(57)【要約】  本発明は、分子病理の診断および予後方法の分野に関する。  特に、本発明は、被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断の決定のため、被験者の角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の発症の危険性を決定するため、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被験者の臨床転帰を決定するため、そして、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４マーカーの発現レベルの決定に基づき、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するため、の方法に関する。  本発明はまた、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断および予後マーカーとして、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を診断するためのインビトロの方法であって、以下を含む：
ａ）前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較すること；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、被験者が角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患していることを示す。
【請求項２】
請求項１に記載のインビトロでの方法であって、前記角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、無症状の円錐角膜（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、臨床円錐角膜（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載のインビトロの方法であって、角膜の前記拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、無症状の円錐角膜（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）であり、基準値を、健康な被験者からのサンプルにおいて測定された、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに一致させる方法。
【請求項４】
請求項２に記載のインビトロでの方法であって、角膜の前記拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、臨床円錐角膜（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）であり、基準値を、無症状の円錐角膜に罹患している被験者からのサンプルにおいて測定されたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに一致させる、方法。
【請求項５】
請求項２に記載のインビトロ方法であって、角膜の前記拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）であって、基準値を、健康な被験者からのサンプルにおいて、測定された、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに一致させる、方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のインビトロの方法であって、前記被験者由来のサンプルが、結膜および角膜組織から選択される、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のインビトロの方法であって、前記発現レベルが、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定することを含む、方法。
【請求項８】
請求項７のインビトロの方法であって、タンパク質レベルが、免疫組織化学、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡから、選択される方法により決定される、方法。
【請求項９】
ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒｓ）、角膜厚と角膜エレベイション（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）から選択された、少なくとも一つパラメータを決定することをも含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
被験者の角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の発症の危険性を決定するためのインビトロの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および
ｂ）前記発現レベルを基準値と比較すること、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、被験者が角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する高い危険性を有することを示す。
【請求項１１】
被験者が以前に屈折欠陥を有すると診断されている、請求項１０に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
前記被験者が、眼のかゆみ、眼をこする、生体顕微鏡の徴候および結膜充血から選択される以前の眼病変を発症したことがある、請求項１０または１１のいずれかに記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被検者の臨床転帰を決定するためのインビトロの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較すること、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、負の臨床転帰を示す。
【請求項１４】
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するインビトロの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値よりも高い場合、前記被験者は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で処置される候補であることを示す。
【請求項１５】
前記治療が、角膜架橋、角膜内リングおよび屈折矯正手術から選択される、請求項１４のインビトロの方法。
【請求項１６】
請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載のインビトロの方法であって、角膜の前記拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、無症状の円錐角膜（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、臨床円錐角膜（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される、方法。
【請求項１７】
前記被験者からのサンプルが、結膜および角膜組織から選択された、請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１８】
請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載のインビトロの方法であって、前記発現レベルが、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定する工程または、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定する工程を含む方法。
【請求項１９】
タンパク質レベルが、免疫組織化学、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡから選択される方法によって決定される、請求項１８に記載のインビトロの方法。
【請求項２０】
屈折欠陥を罹患した被験者が、屈折矯正手術治療の候補であるか否かを決定するインビトロでの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、前記被験者は、前記屈折欠陥のための屈折矯正手術（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）で処置されるべき候補ではないことを示す。
【請求項２１】
下記のための、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のマーカーとしての使用であって、
被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断を決定するためのマーカー；
被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するためのマーカー；
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を罹患した被験者の臨床転帰を決定するためのマーカー；または、
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するためのマーカーの使用。
【請求項２２】
特異的に、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４に結合する、抗体、ポリペプチド、プライマーおよび／またはプローブを含む、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断のための組成物。
【請求項２３】
特異的に、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４に結合する、抗体、ポリペプチド、プライマーおよび／またはプローブを含む、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を診断するためのキット。
【請求項２４】
以下のための、請求項２３のキットの使用。
被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断を決定するため；
被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するため；
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を罹患した被験者の臨床転帰を決定するため；または、
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するため。
【請求項２５】
前記被験者からのサンプルが、結膜および角膜組織から選択される、請求項２０に記載のインビトロの方法。
【請求項２６】
前記発現レベルが、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定、することを含む、請求項２０または２５のインビトロの方法。
【請求項２７】
免疫組織化学、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡから選択される方法により、タンパク質レベルが決定される、請求項２６のインビトロの方法。
【請求項２８】
被験者が、屈折矯正手術（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）の後に、拡張症を罹患する危険性を決定するためのインビトロの方法であって、以下を含む：
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値よりも高い場合、前記被験者は、屈折矯正手術（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）後の拡張症に罹患する高い危険性を示す指標である。
【請求項２９】
前記被験者からのサンプルが、結膜および角膜組織から選択される、請求項２８に記載のインビトロの方法。
【請求項３０】
前記発現レベルが、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定、することを含む、請求項２８または２９に記載のインビトロの方法。
【請求項３１】
免疫組織化学、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡから選択される方法により、タンパク質レベルが決定される、請求項３０のインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、病理のための（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）、分子診断および予後診断の分野に関する。特に、本発明は、被験者における角膜の拡張性疾患の診断を決定するための方法、被験者における角膜の拡張性疾患の進行の危険性を決定するための方法、角膜の拡張性疾患を罹患している被験者の臨床転帰を決定するための方法、および、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）である、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のマーカーの発現レベルの決定に基づいて、角膜の拡張性疾患の治療法で治療すべき被験者を選択することに関する。本発明はまた、角膜の拡張性疾患の診断および予後診断のマーカーとして、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
［発明の背景］
角膜拡張症は、角膜の構造的完全性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に、悪影響を与える進行性疾患である。衰弱した（ｗｅａｋｅｎｅｄ）角膜が膨らみ（ｂｕｌｇｅｓ）、そして、大きな打撃を与える（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）不揃いな乱視（ｉｒｒｅｇｕｌａｒ  ａｓｔｉｇｍａｔｉｓｍ）を発症し始める。乱視は、視力を低下させ、そして、病気が進行するにつれて、角膜の瘢痕化（ｓｃａｒｒｉｎｇ）が発生する。角膜拡張症（Ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｃｔａｓｉａ）は、円錐角膜（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、屈折矯正術後拡張症（ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｅｃｔａｓｉａ）ならびに球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）のような他の稀な疾患を含む。
ＵＶ光およびリボフラビンを使用する、角膜コラーゲン架橋のような、角膜拡張症の治療のための新しい様式が、角膜を強化し（ｓｔｉｆｆｅｎ）、そして、疾患の進行を停止（ｈａｌｔ）するために、開発されてきた。視力が（ｖｉｓｉｏｎ）、不揃いな乱視（ａｓｔｉｇｍａｔｉｓｍ）または瘢痕化によって、低下（ｄｅｇｒａｄｅｄ）する前に、非常に早い段階で、病気の進行を停止することが望ましい。それらの患者の視力を脅かす、屈折矯正術後拡張症（ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｅｃｔａｓｉａ）の最も一般的な原因は、従来からの現在の診断技術によっては検出されなかった初期の拡張症の患者に屈折矯正手術を行っていることである。本件は、彼らを、そのような致命的な（ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ）合併症から救助するために、これらの早期の患者を検出するために使用することができる、特異的かつ敏感な徴候の必要性をハイライトする。
【０００２】
角膜の形状および厚さが、拡張症の現在の診断基準の一つである。それらの使用は、一般集団間のそれらの変動によって複雑になる。角膜の厚さの正常範囲は広く、そして、通常の薄い角膜と早期拡張症患者間の重なりが、拡張症の早期診断例では、この基準の使用を複雑にする。
このように、特異性の欠如は、拡張症の診断のために、角膜肥厚を使用することの重大な制限である。拡張症（Ｅｃｔａｓｉａ）の診断に使用される角膜の形状は、角膜の薄さと同じ制限をシェアする。不揃いの乱視が、正常被験者および、拡張症患者に見られ、診断を行うため、特に軽症例では、その使用を複雑にする。研究の革新的な適応は、被験者の角膜拡張症を診断するため、および、前記疾患の発症および進行の危険性を決定するために、バイオマーカーを提供するというこの文脈において必要である。
【０００３】
［発明の簡単な説明］
第１の態様において、以下を含む、被験者における角膜の拡張性疾患を診断するための、インビトロの方法であり、
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；そして、
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較することを含み、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、被験者は、角膜の拡張性疾患に罹患していることを示す。
別の局面において、本発明は、以下を含む、被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するためのインビトロの方法に関する。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および、
