(57)【要約】本発明は、標的遺伝物質を分解する酵素の送達によって被験体から標的遺伝物質を除去する方法および組成物を提供する。方法は、組織の浸透性を増強し、組織の細胞に核酸を進入させる種々の種類のエネルギーと共に被験体の皮膚などの組織に核酸の組成物を送達することを含み、ここで核酸は、標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子を含む。核酸は、ｃａｓ９遺伝子およびショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの遺伝子を含むプラスミドであってよく、標的遺伝物質はウイルスゲノムであってよい、すなわちｓｇＲＮＡがウイルスゲノムの一部に相補的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の標的遺伝物質を破壊するための方法であって、該方法は、組織の浸透性を増大させるように該組織にエネルギーを加え、それにより核酸を該組織の細胞に進入させることによって、該組織に該核酸を含む組成物を送達するステップを含み、ここで、該核酸がプログラム可能なヌクレアーゼをコードしている、方法。
【請求項２】
前記プログラム可能なヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エネルギーが電気穿孔法により加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記加えられるエネルギーが超音波である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がｃａｓ９遺伝子およびショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの遺伝子を含むプラスミドである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的遺伝物質がウイルス性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｓｇＲＮＡがウイルスゲノムの一部に相補的であり、ヒトゲノムにマッチを有さない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスゲノムがＢ型肝炎ウイルスゲノムであり、前記プラスミドが該Ｂ型肝炎ウイルスゲノム中の位置を標的化する１つまたは複数のｓｇＲＮＡの遺伝子を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つまたは複数のｓｇＲＮＡが、ＰｒｅＳ１、ＤＲ１、ＤＲ２、ポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、ＨｂｘおよびコアＯＲＦから選択される前記Ｂ型肝炎ウイルスゲノム中の位置を標的とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のｓｇＲＮＡが、ｓｇＨＢＶ−ＣｏｒｅおよびｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１からなる群から選択される１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的遺伝物質がウイルスのゲノムであり、前記核酸がｃａｓ９遺伝子および該ウイルスの該ゲノムを標的化する少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含むプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラスミドがウイルス複製開始点をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスがＢ型肝炎ウイルスであり、前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡが、ｓｇＨＢＶ−ＲＴ、ｓｇＨＢＶ−Ｈｂｘ、ｓｇＨＢＶ−Ｃｏｒｅおよびｓｇ−ＨＢＶ−ＰｅｒＳ１からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸が、５’ｃａｐを含むｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組織の浸透性を増大させるように該組織にエネルギーを加え、それにより該組織の細胞にプログラム可能なヌクレアーゼを進入させることによって、該組織に該プログラム可能なヌクレアーゼを含む組成物を送達するステップを含む、被験体を処置するための方法。
【請求項１７】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プログラム可能なヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エネルギーを加えることが前記組織の電気穿孔を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記加えられるエネルギーが超音波エネルギーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
組織にエネルギーを加えるように作動可能なデバイス；および
ウイルスの遺伝物質中の標的を切断するようにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸
を含む、抗ウイルス治療を送達するためのキット。
【請求項２２】
前記デバイスが、電気穿孔発生器および少なくとも１つの電極を含む電気穿孔デバイスである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記プログラム可能なヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項２３に記載のキットであって、内腔を有する細長部材をさらに含み、ここで、該内腔が被験体内の処置部位への前記核酸の送達のために構成されている、キット。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの電極が前記核酸でコーティングされている、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記プログラム可能なヌクレアーゼをコードしている前記核酸が、該プログラム可能なヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡであり、ナノ粒子に被包されている、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
前記ナノ粒子が脂質を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記デバイスが超音波振動子を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項３０】
前記核酸が、前記プログラム可能なヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットであって、内腔を有する細長部材をさらに含み、ここで、該内腔が被験体内の処置部位への前記核酸の送達のために構成されている、キット。
【請求項３２】
前記核酸が前記細長部材内のマイクロバブル中で提供される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記プログラム可能なヌクレアーゼがＣａｓ９であり、前記マイクロバブルが１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記細長部材が針である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記超音波振動子が低強度、非キャビテーション超音波を提供するように作動する、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
組織にエネルギーを加えるように作動可能なデバイス；および
ウイルスの遺伝物質中の標的を切断するようにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼ
を含む、抗ウイルス治療を送達するためのキット。
【請求項３７】
前記デバイスが、電気穿孔発生器および少なくとも１つの電極を含む電気穿孔デバイスである、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、該ガイドＲＮＡがウイルス遺伝物質内の標的に相補的であり、ヒトゲノム内のいかなる標的にも相補的でない、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
請求項３８に記載のキットであって、内腔を有する細長部材をさらに含み、ここで、該内腔が被験体内の処置部位への前記ＲＮＰの送達のために構成されている、キット。
【請求項４０】
前記ＲＮＰがナノ粒子に被包されている、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記ナノ粒子が脂質を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記デバイスが超音波振動子を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４４】
前記プログラム可能なヌクレアーゼが、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ここで、該ガイドＲＮＡがウイルス遺伝物質内の標的に相補的であり、ヒトゲノム内のいかなる標的にも相補的でない、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
請求項４４に記載のキットであって、内腔を有する細長部材をさらに含み、ここで、該内腔が被験体内の処置部位への前記核酸の送達のために構成されている、キット。
【請求項４６】
前記ＲＮＰが前記細長部材内のマイクロバブル中で提供される、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記プログラム可能なヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
前記細長部材が針である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記超音波振動子が低強度、非キャビテーション超音波を提供するように作動する、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、参照によって組み込まれる、２０１５年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／２３４，３４０号の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、治療送達の方法に一般に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝炎、ＨＩＶおよびヘルペスファミリーのウイルス（ヘルペスウイルス科）などのウイルス感染は、社会的困難から死亡に至るまで感染した個体に影響を与える場合がある。これらのウイルスは、ウイルス潜伏期と称される長期間、被験体において休止状態のままでいる潜在性感染を確立することができる。潜伏期は、初感染後、ウイルス増殖が止まっているウイルスの生活環における期間である。しかしウイルスゲノムは、完全には根絶されていない。その結果ウイルスは再活性化し得、急性感染を生じ、いかなる新規感染も伴わずに後代を多量に産生し、前述のウイルスの処置を困難にしている。
【０００４】
ウイルス処置のある有望な方法は、ウイルスゲノム物質を標的とし、感染細胞から除去するための遺伝子編集システムの使用を含む。遺伝子編集システムは、規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼおよびウイルス特異的標的配列に相補的なガイドＲＮＡの使用を含む。これらの遺伝子編集システムは、皮下注射、吸入もしくは経粘膜送達または経口送達などの方法を介して現在投与されている。これらの他の方法は、しばしば有痛性で侵襲性であり、標的細胞への回り道の経路を提供する場合があり、胃腸管症状または他の副作用および、標的細胞に到達できる前の治療用組成物の改変および分解をもたらす場合がある。標的組織に、次いで標的細胞に十分な量の治療用遺伝子編集システムを導入すること自体が困難なままである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、標的化ゲノム改変のための方法およびシステムを提供する。本発明は、宿主自体の遺伝物質または宿主細胞の生存能に影響を与えることなく、ウイルスゲノムなどの標的遺伝物質を特異的に分解できるプログラム可能なヌクレアーゼなどの組成物を産生し、宿主細胞に送達する課題に対処する。本発明の方法は、標的細胞または組織へのエネルギーの共投与により組織へのおよび個々の細胞膜を通る組成物の輸送を増強するための技術を含む。
