(57)【要約】  （ｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの分子量を有するデキストランを含む主鎖と、少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカン側鎖とを有するグラフトコポリマーを含む組成物が開示される。吸収材におけるそれらの使用だけでなく、そのようなグラフトコポリマーを生成する反応もさらに開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランを含む主鎖、
（ｉｉ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカン側鎖
を含むグラフトコポリマーを含む組成物。
【請求項２】
前記ポリα−１，３−グルカン側鎖が、少なくとも約９９％のα−１，３−グリコシド結合を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１つまたは複数の前記ポリα−１，３−グルカン側鎖の個々のＭｗが、少なくとも約１０００００ダルトンである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記グラフトコポリマーが、水性条件下で不溶性である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記デキストランが、
（ｉ）１位および６位で連結したグルコース、約８７〜９３ｗｔ％；
（ｉｉ）１位および３位で連結したグルコース、約０．１〜１．２ｗｔ％；
（ｉｉｉ）１位および４位で連結したグルコース、約０．１〜０．７ｗｔ％；
（ｉｖ）１位、３位および６位で連結したグルコース、約７．７〜８．６ｗｔ％；並びに（ｖ）（ａ）１位、２位および６位、または
（ｂ）１位、４位および６位
で連結したグルコース、約０．４〜１．７ｗｔ％
を含み、
前記デキストランの前記Ｍｗが、約５０〜２００ミリオンダルトンである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記デキストランの前記Ｍｗが、少なくとも約１００ミリオンダルトンである請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記デキストランが、配列番号６または配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素の生成物である請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記グラフトコポリマーが、少なくとも約２．０ｗｔ％のデキストランを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記グラフトポリマーが、少なくとも約１００の保水度（ＷＲＶ）を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、パーソナルケア製品、家庭用製品、医薬製品、または工業製品である請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
酵素反応であって、（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含み、前記酵素反応が、請求項１に記載の組成物によるグラフトコポリマーを生成する酵素反応。
【請求項１２】
前記反応における前記デキストランの初期濃度が、少なくとも約２ｇ／Ｌであり、前記デキストランの前記Ｍｗが、少なくとも約５０ミリオンダルトンである請求項１１に記載の酵素反応。
【請求項１３】
グラフトコポリマーを調製する方法であって、
（ａ）少なくとも（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させるステップであって、それにより、請求項１に記載の組成物によるグラフトコポリマーが生成されるステップと、
（ｂ）場合により、ステップ（ａ）で生成したグラフトコポリマーを単離するステップと
を備える方法。
【請求項１４】
接触ステップ（ａ）において、約６００００ダルトン未満のＭｗを有するデキストランがさらに存在し、少なくとも約１０００００ダルトンのＭｗを有する前記デキストランが、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素による側鎖合成のための基質として優先的に使用される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）に携わる前記デキストランが、少なくとも約５０ミリオンダルトンのＭｗと、少なくとも約２ｇ／Ｌの初期濃度を有し、ステップ（ａ）において生成した前記グラフトコポリマーが単離され、前記単離ステップが、濾過ステップを備え、前記グラフトコポリマーが、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーの濾過率と比較してそれより高い濾過率を有する請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／２５１，１８３号明細書（２０１５年１１月５日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、多糖の分野の開示である。例えば、本開示は、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの生成と、水性液体の吸収力および濾過性の有利な機能を有する組成物におけるそれらの使用とに関する。
【０００３】
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１６年１０月３１日作成のＣＬ６５００ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名の、７９．４キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
微生物もしくは植物宿主の酵素合成または遺伝子工学を使用して新規な構造の多糖類を見出したいという欲求に推進されて、研究者らは、生分解性であって、再生可能な起源の供給原料から経済的に製造できる多糖類を発見するに至った。このような多糖の１つは、ポリα−１，３−グルカンであり、α−１，３−グリコシド結合を備えることを特徴とするグルカンポリマーである。このポリマーは、スクロースの水溶液とストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）酵素とを接触させることによって単離されてきた（非特許文献１）。
【０００５】
特許文献１は、Ｓ．サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素を使用する多糖類繊維の調製物を開示した。この繊維のポリマー内の少なくとも５０％のヘキソース単位は、α−１，３−グリコシド結合を介して連結された。Ｓ．サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素は、最終生成物としてのポリα−１，３−グルカンおよびフルクトースを生成する重合反応における基質としてスクロースを利用する（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。開示されたポリマーは、溶媒中または溶媒を含む混合液中に臨界濃度を超えて溶解されると、液晶溶液を形成した。この溶液から、繊維用途において紡糸して使用することができる長く強い綿様繊維が得られた。
【０００６】
ポリα−１，３−グルカンの生成において進歩がみられる一方、経済的な手法でのこのグルカン生成物を単離することに関しては、問題が残っている。そのために、増強された濾過性および水性液体の吸収力を有するグラフトコポリマーの形態でのポリα−１，３−グルカンが本明細書に開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７００００００号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１４５１−１４６０，１９９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態において、開示は
（ｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランを含む主鎖、
（ｉｉ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカン側鎖
を含むグラフトコポリマーを含む組成物に関する。
【００１０】
別の実施形態は、（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む酵素反応であって、その酵素反応が、本開示のグラフトコポリマーを生成する酵素反応に関する。
【００１１】
別の実施形態は、グラフトコポリマーを調製する方法に関する。この方法は、以下の（ａ）および（ｂ）を備える：（ａ）少なくとも（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させて、それにより、本開示のグラフトコポリマーが生成されるステップ；（ｂ）場合により、ステップ（ａ）で生成したグラフトコポリマーを単離するステップ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーのいくつかの例。この特定の例証において、ポリα−１，３−グルカン鎖（「グルカングラフト」）は、デキストラン主鎖にα−１，４−結合したペンダントグルコースから、グルコシルトランスフェラーゼ酵素（ＧＴＦ）により合成される。
【図２】いくつかの態様におけるデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの写実的表現。デキストラン主鎖とポリα−１，３−グルカン側鎖は、互いにほぼ同じ量で示される。例えば、主鎖は、約１０００ＤＰｗであり得、また側鎖のそれぞれは、約１０００ＤＰｗであり得る。
【図３】グラフは、２時間および２４時間のグルコシルトランスフェラーゼ反応において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーのＤＰｗに与える出発デキストランの濃度（ｇ／Ｌ）の影響を例証する。実施例２を参照されたい。
【図４】１０．６ｗｔ％のデキストランを含有するデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー試料の写真を示す。実施例６を参照されたい。
【図５】０．９ｗｔ％のデキストランを含有するデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー試料の写真を示す。実施例６を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
【表１】
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【００１４】
引用する全ての特許文献および非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１５】
別段の開示がなされていなければ、本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）参照されるものを包含するものとする。
【００１６】
存在する場合、他に特に記載されていない限り、全ての範囲は、包括的および結合可能である。例えば、「１〜５」と記載されている場合、記載範囲は「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」等の範囲を含むと解釈されたい。
【００１７】
本明細書における用語「コポリマー」は、少なくとも異なる２種類のα−グルカン、例えばデキストランおよびポリα−１，３−グルカン等を含むポリマーを意味する。
【００１８】
本明細書における用語「グラフトコポリマー」、「分岐のコポリマー」等は、一般的に、「主鎖」（または「主な鎖」）と主鎖から分かれる側鎖とを含むコポリマーを意味する。側鎖は、主鎖とは構造的に異なる。本明細書におけるグラフトコポリマーの例は、少なくとも約１０００００ダルトンのＭｗを有するデキストランを含む主鎖と、少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンの側鎖とを含む。いくつかの態様においては、デキストランの非還元性末端は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素によってポリα−１，３−グルカン合成をプライムできるので、デキストラン主鎖は、ポリα−１，３−グルカンの鎖延長を有することがある。従って、主鎖は、場合によっては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカン鎖状コポリマーであり得る。いくつかの態様においては、主鎖は、それ自体以下に開示するように分岐構造であることがある；そのような主鎖へのポリα−１，３−グルカンの付加が、元来の分岐構造の分岐を増大させる。
【００１９】
用語「ポリα−１，３−グルカン側鎖」と「ポリα−１，３−グルカン分岐鎖」は、本明細書においては互換可能に使用できる。デキストラン分岐鎖は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素によりポリα−１，３−グルカン合成をプライムできる非還元性末端を有するので、ポリα−１，３−グルカン側鎖は、通常、デキストラン分岐鎖（例えば、ペンダント基のグルコースまたは短鎖）の延長鎖である。
【００２０】
本明細書において使用される用語「ポリα−１，３−グルカンホモポリマー」等は、（ｉ）グラフトコポリマーの一部でなく（ｉｉ）デキストラン−ポリα−１，３−グルカン鎖状コポリマーの一部でもないポリα−１，３−グルカンを意味する。
【００２１】
用語「α−グルカン」、「α−グルカンポリマー」等は、本明細書においては互換可能に使用される。α−グルカンは、α−グルコシド結合により一緒に連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーである。デキストランおよびポリα−１，３−グルカンは、α−グルカンの例である。
【００２２】
本明細書では、「グリコシド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｂｏｎｄ）」などの用語は同義語として使用され、炭水化物分子を他の炭水化物分子に結合する共有結合を意味する。「グルコシド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グルコシド結合（ｂｏｎｄ）」などの用語は、本明細書では互換可能に使用され、２つのグルコース分子間のグリコシド結合を意味する。本明細書で使用する用語「α−１，６−グルコシド結合」は、隣接するα−Ｄ−グルコース環の１位と６位の炭素によって、α−Ｄ−グルコース分子を相互に結合する共有結合を意味する。本明細書で使用する用語「α−１，３−グルコシド結合」は、隣接するα−Ｄ−グルコース環の１位と３位の炭素によって、α−Ｄ−グルコース分子を相互に結合する共有結合を意味する。本明細書で使用する用語「α−１，２−グルコシド結合」は、隣接するα−Ｄ−グルコース環の１位と２位の炭素によって、α−Ｄ−グルコース分子を相互に結合する共有結合を意味する。本明細書で使用する用語「α−１，４−グルコシド結合」は、隣接するα−Ｄ−グルコース環の１位と４位の炭素によって、α−Ｄ−グルコース分子を相互に結合する共有結合を意味する。本明細書では、「α−Ｄ−グルコース」は、「グルコース」と呼ばれることとなる。本明細書で開示する全てのグルコシド結合は、別段の記載がない限り、α−グルコシド結合である。
【００２３】
用語「ポリα−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカンポリマー」、「グルカンポリマー」等は、本明細書において互換可能に使用される。本明細書におけるポリα−１，３−グルカンは、少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合を含む。９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のα−１，３−グルコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンは、大部分未分岐であると推定され、１００％α−１，３−グルコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンは、鎖状／未分岐である。
【００２４】
用語「デキストラン」、「デキストランポリマー」、「デキストラン分子」等は、本明細書においては互換可能に使用され、一般的に、α−１，３結合、α−１，２結合、および／またはα−１，４結合により、主鎖に連結した周期的な分岐を伴う実質的に（ほぼ）α−１，６−結合したグルコースモノマーを有する主鎖を含むα−グルカンを意味する。
【００２５】
いくつかの態様においては、本明細書におけるデキストラン主鎖は、デキストランポリマーの全てのグルコースモノマーのうち約９０〜９５％超を含む。デキストラン主鎖は、場合によっては、実質的に［またはほぼ］α−１，６結合を含むことができ、それは、α−１，６結合を少なくとも約９８．０％有することが可能であることを意味する。いくつかの態様においては、デキストラン主鎖は、少量のα−１，３結合を含むことが可能であり、それは、約２．０％未満のα−１，３結合を有することが可能であることを意味する。
【００２６】
デキストランの分岐鎖は、通常短く、グルコースモノマー３つ分の長さの分岐鎖（ペンダント）であり、デキストランポリマーのグルコースモノマーのうち約１０％未満を含む。そのような短い分岐鎖は、α−１，２−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合、および／またはα−１，４−グルコシド結合を含むことが可能である。いくつかの実施形態のデキストランはまた、主にα−１，６結合を含む分岐鎖を有することがある。そのような分岐鎖の長さは、そこから分岐が始まる点での鎖の長さと同じくらいであってもよい。
【００２７】
本明細書のα−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当技術分野で既知の任意の方法を使用して求めることができる。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲまたは１Ｈ  ＮＭＲ）を使用する方法を用いて求めることができる。使用することができるこれらの方法や他の方法は、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ．Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本明細書のデキストランの「分子量」は、数平均分子量（Ｍｎ）または重量平均分子量（Ｍｗ）として表すことができ、それらの単位はダルトンもしくはｇ／モルである。或いは、分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）またはＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。これらの分子量測定値を算出するためには、当該技術分野では、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、またはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いるなどの様々な手段が知られている。
【００２９】
本明細書では、「スクロース」という用語は、α−１，２−グリコシド結合により連結した、α−Ｄ−グルコース分子およびβ−Ｄ−フルクトース分子からなる非還元性二糖類を意味する。スクロースは、一般には砂糖として知られている。
【００３０】
用語「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ＧＴＦ酵素」、「ＧＴＦ」、「グルカンスクラーゼ」等は、本明細書では互換可能に使用される。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼの活性は、生成物であるα−グルカンおよびフルクトースを作製するための基質スクロースの反応を触媒する。グルコシルトランスフェラーゼ反応の他の生成物（副生成物）としては、グルコースと、ロイクロースをはじめとする様々な可溶性オリゴ糖（ＤＰ２〜ＤＰ７）を挙げることができる。野生型形態のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、一般的に（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、シグナルペプチド、可変ドメイン、触媒ドメイン、およびグルカン結合ドメインを含む。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）によると、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類される。用語「デキストランスクラーゼ」は、場合により使用して、デキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を特徴付けることができる。
【００３１】
本明細書の用語「グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素にα−グルカン合成活性を提供するグルコシルトランスフェラーゼ酵素のドメインを意味する。グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、好ましくはこの活性を有する任意の他のドメインの存在を必要としない。
【００３２】
用語「酵素反応」「グルコシルトランスフェラーゼ反応」、「グルカン合成反応」、「反応溶液」等は、本明細書においては互換可能に使用され、水、スクロース、少なくとも１種の活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素、および場合によりデキストラン等の他の成分を最初に含む反応を一般的に意味する。通常、グルコシルトランスフェラーゼ反応が開始した後に、グルコシルトランスフェラーゼ反応にさらに存在できる成分としては、フルクトース、グルコース、可溶性オリゴ糖（例えば、ＤＰ２〜ＤＰ７）、例えばロイクロース等、並びに、ＤＰ８以上（例えば、ＤＰ１００およびそれ以上）の可溶性および／または不溶性α−グルカン生成物が挙げられる。本明細書の酵素反応は、自然に起こるとは考えられていない。
【００３３】
本明細書で使用される用語「吸収する」は、水性液体を吸い上げる（吸い込む）作用を意味する。本開示の組成物による吸収性は、例えば、保水度（ＷＲＶ）の観点から、またはｇ水性液体／ｇグラフトコポリマー（一定量のグラフトコポリマーに染み込みそれにより保持できる最大量の水性液体）として測定できる。ＷＲＶは、例えば以下の式を用いて、本明細書の任意の水性液体に対して算出できる：（（湿潤ポリマーの容量−乾燥ポリマーの容量）／乾燥ポリマーの容量）＊１００。
【００３４】
本明細書で使用される用語「水性液体」、「水性流体」等は、水または水溶液を意味し得る。本明細書の「水溶液」は、１種もしくは複数種の溶解塩を含むことが可能であり、いくつかの実施形態において、全ての塩の最大濃度は、約３．５ｗｔ％であり得る。本明細書の水性液体は、通常、液体中の唯一の溶媒として水を含むが、水性液体は、場合により、１種もしくは複数種の、水に混和する他の溶媒（例えば、極性有機溶媒）を含むことができる。従って、水溶液は、少なくとも約１０ｗｔ％の水を有する溶媒を含むことができる。
【００３５】
本明細書の「濾過率」は、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーまたは他の対照材料の濾過性よりも少なくとも約１０％速いグラフトコポリマーの濾過性を特徴とする。
【００３６】
「体積パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｖｏｌｕｍｅ）」、「体積パーセント（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ）」、「ｖｏｌ％」、「ｖ／ｖ％」などの用語は、本明細書では同義語として使用される。溶液中の溶質の体積パーセントは、以下の式を用いて求めることができる：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％。
【００３７】