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較すること；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値よりも高い場合、被験者が角膜の拡張性疾患（ｅｃｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａ）を発症する危険性が高いことを示す。
別の局面において、本発明は、以下を含む、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被検者の臨床転帰を決定するためのインビトロの方法に関する。
ａ）前記被験者由来のサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および
ｂ）前記発現レベルを基準値と比較すること；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値よりも高い場合、負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の臨床転帰（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ）を示す。
【０００４】
別の局面において、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するためのインビトロの方法に関し、以下を含む。
ａ）前記被験者由来のサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および
ｂ）前記発現レベルを基準値と比較すること；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、前記被験者が角膜拡張性疾患の治療法で治療される候補であることを示す。
別の態様において、本発明は、被験者の角膜の拡張性疾患の診断を決定するためのマーカーとしてのＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
別の局面において、本発明は、被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するためのマーカーとして、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
別の態様では、本発明は、角膜の拡張性疾患に罹患している被験者の臨床転帰を決定するためのマーカーとしてのＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
最後に、別の局面において、本発明は、角膜の拡張性疾患のための治療法で治療される被験者を選択するためのマーカーとしてのＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、コホートＡの研究グループによる、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現レベルの中央値［四分位数］を示す。対照被験者と比較して、ＴＬＲ２の発現の漸増が、円錐角膜としての角膜拡張症において、観察される：対照＜無症状の円錐角膜＜円錐角膜。
【図２】図２は、コホートＡの研究グループによる、角膜細胞におけるＴＬＲ４の発現レベルの中央値［四分位数］を示す。対照被験者と比較して、ＴＬＲ４の発現の漸増が、円錐角膜としての角膜拡張症において、観察される：対照＜無症状の円錐角膜＜円錐角膜。
【図３】図３は、コホートＢの研究グループによる、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現レベルの中央値［四分位数］を示す。ＴＬＲ２の発現の漸増が観察される：対照＜親族（Ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）＜円錐角膜。同様に、円錐角膜（ＫＣ）の患者は、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＰＭＤ）患者よりも、角膜細胞において、ＴＬＲ２のより高い発現を示した。
【図４】図４は、コホートＢの研究グループによる、角膜細胞における、ＴＬＲ４の発現レベルの中央値［四分位数］を示す。ＴＬＲ４の発現の漸増が観察される：対照＜親族（Ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）＜円錐角膜。同様に、円錐角膜（ＫＣ）の患者は、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＰＭＤ）患者よりも、角膜細胞において、ＴＬＲ４のより高い発現を示した。
【図５】図５は、コホートＢの研究グループによる、結膜細胞のＴＬＲ４の発現レベルの中央値［四分位数］を示す。ＴＬＲ４の発現の漸増が観察される：対照＜親族（Ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）＜ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）。しかし、円錐角膜（ＫＣ）の患者は、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＰＭＤ）患者よりも、結膜細胞において、ＴＬＲ４と同等の発現を示した。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明の発明者らは、拡張症プロセスが免疫応答と関連していることを発見した。この点で、本発明者らは、予想外に、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４タンパク質の発現レベルが、円錐角膜またはペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のような拡張症と診断された被験者において増加していることを見出した。
また、本特許出願の発明者らは、ＴＬＲ２とＴＬＲ４の増大した発現レベルと、前記疾患の進行と関連している特定のパラメーターとの間の相関関係を示した。したがって、これは、病気の診断マーカーとしてだけでなく、該疾患の発症や進行の危険性を予測する代理マーカーとしても、ＴＬＲ２とＴＬＲ４の使用を可能にする。
これらの知見に基づいて、本発明者らは、以下に詳細に説明する異なる実施形態において本発明の方法を開発した。
【０００７】
被験者における角膜拡張症を診断するための方法
第１の態様において、本発明は、被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を診断するためのインビトロの方法に関し、以下、「本発明の第１の方法」と言い、以下を含む。
ａ）前記被験者由来のサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および、
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較すること；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合は、被験者が角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患していることを示す。
【０００８】
本明細書で使用する用語「診断」は、被験者における可能性のある疾患を、決定および／または同定しようとするプロセス、すなわち、診断手順、および、このプロセスによって到達した意見、すなわち、診断意見の両方を指す。このように、個人の状態を、治療および予後に関する医学的判断を可能にする別々の別個のカテゴリーに分類する試みと見なすこともできる。当業者には理解されるように、そのような診断は、それが好ましいものの、診断する被験者の１００％について正確ではないかもしれない。この用語は、しかしながら、このような病理（本件の場合、角膜拡張症）に罹患している被験者の統計学的に有意な集団を特定することができる必要がある。当業者は、一団が、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントｔ−検定、マンホイットニーなどによって、よく知られている様々な統計的評価ツールを用いて統計的に有意であるかどうかを決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は、０．０５，０．０２５，０．００１またはそれ以下であることが好ましい。
【０００９】
本明細書で用いられる用語「角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患」または「角膜拡張症」は、従って、角膜曲率（ｃｏｒｎｅａｌ  ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）の変化を生じさせる、その構造的完全性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に影響を与える、角膜の厚さの漸進的な薄化を含む状態を指す。衰弱した角膜は膨らみ（ｂｕｌｇｅｓ）、そして、不揃いな乱視の大きな打撃が発生し始める。角膜拡張症は、円錐角膜（無症状円錐角膜および臨床円錐角膜に分類することができる）、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）を含む。
角膜の曲率は、以下のような、角膜の曲率に関連するいくつかのパラメータを決定することを許容する、ビデオケラトグラフィ（ｖｉｄｅｏｋｅｒａｔｏｇｒａｐｈｙ）のような角膜トポグラフィー方法（ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することができる。
−Ｋ１：中央３ｍｍのゾーン内で測定し、そして、ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒｓ）（Ｄ）で表わされた、角膜の前面（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ）の弱主経線の曲率力（ｔｈｅ  ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｔ  ｍｅｒｉｄｉａｎ）を決定する。
−Ｋ２：中央３ｍｍのゾーン内で測定し、そして、ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒｓ）（Ｄ）で表わされた、角膜の前面の強主経線の曲率力（ｔｈｅ  ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｅｐ  ｍｅｒｉｄｉａｎ）を決定する。
−Ｋｃ：頂点の最大度数（ｍａｘｉｍｕｍ  ｄｉｏｐｔｅｒ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｅｘ）を決定する
−Ｋｍ：ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒｓ）（Ｄ）で表わされた、中央３ｍｍのゾーン内の角膜の前面の平均曲率力（ｍｅａｎ  ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｐｏｗｅｒ）を決定する。
−Ｋｍａｘ：ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒｓ）（Ｄ）で表わされた、角膜の全前面の最大曲率力（ｍａｘｉｍｕｍ  ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｐｏｗｅｒ）を決定する。
−最も薄い場所（Ｔｈｉｎｎｅｓｔ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）：角膜の厚い領域と最薄点の位置を決定する（μｍ）。
−後面角膜エレベーション（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）（μｍ）。
【００１０】
健康な被験者で測定された前記パラメータは、以下のように纏めることができる。
Ｋ１（中央のジオプトリ）：４１．８〜４５．３Ｄの間；
Ｋ２：４２．２〜４５．３Ｄの間；
後面角膜エレベーション（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）；０．０２４〜０．０３６μｍの間
最薄の部位：５１３．５〜５６７μｍの間。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を診断するための方法に関し、ここで、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患は、無症状円錐角膜、臨床円錐角膜、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｃｔａｓｉａ）からなる群から選択される。
本明細書で使用する用語「円錐角膜」は、角膜が、その内部構造におけるコラーゲン線維変化に起因する、不揃いの円錐形状を採用し、弱視を引き起こす角膜の進行性疾患を意味する。ほとんどの場合、両側性であり、そして、進行は非対称である。円錐角膜の主要な解剖学的症状は、中央または中心旁（ｐａｒａｃｅｎｔｒａｌ）の領域の薄化であり、すなわち、円錐角膜が発達するにつれて角膜が薄くなり、円錐角膜が進行するにつれて視力が低下する。円錐角膜は、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＆  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌによって提案された、ビデオケラトグラフ（ｖｉｄｅｏｋｅｒａｔｏｇｒａｐｈｉｃ）のガイドラインに従って分類することができ、下方―上方度数非対称性（ｉｎｆｅｒｉｏｒ−ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｉｏｐｔｒｉｃ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）が１．４Ｄよりも大きいが、１．９Ｄ未満であり、シミュレートされた中央角膜屈折力（ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｏｗｅｒ）が、４７．２Ｄ以上で、４８．７Ｄ未満の場合、「無症状円錐角膜」として、眼を分類することが可能である。４８．７Ｄを超える中心角膜曲率、並びに、１．９Ｄ以上の下方―上方度数非対称、を示す眼は、「臨床円錐角膜」として分類することができる；２）１．０の値（補正なし、あるいは球面および／または円柱補正をして＜１．５０Ｄ）を有する、無症状円錐角膜眼の距離視力（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｖｉｓｕａｌ  ａｃｕｉｔｙ）（ＤＶＡ）。
【００１２】
本明細書で使用する用語「ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」または「ＰＭＤ」とは、場合によっては一眼にのみ影響を与えるが、角膜の下方および周辺領域に、クリアな両眼が薄くなっていることによって特徴付けられる変性角膜の状態を指す。円錐角膜とは異なり、痛みは一般的には、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）には存在せず、そして、視力喪失を除いて、いかなる症状も病態に伴わない。しかし、まれに、ＰＭＤは、突然の視力喪失の発症と耐え難いほどの眼の痛みを提示することがあり、角膜の薄化が穿孔につながる場合に発生する。通常、ＰＭＤは、角膜の血管新生、瘢痕化、または脂質の沈着を伴わない。
本明細書で使用する用語「球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）」は、角膜内の構造変化が、角膜を非常に薄くし、そして、その通常の緩やかな曲線よりも、より球形に変化させる、眼の変性の非炎症性疾患を指す。最初は、周辺で（ａｔ  ｔｈｅ  ｍａｒｇｉｎ）、角膜の薄層化が起こり、球形でわずかに拡大した眼を齎す。
本明細書で使用する用語「角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）」は、手術中に起こる角膜の内側の層の弱体化による病態を指す。近視や乱視の増加により、視力がぼやけて歪む。
本明細書で使用される場合、用語「ＴＬＲ２」または「Ｔｏｌｌ様受容体２」は、ヒトにおいて、ＴＬＲ２遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＴＬＲ２はまた、ＣＤ２８２（表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）２８２）として指定されている。ＴＬＲ２は、Ｔｏｌｌ様受容体の１つであり、そして、免疫系において役割を果たす。特に、ヒトＴＬＲ２タンパク質の配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリー、ＮＰ＿００３２５５（２０１４年５月２５日のバージョン）で提供されている。
本明細書で使用される、用語「ＴＬＲ４」または「Ｔｏｌｌ様受容体４」は、ヒトにおいて、ＴＬＲ４遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＴＬＲ４はまた、ＣＤ２８４（表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）２８４）として指定されている。ＴＬＲ４の分子量は、約９５ｋＤａである。特に、ヒトＴＬＲ４タンパク質の配列は、ＮＣＢＩデータベースエントリー、ＮＰ＿００３２５７（２０１４年５月２５日のバージョン）に提供されている。
本明細書で使用される用語「被験者」は、哺乳類として分類されるすべての動物を意味し、そして、例えば、家畜および農場動物、霊長類およびヒト、たとえば、人間、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類を含み、これらに限定されない。好ましくは、被験者は、任意の年齢または人種の男性または女性のヒトである。