【０００６】
経皮送達または経粘膜送達は、他の送達方法を超える多数の利点を提供する。具体的には経皮投与または経粘膜投与は、より直接的で、比較的無痛性の身体の細胞への進入を提供でき、一般に他の投与方法よりも副作用を生じることが少ない。そのような送達は、在宅適用を可能にすることおよび化合物の徐放など他の利益も提供できる。
【０００７】
経皮送達は、薬物投与のため有望な手段である一方で、それ自体の一連の課題も有する。皮膚組織の１つの機能は、身体と外環境との間にバリアを提供することである。したがって皮膚は、皮膚を通じて身体に治療用化合物を通すことを困難にし得る角質層などのバリア層を含有する。本発明は、組織の浸透性を増大させ、組織による治療用化合物の取り込みを調節するために皮膚、肝臓または他の組織にエネルギーが投与されるいくつかのエネルギー媒介送達方法に関する。これらの送達方法は、次の、超音波媒介送達（高周波および低周波の両方またはキャビテーション性もしくは非キャビテーション性）、イオン泳動経皮送達、電気穿孔法、化学物質媒介送達、角質層の熱アブレーション、磁気泳動、フォトメカニカル波、ならびにマイクロダーマブレーション、遺伝子銃およびマイクロニードルなどの機械的方法の１つまたは複数を含む場合がある。特に興味深いのは、経細胞送達方法が細胞膜を通る通路を含み、トランスフェクションのために使用され得ることから細胞間送達方法とは対照的な経細胞送達方法である。ある特定の実施形態では、遺伝物質は、本明細書に記載の経皮的方法によりそれ自体が身体に導入される操作されたタンパク質によって細胞膜を越えて輸送され得る。
【０００８】
上記または他の送達方法を使用して、プログラム可能なヌクレアーゼまたは該ヌクレアーゼをコードするベクターなどの組成物は細胞に送達される。ベクターがプログラム可能なヌクレアーゼをコードしているプラスミドなどの核酸である場合、ヌクレアーゼの発現は標的遺伝物質を分解するまたは他の方法で標的遺伝物質に干渉できるようにする。
【０００９】
ある特定の態様では、本発明は、抗ウイルス治療を送達するためのキットを提供する。キットは、組織にエネルギーを加えるように作動できるデバイス；およびウイルスの遺伝物質中の標的を切断するためにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、デバイスは、電気穿孔発生器および少なくとも１つの電極を含む電気穿孔デバイスである。プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。キットは、内腔（inner  lumen）を有する細長部材を含んでよく、ここで前記内腔は、被験体内の処置部位への核酸の送達のために構成されている。少なくとも１つの電極は、核酸でコーティングされていてよい。任意選択で、プログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸は、プログラム可能なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであり、ナノ粒子（例えば脂質の）に被包されている。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ０であってよい。
【００１１】
一部の実施形態では、デバイスは超音波振動子（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を含み；核酸は、プログラム可能なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであり；キットは内腔を有する細長部材（例えば、針）を含み、ここで前記内腔は被験体内の処置部位への核酸の送達のために構成されている、またはその組合せである。好ましくは、核酸は、細長部材内のマイクロバブル中で提供される。任意選択でプログラム可能なヌクレアーゼはＣａｓであり、マイクロバブルは、１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む。超音波振動子は、低強度、非キャビテーション超音波を提供するように作動する。
【００１２】
本発明の態様は、抗ウイルス治療を送達するためのキットを提供する。キットは、組織にエネルギーを加えるように作動できるデバイス；およびウイルスの遺伝物質中の標的を切断するためにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、デバイスは、電気穿孔発生器および少なくとも１つの電極を含む電気穿孔デバイスである。プログラム可能なヌクレアーゼは、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり、ここでガイドＲＮＡはウイルス遺伝物質内の標的に相補的であり、ヒトゲノム内のいかなる標的にも相補的ではない。キットは内腔を有する細長部材を含んでよく、ここで前記内腔は、被験体内の処置部位へのＲＮＰの送達のために構成されている。好ましくは、ＲＮＰはナノ粒子中に被包されている。
【００１４】
一部の実施形態では、キットは、超音波振動子を含む。プログラム可能なヌクレアーゼは、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）としてガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ここでガイドＲＮＡはウイルス遺伝物質内の標的に相補的であり、ヒトゲノム内のいかなる標的にも相補的ではない。キットは内腔を有する細長部材を含んでよく、ここで前記内腔は、被験体内の処置部位への核酸の送達のために構成されている。任意選択でＲＮＰは、細長部材内のマイクロバブル中で提供される。好ましくは、超音波振動子は、低強度、非キャビテーション超音波を提供するように作動する。
【００１５】
任意の好適なプログラム可能なヌクレアーゼは、本発明の任意のキットまたは方法を使用して送達されてよく、活性形態で（例えば、タンパク質もしくはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として）、メッセンジャーＲＮＡにコードされて、または遺伝子として、例えばプラスミドもしくはウイルスベクターなどの核酸ベクター上にコードされて、送達されてよい。プログラム可能なヌクレアーゼは、例えばＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９もしくは修飾Ｃａｓ９またはＣｐｆ１もしくは修飾Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ）であってよい。プログラム可能なヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮもしくは修飾ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってよい。ある特定の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、DNA誘導型ヌクレアーゼ（DNA-guided  nuclease）（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）またはＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）であってよい。プログラム可能なヌクレアーゼ（nuclase）は、例えば参照により組み込まれるKleinstiverら、２０１６年、High-fidelity  CRISPR-Cas9  nucleases  with  no  detectable  genome-wide  off-target  effects、Nature  ５２９巻：４９０〜４９５頁に記載の高フィデリティーＣａｓ９（ｈｉ−ｆｉ  Ｃａｓ９）であってよい。プログラム可能なヌクレアーゼが、例えばＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、核酸ベクターを介して送達される場合、核酸はヌクレアーゼを標的遺伝物質に標的化するガイドＲＮＡを含有してよい。標的遺伝物質がウイルスのゲノムを含む場合、そのゲノムの一部に相補的なガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼによるそのゲノムの分解をガイドでき、それによりいかなるさらなる複製も予防する、または細胞からいかなる未処理ウイルスゲノムも完全に除去することができる。これらの手段によって潜伏ウイルス感染は、根絶のために標的化され得る。潜伏ウイルスのゲノムに特異的な活性を有するヌクレアーゼの遺伝子送達のための方法が提供されることから、本発明の方法は、潜伏ウイルス感染に対処するために使用できる。それにより本発明の方法および組成物は、ＨＢＶ、エプスタイン・バーウイルスまたは他のウイルスなどのウイルスの有害な結果からの軽減を提供できる。
【００１６】
ある特定の態様では、本発明は、被験体から標的遺伝物質を除去するための方法を提供する。方法は、組織に組成物を送達すること、および組織の浸透性を増大させ、組成物が組織またはさらに組織の細胞に進入することを促進するために組織にエネルギーを加えることを含む。組成物は、プログラム可能なヌクレアーゼまたは該ヌクレアーゼをコードする核酸を含む。例えば組成物は、活性Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはＣａｓ９をコードするプラスミドまたはｍＲＮＡを含んでよい。
【００１７】
加えられるエネルギーは、高密度焦点式超音波であってよい。加えられるエネルギーは、代替的に低周波超音波であってよい。ある特定の実施形態では、エネルギーは、電気穿孔により加えられてよい。エネルギーは、イオン泳動により加えられてよい。一部の実施形態では、加えられるエネルギーは、熱であってよい。エネルギーは電波により加えられてよい。エネルギーは、マイクロニードルもしくはマイクロダーマブレーションにより、または細胞に照射する（bombard）ために遺伝子銃を使用することによって、機械的に加えられてよい。ある特定の実施形態では、エネルギーは、磁場により加えられてよい。エネルギーは、フォトメカニカル波により加えられてよい。種々の実施形態では、溶液は、経皮的に送達されてよい。
【００１８】
核酸は、ｃａｓ９遺伝子およびショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの遺伝子を含むプラスミドであってよく、標的遺伝物質は、ウイルスゲノムであってよい、すなわちｓｇＲＮＡがウイルスゲノムの一部に相補的である。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムであり、プラスミドはＰｒｅＳ１、ＤＲ１、ＤＲ２、ポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、Ｈｂｘ、コアＯＲＦまたはこれらの組合せなどのＢ型肝炎ウイルスゲノム中の位置を標的化する１つまたは複数のｓｇＲＮＡの遺伝子を含有する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、標的遺伝物質は、ウイルスのゲノムであり、核酸はｃａｓ９遺伝子およびウイルスのゲノムを標的化する少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含むプラスミドである。プラスミドは、ウイルス複製開始点をさらに含む（すなわち、潜伏ウイルスの予測される複製がそのウイルスを標的化するプラスミド遺伝子そのものの複製をもたらすように）。例示的実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスであり、ｓｇＲＮＡはｓｇＨＢＶ−ＲＴ、ｓｇＨＢＶ−Ｈｂｘ、ｓｇＨＢＶ−Ｃｏｒｅおよびｓｇ−ＨＢＶ−ＰｅｒＳ１の１つまたは複数を含む。
【００２０】
核酸は、ある特定の実施形態では、５’ｃａｐを含むｍＲＮＡを含んでよい。種々の実施形態では、酵素は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってよい。
【００２１】
