(57)【要約】【課題】アンジェルマン症候群（AS）は、出生数15,000に1人発生する遺伝子疾患である。重度の精神遅滞と発作、発話困難と運動失調を特徴とする。ASに関与する遺伝子は、ユビキチンリガーゼのE6-APをコードするUBE3Aであることが発見された。この遺伝子の特徴は、ニューロン特異的な母親性刷り込みである。AS症例の多くで母親由来のUBE3A遺伝子に変異又は欠失あり、その他に、片親性ダイソミーまたは母親由来遺伝子の異常なメチル化によるものがある。重度の精神遅滞を特徴とする人間の疾患の殆どが脳の構造の異常を伴うのに対し、巨視的な解剖学的変化はASとは関連付けられていない。【解決手段】  細胞からの分泌と隣接神経細胞による取り込みを可能にする付加配列を伴うUbe3aタンパク質を作成した。これにより、ニューロンにE6-AP機能タンパク質を供給し、疾患病状から救う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写開始配列、
前記転写開始配列の下流に配置された、配列番号1、配列番号6、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号7のcDNA、配列番号14のcDNA、または相同配列である、UBE3A配列、
前記転写開始配列の下流に配置された、配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号3のcDNA、または相同配列である、分泌配列、および、
前記転写開始配列の下流に配置された、配列番号4、配列番号11、配列番号5のcDNA、または相同配列である、細胞取り込み配列、
を含むUBE3Aベクター。
【請求項２】
前記転写開始配列が、サイトメガロウィルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記転写開始配列の上流に配置されたサイトメガロウイルス最初期エンハンサー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
プラスミドをさらに含み、該プラスミドは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドであり、該組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いていることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
前記組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、pTRプラスミドであることを特徴とする、請求項5に記載のベクター。
【請求項７】
前記分泌配列は、前記UBE3A配列の上流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項８】
前記細胞取り込み配列は、前記UBE3A配列の上流で前記分泌配列の下流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項９】
転写開始配列を有する骨格プラスミドを用意することと、
UBE3Aコンストラクトを作成することと、
前記UBE3Aコンストラクトを前記転写開始配列の下流に挿入することとを含み、
前記UBE3Aコンストラクトを作成することは、さらに、
配列番号1、配列番号6、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号7のcDNA、配列番号14のcDNA、または相同配列である、UBE3A配列を用意することと、
配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号3のcDNA、または相同配列である、分泌配列を前記UBE3A配列に付加することと、
配列番号4、配列番号11、配列番号5のcDNA、または相同配列である、細胞取り込み配列を前記XXXに付加することとを含む、
UBE3Aベクターの合成方法。
【請求項１０】
前記ベクターを増幅宿主に挿入することと、
前記増幅宿主を抗生物質選択に晒すことと、ここで、前記骨格プラスミドは抗生物質耐性遺伝子を有し、
前記増幅宿主を、抗生物質選択を含む培地中で増殖させることと、
増殖した前記増幅宿主を回収することと、
前記ベクターを前記増幅宿主から単離することと、をさらに含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子であり、前記抗生物質選択は、アンピシリン選択であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記骨格プラスミドを少なくとも1つのエンドヌクレアーゼで切断することと、
前記骨格プラスミドの切断端に前記UBE3Aコンストラクトを結合させることとをさらに含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミドは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドであり、該組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いていることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
UBE3A欠損疾患の治療方法であって、
UBE3A欠損疾患を患う患者の脳にベクターを投与することを含み、
該ベクターは、
転写開始配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された、配列番号1、配列番号6、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号7のcDNA、配列番号14のcDNA、または相同配列である、UBE3A配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された、配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号3のcDNA、または相同配列である、分泌配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された、配列番号4、配列番号11、配列番号5のcDNA、または相同配列である、細胞取り込み配列と、を含み、
前記UBE3A欠損疾患は、アンジェルマン症候群、プラダ―・ウィリー症候群またはハンチントン病であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記脳にベクターを投与することが、該ベクターを脳に注射することを含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターが、海馬または脳室に注射されることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターが両側に注射されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターが、約5.55×1011 から約2.86×1012ゲノム/g脳質量で投与されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターが、5.55×1011 から2.86×1012ゲノム/g脳質量、2.86×1012ゲノム/g脳質量、2.40×1012ゲノム/g脳質量、9.80×1011ゲノム/g脳質量または5.55×1011ゲノム/g脳質量で投与されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2015年5月7日に出願された「アンジェルマン症候群の遺伝子治療法のための組み換えUBE3A遺伝子」と題する米国仮出願No．62/158,269の優先権を主張し、参照により、該出願が本明細書中に組み込まれているものとする。
【０００２】
本発明は、アンジェルマン症候群の治療に関する。より詳しくは、本発明は、アンジェルマン症候群治療のための治療方法と治療用組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
アンジェルマン症候群（AS）は、ニューロンに影響を及ぼす遺伝子疾患であり、出生数15,000に1人の割合で発症すると推定されている（非特許文献１）。ただし、おそらく誤診が原因で、実際にASと診断されている数は更に多い。
【０００４】
アンジェルマン症候群は、特に言語技能および運動技能に関する知的および発育的発達の遅滞および低下に現れる一連の機能障害である。特に、ASは、言語によるコミュニケーションがないか、または殆どなく、いくらかの非言語コミュニケーションと、運動失調、頻繁な笑いおよび微笑み、および、興奮性動作を含む傾向を有することによって定義される。
【０００５】
より進行した症例では、重度の精神遅滞、一般に３歳以前または３歳までに開始するコントロールが難しいことのある発作、頻繁な笑い（非特許文献2）、小脳髄症、異常脳波の原因となる。重症例では、患者は、言語の発達がないか、または、使用語数が５〜１０語に留まる場合がある。動作は一般にぎこちなく、歩行は、一般に、手を叩く動きを伴い、ぎこちない。患者は、特に人生の早期から一般にてんかんがあり、また、睡眠時無呼吸を患い、一般に、一度の睡眠時間が５時間にしかならない。社交性があり人との接触を望む。皮膚および眼の色素が殆どまたは全くない場合や、吸啜障害および嚥下障害、熱さに対する感受性、水への執着がある場合がある。UBE3A欠損マウスの研究により、長期シナプス可塑性の障害が示されている。現在、アンジェルマン症候群には治療方法がなく、治療は、緩和的である。例えば、てんかん発作の低減のために抗けいれん薬治療が用いられ、言語技能および運動技能の向上のために、言語療法および理学療法が用いられている。
【０００６】
UBE3A遺伝子は、ASに関与する遺伝子であり、ヒト刷り込み遺伝子の小さなファミリーの一つである点で独特である。UBE3Aは、15番染色体上にあり、E6AP C末端相同（HECT）タンパク質（E6関連タンパク質（E6AP））をコードする（非特許文献3）。UBE3Aは脳内において空間的に定義された母性刷り込みを受け、父親由来のコピーはDNAメチル化によって発現抑制される（非特許文献4）。このようにして、母親由来のコピーのみが活性化し、父親由来の染色体は、脳のその領域のニューロンのプロテオソームに殆どまたは全く作用しない。15番染色体の一部の不活性化、転座または欠失は、このため、機能の非代償性喪失を引き起こす。いくつかの研究により、E3-APタンパク質レベルの異常がアンジェルマン症候群患者の神経突起接触を変化させることが示唆されている（非特許文献5）。
【０００７】
アンジェルマン症候群の症例の大半（70％）は、UBE3A遺伝子を含む母親由来染色体の15q11-q13のおよそ4Mbの新たに発生した欠失によって起こるが（非特許文献6）、母親由来のコピーの異常なメチル化の結果、その発現を妨げること（非特許文献7、非特許文献8）、または、２コピーの父親由来遺伝子が遺伝される片親性ダイソミー（非特許文献9、非特許文献10）によっても起こり得る。残るAS症例は、母親由来染色体の様々なUBE3A変異を原因とするか、または、遺伝的原因なしに診断される（12-15UBE3Aは、E6関連タンパク質（E6-AP）ユビキチンリガーゼをコードする。E6-APはE3ユビキチンリガーゼの一つであり、このため、標的タンパク質に対する特異性を示す。標的タンパク質には、腫瘍抑制分子p53（非特許文献11）、酵母DNA修復タンパク質Rad23のヒトホモログ（非特許文献12）、E6-AP自体、および、最も新しく特定された標的であるArc（非特許文献13、非特許文献14）が含まれる。
【０００８】
軽症例は、ユビキチン経路のE6-APユビキチンリガーゼタンパク質をコードする、染色体15q11-13のUBE3A遺伝子の変異によると考えられ、より重症例は、15番染色体のより広範囲な欠失に起因すると考えられる。一般に、海馬および小脳におけるUBE3A遺伝子の喪失はアンジェルマン症候群の原因となるが、単一の機能喪失型変異もまた障害の原因となり得る。