「重量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔ）」、「重量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」等は、本明細書では同義語として使用される。重量パーセントとは、組成物、混合物、または溶液中に含まれる質量を基準とした物質のパーセンテージを指す。
【００３８】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」等は、本明細書では互換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり、場合により合成、非天然もしくは改変ヌクレオチド塩基を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマーであってよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混合物のうちの１つまたは複数のセグメントから構成されてよい。ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）は、次の一文字略称によって呼ぶことができる：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対して）に対して「Ａ」、シチジル酸またはデオキシチジル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対して）に対して「Ｃ」、グアニル酸またはデオキグアニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対して）に対して「Ｇ」、ウリジル酸（ＲＮＡに対して）に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸（ＤＮＡに対して）に対して「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対して「Ｙ」、ＧまたはＴに対して「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」、ＡまたはＴに対して「Ｗ」、そして任意のヌクレオチドに対して「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列に言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＴまたはＧであってよく；ＲＮＡ配列に言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＵまたはＧであってよい）。
【００３９】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、コード領域からＲＮＡ（ＲＮＡはＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）を発現するポリヌクレオチド配列を指し、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（タンパク質をコードする）または非タンパク質コードＲＮＡであり得る。遺伝子は、コーディング領域単独を意味する場合がある、またはコーディング領域への上流および／または下流の調節配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’転写ターミネーター領域）を含む場合がある。本明細書では、タンパク質をコードするコード領域を、また、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼び得る。「天然の」または「内在性の」遺伝子は、それ自体の調節配列とともに天然に見出されたままの遺伝子を指し；そのような遺伝子は宿主細胞のゲノムの本来の場所に位置する。「キメラ」遺伝子は、天然には一緒に見出されることがない（すなわち、調節領域およびコード領域は互いに非相同である）調節配列およびコード配列を含む、天然遺伝子でない遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一起源に由来するが自然に見いだされるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含む可能性がある。「外来」または「異種」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主有機体に導入された遺伝子を指す。外来／異種遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主の新規な場所に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含む可能性がある。本明細書の所定の実施形態内のポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、遺伝子導入手順（例えば、形質転換）によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する。
【００４０】
本明細書の細胞または生物に含まれる本明細書の「非天然」アミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列は、そのような細胞もしくは生物の天然（自然）対応物中では発生しない。
【００４１】
本明細書で使用する「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）、５’非翻訳領域、イントロンおよび３’非コーディング領域を指し、遺伝子から転写されたＲＮＡの翻訳、プロセシングもしくは安定性および／または翻訳に影響を及ぼす可能性がある。本明細書の調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造および遺伝子発現の調節に関連する他の要素を含む可能性がある。本明細書の１つまたは複数の調節要素は、本明細書のコーディング領域に対して異種であってよい。
【００４２】
本明細書中で使用する「プロモーター」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般に、プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してよい、自然界で見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成されてよい、またはいっそう合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。あらゆる状況下のほとんどの時点で遺伝子が細胞内で発現することを誘発するプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。本明細書の１つまたは複数のプロモーターは、本明細書のコーディング領域にとって異種であってよい。
【００４３】
本明細書で使用する「強力プロモーター」は、単位時間当たり相当に多数の生成開始を指示できるプロモーター、および／または細胞内の遺伝子の平均転写レベルよりも高いレベルの遺伝子転写を駆動するプロモーターである。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「３’非コーディング配列」、「転写ターミネーター」、「ターミネーター」等は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。
【００４５】
本明細書で使用するように、第１核酸配列は、第１核酸配列の一本鎖形が好適なアニーリング条件（例えば、温度、溶液イオン強度）下で第２核酸配列にアニーリングできる場合は第２核酸配列に「ハイブリダイズする」ことができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、よく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）で例証されており、この文献、特に１１章および表１１．１が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
用語「カセット」、「発現カセット」、「遺伝子カセット」等は、本明細書では互換可能に使用される。カセットは、タンパク質コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーターを意味することができる。カセットは、場合により３’非コーディング配列に機能的に連結していてよい。本明細書のカセットの構造は、場合により、「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記方式によって表すことができる。詳細には、Ｘはプロモーターを表し、Ｙはコーディング配列を表し、およびＺはターミネーター（任意選択的）を表す；ＸはＹに機能的に連結しており、およびＹはＺに機能的に連結している。
【００４７】
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用する用語「上流」および「下流」は、それぞれ、「５’」および「３’」を意味する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「発現」は、（ｉ）コーディング領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくは非タンパク質コーディングＲＮＡ）の転写、および／または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を意味する。ポリヌクレオチド配列のコーディング領域の発現は、所定の実施形態では、アップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。
【００４９】
本明細書で使用する用語「機能的に連結した」は、一方の機能が他方の機能によって影響されるような２つ以上の核酸配列の会合を意味する。例えば、プロモーターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と機能的に連結している。すなわち、コーディング配列は、プロモーターの転写調節下にある。コーディング配列は、例えば、１つ（例えば、プロモーター）または２つ以上（例えば、プロモーターおよびターミネーター）の調節配列と機能的に連結させることができる。
【００５０】
「組み換え」という用語は、プラスミド、ベクターまたはコンストラクトなどのＤＮＡ配列を特徴付けるために本明細書で使用されるとき、そうしなければ配列の２つの別々のセグメントであったものを、例えば化学合成により、および／または核酸の分離したセグメントを遺伝子工学の手法で操作することにより人工的に組み合わせることを指す。本明細書に記載の、組み換えコンストラクト／ベクターを調製する方法は、例えばＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１）；  Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  ２００２）により記載される、標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術に従って行うことができる。
【００５１】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、任意の方法により核酸分子を宿主有機体または宿主細胞に移行させることを指す。生物／細胞に形質転換されている核酸分子は、生物／細胞中で自律的に複製する分子、生物／細胞のゲノムに組み込まれる分子または複製もしくは組み込みされずに細胞内に一時的に存在する分子であってよい。例えばプラスミドおよび直鎖状ＤＮＡ分子などの、形質転換のために好適な核酸分子の非限定的な例は、本明細書に開示されている。形質転換核酸配列を含有する、本明細書に記載の宿主有機体／細胞は、例えば、「トランスジェニックの」、「組み換えの」、「形質転換されている」、遺伝子操作されている、「形質転換体」、および／または「外因性遺伝子発現のために改変され」ていると称することができる。
【００５２】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関して、本明細書で使用される「配列相同性」または「相同性」という用語は、特定の比較窓上で最大の一致が得られるよう整列させたときに同一である２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。従って、「配列相同性のパーセント」または「パーセント相同性」は、比較窓上で最適に整列させた２つの配列を比較することにより決定された値を指すが、比較窓内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較すると、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、配列同一性のパーセンテージを得るために、マッチした位置数を生じさせるために両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、マッチした位置数を比較窓内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって計算される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列相同性を計算するとき、ＤＮＡ配列のＴ残基は、ＲＮＡ配列のＵ残基と合致し、したがってＲＮＡ配列のＵ残基と「同一である」と見なし得ることは理解されよう。第１および第２のポリヌクレオチドの「パーセント相補性」を決定する目的では、これは、（ｉ）例えば、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの相補配列間のパーセント相同性（逆も同じ）、および／または（ｉｉ）標準的なワトソン・クリック塩基対を形成し得る第１および第２のポリヌクレオチド間の塩基のパーセントを決定することにより得ることができる。
【００５３】
オンラインにより全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用できるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のアルゴリズムを使用すると、例えば、本明細書で開示する、２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間の同一性率を測定することができる。または、配列間の同一性率は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶもしくはＣｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ）を使用して実施することができる。Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法を使用するマルチプルアラインメントについては、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する可能性がある。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性率の計算のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。核酸については、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であってよい。或いはさらに、配列間の同一性パーセントは、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えばＢＬＯＳＵＭ６２）を使用して、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝偽、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５等のパラメーターで、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えばｎｅｅｄｌｅ）を使用して遂行してもよい。
【００５４】
本明細書では、様々なポリペプチドアミノ酸配列が、特定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書に開示した配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％もしくは９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変異体は、使用または参照することができる。或いは、変異アミノ酸配列は、本明細書に開示した配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有することができる。変異アミノ酸配列は、開示した配列と同一の機能／活性または開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、通常、アミノ酸配列のＮ末端で少なくとも１つの開始メチオニンをさらに含むことができる。メチオニンで始まる、本明細書に開示のポリペプチドアミノ酸配列はいずれも、場合により、このメチオニン残基なしで考えることができる（すなわち、ポリペプチド配列は、配列のＣ−末端残基の２位の残基に関して参照することができる）。
【００５５】
本明細書で使用する用語「単離（された）」は、その天然源から完全に、または部分的に精製されているポリペプチド分子（例、グルコシルトランスフェラーゼ）を意味する。いくつかの例では、単離ポリペプチド分子は、より大きな組成物、バッファ系または試薬ミックスの一部である。例えば、単離ポリペプチド分子は、異種方法で細胞内または生体内に含まれる可能性がある。本明細書のグラフトコポリマー（およびそれを合成する反応）は、合成／人造であり、および／または自然発生しない特性を有するので、単離されているとみなすこともできる。
【００５６】
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量または活性が比較される量または活性より、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％または２００％多い量または活性を指すことができる。本明細書では、「増加した」、「高められた」、「優れた」、「より大きい」、「向上した」などの用語は同義語として使用される。
【００５７】
ポリα−１，３−グルカンの生成において進歩がなされている中で、このグルカン生成物を経済的な方法で単離することに関することがいまだに問題になっている。従って、本明細書に開示されるこの必要性への取り組みは、グラフトコポリマーの形態でのポリα−１，３−グルカンである。そのようなコポリマーの様々な実施形態は、濾過性および／または水性液体の吸収性を高めてきた。
【００５８】
本開示の特定の実施形態は、
（ｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランを含む主鎖、
（ｉｉ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカン側鎖
を含むグラフトコポリマーを含む組成物に関する。
【００５９】
本明細書のグラフトコポリマーの主鎖を形成するデキストランは、例えば、約もしくは少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のα−１，６−グルコシド結合を含むことができる。α−１，６結合プロファイルのそのようなパーセントは、デキストラン（主鎖と分岐部を合わせた）の全ての結合の総計を考慮に入れる。本明細書での用語「デキストラン分岐」等は、本開示のグラフトコポリマーを調製するのに使用する前に、デキストランポリマーに存在する分岐のいずれも包含することを意味する。いくつかの実施形態においては、デキストランは、約もしくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のα−１，６−グルコシド結合を含む主鎖を含む。
【００６０】
本明細書のデキストランは、例えば、約もしくは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％のα−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合および／またはα−１，２グルコシド結合を含むことができる。通常、そのような結合は、分岐点を含むデキストランの分岐部に全体的に、またはほぼ全体的に存在する。いくつかの実施形態においては、デキストラン分岐は、１つ、２つ（例えば、α−１，４とα−１，３；α−１，４とα−１，２；α−１，３とα−１，２）、またはこれらの種類の結合の３つ全て含んでもよい。本明細書のデキストランにおけるα−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合および／またはα−１，２グルコシド結合の総パーセントは、通常、５０％以下である。いくつかの態様においては、例えば、約もしくは少なくとも約、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のα−１，６−グルコシド結合を有する主鎖を含むデキストランに関しては、そのようなデキストランは、約、もしくは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のα−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合および／またはα−１，２グルコシド結合を含む。
【００６１】
本明細書のデキストランの分岐点は、１つのα−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合、またはα−１，２グルコシド結合（例えば、１つの分岐は、デキストラン主鎖にα−１，３−結合した分岐であってよい）を含むことができる。いくつかの実施形態においては、これらの分岐点の３つ全てが存在することがあるが、いくつかの実施形態においては、これらの分岐点のうち１つだけまたは２つ（例えば、α−１，４とα−１，３；α−１，４とα−１，２；α−１，３とα−１，２）の種類が存在する。分岐点が、例えば、デキストラン主鎖のグルコース単位の平均（または少なくとも）５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１０〜３０、１５〜２５、２０〜３０、または２０〜４０毎に生じることが考えられる。本明細書におけるα−１，４グルコシド結合、α−１，３グルコシド結合、および／またはα−１，２グルコシド結合を含むデキストラン分子の分岐鎖は、通常、１つ〜３つのグルコースモノマーの長さであり、デキストランポリマーの全てのグルコースモノマーの約５〜１０％未満を含む。グルコース単位を１つ含む分岐鎖は、場合により、ペンダントグルコース基と称することがある。いくつかの実施形態においては、デキストラン分子の分岐鎖は、デキストラン分子の全てのグルコースモノマーのうち約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満を含むことができる。特定の実施形態におけるデキストランは、このポリマーにおけるグルコシド結合のパーセントとして、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の分岐点を有することができる。本明細書における分岐鎖のグルコシド結合プロファイルは、場合により、分岐鎖を他の鎖に連結することによるグルコシド結合を含むことを特徴とできる。
【００６２】
特定の実施形態におけるグラフトコポリマーの主鎖は、全体的に本開示のデキストランからなることが可能である。しかし、いくつかの態様においては、主鎖が、他の要素を含むことがある。例えば、グラフトコポリマー主鎖は、デキストラン主鎖の非還元性側鎖から始まるポリα−１，３−グルカンを含んでもよく、主鎖（その非還元性末端で）のお蔭で、グラフトコポリマーの合成中に主要なポリα−１，３−グルカン合成をプライムするのを助力する。
【００６３】