ある特定の態様では、本発明は、被験体由来の標的遺伝物質を破壊するための方法を提供する。方法は、組織の浸透性を増大させ、核酸が組織の細胞に進入することを可能にするために組織にエネルギーを加えることによって、組織にリボ核タンパク質を含む組成物を送達することを含み、ここでリボ核タンパク質は、標的遺伝物質および少なくとも１つのショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を切る酵素を含む。酵素は、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮであってよい。エネルギーは、電気穿孔法により加えられてよい、または超音波であってよい。加えられるエネルギーは、低周波超音波または高密度焦点式超音波であってよい。エネルギーは、イオン泳動により加えられてよい。一部の実施形態では、加えられるエネルギーは、熱であってよい。エネルギーは、電波により加えられてよい。エネルギーは、マイクロニードルもしくはマイクロダーマブレーションにより、または細胞に照射するために遺伝子銃を使用することによって機械的に加えられてよい。ある特定の実施形態では、エネルギーは、磁場により加えられてよい。エネルギーは、フォトメカニカル波により加えられてよい。種々の実施形態では、溶液は、経皮的に送達されてよい。
【００２２】
標的遺伝物質は、ウイルスであってよい、すなわちｓｇＲＮＡがウイルスゲノムの一部に相補的である。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムであり、１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、ＰｒｅＳ１、ＤＲ１、ＤＲ２、ポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、Ｈｂｘ、コアＯＲＦまたはこれらの組合せなどのＢ型肝炎ウイルスゲノム中の位置を標的とする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、被験体から標的遺伝物質を除去するための方法を示す図である。
【図２】図２は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって標的化されるＨＢＶゲノム中の重要部分を示す図である。
【図３】図３は、ＨＢＶに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲアッセイから得られたゲルを示す図である。
【図４】図４は、ある特定の実施形態によるプラスミドを示す図である。
【図５】図５は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するための超音波振動子（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を含むシステムを示す図である。
【図６】図６は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するための電気穿孔デバイスを含むシステムを示す図である。
【図７】図７は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するための遺伝子銃を含むシステムを示す図である。
【図８】図８は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するためのイオン泳動デバイスを含むシステムを示す図である。
【図９】図９は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するためのマイクロニードルパッチを含むシステムを示す図である。
【図１０】図１０は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するためのマイクロダーマブレーダーを含むシステムを示す図である。
【図１１】図１１は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するための熱アブレーションデバイスを含むシステムを示す図である。
【図１２】図１２は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するための磁気薬物送達システムを含むシステムを示す図である。
【図１３】図１３は、ある特定の実施形態により被験体から標的遺伝物質を除去するための、レーザーを含むシステムを示す図である。
【図１４】図１４は、ＨＰＶ−１６＋細胞に対するＣａｓ９／ＨＰＶ１６特異的ｓｇＲＮＡリボ核（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ）タンパク質（ＲＮＰ）の効果を評価するための工程を示す図である。
【図１５】図１５は、ＨＰＶ−１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子に沿う種々のｓｇＲＮＡの標的位置を示す図である。
【図１６】図１６は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子に沿う標的を有する種々のｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの電気穿孔による導入後のＨＰＶ−１６＋細胞数を例示するグラフである。
【図１７】図１７は、ＨＰＶ−１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子上の標的位置および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマー位置を例示する図である。
【図１８】図１８は、種々のＨＰＶ１６特異的ＲＮＰでの処理の１および２日後のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子に焦点を合わせたｑＰＣＲ結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、種々のＨＰＶ１６特異的ＲＮＰでの処理の１および６日後の生細胞数を示すグラフである。
【図２０】図２０は、ＨＰＶ−１６＋細胞に対するＨＰＶ１６特異的ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡの効果を評価するための工程を示す図である。
【図２１】図２１は、種々のＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの組合せを用いたヌクレオフェクション後１、３および６日後の正規化された細胞数を示すグラフである。
【図２２】図２２は、種々のｓｇＲＮＡおよびさまざまなＣａｓ９  ｍＲＮＡで処理した細胞についての６日後の細胞数を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ＨＰＶ−１８＋細胞に対するＣａｓ９／ＨＰＶ１８特異的ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の効果を評価するための工程を示す図である。
【図２４】図２４は、ＨＰＶ−１８のＥ６遺伝子に沿う種々のｓｇＲＮＡの標的位置を示す図である。
【図２５】図２５は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６遺伝子を標的化する種々のｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの電気穿孔法による導入後の細胞数を例示するグラフである。
【図２６】図２６は、ＲＮＰフォーマットまたはｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡフォーマットにおけるｓｇＨＰＶ１８Ｅ６−２／Ｃａｓ９での電気穿孔の５日後のＨＰＶ−１８＋がん細胞についての生細胞数比較を示すグラフである。
【図２７】図２７は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質のμｇ用量でのｍＲＮＡおよびＲＮＰ処理細胞での生細胞数の比較を示すグラフである。
【図２８】図２８は、ＨＢＶエピソームＤＮＡ細胞モデルを例示する図である。
【図２９】図２９は、種々のｓｇＲＮＡのＨＢＶゲノム上の標的位置を示す図である。
【図３０】図３０は、ｓｇＲＴ  ＲＮＡ、ｓｇＨＢｘ  ＲＮＡ、ｓｇＣｏｒｅ  ＲＮＡおよびｓｇＰｒｅＳ１  ＲＮＡを形質導入された細胞中のＨＢＶ  ＤＮＡの切断を示すゲル電気泳動分離の結果を示す図である。
【図３１】図３１は、未処理細胞ならびにＨＢＶ特異的ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９で処理した細胞においてｑＰＣＲによって決定されたＨＢＶ  ＤＮＡ量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１は、被験体から標的遺伝物質を除去するための方法を図示する。方法は、組成物を組織の細胞に進入させるための組織へのエネルギーおよび組成物の共投与を含む。組成物は、プログラム可能なヌクレアーゼまたは該ヌクレアーゼをコードする核酸、例えばプラスミドまたはｍＲＮＡを含む。プログラム可能なヌクレアーゼは、遺伝物質を標的化および切断するためにプログラムされた酵素である。
【００２５】
任意の好適なプログラム可能なヌクレアーゼが使用されてよい。プログラム可能なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および、細菌性の規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−関連）ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む。プログラム可能なヌクレアーゼは、DNA誘導型ヌクレアーゼ（例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）またはＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）も含む。プログラム可能なヌクレアーゼ（nuclase）は、例えば、参照により組み込まれるKleinstiverら、２０１６年、High-fidelity  CRISPR-Cas9  nucleases  with  no  detectable  genome-wide  off-target  effects、Nature  ５２９巻：４９０〜４９５頁に記載の高フィデリティーＣａｓ９（ｈｉ−ｆｉ  Ｃａｓ９）であってよい。
【００２６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）は、遺伝子治療（Cell  Stem  Cell.２０１３年、１３巻（６号）：６５３〜８頁）に大いなる見込みを提供した。ウイルスＤＮＡを標的化することによって、近年の研究はＣＲＩＳＰＲでのヒト細胞中の潜伏ウイルス感染症の処置を実証した。両方とも参照により組み込まれるWangおよびQuake、２０１４年、RNA-guided  endonuclease  provides  a  therapeutic  strategy  to  cure  latent  herpesviridae  infection、PNAS  １１１巻（３６号）：１３１５７〜１３１６２頁およびHuら、２０１４年、RNA-directed  gene  editing  specifically  eradicates  latent  and  prevents  new  HIV-1  infection、PNAS  １１１巻（３１号）：１１４６１〜６頁を参照されたい。本発明の方法および材料は、ＨＢＶなどの潜伏ウイルスゲノムなどの具体的な遺伝物質に標的化エンドヌクレアーゼを適用するために使用できる。本発明は、標的細胞（例えば、肝細胞）への核酸（ＤＮＡプラスミドなど）の効率的で安全な送達をさらに提供する。
【００２７】
例示的実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１つまたは複数の遺伝子送達方法とウイルス感染を処置するための標的化エンドヌクレアーゼとの組合せを提供する。
【００２８】
図２は、ＨＢＶゲノムを図示する。一部の実施形態では、本発明は、図２に示す、ＨＢＶゲノムなどのゲノム内の重要な特性に対する１つまたはいくつかのガイドＲＮＡを使用する。図２を参照して、ＨＢＶはＰｒｅＳ１で宿主細胞に結合することによってその感染サイクルを開始する。ＰｒｅＳ１に対するガイドＲＮＡは、コード配列の５’末端に位置する。エンドヌクレアーゼ消化は、挿入／欠失を導入し、ＰｒｅＳ１翻訳のフレームシフトを生じる。ＨＢＶは、同一の反復配列ＤＲ１およびＤＲ２を両末端にならびにＲＮＡキャプシド形成シグナルイプシロンを５’末端に有する長いＲＮＡの形態を経由してそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）は、ＲＮＡをＤＮＡに転換する。Ｈｂｘタンパク質は、ウイルス複製および宿主細胞機能の重要な制御因子である。ＲＴに対するＲＮＡによってガイドされる消化は、挿入／欠失を導入し、ＲＴ翻訳のフレームシフトを生じる。ガイドＲＮＡ  ｓｇＨｂｘおよびｓｇＣｏｒｅは、ＨｂｘおよびＨＢＶコアタンパク質のコーディングにフレームシフトだけでなく、ＤＲ２−ＤＲ１−イプシロンを含有する全領域の欠失ももたらす。組合せでの４つのｓｇＲＮＡは、ＨＢＶゲノムの小片への全体の破壊をもたらす可能性がある。
