ≡Ｎ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２及び−ＮＯ２からなる群から選択される１、２または３個の置換基で置換された、上で定義したアルキルのことを意味する。置換アルキルの例としては、２，２−ジフルオロプロピル、２−カルボキシシクロペンチル及び３−クロロプロピルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明で使用する場合、用語「ヘテロアルキル」自体または別の用語と組み合わせる場合、特に明記しない限り、指定の炭素原子数、及びＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１または２個のヘテロ原子からなる安定した直鎖または分枝鎖のアルキル基のことを意味し、窒素原子及び硫黄原子は任意選択的に酸化されてもよく、窒素へテロ原子は任意選択的に四級化されてもよい。へテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基における任意の位置に配置されてもよく、ヘテロアルキル基の残基と、その残基が結合したフラグメントに加えてヘテロアルキル基内の末端炭素原子に結合したフラグメントとの間を含む。その例としては、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ３が挙げられる。最大２個のヘテロ原子が連続してもよく、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３などである。
【００５０】
本発明で使用する場合、単独でまたはその他の用語と組み合わせて用いる場合の用語「アルコキシ」とは、特に明記しない限り、酸素原子を介して分子の残基と連結した指定の炭素原子数（上で定義）を有するアルキル基のことを意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、１−プロポキシ、２−プロポキシ（イソプロポキシ）、ならびに高ホモログ及び異性体などである。
【００５１】
本発明で使用する場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」単独または別の置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」とは、特に明記しない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のことを意味する。
【００５２】
本発明で使用する場合、用語「シクロアルキル」とは、単環式または多環式の非芳香族ラジカルのことを意味し、環を形成する原子（すなわち、骨格原子）のそれぞれは炭素原子である。一実施形態では、シクロアルキル基は飽和または部分的に不飽和である。別の実施形態では、シクロアルキル基は芳香環と融合する。シクロアルキル基としては、３〜１０個の環原子を有する基が挙げられる。シクロアルキル基の例示としては、以下の部分、
【化２３】
2018537526.tif 000025
が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
単環式シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられるがこれらに限定されない。二環式シクロアルキルとしては、テトラヒドロナフチル、インダニル及びテトラヒドロペンタレンが挙げられるがこれらに限定されない。多環式シクロアルキルとしては、アダマンタイン及びノルボルナンが挙げられる。用語「シクロアルキル」は、「不飽和非芳香族カルボシクリル」基または「非芳香族不飽和カルボシクリル」基を含み、その両方は本明細書で定義する非芳香族炭素環のことを意味し、非芳香族炭素環は、少なくとも１つの炭素炭素二重結合または１つの炭素炭素三重結合を含む。
【００５４】
本発明で使用する場合、用語「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」とは、それぞれがＯ、Ｓ及びＮから選択される１〜４個の環ヘテロ原子を含むヘテロ脂環式基のことを意味する。一実施形態では、それぞれのヘテロシクロアルキル基は、その環系内に４〜１０個の原子を有する（このような基の環が２個の隣接Ｏ原子またはＳ原子を含まないという条件において）。別の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は芳香環と融合する。一実施形態では、窒素へテロ原子及び硫黄へテロ原子は任意選択的に酸化されてもよく、窒素原子は任意選択的に四級化されてもよい。複素環系は、特に明記しない限り、安定構造をもたらす任意のへテロ原子または炭素原子に結合してもよい。複素環は本質的に、芳香族または非芳香族であってもよい。一実施形態では、複素環はヘテロアリールである。
【００５５】
３員環ヘテロシクロアルキル基の一例としては、アジリジンが挙げられるがこれに限定されない。４員環ヘテロシクロアルキル基の例としては、アゼチジン及びβラクタムが挙げられるがこれらに限定されない。５員環ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピロリジン、オキサゾリジン及びチアゾリジンジオンが挙げられるがこれらに限定されない。６員環ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピペリジン、モルホリン及びピペラジンが挙げられるがこれらに限定されない。ヘテロシクロアルキル基のその他非限定例は以下のとおりである。
【化２４】
2018537526.tif 000026
【００５６】
非芳香族複素環の例としては、アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ピロリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、ジオキソラン、スルホラン、２，３−ジヒドロフラン、２，５−ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、チオファン、ピペリジン、１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、１，４−ジヒドロピリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ピラン、２，３−ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、ホモピペラジン、ホモピペリジン、１，３−ジオキセパン、４，７−ジヒドロ−１，３−ジオキセピン及びヘキサメチレンオキシドなどの単環式基が挙げられる。
【００５７】
本発明で使用する場合、用語「芳香族」とは、１つまたは複数の多価不飽和環を有する炭素環または複素環のこと、また芳香族性を有する、すなわち、（４ｎ＋２）個（ｎは整数）の非局在π（パイ）電子を有する炭素環または複素環のことを意味する。
【００５８】
本発明で使用する場合、単独でまたはその他の用語と組み合わせて用いる場合の用語「アリール」とは、特に明記しない限り、１つまたは複数の環（通常は、１、２または３つの環）を含む炭素環式芳香族系のことを意味し、このような環は、ビフェニルなどのペンダント様式で互いに結合していてもよく、ナフタレンなどのように融合していてもよい。アリール基の例としては、フェニル、アンスラシル及びナフチルが挙げられる。
【００５９】
本発明で使用する場合、用語「アリール（Ｃ１−Ｃ３）アルキル」とは、１〜３つの炭素アルキレン鎖がアリール基、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−フェニルに結合している官能基のことを意味する。アリール−ＣＨ２−及びアリール−ＣＨ（ＣＨ３）−が好ましい。用語「置換アリール−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル」とは、アリール基が置換されたアリール−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル官能基のことを意味する。同様に、用語「ヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル」とは、１〜３つの炭素アルキレン鎖がヘテロアリール基、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−ピリジルに結合している官能基のことを意味する。用語「置換ヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル」とは、ヘテロアリール基が置換されたヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ３）アルキル官能基のことを意味する。
【００６０】
本発明で使用する場合、用語「へテロアリール」または「複素環式芳香族」とは、芳香族性を有する複素環のことを意味する。多環式ヘテロアリールは、部分的に飽和した１つまたは複数の環を含んでいてもよい。その例としては以下の部分が挙げられる。
【化２５】
2018537526.tif 000027
【００６１】
ヘテロアリール基の例としては更に、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（特に、２−及び４−ピリミジニル）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（特に、２−ピロリル）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（特に、３−及び５−ピラゾリル）、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル及び１，３，４−オキサジアゾリルが挙げられる。多環式複素環及び多環式ヘテロアリールの例としては、インドリル（特に、３−、４−、５−、６−及び７−インドリル）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（特に、１−及び５−イソキノリル）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（特に２−及び５−キノキサリニル）、キナゾリニル、フタラジニル、１，８−ナフチリジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５−ナフチリジニル、ベンゾフリル（特に、３−、４−、５−、６−及び７−ベンゾフリル）、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２−ベンズイソキサゾリル、ベンゾチエニル（特に、３−、４−、５−、６−及び７−ベンゾチエニル）、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（特に、２−ベンゾチアゾリル及び５−ベンゾチアゾリル）、プリニル、ベンズイミダゾリル（特に、２−ベンズイミダゾリル）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニル及びキノリジジニルが挙げられる。
【００６２】
本発明で使用する場合、用語「置換」とは、原子の水素、または原子の基の水素が、別の基に結合した置換基に置き換えられていることを意味する。用語「置換」とは更に、任意の程度の置換、すなわち、モノ、ジ、トリ、テトラまたはペンタ置換のことを意味する（このような置換が可能である場合）。置換基は独立して選択され、任意の化学的に介入可能な位置において置換が行われてもよい。一実施形態では、置換基は１〜４個の間の数で変動する。別の実施形態では、置換基は１〜３個の間の数で変動する。更に別の実施形態では、置換基は１〜２個の間の数で変動する。
【００６３】
本発明で使用する場合、用語「任意選択的に置換」とは、言及した基が置換または非置換されてもよいということを意味する。一実施形態では、言及した基は０個の置換基で任意選択的に置換される（すなわち、言及した基は非置換される）。別の実施形態では、言及した基は、個別に独立して本明細書に記載の基から選択される１個または複数個の別の基（複数可）で任意選択的に置換される。
【００６４】
一実施形態では、置換基は、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ３）、−Ｎ（ＣＨ３）２、アルキル（直鎖、分枝鎖及び／または不飽和アルキルを含む）、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、フルオロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アルコキシ、フルオロアルコキシ、−Ｓ−アルキル、Ｓ（＝Ｏ）２アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ［置換または非置換アルキル、または、置換または非置換フェニル］、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ［Ｈまたはアルキル］２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ［置換または非置換アルキル］２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ［置換または非置換アルキル、または、置換または非置換フェニル］、−ＮＨＣ（＝Ｏ）アルキル、−Ｎ［置換または非置換アルキル］Ｃ（＝Ｏ）［置換または非置換アルキル］、−ＮＨＣ（＝Ｏ）［置換または非置換アルキル］、−Ｃ（ＯＨ）［置換または非置換アルキル］２及び−Ｃ（ＮＨ２）［置換または非置換アルキル］２からなる群から独立して選択される。別の実施形態では、例として、任意の置換基は、オキソ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ３）、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−Ｓ（＝Ｏ）２−ＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＯＮ（Ｏ）２及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨから選択される。更なる一実施形態では、置換基は、Ｃ１−６アルキル、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、アミノ、アセトアミド、オキソ及びニトロからなる群から独立して選択される。更に別の実施形態では、置換基は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ、アセトアミド及びニトロからなる群から独立して選択される。本発明で使用する場合、置換基がアルキル基またはアルコキシ基である場合、炭素鎖は、分枝鎖、直鎖または環状鎖であってもよく、直鎖が好ましい。
【００６５】
本発明で使用する場合、用語「アナログ」とは、同一ではないが類似の機能的特徴または構造的特徴を有する分子のことを意味する。
【００６６】
本発明で使用する場合、用語「ボルテゾミブ」及び「ベルケイド」（同じ意味で用いられ得る）とは、［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸のことを意味する。
【００６７】
範囲：本開示全体にわたり、本発明の様々な態様は範囲形式で示され得る。範囲形式による記載は便宜上及び簡潔性のためにすぎず、本発明の範囲における確固たる制限と解釈すべきではないということを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、可能性のある下位範囲に加えてその範囲内における個々の数値の全てを明確に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの下位範囲に加えて、その範囲内における個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を明確に開示しているとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関わらず適用される。
【００６８】
説明
本発明は部分的に、カルバメートリンカーを用いることで、Ｂｔｚのボロン酸エステル官能基を連結基として利用することによる骨へのＢｔｚの送達がもたらされるという発見に基づいている。本発明の利点の１つは、骨表面上で生じる低ｐＨ条件の存在下では、リンカーが不安定であるということである。
【００６９】
本発明において有用な化合物
一態様では、本発明は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む化合物を含み、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。本発明で使用する場合、用語「複合体」とは、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートまたは結合した治療薬を含む化合物のことを意味する。
【００７０】
当業者は理解するであろうが、任意の好適なリンカーが本発明において用いられてもよい。リンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、カルバメート、ウレア、アミンまたはその他の結合を含む様々な官能基のいずれかを含んでいてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、開裂可能な結合、例えば、不安定な結合、及び／または特定の細胞内パラメータ（例えば、ｐＨまたは酸化還元電位）が変化すると開裂する結合を含む。一実施形態では、リンカーは酸加水分解により開裂する。別の実施形態では、リンカーは、プロテアーゼなどにより酵素的に開裂する。別の実施形態では、リンカーは、酸加水分解及び酵素的の両方により開裂する。一部の実施形態では、リンカーは開裂不可能である。例えば、複合体自体が所望の生理活性を有している場合、複合体からのＢｔｚの放出速度を妨げるまたは低減させることが望ましい場合がある。当業者は理解するであろうが、リンカーとビスホスホネート基との間及びリンカーとＢｔｚ分子との間の結合の安定性は、特定の環境においてそれぞれの対応する結合がどれほど緩慢にまたは急速に開裂するかに影響し、それにより、Ｂｔｚが複合体からどれほど緩慢にまたは急速に放出され得るかに影響する。一実施形態では、Ｂｔｚは複合体から緩慢に放出される。別の実施形態では、Ｂｔｚは複合体から急速に放出される。非限定的な例では、リンカーは、より安定な結合をもたらすリンカー上の官能基を介してＢｔｚ分子及び／またはビスホスホネートに結合し、その結果、Ｂｔｚが複合体から放出される速度が低減することになる。別の非限定的な例では、リンカーは、より不安定なまたはより安定性に欠ける結合をもたらすリンカー上の官能基を介してＢｔｚ分子及び／またはビスホスホネートに結合してもよく、その結果、Ｂｔｚが複合体から放出される速度が増加することになる。より安定な結合をもたらす官能基の例としては、アミドが挙げられる。より不安定な結合またはより安定性に欠けるもしくは不安定な結合をもたらす官能基の例としては、カーボネート基またはカルバメート基が挙げられる。
【００７１】
その他の実施形態では、リンカーの電子は、Ｂｔｚ分子が複合体から放出される速度に寄与し得る。例えば、式（Ｉ）（Ｚ３がＮの場合）または式（ＩＩ）において、Ｂｔｚ分子に結合したアミンのルイス塩基性は、リンカーの電子に基づいて調節可能である。一実施形態では、リンカー内に別のメチレン基などの電子供与基を組み込むことにより、アミンのルイス塩基性が増し、それにより、リンカーとＢｔｚ分子との間の結合安定性が増加することになる。別の実施形態では、リンカー内に電子求引基を組み込むことにより、アミンのルイス塩基性が減少し、それにより、リンカーとＢｔｚ分子との間の結合安定性が低下することになる。一態様では、本発明の化合物の反応性は、十分に安定な複合体（骨基質内の低ｐＨにより、一旦骨を標的としてもなお効率的にＢｔｚを放出する）の調製を可能とするために調節可能に設計されている。骨に対するビスホスホネートの高い動的親和性により、複合体を著しく分解させることなく、またＢｔｚを全身に放出することなく、骨への輸送を実現することが可能となる。
【００７２】
一実施形態では、リンカーは脂肪族である。別の実施形態では、リンカーは芳香環を含む。芳香環の非限定例としては、アリール基またはヘテロアリール基が挙げられる。一実施形態では、アリール基はフェニル基である。一部の実施形態では、芳香環は置換される。当業者は理解するであろうが、置換芳香環の電子的性質を調節するために芳香環上の置換基を選択してもよい。例えば、環の電子密度を低下させるために電子求引基を芳香環に付加してもよく、その一方で、環の電子密度を増加させるために電子供与基を付加してもよい。一部の実施形態では、環の電子的性質を変化させることを利用してリンカーの反応性を調節することによりリンカーとＢｔｚとの間の開裂速度に影響を及ぼすことで、所望の部位へとＢｔｚ弾頭を送達してもよい。異なる相対開裂速度を有しボルテゾミブまたはその他プロテアソーム阻害薬を放出する、ボロン酸エステル結合の例を図１３に示す。別の実施形態では、本発明の化合物は、インドシアニングリーンまたはその任意のアナログにコンジュゲートする。
【００７３】
一態様では、本発明の化合物は、染料またはその他蛍光分子にコンジュゲートしてもよい。染料またはその他蛍光分子にコンジュゲートした化合物は、それら化合物の骨への結合性及び放出特性を調査するのに有用であってもよい。例えば、化合物を染料または蛍光分子にコンジュゲートさせてから動物の血流中に注入し、別々の時点において、血液及び骨中におけるその放射活性を測定してもよい。任意の染料または蛍光分子が本発明において検討される。一実施形態では、染料はシアニン蛍光体である。一実施形態では、本発明の化合物はＣＷ８００にコンジュゲートする。ＣＷ８００にコンジュゲートした本発明の化合物の例示的な合成を図１２に示す。