本明細書におけるグラフトコポリマーの主鎖を形成するデキストランの分子量（Ｍｗ［重量平均分子量］）は、少なくとも約１０００００ダルトンであり得る。特定の実施形態におけるデキストランは、約もしくは少なくとも約１０００００、１２５０００、１５００００、１７５０００、２０００００、２４００００、２５００００、５０００００、７５００００、もしくは１００００００ダルトンのＭｗを有することが可能であり、または約１０００００〜２０００００、１２５０００〜１７５０００、１３００００〜１７００００、１３５０００〜１６５０００、１４００００〜１６００００、または１４５０００〜１５５０００ダルトンの範囲であり得る。いくつかの態様においては、デキストランは、約もしくは少なくとも約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ミリオンダルトンのＭｗを有することが可能であり、またはいくつかの点で、約１０〜８０、２０〜７０、３０〜６０、４０〜５０、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１１０〜２００、１２０〜２００、５０〜１８０、６０〜１８０、７０〜１８０、８０〜１８０、９０〜１８０、１００〜１８０、１１０〜１８０、１２０〜１８０、５０〜１６０、６０〜１６０、７０〜１６０、８０〜１６０、９０〜１６０、１００〜１６０、１１０〜１６０、１２０〜１６０、５０〜１４０、６０〜１４０、７０〜１４０、８０〜１４０、９０〜１４０、１００〜１４０、１１０〜１４０、１２０〜１４０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、９０〜１１０、１００〜１２０、１１０〜１２０、５０〜１１０、６０〜１１０、７０〜１１０、８０〜１１０、９０〜１１０、１００〜１１０、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、もしくは９５〜１０５ミリオンダルトンの範囲であり得る。本明細書において少なくとも約５０ミリオンのＭｗを有するデキストランを、場合により、「巨大デキストラン」と呼ぶことがある。本明細書のデキストランのＭｗは、１０００００ダルトン以上であり、従って、例えばＴ１０（Ｍｗ＝１００００）、Ｔ２５（Ｍｗ＝２５０００）、またはＴ４０（Ｍｗ＝４００００）デキストランではない。本明細書のいずれのデキストランのＭｗも、場合により、重量平均重合度（ＤＰｗ）として表すことができ、ＤＰｗは、Ｍｗを１６２．１４で割った商である。上述のデキストランのＭｗのいずれも、例えば、デキストラン試料中のデキストラン分子の平均Ｍｗとみなすことができる。
【００６４】
いくつかの態様の巨大デキストランは、（ｉ）１位および６位でのみ連結した約８７〜９３ｗｔ％のグルコース；（ｉｉ）１位および３位でのみで連結した約０．１〜１．２ｗｔ％のグルコース；（ｉｉｉ）１位および４位でのみ連結した約０．１〜０．７ｗｔ％のグルコース；（ｉｖ）１位、３位および６位でのみ連結した約７．７〜８．６ｗｔ％のグルコース；並びに（ｖ）（ａ）１位、２位および６位、または（ｂ）１位、４位および６位でのみ連結した約０．４〜１．７ｗｔ％のグルコースを含むことができる。特定の実施形態においては、デキストランは、（ｉ）１位および６位でのみ連結したグルコース、約８９．５〜９０．５ｗｔ％；（ｉｉ）１位および３位でのみ連結したグルコース、約０．４〜０．９ｗｔ％；（ｉｉｉ）１位および４位でのみ連結したグルコース、約０．３〜０．５ｗｔ％；（ｉｖ）１位、３位および６位でのみ連結したグルコース、約８．０〜８．３ｗｔ％；並びに（ｖ）（ａ）１位、２位および６位、または（ｂ）１位、４位および６位でのみ連結したグルコース、約０．７〜１．４ｗｔ％を含むことができる。
【００６５】
いくつかの態様における巨大デキストランは、１位および６位でのみ連結したグルコースを、約８７、８７．５、８８、８８．５、８９、８９．５、９０、９０，５、９１、９１．５、９２、９２．５または９３ｗｔ％含むことができる。いくつかの例では、１位および６位でのみ連結した約８７〜９２．５、８７〜９２、８７〜９１．５、８７〜９１、８７〜９０．５、８７〜９０、８７．５〜９２．５、８７．５〜９２、８７．５〜９１．５、８７．５〜９１、８７．５〜９０．５、８７．５〜９０、８８〜９２．５、８８〜９２、８８〜９１．５、８８〜９１、８８〜９０．５、８８〜９０、８８．５〜９２．５、８８．５〜９２、８８．５〜９１．５、８８．５〜９１、８８．５〜９０．５、８８．５〜９０、８９〜９２．５、８９〜９２、８９〜９１．５、８９〜９１、８９〜９０．５、８９〜９０、８９．５〜９２．５、８９．５〜９２、８９．５〜９１．５、８９．５〜９１、もしくは８９．５〜９０．５ｗｔ％のグルコースが存在してよい。
【００６６】
いくつかの態様における巨大デキストランは、１位および３位でのみ連結した約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、もしくは１．２ｗｔ％のグルコースを含むことができる。いくつかの例では、１位および３位でのみ連結した約０．１〜１．２、０．１〜１．０、０．１〜０．８、０．３〜１．２、０．３〜１．０、０．３〜０．８、０．４〜１．２、０．４〜１．０、０．４〜０．８、０．５〜１．２、０．５〜１．０、０．５〜０．８、０．６〜１．２、０．６〜１．０、もしくは０．６〜０．８ｗｔ％のグルコースが存在してよい。
【００６７】
いくつかの態様における巨大デキストランは、１位および４位でのみ連結した約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、もしくは０．７ｗｔ％のグルコースを含むことができる。いくつかの例では、１位および４位でのみ連結した約０．１〜０．７、０．１〜０．６、０．１〜０．５、０．１〜０．４、０．２〜０．７、０．２〜０．６、０．２〜０．５、０．２〜０．４、０．３〜０．７、０．３〜０．６、０．３〜０．５、もしくは約０．３〜０．４重量％のグルコースが存在してよい。
【００６８】
いくつかの態様における巨大デキストランは、１位、３位および６位でのみ連結した約７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、もしくは８．６ｗｔ％のグルコースを含むことができる。いくつかの例では、１位、３位および６位でのみ連結した約７．７〜８．６、７．７〜８．５、７．７〜８．４、７．７〜８．３、７．７〜８．２、７．８〜８．６、７．８〜８．５、７．８〜８．４、７．８〜８．３、７．８〜８．２、７．９〜８．６、７．９〜８．５、７．９〜８．４、７．９〜８．３、７．９〜８．２、８．０〜８．６、８．０〜８．５、８．０〜８．４、８．０〜８．３、８．０〜８．２、８．１〜８．６、８．１〜８．５、８．１〜８．１、８．１〜８．３、または８．１〜８．２ｗｔ％のグルコースが存在してよい。
【００６９】
いくつかの態様における巨大デキストランは、（ａ）１位、２位および６位または（ｂ）１位、４位および６位でのみ連結した約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、もしくは１．７ｗｔ％のグルコースを含むことができる。いくつかの例では、（ａ）１位、２位および６位または（ｂ）１位、４位および６位でのみ連結した約０．４〜１．７、０．４〜１．６、０．４〜１．５、０．４〜１．４、０．４〜１．３、０．５〜１．７、０．５〜１．６、０．５〜１．５、０．５〜１．４、０．５〜１．３、０．６〜１．７、０．６〜１．６、０．６〜１．５、０．６〜１．４、０．６〜１．３、０．７〜１．７、０．７〜１．６、０．７〜１．５、０．７〜１．４、０．７〜１．３、０．８〜１．７、０．８〜１．６、０．８〜１．５、０．８〜１．４、０．８〜１．３ｗｔ％のグルコースが存在してよい。
【００７０】
本明細書の「１位および６位で連結したグルコース（グルコースモノマー）」は、２つの隣接グルコースモノマーとの各グルコシド結合に、グルコースモノマーの１位と６位の炭素のみが関与しているデキストランのグルコースモノマーを意味する。この定義は、（ｉ）「１位および３位で連結した」、および（ｉｉ）「１位および４位で連結した」グルコースに同様に適用され、各結合に関与する炭素位がそれぞれに応じて異なることが考慮される。
【００７１】
本明細書の「１位、３位および６位で連結したグルコース（グルコースモノマー）」は、３つの隣接グルコースモノマーとの各グルコシド結合に、グルコースモノマーの１位、３位および６位の炭素が関与しているデキストランのグルコースモノマーを意味する。１位、３位および６位でのみ連結したグルコースは、分岐点である。この定義は、（ｉ）１位、２位および６位で連結した、並びに（ｉｉ）１位、４位および６位で連結したグルコースに同様に適用されるが、各結合に関与する炭素位置がそれぞれに応じて異なることが考慮される。
【００７２】
本明細書でのグルコースの位置（グルコースの炭素位）１、２、３、４および６は、当該技術分野で知られている通りである（下記の構造式に描かれている）。
【化１】
2018532875.tif 000004
【００７３】
巨大デキストランのグルコシド結合プロファイルは、本明細書に開示した任意のプロトコルに従って生成されたデキストランを使用して求めることができる。好適な結合決定プロトコルの例は、実施例８に開示したプロトコルに類似または同一であってよい。例えば、約５〜３０分間（例えば、１０分間）、約７０〜９０℃（例えば、８０℃）で反応系を加熱することによって不活化した０７６８ｇｔｆ酵素反応系を、ＭＯＣＯ１２〜１４ｋＤａの透析チューブ（例えば、再生セルロース製）（例えば、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）４透析チューブ、製品番号１３２７０６、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）内に配置する。次に、不活化した反応系を、約４〜１０日間（例えば、７日間）にわたり約２０〜２５℃（室温）で大量の水（例えば、３〜５Ｌ）に対して透析する。この水は、透析中、毎日交換することができる。次に、デキストラン生成物を、（ｉ）透析した不活化反応系を反応体積の約１〜２倍（１．５倍）量の１００％メタノールと混合することにより沈降させ、（ｉｉ）同一体積の１００％メタノールを用いて少なくとも２回洗浄し、（ｉｉｉ）（場合により、真空下で）約４０〜５０℃（例えば、４５℃）で乾燥させる。乾燥デキストランの溶解可能量を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ）またはＤＭＳＯ／５％ＬｉＣｌ中に溶解し、その後、全ての遊離ヒドロキシル基を（例えば、ＮａＯＨ／ＤＭＳＯスラリー、次いでヨードメタンを連続的に添加するによって）メチル化する。メチル化したデキストランを、次に、（例えば、塩化メチレン中に）抽出し、約１１０〜１２５℃（例えば、１２０℃）でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を使用してモノマー単位に加水分解する。次に、ＴＦＡを留去し、重水素化ホウ素ナトリウムを使用して還元的開環を実施する。グリコシド結合を加水分解することにより生成したヒドロキシル基を、次に、約４０〜６０℃（例えば、５０℃）の温度で塩化アセチルおよびＴＦＡで処理することによってアセチル化する。次に、誘導体化試薬を留去し、生じたメチル化／アセチル化モノマーをアセトニトリル中で再構成させる。その後、この調製物を適切なカラム（例えば、ビスシアノプロピルシアノプロピルフェニルポリシロキサン）を使用してＧＣ／ＭＳにより分析する。メチルおよびアセチル官能基の相対測位は、独特の保持時間を有する種に、公表データベースと比較し得る指数および質量スペクトルを提供する。このような方法で、モノマー単位の誘導体は、各モノマーがデキストランポリマーにおいて最初にどのように連結されたかを示す。
【００７４】
本明細書の巨大デキストランは、相互から反復して分岐する長鎖（大多数または全部がα−１，６−結合を含有する）が存在する分枝状構造（例えば、長鎖は、順にそれ自体が他の長鎖から分岐することができ、さらにそれ自体が、他の長鎖からの分岐鎖であってよい等）であってよいと考えられる。分岐構造はまた、長鎖からの短い分岐鎖を含んでよく、これらの短鎖は、大部分が、例えばα−１，３結合および１，４−結合を含むと考えられる。巨大デキストラン中の分岐点は、他の長鎖から分岐した長鎖からであろうと、長鎖から分岐した短鎖からであろうと、α−１，６−結合内に含まれるグルコースからのα−１，３結合、−１，４結合または−１，２結合を含むと思われる。平均すると、いくつかの実施形態では、巨大デキストランの全分岐点の約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、１５〜３５％、１５〜３０％、１５〜２５％、１５〜２０％、２０〜３５％、２０〜３０％、２０〜２５％、２５〜３５％または２５〜３０％が長鎖に分岐する。他の分岐点の大部分（＞９８％もしくは９９％）または全部が、短鎖に分岐する。
【００７５】
いくつかの態様では、巨大デキストラン分岐構造の長鎖は、類似し得る。長さが類似しているとは、分岐構造内の全長鎖の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の長さ（ＤＰ）が、分岐構造の全長鎖の平均長の±１５％（または１０％、５％）の範囲内にあることを意味する。いくつかの態様では、巨大デキストランの長鎖の平均（ｍｅａｎ）長（平均（ａｖｅｒａｇｅ）長）は、約１０〜５０ＤＰ（すなわち、１０〜５０グルコースモノマー）である。例えば、長鎖の平均個別長は、約１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０もしくは２０〜２５ＤＰの可能性がある。
【００７６】
特定の実施形態では、巨大デキストランの長鎖は、大部分のα−１，６−グルコシド結合と、少量（２．０％未満）のα−１，３−グルコシド結合および／またはα−１，４−グルコシド結合とを含むことができる。例えば、巨大デキストランの長鎖は、α−１，６−グルコシド結合を、約、または少なくとも約、９８％、９８．２５％、９８．５％、９８．７５％、９９％、９９．２５％、９９．５％、９９．７５％または９９．９％含むことができる。特定の実施形態では、デキストラン長鎖は、α−１，４−グルコシド結合を含まない（すなわち、そのような長鎖は、大部分のα−１，６−結合と、少量のα−１，３−結合とを有する）。これとは逆に、いくつかの実施形態では、デキストラン長鎖は、α−１，３−グルコシド結合を含まない（すなわち、そのような長鎖は、大部分のα−１，６−結合と、少量のα−１，４−結合とを有する）。上述の実施形態のデキストラン長鎖のいずれかは、さらに、例えば、α−１，２−グルコシド結合を含まない場合がある。さらにいくつかの態様では、デキストラン長鎖は、α−１，６−グルコシド結合を１００％含むことが可能である（他の鎖から分岐するためにそのような長鎖によって使用される結合を除く）。
【００７７】
いくつかの態様における巨大デキストラン分子の短鎖は、１〜３つのグルコースモノマーの長さであり、デキストランポリマーの全グルコースモノマーの約５〜１０％未満を含んでいる。本明細書の短鎖の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全部は、１〜３つのグルコースモノマーの長さである。デキストランモノマーの短鎖は、例えば、巨大デキストラン分子の全グルコースモノマーの約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％未満を含むことができる。
【００７８】
いくつかの態様における巨大デキストラン分子の短鎖は、α−１，２−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合および／またはα−１，４−グルコシド結合を含むことができる。短鎖は、全部を一緒に（個別にではなく）検討した場合、（ｉ）これらの結合の３つ全て、または（ｉｉ）例えば、α−１，３−グルコシド結合およびα−１，４−グルコシド結合を含んでよい。
【００７９】
巨大デキストランを使用して本開示のコポリマーを生み出す実施形態において、「主鎖」は、巨大デキストランの長鎖であると考えられている。ポリα−１，３−グルカン側鎖は、至る所で本開示の方法で巨大デキストランの長鎖に連結できる（例えば、短鎖または長鎖の非還元性末端から伸びる）。
【００８０】
本明細書の巨大デキストランのＭｗは、約５０〜２００ミリオンであり、または既に開示したいかなるＭｗも、この範囲内に入る。
【００８１】
本明細書の巨大デキストランのｚ平均慣性半径は、約２００〜２８０ｎｍであってよい。例えば、ｚ平均Ｒｇは、約２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５もしくは２８０ｎｍ（または、２００〜２８０ｎｍの間の任意の整数）であってよい。他の例として、ｚ平均Ｒｇは、約２００〜２８０、２００〜２７０、２００〜２６０、２００〜２５０、２００〜２４０、２００〜２３０、２２０〜２８０、２２０〜２７０、２２０〜２６０、２２０〜２５０、２２０〜２４０、２２０〜２３０、２３０〜２８０、２３０〜２７０、２３０〜２６０、２３０〜２５０、２３０〜２４０、２４０〜２８０、２４０〜２７０、２４０〜２６０、２４０〜２５０、２５０〜２８０、２５０〜２７０もしくは２５０〜２６０ｎｍであってよい。
【００８２】
本明細書の用語「半径慣性」（Ｒｇ）は、デキストランの平均半径を意味し、分子の重心からのデキストラン分子の成分（原子）の平均二乗距離平方根として算出される。Ｒｇは、例えば、オングストロームまたはナノメートル（ｎｍ）単位で表すことができる。本明細書のデキストランの「ｚ平均慣性半径」は、光散乱法（例えば、ＭＡＬＳ）を使用して測定されるデキストランのＲｇを意味する。ｚ平均Ｒｇを測定する方法は知られており、従って本明細書で使用できる。例えば，ｚ平均Ｒｇは、米国特許第７５３１０７３号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０００３５１５号明細書および米国特許出願公開第２００９／００４６２７４号明細書、Ｗｙａｔｔ（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２７２：１−４０）、並びにＭｏｒｉおよびＢａｒｔｈ（サイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９９）に開示されるように測定でき、それらの全ては、参照により本明細書に組み込まれている。
【００８３】
いくつかの態様における巨大デキストランのＭｗおよび／またはｚ平均Ｒｇは、実施例８に開示したプロトコルと類似または同一のプロトコルに従って測定できる。例えば、本明細書のＭｗおよび／またはｚ平均Ｒｇは、最初に、１５０〜２５０ｐｐｍ（例えば、約２００ｐｐｍ）のＮａＮ３を含む０．０５〜１．０Ｍ（例えば、約０．０７５Ｍ）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファ中に、０７６８ｇｔｆによって生成されたデキストランを０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度に溶解させることによって測定することができる。乾燥デキストランの溶媒和は、４５〜５５℃（例えば、約５０℃）で１２〜１８時間振盪することによって達成することができる。３台のオンライン検出器と一体となった分離モジュール（例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ製のＡｌｌｉａｎｃｅ（商標）２６９５分離モジュール）を備える好適なフローインジェクションクロマトグラフ装置内に、得られたデキストラン溶液を入れることができる：示差屈折率検出器（例えば、Ｗａｔｅｒｓ２４１４示差屈折率検出器）、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器（例えば、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ製のＱＥＬＳ検出器）を装備する多角度光散乱（ＭＡＬＳ）光度計（例えば、Ｈｅｌｅｏｓ（商標）−２  １８−アングルマルチアングルＭＡＬＳ光度計）、および示差毛管粘度検出器（例えば、Ｗｙａｔｔ製のＶｉｓｃｏＳｔａｒ（商標）示差毛管粘度検出器）。デキストランポリマーピークをインジェクションピークから分離するのに、２つの好適なサイズ排除カラム（例えば、ＣＡ、Ｓａｎｔａ  ＣｌａｒａのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＡＱＵＡＧＥＬ−ＯＨ  ＧＵＡＲＤカラム）を使用することができ、この場合、移動相は試料溶媒（上述）と同じとし、流量は約０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は約０．１ｍＬ、そしてカラム温度は約３０℃とすることができる。データの取得（例えば、ＷａｔｅｒｓのＥｍｐｏｗｅｒＴＭバージョン３ソフトウェア）および多検出器データ整理（Ｗｙａｔｔ製のＡｓｔｒａ（商標）バージョン６ソフトウェア）に好適なソフトウェアを使用することができる。ＭＡＬＳデータは、重量平均分子量（Ｍｗ）およびｚ平均慣性半径（Ｒｇ）を提供することができ、ＱＥＬＳデータは、例えば、ｚ平均流体力学的半径を提供することができる。
【００８４】
本明細書の巨大デキストランは、配列番号６もしくは配列番号７と１００％同一であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である（かつ巨大デキストラン合成活性を有する）アミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の生成物であり得る。配列番号６（または、関連配列）を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素の非限定的な例には、配列番号７と１００％同一であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である（かつ、巨大デキストラン合成活性を有する）アミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が含まれる。特定の実施形態において、巨大デキストランは、ロイコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）グルコシルトランスフェラーゼ酵素ではなく、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）グルコシルトランスフェラーゼ酵素であり得る。
【００８５】
本明細書のデキストランを生成するために使用されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、通常、Ｎ末端シグナルペプチドが欠如する成熟形態である。本明細書の成熟グルコシルトランスフェラーゼ酵素を生成する発現系は、細胞外分泌を指示するＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む、酵素コードポリヌクレオチドを使用することがある。そのような実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌工程中に酵素から切断される。シグナルペプチドは、グルコシルトランスフェラーゼに対して天然または異種のどちらかであってもよい。
【００８６】
配列番号６は、Ｎ末端シグナルペプチドが欠如する成熟グルコシルトランスフェラーゼ酵素の例である。このアミノ酸配列や関連するアミノ酸配列はメチオニン残基で始まらないので、シグナルペプチドを使用せずに（例えば、酵素が細胞内で発現し、細胞溶解液から得られる発現系を用いて）任意のこれらの酵素を発現させる場合は、Ｎ末端開始メチオニンを配列に（直接、または、エピトープなどの介在異種アミノ酸配列を介して）付加することが好ましいことは理解されよう。
【００８７】
特定の実施形態においてデキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、当技術分野で既知の任意の手段、例えば、ポリα−１，３−グルカンを合成する酵素を生成するための以下に開示する手段により生成できる。
【００８８】
特定の実施形態においてデキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、ポリα−１，３−グルカンを合成する酵素を生成するための以下に開示する、任意の精製状態（例えば、純粋または非純粋）で使用してよい。
【００８９】
デキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて求めることができる。例えば、そのような酵素活性は、スクロース（約５０ｇ／Ｌ）、デキストランＴ１０（約１ｍｇ／ｍＬ）およびリン酸カリウムバッファ（ｐＨ  約６．５、５０ｍＭ）を含有する反応系において、還元糖（フルクトースおよびグルコース）の生成を測定することによって求めることができるが、このとき、溶液は約２２〜２５℃で約２４〜３０時間保持される。還元糖は、約１ＮのＮａＯＨ、および約０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウムを含有する混合物に０．０１ｍＬの反応系を加え、次に約５分間にわたってＯＤ４８０ｎｍでの吸光度の増加を監視することによって測定できる。また、例えば、本明細書のｇｔｆ０７６８（配列番号１を含む）等の酵素の１単位は、１００ｇ／Ｌのスクロースを用いて、２６℃、ｐＨ６．５、１時間で、１ｇのスクロースを消費するために必要な酵素量と定義できる。