【００２９】
図２は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって標的化されたＨＢＶゲノム中の重要な部分を示している。
【００３０】
図３は、ＨＢＶに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲアッセイから得られたゲルを示している。レーン１、３、６：ＲＴ、Ｈｂｘ−ＣｏｒｅおよびＰｒｅＳ１に隣接するＨＢＶゲノムのＰＣＲアンプリコン。レーン２、４、５および７：ｓｇＨＢＶ−ＲＴ、ｓｇＨＢＶ−Ｈｂｘ、ｓｇＨＢＶ−Ｃｏｒｅ、ｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１で処理したＰＣＲアンプリコン。
【００３１】
本発明は、前述のガイドＲＮＡを提供する。実証するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイはｃａｓ９タンパク質および標的領域に隣接するＤＮＡアンプリコンを用いて実施された。図２に示すとおりＤＮＡ電気泳動は、標的部位での強度の消化を示している。
【００３２】
細胞でＣＲＩＳＰＲ活性を達成するために、ｃａｓ９およびガイドＲＮＡをコードする発現プラスミドは目的の細胞（例えば、ＨＢＶ  ＤＮＡを保有する細胞）に送達される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで実証するために抗ＨＢＶ効果は、細胞増殖、成長および形態をモニタリングすることならびにＤＮＡ完全性および細胞中のＨＢＶ  ＤＮＡロードを分析することによって評価することができる。
【００３３】
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを送達するために本発明は、標的組織の浸透性を増大させ、治療用化合物の取り込みを調節するための種々の方法の使用を提供する。これらの送達方法は、次の、超音波媒介送達（高周波および低周波の両方またはキャビテーション性もしくは非キャビテーション性）、イオン泳動経皮送達、電気穿孔法、化学物質媒介送達、角質層の熱アブレーション、磁気泳動、フォトメカニカル波ならびにマイクロダーマブレーションおよびマイクロニードルなどの機械的方法の１つまたは複数を含む場合がある。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるPrausnitzおよびLanger、Transdermal  drug  delivery、Nature  Biotechnology  ２６巻、１２６１〜１２６８頁（２００８年）を参照されたい。上記の方法の大部分は、角質層を越える経皮送達ならびに細胞膜流動性を誘導し、本発明の核酸組成物が細胞内に通過できるようにすることによる細胞内送達介する送達における適用を含む。
【００３４】
種々の実施形態では、エネルギーは、超音波により細胞または組織に送達されてよい。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるSmith、Perspectives  on  transdermal  ultrasound  mediated  drug  delivery、Int  J  Nanomedicine.  ２００７年１２月;２巻（４号）：５８５〜５９４頁を参照されたい。これらの方法は、ソノフォレーシスまたはフォノフォレーシスと称されることもある。超音波媒介経皮薬物送達は、超音波振動数の範囲で使用されてよく、一般に高周波（例えば、およそ１〜３ＭＨｚ）または低周波（例えば、およそ２０ｋＨｚ）に分類される。超音波媒介経皮薬物送達は、キャビテーション性および非キャビテーション性の方法に分類されることもある。低周波超音波は、一般に角質層のキャビテーション誘導二重層障害を通じた経皮薬物輸送を増強することにさらに有効である。同文献。低周波超音波により角質層で生成されたキャビテーションバブルの浸透性効果は、数時間持続する場合がある。Prausnitz、２００８年。
【００３５】
超音波は、任意の組織で、被包された超音波マイクロバブルの形態で細胞膜を越える化合物の通過を促進するために使用できる。それぞれの内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるNozakiら、Enhancement  of  ultrasound-mediated  gene  transfection  by  membrane  modification、The  Journal  of  Gene  Medicine、５巻、１２号、１０４６〜１０５５頁、２００３年１２月、Liuら、Encapsulated  ultrasound  microbubbles:  Therapeutic  application  in  drug/gene  delivery、Journal  of  Controlled  Release、１１４巻、１号、２００６年８月１０日、８９〜９９頁を参照されたい。マイクロバブルとの組合せでの低強度超音波は、安全な遺伝子送達方法として近年大きな注目を集めている。超音波は、組織透過効果を示す。それは、非侵襲性で部位特異的である。超音波媒介マイクロバブルは、さまざまな組織への薬物および核酸の非侵襲的送達のための革新的な方法として提案された。超音波トリガー薬物送達では組織透過効果は、超音波造影剤、ガス充填マイクロバブルを使用して強められてよい。核酸の送達のためのマイクロバブルの使用は、標的領域を通る微小血管通過の際の、焦点を合わせた超音波ビームによるＤＮＡロードマイクロバブルの破壊が、非標的化領域を温存する一方で、マイクロバブルシェルの破壊により局所的形質導入を生じるという仮定に基づいている。その内容が参照により組み込まれるTsutsuiら、２００４年、The  use  of  microbubbles  to  target  drug  delivery、Cardiovasc  Ultrasound  ２巻：２３頁を参照されたい。
【００３６】
小さな、親油性化合物は、非キャビテーション超音波で送達できるが、他の、大きな化合物では成功は限定的である。熱は一部の化合物の経皮送達を増強することが示されており、超音波媒介送達の一態様は超音波による組織での熱の生成である。
【００３７】
超音波は、単一のエレメントまたはＢｌａｔｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から入手可能なものなどの他の公知のタイプの振動子を使用して加えられてよい。したがって一部の実施形態では、本発明は、図５に示すとおり超音波振動子３０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００３８】
図５は、抗ウイルス治療を送達するためのキット５００を示す。キット５００は、超音波振動子３０１を含み、組織にエネルギーを加えるように作動可能であり；ウイルスの遺伝物質中の標的を切断するためにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼをコードする遺伝子１０３を含む核酸５０１；またはウイルスの遺伝物質中の標的を切断するためにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼのいずれかを含むデバイスを有する。ある特定の実施形態では、核酸５０１は、プログラム可能なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
【００３９】
任意選択でキット５００は、ヒトゲノムに相補的ではないウイルスゲノム中の標的に好ましくはハイブリダイズするさらに１つのガイドＲＮＡ１０５を含んでよい。キットは、内腔を有する細長部材５０２を含んでよく、ここで前記内腔は被験体内の処置部位への核酸の送達のために構成されている。核酸は、細長部材内のマイクロバブル中で提供されてよい。
【００４０】
ある特定の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼはＣａｓ９であり、マイクロバブルは、１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む。細長部材は、針であってよい。好ましくは、超音波振動子３０１は、低強度、非キャビテーション超音波を提供するように作動する。
【００４１】
代替的実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）５０５としてガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ここでガイドＲＮＡはウイルス遺伝物質内の標的に相補的であり、ヒトゲノム内のいかなる標的にも相補的ではない。キットは内腔を有する細長部材５０２を含んでよく、ここで前記内腔は、被験体内の処置部位へのＲＮＰ５０５の送達のために構成されている。任意選択でＲＮＰ５０５は、例えば脂質を含む場合があるナノ粒子中に被包されている。好ましくは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【００４２】
ある特定の実施形態では、経皮送達は、皮膚組織の電気穿孔により増強され得る。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるPrausnitzら、Electroporation  of  mammalian  skin:  A  mechanism  to  enhance  transdermal  drug  delivery、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９０巻、１０５０４〜１０５０８頁、１９９３年１１月を参照されたい。
【００４３】
図６は、抗ウイルス治療を送達するためのキット６００を示す。キット６００は、組織にエネルギーを加えるように作動可能な電気穿孔デバイス４０１；および（ｉ）ウイルスの遺伝物質中の標的を切断するようにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸；または（ｉｉ）ウイルスの遺伝物質中の標的を切断するようにプログラムされたプログラム可能なヌクレアーゼのいずれかを含む。
【００４４】
好ましくは、電気穿孔発生器４０３および少なくとも１つの電極４０５を含む電気穿孔デバイス４０１。プログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであってよい。
【００４５】
キット６００は、内腔を有する細長部材６０６（例えば、針）を含んでよく、ここで前記内腔は被験体内の処置部位への核酸の送達のために構成されている。任意選択で少なくとも１つの電極４０５は、核酸でコーティングされている。プログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸は、プログラム可能なヌクレアーゼをコードする遺伝子１０３を含むｍＲＮＡ６０１であってよい。ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子などのナノ粒子に被包されていてよい。好ましくは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００４６】
ある特定の実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、活性リボ核タンパク質（ＲＮＰ）５０５としてガイドＲＮＡ１０５と複合体化されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ここでガイドＲＮＡは、ウイルス遺伝物質内の標的に相補的であり、ヒトゲノム内のいかなる標的にも相補的でない。
【００４７】
電気穿孔法は、細胞膜を可逆的に破壊するための電気の高電圧短パルスの使用を含む。電気穿孔法は、キャビテーション超音波と同様に、皮膚の脂質二重層構造物を破壊し、浸透性を増大させ、それにより薬物送達を増強する。電気穿孔法により作製されたエレクトロポアは、処置後数時間持続でき、経皮輸送は、小分子薬、ペプチド、ワクチンおよびＤＮＡについて数桁増大され得る。疼痛および角質層下の神経由来の筋肉刺激などの電気穿孔法の副作用は、電場を角質層内に限定するために密接な間隔の微小電極を使用することにより最小化できる。Prausnitz、２００８年。