【００７４】
有機合成分野において周知の技術を用いて、本発明の化合物を合成してもよい。合成に必要な出発物質及び中間体は民間の供給元から入手可能であり、または、当業者に周知の方法に従い合成してもよい。
【００７５】
一態様では、本発明の化合物は、式（Ｉ）の化合物、
【化２６】
2018537526.tif 000028
（Ｉ）、
その薬学的に許容される塩、その異性体またはその異性体の混合物であり、
式（Ｉ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｒ３は、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ４は、水素、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択され、式中、アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキル及びアルキルＺ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０からなる群から選択され、式中、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ２は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｌ３は、アリール、またはＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の任意の炭素原子は、アルキル、シクロアルキル及びカルボニルからなる群から選択される１〜２個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ３は、Ｎ、ＣＲ１２及びフェニルからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｚ５は、アリール、アルキル、ＯＲ１８及び
【化２７】
2018537526.tif 000029
からなる群から選択され、式中、アリールまたはアルキル基は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ５はそれぞれ独立して、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＣＲ１５及びＮからなる群から選択され、
Ｘ２は、ＣＲ１６及びＮからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ１５及びＲ１６はそれぞれ独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１７、−ＳＲ１７、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ１７、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ１７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＣＯ２Ｒ１７、−ＯＣＯ２Ｒ１７、−ＣＨ（Ｒ１７）２、−Ｎ（Ｒ１７）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｒ１７）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１７、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１７、−Ｃ（ＯＨ）（Ｒ１７）２及び−Ｃ（ＮＨ２）（Ｒ１７）２からなる群から選択され、
Ｒ１７はそれぞれ、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１８は、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜２の整数である。
【００７６】
別の態様では、本発明の化合物は、式（ＩＩ）の化合物、
【化２８】
2018537526.tif 000030
（ＩＩ）、
その薬学的に許容される塩、その異性体またはその異性体の混合物であり、
式（ＩＩ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
ｍは１、２または３であり、
ｐは１、２または３であり、
ｎは、０〜１０の整数である。
【００７７】
別の態様では、本発明の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物、
【化２９】
2018537526.tif 000031
（ＩＩＩ）、
その薬学的に許容される塩、その異性体またはその異性体の混合物であり、
式（ＩＩＩ）中、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、アルキル、−ＯＲ１３、−Ｎ（Ｒ１３）（Ｒ１４）及びハロゲンからなる群から選択され、
Ｙは、−ＰＯ（ＯＲ８）（ＯＲ９）、−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）、−ＣＯ２Ｒ８及び−ＳＯ３Ｒ８からなる群から選択され、
Ｚ１は、ＣＨ２及びＮＲ６からなる群から選択され、
Ａは、ＣＨ２、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ７）及びＣ（＝Ｓ）からなる群から選択され、
Ｚ２は、ＣＨ２、ＮＲ１１、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｚ４は、ＣＨ２及びＯからなる群から選択され、
Ｌ１は、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アルキルシクロアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルキルアリール基またはアルキルシクロアルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立して、水素及びアルキルからなる群から選択され、式中、アルキル基は、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、ハロ、シアノ及びアミノからなる群から選択される１〜４個の置換基で任意選択的に置換され、
ｍは、１〜５の整数であり、
ｎは、０〜１０の整数であり、
ｐは、１〜５の整数であり、
ｘは、０〜１０の整数である。
【００７８】
一実施形態では、Ｒ１のそれぞれは水素である。別の実施形態では、Ｒ１のそれぞれはアルキルである。別の実施形態では、一方のＲ１は水素であり、もう一方のＲ１はアルキルである。
【００７９】
一実施形態では、Ｒ２は水素である。別の実施形態では、Ｒ２はＯＲ１３である。
【００８０】
一実施形態では、Ｒ３はＣ１−Ｃ５アルキルである。別の実施形態では、Ｒ３はｉ−ブチルである。
【００８１】
一実施形態では、Ｒ４は（Ｃ１−Ｃ３アルキル）アリールである。別の実施形態では、Ｒ４はベンジルである。一実施形態では、Ｒ４はＣ１−Ｃ５アルキルである。別の実施形態では、Ｒ４は、１個のヒドロキシル基で置換されたＣ１−Ｃ５アルキルである。
【００８２】
一実施形態では、Ｚ１はＣＨ２である。別の実施形態では、Ｚ１はＮＲ６である。
【００８３】
一実施形態では、Ｘ１はＮである。別の実施形態では、Ｘ１はＣＲ１５である。
【００８４】
一実施形態では、Ｘ２はＮである。別の実施形態では、Ｘ２はＣＲ１６である。
【００８５】
一実施形態では、Ｒ５の少なくとも１個はアリールである。別の実施形態では、Ｒ５の少なくとも１個はフェニルである。
【００８６】
一実施形態では、Ｒ６は水素である。
【００８７】
一実施形態では、ＡはＣ（＝Ｏ）である。別の実施形態では、ＡはＣ（＝ＮＲ７）である。別の実施形態では、ＡはＣ（＝Ｓ）である。別の実施形態では、ＡはＣＨ２である。一実施形態では、ＡはＣ（＝Ｎ）またはＣ（＝Ｏ）である。
【００８８】
一実施形態では、Ｚ２はＣＨ２である。別の実施形態では、Ｚ２はＮＲ１１である。別の実施形態では、Ｚ２はＳである。別の実施形態では、Ｚ２はＯである。
【００８９】
一実施形態では、Ｙは−ＰＯ（ＯＲ８）２である。別の実施形態では、Ｙは−ＰＯ（Ｒ９）（ＯＲ８）である。別の実施形態では、Ｙは−ＣＯ２Ｒ８である。別の実施形態では、Ｙは−ＳＯ３Ｒ８である。
【００９０】
一実施形態では、Ｌ１は、アルキル、アリール及びアルキルアリールからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｌ１はＣ１−Ｃ３アルキル−Ｚ４Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０である。別の実施形態では、Ｌ１はＣ１−Ｃ３アルキル−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１０である。別の実施形態では、Ｌ１はＣ１−Ｃ３アルキル−（ＣＨ２）Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０である。一実施形態では、Ｌ１はアルキルである。別の実施形態では、Ｌ１はＣ１−Ｃ３アルキル基である。別の実施形態では、Ｌ１はＣ２アルキルである。一実施形態では、Ｌ１はアリールである。別の実施形態では、Ｌ１はフェニルである。一実施形態では、Ｌ１はアルキルアリールである。別の実施形態では、Ｌ１は−ＣＨ２ＣＨＲ１９−であり、式中、Ｒ１９は、
【化３０】
2018537526.tif 000032
及び
【化３１】
2018537526.tif 000033
からなる群から選択される。
【００９１】
別の実施形態では、Ｌ２はアリールである。一実施形態では、Ｌ２はフェニルである。別の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖である。別の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基で置換される。一実施形態では、アルキル基はメチル基である。別の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、シクロアルキル基で置換される。一実施形態では、シクロアルキル基は、シクロプロパン及びシクロペンタンからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、カルボニル基で置換される。一実施形態では、Ｌ２は、フェニル、及びＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖からなる群から選択され、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基、カルボニル基またはシクロアルキル基で任意選択的に置換される。
【００９２】
一実施形態では、Ｌ３はアリールである。一実施形態では、Ｌ３はフェニルである。別の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖である。別の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基で置換される。一実施形態では、アルキル基はメチル基である。別の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、シクロアルキル基で置換される。一実施形態では、シクロアルキル基は、シクロプロパン及びシクロペンタンからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖であり、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、カルボニル基で置換される。一実施形態では、Ｌ３は、フェニル、及びＣ１−Ｃ６アルキルのアルキル鎖からなる群から選択され、式中、アルキル鎖中の１個の炭素原子は、２個のアルキル基、カルボニル基またはシクロアルキル基で任意選択的に置換される。
【００９３】
一実施形態では、Ｚ３はＮである。別の実施形態では、Ｚ３はフェニルである。
【００９４】
一実施形態では、Ｚ４はＣＨ２である。別の実施形態では、Ｚ４はＯである。
【００９５】
一実施形態では、Ｚ５はＯＲ１８である。別の実施形態では、Ｚ５は
【化３２】
2018537526.tif 000034
である。別の実施形態では、Ｚ５は置換アルキルである。別の実施形態では、Ｚ５は
【化３３】
2018537526.tif 000035
である。
【００９６】
一実施形態では、Ｒ８は水素である。
【００９７】
一実施形態では、Ｒ９は水素である。別の実施形態では、Ｒ９はＣ１−Ｃ５アルキルである。別の実施形態では、Ｒ９はメチルである。別の実施形態では、Ｒ９はエチルである。別の実施形態では、Ｒ９はｎ−ブチルである。
【００９８】
一実施形態では、Ｒ１０はＣ１−Ｃ３アルキルである。一実施形態では、Ｒ１０はメチルである。
【００９９】
一実施形態では、Ｒ１１は水素である。
【０１００】
一実施形態では、Ｒ１３は水素である。
【０１０１】
一実施形態では、Ｒ１５は水素である。別の実施形態では、Ｒ１５はハロである。別の実施形態では、Ｒ１５はＣｌである。
【０１０２】
一実施形態では、Ｒ１６は水素である。別の実施形態では、Ｒ１６はハロである。別の実施形態では、Ｒ１６はＣｌである。
【０１０３】
一実施形態では、Ｒ１８はベンジルである。
【０１０４】
一実施形態では、ｍは１である。別の実施形態では、ｍは２である。別の実施形態では、ｍは３である。別の実施形態では、ｍは４である。別の実施形態では、ｍは５である。
【０１０５】
一実施形態では、ｐは１である。別の実施形態では、ｐは２である。別の実施形態では、ｐは３である。別の実施形態では、ｐは４である。別の実施形態では、ｐは５である。
【０１０６】
一実施形態では、ｎは０である。別の実施形態では、ｎは１である。
【０１０７】
一実施形態では、ｚは０である。別の実施形態では、ｚは１である。別の実施形態では、ｚは２である。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の化合物は、
【化３４】
2018537526.tif 000036
【化３５】
2018537526.tif 000037
【化３６】
2018537526.tif 000038
【化３７】
2018537526.tif 000039
【化３８】
2018537526.tif 000040
【化３９】
2018537526.tif 000041
【化４０】
2018537526.tif 000042
【化４１】
2018537526.tif 000043
【化４２】
2018537526.tif 000044
【化４３】
2018537526.tif 000045
【化４４】
2018537526.tif 000046
【化４５】
2018537526.tif 000047
及び
【化４６】
2018537526.tif 000048
、または、
その薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物からなる群から選択される。
【０１０９】
一実施形態では、化合物は
【化４７】
2018537526.tif 000049
、またはその薬学的に許容される塩、その異性体もしくはその異性体の混合物である。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む化合物を含み、治療薬はＮｏｔｃｈ阻害薬である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特定の骨疾患及び骨障害、例えば、炎症性骨粗鬆症などにおいて役割を果たすことが分かっている。ＭＰＣ内Ｎｏｔｃｈの持続的な活性化がそれらのＯＢ分化能を制限して骨吸収を引き起こすこと、またＮｏｔｃｈ阻害薬を用いて治療することで骨吸収が防止可能であることが見出された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）。Ｎｏｔｃｈ阻害薬の非限定例としては、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル）、及びＴｈａｐｓｉｇａｒｉｎ（（３Ｓ，３ａＲ，４Ｓ，６Ｓ，６ａＲ，７Ｓ，８Ｓ，９ｂＳ）−６−（アセチルオキシ）−４−（ブチルオキシ）−３，３ａ−ジヒドロキシ−３，６，９−トリメチル−８−｛［（２Ｚ）−２−メチルブタ−２−エノイル］オキシ｝−２−オキソ−２，３，３ａ，４，５，６，６ａ，７，８，９ｂ−デカヒドロアズレノ［４，５−ｂ］フラン−７−イル  オクタノエート）が挙げられる。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ阻害薬が骨同化薬として使用され得ることを示唆している。しかしながら、ボルテゾミブ同様、Ｎｏｔｃｈ阻害薬もまた、全身分布による重篤な副作用を有しており（Ｂａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ  ７：８７−９７）、それらの使用は骨粗鬆症など一般的な疾患に限定されている。それゆえ、本発明はまた、全身性の毒性副作用が低減したまたは全身性の毒性副作用のないＮｏｔｃｈ阻害薬を含む化合物を提供する。
【０１１１】
本発明の化合物の調製
当業者に周知の合成法を用いて、本明細書に記載の一般スキームで式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物を調製してもよい。以下の例において、本発明の非限定実施形態を説明する。
【０１１２】
非限定実施形態では、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて、ホスホネートをジオールとコンジュゲートさせてから、そのジオールをボロン酸部分に結合させることで、本発明の化合物を合成してもよい。
【化４８】
2018537526.tif 000050
【０１１３】
例えば、当該技術分野において周知の任意の方法を用いて、カルバメートを形成するためにアミノホスホネートをトリオールリンカー領域にコンジュゲートさせることで、本発明の化合物を合成してもよい。最初にアミノホスホネートをトリホスゲンで処理してから、ジブチルスズジラウレートの存在下、トリオール部分で処理して、カルバメートジオールを調製してもよい。
【化４９】
2018537526.tif 000051
その後、ジオールをボロン酸に続いてトリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ）で処理してから、ボロン酸エステルを形成することにより、本発明の化合物を調製してもよい。
【化５０】
2018537526.tif 000052
【０１１４】
本発明の化合物は１つまたは複数の立体中心を有していてもよく、それぞれの立体中心は独立してＲ配置またはＳ配置のいずれかで存在していてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、光学活性体またはラセミ体で存在する。本明細書に記載の化合物が、本明細書に記載の治療に有効な特性を有するラセミ体、光学活性体、位置異性体及び立体異性体、またはこれらの組み合わせを包含するということを理解すべきである。一実施形態では、本発明の化合物は、立体異性体及び立体異性体の混合物を含む。光学活性体の調製は、非限定例として、再結晶化技術を用いたラセミ体の分割、光学活性出発物質からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を用いたクロマト分離を含む任意の好適な方法で行われる。一実施形態では、１種または複数種の異性体の混合物が本明細書に記載の治療用化合物として利用される。別の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、１つまたは複数のキラル中心を含む。これらの化合物は、立体選択的合成、エナンチオマー及び／またはジアステレオマーの混合物のエナンチオ選択的合成及び／または分離を含む任意の方法で調製される。化合物及びその異性体の分割は、非限定例として、化学処理、酵素処理、分別結晶、蒸留及びクロマトグラフィーを含む任意の方法で行われる。
【０１１５】
本明細書に記載の方法及び製剤は、Ｎ−オキシド（必要に応じて）、結晶体（多形体としても周知）、溶媒和物、非晶相、及び／または、本発明の任意の化合物構造を有する化合物の薬学的に許容される塩、ならびに、同一タイプの活性を有するこれら化合物の代謝物及び活性代謝物を使用することを含む。溶媒和物としては、水、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）またはアルコール（例えば、エタノール）溶媒和物、アセテートなどが挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、水及びエタノールなどの薬学的に許容される溶媒を含む溶媒和形態で存在する。一実施形態では、本発明の化合物は、メタノール及び水を含む溶媒和物である。別の実施形態では、本明細書に記載の化合物は非溶媒和形態で存在する。
【０１１６】
一実施形態では、本発明の化合物は互変異性体として存在していてもよい。全ての互変異性体は、本明細書で提供する化合物の範囲内に含まれる。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書に記載の化合物はプロドラッグとして調製される。「プロドラッグ」とは、インビボで親薬物へと変換される薬剤のことを意味する。一実施形態では、プロドラッグはインビボ投与されると、生物学的に、薬学的にまたは治療的に活性な化合物形態へと化学的に変換される。別の実施形態では、プロドラッグは、１つまたは複数の工程またはプロセスにより、生物学的に、薬学的にまたは治療的に活性な化合物形態へと酵素的に代謝される。
【０１１８】
一実施形態では、例えば、本発明の化合物における芳香環部分上の部位は、様々な代謝反応を受けやすい。芳香環構造上に適切な置換基を組み込むことにより、この代謝経路を減少、最少化または排除してもよい。一実施形態では、単なる例として、芳香環における代謝反応の受けやすさを低下または排除するための適切な置換基は、重水素、ハロゲンまたはアルキル基である。
