(57)【要約】  本発明は、一般に医薬に関する。より具体的には、本発明は、健康のための介入としての相乗的なプロバイオティクス細菌の使用に関する。  特に、本発明は、酪酸塩レベルの減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用するための、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と、（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有する細菌株を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酪酸塩レベルの減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用するための、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株、及び（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有する細菌株。
【請求項２】
前記株が、組み合わせて、又は連続して、又は別個に投与される、請求項１に記載の使用のための株。
【請求項３】
前記株が前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を全て有する、請求項１又は２に記載の使用のための株。
【請求項４】
前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、（ｉ）酪酸塩を産生する能力を有し、場合により、（ｉｉ）酢酸塩を消費する能力、（ｉｉｉ）細胞外電子を生成する能力、（ｉｖ）乳酸塩を産生する能力のうち１つ以上を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項５】
（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力といった特徴の１つ以上を有する前記株が、デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項６】
前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、（ｉ）〜（ｉｖ）の特徴の全てを有し、及び／又は前記デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株が、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴の全てを有する、請求項４又は請求項５に記載の使用のための株。
【請求項７】
前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための株。
【請求項８】
両方の株が存在するとき、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株のみによる酪酸塩産生と比較して、酪酸塩産生量が増加する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項９】
酪酸塩産生の増加に対する効果が相乗効果である、請求項８に記載の使用のための株。
【請求項１０】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、ＤＳＭ  ３２１８６又はＤＳＭ  １７６７７であり、及び／又はデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株が、ＤＳＭ  ３２１８７である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項１１】
前記使用によって、胃腸管でのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の増殖及びコロニー化が増加する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項１２】
前記疾患が、ディスバイオシス、２型糖尿病、妊娠糖尿病、肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、過敏性腸症候群に関連する腹痛、便秘、便秘に関連する疾患からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項１３】
前記疾患が、２型糖尿病又は妊娠糖尿病である、請求項１２に記載の使用のための株。
【請求項１４】
酪酸塩レベルの減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用するためのデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株。
【請求項１５】
前記デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株がＤＳＭ３２１８７であり、及び／又は前記使用が、請求項１１〜１３のいずれか一項で定義されるものである、請求項１４に記載の使用のための株。
【請求項１６】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株と、（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有する細菌株とを含む組成物。
【請求項１７】
前記株が、請求項３〜１０のいずれか一項で定義されるものである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
キットであって、
（ｉ）フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株と、
（ｉｉ）（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有する株とを含むか、又は
（ｉ）デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株を含む、上記キット。
【請求項１９】
前記株が、請求項３〜１０のいずれか一項に定義されるものである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＤＳＭ  ３２１８６。
【請求項２１】
デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株ＤＳＭ  ３２１８７。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に医薬に関する。より具体的には、本発明は、健康のための介入としての相乗的なプロバイオティクス細菌の使用に関する。本発明は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）種の株のヒトにおける増殖及びコロニー化を補助する方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
健康な成人の体内では、微生物細胞は、ヒトの細胞よりも１０倍多いと概算されている。しかし、これらの集合体は、ほとんど未研究のままであり、ヒトの発達、生理、免疫、栄養及び健康に対する影響はほとんど完全に知られていない。
【０００３】
伝統的な微生物学は、単離された単位としての個々の種の研究に焦点があてられてきた。しかし、ほとんどとは言わないまでも、多くは、分析のための生存可能な検体として首尾良く単離されたものはない。これはおそらく、その増殖が、実験的には再現されたことがない特殊な微小環境に依存しているためである。単離されたこれらの種の中で、遺伝子の構成構造、遺伝子発現パターン及び代謝生理学の分析は、種間の相互作用又は微生物と宿主の相互作用にはほとんど拡張されていない。ＤＮＡシーケンシング技術の進歩によって、培養することができない生物で構成されるものであっても、微生物の集合体を包括的に試験することができる、メタゲノミクスと呼ばれる新しい研究分野が生まれた。実験室で培養した個々の細菌株のゲノムを調べるのではなく、メタゲノミクスアプローチによって、自然環境から収穫した完全な微生物の集合体に由来する遺伝物質の分析が可能になる。例えば、腸内マイクロバイオームは、代謝機能を有する我々自身のゲノムを補完し、ヒトの代謝に影響を与えるため、健康及び疾患において重要な役割を果たす可能性がある。
【０００４】
腸内でのこれらの細菌の変化は、多くの慢性疾患及び変性疾患において、ある種の役割を果たすと考えられている。「ディスバイオシス理論」と呼ばれるものを実証し、明確にする証拠が増えつつある。
【０００５】
「ディスバイオシス」という用語は、元々は、ノーベル賞受賞者のＥｌｉ  Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆが腸内の病原細菌の変化を記述するために作り出したものである。ディスバイオシスは、時に、「腸内細菌叢、その代謝活性及び局所的な分布の質的及び量的な変化として定義される。従って、ディスバイオシスは、多くは微生物の多様性の低下に関連する状態であり、細菌叢は、例えば、
−腸内細菌叢自体の質的及び量的な変化、
−その代謝活性の変化、及び
−その局所的な分布の変化
によって有害な影響を作り出す。
【０００６】
ディスバイオシス仮説は、現代の食生活及び生活様式、さらに、環境における抗生物質及び様々な抗菌剤の使用によって、正常な腸内細菌叢が破壊されていると述べている。これらの因子によって、細菌の代謝が変化し、潜在的に病原性の微生物が過剰に増殖する。変化した細菌叢は、現在、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、及び２型糖尿病を含む種々の代謝性疾患などの障害を含め、いくつかの疾患状態において、ある役割を果たすと考えられている。
【０００７】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、高血糖症と、インスリン分泌及び作用の欠陥を特徴とする代謝障害である。Ｔ２Ｄは世界中で増加しており、推定３億５，０００万人が２０３０年までに罹患するだろう。この慢性疾患は、複数の代謝及び心血管の合併症と関連し、心血管合併症による死亡率の増加と関係がある。同様に、Ｔ２Ｄ患者の約半分が新たに発見され、その多くは診断時に心血管合併症を有しているという事実は驚くべきことである。糖尿病を発症するかなり前に、耐糖能障害（ＩＧＴ）及び他の代謝異常が現れることがある。薬理学的介入と、生活様式への介入は、特に、ＩＧＴ被験体において、糖尿病を減らすか、又は遅らせることができるため、Ｔ２Ｄのリスクがある個人を初期に発見することは、予防と、医療費の削減にとって重要である。
【０００８】
Ｔ２Ｄは、複雑な遺伝子−環境相互作用の結果であり、年齢、家族歴、食事、座りがちな生活様式及び肥満を含むいくつかの危険因子が特定されている。細菌叢の組成に関連する新しく追加された因子は、ヒトの胃腸管内の特定の細菌属及び種の存在を含め、単独で使用されてもよく、又は、ある個人が２型糖尿病を発症するリスクがあるかどうかをより良く予測するために、他の測定値、例えば、ボディマス指数（ＢＭＩ）、ウェストヒップ比（ＷＨＲ）、胴回り（ＷＣ）及び特定のマーカーと組み合わせて使用されてもよい。さらに、細菌叢の組成の特定の変化に関する情報を使用し、介入の選択肢を定式化し、特定のプロバイオティクス製品を用いて特定のディスバイオシスを修正することができる。
【０００９】
腸内細菌叢は、体の代謝及びインスリン感受性に影響を与える環境因子として提案されており、肥満においても変化することが見出されている。しかし、腸内細菌叢とＴ２Ｄとの関係は、最近まで、例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年６月６日）の研究における大きなヒトコホートにおいて研究されていない。さらに、例えばＱｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年９月２６日）によって出版された中国糖尿病患者のメタゲノム研究のように、近年、いくつかの腸内微生物マーカーがＴ２Ｄに関連している。
【００１０】