本発明において、用語「サンプル」または「生物学的サンプル」は、被験者の眼から単離された生物学的材料を意味する。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するのに適した任意の生物学的材料を含むことができ、そして、被験者の細胞および／または非細胞材料を含むことができる。好ましい実施形態では、サンプルは、角膜組織からの細胞を含む任意のサンプルである。他の好ましい実施形態では、サンプルは、結膜組織からの細胞を含む任意のサンプルである。サンプルは、当技術分野で公知の任意の従来の方法を用いて単離することができる。簡潔には、角膜上皮細胞は、
無菌角膜スクレーパーを用いた機械的創傷清拭（ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ）によって、
印象細胞診（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ）によって、または、
眼をこすることによって、標準技術を使用してマイクロピペットを用いて収集され、または既知の他の任意の技術によって、涙液膜（ｔｅａｒ  ｆｉｌｍ）中に放出される角膜上皮細胞などの懸濁された涙サンプルである細胞を採取することによって、
被験者から得ることができる。サンプルが結膜組織由来の結膜細胞である場合、それらはマイクロトレフィン（ｍｉｃｒｏ  ｔｒｅｐｈｉｎｅ）を用いてサンプリングされた組織のような既知のサンプリング技術を用いて得ることができる。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明の第１の方法は、診断される被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第１の方法は、診断される被験者由来のサンプルにおけるＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第１の方法は、診断される被験者由来のサンプルにおけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
本明細書で使用される、用語「発現レベル」は、特定の遺伝子または対応するポリペプチドの発現の程度を測定するパラメータの値を指す。特定の実施形態では、前記値は、目的の遺伝子またはその断片のｍＲＮＡレベルを測定することによって、または、目的の前記遺伝子またはその変異体によってコードされるタンパク質の量を測定することによって決定することができる。したがって、本発明の文脈において、特定の実施形態において、前記発現レベルは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定すること、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定することを含む。
遺伝子の発現レベルを検出および定量するための実質的に任意の従来の方法を、特定の遺伝子の発現レベルを検出および定量するために、本発明の枠組み内で使用することができる。
非限定的な例として、遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量することによって、または、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを定量することによって、決定することができる。ｍＲＮＡの量を測定するための方法は、技術水準において周知である。例えば、試験下の被験者からの眼のサンプルのような、サンプルに含まれる核酸を、従来の方法に従って抽出する（例えば、溶菌酵素、化学溶液または定着樹脂を用いることによって）。抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析またはｍＲＮＡを標識ｃＤＮＡに変換した後に、ＤＮＡまたはＲＮＡアレイ（マイクロアレイ）によって）、および／または酵素連鎖反応による増幅によって検出することができる。一般に、定量的または半定量的な酵素増幅法が好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術が特に有利である。プライマー対は、ｃＤＮＡ増幅を、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からのコンタミネーションと区別するために、イントロンを重畳する目的で設計されることが好ましい。２つのエキソンの間に位置する領域に特異的にハイブリダイズする、好ましくは、例えば蛍光で標識された、追加のプライマーまたはプローブは、ｃＤＮＡ増幅を、ｇＤＮＡからのコンタミネーションと区別するために任意に設計される。所望であれば、前記プライマーは、おおよそ、５’末端から、プライマーの全長の半分までを含むヌクレオチドが、関心のあるエキソンの１つにハイブリダイズするように、および、おおよそ、３’末端から前記プライマー全長の半分までを含むヌクレオチドが他の目的のエキソンとハイブリダイズするように設計することができる。適切なプライマーは、当業者によって容易に設計され得る。他の増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。ｍＲＮＡの量は、定量的または半定量的に測定することが好ましい。遺伝子の発現レベルを定量するための従来の方法についての関連情報は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１−３巻］に見出すことができる。
異なるサンプルにおける１つの遺伝子の発現値を正規化するために、試験下の被験者物からのサンプルにおける目的の遺伝子（すなわち、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４）のｍＲＮＡレベルを、対照のＲＮＡレベルと比較することは可能である。本明細書で使用される、「対照のＲＮＡ」は、遺伝子の発現レベルが、被験者が、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患しているか否かに依存して異ならない、当該遺伝子のＲＮＡである；対照のＲＮＡは、好ましくは、構造的に（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）発現され、かつ、必須の細胞機能（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を果たすタンパク質をコードするハウスキーピング遺伝子に由来するｍＲＮＡである。本発明における使用のためのハウスキーピング遺伝子の、例示的な非限定的な例は、ＧＵＳＢ（β−グルクロニダーゼ）、ＰＰＩＡ（ペプチジル−プロリルイソメラーゼＡ）、β−２−ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＰＳＭＢ４（プロテアソーム  サブユニット  ベータ型４）、ユビキチン、トランスフェリン受容体、１８−ＳリボソームＲＮＡ、シクロフィリン、チューブリン、β−アクチン、３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン  ５−モノオキシゲナーゼ  チロシン  活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）等を含む。ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、試験下の被験者からのサンプルにおける前記遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の発現レベルを測定することにより決定されるならば、サンプルは、追加の分析のために、核酸を調製するために、細胞内成分を、水性または有機溶液に放出する目的で、物理的または機械的に、組織または細胞の構造を破壊するように処理することができる。抽出プロセス中に、ＲＮＡ分解を防止するように注意することが好ましい。
本発明の特定の好ましい実施形態において、遺伝子の発現の増加は、通常、対応するタンパク質の量の増加を伴うため、ＴＬＲ２の発現レベルは、ＴＬＲ２遺伝子またはその変異体によってコードされるタンパク質の発現レベルを決定する手段によって決定される、ことも可能である。
【００１４】
本明細書で使用する「変異体」という用語は、他の種において天然に現れるヒトＴＬＲ２のそれらの変異体、すなわち、ＴＬＲ２のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ）に関する。そのような変異体は、何らの制限なく、以下を含む。
マウスＴＬＲ２：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年５月２５日付の受託番号ＮＰ＿０３６０３５の配列に対応する、
ブタＴＬＲ２：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年１月１０日付の受託番号ＮＰ＿９９８９２６の配列に対応する、
マカクＴＬＲ２：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年３月２日付の受託番号ＮＰ＿００１１２３８９７の配列に対応する、
ラットＴＬＲ２：ＮＣＢＩデータベースで、２０１４年８月１０日付の受託番号ＮＰ＿９４２０６４の配列に対応する。
【００１５】
本発明の他の特定の好ましい実施形態では、ＴＬＲ４の発現レベルは、ＴＬＲ４の遺伝子またはその変異体によってコードされるタンパク質の発現レベルを決定することによって決定される。前記変異体は、制限されず、以下を含む：
マウスＴＬＲ４：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年５月４日付の受託番号ＮＰ＿０６７２７２の配列に対応する；
ブタＴＬＲ４：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年６月７日日付の受託番号ＮＰ＿００１２８０２４５の配列に対応する；
マカクＴＬＲ４：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年２月２６日付の受託番号ＮＰ＿００１０３２１６９の配列に対応する；
ラットＴＬＲ４：ＮＣＢＩデータベースに、２０１４年８月１０日付の受託番号ＮＰ＿０６２０５１の配列に対応する。
本発明における使用に適したＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の天然の変異体はまた、１つ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失によって、前記配列に由来し、そして、天然の対立遺伝子、別の処理から生じる変異体および天然に現れる切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅ  ｆｏｒｍｓ）を含む。
用語「変異体」もまた、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のフラグメント、アイソフォーム、および類似体または誘導体を含む。好ましくは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の変異体は、
（１）１つ以上のアミノ酸残基が、保存または非保存のアミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）によって置換されているポリペプチド。そして、そのような置換されたアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされていても、されていなくてもよい。
（２）たとえば、置換された結合によって修飾された残基のような、一または複数の修飾されたアミノ酸残基がある、ポリペプチド、
（３）類似のｍＲＮＡの代替的なプロセシングから生じるポリペプチド、
（４）ポリペプチド断片および／または
（５）ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４融合から生じるポリペプチド、または、分泌リーダー配列（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または、精製（例えば、Ｈｉｓタグ）または、検出（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）について使用される配列のような、他のポリペプチドを有する、（１）乃至（３）に規定されたぺプチド、
である。
断片には、オリジナルの配列のタンパク質分解切断（多部位タンパク質分解を含む）によって生成されたポリペプチドが含まれる。変異体は、翻訳後または化学的に改変されていてもよい。そのような変異体は、当業者には明らかであると考えられる。
本発明による変異体は、オリジナルのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％同様または同一であるアミノ酸配列を含む。２つのタンパク質間の同一性の程度は、当業者に広く知られている、コンピュータアルゴリズムおよび方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好適には、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２８９４９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］を用いることにより決定される。
【００１６】
タンパク質は、翻訳後に修飾することができる。例えば、本発明の範囲内に入る翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解性ミリストイル化、タンパク質フォールディングおよびタンパク質分解処理などが含まれる。さらに、タンパク質は、翻訳後の修飾によってまたは翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成される非天然のアミノ酸を含むことができる。
特定の遺伝子の発現に対応するタンパク質の量の決定は、例えば、イムノアッセイなどのタンパク質検出および定量のための任意の従来の方法を用いて行うことができる。非限定の例として、決定すべきタンパク質に特異的に結合する能力を有する抗体（またはその抗原決定基を有するその断片）、およびその後、抗原−抗体複合誘導体の定量を用いて、前記決定を行うことができる。抗体は、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘およびＦ（ａｂ‘）2、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒト化抗体等であることができる。前記抗体は、マーカーで標識されていてもいなくてもよい。本発明で使用することができるマーカーの例示的で非限定的な例には、放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素補因子、酵素基質、酵素阻害剤などが含まれる。例えば、ウエスタンブロットまたはイムノブロット技術、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学的手法（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）またはフローサイトメトリーのような、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）技術に基づくアッセイのような、本発明で使用することができる、広い範囲の周知のアッセイがある。
タンパク質を検出および定量する他の方法は、アフィニティークロマトグラフィー、リガンド結合アッセイ技術、粒子増強比濁イムノアッセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＰＥＴＩＡ）等を含む。特定の実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質の発現レベルの決定は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる。好ましい実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定される。簡潔には、フローサイトメトリーは、毎秒数千の粒子までの物理的および化学的特性の同時マルチパラメトリック分析を可能にするレーザーベースの生物物理学（ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ）技術である。典型的には、細胞上または内の、ターゲットの特徴を認識する、抗体に結合している蛍光標識またはフルオロフォアを使用することに基づいているので、それらはまた、細胞膜または別の細胞構造に対する親和性を有する化学物質に結合され得る。各フルオロフォアは、特徴的なピーク励起および発光波長を有しており、そして、発光スペクトルはしばしば重なる。結果として、使用可能な標識の組み合わせは、蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ）を励起するために使用されるランプまたはレーザーの波長および利用可能な検出器に依存する。
所望であれば、異なるサンプル間の、一つのタンパク質、すなわち、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現値を、正規化するために、試験下の被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｏｂｊｅｃｔ）からのサンプルにおける目的のタンパク質のタンパク質レベルを、対照タンパク質レベルと比較することが可能である。特定の一の実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、すなわち、サンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の濃度を提供することによって、絶対的に決定される。別の特定の実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、サンプルにおける全タンパク質量に対して相対的に測定される。
【００１７】