【０１１９】
本明細書に記載の化合物はまた、１個または複数個の原子が、同一原子番号を有するが通常天然に認められる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数の原子で置換された、同位体標識化合物を含む。本明細書に記載の化合物への組み込みに好適な同位体の例としては、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、３６Ｃｌ、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ及び３５Ｓが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、同位体標識化合物は、薬物及び／または基質の組織分布試験に有用である。別の実施形態では、重水素などのより重い同位体へと置換することにより、より高い代謝安定性（例えば、長いインビボ半減期または低用量条件）がもたらされる。更に別の実施形態では、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ及び１３Ｎなどのポジトロン放射同位体への置換は、基質受容体占有率を調べるポジトロン断層法（ＰＥＴ）検査において有用である。同位体標識化合物は、任意の好適な方法により、または、非標識試薬を用いない場合の代わりに適切な同位体標識試薬を用いたプロセスにより調製される。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、発色団もしくは蛍光部分、生物発光標識、または化学発光標識の使用を含むがこれらに限定されないその他の方法で標識される。
【０１２１】
本明細書に記載の化合物、及び異なる置換基を有するその他関連化合物は、本明細書に記載の技術及び原料、また例えば、Ｆｉｅｓｅｒ＆Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１），Ｌａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｗｉｌｅｙ  １９９２）；Ｃａｒｅｙ  ＆  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．Ａ  ａｎｄ  Ｂ（Ｐｌｅｎｕｍ  ２０００，２００１），及びＧｒｅｅｎ  ＆  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，（Ｗｉｌｅｙ  １９９９）（これら全ては本開示に参照として組み込まれる）に記載の技術及び原料を用いて合成する。本明細書に記載の化合物を調製するための全般的な方法は、本明細書で提供する式内に存在する様々な部分を導入するための適切な試薬及び条件を用いることで変更される。
【０１２２】
本明細書に記載の化合物は、民間の供給元から入手可能な化合物から始める任意の好適な手順を用いて合成されるか、または本明細書に記載の手順を用いて調製される。
【０１２３】
一実施形態では、反応性官能基、例えば、ヒドロキシル、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基などは、反応へのそれらの不必要な関与を防止するために保護される。保護基を用いて反応性部分の一部または全てをブロックし、保護基を除去するまでこのような基が化学反応に関与するのを防止する。別の実施形態では、それぞれの保護基は異なる方法により除去可能である。完全に異なる反応条件下で開裂する保護基は、特異的除去の条件を満たす。
【０１２４】
一実施形態では、保護基は、酸性条件、塩基性条件、還元条件（例えば、水素化分解など）及び／または酸化条件下で除去される。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタール及びｔ−ブチルジメチルシリルなどの基は酸に不安定であり、Ｃｂｚ基で保護されたアミノ基の存在下でカルボキシ及びヒドロキシ反応性部分を保護するのに用いられ、水素化分解、及び塩基に対して不安定なＦｍｏｃ基を用いて除去することができる。カルボン酸及びヒドロキシ反応性部分は、酸に不安定な基（ｔ−ブチルカルバメートなど）またはカルバメート（酸と塩基の両方に対して安定であるが加水分解で除去可能）でブロックされたアミンの存在下で、塩基に不安定な基（限定するわけではないが、メチル、エチル及びアセチルなど）でブロックされる。
【０１２５】
一実施形態では、カルボン酸及びヒドロキシ反応性部分が加水分解で除去可能な保護基（ベンジル基など）でブロックされる一方、酸と水素結合可能なアミン基は塩基に不安定な基（Ｆｍｏｃなど）でブロックされる。カルボン酸反応性部分が、本明細書で例示する単純なエステル化合物へと変換すること（アルキルエステルへの変換を含む）により保護されるか、または酸化で除去可能な保護基（２，４−ジメトキシベンジルなど）でブロックされる一方、共存するアミノ基はフッ化物に不安定なシリルカルバメートでブロックされる。
【０１２６】
酸保護基が安定であるためアリルブロック基は酸保護基及び塩基保護基の存在下で有用であり、続いて金属触媒またはπ酸触媒で除去される。例えば、アリルブロックカルボン酸は、酸に不安定なｔ−ブチルカルバメート保護基または塩基に不安定なアセテートアミン保護基の存在下、パラジウム触媒反応で脱保護される。保護基の更に別の形態は、化合物または中間体が結合した樹脂である。残基が樹脂に結合している限り、その官能基はブロックされ反応しない。一旦樹脂から放出されると、その官能基は反応することが可能となる。
【０１２７】
一般的なブロック基／保護基は、
【化５１】
2018537526.tif 000053
から選択され得る。
【０１２８】
その他の保護基に加えて、保護基の形成に応用可能な技術の詳細な説明及び保護基の除去については、Ｇｒｅｅｎｅ  ＆  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９，及びＫｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９４に記載されている（それらの開示は参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１２９】
治療方法
本発明は、骨形成を促進または誘導するための方法を提供する。方法は、例えば、骨吸収を特徴とする疾患及び障害を治療するための治療法として用いてもよい。一実施形態では、方法は、骨粗鬆症を有する対象を治療するために用いられる。別の実施形態では、方法は、骨粗鬆症を発症するリスクのある対象を治療するために用いられる。別の実施形態では、方法は、骨がんを有する対象を治療するために用いられる。更に別の実施形態では、方法は、骨折骨を有する対象を治療するために用いられる。本発明の方法は、骨形成を必要とする部位への本発明の化合物の局所送達を提供する。それゆえ、本発明の方法は骨粗鬆症の治療のみに限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、骨形成が望まれそれが対象にとって有益となる任意の疾患または障害、例えば、多発性骨髄腫、骨粗鬆症、骨壊死、骨髄炎、変形性関節症、関節リウマチ、パジェット病、骨折治癒、プロテーゼの緩み、骨がん、白血病、骨髄増殖性疾患、放射線療法誘発性骨粗鬆症、及び骨に転移したがんを含むと解釈されるべきである。
【０１３０】
一態様では、本発明は、それを必要とする対象における多発性骨髄腫及び骨がんからなる群から選択される疾患を治療するための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。
【０１３１】
一態様では、本発明は、対象内の骨形成を必要とする部位において、骨形成を促進させるための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。一実施形態では、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。
【０１３２】
一態様では、本発明は、対象内の骨に関連するがんの部位またはその近接部位において、骨形成を促進させるための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。一実施形態では、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、対象内の骨吸収抑制を必要とする部位において、骨吸収を抑制するための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。一実施形態では、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、骨、骨髄または周囲組織の炎症を抑制するための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。一実施形態では、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。
【０１３５】
別の態様では、本発明は、対象内の骨、骨髄及び骨周囲組織のがん細胞を殺傷するための方法を含む。一実施形態では、方法は、リンカーを介してホスホネート部分にコンジュゲートした治療薬を含む少なくとも１種の化合物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む。一実施形態では、治療薬はボルテゾミブ（Ｂｔｚ）またはそのアナログである。一実施形態では、対象は多発性骨髄腫を有する。
【０１３６】
一実施形態では、組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を更に含む。一実施形態では、治療薬は、骨形成を必要とする部位において、化合物から制御可能に放出される。別の実施形態では、治療薬は、骨吸収抑制を必要とする部位において、化合物から制御可能に放出される。
【０１３７】
特定の実施形態では、方法は、本発明の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学分野において周知の任意の方法または今後開発される方法を用いて調製することができる。通常、このような調製方法は、活性成分を担体または１種または複数種のその他補助成分と結合させてから、必要に応じてまたは望ましい場合、その生成物に対して成形または包装を施して所望の単回用量単位または複数回用量単位とする工程を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、１種または複数種の別の化合物と組み合わせて有用である。一実施形態では、別の化合物はまた本発明の化合物である。非限定的な例では、本発明の組成物を、１種または複数種の治療薬（または塩、溶媒和物もしくはそのプロドラッグ）と組み合わせて用いてもよい。別の実施形態では、治療薬は、多発性骨髄腫を治療するのに有用な薬物である。別の実施形態では、治療薬は骨標的薬物である。
【０１３９】
本明細書で提供する医薬組成物に関する記載は主としてヒトへの倫理的投与に好適な医薬組成物を指しているが、このような組成物が通常、多種多様な動物への投与に好適であるということは当業者に理解されるであろう。様々な動物への投与に好適な組成物とするために、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に変更を加えることはよく知られており、当業者である獣医薬理学者であれば、必要に応じて通常の実験を行うだけで、このような変更を設計及び実施することができる。本発明の医薬組成物の投与を検討する対象としては、ヒト及びその他の霊長類、哺乳類（非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ及びイヌなどの商業関連の哺乳動物を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４０】
医薬組成物及び投与
本発明の方法に有用な医薬組成物を、眼投与、経口投与、直腸投与、膣内投与、非経口投与、局所投与、肺投与、経鼻投与、頬側投与または別の投与経路に適した製剤に調製、包装または販売してもよい。その他検討される製剤としては、射出ナノ粒子、リポソーム製剤、活性成分を含有させて再び塞いだ赤血球、及び免疫学ベースの製剤が挙げられる。
【０１４１】
本発明の医薬組成物を、単回単位用量のまたは複数の単回単位用量のバルクに調製、包装または販売してもよい。本発明で使用する場合、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個々の量のことである。活性成分の量は通常、対象へと投与される活性成分の用量と同等、または、このような用量の好都合な一部、例えば、このような用量の２分の１または３分の１などである。
【０１４２】
本発明の医薬組成物中における活性成分、薬学的に許容される担体及び任意の追加成分の相対量は、治療する対象の個性、サイズ及び症状に応じて変化し、更に、組成物の投与経路に応じて変化する。例として、組成物は、０．１％〜１００％（重量／重量）の活性成分を含んでいてもよい。
【０１４３】
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１種または複数種の別の医薬活性剤を更に含んでいてもよい。その他の活性剤としては、増殖因子、ホルモン、抗炎症剤（コルチコステロイドを含む）、免疫抑制剤、タンパク質（例えば、ＢＭＰ）などが挙げられる。
【０１４４】
本発明の医薬組成物の制御放出製剤または持続放出製剤は、通常の技術を用いて調製してもよい。
【０１４５】
経口投与用としては、錠剤、糖衣錠、液剤、ドロップ剤、坐剤、または、カプセル剤、カプレット剤及びジェルキャップ剤が特に適している。経口投与に適したその他の剤形としては、散剤または顆粒剤、水性懸濁剤または油性懸濁剤、水性溶媒または油性溶媒、ペースト剤、ゲル剤、歯磨き剤、含嗽剤、コーティング剤、口腔リンス剤、またはエマルション剤が挙げられるがこれらに限定されない。経口使用を目的とした組成物は当該技術分野において周知の任意の方法に従い調製してもよく、このような組成物は、錠剤の製造に適した不活性で非毒性の医薬品添加剤からなる群から選択される１種または複数種の薬剤を含有していてもよい。このような添加剤としては、例えば、ラクトースなどの不活性賦形剤、コーンスターチなどの造粒剤及び崩壊剤、デンプンなどの結合剤、及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が挙げられる。
【０１４６】
錠剤はコーティングされていなくてもよく、または、対象の胃腸管内において崩壊を遅らせて、それにより活性成分の持続放出及び吸収をもたらすために周知の方法を用いてコーティングされていてもよい。例として、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの物質を用いて錠剤をコーティングしてもよい。更なる例として、米国特許番号４，２５６，１０８、４，１６０，４５２及び４，２６５，８７４に記載されている方法を用いて錠剤をコーティングして、浸透圧を利用した放出制御錠を形成してもよい。錠剤は、上品で味のよい製剤を提供するため、甘味剤、香味剤、着色剤、防腐剤、またはこれらの一部の組み合わせを更に含んでいてもよい。
【０１４７】
活性成分を含む硬カプセルは、ゼラチンなど生理的に分解可能な組成物を用いて調製してもよい。このような硬カプセルは活性成分を含み、追加成分（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性な固体賦形剤を含む）を更に含んでいてもよい。
【０１４８】
活性成分を含む軟ゼラチンカプセルは、ゼラチンなど生理的に分解可能な組成物を用いて調製してもよい。このような軟カプセルは活性成分を含み、その活性成分を、水、またはピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油など油性媒体と混合してもよい。
【０１４９】
経口投与用として、本発明の組成物は、通常の方法を用いて調製され、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤などの薬学的に許容される添加剤を含有する錠剤またはカプセル剤の形態であってよい。必要に応じ、適切な方法及びコーティング剤、例えば、Ｃｏｌｏｒｃｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，Ｐａ．が提供しているＯＰＡＤＲＹ（商標）フィルムコーティングシステム（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（商標）ＯＹ  Ｔｙｐｅ、ＯＹＣ  Ｔｙｐｅ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  ＯＹ−Ｐ  Ｔｙｐｅ、Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  ＯＹ−Ａ  Ｔｙｐｅ、ＯＹ−ＰＭ  Ｔｙｐｅ及びＯＰＡＤＲＹ（商標）Ｗｈｉｔｅ、３２Ｋ１８４００）などを用いて錠剤をコーティングしてもよい。
【０１５０】
経口投与用の液状製剤は、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態であってもよい。液状製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは水素添加食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性溶媒（例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール）、及び防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて通常の方法で調製してもよい。経口投与に適した本発明の医薬組成物の液状製剤は、液状、または、使用前に水または別の好適な溶媒で戻すことを目的とした乾燥製品の形態のいずれかで調製、包装及び販売してもよい。
【０１５１】
活性成分を含む錠剤は、例えば、活性成分を圧縮または成形（任意選択的に１種または複数種の追加成分と共に）することにより調製してもよい。圧縮錠剤は、散剤または顆粒剤など流動形態の活性成分を好適な装置で圧縮（任意選択的に、１種または複数種の結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤及び分散剤と混合して）することにより調製してもよい。成形錠剤は、活性成分、薬学的に許容される担体、及び少なくとも十分な液剤（混合物を湿潤させるための）の混合物を好適な装置で成形することにより調製してもよい。錠剤の製造に用いられる薬学的に許容される添加剤としては、不活性賦形剤、造粒剤及び崩壊剤、結合剤、ならびに滑沢剤が挙げられるがこれらに限定されない。周知の分散剤としては、ポテトスターチ及びデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。周知の界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。周知の賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及びリン酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。周知の造粒剤及び崩壊剤としては、コーンスターチ及びアルギン酸が挙げられるがこれらに限定されない。周知の結合剤としては、ゼラチン、アカシア、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるがこれらに限定されない。周知の滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ及びタルクが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５２】
活性成分の出発粉末またはその他粒子状原料を調整するための造粒技術は、医薬技術分野において周知である。通常は、粉末を結合剤と混合させて、「顆粒剤」と呼ばれるより大きく耐久性のある流動性アグロメレートまたは顆粒とする。例えば、溶媒を用いた「湿式」造粒プロセスは通常、粉末を結合剤と混合させて、湿った粒塊（後ほど溶媒を蒸発させる必要がある）を形成する条件下で水または有機溶媒を用いて湿潤させることを特徴とする。
【０１５３】
溶融造粒法は通常、室温で固体または半固体の原料（すなわち、比較的低い軟化点範囲または融点範囲を有する）を用いて、水またはその他液体溶媒を実質的に添加せずに粉末原料またはその他原料の造粒化を促進させることからなる。低融点固体は、その融点範囲の温度まで加熱すると、液化して結合媒体または造粒媒体として働く。液化した固体は、接触する粉末原料の表面上に広がり、冷ますと、最初の原料が共に結合した固体粒塊を形成する。その後、得られた溶融造粒物を錠剤成形機にかけてもよく、または、経口剤形を調製するためにカプセル化してもよい。溶融造粒法においては、固体分散体または固溶体を形成することにより、活性物質（すなわち、薬物）の溶解速度及び生物学的利用能を向上させる。
【０１５４】
米国特許番号５，１６９，６４５は、優れた流動性を有し直接圧縮可能なワックス含有顆粒について開示している。ワックスを溶融物内において流動性を向上させる特定の添加剤と混和させて、その後、冷まして混和物を造粒することにより、顆粒が得られる。特定の実施形態では、ワックス自体のみがワックス（複数可）及び添加剤（複数可）の溶融混合物内において溶融し、その他の例においては、ワックス（複数可）及び添加剤（複数可）の両方が溶融する。
【０１５５】
本発明はまた、本発明の化合物の１種または複数種を遅延放出させるための層、及び、疾患治療用の薬剤を即時放出させるための更なる層を含む多層錠を含む。ワックス／ｐＨ感受性ポリマーの混合物を用いることにより、活性成分を閉じ込めることでその遅延放出を保証する、胃で溶けない組成物を得ることができる。
【０１５６】