妊娠中、通常は２４週頃に、多くの女性が妊娠糖尿病（ＧＤＭ）を発症する。以前の妊娠糖尿病の病歴は、２型糖尿病のその後の発症のリスク条件であることが知られている。妊娠中又は出産後の高い血糖値は、女性の糖尿病発症の強力な予測因子である。相対的な高血糖症は、典型的には、ある程度のインスリン抵抗性及びベータ細胞機能不全を示し、正常な体重及び耐糖能を有していたとしても、このような女性で観察されることがある。
【００１１】
妊婦及び新生児の罹患率、子癇前症及び高出生体重の問題を最小限に抑えるために、ＧＤＭ女性を特定し、治療することも重要である。
【００１２】
正常な妊娠中に起こる免疫及び代謝の変化の多くは、メタボリックシンドロームにも記載されているものと同様である。腸内細菌叢は、上述のように、メタボリックシンドロームに関連する種々の疾患において、ある役割を果たす場合がある。Ｋｏｒｅｎら（Ｃｅｌｌ．２０１２年８月３日）の研究は、腸内細菌叢が第１期（Ｔ１）から第３期（Ｔ３）に劇的に変化することを示した。
【００１３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管の全部又は一部の慢性炎症を伴う。ＩＢＤは、主に、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む。両方とも、通常、重度の下痢、痛み、疲労及び体重減少を伴う。豊富なデータは、ＩＢＤの開始段階及び増幅段階において腸内細菌が原因であるとみなしている。
【００１４】
痛風は、炎症性関節炎の発症が再発し、赤く、柔らかく、熱く、腫れた関節を特徴とすることが多い。これは、一般的に急速に起こる多くの痛みと関連している。根底にある機構は、血中の尿酸レベルの上昇を伴い、診断は、関節液又は痛風結節の中の結晶を観察することによって確認されてもよい。痛風の原因は、食事と遺伝的因子の組み合わせである。近年、痛風がより一般的になり、痛風の発症及び再発の増加は、人口統計的因子の変化を反映する可能性が高い。これらの因子の中でも、集団における寿命の増加、加齢性の心血管系疾患、代謝性疾患及び腎臓疾患の増加、これらの慢性疾患の治療の意図しない結果として尿酸塩バランスを変えてしまう医薬の使用、肥満及び糖尿病の発症に寄与する食品及び食品添加物の食事摂取量の増加が注目される。
【００１５】
嚢炎は、潰瘍性大腸炎及びある種の他の疾患の治療において、外科的に作られる嚢の内層の炎症である。嚢は、肛門のすぐ上の領域の内側に接続しており、排泄する前の廃棄物を保持している。嚢炎は、回腸肛門吻合（ＩＰＡＡ）の最も頻繁に観察される長期合併症である。症状としては、下痢、腹痛、関節痛、けいれん、発熱、排便回数の増加、夜間の糞便浸出、大便失禁、排便の必要性を感じる強い感覚などが挙げられるだろう。急性嚢炎患者の大多数は、抗生物質による初期治療に応答するが、約６０％は、少なくとも１回再発する。
【００１６】
慢性腎臓疾患は、時には慢性腎不全とも呼ばれ、腎機能が徐々に失われることを特徴とし、原因にかかわらず、３ヶ月以上にわたる腎臓損傷の存在（通常は、３０ｍｇ／日以上の尿中アルブミン排泄として検出される）又は腎臓機能の減少（推定糸球体濾過率［ｅＧＦＲ］＜６０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２と定義される）であるとさらに定義される。慢性腎臓疾患が進行した段階に達すると、危険なレベルの体液、電解質及び廃棄物が体内に蓄積する可能性がある。慢性腎臓疾患の利用可能な治療法は、腎損傷の進行を遅らせることに着目している。慢性腎臓疾患は、人工濾過（透析）又は腎臓移植をしなければ致死性である末期の腎不全に進行することがある。
【００１７】
乾癬は、異常な皮膚斑によって特徴付けられる一般的な慢性皮膚障害である。これらの皮膚斑は、赤くなり、かゆみがあり、鱗状になる場合がある。乾癬は、一般に、環境因子が引き金となる遺伝的疾患とされる。この疾患には利用可能な治療法がないが、症状を制御し、均衡を保つのに役立ち得る種々の治療が存在する。
【００１８】
虚弱は、高齢者の健康及び機能の致命的な低下のリスクの上昇を具現化する一般的な高齢者の症候群である。虚弱を診断するための判断基準はないが、虚弱な患者は、しばしば症状や医療の複雑さの負担が増し、医療介入の許容度が下がってしまう。
【００１９】
腸内細菌叢、エネルギーホメオスタシス、炎症の関連性、及び肥満の病因におけるその役割が、ますます認識されている。動物モデル及びヒトのデータは、いくつかの機構を介して変化した細菌叢の組成を、宿主の肥満の発症に結びつける。
【００２０】
細菌種フィーカリバクテリウムプラウスニッツィは、ヒトの腸生態系における最も豊富な細菌の１つであり、腸上皮への様々な代謝産物の重要な供給源である。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの数の減少又は枯渇は、例えば、ＩＢＤ、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、さらにＴ２Ｄ及びＧＤＭとも関連している。例えば、フィーカリバクテリウムのバイオマスを増やす様式として、有益な細菌の成長を促進する特定の基質（例えば、炭素、いわゆるプレバイオティクス、イヌリンを含む）源の使用への示唆がある。このアプローチの１つの考えられる問題は、第１に、フィーカリバクテリウムの特定の株が胃腸管に存在しなければならないこと、第２に、プレバイオティクスは、標的とするフィーカリバクテリウム株が位置する場所に到達しなければならないこと、第３に、これは重要だが、プレバイオティクスは、他の細菌も「餌とする」場合があり、特に、標的とする介入が必要な場合にはこれは非常に望ましくない場合がある。
【００２１】
介入のための好ましいアプローチは、所望の菌株を含むプロバイオティクス製品を与えることであり、好ましくは、さらに、その活性を促進し、胃腸管の適切な位置でバイオマスを増加させるような方法である。しかし、フィーカリバクテリウムなどの細菌は、ヒトの腸に送達した後にコロニー化させるのが非常に困難である。新たな潜在的なプロバイオティクスを開発するために腸内細菌叢の代表例を単離して培養する際の別の困難は、個々の適所及び生息地という観点での腸内環境の複雑さである。また、いくつかの腸内微生物は、他の微生物と相互に餌となっており、宿主からのある程度の成長因子も必要とする場合がある。本発明は、この問題を解決することを目的とする。
【００２２】
定義
本明細書で使用される全ての用語は、当業者に通常与えられる意味を有することが意図されている。明確にするために、以下にいくつかの用語も定義する。
【００２３】
本文全体を通して、「２型糖尿病」（Ｔ２Ｄ）との用語は、高血糖症、インスリン抵抗性及びインスリン分泌における相対的な障害によって特徴付けられる代謝障害を指すために使用される。
【００２４】
「メタゲノミクス」という用語は、個々の種の単離及び研究室での栽培の必要性を回避して、現代のゲノム技術を微生物の自然環での微生物の集団の研究に直接適用することを指す。
【００２５】
「プロバイオティクス」は、十分な量で投与すると、宿主に健康上の利益を与える生きた微生物である。
【００２６】
「相乗作用」とは、２つ以上の薬剤（例えば、２種以上の異なる微生物）、物質、因子又は物質の相互作用であり、これらを合わせた結果である「相乗効果」が、個々の効果の合計よりも大きいような相互作用である。
【００２７】
「共生」は、異なる種の２種以上の異なる生物の間の密接で長期にわたる関連性であり、必ずしもそうとは言えないが、それぞれの構成生物にとって有益な場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Ｋａｒｌｓｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年６月６日）
【非特許文献２】Ｑｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年９月２６日）
【非特許文献３】Ｋｏｒｅｎら（Ｃｅｌｌ．２０１２年８月３日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、特定の嫌気性細菌に基づく哺乳動物におけるプロバイオティクス介入のための方法及び製品に関する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の主要な目的は、細菌種フィーカリバクテリウムプラウスニッツィとデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）（又は本明細書の他の箇所で定義される代替の株）間の固有の電子クロストーク及び共生を利用することによって、種フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの株のヒトにおける増殖及びコロニー化を補助することである。共生は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ単独よりも多くの酪酸塩産生の相乗効果をもたらし、さらには、胃腸管におけるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィのバイオマス又は数を増加させることができる。従って、本発明は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の増殖及びコロニー化（例えば、胃腸管、好ましくはヒトにおける）を増加させるための方法を提供する。
【００３１】
本発明のもう一つの主要な目的は、酪酸塩産生量の減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の減少又は低レベルのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患の治療及び又は予防のために共生株を使用することである。
【００３２】
従って、一実施形態では、本発明は、例えば、プロバイオティクスとして治療に使用するためのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株（Ｆ．  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）及び／又はデスルホビブリオピゲル株（Ｄ．  ｐｉｇｅｒ）を提供する。
【００３３】
本発明の別の目的は、酪酸塩産生量の減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の減少又は低レベルのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患の治療及び／又は予防のためにデスルホビブリオピゲル（又は本明細書に記載する代替の株）を使用することである。デスルホビブリオピゲルは、内因性フィーカリバクテリウムプラウスニッツィを増強するだろう。
【００３４】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの任意の適切な株を、本発明で使用することができる。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィは、嫌気性細菌であり、特に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの適切な株は、（ｉ）酪酸塩を産生する能力を有するだろう。さらに、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの適切な株は、（ｉｉ）酢酸塩を消費する能力、（ｉｉｉ）細胞外電子を生成する能力、及び（ｉｖ）乳酸塩を産生する能力のうちの１つ以上（例えば１つ又は２つ）、又は好ましくは全てを有するだろう。いくつかの実施形態では、特徴（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）を有する株が使用される。乳酸塩（特に、高レベル又は顕著なレベルの乳酸塩）を産生する能力を有する株が特に好ましい。典型的には、これらのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株は、例えばグルコースを乳酸塩及び酪酸塩に変換するグルコース発酵を行う。
【００３５】