【００９０】
巨大デキストランは、デキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ反応において含まれるグルコシルトランスフェラーゼの生成物であり得る。
【００９１】
デキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ反応の温度は、所望ならば、制御できる。特定の実施形態においては、その温度は、約５℃〜約５０℃である。特定の他の実施形態における温度は、約２０℃〜約４０℃である。或いは、その温度は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃であってよい。
【００９２】
デキストランを生成する本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるスクロースの初期濃度は、約２０ｇ／Ｌ〜９００ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ〜１７５ｇ／Ｌもしくは５０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌであり得る。スクロースの初期濃度は、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、５０〜１５０、７５〜１２５、９０〜１１０、５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００、５０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００、５０〜３００、１００〜３００、２００〜３００、５０〜２００、１００〜２００もしくは５０〜１００ｇ／Ｌ（または２０〜９００ｇ／Ｌの任意の整数）であり得る。スクロースは、ポリα−１，３−グルカンを生成する反応に関して以下に開示する純度であり得る。
【００９３】
デキストランを生成する特定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ反応のｐＨは、約４．０〜約８．０であり得る。或いは、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５もしくは８．０であってよい。ｐＨは、好適なバッファ、例えば、限定はされないが、ホスフェート、トリス、シトレート、またはそれらの組み合わせを添加または混入することによって調節または制御できる。ｇｔｆ反応におけるバッファ濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０、２０もしくは５０ｍＭであり得る。
【００９４】
デキストランを生成する本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、場合により、撹拌もしくは旋回振盪によってかき混ぜることができる。そのようなかき混ぜは、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、５０〜１５０、６０〜１４０、７０〜１３０、８０〜１２０もしくは９０〜１１０ｒｐｍであってよい。
【００９５】
デキストランを生成する反応でのグルコシルトランスフェラーゼ酵素の濃度は、例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０Ｕ／Ｌであってよい。いくつかの実施形態においては、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜３５、２５〜３０もしくは３０〜３５Ｕ／Ｌのグルコシルトランスフェラーゼを使用することができる。
【００９６】
デキストランを生成する本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、完了するために約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１８〜３０、２０〜２８もしくは２２〜２６時間を要する可能性がある。反応時間は、例えば、反応において使用されるスクロールおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素の量等の特定のパラメーターに応じて異なることがある。
【００９７】
従って、デキストランを生成するグルコシルトランスフェラーゼ反応を定める本明細書における全ての特徴は、兼ね合わせることがある。単純に１つの例として、０７６８グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号１もしくはその関連配列を含む）を使用する反応は、最初に９０〜１１０ｇ／Ｌ（例えば、約１００ｇ／Ｌ）のスクロース、ｐＨ６．０〜７．０（例えば、約ｐＨ６．５）で１０〜３０ｍＭ（例えば、約２０ｍＭ）のリン酸カリウムバッファおよび２０〜３０Ｕ／Ｌ（例えば、約２５Ｕ／Ｌ）の酵素を含有することができる。そのような反応は、２４〜２８℃（例えば、約２６℃）で、５０〜１５０ｒｐｍ（例えば、約１００ｒｐｍ）で振盪しながら約２０〜２８時間（例えば、約２４時間）保持することができる。
【００９８】
本明細書のグラフトコポリマーは、デキストラン主鎖を含み、その主鎖から、少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカン側鎖が存在する。これらの側鎖は、通常、本明細書においてここに開示されるデキストランを、ポリα−１，３−グルカンを合成できるグルコシルトランスフェラーゼと反応させることにより、生じる。明確な目的上、これらの側鎖は、デキストランの分岐鎖としてみなされるべきではない。
【００９９】
特定の態様におけるポリα−１，３−グルカン側鎖は、約もしくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％のα−１，３グルコシド結合を含むことができる。そのような側鎖は、いくつかの態様においては、ペンダントグルコースもしくはデキストランの他の分岐部（それらの両方とも、伸長の為に酵素に非還元性末端を与える）をプライマーとして用いて、グルコシルトランスフェラーゼ酵素で合成されると考えられる。側鎖が、デキストラン主鎖にそれ自体がα−１，３−結合したペンダントグルコースから合成される場合には、得られる側鎖は、１００％のα−１，３−グリコシド結合、または非常に高いパーセント（例えば、９８％以上）のα−１，３−グリコシド結合を有する可能性がある。いくつかの実施形態においては、デキストラン主鎖とペンダントグルコースもしくはそれより長い分岐鎖と間のグルコシド結合は、側鎖の結合であるとみなされる。いくつかの実施形態においては、デキストラン主鎖と分岐鎖との間のグルコシド結合も、またそれから側鎖が合成される分岐鎖内のグルコシド結合も、側鎖の結合プロファイルを定める際に考慮される。いくつかの実施形態においては、側鎖は、例えば、グラフトコポリマー中のデキストラン成分が１０００００〜２０００００ダルトンであるグラフトコポリマーとのα−１，６グルコシド結合を伴わない。
【０１００】
本明細書におけるポリα−１，３−グルカン側鎖のＭｗは、例えば約もしくは少なくとも約１６２０、１６５０、１７００、２０００、５０００、１００００、１５０００、１６２００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、７５０００、８００００、９００００、１０００００、１１００００、１２００００、１２５０００、１３００００、１４００００、１５００００、１６００００、１６２０００、または１６５０００ダルトンであり得る。本明細書におけるグラフトコポリマーの側鎖は、比較的に均一なサイズであると考えられる。例えば、グラフトコポリマーの側鎖は、それぞれ少なくとも約１０００００、１２００００、１４００００、１６００００、１６２０００、または１６５０００ダルトンであってよい。例えば、グラフトコポリマーの側鎖はまた、約１５００００〜１６５０００、１５５０００〜１６５０００、または１６００００〜１６５０００ダルトンの範囲のＭｗをそれぞれ有してよい。所望ならば、グラフトコポリマーの側鎖の平均Ｍｗはまた、参考にでき、上述の側鎖のＭｗのいずれも、コポリマーの側鎖全ての平均Ｍｗとみなすことができる。本明細書に開示される側鎖のＭｗのいずれも（または任意のグルカンのＭｗ）、場合により、ＤＰｗ（Ｍｗ／１６２．１４）という点で特徴付けることができる。
【０１０１】
本明細書におけるグラフトコポリマーのポリα−１，３−グルカン側鎖の数は、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０であり得る。いくつかの実施形態においては、側鎖の数は、例えば４、５、または６である。いくつかの態様において、ポリα−１，３−グルカン側鎖の上述の数は、少なくとも約１０００００、１２００００、１４００００、１６００００、１６２０００、または１６５０００ダルトンである側鎖の特徴であり、本明細書の任意のデキストラン成分、例えば、１０００００〜２０００００ダルトンの巨大デキストランまたはデキストランは、そのようなコポリマーに含まれ得る。尚さらなる態様においては、ポリα−１，３−グルカン側鎖の上述の数は、グラフトコポリマーを特徴付けることができ、そのグラフトコポリマーにおいて、デキストラン成分が、デキストラン主鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のグルコース単位毎に平均して１つ、ペンダントグルコースおよび／または分岐鎖（そこから側鎖をプライム／合成できる）を有する。デキストラン成分のサイズ（例えば、１０００００〜２０００００ダルトン）、デキストラン主鎖上の分岐鎖／ペンダントグルコースの位置決め（例えば、２０のグルコース単位毎に約１つ）、およびグラフトコポリマーのポリα−１，３−グルカン側鎖の数に応じて、グラフトコポリマーが、ポリα−１，３−グルカン側鎖に伸びないその元来のデキストラン分岐鎖／ペンダントグルコースの大部分（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％）を有する（つまり、分岐鎖／ペンダントグルコースの殆どは、それらを使用して本明細書のグラフトコポリマーを合成する前に、それらは、デキストラン中に存在する）ことが、いくつかの場合に考えられる。さらに、いくつかの他の実施形態において、本明細書のグラフトコポリマーが、最大約５０まで、最大１００まで、最大５００まで、最大１０００まで、最大５０００まで、最大１００００まで、最大１５０００まで、または最大２００００までのポリα−１，３−グルカン側鎖を有する可能性があると思われる。
【０１０２】
特定の実施形態においては、グラフトコポリマーのデキストラン成分は、少なくとも約５０ミリオンダルトンの重量平均分子量（例えば、既に開示したより高い任意のＭｗ）を有するおよび／または（ｉ）１位および６位で連結した約８７〜９３ｗｔ％のグルコース；（ｉｉ）約１位および３位で連結した０．１〜１．２ｗｔ％のグルコース；（ｉｉｉ）１位および４位で連結した約０．１〜０．７ｗｔ％のグルコース；（ｉｖ）１位、３位および６位で連結した約７．７〜８．６ｗｔ％のグルコース；並びに（ｖ）（ａ）１位、２位および６位、または（ｂ）１位、４位および６位で連結した約０．４〜１．７ｗｔ％のグルコースを含み、グラフトコポリマーの側鎖は、少なくとも３０％のα−１，３−グリコシド結合と、側鎖におけるα−１，３結合とα−１，６結合との両方の合計が１００％までである百分率のα−１，６結合とを含んでもよい。例えば、α−１，３結合の百分率は、少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％であってよく、一方、α−１，６結合の百分率は、側鎖におけるα−１，３結合とα−１，６結合との両方の合計が１００％までである百分率であってよい。特定の実施形態においては、そのような側鎖は、交互性（１，３結合と１，６結合を交互に）を含まない。いくつかの実施形態においては、側鎖は、得られるグラフトコポリマーを不溶性とさせるレベルのα−１，３結合を有する。上述の少なくとも３０％のα−１，３−グリコシド結合を含む側鎖を合成するのにいくつかの態様において使用できるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書に開示され、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
少なくとも９５％のα−１，３−グリコシド結合を含む側鎖を特徴とする既に開示した（鎖結合プロファイルを除く）全ての特徴（例えば、Ｍｗ、側鎖の数、デキストラン主鎖の間隔、分岐点のタイプ）は、同様に、少なくとも３０％のα−１，３−グリコシド結合を含む本明細書の側鎖を特徴とする。
【０１０４】
本明細書のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの重量平均分子量（つまり、元来のデキストラン分子とグラフトコポリマーのポリα−１，３−グルカン側鎖とを合わせたＭｗ）は、例えば、約もしくは少なくとも約７５００００、８０００００、９０００００、１００００００、１１０００００、１２０００００、１３０００００、１４０００００、１５０００００、１６０００００、１７０００００、１８０００００、１９０００００、または２００００００ダルトンであってよい。いくつかの実施形態において巨大デキストラン成分を含むデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの重量平均分子量は、巨大デキストラン成分自体に関して既に開示した重量に類似しているが、約０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５または２ミリオンダルトン（２、３個のポリα−１，３−グルカン側鎖が存在する実施形態において）の追加を伴うと思われている。尚いくつかのさらなる態様においては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの重量平均分子量は、本明細書の任意のデキストラン分子のＭｗと、本明細書に開示した任意のポリα−１，３−グルカン側鎖のＭｗ（側鎖の数およびそれぞれのＭｗを考慮する）との合計であってよい。同様に、本明細書のグラフトコポリマーのＭｗは、場合により、デキストラン成分のＭｗおよびポリα−１，３−グルカン側鎖のＭｗの観点で表すことができる。いくつかの態様においては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの重量平均分子量は、６０００００ダルトン以上、６５００００ダルトン以上、または７０００００ダルトン以上である。
【０１０５】
特定の実施形態においては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、約もしくは少なくとも約２．０ｗｔ％のデキストランを含むことができる。いくつかのさらなる実施形態におけるグラフトコポリマー中のデキストランのｗｔ％は、約もしくは少なくとも約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（または１％〜９９％の任意の整数）であってよい。いくつかの実施形態においては、グラフトコポリマー（例えば、２％〜５０％、２％〜１１％、２．５％〜１０．５％、または２％超のデキストランを含むグラフトコポリマー）は、同一タイプであるが重量百分率が低い（例えば、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、または０．８％未満）デキストランを含むグラフトコポリマーと比較すると、向上した濾過性を呈することができる。本明細書の向上した濾過性は、水および／または水溶液（例えば、グラフトコポリマーを生成するのに使用する酵素反応の液体部）をグラフトコポリマー粒子の層（例えば、ウェットケーク）を介して濾過（例えば、重力のみ、置換洗浄、印加力）できることにより、場合により容易性を指すことがある。本発明のグラフトコポリマーは、（ｉ）１．６ｗｔ％未満のデキストランを有する本明細書のグラフトコポリマー（上述）の濾過性、または（ｉｉ）少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のα−１，３−結合を有する、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００のＤＰｗのポリα−１，３−グルカンホモポリマーの濾過性よりも、約もしくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％、１００００％、もしくは１０００００％速い濾過性を呈することができる。そのような比較をするための濾過性測定は、ケーク比抵抗の単位または任意の他の濾過性測定の単位においてであってよい。いくつかの場合において、上述の実施形態におけるデキストラン（少なくとも２．０ｗｔ％のデキストランを含むグラフトコポリマー）は、少なくとも約５０ミリオンのＭｗまたは本明細書のＭｗよりもいくらか大きいＭｗを有する。少なくとも２．０ｗｔ％の本明細書のデキストランを含むグラフトコポリマーは、例えば約３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．２５、もしくは５．５ｍｍの平均直径を有する粒子として現れることがある。特定の態様におけるグラフトコポリマーの向上した濾過性は、通常濾過するのが困難であるポリα−１，３−グルカンホモポリマーに対して利点を示す。
【０１０６】
本明細書のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）（ＰＤＩ）は、例えば、約、少なくとも約５．０、４．７５、４．５、４．２５、４．０、３．７５、３．５、３．２５、３．０、２．７５、２．５、２．２５、または２．０以下であってよい。そのようなＰＤＩは、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーとポリα−１，３−グルカンホモポリマーの両方を生成できる本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応の全ての不溶性生成物（全てを一緒に考えて）を別の方法で特徴付けることができる。一般的に、初期の基質デキストランをより多く（例えば、約もしくは少なくとも約７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、または２０ｇ／Ｌ）含む本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、他の全ての変数が等しいならば、初期の基質デキストランをより少なく（例えば、約、５、４、３、２．５、もしくは２ｇ／Ｌまたは約５、４、３、２．５、もしくは２ｇ／Ｌ未満）含むグルコシルトランスフェラーゼ反応よりもＰＤＩが低い不溶性生成物をもたらす。
【０１０７】
本開示のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、通常、水性条件下で不溶性（非水溶性）である。例えば、グラフトコポリマーは、最大約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０℃までの温度で、水もしくは別の水性組成物に不溶であり得、または完全に溶解できない。水溶液等の本明細書の水性組成物は、少なくとも約１０ｗｔ％の水を有する溶媒を含むことができる。他の実施形態においては、溶媒は、例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｗｔ％（または１０〜１００ｗｔ％の間の任意の整数）の水である。
【０１０８】
本明細書の組成物に含まれるデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、水性液体を吸収できる。水性液体は、例えば水であってよい。特定の態様における水性液体は、塩溶液（塩水）等の水溶液であってよい。塩溶液は、場合により、約もしくは少なくとも約０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．５、３．０、３．５、０．０１〜３．５、０．５〜３．５、０．５〜２．５、もしくは０．５〜１．５ｗｔ％の塩（そのようなｗｔ％値は、通常１種もしくは複数種の塩の総濃度を指す）を含むことができる。本明細書の水溶液で使用できる塩の例としては、１種もしくは複数種のナトリウム塩（例えば、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４）が挙げられる。塩の他の非限定的な例としては、（ｉ）アルミニウム、アンモニウム、バリウム、カルシウム、クロム（ＩＩもしくはＩＩＩ）、銅（ＩもしくはＩＩ）、鉄（ＩＩもしくはＩＩＩ）、水素、鉛（ＩＩ）、リチウム、マグネシウム、マンガン（ＩＩもしくはＩＩＩ）、水銀（ＩもしくはＩＩ）、カリウム、銀、ストロンチウムナトリウム、スズ（ＩＩもしくはＩＶ）または亜鉛カチオン、および（ｉｉ）酢酸塩、ホウ酸塩、臭素酸塩、臭化物、炭酸塩、塩素酸塩、塩化物、亜塩素酸塩、クロム酸塩、シアナミド、シアン化物、重クロム酸塩、リン酸二水素、フェリシアン化物、フェロシアン化第二鉄、フッ化物、炭酸水素、リン酸水素、硫酸水素、硫化水素、亜硫酸水素、水素化物、水酸化物、次亜塩素酸塩、ヨウ素酸塩、ヨウ化物、硝酸塩、窒化物、亜硝酸塩、シュウ酸塩、酸化物、過塩素酸塩、過マンガン酸塩、過酸化物、ホスフェート、リン化物、亜リン酸塩、ケイ酸塩、スズ酸塩、亜スズ酸塩、硫酸塩、硫化物、亜硫酸塩、酒石酸塩またはチオシアン酸塩アニオンを含む塩が挙げられる。従って、例えば、上述の（ｉ）からのカチオン、および上述の（ｉｉ）からのアニオンを有する任意の塩が、本開示の水性液体中に含まれ得る。吸収レベルは、当技術分野で既知の手段、例えば、ＷＲＶ（保水度）の測定に関する実施例７（以下）に開示するプロトコルを用いて、測定できる。
【０１０９】
本明細書の組成物に含まれるデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーによる水性液体の吸収は、例えば組成物のＷＲＶを測定することにより、判定できる。本明細書のＷＲＶは、当技術分野で既知の手段、例えば、実施例７（以下）に開示するプロトコルを用いて、測定できる。簡潔に言えば、ＷＲＶは、以下の式を用いて算出できる：（（湿潤ポリマーの質量−乾燥ポリマーの質量）／乾燥ポリマーの質量）＊１００。ＷＲＶは、例えば本開示の任意の水性液体に対して測定できる。このように、用語ＷＲＶは、語「水」を含み、ポリマーＷＲＶは、任意のタイプの本開示の水性液体、例えば水溶液に関して測定できると理解されることとなる。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーおよび／またはそのポリマーに含まれる組成物は、約もしくは少なくとも約１００の保水度（ＷＲＶ）を有することができる。例えば、本明細書のＷＲＶは、約または少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、または４０００であってよい。
【０１１１】
本明細書の吸収性は、場合により、一定量のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー（ｇ水性液体／ｇグラフトコポリマー）に染み込みそれにより保持できる最大量の水性液体の観点から測定できる。いくつかの態様においては、少なくとも１５ｇの水性液体／ｇグラフトコポリマーの吸収能力を有するグラフトコポリマーは、高吸水性材料としてみなすことができる。
【０１１２】
いかなる特別の信念にも理論にもとらわれることはないが、本明細書のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの向上したＷＲＶは、それらのデキストラン成分に少なくとも一部分起因すると思われている。デキストランはまた、個々のグラフトコポリマー分子のポリα−１，３−グルカン成分を「架橋」（本当の化学架橋ではない）するように見える。
【０１１３】
本開示のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを含む組成物は、例えばパーソナルケア製品、家庭用製品、医薬製品、もしくは工業製品の形態であってもよく、またはそれらの製品内に含まれてもよい。これに関連して、特定の実施形態における組成物は、吸収材または超吸収材として使用できる。そのような材料の例としては、低刺激性である材料が挙げられる。本明細書の超吸収材は、例えば少なくとも１５ｇの水性液体／ｇグラフトコポリマーの、本明細書の水性液体に対する吸収能力を有する。いくつかの実施形態においては、パーソナルケア製品、家庭用製品、医薬製品、または工業製品は、本開示の吸収材または超吸収材を含むことができる。本開示の組成物の１つの特別の利点は、この組成物は、生物分解性であるので、環境適応型であることである。