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と混合された活性成分を含む。このような製剤を、ボーラス投与または連続投与に好適な形態に調製、包装または販売してもよい。注射製剤を、アンプルなどの単位投与剤形、または防腐剤を含有する複数回用量の容器に調製、包装または販売してもよい。非経口投与用製剤としては、懸濁剤、液剤、油性溶媒または水性溶媒中のエマルション剤、ペースト剤、及び埋め込み型の持続放出製剤または生分解性製剤が挙げられるがこれらに限定されない。このような製剤は、懸濁剤、安定化剤または分散剤を含むがこれらに限定されない１種または複数種の追加成分を更に含んでいてもよい。非経口投与用製剤の一実施形態では、活性成分は、戻した組成物を非経口投与する前に、好適な溶媒（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で戻す乾燥形態（すなわち、粉末または顆粒）で提供される。
【０１５７】
医薬組成物を、滅菌注射用の水性懸濁剤もしくは油性懸濁剤または液剤の形態に調製、包装または販売してもよい。この懸濁剤または液剤を周知の技術に従い製剤化してもよく、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤または懸濁剤などの追加成分を含んでいてもよい。このような滅菌注射用製剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの非毒性で非経口的に許容される賦形剤または溶媒を用いて調製してもよい。その他の許容される賦形剤及び溶媒としては、リンゲル液、等張食塩水、ならびに、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドなどの固定油が挙げられるがこれらに限定されない。有用なその他の非経口投与可能な製剤は、微結晶形態の、リポソーム製剤の、または生分解性ポリマー系の構成成分としての活性成分を含む製剤を含む。持続放出または埋め込み用の組成物は、エマルション、イオン交換樹脂、やや溶けにくい高分子、またはやや溶けにくい塩などの薬学的に許容される高分子物質または疎水性物質を含んでいてもよい。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、口腔を介した経肺投与に好適な製剤に調製、包装または販売してもよい。このような製剤は、活性成分を含み約０．５〜約７ナノメートル（好ましくは約１〜約６ナノメートル）の範囲の直径を有する乾燥粒子を含んでいてもよい。このような組成物は都合よく、噴射剤の噴射に粉末を分散させることが可能な乾燥粉末リザーバを備えた装置を用いた、または、低沸点噴射剤中に溶解または懸濁させた活性成分を密閉容器内に備えた装置などの自己噴射型の溶媒／粉末供給容器を用いた投与用の乾燥粉末の形態である。好ましくは、このような粉末は、少なくとも９８重量％の粒子が０．５ナノメートル超の直径を有し、少なくとも９５数量％の粒子が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。より好ましくは、少なくとも９５重量％の粒子は１ナノメートル超の直径を有し、少なくとも９０数量％の粒子は６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は好ましくは、砂糖などの固体微粉末賦形剤を含み、都合よく単位投与剤形で提供される。
【０１５９】
低沸点噴射剤は通常、大気圧下６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は組成物の５０〜９９．９％（重量／重量）を構成していてもよく、活性成分は組成物の０．１〜２０％（重量／重量）を構成していてもよい。噴射剤は、液体状の非イオン性界面活性剤もしくは固体状の陰イオン性界面活性剤、または固体賦形剤（好ましくは、活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有する）などの追加成分を更に含んでいてもよい。
【０１６０】
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と混合された活性成分を含む。このような製剤を、ボーラス投与または連続投与に好適な形態に調製、包装または販売してもよい。注射製剤を、アンプルなどの単位投与剤形、または防腐剤を含有する複数回用量の容器に調製、包装または販売してもよい。非経口投与用製剤としては、懸濁剤、液剤、油性溶媒または水性溶媒中のエマルション剤、ペースト剤、及び埋め込み型の持続放出製剤または生分解性製剤が挙げられるがこれらに限定されない。このような製剤は、懸濁剤、安定化剤または分散剤を含むがこれらに限定されない１種または複数種の追加成分を更に含んでいてもよい。非経口投与用製剤の一実施形態では、活性成分は、戻した組成物を非経口投与する前に、好適な溶媒（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で戻す乾燥形態（すなわち、粉末または顆粒）で提供される。
【０１６１】
医薬組成物を、滅菌注射用の水性懸濁剤もしくは油性懸濁剤または液剤の形態に調製、包装または販売してもよい。この懸濁剤または液剤を周知の技術に従い製剤化してもよく、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤または懸濁剤などの追加成分を含んでいてもよい。このような滅菌注射用製剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの非毒性で非経口的に許容される賦形剤または溶媒を用いて調製してもよい。その他の許容される賦形剤及び溶媒としては、リンゲル液、等張食塩水、ならびに、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドなどの固定油が挙げられるがこれらに限定されない。有用なその他の非経口投与可能な製剤は、微結晶形態の、リポソーム製剤の、または生分解性ポリマー系の構成成分としての活性成分を含む製剤を含む。持続放出または埋め込み用の組成物は、エマルション、イオン交換樹脂、やや溶けにくい高分子、またはやや溶けにくい塩などの薬学的に許容される高分子物質または疎水性物質を含んでいてもよい。
【０１６２】
本発明で使用する場合、「追加成分」としては、以下、添加剤、界面活性剤、分散剤、不活性賦形剤、造粒剤及び崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤、防腐剤、ゼラチンなどの生理的に分解可能な組成物、水性溶媒及び溶媒、油性溶媒及び溶媒、懸濁剤、分散剤及び湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝剤、塩、増粘剤、充填剤、酸化防止剤、抗生剤、抗カビ剤、安定化剤、及び、薬学的に許容される高分子物質または疎水性物質の１種または複数種が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物中に含まれてもよいその他「追加成分」は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５，Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１６３】
本発明の組成物を単独でまたは別の治療薬との併用のいずれかで対象に投与してもよいということは理解されるであろう。
【０１６４】
それゆえ、本発明の治療方法及び予防方法は、骨形成を誘導または促進して本発明の方法を実施する治療薬を含む医薬組成物の使用を包含する。本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するために投与されてもよい。一実施形態では、本発明は、１μＭ〜１０μＭの本発明の化合物の濃度をもたらす用量の哺乳動物への投与を想定している。
【０１６５】
通常、本発明の方法を用いて哺乳動物、好ましくはヒトに投与され得る用量は、正確な投与量が治療する哺乳動物の種類及び疾患状態区分、哺乳動物の年齢、ならびに投与経路を含むがこれらに限定されない多くの因子に応じて変化するが、哺乳動物の体重１キログラムあたり０．５μｇ〜約５０ｍｇの量の範囲である。好ましくは、化合物の用量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約１μｇ〜約１０ｍｇの範囲で変化する。より好ましくは、用量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約３μｇ〜約１ｍｇの範囲で変化する。
【０１６６】
組成物を毎日数回ぐらいの頻度で哺乳動物に投与してもよく、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月間に１回などより少ない頻度で、数ヶ月間に１回もしくは１年間に１回など更により少ない頻度で、またはそれより少ない頻度で投与してもよい。投与頻度は当業者には直ちに明らかとなるであろうが、多くの因子、例えば、限定するわけではないが、治療する疾患の種類及び重症度、哺乳動物の種類及び年齢などによって決まる。
【０１６７】
制御放出製剤及びドラッグデリバリーシステム
一実施形態では、本発明の製剤は、限定するわけではないが、短期製剤、急速相殺製剤に加えて、制御製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤及び拍動放出製剤であってもよい。
【０１６８】
用語「持続放出」とは、薬物を長期間にわたり徐々に放出することで、必ずしもそうなるとは限らないが、長期間にわたり薬物の血中濃度がほぼ一定となり得る薬物製剤のことを意味する。期間は、１日間、１週間、１ヶ月間またはそれ以上の長さであってもよく、ボーラス形態で投与された同量の薬剤よりも長く放出されなければならない。本明細書においてその通常の意味で使用する場合、用語「遅延放出」とは、薬物投与後に一定期間遅れて薬物を初期放出する薬物製剤のことを意味し、必ずしもそうなるとは限らないが、約１０分間〜最大約１２時間の遅延を含んでいてもよい。
【０１６９】
持続放出性とするために、化合物に持続放出性をもたらす好適な高分子物質または疎水性物質を含む化合物を配合してもよい。このように、本発明の方法に用いる化合物は、例えば、微小粒子の形態で注射投与されてもよく、または、ウェーハまたはディスクの形態で埋め込み投与されてもよい。
【０１７０】
本発明の一実施形態では、本発明の化合物は、持続放出製剤を用いて、単剤でまたは別の医薬品と併用して患者に投与される。
【０１７１】
用語「拍動放出」とは、薬物投与後に薬物の拍動血漿プロファイルをもたらすように薬物を放出する薬物製剤のことを意味する。
【０１７２】
用語「即時放出」とは、薬物投与の直後に薬物を放出する薬物製剤のことを意味する。
【０１７３】
本発明で使用する場合、「短期」とは、薬物投与後、最大、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分間、約２０分間または約１０分間、及びその全増分またはその部分増分のいずれかまたは全てを含む任意の期間のことを意味する。
【０１７４】
本発明で使用する場合、「急速相殺」とは、薬物投与後、最大、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分間、約２０分間または約１０分間、ならびにその全増分またはその部分増分のいずれか及び全てを含む任意の期間のことを意味する。
【０１７５】
本明細書に記載の具体的な手順、実施形態、請求項及び例に対する多くの均等物について、当業者は理解し、または、通常の実験を行うだけで確認することが可能であろう。このような均等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、本書に添付する特許請求の範囲により包含される。例えば、反応時間、反応サイズ／容量、実験試薬、例えば、溶媒、触媒など、圧力、雰囲気条件、例えば、窒素雰囲気、還元剤／酸化剤、当業者に周知の代替条件、及び単に定型的な実験法を用いることを含むがこれらに限定されない反応条件における調整は本願の範囲内であると理解すべきである。
【０１７６】
本明細書において数値及び範囲を提供する場合、これらの数値及び範囲を包含する全ての数値及び範囲は、本発明の範囲内に包含されることを意味すると理解すべきである。更に、これらの範囲に含まれる全ての数値に加えて、数値範囲の上限または下限もまた本願とみなされる。
【０１７７】
以下の実施例において、本発明の態様について更に説明する。しかしながら、それらは、本明細書に記載する本発明の教示または開示を限定するものではない。
【実施例】
【０１７８】
ここから、以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。これらの実施例は説明のみを目的として提供されるものであり、本発明は、これら実施例に限定されず、むしろ本明細書において提供する教示の結果として明らかな全ての変形形態を包含する。
【０１７９】
本実施例において提供する実験に用いる物質及び方法、ならびに実験結果について、これから説明する。
【０１８０】
以下の表Ａは、実施例において言及する化合物を含む。
【表１−１】
2018537526.tif 000054
【表１−２】
2018537526.tif 000055
実施例１：ＢＰ−Ｂｔｚ１の合成
ウレタンジオール２の合成
【化５２】
2018537526.tif 000056
【０１８１】
１０ｍＬの乾燥丸底フラスコに、０℃アルゴン下で、テトラエチルアミノメチレンジホスホネート１（２００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中のトリホスゲン（７８ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ、０．４当量）を充填した。無溶媒トリエチルアミン（６７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１当量）を反応用混合液に加えた。得られた反応用混合液を室温まで暖めて一晩攪拌した。２５ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加えて反応混合液の反応を停止させた。相分離後、水相をＣＨ２Ｃｌ２（３  ｘ  ３０ｍＬ）で抽出した。混合有機層を飽和食塩水（１５ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてから、濾過し、減圧下で濃縮して、１９０ｍｇの誘導イソシアネートを黄色の油状物として生成した。
【０１８２】
５ｍＬの乾燥丸底フラスコに上記の粗生成混合物（１９０ｍｇ）を充填し、続いて、ジブチルスズジラウレート（ＤＢＴＤＬ）溶液（３６．６ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、０．１当量）、及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．２ｍＬ）中のトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）（７７．５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、０．９当量）を加えた。得られた反応用混合液を室温で２日間攪拌した。その後、反応混合液をセライトパッドに通して濾過してから、パッドを追加のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２グラジエント、５：９５〜２：８）を用いて残分を精製し、１２６ｍｇ（４０％）のウレタンジオール２（Ｒｆ＝０．４５（ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２、２：８、ＫＭｎＯ４で可視化））を、１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ）  δ  ８．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４３−４．３２  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．０７  （ｓ，  ８Ｈ），  ３．４８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２８  （ｓ，  ４Ｈ），  １．２３  （ｍ，  １２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １１５．３６，  ６３．９８，  ５９．６３，  ５６．６４，  ５６．０３，  ５３．６８，  ４６．１７  （ｔ），  １６．３７；３１Ｐ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １３．０９；ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ５０１．２  （Ｍ＋Ｎａ＋），  ４７９．５  （Ｍ＋Ｈ＋）を有する淡黄色の油状物として生成した。
ＢＰ−Ｂｔｚ１の合成
【化５３】
2018537526.tif 000057
【０１８３】
１０ｍＬの乾燥丸底フラスコに、粉末状の３Åモレキュラーシーブ（１ｇ）（１２０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させて活性化）、２の溶液（１２５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及び乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中のボルテゾミブ（１２０．５ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．２当量）を充填した。反応用混合液を室温で３日間攪拌した。反応混合液をガラスウッドに、続けてセライトパッドに通して濾過した後、濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ  ｘ  ２）で洗浄し、全ての未反応ボルテゾミブ除去し、２１５ｍｇの粗生成物を茶色の固形物として生成した。質量分析にて同定した粗生成物：ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ８２７．４  （Ｍ＋Ｈ＋），  ８４９．４  （Ｍ＋Ｎａ＋），  ８６５．３  （Ｍ＋Ｋ＋）。ボルテゾミブに対応するｍ／ｚ  ３８５．２のイオンは観測されなかった。
【０１８４】
１０ｍＬの乾燥丸底フラスコに、０℃アルゴン下、乾燥ＤＣＭ（８ｍＬ）中の上記粗生成物（２１５ｍｇ、約０．２６ｍｍｏｌ）溶液を充填した。トリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ）（２３９．７ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ、６当量）を磁気撹拌させながら滴加した。滴加完了後、反応混合液を室温まで暖めて一晩攪拌した。その後、反応混合液を減圧下で濃縮し、高真空下に１０分間維持して茶色の固形物を生成した。メタノール（５ｍＬ）を添加して固形物を溶かし、得られた溶液を減圧下で濃縮した。この手順をあと３回繰り返した。得られた固形物をＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）中に溶かしてからＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）へと加え、茶色がかった白色沈殿物を形成させた。固形物を濾過によって分離し、９０℃高真空下で乾燥させ、１７０ｍｇの３（ＢＰ−Ｂｔｚ１）（９１％）を、１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ８．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３７  （ｓ，  ４Ｈ），  ７．１６  （ｓ，  １Ｈ），  ４．７１  （ｔ，  Ｊ  ＝  １０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．３０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ２０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２８  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．０８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７８  （ｍ，  １Ｈ），  １．３２−１．２４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．１６  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７２  （ｍ，  ６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １７７．３８，  １６３．８５，  １５５．７，  １４８．３４，  １４４．３４，  １４４．１４，  １４３．８８，  １３５．２３，  １２９．７２，  １２８．７７，  １２７．３１，  ５９．５９，  ５５．８１，  ５５．６８，  ５２．６７，  ５０．６７，  ４８．７４，  ４７．８８，  ３６．３９，  ２４．８３，  ２３．８５，  ２１．９９；３１Ｐ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  −１．４３，  −４．８１を有する薄茶色の固形物として生成した。
【０１８５】
実施例２：ＴＮＦ介在性骨吸収における骨芽細胞制御試験