任意の適切なフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株を本発明で使用することができるとしても、本願発明者らは、異なるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と比較したときに、いくつかの固有の機能を特定している。酵素Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼが存在する株（又はＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含み、活性酵素を産生又は発現する株）は、乳酸塩を産生するためにより良い特性を有する細菌を与え、この細菌は、この相乗的な関係でデスルホビブリオピゲル株にとってさらに有益であるため、好ましい。例示的なＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又は酵素は、ＥＣ１．１．１．２７遺伝子／酵素として定義される。
【００３６】
本発明での使用のためのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィの特に好ましい株は、本明細書では、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株ＦＢＴ−２２として示されており、２０１５年１０月２０日にＤＳＭＺでのブダペスト条約（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、インホーフェンストリート．７Ｂ、Ｄ−３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツ）に基づいて寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ３２１８６が与えられている。この特定の株は、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを有し、他のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と比較して、より高い乳酸産生を示す。増殖中の乳酸塩が多いほど、デスルホビブリオピゲルの基質が多くなるため、その相互作用が補助される。
【００３７】
この株（例えば、単離された株）、及び例えば、本明細書の他の箇所で記載される疾患を治療するための治療におけるその使用（例えば、プロバイオティクスとしての使用）は、本発明のなおさらなる態様を提供する。
【００３８】
本発明での使用のためのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィの別の好ましい株は、Ａ２−１６５として示される株であり、ＤＳＭＺ（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、インホーフェンストリート．７Ｂ、Ｄ−３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手可能であり、寄託番号ＤＳＭ  １７６７７を有している。
【００３９】
同様に、デスルホビブリオピゲル株の成分については、デスルホビブリオピゲルの任意の適切な株を使用してもよいことが想定される。デスルホビブリオピゲルは、嫌気性細菌であり、特に、適切なデスルホビブリオピゲル株は、（ｉ）酢酸塩の産生、（ｉｉ）乳酸塩の消費及び（ｉｉｉ）（例えば、より多くの硫酸塩を硫化物に還元するために）電子受容体である能力を有することといった特徴のうち１つ以上（例えば、１つ又は２つ）、好ましくは全てを有するだろう。いくつかの実施形態では、特徴（ｉ）及び（ｉｉ）を有する株が使用される。このような株は、一般に、乳酸塩を酢酸塩に変換することができる。デスルホビブリオピゲル細菌のこれらの特定の特徴は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌との共生にとって重要であるので、これらの特徴を有する任意の他の細菌種（すなわち、代替の株）も、本発明に使用することができると考えられる。本発明での使用のためのデスルホビブリオピゲルの特に好ましい株は、本明細書では、デスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３として示されており、２０１５年１０月２０日にＤＳＭＺでのブダペスト条約（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、インホーフェンストリート．７Ｂ、Ｄ−３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツ）に基づいて寄託され、寄託番号ＤＳＭ  ３２１８７が与えられている。
【００４０】
この株（例えば、単離された株）、及び例えば、本明細書の他の箇所で記載される疾患を治療するための治療におけるその使用（例えば、プロバイオティクスとしての使用）は、本発明のなおさらなる態様を提供する。
【００４１】
好ましくは、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ及びデスルホビブリオピゲル（又は代替の）株は、併用療法として一緒に使用される。
【００４２】
好ましくは、本発明で使用するための株は、単離された株であり、例えば、ヒト又は動物の体内から単離された株である。従って、このような菌株は、他の微生物株から、又は単離されるヒト又は動物の体内からの他の不純物から分離され、２種類以上の株が本発明の使用のために混合され、又は合わされている場合を除き、例えば純粋な培養物である。
【００４３】
２種類の株（例えば、上述のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ及びデスルホビブリオピゲル株）が相互作用する場合、例えば、共栽培（共培養）されるか、又は一緒に投与される場合、又は別の方法で互いに接触する場合、両方の株が存在するときに、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株のみによる酪酸塩産生と比較して、酪酸塩産生量が増える。好ましくは、酪酸塩産生量の増加に対する効果は、相乗効果である。必要であれば、本発明で使用される２種類の株間の相互作用又は接触が起こる条件又は環境は、酪酸塩産生を補助するように選択することができる。
【００４４】
従って、本発明のなおさらなる実施形態は、個々に、又は組み合わせて、本明細書に定義するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ及びデスルホビブリオピゲル（又は代替の）株を含む組成物又は製品を提供する。細菌の好ましい組み合わせは、株が互いに相互作用するときに、酪酸塩産生に相乗効果をもたらす組み合わせである。このような相互作用は、共生の一形態である。
【００４５】
上に概略を説明したように、本明細書に記載する株及び株の組み合わせは、治療上の有用性を有し、酪酸塩の産生量の増加から利益を受け得る任意の疾患、又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数又はコロニー化の増加から利益を受け得る疾患の治療又は予防に使用することができる。従って、適切な疾患としては、酪酸塩レベルの減少、例えば、酪酸塩を産生する微生物の減少又は枯渇によって引き起こされる酪酸塩の産生量の減少（又は酪酸塩の枯渇又は酪酸塩の欠乏）に関連する任意の疾患、例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の減少又は低レベルのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患、又は例えば、酪酸塩を産生する微生物による酪酸塩産生の減少によって引き起こされる疾患が挙げられる。又は、本明細書に記載する株及び株の組み合わせを、酪酸塩を産生する微生物の減少又は枯渇に関連する任意の疾患、例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数の減少又は少数又は枯渇したフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用することができる。これらの疾患は、典型的には、胃腸（ＧＩ）管の疾患である。
【００４６】
レベルの減少、産生量の減少、又は枯渇、又は低レベル、又は数の減少などという言及は、容易に理解され、例えば、適切なコントロール（例えば、健康な患者）において見出されるレベルと比較することによって、当業者によって決定されるだろう。従って、このようなレベル又は数などは、正常値未満、又は正常より下、又は以上、又はそうでなければ、正常よりも少ないとされてもよい。好ましくは、このような低下（実際に、本明細書の他の箇所で述べた他の低下又は減少又は負の影響）は、測定可能な低下であり、より好ましくは、有意な低下であり、好ましくは、臨床的に有意であるか、又は統計学的に有意な低下であり、例えば、適切なコントロールレベル又はコントロール値と比較したときの確率値≦０．０５である。
【００４７】
実際に、本明細書において有意な変化が記載されている場合、そのような変化は、統計学的に有意な変化であることが好ましく、例えば、適切なコントロールレベル又はコントロール値と比較したときの確率値≦０．０５である。
【００４８】
例示的な疾患は、本明細書の他の箇所に記載され、Ｔ２Ｄ、ＧＤＭ、肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＩＢＳに伴う腹痛及び便秘（又は便秘に関連する疾患）を含む。治療される好ましい疾患は、Ｔ２Ｄ又はＧＤＭである。治療される別の好ましい疾患又は状態は、ディスバイオシスである。
【００４９】
従って、代替的に見ると、本発明は、Ｔ２Ｄ、ＧＤＭ、肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＩＢＳに関連する腹痛又は便秘（又は便秘に関連する疾患）、又は本明細書に記載する他の疾患又は状態（例えば、ディスバイオシス）の治療又は予防のための、又は代謝性疾患の治療又は予防のための治療方法を提供する。
【００５０】
本明細書に記載される全ての実施形態では、「〜に関連する疾患」との用語は、「〜によって特徴付けられる疾患」を指す場合もある。
【００５１】
上述の２種類の株の互いの共生、好ましくは相乗効果によって、酪酸塩の産生量が増加し、胃腸管におけるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の増殖及びコロニー化が増加し、これによって、疾患を緩和し、治療する。好ましくは、株は、両方の株が一緒に存在するとき（例えば、共培養又は一緒に投与されるとき）に両方の株による全酪酸塩産生が、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌のみを用いて観察された酪酸塩産生より多く、好ましくは、相乗的である、すなわち、両方の株による全酪酸塩産生が、個々の酪酸産生レベルの合計よりも大きい（増えており）、好ましくは、有意に大きい（増えている）ように選択される。
【００５２】
従って、本発明は、さらに、組み合わせた投与、連続的な投与又は別個の投与による治療に使用するための、本明細書に記載するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と、本明細書に記載するデスルホビブリオピゲル株（又は代替の株）を提供する。
【００５３】
本明細書の他の箇所で定義される疾患の治療又は予防における別個の使用、同時の使用又は連続した使用のための組み合わせた調製物として、本明細書に記載するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株とデスルホビブリオピゲル株（又は代替の株）とを含む製品又は組成物がさらに提供される。
【００５４】