本発明の第１の方法の第２ステップは、基準値と、前記方法の第１ステップで得られたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを比較することを含む。本明細書で使用する用語「基準値」は、被験者から得られたサンプルから得られた値／データのための基準として使用される実験室値を指す。基準値（または基準レベル）は、絶対値、相対値、上限および／または下限を有する値、一連の値、平均値（ａｖｅｒａｇｅ  ｖａｌｕｅ）、中央値、平均値（ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ）、または対照または基準値を参照することによって、表わされた値であることができる。基準値は、例えば、試験下の被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｏｂｊｅｃｔ）から得られたサンプルから得られた値、ただし、以前の時点で得られた値、のような、個々のサンプルから得られた値に基づくことができる。基準値は、試験下の被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｏｂｊｅｃｔ）の母集団において得られた値と一致する、実年齢群（ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅ）の被験者の母集団において得られた値のような、多数のサンプルに基づいてもよいし、または、分析されるサンプルの選択または除外のサンプルのセット（ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｒ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｓａｍｐｌｅｓ）に基づいてもよい。
基準値は、疾患状態または特定の表現型を有さない、健康な被験者からのサンプルから得られた、比較されるべきマーカーの発現値に基づくことができる。例えば、基準値は、角膜拡張症に罹患していない被験者から得られた、好ましくは、いかなる角膜外傷または角膜−結膜疾患または、いかなる眼疾患に罹患していない、健常被験者から得られた、分析されるべきマーカーの発現レベルに基づくことができる。好ましい実施形態において、基準値は、健康な被験者または角膜拡張症の前病歴のない被験者からのサンプルまたはサンプルのセットから得られる。
基準値は、また、特定の表現型を有する被験者からのサンプルから得られた、比較すべきマーカーの発現値に基づくこともできる。
基準値が、一旦、確立されると、試験下の被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、基準値と比較される。この比較の結果として、被験者からのサンプルにおける、関心のあるマーカーの発現レベル（例えば、本発明の第１の方法におけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４）が、前記遺伝子についての前記基準値に対して、「より大きい」、「未満」または「等しい」とすることができる。
【００１８】
本発明の文脈において、前記遺伝子についての基準値と比較したとき、例えば、５％、１０％、２５％、５０％、１００％またはそれ以上増加した場合、または、前記マーカーについての基準値と比較したときに、たとえば、少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれ以上増加した場合、被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、前記マーカーについての基準値に対して、「より大きい」または「より高い」と考えられる。本発明の文脈では、また、被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記マーカーの基準値と比較して、例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％減少したとき、被験者からのサンプルにおける目的のマーカー（例えば、本発明の第１の方法におけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４）の発現レベルは、前記マーカーの基準値「未満」であるとも考える。
本発明の文脈では、また、被験者からのサンプルにおける、目的のマーカー（すなわち、本発明の第１の方法におけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４）の発現レベルは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、実質的に、基準値に対して不変であるとき、前記マーカーの基準値「と等しい」と考えられる。たとえば、レベルが０．１％以下、０．２％以下、０．３％以下、０．４％以下、０．５％以下、０．６％以下、０．７％以下、０．８％以下、０．９％以下、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、または、決定で使用される実験方法に関連したエラーと同じであるパーセンテージ値を超えない範囲で、相違するとき、試験下の被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、基準値「と等しい」と考えられる。
一旦、比較が、被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと、前記マーカーの基準値の間で、行われると、本発明の第１の方法は、前記基準値より、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルがより高いことに基づいて、被験者は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患していると決定することを可能にする。
【００１９】
本発明の第１の方法の特定の実施形態では、無症状の円錐角膜に罹患している被験者を診断することを目的としている。その場合、基準値は、健常者からの被験者のサンプル、好ましくは角膜拡張症を持っていない被験者から、好ましくは、いかなる角膜外傷または角膜−結膜疾患または、いかなる眼疾患に罹患していない健常者からのサンプルにおいて測定されたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに対応する。好ましい実施形態において、基準値は、健康な被験者または角膜拡張症の前病歴のない被験者からのサンプルまたはサンプルのセットから得られる。この特定の実施形態では、一旦、比較が、被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと、前記マーカーの基準値の間で、行われると、本発明の第１の方法は、前記基準値より、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルがより高いことに基づいて、被験者は、無症状の円錐角膜に罹患していると決定することを可能にする。本出願の実施例に示されるように、健常被験者の結膜組織において、フローサイトメトリーによって測定されたＴＬＲ２の値は、約２１３（９０〜２９５）ＡＵＦ（任意蛍光単位Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ）である。健常被験者の角膜組織において、フローサイトメトリーにより測定されたＴＬＲ２の値は、約１８５（１１３〜２８６）ＡＵＦである。健常被験者の結膜組織においてフローサイトメトリーで測定されたＴＬＲ４値は、約１５８１（１２８１〜２２６５）ＡＵＦ（任意蛍光単位Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ）である。健常被験者の角膜組織において、フローサイトメトリーによって測定されたＴＬＲ４の値は、約１６５４（１１３４〜２５８７）ＡＵＦである。したがって、所望であれば、前記の値は、本発明の第１の方法の第２ステップでの基準値として使用することができる。
【００２０】
別の特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、臨床円錐角膜を罹患している被験者を診断することを目的とし、この場合、基準値は、無症状円錐角膜に罹患している被験者からのサンプルにおいて測定されたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに対応する。この特定の実施形態では、一旦、比較が、被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと、前記マーカーの基準値の間で、行われると、本発明の第１の方法は、前記基準値より、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルがより高いことに基づいて、被験者は、臨床性円錐角膜疾患に罹患していると決定することを可能にする。本出願の実施例に示されるように、無症状円錐角膜に罹患している被験者の結膜組織において、フローサイトメトリーにより測定されたＴＬＲ２値は、約２０７（１２４〜３９８）ＡＵＦであり、無症状円錐角膜を患っている被験者の角膜組織においてフローサイトメトリーにより測定したＴＬＲ２の値は、約９７７（６４７〜１３３０）ＡＵＦである。無症状円錐角膜に罹患している被験者の結膜組織において、フローサイトメトリーにより測定したＴＬＲ４値は、約１９２２（１５７４から２７７８）ＡＵＦ（任意蛍光単位）であり；無症状円錐角膜に罹患している被験者の角膜組織において、フローサイトメトリーで測定したＴＬＲ４の値は、約２５６９（２０７１〜３８０８）ＡＵＦである。したがって、所望であれば、前記の値は、本発明の第１の方法の第２ステップにおける基準値として使用することができる。
【００２１】
さらに別の特定の実施形態では、本発明の第１の方法は、基準値が、健康な被験者からのサンプルにおいて、測定されたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに対応する場合に、被験者は、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に罹患していると診断することを目的とする。この特定の実施形態では、一旦、比較が、被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと、前記マーカーの基準値の間で、行われると、本発明の第１の方法は、前記基準値より、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、より高いことに基づいて、被験者は、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に罹患していると決定することを可能にする。本出願の実施例に示されるように、健康な被験者の結膜組織において、フローサイトメトリーにより測定されたＴＬＲ２値は、約７３３（５６０〜９４６）ＡＵＦであり；健康な被験者の角膜組織において、フローサイトメトリーにより測定した、ＴＬＲ２の値は、約５８０（４１３〜９７６）ＡＵＦであり；健康な被験者の結膜組織においてフローサイトメトリーにより測定された、ＴＬＲ４値は、約２３８０（１７８１〜３２８３）ＡＵＦ（任意蛍光単位）であり；健康な被験者の角膜組織において、フローサイトメトリーによって測定されたＴＬＲ４の値は、約１５７２（９４９〜２３５３）ＡＵＦである。したがって、所望であれば、前記の値は、本発明の第１の方法の第２ステップでの基準値として使用することができる。特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、角膜組織におけるＴＬＲ２の発現レベルが前記基準値より高いならば、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に罹患していると、被験者を診断することを目的とする。
【００２２】
別の特定の実施形態では、本発明の第１の方法は、前記基準値よりも、角膜または結膜、好適には、結膜組織における、ＴＬＲ４の発現レベルが高い場合に、被験者は、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に罹患していると診断することを目的とする。
別の特定の実施形態において、本発明の第１の方法はまた、ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒ）、角膜厚と角膜エレベーション（ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）から選択される、少なくとも一つのパラメータを決定することを含む。
本明細書で使用される、用語「ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒ）」は、レンズまたはレンズ系の倍率（ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）の単位を指す。レンズの度数（ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ａ  ｌｅｎｓ）は、焦点距離で割った単位（１）に比例するので、ジオプトリのレンズの度数は、メートルでの焦点距離で割った１メートルに数値的に等しい。拡大能（ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）の代数符号（ａｌｇｅｂｒａｉｃ  ｓｉｇｎｓ）は、レンズが、平行光線の入射光束（ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｐｅｎｃｉｌ）を収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅ）させるか、または発散（ｄｉｖｅｒｇｅ）させるかどうかを示す。したがって、１メートルの焦点距離を有する発散レンズは、−１ジオプトリのパワーを有する。ジオプトリは、また、メートルで測定された半径の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）に等しい曲率の測定として使用することができる。
【００２３】
被験者における、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するための方法
第２の態様において、本発明は、被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するためのインビトロの方法に関し、以下、下記を含む、本発明の第２の方法」という：
ａ）前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；そして
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する、
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、被験者は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する高い危険性有することを示す。
本明細書で使用される場合、表現「危険性の決定」または「危険性の予測」または同様の表現は、表現「危険性評価」または「危険性の評価」の同義語であり、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を被験者が発症する危険性を、予測、推定または評価を可能にすることを意味する。危険性の予測は、一般的に、危険性が増加または減少するいずれかのことを意味する。当業者であれば、理解されるように、予測（または危険性）は、評価すべき角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を患っている被験者の１００％について正確であることは好ましいが、その必要はない。この用語は、しかし、統計学的に有意な部分、被験者が、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を有する増加確率を有するとして同定され得ることを必要とする。被験者が統計的に有意であるかどうかは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定等の、様々な周知の統計評価ツールを使用して、当業者によって更なる混乱（ａｄｏ）をすることなく決定することができる。詳細は、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８３年のＤｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，研究のための統計（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で見つけることができる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５，０．０２５，０．００１，０．０００１またはそれ以下である。
【００２４】
本発明の第２の方法は、前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
好ましい実施形態において、本発明の第２の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第２の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第２の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
【００２５】
用語「被験者」、「サンプル」および「角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患」は、以前に、本発明の第１の方法の文脈において定義され、そして、本発明の第２の方法にも等しく適用され得る。
特定の実施形態では、前記被験者からのサンプルは、結膜および角膜組織から選択される。結膜および角膜組織からサンプルを得るための方法は、本発明の第１の方法に詳述されている。
【００２６】
別の特定の実施形態では、拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患は、無症状の円錐角膜、臨床円錐角膜、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される。