【００４８】
細胞膜の電気穿孔は、細胞膜流動性を増大させ、個々の細胞への化合物の通過を可能にするために使用されてよい。それぞれの内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるHoら、Electroporation  of  Cell  Membranes:  A  Review、Critical  Reviews  in  Biotechnology、１６巻、４号、１９９６年、Zhangら、Development  of  an  Efficient  Electroporation  Method  for  Iturin  A-Producing  Bacillus  subtilis  ZK、Int.  J.  Mol.  Sci.２０１５年、１６巻、７３３４〜７３５１頁を参照されたい。細胞膜の電気穿孔は、経皮適用に関して上に記載と同じ原理を使用する。同文献。細胞生存能が本発明の方法に必須であることから、高電圧短パルスの適用には注意が必要である。
【００４９】
電気穿孔法は、例えばＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能なＧｅｍｉｎｉ  Ｘ２  ｓｙｓｔｅｍなどの電気穿孔発生器４０３および電極４０５を含む電気穿孔デバイス４０１を使用して実施されてよい。それにより一部の実施形態では、本発明は、図６に示すとおり、電気穿孔発生器４０３および電極４０５を含む電気穿孔デバイス４０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、ならびに潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００５０】
種々の実施形態では、本発明の核酸組成物は、例えば遺伝子銃を使用するバイオリスティック形質転換またはパーティクルボンバードメントにより宿主細胞に導入されてよい。そのそれぞれの内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるGaoら、Nonviral  Gene  Delivery:  What  We  Know  and  What  Is  Next、AAPS  J.  ２００７年３月;９巻（１号）：Ｅ９２−Ｅ１０４頁、Yangら、In  vivo  and  in  vitro  gene  transfer  to  mammalian  somatic  cells  by  particle  bombardment、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、１９９０年;８７巻：９５６８〜９５７２頁を参照されたい。遺伝子銃を通じたパーティクルボンバードメントは、例えば皮膚、粘膜または限定された領域内の外科的に露出した組織の細胞に本発明の組成物を導入するために使用されてよい。パーティクルボンバードメント方法では、核酸は金粒子の表面に沈着し、次にこれは、例えば加圧ガスによって細胞または組織中へと加速されて、その結果、金粒子の推進力（momentum）により核酸が細胞中に運ばれる。同文献。
【００５１】
パーティクルボンバードメントは、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能なＨｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  Ｓｙｓｔｅｍなどの遺伝子銃を使用して実施されてよい。それにより一部の実施形態では、本発明は、図７に示すとおり、遺伝子銃５０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００５２】
種々の実施形態では、経皮送達は、イオン泳動により増強される場合がある。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるRawatら、Transdermal  Delivery  by  Iontophoresis、Indian  J  Pharm  Sci.  ２００８年１月〜２月;７０巻（１号）：５〜１０頁を参照されたい。イオン泳動は、角質層を越える輸送のための電気的駆動力を提供するための皮膚への低電圧電流の継続的適用を含む。Prausnitz、２００８年。電荷を有する治療用化合物は、角質層を越える電位を生じさせることおよび上述の電流を適用することによって角質層に運ぶことができる。イオン泳動送達の１つの利点は、電流レベルを変更することによって薬物送達の速度を調節する能力である。顕著な電荷を有さない化合物は、角質層中の固定アニオン（例えば、ケラチン）の代わりに移動性カチオン（例えば、Ｎａ＋）の移動によって生成された水の電気浸透流によって角質層を越えて移動し得る。同文献。
【００５３】
イオン泳動は、例えばＭｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｄｅｖｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能なＭＩＣ２  Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒおよび付属物などのイオン泳動コントローラー６０３、リード６０５および導電性パッド６０７を含むイオン泳動デバイス６０１を使用して実施されてよい。したがって一部の実施形態では、本発明は、図８に示すとおり、イオン泳動コントローラー６０３、リード６０５および導電性パッド６０７を含むイオン泳動デバイス６０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、ならびに潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、マイクロダーマブレーションまたはマイクロニードルなどの組織への化合物の送達を増強する機械的手段が使用されてよい。マイクロニードルは、非常に短い針で突き通すことによって角質層を選択的に透過性にする。Pausternitz、２００８年を参照されたい。マイクロニードルは、種々の小分子、タンパク質およびナノ粒子の皮膚浸透性を増大させることが示されており、皮膚への化合物の放出を調節するための徐放パッチにおいて使用できる。同文献。マイクロニードルが皮膚組織内の神経のレベルまで突き通さないことから、経皮薬物投与を増強する比較的痛みの少ない手段を示す。化合物は、マイクロニードルおよび中空内にコーティングされても被包されてもよく、マイクロニードルも使用されてよい。同文献。マイクロニードルは、皮膚へのミクロン規模の経路を作ることによって経皮薬物投与を増強し、マイクロニードルそれ自体が化合物でコーティングされているまたはそれを被包している場合に皮膚に化合物を運ぶこともできる。同文献。
【００５５】
３Ｍ（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から入手可能な固体マイクロニードルパッチなどのマイクロニードルパッチ７０１は、本発明の組成物を送達するために使用できる。ある特定の実施形態では、３Ｍ（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から入手可能なＨｏｌｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍなどの中空マイクロニードル送達システムは、本発明の組成物を送達するために使用できる。それにより一部の実施形態では、本発明は、図９に示すとおり、マイクロニードルパッチ７０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００５６】
本発明により意図される経皮投与の別の機械的方法は、マイクロダーマブレーションである。マイクロダーマブレーションは、研磨材の使用により角質層を取り除くことからなる。皮膚浸透に対するバリアを物理的に除去することによって、化合物の経皮送達は増強される。Prausnitz、２００８年を参照されたい。
【００５７】
マイクロダーマブレーションは、Ｍａｔｔｉｏｌｉ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手可能なＵｌｔｒａｐｅｅｌ  Ｃｒｙｓｔａｌなどのマイクロダーマブレーダー８０１を使用して実施されてよい。それにより一部の実施形態では、本発明は、図１０に示すとおりマイクロダーマブレーダー８０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００５８】
ある特定の実施形態では、組織への核酸の送達を増強するために熱エネルギーが組織に加えられる。Parusnitz  ２００８年を参照されたい。そのような１つの方法、熱アブレーションでは、角質層にミクロン規模の穿孔を生成するために皮膚表面が選択的に加熱される。同文献。熱は、組織表面をマイクロ秒間またはミリ秒間、数百度に加熱するために短い、高強度バーストで加えられてよい。同文献。これらの短いバーストは、組織を生存可能に保つ深部組織への熱の伝播を防ぎ、患者の痛みを予防する。同文献。熱は、角質層中の水を蒸発させるために使用され、膨張した水は層にミクロン規模の穴を生じさせる。同文献。種々の実施形態では、熱は、レーザーもしくは他の光学的手段、電波（ＲＦ）、超音波によりまたは電流を使用して生成されてよい。
【００５９】
熱エネルギーは、それぞれの内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０３１８８４６号またはLeeら、Microsecond  Thermal  Ablation  of  Skin  for  Transdermal  Drug  Delivery、J  Control  Release.  ２０１１年８月２５日;１５４巻（１号）：５８〜６８頁に記載のデバイスなどの例えば熱アブレーションデバイスを使用して組織に加えられてよい。それにより一部の実施形態では、本発明は、図１１に示すとおり、熱アブレーションデバイス９０１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００６０】
本発明の方法において有用なエネルギー増強薬物送達の他の方法は、磁気泳動およびフォトメカニカル波の使用を含む。磁気泳動、または経皮薬物送達を増強するための磁場の使用は、角質層の浸透性を変更すると考えられていないが、代わりにイオン泳動（iontopohoresis）における電流の使用と同様に、組織に磁気運動により化合物を運ぶように作用する。それぞれの内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるMurthyら、Magnetophoresis  for  enhancing  transdermal  drug  delivery:Mechanistic  studies  and  patch  design、Journal  of  Controlled  Release、１４８巻、２号、２０１０年１２月１日、１９７〜２０３頁;米国特許出願公開第２００２／０１４７４２４号を参照されたい。磁気ナノ粒子は、細胞膜を越えて本発明の核酸を送達するために使用されてもよい。核酸キャリアは、超音波および磁場の両方に応答できる、すなわち、磁気的および音響的に活性なリポスフェア（ＭＡＡＬ）である。基本的前提は、治療剤が磁気ミクロ粒子または磁気ナノ粒子に付着している、またはその中に被包されていることである。これらの粒子は、機能を有することができるポリマーもしくは金属コーティングされた磁気コアを有してよい、またはポア内に沈殿された磁気ナノ粒子を含有する多孔性ポリマーからなる場合がある。ポリマーまたは金属コーティングに機能を持たせることによって、例えば本発明の治療用核酸を宿主細胞内の標的ウイルスゲノムに付着させることができる。粒子／治療剤複合体は、本明細書で述べる任意の経皮的方法によりまたは血流への注射もしくは他の公知の方法により身体に導入されてよい。次に磁場が一般に高磁場、高勾配、希土類磁石から導入され、標的部位に焦点が合わされ、粒子が磁場に入ると粒子への力は、それらを捕捉し、標的で溢出させる。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるGuoら、Recent  Advances  in  Non-viral  Vectors  for  Gene  Delivery、Acc  Chem  Res.  ２０１２年７月１７日;４５巻（７号）：９７１〜９７９頁を参照されたい。
【００６１】