【０００９】
解剖学的形態においては、マウスおよびヒトのASの脳に、正常な脳と比較して大きな変化は見られず、認知障害が、本来、発生上の問題ではなく生化学上の問題である可能性を示している（非特許文献15、非特許文献16）。エクソン2の無発現変異による母親由来UBE3A遺伝子の欠陥を有するアンジェルマン症候群マウスモデル（非特許文献15）が使用された。このモデルは、AS患者の特徴となる主要な表現型の再現能力が優れているために、AS研究分野において、信じられないほどの貢献をしてきた。例えば、ASマウスは、誘発性発作、乏しい運動協調性、海馬依存的な学習障害、海馬のLTP（長期増強）の欠陥を有する。ASマウスモデルの認知障害は、以前に、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）のリン酸化状態の異常と関連することが示された（非特許文献17）。αCaMKIIの活性化Thr286部位と抑制Thr305部位の両方におけるリン酸化に有意な増加が見られ（全酵素レベルには変化なし）、全体的な活性低下の原因となっていた。また、シナプス後肥厚部の全CaMKII量の低下もあり、活性CaMKII量の低下を示していた。リン酸化を阻害するThr305部位の点変異のある変異マウスモデルをASマウスと交雑することにより、AS表現型が救われた。つまり、発作活性、運動協調性、海馬依存的な学習、およびLTPが野生型と同等のレベルまで回復した。従って、αCaMKIIの生後の発現は、ASマウスモデルの主要な表現型が、全体的発生障害ではなく生後の生化学的変化によるものであることを示唆している（非特許文献18）。
【００１０】
Ube3aの欠損は、ハンチントン病にも関与している（非特許文献19）。
【００１１】
Matentzoglueは、E6-APが、ホルモンシグナル伝達に関係する非E3活性を有することに注目した（特許文献1）。このため、アンジェルマン症候群、自閉症、てんかん、プラダー・ウィリー症候群、子宮頸癌、脆弱X症候群、およびRet症候群を含む、様々なE6-AP疾患の治療に、アンドロゲン、エストロゲン、グルココルチコイドのようなステロイドの投与が用いられた。Philpotは、トポイソメラーゼ阻害薬を使用して発現抑制された遺伝子を脱メチル化し、これによってUbe3Aの欠損を修正することを提案した（特許文献2）。しかし、当分野における研究および提案された治療法は、ステロイド使用の場合のように基礎疾患に対処していなかったり、または、脱メチル化化合物使用の場合のように自閉症等他の疾患につながる恐れがあったりした。従って、必要とされているのは、安全で効果的な方法で、UBE3A欠損疾患の根本的原因に対処できる治療法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２７２４７２１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０３１７０１８号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Clayton-Smith, Clinical research on Angelman syndrome in the United Kingdom: observations on 82 affected individuals. Am J Med Genet. 1993 Apr 1;46(1):12-5
【非特許文献２】Nicholls, New insights reveal complex mechanisms involved in genomic imprinting. Am J Hum Genet. 1994 May;54(5):733-40
【非特許文献３】Kishino, et al., UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nat Gen. 1997 Jan 15.15(1):70-3
【非特許文献４】Albrecht, et al., Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nat Genet. 1997 Sep;17(1):75-8
【非特許文献５】Tonazzini, et al., Impaired neurite contract guidance in ubuitin ligase E3a (Ube3a)-deficient hippocampal neurons on nanostructured substrates. Adv Healthc Mater. 2016 Apr;5(7):850-62
【非特許文献６】(Kaplan, et al., Clinical heterogeneity associated with deletions in the long arm of chromosome 15: report of 3 new cases and their possible significance. Am J Med Genet. 1987 Sep; 28(1):45-53
【非特許文献７】Buiting, et al., Inherited microdeletions in the Angelman and Prader-Willi syndromes define an imprinting centre on human chromosome 15. Nat Genet. 1995 Apr;9(4):395-400
【非特許文献８】Gabriel, et al., A transgene insertion creating a heritable chromosome deletion mouse model of Prader-Willi and Angelman syndrome. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999 Aug;96(16):9258-63
【非特許文献９】Knoll, et al., Angelman and Prader-Willi syndromes share a common chromosome 15 deletion but differ in parental origin of the deletion. Am J Med Genet. 1989 Fed;32(2):285-90
【非特許文献１０】Malcolm, et al., Uniparental paternal disomy in Angelman’s syndrome. Lancet. 1991 Mar 23;337(8743):694-7
【非特許文献１１】Huibregtse, et al., A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or18. EMBO J. 1991 Dec;10(13):4129-35
【非特許文献１２】Kumar, et al., Identification of HHR23A as a substrate for E6-associated protein-mediated ubiquitination. J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18785-92
【非特許文献１３】Nuber, et al., The ubiquitin-protein ligase E6-associated protein (E6-AP) serves as its own substrate. Eur J Biochem. 1998 Jun 15;254(3):643-9
【非特許文献１４】Greer, et al., The Angelman Syndrome protein Ube3A regulates synapse Development by ubiquitinating arc. Cell. 2010 Mar 5;140(5): 704-16
【非特許文献１５】Jiang, et al., Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 1998 Oct;21(4):799-811
【非特許文献１６】Davies, et al., Imprinted gene expression in the brain. Neurosci Biobehav Rev. 2005 May;29(3):421-430
【非特許文献１７】Weeber,et al  Derangements of hippocampal calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in a mouse model for Angelman mental retardation syndrome. J Neurosci. 2003 Apr;23(7):2634-44
【非特許文献１８】Bayer, et al., Developmental expression of the CaM kinase II isoforms: ubiquitous γ- and δ-CaM kinase II are the early isoforms and most abundant in the developing nervous system. Brain Res Mol Brain Res. 1999 Jun 18;70(1):147-54
【非特許文献１９】Maheshwari, et al., Deficeincy of Ube3a in Huntington’s disease mice brain increases aggregate load and accelerates disease pathology. Hum Mol Genet. 2014 Dec 1;23(23):6235-45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
重度の精神遅滞を特徴とするヒトの疾患の殆どが、脳の構造の異常と関連しているのに対し、ASには、巨視的な解剖学的変化は関連付けられていない。細胞からのUbe3aの分泌を可能にする細胞分泌配列と、隣接する神経細胞による取り込みを可能にする細胞取り込み配列を付加されて含むUbe3aタンパク質を作成した。これにより、ニューロンにE6-AP機能タンパク質を供給し、これにより、疾患病状から救う。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
こうして、UBE3Aベクターを、転写開始配列と、該転写開始配列の下流に配置されたUBEコンストラクトとを用いて作成した。該UBEコンストラクトは、UBE3A配列、分泌配列、細胞取り込み配列から構成される。UBE3A配列の非限定的な例は、配列番号1、配列番号6、配列番号12、配列番号13、15、配列番号7のcDNA、配列番号14のcDNA、または相同配列である。DNA配列の変形形態は、表に示すようなDNAトリプレットコードの保存的変異を含む。具体的な変形形態において、UBE3A配列は、ハツカネズミUBE3A U82122.1、ヒトUBE3A変異体1、変異体2、または変異体3である。分泌配列の非限定的な例は、配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号3のcDNA、または、上述の保存的変異を含むDNA配列の変形形態を含む相同配列である。細胞取り込み配列の非限定的な例は、配列番号4、配列番号11、配列番号5のcDNA、または相同配列である。DNA配列の変形形態は、上述の保存的変異を含む。本発明の具体的変形形態において、分泌配列は、UBE3A配列の上流に配置され、より具体的には、オプションとしてUBE3A配列の上流で分泌配列の下流に配置される。
【００１６】
表１は、重複するトリプレットコードと、対応してコードされるアミノ酸を官能基で分類して示している。
【００１７】
【表１】
2018518946.tif 000003
【００１８】