従って、本発明は、本明細書に記載する疾患、例えば、胃腸管における酪酸塩のレベル又は産生の減少に関連する疾患（例えば、酪酸塩を産生する微生物の減少又は枯渇に起因する、例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数の減少又は少数又は枯渇したフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患、又は酪酸塩を産生する微生物による酪酸塩産生の減少に関連する疾患）、又は本明細書の他の箇所に記載する他の疾患の治療における使用のための、本明細書に記載するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆ．  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株とデスルホビブリオピゲル（Ｄ．  ｐｉｇｅｒ）株（又は代替の株）を提供する。
【００５５】
代替的に見ると、本発明は、本明細書に記載する疾患、例えば、胃腸管における酪酸塩のレベル又は産生の減少に関連する疾患（例えば、酪酸塩を産生する微生物の減少又は枯渇に起因する、例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数の減少又は少数又は枯渇したフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患、又は酪酸塩を産生する微生物による酪酸塩産生の減少に関連する疾患）、又は本明細書の他の箇所に記載する他の疾患の治療のための医薬又は組成物の製造における使用のための、本明細書に記載するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆ．  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株とデスルホビブリオピゲル（Ｄ．  ｐｉｇｅｒ）株（又は代替の株）を提供する。
【００５６】
代替的な態様では、本発明は、本明細書に記載する疾患の治療又は予防において使用するための医薬又は組成物の製造における、本明細書に記載する製品、株又は組成物の使用を提供する。
【００５７】
代替的に見て、本発明は、患者において、本明細書に記載する疾患、例えば、胃腸管における酪酸塩のレベル又は産生の減少に関連する疾患（例えば、酪酸塩を産生する微生物の減少又は枯渇に起因する、例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数の減少又は少数又は枯渇したフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患、又は酪酸塩を産生する微生物による酪酸塩産生の減少に関連する疾患）、又は本明細書の他の箇所に記載する他の疾患を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載する有効量のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆ．  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株とデスルホビブリオピゲル（Ｄ．  ｐｉｇｅｒ）株（又は代替の株）を前記患者に投与することを含む。
【００５８】
本発明の治療及び使用の方法における（又は本明細書に記載する任意の他の治療方法又は治療的な使用の方法における）プロバイオティクス株の投与は、医薬的又は生理学的に有効な量で、治療を必要とする患者に対して行われる。従って、前記方法及び使用は、治療を必要とする被験体を同定するさらなる工程を含んでいてもよい。
【００５９】
本明細書に記載される全ての実施形態では、治療される好ましい疾患は、Ｔ２Ｄ又はＧＤＭである。本明細書に記載の疾患、特にＴ２Ｄ又はＧＤＭの治療又は療法に使用する好ましい株は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株ＤＳＭ  ３２１８６又はデスルホビブリオピゲル株ＤＳＭ  ３２１８７であり、これらは組み合わせて使用することもできる。別の好ましいフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株は、Ａ２−１６５（ＤＳＭ  １７６７７）である。
【００６０】
上に示したように、本発明のなおさらなる態様は、酪酸塩レベルの減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用するためのＤ．ｐｉｇｅｒ株（又は本明細書に記載の代替の株）を提供する。
【００６１】
従って、本発明は、本明細書に記載する疾患を治療するための医薬又は組成物の製造に使用するための、デスルホビブリオピゲル株（又は本明細書に記載の代替の株）も提供する。
【００６２】
本発明はまた、有効量のデスルホビブリオピゲル株（又は本明細書に記載の代替の株）を患者に投与することを含む、患者において本明細書に記載の疾患を治療する方法も提供する。
【００６３】
上述の方法及び使用の好ましい実施形態、例えば、好ましいデスルホビブリオピゲル株（又は代替の株）及び好ましい疾患は、本明細書の他の箇所に記載される通りである。このような実施形態では、デスルホビブリオピゲルの投与は、患者又は被験体において（例えば、患者又は被験体の胃腸管において）内因性フィーカリバクテリウムプラウスニッツィを増強するか、又は増加させる（例えば、本明細書の他の箇所に記載するように、バイオマス又は数を増やすか、又は他の方法で増殖又はコロニー化を増やす）だろう。
【００６４】
本発明の他の目的及び利点は、読者には明らかになるであろう。これらの目的及び利点は、本発明の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ヒトの腸内で腸内細菌叢によって使用される主要な発酵経路を示す。
【図２】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィとデスルホビブリオピゲルとの共生を示す。
【図３】生理学的に関連した成長培地であるＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＬＹＢＨＩ）中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ単離物ＦＢＴ−２２及びＡ２−１６５型の株の比較ＳＣＦＡプロファイルを示し、ｙ軸はｍＭ単位である。
【図４】ＬＹＢＨＩ成長培地中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ型の株Ａ２−１６５の単一培養、Ｄ．ｐｉｇｅｒとの共培養の代謝プロファイルを示し、ｙ軸はｍＭ単位である。
【図５】ＬＹＢＨＩ成長培地中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ単離物ＦＢＴ−２２の単一培養、Ｄ．ｐｉｇｅｒとの共培養の代謝プロファイルを示し、ｙ軸はｍＭ単位である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
上に示したように、本発明は、特定の嫌気性細菌に基づく哺乳動物におけるプロバイオティクス介入のための方法及び製品に関する。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、プロバイオティクス細菌の組み合わせ又は混合物が投与されることが分かるだろう（併用療法）。プロバイオティクス細菌のこのような混合物又は組み合わせは、単一の（同じ）組成物で一緒に投与されてもよく、又は（例えば、異なる製品又は組成物で）別個に投与されてもよい。別個に投与される場合、そのような投与は、連続的であってもよく、又は同時であってもよい。しかし、別個の投与は、同じ治療計画又は方法の一部を形成する。
【００６８】
２つの株の投与が別々であるか又は連続的である実施形態では、投与は、お互いの妥当な時間枠内で行われることが好ましい。例えば、別個の投与は、好ましくは、互いに数時間（例えば、１時間）以内又は数分（例えば、１５分又は３０分）以内で行われ、最も好ましくは、可能な限り短い時間枠内で行われる（同時又は効果的な同時投与を含む）。好ましくは、プロバイオティクス細菌の上述の２つの株は、単一の組成物で一緒に投与される。
【００６９】
プロバイオティクス細菌の１種類より多い株が、１つの組成物中の混合物で使用される実施形態では、又はプロバイオティクス細菌の１種類より多い株が使用されるが、これらが別個に投与される実施形態では、任意の適切な比率の細菌を使用し、株のプロバイオティクス機能（例えば、酪酸塩産生量の増加、好ましくは、酪酸塩産生に対する相乗効果）が有用な程度で保持されるようにすることができる。そのような比は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、２種類の株のこのような組み合わせ（例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ：デスルホビブリオピゲル（又は代替の株））を、１：１０、１：５、１：１、５：１又は１０：１、又はこれらの極値の間のいずれか、例えば、１：１の比率で使用し得る。このような比を、本明細書の他の箇所に記載する本発明の製品、キット、組成物などに使用することもできる。
【００７０】
従って、本発明は、少なくとも２種類のプロバイオティクス細菌株を使用する併用療法を提供し、好ましくは、これらの株が共生し、より好ましくは、特に、酪酸塩産生量の増加という観点で互いに相乗効果を有する。
【００７１】
このような相乗効果（又は実際に増加した効果）は、適切な細菌の組み合わせを選択するために、例えば、任意の適切なアッセイによって、それぞれの個々の株単独での酪酸塩産生のレベルを測定し、次いで、株の酪酸産生が、組み合わせた状態で（例えば、共培養されるか、又は他の方法で互いに相互作用可能な場合に）、個々の株による酪酸塩産生レベルの合計よりも大きい、好ましくは有意に大きいかどうかを評価することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に決定することができる。酪酸塩生産における単純な増加（好ましくは有意な増加）も、この様式で測定することができる。適切なアッセイは、嫌気性条件下で実施されてもよい。適切な例示的な方法は、実施例に記載されている。
【００７２】
本明細書に記載の治療方法及び使用では、哺乳動物の胃腸管において酪酸産生量が増加するように、適切な用量、製剤などで株を投与する。さらに、好ましくは、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数が増加し（例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィのバイオマスが増加する）、又は胃腸管内のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の増殖及びコロニー化が改善される。
【００７３】
好ましくは、このような増加（実際に、他の増加、本明細書の他の箇所で述べた向上又は正の影響）は、測定可能な増加などであり、（適切な場合には）より好ましくは、有意な増加であり、好ましくは、臨床的に有意又は統計学的に有意な増加であり、例えば、（例えば、治療していないか、又はプラセボで治療した被験体と比較して、又は健康又は正常な被験体、又は治療前の同じ被験体と比較して）適切なコントロールレベル又はコントロール値と比較したときの確率値≦０．０５である。
【００７４】
本発明の方法及び使用は、疾患の予防及び疾患の治療に適している。従って、予防的治療も本発明に包含される。この理由のために、本発明の方法及び使用において、治療は、適切な場合には、予防又は防止も含む。
【００７５】
本発明の方法及び使用は、任意の哺乳動物（患者又は被験体）、例えばヒト又は任意の家畜、家禽動物又は実験動物で行うことができる。具体例としては、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ及びサルが挙げられる。しかし、好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００７６】
本発明のさらなる態様では、キット又は医薬用パックが提供される。従って、本発明は、例えば、本明細書の他の箇所に記載する内因性フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの成長を促進するための、
（ｉ）本明細書に記載するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と、