用語「無症状の円錐角膜」、「臨床円錐角膜」、「ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、「球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）」および「角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）」は、以前に定義した。
用語「ＴＬＲ２」、「ＴＬＲ４」および「発現レベル」は、以前に定義された。特定の実施形態において、前記発現レベルは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のタンパク質のレベルを決定することを含む。ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ２の発現レベルを決定するための方法は、本発明の第１の方法との関連で詳述し、そして、本発明の第２の方法にも同様に適用され得る。
特定の実施形態では、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のタンパク質の発現レベルの決定は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる。好ましい実施形態では、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定される。
【００２７】
本発明の第２の方法の第２のステップは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを、基準値と比較することを含む。用語「基準値」は、先に、本発明の第１の方法の文脈において、以前に定義された。
一旦、比較が、研究被験者の被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと基準値の間で行われると、本発明の第２の方法は、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値よりも高い場合に基づき、被験者は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する高い危険性を有するか否か決定することを可能にする。用語「より高い」「より少ない」および「に等しい」は、以前に定義した。
【００２８】
特定の実施形態において、本発明の第２の方法は、以前、屈折欠陥を有すると診断された被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定することを目的とする。
本明細書で使用する、用語「屈折欠陥」は、眼による、網膜上の光の収束における誤りを意味し、屈折欠陥は以下を含む：
−遠くの距離からの光の平行光線が、通常どおり、網膜自体の代わりに、網膜の前方に位置する焦点に収束する、眼の屈折の欠陥を指す、近視。
−眼の２つの経線間の異なる屈折率によって特徴付けられる眼の欠陥を指し、明確にに焦点を結ぶのを妨げ、そして、一般に、角膜のフロント曲率における欠陥のせいである,乱視。
−眼の不完全性に起因する視力の欠陥（多くの場合、眼球が短すぎる場合、またはレンズが十分に丸くならない）であり、近いオブジェクト（ｏｂｊｅｃｔｓ）物体に焦点を結ぶのが困難である、遠視（ｈｙｐｅｒｏｐｉａ）（または遠視（ｈｙｐｅｒｍｅｔｒｏｐｉａ））。
−眼が、近くのオブジェクト（ｏｂｊｅｃｔｓ）に焦点を合わせる能力が徐々に減少を発揮する、加齢に伴う状態である、老眼。
【００２９】
好ましい実施形態において、被験者は、以前に、無症状の円錐角膜を有すると診断された（シミュレートされた中央角膜屈折力（（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｏｗｅｒ）は、４７．２Ｄより大きく、しかし、４８．７Ｄ未満で、下方―上方度数非対称（ｉｎｆｅｒｉｏｒ−ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｉｏｐｔｒｉｃ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）が１．４Ｄよりも大きく、１．９Ｄ未満である）。
【００３０】
本発明の別の特定の実施形態では、試験下の被験者は、眼のかゆみ、眼をこする、生体顕微鏡における徴候および結膜充血から選択される、以前の眼病態を発症した。
用語「眼のかゆみ」は、本明細書で使用する場合、とりわけ、アトピー性角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、春季角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、アレルギー性結膜炎およびアトピー性皮膚炎によって引き起こされ得る眼の掻痒（ｐｒｕｒｉｔｕｓ）を指す。他の原因は、ドライアイ症候群、マイボーム腺機能不全、眼瞼炎（ｂｌｅｐｈａｒｉｔｈｉｓ）、コンタクトレンズ誘起結膜炎、巨大乳頭結膜炎および接触皮膚眼瞼炎（ｄｅｒｍａｔｏｂｌｅｐｈａｒｉｔｈｉｓ）を含む。
用語「生体顕微鏡における徴候」は、本明細書で使用する場合、瞼、結膜、虹彩、レンズ、強膜（ｓｃｌｅｒａ）および角膜を含む眼の前部における領域の異常を指す。網膜や視神経にも見ることができる。
用語「結膜充血」は、本明細書で使用する場合、炎症反応による結膜の血管の充血（ｅｎｇｏｒｇｅｍｅｎｔ）を指す。
【００３１】
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被験者の臨床転帰を決定するための方法
第３の局面において、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被検者の臨床転帰を決定するためのインビトロの方法に関し、以下、「本発明の第３の方法」といい、以下を含む。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定すること；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較すること；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値よりも高い場合には、負の臨床転帰（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ）を示す。
【００３２】
用語「予後を決定する」または「結果を予測する」は、本明細書では、正または負の特定の臨床転帰を、患者が有するであろう可能性を意味するために使用される。本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も適切な治療法（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）を選択することによって、治療決定を行うために臨床的に使用することができる。本発明の予測方法は、患者がこのような屈折矯正手術のような、治療計画に有利に応答する可能性があるかどうかを予測する貴重なツールである。予測は、予後因子を含むことができる。
当業者によって理解されるように、予測は、評価されるべき被験者の１００％について正確であることが好ましいが、その必要はない。しかし、この用語は、被験者の統計学的に有意な部分が、所与の結果を有する増加した確率を有すると同定することができることを必要とする。被験者が、統計的に、有意か否かは、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、交差検定分類率（ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ）等のような、種々の周知の統計学的評価のツールを、当業者が、使用することによって更に面倒にならずに、決定することができる。詳細は、ＤｏｗｄｙとＷｅａｒｄｅｎの、「研究のための統計」（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８３年に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０１、０．００５またはそれ以下である。
【００３３】
本発明の第３の方法は、前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
好ましい実施形態では、本発明の第３の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第３の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第３の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
【００３４】
本発明の第３の方法の第１ステップは、試験下の被験者のサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
用語「被験者」、「サンプル」および「角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患」は、以前に、本発明の第１の方法の文脈において定義され、本発明の第３の方法に等しく適用される。
特定の実施形態では、前記被験者からのサンプルは、結膜および角膜組織から選択される。結膜および角膜組織からサンプルを得るための方法は、本発明の第１の方法において詳述されている。
別の特定の実施形態では、拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患は、無症状の円錐角膜、臨床円錐角膜、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される。用語「無症状の円錐角膜」、「臨床円錐角膜」、「ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、「球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）」および「角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）」は以前に定義されている。
用語「ＴＬＲ２」、「ＴＬＲ４」および「発現レベル」は、以前に定義されている。特定の実施形態において、前記発現レベルは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定することを含む。ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ２の発現レベルを決定するための方法は、本発明の第１の方法の文脈で詳述され、そして本発明の第三の方法に等しく適用され得る。
特定の実施形態では、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のタンパク質の発現レベルの決定は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイで実行される。好ましい実施形態では、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定される。
【００３５】
本発明の第３の方法の第２ステップは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを、基準値と、比較することを含む。用語「基準値」は、以前に定義されている。特定の実施形態において、前記基準値は、健康な被験者または角膜拡張症の既往歴のない被験者からのサンプルまたはサンプルのセットから得られる。
【００３６】
別の特定の実施形態では、前記基準値は、時間のより早い時点で得られた前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４ｍｐ発現レベルを意味する。したがって、本発明の第３の方法は、第１の時点で得られた角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を患っている被験者からのサンプルにおいて決定されたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、第２の時点で得られた角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を患っている被験者からのサンプルにおいて決定された、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと比較される。
第２の時点での被験者のサンプルは、第１の時点の後、いつでも、例えば、最初の被験者のサンプル後、１日、１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年またはそれ以後、採取することができる。
最後に、被験者は、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、基準のサンプルの前記発現レベルよりも高い場合、負の結果を有するものとして分類される。
【００３７】
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に関連した用語「正の結果」は、角膜の変性が進んでいないことを意味する。この用語はまた、角膜変性率の低下を含む。
角膜の拡張（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に関連した、用語「負の結果」は、角膜の変性が進行していることを意味する。
【００３８】
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択する方法
第４の局面において、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するためのインビトロの方法に関し、以下、「本発明の第４の方法」といい、以下を含む。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値より高い場合、前記被験者が、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で処置される候補であることの指標となる。
【００３９】
「治療のために被験者を選択」という用語が、本明細書で使用される場合、疾患を治癒し、または、１つ以上の疾患または状態に関連する症状を緩和するように設計された、治療のための被験者の特定に関する。角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療の特定の場合には、角膜拡張症に関連する症状を、消失、遅延または減少する、任意の治療と理解される。
本発明に従って、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を治療するために、使用することができる適切な治療法は、角膜架橋（ｃｏｒｎｅａｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）、角膜内リング（ｉｎｔｒａｃｏｒｎｅａｌ  ｒｉｎｇｓ）と屈折矯正手術が挙げられる。
角膜架橋は、角膜における化学結合を強化し、そして、それによって角膜の剛性を高めるために、紫外光または、青色スペクトルの光および光増感剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｚｉｔｅｒ）を使用する技術である。
基質内（Ｉｎｔｒａｓｔｒｏｍａｌ）角膜リングまたは角膜内リングは、視力を矯正するために、眼に移植する小さなデバイスである。角膜リングを使用する典型的な視力矯正は、眼科医が眼の角膜に小さな切開部を作り、そして、瞳孔（ｐｕｐｉｌ）の各側に１つずつ、角膜実質（ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｔｒｏｍａ）の層の間に、２つの三日月形または半円形リングセグメントを挿入することを含む。角膜内にリングを埋め込むことで、角膜を平らにし、そして、眼へのその途中で角膜を通過する光の屈折を変化させる効果を有する。
屈折矯正眼科手術は、眼の屈折状態を改善し、そして、眼鏡やコンタクトレンズへの依存を、減少または排除するために使用される。これは、角膜の外科的リモデリングの様々な方法を含めることができる。自動化層状角膜移植（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）（ＡＬＫ）、レーザー支援インサイチュ角膜曲率形成術（Ｌａｓｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｋｅｒａｔｏｍｉｌｅｕｓｉｓ）（ＬＡＳＩＫ）、またはＲｅＬＥｘのような、今日、最も一般的な方法は、角膜の曲率を再形成するために、エキシマレーザーを使用する。
【００４０】
本発明の第４の方法は、前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
好ましい実施形態では、本発明の第４の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第４の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるのＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の第４の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
本発明の第４の方法の第１ステップは、試験下の被験者のサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
用語「被験者」、「サンプル」および「角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患」は、以前に、本発明の第１の方法の文脈において定義され、そして、本発明の第４の方法に等しく適用される。
特定の実施形態において、前記被験者からのサンプルは、結膜および角膜組織から選択される。結膜および角膜組織からサンプルを得るための方法は、本発明の第１の方法に詳述されている。