本発明の変形形態において、転写開始配列は、サイトメガロウイルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターである。本発明は、オプションとしてエンハンサー配列を含む。エンハンサー配列の非限定的な例は、転写開始配列の上流に配置されるサイトメガロウイルス最初期エンハンサー配列である。ベクターは、オプションとして、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントも含む。
【００１９】
変形形態において、ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型２をベースとするプラスミドのようなプラスミドに挿入される。具体的変形形態において、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いている。組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドの非限定的な例は、pTRプラスミドである。
【００２０】
UBE3Aベクターの合成方法も提供される。UBE3Aコンストラクトを、転写開始配列を有する骨格プラスミドに挿入した。ここで、UBE3Aコンストラクトは、UBE3A配列、分泌配列、および細胞取り込み配列で構成される。変形形態においては、UBE3Aコンストラクトを、転写開始配列の下流に挿入した。UBE3A配列の非限定的な例は、配列番号1、配列番号6、配列番号12、配列番号13、配列番号7のcDNA、または相同配列である。DNA配列の変形形態は、表に示すようなDNAトリプレットコードの保存的変異を含む。分泌配列の非限定的な例は、配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号3のcDNA、または、上述の保存的変異を含むDNA配列の変形形態を含む相同配列である。細胞取り込み配列の非限定的な例は、配列番号4、配列番号11、配列番号5のcDNA、または相同配列である。DNA配列の変形形態は、上述の保存的変異を含む。本発明の具体的変形形態において、分泌配列は、UBE3A配列の上流に配置され、より具体的には、がオプションとしてUBE3A配列の上流で分泌配列の下流に配置される。例えば、Ube3a遺伝子をクローニングし、3′DNA配列（他の2つのペプチド配列を伴うN末端）、シグナルペプチド配列およびHIV TAT配列にインフレーム融合し、それらを、AS患者の脳および脊髄における分泌E6-APタンパク質発現のために、組み換えアデノ随伴ウイルスベクターにクローンニングした。オプションとして、骨格プラスミドを少なくとも1つのエンドヌクレアーゼで切断することによってUBEコンストラクトを挿入し、骨格プラスミドの切断端にUBE3Aコンストラクトを結合させた。
【００２１】
ベクターは、その後、オプションとして、抗生物質耐性遺伝子を有する増幅宿主に挿入し、抗生物質耐性遺伝子に応じた抗生物質選択に晒した。増幅宿主は、その後、抗生物質選択を含む培地中で増殖させ、増殖した増幅宿主を回収した。その後、ベクターを、増幅宿主から単離した。本発明の具体的な変形形態において、抗生物質耐性遺伝子は、対応するアンピシリンを抗生物質選択として有する、アンピシリン耐性遺伝子である。
【００２２】
アンジェルマン症候群、プラダ―・ウィリー症候群、またはハンチントン病のようなUBE3A欠損疾患の治療法も提供する。UBE欠損を修正するために、上述のベクターを、UBE3A欠損疾患を患う患者の脳に投与した。ベクターは、オプションとして、注射によって投与した。非限定的な例として、海馬内注射または脳室注射を含む。具体的な変形形態において、ベクターは、両方に注射された。オプションとして、用量は、約5.55×1011ゲノム/g脳質量から約2.86×1012ゲノム/g脳質量,より具体的には5.55×1011 から2.86×1012ゲノム/g脳質量である。用量の非限定的な例は、5.55×1011ゲノム/g脳質量、5.75×1011ゲノム/g脳質量、5.8×1011ゲノム/g脳質量、5.9×1011ゲノム/g脳質量、6.0×1011ゲノム/g脳質量、 6.1×1011ゲノム/g脳質量、6.2×1011ゲノム/g脳質量、6.3×1011ゲノム/g脳質量、6.4×1011 ゲノム/g脳質量、6.5×1011ゲノム/g脳質量、6.6×1011ゲノム/g脳質量、6.7×1011ゲノム/g脳質量、6.8×1011ゲノム/g脳質量、6.9×1011 ゲノム/g脳質量、7.0×1011ゲノム/g脳質量、7.1×1011ゲノム/g脳質量、7.2×1011ゲノム/g脳質量、7.3×1011ゲノム/g脳質量、 7.4×1011ゲノム/g脳質量、7.5×1011ゲノム/g脳質量、7.6×1011ゲノム/g脳質量、7.7×1011 ゲノム/g脳質量、7.8×1011ゲノム/g脳質量、7.9 × 1011ゲノム/g脳質量、8.0×1011ゲノム/g脳質量、8.1×1011ゲノム/g脳質量、8.2×1011ゲノム/g脳質量、8.3×1011ゲノム/g脳質量、8.4×1011ゲノム/g脳質量、8.5×1011ゲノム/g脳質量、8.6×1011ゲノム/g脳質量、 8.7×1011ゲノム/g脳質量、8.8×1011ゲノム/g脳質量、8.9×1011ゲノム/g脳質量、9.0×1011 ゲノム/g脳質量、9.1×1011ゲノム/g脳質量、9.2×1011ゲノム/g脳質量、9.3×1011ゲノム/g脳質量、9.4×1011ゲノム/g脳質量、9.5×1011ゲノム/g脳質量、9.6×1011ゲノム/g脳質量、9.7×1011ゲノム/g脳質量、9.80×1011ゲノム/g脳質量、1.0×1012ゲノム/g脳質量、1.1×1012ゲノム/g脳質量、1.2×1012ゲノム/g脳質量、1.3×1012ゲノム/g脳質量、1.4×1012 ゲノム/g脳質量、1.5×1012ゲノム/g脳質量、1.6×1012ゲノム/g脳質量、1.7×1012ゲノム/g脳質量、1.8×1012ゲノム/g脳質量、1.9×1012ゲノム/g脳質量、2.0×1012ゲノム/g脳質量、2.1×1012ゲノム/g脳質量、2.2×1012ゲノム/g脳質量、2.3×1012ゲノム/g脳質量、2.40 ×1012ゲノム/g脳質量、2.5×1012ゲノム/g脳質量、2.6×1012ゲノム/g脳質量、2.7×1012ゲノム/g脳質量、2.75×1012ゲノム/g脳質量、2.8×1012ゲノム/g脳質量、または2.86×1012ゲノム/g脳質量である.
【００２３】
本発明のより完全な理解のためには、添付図面とともに以下の詳細な説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図示のシグナルペプチドを含むGFPクローンで遺伝子導入されたHEK293細胞からの培地の抗GFPのドットブロットである。
【図２】本発明で使用されるマウスUBE3Aベクターコンストラクトのマップである。主要な遺伝子が示されている。
【図３】プラスミドで遺伝子導入されたHEK293細胞からのE6-APタンパク質の分泌を示すウェスタンブロットである。対照細胞を遺伝子導入された細胞の培地からの培地（cnt txn）、Ube3a遺伝子導入細胞からの培地（Ube3a txn）、および遺伝子導入されていない細胞からの培地（cnt untxn）を、アクリルアミドゲルおよび抗E6-AP抗体上に泳動させた。
【図４】E6-APタンパク質染色面積のパーセンテージを示すグラフである。非トランスジェニック（Ntg）対照マウスは、正常マウスの脳のUbe3a発現レベルを示している。アンジェルマン症候群（AS）マウスは、それらマウス（aka背景染色）の染色レベルを示している。ASマウスの側脳室へのAAV4-STUb注射は、ASマウスと比較したE6-APタンパク質染色レベルの上昇を示している。n=2。
【図５】非トランスジェニックマウスにおける抗EP-A6染色の顕微鏡画像である。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図６】非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図７】注射を受けていないASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。
【図８】注射を受けていないASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。
【図９】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１０】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１１】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳室系（側脳室（LV））の高拡大画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１２】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳室系（第3脳室）の高拡大画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１３】GFPを遺伝子導入された非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-GFP注射で発現は観察されず、上衣細胞および脈絡叢細胞の形質導入だけを示している。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１４】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳の矢状断面である。
【図１５】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の矢状断面である。
【図１６】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の第3脳室（3V）の矢状断面である。
【図１７】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の内角の矢状断面である。
【図１８】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（4V）の矢状断面である。
【図１９】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の第4脳室（LV）の矢状断面である。
【図２０】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す、脳室系の側脳室（LV）および（c）第3脳室（3V）を一層拡大した、脳の矢状断面である。
【図２１】本発明において使用されるヒトUBE3Aベクターコンストラクトのマップである。主要遺伝子が示されている。
【図２２】hSTUbコンストラクトで遺伝子導入されたHEK293細胞ライセートのウェスタンブロットである。タンパク質が、抗E6APで染色された。
【図２３】GDNFシグナルまたはインスリンシグナルを有するhSTUbコンストラクトで遺伝子導入されたHEK293細胞の抗E6APによるドットブロットであり、発現と分泌のためにインスリンシグナルが、よりよく作用していることを示している。
【図２４】抗HAタグ抗体を使用したインスリンシグナル分泌を裏付けるドットブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、単数形（英語原文において“a”、 “an”、 “the”の付されたもの）は、複数の指示対象を含むものとする。従って、例えば、「ポリペプチド（a polypeptide）」)は、2つ以上のポリペプチドの混合物等を含む。
【００２６】
本明細書で使用される「約（about）」は、近似的であることや近いことを意味し、数値または数値範囲の記載である場合には、数値の±15％を意味する。
【００２７】