（ｉｉ）本明細書に記載するデスルホビブリオピゲル株（又は代替の株）とを含む（又はこれらからなる）キット又は医薬用パック、又は
本明細書に記載するデスルホビブリオピゲル株（又は代替の株）を含む（又はこれらからなる）キット又は医薬用パックを提供する。
【００７７】
本明細書の他の箇所に記載されているように、キットの別々の構成要素を形成する２種類の株は、別個の成分として投与することができ、又は投与前に一緒に組み合わせることができる。キットの代替的な実施形態では、この２種類の株を単一のキット又はパックの構成要素として一緒に提供することができる。好ましくは、このようなキット又はパックは、例えば本明細書で定義される疾患の治療における使用のための、本発明の方法及び使用における使用のためのものである。キット又はパックは、場合により、構成要素の投与のための説明書、又はキット又はパックの使用説明書も含む。
【００７８】
以前の研究は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）で観察された細菌の変化が細菌叢の全体的な組成に影響するのではなく、大量の限られた数の種に影響することを示している。具体的には、短鎖脂肪酸である酪酸塩を産生する細菌が減少し、酪酸塩を産生する細菌の枯渇によっても、二次胆汁酸のレベルが低下する。このことは、妊娠糖尿病（ＧＤＭ）疾患及び他の代謝関連疾患においても当てはまると思われる。抗炎症効果を有する酪酸塩を生産するフィーカリバクテリウムは、炎症性腸疾患でも枯渇するが、第３期（Ｔ３）のＧＤＭ妊婦において、平均してあまり豊富には含まれないことが報告されている。
【００７９】
健康なヒトと、疾患を有するヒトにおけるメタゲノム解析を用いた本願発明者ら自身の試験に基づき、本願発明者らは、ヒトの糞便からいくつかのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株を単離し、潜在的なプロバイオティクス株としてのさらなる開発のために最も有望なものを選択した。これらの研究に基づき、本発明における使用のためのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィの適切な株は、本明細書の他の箇所に記載されている。好ましい株は、ＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）である。この特定の株は、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、他のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と比較して、より高い乳酸産生を示す。実際に、本明細書の他の部分で述べているように、乳酸塩（特に、高レベル又は顕著なレベルの乳酸塩）を産生する能力を有する株が特に好ましい。本発明の使用のための株による乳酸塩産生の例示的な適切なレベルは、生物学的効果を有するのに十分なレベル、例えば、共培養したときにデスルホビブリオピゲルの増殖に正の影響を有するのに十分なレベルである。例示的なレベルは、例えば、株が適切な成長培地（例えば、実施例に記載されるようなＰＧＭ又はＬＹＢＨＩ）で培養される場合、少なくとも１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ又は６０ｍＭのレベルである。例示的な高レベルの乳酸塩産生は、例えば、株が適切な成長培地（例えば、実施例に記載されるようなＰＧＭ又はＬＹＢＨＩ）で培養される場合、少なくとも３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ又は６０ｍＭのレベルである。Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む株（又は活性なＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現する株）が特に好ましい。
【００８０】
本明細書の他の箇所で述べたように、酪酸塩を産生する能力を有するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株が特に好ましい。本発明の使用のための株による酪酸塩産生の例示的な適切なレベルは、生物学的効果を有するのに十分なレベル、例えば、本明細書に記載するＴ２Ｄ又は他の疾患に正の影響を有するのに十分なレベルである。例示的なレベルは、例えば、株が適切な成長培地（例えば、実施例に記載されるようなＰＧＭ又はＬＹＢＨＩ）で培養される場合、少なくとも３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ又は１５ｍＭ、又は１０ｍＭ又は１５ｍＭまでのレベルである。好ましくは、本発明によれば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株が、デスルホビブリオピゲル株（又は代替の株）と組み合わせて存在する場合に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィのみによる酪酸塩産生と比較して、酪酸塩産生のレベルが増加し、好ましくは有意に増加する。好ましくは、相乗的な増加が観察される。例示的な増加レベルは、少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍又は３．５倍である。
【００８１】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィは、健康な成人のヒト腸内細菌叢において最も豊富な細菌であり、全細菌集団の５％より多くを占めている。過去５年間で、ますます多くの研究が、健康なヒトの細菌叢の構成要素として、この代謝的に活性が高い共生細菌の重要性を明らかに記載している。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの存在量の変化は、いくつかのヒトの障害におけるディスバイオシスと関連している。
【００８２】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィは、極めて酸素感受性（ＥＯＳ）の高い細菌であり、嫌気性条件下でさえも栽培が困難である。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株によるグルコース発酵の主な最終生成物は、ギ酸塩、乳酸塩及びかなりの量の酪酸塩である（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０ｍＭを超える酪酸塩）。
【００８３】
いくつかの観察は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの腸内障壁での宿主−微生物相互作用において重要な洞察を与える。この株は、
−酪酸塩を産生し、
−グルコースを発酵させ、
−酢酸塩を消費し、
−細胞外電子を生成することができ、例えば、リボフラビンを介して電子を細胞外の電子受容体に逃がすことができ、
−グルコースを電子供与体として使用し、フラビンをメディエーターとして使用する。
【００８４】
健康な腸内でのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィの豊富さと増殖を考慮すると、本願発明者らは、近傍にあり、相乗的な様式で作用し、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの増殖を補助し得る他の細菌が存在しなければならないと仮定した。従って、特定された特徴によって、本願発明者らは、乳酸塩を消費し、酢酸塩を生成し、また電子受容体として作用することもできる細菌を探した。これらの特性に基づいて、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィと共生的に作用する株を選択することができる。１つの可能な候補物質は、デスルホビブリオピゲル中に見出され、特に好ましいデスルホビブリオピゲル株は、ＦＢＴ−２３（ＤＳＭ  ３２１８７）である。しかし、これらの特性を有する他の任意の株（すなわち代替の株）も使用することができる。
【００８５】
Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏは、最初に記載された属の１つであり、おそらく硫酸塩還元細菌の中で最も十分に研究された属である。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏは、硫酸を還元し、非発酵性であり、嫌気性のグラム陰性桿菌であり、顔料デスルスルホビリジンの存在を特徴とする。デスルスルホビリジンは、アルカリ性ｐＨで赤色の蛍光を発し、長波長ＵＶ光下で、酸性ｐＨでは青色から緑色の蛍光を発する。デスルホビブリオピゲル株は、人体から離れて単離されたことはなく、硫酸塩が豊富な胃腸管に天然に存在すると考えられる。
【００８６】
この菌株のいくつかの特徴は、以下の通りである。
−乳酸塩を変換するか、又は乳酸塩、微生物の還元された発酵代謝産物を消費し、還元された生成物である酢酸塩に変換する。
−乳酸塩から酢酸塩への変換は、電子を放出し、この電子が、硫酸塩を硫化物に還元する。
−デスルホビブリオのシトクロムは、周囲の還元された環境又は細菌からの電子受容体として作用し、硫酸塩を硫化物に還元するために利用されてもよい。
【００８７】
驚くべきことに、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌細胞がＤ．ｐｅｅｒ細菌細胞の近傍にあるとき、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィとデスルホビブリオピゲルとの間に固有の電子クロストークと共生がある。この新たな発見は、上述の２つの種の選択された株の組み合わせに基づいて生成物を生成し、ヒトにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株の増殖及びコロニー化を補助することによって、本明細書の発明に利用される。別の可能な製品は、デスルホビブリオピゲルを単独で使用し、内因性フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの増殖を補助するために、例えば、ヒトに投与するためのものだろう。
【００８８】
上述の２種間の共生は、一部には、以下のように記載することができる（図２を参照）。
−フィーカリバクテリウムプラウスニッツィは、グルコースを乳酸塩及び酪酸塩に変換し、酢酸塩を消費し、細胞外電子を生成する。
−デスルホビブリオピゲルは、乳酸塩を酢酸塩に変換し、電子を受容し、さらに多くの硫酸塩を硫化物に還元する。
−正味の結果は、両方の生物のより良い増殖とより多くの酪酸塩の産生であり、相乗効果を示している。
【００８９】
この相互作用は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィとデスルホビブリオピゲルの共培養において、より多い酪酸塩蓄積量を示すことによって確認されている（例４を参照）。
【００９０】
共生によって、本明細書の発明に従って、腸内細菌叢（例えば、胃腸細菌叢ディスバイオシス）におけるディスバイオシスのリスクがあるか、又はディスバイオシスを有するヒトにおけるプロバイオティクス介入のためにフィーカリバクテリウムプラウスニッツィを使用することによって望ましい増殖及び何倍にも増えた酪酸塩の産生が起こり（例４を参照）、酪酸塩を産生する細菌は、Ｔ２Ｄ又はＧＤＭのときのように減少する。
【００９１】
本発明で使用するのに適したプロバイオティック株は、特に、Ｔ２Ｄ、ＧＤＭ肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＩＢＳに関連する腹痛及び便秘疾患、又は本明細書に記載の他の疾患において、胃腸細菌叢のディスバイオシスを患う可能性があるか、又はディスバイオシスを受けやすい任意の哺乳動物から得ることができ、又はこれらから単離することができる。ヒトは、好ましい供給源である。適切なプロバイオティクス細菌を得るのに適したサンプルの種類は、当業者に周知であろう。しかし、糞便サンプルが好ましい。適切な培養条件は、嫌気性条件である。適切な培地は、例えばＰＧＭ培地又はＬＹＢＨＩ又は実施例に記載の他の培地など、当業者によって選択することができる。