【０１１４】
本明細書におけるパーソナルケア製品および／または使用の例としては、赤ちゃん用おむつ、幼児用トレーニングパンツ、失禁用品（例えば、パッド、大人用おむつ）、および女性用衛生用品（例えば、生理用ナフキン／パッド、タンポン、陰唇間製品、パンティーライナー）等の吸収性個人用衛生製品が挙げられる。
【０１１５】
本明細書における工業製品および／または使用の例としては、通信ケーブルラッピング；食品パッド；土壌に水を保持するためのおよび／または植物根に放水するための等の農業および林業用途；消火装置；並びに酸性水溶液または塩基性水溶液のこぼれの浄化が挙げられる。
【０１１６】
本明細書における医薬製品および／または使用の例としては、包帯および外科パッド等の創傷治癒帯；超音波系イメージング用のファントム；病院ベッド用シーツ；生理用ナフキン；制御された薬剤放出デバイス；細胞固定化島（ｃｅｌｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｓｌｅｔｓ）；三次元の細胞培養基材；再生医療用の生物活性スカフォード（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）；胃バルキングデバイス（ｓｔｏｍａｃｈ  ｂｕｌｋｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅｓ）；および規制薬物の廃棄が挙げられる。
【０１１７】
本明細書のいくつかの実施形態におけるパーソナルケア製品、家庭用製品、および／または医薬製品は、尿、血液、血清、液状糞便物（例えば、下痢）、胆汁、胃酸／胃液、嘔吐物、羊水、母乳、脳脊髄液、滲出液、リンパ液、粘液（例えば、鼻漏、痰）、腹腔液、胸膜液、膿汁、カタル性分泌物、唾液、喀痰、滑液、汗および／または涙等の体液を吸収できる。
【０１１８】
本開示の組成物の１つの特別の利点は、この組成物が生物分解性であるので、環境適応型であることである。
【０１１９】
本開示の組成物は、例えば、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９、９９．５、または９９．９ｗｔ％の例えば１種もしくは複数種の本明細書のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを含むことができる。特定の態様における乾燥組成物は、粉末、顆粒、マイクロカプセル、フレークの形態で、または粒状物質の他の任意の形態であってよい。他の例としては、ペレット、棒、穀粒、ビーズ、タブレット、スティック、または他の凝集体等の、より大きな組成物が挙げられる。本明細書の乾燥組成物は、通常、３、２、１、０．５または０．１ｗｔ％未満のその中に含まれる水を有する。
【０１２０】
本開示のさらなる態様は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を含む酵素反応に関する：（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素。そのような酵素反応は、本明細書に開示されるデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを生成する。
【０１２１】
本開示の（例えば、上述または以下の実施例に記載の）少なくとも１０００００ダルトンのデキストランのいずれも、本明細書の酵素反応に使用できる。酵素反応に添加されるデキストランは、例えば、乾燥粉末の形態でも、予め溶解した形態でもよい。反応におけるデキストランの初期濃度は、例えば、約もしくは少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、または２５ｇ／Ｌであってよい。「デキストランの初期濃度」は、反応成分（例えば、少なくとも、水、スクロース、デキストラン、グルコシルトランスフェラーゼ酵素）の全部が加えられた直後のグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるデキストラン濃度を意味する。
【０１２２】
いくつかの実施形態においては、酵素反応は、初期濃度が少なくとも約２ｇ／Ｌ（例えば、既に開示した他の任意の高濃度）の、少なくとも約５０ミリオンダルトンである（例えば、既に開示した他のＭｗが高い任意の）デキストランを含んでもよい。そのような反応は、向上した濾過性プロファイル（既に開示した濾過性のいずれか）を有するデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーをもたらすことができる。生成物の濾過性に与える有利な効果が、僅か２〜１０ｇ／Ｌ（実施例６）のデキストランの初期濃度で観察されるので、特定の実施形態においては、デキストラン（Ｍｗ≧５０ミリオンダルトン）の初期濃度は、いくつかの例において約２．０または２．４ｇ／Ｌ〜約３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｇ／Ｌであってよい。
【０１２３】
グラフトコポリマーを生成する本開示の酵素反応は、少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む。そのような酵素は、デキストランプライマー位置からポリα−１，３−側鎖（既に開示）を合成して、本明細書のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを形成できる。従って、例えばグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、（ｉ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のα−１，３−グリコシド結合を含む、および／または（ｉｉ）Ｍｗが少なくとも約１６２００ダルトンであるポリα−１，３−グルカンを合成できる。
【０１２４】
ポリα−１，３−グルカンを生成する特定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８７４３１号明細書に開示されるアミノ酸配列を含むことができるまたはからなることができ、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。そのような配列の例としては、配列番号１、２、３、４、もしくは５と１００％同一であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、もしくは９９．５％同一であり、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する配列が挙げられる。
【０１２５】
特定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１のアミノ酸５４〜９５７位と１００％同一である、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、もしくは９９．５％同一であり、グルコシルトランスフェラーゼ活性を伴うアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むことができる、またはからなることができる。配列番号１のアミノ酸５４〜９５７位を有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３結合および少なくとも４００のＤＰｗを有するポリα−１，３−グルカンを生成できる（データ示さず、米国特許出願公開第６２／１８０，７７９号明細書の表６を参照）。
【０１２６】
配列番号１（ＧＴＦ７５２７）、２（ＧＴＦ２６７８）、３（ＧＴＦ６８５５）、４（ＧＴＦ２９１９）および５（ＧＴＦ２７６５）は、それぞれの野生型対応物と比較して、シグナルペプチドドメインおよび可変ドメインの全部分もしくは実質的部分が欠如するグルコシルトランスフェラーゼを表す。従って、これらのグルコシルトランスフェラーゼ酵素のそれぞれは、後にグルカン結合ドメインが続く触媒ドメインを有する。これらの酵素の触媒ドメイン配列のおおよその位置は、以下の通りである：７５２７（配列番号１の残基５４〜９５７）、２６７８（配列番号２の残基５５〜９６０）、６８５５（配列番号３の残基５５〜９６０）、２９１９（配列番号４の残基５５〜９６０）、２７６５（配列番号５の残基５５〜９６０）。ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９および２７６５の触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＧＴＦ７５２７の触媒ドメイン配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸５４〜９５７）とのそれぞれ約９４．９％、９９．０％、９５．５％および９６．４％の同一性を有する。これらの特別のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３結合および少なくとも４００のＤＰｗを有するポリα−１，３−グルカンを生成できる（データ示さず、米国特許出願公開第６２／１８０，７７９号明細書の表４を参照）。従って、特定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン配列は、ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９、もしくは２７６５の触媒ドメインのアミノ酸配列と１００％同一である、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、もしくは９９．５％同一であり得る。いくつかの別の実施形態においては、グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン配列は、配列番号１の残基５４〜９５７、配列番号２の残基５５〜９６０、配列番号３の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０または配列番号５の残基５５〜９６０を含んでいない。
【０１２７】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば配列番号１のアミノ酸５４〜９５７位（または配列番号２の５５〜９６０位、配列番号３の５５〜９６０位、配列番号４の５５〜９６０位もしくは配列番号５の５５〜９６０位）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む配列等の触媒ドメイン配列だけを有する必要があると考えられているが、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、より大きなアミノ酸配列内に含めることができる。例えば、触媒ドメインはそのＣ末端でグルカン結合ドメインに連結できる、および／またはそのＮ末端で可変ドメインおよび／またはシグナルペプチドに連結できる。
【０１２８】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒ドメインは、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類されるグルコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインによって示されるような活性を有することができる。そのようなＧＨ７０グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＣＡＺｙ（炭水化物−活性酵素）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）に見つけることができる。
【０１２９】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素のさらにまた別の例は、本明細書に開示した、およびＮ末端および／またはＣ末端上の１〜３００（または、その間の任意の整数［例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０］）個の残基を含むいずれかであってよい。そのような追加の残基は、それにグルコシルトランスフェラーゼ酵素が由来する対応する野生型配列由来であってよい、または例えば、（Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかでの）エピトープタグもしくは（Ｎ末端での）異種シグナルペプチドなどの異種配列であってよい。
【０１３０】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素には、通常Ｎ末端シグナルペプチドが欠如する。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を生成するための発現系は、所望であれば、細胞外分泌を指示するＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む、酵素コーディングポリヌクレオチドを使用することができる。そのような実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌工程中に酵素から切断される。シグナルペプチドは、グルコシルトランスフェラーゼに対して天然および異種のいずれであってもよい。本明細書において有用なシグナルペプチドの例は、細菌種（例えば、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）または真菌種由来のシグナルペプチドである。細菌シグナルペプチドの例は、ａｐｒＥシグナルペプチド、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５５：４０−５２を参照（この文献は参照により本明細書に組み込まれる））由来のものである。
【０１３１】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば細菌もしくは真菌等の任意の微生物起源由来であってよい。細菌グルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種もしくはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来する酵素である。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｓ．サルバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリナス（ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンチロウセッティ（ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティクス（ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびＳ．サングイニス（ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種の例としてはＬ．メセンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンチナム（ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カルノスム（ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）およびＬ．フルクトサム（ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｌ．アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブリュキイ（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．フェルメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
【０１３２】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、当技術分野で既知の任意の手段により生成できる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、微生物異種発現系等の異種発現系内で組換え技術により生成できる。異種発現系の例としては、細菌（例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）、例えばＴＯＰ１０もしくはＭＧ１６５５；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）および真核生物（例えば、酵母、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種）の発現系が挙げられる。
【０１３３】
特定の実施形態においては、異種遺伝子発現系は、タンパク質分泌のために設計される遺伝子発現系であってよい。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、通常、そのような実施形態においてシグナルペプチド（シグナル配列）を含む。シグナルペプチドは、天然シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドのいずれであってもよい。いくつかの実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、自然には発生しない；例えば、本明細書の酵素は（それから本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素が由来している可能性が高い）微生物から自然に分泌される（すなわち、成熟形）酵素であるとは考えられない。
【０１３４】
本明細書に記載したグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、任意の精製状態（例えば、純粋または非純粋）で使用できる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その使用前に精製および／または単離してよい。非純粋であるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例としては、細胞溶解液の形態にあるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が挙げられる。細胞溶解液または抽出物は、酵素を異種発現させるために使用される細菌（例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ））から調製してよい。例えば、細菌は、フレンチプレッシャーセルを使用して破砕してよい。また別の実施形態では、細菌をホモジナイザー（例えば、ＡＰＶ、Ｒａｎｎｉｅ、Ｇａｕｌｉｎ）を用いてホモジナイズすることができる。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、通常、これらのタイプの調製物に可溶性である。本明細書の細菌性の細胞溶解液、抽出物もしくはホモジネートは、分岐のα−グルカンを生成するための反応溶液中で、例えば、約０．１５〜０．３（ｖ／ｖ）％で使用できる。
【０１３５】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、当技術分野で既知の任意の方法で求めることができる。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性は、スクロース（約５０ｇ／Ｌ）、デキストランＴ１０（約１ｍｇ／ｍＬ）およびリン酸カリウムバッファ（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）を含有する反応系中で、還元糖（フルクトースおよびグルコース）の生成を測定することによって求めることができるが、このとき溶液を２２〜２５℃で２４〜３０時間保持する。還元糖は、１ＮのＮａＯＨおよび０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウムを含有する混合物に０．０１ｍＬの反応溶液を加え、次に５分間にわたってＯＤ４８０ｎｍでの吸光度の増加を監視することによって測定することができる。
【０１３６】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応の温度は、所望ならば制御できる。特定の実施形態においては、反応温度は、約５℃〜約５０℃であってよい。特定の他の実施形態における温度は、約２０℃〜約４０℃、または約２０℃〜約３０℃（例えば、約２２〜２５℃）であってよい。
【０１３７】
本明細書の反応溶液中のスクロースの初期濃度は、例えば、約２０ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌであってよい。或いは、スクロースの初期濃度は、約７５ｇ／Ｌ〜約１７５ｇ／Ｌまたは約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌであってよい。或いは、スクロースの初期濃度は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０もしくは１６０ｇ／Ｌ（または４０〜１６０ｇ／Ｌの間の任意の整数）であってよい。「スクロースの初期濃度」は、反応成分（例えば、少なくとも、水、スクロース、デキストラン、グルコシルトランスフェラーゼ酵素）の全部が加えられた直後のグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるスクロース濃度を意味する。
【０１３８】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応に使用されたスクロースは、高度に純粋（≧９９．５％）またはいずれかの他の純度もしくはグレードであってよい。例えば、スクロースは、少なくとも９９．０％の純度を有する可能性がある、または試薬グレードのスクロースであってよい。また別の例として、精製が不完全なスクロースを使用することができる。本明細書の精製が不完全なスクロースは、精白糖まで加工されていないスクロースを意味する。従って、精製が不完全なスクロースは、完全に未精製であってよい、または部分精製されていてよい。未精製スクロースの例は、「粗スクロース」（「粗糖」）およびそれらの溶液である。部分精製スクロースの例は、１回、２回、３回またはそれ以上の結晶化工程を受けていない。本明細書の不完全精製スクロースのＩＣＵＭＳＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（国際砂糖分析法統一委員会））値は、例えば、１５０より大きい可能性がある。本明細書のスクロースは、サトウキビ、テンサイ、カッサバ澱粉、サトウモロコシ、またはトウモロコシ等の任意の再生可能な糖源の由来であってよい。本明細書において有用なスクロースの好適な形態は、例えば、結晶形態または非結晶形態（例えば、シロップ、サトウキビの搾汁、ビートの搾汁）である。
【０１３９】
スクロースのＩＣＵＭＳＡ値を求める方法は、当技術分野で既知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＩＣＵＭＳＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＣＵＭＳＡ）（Ｅｄ．Ｈ．Ｃ．Ｓ．  ｄｅ  Ｗｈａｌｌｅｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９６４）において国際砂糖分析法統一委員会によって開示されている。ＩＣＵＭＳＡは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒ．Ｊ．ＭｃＣｏｗａｇｅ，Ｒ．Ｍ．Ｕｒｑｕｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｂｕｒｇｅ（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｌｏｕｒ  ｏｆ  Ｒａｗ  Ｓｕｇａｒｓ，Ｂｒｏｗｎ  Ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｕｒｅｄ  Ｓｙｒｕｐｓ  ａｔ  ｐＨ  ７．０−Ｏｆｆｉｃｉａｌ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｄｒ．Ａｌｂｅｒｔ  Ｂａｒｔｅｎｓ，２０１１  ｒｅｖｉｓｉｏｎ）によって記載されるように、ＩＣＵＭＳＡ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＧＳ１／３−７によって測定できる。