「投与（administrationまたはadministering）」は、本発明の化合物が単独でまたは他の化合物との組み合わせで患者に送達されるプロセスを記述するために使用される。組成物は、特に、経口、非経口（静脈内および動脈内および他の適切な非経口経路をいう）、髄腔内、筋肉内、皮下、結腸、直腸、経鼻投与を含む、様々な経路で投与されてもよい。これら状態はそれぞれ、疾患または状態を治療するための本発明の化合物の他の投与ルートを使用して容易に治療してもよい。治療的または予防的効果を得るための本発明の化合物および組成物の用量は、当技術分野で周知のように、患者の状況によって決定される。本発明における患者の用量決定は、本発明の化合物若しくは組成物の個々の若しくは単位用量を通して、または、化合物若しくは組成物の組み合わされた若しくは予めパッケージされた若しくは予め調合された用量によって実施されることができる。平均的な40gのマウスは、0.416gの重さの脳を持ち、160gのマウスは、1.02gの重さの脳を持ち、250gのマウスは、1.802gの重さの脳を持っている。平均的なヒトの脳は1508gの重さがあり、これを、本明細書に記載する治療を実施するのに必要なまたは有用な治療量を指示するために、使用可能である。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法によって調合可能である。さらに、本明細書で使用される「薬学的に受容可能な担体」という言葉は、任意の標準的な、薬学的に受容可能な担体を意味する。薬学的に受容可能な担体は、希釈剤、アジュバント、媒体、さらに、インプラント担体、および、不活性な無害の固体または液体の賦形剤、希釈剤、または、本発明の有効成分と反応しないカプセル化材料を含むことができる。例として、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、水、油／水乳濁液のような乳濁液を含むが、これらに限定されない。担体は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物および植物油を含有する、溶媒または分散媒質であってもよい。調合方法は、周知かつ当業者にとって容易に入手可能な多くの情報源に記載がある。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.)には、本発明と組み合わせて使用可能な製剤方法が記載されている。
【００２９】
本明細書で使用される「動物」は、動物界または後生動物に分類される多細胞の真核生物を意味する。この用語は、哺乳動物を含むが、これに限定されない。非限定的例示として、齧歯動物、哺乳動物、水生哺乳動物、犬および猫のような飼育動物、羊、豚、牛、馬のような家畜、および人間を含む。ここで、「動物」（英語で“animal”または複数の“animals”）の用語が使用される場合、当該用語は任意の複数の動物にも適用されることが意図されている。        
【００３０】
本明細書で使用される「相同」の用語は、対象配列に対して少なくとも80％の配列相同性、好ましくは、少なくとも90％の配列相同性、より好ましくは、少なくとも95％の配列相同性を有するヌクレオチド配列、さらに好ましくは、少なくとも98％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を意味する。ヌクレオチド配列の変形形態は、ヌクレオチド配列内の保存的変異、つまり、表に示されるような同じアミノ酸をコードするトリプレットコード内の変異であってもよい。
【００３１】
本明細書で使用される「治療上の有効量」の用語は、アンジェルマン症候群または他のUBE3A関連疾患またはその１つ以上の症状の改善をもたらすか、アンジェルマン症候群または他のUBE3A関連疾患の進行を妨げるか、またはアンジェルマン症候群または他のUBE3A関連疾患の退行を引き起こすために十分な、治療（例えば治療薬または治療ベクター）の量を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される「患者」は、本発明の組成物による予防的治療を含む治療の対象となる動物、好ましくは人間を記述するために使用される。
【実施例１】
【００３３】
分泌｛ぶんぴ｝シグナルの有効性を試験するために、GFPを、ヒトインスリン、GDNFまたはlgKシグナルペプチドとインフレームにクローニングした。コンストラクトをpTRプラスミドに挿入し、HEK293細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）に遺伝子導入した。HEK293細胞は、37℃、5％ CO2で、10％ FBSおよび1％ Pen/Strepを含むダルベッコ変法必須培地（DMEM）中で培養し、80％コンフルエンスで継代培養した。
【００３４】
ベクター（6ウェルプレート中に2μg/ウェル）は、PEI遺伝子導入法を用いて細胞に遺伝子導入した。細胞は、遺伝子導入の2日前に、6ウェルプレート中で、DMEM培地で、ウェル当たり0.5×106細胞で継代培養した。培地は、遺伝子導入前夜に交換した。エンドドキシンフリーなdH2Oを約80℃に加熱し、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO）を溶解した。溶液をそのまま約25℃まで冷まし、水酸化ナトリウムを使用して溶液を中和した。各遺伝子導入ウェルに対し、AAV4−STUbベクターまたは陰性対照（培地のみ）を、200μL毎に2μgで、無血清DMEMに加え、各ウェルに対し、1μg/μLのポリエチレンイミン9μLを混合物に加えた。遺伝子導入混合物を室温で15分インキュベートし、その後、細胞の各ウェルに、ウェル毎に210μLずつ加え、48時間インキュベートした。
【００３５】
各培養ウェルから培地を集め、先細ピペットを使用して、ニトロセルロースメンブレンに2μL滴下した。試料が乾いた後、メンブレンに5％ BSA in TBS-Tを適用し、室温で30分から1時間インキュベートしてメンブレンをブロックし、その後、メンブレンをニワトリ抗GFP（5 μg/mL, Abcam PLC, Cambridge, UK; #ab13970）in BSA/TBS-Tとともに室温で30分インキュベートした。メンブレンを、TBS-Tで３回（各回5分）洗浄した。メンブレンを、HRPとコンジュゲートした抗ニワトリHRPコンジュゲート2次抗体（Southern Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA; #6100-05, 1/3000）とともに室温で30分インキュベートし、その後、メンブレンをTBS-Tで３回（1回15分）洗浄し、引き続き、それぞれ5分で洗浄した。メンブレンを室温でTBSを用いて5分間洗浄し、発光試薬（Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, DE; #WBKLS0100）とともに1分インキュベートした。図１に示すように、メンブレンをGEアマシャム イメージャー 600（General Electric, Fairfield, CA）に記録した。
【００３６】
図１に示されるように、遺伝子導入されていない対照細胞と比較して観察すると、3つの分泌シグナルは全て、細胞からのGFP標識タンパク質放出を引き起こした。3つの分泌コンストラクトのうち、lgKコンストラクトが最も高い分泌レベルを示したが、GDNFクローン2コンストラクトも同様に高いGFP標識タンパク質の分泌を示した。
【実施例２】
【００３７】
pTRプラスミドを用いてマウスUBE3Aベクターを作成した。マウス（Mus musculus）UBE3A遺伝子は、cDNA（U82122.1）；
atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accatcagtt aactgagggc tgtggaaatg aggcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt tcttcgtatg gataacaatg cagcagctat taaagccctt gagctttata aaattaatgc aaaactctgt gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc aaaaggtgca tctaacaact cagagataaa aatgaacaag aaggaaggaa aagattttaa agatgtgatt tacctaactg aagagaaagt atatgaaatt tatgaatttt gtagagagag tgaggattat tcccctttaa ttcgtgtaat tggaagaata ttttctagtg ctgaggcact ggttctgagc tttcggaaag tcaaacagca cacaaaggag gaattgaaat ctcttcaaga aaaggatgaa gacaaggatg aagatgaaaa ggaaaaagct gcatgttctg ctgctgctat ggaagaagac tcagaagcat cttcttcaag gatgggtgat agttcacagg gagacaacaa tgtacaaaaa ttaggtcctg atgatgtgac tgtggatatt gatgctatta gaagggtcta cagcagtttg ctcgctaatg aaaaattaga aactgccttc ctgaatgcac ttgtatatct gtcacctaac gtggaatgtg atttgacata tcataatgtg tatactcgag atcctaatta tctcaatttg ttcattattg taatggagaa tagtaatctc cacagtcctg aatatctgga aatggcgttg ccattatttt gcaaagctat gtgtaagcta ccccttgaag ctcaaggaaa actgattagg ctgtggtcta aatacagtgc tgaccagatt cggagaatga tggaaacatt tcagcaactt attacctaca aagtcataag caatgaattt aatagccgaa atctagtgaa tgatgatgat gccattgttg ctgcttcaaa gtgtttgaaa atggtttact atgcaaatgt agtgggaggg gatgtggaca caaatcataa tgaggaagat gatgaagaac ccatacctga gtccagcgaa ttaacacttc aggagcttct gggagatgaa agaagaaata agaaaggtcc tcgagtggat ccactagaaa ccgaacttgg cgttaaaact ctagactgtc gaaaaccact tatctccttt gaagaattca ttaatgaacc actgaatgat gttctagaaa tggacaaaga ttataccttt ttcaaagttg aaacagagaa caaattctct tttatgacat gtccctttat attgaatgct gtcacaaaga atctgggatt atattatgac aatagaattc gcatgtacag tgaaagaaga atcactgttc tttacagcct agttcaagga cagcagttga atccgtattt gagactcaaa gtcagacgtg accatattat agatgatgca ctggtccggc tagagatgat tgctatggaa aatcctgcag acttgaagaa gcagttgtat gtggaatttg aaggagaaca aggagtaatg agggaggcgt ttccaaagag ttttttcagt tgggttgtgg aggaaatttt taatccaaat attggtatgt tcacatatga tgaagctacg aaattatttt ggtttaatcc atcttctttt gaaactgagg gtcaggttta ctctgattgg catatcctgg gtctggctat ttacaataat tgtatactgg atgtccattt tcccatggtt gtatacagga agctaatggg gaaaaaagga acctttcgtg acttgggaga ctctcaccca gttttatatc agagtttaaa ggatttattg gaatatgaag ggagtgtgga agatgatatg atgatcactt tccagatatc acagacagat ctttttggta acccaatgat gtatgatcta aaagaaaatg gtgataaaat tccaattaca aatgaaaaca ggaaggaatt tgtcaatctc tattcagact acattctcaa taaatctgta gaaaaacaat tcaaggcatt tcgcagaggt tttcatatgg tgactaatga atcgccctta aaatacttat tcagaccaga agaaattgaa ttgcttatat gtggaagccg gaatctagat ttccaggcac tagaagaaac tacagagtat gacggtggct atacgaggga atctgttgtg attagggagt tctgggaaat tgttcattcg tttacagatg aacagaaaag actctttctg cagtttacaa caggcacaga cagagcacct gttggaggac taggaaaatt gaagatgatt atagccaaaa atggcccaga cacagaaagg ttacctacat ctcatacttg ctttaatgtc cttttacttc cggaatattc aagcaaagaa aaacttaaag agagattgtt gaaggccatc acatatgcca aaggatttgg catgctgtaa (配列番号１)