【００９２】
本発明のさらなる目的は、上述の共生のための方法、キット、システム、組成物及び製品を提供することである。
【００９３】
従って、本明細書に記載される株（又はそれらの組み合わせ）は、化合物（薬剤）又は組成物の形態をしていてもよい（例えば、医薬化合物又は組成物又は栄養化合物又は組成物）。
【００９４】
従って、本発明は、例えば、（ｉ）酢酸塩を産生する、（ｉｉ）乳酸塩を消費する、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴のうち１つ以上を有する、本明細書に記載するフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株と、本明細書に記載するデスルホビブリオピゲル株又は代替の細菌株と、担体、希釈剤又は賦形剤（例えば、医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤）、食料又は食品補助物質、又はさらなる治療薬剤又は栄養剤からなる群から選択される少なくとも１つの追加成分とを含む、組成物又は製剤を提供する。従って、前記組成物は、医薬組成物として、又は栄養組成物として（例えば、食品として）製剤化することができる。
【００９５】
本明細書で定義される本発明の株、組成物及び製剤の治療的な使用も提供される。
【００９６】
株、組成物、製剤などの適切な投与及び配合方法は、疾患の部位に応じて選択される。好ましい投与様式は、経口又は直腸であるが、静脈内注射又は筋肉内注射も同様に適切な場合がある。
【００９７】
本明細書で定義される本発明の株、組成物及び製剤の適切な用量は、治療される障害、投与様式及び関連する処方に応じて、当業者によって容易に選択又は決定され得る。例えば、本発明に従って被験体に投与されるプロバイオティクス細菌（又は細菌の組み合わせ）が、治療上又は健康上の利益（例えば、胃腸内での酪酸塩レベルの増加又は胃腸管におけるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の増殖の増加又は疾患の治療）を生じ得るように、容量及び投与計画が選択される。従って、２種類の異なる細菌株が投与される本発明の実施形態では、両方の株が存在する場合に治療上又は健康上の利益が観察されるように、各細菌の適切な用量が選択される。例えば、ある細菌又はそれぞれの細菌の総ＣＦＵ数が１０４〜１０１２、例えば１０５〜１０１０、又は１０６〜１０８、又は１０８〜１０１０の細菌の１日分の用量を使用してもよい。１種類の細菌又はそれぞれの細菌の好ましい１日用量は、約１０８又は１０９の合計ＣＦＵであり、例えば、１０７〜１０１０又は１０８〜１０１０又は１０８〜１０９である。
【００９８】
従って、本明細書で定義される株を含有する製品又は組成物又は製剤又はキットが提供される。好ましい製品又は組成物は、凍結した、凍結して乾燥させた、凍結乾燥した、又は乾燥した細菌を含み、好ましくは単位投与量形式、例えば、カプセル又は錠剤又はゲルである。好ましい製品又は組成物は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株及びデスルホビブリオピゲル（又は代替の）株の両方を含む。このような製品などで使用するのに適した比率及び用量（例えば、細菌又はＣＦＵの数の形態で）は、本明細書及び実施例の他の箇所に記載されている。例えば保存料（例えばグリセロール）、安定剤、ゲル化剤及び／又は凍結保護剤などの他の成分が、このような製品などに含まれてもよい。いくつかの実施形態では、このような追加成分は、非天然の薬剤である。
【００９９】
図１に示すように、理論的に、ホモ酢酸塩、ホモギ酸塩及び乳酸塩の産生は、グルコースが電子供与体として使用されたとき、電子の処分という観点で、最もエネルギー効率の良い経路である。ホモ酪酸塩の形成は、グルコース１モルあたり、４モルの過剰な電子を生成し、一方、乳酸塩から酢酸塩への変換によって、酢酸塩産生１モルあたり、４モルの電子が得られる。グルコースからのプロピオン酸塩（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）の生成によって、過剰な１０モルの電子を生じる。発酵中、この電子不均衡は、混合酸の発酵と気体の生成によって均衡が取れている。微生物の中には、硝酸塩、硫酸塩又は不溶性金属錯体などの細胞外電子受容体に電子を放出するものがいる。さらに、腸の微生物の一部は、少量の酸素を消費することができるので、酸素は、間接的な電子受容体として作用する場合がある。微生物活性の正味の結果は、ヒト又は動物の腸で電子が豊富な還元環境を作り出し、正味の酸化還元電位を負に保つ。この酸素不足の還元環境は、腸管内腔での厳格な嫌気性物の増殖に有利である。腸粘膜からの食物の摂取及び拡散による酸素の連続的な流入があるという事実にもかかわらず、腸の正味の酸化還元電位は、約−３００ｍＶと負のままである。
【０１００】
本明細書で定義される本発明の治療的な使用には、関連する障害又は障害の症状の軽減、予防又は緩和（例えば、疾患症状の調節をもたらすことができる）が含まれる。このような関連する障害は、本明細書の他の箇所に記載され、例えば、Ｔ２Ｄ、ＧＤＭ、肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＩＢＳに関連する腹痛、及び便秘疾患における酪酸塩産生の欠如又は欠乏に関連する障害、又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ細菌に関連する障害である。障害又はその症状の軽減、予防又は緩和は、任意の適切なアッセイによって測定することができる。好ましくは、障害又は症状の軽減又は緩和は、臨床的に及び／又は統計的に有意であり、好ましくは確率値＜０．０５である。このような障害又は症状の軽減、予防又は緩和は、一般的に、適切なコントロール被験体又は集団、例えば、健康な被験体又は治療していないか、又はプラセボで治療された被験体、又は治療前の個々の被験体のベースラインレベルと比較して決定される。
【０１０１】
治療剤の投与及び処方の適切な様式は、治療に応じて選択される。プロバイオティクス細菌又は他の補助物質の好ましい投与様式は、経口又は直腸である。
【０１０２】
共生の組み合わせ、又は実際に本明細書に記載のプロバイオティクス細菌の任意の組み合わせは、凍結乾燥された材料を用い、油系液体（例えば、中鎖トリグリセリド）中で調製することができる。
【０１０３】
原料中のそれぞれの株の好ましい生存率は、１０６ＣＦＵ／ｇ〜１０１０ＣＦＵ／ｇの範囲である。
【０１０４】
被験体への投与は、腸溶性カプセル、遅延放出性又は制御放出性カプセル、軟質ゲルカプセル（例えば咀嚼可能カプセル）、腸溶性コーティングカプセル又はカプセルに入ったカプセルを含む送達様式のいずれかを介して達成することができる。
【０１０５】
乾燥剤コーティングを含むＡＬＵ−ＡＬＵ系のサシェット型による投与が可能である。
【０１０６】
本明細書で定義される治療剤の適切な用量は、特定の薬剤、患者の年齢、体重及び状態、投与様式及び関連する処方に応じて、標準的な方法によって選択することができる。
【０１０７】
本明細書に記載する本発明の治療方法及び予防方法は、特に、Ｔ２Ｄ、ＧＤＭ肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＩＢＳに関連する腹痛及び便秘疾患において、ディスバイオシス、例えば、胃腸細菌叢のディスバイオシスを患う可能性がある任意の種類の被験体又は哺乳動物で行うことができる。本方法は、一般に、ヒトに対して行われる。
【実施例】
【０１０８】
以下は本発明のいくつかの実施例であり、本発明の使用を限定するものではなく、本発明の使用可能な方法の詳細な実施例を示すことを意味している。
（例１）
共培養物としてのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ及びデスルホビブリオピゲルの単離
【０１０９】
驚くべきことに、Ｃｏｙチャンバで使用される厳格な嫌気性条件下（５％Ｈ２、１５％ＣＯ２及び８０％Ｎ２）、微生物の純粋培養技術によって、健康なボランティアの糞便からフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）及びデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３（ＤＳＭ  ３２１８７）を単離した。単離及び栽培のための通常の培養培地として、Ｐｏｓｔｇａｔｅ培地（ＰＧＭ）を使用した。
【０１１０】
ＰＧＭは、以下を含む（ｇ／Ｌ）。リン酸二カリウム：０．５ｇ；塩化アンモニウム：１；乳酸ナトリウム：３．５；酵母抽出物：１；アスコルビン酸塩：０．１；システイン：０．５；塩化ナトリウム：１；ペプトン：１０；硫酸ナトリウム：１；塩化カルシウム脱水物：１；硫酸マグネシウム：２；硫酸第一鉄七水和物：０．５。硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム脱水物を別個にオートクレーブにかけ、一方、硫酸第一鉄七水和物を０．２２μｍのフィルターで滅菌し、オートクレーブにかけて全ての成分を混合した後に添加した。培地の最終ｐＨを、１Ｎ  ＮａＯＨ又は１Ｎ  ＨＣｌを用い、７．２±０．２に調整した。
【０１１１】
培地を１００ｋＰａ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。
【０１１２】
この培地は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィの増殖のための主要な必要条件であるグルコースを欠いているが、比較的多量の乳酸塩を含む。繰り返される継代培養によって、デスルホビブリオピゲル及びフィーカリバクテリウムプラウスニッツィを単離する。
（例２）
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株の別の単離
【０１１３】
Ｃｏｙチャンバで使用される厳格な嫌気性条件下（５％Ｈ２、１５％ＣＯ２及び８０％Ｎ２）、微生物の純粋培養技術によって、健康なボランティアの糞便からフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株を単離する。単離のための通常の培養培地は、以下のものを含有する（ｇ／Ｌ）。酵母抽出物：２．５；カシトン：１０；グルコース：４．５；塩化ナトリウム：０．９；リン酸二カリウム：０．４５；リン酸二水素カリウム：０．４５；硫酸アンモニウム：１．３２；重炭酸ナトリウム：４ｇ；システイン：１、レサズリン：０．００１；ヘミン：０．０１。ビタミンミックスは、１０μｇのビオチン、１０μｇのコバラミン、３０μｇのｐ−アミノ安息香酸、５０μｇの葉酸及び１５０μｇのピリドキサミンを含む。培地中の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の最終濃度は、酢酸が３３ｍＭ、プロピオン酸が９ｍＭ、イソ酪酸、イソ吉草酸及び吉草酸がそれぞれ１ｍＭである。チューブにＣＯ２を流しながら、全ての成分を無菌的に添加する。熱不安定性ビタミンを０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌し、培地をオートクレーブにかけた後に添加し、最終濃度０．０５μｇチアミンｍｌ−１及び０．０５μｇリボフラビンｍｌ−１を得る。培地の最終ｐＨを、１Ｎ  ＮａＯＨ又は１Ｎ  ＨＣｌを用い、７．２±０．２に調整する。培地を１００ｋＰａ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理する。
（例３）
デスルホビブリオピゲル株の別の単離
【０１１４】
Ｃｏｙチャンバで使用される厳格な嫌気性条件下（５％Ｈ２、１５％ＣＯ２及び８０％Ｎ２）、微生物の純粋培養技術によって、健康なボランティアの糞便からデスルホビブリオピゲル株を単離する。単離及び栽培のための通常の培養培地として、Ｐｏｓｔｇａｔｅ培地（ＰＧＭ）を使用する。
【０１１５】