【０１４０】
特定の実施形態における酵素反応のｐＨは、約４．０〜約８．０、または約５．０〜約６．０であってよい。或いは、そのｐＨは、例えば約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５もしくは８．０であってよい。ｐＨは、好適なバッファ、例えば限定はされないが、ホスフェート、トリス、シトレート、またはそれらの組み合わせを添加または混入することによって調節または制御できる。グルカン合成反応中のバッファ濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約１０、２０もしくは５０ｍＭであってよい。
【０１４１】
特定の態様においては、１種または複数の異なるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用してもよい。本明細書の酵素反応は、例えば、１種、２種またはそれ以上のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含有してもよい。
【０１４２】
本開示はまた、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを調製する方法に関し、その方法は、以下の（ａ）および（ｂ）を備える：
（ａ）少なくとも（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させて、それにより、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを生成するステップ；
（ｂ）場合により、ステップ（ａ）において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを単離するステップ。そのような方法におけるステップ（ａ）は、通常、成分（ｉ）〜（ｉｖ）のそれぞれを含む酵素反応の調製を伴う。上述の酵素反応条件および／または以下の実施例に開示する酵素反応条件のいずれも、ステップ（ａ）を特徴づけることができる。同様に、この方法の以下の条件のいずれも、場合により、本明細書の酵素反応を特徴づけることができる。
【０１４３】
本開示のグラフトコポリマーの合成法は、少なくとも水、スクロース、および特定のデキストランと、グルコシルトランスフェラーゼ酵素成分とを互いに接触させることを備える。これらの試薬と場合により他の試薬を全て一緒に加えても、または下記で考察するように任意の順序で加えてもよい。ステップ（ａ）は、通常反応溶液の形成と共に始まるが、不溶性のグラフトコポリマー生成物の合成後に、この溶液が混合物となることを理解することとなる。本明細書の接触ステップは、多くの方法において実施できる。例えば、所望の量のスクロースおよび／またはデキストランを最初に水に溶解させ（場合により、他の成分、例えばバッファ成分もまたこの調製段階で加えることもできる）、その後にグルコシルトランスフェラーゼ酵素を添加することができる。このように調製した反応は、例えば、静置してもよく、撹拌器またはオービタルシェーカーによって撹拌してもよい。通常、本明細書の酵素反応は、無細胞である。
【０１４４】
特定の実施形態における反応の完了は、例えば、視覚的に（例えば、不溶性生成物の蓄積がもはや存在しない）、および／または溶液中に残されたスクロース（残留スクロース）の量を測定することによって決定できるが、このとき約９０％を超えるスクロース消費率は反応完了を指示する可能性がある。通常、開示した方法の反応は、完了するのに約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４もしくは９６時間かかることがあり、その時間は、反応に使用されたスクロースおよび／またはグルコシルトランスフェラーゼ酵素の量等の特定のパラメーターに応じて変わる。いくつかの実施形態においては、反応時間は、１、２、３、４、または５時間であり得る。
【０１４５】
グラフトコポリマー合成法の特定の実施形態においては、接触ステップ（ａ）において、約６００００ダルトン未満の重量平均分子量を有するデキストランがさらに存在し、少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（例えば、既に開示した任意の高いＭｗ）を有するデキストランが、グルコシルトランスフェラーゼ酵素による側鎖合成のための基質として優先的に使用される。従って、様々なデキストラン種が存在し、かつそれらの種のＭｗ範囲が、６００００ダルトン未満（または例えば９００００ダルトン未満、８００００ダルトン未満、７００００ダルトン未満、５００００ダルトン未満、もしくは４００００ダルトン未満）から１０００００ダルトンを超えるまでに及ぶ、不均質のデキストラン基質（例えば、４を超えるＰＤＩ、または４〜１５のＰＤＩ）が使用される特定の場合においては、グラフトコポリマー生成物の分布が、１０００００ダルトン以上のデキストラン成分を有するグラフトコポリマー生成物に対してより高い歪度を有することとなる。例えば、少なくとも約７５重量％、７６重量％、７７重量％、７８重量％、７９重量％、８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、もしくは９５重量％のグラフトコポリマー生成物が、少なくとも１０００００ダルトンのＭｗを有するデキストラン成分を含むと考えられる。
【０１４６】
そのような方法の実施形態は、場合により、Ｍｗが低いデキストランからＭｗが高いデキストランを区分する（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）方法、分画する（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｎｇ）方法、または分離する方法として、特徴付けることができる。Ｍｗが高いデキストランは、不溶性グラフトコポリマーに区分される一方、Ｍｗが低いデキストランは、本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応の溶液相に残存する。いくつかの実施形態においては、この分画効果が現れる反応時間は、少なくとも約１２、１５、１８、２１、または２４時間である。不溶性グラフトコポリマー生成物に区分するデキストランのＭｗは、いくつかの例において、約１０００００もしくは１５００００ダルトンから約２０００００、２５００００、５０００００、７５００００、もしくは１００００００ダルトンまでである。
【０１４７】
特定の実施形態においては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーのＰＤＩは、酵素反応に携わるデキストラン基質の量を調節することにより、グラフトコポリマー合成法において制御できる（例えば、表７を参照）。一般的に、本明細書の酵素反応において、出発デキストランの濃度を増大することにより、ＰＤＩが低いグラフトコポリマーが生成されることとなり、その濃度を低減させるとＰＤＩが高いグラフトコポリマーが生成されることとなる。例えば、酵素反応におけるデキストランの初期濃度を約もしくは少なくとも約、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、７５０％、または１０００％まで増大させるならば、生成物ＰＤＩの減少が、約もしくは少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または６５％まで達成できる。
【０１４８】
特定の実施形態においては、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーのＭｗは、酵素反応に携わるデキストラン基質の量を調節することにより、グラフトコポリマー合成法において制御できる（例えば、表７および図３を参照）。一般的に、本明細書の酵素反応において、出発デキストランの濃度を増大することにより、Ｍｗが低いグラフトコポリマーが生成されることとなり、その濃度を低減させるとＭｗが高いグラフトコポリマーが生成されることとなる。例えば、酵素反応におけるデキストランの初期濃度を約もしくは少なくとも約、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、７５０％、または１０００％まで増大させるならば、生成物Ｍｗの減少が、約もしくは少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％まで達成できる。
【０１４９】
開示した合成法において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、場合により単離できる。例えば、不溶性グラフトコポリマーは、濾過または遠心分離により、分離できる。そのようにする際に、グラフトコポリマーは、水、フルクトースおよび特定の副生成物（例えば、ロイクロース、可溶性オリゴ糖ＤＰ２〜ＤＰ７）を含んでいる可能性がある反応溶液の大部分から分離される。この溶液はまた、残留スクロース（すなわち、未反応のスクロース）も含む。単離は、場合により、グラフトコポリマー生成物を１回、２回、またはそれ以上、水または他の水性液体で洗浄すること、および／または生成物を乾燥することをさらに備えることができる。そのような洗浄は、元来の反応試料または生成試料の体積の約もしくは少なくとも約、０．５倍、１倍、１．５倍、または２倍の洗浄体積を用いることができ、および／または濾過および／または遠心分離を伴う。いくつかの態様における濾過等の洗浄は、置換洗浄を利用でき、その場合、洗浄は、撹拌することなくおよび／またはいかなる力が印加されることもなく、生成物を貫通する。
【０１５０】
いくつかの実施形態（「向上した濾過法」）においては、グラフトコポリマー合成法のステップ（ａ）に携わるデキストランは、少なくとも約５０ミリオンダルトンの重量平均分子量と、少なくとも約２ｇ／Ｌの初期濃度とを有する。そのような実施形態においてステップ（ａ）で生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、濾過ステップを用いて単離される。これらの実施形態におけるグラフトコポリマー生成物は、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーまたは他の対照材料の濾過率と比べてそれらよりも高い濾過率を有する。この向上した濾過法のデキストランのＭｗは、約５０ミリオンダルトン（もしくは本明細書に開示した任意のより大きなＭｗ）であり得る、および／または酵素反応におけるデキストランの初期濃度は、約２ｇ／Ｌ（もしくは本明細書に開示した任意のより大きい濃度）であり得る。本明細書の向上した濾過性は、水および／または水溶液（例えば、ステップ［ａ］からの液体部）を不溶性のグラフトコポリマー生成物の層（例えば、ウェットケーク）を介して濾過（例えば、重力のみ、置換洗浄、印加力）できることにより、場合により容易性を指すことがある。
【０１５１】
本明細書における向上した濾過法におけるグラフトコポリマー生成物は、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーまたは他の対照材料の濾過率と比べてそれらよりも高い濾過率を有する。例えば、本明細書のグラフトコポリマーは、その他は同じまたは同様な濾過条件（例えば、ウェットケーク厚、濾過装置）下で、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーまたは他の対照材料の濾過性よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％、１００００％、または１０００００％速い濾過性を呈することが可能である。そのような比較をするための濾過性測定は、ケーク比抵抗の単位または任意の他の濾過性測定の単位においてであってよい。ケーク比抵抗（濾過ケーク比抵抗）は、例えば、Ｅａｒｌｅ，ＲＬ（Ｕｎｉｔ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ［Ｃｈａｐｔｅｒ  １０：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ］，Ｗｅｂ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ）またはＴｅｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．６１：４９５７−４９６５）に従って測定でき、これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。これらの実施形態におけるポリα−１，３−グルカンホモポリマーは、約５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＤＰｗであり得、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のα−１，３−結合を有することができる。他の対照材料は、向上した濾過法で使用されるのと同じタイプのデキストランを有する本明細書のグラフトコポリマーであってよいが、約１．６重量％未満、１．５重量％未満、１．４重量％未満、１．３重量％未満、１．２重量％未満、１．１重量％未満、１．０重量％未満、０．９重量％未満、または０．８重量％未満のグラフトコポリマーの含有量で使用される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本明細書の向上した濾過法でのグラフトコポリマー生成物は、約もしくは少なくとも約２ｗｔ％のデキストランを含むことができる。例えば、そのようなグラフトコポリマーは、コポリマーの重量の２％〜５０％、２％〜１１％、または２．５％〜１０．５％のデキストランを含んでよい。いくつかの例において、グラフトコポリマー生成物は、例えば約３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．２５、もしくは５．５ｍｍの平均直径を有する粒子として現れることがある。特定の態様におけるグラフトコポリマーの向上した濾過性は、通常濾過するのが困難であるポリα−１，３−グルカンホモポリマーに対して利点を示す。
【０１５３】
本明細書に開示した組成物および方法の非限定的例としては、以下が挙げられる：
１．以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含むグラフトコポリマーを含む組成物：
（ｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストランを含む主鎖、
（ｉｉ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカン側鎖。
２．ポリα−１，３−グルカン側鎖が少なくとも約９９％のα−１，３−グリコシド結合を含む実施形態１に記載の組成物。
３．１種もしくは複数種のポリα−１，３−グルカン側鎖の個々のＭｗが、少なくとも約１０００００ダルトンである実施形態１または２に記載の組成物。
４．グラフトコポリマーが、水性条件下で不溶性である実施形態１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
５．デキストランが以下の（ｉ）〜（ｖ）を含み、
（ｉ）１位および６位で連結したグルコース、約８７〜９３ｗｔ％；
（ｉｉ）１位および３位で連結したグルコース、約０．１〜１．２ｗｔ％；
（ｉｉｉ）１位および４位で連結したグルコース、約０．１〜０．７ｗｔ％；
（ｉｖ）１位、３位および６位で連結したグルコース、約７．７〜８．６ｗｔ％；並びに（ｖ）（ａ）または（ａ）で連結したグルコース、約０．４〜１．７ｗｔ％
（ａ）１位、２位および６位、または（ｂ）１位、４位および６位：
デキストランのＭｗが、約５０〜２００ミリオンダルトンである実施形態１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
６．デキストランのＭｗが、少なくとも約１００ミリオンダルトンである実施形態５に記載の組成物。
７．デキストランが、配列番号６または配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素の生成物である実施形態５または６に記載の組成物。
８．グラフトコポリマーが、少なくとも約２．０ｗｔ％のデキストランを含む実施形態５〜７のいずれかに１つに記載の組成物。
９．グラフトポリマーが、少なくとも約１００の保水度（ＷＲＶ）を有する実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
１０．組成物が、パーソナルケア製品、家庭用製品、医薬製品、または工業製品である実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組成物。
１１．酵素反応であって、（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含み、
酵素反応が、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、または９の組成物によるグラフトコポリマーを生成する酵素反応。
１２．反応におけるデキストランの初期濃度が、少なくとも約２ｇ／Ｌであり、デキストランのＭｗが、少なくとも約５０ミリオンダルトンである実施形態１１に記載の酵素反応。
１３．グラフトコポリマーを調製する方法であって、その方法が以下の（ａ）および（ｂ）を含む方法：
（ａ）少なくとも（ｉ）水、（ｉｉ）スクロース、（ｉｉｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン、および（ｉｖ）少なくとも約９５％のα−１，３−グリコシド結合を含むポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させて、それにより、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、または９の組成物によるグラフトコポリマーが生成されるステップｂ）場合により、ステップ（ａ）で生成したグラフトコポリマーを単離するステップ。
１４．接触ステップ（ａ）において、約６００００ダルトン未満のＭｗを有するデキストランがさらに存在し、少なくとも約１０００００ダルトンのＭｗを有するデキストランが、グルコシルトランスフェラーゼ酵素による側鎖合成のための基質として優先的に使用される実施形態１３に記載の方法。
１５．ステップ（ａ）に携わるデキストランが、少なくとも約５０ミリオンダルトンのＭｗおよび少なくとも約２ｇ／Ｌの初期濃度を有し、ステップ（ａ）で生成したグラフトコポリマーを単離する方法であり、単離ステップが、濾過ステップを含み、グラフトコポリマーが、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーの濾過率と比較してそれよりも高い濾過率を有する実施形態１３または１４に記載の方法。
【実施例】
【０１５４】
本開示を実施例１〜３および５〜８でさらに例示する。これらの実施例は、本明細書の特定の好ましい態様を示しているが、単に説明の目的でのみ記されていると理解すべきである。上述の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、本明細書に開示した実施形態を様々な使用および条件に適合させるために様々な変更および修飾を加えることができる。
【０１５５】
実施例１
高分子量のデキストランプライマーからポリα−１，３−グルカンの合成
本実施例は、重量平均分子量が高い（平均１５０ｋＤａ）市販のデキストランをプライマーとして用いる、グルコシルトランスフェラーゼ酵素でのポリα−１，３−グルカンの合成を記載する。デキストラン主鎖とポリα−１，３−グルカン側鎖とを含むグラフトコポリマーを生成した。
【０１５６】
水、スクロース（約１００ｇ／Ｌ）、デキストラン、および全てまたはほぼ全てα−１，３−グリコシド結合を有するポリα−１，３−グルカンを合成するストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）系のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応（ＡおよびＢ）で、２つの別々のポリα−１，３−グルカンの重合を実施した。そのような反応に使用されるグルコシルトランスフェラーゼの例としては、米国特許出願公開第２０１４／００８７４３１号明細書に開示されるグルコシルトランスフェラーゼが挙げられ、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
９４０ｇのＤＩ（脱イオン）水、１００ｇのスクロース（ＯｍｎｉＰｕｒ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ８５５０；Ｌｏｔ  ＶＦ２０Ｃ；ＦＷ  ３４２．３０）、および１．３６ｇのリン酸カリウム（ＭＷ  １３６．０９；Ｓｉｇｍａ  Ｐ５３７９）を混合して、反応系ＡとＢのそれぞれを調製した。導電率計を用いて、ｐＨを５．６であると測定し、２、３滴の１ＮのＨ２ＳＯ４を用いて、５．５４まで下げるように調節した。ＨＰＬＣの時間ゼロ（予備添加のデキストラン）のために、１ｍＬの試料を採取した。その後、５ｇおよび１０ｇの１５０ｋＤａ（平均）デキストラン（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４８７６）を反応系Ａと反応系Ｂにそれぞれ加えた。５００ｍＬの各反応系を個々のフラスコに装入した。
【０１５８】
各反応系を約１９０ＲＰＭで混合して、添加したデキストランを溶解した後に、時間ゼロ（後に添加するデキストラン）解析のために、１ｍＬのＨＰＬＣ試料を各反応系から採取した。２５℃に設定した循環加熱器／冷却器に各反応系を置き、１５０ｒｐｍで撹拌を開始した。反応を温度（約２４．４℃）まで達しさせて、酵素を加える前に、約４５分間撹拌した。次に、５０Ｕのグルコシルトランスフェラーゼ酵素をそれぞれの反応系に加えた。
【０１５９】
２時間およびそれぞれの反応の終わり（２４時間）に、反応系ＡおよびＢのそれぞれからの濾液試料（すなわち、不溶性生成物から分離した液体）（１ｍＬ）をＨＰＬＣのために採取した。試料を９０℃で１０分間の加熱急冷をすることにより、ＨＰＬＣのために不活性化した。試料を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣ分析のために希釈した。
【０１６０】
反応系Ｂの２時間および２４時間の試料を除いて、全ての時点の濾液試料に対して、２つ全く同一の希釈を行った。２時間の試料Ａ、２時間の試料Ｂ、および２４時間のＢは全て０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過するのが非常に困難であった。様々なＨＰＬＣカラムで全ての試料を重複して行った。
【０１６１】
全反応の試料（５０ｍｌ）を反応系Ａと反応系Ｂのそれぞれから２時間で採取し、使い捨てのプラスティック製フィルターを介してできるだけ乾燥状態に吸引濾過した。不溶性生成物を５０ｍＬの熱水で２回の洗浄をする前に、濾液を取り出し、別々に保存した。不溶性ポリマーの試料をガラス瓶に保存し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による解析で見かけのＤＰ（重合度）、真のＤＰ、見かけのＩＶ（インヘレント粘度）、および真のＩＶを求める前に、１０℃で保管した。それぞれ２時間の試料からの過剰の不溶性ポリマーを６０℃の真空オーブン内で、窒素下で３日間乾燥させ、秤量して固形分パーセントを求めた。
【０１６２】
合成したポリマーから吸引で濾液を引くことは、予期したよりも時間がかかり、濾液中に不溶性ポリマーが連続して生成することに関連していると思われ、濾液は、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を依然として含有した。一旦、濾液を全て収集すると、次に１ｍＬの試料を採取し、ＨＰＬＣのために不活性化し（上述を参照のこと）、その間に７０〜８０℃の水浴内で１５分間、残留物を不活性化し、冷却させた後、濾過して不溶性ポリマー生成物を除去した。
【０１６３】
次に、透析チューブ（１４ｋＤａの分画分子量［ＭＷＣＯ］）に濾液を入れて、流水中で２日間透析して、単糖（フルクトース、グルコース）およびオリゴマー（ＤＰ２〜７）を除去した。透析中に多少の小さな固形物を形成するので、含有物を最初に濾過した後、液状濃縮物になるまでロータリーエバポレーターにかけて（留去）して、その濃縮物を液体窒素中で凍結させた。次に、凍結した濃縮物を２日〜３日凍結乾燥した後、乾燥固形物を秤量して、ＳＥＣで解析した。
【０１６４】