から作成した。
【００３８】
cDNAをサブクローニングし、配列した。マウスUBE3A遺伝子（配列番号１）を、分泌シグナリングペプチドをコードするDNA配列（配列番号２）とHIV TAT配列（配列番号４）に融合した。分泌シグナリングペプチドは、DNA配列；
atg gcc ctg ttg gtg cac ttc cta ccc ctg ctg gcc ctg ctt gcc ctc tgg gag ccc aaa ccc acc cag gct ttt gtc (SEQ ID No. 2)
を有し、タンパク質配列；
MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFV（配列番号３）
をコードし、一方、HIV TAT配列は；
tac ggc aga aag aag agg agg cag aga agg aga (配列番号4)
であり、タンパク質配列；
YGRKKRRQRRR (配列番号5)
をコードする。
【００３９】
配列番号2および配列番号4と融合された配列番号1のコンストラクト配列をpTRプラスミドに挿入した。 Age I および Xho Iエンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを切断し、リガーゼを用いてコンストラクト配列を連結した。ベクターは、図2に示すように、AAV血清型2の末端反復、CMVニワトリベータアクチンハイブリッドプロモーターおよびWPREを含む。組み換えプラスミドはRepおよびCap配列を欠き、宿主DNAへのプラスミドの組み込みが制限されている。
【００４０】
ベクター（AAV4-STUbベクター）は、その後、大腸菌（E. coli, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA; SURE2 cells）に形質転換された。簡略に説明すると、細胞を氷上で平衡化し、1pgから500ngのベクターをE. coliに加え、そのまま1分間インキュベートした。BioRad Gene Pulserを使用し、0.1cmキュベット内で、細胞を電気穿孔した（1.7V, 200オーム）。E. coliは、その後、培地内で60分間培養した後、アンピシリン（50 μg/mL）を含む、ATCC培地1065（American Type Culture Collection, Manassas, VA）のような寒天培地に蒔いた。多量のベクターを集めるため、アンピシリンを含有するブロス内で、E. coliを増殖させた。
【実施例３】
【００４１】
実施例2で作成されたコンストラクトのマウスベクターの特性を、HEK293細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）内で試験した。HEK293細胞は、37℃、5％ CO2で、10％ FBSおよび1％ Pen/Strepを含むダルベッコ変法必須培地（DMEM）中で培養し、80％コンフルエンスで継代培養した。
【００４２】
ベクター（6ウェルプレート中に2μg/ウェル）を、PEI遺伝子導入法を用いて細胞に遺伝子導入した。細胞は、遺伝子導入の2日前に、6ウェルプレート中で、DMEM培地で、ウェル当たり0.5×106細胞で継代培養した。培地は、遺伝子導入前夜に交換した。エンドドキシンフリーなdH2Oを約80℃に加熱し、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO）を溶解した。溶液をそのまま約25℃まで冷まし、水酸化ナトリウムを使用して溶液を中和した。各遺伝子導入ウェルに対し、AAV4-STUbベクターまたは陰性対照（培地のみ）を、200μL毎に2μgで、無血清DMEMに加え、各ウェルに対し、1μg/μlのポリエチレンイミン9μlを混合物に加えた。遺伝子導入混合物を室温で15分インキュベートし、細胞の各ウェルに、ウェル毎に210μLずつ加え、48時間インキュベートした。
【００４３】
AAV4-STUbベクター遺伝子導入細胞、培地のみ遺伝子導入対照細胞、遺伝子導入されていない対照細胞から培地を集めた。培地をウェスタンブロットで泳動させ、ヒトおよびマウスE6-APに対して反応性を示す、ウサギ抗E6-AP抗体（A300-351A, Bethyl Labs, Montgomery, TX）、0.4 μg/mlで染色した。ウサギコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（Southern Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）と2次コンジュゲートを行った。デンシオメトリー法で結果を判定すると、図３に示されるように、AAV4-STUbで遺伝子導入されたHEK293細胞が培地中にE6-APタンパク質を分泌することが示された。
【実施例４】
【００４４】
母親由来UBE3Aに欠失のあるマウスを交雑することにより、トランスジェニックマウスを作成した。（Jiang, et al., Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 1998 Oct;21(4):799-811; Gustin, et al., Tissue-specific variation of Ube3a protein expression in rodents and in a mouse model of Angelman syndrome. Neurobiol Dis. 2010 Sep;39(3):283-91）; Heck, et al., Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Hum Mol Genet. 2008 Jul 15;17(14):2181-9） and GABARB3 ）。マウスを12時間の昼光サイクルで飼育し、餌と水を自由に与えた。月齢3か月のマウスをベクターで治療した。
【００４５】
マウスをイソフルランで麻酔し、定位固定装置（51725D Digital Just for Mice Stereotaxic Instrument, Stoelting, Wood Dale, IL）に置いた。頭蓋の中央部を矢状に切開し、開口を広げるために周囲の皮膚を押し広げた。左右の海馬の位置を特定するために、以下の座標を用いた：AP 22.7mm、L 62.7mm、およびV 23.0mm。マウスは、10 mLハミルトンシリンジによって、各半球内に、20％マンニトール10μL中の濃度1×1012ゲノム/mL (N=2)のAAV4-STUb粒子または媒体（20％マンニトール10μL）のいずれかの、両側海馬内注射を受けた。傷は、生理食塩水で洗浄し、ベットボンド（NC9286393 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）で閉じた。対照動物には、注射を受けていないASマウスと、同腹の野生型マウスが含まれていた（n=2）。マウスは、清潔な、温かいヒーターの上に載せた空のケージ内で回復させ、屠殺するまで単独で飼育した。実験期間を通して、マウスの観察を行った。
【００４６】
治療後30日時点で、販売されている安楽死溶液のSomnasol（登録商標）（0.22 ml/kg）を腹腔内に注射して、マウスを安楽死させた。マウスを安楽死させた後、CSFを回収し、マウスをPBSで灌流し、脳を取り出した。脳は、ショ糖溶液中で凍結保護するに先立って、4％パラホルムアルデヒド溶液内で1晩固定した。ミクロトームで、脳を、25μmの薄片にした。
【００４７】
殆どの組み換え型アデノ随伴ウイルスベクターの研究では、ベクターを直接実質に注射するため、一般的に、細胞の形質導入が限られている（Li, et al., Intra-ventricular infusion of rAAV-1-EGFP resulted in transduction in multiple regions of adult rat brain: a comparative study with rAAV2 and rAAV5 vectors. Brain Res. 2006 Nov 29;1122(1):1-9）。しかし、分泌シグナルリング配列とTAT配列をUbe3Aタンパク質に付加することにより、遺伝子導入された細胞からのHECTタンパク質（すなわちUBE3A）の分泌と近接ニューロンによるペプチドの取り込みが可能となり、離れた部位への注射を、全脳内の別の部位のためのタンパク質供給源として作用させることができる。
【００４８】
屠殺したマウスの脳をミクロトームでスライスし、抗E6-AP抗体（A300-351A, Bethyl Labs, Montgomery, TX）とビオチン標識抗ウサギ2次抗体（Vector Labs #AB-1000）を用いて、E6-APタンパク質の染色を行った。染色は、ABC（Vector Labs）とDAB反応で完成された。切片をZeiss Axio Scan顕微鏡に乗せてスキャンした。染色面積のパーセンテージを、IAE-NearCYTE画像解析ソフトウェア（University of Pittsburgh Starzl Transplant Institute, Pittsburgh, PA）で定量した。
【００４９】
非トランスジェニック（Ntg）対照マウスは、正常マウスの脳のUbe3a発現レベルを示し、図４に示すように約40％であった。これと比較して、アンジェルマン症候群マウス（AS）は、約25％のUbe3aタンパク質染色レベルを示している。ASマウスの側脳室へのAAV4-STUbベクターの挿入は、ベクターがE6-APのレベルを約30〜35％まで増加させたことを示している。
【００５０】
脳スライスの免疫組織化学解析は、非トランスジェニックマウスが、領域特異的染色を伴う比較的高いレベルのE6-APを有していることを示している（図５および図６参照）。アンジェルマン症候群モデルマウスでは、E6-APの染色パターンは類似しているが、E6-APレベルは予想通り極端に減少している（図７および図８参照）。アンジェルマン症候群モデルマウスへのマウスUBE3Aベクター投与は、非トランスジェニックマウスのレベルまでではないものの、E6-APレベル」を上昇させた（図９およ図１０参照）。側脳室の詳細な分析により、UBE3Aベクターの注射により、上衣細胞によるベクター取り込みが起こったことが示されている（図１１参照）。しかし、上衣細胞によるUBE3Aベクター取り込みとE6-AP発現に加えて、図の矢印で示されるように、実質内の近接する細胞も、染色されてE6-AP陽性を示している。さらに、図１２に示されるように、染色は、3d脳室のような、さらに距離の離れた場所にも見られた。このことは、E6-APが遺伝子導入された細胞によって分泌され、近接する細胞によって順調に取り込まれていたことを示し、コンストラクトがE6-APの導入に使用できること、および、アンジェルマン症候群のようなE6-AP発現に関連する全体的な脳の欠陥を治療するための治療用材料として、E6-APコンストラクトを使用できることを裏付けている。図13に示されるように、AAV4-GFPベクターを使用した対照治療においては、対照タンパク質の取り込みを示さず、上衣細胞および脈絡叢細胞の形質導入だけであった。