Ｐｏｓｔｇａｔｅ培地は、以下を含む（ｇ／Ｌ）。リン酸二カリウム：０．５ｇ；塩化アンモニウム：１；乳酸ナトリウム：３．５；酵母抽出物：１；アスコルビン酸塩：０．１；システイン：０．５；塩化ナトリウム：１；ペプトン：１０；硫酸ナトリウム：１；塩化カルシウム脱水物：１；硫酸マグネシウム：２；硫酸第一鉄七水和物：０．５。硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム脱水物を別個にオートクレーブにかけ、一方、硫酸第一鉄七水和物を０．２２μｍのフィルターで滅菌し、オートクレーブにかけて全ての成分を混合した後に添加する。培地の最終ｐＨを、１Ｎ  ＮａＯＨ又は１Ｎ  ＨＣｌを用い、７．２±０．２に調整する。
【０１１６】
培地を１００ｋＰａ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理する。
（例４）
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６のゲノム配列決定
【０１１７】
この試験の目的は、プロバイオティクス候補であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６のゲノム配列決定を行い、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６とデスルホビブリオピゲル  ＤＳＭ  ３２１８７との代謝相互作用にとって重要な因子を特定することであった。
実験手順及び結果
配列決定とアセンブリ
【０１１８】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６株の培養物を収穫し、ＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡは、ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ  Ｕｐｐｓａｌａ（スウェーデン）で、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＲＳ装置で配列決定された。配列決定によって、１７，２４１塩基対（ｂｐ）のＮ５０読み取り長を有する７３，０７１の読み取りを作成した。配列の読み取りは、ＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴＰｏｒｔａｌ及びＨＧＡＰバージョン３アセンブリプロトコル（Ｃｈｉｎら、２０１３）を用いてアセンブリングされた。推定ゲノムサイズを３Ｍｂｐに設定することを除き、デフォルトパラメータを使用した。アセンブリによって、１９７の平均被覆率を有する２，９１５，０１３ｂｐの単一コンティグが得られた。アセンブリを輪状にし、複製後端をＡＭＯＳパッケージ（Ｔｒｅａｎｇｅｎら、２００２）で切断し、染色体の開始点をＤｎａＡ遺伝子開始コドンに設定した。アセンブリ及び輪状化の併合された末端を精緻化するために、生成された輪状染色体を、ＰａｃＢｉｏをこのリファレンスに戻してマッピングし、コンセンサス配列を生成するＳＭＲＴＰｏｒｔａｌ  Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅバージョン１プロトコルにおけるリファレンスとして使用した。このコンセンサス配列をさらなる解析に使用した。
【０１１９】
ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ａｎｇｉｕｏｌｉら、２００８）による最初の遺伝子呼び出し及びアノテーションは、このアセンブリに、不自然に高い数のフレームシフトされた遺伝子（合計２，７６７遺伝子のうち４８９個）が含まれていることを示した。アセンブリの手動での検査は、約６ｂｐの長さを有するＧ又はＣのホモポリマー伸長でフレームシフトが起こったことを示した。ホモポリマーの問題を軽減するために、同じＤＮＡサンプルを、ＧＡＴＣＢｉｏｔｅｃｈのＩｌｌｕｍｉｎａ技術を用いて配列決定のために送った。
【０１２０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ機器では、合計７，６２４，２７９対の読み取り終了長さ（１２６ｂｐ）のエンドリードが生成した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ  ０．３６（Ｂｏｌｇｅｒら、２０１４）は、アダプター配列の読み取り品質の管理とフィルターリングに使用された。ダウンストリーム分析では、合計６，４２４，６５１の高品質ペアエンドリードが使用された。高品質の読み取りは、６００ｂｐ（−Ｘ６００）の挿入サイズの長さを許容する以外は、デフォルトパラメータを使用して、ｂｏｗｔｉｅ２２．２．９（Ｌａｎｇｍｅａｄ及びＳａｌｚｂｅｒｇ、２０１２）を用い、ＰａｃＢｉｏ生成コンセンサス配列と整列させた。高品質の読み取り対のうち、ゲノムに一致して９０．２％がアライメントされ、全体的なアライメント率は９９．７５％であった。アラインメントは、アセンブリの補正のためにＰｉｌｏｎ（Ｗａｌｋｅｒら、２０１４）１．１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ｐｉｌｏｎ／ｒｅｌｅａｓｅｓ）に供給された。Ｐｉｌｏｎは、このアセンブリに１０７４の補正を行い、大部分は、Ｇ又はＣのいずれかの１個の挿入であった。
【０１２１】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６ゲノムの最終的なアセンブリは、２，９０５，１８８塩基対を含んでおり、ＮＣＢＩに提出され、寄託番号ＣＰ０１５７５１を受けた。
ゲノムアノテーション
【０１２２】
ゲノム配列を、ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いてアノテーションし、合計２，７３７遺伝子が染色体上に見出され、そのうち２，６０８がタンパク質コード遺伝子であり、８６がＲＮＡ遺伝子であり、４３が偽遺伝子であった。このゲノムは、６個の完全な５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓリボソーム遺伝子及び６４個のｔＲＮＡ遺伝子を含む。
他の配列決定されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィゲノムと比較した固有な遺伝的可能性
【０１２３】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６は、Ｓｕｂｓｙｓｔｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲＡＳＴ）Ｓｅｒｖｅｒ  （ｈｔｔｐ：／／ｒａｓｔ．ｎｍｐｄｒ．ｏｒｇ／）を用いたＲａｐｉｄ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎによってアノテーションされた。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ  ＤＳＭ  ３２１８６に対して配列決定されたゲノムフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＡ２−１６５、ＳＬ３／３、ＫＬＥ１２５５、Ｌ２−６及びＭ２１２の遺伝子のアノテーションの比較は、以下の固有の機能を特定し、これを表１に列挙している。
【０１２４】
特に興味深いのは、他の配列決定されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株のいずれにも見られないＬ−乳酸デヒドロゲナーゼである。このタンパク質、Ａ８Ｃ６１＿００３７０は、ＤＳＭ３２１８６において、他の配列決定されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィゲノムには近い相同体を有さず、ＮＣＢＩ  ｎｒデータベースに対するＢＬＡＳＴを用いた配列アラインメント検索は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＲｏｓｅｂｕｒｉａからのＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを密接に関連する配列として同定する。Ａ８Ｃ６１＿００３７０  Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼは、ＩｓｌａｎｄＶｉｅｗｅｒ  ３（Ｄｈｉｌｌｏｎら、２０１５）オンラインツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｓｆｕ．ｃａ／ｉｓｌａｎｄｖｉｅｗｅｒ／）によって特定されるゲノムアイランドに直接近接しているため、同様に、遺伝子の水平伝播によってＦ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ＤＳＭ  ３２１８６に移された。実験データは、ＤＳＭ  ３２１８６株が、増殖中にデスルホビブリオピゲルの基質である乳酸塩をさらに多く産生するため、その相互作用を補助することを示す。
【０１２５】
【表１−１】
2018532779.tif 000002
【表１−２】
2018532779.tif 000003
【表１−３】
2018532779.tif 000004
【表１−４】
2018532779.tif 000005
【表１−５】
2018532779.tif 000006
【表１−６】
2018532779.tif 000007
【表１−７】
2018532779.tif 000008
【表１−８】
2018532779.tif 000009
（例５）
相乗効果の評価
【０１２６】
相乗効果を評価するために、例１の共培養物を使用した。代替例として、ｐｏｓｔｇａｔｅ培地中、厳格な嫌気性条件下で、例２からのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株ＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）を、例３からのデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３  （ＤＳＭ  ３２１８７）と共培養した。
【０１２７】
Ｐｏｓｔｇａｔｅ培地は、以下を含む（ｇ／Ｌ）。リン酸二カリウム：０．５ｇ；塩化アンモニウム：１；乳酸ナトリウム：３．５；酵母抽出物：１；アスコルビン酸塩：０．１；システイン：０．５；塩化ナトリウム：１；ペプトン：１０；硫酸ナトリウム：１；塩化カルシウム脱水物：１；硫酸マグネシウム：２；硫酸第一鉄七水和物：０．５。硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム脱水物を別個にオートクレーブにかけ、一方、硫酸第一鉄七水和物を０．２２μｍのフィルターで滅菌し、オートクレーブにかけて全ての成分を混合した後に添加した。培地の最終ｐＨを、１Ｎ  ＮａＯＨ又は１Ｎ  ＨＣｌを用い、７．２±０．２に調整した。
【０１２８】
培地を１００ｋＰａ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。
【０１２９】
これにより、以下のデータが得られ（表２）、酪酸塩産生に対する株の相乗効果を示している。
【０１３０】
【表２】
2018532779.tif 000010
（例６）
両方の株を含む製品の製造
【０１３１】
本試験では、厳格な嫌気的条件下、ＰＧＭ中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株ＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）及びデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３（ＤＳＭ  ３２１８７）株を別々に増殖させた。
【０１３２】
ＰＧＭは、以下を含む（ｇ／Ｌ）。リン酸二カリウム：０．５ｇ；塩化アンモニウム：１；乳酸ナトリウム：３．５；酵母抽出物：１；アスコルビン酸塩：０．１；システイン：０．５；塩化ナトリウム：１；ペプトン：１０；硫酸ナトリウム：１；塩化カルシウム脱水物：１；硫酸マグネシウム：２；硫酸第一鉄七水和物：０．５。硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム脱水物を別個にオートクレーブにかけ、一方、硫酸第一鉄七水和物を０．２２μｍのフィルターで滅菌し、オートクレーブにかけて全ての成分を混合した後に添加した。培地の最終ｐＨを、１Ｎ  ＮａＯＨ又は１Ｎ  ＨＣｌを用い、７．２±０．２に調整した。