別の特定の実施形態では、拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患は、無症状円錐角膜、臨床円錐角膜、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される。用語「無症状円錐角膜」、「臨床円錐角膜」、「ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、「球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）」および「角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）」は、以前に定義されている。
用語「ＴＬＲ２」、「ＴＬＲ４」および「発現レベル」は、以前に定義されている。特定の実施形態において、前記発現レベルは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定することを含む。ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ２の発現レベルを決定するための方法は、本発明の第１の方法との関連で詳述し、そして本発明の第３の方法に等しく適用され得る。
特定の実施形態では、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４のタンパク質の発現レベルの決定は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる。好ましい実施形態では、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定される。
本発明の第四の方法の第２ステップは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを、基準値と比較することを含む。用語「基準値」は、以前に定義された。特定の実施形態において、前記基準値は、健康な被験者または角膜拡張症の既往歴がない被験者からのサンプルまたはサンプルのセットから得られる。
一旦、比較が、試験下の被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと、基準値との間で行われると、本発明の第４の方法は、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値より高い場合、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療されるべき被験者を選択することを許容する。「より高い」、「未満」および「に等しい」という用語は以前に定義した。
【００４１】
屈折欠陥を患っている被験者のための治療としての、屈折矯正手術を選択する方法
第５の局面において、本発明は、屈折欠陥を患っている被験者が、以下を含む屈折矯正手術治療のための候補者であるかどうかを決定するためのインビトロでの方法に関する：
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、前記被験者は、前記屈折欠陥のための屈折矯正手術で処置されべき候補者ではないことを示す。
好ましい実施形態では、本発明の第５の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
用語「屈折矯正手術」は、本明細書で使用する場合、角膜の曲率のリモデリングに基づいて、眼の屈折状態を改善するために使用される任意の眼科手術を指す。
本発明の第５の方法の第１ステップは、試験下の被験者のサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
用語「被験者」、「サンプル」および「屈折欠陥」は、以前に、本発明の第１の方法の文脈において定義され、そして、本発明の第５の方法に等しく適用され得る。
特定の実施形態において、前記被験者からのサンプルは、結膜および角膜組織から選択される。結膜および角膜組織からサンプルを得るための方法は、本発明の第１の方法に詳述されている。
特定の実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質の発現レベルの決定は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる。好ましい実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定される。
本発明の第５の方法の第２ステップは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを、基準値と比較することを含む。用語「基準値」は、以前に定義した。
一旦、比較が、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと、基準値との間で行われると、本発明の第４の方法は、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択することを許容する。「より高い」、「未満」および「に等しい」という用語は以前に定義した。
【００４２】
本発明の使用
第６の態様は、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断を決定するためのマーカーとしてのＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
第７の態様は、本発明は、被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するためのマーカーとしての、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
第８の局面において、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被検者の臨床転帰を決定するためのマーカーとしての、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
最後に、本発明は、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療されるべき被験者を選択するため、または屈折欠陥に罹患している被験者のための治療法として屈折矯正手術を選択するためのマーカーとしての、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用に関する。
用語「ＴＬＲ２」、「ＴＬＲ４」、「診断」、「危険性を決定する」、「臨床転帰を決定する」、「治療法で治療されるべき被験者を選択する」、「角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患」およびそれらの、特定のおよび好ましい実施形態は、以前に、本発明の第１、第２、第３および第４の方法の文脈において定義されており、そして、本発明の用途にも同様に適用可能である。
【００４３】
屈折矯正手術に続いて、患者が拡張症を罹患するという危険性を決定するための方法
他に態様において、本発明は、以下を含む、屈折矯正手術に続いて、患者が拡張症を罹患する危険性を決定するためのインビトロの方法に関する。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値よりも高い場合に、前記被験者は、屈折矯正手術後に、拡張症に罹患する高い危険性を示すという指標である。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
用語「屈折矯正手術」は、本明細書で使用する場合、角膜の曲率のリモデリングに基づいて、眼の屈折状態を改善するために使用される任意の眼科手術を指す。
本発明の第５の方法の第１ステップは、試験下の被験者のサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定することを含む。
用語「被験者」、「サンプル」および「屈折欠陥」は、以前に、本発明の第１の方法の文脈において定義され、そして、本発明の第５の方法に等しく適用され得る。
特定の実施形態において、前記被験者からのサンプルは、結膜および角膜組織から選択される。結膜および角膜組織からサンプルを得るための方法は、本発明の第１の方法に詳述されている。
特定の実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質の発現レベルの決定は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡまたはタンパク質アレイによって行われる。好ましい実施形態において、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルは、フローサイトメトリーによって決定される。
本発明の第５の方法の第２ステップは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを、基準値と、比較することを含む。用語「基準値」は、以前に定義されている。
一旦、比較が、試験下の被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルと基準値の間で行われると、本発明の第４の方法は、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値より高い場合には、角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択することができる。「より高い」、「未満」と「に等しい」という用語は、以前に定義した。
【００４４】
本発明はまた、下記に関する：
１．被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を診断するためのインビトロの方法であって、以下を含む：
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、被験者が角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患していることを示す。
２．態様１に記載のインビトロでの方法であって、前記角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、無症状円錐角膜（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、臨床円錐角膜（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される。
３．態様２に記載のインビトロの方法であって、前記角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、無症状円錐角膜（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）であり、その場合、基準値が、健康な被験者からのサンプルにおいて測定した、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに一致する方法。
４．態様２に記載のインビトロでの方法であって、前記角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、臨床円錐角膜（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）であり、この場合、基準値が、無症候の円錐角膜を患っている被験者からのサンプルにおいて測定されたＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに一致する方法。
５．態様２に記載のインビトロの方法であって、前記角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）であって、その場合、基準値が、健康な被験者からのサンプルにおいて測定された、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルに一致する方法。
６．態様１〜５に記載のインビトロの方法であって、前記被験者由来のサンプルが、結膜および角膜組織から選択される、方法。
７．態様１〜６に記載のインビトロの方法であって、前記発現レベルが、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定することを含む、方法。
８．態様７に係るインビトロの方法であって、タンパク質レベルが、免疫組織化学、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡにより決定される、方法。
９．ジオプトリ（ｄｉｏｐｔｅｒｓ）、角膜厚と角膜エレベーション（ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）から選択された、少なくとも一つのパラメータを決定することをも含む、態様１〜８のいずれかに記載のインビトロの方法。
１０．被験者の角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の発症の危険性を決定するためのインビトロでの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが、前記基準値より高い場合、被験者が角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する高い危険性を有することを示す。
１１．被験者が、以前に、屈折欠陥を有すると診断されている、態様１０に記載のインビトロでの方法。
１２．前記被験者が、眼のかゆみ、眼のこすり、生体顕微鏡の徴候および結膜充血：から選択される以前の眼病変を発症したことがある、態様１０または１１に記載のインビトロでの方法。
１３．角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患している被検者の臨床転帰を決定するためのインビトロでの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおける、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値より高い場合、負の臨床転帰を示す。
１４．角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療されるべき被験者を選択するインビトロの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値よりも高い場合、前記被験者が角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で処置される候補者であることを示す。
１５．前記治療が、角膜架橋、角膜内リングおよび屈折矯正手術から選択される、態様１４に記載のインビトロの方法。
１６．屈折欠陥に罹患した被験者の治療法として、屈折矯正手術を選択するためのインビトロでの方法であって、以下を含む方法。
ａ）前記被験者からのサンプルにおけるＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルを決定する；および
ｂ）前記発現レベルを、基準値と比較する；
ここで、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の発現レベルが前記基準値よりも高い場合、前記被験者は、前記屈折欠陥のための、屈折矯正手術で治療すべき候補者ではないことを示す。
１７．態様１０〜１６のいずれかに記載のインビトロでの方法であって、前記角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患が、無症状円錐角膜（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、臨床円錐角膜（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）、ペルーシド辺縁変性（ｐｅｌｌｕｃｉｄ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、球状角膜（ｋｅｒａｔｏｇｌｏｂｕｓ）および角膜屈折矯正術後拡張症（ｅｃｔａｓｉａ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ）から選択される方法。
１８．前記被験者からのサンプルが、結膜および角膜組織から選択される、態様１０〜１７のいずれかに記載のインビトロの方法。
１９．態様１０〜１８のいずれかに記載のインビトロの方法であって、前記の発現レベルが、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子からコードされるｍＲＮＡのレベルを決定する工程、またはＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４タンパク質のレベルを決定する工程を含む方法。
２０．タンパク質レベルが、免疫組織化学、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡ方法によって決定される、態様１９に記載のインビトロの方法。
２１．以下のマーカーとしての、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４の使用。
被験者における角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の診断を決定するためのマーカー；
被験者における角膜の拡張（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患を発症する危険性を決定するためのマーカー；
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患に罹患した被験者の臨床転帰を決定するためのマーカー；または、
角膜の拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）疾患の治療法で治療される被験者を選択するためのマーカー。
【００４５】
以下の実施例は、単なる例示として提供され、そして、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない。
【００４６】
実施例