【００５１】
アンジェルマン症候群モデルマウスの冠状断面の詳細な解析により、UBE3Aコンストラクトの投与が、側脳室内および側脳室周辺のE6-APのレベルを上昇させることが確認された（図１４〜図２０参照）。
【実施例５】
【００５２】
pTRプラスミドを用いて、ヒトベクターコンストラクトを作成した。ヒトUBE3A遺伝子は、cDNA（AH005553.1）；
ggagtagttt actgagccac taatctaaag tttaatactg tgagtgaata ccagtgagta cctttgttaa tgtggataac caatacttgg ctataggaag ttttttagtt gtgtgtttta tnacacgtat ttgactttgt gaataattat ggcttataat ggcttgtctg ttggtatcta tgtatagcgt ttacagtttc ctttaaaaaa catgcattga gttttttaat agtccaaccc ttaaaataaa tgtgttgtat ggccacctga tctgaccact ttctttcatg ttgacatctt taattttaaa actgttttat ttagtgctta aatcttgttn acaaaattgt cttcctaagt aatatgtcta cctttttttt tggaatatgg aatattttgc taactgtttc tcaattgcat tttacagatc aggagaacct cagtctgacg acattgaagc tagccgaatg taagtgtaac ttggttgaga ctgtggttct tattttgagt tgccctagac tgctttaaat tacgtcacat tatttggaaa taatttctgg ttaaaagaaa ggaatcattt agcagtaaat gggagatagg aacataccta ctttttttcc tatcagataa ctctaaacct cggtaacagt ttactaggtt tctactacta gatagataaa tgcacacgcc taaattctta gtctttttgc ttccctggta gcagttgtag ggaaataggg aggttgagga aagagtttaa cagtctcaac gcctaccata tttaaggcat caagtactat gttatagata cagagatgcg taataattag ttttcaccct acagaaattt atattatact caagagtgaa agatgcagaa gcaaataatt tcagtcactg aggtagaatg gtatccaaaa tacaatagta acatgaagga gtactggagt accaggtatg caataggaat ctagtgtaga tggcagggaa gtaagagtgg ccaggaaatg ctaagttcag tcttgaaatg tgactgggaa tcaggcagct atcaactata agtcaaatgt ttacaagctg ttaaaaatga aatactgatt atgtaaaaga aaaccggatt gatgctttaa atagactcat tttcntaatg ctaattttta aaatgataga atcctacaan tcttagctgt aaaccttgtg atttttcagc tgttgtacta aacaacttaa gcacatatac catcagacaa gcccccntcc ccccttttaa accaaaggaa tgtatactct gttaatacag tcagtaagca ttgacattct ttatcataat atcctagaaa atatttatta actatttcac tagtcaggag ttgtggtaaa tagtgcatct ccattttcta cttctcatct tcatacacag gttaatcact tcagtgcttg actaactttt gccttgatga tatgttgagc tttgtacttg agagctgtac taatcactgt gcttattgtt tgaatgtttg gtacaggaag cgagcagctg caaagcatct aatagaacgc tactaccacc agttaactga gggctgtgga aatgaagcct gcacgaatga gttttgtgct tcctgtccaa cttttcttcg tatggataat aatgcagcag ctattaaagc cctcgagctt tataagatta atgcaaaact ctgtgatcct catccctcca agaaaggagc aagctcagct taccttgaga actcgaaagg tgcccccaac aactcctgct ctgagataaa aatgaacaag aaaggcgcta gaattgattt taaaggtaag atgttttatt ttcaattgag aattgttgcc tgaaaaccat gtgggagatt taaatgtatt agtttttatt tgttttttct tctgtgacat aaagacattt tgatatcgta gaaccaattt tttattgtgg taacggacag gaataataac tacattttac aggtctaatc attgctaatt agaagcagat catatgccaa aagttcattt gttaatagat tgatttgaac tttttaaaat tcttaggaaa aatgtattaa gtggtagtga atctccaaaa ctatttaaga gctgtattat gattaatcag tacatgacat attggttcat atttataatt aaagctatac attaatagat atcttgatta taaagaaagt ttaaactcat gatcttatta agagttatac attgttgaaa gaatgtaaaa gcatgggtga ggtcattggt ataggtaggt agttcattga aaaaaatagg taagcattaa attttgtttg ctgaatctaa gtattagata ctttaagagt tgtatatcat aaatgatatt gagcctagaa tgtttggctg ttttactttt agaacttttt gcaacagagt aaacatacat attatgaaaa taaatgttct cttttttcct ctgattttct agatgtgact tacttaacag aagagaaggt atatgaaatt cttgaattat gtagagaaag agaggattat tcccctttaa tccgtgttat tggaagagtt ttttctagtg ctgaggcatt ggtacagagc ttccggaaag ttaaacaaca caccaaggaa gaactgaaat ctcttcaagc aaaagatgaa gacaaagatg aagatgaaaa ggaaaaagct gcatgttctg ctgctgctat ggaagaagac tcagaagcat cttcctcaag gataggtgat agctcacagg gagacaacaa tttgcaaaaa ttaggccctg atgatgtgtc tgtggatatt gatgccatta gaagggtcta caccagattg ctctctaatg aaaaaattga aactgccttt ctcaatgcac ttgtatattt gtcacctaac gtggaatgtg acttgacgta tcacaatgta tactctcgag atcctaatta tctgaatttg ttcattatcg taatggagaa tagaaatctc cacagtcctg aatatctgga aatggctttg ccattatttt gcaaagcgat gagcaagcta ccccttgcag cccaaggaaa actgatcaga ctgtggtcta aatacaatgc agaccagatt cggagaatga tggagacatt tcagcaactt attacttata aagtcataag caatgaattt aacagtcgaa atctagtgaa tgatgatgat gccattgttg ctgcttcgaa gtgcttgaaa atggtttact atgcaaatgt agtgggaggg gaagtggaca caaatcacaa tgaagaagat gatgaagagc ccatccctga gtccagcgag ctgacacttc aggaactttt gggagaagaa agaagaaaca agaaaggtcc tcgagtggac cccctggaaa ctgaacttgg tgttaaaacc ctggattgtc gaaaaccact tatccctttt gaagagttta ttaatgaacc actgaatgag gttctagaaa tggataaaga ttatactttt ttcaaagtag aaacagagaa caaattctct tttatgacat gtccctttat attgaatgct gtcacaaaga atttgggatt atattatgac aatagaattc gcatgtacag tgaacgaaga atcactgttc tctacagctt agttcaagga cagcagttga atccatattt gagactcaaa gttagacgtg accatatcat agatgatgca cttgtccggg taagttgggc tgctagatta aaaacctaat aatggggata tcatgataca gttcagtgaa ttcattttaa aagtgactga aaaaaatgat accatatagc ataggaacac atggacattt ctgatcttat ataagtatta tacttttgtt gttcctgtgc aagtttatag atgtgttcta caaagtatcg gttgtattat ataatggtca tgctatcttt gaaaaagaat gggttttcta aatcttgaaa actaaatcca aagtttcttt cattcagaag agaatagagt gttggacaaa gaccagaaca agagaaatgt ggagataccc aataataagt gtggatgtgc agtcttgaac tgggagtaat ggtacagtaa aaccatacca taaaattata ggtagtgtcc aaaaaattcc atcgtgtaaa attcagagtt gcattattgt ggacttgaag aagcagttgt atgtgggacg gtatcgataa gcttgatatc gaattcctgc agcccggggg atccactagt gtggtaatta atactaagtc ttactgtgag agaccataaa ctgctttagt attcagtgta tttttcttaa ttgaaatatt taacttatga cttagtagat actaagactt aacccttgag tttctattct aataaaggac tactaatgaa caattttgag gttagacctc tactccattg