【０１３３】
培地を１００ｋＰａ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。
【０１３４】
細菌を静止期になるまで増殖させた後、細胞を蒸留水で洗浄し、その後、感受性物質について遠心分離機を用いて濃縮する。得られた各株のスラリーを１Ｅ＋９ＣＦＵを含むアリコートで測定し、
次に、１：１の比率で互いに混合した。次いで、生成物を２０％グリセロール中に保存し、−８０℃に保った。
（例７）
生理学的に関連する培地ＬＹＢＨＩ中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＡ２−１６５（ＤＳＭ  １７６７７）型及びフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）型の株の代謝プロファイル
【０１３５】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株の詳細な代謝プロファイルを図１及び図２に示す。上述の図において、グルコース発酵では、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィが主要なＳＣＦＡとして酪酸塩を産生し、酢酸塩を消費することが明らかである。さらに、これらの細菌は、乳酸塩、ギ酸塩及び酢酸塩を産生する。
【０１３６】
生理学的に関連する培地ＬＹＢＨＩにおけるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＡ２−１６５（ＤＳＭ  １７６７７）型及びフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）型の株の比較代謝プロファイルは、これらの２種類の細菌が代謝的に異なることを明らかにしている（ＳＣＦＡが何倍変化しているかを表３に示す）。比較グルコース消費量と酪酸塩産生量はほぼ同じであったが、２種類の株は、乳酸塩産生量が異なっていた（図３）。
【０１３７】
生理学的に関連する成長培地ＬＹＢＨＩの組成：１ｍｇ／ｍｌのセロビオース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）、１ｍｇ／ｍｌのマルトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍｌのシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加した、ＬＹＢＨＩ培地（０．５％酵母抽出物を追加した脳心臓注入培地）（Ｏｘｏｉｄ、ＵＫ）。
【０１３８】
完全な炭素と電子のバランスを表４に示す。
（例８）
ＬＹＢＨＩ培地中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＡ２−１６５株（ＤＳＭ  １７６７７）型及びデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３（ＤＳＭ  ３２１８７）型の単一培養及び共培養の代謝プロファイル
【０１３９】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ株Ａ２−１６５及びデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３の相乗効果を、ＬＹＢＨＩ培地（例７に記載の組成物）で評価した。
【０１４０】
図２に示すように、デスルホビブリオピゲルによって電子供与体として使用されるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィによって産生された乳酸塩と、逆に、デスルホビブリオピゲルによって産生された酢酸塩は、酪酸塩産生のためにフィーカリバクテリウムプラウスニッツィによって利用することができる。
【０１４１】
共培養条件下のＬＹＢＨＩ培地では、酪酸塩産生は１．５倍に増加し、乳酸塩産生は２．３分の１に減少した（図４、表３）。これは、共培養／お互いに餌にしあうこと、すなわち酪酸塩生成の増加の有益な効果を示す。
【０１４２】
完全な炭素と電子のバランスを表４に示す。
（例９）
ＬＹＢＨＩ培地中のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィＦＢＴ−２２（ＤＳＭ  ３２１８６）及びデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３（ＤＳＭ  ３２１８７）の単一培養及び共培養の代謝プロファイル
【０１４３】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィＦＢＴ−２２及びデスルホビブリオピゲル株ＦＢＴ−２３の相乗効果を、ＬＹＢＨＩ培地（例７に記載の組成物）で評価した。
【０１４４】
ＬＹＢＨＩ培地では、共培養条件下、酪酸塩産生は２．１倍に増加し、乳酸塩蓄積は２分の１に減少した（図５、表３）。これは、お互いに餌にしあい、相乗効果があることを示している。
【０１４５】
完全な炭素と電子のバランスを表４に示す。
【０１４６】
【表３】
2018532779.tif 000011
【０１４７】
【表４】
2018532779.tif 000012
【図１】
2018532779.tif 000013
【図２−１】
2018532779.tif 000014
【図２−２】
2018532779.tif 000015
【図３】
2018532779.tif 000016
【図４】
2018532779.tif 000017
【図５】
2018532779.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月22日(2017.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酪酸塩レベルの減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用するための、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株、及び（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有するデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株。
【請求項２】
前記株が、組み合わせて、又は連続して、又は別個に投与される、請求項１に記載の使用のための株。
【請求項３】
前記株が前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を全て有する、請求項１又は２に記載の使用のための株。
【請求項４】
前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、（ｉ）酪酸塩を産生する能力を有し、場合により、（ｉｉ）酢酸塩を消費する能力、（ｉｉｉ）細胞外電子を生成する能力、（ｉｖ）乳酸塩を産生する能力のうち１つ以上を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項５】
前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、（ｉ）〜（ｉｖ）の特徴の全てを有し、及び／又は前記デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株が、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴の全てを有する、請求項４に記載の使用のための株。
【請求項６】
前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための株。
【請求項７】
両方の株が存在するとき、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株のみによる酪酸塩産生と比較して、酪酸塩産生量が増加する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項８】
酪酸塩産生の増加に対する効果が相乗効果である、請求項７に記載の使用のための株。
【請求項９】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株が、ＤＳＭ  ３２１８６又はＤＳＭ  １７６７７であり、及び／又はデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株が、ＤＳＭ  ３２１８７である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項１０】
前記使用によって、胃腸管でのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の増殖及びコロニー化が増加する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項１１】
前記疾患が、ディスバイオシス、２型糖尿病、妊娠糖尿病、肥満、痛風、嚢炎、慢性腎臓疾患、乾癬、虚弱、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、過敏性腸症候群に関連する腹痛、便秘、便秘に関連する疾患からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための株。
【請求項１２】
前記疾患が、２型糖尿病又は妊娠糖尿病である、請求項１１に記載の使用のための株。
【請求項１３】
酪酸塩レベルの減少と関連する疾患又はフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌の数の減少又は少数のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌に関連する疾患の治療又は予防に使用するためのデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株。
【請求項１４】
前記デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株がＤＳＭ３２１８７であり、及び／又は前記使用が、請求項１０〜１２のいずれか一項で定義されるものである、請求項１３に記載の使用のための株。
【請求項１５】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株と、（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有するデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株とを含む組成物。
【請求項１６】
前記株が、請求項３〜９のいずれか一項で定義されるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
キットであって、
（ｉ）フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株と、
（ｉｉ）（ｉ）酢酸塩を産生し、（ｉｉ）乳酸塩を消費し、（ｉｉｉ）電子受容体である能力を有するといった特徴の１つ以上を有するデスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株とを含む
、上記キット。
【請求項１８】
前記株が、請求項３〜９のいずれか一項に定義されるものである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＤＳＭ  ３２１８６。
【請求項２０】
デスルホビブリオピゲル（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ）株ＤＳＭ  ３２１８７。
【国際調査報告】
2018532779.tif 000019
2018532779.tif 000020
2018532779.tif 000021