【００４７】
材料および方法
私たちは、患者の２つの異なるコホート（ｃｏｈｏｒｔｓ）を含んだ：
１）コホートＡに、我々は、病理学的（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ）または臨床円錐角膜を有する患者の、角膜上皮と眼球結膜の細胞における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現は、無症状円錐角膜よりも大きく、かつ、対照被験者からのサンプルよりも高いか否かを試験するために、片側(without correction or with spherical and /or cylindrical compensation < 1.50D)円錐角膜患者（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ＫＣ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）と対照被験者を含めた。
２）コホートＢに、我々は、病理学的または臨床円錐角膜を有する患者の角膜上皮と眼球結膜の細胞における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現が、それらの親族よりも大きいか、および対照被験者からのサンプルにおけるよりも高いか試験するために、両側円錐角膜患者、患者の親族、ＰＭＤ患者および対照被験者を含めた。同様に、我々は、ＰＭＤ患者の角膜上皮および眼球結膜の細胞におけるＴＬＲ２とＴＬＲ４の発現が対照被験者よりも大きいかどうかを試験した。
【００４８】
コホートＡの患者と対照被験者
私たちは、５０人の片側円錐角膜患者（５０円錐角膜と５０の無症状円錐角膜眼）と１９人の対照被験者（３８眼）が登録された、前向き横断調査（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ）を設計した。片側円錐角膜患者（６４％の男性；平均年齢３３．３±９．５年）を、Ｓｅｒｖｉｚｏ  Ｇａｌｅｇｏ  ｄｅ  Ｓａuｄｅ、Ｃｏｍｐｌｅｘｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌａｒｉｏ  ｄｅ  Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ、スペイン、での円錐角膜患者のデータベースから選択した。私たちは、それぞれの患者または対照被験者の両眼を研究した。患者は、研究に先立って、一週間、彼らのコンタクトレンズを着用しないよう求められた。対照（４５．９パーセントの男性；平均年齢２８．５±４．７歳）の被験者は、円錐角膜、または、眼をこする、の既往歴はなく、形状の変化はなかった。すべての患者と対照被験者は、この研究の目的のために明確に集められ（ｅｘｐｒｅｓｓｌｙ  ｃｉｔｅｄ）、そしてすべての試験は、同じ研究者によって行われた。収集されたデータは、性別、年齢、患者の眼の履歴、病歴（アレルギー、眼をこする）、および円錐角膜の既往歴を含んだ。本研究は、世界医師会（２００８年）のヘルシンキ宣言に従って行われ、そして、Ｓｅｒｖｉｚｏ  Ｇａｌｅｇｏ  ｄｅ  Ｓａuｄｅでの研究の倫理委員会によって承認された。インフォームドコンセントは、手順の完全な説明の後に、各患者または対照被験者から得た。
【００４９】
包含基準は以下の通りであった：
１）非対称円錐角膜患者（１つの円錐角膜眼と１つの無症状円錐角膜眼）
Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ／ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ基準は、円錐角膜の診断のために使用された（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＹＳ、円錐角膜、Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９８；４２：２９７〜３１９）。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＆  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌによって提案されたビデオケラトグラフィ（ｖｉｄｅｏｋｅｒａｔｏｇｒａｐｈｉｃ）ガイドラインによれば、シミュレートされた中央角膜屈折力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｏｗｅｒ）が、４７．２Ｄより大きく、しかし４８．７Ｄ未満で、下方―上方屈折非対称（ｉｎｆｅｒｉｏｒ−ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｉｏｐｔｒｉｃ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）が、１．４Ｄより大きく、しかし、１．９Ｄ未満の場合、無症状円錐角膜として、眼を分類することができる。
４８．７Ｄを超える中心角膜曲率、並びに１．９Ｄより大きい、下方―上方屈折非対称（ｉｎｆｅｒｉｏｒ−ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｉｏｐｔｒｉｃ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）を示す眼は、「真円錐角膜」として分類することができる。
２）１．０（補正なし、または球形および／または円柱補償＜１．５０Ｄを有する（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｗｉｔｈ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ａｎｄ  ／ｏｒ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ＜  １．５０Ｄ））の値を持つ無症状円錐角膜眼の距離視力（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｖｉｓｕａｌ  ａｃｕｉｔｙ）（ＤＶＡ）。
【００５０】
除外基準は、以下を含む：
それらは、自然免疫の分子マーカーの研究の結果を妨げる可能性があるので、
１）前眼部（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の以前の外科的介入、または小児期角膜外傷または角膜結膜疾患；
２）活性または全身性炎症、または眼疾患、の存在、または全身的または局所的抗炎症薬による現在の治療；
３）肝臓、腎臓、血液、および免疫疾患、甲状腺機能の障害、制御されない糖尿病、サンプル収集に先行する日に感染および固形腫瘍。
【００５１】
コホートＢにおける患者と対照被験者
我々は、５３人の両側円錐角膜患者（１０６の円錐角膜眼）、２４人の親族（４８眼）、１３人のＰＭＤ患者（２６眼）および３４人の対照被験者（６８眼）が登録された、前向き、横断研究を設計した。両側円錐角膜患者（５６％男性；平均年齢３３．３±８．４歳）およびＰＭＤ患者（６９％男性；平均年齢４７．７±８．９歳）を、Ｓｅｒｖｉｚｏ  Ｇａｌｅｇｏ  ｄｅ  Ｓａuｄｅ、Ｃｏｍｐｌｅｘｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌａｒｉｏ  ｄｅ  Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ，スペインで、拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）角膜患者のデータベースから選択した。親族（５２％の男性；平均年齢は、２６．７±９．９歳）の被験者は、円錐角膜の家族歴を有したが、形状の変更（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）はなかった。
対照被験者（４１％の男性；平均年齢３０．５±９．６歳）は、円錐角膜や眼をこする、のような家族歴はなく、および形状変化もなかった。私たちは、各円錐角膜やＰＭＤの患者、親族または対照被験者の両眼を研究した。患者、親族および対照被験者は、試験前一週間、彼らのコンタクトレンズを着用しないよう求められた。すべての患者と対照被験者は、この研究の目的のために、明示で、集められ、そして、同じ研究者がすべての検査を行った。収集されたデータは、性別、年齢、患者の眼の履歴、病歴（アレルギー、眼をこする）、および円錐角膜の家族歴を含んだ。この研究は、世界医師会のヘルシンキ宣言（２００８）に従って行われ、Ｓｅｒｖｉｚｏ  Ｇａｌｅｇｏ  ｄｅ  Ｓａuｄｅでの研究の倫理委員会によって承認された。インフォームドコンセントは、手順の完全な説明の後に、各患者または対照被験者から得た。
選択基準は以下の通りであった：
１）両側円錐角膜患者（２つの円錐角膜眼）。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ／ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ基準は、円錐角膜の診断のために使用された（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＹＳ、円錐角膜、Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９８；４２：２９７〜３１９）。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＆  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌによって提案された、ビデオケラトグラフ（ｖｉｄｅｏｋｅｒａｔｏｇｒａｐｈｉｃ）ガイドラインによれば、シミュレートされた中央角膜屈折力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｏｗｅｒ）が４７．２Ｄより大きく、４８．７Ｄ未満であり、下方―上方屈折非対称（ｉｎｆｅｒｉｏｒ−ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｉｏｐｔｒｉｃ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）が１．４Ｄより大きく、１．９Ｄ未満の場合、無症状円錐角膜として、眼を分類することができる。４８．７Ｄを超える中心角膜曲率、並びに１．９Ｄより大きい、下方―上方屈折非対称を提示する眼は、「真円錐角膜」として分類することができる。
２）１．０（補正なし、あるいは球形および／または円柱補償＜１．５０Ｄを有する）の値を持つ無症状円錐角膜眼の距離視力（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｖｉｓｕａｌ  ａｃｕｉｔｙ）（ＤＶＡ）。
２）ＰＭＤ患者（２つの円錐角膜眼）。我々は、重度の倒乱視（ａｇａｉｎｓｔ−ｔｈｅ−ｒｕｌｅ  ａｓｔｉｇｍａｔｉｓｍ）を有する、垂直軸に沿った、明らかな中央の角膜平坦化、および明らかな下方の周辺角膜の急勾配を識別すると、ＰＭＤを考慮し、ＰＭＤは、典型的に、カニ爪パターンを示す。
３）親族：拡張性（ｅｃｔａｔｉｃ）障害（ＰＭＤまたは円錐角膜）を有するが、形状変化（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）のない患者の第１親等。
【００５２】
除外基準は以下を含む：
それらは、自然免疫の分子マーカーの研究の結果を妨げる可能性があるので、
１）前面部の以前の外科的介入、または小児期角膜外傷または角膜結膜疾患。
２）活性または全身性炎症、または眼疾患の存在、または全身的または局所的抗炎症薬による現在の治療；
３）肝臓、腎臓、血液、および免疫疾患、甲状腺機能の障害、制御されない糖尿病、サンプル収集に先行する日に感染および固形腫瘍。
【００５３】
臨床的変数
−  疫学的変数：年齢、性別、円錐角膜の診断の年、個人および家族の病歴、
−  治療変数：抗ヒスタミン薬、全身または局所抗炎症または抗生物質。
−  円錐角膜に関連する変数：眼のかゆみおよびその強度、眼のこすりおよびその強度、光学補正の有無におけるＡＶＬおよびＡＶＰ、生体顕微鏡（ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ）の徴候、結膜充血スケール（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  ｈｙｐｅｒｅｍｉａ  ｓｃａｌｅ）、シルマー試験（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  ｔｅｓｔ）、コンタクトレンズの着用。
−  形状の（Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ）変数：ＰＤＣ（ｓｉｍＫ）、Ｋ  ｍａｘ、Ｋ  ｍｉｎ、Ｋ１、Ｋ２、Ｋａ、Ｄｋ、ＭＰＤおよび中心までの距離。円錐角膜グレード用のＫｒｕｍｅｉｃｈの分類およびＣＬＥＫの分類、エレベーションおよび誤差測定器の値（Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｖａｌｕｅｓ）
【００５４】
試験群
比較分析のために、我々は次の群を規定した：
コホートＡ：
グループ１：角膜の形状の改変していない（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）対照。
グループ２：無症状の円錐角膜。
グループ３：円錐角膜。
コホートＢ：
グループ１：角膜の形状の改変していない（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）対照。
グループ２：両側（Ｂｉｌａｔｅｒａｌ）円錐角膜。
グループ３：ＰＭＤ。
グループ４：角膜の形状の改変していない（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）親族。
これらのグループは、円錐角膜またはＰＭＤの発症または進行の危険性のバイオマーカーとしてのＴＬＲの的中率（的中率）を決定するために確立された。
【００５５】
装置
基本的な検査器具は、トプコン生体顕微鏡、トプコンの屈折カラム（Ｔｏｐｃｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）およびアルファベットのスネレン視力検査であった。具体的な検査器具として、我々は、ＴＯＰＣＯＮ  ＣＡ−１００システム（トプコン  メディカル  システムズ株式会社、ＮＪ、米国）、およびＯｒｂｓｃａｎ  ＩＩ角膜トポグラファー（Ｏｒｂｓｃａｎ  ＩＩ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｅｒ）（Ｏｒｂｔｅｋ社、ユタ州、米国）を使用した。
【００５６】
手順
私たちのプロトコルは、以下の情報を収集した：第１の眼における、円錐角膜の診断からの経過時間、左右差（ｌａｔｅｒａｌｉｔｙ）、かゆみや擦り、円錐角膜およびアレルギーの家族病歴。
最良の補正を取得した後、生体顕微鏡検査は、円錐角膜の兆候を検出すべく行われた。角膜形状の研究は、トプコンとＯｒｂｓｃａｎのトポグラファー（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｅｒｓ）を用いて行った。次の五つの定量的形状のパラメーターを分析した：
シミュレートされた角膜曲率測定（ｋｅｒａｔｏｍｅｔｒｙ）（Ｋ）の読み（ｒｅａｄｉｎｇｓ）、
後面エレベイション（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）および、
角膜厚の最も薄い点の角膜圧測定（ｔｈｉｎｎｅｓｔ  ｐｏｉｎｔ  ｐａｃｈｙｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａ）。
【００５７】
ＴＬＲ２とＴＬＲ４の発現解析
ＴＬＲ２および４の発現分析は、ＰＶＡ発泡体手術用槍（ＰＶＡ  ｆｏａｍ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｓｐｅａｒ）（ＳＯＦＴ  ＣＥＬＬ（登録商標）、ＯＡＳＩＳ（登録商標）、ＣＡ、ＵＳＡ）の手段によって、全ての対照被験者と無症状円錐角膜患者から得た、結膜および角膜細胞におけるフローサイトメトリーにより行った。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現分析のために、結膜および角膜細胞を、それらの前方および側方散乱信号特性（ｔｈｅｉｒ  ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）によって分離した。ＦＩＴＣ−ＴＬＲ２抗体（ＩＭＭＵＮＯＳＴＥＰ、サラマンカ、スペイン）およびＰＥ−ＴＬＲ４抗体（ＩＭＭＵＮＯＳＴＥＰ、サラマンカ、スペイン）は、ＴＬＲの発現を定量するために使用した。サンプルは、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＮＪ、ＵＳＡ）で分析した。細胞蛍光は、染色直後に測定し、そして、データを、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して分析した。コホートＡについて、結膜（１２５０件のイベント（ｅｖｅｎｔｓ））および角膜細胞（５００イベント（ｅｖｅｎｔｓ））における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の中間発現値を分析し、そして、ＡＦＵ（任意蛍光単位）として表した。コホートＢについて、結膜（２０００件のイベント（ｅｖｅｎｔｓ））および角膜細胞（１０００イベント（ｅｖｅｎｔｓ））における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の中間発現値を分析し、そして、ＡＦＵ（任意蛍光単位）として表した。
【００５８】
統計分析