tttttgctga aatgatttag ctgcttttcc atgtcctgtg tagtccagac ttaacacaca agtaataaaa tcttaattaa ttgtatgtta atttcataac aaatcagtaa agttagcttt ttactatgct agtgtctgtt ttgtgtctgt ctttttgatt atctttaaga ctgaatcttt gtcttcactg gctttttatc agtttgcttt ctgtttccat ttacatacaa aaagtcaaaa atttgtattt gtttcctaat cctactcctt gtttttattt tgtttttttc ctgatactag caatcatctt cttttcatgt ttatcttttc aatcactagc tagagatgat cgctatggaa aatcctgcag acttgaagaa gcagttgtat gtggaatttg aaggagaaca aggagttgat gagggaggtg tttccaaaga attttttcag ctggttgtgg aggaaatctt caatccagat attggtaaat acattagtaa tgtgattatg gtgtcgtatc atcttttgag ttagttattt gtttatctta ctttgtaaat attttcagct atgaagagca gcaaaagaag gatttggtat ggattaccca gaatcacaca tcatgactga atttgtaggt tttaggaact gatttgtatc actaatttat tcaaattctt ttatttctta gaaggaatat tctaatgaag gaaattatct ctttggtaaa ctgaattgaa agcactttag aatggtatat tggaacagtt ggagggattt ctttgctttt tgttgtctaa aaccatcatc aaactcacgg ttttcctgac ctgtgaactt caaagaacaa tggtttgaag agtattgaga gactgtctca caagtatgtc atgctcaaag ttcagaaaca ctagctgata tcacattaat taggtttatt tgctataaga tttcttgggg cttaatatan gtagtgttcc cccaaacttt ttgaactcca gaactctttt ctgccctaac agtagctact caggagctga ggcaggagaa ttgtttgaac ctaggaggca gaggttgcag tgagctgaga tcgtgccact ccagcccacc cctgggtaac agagcgagac tccatctcaa agaaaaaaat gaaaaattgt tttcaaaaat agtacgtgtg gtacagatat aagtaattat atttttataa atgaaacact ttggaaatgt agccattttt tgttttttta tgtttatttt tcagctatgg gtggataaag catgaatata acttttctta tgtgttagta gaaaattaga aagcttgaat ttaattaacg tatttttcta cccgatgcca ccaaattact tactacttta ttcctttggc ttcataaaat tacatatcac cattcacccc aatttatagc agatatatgt ggacattgtt ttctcaagtg ctaatataat agaaatcaat gttgcatgcc taattacata tattttaaat gttttatatg cataattatt ttaagtttat atttgtatta ttcatcagtc cttaataaaa tacaaaagta atgtattttt aaaaatcatt tcttataggt atgttcacat acgatgaatc tacaaaattg ttttggttta atccatcttc ttttgaaact gagggtcagt ttactctgat tggcatagta ctgggtctgg ctatttacaa taactgtata ctggatgtac attttcccat ggttgtctac aggaagctaa tggggaaaaa aggaactttt cgtgacttgg gagactctca cccagtaagt tctttgtcat ttttttaatt cagtctctta gattttattt aaatgcaaaa atttaattta tgtcaaaatt ttaaagtttt tgtttagaat ctttgttgat actcttatca ataagataaa aatgttttaa tctgaccgaa gtaccagaaa cacttaaaaa ctcaaagggg gacattttta tatattgctg tcagcacgaa gctttcgtaa gattgatttc atagagaagt gtttctaaac attttgtttg tgttttagtg aaatcttaag agataggtaa aaatcagagt agccctggct aagggtcttg gtagttacaa cgagtgtgcc tgctcctacc acccccaccc ccaccttgag acaccacaga atttctcata gagcacagtg tgaattctat tgctaaattg gtggtatggg gtttctcagc agagaatggg acatcacagt gactgacaat ctttctttta taggttggaa actatttggg ggactggagg gatactgtct acacttttta caatttttat tgataagatt tttgttgtct tctaagaaga gtgatataaa ttatttgttg tattttgtag ttctatggtg gcctcaattt accatttctg gttgctaggt tctatatcag agtttaaaag atttattgga gtatgaaggg aatgtggaag atgacatgat gatcactttc cagatatcac agacagatct ttttggtaac ccaatgatgt atgatctaaa ggaaaatggt gataaaattc caattacaaa tgaaaacagg aaggtaataa atgtttttat gtcacatttt gtctcttcat taacactttc aaagcatgta tgcttataat ttttaaagaa gtatctaata tagtctgtac aaaaaaaaaa caagtaacta agtttatgta aatgctagag tccacttttc taaatcttgg atataagttg gtatgaaagc acacagttgg gcactaaagc cccttttaga gaaagaggac atgaagcagg agatagttaa tagctaagtg tggttgtagt ataaagcaag aagcagggtg tttcttgtat taagctgtaa gcaggaacct catgattaag gtctttatca cagaacaaat aaaaattaca tttaatttac acatgtatat cctgtttgtg ataaaaatac atttctgaaa agtatacttt acgtcagatt tgggttctat tgactaaaat gtgttcatcg ggaatgggaa taacccagaa cataacaagc aaaaaattat gacaaatata tagtatacct ttaagaaaca tgtttatatt gatataattt tttgattaaa tattatacac actaagggta caangcacat tttcctttta tganttngat acagtagttt atgtgtcagt cagatacttc cacatttttg ctgaactgga tacagtaagc agcttaccaa atattctatg gtagaaaact nggacttcct ggtttgctta aatcaaatat attgtactct cttaaaacgg ttggcattta taaatagatg gatacatggt ttaaatgtgt ctgttnacat acctagttga gagaacctaa agaattttct gcgtctccag catttatatt cagttctgtt taatacatta tcgaaattga catttataag tatgacagtt ttgtgtatat ggccttttca tagcttaata ttggctgtaa cagagaattg tgaaattgta agaagtagtt ttctttgtag gtgtaaaatt gaatttttaa gaatattctt gacagtttta tgtatatggc cttttcatag cttaatattg gctataacag agaattgtga aattgttaag aagtaggtgt aaaattgaat ttttaagaat attcttgaat gtttttttct tggaaaaatt aaaaagctat gcagcccaat aacttgtgtt ttgtttgcat agcatattat aagaagttct tgtgattaat gttttctaca ggaatttgtc aatctttatt ctgactacat tctcaataaa tcagtagaaa aacagttcaa ggcttttcgg agaggttttc atatggtgac caatgaatct cccttaaagt acttattcag accagaagaa attgaattgc ttatatgtgg aagccgggta agaaagcagg tgtctgcaaa aagtcatgta tcgatttatt gtttgtaatg atacagtagt atagcagata actaagacat attttcttga atttgcagaa tctagatttc caagcactag aagaaactac agaatatgac ggtggctata ccagggactc tgttctgatt aggtgaggta cttagttctt cagaggaaga tttgattcac caaaggggtg tgtgattttg cttcagacct ttatctctag gtactaattc ccaaataagc aaactcacaa attgtcatct atatacttag atttgtattt gtaatataat caccattttt cagagctaat cttgtgattt atttcatgaa tgaagtgttg ttatatataa gtctcatgta atctcctgca tttggcgtat ggattatcta gtattcctca ctggttagag tatgcttact gctggttaga agataattaa aataaggcta ccatgtctgc aatttttcct ttcttttgaa ctctgcattt gtgaactgtt acatggcttc ccaggatcaa gcactttttg agtgaaatgg tagtctttta tttaattctt aagataatat gtccagatac atactagtat ttccatttta caccctaaaa aactaagccc tgaattctca cagaaagatg tagaggttcc cagttctatc tgcttttaaa caaatgccct tactactcta ctgtctactt ctgtgtacta catcatcgta tgtagttgtt tgcatttggg ccagttggtt ggggcagggg tctttttttc ttttgtccct taatctgtat cactttttcc tcccaaagtt gagttaaagg atgagtagac caggagaata aaggagaaag gataaataaa 