磁気泳動は、米国特許出願公開第２００２／０１４７４２４号に記載されているものなどの磁気薬物送達システムを使用して実行されてよい。それにより一部の実施形態では、本発明は、図１２に示すとおり、磁気薬物送達システム１００１、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００６２】
レーザーは、経皮薬物送達に関連するおよび上に考察された経皮薬物送達の利益を提供するように角質層を直接取り除くために使用されてよい。追加的に、限定されたアブレーションによりレーザーによって生成されるフォトメカニカル波は、組織浸透性を増大させ、角質層を一時的にだけ改変することによって薬物送達を増強することが示されている。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるLeeら、Photomechanical  Transdermal  Delivery:  The  Effect  of  Laser  Confinement、Lasers  in  Surgery  and  Medicine  ２８巻：３４４±３４７頁（２００１年）を参照されたい。Ｌｅｅにおいて記載のとおりレーザーは、溶液リザーバーの上方の標的に、次に組織にフォトメカニカル波を伝播するために組織表面の上方に向けられてよい。同文献。レーザーは、例えばＮｅｗｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能である。それにより一部の実施形態では、本発明は、図１３に示すとおり、レーザー１００１、標的１１０３およびＣａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクターを含む溶液、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡを含む、ウイルス感染を処置するためのシステムを提供する。
【００６３】
種々の実施形態では、化学浸透増強剤は、単独でまたは経皮薬物送達を増強する上記の方法の１つもしくは複数との組合せで使用されてよい。内容がすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるMitragotri、Synergistic  Effect  of  Enhancers  for  Transdermal  Drug  Delivery、Pharm.  Res.  １７巻、１３５４〜１３５９頁を参照されたい。化学物質浸透増強剤は、例えば、プロピレングリコール、オレイン酸、ＤＭＳＯ、エタノール、リノール酸、アゾン、リモネン、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、イソプロピルミリステート、グリセロールトリオレートおよびリン酸緩衝食塩水を含んでよい。
【００６４】
本発明の組成物は、皮下、経皮、水力学的遺伝子送達によって、局所または任意の他の好適な方法を含む任意の好適な方法によって送達されてよい。一部の実施形態では、組成物１０１は、キャリアに提供され、ヒト皮膚への局所適用のために好適である。組成物は、宿主中の組織への送達によってインサイテュで細胞に導入されてよい。宿主細胞に組成物を導入することは、組成物を宿主におけるウイルス感染の局部リザーバーに、非全身性に例えば局所的に送達することを含んでよい。
【００６５】
本発明の組成物は、医薬の局所送達、皮膚送達、皮内送達または経皮送達のために皮膚表面に適用できる任意の許容可能な製剤などの、許容可能な局所キャリア中で皮膚の患部に送達されてよい。許容可能な局所キャリアと本明細書に記載の組成物との組合せは、本発明の局所製剤と称される。本発明の局所製剤は、当技術分野において周知の方法、例えばREMINGTON:  THE  SCIENCE  AND  PRACTCE  OF  PHARMACY  １５７７〜１５９１頁、１６７２〜１６７３頁、８６６〜８８５頁（Alfonso  R.  Gennaro編）、Ghosh,  T.  K.ら、TRANSDERMAL  AND  TOPICAL  DRUG  DELIVERY  SYSTEMS（１９９７年）などの標準的参考文献によって提供される方法により組成物を局所キャリアと混合することによって調製される。
【００６６】
本明細書に記載の化合物の局所送達のために有用な局所キャリアは、局所的投与医薬品のための当技術分野において公知の任意のキャリア、例えばこれだけに限らないが、多価アルコールまたは水などの許容可能な溶媒；クリームまたはローションなどの乳濁液（水中油または油中水乳濁液のいずれか）；マイクロエマルション；ゲル；軟膏；リポソーム；粉末；および標準的眼科用調製物などの水溶液または懸濁液であってよい。
【００６７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物を送達するために使用される局所キャリアは、乳濁液、ゲルまたは軟膏である。クリームおよびローションなどの乳剤は、本発明による使用のための好適な局所製剤である。乳剤は、一方の相が液滴として他方に直径０．１μｍから１００μｍの範囲で分散する、少なくとも２つの非混和性相を含む分散系である。乳化剤は、典型的には安定性を改善するために含まれる。
【００６８】
別の実施形態では、局所キャリアは、ゲル、例えば２相ゲルまたは単相ゲルである。ゲルは、液体によって相互に浸透した小さな無機粒子または大きな有機分子の懸濁物からなる半固体の系である。ゲル塊が小さな分離した無機粒子のネットワークを含む場合、それは２相ゲルとして分類される。単相ゲルは、分散した高分子と液体との間に明らかな境界は存在しないような、液体全体に均一に分散された有機高分子からなる。本発明における使用のために好適なゲルは、REMINGTON:  THE  SCIENCE  AND  PRACTICE  OF  PHARMACY  １５１７〜１５１８頁（Alfonso  R.  Gennaro編、１９版、１９９５年）に開示されている。本発明における使用のための他の好適なゲルは、米国特許第６，３８７，３８３号（２００２年５月１４日発行）；第６，５１７，８４７号（２００３年２月１１日発行）；および第６，４６８，９８９号（２００２年１０月２２日発行）に開示されている。使用され得るポリマー増粘剤（ゲル化剤）は、化粧品および製薬産業においてしばしば使用される親水性および水−アルコール性ゲル化剤などの当業者に公知のものを含む。好ましくはゲル化剤は、組成物の重量で約０．２％から約４％の間で含む。剤は、一般名カルボマーを与えられた架橋結合アクリル酸ポリマーであってよい。これらのポリマーは、水に溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは他のアミン塩基などの苛性材料での中和で透明またはわずかに濁ったゲルを形成する。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、局所キャリアは、軟膏である。軟膏は、あったとしても極めて少ない水を含有する油性の半固体である。好ましくは、軟膏は、ワックス、ワセリン、またはゲル化ミネラルオイルなどの炭化水素ベースである。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の局所製剤において使用される局所キャリアは、水溶液または懸濁液、好ましくは水溶液である。周知の眼科用溶液および懸濁液は、本発明における使用のために好適な局所キャリアである。本発明の水性局所製剤のｐＨは、好ましくは約６から約８の範囲内である。ｐＨを安定化させるため、好ましくは有効量のバッファが含まれる。一実施形態では、緩衝剤は、水性局所製剤中に、製剤の約０．０５から約１重量パーセントの量で存在する。浸透圧調整剤は、本発明の水性局所製剤に含まれていてもよい。好適な浸透圧調整剤の例は、これだけに限らないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、デキストロース、グリセリンおよびプロピレングリコールを含む。浸透圧剤の量は、製剤の望ましい特性に応じて広く変化し得る。一実施形態では、浸透圧調整剤は、製剤の約０．５から約０．９重量パーセントの量で水性局所製剤中に存在する。好ましくは本発明の水性局所製剤は、０．０１５から０．０２５Ｐａ．ｓ（約１５ｃｐｓから約２５ｃｐｓ）の範囲の粘度を有する。本発明の水性溶液の粘度は、粘度調整剤、例えばこれだけに限らないが、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロクサマー、カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースを加えることによって調整され得る。
【００７１】
本発明の局所製剤は、保護剤、吸着剤、粘滑剤、軟化剤、保存剤、抗酸化剤、保湿剤、緩衝剤、可溶化剤、皮膚浸透剤および界面活性剤などの許容される賦形剤を含んでよい。好適な保護剤および吸着剤は、これだけに限らないが、散布剤、ステアリン酸亜鉛（zinc  sterate）、コロジオン、ジメチコン、シリコーン、炭酸亜鉛、アロエベラゲルおよび他のアロエ産物、ビタミンＥ油、アラトイン、グリセリン、ワセリンならびに酸化亜鉛を含む。好適な粘滑剤は、これだけに限らないが、ベンゾイン、ヒロドキシプロピルセルロース、ヒロドキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルアルコールを含む。好適な軟化剤は、これだけに限らないが、動物性および植物性脂肪および油、ミリスチルアルコール、アラムおよび酢酸アルミニウムを含む。好適な保存剤は、これだけに限らないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミド、塩化デカリニウムおよび塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物；硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、およびチメロサールなどの水銀剤；アルコール剤、例えば、クロロブタノール、フェニルエチルアルコールおよびベンジルアルコール；抗菌性エステル、例えばパラキドロキシ安息香酸のエステル；ならびにクロルヘキシジン、クロロクレゾール、安息香酸およびポリミキシンなどの他の抗微生物剤を含む。二酸化塩素（ＣｌＯ２）、好ましくは、安定化二酸化塩素は、本発明の局所製剤での使用のための好ましい保存剤である。好適な抗酸化剤は、これだけに限らないが、アルコルビン酸およびそのエステル、亜硫酸水素ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、トコフェロールならびにＥＤＴＡおよびクエン酸などのキレート剤を含む。好適な保湿剤は、これだけに限らないが、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、尿素およびプロピレングリコールを含む。本発明における使用のために好適な緩衝剤は、これだけに限らないが、酢酸バッファ、クエン酸バッファ、リン酸バッファ、乳酸バッファおよびホウ酸バッファを含む。好適な可溶化剤は、これだけに限らないが、四級塩化アンモニウム、シクロデキストリン、安息香酸ベンジル、レシチンおよびポリソルベートを含む。好適な皮膚浸透剤は、これだけに限らないが、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、オクチルフェニルポリエチレングリコール、オレイン酸、ポリエチレングリコール４００、プロピレングリコール、Ｎ−デシルメチルスルホシキド、脂肪酸エステル（例えば、イソプロピルミリステート、メチルラウレート、グリセロールモノオレートおよびプロピレングリコールモノオレート）；ならびにＮ−メチルピロリドンを含む。
【００７２】
一部の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ９などの標的遺伝物質を切る酵素の遺伝子１０３をコードしているベクター、および潜伏ウイルスを標的とし、ヒトゲノム中にマッチを有さないｇＲＮＡ、局所キャリアおよび図５〜１３に示すデバイスなどの、皮膚または他の組織への局所キャリアの送達を補助するために構成されたデバイスを含むシステムを提供する。
【００７３】
ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、とりわけリポソーム、アルブミンベース粒子、ＰＥＧ化タンパク質、生分解性ポリマー薬物コンポジット、ポリマー性ミセル、デンドリマーなどの全身治療のためのナノシステムにコンジュゲートされる。参照により組み込まれるDavisら、２００８年、Nanotherapeutic  particles:  an  emerging  treatment  modality  for  cancer、Nat  Rev  Drug  Discov.  ７巻（９号）：７７１〜７８２頁を参照されたい。リポソームなどの長期循環高分子キャリアは、増強された浸透性を活用でき、腫瘍血管からの優先的な血管外溢出について効果を保持する。ある特定の実施形態では、本発明の複合体は、細胞への送達のためにリポソームまたはポリマーソームにコンジュゲートまたは被包される。例えば、リポソームアントラサイクリンは、高効率の被包を達成し、リポソームダウノルビシンおよびペグ化リポソームドキソルビシンなどの循環が長く延長されたバージョンを含む。Krishnaら、Carboxymethylcellulose-sodium  based  transdermal  drug  delivery  system  for  propranolol、J  Pharm  Pharmacol.  １９９６年４月;４８巻（４号）：３６７〜７０頁を参照されたい。これらの細胞送達システムは、本明細書に記載の方法により身体に経皮的に導入され得る。
【００７４】
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを送達するために本発明は、水力学的遺伝子送達の使用も提供することができる。この技術は、内皮細胞および実質細胞の浸透性を増強するために毛細血管中の水力学圧を調節する（Hydrodynamic  Gene  Delivery:  Its  Principles  and  Applications、Molecular  Therapy（２００７年）１５巻  １２号、２０６３〜２０６９頁）。ヒトでの水力学的遺伝子送達の最初の臨床検査は、the  9th  Annual  Meeting  of  the  American  Society  of  Gene  Therapy  (Clinical  Study  with  Hydrodynamic  Gene  Delivery  into  Hepatocytes  in  Humans)で報告された。水力学的遺伝子送達は、ＡＡＶ送達において見られる潜在的宿主免疫応答（肝臓に標的化されたアデノ随伴ベクターに対する抗体媒介中和への長期感受性）を回避する。
【００７５】
水力学的遺伝子送達は、肝臓移植にも適用できる（肝臓移植における水力学的プラスミドＤＮＡ遺伝子治療モデル）。肝臓重量の４０〜７０％の注射容量が遺伝子送達に有効であることが見出されている。水力学的遺伝子送達と標的化エンドヌクレアーゼとの組合せは、潜在的に肝臓移植物からＨＢＶを排除でき、さらに適格な器官を提供できる。
【００７６】
標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ）の送達は、ラミブジンおよびテルビブジンなどの従来の抗ウイルス薬と併用されてよい。このようにウイルスロードはエンドヌクレアーゼ処置前に大きく低減でき、処置効率を改善することができる。
【００７７】
水力学的遺伝子送達に関して組成物は、血管に近位の細胞でポアを生成するために十分な圧力で送達される。水力学的またはエネルギー増強経皮遺伝子送達は、好ましくはエンドヌクレアーゼ酵素をコードするプラスミドなどの核酸を送達するために使用される。好ましい実施形態では、酵素はＣａｓ９である。
【００７８】
Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ免疫系の一部として見出された。そこでは、Ｃａｓ９は外来ＤＮＡを記憶し、その後、次いでＣａｓ９が切る場所の、ガイドＲＮＡの２０塩基対スペーサー領域に相補的な領域を探すために外来ＤＮＡを巻き戻すことによって外来ＤＮＡを切る。Ｃａｓ９は、ＤＮＡに部位特異的二重鎖切断を生じさせるために使用でき、非相同性末端結合および相同組換えを通じた遺伝子不活性化または異種遺伝子の導入をもたらすことができる。遺伝子編集のための他の例示的ツールは、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮタンパク質を含む。
【００７９】
Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡに相補的なほとんどすべての配列を切断できる。天然のＣａｓ９は、会合してガイド−ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を作製する２つの異なるＲＮＡからなるガイドＲＮＡおよびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を使用する。追加的にまたは代替的にＣａｓ９標的化は、キメラ単一ガイドＲＮＡの操作により単純化され得る。
【００８０】
研究は、Ｃａｓ９が２本の標的ＤＮＡ鎖の切断にそれぞれ関与しているＲＮａｓｅ  ＨおよびＨＮＨエンドヌクレアーゼ相同性ドメインを含有していることを示唆している。ＲＮａｓｅ  Ｈに類似している配列は、ＲｕｖＣフォールド（ＲＮａｓｅ  Ｈファミリーのメンバーの１つ）を有し、ＨＮＨ領域はＴ４  Ｅｎｄｏ  ＶＩＩ（ＨＮＨエンドヌクレアーゼファミリーのメンバーの１つ）としてフォールドする。Ｃａｓ９についての以前の研究は、ＨＮＨドメインが標的ＤＮＡの相補性配列切断に関与し、ＲｕｖＣが非相補性配列について関与していることを実証した。本発明の方法および材料は、ｃａｓ９遺伝子およびショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの遺伝子を含むプラスミドを使用する。ｓｓＲＮＡは、ウイルスゲノムの一部に相補的である。
【００８１】
図４は、ある特定の実施形態によるプラスミドを図示している。
【００８２】
ウイルスゲノムがＢ型肝炎ウイルスゲノムである場合、プラスミドは、ＰｒｅＳ１、ＤＲ１、ＤＲ２、ポリメラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、ＨｂｘおよびコアＯＲＦなどのＢ型肝炎ウイルスゲノム中の位置を標的化する１つまたは複数のｓｇＲＮＡの遺伝子を含有してよい。好ましい実施形態では、１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、ｓｇＨＢＶ−ＣｏｒｅおよびｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１からなる群から選択される１つを含む。
【００８３】
水力学的遺伝子送達について組成物は、例えば被験体の標的位置の血管にバルーンカテーテルを進め、バルーンを膨らませ、バルーンカテーテルの管腔を介して組成物を送達することによって、血管内送達カテーテールを介して送達されてよい
【００８４】
参照による組み込み
特許、特許出願、特許公開、学術雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書の参照および引用は、本開示全体を通じて行われている。すべてのそのような文書は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
均等物
本発明およびその多くのさらなる実施形態、付加的に本明細書に示し、記載するものへの種々の改変は、本明細書に引用する科学的および特許の文献を参照することを含んで本文書全体の内容から当業者に明らかになる。本明細書の主題は、重要な情報、例示および指針を含有しており、本発明の種々の実施形態およびその均等物での本発明の実施に適合できる。
【実施例】
【００８６】
（実施例１）
一実施形態では、本発明の方法は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を標的とする上記の遺伝子送達方法を使用する。ヒト人口の４０％超がＨＢＶに感染しており、１年間に２億４０００万人の慢性ＨＢＶキャリアおよびおよそ６２０，０００人のＨＢＶ関連死を生じている。ＨｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーのプロトタイプメンバーであるヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含有する外側のリポタンパク質コーティング（エンベロープとも称される）によって囲まれた２７ｎｍヌクレオカプシドコア（ＨＢｃＡｇ）からなる、４２ｎｍの一部２本鎖のＤＮＡウイルスである。ウイルスは、３から３．３ｋｂのほどけた環状の一部二重鎖のＤＮＡを含有するエンベロープ付きビリオンおよび、ビリオンＤＮＡ鋳型中のギャップを修復でき、逆転写酵素活性を有するビリオン結合ＤＮＡ依存性ポリメラーゼを含む。ＨＢＶは、ポリメラーゼ（Ｐ）、コア（Ｃ）、表面（Ｓ）およびＸタンパクをコードする４個の重複するＯＲＦを含むおよそ３２００ｂｐの環状、一部二重鎖のＤＮＡウイルスである。感染では、ウイルスヌクレオカプシドは、細胞に侵入し、ウイルスゲノムが送達される核に達する。核では、第２鎖のＤＮＡ合成が完了され、両鎖中のギャップは、３．５、２．４、２．１および０．７ｋｂ長である４つのウイルスＲＮＡの転写のための鋳型として働く共有結合性閉環状ＤＮＡ分子をもたらすように修復される。これらの転写物は、ポリアデニル化され、それらがウイルスヌクレオカプシドおよびプレコア抗原（Ｃ、ｐｒｅ−Ｃ）、ポリメラーゼ（Ｐ）、エンベロープＬ（大）、Ｍ（中）、Ｓ（小））、および転写トランス活性化タンパク質（Ｘ）に翻訳される細胞質に輸送される。エンベロープタンパク質は、それ自体を内在性膜タンパク質として小胞体（ＥＲ）の脂質膜に挿入する。ゲノム全体にわたり、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）と呼ばれる３．５ｋｂ分子種は、ＨＢＶポリメラーゼおよびタンパク質キナーゼと共にコア粒子にパッケージングされ、マイナス鎖ＤＮＡの逆転写のための鋳型として働く。ＲＮＡからＤＮＡへの転換は、粒子内で生じる。
【００８７】
ＨＢＶゲノム上の塩基対の番号付けは制限酵素ＥｃｏＲ１の切断部位または、ＥｃｏＲ１部位が存在しない場合は相同部位に基づいている。しかし、コアタンパク質の開始コドンまたはＲＮＡプレゲノムの最初の塩基に基づく他の番号付け方法も使用される。ＨＢＶゲノム中のすべての塩基対は、少なくとも１つのＨＢＶタンパク質をコードすることに関与している。しかしゲノムは、転写のレベルを制御し、ポリアデニル化の部位を決定し、さらにヌクレオカプシドにキャプシド形成するための特異的転写物に印を付ける遺伝エレメントも含有している。４個のＯＲＦは、さまざまなインフレームの開始コドンの使用により７個の異なるＨＢＶタンパク質の転写および翻訳をもたらす。例えば、小さなＢ型肝炎表面タンパク質は、リボソームがａｄｗゲノムの１５５位のＡＴＧで翻訳を始める場合に生成される。中程度のＢ型肝炎表面タンパク質は、リボソームが３２１１位の上流ＡＴＧで始める場合に生成され、タンパク質の５’末端に５５アミノ酸の付加を生じる。
【００８８】
ＯＲＦ  Ｐは、ゲノムの大部分を占め、Ｂ型肝炎ポリメラーゼタンパク質をコードしている。ＯＲＦ  Ｓは、３個の表面タンパク質をコードしている。ＯＲＦ  Ｃは、肝炎ｅタンパク質およびコアタンパク質の両方をコードしている。ＯＲＦ  Ｘは、Ｂ型肝炎Ｘタンパク質をコードしている。ＨＢＶゲノムは、ウイルス複製を生じさせるために必要な多数の重要なプロモーターおよびシグナル領域を含有している。４個のＯＲＦ転写は、４個のプロモーターエレメント（ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、コアおよびＸ）ならびに２個のエンハンサーエレメント（Ｅｎｈ  ＩおよびＥｎｈ  ＩＩ）によって調節されている。すべてのＨＢＶ転写物は、ゲノム中の１９１６〜１９２１にわたる領域に位置する共通のアデニル化シグナルを共有している。得られる転写物は長さ３．５ヌクレオチドから０．９ヌクレオチドの範囲である。コア／プレゲノムプロモーターの配置のために、ポリアデニル化部位は差次的に利用される。ポリアデニル化部位は、カノニカル真核生物ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）ではなくヘキサヌクレオチド配列（ＴＡＴＡＡＡ）である。ＴＡＴＡＡＡは、非効率的に働くことが公知であり（９）、ＨＢＶによる差次的使用に好適である。
【００８９】