結果は、それぞれ、カテゴリ変数について、百分率として、そして、それらの正規分布に依拠、または依拠しない連続変数については、平均（ＳＤ）または中央値［四分位］として、表した。コルモゴロフ−スミルノフ検定（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｔｅｓｔ）は、分布の正規性を試験するために使用した。グループ間の連続変数は、スチューデントのｔ−（正規分布の変数）またはマン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定（非正規分布の変数）と比較し、割合は、カイ二乗検定（ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ）を用いて比較した。ＡＮＯＶＡは、試験群と、角膜や結膜細胞におけるＴＬＲ２とＴＬＲ４との間の関係を分析するために使用された。受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線は、円錐角膜またはＰＭＤの出現または進行の危険性を所望により予測した、角膜および結膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４のカットオフポイントを確立するように構成された。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると考えられた。統計分析は、Ｍａｃ用のＳＰＳＳ  １６．０を用いて行った。
【００５９】
実施例１
コホートＡについての臨床的特徴
性別関連の統計的な差は、研究群間で検出されなかった。しかし、円錐角膜の患者はより高齢であり、そして、円錐角膜のより頻繁な病歴を作った（ｓｏｗｅｄ）（表１）。円錐角膜の眼と最初に診断されてからの経過時間は、１〜３０年（平均、８．３±６．２年）に亘った。２３人の円錐角膜患者（４６％）と１９人の対照被験者（５１．４％）は、アレルギー疾患を、そして、１５人の円錐角膜患者（３０％）は、円錐角膜の家族歴を報告した。１３人の対照被験者（３５．１％）と３１人の患者（６２％）は、眼のかゆみを報告した。眼のかゆみを報告した患者では、７１％が、円錐角膜の眼を、頻繁に激しくこすることを認めた。１３人の対照被験者（３５．１％）も、また眼の擦りを報告した。
【００６０】
表１は、全ての研究群の平均Ｋ２の値を示す。平均Ｋ２は、他の研究群に対して、円錐角膜の眼において、より高かった（Ｐ＜０．０００１）。
2018510651.tif 000002
【００６１】
コホートＡにおける、角膜および結膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現
円錐角膜、無症状円錐角膜および対照群の、角膜および結膜細胞の両方における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現のレベルも、また、表１に示される。角膜および結膜細胞の両方における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４発現は、円錐角膜群の方が、より高かった。また、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現が高くなれはなるほど、円錐角膜の進行もより高くなった（表１）。しかし、対照群と、無症状円錐角膜および円錐角膜群の、ＴＬＲ発現の主な違いは、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現について見いだされた。そのため、予測分析は、角膜細胞におけるＴＬＲ２とＴＬＲ４の発現にのみフォーカスした。
【００６２】
コホートＡについて、円錐角膜の発症および進行の危険性についての、角膜細胞における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現の的中率（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）
ＲＯＣ解析によれば、角膜上皮細胞におけるＴＬＲ２の発現は、高い感度と特異性をもって、対照と比較して、円錐角膜（無症状円錐角膜および円錐角膜共に）の可能性を予測することができる（曲線下面積０．９９５、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．９８７〜１．０００；Ｐ＜０．０００１）。同様に、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現もまた、高い感度と特異性をもって、対照と比較して、無症状円錐角膜の可能性を予測するために有用である（曲線下面積０．９８９、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．９７５〜１．０００；ｐ＜０．０００１）。最後に、角膜のＴＬＲ２の発現も、また、高い感度および特異性をもって、円錐角膜と比較して、無症状の円錐角膜でない可能性を予測する（曲線下面積０．８９３、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．８３４〜０．９５３；ｐ＜０．０００１）。要約すると、表２は、円錐角膜の発症および進行の危険性を検出するために、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現のためのいくつかのカットオフポイント（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔｓ）の有用性について、感度と特異性を示す。
2018510651.tif 000003
【００６３】
他方、ＲＯＣ解析によれば、角膜上皮細胞におけるＴＬＲ４の発現も、また、対照と比較して、高い感度と特異性をもって、円錐角膜（無症状円錐角膜および円錐角膜の両方）の可能性を予測することができる（曲線下面積０．８４６、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．７７６〜０．９１５；Ｐ＜０．０００１）。同様に、角膜細胞におけるＴＬＲ４の発現も、また、高い感度と特異性をもって、対照と比較して、無症状円錐角膜の可能性を予測するのに有用である（曲線下面積０．７５６、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．６５３から０．８６０；ｐ＜０．０００１）。最後に、角膜のＴＬＲ４発現もまた、高い感度および特異性をもって、円錐角膜と比較して、無症候の円錐角膜でない可能性を予測する（曲線下面積０．７６７、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．６７３〜０．８６０；ｐ＜０．０００１）。表３は、円錐角膜の進行の発症の危険性を検出するために、角膜細胞におけるＴＬＲ４の発現のための、いくつかのカットオフポイント（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔｓ）の有用性についての感度と特異性を示す。
結論として、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現は、ＴＬＲ４の発現より、円錐角膜の発症および進行の危険性を検出するための、より高い的中率（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）を示した。
【００６４】
2018510651.tif 000004
【００６５】
コホートＡについて、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現と、円錐角膜の進行の臨床パラメータ（Ｋ２およびｋｃ）との間の相関
円錐角膜の進行に関連する２つの定量的なパラメータ、すなわちＫ２およびＫｃについて、臨床的および無症状円錐角膜の患者からの角膜細胞において、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを分析した。ピアソン検定（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｔｅｓｔ）で二変量の相関を計算して、より単純な線形回帰分析が行われた。結果は、相関係数ｒとして表される。
Ｋ２
ＴＬＲ２；ｒ＝０．５２５；ｐ＜０．０００１
ＴＬＲ４；ｒ＝０．３５９；ｐ＜０．００１
Ｋｃ
ＴＬＲ２；ｒ＝０．４３９；ｐ＜０．０００１
ＴＬＲ４；ｒ＝０．３７９；ｐ＜０．０００１
これらの結果は、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現と、無症状のおよび臨床円錐角膜の進行および重症度との間の関連性を確認する。
【００６６】
実施例２
コホートＢについての臨床的特徴
性別関連の統計的な差は、試験群間で検出されず、しかし、ＰＭＤを有する患者は、より高齢であり、そして、円錐角膜患者は、対照被験者とＰＭＤ患者より、拡張症（ｅｃｔａｔｉｃ）障害のより頻繁な履歴を示した（表４）。２８人の円錐角膜患者（６５％）、６人のＰＭＤ患者（４６％）、９人の親族（３９％）および１４人の対照被験者（４１．２％）が、アレルギー疾患を報告した。同様に、円錐角膜患者の８８％、ＰＭＤ患者の８４％、親戚の３９％および対照被験者の２６％が、眼のかゆみを報告した。眼のかゆみを報告した患者について、円錐角膜患者の７６％、ＰＭＤ患者の７６％、親戚の３５％および対照被験者の３５％が、円錐角膜の眼を、頻繁におよび激しく眼をこすることを認めた。
【００６７】
表４は、すべての試験群についての、中央値Ｋ２、中央Ｋ（ｃｅｎｔｒａｌ  Ｋ）、最小厚点（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｐｏｉｎｔ）および後面エレベイション値（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅｓ）を示す。中央値Ｋ２および中央Ｋは、他の試験群より、円錐角膜の眼においてより高かった（Ｐ＜０．０００１）。同様に、後面エレベイション（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）は、対照と親族被験者（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）より、円錐角膜およびＰＭＤ眼において高かった（Ｐ＜０．０００１）。対照的に、最小厚点は、他の群と比較して、円錐角膜およびＰＭＤ眼についてより低かった（Ｐ＜０．０００１）。
2018510651.tif 000005
【００６８】
コホートＢについて、角膜および結膜細胞における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現
円錐角膜、ＰＭＤ、親族および対照群において、角膜および結膜細胞の両方における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現のレベルも、また、表４に示される。角膜および結膜細胞の両方における、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現は、他のグループに対して、円錐角膜群において、より高かった。さらに、ＰＭＤ群も、また、対照群より、角膜細胞におけるＴＬＲ２、および角膜および特に結膜細胞の両方におけるＴＬＲ４についてより高い発現を示した（表４）。興味深いことに、親族は、対照被験者よりも、角膜および結膜細胞の両方において、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４のより高い発現を示したが、この発現は、円錐角膜の患者よりも、はるかに低い（表４）。しかし、対照群と、円錐角膜群のＴＬＲ発現の主な違いは、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現について発見された。他方、対照群と、ＰＭＤ群におけるＴＬＲ発現の主な違いは、結膜細胞におけるＴＬＲ４の発現について発見された。そのため、予測分析（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ）は、円錐角膜の角膜細胞におけるＴＬＲ２とＴＬＲ４、および、ＰＭＤについての結膜細胞における、ＴＬＲ４の発現についてのみ、焦点があてられた。
【００６９】
コホートＢについて、円錐角膜の発症および進行の危険性に対する、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４発現の的中率（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）
ＲＯＣ解析によれば、角膜上皮細胞におけるＴＬＲ２の発現は、対照と比較して、高い感度と特異性をもって、円錐角膜の可能性を予測することができる（曲線下面積０．８７４、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．８１５〜１．０００；ｐ＜０．０００１）。同様に、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現も、また、高い感度および特異性をもって、親族と比較して、円錐角膜の可能性を予測するために有用である（曲線下面積０．８０２；９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．７２３〜０．８８２；Ｐ＜０．０００１）。要約すると、表５は、円錐角膜の発症および進行の危険性を検出するために、角膜細胞におけるＴＬＲ２の発現のためのいくつかのカットオフポイントの有用性についての、感度と特異性を示す。
他方、ＲＯＣ解析によれば、角膜上皮細胞におけるＴＬＲ４の発現も、また、対照と比較して、高い感度と特異性をもって、円錐角膜の可能性を予測することができる（曲線下面積０．８７７、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．８１８〜０．９３６；ｐ＜０．０００１）。同様に、角膜細胞におけるＴＬＲ４の発現も、また、高い感度と特異性をもって、親族と比較して、円錐角膜の可能性を予測するために有用である（曲線下面積０．８８２、９５％信頼区間（９５％信頼区間（９５％ＣＩ））；０．８２１〜０．９４３；Ｐ＜０．０００１）。
【００７０】
2018510651.tif 000006
【００７１】
表６は、円錐角膜の進行の発症の危険性を検出するための、角膜細胞におけるＴＬＲ４の発現のためのいくらかのカットオフポイント（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔｓ）の有用性について、感度および特異性を示す。
【００７２】
結論として、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現は、円錐角膜の発症および進行の危険性を検出するための高い的中率（predictive value）を示した。
【００７３】
2018510651.tif 000007
【００７４】
コホートＢについての、ＰＭＤの発症や進行の危険性のための、結膜細胞におけるＴＬＲ４の発現の的中率（Predictive value）
最後に、ＲＯＣ解析によれば、対照被験者と比較して、結膜上皮細胞におけるＴＬＲ４の発現は、高い感度および特異性をもって、ＰＭＤの可能性を予測することもできる（曲線下面積０．８２３、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）：０．７３３〜０．９１３；ｐ＜０．０００１）。表７は、円錐角膜の進行の発症の危険性を検出するために、結膜細胞におけるＴＬＲ４の発現のためのいくつかのカットオフポイント（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｐｏｉｎｔｓ）の有用性（ｕｔｉｌｉｔｙ）についての感度と特異性を示す。
結論として、結膜細胞におけるＴＬＲ４の発現は、また、ＰＭＤの発症および進行の危険性を検出するための高い的中率（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）を示した。
【００７５】
2018510651.tif 000008
【００７６】
コホートＢにおいて、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現と、円錐角膜の進行の臨床パラメータ（Ｋ２、ＫｃおよびＫｍａｘ）との間の相関
我々は、円錐角膜患者の進行に関連する３つの量的パラメータ、すなわち、Ｋ２，ＫｃおよびＫｍａｘに関して、円錐角膜患者からの角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現レベルを分析し、そして、ピアソン検定（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｔｅｓｔ）で二変量相関を計算する、より単純な線形回帰分析を行った。結果は、相関係数（Ｒ）として表される。
Ｋ２
ＴＬＲ２；ｒ＝０．２８６；ｐ＜０．０００１
ＴＬＲ４；ｒ＝０．２４９；ｐ＜０．０００１
Ｋｃ
ＴＬＲ２；ｒ＝０．２６６；ｐ＜０．０００１
ＴＬＲ４；ｒ＝０．２８６；ｐ＜０．０００１
Ｋｍａｘ
ＴＬＲ２；ｒ＝０．４０３；ｐ＜０．０００１
ＴＬＲ４；ｒ＝０．２６３；ｐ＜０．０００１
これらの結果は、円錐角膜の進行および重症度と、角膜細胞におけるＴＬＲ２およびＴＬＲ４の発現との間の関連を確認した。
【００７７】
コホートＢについて、結膜細胞におけるＴＬＲ４の発現と、ＰＭＤ進行の臨床パラメーター（Ｋｍａｘ）の間の相関関係
一方、我々はまた、ＰＭＤの進行に関連するパラメーターであるＫｍａｘについて、ＰＭＤ患者からの結膜細胞における、ＴＬＲ４の発現レベルも分析した。私たちは、ピアソンの検定で、二変数の相関を計算する、より単純な線形回帰分析を行った。結果は、相関係数（Ｒ）として表される。
Ｋｍａｘ
ＴＬＲ４；ｒ＝０．３２７；ｐ＜０．０００１
要約すると、これらの結果もまた、結膜細胞におけるＴＬＲ４の発現と、ＰＭＤの進行および重症度との間の関連を確認する。
【図１】
2018510651.tif 000009
【図２】
2018510651.tif 000010
【図３】
2018510651.tif 000011
【図４】
2018510651.tif 000012
【図５】
2018510651.tif 000013
【国際調査報告】
2018510651.tif 000014
2018510651.tif 000015
2018510651.tif 000016
2018510651.tif 000017
2018510651.tif 000018
2018510651.tif 000019