atatataccc aaaggcacct ggagttaatt tttccaaata ttcatttcag tctttttcaa ttcataggat tttgtctttt gctcattact gactgcataa tgtgattata ccatagttta aatagtcact tcctgttact acacacttgg gttttctcaa ttttttacta ttgtagtact aatattttac tatattgtaa tctaatccaa atttttacgt attcagagct gttcaggata aatttgcttg gaaattttta aatcaccaga agtgatacta tcctgataat taacttccaa gttgtctctt aatatagttt taatgcaaat cataagctta tgttagtacc agtcataatg aatgccaaac tgaaaccagt attgtatttt ttctcattag ggagttctgg gaaatcgttc attcatttac agatgaacag aaaagactct tcttgcagtt tacaacgggc acagacagag cacctgtggg aggactagga aaattaaaga tgattatagc caaaaatggc ccagacacag aaaggtaggt aattattaac ttgtgactgt atacctaccg aaaaccttgc attcctcgtc acatacatat gaactgtctt tatagtttct gagcacattc gtgattttat atacaaatcc ccaaatcata ttagacaatt gagaaaatac tttgctgtca ttgtgtgagg aaacttttaa gaaattgccc tagttaaaaa ttattatggg gctcacattg gtttggaatc aaattagtgt gattcattta cttttttgat tcccagcttg ttaattgaaa gccatataac atgatcatct atttagaatg gttacattga ggctcggaag attatcattt gattgtgcta gaatcctgtt atcaaatcat tttcttagtc atattgccag cagtgtttct aataagcatt taagagcaca cactttgcag tcttgtaaaa caggtttgag tattttctcc accttagagg aagttacttg acttctcagt gacctaacct ctaaagtgca tttactgatg tcctctctgt ggttttgttg tggaaagatt tagttaaatg aactgtaaga attcagtacc taaaatggta tctgttatgt agtaaaaact caatggatac agtatcttat catcgtcact agctttgagt aatttatagg ataaaggcaa cttggtagtt acacaacaaa aagtttatga tttgcattaa tgtatagttt gcattgcaga ccgtctcaac tatatacaat ctaaaaatag gagcatttaa ttctaagtgt atttcccatg acttacagtt ttcctgtttt tttccccttt tctctattta ggttacctac atctcatact tgctttaatg tgcttttact tccggaatac tcaagcaaag aaaaacttaa agagagattg ttgaaggcca tcacgtatgc caaaggattt ggcatgctgt aaaacaaaac aaaacaaaat aaaacaaaaa aaaggaagga aaaaaaaaga aaaaatttaa aaaattttaa aaatataacg agggataaat ttt（配列番号６）から作成し、このcDNAは；
MKRAAAKHLIERYYHQLTEGCGNEACTNEFCASCPTFLRMDNNAAAIKALELYKINAKLCDPHPSKKGASSAYLENSKGAPNNSCSEIKMNKKGARIDFKDVTYLTEEKVYEILELCREREDYSPLIRVIGRVFSSAEALVQSFRKVKQHTKEELKSLQAKDEDKDEDEKEKAACSAAAMEEDSEASSSRIGDSSQGDNNLQKLGPDDVSVDIDAIRRVYTRLLSNEKIETAFLNALVYLSPNVECDLTYHNVYSRDPNYLNLFIIVMENRNLHSPEYLEMALPLFCKAMSKLPLAAQGKLIRLWSKYNADQIRRMMETFQQLITYKVISNEFNSRNLVNDDDAIVAASKCLKMVYYANVVGGEVDTNHNEEDDEEPIPESSELTLQELLGEERRNKKGPRVDPLETELGVKTLDCRKPLIPFEEFINEPLNEVLEMDKDYTFFKVETENKFSFMTCPFILNAVTKNLGLYYDNRIRMYSERRITVLYSLVQGQQLNPYLRLKVRRDHIIDDALVRLEMIAMENPADLKKQLYVEFEGEQGVDEGGVSKEFFQLVVEEIFNPDIGMFTYDESTKLFWFNPSSFETEGQFTLIGIVLGLAIYNNCILDVHFPMVVYRKLMGKKGTFRDLGDSHPVLYQSLKDLLEYEGNVEDDMMITFQISQTDLFGNPMMYDLKENGDKIPITNENRKEFVNLYSDYILNKSVEKQFKAFRRGFHMVTNESPLKYLFRPEEIELLICGSRNLDFQALEETTEYDGGYTRDSVLIREFWEIVHSFTDEQKRLFLQFTTGTDRAPVGGLGKLKMIIAKNGPDTERLPTSHTCFNVLLLPEYSSKEKLKERLLKAITYAKGFGML（配列番号7）をコードする。
【００５３】
cDNAをサブクローニングし、配列した。UBE3A変異体1遺伝子（配列番号6）を、
GDNFに基づく；
ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCC（配列番号8）、
インスリンタンパク質からの；
ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCC（配列番号9）、
またはlgKからの；
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT（配列番号10）の、分泌シグナリングペプチドをコードする3つの遺伝子の1つに融合した。
【００５４】
コンストラクトを、CMVニワトリベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターのもとで、hSTUbベクターに挿入した。ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（WPRE）が存在し、発現レベルを上昇させる。
【００５５】
UBE3A分泌シグナルコンストラクトを、次に、
HIV TAT配列；
YGRKKRRQRRR（配列番号5）、または
HIV TATk配列；
YARKAARQARA（配列番号11）、
のいずれかの細胞取り込みペプチド（細胞透過性ペプチド）に結合させた。
【００５６】
図21に示すヒトUBE3Aベクターを、その後、実施例２に記載のヒートショック法を使用してE. coliに形質転換した。形質転換されたE. coliを、ベクターを選択し多量のベクターを回収するために、アンピシリン含有ブロス内で増殖させた。
【００５７】
UBE3Aの他の配列として、以下に示す変異体1、2または3が含まれる。
【００５８】
ヒトUBE3A変異体1；
2018518946.tif 000004
2018518946.tif 000005
（配列番号12）。
【００５９】
ヒトUBE3A変異体2；
2018518946.tif 000006
2018518946.tif 000007
2018518946.tif 000008
（配列番号13）、タンパク質をコードする。
2018518946.tif 000009
（配列番号14）
【００６０】
ヒトUBE3A変異体3；
2018518946.tif 000010
2018518946.tif 000011
（配列番号12）。
【実施例６】
【００６１】
ヒトベクターの特性を、10％ FBSおよび1％ Pen/Strepを含むDMEM中で、37℃、5％ CO2で培養し、80％コンフルエンスで継代培養されたHEK293細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）内で試験した。
【００６２】
ベクター（6ウェルプレート中に2μg/ウェル）を、PEI遺伝子導入法を用いて細胞に遺伝子導入した。細胞は、遺伝子導入の2日前に、6ウェルプレート中で、DMEM培地で、ウェル当たり0.5×106細胞で継代培養した。培地は、遺伝子導入前夜に交換した。エンドドキシンフリーなdH2Oを約80℃に加熱し、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO）を溶解した。溶液をそのまま約25℃まで冷まし、水酸化ナトリウムを使用して溶液を中和した。各遺伝子導入ウェルに対し、AAV4−STUbベクターまたは陰性対照（培地のみ）を、200μL毎に2μgで、無血清DMEMに加え、各ウェルに対し、1μg/μlのポリエチレンイミン9μlを混合物に加えた。遺伝子導入混合物を室温で15分インキュベートし、細胞の各ウェルに、ウェル毎に210μlずつ加え、48時間インキュベートした。細胞をプレートからかきとることによって、細胞と培地を回収した。その後、培地と細胞を5000×gで5分間遠心分離した。
【００６３】
抽出物のウェスタンブロットのために、細胞ペレットを50μLの低浸透圧緩衝液内に再懸濁し、凍結／解凍を3回繰り返すことによって細胞を溶解した。ライセート（可溶化液）をLamelli試料緩衝液とともに加熱し、BioRad 4〜20％ アクリルアミドゲル上で泳動させた。トランスブロットを使用して、ニトロセルロースメンブレンに転写した。5％ミルクでブロットをブロックし、抗E6AP抗体を使用してタンパク質を検出した。
【００６４】
図22に示されるように、コンストラクトで遺伝子導入された細胞は、UBE3A遺伝子、すなわちE6-APを発現している。さらに、様々な分泌シグナルへの遺伝子の付加は、分泌シグナルペプチドに応じて、様々な結果を示した。例えば、図23に示されるように、GDNF分泌シグナルに基づくコンストラクトを使用した遺伝子導入は、より低い発現を示し、遺伝子導入細胞からの検出可能な分泌は示されなかった。インスリン分泌シグナルの使用は、細胞内のコンストラクトの高い発現とともに、遺伝子導入細胞からの中程度のE6AP分泌を引き起こした。インスリンシグナル分泌の結果は、図24に示されるように、HA標識コンストラクトを使用して確認された。
【００６５】
以上の明細書において、開示された全ての文書、行為または情報は、その文書、行為、情報またはその任意の組み合わせが、優先日において、公に入手可能であったか、公知であったか、当該分野における一般的知識の一部であったか、または何らかの問題解決に関連することが知られていたことを認めるものではない。
【００６６】
以上で引用された全ての公開物の開示は、各公開物が個々に参照により組み込まれたのと同程度に、個々に、完全に、参照により明示的に本明細書中に組み込まれる。
【００６７】
UBE3A欠損の治療法の具体的実施形態について記載、例示を行ってきたが、本発明の広範な精神と原理から逸脱することなしに、変形および改変を行い得ることは、当業者にとって明らかである。以下の請求項が、ここに記載された本発明の一般的および具体的特徴の全て、および、言語上、範囲に含まれる可能性のある、本発明の範囲の記述を全て、網羅することを意図することも、理解されるべきである。
【図１】
2018518946.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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