２４時間後、反応系ＡおよびＢのそれぞれから生じるポリマー生成物スラリーを吸引濾過した。それぞれの濾液を別々に保存し、ＨＰＬＣ試料を採取した。ポリマーを５００ｍＬの蒸留水（室温）で２回洗浄した後、ウェットケークを残して、全ての水を吸引除去した。ウェットケークを秤量し、それらの試料をＳＥＣ解析のために採取した。ウェットケーク試料（約５〜６ｇ）をオーブンで乾燥（６０℃で３日間）して、初期のウェットケークの重量を基準として、不溶性ポリマー生成物の総収量を算出した。残留するポリマーウェットケークを後の解析のために凍結した。残留濾液を９０℃の水浴内で１５分間、活性化して、上述のように流水で２日間透析した。透析物を濾過し、約８０ｍＬまで留去し、凍結乾燥し、秤量して、ＳＥＣを施した。ＨＰＬＣ分析ごとに、単糖およびオリゴマー（ＤＰ２〜７）形成は、正常であり、重合ＡとＢで類似していた。室温で１０分間、ＤＭＳＯ／２％のＬｉＣｌ中で振盪することにより、ＳＥＣ解析のために、ウェットケーク試料を溶解した。
【０１６５】
反応系Ａと反応系Ｂの濾液および不溶性生成物の様々な態様を以下の表１〜４に提供する。
【０１６６】
【表２】
2018532875.tif 000005
【０１６７】
【表３】
2018532875.tif 000006
【０１６８】
【表４】
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【０１６９】
【表５】
2018532875.tif 000008
【０１７０】
それぞれの反応で使用した出発デキストランのＳＥＣ解析により、出発デキストランは分岐していたことがわかった。デキストランのモノマー単位ほぼ２０毎に出発デキストランから分岐するペンダントグルコースが存在することを推測した。それぞれの重合反応（２４時間）から、ＤＰｗが高い水不溶性ポリマーを得た：反応系Ａ（１０ｇ／Ｌのデキストラン投入）では約６０００、反応系Ｂ（２０ｇ／Ｌのデキストラン投入）では約５０００（表４）。ポリα−１，３−グルカン鎖は、デキストラン分岐点から伸長し、グラフトコポリマーを形成する（図１および２を参照のこと）。
【０１７１】
デキストラナーゼ劣化解析は、ポリα−１，３−グルカン側鎖はそれぞれ、おおよそ１０００のＤＰｗを有したことを示した。簡潔に言えば、緩衝反応（ｐＨ５．３〜５．７、室温、章動（ｎｕｔａｔｉｏｎ））において、デキストラナーゼとデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー生成物を約４日間、個々に反応させて、デキストラナーゼアッセイを行った。
【０１７２】
従って、出発デキストランが、約１５００の測定ＤＰｗ（表３）を有し、各側鎖が、約１０００のＤＰｗであり、各デキストランに平均約４〜５つのポリα−１，３−グルカン鎖が存在した可能性があると考察する。この観察に基づくと、デキストランのペンダントグルコース単位のほんの一部だけが、ポリα−１，３−グルカン側鎖の合成をプライムするのに助力したように見える（すなわち、約４〜５つの鎖だけが存在したようであるが、デキストランのモノマー単位２０毎にペンダントグルコース基の存在をもたらす約７５つ［ＤＰｗ１５０７を２０で割る］の側鎖を有していた可能性があり得る）。
【０１７３】
２４時間の反応の濾液試料で回収したデキストランの分子量は、出発デキストランの分子量（表３）と比較すると、小さかった。反応においてグルコシルトランスフェラーゼ酵素によりデキストランが劣化した可能性があるとするのは仮説のひとつであるが、これは、そうではないと判明された（実施例３を参照のこと）。従って、ポリα−１，３−グルカン側鎖の合成をプライムするために、基質として優先的に使用される高分子量のデキストランで、反応中にデキストランを効果的に分画したと思われた。この仮定に従えば、不溶性グラフトコポリマーの合成をプライムするのに使用される大きいデキストラン分子を可溶性プールから除去し、反応濾液中に小さなデキストラン分子を残すこととなる。デキストランの分子量は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素による１，３−グリコシド結合を含むグルカン合成をプライムするデキストランの役割を果たさないと提案する他の特許文献（国際特許出願第１５／１１９８５９号パンフレット）を考慮に入れると殊に、この観察は、興味をそそる。
【０１７４】
従って、デキストラン主鎖およびポリα−１，３−グルカン側鎖を含むグラフトコポリマーを生成した。比較的に少ない鎖（４〜５つ）が存在した、そのことを考慮すると、理論的には少なくとも１０〜１５倍以上の合成された側鎖が存在した可能性があったことに、潜在的に関心がある。同様に、このグラフトコポリマーを調製する反応においては、高分子量のデキストランは、低分子量のデキストランとは対照的に、大部分α−１，３−グリコシド結合を含むグルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼによって、基質として優先的に使用されると思われる。
【０１７５】
実施例２
グルコシルトランスフェラーゼ酵素反応のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー生成物の分子量および多分散性の制御
本実施例は、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素反応に携わるデキストランの濃度を修正して、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー生成物の分子量および多分散性を制御できることを、実施例１に加えて共に例証する。
【０１７６】
一般的に、下記の場合を除いて、実施例１に記載の手順を適用して、デキストラン−ポリα−１，３−グルカンコポリマーを合成および解析した。
【０１７７】
簡潔に言えば、スクロース１００ｇ／Ｌと、全てもしくはほぼ全てα−１，３−グリコシド結合を有するポリα−１，３−グルカンを合成するＳ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）系のグルコシルトランスフェラーゼ酵素１００Ｕ／Ｌを１５０ｒｐｍで撹拌しながら、約２５℃で、２つの５００ｍＬのグルカン合成反応を行った。これらの反応をセットアップするために、１００ｇのスクロース（ＯｍｎｉＰｕｒ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ８５５０）と、１．３６ｇのリン酸カリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５３７９）を９４０ｇの水道水に溶かし、ＮａＯＨでｐＨを５．５に調節した。１ｍＬの試料（ｔ＝０）ＨＰＬＣ分析のために採取し、その後に溶液を５００ｍＬの２つの部分に分けた。反応系ＡおよびＢのフラスコそれぞれに、５００ｍＬのスクロース溶液およびそれぞれ１．２５ｇまたは２．５ｇの１５０−ｋＤａ（平均）デキストラン（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４８７６）を装入した。ＨＰＬＣ（ｔ＝０）試料を採取し、その後にグルコシルトランスフェラーゼ酵素を加えた。
【０１７８】
酵素を添加して２時間後に、反応系ＡおよびＢのそれぞれから、５０ｍＬの試料（反応溶液および不溶性生成物）を採取し、吸引濾過した。濾液を保存した；ＨＰＬＣ（ｔ＝２時間）のために各濾液を１ｍＬ取り出した。不溶性ポリマー生成物を５０ｍＬの熱水で２回洗浄し、ＳＥＣにより解析した。８０℃の水浴内で１５分間、濾液を不活性化し、再濾過し、１８日間、流水中で透析（１４ｋＤａのＭＷＣＯ）して、単糖（フルクトース、グルコース）およびオリゴマー（ＤＰ２〜７）を取り出した。
【０１７９】
酵素を添加して２４時間後に、反応系ＡおよびＢそれぞれで生じたポリマー生成物スラリーを循環浴内で６５℃まで加熱し、１時間撹拌して、酵素を不活性化した。次に、スラリーを吸引濾過した；各濾液を保存し、１ｍＬの試料（ｔ＝２４時間）をＨＰＬＣ解析のために採取した。ポリマーを洗浄し、その後ウェットケークを残して、全ての水を吸引除去した。ウェットケークを秤量し、それらの試料をＳＥＣ解析のために採取した。ウェットケーク試料をオーブンで乾燥（６０℃で３日間）して、初期のウェットケークの重量を基準として、不溶性ポリマー生成物の総収量を算出した。残留するポリマーウェットケークを後の解析のために凍結した。上述のように、１７日間、濾液を流水中で透析した。透析物を濾過し、約８０ｍＬまで留去し、凍結乾燥し、秤量して、ＳＥＣを施した。ＨＰＬＣ解析ごとに、単糖およびオリゴマー（ＤＰ２〜７）形成は、正常であり、重合ＡとＢで類似していた。
【０１８０】
本実施例の反応系Ａと反応系Ｂの濾液および不溶性生成物の様々な態様を以下の表５〜７に提供する。
【０１８１】
【表６】
2018532875.tif 000009
【０１８２】
【表７】
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【０１８３】
【表８】
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【０１８４】
本実施例における２４時間後の重合反応のそれぞれは、約７５００の高いＤＰｗ（表７）を有する水不溶性ポリマーを生成した。不溶性ポリマー生成物の多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）は、比較的に高く、殊に出発デキストランの濃度が低い反応系ほど高く（表７）、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーに加えて不溶性生成物中にポリα−１，３−グルカンホモポリマーが存在することを示す。そのような結果は、デキストランを欠乏する系において予測されることであった；事実、それより多い量の出発デキストランを有する反応系（実施例１）は、多分散性が低い生成物をもたらした（表７）。従って、本明細書において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの多分散性は、グルコシルトランスフェラーゼ反応に携わるデキストランの濃度の関数として、制御できると考えられる。
【０１８５】
図３は、出発デキストランの大部分が消費された２４時間の反応系に関する、出発デキストランの濃度と形成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー生成物のＤＰｗとの関係を示す。ポリα−１，３−グルカンだけの単重合は、低いデキストラン濃度でプライムするデキストランに匹敵するが、デキストラン鎖のそれぞれは、デキストラン濃度が高いほど、小さいグルカングラフトを得る。グラフトコポリマーの最大分子量は、１００ｇ／Ｌのスクロースおよび１００Ｕ／Ｌのグルコシルトランスフェラーゼ酵素を有する反応系において５ｇ／Ｌのデキストラン（図３、表７）を用いる場合に、生成されるようである。従って、本明細書において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの分子量は、グルコシルトランスフェラーゼ反応に携わるデキストランの濃度の関数として、制御できると考えられる。
【０１８６】
従って、デキストラン主鎖およびポリα−１，３−グルカン側鎖を含むグラフトコポリマーを生成した。同様に、デキストラン−ポリα−１，３−グルカンコポリマー生成物の分子量および多分散性は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素反応に携わるデキストランの濃度を修正して、制御できる。
【０１８７】
実施例３
デキストランを劣化しないグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性
本実施例は、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを合成するのに実施例１および２で用いたグルコシルトランスフェラーゼが、デキストランを劣化しないことを例証する。従って、上述の反応で観察した見かけのデキストラン分画効果は、グルコシルトランスフェラーゼ活性によるデキストランの劣化に起因するのではない。
【０１８８】
実施例１に記載するように、グルコシルトランスフェラーゼ酵素でのポリα−１，３−グルカンの合成が、デキストランを用いてプライムされる場合、回収した未反応のデキストランは、反応で最初に使用したデキストランよりもかなり低い分子量を有する。デキストランが、グルコシルトランスフェラーゼ反応において効果的に分画されたかどうか、つまり優先的に大きなデキストラン鎖と反応して不溶性デキストラン−ポリα−１，３−グルカンコポリマーを形成し、小さな未反応のデキストラン鎖が反応溶液中に残ったかどうかは不明であり、グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、デキストランを劣化できたかどうかも不明である。
【０１８９】
この実験の目的は、スクロースを用いないで、標準の反応条件下で、実施例１および２に使用したグルコシルトランスフェラーゼ酵素にデキストランをさらしたならば、デキストランの劣化が起こるかどうかを調べることであった。２．５ｇの１５０ｋＤａ（平均）デキストラン（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４８７６）と０．６８ｇのリン酸カリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｐ５３７９）を、４９０ｇの水道水に溶かして、ｐＨ５．５９の溶液をもたらした。この溶液を反応器内において２５℃で撹拌し、その後、５０Ｕのグルコシルトランスフェラーゼ酵素を加えた。次に、溶液を１５０ｒｐｍで２４時間撹拌した後、熱水浴から留去して、湿った固形物を残した。固形物を２０ｍＬの蒸留水中に取り入れて、得られた濁った溶液を吸引濾過により透明にした；非常に少量（約０．１ｇ）の淡褐色固体を除去した。濾液を凍結乾燥して、２．８７ｇのデキストランを回収し、それをＳＥＣにより解析し、出発デキストラン（表８）と比較した。
【０１９０】
【表９】
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【０１９１】
表８における結果は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、実施例１および２で採用した反応条件（しかし、スクロースを含まない）下で、デキストランを劣化しないことを示す。この結果は、デキストランにグラフト化するポリα−１，３−グルカンの酵素プロセスが、上述のように分子量に基づいてデキストランを分画するように効果的に働くことを示す。
【０１９２】
実施例４
低分子量デキストラン（比較例）からのポリα−１，３−グルカンの合成
本実施例は、重量平均分子量が約４０ｋＤａの市販のデキストランプライマーを用いるグルコシルトランスフェラーゼ酵素でのポリα−１，３−グルカンの合成を記載する。
【０１９３】
この実験の目的は、実施例１および２で用いたデキストランよりも低分子量のデキストランを用いてデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを合成することである。この実験に用いるデキストランは、約３５〜４５ｋＤａの分子量を有し、その分子量は、実施例１および２で採用したデキストランの分子量のほぼ４分の１よりも小さい。
【０１９４】
以下のように、１０００ｍＬのポリα−１，３−グルカンの重合反応を実施した。スクロース（１００ｇ；ＯｍｎｉＰｕｒ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ８５５０）、デキストラン（１０ｇ、３５〜４５ｋＤａ、ＤＰｗ＝２２０〜２８０、Ｓｉｇｍａ  Ｄ１６６２）およびリン酸カリウム（１．３６ｇ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ５３７９）を９４０ｇの水道水に溶かし、ｐＨ５．６７を得た。次に、２５℃／１５０ｒｐｍでの撹拌を開始した後、上述の実施例で用いたグルコシルトランスフェラーゼを１００Ｕ加えた；２５℃／１５０ｒｐｍでの撹拌を２４時間続けた。１．５時間後、５０ｍＬの不溶性生成物試料を吸引濾過し、洗浄し、湿ったウェットケーク（８．７ｇ）に吸着させ、ＳＥＣ解析を施した。２４時間で、不溶性生成物スラリーを吸引濾過し、５００ｍＬの熱水道水で３回洗浄した。全ての水を吸引除去し、ウェットケークを秤量した（４８０ｇ）。ウェットケーク試料をＳＥＣ解析のために採取し、固形分のパーセントを求めた（７．６ｗｔ％）、固形分をオーブン乾燥した（６０℃で３日間）。初めのウェットケークの重量および固形分パーセントを基準として、不溶性デキストラン−ポリα−１，３−グルカン生成物の総収量を算出した。１．５時間および１２時間での各不溶性生成物の分子量プロファイルを求めた（表９）。
【０１９５】
【表１０】
2018532875.tif 000013
【０１９６】
測定したＤＰｗに基づいて、２個または最大でも３個のポリα−１，３−グルカン側鎖が、デキストラン上で合成されると思われる。この実施例で用いるデキストラン（４０ｋＤａ）のほぼ４倍以上のデキストラン（１５０ｋＤａ平均、実施例１）が、そこで合成されたポリα−１，３−グルカン側鎖を約４〜５個有した（実施例１を参照のこと）ことから、この結果は、興味深いようである。２〜３個の側鎖が、４０ｋＤａのデキストラン上で合成できるならば、約８〜１２個の側鎖（４〜５個の代わりに）が、１５０ｋＤａのデキストラン上で合成されると期待された可能性がある。
【０１９７】
本実施例で示すように、約４０ｋＤａのデキストランを用いて、ポリα−１，３−グルカン側鎖の合成をプライムした。この結果は、同じくらいの分子量のデキストランが、それより大きなデキストラン分子が存在する場合にそのような側鎖合成をプライムしないことを示す実施例１を考慮すると、注目すべきである。実施例１で観察した分画効果（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）（不溶性生成物の合成をプライムするのにより大きなデキストランを優先的に使用し、一方小さいデキストランが溶液に残る）は、従ってさらに魅力的であり、より小さい分子量のデキストランが、単独である場合に、ポリα−１，３−グルカン側鎖の合成をプライムできることを示す本実施例の結果が得られる。
【０１９８】
実施例５
分子量が非常に高いデキストランプライマーからのポリα−１，３−グルカンの重合
本実施例は、重量平均分子量が非常に高い（少なくとも５０ミリオンダルトン）のデキストランを用いるグルコシルトランスフェラーゼ酵素でのポリα−１，３−グルカンの合成を記載する。巨大デキストラン主鎖とポリα−１，３−グルカン側鎖とを含むグラフトコポリマーを生成した。
【０１９９】
３００ｇ／Ｌのスクロースを含む酵素反応系を用いた以外、下の実施例８に記載するように、重量平均分子量が非常に高いデキストランを最初に調製した。このデキストランの構造は、（ｉ）１位および６位で連結したグルコースを約８７〜９３ｗｔ％；（ｉｉ）１位および３位で連結したグルコースを約０．１〜１．２ｗｔ％；（ｉｉｉ）１位および４位で連結したグルコースを約０．１〜０．７ｗｔ％；（ｉｖ）１位、３位および６位で連結したグルコースを約７．７〜８．６ｗｔ％；（ｖ）（ａ）１位、２位および６位、または（ｂ）１位、４位および６位で連結したグルコースを約０．７〜１．４ｗｔ％含む。このデキストランを以下の酵素反応に用いた。
【０２００】
１００ｇ／Ｌのスクロースと、９．８ｇ／Ｌのデキストランと、上述の実施例で使用したグルコシルトランスフェラーゼを１００Ｕ／Ｌとを用いて、１５０ｒｐｍで撹拌しながら、２５℃で５００ｍＬのポリα−１，３−グルカンの合成反応を行った。この反応をセットアップするために、デキストラン（４．９ｇ）を乳鉢と乳棒で粉砕し、５０℃で４７０ｇの水道水と１６時間撹拌し、濁った溶液を得た。次に、スクロース（５０ｇ、ＯｍｎｉＰｕｒ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ８５５０）とリン酸カリウム（０．６８ｇ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ５３７９）を加え、撹拌しながら溶かし、ｐＨ５．７５を得た。溶液を反応器中２５℃で撹拌し、その後、グルコシルトランスフェラーゼ酵素（５０Ｕ）を加えた。約３０分内に、反応系は、約５ｍｍの大きさの堅くスポンジ状の粒子の懸濁液となった。
【０２０１】
２時間で、５０ｍＬの試料を反応系から取り出した（ピペットがポリマー粒子で詰まるので、それほど多くの不溶性生成物は得られなかった）。この試料（懸濁液）を吸引濾過して、洗浄し、湿ったウェットケーク（１．３ｇ）に吸着させ、ＳＥＣ解析を施す前に、試料を２、３時間、放置した。試料は、不活性化されず、酵素活性を弱めなかったので、試料を吸引濾過する前にさらなるポリα−１，３−グルカンが形成したようである。濾液を加熱して、濾液中で酵素を不活性化した。その反応を２４時間続け、その後、不溶性生成物スラリーを吸引濾過した；濾液（３５０ｍＬ）を保存し、ＨＰＬＣで解析した。
【０２０２】
１００ｍＬ／分および１０ｐｓｉｇで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＥＬＬＩＣＯＮ  ２  ＰＬＣＴＫ再生セルロースの直交流膜（３０ｋＤａ  ｃｕｔｏｆｆ；０．１ｍ２）を横切って循環させて、初期の濾液を透析した。この透析は、単糖およびオリゴマーを（透過液を介して）除去するのに助力し、未反応の可溶性デキストランを保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中に残す。再循環する供給原料に脱イオン水を連続して加えて、透過して失った水を補う；最終的に、単糖およびオリゴマーを洗い流すのに３５００ｍＬの水を使用した。次に、保持液を凍結乾燥して、０．１ｇ未満の未反応のデキストランを回収した。酵素反応において少量の可溶性デキストランのみとなるこれらの結果は、ポリα−１，３−グルカン合成をプライムするのにデキストランの殆どを使用し、そうしてデキストランが反応の不溶性生成物になることを示す。見かけの分画効果が存在しない（実施例１と異なる）ことは、多分、出発デキストランの均質性が比較的に高いことに関連する。
【０２０３】
グルコシルトランスフェラーゼ反応の不溶性生成物（デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー）を５００ｍＬの熱水道水で３回洗浄し、その生成物は、大部分５ｍｍの粒子と少量の細粒からなった。全ての水を吸引除去し、湿った粒子を秤量した（８２．８ｇ；２４時間試料）；生成物試料をＳＥＣおよび固形分パーセント測定ために取り出した。この目的により、ウェットケーク試料（１．１０５ｇ）をオーブン乾燥した（６０℃／２日）。単離したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、約２５％のデキストランと、７５％のポリα−１，３−グルカンを含んだ。
【０２０４】
デキストラナーゼの劣化解析（実施例１に記載したように実施）は、合成したコポリマーのポリα−１，３−グルカン側鎖はそれぞれ、おおよそ１０００のＤＰｗを有することを示した。この側鎖長の推定分子量は、低分子量のデキストラン（実施例１〜２）から合成した側鎖を実測した分子量と同じである。
【０２０５】
従って、（ｉ）巨大な分岐のデキストラン主鎖と、（ｉｉ）ポリα−１，３−グルカン側鎖とを含むグラフトコポリマーを生成した。そのようなコポリマーは、以下の実施例６〜７に記載するように、向上した濾過性および吸収性のプロファイルを有した。
【０２０６】
実施例６
非常に高い分子量のデキストランを含むデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの濾過性
本実施例は、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー生成物の濾過性を記載する。一般的に、分子量が非常に高いデキストランを高含有量含むコポリマーは、そのようなデキストランを低含有量有するコポリマーと比較すると、より容易に濾過分離した。
【０２０７】
８つのグルコシルトランスフェラーゼ（１００Ｕ／Ｌ）反応をセットアップして、以下の修正をした以外は、概して実施例５に記載したように行った。ヘリカルリボン型撹拌器を用いて１５０ｒｐｍで撹拌される１Ｌの反応系中でその反応を２５℃で行った。表１０は、各反応に携わるデキストランおよびスクロースの量を列挙する。反応のｐＨは、５．２〜５．８であり、調節しなかった。反応開始後２４時間で不溶性生成物試料を採取した；これらの試料を濾過および洗浄により調製した。得られたウェットケークを秤量し、それらの試料を乾燥させて、固形分パーセントと収量を求めた。ＳＥＣとＮＭＲにより、不溶性生成物試料を解析した。それぞれの反応の結果を表１０にまとめる。
【０２０８】
【表１１】
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【０２０９】