骨修復におけるＵＰＳ介在性タンパク質調節の役割については、これまで何ら研究されてこなかった。しかしながら、ユビキチンＥ３リガーゼ及び骨芽細胞制御に関する研究過程において、Ｓｍｕｒｆ１、ＷＷＰ１及びＩｔｃｈ（Ｅ３リガーゼのＮｅｄｄ４サブクラスにおけるメンバー）を欠損したマウス由来のＭＳＣが、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）を介してＲｕｎｘ２、ＪｕｎＢ及びＣＸＣＲ４タンパク質の安定性を向上させることにより、遊走、増殖及び骨芽細胞（ＯＢ）分化を促進していることが見出された（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１：７０−７８）。Ｒｕｎｘ２及びＪｕｎＢはＯＢ分化における主要な陽性調節因子であり、またＣＸＣＲ４は細胞遊走に不可欠である。それゆえ、ＵＰＳを標的とすることは、ＭＰＣの機能を向上させて骨折治癒を促進するための新しい戦略となり得る。
【０１８６】
薬物を骨に送達することは、骨研究分野における大きな課題である。臨床で用いられている薬物または化合物の多く（ボルテゾミブを含む）は、培養細胞中のＯＢに対するプラスの作用を有している。しかしながら、全身分布によるその他細胞型への重篤な副作用ゆえに、それら薬物または化合物を、骨粗鬆症及び骨折などの一般的な骨疾患の治療に用いることはできていない。更に、化学反応の難しさがその達成を困難なものとしている。
【０１８７】
ビスホスホネート（ＢＰ）を用いて骨へと薬物を向かわせる初期の手法には、これまで限定的な効果があった（Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：９０１−９１９；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｓａｋｉ，２００３，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４２：１３１９−１３３０）。しかしながら、カルバメートリンカー複合体を介して、エストロゲンアナログ（Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：１１４３−１１４８）、抗生剤（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０：１３５５−１３５９）及びプロスタグランジン（Ａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：２１３１−２１４０）を骨へと向かわせる最近の試みは、とりわけ、化学結合が骨表面における続く活性剤放出を可能とするという点において、より成功している。この手法は、子宮内膜増殖症などの副作用を制限しつつ、エストラジオールの効果を向上させて骨吸収を阻害させる（Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：１１４３−１１４８）。関連する取り組みとして、本ＢＰ−薬物複合体技術は、骨への十分な送達を促進し、送達薬物の濃度を評価する放射線標識ＰＫ試験においては、プロスタグランジン「弾頭」の持続放出を促進している（Ａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：２１３１−２１４０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．３０：６７０−６８０）。骨吸収部位の破骨細胞波状縁下の酸性微環境においてカルバメートリンカーが酵素法または加水分解法によって開裂することにより、活性薬物（「弾頭／ペイロード」）が放出される（Ａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：２１３１−２１４０）。本明細書において実証しているが、カルバメートリンカーを用いることで、Ｂｔｚのボロン酸エステル官能基をリンカーとして利用することによる骨へのＢｔｚの送達がもたらされ、そのリンカーは、骨表面上で生じる低ｐＨ条件の存在下では不安定である。
【０１８８】
本明細書に記載する結果は、ボルテゾミブ、ＢＰ−Ｂｔｚ１を含む骨標的複合体化合物（Ｂｔｚが骨に放出されたかどうかを確認するために用いた）が、インビトロの破骨細胞形成アッセイにおいて少なくとも標準的なＢｔｚと等しい抗破骨細胞効果を有することを示している。対照として、骨区画に放出される非生理活性ビスホスホネート（ＢＰ）の作用についてもまた試験した。骨スライス上でのインビトロ試験では、この分解可能なボロン酸エステルリンカーを持つＢｔｚ複合体がＢｔｚそのもの以上の抗破骨細胞活性を有することが示された。重要なインビトロ試験では、このＢＰ−Ｂｔｚ１及びＢｔｚを別々に骨スライス上で２４時間インキュベートし、その後、それら骨スライスを取り出してから、破骨細胞前駆体と共に新鮮な培地を入れた培養ウェル内に置いた。これら前駆体から誘導した破骨細胞の形成及び活性は、複合体（１μＭ）でプレインキュベートした骨スライス上において有意に低下したが、Ｂｔｚのみでプレインキュベートしたそれらスライス上においては低下しなかった。これらの結果は、ビスホスホネート構成成分が２４時間の曝露中に骨スライスに結合し、Ｂｔｚが放出されて、続いて破骨細胞前駆体がそのＢｔｚを取り込むことにより破骨細胞への分化を阻害することと一致する。骨芽細胞アッセイはまた、Ｂｔｚと同様にＢＰ−Ｂｔｚ１がマウスＭＰＣ及びヒトＭＰＣの骨芽細胞分化を刺激するため、この化学的手法がＢｔｚの骨同化作用に悪影響を及ぼさないことを示した（図１）。
【０１８９】
用量反応試験によるインビボ試験では、複合体ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨吸収を阻害して、Ｂｔｚ単剤の有効量未満の用量で形成を刺激することが示されている。ＢＰ−Ｂｔｚ１のアナログを試験するためのインビトロ試験もまた用いた。
【０１９０】
実施例３：ＴＮＦ介在性骨吸収における骨芽細胞制御試験
骨におけるＥ３リガーゼのＳｍｕｒｆ１、ＷＷＰ１及びＩｔｃｈの役割が、Ｓｍｕｒｆ１−／−、ＷＷＰ１−／−及びＩｔｃｈ−／−マウスを用いて研究されている。これらノックアウトマウス全ては、ＪｕｎＢ及びＲｕｎｘ２のユビキチン化及び分解を生じさせることにより、骨体積、骨形成及びＯＢ分化を促進させている（Ｗｅａｔｈｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｌａｍｐａｌｌｉ，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：６−１２；Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：１１４３−１１４８；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０：１３５５−１３５９；Ａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０：２１３１−２１４０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．；Ｂａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ  ７：８７−９７；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６２：１８８１−１８８９）。骨折修復は、炎症、血管新生及び骨形成を含む一連の現象（複数の機構により制御される）で構成される。しかしながら、骨折治癒におけるＵＰＳによるタンパク質代謝回転の役割についてはこれまで研究されていなかった。骨折カルス内におけるＥ３リガーゼ及びＵｂタンパク質の高発現レベルが検出され（図１）、ＵＰＳ介在性細胞現象が骨修復プロセスに関与し得る（本出願の基礎をなす）ことを示した。Ｎｅｓｔｉｎ−ＧＦＰマウスを用いて間葉系幹／前駆細胞（ＭＰＣ）を標識すると（Ｍｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６９：３１１−３２４；Ｍｅｎｄｅｚ−Ｆｅｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  ４６６：８２９−８３４）、骨折カルスの初期段階においてＮｅｓｔｉｎ＋ＭＰＣの顕著な増加が認められた。
【０１９１】
プロテアソーム阻害薬ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）が骨折マウスにおけるカルス形成を促進して骨強度を増加させており、それは、Ｎｅｓｔｉｎ＋ＭＰＣ及びＵｂタンパク質に関係しているということが更に実証された（図２）。短期間のＢｔｚ治療が、骨折カルス内におけるＵｂタンパク質の蓄積（図２）に伴いマウスにおける骨折治癒を促進することが見出された（Ｂｔｚが骨再生を促進し得ることを示唆している）。しかしながら、骨髄腫治療の臨床情報は、Ｂｔｚ、及びカルフィルゾミブ（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓがカイプロリスとして市販している）を含むその他プロテアソーム阻害薬が、末梢神経障害及び血小板減少症などの重大な毒性を有している（それにより阻害薬の利用が制限される）ことを示している。本明細書に記載のとおり、Ｂｔｚ及びビスホスホネート（ＢＰ）の複合体はカルバメートリンカーを用いて合成されており（図３）、それにより、破骨細胞及び骨破壊に対するＢＰの直接作用に関連する任意の交絡効果が回避される。
【０１９２】
骨標的ボルテゾミブ複合体の設計及び合成
ＢＴ−Ｂｔｚ複合体における２種類の構造分類の合成を実施した。第１の分類、ＢＴ−Ｂｔｚ１では、Ｂｔｚはカルバメート結合を介してＢＰにコンジュゲートしている（図３）。Ｂｔｚの放出は、２種類の発生し得る機構の一方または両方により達成することができる。例えば、Ｂｔｚは、カルバメート開裂及び加水分解によって、または、Ｂｔｚのアミン安定化ボレート複合体の単純な加水分解によって放出され得る。第２の分類、ＢＴ−Ｂｔｚ２では、Ｂｔｚはアミン安定化ボロン酸エステル複合体を介してＢＰにコンジュゲートしている。
【０１９３】
化学的設計及び合成
ＢＴ−Ｂｔｚ１（カルバメート結合を有する）
酸性微環境における酵素反応によりカルバメートリンカーが開裂し、活性薬物が放出される。この手法はいくつかのＢＴ薬物において最近用いられてきた（Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：１１４３−１１４８；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０：１３５５−１３５９；Ａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０：２１３１−２１４０）。それゆえ、ＢＴ−Ｂｔｚ１が、ＭＭＰなどのプロテアーゼの活性が高い環境、または骨吸収部位の破骨細胞波状縁下にある場合、Ｂｔｚは放出される。
【０１９４】
１．設計
限定された細胞活性及び抗吸収活性を有していることから２−アミノメタン−１，１−ビスホスホン酸を標的ＢＰモジュールとして用いることにより、Ｂｔｚ弾頭によりもたらされた活性の同定が可能となる。当業者は理解するであろうが、ペイロードの放出速度を調節するために、固有の化学結合点及びその他化学変異体に対して変更を行ってもよい。Ｂｔｚを用いたこのような標的化の代表例は図３に示されており、リンカータイプの１つ及び放出機構に加え、Ｂｔｚのアミン安定化ボロネート複合体の加水分解を例示している。
【０１９５】
２．合成
これまでに報告されていた方法を用いて既知のＢＰイソシアネート１を調製し、トリエタノールアミンを用いて縮合させてＢＰカルバモイルジオール２を生成する。標準的な手順を用いてボレートの二水和物を形成し、ＢＰエステルを開裂させて標的化ＢＰ−Ｂｔｚ１のモノ−（またはジ−）ナトリウム塩とすることにより、標的化アミン安定化ボレート複合体ＢＰ−Ｂｔｚ１を調製する（化合物４、図３）。
【０１９６】
３．精製
生物学的試験に用いる前に、標準的な技術、例えば、沈殿、クロマトグラフィー（超臨界ＣＯ２を備えたＨＰＬＣを含む）などを用いて、ＢＴ−Ｂｔｚ複合体を＞９９％純度まで精製する。標準的な分光技術及び分析技術（１Ｈ、１３Ｃ及び３１Ｐ  ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、燃焼元素分析、ならびに、分析ＴＬＣ及び分析ＨＰＬＣを含む）を用いて、複合体の化学構造及び純度を確認する。
【０１９７】
ＢＴ−Ｂｔｚ２（アミン安定化ボロン酸エステル複合体を有する）
ＢＴ−Ｂｔｚ１とは異なり、Ｂｔｚは、骨基質の酸性微環境におけるＢｔｚのアミン安定化ボレート複合体の加水分解によってのみＢＴ−Ｂｔｚ２から放出され得る。弱い抗破骨細胞作用を有する２−アミノメタン−１，１−ビスホスホン酸をＢＰモジュール（キャリア）として用いているため、ＢＴ−Ｂｔｚ２の生理活性は主にＢｔｚによるものであるという仮説が立てられる。
【０１９８】
１．設計
ＢＴ−Ｂｔｚ１と同様に、２−アミノメタン−１，１−ビスホスホン酸を用いてＢＰの潜在的作用を低下させる。ロバストであるが単純なアミドリンカー、及び同一のアミン安定化ボロネート基を用いて、Ｂｔｚのボロン酸部分の安定化要素としてだけでなく、また骨基質などの酸性環境における好適な放出機構としての両方で機能させる。
【０１９９】
２．合成
モノ−（またはジ−）ナトリウム塩を用いて、アミン安定化ボレート複合体の安定性を確保する。ＢＰ−Ｂｔｚ２の調製は、アミン安定化ボロン酸エステル複合体を用いてＢｔｚをＢＰにコンジュゲートさせることを含む（図４）。シリル保護したカルボン酸塩６の合成は、標準的な文献手順により行う。標準的な方法を用い、ＢＰアミン７を、中間体の酸塩化物を経て６に結合させる。シリル保護基の開裂、及びＢｔｚを有するアミン安定化ボレート複合体の形成は、図３に示した同一の二水和物化プロセスにより行い、続いて、リン酸エステルの開裂及びＮａＯＨ水溶液による塩基化を行い、モノ−またはジ−ナトリウム塩として標的化複合体ＢＰ−Ｂｔｚ２を生成する。
【０２００】
３．精製
ＢＰ−Ｂｔｚ２の精製は、ＢＴ−Ｂｔｚ１について記載した同一手順を用いて行う。
【０２０１】
インビトロで骨芽細胞及び破骨細胞を制御する骨標的ボルテゾミブの試験
骨標的−Ｂｔｚ（ＢＴ−Ｂｔｚ）とＢｔｚ（骨標的ではない）との決定的な違いは、インビボでＢＴ−Ｂｔｚが骨にＢｔｚを放出することでその生理活性を局所的に発揮する一方で、Ｂｔｚはその生理活性を全身的に発揮するという点である。この仮説をインビボで試験する前に、インビトロでの細胞培養を用いて、プラスチック上で細胞を培養する際にＢＰ−Ｂｔｚ複合体がＯＢ機能及びＯＣ機能に対してＢｔｚ同様の生物学的作用を有しているが、骨スライス上で細胞を培養する際により強い作用を有していることを確認する。ＢＰ−Ｂｔｚ複合体がＯＢを増加させＯＣを阻害するかどうかを調べるために、様々な培養条件を用いてＢＰ−Ｂｔｚ複合体を試験する。ＷＴマウス骨髄細胞から誘導したＭＰＣ及びＯＣＰをそれぞれ、ＯＢ分化アッセイ及びＯＣ形成アッセイを用いてＢＰ−Ｂｔｚ複合体またはＢｔｚで治療する。ＯＢ分化能（アルカリホスファターゼ＋染色及び結節形成）について試験する。ＯＣ形成及びＯＣ機能をＴＲＡＰ染色及び骨吸収により評価する。骨吸収アッセイにおいてＢＰ−Ｂｔｚ複合体またはＢｔｚでインキュベートした骨スライド上でＯＣＰを培養することにより、ＢＰ−Ｂｔｚの骨標的特性を試験する。
【０２０２】
実験設計及び方法
インビトロでのＯＢ分化及びタンパク質分解に対するＢＴ−Ｂｔｚ複合体作用の同定
インビボ試験用のＢＴ−Ｂｔｚ１複合体及びＢＴ−Ｂｔｚ２複合体を選択するために、最大用量反応試験及び時間経過試験を行う（以下を参照のこと）。ＷＴ  Ｃ５７／Ｂ６マウス（在庫＃０００６６４，Ｊａｘ  ｌａｂ）由来のＢＭ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）を１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ中で３回継代培養して、ＢＭＳＣ（これまでＭＰＣと特性決定されていた）を生成する（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２８：１９２５−１９３５）。細胞に対して以下のアッセイを行う。
【０２０３】
１．ＯＢ分化
ＯＢ分化培地±Ｂｔｚ、ＢＴ−Ｂｔｚ１またはＢＴ−Ｂｔｚ２（０．１、０．５、１、５、１０μＭ）中で、ＭＰＣを１〜３週間培養する。培地にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色及びアリザリンレッド染色を行い、またｑＰＣＲ解析を行う。ＡＬＰ＋の領域及び石灰化骨結節を評価する。ＯＢマーカー遺伝子（ＡＬＰ、オステオカルシン、Ｒｕｎｘ２）の発現レベルを測定する。
【０２０４】
２．Ｕｂタンパク質
有効量のＢｔｚ、ＢＴ−Ｂｔｚ１またはＢＴ−Ｂｔｚ２でＭＰＣを４時間または８時間治療する。全細胞溶解物をプロテアーゼ阻害薬カクテル含有ＲＩＰＡ溶解緩衝液で溶解する。ａ）ウェスタンブロット：溶解液（４０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えて、抗ユビキチン抗体、Ｒｕｎｘ２抗体またはＪｕｎＢ抗体でブロットし、全Ｕｂタンパク質、Ｒｕｎｘ２及びＪｕｎＢの発現レベルを測定する。ｂ）Ｕｂアッセイ：溶解液（２００μｇ）をＵｂｉＱａｐｔｕｒｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｍｏｌ）でインキュベートしてＵｂタンパク質をプルダウンしてから、抗Ｒｕｎｘ２抗体及びＪｕｎＢ抗体でブロットし、図２に示し上述したように、Ｕｂ−Ｒｕｎｘ２及びＵｂ−ＪｕｎＢの発現レベルを測定する（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２５：１２４６−１２５６；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２９：１６０１−１６１０）。
【０２０５】
インビトロでのＯＣ形成及び骨吸収に対するＢＴ−Ｂｔｚ複合体作用の試験
２つの培養条件を用いる：１）培地へのＢＴ−Ｂｔｚ複合体の添加、２）骨スライスでのＢＴ−Ｂｔｚ複合体のプレインキュベーション。
【０２０６】
１．培地中のＢＴ−Ｂｔｚ複合体
骨髄細胞をＭ−ＣＳＦで３日間培養してＯＣ前駆体（ＯＣＰ）を生成する。Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬ±ＢＴ−Ｂｔｚ１またはＢＴ−Ｂｔｚ２（０．１、０．５、１、５、１０μＭ）を含有するプラスチックディッシュ上または骨スライス上で、ＯＣＰを５〜１０日間培養する。ＯＣを評価するために細胞を酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）で染色し、吸収窩を評価するために骨スライスをトルイジンブルーで染色する。全ての実験には、対照として同一用量のＢｔｚを含有させている。
【０２０７】
２．骨スライスでのＢＴ−Ｂｔｚ複合体のプレインキュベーション
骨スライスをＢＴ−Ｂｔｚ１またはＢＴ−Ｂｔｚ２（０．１、０．５、１、５、１０μＭ）で１２時間インキュベートする。化合物を除去して、骨スライスを培地で２回洗浄する。骨スライスと共に骨髄細胞をウェルに播種し、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬで１０日間培養してＯＣを生成させる。トルイジンブルー染色を行い吸収窩を評価する。全ての実験には、対照として同一用量のＢｔｚを含有させている。
【０２０８】
これらの実験では、ＢＴ−Ｂｔｚ複合体が、１）Ｂｔｚと比較して、ＭＰＣ−ＯＢ分化及びＵｂタンパク質発現、Ｒｕｎｘ２分解及びＪｕｎＢ分解に対する同様の刺激作用、及び、ＯＣ形成及び骨吸収に対する同様の阻害作用を有しているかどうか、及び、２）ＢＴ−Ｂｔｚでプレインキュベートした骨スライス上で培養する際に、ＯＣに対するより強い阻害作用を有しているかどうかについて試験する。
【０２０９】
いかなる特定の理論に制限されるものではないが、これらインビトロ実験において、細胞を大きなプラスチックディッシュ内で培養してＢＴ−Ｂｔｚ複合体及びＢｔｚを直接培地に加えるため、ＢＴ−Ｂｔｚ１及びＢＴ−Ｂｔｚ２は、Ｂｔｚと比較して、同様に高いＡＬＰ染色及び結節形成、ならびにＲｕｎｘ２＆ＪｕｎＢレベル、または、同様に低いＴＲＡＰ＋ＯＣ数及び吸収窩を有し得る。
【０２１０】
ＢＴ−Ｂｔｚでプレインキュベートした骨スライスがＯＣ形成及びＯＣ吸収に対する阻害作用を有する一方で、Ｂｔｚでプレインキュベートした骨スライスはこのような作用を有していない。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、この結果は、ＢＰ−Ｂｔｚ１及びＢＰ−Ｂｔｚ２が洗浄にも関わらず骨基質への結合を維持している（それに対し、Ｂｔｚは結合を維持していない）ということを示唆している。
【０２１１】
本明細書に記載のとおり、インビトロの細胞培養液を用いて、骨標的ボルテゾミブが骨芽細胞及び破骨細胞を制御する作用について試験する。これらの化合物に対してもまた、上記の骨折モデルを用いたインビボ試験を行ってもよい。最初に、細胞手法及び形態学的手法の組み合わせを用いて、ＢＰ−Ｂｔｚ複合体がインビボで骨折治癒を促進するかどうかを試験する（図１及び図２）。脛骨骨折治癒におけるＢＴ−Ｂｔｚ複合体及びＢｔｚ（骨標的ではない）の作用について、μＣＴ試験、組織構造試験及び生体力学試験を用いて試験し、骨折カルス内におけるＵｂタンパク質（全、Ｒｕｎｘ２及びＪｕｎＢ）発現についてもまた試験する。胸腺、骨髄及び脾臓内の免疫細胞に対するそれらの全身的な作用をＦＡＣＳで試験する。高いＭＭＰ活性、ならびに、破骨細胞介在性または軟骨吸収細胞介在性の軟骨リモデリング及び骨リモデリングが、ＢＴ−Ｂｔｚ複合体からのＢｔｚ放出に有利な局所環境を形成するため、成体マウスから骨折治癒を選択してＢＴ−Ｂｔｚ複合体のインビボ生理活性について試験した。若年マウス及び高齢マウスにおける骨疾患のその他モデル（骨粗鬆症、多発性骨髄腫及び難治性骨折を含む）についてもまた試験してもよい。
【０２１２】
統計計画及びデータ解析