ゲノムによってコードされる、Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳと称される４個の公知の遺伝子がある。コアタンパク質は、遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によってコードされ、その開始コドンはプレコアタンパク質が産生される上流インフレームＡＵＧ開始コドンに先行されている。ＨＢｅＡｇは、プレコアタンパク質のタンパク質分解プロセシングによって産生される。ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子Ｐによってコードされている。遺伝子Ｓは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、１個の長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を３個のセクション、ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２およびＳに分割する３個のインフレーム開始（ＡＴＧ）コドンを含有する。複数の開始コドンのために、大、中および小（ｐｒｅ−Ｓ１＋ｐｒｅ−Ｓ２＋Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ２＋Ｓ、またはＳ）と称される３個の異なるサイズのポリペプチドが産生される。遺伝子Ｘによってコードされるタンパク質の機能は、十分に理解されていないが、肝臓がんの発症に関連している。それは細胞成長を促進する遺伝子を刺激し、成長制御分子を不活性化する。
【００９０】
ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体の逆転写によってそのゲノムを複製する。ＲＮＡ鋳型は、最初に１本鎖ＤＮＡ分子種（マイナス鎖ＤＮＡ）に転換され、それは次にプラス鎖ＤＮＡ合成のための鋳型として使用される。ＨＢＶでのＤＮＡ合成は、プラス鎖ＤＮＡ合成のためのプライマーとしてオリゴリボヌクレオチドを使用し、合成は１本鎖ＤＮＡ上の内部の位置で主に開始する。プライマーはＲＮａｓｅ  Ｈ切断を介して生成され、ＲＮＡ鋳型の５’末端からの配列非依存性の大きさ（measurement）である。この１８ｎｔ  ＲＮＡプライマーは、マイナス鎖ＤＮＡの３’末端にアニールし、このプライマーの３’末端は１２ｎｔ直列反復配列である、ＤＲ１内に位置している。大部分のプラス鎖ＤＮＡ合成は、プライマー転座（primer  translocation）の結果としてマイナス鎖ＤＮＡの他方の末端近くに位置する１２ｎｔ直列反復配列、ＤＲ２から開始する。プラス鎖プライミングの部位は、重要である。インサイテュでのプライミングは、二重鎖直鎖状（ＤＬ）ＤＮＡゲノムを生じる一方で、ＤＲ２からのプライミングは、環状化と称される、第２の鋳型切り替えの完了に続くほどけた環状（ＲＣ）ＤＮＡゲノムの合成をもたらす場合がある。なぜヘパドナウイルスがプラス鎖ＤＮＡ合成をプライミングするためにこのさらなる複雑性を有するのかは明らかでないままだが、プライマー転座の機構は、将来性がある治療標的である。ヘパドナウイルス（ヒト病原体、Ｂ型肝炎ウイルスを含む）慢性キャリア状態の維持のためにウイルス複製が必要であることから、複製を理解し、治療標的を明らかにすることは、キャリアにおいて疾患を抑えるために不可欠である。
【００９１】
ＰｒｅＳ１に対するガイドＲＮＡは、コード配列の５’末端に位置する。エンドヌクレアーゼ消化は、挿入／欠失を導入し、ＰｒｅＳ１翻訳のフレームシフトを生じる。ＨＢＶは、同一の反復配列ＤＲ１およびＤＲ２を両末端にならびにＲＮＡキャプシド形成シグナルイプシロンを５’末端に有する長いＲＮＡの形態を経由してそのゲノムを複製する。ポリメラーゼ遺伝子の逆転写酵素ドメイン（ＲＴ）は、ＲＮＡをＤＮＡに転換する。Ｈｂｘタンパク質は、ウイルス複製および宿主細胞機能の重要な制御因子である。ＲＴに対するＲＮＡによってガイドされる消化は、挿入／欠失を導入し、ＲＴ翻訳のフレームシフトを生じる。ガイドＲＮＡ  ｓｇＨｂｘおよびｓｇＣｏｒｅは、ＨｂｘおよびＨＢＶコアタンパク質のコーディングにフレームシフトだけでなく、ＤＲ２−ＤＲ１−イプシロンを含有する全領域の欠失ももたらす。組合せでの４つのｓｇＲＮＡは、ＨＢＶゲノムの小片への全体の破壊をもたらすことができる。
【００９２】
図２は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって標的化されるＨＢＶゲノムの重要な部分を示している。
【００９３】
図３は、ＨＢＶに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＲＩＳＰＲアッセイから得られたゲルを示している。レーン１、３、６：ＲＴ、Ｈｂｘ−コアおよびＰｒｅＳ１に隣接するＨＢＶゲノムのＰＣＲアンプリコン。レーン２、４、５および７：ｓｇＨＢＶ−ＲＴ、ｓｇＨＢＶ−Ｈｂｘ、ｓｇＨＢＶ−Ｃｏｒｅ、ｓｇＨＢＶ−ＰｒｅＳ１で処理したＰＣＲアンプリコン。
【００９４】
したがって、本発明の物質は、ＨＢＶウイルスゲノムを断片化する（fragment  and  HBV  virus  genome）ことが示される。
【００９５】
（実施例２）
電気穿孔法は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に導入するために使用できる。ＨＰＶ１６＋がん細胞をＨＰＶ１６特異的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）で処理し、ＨＰＶ１６＋がん細胞を死滅させることを見出した。図１４に例示のとおり、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをＳｉＨａ  ＨＰＶ−１６＋細胞に電気穿孔法により導入した。次いで細胞を培養し、生細胞数を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して取得した。
【００９６】
図１５は、ＨＰＶ−１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子に沿う種々のｓｇＲＮＡの標的位置を示す。図１６は、図１５に例示のＨＰＶ−１６  Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子に沿う標的を有する種々のｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの電気穿孔による導入後の細胞数を例示する。細胞数は、ｓｇＨＰＶ１８対照に対して正規化し、Ｃａｓ９含有ＲＮＰ投与量のμｇでプロットした。ｓｇＨＰＶ１６  Ｅ６−１、ｓｇＨＰＶ１６  Ｅ７−２およびｓｇＨＰＶ１６  Ｅ７−３を含むＲＮＰでの電気穿孔は、図１６に示すとおり対照と比較してすべて細胞数の低減を生じた。
【００９７】
図１７は、ＨＰＶ−１６のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子上の標的位置および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマー位置を例示している。図１８は、種々のＨＰＶ１６特異的ＲＮＰでの処理の１および２日後のＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子に焦点を合わせたｑＰＣＲ結果をｓｇＨＰＶ１８  ＲＮＰ対照に対して正規化して示す。ｓｇＨＰＶ１６  Ｅ６−１、ｓｇＨＰＶ１６  Ｅ７−２およびｓｇＨＰＶ１６  Ｅ７−３ガイドＲＮＡを含むＲＮＰは、Ｅ６またはＥ７遺伝子でＨＰＶ１６  ＤＮＡの切断をすべて示した。処理の１および６日後の生細胞数をｓｇＨＰＶ１８対照に対して正規化して図１９に示す。やはり、３個のＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７標的化ＲＮＰは、ＨＰＶ１６＋がん細胞の電気穿孔後にＨＰＶ１６細胞数を低減させる能力を示している。
【００９８】
（実施例３）
電気穿孔法は、エンドヌクレアーゼをガイドＲＮＡと共にコードするｍＲＮＡを導入するために使用できる。ＨＰＶ１６＋がん細胞をＨＰＶ１６特異的ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡで電気穿孔法によって処理し、ＨＰＶ１６＋がん細胞を死滅させることを見出した。図２０に例示のとおり、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡをコードするｍＲＮＡをＳｉＨａ  ＨＰＶ−１６＋細胞に電気穿孔法により導入した。次いで細胞を培養し、生細胞数を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して取得した。
【００９９】
図２１は、種々のＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの組合せを用いたヌクレオフェクション後１、３および６日後の正規化細胞数をすべてｓｇＨＰＶ１８対照に対して正規化して示している。図２２は、６μｇの種々のｓｇＲＮＡおよびさまざまなＣａｓ９  ｍＲＮＡで処理した細胞についての６日後の細胞数をｓｇＨＰＶ１８対照に対して正規化して示している。図２１および図２２の両方がＨＰＶ１６特異的ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲｎａでヌクレオフェクトした細胞において細胞数の低減を示している。
【０１００】
（実施例４）
ＨＰＶ１８＋がん細胞をＨＰＶ１８特異的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）で処理し、ＨＰＶ１８＋がん細胞を死滅させることを見出した。図２３に例示のとおり、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡを含むＲＮＰをＳｉＨａ  ＨＰＶ−１８＋細胞に電気穿孔法により導入した。次いで細胞を培養し、生細胞数を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して取得した。
【０１０１】
図２４は、ＨＰＶ−１８のＥ６遺伝子に沿う種々のｓｇＲＮＡの標的位置を示す。図２５は、図２４に例示のＨＰＶ−１８  Ｅ６遺伝子を標的化する種々のｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの電気穿孔法による導入後の細胞数を例示する。細胞数は、ｓｇＥＢＶ対照に対して正規化されている。ＨＰＶ１８特異的ＲＮＰを含むＲＮＰでの電気穿孔は、図２５に示すとおり対照と比較してすべて細胞数の低減を生じた。図２６は、ＲＮＰフォーマットでのまたはｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡフォーマットでのｓｇＨＰＶ１８Ｅ６−２／Ｃａｓ９を用いた電気穿孔法の５日後のＨＰＶ−１８＋がん細胞についての生細胞数を比較して示している。両方の方法は、明らかに細胞数の低減をもたらした。
【０１０２】
図２７は、μｇ用量のＣａｓ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質によるｍＲＮＡおよびＲＮＰ処理細胞での生細胞数の比較を示している。ｍＲＮＡ処理は、低い投与量でＲＮＰ処理よりも大きく低減させ、投与量を増加させると、それらの処理法は同様の結果を生じた。
【０１０３】
（実施例５）
本発明の実施形態は、ＨＢＶなどの種々のウイルスのＤＮＡを標的化する誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入するために使用できる。Ｃａｓ９は種々のＨＢＶ特異的ガイドＲＮＡと協調して、ウイルスゲノム中のある特定の部位（cite）での標的化切断により細胞中のウイルスＤＮＡロードを低減することが示されている。図２８は、ＨＢＶエピソームＤＮＡ細胞モデルを例示する。示すとおりＣａｓ９＋ＧＦＰ＋ＨＥＤ２９３細胞にＨＢＶゲノムプラスミドをトランスフェクトした。次いでＨＢＶ特異的ｓｇＲＮＡを、レンチウイルスベクターを使用する形質導入により導入した。次いで細胞を回収し、ＨＢＶ  ＤＮＡ切断をＴ７Ｅ１アッセイによって測定し、ＨＢＶ  ＤＮＡをｑＰＣＲによって測定した。
【０１０４】
図２９は、モデルで使用される種々のｓｇＲＮＡのＨＢＶゲノム上での標的位置を、ＨＢＶ  ＤＮＡ切断を評価するために使用されるプライマーセット標的の位置と共に示している。図３０は、ｓｇＲＴ  ＲＮＡ、ｓｇＨＢｘ  ＲＮＡ、ｓｇＣｏｒｅ  ＲＮＡおよびｓｇＰｒｅＳ１  ＲＮＡを形質導入された細胞中のＨＢＶ  ＤＮＡの切断を示すゲル電気泳動の結果を示している。図３１は、未処理細胞およびＨＢＶ特異的ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９で処理した細胞においてｑＰＣＲによって決定されたＨＢＶ  ＤＮＡ量を示している。４個の検査したｓｇＲＮＡそれぞれは、未処理細胞と比較してＨＢＶ  ＤＮＡ量の低減を示した。図３０および３１に例示する結果は、処理の２日後の未選別細胞由来のものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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