表１０に示すように、異なる反応系のデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマー生成物は、それらの濾過性により、特徴付けられる。総体的に、デキストラン含有量が高い（例えば、２．４〜１０．６ｗｔ％）グラフトコポリマーは、デキストラン含有量が低い（例えば、０．９〜１．４ｗｔ％）のグラフトコポリマーと比べて、大きな粒子として現れ、より容易に濾過される。図４および５は、１０．６ｗｔ％のデキストランを含有するグラフトコポリマー試料（表１０、列１、濾過し易い）と０．９ｗｔ％のデキストランを含有するグラフトコポリマー試料（表１０、列８、濾過し難い）の写真をそれぞれ示す。
【０２１０】
グラフトコポリマー生成物の濾過性が、少なくとも一部、グラフトコポリマー中のデキストランの含有量に応じて決まることは、興味をそそることである。この結果は、幾分有用である：ポリα−１，３−グルカン合成反応において非常に高い（５０ミリオンダルトンを超える）分子量のデキストランを含むことにより、主にポリα−１，３−グルカンからなる濾過性生成物の合成をもたらすことができることがわかるようになった（但し、最も高いデキストラン含有量は、１０．６ｗｔ％であり、他の濾過性生成物は、それより低いデキストラン含有量を有する）。これは、劣った濾過性を示し易い不溶性ポリα−１，３−グルカンホモポリマーを超える強化である。従って、少なくとも約２．４ｗｔ％（および、おそらく少なくとも約２．０ｗｔ％）のデキストラン（非常に高い分子量）含有量を有するデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、例えば、その合成および単離の観点からポリα−１，３−グルカンホモポリマーを超える経済上の利点を提供することがある。さらに、グルコシルトランスフェラーゼ反応において少量の非常に高い分子量のデキストランだけが、この効果を誘導する必要があることが表１０からわかる。表１０に基づいて、僅か２ｇ／Ｌの例えば、非常に高い分子量のデキストランをグルコシルトランスフェラーゼ反応に用いることにより、濾過性のグラフトコポリマー生成物を多く産出できると考えられる。最終的に、濾過性に及ぼすこの効果は、低分子量のデキストラン（１５０−ｋＤａ［平均］、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４８７６）をプライマーとして使用したグルコシルトランスフェラーゼ反応において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーでは容易に観察されなかった（データなし）。
【０２１１】
従って、少なくとも約２ｗｔ％の、例えば、非常に高い分子量のデキストランを含むデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーは、デキストラン含有量が低いグラフトコポリマーと比較すると、濾過し易い。
【０２１２】
実施例７
非常に高い分子量のデキストランを含むデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーによる水性液体の吸収力
本実施例は、様々なデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーの保水度（ＷＲＶｓ）を記載する。これらのコポリマーで測定したＷＲＶは、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーで測定したＷＲＶよりも大きい。
【０２１３】
これらのグルコシルトランスフェラーゼ（１００Ｕ／Ｌ）反応をセットアップし、概して実施例６に記載するように、１００ｇ／Ｌのスクロースおよびデキストランを２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌを用いて、行った。これらの反応（２４時間）は、それぞれ、９５％、８７．５％、または７５％のα−１，３グルコシド結合を含むデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを生成した。この生成物の結合プロファイルは、同様の反応条件（初期のスクロースおよびデキストランの濃度）下で作製した、表１０の列１および３に列挙する生成物と一致する（但し、各生成物のデキストラン成分は、概してα−１，６−グルコシド結合を表す）。
【０２１４】
これらのグラフトコポリマー生成物のそれぞれのＷＲＶを測定し、ポリα−１，３−グルカンホモポリマー（ＤＰｗ８００）のＷＲＶと比較した（表１１）。各ポリマーのＷＲＶを以下のように測定した。乾燥したポリマー粉末（１ｇ）を２０ｍＬのＤＩ水中に浸漬させ、２時間放置して平衡状態になった（但し、ポリマーの乾燥は、凍結乾燥ステップを伴わなかった）。次に、チューブの上半分に０．４５ミクロンのＰＶＤＦ挿入フィルターを収容する５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮチューブ中に、固体材料（スラリーに見える）を移した。次に、固定回転子を有するＥＰＰＥＮＤＯＲＦ５８０４遠心機内で、４５００ｒｐｍで２０分間、ＦＡＬＣＯＮチューブを遠心分離した。挿入フィルターにより、遠心分離中に湿潤材料から大量の過剰液体が除去／分離した。次に、湿潤材料の質量を天秤で測定した後、湿潤材料を６０℃のオーブン内で終夜乾燥させた。その後、乾燥質量を測定した。以下の式を用いて、各ポリマーのＷＲＶを算出した：（（湿潤ポリマーの質量−乾燥ポリマーの質量）／乾燥ポリマーの質量）＊１００。
【０２１５】
【表１２】
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【０２１６】
表１１における結果は、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーが、少量のα−１，６グルコシド結合（＜５％）を含有する場合でさえも、ポリα−１，３−グルカンホモポリマーのＷＲＶと比較してかなり高いＷＲＶを有することを示す。
【０２１７】
非常に高い分子量のデキストラン５０ｇ／Ｌと様々な量のスクロース（２０〜２００ｇ／Ｌ）とを用いたことを除いて、さらなるグルコシルトランスフェラーゼ（１００Ｕ／Ｌ）反応（２４時間）を上述のように行った。これらの反応で生成した合成デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーそれぞれのＷＲＶを上述のように測定したが、水の添加の際に生成物がゲル様になる（通常、測定したＷＲＶが約１０００を超える場合に生じる）ので、以下の修正をして、測定した。このプロトコルの修正を行い、遠心分離中のフィルターの目詰まりを回避した。具体的には、水の添加後、ＰＶＤＦ挿入フィルターを伴わない５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮチューブに膨張した材料を加え、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ５８０４内で、４５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。膨張したゲル相を遠心分離中にチューブの底に沈降させて、過剰の水を容易にデカンテーションできる。次に、湿潤材料の質量を天秤で測定した後、湿潤材料を６０℃のオーブン内で終夜乾燥させ、乾燥した材料を秤量した。次に、上述の式に従って、ＷＲＶを求め、表１２に示す。
【０２１８】
【表１３】
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【０２１９】
表１２における結果は、非常に高い分子量のデキストランを多量（５０ｇ／Ｌ）含むグルコシルトランスフェラーゼ反応において生成したデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーが、向上したＷＲＶを有することを示す。
【０２２０】
従って、デキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを含む組成物は、水性液体を吸収できる。そのような吸収性は、これらの組成物が、その性能が水性液体の吸収力に一部において基づく様々なパーソナルケア用品（例えば、おむつ、特定の女性用衛生製品）の使用に好適であり得ると示唆する。さらに、化学変性（例えば、架橋）を必要とせず、これらの材料が向上したＷＲＶを実現したことは注目すべきことであり、化学変性を行ったならばそれにより、材料が特定のパーソナルケア用途に適切でないようになることがある（例えば、化学処理により、皮膚炎に連結する不純物が残ることがある）。
【０２２１】
実施例８
分子量が非常に高いデキストランの合成および解析
本実施例は、分子量が非常に高い（５０ミリオンダルトンを超える）デキストランの生成を記載する。実施例５〜７（上述）においてそのようなデキストランを用いて、向上した特徴を有するデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを生成した。
【０２２２】
Ｇｔｆ０７６８の生成
１，４８４個のアミノ酸を有する推定上のＹＧリピート含有ヒドロラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫでＧＩ番号３３９４８０７６８に分類されたが、現在はＧＩ番号４９７９６４６５９を有する）は、全ゲノムショットガンシーケンシングによってロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）株ＫＣＴＣ３６５２から同定した。この推定グルコシルトランスフェラーゼ（本明細書では、ｇｔｆ０７６８という）は、グルカン結合ドメインを含有するグリコシルヒドロラーゼのＧＨ７０ファミリーに属する。ｇｔｆ０７６８のＮ末端３７アミノ酸セグメントは、ＳＩＧＮＡＬＰ  ４．０プログラム（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７８５−７８６）によって、この酵素のシグナルペプチドであると推定された。ｇｔｆ０７６８の成熟型は、配列番号６によって表される。
【０２２３】
ｇｔｆ０７６８の細菌発現のためのプラスミドを構築するために、シグナルペプチドを使用せずにｇｔｆの成熟型をコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成した。合成配列を、ｐＥＴ２３Ｄ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位内にサブクローニングした。このコンストラクトによってコードされた０７６８ｇｔｆ（配列番号７）は、ｇｔｆ０７６８の野生型成熟（予測）型（配列番号６）と比べると、Ｎ末端で開始メチオニンおよび３個の追加アミノ酸（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ）を、そしてＣ末端で６個のヒスチジン残基を含んでいた（すなわち、配列番号６は配列番号７の中に含まれる）。プラスミドコンストラクトの配列を確認し、アンピシリン選択を行って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ３宿主細胞内に形質転換して、発現菌株ＥＣ００５２を得た。
【０２２４】
ＥＣ００５２細胞と、空のｐＥＴ２３Ｄ＋ベクターだけを含有する対照菌株を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地で約０．５のＯＤ６００増殖させ、次に、１ｍＭのＩＰＴＧにより３７℃で３時間、または２３℃で終夜誘導した。この誘導期間後、細胞を４０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって収集し、ＰＢＳバッファ（ｐＨ６．８）に再懸濁した。次に、細胞を１４，０００ｐｓｉ（約９６．５３ＭＰａ）でＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに２回通すことにより溶解し、その後、細胞破片を１５，０００×ｇで２０分間遠心分離することによりペレット化した。各未精製の細胞溶解液の上清を等分し、−８０℃で凍結させた。
【０２２５】
ＥＣ００５２細胞由来の未精製の細胞溶解液の活性を、スクロースとの反応によってチェックした。対照反応を、空ベクターを含有する細胞から調製した細胞溶解液を用いて同様にセットアップした。１０％（ｖ／ｖ）の細胞溶解液を１００ｇ／Ｌのスクロース、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５）および１ｍＭのＣａＣｌ２と共に使用して、各スクロース反応をセットアップした。３７℃で数時間、反応系をインキュベートした後、ＥＣ００５２細胞溶解液を加えた試験管内に、ゲル様生成物（デキストランであると考えられる）が生成した。対照反応系には、ゲル様生成物は生成されなかった。ＨＰＬＣ解析より、ＥＣ００５２細胞溶解液を含有する反応系中ではスクロースが消費されたが、対照反応系中では消費されなかったことが確認された。この結果は、ＥＣ００５２未精製細胞溶解液が活性ｇｔｆ０７６８酵素を発現すること、およびこのｇｔｆが高粘度を有するデキストラン生成物を生成することを示唆した。
【０２２６】
分子量が非常に高いデキストランの合成および解析
水、スクロースおよびｇｔｆ０７６８を含む反応系をセットアップし、解析を実施して、デキストラン生成物の構造的特徴を求めた。
ｇｔｆ反応系を調製するための試薬：
−スクロース（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｓ−９３７８）。
−リン酸ナトリウムバッファストック（１Ｍ、ｐＨ６．５、Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｓ０２７６）。
−Ｇｔｆ０７６８酵素（配列番号６を含む）溶液（上述のように調製した細胞溶解液）。
【０２２７】
Ｇｔｆ反応の条件：
２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（バッファを１Ｍストック（ｐＨ６．５）からｄｄＨ２Ｏを用いて５０倍に希釈した）、１００ｇ／Ｌのスクロース、および０．１ｍＬのｇｔｆ０７６８酵素溶液（配列番号６を含む）を含有する５０ｍＬの反応系を調製した。この反応系をインキュベーターシェーカー（Ｉｎｎｏｖａ，Ｍｏｄｅｌ４０００）内、１００ｒｐｍ、２６℃で４３時間振盪した；反応系は、約２４時間後、粘性を示した。２００、３００または８００ｇ／Ｌのスクロースを含有する他の反応（２４時間）も実施した（データ示さず）。
【０２２８】
反応を８０℃で１０分間加熱してｇｔｆ酵素を不活化した。次に、不活化した粘性反応系に１００％メタノール７５ｍＬを混合して、粘性生成物を沈殿させた。白色沈殿を形成した。上清を注意深くデカンテーションした後、白色沈殿を１００％メタノール７５ｍＬで２回洗浄した。固体生成物を４５℃で４８時間、オーブン内で真空乾燥させた。
【０２２９】
０、０．５、１、２および２４時間後に、反応の試料（１ｍＬ）をそれぞれ採取した。８０℃で１０分間加熱して、各試料においてｇｔｆ酵素を不活化した。次に、各試料を殺菌水で１０倍に希釈した。５００μＬの希釈試料を遠心管フィルター（ＳＰＩＮ−Ｘ、０．４５μｍのナイロン、２．０ｍＬのポリプロピレンチューブ、Ｃｏｓｔａｒ＃８１７０）中に移し、卓上遠心分離機により、１２，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、その後、ＨＰＬＣ解析のために２００μＬのフロースルーを使用して反応中のスクロース消費量を測定した。各試料を解析するために次のＨＰＬＣ条件を適用した：カラム（ＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−８７Ｃ炭水化物カラム、３００×７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、製品番号１２５−００９５）、溶離液（水）、流量（０．６ｍＬ／分）、温度（８５℃）、屈折率検出器。試料のＨＰＬＣ解析により、０７６８ｇｔｆの反応中に、相当量のスクロースが消費されたことが示された。
【０２３０】
また、ＨＰＬＣを使用して、反応の他の生成物を解析した。ポリマー収量は、反応において残留した他の全糖類の量を出発スクロースの量から減じることによって逆算した。逆算した数値は、粘性生成物の乾燥重量分析と一致した。スクロース、ロイクロース、グルコースおよびフルクトースは、ＨＰＸ−８７Ｃカラムを用いるＨＰＬＣ（上述したＨＰＬＣ条件）によって定量した。ＤＰ２−７二糖類は、次の条件を用いてＨＰＬＣによって定量した：カラム（ＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−４２Ａ炭水化物カラム、３００×７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、製品番号１２５−００９７）、溶離液（水）、流量（０．６ｍＬ／分）、温度（８５℃）、屈折率検出器。これらのＨＰＬＣ解析により、０７６８ｇｔｆ反応のグルコシル含有糖生成物が、９２．３％のポリマー生成物、１．３％のグルコース、５．０％のロイクロースおよび１．４％のＤＰ２−７オリゴ糖からなることが示された。
【０２３１】
上述の反応の乾燥デキストラン粉末生成物の試料（約０．２ｇ）を分子量分析のために使用した。３台のオンライン検出器と一体となったＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）製のＡｌｌｉａｎｃｅ（商標）２６９５分離モジュールを用いて、フローインジェクションクロマトグラフ法により、分子量を求めた：Ｗａｔｅｒｓ製の示差屈折率検出器２４１４、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）製の準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器を伴うＨｅｌｅｏｓ（商標）−２  １８−アングルマルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）光度計、およびＷｙａｔｔ製のＶｉｓｃｏＳｔａｒ（商標）示差毛管粘度検出器。乾燥デキストラン粉末を、２００ｐｐｍのＮａＮ３を含有する水性トリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）バッファ（０．０７５Ｍ）中に０．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。５０℃で終夜振盪して、デキストランを溶解させた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）製の２本のＡＱＵＡＧＥＬ−ＯＨ  ＧＵＡＲＤカラムを使用して、インジェクションピークからデキストランポリマーのピークを分離した。この手順の移動相のベースは、デキストランの溶媒と同じであり、流量は０．２ｍＬ／分、注入量は０．１ｍＬ、カラム温度は３０℃であった。データ収録には、ＷａｔｅｒｓのＥｍｐｏｗｅｒ（商標）バージョン３ソフトウェアを使用し、マルチ検出器のデータ量削減にはＷｙａｔｔのＡｓｔｒａ（商標）バージョン６を使用した。この研究から、デキストランポリマー生成物が１．０２２（±０．０２５）×１０８ｇ／モル（すなわち、大まかに１００，０００，０００ダルトン）の重量平均分子量（ＭＡＬＳ分析から）、２４３．３３（±０．４２）ｎｍのｚ平均慣性半径（ＭＡＬＳ分析から）および２１５ｎｍのｚ平均流体力学半径（ＱＥＬＳ分析から）を有することが判明した。また、ＱＥＬＳ分析から、デキストランが約０．２５９の粒径分布（ＰＳＤ）標準偏差を有することが判明し、デキストランが流体力学的サイズに関して多分散性である可能性が高いことを示した。
【０２３２】
グリコシド結合解析のために、反応時間を２４時間（反応系が粘性になった）としたことを除いて、本実施例で先に記載したようにして、５０ｍＬのｇｔｆ反応を調製した。反応を８０℃で１０分間加熱してｇｔｆ酵素を不活化した。次に、不活化した粘性反応を、１２〜１４ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を備える、再生セルロース製の頑丈な透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）４透析チューブ、製品番号１３２７０６、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中に配置し、室温で１週間にわたり４Ｌのフィルター水で透析した。透析中、水は毎日交換した。次に、透析した粘性反応系を沈殿させ、本実施例で先に記載したようにして乾燥させた。ＧＣ／ＭＳ連動解析用に、約０．２ｇの乾燥粉末を供した。
【０２３３】
連動解析は、Ｐｅｔｔｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７：１５９０−１６０７）が報告している方法に従って行った。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に言えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または５％塩化リチウムを溶かしたＤＭＳＯ中に乾燥デキストラン試料を溶解させ、次に、水酸化ナトリウム／ＤＭＳＯスラリー、その後にヨードメタンを連続的に添加することによって全ての遊離ヒドロキシル基をメチル化した。次に、塩化メチレン中にメチル化ポリマーを抽出し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を使用して１２０℃でモノマー単位まで加水分解した。その後、試料からＴＦＡを留去し、還元端を重水素原子で標識した重水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元開環を行った。次に、グリコシド結合を加水分解することにより生成したヒドロキシル基を、５０℃の温度で塩化アセチルおよびＴＦＡで処理することによりアセチル化した。最後に、誘導体化試薬を留去し、得られたメチル化／アセチル化モノマーをアセトニトリル中で再構成し、ビスシアノプロピルシアノプロピルフェニルポリシロキサンカラムを用い、質量分析計を備えたガスクロマトグラフィ（ＧＣ／ＭＳ）により分析した。重水素標識とともに、メチルおよびアセチル官能基の相対測位から、他とは明確に区別できる保持時間指数および公表データベースと比較できる質量スペクトルを有する化学種を得た。この方法で、モノマー単位の誘導体によって、各モノマーがデキストランポリマー内で最初にどのように連結していたのか、また、モノマーが分岐点であったか否かが示された。これらのサンプル（最初にＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ／５％のＬｉＣｌ中に溶解させたデキストラン）を分析した結果を表１３に示す。
【０２３４】
【表１４】
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【０２３５】
一般的に、表１３の結果は、既に解析したデキストラン生成物が：
（ｉ）１位および６位でのみ連結したグルコース、約８７〜９３ｗｔ％；
（ｉｉ）１位および３位でのみ連結したグルコース、約０．１〜１．２ｗｔ％；
（ｉｉｉ）１位および４位でのみ結合したグルコース、約０．１〜０．７ｗｔ％；
（ｉｖ）１位、３位および６位でのみ結合したグルコース、約７．７〜８．６ｗｔ％；並びに
（ｖ）（ａ）１位、２位および６位、または（ｂ）１位、４位および６位でのみ連結したグルコース、約０．４〜１．７ｗｔ％
を含むことを示している。
【０２３６】
この情報および他のいくつかの研究（データは示していない）に基づくと、この生成物は、相互に反復して分岐する（平均）長さが約２０ＤＰの長鎖（大部分または全部がα−１，６−である結合を含有する）が存在する分岐構造（例えば、長鎖が他の長鎖からの分岐で、次にそれ自体が他の長鎖からの分岐であり得るなど）であると考えられる。分岐構造は、また長鎖からの短鎖を含むようである；これらの短鎖は、例えば、長さが１〜３ＤＰであり、大部分が例えばα−１，３およびα−１，４である結合を含むと考えられる。デキストラン中の分岐点は、他の長鎖から分岐している長鎖からであろうと、または長鎖から分岐している短鎖からであろうと、α−１，６結合内に含まれるグルコースからのα−１，３、−１，４または−１，２結合を含むと思われる。デキストランの全分岐点の大まかに２５％は、長鎖に分岐した。
【０２３７】
従って、独特な構造特性を有する、分子量が非常に高いデキストランを生成した。実施例５〜７（上述）においてこのデキストランを用いて、向上した特徴を有するデキストラン−ポリα−１，３−グルカングラフトコポリマーを生成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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