全てのインビトロ実験を少なくとも３回繰り返す。対応のないｔ検定を二群間比較に用いる。ＡＮＯＶＡ検定に続いてボンフェローニ／ダネット検定を三群間以上における比較に用いる。それぞれの変数における平均値及び標準誤差を計算する。ｐ＜０．０５の数値を統計上有意とみなす。
【０２１３】
実施例４：骨細胞制御におけるタンパク質調節
高齢者におけるＵＰＳ阻害が、ＭＰＣ機能を向上させることにより骨折治癒を促進するという仮説を立てる。この仮説を支持するものとして、若年（３ヶ月齢）マウス由来の骨折カルス内と比較して高齢（２０ヶ月齢）マウス由来の骨折カルス内において、より多量のユビキチン化（Ｕｂ）タンパク質が観察された（図６）。Ｎｅｓｔｉｎ−ＧＦＰマウスを用いてＭＰＣを標識すると（Ｍｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６９：３１１−３２４；Ｍｅｎｄｅｚ−Ｆｅｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  ４６６：８２９−８３４）、骨折カルスの初期段階においてＮｅｓｔｉｎ＋ＭＰＣの顕著な増加が認められた（図７）。より重要なことに、ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）は、骨折高齢マウスにおいてカルス形成を促進させ骨強度を向上させた（ＭＰＣの増加に関連）（図８）。
【０２１４】
骨標的ボルテゾミブ複合体の設計、合成、及びインビトロでの試験
Ｂｔｚが不活性ＢＰに化学的に結合してＢＰ−Ｂｔｚ複合体となり、ＢＰ−Ｂｔｚが骨スライスに結合してＯＣを阻害しＯＢを増加させる。２つの化学合成手法を用いて２種類の骨標的ＢＰ−Ｂｔｚ複合体を合成する。両方の複合体分類は骨基質に結合し、酸加水分解及び／またはプロテアーゼまたはその組み合わせによりＢｔｚを放出する。ＢＰ−ＢｔｚまたはＢｔｚでプレインキュベートした骨スライス上のＯＣ前駆体を培養することにより、これらのＢＰ−Ｂｔｚ複合体が骨スライスに結合してＯＣ機能を阻害するかどうかを確認するために、これらのＢＰ−Ｂｔｚ複合体を試験する。ＯＢ分化に対するそれら作用についてもまた試験する。ＵｂＧ７６Ｖ−ＧＦＰマウス由来の骨髄細胞、ＵＰＳの活性化状態をモニターするためのレポーターマウス系統を用いる。有望なＢＰ−Ｂｔｚ複合体を選択して、インビボ試験に用いる。
【０２１５】
実験設計及び方法
新規骨標的ボルテゾミブ複合体の設計及び合成
ＢＰ−Ｂｔｚ１の改善された調製法（図５Ａ）を用いてＢＰ−Ｂｔｚ１の優れたインビトロ活性を観察することにより、現行の経路でインビボ活性を示すことができる十分な量のＢＰ−Ｂｔｚ１を調製する。骨への輸送を可能とする複合体の十分な安定性を維持しつつ、ＢＰ−Ｂｔｚ複合体からのＢｔｚの放出を向上させる。ＢＰ−Ｂｔｚ複合体には２種類の化学構造分類がある：１）アミン安定化ボロン酸エステル複合体ＢＰ−Ｂｔｚ２〜ＢＰ−Ｂｔｚ６（ＢＰ−Ｂｔｚ１のアナログ、図９）、及び２）リンカーがカルバメート結合またはアミド結合を有する非アミン安定化ボロン酸エステルＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０（図１０）。
【０２１６】
リンカーには２種類、アミンボロン酸エステル複合体と結合した酵素的に開裂不可能なリンカー（アミド）及び酵素的に開裂可能なリンカー（カルバメート）があり、後者は、複数の機構（加水分解、または酵素／加水分解）による放出を可能にする。しかしながら、それら両方はボロン酸エステル部位において等しい不安定性を示すため、全体として同様の効果を有する。化合物ＢＰ−Ｂｔｚ２〜ＢＰ−Ｂｔｚ６はカルバメート結合またはアミド結合を介してＢＰに結合しており、前者は、酸性微環境における酵素反応及び／または加水分解のいずれかにより開裂して活性薬物を放出する。それゆえ、ＢＰ−Ｂｔｚ２〜ＢＰ−Ｂｔｚ６が、プロテアーゼ活性及び／または酸性度が高い環境内（例えば、骨吸収部位のＯＣ波状縁下など）に存在する場合、Ｂｔｚは放出される。アミド結合を持つアナログは、タンパク質酵素分解を容易に受けることはなく、酸性環境下において、酸触媒加水分解によるＢｔｚの放出能を維持する。実行可能な放出機構の一方または両方のいずれかを実施することにより、これらの化合物を同定することが可能となる（最初はインビトロで、最終的にはインビボで）。
【０２１７】
第２の化学構造分類である化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０（カルバメート結合またはアミド結合のいずれかを持つ）はボロン酸エステル複合体の高い反応性を示し、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ２〜ＢＰ−Ｂｔｚ６と比較して、より急速に加水分解を受けてＢｔｚを放出するものと予想される。Ｂｔｚの加水分解放出を更に調節するために、リンカー内のジオール構造を変化させてもよい。ＢＰ−Ｂｔｚ７（図１１）に示すものに類似の合成経路を用いて、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０を調製してもよい。
【０２１８】
ＢＰ−Ｂｔｚ３、ＢＰ−Ｂｔｚ５（カルバメート結合及びアミン安定化ボロン酸エステル複合体）
１．設計
化合物ＢＰ−Ｂｔｚ３及びＢＰ−Ｂｔｚ５の構造（図９）は、ＢＰ−Ｂｔｚ１の構造と関連している（アミン安定化ボロン酸エステル複合体における環の大きさの違いがペイロード（Ｂｔｚ）放出速度を調節する）。
【０２１９】
２．合成
ＢＰ−Ｂｔｚ１（図５Ａ）に示すものに類似の合成経路を用いて、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ３及びＢＰ−Ｂｔｚ５を調製する。
【０２２０】
３．精製
生物学的試験に用いる前に、標準的な技術、例えば、選択的沈殿などを用いて、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ３及びＢＰ−Ｂｔｚ５を精製する。標準的な分光技術及び分析技術（１Ｈ、１３Ｃ及び３１Ｐ  ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、燃焼元素分析、ならびに、分析ＴＬＣ及び分析ＨＰＬＣを含む）を用いて、複合体の化学構造及び純度を確認する。
【０２２１】
ＢＰ−Ｂｔｚ２、ＢＰ−Ｂｔｚ４及びＢＰ−Ｂｔｚ６（アミド、及びアミン安定化ボロン酸エステル部分の両方を有するリンカーを持つ）
１．設計
化合物ＢＰ−Ｂｔｚ２、ＢＰ−Ｂｔｚ４及びＢＰ−Ｂｔｚ６の構造は、ＢＰ−Ｂｔｚ１に極めて類似させて設計されているが、リンカー内に、アミド、及びそれぞれ２つの２、３及び４炭素アルコール側鎖を持つアミン安定化ボロン酸エステル部分の同一セットを有している。アミド／アミノジオールリンカーの使用（化合物ＢＰ−Ｂｔｚ２、ＢＰ−Ｂｔｚ４及びＢＰ−Ｂｔｚ６など）により、ボロン酸エステル部分においてのみ開裂することによって薬理活性を保持する開裂可能な複合体の調製が可能となるはずであるという仮説を立てる。
【０２２２】
２．合成
アミド結合したＢＰの合成は、図５Ａに略記した一般的な経路に従う（リンカー内においてアミドがカルバメート部分に置き換わっていること以外は）。
【０２２３】
３．精製
本明細書の他の箇所に記載した方法（ＢＰ−Ｂｔｚ１用）を用いて、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ２、ＢＰ−Ｂｔｚ４及びＢＰ−Ｂｔｚ６を精製する。
【０２２４】
ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０
設計
化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０の構造（ボロン酸エステルのアミン安定化基が欠けたＢＰ−Ｂｔｚ複合体）（図１０）を設計し、Ｂｔｚの放出速度について更なる調節を可能とした。不安定化ボロン酸エステルは、効果を潜在的に高めるために、その他のＢＰ−Ｂｔｚ化合物と比較して更に速くＢｔｚを放出するはずであるという仮説を立てる。一実施形態では、ジオール構成成分を調節することにより、Ｂｔｚの放出速度を更に調節することができる。カルバメート結合したアナログ及びアミド結合したアナログの両方を調製して、酵素開裂が放出機構において役割を果たすかどうかを確認する。ジオールのｐＫａ、その置換度、及び得られたボロン酸エステルの環の大きさは全て、Ｂｔｚの加水分解放出速度を調節し得る変動要因である。
【０２２５】
２．合成
化合物ＢＰ−Ｂｔｚ１〜ＢＰ−Ｂｔｚ６に示すものに類似の合成経路（図１１に示す）を用いて、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０を調製する。
【０２２６】
３．精製
本明細書の他の箇所に記載した方法（ＢＰ−Ｂｔｚ１用）を用いて、化合物ＢＰ−Ｂｔｚ７〜ＢＰ−Ｂｔｚ１０を精製する。
【０２２７】
インビトロでのＯＢ分化及びＯＣ形成に対するＢＰ−Ｂｔｚ複合体生理活性の試験
ＵｂＧ７６Ｖ−ＧＦＰマウス由来のＢＭ細胞、ＵＰＳ活性化用のレポーターマウス系統を用いる。３セットのアッセイを用いる：１）ＯＣ機能及びＯＢ機能に対するＢＰ−Ｂｔｚの作用を試験するためのＯＣアッセイ及びＯＢアッセイ、２）Ｕｂ、及び標的タンパク質の分解におけるＢＰ−Ｂｔｚの役割を確認するためのウェスタンブロット／Ｕｂアッセイ、３）ＵＰＳの活性化状態に多少作用するＢＰ−ＢｔｚのＧＦＰ＋細胞。
１．上記の方法を用いて、Ｂ６バックグラウンドのＵｂＧ７６Ｖ−ＧＦＰマウス（在庫＃００８１１１，Ｊａｘ  ｌａｂ）を作製する（Ｌｉｎｄｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：８９７−９０２）。ニワトリβアクチンプロモーター、及び、変異ユビキチン部分（ＵｂＧ７６Ｖ）、構成的に活性なプロテアソーム分解シグナルに融合したＧＦＰの上流のＣＭＶ即時初期エンハンサーを用いて、ＵｂＧ７６Ｖ−ＧＦＰ導入遺伝子を設計した。プロテアソーム阻害薬の投与後、ＵｂＧ７６Ｖが蓄積してＧＦＰ蛍光が容易に識別可能となる。ＢｔｚをＯＣ培養液へと加えた４時間後及び８時間後にＧＦＰ＋ＯＣを検出し、添加後２４時間時点に消失した。より重要なことに、ＧＦＰ＋細胞は、ＢＰ−Ｂｔｚ１でプレインキュベートした骨スライス上には存在したが、ＢｔｚまたはＢＰでプレインキュベートした骨スライス上には存在しない（図５Ｂ）ことが示され、Ｂｔｚの生理活性はＢＰ−Ｂｔｚ１に限られていることを示した。
２．本明細書に記載するとおり（図４）、また上記の方法（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：３２００−３２１４；Ｘｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：２９７−３１０）を用いて、ＯＣ形成及び吸収アッセイ、ならびにデータ解析を実施する。ＢＭ細胞をＭ−ＣＳＦで培養し、３種類の条件下±ＢＰ−Ｂｔｚ複合体、ＢｔｚまたはＢＰ（０．１〜１００ｎＭ）：ｉ）ＢＰ−Ｂｔｚ複合体がその生理活性を変化させるかどうかを試験するためにプラスチックシャーレ上で、ｉｉ）ＢＰ−Ｂｔｚの作用が活性化ＯＣによるＢｔｚ放出を必要とするかどうかを試験するために骨スライス上で、及びｉｉｉ）ＢＰ−Ｂｔｚが骨基質に結合しているかどうかを試験するためにプレインキュベートした骨スライド上で培養したＯＣ前駆体（ＯＣＰ）を生成する。ＯＣ及び吸収窩の数及び領域を評価する。ＯＣ形成中における、骨スライス及び骨スライスを囲むプラスチック上のＧＦＰ＋細胞の外観、強度及び分布を観察して記録する。
３．ＯＢ分化。上述したように、ＢＭ間質細胞の第３継代をＭＰＣとして用いる（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．２８：１９２５−１９３５；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：３２００−３２１４）。ＯＢ誘導培地±ＢＰ−Ｂｔｚ複合体、ＢｔｚまたはＢＰ（０．１〜１００ｎＭ）を含むプラスチックシャーレ上でＭＰＣを１〜３週間培養する。培地にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色及びアリザリンレッド染色を行い、またｑＰＣＲ解析を行う。ＡＬＰ＋及び石灰化骨結節の領域、ならびにＯＢマーカー遺伝子（ＡＬＰ、オステオカルシン、Ｒｕｎｘ２）の発現レベルを測定する。ＯＢ分化中のＧＦＰ＋細胞をＯＣと同様に観察する。並行実験において、ヒトＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ製）をＯＢ誘導培地中のＢＰ−Ｂｔｚ、ＢｔｚまたはＢＰで治療して、図５Ｃ及び図５Ｄに示すとおりＯＢ分化に対するそれらの作用を試験した。
４．ウェスタンブロット／Ｕｂアッセイ。ＯＣＰまたはＭＰＣを好ましい用量の有望なＢＰ−Ｂｔｚ、Ｂｔｚ及びＢＰで治療する。α−ＮＦ−κＢメンバー及びＴＲＡＦ６  Ａｂを用いて、ＯＣＰ溶解物をウェスタンブロットに供す。α−ユビキチン、Ｒｕｎｘ２またはＪｕｎＢ  Ａｂを用いてＯＢ溶解物をウェスタンブロットに供し、上記の方法を用いて、ＵｂｉＱａｐｔｕｒｅ  ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｍｏｌ）を用いたＵｂアッセイでＵｂタンパク質に続いて、α−Ｒｕｎｘ２及びＪｕｎＢ  Ａｂをプルダウンする（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．２５：１２４６−１２５６；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２９：１６０１−１６１０）。
【０２２８】
いかなる特定の理論に制限されるものではないが、ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨に結合し、ＯＣ及びプロテアソーム機能の阻害に関してその生理活性を維持していることを、予備データが示唆している（図５）。ＯＢアッセイの目的は、骨標的Ｂｔｚと骨標的ではないＢｔｚの間の違いを試験することではなく、ＢＰ−Ｂｔｚ複合体が依然として生理活性を有するかどうかを確認することである。ＭＰＣを大きなプラスチックディッシュ内で培養してＢＰ−Ｂｔｚ及びＢｔｚを直接培地に加えるため、ＢＰ−Ｂｔｚ複合体が、同様に高いＡＬＰ染色及び結節形成、ならびにＢｔｚレベルと同様のＲｕｎｘ２＆ＪｕｎＢレベルを有し得るという仮説を立てる。
【０２２９】
インビボでの骨体積及び再生に対する骨標的ボルテゾミブ複合体の試験
１）ＯＶＸ誘導骨吸収を抑制すること、及び２）Ｂｔｚによるものと比較して全身的な副作用を低くしつつ高齢マウスの骨折治癒を促進することに対して、ＢＰ−Ｂｔｚが高い効果を有すると予想される。ＢＰ−ＢｔｚとＢｔｚとの決定的な違いは、インビボでＢＰ−Ｂｔｚが骨にＢｔｚを届けることでその生理活性を局所的に発揮する一方で、Ｂｔｚはその生理活性を全身的に発揮し得るという点である。ＢＰ−Ｂｔｚ複合体は骨体積に関してＢｔｚと比較して同等またはより優れた明確な生理活性を有するが、副作用に関しては有意に抑制されるはずであるという仮説を立てる。ヒトにおけるＢｔｚの毒性としては、末梢神経障害及び血小板減少症が挙げられる（Ｗｅａｔｈｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｌａｍｐａｌｌｉ，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：６−１２）。マウスにおけるＢｔｚの毒性についてはほとんど知られていない。マウス研究において、Ｂｔｚ注入により全胸腺細胞、ＣＤ４＋胸腺細胞及びＣＤ８＋胸腺細胞は顕著に減少するが、脾細胞の数は減少しないことが報告されている（Ｍａｓｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１５：６００−６１２）。Ｂｔｚで治療した高齢マウスでは低い生存率が観察された（５３％対溶媒では９１％）一方で、Ｂｔｚが若年マウスの生存に影響を及ぼすということは見出されなかった（９４％対溶媒では１００％）。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、これらの副作用は薬物の全身分布によるものと考えられている。それゆえ、骨標的Ｂｔｚを生成することで、局所的な薬物濃度によりまたは局所的な薬物濃度を増加させることによりＢｔｚの効果を利用する一方で、全身性副作用を抑制するという重要な臨床条件を満たすことが可能となる。プロテアソーム阻害薬が、正常マウス及びＯＶＸマウスにおける骨体積を増加させて、成体マウスにおける骨折治癒を促進させ得る（Ｋｈｅｄｇｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．４：ｅ７７８；Ｍａｓｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１５：６００−６１２）ため、ＯＶＸモデル及び骨折モデルを用いて、骨上の有望なＢＰ−Ｂｔｚ複合体の効果を試験する。高齢マウスが多くの場合、癒合遅延または難治性骨折を示すため、高齢マウスを骨折実験に用いる（Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．）。胸腺細胞数及び死亡を、Ｂｔｚの全身性副作用のアウトカム指標として用いる。ＯＶＸを受けた３ヶ月齢のＷＴ  Ｃ５７／Ｂ６雌マウスにおける骨体積、骨形成／吸収マーカー、ＯＣ及びＯＢに対するＢＰ−Ｂｔｚ複合体及びＢｔｚの作用を、μＣＴ、組織構造及びＥＬＩＳＡアッセイで試験する。２０ヶ月齢（高齢）マウスの脛骨骨折治癒に対するＢＰ−Ｂｔｚ複合体の作用を、μＣＴ、組織構造及び生体力学試験で試験する。マウス生存率に対する化合物の全身的な作用を生存曲線及び胸腺内の免疫細胞で試験する一方で、骨髄及び脾臓はフローサイトメトリーで試験する。
【０２３０】
実験設計及び方法
ＯＶＸ誘導骨吸収を予防するためのＢＰ−Ｂｔｚ効果の試験
１．動物及び群：３ヶ月齢の雌ＷＴ  Ｃ５７／Ｂ６マウスにＯＶＸ手術または擬似手術を施す。生理食塩水、２種類のＢＰ−Ｂｔｚ複合体（０．２ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ）、またはＢｔｚを週に２回、４週間にわたりｉ．ｐ．注射してマウスを治療する。Ｂｔｚ（０．６ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．）を１日目、３日目、５日目に投与した３ヶ月齢のマウスは、１０日目に骨体積が増加していることが観察された。Ｎ＝１０匹のマウス／群  ｘ  ７  ｘ  ２  ＝  １４０匹のマウス。
２．アウトカム指標：Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ内のＢｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅで、μＣＴ試験及び生体力学試験を実施する。
ａ）体重を毎週測定する。ベースライン時及び殺傷前に血清を採取する。殺傷前のマウスにカルセインを２回注入して、骨形成率（ＢＦＲ）及びミネラル付加率（ＭＡＲ）を評価する。
ｂ）左大腿骨及びＬ５椎骨に対して、生体力学試験を実施する。破壊時の最大圧縮荷重、最大力時の最大変形、剛性、及び破壊エネルギーを測定する。
ｃ）左脛骨、ならびにＴ１２椎骨及びＬ１椎骨を用いて、μ−ＣＴ及びＢＦＲを試験する。骨密度、骨体積分率、骨表面、小柱数、小柱間隔及び小柱厚、連結密度、構造モデル指数、異方性度、多孔性パラメータ及び皮質パラメータを再試験する（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｘｉｎｇ，２０１３，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１：１５７４−１５８３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：３２００−３２１４；Ｘｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：２９７−３１０）。それから、これらの骨をプラスチック包埋し、ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅソフトウェアを用いてＢＦＲを評価する。
ｄ）右脛骨及びＬＶ２〜ＬＶ４のパラフィン切片で組織形態計測を実施して、これまでに報告されていた方法（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｘｉｎｇ，２０１３，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１：１５７４−１５８３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：３２００−３２１４；Ｘｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：２９７−３１０）を用い、ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ画像解析ソフトウェアを用いて骨パラメータ（ＢＶ／ＴＶ、Ｔｂ．Ｔｈ、Ｔｂ．Ｎ及びＴｂ．Ｓｐ、ＯＣ数及びＯＣ表面、ならびにＯＢ表面）を評価する。
ｅ）皮質骨を用いて、図６に示すとおりウェスタンブロットでＵｂタンパク質を試験する。
ｆ）これまでに報告されていた方法（Ｘｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：２９７−３１０；Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：３０２４−３０３４）を用いて、血清中の骨吸収及び形成の全身性マーカー、オステオカルシン及びＴＲＡＰ５ｂの全身性マーカーをＥＬＩＳＡで測定する。
ｇ）胸腺、脾臓及び右大腿骨を採取して、フローサイトメトリー用に、単一細胞懸濁液をフルオレセイン標識したα−ＣＤ４及びＣＤ８（Ｔ細胞）、ならびにＢ２２０（Ｂ細胞）Ａｂで染色する。胸腺、脾臓及び大腿骨ＢＭの総数、ならびに、Ｔ細胞またはＢ細胞の総数及び割合を測定する。任意の副作用について、脳、心臓、肺、肝臓及び腎臓の試料を組織構造的に試験する。
【０２３１】
高齢マウスの骨折修復に対するＢＰ−Ｂｔｚ複合体の効果の試験
１．動物及び群：２０ヶ月齢のＷＴ  Ｃ５７／Ｂ６雄マウス（ＮＩＡから購入）の左脚に開放性脛骨骨折手術を施す（図７〜図９）。マウスをランダムに２セットに分ける。図８のとおり、好ましい用量のＢＰ−Ｂｔｚを、骨折後１、３，５、７日目にｉ．ｐ．で投与する。
２．アウトカム指標：それからマウスの生存率を記録する。
ａ）μＣＴ及び組織構造：セット１のマウスをランダムに４群、１）生理食塩水、２＆３）２種の有望なＢＰ−Ｂｔｚ複合体、４）Ｂｔｚに分け、骨折後２８日目及び３５日目に殺す。左脛骨（骨折）にμＣＴを実施してから、組織構造用にパラフィン包埋する。図８に示すように、カルス及び石灰化組織の体積を定量する。パラフィン切片を用いて、組織形態計測解析を実施する。切片をアルシアンブルー／オレンジＧで染色し、またＴＲＡＰ活性用に染色する。上記の方法（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．８８：３０２４−３０３４）を用いて図８のとおり、ＷＳＩソフトウェア及びＶｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェアを用い、骨折カルス内の個々の組織領域（新たに形成された線維性骨、全軟骨及び線維性組織）及びＯＣパラメータを測定する。Ｎ＝１０匹のマウス／群  ｘ  ４  ｘ  ２  ＝  合計８０匹のマウス。
ｂ）フローサイトメトリー：上記のとおり、セット１のマウス由来の胸腺、脾臓及び大腿骨ＢＭを、ＣＤ４及びＣＤ８（Ｔ細胞）、ならびにＢ２２０（Ｂ細胞）を測定するためにフローサイトメトリーにかける。
ｃ）生体力学試験：セット２のマウスを最適用量のＢＰ−Ｂｔｚ、Ｂｔｚまたは生理食塩水で治療し、図８にあるように生体力学試験のため、骨折後２８日目に殺す。Ｎ＝１０匹のマウス／群  ｘ  ４  ＝  ４０匹のマウス。
【０２３２】
ＢＰ−Ｂｔｚ複合体が、１）骨吸収予防及び骨折治癒促進に優れているかどうか、及び２）全身性副作用が少ないかまたは有していないかに関わらず、Ｂｔｚとの比較でこれらの実験を行う。
【０２３３】
ＢＰ−Ｂｔｚ複合体が、骨の石灰化表面に結合して局所的に作用するという仮説を立てる。それゆえ、ＢＰ−Ｂｔｚ複合体は、Ｂｔｚと比較してより速くまたはより低用量のいずれかで、高い効果を有し、ＯＶＸ介在性骨吸収を予防し骨折治癒を促進するという仮説を立てる。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、このことは、Ｂｔｚと比較して、骨内の局所により多く集中することによるものであり得る。
【０２３４】
ＢｔｚがＣＤ４＋及びＣＤ８＋、胸腺細胞を減少させる一方で、ＢＰ−Ｂｔｚ複合体にはこのような作用がないという仮説を立てる。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、このことは、Ｂｔｚとは異なり、骨標的戦略が実際に全身的な作用を予防し得ることを示唆する。臨床におけるＢｔｚの一般的な副作用としては、末梢神経障害及び血小板減少症が挙げられ、薬物の全身分布によるものである。これらの副作用をマウスで試験することは困難な場合がある。それゆえ、胸腺細胞減少及び生存率は、マウスにおけるＢｔｚの潜在的な全身的作用を試験するのに良好なアウトカム指標である。副作用についての、胸腺及びその他内部器官の切片による組織学的評価もまた試験する。
【０２３５】
統計計画及びデータ解析
インビボ試験のサンプル数は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ及び上記の方法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ９９６５６）を用いて実施される、対応のないｔ検定の検定力分析結果を基準としている。骨折マウスのカルス体積を評価して、５％のアルファ過誤で骨折していない対照との有意差を検出するためには、それぞれの群に１０匹のマウスが必要となる。検定力は０．９８、すなわち、アルファ＝０．０５の場合、９５％の信頼で特定の作用を検出する可能性が９８％ある。対応のないｔ検定を二群間比較に用いる。ＡＮＯＶＡ検定に続いてボンフェローニ／ダネット検定を三群間以上における比較に用いる。それぞれの変数における平均値及び標準誤差を計算する。ｐ＜０．０５の数値を統計上有意とみなす。
【０２３６】
実施例５：骨標的ボルテゾミブは、ボルテゾミブと比較してより少ない全身性副作用でより効果的にＯＶＸ誘導骨吸収及び骨髄腫誘導骨吸収を予防する
本明細書に記載の結果は、Ｂｔｚ単剤と比較して、ＢＰ−Ｂｔｚ１がより高濃度でＢｔｚを局所的に骨へと送達させて、より少ない全身性副作用でＯＶＸ関連骨吸収及びＭＭ関連骨吸収を予防するはずであることを示す。骨標的Ｂｔｚ（ＢＰ−Ｂｔｚ１）を生成するために抗吸収活性を欠くビスホスホネート（ＢＰ）部分と結合したＢｔｚの作用を、マウスにおけるＯＶＸ誘導骨吸収及びＭＭ誘導骨吸収、ならびに全身腫瘍組織量で試験した。Ｂｔｚと比較して、ＢＰ−Ｂｔｚ１がより少ない全身性副作用でより効果的にＯＶＸ誘導骨吸収及びＭＭ誘導骨吸収を予防するという仮説を立てた。
【０２３７】
物質及び方法：
１０週齢の雌Ｃ５７／Ｂ６マウスに対して卵巣摘出術を行った。
【０２３８】
６週齢雌ＮＩＨ−ＩＩＩヌードマウスへの５ＴＧＭ１−ＧＦＰ骨髄腫細胞の尾静脈注射を用いてＭＭモデルを作製した。全身腫瘍組織量及び骨体積を試験した。
【０２３９】
ＢＰ−Ｂｔｚ１は骨基質に結合し、破骨細胞機能及び骨芽細胞分化を阻害する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨基質に結合し、破骨細胞機能及び骨芽細胞分化を阻害することを示す（図１５）。
【０２４０】
ＢＰ−Ｂｔｚは骨芽細胞分化を刺激する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨芽細胞分化を刺激することを示す（図１６）。
【０２４１】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＷＴマウスの骨体積及び骨芽細胞分化を促進させる
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＷＴマウスの骨体積及び骨芽細胞分化を促進させることを示す（図１７）。
【０２４２】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＢｔｚよりもより持続するユビキチン化作用を有する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚよりもより持続するユビキチン化作用を有することを示す（図１８）。
【０２４３】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＢｔｚと同じくらい効果的にＯＶＸマウスの骨量及び強度を増加させる
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと同じくらい効果的にＯＶＸマウスの骨量及び強度を増加させることを示す（図１９）。組織形態計測（図２０Ａ）及び生体力学試験（図２０Ｂ）もまた実施した。これらの実験は、Ｃ５７／Ｂ６マウス（１０週）を用いて行った（ＯＶＸ後４週目から４週間の治療）。
【０２４４】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＯＶＸマウスの骨芽細胞分化をより強力に促進する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＯＶＸマウスの骨芽細胞分化をより強力に促進することを示す。ＣＦＵ−Ｆ（図２１）及びＣＦＵ−ＡＬＰ（図２２）のコロニー形成を試験した。
【０２４５】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はインビトロで骨髄腫細胞の増殖を阻害する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がインビトロで骨髄腫細胞の増殖を阻害することを示す（図２３）。骨髄腫細胞を異なる濃度の試験化合物で２４時間治療した。生細胞の数をカウントした。＊Ｂｔｚに対して、ｐ＜０．０５。図２４は、ＢＰ−Ｂｔｚ１を試験するのに使用可能である例示的な多発性骨髄腫マウスモデルを示す。
【０２４６】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＢｔｚと比較してより効果的に全身腫瘍組織量及び骨髄腫誘導骨吸収を抑制する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより効果的に全身腫瘍組織量及び骨髄腫誘導骨吸収を抑制することを示す（図２５）。
【０２４７】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＢｔｚと比較してより効果的に骨髄腫誘導骨吸収を予防する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較してより効果的に骨髄腫誘導骨吸収を予防することを示す（図２６〜図２７）。
【０２４８】
ＢＰ−Ｂｔｚ１で治療した骨髄腫マウス由来の骨髄細胞はより多くの骨芽細胞コロニーを形成する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１で治療した骨髄腫マウス由来の骨髄細胞がより多くの骨芽細胞コロニーを形成することを示す（図２８）。
【０２４９】
ＢＰ−Ｂｔｚ１はＢｔｚと比較して血球数に関する副作用を抑制する
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１がＢｔｚと比較して血球数に関する副作用を抑制することを示す（図２７）。
【０２５０】
ＢＰ−Ｂｔｚ１は骨髄中のＢ細胞数を減少させる
本明細書で提供する実験は、ＢＰ−Ｂｔｚ１が骨髄内のＢ細胞数を減少させ、Ｂｔｚと比較してより低い全身性毒性を有し、神経細胞への毒性作用を予防することを示す（図２９）。
【０２５１】
実施例６：合成実施例
（（（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパンアミド）−ブチル）−１，３，７，２−ジオキサザボレカン−７−イル）エトキシ）カルボニル）アミノ）メチレン）ジホスホン酸の合成
（（（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパンアミド）−ブチル）−１，３，７，２−ジオキサザボレカン−７−イル）エトキシ）カルボニル）アミノ）メチレン）ジホスホン酸の例示的な合成を図３０に示す。
【０２５２】
工程４／５：ジエチル３，３’−（（２−（（（ビス（ジエトキシホスホリル）メチル）カルバモイル）オキシ）−エチル）アザンジイル）ジプロパノエートの合成
【化５４】
2018537526.tif 000058
実施例１に記載のとおり、テトラエチル（アミノメチレン）ビス（ホスホネート）を合成した。オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水ジクロロメタン中のテトラエチル（アミノメチレン）ビス（ホスホネート）の溶液（２ｇ、３５ｍＬ中６．５９ｍｍｏｌ）を充填した。０℃まで冷却した後、トリホスゲン（０．７８２ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を加え、続いて、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．１８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合液を室温まで徐々に暖め、１４時間攪拌した。減圧下で濃縮後、粗混合物を無水ジクロロメタン（１６ｍＬ）中に再溶解させた。無溶媒ジブチルスズジラウレート（０．４１６ｇ、０．６５９ｍｍｏｌ）及びジエチル３，３’−（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ジプロパノエートを連続的に加え、その内容物を室温で３日間攪拌した。減圧下で濃縮後、カラムクロマトグラフィーを用いてシリカ（ジクロロメタン中０％〜３％のメタノール）上で粗混合物を精製し、ジエチル３，３’−（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ジプロパノエート（２．６６ｇ、６８％）を黄色の粘稠な油状物として得た。
Ｒｆ  ０．２（１００％エチルアセテート、２回溶出、ＫＭｎＯ４活性）
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ２２Ｈ４４Ｎ２Ｏ１２Ｐ２に対する計算値：  ５９１．５４，  実測値：  ５９１．５
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６５−４．４５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２５−４．１４  （ｍ，  ８  Ｈ），  ４．１３−３．９６  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．７９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．６６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ２．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．３９−１．２２  （ｍ，  １２Ｈ），  １．２１  （ｔ，    Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ６Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７２．２９，  １５５．６８，  ６３．８９，  ６３．４９，  ６０．３３，  ４２．３０，  ４９．８４，  ４５．９４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５８８  Ｈｚ），  ３２．８３，  １６．２６，  １４．１０．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７．１３．
【０２５３】
工程６：２−（ビス（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）エチル（ビス（ジエトキシホスホリル）−メチル）カルバメートの合成
【化５５】
2018537526.tif 000059
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水テトラヒドロフラン中のジエチル３，３’−（（２−（（（ビス（ジエトキシホスホリル）メチル）カルバモイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ジプロパノエートの溶液（０．７ｇ、７ｍＬ中１．１８ｍｍｏｌ）を充填した。０℃まで冷却した後、無溶媒ジイソブチルアルミニウムハイドライド（０．８５ｇ、５．９２ｍｍｏｌ）を滴下して加え、その内容物を０℃で３０分間攪拌した。反応混合液を半飽和硫酸ナトリウムでクエンチし、その内容物を室温で１時間攪拌した。固形分を濾過してから濾液を減圧下で濃縮して粗混合物を得た。カラムクロマトグラフィーを用いてシリカ（ジクロロメタン中０％〜１２％のメタノール）上でその粗混合物を精製し、２−（ビス（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）エチル（ビス（ジエトキシホスホリル）メチル）カルバメート（０．１２７ｇ、２２％）を無色油状物として得た。
Ｒｆ  ０．２（ジクロロメタン中８％のメタノール、ＫＭｎＯ４活性）
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ１８Ｈ４０Ｎ２Ｏ１０Ｐ２に対する計算値：  ５０７．４７，  実測値：  ５０７．５
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５．６８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６５−４．４７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３１−４．０７  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．６９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．７５−２．５５  （ｍ，  ６  Ｈ），  １．６９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．３１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  １２Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １５５．８３，  ６３．５５，  ６３．３７，  ６１．９，  ５３．０５，  ５２．３８，  ４６．０２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５８８  Ｈｚ），  ２８．７４，  １６．２８．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７．１３．
【０２５４】
工程７／８：（（（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，７，２−ジオキサザボレカン−７−イル）エトキシ）カルボニル）−アミノ）メチレン）ジホスホン酸の合成
【化５６】
2018537526.tif 000060
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、トルエン中の２−（ビス（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）エチル（ビス（ジエトキシホスホリル）メチル）カルバメートの溶液（８７ｍｇ、１５ｍＬ中０．１７１ｍｍｏｌ）を充填した。ベルケイド（８４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、ディーンスターク装置を用いてその内容物を４日間還流させた。トルエンを減圧下で蒸溜し、その内容物を無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中に再度溶解させた。０℃まで冷却した後、無溶媒トリメチルシリルブロミド（１．２ｍＬ）を加え、その内容物を室温で１６時間攪拌した。減圧下で濃縮後、粗混合物をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解させ、その内容物を室温で１０分間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、上記の手順を２回繰り返した。それから粗混合物をエーテルで３回洗浄し、（（（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，７，２−ジオキサザボレカン−７−イル）エトキシ）カルボニル）−アミノ）メチレン）ジホスホン酸を得た。
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ２９Ｈ４５ＢＮ６Ｏ１２Ｐ２に対する計算値：７４３．４６，  実測値：  ７４３．５．
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏを含むＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ９．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２９−７．０５  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．８１−４．６１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３２−４．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１２−４．０１  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５９−３．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．２１−２．８９  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．５３−２．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７９−１．６１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４４−１．３６  （ｍ，  １Ｈ），  １．３５−１．２１  （ｍ，  １Ｈ），  １．２０−１．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ，  ６Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏを含むＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７０．６１，  １６２．８２，  １４８．２３，  １４４．３２，  １４４．０３，  １４３．６３，  １３７．５９，  １２９．６３，  １２８．５８，  １２６．９５，  ５８．４１，  ５４．２５，  ５４．０２，  ５２．０６，  ５１．７２，  ５１．５３，  ４８．９２，  ３８．６２，  ２６．２２，  ２５．２，  ２３．５７，  ２２．３０．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏを含むＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  −０．９１３．
【０２５５】
（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）アセトアミド）メチレン）ジホスホン酸の合成
（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）アセトアミド）メチレン）ジホスホン酸の例示的な合成を図３１に示す。
【０２５６】
工程４／５：テトラエチル（５−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）−９，９，１０，１０−テトラメチル−３−オキソ−８−オキサ−２，５−ジアザ−９−シラウンデカン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）の合成
【化５７】
2018537526.tif 000061
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水ジクロロエタン中のテトラエチル（アミノメチレン）ビス（ホスホネート）の溶液（２ｇ、１５ｍＬ中６．６ｍｍｏｌ）を充填した。あらかじめ活性化した炭酸カリウム（４．５ｇ、３３ｍｍｏｌ）を一度に加え、白色懸濁液を０℃まで冷却した。無溶媒２−塩化クロロアセチル（０．５５ｍＬ、６．９３ｍｍｏｌ）を加え、その内容物を室温まで徐々に暖め、１４時間攪拌した。無溶媒ビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）アミン（２．４２ｇ、７．２６ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（０．１ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加え、その内容物を室温で２４時間攪拌した。無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）で希釈後、反応混合液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィーを用いてアルミナ（ｎ−ヘキサン中４０％〜６０％のエチルアセテート）上で粗混合物を精製し、テトラエチル（５−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）−９，９，１０，１０−テトラメチル−３−オキソ−８−オキサ−２，５−ジアザ−９−シラウンデカン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（１．７２ｇ、３９％）を淡黄色の油状物として得た。
Ｒｆ  ０．６（ジクロロメタン中４％のメタノール、２回溶出、ＫＭｎＯ４活性）
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ２７Ｈ６２Ｎ２Ｏ９Ｐ２Ｓｉ２に対する計算値：６７７．９１，  実測値：  ６７７．９
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ７．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０３−４．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２４−４．０８  （ｍ，  ８  Ｈ），  ３．６８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．３５−１．２１  （ｍ，  １２  Ｈ），  ０．８４  （ｓ，  １８Ｈ），  ０．０１  （ｓ，  １２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７０．７１，  ６３．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５２  Ｈｚ），  ６１．５７，  ５９．４５，  ５６．９８，  ４３．０８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５８４  Ｈｚ），  ２５．７５，  １８．０３，  １６．２９  （ｔ，  Ｊ  ＝  １２  Ｈｚ），  −５．５２．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７．３２
【０２５７】
工程６：テトラエチル（（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）アセトアミド）メチレン）−ビス（ホスホネート）の合成
【化５８】
2018537526.tif 000062
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水テトラヒドロフラン中のテトラエチル（５−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）−９，９，１０，１０−テトラメチル−３−オキソ−８−オキサ−２，５−ジアザ−９−シラウンデカン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）の溶液（０．３９ｇ、１ｍＬ中０．５７６ｍｍｏｌ）を充填した。フッ化テトラブチルアンモニウムの溶液（２．３ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ、１Ｍ）を加え、その内容物を室温で１時間攪拌した。減圧下で濃縮後、カラムクロマトグラフィーを用いてシリカ（ジクロロメタン中３％〜６％のメタノール）上で粗混合物を精製し、テトラエチル（（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）アセトアミド）メチレン）−ビス（ホスホネート）（０．１４ｇ、５４％）を無色油状物として得た。
Ｒｆ  ０．３（ジクロロメタン中５％のメタノール、ＫＭｎＯ４活性）
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ１５Ｈ３４Ｎ２Ｏ９Ｐ２に対する計算値：  ４４９．３９，  実測値：  ４４９．４
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ８．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０１−４．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２１−４．０３  （ｍ，  ８  Ｈ），  ３．９３  （ｂｓ，  ２Ｈ），  ３．６０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ３．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．２９  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ３．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．７５−１．５７  （ｂｓ，  ２Ｈ），  １．３７−１．２３  （ｍ，  １２  Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７１．２６，  ６３．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４０  Ｈｚ），  ５９．７３，  ５９，６，  ５８．２８，  ４３．３５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５８８  Ｈｚ），  １６．２３．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７．５０．
【０２５８】
工程７／８：（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）アセトアミド）メチレン）ジホスホン酸の合成
【化５９】
2018537526.tif 000063
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、トルエン中のテトラエチル（（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）アセトアミド）メチレン）−ビス（ホスホネート）の溶液（０．１３ｇ、１５ｍＬ中０．２９ｍｍｏｌ）を充填した。ベルケイド（０．１４５ｇ、０．３７７ｍｍｏｌ）を加え、ディーンスターク装置を用いてその内容物を４日間還流させた。トルエンを減圧下で蒸溜し、その内容物を無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中に再度溶解させた。０℃まで冷却した後、無溶媒トリメチルシリルブロミド（１．５ｍＬ）を加え、その内容物を室温で１６時間攪拌した。減圧下で濃縮後、粗混合物をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解させ、その内容物を室温で１０分間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、上記の手順を２回繰り返した。それから粗混合物をエーテルで３回洗浄し、（（２−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）−プロパンアミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）アセトアミド）メチレン）−ジホスホン酸を得た。
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ２６Ｈ３９ＢＮ６Ｏ１１Ｐ２に対する計算値：６８５．３８，  実測値：  ６８５．４．
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏを含むＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ９．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２９−７．０３  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．８１−４．６１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．５９−４．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６９−３．５７  （ｍ，  ４Ｈ）．３．３３−３．２３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．１９−２．８９  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．９１−２．７８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４８−１．３９  （ｍ，  １Ｈ），  １．３５−１．２１（ｍ，  １Ｈ），  １．２１−１．１１  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ，  ６Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏを含むＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７３．７５，  １６３．４７，  １４７．８９，  １４４．１０，  １４３．３５，  １４３．２，  １３６．８１，  １２９．４１，  １２８．６９，  １２７．１３，  ５６．２３，  ５５．１４，  ５４．９５，  ５４．２８，  ４０．８７，  ３８．６３，  ２５．０１，  ２３．２５，  ２１．９１．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏを含むＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  −０．７８７．
【０２５９】
（（４−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパン−アミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）ブタンアミド）メチレン）ジホスホン酸の合成
（（４−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパン−アミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）ブタンアミド）メチレン）ジホスホン酸の例示的な合成を図３２に示す。
【０２６０】
工程４：テトラエチル（（４−クロロブタンアミド）メチレン）ビス（ホスホネート）の合成
【化６０】
2018537526.tif 000064
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水ジクロロメタン中のテトラエチル（アミノメチレン）ビス（ホスホネート）の溶液（０．８ｇ、６ｍＬ中２．６４ｍｍｏｌ）を充填した。あらかじめ活性化した炭酸カリウム（１．８ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を一度に加え、白色懸濁液を０℃まで冷却した。無溶媒４−塩化クロロブチル（０．３７ｍＬ、３．１２ｍｍｏｌ）を加え、その内容物を室温まで徐々に暖め、５時間攪拌した。無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）で希釈後、反応混合液を濾過し、濾液をメタノール（５ｍＬ）で処理した。混合有機相を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィーを用いてシリカ（ジクロロメタン中０％〜４％のメタノール）上で粗混合物を精製し、テトラエチル（（４−クロロブタンアミド）メチレン）ビス（ホスホネート）（０．７９ｇ、７４％）を淡黄色の油状物として得た。
Ｒｆ  ０．５（ジクロロメタン中５％のメタノール、２回溶出、ＫＭｎＯ４活性）
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ１３Ｈ２８ＣｌＮＯ７Ｐ２に対する計算値：４０７．７６，  実測値：  ４０７．８  ａｎｄ  ４０８．８
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ６．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０９−４．９１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２９−４．０５  （ｍ，  ８  Ｈ），  ３．５９  （ｔ，  Ｊ  ＝    ８  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ２．４２  （ｔ，  Ｊ＝  ８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１３−１．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３５−１．２１  （ｍ，  １２Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７１．１４，  ６３．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６４  Ｈｚ），  ４４，  ４３．３４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５８８  Ｈｚ），  ３２．５９，  ２８．０９，  １６．２３．
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １６．９７．
【０２６１】
工程５／６：テトラエチル（（４−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ブタンアミド）−メチレン）ビス（ホスホネート）の合成
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水ベンゼン中のテトラエチル（（４−クロロブタンアミド）メチレン）ビス（ホスホネート）の溶液（０．６８ｇ、２ｍＬ中１．６６７ｍｍｏｌ）を充填した。無溶媒Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（０．３ｍＬ）及び無溶媒ビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリル）オキシ）エチル）アミン（０．５２８ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を連続的に加え、その内容物を１６時間還流させた。反応混合液を減圧下で濃縮し、粗混合物を精製せずに次の工程へと移した。
【０２６２】
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、無水テトラヒドロフラン中の前工程の粗混合物溶液（１ｍＬ）を充填した。テトラヒドロフラン中のフッ化テトラブチルアンモニウムの溶液（５ｍＬ、５ｍｍｏｌ、１Ｍ）を加え、その内容物を室温で１時間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィーを用いてシリカ（ジクロロメタン中０％〜８％のメタノール）上で粗混合物を精製し、テトラエチル（（４−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ブタンアミド）−メチレン）ビス（ホスホネート）を無色油状物として得た。
Ｒｆ  ０．３（ジクロロメタン中５％のメタノール、ＫＭｎＯ４活性）
熱ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）  Ｃ１７Ｈ３８Ｎ２Ｏ９Ｐ２に対する計算値：４７７．４４，  実測値：  ４７７．４
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ６．０６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０８−４．９１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２５−４．１１  （ｍ，  ８  Ｈ），  ３．６８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．４２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１４−２．１１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３５−１．２１  （ｍ，  １２Ｈ）
３１Ｐ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １７．３２
【０２６３】
工程７／８：（（４−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパン−アミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）ブタンアミド）メチレン）ジホスホン酸の合成
【化６１】
2018537526.tif 000065
オーブンで乾燥した丸底フラスコに、トルエン中のテトラエチル（（４−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ブタンアミド）−メチレン）ビス（ホスホネート）の溶液（０．１ｇ、１５ｍＬ中０．２１ｍｍｏｌ）を充填した。ベルケイド（０．１０５ｇ、０．２７３ｍｍｏｌ）を加え、ディーンスターク装置を用いてその内容物を４日間還流させた。トルエンを減圧下で蒸溜し、その内容物を無水ジクロロメタン（１．５ｍＬ）中に再度溶解させた。０℃まで冷却した後、無溶媒トリメチルシリルブロミド（１．５ｍＬ）を加え、その内容物を室温で１６時間攪拌した。減圧下で濃縮後、粗混合物をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解させ、その内容物を室温で１０分間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、上記の手順を２回繰り返した。それから粗混合物をエーテルで３回洗浄し、（（４−（２−（（Ｒ）−３−メチル−１−（（Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−カルボキシアミド）プロパン−アミド）ブチル）−１，３，６，２−ジオキサザボロカン−６−イル）ブタンアミド）メチレン）−ジホスホン酸を得た。
【０２６４】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、それら全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０２６５】
特定の実施形態を参照して本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、当業者が本発明のその他の実施形態及び変形形態を考案可能であることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような実施形態及び同等の変形形態を含むと解釈されることを目的としている。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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